(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＴＬＡ４−陽性、ＣＤ２８−陽性、およびｇｐ３９−陽性細胞とＢ７−陽性およびＣＤ４０−陽性細胞との相互作用を介する移植拒絶反応を阻止するための薬剤の製造のために、ＣＴＬＡ４−陽性細胞上のＣＴＬＡ４抗原及び／又はＣＤ−２８陽性細胞上のＣＤ２８抗原がＢ７抗原と結合することを防止する第１の可溶性リガントと、ｇｐ３９−陽性細胞上のｇｐ３９抗原がＣＤ４０抗原と結合することを防止する第２の可溶性リガントとの組み合わせであって、該移植は血管柄付移植であり、該第１の可溶性リガントは、可溶性ＣＴＬＡ４、可溶性ＣＤ２８、可溶性Ｂ７、ＣＴＬＡ４に結合する抗体、ＣＤ２８に結合する抗体及びＢ７に結合する抗体からなる群より選ばれ、更に第２の可溶性リガントは、可溶性ＣＤ４０、可溶性ｇｐ３９、ＣＤ４０に結合する抗体およびｇｐ３９に結合する抗体からなる群より選ばれる、該第１の可溶性リガントと該第２の可溶性リガントとの組み合わせの有効量の使用。
【請求項２】
ＣＴＬＡ４−陽性、ＣＤ２８−陽性、およびｇｐ３９−陽性細胞とＢ７−陽性およびＣＤ４０−陽性細胞との相互作用を介する移植拒絶反応を阻止するための薬剤の製造のために、ＣＴＬＡ４−陽性細胞上のＣＴＬＡ４抗原及び／又はＣＤ−２８陽性細胞上のＣＤ２８抗原がＢ７抗原と結合することを防止する第１の可溶性リガントと、ＣＤ４０抗原およびＣＤ４０−陽性細胞がｇｐ３９抗原と結合することを防止する第２の可溶性リガントとの組み合わせであって、該移植は血管柄付移植であり、該第１の可溶性リガントは、可溶性ＣＴＬＡ４、可溶性ＣＤ２８、可溶性Ｂ７、ＣＴＬＡ４に結合する抗体、ＣＤ２８に結合する抗体及びＢ７に結合する抗体からなる群より選ばれ、更に第２の可溶性リガントは、可溶性ＣＤ４０、可溶性ｇｐ３９、ＣＤ４０に結合する抗体およびｇｐ３９に結合する抗体からなる群より選ばれる、該第１の可溶性リガントと該第２の可溶性リガントとの組み合わせの有効量の使用。
【請求項３】
ＣＴＬＡ４−陽性、ＣＤ２８−陽性、およびｇｐ３９−陽性細胞とＢ７−陽性およびＣＤ４０−陽性細胞との相互作用を介する移植拒絶反応を阻止するための薬剤の製造のために、Ｂ７−陽性細胞上のＢ７抗原がＣＴＬＡ４−陽性細胞上のＣＴＬＡ４抗原及び／又はＣＤ−２８陽性細胞上のＣＤ２８抗原と結合することを防止する第１の可溶性リガントと、ｇｐ３９−陽性細胞上のｇｐ３９抗原がＣＤ４０抗原と結合することを防止する第２の可溶性リガントとの組み合わせであって、該移植は血管柄付移植であり、該第１の可溶性リガントは、可溶性ＣＴＬＡ４、可溶性ＣＤ２８、可溶性Ｂ７、ＣＴＬＡ４に結合する抗体、ＣＤ２８に結合する抗体及びＢ７に結合する抗体からなる群より選ばれ、更に第２の可溶性リガントは、可溶性ＣＤ４０、可溶性ｇｐ３９、ＣＤ４０に結合する抗体およびｇｐ３９に結合する抗体からなる群より選ばれる、該第１の可溶性リガントと該第２の可溶性リガントとの組み合わせの有効量の使用。
【請求項４】
ＣＴＬＡ４−陽性、ＣＤ２８−陽性、およびｇｐ３９−陽性細胞とＢ７−陽性およびＣＤ４０−陽性細胞との相互作用を介する移植拒絶反応を阻止するための薬剤の製造のために、Ｂ７−陽性細胞上のＢ７抗原がＣＴＬＡ４−陽性細胞上のＣＴＬＡ４抗原及び／又はＣＤ−２８陽性細胞上のＣＤ２８抗原と結合することを防止する第１の可溶性リガントと、ＣＤ４０抗原およびＣＤ４０−陽性細胞がｇｐ３９抗原と結合することを防止する第２の可溶性リガントとの組み合わせであって、該移植は血管柄付移植であり、該第１の可溶性リガントは、可溶性ＣＴＬＡ４、可溶性ＣＤ２８、可溶性Ｂ７、ＣＴＬＡ４に結合する抗体、ＣＤ２８に結合する抗体及びＢ７に結合する抗体からなる群より選ばれ、更に第２の可溶性リガントは、可溶性ＣＤ４０、可溶性ｇｐ３９、ＣＤ４０に結合する抗体およびｇｐ３９に結合する抗体からなる群より選ばれる、該第１の可溶性リガントと該第２の可溶性リガントとの組み合わせの有効量の使用。
【請求項５】
ＣＴＬＡ４−陽性細胞上のＣＴＬＡ４抗原及び／又はＣＤ２８−陽性細胞上のＣＤ２８抗原がＢ７抗原と結合することを防止する第１の可溶性リガントは、ＣＴＬＡ４と結合する抗体、ＣＤ２８と結合する抗体または可溶性Ｂ７である、請求項１又は２記載の使用。
【請求項６】
Ｂ７−陽性細胞上のＢ７抗原がＣＤ−２８陽性細胞上のＣＤ２８抗原及び／又はＣＴＬＡ４−陽性細胞上のＣＴＬＡ４抗原と結合することを防止する第１の可溶性リガントは、Ｂ７と結合する抗体、可溶性ＣＴＬＡ４又は可溶性ＣＤ２８である、請求項３又は４記載の使用。
【請求項７】
前記可溶性ＣＴＬＡ４は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインの少なくとも一部を有する組み換え結合分子である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは非ＣＴＬＡ４タンパク質配列に結合する、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記非ＣＴＬＡ４タンパク質配列は免疫グロブリン分子の少なくとも一部である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記可溶性ＣＴＬＡ４は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質である、請求項６に記載の使用。
【請求項１１】
前記ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質はＡＴＣＣ６８６２９と命名されるＣＴＬＡ４Ｉｇである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記可溶性ＣＴＬＡ４はＣＤ２８Ｉｇ／ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質ハイブリッドである、請求項６に記載の使用。
【請求項１３】
前記ＣＤ２８Ｉｇ／ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質ハイブリッドは、ＣＴＬＡ４受容体の細胞外ドメインの一部に対応する第２のアミノ酸配列に融合したＣＤ２８受容体の細胞外ドメインの一部に対応する第１のアミノ酸配列と、ヒト免疫グロブリンＣ（ガンマ）１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３に対応する第３のアミノ酸配列とを有するＣＤ２８Ｉｇ／ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質ハイブリッドである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
可溶性ＣＤ２８は、ＣＤ２８の細胞外ドメインの少なくとも一部を有する組み換え結合分子である、請求項６に記載の使用。
【請求項１５】
前記可溶性ＣＤ２８はＣＤ２８Ｉｇ／ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質ハイブリッドである、請求項６に記載の使用。
【請求項１６】
ｇｐ３９−陽性細胞上のｇｐ３９抗原がＣＤ４０抗原と結合することを防止する第２の可溶性リガントは、ｇｐ３９と結合する抗体または可溶性ＣＤ４０である、請求項１又は３記載の使用。
【請求項１７】
ＣＤ４０−陽性細胞上のＣＤ４０抗原がｇｐ３９抗原と結合することを防止する第２の可溶性リガントは、ＣＤ４０と結合する抗体または可溶性ｇｐ３９である、請求項２又は４記載の使用。
【請求項１８】
ｇｐ３９と結合する抗体はＭＲ１モノクローナル抗体である、請求項１６に記載の使用
【請求項１９】
自己移植片、同系移植片、アログラフト及び異種グラフトの拒絶を阻止する、請求項１〜１８いずれかの項記載の使用。
【請求項２０】
慢性的な移植後血管障害を阻止する、請求項１９記載の使用。
【発明の詳細な説明】
本出願全体に種々の公報類が参照されている。これらの公報類の開示はそのまま本出願に参考として組み込まれ、本発明が関係する技術の状況をより完全に説明するものとする。
発明の背景
ＣＤ２８は大部分のＴ系列細胞および形質細胞に発現する（ジューン（June,C.H.）ら、Immunol.Today、１１巻、２１１−１６ページ（１９９０）；ダムル（Damle）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.７８巻：５０９６−６００１（１９８１））。ＣＤ２８のリガンドはＢ７であり、それは活性化されたＢ細胞上に発現する（リンスレイ（Linsley,P.S.）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ８７巻、５０３１−３５ページ（１９９０）；リンスレイら、J.Exp.Med.１７３巻、７２１−７３０ページ（１９９１））。
ＣＤ４０はタイプＩ膜結合シグナル化受容体類の腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバーである。最初はＢ細胞抗原として確認されたとはいえ、ＣＤ４０は、樹状細胞、単球およびＢ細胞を含むすべての抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって発現される。
ＣＤ４０のリガンドはｇｐ３９である；これはＣＤ４０に結合し、それによってＢ細胞を活性化することができる。ｇｐ３９はＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＰおよびＴ−ＢＡＭとしても知られている。ｇｐ３９はＴＮＦと顕著な相同性を有するタイプII細胞表面タンパク質であり、活性化されたＴ細胞によって一時的に発現される。Ｔ細胞の他に、ｇｐ３９は好塩基球、肥満細胞、および好酸球によって発現される。
ＣＤ２８およびＣＤ４０経路はＴ依存性免疫反応の開始および増幅に重要な役割を演ずる（ブルーストン（Bluestone,J.A.）Immunity２巻、５５５−９ページ（１９９５）；バンケロー（Banchereau J.）ら、Own.Rev.Immunol.１２巻、８８１−９２２ページ（１９９４）；ドュリー（Durie,F.H.）ら、Science ２６１巻、１３２８−３０ページ（１９９３）；フォイ（Foy,T.M.）ら、J.Exp.Med１７８巻、１５６７−７５ページ（１９９３）；ヴァン・デン・アートウェー（Van den Eertwegh,A.J.M.）ら、J.Exp.Med.１７８巻、１５５５−６５ページ（１９９３））。
ＣＤ２８／Ｂ７相互作用は最適Ｔ細胞活性化、およびＩＬ−２産生のために必要な、重要な“第二シグナル”を提供する（ジェンキンス（Jenkins,M.K.）ら、J.Immunol.１４７巻、２４６１−６ページ（１９９１）；シュワルツ（Schwartz,R.H.）Cell ７１巻、１０６５−８ページ（１９９２）；ブッシオティス（Boussiotis,V.A.）ら、J.Exp.Med.１７８巻、１７５３−１７６３（１９９３））、一方ＣＤ４０／ｇｐ３９シグナルはＢ細胞、マクロファージ、内皮細胞、およびＴ細胞の活性化のためのコスティミュレーションを提供する（グレワル（Grewal,I.S.）ら、Nature  ３７８巻、６１７−６２０ページ（１９９５）；ヴァン・エッセン（van Essen,D）ら、Nature  ３７８巻、６２０−６２３ページ（１９９５）；ホレンボー（Hollenbaugh,D.）ら、J.Exp.Med.１８２巻、３３−４０ページ（１９９５）；アルミテイジュ（Armitage,R.J.）ら、Nature  ３５７巻、８０−８２ページ（１９９２）；カヤビアブ（CaYabyab,M.）ら、J.Immunol.１５２巻、１５２３−３１ページ（１９９４）；ノエル（Noelle,R）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ  ８９巻、６５５０−６５５４ページ（１９９２）；アルダソン（Alderson,M）ら、J.Exp.Med.１７８ページ、６６９−６７４ページ（１９９３）。
ホスト免疫反応はしばしば移植組織および臓器の拒絶反応を起こす。そこでこれらの免疫反応の阻害は組織移植の成功のために重要である。ＣＤ２８またはＣＤ４０経路どちらかのブロック（閉鎖、ブロッケージ）を目的とする諸研究が行われているが、これらの経路のどちらか一方だけのブロックは、高度に免疫原性のアログラフト（同種異型植接用片）を生着させるには不十分であった（ターカ（Turka,L.A.）ら、Proc.NatOl Acad.Sci.ＵＳＡ８９巻、１１１０２−１１１０５ページ（１９９２）；パーカー（Parker,D.C.）ら、Proc.NatOl Acad.Sci.ＵＳＡ  ９２巻、９５６０−９５６４ページ（１９９５）：ラーゼン（Larsen,C.P.）ら、Transplantation ６１巻、４−９ページ（１９９６））。ＣＤ２８またはＣＤ４０いずれかの経路をブロックする単独治療は移植組織を最良の一時に、時には比較的長期間生存させるに過ぎない。どちらのブロックも単独ではグラフト（植接用片）の生存を一様に促進することはなかった。
異種臓器移植に対する激しい免疫反応は、臨床的移植にこの技術を適用することの強力な障壁となっている（プラット（Platt J.L.）Curr.Opin.Imm.８巻、７２１−７２８ページ（１９９６））。異種皮膚グラフトを長持ちさせるこれまでの実験的試みは、全身照射後、混合異種／同系再構成（アイルシュタット（Ildstad S.T.）、サクス（Sachs D.H.）、Nature３０７巻：１６８−１７０ページ（１９８４））か、胸腺摘出術と抗Ｔ細胞抗体除去との組み合わせによるきびしいプレコンディショニング（ピエルソン（Pierson III R.N.）、ウィン（Winn H.J.）、ラッセル（Russell Ｐ．Ｓ．）、オーチンクロス（Auchincloss Jr.H.）、J.Exp.Med.１７０巻：９９１−９９６ページ（１９８９）；およびシャラビ（Sharabi Y.）、アクセンチジェヴィッチ（Aksentijevich I.）、サンド（Sundt III T.M.）、サックス（Sachs D.H.）、サイクス（Sykes M.）J.Exp.Med.１７２巻：１９５−２０２ページ（１９９０））のどちらかを必要とする。最近これらの戦略は、調和しない異種障壁を介する皮膚グラフトの受け入れを促進するために用いられている（ザオ（Zhao Y.）、スウェンソン（Swenson K.）、セルジオ（Sergio J.）、アーン（Arn J.S.）、サックス、サイクス、Nat.Med.２（１１）巻：１２１１−１２１６ページ（１９９６））。しかし、細胞傷害性（シトアブラティブ）治療法に関連して病的状態がおきる可能性があるために、臨床的充実性臓器移植における使用にこれらの戦略を導入することは阻止される。そこで異種グラフトの生存期間を長くする非細胞傷害性戦略が開発されるならば、これら戦略の臨床的適用は非常に容易になるであろう。
現在、ホストによる移植組織の長期受容性をもたらす方法を提供し、それによって移植の生存率を高める必要がある。そのためには、移植片受容体において十分な免疫不応答を確実にすることが必要である。
我々は、ＣＤ２８またはＣＤ４０シグナルいずれかのブロックによるＴ依存性免疫反応阻止が、強力ではあるが不完全であることを見い出した。本明細書に示すデータは、これら経路の同時ブロックが、思いがけずインビボにおける移植組織の急性および慢性拒絶反応を阻止することを示した。可溶性ＣＴＬＡ４分子または、ｇｐ３９を認識して、これに結合する抗体類を用いるこれら経路の独立的ブロックは、一次皮膚移植組織の生存を短期間延ばすこともできなかった。
本発明は、ＣＤ２８およびＣＤ４０シグナルの同時ブロックが、完全な異型、並びに異種の皮膚グラフトの長期生存を促進することの発見を含める。皮膚アログラフト生存期間の延長はシクロスポリンＡ（ＣｙＡ）によって消失する；これは、それがＴｃＲ／ＣＤ３複合体および／またはその他のＣｙＡ感受性経路による完全なシグナル化を必要とする活性プロセスであることを示唆する。その上、ＣＴＬＡ４Ｉｇ／ＭＲ１は本来血管化した心臓グラフト組織の長期受容を促進し、慢性血管性拒絶反応の発生を阻止した。
本明細書の２つの移植モデルで示された効果は、ＣＤ２８およびＣＤ４０が、効果的なＴ細胞反応の発生のために必要な、相関性はあるが独立したシグナル化経路を提供することを示す。この発見は、グラフトの拒絶反応の抑制を含む免疫反応操作のための新しい、より効果的戦略となる方法を提供する。
発明の概要
本発明は移植組織の拒絶反応を阻止する方法を提供する。この方法は、ｇｐ３９およびＣＤ４０からなる群から選択される細胞上の内因性分子（例えば抗原）がその内因性リガンドと結合するのを阻止し、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、およびＢ７からなる群から選択される細胞上の内因性分子がその内因性リガンドと結合するのを阻止することを含んでなる。このような分子とそれらのリガンドとの結合の阻止は、２つの独立的シグナル経路をブロックし、移植組織拒絶反応を起こす免疫反応を阻止する。
さらに、本発明は、移植組織拒絶反応と関係する免疫反応を阻止するための反応であって、Ｂ７−陽性細胞を、Ｂ７抗原を認識しこれに結合する第１の可溶性リガンドと接触させ、ｇｐ３９−陽性細胞を、ｇｐ３９を認識しこれに結合する第２の可溶性リガンドと接触させることを含む方法を提供する。Ｂ７−陽性細胞と第１の可溶性リガンドとの結合はＢ７抗原と内因性ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８との反応をブロックする。さらにｇｐ３９抗原と第２の可溶性リガンドとの結合はｇｐ３９抗原と内因性ＣＤ４０との反応をブロックする。このｇｐ３９およびＢ７両経路のブロックは免疫反応を阻止する。
出願人の発見は、ある対象におけるｇｐ３９およびＢ７経路を介する免疫反応を阻止する方法を含む。この方法は、その対象に、Ｂ７抗原を認識しこれに結合する第１の可溶性リガンドと、ｇｐ３９を認識しこれに結合する第２の可溶性リガンドとを投与することを含んでなる。
第１および第２両方の可溶性リガンドとそれらの受容体との結合は、ｇｐ３９およびＣＤ４０抗原からなる群から選択される細胞上の内因性分子がその内因性リガンドに結合することを防止し、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、またはＢ７からなる群から選択される細胞上の内因性分子がそのリガンドと結合することを防止し、それによってｇｐ３９およびＢ７経路によって介される免疫反応を阻止する。
本発明はある対象における移植片の拒絶反応を阻止するための方法をも提供する。この方法はその対象に、Ｂ７−陽性細胞上のＢ７抗原を認識しこれに結合する第１の可溶性リガンドと、ｇｐ３９−陽性細胞上のｇｐ３９抗原を認識しこれに結合する第２の可溶性リガンドとの組み合わせを有効量投与することを含んでなる。
Ｂ７−陽性細胞と第１の可溶性リガンドとの結合、およびｇｐ３９−陽性細胞と第２の可溶性リガンドとの結合は、内因性ＣＴＬＡ４−、ＣＤ２８−、およびｇｐ３９−陽性細胞とＢ７−陽性細胞およびｇｐ３９−陽性細胞との相互作用を破壊し、移植片の拒絶反応は阻止される。
図の簡単な説明
図１は、インビボにおいてＣＤ２８およびＣＤ４０シグナルの同時ブロックが膝窩リンパ節同種異型免疫反応を除去することを示す棒グラフである。
図２Ａは、ＣＴＬＡ４Ｉｇ／ＭＲ１投与が、ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＭＲ１単独と比較して心臓アログラフトの生存を延長することを示す線グラフである。
図２Ｂは、広範囲のリンパ球侵潤、間質性線維症、および慢性拒絶反応に一致する重度冠状動脈内膜肥厚および線維症を示す６２日目のＣＴＬＡ４Ｉｇ投与−心臓アログラフトの組織学的切片の写真である（左側倍率１００；右側倍率４００）。
図２Ｃは、リンパ球侵潤および間質性線維症はより軽度であるが、慢性拒絶反応の特徴である重度冠状血管異常を示す６２日目のＭＲ１−投与心臓アログラフトの組織学的切片の写真である（左側倍率１００；右側倍率４００）。
図２Ｄは、リンパ球侵潤も線維症も冠状血管内膜損傷もない、５８日目のＣＴＬＡ４Ｉｇ／ＭＲ１−投与心臓アログラフトの組織学的切片の写真である（左側倍率１００；右側倍率４００）。
図２Ｅは、正常な、移植していないＢＡＬＢ／ｃ心臓を示す組織学的切片の写真である（左側倍率１００；右側倍率４００）。
図３Ａは、未投与、ＭＲ１投与、ＣＴＬＡ４Ｉｇ投与、およびＭＲ１／ＣＴＬＡ４Ｉｇ投与心臓アログラフトにおける、ＲＴ−ＰＣＲを用いた免疫メディエーター転写物のグラフト内発現を示す臭化エチジウム染色ゲルストリップの写真である。
図３Ｂは、平均ＰＣＲ生成物バンド強度±標準偏差を示す棒グラフである。
図４Ａは、ＭＲ１のみ、ＣＴＬＡ４Ｉｇのみ、およびＭＲ１とＣＴＬＡ４Ｉｇとの組み合わせを投与したマウスのデータを示す線グラフである。
図４Ｂは、ＣｙＡ、ＣｙＡとＣＴＬＡ４Ｉｇ、およびＣｙＡとＭＲ１を投与したマウスのデータを示す線グラフである。
図４Ｃは、一次皮膚アログラフトにおけるＹＴＳ１９１のみ、ＭＲ１のみ、ＭＲ１とＣＴＬＡ４Ｉｇ、およびＹＴＳ１９１とＣＴＬＡ４Ｉｇの手術時投与の効果を示す線グラフである。
図４Ｄは、ＣＴＬＡ４Ｉｇ／ＭＲ１投与受容体におけるＢＡＬＢ／ｃ皮膚グラフトの健康な外観を示す写真である。
図４Ｅは、拒絶反応を受けるコントロール−アログラフトを示す写真である。
図４Ｆは、移植後１００日目の生着したグラフトの、十分に保存された表皮毛包および付属構造を有する健康な外観を示す皮膚グラフトの組織学的切片の写真である。
図４Ｇは、未投与受容体に移植後８日目の、ＢＡＬＢ／ｃ皮膚グラフトを示す写真である。
図５Ａは、インビトロにおけるＭＲ１のみ、ＣＴＬＡ４Ｉｇのみ、およびＭＲ１／ＣＴＬＡ４Ｉｇ組み合わせを投与した異なる３細胞集団に与える効果を示す線グラフである。
図５Ｂは、ＭＲ１のみ、ＣＴＬＡ４Ｉｇのみ、およびＭＲ１／ＣＴＬＡ４Ｉｇ組み合わせ使用のインビボ効果を示す棒グラフである。
図６Ａは、照射した（２０００ＲＡＤＳ）ラット（スプラグ−ダウレイ）脾細胞による足免疫に反応したＣ３Ｈマウスにおける、免疫された膝窩リンパ節の重量と反対側リンパ節の重量との比を示す棒グラフである。ヒトＩｇＧ（点斑）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（灰色）、ＭＲ１（白）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ／ＭＲ１（黒）、免疫していない正常リンパ節（斜線）。
図６Ｂは、免疫後５日目に膝窩リンパ節を収穫した後のリンパ節細胞のインビトロ増殖を示す線グラフである。ヒトＩｇＧ（斜線）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（灰色）、ＭＲ１（白色）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ／ＭＲ１（黒）、免疫していない正常リンパ節（斜線）。
図６Ｃは、ＣＤ４０およびＣＤ２８経路の同時ブロックがＩＬ−２のサイトカイン産生を著しく阻止することを示す棒グラフである。ヒトＩｇＧ（斜線）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（灰色）、ＭＲ１（白色）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ／ＭＲ１（黒）、免疫していない正常リンパ節（斜線）。
図６Ｄは、ＣＤ４０およびＣＤ２８経路の同時ブロックがＩＮＦｇのサイトカイン産生を著しく阻止することを示す棒グラフである。ヒトＩｇＧ（斜線）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（灰色）、ＭＲ１（白色）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ／ＭＲ１（黒）、免疫していない正常リンパ節（斜線）。
図７Ａは、０、２、４および６日目のＭＲ１（５００μｇ）投与と組み合わせて０、２、４および６日目にＣＴＬＡ４−Ｉｇ（５００μｇ）を投与したＣ３Ｈ受容体が、スプラグ−ダウレイラット心臓アログラフトの生存期間を延長したことを示す線グラフである。
図７Ｂは、広がった組織破壊を示す６日目の未投与心臓異種グラフトの写真である（４００×）。
図７Ｃは、リンパ球侵潤、単球破壊および冠状動脈血管症を示す２０日目のＣＴＬＡ４−Ｉｇ投与心臓異種グラフトの写真である（４００×）。
図７Ｄは、リンパ球侵潤、単球破壊および冠状動脈血管症を示す２０日目のＭＲ１投与心臓異種グラフトの写真である（４００×）。
図７Ｅは、正常な、移植されてないスプラグ−ダウレイラット心臓の写真である（４００×）。
図７Ｆは、リンパ球侵潤および線維症がほとんどない、２０日目のＣＴＬＡ４−Ｉｇ／ＭＲ１投与心臓異種グラフトの写真である（４００×）。
図７Ｇは、単球および血管構造が両方ともよく保存されていることを示す、１２２日目のＣＴＬＡ４−Ｉｇ／ＭＲ１投与心臓異種グラフトの写真である（４００×）。
図８Ａは、手術時にＭＲ１およびＣＴＬＡ４−Ｉｇを同時投与したＣ３Ｈマウスのスプラグ−ダウレイラット皮膚異種グラフトの生存が、ＭＲ１のみまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇのみを投与した受容体および未投与コントロールの異種グラフトの生存と比較して長くなることを示す一連の線グラフである。
図８Ｂは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ／ＭＲ１組み合わせ、またはＭＲ１のみを長期投与（標準的４投与体系後に開始）した場合、この両投与間では異種グラフト生存に顕著な変化がないことを示す一連の線グラフである。
図８Ｃは、移植後１００日目の、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ／ＭＲ１投与Ｃ３Ｈ受容体のラット皮膚グラフトの健康な外観を示す写真である。
図８Ｄは、移植後１０日目に拒絶反応を受けたコントロール皮膚異種グラフトを示す写真である。
図８Ｅは、移植後５０日目のよく保存された組織学的構造を示す、受容されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ／ＭＲ１投与グラフトのヘマトキシリン−エオシン染色組織学的切片の写真である（４００×）。
図８Ｆは、投与しなかったＣ３Ｈ受容体における移植後８日目のスプラグ−ダウレイラット皮膚グラフトのヘマトキシリン-エオシン染色組織学的切片の写真である（４００×）。
図９Ａは、スプラグ−ダウレイドナーからの皮膚異種グラフト移植後５５日目に、Ｃ３Ｈ受容体から集めた血清における誘発異種抗体反応の減少を示す散乱プロットである。投与を受けなかったコントロール・マウスは容易に検出できるＩｇＧ異種抗体を有した。ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＭＲ１単独投与は異種抗体反応を部分的にブロックした。ＣＴＬＡ４−ＩｇとＭＲ１との組み合わせは誘発異種抗体反応を実質上除去した。各データ点は個々の受容体の分析を表す。
図９Ｂは、スプラグ−ダウレイドナーからの心臓異種グラフト移植後２０日目にＣ３Ｈ受容体から集めた血清中の誘発異種抗体反応の減少を示す散乱プロットである。
発明の詳細な説明
定義
本出願に用いたすべての科学的および技術的用語は、特に記載しない限り、この分野で一般的に用いられる意味を有する。本出願に用いる下記の単語または語句は特殊の意味を有する。
本明細書に用いる“ｇｐ３９に対するモノクローナル抗体”または“抗−ｇｐ３９”はＭＲ１を含める。抗−ｇｐ３９は文献では抗ＣＤ４０リガンドとしても知られている。ＭＲ１の例は、マウスから得たｇｐ３９に対するモノクローナル抗体を含めるが、これに制限されるものではない；他の種、例えばサル、ヒツジ、ヒトなどからのｇｐ３９に対する抗体も含まれる。その上、“ｇｐ３９に対するモノクローナル抗体”または“抗−ｇｐ３９”は、ｇｐ３９を認識しこれに結合するあらゆる抗体分子、それらの断片、または組換え結合タンパク質を含める。
本明細書に用いる“投与する（アドミニスタリング）”は、経口投与、坐薬としての適用、局所的接触、静脈内−、筋肉内−または皮下投与、またはミニ浸透圧ポンプなどの除放性デバイスの対象への埋め込みを意味する。
本明細書に用いる“薬学的に容認される担体”とは、抗体と組み合わせたときに抗体の免疫原性を保持し、対象の免疫系と反応しない物質を含める。例としては、これに制限されるものではないが、リン酸緩衝食塩液、水、例えば水中油滴型エマルジョン等のエマルジョン、種々のタイプの湿潤剤など、あらゆる標準的薬学的担体を含む。その他の担体には、滅菌溶液、上衣錠剤を含める錠剤類、およびカプセル類も含む。
典型的にはこのような担体は、賦形薬、例えば澱粉、ミルク、砂糖、ある種の粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはそれらの塩類、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、タルク、植物脂肪または油、ガム類、グリコール類またはその他の公知の賦形薬類も含む。このような担体は香料および色素添加物またはその他の成分も含むことができる。このような担体を含んでなる組成物は公知の一般的方法によって処方される。
本明細書に用いる“移植組織（トランスプランティドティシュ）”とは、自己移植片、同系移植片、アログラフトおよび異種グラフトを含める。移植組織の例は、これに制限されるものではないが、例えば心臓、肝臓または腎臓の充実性器官移植組織、皮膚グラフト、膵島細胞、骨髄グラフトまたは細胞懸濁液などを含む。
ここに用いる“Ｂ７”とは、Ｂ７−１（ＣＤ８０とも呼ばれる）、Ｂ７−２（ＣＤ８６とも呼ばれる）、Ｂ７−３およびＢ７ファミリー、例えばＢ７−１、Ｂ７−２および／またはＢ７−３の組み合わせを含む。
ここに記載の発明をより完全に理解するために下記の説明を記す。
ここに記載の発見は移植組織の拒絶反応を阻止する方法に関するものである。１実施態様において、本発明の方法はｇｐ３９およびＣＤ４０からなる群から選択される細胞上の内因性分子の、その内因性リガンドとの結合を防止することを含む。本発明の方法はＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、およびＢ７からなる群から選択される細胞上の内因性分子の、その内因性リガンドとの結合を防止することを提供する。これらの分子をそれらの内因性リガンドとの結合から防止すると、２つの独立的シグナル経路がブロックされる。これら２つの独立的シグナル経路のブロックは、移植組織の拒絶反応をおこす免疫反応を阻止する。
本発明の１例において、内因性ｇｐ３９抗原はその内因性リガンドとの結合が防止される。この例は、ｇｐ３９−陽性細胞を、ｇｐ３９抗原を認識しこれに結合する可溶性リガンドと接触させる工程を含む。（例えば、ＭＲ１、またはｇｐ３９と結合するその他の抗体類などの可溶性リガンド、および可溶性ＣＤ４０分子類を用いる）
この例は、内因性ＣＴＬＡ４抗原のその内因性リガンドとの結合を防止する付加的工程を含む。これは、Ｂ７−陽性細胞を、Ｂ７抗原を認識しこれに結合する可溶性リガンド、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ（１９９５年７月１８日発行の米国特許第５，４３４，１３１号）、ＢＢ−１モノクローナル抗体またはその他のＢ７に対する抗体と接触させる付加的工程を含む。
ｇｐ３９−陽性細胞とその可溶性リガンドとの結合は、内因性ｇｐ３９抗原と内因性ＣＤ４０との反応をブロックする。Ｂ７−陽性細胞とその可溶性リガンドとの結合は、内因性Ｂ７抗原と内因性ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８との反応をブロックする。この両ブロックの組み合わせは免疫反応を阻止する。
また別の例において、内因性ＣＤ４０抗原はその内因性リガンドとの結合が防止される。この例は、ＣＤ４０−陽性細胞を、ＣＤ４０抗原を認識しこれに結合する可溶性リガンドと接触させる工程を含む。適したリガンドは、ＣＤ４０または可溶性ｇｐ３９（ｓｇｐ３９）に対する抗体を含む。
この例は、内因性ＣＴＬＡ４抗原とその内因性リガンドとの結合を防止する付加的工程を含む。この工程はＢ７−陽性細胞を、Ｂ７抗原を認識しこれに結合する可溶性リガンドと接触させることを含む。この可溶性リガンドの例は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、可溶性ＣＤ２８分子、およびＢ７に対する抗体を含む。
ＣＤ４０−陽性細胞とその可溶性リガンドとの結合はＣＤ４０抗原と内因性ｇｐ３９との反応をブロックする。Ｂ７−陽性細胞とその可溶性リガンドとの結合はＢ７抗原と内因性ＣＴＬＡ４との反応をブロックする。このブロックの組み合わせは免疫反応を阻止する。
もう一つの例においては、内因性ｇｐ３９抗原は上記のようにその内因性リガンドとの結合が防止される。この例は、さらに内因性ＣＤ２８抗原のその内因性リガンドとの結合を防止する付加的工程も含む。この工程はＢ７−陽性細胞を、Ｂ７抗原を認識しこれに結合する可溶性リガンドと接触させることを含む。例としてはＣＴＬＡ４Ｉｇ、可溶性ＣＤ２８分子、およびＢＢ−１などのＢ７に対する抗体が含まれる。
ｇｐ３９−陽性細胞とその可溶性リガンドとの結合はｇｐ３９抗原と内因性ＣＤ４０との反応をブロックする。Ｂ７−陽性細胞とその可溶性リガンドとの結合はＢ７抗原と内因性ＣＤ２８との反応をブロックする。このブロックの組み合わせは免疫反応を阻止する。
もう一つの例においては、上記のように内因性ＣＤ４０抗原のその内因性リガンドとの結合を防止される。この例は、さらに内因性Ｂ７抗原のその内因性リガンドとの結合を防止する付加的工程をも提供する。これはＣＤ２８−陽性細胞を、ＣＤ２８抗原を認識しこれに結合する可溶性リガンドと接触させることを含んでなる。このような可溶性リガンド類の例は、可溶性Ｂ７分子およびＣＤ２８に対する抗体を含む。
ＣＤ４０−陽性細胞とその可溶性リガンドとの結合はＣＤ４０抗原と内因性ｇｐ３９との反応をブロックする。ＣＤ２８−陽性細胞とその可溶性リガンドとの結合はＢ７抗原と内因性ＣＤ２８との反応をブロックする。このブロックの組み合わせは免疫反応を阻止する。
もう一つの例において、上記のように内因性ＣＤ４０抗原はそのリガンドに結合することを防止される。この例は、ＣＴＬＡ４−陽性細胞を、ＣＴＬＡ４抗原を認識しこれに結合する可溶性リガンドと接触させることを含んでなる、内因性Ｂ７抗原のその内因性リガンドとの結合を防止する付加的工程を提供する。このような可溶性リガンドの例は可溶性Ｂ７分子およびＣＴＬＡ４に対する抗体を含む。
ＣＤ４０−陽性細胞のその可溶性リガンドへの結合は、ＣＤ４０抗原と内因性ｇｐ３９との反応をブロックする。その上、ＣＴＬＡ４−またはＣＤ２８−陽性細胞のその可溶性リガンドへの結合は、ＣＴＬＡ４抗原と内因性Ｂ７との反応をブロックする。このブロックの組み合わせは免疫反応を阻止する。
その他の例において、内因性ＣＤ４０抗原は上記のようにそのリガンドとの結合を防止される。この例は、ＣＤ２８−陽性細胞を、ＣＤ２８抗原を認識しこれに結合する可溶性リガンドと接触させることを含んでなる、内因性Ｂ７抗原のその内因性リガンドとの結合を防止する付加的工程を提供する。このような可溶性リガンドの例は可溶性Ｂ７分子およびＣＤ２８に対する抗体を含む。
ＣＤ４０−陽性細胞とその可溶性リガンドとの結合はｇｐ３９抗原と内因性ＣＤ４０との反応をブロックする。さらに、ＣＤ２８−陽性細胞と可溶性リガンドとの結合はＣＤ２８抗原と内因性Ｂ７との反応をブロックする。このブロックの組み合わせは免疫反応を阻止する。
またその他の例において、内因性ＣＤ４０抗原は上記のようにそのリガンドとの結合が防止される。この例は、ＣＴＬＡ４−陽性細胞を、ＣＴＬＡ４を認識しこれに結合する可溶性リガンドと接触させることを含んでなる、内因性Ｂ７抗原のその内因性リガンドとの結合を防止する付加的工程を提供する。
ＣＤ４０−陽性細胞と可溶性リガンドとの結合はｇｐ３９抗原と内因性ＣＤ４０との反応をブロックする。その上、ＣＴＬＡ４−陽性細胞と可溶性リガンドとの結合はＣＴＬＡ４抗原と内因性Ｂ７との反応をブロックする。このブロックの組み合わせは免疫反応を阻止する。
その上、本発明はグラフトの拒絶反応を起こす免疫反応を阻止する方法のもう一つの実施態様を提供する。この実施態様はＢ７−陽性細胞を、Ｂ７抗原を認識しこれに結合する第１の可溶性リガンドと接触させ、ｇｐ３９−陽性細胞を、ｇｐ３９抗原を認識しこれに結合する第２の可溶性リガンドと接触させることを含む。
Ｂ７−陽性細胞と第１の可溶性リガンドとの結合はＢ７抗原と内因性ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８との反応をブロックする。さらに、ｇｐ３９抗原と第２の可溶性リガンドとの結合はｇｐ３９抗原と内因性ＣＤ４０との反応をブロックする。このブロックの組み合わせは免疫反応を阻止する。
その上、本発明は対象におけるＣＴＬＡ４／ＣＤ２８／Ｂ７およびｇｐ３９／ＣＤ４０経路を介する免疫反応を阻止する方法を提供する。本発明の実施によると、対象はヒト、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウマ、マウス、ブタ、またはウシ等の動物対象であってもよい。
この方法はその対象に、Ｂ７抗原を認識しこれに結合する第１の可溶性リガンド（例えば可溶性ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８分子、例えば、ブダペスト条約の規定により１９９１年５月３１日にロックヴィル、マリーランドのアメリカンタイプ培養コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された、それぞれＡＴＣＣ受入れ番号６８６２９および６８８２８のＣＴＬＡ４ＩｇおよびＣＤ２８Ｉｇ融合タンパク質）およびｇｐ３９抗原を認識しこれに結合する第２の可溶性リガンド（例えばｇｐ３９に対するモノクローナル抗体（ＭＲ１）または可溶性ＣＤ４０分子）を投与することを含む。第１および第２のリガンドとそれらの受容体との結合はＣＴＬＡ４−、ＣＤ２８−、およびｇｐ３９−細胞とＢ７−およびＣＤ４０−陽性細胞との相互作用によって仲介される免疫反応を阻止する。
また、本発明は対象における移植片の拒絶反応を阻止する方法を提供する。この方法はその対象に、Ｂ７−陽性細胞上のＢ７抗原を認識しこれに結合する第１の可溶性リガンドと、ｇｐ３９−陽性細胞上のｇｐ３９抗原を認識しこれに結合する第２の可溶性リガンドとの組み合わせを有効量投与することを含んでなる。Ｂ７−陽性細胞と第１の可溶性リガンドとの結合およびｇｐ３９−陽性細胞と第２の可溶性リガンドとの結合は内因性ＣＴＬＡ４−、ＣＤ２８−、およびｇｐ３９−細胞とＢ７−陽性細胞およびｇｐ３９−陽性細胞との相互作用を破壊し、それによって移植片拒絶反応は阻止される。
本発明の実施によると、第１の可溶性リガンドは、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインの少なくとも一部を有する組換え結合分子であってもよく、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは非ＣＴＬＡ４タンパク質配列に結合する。非ＣＴＬＡ４タンパク質配列は免疫グロブリン分子の少なくとも一部であってもよい。
発明の１つの特別な例において、リガンドはＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質である；それは例えば、１９９１年５月３１日のブダペスト条約の規定により、ロックヴィル、マリーランドのアメリカンタイプ培養コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された、ＡＴＣＣ受入れ番号：６８６２９をもつＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質である。あるいは、そのリガンドはＣＤ２８Ｉｇ／ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質ハイブリッドでもよい（１９９５年７月１８日発行の米国特許第５，４３４，１３１号）。
また別の実施態様では、第１の可溶性リガンドはＢ７抗原と反応するモノクローナル抗体でもよい、例えばその抗体は抗ＢＢ１モノクローナル抗体でもよい（クラーク（Clerk）ら、Human Immunol.１６巻：１００−１１３ページ（１９８６）；ヨコチら、J.Immunol.１２８巻：８２３ページ（１９８１）；フリーマン（Freeman）らJ.Immunol.１４３（８）巻：２７１４−２７２２ページ（１９８９）；およびフリードマンら、J.Immunol.１３９巻：３２６０ページ（１９８７））。
もう一つの実施態様において、リガンドは、ＣＴＬＡ４受容体の細胞外ドメインの一部に対応する第２のアミノ酸配列に融合したＣＤ２８受容体の細胞外ドメインの一部に対応する第１のアミノ酸配列と、ヒト免疫グロブリンＣｇ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に対応する第３アミノ酸配列とを有するＣＤ２８Ｉｇ／ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質ハイブリッドでもよい。
本発明の１実施態様において、ｇｐ３９抗原の第２の可溶性リガンドはｇｐ３９抗原と反応するモノクローナル抗体、例えばＭＲ１抗ネズミモノクローナル抗体または抗ヒトｇｐ３９抗体でもよい（１９９５年１２月１２日発行の米国特許第５，４７４，７７１号）。
本発明のまた別の実施態様では、この方法は対象に可溶性融合タンパク質、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを含む可溶性融合タンパク質、を投与することを含む。
１例において、第１の結合ドメインは、ｇｐ３９抗原を認識しこれに結合するリガンドである。幾つかの例はｇｐ３９に対するＣＤ４０およびモノクローナル抗体を含む。その他の例では、第１の結合ドメインはＣＤ４０抗原を認識しこれに結合するリガンドである。幾つかの例はＣＤ４０に対するｇｐ３９およびモノクローナル抗体を含む。
１例において、第２の結合ドメインは、ＣＴＬＡ４を認識しこれに結合するリガンドである。幾つかの例はＣＴＬＡ４に対するＢ７およびモノクローナル抗体を含む。その他の例では、第２の結合ドメインはＣＤ２８抗原を認識しこれに結合するリガンドである。幾つかの例は、ＣＤ２８に対するＢ７およびモノクローナル抗体を含む。その他の例では、第２の結合ドメインは、Ｂ７抗原を認識しこれに結合するリガンドである。幾つかの例はＢ７に対するＣＴＬＡ４、ＣＤ２８およびモノクローナル抗体を含む。
可溶性リガンドは移植中、移植前または移植後に投与することができる。可溶性リガンドは経口的、経皮的、静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下投与によって投与できる。
本発明の最も有効な投与法および用量範囲は治療すべき組織または疾患の部位、病気のきびしさおよび経過、対象の健康および治療に対する反応、および治療医の判断による。よって、これら分子の用量は個々の対象ごとに決めるべきである。
例として、ｍｇ／ｍ2表面積に基づく種々の大きさおよび種類の動物およびヒトの用量の相互関係をフライライヒ（Freireich,E.J.）らが報告している（Cancer Chemother.,Rep.５０（４）巻：２１９−２４４（１９６６））。用量体系の調節を行い、グラフトの拒絶反応を起こす免疫反応の抑制を最適化することができる；例えば用量を分割し、１日ベースで投与してもよいし、状態によって比例的に用量を減らすこともできる（例えば１日に数回に分割した量を与えるかまたは特殊な治療的状態によっては比例的に減らすこともできる）。
適切な臨床的結果を得るのに必要な本発明の組成物の用量はスケジュールの最適化とともにさらに減らすことができることは明らかである。
本発明はグラフトの拒絶反応の阻止または免疫反応の阻止に有効な薬学的組成物をも提供する。１実施態様において、これらの組成物は（ａ）ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、およびＢ７抗原のいずれかを認識しこれに結合する可溶性リガンドと、（ｂ）ｇｐ３９およびＣＤ４０抗原のいずれかをを認識しこれに結合する可溶性リガンドとの組み合わせの有効量、並びに容認される担体を含んでなる。その他の実施態様において、これらの組成物は、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含んでなる可溶性融合タンパク質の有効量を含み、ここで第１の結合ドメインはｇｐ３９またはＣＤ４０抗原のいずれかを認識しこれに結合するリガンドであり、第２の結合ドメインは、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８およびＢ７抗原のいずれかを認識しこれに結合するリガンドである。
本発明の利点：臨床的免疫抑制における多くの進歩にもかかわらず、慢性血管性拒絶反応は移植失敗の主な原因であり、その有効治療はまだない。以下に述べる実験は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４／Ｂ７およびｇｐ３９／ＣＤ４０経路のブロックが移植組織における慢性移植組織血管症の発生を阻止することを示す。これらのデータは、異型および異種グラフトに対する免疫反応が細胞の破壊なしに阻止されることを示す。可溶性ＣＴＬＡ４分子のみの使用に比較して、可溶性ＣＴＬＡ４分子を、ｇｐ３９を認識しこれに結合する可溶性リガンドとともに使用すると免疫抑制期間は劇的に延長する。
下記の例は、本発明を説明し、これを作成し、使用する当業者を助けるために示される。これらの例は決して本発明の範囲を制限するものではない。
例１
この例のデータは、インビボにおいてＣＤ２８およびＣＤ４０シグナルの同時ブロックが膝窩リンパ節同種異型免疫反応を除去することを示す。
方法
雄Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（ジャクソン研究所、バールハーバー、ＭＥ）マウスに、０日目に左足に滅菌正常生理食塩液５０ｍｌ中、２×１０６ＢＡＬＢ／ｃ脾細胞を皮下注射することによって免疫し、右足には滅菌正常生理食塩液５０ｍｌを注射した。そして０、２および４日目にＭＲ１（２５０ｍｇ）、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（２５０ｍｇ）またはこれら両試薬を腹腔内に注射した。
マウスを５日目に殺し、手術用顕微鏡（倍率２０×）を用いて膝窩リンパ節を収穫し、各々のリンパ節の新鮮重量を分析秤（Ａ−１６０型、デンバー・インスツルメント・カンパニー、アルヴァダ、ＣＯ）でほぼ０．１ｍｇまで測定した。
検討
異型脾細胞による皮下免疫後５日目に、未治療コントロール・マウスでは、抗原攻撃側の排液（ドレイニング）膝窩リンパ節の重量は反対側リンパ節と比べて５倍を超えた。ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＭＲ１の投与はその反応を５０−６０％阻止し、一方ＣＴＬＡ４ＩｇとＭＲ１との同時投与は抗原攻撃に反応したリンパ節膨張を除去した。結果は、各群の３匹づつのマウスの平均値±標準偏差を示す。３回の独立した実験でも同様な結果が得られた。
コントロール・マウスでは免疫した足の排液したリンパ節の重量が、滅菌生理食塩液を注射した反対側の足と比較して４〜６倍増加することがわかった（図１）。この重量増加は富リンパ球−傍皮質（Ｔ細胞）および皮質（Ｂ細胞）領域の著しい膨張を伴う。単独で投与したとき、ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＭＲ１はそれぞれ、この反応を部分的に阻止した（それぞれ５７％および５６％）。ＣＴＬＡ４Ｉｇ／ＭＲ１の組み合わせはリンパ節膨張を除去し（９８％阻止、図１）、傍皮質およびリンパ濾胞の膨張を防止した。
例２
この例は、心臓アログラフトの生存の延長および慢性拒絶反応に関係する血管症の阻止を示す。
方法
齢８〜１２週の雄Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスに一次血管化ＢＡＬＢ／ｃ心臓アログラフトをマイクロサージカル法を用いて移植した（コリー（Corry,R.J.）、ウィン（Winn,H.J.）、ラッセル（Russel,P.S.）、Transplantation １６巻、３４３−３５０ページ（１９７３））。
拒絶反応は、触診可能の心臓収縮の消失と開腹して直接目で見て確認することによって決定した。移植後の特定時に移植心臓を摘出し、ホルマリン固定し、パラフィンに埋封した。組織切片（５ｍｍ）をマッソンのトリクロームまたはヘマトキシリン−エオシンで染色した。各組織学的試料を治療法にはブラインド（盲検）である心臓移植病理学者（ＫＪＷ）が検査した。
検討
図２Ａにおいて、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ受容体を０、２、４および６日目のＣＴＬＡ４Ｉｇ（２００ｍｇ／投与）と０、２、および４日目のＭＲ１（２５０ｍｇ／投与）の組み合わせで治療し、ＢＡＬＢ／ｃ心臓アログラフトの長期生存を達した（メジアン生存期間（ＭＳＴ）＞７０日、ｎ＝７）。対照群は：ＣＴＬＡ４Ｉｇのみ（ＭＳＴ＝５０日、ｎ＝１２）；ＭＲ１のみ（ＭＳＴ＝７０日、ｎ＝１２）；投与せず（ＭＳＴ＝１２日、ｎ＝７）を含めた。
各実験群で、生きている移植臓器を有する３匹のマウスを除いて（これらのマウスは組織学的分析のために移植後５８〜６３日目に殺した）、すべての受容体を７０日間追跡した；。
図２Ｂにおいて、６２日目のＣＴＬＡ４Ｉｇ投与心臓アログラフトは広範囲のリンパ球侵潤、間質性線維症および、慢性拒絶反応に一致するひどい冠状動脈内膜肥厚および線維症を示す。
図２Ｃにおいて、６２日目のＭＲ１投与心臓アログラフトはより少ないリンパ球侵潤および間質性線維症を示すが、慢性拒絶反応に特徴的な冠状血管異常はよりひどい。
図２Ｄにおいて、５８日目のＣＴＬＡ４Ｉｇ／ＭＲ１投与心臓アログラフトは上記とは非常に対照的に、リンパ球侵潤、線維症は顕著に消失し、冠状動脈内膜損傷が最も顕著になくなっていた。これらのグラフトの実質（パレンキマ）および血管は正常な、移植されていないＢＡＬＢ／ｃ心臓とはほとんど見分けがつかなった。
図２Ｅには、正常な移植されていないＢＡＬＢ／ｃ心臓が示される。
各実験群で３種類のアログラフトから同様な組織学的結果が得られた。ＣＴＬＡ４Ｉｇのみ、ＭＲ１のみ、またはＣＴＬＡ４Ｉｇ／ＭＲ１を投与したＣ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｈ−２ｋ）受容体において、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）心臓アログラフトの生存は未投与コントロールに比べればすべて延長を示した（図２Ａ）。だが移植後５８〜６２日後の組織学的検査では、顕著な差が明らかになった。
ＣＴＬＡ４Ｉｇ投与受容体からのアログラフトは広範囲のリンパ球侵潤、間質性線維症、および慢性拒絶反応に一致する重度冠状動脈内膜肥厚および線維症を示した（図２Ｂ）。ＭＲ１投与アログラフトはより少ないリンパ球侵潤および間質性線維症を示したが、慢性拒絶反応の特徴である重度の冠状血管異常が見られた（図２Ｃ）。
これらとは非常に対照的に、ＣＴＬＡ４Ｉｇ／ＭＲ１投与受容体からのアログラフトにはリンパ球侵潤、線維症がほとんどなく、最も重要なことに、冠状動脈内膜損傷がなかった（図２Ｄ）。実際、これらのグラフトの実質および血管は正常なＢＡＬＢ／ｃ心臓に見られるものとほとんど区別できなかった（図２Ｅ）。
例３
この例はＴ細胞サイトカインおよびコスティミュラトリー分子転写物の発現のブロックを示す。
方法
移植後８日目に、心臓グラフトを取り出し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ジブコBRL、ガイザースバーグ、ＭＤ）を用いて組織からすべてのＲＮＡを調製した。スーパースクリプトプリアンプリフィケーションシステム（ジブコBRL、ガイザースバーグ、ＭＤ）で、総ＲＮＡ鋳型５ｍｇを用いてｃＤＮＡを合成した：最終的容量２０ｍｌ。ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ生成物を臭化エチジウムで染色した１％アガロース（バイオ−ラッド、ハーキュルス、ＣＡ）、２％ヌシーブ（NuSieve ＧＴＧアガロース（ＦＭＣバイオプロダクト、ロックランド、ＭＥ）ゲル上で可視化した。ＵＶＰゲルドキュメンテーションシステム５０００を用いてゲル画像を保存した。バンドの強度をゲルリーダー分析ソフトウエア（ナショナル  センター  フォー  スーパーコンピューティング  アプリケーションズ、アーバン、ＩＬ）を用いて測定した。
図３Ａにおいて、未投与、ＭＤ投与、ＣＴＬＡ４Ｉｇ投与、およびＭＲ１／ＣＴＬＡ４Ｉｇ投与心臓アログラフトで、免疫メディエーター転写物のグラフト内発現を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した。
各投与群および対照群からの３つづつのアログラフトを移植後８日目に分析した。移植後８日目の正常心臓組織（Ｎ）および同系の心臓グラフト（Ｓ）を比較のために含めた。
図３Ｂには、平均ＰＣＲ生成物バンド強度±標準偏差をグラフによって示す。
検討
対照アログラフト（図３Ａ、未投与）とＭＲ１−投与アログラフト（図３Ａ）との間には、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＦＮｇのためのＴ細胞サイトカイン転写物、またはコスティミュラトリー分子転写物（Ｂ７−１およびＢ７−２）の発現の首尾一貫した差は認められなかったが、ＣＴＬＡ４ＩｇはＩＬ−４転写物の発現を部分的に阻止した。
ＣＴＬＡ４Ｉｇ／ＭＲ１投与受容体からのアログラフトは、Ｔｈ１サイトカイン（ＩＬ−２およびＩＦＮｇ）およびＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、およびＩＬ−１０）転写物両方の発現の著しい減少を示した。しかしグラフト内Ｂ７−１およびＢ７−２コスティミュラトリー分子転写物はＣＴＬＡ４Ｉｇ／ＭＲ１投与受容体ではほんの少しだけ減少した。
逆転写酵素なしで作成した鋳型を用いるＰＣＲ反応は、イントロンのないＧＡＤＰＨ遺伝子でさえ生成物を与えなかった（図３Ａ、ＧＡＤＰＨ、ＮＯＲＴ）；これは混入ゲノムＤＮＡが存在しないことを確認するものである。
グラフト内Ｂ７−１およびＢ７−２コスティミュラトリー分子転写物はＣＴＬＡ４Ｉｇ／ＭＲ１投与受容体ではほんのわずか減少し（図３）、ＣＤ２８／Ｂ７−非依存性またはＣＤ４０／ｇｐ３９−非依存性因子、例えばＧＭＣＳＦ（ラーセン（Larsen,C.P.）ら、J.Immunol.１５２巻、５２０８−５２１９ページ（１９９４））がグラフト内Ｂ７発現の重要な調節物質であることを示唆する。こうして、ＣＤ４０経路のＭＲ１仲介性ブロックはエフェクターＡＰＣのためのＴ細胞系の助けを阻止するのみならず、ＣＴＬＡ４Ｉｇの、アログラフト内におけるＴ細胞活性化転写物発現阻止能力を高める。これらのデータは、我々のインビトロ研究からのデータ―ＭＲ１は単独投与では同種異型混合白血球反応における細胞増殖にわずかな負の効果を与えるに過ぎないが、ＭＲ１は最適以下の濃度のＣＴＬＡ４Ｉｇの阻止効果を増強することを示したデータ―と一致する。
例４
この例は、ＢＡＬＢ／ｃマウスからの全厚皮膚アログラフトを移植したＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスを用いて、ネズミのアログラフトの生存期間の延長を証明する。
方法
全厚尾−または耳皮膚の約１平方ｃｍの切片を受容体マウスの後外側胸壁に移植し、周囲バンドエイド（登録商標）で固定した。グラフトをその後毎日、目で検査した。拒絶反応は、目に見える表皮グラフト組織の完全な喪失と定義された。ＭＲ１およびＣＴＬＡ４Ｉｇの投与プロトコルは、図１に心臓移植組織受容体に関して詳述した。５０ｍｇ／ｍｌ濃度のＣｙＡ（サンド社、イースト  ハノーバー、ＮＪ）を浸透圧ポンプ（アルツェット（Alzet）２００２型、アルツァ、パルトアルト、ＣＡ）によって０．５ｍｌ／ｈｒの速度で（〜２０ｍｇ／ｋｇ／日）１４日間投与した。浸透圧ポンプは皮膚移植時に受容体の背中部分の皮下に埋め込まれ、移植後２１日目に除去された（ペリーラ（Pereira,G.M.）、ミラー（Miller,J.F.）& シェヴァック（Shevach,E.M.）J Immunol、１４４巻、２１０９−２１１６ページ（１９９０））。殺した後、皮膚グラフトを切り取り、ホルマリン固定し、パラフィンに埋封した。組織切片（５ｍｍ）をヘマトキシリン−エオシンで染色した。
図４Ａにおいて、ＭＲ１のみ（ＭＳＴ＝１３日、ｎ＝５）、またはＣＴＬＡ４Ｉｇのみ（ＭＳＴ＝１２日、ｎ＝７）を投与したＣ３Ｈ／ＨｅＪ受容体は未投与対照群（ＭＳＴ＝１３日、ｎ＝５）と同じ速度で、ＭＨＣ−非相対性ＢＡＬＢ／ｃ皮膚グラフトを完全に拒絶反応した。それとは対照的に、ＭＲ１とＣＴＬＡ４Ｉｇとを手術時に同時に投与した場合にはアログラフトは著しく長い生存期間を享受した（ＭＳＴ＞５０、ｎ＝１５）。
図４Ｂにおいて、ＣｙＡのみ（ＭＳＴ＝３０日、ｎ＝４）、ＣｙＡプラスＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＭＳＴ＝３０日、ｎ＝５）、またはＣｙＡおよびＭＲ１（ＭＳＴ＝３２日、ｎ＝４）を投与したマウスはすべて、同様に少し長い皮膚グラフト生存を示した。驚いたことに、ＣＴＬＡ４Ｉｇ／ＭＲ１が皮膚グラフト生存に与える好都合な効果は、シクロスポリンの同時投与によって完全に消失した（ＭＳＴ＝３４日、ｎ＝４）。
図４Ｃにおいて、ＢＡＬＢ／ｃ皮膚グラフトのＣ３Ｈ受容体は治療を受けないか（ＭＳＴ＝１０日、ｎ＝３）またはＭＲ１（ＭＳＴ＝１３日、ｎ＝３）、ＹＴＳ１９１．１（ＭＳＴ＝１４日、ｎ＝６）、ＹＴＳ１９１．１およびＭＲ１（ＭＳＴ＝１６日、ｎ＝６）、ＹＴＳ１９１．１およびＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＭＳＴ＝１９日、ｎ＝５）、またはＣＴＬＡ４ＩｇおよびＭＲ１（ＭＳＴ＞５０日、ｎ＝２２）で治療した。こうしてこれまでに５３匹を超えるマウスがＣＴＬＡ４Ｉｇ／ＭＲ１を受けた。この群のなかで２匹は１３日目および２１日目に死んだ。すべての他のマウスは実験期間中、体重喪失、感染症または悪性腫瘍の兆候もなく、健康であった。
ＣＴＬＡ４Ｉｇ／ＭＲ１投与Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ受容体の、移植後５０日目のＢＡＬＢ／ｃ皮膚グラフトの健康な外観は（図４Ｄ）、拒絶反応を受けたコントロール−アログラフト（図４Ｅ）とはっきり対比される。ヘマトキシリン−エオシン染色切片で、受容されたグラフトは移植後１００日目によく保存された表皮、毛包および付属構造を示し（図４Ｆ）、それは未投与Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ受容体の移植後８日目のＢＡＬＢ／ｃ皮膚グラフトとは対照的である；後者は広範囲のリンパ球侵潤を示す（図４Ｇ）。
検討
マウスの一次皮膚アログラフト生存に対するＣＴＬＡ４ＩｇおよびＭＲ１、単独および併用の効果を試験した（図４）。比較のために、受容体をＣｙＡ単独、またはＣｙＡとＣＴＬＡ４ＩｇまたはＭＲ１どちらかとの組み合わせでも治療した。ＭＲ１のみまたはＣＴＬＡ４Ｉｇのみを投与したＣ３Ｈ／ＨｅＪ受容体はＭＨＣ−非相対性ＢＡＬＢ／ｃ皮膚グラフトを未投与コントロールと同じ速度で完全に拒絶反応した（図４Ａ）。
ＣｙＡのみ、ＣｙＡプラスＣＴＬＡ４Ｉｇ、またはＣｙＡおよびＭＲ１はすべて、皮膚グラフト生存期間を少し長くした（図４Ｂ）。しかし、これらのアログラフトのすべては結局は拒絶反応され、薬剤とＣｙＡとの間で明らかな効果は示されなかった。
ＣＤ４０／ＣＤ２８ブロックの異型免疫反応阻止能を測定する厳密な試験として、我々はマウスにおける一次皮膚アログラフト生存期間に与えるＣＴＬＡ４ＩｇおよびＭＲ１、単独および組み合わせの手術時投与の効果を研究した。比較のために、受容体にＣｙＡ、抗−ＣＤ４ｍＡｂＹＴＳ１９１．１、またはこれら作用物質をＣＴＬＡ４ＩｇかまたはＭＲ１のいずれかと組み合わせた治療をほどこした（図４Ｂおよび４Ｃ）。ＭＲ１、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、またはＹＴＳ１９１．１のみを投与したＣ３Ｈ／ＨｅＪ受容体は未投与コントロールとほぼ同じ速度でＭＨＣ−非相対性ＢＡＬＢ／ｃ皮膚グラフトを完全に拒絶反応した（図４Ｂおよび４Ｃ）。ＹＴＳ１９１．１およびＭＲ１、ＹＴＳ１９１．１およびＣＴＬＡ４Ｉｇ、ＣｙＡのみ、ＣｙＡプラスＣＴＬＡ４Ｉｇ、またはＣｙＡおよびＭＲ１を投与したマウスは皮膚グラフト生存期間を少し延長した（図４Ｂおよび４Ｃ）。しかしこれらのアログラフトはすべて結局は拒絶反応された。
これらとは対照的に、ＭＲ１とＣＴＬＡ４Ｉｇの両方を手術時に投与した受容体では皮膚アログラフトは生存期間の著しい延長を示した。移植後５０日目のこれらアログラフトの肉眼による検査では、そのグラフトは見たところ健康で、よく血管化し、しなやかで、短い白い毛が生えていた（図４Ｄ）。組織学的にはこの受容されたグラフトはよく保存された表皮、毛包および付属構造を示した（図４Ｆ）。驚いたことに、ＣＴＬＡ４Ｉｇ／ＭＲ１の、皮膚グラフト生存期間に対する好都合な効果はシクロスポリンの同時投与によって完全に消失した（図４Ｂ）。
この効果の目だった効力は一次皮膚アログラフトモデルにおいて最も明らかに示された。ＣＴＬＡ４Ｉｇ／またはＭＲ１のみ、またはＣｙＡとの併用は皮膚アログラフトの生存期間を顕著には延長しなかった。ＣＴＬＡ４ＩｇとＭＲ１との併用のみが完全−ＭＨＣ不一致皮膚アログラフトの５０日を超える生存をもたらした。この厳しい同種異型免疫反応阻止試験における（生存の）同様な延長は、以前、重度細胞傷害性および／または血液生成性キメリズム−ベース戦略を用いて観察された（マユミ（Mayumi,H.）およびグッド（Good,R.A.）J Exp Med；１６９巻、２１３−２３８ページ、（１９９０）；（イルシュタット（Ildstad,S.T.）、およびサックス（Saｃｈs,D.H.）、Nature３０７巻：１６８−１７０ページ（１９８４）；イルシュタットら、J Exp Med；６２巻、２３１−４４ページ（１９８５）；コッボルド（Cobbold,S.P.）、マーチン（Martin,G.）ら、Nature３２３巻、１６４−１６６ページ（１９８６）；キン（Qin,S.）ら、Science ２５９巻、９７４−９７７ページ（１９９３））。
例５
ＣＤ２８およびＣＤ４０経路のブロックがＴ細胞増殖に与える効果を探査するために、Ｉｅｋが制限されたハトシトクロームｃ−反応性（ｐｃｃ−ＴＣＲＴｇ）およびＬｄ−異型反応性（２Ｃ）Ｔ細胞受容体トランスジェニックマウス（ＲＥＦＨＥＤおよびＬＯＨ）両方からのＴ細胞を用いて一次同種異型混合白血球反応を研究した。ＣＴＬＡ４Ｉｇ、ＣＤ２８およびその相同体ＣＴＬＡ４のリガンドに結合する融合タンパク質は３つのＴ細胞集団すべての増殖を効果的に阻止した（図５Ａ）。
対照的に、ＣＤ４０経路のハムスター抗−ｇｐ３９ｍＡｂ、ＭＲ１、によるブロックは、ＢＡＬＢ／ｃ樹状細胞に反応するＣ３Ｈ／ＨｅＪＴ細胞増殖を若干（〜５０％）阻止し、シトクロームｃに反応するｐｃｃ−ＴＣＲＴｇＴ細胞を劇的に阻止した（3８５％）、しかしＬｄ−担持ＢＡＬＢ／ｃ樹状細胞に反応した２ＣＴ細胞の増殖にはごくわずかの効果しか与えなかった（図５Ａ）。
さらに、これらの作用物質による同時ブロックは、同種異型混合白血球反応におけるＴ細胞増殖およびｐｃｃ−ＴＣＲＴｇＴ細胞を協力的に阻止し、一方ＣＴＬＡ４Ｉｇと併用した時、ＭＲ１は２ＣＴ細胞の増殖に効果を与えないか、またはわずかに増加させた（図５Ａ）。これらの結果は、すべてのＴ細胞がクローン拡張のためのＣＤ４０シグナルに依存するわけではないことを示唆し、ＣＤ４０のブロックがアログラフト拒絶反応を完全には阻止できないことを説明するかも知れない。
インビボＴ細胞反応に関するＣＤ２８およびＣＤ４０ブロックの影響を、足をＤＢＡ／２（Ｈ−２ｄ、ＭＭＴＶ−７＋）脾細胞で免疫したＣ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｈ−２ｋ、ＭＭＴＶ−７−）において評価した。免疫後５日目に、ヒトＩｇＧを投与したコントロール・マウスの排液膝窩リンパ節は４〜６倍の重量増加を示した（図５Ｂ）。これは、ＭＭＴＶ−７−スーパー抗原反応性Ｖｂ＋ＣＤ＋４Ｔ細胞数の３０倍の増加および膝窩リンパ節内のＶｂ＋ＣＤ＋Ｔ細胞数の９０倍を超える増加を伴った。単独ではＣＴＬＡ４ＩｇまたはＭＲ１はこれらの反応を部分的に阻止した。対照的にＣＴＬＡ４Ｉｇ／ＭＲ１併用は、リンパ節の大きさの増加、Ｖｂ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の膨張および芽球化をほとんど消失させた（図５Ｂ）。
これらのデータは、ＣＤ２８およびＣＤ４０経路の同時ブロックはインビトロおよびインビボにおける複雑なＴ依存性免疫反応を阻止することを示している。
例６
この例は、ＣＤ２８およびＣＤ４０経路の同時ブロックが、細胞傷害性コンディショニング治療を必要とすることなく、異種抗原に対する細胞−および抗体反応の顕著な阻止、並びに異種（ラット対マウス）心臓-および皮膚グラフトの長期受容性をもたらすことを示す。
方法
リンパ節検定。雄Ｃ３Ｈ（ジャクソン研究所、バールハーバー、ＭＥ）マウスを、５０μｌ滅菌正常生理食塩液中２×１０６雄スプラグ−ダウレイ（ハーラン、インディアナポリス、ＩＮ）照射（２０００ＲＡＤＳ）ラット脾細胞で足を免疫し、それから０、２および４日目にＭＲ１（５００μｇ）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（５００μｇ）またはそれら両試薬（各々５００μｇ）を腹腔内（i.p.）注射した。５日目に膝窩リンパ節を摘出し、秤量し、それから細かくちぎり、洗い、その後１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０の６００μｌ（メディアテック、ハーンドン、ＶＡ）に再懸濁した。各再懸濁したリンパ節をその後等しい４部分（各１５０μｌ）に分けた。３部分は９６ウェルプレートに培養した。３７℃で２４時間インキュベーション後、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）（アマーシャム、アーリントンハイツ、ＩＬ）挿入を測定した。そこで、各個々の動物の結果は１リンパ節あたり３つのウェルの平均値をあらわす。第４の部分は３７℃で２４時間インキュベートし、ＥＬＩＳＡ法によるサイトカイン分析のための上澄液を作るために用いた。グラフのすべてにある各点は、１群あたり５匹のマウスの平均値±標準偏差をあらわす。実験を繰り返し、同様な結果を得た。
サイトカインＥＬＩＳＡ。一対の抗体類｛抗ＩＬ−２、抗−ＩＦＮ−ガンマ、抗−ＩＬ−２ビオチン、抗−ＩＬ−４−ビオチン、抗−ＩＮＦ−ガンマビオチン（ファーミンゲン、サンジエゴ、ＣＡ）、抗ＩＬ４（ピータージェンセンからの寄贈）｝およびストレプトアビジン-ＨＲＰ（ピエス、ロックフォード、ＩＬ）を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。ＴＭＢ基質（ピエス）を用いて比色検定した。データをスペクトラマックスプレートリーダーを用いて集め、吸光度（３７０ｎｍ）＋／−セムとしてプロットした。各サイトカインの標準曲線を組換えサイトカインを用いて作成した（ｒＩＬ２、ベーリンガー  マンハイム、インディアナポリス、ＩＮ；ｒＩＬ４、Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ＭＮ；およびｒＩＦＮ−ガンマ、ビオソースインターナショナル、カマリロ、ＣＡ）。
マウス。雄Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｈ−２ｋ）およびＤＢＡ／２（Ｈ−２ｄ）マウスおよびスプラグ−ダウレイラットはジャクソン研究所（バールハーバー、ＭＥ）から購入し、齢８〜１２週で使用した。
心臓移植。ラーゼン、アレキサンダー（Alexander D.Z.）、ホレンボーら、Transplantation、６１（１）巻、４−９ページ（１９９６）およびコリー、ウィン、ラッセル、Transplantation、１６（４）巻、３４３−３５０ページ（１９７３）に記載されているように、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪまたはＤＢＡマウスに、一次血管化スプラグ−ダウレイラット心臓異種グラフトを移植し、拒絶反応反応をモニターした。受容体に０、２、４および６日目に５００ｍｇＣＴＬＡ４−Ｉｇと５００ｍｇＭＲ１との組み合わせを投与した。対照群はＣＴＬＡ４Ｉｇのみ、ＭＲ１のみ、またはヒトＩｇを投与した受容体を含めた。パラフィン埋封組織切片（５μｍ）をマッソンのトリクロームまたはヘマトキシリン−エオシンで染色した。組織学的試料を治療法にはブラインドの心臓移植病理学者（ＫＪＷ）が検査した。
皮膚移植。スプラグ−ダウレイラットからの全厚皮膚グラフト（〜１平方センチメートル）をＣ３Ｈ受容体マウスの背側胸部に移植し、その後の生存期間、毎日肉眼による検査を行った。拒絶反応反応は、目に見える表皮グラフト組織の完全な消失と定義した。対照群はＣＴＬＡ４−Ｉｇのみ；ＭＲ１のみ；およびヒトＩｇを投与した受容体を含めた。各実験群で２匹の付加的マウスを移植後２０日目に殺し、組織学的分析を行った。
異種抗体検定。麻酔動物の尾から血清を集めた。スプラグ−ダウレイラットのリンパ節からの単一細胞懸濁液を標的細胞として用い、受容体マウスの血清と４℃で２０分間インキュベートした。細胞を洗い、ＩｇＧ異種抗体をロバ抗マウスＩｇＧビオチン（ジャクソンイムノリサーチ、ウェストグローブ、ＰＡ）で、その後ストレプトアビジン−ＰＥ（サザーンバイオテック、バーミンガム、ＡＬ）で検出した。細胞をベクトン-ジキンソンＦＡＣスキャンで、セルクェストソフトウェアを用いて分析した。
結果
インビボ異種抗原攻撃に対する反応にＣＤ２８およびＣＤ４０ブロックが与える効果を測定する最初のアプローチとして、我々はラーゼン、エルウッド（Elwood E.T.）、アレキサンダーら、Nature、３８１巻：４３４−４３８ページ（１９９６）に記載されている膝窩リンパ節検定を用いた。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｈ−２ｋ）マウスに照射スプラグ−ダウレイ（ＳＤ）ラット脾細胞を注射した。足免疫後５日目、ヒトＩｇＧを投与したコントロール・マウスの排液膝窩リンパ節は、滅菌生理食塩液を注入した反対側リンパ節に比較して５．２倍増加した重量を示した（図６Ａ）。ＣＴＬＡ４−Ｉｇはリンパ節膨張を部分的に阻止した。ＭＲ１も同様にこの反応を部分的に阻止した。これに対して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ／ＭＲ１併用は異種抗原誘起性リンパ節膨張を実質上消失させた（図６Ａ）。
その後異種抗原プライムド−マウスの種々の群からのリンパ節細胞の生体外増殖を比較した。いずれの治療も単独では増殖を部分的にブロックするに過ぎなかったが（図６Ｂ）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ／ＭＲ１の併用は増殖反応性反応を実質上除去した（併用では３０２＋／−２３５ＣＰＭであるのに対し、正常な刺激しないリンパ節では１４３＋／−１４５）。さらに、併用治療はＴｈ１サイトカイン（ＩＬ−２およびＩＦＮｇ）を正常な刺激していない細胞のレベルにまで抑制した（図６Ｃおよび６Ｄ）。Ｔｈ２サイトカインＩＬ−４のレベルは全サンプルにおいて検出限界値より低かった。
この強力な免疫調節が細胞欠失の結果ではないことを認めることは重要である。投与マウスの末梢血液のフローサイトメトリー分析は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞の欠失を示さなかった。これらのデータは、方法の部に記載したように、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＭＲ１どちらかを、またはこれらを組み合わせ投与した群につき３匹づつのマウスの、０、２、４および６日目の個々の分析結果である。末梢血液は６および２０日目に尾を出血させて集めた。
リンパ節検定の結果、Ｂ７／ＣＤ２８およびＣＤ４０／ｇｐ３９経路の同時ブロックは異種グラフト拒絶反応を阻止することが示唆された。この仮説を調べるために、我々はSDラットをドナーとし、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスを受容体として用いる血管化心臓異種グラフトモデルを研究した。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（ＭＳＴ＝３３日）またはＭＲ１（ＭＳＴ＝５１日）のみの投与は異種グラフトの生存期間を、未投与コントロール（ＭＳＴ＝６日）に比較して延長した（図７Ａ）。しかしＣＴＬＡ４−Ｉｇ／ＭＲ１の組み合わせは生存期間を著しく延長した（ＭＳＴ＝１０４．５日）。
移植後２０日目に組織学的研究を行ったとき、ＣＴＬＡ４−Ｉｇのみ（図７Ｃ）またはＭＲ１のみ（図７Ｄ）を投与した異種グラフトはひどいリンパ球侵潤を示し、同時に中程度〜重度細胞拒絶反応に一致する筋細胞破壊および血管異常の証拠を示した。明らかに対照的に、ＣＴＬＡ４Ｉｇ／ＭＲ１投与受容体からの異種グラフトにはリンパ球侵潤、間質性線維症、および冠状動脈内膜損傷はほとんどなかった（図７Ｆ）。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ／ＭＲ１投与心臓異種グラフトは、１２２日目に筋細胞および血管構造両方ともよく保存されていることを示した（図７Ｇ）。未投与異種グラフトは６日目に広範囲の組織破壊を示した（図７Ｂ）。正常な移植していないスプラグ−ダウレイラット心臓を図７Ｅに示す。
ＣＤ４０／ＣＤ２８ブロックの、異種免疫反応阻止能を調べる厳密な試験として、マウスにおいて、短期間のＣＤ２８および／またはＣＤ４０ブロックが一次皮膚異種グラフトの生存期間に与える影響を研究した。
ＭＲ１（ＭＳＴ＝１１．５日、ｎ＝４）またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ（ＭＳＴ＝１２日、ｎ＝４）のみのどちらかを投与したＣ３Ｈ受容体はスプラグ−ダウレイラットからの全厚皮膚グラフトを、未投与コントロールと同じ速度で拒絶反応した（未投与コントロールＭＳＴ＝１１．５日、ｎ＝８）（図８Ａ）。これに対し、手術時にＭＲ１およびＣＴＬＡ４−Ｉｇを同時に投与した受容体の皮膚異種グラフトは著しく延長された生存期間を示した（ＭＳＴ＝５３日、ｎ＝２５）（図８Ａ）。合計２５匹のマウスが異種グラフトおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ／ＭＲ１投与を受けた。４日目に死んだ１匹のマウスを除いて、すべての他のマウスは実験期間中、体重喪失、感染症または悪性腫瘍の兆候もなく健康であった。
慢性投与（標準的４投与体系後に開始）をＣＴＬＡ４Ｉｇ／ＭＲ１併用（両作用物質とも１週５００μｇづつ１００日間かまたは拒絶反応まで（早く到来した方）投与）またはＭＲ１（１００日間または拒絶反応まで１週５００μｇＭＲ１を投与）で行った場合は、異種グラフト生存期間に顕著な変化はなかった（図８Ｂ）。
同時ＭＲ１/ＣＴＬＡ４−Ｉｇ治療後の異種グラフト生存率は５０日および１００日でそれぞれ５２％および２１％であった。移植後５０日目（図８Ｅ）および１００日目（図８Ｃ）に生き残っている異種グラフトは外観的に健康で、よく保存された組織学的構造を示した。併用治療を行わない未投与コントロールでは、拒絶反応が速やかに起こり、これらの異種グラフトは著しい炎症性侵潤を示した（図８Ｄおよび８Ｆ）。
ＤＢＡ［Ｈ−２ｄ］）受容体でも同様なスプラグ−ダウレイ皮膚異種グラフトの生存延長が認められた（未投与コントロールＭＳＴ＝１４日（ｎ＝５）対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ／ＭＲ１ＭＳＴ＝８６日、ｎ＝５）、これは併用治療の強力な効果が単一の受容体マウス種に限られないことを示唆している。
手術後２５日から７５日までの間の皮膚異種グラフト喪失の進行は、遅い時期のグラフト失敗がＣＴＬＡ４−Ｉｇおよび／またはＭＲ１の治療量以下の濃度によるらしいことを示唆している。この可能性に取り組むために、標準的４−投与組み合わせ法による治療後に、マウスに１００日間またはグラフト喪失が起きるまで、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ／ＭＲ１の組み合わせまたはＭＲ１のみを毎週投与した。これらの慢性治療法のどちらも皮膚異種グラフト生存率を目立っては改善しなかった；これはＣＴＬＡ４−Ｉｇ／ＭＲ１投与マウスのグラフト失敗が不十分な薬剤効力以外の要因に起因すること、およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ／ＭＲ１によって完全には阻止されない、代わりの経路が亜急性異種グラフト喪失に重要らしいことを示唆するものである。
細胞を介するエフェクターメカニズムに加えて、誘発される異種抗体反応が、調和する異種グラフトの血管性拒絶反応の促進に重要な役割を演ずるらしい（アクセンチジェヴィッチ（Aksentijevich I.）、サックス（Sachs D.H.）、サイクス（Sykes M.）Transplantation、５３（５）巻：１１０８−１４ページ（１９９２））。誘発される異種抗体反応に対する同時ブロックの影響を試験するために、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスからの血清サンプル中の抗ラット抗体を、スプラグ−ダウレイラット皮膚グラフト移植後５５日目（図９Ａ）およびスプラグ−ダウレイラット心臓グラフト移植後２０日目（図９Ｂ）に分析した。ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＭＲ１のみの投与はＩｇＧ抗体反応を減少させ、一方同時組み合わせＣＤ２８／ＣＤ４０ブロックはラット異種抗原に対する誘発抗体反応を実質上排除した。そこで、Ｔ細胞活性化および抗体産生両方の阻止が、Ｂ７／ＣＤ２８およびＣＤ４０／ｇｐ３９経路の同時ブロック後の異種グラフト生存に機能的に重要であると考えられる。
検討
ＣＤ２８およびＣＤ４０経路の組み合わせブロックは異種抗原に対する免疫反応を顕著に阻止する。この組み合わせ治療の効力が特に一次皮膚異種グラフトモデルにおいて示された。どの作用物質も単独では皮膚異種グラフト生存期間を延長しないが、ＣＴＬＡ４−ＩｇとＭＲ１の同時投与は協力的に異種拒絶反応を阻止した。この知見の特異性は、皮膚グラフトモデルの厳しさにある、なぜならばＣＴＬＡ４−Ｉｇのみでマウスモデルの異種膵島の生存を延長できることがすでに示されているからである（レンスコウ（Lenschow D.）、ツェング（Zeng Y.）、シスレスウェイト（Thistleswait J.）ら、Science ２５７巻：７８９−７９２ページ（１９９２））。異種皮膚グラフトの長期生存はこれまでにも強力な細胞傷害性および／または血液生成性キメリズムに基づく戦略を用いて認められている（イルシュタット（Ildstad S.T.）、サックス（Sachs D.H.）Nature ３０７巻：１６８−１７０ページ（１９８４）、ザオ（Zhao Y.）、スウェンソン（Swenson K.）、セルジオ（Sergio J.）、アーン（Ahn J.S.）、ザックス、サイクス、Nat.Med.２（１１）巻：１２１１−１２１６ページ（１９９６）、マユミ、グッド、J.Exp.Med.１６９（１）巻：２１３−２３８ページ（１９９０）、コッボルト（Cobbold S.P.）、マーチン、チン（Zin S.）、ワルドマン、Nature  ３２３巻：１６４−１６６ページ（１９８６）、キン（Qin S.）、コッボルト、ベンジャミン（Benjamin R.）、ワルドマン、J.Exp.Med.１６９巻：７７９−７９４ページ（１９８９））。
同時ＣＤ２８／ＣＤ４０ブロックが異種グラフト生存を劇的に延長するという観察は、異種グラフト破壊のための抗体および細胞仲介性メカニズム両方がこの戦略によって効果的に阻止されることを示唆する。急性血管性異種グラフト拒絶反応の原因は完全には明らかになっていないが、少なくとも一部は異種反応性抗体によって起きるという証拠がある（コッタレル（Cotterell A.H.）、コリンズ（Collins B.H.）、パーカー（Parker W.）、ハーランド（Harland R.C.）、プラット（Platt J.L.）、Transplantation、６０（８）巻：８６１−８６８ページ（１９９５））。我々のモデルにおける未投与コントロール心臓異種グラフトの、細胞侵潤のない急速な破壊は、抗体仲介性拒絶反応の役割を示唆している。この考察およびその他の考察（アクセンチジェヴィッチ、サックス、サイクス、Transplantation、５３（５）巻：１１０８−１４ページ（１９９２））は、ＣＤ２８およびＣＤ４０経路のブロック後の誘発異種抗体反応の劇的阻止の証拠（図９Ａおよび図９Ｂ）とともに、異種反応がこれらの経路の阻止によって十分にコントロールされ、不一致種の組み合わせにおける異種移植のための細胞非傷害性戦略の開発が可能となることを示唆する。
ＣＤ２８およびＣＤ４０経路の組み合わせブロックは異種グラフト拒絶反応反応を顕著に阻止する一方、我々の実験系ではこのブロックは一様な無制限の心臓または皮膚グラフト生存には達しなかった。投与期間は延長してもグラフト生存率は改善されなかったという観察は驚くべきである。これは、これら経路の不十分なブロックが“遅発性”グラフト失敗の原因ではないことを示唆し、代わりの経路、例えばＮＫ細胞、またはＣＤ２８／ＣＤ４０同時刺激を必要としないその他の細胞が遅発性異種グラフト拒絶反応を促進する可能性が持ち上がる。異種グラフト拒絶反応にＮＫ細胞が関与しているという示唆的証拠はこの可能性を裏付ける（ザオ、スウェンソン、セルジオ、アーン、サックス、サイクス、Nat.Med.、２（１１）巻：１２１１−１２１６ページ（１９９６）、マリギン（Marlyguine A.M.）、サーディ（Saadi S.）、プラット（Platt J.L.）、ドーソン（Dowson J.R.）Transplantation６１（１）巻：１６１−１６４ページ（１９９６））。その上我々は調和した心臓および皮膚異種グラフト拒絶反応の、ＣＤ４０およびＣＤ２８経路の同時ブロックによる阻止が誘発異種反応性抗体反応の“遅い”発生の予防と関係することを示した（図９Ａおよび９Ｂ）；抗体反応の発生が、遅発性グラフト喪失と関係する可能性は排除されない。
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ／ＭＲ１併用投与が心臓異種グラフトにおける移植組織血管症の発生を阻止し、皮膚異種グラフトを長持ちさせることができることは、臨床的に重要な意味をもつ。天然にあらかじめ形成された異種反応性抗体の効果を阻止する技術の研究とともにＣＤ２８およびＣＤ４０経路ブロックのさらなる研究によって、臨床的異種グラフト移植を容易にする新しい効果的戦略の可能性が約束される。
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５】
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【図６ａ−６ｄ】
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【図７ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８ａ−８ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９ａ−９ｂ】
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