(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２次元分布図に出現する血液中に含まれる特定の成熟血球とその幼若血球とを含む粒子集団から前記成熟血球の粒子集団を分画する方法であって、
特定の成熟血球とその幼若血球とを含む粒子集団を、前記成熟血球のみが分布する第１集団と前記成熟血球および幼若血球が分布する第２集団とに分割するように前記粒子集団の最頻度値座標を通る直線を設定し、第１集団が最頻度値座標に関して点対称となる第３集団を推定し、第１および第３集団からなる集団の分散および共分散に基づいて求められ、第１および第３集団を囲む楕円形領域内の粒子集団を前記成熟血球の粒子集団として分画を行う分画方法。
【請求項２】
成熟血球が、成熟顆粒球であり、
幼若血球が、幼若顆粒球である、請求項１記載の分画方法。
【請求項３】
２次元分布図が、核酸染色された白血球を含む検体からフローサイトメータによって検出した側方蛍光強度と側方散乱光強度とによるスキャッタグラムである請求項２記載の分画方法。
【請求項４】
成熟血球が、成熟赤血球であり、
幼若血球が、網赤血球である、請求項１記載の分画方法。
【請求項５】
２次元分布図に出現する血液中に含まれる特定の成熟血球とその幼若血球とを含む粒子集団から前記成熟血球の粒子集団を分画可能な血液分析装置であって、
血液に含まれる血球の特徴パラメータを検出する検出部と、
前記検出部で検出された特徴パラメータに基づいて生成される２次元分布図に現れる特定の成熟血球とその幼若血球とを含む粒子集団を、前記成熟血球のみが分布する第１集団と前記成熟血球および幼若血球が分布する第２集団とに分割するように前記粒子集団の最頻度値座標を通る直線を設定し、第１集団が最頻度値座標に関して点対称となる第３集団を推定し、第１および第３集団からなる集団の分散および共分散に基づいて求められ、第１および第３集団を囲む楕円形領域内の粒子集団を前記成熟血球の粒子集団として分画を行う分析部と、を備えた血液分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は２次元分布図の分画方法とそれを用いた血液分析装置に関し、主に血液中の成熟血球と幼若血球とを２次元分布図上で分画する方法と装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、このような方法としては、一次元頻度分布図における分布のピーク位置を求め、ピーク位置に基づいて頻度のしきい値を設定し、そのしきい値によって分布図を２つの集団に分画する方法を用いて、血液中の成熟赤血球と網赤血球からなる２つの粒子集団を一次元頻度分布図上で分画するようにしたものが知られている（例えば、特許公報第２６７４７０５号参照）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
この発明は、２種類の粒子を含む粒子集団を２次元分布図上で分画するにあたって、分画精度の向上を計ることを課題とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
この発明は、２次元分布図に出現する血液中に含まれる特定の成熟血球とその幼若血球とを含む粒子集団から前記成熟血球の粒子集団を分画する方法であって、特定の成熟血球とその幼若血球とを含む粒子集団を、前記成熟血球のみが分布する第１集団と前記成熟血球および幼若血球が分布する第２集団とに分割するように前記粒子集団の最頻度値座標を通る直線を設定し、第１集団が最頻度値座標に関して点対称となる第３集団を推定し、第１および第３集団からなる集団の分散および共分散に基づいて求められ、第１および第３集団を囲む楕円形領域内の粒子集団を前記成熟血球の粒子集団として分画を行う分画方法を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
この発明において、２次元分布図とは、例えば白血球の成熟顆粒球と幼若顆粒球とを含む粒子集団や、成熟赤血球と網赤血球とを含む粒子集団を表す。その場合、この方法で算出された楕円により成熟顆粒球又は成熟赤血球の集団が分画される。
【０００６】
また、白血球の成熟顆粒球と幼若顆粒球とを分画する場合には、２次元分布図として、核酸染色した白血球を含む検体からフローサイトメータによって検出した側方蛍光強度と側方散乱光強度をパラメータとするスキャッタグラムを用いることができる。
【０００７】
また、成熟赤血球と網赤血球とを分画する場合には、蛍光染色した赤血球を含む検体からフローサイトメータによって得られる側方蛍光強度と前方散乱光強度をパラメータとするスキャッタグラムを分布図として用いることができる。
さらに、この発明は、上記分画方法を採用して血液の分析を行う血液分析装置を提供するものである。
【０００８】
実施例
以下、図面に示す実施例に基づいてこの発明を詳述する。なお、各図面の共通の要素には共通の番号および記号を付記している。
【０００９】
血液分析装置の構成
図１はこの発明の方法を用いた血液分析装置の光学系を示す斜視図である。同図においてレーザダイオード２１から出射されたビームはコリメートレンズ２２を介してシースフローセル２３のオリフィス部を照射する。オリフィス部を通過する血球から発せられる前方散乱光は、集光レンズ２４とピンホール板２５とを介してフォトダイオード２６に入射する。
【００１０】
一方、オリフィス部を通過する血球から発せられる側方散乱光と側方蛍光については、側方散乱光は集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とを介してフォトマルチプライアチューブ（以下、フォトマルという）２９に入射し、側方蛍光は集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とフィルタ３６とピンホール板３０を介してフォトマル３１に入射する。
【００１１】
フォトダイオード２６から出力される前方散乱光信号と、フォトマル３１から出力される側方散乱光信号と、フォトマル３１から出力される側方蛍光信号とは、それぞれアンプ３２，３３，３４により増幅され、解析部３５に入力される。
【００１２】
図２は図１に示す血液分析装置の流体系を示す系統図である。同図において、先ず洗浄工程においては、バルブ４１，５０が開かれ、シース液を収容したシース液チャンバー４２からシース液が圧力装置４３から印加される圧力Ｐによって送出され、バルブ４１と定量シリンジ４４とノズル６とを介して廃液チャンバー４５へ排出されると共に、バルブ５０とセル１とを介して廃液チャンバー４５に排出され、所定時間後にバルブ４１，５０が閉じられる。これによって、定量シリンジ４４，ノズル６，セル１およびその経路がシース液により洗浄される。
【００１３】
次に、測定工程においては、バルブ４６，４７が開かれ、血液含有試料液を試薬で反応させて収容する反応チャンバー４８から試料液が吸引装置４９の負圧により吸引され、バルブ４６とノズル６間の経路が試料液で満たされると、バルブ４６，４７が閉じられる。次に、バルブ５０が開かれると、シース液がシース液チャンバー４２から圧力装置４３の圧力によりセル１へ送出され、廃液チャンバー４５に排出される。
【００１４】
次に、バルブ４１が開かれると、圧力装置４３からの圧力Ｐは定量シリンジ４４を介してノズル６の先端へも伝達され、ノズル６の先端においてノズル外部のシース液の圧力とノズル内部の試料液の圧力とが平衡する。従って、この状態で定量シリンジ４４のピストン４４ｂがモータ４４ａにより駆動されると、バルブ４６とノズル６間に存在する試料液はノズル６からオリフィス部１３へ容易に吐出され、シース液によって細く絞られてオリフィス部１３を通過し、シース液と共に廃液チャンバー４５へ排出される。
そして、定量シリンジ４４のピストン４４ｂの駆動が終了すると、測定工程を終了する。
【００１５】
次に、モータ４４ａが逆転してピストン４４ｂが引き戻され、定量シリンジ４４は初期状態に復帰するが、この間にはバルブ４１，５０は開かれたままであるので、前述の洗浄工程が行われ、次の測定工程に備えられることになる。
【００１６】
従って、他の反応チャンバー５１，５２，５３に収容された他の試料液についてもバルブ５４，５５，５６を開閉して前述と同様の工程を順次実行することにより測定を行うことができる。
なお、バルブ５７は廃液チャンバー４５から廃液を排出するバルブであり、必要に応じて開閉される。
【００１７】
図３は、図１の分析部３５の構成を示すブロック図である。図３において、６１は各種の数値や領域などの条件を予め設定するためのデータの入力部であり、例えば、キーボードやマウスにより構成される。
【００１８】
また、６２は設定された各種条件を格納する設定条件格納部、６３はフォトダイオード２６とフォトマル２９，３１の出力信号から得られる光学情報を格納するデータ格納部である。６４はデータ格納部６３に格納された光学情報、つまり前方散乱光強度（Ｆｓｃ），側方散乱光強度（Ｓｓｃ），側方蛍光強度（Ｓｆｌ）の内いずれか２つのパラメータを用いて２次元分布図を作成する分布図作成部、６５は分布図作成部６４で作成された分布図から座標や領域を抽出する抽出部である。
【００１９】
６６は分布図作成部６４で作成される分布図において各粒子の分画領域を決定する分画領域決定部、６７は分画領域内の粒子数の計数を行う演算部である。そして、演算部６７の演算結果は分布図作成部６４で作成された分布図と共に表示部６８に表示される。６９は図７に示すバルブ４１，４６，４７，５０，５４，５５，５６，５７およびモータ４４ａを駆動する流体系駆動部である。また、分析部３５はパーソナルコンピュータで構成される。
【００２０】
２次元分布図の作成
入力部６１において、検体ごとに「有核赤血球測定モード」，「白血球、好塩基球測定モード」、「白血球４分類測定モード」、「網赤血球測定モード」の４種類の測定モードのいずれか１つが設定される。設定に対応して、図示しない血液定量部にて定量された血液と、希釈液、染色液、溶血剤などの試薬とが、反応チャンバー４８，５１，５２，５３の内の対応するチャンバーに収容されて所定の処理が施される。このように調製された血液試料は、シースフローセル１にて順次測定される。
【００２１】
「有核赤血球測定モード」では、血液１８μｌがストマトライザーＮＲ溶血剤（シスメックス（株）製）８８２μｌとともに反応チャンバー４８に運ばれる。そしてストマトライザーＮＲ染色液（シスメックス（株）製）１８μｌが添加される。この状態で約７秒間反応させることで、赤血球が溶血させられ、白血球・有核赤血球が染色される。
【００２２】
この処理がされた試料は定量シリンジ４４によって、ノズル６から吐出され、光学的に測定して得られた情報のうち、側方蛍光強度（Ｓｆｌ）と前方散乱光強度（Ｆｓｃ）とを２次元分布図にした例が図４である。破線で示す予め設定された予想出現領域にそれぞれ有核赤血球と赤血球と白血球が出現している。
【００２３】
「白血球、好塩基球測定モード」では、血液１８μｌがストマトライザーＦＢ（II）（シスメックス（株）製）８８２μｌとともに反応チャンバー５１に運ばれる。この状態で約１４秒間反応させることで、赤血球が溶血させられ、好塩基球以外の白血球が裸核化・収縮される。
【００２４】
この処理がされた試料は定量シリンジ４４によって、ノズル６から吐出され、光学的に測定して得られた情報のうち、側方散乱光強度（Ｓｓｃ）と前方散乱光強度（Ｆｓｃ）とを２次元分布図にした例が図５である。破線で囲まれた領域はそれぞれ好塩基球とその他の白血球（リンパ球＋単球＋好中球＋好酸球）の予想出現領域である。
【００２５】
「白血球４分類測定モード」では、血液１８μｌがストマトライザー４ＤＬ（シスメックス（株）製）８８２μｌとともに反応チャンバー５２に運ばれる。そしてストマトライザー４ＤＳ（シスメックス（株）製）１８μｌが添加される。この状態で約２２秒間反応させることで、赤血球が溶血させられ、白血球が染色される。
【００２６】
この処理がされた試料は定量シリンジ４４によって、ノズル６から吐出され、光学的に測定して得られた情報のうち、側方散乱光強度（Ｓｓｃ）と側方蛍光強度（Ｓｆｌ）とを２次元分布図にした例が図６である。白血球がリンパ球、単球、好中球＋好塩基球、好酸球がそれぞれ破線で囲まれた予想領域に対応して集団を形成している。
【００２７】
「網赤血球測定モード」では、血液４．５μｌがレットサーチ（II）希釈液（シスメックス（株）製）８９５．５μｌとともに反応チャンバー５３に運ばれる。そしてレットサーチ（II）染色液（シスメックス（株）製）１８μｌが添加される。この状態で３１秒間反応させることで、網赤血球等が染色される。
【００２８】
この処理がされた試料は定量シリンジ４４によって、ノズル６から吐出され、光学的に測定して得られた情報のうち、側方蛍光強度（Ｓｆｌ）と前方散乱光強度（Ｆｓｃ）とを２次元分布図にした例が図７である。網赤血球と成熟赤血球と血小板がそれぞれ破線で囲まれた予想領域に対応して集団を形成している。
【００２９】
分画処理
白血球にはリンパ球、単球、好中球、好塩基球、好酸球という種類があり、これらは「白血球４分類測定モード」において、図６のように分布する。ところで、幼若顆粒球つまり幼若好中球が存在する異常検体の場合には、図６に対応する２次元分布図は図８のようになる。つまり、幼若好中球は分布図において好中球＋好塩基球からなる集団に連続してその上側に出現し、その下側には出現しない。
【００３０】
そこで、分画領域決定部６６（図３）は、この発明の方法により、図９に示すフローチャートに基づいて好中球＋好塩球の集団と幼若好中球の集団とを精度よく分画する。
【００３１】
先ず、図１０に示すように対象の粒子集団Ｇ０の最頻度値座標Ｐを通る直線Ｌを設定し（ステップＳ１）、対象粒子集団を直線Ｌによって下方の第１粒子集団Ｇ１と、上方の第２集団Ｇ２に分割する（ステップＳ２）。ここで第１粒子集団Ｇ１は幼若好中球が含まれていない集団であり、正常な粒子のみが正規分布している集団と考えることができる。
【００３２】
次に、図１１に示すように直線Ｌより下方の第１粒子集団Ｇ１のみに着目し、図１２に示すように第１粒子集団Ｇ１の点Ｐに関して対称な第３粒子集団Ｇ３を推定する（ステップＳ３）。すなわち粒子集団Ｇ３は、幼若好中球が含まれていないと考えられる第１粒子集団Ｇ１に基づき、点Ｐに関して点対称である集団として推定される。
【００３３】
次に、第１および第３粒子集団Ｇ１，Ｇ３からなる粒子集団が正規分布するものと仮定してその分散と共分散を求める（ステップＳ４）。
【００３４】
次に、図１３に示すように集団Ｇ１，Ｇ３を囲む楕円Ｑの長径Ｄ１および傾きθと、その短径Ｄ２とを分散と共分散から算出し、分布図座標における楕円Ｑの式を決定する（ステップＳ５）。
【００３５】
そして、図１４に示すように、決定された楕円Ｑにより、もとの粒子集団Ｇ０を分画する（ステップＳ６）。そこで、演算部６７（図３）は、楕円Ｑの内部の粒子を好中球＋好塩基球として計数し、楕円Ｑの外部の粒子を幼若好中球として計数し、計数結果を表示部６８に表示させる。
【００３６】
なお、図１３に示す楕円Ｑを決定する手法を数式を用いて説明すると次のようになる。
点Ｐの座標を（Ｐ1，Ｐ2）、楕円Ｑの長径方向の分散をＶL、楕円Ｑの短径方向の分散をＶS、分布図上の任意の座標を（Ｘ，Ｙ）とした場合、楕円Ｑは以下の式を満たす。
（Ｘ−Ｐ1）2／ＶＬ＋（Ｙ−Ｐ2）2／ＶＳ＝Ｃ（Ｃは固定値）
なお、この式の左辺は楕円Ｑ７の長径と短径の比、傾きを定義するものであり、楕円Ｑの大きさは固定値Ｃによって適宜決まる。
【００３７】
以上の分画処理においては、第１粒子集団Ｇ１の点Ｐに関して対称な位置に存在する集団を第３粒子集団Ｇ３として推定している。そのため、粒子集団Ｇ０が直線Ｌに対してどのような角度をもって分布しても、常にＧ１と同等の集団としてＧ３が推定され、結果としてＧ１とＧ３からなる粒子集団は正規分布するものと仮定することができ、正確な分画を実現することができる。
また、上記分画方法は図７に示す成熟赤血球と網赤血球との分画にも、同様にして適用することができる。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、血液中の成熟顆粒球および幼若顆粒球のように、生理的にまたは形態的にその境界が完全には明確でない二つの粒子集団を、２次元分布図上で正確に分画することが可能となる。またそのような粒子集団が分布する２次元分布図が、検体によって粒子集団の分布状態、例えば集団の傾き具合が変動しがちな測定項目に関するものである場合でも、精度良く分画することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の実施例に係る光学系を示す斜視図である。
【図２】この発明の実施例に係る流体系を示す系統図である。
【図３】この発明の実施例に係る分析部の構成を示すブロック図である。
【図４】この発明の実施例に係る分布図の表示例である。
【図５】この発明の実施例に係る分布図の表示例である。
【図６】この発明の実施例に係る分布図の表示例である。
【図７】この発明の実施例に係る分布図の表示例である。
【図８】この発明の実施例に係る分布図の表示例である。
【図９】この発明の実施例における処理手順を示すフローチャートである。
【図１０】この発明の実施例に用いる分布図の一例である。
【図１１】この発明の実施例に用いる分布図の一例である。
【図１２】この発明の実施例に用いる分布図の一例である。
【図１３】この発明の実施例に用いる分布図の一例である。
【図１４】この発明の実施例に用いる分布図の一例である。
【符号の説明】
２１  レーザダイオード
２２  コリメートレンズ
２３  シースフローセル
２４  集光レンズ
２５  ピンホール板
２６  フォトダイオード
２７  集光レンズ
２８  ダイクロイックミラー
２９  フォトマルチプライアチューブ
３０  ピンホール板
３１  フォトマルチプライアチューブ
３２  アンプ
３３  アンプ
３４  アンプ
３５  解析部
３６  フィルタ
【図１】
0004751535.tif 000002
【図２】
0004751535.tif 000003
【図３】
0004751535.tif 000004
【図４】
0004751535.tif 000005
【図５】
0004751535.tif 000006
【図６】
0004751535.tif 000007
【図７】
0004751535.tif 000008
【図８】
0004751535.tif 000009
【図９】
0004751535.tif 000010
【図１０】
0004751535.tif 000011
【図１１】
0004751535.tif 000012
【図１２】
0004751535.tif 000013
【図１３】
0004751535.tif 000014
【図１４】
0004751535.tif 000015