(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸高分子を分解する核酸高分子の分解方法であって、
プローブ核酸高分子と微粒子とを結合させて、プローブ核酸高分子結合微粒子を形成する工程と、
標的核酸高分子を前記プローブ核酸高分子結合微粒子に含まれるプローブ核酸高分子に付加させて、付加微粒子を形成する工程と、
レーザーを照射することによって前記付加微粒子に含まれる微粒子を高エネルギー状態にして、前記高エネルギー状態となった微粒子からのエネルギー移動により前記標的核酸高分子を分解する工程と、
を含み、
前記微粒子は、金属微粒子であり、前記レーザーの集光領域は、（１μｍ）3〜（１ｍｍ）3の範囲であることを特徴とする核酸高分子の分解方法。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸高分子の分解方法であって、
前記微粒子の表面から１００ｎｍ以下の範囲に存在する前記標的核酸高分子を分解することを特徴とする核酸高分子の分解方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の核酸高分子の分解方法であって、
前記標的核酸高分子は、ＤＮＡ及びＲＮＡのうち少なくとも１つであることを特徴とする核酸高分子の分解方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸高分子の分解方法であって、
前記プローブ核酸高分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＰＮＡのうち少なくとも１つであることを特徴とする核酸高分子の分解方法。
【請求項５】
標的核酸高分子を分解する核酸高分子の分解装置であって、
プローブ核酸高分子と微粒子とを結合させ、前記プローブ核酸高分子に標的核酸高分子を付加させた付加微粒子を収容するための収容部と、
レーザーを照射することによって前記付加微粒子に含まれる微粒子を高エネルギー状態にするためのエネルギー供給手段と、
を有し、
前記高エネルギー状態となった微粒子からのエネルギー移動により前記標的核酸高分子を分解し、
前記微粒子は、金属微粒子であり、前記レーザーの集光領域は、（１μｍ）3〜（１ｍｍ）3の範囲であることを特徴とする核酸高分子の分解装置。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸高分子の分解装置であって、
さらに、前記収容部中の付加微粒子を分散させるための分散手段を有することを特徴とする核酸高分子の分解装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸高分子の特定部位を分解する核酸高分子の分解方法及び分解装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸高分子の特定部位を分解する方法として、例えば、制限酵素によるＤＮＡの特定部位の切断が知られている。この制限酵素は主に二重鎖ＤＮＡの位置特異的切断を触媒する酵素であり、ＤＮＡの切断がすべてリン酸ジエステル結合の加水分解により進行する。また、ＤＮＡリガーゼを用いて切断断片と他のＤＮＡ断片を自由に結合できる。
【０００３】
また、化学合成された分子によるＤＮＡの特定部位を切断する方法が知られている。例えば特許文献１には、化学合成された分子としてテキサフィリンを用い、オリゴヌクレオチドにテキサフィリンを共有結合させ、ＤＮＡの特定部位切断を可能とする方法が記載されている。この場合、ＤＮＡの切断は、光分解的切断である。切断は、加水分解（水分子が結合を破壊するように結合をはさんで添加される）ではないと考えられており、また切断は、単独の酸化（光の非存在下で酸化反応が結合の破壊を引き起こす）ではないとも考えられている。切断の機構の詳細は今のところ不明である。
【０００４】
また、リボザイムによるＤＮＡの特定部位を切断する方法も知られている。例えば、特許文献２には、ＲＮＡがすべて、標的ＲＮＡとハイブリッドを形成するように適切に設計されたオリゴヌクレオチドすなわち外部ガイド配列を用いて、原核細胞または真核細胞由来のＲＮａｓｅ  Ｐによる切断に特異性を付与する方法が記載されている。これは標的ＲＮＡの機能発現の防止や生体内における疾患起因遺伝子または障害を起こす遺伝子発現の防止のために有用である。また、この方法によれば、上記の制限酵素による核酸の切断の場合と同様、ＤＮＡ切断がすべてリン酸ジエステル結合の加水分解により進行し、ＤＮＡリガーゼを用いて切断断片と他のＤＮＡ断片を自由に結合できる。
【０００５】
【特許文献１】特表平１０−５０８５８１号公報
【特許文献２】特表平１０−５０８１８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、制限酵素によるＤＮＡの切断方法では、切断部位は予め酵素の種類により決まったＤＮＡ配列部位になるため、自由な位置での切断は困難である。また、酵素による核酸切断の時間空間の制御は困難である。さらに、ＤＮＡ、ＲＮＡの切断部位の塩基がメチル化等により修飾されている場合に切断の効率が低下する。
【０００７】
また、特許文献１の方法では、酵素による核酸切断の時間空間の制御は困難である。
【０００８】
さらに特許文献２の方法でも、制限酵素による核酸の切断の場合と同様、リボザイムによる方法も触媒による核酸の切断であるため時間空間の制御が困難である。また、制限酵素による核酸の切断の場合と同様、リボザイムによる場合もＤＮＡ、ＲＮＡの切断部位の塩基がメチル化等により修飾されている場合に切断の効率が低下する。
【０００９】
本発明は、時間空間を制御して核酸高分子の特定部位を分解する核酸高分子の分解方法及び分解装置である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、標的核酸高分子を分解する核酸高分子の分解方法であって、プローブ核酸高分子と微粒子とを結合させて、プローブ核酸高分子結合微粒子を形成する工程と、標的核酸高分子を前記プローブ核酸高分子結合微粒子に含まれるプローブ核酸高分子に付加させて、付加微粒子を形成する工程と、レーザーを照射することによって前記付加微粒子に含まれる微粒子を高エネルギー状態にして、前記高エネルギー状態となった微粒子からのエネルギー移動により前記標的核酸高分子を分解する工程と、を含み、前記微粒子は、金属微粒子であり、前記レーザーの集光領域は、（１μｍ）3〜（１ｍｍ）3の範囲である。
【００１１】
また、前記核酸高分子の分解方法において、前記微粒子の表面から１００ｎｍ以下の範囲に存在する前記標的核酸高分子を分解することが好ましい。
【００１５】
また、前記核酸高分子の分解方法において、前記標的核酸高分子は、ＤＮＡ及びＲＮＡのうち少なくとも１つであることが好ましい。
【００１６】
また、前記核酸高分子の分解方法において、前記プローブ核酸高分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＰＮＡのうち少なくとも１つであることが好ましい。
【００１７】
また、本発明は、標的核酸高分子を分解する核酸高分子の分解装置であって、プローブ核酸高分子と微粒子とを結合させ、前記プローブ核酸高分子に標的核酸高分子を付加させた付加微粒子を収容するための収容部と、レーザーを照射することによって前記付加微粒子に含まれる微粒子を高エネルギー状態にするためのエネルギー供給手段と、を有し、前記高エネルギー状態となった微粒子からのエネルギー移動により前記標的核酸高分子を分解し、前記微粒子は、金属微粒子であり、前記レーザーの集光領域は、（１μｍ）3〜（１ｍｍ）3の範囲である。
【００１８】
また、前記核酸高分子の分解装置において、さらに、前記収容部中の付加微粒子を分散させるための分散手段を有することが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明では、微粒子に結合したプローブ核酸高分子を標的核酸高分子の特定の位置で特異的相補鎖対形成させ（以下、ハイブリダイズ（hybridize）またはハイブリダイゼーシ
ョン（hybridization）という）、次に微粒子を高エネルギー状態にすることにより、時
間空間を制御して微粒子近傍の標的核酸高分子の部位を切断することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本明細書において「高エネルギー状態」とは通常の状態から少しでも高いエネルギー状態にあることをいう。これは、微粒子を構成する原子、分子の振動回転励起、電子の励起、電子の集団励起、また励起状態の緩和による熱エネルギー、また高エネルギーを有する微粒子の構成粒子やそのイオン、または電子、ラジカル、さらにはプラズマ状態などが含まれる。またこれらのエネルギーが周囲の溶媒に緩和し、溶媒自体が高エネルギー状態になった場合や常温常圧では存在しない
物質状態や高圧状態も含む。また、「表面近傍」とは具体的には微粒子表面から外部または内部に１００ｎｍ以下、好ましくは１０ｎｍ以下、より好ましくは１ｎｍ以下の範囲のことをいう。
【００２１】
本実施形態に係る核酸高分子の分解方法について説明する。
【００２２】
（１）プローブ核酸高分子（探索子用核酸高分子）と微粒子との結合によるプローブ核酸高分子結合微粒子の形成。
まず、標的核酸高分子（ターゲット核酸高分子）中の特定の部位に相補的に付加するプローブ核酸高分子と微粒子とを結合させ、プローブ核酸高分子結合微粒子を形成する。プローブ核酸高分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＰＮＡのうち少なくとも１つである。プローブ核酸高分子を標的核酸高分子の切断対象となる位置と相補的に付加するように適切に設計することにより、標的核酸高分子の目的の位置への特異性を付与することができる。この場合、制限酵素のような特異性付与に関する制限がない。
【００２３】
プローブ核酸高分子の長さとしては特に制限はないが、１０ｍｅｒ〜５０ｍｅｒのものを用いると標的核酸高分子と付加し易いので好適である。標的核酸高分子の分解位置を精度良くするためには、プローブ核酸高分子の長さはできるだけ長い方が良い。また、微粒子の量に対するプローブ核酸高分子の量は、特に制限はないが、１〜数十個の範囲、例えば１〜５０個の範囲が好ましい。
【００２４】
プローブ核酸高分子と微粒子とを結合させる方法としては、例えば、溶液のｐＨ、プローブ核酸高分子のイオン状態等を変化させる等により、プローブ核酸高分子を微粒子の表面に選択的に吸着させる方法、あるいはプローブ核酸高分子と親和性を持つように微粒子の表面を修飾する方法、微粒子と親和性を持つようにプローブ核酸高分子を修飾する方法、その他適当な手法によりプローブ核酸高分子と微粒子表面とを化学的に結合（イオン結合、共有結合、配位結合、金属結合、水素結合、ファンデルワールス結合等）させる方法、微粒子の表面付近にプローブ核酸高分子が入り込むように収着させる方法、また、プローブ核酸高分子の末端を化学修飾し微粒子と結合する方法、すなわち、例えば、微粒子として金微粒子を、プローブ核酸高分子としてＤＮＡを用いた場合については、このＤＮＡの末端を例えばチオール標識したものを用意し、これを金微粒子の表面に結合させる方法等が挙げられる。プローブ核酸高分子の末端の化学修飾としては、このチオール標識の他にもビオチン化標識、ジコキシジエニン化等が挙げられる。
【００２５】
プローブ核酸高分子としてＰＮＡを用いるとより効果的な場合がある。ＰＮＡとは「Peptide Nucleic Acid」の略で、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）に替わる物質として開発された化学合成核酸アナログである。ＰＮＡは、核酸の基本骨格構造である五単糖・リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置換したもので、核酸によく似た３次元構造を有する。ＰＮＡは以下の利点を有する。
【００２６】
（ａ）ＰＮＡは、プローブＤＮＡあるいはプローブＲＮＡと比較して相補的核酸に対し、非常に特異的でかつ強力に結合する。また、核酸の二重鎖に入り込み相補部分とハイブリダイズする性質を持つ。
（ｂ）ＰＮＡと標的核酸高分子とのハイブリダイゼーション反応が迅速に行われるため、ＤＮＡまたはＲＮＡをプローブ核酸高分子として用いるより反応時間を大幅に短縮することができる。
（ｃ）ＰＮＡは電荷のない中性の安定した骨格構造を有するため、溶液のｐＨ、塩濃度等に影響されることなくハイブリダイゼーションが進行する。
（ｄ）ＰＮＡは生体内に存在しない化学合成物質のため、核酸、タンパク分解酵素、加水分解等によりほとんど分解されることがない。
【００２７】
本実施形態において使用される微粒子としては、金属微粒子、非金属微粒子、高分子微粒子等が挙げられる。また、微粒子中には、レーザー等を吸収する有機色素等を含有させて複合微粒子としてもよい。さらに、プローブ核酸高分子と親和性を持たせるために微粒子の表面を修飾してもよい。
【００２８】
金属微粒子としては、典型金属、遷移金属の微粒子であれば特に制限はないが、例えば、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｓｃ、Ｙ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ａｕ、Ａｇ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｒｅ、ランタノイド、アクチノイド等の遷移金属、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ、Ａｌ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｔｌ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｂ、Ａｓ、Ｓｂ、Ｂｉ等が挙げられる。遷移金属の中では、Ａｕ、Ａｇ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｗ、Ｔａ及びＮｂであることがより好ましく、Ａｕ、Ａｇ及び白金族（Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ）等の貴金属であることが酸化されにくいこと等の点からさらに好ましく、Ａｕ、Ｐｔが特に好ましい。また、Ａｕ、Ｐｔ等の表面プラズモン共鳴やバンド間遷移等の光吸収が強く起こるような金属微粒子も好ましい。また、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ等の表面プラズモン共鳴帯が可視領域にある金属微粒子もさらに好ましい。また、ＧａＡｓ、ＧａＴｅ、ＣｄＳｅ等の複合金属の微粒子であってもよい。
【００２９】
非金属微粒子としては、有機色素、有機顔料等の有機化合物、無機顔料等の無機化合物等の微粒子が挙げられる。
【００３０】
高分子微粒子としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ラテックス等の微粒子が挙げられる。また、高分子微粒子中に有機色素、有機顔料等の有機化合物、無機顔料等の無機化合物等を含有させたり、光吸収の大きな基を化学的に結合させたりしてもよい。
【００３１】
微粒子の平均粒径としては、微粒子の溶液中での高い分散性が望ましい等の点から、１００μｍ以下であることが好ましく、１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲であることがより好ましく、１ｎｍ〜１０ｎｍの範囲であることがさらに好ましい。金属微粒子の平均粒径が１ｎｍより小さいと、照射レーザー等の波長が短波長になる傾向があり、操作が煩雑になる可能性がある。また、微粒子の平均粒径の大きさによって標的物の分解反応を起こさせる領域を制御できるため、微粒子の平均粒径は分解の目的等に応じて選択すればよい。なお、微粒子の平均粒径は、例えば大塚電子製の光散乱測定装置（ＤＬＳ−７０００型）を用いて測定することができる。
【００３２】
金属微粒子の製造方法としては、水等の液体中で金属プレート表面をレーザー照射またはマイクロ波照射によりアブレーションするＳＦ−ＬＡＳ法（Surfactant-free laser ablation in solution）、界面活性剤を添加した水等の液体中で金属プレート表面をレーザー照射またはマイクロ波照射によりアブレーションするＳＣ−ＬＡＳ法（Surfactant-controlled laser ablation in solution）、化学的に還元する方法、溶液中で放電する方法等が挙げられ、特に制限はない。金属微粒子に界面活性剤を添加することにより、金属微粒子を安定化させることができ、製造において操作が容易となる等のため、好ましい。
【００３３】
界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系、両性の界面活性剤を使用することができる。通常は、界面活性剤の溶解度、溶媒中の金属微粒子の安定化力等の点からドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が使用される。
【００３４】
（２）プローブ核酸高分子結合微粒子に含まれるプローブ核酸高分子への標的核酸高分子の付加による付加微粒子の形成。
次に、前記プローブ核酸高分子結合微粒子に含まれるプローブ核酸高分子に標的核酸高分子を付加、すなわち標的核酸高分子の特定の位置でプローブ核酸高分子を特異的相補鎖対形成させて、付加微粒子を形成する。例えば、上記プローブ核酸高分子結合微粒子として、金微粒子にプローブＤＮＡを結合させたものを用いた場合、プローブＤＮＡを含む溶液と標的核酸高分子として標的ＤＮＡを含む溶液を混合し、ハイブリダイゼーションさせる。
【００３５】
ハイブリダイゼーションさせるときの、反応液の温度は通常２５℃〜７５℃の範囲で行われるが、３０℃〜４０℃の範囲が好ましい。また、反応時間は通常１時間〜４８時間の範囲で行われるが、５時間〜１２時間の範囲が好ましい。プローブＤＮＡの長さが長い場合には、反応温度を上げてプローブＤＮＡの絡み合いを低減するとハイブリダイズしやすくなる傾向にある。例えば、プローブＤＮＡを含む溶液と標的核酸高分子として標的ＤＮＡを含む溶液を混合し、混合溶液を６０℃に２４時間保ちハイブリダイゼーションさせる。
【００３６】
また効率よくハイブリダイゼーションが起こるために添加物を加えてもよい。界面活性剤（ＳＤＳ、ＮＰ−４０（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（９）Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  Ｅｔｈｅｒ）等）や有機溶媒（ホルムアミド、酢酸など）の溶液中では、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの標的核酸高分子の２次構造が破壊され、プローブ核酸高分子が接近しやすくなるという利点がある。
【００３７】
（３）微粒子を高エネルギー状態することによる標的核酸高分子の分解。
最後に、付加微粒子に含まれる微粒子を高エネルギー状態にして、高エネルギー状態となった微粒子からの周囲へのエネルギー移動により標的核酸高分子を特定部位で分解する。
【００３８】
本発明の実施形態に係る核酸高分子の分解装置の一例の概略を図１に示し、その構成について説明する。分解装置１は、エネルギー供給手段であるレーザー発生装置１０と、集光手段であるレンズ１２と、収容部であるセル１４と、分散手段である撹拌子１６と、を備える。
【００３９】
さらに詳細に説明すると、分解装置１において、例えば有底四角筒状のセル１４の内底部に撹拌子１６を備え、セル１４の開口部２６の図１における上方にレンズ１２が配置され、レンズ１２の図１における上方にはレーザー発生装置１０が配置されている。
【００４０】
本実施形態に係る核酸高分子の分解装置１の動作について図１に基づいて説明する。まず、付加微粒子２０を含む反応液２２が準備され、セル１４に入れられる。このとき、付加微粒子２０は通常、反応液２２に分散された状態である。
【００４１】
その後、反応液２２を撹拌子１６で撹拌しながら、レーザー発生装置１０から発せられるレーザー２４がレンズ１２により集光され、セル１４中の反応液２２に照射される。レーザー２４が所定の強度、所定の時間、付加微粒子２０が分散した反応液２２に照射されると、付加微粒子２０中の微粒子３０は高エネルギー状態となり、高エネルギー状態となった微粒子３０から周囲へのエネルギー移動により、微粒子３０の表面近傍に存在する標的核酸高分子２８が特定部位で分解される。分解効率、位置選択性等の向上のために、反応液２２にレーザー２４を照射するときにレーザー２４をレンズ１２等の集光手段により反応液２２中で集光させることが好ましい。
【００４２】
本実施形態において分解の対象となる標的核酸高分子２８は、ＤＮＡ及びＲＮＡのうち少なくとも１つである。標的核酸高分子２８が核酸の場合、一本鎖核酸でも二本鎖核酸で
もよい。二本鎖核酸の場合、プローブ核酸高分子としてＰＮＡを使用すると効率よく二本鎖核酸に入り込み、相補的な部位とハイブリダイズを起こさせることができる。
【００４３】
反応液２２に使用される溶媒としては、付加微粒子２０を均一に分散、懸濁あるいは溶解させることができればよく特に制限はないが、水や一般的な有機溶媒を使用することができる。水としては、特に制限はなく、例えば、水道水、地下水、イオン交換水等の純水、超純水等が挙げられるが、分解効率を向上させるためには不純物が少ない方がよく、通常はイオン交換水等の純水、超純水が用いられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール系溶媒、ベンゼン、トルエン等の芳香族系溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン系溶媒、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン等の直鎖飽和炭化水素系溶媒、シクロヘキサン等の環状飽和炭化水素系溶媒、アセトニトリル等を用いることができる。この中で、適用範囲が広いことから水、アルコール系溶媒が好ましく、水がより好ましい。
【００４４】
反応液２２中の付加微粒子２０の濃度は、付加微粒子２０を懸濁、分散できる程度の濃度であれば特に制限はないが、通常、１０１５個／ｍＬ以下である。
【００４５】
微粒子３０の量に対する標的核酸高分子２８の量は特に制限はないが、微粒子１個に対して標的核酸高分子の個数が１〜数十個の範囲、例えば１〜５０個の範囲が好ましい。
【００４６】
付加微粒子２０を含む反応液２２を収容するための収容部であるセル１４としては特に制限はないが、通常、石英、ガラス等の材質のものが使用される。収容部はセル１４の代わりにガラス、シリコン、アクリル等の有機高分子、サファイヤやアルミナ等の無機物等の基板であってもよい。
【００４７】
本実施形態では微粒子３０を高エネルギー状態にするために付加微粒子２０にレーザーを照射しているが、微粒子３０を高エネルギー状態にするための手段であれば特に制限はなく、例えば、マイクロ波、可視光、紫外光、赤外光、Ｘ線、γ線等の電磁波あるいは音波（弾性波）等を照射すればよい。電磁波としては、マイクロ波、可視光、紫外光、赤外光が好ましく、レーザーであってもよい。また、音波としては超音波が好ましい。
【００４８】
前述したように「高エネルギー状態」とは、通常の状態から少しでも高いエネルギー状態にあることをいうが、例えば、波長５３２ｎｍのパルスレーザー光を照射した場合は、微粒子３０がレーザー光を１光子吸収して通常の状態から５ｅＶ程度以上高い状態となる。
【００４９】
反応液２２に照射されるレーザー２４のエネルギー密度は水中でプラズマが発生しない程度、０．１ｍＷ／ｃｍ２〜１０１０Ｗ／ｃｍ２の範囲であり、０．１ｍＷ／ｃｍ２〜１０Ｗ／ｃｍ２の範囲であることが好ましい。
【００５０】
反応液２２中でのレーザー２４等の集光領域は、（１μｍ）３〜（１ｍｍ）３の範囲、好ましくは（１μｍ）３〜（０．２ｍｍ）３の範囲であることが好ましい。装置上の制約から集光領域は（１μｍ）３程度より小さく絞ることは困難であり、集光領域が（１ｍｍ）３程度より大きい範囲であると、分解効率が低下する場合がある。また、レーザー２４等の照射はパルス状であってもよいし、連続的であってもよい。
【００５１】
反応液２２に照射されるレーザー２４等の強度は、微粒子３０が高エネルギー状態となり効率よく標的核酸高分子２８が分解される強度であれば特に制限はないが、パルスレーザーの場合、１００μＪ／パルス〜１００ｍＪ／パルスの範囲であることが好ましく、１ｍＪ／パルス〜２０ｍＪ／パルスの範囲であることがより好ましい。連続波レーザー（Ｃ
Ｗレーザー）の場合は、０．１ｍＷ〜１０Ｗの範囲であることが好ましい。レーザー２４の強度が大きいと標的核酸高分子２８の分解効率が高くなるが、レーザー２４の照射強度が１００μＪ／パルスより低いと、標的核酸高分子２８の分解が進行しない場合があり、１００ｍＪ／パルスより大きいと、集光領域の大きさによっては、溶媒自体が誘電破壊する場合があり、さらには容器（セル）が損傷する場合がある。レーザー２４等の強度を高くすると標的核酸高分子２８の分解部分の範囲が大きくなるため、レーザー強度の調整により標的核酸高分子２８の分解部分の範囲を制御することができる。
【００５２】
反応液２２にレーザー２４等を照射する時間は、特に制限はないが、通常１パルス幅の時間〜１００分の範囲、好ましくは、１パルス幅の時間〜１０分の範囲である。パルスレーザーの場合、パルス周波数は特に制限はないが、好ましくは５Ｈｚ〜２０Ｈｚの範囲である。
【００５３】
反応液２２に照射されるレーザー２４等の波長としては、微粒子３０の種類に応じて効率よく高エネルギー状態となる波長を選択すればよく特に制限はないが、例えば、微粒子３０として金属微粒子を使用する場合、金属微粒子の表面プラズモン共鳴波長付近の波長であること、金属微粒子が大きな吸収係数を有する波長であること、金属微粒子のバンド間遷移付近の波長であること等が好ましい。ここで、大きな吸収係数とは、１００Ｍ−１ｃｍ−１以上の強度の吸収であることが好ましい。例えば、微粒子３０が金微粒子の場合はその表面プラズモン共鳴波長付近の５３２ｎｍの波長を用いることが好ましい。微粒子３０が白金微粒子の場合のように、可視領域に特に強い吸収を有さない場合は、どの波長のレーザーを用いてもよい。微粒子３０がレーザー２４等を吸収しない場合、あるいはレーザー２４の吸収効率が低い場合には、前述したように微粒子３０中に、レーザー２４等を吸収する有機色素等を含有させてもよい。
【００５４】
使用されるレーザー２４の種類としては、照射するレーザーの波長に応じて選択すればよく特に制限はないが、例えば、半導体レーザー、固体レーザー、気体レーザー、色素レーザー、エキシマレーザー等を使用することができる。
【００５５】
なお、反応液２２に照射されるレーザー２４は、セル１４の開口部を通して照射されることが好ましい。セル１４を通して照射されると、レーザー２４の強度によっては、セル１４自体がレーザーによりスパッタされ損傷を受けてしまう可能性がある。また、このため、セル１４は透明な材質であることが好ましい。レーザー２４の照射は、例えば図１に示すように、セル１４の上面の開口部２６を通して行われる。
【００５６】
反応液２２の温度は、標的核酸高分子２８が効率的に分解される温度であれば特に制限はないが、０℃〜１００℃の範囲、通常は１０℃〜３０℃の室温である。
【００５７】
本実施形態に係る分解方法において、レーザー等の照射時に反応系を特に加圧する必要はなく、分解は通常は常圧下で行われる。なお、必要に応じて反応系を０．２ＭＰａ〜１００ＭＰａの範囲に加圧してもよい。
【００５８】
セル１４に入れられた反応液２２は、撹拌子１６や撹拌羽根等の分散手段により反応液２２内の付加微粒子２０が撹拌、分散されることが好ましい。また、撹拌の他に分散手段として超音波を用いて分散することもできる。撹拌、分散することによりレーザーを反応液全体に均一に照射することができる。付加微粒子２０が撹拌子１６等の分散手段を使用しなくても自然に分散している場合には分散手段は使用しなくてもよい。
【００５９】
このように、付加微粒子２０を溶媒に分散、溶解させてレーザー２４等を付加微粒子２０に照射することによって、高エネルギー状態になった微粒子３０からの周囲へのエネル
ギー移動により標的核酸高分子２８が特定部位で分解される。エネルギー移動の形態としては、熱エネルギー、高エネルギーを有する微粒子３０の構成粒子、またはそのイオンや電子等が考えられる。レーザー照射で金微粒子を高エネルギー状態にする場合を例に説明すると、金微粒子の表面プラズモン共鳴によりレーザー光を吸収した電子のエネルギーが金微粒子の格子の振動エネルギーに緩和し、固体状態の金微粒子が溶解を始める。溶液状態になった金微粒子はさらに蒸発して原子状になる。このようにして高エネルギー状態の金微粒子表面から放出された金原子、金クラスター、金イオン、電子、ラジカル等の高エネルギー粒子が金微粒子表面近傍に存在する標的核酸高分子２８を分解すると考えられる。また、放出された電子はレーザーの強い電場で加速され、これが周囲の金原子や溶媒分子と衝突してこれをイオン化し、ここから放出された電子がさらに次の分子と衝突し、雪崩のようにプラズマ状態等の高エネルギー状態に移行する。これらの高エネルギー粒子は微粒子表面から数１０ｎｍ以下の微粒子表面近傍に存在すると考えられるので、標的核酸高分子２８の分解される部位も微粒子表面近傍に存在するものに限られる。すなわち、分解される標的核酸高分子の部位は、微粒子表面近傍に存在する数塩基程度の部位に限られるため、位置特異的切断が進行する。
【００６０】
この分解の概念図を図２に示す。末端がチオール標識されたプローブ核酸高分子３２にチオール結合した金微粒子３４（プローブ核酸高分子結合微粒子）と標的核酸高分子２８とのハイブリッド（付加微粒子２０）を含む溶液にレーザー２４を照射し、金微粒子３４の周囲に高エネルギー領域３６を生成させる。すると近傍のプローブ核酸高分子３２とともに標的核酸高分子２８のうち金微粒子３４の近傍にある部分が分解され切断される。
【００６１】
通常、水等の溶媒に高強度のレーザーを照射すると、レーザーの集光領域（例えば、（１μｍ）３以上）内の全てがプラズマ状態等になるが、本実施形態に係る方法では、レーザーの集光領域内の全てがプラズマ状態等になるわけではなく、レーザー集光領域内に存在する微粒子の近傍がプラズマ状態等になる。また、微粒子の平均粒径の大きさ及び照射レーザー強度等によってプラズマ状態等になる領域を制御することができるため、微粒子の平均粒径及び照射レーザー強度等を分解の目的等に応じて選択すれば、標的核酸高分子の分解反応を起こさせる領域を制御することができる。
【００６２】
本実施形態においては、プローブ核酸高分子３２と微粒子３０とを結合させ、そのプローブ核酸高分子３２に標的核酸高分子２８を付加させた付加微粒子２０としているため、選択的に標的核酸高分子２８の特定部位を微粒子３０の表面近傍に存在させている。その上で、レーザー２４等を微粒子３０に照射し、標的核酸高分子２８の特定部位を選択的に分解することができる。上述したように、本実施形態では、高エネルギー粒子は微粒子表面近傍にほとんどが存在すると考えられるので、標的核酸高分子２８の分解される範囲も微粒子表面近傍に存在するものに限られ、標的核酸高分子２８の特定部位を選択的に分解することができ、微粒子１８の表面近傍に存在しない標的核酸高分子２８の部位はほとんど分解されない。また、微粒子周囲の高エネルギー状態による切断であるため標的核酸高分子の塩基の修飾による影響を受けない。
【００６３】
ここで、標的核酸高分子が切断される領域は微粒子周囲の高エネルギー領域の大きさと一致すると考えられる。ここでは、レーザー照射による金微粒子周囲の高エネルギー状態領域の大きさを以下に見積もった。
【００６４】
水中でレーザープラズマ形成に必要な電子を水分子から引き出すには〜１０１０Ｗ／ｃｍ２のエネルギー密度が必要だが、以下に示す例でのレーザー照射のエネルギー密度は〜１０９Ｗ／ｃｍ２であるため、レーザープラズマを生成するには十分なレーザー強度ではない。このとき、一方で金微粒子はレーザーの多光子吸収により１０４〜５Ｋ程度の温度になっていると考えられる。すると金の仕事関数は９．６ｅＶなので、金微粒子を構成す
る金原子のうち約１０−４〜１０−３の割合の金原子が電子を放出すると考えられる。ここで金微粒子中の金原子の密度は、〜６．０×１０２２ａｔｏｍｓ／ｃｍ３なので放出電子の密度は、〜１０１９／ｃｍ３以上となる。水中でのプラズマ形成に必要な電子密度〜１０１８／ｃｍ３より十分に大きい。
【００６５】
溶液中プラズマ中の自由電子密度ρの生成方程式は、次式のように書ける。
【００６６】
【数１】
0004751691.tif 000002
【００６７】
右辺の第一項は電子雪崩による自由電子の生成を表わし、ηは自由電子が水分子に衝突し、結合電子をたたき出す確率を表わす。この過程はレーザーパルス中に起こり続け、このようにして水分子から放出された自由電子はレーザーの強い電場によって加速され、さらに電子を水分子から放出する反応を行う。右辺第二項は自由電子の再結合、捕捉、拡散による自由電子密度の変化を表わす。ｇはこれらの効果を合わせたものである。最後の項はレーザーパルス照射中に多光子吸収により生成する自由電子を表わす。
【００６８】
金微粒子からの電子の放出はレーザー照射の間に持続する。したがって、プラズマの大きさはレーザーパルス照射の初期に金微粒子から生成した自由電子の上記ｇで表わされる効果によって決まる存在領域の大きさとおおまかには一致するとしてよい。この自由電子の存在領域の大きさは上で述べたように電子の再結合、捕捉、拡散によって決定される。自由電子がレーザーの強い光子を吸収しているときは、自由電子の寿命はレーザーパルスの時間より長いと仮定する。よって、電子とホールの再結合は無視する。また局所ポテンシャル井戸への捕捉エネルギーはレーザーの１光子を吸収するだけで十分再イオン化することができるので、この効果も無視できる。
【００６９】
これらの仮定から自由電子の存在領域の大きさはその拡散領域で決まると考えられる。その大きさ（ｄupper limit）は次式で決まる。
【００７０】
【数２】
0004751691.tif 000003
【００７１】
ここで、Ｄは電子の拡散係数、τpは照射レーザーのパルス幅を表わす。また、Ｄは次
式で表される。
【００７２】
【数３】
0004751691.tif 000004
【００７３】
ここで、εavは電子の平均エネルギー、ｍは電子の質量である。νは自由電子の水分子との衝突間隔時間である。εavとνは次式で計算できる。
【００７４】
【数４】
0004751691.tif 000005
【数５】
0004751691.tif 000006
【００７５】
ここで、Ｅionは電子の結合エネルギー、τは電子の水分子との衝突頻度である。Ｅionの値として金の仕事関数である９．６ｅＶを、τの値として１．０×１０−１５ｓｅｃを代入した。すると、Ｄの値として５．９×１０−５ｍ２／ｓｅｃが得られる。するとｄupper limitの値は〜７．０×１０−６ｍとして求められる。実際はプラズマの大きさはｄupper limitの値より小さいと考えられる。なぜなら、放出された電子と正に帯電した金微粒子とのクーロン相互作用やプラズマ生成に必要な電子の密度について考慮されていないからである。また仮に金微粒子を構成する金原子がすべて電子を放出したとすると、その電子密度は〜６．０×１０２２ａｔｏｍｓ／ｃｍ３になる。これが均一に拡散しプラズマ形成に必要な電子密度まで下がるときの体積は（〜１０−７ｍ）３となる。よって、この（〜１０−７ｍ）３程度の大きさの領域内にある標的核酸高分子が切断されると考えられる。
【００７６】
微粒子による標的核酸高分子の分解は、例えば、レーザー等を照射した後の反応液を、紫外可視吸収スペクトル、赤外吸収スペクトル、核磁気共鳴スペクトル等を測定することにより、あるいは高速液体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ、電気泳動等により確認することができる。
【００７７】
このように、本実施形態に係る核酸高分子の分解方法により発生する、高エネルギー微粒子によるプラズマ等では空間及び時間の制御が容易である。すなわち、本実施形態に係る核酸高分子の分解方法によれば、放電プラズマと比較して非常に微小な領域、例えば（１ｎｍ）３〜（〜１００ｎｍ）３レベルの微小領域に限定されたプラズマ等を発生させることができる。これによって微粒子の表面近傍に存在する標的核酸高分子を特定部位で分解することができる。また、レーザー等を用いて微粒子を高エネルギー状態にした場合、プラズマ等を１ｆｓｅｃ〜１００ｎｓｅｃのナノオーダの精度で生成できるため標的核酸高分子分解の時間制御も制限酵素による方法、化学合成された分子による方法、リボザイムによる方法等に比較して精度が非常に高い。
【００７８】
また、膜構造物、例えば細胞などの内部にプローブ核酸高分子結合微粒子を封入し、このプローブ核酸高分子結合微粒子を細胞内部のＤＮＡやＲＮＡとハイブリダイゼーションさせた後、微粒子をレーザー等で高エネルギー状態にすることにより、この微粒子の近傍にあるＤＮＡやＲＮＡ（標的核酸高分子）を選択的に分解することができる。この場合、微粒子表面近傍のみにプラズマ状態等が生成するため他の領域の混在物を破壊することはない。
【００７９】
本実施形態に係る核酸高分子の分解方法及び分解装置は、ＤＮＡ、ＲＮＡの分析全般の用途、医療用途、またはＤＮＡ、ＲＮＡ分子の機能調査の用途等において使用することができる。
【００８０】
高分子、特に生体高分子を扱う方法の発展に伴い、遺伝子操作の対象が下等生物から高等生物へと移行しつつあるなか、大きなＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、糖鎖などを自在に操作する技術が重要になってきている。例えば、天然の制限酵素はプラスミドＤＮＡの遺伝子操作に有用となるが、高等生物の巨大ＤＮＡを同じように制限酵素で処理すると、きわめて多数の箇所で切断が起こってしまい、正確な遺伝子操作は困難となる。そこで、本実施形態のように、微粒子、特に金属微粒子とプローブ核酸高分子とを結合させたプローブ核酸高分子結合微粒子を用いて、標的核酸高分子の特定の位置にハイブリダイゼーションさせ、微粒子を高エネルギー状態にすることによって位置特異的に標的核酸高分子を切
断することができる。その最大の長所は、（１）巨大なＤＮＡでも望みの位置特異性をもって切断できることができる、（２）プローブ核酸高分子の用意が他の方法に比較して非常に簡単である、ことである。この方法を用いることにより、標的ＲＮＡの機能の発現を消失させ、生体内における疾患起因遺伝子または障害を起こす遺伝子の発現を防止することもできる。
【００８１】
このように、本実施形態に係る核酸高分子の分解方法及び分解装置により、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸高分子の特定箇所のみを再現性よく切断することができ、遺伝子解析の効率を著しく向上することができる。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００８３】
（実施例１）
＜金微粒子の作製＞
金微粒子はＨＡｕＣｌ４のクエン酸による還元法により作製した。１ｍＭのＨＡｕＣｌ４水溶液１０ｍＬを撹拌しながら加熱して還流条件下においた。これに３８．８ｍＭのクエン酸三ナトリウムをすばやく加えた。溶液の色が黄色から深赤に変わったら、さらに１５分間撹拌した。溶液を室温（２５℃）まで下げ、径が０．４５μｍのフィルターに通した。このように合成した金微粒子の平均粒径については、ＨＡｕＣｌ４とクエン酸の濃度を調整し、１３ｎｍになるようにした。
【００８４】
＜金微粒子とプローブＤＮＡとが結合したプローブ核酸高分子結合微粒子の作製＞
平均粒径１３ｎｍの金微粒子を含む水溶液に末端をチオール化したプローブＤＮＡ（５０ｍｅｒ）を５μＭの濃度で混ぜ１６時間放置した。さらに０．１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）の溶液にし、さらに４０時間放置した。そしてこれを遠心と再分散を３回繰り返し、余分な物質を除去した。
【００８５】
図３に本実施例１で使用したプローブ核酸と標的核酸Ｍ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮＡ  ７２４９ｂ．ｐ．の塩基配列を示す。プローブ核酸は標的核酸の３６０１番目の塩基から塩基対を組むように設計した。また探索子核酸の５’端をチオール標識し、金微粒子と結合するようにした。
【００８６】
＜金微粒子とプローブＤＮＡとが結合したプローブ核酸高分子結合微粒子と標的ＤＮＡのハイブリダイズとその確認＞
標的ＤＮＡのＭ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ  ７２４９ｂ．ｐ．）と上記プローブ核酸高分子結合微粒子を混合し、５分間６０℃に保温した。さらにこれを室温（２５℃）で３時間放置した。アガロースゲル電気泳動により確認したところ、これではハイブリダイズしなかった。そこで、放置時間が足りないと考えられたので、５０℃で４８時間放置した。アガロースゲル電気泳動にてハイブリダイゼーションの確認を行った。ゲルの写真を図４と図５に示す。
【００８７】
図４からわかるように、標的ＤＮＡとハイブリダイズしたプローブＤＮＡに結合した金微粒子はアガロース中をハイブリダイズしたまま泳動する。これが深紅色のバンドとしてアガロース中のレーン１と２の矢印Ｂの位置に観察された（図に点線を示す）。矢印Ａは電気泳動の最前部を示す。矢印Ａの最前部には標的ＤＮＡとハイブリダイズしなかったプローブＤＮＡがそれに結合した金微粒子の深紅色のバンドとして観測された。また、このゲルにＵＶ照射すると、図５からわかるように、図４で示した金微粒子のバンドと同じ位置に標的ＤＮＡにインターカレートした色素の蛍光のバンドがレーン１と２の矢印Ｂの位
置に観察された（図に点線を示す）。矢印Ａは電気泳動の最前部を示す。これは標的ＤＮＡに金微粒子が結合したプローブＤＮＡがハイブリダイズしていることを示している。ここで、溶液はリン酸バッファでｐＨを７．０に調整し、さらに０．１ＭのＮａＣｌを添加した。
【００８８】
＜標的ＤＮＡのレーザー照射による切断＞
上記で作製した金微粒子が結合した探索子用ＤＮＡと標的ＤＮＡとのハイブリッド（付加微粒子）を含む溶液５０μＬを底面が０．５ｃｍ×０．５ｃｍのセルに入れ、波長５３２ｎｍで１パルスあたり４ｍＪレーザーを５分間照射した。レーザー光はレンズを用いて、（０．１ｍｍ）３程度になるように溶液中に集光した。この間、セルの底に長さ２ｍｍ幅１ｍｍの撹拌子を入れ溶液を撹拌した。波長５３２ｎｍは金微粒子の表面プラズモン共鳴に一致しているため、効率よく金微粒子を高エネルギー状態にすることができた。標的ＤＮＡの切断の確認はアガロースゲル電気泳動にて行った。
【００８９】
図６は、標的ＤＮＡ（Ｍ１３ｓｓＤＮＡ）と金微粒子が結合したプローブＤＮＡとのハイブリッドを含む溶液にレーザー照射（４ｍＪ／ｐｕｒｓｅ）した前後の溶液のアガロースゲル電気泳動を示す。矢印Ａは泳動の最前部、矢印ＢはＭ１３ｓｓＤＮＡのバンドの位置を示す。レーン４の溶液にレーザー照射したものをレーン２に、レーン５の溶液にレーザー照射したものをレーン３に示す。レーン４及び５で見られるＭ１３ｓｓＤＮＡのバンド（図中、点線内）がレーン２及び３で見られないことから、レーザー照射後にＭ１３ｓｓＤＮＡのバンドが消失し、Ｍ１３ｓｓＤＮＡが切断されたことを示す。これはアガロースゲル電気泳動では確認できないほど標的ＤＮＡが分子量の小さなＤＮＡ片に分解したためと考えられる。レーン１はＭ１３ｓｓＤＮＡのバンドの位置を確認するためにＭ１３ｓｓＤＮＡのみを泳動した（図に点線を示す）。
【００９０】
（実施例２）
＜金微粒子とプローブＤＮＡとが結合したプローブ核酸高分子結合微粒子と標的ＤＮＡのハイブリダイズとその確認＞
標的ＤＮＡのＭ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ  ７２４９ｂ．ｐ．）（濃度１．８×１０−８Ｍ）と、図７に示したＤＮＡ−１とＤＮＡ−２をそれぞれプローブＤＮＡとして用いたものが結合した金微粒子（濃度５．４×１０−８Ｍ）を混合し、３０℃に保温した。溶液はリン酸バッファー（０．０１Ｍ）でｐＨを７．０に調整し、さらに０．１ＭのＮａＣｌになるようにＮａＣｌを添加した。
【００９１】
図７に、本実施例２で使用したプローブＤＮＡと標的ＤＮＡ  Ｍ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮＡ  ７２４９ｂ．ｐ．の塩基配列を示す。プローブ核酸ＤＮＡ−１（５０ｍｅｒ）は標的ＤＮＡの３６０１番目の塩基から塩基対を組むように、プローブ核酸ＤＮＡ−２（５０ｍｅｒ）は標的ＤＮＡの７１９９番目の塩基から塩基対を組むように設計した。またプローブ核酸は５’端をチオール標識し金微粒子と結合するようにした。
【００９２】
＜標的ＤＮＡのレーザー照射による切断＞
作製した金微粒子が結合したプローブＤＮＡと標的ＤＮＡのハイブリッド（付加微粒子）を含む溶液に波長５３２ｎｍで１パルスあたり２ｍＪのレーザーを５分間照射した（実施例１に比較してレーザー強度は弱い）。標的ＤＮＡの切断の確認はアガロースゲル電気泳動にておこなった。これを図８に示す。レーン１と２はそれぞれＤＮＡ−２とＤＮＡ−１をプローブＤＮＡとして用いたものにレーザー照射したもの、レーン３と４はそれぞれＤＮＡ−２とＤＮＡ−１をプローブＤＮＡとして用いたもののレーザー照射前のもの、ＭはＲＮＡマーカーでその右側に塩基数を示した。左側の欄に表示した１、２、３ｍｅｒは標的核酸が１つの金微粒子にハイブリダイズした数を、Ａ、Ｂはそれぞれレーン１と２に検出された標的ＤＮＡの切断生成物バンドの位置を示す（図に点線を示す）。標的位置に
よって長さの異なるＤＮＡに切断されていることがアガロースゲル電気泳動で確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】本発明の実施形態に係る核酸高分子の分解装置の構成の一例を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係る核酸高分子の分解方法の概略を示す図である。
【図３】本発明の実施例１で使用したプローブＤＮＡと標的ＤＮＡの配列を示す図である。
【図４】本発明の実施例１におけるハイブリダイゼーション後の反応液のアガロースゲル電気泳動を示す写真である。
【図５】本発明の実施例１におけるハイブリダイゼーション後の反応液のアガロースゲル電気泳動において、ゲルにＵＶを照射したときの様子を示す写真である。
【図６】本発明の実施例１における標的ＤＮＡと金微粒子が結合したプローブＤＮＡとのハイブリッドを含む溶液にレーザー照射した前後の溶液のアガロースゲル電気泳動を示す写真である。
【図７】本発明の実施例２で使用したプローブＤＮＡと標的ＤＮＡの配列を示す図である。
【図８】本発明の実施例２におけるレーザー照射前後の反応液のアガロースゲル電気泳動を示す写真である。
【符号の説明】
【００９４】
１  分解装置、１０  レーザー発生装置、１２  レンズ、１４  セル、１６  撹拌子、２０  付加微粒子、２２  反応液、２４  レーザー、２６  開口部、２８  標的核酸高分子、３０  微粒子、３２  プローブ核酸高分子、３４  金微粒子、３６  高エネルギー領域。
【図１】
0004751691.tif 000007
【図２】
0004751691.tif 000008
【図３】
0004751691.tif 000009
【図７】
0004751691.tif 000010
【図４】
0004751691.tif 000011
【図５】
0004751691.tif 000012
【図６】
0004751691.tif 000013
【図８】
0004751691.tif 000014