(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−ピラノシルウロン酸）−４，６−ビス−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトース単位の含量が２０モル％〜１００モル％であり、下記の特性を有し、軟体動物から得られたガラクトサミノグリカンまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含むアレルギー性疾患処置剤。
（Ａ）構成二糖における硫酸基数が０．９〜１．８である。
（Ｂ）コンドロイチナーゼＡＢＣでの消化率が６０％〜１００％である。
【請求項２】
ガラクトサミノグリカンがさらに下記の特性を有する請求項１記載のアレルギー性疾患処置剤。
（Ｃ）コンドロイチナーゼＡＢＣで消化し、高速液体クロマトグラフィーで分析して算出される構成不飽和二糖組成において、ΔＤｉ−ｄｉＳＥで示される２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−４，６−ビス−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトースが５０モル％〜７０モル％、かつΔＤｉ−ｄｉＳＥと、ΔＤｉ−４Ｓで示される２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−４−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトースと、ΔＤｉ−６Ｓで示される２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトースとの合計が８０モル％〜１００モル％である。
【請求項３】
ガラクトサミノグリカンが、コンドロイチナーゼＡＢＣで消化し、高速液体クロマトグラフィーで分析して算出される構成不飽和二糖組成において、ΔＤｉ−ｄｉＳＥで示される２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−４，６−ビス−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトースが５５モル％〜６５モル％であるガラクトサミノグリカンであることを特徴とする請求項１または２に記載のアレルギー性疾患処置剤。
【請求項４】
ガラクトサミノグリカンが、コンドロイチナーゼABCでの消化率が80％〜100％であるガラクトサミノグリカンであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに1項に記載のアレルギー性疾患処置剤。
【請求項５】
ガラクトサミノグリカンが、平均分子量１０００〜１０００００ダルトンのガラクトサミノグリカンであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のアレルギー性疾患処置剤。
【請求項６】
ガラクトサミノグリカンが、軟体動物から得られたガラクトサミノグリカンと同一の理化学的性質を有するガラクトサミノグリカンであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載のアレルギー性疾患処置剤。
【請求項７】
ガラクトサミノグリカンが、イカ軟骨から得られたガラクトサミノグリカンであることを特徴とする請求項６に記載のアレルギー性疾患処置剤。
【請求項８】
ガラクトサミノグリカンが、イカ軟骨から得られるガラクトサミノグリカンを低分子化して得られたガラクトサミノグリカンであることを特徴とする請求項６または７に記載のアレルギー性疾患処置剤。
【請求項９】
アレルギー性疾患が、I型アレルギー反応またはIV型アレルギー反応に起因する疾患である請求項１から８のいずれか１項に記載のアレルギー性疾患処置剤。
【請求項１０】
アレルギー性疾患が、アレルギー性皮膚炎である請求項９に記載のアレルギー性疾患処置剤。
【請求項１１】
アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎またはアレルギー性接触性皮膚炎である請求項１０に記載のアレルギー性疾患処置剤。
【請求項１２】
局所投与剤である請求項１〜１１のいずれか1項に記載のアレルギー性疾患処置剤。
【請求項１３】
外用剤である請求項１２に記載のアレルギー性疾患処置剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は特定の性質をもつガラクトサミノグリカンまたはその塩を有効成分とするアレルギー性疾患処置剤、好ましくはI型アレルギー反応またはIV型アレルギー反応に起因する疾患、特にアレルギー性皮膚炎（アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎等）の予防または治療に用いられるアレルギー性疾患処置剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年アレルギー性疾患が増加し、医療分野で大きな問題となっている。この種の疾患としては、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性接触性皮膚炎、花粉症、アレルギー性鼻炎、気管支炎、気管支喘息、食事性アレルギーに伴う消化管異常、アレルギー性結膜炎、アレルギー性角膜炎、金属アレルギー、多発性硬化症など広範囲な疾患が含まれる。これらの疾患に対してはステロイド剤、非ステロイド系抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、免疫抑制剤をはじめ様々な薬剤が治療に用いられているが、これら薬剤の副作用が問題となっている。
【０００３】
これらアレルギー性疾患のうち、アトピー性皮膚炎は、近年急速に患者数が増加しており、時には患部からの出血、患部の紅斑、創傷、痒みを伴う慢性的な皮膚病変を引き起こす。その病態については不明な点も多く残されているが、アレルギー性炎症を主体とする免疫学的機能に加え、皮膚バリア機能障害がその発症に関与していると考えられる。これらの原因に着目して様々な治療が模索されてきた。例えば、免疫異常があることから、主として皮膚炎症の沈静化を目的としたステロイド外用剤、あるいは免疫抑制剤の投与が行われている。しかし、副腎皮質ステロイドには副腎皮質機能の抑制作用、易感染性の惹起、あるいは消化性潰瘍、高血圧、骨粗鬆症の発症や、特に外用剤として顔面に長期にわたって用いた場合に酒さ様皮膚炎を発症する等の様々なきわめて重篤な副作用がある。また、免疫抑制剤も骨髄抑制、胃腸障害、肝障害、間質性肺炎、腎障害、出血性膀胱炎の発症等のきわめて重篤な副作用を有する。
【０００４】
さらに、痒みを抑えるために数多くのヒスタミン拮抗薬や肥満細胞からの化学伝達物質遊離抑制薬のいわゆる抗アレルギー薬が使用されてきた。しかしこれらの薬剤には倦怠感、眠気感等の副作用があり、一部のものには母乳移行性があるため妊婦への使用は禁忌となっている。
また、アトピー性皮膚炎においては角質層が破壊され、皮膚中における水分が健常人に比べ著しく低下している。そのため外来アレルゲンとの皮膚を介した接触機会が増え、病状の安定化を阻害している。
【０００５】
その他、外用剤としては、水分を保つためにこれまでワセリンを中心とした保湿成分含有の軟膏が広く処方されているが、破壊された角質層に塗布するには伸展性がよくなく、また油性感も強いために塗布感はあまりよいものではない。なおかつ保湿作用を維持するためには頻繁に塗布する必要があり、冬季などの乾燥期における患者のＱＯＬ（quality of life）は高いものとは言えない。
【０００６】
一方、コンドロイチン硫酸等を含む医薬品または化粧品、特に外用または局所投与用組成物あるいはその使用方法としては、硫酸化多糖（ムコ多糖の硫酸化物等）もしくはその塩を含有する油中水型乳化組成物（特許文献１）、硫酸化多糖類（ムコ多糖の硫酸化物等）及び／又はその塩並びに乳化安定剤を含有する水中油型乳剤性ローション剤（特許文献２）、多硫酸化ムコ多糖類（多硫酸化コンドロイチン硫酸等）を有効成分とするアレルギー性疾患の予防または治療薬（特許文献３）、多硫酸化ムコ多糖類（多硫酸化コンドロイチン硫酸等）を有効成分とするセレクチン依存性細胞接着阻害剤（特許文献４）、グリコサミノグリカンと少なくとも一つの血中への経皮吸収剤を用いた、アレルギー性疾患、自己免疫疾患、接着や転移によって起こる疾患に対する予防又は治療法（特許文献５）などが知られており、またコンドロイチン硫酸EがP-及びL-セレクチンに結合することにより、白血球の細胞浸潤を抑制すること（非特許文献１）が知られているが、本願発明のアレルギー性疾患処置剤に含まれるような特定の性質を持つガラクトサミノグリカンが、アレルギー性疾患、特にアトピー性皮膚炎の予防又は治療に有効であることは知られていなかった。
【０００７】
【特許文献１】特開平7-118306
【特許文献２】特開平11-180821
【特許文献３】特開平11-335288
【特許文献４】特開2001-335490
【特許文献５】WO02/09728
【非特許文献１】Miyasaka et al., J. Biol. Chem. 277 (15) 12921-12930, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、抗アレルギー作用を有した、安全かつ実用的なアレルギー性疾患処置剤、特に外部からの刺激に対して敏感な患者に対しても適用できる、刺激の少ない、使用感のよいアレルギー性疾患処置剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、アトピー性皮膚炎の動物モデルであるNC/Ngaマウス（Matsuda H. et al, Development of atopic dermatitis-like skin lesion with IgE hyperproduction in NC/Nga mice., International Immunology. Vol. 9, No. 3, pp.101-106）を用いてガラクトサミノグリカンあるいはその薬理学的に許容される塩の薬理作用を試験した結果、特定の性質を持つガラクトサミノグリカンあるいはその薬理学的に許容される塩が、同動物モデルの皮膚炎における出血、紅斑、創傷等の皮膚損傷を回復させる効果を有し、しかも刺激性が少なく安全性に優れていることを見いだした。
【００１０】
従って本発明は、特定の性質を有するガラクトサミノグリカンあるいはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するアレルギー性疾患処置剤（以下、本発明処置剤ともいう。）を提供する。なお、本発明にいう「アレルギー性疾患処置剤」とは、アレルギー性疾患の予防及び／または治療に使用することができる薬剤を意味する。
【００１１】
本発明のアレルギー性疾患処置剤の有効成分であるガラクトサミノグリカンは、２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−ピラノシルウロン酸）−４，６−ビス−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトース単位の含量が20モル％〜100モル％であるガラクトサミノグリカンまたはその薬理学的に許容される塩である。
【００１２】
本発明のアレルギー性疾患処置剤の有効成分であるガラクトサミノグリカンは、好ましくは下記特性を有する。
(A) 構成二糖における硫酸基数が0.5〜2.0である。
(B) コンドロイチナーゼABCでの消化率が60%〜100%である。
(C) コンドロイチナーゼABCで消化し、高速液体クロマトグラフィーで分析して算出される構成不飽和二糖組成において、ΔDi-diSEで示される２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−４，６−ビス−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトースが20モル％〜100モル％、かつΔDi-diSEと、ΔDi-4Sで示される２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−４−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクト−スと、ΔDi-6Sで示される２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトースとの合計が80モル％〜100モル％である。
【００１３】
本発明のアレルギー性疾患処置剤の有効成分である上記ガラクトサミノグリカンは、さらに好ましくは下記特性の１以上を有する。
【００１４】
ガラクトサミノグリカンが、コンドロイチナーゼABCで消化し、高速液体クロマトグラフィーで分析して算出される構成不飽和二糖組成において、ΔDi-diSEで示される２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−４，６−ビス−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトースが50モル％〜70モル％である。
ガラクトサミノグリカンのコンドロイチナーゼABCでの消化率が80％〜100％である。
ガラクトサミノグリカンの平均分子量が１０００〜１０００００ダルトンである。
【００１５】
ガラクトサミノグリカンが、軟体動物から得られたガラクトサミノグリカンであるか、該ガラクトサミノグリカンと同一の理化学的性質を有するガラクトサミノグリカンである。
ガラクトサミノグリカンが、イカ軟骨から得られるガラクトサミノグリカンである。
【００１６】
ガラクトサミノグリカンが、イカ軟骨から得られるガラクトサミノグリカンを低分子化して得られたガラクトサミノグリカンである。
【００１７】
本発明のアレルギー性疾患処置剤は、好ましくはI型アレルギー反応またはIV型アレルギー反応に起因する疾患、より好ましくはアレルギー性皮膚炎、特にアトピー性皮膚炎またはアレルギー性接触性皮膚炎の予防及び／または治療に使用することができる。
本発明のアレルギー性疾患処置剤は、局所投与剤の形態にあることが好ましく、外用剤の形態にあることが特に好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のアレルギー性疾患処置剤によれば、I型またはIV型アレルギー反応に起因する疾患、特にアレルギー性皮膚炎（アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、蕁麻疹、湿疹）、花粉症、アレルギー性鼻炎、気管支炎、気管支喘息、食事性アレルギーに伴う消化管異常、アレルギー性結膜炎、アレルギー性角膜炎、金属アレルギー、多発性硬化症などのアレルギー反応に起因する疾患の処置剤が提供できる。
【００１９】
特に、アトピー性皮膚炎による出血、紅斑、創傷等の皮膚損傷を回復させる効果がある。また、刺激に対して敏感な患者に対しても適用できる安全性に優れた使用感の良い外用剤が提供でき、しかも有意な副作用を示すことがない。また、他のアトピー性皮膚炎治療薬、例えば副腎皮質ステロイドホルモン、免疫抑制剤等と併用することにより、これらの重篤な副作用を示す薬剤の使用量を低減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
一般的に「ガラクトサミノグリカン」とは、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸あるいはＬ−イズロン酸からなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とし、構成糖であるＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンの４位もしくは６位または４位および６位、または／及びＬ−イズロン酸もしくはＤ−グルクロン酸の２位に硫酸基を有するグリコサミノグリカンの総称で、デルマタン硫酸及びコンドロイチン硫酸を意味する(Annu. Rev. Biochem., 60, 443-457, 1991)。
【００２１】
ガラクトサミノグリカンを酵素（リアーゼ(lyase)）で分解すると下記一般式Iで示される不飽和二糖が生成する。これらの不飽和二糖の組成を分析すれば、上記のガラクトサミノミノグリカンの構成二糖単位における硫酸基の数及び結合位置を解析することができる。
【００２２】
より詳細には、ガラクトサミノグリカンに作用して不飽和二糖を生成させるリアーゼでガラクトサミノグリカンを酵素処理し、該ガラクトサミノグリカンの構成二糖の種類及び量を反映して生成する不飽和二糖を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、同定及び定量することができる。
不飽和二糖分析で用いるリアーゼは、最終的に不飽和二糖にまで分解することができる限り特に限定されず、分析するガラクトサミノグリカンに応じて当業者が適宜選択することができ、例えばコンドロイチナーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、ヒアルロニダーゼ等を使用することができる。
【００２３】
上記のＨＰＬＣによる分析方法は、当業者には公知の方法であり、ガラクトサミノグリカンを酵素処理して得た不飽和二糖の溶出位置を、標準不飽和二糖の溶出位置と比較することにより不飽和二糖を同定、定量することができる。ＨＰＬＣでの溶出位置は、通常紫外部（例えば波長２３２nm）の吸収によりモニターし、各二糖単位のガラクトサミノグリカン中での含量は、その溶出パターンの積分値（面積）を濃度既知の標準不飽和二糖の溶出パターンの積分値（面積）と比較することにより求めることができる。
【００２４】
近接する溶出位置をもつ下記ΔＤｉ−４Ｓ及びΔＤｉ−６Ｓの区別、並びに、ΔＤｉ−ｄｉＳB及びΔＤｉ−ｄｉＳEの厳密な区別は、特異的なスルファターゼ（例えばコンドロ−６−スルファターゼ等）による消化により行うことができる。
【００２５】
すなわち、例えば不飽和二糖をコンドロ−６−スルファターゼにより処理した結果、ＨＰＬＣの溶出位置がΔＤｉ−４Ｓの位置にシフトした分がΔＤｉ−ｄｉＳEであると同定される。また、溶出位置が近接する不飽和二糖同士の分離が可能なカラム（例えば、ゾルバックスSAX(Zorbax SAX)カラム；Rockland Technologies 社製等）を用いて、これら不飽和二糖を厳密に区別することが可能である。なお、Ｄ−グルクロン酸残基の１位とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基の４,６−二硫酸化物の３位とがグリコシド結合した構造、及びＬ−イズロン酸残基の１位とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基の４,６−二硫酸化物の３位とがグリコシド結合した構造は、二糖分析においてはいずれもΔＤｉ−ｄｉＳEとして検出される。
【００２６】
このような不飽和二糖における硫酸基の数及び結合位置による異性体を、それらを示す略号とともに下記表１にまとめる。
【００２７】
【化１】
0004786911.tif 000002
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は水素原子またはＳＯ3−を示し、Ａｃはアセチル基を示す。
【００２８】
【表１】
0004786911.tif 000003
【００２９】
また、上記各異性体の化学名は以下の通りである。
ΔDi-0S：２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−Ｄ−ガラクト−ス
ΔDi-4S：２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−４−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクト−ス
ΔDi-6S：２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトース
ΔDi-diSD：２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトース
ΔDi-diSE：２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−４，６−ビス−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトース
ΔDi-diSB：２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−４−Ｏ−スルホ−Ｄ−グリコース
ΔDi-triS：２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−４，６−ビス−Ｏ−スルホ−Ｄ−グリコース
【００３０】
本発明において、ガラクトサミノグリカンの「構成不飽和二糖組成」とは、上記のようにしてガラクトサミノグリカンをリアーゼにより分解して生成した各不飽和二糖について求められた生成不飽和二糖全体に対する比率を意味し、モル％で表す。
【００３１】
本発明のアレルギー性疾患処置剤に有効成分として含まれる特定の性質を有するガラクトサミノグリカンは、２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−ピラノシルウロン酸）−４，６−ビス−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトース単位の含量が20モル％〜100モル％であるガラクトサミノグリカン（以下「本発明ガラクトサミノグリカン」と記載する）であり、より好ましくは、構成不飽和二糖組成において、ΔDi-diSEが20モル％〜100モル％、特に好ましくは約50モル％〜約70モル％であり、かつΔDi-4S、ΔDi-6S及びΔDi-diSEの合計が約80モル％〜100モル％、特に好ましくは約80モル％〜約95モル％であるガラクトサミノグリカンであり、具体的にはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンの４位および６位に硫酸基をもち、Ｄ−グルクロン酸の２位に硫酸基をもたない、下記に示される二糖の繰り返し構造を基本骨格とするガラクトサミノグリカンである。
【００３２】
【化２】
0004786911.tif 000004
【００３３】
本発明ガラクトサミノグリカンは、前記の性質を有する限り特に限定されるものではないが、通常、軟体動物、例えばイカ軟骨等を原料とし、破砕、煮沸、抽出、酵素分解、有機溶媒沈殿、塩析、塩溶、各種クロマトグラフィー等、ガラクトサミノグリカンまたはグリコサミノグリカンの分離、精製に通常用いられる方法を適宜組み合わせて分離、精製して製造することができる。好ましくは、例えばイカ軟骨をプロテアーゼで加水分解してタンパク質を分解し、加水分解液を濾過後、濾液を塩化ナトリウム存在下でエタノール等のアルコールを用いてガラクトサミノグリカン画分を沈殿させて得ることができる。必要に応じて、複数回のプロテアーゼ処理や水酸化ナトリウム水溶液処理、アルコール沈殿、濾過、脱塩することにより抽出液中のタンパク質及びペプチド含量を低下させる。
【００３４】
このように軟体動物から抽出、精製されるガラクトサミノグリカンの平均分子量は１万〜１０万ダルトン程度である。また本発明ガラクトサミノグリカンが得られる限り、上記イカの種類も特に限定されるものではないが、例えばマイカ、アカイカ、スルメイカ、ヤリイカ等が挙げられる。
尚、本発明ガラクトサミノグリカンの分離方法は、上記方法に限定されることはなく、特公昭６０−９０４２号、特公昭６１−２１２４１号、特開平９−２０２７３１号等に記載された公知の方法に準じて抽出、精製して得ることもできる。
【００３５】
また、本発明ガラクトサミノグリカンは上記のように軟体動物からの抽出または精製と多糖類の低分子化の常法に準じた方法による低分子化法を組み合わせて得られた低分子化されたガラクトサミノグリカンであってもよい。このような低分子化法としては、酸またはアルカリを用いる公知の化学的加水分解法、微生物、哺乳動物等に由来するガラクトサミノグリカン分解酵素（コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼAC、ヒアルロニダーゼ等）を用いる酵素分解法が挙げられる。酵素分解法が好ましく、特にコンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼAC等の微生物由来のリアーゼまたは動物由来睾丸ヒアルロニダーゼ（加水分解酵素）を使用する方法が好ましい。なお、リアーゼを用いると非還元末端が不飽和糖となる。このように低分子化されたガラクトサミノグリカンの分子量は、通常約1,000〜30,000ダルトンである。
【００３６】
本発明ガラクトサミノグリカンの塩は、薬理学的に許容される塩であればその種類は特に限定されるものではないが、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩等が好ましく、ナトリウム塩が特に好ましい（以下、特に断らない限り、用語「ガラクトサミノグリカン」は、その薬理学的に許容される塩も含めた意味で使用する）。
本発明ガラクトサミノグリカンの重量平均分子量は、特に限定されないが、通常は約1,000〜約100,000ダルトン（Da）、好ましくは約3,000〜約90,000Da、より好ましくは約5,000〜70,000Da、さらに好ましくは約5,000〜約26,000Daである。
【００３７】
また、本発明ガラクトサミノグリカンにコンドロイチナーゼABCを作用させたときの消化率は、通常は約60重量％〜約100重量％、好ましくは約80重量％〜100重量％である。ここでコンドロイチナーゼABCを作用させたときの消化率とは、コンドロイチナーゼABC消化パターンの分析により得られる値であり、コンドロイチナーゼABC消化により生成された不飽和二糖の消化前のガラクトサミノグリカンに対する百分率（重量％）を意味する。
【００３８】
また、本発明ガラクトサミノグリカンの構成二糖あたりの硫酸基数は、通常は約0.5〜2.0の範囲であり、好ましくは約0.9〜1.8の範囲である。尚、平均硫酸基数は構成二糖全体についての平均により表す。
本発明ガラクトサミノグリカンのΔDi-4S、ΔDi-6S及びΔDi-diSEの合計は、通常は約80モル％〜約100モル％であり、好ましくは約80モル％〜約95モル％である。
【００３９】
また、本発明のガラクトサミノグリカンの構成不飽和二糖の組成比において、ΔDi-diSEは通常約20モル％〜約100モル％、好ましくは約50モル％〜約70モル％、より好ましくは約55モル％〜約65モル％である。ΔDi-6Sは通常約1モル％〜約25モル％、好ましくは約5モル％〜約20モル％であり、ΔDi-4Sは通常約5モル％〜約30モル％、好ましくは約10モル％〜約25モル％である。
本発明のアレルギー性疾患処置剤の適用対象はアレルギー性疾患であれは特に限定されないが、特にI型またはIV型アレルギー反応に起因する疾患の予防及び／または治療に使用することができる。
【００４０】
本発明にいうI型アレルギー反応とは、当分野においてこの用語により理解される意味を有し、典型的には抗原に特異的なIgEの産生の誘導が起こり、この誘導されたIgEに活性化された肥満細胞や好中球からヒスタミン、好酸球遊走因子（ECF-A）、ロイコトリエン、血小板活性化因子（PAF）、トロンボキサンなどの各種のメディエーターが産生され、遊離され、このメディエーターによってアレルギー性炎症が惹起される生体反応を意味する（日経バイオ最新用語辞典  第５版、第４２〜４４ページ、２００２年９月１７日、日経BP社発行）。
【００４１】
I型アレルギー反応に起因する疾患の例としては、アレルギー性皮膚炎（アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、湿疹等）、花粉症、アレルギー性鼻炎、気管支炎、気管支喘息、食事性アレルギーに伴う消化管異常、アレルギー性結膜炎、アレルギー性角膜炎などが挙げられ、アレルギー性皮膚炎、特にアトピー性皮膚炎が本発明のアレルギー性疾患処置剤の使用対象疾患として好ましい。
【００４２】
一方、IV型アレルギーは、遅延型アレルギーともよばれ、抗体によらない反応である。抗原とリンパ球（T細胞）の反応により、ケミカル・メディエーターのリンホカインが放出され、その結果、貪食細胞や白血球が集合し、また血管透過性が高まるなどして炎症反応が起きる。（日経バイオ最新用語辞典  第５版、第４２〜４４ページ、２００２年９月１７日、日経BP社発行） 
【００４３】
IV型アレルギー反応に起因する疾患の例としては、アレルギー性皮膚炎（アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、蕁麻疹等）、金属アレルギー、多発性硬化症などが挙げられ、特にアトピー性皮膚炎及びアレルギー性接触性皮膚炎が本発明のアレルギー性疾患処置剤の使用対象疾患として好ましい。
【００４４】
本発明処置剤の投与方法は、本発明処置剤によるアレルギー性疾患に対する作用が発揮される限りにおいて特に限定されないが、例えば注射（静脈内、皮下、皮内等）、経鼻、経口、経皮、吸入等の経口的および非経口的投与経路が挙げられる。その投与方法は、注射による特定部位への直接投与や、点滴による投与など、適用される疾患や部位等によって適宜選択される。
【００４５】
このような投与経路や投与方法に応じて、本発明ガラクトサミノグリカン又はその薬学的に許容される塩を適宜製剤化して、本発明処置剤とすることができる。剤型としては、注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、坐剤などの非経口剤、錠剤、カプセル剤、液剤、顆粒剤、散剤、リポ化剤、吸入散剤等の経口剤、局所投与剤、特に軟膏剤、硬膏剤、貼付剤、液剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、エアゾール剤、スプレー剤（噴霧剤）、パスタ剤、ゲル剤、外用散剤、点眼剤等の外用剤が挙げられる。
【００４６】
本発明のアレルギー性疾患処置剤の製剤化には公知の方法を用いることができる。また製剤化にあたり、本発明ガラクトサミノグリカン又はその薬学的に許容される塩に悪影響を与えず、かつ本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分（ステロイド剤、抗ヒスタミン剤、免疫抑制剤、抗菌剤、抗生物質、抗炎症剤等の薬剤）や、医薬として許容される通常の安定剤、乳化剤、溶解剤、増粘剤、界面活性剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調節剤等の補助剤を適宜配合することができる。
【００４７】
例えば、本発明のアレルギー性疾患処置剤を、外用剤としてアレルギー性皮膚炎、特にアトピー性皮膚炎の治療に用いる場合は、通常は本発明ガラクトサミノグリカンを適当な基剤に混合、溶解、分散等して外用剤を形成し、該外用剤を塗布、貼付、噴霧等により損傷のある皮膚や粘膜に経皮的に投与する。該外用剤の剤型は特に限定されないが、上記のように軟膏剤、硬膏剤、貼付剤、液剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、エアゾール剤、スプレー剤（噴霧剤）、パスタ剤、ゲル剤、外用散剤等が挙げられる。
【００４８】
外用剤の基剤としては外用剤に通常使用される基剤を用いることができるが、パラベン、ラノリンなどの刺激性のある表示指定成分を含まないものを使用すれば、本発明ガラクトサミノグリカン自体は刺激性がないので、刺激に対して敏感な患者にも本発明のアレルギー性疾患処置剤を適用でき、好ましい。
【００４９】
通常使用される基剤としては、ポリエチレングリコール、カルボキシビニルポリマー、ミツロウ、白色ワセリン、プラスチベース、高級脂肪酸または高級アルコール、親水軟膏、バニシングクリーム、親水ワセリン、オイセリン、ネオセリン、吸水軟膏、親水プラスチベース、流動パラフィン、アイソパー、シリコン油、脂肪酸エステル、植物油、スクワラン、多価アルコール脂肪酸エステル、多塩基エステル、アルキルグリセリルエーテル、大豆レシチン、ステアリン酸等が挙げられる。
【００５０】
外用剤の場合、本発明のガラクトサミノグリカンは、本発明のアレルギー性疾患処置剤の重量に対して約0.1〜3.0重量％、好ましくは約0.3〜1.5重量％の濃度となるように基剤に配合される。
【００５１】
また、本発明のアレルギー性疾患処置剤を外用剤として用いる場合は、さらにヒアルロン酸ナトリウムを添加してもよい。用いられるヒアルロン酸ナトリウムの重量平均分子量は特に限定されないが、１０００〜６００万ダルトンであるものが好ましく、３０万〜３００万ダルトンであるものがより好ましく、６０万〜８０万ダルトンであるものがさらに好ましい。ヒアルロン酸ナトリウムの配合量は、本発明のアレルギー性疾患処置剤の重量に対して約0.001〜1.0重量％が好ましく、約0.01〜0.1重量％%がより好ましい。
【００５２】
本発明のアレルギー性疾患処置剤を、点眼剤として用いる場合は、本発明ガラクトサミノグリカンの他、所望により等張化剤（例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムなど）、緩衝剤（例えばホウ酸、リン酸−水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなど）、保存剤（例えば塩化ベンザルコニウム、フェノキシエタノール、クロロブタノールなど）、抗生物質（オキシテトラサイクリンなど）または抗炎症剤（例えばジクロフェナック、グリチルリチンなど）のような点眼剤に通常用いられる薬剤、添加剤を加えてもよい。
【００５３】
本発明の有効成分であるガラクトサミノグリカンの配合量並びに投与量は、その製剤の投与方法、投与形態、使用目的、患者の具体的症状、患者の体重等に応じて個別的に決定される事項であり、特に限定されないが、患者に投与されるガラクトサミノグリカン量は、外用剤として局所投与する場合、例えば成人に対し、１回あたり約100μg/kg〜20 mg/kg、好ましくは、250 μg/kg〜15 mg/kg程度を例示することができる。
また、本発明の投与回数は、１日１回でもよく、１日２〜４回、またはそれ以上の回数に分けて投与することもでき、そのような投与を必要に応じて毎日、あるいは適当な日数をおいて必要な期間投与することができる。
【００５４】
本発明の適用対象動物としては、ヒトを含む哺乳動物（ヒト等の霊長類、犬、猫等の愛玩動物、牛、豚、馬等の家畜等）、鶏等の鳥類が挙げられ、これらの動物の上記のような症状の予防、治療あるいは軽減に使用することができる。
【００５５】
[実施例]
以下に本発明の実施例を具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるものではない。なお、実施例中、特に断らない限り、「分子量」、「平均分子量」とは「重量平均分子量」を意味する。
【００５６】
[参考例１]  ガラクトサミノグリカン画分１の調製
スルメイカより得られた軟骨750gを細断し、10分間煮沸した後、50℃まで冷却した。NaOHを用いてｐH11に調整後、エスペラーゼ（ノボノバルティス社製）150gを用いて、ｐH10、50℃の条件下で一晩抽出した。
得られた抽出液に炭酸ナトリウム3.75gを添加してｐH10、50℃の条件下で１時間撹拌した後、濾過し、濾液を750ｍｌまで濃縮した。
【００５７】
得られた濃縮液に16gのNaOHを添加し、35℃で２時間反応させた後、遠心分離を行った。得られた上清を、エタノール1105ml、エタノール＋3%酢酸ナトリウム（pH4.8）600ml、エタノール＋3%酢酸ナトリウム（pH4.8）612mlで３回分画し、次いでエタノール1500mlを添加して粗ガラクトサミノグリカン18.8ｇを得た。
得られた粗ガラクトサミノグリカン10gを0.1M Tris-HCl(pH8.0)に溶解し、アクチナーゼE（科研製薬社製）を加えて、37℃で一晩、さらにタンパク質を分解した。
【００５８】
分解後NaOHを加えて、全反応液を0.5Nとし、40℃で1時間反応させた。次いでエタノールを反応液と等量加え、生じた沈殿を水に溶解させた。溶解後、pHを3に調整し酢酸ナトリウムを5%水溶液になるように添加した。pHを4.8±0.2に調整後、エタノールを等量加えた。
【００５９】
生じた沈殿を回収し、水で溶解後、pHを4.8±0.2に調整して、エタノールを4分の1量加えた。次いで活性炭2gを加えて50℃、1時間で処理を行い、濾過助剤を用いて濾過した。濾液に酢酸ナトリウムを2%となるように添加してpH5.0〜5.5とし、濾過を行った。
【００６０】
得られた濾液に等量のエタノールを加えて白濁させ、白濁液を、先に加えたエタノールと等量のエタノールに添加して沈殿させた。得られた沈殿を回収し、アルコールで洗浄後、沈殿物を分離した。沈殿物を真空乾燥機を用いて乾燥し、精製ガラクトサミノグリカン（平均分子量：約90,000Da）6.8gを得た。
【００６１】
得られた精製ガラクトサミノグリカンを1.5g分取し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）(pH5.3)に溶解した。この溶液に羊由来睾丸ヒアルロニダーゼ（SIGMA社製）2mgを加えて37℃で反応させた。経時的に反応液の一部を取り、GPC-HPLCにて低分子化の度合いを調べた。分子量が約25kDaに達したところで反応液を煮沸して反応を停止した。得られた反応液に活性炭を加えて50℃で1時間反応させた。反応液は濾過後、濾液に3%となるように酢酸ナトリウムを加えた。この溶液に4倍量のエタノールを加えて沈殿を得た。沈殿物をエタノールで洗浄後、乾燥して精製画分（ガラクトサミノグリカン画分１）1.3gを得た。
【００６２】
[参考例２]  ガラクトサミノグリカン画分２〜４の調製
上記精製ガラクトサミノグリカン（平均分子量：約90,000Da）を4.0g分取し、PBS(pH5.3)に溶解した。この溶液に羊由来睾丸ヒアルロニダーゼ200mgを加え、37℃で一晩反応を行った。得られた反応液をA、Bの2つに分け、Bにはさらにヒアルロニダーゼを80mg加えて37℃で一晩反応させた。A、Bはそれぞれ分子量3万カットのラボスケールTFF装置（ミリポア社製）で濾過を行った。A、Bの濾液を濃縮した後、セファデックスG25（アマシャムバイオサイエンス社製）を充填したカラムにアプライし、0.1M NaClを溶媒として溶出させた。溶出液はフラクションコレクターにより分画し、得られた画分をカルバゾール法にて分析し、ガラクトサミノグリカンの溶出位置を確認した。また参考例３（１）に後述するように、GPC-HPLCにより各画分のガラクトサミノグリカン分子量を測定した。Aから得られた画分は、平均分子量6kDa前後の画分を集めた。また、Bから得られた画分からは分子量2.5kDa以下の画分を集めた。A、Bから得られた各画分を濃縮、脱塩した後、凍結乾燥することにより、それぞれ粉末状のガラクトサミノグリカン画分２および３を得た。
また、参考例１に準じて精製ガラクトサミノグリカン（平均分子量69,950Da）を得た（ガラクトサミノグリカン画分４）。この画分については、酵素消化による低分子化を行わず、試験に供した。
【００６３】
[参考例３]  ガラクトサミノグリカンの分析
（１）重量平均分子量の測定
重量平均分子量の測定は荒井らの方法（Biochim. Biophy. Acta, 1117, 60-70, 1992）に準拠して求めた。すなわち、分子量が既知のコンドロイチン硫酸（重量平均分子量52,200、31,400、20,000、10,200、6,570、459）及びヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量104,000、62,000）を標準品として高速液体クロマトグラフィーを用いたゲル濾過（GPC-HPLC）での溶出時間により決定した。カラムは、TSK gel G4000PWXL、G3000PWXL、G2500PWXL（各φ7.8×300mm、東ソー（株）製）を連結したものを用いた。溶媒は0.2mol／L塩化ナトリウム溶液を用い、流速は0.6mL／分とし、検出器は示差屈折率検出計（RI-8100、東ソー（株）製）及び紫外可視検出器（UV-8010、東ソー（株）製）を用いた。
【００６４】
（２）コンドロイチナーゼABCによる消化率の測定
ガラクトサミノグリカン1%溶液100μLにトリス塩酸緩衝液（pH8.0）と0.25UのコンドロイチナーゼABC（生化学工業（株）製）を加えて37℃で一晩消化させた。沸騰水浴中で3分加熱して反応を停止させ、消化物50μg相当分をGPC-HPLCで分析し、酵素未消化ガラクトサミノグリカンと比較することにより消化率を算出した。
【００６５】
（３）構成不飽和二糖組成分析
硫酸基位置の分析は、公知の方法、［新生化学実験講座3、糖質II、p49-62（1991年、東京化学同人発行）に記載の「2・8グリコサミノグリカン分解酵素とHPLCを組み合わせた構造分析より」参照］により以下のようにして行った。
すなわち、ガラクトサミノグリカンをコンドロイチナーゼABC（生化学工業（株）製）により完全に二糖に消化し、生成した不飽和結合を含む二糖（不飽和二糖）群を陰イオン交換-HPLCで分析した。
【００６６】
さらにこの条件下では分離不能なΔDi-diSBとΔDi-diSEとを分離するために、消化物をさらにコンドロ−6−スルファターゼ（生化学工業（株）製）で消化し、ΔDi-diSEをΔDi-4Sにシフトさせ、同様に陰イオン交換-HPLCで分析した。２つの結果を比較分析して構成不飽和二糖組成を算出した。詳細を以下に記載する。
【００６７】
（ｉ）コンドロ−6−スルファターゼによる消化
コンドロイチナーゼABCによる消化物100μg相当に対し、緩衝液C（0.02 mol/L Tris-AcOH、pH7.0）50μLに0.25 Uのコンドロ−6−スルファターゼ（生化学工業（株）製）を溶解したものを加え、37℃で24時間消化し、遠心分離により不溶物を除去した。
【００６８】
（ｉｉ）HPLCによる分析
上記消化物、即ちコンドロイチナーゼABC消化液、あるいはそれをさらにコンドロ−６−スルファターゼで消化した消化液をそれぞれHPLCを用いて分析した。カラムはYMC-Pack PA-120-S5イオン交換カラム（φ2.6×250 mm、YMC（株）製）を用いた。
【００６９】
流速1.5mL/分で60分間に0.8 mol/Lリン酸水素ナトリウムを2％から100％までの直線濃度勾配で流した。不飽和コンドロ−二糖キット（生化学工業（株）製）の溶出位置を基準として、この間に溶出する各種不飽和二糖を232 nmで同定し、不飽和二糖と同定されたピーク面積の総和を100％として計算して不飽和二糖組成を求めた。
【００７０】
（４）硫酸基数の測定
構成二糖あたりの硫酸基数は、ガラクトサミノグリカンの不飽和二糖組成（モル％）に硫酸基個数の係数を乗じることにより得られるものであり、下記式により求めた。
構成二糖あたりの硫酸基数（個） = [ΔDi-0Sのモル％×0 + (ΔDi-6Sのモル％ +ΔDi-4Sのモル％)×1 + (ΔDi-diSDのモル％ + ΔDi-diSBのモル％ + ΔDi-diSEのモル％)×2 + ΔDi-triSのモル％×3] ÷ 100
【００７１】
（５）結果
参考例１及び２で調製したガラクトサミノグリカン画分１〜４について、上記の分析方法により求めた重量平均分子量、コンドロイチナーゼABCによる消化率、構成不飽和二糖組成及び構成二糖あたりの硫酸基数を下記表２にまとめる。
【００７２】
【表２】
0004786911.tif 000005
【実施例１】
【００７３】
ガラクトサミノグリカン配合皮膚外用剤のアトピー性皮膚炎に対する治療効果
【００７４】
本発明ガラクトサミノグリカンを含む皮膚外用剤のアトピー性皮膚炎に対する治療効果を試験するため、参考例１及び２で得られた本発明ガラクトサミノグリカン画分１〜３及びサメ軟骨由来コンドロイチン硫酸ナトリウムを用い、下記のようにして被験物質I〜IVを調製した。上記サメ軟骨由来コンドロイチン硫酸ナトリウムは構成不飽和二糖組成としてΔDi-6Sを60.44モル％、ΔDi-4Sを20.99モル％、ΔDi-SEを2.01モル％含み、本発明ガラクトサミノグリカンに該当せず、被験物質IVは比較例である。
【００７５】
＜皮膚外用剤の調製＞
ジメチルポリシロキサン２重量部、スクワラン４重量部、パルミチン酸イソプロピル２重量部、パルミチン酸イソヘキサデシル１．５重量部、ベヘニルアルコール０．５重量部、トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル０．５重量部、フェノキシエタノール０．５重量部を含む油系成分を容器に秤り込み、さらに乳化剤を少量加え、約70℃に加温して撹拌溶解した。また別容器に、グリセリン３重量部、１，３−ブチレングリコール３重量部、ガラクトサミノグリカン画分（上記ガラクトサミノグリカン画分１〜３のいずれか）１重量部またはサメ軟骨由来コンドロイチン硫酸ナトリウム０．４５重量部、精製水78.25重量部、および少量のその他の公知の界面活性剤などの水溶性物質を含む水系成分を容器に秤り込み、約70℃にて撹拌溶解した。水系成分が十分に溶解したら、油系成分を徐々に添加して均一に乳化した後水冷しながら室温まで冷却し、水中油系皮膚外用剤である被験物質I、II、III及びIV（ガラクトサミノグリカン画分１，２，３及びサメ軟骨由来コンドロイチン硫酸ナトリウムをそれぞれ含む）を調製した。
【００７６】
＜アトピー性皮膚炎自然発症モデルマウスに対する皮膚外用剤の治療効果＞
アトピー性皮膚炎自然発症モデルマウスconventional NC/Ngaマウス（日本エスエルシー株式会社）に対して、被験物質Ｉ〜IVのそれぞれを適用し、アトピー性皮膚炎に対する効用を測定した。予備飼育を6週齢のマウスから行い、週2回の頻度で観察し、下記表４に示す評価基準により皮膚炎の状態を評価した。皮膚炎スコア１あるいは２を２回以上持続して示した動物を各群に配分した。配分は各群の皮膚炎スコア及び平均体重ができるだけ等しくなるように順次振り分けた。検体数は各群共に8匹とした。
【００７７】
あらかじめ1匹当たりの被験物質用量（0.10g）を秤量しておき、発症したマウスに対して皮膚炎発症部位に開放塗布した。塗布回数は1日1回、21回（第3週）までとした。被験物質塗布開始後、週２回の頻度で皮膚炎の状態を被験物質塗布前に観察し、第３週まで観察を行った（観察回数６回）。同様に下記表３に示す評価基準により皮膚炎の状態を評価した。
【００７８】
陰性対照としては無処置群を用いた。予備飼育期間中及び投与期間中、マウス体重を週1回測定した。
【００７９】
【表３】
0004786911.tif 000006
【００８０】
試験結果を図1に示す。図１のグラフ中、縦軸は各群の平均評価スコア、横軸は観察回数を示す。これらの結果から明らかなように、ガラクトサミノグリカン画分１、画分２及び画分３配合皮膚外用剤投与群において、無処置群に対して明らかな皮膚炎評価スコアの違いが得られた。これにより本発明ガラクトサミノグリカン画分配合皮膚外用剤はアトピー性皮膚炎に対して有効であることが確認された。
【実施例２】
【００８１】
ガラクトサミノグリカン配合皮膚外用剤の官能試験
外用剤としての使用感について、表１記載の本発明の被験物質Ｉ、本発明のアレルギー性疾患処置剤に該当しないガラクトサミノグリカン（コンドイチン硫酸）配合皮膚外用剤である商品名：ポリムコン（登録商標）Ｓ（生化学工業株式会社製）及び商品名：ヒルドイド（登録商標）ソフト（マルホ株式会社製）と比較した。
【００８２】
試験は２０代〜４０代の被験部位に創傷を持たない健康な男女３０名を対象として行った。男女の比率は固定しなかった。
各被験者に、皮膚外用剤Ａ（商品名：ポリムコン（登録商標）Ｓ）、皮膚外用剤Ｂ（商品名：ヒルドイド（登録商標）ソフト、Ｌｏｔ  ３７６１２）、皮膚外用剤Ｃ（被験物質Ｉ）の順で、それらの使用感や外観を含めた嗜好性（好き嫌い）を評価してもらった。使用感についての官能試験の指標としては、通常用いられる、なじみ、閉塞感、落ち着きを使用し、嗜好性と併せて評価した。なじみ、閉塞感、落ち着き、嗜好性の評価基準を下記表４〜７に示す。
【００８３】
【表４】
0004786911.tif 000007
【００８４】
【表５】
0004786911.tif 000008
【００８５】
【表６】
0004786911.tif 000009
【００８６】
【表７】
0004786911.tif 000010
【００８７】
結果を図２に示す。これらの結果から、本発明の皮膚外用剤は、なじみが良く、つけた後の閉塞感が少なく、べたつきが少ない外用剤であることが分かった。ただし、嗜好性（好き嫌い）は人によって異なるものであることから、嗜好性に差異は見られなかった。以上のように、本発明の皮膚外用剤はなじみが良く、つけた後の閉塞感が少なく、べたつきが少ないことから、日中の使用にも好ましく、また全身塗布にも好ましい外用剤である。
【００８８】
また、上記試験において、皮膚外用剤Ｂを使用中に発赤、炎症反応が見られた被験者が１０％（３人）見られ、これらは皮膚外用剤Ｂに含まれるパラベン、ラノリンなどの刺激性のある基剤成分に起因するものと考えられることから、敏感なアトピー性皮膚炎患者にはより低刺激性の本発明の皮膚外用剤がより好ましいと考えられる。
【実施例３】
【００８９】
ヒスタミン遊離抑制作用
参考例１及び２で調製した画分１及び画分２、及び多硫酸化コンドロイチン硫酸(MPS: 特開平１１−３３５２８８ )のヒスタミン遊離抑制作用を測定した。
Spargue-Dawley系12週齢雌性ラットの腹腔内から採取した肥満細胞を60% Percoll(アマシャム社製)で分離し、1 x 105 細胞/mlに調製した。ここに画分１、画分２またはMPSを加え（終濃度10、30または100μl/ml）、37℃で10分間培養した。なお、対照群には緩衝液を添加した。その後、compound48/80(シグマ社製、終濃度0.1μg/ml)を添加し、37℃で30分間培養した。その後、培養容器を氷上に移して反応を停止させた後、培養液を遠心分離し、その上清を回収して遊離ヒスタミン測定用試料とした。沈殿(細胞)に蒸留水を加え、凍結融解により細胞を破壊し、遠心分離し、その上清を細胞内ヒスタミン測定用試料とした。ヒスタミンの測定は市販のELISAキット(Oxford Biomedical Res.社製)を用いて行った。測定された遊離ヒスタミン量と細胞内ヒスタミン量から次式によりヒスタミン遊離率を求めた。
【００９０】
【数１】
0004786911.tif 000011
【００９１】
試験結果を図３に示す。縦軸に肥満細胞からのヒスタミン遊離率を示し、各棒によりその下に示す各試料及び濃度に対応する肥満細胞からのヒスタミン遊離率を平均値±SE(n=4)で示す。*はp<0.05で、**はp<0.01で対照群に対して有意差を有することを示す。これらの結果から判るように、画分１及び画分２では有意なヒスタミン遊離率の抑制が認められた。一方、MPSはヒスタミン遊離率を有意に抑制することはなかった。これにより本発明ガラクトサミノグリカンが肥満細胞からのヒスタミン遊離を抑制することが確認され、アレルギー性疾患の治療に有効であることが示唆された。
【実施例４】
【００９２】
マウス受身皮膚アナフィラキシー反応によるI型アレルギー反応抑制作用
マウス受身皮膚アナフィラキシー反応に対する、参考例１および２で調製した画分１、画分２及び画分４の効果を測定した。陽性コントロールとして市販の抗アレルギー剤であるケトチフェン(シグマ社製)を用いた。
【００９３】
BALB/c系8週齢雌性マウスの除毛した背部1ヶ所に抗ジニトロフェニル モノクローナル抗体(生化学工業社製)溶液20μlを皮内投与した。24時間後、画分１ 100 mg/kg、画分２ 100 mg/kg、画分４ 100mg/kgまたはケトチフェン 1 mg/kg を静脈内投与した。対照群には生理的食塩水を投与した。この30分後1 mg/ml ジニトロフェニル化ウシ血清アルブミン(シグマ社製)と 0.5% エバンスブルー(和光純薬社製)の等量混液を10ml/kgの量で尾静脈内に投与した。30分後、背部皮膚青染部を摘出した後、組織中の色素を定量した。
【００９４】
試験結果を図４に示す。縦軸に受身皮膚アナフィラキシー反応により漏出した色素量を示し、各棒によりその下に記載する各試料により得られた受身皮膚アナフィラキシー反応により漏出した色素量を平均値±SE(n=13)で示す。*はp<0.05で、**はp<0.01で対照群に対して有意差を有することを示す。これらの結果から判るように、画分１、画分２及び画分４では有意な色素漏出の抑制が認められた。これにより本発明ガラクトサミノグリカンがI型アレルギー反応である受身皮膚アナフィラキシー反応に対し有効であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】NC/Ngaマウスを用いたガラクトサミノグリカン添加皮膚外用剤のアトピー性皮膚炎への効果を示すグラフである。
【図２】本発明皮膚外用剤の使用感試験の結果を示すグラフである。
【図３】本発明グリコサミノグリカンのヒスタミン遊離抑制作用試験の結果を示すグラフである。
【図４】本発明グリコサミノグリカンのI型アレルギー反応抑制作用試験の結果を示すグラフである。
【図１】
0004786911.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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