(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’−ＧＡＡＴＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＣＡＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＧ−３’（配列番号１）の内、連続する少なくとも１５個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び、５’−ＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＣＣＴＧＣＡＴＧＣ−３’（配列番号２）の内、連続する少なくとも１５個の塩基から成るオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ヒラメのゲノムＤＮＡにポリメラーゼ連鎖反応法を行い、得られた産物にゲル電気泳動法を施して１０１ｂｐのバンドの有無を確認し、１０１ｂｐのバンドがあるヒラメは白化異常が発生しやすいヒラメであると判別する判別法。
【請求項２】
下記（１）のオリゴヌクレオチドから成る、請求項１記載の判別法に用いるポリメラーゼ連鎖反応用プライマー。
（１）５’−ＧＡＡＴＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＣＡＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＧ−３’（配列番号１）の内、連続する少なくとも１５個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び、５’−ＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＣＣＴＧＣＡＴＧＣ−３’（配列番号２）の内、連続する少なくとも１５個の塩基から成るオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡマーカーを用いた白化異常が発生しやすいヒラメを判別する判別法、及び、この判別法に用いるプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒラメの白化異常は、天然個体、飼育個体を問わずしばしば見られる。その中でも、本来黒褐色である有眼側の体色が一部白色になる白化は、商品価値の低下を招くため、養殖産業上解決すべき大きな問題の一つである。
ヒラメの白化異常には、種苗生産時の餌料や栄養、飼育環境等の様々な原因が考えられ、有効な防除策についての研究が進められてきた。
【０００３】
例えば、ヒラメ及びカレイの無眼側の白色体表面に黒色部分が発生する黒化を防ぐために、内部底面に粗面または凹凸を設けた水槽で養殖する方法が提案されている（特許文献１参照）。
ところが、近年、ヒラメの白化には複数の遺伝子の関与が示唆されており、また、白化しやすい系統、白化し難い系統の存在も知られている。即ち、ヒラメの養殖を効率的に行うには、遺伝的に白化しやすい系統を予め排除しておくことが重要である。
しかし、白化に関連する遺伝子については、未だ具体的に解明されていなかった。
【０００４】
【特許文献１】特開平５−３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、特定の遺伝マーカーを用いて養殖種苗生産で問題となっている白化しやすいヒラメを判別し、排除することができて効率的な養殖を可能とするヒラメにおける白化形質の遺伝的背景の判別法、及び、この判別法に用いられるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用プライマーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
長年に亘って行われているヒラメ養殖において、選抜飼育されてきた白化個体出現率の高い系統と、白化個体出現率の低い系統とを交配し、この交配によって作出された集団に戻し交配を行い、戻し交配集団を作出した。
作出した戻し交配集団、その両親及び祖父母に対してＤＮＡマーカーを用いたＱＴＬ解析を行った結果、発明者らが既に見出していたヒラメの遺伝子連鎖地図｛Ｍ．Ｍ．Ｃｏｉｍｂｒａ、東京水産大学博士学位論文（２００１）；Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ（２００３）｝と照らし合わせると、このヒラメ遺伝子連鎖地図における遺伝子連鎖群（ＬＧ）５のマーカー座Ｐｏｌｉ２１５ＴＵＦに白化関連遺伝子があることがわかった。
そして、ＬＧ５のマーカー座Ｐｏｌｉ２１５ＴＵＦに関する特定のプライマーを用いて、ヒラメのゲノムＤＮＡにＰＣＲ法を行い、得られたＰＣＲ産物にゲル電気泳動法を施すことにより、白化しやすい個体を判別することができる。
【０００７】
本発明の白化異常が発生しやすいヒラメを判別する判別法は、５’−ＧＡＡＴＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＣＡＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＧ−３’（配列番号１）の内、連続する少なくとも１５個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び、５’−ＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＣＣＴＧＣＡＴＧＣ−３’（配列番号２）の内、連続する少なくとも１５個の塩基から成るオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ヒラメのゲノムＤＮＡにＰＣＲ法を行い、得られたＰＣＲ産物にゲル電気泳動法を施して１０１ｂｐのバンドの有無を確認し、１０１ｂｐのバンドがあるヒラメは白化異常が発生しやすいヒラメであると判別する。
本発明の白化異常が発生しやすいヒラメを判別する判別法に用いられるＰＣＲ用プライマーは、次の（１）のオリゴヌクレオチドから成る。
（１）５’−ＧＡＡＴＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＣＡＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＧ−３’（配列番号１）の内、連続する少なくとも１５個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び、５’−ＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＣＣＴＧＣＡＴＧＣ−３’（配列番号２）の内、連続する少なくとも１５個の塩基から成るオリゴヌクレオチド。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、遺伝的に白化異常が発生しやすいヒラメを判別できるので、ヒラメの養殖において白化個体の出現率を押えることが可能であり、経済的な効果が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
遺伝子連鎖群ＬＧ５上のマーカー座Ｐｏｌｉ２１５ＴＵＦの遺伝マーカーを用いて、ヒラメにおける白化形質の遺伝的背景を判別し、白化し易いと判別された個体を除いて飼育することにより、白化個体出現率を抑制する。
以下、本発明の実施例について詳細に説明する。
【００１０】
（解析家系）
解析家系として、白化個体出現率の高い系統（ＫＰ−Ｃ）と、白化個体出現率の低い系統（ＫＰ−Ａ）を用いて戻し交配家系を作出した。これらの系統は、表現型に基づいた選別によって、神奈川県水産総合技術センターにおいて継代飼育されてきた。
１９９８年から２００３年まで、毎年ＫＰ−Ｃ及びＫＰ−Ａのヒラメをそれぞれ１００〜２００匹飼育し、ＫＰ−Ｃ及びＫＰ−Ａにおける白化出現率を調べた。その結果を表１に示す。
ＫＰ−Ｃの平均白化個体出現率は７７．８％であり、ＫＰ−Ａの平均白化個体出現率は１９．１％であって、白化異常には遺伝性のあることがはっきりした。
【００１１】
【表１】
0004822210.tif 000002
【００１２】
ＫＰ−Ｃの雌とＫＰ−Ａの雄とを交配し、得られたＦ１（ＫＰ−ＣＡ）の雌（白化個体）とＫＰ−Ａの雄とを戻し交配して、２３８匹の戻し交配集団（ＫＰ−ＣＡＡ）を得た。
ＫＰ−ＣＡＡの受精卵を１００Ｌ水槽に収容し、７０Ｌの海水で平均水温１５．５℃において止水飼育した。受精３日後、５００Ｌ水槽に移し、１５．５℃〜２２．５℃の範囲で流水飼育した。孵化後２５日目までは、餌料としてワムシを与え、１５日目から６０日目までは、アルテミアを加え、３０日以降は市販の配合飼料を与えた。
【００１３】
（白化面積占有率の算出）
孵化後３ヶ月目に、以下のようにしてＫＰ−ＣＡＡ２３８個体の白化面積占有率を算出した。
始めに、ヒラメの有眼側体表面を実体顕微鏡に取付けたデジタルカメラで撮影し、その画像をコンピュータに取り込んで、画像解析ソフトを用いて各個体毎に次のような画像解析を行った。
背鰭、尻鰭、尾鰭は、肉眼で白化の有無を判別するのが困難なため、全体像から鰭を含まない部分を切り取り、有眼側体表面積と白化部分の面積を測定し、白化面積占有率（白化部分の面積／有眼側体表面積×１００）を算出した。
ＫＰ−ＣＡＡ集団について、算出した白化面積占有率の分布を図１に示す。
ｚ＝（白化面積占有率−白化面積占有率の平均値）／標準偏差を求め、ｚ＜０の個体を非白化個体とし、ｚ＞０の個体を白化個体とすると、ＫＰ−ＣＡＡ集団において、非白化固体は１５７匹、白化個体は８１匹であった。
【００１４】
（実施例１）
祖父母であるＫＰ−Ｃ及びＫＰ−Ａ、Ｆ１のＫＰ−ＣＡ、ＫＰ−ＣＡＡの全てのヒラメに対し、次のようにしてＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ法を行い、得られたＰＣＲ産物にゲル電気泳動法を施し、その遺伝子型を確認した。
【００１５】
まず、全てのヒラメからのＤＮＡ抽出は、以下の手順で行った。
尾鰭を１ｃｍ角の大きさで採取し、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔris−ＨＣｌ（pH８．０）、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ Proteinase Ｋを含む消化溶液を６００μＬ加え、３７℃で一晩静置した。
さらに、フェノール／クロロホルム（１：１）抽出を１回行った後、エタノール沈殿にて染色体ＤＮＡを析出させた。回収したＤＮＡは７０％エタノールで洗浄、乾燥後、ＴＥ溶液（０．０１Ｍ Ｔris−ＨＣｌ pH７．４、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ pH８．０）５０μＬに溶解した。
【００１６】
次に、
Ｆ：５’−ＧＡＡＴＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＣＡＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＧ−３’（配列番号１）
Ｒ：５’−ＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＣＣＴＧＣＡＴＧＣ−３’（配列番号２）
の一組のプライマーを合成し、２．５ｐｍｏｌ Ｆプライマーと［γ-33Ｐ］ＡＴＰ、Ｔ４ polynucleotide kinaseによって標識した０．１７ｐｍｏｌ Ｒプライマー、０．１７５ｍＭ each ｄＮＴＰ、２０ｍＭ Ｔris−ＨＣｌ（pH８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１％ＢＳＡ、０．２５ Ｕ Ｔaq ＤＮＡ polymerase（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）、５０ｎｇのテンプレートＤＮＡを含む１１μｌの溶液で、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９６００  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）にて、ＰＣＲ法を行った。
【００１７】
なお、このプライマーを用いたＰＣＲ反応組成（１サンプル分）を表２に示し、ＲプライマーのＲＩ標識用液組成（４９サンプル分）を表３に示す。
【００１８】
【表２】
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【００１９】
【表３】
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【００２０】
ＰＣＲ条件は、９５℃、２分−（９５℃、３０秒−５５℃、１分−７２℃、１分）×３５サイクル−（９５℃、３０秒−５５℃、１分−７２℃、３分）×１サイクルとした。
反応後、等量のLoading dye（９５％ formamide,１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０５％ bromophenol blue and xylene cyanol）とよく攪拌し、ＰＣＲ産物を熱変性によって１本鎖にし、６％アクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。
その後、１時間乾燥させたゲルを、Imaging Plate(ＩＰ)に３〜１２時間感光させ、放射線の感光像が記憶されたＩＰをBio-imaging Analyzer（ＢＡＳ１０００，Fuji Photo Films）で読み取り、コンピュータで映像化した。
その結果を図２及び図３に示す。
【００２１】
図２及び図３からわかるように、白化個体であるＫＰ−Ｃ及びＫＰ−ＣＡでは１０１ｂｐにバンドがあり、非白化個体であるＫＰ−Ａでは１０１ｂｐにバンドが観察されなかった。また、ＫＰ−ＣＡＡは１０１ｂｐにバンドがあるものと無いものとに分かれ、バンドのあるものは１２９匹、無いものは１０９匹であった。
さらに、ＫＰ−ＣＡＡにおいて、白化の発生と、１０１ｂｐのバンドの有無との関係を調べ、その結果を表４に示す。
【００２２】
【表４】
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【００２３】
表４から明らかなように、１０１ｂｐにバンドの無い群では、白化個体が１７匹、非白化個体が９２匹であるのに対し、１０１ｂｐにバンドのある群では、白化個体が６４匹、非白化個体が６５匹であった。
即ち、１０１ｂｐにバンドが確認された群では、１０１ｂｐにバンドが確認されなかった群に比べて、明らかに白化個体出現率が高かった。
【００２４】
白化とこのバンドとの連鎖関係の確かさはＬｏｄ  Ｓｃｏｒｅ（Map Manager ＱＴ2968k：Manly and Olson，１９９９）で示される。
１０１ｂｐにバンドがある非白化個体と、１０１ｂｐにバンドの無い白化個体の合計は８２匹であり、Ｌｏｄ  Ｓｃｏｒｅ＝８２ｌｏｇ（８２／２３８）＋（２３８−８２）ｌｏｇ（１−８２／２３８）＋２３８ｌｏｇ０．５＝５．０８となる。
即ち、このバンドと白化との間に連鎖関係があることは、１／１０5.08の危険率で確実であり、本実施例のプライマーを用いたＰＣＲ産物に１０１ｂｐのバンドがあるヒラメは、白化異常が発生しやすいヒラメであるといえる。
【００２５】
また、配列番号１と配列番号２で表されるプライマーにより増幅される１０１ｂｐのバンドを持たない個体の８４．４％は、白化占有率が低い（通常）個体であり、白化を引き起こす遺伝子を排除した個体を選ぶことが可能となる。
また、配列番号２と配列番号３で表されるプライマーにより増幅される１０１ｂｐのバンドを持つ個体の５０．４％は、白化占有率が低い（通常）個体であるが、次世代に白化個体を出現させる可能性がある個体と考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＫＰ−ＣＡＡ集団における白化面積占有率の分布を示す図。
【図２】実施例１のプライマーを用いたＰＣＲ産物のゲル電気泳動像であり、（ａ）はＫＰ−ＣＡＡの通常個体、（ｂ）はＫＰ−ＣＡＡの白化個体、（ｃ）はＫＰ−Ｃ、ＫＰ−Ａ、ＫＰ−ＣＡを示す。
【図３】実施例１のプライマーを用いたＰＣＲ産物のゲル電気泳動の模式図であり、（ａ）はＫＰ−ＣＡＡの通常個体、（ｂ）はＫＰ−ＣＡＡの白化個体、（ｃ）はＫＰ−Ｃ、ＫＰ−Ａ、ＫＰ−ＣＡを示す。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【配列表】
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