(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列から成るＤＮＡ：（ａ）配列番号：１８で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードする塩基配列；又は（ｂ）配列番号：１９で示される塩基配列において配列番号：１８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列。
【請求項２】
配列番号：１８で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド。
【請求項３】
請求項１記載のＤＮＡを導入した宿主細胞で作製される組換え蛋白質である、請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを導入した組換え動物細胞。
【請求項６】
請求項４記載の組換えベクターを導入した組換え非ヒト動物。
【請求項７】
請求項１記載のＤＮＡを用いた、血管増殖分化制御因子又は血管増殖分化を制御する化合物のスクリ−ニング方法。
【請求項８】
請求項２記載のポリペプチドを用いた、生体内血管増殖分化制御因子又は血管増殖分化を制御する化合物のスクリ−ニング方法。
【請求項９】
請求項５又は６記載の組換え非ヒト動物又は組換え動物細胞を用いた、生体内血管増殖分化制御因子又は血管増殖分化を制御する化合物のスクリ−ニング方法。
【請求項１０】
配列番号：１８で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを活性成分として含む血管新生阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、Ｐｌｅｘｉｎ様配列を有し、個体発生時の血管形成時期の初期から血管形成時期全般を通して血管特異的に発現し、成長後の成体では胃・重層扁平上皮に於いて強い発現、子宮に於いてやや強い発現が、また、脳をはじめとした各種臓器に於いて発現が認められる新規ＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子、該ＤＮＡにコードされる新規ポリペプチド及び該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、新規ポリペプチドに対する抗体、並びに、血管細胞増殖分化制御、癌増殖を支持する血管増殖阻害に関わる制御する生体内血管増殖分化制御因子、化合物のスクリ−ニング方法、及び該分化制御因子、化合物の血管増殖分化制御活性測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】  近年のヒトゲノムプロジェクト及びヒトｃＤＮＡプロジェクトの成功により、多くのヒト疾患関連遺伝子が同定あるいは推定されるにいたった。しかしながらその一方で倫理上の問題からヒト遺伝子を用いた研究には制約があり、新たな研究の方向性が模索されている。このような観点からモデル生物における相同遺伝子を同定することは、研究を進展させる意味できわめて重要なステップと考えられる。特に齧歯類、とりわけマウスは最も研究が進んでいるモデル生物で、ゲノム情報や変異種の情報も比較的多く蓄積されているが、蓄積されたゲノム情報はまだ十分なものではない。一方、生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、ｃＤＮＡの配列をランダムに解析する研究がなされ、得られたｃＤＮＡの断片配列がＥｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ（ＥＳＴ）としてデータベースに登録、公開がなされた。しかし、多くのＥＳＴは１００塩基長から５００塩基長といった短い塩基配列情報のみであり、その機能を推定することは困難である。【０００３】  各種臓器においては、多くのホルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれている。また、各種臓器における機能の調節には、機能を受け持つ特異的な細胞の増殖やガイダンス、あるいは細胞の活性化が関係している。従って、個体発生時の血管形成時期の初期から血管形成時期全般を通して血管特異的に発現する等、各種臓器に於いて発現が認められる新規な遺伝子を取得して、その遺伝子にコードされる血管形成あるいは各種臓器で複雑な機能を調節する蛋白質を得ることは、医薬品開発に有用である。また、得られた蛋白質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医薬品を開発するためには、生体内で発現している該蛋白質の遺伝子の機能をホモロジー検索から推定し、その情報を基にして該蛋白質を適当な発現系で発現させて組換え蛋白質を得、更にして該蛋白質に特異的に結合する抗体を得ることが必要であった。また、マウスＥＳ細胞を用いた血管形成をモデル化した実験系に於いて、血管形成に関わる遺伝子を網羅的に取得する試みがなされ、基礎的な知見の蓄積が進んでいる（文献１４）。しかし、血管形成に関わる４，０００塩基長以上の齧歯類、とりわけマウス由来の長大な遺伝子について報告はない。【０００４】長鎖ヒトｃＤＮＡプロジェクトにて、ヒト脳由来のヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子
（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．，Ｎａｇａｓｅ，Ｔ．，Ｓｕｙａｍａ，Ｍ．，Ｍｉｙａｊｉｍａ，Ｎ．，Ｔａｎａｋａ，Ａ．，Ｋｏｔａｎｉ，Ｈ．Ｎｏｍｕｒａ，Ｎ．ａｎｄ  Ｏｈａｒａ，Ｏ．，ＤＮＡ  Ｒｅｓ．，１９９８，５：１６９−１７６，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｕｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｓ  Ｘ．Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  １００  ｎｅｗ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｒａｉｎ  ｗｈｉｃｈ  ｃａｎ  ｃｏｄｅ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．，ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０１４５２０，６，７５４  ｂｐ，１，７４６ａａ，Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ，ｃＤＮＡ，ＫＩＡＡ０６２０，Ｏｈａｒａ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．）が報告され、マウス発生過程において血管内皮細胞あるいは中枢神経系（ＣＮＳ）でヒトＫＩＡＡ０６２０関連遺伝子のｍＲＮＡが発現していること等が報告（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｗａａｇ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２００２，２２５：３３６−３４３）されているが、その機能については不明であった。【０００５】  ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子は染色体染色体３ｑ２１．３に存在し、更に、ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子のＳＮＰｓも複数箇所報告されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＆ｃｍｄ＝Ｄｉｓｐｌａｙ＆ｄｏｐｔ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＿ｓｎｐ＆ｆｒｏｍ＿ｕｉｄ＝３３２７０５３）。ヒト疾患の大部分が単なる遺伝子の欠失によって引き起こされるのではなくて、アミノ酸置換によって蛋白質の機能や活性が一部分だけ変化することにより引き起こされることを鑑みると、ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子は傷治癒、骨折治癒、血管閉塞と側副血行路形成、子宮粘膜での周期的血管網形成（一過性、黄体形成時）等、また、血管新生過程が関与しそれが望ましくない癌増殖、慢性関節リュウマチ、糖尿病性網膜症、子宮内膜症、肥満、また、血管新生過程が望ましい心臓発作、神経変性疾患、足の血行障害、閉塞性動脈硬化症、尋常性乾癬といった各種疾患に関与している可能性が考えられる。ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子を用いた、マウス発生過程での血管内皮細胞あるいは中枢神経系（ＣＮＳ）でヒトＫＩＡＡ０６２０関連遺伝子のｍＲＮＡが発現していることが報告されたが、ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子とその関係をより詳細に研究するためには、ヒトではなく実験動物を用いた研究が必須である。しかし、ヒト病態の解明に重要なモデル動物である齧歯類、とりわけマウスに於けるヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子に対応する遺伝子は未取得であり、該遺伝子を用いた研究を実施することが出来なかった。【０００６】
【非特許文献１】渋谷正史，１９９９，実験医学，１７：７１２−７１５，血管新生研究の現状と分子調節機構
【非特許文献２】平島正則，西川伸一，１９９９，実験医学，１７：７１６−７２０，血管内皮細胞の発生学
【非特許文献３】山下潤，２００１，実験医学，１９：８３０−８３５，ＥＳ細胞からの血管形成
【非特許文献４】高倉伸幸，２００１，実験医学，１９：８３６−８４０，血管細胞と血管新生
【非特許文献５】宿南知佐，柴田洋之，開祐司，２００１，実験医学，１９：８４１−８４６，軟骨・骨形成と血管侵入
【非特許文献６】松浦成昭，岡崎能久，谷直之，江口英利，１９９９，実験医学，１７：７４１−７５２，腫瘍の産生する血管新生阻害因子
【非特許文献７】ジェイン，Ｒ．Ｋ．＆  カルメリ，Ｐ．Ｆ．，２００２，日経サイエンス，３月号，２２−２９，医療を変える血管新生の科学
【非特許文献８】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｗａａｇ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２００２，２２５：３３６−３４３，ＰＬＥＸＩＮ−Ｄ１，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｌｅｘｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ，ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ａｎｄ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．
【非特許文献９】Ｔａｍａｇｎｏｎｅ  Ｌ，Ａｒｔｉｇｉａｎｉ  Ｓ，Ｃｈｅｎ  Ｈ，Ｈｅ  Ｚ，Ｍｉｎｇ  ＧＩ，Ｓｏｎｇ  Ｈ，Ｃｈｅｄｏｔａｌ  Ａ，Ｗｉｎｂｅｒｇ  ＭＬ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ＣＳ，Ｐｏｏ  Ｍ，Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ  Ｍ，Ｃｏｍｏｇｌｉｏ  ＰＭ．，２００１，Ｃｅｌｌ，９９：７１−８０，Ｐｌｅｘｉｎｓ  ａｒｅ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ，ｓｅｃｒｅｔｅｄ，ａｎｄ  ＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｓ  ｉｎ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ．
【非特許文献１０】Ｍａｎａｈａｎ，Ｄ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：４８−５０，Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ．
【非特許文献１１】Ｂａｒｉｎａｇａ，Ｍ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：４８２−４８４，Ｄｅｓｉｇｉｎｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｔａｒｇｅｔ  ｔｕｍｏｒ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ．
【非特許文献１２】Ａｓａｈａｒａ  Ｔ，Ｍｕｒｏｈａｒａ  Ｔ，Ｓｕｌｌｉｖａｎ  Ａ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｍ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｅｅ  Ｒ，Ｌｉ  Ｔ，Ｗｉｔｚｅｎｂｉｃｈｌｅｒ  Ｂ，Ｓｃｈａｔｔｅｍａｎ  Ｇ，Ｉｓｎｅｒ  ＪＭ．Ａｓａｈａｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：９６４−９６７，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．
【非特許文献１３】Ｒｉｓａｕ，Ｗ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ，３８６：６７１−６７４，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．
【非特許文献１４】Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｊ，Ｉｔｏｈ  Ｈ，Ｈｉｒａｓｈｉｍａ  Ｍ，Ｏｇａｗａ  Ｍ，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｓ，Ｙｕｒｕｇｉ  Ｔ，Ｎａｉｔｏ  Ｍ，Ｎａｋａｏ  Ｋ，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｓ．Ｆｌｋ１−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｒｖｅ  ａｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．
【非特許文献１５】Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｋ，Ｎａｇａｓｅ  Ｔ，Ｓｕｙａｍａ  Ｍ，Ｍｉｙａｊｉｍａ  Ｎ，Ｔａｎａｋａ  Ａ，Ｋｏｔａｎｉ  Ｈ，Ｎｏｍｕｒａ  Ｎ，Ｏｈａｒａ  Ｏ．，１９９８，ＤＮＡ  Ｒｅｓ．，５：１６９−７６，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｓ  Ｘ．Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  １００  ｎｅｗ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｒａｉｎ  ｗｈｉｃｈ  ｃａｎ  ｃｏｄｅ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．
【非特許文献１６】Ｔａｍａｇｎｏｎｅ  Ｌ，＆  Ｃｏｍｏｇｌｉｏ  ＰＭ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０：３７７−３８３，Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｂｙ  ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｃｅｌｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ．
【非特許文献１７】Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｍ，Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｙ，Ｓｕｔｏ  Ｆ，Ｆｕｊｉｓａｗａ  Ｈ，２０００，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４８：１２８３−１２９３，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  従来、ヒト長鎖ｃＤＮＡプロジェクトでヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子が取得されていたが、遺伝子情報が完全でなく、その機能に関する情報も不完全であった。すなわち、ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子をプローブとしてマウス発生過程でのヒトＫＩＡＡ０６２０関連遺伝子発現の検出実験において、血管内皮細胞あるいは中枢神経系（ＣＮＳ）においてヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子と反応するｍＲＮＡが発現していることが報告された。しかし、ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子あるいはそれと関連する遺伝子の機能についてより詳細に研究するためには、ヒトではなく実験動物を用いた研究が必須であり、ヒト病態の解明に重要なモデル動物である齧歯類に属するラット、マウスあるいはハムスター等、とりわけマウスに於けるヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子に対応する遺伝子がその取得が困難であったため未取得のまま放置され、該遺伝を用いた研究を実施することが出来なかった。【０００８】  従って、ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子に関連する齧歯類に由来するラット、マウスあるいはハムスター等、とりわけマウス由来新規遺伝子を取得し、本発明の新規遺伝子がコードする蛋白質の機能に関する情報を得ることは、本発明のポリペプチドの特異的結合蛋白質や、アゴニスト、アンタゴニストを検索する際の非常に重要な手段となる。上記のポリペプチドに対する特異的結合蛋白質が見出されなくても、本発明のポリペプチドの不活化実験（例えば該遺伝子を過剰発現あるいはノックアウトした組換え動物細胞や組換え動物の作製）からそのポリペプチドの生理作用を解析することにより、本発明のポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストを作製することが可能であり、本発明のポリペプチドに対する特異的結合蛋白質、アゴニストまたはアンタゴニストなどは、各種臓器に関わる疾患の患者の機能不全に関連する疾患の予防あるいは治療薬や診断薬として活用することが可能となる。【０００９】  生体での本発明のポリペプチドの機能の低下または昂進が、各種臓器に関わる疾患の原因となっている場合が考えられる場合がある。この場合には、そのポリペプチド該蛋白質に対するリガンドやリガンド阻害因子、あるいはアンタゴニストやアゴニストの投与だけでなく、そのポリペプチドの各種臓器をターゲットとした本発明のポリペプチドや抗体投与や、そのポリペプチドをコードする遺伝子に対するアンチセンス核酸や同遺伝子配列情報を基に合成した短い２重鎖ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）の投与、あるいは該遺伝子を用いた遺伝子治療に応用することもできる。この場合には本発明のポリペプチドをコードする塩基配列は、本発明のポリペプチドの各種臓器に関わる疾患の患者の遺伝子欠失や変異の有無を調べるために必要な情報であり、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、本発明のポリペプチドの機能不全に関与する疾患の予防あるいは治療薬や診断薬に応用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本発明者は、材料及びスクリーニング方法を今までと全く異なるものを使用することにより鋭意研究を重ねた結果、マウス胎児尾芽由来のｃＤＮＡライブラリーから、ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子に高いホモロジーを示す遺伝子（ＤＮＡ）をクローニングし、その遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列とヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列とでは約９１．８８％のホモロジーを示す全く新しい１，７４６アミノ酸長配列であること、また、得られた遺伝子が個体発生時の血管形成時期の初期から血管形成時期全般を通して血管特異的に発現し、成長後の成体では胃・重層扁平上皮に於いて強い発現、子宮に於いてやや強い発現が、また、脳をはじめとした各種臓器に於いて発現が認められることを見出した。【００１１】  また、マウスＥＳ細胞を用いた血管形成をモデル化した実験系を用い、血管形成初期の内皮細胞の誕生及びその増殖に関わる遺伝子を網羅的に取得することを可能とする実験系（文献：２，３，１４）を使用することによって、今回初めて、血管形成に関わる４，０００塩基長以上の齧歯類、とりわけマウス由来の長大な遺伝子として本発明の遺伝子を見出した。【００１２】  更に、得られた遺伝子情報を解析することにより、本発明のポリペプチド配列は、Ｐｌｅｘｉｎファミリーに特徴的なドメインが存在することを発見し、それらのドメインが血管形成時の、あるいは各種組織を構成する細胞の増殖・分化、ガイダンスといった重要な機能に係わっていることを示し、更にその遺伝子情報をもとに新規ポリペプチドとそれに特異的な抗体を得た。更に、ヒト又はマウスＫＩＡＡ０６２０遺伝子がコードするタンパク質の膜外部分を規定する領域が、血管新生の阻害、特に、網膜血管網の正常な構築を阻害することを見出した。以上の知見に基づき本発明を完成するに至った。【００１３】  即ち、本発明は第一の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列から成るＤＮＡ：（ａ）配列番号：１、配列番号：１５又は配列番号：１８で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列の一部（例えば、以下に示す新規Ｐｌｅｘｉｎファミリー様のもの、配列番号１で示されるアミノ酸配列において２番目（メチオニン）〜１，７４６番目（アラニン）の１，７４５個のアミノ酸から成るポリペプチド、又は、配列番号１５で示されるアミノ酸配列において２番目（メチオニン）〜１，９９７番目（アラニン）の１，９９６個のアミノ酸から成るポリペプチド）又は全部から成るポリペプチド；又は（ｂ）配列番号：１、配列番号：１５又は配列番号：１８で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドの一部又は全部と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドに係る。
本発明の第二の態様として、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡ：（ａ）配列番号：２、配列番号１６又は配列番号１９で示される塩基配列において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列（配列番号：２の塩基対第３〜５，２４０番目の５，２３８塩基対長）、配列番号：１５で示されるアミノ酸配列（配列番号：１６の塩基対第３〜５，９９３番目の５，９９１塩基対長）、又は配列番号１８で示されるアミノ酸配列及びそれらの一部（例えば、以下に示す新規Ｐｌｅｘｉｎ配列に認められるモチーフの少なくとも一つを有するもの、又は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において２番目（メチオニン）〜１，７４６番目（アラニン）の１，７４５個のアミノ酸から成るポリペプチド、又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列において２番目（メチオニン）〜１，９９７番目（アラニン）の１，９９６個のアミノ酸から成るポリペプチド）又は全部をコードするＤＮＡ；（ｂ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；又は（ｃ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（ａ）のポリペプチドの一部又は全部と実質的に同質の生物学的活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡに係る。
以上の本発明の第一及び第二の態様であるＤＮＡをまとめて、以下、「本発明のＤＮＡ」ともいう。本発明のＤＮＡは、新規ポリペプチドをコードするものである。又、本発明はこれらＤＮＡを含む、ラット、マウスあるいはハムスター等の齧歯類由来遺伝子、特にマウス遺伝子にも係る。特に、このようなマウス遺伝子は「マウス（ｍ）ＫＩＡＡ０６２０遺伝子」又は「ｍｐｆ００９２０遺伝子」ともいう。
更に、本発明は本発明のＤＮＡ又は遺伝子（以下、「ＫＩＡＡ０６２０遺伝子」ともいう。）にコードされるポリペプチド（以下、「本発明のポリペプチド」ともいう。）、例えば、本発明のＤＮＡ又は遺伝子を導入した宿主細胞で作製される組換え蛋白質であるポリペプチド（以下、「ＫＩＡＡ０６２０蛋白質」ともいう）に係る。それらは齧歯類における個体発生時の血管内皮細胞（Ｆｌｋ−１陽性細胞：文献１，１０，１２，１４）、又は血管内皮細胞の前駆細胞から血管内皮細胞に分化する途中の細胞の新規な分子マーカーとして有用である。或いは、本発明のポリペプチドは、血管新生に関わるバイオマーカー、抗体作製に必要なアミノ酸配列、血管新生阻害剤等を提供するものとして有用である。
また、本発明は、本発明のＤＮＡ又は遺伝子を含む組換えベクター、及び、本発明のポリペプチド若しくはその部分ペプチド（例えば、以下の実施例に示すような、Ｃ−末端領域にある数個数十個のアミノ酸配列からなるポリペプチド）、又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を又はそれらの塩に特異的に結合する抗体に係る。【００１４】また、本発明のＤＮＡ、遺伝子、ポリペプチド若しくは組換え蛋白質、又は抗体を用いることによって、本発明のポリペプチドや組換え蛋白質と特異的に結合する物質（リガンド）やリガンド阻害因子、該蛋白質の発現量を変化させる化合物、該蛋白質に結合する蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）のスクリーニング方法、該スクリーニング用キットを提供する。【００１５】  更に、本発明の組換えベクターを導入した遺伝子導入細胞、又は遺伝子導入動物を作製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ病態モデルを提供する。【００１６】  更に、本発明のＤＮＡ、遺伝子、ポリペプチド若しくは組換え蛋白質を、組換え動物若しくは組換え動物細胞、又は、抗体を用いた、血管増殖分化制御因子、あるいは制御化合物（合成化合物を含む）のスクリ−ニング方法、及び該スクリーニング用の各種キットを提供する。
即ち、本発明のＤＮＡ又は遺伝子を用いた、血管増殖分化制御因子又は制御化合物のスクリ−ニング方法、及び該方法に用いる遺伝子発現測定キット；本発明のポリペプチド若しくは組換え蛋白質を用いて作製した蛋白質相互作用検出系又はアゴニスト・アンタゴニスト・生体内リガンド検索系に基づく、血管増殖分化制御因子又は制御化合物のスクリ−ニング方法、及び方法に用いるポリペプチド結合物質測定キット；組換え動物若しくは組換え動物細胞を用いた、血管増殖分化制御因子又は制御化合物のスクリ−ニング方法、及び該方法に用いる血管増殖分化制御活性測定キット；更に、本発明の抗体を用いて作製した蛋白質相互作用検出系、アゴニスト・アンタゴニスト・生体内リガンド検索系に基づく、血管増殖分化制御因子又は制御化合物のスクリ−ニング方法、及び該方法に用いる抗体力測定キット等も提供する。【００１７】  更に、本発明は、本発明のＤＮＡ、本発明のＤＮＡを含有する組換えベクター又は発現ベクター、該ベクターを保持する形質転換体、該形質転換体を培養し、本発明のポリペプチドの一部あるいは全長のポリペプチドを含む組換え蛋白質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする、本発明のポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、又はその塩の製造方法、及び、こうして得られる本発明のポリペプチドの一部あるいは全長のポリペプチドを含む組換え蛋白質またはその塩を提供する。又、本発明は、本発明のＤＮＡを含有してなる医薬、本発明のポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質をコードするＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスヌクレオチド、又はそれらを含有してなる医薬、本発明のＤＮＡの配列情報を基に合成した短い２重鎖ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）又はそれらを含有してなる医薬、本発明のポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を含有してなる医薬を提供する。【００１８】  更に、本発明は、本発明ＤＮＡ、本発明ポリペプチド、その部分ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、又は、本発明のＤＮＡ又は遺伝子に対する抗体を網羅的に作成し、それらを集積させて得られる、所謂、ＤＮＡチップ（アレイ）、プロテインチップにも係る。
【発明の効果】
【００１９】  今回、本発明者はマウス胎児尾芽由来のｃＤＮＡライブラリーを使用し、特別なスクリーニング法を適用することにより、今までに取得不可能であったヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子に高いホモロジーを示す遺伝子（ＤＮＡ）をクローニングし、新規ＰｌｅｘｉｎポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を取得することに成功した。その新規ＤＮＡ配列にコードされるポリペプチドは１，７４６アミノ酸長又は１，９９７アミノ酸長であり、また、そのポリペプチドは、Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ／ＣＤ１００  ａｎｔｉｇｅｎドメイン、３つのＰｌｅｘｉｎ／Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ／ｉｎｔｅｇｒｉｎドメイン、及び３つのＣｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＰＴ／ＴＩＧを有し、かつＣ−末端側に膜貫通（ＴＭ）セグメントが存在する今までにない構成であり、血管内皮胞の増殖、分化あるいは機能の発現といった細胞の重要なプロセスに関係することが推定された。
又、本発明の遺伝子配列は、個体発生時の血管形成時期の初期から血管形成時期全般を通して血管特異的に発現し、成長後の成体では胃・重層扁平上皮に於いて強い発現、子宮に於いてやや強い発現が、また脳をはじめとする各種臓器に於いて発現していることが今回初めて見出され、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドが血管新生において、あるいは脳をはじめとする各種臓器において、発育、機能保全、更に各種臓器における血管新生が関係する疾患に関わる重要な働きに関わっている可能性が示された。【００２０】  更に、脳をはじめとした各種臓器に於いて発現が認められるマウスＫＩＡＡ０６２０タンパク質の膜外部分に相当する新規ポリペプチドが、血管新生の阻害、特に、網膜血管網の正常な構築を阻害することを見出した。即ち、組換えＰｌｅｘｉｎが膜蛋白質であること、更にその膜外領域を発現させて得た組換えＰｌｅｘｉｎ膜外領域が血管新生を阻害することを、哺乳動物細胞を宿主とした遺伝子組換え法による所望蛋白質取得とそれを投与すると新生仔ＩＣＲマウス網膜血管網の正常な構築を阻害することが見出され、組換えＰｌｅｘｉｎ膜外領域の網膜血管新生に関わる機能に関わる知見を得た。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の新規Ｐｌｅｘｉｎポリペプチドに認められたＳｅｍａｐｈｏｒｉｎ／ＣＤ１００  ａｎｔｉｇｅｎドメイン、３つのＰｌｅｘｉｎ／Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ／ｉｎｔｅｇｒｉｎドメイン、３つのＣｅｌｌｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＰＴ／ＴＩＧドメイン、及び膜貫通（ＴＭ）セグメントを示す（ａａ：アミノ酸配列で数字はアミノ酸数、ボックス：上から、ＨＭＭＰｆａｍ検索法、ＨＭＭＳｍａｒｔ検索法、またＳｏｓｕｉ検索法といった異なった検索法にて同定したドメインと膜貫通（ＴＭ）セグメントを示す。これらの結果から、ＨＭＭＰｆａｍ検索法、ＨＭＭＳｍａｒｔ検索法、またＳｏｓｕｉ検索法により、新規Ｐｌｅｘｉｎポリペプチドを新たに同定した。
【図２Ａ】ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ法によるｍｐｆ００９２０（マウスＫＩＡＡ０６２０）遺伝子のマウス各発生段階１０．５ｄ．ｐ．ｃ．における発現部位を示す。センスブローブによる陰性コントロールによる検出像を示す（血管にそった濃染部位が発現部位）。
【図２Ｂ】ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ法によるｍｐｆ００９２０（マウスＫＩＡＡ０６２０）遺伝子のマウス各発生段階１０．５ｄ．ｐ．ｃ．における発現部位を示す。アンチセンスプローブによるｍｐｆ００９２０遺伝子の発現強度を示す（血管にそった濃染部位が発現部位）。
【図２Ｃ】ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ法によるｍｐｆ００９２０（マウスＫＩＡＡ０６２０）遺伝子のマウス各発生段階８  ｄ．ｐ．ｃにおける発現部位を示す（血管にそった濃染部位が発現部位）。
【図２Ｄ】ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ法によるｍｐｆ００９２０（マウスＫＩＡＡ０６２０）遺伝子のマウス各発生段階９．５ｄ．ｐ．ｃにおける発現部位を示す（血管にそって濃染部位が認められる）。
【図３Ａ】受精後１４．５日目胎仔の矢状方向（ｓａｇｉｔｔａｌ）凍結切片について、ｉｎ  ｓｉｔｕ法によるｍｐｆ００９２０（マウスＫＩＡＡ０６２０）遺伝子の発現部位を示す。上はセンスブローブによる陰性コントロールによる検出像を示し、下はアンチセンスプローブによるｍｐｆ００９２０遺伝子の発現強度を示す（濃染部位が発現部位）。
【図３Ｂ】アンチセンスプローブによるｍｐｆ００９２０遺伝子の発現強度の脳の強拡大した検出像を示す（濃染部位が発現部位）。
【図４Ａ】成体における胃のパラフィン切片について、ｉｎ  ｓｉｔｕ法によるｍＲＮＡレベルでのｍｐｆ００９２０（マウスＫＩＡＡ０６２０）遺伝子の発現部位を示す。胃の重層扁平上皮濃染部位が濃染されている。
【図４Ｂ】成体における大脳のパラフィン切片について、ｉｎ  ｓｉｔｕ法によるｍＲＮＡレベルでのｍｐｆ００９２０（マウスＫＩＡＡ０６２０）遺伝子の発現部位を示す。大脳の神経膠細胞が濃染されている。
【図４Ｃ】成体における小脳のパラフィン切片について、ｉｎ  ｓｉｔｕ法によるｍＲＮＡレベルでのｍｐｆ００９２０（マウスＫＩＡＡ０６２０）遺伝子の発現部位を示す。小脳のプルキンエ細胞層が濃染されている。
【図５】ＲＴ−ＰＣＲ法によるマウスＫＩＡＡ０６２０遺伝子のマウス胎仔発生過程に於けるｍＲＮＡレベルでの発現頻度の比較を示す電気泳動の写真である。上段はコントロールとして用いたＦｌｋ１遺伝子の発現強度、下段はマウスＫＩＡＡ０６２０遺伝子の発現強度を、アガロース電気泳動で分画した後のエチジウムブロミド染色パターンについて示す。
【図６】ウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法によるＨＥＫ２９３細胞を宿主とするｌａｃＺ−Ｖ５融合蛋白質（ｌａｃＺ−Ｖ５  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）及びマウスＫＩＡＡ０６２０−Ｖ５融合蛋白質（ｍＫＩＡＡ０６２０−ｃｄｓ−Ｖ５  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の検出の結果を示すメンブレンフィルターの写真である。図中、Ｍ：ｈｉｇｈ  ｒａｎｇｅ  ｍａｒｋｅｒ、１：ＨＥＫ２９３  ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２：ｌａｃＺ−Ｖ５  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、３：ｍＫＩＡＡ０６２０−ｃｄｓ−Ｖ５  ｐｒｏｔｅｉｎｓ（以上の１〜４レーンは抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体による染色）、４：ＨＥＫ２９３  ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、５：ｌａｃＺ−Ｖ５  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、６：ｍＫＩＡＡ０６２０−ｃｄｓ−Ｖ５  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、７：ＨＥＫ２９３  ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、８：ｌａｃＺ−Ｖ５  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、９：ｍＫＩＡＡ０６２０−ｃｄｓ−Ｖ５  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、（以上の５〜８レーンは抗ｍＫＩＡＡ０６２０抗体による染色）を夫々示す。尚、図中の数値は希釈倍率を示す。
【図７】ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を用いた新生仔網膜血管におけるマウスＫＩＡＡ０６２０遺伝子発現の検出の結果を示す顕微鏡の写真である（図左：生後２日目、中央：４日目、右：７日目；血管新生にそって濃染部位が認められる）。
【図８】ＨＥＫ２９３細胞を宿主として、マウスＫＩＡＡ０６２０全長−Ｖ５融合蛋白質、及び膜貫通領域（ＴＭ）を含むマウス膜外領域、すなわちマウスＫＩＡＡ０６２０膜外領域（ＴＭ）−Ｖ５融合蛋白質を発現せしめ、全蛋白質画分を抽出したもの、及び該全蛋白質画分から疎水性蛋白質を抽出したものをウエスタンブロット法を用いた解析した結果を示す写真である。図中、１．はコントロール細胞から調製した全蛋白質画分、２．はコントロール細胞から調製した疎水性蛋白質画分、３．はマウスＫＩＡＡ０６２０全長−Ｖ５融合蛋白質発現細胞から調製した全蛋白質画分、４．はマウスＫＩＡＡ０６２０全長−Ｖ５融合蛋白質発現細胞から調製した疎水性蛋白質画分、５．はマウスＫＩＡＡ０６２０膜外領域（ＴＭ）−Ｖ５融合蛋白質発現細胞から調製した全蛋白質画分、６．はマウスＫＩＡＡ０６２０膜外領域（ＴＭ）−Ｖ５融合蛋白質を発現から調製した疎水性蛋白質画分の解析結果を示す。尚、左の写真は発色法による検出像を示し、右の写真は化学発光法による検出像を示し、中央のラダーと数値（ｋＤａ）はサイズマーカーとそれによる分子量を表す。
【図９】マウスＫＩＡＡ０６２０膜外部分−ＩｇＧ１Ｆｃ融合蛋白質を用いた新生仔マウス網膜血管発生の阻害実験（生後５日目投与５時間後）の結果を示す顕微鏡の写真である。眼球注射５時間後には、発達途上の網膜血管、特に血管新生先端部の内皮細胞において過剰な糸状足形成が認められた（図左下、右下：ｍＫＩＡＡ０６２０膜外部分−Ｆｃ）。これに対し、ＩｇＧ１Ｆｃ蛋白質単独の眼内注射では全く変化がみられなかった（図左上、右上：Ｆｃ）。
【図１０】マウスＫＩＡＡ０６２０膜外部分−ＩｇＧ１Ｆｃ融合蛋白質を用いた新生仔マウス網膜血管発生の阻害実験（生後１日目投与３日後）の結果を示す顕微鏡の写真である。眼球注射３日後には、網膜血管網の正常な構築が著しい障害が認められた（図右：ｍＫＩＡＡ０６２０膜外部分−Ｆｃ）。これに対し、ＩｇＧ１Ｆｃ蛋白質単独の眼内注射では全く変化がみられなかった（図左：Ｆｃ）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】本発明のＤＮＡは、本発明者により採取されたマウス胎児尾芽由来ｍＲＮＡを出発材料として、本発明者が調製したｃＤＮＡライブラリーから、ｃＤＮＡ断片として単離した後に、塩基配列を決定し同定したものである。即ち、具体的には、（ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，９：４７−５７、及びＮｕｃｒｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９，ｅ２２（２００１））に従って調製したマウス胎児尾芽由来のｃＤＮＡライブラリーから、約１６，６０８個の組換え体を選択し、その全ての３’末端ＤＮＡ配列を決定し、その中から、ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子に高い相同性を有するクローンを選択し全塩基配列の決定を行なった。次に、こうして得られた全塩基配列に基づき、ＤＮＡ解析プログラム（ＧＣＧ，Ｆａｓｔａ＆  Ｂｌａｓｔ）を用いてホモロジー検索を行ない、その困難性から今までに取得され得なかった本発明のＤＮＡを鋭意検討の結果、ようやく取得するに至った。【００２３】  すなわち、マウス胎児尾芽由来ｃＤＮＡライブラリーに対し、ヒト長鎖ｃＤＮＡ（ＫＩＡＡ０６２０）にホモロジーを有する遺伝子取得を試みたところ、驚くべきことにヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列とアミノ酸配列レベルで約９１．８８％のホモロジーを示す全く新しい１，７４６アミノ酸長配列（配列番号：１）を有する新規ポリペプチド（本発明のポリペプチド）をコードする新規遺伝子を含む塩基配列（配列番号：２）を有するクローン（クローン名：ｍｐｆ００９２０）を取得することに成功した。【００２４】  本発明の配列番号１で示されるアミノ酸配列（１，７４６アミノ酸長）の１番目から１，７４６番目までのアミノ酸配列（１，７４６アミノ酸長）は、ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子がコードするアミノ酸配列（１，９８５アミノ酸長）のほぼ全長に近い配列（２３８番目から１，９８５番目までの１，７４８アミノ酸長）に対して約９１．８８％という有意な相同性を有する。【００２５】  本発明により得られた上記のアミノ酸配列について、以下の実施例に記載したように、公共のデータベースを用いてホモロジー検索を行った結果、今までに出願された２つの配列に対して「本発明のポリペプチド」の配列の全長１，７４６アミノ酸長について約９１．７０％及び約９１．５１％という比較的高いホモロジーが認められた。しかし、それらはヒト由来配列であり、ヒト病態の解明に重要なモデル動物である齧歯類、とりわけマウスに於けるヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子に対応する遺伝子は本発明により初めて取得され、同遺伝子がコードする「本発明のポリペプチド」配列の解明により、ようやく新規配列蛋白とその機能を述べること可能となった。【００２６】  尚、配列番号：２に示される塩基配列を有する本発明のＤＮＡを含むプラスミド（プラスミド表示名：ｍｐｆ００９２０）は、茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１５年９月１０日付けで寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５１８が付されている。該プラスミドは更に、２００４年１０月２５日付けで、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０１５４が付されている。【００２７】  ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子の配列は６，７５４塩基対長であり、コードされているポリペプチドのアミノ酸配列の長さは１，９８５アミノ酸である（ＤＮＡ  Ｒｅｓ  ｅａｒｃｈ，１９９８，５：１６９−１７６，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｈｕｇｅ／ｇｆｐａｇｅ／ＫＩＡＡ０６２０／，ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０１４５２０）。ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子ホモログを詳細に研究することにより、Ｎ−末端側にはさらにポリペプチドがコードされている可能性について検証される可能性がある。本発明の配列番号２に示されるＤＮＡにコードされているポリペプチドのアミノ酸配列の長さは１，７４６アミノ酸であるが、本発明のＤＮＡに対するホモログについて更に詳細に研究することにより、Ｎ−末端側に更に伸張してポリペプチドがコードされていることを見つける可能性がある。【００２８】  尚、当業者であれば、本明細書によって初めて開示された配列番号：２に示した塩基配列に基づいてクローンの５’側に適当なプライマー（例えば、配列番号：２の塩基対第６１〜８０番目５’−ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＧＧＧＣＡＣＣＧＧＧ−３に対応させて合成した配列５’−ＣＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＡＧＧＴＡＧＧＣＧ−３’）を調製し、該プライマーと市販されている齧歯類由来のｍＲＮＡ、あるいは齧歯類由来組織から調製したｍＲＮＡとハイブリダイゼーションを行なった後に逆転写反応を行なうことにより本発明のＤＮＡの上流側（遺伝子の５’側）の領域を含む新たなｃＤＮＡ断片を特異的に合成することができる。合成した５’側の領域を含む新たなｃＤＮＡ断片をプラスミドに挿入した後、配列番号２の一部分をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションのような相同性クローニングによって、本発明のＤＮＡを含む齧歯類由来ＫＩＡＡ０６２０遺伝子の全領域を調製することが可能である。あるいは他の方法、例えば、本発明のＤＮＡをプローブとして用いれば、コロニーハイブリダイゼーションのような相同性クローニングによって、マウスを含めた各種齧歯類由来ＫＩＡＡ０６２０遺伝子の５’末端領域を調製することができる。【００２９】  実際には、本発明者は、長鎖ｃＤＮＡといった対象テキスト配列が長い材料を哺乳動物のゲノム配列を高速検索することを可能にするために、特開２００３−２１６６１５号公報に基づくメモリに比較回路を付加したｃｏｎｔｅｎｔ  ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ｍｅｍｏｒｙ（ＣＡＭ）を用いた配列の長さに計算時間が依存しない並列比較可能な計算機（ハードウエア）開発とその制御アルゴリズム設計を鋭意研究することにより、超並列ゲノムコンパレーターといった改良された新規システムを構築して、長鎖ｃＤＮＡを対象とした解析方法を完成した。完成した超並列ゲノムコンパレーターを使用し、公開済みのマウスゲノム配列からマウスｍＫＩＡＡ０６２０に対する大規模・高速塩基配列検索を実施し、公開済みのマウスゲノム配列のなかからｍＫＩＡＡ０６２０塩基配列に対し付加する配列に関わる情報を検索し、本発明の配列番号１に示したアミノ酸配列のＮ末側に新たに付加されるアミノ酸配列を取得するた���に必要なプライマー配列を設計するに至った。それらプライマーを使用して５’ＲＡＣＥ等のＰＣＲ法を使用することによって、本明細書の実施例に具体的に記載したように、Ｎ末側に新たに付加される２５１個の新たなアミノ酸配列を決定することができた。【００３０】  本発明のＤＮＡとしては、前述した本発明のポリペプチドをコードする塩基配列から成るものであればいかなるものであってもよい。各種齧歯類由来の各種臓器、例えば、脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、胸腺、筋肉、骨髄等、あるいは発生の各段階の各種組織・細胞に由来するｃＤＮＡライブラリー等から同定・単離されたｃＤＮＡ、又は、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリー作成に使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織、あるいはそれらの細胞質よりｔｏｔａｌＲＮＡ画分またはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて、直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって増幅することもできる。【００３１】  配列番号：１、配列番号：１５又は配列番号１８で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：１、配列番号：１５又は配列番号１８で示される全アミノ酸配列との相同性の程度が、全体の平均で約９２．５％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上であるアミノ酸配列を意味する。従って、本発明の配列番号：１、配列番号：１５又は配列番号１８で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：１、配列番号：１５又は配列番号：１８で示されるアミノ酸配列に対して上記の相同性を有し、配列番号：１、配列番号：１５又は配列番号：１８で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドを挙げることができる。ここで、実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。又、本発明のポリペプチドには、例えば、配列番号：１、配列番号：１５又は配列番号：１８で示されるアミノ酸配列中において、一部（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列、或いはそれらを組み合わせたアミノ酸配列から成り、配列番号：１、配列番号：１５又は配列番号：１８で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドも含まれる。【００３２】  更に、本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号：２、配列番号１６又は配列番号１９で示される塩基配列において、配列番号：１、配列番号：１５又は配列番号１８で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、又は、該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、好ましくは更に配列番号：１又は配列番号：１５で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと同質の生物学的活性を有するポリペプチド（蛋白質）をコードするＤＮＡであればいずれのものでもよい。かかる条件下で、配列番号：��、配列番号：１６又は配列番号：１９で示される塩基配列において、配列番号：１、配列番号：１５又は配列番号：１８で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、約８７．５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ  Ｎｏ．１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ  Ｎｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、４０℃の０．１ｘＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１ｘＳＳＣは０．１５ＭＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）でのサザンブロットハイブリダイゼーションで本発明ヒトＤＮＡプローブにハイブリダイズする程度の条件である。【００３３】  本発明のＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のポリペプチドの部分等の適当な塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素キット（ギブコＢＲＬ社）等を用いて、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法などの公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。クローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。【００３４】  本発明のポリペプチドの発現ベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することができる。例えば、（１）本発明のＤＮＡ又は本発明のＤＮＡを���む齧歯類由来遺伝子を含有するＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、あるいはＳＶ４０、ＣＭＶウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、ウシパピローマウイルスなどの動物ウイルス由来配列を使用した発現ベクター等を利用することができる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、あるいはそれらプロモーターを組み合わせまたは複合させたプロモーターなどが、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＨＳＰプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどが挙げられる。【００３５】  発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、カルモデュリンバインディング蛋白質、及びプロテインＡ等）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、適当なプロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することができる。【００３６】  更に、組換え動物細胞を作成することを目的とした動物細胞をターゲットとした遺伝子導入用発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋／−）ベクターを鋳型に血管内皮細胞特異的発現を目的にしたＴｉｅ２プロモーター（血管内皮細胞特異的プロモーター）を連結したものを利用するとよい。それら発現ベクターとプロモーターを使用することで血管内皮細胞特異的発現が可能となる。或いは、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）クローニングテクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｃａｔ．Ｎｏ．１１８２１−０１４）として知られているクローニングシステムを利用することも出来る。【００３７】  宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２由来のＤＨ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）），ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）），ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）），及びＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９））、あるいはエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｂ株等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）），２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。動物細胞としては、例えば、サル腎臓細胞由来ＣＯＳ−１，ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ細胞，チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３細胞，ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ヒトＦＬ細胞、ヒトＨｅｌａ細胞あるいはヒトミエローマ細胞などが用いられる。【００３８】  また、組換え動物細胞を作成することを目的とした動物細胞をターゲットとした遺伝子導入用の細胞としては例えば、培養マウスＥＳ細胞、マウス受精卵、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞株、ヒト胎仔腎細胞由来２９３細胞株などが用いられる。【００３９】  これら宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、以下に記載の文献を参照することができる。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（６９巻、２１１０−、１９７２）、Ｇｅｎｅ（１７巻、１０７−、１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１６８巻、ｐ１１１−、１９７９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９４巻、ｐ１８２−１８７、１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（７５巻、１９２９−、１９７８）、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール（ｐ２６３−２６７、１９９５、秀潤社発行）、及びＶｉｒｏｌｏｇｙ（５２巻、４５６−、１９７３）。【００４０】  更に、遺伝子導入動物の形質転換を目的とした宿主動物細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、以下に記載の文献を参照することができる。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（７７巻、ｐ７３８０−７３８４、１９８０）、別冊実験医学・ジーンターゲイングの最新技術（ｐ３４−４１、２０００、羊土社発行）、マウス操作マニュアル第二版（ｐ２２５−２５２、ｐ２７９−２８５、１９９４、近代出版発行）、増刊実験医学・発生工学実験法（全１９６頁、１９９４、羊土社発行）、及びＴｒｅｎｄ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（５巻、ｐ７０−７６、１９８９）【００４１】  具体的には、トランスジェニックマウス作製においては、マイクロインジェクション法を用いる。採卵用のマウス（マウス系統Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ３Ｈ，ＢＤＦ１）に妊馬血清（５単位）の腹腔内投与、その４８時間後ヒト絨毛性ゴナドトロピン（５単位）の腹腔内投与を行い、排卵誘発を行う。ホルモン注射後１４時間後に排卵が起こるので、その間に雄マウスと交尾させる。雌の膣栓の有無で交尾の確認後に雌マウスを屠刹し、卵管膨大部から受精卵を採取する。採取した受精卵は、培養液の入ったペトリ皿に移し、顕微鏡下でマイクロマニピュレーターを用いて受精卵の前核中に目的遺伝子を注入する。目的遺伝子注入後、生き残った受精卵は、偽妊娠マウスの卵管内に移入する。受精卵移入後、約２０日後に新生仔（トランスジェニックマウス）が得られる。【００４２】  また、ノックアウトマウス作製には、培養マウスＥＳ細胞に電気穿孔法で目的遺伝子を導入し、標的遺伝子相同組換えを起こした細胞を選択した後に、このＥＳ細胞を他の胚盤胞内に注入したものを仮親の卵管内へ移入し、キメラマウスを作製する。この方法では、まず遺伝子導入されていないＥＳ細胞または導入されているがランダムに入ったＥＳ細胞から相同組換えを起こしたＥＳ細胞を選別する必要があり、このための選択マーカー遺伝子としてネオマイシン耐性遺伝子を利用する。この遺伝子は相同領域間に挿入する。相同組換えの成否は、サザンブロット法とＰＣＲ法でＤＮＡ断片が検出できるか確認する。あるいは、他の手法としてポジテイブ・ネガテイブ選択法が利用できる。この場合には前者と異なり、ネオマイシン耐性遺伝子にプロモーターを付加する必要がある。ランダムに組み込んだ細胞との選別のため、第二の選択マーカー遺伝子として、ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子やジフテリア毒素フラグメントＡ遺伝子を利用する。標的遺伝子の相同組換え細胞以外はガンシクロビル添加またはジフテリア毒素フラグメントＡの発現により殺すことが可能である。培養１０日目程度でコロニーが明瞭になれば、サザンブロット法またはＰＣＲ法で相同組換えを起こしたクローンを同定する。同定したＥＳ細胞クローンは、レシピエントの胚盤胞中にマイクロインジェクションで注入後、仮親の子宮内へ移入する。移入後、約２０日後に新生仔（生殖キメラマウス）が得られる。【００４３】  このようにして得られた、本発明のＤＮＡを含む齧歯類由来遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、当該技術分野で公知の方法に従って培養することができる。例えば、宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常、約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培養は通常、ｐＨ約５〜８に調整された培地を用いて約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や��拌を加えることもできる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、ｐＨは約６〜８に調整された培地を用いて、通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。【００４４】  上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。こうして得られた本発明のポリペプチド（蛋白質）は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。更に、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に、メチオニンアミノペプチダーゼを用いてＮ−末端メチオニンを除去したり、ミリストイル転移酵素を用いてＮ−末端アミノ酸のミリストイル化を行ったり、アセチルトランスフェラーゼを用いてＮ−末端アミノ酸のアセチル化を行ったり、或いはその他の修飾酵素を用いることにより任意にアミノ酸の修飾を行うことができる。又、Ｃ−末端を修飾するプロセシングカルボキシルペプチダーゼ、Ｃ−末端アミド化酵素等を作用させてＣ−末端アミノ酸を修飾することもできる。更に、トリプシン、キモトリプシン、ＦａｃｔｏｒＸａ、トロンビン、又は、ＫＥＸ２プロテアーゼのような適当な蛋白限定分解酵素を作用させることにより、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。
融合蛋白質として産生させた場合には、適当な蛋白質限定分解酵素を用いて不必要なポリペプチド部分を除去することもできる。
本発明ポリペプチド（蛋白質）又はその塩の存在は、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。【００４５】  本発明のポリペプチド（蛋白質）は、Ｃ−末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ−末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルエステルなどが用いられる。【００４６】  本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）がＣ−末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ−末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明の蛋白質には、Ｎ−末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ−末端のグルタミン酸残基がピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上にある、例えばＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＳＨなどが適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。【００４７】  本発明のポリペプチドの一部からなるペプチドとしては、前記した本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）の部分ペプチドであって、実質的に同質の活性を有するものであればいずれのものでもよい。例えば、本発明のポリペプチド（蛋白質）の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有し、例えば、本発明の組換え蛋白質と実質的に同質の生物学的活性を有するペプチドなどが用いられる。このような部分ペプチドの具体例としては、配列番号：１で示されるアミノ酸配列の中の、新規Ｐｌｅｘｉｎに特徴的なモチーフを含むもの、又は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において２番目（メチオニン）〜１，７４６番目（アラニン）の１，７４５個のアミノ酸から成るポリペプチドを挙げることができる。又、本発明の部分ペプチドはＣ−末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、前記した本発明の蛋白質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明の蛋白質と同様に、Ｎ−末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ−末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。【００４８】  本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）又はその一部からなるペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。【００４９】  本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）、その一部からなるペプチドもしくはそれらの塩またはそれらのアミド体は、当該技術分野で公知の化学合成方法を用いて調製することもできる。例えば、通常市販されている蛋白質合成用樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の配列通りに、当業界において自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、例えば、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、及びＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドのようなカルボジイミド類に代表される蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対照とする酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。【００５０】  保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、酸アミド類、ハロゲン化炭化水素類、アルコール類、スルオキシド類、及びエーテル類等、当業界において蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。原料の各アミノ基、カルボキシル基、及びセリン水酸基等の保護基としても、当該技術分野において、通常使用される基を使用することができる。原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離���反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。【００５１】  本発明の一部からなるペプチドまたはそれらの塩は、当該技術分野において自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明の蛋白質を適当な蛋白質限定分解酵素で切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（１）〜（３）に記載された方法が挙げられる。
（１）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）（２）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、蛋白質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）（３）矢島治明監修、続医薬品の開発第１４巻ペプチド合成広川書店。
又は、一部からなるペプチドは、例えば、Ｃ−末端から十数残基の配列或いは配列番号：１で示されるアミノ酸配列の任意の場所の十数残基の部分を公知のペプチド合成装置等を用いて合成することができる。更に、このような部分ペプチドは例えば約５０から５００アミノ酸長までの長さの適当な部位のポリペプチド、または約５００アミノ酸長から全長までの長さの適当な場部位のポリペプチドを選択して、組換え蛋白質として前述の遺伝子組換え技術を用いて製造しても良い。【００５２】  反応後の精製も自体公知の方法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。【００５３】  本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）、その一部からなるペプチドまたはそれらの塩と特異的に結合する抗体は、それらを特異的に認識し得るものであれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明のポリペプチド（蛋白質）、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、本発明のポリペプチド（蛋白質）又はその部分ペプチドを抗原として用い、当業者に公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。このように免疫原として使用できる部分ペプチドの例として、本明細書の実施例に具体的に記載されているように、配列番号１に示される本発明ポリペプチドのＣ末端領域における十数個〜１００個程度の連続したアミノ酸から成るペプチドを挙げることができる。【００５４】  例えば、ポリクローナル抗体の場合には、上記抗原を単独、又は、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等の適当な担体に結合させて、アジュバントの存在又は非存在下で、例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの適当な動物に対して免疫誘導することによって容易に得ることができる。ポリクローナル抗体は免疫された動物の血清から公知の様々な方法によって回収及び精製することができる。【００５５】  一方、モノクローナル抗体を製造するためには、例えば、上記の免疫された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓又はリンパ節由来）を回収し、公知の不死化増殖細胞（例えば、マウスミエローマ株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８株やそれ由来のＳｐ２／ＯＡｇ−１４等、あるいはラットミエローマ株Ｙ３−Ａｇ１．２．３，ＹＢ２／０，ＩＲ９８３Ｆ等の骨髄腫細胞株）との細胞融合により、ハイブリドーマを作成する。これを更にクローニングし、本発明のポリペプチド等に特異的に認識する抗体を生産しているハイブリドーマのクローンを選別し、該ハイブリドーマの培養液からモノクローナル抗体を回収し精製することによって容易に得ることができる。【００５６】  尚、合成ペプチドに対する抗体の作製と抗体の精製に関する参考文献として、例えば、新細胞工学実験プロトコル、東大医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、１９９３年、２−２−２，合成ペプチドに対する抗体の作製、ｐ２１��−２１７を挙げることができる。【００５７】  更に、当業者には公知である様々な遺伝子工学的手法により、こうして得られた抗体の抗原決定基等を含む、ヒト化抗体等の各種キメラ抗体も容易に製造することができる。本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のポリペプチド（蛋白質）等を検出するために使用することができる。また、これらを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のポリペプチド（蛋白質）の検出、被検細胞内における本発明のポリペプチド（蛋白質）の挙動の分析などのために使用することができる。【００５８】  更に、本発明の抗体は、公知の方法による被検液中の本発明のポリペプチド（蛋白質）等の定量、特に、モノクローナル抗体を使用したサンドイッチ免疫測定法による定量、及び組織染色等による検出などに使用することができる。それによって、例えば、本発明のポリペプチド（蛋白質）等が関与する疾病の診断を行なうことができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる本発明の蛋白質等の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、蛋白質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、当該技術分野で公知の、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などを用いることができる。【００５９】  これらの測定・検出方法に関する一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、同書Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＢ））、同書Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、同書Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）、また、個体発生の実験法を含め発生工学的実験法は、別冊実���医学・ジーンターゲイングの最新技術（ｐ３４−４１、２０００、羊土社発行）、マウス操作マニュアル第二版（ｐ２２５−２５２、ｐ２７９−２８５、１９９４、近代出版発行、増刊実験医学・発生工学実験法（全１９６頁、１９９４、羊土社発行などを参照することができる。【００６０】  本発明のポリペプチド（蛋白質）又はその一部分からなるペプチドをコードするＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンス核酸としては、当該ＤＮＡの塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンス核酸であってもよい。実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列の全塩基配列または部分塩基配列と約９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。又、これらアンチセンス核酸と同様の作用を有する核酸配列（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれら核酸の修飾体）も本発明でいうアンチセンス核酸に含まれる。また、当該ＤＮＡの塩基配列情報を基に合成した短い２重鎖ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）についても、公知の核酸合成装置などを用いて製造することができる。【００６１】  更に、本発明のポリペプチド（蛋白質）等は、これら物質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。すなわち、本発明は、本発明のポリペプチド（蛋白質）、その一部からなるペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴とする、該物質又はそれらの塩の活性を阻害する化合物（以下、「阻害剤」ともいう）のスクリーニング方法、及びその為のスクリーニング用キットを提供する。本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチド（蛋白質）等の生物学的活性を阻害する化合物である。該化合物またはその塩は、本発明の蛋白質等の活性を直接阻害するものであってもよいし、本発明のポリペプチド（蛋白質）等の発現を阻害することによって間接的に本発明のポリペプチド（蛋白質）等の活性を阻害するものであってもよい。該化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。本発明のポリペプチド（蛋白質）等の生物学的活性を阻害する化合物も上記各種疾病に対する治療・予防剤などの医薬として使用できる可能性がある。【００６２】  本発明のＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む齧歯類由来遺伝子をプローブとして使用することにより、マウスはもとより齧歯類、更にヒトにおける本発明のポリペプチド又はその一部分からなるペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、���ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。更に、本発明の相同遺伝子であるヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子に異常があったり、欠損している場合あるいは発現量が減少している場合、生体内において正常な機能を発揮できない患者に対しては、公知手段に従って（１）レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターをベヒクルとして使用する遺伝子治療によって、本発明のＤＮＡ又はヒト由来遺伝子を該患者体内に導入し、発現させるか、又は（２）本発明のポリペプチド（蛋白質）あるいはヒト由来ポリペプチド（蛋白質）又は本発明の抗体を該患者に注入すること等によって、該患者において本発明の蛋白質等の機能を発揮させることができるものと考えられる。前者の場合、本発明のＤＮＡ又はヒト由来遺伝子を適当なベクターをベヒクルとして使用し、ベクターにのせた形の該ＤＮＡを単独、又は、摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することも可能である。【００６３】  本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＣｏｍｍｉｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。【００６４】  本願明細書の配列表中で、以下の配列番号は以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（アミノ酸数：１，７４６）を示す。
〔配列番号：２〕配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を含む、クローンｍｐｆ００９２０の全塩基配列（６，１７８塩基対）を示す。
〔配列番号：１５〕配列番号１に示される本発明のポリペプチドのＮ末端側に更に２５１個のアミノ酸（配列番号１１）が付加されたアミノ酸配列（アミノ酸数：１，９９７）を示す。
〔配列番号：１６〕配列番号：配列番号：１５で示されるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を含む全塩基配列（６，９３１塩基対）を示す。
〔配列番号：１８〕マウス由来の本発明ポリペプチド膜外領域のアミノ酸配列（アミノ酸数：１，３３７）を示す。
〔配列番号：１９〕配列番号：１８で示されるアミノ酸配列を有する本発明ポリペプチド膜外領域をコードするＤＮＡの塩基配列を含む全塩基配列（４，０１１塩基対）を示す。
【実施例】
【００６５】  以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、実施例における各種遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載されている方法に従った。【００６６】（１）マウス胎児尾芽由来ｃＤＮＡライブラリーの構築
ａｔｔＢ１部位を有するオリゴヌクレオチド：５’−ＦｇｃＧＣＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣ（Ｔ）１８−３’（Ｆ、ｇおよびｃは、それぞれフルオレッセイン基、フォスフォロチオエイト修飾Ｇ、フォスフォロチオエイト修飾Ｃ残基を表す）をプライマーとして、マウス胎児尾芽（ＩＣＲマウス受精１１．５日目のＳ１，Ｓ０，Ｓ−１，及びＳ−２に関わる前体節中胚葉及び体節中胚葉）由来ｍＲＮＡを鋳型にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素キット（インビトロジェン社製）で２本鎖ｃＤＮＡを合成した。これにａｔｔＢ１部位を有するアダプターをｃＤＮＡにライゲーションした。その後、アガロースゲルで１ｋｂ−２ｋｂ、２ｋｂ−３ｋｂ、３ｋｂ−４ｋｂ、４ｋｂ−５ｋｂ、と５ｋｂ−７ｋｂにｃＤＮＡをサイズ分画した。これらを、サイズを小さくしたａｔｔＰ  ｐＳＰＯＲＴ−１エントリーベクター（インビトロジェン社製）にＢＰ反応により移し換えた後、大腸菌ＥｌｅｃｔｏｒｏＭａｘ  ＤＨ１０Ｂ株（インビトロジェン社製）にエレクトロポーレーション法により導入した。プレートに出現した１０６個以上の形質転換体を集め、液体培地中で、３７℃で２−３時間培養した後プラスミドを調製した。スーパーコイルドプラスミドの形でサイズ分画した後、ＬＲ反応によりａｔｔＲ  ｐＢＣデスティネーションベクター（インビトロジェン社製）にｃＤＮＡを移し換えた。このプラスミドを精製後、ＤＨ１０Ｂ株にエレクトロポーレーション法により導入し、各分画が期待されるサイズになるまで、上記の分画操作を２−３回繰り返した。最後に各分画ごとにＤＨ１０Ｂ株にプラスミドを導入した。なお、ここで用いた試験管内での相同組み換え反応を利用したクローニングシステムは小原等の方法（Ｎｕｃｒｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９，ｅ２２（２００１）およびＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．９，４７−５７（２００２））に従った。【００６７】  次に、全ての画分に含まれる約１６，６０８個のクローンの３’末端ＤＮＡ配列を決定した。この中から、ヒトＫＩＡＡ０６２０に相同性が高いクローンのｃＤＮＡに関して全塩基配列の決定を行なった。配列決定には、アプライドバイオシステム社製のＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７００）と同社製反応キットを使用した。大部分の配列はショットガンクローンをダイターミネーター法を用いて決定した。一部の塩基配列については、決定した塩基配列を元にしてオリゴヌクレオチドを合成し、プライマーウォーキング法で決定した。【００６８】（２）ホモロジー検索による本発明ＤＮＡを含むクローンの決定
次に、こうして得られた全塩基配列に基づき、ＤＮＡ解析プログラム（Ｆａｓｔａ  ＆  Ｂｌａｓｔ）を用いたホモロジー検索を実施したところ、公開されているデータベースの中のヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子と高いホモロジーを示す候補クローンｍｐｆ００９２０が見出された。更に、別のＤＮＡ解析プログラム（ＢＥＳＴＦＩＴ）を用いて、このクローンｍｐｆ００９２０とヒトＫＩＡＡ０６２０のアミノ酸配列と塩基配列について比較したところ、アミノ酸配列のレベルでは、ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子がコードするアミノ酸配列（１，９８５アミノ酸長）の２３８番目から１，９８５番目（１，７４８アミノ酸長）と配列番号：１で示されるｍｐｆ００９２０のアミノ酸配列（１，７４６アミノ酸長）の１番目から１，７４６番目までアミノ酸配列（１，７４６アミノ酸長）について、約９１．８８％のホモロジーを示すことが判明した。また、本発明の配列番号：１で示されるアミノ酸配列（１，７４６アミノ酸長）の９７４番目から９７５番目の間に、ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列では、２つのアミノ酸、すなわちバリン及びアラニン（Ｖ，Ａ）の挿入が認められることが判明した。【００６９】  公開されたポリペプチドのアミノ酸配列に関するデータベースを検索すると、複数の報告があったが、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と同じ配列についての報告はなかった。詳しくには、次に示す公開されたポリペプチドのアミノ酸配列に対し、本発明のｍｐｆ００９２０ポリペプチドのアミノ酸配列（１，７４６アミノ酸長）と、比較的高いホモロジーを示す配列が２件認められるが、実質的に同一である配列はない。【００７０】  １）国際公開番号ＷＯ２００１１４４２０−Ａ２（発明の名称：Ｈｕｍａｎ  Ｐｌｅｘｉｎ−Ｄ１，Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：Ｈｙｓｅｑ  ＩＮＣ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：１１，Ｏｃｔ．２００１）のＨｕｍａｎ  Ｐｌｅｘｉｎ−Ｄ１（１，９２５アミノ酸長）の１７８番目から１，９２５番目の１，７４８アミノ酸長のアミノ酸配列と、本発明のｍｐｆ００９２０蛋白質（１，７４６アミノ酸長）の１番目から１，７４６番目の１，７４６アミノ酸長のアミノ酸配列とで、比較的高いホモロジーが認められた（約９１．７０％）。ＷＯ２００１１４４２０−Ａ２のＨｕｍａｎ  Ｐｌｅｘｉｎ−Ｄ１（１，９２５アミノ酸長）はヒト由来であり、ポリペプチド断片のアミノ酸配列について診断用蛋白質、治療用あるいはバイオ医薬用として記載されているが、その機能については不明である。相同する１，９２５アミノ酸長のアミノ酸配列に対し、本発明のマウス由来の１，７４６アミノ酸配列は、新規配列でありかつ機能についても記載可能で有用である。【００７１】  ２）国際公開番号ＷＯ２００１５７１８８−Ａ２（発明の名称：Ｈｕｍａｎ  ｐｌｅｘｉｎ−Ｂ１／ＳＥＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０７９，Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：Ｈｙｓｅｑ  ＩＮＣ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：０９，Ａｕｇ．２００１）のＨｕｍａｎ  Ｐｌｅｘｉｎ−Ｂ１／ＳＥＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０７９Ｄ１（１，９９２アミノ酸長）の２３８番目か���１，９９２番目の１，７５５アミノ酸長のアミノ酸配列と、本発明のｍｐｆ００９２０蛋白質（１，７４６アミノ酸長）の１番目から１，７４６番目の１，７４６アミノ酸長のアミノ酸配列とで、比較的高いホモロジーが認められた（約９１．５１％）。ＷＯ２００１５７１８８−Ａ２のＨｕｍａｎ  Ｐｌｅｘｉｎ−Ｂ１／ＳＥＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０７９Ｄ１（１，９９２アミノ酸長）はヒト由来であり、ポリペプチド断片のアミノ酸配列について診断用蛋白質、治療用あるいはバイオ医薬用として記載されているが、その機能については不明である。相同する１，９２５アミノ酸長のアミノ酸配列に対し、本発明のマウス由来の１，７４６アミノ酸配列は、新規配列でありかつ機能についても記載可能で有用である。【００７２】  公開された遺伝子の塩基酸配列に関するデータベースを検索すると、本発明のｍｐｆ００９２０塩基配列（６，１７８塩基長）とホモロジーを有する配列について複数の報告があったが、本発明のｍｐｆ００９２０塩基配列と同じ配列についての報告はなかった。詳しくには、次に示す公開された塩基配列に対し、本発明のｍｐｆ００９２０塩基配列（６，１７８塩基長）と、やや高いホモロジーを示す配列が４件認められるが、本発明のｍｐｆ００９２０塩基配列（６，１７８塩基長）と実質的に同一である配列はない。【００７３】  １）国際公開番号ＷＯ２００２８１７４５−Ａ２（発明の名称：Ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＳＥＱ  ＩＤ  １１８，ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  ＳＡ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：１７，Ｏｃｔ．２００２）のＣｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＳＥＱ  ＩＤ  １１８，ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ（６，７５４塩基長）の７１０番目から５，９５８番目までの５，２４９塩基長と本発明の塩基配列（６，１７８塩基長）の１番目から５，２４３番目までの５，２４３塩基長とで、約８６．９５％という比較的高いホモロジーが認められた。Ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＳＥＱ  ＩＤ  １１８は骨形成時に発現抑制が認められるヒト由来の塩基配列であり、本発明のｍｐｆ００９２０塩基配列（配列番号２：６，１７８塩基長）に対して比較的高いホモロジーが認められるが、本発明の塩基配列とは異なる配列である。【００７４】  ２）国際公開番号ＷＯ２００１１４４２０−Ａ２（発明の名称：Ｈｕｍａｎ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｐｌｅｘｉｎ−Ｄ１，Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：Ｕｎｉｖ．Ｔｏｒｉｎｏ，Ｕｎｉｖ．Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：０１，Ｍａｒ．２００１）Ｈｕｍａｎ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｐｌｅｘｉｎ−Ｄ１（５，８９２塩基長）の５４２番目から５，７９０番目までの５，２４９塩基長と本発明の塩基配列（６，１７８塩基長）の１番目から５，２４３番目までの５，２４３塩基長とで、約８６．９１％というやや高いホモロジーが認められた。Ｈｕｍａｎ  Ｐｌｅｘｉｎ−Ｄ１（６，１７８塩基長）はヒト由来であり、それがコードするポリペプチド断片のアミノ酸配列について診断用蛋白質、治療用あるいはバイオ医薬用として記載されているが、その機能については不明である。このやや高いホモロジーが認められる６，１７８塩基長の塩基配列に対し、本発明のマウス由来の６，１７８塩基長の塩基配列は、新規配列でありかつ機能についても記載可能で有用である。【００７５】  ３）国際公開番号ＷＯ２００１５７１８８−Ａ２（発明の名称：Ｈｕｍａｎ  ｐｌｅｘｉｎ−Ｂ１／ＳＥＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃＤＮＡ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２９，Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：ＨＹＳＥＱ  ＩＮＣ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：０９，Ａｕｇ．，２００１）のＨｕｍａｎ  Ｐｌｅｘｉｎ−Ｂ１／ＳＥＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃＤＮＡ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２９（７，０８０塩基長）の配列番号７１０番目から５，９７９番目までの５，２７０塩基長と本発明の塩基配列（６，１７８塩基長）の配列番号１番目から５，２４３番目までの５，２４３塩基長とで、約８５．５０％というやや高いホモロジーが認められた。Ｈｕｍａｎ  Ｐｌｅｘｉｎ−Ｂ１／ＳＥＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃＤＮＡ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２９（７，０８０塩基長）はヒト由来であり、それがコードするポリペプチド断片のアミノ酸配列について診断用蛋白質、治療用あるいバイオ医薬用として記載されているが、その機能については不明である。このやや高いホモロジーが認められる７，０８０塩基長の塩基配列に対し、本発明のマウス由来の６，１７８塩基長の塩基配列は、新規配列でありかつ機能についても記載可能で有用である。【００７６】  ４）国際公開番号ＷＯ２００２８１７４５−Ａ２（発明の名称：Ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＳＥＱ  ＩＤ  ４３，ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ（Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  ＳＡ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：１７，Ｏｃｔ．，２００２）のＣｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＳＥＱ  ＩＤ  ４３，ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ（１，０７３塩基長）の９６番目から１，０６３番目までの９６８塩基長と本発明の塩基配列（６，１７８塩基長）の４，９０９番目から５，８７５番目までの９６７塩基長とで、約９９．９０％という高いホモロジーが認められた。Ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＳＥＱ  ＩＤ  ４３は骨形成時に発現抑制が認められるヒト由来の塩基配列であり、本発明のｍｐｆ００９２０塩基配列（６，１７８塩基長）に対して高いホモロジーが認められるが１，０７３塩基長とかなり短く、本発明の塩基配列の３プライム側非コード領域に本発明の塩基配列の一部と相同性を有するのみの配列といえる。【００７７】  １）、２）及び３）で出願された配列については、本発明の塩基配列（６，１７８塩基長）と比較すると、上記に示すようにやや高いホモロジーが認められた。しかし、本発明の遺伝子の配列はやや高いホモロジーが認められるものの全く異なる新規な配列と判断される。また、４）で出願された配列については、本発明の塩基配列すなわちｍｐｆ００９２０遺伝子配列（６，１７８塩基長）の全長をカバーするものでなく、３プライム側非コード領域��本発明の塩基配列の一部と部分的に高いホモロジーが認められる関係にあり、４）の配列と本発明の遺伝子の配列は、一部分に高いホモロジーが認められるものの全く異なる新規な配列と判断される。【００７８】  以上のホモロジー検索の結果から、候補クローンｍｐｆ００９２０はヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子と比較的高いホモロジーを示し、既にいくつかの報告がある数個の既知遺伝子に類似であるが、全く新しい齧歯類由来の新規遺伝子であることが判明した。【００７９】（３）モチ−フ検索
本発明のＤＮＡに関して、ＰＲＯＳＩＴＥ  ｄａｔａｂａｓｅを検索するための蛋白質解析プログラムであるｐｆｔｏｏｌｓ（Ｂａｉｒｏｃｈ  Ａ，Ｂｕｃｈｅｒ  Ｐ，Ｈｏｆｍａｎｎ  Ｋ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９７  Ｊａｎ  １；２５（１）：２１７−２１）、及びＰｆａｍ  ｄａｔａｂａｓｅを検索するための蛋白質解析プログラムｈｍｍｅｒ２．１（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｅ．Ｌ．Ｌ．，Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｒ．，Ｂｉｒｎｅｙ，Ｅ．，Ｂａｔｅｍａｎ，Ａ．，ａｎｄ  Ｄｕｒｂｉｎ，Ｒ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９８；２６，３２０−３２２）を用いてモチ−フ検索を行なった（Ｓｕｙａｍａ  ｅｔ．ａｌ．１９９９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：３３８−３３９）。【００８０】詳しくは、ＨＭＭＳｍａｒｔ検索法（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９５：５８５７−５８６４）によると、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうちＮ−末端側から３−３５２番目にＳｅｍａｐｈｏｒｉｎ／ＣＤ１００  ａｎｔｉｇｅｎドメインが見出された。次に、ＨＭＭＳｍａｒｔ検索法によると、あるいはＨＭＭＰｆａｍ検索法によっても同じく配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうちＮ−末端側から３７１−４２４番目にＰｌｅｘｉｎ／Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ／ｉｎｔｅｇｒｉｎドメインが見出された。更に、ＨＭＭＰｆａｍ検索法によると、５２４−５７６番目及び６７１−７１２番目にＰｌｅｘｉｎ／Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ／ｉｎｔｅｇｒｉｎドメインを検出することができた。また、ＨＭＭＳｍａｒｔ検索法によるとＮ−末端側から７１３−８０２番目に、ＨＭＭＰｆａｍ検索法によるとＮ−末端側から７１４−８０２番目にＣｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＰＴ／ＴＩＧドメインを、また、ＨＭＭＳｍａｒｔ検索法によるとＮ−末端側から８０３−８８９番目に、ＨＭＭＰｆａｍ検索法によるとＮ−末端側から８０４−８８９番目にＣｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＰＴ／ＴＩＧドメインを、更に、ＨＭＭＳｍａｒｔ検索法によるとＮ−末端側から８９１−９７０番目に、ＨＭＭＰｆａｍ検索法によるとＮ−末端側から８９２−９７８番目にＣｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＰＴ／ＴＩＧドメインが見出された。更に、ＳＯＳＵＩという汎用ｔｒａｎｓｍｅｎｂｒａｎｅ（ＴＭ）ｓｅｇｍｅｎｔ検索用プログラムにより検索すると、Ｎ−末端側から１，０９０−１，１１２番目にＥＴＡＩＶＶＳＩＶＩＣＳＶＬＬＬＬＳＶＶＡＬＦで示される膜貫通（ＴＭ）セグメントが見出された。【００８１】  Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ／ＣＤ１００  ａｎｔｉｇｅｎドメインは、Ｐｌｅｘｉｎファミリーの細胞膜外に認められるその配列の保存性が高い特徴的なドメインで、Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎとの特異的結合に関係すると考えられている（文献９，１６）。Ｐｌｅｘｉｎ／Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ／ｉｎｔｅｇｒｉｎドメインは、Ｐｌｅｘｉｎ，Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ及びＩｎｔｅｇｒｉｎにみられる特徴的な配列からなる特定のドメインをいう。細胞外に出ているいくつかの受容体に認められるシステインに富むこの繰り返し構造の機能について詳細は不明であるが、��種親和性を経由する細胞接着を仲介する新規な神経細胞表面分子として知られている。Ｐｌｅｘｉｎは脳や上皮の組織中に存在しＳｅｍａｐｈｏｒｉｎが誘導する脳成長錐体（ｇｒｏｗｔｈ  ｃａｎｅ）の崩壊や喪失に、また、Ｉｎｔｅｇｒｉｎは上皮細胞の移動機能を完結するのに関わっている（文献９，１６）。ＩＰＴ／ＴＩＧドメインはイムノグロビュリン様の折りたたみ構造を有し、同ドメインはＤＮＡ結合に関連する細胞内転写因子と同じくＭｅｔ、Ｒｏｎといった細胞膜表面受容体にも認められる。Ｒｏｎチロシンキナーゼ受容体はＭｅｔやＳｅａといったサブファミリーのメンバーと特徴的な機能を共有する。例えば、その機能は細胞の分離や解離、細胞の運動、細胞外骨格の細胞内陥没（ｉｎｖａｓｉｏｎ）といった現象を制御する機能である（文献９，１６）。【００８２】  これらにより、本発明のｍｐｆ００９２０遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列は、１，７４６アミノ酸長とヒトＫＩＡＡ０６２０と比較し２３７アミノ酸短く、Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ／ＣＤ１００  ａｎｔｉｇｅｎドメイン、３つのＰｌｅｘｉｎ／Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ／ｉｎｔｅｇｒｉｎドメイン、及び３つのＣｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＰＴ／ＴＩＧを有し、かつＣ−末端側に膜貫通（ＴＭ）セグメントが存在する、ヒトＫＩＡＡ０６２０蛋白質（１，９８５アミノ酸）より２３９アミノ酸長短い構成（図１）であることを見出し、機能を推定することが可能となった。【００８３】（４−１）マウス胎仔を用いた発生過程におけるｍｐｆ００９２０遺伝子の発現部位検索
ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子は、Ｐｌｅｘｉｎファミリー（Ｔａｍａｇｎｏｎｅ，Ｌ．，ｅｔ  ａｔ．，２００１，Ｃｅｌｌ，９９：７１−８０）であること、ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子をプローブとしてマウス発生過程においてｍＲＮＡを検索した結果、血管内皮細胞あるいは中枢神経系（ＣＮＳ）でヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子とハイブリダイズするｍＲＮＡが発現していること等の報告があるが（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｗａａｇ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２００２，２２５：３３６−３４３）、本発明の新規Ｐｌｅｘｉｎ遺伝子のマウス発生過程における、発現部位は不明であった。本発明の遺伝子うちの一つであるマウスｍｐｆ００９２０遺伝子の発生過程における発現部位を検索することを目的として以下の実験を行った。【００８４】  マウスｍｐｆ００９２０遺伝子をＰＣＲ法で増幅してＰｒｏｂｅを作成するために必要なフォアワードプライマーとリバースプライマーを市販のＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。フォアワードプライマーの配列を５’−ＣＣＣＣＧＧＡＡＣＴＴＧＡＡＣＧＴＧＴＣ−３’（配列番号：３）、リバースプライマーの配列を５’−ＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＴＧＴＧＣＴＧ−３’（配列番号：４）とし、それらのプライマーを用いてマウスｍｐｆ００９２０遺伝子の転写産物をＰＣＲ法で増幅すると、アンチセンスあるいはセンスプローブとして働く各々約１，０６９塩基長（ｂｐ）のＤＮＡ断片が得られる設計にした。目的とするＰＣＲ産物、すなわちアンチセンスあるいはセンスプローブ用の約１，０６９（ｂｐ）ＤＮＡ断片をＰｒｏｍｅｇａ社が供給するＴ−ｖｅｃｔｏｒにクローン化した。Ｔ−ｖｅｃｔｏｒにクローン化した１，０６９（ｂｐ）ＤＮＡ断片を鋳型とし、Ｔ７またはＳＰ６ＲＮＡポリメレースを用いてＰｒｏｍｅｇａ社が示す方法によりマウスｍｐｆ００９２０遺伝子発現産物を検出可能とするアンチセンスｃＲＮＡプローブ及び陰性コントロール用として使用するセンスｃＲＮＡプローブを作製し、同遺伝子の各個体発生段階に対応した組織特異的発現解析を目的とする以下の実験に供した。【００８５】  すなわち、受精後の経過日数に従ってホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用に通常用いられるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用固定法により固定されたさまざまな時期の個体発生段階を反映するマウス胎仔（ｄ．ｐ．ｃ：発生段階を交尾後の日数にて表示する）を被検体として用い、ＳｕｐｅｒＢｉｏＣｈｉｐｓ  Ｌａｂ社が供給するＤＩＧラベル法により同社が示すホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの方法に用いてマウス胎仔ホールマウント組織特異的発現の解析を行った（参照：細胞工学別冊  脱アイソトープ実戦プロトコール、１９２−２２３、１９９８）。【００８６】  マウス胎仔を用いた本遺伝子発現部位の解析結果により以下の点について新知見を見出した。すなわち、マウスｍｐｆ００９２０遺伝子は個体発生時の血管形成時期（Ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）にのみ血管内皮細胞特異的に発現すること、とりわけ、個体発生時における血管前駆細胞（Ｆｌｋ１陽性細胞）が出現する時期（７．５〜８．０ｄ．ｐ．ｃ）と一致して、血管部位のｍｐｆ００９２０陽性シグナル認められ、血管形成時期を通して血管特異的な発現パターンを示した。顕微鏡下におけるｍｐｆ００９２０遺伝子の個体発生時における発現部位の詳細な解析から、ｍｐｆ００９２０遺伝子の発現は単に血管内皮細胞特異的発現として認められるのでなく、マウス胎仔発生過程における初期血管形成時期（１０．５，８．０，；及び９．５ｄ．ｐ．ｃ）に血管内皮細胞特異的な発現パターンを示すことが認められた（図２Ａ，図２Ｂ，図２Ｃ、図２Ｄ）。一方、個体発生後期から成体にかけての時期では、血管内皮細胞特異的な発現は認められなかった。【００８７】  尚、図２Ａの上の図は陰性コントロールとして用いたセンスｃＲＮＡ断片で非特異的遺伝子発現の検出を、図２Ａの下の図はアンチセンスｃＲＮＡ断片で検出したｍｐｆ００９２０遺伝子の発現パターンの検出を試みた結果を示す。これらの結果により、アンチセンスｃＲＮＡ断片でｍｐｆ００９２０遺伝子発現が検出されるが、センスｃＲＮＡ断片で検出されず、用いた約１，０６９塩基長（ｂｐ）のＤＮＡ断片が非特異的遺伝子発現のシグナルをひろう可能性が低いことが示された。【００８８】（４−２）受精後１４．５日目胎仔及び成体におけるｍｐｆ００９２０遺伝子のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法によるｍＲＮＡレベルでの発現頻度の検索
ヒトにおけるｍＲＮＡレベルでのヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子の発現頻度についての知見はないが（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｈｕｇｅ／ｇｆｐａｇｅ／ＫＩＡＡ０６２０／、ＤＮＡ  Ｒｅｓ．，１９９８，５：１６９−１７６ｅａｒｃｈ，１９９７，４：３４５−３４９）、ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子と相同性を示すマウスｍｐｆ００９２０遺伝子のマウスにおけるｍＲＮＡレベルでの発現頻度について、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により成長後の成体マウスを用いて組織特異的発現を解析することにより検索した。マウスｍｐｆ００９２０遺伝子をＰＣＲ法で増幅してＰｒｏｂｅを作成するために必要なフォアワードプライマーとリバースプライマーを市販のＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。フォアワードプライマーの配列を５’−ＣＣＣＣＧＧＡＡＣＴＴＧＡＡＣＧＴＧＴＣ−３’（配列番号：３）、リバースプライマーの配列を５’−ＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＴＧＴＧＣＴＧ−３’（配列番号：４）とし、それらのプライマーを用いてマウスｍｐｆ００９２０遺伝子の転写産物をＰＣＲ法で増幅すると、アンチセンスあるいはセンスプローブとして働く各々約１，０６９塩基長（ｂｐ）のＤＮＡ断片が得られる設計にした。目的とするＰＣＲ産物、すなわちアンチセンスあるいはセンスプローブ用の約１，０６９（ｂｐ）ＤＮＡ断片をＰｒｏｍｅｇａ社が供給するＴ−ｖｅｃｔｏｒにクローン化した。Ｔ−ｖｅｃｔｏｒにクローン化した１，０６９（ｂｐ）ＤＮＡ断片を鋳型とし、Ｔ７またはＳＰ６ＲＮＡポリメレースを用いてＰｒｏｍｅｇａ社が示す方法によりマウスｍｐｆ００９２０遺伝子発現産物を検出可能とするアンチセンスｃＲＮＡプローブ及び陰性コントロール用として使用するセンスｃＲＮＡプローブを作製し、同遺伝子の組織特異的発現解析を目的とする以下の実験に供した。【００８９】  すなわち、マウス受精後１４．５日目胎仔の矢状方向（ｓａｇｉｔｔａｌ）凍結切片を被検体として用い、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋで３７℃、１５分間処理を含む固定を行った後、ＳｕｐｅｒＢｉｏＣｈｉｐｓ  Ｌａｂ社が供給するＤＩＧラベル法により同社が示すｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの方法に従って、一つのスライドグラス上の組織片に対し５００ｎｇ  ＤＩＧラベルＲＮＡをプローブとして使用し、５０℃で１６時間のハイブリダイゼーションを行い、組織特異的な発現解析を行った（参照：細胞工学別冊  脱アイソトープ実戦プロトコール、１９２−２２３、１９９８）。【００９０】  表１に示したように、得られた各組織切片におけるマウスｍｐｆ００９２０遺伝子の発現シグナルの強度解析結果によると、発現強度は脳・大脳皮質、顎下腺に於いて強い発現が、三叉神経の神経節、骨・肋骨、広背筋、胃、腸に於いてやや強い発現が、また、皮膚・真皮、脳・小脳、骨・背骨、心臓・心房の血管、心臓・心室の心筋層、心臓・心室の血管といった各種臓器に於いて発現が認められた。皮膚の表皮、肺の血管、肺・肺胞細胞、心臓・心房の心筋層についてはシグナルが弱くて確認できなかった。図３Ａ及び図３Ｂ参照。【００９１】  以上の結果から、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドは、マウス受精後１４．５日目胎仔に���いて脳・大脳皮質、顎下腺に於いて強い発現が、三叉神経の神経節、骨・肋骨、広背筋、胃、腸に於いてやや強い発現が認められ、脳・神経、顎下腺、皮膚、骨、筋肉、心臓をはじめ各種臓器に広範に認められ、これにより関連する臓器、組織の発生・分化や機能保全に関わっているといえる。【００９２】表１）マウス受精後１４．５日目胎仔の矢状方向（ｓａｇｉｔｔａｌ）凍結切片を用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果（＋＋＋：強い発現、＋＋：やや強い発現、＋：発現が認められる、−：シグナルが弱くて確認できない）【００９３】
【表１】
0004751202.tif 000002
【００９４】  更に、マウス成体の各組織について作製されたパラフィン組織切片を載せたＴｉｓｓｕｅ  Ａｒｒａｙ  Ｓｌｉｄｅ（ＳｕｐｅｒＢｉｏＣｈｉｐｓ  Ｌａｂ社製：フナコシ株式会社が供給するＬｏｔ：ＺＥ１）を被検体として用い、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋで３７℃、１５分間処理を含む固定を行った後、ＳｕｐｅｒＢｉｏＣｈｉｐｓ  Ｌａｂ社が供給するＤＩＧラベル法により同社が示すｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの方法に従って、一つのスライドグラス上の組織片に対し５００ｎｇ  ＤＩＧラベルＲＮＡをプローブとして使用し、５０℃で１６時間のハイブリダイゼションを行い、組織特異的な発現解析を行った（参照：細胞工学別冊  脱アイソトープ実戦プロトコール、１９２−２２３、１９９８）。【００９５】  表２に示したように、得られた各組織切片におけるマウスｍｐｆ００９２０遺伝子の発現シグナルの強度解析結果によると、同遺伝子の成長後の成体において発現強度は胃の重層扁平上皮に於いて強い発現、子宮の子宮腺上皮細胞、脳のプルキンエ細胞層に於いてやや強い発現が、また、皮膚、脾臓、心臓、舌、腎臓、精巣、大脳の神経膠細胞といった各種臓器に於いて発現が認められた。皮膚の真皮、脾臓の赤脾髄、骨格筋、肺、肺の血管、心臓の血管、唾液腺、肝臓、膵臓、小腸、大腸、卵巣、胸腺、についてはシグナルが弱くて確認できなかった。図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ参照。【００９６】  以上の結果から、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドは、成体において胃、子宮、脳をはじめ各種臓器に広範に認められ、これにより関連する臓器、組織の発生・分化や機能保全に関わっているといえる。特に、本発明のポリペプチドが、脳・神経系における神経細胞の伸張やネットワーク維持、心臓・血管や腎臓等管腔構造を有する臓器での構造維持に関わると推定される。また、本発明のポリペプチドが、発生初期において血管新生に関わっている場合の機能と、成体における脳をはじめとする各種組織での例えば神経細胞のガイダンスに関わっている機能とで、分子の働きが異なる可能性もある。例えば、神経細胞においてＰｌｅｘｉｎはＮｅｕｒｏｐｉｌｉｎと共同して、ダイマー化したＳｅｍａｐｈｏｒｉｎと結合して複合体を形成し、神経細胞の伸張を追い払う調節がなされるという（文献１６）。【００９７】  表２）マウス成体パラフィン組織切片を用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果（＋＋＋：強い発現、＋＋：やや強い発現、＋：発現が認められる、−：シグナルが弱くて確認できない）【００９８】
【表２】
0004751202.tif 000003
【００９９】（４−３）マウス胎仔発生過程に於けるｍＫＩＡＡ０６２０のｍＲＮＡレベルでの発現頻度
ＲＴ−ＰＣＲ法によりマウスにおけるマウス胎仔発生過程に於けるｍＫＩＡＡ０６２０のｍＲＮＡレベルでの発生段階特異的発現を解析した。フォアワードプライマーの配列を５’−ＣＣＣＣＧＧＡＡＣＴＴＧＡＡＣＧＴＧＴＣ−３’（配列番号：３）、リバースプライマーの配列を５’−ＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＴＧＴＧＣＴＧ−３’（配列番号：４）とし、それらのプライマーを用いてマウスｍｐｆ００９２０遺伝子の転写産物をＰＣＲ法で増幅すると、アンチセンスあるいはセンスプローブとして働く各々約１，０６９塩基長（ｂｐ）のＤＮＡ断片が得られる設計にした。目的とするＰＣＲ産物、すなわちアンチセンスあるいはセンスプローブ用の約１，０６９（ｂｐ）ＤＮＡ断片をＰｒｏｍｅｇａ社が供給するＴ−ｖｅｃｔｏｒにクローン化した。Ｔ−ｖｅｃｔｏｒにクローン化した１，０６９（ｂｐ）ＤＮＡ断片を鋳型とし、Ｔ７またはＳＰ６ＲＮＡポリメレースを用いてＰｒｏｍｅｇａ社が示す方法によりマウスｍｐｆ００９２０遺伝子発現産物を検出可能とするアンチセンスｃＲＮＡプローブ及び陰性コントロール用として使用するセンスｃＲＮＡプローブを作製し、同遺伝子のマウス胎仔発生過程に対応した発現強度解析を目的とする以下の実験に供した。すなわち、各マウス胎仔発生過程における１ｓｔストランドｃＤＮＡと上記プライマーをそれぞれ混合し、各々についてＰＣＲを行い、マウスＫＩＡＡ０６２０遺伝子の転写産物のうち約１，０６９（ｂｐ）ＤＮＡ断片の増幅を図った。ＰＣＲは、ＴａｑポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造，＃ＲＰ００１Ａ）を用い、上述のＤＮＡ混合液を９５°Ｃ（２．５分）で加熱した後、９５°Ｃ（３０秒）／６０°Ｃ（３０秒）／７２°Ｃ（３０秒）のサイクルを３５回繰り返して行った。コントロールとしてＦｌｋ１遺伝子発現を検出するプライマーを使用したＦＬｋ１転写産物由来約１１２９ｂｐＤＮＡ断片の増幅も同様にして行った。増幅を終えたＰＣＲ産物を、サイズマーカーとともに２％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製、＃５００７０）を用いて電気泳動で分画し、分画したＰＣＲ産物の量を半定量的に比較した（図５）。その結果、Ｆｌｋ１はマウス胎仔発生過程に於ける血管形成が開始された７．５ｄ．ｐ．ｃ．で発現が認められ、血管形成時期を通じて９．５ｄ．ｐ．ｃ．に至るまで高発現が継続したのに対し、マウスＫＩＡＡ０６２０遺伝子発現は、血管形成が観察されるようになる時期より少し早い６．５ｄ．ｐ．ｃ．で検出され、血管形成時期を通じて９．５ｄ．ｐ．ｃ．に至るまで高発現が継続した。このことにより、従来から血管形成のマーカー遺伝子としていわれてきたＦｌｋ１に対し、更に早い時期にＫＩＡＡ０６２０は発現し血管形成を誘導していると推察することが出来た。【０１００】（５−１）５’端ＤＮＡ配列伸張
マウスｍＫＩＡＡ０６２０（遺伝子名：ｍｐｆ００９２０）の５’端はヒトＫＩＡＡ０６２０に比較して短く、ｍＫＩＡＡ０６２０塩基配列に対し付加する配列があるのではないかと推測された。しかし、上記（２）においてヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子との比較から推測された５’端配列をマウスｃＤＮＡライブラリーから取得することは困難を極めた。そこで、長鎖ｃＤＮＡといった対象テキスト配列が長い材料を哺乳動物のゲノム配列を高速検索することを可能にするために、特開２００３−２１６６１５号公報に基づくメモリに比較回路を付加したｃｏｎｔｅｎｔ  ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ｍｅｍｏｒｙ（ＣＡＭ）を用いた配列の長さに計算時間が依存しない並列比較可能な計算機（ハードウエア）開発とその制御アルゴリズム設計を鋭意研究することにより、超並列ゲノムコンパレーターといった改良された新規システムを構築して、長鎖ｃＤＮＡを対象とした解析方法を完成した。完成した超並列ゲノムコンパレーターを使用し、公開済みのマウスゲノム配列からマウスｍＫＩＡＡ０６２０に対する大規模・高速塩基配列検索を実施し、公開済みのマウスゲノム配列のなかからｍＫＩＡＡ０６２０塩基配列に対し付加する配列に関わる情報（配列番号１７）を検索し、その結果、以下に具体的に示すように、本発明の配列番号１に示したアミノ酸配列のＮ末側に付加される２５１アミノ酸長のアミノ酸配列を取得するために必要なプライマー配列を設計可能にするに至った。【０１０１】（５−２）５’端ＤＮＡ配列伸張
配列２に示すｍｐｆ００９２０遺伝子配列の部分配列情報を基にＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（ＡＡＴＣＴＴＧＡＴＧＴＧＧＴＡＣＴＣＡＴＧＧＣＴＣＴＣ，２７塩基長，名称ＧＳＰ１，配列２の３，０９０番目から３，１１６番目の２７塩基長配列に対する相補的配列：配列番号５）のデザインを行い、マウス胎仔（胎生１０．５日齢）から分離・精製したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを材料にＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＮａｓｅＨ−ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるインビトロ逆転写反応（５０℃  ６０分間）を行い、１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄｃＤＮＡ（未確認配列を含む）を合成した。次に上記コンパレータによる予想配列情報（ゲノム配列より予想）からＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（ＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＡＴＧＧＧＣＴ，２６塩基長，配列１７の７２番目から９７番目の２６塩基長配列：配列番号６）を、又、配列２に示すｍｐｆ００９２０遺伝子配列の部分配列情報を基にしてとＧＳＰ１より少し内側にＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（ＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＣＴＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＣ，２４塩基長，名称ＧＳＰ２，配列２の１，５２４番目から１，５４７番目の２４塩基長配列に対する相補的配列：配列番号７）をデザインし、ＰＣＲ反応を用いて、予測配列断片の増幅を行った。しかし、この領域のＰＣＲは、通常の反応条件では増幅反応が起こらず、ＰＣＲ産物を得ることができなかった。増幅が期待される領域内に反応を阻害する特殊な配列（ＧＣに富む配列）が存在することが推察された。
そこで、ＧＣに富む配列を含む特殊なＤＮＡ断片の増幅を可能とすることを目的とし、上記Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒとＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（ＧＳＰ２）を使用して、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｃａｔ  Ｎｏ．１１７０８−０１３）と添付のＰＣＲｘ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを用い、条件（１×ＰＣＲｘ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ条件：Ｄｅｎａｔｕｒｅ：９４℃  ｆｏｒ１５ｓ  Ａｎｎｅａｌ：５０℃  ｆｏｒ  ３０ｓ  Ｅｘｔｅｎｄ：６８℃  ｆｏｒ  ３ｍｉｎ３０ｓ，４０ｃｙｃｌｅｓ）を新たに設定して伸張反応を行った。その結果、目的とする断片約２，３００塩基長を含む約２，３１４塩基長のＤＮＡ断片をＰＣＲ反応により増幅することが出来た。【０１０２】得られたＤＮＡ断片をプライマリーな鋳型として、上記同様Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。すなわち、Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（ＴＴＧＴＣＧＡＣＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＴ  ａｔｇ  ｇｇｃ  ｔｇｔ  ｇｇｇ  ｃｇｔ  ｇｇｔ  ｃｔｃ  ｃａｃ  ｇｇａ  ｇｃｃ  ｇｃｃ  ｃｃｃ  ｇｇｇ  ｃｔｇ  ａｇｃ，８０塩基長，配列１７の９１番目から１３５番目の４５塩基長配列を含む８０塩基長：配列番号８）を、又、配列２に示すｍｐｆ００９２０遺伝子配列の部分配列情報を基にしてとＧＳＰ２より少し内側にＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（ＡＡＡＴＧＴＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＴＴＧＧＴ，２３塩基長，配列２の１，２１５番目から１，２３７番目の２３塩基長配列に対する相補的配列：配列番号９）をデザインし、ＧＣに富む配列を含む特殊なＤＮＡ断片の増幅を可能とすることを目的とした上記で述べたＰＣＲ条件を参考としてＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件の詳細は、ｆｉｎａｌ：１×ＰＣＲｘ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｄｅｎａｔｕｒｅ：９４℃  ｆｏｒ１５ｓ  Ａｎｎｅａｌ：５０℃  ｆｏｒ  ３０ｓ  Ｅｘｔｅｎｄ：６８℃  ｆｏｒ  ３ｍｉｎ，３５ｃｙｃｌｅｓであった。その結果、目的とする断片約２，０２０塩基長のＤＮＡ断片をＰＣＲ反応により増幅することが出来た。【０１０３】得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ４５７５−Ｊ１０）へ挿入し、大腸菌（ＤＨ５α株）の形質転換を行い、目的とするＰＣＲ産物を含むプラスミドＤＮＡを取得した。取得した形質転換株を用いて得られたプラスミドＤＮＡの増幅を行い、増幅したプラスミドＤＮＡを用いてシークエンサーによる目的とするＰＣＲ産物の塩基配列の決定を行った。その結果、７５３塩基長の新規な塩基配列（配列番号１０）及びそれにコードされるアミノ酸配列（配列番号１１）を新規配列として取得することが出来た。配列番号１０を用いた解析結果から、配列番号１１がコードする２番目のＭｅｔがＮ’端であると推定された。これはヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列で推定されるＮ’末端のＭｅｔの位置、あるいはｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｗａａｇ等（Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２００２，２２５：３３６−３４３，：非特許文献８）の���告にあるヒトＰＬＥＸＩＮ−Ｄ１のアミノ酸配列のＮ’末端のＭｅｔの位置に比較して７１アミノ酸長だけ長い。そこで、本発明の発現実験に於いては、配列番号１１の２番目のＭｅｔを含むＤＮＡ断片を使用した。しかし、同ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｗａａｇ等の報告にあるヒトＰＬＥＸＩＮ−Ｄ１のアミノ酸配列で示されるＮ’から３０番目から４６番目のシグナル配列（ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に相当する配列が、配列１１の１０２番目から１２０番目に認められることから、機能的には配列番号１１のマウス配列に於いても７３番目のＭｅｔから蛋白合成が始まっていてもおかしくはない。すなわち配列１１の２番目と７３番目のＭｅｔは共に蛋白合成開始点である可能性が考えられた。【０１０４】（５−３）ホモロジー検索
こうして得られた、ｍｐｆ００９２０塩基配列に対し５’に付加した２５１アミノ酸長及び７５３塩基長の配列についてホモロジー検索を、ＦＡＳＴＡ等により検索を実施した結果、比較的高いホモロジーを示す配列が２件認められたが、実質的に同一である配列はない。【０１０５】即ち、国際公開番号ＷＯ２００１１４４２０−Ａ２（発明の名称：Ｈｕｍａｎ  Ｐｌｅｘｉｎ−Ｄ１，Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：Ｈｙｓｅｑ  ＩＮＣ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：１１，Ｏｃｔ．２００１）のＨｕｍａｎ  Ｐｌｅｘｉｎ−Ｄ１（１，９２５アミノ酸長）の１番目から１７７番目の１７７アミノ酸長のアミノ酸配列と、本発明のｍｐｆ００９２０アミノ酸配列に対し５’に付加した２５１アミノ酸長の配列（配列１５で示すアミノ酸配列における１番目から２５１番目のアミノ酸配列）の７３番目から２５１番目の１７９アミノ酸長のアミノ酸配列とで、やや高いホモロジーが認められる（約８６．０３％）。【０１０６】更に、国際公開番号ＷＯ２００１５７１８８−Ａ２（発明の名称：Ｈｕｍａｎ  ｐｌｅｘｉｎ−Ｂ１／ＳＥＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０７９，Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：Ｈｙｓｅｑ  ＩＮＣ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：０９，Ａｕｇ．２００１）のＨｕｍａｎ  Ｐｌｅｘｉｎ−Ｂ１／ＳＥＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０７９Ｄ１（１，９９２アミノ酸長）の１番目から２３７番目の２３７アミノ酸長のアミノ酸配列と、本発明のｍｐｆ００９２０アミノ酸配列に対し５’に付加した２５１アミノ酸長の配列（配列１５で示すアミノ酸配列における１番目から２５１番目のアミノ酸配列）の１３番目から２５１番目の２３７アミノ酸長のアミノ酸配列とで、やや高いホモロジーが認められた（約８０．７５％）。【０１０７】以下に示すように、ｍｐｆ００９２０塩基配列に対し５’に付加した７５３塩基長の配列（配列１６で示す塩基配列における１番目から７５３番目の塩基配列）とホモロジーを有する部分配列をクレームする出願は下記のように２件あるが本発明で追加した７５３塩基長実質的に同一である配列の出願はない。【０１０８】国際公開番号ＷＯ２００２８１７４５−Ａ２（発明の名称：Ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＳＥＱ  ＩＤ  １１８，ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  ＳＡ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：１７，Ｏｃｔ．２００２）のＣｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＳＥＱ  ＩＤ  １１８，ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ（６，７５４塩基長）の２８４番目から７０９番目までの４２６塩基長あるいは２５番目から２３０番目までの２０６塩基長と、本発明の５’に付加した７５３塩基長の配列（配列１６で示す塩基配列における１番目から７５３番目の塩基配列）のうち３２８番目から７５３番目までの４２６塩基長あるいは６４番目から２６８番目までの２０５塩基長とで、約８９．２８％あるいは９５．１５％という比較的高いホモロジーが認められた。【０１０９】国際公開番号ＷＯ２００１５７１８８−Ａ２（発明の名称：Ｈｕｍａｎ  ｐｌｅｘｉｎ−Ｂ��／ＳＥＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃＤＮＡ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２９，Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：ＨＹＳＥＱ  ＩＮＣ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：０９，Ａｕｇ．，２００１）のＨｕｍａｎ  Ｐｌｅｘｉｎ−Ｂ１／ＳＥＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃＤＮＡ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２９（７，０８０塩基長）の配列番号２８４番目から７０９番目までの４２６塩基長あるいは配列番号２５番目から２３０番目までの２０６塩基長と、本発明の５’に付加した７５３塩基長の塩基配列（配列１６で示す塩基配列における１番目から７５３番目の塩基配列）のうち配列番号３２８番目から７５３番目までの４２６塩基長あるいは配列番号６４番目から２６８番目までの２０５塩基長とで、約８９．２８％あるいは９５．１５％という比較的高いホモロジーが認められた。【０１１０】以上のホモロジー検索の結果から、既に記載したｍｐｆ００９２０遺伝子（配列２で示す塩基配列）の５’に７５３塩基長の塩基配列が付加された塩基配列（配列１６で示す塩基配列）は、各々ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子と比較的高いホモロジーを示し、既にいくつかの報告がある数個の既知遺伝子に類似であるが、全く新しい齧歯類由来の新規遺伝子であることが判明した。【０１１１】（６）遺伝子導入細胞作製
配列２で示すｍｐｆ００９２１遺伝子配列（５’端配列を欠く非全長ｃＤＮＡ：６，１７８塩基長）と上記（５）で取得した５’端ＤＮＡ断片（配列番号１０）を含むＰＣＲ産物を用いて以下の手順で、ＯＲＦ該当部位の全長ｃＤＮＡ（配列１６）を取得した。最初に配列２で示すｍｐｆ００９２１遺伝子配列（マウスＫＩＡＡ０６２０の非全長ｃＤＮＡ）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）のマルチクローニングサイトに挿入して組換えプラスミドを作製した。すなわち、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）のマルチクローニングサイトの配列内Ｂａｍ  ＨＩサイトを利用し、同一制限酵素で切断処理した５’端ＤＮＡ断片をフレームが合うようにデザインしＬｉｇａｔｉｏｎし、大腸菌（ＤＨ５α株）の形質転換を行い、目的とする完全長ＤＮＡ断片を含むプラスミドＤＮＡを取得した。完全長ＯＲＦｃＤＮＡ（５，９９２塩基長：１，９９６アミノ酸長のポリペプチドに終始コドンを付加した配列を含めた長さ）を含む上記プラスミドを大腸菌へ形質転換後、精製・回収した。このプラスミドを鋳型に複数の発現コンストラクトを作製した。発現コンストラクト作製には、Ｇａｔｅｗａｙクローニングテクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｃａｔ．Ｎｏ．１１８２１−０１４）システムを利用し、以下の目的ＰＣＲ産物をｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：）へ組み込んだエントリークローンを作製した。ネイテイブ蛋白質用として用いるＰＣＲ産物は、完全長ｃＤＮＡ（開始コドンから終始コドンまで）として次のプライマーを設計し合成して使用しＰＣＲ反応により作製した。すなわち、Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒとしてＣＡＣＣａｔｇｇｇｃｔｇｔｇｇｇｃｇｔｇｇｔｃｔ（２４塩基長，配列１６の６番目から２５番目の２０塩基長配列を含む２４塩基長配列：配列番号１２）を、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒはＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ１（ＴＣＡＧＧＣＣＴＣＧＣＴＧＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＡＧＡ，２６塩基長，配列２の５，２１８番目から５，２４３番目の２６塩基長配列に対する相補的配列，終始コドンを含む：配列番号１３）を用いてエントリークローンを作製した。また、タグ付き融合蛋白型用として用いるタグ付きＰＣＲ産物は、タグ付き完全長ｃＤＮＡ（開始コドンから終始コドンまで）として次のプライマーを設計し合成して使用しＰＣＲ反応により作製した。すなわち、Ｆｏｒ  ａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒは上述のＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（ＣＡＣＣａｔｇｇｇｃｔｇｔｇｇｇｃｇｔｇｇｔｃｔ，２４塩基長，配列１６の６番目から２５番目の２０塩基長配列を含む２４塩基長配列：配列番号１２）をＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒはＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ２（ＧＧＣＣＴＣＧＣＴＧＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＡＧＡ，２３塩基長，配列２の５，２１８番目から５，２４０番目の２３塩基長配列に対する相補的配列，終始コドンを含まない：配列番号１４）を用いてエントリークローンを作製した。【０１１２】  各エントリークローンをＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ酵素ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｃａｔ．Ｎｏ．１１７９１−０１９）を用いた部位特異的組換え反応により発現用デステイネーションベクター（ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０  ｖｅｃ���ｏｒ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４７  ｖｅｃｔｏｒ：どちらもＣＡＧプロモーター制御下にて発現するプラスミドベクター）へ組換えて発現ベクターの構築を行い、マウスＫＩＡＡ０６２０ネイテイブ蛋白質、マウスＫＩＡＡ０６２０−ＧＦＰ−ＨｉｓＴａｇ、マウスＫＩＡＡ０６２０−Ｖ５融合蛋白質型の哺乳類細胞での強制発現ベクターを構築した。これらをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（Ｆｕｇｅｎｅ６；Ｒｏｃｈｅ社またはＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１試薬；Ｍｉｒｕｓ社）を用いてヒト胎児由来腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）に遺伝子導入し、遺伝子導入細胞を作製した。【０１１３】（７−１）合成ペプチドを抗原としたウサギポリクローナル抗体の作製
マウスＫＩＡＡ０６２０遺伝子がコードするポリペプチドの一部からなるアミノ酸配列をもとに、ペプチド合成して作製した合成ペプチドを免疫原（抗原）として、常法に従い、ウサギポリクローナル抗体を作製した。抗原としてはｍｐｆ００９２０ポリペプチド配列のうちＣ−末端から約１６９アミノ酸離れたところにある１５アミノ酸長配列（配列：ＦＬＥＥＱＡＥＫＲＧＩＳＤＰＤ）に対し末端にシステインを付加した合成ペプチド（配列：ＣＦＬＥＥＱＡＥＫＲＧＩＳＤＰＤ）を、そのＮ−末で担体とするキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にキャリアーカップリングさせ、担体と結合した合成ペプチドを８０％から９０％の純度にまで精製したものを抗原として用いた。日本白色種家兎（メス）に初回は抗原量０．１５ｍｇにて皮内免疫を、その後は約２週間ごとに抗原量０．３ｍｇにて４回の感作を実施して合計５回の皮内免疫を行った。３回目、４回目の各皮内免疫の後の約５週間目、約７週間目に各々５ｍｌの試験採血を行い、ＨＲＰＯ（ホースラディッシュパーオキシダーゼ）結合ヤギＩｇＧ抗ウサギ抗体（ＣＡＰＰＥＬ社製）を用いたＥＬＩＳＡ法にて抗原に対する抗体値を測定した。全部で２回の試験採血において、夫々、１，０００倍希釈、２，０００倍希釈、４，０００倍希釈、８，０００倍希釈、１６，０００倍希釈にて吸光度（４９０ｎｍ）が３となり、試験採血において抗体価の十分な上昇を確認された。この２回目の試験採血の後、約８週目にに５回の感作を実施し、その後、約９週間目に抗体精製用の全採血を行った。採血した血液から血清を遠心にて分離し抗血清を得た。その抗血清を、ウサギポリクローナル抗体（ａｎｔｉ−ｍＫＩＡＡ０６２０ａｂ）として用いた。【０１１４】  また、コントロール血清を確保する目的で免疫前に試採血（３ｍｌ）を前もって実施した。免疫前のコントロール血清において、１，０００倍希釈、２，０００倍希釈、４，０００倍希釈、８，０００倍希釈、１６，０００倍希釈にて吸光度（４９０ｎｍ）が各々０．１７１、０．１０１、０．０８９、０．０８４、０．０７６となり、抗原として用いたアミノ酸配列は免疫前ウサギ血清と反応せず特異性があることが確認された。【０１１５】（７−２）精製ウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法による各種遺伝子導入細胞でのマウスＫＩＡＡ０６２０蛋白質の検出
上記で得られた精製ウサギポリクローナル抗体を用い、ウエスタンブロット法にて各種遺伝子導入細胞でのマウスＫＩＡＡ０６２０蛋白質の検出を試みた。遺伝子導入細胞からの蛋白質回収操作については、マウスＫＩＡＡ０６２０遺伝子強制発現ベクター導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養ディッシュ上でＰＢＳ（−）溶液で洗浄し、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＮＥ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いピペッティング操作を繰り返して可溶化させ、可溶化した溶液を２８Ｇの注射針を通し、次に、遠心操作（７００ｇ，１０ｍｉｎ）後，上清をサンプル液として回収した。サンプル液にはマウスＫＩＡＡ０６２０遺伝子導入細胞由来蛋白質が含まれる。その他のサンプルとして、マウスＫＩＡＡ０６２０蛋白質のＶ５融合蛋白質型を発現する発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用し、上記と同様な方法でサンプル液を調製した。各種サンプル液をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）にて分画した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ポリアクリルアミドゲルの各レーンに約２０マイクログラムの各種遺伝子導入細胞由来蛋白質をアプライして電気泳動で分画し、次に分画した蛋白質をメンブレンにブロットし、ブロットしたメンブレンに対し５００または１０００倍希釈した抗体を用いて免疫染色反応を行った。すなわち、ポリアクリルアミドゲル電気泳動はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製の４〜１２％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｇｅｌ（＃Ｎｏ．ＥＣ６０３５Ｂｏｘ）を用いて行い、ＢｉｏＲａｄ社製のセミドライ式トランスファーセルを用いて蛋白質を転写し、メンブレンにブロットした。二次抗体には５０００倍希釈したＢｉｏｓｏｕｒｃｅ社製Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（＃Ｎｏ．ＡＬＩ０４０４）を用い、検出には同社のＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（＃Ｎｏ．ＲＰＮ２１３３）を用いた。分子量を知る目的でナカライテスク社製のプレステインドタンパク質マーカー（Ｈｉｇｈ  Ｒａｎｇｅ，ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（＃Ｎｏ．２６０３９−７５）を各サンプルとともに電気泳動した。【０１１６】  まず、マウスＫＩＡＡ０６２０蛋白質のＶ５融合蛋白質型を発現する発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔ組換え細胞あるいはその他の組換え細胞を出発材料としたメンブレンにおいて、抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体（５０００倍希釈で使用）を用いたウエスタンブロッティング法による検出実験においては、抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体によりマウスＫＩＡＡ０６２０−Ｖ５融合蛋白質のサイズ（約２２０ｋＤａ）に一致する位置に明瞭な単一バンドを検出することが出来た。検出したバンドの分子量が、マウスＫＩＡＡ０６２０−Ｖ５融合蛋白質の理論上の分子量と一致することから、マウス完全長ＫＩＡＡ０６２０蛋白質がＶ５融合蛋白質として発現していることが確認出来た。【０１１７】  次に、マウスＫＩＡＡ０６２０蛋白質のＶ５融合蛋白質型を発現する発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔ組換え細胞あるいはコントロールとして使用した組換え細胞を出発材料としたメンブレンにおいて、上記で得られた精製ウサギポリクローナル抗体（抗ｍＫＩＡＡ０６２０抗体）を５００倍、１，０００倍希釈して用いた検出系においては、マウスＫＩＡＡ０６２０−Ｖ５融合蛋白質のサイズ（約２２０ｋＤａ）に一致する位置に明瞭なバンドが検出された。一方、約２２０ｋＤａ以外にも数本のバンドがより低分子量の位置に検出された。それらの数本のバンドがマウスＫＩＡＡ０６２０−Ｖ５融合蛋白質に起因するかどうかはこの実験からは明らかでない。マウスＫＩＡＡ０６２０は膜貫通部分を含むのでサンプル調製の過程において、十分に可溶化されずに膜画分に残り可溶性画分には含量が少なく認められた分子量の低い数本のバンドに比較して見かけ上少ない含量として検出された可能性もある。これにより、作製したポリクローナル抗体が目的とするｍＫＩＡＡ０６２０蛋白質融合蛋白と反応し、本発明のポリクローナル抗体（抗ｍＫＩＡＡ０６２０抗体）がｍＫＩＡＡ０６２０蛋白質アミノ酸配列を検出するのに有用と判断された。尚、以上の結果は図６に示す。【０１１８】（８）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を用いた新生仔網膜血管に於けるマウスＫＩＡＡ０６２０遺伝子発現の時間的・空間的同定
マウス胎仔網膜血管における於けるｍＫＩＡＡ０６２０遺伝子のｍＲＮＡレベルでの時間的・空間的発現を解析した。フォアワードプライマーの配列を５’−ＣＣＣＣＧＧＡＡＣＴＴＧＡＡＣＧＴＧＴＣ−３’（配列番号：３）、リバースプライマーの配列を５’−ＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＴＧＴＧＣＴＧ−３’（配列番号：４）とし、それらのプライマーを用いてマウスｍｐｆ００９２０遺伝子の転写産物をＰＣＲ法で増幅すると、アンチセンスあるいはセンスプローブとして働く各々約１，０６９塩基長（ｂｐ）のＤＮＡ断片が得られる設計にした。目的とするＰＣＲ産物、すなわちアンチセンスあるいはセンスプローブ用の約１，０６９（ｂｐ）ＤＮＡ断片をＰｒｏｍｅｇａ社が供給するＴ−ｖｅｃｔｏｒにクローン化した。Ｔ−ｖｅｃｔｏｒにクローン化した１，０６９（ｂｐ）ＤＮＡ断片を鋳型とし、ＲＮＡ合成酵素（Ｒｏｃｈｅ社、ＤＩＧ  ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ）を用いてＲｏｃｈｅ社が示す方法によりマウスｍｐｆ００９２０遺伝子発現産物を検出可能とするアンチセンスｃＲＮＡプローブ及び陰性コントロール用として使用するセンスｃＲＮＡプローブを作製し、新生仔ＩＣＲマウスより摘出した網膜におけるマウスＫＩＡＡ０６２０遺伝子の発現を網膜フラットマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により観察した。また、抗マウス４型コラーゲン抗体（ＬＳＬ社、ウサギポリクローナル抗体）を用いた免疫染色法を同一サンプルにて行い、網膜血管網の観察を同時に行ない血管に沿ってマウスＫＩＡＡ０６２０遺伝子発現が認められることを確認した。これらの実験結果から、新生仔マウス（生後２ないし４日）網膜における発達途上の血管では、特に新生血管先端部位の内皮細胞においてマウスＫＩＡＡ０６２０遺伝子発現が非常に強く認められた。これに対し、生後７日マウス網膜では、マウスＫＩＡＡ０６２０遺伝子発現は網膜周辺部における血管新生部位に認められるのみで、すでに血管が形成されている網膜中心部では、当該遺伝子の発現が著しく消退していることが認められた（図７）。【０１１９】（９）本発明遺伝子の機能推定
本発明のポリペプチド配列についてモチーフ検索を行った結果、Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ／ＣＤ１００  ａｎｔｉｇｅｎドメイン、３つのＰｌｅｘｉｎ／Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ／ｉｎｔｅｇｒｉｎドメイン、及び３つのＣｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＰＴ／ＴＩＧを有し、かつＣ−末端側に膜貫通（ＴＭ）セグメントが存在する構成である、全く新しいタイプの齧歯類由来新規Ｐｌｅｘｉｎポリペプチドといえる。【０１２０】  ＰｌｅｘｉｎファミリーにはＰｌｅｘｉｎ−Ａ（タイプＡ１、タイプＡ２、タイプＡ３、及びタイプＡ４）、Ｐｌｅｘｉｎ−Ｂ（タイプＢ１、タイプＢ２、及びタイプＢ３）、Ｐｌｅｘｉｎ−Ｃ１、Ｐｌｅｘｉｎ−Ｄ１と４つのサブファミリーに分類されること、ＰｌｅｘｉｎＡはセマフオリン１ａの機能的な受容体として、ＰｌｅｘｉｎＢ１は膜貫通セマフオリンＳｅｍａ４Ｄ（ＣＤ００）の受容体として、Ｐｌｅｘｉｎ−Ｃ１はＧＰＩがアンカーしたセマフオリンＳｅｍａ７Ａ（Ｓｅｍａ−Ｋ１）の受容体として働くことが報告されている（Ｔａｍａｇｎｏｎｅ  Ｌ，Ａｒｔｉｇｉａｎｉ  Ｓ，Ｃｈｅｎ  Ｈ，Ｈｅ  Ｚ，Ｍｉｎｇ  ＧＩ，Ｓｏｎｇ  Ｈ，Ｃｈｅｄｏｔａｌ  Ａ，Ｗｉｎｂｅｒｇ  ＭＬ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ＣＳ，Ｐｏｏ  Ｍ，Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ  Ｍ，Ｃｏｍｏｇｌｉｏ  ＰＭ．，２００１，Ｃｅｌｌ，９９：７１−８０）。更に、Ｐｌｅｘｉｎファミリーに属するＰｌｅｘｉｎ蛋白質は、分子量が大きな膜貫通型の蛋白質であり、膜外の特徴的なシステインに富むドメインを含有する。その受容体としては、セマフオリンあるいはニューロフィリンが知られている。セマフオリンは、神経系において神経軸索ガイダンスの反発として影響を与えること、また、血管や筋肉の発達、免疫反応、血管新生、腫瘍の成長や転移に影響を与えることが報告されている。特に、Ｐｌｅｘｉｎ−Ａは運動神経あるいはＣＮＳ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）の神経軸索ガイダンスを調節することが知られている。【０１２１】  本発明のポリペプチドはヒトＰｌｅｘｉｎ−Ｄ１に比較的高いホモロジーを有し、Ｐｌｅｘｉｎファミリーに共通して認められる膜外に位置するｓｅｍａドメイン、システインに富むＭＲＳモチーフ、及びＳＰドメインといわれるｐｌｅｘｉｎに特徴的な膜内ドメインが全て認められる。特にシステインに富むＭＲＳモチーフのコンセンサス配列はＣ−Ｘ（５−６）−Ｃ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ（６−８）−Ｃ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ（３−５）−Ｃで、本発明の配列には１つの完全なＭＲＳモチーフともう１つの不完全なＭＲＳモチーフが認められた。これらの特徴的構造を有するＰｌｅｘｉｎ蛋白質は、軸索ガイダンスに重要な役割を持ち、形態形成（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）や病気に起因する現象（癌の侵襲や転移）に関係するので重要である（Ｔａｍａｇｎｏｎｅ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃｅｌｌ，９９：７１−８０）。従って、本発明のポリペプチドも血管新生等に必要なガイダンスに重要な役割を持ち、脈官形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）、及びそれから一連の血管構築過程を経ることにより完成する血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）や病気に起因する現象（癌の侵襲や転移）と深く関わるので動物の個体維持にとって重要である。例えば、脳・神経系においてはＮｅｕｒｏｐｉｌｉｎと共同してＳｅｍａｐｈｏｒｉｎと結合することによって、あるいは血管形成においてはＮｅｕｒｏｐｉｌｉｎと共同してＶＥＧＦとと結合することによって文献１６，１７）、本発明の新規Ｐｌｅｘｉｎポリペプチドが神経や血管内皮の増殖・分化を新規なシグナル伝達系を介して調節する可能性が容易に考えられる。【０１２２】  また、ｍｐｆ００９２０遺伝子の成体に於ける組織特異的発現パターンから、本発明のポリペプチドは個体発生過程の血管形成を担う役割のみならず各種組織における細胞の重要な機能に係わっていると類推される。これらを総合すると、本発明の新規Ｐｌｅｘｉｎポリペプチドは、主に発生初期には血管発生、分化過程に関与するが、その他にも成体においては管空構造を有する組織、細胞つまり胃腺、子宮腺、尿細管と言った細胞の重要なプロセスを担う新規ポリペプチドであり、それら重要機能に関わる各種臓器における生体内の複合蛋白質の中心をなしているといえる。【０１２３】  更に、ｍｐｆ００９２０遺伝子由来の該遺伝子発現検出用プローブは、齧歯類等における個体発生時の血管内皮細胞（Ｆｌｋ−１陽性細胞：文献１，１０，１２，１４）を特異的に染色するので、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）におけるごく初期の時期（内皮細胞の増殖・分化の時期）から、出現する血管内皮細胞（Ｆｌｋ−１陽性細胞）を検出可能である。血管新生における次の段階（内皮細胞の形態形成及び動脈、静脈への分化の時期）では、構成する内皮細胞がＦｌｔ−１陽性（Ｆｌｔ−１陽性細胞：文献１，１０）となるがこの時期にも本発明の遺伝子は発現している。また、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドは細胞膜受容体構造を持つため、そのリガンドは新規血管誘導因子である可能性が予測され、該ポリペプチドあるいはそれに対応する抗体は、予測される血管誘導因子を探索するためのツールとして利用可能である。【０１２４】  これまでに、ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子に関連する齧歯類に由来するラット、マウスあるいはハムスター等、とりわけマウス由来Ｐｌｅｘｉｎ様ポリペプチドをコードする新規ＤＮＡの取得がなされた例がない。また、新規Ｐｌｅｘｉｎアミノ酸配列をコードする本発明の遺伝子配列は、ｍＲＮＡレベルでの発現頻度解析の結果、個体発生時の血管形成時期の初期から血管形成時期全般を通して血管特異的に発現し、成長後の成体では胃・重層扁平上皮に於いて強い発現、子宮に於いてやや強い発現が、また脳をはじめとした各種臓器に於いて発現していることが今回初めて見出され、本発明の遺伝子がコードする蛋白質が、血管形成時期の初期から血管形成時期全般を通して血管特異的に、また成体では多くの組織に於いて細胞の増殖・分化を制御する重要な働きに関わっている可能性が示された。【０１２５】  本発明の新規ポリペプチドをコードする遺伝子は、特に血管形成時期の初期から血管形成時期全般を通して血管特異的発現と、成長後の成体に於いては各種臓器で発現していることを特徴とし、本発明のポリペプチドは新規なポリペプチドであり、それら組織に於いて発育、機能保全、あるいは全身の臓器に関わる病態（例えば癌化・老���・機能不全）解明、それによる予防薬、治療薬、検査薬の開発に有用であることが明らかで、それが本発明の優れた点である。また、本発明の組換え蛋白質、あるいは組換え蛋白質を発現する組換え体を利用することにより、アゴニスト、アンタゴニストのスクリーニングあるいはドラッグデザイン研究に利用できる点が優れている。【０１２６】  更に、ｍｐｆ００９２０遺伝子は、齧歯類等における個体発生時の血管内皮細胞（Ｆｌｋ−１陽性細胞：文献１，２，３，１０，１２，１４）あるいは血管内皮細胞の前駆細胞から血管内皮細胞に分化する途中の細胞の新規な分子マーカーとして有用であること、また、該遺伝子がコードするポリペプチドは細胞膜受容体構造を持つため、そのリガンドは新規血管誘導因子である可能性が予測され、該ポリペプチドあるいはそれに対応する抗体は、予測される血管誘導因子を探索するためのツールとして有用である。【０１２７】  ヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子のヒトにおけるｍＲＮＡレベルの発現について知見はないが、同遺伝子とハイブリダイズするｍＲＮＡがマウス発生過程での血管内皮細胞あるいは中枢神経系（ＣＮＳ）でｍＲＮＡが発現していることが報告されたが（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｗａａｇ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２００２，２２５：３３６−３４３）、本発明のｍｐｆ００９２０遺伝子は、個体発生時の血管形成時期の初期から血管形成時期全般を通して血管特異的に発現し、成長後の成体では胃・重層扁平上皮に於いて強い発現、子宮に於いてやや強い発現が、また脳をはじめとした各種臓器に於いて発現していることから、特に血管新生において、また、脳をはじめとする各種臓器において、発育、機能保全、あるいは各種臓器における血管新生が関係する病態や老化、機能不全、あるいは先天奇形など分化異常を含めたヒト疾患の機序解明及び診断・治療薬、検査薬の開発に有用である。本発明の組換え蛋白質、あるいは組換え蛋白質を発現する組換え体を利用することにより、アゴニスト、アンタゴニストのスクリーニングあるいはドラッグデザイン研究に利用できる。【０１２８】  このように血管内皮の増殖・分化や老化に極めて重要なヒトＫＩＡＡ０６２０遺伝子に関連する齧歯類に由来するラット、マウスあるいはハムスター等、とりわけマウス由来Ｐｌｅｘｉｎ様ポリペプチドをコードする遺伝子は、それ自身も直接疾患原因遺伝子となりうる。本発明のＰｌｅｘｉｎ様ポリペプチドについては、以下の疾患原因となりうることが容易に推察される。【０１２９】  例えば、各種臓器における血管新生が関係する病態（例えば傷治癒、骨折治癒、血管閉塞と側副血行路形成等、また、血管新生過程が関与しそれが望ましくない癌増殖、慢性関節リュウマチ、糖尿病性網膜症、子宮内膜症、肥満、また、血管新生過程が望ましい心臓発作、神経変性疾患、足の血行障害、閉塞性動脈硬化症、尋常性乾癬等の疾患原因となりうる。【０１３０】  本発明の本発明のマウスｍＫＩＡＡ０６２０ポリペプチドのアミノ酸配列、それをコードする核酸配列、該アミノ酸配列に特異的に結合する抗体を応用することにより有用性を発揮できる医療分野は、血管新生と病態との関わりがある次のような分野である。すなわち、成長後に於いて正常な血管新生過程に関わる傷治癒、骨折治癒、血管閉塞と側副血行路形成、子宮粘膜での周期的血管網形成（一過性、黄体形成時）等に於ける血管増殖・分化調節因子あるいは薬剤の、また、血管新生過程が関与しそれが望ましくない癌増殖、慢性関節リュウマチ、糖尿病性網膜症、子宮内膜症、肥満、また、血管新生過程が望ましい心臓発作、神経変性疾患、足の血行障害、閉塞性動脈硬化症、尋常性乾癬といった各種病気に於ける、血管増殖・分化調節因あるいは薬剤の研究開発に関係する分野である（文献１，４，５，７，１１）。特に、癌増殖については癌組織での新生血管形成に関与していることが想定されるので、本発明により製造可能となるツールを使用することにより、エンドスタチン、アンジオスタチン（文献６，７）に代表される生体内でつくられる固形癌増殖を停止せしめる能力がある各種増殖阻害因子、あるいは受容体ブロッカー、細胞外結合部位に対するモノクローナル抗体等、特異的血管新生を阻害する増殖阻害因子、薬物が見出されば抗癌剤として使用が可能となる。また、再生治療において血管芽細胞の単離用蛋白あるいは抗体、また単離した血管芽細胞増殖（文献１，２，３，１４）に関連する増殖因子、増殖阻害因子の新規スクリーニング系に使用可能である。【０１３１】  ヒトＫＩＡＡ０６２０蛋白質、あるいはＰｌｅｘｉｎファミリーＤ１にホモロジーを有する、本発明のマウスｍＫＩＡＡ０６２０ポリペプチドのアミノ酸配列、それをコードする核酸配列、該アミノ酸配列に特異的に結合する抗体を使用することにより、目的とするマウス等齧歯類遺伝子あるいは遺伝子産物等を利用した、血管増殖分化制御因子、あるいは制御合成化合物のスクリ−ニング方法、及び測定キット、言い替えると組換え蛋白質を用いて相互作用検出系作製、アゴニスト・アンタゴニスト・生体内リガンド検索系作製を、また遺伝子導入細胞、動物遺伝子導入動物を作製することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ病態モデルを作製し、該遺伝子の発現を制御する化合物を組換え細胞、組換え動物で評価したりすることが可能となり、血管細胞増殖分化制御、癌増殖を支持する血管増殖阻害に関わる研究が遺伝子を変異させた病態モデル動物を作製することが可能となる。また、作製した組換え細胞、マウス等病態モデル動物変異動物を利用することにより、アゴニスト、アンタゴニストのスクリーニングあるいはドラッグデザイン研究に利用点が優れている。さらに、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列、それをコードする核酸配列、該アミノ酸配列に特異的に結合する抗体を使用することによりの血管細胞増殖分化制御、癌増殖を支持する血管増殖阻害機構の解明、それによる予防薬、治療薬、検査薬の開発に有用であることが明らかで、それが本発明の優れた点である。【０１３２】（１０）ＫＩＡＡ０６２０全長ポリペプチド及び膜外領域の組換え細胞による強制発現
段落番号００７９で記載したように、ＳＯＳＵＩという汎用ｔｒａｎｓｍｅｎｂｒａｎｅ（ＴＭ）ｓｅｇｍｅｎｔ検索用プログラムにより検索すると、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうちＮ−末端側から１，０９０−１，１１２番目（配列番号１５ではＮ−末端側から１，３４１−１，３６３番目）にＥＴＡＩＶＶＳＩＶＩＣＳＶＬＬＬＬＳＶＶＡＬＦで示される膜貫通（ＴＭ）セグメントが見出された。膜貫通（ＴＭ）セグメントの存在により、本発明のポリペプチドが膜蛋白質であることが推察されたが、実際に以下の実験の結果から膜蛋白質であることを確認した。【０１３３】  まず、マウスＫＩＡＡ０６２０全長−Ｖ５融合蛋白質の哺乳類細胞を宿主とする強制発現ベクターを構築した。即ち、段落番号１１１０で示した様に、Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒは（ＣＡＣＣａｔｇｇｇｃｔｇｔｇｇｇｃｇｔｇｇｔｃｔ，２４塩基長，配列番号：１６の６番目から２５番目の２０塩基長配列を含む２４塩基長配列：配列番号１２）をＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒはＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ２（ＧＧＣＣＴＣＧＣＴＧＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＡＧＡ，２３塩基長，配列２の５，２１８番目から５，２４０番目の２３塩基長配列に対する相補的配列，終始コドンを含まない、また、配列番号１５では５，９７１番目から５，９９３番目である２３塩基長の配列：配列番号１４）を使用して作製したエントリークローンを用い、ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ酵素ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｃａｔ．Ｎｏ．１１７９１−０１９）を用いた部位特異的組換え反応により発現用デステイネーションベクター（ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０  ｖｅｃｔｏｒ、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴ  ｖｅｃｔｏｒ：前者はＣＭＶプロモーター、後者はＥＦ−１αプロモーター制御下にて発現するプラスミドベクター）へ組換えることで、配列番号１に示される本発明のポリペプチドのＮ末端側に更に２５０個のアミノ酸（配列番号１１のＮ−末端側の１番目Ｇｌｕを除いた２番目から２５１番目までのアミノ酸数２５０の配列）が付加されたアミノ酸配列（配列番号１５におけるＮ−末端側の１番目Ｇｌｕを除いた２番目から１，９９７番目のアミノ酸数１，９９６の配列）をコードした、マウスＫＩＡＡ０６２０全長−Ｖ５融合蛋白質の哺乳類細胞を宿主とする強制発現ベクターを構築した。【０１３４】  次に、配列番号１５における第２番目〜１，３６３番目の１，３６２個のアミノ酸配列から成る膜外領域と膜貫通（ＴＭ）部分を含むポリペプチドをコードした、マウスＫＩＡＡ０６２０膜外領域（ＴＭ）−Ｖ５融合蛋白質の哺乳類細胞を宿主とする強制発現ベクターを、マウスＫＩＡＡ０６２０全長−Ｖ５融合蛋白質の哺乳類細胞を宿主とする強制発現ベクターと同様に、ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ酵素ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｃａｔ．Ｎｏ．１１７９１−０１９）を用いた部位特異的組換え反応により発現用デステイネーションベクター（ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０  ｖｅｃｔｏｒ、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴ  ｖｅｃｔｏｒ：前者はＣＭＶプロモーター、後者はＥＦ−１αプロモーター制御下にて発現するプラスミドベクター）へ組換えることで、構築した。【０１３５】  構築したマウスＫＩＡＡ０６２０��長−Ｖ５融合蛋白質発現プラスミドベクター及びマウスＫＩＡＡ０６２０膜外領域（ＴＭ）−Ｖ５融合蛋白質発現プラスミドベクター（どちらも目的遺伝子をクローニングしたＦｌｐ−Ｉｎ用発現ベクター、インビトロジェン社が供給するｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴ由来）をヒト胎児由来腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）に遺伝子導入し、ＫＩＡＡ０６２０全長ポリペプチドあるいは同膜外領域の遺伝子導入強制発現細胞を作製した。【０１３６】  すなわち、１０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地で満たした６ウエルプレートを使用し、水蒸気で飽和せしめた５％ＣＯ２を添加した空気を気相とし、３７℃で保温する炭酸ガスインキュベーターを使用して、ＨＥＫ２９３宿主細胞をサブコンフルエントとなるまで培養した。次に、マウスＫＩＡＡ０６２０全長−Ｖ５融合蛋白質発現プラスミドベクター又はマウスＫＩＡＡ０６２０膜外領域（ＴＭ）−Ｖ５融合蛋白質発現プラスミドベクター２μｇに対してトランスフェクション液（ロッシュ社が供給するＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ溶液）を３μＬ用いて、それぞれ２ウエルずつ形質転換の処理を行った。コントロールの２ウエルはプラスミドベクターなしのトランスフェクション液（ＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ溶液）で処理して培養を継続した。【０１３７】  形質転換の処理後、２日間培養した合計６ウエルから細胞を回収して、それぞれ２通りの方法を適用して蛋白質を調製した。まず、全蛋白質を調製するためにＳＤＳサンプルバッファーを用いて定法にて可溶化し、６つのウエルのうち３つのウエルにあたるそれぞれの細胞由来全蛋白質を得た。【０１３８】  次に、ＰＩＥＲＣＥ  ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ社が提供するＭｅｍ−ＰＥＲ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、同社が示す条件に従い全蛋白質を調製し、その全蛋白質を材料にして疎水性蛋白質画分を分離して抽出した。これにより、３つのウエルからそれぞれの細胞由来の全蛋白質、ＰＩＥＲＣＥ  ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ社の膜蛋白質画分キットによる全蛋白質及び膜蛋白質画分を得た。得られたマウスＫＩＡＡ０６２０全長−Ｖ５融合蛋白質発現ベクターで形質転換した組換え細胞由来、マウスＫＩＡＡ０６２０膜外領域（ＴＭ）−Ｖ５融合蛋白質発現ベクターで形質転換した組換え細胞由来、あるいはコントロール細胞由来である２通りの調製法により取得したそれぞれの蛋白質画分について、上記（７−２）と同様に、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法でサイズ分画し、Ｖ５タグを認識する抗Ｖ５モノクローナル抗体（インビトロジェン社；Ｖ５−ＨＲＰ，Ｒ９６１−２５又はＶ５，Ｒ９６０−２５）とＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いた化学発光法、あるいは、それらの抗体を用いた通常の発色法によるウエスタンブロット法を用いて目的とする組換え蛋白質の検出を行った。その結果、コントロール細胞では細胞由来全蛋白質画分、ＰＩＥＲＣＥ  ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ社の膜蛋白質画分キットによる全蛋白質及び膜蛋白質画分の全ての画分で目的とする組換え蛋白質は検出されなかった。一方、マウスＫＩＡＡ０６２０全長−Ｖ���融合蛋白質発現ベクターで形質転換した組換え細胞に於いては細胞由来全蛋白質画分に、また、マウスＫＩＡＡ０６２０膜外領域（ＴＭ）−Ｖ５融合蛋白質発現ベクターで形質転換した組換え細胞に於いても細胞由来全蛋白質画分に、それぞれ目的とする約２００ｋＤａ付近あるいは１４０ｋＤａ付近にバンドが検出された。ＰＩＥＲＣＥ  ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ社の膜蛋白質画分キットによる全蛋白質画分に於いては、マウスＫＩＡＡ０６２０全長−Ｖ５融合蛋白質発現ベクターで形質転換した組換え細胞では約２００ｋＤａ付近に、また、マウスＫＩＡＡ０６２０膜外領域（ＴＭ）−Ｖ５融合蛋白質発現ベクターで形質転換した組換え細胞では約１４０ｋＤａ付近に弱いがバンドが検出された。【０１３９】  そこで、ＰＩＥＲＣＥ  ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ社が提供するＭｅｍ−ＰＥＲ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて得られる全蛋白質画分とそれから更に分離調製した疎水性蛋白質画分の２種類の蛋白質画分について、上記と同様な方法により調製した各種細胞を材料とし、ウルトラフィルトレーション法による濃縮の工程を付加し調製して溶液中の蛋白濃度を高めた後に、上記と同様なウエスタンブロット法を用いた検出実験を行った。その結果、コントロール細胞では全蛋白質抽出画分とそれから更に分離調製した疎水性蛋白質画分の両方の画分で組換え蛋白質は検出されなかった。一方、マウスＫＩＡＡ０６２０全長−Ｖ５融合蛋白質発現ベクターで形質転換した組換え細胞では、全蛋白質画分に目的とする約２００ｋＤａ付近に明瞭なバンドが検出された。また、全蛋白質抽出画分から分離調製した疎水性蛋白質画分にも約２００ｋＤａ付近に弱いがバンドが検出された。マウス膜外領域と膜貫通（ＴＭ）部分を含むマウスＫＩＡＡ０６２０膜外領域（ＴＭ）−Ｖ５融合蛋白質発現ベクターで形質転換した組換え細胞では、全蛋白質画分に１４０ｋＤａ付近に明瞭なバンドが検出された。又、全蛋白質画分から調製した疎水性蛋白質画分では約１４０ｋＤａ付近に弱いがバンドが認められた。【０１４０】  マウスＫＩＡＡ０６２０全長−Ｖ５融合蛋白質が全蛋白質画分及び疎水性蛋白質画分に検出されたことにより、ＫＩＡＡ０６２０蛋白質は膜貫通（ＴＭ）セグメントが確かに機能し、膜蛋白質として膜に局在していることを確認した。また、上記で示した膜外領域と膜貫通（ＴＭ）部分を含むポリペプチドを組換え蛋白質として人工的に作製したものは膜貫通（ＴＭ）部分を含むため、期待通り、全蛋白質画分及び疎水性蛋白質画分の双方に存在している結果が得られた。ＰＩＥＲＣＥ  ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ社が提供するＭｅｍ−ＰＥＲ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔの疎水性蛋白質と親水性蛋白質の溶媒による分配条件では、本発明のポリペプチドは１ヶ所の膜貫通領域（ＴＭ）を含むにも拘わらず疎水性蛋白質画分に必ずしも多く分配される結果とはならなかった。しかしながら、以上の結果から、作製したマウスＫＩＡＡ０６２０全長−Ｖ５融合蛋白質発現ベクター及びマウスＫＩＡＡ０６２０膜外領域（ＴＭ）−Ｖ５融合蛋白質発現ベクターは哺乳類細胞を宿主とし���組換え蛋白質を産生すること、また、マウスＫＩＡＡ０６２０全長−Ｖ５融合蛋白質が確かに疎水性蛋白質画分に存在していることが示された。尚、以上の結果は図８に示す。【０１４１】  （１１）ＫＩＡＡ０６２０全長ポリペプチド及び膜外領域の組換え細胞による強制発現
上記（１０）と同様に、各エントリークローンをＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ酵素ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｃａｔ．Ｎｏ．１１７９１−０１９）を用いた部位特異的組換え反応により発現用デステイネーションベクター（ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０  ｖｅｃｔｏｒ、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴ：前者はＣＭＶプロモーター、後者はＥＦ−１αプロモーター制御下にて発現するプラスミドベクター）へ組換えて発現ベクターの構築を行い、マウスＫＩＡＡ０６２０全長ネイテイブ蛋白質、及びマウスＫＩＡＡ０６２０全長−Ｖ５、マウスＫＩＡＡ０６２０膜外領域−Ｖ５、マウスＫＩＡＡ０６２０全長−ＧＦＰ、マウスＫＩＡＡ０６２０膜外領域−ＧＦＰ、マウスＫＩＡＡ０６２０全長−ＤｓＲｅｄ、マウスＫＩＡＡ０６２０膜外領域−ＤｓＲｅｄ、マウスＫＩＡＡ０６２０全長−ヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片、マウスＫＩＡＡ０６２０膜外領域−ヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片融合蛋白質型の哺乳類細胞での強制発現ベクターを構築した。これらをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（Ｆｕｇｅｎｅ６；Ｒｏｃｈｅ社）を用いてヒト胎児由来腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）に遺伝子導入し、遺伝子導入細胞を作製し、それぞれの融合蛋白質の発現を以下のようにして確認した。【０１４２】  まず、マウスＫＩＡＡ０６２０全長又は膜外領域蛋白質のＶ５融合蛋白質型を発現する発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３組換え細胞あるいはその他の組換え細胞を出発材料としたメンブレンにおいて、上記（１０）と同様に、抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体を用いたウエスタンブロッティング法による検出実験を行い、抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体によりマウスＫＩＡＡ０６２０全長−Ｖ５融合蛋白質のサイズ（約２００ｋＤａ）又はＫＩＡＡ０６２０膜外領域−Ｖ５融合蛋白質のサイズ（約１４０ｋＤａ）に一致する位置に明瞭な単一バンドを検出することが出来た。検出されたバンドの分子量が、マウスＫＩＡＡ０６２０全長又は膜外領域−Ｖ５融合蛋白質の理論上の分子量と一致することから、マウスＫＩＡＡ０６２０完全長又は膜外領域蛋白質がＶ５融合蛋白質として発現していることが確認出来た。【０１４３】  同様にして、マウスＫＩＡＡ０６２０全長又は膜外領域蛋白質のＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ、及びヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片融合蛋白質型を発現する発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３組換え細胞あるいはその他の組換え細胞を出発材料としたメンブレンにおいて、抗ＧＦＰマウスモノクローナル抗体（ナカライテスク社、品番０４３６３−２４）、又は抗ＤｓＲｅｄウサギポリクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、品番６３２３９７）、抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃマウスモノクローナル抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ社、品番ＭＡＢ１３０２）を用いたウエスタンブロッティング法による検出実験を行い、それぞれの抗体によりそれぞれの融合蛋白質のサイズに一致する位置に明瞭な単一バンドを検出することが出来た。検出されたバンドの分子量が、それぞれの融合蛋白質の理論上の分子量と一致することから、マウスＫＩＡＡ全長０６２０蛋白質及びマウスＫＩＡＡ０６２０膜外領域蛋白質がそれぞれのタグの融合蛋白質として発現していることが確認出来た。【０１４４】（１２）遺伝��発現安定株の作成
構築したマウスＫＩＡＡ０６２０全長又は膜外領域−ＧＦＰ融合蛋白質発現プラスミドベクター（目的遺伝子をクローニングしたＦｌｐ−Ｉｎ用発現ベクター、インビトロジェン社が供給するｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴ由来）、及びマウスＫＩＡＡ０６２０全長又は膜外領域−ＤｓＲｅｄ融合蛋白質発現プラスミドベクター（目的遺伝子をクローニングしたＦｌｐ−Ｉｎ用発現ベクター、インビトロジェン社が供給するｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴ由来）をそれぞれインビトロジェン社が供給するＦｌｐ−ｉｎ発現システムを用いて、ヒト胎児由来腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）に遺伝子導入し、ＫＩＡＡ０６２０全長ポリペプチドあるいは同膜外領域の遺伝子導入強制発現安定株を作製した。【０１４５】  すなわち、１０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地で満たした６ウエルプレートを使用し、水蒸気で飽和せしめた５％ＣＯ２を添加した空気を気相とし、３７℃で保温する炭酸ガスインキュベーターを使用して、ＨＥＫ２９３宿主細胞（インビトロジェン社が供給するＦｌｐ−ｉｎ−２９３細胞：２９３ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｙ  ｃｅｌｌｓ由来で、転写されうるゲノムの位置にＦｌｐリコンビナーゼ標的部位（ＦＲＴ部位）が１ヶ所だけ存在する）をサブコンフルエントとなるまで培養した。【０１４６】  次に、マウスＫＩＡＡ０６２０全長又は膜外領域−ＧＦＰ融合蛋白質発現プラスミドベクター、又はマウスＫＩＡＡ０６２０全長又は膜外領域−ＤｓＲｅｄ融合蛋白質発現プラスミドベクターマウス２μｇに対してトランスフェクション液（ロッシュ社が供給するＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ溶液）を３μＬを用いてそれぞれ２ウエルずつ形質転換の処理を行った。コントロールの２ウエルはプラスミドベクターなしのトランスフェクション液（ＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ溶液）で処理して培養を継続した。【０１４７】  形質転換の処理後、２日間培養とそれに続くハイグロマイシンＢ（２００／ｍｉｃｒｏ  ｇ／ｍｌ）選択培地を用いた約１０日間の選択圧をかけた培養が終了した後に、各々のウエルで増殖したそれぞれの形質転換細胞を、融合している蛍光タンパク（ＧＦＰ又はＤｓＲｅｄ）の発色があるものについて、ＦＡＣＳでソーティングを行い、導入した遺伝子を安定に発現する細胞だけを集めた安定株を作製した。【０１４８】（１３）マウスＫＩＡＡ０６２０蛋白質の膜外部分−ＩｇＧ１Ｆｃ融合蛋白質を用いた新生仔マウス網膜血管発生における本発明のポリペプチド機能解析
配列番号：１８に示される１，３３７個のアミノ酸配列（配列番号：１５に示されるアミノ酸配列の第２番目から第１，３３８番目と同一）からなる膜外領域ポリペプチドとヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片領域と遺伝子組換え法を用いて融合し、さらにこの遺伝子産物をＣＡＧプロモーター制御下にて発現するプラスミドベクターを作製した。これをＭｉｒｕｓ社ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓを用いて２９３Ｔ細胞に遺伝子導入し、無血清培地（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社Ｇｉｂｃｏ  ＣＤ２９３）にて３日間培養した後、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ＨｉＴｒａｐ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ）を用いて培養上清からマウスＫＩＡＡ０６２０膜外部分−ＩｇＧ１Ｆｃ融合蛋白質を精製した。【０１４９】このようにして得られた融合蛋白質溶液（リン酸緩衝液中２．３ｍｇ／ｍｌ）を、ガラス毛細管を装着したマイクロインジェクター（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ社、ＮＡＮＯＪＥＣＴ  ＩＩ，Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，Ｂｒｏｏｍａｌｌ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて新生仔ＩＣＲマウス（生後１、３、ないし５日）眼球内に５００ｎｌ注入した。また、同濃度のヒトＩｇＧ１Ｆｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ）を同様の方法により眼球内に注入したサンプルをコントロールとして用いた。各眼球サンプルは抗マウスＰＥＣＡＭ−１モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、Ｍｅｃ１３．３）を用いた網膜フラットマウント蛍光免疫染色法により、網膜血管の変化を観察した。観察にはＡｘｉｏｐｌａｎ２蛍光顕微鏡およびＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎ３．０ソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、また共焦点顕微鏡システムによる画像観察にはＡｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍレーザー顕微鏡およびＬＳＭ５１０−Ｖ３．２ソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。【０１５０】その結果、眼球注射５時間後には、発達途上の網膜血管、特に血管新生先端部の内皮細胞において過剰な糸状足形成が認められ（図９）、さらにその２日後および３日後（図１０）には、網膜血管網の正常な構築が著しく障害されていることを見いだした。これに対し、陰性コントロールとなるＩｇＧ１Ｆｃ蛋白質単独の眼内注射では全く変化がみられなかった（図９、図１０）。
【産業上の利用可能性】
【０１５１】  これまでに記載したことから、本発明のＤＮＡ、本発明のポリペプチドあるいは本発明の抗体は、血管新生において、あるいは脳をはじめとする各種臓器において、発育、機能保全、あるいは各種臓器における血管新生が関係する疾患や老化、機能不全、あるいは先天奇形など分化異常を含めたヒト疾患の機序解明及び診断・治療上、また、各種臓器の機能保全や老化の防止に必要不可欠な役割を果たすと考えられる。また、ｍＲＮＡレベルでの発現頻度解析のよる各組織及び発生段階での発現のパターン情報は、各種臓器に普遍的に発現していること、及び各発生過程に於いて普遍的に発現していることを明らかとし、本発明の遺伝子が各種臓器の発生・分化やその機能保全また老化において重要性であること明らかにした。【０１５２】  従って、本発明のＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む齧歯類由来遺伝子、それらがコードするポリペプチドの一部又は全長、該ポリペプチドの一部又は全長に対する抗体、アンチセンスＤＮＡ等は、癌や先天奇形を含めたヒト疾患を治療する為のモデル動物であるマウスを用いた各種治療・予防方法開発において、医薬や検査薬として使用することが可能である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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