(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞タンパク質合成系に、
（１）タンパク質をコードする遺伝子、
（２）改変型ｔＲＮＡＴｙｒ、および
（３）前記改変型ｔＲＮＡＴｙｒをチロシンアナログ化することができるＤ３２１Ｒの変異を有する変異型チロシルｔＲＮＡ合成酵素
を添加して、前記タンパク質中の特定部位のアミノ酸を非天然アミノ酸に変異させた非天然アミノ酸含有タンパク質を製造する方法。
【請求項２】
前記改変型ｔＲＮＡＴｙｒがアンチコドンを前記タンパク質中の前記特定部位をコードするコドンに対応させた請求項１記載の非天然アミノ酸含有タンパク質を製造する方法。
【請求項３】
前記無細胞タンパク質合成系が、前記タンパク質の非天然アミノ酸に変異させる特定部位のアミノ酸コドンに対応する天然のｔＲＮＡを選択的に減少又は除去された無細胞タンパク質合成系を用いる請求項１又は２記載の非天然アミノ酸含有タンパク質を製造する方法。
【請求項４】
変異させる特定部位のアミノ酸コドンに対応するｔＲＮＡを固定化プローブＤＮＡを用いて無細胞タンパク質合成系から減少又は除去された請求項３記載の方法。
【請求項５】
改変型ｔＲＮＡＴｙｒのアンチコドン部分がコドンＡＧＹ用に変更された改変型ｔＲＮＡＴｙｒである請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項６】
Ｄ３２１Ｒの変異を有する変異型チロシルｔＲＮＡ合成酵素が、以下の（１）、又は（２）のいずれかからなる変異体である請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
（１）配列番号１で示されるチロシルｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸配列に対し、１又は数個のアミノ酸が置換、付加及び／又は欠失した配列で示される、改変型ｔＲＮＡＴｙｒをチロシンアナログ化できるＤ３２１Ｒの変異を有する変異型チロシルｔＲＮＡ合成酵素
（２）配列番号１で示される酵母由来チロシルｔＲＮＡ合成酵素と同一性が９０％以上のアミノ酸配列で示され、改変型ｔＲＮＡＴｙｒをチロシンアナログ化できるＤ３２１Ｒの変異を有する変異型チロシルｔＲＮＡ合成酵素
【請求項７】
改変型ｔＲＮＡＴｙｒが以下の（１）、及び／又は（２）からなる改変型ｔＲＮＡＴｙｒである請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
（１）酵母ｔＲＮＡＴｙｒの塩基配列において、アンチコドン部位及び／又はその他塩基が変更された塩基配列で表される改変型ｔＲＮＡＴｙｒ
（２）ｔＲＮＡＴｙｒの塩基配列において、少なくとも３’末端にＡＣＣＡの配列を有する塩基配列で表される改変型ｔＲＮＡＴｙｒ
【請求項８】
改変型ｔＲＮＡＴｙｒが以下の（１）又は（１）及び（２）からなる改変型ｔＲＮＡＴｙｒである請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
（１）酵母ｔＲＮＡＴｙｒの塩基配列において、アンチコドン部位が、ＡＣＵ、ＵＡＡ、ＧＣＧ、ＧＣＵ、ＧＧＡ、及びＵＧＵから選択されるいずれかのアンチコドンである改変型ｔＲＮＡＴｙｒ
（２）少なくとも３’末端にＡＣＣＡの配列を有する改変型ｔＲＮＡＴｙｒ
【請求項９】
無細胞タンパク質合成系に、
（１）タンパク質をコードする遺伝子、
（２）改変型ｔＲＮＡＴｙｒ、および
（３）前記改変型ｔＲＮＡＴｙｒをチロシル化することができるＤ３２１Ｒの変異を有する変異型チロシルｔＲＮＡ合成酵素
を添加し、前記タンパク質中の特定部位のアミノ酸を他のアミノ酸に変異させた非天然タンパク質を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、任意の天然アミノ酸を非天然アミノ酸に代えた非天然アミノ酸含有タンパク質を合成方法に関する。より具体的には、タンパク質をコードする遺伝子の特定部位のコドンに非天然アミノ酸を導入するように翻訳する、非天然アミノ酸含有蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非天然アミノ酸含有タンパク質の調製方法としては次のような方法が知られている。
（１）サプレッサーｔＲＮＡを用い、本来３つある終始コドンの１つ（アンバーコドン）を非天然アミノ酸コドンとして、部位特異的に非天然アミノ酸を組み込む方法が開発された（非特許文献１：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１８２−１８８（１９８９））。本方法は、遺伝子中の非天然アミノ酸を導入したい部位のコドンをサプレッサーｔＲＮＡに対応するコドンに変異させ、かかる変異遺伝子を用いて、サプレッサーｔＲＮＡと非天然アミノ酸を化学的に結合された非天然アミノ酸結合ｔＲＮＡの存在下で無細胞タンパク質翻訳を行わせることにより調製された。
その後、変異遺伝子を用いて、サプレッサーｔＲＮＡと非天然アミノ酸を化学的に結合された非天然アミノ酸結合ｔＲＮＡをＸＥＮＯＰＵＳ卵母細胞へ注入し、非天然アミノ酸を部位特異的に含むタンパク質が合成されている（非特許文献２：ＪＢＣ  ｖｏｌ．２７１，ｐｐ．２３１６９）。
また、サプレッサーｔＲＮＡを利用する方法では、非天然アミノ酸の導入率が限られるということで、種々のｔＲＮＡの一部に非天然アミノ酸を結合させる方法（特許文献１参照）がある。この製造法は、無細胞タンパク質合成系下で、特定のアミノ酸に対応するアイソアクセプティングｔＲＮＡのうち、一部のもののみを非天然アミノ酸と結合させたものと、タンパク質構成アミノ酸（以下標準アミノ酸もしくは天然アミノ酸と呼ぶこともある）とを用いてタンパク質合成を行って、非天然アミノ酸を特定のコドングループに組込むものである。
更に、最近では、特定のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素とｔＲＮＡを組み合わせて用いることにより、ｔＲＮＡを再利用しつつ、非天然アミノ酸含有タンパク質（以下非天然アミノ酸タンパク質とも呼ぶ）を合成することが行われている。メタノコッカス属由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳ）を非天然アミノ酸に特異的に変異させた変異体酵素と内生ｔＲＮＡを用いて大腸菌内で非天然アミノ酸含有タンパク質の合成を行っている（非特許文献３：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｖｏｌ．２９２，ｐｐ．４９８−５００）。
本願発明者らも、すでに、チロシンアナログと、サプレッサーｔＲＮＡと、前記チロシンアナログをサプレッサーｔＲＮＡに結合させるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体とを含有するタンパク質合成系に、鋳型を加えてタンパク質合成させる方法を発明している。本方法は、チロシンアナログとして、アジドチロシン、アセチルチロシン、アミノチロシン又はドーパを導入できるものである（特許文献２：特開２００４−２６１１６０）。
一方、従来より、タンパク質のＸ線結晶構造解析には、例えば非特許文献４に開示されている方法により製造されたセレノメチオニン置換タンパク質が用いられている。このセレノメチオニン置換タンパク質を製造する際には、まず、大腸菌のメチオニン要求株と目的タンパク質の遺伝子が挿入されているプラスミドを準備して形質転換を行った後、抗生物質を含むアガロースゲルプレートを用いて目的タンパク質を発現する単一コロニーを単離する。次に、単離された形質転換体をメチオニンの代わりにセレノメチオニンを含む培地中で培養することにより目的タンパク質を発現させて精製するものである。
【特許文献１】特許第３３１７９８３号
【特許文献２】特開２００４−２６１１６０号
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１８２−１８８（１９８９）
【非特許文献２】ＪＢＣ  ｖｏｌ．２７１，ｐｐ．２３１６９
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｖｏｌ．２９２，ｐｐ．４９８−５００
【非特許文献４】清水敏之、岡田健吾、箱嶋敏雄、第１７章  Ｘ線結晶構造解析セレノメチオニン置換タンパク質の発現と調製、「基礎生化学実験法３  タンパク質Ｉ．検出・構造解析法」、株式会社東京化学同人、第１版第１刷  ２００１年２月１５日、ｐ．１８９−１９０。
【発明の開示】
【０００３】
上述したように、サプレッサーｔＲＮＡと、前記アミノ酸アナログをサプレッサーｔＲＮＡに結合させるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をタンパク質合成系に利用する方法は、非天然アミノ酸タンパク質を効率的に生産する上で望ましい。しかしながら、現在までのところ、導入できる非天然アミノ酸の種類に限定があり、チロシンのアナログ（類縁体）、アラニンのアナログなどに限られ、アンバーコドン特異的な非天然アミノ酸の導入であるため、目的タンパク質遺伝子にアンバーコドン変異を導入する必要があるなどの問題点があげられる。
そこで、本願発明は、目的の遺伝子に変異を導入することなく、アンバーコドン等ストップコドン以外の、アミノ酸をコードするコドンにチロシンアナログを含む変異タンパク質の製造方法を提供することを１つの課題とする。
本願発明者らは、ストップコドン以外のアミノ酸をコードするコドンにチロシンアナログを含む変異タンパク質の製造方法を開発するための要件を検討した。
たとえば、ＳｅｒコドンＡＧＵ／ＡＧＣ（ＡＧＹ）をチロシンアナログ用に割り当てようとすると、以下の問題が生じる。
（１）ＡＧＵ又はＡＧＣをチロシンアナログ用に割り当てた新規ｔＲＮＡ、つまりアンチコドンにＡＣＵ／ＧＣＵを有し、チロシンアナログを結合させることができる新規ｔＲＮＡを合成する必要がある。通常、ＡＧＵ、ＡＧＣ（ＡＧＹ）コドンは、アンチコドンＧＣＵのｔＲＮＡ１種類のみを利用して両方とも読まれている。通常アンチコドンＡＣＵのｔＲＮＡは存在しない。したがって、以下では、単にＡＧＵ用ということもあるが、これは、ＡＧＵ／ＡＧＣ用、つまりＡＧＹ用のことである。
（２）上記新規ｔＲＮＡをチロシンアナログでアミノアシル化する必要がある。そこで、上記新規ｔＲＮＡをチロシンアナログでアミノアシル化する新規変異酵素（新規チロシンアナログｔＲＮＡ合成酵素）を作成する必要がある。
（３）前記新規変異酵素は、前記無細胞タンパク質合成系にもともと存在するｔＲＮＡを認識してはならない。また、上記新規ｔＲＮＡは無細胞タンパク質合成系にもともと存在するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の基質となってはならない。
（４）また、大腸菌細胞抽出系等の上記無細胞タンパク質合成系にもともと存在しているＡＧＵ用のｔＲＮＡＳｅｒ（アンチコドンＧＣＵ：なお、上記したように通常アンチコドンＡＣＵは存在しない）を除かないとチロシンアナログが結合した新規ｔＲＮＡとＳｅｒが結合したｔＲＮＡが上記ＡＧＵ又はＡＧＣコドンを巡って競合することになる。他方、ＡＧＵ用以外のｔＲＮＡＳｅｒは、そのまま使用するので、除いてはならない。
そこで、発明者らは、既に発明者らが見出している非天然アミノ酸（チロシンアナログ）をサプレッサーコドン特異的に導入する技術を開発しているので、これを利用することにより、つぎのような解決手段を見出した。
たとえば、大腸菌細胞抽出液によるタンパク質合成系においては、
（イ）酵母由来のチロシンｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＴｙｒ）に変異を導入し、ＡＧＹ用（アンチコドンＡＣＵ又はＧＣＵ）に改変し（改変型ｔＲＮＡＴｙｒと呼ぶ）、
（ロ）酵母由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体（ＴｙｒＲＳ変異体とも呼ぶ）を調製し、
（ハ）大腸菌細胞抽出液によるタンパク質合成系から全種類ｔＲＮＡを選択的に分離し、全種類ｔＲＮＡ混合物からＡＧＵ用のｔＲＮＡのみを除去し、ＡＧＵ用ｔＲＮＡ以外を再度タンパク質合成系に戻した無細胞タンパク質合成系を調製する。
上記改変型ｔＲＮＡＴｙｒ及びＴｙｒＲＳ変異体を用いて、ＡＧＵ用ｔＲＮＡを除いた大腸菌由来の無細胞タンパク質合成系により、チロシンアナログの存在下、鋳型ＤＮＡより非天然アミノ酸含有タンパク質を合成できる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−１７４０９７号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、大腸菌細胞抽出液から全種類ｔＲＮＡを除去する条件の検討結果を示す。：大腸菌細胞抽出液に対しその５倍量のＱ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ樹脂をスピンカラムに詰め１０００ｒｐｍ×３ｍｉｎ  ４℃で遠心した。Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓ３０に０〜０．７Ｍ酢酸カリウムを加えた溶液を用意し、それぞれを用い樹脂を平衡化した。大腸菌細胞抽出液をロードし、素通りを回収した。各条件における回収物を７Ｍ尿素を含む１０％ポリアクリルアミドゲルにて泳動し、核酸を染色した。
図２は、各濃度の酢酸カリウムで処理した大腸菌細胞抽出液を用いてタンパク質合成を行った結果を示す。：大腸菌細胞抽出液（Ｓ３０）を酢酸カリウム０．４〜０．６Ｍの濃度で処理した場合、全種類ｔＲＮＡの混合物（以下ｔＲＮＡＭｉｘと呼ぶこともある）を反応液に加えた場合にのみタンパク質の合成が確認できることから、この範囲であれば大腸菌細胞抽出液（Ｓ３０）からタンパク質合成能を低下させず、全種類ｔＲＮＡを除けることが確認できたことを示す。
図３は、ｔＲＮＡＳｅｒ（ＡＧＹ）除去処理を行ったｔＲＮＡＭｉｘ（ｔＲＮＡＭｉｘ−Ｓｅｒ（ＡＧＹ））と、回収したｔＲＮＡＳｅｒ（ＡＧＹ）の純度の確認を示す。
図４は、ノーザンハイブリダイゼーションによるｔＲＮＡＳｅｒ（ＡＧＹ）の検出結果を示す。
図５−１は、チロシン受容の測定結果を示す。：各サンプルについて５分後、１０分後、１５分後の放射能の値とチロシンの比活性値からｐｍｏｌ／ＯＤを算出することにより、ＷＴのｔＲＮＡＴｙｒとｔＲＮＡＴｙｒ改変体とのチロシン取り込みを比較した結果を示す。。各ｔＲＮＡＴｙｒ改変体は、それぞれのアンチコドンにより示されている。
図５−２は、図５−１と同様である。
図５−３は、図５−１と同様である。
図５−４は、図５−１と同様である。
図５−５は、図５−１と同様である。
図６−１は、アンチコドンに対応するアミノ酸受容の測定結果を示す。：ｔＲＮＡＴｙｒ改変体のアンチコドンに対応する１４Ｃアミノ酸を用いて、５分後、１０分後、１５分後の放射能を測定し、ｔＲＮＡ  Ｍｉｘを用いたそのアミノ酸の取り込みと比較した。ｔＲＮＡＴｙｒ改変体は、それぞれのアンチコドンにより示されている。
図６−２は、図６−１と同様である。
図６−３は、図６−１と同様である。
図６−４は、図６−１と同様である。
図６−５は、図６−１と同様である。
図６−６は、図６−１と同様である。
図６−７は、図６−１と同様である。
図６−８は、図６−１と同様である。
図７は、上段のグラフはチロシン受容能、下段のグラフはアンチコドンに対応するアミノ酸受容能をあわせて示す。
図８は、酵母ＴｙｒＲＳ変異体（Ｄ３２１Ｒ  ＴｙｒＲＳ）を用いたｔＲＮＡＴｙｒ改変体のチロシン受容能を示す。
図９は、酵母ＴｙｒＲＳ変異体（Ｄ３２１Ｑ  ＴｙｒＲＳ）を用いたｔＲＮＡＴｙｒ改変体のチロシン受容能を示す。
図１０は、酵母ＴｙｒＲＳ変異体（Ｄ３２１Ｎ  ＴｙｒＲＳ）を用いたｔＲＮＡＴｙｒ改変体のチロシン受容能を示す。
図１１は、酵母ＴｙｒＲＳ変異体（Ｄ３２１Ｋ  ＴｙｒＲＳ）を用いたｔＲＮＡＴｙｒ改変体のチロシン受容能を示す。
図１２は、ＧＦＰｕｖ遺伝子中ＡＧＵコドンにチロシンが導入できたことを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本願発明には、無細胞タンパク質合成系を用いて、コドン特異的に非天然アミノ酸を導入する非天然アミノ酸含有タンパク質合成方法に関する。
より具体的には、本願発明には、（Ｉ）以下の（イ）−（ニ）の工程により調製されるコドン特異的に非天然アミノ酸を導入する非天然アミノ酸含有タンパク質合成系を包含する。
（イ）基本となる無細胞タンパク質合成系に含まれるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の基質とはならないチロシンｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＴｙｒ）について、チロシンｔＲＮＡのアンチコドン部位を特定のアンチコドン（ａ）へと変異を導入し、特定のアンチコドン（ａ）に対応するコドン用のｔＲＮＡに改変した改変型ｔＲＮＡＴｙｒを調製する工程。
（ロ）前記改変型ｔＲＮＡＴｙｒをアミノアシル化することができるチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体（ＴｙｒＲＳ変異体）を調製する工程。
（ハ）前記無細胞タンパク質合成系から全種類ｔＲＮＡを選択的に分離し、全種類ｔＲＮＡ混合物（ｔＲＮＡＭｉｘ）から前記特定のアンチコドン（ａ）を有するｔＲＮＡのみを除去し、前記特定のアンチコドン（ａ）を有するｔＲＮＡ以外を再度無細胞タンパク質合成系に戻す工程。
（ニ）上記改変型ｔＲＮＡＴｙｒ及びＴｙｒＲＳ変異体を前記処理された無細胞タンパク質合成系に添加する工程。
本願発明は、（ＩＩ）上記した非天然アミノ酸含有タンパク質合成系に、目的のタンパク質をコードする遺伝子及びチロシンアナログを添加し、前記アンチコドン（ａ）に対応するコドンに特異的にチロシンアナログを導入する非天然アミノ酸含有タンパク質を合成する方法を包含する。
また、本願発明は、無細胞タンパク質合成系を用いて、遺伝子を改変することなく、コドン特異的にアミノ酸を変更した非天然タンパク質合成方法に関する。
具体的には、
（イ）基本となる無細胞タンパク質合成系に含まれるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の基質とはならないチロシンｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＴｙｒ）について、チロシンｔＲＮＡのアンチコドン部位に変異を導入し特定のアンチコドン（ａ）に改変し、特定のアンチコドン（ａ）に対応するコドン用のチロシンｔＲＮＡに改変する工程、
（ロ）前記改変型ｔＲＮＡＴｙｒをアミノアシル化することができるチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体（ＴｙｒＲＳ変異体）を調製する工程、
（ハ）前記無細胞タンパク質合成系から全種類ｔＲＮＡを選択的に分離し、全種類ｔＲＮＡ混合物（ｔＲＮＡＭｉｘ）から前記特定のアンチコドン（ａ）を有するｔＲＮＡのみを除去し、前記特定のアンチコドン（ａ）を有するｔＲＮＡ以外を再度無細胞タンパク質合成系に戻す工程、及び
（ニ）上記改変型ｔＲＮＡＴｙｒ及びＴｙｒＲＳ変異体を前記処理された無細胞タンパク質合成系に添加する工程により調製された非天然アミノ酸含有タンパク質合成系に、目的のタンパク質をコードする遺伝子及びチロシンアナログを添加し、前記アンチコドン（ａ）に対応するコドンに特異的に非天然アミノ酸を導入する非天然アミノ酸含有タンパク質を合成する方法を包含する。
基本となる無細胞タンパク質合成系
本発明で用いる無細胞タンパク質合成系としては、鋳型としてのｍＲＮＡからの翻訳を行わせるインビトロ翻訳系、又は鋳型としてのＤＮＡから転写及び翻訳を行わせるインビトロ転写翻訳系の両者とも利用可能である。これらインビトロタンパク質合成系としては、従来は、細胞を破砕し、Ｓ３０を中心に、２０種類のアミノ酸並びにエネルギー源としてのＡＴＰ及びＧＴＰを添加し、更に、エネルギー再生系を加えた系が用いられてきており、特に大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球から調製したもの、さらに純粋に各構成成分から再構成された再構成タンパク質合成系が広く用いられてきている。本発明では、どのような無細胞タンパク質合成系であっても、用いることができる。更に最近では翻訳、必要に応じ転写に必要な成分をそれぞれ精製し、混合することにより構築された系も用いることができる。又は、前記両者の系を混合することにより構築されたものも用いることができる。
また、非天然アミノ酸の導入に負に働く因子（例えば核酸分解酵素、蛋白質分解酵素、解離因子、酸化・還元酵素等）を破壊（欠損）、又は免疫沈降等により取り除いた細胞抽出液も好適に用いられる。
無細胞タンパク合成系としては、例えば、リボソーム、開始因子、伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、及び緩衝液等を含む系、あるいは、タンパク質合成に最低限必要な因子から構成された系があげられる。
１．無細胞タンパク質合成系からの全種類ｔＲＮＡの抽出分離方法
従来より、バルクのｔＲＮＡは、細胞を適当な緩衝液に懸濁し直接フェノール処理し粉砕し、振とう抽出し、遠心分離後、水相に可溶性の区分からエタノールで核酸を沈殿し回収され、１Ｍ  ＮａＣｌに溶解し、不溶物（ｒＲＮＡ）を除去し、再度エタノールで核酸を沈殿し、酢酸ナトリウムに溶解後、イソプロピルアルコールで析出するＤＮＡを除去し、再度酢酸ナトリウムに溶解後、ｔＲＮＡ含有ＲＮＡ分画を析出させ、セファデックスＧ−１００又はＤＥＡＥ−セファデックスなどのカラムで精製し、入手されている。イオン交換樹脂なども用いられることもある。
本発明の方法においては、調製した無細胞タンパク質合成系から、他の成分を失活させることなく、全種類ｔＲＮＡを除去することが必要である。たとえば、細胞を破砕した細胞抽出液を、種々の樹脂を用いたクロマトグラフィーにより分離することにより、全種類ｔＲＮＡが除去できる。クロマトグラフィーとしては、陰イオン樹脂、たとえば、Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ、ＤＥＡＥ樹脂等を用い、塩存在下で前記樹脂に細胞破砕液をロードし、ｔＲＮＡを樹脂に吸着させることにより、前記細胞破砕液より、全種類ｔＲＮＡを分離することができる。
塩としては、種々の塩、たとえば、塩化カリウム、酢酸カリウムなどが用いることができるが、好適には酢酸カリウムを用いることができる。
２．全種類ｔＲＮＡの混合物からの特定コドン用ｔＲＮＡの除去
全種類ｔＲＮＡの混合物（ｔＲＮＡＭｉｘ）から、特定のアミノ酸用のｔＲＮＡを分離することは、たとえば、ＲＰ−ＨＰＬＣ逆相高速液体クロマトグラフィーなどを用いて行われてきた。具体的には、たとえば、ｔＲＮＡＰｈｅは、まずフェニルセファロース疎水性クロマトグラフィーを用い、次に逆相高速液体クロマトグラフィーを用いる方法（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ  Ｖｏｌ．２８，ｅ６４）などを用いることができる。また、高速液体クロマトグラフィーには、ＤＥＡＥ−５ＰＷ、ＢＤ−５ＰＷ、ヒドロキシアパタイト、ＮＥＯＳＯＲＢ又はＬＣ−Ｎ−７などのカラムのほか、通常高速液体クロマトグラフィーには用いられていない、ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ、又はブチル−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬなども用いることができる（「新生化学実験講座２核酸Ｉ分離精製」日本生化学会編、東京科学同人）。特定のアミノ酸をすべて、非天然型アミノ酸に改変する場合は、これらの方法を用いることができる。
他方、同じアミノ酸用のｔＲＮＡの内、特定のコドン用ｔＲＮＡのみを分離する場合には、特定コドン用のそれぞれのコドンに対応したプローブを用いて分離することができる。
たとえば、アンチコドン部分を含むｔＲＮＡ配列に十分に相補的な配列を含むプローブを用いて目的とするｔＲＮＡを採取することができる。プローブは、プローブの回収に好適な手段たとえば、プローブを支持体（オリゴ−セルロース、オリゴ−セファロース、ｏｒｉｇｏｔｅｘなど）に共有結合したもの、又はビオチン化しものとアビジン若しくはストレプトアビジンを支持体と結合させたもの（アビジンーセファロース、ストレプトアビジンーセルロースなど）と結合させて回収することもできる。このようにして、非天然型アミノ酸の導入に不必要な、非天然型アミノ酸用に割り当てるセンスコドンに相当するアンチコドンを持つ通常のｔＲＮＡを除去することができる。
例えば、タンパク質にチロシンアナログを導入する場合には、アンチコドンが、ＡＣＵ、ＵＡＡ、ＧＣＧ、ＧＣＵ、ＧＧＡ又はＵＧＵの通常のｔＲＮＡを除去することができる。なお、上述したように、通常は、ＡＣＵはもともと存在しない。
３．ｔＲＮＡＴｙｒ及び改変型ｔＲＮＡＴｙｒ（ｔＲＮＡＴｙｒ改変体とも呼ぶ）の調製
任意のコドンにチロシンアナログを割り当てるために、ｔＲＮＡＴｙｒを、標的とするコドンに対応するアンチコドンを有するように改変し、標的コドン用改変型ｔＲＮＡＴｙｒとする。そしてこの改変した標的コドン用改変型ｔＲＮＡＴｙｒがチロシンアナログを受容できるように、チロシルｔＲＮＡ合成酵素を変異させる。なお、この場合、上記の無細胞タンパク質合成系に存在する内在性の酵素の基質となってはならない。通常利用されている大腸菌由来の無細胞タンパク質合成系に用いる場合には、例えば、酵母細胞質由来など真核生物由来のｔＲＮＡを用いることができる。また、小麦胚芽由来の無細胞タンパク質合成系など真核生物由来無細胞タンパク質合成系の場合は、酵母ミトコンドリア由来、もしくは原核生物由来のｔＲＮＡを用いることができる。
具体的には、まず、チロシンアナログを導入しようとする遺伝子において、当該チロシンアナログ導入予定位置のアミノ酸をコードするコドンを同定する。そしてｔＲＮＡＴｙｒのアンチコドンを当該チロシンアナログ導入予定位置のコドンに対するアンチコドンに改変する。
より具体的には、たとえば、酵母細胞質ｔＲＮＡＴｙｒ（ｔＲＮＡＴｙｒ）をコードする遺伝子（例えば、配列番号３）をＰＣＲ法により増幅させる。
ＰＣＲ産物を６％ポリアクリルアミドゲルで精製後、適宜なベクター、たとえば、ｐＧＥＭＥＸ−１  ｖｅｃｔｏｒにライゲーションする。ベクターに組み込まれたものを、変異配列を持つプライマーとＰＣＲを利用したクイックチェンジ法により、アンチコドン部位を野生型（ＡＧＵ）から目的のアンチコドンに変異させる。
上記変異体を組み込んだベクターを鋳型に転写法により改変型ｔＲＮＡＴｙｒを調製する。まず、（Ｋａｏ，Ｃ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｍ．ａｎｄ  Ｒｕｄｉｓｓｅｒ，Ｓ．１９９９  ＲＮＡ，５，１２６８−１２７２）に従い３’末端のＣＣＡでストップさせるためのプライマーを設計する。
これらのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行う。ここで得られた改変型ｔＲＮＡＴｙｒは余分な配列を持っているので活性型の改変型ｔＲＮＡＴｙｒを得るにはＲＮａｓｅＰで余分な配列を切らなければならない。ＲＮａｓｅＰは活性中心であるＭ１ＲＮＡとＣ５タンパク質からなる酵素であり、Ｍ１ＲＮＡ又はＭ１ＲＮＡ及びＣ５タンパク質を上記した余分の配列を含む改変型ｔＲＮＡＴｙｒ回収物に加え、３７℃で１ｈｒ反応させる。電気泳動後、ゲルを切り出し、ゲルエリューションにより、アンチコドン部分を改変したｔＲＮＡＴｙｒ改変体が回収できる。
なお、チロシンアナログ用の改変型ｔＲＮＡＴｙｒには、少なくとも３’末端がＡＣＣＡの配列を有することが望ましい。例えば、チロシン又はチロシンアナログ用の改変型ｔＲＮＡＴｙｒは、アンチコドンが、ＡＣＵ、ＵＡＡ、ＧＣＧ、ＧＣＵ、ＧＧＡ又はＵＧＵであることが望ましい。
４−１．前記ｔＲＮＡＴｙｒ及び改変型ｔＲＮＡＴｙｒをチロシン化又はチロシンアナログ化する変異型チロシルｔＲＮＡ合成酵素（チロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体もしくはＴｙｒＲＳ変異体とも呼ぶ）の調製
変異を導入するチロシルｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳとも呼ぶ）としては、無細胞タンパク質合成系に内在するｔＲＮＡを認識しないことが必要であることから、たとえば、大腸菌由来の無細胞タンパク質合成系を用いるのであれば、酵母由来のＴｙｒＲＳ、人など他の真核生物由来のＴｙｒＲＳ、古細菌由来のＴｙｒＲＳなどをあげることができる。以下、酵母由来ＴｙｒＲＳ及びＴｙｒＲＳ変異体の調製について、具体的に説明するが、他の生物由来のものも同様にして行うことができる。なお、酵母由来ＴｙｒＲＳのアミノ酸配列に対して６０％以上、好適には８０％以上、更に好適には９０％以上、更に好適には９５％以上、更に好適には９９％以上の同一性を有し、且つチロシルｔＲＮＡ合成活性を有するタンパク質に変異を導入することができる。
４−２．酵母由来チロシルｔＲＮＡ合成酵素及び変異型チロシルｔＲＮＡ合成酵素の調製
前記チロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体は、前記チロシンアナログ（以下Ｙアナログとも記載する）を前記標的アンチコドンを有する改変型ｔＲＮＡＴｙｒに特異的に結合させる酵素（チロシンアナログｔＲＮＡ合成酵素と呼ぶこともある）である。このアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体としては、前記チロシンアナログを基質とするものであれば特に限定されないが、無細胞タンパク質合成系に内在するｔＲＮＡを認識しないことが必要であり、標準型アミノ酸に対する基質特異性が低くなりやすく有用であることから野生型のチロシルｔＲＮＡ合成酵素を改変したチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体（ＴｙｒＲＳ変異体）、たとえば、特開２００４−２６１１６０号に記載のものも用いることができる。
具体的には、野生型のチロシルｔＲＮＡ合成酵素としては、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来チロシルｔＲＮＡ合成酵素が挙げられる。本酵素をコードする遺伝子を配列番号２に示す。この酵母由来チロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体、即ち酵母ＴｙｒＲＳ変異体としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列の４３番目のＴｙｒがＧｌｙに置換されたＹ４３ＧチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体（Ｙ４３Ｇ  ＴｙｒＲＳ）、配列番号１で表されるアミノ酸配列の８１番目のＨｉｓがＶａｌに置換されたＨ８１ＶチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体（Ｈ８１Ｖ  ＴｙｒＲＳ）、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１８６番目のＧｌｎがＶａｌに置換されたＱ１８６ＶチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体（Ｑ１８６Ｖ  ＴｙｒＲＳ）、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１８６番目のＧｌｎがＴｈｒに置換されたＱ１８６ＴチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体（Ｑ１８６Ｔ  ＴｙｒＲＳ）、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列の１８６番目のＧｌｎがＩｌｅに置換されたＱ１８６ＩチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体（Ｑ１８６Ｉ  ＴｙｒＲＳ）が挙げられる。また、前記Ｙ４３Ｇ  ＴｙｒＲＳ、Ｈ８１Ｖ  ＴｙｒＲＳ、Ｑ１８６Ｖ  ＴｙｒＲＳ、Ｑ１８６Ｔ  ＴｙｒＲＳ若しくはＱ１８６Ｉ  ＴｙｒＲＳの１〜３６４番目のアミノ酸配列からなる変異体も同様の酵素活性があることから用いることができる。更に、Ｎ末の最初のＭｅｔは欠失していてもよい。結局、配列番号１で表されるタンパク質に対して１以上のアミノ酸が欠失、付加、及び／又は置換されたタンパク質であって、（３２１番目のアミノ酸残基を含み、）チロシルｔＲＮＡ合成活性を有するものであればよい。更に、好適には、配列番号１で表されるタンパク質に対して１以上５０以下のアミノ酸が欠失、付加、及び／又は置換されたタンパク質であって、（３２１番目のアミノ酸残基を含み、）チロシルｔＲＮＡ合成活性を有するものが挙げられる。更に好適なものとしては、配列番号１で表されるタンパク質に対して１以上１０以下のアミノ酸が欠失、付加、及び／又は置換されたタンパク質であって、（３２１番目のアミノ酸残基を含み、）チロシルｔＲＮＡ合成活性を有するものが上げられる。
また、ｔＲＮＡＴｙｒ導入したアンチコドンへの変異の種類により、上記ＴｙｒＲＳおよびＴｙｒＲＳ変異体には、さらに別の変異を導入し、アミノアシル化効率を改善することすることができる。たとえば、上記アンチコドンをセリンのＡＧＵ等、他のアミノ酸のアンチコドンに改変したｔＲＮＡＴｙｒをチロシルアナログ化するためには、３２１番目のアスパラギン酸をアルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジン、グルタミン酸などに改変したＤ３２１Ｒ  ＴｙｒＲＳ、Ｄ３２１Ｎ  ＴｙｒＲＳ、Ｄ３２１Ｑ  ＴｙｒＲＳ、Ｄ３２１Ｋ  ＴｙｒＲＳ、及びＤ３２１Ｅ  ＴｙｒＲＳなどを用いることができ、特に好適には、Ｄ３２１Ｒ  ＴｙｒＲＳを用いることができる。
そこで、改変型ｔＲＮＡＴｙｒをチロシンアナログ化する変異型チロシルｔＲＮＡ合成酵素としては、配列番号１について言えば、チロシンアナログ（非天然アミノ酸）の導入を考慮した場合、基質アミノ酸（チロシン）認識部位は４３位、８１位、１２６位、１７４位、１７７位、１８１位、１８６位であり、この部位が変異の対象となることから、４３位、８１位、１２６位（Ｓ１２６Ｔ）、１７４位、１７７位、１８１位、及び又は１８６位、と３２１位の変異又はその組み合わせ変異を配列番号１の酵素に導入した変異型チロシルｔＲＮＡ合成酵素が上げられる。具体例としては、（Ｙ４３Ｇ，Ｄ３２１Ｒ）ＴｙｒＲＳ、（Ｈ８１Ｖ，Ｄ３２１Ｒ）ＴｙｒＲＳ、（Ｑ１８６Ｖ，Ｄ３２１Ｒ）ＴｙｒＲＳ、（Ｑ１８６Ｔ，Ｄ３２１Ｒ）ＴｙｒＲＳ若しくは（Ｑ１８６Ｉ，Ｄ３２１Ｒ）ＴｙｒＲＳの１〜３６４番目のアミノ酸配列が挙げられ、好ましくは、４３位と３２１位の変異を組み合わせ、８１位と３２１位の変異の組み合わせ、１８６位と３２１位の変異の組み合わせが挙げられ、４３位１２６位３２１位の変異の組み合わせも重要である。
なお、配列番号１に上記した変異を導入した配列に対して（１）６０％以上、好適には８０％以上、更に好適には９０％以上、更に好適には９５％以上の同一性を有し、且つ改変型ｔＲＮＡＴｙｒをチロシンアナログ化できるＴｙｒＲＳ変異体、並びに（２）１又は数個のアミノ酸が置換、付加及び／又は欠失した配列で示される、改変型ｔＲＮＡＴｙｒをチロシンアナログ化できるＴｙｒＲＳ変異体も用いることができる。
なお、無細胞タンパク質合成系を用いて、遺伝子を改変することなく、コドン特異的にアミノ酸を変更したタンパク質合成を目的とする場合には、配列番号１において３２１番目のアスパラギン酸をアルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジン、グルタミン酸などに改変したＤ３２１Ｒ  ＴｙｒＲＳ，Ｄ３２１Ｎ  ＴｙｒＲＳ，Ｄ３２１Ｑ  ＴｙｒＲＳ，Ｄ３２１Ｋ  ＴｙｒＲＳ，及びＤ３２１Ｅ  ＴｙｒＲＳなどを用いることができ、特に好適には、Ｄ３２１Ｒ  ＴｙｒＲＳを用いることができる。更に、前記Ｄ３２１Ｒ・Ｄ３２１Ｎ・Ｄ３２１Ｑ・Ｄ３２１Ｋ・Ｄ３２１Ｅの変異を導入した配列番号１に対して、
（１）６０％以上、好適には８０％以上、更に好適には９０％以上、更に好適には９５％以上の同一性を有し、且つ改変型ｔＲＮＡＴｙｒをチロシル化できるＴｙｒＲＳ変異体、並びに
（２）１又は数個のアミノ酸が置換、付加及び／又は欠失した配列で示される、改変型ｔＲＮＡＴｙｒをチロシル化できるＴｙｒＲＳ変異体も用いることができる。
また、ＴｙｒＲＳ変異体をコードする遺伝子配列としては、配列番号２のものにおいて、第９６１から９６３番目の塩基を改変したもの、具体的には、配列番号４７〜５１で示される塩基配列が挙げられる。  更に、ＴｙｒＲＳ変異体をコードする遺伝子としては、配列番号４７〜５１で示される塩基配列に対して、
（１）６０％以上、好適には８０％以上、更に好適には９０％以上、更に好適には９５％、更に好適には、９９％以上以上の同一性を有し、且つ改変型ｔＲＮＡＴｙｒをチロシル化できるＴｙｒＲＳ変異体をコードする塩基配列、又は
（２）ストリンジェントな条件下で、前記配列番号４７〜５１で示されるＤＮＡの相補鎖に対してハイブリダイズすることができ、改変型ｔＲＮＡＴｙｒをアミノアシル化できるＴｙｒＲＳ変異体をコードする塩基配列で示されるものも用いることができる。
なお上記ストリンジェントな条件下としては、例えば、次のような条件を挙げることができる。１２０℃で２０分間処理してＤＮＡを結合させたＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋  ナイロンメンブレン（アマシャムファルマシア）をリン酸塩緩衝液（０．５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび７％  ＳＤＳ）中、６５℃で５分間処理し、プレハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは同緩衝液中に配列番号４８−５１で表される遺伝子を添加後、６５℃で１７時間行う。ハイブリダーゼーション後のメンブレンは室温で２０分間、０．１％  ＳＤＳを含む２ｘ  ＳＳＣ（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ；１ｘ  ＳＳＣは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ、ｐＨ７．０）で処理下後、０．１％  ＳＤＳを含む１ｘ  ＳＳＣ中６５℃で２０分間の洗浄を２回行う。さらに０．１％  ＳＤＳを含む０．１ｘ  ＳＳＣ、６５℃で２０分間処理し洗浄を完了する。Ｘ線フィルムへの感光は−８０℃で２４時間行う。
なお、ストリンジェントな条件としては、また、次のような一般的方法によることもできる。ＤＮＡ又はＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２ｘ  ＳＳＣ溶液（１ｘ  ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
さらに、このＴｙｒＲＳ変異体としては、精製が容易であること等から、前記ＴｙｒＲＳ変異体のＣ末端にヒスチジンタグ等のタグ（ｔａｇ）が結合したものを用いるとよい。なお、前記Ｙ４３Ｇ  ＴｙｒＲＳについては、Ｓ．Ｏｈｎｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ  ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｂｙ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３０，４１７−４２３（２００１）に開示されている。また、前記ＴｙｒＲＳ変異体はいずれも、ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒ（ｓｕｐ．ｔＲＮＡＴｙｒ）（アンバー、オーカー又はオパール）を基質とする。
前記鋳型は、前記ｓｕｐ．ｔＲＮＡＴｙｒが認識する終止コドンを、部位特異的突然変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）等により人為的に翻訳領域に配したポリヌクレオチドであり、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの形態で用いられる。前記ＤＮＡとしては、転写に必須な配列を含む二本鎖ＤＮＡが挙げられ、種々のベクターやプラスミド等に導入して利用するのが最も簡便である。なお、前記翻訳領域の３’末端に位置する終止コドンは、前記ｓｕｐ．ｔＲＮＡＴｙｒが認識する終止コドンとは異なる塩基配列のコドンが配される。
５．チロシンアナログ
本発明者らによる先願（特開２００４−２６１１６０）に記載のチロシンアナログを利用できる。
具体的には、Ｙアナログとしては、アジドチロシン（ａｚｉｄｏ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、アセチルチロシン（ａｃｅｔｙｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、アミノチロシン（ａｍｉｎｏ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ）又はドーパ（ＤＯＰＡ；３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）が用いられる。これらのＹアナログは、下記化１又は化２に示される構造を有している。
【化１】
0004654449.tif 000002
0004654449.tif 000003
但し、Ｒ１はアジド基、アセチル基、アミノ基又は水酸基。
【化２】
0004654449.tif 000004
但し、Ｒ２はアジド基、アセチル基又はアミノ基。
即ち、化１に示されるＹアナログは、チロシンの側鎖を構成するフェノール性芳香族環の３（メタ）位に置換基Ｒ１としてアジド基（−Ｎ３）、アセチル基（−ＣＯＣＨ３）、アミノ基（−ＮＨ２）又は水酸基（−ＯＨ）を有している。化２に示されるＹアナログは、チロシンの側鎖を構成するフェノール性芳香族環の２（オルト）位に置換基Ｒ２としてアジド基、アセチル基又はアミノ基を有している。なお、これらのＹアナログの置換基は、メタ位又はオルト位のいずれに結合されていても構わないが、側鎖の端部側に位置しＹアナログ修飾体にする反応が進行しやすいことからメタ位に結合されているのが好ましい。また、これらのＹアナログは、Ｌ型又はＤ型のいずれの光学異性体であっても構わないが、タンパク質合成効率が高いことからＬ型であるのが好ましい。
Ｙアナログ修飾体は、前記Ｙアナログの側鎖（フェノール性芳香族環の２位又は３位）に修飾物が結合した有機化合物である。前記修飾物は、修飾基と、その修飾基に結合した反応基とを備えている。前記反応基としては、オルトアルコキシカルボニルアリールジアリールホスフィン（トリアリールホスフィン（ｔｒｉａｒｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）誘導体）、ヒドラジン（ｈｙｄｒａｚｉｎｅ）、コハク酸イミドエステル（ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）、イソチオシアン酸（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）塩、塩化スルホニル（ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、アルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｅ）、又はカルボン酸や酸ハライド若しくはその酸無水物が挙げられる。前記修飾基は、特に限定されないが、実用的な用途拡大が容易であることから、蛍光物質、疎水性の巨大分子、親水性物質、電荷を有する物質、水素結合能を有する物質、化学反応性を有する物質、生理活性物質（酵素等）、生体構成物質（タンパク質、糖鎖、ポリヌクレオチド、脂肪酸等）、ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）、抗体又はその一部等が好適に用いられる。また、修飾基として、ポリエチレングリコール等のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に用いられる機能性担体を用いてもよい。
このＹアナログ修飾体は、Ｙアナログの置換基と、前記修飾物の反応基とを化学的又は生物化学的に結合（共有結合）させることにより得られる。
前記置換基と反応基との組合わせとしては、置換基がアジド基の場合には反応基としてはトリアリールホスフィン誘導体となる。また、置換基がアセチル基の場合には反応基がヒドラジンとなり、置換基がアミノ基の場合には反応基がコハク酸イミドエステル、イソチオシアン酸塩、塩化スルホニル、アルデヒド、又はカルボン酸や酸ハライド若しくはその酸無水物となる。これら置換基と反応基との反応は化学的反応である。また、前記Ｙアナログがドーパの場合には、そのフェノール性芳香族環の３位及び４位の水酸基をドーパオキシダーゼ（ＤＯＰＡｏｘｉｄａｓｅ）による酵素反応を利用しつつ反応基としてのアミノ基と結合（生物化学的反応）させることにより、修飾物が結合してＹアナログ修飾体となる。これらのＹアナログの置換基を修飾する反応は、生理的条件下（例えば大腸菌や酵母等の一般細菌又は単細胞生物が生存可能な条件下）で行うことが可能となっている。
６．チロシンアナログをコドン特異的に含む非天然アミノ酸含有タンパク質の製造
非天然アミノ酸含有蛋白質は、本発明者らによる先願（特開２００４−２６１１６０）の方法に準じて行うことができる。
例えば、上記した１．「無細胞タンパク質合成系からの全種類ｔＲＮＡの抽出分離方法」により、全種類ｔＲＮＡが除去された無細胞タンパク質合成系に、上記２．「ｔＲＮＡＭｉｘから特定コドン用のｔＲＮＡの除去」により、特定コドン用のｔＲＮＡが除去された残りのｔＲＮＡを添加してなる無細胞タンパク質合成系に、３．「改変型ｔＲＮＡＴｙｒの調製」で調製された特定コドンにチロシンもしくはチロシンアナログを割り当てる改変型ｔＲＮＡｔｙｒ、４．「改変型ｔＲＮＡＴｙｒをチロシン化もしくはチロシンアナログ化するされたチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体の調製」で調製されたＴｙｒＲＳ変異体、及び前記５．のチロシンアナログの存在下で、鋳型ｍＲＮＡ又は鋳型ＤＮＡを元に非天然アミノ酸（アミノ酸アナログ）を含有する非天然タンパク質を製造することができる。
言い換えれば、
（１）非天然アミノ酸を含有させたいタンパク質又はタンパク質をコードする遺伝子中で置換させたいアミノ酸に対応するコドンを選択する。望ましくは、ロイシン、アルギニン、セリン、スレオニンに対するコドンで、ＵＵＡ、ＣＧＣ、ＡＧＵ、ＣＧＡ、ＡＣＡ、アンチコドンが、ＡＣＵ、ＵＡＡ、ＧＣＧ、ＧＣＵ、ＵＧＵを選択することが望ましい。該選択されたアンチコドンを有するｔＲＮＡを、使用する無細胞タンパク質合成系から除去し、残りのｔＲＮＡを該無細胞タンパク質合成系に再度添加する。
（２）ｔＲＮＡＴｙｒ改変体については、チロシン受容能も高く、本来対応するアミノ酸は全く受容しないｔＲＮＡＴｙｒ改変体が望ましい。具体的には、アンチコドンが、ＡＣＵ、ＵＡＡ、ＧＣＧ、ＧＣＵ、ＵＧＵであるｔＲＮＡＴｙｒ改変体を選択することが望ましい。当該ｔＲＮＡＴｙｒ改変体を、前記無細胞タンパク質合成系に添加する。
（３）改変型ｔＲＮＡＴｙｒをチロシンアナログ化する変異型チロシンｔＲＮＡＴｙｒ合成酵素としては、配列番号１に対し４３位、８１位、１２６位（Ｓ１２６Ｔ）、１７４位、１７７位、１８１位及び１８６位から選ばれる１以上の変異、と３２１位の変異の組み合わせ変異を導入した変異型チロシルｔＲＮＡＴｙｒ合成酵素が上げられる。具体例としては、（Ｙ４３Ｇ，Ｄ３２１Ｒ）ＴｙｒＲＳ、（Ｈ８１Ｖ，Ｄ３２１Ｒ）ＴｙｒＲＳ、（Ｑ１８６Ｖ，Ｄ３２１Ｒ）ＴｙｒＲＳ、（Ｑ１８６Ｔ，Ｄ３２１Ｒ）ＴｙｒＲＳ若しくは（Ｑ１８６Ｉ，Ｄ３２１Ｒ）ＴｙｒＲＳの１〜３６４番目のアミノ酸配列が挙げられ、好ましくは、４３位と３２１位の変異を組み合わせ、８１位と３２１位の変異の組み合わせ、１８６位と３２１位の変異の組み合わせが挙げられ、４３位１２６位３２１位の変異の組み合わせも重要である。
（４）上記（１）で調製した無細胞タンパク質合成系に（２）のｔＲＮＡＴｙｒ改変体および（３）の改変型ｔＲＮＡＴｙｒをチロシンアナログ化する変異型チロシンｔＲＮＡＴｙｒ合成酵素を添加し、チロシンアナログの存在下で、非天然アミノ酸を含有させたいタンパク質をコードする遺伝子を加えて、非天然アミノ酸（チロシンアナログ）含有タンパク質を合成することができる。
例えばより具体的には、ＧＦＰｕｖ遺伝子（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）中ＡＧＵコドンにチロシンアナログを導入するためには、（１）ｔＲＮＡを除いた大腸菌Ｓ３０抽出液（Ｓ３０／−ｔＲＮＡ）、（２）ｔＲＮＡ混合物からセリンに割り当てられているコドンのうち特定のコドン（ＡＧＹ）を読み取るｔＲＮＡＳｅｒ（ＡＧＹ）を除いたｔＲＮＡ混合物（ｔＲＮＡＭｉｘ−Ｓｅｒ（ＡＧＹ））、（３）ＡＧＵコドンにチロシンを割り当てた改変型ｔＲＮＡＴｙｒ及び（４）（Ｙ４３Ｇ、Ｄ３２１Ｒ）ＴｙｒＲＳ変異体を利用すればよい。
【実施例】
【０００６】
［参考例１］  Ｃ５タンパク質の調製
Ｃ５タンパク質遺伝子（ｒｎｐＡ）は大腸菌ＪＭ１０９株のゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。ＮｄｅＩとＸｈｏＩサイトを付加するために、使用したプライマーはそれぞれ５’−ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＴＡＴ  ＧＧＴ  ＴＡＡ  ＧＣＴ  ＣＧＣ  ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＣＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４）と５’−ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＣＧＡ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＧＣＧ  ＣＴＣ  ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＣＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５）（下線部がＮｄｅＩとＸｈｏＩサイト）である。ＰＣＲしたフラグメントはｐＥＴ２１ａ（＋）にクローニングした（これをｐＥＴＣ５と呼ぶ）。ｐＥＴＣ５をトランスフォーメーションした大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株は１リットルのＬＢ培地でＯＤ６００が０．５−０．８になるまで培養し、０．５ｍＭのＩＰＴＧによって発現誘導した。４時間保温した後、発現菌体は集菌、冷凍した。冷凍された菌体は５０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  １Ｍ  ＮａＣｌ溶液で懸濁し、超音波破砕機（バイオラプター、トウショウデンキジャパン）で破砕した。３０，０００ｘｇで３０分遠心した後、上清は５０％飽和硫酸アンモニウム沈殿処理を行った。１７，０００ｘｇで１５分遠心した後、上清は８０％飽和硫酸アンモニウム沈殿処理を行った。１７，０００ｘｇで１５分遠心して回収した沈殿は、バッファーＡ（５０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ６．５），５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２５Ｍ  ＮａＣｌ）に溶解し、その溶液をさらにバッファーＡに対して透析した。透析したタンパク質溶液は、１０ｍｌのＳＰセファロースカラム（アマシャム）を用いて精製を行った。流速２ｍｌ／ｍｉｎでＮａＣｌの直線濃度勾配（０．２５−１．０Ｍ，トータル２００ｍｌ）で溶出操作を行った。Ｃ５タンパク質を含むフラクションを回収、アミコンウルトラで濃縮、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，４０ｍＭ  ＫＣｌ，６ｍＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ  ａｎｄ  ５０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌに対して一晩透析し、−３０℃で保存した。
（結果）
Ｃ５タンパク質遺伝子の挿入が確認されたｐＥＴＣ５を用いて、Ｃ５タンパク質の発現を行った。発現確認のため少量のＳ３０画分をＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅを用いて精製したものを１５％アクリルアミドゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで行った。結果はＥｌｕｔｉｏｎに見られるバンドが一つであった。
［参考例２］  Ｍ１ＲＮＡの調製
Ｍ１ＲＮＡのゲノム（ｒｎｐＢ）は、大腸菌ＪＭ１０９株のゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅した。プライマーは、ＥｃｏＲ  ＩサイトとＴ７プロモーターを融合させるために５’−ＧＧＧ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６）（下線部）そしてＢａｍＨ  Ｉを組み込むために５’−ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＡＡ  ＡＴＣ  ＡＧＧ  ＴＧＡ  ＡＡＣ  ＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７）を用いた。ＰＣＲ後の断片はｐＵＣＭ１を作成するために、ｐＵＣ１９プラスミドにクローニングした。Ｍ１  ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写のためのテンプレートは、Ｔ７プロモーター領域（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４３））とハイブリダイズするＴ７プライマーとＭ１  ＲＮＡの３’末端領域と相補的なプライマー（５’−ＡＧＧ  ＴＧＡ  ＡＡＣ  ＴＧＡ  ＣＣＧ  ＡＴＡ  ＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８））によって、ｐＵＣＭ１からＰＣＲ増幅で調製した。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写は、（Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．Ｃ．１９８８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５  １０３３−１０３７）に従って行った。転写後、反応混合物は、１ｍｌのＱセファロースカラム（アマシャム）で精製した。０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で、ＮａＣｌの直線グラジェント（０．４−１．０Ｍ，トータル２０ｍｌ）によって溶出操作を行った。Ｍ１  ＲＮＡは溶出液からエタノール沈殿によって回収した。
（結果）
Ｍ１  ＲＮＡ遺伝子の挿入が確認されたｐＵＣＭ１からＰＣＲ増幅を用いて鋳型の調製を行った。これを用いＭ１  ＲＮＡの転写調製を行った。確認を６％アクリルアミドゲルを用いて行った。結果、目的の長さに相当するバンドが確認できた。
［実施例１］
大腸菌細胞抽出液から全種類ｔＲＮＡを除く方法
１−１．大腸菌細胞抽出液の調製
グリセロールストックされた大腸菌Ｑ１３株（ＲＮａｓｅ  Ｉ欠損株）を白金耳で、ＬＢプレートに画線培養した。現れたコロニーの一つをＬＢ培地に植菌して３７℃で一晩振とう培養し、これを前培養液とした。本培養は、２×ＴＹ培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  １６ｇ／ｌ、Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  １０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ）の１０％に相当する容量の前培養液を移し、３７℃で振とう培養した。６００ｎｍの吸光度が０．４になったところで培地を冷やした。５，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心して集菌した。上清をできるだけ取り除き、菌体量を測定し、２倍量のＢｕｆｆｅｒ  Ｓ３０（２０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ  酢酸アンモニウム、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、１０ｍＭ  β−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）に菌体を懸濁した。懸濁液と同容量のガラスビーズ（Ｂ．ＢＲＡＵＮ社製、φ０．４５ｍｍ）を入れたガラス管（岩城硝子社製）に移し、ＭＳＫ  ｃｅｌｌ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（Ｂ．ＢＲＡＵＮ社）で細胞を破砕した。破砕液を３０，０００×ｇで３０ｍｉｎ遠心し、その上清を大腸菌細胞抽出液とした。これを小分けし、液体窒素で凍結させて保存した。
１−２．大腸菌細胞抽出液からの全種類ｔＲＮＡの除去
大腸菌細胞抽出液に対しその５倍量のＱ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ樹脂をスピンカラムに詰め１０００ｒｐｍ×３ｍｉｎ  ４℃で遠心した。Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓ３０に０Ｍ，０．１Ｍ，０．２Ｍ，０．３Ｍ，０．４Ｍ，０．５Ｍ，０．６Ｍ，又は０．７Ｍ  酢酸カリウムを加えた溶液（８種類）を用意し、それぞれを用い樹脂を平衡化した。大腸菌細胞抽出液をロードし、素通りを回収した。７Ｍ  尿素を含む１０％ポリアクリルアミドゲルにてｔＲＮＡの除去を確認した。（図１）
２−１．全種類ｔＲＮＡを除去した大腸菌細胞抽出液を用いたタンパク質合成
以下の反応組成に全種類ｔＲＮＡの混合物（ｔＲＮＡＭｉｘ）を加えない場合と、加えた場合とでタンパク質（ＧＦＰｕｖ）合成を行い、電気泳動によって全種類ｔＲＮＡ除去とタンパク質合成能力を確認した。
【表１】
0004654449.tif 000005
結果を図２に示す。
大腸菌細胞抽出液（Ｓ３０）を酢酸カリウム０．４〜０．６Ｍの濃度で処理した場合、全種類ｔＲＮＡの混合物（ｔＲＮＡＭｉｘ）を加えた場合にのみタンパク質の合成が確認できることから、この範囲であれば大腸菌細胞抽出液（Ｓ３０）から全種類ｔＲＮＡを除けることが確認できた。
［実施例２］
全種類ｔＲＮＡの混合物（ｔＲＮＡＭｉｘ）から特定の配列を持つｔＲＮＡを除く方法
以下では、アンチコドンとしてＧＣＵを持つｔＲＮＡＳｅｒ（ＡＧＹ）を全種類ｔＲＮＡの混合物（ｔＲＮＡＭｉｘ）から除去する方法について記載するが、特定の配列を持つｔＲＮＡに応じたＤＮＡプローブを用い同様の操作にて特定の配列を持つｔＲＮＡを除去することができる。なお、通常、セリンに割り当てられているＡＧＵ及びＡＧＣの両者、つまりＡＧＹは、アンチコドンがＧＣＵのｔＲＮＡＳｅｒ（ｔＲＮＡＳｅｒ（ＡＧＹ））１種類のみを利用して、両方が読まれている。ｔＲＮＡＭｉｘからｔＲＮＡＳｅｒ（ＡＧＹ）が除去されたｔＲＮＡＭｉｘを、ｔＲＮＡＭｉｘ−Ｓｅｒ（ＡＧＹ）と呼ぶ。
（１）ビオチン化ＤＮＡ結合樹脂の作製
１．５ｍｌのろ過チューブのフィルター容器３本（Ａ，Ｂ，Ｃとする）に５０μｌのストレプトアビジンアガロース懸濁液（樹脂量２５μｌ）を加え、６０００ｘｇで１０秒ほど遠心し、緩衝液を除いた。４００μｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）をフィルター溶液に加え、樹脂を懸濁した。その後、６０００ｘｇで遠心し、緩衝液を除いた。この操作を２度繰り返した。ビオチン化オリゴＤＮＡプローブ（配列ＣＧＧ  ＴＧＡ  ＧＧＣ  ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＣＣＣ  ＧＧＡ  ＴＧＣ−ｂｉｏｔｉｎ）８００ｐｍｏｌ相当を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）で４００μｌに希釈し、これを３倍量（ｔｏｔａｌ  １２００μｌ）作っておく。このＤＮＡ溶液の吸光度を測定しておき（０．６１９  Ａ２６０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、これをストレプトアビジンアガロース樹脂が入ったフィルター容器に各々４００μｌずつ加え、たびたび振りながら室温で１０分ほど放置した。これを６０００ｘｇで遠心し、結合しなかったＤＮＡプローブを除いた。Ａ，Ｂ，Ｃのチューブから抜けてきたＤＮＡ溶液の吸光度も測定した。
結果は次の表２のとおりであった。
【表２】
0004654449.tif 000006
（２）固相化プローブ法によるｔＲＮＡの回収
３５Ａ２６０ｕｎｉｔのＥ．ｃｏｌｉ全種類ｔＲＮＡの混合物（ｔＲＮＡＭｉｘ）に×１２Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ，Ｂ，Ｃを各々２００μｌ加え、ＲＮａｓｅＦｒｅｅ水で４００μｌとした。
なお、１２Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ、Ｂ、及びＣの組成を以下に示す。
【表３】
0004654449.tif 000007
６５℃で５分間、ｔＲＮＡ溶液を保温した。先に作製したフィルター容器Ａ，Ｂ，Ｃに、各々対応するｔＲＮＡ溶液を加え、さらに６５℃で２分間保温した。その後２５℃までゆっくり冷やし、目的のｔＲＮＡを樹脂に結合させた。６０００ｘｇで１０秒ほど遠心し、結合しなかったｔＲＮＡ溶液を取り除いた。抜けてきたｔＲＮＡ溶液の吸光度も測定し、ｔＲＮＡ量を算出した。
【表４】
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４００μｌの３ｘ  ＳＳＣをフィルター容器に加え樹脂を攪拌し、６０００ｘｇで１０秒程度遠心して３ｘ  ＳＳＣを除き、樹脂を洗った。抜けてくる３ｘ  ＳＳＣの吸光度が０．０１Ａ２６０ｕｎｉｔ／ｍｌ以下になるまでこの操作を繰り返した。あらかじめ６５℃で保温しておいた０．１ｘ  ＳＳＣ  ２００μｌをフィルター容器に加え、６５℃で５分間保温した。溶液が冷えないうちに６０００ｘｇで１０秒程度遠心。ｔＲＮＡ溶液を回収した。この操作をもう一度繰り返した。回収されたｔＲＮＡ溶液の吸光度を測定した。
【表５】
0004654449.tif 000009
（３）回収したｔＲＮＡＳｅｒの純度の確認
各Ｂｕｆｆｅｒを用いて回収したｔＲＮＡの純度および、全種類ｔＲＮＡの混合物（ｔＲＮＡＭｉｘ）からの回収率を確認するため、１５％アクリルアミド７Ｍ  Ｕｒｅａゲルを用いた電気泳動にて確認した。（図３）
固相化プローブ法によるｔＲＮＡＳｅｒ（ＡＧＹ）の回収量は、吸光度測定の結果より、ＴＭＡＣｌ＞ＮａＴＣＡ＞ＮａＣｌであった。
更に、図３より、電気泳動のレーン（２）、（３）、（４）を比較すると、（２）、（３）、（４）の順にｔＲＮＡＳｅｒだと思われる位置のバンドの濃さが減少している。（ｔＲＮＡＳｅｒのバンドの位置の特定は（５）〜（７）より）
この結果は、先の吸光度からの回収量の特定の結果を支持する。
さらに、ノーザンハイブリダイゼーションによるｔＲＮＡＳｅｒ（ＡＧＹ）の検出結果（図４）でも、ｔＲＮＡＳｅｒ（ＡＧＹ）のバンドの濃さは（２）、（３）、（４）の順に減少している。
以上の結果より、ＴＭＡＣｌを用いた調製法が適当と思われる。
［実施例３］
改変したアンチコドンを有するｔＲＮＡＴｙｒの調製
３−１．ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅによる改変型ｔＲＮＡＴｙｒ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡの調製
【表６】
0004654449.tif 000010
上記プライマー１及びプライマー２は以下［表７］に示される組み合わせ（例えば、ＴＮＴ−Ｆ及びＴＮＴ−Ｒのように対応するフォワードプライマーとリバースプライマーのセット）から選択された。
【表７】
0004654449.tif 000011
なお、配列中のＲはＡ又はＧを示す。
（Ｒ’  ＡｏｒＧ）
なお、配列中のＲはＡ又はＧを示す。
（Ｒ’  ＡｏｒＧ）
上記組成で反応液を調製し、ＰＣＲにより改変型ｔＲＮＡＴｙｒ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲに用いた改変前の野生型ｔＲＮＡＴｙｒ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡは、５’−ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＴＡＧ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＧＧＴ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＴＴＡ  ＡＧＧ  ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＡＣＴ  ＧＴＡ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＧＧＧ  Ｃ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４４）と５’−ＧＧＧ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＴＧＧ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＣＣ  ＣＧＡ  ＴＣＴ  ＣＡＡ  ＧＡＴ  ＴＴ−３’（下線部は相補的な配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）をアニーリング処理後、Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔにより２本鎖を形成させ、Ｘｂａ  Ｉ，ＨｉｎｄＩＩＩサイトを利用してｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社）に組み込み作製した。
ＰＣＲ産物にＤｐｎ１を０．５μｌ加え、１時間保温し、コンピテントセルＤＨ５ａｌｐｈａに投入し形質転換をおこなった。そして生じたコロニーからプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡの配列を、日立のシーケンサー（ＳＱ５５００Ｅ）で確認した。
３−２．転写反応とプロセシングによる野生型および改変型ｔＲＮＡＴｙｒ４７種類の調製
３−２−１．転写用鋳型ＤＮＡの調製
【表８】
0004654449.tif 000012
なお、５’−Ｔ７プライマー、３−’ＯＭＥプライマー次の通りである。
５’−Ｔ７プライマー：５’ＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３３）
３−’ＯＭＥプライマー：ＴＧｍＧＴＣＴＣＣＣＧＧＧＧＧＣＧＡＧＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３４）
上記の組成で反応液を調製し、ＰＣＲを行うことにより転写に必要な部位の増幅を行った。
ＰＣＲ産物をフェノール・クロロホルム処理し、エタノール沈殿して、乾燥させ−３０℃で保存した。
３−２−２．転写反応とプロセシング
【表９】
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なお、１０×ＴＤＭ  Ｂｕｆｆｅｒ、１０×ＳＢ  Ｂｕｆｆｅｒ、及び１０×ＮＴＰ  Ｂｕｆｆｅｒの組成は下記の通りである。
【表１０】
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上記の組成で、上記（２）で得た転写用鋳型ＤＮＡを用い、反応時間は１時間、反応温度は４２℃で転写反応を行った。
反応後、Ｍ１  ＲＮＡを８０ｐｍｏｌ，Ｃ５タンパク質を８０ｐｍｏｌ加え、３７℃で１時間保温しプロセシング反応を行った。
転写とプロセシングが正しく行われていることが確認できたら反応液にＥＤＴＡ（０．５Ｍ）を反応液の１／２０量加え１５０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心した後、エタノール沈殿した。
３−３．Ｇｅｌ  Ｅｌｕｔｉｏｎ法によるＲＮＡの精製
プロセシング後のＲＮＡ乾燥物を５０μｌのＵｒｅａＬＳに溶解し、１５０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心した後、上清を１０％ポリアクリルアミドゲル（７Ｍ  Ｕｒｅａ）で電気泳動した。ゲルから切り出した後、ＤＥＰＣ処理Ｇｅｌ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを４５０μｌ加え、一晩振とう後エタノール沈殿し、乾燥させｄＨ２Ｏ  ５０μｌに溶解し、ｔＲＮＡ溶液を調製した。
なお、ＤＥＰＣ処理Ｇｅｌ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒは以下のように調製した。
【表１１】
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１００ｍｌで上記の組成になるように調製し、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）を１００μｌ加えた。一晩攪拌後、オートクレーブにかけジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）を分解、除去した。
結果を以下の表に示す。
【表１２】
0004654449.tif 000016
３−４．改変型ｔＲＮＡを用いてチロシン受容能の測定とそのアンチコドンに対応するアミノ酸受容能の測定
（１）チロシン受容能の測定
各ｔＲＮＡＴｙｒのチロシン受容能を測定するために１４Ｃチロシンを使ってアミノアシル化反応を行った。下記の反応組成で酵素を除いた状態で反応液を３０℃で５ｍｉｎ程度保温した後、酵素を加え３０℃でインキュベートし、０、５、１０、１５ｍｉｎの各時間で５％  ＴＣＡを湿らせておいた濾紙にスポットし、５％  ＴＣＡに浸した。各時間の反応液をスポットし終わったら、５％  ＴＣＡをいったん捨て、新たな５％  ＴＣＡをビーカーに加え１０ｍｉｎ間振とうした。これを２回繰り返したら１００％エタノールを加えて軽く振とうし、電熱灯下で乾燥させた。その後、シンチレーターに浸し、液体シンチレーションカウンターでカウントを測定した。シンチレーターは、Ｄｏｔｉｔｅ  ＤＰＯ  ４ｇ、Ｄｏｔｉｔｅ  ＰＯＰＯＰ  ０．１ｇをトルエンで比に調製した。
放射能の値とチロシンの比活性値からｐｍｏｌ／ＯＤを算出することにより、ＷＴのｔＲＮＡＴｙｒとｔＲＮＡＴｙｒ改変体とのチロシン取り込みを比較した。
【表１３】
0004654449.tif 000017
ポジティブコントロールとして改変型ｔＲＮＡの変わりにＷＴｔＲＮＡｔｙｒを０．０９Ａ２６０ｕｎｉｔ用いた。
結果を図５−１から図５−５に示した。（改変型ｔＲＮＡについては、アンチコドンにより示されている。）
（２）アンチコドンに対応するアミノ酸受容能の測定
アミノ酸受容能の測定
改変したｔＲＮＡＴｙｒのアンチコドンに対応するアミノ酸受容活性を測定するためにそれぞれの１４Ｃアミノ酸を使ってアミノアシル化反応を行った。下記の反応組成で酵素を除いた状態で反応液を３０℃で５ｍｉｎ程度保温した後、酵素を加え３０℃でインキュベートし、０、５、１０、１５ｍｉｎの各時間で５％  ＴＣＡを湿らせておいた濾紙にスポットし、５％  ＴＣＡに浸した。各時間の反応液をスポットし終わったら、５％  ＴＣＡをいったん捨て、新たな５％  ＴＣＡをビーカーに加え１０ｍｉｎ間振とうした。これを２回繰り返したら１００％エタノールを加えて軽く振とうし、電熱灯下で乾燥させた。その後、シンチレーターに浸し、液体シンチレーションカウンターでカウントを測定し、全種類ｔＲＮＡの混合物（ｔＲＮＡＭｉｘ）を用いたそのアミノ酸の取り込みと比較した。シンチレーターは、Ｄｏｔｉｔｅ  ＤＰＯ  ４ｇ、Ｄｏｔｉｔｅ  ＰＯＰＯＰ  ０．１ｇをトルエンで１Ｌに調製した。
【表１４】
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ポジティブコントロールとしてｔＲＮＡ改変体の代わりにｔＲＮＡＭｉｘを０．６Ａ２６０ｕｎｉｔ、トリプトファンの場合はｔＲＮＡＭｉｘを３．０Ａ２６０ｕｎｉｔ用いた。
なお、５×ＡＡＭは以下の通りである。
【表１５】
0004654449.tif 000019
結果を図６−１から図６−８に示した。
更に、図５及び図６をあわせて、図７の上段にチロシン受容能の測定結果、下段にアミノ酸受容能の測定結果をしめした。
ＴｙｒＲＳはアンチコドンの１文字目のＧを強く認識することから、チロシン受容能の高い改変体はアンチコドンの１文字目がＧであるものが多い。また、アンチコドンＵＧＵ、ＵＡＡで受容能が高かった理由としては、ｔＲＮＡＴｙｒのアンチコドン部位の両隣の塩基、すなわち３５番目と３９番目の塩基に注目すると、３５番目から３７番目の塩基配列はＵＧＵ、３７番目から３９番目の塩基配列はＵＡＡであり、ＴｙｒＲＳがアンチコドン部位だけでなく、その両隣を含めた３塩基を認識して、チロシンが受容されることにより、受容能が高くなることが考えられた。
今回得られた結果からアンチコドンが、ＵＡＡ、ＧＣＧ、ＧＣＵ、ＵＧＵのｔＲＮＡＴｙｒ改変体については、チロシン受容能も高く、本来対応するアミノ酸であるロイシン、アルギニン、セリン、スレオニンは全く受容しないことから、有用な非天然アミノ酸運搬用ｔＲＮＡとして利用できる可能性がある。これらの改変型ｔＲＮＡＴｙｒを非天然アミノ酸用に遺伝暗号表に割り当てても、まだロイシン、アルギニン、セリン、スレオニンのコドンはまだ余っていることから、数種類の非天然アミノ酸を遺伝暗号表に割り当てることも可能になるだろう。
［実施例４］
改変したアンチコドンを有するｔＲＮＡをアミノアシル化する酵素の調製
（１）Ｄ３２１Ｒ  ＴｙｒＲＳ、Ｄ３２１Ｎ  ＴｙｒＲＳ、Ｄ３２１Ｑ  ＴｙｒＲＳ、Ｄ３２１Ｋ  ＴｙｒＲＳ、及びＤ３２１Ｅ  ＴｙｒＲＳ変異体発現用ベクターの作製
（１−１）ＰＣＲ法を用いた部位特異的変異の導入による酵母チロシル−ｔＲＮＡ合成酵素変異体遺伝子の作製
ｐＥＴ−Ｆｕｌｌ−ｙＹＲＳｔａｇをｔｅｍｐｌｅｔｅとし、以下のような変異体用プライマーを合成し、ｐＥＴ−ｔｏ−ｐＱＥ−５’（ＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３５））と−プライマーの組み合わせ、ｐＥＴ−ｔｏ−ｐＱＥ−３’（ＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３６））と＋プライマーの組み合わせでＰＣＲ反応を行いアガロースゲルとガラスパウダーにより精製を行った。ただし３’側プライマーと＋プライマーの組み合わせにより生じたＰＣＲ産物は３％  ＧＴＧアガロースゲルを使い、目的のバンドを切り出し−８０℃でゲルを凍結し濾過エッペンドルフチューブによりＤＮＡ断片を回収した。−側のＰＣＲ産物と＋側のＰＣＲ産物を合わせエタノール沈殿を行い、以下のようにＫｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ反応液を調製した後９５℃で５分保温し、その後氷中に移し急冷（氷中５分）した。この反応溶液にＫｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔを６ｕｎｉｔｓ加え３７℃で１．５時間反応した。さらにこのＫｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ反応液の一部を用いて以下のようにＦｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ＰＣＲ反応液を調製しＦｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ産物をアガロースゲルにより精製を行い、部位特異的変異を導入された酵母ＴｙｒＲＳ変異体遺伝子を得た。
用いたプライマーは次のとおりである。
Ｄ３２１Ｒ用−プライマー／２７ｍｅｒ：ＡＣＣＡＡＴＴＴＴＴＡＧＧＣＧＡＧＧＴＧＧＧＧＡＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３７）
Ｄ３２１Ｒ用＋プライマー／２７ｍｅｒ：ＴＴＧＴＣＣＣＣＡＣＣＴＣＧＣＣＴＡＡＡＡＡＴＴＧＧＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３８）
Ｄ３２１Ｎ・Ｄ３２１Ｑ用−プライマー／２７ｍｅｒ：ＡＡＣＡＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＴＡＧＧＴＧＧＧＧＡＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３９）
Ｄ３２１Ｎ・Ｄ３２１Ｑ用＋プライマー／２７ｍｅｒ：ＴＴＧＴＣＣＣＣＡＣＣＴＣＡＧＡＡＡＡＴＴＧＧＴＧＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４０）
Ｄ３２１Ｋ・Ｄ３２１Ｅ用−プライマー／２７ｍｅｒ：ＡＣＣＡＡＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＡＧＧＴＧＧＧＧＡＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４１）
Ｄ３２１Ｋ・Ｄ３２１Ｅ用＋プライマー／２７ｍｅｒ：ＴＴＧＴＣＣＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＡＡＡＡＡＴＴＧＧＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４２）
【表１６】
0004654449.tif 000020
【表１７】
0004654449.tif 000021
【表１８】
0004654449.tif 000022
（２）ベクターの構築
前述の方法に従い、ＰＣＲ法により部位特異的変異を導入された酵母ＴｙｒＲＳ変異体遺伝子をｐＵＣ１９に導入し、ＤＮＡシークエンサーで配列を確認した。配列の明らかにされた各酵素変異体遺伝子を発現ベクターのｐＥＴ２１−ａ（＋）に乗せ換えｐＥＴＤ３２１変異体ベクターを構築した。
（３）Ｄ３２１変異体の発現と精製
６ｘＨｉｓ−Ｔａｇを融合して発現させた酵母ＴｙｒＲＳ変異体を、アフィニティークロマトグラフィーとイオン交換カラムクロマトグラフィーにより以下のような操作で精製を行った。
集菌した菌体を１５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡに懸濁し、懸濁液を超音波破砕機を用いて２０秒超音波処理を行い、４０秒静置し冷却するという操作を３０回繰り返し菌体を破砕した。破砕液をＡｖａｎｔｉＴＭ  Ｊ−２５  Ｉ（ＢＥＣＫＭＡＮ製）で３０，０００ｘｇで３０分間遠心分離してＳ３０（上清）を得た。あらかじめｂｕｆｆｅｒＡで平衡化しておいたＮｉ−ＮＴＡ樹脂（１ｍｌ）に、得られたＳ３０をロードし２８０ｎｍの吸収がおちつくまでｂｕｆｆｅｒＡで洗浄した。以下のようなＥｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを加え２８０ｎｍの吸収がみられるサンプルを回収した。さらなる精製として、回収したサンプルをあらかじめ０．０５Ｍ  ＫＣｌで平衡化した陽イオン交換カラムＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  １ｍｌ（アマシャムファルマシア製）にロードした。０．０５Ｍから１Ｍ  ＫＣｌまでの濃度勾配、流速１ｍｌ／分で目的タンパク質の分離を行った。溶出液は０．５分（０．５ｍｌ）ごとに分取した。分画したサンプルを１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析し、目的タンパク質を含むフラクションを回収した。アミコンウルトラを用いて約１ｍｌに濃縮したサンプルを透析チューブに入れ、透析外液をｓｔｏｃｋ  ｂｕｆｆｅｒにして透析した。タンパク質濃度は２２８．５−２３４．５ｎｍで測定する方法により算出した。なお、ｂｕｆｆｅｒＡ及びＢ、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、並びにｓｔｏｃｋ  ｂｕｆｆｅｒの組成を以下に示す。
【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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（４）アミノアシル化測定
酵母ＴｙｒＲＳ変異体を用いたｔＲＮＡＴｙｒ改変体のチロシン受容能の測定
酵母ｔＲＮＡＴｙｒのアンチコドンを各種アミノ酸をコードしているコドンに対応するように改変させたｔＲＮＡＴｙｒ改変体を、以下の組成で３７℃でアミノアシル化させた。
【表２３】
0004654449.tif 000027
計測は１０分後に行い９μｌをサンプリングした。また、ポジティブコントロールとして、大腸菌で発現させて得たｔＲＮＡＴｙｒとアンバーサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒを各０．０１Ａ２６０ｕｎｉｔ用いたもの、ネガティブコントロールとしてｔＲＮＡを入れないものを用意し実験を行った。
【表２４】
0004654449.tif 000028
得られた結果を図にまとめると図８から図１１に示される通りとなる。太い斜め線（左上から右下方向の斜線）をアミノアシル化能力が高い、細い斜め線（左上から右下方向根の斜線）をアミノアシル化能力が次に高い、薄く太い十文字線をアミノアシル化能力がその次に高い、点線がアミノアシル化能力が低い、塗りつぶされている部分がアミノアシル化能力一番低い（ほとんどない）で示した。結果として、Ｄ３２１ＲはコドンとしてＣＧＧ，ＧＡＧ，ＧＧＧを認識するｔＲＮＡ以外の幅広いｔＲＮＡを基質として認識し、アミノ酸を受容させることが可能であることがわかった。
［実施例５］
セリン用コドンへのチロシンの導入
各実施例に記載の方法にて調製した全種類ｔＲＮＡを除いた大腸菌Ｓ３０抽出液（Ｓ３０／−ｔＲＮＡＭｉｘ）、全種類ｔＲＮＡの混合物（ｔＲＮＡＭｉｘ）からｔＲＮＡＳｅｒ（ＡＧＹ）を除いたｔＲＮＡ混合物（ｔＲＮＡＭｉｘ−Ｓｅｒ（ＡＧＹ））、アンチコドンをＧＣＵに改変した改変型ｔＲＮＡＴｙｒ及びＤ３２１Ｒ  ＴｙｒＲＳ変異体を利用して、ＧＦＰｕｖ遺伝子中ＡＧＵコドンにチロシンの導入を行った。なお、セリンに割り当てられているＡＧＵ及びＡＧＣの両者、つまりＡＧＹが、アンチコドンがＧＣＵの改変型ｔＲＮＡＴｙｒ１種類により読まれる。ただし、ＧＦＰｕｖ遺伝子には、ＡＧＣのコドンは存在しない。
反応条件は、ヘペス緩衝液（Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）５５ｍＭ）、酢酸マグネシウム（１０．７ｍＭ）、酢酸アンモニウム（２７．５ｍＭ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ  １．７ｍＭ）、ヌクレオチド三リン酸（ＡＴＰ  １．２５ｍＭ，ＧＴＰ  ０．８３ｍＭ，ＵＴＰ  ０．８３ｍＭ，ＣＴＰ  ０．８３ｍＭ）、クレアチンリン酸（８０ｍＭ）、クレアチンキナーゼ（０．２１ｍｇ／ｍｌ）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（本発明者らが単離  ０．１ｍｇ／ｍｌ）、全種類ｔＲＮＡ混合物からｔＲＮＡＳｅｒ（ＡＧＹ）を除いたｔＲＮＡ混合物（ｔＲＮＡＭｉｘ−Ｓｅｒ（ＡＧＹ））（本発明者らが実施例２に準じて単離  ３．４Ａ２６０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、標準型アミノ酸２０種（ｅａｃｈ  １ｍＭ）、ホリン酸（６８μＭ）、酢酸カリウム（２１０ｍＭ）、ポリエチレングリコールｗｔ．８０００（４％）、ＴｙｒＲＳ変異体（Ｄ３２１Ｒ  ＴｙｒＲＳ）（本発明者らが作製  ０．０２ｍｇ／ｍｌ）、改変型ｔＲＮＡＴｙｒ（本発明者らが実施例３に準じて作製 ０．２Ａ２６０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、鋳型ＤＮＡ（２０μｇ／ｍｌ）、全種類ｔＲＮＡを除いた大腸菌Ｓ３０抽出液（Ｓ３０／−ｔＲＮＡ）及び脱イオン水を、括弧内に記載された終濃度となるように試験管内に入れて混合した後、３０℃で１時間インキュベートした。
反応後ゲル電気泳動を行い、蛍光イメージャーにて解析した。
結果を図１２に示す。図１２より、全種類ｔＲＮＡを除いた大腸菌Ｓ３０抽出液（Ｓ３０／−ｔｔＲＮＡＭｉｘ）に全種類ｔＲＮＡの混合物（ｔＲＮＡＭｉｘ）を加えたものは合成物が確認でき（左から２レーン目）、ｔＲＮＡＳｅｒ（ＡＧＹ）を除いたｔＲＮＡ混合物（ｔＲＮＡＭｉｘ−Ｓｅｒ（ＡＧＹ））を加えた場合は合成が確認できなかった（左から３レーン目）。また、Ｓ３０／−ｔＲＮＡＭｉｘ、ｔＲＮＡＭｉｘ−Ｓｅｒ（ＡＧＹ）、改変型ｔＲＮＡＴｙｒ、及びＴｙｒＲＳ変異体（Ｄ３２１Ｒ）全てを加えた場合、合成が確認できた（左から４レーン目）。このことから、セリン用コドンＡＧＵコドンをチロシンに割り当てることが可能となった。また、我々はチロシンアナログを導入するための変異体の作製にも成功しており、これと組み合わせることで、ＡＧＵコドンに非天然アミノ酸（チロシンアナログ等）を導入できる。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明により、変異アミノ酸を導入しようとするタンパク質をコードする遺伝子を変異させる必要なく、確実にコドン特異的に変異アミノ酸を入れた非天然アミノ酸蛋白質を効率的に製造できるようになった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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