(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞ＲＮＡに対してＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を行うための方法であって、
Ａ）
ｉ）細胞ＲＮＡを含んでなるユニークな生体サンプルに対応する少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットを得ること、
ｉｉ）ユニークな生体サンプルに対して用いられる一般的な分析プラットフォーム上のサンプルから得られる少なくとも一つのエレクトロフェログラムデータセットに対する標準サンプルを特定すること、ここで１８Ｓピークおよび２８Ｓピークは、それぞれ１８ＳｒＲＮＡピークおよび２８ＳｒＲＮＡピークを表し、
ｉｉｉ）標準サンプルからの１８Ｓピークおよび２８Ｓピークに対する標準保持時間を決定すること、
ｉｖ）１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの潜在的シフトを合わせるような２つの識別範囲および標準保持時間を使用し、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークを検出し、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークを定義した後に中間領域および低Ｃバンド領域を決定し、ここで中間領域は決定した１８Ｓピークと２８Ｓピークとの間であり、かつ低Ｃバンド領域は１８Ｓピークより下で１８Ｓピーク、中間領域および低Ｃバンド領域に隣接する低バンディング領域の上部であり、特徴は中間領域面積および低Ｃバンド領域面積の少なくとも一つおよび２８Ｓピーク面積および１８Ｓピーク面積の少なくとも一つを含み、位置決定された１８Ｓピークおよび２８Ｓピークに少なくとも部分的に基づいて導かれた特徴を計算することにより、少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットから特徴に関する値を決定すること、ならびに
ｖ）特徴の値の組合せに基づいてＲＤＡスコアを決定すること、ＲＤＡスコアはＲＮＡ分解の程度を示し、または
Ｂ）
ｉ）細胞ＲＮＡを含んでなるユニークな生体サンプルに対応する複数のエレクトロフェログラムデータセットを得ること、
ｉｉ）潜在的シフトを合わせるように２つの識別範囲を定義して、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークを検索し、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークを識別し、かつ識別された１８Ｓピークおよび２８Ｓピークに基づいて値を計算すること、
ｉｉｉ）識別された１８Ｓピークおよび２８Ｓピークに基づいて計算された値を用いて複数のエレクトロフェログラムデータセットから標準サンプルを識別すること、
ｉｖ）複数のエレクトロフェログラムデータセットを調整群と標準群に分類すること、
ｖ）標準群の複数のエレクトロフェログラムデータセットから正常サンプルに代表的な正常な特徴を識別すること、正常な特徴は１８Ｓピークおよび２８Ｓピークに対する標準保持時間を含み、
ｖｉ）調整群のエレクトロフェログラムデータセットに関して１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの位置を決定し、かつそれらの１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの位置を正常な特徴に基づいて調整すること、
ｖｉｉ）１８Ｓピークおよび２８Ｓピークが調整された後の調整群におけるエレクトロフェログラムデータセットに対する中間領域および低Ｃバンド領域を決定すること、ここで中間領域は決定した１８Ｓピークと２８Ｓピークとの間であり、かつ低Ｃバンド領域は１８Ｓピークより下で１８Ｓピーク、中間領域および低Ｃバンド領域に隣接する低バンディング領域の上部であり、
ｖｉｉｉ）調整後の調整群からのエレクトロフェログラムおよび標準群からのエレクトロフェログラムから特徴に関する値を決定すること、ここで特徴は中間領域面積および低Ｃバンド領域面積の少なくとも一つおよび１８Ｓピーク面積および２８Ｓピーク面積の少なくとも一つを含み、かつ位置決定された１８Ｓピークおよび２８Ｓピークに少なくとも部分的に基づいて導かれた特徴を計算し、
ｉｘ）特徴の値の組合せに基づいてＲＤＡスコアを決定すること、ＲＤＡスコアはＲＮＡ分解の程度を示す、
を含んでなる、方法。
【請求項２】
デフォルト範囲を２つの識別範囲と定義して１８Ｓピークおよび２８Ｓピークを検索すること、およびマーカー領域がその予測位置になければ、デフォルト範囲を調整することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マーカー領域の開始時間が２２．５秒になければ、デフォルト範囲が、ｒｎｇｓｈｆｔ＝マーカー時間−２２．５に従って調整され、
マーカー領域がその予測位置になければ、１８Ｓピークのデフォルト範囲が［３９．５＋ｒｎｇｓｈｆｔ×１．５、４４．９５＋ｒｎｇｓｈｆｔ×１．５］に従ってシフトされ、および／または
２８Ｓピークのデフォルト範囲が［４５．０５＋ｒｎｇｓｈｆｔ×２．５、５３．５＋ｒｎｇｓｈｆ×２．５］に従ってシフトされる、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
まず１８Ｓピークおよび２８Ｓピークが潜在的ピーク候補を２つの識別範囲内で位置決定され、各潜在的ピーク候補の高さ差を計算し、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークを２つの最大ピーク候補と定義することにより、ピークが位置決定され、所与のピーク候補の高さ差が、その所与のピーク候補の最高ピーク値と最低ピーク値平均との差と定義され、ここで平均が採られる低ピーク値は最高ピーク値に関する始点と終点である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ｉ）標準サンプルは、１８Ｓピーク面積と２８Ｓピーク面積の和に対する、中間面積と低Ｂバンド領域面積と低Ｃバンド領域面積との和の比により定義される最小標準スコアを有し、
ｉｉ）識別作業が、標準保持時間を正常な特徴と定義することを含んでなり、該標準保持時間は、標準群におけるエレクトロフェログラムに関する対応する保持時間の統計的尺度により定義され、ここで統計的尺度が中央値および平均値のうち１つを含んでなり、
ｉｉｉ）調整群におけるエレクトロフェログラムに関するピークの位置決定の作業が、対応する標準保持時間の前後でピークを位置決定することにより、調整群におけるエレクトロフェログラムの１８Ｓピークおよび２８Ｓピークに関する保持時間を決定することを含んでなり、
ｉｖ）複数のエレクトロフェログラムデータセットが、ＲＮＡチップ上のユニークな生体サンプルに由来し、および／または
ｖ）ＲＤＡスコアが少なくとも２つのＲＤＡゾーンを含んでなる、またはＲＤＡスコアがＲＤＩスコアを含んでなり、ここで各ＲＤＡゾーンはＲＮＡ分解スコアの範囲を含む処置応答結果に関連する臨床ゾーンであり、かつＲＤＩは分析された特徴の比である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
分類作業が、所与のサンプルの１８Ｓピークおよび２８Ｓピークのうち少なくとも１つの保持時間が、対応する標準サンプルの１８Ｓピークおよび２８Ｓピークのうち少なくとも１つの保持時間と、特定の時間閾値を超えて異なれば、その所与のエレクトロフェログラムデータセットを調整群に割り付けることをさらに含んでなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ｉ）特徴が１８Ｓピーク面積と２８Ｓピーク面積との和に対する、低Ｃバンド領域面積の比を定義するために使用され、ここで、該低Ｃバンド領域は１８Ｓピーク領域の下の中間領域の部分であり、
ｉｉ）特徴が２８Ｓピーク面積と１８Ｓピーク面積との和に対する、低Ｃバンド領域面積と中間面積の和との比を定義するために使用され、
ｉｉｉ）特徴が少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最大比を定義するために使用され、ここで、該比は中間面積を１８Ｓピーク面積と２８Ｓピーク面積との和で割った商と定義され、
ｉｖ）特徴が１８Ｓピーク面積と２８Ｓピーク面積との和に対する、低Ｃバンド領域面積の比を定義するために使用され、および／または
ｖ）特徴が２８Ｓピーク面積と１８Ｓピーク面積との和に対する、中間面積の比を定義するために使用される、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
Ａ）ＲＤＡスコアを決定するために三次元特徴セットが使用され、該三次元特徴セットはそれぞれ少なくとも１つの特徴を含んでなり、各特徴セットは直交変数に割り付けられ、ＲＤＡスコアが分析のために閾値曲線または閾値面と比較され、
ｉ）第１の変数が１８Ｓピーク面積と２８Ｓピーク面積との和を含んでなり、第２の変数が１８Ｓピーク高さと２８Ｓピーク高さの和を含んでなり、第３の変数が低Ｃバンド面積を含んでなる、
ｉｉ）第１の変数が１８Ｓピーク面積と２８Ｓピーク面積との和を含んでなり、第２の変数が１８Ｓピーク高さと２８Ｓピーク高さの和を含んでなり、第３の変数が中間面積を含んでなる、または
ｉｉｉ）第１の変数が１８Ｓピーク面積と２８Ｓピーク面積との和を含んでなり、第２の変数が１８Ｓピーク幅と２８Ｓピーク幅の和を含んでなり、第３の変数が低Ｃバンド面積を含んでなる、
または
Ｂ）ＲＤＡスコアを決定するために二次元特徴セットが使用され、該二次元特徴セットは各特徴セットに少なくとも１つの特徴を含んでなり、各特徴セットは直交変数に割り付けられ、ＲＤＡスコアが分析のために閾値直線またはＲＤＡゾーンと比較され、
ｉ）第１の変数が２８Ｓピーク面積と１８Ｓピーク面積との和を含んでなり、第２の変数が低Ｃバンド領域面積を含んでなる、
ｉｉ）第１の変数が１８Ｓピーク面積と２８Ｓピーク面積との和を含んでなり、第２の変数が中間面積を含んでなる、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの潜在的シフトに合わせることが、少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットまたは複数のエレクトロフェログラムデータセットの少なくとも２つのシフト領域を定義すること、およびその少なくとも２つのシフト領域から特徴に関する値を決定することを含んでなり、シフト領域が、シフトした１８Ｓ領域、シフトした２８Ｓ領域、シフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピークとシフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピークとの間の中間バンド領域、およびマーカー領域を除く１８Ｓピークの下の低バンド領域のうち少なくとも１つを含んでなり、
ｉ）特徴の組合せが、総面積に対する、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積の比を含んでなり、該総面積はシフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積、２８Ｓピーク面積、中間バンド領域面積および低バンド領域面積を含んでなる、
ｉｉ）特徴の組合せが、総面積に対する、シフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積の比を含んでなり、該総面積は１８Ｓピーク面積、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積、中間バンド領域面積および低バンド領域面積を含んでなる、
ｉｉｉ）特徴の組合せが、総面積に対する、中間バンド領域面積の比を含んでなり、該総面積はシフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積、中間バンド領域面積および低バンド領域面積を含んでなる、
ｉｖ）特徴の組合せが、総面積に対する、低バンド領域面積の比を含んでなり、該総面積はシフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積、中間バンド領域面積および低バンド領域面積を含んでなる、
ｖ）特徴の組合せが、シフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積とシフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積との和に対する、中間バンド領域面積の比を含んでなる、
ｖｉ）特徴の組合せが、シフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積とシフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積との和に対する、低バンド領域面積の比を含んでなる、
ｖｉｉ）特徴の組合せが、シフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積に対する、中間バンド領域面積の比を含んでなる、
ｖｉｉｉ）特徴の組合せが、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積に対する、中間バンド領域面積の比を含んでなる、
ｉｘ）特徴の組合せが、シフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積とシフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積との和に対する、低バンド領域面積と中間バンド領域面積との和の比を含んでなる、
ｘ）特徴の組合せが、少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最大比を含んでなり、該比は中間バンド領域面積をシフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積とシフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積の和で割った商と定義される、
ｘｉ）特徴の組合せが、少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最小比を含んでなり、該比は中間バンド領域面積をシフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積とシフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積の和で割った商と定義される、
ｘｉｉ）特徴の組合せが、少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最大比を含んでなり、該比は中間バンド領域面積を総面積で割った商と定義され、該総面積はシフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積、中間バンド領域面積および低バンド領域面積の和である、
ｘｉｉｉ）特徴の組合せが、少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最小比を含んでなり、該比は低バンド領域面積を総面積で割った商であり、該総面積はシフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積、中間バンド領域面積および低バンド領域面積の和である、
ｘｉｖ）特徴の組合せが、低バンド領域面積を総面積で割った比および少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最大第２比を含んでなり、該最大第２比は中間バンド面積を総面積で割った商と定義され、該総面積はシフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積、中間バンド領域面積および低バンド領域面積の和である、
ｘｖ）特徴の組合せが、少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最大比を含んでなり、該比は２８Ｓピーク面積を総面積で割った商と定義され、該総面積はシフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積、中間バンド領域面積および低バンド領域面積の和である、
ｘｖｉ）特徴の組合せが、少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最小比を含んでなり、該比は２８Ｓピーク面積を総面積で割った商と定義され、該総面積はシフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積、中間バンド領域面積および低バンド領域面積の和である、
ｘｖｉｉ）特徴の組合せが、少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最大比を含んでなり、該比は１８Ｓピーク面積を総面積で割った商と定義され、総面積はシフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積、中間バンド領域面積および低バンド領域面積の和である、または
ｘｖｉｉｉ）特徴の組合せが、少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最小比を含んでなり、該比は１８Ｓピーク面積を総面積で割った商と定義され、該総面積はシフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積、中間バンド領域面積および低バンド領域面積の和である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットの時間軸が０〜１００単位の尺度に変換された場合に、シフトした領域が、４０．９〜５０．４単位の範囲のシフトした１８Ｓ領域と５８．１〜６９．５単位の範囲のシフトした２８Ｓ領域を含んでなり、および
シフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積を総面積で割った商に１００を掛けたものが、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積を総面積で割った商に１００を掛けたものの８倍より小さければ、シフトした１８Ｓ領域は４２．８〜５１．４単位の範囲であると定義され、総面積は１８Ｓピーク面積、２８Ｓピーク面積、中間バンド領域面積および低バンド領域面積を含んでなる、および／または
シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積を総面積で割った商に１００を掛けたものがシフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積を総面積で割った商に１００を掛けたものの８倍より小さければ、シフトした２８Ｓ領域は５２．３〜６９．５単位の範囲であると定義され、総面積は１８Ｓピーク面積、２８Ｓピーク面積、中間バンド領域面積および低バンド領域面積を含んでなる、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
１８Ｓピーク幅が０．６〜７．６単位の間であり、および／または２８Ｓピーク幅が０．８〜１０．５単位の間であり、
１８Ｓピーク面積が閾値より小さければ、１８Ｓピークは２つ以上の最大値を含んでなるように定義され、２８Ｓピーク面積が閾値より小さければ、２８Ｓピークは２つ以上の最大値を含んでなるように定義される、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの幅をある一定の幅範囲になるように調整すること、ならびに１８Ｓピークと２８Ｓピークの間の距離がある距離閾値よりも大きければ、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの少なくとも一方の位置を調整することをさらに含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
所与のピークのピーク面積が、その所与のピークの両側の２つの極小値の間の面積により定義される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットを得る工程が、細胞ＲＮＡを電気泳動により分離すること、分離した細胞ＲＮＡの量を検出すること、分離した細胞ＲＮＡの量を相応にプロットしてエレクトロフェログラムを得ること、およびエレクトロフェログラムからエレクトロフェログラムデータセットを得ることを含んでなり、電気泳動がマイクロキャピラリーゲル電気泳動を含んでなる、または電気泳動が、所与のサンプルのＲＮＡを電気泳動により分離するためのマイクロチャネルを含んでなるＲＮＡチップの使用を含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＲＤＡスコアを一以上の閾値と比較して、一以上の閾値が用いられる場合には、各閾値はその処置の有効性を決定するためにＲＤＡゾーン境界に対応する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
閾値のあるものが選択された陰性的中率（ＮＰＶ）に相当して、ＲＤＡゾーン２とＲＤＡゾーン３の間の境界を画定し、該閾値の別のものが選択された陽性的中率（ＰＰＶ）に相当して、ＲＤＡゾーン１とＲＤＡゾーン２の間の境界を画定する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞ＲＮＡに対するＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を行うための請求項１に記載の方法であって、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの識別が以下を含んでなる、方法：
１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの両方に対して少なくとも１つのパラメーター値を決定すること、少なくとも１つのパラメーター値がピーク面積、ピーク幅およびピーク位置のうち少なくとも１つを含んでなり、および
少なくとも１つのパラメーター値に適用される１以上の規則によって必要とされる場合には、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの少なくとも一方を再定義すること、ここで、１以上の規則が、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの少なくとも一方がピーク面積に基づいて２つ以上の最大値を有するか否かを決定すること、１８Ｓピークと２８Ｓピークが位置決定される境界が２８Ｓピークおよび１８Ｓピークの面積の相互比較に応じた調整を必要とするか否かを決定すること、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの幅をある一定の幅範囲になるように調整すること、ならびに１８Ｓピークと２８Ｓピークの間の距離がある距離閾値よりも大きければ、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの少なくとも一方の位置を調整することのうち少なくとも１つを含んでなり、かつここで１８Ｓピークおよび２８Ｓピークは、それぞれ１８ＳｒＲＮＡピークおよび２８ＳｒＲＮＡピークを表す。
【請求項１８】
細胞傷害性処置前、処理中または処置後の時点の細胞ＲＮＡを含んでなる生体サンプルにおけるＲＮＡ破壊の量を、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法に従って行われるＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を用いて定量すること、ならびに
細胞ＲＮＡのＲＮＡ破壊の量が増加しているか否かを決定すること、決定工程が、定量された生体サンプルにおけるＲＮＡ破壊の量と、閾値または参照値とを比較することを含んでなる決定工程を含んでなる、アッセイ。
【請求項１９】
ＲＮＡ破壊の量が閾値または参照値に比べて増加していれば、その腫瘍を化学療法に応答性と識別することをさらに含んでなる、請求項１８に記載のアッセイ。
【請求項２０】
細胞傷害性処置に対する細胞の感受性を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイであって、
処置前、処置中または処置後の時点の細胞ＲＮＡを含んでなる生体サンプルにおけるＲＮＡ破壊の量を、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法に従って行われるＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を用いて定量すること、および
定量されたＲＮＡ破壊の量を閾値もしくは参照値または閾値もしくは参照二次元もしくは三次元領域と比較し、ＲＮＡ破壊の量が参照値に比べて増加していれば、その細胞を感受性と識別し、増加していなければ、その細胞をその処置に対して耐性と識別することを含んでなる、請求項１８に記載のアッセイ。
【請求項２１】
被験体が細胞傷害性療法に応答しているか否かを決定／予測するためのアッセイであって、該被験体が処置を受ける前、受けている間および／または受けた後にその被験体から得られた生体サンプルをＲＮＡ破壊の量に関して、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法に従って行われるＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を用いてアッセイすることを含んでなり、ＲＮＡ破壊の量が閾値または参照値に比べて増加していれば、その被験体はその処置に応答していると識別される、請求項１８または１９に記載のアッセイ。
【請求項２２】
応答が治療結果の指標となり、閾値または参照値に比べての非自己分解性ＲＮＡ破壊の量の増加は正の治療結果の指標となり、閾値または参照値に比べての非自己分解性ＲＮＡ破壊の欠如は負の処置応答の指標となる、請求項２１に記載のアッセイ。
【請求項２３】
正の治療結果が、処置後の病理学的完全応答、部分または完全応答、疾病進行のリスク軽減、安定疾患、または無病もしくは全生存期間の延長である、請求項２２に記載のアッセイ。
【請求項２４】
生体サンプルが、被験体が１サイクル目の化学療法、補助療法および／または放射線療法を受けた後に得られ、生体サンプルが、被験体が２サイクル、３サイクル、４サイクルまたはそれを超えるサイクルの化学療法、補助療法および／または放射線療法を受けた後に得られ、または生体サンプルが化学療法、補助療法および／または放射線療法計画の完了後に得られる、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項２５】
応答性および／または正の治療結果の指標となるＲＮＡ破壊スコアが、ＲＮＡ完全性の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の低下と相関する、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項２６】
癌処置を受ける被験体を評価するための、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載のアッセイであって、ここで被験体が細胞傷害性処置を受けた後に、アッセイが行われ、
被験体が応答していれば細胞傷害性処置の投与を継続し、ならびに／または被験体が応答していなければ処置を中断および／もしくは変更することから利益を受ける被験体を同定すること
を含んでなる、方法。
【請求項２７】
癌処置が、微小管安定化剤、ＤＮＡ合成阻害剤、Ｈｅｒ２受容体阻害剤、ＤＮＡ架橋剤、ＶＥＧＦＡ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、ビスホスホネート、チミジル酸シンターゼ阻害剤、タキサン、アントラサイクリン、およびビンカアルカロイド、ならびにヌクレオシド類似体から選択される化学療法である、
請求項２６に記載のアッセイ。
【請求項２８】
癌が乳癌、前立腺癌、肺癌、肉腫、結腸癌、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫または卵巣癌から選択される、請求項１８〜２７のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項２９】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の細胞ＲＮＡに対するＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を行うための方法を実施するために装置を適合させるための装置のマイクロプロセッサ上で実行可能な複数の命令を含んでなる、非一時的コンピューター可読媒体。
【請求項３０】
細胞ＲＮＡに対するＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を行うための装置であって、以下を含んでなる、装置：
Ａ）
細胞ＲＮＡを含んでなるユニークな生体サンプルに対応する少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットを受容するためのデータインプット、
該データインプットに連結されたプロセッシングユニット、該プロセッシングユニットは、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の工程を行うように構成され、ならびに
ＲＤＡスコアの指示を伝達するようにプロセッシングユニットに連結されたデータアウトプット、または
Ｂ）
細胞ＲＮＡを含んでなるユニークな生体サンプルに対応する少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットを得るための手段、
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の工程を行うことによって少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットまたは複数のエレクトロフェログラムから特徴に関する値を決定するための手段、ならびに
該特徴の値の組合せに基づいてＲＤＡスコアを決定するための手段。
【請求項３１】
装置が、データインプットに連結された電気泳動デバイスをさらに含んでなり、該電気泳動デバイスが少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットを作成するように構成された、請求項３０に記載の装置。
【請求項３２】
ユニークなサンプルが、増殖性障害に対する処置から選択される細胞障害性処置の処置後、処置中に得られる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法または請求項１８〜２８のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３３】
細胞障害性処置が、化学療法、補助療法、および／または放射線療法から選択される、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本明細書に記載の種々の実施形態は一般に、場合により細胞傷害性処置、場合により化学療法および／または放射線療法に応答したＲＮＡ破壊を評価するためのアッセイ、方法および装置に関する。
【０００２】
背景技術
リボ核酸（ＲＮＡ）は、タンパク質をコードするなど、遺伝情報をコードし、細胞において種々の役割を果たす生体高分子である。ＲＮＡ調製物は、例えば、マイクロアレイ実験、ＲＴ−ＰＣＲおよび多くの他の方法による遺伝子発現の検討において使用される。ＲＮＡ調製物を使用する実験の結果およびそのような実験により得られた結果の有意性は、用いたＲＮＡの完全性によるところが大きい。サンプルのＲＮＡ完全性を評価するためには種々の方法が利用できる。一般に、これらの方法では、熱分解またはＲＮアーゼ分解されたサンプルと完全なＲＮＡを有するサンプルとを、特定の分解レベルでのＲＮＡの能力が「ハウスキーピング」遺伝子などの特定のｍＲＮＡのＰＣＲ増幅を可能とするに十分完全であるかどうかに関して比較する。
【０００３】
例えば、Schroeder, A., O. Mueler, et al. (2006)は、ベイズ学習技術に基づくシグナル測定および構築物回帰モデルから特徴を自動的に選択する方法を記載している。次元の異なる特徴空間がベイズの枠組みで比較され、これにより、高い事後確率を有するモデルに相当する最終的な特徴の組合せが選択できる。このアプローチが、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーで記録された電気泳動ＲＮＡ測定値の大きな集合に対して適用され、ＲＮＡ完全性を記述するアルゴリズムが開発された。得られたアルゴリズムは、特定の条件下、および／または特定のサンプルに関してＲＮＡインテグリティーナンバー(RNA integrity number)（ＲＩＮ）の計算を可能とするＲＮＡ品質管理の標準化のための、ユーザーに依存しない、自動かつ信頼性のある手順である。
【０００４】
癌患者において化学療法の応答を測定するために腫瘍ＲＮＡの完全性を使用する方法が、２００８年９月５日出願のＰＣＴ／Ａ２００８／００１５６１に開示されている。
【発明の概要】
【０００５】
種々の実施形態の概要
一側面において、本明細書に記載の少なくとも１つの実施形態では、場合により、細胞傷害性処置、場合により増殖性障害に対する処置、場合により癌処置、場合により化学療法、補助療法または放射線療法に応答した細胞ＲＮＡに対してＲＮＡ破壊アッセイ(RNA Disruption Assay)（ＲＤＡ）を行うための方法が提供される。この方法は、場合により処置前、処置中または処置後の時点の細胞ＲＮＡを含んでなるユニークな生体サンプルに対応する少なくとも１つのエレクトロフェログラム(電気泳動図)データセットを得ること、１８Ｓおよび２８Ｓピークの潜在的シフトを合わせるような（to accommodate）２つの識別範囲を使用し、１８Ｓおよび２８Ｓピークを検出し、位置決定された１８Ｓおよび２８Ｓピークに少なくとも部分的に基づいて導かれた特徴を計算することにより、前記少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットから特徴に関する値を決定すること、ならびに場合により、前記特徴の値の組合せに基づいてＲＤＡスコアを決定することを含んでなる。
【０００６】
一側面において、本明細書に記載の少なくとも１の実施形態では、細胞傷害性処置、場合により化学療法および／または放射線療法に応答した細胞ＲＮＡに対してＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を行うための方法が提供される。この方法は、処置前、処置中または処置後の時点の細胞ＲＮＡを含んでなるユニークな生体サンプルに対応する少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットを得ること、前記少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットの少なくとも２つのシフト領域から特徴に関する値を決定すること、前記シフトは前記処置によるものである、ならびに場合により、前記特徴の値の組合せに基づいてＲＤＡスコアを決定することを含んでなる。
【０００７】
別の側面において、本明細書に記載の少なくとも１つの実施形態では、細胞傷害性処置、場合により癌処置、場合により化学療法薬、補助療法および／または放射線療法前、処置中または処置後の時点の細胞ＲＮＡを含んでなる生体サンプルにおけるＲＮＡ破壊の量を、本明細書に記載のＲＤＡを行うための方法に従って行われるＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を用いて定量すること、ならびに前記細胞ＲＮＡのＲＮＡ破壊の量が増加しているかしていないかを決定することを含んでなるアッセイが提供される。
【０００８】
別の側面において、本明細書に記載の少なくとも１つの実施形態では、細胞傷害性処置、場合により化学療法に対する感受性、例えば、化学療法に対する細胞の化学感受性および／または場合により放射線療法に対する細胞の放射線感受性を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが提供される。このアッセイは、処置前、処置中または処置後の時点の細胞ＲＮＡを含んでなる生体サンプルにおけるＲＮＡ破壊の量を、本明細書に記載のＲＤＡを行うための方法に従って行われるＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を用いて定量すること、ならびに定量されたＲＮＡ破壊の量を閾値または参照値と比較し、ＲＮＡ破壊の量が参照値に比べて増加していれば、その細胞をその処置に対して感受性（例えば、化学感受性および／または放射線感受性）と識別し、増加していなければ、その細胞をその処置に対して耐性と識別することを含んでなる。
【０００９】
別の側面において、本明細書に記載の少なくとも１つの実施形態では、被験体が細胞傷害性療法、場合により癌療法、場合により化学療法薬および／または放射線処置に応答しているか否かを決定するためのアッセイであって、前記被験体が処置、例えば化学療法および／または放射線療法を受ける前、受けている間および／または受けた後にその被験体から得られた生体サンプルをＲＮＡ破壊の量に関して、本明細書に記載のＲＤＡを行うための方法に従って行われるＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を用いてアッセイすることを含んでなり、ＲＮＡ破壊の量が閾値または参照値に比べて増加していれば、その被験体はその処置に応答していると識別されるアッセイが提供される。
【００１０】
別の側面において、本明細書に記載の少なくとも１つの実施形態では、癌処置の必要がある被験体を処置する方法であって、癌処置、場合により化学療法薬、補助処置および／または放射線を投与すること、前記被験体がその処置に応答しているか否かを、本明細書に記載のＲＤＡ法に従って決定すること、および前記被験体が応答していれば前記処置の投与を継続し、ならびに／または前記被験体が応答していなければ前記処置の投与を変更および／もしくは中断することを含んでなる方法が提供される。
【００１１】
別の側面において、本明細書に記載の少なくとも１つの実施形態では、細胞ＲＮＡに対するＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を行うための方法、場合により増殖性障害のための方法、場合により癌処置、場合により化学療法、補助療法または放射線療法を実施するために装置を適合させることを目的とする、装置のマイクロプロセッサ上で実行可能な複数の命令を含んでなる非一時的（持続性）コンピューター可読媒体が提供される。この方法は、処置前、処置中または処置後の時点の細胞ＲＮＡを含んでなるユニークな生体サンプルに対応する少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットにアクセスすること、１８Ｓおよび２８Ｓピークの潜在的シフトを合わせるような２つの識別範囲を使用し、前記１８Ｓおよび２８Ｓピークを検出し、位置決定された１８Ｓおよび２８Ｓピークに少なくとも部分的に基づいて導かれた特徴を計算することにより、少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットから特徴に関する値を決定すること、ならびに場合により、前記特徴の値の組合せに基づいてＲＤＡスコアを決定することを含んでなる。
【００１２】
別の側面において、本明細書に記載の少なくとも１つの実施形態では、細胞ＲＮＡに対するＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）、場合により増殖性障害に対する処置、場合により癌処置、場合により化学療法、補助療法または放射線療法を行うための装置が提供される。この装置は、処置前、処置中または処置後の時点の細胞ＲＮＡを含んでなるユニークな生体サンプルに対応する少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットを受容するためのデータインプット、前記データインプットに連結されたプロセッシングユニット、前記プロセッシングユニットは、１８Ｓおよび２８Ｓピークの潜在的シフトを合わせるような２つの識別範囲を使用し、前記１８Ｓおよび２８Ｓピークを検出し、位置決定された１８Ｓおよび２８Ｓピークに少なくとも部分的に基づいて導かれた特徴を計算することにより、前記少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットから特徴に関する値を決定するように構成されている、ならびにＲＤＡスコアの指示を伝達するように前記プロセッシングユニットに連結されたデータアウトプットを含んでなる。
【００１３】
別の側面において、本明細書に記載の少なくとも１つの実施形態では、細胞ＲＮＡに対するＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）、場合により増殖性障害の処置、場合により癌処置、場合により化学療法、補助療法または放射線療法を行うための装置が提供される。この装置は、処置前、処置中または処置後の時点の細胞ＲＮＡを含んでなるユニークな生体サンプルに対応する少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットを得るための手段、１８Ｓおよび２８Ｓピークの潜在的シフトを合わせるような２つの識別範囲を使用し、前記１８Ｓおよび２８Ｓピークを検出し、位置決定された１８Ｓおよび２８Ｓピークに少なくとも部分的に基づいて導かれた特徴を計算することにより、少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットから特徴に関する値を決定するための手段、ならびに前記特徴の値の組合せに基づいてＲＤＡスコアを決定するための手段を含んでなる。
【００１４】
別の側面において、本明細書に記載の少なくとも１つの実施形態では、細胞ＲＮＡに対するＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を行うための方法が提供される。この方法は、ある時点の細胞ＲＮＡを含んでなるユニークな生体サンプルに対応する少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットを得ること、前記少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットから１８Ｓピークおよび２８Ｓピークを定義すること、前記１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの両方に対して少なくとも１つのパラメーター値を決定すること、前記少なくとも１つのパラメーター値に適用される１以上の規則によって必要とされる場合には、前記１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの少なくとも一方を再定義すること、１８Ｓピーク面積および２８Ｓピーク面積を決定すること、ならびに前記１８Ｓピーク面積および２８Ｓピーク面積の少なくとも一方に基づいてＲＤＡスコアを決定することを含んでなる。
【００１５】
別の側面において、本明細書に記載の少なくとも１つの実施形態では、細胞ＲＮＡに対するＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を行うための方法が提供される。この方法は、ある時点の細胞ＲＮＡを含んでなるユニークな生体サンプルに対応する少なくとも１つのエレトロフェログラムデータセットを得ること、前記少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットから１８Ｓピークおよび２８Ｓピークを定義すること、前記１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの両方に対して少なくとも１つのパラメーター値を決定すること、ならびに前記少なくとも１つのパラメーター値に適用される１以上の規則によって必要とされる場合には、前記１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの少なくとも一方を再定義することを含んでなる。
【００１６】
別の側面において、本明細書に記載の少なくとも１つの実施形態では、細胞ＲＮＡに対するＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を行うための方法を実施するために装置を適合させることを目的とする、装置のマイクロプロセッサ上で実行可能な複数の命令を含んでなる、非一時的コンピューター可読媒体が提供される。この方法は、ある時点の細胞ＲＮＡを含んでなるユニークな生体サンプルに対応する少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットを得ること、前記少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットから１８Ｓピークおよび２８Ｓピークを定義すること、前記１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの両方に関して少なくとも１つのパラメーター値を決定すること、ならびに前記少なくとも１つのパラメーター値に適用される１以上の規則によって必要とされる場合には、前記１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの少なくとも一方を再定義することを含んでなる。
【００１７】
別の側面において、本明細書に記載の少なくとも１つの実施形態では、細胞ＲＮＡに対するＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を行うための装置が提供される。この装置は、ある時点の細胞ＲＮＡを含んでなるユニークな生体サンプルに対応する少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットを受容するためのデータインプット、前記データインプットに連結されたプロセッシングユニット、前記プロセッシングユニットは、前記少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットから１８Ｓピークおよび２８Ｓピークを定義し、前記１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの両方に対して少なくとも１つのパラメーター値を決定し、前記少なくとも１つのパラメーター値に適用される１以上の規則によって必要とされる場合には、前記１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの少なくとも一方を再定義するように構成されている、ならびにＲＤＡの指示を伝達するように前記プロセッシングユニットに連結されたデータアウトプットを含んでなる。
【００１８】
本開示のその他の特徴および利点は以下の詳細な説明から明らかとなる。しかしながら、本開示の趣旨および範囲の範囲内の種々の変更および改変が本詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明および具体例は、本開示の好ましい実施形態を示すが、単に例として示されるに過ぎないと理解されるべきである。
【００１９】
本明細書に記載の種々の実施形態のより良い理解のために、また、これらの種々の実施形態をどのように実行すればよいかをより明確に示すために、少なくとも１つの実施例を示す添付の図面を例として参照される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、自己分解性分解が起こる２４時間、室温にて生理食塩水中で維持したＭＣＦ−７腫瘍異種移植片のパンチ生検から単離したＲＮＡのエレクトロフェログラム出力の例である。
【図２】図２は、化学療法薬ドセタキセル（リン酸緩衝生理食塩水で１：２希釈した媒体（５０％媒体）中１０μＭ）で３７℃にて２４時間処置したヒトＡ２７８０卵巣癌細胞から単離したＲＮＡのエレクトロフェログラム出力(trace)の例である。
【図３】図３は、化学療法薬エピルビシン（５０％媒体中２０μＭ）で３７℃にて２４時間処置したＡ２７８０細胞から単離したＲＮＡのエレクトロフェログラム出力の例である。
【図４】図４は、ＲＮＡ破壊を評価するために使用可能な装置の実施形態のブロック図である。
【図５Ａ】図５Ａは、ＲＮＡ破壊を評価するために使用可能な方法の実施形態のフローチャートである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、それぞれ１８Ｓおよび２８Ｓシフト領域における１８Ｓおよび２８Ｓピークに関連する特徴を決定するために使用可能な方法の実施形態のフローチャートである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、１８Ｓピーク、２８Ｓピーク、中間バンド領域、低バンド領域およびマーカー領域を定義するエレクトロフェログラム例のグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、ｌｏｇ（最大中間／（２８Ｓ＋１８Ｓ））対、ｌｏｇ  ＲＮＡ濃度の特徴の両対数グラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、サンプル試験に関する最小中間／（２８Ｓ＋１８Ｓ）対、ｌｏｇ  ＲＮＡ濃度の特徴の片対数グラフである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、サンプル試験に関する最大中間／総面積対、ｌｏｇ  ＲＮＡ濃度の特徴の片対数グラフである。
【図６Ｄ】図６Ｄは、サンプル試験に関する最小値低バンド／総面積対、ｌｏｇ  ＲＮＡ濃度の特徴の片対数グラフである。
【図６Ｅ】図６Ｅは、サンプル試験に関する低／総面積比対、最大中間／総面積比の特徴のグラフである。
【図６Ｆ】図６Ｆは、サンプル試験に関する最大２８Ｓ／総面積対、ｌｏｇ  ＲＮＡ濃度の特徴の片対数グラフである。
【図６Ｇ】図６Ｇは、サンプル試験に関する最小２８Ｓ／総面積対、ｌｏｇ  ＲＮＡ濃度の特徴の片対数グラフである。
【図６Ｈ】図６Ｈは、サンプル試験に関する最大１８Ｓ／総面積対、ｌｏｇ  ＲＮＡ濃度の特徴の片対数グラフである。
【図６Ｉ】図６Ｉは、サンプル試験に関する最小１８Ｓ／総面積対、ｌｏｇ  ＲＮＡ濃度の特徴の片対数グラフである。
【図６Ｊ】図６Ｊは、サンプル試験に関する最大中間／２８Ｓ対、ｌｏｇ  ＲＮＡ濃度の特徴の片対数グラフである。
【図６Ｋ】図６Ｋは、サンプル試験に関する最小中間／２８Ｓ対、ｌｏｇ  ＲＮＡ濃度の特徴の片対数グラフである。
【図７Ａ】図７Ａは、ＲＤＡゾーンにおける患者分布のグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図６Ａに対応するＲＯＣ曲線である。
【図８Ａ】図８Ａは、電気泳動により分離された異種移植腫瘍ＲＮＡサンプルのゲルの画像である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図８Ａのゲルのレーン１のエレクトロフェログラム出力の図である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、図８Ａのゲルのレーン２に対応するエレクトロフェログラム出力の図である。
【図８Ｄ】図８Ｄは、図８Ａのゲルのレーン３に対応するエレクトロフェログラム出力の図である。
【図８Ｅ】図８Ｅは、図８Ａのゲルのレーン４に対応するエレクトロフェログラム出力の図である。
【図８Ｆ】図８Ｆは、図８Ａのゲルのレーン５に対応するエレクトロフェログラム出力の図である。
【図８Ｇ】図８Ｇは、図８Ａのゲルのレーン６に対応するエレクトロフェログラム出力の図である。
【図８Ｈ】図８Ｈは、図８Ａのゲルのレーン７に対応するエレクトロフェログラム出力の図である。
【図８Ｉ】図８Ｉは、図８Ａのゲルのレーン８に対応するエレクトロフェログラム出力の図である。
【図８Ｊ】図８Ｊは、図８Ａのゲルのレーン９に対応するエレクトロフェログラム出力の図である。
【図８Ｋ】図８Ｋは、図８Ａのゲルのレーン１０に対応するエレクトロフェログラム出力の図である。
【図８Ｌ】図８Ｌは、図８Ａのゲルのレーン１１に対応するエレクトロフェログラム出力の図である。
【図８Ｍ】図８Ｍは、図８Ａのゲルのレーン１２に対応するエレクトロフェログラム出力の図である。
【図９Ａ】図９Ａは、種々の時間、種々の濃度のドセタキセルで処置した後の、培養Ａ２７８０卵巣癌細胞の数を示すグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、種々の時間、種々の濃度のドセタキセルで処置したＡ２７８０卵巣癌細胞に関する細胞当たりのＲＮＡ量のグラフである。
【図９Ｃ】図９Ｃは、種々の時間、０．２マイクロモルのドセタキセルで処置した細胞に関して細胞総数をプロットしたグラフである。
【図９Ｄ】図９Ｄは、２４時間、種々の濃度のドセタキセルで処置したＡ２７８０卵巣癌細胞ＲＮＡサンプルを電気泳動により分離した場合のゲルの画像である。
【図９Ｅ】図９Ｅは、図９Ｄの０．００５マイクロモルレーンおよび０．２マイクロモルレーンに対応するエレクトロフェログラム出力の図である。
【図９Ｆ】図９Ｆは、図９Ｅの出力から計算した中間面積／（２８Ｓ＋１８Ｓ）のグラフである。
【図９Ｇ】図９Ｇは、図９Ｅの出力から計算した低面積／（２８Ｓ＋１８Ｓ）のグラフである。
【図９Ｈ】図９Ｈは、種々の時間、種々の濃度のドセタキセルで処置した細胞のＡ２７８０卵巣癌細胞ＲＮＡサンプルを電気泳動により分離した場合のゲルの画像である。
【図９Ｉ】図９Ｉは、Ａ２７８０感受性および耐性細胞ＲＮＡサンプルを電気泳動により分離した場合のゲルの一連の画像である。
【図９Ｊ】図９Ｊは、カスパーゼ阻害剤の存在下または不在下、種々の時間、種々の濃度のドセタキセルで処置したＡ２７８０卵巣癌細胞ＲＮＡサンプルを電気泳動により分離した場合のゲルの画像である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、種々の時間、放射線で処置したＡ２７８０卵巣癌細胞に関して計算した中間面積／（２８Ｓ＋１８Ｓ）のグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、種々の用量および時間、放射線で処置した細胞のＡ２７８０卵巣癌細胞ＲＮＡサンプルを電気泳動により分離した場合のゲルの画像である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＦＥＣ、放射線およびドセタキセルで処置した患者に関して計算した濃度に対する中間面積／（２８Ｓ＋１８Ｓ）のグラフである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＦＥＣ、放射線およびドセタキセルで処置した患者に関する低面積／（２８Ｓ＋１８Ｓ）のグラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、それぞれ１８Ｓおよび２８Ｓシフト領域における１８Ｓおよび２８Ｓピークに関連する特徴を決定するために使用可能な方法の別の実施形態のフローチャートである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、エレクトロフェログラム例のグラフであり、１８Ｓピーク、２８Ｓピーク、中間バンド領域、低Ｃバンド領域、低Ｂバンド領域、低Ａバンド領域およびマーカー領域が定義されている。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、図１２Ａの方法を用いてどのようにピークが決定されるかを示すグラフである。
【図１３】図１３は、修正ピーク識別法を用いたサンプル試験に関するｌｏｇ（中間／（２８Ｓ＋１８Ｓ））対、ｌｏｇ  ＲＮＡ濃度の特徴の両対数グラフである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、修正ピーク識別法を用いたＲＤＡゾーンにおける患者分布のグラフである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、図１４Ａに対応するＲＯＣ曲線である。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、修正ピーク識別法を用いたサンプル試験に関するｌｏｇ（低Ｃ／（２８Ｓ＋１８Ｓ））対、ｌｏｇ  ＲＮＡ濃度の特徴の両対数グラフである。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、修正ピーク識別法を用いたサンプル試験に関するｌｏｇ（中間＋低Ｃ）／（２８Ｓ＋１８Ｓ）対、ｌｏｇ  ＲＮＡ濃度の特徴の両対数グラフである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、修正ピーク識別法を用いたサンプル試験に関する（２８Ｓピーク幅＋１８Ｓピーク幅）対、（２８Ｓ＋１８Ｓ）の特徴のグラフである。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、線形判別分析（ＬＤＡ）により決定された仕切線(partition line)をさらに含んでなる図１５Ａのグラフである。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、別の例のＬＤＡ対により決定された仕切線をさらに含んでなる図１５Ａのグラフである。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、二次判別分析（ＱＤＡ）により決定された仕切線をさらに含んでなる図１５Ａのグラフである。
【図１６Ａ】図１６Ａは、修正ピーク識別法を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に関する低Ｃ／（２８Ｓ＋１８Ｓ）対、ドセタキセル用量の特徴のグラフである。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、修正ピーク識別法を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に関する（中間＋低Ｃ）／（２８Ｓ＋１８Ｓ）対、ドセタキセル用量の特徴のグラフである。
【図１７Ａ】図１７Ａは、トラスツズマブによる術前補助療法を受けている患者のサンプル試験に関す最大中間／（２８Ｓ＋１８Ｓ）対、ＲＮＡ濃度の特徴のグラフである。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、トラスツズマブによる術前補助療法を受けている患者のサンプル試験に関する最大中間／（２８Ｓ＋１８Ｓ）対、ＲＮＡ濃度の特徴のグラフである。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ゾメタによる術前補助療法を受けている患者のサンプル試験に関する最大中間／（２８Ｓ＋１８Ｓ）対、ＲＮＡ濃度の特徴のグラフである。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、ゾメタによる術前補助療法を受けている患者のサンプル試験に関する最大中間／（２８Ｓ＋１８Ｓ）対、ＲＮＡ濃度の特徴のグラフである。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｆはエレクトロフェログラム出力の一連の図であり、それぞれについて計算されたＲＩＮ値およびＲＤＩ値を添えた。
【図１９】図１９は、電気泳動により分離したＲＮＡサンプルのゲルの画像、および各サンプルに関して対応するＲＩＮ値およびＲＤＩ値である。
【図２０Ａ】図２０Ａは、スニチニブとともにインキュベートした結腸腺癌細胞に関する中間面積／（２８Ｓ面積＋１８Ｓ面積）の特徴のグラフである。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、マフォスファミドとともにインキュベートした結腸腺癌細胞に関する中間面積／（２８Ｓ面積＋１８Ｓ面積）の特徴のグラフである。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、エピルビシンとともにインキュベートした結腸腺癌細胞に関する中間面積／（２８Ｓ面積＋１８Ｓ面積）の特徴のグラフである。
【発明の具体的説明】
【００２１】
種々のアッセイ、方法または装置を、各特許請求発明の実施形態の一例を示すために以下に記載する。下記の実施形態はいずれの特許請求の範囲に記載の発明も限定せず、いずれの特許請求の範囲に記載の発明も下記のものとは異なる方法または装置を包含し得る。これらの特許請求の範囲に記載の発明は、下記のいずれか１つの装置または工程の特徴の総てを有する装置または工程に限定されず、または、下記の装置もしくは工程の複数もしくは総てに共通の特徴に限定されない。下記の装置または工程がいずれの特許請求の範囲に記載の発明の実施形態でもない場合があり得る。本明細書で特許請求されない下記の装置または工程で開示される発明はいずれも、別の保護手段、例えば、継続特許出願の手段となり得、当該出願者、発明者または権利者は、本明細書におけるその開示によりかかる発明の放棄、権利不要求または公衆への献呈を意図しない。
【００２２】
さらに、説明を簡単かつ明瞭にするために、適当であると考えられる場合、対応するまたは類似の要素を示すために図面間で参照番号を繰り返す場合があると理解される。さらに、本明細書に記載の実施形態の十分な理解を提供するために多くの具体的詳細が示される。しかしながら、当業者には、本明細書に記載の実施形態がこれらの具体的詳細を用いずに実施され得ることが理解されるであろう。他の例では、本明細書に記載の実施形態を不明瞭にしないために周知の方法、手順および成分は詳細に記載されていない。また、このような記載は本明細書に記載の実施形態の範囲を限定するものと見なされるべきでない。
【００２３】
Ｉ．定義
本明細書で使用する用語「連結される」とは、２つの要素が互いに直接連結され得るか、または１以上の介在要素を介して互いに連結され得ることを示す。
【００２４】
用語「自己分解性ＲＮＡ分解」とは、本明細書で使用する場合、自己分解性細胞破壊中に起こるＲＮＡ分解を意味する。自己融解（分解）は、例えば、生理学的または病態生理学的な活動プロセスによるものではなく細胞の活動プロセスの停止によって細胞質中に消化酵素を放出する細胞のリソソームによって誘発される。サンプル中の自己分解性ＲＮＡ分解は、生理学的環境から長時間、細胞を取り出すこと（例えば、生理食塩水中でのインキュベーション）および／または非特異的な生理学的プロセスの停止、例えば熱処理によって誘発することができる。
【００２５】
用語「ＲＮＡ破壊」とは、本明細書で使用する場合、薬物処置、例えば、化学療法、放射線療法および／または細胞傷害性抗体処置（例えば、トラスツズマブ）などの細胞傷害性処置に応答して誘導されるシグナルである、個々に断片化され、かつ／または分解されたＲＮＡを意味する。細胞傷害性シグナル誘導性ＲＮＡ破壊は、自己分解性分解、特に例えば後期ステージのそれに似たいくつかの特徴を有するＲＮＡ分解を含み得る。
【００２６】
用語「被験体」とは、本明細書で使用する場合、例えば、癌などの増殖性障害を有する、または有する疑いのある被験体を含む、動物界のメンバー、好ましくはヒトを意味する。
【００２７】
用語「対照」とは、本明細書で使用する場合、完全なＲＮＡなどの比較対象、被験体または既知の結果を有する個体群からの処置前サンプル、および／またはそのようなサンプルに対応するもしくはそのようなサンプルから導かれた値を意味する。治療結果を評価するための方法に関して、対照は、特定の細胞または癌性腫瘍に関するＲＮＡ分解のベースライン量またはもしくは中央もしくは平均処置前量などの参照値であり得る。対照は、癌処置、例えば、化学療法および／もしくは放射線療法などの細胞傷害性処置に応答しているもしくは応答していないことが分かっている１もしくは複数の被験体からのサンプル、またはそのようなサンプルから決定可能な値、例えば、それを上回るか下回るかで（その閾値または測定値がどのように定義されるかによる）、サンプルが破壊されたＲＮＡを有する尤度、または被験体もしくは疾患がその細胞傷害性処置に応答性である尤度、例えば腫瘍が化学療法処置に応答性である尤度を識別する１以上の閾値であり得る。対照はまた、被験体の既知の結果群に対して臨床ゾーンを定義する一連の閾値などの２つ以上の対照であってもよく、ここで、各ゾーンは予想応答と関連する。多くの細胞種由来の、または、例えば処置前腫瘍サンプル由来の非処置細胞（例えば、処置前細胞）は、高いＲＮＡ完全性を持ち得る。よって、対照は、例えば、１以上の処置前サンプルから導かれた処置前値であり得る。以下に記載するように、ＭＡ２２試験において、閾値を超える処置中腫瘍値を有する（例えば、分解の増大を示した）被験体は、処置後の乳房および腋窩内の病理学的完全応答と相関していた。
【００２８】
用語「内部標準」とは、本明細書で使用する場合、特定のアッセイに対して正規化因子として使用されるＲＮＡサンプルを意味する。例えば、アッセイがＲＮＡチップの使用を含んでなる場合、内部標準は、尺度：（中間面積＋低Ｂ面積＋低Ｃ面積）／（２８Ｓ面積＋１８Ｓ面積）に対して最小値を有すると決定されるサンプルであり得る。内部標準は、どのサンプルを調整するか識別するために使用することができる。内部標準は被験サンプルおよび／または対照サンプルであってもよい。
【００２９】
用語「ベースライン量」とは、本明細書で使用する場合、後の時点で、例えば、処置中または処置後、例えば、化学療法、細胞傷害性抗体処置および／または放射線処置を含んでなる処置計画中または処置計画後に採取した試験サンプルとの比較（例えば、細胞集団および／または腫瘍との比較）に使用される処置前サンプルなどのサンプルにおける、ＲＮＡ分解（例えば、ＲＮＡ破壊および／または自己触媒性ＲＮＡ分解）の量を意味する。例えば、処置に対する応答のモニタリングに関する方法では、「ベースライン量」は、後のサンプルの前に採取したサンプルにおけるＲＮＡ分解レベルを意味し、例えば、ベースラインサンプルは処置前に採取し、それとの比較が処置に対する応答の指標となる。
【００３０】
ＲＮＡ分解（例えば、破壊）に関して用語「量」とは、本明細書で使用する場合、サンプルから単離されたＲＮＡにおいて、検出可能または測定可能なＲＮＡの分解／破壊の量を（例えば、相対量または絶対量）を意味する。例えば、この量は、絶対値（例えば、ＲＤＩ値）または相対量、例えば、対照量の１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、１０、１５、２０、２５、３０、４０、６０、８０および／または１００倍などを用いて表すことができ、ここで、例えば、対照量は、例えば、処置前量または、例えば、非処置または処置前サンプルにおける平均値または中央値レベルに対応する参照値である。この量は、その処置に応答している尤度を有する被験体を識別する閾値と比較することができる。
【００３１】
対象結果の判別に関して用語「閾値」（「カットオフ」または「カットオフ値」とも呼ばれる）とは、本明細書で使用する場合、既知の結果を有するサンプルの集団から導かれ、かつ、選択された特異度および／または感度に関して臨床ゾーン境界（例えば、ＲＤＡゾーン）を識別する値を意味する。複数の臨床ゾーン境界を画定する複数の閾値が使用可能である。ゾーン境界は臨床ゾーンを画定し、ＲＤＡゾーン内に入るＲＤＡスコア（例えば、ＲＤＩ）を有する被験体は、そのゾーンにより定義される、特定の細胞傷害性処置、例えば、化学療法および／または放射線療法に応答するまたは応答しない高い尤度を有すると識別される。例えば、閾値は、既知結果の患者のパネルに関する最高値（例えば、特異度１００％）または例えば本明細書に記載の実施例の１つに従って計算した場合の中央値レベルもしくは他の選択されたレベルでああり得る。閾値を超えるか、またはある閾値より小さい、もしくは２つの閾値の間にある、もしくは第２の閾値より大きいとして特定されるゾーン内に入るＲＤＩスコアを有する被験体は、例えば、その処置に応答している可能性があるか、不明確であるか、またはその処置に応答していない可能性があると予測される。閾値は、例えば複数のサンプルのデータベースから導くことができる。
【００３２】
用語「１８Ｓ」および「２８Ｓ」とは一般に、これらの用語がピークまたは幅またはバンドなどの他の単語により修飾されない限り（ゲル上で分離された１８Ｓおよび２８Ｓバンドを意味し得る）、それぞれ１８Ｓピーク面積および２８Ｓピーク面積を意味する。よって、用語「１８Ｓピーク」および「２８Ｓピーク」は、それぞれ１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの高さを表す。さらに、用語１８Ｓ幅および２８Ｓ幅は、それぞれ１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの幅を表す。ひと度、ピークが位置決定されれば、本明細書に記載の特定の方法に従ってピーク幅およびピーク高さが決定される。例えば、ピーク幅は、ピークの終了時間からピークの開始時間を引くことによって定義することができる。別の例として、ピーク高さはピーク領域またはバンドの最高点の絶対値と定義できる場合がある。
【００３３】
用語「特異度」とは、本明細書で使用する場合、例えば対照レベルおよび／またはカットオフレベル以下であるＲＮＡ破壊スコアに基づいて処置に応答していないと識別された、その処置に応答している被験体のパーセンテージを意味する。
【００３４】
用語「感度」とは、本明細書で使用する場合、ＲＮＡ破壊アッセイスコア、すなわち、例えば、対照量および／または閾値を超えることに基づいて処置に応答していると識別された、応答性のある被験体のパーセンテージを意味する。
【００３５】
用語「サンプル」とは、本明細書で使用する場合、１）被験体（例えば、試験被験体）からの任意の体液、細胞もしくは組織サンプル、または細胞ＲＮＡを含んでなる細胞株、場合により、腫瘍組織／細胞、および／または２）このようなサンプルに由来するＲＮＡを意味する。例えば、サンプルは、微細針穿刺液などの針穿刺液、コア生検、ブラシ生検および／または腹腔鏡下生検を含む生検であり得る。サンプルは、例えば、「処置後」サンプル（このサンプルは１種類以上の細胞傷害性、例えば、癌処置後に得られる）、または「ベースラインサンプル」（これは、場合により処置前に得られるか、または処置後サンプルよりも早い時点で採取され、例えば、細胞傷害性処置に対する応答を評価またはモニタリングするためにベースラインとして使用される）であり得る。腫瘍組織／細胞は、任意の組織または細胞、例えば、癌性組織または細胞、例えば、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、肉腫、白血病、リンパ腫もしくは多発性骨髄腫もしくは結腸癌、および／または任意の癌、例えば、アントラサイクリンおよび／またはタキサンによって処置可能な癌（例えば、ＨＥＲ２＋／−、ＥＲ＋／−、ＰＲ＋／−、トポイソメラーゼ＋／−またはトリプルネガティブ乳癌を含む、その任意のサブタイプを含む）であり得る。
【００３６】
用語「ＲＮＡ破壊アッセイスコア」または「ＲＤＡスコア」とは、本明細書で使用する場合、本明細書に記載のＲＮＡ破壊アッセイに基づいて評価されるＲＮＡ分解の程度および／または処置に対する応答の尤度の指標となるスコアまたは尺度である。ＲＤＡスコアは、例えば、下記に記載されるＲＮＡ破壊指数（ＲＤＩ）として表される、例えば、本明細書に記載のエレクトロフェログラム特性に基づいた計算の出力であり得、またはカットオフもしくは閾値に基づいた臨床ＲＤＡゾーンにより定義される、変換された尺度であり得、各スコアまたはＲＤＡゾーンは、例えばＮＰＶおよび／またはＰＰＶにより定義される、例えば、処置に対する応答性の尤度に関連した応答の尤度と関連している。一実施形態では、高いまたは増大したＲＮＡ破壊アッセイスコア（例えば、ベースラインサンプルまたは対照と比較）は、高いまたは増大したＲＮＡ破壊の指標となる。例えば、このような実施形態では、ＲＮＡ破壊スコアが高いほどＲＮＡ破壊が大きい（また、ＲＮＡ完全性が低下）。例えば、３、１０、または６００など任意の尺度を使用することができる。当業者ならば、この尺度はまた逆数としてもよく（例えば、１をスコアで割ること、例えば、１／ＲＮＡスコアによる）、そうすればＲＮＡ破壊スコアが低いほどＲＮＡ破壊が大きくなることを認識するであろう。
【００３７】
用語「ＲＤＡゾーン」とは、本明細書で使用する場合、一定範囲のＲＮＡ破壊スコア、例えば、ＲＤＩ値を含んでなる処置応答結果に関連する臨床ゾーンを意味する。各ＲＤＡゾーンは１または２つの境界により画定され、各境界は選択された閾値に対応する（例えば、所望のＮＰＶまたはＰＰＶに対応する）。前記臨床ゾーンに入る対象ＲＤＡスコア（場合により、ＲＤＩ値）は、処置応答、例えば、ｐＣＲに関連するか、またはその指標となる。これらの実施例では、選択されたＮＰＶおよび／またはＰＰＶにより定義されるＲＤＡゾーン１、ＲＤＡゾーン２およびＲＤＡゾーン３の３つのＲＮＡ破壊アッセイゾーンが使用される。当業者ならば、それぞれ選択された閾値が異なる任意の数のゾーンが使用できる状況を容易に実現することができよう。
【００３８】
用語ＲＮＡ破壊指数「ＲＤＩ」とは、本明細書で使用する場合、ＲＤＡを用いて求められる値であり、本明細書に記載の特徴のＬＤＡまたは二次判別分析のアウトプットに関する、本明細書に定義される特徴の比であり得る。既知の応答結果患者群から決定された（例えば、特定のＮＰＶまたはＰＰＶに関連すると決定された）ＲＤＩ値は、ＲＤＡゾーンの閾値境界を画定するために使用することができる。
【００３９】
用語「ＲＤＡゾーン１」とは、本明細書で使用する場合、少なくとも０．８、少なくとも０．８５、少なくとも０．９、少なくとも０．９５、少なくとも０．９６、少なくとも０．９７、少なくとも０．９８またはそれを超える陰性的中率（ＮＰＶ）を有するＲＤＡスコア（例えば、ＲＤＩ値）の範囲を意味する。これらの数値および関連の閾値は、例えば、実施例で使用される３サイクル目のＭａ−２２データセットのｐＣＲおよびＲＤＡ測定値に基づく。例としての実施形態では、ＲＤＡゾーン１は、中間面積／（２８Ｓ面積＋１８Ｓ面積）の特徴を用いて計算された１０以下のＲＤＩに相当する。他の実施形態では、他の特徴または特徴の組合せが使用可能である。「ＲＤＡゾーン１」は、所望のＮＰＶを選択することによって任意のスコアセットを含むように定義され得る。
【００４０】
用語「ＲＤＡゾーン２」とは、本明細書で使用する場合、ＲＤＡゾーン１と３の間に入るＲＤＡスコア（例えば、ＲＤＩ値）の範囲を意味し、中間または中間ゾーンとみなすことができる。
【００４１】
用語「ＲＤＡゾーン３」とは、本明細書で使用する場合、少なくとも０．１５、少なくとも０．１６、少なくとも０．１７、少なくとも０．１８、少なくとも０．１９、少なくとも０．２またはそれを超える陽性的中率（ＰＰＶ）を有するＲＤＡスコア（例えば、ＲＤＩ値）の範囲を意味する。これらの数値および関連閾値は、例えば、実施例で使用される３サイクル目のＭａ−２２データセットのｐＣＲおよびＲＤＡ測定値に基づく。「ＲＤＡゾーン３」は、所望のＮＰＶを選択することによって任意のスコアセットを含むように定義され得る。
【００４２】
用語「応答」、「応答する」または「応答性」とは、本明細書で使用する場合、細胞、例えば、ある腫瘍内の癌細胞または癌細胞のサブセットがＲＮＡ破壊に関して処置に応答する場合の、化学療法および／または放射線療法などの細胞傷害性処置に対する癌性細胞または腫瘍などの細胞応答を意味し、例えば、ある被験体に関して、これらの細胞は処置により誘導される有意なＲＮＡ分解を示し、その被験体は正の治療結果、例えば、腫瘍量の減少、疾病の安定化、生存の改善、例えば、無病生存および／または病理学的完全応答を有する。一実施形態では、例えば、腫瘍量の減少、疾病の安定化、生存の改善、例えば、無病生存および／または病理学的完全応答のうち１以上をもって細胞傷害性処置に応答する被験体は「応答者」と見なされ、および／または例えば、腫瘍量の減少、疾病の安定化、生存の改善、例えば、無病生存および／または病理学的完全応答のうち１以上を示さない被験体は「不応答者」と見なされる。
【００４３】
癌性細胞または腫瘍などの細胞に関して用語「耐性」とは、本明細書で使用する場合、細胞、例えば、腫瘍内の癌細胞または癌細胞のサブセットが、ＲＮＡ破壊に関してその処置に対する応答を全く示さないか、またはほとんど示さず、負の治療結果、例えば、疾病進行および／または癌性腫瘍を有する被験体にとっての治療利益の欠如を示す場合の、細胞傷害性処置に対する細胞または腫瘍応答を意味する。
【００４４】
用語「ＲＮＡ濃度の低下」とは、本明細書で使用する場合、対照または対応する参照値、例えば、処置前サンプルまたは例えば最大値よりも少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低いＲＮＡ濃度を意味する。ＲＮＡ濃度は、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーマシン、その等価なＲＮＡ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ（ＲＱＩ）を用いるＥｘｐｅｒｉｏｎ（商標）キャピラリー電気泳動システム、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）または他の等価なシステム、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｕｍｅｘ、またはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造されたものまたは類似のシステムを使用する例えば、マイクロキャピラリー電気泳動を含むいくつかの方法によって決定することができる。ＲＮＡ濃度は、例えば、２６０ｎｍでＵＶ吸光度を評価することによるなど、ＵＶ吸光度に基づいてもよい。
【００４５】
用語「低リスク」とは、進行に関して使用する場合、例えば、同様に処置された同じ癌を有する患者群に関して計算された平均リスクよりも十分に低いリスク（例えば、確率の低下）を意味し、従って、それらの患者は保存療法で高い生存確率を有することになり、また、高い進行リスクは、患者の低リスク群に比べて平均リスクよりも高いこと（例えば、確率の増加）を意味する。
【００４６】
用語「安定なＲＮＡ完全性」または「ＲＮＡ破壊の欠如」とは、本明細書で使用する場合、例えば、適当な比較対象サンプルまたは組織の細胞種に関して予測されるＲＮＡ完全性と比較した場合に測定できるほど分解されないＲＮＡ、例えば、１０％未満の完全性低下または１５％未満の完全性低下を意味する。
【００４７】
用語「ＲＮＡ単離または安定化組成物」とは、本明細書で使用する場合、ＲＮアーゼ活性を十分に阻害し、かつ／またはＲＮＡを安定化してＲＮＡ分解を防ぐいずれの組成物も意味する。
【００４８】
用語「ＲＮＡ完全性」とは、本明細書で使用する場合、細胞または組織からの抽出または単離後のＲＮＡの無傷な程度、例えば、単離されたＲＮＡが分解（例えば、破壊および／または自己分解性破壊）されるかどうかを意味する。高いＲＮＡ完全性は一般に、分解がほとんどない〜全くないこと、例えば、最大ＲＮＡ完全性および／もしくは対照サンプルからの３０％未満、２５％未満、２０％未満もしくは１０％未満の減少、または抽出または単離後に対象とするｍＲＮＡを増幅する能力を保持することを意味すると考えられる。低い完全性のＲＮＡは、例えば、最大および／もしくは対照サンプルからの２０％より大きい、２５％より大きい、３０％より大きい、３５％より大きい、４０％より大きい、４５％より大きい、５０％より大きい、５５％より大きい、６０％より大きい、６５％より大きい、７０％より大きい、もしくは７５％より大きい減少、またはそれらが抽出または単離後のＲＮＡの対照中に存在することが分かっている場合には、対象とするｍＲＮＡを増幅する能力の低下を示すＲＮＡである。ＲＮＡ完全性はまた、絶対数として表すこともできる。例えば、１つのＲＮＡ完全性尺度を１〜６００に割り付け、スコアが増えるほど高いＲＮＡ破壊／分解に関連する。例えば、スコア５００を含むサンプルは、スコア４００のサンプルよりも大きいＲＮＡ分解を含む。
【００４９】
本明細書で使用する場合、当技術分野で十分に理解されているように、「処置」とは、臨床結果を含め、有益または所望の結果を得るためのアプローチである。有益または所望の臨床結果としては、限定されるものではないが、検出可能または検出不能に関わらず、１以上の症状または病態の緩和または改善、疾患の程度の減弱、病状の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患の拡散の予防、疾病進行の遅延または緩徐化、疾患の逆転、病状の改善または軽減、および緩解（部分的または全面的に関わらず）を含み得る。「処置」とはまた、処置を受けない場合に予測される生存期間と比較した場合の生存期間の延長も意味し得る。
【００５０】
用語「シグナル誘導性細胞傷害性処置」とは、本明細書で使用する場合、疾患、例えば癌の処置に使用される、細胞死を誘導し得る任意の薬剤または放射線、例えば、従来型および非従来型化学療法（例えば、標的化療法）、放射線療法、ホルモン療法（例えば、応答性癌に対する）およびそれらの組合せを意味する。このような薬剤としては、限定されるものではないが、微小管安定化剤、例えばドセタキセルおよびパクリタキセル、ＤＮＡ合成阻害剤、例えばエピルビシン、Ｈｅｒ２受容体阻害剤、例えばトラスツズマブ、ＤＮＡ  架橋剤、例えばマフォスファミド、カルボプラチンおよびシスプラチン、ＶＥＧＦＡ阻害剤、例えばベバシズマブ、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えばスニチニブおよびトセラニブ、ビスホスホネート、例えばゾレンドロン酸、チミジル酸シンターゼ阻害剤、例えば５−フルオロウラシルを含む。
【００５１】
処置に関して用語「放射線」とは、例えば電磁放射線を含め、腫瘍に適用される任意のエネルギー、光子または粒子を意味する。
【００５２】
放射線に関して用語「用量」とは、本明細書で使用する場合、スケジュール内の各時点で投与される個々の放射線暴露またはスケジュール内の放射線暴露の総量を意味する。化学療法に関して、用量は、スケジュール内の各時点で投与される個々の薬剤の量または化学療法コース中に投与されル薬剤の総量を意味する。
【００５３】
用語「癌処置を変化させる」または「癌処置を変更する」とは、本明細書で使用する場合、例えば、放射線の用量レベルを変化させること、処置を中断すること、処置に１または複数の化学療法薬を加えること、または薬物療法または手術などの代替癌処置に切り替えることのうち１以上を含む。
【００５４】
本開示の範囲を理解する上で、用語「含んでなる」およびその派生語は、本明細書で使用する場合、記載されている特徴、要素、成分、群、整数、および／または工程の存在を条件として指定するが、記載されていない他の特徴、要素、成分、群、整数および／または工程の存在を排除しない、オープンエンドタームであることが意図される。以上のことはまた、用語「含む」、「有する」およびそれらの派生語などの類似の意味を有する用語にも当てはまる。
【００５５】
本開示の範囲を理解する上で、「実質的に」、「約」および「およそ」などの程度の用語は、本明細書で使用する場合、修飾されている用語の妥当な偏差量を意味し、従って、最終結果は有意に変化を受けない。これらの程度の用語は、この偏差が、それが修飾する用語の意味を打ち消さない限り、修飾された用語の少なくとも±５％の偏差を含むと解釈されるべきである。
【００５６】
本開示の範囲を理解する上で、用語「からなる」およびその派生語は、本明細書で使用する場合、記載されている特徴、要素、成分、群、整数、および／または工程の存在を条件として指定し、かつ、記載されていない特徴、要素、成分、群、整数および／または工程の存在も排除するクローズエンドタームであることが意図される。
【００５７】
本明細書で終点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包含される総ての数および分数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、および５を含む）。また、総ての数およびその分数は「約」という用語で修飾されると考えられることも理解されるべきである。さらに、内容がそうではないことを明示しない限り、「１つの(a)」、「１つの(an)」および「その(the)」は複数の指示語を含むことも理解されるべきである。用語「約」は、参照される数値のプラスまたはマイナス０．１〜５０％、５〜５０％、または１０〜４０％、好ましくは１０〜２０％、より好ましくは１０％または１５％を意味する。
【００５８】
さらに、特定の節に記載される定義および具体例は、当業者に理解されているようにそれらが好適であると記載されている本明細書における他の具体例に適用可能であることが意図される。例えば、以下の節で、本発明の種々の側面がより詳細に定義される。このように定義される各側面は、そうではないことが明示されない限り、他のいずれの１または複数の側面と組み合わせてもよい。特に、好ましいまたは有利であると示される特徴はいずれも、好ましいまたは有利であると示される他のいずれの１または複数の特徴または特徴と組み合わせてよい。
【００５９】
ＩＩ．アッセイ、方法および製品
引用することにより本明細書の開示の一部とされる２００８年９月５日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１５６１、例えば、局所進行性乳癌患者における化学療法に対する応答を、例えば、ＲＮＡインテグリティーバリュー（ＲＩＮ）(Schroeder, Mueller et al. 2006)ならびに２８Ｓ：１８ＳリボソームＲＮＡ比により測定される、化学療法薬のＲＮＡ分解誘導能をモニタリングすることによりモニタリングする方法。カナダ臨床試験（ＣＡＮ−ＮＣＩＣ−ＣＴＧ−ＭＡ．２２、以下、「ＭＡ２２」）からのデータを用い、腫瘍ＲＩＮ値はエピルビシン／ドセタキセル化学療法で処置中の一部の乳癌患者では有意に低下したこと、および処置中の低い腫瘍ＲＩＮ値はその計画の高い薬物用量レベルと有意に相関し得ること（ｐ＝０．０５）が実証された(Parissenti, Chapman et al. 2010)。彼らはまた、低い処置中腫瘍ＲＩＮ値と乳房および腋窩処置後の範囲内での病理学的完全応答との間に相関を示すこともできた。
【００６０】
臨床応答と相関するエレクトロフェログラムの成分を決定するために、ＭＡ２２  ＲＮＡエレクトロフェログラムデータを調べた。Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーソフトウエアは、２０％を超えるサンプルでエレクトロフェログラムの２８Ｓピークまたは１８Ｓピークのいずれかが誤った識別を受けていたことが明らかになった。例えば、これらのサンプルの少なくともいくつかでは、ピークの先端の小部分がピーク全体と識別されていた。しかしながら、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーソフトウエア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅｘｐｅｒｔ）(Mueller 2004、 Vespucci 2005)は、目で識別可能な完全なＲＮＡのエレクトロフェログラム上で２８Ｓピークと１８Ｓピークを正しく識別することができた。しかしながら、破壊されたＲＮＡを含むサンプルでは、エレクトロフェログラムピークはＡｇｉｌｅｎｔ  ＲＩＮソフトウエアにより誤った識別を受けていたが、正しいピークがエレクトロフェログラム上の視覚的に適当な位置に留まっていた。ＲＩＮ値を求めるＡｇｉｌｅｎｔ法（以下、ＲＩＮアルゴリズムと呼称）は、無傷か完全な自己分解性分解を受けたかのいずれかであって、「部分的に分解された」サンプルをほとんど含まないＲＮＡサンプルに基づくものであった(Schroeder, Mueller et al. 2006)。Ａｇｉｌｅｎｔ法などの方法は、一般に、自己分解性分解を評価するためのものである。
【００６１】
重要なこととして、現行のＲＩＮアルゴリズムの２８Ｓピークと１８Ｓピークの識別の誤りは、異常な２８Ｓ：１８Ｓ比（「０」値をとることが多い）またはＮ／Ａと表示されたＲＩＮ値を生じた（例えば、図１８Ａ〜１８Ｆ参照）。
【００６２】
本明細書では、化学療法および／または放射線療法などの細胞傷害性処置により誘発されるＲＮＡ破壊は、自己分解性分解を受けたＲＮＡからの種々のプロフィールの特徴を含んでなることが開示される。例えば、図１は、生理食塩水に２４時間浸したガーゼ（そこで自己分解性分解が起こる）中の腫瘍サンプルのエレクトロフェログラム出力を示す。この出力のおよそ２６秒のマークのところに小断片の大きなピークが見られる。また、２８Ｓピークの減損も見られる。
【００６３】
化学療法薬で処置した細胞は、異なるＲＮＡ破壊のパターンを示す。例えば、図２は、化学療法薬ドセタキセルで処置したヒト卵巣癌細胞株Ａ２７８０を示し、中間ピークおよび１８Ｓピークに隣接したピークを示す。図３は、化学療法薬エピルビシンで処置したＡ２７８０細胞を示す。エレクトロフェログラムは、１８Ｓピークと２８Ｓピークの間に中間バンドを示す。図９Ｄは、漸増濃度の化学療法薬ドセタキセルで処置したＡ２７８０細胞由来のＲＮＡのゲルの画像を示す。０．０５μＭドセタキセルで処置した細胞では、付加的なバンドが見られる。図９Ｅは、０．００５μＭと０．２μＭの時点のエレクトロフェログラムを示し、ｘ軸はヌクレオチドのサイズである。０．２μＭ時点のエレクトロフェログラムは、１８Ｓピークと２８Ｓピークの間に中間バンドを示す。さらに、２８Ｓピークおよび１８Ｓピークは図１の場合に比べてシフトし、自己分解性ＲＮＡ分解を示す。
【００６４】
また、ＲＩＮアルゴリズムを用いて誤った識別を受けたピークがＲＮＡサンプルに見られ、２８Ｓピークと１８Ｓピークの間に位置する大きな「中間バンド」ピークを持っていたことも確認された（図１８Ａ〜Ｆおよび図１９の例を参照）。
【００６５】
類似のパターンが放射線処置でも見られた。付加的なバンドは放射線で処置した細胞でも見られる。
【００６６】
よって、本開示の一側面は、癌患者が化学療法薬に応答性であるか否かを識別するためのアッセイ、方法および装置を含む。一般に、本方法は、細胞傷害性処置によるエレクトロフェログラムの４つの異なるシフト領域、すなわち、シフトした２８Ｓピーク、シフトした１８Ｓピーク、「中間バンド」領域内の少なくとも１つのピーク（この中間バンド領域は、シフトした１８Ｓピークとシフトした２８Ｓピークの間にある）、および「低バンド」領域内の少なくとも１つのピーク（この低バンド領域は、シフトした１８Ｓピーク下にある）、のうち少なくとも２つから得られる特徴を識別することを含んでなる。例えば、０〜１００単位（ユニット）の尺度（この尺度は図５Ｂに関してさらに詳細に記載される）を選択することができ、これはＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーで実行されるＣａｌｉｐｅｒ  Ｎａｎｏチップの条件下で９．５〜４２．８秒の間に移動する全ＲＮＡを含む。
【００６７】
ここで図４を参照すると、ＲＮＡ破壊を評価するために使用可能な装置１００の例としての実施形態のブロック図が示されている。装置１００は、癌サンプルを化学療法薬および／または放射線に曝した後にその癌ＲＮＡサンプルなどのＲＮＡサンプルのエレクトロフェログラムを評価するための方法を実行するように構成されている。この評価は、本明細書に記載のエレクトロフェログラムデータに基づいた種々の特徴を組み込んだＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）スコアをもたらす。高いＲＤＡスコアは、例えば、その後のｐＣＲなどの正の処置応答と関連し、低いＲＤＡスコアは、患者が長期間、化学療法および／または放射線利益を受ける見込みがないことを示す。本明細書に記載の方法は、化学療法および／または放射線療法の有効性の評価を助けるため、高い分解能と高い堅牢度を備えたエレクトロフェログラムにおいてピークおよび異常なピークを検出する。よって、本明細書に記載の方法の適用は、ＲＮＡ分子分離の際の蛍光強度の正確な記録に依存するが、エレクトロフェログラムデータにおいてピークを分析するために使用される市販のソフトウエアには依存しない。
【００６８】
一般に、装置１００は、少なくとも１つのプロセッシングユニット１０２、ディスプレー１０４、ユーザーインターフェース１０６、データインターフェース１０８、インプット／アウトプット（Ｉ／Ｏ）ハードウエア１１０、ワイヤレスモジュール１１２、電源１１４、メモリー１１６、およびエレクトロフェログラムデバイス１１８を含んでなる。メモリー１１６は、オペレーティングシステム１２０を実施するためのソフトウエアコード、ファイルシステム１２２、ＲＮＡ破壊分析モジュール１２６を含む種々のプログラム１２４および少なくとも１つのデータベース１２８を含んでなる。装置１０はスタンドアロンデバイスであってもよいし、またはデスクトップコンピューター、ラップトップ、モバイルデバイス、スマートホン、セルホン、タブレット、パーソナル・デジタル・アシスタントなどを搭載してよい。
【００６９】
前記成分の１以上が使用されない装置１００の別の様々な実施形態が存在し得る。例えば、いくつかの実施形態では、ワイヤレスモジュール１１２は任意選択である。いくつかの実施形態では、ワイヤレスモジュール１１２またはデータインターフェース１０８のいずれかを使用し得る。さらに、いくつかの実施形態では、エレクトロフェログラムデータは、例えば、データ通信ネットワークまたはワイヤレス通信を介して取得および送信され得るか、またはそうでなければ、例えば、ＣＤ、ＵＳＢドライブ、ＵＳＢキーなどを介して装置１００に提供されるので、エレクトロフェログラムデバイス１１８は含まれない。これらの場合、エレクトロフェログラムデータは一般に、スプレッドシート形式または１以上のサンプルに関して時系列の蛍光強度を提供する他の多くの形式であり得るデータファイルにおいて利用可能である。これらの場合、医療専門家、医療機関または研究機関はこのエレクトロフェログラムデータを取得し、このデータを装置１００による分析に供することができる。例えば、第二機関が装置１００を所有し、エレクトロフェログラムデータを受け取り、装置１００を用いて前記エレクトロフェログラムデータを分析し、その後、結果を、前記エレクトロフェログラムデータを最初に提供した機関に送るという状況があり得る。
【００７０】
プロセッシングユニット１０２は装置１００の動作を制御し、当業者により知られているような、装置１００の構成に応じた好適ないずれのプロセッサであってもよい。いくつかの実施形態では、プロセッシングユニット１０２は、特定用途向け集積回路(Application Specific Circuit）（ＡＳＩＣ）、プログラマブルロジックアレイ、または離散的アナログと離散回路の集合体を用いて実施することができる。
【００７１】
ディスプレー１０４は、装置１００の構成に応じて視覚的情報を与える好適ないずれのディスプレーであってもよい。例えば、ディスプレー１０４は、装置１００がコンピューターである場合には、陰極線管、フラットスクリーンモニターなどであり得る。他の場合には、ディスプレー１０４は、ラップトップ、タブレット、またはＬＣＤに基づくディスプレーなどのハンドヘルドデバイスに好適なディスプレーであり得る。
【００７２】
ユーザーインターフェース１０６は、この場合にも装置１００の特定の実装に応じて、グラフィカルユーザーインターフェース、マウス、キーボード、タッチスクリーン、サムホイール、トラックパッド、トラックボール、カードリーダー、音声認識ソフトウエアなどのうち少なくとも１つを含み得る。場合によっては、これらの成分のいくつかは互いに組み込まれていてもよい。
【００７３】
データインターフェース１０８は、装置１００を他のデバイスまたはコンピューターと通信可能とするいずれのインターフェースであってもよい。場合によっては、データインターフェース１０８は、シリアルポート、パラレルポート、またはＵＳＢ接続を提供するＵＳＢポートのうち少なくとも１つを含み得る。データインターフェース１０８はまた、イーサネット、ファイヤワイヤもしくはモデム接続を介した、またはデジタル加入者線を介したインターネットまたはローカルエリアネットワーク接続のうち少なくとも１つも含み得る。データインターフェース１０８内には、これらの要素の種々の組合せを組み込むことができる。
【００７４】
Ｉ／Ｏハードウエア１１０は、マイクロホン、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＣＤ−ＲＯＭ読取り／書込みドライブ、スピーカーおよびプリンターのうち少なくとも１つを含み得る。ワイヤレスモジュール１１２は、ＩＥＥＥ  ８０２．１１ａ、８０２．１１ｂ、または８０２．１１ｇなどの適当な標準に従ってＣＤＭＡ、ＧＳＭ、ＧＰＲＳまたはＢｌｕｅｔｏｏｔｈプロトコールを使用して通信する無線であってよい。電源１１４は、当業者に知られているように、装置１００の実装に応じてパワーアダプターまたは再充電可能なバッテリーパックなど、装置１００に電力を供給する好適ないずれの電源であってもよい。
【００７５】
メモリー１１６は、ＲＡＭおよびフラッシュメモリー素子、ならびにディスクドライブおよびハードドライブなどの他の記憶素子を含み得る。メモリー１１６は、当業者に一般に知られているように、オペレーティングシステム１２０、ファイルシステム１２２およびプログラム１２４を保存するために使用される。例えば、オペレーティングシステム１２０およびファイルシステム１２２は、装置１００に様々な基本動作プロセスを提供する。プログラム１２４は、ユーザーがデータの閲覧、分析およびレポート、ならびに装置１００の実装によっては可能性としてメッセージの送信および受信を含めて装置１００と対話できるように、様々なユーザープログラムを含む。
【００７６】
メモリー１１６はまた、ＲＮＡ破壊分析モジュール１２６および１以上のデータベース１２８も保存する。ＲＮＡ破壊分析モジュール１２６は、ある形態の化学療法および／または放射線を受けている患者から得られたサンプルに対するＲＮＡ破壊値を、それぞれ図５Ａ、および５Ｂまたは１２Ａでより詳細に記載される様々な特徴および方法に従って決定することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ破壊分析モジュール１２６は、一般に、プロセッシングユニット１０２（ファイヤワイヤを用いてプログラムされるか、または実行可能なコードを実行するプロセッサであり得る）により実装可能であるか、または装置１００の実装に応じて離散回路部品によって実装される。
【００７７】
一般に、プロセッシングユニット１０２は、少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットの少なくとも２つのシフト領域から特徴に関する値を決定し、かつ、それらの特徴の値の組合せに基づいてＲＤＡスコアを決定するように構成されている。よって、プロセッシングユニット１０２、その様々な選択的実装において、少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットの少なくとも２つのシフト領域から特徴に関する値を決定するための手段、およびそれらの特徴の値の組合せに基づいてＲＤＡスコアを決定するための手段として働き得る。このシフトは、細胞傷害性処置、例えば、化学療法および／または放射線による処置によるものである。
【００７８】
プロセッシングユニット１０２は、処置中または処置後のうち少なくとも１つを含む種々の時点の細胞ＲＮＡ、例えば癌性腫瘍ＲＮＡを含んでなるユニークな生体サンプルに対応する少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットを受容するようにデータインプットに連結されている。場合によっては、エレクトロフェログラムデータセットは、処置を受けていないユニークな生体サンプルに対応する（すなわち、由来する）してもよい。いくつかの実施形態では、エレクトロフェログラムデバイス１８、データインターフェース１０８、ワイヤレスモジュール１１２、Ｉ／Ｏハードウエア１１０、メモリー１１６および他の好適なデバイスのうち少なくとも１つが、データインプットとしてまたは少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットを得るための手段として働き得る。プロセッシングユニット１０２はまた、ＲＤＡスコア、例えば、ＲＤＩスコア、ＲＤＡゾーン、または少なくとも一被験体に関する他の関連のあるいずれかの分析的ＲＮＡデータの指示を伝達するようにデータアウトプットに連結されている。いくつかの実施形態では、ディスプレー１０４、ワイヤレスモジュール１１２、データインターフェース１０８、メモリー１１６、および他の好適ないずれかのデバイスのうち少なくとも１つは、データアウトプットとして働き得る。
【００７９】
データベース１２８は、ＲＮＡ破壊分析モジュール１２６で評価されるサンプルのデータを保存するために使用することができる。データベース１２８はまた、プログラム１２４またはオペレーティングシステム１２０の動作に必要な他の情報、例えば、動的にリンクされたライブラリーなどを保存することもできる。
【００８０】
エレクトロフェログラムデバイス１１８は、サンプルのエレクトロフェログラムを作成するように構成されている。一般に、エレクトロフェログラムデバイス１１８は、サンプルのＲＮＡをそれらの粒子のサイズと電荷によって分画するために、特定の孔隙率を有するゲルを用いる。次に、そのサンプルに対するエレクトロフェログラム出力を作成するために、分画されたＲＮＡに関連する蛍光情報を得る。その後、エレクトロフェログラム出力をデジタル化してエレクトロフェログラムデータセットを形成する。エレクトロフェログラムデバイス１１８は様々な方法で実装可能である。例えば、いくつかの実施形態では、エレクトロフェログラムデバイス１１８は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  ＮａｎｏキットおよびＣａｌｉｐｅｒ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＲＮＡナノチップを用いるＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーである。
【００８１】
装置１００は少なくとも１つのユーザーインターフェースを含んでなり、プロセッシングユニット１０２は、エレクトロフェログラムデータならびに他の情報、例えば、エレクトロフェログラムが導かれた個体に関する情報を受容するように、これらのユーザーインターフェースのうち少なくとも１つと通信する。このデータは、装置１００の特定の実装およびデータのタイプに応じて、データインターフェース１０８、Ｉ／Ｏハードウエア１１０、ワイヤレスモジュール１１２、メモリー１１６またはエレクトロフェログラムデバイス１１８を介して受容可能である。プロセッシングユニット１０２は、ＲＤＡスコアを出力するために、これらの素子のうちいずれか１つならびにディスプレー１０４またはＩ／Ｏハードウエア１１０と通信可能である。例えば、装置１００は、装置１００のユーザーに対してＲＤＡスコアを出力することができる。さらに、装置１００のユーザーは、得られたＲＤＡスコアを、ネットワーク接続を介して保存および／または他の医療専門家によるさらなる分析のためのリモートシステムに伝達することができる。この通信は、いくつかの実施形態ではｅメール通信も含むことができる。
【００８２】
別の実施形態では、装置１００は、ウェブサーバーとして働き、ウェブサイトにコンテツを提供するコンピューターであり得る。ウェブサイト上のウェブページの１つは、本明細書に記載されるようにサンプルからの１以上のＲＤＡスコアを提供するウェブページであり得る。この場合、ユーザーは、エレクトロフェログラムデータを得るためにそのウェブページと対話することができ（例えば、データをアップロードすることによる）、装置１００はエレクトロフェログラムデータを分析し、ウェブページ上にＲＤＡスコアを表示し、かつ／またはそのＲＤＡスコアをユーザーにｅメールで知らせ、かつ／またはユーザーによるダウンロード用のＲＤＡスコアを提供することができる。あるいは、エレクトロフェログラムデータは、ｅメール通信でウェブサーバーに送ることができ、ウェブサーバーは、エレクトロフェログラムデータを分析してＲＤＡスコアを決定した後、この情報を所定の宛先へｅメール通信を介して送ることができる。
【００８３】
ここで、図５Ａを参照すると、ＲＮＡ破壊を評価するために使用可能な方法２００の例としての実施形態のフローチャートが示されている。方法２００は一般に、同じ時点で少なくとも１つのサンプルから得られたエレクトロフェログラムデータのＲＮＡ破壊アッセイスコアを決定するために、必要な場合、装置１００の付加的要素と協調してプロセッシングユニット１０２により行われる。
【００８４】
よって、本開示の側面は、細胞傷害性処置に応答した細胞ＲＮＡに対してＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を行うための方法を含み、その方法は、
処置過程または処置の完了後の時点の細胞ＲＮＡを含んでなるユニークな生体サンプルに対応する少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットを得ること、
少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットの少なくとも2つのシフト領域から特徴に関する値を決定すること、このシフトは前記処置によるものである、および
前記特徴の値の組合せに基づいてＲＤＡスコアを決定すること
を含んでなる。
【００８５】
２０２において、エレクトロフェログラムデータは、サンプルに関して作成される。これには、細胞傷害性処置中または処置後、例えば、それぞれ療法前、療法中および療法後とも（また、処置前、処置中および処置後とも）呼べる特定の時点で、患者または試験被験体から採取された（またはｉｎ  ｖｉｔｒｏであれば回収された）ユニークな生体サンプルからそれぞれいくつかのエレクトロフェログラムデータセットを作成することを含んでよく、ここで、療法は、何分か、何日かまたは何週間かなどの特定の期間にわたって行われる一連の化学療法薬および／または放射線投与（例えば、注射、暴露）と定義される。一般に、エレクトロフェログラムデータセットは、あるサンプルに関して作成されたデジタル型のエレクトロフェログラム出力である。エレクトロフェログラムデータセットは、ＲＤＡスコアを作成するために処理された数列である。いくつかの実施形態では、エレクトロフェログラムデータセットは、カンマ区切り値(Comma Value Separated )（ＣＶＳ）データファイル形式またはＥＸＣＥＬデータファイル形式などのスプレッドシート形式であり得る。いくつかの実施形態では、方法２００の２０２は、エレクトロフェログラムデータが別の機関によって作成される場合には任意選択であってよく、その後、分析のために別の場所に送られ、その場合には、方法２００は２０４から始まる。
【００８６】
２０４において、ユニークな生体サンプルに対して少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットが得られる。得られるデータセットの数は、ＲＤＡスコアを決定するために使用される特徴によって決まる。例えば、いくつかの特徴は、１つのサンプルから作成された１つだけのエレクトロフェログラムデータセットからの値を必要とするＲＤＡスコアを決定するために使用することができる。しかしながら、いくつかの特徴は、いくつかのユニークな生体サンプルから作成されたいくつかのエレクトロフェログラムデータセット、例えば、２つまたは３つのユニークな生体サンプルから得られた２つまたは３つのデータセットを必要とするＲＤＡスコアを決定するために使用することができる。いずれの場合でも、エレクトロフェログラムデータセットは一般に、メモリー素子１１６、ＣＤ−ＲＯＭ、ＵＳＢキー、ポータブルハードドライブなどの記憶デバイスから、データベースから、ネットワーク素子から、またはインターネットにアップロードされたデータから得られる。
【００８７】
２０６において、１または複数のエレクトロフェログラムデータセットにおいて１８Ｓピークおよび２８Ｓピークのうち少なくとも一方の潜在的シフトを合わせるような（考慮するように）２つの識別範囲を用いて、特徴に関する値が決定される。例えば、前記識別領域は、１または複数のエレクトロフェログラムデータセットの少なくとも２つのシフト領域であり得る。前記特徴に関する値を決定するために分析されるシフト領域は、シフトした１８Ｓ領域、シフトした２８Ｓ領域、中間バンド領域および低バンド領域のうち少なくとも２つを含む。中間バンド領域は、２８Ｓピークと１８Ｓピークの間の領域と定義される。低バンド領域は、１８Ｓピークの下の総てのバンドを含むが、マーカー領域は含まない。図５Ｃは、これらの種々のピークおよび領域が示されているエレクトロフェログラム例である。２８Ｓピークおよび１８Ｓピークは、特定のｘ軸（すなわち、時間軸）範囲内にあると定義され、複数の最大値を含み得る。しかしながら、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの識別に別法を使用することもでき、下記で図１２Ａに関してより詳細に記載する。この場合、識別範囲は、これらのピークがシフトするか、またはそうでなければ１または複数のエレクトロフェログラムデータセット内に分布するかに関わらず、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの位置を決定するために定義される（例えば、特定の大きさを有する）２つの広い領域である。図５Ｂの方法が使用されるか図１２Ａの方法が使用されるかに関わらず、これらの領域および／またはピークに基づいて様々な特徴を定義することができる。例えば、これらの特徴は、１８Ｓピークの面積、２８Ｓピークの面積、中間バンド領域の面積、低バンド領域の面積、１以上のバンド部分領域の面積、および総面積のうち１以上を含み得る。総面積は、１８Ｓピーク、２８Ｓピーク、中間バンド領域および低バンド領域の面積の和である。他の特徴としては、１８Ｓピークの幅および２８Ｓピークの幅のうち１以上を含み得る。これらのピークおよび領域の面積は、一般に、数値積分法のための台形公式（Ａｔｋｉｎｓｏｎ、１９８９）などの周知の数学法を用いて計算することができる。しかしながら、これらのピークおよび領域の始点は、それらのサンプルに対する化学療法薬効果によって異なる。よって、場合によっては、これらの特徴の値を正確に決定するために、付加的な公式を使用しなければならない。
【００８８】
方法２００の作業２０６で使用することができる、１８Ｓピークと２８Ｓピークの識別およびこれらのピークまたは隣接領域に関連する特定の特徴の計算のための改良法の別の例としての実施形態を図１２Ａに関して記載する。低バンド領域はまた、本明細書に記載のいくつかの方法で使用するために、図１２Ｂで示されるように、「低Ｃ」、「低Ｂ」および「低Ａ」部分領域またはバンド領域に分けることができる。低Ａバンド領域は自己分解性分解によるならびに他の影響によるＲＮＡを含み得ること、および低Ｃバンド領域は、例えば、細胞傷害性処置などの様々な外的刺激によるＲＮＡへの影響を評価する上で重要な領域であることが分かっている。また、特定の薬物に応答して、ＲＮＡは低Ｃバンド領域へ、そして低Ｂバンド領域へ、さらには低Ａバンド領域へと拡散を始めることも分かっている。
【００８９】
２０８において、ＲＤＡスコアは、様々な特徴に関する値の組合せに基づいて決定される。これらの組合せは、これらの特徴のうちいくつかの比を含み得る。いくつかの場合では、ＲＤＡスコアを決定するために、１つのサンプルから１つだけのエレクトロフェログラムデータセットが使用される。他の場合では、ＲＤＡスコアを決定するために、同時点で得られたいくつかのユニークな生体サンプルからいくつかのエレクトロフェログラムデータセットが使用される。これら後者の場合では、これらの値は、ミニマム関数またはマキシマム関数などの数学関数を用いて組み合わせることができる。
【００９０】
特徴はまた、ピーク高さ、ピーク幅およびピーク位置のうち１以上など、エレクトロフェログラムのシフト領域の他の成分に基づいてもよい。例えば、一実施形態では、特徴の組合せは、応答者と不応答者間を判別するために１８Ｓピーク幅と２８Ｓピーク幅に基づくことが可能であり得る。
【００９１】
一実施形態では、特徴の組合せは、シフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積に対する、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積の比を含んでなり、「２８Ｓ／１８Ｓ」または「２８Ｓ：１８Ｓ」という表現で表すことができる。
【００９２】
一実施形態では、特徴の組合せは、総面積に対する、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積の比を含んでなり、「２８Ｓ／総面積」という表現で表すことができる。
【００９３】
一実施形態では、特徴の組合せは、総面積に対する、シフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積に比を含んでなり、「１８Ｓ／総面積」という表現で表すことができる。
【００９４】
一実施形態では、特徴の組合せは、総面積に対する、中間バンド領域面積の比を含んでなり、「中間面積／総面積」という表現で表すことができる。
【００９５】
一実施形態では、特徴の組合せは、総面積に対する、低バンド領域面積の比を含んでなり、「低バンド面積／総面積」という表現で表すことができる。
【００９６】
一実施形態では、特徴の組合せは、シフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積とシフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積の和に対する、中間バンド領域面積に比を含んでなり、「中間バンド面積／（１８Ｓ＋２８Ｓ）」という表現で表すことができる。
【００９７】
一実施形態では、特徴の組合せは、シフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積とシフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積の和に対する、低バンド領域面積の比を含んでなり、「低バンド面積／（１８Ｓ＋２８Ｓ）」という表現で表すことができる。
【００９８】
一実施形態では、特徴の組合せは、シフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積とシフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積の和に対する、低Ｃバンド領域面積の比を含んでなり、「低Ｃ／（１８Ｓ＋２８Ｓ）」という表現で表すことができる。１８Ｓと２８Ｓは、これらの表現のいずれにおいても２８Ｓ＋１８Ｓのように逆転させることができ、この表現の意味を変化させないことに留意すべきである。
【００９９】
一実施形態では、特徴の組合せは、シフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積に対する、中間バンド領域面積の比を含んでなり、「中間バンド面積／１８Ｓ」という表現で表すことができる。
【０１００】
一実施形態では、特徴の組合せは、シフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積に対する、低バンド領域面積の比を含んでなり、「低バンド面積／１８Ｓ」という表現で表すことができる。
【０１０１】
一実施形態では、特徴の組合せは、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積に対する、中間バンド領域面積の比を含んでなり、「中間バンド面積／２８Ｓ」という表現で表すことができる。
【０１０２】
一実施形態では、特徴の組合せは、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積に対する、低バンド領域面積の比を含んでなり、「低バンド面積／２８Ｓ」という表現で表すことができる。
【０１０３】
一実施形態では、特徴の組合せは、シフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積とシフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積の和に対する、低バンド領域面積と中間バンド領域面積の和の比を含んでなり、「（低バンド面積＋中間バンド面積）／（１８Ｓ＋２８Ｓ）」という表現で表すことができる。
【０１０４】
一実施形態では、特徴の組合せは、少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最大比を含んでなる。この比は、中間バンド領域面積をシフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積とシフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積の和で割った商と定義される。これは、「最大中間バンド面積／（１８Ｓ＋２８Ｓ）」という表現で表すことができる。この場合、マキシマム関数を以下の特定の特徴とともに使用する他の計算を用いた場合と同様に、中間バンド面積／（１８Ｓ＋２８Ｓ）の比は、２以上のエレクトロフェログラムデータセット（同時点の２以上のユニークな生体サンプルに由来）に関して計算され、これらの比の最大値が計算され、その後、その対数が計算される。例えば、２以上のエレクトロフェログラムデータセットは、同時点で採取された２以上の生検および／または２以上のサンプルに分けられる生検に由来し得る。
【０１０５】
一実施形態では、特徴の組合せは、少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最小比を含んでなる。この比は、中間バンド領域面積をシフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積とシフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積の和で割った商と定義される。これは、「最小中間バンド面積／（１８Ｓ＋２８Ｓ）」という表現で表すことができる。この場合、ミニマム関数を以下の特定の特徴とともに使用する他の計算を用いた場合と同様に、中間バンド面積／（１８Ｓ＋２８Ｓ）の比は、２以上のエレクトロフェログラムデータセット（同時点の２以上のユニークな生体サンプルに由来）に関して計算され、これらの比の最小値が計算される。
【０１０６】
一実施形態では、特徴の組合せは、少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最大比を含んでなる。この比は、中間バンド領域面積を総面積で割った商と定義される。これは、「最大中間バンド面積／総面積」という表現で表すことができる。
【０１０７】
一実施形態では、特徴の組合せは、少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最小比を含んでなる。この比は、低バンド領域面積を総面積で割った商と定義される。これは、「最小低バンド面積／総面積」という表現で表すことができる。
【０１０８】
一実施形態では、特徴の組合せは、低バンド領域面積を総面積で割った比および少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された第２の比の最大値を含んでなり、この第２の比は、中間バンド面積を総面積で割った商である。これらの特徴の組合せは、それぞれ「低バンド面積／総面積」および「最大中間バンド面積／総面積」という表現で表すことができる。
【０１０９】
一実施形態では、特徴の組合せは、少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最大比を含んでなる。この比は、２８Ｓピーク面積を総面積で割った商と定義される。これは、「最大２８Ｓ／総面積」という表現で表すことができる。
【０１１０】
一実施形態では、特徴の組合せは、少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最小比を含んでなる。この比は、２８Ｓピーク面積を総面積で割った商と定義される。これは、「最小２８Ｓ／総面積」という表現で表すことができる。
【０１１１】
一実施形態では、特徴の組合せは、少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最大比を含んでなる。この比は、１８Ｓピーク面積を総面積で割った商と定義される。これは、「最大１８Ｓ／総面積」という表現で表すことができる。
【０１１２】
一実施形態では、特徴の組合せは、少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最小比を含んでなる。この比は、１８Ｓピーク面積を総面積で割った商と定義される。これは、「最小１８Ｓ／総面積」という表現で表すことができる。
【０１１３】
一実施形態では、特徴の組合せは、少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最大比を含んでなる。この比は、中間面積をシフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積で割った商と定義される。これは、「最大中間／２８Ｓ」という表現で表すことができる。
【０１１４】
一実施形態では、特徴の組合せは、少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最小比を含んでなる。この比は、中間面積をシフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積で割った商と定義される。これは、「最小中間／２８Ｓ面積」という表現で表すことができる。
【０１１５】
上記のこれらの特徴の組合せのそれぞれにおいては、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークならびに他の領域を定義するために方法３００または方法４００（図１２Ａに記載）のいずれもが使用可能であることに留意すべきである。シフト領域が使用されるのではなく方法４００が使用される場合、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの位置を決定するためにより広い領域が使用される。
【０１１６】
２１０において、ＲＤＡスコアは、処置の有効性を決定するために閾値と比較することができる。閾値は、応答者を識別するために様々な試験結果のデータベースに対してＲＯＣ分析を行うことに基づいて決定されるスカラー値であってよく、この分析は高い陽性的中率（予測値）(predictive value)（ＰＰＶ）と低い偽陽性率を達成するために閾値を選択することによって行うことができる。この分析はまた、不応答者が高い陰性的中率（ＮＰＶ）と低い偽陰性率で識別できるように閾値を選択することによって不応答者を識別するために行うことができる。よって、この目標は、高いＰＰＶのための閾値および高いＮＰＶを伴う閾値を得ること、およびＰＰＶ閾値とＮＰＶ閾値の間の距離を最小とすることである。いくつかの実施形態では、いくつかの閾値が、完全応答、部分応答および不応答の尤度の上昇など、予測される処置結果の種々のタイプに関するいくつかのＲＤＡゾーンを定義するために使用可能である（ＲＤＡゾーンの例としては、図７Ａおよび／または図１４Ａ参照）。
【０１１７】
別の実施形態では、ＲＤＡスコアを閾値と比較するのではなく、ＲＤＡスコアを、線形もしくは非線形であり得る閾値曲線、または閾値三次元領域と比較してもよい。この場合、閾値直線、閾値曲線または閾値面は、図１５Ｂ〜１５Ｄに関して記載されているように、ＬＤＡまたはＱＤＡを用いて決定することができる。
【０１１８】
ここで、図５Ｂを参照すると、それぞれ１８Ｓシフト領域および２８Ｓシフト領域における１８Ｓピークおよび２８Ｓピークに関する特徴を決定するために使用することができる方法３００の例としての実施形態のフローチャートが示されている（別法が図１２Ａに関して記載されている）。これらのピークは他のピークから識別可能であり、特定のサイズを有するとともに、これらのピークおよび結果として得られるそれらの面積の決定の精度を増すために、１以上の規則が使用できる。しかしながら、以下の規則の総てが適用される必要はない。例えば、強い１８Ｓピークおよび２８Ｓピークが存在し、中間バンドがほとんど存在しないかもしくは全く存在しない場合、工程３１０および３１２は行わなくてもよい。
【０１１９】
３０２において、エレクトロフェログラムのシフト領域の境界は、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークを適正に決定するためにサンプルに対して、化学療法の効果、または他のいくつかの処置計画もしくは効果によって定義される。複数の実験結果と通して繰り返したところ、１８Ｓピークの約９５％が３９．５〜４３．５秒の範囲（すなわち、シフトした１８Ｓ領域）に見られ、２８Ｓピークの約９５％が４７．５〜５３．５秒の範囲（すなわち、シフトした２８Ｓ領域）にあったが、この分析を他の処置計画に対して繰り返すことができる。従って、シフトした１８Ｓ領域および２８Ｓ領域の境界条件はそれぞれ、３８．５〜４６．５秒の範囲および４３〜５３．５秒の範囲から、３９．５〜４３．５秒の範囲および４７．５〜５３．５秒の範囲へ変化していた。これらの範囲は例えば図１２Ａに関して記載したものなど、処理技術の違いによって変化し得ることに留意するべきである。エレクトロフェログラムデータセットの時間軸（例えば、ｘ軸）が０〜１００単位の尺度に変換される場合、シフトした１８Ｓ領域の境界条件は４０．９〜５０．４となり、シフトした２８Ｓ領域の境界条件は５８．１〜６９．５となる。この変換は、マーカー領域の端部を０単位に、そして約６０〜６５秒の領域の時点、例えば６３秒を、例えば１００単位に位置決めすることを含む。これにより、よりストリンジェントな条件により定義される１８Ｓピークおよび２８Ｓピークが得られた。
【０１２０】
ほとんどのピークは、これらのシフトした１８Ｓ領域および２８Ｓ領域を適正に用いて同定された。これは、まず、総てのピーク候補に関して検索し、次に、最大の面積を有するものを１８Ｓピークまたは２８Ｓピークとして選択することを含み得る。幅が、それぞれ１８Ｓピークの場合には約０．６〜７．６単位の範囲内、２８Ｓピークの場合には約０．８〜１０．５単位の範囲内にない候補ピークは、１８Ｓピークまたは２８Ｓピークとして選択されないように、候補ピークセットから除外されてよい。２８Ｓピークを誤って識別する確率は１８Ｓピークを誤って識別する確率よりもはるかに大きいことが分かっている。従って、まず、１８Ｓピークを識別するとよい。また、２８Ｓピークを識別する場合、１８Ｓピークとの距離が距離閾値よりも大きい２８Ｓピーク候補は、２８Ｓピークとして選択されないようにピーク候補から除外される。
【０１２１】
３０４において、例えば１８Ｓピークおよび２８Ｓピークなどのピークに関してピーク面積が決定される。この決定を行うために、極小値の概念（Ｓｔｅｗａｒｔ, ２００８）を用いてピーク面積を定義する。ある関数の極小値は、ある近傍内の点でその関数がとる最小の値である。１８Ｓまたは２８Ｓのピークが分かれば、そのピークに最も近い２つの極小値を見つけることができる。そのピークの左側の極小値に対応する点（シフト領域内）はそのピークの始点と定義することができ、そのピークの右側の極小値に対応する点（シフト領域内）はそのピークの終点と定義することがでる。ピーク面積は、これら２つの極小値の間の面積と定義される。よって、あるピークのピーク面積は、そのピークが１つの最大値を有する、あるシフト領域内のピークの両側の２つの極小値間の面積により定義される。
【０１２２】
しかしながら、下記のような特定の場合では、ピークが２つ以上の最大値を有すると定義することもできる。３０６において、ピークが、そのピークの面積に応じて２つ以上の最大値（すなわち、２つ以上のピーク）をもつべきか否かが決定される。ＲＩＮ法を用いた場合に見られた誤りの多くは２８Ｓピークおよび１８Ｓピーク内の複数の最大値によるものであったことからこの調整が用いられる（図１８参照）。複数のピークまたは１つのピークにおける複数の値の存在は、いくつかの方法において決定することができる。試験データを分析することにより、ピーク面積の値が閾値よりも小さいことが分かった場合、そのピークは２つ以上の最大値を含んでなることを許容された。言い換えれば、計算された面積が対応するピークとマッチしなければ、すなわち、ピークが実際に大きい場合にピーク面積が極めて小さければ、そのピークは複数のピークを持つと定義される。例えば、そのピークは２つの最大値を持ち得る。１つの例としての実施形態では、閾値は０．２ＦＵ・秒である。この条件によって、ＲＩＮ法に関してこれまでに不適切に検出された例のほとんどがうまく補正された。
【０１２３】
３０８において、シフトした１８Ｓ領域および２８Ｓ領域の境界は、必要であれば、これらのピークの互いに対する面積に応じて調整される。例えば、シフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積を総面積で割った商に１００を掛けたもの（１８Ｓ％で表される）が、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積を総面積で割った商に１００を掛けたもの（２８Ｓ％で表される）の約８倍より小さければ、シフトした１８Ｓ領域は４２．８〜５１．４単位（時間軸が０〜１００の尺度に変換される場合）の範囲であると定義され、すなわち、シフトした１８Ｓ領域の範囲は４２．８〜５０．４単位から約４２．８〜５１．４単位に拡大された。同様に、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積を総面積で割った商に１００を掛けたもの（すなわち、２８Ｓ％）が、シフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積を総面積で割った商に１００を掛けたもの（すなわち、１８Ｓ％）の８倍より小さければ、シフトした２８Ｓ領域は約５２．３〜６９．５単位（時間軸が０〜１００の尺度に変換される場合）の範囲であると定義され、すなわち、シフトした２８Ｓ領域の範囲は約５８．１〜６９．５単位から約５２．３〜６９．５単位に拡大された。
【０１２４】
３１０において、ピーク幅は、必要であれば、すなわち、その幅がピークの始点と終点の位置および試験結果の検討に基づけば大きすぎると定義される場合に調整される。従って、１８Ｓおよび２８Ｓのピーク幅が計算された後に、次に、時間軸が０〜１００の尺度に変換される場合に、その幅が、１８Ｓピークの幅が０．６〜７．６単位の範囲内に入るべき、また、２８Ｓの幅が０．８〜１０．５単位の範囲内に入るべき範囲の幅の外側にあれば、それらは調整された。
【０１２５】
３１２において、ピーク間の距離は、１８Ｓおよび２８Ｓピークの定義を強めるには離れすぎていると計算される場合に調整される。従って、１８Ｓピークと２８Ｓピークの間の距離が距離閾値より大きければ、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの少なくとも一方の位置が、違う候補ピークを選択することにより調整される。例えば、いくつかの実施形態では、１８Ｓピークの終点と２８Ｓピークの始点の間の距離は、約１７．１単位より小さいと定義される。
【０１２６】
よって、本開示の別の側面は、細胞ＲＮＡに対してＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を行うための方法であり、その方法は、ある時点の細胞ＲＮＡを含んでなるユニークな生体サンプルに対応する少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットを得ること、前記少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットから１８Ｓピークおよび２８Ｓピークを定義すること、前記１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの両方に対して少なくとも１つのパラメーター値を決定すること、および前記少なくとも１つのパラメーター値に適用される１以上の規則によって必要とされる場合には、前記１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの少なくとも一方を再定義することを含んでなる。少なくともいくかの例では、本方法は、１８Ｓピーク面積および２８Ｓピーク面積を決定すること、ならびに前記１８Ｓピーク面積および２８Ｓピーク面積の少なくとも一方に基づいてＲＤＡスコアを決定することをさらに含み得る。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのパラメーター値は、ピーク面積、ピーク幅およびピーク位置のうち少なくとも１つを含んでなる。
【０１２８】
前記１以上の規則は、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの少なくとも一方がピーク面積に基づいて２つ以上の最大値を有するか否かを決定すること、１８Ｓピークと２８Ｓピークが位置決定される境界が２８Ｓピークおよび１８Ｓピークの面積の相互比較に応じた調整を必要とするか否かを決定すること、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの幅をある一定の幅範囲になるように調整すること、ならびに１８Ｓピークと２８Ｓピークの間の距離がある距離閾値よりも大きければ、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの少なくとも一方の位置を調整することのうち少なくとも１つを含んでなる。場合によっては、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの幅をある一定の幅範囲になるように調節する、ならびに１８Ｓピークと２８Ｓピークの間の距離がある距離閾値より大きければ１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの少なくとも一方の位置を調整するという２つの規則は任意選択である。
【０１２９】
ひと度、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークが方法２００に従って定義されれば、中間面積、低バンド面積などのような他の値も決定することができる。
【０１３０】
下記のこれらの特徴の組合せのそれぞれにおいては、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークならびに他の領域を定義するために方法３００または方法４００（図１２Ａに記載）のいずれもが使用可能であることに留意すべきである。シフト領域が使用されるのではなく方法４００が使用される場合、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの位置を決定するためにより広い領域が使用される。
【０１３１】
一実施形態では、特徴の組合せは、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積とシフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積の和に対する、中間面積の比を含んでなり、「中間／（２８Ｓ＋１８Ｓ）」という表現で表すことができる。
【０１３２】
一実施形態では、特徴の組合せは、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積とシフトした１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積の和に対する、低Ｃバンド領域面積と中間面積の和の比を含んでなり、「中間＋低Ｃ／（２８Ｓ＋１８Ｓ）」という表現で表すことができる。
【０１３３】
一実施形態では、特徴の組合せは、シフトした２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積とシフトした１８Ｓピーク領域内の１８Ｓピーク面積の和に対する、低Ｃバンド領域面積と中間面積の和の比を含んでなり、「（低Ｃ＋中間）／（２８Ｓ＋１８Ｓ）」という表現で表すことができる。
【０１３４】
一実施形態では、特徴の組合せは、少なくとも２つのエレクトロフェログラムデータセットから決定された最大比を含んでなる。この比は、中間面をそれぞれシフトした１８Ｓ領域および２８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積と２８Ｓピーク面積の和で割った商と定義される。これは、「最大中間／（２８Ｓ＋１８Ｓ）」という表現で表すことができる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、装置１００およびコンピューター可読媒体は、方法２００および３００、または方法２００および４００、または方法２００、３００および４００（ここで、方法４００は図１２Ａに関して記載されている）を実施するように構成することができる。
【０１３６】
少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットを得る工程は、一実施形態において、細胞ＲＮＡを電気泳動により分離すること、分離された細胞ＲＮＡの１以上の種を検出すること、エレクトロフェログラムをプロットすること、および前記エレクトロフェログラムプロットから少なくとも１つのエレクトロフェログラムデータセットを得ることを含んでなる。
【０１３７】
ＲＮＡを分離するための電気泳動は慣用の技術である。例えば、分離されたＲＮＡ種を検出するために蛍光色素を含有するゲルを使用することができる。ＲＮＡ種を分離するために使用可能な自動マイクロフルイディスクに基づく電気泳動法およびシステム、例えば、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ自動電気泳動システム（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）およびＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．）が開発されている。これらのシステムでは、極めて少量のＲＮＡを使用し、マイクロチップチャネルにおいてマイクロキャピラリー電気泳動を行う。
【０１３８】
従って、前記ゲル電気泳動は、マイクロキャピラリー電気泳動である。別の実施形態では、マイクロキャピラリー電気泳動は、ＲＮＡを電気泳動により分離するためのＲＮＡチップを使用することを含んでなる。
【０１３９】
分離された細胞ＲＮＡの検出は、例えば、ＲＮＡと結合するＲＮＡ色素、例えば蛍光色素を使用して行われる。ＲＮＡ色素は電気泳動ゲルに加えることができ、色素シグナルを検出することによってＲＮＡの検出を可能とする。
【０１４０】
アッセイにおいて使用するための細胞ＲＮＡは、例えば、当技術分野で公知の技術を用いて生体サンプル（例えば、細胞株、ヒト組織または動物組織の細胞を含んでなるサンプルを含め、癌細胞を含んでなる任意の生体サンプルを含む）から単離することができる。例えば、細胞および／または生検は、ＲＮＡｚｏｌ（商標）（Ｓｉｇｍａｌ／Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＲＮＡ  Ｓｔａｂｌｅ（商標）（Ｂｉｏｍａｔｒｉｃａ  Ｃｏ．）、ＲＮＡ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）などのＲＮＡ単離または安定化溶液に再懸濁／溶解させることができ、ＲＮＡは、限定されるものではないが、ＲＮｅａｓｙ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ｍｉＲＮｅａｓｙ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＲＮＡｚｏｌ（商標）（Ｓｉｇｍａｌ／Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）、全ＲＮＡ単離キット（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ  Ｃｏ．およびＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｐｕｒｅｌｉｎｋ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌａｂｓ）、５  ＰＲＩＭＥ  ＰｅｒｆｅｃｔＰｕｒｅ（商標）、およびＧｅｎｅＪＥＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）キットを含む１以上の市販のキットを用いて（製造者の指示に従う）単離することができる。
【０１４１】
上述のように、細胞傷害性処置に対する応答をモニタリングするためにＲＮＡ破壊の変化を使用することができる。例えば、図６Ａ〜６Ｋ、１３、１４Ａ〜Ｄ、１５Ａ〜１５Ｄおよびその他は、ｐＣＲの高い尤度を有する化学療法受容被験体を不応答者（すなわち、非ｐＣＲ応答者）から判別するとともに、中間ＲＤＡゾーン内の患者を識別するためにＲＤＡが使用可能であることを示す。ＲＮＡ破壊の変化はまた放射線を用いた場合にも見られる（例えば、図１０、１１Ａおよび１１Ｂ参照）。理論に縛られることを望むものではないが、腫瘍細胞におけるＲＮＡ破壊は、細胞死前および／または細胞充実度の変化前、特に処置の初期段階で起こり得る。従って、ＲＤＡは、化学療法などの細胞傷害性処置に対する被験体の応答を評価するのに好適である。
【０１４２】
本開示の別の側面は、
例えば限定されるものではないが、化学療法、補助療法および細胞傷害性補助療法などの細胞傷害性処置中または処置後の時点の細胞腫瘍ＲＮＡを含んでなる生体サンプルにおけるＲＮＡ破壊の量を、例えば、本明細書に記載のＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を用いて定量してＲＤＡスコアを決定すること、ならびに
前記細胞ＲＮＡのＲＮＡ破壊の量が増加しているかしていないかを決定すること
を含んでなるアッセイを含む。
【０１４３】
上述のように、これは、被験体がＲＤＡゾーン内に入るか否かを決定することを含み得る。例えば、図７Ａおよび１４Ａは、両対数プロットであり、応答者と不応答者がＲＤＡゾーンにより分離できることを示す。
【０１４４】
一実施形態において、ＲＤＡゾーン情報は、被験体に、場合により医療専門家を通じて伝達され得る。
【０１４５】
腫瘍細胞ＲＮＡは例えば腫瘍細胞株由来であってもよいし、または生検などの被験体からの腫瘍細胞サンプル由来であってもよい。
【０１４６】
一実施形態では、評価される腫瘍細胞ＲＮＡは非処置サンプル（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける非処置腫瘍細胞）由来であるか、または処置前（例えば、療法前）の時点の被験体に由来する。
【０１４７】
異常な２８Ｓ／１８Ｓ比を示す腫瘍サンプルの報告がなされている。
【０１４８】
例えば、異常な２８Ｓ：１８Ｓ比は、非処置腫瘍組織で報告されている(Skrypina, et al. 2003)。この２８Ｓにおける減損はＧＣリッチ領域内の優先的切断によることが示唆されている(Johnson, Sendler, Lalancette, Hauser, Diamond, & Krawetz, 2011)。
【０１４９】
一実施形態では、細胞ＲＮＡは、正常な細胞から単離される。例えば、本方法およびアッセイは、限定されるものではないが、化学療法薬などの細胞傷害性薬物に対する正常細胞の応答をアッセイするため、例えば、非癌細胞に対する薬物毒性を評価するために使用可能である。
【０１５０】
一実施形態では、決定工程は、生体サンプルにおいて定量されたＲＮＡ破壊の量を閾値または参照値などの対照と比較することを含んでなる。一実施形態において、参照値は処置前値に相当する。
【０１５１】
一実施形態において、増加は、対照または予測される処置前スコアに対するものである。
【０１５２】
例えば癌性腫瘍細胞ＲＮＡを含んでなる処置前サンプルが含み得るＲＮＡ破壊は相対的に低いか、または全く含まない。例えば、ＲＮＡ完全性は安定であると考えられる。例えば、本明細書に記載の方法を用いてＲＮＡ破壊に関して評価される非処置乳癌腫瘍生検は一般に、ゾーン１内に入ると識別される。ＲＮＡ分解は、いくつかの実施形態では、比較対象に関連せずに（例えば、絶対尺度を用いて）スコア化することができる。いくつかの実施形態では、閾値が使用され得る。例えば、あるゾーンを定義する閾値は、被験体を分類するために使用することができる。よって、例えばゾーン２または３内に入るＲＤＡスコアの決定は、比較対象サンプルが存在しなくても、予測される非処置のＲＮＡ破壊量に基づいて、サンプルが破壊されたＲＮＡを含んでいたという指標となる。従って、決定工程は、先験的に決定された値またはその腫瘍種に関して予測される値と比較することを含んでなり得る。
【０１５３】
別の実施形態では、ＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）は、癌処置、例えば、化学療法および／または放射線により誘導されるＲＮＡ破壊を測定するためのものである。ＲＤＡを使用するアッセイは、どの被験体および／または腫瘍が化学療法および／または放射線療法に応答するか識別するために使用することができる。
【０１５４】
従って、別の実施形態では、アッセイは、ＲＮＡ破壊の量（例えば、ＲＤＡスコア）が参照値または閾値に比べて増加していれば、その腫瘍は癌処置、場合により化学療法および／または放射線療法に応答性と識別することをさらに含んでなる。
【０１５５】
別の実施形態では、生体サンプルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで処置された癌性腫瘍細胞などの細胞に相当する。
【０１５６】
図９Ｉは、感受性Ａ２７８０細胞はＲＮＡ破壊を示すが、耐性Ａ２７８０細胞は示さないことを示している。
【０１５７】
また、本明細書に記載の一実施形態では、学療法および／または放射線療法などの癌処置に対する癌性腫瘍細胞または正常細胞の感受性を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイも提供され、このアッセイは、
細胞または細胞集団を化学療法薬および／または放射線で処置すること、
前記細胞または細胞集団を前記化学療法薬および／または放射線で処置している間または処置後の時点の細胞ＲＮＡを含んでなる生体サンプルにおけるＲＮＡ破壊の量を、本明細書に記載のＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を用いて定量し、場合により、ＲＤＡスコアを決定すること、ならびに
定量されたＲＮＡ破壊の量を閾値または参照値と比較し、ＲＮＡ破壊の量が参照値に比べて増加していれば、その細胞をその化学療法および／または放射線療法に対して感受性と識別し、増加していなければ（例えば、有意に増加していなければ）、その細胞をその処置に対して耐性と識別すること
を含んでなる。
【０１５８】
一実施形態では、ＲＮＡ破壊はＲＤＡスコアとして表される。ＲＤＡスコアは、サンプルにおけるＲＮＡ破壊の量を反映したものであり、ＲＤＡスコアの増加はＲＮＡ破壊の増加を反映している。
【０１５９】
上述のように、これらのアッセイは、被験体が癌処置に対して応答性となるかもしくは応答しているかという尤度、および／またはそれらの進行リスクを決定するために使用可能である。
【０１６０】
従って、さらなる実施形態は、被験体が癌処置に応答しているか否かを決定するためのアッセイであって、前記被験体が癌処置、場合により化学療法および／または放射線療法を受けている間および／または受けた後にその被験体から得られた生体サンプルをＲＮＡ破壊の量に関して、本明細書に記載の方法に従って行われるＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を用いてアッセイすることを含んでなり、ＲＮＡ破壊の量（例えば、ＲＤＡスコア）が閾値または参照値に比べて増加していれば、その被験体はその処置に応答していると識別されるアッセイを含んでなる。
【０１６１】
一実施形態では、この応答性は治療結果の指標となり、閾値または参照値に比べてのＲＮＡ破壊の量の増加（化学療法により誘発されるＲＮＡ破壊の増加の指標）は正の治療結果の指標となり、閾値または参照値に比べてＲＮＡ破壊がないこと（例えば、化学療法により誘発される破壊がほとんどないかまたは全くないことの指標）は負の処置応答（例えば、長期利益がないこと）の予測となる。
【０１６２】
別の実施形態では、正の治療結果は、処置後の病理学的完全応答、部分応答、疾病進行のリスク軽減、安定疾患または全生存期間の延長である。
【０１６３】
一実施形態では、評価される癌性腫瘍サンプルは、処置中および／もしくは処置後の被験体から得られ、かつ／または前記時点は処置中および／もしくは処置後である。
【０１６４】
一実施形態では、本明細書に記載の方法またはアッセイは、処置応答をモニタリングするために使用される。例えば、後のサンプルが、ベースラインサンプルまたはベースライン値などの従前のサンプルと比較される。別の実施形態では、本明細書に記載のアッセイおよび方法は臨床試験において、どの被験体が処置に対して応答しているか評価および／またはモニタリングするために使用される。例えば、被験体には場合により発現分析に基づいて処置を割り当てることができる。
【０１６５】
生検は処置中および／または処置後に採取することができ、ＲＤＡは、応答を予測するため、例えば、被験体が処置に留まることから利益を受け得る（例えば、応答者である）か、処置を切り替えて、それにより処置応答、十分な用量などをモニタリングすることから利益を受け得るかを予測するためなどに使用可能である。ＲＤＡに従って応答していない被験体については、サブセットを新たな処置に切り替えることができる。切り替えを行った患者の結果は、ＲＤＡスコアに従って有効でないと予測された処置に留まった患者の結果と比較することができる。
【０１６６】
従って、一実施形態では、本方法またはアッセイは、不応答者を選択し、２以上の臨床試験群への参加を無作為化することをさらに含んでなる。
【０１６７】
さらに別の実施形態では、本方法またはアッセイは、応答者を選択し、２以上の臨床試験群への参加を無作為化することをさらに含んでなる。
【０１６８】
別の側面において、本開示は、多群臨床試験のための被験体を選択するための方法を含み、その方法は、
化学療法および／または放射線療法などの細胞傷害性処置を受けている被験体がその処置に応答しているかいないかを、本明細書に記載のＲＤＡスコアを決定するための方法に従って予測すること、
不応答者を２以上の処置群に無作為化すること、および
場合により、応答者を２以上の処置群に無作為化すること
を含んでなる。
【０１６９】
さらなる側面は、化学療法および／または放射線療法などの細胞傷害性処置の有効性を予測するための方法であって、
被験体群を少なくとも２つのサブグループに分類すること、
各サブグループの被験体に好適な期間、化学療法を施すこと、
各被験体についてＲＤＡスコアを本明細書に記載の方法に従って決定すること、および
前記被験体が閾値または参照値を超えるＲＤＡスコアを有する場合には、その処置を有効であると予測し、前記被験体が閾値または参照値より低いＲＤＡスコアを有する場合には、その処置を有効でないと予測すること
を含んでなる方法を含む。
【０１７０】
また、被験体に対する化学療法の有効性を予測するための方法であって、
被験体に好適な期間、化学療法を施すこと、
本明細書に記載の方法に従ってＲＤＡスコアを決定すること
を含んでなり、
前記被験体が閾値または参照値を超えるＲＤＡスコアを有する場合には、その処置は有効であると予測され、前記被験体が閾値または参照値より低いＲＤＡスコアを有する場合には、その処置は有効でないと予測される、
方法も提供される。
【０１７１】
被験体が細胞傷害性処置に応答していないと識別される場合、その被験体の処置を変更するかまたは変化させることができる。例えば投与する処置用量を増やすことができ、放射線および／もしくは化学療法薬を計画に加えることができ、または処置を中断し、かつ／もしくは違う細胞療法計画を開始することができる。これらの方法およびアッセイはまた、変更された処置に対する応答をモニタリングするために使用することもできる。細胞傷害性、例えば化学療法に応答していなければ、放射線療法または手術などの他の治療法を使用することもできる。
【０１７２】
化学療法および放射線などの細胞傷害性処置はサイクルで投与する場合が多く、そのサイクルは、各期間当たり、例えば、１日当たり、１週間当たり、２週間当たり、１、２またはそれを超える用量の投与を含んでなり得る。種種の薬物および種種の癌に対するプロトコールが確立されている。治療計画は１、２、３、４、５、６またはそれを超えるサイクルからなり得る。よって、一実施形態では、ＲＮＡサンプルは、最初のサイクルの後の時点のものである。別の実施形態では、評価されるＲＮＡサンプルは処置中の被験体から得られ、かつ／またはその時点は処置中である（例えば、６サイクルの治療計画では、評価されるＲＮＡサンプルは被験体から得られ、かつ／またはその時点は２、３もしくは４サイクルの後である）。
【０１７３】
一実施形態では、生体サンプルは、被験体が１サイクル目の細胞傷害性処置、例えば、１サイクル目の化学療法薬または放射線療法を受けた後に得られる。別の実施形態では、生体サンプルは、被験体が２、３、４またはそれを超える処置を受けた後の被験体から得られる。さらに別の実施形態では、生体サンプルは、処置計画の完了後に被験体から得られる。
【０１７４】
一実施形態では、生体サンプルは、穿刺吸引液などの生検である。別の実施形態では、生体サンプルは、被験体から単離された癌細胞の集団を含んでなる。
【０１７５】
２つ以上の生体サンプルが評価可能である。例えば、複数のサンプル、例えば、２以上の穿刺吸引生検がある時点および／または同時点で採取される場合、各サンプルは別に評価することができ、処置応答の不均一性があれば決定するために、それらのサンプルの適合性を評価することができる。
【０１７６】
一実施形態では、応答性および／または正の治療結果の指標となるＲＤＡスコアは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％のＲＮＡ完全性の低下（例えば、ＲＮＡ破壊の増加）と相関する。
【０１７７】
一実施形態では、ピークはシフトされない。しかしながら、本方法はやはり本明細書に記載の方法に従って適用される。
【０１７８】
一実施形態では、本明細書に記載の方法およびアッセイは、非腫瘍ＲＮＡサンプル、例えば、薬物に対して感受性のある、例えば、化学療法に対して化学感受性のある、および／または放射線療法に対して放射線感受性のある正常細胞とともに適用される。
【０１７９】
理論に縛られることを望むものではないが、ＲＮＡ破壊は中間的または非急性の応答において安定な細胞に影響を及ぼすプロセスであると考えられる。よって、本方法、アッセイ、および製品は、刺激により誘導される細胞傷害性、例えば、ＲＮＡ破壊を受けているいずれの細胞種にも適用可能である。
【０１８０】
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ白血病細胞株の全ＲＮＡはドキソルビシンによる化学的攻撃に感受性があったことが実証されている(Fimognari et al 2009)。
【０１８１】
本アッセイは、いずれの腫瘍種および／またはサブタイプにも適用可能である。例えば、癌性腫瘍は、乳癌、肺癌、肉腫、前立腺癌、結腸癌または卵巣癌（それらの任意のサブタイプを含む）であり得る。特定の実施形態では、本方法およびアッセイは、白血病、多発性骨髄腫またはリンパ腫などの血液癌に適用される。一実施形態でが、癌は、アントラサイクリンおよび／またはタキサンおよび／または放射線により処置可能な癌である。例えば、前立腺癌は、ドセタキセルにより処置され得る癌であり、肺癌および肉腫はアントラサイクリンおよび／またはタキサンによっても処置され得る。アントラサイクリンには、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシンおよびミトキサントロンが含まれる。タキサンには、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、アブラキサン、ドコサヘキサエン酸(docoxahexaenoic acid)様パクリタキセル、パクリタキセルポリグルメックス(paclitaxel polyglumex)、オルタタキセル、ゲノキソール、リポソーム封入パクリタキセル、およびパクリタキセルビタミンＥエマルションが含まれる。
【０１８２】
例えば、図１０に示されるように、癌細胞は、放射線療法に応答してＲＮＡ破壊を示す。図１１Ａおよび１１Ｂは、患者が化学療法および放射線療法を受けた場合の分析の説明を示す。
【０１８３】
一実施形態では、被験体または細胞は、１、２、３、４、５、６またはそれを超える用量の放射線を受容している。一実施形態では、これらの細胞および／または被験体は、放射線療法の前またはそれと同時に一用量の化学療法で処置される。
【０１８４】
ＭＡ２２データセットは例えば、ＥＲ、ＰＲ、Ｈｅｒ２、トポイソメラーゼ状態の異なるサンプルを含んでいた。実施例の節で示されるように、本明細書に記載の方法およびアッセイは、ＥＲ、ＰＲ、Ｈｅｒ２、トポイソメラーゼの状態に依存せずに適用可能である。本方法は、トリプルネガティブサンプルを含む、ＥＲ、ＰＲおよびＨｅｒ２状態が異なる乳癌サンプルを評価するために用いられた。
【０１８５】
一実施形態では、癌性腫瘍は、乳癌、前立腺癌、結腸癌および卵巣癌またはそれらの任意のサブタイプから選択される。
【０１８６】
実施形態では、癌性腫瘍は、白血病、リンパ腫もしくは多発性骨髄腫、ならびに／またはアントラサイクリンおよび／もしくはタキサンにより処置可能な任意の癌から選択される。
【０１８７】
一実施形態では、癌性腫瘍は乳癌である。
【０１８８】
別の実施形態では、乳癌はＨＥＲ２＋陽性乳癌である。
【０１８９】
さらなる側面は、それを必要とする癌を有する被験体を処置する方法であって、
細胞傷害性処置、場合により化学療法および／または放射線療法を投与すること、
前記被験体がその処置に応答しているか否かを、本明細書に開示されている方法に従って決定すること、および
前記被験体が応答していれば前記処置の投与を継続し、ならびに／または前記被験体が応答していなければ前記処置の投与を中断すること
を含んでなる方法を含む。
【０１９０】
一実施形態では、細胞傷害性処置用量、例えば、化学療法薬用量が増やされ、例えば、  その場合、被験体サンプルは中間レベルのＲＮＡ破壊、例えば、ＲＤＡゾーン２を含む。ＲＤＡゾーン３に入る被験体は病理学的完全応答者である可能性が高いので、ＲＤＡスコアがＲＤＡゾーン内に入らない被験体は、処置用量の増加から利益を受ける可能性がある。
【０１９１】
一実施形態では、化学療法は、微小管安定化剤、例えばドセタキセルおよびパクリタキセル、ＤＮＡ合成阻害剤、例えばエピルビシン、Ｈｅｒ２受容体阻害剤、例えばトラスツズマブ、ＤＮＡ架橋剤、例えばマフォスファミド、カルボプラチンおよびシスプラチン、ＶＥＧＦＡ阻害剤、例えばベバシズマブ、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えばスニチニブおよぶトセラニブ、ビスホスホネート、例えばゾレンドロン酸、ならびにチミジル酸シンターゼ阻害剤、例えば５−フルオロウラシルから選択される。
【０１９２】
一実施形態では、化学療法は、タキサン、アントラサイクリン、およびビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン、アルキル化剤、例えばシスプラチン、およびヌクレオシド類似体、例えば５−ＦＵ、ならびにそれらの組合せから選択される。一実施形態では、化学療法は、ドセタキセル、パクリタキセル、エピルビシン、ドキソルビシン、ビンブラスチンおよびシスプラチンならびに／またはそれらの組合せから選択される薬物を含んでなる。一実施形態では、タキサンは、パクリタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、アブラキサン、ドコサヘキサエン酸(docoxahexaenoic acid)様パクリタキセル、パクリタキセルポリグルメックス(paclitaxel polyglumex)オルタタキセル、ゲノキソール、リポソーム封入パクリタキセル、およびパクリタキセルビタミンＥエマルションから選択される。
【０１９３】
乳癌は、例えば、タキサン、アントラサイクリン、または、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、ドセタキセルおよびエピルビシン、ならびにそれらの組合せで処置することができる。
【０１９４】
卵巣癌は、例えば、タキサン、アントラサイクリン、およびビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン、アルキル化剤、例えばシスプラチン、およびヌクレオシド類似体、例えば５−ＦＵ、ならびにそれらの組合せで処置することができる。
【０１９５】
一実施形態では、ＲＮＡ完全性は、全ＲＮＡに関して決定される。別の実施形態では、ＲＮＡ完全性は、リボソームＲＮＡに関して決定される。リボソームＲＮＡには、例えば、２８Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓおよび５Ｓ  ｒＲＮＡが含まれる。
【０１９６】
本明細書に記載の方法、アッセイおよび製品はまた、自己分解性分解を評価するために使用することもできる。例えば、自己分解性分解は、低Ａの面積／総面積を決定することにより評価することができる。この特徴を生理食塩水で長期間インキュベートした異種移植腫瘍を用いて測定すると、ＢｉｏＡｇｉｌｅｎｔのＲＩＮソフトウエアを用いた場合に可能なものより、高頻度で自己分解性分解が測定でき、かつ、より正確に測定され得ることが示される。例えば、低Ａ面積／総面積の比を用いれば、自己分解性分解の程度のより正確なマッピングが可能である。
【０１９７】
ソフトウエアを介して実装される本明細書に記載の方法の要素の少なくともいくつかは、オブジェクト指向プログラミングまたはスクリプト言語などの高水準手続き型言語で書かれてよい。よって、プログラムコードは、Ｃ、Ｃ＋＋、ＳＱＬまたは他の任意の好適なプログラミング言語で書かれてよく、オブジェクト指向プログラミングの熟練者に知られているようなモジュールまたはクラスを含んでなってよい。ソフトウエアを介して実装される本明細書に記載の方法の要素の少なくともいくつかは、必要に応じてアセンブリ言語、機械語またはファイヤワイヤで書かれてよい。いずれの場合でも、プログラムコードは、プロセッサ、オペレーティングシステムおよび関連のハードウエア、ならびに本明細書に記載の実施形態の少なくとも１つの機能性を実装するために必要なソフトウエアを備えた汎用または専用のプログラム可能なコンピューターデバイスにより読み取り可能な記憶媒体またはコンピューター可読媒体に保存することができる。プログラムコードは、コンピューターデバイスにより読まれた場合に、本明細書に記載の方法の少なくとも１つを実行するために、新たな、特定の、かつ、予め定義された様式で動作するようにコンピューターデバイスを設定する。
【０１９８】
さらに、本明細書に記載の方法の少なくともいくつかは、１以上のプロセッサに対するコンピューター使用可能な命令を有するコンピューター可読媒体を含んでなるコンピュータープログラムプロダクトに分散させることができる。コンピューター可読媒体は、限定されるものではないが、１以上のディスケット、コンパクトディスク、テープ、チップ、ＵＳＢキー、外付けハードドライブ、有線伝送、衛星伝送、インターネット伝送またはダウンロード、磁気および電子記憶媒体、デジタルおよびアナログ信号など、様々な非一時的形態およびその他の形態で提供され得る。コンピューター使用可能な命令はまた、コンパイル済みコードおよび非コンパイルコードを含む様々な形態であってもよい。
【０１９９】
上記開示は一般に本出願を記載している。より完全な理解は、下記の具体的な例を参照することにより得られる。これらの例は単に例示のために記載されるに過ぎず、本出願の範囲を限定するものではない。状況が好都合であることを示唆または明示する場合には、形態の変更および等価物の置き換えが企図される。本明細書では具体的な用語を用いたが、このような用語は説明の意味で意図され、限定することを目的とするものではない。
【０２００】
下記の限定されない例は、本開示の例示である。
【実施例】
【０２０１】
実施例１
これらの実験で使用した培地は５％ＦＢＳを含み、５０％培地は、ＰＢＳで希釈した培地である（１：１）。
【０２０２】
室温にて生理食塩水中で２４時間維持したＭＣＦ−７腫瘍異種移植片のコア生検（そこで自己分解性分解が起こる）からＲＮＡを単離し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーを用いて分離した。
【０２０３】
５０％培地中１０μＭドセタキセルまたは５０％培地中２０μＭエピルビシンで処置した卵巣癌細胞株Ａ２７８０細胞からＲＮＡを単離した。細胞は３７℃にて２４時間、化学療法薬で処置した。単離されたＲＮＡをＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーを用い、マイクロキャピラリー電気泳動により分離した。
【０２０４】
図１〜３は、自己分解性ＲＮＡ分解を生じる、室温にて生理食塩水で維持したＭＣＦ−７腫瘍ＲＮＡのエレクトロフェログラム出力（図１）と化学療法薬ドセタキセルおよびエピルビシンで処置したＡ２７８０腫瘍細胞ＲＮＡ（それぞれ図２および図３）のエレクトロフェログラム出力を示す。
【０２０５】
生理食塩水中で２４時間維持した異種移植腫瘍は、出力のおよそ２６秒のマークのところに小断片の大きなピークを示す（図１）。２８Ｓピークの面積の減損も見られる。化学療法薬で処置した癌細胞は、異なるＲＮＡ破壊のパターンを示す。例えば、化学療法薬ドセタキセルで処置したヒト卵巣癌細胞株Ａ２７８０を示す図２は、中間ピークおよび１８Ｓピークに隣接したピークを示す。図３は、化学療法薬エピルビシンで処置したＡ２７８０細胞を示す。エレクトロフェログラムは、１８Ｓピークと２８Ｓピークの間に中間バンドを示す。さらに、検出された２８Ｓピークおよび１８Ｓピークの位置は、完全なＲＮＡおよび自己触媒性ＲＮＡ分解に比べて、１８Ｓおよび２８Ｓピークに対してシフトされている。
【０２０６】
液体窒素、ＲＮＡＬａｔｅｒ（商標）溶液中で保存した、または自己触媒性分解を誘発するために生理食塩水中で１時間、２時間、５時間および２４時間置いた異種移植腫瘍から単離されたＲＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーを用いてＲＮＡインテグリティーナンバー（ＲＩＮ）を測定することにより分析した。図８Ｂ〜８Ｍは、２８Ｓピークおよび１８Ｓピークは、自己分解性分解を伴うＲＮＡサンプル（図８Ａのサンプル４〜７および９〜１２）において、このソフトウエアによって誤った識別を受けないことを示す。ゲルレーンの上の丸は、ＲＩＮナンバーが計算できたことを示す（図８Ａ）。四角で囲まれた丸は、ＲＩＮナンバーが計算できなかったサンプルを示す。対照サンプルは、非処置の異種移植腫瘍（１〜７）であった。処置サンプル（８〜１２）は所与のドセタキセルであった。
【０２０７】
実施例２
エレクトロフェログラムのどの成分が臨床応答と最もよく相関していたかを決定するためにＭＡ２２  ＲＮＡエレクトロフェログラムデータを調べた。Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーソフトウエアは、２０％を超えるサンプルでエレクトロフェログラムの２８Ｓピークまたは１８Ｓピークのいずれかが誤った識別を受けていたことが明らかになった。これらのサンプルでは、ピークの先端の小部分がピーク全体と識別されていた。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーソフトウエア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅｘｐｅｒｔ）(Mueller 2004、 Vespucci 2005)は、目で識別可能な完全なＲＮＡのエレクトロフェログラム上で２８Ｓピークと１８Ｓピークを正しく識別することができた。しかしながら、破壊されたＲＮＡを含むサンプルでは、エレクトロフェログラムピークはＡｇｉｌｅｎｔ  ＲＩＮソフトウエアにより誤った識別を受けていたが、正しいピークがエレクトロフェログラム上の視覚的に適当な位置に留まっていた。ＲＩＮ値を求めるＡｇｉｌｅｎｔ法（以下、ＲＩＮアルゴリズムと呼称）は、無傷か完全な自己分解性分解を受けたかのいずれかであって、「部分的に分解された」サンプルをほとんど含まないＲＮＡサンプルに基づくものであった(Schroeder, Mueller et al. 2006)。
【０２０８】
従って、図５Ａおよび５Ｂに関して記載されたように、ＲＩＮを計算するために使用された方法とは異なる方法が、本明細書においてＲＤＡスコアを決定するために使用された。アウトプットされたＲＤＡスコアに対して受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を行ってＲＯＣ曲線を作成し、曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した(Hurley 2011)。次に、このＲＯＣ曲線を、エレクトロフェログラムの特定の特徴を用いて不応答者から応答者を判別する際の有用性を決定するために用いた（処置後の病理学的完全応答により測定）。
【０２０９】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００ナノキットおよびＣａｌｉｐｅｒ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＲＮＡナノチップとともにＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーを用いたＲＮＡ品質および濃度の評価：  上記のＲＮＡ調製物の品質および完全性（ＲＮＡ品質とも呼ばれる）を評価するために用いた手順は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓウェブサイト（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐａｒｔ  Ｎｕｍｂｅｒ：Ｇ２９３８−９００３５）で入手可能なＡｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｋｉｔ  Ｇｕｉｄｅに詳細に記載されているプロトコールを用いる、２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ミシソーガ、ＯＮ）でのキャピラリー電気泳動を含んだ。
【０２１０】
プロトコール文書は、アッセイ器具の設定、ＲＮＡナノチップの調製および実施、ならびにＡｇｉｌｅｎｔ  ２１０００バイオアナライザーとその関連する「Ｅｘｐｅｒｔソフトウエア」を用いたキャピラリー電気泳動データの分析に関する詳細な説明を含む。この文書は、従うべき「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ」を含む。ＲＮＡ  ６０００「ナノチップ」および関連の溶液はＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ミシソーガ、ＯＮ）から購入できるＲＮＡ  ６０００ナノキットで得られる。ＲＮＡナノチップは、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ホプキントン、ＭＡ）により製造されている。所与のサンプルにおけるｒＲＮＡのサイズおよびＲＮＡの濃度は、ＲＮＡ  ６０００ナノキットに提供されている参照ＲＮＡの標準曲線からの外挿により決定される。バイオアナライザー実行からのデータは、ＰＤＦおよびＸＡＤファイルに保存した。所与のＲＮＡ調製物に関するＲＮＡのサイズならびにＲＮＡ完全性／品質および量を含む、キャピラリー電気泳動実行からのあらゆるデータを得るためにＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｅｘｐｅｒｔソフトウエアを用いた。次に、各エレクトロフェログラムからの生データを、ＸＡＤファイルから、０．０５秒の時間間隔で生エレクトロフェログラムデータを含むＥＸＣＥＬファイルにエクスポートした。
【０２１１】
ピーク識別コード
本明細書に記載の方法に基づけば、ピーク誤識別の現行の誤り率は、化学療法処置サンプルでは３％である。
【０２１２】
面積および比の計算の結果
２８Ｓピークおよび１８Ｓピークの正しい識別の誤り率は、記載の方法を使用すれば、２５％から３％に下がる。誤りとしては、「中間バンド」領域に融合した２８Ｓピークおよび１８Ｓピークが含まれ、これらはピーク下面積を小さな値にした。ＲＮＡ実行が異常にも誤り率１％となったエレクトロフェログラムの２８Ｓピークおよび１８Ｓピークの中間識別のみを含む。この方法を用いて比の値が「０」の場合を総て除いた後は、ＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーによってＮ／ＡのＲＩＮ値に割り当てられたサンプルは定量可能であった。
【０２１３】
【表１】
0006279549.tif 000002
【０２１４】
ＲＤＡを評価するために使用したサンプルは、３サイクル目の化学療法の後に採取した。療法前サンプルの分析によれば、ＲＮＡ完全性／品質および量は一般に高く、応答者と不応答者間は判別できなかったことが判明した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究および異種移植マウスモデルにおける腫瘍の処置により、１サイクル目の化学療法後という早期に硬化を実証できることが示唆される。
【０２１５】
２８Ｓ：１８Ｓの比を、新しい面積値に基づいて計算した。完全なＲＮＡでは、２８Ｓ：１８Ｓの許容される最大値は２．０である(Sambrook, Fritsch, & Maniatis, 1989)。この比は加齢(Mori, Mizuno et al. 1978) (Payao, Smith, Winter, & Bertolucci, 1998)、アルツハイマー(da Silva, Payao, Borsatto, Bertolucci, & Smith, 2000)およびアテローム性動脈硬化症(Martinet, De Meyer, Herman, & Kockx, 2004)などの疾患で変化することが示されている。
【０２１６】
従前の研究では、自己分解性ＲＮＡ分解中、２８Ｓピークの高さは、１８Ｓピークの高さよりも急激に低くなることが示されている(Schroeder, et al., 2006)。しかしながら、化学療法により破壊されたＲＮＡでは、この比は小さくなって２８Ｓの優先的減損を示し得る場合があり、また、大きくなって、２８Ｓピークに比べて１８Ｓピークの断片化の速度が速いことを示すことが分かってもいた。この比は、無傷なＲＮＡと化学療法により破壊されたＲＮＡの間の判別に有用であり得るが、およそ２．５を上回るか、またはおよそ１．３を下回る値が化学療法により破壊されたＲＮＡの指標となるような２つのカットオフ値を必要とすると考えられる。高い比は、一般には、自己分解性分解では見られない。
【０２１７】
異常な２８Ｓ：１８Ｓ比は、結合組織および腫瘍組織(Skrypina et al. 2003)などの他の系、ならびに２８Ｓの消失が体細胞に関して記載されている比よりも有意に低い比（中央値０．１１）をもたらす純粋な精子画分(Cappallo-Obermann, Schulze et al. 2011)で見られている。この２８Ｓの減損はＧＣリッチ領域内での優先的切断によるものであることが示唆されている(Johnson, Sendler, Lalancette, Hauser, Diamond, & Krawetz, 2011)。
【０２１８】
中間バンド領域の面積を測定し、比を計算して総面積に対して正規化し（すなわち、中間／総面積）、また、この中間バンド領域の面積がいかに２８Ｓピークと１８Ｓピークの面積に匹敵しているか（すなわち、中間／（２８Ｓ＋１８Ｓ））を決定した。低バンド領域（１８Ｓピークの下）の面積も計算した。中間／２８Ｓ、中間／１８Ｓ、（低＋中間）／（２８Ｓ＋１８Ｓ）および低バンド領域／総面積を含む他の比も計算した。同時に採取されたサンプルのいくつかのエレクトロフェログラムに関して最小比および最大比を決定し、濃度に対してグラフ化し、その例を図６Ａに示す。従って、特徴に最大または最小という用語を用いる場合、これは、各エレクトロフェログラムデータセットについて比が計算されたこと、およびその後、場合に応じて、これらの比の最大または最小が計算されたことを意味する。
【０２１９】
以下の特徴の比において、用語「中間」とは、中間領域の面積を意味し、用語「２８Ｓ」とは、２８Ｓピークの面積を意味し、用語「１８Ｓ」とは、１８Ｓピークの面積を意味し、用語「低バンド」とは、低バンド領域の面積を意味し、用語「総面積」とは、低バンド領域、１８Ｓピーク、中間領域および２８Ｓピークの面積の和を意味する。用語濃度（図６Ａ〜６Ｄおよび図６Ｆ〜６Ｋのグラフの場合）とは、エレクトロフェログラムが作成されたサンプル中のＲＮＡの濃度を意味する。比の最大または最小がとられた場合には、そのプロットに使用された濃度は、その比に対する最大または最小値を持っていたエレクトロフェログラムデータセットの濃度であった。
【０２２０】
最大中間／（２８Ｓ＋１８Ｓ）の特徴に関するＡＵＣ値は０．８１であり、最小中間／（２８＋１８）の比に関するＡＵＣ値は０．７５であったが、これはこれらの比が応答者と不応答者の間の判別が可能であることを示す。ＡＵＣは、ＲＯＣ曲線下面積であった。ＲＯＣ曲線は、示された特徴に基づいて求められたＲＤＡスコアに閾値を当てはめることによって得られた。第１の特徴の組合せと対数濃度との両対数グラフを図６Ａに示し、第２の特徴の組合せと対数濃度との片対数グラフを図６Ｂに示す。
【０２２１】
最大中間／総面積の特徴に関するＡＵＣ値は０．７１であり、最小中間／総面積ＡＵＣの比に関するＡＵＣ値は０．５６であった。最大中間／総面積の特徴と対数濃度との片対数グラフを図６Ｃに示す。
【０２２２】
最小低バンド／総面積の特徴に関するＡＵＣ値は０．６３であったが、最大低バンド／総面積値の特徴に関するＡＵＣ値は０．５０であった。最小低バンド／総面積の特徴と対数濃度との片対数グラフを図６Ｄに示す。低バンド／総面積の特徴は、図６Ｅに示されるように、他の成分と組み合わせて有用な特徴となり得る。
【０２２３】
また、総面積に対する（に関する、またはで割った）２８Ｓピーク面積（２８Ｓ／総面積）および総面積に対する１８Ｓピーク面積（１８Ｓ／総面積）に関しても比を求めた。２８Ｓ／総面積の最大比および最小比の特徴を、それぞれ図６Ｆ〜６Ｇに示されるように、片対数グラフ上で対数濃度に対してグラフ化した。１８Ｓ／総面積の最大比および最小比の特徴を、それぞれ図６Ｈ〜６Ｉに示されるように、片対数グラフ上で対数濃度に対してグラフ化した。
【０２２４】
最大２８Ｓ／総面積の特徴に関するＡＵＣ値は０．６９であった。最小２８Ｓ／総面積の特徴に関するＡＵＣ値は０．６２であった。最大１８Ｓ／総面積の特徴に関するＡＵＣ値は０．７６であった。最小１８Ｓ／総面積の特徴に関するＡＵＣ値は０．６８であった。これは、これらの特徴が応答者を不応答者から分離するために有用な成分であり得ることを示唆する。
【０２２５】
中間／２８Ｓの最大比および最小比の特徴を図６Ｊ〜６Ｋに示す。
【０２２６】
ＭＡ２２データセットに関して１８Ｓピーク幅および２８Ｓピーク幅を計算し、それらが応答者と不応答者の間の判別が可能か否か評価した。ＲＤＡスコアを求めるために、この特徴の組合せを用いて線形判別分析により決定した場合、精度（例えば、（それらの真ラベルが予測ラベルに等しいデータの数）／（データ総数））は０．６であり、０．６７のＡＵＣを持っていた。
【０２２７】
ＲＮＡ破壊とＲＮＡ自己分解性分解
薬物の断片化作用と自己分解性分解の間の識別は、Ａ）エレクトロフェログラムグラフィカルベースライン（すなわち、ピーク間の底辺の測定）の変化、Ｂ）低分子量バンドの出現、Ｃ）低ＲＮＡ濃度、および／またはＤ）１８Ｓピークと比べての２８Ｓの減損の測定、を用いて可能となり得る。
【０２２８】
考察
本明細書に報告されるように、自己分解性ＲＮＡ分解のエレクトロフェログラムは、化学療法により誘発されるＲＮＡ破壊とは異なり得る。ＲＮＡ分解を分析するための既存のツールは、非自己分解性分解を評価することに向けられていなかった。ＲＮＡエレクトロフェログラムの正確な分析は、化学療法を施した腫瘍ＲＮＡサンプルにおける破壊の程度を決定するのに重要である。開示のピーク識別法は、ＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーによりＮ／ＡのＲＩＮと予めマークされたサンプルが評価され、本明細書に記載の方法を用いて面積値が求められたことから、多数のサンプルを十分に分析する能力を提供する。化学療法によるｒＲＮＡ破壊に関連する特徴を表２に示す。
【０２２９】
【表２】
0006279549.tif 000003
【０２３０】
１８Ｓに対する２８Ｓの最大比は一般に２．０の値に割り付けられており、この比の低下は分解のためだとされていた（例えば、１．８未満）。実施例２の検討では、破壊されたＲＮＡを含むサンプルでは、２８Ｓ：１８Ｓ比は低下していたか、または場合によっては増大していたことが分かった。どちらの場合でも、強い中間バンドが存在していた。２８Ｓの断片化の程度は、１８Ｓ  ｒＲＮＡで見られる断片化とは異なっていた。
【０２３１】
中間バンド領域は、ＲＮＡの断片化（例えば、ＲＮＡ破壊）の程度を決定する場合に、ＲＮＡエレクトロフェログラムにおける重要な成分であると思われる。２８Ｓバンドおよび／または１８Ｓバンドとともに、中間領域における総面積により小さな面積を占めるバンドの出現は、ＲＮＡの破壊を示す。
【０２３２】
実施例３
予後バイオマーカーにとっての長期乳癌化学療法の有効性を評価する必要性は、十分に確立されている。ＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）は、術前化学療法を受けている女性のための、処置中の薬物有効性の評価を可能とする新規な予後検査である。ＲＤＡは、局所進行性乳癌（ＣＡＮ−ＮＣＩＣ−ＣＴＧ  ＭＡ−２２）を有する女性に関する臨床試験の知見から開発された。種々の用量のドセタキセルおよびエピルビシンが２週間隔（ドーズデンス）または３週間隔で与えられた。腫瘍から療法前、療法中および療法後の３時点において２回ずつ生検を採った。治験エンドポイントは、臨床応答、病理学的完全応答（ｐＣＲ）、無病生存期間および全生存期間を含んだ。
【０２３３】
方法：
ＲＤＡは、ＲＮＡ完全性／品質を評価するために作成されたＲＮＡエレクトロフェログラムの分析に基づく。療法中、処置に応答している腫瘍を有する患者は、ＲＮＡ品質に劇的な低下（ＲＮＡ破壊）を示した。次に、その後ｐＣＲを示した患者と示さなかった患者とを判別するためにエレクトロフェログラムの様々な特徴を組み合わせることにより、ＲＤＡスコアを提供するための方法が開発された。この方法は、ＲＮＡ破壊の程度を示すＲＤＡスコアを求める。高いＲＤＡスコアは後のｐＣＲに関連するが、低いＲＤＡスコアは、患者が長期化学療法利益を受ける見込みがないことを示す。この例に関して、ＲＤＡスコアは、２８Ｓピークと１８Ｓピークの面積の和(the sum or the areas of the 28S and 18S peaks)に対する中間領域の面積の比（すなわち、中間／（２８Ｓ＋１８Ｓ））の最大値に基づいた。
【０２３４】
結果：
ＭＡ−２２治験の患者（一部の患者詳細はＰａｒｉｓｓｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０およびＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１５６１で入手可能であり、３５名のさらなる患者が合計８５名の患者として分析されており、場合によっては、１被験体当たり３サンプルが分析され、本明細書に記載のＰＰＶ  ＡＮＤ  ＮＰＶナンバーは全データセットに基づく）に、３サイクル目または４サイクル目の化学療法の後に適用したところ、ＲＤＡスコア（例えば、中間面積／（２８Ｓ面積＋１８Ｓ面積）に比に基づく）は以下の予測を立てた。それは治験を受けた８５名の患者のうち３２％を不応答者と予測した。この予測の陰性的中率は０．９９であり、９５％信頼限界は０．９８〜１．０であり、偽陰性率は２％であった。ＲＤＡは、ｐＣＲに達した患者のうち８７％を高い応答機会を持つと予測した。この予測の陽性的中率は０．１９であり、薬物効果を持っていた患者もいたがｐＣＲには達しなかったことを反映している。図７Ａは、ＲＤＡゾーンおよび識別された応答者と不応答者を示し、図７ＢはＲＯＣ曲線を示す。応答者数も下記の表３に示す。
【０２３５】
例えば、ＲＤＡスコアに閾値１０．２を選択すると、処置中の応答者の負の予測値は０．９９である。これは、例えば１０を超えるＲＤＡを有する腫瘍サンプルが９９％を超える信頼度でその化学療法に対して不応答性であると予測され得ることを意味する。
【０２３６】
３反復で、中間面積／（２８Ｓ面積＋１８Ｓ面積）の比に基づくＲＤＩを用いて測定されたサンプルの平均標準偏差は４１であった。これは療法中のサンプルに対するものであり、腫瘍が極めて不均質であり得ると予測される。
【０２３７】
【表３】
0006279549.tif 000004
【０２３８】
結論：
臨床診療におけるＲＤＡの使用は、乳癌化学療法に応答する見込みのない患者の識別を可能とする。長期化学療法利益を示さないＲＤＡスコアを有する患者は、次に、化学療法の有毒な副作用を避けることができ、別の処置に切り替えることができ、これによってより良い臨床結果ならびに医療コストの削減をもたらすことができる。
【０２３９】
実施例４
本明細書に記載の方法およびアッセイは、不応答者に対して療法を変更する利益を評価するために使用することができる。患者応答に基づいて化学療法プロトコールを途中で変更することによって、全生存率の向上ならびに無病生存率の向上をもたらすことができる。
【０２４０】
最終応答を迅速に、例えば１サイクルまたは２サイクルの化学療法処置後に予測することは、臨床利益を最大にし、かつ／または毒性を最小にするために有用な情報を提供し得る。
【０２４１】
これを評価するため、患者を１以上の異なる化学療法薬で処置する。処置前、処置中および／または処置後の１以上の時点で患者からコア生検を採取する。これらの生検を、ＲＮＡ分解アッセイを用いて分析する。前記ＲＤＡアッセイに基づいて予測される応答者および不応答者を識別する。不応答者を２以上の群に無作為化する。例えば、被験体は、同じ処置で維持されてもよく、または補助処置もしくは他の処置（例えば、補助処置、異なる薬物、または手術もしくは放射線などの他の療法）を受けてもよい。予測された「不応答者」群の結果を比較して、予測の精度を評価し、また、処置の変更（例えば、補助処置、異なる薬物、または手術もしくは放射線などの他の療法）が結果の向上をもたらすか否かを評価する。
【０２４２】
さらなるマーカーを処置前、処置中および／または処置後に分析することができる。
【０２４３】
実施例５
ＥＲ／ＰＲ＋／ＨＥＲ２陰性およびトリプルネガティブ腫瘍を有する被験体を、例えば、分子プロファイリングに基づいて療法に割り付ける。例えば、ある処置群が術前補助ホルモン療法を受け、第２の処置群が術前補助化学療法Ａを受けることができる。
【０２４４】
応答者と不応答者は、ＲＮＡ破壊アッセイ法を用いて予測する。不応答者を異なる処置または付加的処置を受けるように無作為化することができる。例えば、第１群の不応答者をホルモン療法で継続し、または化学療法もしくはホルモン療法に加えて補助療法を受け、第２群の不応答者は化学療法Ａを受け続けるか、または化学療法Ｂおよび／もしくは手術を受ける。全患者およびまた療法を切り替えた患者の無病生存率などの結果を、療法を継続している患者と比較する。
【０２４５】
実施例６
細胞を播種し、０．００１〜４０μＭの範囲のドセタキセル濃度で２４〜７２時間処置し、細胞数、ＲＮＡ含量、および完全性（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．からのバイオアナライザー２１００を用いて測定）に対する効果を評価した。
【０２４６】
Ａ２７８０細胞を、０．００５μＭおよび０．２μＭのドセタキセルで最大７２時間処置した。各時点で細胞総数を評価した。細胞数は、０．００５μＭ以上のドセタキセル濃度に対して一定を維持していた（図９Ａ）。図９Ａおよび９Ｂにおけるアステリスク（＊）の使用は、薬物処置サンプルと薬物不含対照の間の違いが統計的に有意とみなされるか否かを意味する（有意性を決定するためのボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ）。
【０２４７】
０．００５μＭおよび０．２μＭのドセタキセルで最大７２時間処置したＡ２７８０細胞を、細胞当たりのＲＮＡ量に関して分析した。ＲＮＡを単離し、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーを用いて電気泳動により分離した。細胞当たりのＲＮＡ量を計算したところ、時間依存的かつ用量依存的に増加することが示された。結果を図９Ｂに示す。
【０２４８】
次に、Ａ２７８０細胞が０．２μＭドセタキセルにより処置から回復できるか否かを決定するために、回復アッセイを行った。Ａ２７８０細胞を０．２μＭドセタキセルで最大７２時間処置した後、洗浄し、薬物不含培地に再び播種した。これらの条件下で細胞増殖の再開は見られなかった（図９Ｃ）。
【０２４９】
０〜４０μＭの範囲の濃度のドセタキセルで２４時間処置した細胞からのＡ２７８０細胞ＲＮＡの電気泳動分離は、中間領域および低バンド領域にバンドの出現を示す。ＲＮＡを単離し、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーにて電気泳動により分離した。図９Ｄに示されるように、０．００５μＭで、２８Ｓバンドのすぐ下（例えば、中間）および１８Ｓバンドのすぐ下（例えば、低バンド領域）にバンドが出現し、０．２μＭにピークがあった。
【０２５０】
また、エレクトロフェログラムの出力も、０．００５μＭの濃度で２８Ｓピークおよび１８Ｓピークのすぐ下に見られるバンドは０．２μＭの濃度にピークがあることを示す（図９Ｅ）。
【０２５１】
図９Ｆおよび９Ｇに示されるＲＤＩ値は方法２００および３００を用いて決定されたが、方法３００の代わりに方法４００を使用可能であることに留意すべきである。
【０２５２】
ＲＤＡを用いた分析を行った。図９Ｆは、０．００５μＭおよび０．２μのドセタキセル濃度で２４〜７２時間処置したＡ２７８０細胞に関して中間／（２８Ｓ＋１８Ｓ）の測定値をプロットしたものである。各値は単一のサンプルを表す。２反復の試験は同様の結果を有した。グラフは、中間／（２８Ｓ＋１８Ｓ）の比が経時的に劇的に増大することを示す。同様に、低バンド面積／（２８Ｓ＋１８Ｓ）の比のグラフは、この比も経時的に増大することを示す（図９Ｇ）。前の通り、各値は単一のサンプルを表す。２反復の試験は同様の結果を有した。
【０２５３】
Ａ２７８０細胞で経時的推移試験を行った。細胞を０．００５μＭおよび０．２μＭの．ドセタキセルで最大７２時間処置した。ＲＮＡを単離し、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーに流した。図９Ｈは、総ての時点で２８Ｓバンドおよび１８Ｓバンドより下にバンドが見られることを示す。
【０２５４】
ドセタキセルＡ２７８０耐性細胞株は、Li et al., Int. J. Mol. Med 2004 14(20): 257-264に記載のとおりに作製した。
【０２５５】
経時的推移実験を行った。感受性親Ａ２７８０細胞およびドセタキセル耐性Ａ２７８０細胞をドセタキセルで２４時間処置した。ＲＮＡを単離し、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーに流した。
【０２５６】
図９Ｉに示されるように、感受性細胞では０．００５μＭにおいて２８Ｓバンドおよび１８Ｓバンドより下にバンドが出現する。しかしながら、耐性細胞ではバンドは明らかでない。
【０２５７】
次に、ＲＮＡ完全性の変化に及ぼすカスパーゼ阻害剤の影響を評価した。細胞を、１０μＭ濃度のカスパーゼ阻害剤Ｑ−ＤＥＶＤ−ＯＰＨ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の存在下または不在下、０．２μＭ濃度のドセタキセルで処置し、または処置しなかった。
【０２５８】
ＲＮＡを単離し、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーに流し、バンドパターンを図９Ｊに示す。この阻害剤は、７２時間における２８Ｓバンドおよび１８Ｓバンドの減損を軽減する。カスパーゼ阻害剤の存在下でも不在下でも、２８Ｓバンドおよび１８Ｓバンドより下のバンドは検出可能である。
【０２５９】
０．００５μＭ以上の濃度のドセタキセルでは細胞数が一定に留まっていたが、この薬物を中止しても細胞増殖の再開は起こらなかった。細胞当たりのＲＮＡ含量は増加したが（ｐ＜０．０５）、ＲＩＮは、この範囲では、有意に変化しなかった。しかしながら、新規な離散バンドが０．００５μＭでｒＲＮＡバンドパターンの、２８ｓおよび１８ｓ  ｒＲＮＡバンドのすぐ下に出現し、０．２μＭドセタキセルをピークとした。対照的に、ドセタキセル耐性Ａ２７８０ＤＸＬ細胞は処置に対して同様の変化を示さず、このことは、腫瘍細胞ＲＮＡ含量および完全性における変化が化学療法薬に対する応答をモニタリングするために使用可能であることを示している。
【０２６０】
実施例７
Ａ２７８０卵巣癌細胞を、Ｇｕｌｍａｙ  ＲＳ３２０  Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて２〜１０グレイの放射線で処置し、続いて２４、４８および７２時間後に回収した。ＲＮＡを単離し、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーに流した。エレクトロフェログラムの分析は、放射線処置細胞において７２時間での中間面積／（２８Ｓ面積＋１８Ｓ面積）比の増加が検出可能であることを示した（図１０Ａ）。例えば、１０グレイで７２時間処置した細胞は中間領域と低バンド領域においてＲＮＡ破壊を示すが、自己融解ピークが存在するエレクトロフェログラムの面積には大きな違いはない。図１０Ｂは、５Ｇｙで２４時間（レーンＡ）、５Ｇｙで４８時間（レーンＢ）、５Ｇｙで７２時間（レーンＣ）、１０Ｇｙで２４時間（レーンＤ）、１０Ｇｙで４８時間（レーンＥ）および１０Ｇｙで７２時間（レーンＦ）処置したＡ２７８０細胞を示す。ＲＮＡ破壊は、両用量レベルとも、７２時間で明らかとなる。
【０２６１】
実施例８
方法
ＦＥＣ−Ｄ計画の投与と放射線の併用
ステージＩＩＩ非転移性、非浸潤性局所進行性乳癌を有する３２名の患者に、３週間毎の術前補助５−フルオロ−ウラシル、エピルビシン、およびシクロホスファミド（ＦＥＣ、ＣＥＦとも呼称）４サイクルの後、１週間毎のドセタキセル（３５ｍｇ／ｍ２）処置を、局所放射線（４５Ｇｙ、２５および５画分では１６Ｇｙを追加照射）６週間、その後、放射線を用いずにさらに３週間のドセタキセル化学療法と併用して行った。その後、根治的乳房切除術変法を行った。患者および腫瘍の特徴をベースライン時と処置後に記録し、臨床応答および処置関連の毒性を記述した。処置前、処置中および処置後の患者から画像誘導連続１４ゲージ腫瘍コア生検を採取し、すぐにこれらの生検から１ｍｍ３切片を採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）に浸漬し、冷凍保存した。ＭＩＤ処置は、ＦＥＣ後で放射線療法併用のドセタキセル前とする。
【０２６２】
腫瘍コア生検からのＲＮＡの単離
処置前、処置中および処置後の患者の画像誘導腫瘍コア生検から、Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉＲＮｅａｓｙ（商標）ミニキットを用い、製造者のウェブサイトhttp://www1.qiagen.com/literature/handbooks/literature.aspx?id=1000291に公開されているプロトコールの変法に従ってＲＮＡを単離した。様々なアッセイのために生検をいくつかの切片に切り分け、ＲＮＡ完全性分析に使用する切片をＲＮＡｌａｔｅｒに入れた。ＲＮＡｌａｔｅｒ中の生検は、すぐに、１．５ｍｌチューブのβ−ＭＥ（１ｍｌに１０μｌ）含有ＲＬＴバッファー０．５ｍｌ中に落とした。ＲＬＴバッファー中の生検をコアレスモーターホモジナイザー（Ｋｏｎｔｅｓ  Ｇｌａｓｓ  Ｃｏｍｐａｎｙから）で５分間ホモジナイズした。次に、この溶解液を、ＲＮアーゼ不含シリンジに取り付けた２０ゲージ針（直径０．９ｍｍ）に少なくとも５回通した。その後、このサンプルを冷却微量遠心機にて４℃で３分間、高速で遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。１容量（５００μｌ）の７０％エタノールをこの上清に加え、このサンプルを、ピペット操作を繰り返すことによってよく混合した。ホモジナイゼーション中に一部の溶解液が損失した場合には、エタノールの容量を相応に調整した。いくつかのサンプルでエタノールの添加後に生じた目に見える沈殿は、このＲＮＡ単離手順に影響を及ぼさなかった。存在する場合には沈殿も含めて最大７００μｌのサンプルをＱｉａｇｅｎ（商標）ミニカラムに加え、２ｍｌの回収チューブに入れた。このカラムを８０００ｘｇ以上（１０，０００ｒｐｍ以上）で１５分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。次に、残りのサンプルをカラムに加え、そのカラムを再び遠心分離した。これ以降、製造者のプロトコールに従って、カラムをＲＰＥバッファーで２回洗浄し、遠心分離により乾燥させた。次に、３０μｌのＲＮアーゼ不含水でカラムからＲＮＡを溶出させ、溶出液を再び適用し、カラムから溶出させ、得られるＲＮＡの収量および濃度を高めた。
【０２６３】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーを用いたＲＮＡ品質の評価
上記ＲＮＡサンプルをＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｌａｐｃｈｉｐｓ（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から購入）に適用し、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）２１００バイオアナライザーを用いたキャピラリー電気泳動にかけた。
【０２６４】
試験結果および臨床結果のさらなる詳細は、Cancer Res 2012、72(24 Suppl):Abstract nr P1-14-13に示されている。
【０２６５】
結果
放射線後に患者腫瘍サンプルから単離されたＲＮＡをＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーに流した。エレクトロフェログラムの分析は、病理学的完全応答を示した２名の患者において中間面積／（２８Ｓ面積＋１８Ｓ面積）比の増大を示した（図１１ａ）。
【０２６６】
また、エレクトロフェログラムの分析は、病理学的完全応答を示した２名の患者において低面積／（２８Ｓ面積＋１８Ｓ面積）比の増大も示した（図１１ｂ）。
【０２６７】
実施例９
別の方法をピーク識別に使用することもでき、一般に、複数のサンプル、例えば、ＲＮＡチップなどのプラットフォーム上に提供されるサンプルに対する標準サンプル（すなわち、正常サンプル）を決定することを含んでなり、２８Ｓピークおよび１８Ｓピーク、ならびに対象とする他の特徴を、各サンプルの保持時間を標準サンプルと比較することによって識別する。例えば、標準サンプルが決定される場合、その方法は次に、一般に、どのサンプルが調整を必要とするかを決定すること（例えば、調整群を形成すること）、プラットフォームに対する標準保持時間を決定すること、その標準保持時間に基づいて、前記調整群のサンプルを調整すること、前記標準保持時間を用いてピークを決定すること、およびそれらのピークおよび近傍領域の１以上の特徴を計算することを含んでなる（図５Ａの考察に与えられている例により示される通り）。各プラットフォームに関して「標準」または「正常」サンプルを特定することにより（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーチッププラットフォームが例えば１チップ当たり１２サンプルを流し得る場合と同様に、複数の試験サンプルが流される場合）、２８Ｓピークおよび１８Ｓピークは、各サンプルの保持時間をチッププラットフォームの「標準」サンプルの保持時間と比較することによってより容易に決定することができる。次に、これは、同時点で採取されたサンプルに対して、同じ平均値を用いての正規化を可能とする。この方法についてのさらなる詳細は、実施例１０および図１２Ａに示され、図１２Ａには、上述のピーク識別および特徴計算の方法を実施するための例としての実施形態のフローチャートが示されている。
【０２６８】
また、図１２Ｂでは、低バンド領域が低Ａバンド領域、低Ｂバンド領域および低Ｃバンド領域を含む複数領域に三分されるというさらなる特徴も見て取ることができる。
【０２６９】
実施例１０
Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーを用いた変法
ここで、図１２Ａを参照すると、そこにはピークを識別し、エレクトロフェログラムデータセットに関する特徴を計算するための方法４００の別の実施形態の例が示されている。方法４００は一般に、例えばＲＮＡチップなどの一般的な分析プラットフォーム上のサンプルから得られる複数のエレクトロフェログラムデータセットに対する標準サンプルまたは正常サンプルを特定すること、およびその後、調整が必要であると決定された、従って調整群内に含まれるサンプルのエレクトロフェログラムに関してピークの位置を調整するために標準サンプルを使用することを含む。複数のエレクトロフェログラムデータセットが、例えばＲＮＡチップなどの同じプラットフォームを用いて分析されたサンプルを用いて作成される。ＲＮＡチップが違えば（例えば、違うプラットフォームでは）ピーク保持時間が違うことが分かった。方法４００は、高度に断片化されたサンプルにおける１８Ｓピークおよび２８Ｓピークのより正確な評価を可能とすることが分かった。
【０２７０】
４０２において、方法４００は、対象とするピークの範囲を決定する。この範囲はデフォルト設定に初期化し、必要であればシフトさせることができる。例えば、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークでは、デフォルト範囲は［３９．５秒，４４．９５秒］および［４５．０５秒，５３．５秒］に初期設定することができる。０〜１００の尺度では、１８Ｓ領域の範囲は［４５．８５，６１．２５］であり、２８Ｓ領域の範囲は［６１．６，８５．７５］である。次に、これらの範囲を、限定されるものではないが、マーカー領域がその予測位置にない場合などの特定の条件下でシフトさせることができる。例えば、これらの範囲は、マーカーの時間、すなわち、色素のみのピーク（それがＲＮＡを含んでおらず、むしろゲルに対して泳動の開始を示すことを意味する）である最初のピークに関連する時間が約２２．５秒でなければ、シフトさせることができる。これらのサンプルでは、移動係数は式１に従って計算される。
ｒｎｇｓｈｆｔ＝マーカー時間−２２．５    （１）
式中、マーカー時間は、マーカーの開始時間である。次に、１８Ｓ領域の範囲は、［３９．５＋ｒｎｇｓｈｆｔ×１．５，４４．９５＋ｒｎｇｓｈｆｔ×１．５］に従って上にシフトさせ、２８Ｓ領域の範囲は、［４５．０５＋ｒｎｇｓｈｆｔ×２．５，４４．９５＋５３．５＋ｒｎｇｓｈｆｔ×２．５］に従って上にシフトさせる。
【０２７１】
ここで、図１２Ｃを参照すると、方法４００を用いてピークがいかに定義されるかのいくつかの側面を示すためにここで用いるピーク例のグラフが示される。図１２Ｃは、１つの部分ピークを持つ総合ピークのプロットを示し、ここで、ｘ軸は時間（秒）であり、ｙ軸は［ＦＵ］値である。
【０２７２】
非線形ラインと定義される実数値関数ｆは、０より大きいεがいくつか存在すれば、従って|ｘ−ｘ＊|＜εであるとき、ｆ（ｘ＊）≧ｆ（ｘ）であれば、時点ｘ＊において極大点（すなわち、相対的最大点）を有するとされる。極大点の値は他の総ての点の値より大きくなくてもよく、むしろそれは局所的範囲内で最も大きい値であればよいだけである。関数ｆは、総てのｘについてｆ（ｘ＊）≧ｆ（ｘ）であれば、全体的（すなわち、絶対的）最大点を有する。全体的最大点は最も大きな値を持たなければならない。関数は２つ以上の極大点を持ち得るが、全体的最大点は１つだけである。同様に、極小点と全体的最小点もある。
【０２７３】
全ピーク領域は時間ａから時間ｂまでで定義される。時点ａはピークの始点であり、時点ｂは終点である。範囲［ａ，ｂ］内の全体的最小点は、ａまたはｂのいずれかである。ピーク点は、全体的最大点、すなわち、ｃと定義される。ピーク高さは、最高点の値、すなわち、ｃの値と定義される。ピーク幅は、（終了時間−開始時間）、すなわち、ｂ−ａと定義される。ピーク面積は、ｘ軸の上、かつ、時点ｘ＝ａからｘ＝ｂまでの曲線下の面積と定義される。極大点ｅは、部分ピーク点である。１８Ｓピークおよび２８Ｓピークは、２つ以上の部分ピークを持ち得る。極最点ｄは、低い部分ピークである。
【０２７４】
４０４において、ピークは、まず、２つの識別範囲内の総ての潜在的ピーク候補を検索することによって位置決定される。これには、両側を極小値に囲まれた極大値検索することが含まれる。これらの判定基準を有する範囲内のエレクトロフェログラムの各部分は、「ピーク候補」と呼ばれる。次に、各潜在的ピーク候補の高さ差を計算する。ピーク候補の高さ差は、最高ピーク値と平均最低ピーク値の差と定義される。平均が採られる最低ピーク値は、各ピークの開始時間と終了時間におけるピークの始点と終点であり、部分ピーク低値（すなわち、極小値）は含まれない。最も大きい高さ差を有する２つのピーク候補が、１８Ｓおよび２８Ｓとして選択され得る。１８Ｓピークまたは２８Ｓピークは、より高い値を持つ可能性がある。１８Ｓピークおよび２８Ｓピークがひと度、正しく識別されれば、次に、限定されるものではないが、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの幅、高さおよび面積、中間面積、低Ｃバンド領域面積などのような所望の特徴を計算することができる。部分ピークは面積計算または幅計算に含まれ、その高さの影響を受けない（常に小さいため）。これらの特徴に関する値は、それらがサンプルのいくつかでは変換するとは考えられないので、ここで計算することができる。別の実施形態では、これらの特徴に関する値は、総てのサンプルに関して、調整を必要とするサンプルが調整された後に計算することができる。
【０２７５】
方法４００では、ピークが２つ以上の最大値を持つことが許容される場合は２つあることに留意すべきである。第１に、ピーク幅が０．１５秒未満であれば、このピークはその隣接するピークの部分ピークとみなされる。第２に、ピークの開始値と終了値の差が大きすぎれば、このピークはその隣接するピークの部分ピークとみなされる。この差は、部分ピークの高さ（すなわち、図１２Ｃの時点ｅの値−時点ｂの値）を極大値と極小値の差（すなわち、図１２Ｃの時点ｅの値−時点ｄの値）で割った商が、限定されるものではないが、例えば５などの閾値よりも大きければ、大きすぎるとみなされる。一般に、方法４００を用いれば、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークに１または２つのピークが伴う場合があることが分かっている。
【０２７６】
さらに、方法４００では、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの位置を決定する場合に、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの幅に基づく制限はない。また、方法４００では、１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの位置を決定する場合に、１８Ｓピークと２８Ｓピーク間の距離に基づく制限もない。
【０２７７】
４０６において、複数のサンプルに対する標準サンプルが決定される。標準サンプルは、複数のサンプルで最も小さい標準スコアを有するサンプルと定義することができ、標準スコアは式２で定義される。
【数１】
0006279549.tif 000005
【０２７８】
４０８において、標準サンプルの保持時間が、他のサンプルの保持時間と比較される。この保持時間は、２８Ｓピークと１８Ｓピークの両方について調べられる。保持時間が標準サンプルの保持時間の前後でないサンプルは調整群に割り付けられ、残りのサンプルは標準群に割り付けられる。限定されるものではないが、０．５秒などの閾値が、これ（すなわち、「前後」にない保持時間）を評価するために使用可能である。よって、あるサンプルに関する１８Ｓピークと２８Ｓピークの両方の保持間時の差が、標準サンプルの同じピークに比べて０．５秒より大きく離れていれば、そのサンプルは調整群としられ、調整を必要とする。
【０２７９】
４１０において、１８Ｓピークと２８Ｓピークに関する標準保持時間は、標準群のサンプルに基づいて選択される。例えば、標準保持時間は、標準群のサンプルの保持時間の中央値として選択され得る。別の実施形態では、限定されるものではないが、平均値または平均値に対する何らかの変形などの他の統計的尺度が使用可能である。
【０２８０】
４１２において、調整群の各サンプルに関する１８Ｓピークおよび２８Ｓピークは、作業４１０において決定された標準保持時間（すなわち、標準サンプルから決定された１８Ｓピークおよび２８Ｓピークの時間）前後にあるピークを位置決定することにより決定される。例えば、標準群にある、ゆえに最も完全なＲＮＡに相当するサンプルを用い、２８Ｓおよび１８Ｓの保持時間の中央値を識別する。次に、調整群の各サンプルを調べて、その保持時間に見られるピークを探す。しかしながら、２８Ｓピークおよび１８Ｓピークの実際の保持時間は、標準サンプルの保持時間と同一とはいえず、これは標準サンプルのピークは同じ正確な保持時間にその最高点を持たない場合があるからである。この場合、そのピーク面積が「標準保持時間」をなお含んでいれば、たとえそのピークの最大値が正確に同じ保持時間に存在しなくても、このピークは１８Ｓピークまたは２８Ｓピークと呼ばれる。次に、このピークに基づいて総ての測定値（幅、高さ、面積）を採る。１８Ｓピークおよび２８Ｓピークがひと度、位置決定されれば、限定されるものではないが、例えば低Ｃバンド領域および中間領域などの、対象とする他の領域も決定することができる。
【０２８１】
次に、４１４において、ＲＤＡスコアまたはＲＤＩを決定する上で使用される対象とする特徴を総てのサンプルについて計算する。
【０２８２】
ＲＤＩスコアは、「完全なＲＮＡ」に最も近いＲＮＡチップ上のサンプルと定義することができる「対照」サンプルを含む、ＲＮＡチップの各サンプルに関して計算すればよい。
【０２８３】
一実施形態では、特徴の組合せは、１８Ｓピーク面積と２８Ｓピーク面積の和に対する、低Ｃバンド領域面積の比であり、これは、「低Ｃ／（１８Ｓ＋２８Ｓ）」という表現で表すことができる。方法３００もまた、この特徴の組合せとともに使用することができる。
【０２８４】
ＲＮＡチップ上に２種類のサンプルがあり、そのサンプルの一方が、実際に全チップに流される完全なＲＮＡの陽性対照サンプルであり、他方のサンプルがＲＤＡまたはＲＤＩ値が得られるサンプルであり得る場合には、方法４００も動作可能であることに留意すべきである。あるいは、第２のサンプルはまた、ある状況下で有用であり得る分析サンプルであってもよい。
【０２８５】
従って、本明細書に記載の少なくとも１つの実施形態は、試験サンプルと対照サンプルに対応する２つのエレクトロフェログラムデータセットを得ること、前記試験サンプルは、分析を必要とする、場合により処置前、処置中または処置後の時点の細胞ＲＮＡを含んでなるユニークな生体サンプルであり、前記対照サンプルは、別のユニークな生体サンプルまたは完全なＲＮＡもしくはほぼ完全なＲＮＡの陽性対照サンプルである、前記試験サンプルのエレクトロフェログラムを調整群とし、前記対照サンプルのエレクトロフェログラムを標準群としること、前記標準群からの正常サンプルに代表的な正常な特徴を識別すること、前記調整群のエレクトロフェログラムに関してピークの位置を決定し、それらのピークの位置を正常な特徴に基づいて調整すること、ならびに調整されたエレクトロフェログラム、および場合により、対照サンプルが分析を必要とする別のユニークな生体サンプルである場合には、標準群からのエレクトロフェログラムから、特徴に関する値を決定することを含んでなる。
【０２８６】
実施例１１
低Ａ、低Ｂ、および低Ｃバンド領域の境界
境界は、マーカー領域と１８Ｓ領域（すなわち、１８Ｓバンド）の間の領域である低領域内の、ピークの離散セットの位置に基づいて設定した。低Ａバンド領域は、マーカー領域と３０．０秒の間の範囲として定義することができる。低Ｂバンド領域は、３０．０秒と３５．０秒の間の範囲と定義することができる。低Ｃバンド領域は、３５．０秒と１８Ｓ領域の間と定義することができる。
【０２８７】
ＭＡ２２データセットにおいて最も予測性の高い特徴を特定するために、線形判別分析を用いた。２つまたは３つの特徴の組合せが予測性能を高めることが分かり、表７〜８に挙げられた多くの組合せは、それらの応答者予測能が極めて近かった。本分析に用いた様々な特徴（すなわち、２８Ｓ、１８Ｓ、中間、低Ｃ）に関する総てのピーク測定値、免疫測定値、および幅測定値は総面積に対して正規化した。総面積は、低バンド領域、１８Ｓ領域、中間領域および２８Ｓ領域の面積の和であると定義され、分析したサンプル中に存在するＲＮＡの総量に相当する。
【０２８８】
実施例１２
実施例２の方法２００および３００の使用と同じ様式でＭＡ２２治験データセットを評価するために方法２００および４００を用いた。療法中の腫瘍サンプルから単離されたＲＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーを用いて分析した。結果は、化学療法で処置したサンプルにおける２８Ｓピークの識別の誤りは、方法４００を用いた場合には０．３％に低下したというものであった（表４参照）。
【０２８９】
【表４】
0006279549.tif 000006
【０２９０】
療法中の腫瘍サンプルに関して２８Ｓ面積と１８Ｓ面積の和に対する、中間面積の比を求め、両対数グラフに濃度に対してプロットした。特に、各患者に関する最大の比の値をグラフ化した（図１３）。ＲＤＡゾーンは、臨床判定基準に基づいて設定した。この例では、臨床判定基準は、０．９８または０．９９地点のゾーン１と２の間の閾値の陰性的中率であった。ゾーン２と３では、臨床判定基準は可能性のある最良のＰＰＶ値となるように選択され、しかもゾーン３では応答者の大部分を含む。各患者に関する最大ＲＤＡを片対数チャート上に対数濃度に対してグラフ化し、様々なＲＤＡゾーンに関して図１４Ａに示す。図１４Ｂは、中間面積／（１８Ｓ＋２Ｓ）の比の最大値に関する受信者動作特性（感度対、１−特異度）曲線を示す。曲線下面積（ＡＵＣ）は約０．８であった。
【０２９１】
また、２８Ｓ面積と１８Ｓ面積の和に対する低Ｃバンド領域面積の比も求めた。各患者に関するこの比の最大値を両対数プロット上にＲＮＡサンプル濃度（最大比を持っていたサンプルに関するもの）に対してプロットし、図１４Ｃに示す。
【０２９２】
また、２８Ｓ面積と１８Ｓ面積の和に対する中間面積と低Ｃバンド領域面積の和の比も求めた。各患者に関するこの比の最大値をＲＮＡサンプル濃度（最大比を持っていたサンプルに関するもの）に対してプロットし、図１４Ｄに示す。
【０２９３】
他の比も計算し、次に、ＭＡ２２データセットに関して最も予測性の高かった特徴を特定するために、線形判別分析（ＬＤＡ）を用いた。ＬＤＡの適用に関する詳細は、以下の実施例１３で述べる。一般に、２つまたは３つの特徴の組合せは、より優れた予測性能をもたらすことが分かったが、以下の表８および９に挙げられている組合せのほとんどは、応答者と不応答者を予測するそれらの能力が近いことが分かった。
【０２９４】
表５は、方法４００を用いた場合に決定される化学療法によるＲＮＡ破壊に関連する特徴を示す。
【０２９５】
【表５】
0006279549.tif 000007
【０２９６】
方法１００および４００をＭＡ−２２治験における患者に、３サイクル目または４サイクル目の化学療法後に適用した場合（患者詳細はParissenti et al. 2010およびＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１５６１から入手可能）、ＲＤＡスコアを用いたところ、治験を受けた８５名の患者のうち２７％が不応答者であったと予測された。この予測の陰性的中率は０．９９であり、９５％信頼限界は０．９５〜１．０であった。ｐＣＲに達した患者のうち、ＲＤＡスコアは、これらの患者の８７％を高い応答機会を持つと予測した。この予測の陽性的中率は０．２２であり、薬物効果を持っていた患者もいたがｐＣＲには達しなかったことを反映している。図１４Ａは、ＲＤＡゾーンおよび識別された応答者と不応答者を示し、図１４ＢはＲＯＣ曲線を示す。応答者数も下記の表６に示す。
【０２９７】
【表６】
0006279549.tif 000008
【０２９８】
実施例１３
曲線下面積（ＡＵＣ）は、当業者に知られているように、検出または予測技術に関する精度の重要な尺度である。従って、どの特徴、また、どの特徴の組合せが、処置計画の特定の時点で採取したサンプルに基づいて特定の処置に対する応答者または不応答者を予測するために有用であるかを決定するために、ＡＵＣを用いた。例えば、このようなサンプルには、化学療法または放射線療法などの誘導因子に応答してＲＮＡ変化を示す患者サンプルが含まれる。また、どの特徴または特徴の組合せが最良の予測能または判別能を持っていたか決定する目的で種々の特徴を評価するために、異なる閾値とともに線形判別分析（最も慣用されている分類法の１つ）も使用した。２セットまたは３セットの組合せを、それぞれ表８および９に示されるような二次元または三次元プロット上にプロットした場合にＬＤＡを用いたが、これをそれぞれ二次元特徴セットおよび三次元特徴セットと呼称する。
【０２９９】
表７は、単一の特徴を含んでなる一次元特徴セットを、方法１００および４００を用いてＭＡ２２データセットで評価した場合のＡＵＣ値を示す。この場合、様々な一次元的単一特徴に関する値を計算し、応答者と不応答者間を判別するために様々な閾値と比較した（すなわち、これらの閾値はスカラー値であった）。
【０３００】
【表７】
0006279549.tif 000009
【０３０１】
単一の特徴のみが使用される一次元特徴セットが応答者と不応答者間の判別のために使用される場合、１８Ｓピーク面積、２８Ｓピーク面積および２８Ｓピーク高さは最良の性能を有することが分かり、１８Ｓピーク高さ、中間面積、低Ｃ面積および低Ｂ面積の特徴は、２番目に良い性能を持っていた。しかしながら、１８Ｓピーク幅、２８Ｓピーク幅および濃度の特徴もいくらか有用な予測情報を持っている可能性がある。
【０３０２】
従って、一実施形態では、単一の特徴は、１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク面積であり得る。これは、「１８Ｓ」または「１８Ｓピーク面積」という表現で表すことができる。
【０３０３】
一実施形態では、単一の特徴は、２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク面積であり得る。これは、「２８Ｓ」または「２８Ｓピーク面積」という表現で表すことができる。
【０３０４】
一実施形態では、単一の特徴は、１８Ｓ領域内の１８Ｓピーク高さであり得る。これは、「１８Ｓピーク高さ」という表現で表すことができる。
【０３０５】
一実施形態では、単一の特徴は、２８Ｓ領域内の２８Ｓピーク高さであり得る。これは、「２８Ｓピーク高さ」という表現で表すことができる。
【０３０６】
一実施形態では、単一の特徴は、中間面積であり得る。これは、「中間」または「中間面積」という表現で表すことができる。
【０３０７】
一実施形態では、単一の特徴は、低Ｃバンド領域面積であり得る。これは、「低Ｃ面積」または「低Ｃ」という表現で表すことができる。
【０３０８】
一実施形態では、単一の特徴は、低Ｂバンド領域面積であり得る。これは、「低Ｂ面積」または「低Ｂ」という表現で表すことができる。
【０３０９】
表８は、各特徴セット中の少なくとも１つの特徴を含んでなる二次元特徴セットを、方法１００および４００を用いてＭＡ２２データセットで評価した場合のＡＵＣ値を示す。この場合、様々な二次元特徴セットに関する値を計算し、応答者と不応答者間の判別のために様々な二次元閾値ゾーンと比較した（すなわち、これらの閾値ゾーンは直線で定義される）。
【０３１０】
【表８】
0006279549.tif 000010
【０３１１】
応答者と不応答者間の判別を行うために二次元特徴セットを使用したところ、ピーク面積およびピーク高さが判別に有用であることが分かった。従って、それらを他の特徴と組み合わせた場合に、より良好な判別結果を得ることができる。表８から、（１８Ｓピーク面積＋２８Ｓピーク面積）と低Ｃバンド領域面積、（１８Ｓピーク面積＋２８Ｓピーク面積）と（１８Ｓピーク幅＋２８Ｓピーク幅）、および（１８Ｓピーク高さ＋２８Ｓピーク高さ）と（１８Ｓピーク面積＋２８Ｓピーク面積）の二次元特徴セットが、最良のＡＵＣ結果を有することが分かった。表８に挙げられている他の組合せも有用であり得る。
【０３１２】
従って、一実施形態では、二次元特徴セットは、不応答者から応答者を判別するために使用されるＲＤＡ座標をグラフ化するために、各特徴セットを表す２つの直交変数(orthogonal variable)を用いた二次元プロットで使用される。これらの変数の一方は第１の特徴セットにより定義され、他方の変数は第２の特徴セットにより定義される。これらの変数は、図１５Ａ〜１５Ｄに関して記載されるように、ＬＤＡまたはＱＤＡを用いて組み合わせてもよい。第１の変数は１８Ｓピーク面積を含んでなり、第２の変数は２８Ｓピーク面積を含んでなる。これは、「１８Ｓ面積対、２８Ｓ面積」または「１８Ｓ対、２８Ｓ」という表現で表すことができる。
【０３１３】
別の実施形態では、第１の変数は１８Ｓピーク高さを含んでなり、第２の変数は２８Ｓピーク高さを含んでなる。これは、「１８Ｓピーク高さ対、２８Ｓピーク高さ」という表現で表すことができる。
【０３１４】
さらに別の実施形態では、第１の変数は２８Ｓピーク面積と１８Ｓピーク面積の和を含んでなり、第２の変数は低Ｃバンド領域面積を含んでなる。これは、「（２８Ｓ＋１８Ｓ）対、低Ｃ」という表現で表すことができる。
【０３１５】
さらに別の実施形態では、第１の変数は２８Ｓピーク面積と１８Ｓピーク面積の和を含んでなり、第２の変数は低Ｂバンド領域面積を含んでなる。これは、「（２８Ｓ＋１８Ｓ）対、低Ｂ」という表現で表すことができる。
【０３１６】
さらに別の実施形態では、第１の変数は１８Ｓピーク面積と２８Ｓピーク面積の和を含んでなり、第２の変数は１８Ｓピーク幅と２８Ｓピーク幅の和を含んでなる。これは、「（１８Ｓ＋２８Ｓ）対、（１８Ｓピーク幅＋２８Ｓピーク幅）」という表現で表すことができる。
【０３１７】
さらに別の実施形態では、第１の変数は２８Ｓピーク高さと１８Ｓピーク高さの和を含んでなり、第２の変数は２８Ｓピーク面積と１８Ｓピーク面積の和を含んでなる。これは、「（２８Ｓピーク高さ＋１８Ｓピーク高さ）対、（２８Ｓ＋１８Ｓ）」という表現で表すことができる。
【０３１８】
さらに別の実施形態では、第１の変数は１８Ｓピーク面積と２８Ｓピーク面積の和を含んでなり、第２の変数は中間面積を含んでなる。これは、「（１８Ｓ＋２８Ｓ）対、（中間）」という表現で表すことができる。
【０３１９】
別の実施形態では、第１の変数は１８Ｓピーク面積と２８Ｓピーク面積の和を含んでなり、第２の変数はサンプルのＲＮＡ濃度を含んでなる。これは、「（１８Ｓ＋２８Ｓ）対、（濃度）」という表現で表すことができる。
【０３２０】
別の実施形態では、第１の変数は１８Ｓピーク高さと２８Ｓピーク高さの和を含んでなり、第２の変数はサンプルのＲＮＡ濃度を含んでなる。これは、「（１８Ｓピーク高さ＋２８Ｓピーク高さ）対、（濃度）」という表現で表すことができる。
【０３２１】
濃度は、いくつかの他の特徴と組み合わせた場合に良好な判別能を示すことが分かっているので、二特徴分析における一方の特徴として使用することができることに留意すべきである。この濃度はサンプル中のＲＮＡ濃度であり、様々な技術を用いて決定することができる。例えば、エレクトロフェログラムがＢｉｏａｇｉｌｅｎｔシステムのようなシステムによって作成される実施形態では、ＲＮＡ濃度は、エレクトロフェログラムから得ることのできる測定値を用いて決定することができる。一例では、ＲＮＡ濃度は、既知量の既知の標準、例えばマーカーまたはラダーと比較することによって決定することができる。例えば、標準またはラダーバンド中のＲＮＡの量を全マーカーの曲線下面積で割る。次に、各サンプルの総面積にこの値を掛けて、各サンプルに関するＲＮＡ濃度を得ることができる。
【０３２２】
別の実施形態では、第１の変数は１８Ｓピーク高さと２８Ｓピーク高さの和を含んでなり、第２の変数は中間面積を含んでなる。これは、「（１８Ｓピーク高さ＋２８Ｓピーク高さ）対、（中間）」という表現で表すことができる。
【０３２３】
別の実施形態では、第１の変数は１８Ｓピーク高さと２８Ｓピーク高さの和を含んでなり、第２の変数は低Ｃバンド領域面積を含んでなる。これは、「（１８Ｓピーク高さ＋２８Ｓピーク高さ）対、低Ｃ」という表現で表すことができる。
【０３２４】
別の実施形態では、第１の変数は１８Ｓピーク幅と２８Ｓピーク幅の和を含んでなり、第２の変数は１８Ｓピーク面積と２８Ｓピーク面積の和を含んでなり、これは「（１８Ｓピーク幅＋２８Ｓピーク幅）対、（１８Ｓ＋２８Ｓ）」という表現で表すことができる。
【０３２５】
表９は、各特徴セット中の少なくとも１つの特徴を含んでなる三次元特徴セットを、方法１００および４００を用いてＭＡ２２データセットで評価した場合のＡＵＣ値を示すこの場合、様々な三次元特徴セットに関する値を計算し、応答者と不応答者間の判別のために様々な三次元閾値ゾーンと比較した（すなわち、これらの閾値ゾーンは面で定義される）。
【０３２６】
【表９】
0006279549.tif 000011
【０３２７】
三次元特徴セットは、最良の二次元特徴セット組合せに基づいて分析向けに選択した。第１の特徴が（１８Ｓピーク面積＋２８Ｓピーク面積）を含んでなり、第２の特徴セットが（１８Ｓピーク幅＋２８Ｓピーク幅）を含んでなり、第３の特徴セットが低ｃ面積を含んでなる三次元特徴セットは、サンプル試験に基づけば、最高のＡＵＣを有することが分かった。また、三次元特徴セットの使用はデータの拡散を高め、これが応答者と不応答者間の判別をより容易にすることも分かった。
【０３２８】
よって、一実施形態では、三次元特徴セットは、不応答者から応答者を判別するために使用されるＲＤＡ座標をグラフ化するために、各特徴セットを表す３つの直交変数を用いた三次元プロットで使用される。これらの変数の１つは第１の特徴セットにより定義され、もう１つの変数は第２の特徴セットにより定義され、第３の変数は第３の特徴セットにより定義される。これらの変数は、図１５Ａ〜１５Ｄに関して記載されるように、ＬＤＡまたはＱＤＡを用いて組み合わせてもよい。第１の変数は１８Ｓピーク面積と２８Ｓピーク面積の和を含んでなり、第一軸に関連付けられる。第２の変数は、１８Ｓピーク高さと２８Ｓピーク高さの和を含んでなり、第二軸に関連付けられる。第３の変数は、低Ｃバンド面積を含んでなり、第三軸に関連付けられる。これは、「（１８Ｓ＋２８Ｓ）対、（１８Ｓピーク高さ＋２８Ｓピーク高さ）対、低Ｃバンド面積」という表現で表すことができる。
【０３２９】
別の実施形態では、第１の変数は、１８Ｓピーク面積と２８Ｓピーク面積の和を含んでなり、第一軸に関連付けられる。第２の変数は、１８Ｓピーク高さと２８Ｓピーク高さの和を含んでなり、第二軸に関連付けられる。第３の変数は、１８Ｓピーク幅と２８Ｓピーク幅の和を含んでなり、第三軸に関連付けられる。これは、「（１８Ｓ＋２８Ｓ）対、（１８Ｓピーク高さ＋２８Ｓピーク高さ）対、（１８Ｓピーク幅＋２８Ｓピーク幅）」という表現で表すことができる。
【０３３０】
別の実施形態では、第１の変数は、１８Ｓピーク面積と２８Ｓピーク面積の和を含んでなり、第一軸に関連付けられる。第２の変数は、１８Ｓピーク高さと２８Ｓピーク高さの和を含んでなり、第二軸に関連付けられる。第３の変数は、中間面積を含んでなり、第三軸に関連付けられる。これは、「（１８Ｓ＋２８Ｓ）対、（１８Ｓピーク高さ＋２８Ｓピーク高さ）対、中間面積」という表現で表すことができる。
【０３３１】
別の実施形態では、第１の変数は、１８Ｓピーク面積と２８Ｓピーク面積の和を含んでなり、第一軸に関連付けられる。第２の変数は、１８Ｓピーク幅と２８Ｓピーク幅の和を含んでなり、第二軸に関連付けられる。第３の変数は、低Ｃバンド面積を含んでなり、第三軸に関連付けられる。これは、「（１８Ｓ＋２８Ｓ）対、（１８Ｓピーク幅＋２８Ｓピーク幅）対、低Ｃバンド面積」という表現で表すことができる。
【０３３２】
実施例１４
以下の実施例は、特徴（１８Ｓピーク面積＋２８Ｓピーク面積）と（１８Ｓピーク幅＋２８Ｓピーク幅）の組合せを含んでなる特徴の選択されたセットに対するデータセットに関して選択閾値がどのように決定されるかを記載するが、これは単に例示目的で本明細書に示されるものである。この手順を、他の特徴または特徴の組合せを用いて繰り返すことができる。ＬＤＡまたはＱＤＡとともに使用される特徴セットは、低バンド領域、１８Ｓ領域、中間領域および２８Ｓ領域の面積である総面積に対して正規化されていることに留意すべきである。
【０３３３】
ここで図１５Ａを参照すると、ＭＡ２２治験からの種々の患者に関して、１８Ｓピーク面積＋２８Ｓピーク面積を表す第１の変数がｘ軸にプロットされ、１８Ｓピーク幅＋２８Ｓピーク幅を表す第２の変数がｙ軸にプロットされている。図１５Ａにおいて、丸「○」は応答者を表し、バツ「×」は不応答者を表す。
【０３３４】
各閾値に関して、分類法であるＬＤＡを用いて、第１の変数および第２の変数とともに使用可能な係数ならびにサンプルを２群（すなわち、応答者と不応答者）に分けるために使用可能な線を定義するための閾値に関して値を求めた。この線は式３を満たす。
ａ×（１８Ｓピーク面積＋２８Ｓピーク面積）＋ｂ（１８Ｓピーク幅＋２８Ｓピーク幅）−閾値＝０    （３）
式中、ａおよびｂはＬＤＡにより決定された係数の値である。
【０３３５】
一般に、式３は式４に書き換えることができることに留意すべきである。
ｙ＝ｋｘ＋ｂ      （４）
ここで、変数ｘおよびｙに対して１つの特徴または特徴の組合せが使用される。この例では、ｘは（１８Ｓ面積＋２８Ｓ面積）であり、ｙは（１８Ｓ幅＋２８Ｓ幅）である。パラメーターｋは、ＬＤＡにより決定される直線の傾きである。パラメーターｂは、直線の切片、すなわち、ｙ軸と直線の交点である。
【０３３６】
複数の閾値を用いて複数の直線を決定することができ（各閾値が１つの直線に関連付けられる）、これらの直線を用いて、２つの変数のプロット内にゾーンを作り出すことができる。例えば、２つの異なる閾値に関して２本の直線を決定し、２本の直線で患者を３つのゾーンに分けることができる。これは、図１５Ｂに示されるように、直線が互いに平行となるように行うこともできる。これらの直線の傾きはＬＤＡにより決定され、それは実際のデータサンプルならびに異なる変数に対して使用される特徴の組合せによって決まる。
【０３３７】
閾値を決定するために、多くの異なる閾値が１以上の予測手段または検出手段に関して評価される。例えば、各閾値に関して、ＬＤＡを用いて直線を作成することができ、次に、得られたゾーン内のサンプルを評価して、その閾値に関連する感度、特異度、陰性的中率、陽性的中率、偽陰性率および偽陽性率のうち少なくとも１つを決定することができる。その後、最良の判別値または予測値を有するものに基づいて閾値が選択される。例えば、閾値は、どの閾値が最良の陽性的中率および陰性的中率を有するかについて評価することができる。
【０３３８】
各患者に関して、ｘ変数およびｙ変数として選択された２つの特徴ならびにＬＤＡ分析により決定された傾きを用い、式３を用いて患者に関する特定の切片を決定し、患者に関するＬＤＡスコアとして使用することができる。
【０３３９】
例えば、ゾーン仕切線を定義するためにｙ切片として０．１と０．２が選択されると仮定する。次に、患者を、図１５Ｃに示されるように、３つのゾーンに分けることができる。上の直線は式ｙ＝−１．６ｘ＋０．２（または８ｘ＋５ｙ＝１）で与えられ、下の直線は式ｙ＝−１．６ｘ＋０．１（または８ｘ＋５ｙ＝０．５）で与えられる。ｘ軸およびｙ軸の変数はそれぞれ（１８Ｓピーク面積＋２８Ｓピーク面積）および（１８Ｓピーク幅＋２８Ｓピーク幅）である。
【０３４０】
下の直線の下でｘ軸の上、かつ、ｙ軸の右の領域をゾーン１と定義し、２９名の患者が存在し、そのうち６名が応答者である。上の直線と下の直線の間で、かつ、ｙ軸の右の領域はゾーン２を定義し、２２名の患者が存在し、そのうち２名が応答者である。上の直線の上、かつ、ｙ軸の右の領域はゾーン３を適宜死、３４名の患者が存在し、その総てが不応答者である。
【０３４１】
実施例１５
別の実施形態では、図１５Ｂおよび１５Ｃで行ったように、ＲＤＡゾーンを決定するためにＬＤＡを使用するのではなく、二次判別分析（ＱＤＡ）を用いて、予測に使用可能なゾーンのための仕切線を決定することができる。異なる閾値を用いると、ＱＤＡは、サンプルを様々な群に分けるための異なる曲線を与える。例えば、２つの閾値を用いると、２群は下式５を満たす。
ｃ１×（１８Ｓピーク面積＋２８Ｓピーク面積）２＋ｃ３×（１８Ｓピーク幅＋２８Ｓピーク幅）２＋ｃ２×（１８Ｓピーク面積＋２８Ｓピーク面積）×（１８Ｓピーク幅＋２８Ｓピーク幅）＋ａ１×（１８Ｓピーク面積＋２８Ｓピーク面積）＋ｂ１×（１８Ｓピーク幅＋２８Ｓピーク幅）−閾値＝０      （５）
式中、第１の変数は１８Ｓピーク面積＋２８Ｓピーク面積の特徴を表し、第２の変数は１８Ｓピーク幅＋２８Ｓピーク幅の特徴を表し、パラメーターａ１、ｂ１、ｃ１、ｃ２およびｃ３はＱＤＡにより決定される。
【０３４２】
式４は、図１５Ｄに示されるように、患者を３つのゾーンに分けることができる２つの同心円曲線を作成するために２つの閾値とともに使用することができる。この場合にも、丸「○」は応答者を表し、バツ「×」は不応答者を表す。適当な閾値は、ＬＤＡを用いて十全に説明したように決定することができ、すなわち、いくつかの閾値では、各閾値について感度、特異度、陰性的中率、陽性的中率、偽陰性率および偽陽性率の予測尺度を計算することができる。次に、最良の予測値が得られる望ましい閾値を選択することができる。
【０３４３】
３つの特徴の組合せでは、同じ分析を用い、ＬＤＡまたはＱＤＡのいずれかを用いてＲＤＡゾーンを決定することができる。
【０３４４】
別の実施形態では、他の技術を用いてＲＤＡゾーンを決定してもよいことに留意すべきである。例えば、もっと大きなデータセットが存在する場合に予測を行うために、限定されるものではないが、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ニューラルネットワーク、およびｋ近傍法アルゴリズム（ｋＮＮ）などの他の機械学習法を使用してもよい。
【０３４５】
実施例１６
ＲＤＩ
ＲＮＡ破壊指数（ＲＤＩ）は、本明細書に記載のＲＤＡアッセイのアウトプット、例えば、本明細書に記載の特徴の様々な組合せの少なくとも一部の比、または本明細書に記載の少なくとも２つの特徴セットのＬＤＡもしくは二次判別分析の結果に相当する値である。ゾーン２とゾーン３の間のカットオフ点はＰＰＶが最大となるように選択することができ、従って、ＭＡ２２データセット由来の大部分の応答者がゾーン３に位置することとなる。例えば、試験サンプルに基づいて使用されるＲＤＩ範囲は、約０．３〜１０（ゾーン１）、１０．１〜３５（ゾーン２）および３５．１超（ゾーン３）である。他の状況では、他のゾーンが存在してよい。例えば、断片化されたＲＮＡは、中間領域面積と低Ｃ領域面積の和により決定することができる。この指数を用い、例えば研究目的で、ＲＮＡ破壊の程度に関してサンプルを比較することができる。一定範囲のＲＤＩ値を捕捉する臨床ゾーンを確立することができ、この場合、臨床ゾーンは、カットオフ点（例えば、ゾーン１と２の間、かつゾーン２と３の間）により定義される。例えば、ゾーン１とゾーン２の間のカットオフ点は、ＮＰＶが０．９９となるＲＤＩ値に相当するように設定することができる。
【０３４６】
実施例１７
実施例６に記載のデータを、実施例１０に記載のピーク識別法４００を用いて再分析した。
【０３４７】
中間面積／（２８Ｓ＋１８Ｓ）および低Ｃ面積／（２８Ｓ＋１８Ｓ）の特徴の組合せのプロットを、方法４００を用いて作成したが、方法３００も使用可能である。
【０３４８】
低Ｃ面積／（２８Ｓ＋１８Ｓ）の比をドセタキセル用量に対してプロットした。小さな変化が８時間、２４時間、または４８時間に見られた。しかしながら、７２時間後では、サンプルに劇的な増加が見られた。２反復の実験は同様の結果を示した。
【０３４９】
比（中間面積＋低Ｃ面積）／（２８Ｓ＋１８Ｓ）の最大値をドセタキセル用量に対してプロットし、結果を図１６Ｂに示す。各値は単一のサンプルを表す。２反復の実験は同様の結果を示した。
【０３５０】
実施例１８
処置投与の前後の生検サンプルを、トラスツズマブによる術前補助療法を受けている患者から得た。ＲＮＡを単離し、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーを用いて分析した。方法１００および４００を用いてエレクトロフェログラムを分析し、最大ＲＤＩスコアを各時点の各腫瘍サンプルに対してグラフ化した。一部の患者で１サイクル目のトラスツズマブの後にＲＤＩ値が増大している（図１７Ａおよび図１７Ｂ）。
【０３５１】
生検サンプルを、ゾメタによる術前補助療を受けている患者から得た。ＲＮＡを単離し、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーを用いて分析した。方法１００および４００を用いてエレクトロフェログラムを分析し、最大ＲＤＩスコアを各時点の各腫瘍サンプルに対してグラフ化した。一部の患者で１サイクル目のゾメタの後にＲＤＩ値が増大している（図１７Ｃおよび図１７Ｄ）。
【０３５２】
実施例１９
図１８Ａ〜１８Ｆは、ＲＩＮアルゴリズムが低ＲＩＮまたは「ｎ／ａ」を与えるが、本明細書に記載されるように決定されたＲＤＩスコアがこれらのサンプルをより良く識別することができる、いくつかのサンプルを示す。図１８Ａ〜１８Ｆのエレクトフェログラムを療法中のＭＡ２２データから取得した。図１８Ａ〜１８Ｆはまた、異なるパターンを示すエレクトロフェログラムにおいてＲＩＮ値が同じであり得るが、ＲＤＩスコアはこれらのエレクトロフェログラム間を識別できると思われることも示す。ＲＤＩは、中間面積／（２８Ｓ面積＋１８Ｓ面積）の比または特徴の組合せを用いて計算した。
【０３５３】
図１９は、療法中のＭＡ２２サンプルにおいてＲＩＮとＲＤＩｗｐ比較したものである。ＲＮＡが無傷である場合には、ＲＩＮスコアおよびＲＤＩスコアは両方とも正確である。しかしながら、例えば薬物暴露によってひと度ＲＮＡが断片化されると、ＲＤＩの方が良好な尺度となる。ＲＤＩの決定に用いた特徴の組合せは中間面積／（２８Ｓ＋１８Ｓ）であった。
【０３５４】
実施例２０
バイオマーカーにとっての、長期乳癌化学療法有効性を正確に評価する必要性は十分に確立され、特にトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）に必要とされている。これまでのところ、提供されたほとんどのｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断検査は、ホルモン受容体陽性患者に限定されていた。本明細書に記載のＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）は、術前化学療法を受けている患者のための、処置中の薬物有効性の評価を可能とする、新規な予後検査である。ＲＤＡは、局所進行性乳癌を有する女性のＣＡＮ−ＮＣＩＣ−ＣＴＧ  ＭＡ−２２臨床試験に関連して開発された。種々の用量のドセタキセルおよびエピルビシンが２週間隔（ドーズデンス）または３週間隔で与えられた。腫瘍から療法前、療法中および療法後の３時点において２回ずつ生検を採った。治験エンドポイントは、臨床応答、病理学的完全応答（ｐＣＲ）、無病生存期間および全生存期間を含んだ。
【０３５５】
ＲＤＡは、療法中にリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）破壊の程度により測定されるＲＮＡ品質を評価するために作成されるＲＮＡエレクトロフェログラム分析に基づく。ｒＲＮＡ破壊は、本明細書に記載の、例えば、図５Ａおよび５Ｂまたは１２Ａに記載の方法によって定量され、その後、ＲＮＡ破壊の程度に対応する３ゾーンを有するＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）スコアに階層化される。ゾーン３のＲＤＡスコアは、その後の病理学的完全応答の尤度の増大に関連付けられ、ゾーン２のＲＤＡスコアは、少なくとも部分応答の尤度の増大に関連付けられ、ゾーン１のＲＤＡスコアは、患者が長期化学療法利益を受ける見込みがあまりない、例えばＮＰＶ＞０．９８であることを示す。
【０３５６】
ＭＡ−２２治験の、３サイクル目または４サイクル目の化学療法の後に適用したところ、８５名のうち３４名の患者（４０％）がゾーン１のＲＤＡスコアを有する腫瘍を持っていた。
【０３５７】
続いて、腫瘍細胞株において、ｒＲＮＡ破壊がその後の腫瘍細胞死を直接導くこと、およびｒＲＮＡ破壊が細胞株タイプ、用量、および時間依存的であることが実証された。
【０３５８】
方法
８２名のＭＡ−２２患者からのパラフィン包埋、ホルマリン固定腫瘍を、療法前に、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）およびＨｅｒ２／ｎｅｕ（Ｈｅｒ２）発現状態に対する免疫組織化学によってサブタイプに分類した。
【０３５９】
ＲＤＡ、臨床応答データおよびｐＣＲ出現データを各患者に関して得、上記受容体の腫瘍発現状態とマッチさせた。ＲＤＡ決定に用いた特徴の組合せは中間面積／（２８Ｓ＋１８Ｓ）であった。次に、ＴＮＢＣ患者の腫瘍をＲＮＡ破壊に関して評価し（ＲＤＡゾーン１、２または３）、受容体陽性患者の同様のデータと比較した。同様の比較を、臨床応答（例えば、不応答／安定疾患、部分応答、または完全臨床応答）により患者を分類することにより行った。
【０３６０】
結果
トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）患者と受容体陽性患者の両方は、３つのＲＤＡゾーンのそれぞれに、また、臨床応答カテゴリーのそれぞれに腫瘍を有していた。ｐＣＲ応答率は、ＴＮＢＣ患者では２１名のうち３名（応答率１４％）、ＥＲ＋、Ｈｅｒ２−ｖｅ患者では４３名のうち０名（応答率０％）、ＥＲ＋、Ｈｅｒ２＋患者では６名中１名（応答率１７％）、およびＨｅｒ２＋患者では１２名のうち４名（応答率３３％）であった。８名のｐＣＲ応答者のうち６名はＲＤＡゾーン３内であり、２名はＲＤＡゾーン２内であった。臨床的には、８名のｐＣＲ応答者のうち６名は完全応答を示し、２名は部分応答を示した。安定疾患を示した３名のＴＮＢＣ臨床不応答者については、１名の患者は、ＲＤＡスコアがＲＤＡゾーン３であり、２番目の患者ではＲＤＡゾーン２であり、３番目の患者ではＲＤＡゾーン１であった。１８名の不応答者ＴＮＢＣ患者のうち７名はＲＤＡゾーン１であった。しかしながら、臨床的には、これらの患者のうち５名は部分応答を示し、１名は完全応答を示し、１名は安定疾患を示した。３名のＴＮＢＣ  ｐＣＲ応答者のうち２名は、ＲＤＡゾーン３内のＲＤＡスコアを示したが、臨床的には、１名が部分応答を示した。他のサブタイプでは、４４名のＥＲ＋、Ｈｅｒ２−ｖｅ患者のうち１２名はＲＤＡゾーン１であり、６名のＥｒ＋ｖｅ、Ｈｅｒ２＋ｖｅ患者のうち３名はＲＤＡゾーン１であり、１２名のＨｅｒ２＋ｖｅ患者のうち２名はＲＤＡゾーン１であった。定義的判定基準としてｐＣＲおよび非ｐＣＲを用い、ＲＤＡは完全応答の予測については臨床応答の場合と同等の予測能であったが、ｐＣＲ不応答の予測については遙かに優れていた。
【０３６１】
結論
ＴＮＢＣおよび局所進行性乳癌の他のサブタイプは両方とも、ＲＤＡは、臨床応答よりもｐＣＲ不応答者を遙かに良好に識別する。現在のところ、この試験に基づけば、ＲＤＡは、ＥＲ＋ｖｅ  Ｈｅｒ２−ｖｅ患者ではおよそ２８％であるのに対して、ＴＮＢＣ患者のおよそ３３％を不応答者と識別することができる。これらの結果は、応答誘導療法に対する試験としてのＲＤＡは、不応答性ＴＮＢＣ患者の部分集団を識別することができることを示し、これらの部分集団には別の療法が考慮され得る。
【０３６２】
実施例２１
化学療法薬を用いた腫瘍破壊の成功の１つの主要な障害は、抗癌剤に対する内因性または獲得耐性の存在である。本明細書では、腫瘍ＲＮＡ量および完全性における化学療法依存的変化がＡ２７８０卵巣癌細胞株を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでも証明できるか否かが評価される。同数の細胞を播種し、様々なドセタキセル濃度で処置し、細胞分裂、細胞ＲＮＡ含量、およびＲＮＡ完全性に及ぼす薬物の影響を決定した。低ドセタキセル濃度では、おそらく有糸分裂における細胞周期停止の前にｒＲＮＡ生産が増加するために、細胞当たりのＲＮＡ含量は増加した。しかしながら、高ドセタキセル濃度（≧０．１μＭ）では、細胞数および細胞ＲＩＮ値の用量および時間依存的減少が見られたが、中間面積／（２８Ｓ＋１８Ｓ）の特徴組合せに基づくＲＤＩは増加し、これにＲＮＡバンドパターンの劇的な変化（すなわち、ＲＮＡ破壊）が伴った。これは、２８Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡバンドとは明瞭に異なる新規な離散バンドの形成を含んだ。対照的に、ドセタキセル耐性Ａ２７８０ＤＸＬ細胞をドセタキセルで処置してもＲＮＡ破壊または細胞ＲＮＡ含量の変化は起こらなかった。これらの所見は、腫瘍細胞ＲＮＡ含量および完全性における化学療法依存的変化（本明細書に記載のＲＮＡ破壊アッセイまたはＲＤＡ技術を用いて測定）は、化学療法薬に対する細胞応答をモニタリングするため、また、薬物感受性腫瘍細胞と薬物耐性腫瘍細胞とをｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで識別するために効果的に使用できるという見解を支持する。
【０３６３】
実施例２２
結腸腺癌細胞ＬＳ１７４Ｔを受容体チロシンキナーゼ阻害剤であるスニチニブとともにインキュベートした。細胞からＲＮＡを単離し、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーを用いて分析した。ＲＮＡ破壊は５４ｍＭにて２４時間で明らかになる（図２０Ａ参照）。
【０３６４】
結腸腺癌細胞ＬＳ１７４ＴをＤＮＡ架橋剤であるマフォスファミドとともにインキュベートした。細胞からＲＮＡを単離し、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーを用いて分析した。ＲＮＡ破壊は４８．２ｍＭにて４８時間で明らかになる（図２０Ｂ参照）。
【０３６５】
結腸腺癌細胞ＳＷ４８０をＤＮＡ合成阻害剤であるエピルビシンとともにインキュベートした。細胞からＲＮＡを単離し、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーを用いて分析した。ＲＮＡ破壊は０．５ｍＭにて７２時間で明らかになる（図２０Ｃ参照）。
【０３６６】
ＬＤＡおよびＱＤＡ分析に使用される特徴の組合せまたは特徴セットに関する値を決定する上で方法３００または方法４００はいずれも使用可能であることに留意すべきである。
【０３６７】
本明細書に記載の出願者の教示は例示目的の様々な実施形態を伴うが、本出願人らの教示はこのような実施形態に限定されることは意図されない。それとは反対に本明細書に記載および例示される本出願者らの教示は、それらの実施形態から逸脱することなく、様々な代替、改変、および等価物を包含し、それらの一般範囲は添付の特許請求の範囲に定義される。
【０３６８】
総ての刊行物、特許および特許出願は、各個の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個々に引用することにより、その全内容が本明細書の開示の一部とされることが示される場合と同程度に、引用することによりそれらの全内容が本明細書の開示の一部とされる。特に、表または他所に示される、例えば、受託番号および／またはバイオマーカー配列（例えば、タンパク質および／または核酸）を含め、本明細書に示される各受託番号に関連する配列は、引用することによりその全内容が本明細書の開示の一部とされる。
【０３６９】
本明細書に引用される参照文献の出典
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図８Ｋ】
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【図８Ｌ】
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【図８Ｍ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
0006279549.tif 000049
【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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