(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に生理活性薬剤を送達するためのナノカプセルであって、該ナノカプセルが、以下：
（ａ）  該生理活性薬剤を含むコア；
（ｂ）  ミセルを形成するために該コアを少なくとも部分的に覆う界面活性剤分子であって、該界面活性剤分子が、６．０単位未満のＨＬＢ値を有する、界面活性剤分子；および、
（ｃ）  該コアおよび該ミセルを取り囲むシェルであって、該シェルが、生体適合性ポリマーを含有する、シェル
を含み、該ナノカプセルのサイズが、５０ｎｍ以下である、ナノカプセル。
【請求項２】
前記生理活性薬剤が、化学療法剤である、請求項１に記載のナノカプセル。
【請求項３】
前記生理活性薬剤が、高分子である、請求項１に記載のナノカプセル。
【請求項４】
前記高分子が、オリゴペプチド、ペプチド、炭水化物またはタンパク質である、請求項３に記載のナノカプセル。
【請求項５】
前記生理活性薬剤が、ポリヌクレオチドである、請求項１に記載のナノカプセル。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターである、請求項５に記載のナノカプセル。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、ＲＮＡである、請求項５に記載のナノカプセル。
【請求項８】
前記ＤＮＡのサイズを減少するために縮合薬剤をさらに含有する、請求項５〜７のいずれかに記載のナノカプセル。
【請求項９】
前記界面活性剤が、２００μＭ未満の臨界ミセル濃度を有する、請求項１〜８のいずれかに記載のナノカプセル。
【請求項１０】
前記界面活性剤が、アセチレン型ジオールまたはセチルアルコールを含有する、請求項１〜９のいずれかに記載のナノカプセル。
【請求項１１】
前記界面活性剤が、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオールまたはその混合物を含有する、請求項１〜９のいずれかに記載のナノカプセル。
【請求項１２】
前記界面活性剤が、無極性生体適合性油との混合物である、請求項１〜１１のいずれかに記載のナノカプセル。
【請求項１３】
前記シェルの少なくとも１つの生体適合性ポリマーが、特定の細胞の取り込みまたは組織の取り込みのためのものである、請求項１〜１２のいずれかに記載のナノカプセル。
【請求項１４】
前記生体適合性ポリマーが、細胞表面抗原に対する抗体、細胞表面レセプターに対するリガンドまたはペプチドホルモンを含有する、請求項１３に記載のナノカプセル。
【請求項１５】
前記生体適合性ポリマーが、レセプター媒介エンドサイトーシスに関連する細胞表面レセプターに対するリガンドを含む、請求項１４に記載のナノカプセル。
【請求項１６】
前記シェルが、特定の細胞の取り込みまたは組織の取り込みのための細胞認識成分を含有する、請求項１〜１２のいずれかに記載のナノカプセル。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載のナノカプセルであって、前記生体適合性ポリマーが、界面活性剤ミセルを実質的にコートし得る親水性のポリマーである、ナノカプセル。
【請求項１８】
前記生体適合性ポリマーが、ヒアルロナン、テネイシンまたはポリビニルピロリドン、あるいはヒアルロナンレセプターもしくはテネイシンレセプターによる特定の細胞の取り込みのためのリガンドを含む、請求項１〜１７のいずれかに記載のナノカプセル。
【請求項１９】
前記生体適合性ポリマーが、イオントフォレーシスポリマーを含む、請求項１〜１８のいずれかに記載のナノカプセル。
【請求項２０】
前記シェルが、イオン沈殿物質をさらに含有する、請求項１〜１９のいずれかに記載のナノカプセル。
【請求項２１】
前記イオン沈殿物質が、Ｌｉ＋を含有する、請求項２０に記載のナノ粒子。
【請求項２２】
固体投薬形態である請求項１〜２１のいずれかに記載のナノカプセル。
【請求項２３】
小胞媒介ピノサイトーシスによる標的細胞への該生理活性薬剤の送達のために使用される、請求項１〜２１のいずれかに記載のナノカプセル。
【請求項２４】
請求項１〜２１のいずれかに記載のナノカプセルを作製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
生理活性薬剤と、６．０単位未満のＨＬＢ値を有する界面活性剤とを、水混和可能溶媒中に溶解または分散させて、ミセルを形成する工程であって、該ミセルの各々が、界面活性剤分子で少なくとも部分的に覆われた生理活性薬剤のコアを有する、工程；および、
該ミセルの各々が、各々生体適合性ポリマーのシェルでそれぞれコーティングされるように、該生体適合性ポリマーを含む水性組成物中に該界面活性剤ミセルを含有する該水混和可能溶媒を分散する工程、
を包含する、方法。
【請求項２５】
前記生理活性薬剤が、前記ミセルの形成の前にそのサイズを減少するために縮合剤で処理される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ミセルが、生体適合性油および／または水混和可能溶媒を含む組成物において形成される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２４、２５または２６に記載の方法であって、前記コートされたミセルを含む水性組成物が、生体適合性ポリマーを凝固および硬化するための溶質を含む第２の水性組成物に移される、方法。
【請求項２８】
前記溶質が、Ｌｉ＋を含有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記コートされたミセルが、前記第２の水性組成物中でインキュベーションされる、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、Ｇｒｅｔｃｈｅｎ  Ｍ．Ｕｎｇｅｒによる「ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥ  ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤ」と題する出願番号第６０／１８５，２８２号（２０００年２月２８日出願）からの優先権を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、概して、高分子、特に核酸および遺伝子治療のための制御放出送達系の分野に関する。より詳細には、本発明は、約５０ナノメートル未満の直径を有するナノカプセル（このナノカプセル中において、生物活性成分が、ナノカプセルのコアに位置する）、およびこれらのナノカプセルを形成する方法に関する。
【０００３】
過去数十年間にわたって、生理活性薬剤の送達におけるナノ粒子の使用に関する活発で広範囲にわたる研究により、ナノ粒子の調製における数多くのアプローチが行われてきた。これらのアプローチとしては、代表的には、１００ナノメートルより大きい直径を有するナノ粒子を調製するための熱、高圧、均質化、もしくは高強度超音波処理の使用、または１００ナノメートル未満の直径を有するナノ粒子を調製するための、大量の溶媒もしくは油、架橋剤のような細胞傷害性化学物質、アジュバント、触媒またはこれらのいずれかの任意の組合せが挙げられる。さらに、これらのアプローチは、多数の変数のせいで挑戦を続けている。
【０００４】
例えば、有機溶媒は、ナノ粒子の製造において含まれ、この有機溶媒は、生理活性薬剤を変性し得、その生理活性薬剤の全てではなくとも大部分の有効性を減少させる。実際、生理活性薬剤の変性は、例えば、ナノ粒子の投与の際のヒト被験体に対する毒性応答を促進し得る。
【０００５】
さらに、有機溶媒がナノ粒子の調製に使用される場合、有機溶媒または溶媒可溶性ポリマーは、分解を受けて低ｐＨ環境を形成し、生理活性因子の有効性を破壊する。従って、有機溶媒は、一般的には、ナノ粒子の調製中または調製後に生理活性因子を変性し得る。
【０００６】
結果として、有機溶媒は、代表的にはナノ粒子の製造プロセス中に除去される。しかし、１つ以上の有機溶媒除去技術を含むことにより、一般的に、ナノ粒子形成の費用および複雑さが増加する。
【０００７】
ナノ粒子を調製するための高圧均質化または高強度超音波処理の組込みは、生理活性薬剤のナノ粒子のポリマーマトリックス中における絡まり（ｅｎｔａｎｇｌｉｎｇ）または包埋を生じる。ポリマーマトリックス中の生理活性薬剤の絡まりまたは包埋はまた、生理活性薬剤を変性し、それにより生理活性薬剤の有効性を減少し得る。
【０００８】
ナノ粒子のポリマーマトリックス中の生理活性薬剤の絡まりまたは包埋はまた、標的細胞に到達する前に生理活性薬剤を早期放出させることにより、生理活性薬剤の有効性を減少し得る。生理活性薬剤の早期放出は、代表的には、ナノ粒子の投与中の細胞傷害性または細胞死を促進する。
【０００９】
さらに、標的細胞に到達するナノ粒子は、代表的には、エンドソーム調節経路を介して標的細胞中に輸送され、この経路は、生理活性薬剤およびナノ粒子のリソソーム分解を生じる。従って、標的細胞の内部の生理活性薬剤の機能的活性は、この生理活性薬剤およびナノ粒子が分解を受けるために、生じないかもしれない。本明細書中で使用される場合、用語「機能的活性」とは、標的細胞に対する治療的効果の提供を目的として、標的細胞内において生理活性薬剤が機能する能力をいう。
【００１０】
さらに、高圧均質化または高強度超音波処理技術は、しばしば複雑で高価な装置を必要とし、これは、一般的にナノ粒子の調製における費用を増加する。したがって、有機溶媒のような細胞傷害性化学物質を使用しないか、または複雑で高価な装置を使用しないナノ粒子の調製に対する緊急の必要性が存在する。さらに、ナノ粒子中の生理活性薬剤を絡ませることも包埋させることもなく、その結果細胞傷害性応答が最小限になるナノ粒子の調製に対する緊急の必要性が存在する。さらに、生理活性薬剤が放出される標的細胞中に輸送されて、生理活性薬剤の治療的送達を達成し得るナノ粒子を開発する緊急の必要性が存在する。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、概して、ナノカプセルおよびこれらのナノカプセルを調製する方法に関する。本発明は、界面活性物質ミセルを形成し、そして親水性ポリマーを有する水性組成物中にこの界面活性物質ミセルを分散して、界面活性物質ミセルの安定化された分散を形成する方法を包含する。この方法はさらに、この界面活性物質ミセルの安定化された分散の液滴を機械的に形成する工程、親水性ポリマーを沈殿させて沈殿ナノカプセルを形成する工程、このナノカプセルをインキュベートしてナノカプセルの直径を減少する工程、およびこのナノカプセルを濾過または遠心分離する工程を包含する。
【００１２】
（詳細な説明）
本発明は、一般に、約５０ナノメートル（ｎｍ）未満の直径を有するナノカプセルに関する。本発明はまた、これらのナノカプセルを調製する方法に関する。本発明の方法にしたがって、ナノカプセルは、界面活性剤分子のコア内の生理活性な成分を分離し、そしてその界面活性剤分子を生体適合性のポリマーのシェルで囲むことによって形成される。
【００１３】
ナノカプセルを製造する方法は、概して図１の１０に示される。方法１０において、生理活性成分１２は、第１の水性の組成物１４中に均一に分散され、親水性の組成物（示さず）を形成する。次に、複数の界面活性剤分子および必要に応じて生態適合性の油成分１８を含有する界面活性剤組成物１６（界面活性剤成分を含む）（示さず）を、親水性組成物とともに第１の分散装置２０に導入する。その界面活性剤組成物１６を、生理活性成分１２の表面上への界面活性剤分子の少なくとも部分的な吸着を開始する第１の分散装置２０の条件に供する。
【００１４】
生理活性成分１２の表面上への界面活性剤分子の部分的な吸着は、第１の水性組成物１４における界面活性分子から形成されたシェルのコアへの生理活性成分１２の分離を開始する。界面活性剤分子の生理活性成分１２の表面上への吸着は、生理活性成分１２の全表面がその界面活性剤分子によって覆われて、その生理活性成分１２が、界面活性剤分子のコアへの完全な分離を完了し、そして界面活性剤ミセル２２を形成するまで進行する。
【００１５】
次に、生体適合性ポリマー成分２４を、界面活性剤ミセル２２に添加し、第１の水性組成物１４に位置する界面活性剤ミセル２２を安定化する。好ましくは、その生体適合性成分２４は、その界面活性剤ミセル２２を安定化装置２６中に囲んで、安定化した界面活性剤ミセル２８を形成する。
【００１６】
安定化後、その安定化した界面活性剤ミセル２８を、安定化装置２６から、第２の分散装置３２に位置する第２の水性組成物３０へと移す。好ましくは、組成物の第２の水性組成物３０は、安定化した界面活性剤ミセル２８をコートするその生体適合性ポリマー成分２４を沈殿させ得る溶質（示さず）を含んでいる。安定化した界面活性剤ミセル２８のその生体適合性ポリマー成分２４を分離した後、分散した、必要に応じて微粒化した沈殿したナノカプセル３６（本明細書中以下でナノカプセル３６と呼ぶ）を形成する。
【００１７】
約６．０ユニット未満の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）値を有する界面活性剤成分を含む界面活性剤組成物を生理活性成分を含有する水性組成物中に分散することにより、その生理活性成分を囲む界面活性剤ミセルが形成されることが見出されている。約５０ｎｍ未満の直径を有するナノカプセルを形成するように生体適合性ポリマーコートを界面活性剤ミセルに添加することにより、その界面活性剤ミセルを安定化することが、さらに見出されている。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、用語「ナノ粒子」は、約１，０００ナノメーター未満のサイズのマトリックス型構造を有する粒子のことをいう。そのナノ粒子が、生理活性成分を含む場合、その生理活性成分は、ナノ粒子のマトリックスタイプの構造に巻き込まされるかまたは包埋される。
【００１９】
本明細書中で使用される用語「ナノスフェア」は、約１，０００ナノメーター未満のサイズを有する固体球状型の構造を有する粒子をいう。そのナノスフェアが生理活性成分を含む場合、その生理活性成分は、ナノスフェアの表面上に吸着されるか、またはナノスフェアに包埋される。
【００２０】
同様に、本明細書中で使用される用語「ナノコア」とは、約１，０００ナノメーター未満のサイズを有する固体コアを有する粒子のことをいう。そのナノコアが生理活性成分を含む場合、その生理活性成分は、ナノコア中に巻き込ませられる。
【００２１】
本明細書中で使用する場合、用語「ナノカプセル」は、その粒子が約１，０００ナノメーター未満のサイズを有するように、シェルによって囲まれる中空コアを有する粒子のことをいう。ナノカプセルが、生理活性成分を含む場合、その生理活性成分は、ナノカプセルのシェルによって囲まれるコア中に位置している。用語「ナノカプセル」は、包含することを意味せず、そして一般的に約１，０００ナノメーター未満のサイズを有する粒子を包含せず、ここで、生理活性成分は、ナノカプセルのマトリックス中に巻き込まされるか、または包埋されるか、あるいはナノカプセルを囲むシェル上に吸着される。
【００２２】
生理活性成分１２は、液体、蒸気としてかまたは顆粒状形態で、第１の水性組成物１４中に含まれ得る。選択される生理活性成分１２の形態は、好ましくは、その生理活性成分１２が、（１）第１の水性組成物１４中に溶解または分散する前に安定のままであること、（２）第１の水性組成物１４中に均一に分散されること、（３）生理活性成分１２のサイズを減少するように必要に応じて縮合されること、（４）界面活性剤ミセル２２のコア中に分割されること、（５）ナノカプセル３６の生体適合性ポリマーシェル２４が分解する際に放出されること、および（６）ナノカプセル３６から放出される際に機能的に活性であることを、可能にする。
【００２３】
この生理活性成分１２は、「親水性」または「疎水性」として特徴付けされ得る。本明細書中で使用される場合、用語「親水性の」および「疎水性」は、分子が、水を吸着するかまたは水と１つ以上の水素結合を形成する能力をいう。「親水性」に対するすべての言及はまた、水を吸着し得るかまたは水と１つ以上の水素結合を形成し得る分子の任意の部分を包含すると理解される。本明細書中で使用される場合、用語「疎水性の」および「疎水性」は、分子が、水を吸着も水と１つ以上の水素結合を形成もしない能力をいう。「疎水性」に対するすべての言及はまた、水を吸着も水と１つ以上の水素結合を形成もできない分子の任意の部分を包含すると理解される。
【００２４】
この生理活性成分１２が親水性生理活性成分である場合、この親水性生理活性成分は、第１の水性組成物１４に直接添加され得る。代替策として、この親水性生理活性成分１２は、１つ以上の溶媒（例えば、水、非極性溶媒、極性溶媒、またはこれらのいずれかの任意の組み合わせ）中に、必要に応じて溶解または分散され得る。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「非極性溶媒」は、永久電気双極子モーメントを有さず、従って、極性溶媒との分子間結合に関する能力を有さない、溶媒をいう。さらに、非極性溶媒は、約２０単位未満の誘電率を有する分子を含む溶媒として特徴付けられ得る。同様に、用語「非混和性」は、本明細書中で使用される場合、２つ以上の物質（例えば、２つ以上の液体、固体、蒸気、またはこれらのいずれかの任意の組み合わせ）が別の物質と分子間結合を形成できないことをいう。非極性溶媒のいくつかの非網羅的例が、Ｐｅｒｒｙ’ｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（本明細書中で参考として援用される）において見出され得る。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「極性溶媒」は、永久電気双極子モーメントを有し、従って、別の極性物質（例えば、水、個体、蒸気、またはこれらのいずれかの任意の組み合わせ）との分子間結合に関する能力を有する、溶媒をいう。さらに、極性溶媒は、約２０単位より大きい誘電率を有する分子を含む溶媒として特徴付けられ得る。同様に、用語「混和性」は、本明細書中で使用される場合、２つ以上の物質が互いと分子間結合を形成する能力をいう。極性溶媒のいくつかの非網羅的例が、Ｐｅｒｒｙ’ｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（本明細書中で参考として援用される）において見出され得る。
【００２７】
この生理活性成分１２が疎水性生理活性成分である場合、この疎水性生理活性成分は、その疎水性分子を分散または溶解することができる溶媒（例えば、上記の水、非極性溶媒、極性溶媒、またはこれらのいずれかの任意の組み合わせ）中に、分散または溶解され得る。好ましくは、この生理活性成分１２が疎水性生理活性成分１２である場合、この疎水性生理活性成分１２は、水混和性溶媒（例えば、アセトン、アセトニトリル、エタノール、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））中に溶解または分散される。水混和性溶媒の他の適切な非網羅的例が、Ｐｅｒｒｙ’ｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（本明細書中で参考として援用される）において見出され得る。
【００２８】
記載されたように、この生理活性成分１２は、界面活性剤ミセル１６を形成する前に、必要に応じて、第１の水性組成物１４中で縮合され得る。例えば、この生理活性成分がポリヌクレオチドである場合、このポリヌクレオチドは、ＤＮＡ縮合剤を使用して縮合され得る。本明細書中で使用される場合、「ＤＮＡ縮合剤」は、ＤＮＡの縮合またはサイズ減少を促進する分子である。
【００２９】
この生理活性成分１２の縮合は本発明にとって重要でないが、この生理活性成分１２の縮合は、この生理活性成分１２のサイズを減少するために実施され得る。この生理活性成分１２の縮合は、一般に、界面活性剤ミセル１６のコア中に分割する前に、この生理活性成分１２のサイズを減少する。この生理活性成分１２のサイズを減少することによって、界面活性剤ミセル２２中へのこの生理活性成分１２の最大の組込みが可能になり得るか、またはナノカプセル３６の全体のサイズの減少が補助され得る。ナノカプセル３６の一部として含まれ得る生理活性成分１２の量が増加することによって、多数のモノマー（例えば、多数の塩基対またはアミノ酸）を有する高分子の組み込みが可能になる。縮合剤のいくつかの非網羅的例が、Ｒｏｌｌａｎｄ，Ａ．Ｐ．（１９９８）、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ．Ｃａｒｒ．Ｓｙｓｔ．１５：１４３〜１９８（本明細書中で参考として援用される）において概説されている。
【００３０】
この生理活性成分１２は、この生理活性成分１２と適合しかつこの生理活性成分１２の溶媒和または分散を妨げない、さらなる成分をさらに含み得る。この生理活性成分１２に添加され得るさらなる成分のいくつかの非網羅的例としては、ＤＮＡ会合部分が挙げられ、これは、核酸と非共有結合様式で相互作用する分子またはその一部をいう。ＤＮＡ会合部分としては、主溝および副溝結合剤、ＤＮＡインターカレーター、ポリカチオン、ＤＮＡマスキング成分、膜透過成分、亜細胞局在成分などが挙げられ得るが、これらに限定されない。主溝および副溝バインダーは、本明細書中で使用される場合、二本鎖ＤＮＡの主溝または副溝との会合によって、ＤＡＮと相互作用すると考えられる分子である。
【００３１】
同様に、本明細書中で使用される場合、用語「ＤＮＡ挿入物（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）」は、ヌクレオチド塩基対間およびそれらに平行してそれら自体を挿入することによってＤＮＡ内に挿入すると考えられる、平面分子または分子の平面部分をいう。本明細書中で使用される場合、用語「ポリカチオン」は、ＤＮＡバックボーンのネガティブな変化に関連すると考えられる。このＤＮＡに関連した部分は、本発明の官能基成分に「反応基」を介して共有結合され得る。この反応基は、官能基成分の求核基と容易に反応される。反応基（それらに対応する反応性求核基との）のいくつかの非網羅的な例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（例えば、アミン）、マレイミドおよびマレイミドフェニル（例えば、スルフヒドリル）、二硫化ピリジン（例えば、スルフヒドリル）、ヒドラジド（例えば、炭水化物）、ならびにフェニルグリオキサール（例えば、アルギニン）。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「ＤＮＡマスキング成分」は、ポリペプチドの全部または一部をマスキングし、続いてナノカプセルから放出して、試薬（例えば、循環内に存在するヌクレアーゼ）を分解することによって、および／または細網内皮系による取り込みを妨害することによって攻撃を阻害することにより、その循環性半減期を増加させ得る分子をいう。同様に、本明細書中で使用される場合、用語「膜透過性成分」は、膜を横切るポリヌクレオチドまたはカプセル化されたポリヌクレオチドの通過を補助する任意の成分をいう。従って、「膜透過性成分」は、ポリヌクレオチドの過負電荷を中和し、かつこのポリヌクレオチドが疎水性膜内部を横断するのを可能にする電荷中和成分（通常は、ポリカチオン）を部分的に含む。
【００３３】
多数の電荷中和成分が、膜透過性物質として作用し得る。膜透過性はまた、両親媒性分子から生じ得る。本明細書中で使用される場合、「膜透過性物質」は、常々は不透過性の分子が細胞膜を横切り、そして細胞の細胞質の入口に達するのを補助し得る分子である。この膜透過性物質は、ペプチド、胆汁酸塩、糖脂質、リン脂質または界面活性分子であり得る。膜透過性物質は、しばしば、一方の部分が疎水性であり、そして他方が親水性であるような両親媒性特性を有し、それによって、それらが膜と相互作用するのを可能にする。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「亜細胞局在成分」は、標的細胞において亜非細胞成分を認識し得る分子をいう。認識される亜細胞局在成分としては、核、リボソーム、ミトコンドリアおよび葉緑体が挙げられる。特定の亜細胞局在成分は、分子をこの核内に送達するのを補助する「核局在成分」を含み、そして核局在ペプチドおよびアミノ酸配列を含むことは公知である。
【００３５】
生理活性成分１２は、インビトロ細胞、インビボ細胞またはエキソビボ細胞のような複数の細胞を形質転換するための治療学的に有効な量において含まれ得る。本明細書中で使用される場合、「形質転換」は、ナノカプセルを複数の細胞に曝した後の、この複数の細胞における生理活性成分の存在および／または機能的活性化をいう。
【００３６】
さらに、当業者は、生理活性成分１２の量が、この生理活性成分１２、温度、ｐＨ、浸透圧、任意の溶質、第一水性組成物１４に存在する任意のさらなる成分もしくは任意の溶媒、界面活性剤組成物１６、界面活性剤ミセル２２の型もしくは量、生体適合性ポリマー成分２４、安定化界面活性剤ミセル２８の任意の所望の特徴、ナノカプセル３６の任意の所望の特徴またはこれらのいずれかの任意の組み合わせに依存して変化し得ることを認識する。
【００３７】
ナノカプセル３６の生理活性成分１２は、個々の高分子として供給され得るか、または種々に調製された２つ以上の高分子の混合物に供給され、この混合物は、続いて生理活性成分１２を形成するように組み合わされ得る。生理活性成分１２の一部として封入に適切であり得る親水性高分子のいくつかの非網羅的な例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：ポリヌクレオチド、ポリペプチド、遺伝物質、ペプチド核酸、アプタマー、炭水化物、ミニ染色体、分子ポリマー、無機もしくは有機性質の凝集体もしくは会合体、遺伝子、任意の他の親水性高分子またはこれらのいずれかの任意の組み合わせ。
【００３８】
生理活性成分１２の一部に含まれ得る、疎水性高分子のいくつかの非網羅的な例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アドレナリン作動薬、副腎皮質ステロイド、副腎皮質抑制剤、アルドステロン拮抗剤および同化剤；興奮薬、鎮痛剤、麻酔薬、食欲抑制薬および抗挫瘡薬；抗アドレナリン作用薬、抗アレルギー薬、抗アメーバ薬、抗貧血剤および抗狭心症薬；抗関節炎薬、抗喘息薬、抗アテローム性動脈硬化薬、抗菌薬および抗コリン作用薬；抗凝固薬、抗痙攣薬、抗うつ剤、抗糖尿病薬および止瀉薬；抗利尿薬、抗嘔吐薬、抗てんかん薬、抗線維素溶解薬（ａｎｔｉｌｉｂｒｉｏｌｙｔｉｃ）および抗真菌薬；抗出血薬、炎症薬、抗菌薬、抗片頭痛薬および抗縮瞳薬；抗真菌剤、抗嘔吐薬、抗腫瘍薬、抗好中球減少薬および駆虫薬；抗増殖薬、抗精神病薬、抗リウマチ薬、抗脂漏薬および抗分泌薬；鎮痙薬、抗血栓薬、抗潰瘍薬、抗ウイルス薬および食欲抑制剤；血中グルコース調節因子、骨吸収抑制剤、気管支拡張薬、心臓血管薬およびコリン作用薬；蛍光物質、遊離酸素遊離基捕捉剤、胃腸運動エフェクター、糖質コルチコイドおよび発毛刺激薬；止血剤、ヒスタミンＨ２レセプター拮抗剤；ホルモ剤；低コレステロール血症薬および低血糖薬；低脂血症薬、降圧薬およびイメージング薬、免疫剤および作用剤；気分調節因子、粘液溶解剤、散瞳薬もしくは鼻づまり薬；神経筋遮断剤；神経保護剤、ＮＭＤＡ拮抗剤、非ホルモンステロール誘導体剤、プラスミノゲンアクチベーター剤および血小板活性化因子拮抗剤；血小板凝集抑制剤、向精神薬、放射活性剤、抗疥癬薬および硬化剤；鎮静薬、鎮静−睡眠薬、選択性アデノシンＡ１拮抗剤、セロトニン拮抗剤およびセロトニン抑制剤；セロトニンレセプター拮抗剤；ステロイド剤、甲状腺ホルモン剤、甲状腺ホルモン剤および甲状腺抑制剤；甲状腺模倣剤（ｔｈｙｒｏｍｉｍｅｔｉｃ）、精神安定薬、筋萎縮性側索硬化症剤、脳虚血剤およびパジェット病剤；不安定アンギナ薬剤、血管収縮薬、血管拡張剤、創傷治癒薬剤およびサンチンオキシダーゼ抑制剤；免疫学的な薬剤、病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌および寄生生物）由来の抗原、必要に応じて、全体が不活性化した生物体の形態において、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、炭水化物またはそれらの組み合わせ、上で言及されるカテゴリー内にあり、かつ公開された文献において見出され得るヒトへの使用が許可された、薬理学的薬剤または免疫学的薬剤の任意の例、任意の他の疎水性生理活性成分、あるいはこれらのいずれかの任意の組み合わせ。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、アミノ酸の数によって制限されないアミノ酸のポリマーをいう。この用語「ポリペプチド」が、例えば、オリゴペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含むことを意味することもまた理解されるべきである。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、単鎖、二重鎖または三重鎖形態のいずれかにおいて、１より多くのヌクレオチドのＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列をいう。この用語「ポリヌクレオチド」はまた、２’−デオキシ−Ｄ−リボースもしくはその改変した形態を含むポリデオキシリボヌクレオチド、ＲＮＡおよびプリンもしくはピリミジン塩基、または改変したプリンもしくはピリミジンの塩基もしくは塩基ヌクレオチドのＮ−グリコシドまたはＣ−グリコシドである、任意の他の型のポリヌクレオチドを含むことを意味する。このポリヌクレオチドは、プロモーター領域、オペレータ領域、構造領域、終止領域、それらの組み合わせまたは任意の他の遺伝学的関連物質をコードし得る。同様に、本明細書中で使用される場合、用語「遺伝的」は、遺伝子発現を改変し得る任意の物質をいう。
【００４１】
第一水性組成物１４は、ゲル、液体としてか、または蒸気形態で本発明の方法に含まれ得る。選択される第一水性組成物１４の形態は、好ましくは、この第一水性組成物１４が以下のことをするのを可能にする：（１）生理活性成分、界面活性剤組成物１６、界面活性剤ミセル２２または必要に応じて安定化界面活性剤ミセル２８を溶解するまたは分散する前に安定性を維持する、（２）生理活性成分１２、界面活性剤組成物１６、界面活性剤ミセル２２または必要に応じて安定化界面活性剤２８を均一に分散する、（３）水中油エマルジョン中で連続相として機能する、（４）生理活性成分１２の機能的活性を阻害または遮蔽しない、そして（５）生理活性成分１２、界面活性剤組成物１６、界面活性剤ミセル２２または必要に応じて安定化界面活性剤ミセル２８を改変または分解しない。
【００４２】
第一水性組成物１４は、水のみを含み得るか、または必要に応じて、ナノカプセル３６を形成する方法を阻害せず、生理活性成分１２の機能的活性も遮断しない、さらなる溶質もしくは溶媒を含み得る。さらに、当業者は、ナノカプセル３６を調製するために使用される第一水性組成物１４の量が、生理活性成分１２、界面活性剤組成物１６、温度、ｐＨ、浸透圧、任意の溶質または任意の溶媒、界面活性剤ミセル２２、生体適合性ポリマー成分２４、安定化界面活性剤ミセル２８またはナノカプセル３６の任意の所望の特徴に依存して変化し得ることを認識する。
【００４３】
生理活性成分１２は、第一水性組成物１４に添加され得るか、またはこの第一水性組成物１４が、生理活性成分１２に添加され得る。生理活性成分１２および第一水性組成物１４の添加の順序は、本発明において重要ではないが、生理活性成分１２が、第一水性組成物１４に溶解または分散される場合に形成される親水性組成物（図示せず）は、好ましくは、親水性組成物への均一な溶解または分散を維持し得る。
【００４４】
第一水性組成物１４は、個々の成分として供給され得るか、または種々に調製された２つ以上の成分の混合物に供給され、続いてこの混合物は、第一水性組成物１４を形成するように組み合わされ得る。第一水性組成物１４のいくつかの網羅的な例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：上記の水、無極性溶媒、極性溶媒またはこれらのいずれかの任意の組み合わせ。好ましくは、水は、第一水性組成物１４である。
【００４５】
界面活性剤組成物１６は、生理活性成分１２、第一水性組成物１４、親水性組成物に液体、蒸気としてか、または顆粒形態で導入され得る。選択される界面活性剤組成物１６の形態は、好ましくは、この界面活性剤組成物１６が以下のことをするのを可能にする：（１）生理活性成分１２、第一水性組成物１４または親水性組成物に導入する前に安定性を維持する、（２）生理活性成分１２、第一水性組成物１４または親水性組成物に均一に分散される、（３）ミセル構造を形成する、（４）生理活性成分１２、第一水性組成物１４、親水性組成物の表面に吸着される、（５）生理活性成分１２の表面に配置される第一水性組成物を置換する、（６）生理活性成分１２または親水性組成物を、界面活性剤ミセル２２を形成するためにミセル構造のコアに分割する、そして（７）生理活性成分１２、界面活性剤ミセル２２、安定化界面活性剤２８またはナノカプセル３６のサイズを減少させるのに有効な熱力学的推進力を供給する。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「界面活性剤」は、極性溶媒によって溶解されるのが熱力学的に好ましい極性部分、および無極性溶媒によって溶解されるのが熱力学的に好ましい炭化水素部分を含む任意の分子をいう。この用語「界面活性剤」はまた、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤を含むことも意味される。本明細書中で使用される場合、用語「アニオン性界面活性剤」は、水溶液中でアニオンを形成するようにイオン化する極性部分を有する界面活性剤をいう。同様に、「カチオン性界面活性剤」は、水溶液中でカチオンを形成するようにイオン化するカチオン極性部分を有する界面活性剤をいう。同様に、「非イオン性」界面活性剤は、水溶液中でイオン化しない極性部分を有する界面活性剤をいう。
【００４７】
理論に束縛されることを望まないが、界面活性剤は、第一物質が溶媒和され、そしてこの第一物質の任意の分子群が分散されるように、第二物質中に分散された第一物質の間の表面張力または界面張力を減少するのに有効な分子をいうと、一般的に考えられる。代表的には、第一物質の流体力学的直径は、界面活性剤の添加後に増加する。それにもかかわらず、界面活性剤組成物１６は、第一水性組成物１４で界面活性剤ミセル２２のサイズまたは直径を減少させ、そのため、本発明を行う際に、ナノカプセル３６のサイズを減少させるのに有効であると考えられる。
【００４８】
界面活性剤組成物１６は、界面活性剤成分（図示せず）のみを含有し得るか、または必要に応じて生体適合性油成分１８を含有し得る。この界面活性剤成分は、約１未満から約１３単位より上の範囲のＨＬＢ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  Ｂｏｌａｎｃｅ）スケールにおいて特徴付けられ得る。
【００４９】
約６．０単位未満のＨＬＢ値を有する界面活性剤成分は、不十分であるか、または水性（ａｑｕｅｏｕｓ）もしくは水性（ｗａｔｅｒ−ｂａｓｅｄ）組成物中に分散し得ないと記載され得る。さらに、約６．０単位未満のＨＬＢ値を有する界面活性剤成分は、疎水性または非イオン性界面活性剤として特徴付けられ得る。約７．０単位より大きいＨＬＢ値を有する界面活性剤成分は、約７．０単位より大きいＨＬＢ値を有する界面活性剤が水性（ａｑｕｅｏｕｓ）もしくは水性（ｗａｔｅｒ−ｂａｓｅｄ）組成物中に分散される場合、分散を明確にするための半透明の乳状物を形成し得るものと記載され得る。
【００５０】
好ましくは、界面活性剤組成物１６の界面活性剤成分は、本発明の方法を行う際に、約６．０未満のＨＬＢ値を有する。なおより好ましくは、界面活性剤組成物１６の界面活性剤成分は、約５０ｎｍ未満の直径を有するナノカプセルの調製を容易にするために、約５．０単位未満のＨＬＢ値を有する。
【００５１】
界面活性剤成分はまた、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）値によって特徴付けられ得る。好ましくは、界面活性剤組成物１６の界面活性剤成分は、約３００マイクロモル（μｍ）未満のＣＭＣ値を有する。なおより好ましくは、界面活性剤成分は、約２００μｍ未満のＣＭＣ値を有する。
【００５２】
理論に束縛されることを望まないが、第一水性組成物１４に導入して、第一水性組成物１４によって作製された熱力学的に不都合な状況に対して、疎水性界面活性剤成分の表面の曝露を最小化する場合、界面活性剤組成物１６の界面活性剤成分は、生理活性成分１２の表面に吸着すると考えられる。従って、界面活性剤成分は、生理活性成分の表面に吸着して、第一水性組成物１４に曝露され得る界面活性剤成分の表面領域を減少させる。生理活性成分１２上への界面活性剤組成物の吸着は、生理活性成分１２および／または界面活性剤ミセル２２のサイズの減少を容易にすると考えられる。
【００５３】
界面活性剤組成物１６の界面活性剤成分は、個々の界面活性剤として供給され得るか、または種々に調製された２つ以上の界面活性剤の混合物に供給され、続いてこの混合物は、界面活性剤組成物１６を形成するように組み合わされ得る。約６．０単位未満のＨＬＢ値または約２００μｍ未満のＣＭＣ値を有する、適した界面活性剤のいくつかの非網羅的な例は、Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｂａｒｒｙ，Ｂ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，（１９８３））またはＰｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ：ｄｒｕｇ，ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，第３版、Ｂｒｏｎｏｕｇｈ，Ｒ．編．，１９９９、またはＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ（Ａｓｈ，Ｍ．編、Ｇｏｗｅｒ  Ｐｕｂ．（１９９３））（これらは本明細書中で参考として援用される）に列挙される。例として、界面活性剤成分は、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭ−ジオール）、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭ−ジオール）のブレンド、１つ以上のアセチレンジオール基を有する分子、セチルアルコールまたはこれらのいずれかの任意の組み合わせ、であり得る。
【００５４】
界面活性剤組成物１６の任意の生体適合性油成分１８は、液体、蒸気として、または顆粒形態で界面活性剤成分と組み合わされ得る。選択される任意の生体適合性油成分１８の形態は、好ましくは、この任意の生体適合性油成分１８が以下のことをするのを可能にする：（１）界面活性剤組成物１６内に導入される前に、安定性を維持する、（２）界面活性剤組成物１６内に均一に混合される、（３）界面活性剤成分を溶解または分散する、そして（４）界面活性剤組成物１６の疎水性を増加させ、それによって、生理活性成分１２、界面活性剤ミセル２２、安定化界面活性剤ミセル２８またはナノカプセル３６のサイズが、本発明を行う場合に減少され得る程度が増加される。
【００５５】
好ましくは、界面活性剤組成物１６中の任意の生体適合性油成分１８の濃度は、第一水性組成物１４中の安定化界面活性剤ミセル２８の全容量に基づいて、約１０−７重量パーセントから約１０重量パーセントの範囲である。安定された界面活性剤ミセル２８の全容量に基づいて、約１０重量パーセントより高い任意の生体適合性油成分１８の濃度は、所望され得ない。なぜなら、このようにより高い濃度は、生体適合性油の相容積を増加させ、続いて界面活性剤ミセル２２、安定化界面活性剤ミセル２８またはナノカプセル３６を調製、分散および／または操作する際に問題を生じ得るからである。界面活性剤組成物１６中で約１０−７重量パーセントより低い任意の生体適合性油成分の濃度は、好ましくない。なぜなら、このようにより低い濃度は、界面活性剤組成物の溶媒和または界面活性剤組成物１６の疎水性を増加させるのに有効ではなく、そしてナノカプセル３６の直径を究極的に増加させ得る。
【００５６】
界面活性剤組成物１６の任意の生体適合性油成分１８の濃度は、個々の生体適合性油として供給され得るか、または種々に調製された２つ以上の生体適合性油の混合物に供給され、続いてこの混合物は、任意の生体適合性油成分１８を形成するように組み合わされ得る。生体適合性油成分１８の一部として含まれ得る、適した生体適合性油成分１８のいくつかの非網羅的な例は、Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｂａｒｒｙ，Ｂ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，（１９８３））またはＰｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ：ｄｒｕｇ，ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，第３版、Ｂｒｏｎｏｕｇｈ，Ｒ．編．，１９９９、またはＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ（Ａｓｈ，Ｍ．編、Ｇｏｗｅｒ  Ｐｕｂ．（１９９３））（これらは本明細書中で参考として援用される）に見出され得る。好ましくは、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ヒマシ油もしくはそれらの任意の組み合わせのような、食品油またはＵＳＰグレード油が、本方法を行うために使用される。
【００５７】
界面活性物質組成物１６は、界面活性物質ミセル２２を形成する場合に、生理活性成分１２、第１水性組成物１４、または親水性組成物をミセル構造のコアへ区分化するミセル構造を形成するのに有効な量で含まれ得る。なおさらに好ましくは、界面活性物質組成物１６は、本発明を実施する場合の、生理活性成分のサイズ、界面活性物質ミセル２２のサイズ、および究極的にはナノカプセル３６のサイズを最小化する最大の熱力学的駆動力を提供するのに有効な量で含まれる。
【００５８】
さらに、当業者は、界面活性物質組成物１６の量が、生理活性成分１２、第１水性組成物１４、最適生体適合性油１８に対する界面活性物質成分の比、界面活性物質ミセル２２の任意の所望される特徴、安定型界面活性物質ミセル２８またはナノカプセル３６に基づいて変化し得ることを、理解する。例えば、ヒマシ油のような非極性生体適合性油と混合される約６．０単位のＨＬＢ値を有する界面活性物質成分を含む界面活性物質組成物は、ＤＭＳＯと混合される約４．０単位の界面活性物質成分を含む第２界面活性物質組成物と同程度の熱力学的駆動力を提供し得る。
【００５９】
界面活性薬剤組成物１６の量は、安定型界面活性薬剤ミセル２８の全容量に基づいて、約０．５重量パーセントまで変化し得る。なおさらに好ましくは、界面活性薬剤組成物１６の量は、安定型界面活性薬剤ミセル２８の全容積に基づいて、約０．２５重量パーセント未満である。さらに好ましくは、界面活性薬剤組成物１６は、安定型界面活性薬剤ミセル２８の全容積に基づいて、約０．０５重量パーセント未満の量で存在する。１つの非包括的な例として、界面活性薬剤組成物１６は、安定型界面活性薬剤ミセル２８の全容積に基づいて、約５００ｐｐｍの濃度で全容積の親水性組成物へ加えられ得る。
【００６０】
第１分散装置２０は、生理活性成分１２、第１水性組成物１４および界面活性物質組成物１６に基づくミセル構造の形成を開始および促進する。生理活性成分１２、または親水性組成物の表面上への界面活性物質成分の吸着は、界面活性物質分子がすべて、界面活性物質ミセル２２を形成するために、ミセル構造のコアにおいて生理活性成分１２または親水性組成物を覆い、そしてそれゆえ捕捉するまで、継続する。第１水性組成物１４中の多数の界面活性物質ミセル２２の形成は、界面活性物質ミセル２２の分散を形成する。
【００６１】
一般的に、均質に混合または分散し得る任意の従来の分散装置２０は、本発明に従って、界面活性物質ミセルの分散を形成する際に使用するのに適切であり得る。さらに、当業者は、第１分散装置２０がナノカプセル３６の所望される特徴に依存して非常に変動し得ることを認識する。例えば、第１分散装置２０は、親水性組成物中の生理活性成分１２を分散するため、および界面活性物質組成物１６の添加後の界面活性物質ミセル２２の形成ための任意のデバイス（例えば、音波破砕装置またはボルテックス装置（示されない）など）を備え得る。それにも関わらず、第１分散装置２０が音波破砕装置またはボルテックス装置を備え得るが一方で、この音波破砕装置もボルテックス装置も、本発明の方法を実施する場合に不可欠ではない。
【００６２】
本明細書中で使用される「界面活性物質ミセル」は、障壁が生理活性成分１２、第１水性組成物１４または親水性組成物をカプセル化するように、生理活性組成物生物１２と界面活性物質組成物１６との間の界面での界面活性物質分子の密接に充填された（ｃｌｏｓｅ  ｐａｃｋｅｄ）単一分子障壁として、特徴づけられ得る。この用語「界面活性物質ミセル」が、生理活性成分１２、第１水性組成物１４または親水性組成物を部分的に囲む部分的界面活性物質ミセルまたは半界面活性物質ミセルを含むこともまた理解されるべきである。
【００６３】
上記生理活性成分１２が親水性生理活性成分である場合、界面活性物質分子の極性部分は、親水性生理活性成分の表面と結合する。生理活性成分１２が疎水性生理活性成分である場合、界面活性物質ミセルの炭化水素部分は、疎水性生理活性成分の表面と結合する。
【００６４】
界面活性物質ミセルの形成は、代表的に、臨界ミセル濃度として公知の十分に定義された濃度で生じる。記載されるように、本発明を実施する場合、約２００マイクロモル未満のＣＭＣ値を有する界面活性物質成分が好ましい。
【００６５】
界面活性物質ミセルの２２の分散を形成した後、界面活性物質ミセル２２の分散は、安定化装置２６中へ移送され、ここにおいて、生体適合性ポリマー成分２４が界面活性物質ミセル２２の分散を安定化するために添加される。あるいは、生体適合性ポリマー成分２４は、第１分散装置２０中で界面活性物質ミセル２２の分散へ加えられ得、これは、安定化装置２６の必要性を不要にする。
【００６６】
生体適合性ポリマー成分２４は、第１水性組成物１４中で、安定型界面活性物質ミセル２８を形成するための界面活性物質ミセル２２の分散を安定化する。それゆえ、安定型界面活性物質ミセル２８の分散は、生体適合性ポリマー成分２４の添加後、第１水性組成物１４中で存在する。
【００６７】
本明細書中で使用される用語「生体適合性」は、細胞傷害性（所望されないタンパク質または核酸の改変もしくは所望されない免疫応答の活性化）を引き起こすことなく生物学的な系と相互作用し得る物質をいう。
【００６８】
生体適合性ポリマー成分２４は、液体として、蒸気として、または顆粒形態で、界面活性物質ミセル２２の分散へ導入され得る。生体適合性ポリマー成分２４の選択される形態は、好ましくは、生体適合性ポリマー成分２４が（１）界面活性物質ミセル２２の分散への添加前まで安定した状態を維持する、（２）界面活性物質ミセル２２の分散へ均質に分散される、（３）第１水性組成物１４の粘度を増加させる、（４）界面活性物質ミセル２２および第１水性組成物１４の界面で境界層を形成する、（５）界面活性物質ミセル２２の表面上で吸着される、（６）イオントフォレーシスの交換が可能である、（７）溶質の添加の際に沈殿され得る、（８）酵素変性、表面侵食および／またはバルク侵食し得る、（９）生理活性成分１２の機能的活性を妨害もマスクもしない、（１０）界面活性物質ミセル２２の分散の凝集および／または凝塊形成を妨げる、そして（１１）粒子溶解プロフィールを入手し得る、ことを可能にする。
【００６９】
生体適合性ポリマー成分２４は、界面活性物質ミセル２２をコーティングし、そしてそれゆえ界面活性物質ミセル２２を安定化するのに有効な量で、含まれ得る。さらに、当業者は、界面活性物質ミセル２２を安定化するために使用される生体適合性ポリマー成分２４の量が、生理活性成分１２、第１水性組成物１４、界面活性物質組成物１６、温度、ｐＨ、浸透圧モル濃度、任意の最適溶質または最適溶媒の存在、界面活性物質ミセル２２、安定型界面活性物質ミセル２８の任意の所望される特徴、ナノカプセル３６、あるいは所望される溶解プロフィールに依存して、変化し得ることを理解する。
【００７０】
生体適合性ポリマー成分２４の濃度は本発明に重要ではないが、生体適合性ポリマー成分２４の濃度は、好ましくは、生理活性成分１２および所望される溶解プロフィールに基づく。生体適合性ポリマー成分２４の濃度が高すぎる場合、ナノカプセル３６のシェルは溶解し得ない。生体適合性ポリマー成分２４の濃度が低すぎる場合、ナノカプセル３６のシェルは、例えば、細胞傷害性を促進する様式で迅速に溶解し得る。さらに、低すぎる濃度の生体適合性成分２４は、界面活性薬剤ミセル２８を安定化するのに有効な程度の力学的な力を提供し得ない。
【００７１】
生体適合性ポリマー成分２４の高すぎる濃度はまた、このような高い濃度が第１水性組成物１４の粘度を増大させ得、そして結果として安定型界面活性薬剤ミセル２８を調製、混合および／または移送するのに困難を生じ得るので、あまり所望され得ない。生体適合性ポリマー成分２４の低すぎる濃度は、より低濃度が界面活性薬剤ミセル２２を安定化するために必要とされる粘度を提供し得ず、しかも第１水性組成物１４中の界面活性薬剤ミセル２２の凝集を妨げるために界面活性薬剤ミセル２２を効率的にコーティングすることができないので、あまり好適ではあり得ない。
【００７２】
生体適合性ポリマー成分２４は、個々の生体適合性ポリマーとして供給され得るか、または２つ以上の生体適合性ポリマー（これらは、引き続いて組み合わされ、生体適合性ポリマー成分１８を形成する）の種々の調製混合物で供給され得る。生体適合性ポリマーのいくつかの非包括的な例としては、以下が挙げられる：ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート（ｐｏｌｙａｌｋｙｌｅｎｅ  ｔｅｒｅｐｔｈａｌａｔｅ）、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそのコポリマー、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル酸エステルとメタクリル酸エステルとのポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチラート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシルエチルセルロース、セルローストリアセテート、セルロース硫酸ナトリウム塩、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）（ｐｏｌｙ（ｈｅｘｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルアセテート）、ポリビニルクロリドポリスチレン、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｒｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルテン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギネート、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）（ｐｏｌｙ（ｈｅｘｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）（ｐｏｌｙ（ｏｃｔａｄｅｃｌ  ａｃｒｙｌａｔｅ））、ならびにこれらの任意のコポリマーおよびこれらの任意の組み合わせ。
【００７３】
さらに、酵素学的分解、または、光、超音波エネルギー、照射、温度変化、ｐＨ変化、浸透圧変化、溶質濃度変化もしくは溶媒濃度変化の適用に際した変化に対して改変される生体適合性ポリマーもまた、生体適合性ポリマー成分２４の部分として含められ得る。好ましくは、生体適合性ポリマー成分２４は、界面活性物質ミセル２２を実質的にコーティーングし得る（そして、好ましくは、連続的にコーティーングし得る）、親水性ポリマーである。さらにより好ましくは、親水性の生体適合性ポリマー成分２４は、イオントフォレーシス交換（ｉｏｎｏｔｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）をなし得る。
【００７４】
本発明の説明は、主として、親水性の生体適合性ポリマー成分２４に関してなされるが、任意の他の生体適合性ポリマー（例えば、疎水性の生体適合性ポリマー）が、なお本発明の利点を実現させながら、本発明に従って、親水性の生体適合性ポリマーの代わりに置き換えられ得るということを理解すべきである。同様に、任意の生体適合性ポリマーの任意の組み合わせが、なお本発明の利点を実現させながら、本発明に従って、含められ得ることが理解されるべきである。
【００７５】
一般的に、生体適合性ポリマー成分２４が界面活性物質ミセル２２を安定化させるのを許容するために適切である、任意の従来の装置および技術が、本発明に従って、安定化装置２６として使用され得る。さらに、他のいかなるデバイス（例えば、高圧ホモジナイズ化または高度超音波処理）も、好ましくは、安定化の間には含ませない。
【００７６】
界面活性物質ミセル２２を安定化させた後、安定化された界面活性物質ミセル２８を、第２分散装置３２内に配置された第２水性組成物３０に移し得る。安定化された界面活性物質ミセル２８は、安定化された界面活性物質ミセル２８の液滴を機械的に形成することによって移され得、これが引き続いて、第２水性組成物３０に導入される。
【００７７】
第２水性組成物３０は、水のみを含み得るか、または必要に応じて、安定化された界面活性物質ミセル２８を取り囲む生体適合性ポリマー成分２４を沈殿させるための溶質を含み得る。生体適合性ポリマー２４を沈殿させるために使用され得る溶質のいくつかの非包括的な例としては、周期表に列挙された元素から誘導されるイオン種が挙げられる。
【００７８】
好ましくは、第２水性組成物３０は、生体適合性ポリマー成分２４を沈殿させ、かつ、本発明の分散され、そして必要に応じて微粒化されたナノカプセル３６を形成するために有効な量の溶質を含む。本明細書中で使用される場合、用語「沈殿（させる）」は、安定化された界面活性物質ミセル２８を取り囲む生体適合性ポリマー成分２４を凝固させることか、または硬化させることをいう。用語「沈殿」がまた、生体適合性ポリマー成分２４を溶質に曝露した場合に生じ得る、生体適合性ポリマー２４の任意の結晶化を包含することを意味するということもまた、理解されるべきである。
【００７９】
さらに、ナノカプセル３６の効力を調節し得る任意の他の成分が、第２水性組成物の部分として含めることにより、ナノカプセル３６の機能的活性を調節し得る。例えば、第２水性組成物は、さらなるコーティーング賦形剤（例えば、細胞認識成分または種々のイオン種（例えば、Ｍｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ａｌ３＋、Ｂｅ２＋、Ｌｉ＋、Ｂａ２＋、Ｇｄ３＋）、もしくは生体適合性ポリマー成分２４と相互作用し得る任意の他のイオン種）を含み得る。
【００８０】
用語「細胞認識成分」は、本明細書中で使用される場合、標的細胞の表面上の成分を認識し得る分子をいう。細胞認識成分としては、細胞表面抗原に対する抗体、細胞表面レセプター（例えば、レセプター媒介性エンドサイトーシス、ペプチドホルモンなどに関与する細胞表面レセプター）に対するリガンドが挙げられ得る。
【００８１】
安定化された界面活性物質ミセル２８が、生体適合性ポリマー成分２４を沈殿させるための溶質を含む第２水性組成物３０中でインキュベートされる場合に、ナノカプセル３６がサイズの減少を受けることが観察された。さらに、ナノカプセル３６の凝結懸濁物の形成もまた、安定化された界面活性物質ミセル２８を第２水性組成物中においてインキュベートした後に観察された。
【００８２】
本明細書中で使用される場合、「凝結懸濁物」は、生理活性成分の物理的吸着によってか、化学的相互作用（沈殿）の間の架橋によってか、またはより長い範囲では、より短い範囲の相反力を超えるファンデルワールス引力によってのいずれかにより、ネットワーク様構造において一緒に保持された、分散粒子の緩い凝集の形成をいう。ナノカプセル３６の凝結懸濁物は、ネットワーク様構造において、種々の量の第１水性組成物１４または第２水性組成物３０を捕捉し得る。さらに、ナノカプセルの凝結懸濁物は、ナノカプセル３６を分散させるために緩く捕捉（ｔａｐｐｅｄ）され得る。
【００８３】
安定化された界面活性物質ミセル２８は、特定のオリフィスサイズを有するノズル（示さず）を介するか、またはエアロゾル化装置（示さず）を介する微粒化を通して、第２水性組成物３０に移され得る。安定化された界面活性物質ミセル２８の微粒化またはエアロゾル化は、代表的に、安定化された界面活性物質ミセル２８をさらに分散させることを可能にし得る剪断力の適用を含む。さらに、転移の間における剪断力の適用はまた、（１）ナノカプセル３６のサイズを減少させるため、または（２）安定化装置２６内において形成され得る、安定化された界面活性物質ミセル２８間のいかなる集塊化も会合も破壊するため、に有効であり得る。例えば、約１００ｐｓｉ未満のノズル圧を使用して、安定化された界面活性物質ミセル２８を微粒化し得る。
【００８４】
ナノカプセル３６の直径もまた、安定化された界面活性物質ミセル２８を第２水性組成物中に移すために使用され得るノズルのオリフィスサイズに依存して、変動し得る。あるいは、安定化された界面活性物質ミセル２８を、生体適合性ポリマー２４を沈殿させる溶質を含む第２水性組成物３０に添加して、ナノカプセルの皮下送達用散剤などを提供する目的のナノカプセル３６の散剤を形成し得る。
【００８５】
第２水性組成物３０中においてナノカプセル３６を沈殿および／または必要に応じてインキュベートした後に、ナノカプセル３６を濾過するか、遠心分離するか、または乾燥して、分離かつ分散したナノカプセル３６を獲得し得る。ナノカプセル３６は、後の使用のために、凍結され得るかもしくは再構築され得るか、または以下のような投与経路によって、標的細胞もしくは標的組織に送達され得る：経口、静脈内、皮下、腹腔内、クモ膜下腔内、筋内、吸入、局所的、経皮的、坐剤（直腸）、膣座薬（膣）、尿道内、門脈内、肝内、動脈内、眼内、経鼓膜的、体液内（ｉｎｔｒａｕｍｏｒａｌ）、クモ膜下腔内、経粘膜、口腔内または任意のこれらの任意の組み合わせ。
【００８６】
約５０ｎｍ未満の直径を有するナノカプセル３６は、いくつかの理由のために、標的細胞への生理活性成分の送達において有利である。第１に、約５０ｎｍ未満の直径を有するナノカプセル３６は、標的細胞への輸送の間の分解に対して、生理活性成分を防御することによって、生理活性成分の送達を増強する。
【００８７】
第２に、約５０ｎｍより小さい直径を有するナノカプセル３６は、効率的な細胞の取り込みを促進する。標的細胞中への効率的な細胞の取り込みは、粒子が約５０ｎｍよりも大きい直径を有する場合に対して、粒子が約５０ｎｍより小さい場合に代表的に起こる。
【００８８】
第３に、標的細胞によるナノカプセル３６の取り込みは、輸送系（例えば、ナノカプセルの３６のリソソームによる分解を回避する非エンドソーム経路）を介して起こると考えられる。実際に、本発明のナノカプセル３６は、ナノカプセル３６を代表的に分解するエンドソーム調節経路を（全てでないにしても）ほとんど迂回するカベオリン調節経路を介して細胞中に効果的に輸送されると考えられる。
【００８９】
第４に、ナノカプセル３６は、生物活性の成分から分離する生体適合性ポリマーシェル（ｓｈｅｌｌ）を有する。事実、この生物活性成分は、このナノカプセル３６の生物適合性ポリマーシェルに巻き込まれたり、包埋されたり、または吸着されたりしていない。生物活性成分が、生体適合性ポリマーシェルに巻き込まれたり、包埋されたり、または吸着されたりしていない場合、このナノカプセル３６を取り込む細胞は、アポトーシスまたは細胞死を回避する。
【００９０】
第５に、ナノカプセル３６を本方法に従って調製する場合、生体適合性ポリマーシェルによって囲まれた生物活性成分をコア内に封入することは、このナノカプセル３６の早まった分解を避けるか、またはこのナノカプセルのインビボでの輸送の間の細胞傷害性応答を避けるのに有利である。コア内に生物活性成分を封入することは、このナノカプセル３６から放出する間にいかなる零破裂現象なく生物活性成分の一次放出速度を生じる。
【００９１】
いかなる零破裂現象もないナノカプセルから生物活性成分の一次放出速度はまた、コーティング溶解プロフィールの合理的な設計が、細胞傷害性を最小にすることを可能にする一次放出速度としての有用な性質である。本明細書において使用される場合、用語「溶解プロフィール（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ）」とは、生体適合性ポリマーシェルがナノカプセルのコアから生物活性因子を放出するように溶解されるかまたは分解される速度をいう。
【００９２】
本発明の方法によって調製されるナノカプセル３６の別の利点は、有機溶媒の添加が、このナノカプセル３６を形成するのにほとんど（例えあったとしても）必要とされないことである。ほとんどの（全てではない）有機溶媒の使用を本発明の方法から排除することは、有益である。なぜなら、有機溶媒が生物活性成分１２に損傷を与え得るか、標的細胞を破壊し得るか、またはナノカプセル３６の調製の間に有毒であり得るからである。ほとんどの（全てではない）有機溶媒の排除は、複雑な溶媒除去技術（例えば、溶媒希釈、真空エバポレーションなど）の必要性を排除し、そしてこのナノカプセル３６の調製の間、任意の関連費用または複雑なプロセスストラテジーを未然に防ぐ。
【００９３】
本発明のナノカプセル３６はさらに、生物活性成分（特に、疎水性生物活性成分（例えば、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド））の安定なカプセル化を可能にする。本明細書において用いられる場合、「安定なカプセル化」とは、カプセル化された生物活性成分の構造の維持をいう。核酸について、低分子量の核酸分解産物の出現（これについては、電気泳動によってアッセイし得る）は、実質的に排除される。このナノカプセル３６をまた用いて、水への可溶性または電荷密度を問わず、いかなる生物活性成分をもカプセル化し得る。
【００９４】
（適用）
ナノカプセル３６は、さらなるポリマー結合剤、界面活性剤、充填剤、および他の賦形剤を併用して、生物活性成分１２の送達を増強させる使用のために、ナノカプセル３６を固形投薬形態（例えば、顆粒剤、錠剤、ペレット、フィルムまたはコーティング）へと組み込み得る。このように、溶解プロフィールの設計、粒子サイズおよび細胞の取り込みの制御は、ナノカプセルのレベルでとどまっている。このような適用は、肺送達のためのナノカプセルのペレットまたはデバイス媒介送達のためのナノカプセルフィルムを迅速に溶解するという創造を含むがこれに限定されない。
【００９５】
別の適用において、ナノカプセル３６を、ナノカプセルの生体適合性ポリマーシェルまたはコーティング中への、ポリマー選択による特定の細胞もしくは組織の取り込みおよび／または細胞認識成分の封入について設計し得る。このようなコーティングは、標的細胞への生物活性因子の特異的な送達または標的細胞への生物活性因子の送達の増加に対して有用性を有する。このような適用としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：化学療法剤もしくはアンチセンスＤＮＡの腫瘍のターゲッティング、抗原提示細胞への抗原送達、網膜細胞へのリボザイムの眼球送達、タンパク質抗体の経皮送達、あるいはペプチド核酸の経鼓膜送達。
【００９６】
（性質の決定および特徴付け技術）
種々の技術を本明細書において利用した。これらの技術の説明は、以下に従う：
（図２Ａ）：サンプルを、分散されるように新たな劈開雲母上に調製し、風乾させ、Ｊ型スキャナーおよび周囲タッピング（ｔａｐｐｉｎｇ）モードホルダーを備えるＮａｎｏｓｃｏｐｅ  ＩＩ  マルチモードＡＦＭ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてイメージングした。１２５μｍ長のシリコンカンチレバー（ＩＢＭＳＣ型）は、ＩＢＭから提供され、そして２５０〜４５０ｋＨｚの共鳴周波数を有する。全てのイメージングはタッピングモードで行われ、イメージは５１２×５１２ピクセルであり、走査周波数は１ｋＨｚであった。高さ、振幅、および位相を収集した。イメージをＤＩソフトウェアでプロセスし、そしてＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  ＳＸＭで分析した。Ａ：２相系（低ＨＬＢ界面活性剤）からの処方Ｑ、Ｂ：２相系（高ＨＬＢ界面活性剤）からの処方Ｓ、Ｃ：１相系（高ＨＬＢ界面活性剤）からの処方Ｔ、Ｄ：２相系（ＣＭＣより低い界面活性剤）からの処方Ｖ。
（図２Ｂ）：ナノカプセルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２））中に１０％イソブタノール溶液中に放出した。サンプルを、二通り実行した。
（図２Ｃ）：公称３００ｎｇのＤＮＡサンプルを、界面活性剤を含むマスターバッチからアリコートし、そして市販のミニプレップカラムを通してプロセスした。溶出液を、ＱｉａｑｕｉｋＴＭカラムを通して再循環させて３回（４、５）または２回（６、７）のいずれかで回収するか、あるいはＺｙｍｏｃｌｅａｎＴＭカラムを通して再循環させて２回（８，９）回収した。サンプルを、市販の共沈剤を用いてアルコール沈澱させ、ＳｙｎｅｒｇｅｌＴＭを用いて改変した１．５％アガロースゲル上で電気泳動し、ＳｙｂｒＧｏｌｄＴＭ色素を用いて染色し、Ｓｔｏｒｍ８６０ＴＭでデジタル化し、そして同じマスターバッチ（１０、１１）由来の改変されていないが再沈澱させたサンプルと比較した。レーン１〜３：１００ｎｇ、５０ｎｇおよび５ｎｇのλＤＮＡ。
（図３）：エンドサイトーシス活性を、クラスリン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）の免疫シグナルレベルによって評価した。ポトサイトーシス（ｐｏｔｏｃｙｔｏｔｉｃ）活性を、この文献（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において記載されるように、カベオリン−１の免疫シグナルによって評価した。リソソーム活性を、Ｌａｍｐ−１に対するモノクローナル抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって検出した。ナノカプセルの局在化を、ヒツジＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に対して指向するストレプトアビジン−ビオチン免疫複合体によって検出した。ナノカプセルコーティングをヒツジＩｇＧを用いてスパイクしてこの検出ストラテジーを可能にした。
（図４）：７０％コンフルエントでの不朽化したＲｔ−１線維芽細胞培養物を、ナノカプセルの処方Ｋの量を漸増させながら４日間処理し、そして最適化リポソームの処方（用量、５００ｎｇ）を用いて一時的に（３時間）処理した。結果を、細胞のアクチン統合強度（ａｃｔｉｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の割合として表し、そのリポソームの処方と比較した。発現ベクターは、コード４８８であった：ｐＥＦ／ｍｙｃ−ｈｉｓ／ＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
（図５Ａ）：放射線照射したブタ生検を、生理食塩水または６μｇの徐放性ナノカプセルを用いた処理から７日後、スナップ凍結（ｓｎａｐｆｒｏｚｅｎ）させ、次いで、ＲＩＰＡ中でホモジナイズした。１００μｇの溶解サンプルを、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ勾配ゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写（ｔｒａｎｓｆｅｒ）し、そしてβ−ガラクトシダーゼ（１２１ｋＤ）または被膜（約１００ｋＤ）のいずれかについて化学発光を用いて検出した。結果を、ゲル欠損由来の１００ｋＤでの干渉に起因してクマシーブルーを用いて染色した転写後のゲルを標準化した。上基底細胞によって生産された被膜（角質化した膜の成分）を、放射線照射されたブタの皮膚において検出し得、そしてこれを今後の標準化目的のために用いる。レーンＡ：Ｎ、局所的、生検ｏｃ−２；レーンＢ：Ｎ、局所的、生検ｏｃ−３；レーンＣ：Ｏ、局所的、生検１−１；レーンＤ：ＰＢＳのみ、生検１−５；レーンＥ：Ｎ、皮下注射、生検１−６。
（図５Ｂ）：βガラクトシダーゼレセプタータンパク質を、組み込まれた融合タンパク質タグで指向されるモノクローナル抗体によって検出した。Ａ：Ｎ、局所的、生検ｏｃ−１、抗ＸｐｒｅｓｓＴＭでの検出；Ｂ：抗ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｎｂｒａｎｄ因子（Ｓｉｇｍａ）についての検出でＡに対する見解と一致する；Ｃ：未処理の生検、抗ＸｐｒｅｓｓＴＭでの検出。（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
（図６）：ナノカプセルを、水溶性縫合糸コーティング中に組み込み、そして縫合糸を、器官培養中のブタ皮膚の生検に適用した。ナノカプセルを、Ｃｙ３結合ストレプトアビジン−ビオチン複合体を用いて、組み込まれたブタＩｇＧに対して検出し、そして核局在化ＧＦＰ導入遺伝子の発現を、ウサギＩｇＧに対するＦｉｔｃ結合ポリクローナル抗体およびＦｉｔｃ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）に対するＡｌｅｘａ４８８結合ポリクローナル抗体と組合せて、ＧＦＰ（Ａｂｃｏｍ）に対するウサギポリクローナル抗体によって検出した。１０μｇ／ｍｌのビスベンザミドを用いて細胞核を対比染色した。一次抗体を省略するコントロールを、バックグラウンドに対するシグナルレベルの評価のために含む。
（図７Ａ）：ナノカプセルを既に記載したように検出し、核局在化ＧＦＰ導入遺伝子の発現を、ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に対するＣｙ３結合抗体と組合せて、ＧＦＰに対するウサギポリクローナル抗体によって検出した。
（図７Ｂ）ＧＦＰ発現を、図６に記載されるように検出し、そして１０μｇ／ｍｌのビスベンザミドを用いて細胞核を対比染色した。
（図７Ｃ）：癌細胞およびＨＤＦ細胞を、１ウェル当り２０００個および６０００個の細胞をそれぞれ９６ウェルプレートに一晩藩種した。シスプラチン調製物を、グラフに記載されるように、洗浄するのではなく、１８時間ウェルに添加した。７２時間後、細胞の生存度を、市販のＭＴＴアッセイ（ＷＳＴアッセイ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によって評価した。ウェルを、二通り実行した。
（図８Ａおよび図８Ｂ）：リソソームとの共存を、Ｌａｍｐ−１（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に対するモノクローナル抗体を用いて検出した。ナノカプセル化または２７ＫＤのポリエチレンイミンとの複合体化によって形成されるＯ−メチルＲＮＡのＡＦＭイメージが含まれる。
【００９７】
（実施例）
本発明は、以下の実施例においてさらに詳細に記載され、これらは、本発明の範囲内の多数の改変およびバリエーションが当業者に明白であるので、例示としてのみ意図するものである。
【００９８】
（試薬）
（Ａ．核酸縮合試薬）
２７キロダルトン（ｋＤ）のポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）。ＰＥＩを最適化条件（９０％電荷中和）で用いた。
７０〜１５０，０００分子量のポリリジン（ＰＬＬ）。ＰＬＬ縮合材料を、Ｐｉｅｒｅｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手可能なカルボキシイミド化学を用いて、核シグナル局在化ペプチド（ＳＶ−４０Ｔ抗原またはｃｙｓ−ｇｌｙ−ｔｙｒ−ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ａｒｇ−ｌｙｓ−ｖａｌ−ｇｌｙ−ｇｌｙのいずれか）と結合させた。
核マトリクスタンパク質（ＮＭＰ）の調製。ＮＭＰをラット線維芽細胞株、およびＧｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７１（１９９８）：３６３−３７４（これは、参考として本明細書において援用される）において記載される手順を用いてヒトケラチノサイト細胞株から収集した。タンパク質調製物を、記載されるように、核シグナル局在化ペプチドと結合させた。
【００９９】
（Ｂ．界面活性剤）
２，４，７，９−トリメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭ−ジオール）；ＨＬＢ＝４−５、ＣＭＳは決定されない、
ポリ（オキシ−１，２−エタンジオール）、ａ−（４−ノニルフェノール）−ｗ−ヒドロキシ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ−４０（ＮＰ−４０）、Ｎｏｎｏｘｙｎｏｌ−４０、ＰＯＥ（４０）ノニルフェニルエーテル：ＨＬＢ＝１７．８、ＣＭＣ  ２３２μＭ、
ポリオキシエチレン８０ソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）：ＨＬＢ＝１０、ＣＭＣ  １２μＭ、
セチルアルコール：ＨＬＢ＝４、ＣＭＣは決定されない。
【０１００】
（Ｃ．ポリマー）
ヒアルロナン、組換え体、１００万キロダルトン（ＭＭｋＤ）および米国特許第５，８４６，５６１号（これは、本明細書において参考として援用される）において記載されるような核局在化シグナルペプチドとの結合体化。
ヒアルロナン、ヒト臍帯由来、約４ＭＭＫＤおよび結合体化しない。
ポビドン（ポリビニルピロリドン、ＰＶＰ）１０，０００ｋＤ  ＭＷ、および生体結合体化（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）しない。
ポビドン（ポリビニルピロリドン、ＰＶＰ）４０，０００ｋＤ  ＭＷ、および生体結合体化しない。
ポビドン（ポリビニルピロリドン、ＰＶＰ）３６０，０００ｋＤ  ＭＷ、および生体結合体化しない。
テネイシン、２２０ｋＤ、および生体結合体化しない。
【０１０１】
（Ｄ．発現ベクター）
３３４：ｐｃＤＮＡ／Ｈｉｓ／ＬａｃＺ、グルコシダーゼを産生し、ＣＭＶプロモーターを組み込む、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づく、８．６ｋＢ（キロベース）。
４２５：ｐＥＧＦＰ−ｃ／ｆａｒｎ、顕微鏡法を改善するようにファルネシル（ｆａｒｎａｓｙｌ）部分で改変した増強されたＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）発現ベクター、ＣＭＶプロモーター、４．６ｋＢ。
４２３：ｐＥＧＦＰ−ｃ３／ｐ５７（Ｋｐｎ／Ｓｍａ）Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、顕微鏡法を改善するようにサイクリン依存性キナーゼから核局在化タグで改変した増強されたＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）発現ベクター、４．６ｋＢ。
【０１０２】
（Ｅ．細胞）
ＣＣＲＬ１７６４：不朽化したラット新生仔線維芽細胞株（ＲＴ−１’ｓ）
ＨａＣａＴ：不朽化したヒトケラチノサイト細胞株
Ｃａ９：舌起源の扁平上皮細胞癌由来のヒト腫瘍細胞。
【０１０３】
（実施例１Ａ−親水性ナノカプセルに対する変化する分散条件の影響）
適切な分散条件の重要性を、以下の一連の処方物において研究した。処方を、以下によって産生した：ｉ）バス型超音波処理器を用いて氷上で２５μｇのＤＮＡ（４２５）を予め分散させ、ｉｉ）少量の水の中でＤＮＡをボルテックスすることによって凝縮させ、次いで２０分間氷上にてインキュベートし、ｉｉｉ）界面活性剤を添加し、次いで油を３０秒間、１０ワットでプローブ型超音波処理にかけ、ｉｖ）最初に生理食塩水を添加し、続いて１ＭＭｋＤのヒアルロナンポリマー（１％）を防護コロイドとして添加してバス型超音波処理を用いて３ミリリットル（ｍＬ）に分散希釈させ、ｖ）２２ｍＬのＰＢＳ、１０ミリモーラー（ｍＭ）のＣａ２＋、２００ｍＭのＬｉ＋に２５０マイクロメートル（μｍ）の穴に通してパニングすることによって液滴中にエマルションを機械的に剪断し、ｖｉ）一晩中始終インキュベートし、そしてｖｉｉ）遠心分離して、ナノ粒子を回収し、再懸濁および滅菌ろ過した。ＤＮＡに対する凝縮体の重量比を、９０％の電荷中和で色素排除によって決定した。ＴＭジオールは、この実験において、水−非ミセル界面活性剤を表すために用いられるが、一方、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ４０およびＴｗｅｅｎ８０が水−可溶性およびさらにより水−可溶性乳化剤／分散剤補助を表すために用いられた。
【０１０４】
分散状態を、意図的に変化させ、以下によって水溶性媒体中でのミセル形成を阻止した：ｉ）水−可溶性界面活性剤（処方Ｓ、処方Ｔ、処方Ｕ、処方Ｗおよび処方Ｖ）を選択し、ｉｉ）分散相（処方Ｔ）を除去し、そしてｉｉｉ）ミセル形成に必要である界面活性剤負荷未満に減少させた。処方Ｕは、水−不混合性の油（シリコン油）の使用を特徴とした。
【０１０５】
処方を、物理的に特徴付け、そしてインビトロでの遺伝子導入における機能について試験した。定量的結果を表１Ａに要約する：
（表１Ａ：疎水性ナノカプセルにおいて変化する分散条件の影響）
【０１０６】
【表１】
0004751556.tif 000002
ナノカプセルのサイジングを、タッピングモードのＡＦＭによって決定し、そしてイメージを図２Ａにおいて例示する。このデータは、５０ｎｍより小さい平均ナノカプセルサイズが、低水溶性界面活性剤と組合せて多相系でのみ達成し得ることを示す（表１Ａ：処方Ｑ、処方Ｒ  対  処方Ｓ、処方Ｔ、処方Ｕ、処方Ｖ、および処方Ｗ）。さらに、５０ｎｍより小さいナノカプセルのみが、ＣＲＬ−１７６４ラット線維芽細胞において検出可能な導入遺伝子を生じた（表１Ａ）。効果的な分散はまた、減少した凝縮に対応し、そしてＤＮＡの安定性を増強した（減少した電気泳動の分解産物によって示されるような）。開始ＤＮＡを、部分的に弛緩させた（電気泳動による７６％のスーパーコイル化）。この値を基準として用い、１００時間の放出試験の後、なおカプセル化されたＤＮＡにおけるスーパーコイル保持は、多相系において優れていた。
【０１０７】
親水性分散型微粒化ナノカプセルについての放出プロフィールは、直線状であり、０破裂（ｚｅｒｏ  ｂｕｒｓｔ）を示さず、そして７２時間後に約６０％の放出を生じた（図１Ｂを参照のこと）。処方物Ｗ（このシリーズにおける標準界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ  ８０）を合理的ローディイング値（０．４％）で用いて製造される）は、ロードされたＤＮＡの完全な放出をし損なった。図２Ｃは、少量のＤＮＡ（この場合、３００ｎｇのＤＮＡ）が、１０％ブタノール／生理食塩水放出液体のブタノール抽出、続くミニプレップカラム上での単離、そして２６０ｎｍ励起での吸光度の測定をを包含する手順において、正確に回収され得ることを例示する。ＵＶ分光法から得られた結果は、市販の共沈補助剤とのアルコール共沈後の、回集されたＤＮＡの電気泳動によって確認される。実験１Ａは、ミセル溶液由来のコートされた粒子を生成することにおける多相系の重要性を実証し、界面活性剤の所要量を規定し、そしてインビトロ放出プロフィールを測定するための方法を確認する。
【０１０８】
（実施例１Ｂ−粒子機能性に対するプロセスパラメーターの効果）
ＤＮＡ送達についてのナノカプセル機能性に対するプロセスパラメーターの調節の効果を研究するために、一連の処方物（３日間放出するように設計される）を調製した。ラット線維芽細胞培養５日後において、核グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター導入遺伝子を送達するためのこれらの処方物の形質導入の効率を測定した。ＤＮＡ分子の電荷の中和、界面活性剤／油系、総界面活性剤相の容量、プローブ超音波処理の包含、微粒化のための絶対的な要求量および受容浴（ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｂａｔｈ）浸透圧重量モル濃度が調節された。この実験の結果を、表１Ｂにまとめる：
【０１０９】
【表２】
0004751556.tif 000003
本発明の方法における難溶性界面活性剤によるＤＮＡ縮合物の水性分散は、５０ｎｍ未満の平均ナノカプセル直径を生じた。多くの成功した操作レジメンは、カプセル化収量に対する変動する効果を伴って可能であった。セチルアルコール／ヒマシ油系において、縮合下で、２０ｎｍから１２ｎｍまでの平均粒子直径の減少を生じた（表１Ｂ：Ｆ１対Ｆ２）。縮合剤重量比における同じ減少は、２４ｎｍから３６ｎｍまでの平均の粒子の大きさの増加を誘導しつつ、最初のミセル形成のためにＴＭジオール／ＤＭＳＯ界面活性剤系を使用した場合、導入遺伝子送達についてのナノカプセル機能性をさらに維持した（表１Ｂ：Ｆ４対Ｆ５）。この知見は、界面活性剤の選択が、最終平均ナノカプセル直径に影響することを教示する。
【０１１０】
中程度のエネルギー入力のナノカプセル形成の間での除去（プローブの超音波処理、微細化を低下したが、浴超音波処理は続けた）は、そして減少した収量を伴って機能的粒子を生じた（表１Ｂ：Ｆ３対Ｆ４）。この知見は、最適なナノカプセル産生は、いかなる自然微小乳化プロセスにも依存しないことを示す。共溶媒相の容量を、４重量％から５００ｐｐｍまで、粒子機能性に対するいかなる負の効果もなしに、減少した（表１Ｂ：Ｆ４対Ｆ６）。この発見は、本質的に溶媒の存在しないナノカプセルを、本発明の方法によって生成し得ることを示す。最終的に、微粒化受容浴から、ナノカプセル機能性に対するいかなる負の効果もなしに塩を除去した。（表１Ｂ：Ｆ６対Ｆ７）
（実施例２−ヒトケラチノサイトにおけるナノカプセル取り込みに対するナノカプセルのサイジングの影響）
不死化ＨａｃａＴヒトケラチノサイト培養物（ＨａｃａＴ）における細胞内輸送のに対するナノカプセルのサイジングの効果を、この実施例において調査した。この一連の処方物において、このミセル分散物を、異なる開口部直径のシリンジによって剪断した。このコーティング重量をまた、１：１  ＤＮＡ：ポリマー（ｗ／ｗ）から１：４０まで低くして、溶解プロフィールを５日から３日まで短くした。このれの実験において、ナノカプセル処方物を、ＤＮＡおよびＰＥＩの標準ポリプレックス（ｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ）、ならびにリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｄ）プラスミドＤＮＡと比較した。表２は、実験設計および結果をまとめる：
【０１１１】
【表３】
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刺激されていない状態と比較して、ナノカプセルは、標準処方物に対して、細胞飲作用活性を増加させ、そしてより小さいナノカプセルは、クラスリンコート小窩（ｐｉｔ）から小胞（ｃａｖｅｏｌａｅ）へと飲作用活性を変化させたことが観察された（表２：処方物Ｏ対ｐｅｉ−ＤＮＡおよびリポプレックスｐＤＮＡ）。ナノカプセルが、添加後１０時間で、リソソーム共存を回避し、より小さいナノカプセルが特に効果的であることがさらに観察された（表２：処方物Ｏ対ｐｅｉ−ＤＮＡおよびリポプレックスｐＤＮＡを参照のこと）。これらの結果は、さらに図３に例示される。この改良は、ＨａｃａＴケラチノサイトについての公開された取り込み研究との比較によってさらに強調される。初代ケラチノサイトと比較して、裸のＤＮＡオリゴヌクレオチド（２０μＭ）の取り込みが、ＨａｃａＴにおいて非常に乏しく、そして２時間でリソソームと一致して点状の小胞におけるオリゴヌクレオチドの蓄積を示した。対照的に、本発明の方法の親水性分散型微粒化ナノカプセルを使用して、添加後１０時間でのリソソームの完全な回避が実証された。これらの結果は、本発明のプロセスの産物が、増加しかつ長期の有効性を有することを示す。
【０１１２】
（実施例３−ＤＮＡおよび試薬誘導細胞毒性に対するナノ粒子の効果）
リポソームまたはデンドリマー（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）から放出された可溶化外因性ＤＮＡがアポトーシスを誘導するかどうかを試験するために、Ｒｔ−１を、ロードしたリポソーム複合体／ロードしないリポソーム複合体、ロードしたデンドリマー複合体／ロードしないデンドリマー複合体、ロードしたナノカプセル／ロードしないナノカプセルおよび１μｇ／ｍｌエトポシド（陽性コントロールとしてのＤＮＡインターカレート剤）で処理した。培養物を、標準処方物で３時間処理し、次いで遺伝子産物発現について３０時間後にアッセイした。培養物を、実験の間の完全なＤＮＡ放出を保証するために、ナノカプセルで４日間処理した。コントロールは、アポトーシス細胞死についての陽性コントロールとして、実験が終了する前に一晩培養に適用された、１μｇ／ｍｌエトポシド（ＤＮＡインターカレート剤）を含んだ。他のコントロールとしては、標準化ＰＥＩ−ＤＮＡ複合体、空のナノカプセル、および空のベクタープラスミドＤＮＡを含むナノカプセルが挙げられた。親水性ナノカプセルを、先に記載されるように、３５ゲージシリンジを使用してこの実験のために作製した。
【０１１３】
アポトーシスにおける後の工程の１つは、アポトーシスプログラムの結果としてエンドヌクレアーゼの活性化によって媒介されるＤＮＡ断片化である。従って、ＤＮＡ断片化を、外因性酵素および置換ヌクレオチド（ＴＵＮＥＬ：ｔｄｔ調節ウリジンヌクレオチドおよび標識化）を使用する、フラグメントの末端標識によってアッセイした。結果を、断片化指数として、またはＢＲＤＵ末端標識ＤＮＡを示す総培養物における細胞のパーセントとして表す。培養を、２連で行った。この実験設計および結果を、表３にまとめる。
【０１１４】
【表４】
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徐放性ナノカプセルの使用は、線維芽細胞培養物においてのアポトーシス細胞の画分が３分の１〜１００分の１に減少した。ＤＮＡを含まない従来の試薬は、ＦＩ（断片化指数）において、空のナノカプセルに対して４倍の増加を示したが、さらなる試薬を含まないさらなるＤＮＡの存在下において、さらなる試薬を含まずに、さらに５０〜１００％増加した。コーティング重量を１：４０から１：４００に減少すると、平均ナノカプセル直径の２０ｎｍから５７ｎｍへの増加、および培養におけるアポトーシスの誘導の領域の出現を生じた（表３：処方物オミクロン対処方物ウプシロン３５）。コーティング重量を１：４０から中間の１：１００に減少すると、粒子サイズの増加および細胞毒性の出現を伴わずに、形質導入の効率が減少した。これらの知見は、ナノカプセル設計が、ナノカプセルの完全性の維持において役割を果たすこと、ならびにサイズの効果および溶解プロフィールが、観察される細胞毒性および機能性とに寄与し得ることを示す。本発明者らは、ナノカプセル処方物の適用が、アポトーシスプログラムの誘導を伴わずに投薬を有用な効率レベルに上昇したと結論付けた。
【０１１５】
表３Ｂは、線維芽細胞溶解物中で測定された処方物Ｋ．３５の用量応答を用いてこの改良を例示する。ＧＦＰ産生を、漸増用量のナノカプセルによる４日間の処理の後に、線維芽細胞溶解物中で測定した。９．５μｇ用量のナノカプセルは、細胞毒性のいかなる痕跡も含まないリポソーム処方物の産生に匹敵した。
【０１１６】
（実施例４−経皮的手段および皮下的手段による、角質化障壁上皮を横断するブタ組織への高分子のナノカプセル送達）
ブタ生検器官培養系における組織への非ウイルス核酸送達のためのナノカプセルの有用性を、実験した。６ｍｍおよび８ｍｍの円状の生検を、滅菌条件下で、鎮静化した研究動物から収集し、そしてメッシュ上で、２０％ウシ胎仔血清を含有する培地と部分的に接触させて培養した。生検を、９０μｌ（６．３μｇ）で注射するか、または３×３０μｌのアリコートで局所処理するかのいずれかを行った。生検を、７日後に瞬間冷却し、そしてβガラクトシダーゼ産生測定のために、切片化／ホモジナイズした。この実験からの処方物の情報および結果を、表４にまとめる：
【０１１７】
【表５】
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照射した組織溶解産物のウエスタンブロットは、生理食塩水で処理して同様に培養した６ｍｍ生検材料を超える、処方物Ｎ（Ｆｏｍｕｌａ  Ｎ）を用いて局所的に処理した２連の生検材料における、β−ガラクトシダーゼの３倍の増加を示した。処方物Ｏナノ粒子を用いて局所的に処理した８ｍｍ生検材料においては、２倍の増加しか測定されなかった（図５Ａ参照）。処方物Ｏは、処方物Ｎポリマーのより高分子量のアナログを用いて生成し、このことは、粒子形態、用量効果、またはこの差異に関連する２つの処方物間の異なるインサイチュ放出プロファイルの相違を示唆する。ナノカプセル送達効果における初期の細胞型特異的な差異を同定するために、組織切片を、細胞特異的エピトープに対する抗体を使用する二重標識実験において、β−ガラクトシダーゼ発現に対して分析した（図４Ｂ参照）。これらの切片のデジタル画像分析は、照射したケラチノサイトおよび内皮細胞が、１０日放出処方物を用いた処理後７日目の器官培養物において、容易に形質導入されることを示した。線維芽細胞の特定の定量は、細胞特異的マーカーなしでは不可能であったが、発現領域の１１倍の増加をＮ生検材料の真皮において測定した（図５Ｂ参照）。興味深いことに、試験した処方物ＮおよびＯで局所的に処理した生検材料の両方について、形質導入された血管の領域パーセントは、１００μｍ〜３００μｍの間の深さの近傍領域において約５０％減少した（表４：乳頭状内皮細胞（ｐａｐ）と網様状内皮細胞（ｒｅｔ）との比較）。これらのデータは、ナノカプセルが表皮を透過して真皮に侵入したことを示唆する。
【０１１８】
（実施例５：物理学的標的化におけるさらなる有用性のための固体投薬形態への本発明のナノカプセルの組込み）
核ＧＦＰ導入遺伝子を含むナノカプセルまたは空のベクターを、以下の成分をボルテックスすることにより縫合糸コーティングに組み込んだ：１０００μｌの容積中のｉ）プラスミドＤＮＡ含有５０μｇのナノカプセル、ｉｉ）２００μｇのウシムチンおよびｉｉｉ）７５μｇのスクロース（６０％ｗ／ｗ）。縫合糸を、このコーティングを含む穿刺した微量遠心分離チューブに縫合糸を５回通すことにより無菌的にコートした。遺伝子導入についてのコーティングの機能性を、培養したブタの皮膚生検材料中に縫合糸を適用することによって試験した。生検材料を、生検材料の底が細胞培養培地に接触するようにメッシュ上で培養した。生検材料を、７日間処理し、次いでスナップ冷凍（ｓｎａｐ−ｆｒｏｚｅｎ）し、そして免疫蛍光顕微鏡法のために切片化して、ナノカプセル透過性および導入遺伝子送達を評価した。
【０１１９】
ナノカプセル透過性を、ヒツジＩｇＧに対するストレプトアビジン−ビオチン免疫複合体によって検出した。ナノカプセルコーティングを、ヒツジＩｇＧを用いてスパイクしし、この検出ストラテジーを可能した。図６Ａは、毛細血管上の蓄積を伴うブタ真皮組織にあたるヒツジＩｇＧシグナルの分布を示している。図６Ａ’において、一次抗体を、スライド処理の間に除去し、バックグラウンド蛍光のレベルを決定した。縫合糸は、この視野において可視である。縫合糸を、陽性の核対比染色を用いず滑らかな対象物として同定可能であった。ＧＦＰ発現をポリクローナルＧＦＰ抗体を使用して確認し、そして非特異的な組織緑蛍光の効果を未然に除去した。図６Ｂは、ＧＦＰポリクローナル抗体を使用した、縫合糸処理した真皮全体にわたる核局在したＧＦＰ発現を示す。縫合糸は、７５０ミクロン離れていて現れている。図６Ｃは、空のベクターコーティングで処理した生検材料におけるＧＦＰ発現の損失を示している。この実施例は、物理学的に標的化された高分子送達における使用についてナノカプセルの有用性を実証する。
【０１２０】
（実施例６：ナノカプセルコーティングの設計による局所標的化のためのナノカプセルの有用性）
（線維芽細胞標的化）
ＧＦＰナノカプセルを、実施例１で上述したような分散噴霧化により調製した。ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｙｌｏｄｏｎｅ）（ＰＶＰ，ＭＷ１０，０００）を、コーティング基剤として使用した。１：４０のコーティング質量比を使用して、２３±２ｎｍの棒状ナノカプセルを生成した。１μｇのＰＶＰナノカプセルを、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）培養物およびＨａｃａＴケラチノサイト培養物の両方に対して４時間適用し、次いでヒツジＩｇＧに対するストレプトアビジン−ビオチン免疫複合体によるナノカプセル取り込みを検出のために固定した。ナノカプセルコーティングを、ヒツジＩｇＧを用いてスパイクし、この検出ストラテジーを可能にした。図７Ａは、ＨＤＦ中のＰＶＰナノカプセルの陽性核局在およびケラチノサイト中のＰＶＰナノカプセルの陰性同時局在（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）（図７：７ａ対７ｂ）を示している。処理していない培養物の図を比較のために含めた（７ａ’７ｂ’）。培地をまた、５μｇのＰＶＰナノカプセルを用いて５日間処理し、次いでＧＦＰ導入遺伝子産生に対して試験した。取り込みの研究と一致して、線維芽細胞培養物のみが、ＧＦＰ導入遺伝子産生を示した（図７：７ａ”対７ｂ”）。
【０１２１】
（腫瘍標的化）
ＧＦＰナノカプセルを、実施例１で上述したような分散噴霧化により調製する。テネイシン（ＴＮ，ＭＷ２００，０００）を、コーティング基剤として使用した。１：２０のコーティング質量比を使用して、１９±０．９ｎｍの球状ナノカプセルを生成した。５００ｎｇのＴＮナノカプセルを、器官培養物中に維持されたブタ生検材料に対して連続的な小さなアリコートで局所的に適用した。生検材料を、局所適用の３分後に培養培地でリンスして、その後、局所以外の任意の送達を除外するために器官培養において新しい培地に交換した。
【０１２２】
上皮由来起源の腫瘍病巣をシミュレートするために、生検材料に１２時間前に、５０，０００個のヒト鱗癌細胞（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）を播種した。７日後の生検材料をスナップ冷凍し、そしてＧＦＰ産生の免疫学的検出のために切片化した。図７Ｂにおいて、図「ａ」は、腫瘍中心における強いＧＦＰ蛍光を示し、図「ｂ」は、ＧＦＰに対するポリクローナル抗体を用いて、このＧＦＰ発現を確認し、図「ｃ」は、細胞核に対する対比染色を用いて切片中の細胞の配置を示し、そして図「ｄ」は、ＧＦＰ抗体を除去したことによるバックグラウンド蛍光のレベルを示す。腫瘍の起源を、上皮マーカーであるケラチン１０／１に対する抗体を用いた陽性検出によって確認した。図「ｂ」と図「ｃ」の比較は、ＧＦＰ発現が、腫瘍中の細胞に限定されていることを示す。既に実施例５で示したように、組織全体にわたる発現もまた、実現可能であり、そしてコーティング設計により調節し得る。この実施例は、ナノカプセル送達が生産的に標的化され得ることを実証する。
【０１２３】
（増強された薬物治療学的ウインドウのための細胞特異的送達）
ナノカプセルを、実施例１に記載したように調製して、疎水性の分子であって、重い副作用が伴う一般的な癌の化学療法剤であるシスプラチンをカプセル化した。１：１００のコーティング質量比を使用して、２９±３ｎｍの不規則なナノカプセルを生成した。標的化効力を、線維芽細胞培養物と扁平上皮癌培養物との比較した、細胞増殖阻害についての用量応答における変化により実証した。細胞を、９６ウェルプレート中に一晩播種し、漸増量のカプセル化したかまたは裸の薬剤で１８時間処理し、次いで、薬物を除去し、そして培地を４８時間後にＭＩＴアッセイを使用して細胞増殖阻害について評価した（総増殖時間は、７２時間となる）。図７Ｃにおいて結果を図示した。このデータは、テネイシンナノカプセルが、非標的細胞を、裸の薬物を使用して細胞が死滅する薬物レベルでの細胞死（ゼロ死（ｚｅｒｏ  ｄｅａｔｈ））から保護した（図７Ｃ：白円と黒円）ことを示す。癌培養物中、ＴＮナノカプセルは、３５０μｇ／ｍｌから１６５μｇ／ｍｌへ推定２００％、細胞生存に対する阻害濃度（ＩＣ５０）を生産的に減少した。実施例６は、コーティング−標的化高分子送達の用途におけるナノカプセルの有用性を実証する。
【０１２４】
（実施例７：薬剤、栄養剤、研究薬剤または美容剤として使用される他の種の改善された細胞取り込みについてのナノカプセル化の有用性）
５００ｋＤのＦｉｔｃ標識したデキストラン、２０マーのＦｉｔｃ標識Ｏメチル化ＲＮＡオリゴヌクレオチドおよび１６マーのリン酸ジエステルＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかを含むナノカプセルを、実施例１に記載のように調製した。１：４０のコーティング質量比を使用して、そして１ＭＭｋＤ組換えヒアルロナン（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）をコーティング基材として利用した。ＰＥＩを使用して，リン酸ジエステルＤＮＡオリゴヌクレオチドを縮合したが、しかし、デキストランまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドナノカプセル処方物にはＰＥＩを含めなかった。薬物送達に対するナノカプセル機能性を、ヒト真皮線維芽細胞の３５ｍｍの培養物中の細胞取り込み活性およびリソソーム活性および細胞取り込みにおける変化を評価することによって試験した。ナノカプセル処方物を裸の種または複合体として処方した種に対して比較した。定量的結果を表７に要約する。
【０１２５】
【表６】
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表７は、ＡＦＭにより全てのナノカプセルついての平均直径が、５０ｎｍ未満であったことを示す。ＤＮＡオリゴヌクレオチドのＰＥＩ複合体を、６７ｎｍで測定して、そして、非荷電ＲＮＡ  Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドのＰＥＩ複合体を、２３６ｎｍで測定した。実施例２で議論したように、ケラチノサイト培養物およびプラスミドＤＮＡを用い、ナノカプセルが、クラスリンおよびカベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）の増大したシグナルレベルに示されるように取り込み活性を刺激する。５００ｋＤのデキストランの場合、取り込み活性は、ナノカプセル化を用いて、小胞およびポトサイトーシス（ｐｏｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）に対して生産的にシフトする（表７、５００ｋＤデキストラン）。添加後４．５時間で、核の取り込みが、裸の種と比較してカプセル化されたデキストランおよびＲＮＡについて増強された。ＤＮＡオリゴヌクレオチドの場合、ナノカプセル化したオリゴヌクレオチドの細胞の取り込みは、複合体化したオリゴヌクレオチドにと比べて減少した。しかし、単純に複合体化したＤＮＡオリゴヌクレオチドの大部分は、その４．５時間までにすでに非生産的にリソソーム中に隔離されている（表７）。添加後１８時間において、ナノカプセル種は、リソソームからの連続性排除を示し、その一方、ＤＮＡオリゴヌクレオチドポリプレックス（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）種は、高いレベルの隔離を示す。リソソームからのナノカプセル排除およびリソソームにおけるポリプレックス隔離のパターンを、フルオレセイン標識されたＯ−メチルＲＮＡオリゴヌクレオチド種（ＦＩＴＥＬ）について図８Ａおよび図８Ｂで図示する。図「８Ａａ」および「８Ｂｂ」は、添加後１８時間後での培養物中のフルオレセイン検出を示す。その分布が、ＲＮＡオリゴヌクレオチドのナノカプセルについては全く核においてのみである（図８Ｂ：ａ対ａ’）ことを示す。ＲＮＡオリゴヌクレオチドポリプレックスで処理した培養物中にリソソームに対する免疫学的マーカーと同時局在する点状の封入体が、みられる（図８Ａ：ａ対ａ’）。ポリプレックスおよびナノカプセルについてＡＦＭ顕微鏡からの粒子サイズ化結果を、ナノカプセル化後のサイズ化における劇的な相違を実証するために含めた（図８Ａ、８Ｂ：８Ｂｂ対ｂ、８Ｂｂ’）。より低分子量であるデキストランおよび安定化していないＲＮＡをカプセル化した処方物をまた、ナノカプセル化が標的化機能のみではなく化学的分解または酵素的分解に感受性をもつ分子の安定化においての補助を提供し得ることを実証するために、類似の取り込み、ナノカプセルサイズおよび収率で調製した。これら実施例は、広範な高分子の送達における使用について、ナノカプセル３６の有用性を実証する。
【０１２６】
本発明を、好ましい実施形態について記載してきたが、当業者は、改変が形態および詳細において本発明の精神および範囲から逸脱することなしに行われ得ることを認識する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ナノカプセルを調製するための本発明の方法の模式図である。
【図２Ａ】  図２Ａ：「異なる分散条件下で調製されたカプセル」は、異なる分散条件下で調製されたナノカプセル処方物の原子間力顕微鏡図を図示する。
【図２Ｂ】  図２Ｂ：「ナノカプセル処方物の累積放出研究」は、放出溶液からの少量のＤＮＡの定量的回収を実証する実験からの結果を図示する。
【図２Ｃ】  図２Ｃ：「レシーバ溶液からのＤＮＡの定量的回収」は、異なる分散条件下で調製されたナノカプセルに関する７２時間にわたる累積放出を図示する。
【図３】  図３：「細胞取り込みのナノカプセル調節」は、ＤＮＡ複合体で処理されたか、ＤＮＡを含有するナノカプセルで処理されたかまたは未処理のＨａｃａＴケラチノサイト培養物の相対的飲細胞活性を図示する。
【図４】  図４：「ナノカプセル処方物についての用量応答」は、ラット線維芽細胞培養物からの全タンパク質のウェスタンブロットの結果を図示する。
【図５Ａ】  図５Ａ：「ブタ真皮におけるナノカプセル送達導入遺伝子産生」は、図５Ｂの実験からのウェスタンブロットの結果を図示する。
【図５Ｂ】  図５Ｂ；「角化関門上皮を横切る高分子送達」は、角化関門上皮を横切る局所ナノカプセル送達を実証する、器官培養研究からのブタ皮膚組織切片の免疫蛍光顕微鏡図を図示する。
【図６】  図６：「縫合中へのナノカプセルの組み込み」は、ナノカプセルの固形投薬形態への組込みを示す。
【図７Ａ】  図７Ａ：「ＰＶＰナノカプセルは、繊維芽細胞により取り込まれるが、ケラチノサイトには取り込まれない」は、３５ｍｍのヒト皮膚繊維芽細胞培養物および不死化ケラチノサイト培養物における、ポリビニルピロリドンナノカプセル取り込みおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を図示する。
【図７Ｂ】  図７Ｂは、テネイシンナノカプセルによるＧＦＰプラスミドＤＮＡの腫瘍標的化を図示する。
【図７Ｃ】  図７Ｃ：「増大した薬物安全性のためのナノカプセルコーティング設計」は、扁平上皮癌およびヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦ）培養物における成長阻害に対する、テネイシンでコーティングされたナノカプセルおよびテネイシンでコーティングされていないナノカプセルの効果を図示する。
【図８Ａ】  図８Ａ：「ポリエチレンイミンと複合体化したＲＮＡオリゴマーの細胞取り込みおよびリソソーム隔離（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）」は、２０マーＦｉｔｅ標識Ｏ−メチルＲＮＡオリゴヌクレオチドを含有するナノカプセルで処理されたＨＤＦ培養物の取り込みを示す。
【図８Ｂ】  図８Ｂ：「添加後１８時間でナノカプセルはリソソーム隔離を回避する」は、２０マーＦｉｔｅ標識Ｏ−メチルＲＮＡオリゴヌクレオチドを含有するナノカプセルで処理されたＨＤＦ培養物の取り込みを示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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