(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵内の鳥類胚の性別、発生段階および／または生存能の非破壊的決定のための方法であって、
（ａ）卵の培養から孵化までの間の卵内の糖および／またはアミノ酸、その前躯体および代謝物から選択される第１の発生マーカー化合物を少なくとも検出し；
（ｂ）少なくとも前記第１の検出された発生マーカー化合物の量を測定し、および
（ｃ）雄および雌、前記胚の発生段階、ならびに／または、生きている胚および死亡した胚もしくは発達していない胚について確立したベースラインと前記量とを比較して、前記胚が生存能力があるかどうかを、雄および／もしくは雌を、ならびに／または前記胚の発生段階を決定すること
を有する、方法。
【請求項２】
少なくとも前記第１の発生マーカー化合物が、卵の胚液中で検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記胚液が、尿膜腔液である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも第２のマーカーが工程（ａ）で検出され、少なくとも前記第１および前記第２のマーカーが分析され、発生マーカー比を確立するためにベースライン、および互いと比較される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記発生マーカーが、グルコース、コリンおよび／またはバリンから選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記鳥類の種が、ガッルス・ガッルス・ドメスティクス（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）であり、この際第１またはさらなる発生マーカーが、雌胚に関して３０μＭ／ｍｌ〜７０μＭ／ｍｌの範囲内、雄胚に関して１μＭ／ｍｌ〜３０μＭ／ｍｌの範囲内の絶対量のグルコースである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第１のまたはさらなる発生マーカーが、雌胚に関して１１０μＭ／ｍｌ〜１３０μＭ／ｍｌの範囲内、雄胚に関して９０μＭ／ｍｌから１１０μＭ／ｍｌ未満の絶対量のコリンである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
第１またはさらなる発生マーカーが、雌胚に関して１１０μＭ／ｍｌ〜１３０μＭ／ｍｌの範囲内、雄胚に関して９０μＭ／ｍｌから１１０μＭ／ｍｌ未満の絶対量のバリンである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも第１および第２の発生マーカーが検出および分析され、この際前記絶対量および少なくとも第１のマーカーの第２のマーカーに対する比を用いて性別および／または生存能が決定される、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記胚液を侵襲的にまたは非侵襲的に分析する工程を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記分析が、核共鳴法を含む磁気共鳴画像形成法によって；赤外もしくはラマン分光法を含むスペクトル共鳴法によって；ならびに／または、適当な検出器が連結されたＧＣもしくはＨＰＬＣ、蛍光分光法および／もしくは酵素結合免疫吸着測定法のような分析法によって実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
卵内の胚が、生存能力のある雄であるか、または生存能力のある雌であるかを決定し、および、多数の生存能力のある雄卵を多数の生存能力のある雌卵から分離して、大部分が雄または大部分が雌の選別卵を形成することをさらに有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記生存能力のある雌または雄の選別卵を培養および孵化処理し、大部分が雌または雄のヒヨコ集団を作ることをさらに有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記胚の発生段階および孵化が起こるであろう時間を決定し、ならびに卵を同様のまたは等しい発生段階の多数の卵に分離することをさらに有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記胚の生存能を決定し、および卵を多数の生存能力のある卵と生存能力のない卵に分離することをさらに有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記生存能力のある選別卵に、予測される孵化日に沿って培養および孵化処理し、大部分が同じ発生段階のヒヨコ集団を形成することをさらに有する、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
生存胚を含有するもの、雄もしくは雌、および／または特定の発生段階として識別された各々の卵にウイルスまたはウイルス様物質を注入することをさらに有する、請求項１２または１５に記載の方法。
【請求項１８】
得られたワクチンを培養した卵から単離することをさらに有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の卵内の鳥類胚の発生段階の決定のための方法であって、
（ａ）卵内のアミノ酸、その前駆体および代謝物から選択される少なくとも第１の発生マーカー化合物を検出し；
（ｂ）少なくとも前記第１の検出した発生マーカー化合物の量を測定し、および
（ｃ）産卵から孵化までの発生段階について確立したベースラインと前記量を比較して、前記胚の発生段階および孵化が起こるであろう時間を決定すること
を有する、方法。
【請求項２０】
少なくとも第２のマーカーが、工程（ａ）で検出され、この際少なくとも前記第１および第２のマーカーが分析され、発生マーカー比を確立するために前記ベースライン、および互いと比較される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記鳥類の種が、ガッルス・ガッルス・ドメスティクス（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）であり、この際前記発生マーカーが、トリメチルグリシン；アスパラギン酸塩および／もしくはアスパラギン；グルタミン酸塩および／もしくはグルタミン、ならびに／またはプロリンから選択される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも第１および第２の発生マーカーが検出および分析され、この際前記絶対量および少なくとも前記第１のマーカーの第２のマーカーに対する比が、前記発生段階を決定するために用いられる、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記胚液を侵襲的にまたは非侵襲的に分析する工程を有する、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記分析が、核共鳴法を含む磁気共鳴画像形成法；赤外もしくはラマン分光法を含むスペクトル共鳴法、ならびに／または適当な検出器が連結されたＧＣもしくはＨＰＬＣ、蛍光分光法および／もしくは酵素結合免疫吸着測定法のような分析法によって実施される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
実質的に同じ発生段階の卵を選択することをさらに有する、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記選別卵を発生段階に沿って培養および孵化処理し、実質的に同じ年齢のヒヨコ集団を形成することをさらに有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
卵内の胚が生存能力があるかどうかを決定し、孵化および／またはワクチン注入工程の前に生存能力のない卵を分離することをさらに有する、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
胚が雄または雌であるかを決定し、多数の雄卵を多数の雌卵から分離して、大部分が雄または大部分が雌の選別卵を形成することをさらに有する、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記胚の発生段階に沿って、生存胚を含有するものおよび雄または雌として識別された各々の卵にウイルスまたはウイルス様物質を注入することをさらに有する、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
得られたワクチンを培養した卵から単離することをさらに有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
動物および／もしくはヒト食料製造のために、化粧品化合物、医薬化合物および／もしくは栄養化合物の製造および／もしくは単離のために、発酵によるメタン生成のために、ならびに／または高品質の肥料生産のために、得られた多数の卵を使用することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵内の、より具体的には尿膜腔液中の発生マーカーの存在を決定することによる、卵内の鳥類胚の性別、生存能および／または発生段階の決定のための方法に関する。この方法はさらに、鳥類胚の生存能の決定、および雄卵および雌卵の選別のための方法、ならびにこれらの選択された卵を用いるワクチンおよび／またはヒヨコの産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
大部分の鳥類の種、特に商業的に飼育された鳥類の種、例えば家畜化されたニワトリ（ガッルス・ガッルス・ドメスティクス（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ））、アヒル、ガチョウおよびシチメンチョウの受精卵は、孵化するとほぼ均しい分布の雄ヒヨコと雌ヒヨコをもたらす傾向がある。孵化場の管理において、トリを様々な特徴、特に性別に基づいて分離することが望ましいであろう。例として、雄および雌のトリに異なるワクチンを接種すること、または飼料効率を得る、処理の均一性を改善する、ならびに、雄および雌のトリの成長速度および栄養要求量に違いがある生産コストを低下させるために集団を分けることが望ましいであろう。なおさらに、卵の商業的生産にとって、雄ヒヨコの孵化および飼育は、毎年数十億もの雄ヒヨコの選択除去につながり、非常に望ましくない。
【０００３】
さらに、受精していない、または培養期間の初めに生存能力のある胚を含まない卵の割合があり、それは孵化場で孵卵器の能力を大いに低下させる。これまで、生存能力のある、すなわち生きている胚の決定は、一般に、例として欧州特許第２３６９３３６号および米国特許第７９５０３４９号に開示されるような、「キャンドリング」として公知の技法を用いて実施された。
【０００４】
ここにおいて、卵は、少なくとも一部分において卵を通過することのできる波長の光を発する光源を用いて検査される。
【０００５】
これにより、卵が生存胚を含有しているかどうかを識別することができるのであるが、信頼に足る結果を得るためには、少なくとも１１日目までか、またはその発生の後期まで進んでいる卵を必要とするであろう。さらに、この技法は生存卵と非生存卵とを区別することができるが、孵化していないトリの性別およびその他の特徴を確実に決定することを可能にするものではない。
【０００６】
その結果、現在のヒヨコ農場の孵卵収容力は、早期の性別選択が利用できる、主に雌のヒヨコ胚だけを選択することが可能になる場合に必要な収容力の少なくとも２倍を要求される。
【０００７】
したがって、必要とされるエネルギーおよびその他の資源の量を減らすことによって、それは環境にとって大いに価値があり、しかし同時に新しく孵化したトリのストレスの低減と同じく、不要な雄ヒヨコの選択除去の排除にとって大いに価値があり、培養期よりも前に鳥類胚の性別を決定することのできる初期段階法が利用できるなら、孵化場の収容力を大いに増加させることもできる。
【０００８】
Ｙ．Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、Ａｐｐｌ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．（２００７）、３２，２５７−２６８において、９００ＭＨｚの超高電界強度でのＮＭＲ分光法による、９日目の鶏卵の尿膜腔液中の代謝物の分析を開示する。
【０００９】
Ｇｕ  Ｄ．−Ｃ．ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．７，２３−２５は、ＨＰＬＣによる卵をかえす培養中の尿膜腔液および羊水中の遊離アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニンおよびロイシン濃度の分析を開示する。しかし、開示される方法は、特定されていない産卵日の卵の比較のためのベースラインの生成を超えるものではなく、単に４つのアミノ酸のベースラインを確立する。さらに、開示される検査方法は、生存胚をもつ卵が検査後に幼体へと成熟できず、またはワクチン産生のような、その他の目的に使用されないという点で破壊的である。
【００１０】
米国特許出願公開第２００３／００９６３１９号および国際公開第２００６１２４４５６号は、胚液、例えば鳥類の卵由来の尿膜腔液または血液などの試料中のエストロゲン様ステロイド化合物の存在を決定することにより、卵の中の鳥類胚の性別を決定する方法を開示する。これは卵を破壊せずに実現可能でありうるが、エストロゲン様ステロイドの量は最小限度であり、検査は生殖腺の発生の後、ゆえに胚の発生の比較的遅い時点でのみ成功する。さらに、国際公開第２００６１２４４５６号の方法はまた、おそらく各々の種およびそのサブグループに対する蛍光マーカーの修飾、またはそのような種の遺伝子組み換えも必要とするだろう。
【００１１】
Ｏｈｔａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．８０，Ｎｒ．１０，１４３０−１３４６は、アミノ酸の卵内投与がブロイラー種鶏の卵由来の胚のアミノ酸濃度およびその他の卵の内容物にどのように作用するのかを知るために、アミノ酸の卵内投与の影響を開示する。しかし、これは鳥類の卵の性別、生存能および／または発生段階を決定するための方法ではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本発明は、（ａ）卵内の、糖および／またはアミノ酸、その前躯体および代謝物から選択される少なくとも第１の発生マーカー化合物を、卵の培養の始まりから孵化までの期間に検出すること；（ｂ）少なくとも第１の検出した発生マーカー化合物の量を測定すること、ならびに（ｃ）雄および雌、胚の発生段階、ならびに／または、生きている胚および死亡したかもしくは発達していない胚について確立したベースラインと前記量とを比較して、その胚が生存能力があるかどうかを、雄および／もしくは雌を、ならびに／または胚の発生段階を決定することを有する、卵内の鳥類胚の性別、発生段階および／または生存能の決定のための方法に関する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明の方法はまた、（ａ）卵内の、糖および／またはアミノ酸、その前躯体および代謝物から選択される少なくとも第１の発生マーカー化合物を、卵の培養の始まりから孵化までの期間に検出すること；（ｂ）少なくとも第１の検出した発生マーカー化合物の量を測定すること、および（ｃ）雄および雌、ならびに／または、生きている胚および死亡したかもしくは発達していない胚について確立したベースラインと前記量とを比較して、その胚が生存能力があるかどうか、雄および／または雌を決定することを有する、卵内の鳥類胚の性別および／または生存能の決定のための方法に関する。
【００１４】
なおさらなる態様では、本発明は、（ａ）卵内のアミノ酸、その前駆体および代謝物から選択される少なくとも第１の発生マーカー化合物を検出すること；（ｂ）少なくとも第１の検出した発生マーカー化合物の量を測定すること、および（ｃ）産卵から孵化までの発生段階について確立したベースラインと前記量とを比較して、胚の発生段階および孵化が起こる可能性のある時までの時間を決定することを有する、先の請求項のいずれか一つに記載の卵内の鳥類胚の発生段階の決定のための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実験室セットの鶏卵から１Ｈ  ＮＭＲで検出された全ての代謝物に基づいて試料を分類するための、１Ｈ  ＮＭＲデータに対する部分最小二乗モデリング、教師なし多変量データ解析を示す図である。Ｆは雌を表し、Ｍは雄を表す。
【図２】図２は、商業的なヒヨコ孵化場からの、より大きい検査セットの１Ｈ  ＮＭＲで検出された全ての代謝物に基づいて試料を分類するための、１Ｈ  ＮＭＲデータに対する部分最小二乗モデリング、教師なし多変量データ解析を示す図である。Ｆは雌を表し、Ｍは雄を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明を、本発明の好ましい実施形態が示される、以下の添付の図面を参照してより詳細に説明する。しかし、本発明は、多くの異なる形態にて具体化されてよく、本明細書に示す実施形態に限定されると解釈されるべきではない；むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全であって、当業者に本発明の範囲を完全に伝えることになるように提供される。他に規定されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本明細書中の本発明の説明において使用される用語法は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明を限定するものではない。
【００１７】
用語「鳥類（ａｖｉａｎ）」および「トリ（ｂｉｒｄ）」は、本明細書において、任意の鳥類の種の雄または雌を含むが、主に卵または食肉のために商業的に飼養される家禽を包含することを意図する。したがって、用語「トリ（ｂｉｒｄ）」および「鳥類（ａｖｉａｎ）」は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラおよびキジを包含することを特に意図する。
【００１８】
用語「培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）」は、本明細書において、トリがその卵をかえすプロセスをさし、雌鶏の卵管を離れた後の卵の内部での胚の発生をさす。培養期間とは、本明細書において、特定の卵が、トリの発生が止まらないという条件で、あらゆる取扱いまたは例えば孵卵器から孵化場のユニットまでの移動を含む、孵化、すなわちトリの出現までの抱卵をまねた条件におかれている間の連続した時間をさす。
【００１９】
用語「卵内の（ｉｎ  ｏｖｏ）」とは、本明細書において、孵化の前に卵の中に含まれるトリ胚をさす。本発明は、限定されるものではないが、（家畜化された）ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、およびキジの卵を含む、任意の種類のトリ卵で実践することができる。
【００２０】
用語「注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）」および「注入すること（ｉｎｊｅｃｔｉｎｇ）」は、本明細書において、装置（一般に細長い装置）を卵または胚の中に挿入する方法を包含し、物質を卵または胚の中に送達または排出する方法、物質（すなわち試料）を卵または胚から取り出す方法、および／または検出装置を卵または胚の中に挿入する方法が含まれる。
【００２１】
好ましくは、本発明に従う決定は、非破壊的な方法として実施され、すなわち、胚が生存能力をもつという条件で、このように検査した鳥類胚を成長させること、そのように望む場合または卵内のワクチン産生などのさらなる工程に付すことができる。
【００２２】
用語「尿膜腔液（ａｌｌａｎｔｏｉｃ  ｆｌｕｉｄ）」は、本明細書において、その他の卵材料の存在の有無にかかわらず尿膜腔液を包含する。例えば、尿膜腔液という用語には、血液と尿膜腔液の混合物が含まれてよい。本発明の実施形態は、尿膜腔液から、または卵の上面に近い領域から材料を抽出することに限定されない。本明細書に記載される尿膜腔液からの材料の除去は、本発明の可能性のある実施形態の単なる一例として提供される。限定されるものではないが、羊膜、卵黄、卵殻、卵白、組織、膜および／または血液を含む様々な材料は、卵から抽出され、下に記載される１以上の発生マーカーを識別するために検定されるであろう。材料は、実質的にあらゆる配向をもつ卵から抽出することができる。
【００２３】
用語「所定の場所」は、本明細書において、卵の内部の固定された位置または深さを示す。例えば、装置は、卵内の固定された深さおよび／または固定された位置まで、卵の中に注入されてよい。別の実施形態では、注入は、卵から得られた情報、例えば卵の内部の胚の位置または胚下腔に関する情報に基づいて実行することができる。
【００２４】
用語「量を比較する」には、有利には、測定した代謝物の一変量もしくは好ましくは多変量分析、および鳥類胚と特定の集団との関連の決定が含まれてよい。このステップは、試料材料中の分析物、すなわち代謝物の存在を、質量スペクトル、ＮＭＲ、または他の測定した適当なデータの多変量統計解析によって決定することを含んでよい。多変量統計解析プログラムは、好ましくは、主成分分析プログラム、および／または部分最小二乗回帰分析プログラムを含む。よって、本発明は、多変量統計解析プログラム、ならびにその決定のためのマイクロプロセッサで実行されるプロセスを含む、卵内の鳥類胚の性別、発生段階および／または生存能の決定のための方法、装置およびシステムにも関する。
【００２５】
本発明の実施形態での方法および装置は、その培養期間とも呼ばれる胚発生期の間のいつでも、卵の１以上の特徴を識別するために利用されてよい。本発明の実施形態は、胚発生期の間の特定の日に限定されない。
【００２６】
本方法において、発生マーカーは、好ましくは、侵襲的にまたは非侵襲的に分析されてよい。
【００２７】
分析が侵襲的に実施される場合、これには、一般に、卵材料の試料の抽出が含まれる。好ましくは、試料は、胚を傷つける可能性が最も低いため、胚液、好ましくは尿膜腔液から採取される。尿膜腔液は、一般に鳥類胚の窒素性代謝物の排泄媒体である。Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ，Ｖ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＨＬ（１９５１）．“Ａ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｓｔａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋ  ｅｍｂｒｙｏ”．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ８８（１）：４９−９２に開示されるように、尿膜腔液は培養の３日目前後に生じ始める。
【００２８】
本明細書において、尿膜は、培養の６５時間後に、短いく壁の厚いポケットとして識別可能であることが示され；まだ小胞ではない。７２時間後、尿膜は、小胞であり、サイズは変化し；平均的に中脳のサイズであり、尿膜および尿膜腔液が３日目に存在していることを示している。
【００２９】
それは培養の約１３日に最大体積に達し、その後、培養が続くにつれて湿分の損失および液の再吸収によって体積が減少するが、培養の１８日目になってもまだ、かなりの体積で存在する。
【００３０】
尿膜腔液は、内卵殻膜および外卵殻膜ならびに漿尿膜によって卵殻から隔てられている。尿膜腔液は、孵化卵の全周を取り囲むが、尿膜腔液は一般に気室を覆う膜の直下の卵の上部に集まる。
【００３１】
卵の上部での尿膜腔液の蓄積は、重力ならびに高密度の胚および卵黄嚢による置き換えに起因する。卵が直立している間に卵の上部を通して尿膜腔液を正確に試料採取しようとすることは、卵から卵までの空間の変動性のために困難でありうる。重力を用いて尿膜腔液を局所部位にためることができる。卵をその縦軸で回転させると、尿膜腔液は卵殻の直下の卵の上側にたまる。卵をその縦軸に置くことにより、尿膜腔液を試料の抽出に役立つようにする。
【００３２】
卵から材料、例えば尿膜腔液などの抽出は、様々な方法で実施されてよく、それには、卵殻を貫通し、サンプリングカニューレを膜を通して挿入することが含まれる。次に、試料採取される流体の試料を回収してよく、その間、膜および／または殻は適当な密封剤で能動的に密封するか、またはそれ自体に密封させる。
【００３３】
卵の貫通および卵材料の侵襲的試料採取に適当な方法および装置は、例として、米国特許出願公開第２００７０１３７５７７号、国際公開第００／２２９２１号または国際公開第９９／３４６６７号に開示される。このように採取された試料は、次に、好ましくは、発生マーカーの検出、ならびに存在する発生マーカーの相対量および／または絶対量の分析を可能にする適当なプロトコールに付される。
【００３４】
試料は、１または複数の発生マーカーを検出し、定量化するために適当な任意の方法によって分析することができる。好ましくは、分析は、核共鳴法を含む磁気共鳴画像形成法；赤外またはラマン分光法を含むスペクトル共鳴法、ならびに／または、ディップスティック法を使用するような、湿式法もしくは乾式法を含む、適当な検出器が連結されたＧＣまたはＨＰＬＣ、蛍光分光法および／もしくは酵素結合免疫吸着測定法によって実施される。侵襲的な方法では、試料を直接採取し、採取した流体を分析にかけることができるが、分析方法の効率、ならびに卵殻およびその中の膜が無孔のまま残るということにより、分析は非侵襲的に実施することが好ましい。
【００３５】
任意の適当な方法を用いてかかる非侵襲的分析を実施してよい。一般に、赤外またはラマン分光法を含む定量的スペクトル共鳴法が用いられてよく、好ましくは、卵内に存在する発生マーカーの存在ならびに絶対量および／または相対量の決定のための二次スペクトルを使用する。いくつかの公報、例えば米国特許出願公開第２０１１／１４４４７３号および米国特許第７９５０３４９号が、非侵襲的方法の使用を開示しているとはいえ、これらの公報は漠然と全体的な発光スペクトルを記載するにすぎない；これは、実際には胚の発生段階、生存能および／または性別を選択することを可能にするものではない。本発明の方法は、卵内の特定の成分の存在が決定されるという点で特にこの開示される方法とは異なり、これは、１以上の発生マーカー化合物の絶対量および相対量を選択的に求めることを許容する二次導関数スペクトルを使用することによって有利に行うことができる。
【００３６】
特に、示差的二次導関数フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法およびＦＴ−ラマン分光法、またはその組合せは、必要な正確さおよび反復性を達成するために有利に用いることができ、一方、核磁気共鳴法は、発生マーカーの性質を決定するため、およびシステムを較正するベースラインを確立するために適切に用いることができる。
【００３７】
本発明の方法は、胚の生存能、および／もしくは性別、ならびに／または好ましくは卵の培養の始まりから孵化までの発生段階を決定することを有利に可能にする。
【００３８】
好ましくは、決定は、培養が開始した後１〜１５日の期間、より好ましくは２〜１４日の期間、さらにより好ましくは３〜１３日の期間、いっそうより好ましくは４〜１２日の期間に実施され、例えば工程ａ）を好ましくは卵の培養が開始した後６〜１２日の期間で実施する。
【００３９】
これにより、生存能力がない、および／または所望の性別でない卵を孵化させることに関連するコストを回避することが可能になる。さらに、卵の実際の発生段階を決定することができる。家畜化されたニワトリよりも短いかまたは長い培養時間をもつ種に対して、適したように、その他の期間を適用することができる。
【００４０】
本発明に係る発生マーカーは、好ましくは糖、アミノ酸、ならびにそれらのそれぞれの代謝物および／または前躯体から選択される。
【００４１】
これらのうちで、特に重要な発生マーカーは、グルコース、コリンおよびバリンを含み、その各々が鳥類胚の性別の決定に統計学的に有意な影響を及ぼした。
【００４２】
特定の理論に縛られることを望むものではないが、コリンおよびトリメチルグリシン、そのアミノ酸誘導体は、胎児の発達中の神経系を支えるために特に使用されると思われる。コリンとトリメチルグリシン（ベタイン）の比は、雄胚と雌胚との間で強く異なり、一方、コリンの絶対量も雌胚の尿膜腔液中で高かったことが見出された。一般に、コリンおよびその代謝物は、３つの主な生理的目的：細胞膜に対する構造的一体性とシグナル伝達の役割、コリン作動性神経伝達（アセチルコリン合成）、および、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭｅ）合成経路に関与する、その代謝産物、トリメチルグリシン（ベタイン）を介するメチル基の主な供給源、のために必要とされる。一方、バリンおよびグルコースも雄胚と雌胚との間で著しく変化することが見出された。
【００４３】
鳥類の種がガッルス・ガッルス・ドメスティクス（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）である場合、好ましくは第１またはさらなる発生マーカーは、尿膜腔液中、雌胚に関して３０μＭ／ｍｌ〜７０μＭ／ｍｌの範囲内、雄胚に関して１μＭ／ｍｌ〜３０μＭ／ｍｌの範囲内の絶対量のグルコースである。
【００４４】
ガッルス・ガッルス・ドメスティクス（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）胚に対するさらなる第１のまたはさらなる好ましい発生マーカーは、尿膜腔液中、雌胚に関して１１０μＭ／ｍｌ〜１３０μＭ／ｍｌの範囲内、雄胚に関して９０μＭ／ｍｌから１１０μＭ／ｍｌ未満の絶対量のコリンである。
【００４５】
ガッルス・ガッルス・ドメスティクス（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）胚に対するなおさらなる第１のまたはさらなる発生マーカーは、好ましくは、尿膜腔液中、雌胚に関して１１０μＭ／ｍｌ〜１３０μＭ／ｍｌの範囲内、雄胚に関して９０μＭ／ｍｌから１１０μＭ／ｍｌ未満の絶対量のバリンである。
【００４６】
好ましくは、本発明の方法では、少なくとも第２のマーカーを工程（ａ）で検出し、この際少なくとも第１および第２のマーカーを分析し、発生マーカー比を確立するためにベースライン、および互いと比較される。
【００４７】
２または３のマーカーの分析を相互に関連付けることにより、生存能および性別の決定の選択性を有利にさらに改善することができる。したがって、好ましくは少なくとも第１および第２のおよび／またはさらなる発生マーカーを検出および分析し、この際絶対量ならびに少なくとも第１のマーカーと第２のマーカーおよび／またはさらなるマーカーとの比を用いて性別および／または生存能を決定する。
【００４８】
本発明の方法は、さらに有利には、卵内の胚が生存能力のある雄であるか、または生存能力のある雌であるかを決定すること、多数の生存能力のある雄卵を多数の生存能力のある雌卵から分離して、主に雄かまたは主に雌の卵選択を形成することを含む。
【００４９】
このように形成された生存能力のある雌または雄の卵選択は、有利に培養および孵化処理され主に雌または雄のヒヨコ集団を形成することができる。
【００５０】
本発明の方法は、さらに好ましくは、ウイルスまたはウイルス様物質を、生存胚を含有し雄または雌であると識別された各々の卵の中に注入することを含む、好ましくは、培養の後に得られたワクチンを孵化した卵から単離することを含む。
【００５１】
種ウイルスの注入後、生存胚を含有する卵は、好ましくは所定の期間、孵卵器に移される。この期間の終わりに、卵は、各々の卵由来材料、例えば羊水を抽出するワクチン収集ステーションに移される。
【００５２】
したがって、本発明の方法は、好ましくは、感染した卵内の胚を安楽死させる工程、および各々の安楽死させた卵から羊水を収集する工程も含み、この際、羊水はワクチンを含み；好ましくは羊水からワクチンを単離する工程も有する。好ましくは、ウイルスはヒトインフルエンザウイルスを含み、そのため、収集した羊水はヒトインフルエンザワクチンを含む。
【００５３】
本発明による発生マーカーは、好ましくは胚の時期を決定するために用いることもでき、または、その他のマーカーを適切に適用することもできる。
【００５４】
胚時期の決定に有用な発生マーカーは、好ましくはアミノ酸、およびそれらのそれぞれの代謝物および／または前躯体から選択される。出願人らは、特にアミノ酸の絶対量および相対量、より好ましくは、ベタインとして知られるトリメチルグリシン、アスパラギン酸塩およびアスパラギン、グルタミン酸塩およびグルタミンならびにプロリンの絶対量および相対量は、卵内の鳥類胚の発生段階に直接関連し得ることを見出した。特に発生の初期段階の鳥類胚の発生段階、または年齢を決定することを可能にする特徴は少ないので、これは非常に関連性がある。
【００５５】
したがって、本発明の方法はまた、好ましくは、実質的に同じ発生段階または実際の時期の卵を選択すること、および実質的に同じ年齢の多数の卵を組み合わせて、制御された培養を卵に受けさせることも可能にする。結果として生じる孵化期間は、より均一となるはずであり、その結果、レクード（ｒｅｃｕｅｄ）ストレスに起因する高品質の、より均一なヒヨコ集団となり、人工培養条件に長期間さらされる、早期に孵化したトリの数を減少させる。
【００５６】
結果として生じる孵化したトリ集団は、結果としてより高い産生高となる、より高い品質と、例えば減少した処理量による、ヒヨコ集団に対する減少したフォローアップ要件を示す。
【００５７】
同様に、本明細書において、鳥類胚の発生段階は、最も効率的にウイルスを注入し、ワクチンを収集する時点に関連があるため、年齢で選択された卵の集団の使用は、ワクチンをより効率的に準備することも可能にすることになる。
【００５８】
本発明はまた、卵の選別、および孵化後、本方法によって得られるヒヨコまたはヒヨコ集団に関する。
【００５９】
以下の限定されない例は、本発明を説明するために記載される。
【実施例】
【００６０】
実施例１
卵内の代謝プロファイリング手順
ガッルス・ガッルス・ドメスティクス（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）の卵を、ＭＳ  Ｂｒｏｅｄｍａｃｈｉｎｅｓ  Ｖ．Ｏ．Ｆ．より商業的に入手可能な孵卵器モデル５０において３７．８℃で培養し、１時間おきに回転させた。
【００６１】
１２個の卵からなる１つの群を９日間、１２個の卵からなる第２の群を１０日間、１２個の卵からなる第３の群を１１日間培養した。
【００６２】
卵を孵卵器から取り出し、顕微鏡の下で気嚢を上にしてペーパーホルダーに設置した。殻および膜を穿刺し、気嚢の周囲を壊して開け、内膜は無傷のままにした。光を用いて、内殻膜の上を流れる血管を位置付け、内膜および外膜を貫いて尿膜腔の中までの、血管を避ける小さな穴を作成した。
【００６３】
卵を傾け、次に１ｍｌピペットを用いて尿膜腔の中に空気を吹き込み、その後、ピペットを用いて１．５〜２ｍｌの尿膜腔液を抽出した。これをクライオバイアルに移し、それを直ちに液体窒素の中に沈めた。次に試料を取り出し、−８０℃で保存した。
【００６４】
胚を、膜を切り離すことによって、そして小さいスプーンを用いることによって卵から取り出した。それを、９６％エタノールを充填した氷上のファルコンチューブに入れ、暗所で室温にて保存した。
【００６５】
尿膜腔液を−８０℃から取り出し、解凍し、１ｍｌの試料を取り出してガラスバイアルの中に入れた。
【００６６】
１ｍｌのクロロホルムおよび１ｍｌのメタノールおよび水（１：１）の混合物を、ガラスパスツールピペットを用いて試料に添加した。キャップを用いてバイアルを閉め、次に２０秒間振盪し、次に４℃で１０分間置いた。ガラスパスツールピペットを用いて、混合物の上部の１ｍｌを取り出し、クライオバイアルに移した。このクライオバイアルのキャップを穿刺し、それを一晩凍結乾燥させた。この凍結乾燥生成物をＮＭＲ試料として用いた。
【００６７】
実施例２
卵内の代謝プロファイリング手順
ガッルス・ガッルス・ドメスティクス（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）の卵を、Ｐｅｔｅｒｓｉｍｅ  ＮＶより市販されている産業用孵卵器において商業用の孵化場で３７．８℃で培養し、１時間おきに回転させた。５０個の卵からなる１つの群を８日間、５０個の卵からなる第２の群を９日間、そして５０個の卵からなる第３の群を１０日間培養した。
【００６８】
卵を孵卵器から取り出し、顕微鏡の下で気嚢を上にしてプラスチックホルダーに設置した。
【００６９】
殻および膜を穿刺し、気嚢の周囲を壊して開け、内膜は無傷のままにした。光を用いて、内殻膜の上を流れる血管を位置付け、内膜および外膜を貫いて尿膜腔の中までの、血管を避ける小さな穴を作成した。
【００７０】
卵を傾け、次に１ｍｌピペットを用いて尿膜腔の中に空気を吹き込み、その後、ピペットを用いて１．５〜２ｍｌの尿膜腔液を抽出した。これをクライオバイアルに移し、それを直ちに液体窒素の中に沈めた。次に試料を取り出し、−８０℃で保存した。
【００７１】
胚を、膜を切り離すことによって、そして小さいスプーンを用いることによって卵から取り出した。それを、９６％エタノールを充填した氷上のファルコンチューブに入れ、暗所で室温にて保存した。
【００７２】
尿膜腔液を−８０℃から取り出し、解凍し、０．５ｍｌの試料をクライオバイアルの中に入れた。このクライオバイアルのキャップを穿刺し、それを一晩凍結乾燥させた。この凍結乾燥生成物をＮＭＲ試料として用いた。
【００７３】
性別決定−検証：
ニワトリ胚をエタノールから取り出し、外に出したまま室温で１０分間乾燥させた。左下肢の一部を切り取り、これを用いて、ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙキットとして商業的に入手可能）を用いてＤＮＡを抽出し、その後、ナノドロップ装置を用いて量を測定した。
【００７４】
Ｓｉｇｍａより商業的に入手可能なプライマーペア１２７２Ｈおよび１２３７Ｌを用いるＰＣＲを用いて、胚の性別を決定した。使用したＰＣＲプログラムは、９５℃５分、次に３６回９５℃４５秒、５６℃４５秒、７２℃１分であり、その後７２℃で５分間１回実行した。胚の性別は、結果として生じるＰＣＲ産物に基づいて決定し、２％寒天ゲルを用いることにより識別した。
【００７５】
ＮＭＲ試料調製
上記のように得た５０〜１００ｍｇの試料材料を、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．３，２０１０，ｐａｇｅｓ  ５３６−５４９およびＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７１，２０１０，７７３−７８４に記載されるように、内部標準として３−（トリメチルシリル）−２，２，３，３−ｄ４プロピオン酸（ＴＳＰ）を用いて、二次元（２Ｄ）−１Ｈ−１Ｈ−Ｊ−分解ＮＭＲ測定にかけた。
【００７６】
実施例１について得たデータを表１に表す：
【００７７】
【表１】
0006279574.tif 000002
【００７８】
多変量データ解析
部分最小二乗モデリング、教師なし多変量データ解析を、１Ｈ  ＮＭＲデータに用いて、１Ｈ  ＮＭＲで検出された全ての代謝物に基づいて試料を分類した。得られた最も重要な情報は、２つのデータセット、すなわち、測定した１Ｈ  ＮＭＲシグナル（代謝物）と試料分類（グループ情報）との間の相間関係であった。
【００７９】
分析は、雄胚か雌胚のいずれかの発生マーカーの絶対量を明らかにしただけでなく、相対量も明らかにした。第２のマーカーおよび第３のマーカーを加えた場合、それぞれ、検査の選択性がさらに増加した。図１および２は、それぞれ、実施例１および２の多変量分析の結果を開示し、性別決定を重ね合わせている。
【００８０】
実施例３
胚年齢の決定
実施例１を繰り返した。しかし胚の発生段階、または年齢の決定に関連があることが見出された以下の発生マーカーを分析した。
【００８１】
【表２】
0006279574.tif 000003
【００８２】
上記のデータは、胚の発生段階は１以上の発生マーカーから決定することができることを明白に示す。
【００８３】
部分最小二乗モデリング、教師なし多変量データ解析を、１Ｈ  ＮＭＲデータに用いて、１Ｈ  ＮＭＲで検出された全ての代謝物に基づいて試料を分類した。得られた最も重要な情報は、２つのデータセット、すなわち、測定した１Ｈ  ＮＭＲシグナル（代謝物）と試料分類（グループ情報）との間の相間関係であった。
【００８４】
多変量モデルは、胚の性別、年齢および／または生存能と、存在する代謝物の相対量との間の相間関係を示した。代わりとなる分析法、例えばＧＣＭＳなどを用いると、同様の結果が得られ、それによってこの結果を裏付けている。
【００８５】
この分析は、発生段階の発生マーカーの絶対量を明らかにしただけでなく、相対量も明らかにした。第２、第３および第４のマーカーを加えた場合、それぞれ、検査の選択性はさらに増加した。
【００８６】
上記の実施例は、本発明の方法および材料の利点を明らかに示す。本発明のいくつかの具体的な実施形態が上の詳細な説明で記載されているが、この記述は、制限的であるよりもむしろ例証的であると認識されるものであるので、本明細書に開示される特定の形態または実施形態に本発明を制限することを意図するものではなく、本発明が実施例に制限されないことは当業者には明白である。
【図１】
0006279574.tif 000004
【図２】
0006279574.tif 000005