(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ｐ）を有しかつ動物由来成分を含有しない支持体に、接着性細胞を接着させ、この接着性細胞を動物由来成分を含有しない培地で培養し、培養した接着性細胞を動物由来成分を含有しない植物由来の蛋白質分解酵素、遺伝子組換え微生物由来の蛋白質分解酵素又はこれらの組み合わせである細胞分散剤を用いて継代培養した後、接着性細胞の培養細胞にウイルスを接種して増殖させることを特徴とするウイルスの生産方法。
【請求項２】
前記ウイルスが、フラビウイルス科、オルソミクソウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ピコルナウイルス科、パラミクソウイルス科、トガウイルス科及びポックスウイルス科からなる群より選ばれる少なくとも１種に属するウイルスである請求項１記載の生産方法。
【請求項３】
前記支持体が、マイクロキャリアーである請求項１又は２記載の生産方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のウイルスの生産方法を用いて製造され得るワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＢＳＥ（ウシ海綿状脳症）感染やトリインフルエンザウイルス感染等の人獣共通感染症に対する危険性が懸念され始めている。そして、主に動物に由来する原料又は材料を用いた製品（例えば、ワクチン，血液製剤，細胞培養／遺伝子組換え製剤，細胞組織医療品など）には、感染因子が混入する危険性が高く、未知の感染性因子を含有している可能性が否定できない他、感染因子の不活化処理等に限界があるなどの問題があった。このような問題に関する対策として、平成１５年度の薬事法の改正により「生物由来製品」という枠組みが新たに設けられるなど法的な安全性対策が強化されており、動物由来成分を全く含まない医薬製品の開発が望まれていた。【０００３】
各培地メーカーより動物由来成分を含有しない無血清培地が市販されるなど血清を必要としない培養条件を得るための多くの試みがなされているものの、無血清培地と、接着性細胞の培養の支持体として担体表面に適正な電荷を帯びさせて細胞を付着させるマイクロキャリアーとを使用した培養方法では、マイクロキャリアーへの付着率が低下し細胞を効率よく大量に培養することが困難であるといった問題があった。そのため、従来このような培養条件下では、例えば非特許文献１に記載されているようなブタ変性コラーゲンが被覆されたマイクロキャリアーなどの動物由来成分を含有するものが用いられていた。【０００４】
また、細胞の接着・増殖性が高く、無血清培地を用いても血清含有培地と同等以上の接触・増殖性を与える動物細胞培養用ビーズが特許文献１に開示されている。しかしながら、特許文献１には、細胞培養において無血清条件下で細胞の効率的な培養が可能なことが示されているものの、ウイルスの接種や増殖方法などウイルスの生産条件については開示されていない。【０００５】
また、特許文献２には、Ｖｅｒｏ細胞のような脊椎動物細胞培養を得、（血清および非血清タンパクを含まない）無タンパク培地中のみで細胞を増殖させ、この培養にウイルスを感染させ、ウイルスを感染させた細胞培養をインキュベーションして、培地中でウイルスを増殖させ、ウイルス含有培地を生産する工程を含むウイルスの生産方法が開示され、さらに、ウイルスの活性を増強する物質として原核生物供給源由来のプロテアーゼを用いることが開示されている。特許文献２には、この方法によれば得られるウイルスがヒト供給源、または動物供給源由来のあらゆる夾雑化合物、または病原性物質であるタンパクを含まないと記載されているが、実施例には、ウイルスの活性を増強する物質として動物由来成分のトリプシンが使用されている。【０００６】
さらに、特許文献３には、天然由来のタンパク質を使用せず細胞接着性の高い細胞接着支持体を用いたウイルス感染昆虫細胞の生産方法が開示されている。この生産方法は、細胞接着性人工ペプチド及び／又は細胞接着補助人工ペプチドを用いて、変温動物由来細胞及び基材を接着させ、この細胞接着基材を用いて細胞培養することを特徴とするウイルス感染昆虫細胞の生産方法である。特許文献３には、基材に天然由来のタンパク質を用いないためにヒト感染性のウイルス等の感染物質を含有する危険性がなく安全性が高いと記載されているものの、動物由来成分を含有しない細胞分散剤及び恒温動物由来の接着性細胞についての開示はない。一方、非特許文献１の細胞の継代には細胞分散剤として、動物由来のプロテアーゼ（例えば、ブタ由来トリプシンなど）が使用されている。
【特許文献１】特開２００３−１８９８４８号公報
【特許文献２】特許３１５８１５７号公報（ＷＯ９６／１５２３１号パンフレット）
【特許文献３】特開２００３−２１０１６６号公報
【非特許文献１】Otfried  Kistner  et  al．  ”Development  of  a  Novel  MammalianCell  (Vero)  Derived  influenza  Vaccine”Poster  Presented  at：Options  for  ControlOf  Influenza  V，Okinawa，Japan，October  7-11，2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、接着性細胞の培養とその細胞培養によるウイルスの工業的生産までの工程において、動物由来成分を全く含有せず、安全で効率の良いウイルスの生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題に鑑みて鋭意検討した結果、動物由来成分を含有しない培養材料を用いることによって、安全で効率の良いウイルスの生産方法を見出し、本発明に想到した。【０００９】
本発明のウイルスの生産方法の特徴は、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ｐ）を有しかつ動物由来成分を含有しない支持体に、接着性細胞を接着させ、この接着性細胞を動物由来成分を含有しない培地で培養し、培養した接着性細胞を動物由来成分を含有しない植物由来の蛋白質分解酵素、遺伝子組換え微生物由来の蛋白質分解酵素又はこれらの組み合わせである細胞分散剤を用いて継代培養した後、接着性細胞の培養細胞にウイルスを接種して増殖させる点を要旨とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のウイルスの生産方法は、安全で効率良くウイルスを生産することができる。よって、本発明の方法は、ワクチンの生産に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１及び比較例１〜３における細胞密度の経時的変化を示すグラフである。
【図２】実施例１及び比較例１〜３におけるＥＬＩＳＡによるウイルス産生量の経時的変化を示すグラフである。
【図３】実施例１及び比較例１〜３におけるＨＡによるウイルス産生量の経時的変化を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において「動物由来成分を含有しない」とは、恒温動物、特に哺乳類（例えば、ヒト，ウシ，ブタ，イヌ，ウサギ，ネコなど），鳥類、魚類などの動物由来の成分を含有しないことを意味する。【００１３】
また、本発明において接着性細胞とは、固体表面に接着して増殖し、ウイルスを増殖可能な恒温動物由来の細胞であれば特に限定されないが、例えば、上皮細胞（Ｖｅｒｏ細胞，ＭＤＣＫ細胞，ＣＨＯ細胞，ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞など），腫瘍細胞（Ｈｅｌａ細胞，ＶＡＣＯ細胞など）、内皮細胞（ＨＵＶＥＣ細胞，ＤＢＡＥ細胞など），白血球（ＨＩＴ−Ｔ１５細胞など），線維芽細胞（ＷＩ３８細胞，ＢＨＫ２１細胞，ＳＦＭＥ細胞など），筋肉細胞（ＨＬ１細胞，Ｃ２Ｃ１２細胞など），神経／内分泌腺細胞（ＲＯＣ−１細胞，ＩＭＲ−３２細胞など）及び初代細胞（鶏胚初代細胞、ウズラ胚初代細胞及びウサギ腎初代細胞等）などが挙げられる。これらのうち好ましくは、上皮細胞及び初代細胞、さらに好ましくは、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞及び初代細胞、特に好ましくＶｅｒｏ細胞及びＭＤＣＫ細胞、最も好ましくはＶｅｒｏ細胞である。【００１４】
また、本発明で接着性細胞に接種されるウイルスとしては、例えば、フラビウイルス科(Flaviviridae)｛例えば、黄熱病ウイルス(Yellow  fever  virus)、  日本脳炎ウイルス(Japanese  encephalitis  virus)、C型肝炎ウイルス(hepatitis  C  virus)及びデング熱ウイルス(Dengue  fever  virus)等｝、オルソミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)｛インフルエンザウイルス(Influenza  virus)等｝、アデノウイルス科(Adenoviridae)｛ヒトアデノウイルス１〜３４型（Human  adenovirus  1-34）等｝、ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)｛単純ヘルペスウイルス1型、(Herpes  simplex  I)、単純ヘルペスウイルス2型(Herpes  simplex  II)、仮性狂犬病ウイルス（Pseudorabies  virus）、水痘帯状疱疹ウィルス(Varicella-zoster  virus)及びヒトサイトメガロウイルス(Human  cytomegalovirus)等｝、ピコルナウイルス科(Picornaviridae)｛アフトウイルスＯ型(Aphthovirus  O)、口蹄疫ウイルス(Foot-and-mouth  disease  virus)、ポリオウイルス(Poliovirus)  及びA型肝炎ウィルス(Hepatitis  A  virus)等｝、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)｛麻疹ウイルス(Measles  virus)、おたふくかぜウイルス(Mumps  virus)及びセンダイウイルス(Sendai  virus)等｝、トガウイルス科(Togaviridae)｛風疹ウイルス(Rubella  virus)及び脳炎ウイルス(Encephalitis  virus)等｝、  ポックスウイルス科(Poxviridae)｛［ワクシニアウイルス(Vaccinia  virus)、痘瘡ウイルス(Variola  virus)、牛痘ウイルス(Cowpox  virus)及びサル痘ウイルス（Monkeypox  virus）等］、レトロウイルス科  (Retroviridae)｛ヒト免疫不全ウイルス(Human  immunodeficiency  virus,  HIV)及び  成人T細胞白血病ウィルス(Human  T-lymphotropic  virus)等｝、及びコロナウイルス科(Coronaviridae)｛ニワトリ伝染性気管支炎ウイルス(Avian  infections  bronchitis  virus)等｝等が含まれる｛生化学辞典（第２版）、東京化学同人１９９７年９月１１日発行｝。これらのうち、フラビウイルス科、オルソミクソウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ピコルナウイルス科、パラミクソウイルス科、トガウイルス科又はポックスウイルス科に属するウイルスが好ましく、さらに好ましくはフラビウイルス科、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科又はトガウイルス科に属するウイルス、特に好ましくはオルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科又はトガウイルス科に属するウイルス、最も好ましくはオルソミクソウイルス科に属するウイルスである。【００１５】
さらに、本発明で使用した動物由来成分を含有しない培養材料（例えば、培地，細胞分散剤，接着性細胞を接着させるための支持体など）は、動物由来成分を含有していないため、外来性物質による汚染の可能性を最低限に抑えることができ、未知の感染性因子を含有していることがなく、さらに感染因子混入の危険性が低く、そのため感染因子を不活化させる処理を行う必要がないなどの利点を有する。以下、動物由来成分を含有しない培養材料について具体的に説明する。【００１６】
接着性細胞の培養およびウイルス生産に用いる培地は、動物由来成分である血清やタンパク質などを含有しない培地（以下、無血清培地）であれば特に限定されず、例えば、市販の無血清培地｛ＯPTIＰＲＯTMＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、ＶＰ−ＳＦＭ（インビトロジェン社製）及びＥＸ−ＣＥＬＬ５２５（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製等）｝、基礎培地｛イーグルＭＥＭ培地、ダルベッコ改変イーグル培地、イスコフ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＭＣＤＢ１０５培地、ＭＣＤＢ１０７培地、ＭＣＤＢ１１０培地、ＭＣＤＢ１３１培地、ＭＣＤＢ１５１培地、ＭＣＤＢ１５２培地、ＭＣＤＢ１５３培地、ＭＣＤＢ２０１培地、ＭＣＤＢ３０２培地及びＭＥＤＩＵＭ１９９等｝及びこれらの混合培地等が挙げられる。これらのうち、培地の調製の観点等から、市販の無血清培地が好ましく、さらに好ましくはＯPTIＰＲＯTMＳＦＭ培地、ＶＰ−ＳＦＭ及びＥＸ−ＣＥＬＬ５２５、特に好ましくはＶＰ−ＳＦＭ及びＥＸ−ＣＥＬＬ５２５、特に好ましくはＶＰ−ＳＦＭである。このＶＰ−ＳＦＭは、ウイルスの増殖に利用されるＶｅｒｏ，ＣＯＳ−７，ＭＤＣＫ，ＢＨＫ−２１，ＨＥｐ−２等の細胞系の培養に適している。無血清培地中には、動物由来ではない添加物として、遺伝子組換え微生物由来等のホルモン（インシュリン及びヒドロコルチゾン等）、細胞増殖因子（上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）及び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等）及び抗菌剤（カナマイシン等）等を適宜添加して、細胞の増殖性を安定的に向上させることができる。【００１７】
支持体の材質としては、接着性細胞が接着できる材質であれば特に限定されないが、細胞毒性の観点等から以下の物質を主成分とすることが好ましい。
（１）合成高分子：ビニル樹脂、ポリエステル、ポリウレタン、エポキシ樹脂、ナイロン及びポリカーボネート等。
（２）天然高分子：セルロース、セルロース誘導体（セルロースジアセテート及びセルローストリアセテート等）、及びデキストラン等。
（３）無機物：酸化アルミニウム、ハイドロキシアパタイト、酸化チタン、シリカ及びガラス等。【００１８】
これらのうち、合成高分子、天然高分子及びハイドロキシアパタイトが好ましく、さらに好ましくは合成高分子及び天然高分子、特に好ましくは合成高分子、最も好ましくはビニル樹脂及びナイロンである。【００１９】
ビニル樹脂としては、ビニルモノマー｛アクリルモノマー、アルケン及びスチレン等｝及び必要により多官能性モノマー等を構成単位としてなるポリマー｛ポリスチレン、架橋ポリスチレン、ポリメチル（メタ）アクリレート、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリアクリルアミド架橋体（アクリルアミドとエチレングリコールジアクリレートとの共重合体等）及びポリ（メタ）アクリロニトリル等｝等が挙げられる。これらのうち、スチレンを必須構成単位としてなる樹脂が好ましく、さらに好ましくは架橋ポリスチレンである。【００２０】
多官能性モノマーとしては、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリビニルベンゼン及びトリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート等が含まれる。【００２１】
支持体の形状としては、接着性細胞が接着できる形状であれば特に限定されず、プレート、シャーレ、Ｔ−フラスコ、ローラーボトル、マイクロキャリアー、ホローファイバー、シート（フィルム、フォーム（スポンジ）及び布等）及びゲル等のいずれでもよい。これらのうち、培養量の観点等から、シャーレ、Ｔ−フラスコ、ローラーボトル、マイクロキャリアー及びホローファイバーが好ましく、さらに好ましくはローラーボトル、マイクロキャリアー及びホローファイバー、特に好ましくはマイクロキャリアー及びホローファイバー、最も好ましくはマイクロキャリアーである。【００２２】
マイクロキャリアーの形態には中実型と多孔質型とがあるがいずれも使用できるが、細胞への栄養や酸素の供給効率や細胞の回収率の観点等から、中実型が好ましい。また、マイクロキャリアーの形状としては、球状及び扁平（楕円）等のいずれも使用できる。【００２３】
マイクロキャリアーの粒子径（μｍ）は、中実型の場合、２０〜２０００が好ましく、さらに好ましくは４０〜１０００、特に好ましくは８０〜５００である。一方、多孔質型の場合、粒子径（μｍ）は、３０〜２５０００が好ましく、さらに好ましくは６０〜１２０００、特に好ましくは１２０〜６０００である。この範囲内であると、細胞の増殖量がさらに高くなる。【００２４】
マイクロキャリアーの真比重は特に制限ないが、マイクロキャリアーを培地とともに撹拌しながら培養する一般的な方法において、撹拌中はビーズは浮遊し、撹拌を止めると沈降することが好ましい。このような観点から、マイクロキャリアーの真比重（ｇ／ｃｍ3）は、１.００〜１.１０が好ましく、さらに好ましくは１.０１〜１.０８、特に好ましくは１．０１〜１．０５である。【００２５】
マイクロキャリアーは市場から容易に入手でき、以下のような商品等が使用できる。
（１）ポリスチレン製：ナルジェヌンク社製バイオシロン（Biosilon）、ソロヒル社製プラスチックビーズ（Plastic  beads）及びラックス社製サイトスフェア（Cytosphere）等。
（２）ポリアクリルアミド製：バイオラッド(株)製バイオキャリア（Biocarrier）等。
（３）ポリウレタン製：イノアック(株)製ＰＵＦ等。
（４）セルロース製：バイオマテリアル(株)製セルスノウ（Cellsnow）等。
（５）デキストラン製：アムシャムファルマシア社製サイトデックス（Cytodex）等。
（６）ガラス製：スコット社製シラン（SIRAN）等。【００２６】
支持体は、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ｐ）が含有している。ポリペプチド（Ｐ）を含有することにより、動物由来の材料を使用しなくても効率の高いウイルス生産が実現できるのである。【００２７】
「細胞接着性最小アミノ酸配列」とは、細胞のインテグリンレセプターに認識され細胞が基材に接着しやすくなる性質を有する最小アミノ酸配列を意味する。【００２８】
ポリペプチド（Ｐ）中の細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）の含有個数（個）は、細胞接着性の観点等から、（Ｐ）１分子中、１〜５０が好ましく、さらに好ましくは３〜３０、特に好ましくは４〜２０である。【００２９】
細胞接着性最小アミノ酸配列（X)としては、接着シグナルとして働くものであればいずれも使用でき、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７、１９９０年、５２７頁に記載されているもの等が使用できる。これらのうち、接着しやすい細胞の種類が多いという観点等から、Arg  Gly  Asp配列、Leu  Asp  Val配列、Leu  Arg  Glu配列、His  Ala  Val配列、及び配列番号（１）〜（８）で表される配列が好ましく、さらに好ましくはArg  Gly  Asp配列、His  Ala  Val配列及び配列番号（７）で表される配列であり、特に好ましくはArg  Gly  Asp配列である。【００３０】
ポリペプチド（Ｐ）は、細胞接着性最小アミノ酸配列（X)以外に、（Ｐ）の熱安定性向上の観点等から、補助アミノ酸配列（Ｙ）を有することが好ましい。【００３１】
補助アミノ酸配列（Ｙ）としては、最小アミノ酸配列（Ｘ）以外のアミノ酸配列が使用でき、ポリペプチド（Ｐ）の耐熱性向上の観点等から、Gly  及び／又はAlaを有する配列が好ましい。【００３２】
補助アミノ酸配列（Y）としては、（Gly  Ala）a  配列、（Gly  Ala  Gly  Ala  Gly  Ser）b配列、（Gly  Ala  Gly  Ala  Gly  Tyr）c配列、（Gly  Ala  Gly  Val  Gly  Tyr）ｄ配列、（Gly  Ala  Gly  Tyr  Gly  Val）e配列、｛Asp  Gly  Gly  (Ala)f  Gly  Gly  Ala｝g配列、（Gly  Val  Pro  Gly  Val）h配列、（Gly）i配列、（Ala）j配列、（Gly  Gly  Ala）k配列、（Gly  Val  Gly  Val  Pro）ｍ配列、（Gly  Pro  Pro）ｎ配列、（Gly  Ala  Gln  Gly  Pro  Ala  Gly  Pro  Gly）ｏ配列、（Gly  Ala  Pro  Gly  Ala  Pro  Gly  Ser  Gln  Gly  Ala  Pro  Gly  Leu  Gln）ｐ配列及び／又は（Gly  Ala  Pro  Gly  Thr  Pro  Gly  Pro  Gln  Gly  Leu  Pro  Gly  Ser  Pro）ｑ配列を有する配列等が含まれる。これらのうち、（Gly  Ala）a配列、（Gly  Ala  Gly  Ala  Gly  Ser）b配列、（Gly  Ala  Gly  Ala  Gly  Tyr）c配列、（Gly  Ala  Gly  Val  Gly  Tyr）d配列、（Gly  Ala  Gly  Tyr  Gly  Val）e、｛Asp  Gly  Gly  (Ala)f  Gly  Gly  Ala｝g配列、（Gly  Val  Pro  Gly  Val）h配列、（Gly  Val  Gly  Val  Pro）ｍ配列及び／又は（Gly  Pro  Pro）ｎ配列を有するものが好ましく、さらに好ましくは（Gly  Ala  Gly  Ala  Gly  Ser）b配列、（Gly  Val  Pro  Gly  Val）h配列、（Gly  Val  Gly  Val  Pro）ｍ配列及び／又は（Gly  Pro  Pro）ｎ配列を有するもの、特に好ましくは（Gly  Ala  Gly  Ala  Gly  Ser）b配列を有するものである。【００３３】
なお、aは５〜１００の整数、b、ｃ、ｄ及びｅは２〜３３の整数、fは１〜１９４の整数、ｇは｛１｝〜｛２００／（６＋ｆ）｝の小数点以下を切り捨てした整数、hは２〜４０の整数、i及びjは１０〜２００の整数、kは３〜６６の整数、ｍは２〜４０の整数、ｎは３〜６６の整数、ｏは１〜２２の整数、ｐ及びｑは１〜１３の整数である。【００３４】
補助アミノ酸配列（Ｙ）は、グリシン(Gly)及び／又はアラニン(Ala)を含むことが好ましい。グリシン（Gly）及びアラニン（Ala）を含む場合、これらの合計含有割合（％）は、補助アミノ酸配列（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて、１０〜１００が好ましく、さらに好ましくは２０〜９５、特に好ましくは３０〜９０、最も好ましくは４０〜８５である。この範囲であると、耐熱性がさらに良好となる。【００３５】
グリシン（Gly）及びアラニン（Ala）の両方を含む場合、これらの含有個数割合（Gly／Ala）は、０．０３〜４０が好ましく、さらに好ましくは０．０８〜１３、特に好ましくは０．２〜５である。この範囲であると、耐熱性がさらに良好となる。【００３６】
ポリペプチド（Ｐ）中の補助アミノ酸配列（Ｙ）の含有個数は、耐熱性向上の観点等から、（Ｐ）１分子中、２〜５１が好ましく、さらに好ましくは３〜３５、特に好ましくは４〜２０である。また、ポリペプチド（P）は、２種以上の補助アミノ酸配列（Ｙ）を含んでもよい。【００３７】
（Gly  Ala）a配列を有する補助与アミノ酸配列としては、配列番号（９）〜（１１）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。【００３８】
（Gly  Ala  Gly  Ala  Gly  Ser）b配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１２）〜（１４）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。【００３９】
（Gly  Ala  Gly  Ala  Gly  Tyr）c配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１５）〜（１７）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。【００４０】
（Gly  Ala  Gly  Val  Gly  Tyr）d配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１８）〜（２０）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。【００４１】
（Gly  Ala  Gly  Tyr  Gly  Val）e配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２１）〜（２３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。【００４２】
｛Asp  Gly  Gly  (Ala)f  Gly  Gly  Ala｝g配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２４）〜（２６）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。【００４３】
（Gly  Val  Pro  Gly  Val）h配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２７）〜（３０）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。【００４４】
（Gly）i配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３１）〜（３３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。【００４５】
（Ala）j配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３４）〜（３６）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。【００４６】
（Gly  Gly  Ala）k配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３７）〜（３９）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。【００４７】
（Gly  Val  Gly  Val  Pro）ｍ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４０）〜（４２）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。【００４８】
（Gly  Pro  Pro）ｎ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４３）〜（４５）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。【００４９】
（Gly  Ala  Gln  Gly  Pro  Ala  Gly  Pro  Gly）ｏ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４６）〜（４８）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。【００５０】
（Gly  Ala  Pro  Gly  Ala  Pro  Gly  Ser  Gln  Gly  Ala  Pro  Gly  Leu  Gln）ｐ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４９）〜（５１）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。【００５１】
（Gly  Ala  Pro  Gly  Thr  Pro  Gly  Pro  Gln  Gly  Leu  Pro  Gly  Ser  Pro）ｑ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５２）〜（５４）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。【００５２】
これらのアミノ酸配列のうち、配列番号（９）、（１０）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）、（１６）、（１８）、（１９）、（２１）、（２２）、（２４）、（２５）、（２６）、（２７）、（２８）、（３０）、（３１）、（３２）、（３４）、（３５）、（３７）、（３８）、（４０）、（４１）、（４３）、（４４）、（４６）、（４７）、（４９）、（５０）、（５２）又は（５３）で表されるアミノ酸配列が好ましく、さらに好ましくは配列番号（１０）、（１２）、（１３）、（１４）、（１６）、（１９）、（２２）、（２６）、（２７）、（２８）、（２９）、（３０）、（３２）、（３５）、（３８）、（４１）、（４４）、（４７）、（５０）又は（５３）で表されるアミノ酸配列、特に好ましくは配列番号（１２）、（１３）又は（３０）で表されるアミノ酸配列である。【００５３】
ポリペプチド（Ｐ）は、分岐鎖を含んでいてもよく、一部が架橋されていてもよく、環状構造を含んでいてもよい。しかし、ポリペプチド（Ｐ）は、架橋されていないことが好ましく、さらに好ましくは架橋されていない直鎖構造、特に好ましくは環状構造を持たず架橋されていない直鎖構造である。なお、直鎖構造には、β構造（直鎖状ペプチドが折れ曲がってこの部分同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造）も含まれる。【００５４】
ポリペプチド（Ｐ）は、細胞接着性及び耐熱性の観点等から、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造であることが好ましい。この場合、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との繰り返し単位（Ｘ−Ｙ）の数（個）は、細胞接着性の観点等から、１〜５０が好ましく、さらに好ましくは２〜４０、特に好ましくは３〜３０、最も好ましくは４〜２０である。【００５５】
また、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との含有個数は同じでも異なっていてもよい。異なっている場合は、いずれかの含有個数が他方の含有個数より１個少ないことが好ましい｛この場合、補助アミノ酸配列（Ｙ）が少ないことが好ましい｝。ポリペプチド（Ｐ）中の最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との含有個数割合（Ｘ／Ｙ）は、０．６６〜１．５が好ましく、さらに好ましくは０．９〜１．４、特に好ましくは１〜１．３である。【００５６】
また、ポリペプチド（Ｐ）の末端部分（最小アミノ酸配列（Ｘ）又は補助アミノ酸配列（Ｙ）からペプチド末端まで）に他のアミノ酸を含んでもよい。他のアミノ酸を含む場合、その含有量は、ポリペプチド１個当たり、１〜１０００個が好ましく、さらに好ましくは３〜３００、特に好ましくは１０〜１００である。【００５７】
ポリペプチド（Ｐ）の数平均分子量（Ｍｎ）は、１，０００〜１，０００，０００が好ましく、さらに好ましくは２，０００〜７００，０００、特に好ましくは３，０００〜４００，０００、最も好ましくは４，０００〜２００，０００である。なお、ポリペプチドの数平均分子量（Ｍｎ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプル｛ポリペプチド等｝を分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法等の公知の方法によって求められる（以下、同じ）。【００５８】
ポリペプチド（Ｐ）の好適な例を以下に示す。
（１）最小アミノ酸配列（Ｘ）がArg  Gly  Asp配列（ｘ１）の場合
（ｘ１）の１３個と（Gly  Ala  Gly  Ala  Gly  Ser）9配列（１３）（ｙ１）の１３個とを有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約１１万のポリペプチド（「プロネクチンＦ」、プロネクチン：登録商標（日本及び米国）、三洋化成工業（株）製＜以下同じ＞）；
（ｘ１）の５個と（Gly  Ala  Gly  Ala  Gly  Ser）3配列（１２）（ｙ２）の５個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約２万のポリペプチド（「プロネクチンＦ２」）；
（ｘ１）の３個と（Gly  Val  Pro  Gly  Val）2  Gly  Gly  （Gly  Ala  Gly  Ala  Gly  Ser）3配列（３０）（ｙ３）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約１万のポリペプチド（「プロネクチンＦ３」）等。
（２）最小アミノ酸配列（Ｘ）がIle  Lys  Val  Ala  Val配列（ｘ２）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のArg  Gly  Asp配列（ｘ１）をIle  Lys  Val  Ala  Val配列（７）（ｘ２）に変更した「プロネクチンＬ」、「プロネクチンＬ２」、又は「プロネクチンＬ３」等。
（３）最小アミノ酸配列（Ｘ）がTyr  Ile  Gly  Ser  Arg配列（ｘ３）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のArg  Gly  Asp配列（ｘ１）をTyr  Ile  Gly  Ser  Arg配列（ｘ３）に変更した「プロネクチンＹ」、「プロネクチンＹ２」、又は「プロネクチンＹ３」等。【００５９】
また、（１）〜（３）のポリペプチドの他、宝酒造（株）製ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（リコンビナントヒトフィブロネクチンＣＨ−２９６）｛最小アミノ酸配列（Ｘ）としてArg  Gly  Asp配列（ｘ１）及びLeu  Asp  Val配列を含有するＭｎ約6万のポリペプチド｝、同ＲＧＤＳ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ｛最小アミノ酸配列（Ｘ）としてArg  Gly  Asp配列（ｘ１）を含有するＭｎ約３万のポリペプチド｝も好ましく使用できる｛ただし、これらのポリペプチドは補助アミノ酸配列（Ｙ）が含まれていない。よって、耐熱性等が上記の（１）〜（３）よりも劣る。また、これらのポリペプチドのアミノ酸配列は特開平２−３１１４９８号（ＵＳ５１９８４２３Ａの開示内容を参照により本出願に取り込む）に開示されている。｝。【００６０】
ポリペプチド（Ｐ）の製造方法は特に制限されず、ペプチドを合成する従来既知の方法と同様にして製造することができ、例えば、有機合成法（固相合成法、液相合成法等）及び生化学的合成法［遺伝子組換え微生物（酵母、細菌、大腸菌等）］等によって合成することができる。有機合成法に関しては、例えば、日本生化学学会編「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）」第６４１〜６９４頁（昭和６２年５月２０日；株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が用いられる。生化学的合成法に関しては、例えば、特表平３−５０２９３５号公報（ＵＳ５２４３０３８Ａ、ＵＳ５４９６７１２Ａ、ＵＳ５５１４５８１Ａ、ＵＳ５６０６０１９Ａ、ＵＳ５６４１６４８Ａ、ＵＳ５７２３５８８Ａ、ＵＳ５７７０６９７Ａ、ＵＳ５７７３２４９Ａ、ＵＳ５８０８０１２Ａ、ＵＳ５８３０７１３Ａ、ＵＳ６０１８０３０Ａ、ＵＳ６１４００７２Ａ、ＵＳ６１８４３４８Ｂ１、ＵＳ６３５５７７６Ｂ１、ＵＳ６３８０１５４Ｂ１、ＵＳ２００３０８３４６４Ａ１及びＵＳ２００３１７６３５５Ａ１の開示内容を参照により本出願に取り込む）に記載されている方法等が用いられる。高分子量のポリペプチド（Ｐ）を容易に合成できる点で、遺伝子組換え微生物による生化学的合成法が好ましく、特に好ましくは遺伝子組換大腸菌を用いて合成する方法である。【００６１】
支持体にポリペプチド（Ｐ）を含有する場合、（Ｐ）は、支持体の表面に含有していればよく、（Ｐ）は化学結合（イオン結合、水素結合及び／又は共有結合等）及び／又は物理吸着（ファンデルワールス力による吸着）によって、支持体の表面に結合されている。これらのうち、化学結合が好ましく、さらに好ましくは共有結合である。【００６２】
支持体にポリペプチド（Ｐ）を共有結合させる反応は公知の方法で行うことができる。例えば、「ペプチド合成の基礎と実験、平成９年１０月５日、丸善株式会社発行」に記載の方法が挙げられ、具体的には、以下の（１）〜（３）の通りである。【００６３】
（１）ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものとポリペプチド（Ｐ）を含有しない支持体（以下、Ｐ未含有支持体）のうちカルボキシル基を有するものとを反応させる場合、Ｐ未含有支持体のカルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素｛Ｒ’−Ｎ＝Ｃ（ＯＣＯＲ）−ＮＨ−Ｒ’（−ＯＣＯＲが支持体に由来する部分）｝を得た後、ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものをこのアシルイソ尿素に加えることによって、Ｐ未含有支持体とポリペプチドとをアミド結合できる。【００６４】
カルボジイミド化合物としては、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等が挙げられる。【００６５】
（２）ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものとＰ未含有支持体のうちヒドロキシル基を有するものとを反応させる場合、Ｐ未含有支持体のヒドロキシル基を予めカルボニルジイミダゾール化合物と反応させ、イミダゾール誘導体｛Ｒ−Ｉｍ、Ｉｍはイミダゾリン環、Ｒが支持体に由来｝を得た後、ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものをこのイミダゾール誘導体に加えることによって、Ｐ未含有支持体とポリペプチドとをＮ−Ｃ結合できる。【００６６】
カルボニルジイミダゾール化合物としては、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール等が挙げられる。【００６７】
（３）ポリペプチドのうちヒドロキシル基を有するものとＰ未含有支持体のうちカルボキシル基を有するものとを反応させる場合、Ｐ未含有支持体のカルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素を得た後、ポリペプチドのうちヒドロキシル基を有するものをこのアシルイソ尿素に加えることによって、Ｐ未含有支持体とポリペプチドとをエステル結合できる。【００６８】
ポリペプチドをＰ未含有支持体に、物理吸着、イオン結合及び／又は水素結合させる方法としては、溶媒等にポリペプチドとＰ未含有支持体とを投入し、混合して作製する方法等が挙げられる。溶媒としては特に制限はないが、水（水道水、イオン交換水、蒸留水及びイオン交換した蒸留水等）の他に、無機塩、有機酸塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液（例えば特開２００３−１８９８４８）等が使用できる。無機塩、有機酸塩、酸及び塩基の含有量（重量％）は、水溶液の重量に基づいて、０．００１〜５０が好ましく、さらに好ましくは０．００５〜３０、特に好ましくは０．０１〜１０である。【００６９】
これらの溶媒の中で、無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液、並びに水が好ましく、さらに好ましくは無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液、並びにイオン交換した蒸留水、特に好ましくは無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液である。【００７０】
支持体にポリペプチド（Ｐ）を含有する場合、ポリペプチド（Ｐ）の含有量（μｇ／ｃｍ2）は、支持体の平均表面積１ｃｍ2当り、０．０００１〜１０００００が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜１００００、特に好ましくは０．０１〜１０００である。この範囲であると、細胞培養の効率がさらに高くなる。【００７１】
ポリペプチド（Ｐ）の含有量は、次のようにして求められる。
（１）支持体の単位重量当たりのポリペプチド（Ｐ）の含有量（μｇ／ｇ）を、例えば免疫学的測定法（特開２００４−０４９９２１等に記載）により定量する。すなわち、支持体と、ポリペプチド（Ｐ）と結合する抗体に酵素を標識したもの（以下、酵素標識抗体１）とを反応させ、この反応した酵素標識抗体１の酵素量を測定することにより、単位重量あたりのポリペプチド（Ｐ）の含有量を測定する。
（２）次に、表面形状測定顕微鏡｛共焦点原理を利用した３Ｄ形状測定顕微鏡、たとえばキーエンス（株）製ＶＫ−９５００｝を用いて、支持体をスライドガラスに接着剤等で固定化したもの（以下、固定化支持体）の上部の表面（例えば、２０μｍ×２０μｍ）について、表面形状の３次元データ得る。そして、この３次元データから細孔（直径１μｍ未満）部分を一律に除外して（平坦な表面として補正して）、リブ（畝）等を有する支持体の部分表面積（Ａ）を求める。また、表面形状の３次元データから、細孔（直径１μｍ未満）及びリブ（畝）等を一律に除外して（平坦な表面として補正して）、表面がフラットな支持体の部分表面積（Ｂ）を求める。さらに支持体の９個について３次元データを同様にして測定し、支持体の部分表面積（Ａ）及び支持体の部分表面積（Ｂ）を求める。そして、支持体１０個について、リブ等を有する支持体の部分表面積（Ａ）の平均部分表面積（ＨＡ）及び表面がフラットな支持体の部分表面積（Ｂ）の平均部分表面積（ＨＢ）を算出する。【００７２】
支持体が球状の場合は、式｛単位重量当たりの平均表面積（ｃｍ2／ｇ）＝［４×π×（ｒａ／２／１００００）2］／［４／３×π×（ｒａ／２／１００００）3×ｄ］×［（ＨＡ）／（ＨＢ）］｝から、支持体の単位重量当たりの平均表面積を算出する。なお、ｒａは支持体の粒子径であり、ｄは支持体の真比重である。【００７３】
なお、球状でない支持体（棒状、直方体及び板状等）や多孔質の支持体であって、上記の方法では計算できない場合、支持体の単位重量当たりの平均表面積は、以下のようにして算出される。【００７４】
比表面積計（例えば、ＱＵＡＮＴＡＳＯＲＢ（ユアサアイオニクス製）を用いて支持体の表面積を測定（測定ガス；Ｈｅ／Ｋｒ＝９９．９／０．１体積比、検出ガス；窒素）し、式｛支持体の表面積／支持体の重量｝から、支持体の単位重量当たりの平均表面積（ｃｍ2／ｇ）を算出する。
（３）単位重量当たりのポリペプチド（Ｐ）の含有量（μｇ／ｇ）を、単位重量当たりの平均表面積（ｃｍ2／ｇ）で除して、支持体の平均表面積１ｃｍ2当たりの含有量（μｇ／ｃｍ2）を算出する。【００７５】
細胞分散剤とは、継代培養の際に使用される動物由来成分を含有しない細胞分散剤であって、支持体から細胞を剥離する目的で使用するものを意味する。細胞分散剤としては、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、２〜３０℃の無血清培地、植物由来の蛋白質分解酵素（パパイン等）、遺伝子組換え微生物由来の蛋白質分解酵素（トリプシン様酵素（インビトロジェン社製rProtease等））及びこれらの組合せ等が挙げられる。これらのうち、支持体から細胞の剥離性の観点等から、植物由来の蛋白質分解酵素、遺伝子組換え微生物由来の蛋白質分解酵素及びこれらの組合せが好ましく、さらに好ましくは遺伝子組換え微生物由来の蛋白質分解酵素である。【００７６】
本発明のウイルスの生産方法は、接着性細胞を動物由来成分を含有しない支持体に接着させ、この接着性細胞を動物由来成分を含有しない培地で培養し、培養した接着性細胞を動物由来成分を含有しない細胞分散剤を用いて継代培養した後、接着性細胞の培養細胞にウイルスを接種して増殖させることによりウイルスを大量に生産することができる。【００７７】
細胞播種に用いる接着性細胞を得るための培養（以下、プレ培養）には特に制限が無く、動物由来成分を含有する材料（支持体、培地及び細胞分散剤等）及び動物由来成分を含有しない材料（支持体、培地及び細胞分散剤等）のいずれを用いてもよい。しかし、プレ培養においても、動物由来成分を含有しない材料（支持体、培地及び細胞分散剤等）だけを用いることが好ましい。【００７８】
プレ培養で得られた接着性細胞を支持体に接着させる方法は、通常の方法でよく、培地及び支持体に細胞播種すること等が適用できる。【００７９】
接着性細胞の播種量（万個／ｃｍ2）は、接着性細胞の種類等によって決定されるが、支持体の平均表面積１ｃｍ2当り、０．００１〜１０００が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１００、特に好ましくは０．１〜１０である。接着性細胞の個数の測定方法には特に制限がないが、例えば、細胞核数をウィーゼル（Wezel）によるクリスタルバイオレットを用いた細胞核計数法で測定することができる。また、培地の細胞密度（万個／ｍＬ）は、培地１ｍＬ当たり、０．０１〜１００００が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１０００、特に好ましくは１〜１００、特に好ましくは５〜５０、最も好ましくは１０〜３０である。【００８０】
接着性細胞の培養の期間（日）は、３〜３０が好ましく、さらに好ましくは４〜２１、特に好ましくは５〜１５、次に好ましくは６〜１０、最も好ましくは７又は８である。接着性細胞の種類等によって異なるが、８日間培養すると、培地の細胞密度は、培養開始時に比べて３〜３０倍程度に増加する。【００８１】
培地の交換は、１〜５日毎に、１／３量〜全量の培地を交換することが好ましい。【００８２】
培養中の二酸化炭素濃度（体積％）は、培養雰囲気の体積に基づいて、２〜１０が好ましく、さらに好ましくは４〜６、特に好ましくは５である。【００８３】
培養温度（℃）は、２５〜４２が好ましく、さらに好ましくは３０〜４０、特に好ましくは３５〜３９、最も好ましくは３７である。【００８４】
支持体としてマイクロキャリアー（粒子径；２０〜５００μｍ、表面積；１００ｃｍ2〜１００ｍ2等）を用いるとき、培養容器としては、（１）スピンナーフラスコ又はベッセルと、（２）ラジアルフロー型リアクター等が使用できる。【００８５】
（１）スピンナーフラスコ又はベッセル等を使用する場合、例えば、培養容器（容量；１００ｍＬ〜１００L等）中に、接着性細胞、マイクロキャリアー及び培地を入れて、撹拌しながら培養する方法が適用できる。【００８６】
（２）ラジアルフロー型リアクター等を使用する場合、例えば、培養容器（全容量；１００ｍＬ〜１００Ｌ等）にマイクロキャリアーをセットした後、接着性細胞を含む培地を循環しながら培養する方法等が適用できる。【００８７】
一方、支持体としてホローファイバー（内径１０〜５００μｍ等）を用いるとき、カートリッジ（全容量；１０ｍＬ〜１０Ｌ等）等に、接着性細胞を含む培地を加えた後、ホローファイバー内に培地を循環しながら培養する方法等が適用できる。【００８８】
また、支持体としてローラーボトル（全容量；０．１〜２０Ｌ等）等を用いるとき、接着性細胞を含む培地を培養容器に加えた後、撹拌させながら培養する方法等が適用できる。【００８９】
細胞分散剤を用いた継代培養とは、上記のようにして培養により得た接着性細胞を細胞分散剤によって細胞分散液にした後、この細胞分散液を用いて再び接着性細胞の培養を行うことを意味する。【００９０】
接着性細胞の培養細胞にウイルスを接種するタイミングとしては、接着性細胞の培養を開始後、３〜３０日目が好ましく、さらに好ましくは４〜２１日目、特に好ましくは５〜１５日目、次に好ましくは６〜１０日目、最も好ましくは７又は８日目である。【００９１】
またウイルスを接種する際の培養細胞の細胞密度（万個／ｍＬ）は、０．２〜２０００００が好ましく、さらに好ましくは２〜２００００、特に好ましくは２０〜２０００、次に好ましくは１００〜１０００、最も好ましくは２００〜５００である。【００９２】
ウイルスを接種する前に、無血清培地で培地交換を行うことが好ましく、さらに好ましくは細胞培養の培地を除去し、ＰＢＳ（０．０２Ｍリン酸緩衝液等）及び／又は無血清培地を加えて１分〜１時間攪拌した後、加えたＰＢＳ及び／又は無血清培地を除去し、無血清培地を加えることである。【００９３】
この無血清培地は、細胞培養で使用したものと同じものが好ましい。【００９４】
この無血清培地には細胞分散剤が含有されていてもよく、含有されていなくてもよい。インフルエンザウイルス等の場合、無血清培地に細胞分散剤が含有されていることが好ましい。無血清培地に細胞分散剤が含有される場合、この含有量（体積％）は、無血清培地の体積に基づいて、０．５〜４０が好ましく、さらに好ましくは１〜２０、特に好ましくは２〜１０である。【００９５】
ウイルスを接種する時のM.O.I（感染多重度）は、細胞やウイルスの種類によって異なるが、１〜０．００００００１が好ましく、さらに好ましくは０．１〜０．００００１、特に好ましくは０．０５〜０．０００１である。【００９６】
ウイルスの培養期間（増殖期間；日）は、２〜１４が好ましく、さらに好ましくは３〜１０である。【００９７】
ウイルスの培養温度（増殖温度；℃）は、３０〜３９が好ましく、さらに好ましくは３２〜３８、特に好ましくは３３〜３７である。【００９８】
培地のｐＨは、一定の範囲に制御することが好ましく、その範囲は、６〜９が好ましく、さらに好ましくは６．５〜８．５、特に好ましくは７〜８である。【００９９】
本発明のウイルスの生産方法を用いて製造され得るワクチンとしては特に制限がないが、日本脳炎ワクチン、デング熱ワクチン、西ナイル熱ワクチン、インフルエンザワクチン、狂犬病ワクチン、水痘ワクチン、ポリオワクチン、A型肝炎ワクチン、麻疹ワクチン、風疹ワクチン及びおたふくかぜワクチンが好ましく、さらに好ましくは日本脳炎ワクチン、デング熱ワクチン、西ナイル熱ワクチン、インフルエンザワクチン、ポリオワクチン、麻疹ワクチン、風疹ワクチン及びおたふくかぜワクチン、特に好ましくはインフルエンザワクチン、麻疹ワクチン、風疹ワクチン及びおたふくかぜワクチン、最も好ましくはインフルエンザワクチンである。【０１００】
本発明の方法によれば、細胞培養およびウイルスの生産の工程において、全く動物由来成分を含有しない培養材料を用いているため、安全で且つ品質が一定した接着性細胞が大量に培養できる。さらに、外来性物質による汚染の可能性を最低限に抑えることができ、さらに未知の感染性因子を含有していることがないため感染因子を不活化させる処理を行う必要がないなどの利点を有する。【０１０１】
本発明は上記の記載内容に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内において種々の変形実施が可能である。【０１０２】
以下、本発明について、実施例及び図面を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜細胞播種に用いる接着性細胞を得るための培養＞
ダルベッコminimum  essential  medium（DMEM）培地  ＋  ５体積％ウシ胎児血清（FBS）（インビトロジェン社製）にてプレ培養中のVero細胞を、細胞分散剤（インビトロジェン社製、ｒProtease（登録商標））を必要に応じてPBSで希釈した希釈液にて３７℃条件下で細胞分散を行い、遠心操作により上清を除去して、細胞播種用Ｖｅｒｏ細胞（Ｓ）を得た。
【実施例１】
【０１０３】
＜無血清培地及びプロネクチンＦ結合ナイロンビーズを用いた日本脳炎ウイルスの生産＞（１）プロネクチンＦをリン酸バッファー液（ＰＢＳ）でプロネクチンＦの濃度が３００μｇ／ｍｌとなるように希釈し、プロネクチンＦ溶液を作製した。水溶性カルボジイミド溶液｛１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド  ハイドロクロリド、ドジンド（株）製、３００ｍＭ水溶液）１００ｍｌに、１２ナイロンビーズ（粒子径１５０〜２５０μｍ、トライアル株式会社製）５０ｇを加え、撹拌子で２時間撹拌した後、これにリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）１００ｍｌを添加し溶液を吸引除去する操作を５回行うことにより（洗浄）カルボジイミド結合ナイロンビーズ（１）を得た。引き続きこのカルボジイミド結合ナイロンビーズ（１）をプロネクチンＦ溶液１００ｍｌに浸積して２時間撹拌し、リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）１００ｍｌを添加し溶液を吸引除去する操作を３回行った（洗浄）後、アンモニア水溶液（３００ｍＭ、１００ｍｌ）中で２時間撹拌した。その後、イオン交換水１００ｍｌを添加し溶液を吸引除去する操作を３回行い（洗浄）、次いで１００℃の熱風を吹きつけながら、６０分間乾燥しプロネクチンＦ結合ナイロンビーズ｛プロネクチンＦ結合量：０．３μｇ／ｃｍ2を得た。
（２）動物由来成分を含有しない無血清培地（インビトロジェン社製、VP−SFM）と動物由来成分を含有しないプロネクチンＦ結合ナイロンビーズからなるサンプル４をスピンナーフラスコ（テクネ社製、F７６８９）に入れた。【０１０４】
次に、細胞播種用Ｖｅｒｏ細胞（Ｓ）が細胞密度２×１０5cells／ｍＬとなるように上記サンプル４の入ったスピンナーフラスコに播種し、作動容量（Ｍ）１００ｍＬとした。その後、細胞，培地およびマイクロキャリアーの入った培養液を２５rpmで攪拌し、細胞をマイクロキャリアーに接着させた後、細胞を２４日間、３７℃の恒温室にてマグネチックスターラー（テクネ社製、MCS-104L）を用いて２５rpm〜３５rpmの攪拌回転数により培養した。【０１０５】
細胞継代は８日毎に行い、細胞播種３日目より毎日５０体積％の培地交換を行った。なお、動物由来成分を含有しない細胞分散剤（インビトロジェン社製、ｒProtease（登録商標））をPBSで５倍希釈した希釈液にて３７℃条件下で細胞分散を行い、遠心操作により上清を除去後、必要量を予め用意されたスピンナーフラスコに播種して、継代操作を行った。【０１０６】
サンプル４の経時変化における細胞密度を、一般的な血球計数法や顕微鏡観察法などの方法により求め、縦軸に細胞密度（cells／ｍL）を横軸に時間を表すグラフを図１に示した。【０１０７】
細胞培養開始２４日目にスピンナーフラスコ内の培養液を除去し、PBSによる洗浄を2回行った後、日本脳炎ウイルス（JEV）をM.O.I=０．０１で接種し、３７℃恒温室で攪拌回転数３５rpmにて培養した。JEV培養2日目に７．５体積％炭酸水素ナトリウム溶液をスピンナーフラスコにそれぞれ１．５ｍL添加し、ｐHを７．２とした。【０１０８】
サンプリングは、JEV培養２〜８日目まで行い、細胞数についてはクエン酸処理後の核数を測定した。JEV増殖の指標は（１）HA（赤血球凝集反応、Hemagglutination）価については定法に従い測定し、（２）ELISA（酵素抗体法、Enzyme-linked  immunosorbent  assay）については、抗JEV抗血清をプロテインAカラムによる抗体精製を実施し、ウエスタンブロッティング法により特異反応性を確認後、精製抗体のペルオキシダーゼ標識を行い、サンドイッチELISAを構築した。なお、ELISA値は参照日本脳炎ワクチン北京株Lot．１９７−Pより自家値を付し、不活性精製JEV液を標準抗原として使用した。ELISAによるJEV産生量の経時変化を表すグラフを図２に示し、HAによるJEV産生量の経時変化を表すグラフを図３に示した。また、ELISA及びHAの測定値の最高値を表１に示した。【０１０９】
【表１】
0004650798.tif 000002
【比較例１】
【０１１０】
＜血清培地とデキストランビーズ（アマシャム製、商品名Cytodex１））を用いた日本脳炎ウイルスの生産＞
実施例１に記載のサンプル４の代わりに、サンプル１｛血清培地（DMEM培地＋５体積％FBS）と動物由来成分を含有しないデキストランビーズ｝を使用すること以外、実施例１と同様にしてウイルスの生産を行った。
【比較例２】
【０１１１】
＜無血清培地とデキストランビーズ（アマシャム製、商品名Cytodex１））を用いた日本脳炎ウイルスの生産＞
実施例１に記載のサンプル４の代わりに、サンプル２｛動物由来成分を含有しない無血清培地（インビトロジェン社製、VP−SFM）と動物由来成分を含有しないデキストランビーズ｝を使用すること以外、実施例１と同様にしてウイルスの生産を行った。
【比較例３】
【０１１２】
＜無血清培地とブタ変性コラーゲンが被覆されたデキストランビーズ（アマシャム製、商品名Cytodex３））を用いた日本脳炎ウイルスの生産＞
実施例１に記載のサンプル４の代わりに、サンプル３｛動物由来成分を含有しない無血清培地（インビトロジェン社製、VP−SFM）とブタ変性コラーゲンが被覆されたデキストランビーズ｝を使用すること以外、実施例１と同様にしてウイルスの生産を行った。
【０１１３】
比較例１〜３について、実施例１と同様にして、ウイルス接種時細胞数及びELISA及びHAの測定値の最高値を表１に示し、細胞密度−時間グラフを図１に、ELISA  Titer−日数グラフを図２に、HA  Titer−日数グラフを図３に示した。
【０１１４】
図１及び表１より、実施例１（サンプル４）では、培養開始８日目、１６日目及び２４日目の細胞密度が最高位であり、比較例１（サンプル１）、比較例２（サンプル２）及び比較例３（サンプル３）に比べて、安定的に且つ効率よく増殖していることが判った。
【０１１５】
また、図２、図３及び表１より、実施例１（サンプル４）は、ＥＬＩＳＡ及びＨＡとも、比較例１（サンプル１）、比較例２（サンプル２）及び比較例３（サンプル３）に比べて、高い数値を示しており、日本脳炎ウイルスが効率よく増殖していることが判った。
【実施例２】
【０１１６】
＜無血清培地とプロネクチンＦ結合ナイロンビーズを用いたインフルエンザウイルスの生産＞
VP−SFM培地とプロネクチンＦ結合ナイロンビーズからなるサンプル８をスピンナーフラスコ（テクネ社製、F７６８９）に入れた。【０１１７】
次に、細胞播種用Ｖｅｒｏ細胞（Ｓ）が細胞密度２×１０5cells／ｍLとなるように上記サンプル８の入ったスピンナーフラスコに播種し、作動容量（Ｍ）１００mLとした。その後、細胞，培地およびマイクロキャリアーの入った培養液を３５rpmで攪拌し、細胞をマイクロキャリアーに接着させた後、細胞を２４日間、３７℃の恒温室にてマグネチックスターラー（和研薬社製、MODEL1104M）を用いて３５rpmの攪拌回転数により培養した。【０１１８】
細胞継代は８日毎に行い、細胞播種３日目より毎日５０体積％の培地交換を行った。細胞継代時に用いたｒProteaseを３７℃条件下で細胞分散を行い、遠心操作により上清を除去後、必要量を予め用意されたスピンナーフラスコに播種して、継代操作を行った。【０１１９】
細胞洗浄操作は細胞培養開始２４日目にスピンナーフラスコの攪拌を止め、培養液を除去し、PBSを５０ｍＬ加え、33℃恒温室にて２０分間攪拌した。続いて、同様の条件で細胞洗浄操作をVP-SFM培地にて行った。その後、VP-SFM培地を除去し、新たにVP-SFM培地を容量９５mLになるようにスピンナーフラスコに加えた。このスピンナーフラスコにｒProteaseを５mL加え、M.O.I＝０．００１になるようにインフルエンザウイルス（B/Johannesburg/５/９９）を接種した。インフルエンザウイルス培養は３３℃恒温室にて、３５rpmの攪拌回転数で行い、スピンナーフラスコのキャップを緩めて培養を行った。なお、インフルエンザウイルスを接種後、培地のｐＨは７．５体積％炭酸水素ナトリウム溶液にてｐH７．２〜ｐH７．８に維持した（インフルエンザウイルス培養１８時間後に、７．５体積％炭酸水素ナトリウム溶液を０．４mL、同様に４２時間後に０．６ｍL加えた。）。サンプリングはインフルエンザウイルス培養６７時間後に行い、ニワトリ赤血球を用いたHA法をインフルエンザウイルス増殖の指標としたところ、HAは１２８倍となった。
【実施例３】
【０１２０】
＜無血清培地とプロネクチンＦ２結合ナイロンビーズを用いたインフルエンザウイルスの生産＞
実施例２に記載のプロネクチンＦ結合ナイロンビーズの代わりに、プロネクチンＦ２結合ナイロンビーズ｛プロネクチンＦ２結合量：０．３μｇ／ｃｍ2、プロネクチンＦの代わりにプロネクチンＦ２を使う以外はプロネクチンＦ結合ナイロンビーズと同様にして製造した。）｝を使用すること以外、実施例２と同様にしてウイルスの生産を行った。実施例２と同様にして得たＨＡは１２８倍であった。
【実施例４】
【０１２１】
＜無血清培地とプロネクチンＦ３結合ナイロンビーズを用いたインフルエンザウイルスの生産＞
実施例２に記載のプロネクチンＦ結合ナイロンビーズの代わりに、プロネクチンＦ３結合ナイロンビーズ｛プロネクチンＦ３結合量：０．２μｇ／ｃｍ2、プロネクチンＦの代わりにプロネクチンＦ３を使う以外はプロネクチンＦ結合ナイロンビーズと同様にして製造した。）｝を使用すること以外、実施例２と同様にしてウイルスの生産を行った。実施例２と同様にして得たＨＡは１２８倍であった。
【比較例４】
【０１２２】
＜血清培地とデキストランビーズ（アマシャム製、商品名Cytodex１））を用いたインフルエンザウイルスの生産＞
実施例２に記載のサンプル８の代わりに、サンプル５｛血清培地（DMEM培地＋５体積％FBS）と動物由来成分を含有しないデキストランビーズ｝を使用すること以外、実施例２と同様にしてウイルスの生産を行った。実施例２と同様にして得たＨＡは３２倍であった。
【比較例５】
【０１２３】
＜無血清培地とデキストランビーズ（アマシャム製、商品名Cytodex１））を用いたインフルエンザウイルスの生産＞
実施例２に記載のサンプル８の代わりに、サンプル６｛動物由来成分を含有しない無血清培地（インビトロジェン社製、VP−SFM）と動物由来成分を含有しないデキストランビーズ｝を使用すること以外、実施例２と同様にしてウイルスの生産を行った。実施例２と同様にして得たＨＡは４倍であった。
【比較例６】
【０１２４】
＜無血清培地とブタ変性コラーゲンが被覆されたデキストランビーズ（アマシャム製、商品名Cytodex３））を用いたインフルエンザウイルスの生産＞
実施例２に記載のサンプル８の代わりに、サンプル７｛動物由来成分を含有しない無血清培地（インビトロジェン社製、VP−SFM）とブタ変性コラーゲンが被覆されたデキストランビーズ｝を使用すること以外、実施例２と同様にしてウイルスの生産を行った。実施例２と同様にして得たＨＡは４倍であった。
【０１２５】
実施例２、実施例３及び実施例４では、比較例４、比較例５及び比較例６と比較して、ＨＡの値が極めて高く、インフルエンザウイルスが極めて効率よく増殖していることが判った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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