(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬的に許容され得る担体及びタンパク質を含む甲殻類動物における白点症候群の予防及び／または治療に使用するためのワクチンであって、前記タンパク質は配列番号４に示すアミノ酸配列を含む前記ワクチン。
【請求項２】
ワクチンが、配列番号３または１０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、及び／または配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質及び／または配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質を更に含む請求の範囲第１項に記載のワクチン。
【請求項３】
甲殻類動物における白点症候群の予防または治療に使用するためのベクターワクチンであって、前記ワクチンはゲノム中に白点症候群ウイルスタンパク質をコードする異種核酸配列を含む弱毒化細菌またはウイルスを含み、前記白点症候群ウイルスタンパク質は配列番号４に示すアミノ酸配列を含む前記ベクターワクチン。
【請求項４】
白点症候群ウイルス由来の構造タンパク質であって、該タンパク質のアミノ酸配列が配列番号４に示すアミノ酸配列であることを特徴とする前記構造タンパク質。
【請求項５】
白点症候群ウイルスの構造タンパク質をコードする核酸であって、前記構造タンパク質が配列番号４に示すアミノ酸配列を有する前記核酸。
【請求項６】
白点症候群ウイルスの構造タンパク質をコードする核酸であって、前記核酸が配列番号２に示す配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする前記核酸。
【請求項７】
請求の範囲第４項に記載の構造タンパク質の甲殻類動物のための薬剤としての使用。
【請求項８】
医薬的に許容され得る担体、及び少なくとも請求の範囲第４項に記載の構造タンパク質または少なくとも請求の範囲第５項または第６項に記載の核酸を含む医薬組成物。
【請求項９】
請求の範囲第４項に記載の構造タンパク質に対する抗体。
【請求項１０】
医薬的に許容され得る担体またはビヒクル及び少なくとも請求の範囲第９項に記載の抗体を含むワクチンまたは医薬組成物。
【請求項１１】
請求の範囲第５項または第６項に記載の核酸または請求の範囲第９項に記載の抗体を含む白点症候群ウイルス検出用診断キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、白点症候群ウイルス由来のタンパク質、前記タンパク質をコードする核酸配列、及び甲殻類動物において白点症候群を予防及び／または治療するためのワクチンの製造における前記タンパク質の使用に関する。
【０００２】
白点症候群ウイルス（ＷＳＳＶ）は東南アジアの多くの地域でのシュリンプの重大なウイルス疾患である。このウイルスは甲殻類動物において広い宿主域を有し（Ｆｌｅｇｅｌ，１９９７）、単離体間での遺伝子変化はほとんどない（Ｌｏら，１９９９）。電子顕微鏡（ＥＭ）研究から、前記ビリオンはエンベロープを有し、長さ約２７５ｎｍ、幅１２０ｎｍで一端にテール様付属体を有するロッドまたはビュレット形の外観を有する。エンベロープを欠くヌクレオキャプシドは網状外観及び約３００ｎｍ×７０ｎｍのサイズを有する（Ｗｏｎｇｔｅｅｒａｓｕｐａｙａら，１９９５）。このビリオン形態、その核局在化及びその形態形成は昆虫のバキュロウイルスを連想させる（Ｄｕｒａｎｄら，１９９７）。元々、ＷＳＳＮはバキュロウイルス科の非帰属メンバーとして分類されており（Ｆｒａｎｃｋｉら，１９９１）、よってシステミックエクトダーマルメソダーマル(Systemic Ectodermal Mesodermal)バキュロウイルス（ＳＥＭＢＶ）または白点(White Spot)バキュロウイルス（ＷＳＢＶ）と呼ばれていた。現在、ＷＳＳＶは分子情報がないのでこの科に属さない（Ｍｕｒｐｈｙら，１９９５）。二本鎖ウイルスＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼ分析（Ｙａｎｇら，１９９７）から推定されるように２００ｋｂ以上のサイズを有する。
【０００３】
東南アジアで養殖シュリンプにＷＳＳＶが流行し、シュリンプが大量に死亡している。この病気の特徴は甲皮、付属体及び及びクチクラ上の白点及びシュリンプの肝膵臓の赤みがかった色である。感染を受けたシュリンプは致死的兆候及び餌消費の急速な低下を示し、３〜５日以内にこれらのシュリンプは死亡する。ＷＳＳＶの流行により、養殖シュリンプ業界はかなりの損失を受け、その結果シュリンプをＷＳＳＶ感染から防御し得るワクチンが強く要望されている。前記ワクチンに使用することができる主要構造ＷＳＳＶタンパク質を同定及び特性化すると、前記ワクチンが開発されるであろう。
【０００４】
クーマシーブリリアントブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの移動度から推定される分子量により、ＶＰ２８（２８ｋＤａ）、ＶＰ２６（２６ｋＤａ）、ＶＰ２４（２４ｋＤａ）及びＶＰ１９（１９ｋＤａ）と命名されたＷＳＳＰの４つの主要タンパク質が同定された。ＶＰ２６及びＶＰ２４はヌクレオキャプシドタンパク質であり、ＶＰ２８及びＶＰ１９はエンベロープタンパク質である。ＷＳＳＶタンパク質のＮ末端アミノ酸残基はタンパク質の配列決定により得られ、ＷＳＳＶゲノム上の遺伝子（それぞれ、ｖｐ２８、ｖｐ２６、ｖｐ２４及びｖｐ１９）を同定するために使用した。ｖｐ２６のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は５５５ヌクレオチドを含み、図２ｂに１８４アミノ酸残基配列（配列番号３）として示すＶＰ２６の推定アミノ酸配列と共に図２ｂ（配列番号１）に示す。ｖｐ２６の第２オープンリーディングフレームは６１２ヌクレオチドを含み、配列番号１０として別に示す２０４残基からなる推定アミノ酸配列と共に配列番号９に示す。ｖｐ２８のオープンリーディングフレームは６１５ヌクレオチド（配列番号２）を含み、推定アミノ酸配列（配列番号４）と共に図２ｃに示す。ＶＰ２８の推定アミノ酸配列は２０４アミノ酸である。ＶＰ２６及びＶＰ２８はＮ末端に想定膜貫通ドメイン及び多くの想定Ｎ−及びＯ−グリコシル化サイトを含む。遺伝子ｖｐ２６及びｖｐ２８のＯＲＦはそれぞれ２０ｋＤａ及び２２ｋＤａの理論サイズを有するタンパク質をコードしていた。ＶＰ２６及びＶＰ２８の推定アミノ酸配列は直接タンパク質配列決定により確認された。ＶＰ２６及びＶＰ２８の理論サイズはクーマシーブリリアントブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの移動度により推定されるサイズとは６ｋＤａ異なる。このサイズの差はグリコシル化、リン酸化等の翻訳後修飾から説明され得る。ＶＰ２４のＮ末端アミノ酸配列及びＶＰ１９の部分アミノ酸配列をそれぞれ配列番号５及び６に示す。ｖｐ２４の完全オープンリーディングフレームは６２７ヌクレオチドを含み、ＶＰ２４の推定アミノ酸配列と共に配列番号１１に示す。ＶＰ２４の推定アミノ酸配列は２０８残基を有し、配列番号１２に別に示す。４つのタンパク質及び各ヌクレオチド配列はＷＳＳＶに対して特異的である。
【０００５】
本発明は第１に甲殻類動物をＷＳＳＶ感染から防御するための組換えワクチンを作製する手段を提供する。既に同定され、特性化されているＷＳＳＶの４つの主要タンパク質ＶＰ２８、ＶＰ２６、ＶＰ２４及びＶＰ１９が甲殻類動物をＷＳＳＶ感染から防御するためのサブユニットワクチンの製造に使用するのに適していることが判明した。本発明のヌクレオチド配列のクローニング及び特性化により、ＷＳＳＶの構造タンパク質が組換えテクノロジーを用いて作製される。このようにして、他のＷＳＳＶタンパク質を実質的に含まない組換え構造ＷＳＳＶタンパク質を得ることができる。単離された構造ＷＳＳＶタンパク質は甲殻類動物をＷＳＳＶ感染から防御するためのサブユニットワクチンを製造するために使用され得る。或いは、ＷＳＳＶの構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列は甲殻類動物をＷＳＳＶ感染から防御するためのベクターワクチンを作製するために使用され得る。更に、本発明のヌクレオチド配列は診断目的で、例えば現場でＷＳＳＶの存在を検出するために使用され得る。加えて、本発明のＷＳＳＶタンパク質はＷＳＳＶ特異的抗体を作製するために使用され得る。前記抗体は甲殻類動物の受動免疫化のためのＷＳＳＶワクチンを作製するために使用され得る。前記抗体は甲殻類動物においてまたはフィールドでのＷＳＳＶの検出のような診断目的でも使用され得る。
【０００６】
従って、第１の態様で、本発明はＷＳＳＶの構造タンパク質を提供する。より具体的には、本発明は構造タンパク質ＶＰ２４、ＶＰ２６、ＶＰ２８及びＶＰ１９を提供する。特に、本発明は図２ｂに示すアミノ酸配列（配列番号３）またはその誘導体配列（例えば、配列番号１０）を有するタンパク質ＶＰ２６；及び図２ｃに示すアミノ酸配列（配列番号４）またはその誘導体配列を有するタンパク質ＶＰ２８を提供する。本発明は更に配列番号５に示すＮ末端アミノ酸配列ＭＨＭＷＧＶＹＡＡＩＬＡＧＬＴＬＩＬＶＶＩＳＩＶＶＴＮＩＥＬＮＫＫＬＤＫＫＤＫまたはその誘導体を含むタンパク質ＶＰ２４；及び配列番号６に示す部分アミノ酸配列ＩＶＬＩＳＩ（Ｇ／Ｖ）ＩＬＶＬＡＶＭＮＶ（Ｐ／Ａ／Ｔ）ＭＧＰＫＫＤＳまたはその誘導体を含むタンパク質ＶＰ１９を提供する。好ましくは、タンパク質ＶＰ２４は配列番号１２に示すアミノ酸配列またはその誘導体配列を有する。配列番号３、４、５、６、１０または１２に示すアミノ酸配列の誘導体配列を有するタンパク質も本発明の範囲に含まれると理解すべきである。本発明では、タンパク質アミノ酸配列の誘導体は配列番号３、４、１０または１２に示すアミノ酸配列或いは配列番号５または６に示す部分配列に比較してタンパク質の抗原性または免疫原性に影響を及ぼさない程度の変更を含む。本発明では、タンパク質の抗原性特性はＷＳＳＶタンパク質を認識し得る及び／または該タンパク質と反応し得る抗体を作製するタンパク質の能力と理解される。免疫原性は甲殻類動物においてＷＳＳＶ感染に対する防御応答を誘発するタンパク質の能力であると理解される。
【０００７】
本発明の配列中で起こり得る変更は、例えば全体配列における１つ以上のアミノ酸の保存アミノ酸の置換、欠失、挿入、逆位または付加により生じ得る。免疫特性を変更しないと予想されるアミノ酸置換は公知である。関連アミノ酸間のアミノ酸置換または進化過程にしばしば起こる置換は、特にＳｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，タンパク質配列及び構造のアトラス(Atlas of protein sequence and structure)，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．（１９７８），５巻、追補３参照）。この情報に基づいて、Ｌｉｐｍａｎ及びＰｅａｒｓｏｎはタンパク質を迅速且つ鋭敏に比較し、タンパク質相同性を有するタンパク質及びペプチドの機能類似性を調べる方法を開発した（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２２７，ｐ．１４３５−１４４１（１９８５））。所与のアミノ酸配列及びその誘導体を有するタンパク質またはペプチド間の配列相同性を決定するためにＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等の数種のコンピュータプログラムを利用することができる。配列間の最も整合する領域はこれらのプログラムにより自動的に決定され得る。よって、本発明の誘導体タンパク質は依然として構造ＷＳＳＶタンパク質を認識し、それと反応することができる抗体を作製するかまたは予防接種した甲殻類動物においてＷＳＳＶ感染から防御する防御応答を誘発することができる。本発明で使用し得る他の誘導体タンパク質は、構造ＷＳＳＶタンパク質を認識し、それと反応することができる抗体を作製するかまたは予防接種した甲殻類動物においてＷＳＳＶ感染から防御する防御応答を誘発することができるならば、ＷＳＳＶタンパク質の断片である。
【０００８】
第２の態様で、本発明は１つ以上のＷＳＳＶの構造タンパク質をコードする核酸配列を提供する。より好ましくは、本発明はそれぞれ主要構造タンパク質ＶＰ２４、ＶＰ２６、ＶＰ２８及び／またはＶＰ１９をコードする核酸配列を提供する。特に、本発明はそれぞれＶＰ２６、ＶＰ２８及びＶＰ２４をコードする配列番号１または９、配列番号２または配列番号１１に示すｖｐ２６、ｖｐ２８及びｖｐ２４の核酸配列を提供する。各ヌクレオチド配列は推定アミノ酸配列の第１Ｍ残基をコードするＡＴＧコドンから始まり、Ｃ末端アミノ酸残基をコードするコドンまで続く。本発明では、配列番号１、配列番号２、配列番号９または配列番号１１に示す配列と配列相同性を有する核酸配列も本発明の範囲に入ると理解すべきである。本発明において配列相同性は少なくとも７０％、好ましくは７５％、より好ましくは８０％、更に好ましくは８５％であると見做される。配列番号１、２、９または１１に示す配列と少なくとも９０％、より好ましくは９５％の配列相同性を有する核酸配列が非常に好ましい。
【０００９】
本発明では、配列相同性は当該ヌクレオチド配列を配列番号１、配列番号２または配列番号１１に示す配列の対応部分と比較することにより決定される。本発明において配列相同％は比較した配列間での同一ヌクレオチドの％と定義される。配列相同性は、例えばＢＬＡＳＴ  Ｎ等のようなコンピュータプログラムにより決定され得る。前記プログラムは自動的に最も整合する領域を定める。
【００１０】
本発明の配列相同性を有する核酸配列は、密接に関連するＭＳＳＶ菌株から一般的なクローニング・ハイブリダイゼーション法により配列番号１、２、１１または９に示す配列の１つまたは前記配列の断片を用いて容易に単離され得る。本発明では、ハイブリダイゼーションをストリンジェントな条件下、好ましくは非常にストリンジェントな条件下で実施する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は６５℃の温度で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件であると理解される。非常にストリンジェントな条件はＳＣＣ濃度を０．３×ＳＳＣに下げた洗浄条件を指す。誤って同定された塩基の排除を要するように特定情報を狭く解釈すべきではない。本明細書に記載の特定配列は他の菌株から相同性ヌクレオチド配列を単離するために容易に使用され得る。
【００１１】
配列番号１、２または１１に示す配列の１つと配列相同性を有する核酸配列は、配列番号３、４、１０及び１２に示すアミノ酸配列の１つまたは配列番号５及び６に示す部分アミノ酸配列の１つと比較してタンパク質の抗原性または免疫原性に影響を与えない程度の変更を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。ＶＰ２６タンパク質をコードする前記相同性ヌクレオチド配列の例は配列番号９に示すヌクレオチド配列であり、これは配列番号３に示すアミノ酸に比較して変更を有するＶＰ２６タンパク質をコードする。
【００１２】
本発明のＷＳＳＶタンパク質は一般的な生化学分離及び精製方法により得ることができ、或いはこのタンパク質は一般的な組換えテクノロジーにより作製され得る。本発明のヌクレオチド配列は、実質的に他のＷＳＳＶタンパク質を含まない構造ＷＳＳＶタンパク質の組換え産生に使用するのに特に適している。ヌクレオチド配列はタンパク質を発現し得る適当な発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞を前記発現ベクターを用いて形質転換し、宿主細胞を適当な培地で培養する。発現させたタンパク質を細胞または培地から単離、精製することができる。適当な発現ベクターは、特にプラスミド、コスミド、ウイルス、及び複製及び発現のために必要な制御領域を含むＹＡＣ（酵母人工染色体）である。発現ベクターを宿主細胞で発現するために使用し得る。適当な宿主細胞は、例えば細菌、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞である。前記発現技術は当業界で公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅら，分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: a Laboratory Manual)，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒに所在のＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行；Ｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｅｅ，１９９２）。
【００１３】
第３態様で、本発明は１つ以上のＷＳＳＶの構造ビリオンタンパク質ＶＰ２４、ＶＰ２６、ＶＰ２８またはＶＰ１９及び医薬的に許容され得る担体を含むワクチンを提供する。より具体的には、本発明のワクチンはビリオンタンパク質ＶＰ２４、ＶＰ２６、ＶＰ２８またはＶＰ１９、または前記タンパク質の２つ以上の組合せを含む。好ましくは、本発明のワクチンは、配列番号１２に示すアミノ酸配列、配列番号５に示すＮ末端アミノ酸配列、または前記のいずれかの配列の誘導体配列を含むＶＰ２４；配列番号３または配列番号１０に示すアミノ酸配列、または前記のいずれかの配列の誘導体配列を含むＶＰ２６；配列番号４に示すアミノ酸配列またはその誘導体配列を含むＶＰ２８；または配列番号６に示すＮ末端アミノ酸配列またはその誘導体配列を含むＶＰ１９；または前記した２つ以上のタンパク質の組合せを含む。より好ましくは、本発明のワクチンはＷＳＳＶタンパク質ＶＰ２６及びＶＰ２８、及び任意にＶＰ２４を含む。
【００１４】
更に、本発明の核酸配列は甲殻類動物にＷＳＳＶ感染に対する予防接種をするためのベクターワクチンを製造するために使用することができる。ベクターワクチンは、弱毒化生細菌またはウイルスが遺伝子材料に挿入された異種ヌクレオチドを１つ以上含むように修飾されているワクチンであると理解されたい。これらの所謂ベクター細菌またはウイルスは挿入されたヌクレオチドによりコードされる異種タンパク質を同時発現することができる。従って、第４の態様で、本発明は遺伝子材料中に１つ以上の本発明のヌクレオチド配列を含むように修飾されてなる弱毒化生細菌または細菌及び医薬的に許容され得る担体を含むベクターワクチンを提供する。
【００１５】
本発明のワクチンは甲殻類動物、例えばＰ．ｍｏｎｏｄｏｎ、Ｐ．ｖａｎｎａｍｅｉ、Ｐ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｍｅｒｇｕｅｎｓｉｓまたはＭｅｔａｐｅａｅｕｓ  ｓｐｐ．のようなＰｅｎａｅｉｄａｅ科のメンバーを含めたシュリンプ類；Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ  ｓｐｐ．またはＰａｌａｅｍｏｎ  ｓｐｐ．のようなＰａｌａｅｍｏｎｉｄａｅ科のメンバーを含めたプローン類；Ｃａｌｉｎｅｃｔｅｓ  ｓｐｐ．、Ｐａｌｉｎｕｒｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐａｎｕｌｉｒｉｓ  ｓｐｐ．またはＨｏｍａｒｕｓ  ｓｐｐ．のようなＰａｌｉｎｕｒｉｄａｅ及びＮｅｐｈｒｏｐｉｄａｅ科のメンバーを含めたロブスター類；Ａｓｔａｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｃａｍｂａｒｕｓ  ｓｐｐ．及びＯｒｏｎｅｃｔｅｓ  ｓｐｐ．のようなＡｓｔａｃｉｄａｅ科のメンバーを含めたザリガニ類；Ｃａｎｃｅｒ  ｓｐｐ．、Ｃａｌｌｉｎｅｃｔｅｓ  ｓｐｐ．、Ｃａｒｃｉｎｕｓ  ｓｐｐ．及びＰｏｒｔｕｎｕｓ  ｓｐｐ．のようなＣａｎｃｒｉｄａｅ及びＰｏｒｔｕｉｄａｅ科のメンバーを含めたカニ類を防御するために使用することができる。ただし、甲殻類動物は上に挙げたメンバーに限定されない。
【００１６】
本発明のワクチンは当業者に公知であり、例えばＡ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏら編、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、７２章、ｐ．１３８９−１４０４、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉｃ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０年）発行に記載されている方法に従って製造され得る。
【００１７】
本発明のワクチンは有効量の１つ以上の本発明のタンパク質、ベクター細菌またはウイルス、及び医薬的に許容され得る担体を含む。本明細書中、「有効」は甲殻類動物において防御応答を誘発するのに十分な量として定義される。ベクターまたはタンパク質の量はベクターまたはタンパク質の種類、投与経路、投与時期、予防接種対象、年令、全身健康状態、体温及び食餌に依存する。
【００１８】
通常、動物１匹あたり０．０１〜１，０００μｇのタンパク質、好ましくは動物１匹あたり０．５〜５００μｇ、より好ましくは動物１匹あたり０．１〜１００μｇのタンパク質が使用され得る。ウイルスベクターワクチンの場合、通常動物１匹あたり１０３〜１０８ｐｆｕ（プラーク形成単位）の量が使用され得る。
【００１９】
本発明のワクチンに使用するのに適した医薬的に許容され得る担体は無菌且つ生理学的に適合するもの、例えば滅菌水、食塩水、水性緩衝液（例えば、ＰＢＳのようなアルカリ金属ホスフェート）、アルコール、ポリオール等である。更に、本発明のワクチンは他の添加剤、例えば助剤、安定剤、酸化防止剤、保存剤等を含んでいてもよい。
【００２０】
適当な助剤には、アルミニウム塩またはゲル、カルボマー、非イオン性ブロックコポリマー、トコフェロール、モノホスフェリル脂質Ａ、ムラミルジペプチド、油エマルション、グルカン、サイトカイン、サポニン（例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ）等が含まれるが、これらに限定されない。添加される助剤の量は助剤そのもものの種類に依存する。
【００２１】
本発明のワクチンに使用するのに適した安定剤には、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、デキストリン及びグルコース）、タンパク質（例えば、アルブミンまたはカゼイン）、または緩衝液（例えば、アルカリホスフェート）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２２】
好適な保存剤には、特にチメロサール及びメルチオラートが含まれる。
【００２３】
本発明のワクチンは注射、液浸、浸漬、噴霧またはエアゾールを介して、または経口的に投与され得る。好ましくは、前記ワクチンは、特に商業的養殖場では液浸または経口により甲殻類動物に投与される。
【００２４】
経口投与の場合、ワクチンを経口投与に適した担体、すなわち、セルロース、食物、代謝可能物質、例えばα−セルロース、または植物または動物起源の各種油と混合することが好ましい。本発明のワクチンを経口デリバリーするための特に好適に食物担体はワクチンをカプセル化することができる生餌生物(lived-feed organism)である。好適な生餌生物には、プランクトン様非選択的フィルタフィーダー、好ましくは輪形動物（Ｒｏｔｉｆｅｒａ）、ホウネンエビ（Ａｒｔｅｍｉａ）等が含まれるが、これらに限定されない。ブラインシュリンプＡｒｔｅｍｉａ  ｓｐ．が非常に好ましい。
【００２５】
本発明のタンパク質は、当業者が利用できる一般的方法を用いて抗体の作製に使用することができる。好ましくは、前記タンパク質は特異的モノクローナル抗体を作製するために使用される。本発明の抗体は標準的方法に従って作製され得る。動物（例えば、マウス）をタンパク質で免疫化し、タンパク質特異的モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する方法は当業界で公知である（例えば、Ｃｌｉｇａｎら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９２；Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，ｐ．４９５−４９７（１９７５）；Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，１９，ｐ．１２５−１３４（１９９４）参照）。得られた抗体は現場でＷＳＳＶを検出するため、または甲殻類動物におけるＷＳＳＶの存在を検出するための診断において使用され得る。本発明のヌクレオチド配列は診断に使用するのにも適している。前記配列またはその断片は、例えば現場でまたは甲殻類動物においてＷＳＳＶの存在を検出するためのＰＣＲ法において使用され得る。従って、別の態様で、本発明は１つ以上の本発明のヌクレオチド配列または抗体を含む診断キットを提供する。
【００２６】
本発明のタンパク質ＶＰ２８、ＶＰ２６、ＶＰ２４及びＶＰ１９に対する抗体は更に甲殻類動物の受動免疫化のための抗体ワクチンを製造するために使用され得る。従って、別の態様で、本発明はＶＰ２８、ＶＰ２６、ＶＰ２４またはＶＰ１９、または前記タンパク質の２つ以上の組合せに対する抗体を含むＷＳＳＶに対する受動免疫化のためのワクチンを提供する。前記ワクチンは上記したように標準的方法により製造され得る。好ましくは、抗体の経口投与用ワクチンは、抗体を食用担体（例えば、魚の餌）と混合して製造される。より好ましくは、ワクチンは鶏卵で作製した抗体（ＩｇＹ抗体）から製造される。
【００２７】
下記実施例は本発明の例示であり、決して本発明を限定すると解釈すべきでない。
【００２８】
（図面の説明）
図１は、ＷＳＳＶタンパク質。（Ａ）逆染色した無傷のビリオンのＴＥＭ写真。（Ｂ）逆染色したＷＳＳＶヌクレオキャプシドのＴＥＭ写真。（Ｃ）精製ＷＳＳＶの１５％クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。レーン１：低分子量タンパク質マーカー、レーン２：非感染シュリンプの精製「ＷＳＳＶ粒子」、レーン３：精製ＷＳＳＶ粒子、レーン４：精製ＷＳＳＶヌクレオキャプシド。
【００２９】
図２は、ＷＳＳＶ  ＶＰ２６及びＶＰ２８のヌクレオチド配列。（Ａ）ＷＳＳＶゲノム断片上のＶＰ２６及びＶＰ２８の位置。（Ｂ）ＶＰ２６のヌクレオチド及びタンパク質配列。（Ｃ）ＶＰ２８のヌクレオチド及びタンパク質配列。ｖｐ２６及びｖｐ２８のＯＲＦはそれぞれ推定アミノ酸配列の第１Ｍ残基をコードするＡＴＧコドンから始まる。Ｎ末端配列アミノ酸は太字で示す。想定Ｎ−グリコシル化サイトの位置には下線を付し、想定Ｏ−グリコシル化サイトの位置には二重下線を付した。ＶＰ２８上の縮重プライマー位置のヌクレオチド配列はイタリックで示す。
【００３０】
図３は、（Ａ）ＶＰ２６及び（Ｂ）ＶＰ２８の疎水性プロットである。
【００３１】
図４は、１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びウェスタンブロットで分析した昆虫細胞におけるＷＳＳＶ構造タンパク質のバキュロウイルス発現。（Ａ）Ｓｆ２１細胞の抽出物のクーマシー染色ゲル。レーン１：低分子量タンパク質マーカー、レーン２：モック感染、レーン３：ＡｃＭＮＰＶ−ｗｔ感染、レーン４：ＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰ感染、レーン５：ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６感染、レーン６：ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６感染、レーン７：ＷＳＳＶ。（Ｂ）精製ＷＳＳＶに対するポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット。
【００３２】
図５は、構造タンパク質ＶＰ２８に対する抗血清によるシュリンプ中のＷＳＳＶの中和。ネガティブコントロール：ＮａＣｌ溶液を投与されたシュリンプ、ポジティブコントロール：ＷＳＳＶを投与されたが、抗血清を投与されなかったシュリンプ、前免疫血清：ＷＳＳＶ及び前免疫血清を投与されたシュリンプ、ＶＰ２８抗血清：ウイルス及び抗−ＶＰ２８抗血清を投与されたシュリンプ。
【００３３】
図６は、シュリンプへのＷＳＳＶタンパク質の予防接種。ネガティブコントロール：ＮａＣｌ溶液を投与されたシュリンプ、ポジティブコントロール：ＮａＣｌ及びＷＳＳＶを投与されたシュリンプ、群３：ＶＰ２４を予備接種されたシュリンプ、群４：ＶＰ２６ｃを予備接種されたシュリンプ、群５：ＶＰ２８を予備接種されたシュリンプ、群６：ＶＰ２４、ＶＰ２６ｃ及びＶＰ２８の混合物を予備接種されたシュリンプ。
【００３４】
（実施例）
方法
白点症候群ウイルスの調製及び精製
本研究で使用したウイルスはタイからの感染Ｐｅｎａｅｕｓ ｍｏｎｏｄｏｎシュリンプから単離した。感染組織をＴＮ緩衝液（２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ，４００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）中で均質化した。１，７００×ｇで１０分間遠心後、上清を０．４５μｍフィルターを用いて濾過した。濾液を健康なＰ．ｍｏｎｏｄｏｎの第４腹節の外側域に筋肉内注射して、感染を開始した。４日後に体液を瀕死状態のシュリンプから抜き、抗凝固剤として修飾Ａｌｓｅｖｅｒ溶液（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，１９９５）と混合した。ＴＮＥ（２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ，４００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）で希釈後、体液を４℃において１，７００×ｇで１０分間遠心して清澄化した。ウイルス粒子を４℃において４５，０００×ｇで１時間遠心して沈降させ、ペレットからＴＮに懸濁させた。
【００３５】
ウイルスエンベロープを、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０（ＮＰ４０）で処理して上記ウイルス粒子から除去した。１％  ＮＰ４０をウイルス溶液に添加し、ゆっくり揺り動かしながら室温で３０分間インキュベートした。ヌクレオキャプシドを４℃において８０，０００×ｇで３０分間沈降させた。ペレットをＴＥ（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＦＴＡ，ｐＨ７．５）に溶解した。
【００３６】
ビリオン懸濁液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
タンパク質分析のために、ＷＳＳＶビリオン調製物（エンベロープを有するビリオン、ヌクレオカプトジ及びネガティブコントロール）を１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて分析した。タンパク質をクーマシーブリリアントブルー染色を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに可視化した。
【００３７】
電子顕微鏡検査
透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）のために、ウイルス懸濁物を、リンタングステン酸（２％  ＰＴＡ）で逆染色されているｆｏｒｍｖａｒコートした炭素安定化ニッケルグリッド（４００メッシュ）上に載せた。試料をＰｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１２電子顕微鏡を用いて検査した。
【００３８】
核酸精製
ウイルスＤＮＡを、プロテイナーゼＫ（０．２ｍｇ／ｍｌ）及びサルコシル（１％）を用いて４５℃で３時間処理した後フェノール／クロロホルム抽出し、ＴＥ（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）に対して透析することにより精製ビリオンから単離した。ＤＮＡの純度及び濃度をマーカーを用いてアガロースゲル電気泳動により測定した。
【００３９】
プラスミドの構築
ＷＳＳＶサブゲノム断片を標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（Ｓｔａｔａｇｅｎｅ）にクローン化し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した、ＤＮＡ単離、制限酵素消化、アガロースゲル電気泳動及びコロニーリフティングは標準プロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）に従って実施した。ＰＣＲは注文設計し、合成したプライマーを用いて実施した。ｖｐ２８のＮ末端をコードするＤＮＡを、全ＷＳＳＶ  ＤＮＡからＶＰ２８のＮ末端アミノ酸配列に基づく縮重プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。使用した前進プライマーは５’ＣＡＧＡＡＴＴＣＴＣＤＡＴＮＧＴＹＹＴＮＧＴＮＡＣ３’（配列番号７）であり、逆プライマーは５’ＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＹＹＴＮＷＳＮＴＴＹＡＣ３’（配列番号８）であり、いずれもＥｃｏＲＩサイト（下線部）を有する（Ｄ＝Ａ、ＴまたはＧ；Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；Ｙ＝ＣまたはＴ；Ｗ＝ＡまたはＴ；Ｓ＝ＣまたはＧ）。ｖｐ２４のＮ末端を、全ＷＳＳＶ  ＤＮＡからＶＰ２４のＮ末端アミノ酸配列に基づく１組の縮重プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。前進プライマーとして５’ＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＹＡＴＧＴＧＧＧＧＮＧＴ３’（配列番号３）を使用し、逆プライマーとして５’ＣＡＧＡＡＴＴＣＹＴＴＲＴＣＹＴＴＹＴＴＲＴＣＩＡＲＹＴＴ３’（配列番号１４）を使用し、いずれもＥｃｏＲＩサイト（下線部）を含む。
【００４０】
ＤＮＡ配列決定及びコンピュータ分析
配列決定のためのプラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐ  ＭｉｎｉｐｒｅｐシステムまたはＪＥＴｓｔａｒプラスミド精製システム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて精製した。配列決定は普遍ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ前進及び逆ヌクレオチドプライマー及び両鎖由来の注文合成したプライマーを用いて実施した。自動配列決定はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動化ＤＮＡシーケンサー（ベルギー国に所在のＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）を用いて実施した。
【００４１】
作製した配列をＵＷＧＣＧコンピュータプログラム（リリース１０．０）を用いて分析した。ＤＮＡ及び推定アミノ酸排列をプログラムＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８）及びＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７）を用いて最新のＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ、ＳＷＩＳＳＰＯＲＴ及びＰＩＲデータベースと比較した
細胞及びウイルス
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ−ＡＥ−２１）細胞（Ｖａｕｇｈｎら，１９７７）を１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したグレース昆虫培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）において培養した。Ａｕｔｏｇｒａｐｈ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）のＥ２−株（Ｓｍｉｔｈ及びＳｕｍｍｅｒｓ，１９８２）を野生型（ｗｔ）ウイルスとして使用した。日常的な細胞培養維持及びウイルス感染方法は公表された方法（Ｓｕｍｍｅｒｓ及びＳｍｉｔｈ，１９８７；Ｋｉｎｇ  Ｐｏｓｓｅｅ，１９９２）に従って実施した。
【００４２】
組換え体の工学処理
昆虫細胞においてＷＳＳＶ  ＶＰ２４（配列番号１２）、ＶＰ２６（配列番号３）、ＶＰ２６ｃ（配列番号１０）及びＶＰ２８（配列番号４）を過剰発現するためにＢａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃシステム（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を使用した。昆虫細胞の感染時にＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ組換え体の検出及び滴定を容易にするために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子をｐ１０プロモーターの下流のｐＦａｓｔＢａｃ−ＤＵＡＬベクターに導入した。プラスミドｐＶＬ９２ＧＦＰ（Ｒｅｉｌａｎｄｅｒら，１９９６）をＸｂａｌ及びｋｐｎｌで消化後このプラスミドからＧＦＰ遺伝子を除去した。７００ｂｐ  ＧＦＰ含有断片をアガロースゲル電気泳動及びＧｌａｓｓＭＡＸ精製（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）により単離し、ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端とし、ｐ１０プロモーターの下流のｐＦａｓｔＢａｃ−ＤＵＡＬの多重クローニング領域ＩＩのＳｍａＩサイトに挿入した。生じたプラスミドをｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄ−ＧＦＰと呼び、ポリヒドリンプロモーターの下流に外来遺伝子の挿入のための領域１を含んでいた。ｐ１０プロモーターからＧＦＰのみを発現する組換えウイルスをＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステムプロトコル（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）に従って構築し、このウイルスをＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰと命名した。
【００４３】
ＰＣＲをｖｐ２６（配列番号１）及びｖｐ２８（配列番号２）の推定完全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＷＳＳＶプラスミドに対して実施し、ＯＲＦの３’末端にＢａｍＨＩサイト及び５’末端にＨｉｎｄＩＩＩサイトを導入した。ｖｐ２６（配列番号１）及びｖｐ２８（配列番号２）をまずｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローン化し、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで切除し、プラスミドｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄ／ＧＦＰのポリヒドリンプロモーターの下流に挿入した。生じたプラスミドをそれぞれｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄ／Ｇ−ｖｐ２６及びｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄ／Ｇ−ｖｐ２８と命名した。ｖｐ２６ｃ（配列番号９）及びｖｐ２４（配列番号１１）を５’末端にＢａｍＨＩサイト及び３’末端にＥｃｏＲＩサイトに導入するプライマーを用いて推定ＯＲＦ含有プラスミドに対してＰＣＲ増幅した。消化後、ｖｐ２６ｃ（配列番号９）及びｖｐ２４（配列番号１１）のＯＲＦをｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄ／ＧＦＰのポリヒドリンプロモーターの下流に挿入すると、プラスミドｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄ／Ｇ−ｖｐ２６ｃ及びｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄ／Ｇ−ｖｐ−２４が生じた。ｐ１０プロモーターからＧＦＰ及びポリヒドリンプロモーターからＶＰ２４（配列番号１２）、ＶＰ２６（配列番号３）、ＶＰ２６ｃ（配列番号１０）またはＶＰ２８（配列番号４）を発現する組換えウイルスをＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステムプロトコル（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて構築し、これらのウイルスをそれぞれＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２４、ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６、ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６ｃ及びＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２８と命名した。
【００４４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、タンパク質配列決定及び免疫ブロッティング
野生型ＡｃＭＮＰＶ及び異種タンパク質（ＧＦＰ、ＶＰ２６、ＶＰ２８）を発現する組換えＡｃＭＮＰＶを感染させた昆虫細胞を１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて分析した。タンパク質をクーマシーブリリアントブルー染色を用いて可視化した。半乾燥ブロッティングは、ＣＡＰＳ緩衝液（１０％メタノール中１０ｍＭ  ＣＡＰＳ）を用いてポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に対して、またはトリス−グリシン緩衝液（２５ｍＭ  トリス塩基，１９２ｍＭ  グリシン，１０％（ｖ／ｖ）メタノール，ｐＨ３．８）を用いてＩｍｍｕｎｏｂｉｌｏｎ（商標）−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に対して実施した。タンパク質をクーマシーブリリアントブルー染色を用いてＰＶＤＦ膜上に可視化した。ＷＳＳＶビリオン調製物からの主要タンパク質バンドをフィルターから切除し、Ｎ−末端の配列を決定した（マサチュセッツに所在のＰｒｏＳｅｑ，Ｉｎｃ．）。
【００４５】
Ｉｍｍｏｂｕｌｏｎ−Ｐ膜をＴＢＳ（０．２Ｍ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）中２％低脂肪粉乳（オランダ国のＣａｍｐｉｎａ）でブロックした。ブロットをＴＢＳ中で０．２％低脂肪粉乳で１：２，０００希釈したポリクローナル家兎抗−ＷＳＳＶ血清（ハワイ州ホノルル大学のＰ．Ｃ．Ｌｏｈ教授から提供された）において室温で１時間インキュベートすることにより免疫検出した。その後、ホースラディシュペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をコンジュゲートした抗−家兎抗体を１：２，０００の濃度で使用し、強化化学ルミネセント光検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で実施した。
【００４６】
ＶＰ２８ポリクローナル抗体
主要ＷＳＳＶ構造エンベロープタンパク質ＶＰ２８をバキュロウイルスＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２８を用いて昆虫細胞において発現させ、Ｐｒｅｐｃｅｌｌ（Ｂｉｏｒａｄ）及び分画コレクターを用いて精製した。ＶＰ２８を含有する分画を収集し、濃縮した。精製ＶＰ２８タンパク質を家兎に注入して、ポリクローナル抗体を作製した。この抗体を精製ＷＳＳＶビリオンを含有するウェスタンブロットで検査し、ＷＳＳＶビリオン由来のＶＰ２８と十分反応させた。このＶＰ２８抗血清をＷＳＳＶ中和実験において使用した。
【００４７】
ＷＳＳＶウイルスストック
１週間前に低濃度ＷＳＳＶを筋肉内注射したザリガニＰｒｏｃａｍｂａｒｕｓ ｃｌａｒｋｉｉの体液からウイルスを精製して白点症候群ウイルス（ＷＳＳＶ）ウイルスストックを調製した。前記体液を連続スクロース勾配で精製し、ウイルスバンドを採取した。ウイルスをペレット化した後、ウイルスをＴＥ（ｐＨ７．５）に溶解した。実験に使用するまでウイルスストックを−７０℃で保存した。
【００４８】
タンパク質のワクチン接種
主要ＷＳＳＶ構造エンベロープタンパク質ＶＰ２８（配列番号４）、ヌクレオキャプシドタンパク質ＶＰ２６ｃ（配列番号１０）及びＶＰ２４（配列番号１２）を、ｐ１０プロモーターからＧＦＰ及びポリヒドリンプロモーターからＷＳＳＶ構造タンパク質を発現するバキュロウイルスＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２８、ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６ｃ及びＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２４を用いて昆虫細胞において発現させた。感染から３日後に、感染した昆虫細胞を収集し、音波により破壊した。上清をＰ．ｍｏｎｏｄｏｎに予防接種するために使用した。
本実験には６群のシュリンプを使用した。
【００４９】
【表１】
0004786093.tif 000002
【００５０】
ミックスでは、等容量のＶＰ２８溶液、ＶＰ２６ｃ溶液及びＶＰ２４溶液を混合してから注射した。予防接種から５日後、シュリンプに追加接種する。２日後、ＷＳＳＶ（ストックウイルス、中和実験参照）を注射することによりチャレンジする。注射後、シュリンプを６日間追跡し、死亡したシュリンプについては電子顕微鏡によりＷＳＳＶの存在を調べた。
【００５１】
結果
配列決定のためのＷＳＳＶタンパク質の単離
精製ウイルス調製物を筋肉内注射することによりＰｅｎａｅｕｓ ｍｏｎｏｄｏｎシュリンプをＷＳＳＶ感染させた。感染から４日後、感染動物の体液からウイルスを単離した。ネガティブコントロールとして、非感染シュリンプから体液を採取した。これらの調製物をＷＳＳＶビリオンの存在及び純度について電子顕微鏡により分析した。非感染動物のサンプルにはウイルス粒子が観察されなかったが、感染動物のサンプル中には多くの主にエンベロープビリオンが観察された（図１ａ）。ＮＰ４０で処理後ウイルス粒子からウイルスエンベロープを除去すると、ＷＳＳＶヌクレオキャプシドの表面に近いセグメント外観特徴（Ｄｕｒａｎｄｓら，１９９７）を有する精製ヌクレオキャプシドが生じた（図１ｂ）。エンベロープビリオン及びヌクレオキャプシドのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した（図１ｃ）。ビリオン中にそれぞれ２８ｋＤａ（ＶＰ２８）、２６ｋＤａ（ＶＰ２６）、２４ｋＤａ（ＶＰ２４）及び１９ｋＤａ（ＶＰ１９）の見かけ分子量を有する４つの主要ペプチドが同定された。数個のやや弱いバンドも観察された。そこには３０〜６５ｋＤａの範囲に約６個のバンドがあり、８６〜１３０ｋＤａの範囲に少なくとも７つの弱いタンパク質バンドがある。体液に由来する３つの主要タンパク質バンドはビリオンと共精製され、６７〜７８ｋＤａの範囲に存在する。この領域に存在する小さいタンパク質バンドはこのゲルでは観察できなかった（図１）。主要ＷＳＳＶタンパク質ＶＰ２８及びＶＰ１９で見られるサイズは精製ヌクレオキャプシドを含むレーン（図１ｃ）には存在せず、よってウイルスエンベロープまたは外皮に由来しているようである。ＶＰ２６及びＶＰ２４はヌクレオキャプシド及びビリオンの両方に存在していた。これから、ＶＰ２６及びＶＰ２４はヌクレオキャプシドに由来すると示唆される。
【００５２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの内容物を半乾燥ブロッティングによりポリビニリデンジフロリド膜に移し、主要ウイルスタンパク質バンドを切り取り、配列決定した。ＶＰ２８及びＶＰ２６から４０以上のアミノ酸がＮ末端から配列決定された（それぞれ、図２ｂ及び２ｃに太字で示す）。ＶＰ２６のＮ末端配列はＭＥＦＧＮＬＴＮＬＤＶＡＩＩＡＩＬＳＩＡＩＩＡＬＩＶＩＭＶＩＭＩＶＦＮＴＲＶＧＲＳＶＶＡＮを含んでいた。ＶＰ２８のＮ末端配列決定により、アミノ酸配列ＭＤＬＳＦＴＬＳＶＶＳＡＩＬＡＩＴＡＶＩＡＶＦＩＶＩＦＲＹＨＮＴＶＴＫＴＩＥｔＨｓＤが得られ、このうち３９位のスレオニン及び４１位のセリンは未確定である。Ｎ末端配列はいずれも疎水性である（図３）。ＶＰ２４についてＮ末端ペプチド配列決定して得たＮ末端アミノ酸配列はＭＨＭＷＧＶＹＡＡＩＬＡＧＬＴＬＩＬＶＶＩＳＩＶＶＴＮＩＥＬＮＫＫＬＤＫＫＤＫ（配列番号５）である。ＶＰ１９はＮ末端ブロックされていることが判明し、ＶＰ１９の部分内部配列はＮ末端ブロックしたペプチドをＣＮＢｒ消化すると得られ、アミノ酸配列ＩＬＶＩＳＩ（Ｇ／Ｎ）ＩＬＶＬＡＶＭＮＶ（Ｐ／Ａ／Ｔ）ＭＧＰＫＫＤＳ（配列番号６）であった。ＶＰ１９部分配列の７位のアミノ酸残基はＧまたはＶであり、１７位はＰ、ＡまたはＴ残基であり得る。
【００５３】
２４ｋＤａタンパク質遺伝子の局在化及び配列
ＶＰ２４のＮ末端タンパク質配列に基づいて、いずれもＥｃｏＲＩサイト（下線）を含む、前進プライマーとして５’ＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＹＡＴＧＴＧＧＧＧＮＧＴ３’（配列番号１３）、逆プライマーとして５’ＣＡＧＡＡＴＴＣＹＴＴＲＴＣＹＴＴＹＴＴＲＴＣＩＡＲＹＴＴ３’（配列番号１４）を有する１組の縮重ＰＣＲプライマーを開発した。鋳型としてＷＳＳＶゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲを実施した。１３３ｂｐ長断片を得、２％アガロースゲルから精製後ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋にクローン化し、配列決定した。このＰＣＲ産物の配列はＷＳＳＶ  ＶＰ２４のＮ末端タンパク質配列（配列番号５）に相当し、ＶＰ２４の完全ＯＲＦを同定するためにＷＳＳＶプラスミドライブラリーに対するコロニーリフトアッセイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）におけるプローブとして使用した。この断片とハイブリダイズする１８ｋｂｐ  ＢａｍＨＩ断片を更なる分析のために選択した。
【００５４】
６２７ヌクレオチドを含む完全ｖｐ２４  ＯＲＦ及びこの遺伝子のプロモーター領域が１８ｋｂｐ  ＢａｍＨＩ断片上で認められた。翻訳開始コドンは効率的な真核翻訳開始（Ｋｏｚａｋ，１９８９）のための好ましい範囲（ＡＡＡＡＴＧＣ）に存在していた。プロモーター領域には、Ａ／Ｔリッチ配列のストレッチが見られたが、コンセンサスＴＡＴＡボックスは見られなかった。ポリＡシグナルは翻訳停止コドンと重複していた。ｖｐ２４  ＯＲＦ（配列番号１１）は、ＶＰ２４の実験的に決定したＮ末端配列（配列番号５）を含むアミノ酸配列を有する２０８アミノ酸（配列番号１２）の推定タンパク質をコードした。ＶＰ２４は２３ｋＤａの理論サイズ及び８．７の等電点を有する。Ｎ−結合グリコシル化に対する４つの潜在的サイト（Ｎ−｛Ｐ｝−［ＳＴ］−｛Ｐ｝）、Ｏ−グリコシル化に対する１つのサイト（Ｈａｎｓｅｎら，１９９８）及び９つの可能なリン酸化サイト（［ＳＴ］−Ｘ−Ｘ−［ＤＥ］または［ＳＴ−Ｘ−［ＲＸ］）がＶＰ２４内に認められたが、これらの修飾が起こったかどうかは不明である。ＰＲＯＳＩＴＥデータベースに存在する他のモチーフはＶＰ２４中には見られなかった。２０８アミノ酸のコンピュータ分析から、ＶＰ２４のＮ末端にアミノ酸６〜２５により形成される想定膜貫通α−らせんを含む非常に疎水性の領域が存在することが判明した。Ｇａｒｎｉｅｒら（１９７８）のアルゴリズムから、タンパク質に沿って数個の他のα−らせん及びβ−シートが予測された。
【００５５】
２６ｋＤａタンパク質遺伝子の局在化及び配列
ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩの部分ＷＳＳＶゲノムライブラリーをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ＋（ｖａｎ  Ｈｕｌｔｅｎら，２０００）において構築し、多くのＷＳＳＶ断片から末端ヌクレオチド配列を得た。ＶＰ２６のＮ末端配列をコードするヌクレオチド配列は６ｋｂ  ＢａｍＨＩ断片の末端近くに存在していた（図２ａ）。メチオニン出発コドン（ＡＡＡＡＴＧＧ）の周りの配列は効率的な真核翻訳開始のＫｏｚａｋルール（Ｋｏｚａｋ，１９８９）に一致した。ｖｐ２６の非翻訳リーダーの４９ヌクレオチドのみが決定され得、末端ＢａｍＨＩサイトまで延びていた（図２ａ）。
【００５６】
６ｋｂ  ＢａｍＨＩ断片は、ＶＰ２６のＮ末端アミノ酸をコードするものを含めた５５５ｎｔのオープンリーディングフレームを含んでいた（図２ｂ）。ポリＡシグナルはｖｐ２６の翻訳停止コドンの９４ヌクレオチド（ｎｔ）下流に存在している。このＯＲＦ（ｖｐ２６）は２０ｋＤａの理論サイズを有する１８４アミノ酸のタンパク質をコードした。推定タンパク質は９．４の等電点を有する塩基性であった。Ｎ−結合グリコシル化のための３つの潜在サイト（Ｎ−｛Ｐ｝−［ＳＴ］−｛Ｐ｝）が存在し、３つの想定Ｏ−グリコシル化サイト（図２ｂ）をプログラムＮｅｔＯｇｌｙｃ（Ｈａｎｓｅｎら，１９９８）を用いて予想した。１３の可能なリン酸化サイト（［ＳＴ］−Ｘ−Ｘ−［ＤＥ］または［ＳＴ−Ｘ−［ＲＫ］）が見つかったが、他のモチーフはＰＲＯＳＩＴＥデータベースには存在しない。ＶＰ２６の１８４アミノ酸の疎水性分析は、非常に疎水性の領域がタンパク質のＮ末端に存在することを示した（図３ａ）。この領域は、α−らせんの形態でアミノ酸１２〜３４で形成される想定膜貫通アンカーを含んでいた。このアンカーの後には２つのアルギニンを含む正帯電領域があり、このことからＣ末端部分が細胞質側に向いていることが示唆される（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒら，１９９８）。膜貫通α−らせんの他に、Ｇａｍｉｅｒら（１９７８）のアルゴリズムを用いて１２７〜１４１位に潜在的なβ−シートが見つかった。タンパク質には１つのシステインしか存在せず、タンパク質内ジスルフィド架橋が形成され得ないことが示された。このシステインはＶＰ２８の場合のようにタンパク質のＣ末端部分に局在化していた。
【００５７】
２８ｋＤａタンパク質遺伝子の局在化及び配列
ＶＰ２８のアミノ酸配列はＷＳＳＶ末端断片配列の翻訳から得られなかった。このペプチドのＮ末端配列に基づいて、１組の縮重プライマーが開発された。前進プライマーは５’ＣＡＧＡＡＴＴＣＴＣＤ  ＡＴＮＧＴＹＴＴＮＧＴＮＡＣ３’（配列番号７）であり、逆プライマーは５’ＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＹＹＴＮ  ＷＳＮＴＴＹＡＣ３’（配列番号８）であり、いずれもＥｃｏＲＩサイト（下線）を含んでいた。配列上のプライマーの位置を図２ｃに示す。鋳型としてゲノムＷＳＳＶ  ＤＮＡを用いてＰＣＲを実施した。１２８ｂｐ長断片が得られ、２．５％アガロースゲルから精製後ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋にクローン化し、配列決定した。ヌクレオチド配列はＷＳＳＶ  ＶＰ２８のＮ末端タンパク質配列をコードし、この１２８ｂｐ断片を数個のＷＳＳＶプラスミドライブラリーに対するコロニーリフトアッセイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）で使用した。３ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片をこの断片とハイブリダイズし、更に分析した。
【００５８】
この遺伝子の６１２ｎｔ及びプロモーター領域の完全ＯＲＦ（ｖｐ２８）が３ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片に認められた（図２ｃ）。メチオニン出発コドン（ＧＴＣＡＴＧＧ）は効率的な真核翻訳開始（Ｋｏｚａｋ，１９８９）のための好ましい範囲にある。プロモーター領域には、コンセンサスＴＡＴＡボックスは存在しなかったが、Ａ／Ｔリッチ領域のストレッチは存在していた。ポリＡシグナルは翻訳停止コドンの５５ヌクレオチド下流に観察された。前記ＯＲＦはＮ末端配列アミノ酸を含む２０４アミノ酸の推定タンパク質をコードした。この酸性タンパク質の理論サイズは２２ｋＤであり、等電点は４．６であった。５つの可能なＮ−結合グリコシル化サイト（Ｎ−｛Ｐ｝−［ＳＴ］−｛Ｐ｝）、２つのＯ−グリコシル化サイト（Ｈａｎｓｅｎら，１９９８）（図２ｃ）及び９つの可能なリン酸化サイト（［ＳＴ］−Ｘ−Ｘ−［ＤＥ］または［ＳＴ−Ｘ］−［ＲＫ］）が見られた。ＰＲＯＳＩＴＥデータベース中に存在する他のモチーフはＶＰ２８では認められなかった。
【００５９】
２０４アミノ酸タンパク質のコンピユータ分析は、アミノ酸９〜２７により形成される想定膜貫通α−らせん配列を含む非常に疎水性の領域がタンパク質のＮ末端に存在したことを示した（図３ｂ）。ＶＰ２６の場合のように、前記膜貫通アンカー配列の後に正帯電領域があり、これから前記タンパク質は外から内に向かっていると示唆される。配列のＣ末端部分には、膜貫通配列を構成するであろう他の疎水性領域が認められた。しかしながら、Ｇａｒｎｉｅｒら（１９７８）のアルゴリズムはＶＰ２８のこの位置にα−らせんを予測していなかった。前記アルゴリズムは８９〜９９位に別のα−らせんを予測したが、タンパク質に沿ったβ−シートは予測していなかった。ＶＰ２６の場合のように、ＶＰ２８には１つのシステインしか存在していなかった。このシステインはタンパク質のＣ末端部分に局在化していた。
【００６０】
組換えｖｐ２４、ｖｐ２６及びｖｐ２８の発現及び分析
昆虫細胞において推定ＷＳＳＶビリオンタンパク質ＶＰ２４、ＶＰ２６、ＶＰ２６ｃ及びＶＰ２８を発現する組換えバキュロウイルスを作製するためにＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を使用した。ｖｐ２４、ｖｐ２６、ｖｐ２６ｃ及びｖｐ２８遺伝子（それぞれ、配列番号１１、配列番号１、配列番号９及び配列番号２）を、ｐ１０プロモーターの下流にＧＦＰ遺伝子を含むプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄ／ＧＦＰ由来のポリヒドリンプロモーターの下流にクローン化した。ｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄ／ＧＦＰ（コントロール）及びｖｐ２４、ｖｐ２６、ｖｐ２６ｃ及びｖｐ２８を含むプラスミドから作製した組換えウイルスをそれぞれＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰ、ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２４、ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６、ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６ｃ及びＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２８と命名した。すべての組換えウイルスはｐ１０プロモーターからＧＦＰを発現した。後者の４つは更にポリヒドリンプロモーターからＶＰ２４（配列番号１２）、ＶＰ２６（配列番号３）、ＶＰ２６ｃ（配列番号１０）及びＶＰ２８（配列番号４）を発現した。
【００６１】
ＡｃＭＮＰＶ−ｗｔ、ＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰ、ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６及びＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ８を感染させたＳｆ２１細胞の抽出物を１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。野生型ＡｃＭＮＰＶを感染させた細胞（図４ａのレーン３）では、ポリヒドリンである３２ｋＤａバンドが目視された。ＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰ感染細胞（レーン４）及びＷＳＳＶタンパク質を発現する組換え体を感染させた細胞（レーン５及び６）の抽出物を含むレーンでは、約２９ｋＤａでＧＦＰタンパク質バンドが観察された。ＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰ感染細胞におけるＧＦＰ発現はポリヒドリンプロモーター由来のＷＳＳＶタンパク質を発現するバキュロウイルスにおけるＧＦＰ発現に比してより強かった（レーン５及び６）。これは、各種ＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰ組換え体を感染させた細胞をＵＶ照射後にも容易に観察された。ＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰ感染細胞中のＧＦＰの蛍光が最強である（図示せず）。ポリヒドリンプロモーター由来のＷＳＳＶタンパク質の発現はｐ１０プロモーター由来のＧＦＰの発現に比して有意に高い（レーン５及び６）。多分ＷＳＳＶ  ＶＰ２６を表す２１ｋＤａタンパク質の強い発現はＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６感染細胞の抽出物で観察された（レーン５）。２８ｋＤａタンパク質の強い発現はＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２８感染細胞で観察された（レーン６）。これらのゲル中のＧＦＰの位置は抗−ＧＦＰ抗血清を用いるウェスタン分析により確認された（データ示さず）。
【００６２】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで電気泳動にかけた野生型及び組換えＡｃＭＮＰＶ感染Ｓｆ２１細胞のサンプルをウェスタン分析した。組換えＶＰ２６及びＶＰ２８を検出するためにＷＳＳＶビリオンに対するポリクローナル抗体を使用した（図４ｂ）。ＶＰ２６及びＶＰ２８の両方が前記細胞抽出物中で検出された。ＶＰ２６は２１ｋＤａで検出され、クマーシーブリリアントブルー染色ゲルと一致した（図４ａのレーン５；図４ｂのレーン５）。組換えＶＰ２８はＶＰ２８と同一位置でＷＳＳＶビリオンから遊走し、このタンパク質の理論サイズ２２ｋＤａよりも有意に高い。ポリクローナル抗体は、前記サンプルの非常に低いバックグラウンド反応で観察されたように昆虫細胞（レーン２）またはバキュロウイルス（レーン３及び４）と主要な交差反応性を示さなかった。
【００６３】
ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６ｃ及びＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２４を感染させたＳｆ２１細胞の抽出物を１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。低分子量マーカー及び精製ＷＳＳＶビリオンをも同一ゲルで分析した。ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６ｃ及びＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２４感染細胞を含むレーンでは２９ｋＤａでＧＦＰを表す弱いバンドが観察され、このバンドは感染細胞をＵＶ照射後はっきりと観察された。更に、ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６ｃ感染細胞を含むレーンでは、ゲル中のＷＳＳＶビリオンの２６ｋＤバンドと同じ位置に強いバンドが２６ｋＤで観察された。ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２４感染細胞を含むレーンでは、ＷＳＳＶビリンオンの２４ｋＤａタンパク質の位置に相当する２４ｋＤａに明らかなバンドが観察された。ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６ｃ感染細胞中の２６ｋＤａバンド及びＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２４感染細胞中の２４ｋＤａバンドがＷＳＳＶビリンオンの２６ｋＤａ及び２４ｋＤａタンパク質に相当することを確認するために、このゲルのウェスタンブロットをＷＳＳＶビリオンに対するポリクローナル抗体を用いて実施した。ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６ｃ感染細胞中の２６ｋＤａバンド及びＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２４感染細胞中の２４ｋＤａバンドがうまく検出された。
【００６４】
ＶＰ２６及びＶＰ２８の関連性
ＷＳＳＶ  ＶＰ２４、ＶＰ２６、ＶＰ２６ｃ及びＶＰ２８の相同性研究をＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴを用いてＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ、ＳＷＩＳＳＰＯＲＴ及びＰＩＲデータベースに対して実施した。ＧｅｎＢａｎｋ中の配列は、バキュロウイルスエンベロープまたはキャプシドタンパク質、他の大きなＤＮＡウイルス由来の構造タンパク質と有意な相同性が認められなかった。
【００６５】
中和実験
ウイルスストックの力価を滴定実験で求めた。ウイルスストックを１×１０７〜５×１０１１倍希釈し、各希釈物１０μｌを１０シュリンプ（Ｐｅｎａｅｕｓ ｍｏｎｏｄｏｎ，３〜４カ月令）に筋肉内注射した。ストックＷＳＳＶ溶液の１×１０８希釈物では７〜１２日後の死亡率は５０％であり、これを更なる実験で使用した。
４群のシュリンプを中和実験で使用した。
【００６６】
【表２】
0004786093.tif 000003
【００６７】
１シュリンプに投与したウイルスの総量はすべての群で一定であり、ウイルスストックの１×１０８希釈物１０μｌに等しい。群３及び４における血清濃度は同じである（注射１回につき、ＷＳＳＶ  １μｌ及び血清  ９μｌ）。注射後、シュリンプを４週間追跡し、死亡したシュリンプをＷＳＳＶの存在について電子顕微鏡で調べた。結果を図５に示す。
【００６８】
群１（ネガティブコントロール）のシュリンプはいずれもＷＳＳＶで死亡しなかったので、死亡率は０％である。群２（ポジティブコントロール）では、２３日後に死亡率は１００％に達した。前免疫血清（家兎にＶＰ２８タンパク質を注射する前に採取した血清）をＷＳＳＶに添加した群（群３）では、２５日後に死亡率は１００％に達した。ＶＰ２８抗血清をＷＳＳＶに添加したとき（群４）、すべてのシュリンプが生存しており、死亡率は０％であった。これらの結果は、ＶＰ２８抗血清がＰ．ｍｏｎｏｄｏｎにおけるＷＳＳＶ感染を中和できることを示す。
【００６９】
タンパク質の予防接種
群３〜６に異なるタンパク質溶液５μｌ（予防接種）及びｌ０μｌ（追加接種）を注射した。予防接種のために、群３にはＶＰ２８タンパク質２．５μｇ、群４にはＶＰ２６ｃタンパク質３．６μｇ、群５にはＶＰ２４タンパク質０．７μｇを与えた。群６には等容量のＶＰ２８溶液、ＶＰ２６ｃ溶液及びＶＰ２４溶液を含む混合物（タンパク質総量２．７μｇ）を与えた。追加接種のためにはシュリンプに高量のタンパク質を与えた。すなわち、群３にはＶＰ２８タンパク質９．６μｇ、群４にはＶＰ２６ｃタンパク質５．７μｇ、群５にはＶＰ２４タンパク質５．９μｇ、群６にはタンパク質総量７．１μｇを与えた。すべての群のシュリンプにストックＷＳＳＶ溶液の１×１０８希釈物１０μｌを注射した。
【００７０】
予防接種の結果を図６に示す。群１（ネガティブコントロール）のシュリンプはいずれもＷＳＳＶで死亡せず、よって死亡率は０％である。群２では、シュリンプは１日後からＷＳＳＶ感染のために死亡しはじめ、死亡率は増加し続ける。これらのシュリンプには中和実験のシュリンプと同一用量のＷＳＳＶウイルスを与えたが、群２のシュリンプは早くから死亡している。これは多分、この実験でシュリンプが複数回注射を受けたストレスの結果であろう。群３〜５（それぞれＶＰ２４、ＶＰ２６ｃ及びＶＰ２８を予防接種したシュリンプ）では、死亡は遅くなったが、群６（ＶＰ２４、ＶＰ２６ｃ及びＶＰ２８の混合物を予防接種したシュリンプ）ではＷＳＳＶで死亡したシュリンプはなく、よって死亡率は０％である。予防接種中の各タンパク質の用量を最適にすると、ＷＳＳＶ感染に対して高い防御効果が得られる。
【００７１】
【参考文献】
【表３】
0004786093.tif 000004
0004786093.tif 000005
0004786093.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】  ＷＳＳＶタンパク質であり、逆染色した無傷のビリオンの形態を示す写真である。
【図１ｂ】  ＷＳＳＶタンパク質であり、逆染色したＷＳＳＶヌクレオキャプシドの形態を示す写真である。
【図１ｃ】  ＷＳＳＶタンパク質であり、精製ＷＳＳＶの１５％クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真である）。
【図２ａ】  ＷＳＳＶ  ＶＰ２６及びＶＰ２８のヌクレオチド配列であり、ＷＳＳＶゲノム断片上のＶＰ２６及びＶＰ２８の位置を示す。
【図２ｂ】  ＷＳＳＶ  ＶＰ２６及びＶＰ２８のヌクレオチド配列であり、ＶＰ２６のヌクレオチド及びタンパク質配列を示す。
【図２ｃ】  ＷＳＳＶ  ＶＰ２６及びＶＰ２８のヌクレオチド配列であり、ＶＰ２８のヌクレオチド及びタンパク質配列を示す。
【図３ａ】  ＶＰ２６の疎水性プロットである。
【図３ｂ】  ＶＰ２８の疎水性プロットである。
【図４ａ】  １５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びウェスタンブロットで分析した昆虫細胞におけるＷＳＳＶ構造タンパク質のバキュロウイルス発現を示す。
【図４ｂ】  １５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びウェスタンブロットで分析した昆虫細胞におけるＷＳＳＶ構造タンパク質のバキュロウイルス発現を示す。
【図５】  構造タンパク質ＶＰ２８に対する抗血清によるシュリンプ中のＷＳＳＶの中和の結果を示す。
【図６】  シュリンプへのＷＳＳＶタンパク質の予防接種の結果を示す。
【配列表】
0004786093.tif 000007
0004786093.tif 000008
0004786093.tif 000009
0004786093.tif 000010
0004786093.tif 000011
0004786093.tif 000012
0004786093.tif 000013
0004786093.tif 000014
【図１ａ】
0004786093.tif 000015
【図１ｂ】
0004786093.tif 000016
【図１ｃ】
0004786093.tif 000017
【図２ａ】
0004786093.tif 000018
【図２ｂ】
0004786093.tif 000019
【図２ｃ】
0004786093.tif 000020
【図３ａ】
0004786093.tif 000021
【図３ｂ】
0004786093.tif 000022
【図４ａ】
0004786093.tif 000023
【図４ｂ】
0004786093.tif 000024
【図５】
0004786093.tif 000025
【図６】
0004786093.tif 000026