(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養中の成人赤血球を調製する方法であって、
エキソビボ供給源から幹細胞または細胞系を得る工程、
該細胞を規定培地中で培養する工程、
該細胞を転写因子ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦで改変する工程、および
該細胞中の胎児グロビンを成人グロビンへと変換する工程、
を包含する、方法であって、該エキソビボ供給源は、臍帯血、人工多能性幹細胞、赤血球幹細胞、または赤血球生成細胞系から選択される、方法。
【請求項２】
成人グロビンの発現が誘導される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
成人β−グロビンの発現が増加し、および／または胎児γ−グロビンの発現が減少する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、改変前に胎児ヘモグロビンを発現する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、胎児表現型から成人表現型へと変換される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、細胞を除核するさらなる工程を包含し、ここで該細胞が人工多能性幹細胞から誘導される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、表面抗原ＣＤ３４を発現する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞をＢＣＬ１１Ａ、タギング形態のＥＫＬＦ、ＧＡＴＡ  １、ＦＯＧ  １、ＳＣＬ、ＳＯＸ６のうちの１つまたはそれより多くで改変する工程をさらに包含する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記培養培地が、血清、胎仔ウシ血清、インスリン、ヘパリン、トランスフェリンのうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記培地に、ＳＣＦ、ＥＰＯまたは鉄飽和トランスフェリンのうちの少なくとも１つが補充され得る、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法に従って調製された赤血球。
【請求項１２】
成人表現型を有し、除核され、かつ未改変細胞と比較してβ−グロビンの発現が増加するようにインビトロで改変された培養幹細胞から分化した、成人表現型の赤血球であって、該培養幹細胞は、臍帯血、人工多能性幹細胞、赤血球幹細胞、または赤血球生成細胞系に由来し、該成人表現型の赤血球が、該未改変細胞と比較して減少したγ−グロビンの発現を有し、該培養幹細胞が、転写因子ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦでコトランスフェクトすることにより改変されている、赤血球。
【請求項１３】
請求項１１または１２のいずれか一項に記載の赤血球および薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む、組成物。
【請求項１４】
請求項１１または１２に記載の赤血球または請求項１３に記載の組成物を備える、輸血パック。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬、輸血、および移植における診断用途および治療的用途のために、インビトロで成人赤血球を調製する方法に関連する。本発明はまた、その方法によって調製されたそのような細胞を含む血液組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
全血由来の赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）（ＲＢＣ）または赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）は、貧血のための救命治療として、および輸血のための適合血液の選択を可能にするために、患者血清に存在する同種抗体の特異性を検出および決定するための試薬として、医薬、輸血、および手術において広範囲に使用されている。現在、成人赤血球の主な供給源は、それらを成人血液ドナーによって提供された全血から単離することである。現在、特に珍しい血液型表現型を有する、およびより一般的に、患者の必要量が提供によって入手可能な血液を超える場合に、輸血のための血液の入手不足をカバーするために、成人表現型の培養細胞の代替供給の必要性が存在する。
【０００３】
全ての赤血球は、主な成分としてヘモグロビンを有する。ヘモグロビンは、呼吸のために必須である酸素運搬タンパク質である。ヘモグロビンＡ、ヘモグロビンＡ２、およびヘモグロビンＦを含む、ほとんどの型の通常ヘモグロビンは、４つのタンパク質サブユニットおよび４つのヘム補欠分子族から構成されるテトラマーである。成人ヘモグロビン（ＨｂＡ）は、２つのアルファサブユニットおよび２つのベータサブユニットから構成されるが、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）は、２つのアルファサブユニットおよび２つのガンマサブユニットから構成され、通常α２γ２と示す。胎児ヘモグロビンにおけるその存在のために、ガンマサブユニットは通常「胎児」ヘモグロビンサブユニットと呼ばれる。
【０００４】
胎児から成人ヘモグロビンへの移行は、誕生後最初の４〜６ヶ月の間に起こる。ＨｂＦは、ＨｂＡよりも高い酸素親和性を有し、そしてそのことは母親から胎児への酸素の移動を促進するので、この性質は子宮内の胎児に有利である。しかし、ＨｂＦ由来の酸素は、組織へより放出されにくいので、この性質は、成人においては最適でない。
【０００５】
第１１染色体上のヒトβ−グロビン遺伝子座は、胚性（ε）、胎児（ＧγおよびＡγ）、および成人（β）グロビン遺伝子を含み、それらは発生の間逐次発現する。その遺伝子座の上流の、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）として公知である、シス調節エレメントが、グロビン遺伝子の高レベル発現のために必須である［１−４］。ＬＣＲとグロビン遺伝子との相互作用は、長い範囲の相互作用、および活発に発現するグロビン遺伝子のプロモーターをＬＣＲと空間的に近くする染色体ループ形成によって達成される［５］。ＬＣＲは１度に１つの遺伝子だけをアップレギュレートし、グロビン遺伝子はお互いに、ＬＣＲとの相互作用に関して競合する、相互作用の１つの決定因子は、ＬＣＲから相対的な遺伝子距離である［６］。成人細胞において、胎児βグロビン遺伝子からより遠いβグロビン遺伝子への最終的なスイッチングは、胎児遺伝子のアクティブサイレンシングによって達成される［７−９］。この胎児グロビンから成人グロビンへのスイッチングは、その臨床的な重要性のために集中的な研究の対象となっており、そして現在まで成人細胞における反応性γ−グロビンの発現が、鎌状赤血球症およびβ−サラセミアのような異常β−ヘモグロビン症の重症度を寛解させる治療に、多くの仕事が焦点をあわせた。しかし、そのスイッチングを調節する分子メカニズムは、解明にはほど遠い。
【０００６】
輸血目的のためのインビトロにおけるＲＢＣの生成は、感染性因子のリスクが低い輸血製品の補充可能な供給を提供する可能性、ならびに複雑な同種免疫問題および珍しい血液型の製品の入手可能性を解決する可能性を有するので、そのような技術は、世界的に公共医療の大きな目的である。近年、インビトロで赤血球を生成するためのシステムの開発における進歩は、末梢血、臍帯血、およびヒト多能性幹細胞（胚性幹細胞（ＥＳＣ）、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））から単離された前駆細胞を用いて、急速に進歩した。
【０００７】
全ての前駆細胞供給源由来の細胞を、赤血球経路に分化するように効率的に誘導し得る。しかし、臍帯血から単離された前駆細胞は、末梢血から単離されたものよりもより高い増幅能力という明確な利点を有する［１０］。ＥＳＣおよびｉＰＳＣは、大きな体積のＲＢＣを生成するための前駆細胞の無尽蔵の供給源を提供する可能性、ならびに輸血目的のための同種および珍しい血液型製品の革新的な開発を促進する可能性を有する［１１、１２］。しかし、臍帯血、ＥＳＣおよびｉＰＳＣは、魅力的および現実的な治療可能性を提供するが、依然として未解決の１つのハードルは、γグロビン発現からβグロビン発現へのスイッチングを受ける赤芽球の分化の失敗であり、胎児グロビンを主に、またはそれのみを発現する赤血球を生じる。
【０００８】
末梢血由来の赤血球前駆細胞の限られた増殖能力は、インビトロ培養法によって得ることができる赤血球の数を制限し、そしてこの供給源から治療的な量の赤血球を産生する経済的実行可能性に大きな影響を与える。ドナーから得られる従来の赤血球製品は、異なる年齢の赤血球の混合物を含む。対照的に、培養赤血球は、全て発生期のものであり、そしておそらく末梢循環において同じ長期間生存する。規則的な輸血を必要とする患者（例えば鎌状赤血球症、サラセミア、骨髄異形成症候群を有する患者）は、反復する輸血による鉄の過負荷の結果として、臓器の損傷を患う。培養赤血球のインビボにおける寿命の増加のために、このタイプの患者に必要な輸血回数が減少し、そして従って鉄の過負荷の問題が改善されることが予期され得る。インビトロで生成された赤血球を用いることによって、ウイルス混入およびプリオンの存在のような、ドナー血液に関連するリスクを回避し得る。
【０００９】
ＷＯ２００７／０９５０６４は、ヒト胚性幹細胞から得られた赤血球細胞を開示し、それは培地で３０日間培養された場合、ＰＣＲによって決定されるように、成人および胎児ヘモグロビンをどちらも内因的に発現する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００７／０９５０６４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、この分野における困難のいくつかに取り組もうとする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によって、供給源から幹細胞または細胞系を得る工程、その細胞を規定の培地中で培養する工程、および当該細胞をインビトロにおいて１つまたはそれより多くの転写因子で改変して胎児グロビンを成人グロビンに変換する工程を含む、成人赤血球を調製する方法が提供される。
【００１３】
その方法は、成人β−グロビンの発現を増加させ得るかもしくは誘導し得る、および／または胎児γ−グロビンの発現を抑制し得る。
【００１４】
その得られる細胞は、胎児ヘモグロビンを発現し得る。
【００１５】
その方法はさらに、胎児表現型から成人表現型への細胞の変換を含み得る。
【００１６】
その方法は、細胞の除核の追加工程を有し得、ここでその細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはＥＳＣ細胞由来である。
【００１７】
その供給源から選択または単離された細胞は、表面抗原ＣＤ３４を発現し得る。その細胞を、１つまたはそれより多くの転写因子を発現するよう改変し得る。
【００１８】
その転写因子を、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ１１Ａの他のアイソフォーム、ＥＫＬＦ、タギング形態のＥＫＬＦ、ＧＡＴＡ１、ＦＯＧ１、ＳＣＬ、ＳＯＸ６およびそのあらゆるバリアントから選択し得る。その細胞を、臍帯血、人工多能性幹細胞、赤血球幹細胞（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、または赤血球生成（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｔｉｃ）細胞系から得ることができる。
【００１９】
１つの実施態様において、ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦの組み合わせを使用して、臍帯血由来細胞において胎児グロビンを成人グロビンへ変換する。
【００２０】
その細胞培養および改変を、インビトロで行い得る。
【００２１】
その培養培地は、血清、ウシ胎仔血清、インスリン、ヘパリン、トランスフェリンのうちの少なくとも１つを含む。その培地にさらに、ＳＣＦ、ＥＰＯ（エリスロポエチン）、または鉄飽和トランスフェリンのうちの少なくとも１つを補充し得る。
【００２２】
本発明のさらなる局面において、本方法によって調製した赤血球が提供される。
【００２３】
本発明の別の局面によれば、成人表現型を有し、除核され、かつ未改変の細胞と比較して増加したβ−グロビン発現を有するようにインビトロで改変された培養幹細胞から構成される、成人表現型を有する赤血球が提供される。
【００２４】
その赤血球はさらに、未改変細胞と比較して減少したγ−グロビン発現を有し得る。
【００２５】
その培養幹細胞を、転写因子ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦまたはその任意のバリアントでコトランスフェクトすることによって改変し得る。
【００２６】
本発明はさらに、本明細書中で記載されたように調製された赤血球、および薬学的に受容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む組成物を提供する。
【００２７】
本発明による赤血球を備える輸血パックも調製され得る。
【００２８】
その転写因子を、ＢＣＬ１１Ａ、（ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬおよび他のアイソフォーム）、ＥＫＬＦ、またはＨＡ−ＥＫＬＦのような改変またはタグ化バージョン、およびβ−グロビンの発現を増加させる、および／またはγ−グロビンの発現を抑制するという望ましい効果を有するその任意のバリアントから選択し得る。グロビンのスイッチングおよび赤血球成熟に関与する他の転写因子をまた、単独で、または例えばＧＡＴＡ１、ＦＯＧ１、ＳＣＬ−および他のものと組み合わせて使用し得る。特に、ＥＫＬＦおよびＢＣＬ１１Ａと相互作用する、または複合体を形成する他の転写因子、例えばＧＡＴＡ１、ＦＯＧ１、ＳＯＸ６。
【００２９】
その赤血球を、臍帯血、ｉＰＳＣ、またはＥＳＣおよびこれらの幹細胞供給源のいずれか由来の赤血球生成（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｔｉｃ）細胞系、およびこれらの供給源由来ではないが胎児グロビンを発現する赤血球生成（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｔｉｃ）細胞系、または任意の供給源由来の前駆細胞から得ることができる。好ましくは、細胞の供給源はヒト由来である。
【００３０】
本発明の別の局面によって、臍帯血細胞をＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦから選択される１つまたはそれより多くの転写因子で改変することを含む、赤血球においてβ−グロビンの発現を増加させる方法が提供される。
【００３１】
さらなる局面によって、未改変細胞と比較して、β−グロビンおよび成人表現型を有する赤血球で通常発現する他の赤血球タンパク質の発現が増加した改変赤血球を含む組成物が提供される。別の局面によれば、β−グロビンの発現が増加し、そしてγ−グロビンの発現が減少した改変赤血球が提供される。
【００３２】
プラスミド、ウイルス性もしくは他のベクター、または発現因子、ペプチド、ペプチド模倣物の添加を用いて、適切な遺伝子を細胞に挿入することによって細胞を改変して、胎児グロビンから成人グロビンへのスイッチングをし得る、および胎児表現型から成人表現型へ発達させ得る、そしてｉＰＳＣおよびＥＳＣの場合、成人表現型の除核赤血球の産生を促進し得る。
【００３３】
臍帯血、胚性幹細胞（ＥＳＣ）およびｉＰＳＣのような供給源由来の幹細胞から生成した赤芽球は、治療目的のためのインビトロにおけるＲＢＣの生成に関して、より高い増幅可能性ならびに同種および珍しい血液型の製品の革新的な開発の促進のような、末梢血幹細胞に対する多くの利点を有する。しかし、これらの細胞は、主に成人（β）グロビンではなく胎児（γ）グロビンを発現し、それらは異なる生化学的性質および分子的性質を有する。その細胞は、非胚性供給源由来であり得る。
【００３４】
培養ヒト赤血球の生成に臍帯血、ｉＰＳＣまたはＥＳＣ由来の幹細胞の増殖能力を利用するために、発明者らは、培養赤血球細胞において胎児ヘモグロビンから成人ヘモグロビンへのスイッチングを誘導するための条件を見出した。本発明は、ガンマグロビンからベータグロビンへのスイッチングを、胎児グロビンを発現する臍帯血前駆細胞、ｉＰＳＣまたはＥＳＣおよび赤血球生成（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｔｉｃ）細胞系（例えばＫ５６２細胞）由来の赤血球細胞の、２つの転写因子（ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦ（ＫＬＦ１））でのコトランスフェクションまたは共形質導入によって行い得ることを示す。ＥＫＬＦは、グロビン遺伝子に加えて、多くの赤血球遺伝子に影響を与える、赤血球成熟の重要な制御因子である（Ｔａｌｌａｃｋ  ＭＲ、Ｐｅｒｋｉｎｓ  ＡＣ、ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ  ２０１０；６２（１２）：８８６−８９０）。それによって本発明はまた、胎児表現型を発現する赤血球前駆細胞を、成人表現型へ変換する一般的な方法を提供する。
【００３５】
本発明者らは以前に、胎児グロビンを発現する赤血球生成（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｔｉｃ）細胞系（Ｋ５６２細胞）を、γグロビンからβ−グロビンへのスイッチング、β−グロビンの発現の誘導、および赤血球生成（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｔｉｃ）細胞の発達に必須であることが公知である転写因子ＥＫＬＦでトランスフェクトした。しかし、誘導されたβ−グロビンのレベルは、最小限であった。２番目の転写因子ＢＣＬ１１Ａは、より最近に、成人赤芽球における胎児γ−グロビンの抑制に必須であり、γ−グロビンからβ−グロビンへのスイッチングを促進することが示された。発明者らは、Ｋ５６２細胞を、ＥＫＬＦおよびＢＣＬ１１Ａの両方でコトランスフェクトし、そしてそれらは、組み合わせでβ−グロビン発現への確固としたスイッチングを誘導することを見出した。発明者らはまた、臍帯血由来の赤芽球を、ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬおよびＥＫＬＦでコトランスフェクトし、そしてβ−グロビンの発現の著明な増加を誘導した。
【００３６】
γ−グロビンからβ−グロビンへのスイッチングの調節に関与することが公知である、非常に少数の転写因子のうち、同定された２つの決定的なプレイヤーは、ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦである。
【００３７】
ＢＣＬ１１Ａは、ＨｂＦレベルの遺伝的関連研究から同定されたジンクフィンガー（ＺＦ）転写因子であり［１３−１６］、そしてヒトにおけるγ−グロビン発現の決定的な制御因子であることが示された［１７］。ＢＣＬ１１Ａの複数のバリアントが発現されるが、報告される３つの主な形態は、ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬ、ＢＣＬ１１Ａ−ＬおよびＢＣＬ１１Ａ−Ｓである［１７、１８］。全てのバリアントは、共通のエキソン１、２、および３およびエキソン４の一部を共有し、各形態において可変数のＺＦを生じる；エキソン４は、６個のＺＦをＢＣＬ１１Ａ−ＸＬに、３個をＢＣＬ１１Ａ−Ｌに、そして１個をＢＣＬ１１Ａ−Ｓに与え、これらはエキソン２によってコードされる単一のＺＦに全て付加される。それに加えて、ＢＣＬ１１Ａ−Ｌおよび−Ｓは、さらなるエキソン５を有し、それはＢＣＬ１１Ａ−ＸＬに存在しない。
【００３８】
ヒト赤芽球の発生分析は、ＢＣＬ１１Ａの全長形態は、成人細胞において活発に発現し、胎児細胞においてかなり低いレベルであり、そして原始的な赤芽球において欠如していることを示し［１７］、これらの細胞における胎児グロビン（ＨｂＦ）の発現と逆の関係である。成人赤血球細胞において、全長ＢＣＬ１１Ａは、ＬＣＲのＨＳ３およびＡγ−グロビンおよびδ−グロビン遺伝子の間の遺伝子間領域を含む、ヒトβ−グロビンクラスター内で、いくつかの別々の領域を占める［１７］。ＢＣＬ１１Ａはまた、これらの細胞において、ＮＵＲＤ抑制複合体の成分と会合している［１７］。ヒトの最終的な赤芽球におけるＢＣＬ１１Ａのノックダウンは、ＨｂＦの発現の増加［１７］およびγ遺伝子が優先的にＬＣＲと会合するようにβ−グロビン遺伝子座における３Ｄクロマチンループ形成の再配置を引き起こす［１９］。それに加えて、ＢＣＬ１１Ａノックアウトマウスへのヒトβ遺伝子座導入遺伝子の導入は、最終的な赤血球系統におけるγ−遺伝子の損なわれたサイレンシングを引き起こした［２０］。これらのデータは合わせて、γ−グロビンサイレンシングおよびＨｂＦグロビンから成人（ＨｂＡ）グロビンへの発生的なスイッチングの決定的なメディエーターとしてのＢＣＬ１１Ａの役割を支持する。よってＢＣＬ１１Ａは、異常β−ヘモグロビン症（ｈｅｍａｇｌｏｂｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）を有する患者において、ＨｂＦの再活性化の潜在的な標的を表す。確かに、そのような効果がＳＣＤトランスジェニックマウスにおいて最近実証され、それによってＢＣＬ１１Ａの不活性化が、ＨｂＦの誘導によって、ＳＣＤに関連する血液学的および病理学的な欠損を修正する［２１］。
【００３９】
ＥＫＬＦ（ＫＬＦ１）は、β−グロビン発現、最終的な赤血球生成、およびＨｂＦからＨｂＡへのスイッチングに必須の赤血球特異的転写因子である［２２−２４］。β−グロビン発現におけるＥＫＬＦの役割が、広範囲に研究された［２５］。ＥＫＬＦヌルマウスは、胎児肝臓赤血球生成中のβ−グロビン遺伝子発現の失敗のために、胎生期１４〜１５日目あたりに子宮内で死亡する［２２］。β−グロビンの発現はまた、ヒトβ遺伝子座導入遺伝子を含むＥＫＬＦヌルマウスにおいて存在しないが、一方γ−グロビンは増加する［２４］。同様に、成人赤芽球におけるＥＫＬＦのノックダウンは、γ−グロビン対β−グロビン比の増加を引き起こし、そしてＢＣＬ１１Ａの発現を顕著に抑制する［２６］。蓄積するデータは、ＥＫＬＦはまた、多くの他の赤血球遺伝子も制御し、そして従って赤血球生成において決定的および中心的な役割を果たすことを示す［２２、２７−３０］。
【００４０】
翻訳後修飾によって調節されて、ＥＫＬＦは、他のタンパク質および複合体との相互作用によって、クロマチンリモデリングおよび転写活性の両方を調節する［３１−３４］。ＥＫＬＦは、インビボで、ＬＣＲのＨＳ２およびＨＳ３と、およびβ−グロビン近位プロモーターと相互作用することが示された［３５］。ＥＫＬＦがβ−グロビン発現を調節する正確なメカニズムはまだ完全には解明されていないが、データは、ＥＫＬＦが、成人赤血球細胞においてβ−グロビン発現を引き起こす、ＬＣＲと近位β−グロビンプロモーターとの相互作用の促進において中心的な役割を果たすことを示す［３６］。よって、鎌状赤血球症およびβ−サラセミアを有する個体において、ＨｂＦを活性化する戦略として、ＥＫＬＦの標的化ノックダウンも提案された。
【００４１】
ＥＫＬＦおよびＢＣＬ１１Ａは、成人β様グロビンへのスイッチング、およびその発現に決定的であるので、本発明者らは、驚くべきことに、胎児グロビンを固有に発現する赤血球細胞は、これらの転写因子の発現が存在しない、または低減していることを見出した。２番目に、ＥＫＬＦまたはＢＣＬ１１Ａのいずれかのノックダウンは、胎児グロビンの同時増加を伴うグロビンスイッチングの逆転を引き起こし得るので、本発明者らは、驚くべきことに、胎児グロビンを固有に発現する細胞における、逆に誘導された、または増加したこれらの転写因子の発現は、成人グロビン発現へのスイッチングを誘導することを見出した。
【００４２】
産生された赤血球細胞は、成人グロビンではなく胎児グロビンを発現し、それは異なる生化学的性質を有するので、グロビンのスイッチングは、臍帯、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）および他の非成人造血幹細胞からの、ヒト赤血球の商業的製造の大きな障壁である。それに加えて、そのような幹細胞供給源由来の赤血球細胞は、より未熟な表現型を有し、成人ＲＢＣとはいくつかの細胞表面抗原の発現が異なり、そして不完全な、または低い除核率を有する。ＥＫＬＦおよびＢＣＬ１１Ａは両方とも、胎児（γ）グロビンから成人（β）グロビンへの発生スイッチング、および最終的な赤血球生成に必須であり、ＥＫＬＦは、細胞骨格タンパク質、膜タンパク質、および細胞周期調節に関与するものを含む、多くの必須の赤血球遺伝子を調節する。
【００４３】
上記の幹細胞供給源から生成された赤血球細胞の、ＥＫＬＦおよびＢＣＬ１１Ａによる形質導入は、γ−グロビンからβ−グロビンへのスイッチングを誘導することが示されており、そして産生された赤血球の、成人赤血球表現型への成熟を誘導し得る。これは、インビトロで低レベルの除核が観察される、ｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣからの赤血球の産生によって現在起きる大きな問題を解決する利点を有する。これらのハードルを克服することは、治療的および診断的適用のために、そのような成人表現型の培養改変赤血球の使用を可能にする。
【００４４】
本発明は、以下の実施例および付随する図面において、例証としてのみ説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、Ｋ５６２細胞におけるＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦの発現を示す。（Ａ）ＢＣＬ１１ＡバリアントＢＣＬ１１Ａ−ＸＬ、ＢＣＬ１１Ａ−Ｌ、およびＢＣＬ１１Ａ−Ｓの転写物を、ＰＣＲによって、Ｋ５６２細胞および末梢血前駆細胞から分化した赤芽球において比較した。ＢＣＬ１１Ａ−ＳおよびＢＣＬ１１Ａ−Ｌに関して２つのプライマーセットを用いた。（Ｂ）ＢＣＬ１１Ａ抗体でプローブした、Ｋ５６２細胞由来の２０μｇのタンパク質のウェスタンブロット。末梢血前駆細胞から分化した赤芽球由来の全タンパク質を、ポジティブコントロールとして使用した。（Ｃ）Ｋ５６２細胞およびポジティブコントロール（赤血球コントロール）としての培養９日目における末梢血由来赤芽球における、ＥＫＬＦ転写物（左側パネル）およびタンパク質（右側パネル）。膜をはがし、そしてタンパク質量のコントロールとして、チューブリンに対する抗体で再プローブした。
【図２Ａ】図２は、Ｋ５６２細胞のＥＫＬＦおよびＢＣＬ１１Ａによるトランスフェクションは、β−グロビンの発現を誘導することを示す。Ｋ５６２細胞を、５μｇのｐＣＤＮＡ３  Ｆｌａｇ−ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬ（Ｂ−ＸＬ）、５μｇのｐＢｐ  ＨＡ−ＥＫＬＦ（Ｅ）でトランスフェクトした、または５μｇの各プラスミドでコトランスフェクトした。トランスフェクションの２０時間後、細胞を回収した。（Ａ）ＢＣＬ１１ＡおよびＨＡ−タグ抗血清（ＥＫＬＦに対する）でプローブした、トランスフェクトおよびＫ５６２コントロール（Ｃｔｒｌ）細胞由来の全タンパク質のウェスタンブロット。（Ｂ）ｑＰＣＲによって分析した、トランスフェクト細胞およびＫ５６２コントロール細胞におけるβ−グロビンの転写物。相対的なβ−グロビン発現を、ＰＡＢＰＣ１の発現に対して標準化し、そしてＫ５６２コントロールに対して較正した。（Ｃ）β−グロビン抗体でプローブした、トランスフェクトおよびＫ５６２コントロール細胞由来の全タンパク質のウェスタンブロット。全てのウェスタンブロットをはがし、そしてタンパク質量のコントロールとしてチューブリンに対する抗体で再プローブした。
【図２Ｂ−Ｃ】図２は、Ｋ５６２細胞のＥＫＬＦおよびＢＣＬ１１Ａによるトランスフェクションは、β−グロビンの発現を誘導することを示す。Ｋ５６２細胞を、５μｇのｐＣＤＮＡ３  Ｆｌａｇ−ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬ（Ｂ−ＸＬ）、５μｇのｐＢｐ  ＨＡ−ＥＫＬＦ（Ｅ）でトランスフェクトした、または５μｇの各プラスミドでコトランスフェクトした。トランスフェクションの２０時間後、細胞を回収した。（Ａ）ＢＣＬ１１ＡおよびＨＡ−タグ抗血清（ＥＫＬＦに対する）でプローブした、トランスフェクトおよびＫ５６２コントロール（Ｃｔｒｌ）細胞由来の全タンパク質のウェスタンブロット。（Ｂ）ｑＰＣＲによって分析した、トランスフェクト細胞およびＫ５６２コントロール細胞におけるβ−グロビンの転写物。相対的なβ−グロビン発現を、ＰＡＢＰＣ１の発現に対して標準化し、そしてＫ５６２コントロールに対して較正した。（Ｃ）β−グロビン抗体でプローブした、トランスフェクトおよびＫ５６２コントロール細胞由来の全タンパク質のウェスタンブロット。全てのウェスタンブロットをはがし、そしてタンパク質量のコントロールとしてチューブリンに対する抗体で再プローブした。
【図３Ａ】図３は、β−グロビンの転写物レベルは、ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦの発現とパラレルであることを示す。Ｋ５６２細胞を、５μｇのｐＣＤＮＡ３  Ｆｌａｇ−ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬ（Ｂ−ＸＬ）および５μｇのｐＢｐ  ＨＡ−ＥＫＬＦ（Ｅ）でコトランスフェクトした。トランスフェクションの２４および４８時間後、細胞を回収した。（Ａ）トランスフェクションの２４および４８時間後における、コトランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール（Ｃｔｒｌ）細胞におけるＢＣＬ１１Ａ、ＥＫＬＦおよびβ−グロビンの転写物。培養７日目の、末梢血前駆細胞から分化した赤芽球を、ポジティブコントロール（Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  Ｃｔｒｌ）として使用した。ＥＫＬＦ転写物のＰＣＲ増幅のために、前向きプライマーをＨＡタグ領域内でデザインした。（Ｂ）ＢＣＬ１１ＡおよびＨＡ−タグ（ＥＫＬＦ抗血清に関して）でプローブした、コトランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール細胞由来の全タンパク質のウェスタンブロット。ブロットをはがし、そして添加量のコントロールとしてチューブリンに対する抗体で再プローブした。（Ｃ）ｑＰＣＲによって分析した、トランスフェクションの２４および４８時間後の、コトランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール細胞におけるβ−グロビン転写物のレベル。相対的なβ−グロビン発現を、ＰＡＢＰＣ１の発現に対して標準化し、そしてＫ５６２コントロールに対して較正した。（Ｄ）トランスフェクションの２４および４８時間後の、コトランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール細胞における、全βおよびγ−グロビンに対する比としての、βおよびγ−グロビン発現プロファイル。
【図３Ｂ】図３は、β−グロビンの転写物レベルは、ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦの発現とパラレルであることを示す。Ｋ５６２細胞を、５μｇのｐＣＤＮＡ３  Ｆｌａｇ−ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬ（Ｂ−ＸＬ）および５μｇのｐＢｐ  ＨＡ−ＥＫＬＦ（Ｅ）でコトランスフェクトした。トランスフェクションの２４および４８時間後、細胞を回収した。（Ａ）トランスフェクションの２４および４８時間後における、コトランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール（Ｃｔｒｌ）細胞におけるＢＣＬ１１Ａ、ＥＫＬＦおよびβ−グロビンの転写物。培養７日目の、末梢血前駆細胞から分化した赤芽球を、ポジティブコントロール（Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  Ｃｔｒｌ）として使用した。ＥＫＬＦ転写物のＰＣＲ増幅のために、前向きプライマーをＨＡタグ領域内でデザインした。（Ｂ）ＢＣＬ１１ＡおよびＨＡ−タグ（ＥＫＬＦ抗血清に関して）でプローブした、コトランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール細胞由来の全タンパク質のウェスタンブロット。ブロットをはがし、そして添加量のコントロールとしてチューブリンに対する抗体で再プローブした。（Ｃ）ｑＰＣＲによって分析した、トランスフェクションの２４および４８時間後の、コトランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール細胞におけるβ−グロビン転写物のレベル。相対的なβ−グロビン発現を、ＰＡＢＰＣ１の発現に対して標準化し、そしてＫ５６２コントロールに対して較正した。（Ｄ）トランスフェクションの２４および４８時間後の、コトランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール細胞における、全βおよびγ−グロビンに対する比としての、βおよびγ−グロビン発現プロファイル。
【図３Ｃ−Ｄ】図３は、β−グロビンの転写物レベルは、ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦの発現とパラレルであることを示す。Ｋ５６２細胞を、５μｇのｐＣＤＮＡ３  Ｆｌａｇ−ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬ（Ｂ−ＸＬ）および５μｇのｐＢｐ  ＨＡ−ＥＫＬＦ（Ｅ）でコトランスフェクトした。トランスフェクションの２４および４８時間後、細胞を回収した。（Ａ）トランスフェクションの２４および４８時間後における、コトランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール（Ｃｔｒｌ）細胞におけるＢＣＬ１１Ａ、ＥＫＬＦおよびβ−グロビンの転写物。培養７日目の、末梢血前駆細胞から分化した赤芽球を、ポジティブコントロール（Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  Ｃｔｒｌ）として使用した。ＥＫＬＦ転写物のＰＣＲ増幅のために、前向きプライマーをＨＡタグ領域内でデザインした。（Ｂ）ＢＣＬ１１ＡおよびＨＡ−タグ（ＥＫＬＦ抗血清に関して）でプローブした、コトランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール細胞由来の全タンパク質のウェスタンブロット。ブロットをはがし、そして添加量のコントロールとしてチューブリンに対する抗体で再プローブした。（Ｃ）ｑＰＣＲによって分析した、トランスフェクションの２４および４８時間後の、コトランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール細胞におけるβ−グロビン転写物のレベル。相対的なβ−グロビン発現を、ＰＡＢＰＣ１の発現に対して標準化し、そしてＫ５６２コントロールに対して較正した。（Ｄ）トランスフェクションの２４および４８時間後の、コトランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール細胞における、全βおよびγ−グロビンに対する比としての、βおよびγ−グロビン発現プロファイル。
【図４Ａ】図４は、ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦの増加したレベルによる、β−グロビン転写物のアップレギュレーションを示す。Ｋ５６２細胞を、１０μｇのｐＣＤＮＡ３  Ｆｌａｇ−ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬ（Ｂ−ＸＬ）または１０μｇのｐＢｐ  ＨＡ−ＥＫＬＦでトランスフェクトし（Ｅ）、または５μｇもしくは１０μｇの両プラスミドそれぞれでコトランスフェクトした。トランスフェクションの１７時間後に細胞を回収した。（Ａ）ＢＣＬ１１Ａ、ＨＡ−タグ（ＥＫＬＦに関して）、（Ｄ）β−グロビン抗血清および（Ｅ）チューブリンでプローブした、コトランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール（Ｃｔｒｌ）細胞由来の全タンパク質のウェスタンブロット。ブロットをはがし、そしてチューブリンに対する抗体で再プローブした。（Ｂ）ｑＰＣＲによって分析した、トランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール細胞におけるβ−グロビンの転写物。相対的なβ−グロビンの発現を、ＰＡＢＰＣ１の発現に対して標準化し、そしてＫ５６２コントロールに対して較正した。（Ｃ）コトランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール細胞における、全βおよびγ−グロビンに対する比としての、βおよびγ−グロビン発現プロファイル。
【図４Ｂ−Ｃ】図４は、ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦの増加したレベルによる、β−グロビン転写物のアップレギュレーションを示す。Ｋ５６２細胞を、１０μｇのｐＣＤＮＡ３  Ｆｌａｇ−ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬ（Ｂ−ＸＬ）または１０μｇのｐＢｐ  ＨＡ−ＥＫＬＦでトランスフェクトし（Ｅ）、または５μｇもしくは１０μｇの両プラスミドそれぞれでコトランスフェクトした。トランスフェクションの１７時間後に細胞を回収した。（Ａ）ＢＣＬ１１Ａ、ＨＡ−タグ（ＥＫＬＦに関して）、（Ｄ）β−グロビン抗血清および（Ｅ）チューブリンでプローブした、コトランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール（Ｃｔｒｌ）細胞由来の全タンパク質のウェスタンブロット。ブロットをはがし、そしてチューブリンに対する抗体で再プローブした。（Ｂ）ｑＰＣＲによって分析した、トランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール細胞におけるβ−グロビンの転写物。相対的なβ−グロビンの発現を、ＰＡＢＰＣ１の発現に対して標準化し、そしてＫ５６２コントロールに対して較正した。（Ｃ）コトランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール細胞における、全βおよびγ−グロビンに対する比としての、βおよびγ−グロビン発現プロファイル。
【図４Ｄ−Ｅ】図４は、ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦの増加したレベルによる、β−グロビン転写物のアップレギュレーションを示す。Ｋ５６２細胞を、１０μｇのｐＣＤＮＡ３  Ｆｌａｇ−ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬ（Ｂ−ＸＬ）または１０μｇのｐＢｐ  ＨＡ−ＥＫＬＦでトランスフェクトし（Ｅ）、または５μｇもしくは１０μｇの両プラスミドそれぞれでコトランスフェクトした。トランスフェクションの１７時間後に細胞を回収した。（Ａ）ＢＣＬ１１Ａ、ＨＡ−タグ（ＥＫＬＦに関して）、（Ｄ）β−グロビン抗血清および（Ｅ）チューブリンでプローブした、コトランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール（Ｃｔｒｌ）細胞由来の全タンパク質のウェスタンブロット。ブロットをはがし、そしてチューブリンに対する抗体で再プローブした。（Ｂ）ｑＰＣＲによって分析した、トランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール細胞におけるβ−グロビンの転写物。相対的なβ−グロビンの発現を、ＰＡＢＰＣ１の発現に対して標準化し、そしてＫ５６２コントロールに対して較正した。（Ｃ）コトランスフェクトした、およびＫ５６２コントロール細胞における、全βおよびγ−グロビンに対する比としての、βおよびγ−グロビン発現プロファイル。
【図５Ａ−Ｂ】図５は、臍帯血および末梢血ＲＢＣにおけるグロビンアイソフォーム、および臍帯血および末梢血前駆細胞から培養した赤芽球におけるＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦの発現を示す。（Ａ）成熟臍帯血および成人ＲＢＣにおけるグロビンアイソフォームを示すゲル。（Ｂ）ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦ抗血清でプローブした、６、８、および１１日目の臍帯血および末梢血由来赤芽球由来の全タンパク質のウェスタンブロット。ブロットをはがし、そしてタンパク質量のコントロールとしてチューブリンに対する抗体で再プローブした。（Ｃ）臍帯血（ＣＢ）および末梢血（ＰＢ）由来赤芽球のエキソビボ培養中に観察された細胞型％を示すグラフ。
【図５Ｃ】図５は、臍帯血および末梢血ＲＢＣにおけるグロビンアイソフォーム、および臍帯血および末梢血前駆細胞から培養した赤芽球におけるＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦの発現を示す。（Ａ）成熟臍帯血および成人ＲＢＣにおけるグロビンアイソフォームを示すゲル。（Ｂ）ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦ抗血清でプローブした、６、８、および１１日目の臍帯血および末梢血由来赤芽球由来の全タンパク質のウェスタンブロット。ブロットをはがし、そしてタンパク質量のコントロールとしてチューブリンに対する抗体で再プローブした。（Ｃ）臍帯血（ＣＢ）および末梢血（ＰＢ）由来赤芽球のエキソビボ培養中に観察された細胞型％を示すグラフ。
【図６Ａ】図６は、臍帯血由来赤芽球の、ＥＫＬＦおよびＢＣＬ１１Ａによるコトランスフェクションは、β−グロビンの発現を増加させることを示す。臍帯血前駆細胞から培養した赤芽球を、それぞれ５μｇのｐＣＤＮＡ３  Ｆｌａｇ−ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬ（Ｂ−ＸＬ）およびｐＢｐ  ＨＡ−ＥＫＬＦ（Ｅ）でコトランスフェクトした。トランスフェクションの１７時間後に細胞を回収した。（Ａ）ＢＣＬ１１ＡおよびＨＡ−タグ（ＥＫＬＦに関して）抗血清でプローブし、次いではがし、そしてβ−グロビン抗血清で再プローブした、コトランスフェクトした（ＢＸ−Ｌ：Ｅ）および偽（ＤＮＡ無し）トランスフェクトコントロール臍帯血由来赤芽球由来の全タンパク質のウェスタンブロット。そのブロットを再びはがし、そしてタンパク質量のコントロールとしてチューブリンに対する抗体で再プローブした。（Ｂ）ｑＰＣＲによって分析した、コトランスフェクトした細胞におけるβ−グロビンの転写物。相対的なβ−グロビンの発現を、ＰＡＢＰＣ１の発現に対して標準化し、そしてコントロール（ＤＮＡなし）トランスフェクト臍帯血細胞に対して較正した（ｎ＝２）。（Ｃ）チューブリン発現に対して標準化し、そして偽（ＤＮＡなし）トランスフェクトコントロール細胞に対して較正した、単独およびコトランスフェクト細胞における、相対的なβ−グロビンタンパク質発現（ｎ＝３）。
【図６Ｂ−Ｃ】図６は、臍帯血由来赤芽球の、ＥＫＬＦおよびＢＣＬ１１Ａによるコトランスフェクションは、β−グロビンの発現を増加させることを示す。臍帯血前駆細胞から培養した赤芽球を、それぞれ５μｇのｐＣＤＮＡ３  Ｆｌａｇ−ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬ（Ｂ−ＸＬ）およびｐＢｐ  ＨＡ−ＥＫＬＦ（Ｅ）でコトランスフェクトした。トランスフェクションの１７時間後に細胞を回収した。（Ａ）ＢＣＬ１１ＡおよびＨＡ−タグ（ＥＫＬＦに関して）抗血清でプローブし、次いではがし、そしてβ−グロビン抗血清で再プローブした、コトランスフェクトした（ＢＸ−Ｌ：Ｅ）および偽（ＤＮＡ無し）トランスフェクトコントロール臍帯血由来赤芽球由来の全タンパク質のウェスタンブロット。そのブロットを再びはがし、そしてタンパク質量のコントロールとしてチューブリンに対する抗体で再プローブした。（Ｂ）ｑＰＣＲによって分析した、コトランスフェクトした細胞におけるβ−グロビンの転写物。相対的なβ−グロビンの発現を、ＰＡＢＰＣ１の発現に対して標準化し、そしてコントロール（ＤＮＡなし）トランスフェクト臍帯血細胞に対して較正した（ｎ＝２）。（Ｃ）チューブリン発現に対して標準化し、そして偽（ＤＮＡなし）トランスフェクトコントロール細胞に対して較正した、単独およびコトランスフェクト細胞における、相対的なβ−グロビンタンパク質発現（ｎ＝３）。
【図７】図７は、ＥＫＬＦおよびＢＣＬ１１Ａ−ＸＬによる２重形質導入の４８時間後のＫ５６２細胞を示す。Ｋ５６２細胞を、レンチウイルス構築物ｐＸＬＧ３−ｍｃｈｅｒｒｙ−ＥＫＬＦおよびｐＸＬＧ３−ｅＧＦＰ−ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬで形質導入した。以下の共焦点画像は、ＥＫＬＦを発現する細胞を赤で示し（Ａ）、ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬを発現する細胞を緑で示し（Ｂ）、そしてＥＫＬＦおよびＢＣＬ１１Ａを両方発現する細胞を、オレンジ／黄色で示す（Ｃ）。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
方法
実施例１−プラスミド構築
野生型（ＷＴ）ＥＫＬＦ発現プラスミドｐＢａｂｅ  ｐｕｒｏ  ＨＡＩＩ  ＷＴ  ＥＫＬＦは、Ｂｅｌｉｎｄａ  Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ博士から親切に提供された。簡単には、全長ＥＫＬＦを、以下のプライマーを用いて増幅し：５’−ＧＡＴＴＡＣＧＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＧＧＣＣＣＡＣＡＧＣＣＧＡＧＡＣＣ−３’（配列番号１）および５’−ＧＡＴＡＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＴＴＣＡＴＧ−３’（配列番号２）、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、続いてｐＢａｂｅ  ｐｕｒｏ  ＨＡＩＩ（プラスミド１４７３８、Ａｄｄｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳ  Ｄｒ．Ａｄｒｉｅｎｎｅ  Ｃｏｘの研究室の好意）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。
【００４７】
ＢＣＬ１１Ａ発現プラスミドｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬ、ｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ＢＣＬ１１Ａ−ＬおよびｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ＢＣＬ１１Ａ−Ｓは、Ｐ．Ｔｕｃｋｅｒ博士およびＢａｅｃｋ−Ｓｅｕｎｇ  Ｌｅｅ博士（Ｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ）の親切な寄贈であった。
【００４８】
実施例２−細胞培養およびヌクレオフェクション
ＭｉｎｉＭａｃｓＴＭ  磁気ビーズ分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）を用いて臍帯血から単離したＣＤ３４＋細胞を、以前に記載された３段階赤血球培養法［３７］；３％（ｖ／ｖ）のＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ）、２％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＵＫ  Ｌｔｄ）、１０μｇ／ｍｌのインスリン（Ｓｉｇｍａ）、３Ｕ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ）、２００μｇ／ｍｌのトランスフェリン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＩＭＤＭ（Ｓｏｕｒｃｅ  ＢｉｏＳｃｉｎｅｃｅ）を用いて、エキソビボで５〜８日間培養した。第１段階において（０〜８日目）、これに１０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ（幹細胞因子）、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、および３Ｕ／ｍｌのＥＰＯ（エリスロポエチン）を；第２段階において（８〜１１日目）、１０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、３Ｕ／ｍｌのＥＰＯおよびさらに８００μｇ／ｍｌの鉄飽和トランスフェリンを、および最後の段階において（１１〜２０日目）、３Ｕ／ｍｌのＥＰＯ、およびさらなる８００μｇ／ｍｌの鉄飽和トランスフェリンを補充した。
【００４９】
Ｋ５６２細胞を、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、ＵＫ）から得て、そして１０％のウシ胎仔血清を加えたＬ−グルタミンを含むイスコフのダルベッコ改善培地において、２×１０５細胞／ｍｌで、培養中で維持した。
【００５０】
臍帯血細胞およびＫ５６２細胞を、Ａｍａｘａ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４＋  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｋｉｔ  およびＡｍａｘａ（登録商標）  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）  Ｋｉｔ  Ｖをそれぞれ有する、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（登録商標）システム（Ｌｏｎｚａ  Ｃｏｌｏｇｎｅ  ＡＧ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、製造会社のプロトコールに従ってトランスフェクトした。簡単には、各ヌクレオフェクション反応に関して、１．５−２×１０６細胞を、補充物を含む１００μｌのＡｍａｘａ（登録商標）  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）溶液に穏やかに再懸濁し、５〜１０μｇのＢＣＬ１１Ａおよび／または野生型ＥＫＬＦプラスミドＤＮＡと混合し、そして前もって決定したプログラムでパルスした（臍帯血細胞に関してはＵ−００８、およびＫ５６２細胞に関してはＴ−０１６）。トランスフェクトした細胞を、サンプルあたり２ｍｌ（最終的な容積）の培地を有する、１２穴プレートのウェルに移し、そして５％ＣＯ２加湿インキュベーターにおいて３７℃に維持した。
【００５１】
実施例３−標準および定量的ポリメラーゼ連鎖反応分析
最低で５×１０５細胞を、１×ハンクス緩衝化食塩水溶液（ＨＢＳＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で２回洗浄し、そしてＲＮＡ  Ｌａｔｅｒ中で凍結した。全ＲＮＡを抽出し、そして収量を定量した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ）を用いて、４００ｎｇのＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写した。ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦ発現を、標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって分析し、一方β−グロビンおよびγ−グロビンの遺伝子発現を、定量的（ｑ）ＰＣＲによって分析した。全ての方法は、以前に記載された［３８］。ＰＣＲおよびｑＰＣＲで使用する配列は、以下の通りである：
【００５２】
【化１】
0006363956.tif 000002
ｑＰＣＲ分析に関して、全ての標的遺伝子配列を、ＰＡＢＰＣ１に対して標準化し、そして図の凡例に示されるコントロールに対して較正した。
【００５３】
実施例４−ウェスタンブロット分析
細胞ペレットを１×ＨＢＳＳで２回洗浄し、次いで可溶化緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、１％のＴｒｉｔｏｎ、０．１％のＳＤＳ、１×完全プロテアーゼ阻害剤、および２ｍＭのＰＭＳＦ）中で１時間細胞全体を溶解し、続いて１２．５ＵのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録番号）ヌクレアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｄａｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で１時間処置することによって、トランスフェクトしたＫ５６２細胞および臍帯血細胞を、ウェスタンブロット分析のために調製した。ＢｉｏＲａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｄｙｅ試薬によって定量したタンパク質（３〜１５μｇ）を、８％、１２％、または１８％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離し、そしてＰＶＤＦ膜に移した。以下の抗体と最低１時間インキュベートすることによって、ＥＫＬＦ、ＢＣＬ１１Ａおよびβ−グロビンを検出した；ＨＡ．ＩＩ（１６Ｂ１２  Ｃｏｖａｎｃｅ、Ｃｒａｗｌｅｙ、ＵＫ）またはＥＫＬＦ（Ｈ−２１０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、Ｃｔｉｐ１（１４Ｂ５、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、およびＨｅｍｏｇｌｏｂｉｎβ（３７−８  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）。タンパク質のバンドを、ＢＩＯＲＡＤ  Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェアバージョン４．５．１を用いて定量した。
【００５４】
実施例５−レンチウイルスの調製および細胞形質導入
ＥＫＬＦおよびＢＣＬ１１Ａ−ＸＬコード領域をＰＣＲによって増幅し、そしてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ｐＸＬＧ３−ｅＧＦＰまたはｐＸＬＧ３−ｍｃｈｅｒｒｙレンチウイルスベクターに挿入した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて、構築物ｐＭＤＧ２（ウイルスコート）、ｐＣＭＶＲ８．９１（パッケージングタンパク質）およびｐＸＬＧ３−ｅＧＦＰ−ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬおよびｐＸＬＧ３−ｍｃｈｅｒｒｙ−ＥＫＬＦでトランスフェクトした。ＰＥＩ／ＤＮＡ溶液を、細胞と４時間インキュベートし、その後培地を交換した。４８時間後、ウイルスを含む培地をろ過し、そしてアリコートに分けた。赤血球細胞を、８μｇ／ｍｌのポリブレンを添加した１ｍｌのウイルスとインキュベートした。細胞を４８時間目に回収し、そして４％のパラホルムアルデヒドでポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたカバーガラスに固定し、そして共焦点顕微鏡を用いて画像化した。
【００５５】
結果
実施例６−Ｋ５６２細胞におけるＢＣＬ１１Ａの発現
ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬ、ＢＣＬ１１Ａ−ＬおよびＢＣＬ１１Ａ−Ｓの転写物の発現を、Ｋ５６２細胞、ＨｂＥおよびＨｂＦを発現するがＨｂＡは発現しない赤血球生成（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｔｉｃ）細胞系、およびポジティブコントロールとして培養９日目の末梢血ＣＤ３４＋細胞から培養した赤芽球において、各ＢＣＬ１１Ａバリアントに特異的なプライマーを用いたＰＣＲによって決定した。３つのＢＣＬ１１Ａバリアント全ての転写物を、赤芽球において検出したが、Ｋ５６２細胞においては転写物を検出しなかった（図１Ａ）。それに加えて、全長ＢＣＬ１１Ａタンパク質を、赤血球において容易に検出したが、Ｋ５６２細胞においてはＢＣＬ１１Ａタンパク質の全長または短いバリアントのどちらも検出されなかった（図１Ｂ）。Ｋ５６２細胞においてＫＬＦ−１の転写物が検出されたが、９日目の赤芽球と比較して低いレベルであり、しかしＫＬＦ−１タンパク質は検出されなかった（図１Ｃ）。従ってＫ５６２細胞は、ＥＫＬＦに関してヌルであると考えられる。従って、Ｋ５６２細胞におけるβ−グロビンの発現の欠如は、ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦの欠如と関連している。
【００５６】
実施例７−Ｋ５６２細胞のＥＫＬＦおよびＢＣＬ１１Ａ−ＸＬによるトランスフェクションは、β−グロビンの発現を誘導する
Ｋ５６２細胞を、ｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬ（ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬ；５μｇ）、ｐＢｐ  ＨＡ−ＥＫＬＦ（ＨＡ−ＥＫＬＦ；５μｇ）で一時的にトランスフェクトした、または両方のプラスミド（それぞれ５μｇ）でコトランスフェクトした。トランスフェクションの２０時間後、細胞を回収し、そしてＢＣＬ１１Ａ、ＥＫＬＦ、およびβ−グロビンの発現に関して分析した。ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬまたはＨＡ−ＥＫＬＦでトランスフェクトした細胞は、それぞれのタンパク質を発現し、コトランスフェクトした細胞は、両方のタンパク質を発現した（図２Ａ）。次いで単独またはコトランスフェクトした細胞におけるβ−グロビン転写物のレベルを、ｑＰＣＲによって分析した。ＢＣＬ１１Ａでトランスフェクトした細胞において、わずかなβ−グロビンの転写物が検出され、一方ＨＡ−ＥＫＬＦトランスフェクタントにおいて少しの増加（トランスフェクトしていないＫ５６２細胞の３倍）が検出された（図２Ｂ）。しかし、ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬおよびＨＡ−ＥＫＬＦでコトランスフェクションすると、β−グロビンの転写物レベルは、トランスフェクトしていない細胞と比較して１６８倍増加し（図２Ｂ）、β−グロビンタンパク質のレベルが著しく増加した（チューブリンに対して標準化し、そしてトランスフェクトしていないＫ５６２細胞と比較した場合７．９倍；図２Ｃ）。
【００５７】
実施例８−β−グロビンの発現は、ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦの発現レベルとパラレルである
β−グロビンの発現レベルが、トランスフェクション後の時間と共に増加するかどうかを決定するために、ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬおよびＨＡ−ＥＫＬＦ（それぞれ５μｇ）でコトランスフェクトしたＫ５６２細胞を、トランスフェクションの２４および４８時間後に、ＢＣＬ１１Ａ、ＥＫＬＦおよびβ−グロビンに関して分析した。トランスフェクション後、ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦの転写物およびタンパク質を容易に検出したが、そのレベルはトランスフェクション後２４および４８時間の間に減少した（図３ＡおよびＢ）。β−グロビンの発現は、再びトランスフェクトしていない細胞と比較してコトランスフェクトした細胞において著しく高かったが、転写レベルはトランスフェクション後２４から４８時間まで減少し、ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦのレベルの減少とパラレルであった（図３ＡおよびＣ）。それに加えて、γ対β−グロビン発現の比は、トランスフェクション後減少したが、トランスフェクション後２４時間と４８時間との間にわずかに増加した（図３Ｄ）。
【００５８】
従って、ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬおよびＥＫＬＦだけのコトランスフェクションは、明らかにこれらに細胞においてβ−グロビンの発現を誘導および調節するために十分である。
【００５９】
実施例９−Ｋ５６２細胞の増加した量のＢＣＬ１１Ａ−ＸＬおよびＥＫＬＦによるトランスフェクションは、β−グロビンの発現をさらに増強する
コトランスフェクトしたＫ５６２細胞において、β−グロビンの発現レベルを増加させる試みにおいて、我々は、トランスフェクションに使用するＤＮＡの量を、５μｇから１０μｇの各プラスミドに増加させた。我々はまた、トランスフェクション後異なる時間に転写レベルを比較し、そしてこの実施例において１７時間が最適であることを見出した（データは示していない）。より高い濃度のＤＮＡによるコトランスフェクションは、細胞におけるＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦのレベルを増加させた（図４Ａ）。Ｋ５６２細胞を、最初にＢＣＬ１１Ａ−ＸＬ（１０μｇ）またはＨＡ−ＥＫＬＦ（１０μｇ）でトランスフェクトし、そしてトランスフェクションの１７時間後に、ｑＰＣＲによってβ−グロビンの発現を分析した。ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬまたはＨＡ−ＥＫＬＦだけによるトランスフェクションは、トランスフェクトしていないＫ５６２細胞と比較して、β−グロビン転写物のレベルをそれぞれ５．９および７．５倍増加させた（図４Ｂ）。それぞれ５μｇのＢＣＬ１１Ａ−ＸＬおよびＨＡ−ＥＫＬＦによるコトランスフェクションは、β−グロビン転写物のレベルを３０５±１５６．９倍増加させた（ｎ＝２）（図４Ｂ）。しかし、それぞれ１０μｇのＢＣＬ１１Ａ−ＸＬおよびＨＡ−ＥＫＬＦによるコトランスフェクションは、β−グロビン転写物のレベルを、トランスフェクトしていないＫ５６２細胞と比較して、８８７±１４３倍（ｎ＝２）増加させた（図４Ｂ）。両方の濃度のＤＮＡによるトランスフェクション後、Ｋ５６２細胞においてベータグロビンタンパク質が検出された（図４Ａ）。γ−グロビン対β−グロビン発現の比は、ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬおよびＥＫＬＦによるコトランスフェクション時に再び減少したが、５μｇの各プラスミドと比較して、１０μｇによるトランスフェクション時に、その比における非常に小さい減少のみが検出された（図４Ｃ）。
【００６０】
ｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ＢＣＬ１１Ａ−ＬまたはｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ＢＣＬ１１Ａ−Ｓと、ＨＡ−ＥＫＬＦ（それぞれ１０μｇ）による細胞のコトランスフェクションは、ＥＫＬＦ単独でトランスフェクトした細胞と比較して、β−グロビンの発現レベルを増加させなかった（データは示していない）。
【００６１】
従ってＢＣＬ１１Ａ−ＸＬおよびＥＫＬＦはそれぞれ、β−グロビン発現の誘導に対して中程度の効果を有する。しかし、ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬおよびＥＫＬＦによるＫ５６２細胞のコトランスフェクションは、これらの細胞におけるβ−グロビン発現の誘導に確固とした効果を有する。
【００６２】
実施例１０−末梢血前駆細胞と比較した、臍帯血から分化した赤芽球におけるＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦの発現
臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞から分化した赤芽球は、通常の成人赤血球細胞と同様に主にＨｂＡ（約９４％）を発現する末梢血ＣＤ３４＋細胞から分化した赤芽球と対照的に、主にＨｂＦ（約６５％）を発現する。図５Ａは、臍帯ＲＢＣと比較して、成人ＲＢＣに存在するグロビンアイソフォームを示す。
【００６３】
臍帯血赤芽球のグロビン発現プロファイルを、成人赤血球細胞のものへスイッチングすることは、これらの細胞が良好な増幅能力を有し、そして従って輸血目的のためのＲＢＣを生成するためのインビトロシステムの魅力的な前駆細胞であるので、非常に望ましい目的である。
【００６４】
ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦのレベルは、そのグロビン発現プロファイルと一致して、末梢血ＣＤ３４＋細胞と比較して、臍帯血由来の赤芽球においてより低いことが示された。臍帯血および末梢血前駆細胞から培養した赤芽球におけるＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦのレベルを、特異的なＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦ抗血清によるウェスタンブロットによって、培養中の様々な時点で比較した。臍帯血赤芽球におけるＥＫＬＦのレベル（チューブリンコントロールに対して標準化した）は、末梢血赤芽球より、実験した全ての時点で、有意により低く、６、８、および１１日目でそれぞれ４１、１０、および２．５倍であった（図５Ｂ）。レベルの差は、１１日目までに顕著な、臍帯血由来細胞と比較した、末梢血における、増殖性プレプロおよびプロ正赤芽球の数の減少、および分化した赤芽球の増加と共に、２つの培養の間のシンクロニシティーが減少するにつれて小さくなった（図５Ｃ）。培養６および８日目の赤芽球におけるＢＣＬ１１Ａのレベルは、末梢血由来赤芽球と比較して、臍帯においてそれぞれ９および６倍低かった（図５Ｂ）。培養１１日目に、ＢＣＬ１１Ａのレベルは低下し、そして両方の細胞集団において極端に低かった。従って、ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦ両方のレベルは、末梢血由来赤芽球と比較して、臍帯血由来赤芽球において、一貫してより低く、それはこれらの細胞におけるγ対β−グロビンの発現比と関連している。
【００６５】
実施例１１−臍帯血由来赤芽球の、ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬおよびＥＫＬＦによるコトランスフェクションは、β−グロビンの発現を増加させる
臍帯血赤芽球においてＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦの発現を増加させることは、成人β−グロビンの発現を増加させることが見出された。
【００６６】
臍帯血前駆細胞から培養された赤芽球を、ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬおよびＨＡ−ＥＫＬＦでコトランスフェクトした。トランスフェクションプログラムは、有意な量の細胞死を引き起こした（約５０％）。しかし、トランスフェクション後、ＢＣＬ１１Ａタンパク質およびＨＡ−ＥＫＬＦタンパク質のレベルは、ＤＮＡの非存在下でヌクレオフェクションを行った細胞におけるものと比較して、著しく増加した（図６Ａ）。対応して、β−グロビン転写物のレベルが、４．９±１．３増加した（図６Ｂ；ｎ＝２）。我々はまた、コトランスフェクトした細胞と同様、ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬまたはＨＡ−ＫＬＦ−１だけでトランスフェクトした細胞において、β−グロビンタンパク質のレベルを分析した。ＢＣＬ１１ＡまたはＫＬＦ−１でトランスフェクトした細胞におけるβ−グロビンのレベル（チューブリンコントロールに対して標準化した）は、明らかな増加を示さなかった（コントロール細胞と比較してそれぞれ１．１±０．１４および１．２３±０．１８倍）。しかし、ＢＣＬ１１ＡおよびＫＬＦ−１でコトランスフェクトした細胞は、コントロール細胞と比較して、β−グロビンタンパク質レベルの５．１±２倍（ｎ＝３）の増加を示した（図６ＡおよびＣ）。
【００６７】
これらのデータは、明らかに、臍帯血由来赤芽球においてＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦの発現を増加させることは、β−グロビンの発現の有意な増加を引き起こすことを示す。得られたβ−グロビンの発現の増加は有意であり、β−グロビンｍＲＮＡの５倍の減少が、ＫＬＦ１ノックアウトで報告された［２２］。
【００６８】
実施例１２−ウイルス形質導入手順を用いた、ＥＫＬＦおよびＢＣＬ１１Ａの遺伝子の赤血球細胞への伝達
ＥＫＬＦおよびＢＣＬ１１Ａ両方の遺伝子を赤血球細胞へ伝達するための、より効率的なシステムを開発した。レンチウイルスｐＳＥＷ−ＧＦＰプラスミドを用いた、ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦ遺伝子両方のためのレンチウイルス構築物を作成した（バックボーンプラスミド、ウイルスパッケージングプラスミド、導入ベクタープラスミドおよび２９３Ｔ細胞は、Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙによって提供された）。そのアプローチの実行可能性を確認するために、赤血球生成（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｔｉｃ）細胞系、Ｋ５６２細胞を、レンチウイルス構築物ｐＸＬＧ３−ｍｃｈｅｒｒｙ−ＥＫＬＦ（図７Ａ）およびｐＸＬＧ３−ｅＧＦＰ−ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬ（図７Ｂ）で同時に形質導入した。形質導入効率は、慣用的に＞８０％であった。ＥＫＬＦおよびＢＣＬ１１Ａ共焦点画像のオーバーレイは、＞４０％のその転写因子の二重発現を示した（図７Ｃ）。
【００６９】
臍帯血赤芽球を、単離後５日目に、ＥＫＬＦ構築物およびＢＣＬ１１Ａ構築物で共形質導入した。ｑＰＣＲおよびウェスタンブロットによるグロビン発現の分析のために、８から９日目に細胞を単離した。
【００７０】
胎児起源である、臍帯血ＣＤ３４＋細胞から生成された赤芽球は、成人ＣＤ３４＋細胞から生成された赤芽球より固有に未熟であり、いくつかの細胞表面ＲＢＣ抗原の発現が異なり、例えば成人Ｉ抗原ではなくｉである。
【００７１】
二重形質導入プロトコールの後、細胞を赤血球経路に分化させ、そして形態学的特徴および除核に関して分析し、特異的抗血清のパネルを用いてフローサイトメトリーによってある範囲の細胞表面赤血球抗原に関して、および成人表現型の重要な尺度である酸素結合および放出を含む機能的性質に関してスクリーニングした。ＥＫＬＦおよびＢＣＬ１１Ａの誘導された発現は、臍帯血細胞の成人表現型への成熟を誘導し、そして除核を促進した。
【００７２】
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（項目１）
成人赤血球を調製する方法であって、
供給源から幹細胞または細胞系を得る工程、
該細胞を規定培地中で培養する工程、および
該細胞を少なくとも１つの転写因子で改変して、胎児グロビンを成人グロビンへと変換する工程
を包含する、方法。
（項目２）
成人グロビンの発現が誘導される、項目１に記載の方法。
（項目３）
成人β−グロビンの発現が増加し、そして／または胎児γ−グロビンの発現が減少する、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
得られる細胞が胎児ヘモグロビンを発現する、いずれかの先行項目に記載の方法。
（項目５）
前記細胞が、胎児表現型から成人表現型へと変換される、いずれかの先行項目に記載の方法。
（項目６）
前記方法が、細胞を除核するさらなる工程を包含し、ここで該細胞が人工多能性幹細胞から誘導される、いずれかの先行項目に記載の方法。
（項目７）
前記細胞が、表面抗原ＣＤ３４を発現する、いずれかの先行項目に記載の方法。
（項目８）
前記転写因子が、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ１１Ａの他のアイソフォーム、ＥＫＬＦ、タギング形態のＥＫＬＦ、ＧＡＴＡ  １、ＦＯＧ  １、ＳＣＬ、ＳＯＸ６およびそれらの任意のバリアントから選択される、いずれかの先行項目に記載の方法。
（項目９）
使用される前記転写因子が、ＢＣＬ１１ＡとＥＫＬＦとの組合せである、いずれかの先行項目に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞が、臍帯血、人工多能性幹細胞、赤血球生成幹細胞または赤血球生成細胞系から得られる、いずれかの先行項目に記載の方法。
（項目１１）
前記培養培地が、血清、胎仔ウシ血清、インスリン、ヘパリン、トランスフェリンのうちの少なくとも１つを含む、いずれかの先行項目に記載の方法。
（項目１２）
前記培地に、ＳＣＦ、ＥＰＯまたは鉄飽和トランスフェリンのうちの少なくとも１つが補充され得る、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法に従って調製された赤血球。
（項目１４）
成人表現型を有し、除核され、かつ未改変細胞と比較してβ−グロビンの発現が増加するようにインビトロで改変された培養幹細胞から構成される、成人表現型の赤血球。
（項目１５）
前記細胞が、前記未改変細胞と比較して減少したγ−グロビンの発現をさらに有する、項目１４に記載の赤血球。
（項目１６）
前記培養幹細胞が、転写因子ＢＣＬ１１ＡおよびＥＫＬＦまたはそれらの任意のバリアントでコトランスフェクトすることにより改変されている、項目１４または１５に記載の赤血球。
（項目１７）
項目１３〜１６のいずれか一項に記載の赤血球および薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む、組成物。
（項目１８）
項目１３〜１６のいずれか一項に記載の赤血球または項目１７に記載の組成物を備える、輸血パック。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ−Ｃ】
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【図４Ｄ−Ｅ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−Ｃ】
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【図７】
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【配列表】
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