(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の第一核酸と、有効量の第二核酸と、有効量の第三核酸と、医薬的に許容可能なキャリアと、を有し、
前記第一核酸の配列は、配列番号1の配列又はそれに対応するDNA配列を含み、
前記第二核酸の配列は、配列番号2の配列又はそれに対応するDNA配列を含み、
前記第三核酸の配列は、配列番号3の配列又はそれに対応するDNA配列を含む、
瘢痕形成を軽減するための医薬組成物。
【請求項２】
トランスフェクションに有効な量のトランスフェクション試薬を更に有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記トランスフェクション試薬は、カチオン性脂質又は細胞透過ペプチドである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記トランスフェクション試薬は、1又は複数の細胞透過ペプチドを含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記第一核酸、前記第二核酸及び前記第三核酸のうちの少なくとも1つは、ウイルスベクターに構築されている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記第一核酸、前記第二核酸及び前記第三核酸は、それぞれ、3つの前記ウイルスベクターに構築されている、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記第一核酸、前記第二核酸及び前記第三核酸は、低分子干渉リボ核酸(siRNA)、低分子ヘアピン型リボ核酸(shRNA)又はマイクロリボ核酸(miRNA)である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記第一核酸、前記第二核酸及び前記第三核酸は、siRNAである、請求項８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1.  技術分野
【０００２】
本開示は、対象における瘢痕形成を軽減する医薬組成物及び方法に関する。より詳しくは、開示する発明は、瘢痕形成を軽減するための3つの核酸の混合物の使用に関する。
【０００３】
2.  関連技術の説明
【０００４】
皮膚は、ヒトにおける最大の臓器である。これは、環境から内部臓器/組織を保護する。殆どのヒトは、疾患(例えば、プレッシャー、静脈うっ血及び糖尿病)だけでなく外傷、熱傷又は他の外部からの物理的な原因によって引き起こされる皮膚損傷を経験している。創傷治療の主目的には、機能的且つ美学的に満足のいく皮膚組織の迅速な創傷閉鎖と再生が含まれる。しかしながら、創傷治癒は、様々な要因を伴うダイナミックでインタラクティブなプロセスであり、肥厚性瘢痕の発生率は、細胞及び分子生物学の進歩にもかかわらず高いままである。これら肥厚性瘢痕は、多くの場合、機能的障害及び心理的病的状態を引き起こし、より多くの健康管理費を負担することになる。
【０００５】
胎児の創傷は、瘢痕が形成されることなく、ほぼ完璧に治癒することが認められている。胎児及び成人での皮膚創傷治癒プロセスの相違によって、瘢痕形成プロセスに関与する要因の特徴付けに対して多くの関心が払われてきた。このアプローチを通じて同定された様々な要因の中で、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)が、創傷治癒及び瘢痕形成プロセスに重要な役割を演じていると考えられている。
【０００６】
TGF-βは、広範囲にわたる生体システムにおいて、細胞成長、分化、アポトーシス、線維形成及び発生を調節するサイトカインの一種である。一般的に、TGF-βは、TGF-β受容体I型(TGFBRI)及びII型(TGFBRII)によって媒介されるタンパク質分解活性を通じて、その後に活性化される潜在型として分泌される。ヒトTGF-βは、3つのアイソフォーム、TGF-β1、TGF-β2及びTGF-β3を有する。これらのアイソフォームは、重複する機能を有しており、主に、細胞内SMAD経路を通じてそれらの効果を媒介する。皮膚創傷治癒プロセスにおいて、TGF-β1は、免疫抑制、線維芽細胞遊走及び増殖、創傷収縮、肉芽組織形成、コラーゲン合成及び沈着、血管新生並びに再上皮形成に関与している報告されている。胎児及び成人での創傷におけるTGF-βアイソフォームの発現の差異の調査によって、TGF-β1及びTGF-β3のレベルは、それぞれ、成人及び胎児での創傷において上昇することが発見された。このことは、TGF-β1が成人での創傷における瘢痕形成の原因となる可能性がある一方で、胎児での創傷における瘢痕が残らない創傷治癒は、TGF-β3のレベルの増加に起因する可能性があることを示唆している。
【０００７】
研究者達は、瘢痕が残らない創傷治癒を成し遂げることを願って、抗-TGF-β1抗体又はTGF-β1を標的とするsiRNAを用いて創傷部位でのTGF-β1のレベルを下方制御することを試みた。しかしながら、TGF-β/SMADシグナル伝達経路には、多数のメディエーターが関与し、そして、創傷治癒は、種々のステージにおいて種々のメディエーターを必要とする多段階プロセスである。従って、TGF-β1のレベルを低下させるだけでは、満足な結果は得られない。例えば、TGF-β1-欠損マウスにおける全層創傷は、初期ステージにおいて正常に治癒する。しかしながら、TGF-β1欠損は、これらのマウスにおける創傷治癒の後期ステージを妨げる炎症を引き起こす。更に、T及びB細胞を欠くTGF-β1ノックアウトマウス(Tgfb1-/-Scid-/-マウス)においては、創傷治癒が、野生型Tgfb1対立遺伝子を有する免疫不全(Scid-/-)マウスと比較して、約1週間遅延する(Crowe M et al., J. Invest. Dermatol, 2000, 115, 3-11)。
【０００８】
前述の観点を鑑みると、瘢痕形成を軽減する効果的な治療を提供する技術が必要とされている。
【０００９】
要約
基礎的な知識を読者に提供するために、本開示の簡単な要約を以下に示す。この要約は、本開示の網羅的な概要ではなく、本発明の鍵となる/重要な要素を特定することでも本発明の範囲を詳細に描写することでもない。この唯一の目的は、後で示されるより詳細な説明の前書きとして、簡単な形で本願明細書に開示される幾つかの概念を提示することである。
【００１０】
一つの態様において、本開示は、瘢痕形成の軽減を必要とする対象における瘢痕形成を軽減するための医薬組成物に関する。上記医薬組成物は、ヒトTGF-β受容体I型(TGFBRI)遺伝子を標的とする3つの核酸の混合物を含む。
【００１１】
本開示の様々な実施形態によれば、上記医薬組成物は、有効量の第一、第二及び第三核酸と医薬的に許容可能なキャリアとを含む。上記3つの核酸は、リボ核酸(RNA)又はデオキシリボ核酸(DNA)とすることができる。3つの核酸がRNAである場合、上記3つの核酸の配列は、それぞれ、配列番号1、配列番号2及び配列番号3の配列を含む。上記3つの核酸がDNAである場合、上記3つの核酸の配列は、それぞれ、配列番号1、配列番号2及び配列番号3の配列に対応するDNA配列を含む。
【００１２】
本開示のある種の実施形態において、上記医薬組成物は、トランスフェクションに有効な量のトランスフェクション試薬を更に含む。トランスフェクション試薬の例として、カチオン性脂質及び細胞透過ペプチドが挙げられる。
【００１３】
ある実施形態によれば、第一核酸、第二核酸及び第三核酸のうちの少なくとも1つは、ウイルスベクターに構築されている。例えば、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター又はレンチウイルスベクターとすることができる。各種実施形態において、上記3つの核酸は、それぞれ、3つの別々のウイルスベクターに構築することができ、代わりに、同じウイルスベクターに構築することもできる。更にその代わりに、上記3つの核酸のうちの2つを同じウイルスベクターに構築して、残りの核酸を異なるウイルスベクターに構築することもできる。
【００１４】
本開示の様々な実施形態によれば、第一核酸、第二核酸及び第三核酸は、低分子干渉リボ核酸(siRNA)、低分子ヘアピン型リボ核酸(shRNA)又はマイクロリボ核酸(miRNA)とすることができる。
【００１５】
本開示のある種の実施形態において、第一核酸、第二核酸及び第三核酸は、siRNAであり、第一、第二及び第三核酸のセンス鎖の配列は、それぞれ、配列番号1、配列番号2及び配列番号3の配列と同一である。
【００１６】
別の態様において、本開示は、瘢痕形成の低減を必要とする対象における瘢痕形成を低減する方法に関する。上記方法では、TGFBRI遺伝子を標的とする3つの核酸の混合物を使用する。
【００１７】
本開示のある種の実施形態によれば、上記方法は、対象に、有効量の第一、第二及び第三核酸を投与するステップを有する。上記3つの核酸の配列は、それぞれ、配列番号1、配列番号2及び配列番号3の配列又はそれらに対応するDNA配列を含む。
【００１８】
本開示の幾つかの任意の実施形態において、上記方法は、対象に、トランスフェクションに有効な量のトランスフェクション試薬を投与するステップを更に有する。各種実施形態において、上記siRNA混合物の投与は、上記トランスフェクション試薬の投与の前に、それと同時に、又は、その後に行われる。
【００１９】
各種実施形態によれば、上記トランスフェクション試薬及び上記siRNA混合物は、単一調製物又は別々の調製物として調製することができる。
【００２０】
本開示の様々な実施形態によれば、上記トランスフェクション試薬は、1又は複数のカチオン性脂質、ポリマー又は細胞透過ペプチドとすることができる。
【００２１】
本開示における多数の付随の特徴及び効果は、添付の図面を考慮しつつ以下の詳細な説明を参照することによってより理解できるだろう。
【００２２】
本記述は、添付の図面を踏まえつつ読む以下の詳細な説明からより理解できるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図1は、本開示の実施例1による、3日目でのヒト肥厚性瘢痕線維芽細胞におけるTGFBRI遺伝子の相対的mRNA発現を示している棒グラフ(n = 3)である。
【００２４】
【図２】図2は、本開示の実施例1による、5日目でのヒト肥厚性瘢痕線維芽細胞におけるTGFBRI遺伝子及びGAPDH遺伝子のタンパク質発現を示しているウェスタンブロットの代表的な写真である。
【００２５】
【図３】図3は、本開示の実施例1による、スクランブルsiRNAは又はsiTGFBRI混合物を用いてトランスフェクションした5日後でのTGFBRIに関する代表的な免疫蛍光染色写真を提供する。
【００２６】
【図４】図4は、本開示の実施例2による、siTGFBRI混合物又はスクランブルsiRNAを用いたsiRNAトランスフェクションの3、7及び10日後でのヒト肥厚性瘢痕線維芽細胞の成長曲線(n = 5)である。
【００２７】
【図５】図5は、本開示の実施例2による、TGF-βI刺激が有る場合と無い場合でのsiTGFBRI混合物又はスクランブルsiRNAを用いたsiRNAトランスフェクションの3、7及び10日後でのヒト肥厚性瘢痕線維芽細胞の成長曲線(n = 5)である。
【００２８】
【図６】図6は、本開示の実施例3による、3日目でのヒト肥厚性瘢痕線維芽細胞における様々な遺伝子の相対的mRNA発現を示している棒グラフ(n = 5)を提供する。
【００２９】
【図７】図7は、本開示の実施例3による、スクランブルsiRNA又はsiTGFBRI混合物を用いたトランスフェクションの7日後での、分泌されたI型コラーゲンに対する酵素免疫測定法の結果を示している棒グラフ(n = 5)である。
【００３０】
【図８】図8は、本開示の実施例3による、スクランブルsiRNA又はsiTGFBRI混合物を用いたトランスフェクションの6日後でのフィブロネクチンに関する代表的な免疫蛍光法写真を提供する。
【００３１】
【図９】図9は、本開示の実施例4による、損傷の6、10及び14週間後でのラビットの耳における創傷肉芽組織の代表的な写真(バー= 500μm)を提供する。
【００３２】
【図１０】図10は、本開示の実施例4による、損傷の6、10及び14週間後でのラビットの耳における創傷のバンクーバー瘢痕スケール(Vancouver scar scale)をまとめた棒グラフである。
【００３３】
【図１１】図11は、本開示の実施例5による、損傷の6、10及び14週間後に収集された瘢痕組織の皮膚切片の代表的な写真(左パネル;バー= 2mm)と、皮膚切片の部分拡大図(中央及び右パネル;バー= 100μm)を提供する。
【００３４】
【図１２】図12は、本開示の実施例5による、損傷の6、10及び14週間後でのラビットの耳における創傷の瘢痕隆起指数(scar elevation index)をまとめた棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
記述
添付の図面に関連して下記で提供する詳細な説明は、本実施例の記述を意図するものであり、本実施例を構成する又は利用することができる唯一の形態を表す意図はない。本記述は、実施例の機能並びに実施例を構成及び操作するためのステップの順序を記載する。しかしながら、同一又は等価な機能及び順序は、異なる実施例によっても達成することができる。
【００３６】
便宜上、明細書、実施例及び添付の請求項において使用されるある種の用語は、ここに集めている。別途規定されない限り、本願明細書において用いられる全ての技術的及び科学的な用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。
【００３７】
本願明細書に別途規定されない限り、本開示において使用される科学及び技術専門用語は、当業者が一般的に理解し使用するのと同じ意味を有する。文脈によって別途要求されない限り、単数形の用語は、それと同じものの複数形を含み、複数形の用語は、単数形を含むことが理解されよう。具体的には、本願明細書及び特許請求の範囲において使用される単数形「a」及び「the」は、文脈で別途明確に明示しない限り、複数形の言及を含む。また、本願明細書及び特許請求の範囲において使用される「少なくとも一つの」及び「1又は複数」という用語は、同じ意味を有し、1つ、2つ、3つ以上を含む。
【００３８】
本発明を幅広く記載する数値範囲及びパラメーターが近似値であったとしても、特定の実施例において記載されている数値は、可能な限り正確に報告されている。しかしながら、任意の数値は、それぞれの試験測定値で見つかる、標準偏差から必然的に生じるある種の誤差を本質的に含む。また、本願明細書において使用される用語「約」は、所定の値又は範囲の10%、5%、1%又は0.5%以内を一般的に意味する。あるいは、用語「約」は、当業者が検討する場合の許容可能な平均の標準誤差以内を意味する。
【００３９】
特に明記しない限り、本願明細書において用いられるポリヌクレオチドの表記は、一般的な使用法に従って、左側末端が5'末端であり、右側末端が3'末端である。
【００４０】
本明細書で用いられる、瘢痕形成に関する「軽減」という用語は、瘢痕形成がヒトによる干渉を受けない通常状態と比較して、瘢痕形成の発生率がより低くなる、任意の利用可能な若しくは将来の評価手順による瘢痕評価スケールの度合いが低下する、又は、瘢痕面積若しくは瘢痕体積の度合いが低くなる、程度に関する。
【００４１】
本明細書で使用される用語「有効(な)量」は、所望の反応を得るのに十分な成分の量を指す。特定の有効(な)量は、要因(例えば、治療されている特定の状態、対象の物理的状態(例えば、対象の体重、年齢又は性別)、治療されている哺乳動物又は動物のタイプ、治療期間、併用療法の性質(もし、ある場合)及び使用される特定の調製物)によって変動するものである。有効(な)量には、成分又は組成の任意の有毒又は不利益な効果を有益な治療効果が上回るものもある。有効(な)量は、例えば、グラム、ミリグラム若しくはマイクログラム又は体重１キログラム当りのミリグラム(mg/kg)として表すことができる。あるいは、有効(な)量は、医薬組成物の活性成分の濃度(例えば、モル濃度、質量濃度、体積濃度、質量モル濃度、モル分率、質量分率及び混合比)として表すことができる。
【００４２】
具体的には、本願明細書に記載されている核酸に関連して使用する用語「有効(な)量」は、対象における瘢痕形成の軽減を誘発するのに十分な核酸の量を指す。同様に、「トランスフェクションに有効な量」は、核酸のトランスフェクションが有効になるのに十分なトランスフェクション試薬の量である。
【００４３】
本明細書で用いられる「医薬的に許容可能なキャリア」は、適切な利益/リスク比に見合う、過度の有害副作用(例えば毒性、刺激及びアレルギー反応)が存在しない、ヒト及び/又は動物での使用に適しているものである。また、各キャリアは、医薬調製物の他の成分と適合するという意味において「許容可能」でなければならない。上記キャリアは、固体、半固体若しくは液体の希釈剤、クリーム又はカプセルの形態とすることができる。
【００４４】
本明細書中で使用される用語「キャリア」は、本開示の核酸のためのビヒクル/賦形剤を形成する任意の不活性物質(例えば、粉末又は液体)を意味する。上記キャリアは、医薬組成物を作成するために有用な、医薬品業界で公知の任意物質(例えば、充填剤、希釈剤、凝着剤、結合剤、潤滑剤、滑走剤、安定剤、着色剤、湿潤剤、崩壊剤等)を含んでいてもよい。
【００４５】
用語「適用」又は「投与」、瘢痕化を軽減又は改善させるために本願の核酸又はそれを含む医薬組成物を対象に提供する意味を指すために、本願明細書において互いに置換可能に使用される。本開示の様々な実施形態によれば、局所投与、局所注入及び経皮送達が一般的な送達ルートである。例えば、本発明の核酸又は医薬組成物を対象の皮膚に局所的に適用すると、本願の核酸又は医薬組成物が瘢痕形成を軽減又は改善するように標的部位(例えば、真皮)に到達する。
【００４６】
用語「対象」は、本発明の核酸、医薬組成物及び/又は方法によって治療可能である、ヒト種を含む哺乳動物を指す。用語「対象」は、1つの性別を具体的に明示しない限り、男女両方の性別を指すことを意図とする。
【００４７】
本発明は、ヒトTGFBRI遺伝子(NM_004612.2)の種々の領域を標的とする3つのsiRNAの混合物が創傷治癒プロセスの間に瘢痕形成を軽減することができる発見に、少なくとも基づくものである。特に、3つのsiRNAの組み合わせは、siRNAのうちの1つの瘢痕軽減効果を増強する。従って、一つの態様において、本開示は、上記3つのsiRNAを含む混合物に関する。更に、本開示によるsiRNA混合物は、瘢痕形成を軽減(予防を含む)するために提供することができ、例えば、医薬(例：医薬組成物に含まれるもの)として製造される。本願のsiRNA混合物及びそれを含む医薬組成物は、瘢痕形成を軽減する方法で適用することもできる。従って、本開示は、瘢痕形成の軽減を必要とする対象における瘢痕形成を軽減する方法も予定している。
【００４８】
本開示のある種の実施形態によれば、3つのsiRNAは、それぞれ、配列番号1、配列番号2及び配列番号3のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を有する。siRNAは、多くの場合、平滑、3'-オーバーハング又は5'-オーバーハング末端を有する二本鎖である。以下に提供する実施例では、siRNAは、平滑末端であり、siRNAのアンチセンス鎖は、それぞれのセンス鎖を完全に相補する。
【００４９】
当業者であれば理解しているように、mRNA翻訳のサイレンシング又は阻害は、siRNA以外のヌクレオチド分子によっても成し遂げることができ、これらのヌクレオチド分子も本発明の実施形態によって予定されるものである。例えば、shRNAは、RNA分子がループ構造を形成することを可能にする短いスペーサーヌクレオチドを介して接続したセンス及びアンチセンス配列を含むRNA分子であり、本開示の実施形態によれば、第一、第二及び第三核酸を、shRNAのセンス配列が配列番号1、配列番号2及び配列番号3の配列とそれぞれ同一であるshRNAとすることができる。他の実施態様において、上記核酸は、miRNA又はその前駆体(例えば、プリmiRNA又はプレmiRNA)の形で提供され、miRNA又は前駆体は、それぞれ、配列番号1、配列番号2及び配列番号3の配列を含む配列を有する。更にその代わり、本願の核酸は、配列番号1-3の配列(又は、それに対応するDNA配列)を含む任意の二本鎖又は一本鎖のアンチセンスオリゴヌクレオチドとすることができる。
【００５０】
ある種の実施形態において、医薬組成物は、標的細胞(又は、宿主)にsiRNAのトランスフェクションを促進又は可能にするのに十分な量のトランスフェクション試薬を更に含んでいてもよい。理解している通り、トランスフェクション試薬及びsiRNA混合物は、単一の調製物又は別々の調製物に調製することができる。代わりに又は付加的に、標的細胞を、1又は複数の外部刺激(例えば、トランスフェクション効率を高めるエレクトロポレーション又はリン酸カルシウム)によって処理することができる。
【００５１】
本開示のある種の実施形態によれば、トランスフェクション試薬は、カチオン性脂質とすることができる。商業的に入手可能なカチオン性脂質には、オリゴフェクトアミンTM(OligofectamineTM)、リポフェクトアルニンTM(LipofectArnineTM)、リポフェクトアミン2000TM(LipofectAmine 2000TM)(Invitrogen)が含まれるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、トランスフェクション試薬には、PepMuteTM(SignaGen)、N-TERTMナノ粒子(Sigma-Aldrich)及びDeliverXTM(Isogen)といった細胞透過ペプチドが含まれる。
【００５２】
siRNAを含む医薬組成物は、siRNAの安定性を保護したり、siRNAの有効期間を延長したり、siRNAの機能を強化したり、siRNAの標的を特定組織/細胞にしたりする追加の成分を含んでいてもよい。
【００５３】
任意の実施形態において、本医薬組成物に含まれる3つの核酸は、1又は複数のウイルスベクター(例えば、アデノ随伴ウイルスベクター又はレンチウイルスベクター)に構築してもよい。各種実施形態において、1つのウイルスベクターに、3つ全ての核酸を載せてもよく、代わり、上記3つの核酸のうちの1つ又は2つをそれぞれ載せている複数のウイルスベクターとすることもできる。
【００５４】
本開示の様々な実施形態によれば、本願のsiRNA混合物(又は、上述のshRNA混合物、miRNA混合物又は1若しくは複数のウイルスベクター;以下同じ)又はそれを含む医薬組成物は、対象、特に、創傷治癒プロセスの間に瘢痕形成を改善するように対象の標的サイトに投与することができる。例えば、siRNA混合物又は医薬組成物は、対象の創傷サイトに局所的に適用することができる。あるいは、siRNA混合物又は医薬組成物は、対象の表皮への適用後、真皮層に位置する創傷部位に到達する経皮的投与形態として調製される。更にその代わり、siRNA混合物又は医薬組成物は、創傷部位に局所的に注入する。局所送達に加えて、siRNA混合物又は医薬組成物は、例えば、全身的(例えば、静脈内)に投与して、外傷を受けた組織部位に移動させてもよい。これらの場合、医薬組成物に、1又は複数のキャリアを任意に含めてsiRNA混合物の局所的又は全体的送達を向上させてもよい。
【００５５】
本開示の任意の実施形態によれば、瘢痕形成を軽減する方法は、対象に、トランスフェクションに有効な量のトランスフェクション試薬を投与するステップを更に有する。各種実施形態において、siRNA混合物の投与は、トランスフェクション試薬の投与の前に、それと同時に、又は、その後に行われる。siRNA混合物の投与がトランスフェクション試薬の投与と同時に行なう場合には、siRNA混合物及びトランスフェクション試薬は、同じ調製物又は別々の調製物に調製することができる。
【００５６】
以下の実施例は、本発明のある種の態様を明らかにして、本発明を実施する当業者を補助するために提供される。これらの実施例は、いかなる方法であっても本発明の範囲を制限するものと考えるべきではない。更なる詳細な説明がなくても、当業者は、本願明細書の記述に基づいて、本発明を最大限利用することができると考えられる。本願明細書に引用される全ての刊行物は、それらの全てを本願明細書に援用したものとする。
【実施例】
【００５７】
実施例
【００５８】
材料及び方法
【００５９】
ヒト肥厚性瘢痕線維芽細胞の培養
一次培養したヒト肥厚性瘢痕線維芽細胞(hHSF)を、5つの皮膚サンプル(4人の男性及び1人の女性(年齢36-86))から確立した。これらの皮膚サンプルの全ては、瘢痕整形手術由来の廃棄された瘢痕組織であった。サンプル収集プロトコールは、三軍総医院(台北、台湾、R.O.C)の施設内倫理委員会によって承認され、各ドナーから書面でのインフォームドコンセントを取得した。試料は、以下の通りに処理した。簡潔に述べれば、試料を小断片に切り取り、上皮を取り除くために0.2%のディスパーゼII(Roche Applied Science、マンハイム、ドイツ)及びリーボビッツL-15培地(Gibco、グランドアイランド、NY)中において消化させた。次に、真皮層を37℃、5%のCO2下で24時間、10%のウシ胎児血清(FBS)(Gibco)を補充した0.05%のコラゲナーゼを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Gibco)においてインキュベートした。次に、得られた細胞を、10%のFBSを補充したDMEMに維持した。この培地を、2-3日毎に新しくした。3〜6継代の線維芽細胞を、その後の研究のために回収した。
【００６０】
siRNAトランスフェクションTGFBRIステルスsiRNAの設計は、プログラムBLOCK-iTTM RNAi デザイナー(Invitrogen、カールズバッド、CA)及びNCBI-BLASTに基づいた。3つの選択された二体鎖siRNA(siTGBRI-a: GACAUCUAUGCAAUGGGCUUAGUAU(配列番号1)、siTGBRI-b: GCAUCUCACUCAUGUUGAUGGUCUA(配列番号2)及びsiTGBRI-c: AGUAAGACAUGAUUCAGCCACAGAU(配列番号3))は、ヒトTGFBRI mRNA(NM_004612.2)のセンス鎖の種々の領域をカバーする。これらの3つの二体鎖siRNAは、ラビットTGFBRI mRNA(XM_002708153.1)に合うようにも設計した。設計したTGFBRI siRNA配列は、Invitrogenに注文して合成した。非特異的スクランブルsiRNA(5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3')(MDbio、台北、台湾)をコントロールとして使用した。3つのTGFBRI siRNA(単独又は組み合わせ)及びスクランブルsiRNAを、PepMuteトランスフェクションキット(SignaGen、ロックビル、MD)を用いて線維芽細胞にそれぞれリバーストランスフェクションした。簡潔に述べれば、TGFBRI siRNA混合物又は単一TGFBRI siRNAを100μlのトランスフェクション緩衝液に希釈して、次に、1μlのPepMute試薬を加えて、そして、混合物を15分間室温でインキュベートした。細胞を、10%のFBSを有する900μlのDMEM中に懸濁して、次に、100μlの希釈された二体鎖siRNAを有する6ウェル培養皿に播種(2×105細胞/ウェル)して、37℃、5%のCO2下でインキュベートした。最終的なsiRNA濃度は、60nMであったが、これは、最適な試験次第である。24時間後、培地を、2ng/mlの追加のTGF-βI(Invitrogen)が有るものと無いものとがある5%のFBSを含むDMEMで置き換えた。5つのhHSF株を、同じプロセスを使用して処理した。
【００６１】
RNA分離、逆転写及び定量的リアルタイムPCR
処理した細胞の遺伝子発現を、siRNAトランスフェクションの72時間後に分析した。全RNAを、RNeasy Miniキット(Qiagen GmbH、ヒルデン、ドイツ)を使用して単離した。RNAの質及び量は、NanoDrop2000(Thermo Fisher Scientific、ウィルミントン、DE)によって決定した。次に、RNAを、MultiScript High Capacity cDNA Reverse Transcriptionキット(Applied Biosystems、フォスターシティー、CA)を用いてcDNAに変換した。遺伝子発現レベルは、キュアンチファスト(QuantiFast)(登録商標)Probe Assayキット(Qiagen)を用いた定量的リアルタイムPCRによって、TGFBRI及びグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)に関して測定した。I型コラーゲン、III型コラーゲン、結合組織成長要因(CTGF)及びフィブロネクチンに関して、遺伝子発現レベルは、Power SYBR Green PCRマスターミックス(Invitrogen)を適切なプライマー(表1)と、内部標準の役目を果すGAPDH遺伝子発現を用いて定量化した。TaqManリアルタイムPCR及びSYBR Green定量的リアルタイムPCRは、LightCycler480システム(Roche Applied Science)において実行し分析した。
【表１】
0006363737.tif 000002
【００６２】
TGFBRIタンパク質発現に関するウェスタンブロット
処理した細胞のTGFBRIタンパク質発現は、TGFBRI siRNAトランスフェクションの5日後にウェスタンブロット法によって分析した。細胞を、タンパク質分解酵素阻害剤(Roche Applied Science)を含むプロ-プレップタンパク質抽出溶液(Intron、ソウル、韓国)において溶解した。タンパク質抽出物を、4-20%のグラジエントゲル(BioRad、ヘラクレス、CA)にアプライして、次に、PVDF膜に転写した。PVDF膜を、ラビット抗ヒトTGFBRI抗体(GeneTex、サンアントニオ、TX)と内部標準としてマウス抗GAPDH(GeneTex、サンアントニオ、TX)を用いて免疫ブロットした。適切なHRP結合二次抗体を膜と共にインキュベートして、化学発光基質(Visual protein、台北、台湾)を活性化させた。タンパク質発現レベルは、UVP BioImaging System(UVP、アップランド、CA)によって検出して数量化した。
【００６３】
線維芽細胞増殖アッセイ
線維芽細胞増殖は、Cell Counting Kit-8(Boster Biological Technology、武漢、中国)を使用して定量化した。簡潔に述べれば、上記の通り、5つの皮膚サンプル由来のhHSFを、3つ一組となるように96ウエルプレートに5×103細胞/ウェルで播種して、60nMのTGFBRI siRNAで処理した。処理の1日後に、培地を、2ng/mlの追加のTGF-βIが有る培地又は無い培地に交換した。培地を、2日毎に新しくした。処理の3、7及び10日後に、フェノールレッドを含まない90μlのDMEM中の10μlのCCK-8溶液を各ウェルに加えた。1時間のインキュベーション後、吸光度を450nmで記録した。
【００６４】
I型コラーゲンの酵素免疫測定
TGFBRI siRNAトランスフェクション後の線維芽細胞の上清中のI型コラーゲン生産を決定するために、siRNAトランスフェクション線維芽細胞を、37℃、5%のCO2下で、2ng/mlの追加のTGF-βIを有する培地においてインキュベートした。培地を、1日毎に新しくした。7日目に、培地を回収して、上清を、ヒトI型コラーゲンELISAキット(BlueGene、上海、中国)を使用した酵素免疫測定法(ELISA)で測定した。吸光度を、分光光度計(BioRad)による検量線に対して、450nmで記録した。全ての測定は、3つ一組で行い、5つのhHSF株において実施し、μg/mLで表した。
【００６５】
動物モデル
国防医学院の動物ケアセンターで飼育された成体ニュージーランドホワイトラビットを、行政院農業委員会家畜衛生試験所(新北市、台湾)から購入した。全ての外科手術アプローチ及び手順は、国防医学院の動物実験委員会の承認を得た。6月齢のラビット(3-3.5kg)を、ゾレチル(zoletil)(1mg/kg)及びキシラジン(3mg/kg)の筋肉内注入によって鎮静化して、1.5-4%のイソフルランを用いた吸入によって麻酔させた。ケトプロフェン(10mg/kg)を実験中の鎮痛剤として与えた。軟骨膜を除去した4つの1.8×1.8cm2の全層皮膚欠損創傷を、各耳の凹面側に形成した。創傷は、ワセリンガーゼを用いてカバーして、CoBan(3M Healthcare、セントポール、MN)を用いて固定し、2週間、創傷が感染しない限り交換しなかった。これらの手順によって、14日目に約5mmの肉芽組織が病変側の縁に形成された。88個の創傷を、TGFBRI siRNA治療グループとコントロールグループに分けた。TGFBRI siRNA治療グループにおいては、各創傷の肉芽部位へ、創傷の2、3及び4週間後に、2.5μlのPepMute試薬を用いて調製した40μlのトランスフェクション緩衝液中の240pmolのTGFBRI siRNAを注入した。コントロールグループは、siRNA注入のない同じ手順を使用して治療した。siRNA注入の前に、動物を上記の通りに鎮静化させた。修復された創傷は、皮膚欠損手術の6、10及び14週間後に、バンクーバー瘢痕スケール(VSS)(Fearmonti, R., Bond, J., Erdmann, D. & Levinson, H. (2010)A review of scar scales and scar measuring devices. Eplasty 10: e43.)によって評価した。次に、瘢痕試料を収集するために、動物を麻酔の過剰投与によって屠殺した。瘢痕試料を、10%のホルマリンで固定して、パラフィンに包埋し、スライドガラスにおいて5μmに切断し、マッソン三色染色法(Sigma-Aldrich、セントルイス、MO)で着色した。肥厚した真皮を、瘢痕隆起指数(SEI)(Kloeters, O., Tandara, A. & Mustoe, T. A. (2007). Hypertrophic scar model in the rabbit ear: a reproducible model for studying scar tissue behavior with new observations on silicone gel sheeting for scar reduction. Wound Repair Regen 15 Suppl 1: S40-45.)を使用して評価した。
【００６６】
統計解析
全てのデータは、平均±標準偏差(SD)として表した。統計解析は、一方向ANOVAを使用して実行した。特に明記しない限り、0.05未満のP値を有する差異を、統計的に有意であるとみなした(P < 0.05)。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
【００６７】
実施例1
【００６８】
TGBRI siRNA混合物は、TGFBRI遺伝子発現を低下させる
【００６９】
この実施例において、ヒト肥厚性瘢痕線維芽細胞に、60nMのsiTGBRI-a、siTGBRI-b、siTGBRI-c若しくはスクランブルsiRNA又はsiTGBRI-a、siTGBRI-b及びsiTGBRI-cを含む60nMのsiTGBRI混合物をトランスフェクションした。TGFBRI遺伝子発現は、上記プロトコールに従って、3日目に定量的逆転写PCR分析によって確認した。スクランブルsiRNA 1をトランスフェクションした細胞由来のmRNAレベルを、1に正規化し、図1において提供されるデータは、コントロールグループと各治療グループとの間の変化を倍数として表している。
【００７０】
図1に示しているように、上記3つのsiRNAは、単独又は組み合わせで、TGFBRI遺伝子のmRNA発現レベルを著しく低下させた。しかしながら、本発明者は、TGFBRIのmRNA発現の減少の観点から、siRNA混合物(siTGBRI混合物)が、3つのsiRNAのいずれかによって誘導されたものよりも顕著な効果を引き出すことを観察した。言い換えると、3つのsiRNAの組み合わせは、相乗効果を成し遂げた。更に、統計解析によって、siTGFBRI混合物治療グループと単一siRNA治療グループのいずれかとの間に確かな有意差があることを明らかにした。従って、この相乗効果は、先行技術から明白ではない程度に予想されるものよりも顕著である。
【００７１】
ウェスタンブロット解析(図2)及び免疫蛍光染色(図3)からも、siTGFBRI混合物がTGFBRIタンパク質の発現レベルを低下させることが確認された。
【００７２】
実施例2
【００７３】
TGBRI siRNA混合物は、ヒト真皮線維芽細胞の細胞増殖を阻害する
【００７４】
様々な濃度のsiTGBRI混合物(15、60又は150nM)又はスクランブルsiRNA(60nM)を用いてトランスフェクションされたヒト肥厚性瘢痕線維芽細胞の細胞増殖は、siRNAトランスフェクションの3、7及び10日後に調査した。図4には、15-150nMのsiTGBRI混合物の投与が線維芽細胞増殖を効果的に阻害するという結果が示されている。トランスフェクション後の初期ステージ(例えば、第一週目)の間、siTGBRI混合物の濃度は、阻害作用に対して著しい影響を及ぼさなかった。しかしながら、トランスフェクションの10日後、siTGBRI混合物の濃度が高いほど線維芽細胞増殖に対する阻害レベルが大きくなるという用量依存的阻害作用が観察された。
【００７５】
加えて、ヒト肥厚性瘢痕線維芽細胞に、追加のTGF-βI(2ng/ml)が有る場合と無い場合とで、60nMのsiTGFBRI混合物又は60nMのスクランブルsiRNAを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの3、7及び10日後の各治療グループから得られた細胞数を図5にまとめられている。「スクランブルsiRNA + TGF-βI」と「siTGFBRI混合物  + TGF-βI」を用いて治療したグループで比較すると、siTGFBRI混合物の投与が線維芽細胞増殖を著しく阻害したことが明らかである。
【００７６】
実施例3
【００７７】
TGFBRIの下方制御は、ECM生産を低下させる
【００７８】
細胞外基質の形成には、様々なメディエーター及び成分(例えば、I型コラーゲン、III型コラーゲン、フィブロネクチン及び結合組織成長要因(CTGF))が関与する。この実施例において、追加のTGF-βIが有る場合と無い場合とで、60nMのsiTGFBRI混合物又はスクランブルsiRNAをトランスフェクションしたヒト肥厚性瘢痕線維芽細胞における上記タンパク質の相対的mRNA発現レベルをsiRNAトランスフェクションの72時間後にリアルタイムPCRで分析した。スクランブルsiRNAを用いてトランスフェクションして、TGF-β1(ポジティブコントロール)を用いて刺激した細胞由来の本来のmRNAレベルを、1に正規化し、図6にて提供されるデータは、ポジティブコントロールに対する各治療グループの変化を倍数として表している。
【００７９】
図6のデータは、「siTGFBRI混合物 + TGF-βI」を用いて治療したグループにおいて、I型コラーゲン、III型コラーゲン、フィブロネクチン及びCTGFのmRNA発現レベルが、「スクランブルsiRNA + TGF-βI」を用いて治療したグループと比較して実質的に低下したことを示している。
【００８０】
治療した細胞の培地を、siRNAトランスフェクションの7日後に回収して、分泌されたI型コラーゲンに関してELISAによって分析した。図7にまとめているように、ELISAの結果は、siTGFBRI混合物のトランスフェクションが実質的に線維芽細胞のI型コラーゲンの合成を低下させたことを示している。
【００８１】
図8は、フィブロネクチンに関する免疫蛍光染色の写真である。図8に示すように、siTGFBRI混合物を用いたトランスフェクションは、トランスフェクションの6日後にECMにおけるフィブロネクチンが低下した。
【００８２】
前述の観点から、siTGFBRI混合物の投与は、トランスフェクションされた線維芽細胞におけるECM生産を低下させた。
【００８３】
実施例4
【００８４】
TGFBRI siRNA混合物は、インビボで、肥厚性瘢痕を減弱させる
【００８５】
siTGFBRI混合物を、損傷の2、3及び4週間後に、ラビットの耳における創傷肉芽組織に注入した。修復された組織を、損傷の6、10及び14週間後に撮影した
【００８６】
図9において、siTGFBRI混合物で治療したラビットの創傷は、コントロールラビットの創傷と比較すると治癒していた。具体的には、siTGFBRI混合物で治療したラビットの瘢痕面積及び瘢痕体積は、コントロールラビットのものよりも小さかった。また、siTGFBRI混合物で治療したラビットの瘢痕の淡い色から判断すると、siTGFBRI混合物で治療した創傷における色素沈着は、僅かであった。
【００８７】
修復された創傷は、バンクーバー瘢痕スケール(VSS)によって評価した。結果は、図10にまとめている。VSSは、修復された組織の血管分布、高さ/厚さ、柔軟性及び色素沈着を評価するものであり、治療法を評価するために広く適用でき、熱傷の結果の目安として考えられている。VSS評価によれば、スケールゼロは、完全に又はほぼ完全に治癒された組織を意味する。図10のデータは、siTGFBRI混合物の治療がインビボで肥厚性瘢痕の形成を効果的に改善したことを立証している。
【００８８】
実施例5
【００８９】
TGFBRI siRNA混合物は、インビボでコラーゲン沈着を軽減する
【００９０】
(上記)実施例4において治療したラビットの瘢痕組織は、損傷の6、10及び14週間後に回収して、切片を(上記)「材料及び方法」箇所で説明したように作成した。
【００９１】
修復された組織の代表的な顕微写真を図11に提供している。図11から明らかなように、siTGFBRI混合物の適用は、siTGFBRI混合物で治療したグループにおいてはコラーゲン(青)の密度が高くないため、修復された組織においてコラーゲン沈着を著しく低下させた。
【００９２】
組織切片を、瘢痕隆起指数(SEI)によって更に評価した。SEIは、通常瘢痕と比較した、瘢痕の高さに関する組織学的測定である。各瘢痕の肥厚の程度は、肥厚性瘢痕下の通常組織の領域に対する合計創傷領域の組織高さの比率であり、SEIが1の場合は、瘢痕高の上昇がないことを示す。図12にまとめているSEIの結果は、コントロールラビットのものと比較して、より少ない瘢痕隆起がsiTGFBRI混合物で治療したラビットにおいて観察されたことを示している。
【００９３】
実施形態での上記記載は、単に一例として提供するものであり、様々な変更形態が当業者によってなされることが理解されよう。上記明細書、実施例及びデータは、本発明の例示的な実施形態の構造及び使用に関する完全な記載を提供するものである。本発明の様々な実施形態は、ある程度詳細に、又は、1又は複数の個々の実施形態を参照しつつ記載されているが、当業者は、本発明の精神又は範囲を逸脱しない範囲で開示された実施形態に対する多数の改良形態をなすことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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