(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容される賦形剤または担体、および
式（I）の二糖類の繰り返し単位を含む治療的有効量のヒアルロン酸誘導体であって、一部の式（I）の二糖単位が、独立して、式中Rが-C(O)-(C2-C4)-アルキルである式（II）の二糖類構造で置き換えられている、ヒアルロン酸誘導体、または薬学的に許容されるナトリウムもしくはカリウム塩、エステル、もしくはグルコシド
を含む、炎症を治療するための医薬組成物であって、
0006363119.tif 000033
0006363119.tif 000034
当該ヒアルロン酸誘導体が少なくとも約20kDaである分子量を有し、かつ
当該ヒアルロン酸誘導体が炎症性サイトカインの産生を減少させる、
前記医薬組成物。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸誘導体が架橋されている、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項３】
Rが-C(O)-(C3)-アルキルである、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記置き換えられた一部のN-アセチル基が少なくとも約10％である、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記置き換えられた一部のN-アセチル基が約20％から約80％の間である、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項６】
分子量が少なくとも約30kDaである、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項７】
分子量が約20kDaから約250kDaの間である、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項８】
(a)炎症
(b)炎症状態もしくは変性リウマチ状態
(c)胃腸の炎症状態
(d)歯茎もしくは歯周構造の炎症性疾患
(e)膀胱の炎症性疾患
(f)呼吸器の炎症性疾患
(g)アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、もしくは脳血管疾患に関連する炎症、または
(h)サイトカインの放出に関連する皮膚の炎症状態
の治療のための医薬組成物であって、
グルクロン酸およびN-アセチルグルコサミンを含む二糖類の繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体であって、一部のN-アセチルグルコサミンのN-アセチル基が独立して式-N-C(O)-(C2-C4)-アルキルである基で置き換えられ、かつ当該ヒアルロン酸誘導体が少なくとも約20kDaである分子量を有する、ヒアルロン酸誘導体、またはその薬学的に許容されるナトリウムもしくはカリウム塩、エステル、もしくはグルコシド
を含む、前記医薬組成物。
【請求項９】
前記炎症が、患者における炎症誘発性サイトカインの産生によるものである、請求項8記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記リウマチ状態が、関節リウマチ、乾癬性関節炎、慢性結節性痛風、急性痛風、強直性脊椎炎、結合組織病、脈管炎、または骨関節炎である、請求項8記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記の胃腸の炎症状態が、炎症性腸疾患、クローン病、または潰瘍性大腸炎である、請求項8記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記の歯茎または歯周構造の炎症性疾患が歯肉炎または炎症性歯周病である、請求項8記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記の膀胱の炎症性疾患が急性間質性膀胱炎または慢性間質性膀胱炎である、請求項8記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2013年3月14日に提出された米国仮出願第61/782,298号の優先権の恩典を主張し、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
分野
本開示は、ヒアルロン酸誘導体に関連し、特に、ヒアルロン酸のN-アセチル基が置換されている誘導体、ならびにそれに関連する方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
序論
ヒアルロナン（ヒアルロン酸）は、動物組織中に広く分布するグルコサミノグリカンであり、交互に繰り返す単糖単位であるN-アセチルグルコサミン（N-アセチル-2-アミドグルコース）およびグルクロン酸により構成されている。ヒアルロナンは、水和、細胞移動用マトリックスの提供、および関節の潤滑化を含む、複数の機能を有する。未変化のヒアルロナンは1,000kDaより大きい高分子量を有するが、低分子量の形態、例えば100〜150kDa、として存在することも可能である。商業的には、多くの場合、未変化のヒアルロナンは、雄鶏のとさかまたは微生物に由来する。高分子量ヒアルロナンは、高粘性であり、これは関節における潤滑剤の性質として重要である。しかしながら、1,000kDaを超えるヒアルロナンの大きさや、予想される折り畳み構造は、より小さい分子量の形態のものと比較して、細胞受容体に異なる物理化学的環境、および、別の相互作用するマトリックス高分子の構成を提供する。高分子量ヒアルロナンは、組織内で酵素的に分解され、より低い分子量の断片となると考えられている。
【０００４】
ヒトの自然免疫は、Toll様受容体もしくはTLRを介する。恒常的活性型のTLR4変異体はNF-κB活性を誘導することができ、従って炎症誘発性サイトカインの産生を増加させる（Medzhitov, R. et al. 1997, Nature 388:394（非特許文献1））。細菌性リポ多糖（LPS）が自然免疫系に認識されることにより、TNF、IL-1、IL-6、およびIL-8等のサイトカイン産生、ならびに、ICAM-1遺伝子活性化を特徴とする免疫反応が得られる（Lu Y.C. et al. Cytokine. 2008; 42:145-51（非特許文献2））。ヒアルロナンは、細胞膜受容体、CD44、および複数のマトリックスタンパク質、とりわけプロテオグリカンコアタンパク質のリンク領域と結合することができる。関節リウマチなど、一部の種類の炎症性関節炎において、CD44は上方制御されているとの報告がある。より小さい分子量のヒアルロナンは、CD44と相互作用することにより炎症性疾患に関与する細胞を活性化し、マトリックス分子に影響を与えることが可能であり、これは高分子量ヒアルロナンにおいては一般的でない（Horton MR. et al. J Biol Chem 1998 Vol. 273, No. 52, 35088-35094（非特許文献3））。慢性炎症状態においては複数のサイトカインが誘導され、高レベルを示す。これらのサイトカインに対するヒト化モノクローナル抗体は、慢性炎症状態に対して治療的に使用される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Medzhitov, R. et al. 1997, Nature 388:394
【非特許文献２】Lu Y.C. et al. Cytokine. 2008; 42:145-51
【非特許文献３】Horton MR. et al. J Biol Chem 1998 Vol. 273, No. 52, 35088-35094
【発明の概要】
【０００６】
概要
本開示は、ヒアルロン酸のN-アセチル基が除去または別のアシル基で置換されたヒアルロン酸誘導体に関する。従って、一つの態様においては、D-グルクロン酸およびN-アセチルグルコサミン部分を含む二糖類の繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体であって、一部の二糖類部分のN-アセチルグルコサミン部分のN-アセチル基（NHC(O)CH3）がそれぞれ独立して水素または式-N-C(O)-(C2-C20)-アルキル、-N-C(O)-(C2-C20)-アルケニル、もしくは-N-C(O)-(C2-C20)-アルキニルである基で置換され、かつ当該ヒアルロン酸誘導体の分子量が少なくとも約20kDaであるヒアルロン酸誘導体、またはその薬学的に許容される塩もしくはグルコシド、が含まれる。
【０００７】
別の態様において、ヒアルロン酸誘導体は、以下の構造
0006363119.tif 000002
を有する式（I）の二糖類の繰り返し単位を含み、
ここで、該ヒアルロン酸誘導体において一部の式（I）の二糖単位は式（II）
0006363119.tif 000003
の二糖単位で置換され（置き換えられ）、
式中、RはH、-C(O)-(C2-C20)-アルキル、-C(O)-(C2-C20)-アルケニル、または-C(O)-(C2-C20)-アルキニルである。
【０００８】
一つの態様において、本開示におけるヒアルロン酸誘導体における遊離ヒドロキシル基、遊離カルボキシル基、および／または遊離アミノ基（RがHの場合）が適切なクロスリンカーと反応して架橋されたヒアルロン酸誘導体を形成し、ここで、これら本開示のヒアルロン酸誘導体の一つ以上が架橋されて、ゲル化の様々な程度を有する架橋ポリマーを形成する。
【０００９】
別の態様において、RがHの場合、一部の式（II）の二糖単位は、式（III）の二糖単位で置換され、ここで、遊離アミン基（-NH2）は適切なクロスリンカーと反応して式（III）
0006363119.tif 000004
の構造を形成し、
式中、Xは適切なクロスリンカーである。
【００１０】
一つの態様において、クロスリンカーは生体適合性である。別の態様において、クロスリンカーは（1R,4aS,5,7aS-テトラヒドロ-1-ヒドロキシ-7-（ヒドロキシメチル）-シクロペンタ[c]ピラン-4-カルボン酸メチルエステル（ゲニピン））である。架橋反応は、例えば、ヒアルロン酸誘導体（RがHの場合）の遊離アミンと架橋剤（ゲニピン等）との間で生じて、ゲル化の様々な程度を有する架橋ヒアルロン酸誘導体ポリマーが得られる。このようなポリマーは、コラーゲンならびに他のマトリックスタンパク質および糖タンパク質などの結合組織成分と混和または更に架橋されて、異なる組成や生体力学的特徴を有するゲルを形成し得る。
【００１１】
一つの態様において、ヒアルロン酸誘導体は、式（I）
0006363119.tif 000005
の構造を有する二糖類の繰り返し単位を含み、
ここで、該ヒアルロン酸誘導体における一部の式（I）の二糖単位は式（II）
0006363119.tif 000006
の二糖単位で置換され、
式中、RはH、-C(O)-(C2-C20)-アルキル、-C(O)-(C2-C20)-アルケニル、または-C(O)-(C2-C20)-アルキニルであり、
かつ一部の式（II）の二糖単位が式（III）
0006363119.tif 000007
の二糖単位で置換され、
式中、Xは任意の適切なクロスリンカーである。
【００１２】
一つの態様において、架橋されたヒアルロン酸誘導体は、式（IV）
0006363119.tif 000008
の構造を有し、
式中、
0006363119.tif 000009
は、本開示のヒアルロン酸誘導体の式（I）、（II）および（III）の繰り返し二糖単位を示し、少なくとも一部または全ての式（III）の単位が別のヒアルロン酸誘導体と架橋されて式（IV)の架橋構造を形成する。
【００１３】
本開示のヒアルロン酸誘導体および架橋された誘導体は、炎症誘発性サイトカインの関与する状態の治療に有用である。例えば、当該誘導体は、炎症状態、変性リウマチ状態、胃腸の炎症状態、歯茎もしくは歯周構造の炎症性疾患、膀胱の炎症性疾患、呼吸器の炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、または脳血管疾患に関連する炎症、乾癬を含む皮膚の炎症状態、または敗血症性ショック等のサイトカインの大量放出に関連する疾患の治療に有用である。
【００１４】
別の態様において、単独、またはコラーゲンなど結合組織マトリックスのその他の分子との混合物としての架橋されたヒアルロン酸誘導体は、ゲル化や粘性の増加が追加のまたは回復に役立つ望ましい特性である状態の治療に有用である。その様な状態としては、例えば、骨病変または骨折の修復、軟骨またはその他関節内の病変または損傷、医学的または美容的理由による皮膚構成物質の損失などの老化の状態、またはドライアイなどの眼の状態、シェーグレン症候群、または硝子体剥離における硝子体の成分の回復、白内障発症、または角膜の疾患もしくは損傷、または眼水晶体の製造もしくは機能への追加が挙げられる。一つの態様において、架橋されたヒアルロン酸誘導体は、火傷を覆うため、または、整形外科や美容外科的処手術の植皮として、必要な大きさや幅のシートの形とすることができる。
【００１５】
[本発明1001]
グルクロン酸およびN-アセチルグルコサミンを含む二糖類の繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体であって、一部のN-アセチルグルコサミンのN-アセチル基が独立して水素または式-N-C(O)-(C2-C20)-アルキル、-N-C(O)-(C2-C20)-アルケニル、もしくは-N-C(O)-(C2-C20)-アルキニルである基で置換され、かつ当該ヒアルロン酸誘導体が少なくとも約20kDaである分子量を有する、ヒアルロン酸誘導体、またはその薬学的に許容される塩、エステル、もしくはグルコシド。
[本発明1002]
前記二糖類が式（I）
0006363119.tif 000010
の構造を有し、ヒアルロン酸誘導体における一部の式（I）の二糖単位が式（II）
0006363119.tif 000011
の二糖類構造で置換され、
式中、RがH、-C(O)-(C2-C20)-アルキル、-C(O)-(C2-C20)-アルケニル、または-C(O)-(C2-C20)-アルキニルである、
本発明1001のヒアルロン酸誘導体。
[本発明1003]
RがH、-C(O)-(C2-C16)-アルキル、-C(O)-(C2-C16)-アルケニル、または-C(O)-(C2-C16)-アルキニルである、本発明1002のヒアルロン酸誘導体。
[本発明1004]
RがH、-C(O)-(C2-C10)-アルキル、-C(O)-(C2-C10)-アルケニル、または-C(O)-(C2-C10)-アルキニルである、本発明1003のヒアルロン酸誘導体。
[本発明1005]
RがH、-C(O)-(C2-C6)-アルキル、-C(O)-(C2-C6)-アルケニル、または-C(O)-(C2-C6)-アルキニルである、本発明1004のヒアルロン酸誘導体。
[本発明1006]
RがHまたは-C(O)-(C2-C6)-アルキルである、本発明1005のヒアルロン酸誘導体。
[本発明1007]
RがHまたは-C(O)-(C2-C4)-アルキルである、本発明1006のヒアルロン酸誘導体。
[本発明1008]
RがHまたは-C(O)-(C4)-アルキルである、本発明1007のヒアルロン酸誘導体。
[本発明1009]
置換された一部のN-アセチル基が少なくとも約10％である、本発明1001から1008のいずれかのヒアルロン酸誘導体。
[本発明1010]
前記一部が少なくとも約20％である、本発明1009のヒアルロン酸誘導体。
[本発明1011]
置換された一部のN-アセチル基が約10％から100％の間である、本発明1001から1008のいずれかのヒアルロン酸誘導体。
[本発明1012]
前記一部が約20％から約80％の間である、本発明1009のヒアルロン酸誘導体。
[本発明1013]
少なくとも約25kDaである分子量を有する、本発明1001から1012のいずれかのヒアルロン酸誘導体。
[本発明1014]
分子量が少なくとも約30kDaである、本発明1013のヒアルロン酸誘導体。
[本発明1015]
約20kDaから約500kDaの間である分子量を有する、本発明1001から1014のいずれかのヒアルロン酸誘導体。
[本発明1016]
分子量が約20kDaから約250kDaの間である、本発明1013のヒアルロン酸誘導体。
[本発明1017]
適切なクロスリンカーにより架橋されている、本発明1001から1016のいずれかのヒアルロン酸誘導体。
[本発明1018]
前記適切なクロスリンカーがゲニピンである、本発明1017のヒアルロン酸誘導体。
[本発明1019]
ヒアルロン酸誘導体が、式（I）
0006363119.tif 000012
の構造を有する二糖類の繰り返し単位を含み、
該ヒアルロン酸誘導体における一部の式（I）の二糖単位が式（II）
0006363119.tif 000013
の二糖単位で置換され、
式中、RがH、-C(O)-(C2-C20)-アルキル、-C(O)-(C2-C20)-アルケニル、または-C(O)-(C2-C20)-アルキニルであり、
かつ一部の式（II）の二糖単位が式（III）
0006363119.tif 000014
の二糖単位で置換され、
式中、Xが任意の適切なクロスリンカーである、
本発明1001から1016のいずれかのヒアルロン酸誘導体。
[本発明1020]
式（IV）
0006363119.tif 000015
の構造を有し、
式中、
0006363119.tif 000016
が、本開示のヒアルロン酸誘導体の式（I）、（II）および（III）の繰り返す二糖単位を示し、少なくとも一部の式（III）の単位が別のヒアルロン酸誘導体と架橋することにより式（IV)の架橋構造を形成する、本発明1019のヒアルロン酸誘導体。
[本発明1021]
Xがゲニピンである、本発明1020のヒアルロン酸誘導体。
[本発明1022]
本発明1001から1021のいずれかのヒアルロン酸誘導体を、その必要のある患者に投与することを含む、炎症を治療するための方法。
[本発明1023]
前記炎症が、患者における炎症誘発性サイトカインの産生によるものである、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記炎症誘発性サイトカインがIL1-β、IL6、IL8、MCP1、およびTNF-αより選択される、本発明1023の方法。
[本発明1025]
本発明1001から1021のいずれかのヒアルロン酸誘導体を、その必要のある患者に投与することを含む、炎症状態または変性リウマチ状態を治療するための方法。
[本発明1026]
前記リウマチ状態が、関節リウマチ、乾癬性関節炎、慢性結節性痛風、急性痛風、強直性脊椎炎、結合組織病、脈管炎、または骨関節炎である、本発明1025の方法。
[本発明1027]
本発明1001から1021のいずれかのヒアルロン酸誘導体を、その必要のある患者に投与することを含む、胃腸の炎症状態を治療するための方法。
[本発明1028]
前記の胃腸の炎症状態が、炎症性腸疾患、クローン病、または潰瘍性大腸炎である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
本発明1001から1021のいずれかのヒアルロン酸誘導体を、その必要のある患者に投与することを含む、歯茎または歯周構造の炎症性疾患を治療するための方法。
[本発明1030]
前記の歯茎または歯周構造の炎症性疾患が歯肉炎または炎症性歯周病である、本発明1029の方法。
[本発明1031]
本発明1001から1021のいずれかのヒアルロン酸誘導体を、その必要のある患者に投与することを含む、膀胱の炎症性疾患を治療するための方法。
[本発明1032]
前記の膀胱の炎症性疾患が急性間質性膀胱炎または慢性間質性膀胱炎である、本発明1031の方法。
[本発明1033]
本発明1001から1021のいずれかのヒアルロン酸誘導体を、その必要のある患者に投与することを含む、呼吸器の炎症性疾患を治療するための方法。
[本発明1034]
前記の呼吸器の炎症性疾患が急性喘息、慢性喘息、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、または閉塞性細気管支炎性器質化肺炎である、本発明1033の方法。
[本発明1035]
本発明1001から1021のいずれかのヒアルロン酸誘導体を、その必要のある患者に投与することを含む、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、または脳血管疾患に関連する炎症を治療するための方法。
[本発明1036]
本発明1001から1021のいずれかのヒアルロン酸誘導体を、その必要のある患者に投与することを含む、サイトカインの放出に関連する疾患を治療するための方法。
[本発明1037]
前記疾患が敗血症性ショックである、本発明1036の方法。
[本発明1038]
本発明1020のヒアルロン酸誘導体を、その必要のある患者に投与することを含む、疾患を治療するための方法であって、該疾患または状態が骨病変または骨折の修復、軟骨またはその他関節内の病変または損傷、医学的または美容的理由による皮膚構成物質の損失などの老化の状態、またはドライアイなどの眼の状態、シェーグレン症候群、または硝子体剥離における硝子体の成分の回復、白内障発症、または角膜の疾患もしくは損傷、または眼水晶体の製造もしくは機能への追加である、前記方法。
[本発明1039]
火傷を覆うため、または植皮としての、本発明1020のヒアルロン酸誘導体の使用。
[本発明1040]
細胞を増殖させるための人工マトリックスとしての、本発明1020のヒアルロン酸誘導体の使用。
[本発明1041]
前記細胞が皮膚細胞または繊維芽細胞である、本発明1040の使用。
[本発明1042]
光学レンズ調製のための、本発明1020のヒアルロン酸誘導体の使用。
[本発明1043]
本発明1001から1021のいずれかのヒアルロン酸誘導体および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む医薬組成物。
本開示のその他の特徴および利点は、以下の詳細な記載から明らかになるであろう。詳細な説明および具体的な例は、本開示の好ましい態様を示すにすぎないことが理解されるべきである。この詳細な説明より、本開示の精神および範囲を逸脱することなく、種々の改変および変更がされ得ることが、当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
以下の図を参照することによって、本開示を更に詳細に説明する。
【００１７】
【図１】アセチル化ヒアルロン酸濃度を増加させた際のマクロファージ培養液の数値を示す棒グラフ。
【図２】本開示の化合物を添加した際のマクロファージ培養液の数値を示す棒グラフ。
【図３】本開示の化合物を添加した際のマクロファージ培養液の数値を示す棒グラフ。
【図４】IL-1-βの標準曲線を示すグラフ。
【図５】IL-1-β形成の用量反応をアセチル化ヒアルロン酸濃度と共に示す棒グラフ。
【図６】IL-6合成に対する本開示の化合物の効果を示す棒グラフ。
【図７】IL-8合成に対する本開示の化合物の効果を示す棒グラフ。
【図８】IL-8β合成に対する本開示の化合物の効果を示す棒グラフ。
【図９】MCP-1の形成に対する本開示の化合物の効果を示す棒グラフ。
【図１０】TNF-αの形成に対する本開示の化合物の効果を示す棒グラフ。
【図１１】IL-1βの形成に対する本開示の化合物の効果を示す棒グラフ。
【図１２】IL-6の形成に対する本開示の化合物の効果を示す棒グラフ。
【図１３】IL-8の形成に対する本開示の化合物の効果を示す棒グラフ。
【図１４】TNF-αの形成に対する本開示の化合物の効果を示す棒グラフ。
【図１５】様々なヒアルロン酸誘導体のアガロースゲル画像を示す。
【図１６】図16AおよびBは、ヒアルロン酸のヒドラジン分解およびNaOH消化により得られた誘導体の大きさを比較する二つのアガロースゲル画像を示す。
【図１７】HA誘導体によるIL-1βに対する刺激の度合いを示す。
【図１８】分子量の異なるHA誘導体によるIL-1βに対する刺激の度合いを示す。
【図１９】HAポリマーの再アシル化を表す1H-NMRスペクトルを示す。
【図２０】図20A、B、Cは、HA誘導体の細胞表面受容体の同定を示す。
【図２１】架橋されたヒアルロン酸誘導体のグルコサミンとウロン酸のモル比を示す。
【図２２】架橋されたヒアルロン酸誘導体の異なる濃度における弾性および粘性係数の変動を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
（I）定義
用語「ヒアルロン酸」または「ヒアルロナン」は、当技術分野において公知であり、本明細書においては、D-グルクロン酸などのグルクロン酸およびD-N-アセチルグルコサミンなどのN-アセチルグルコサミンから構成される二糖類の繰り返し単位により構成されるグリコサミノグリカンポリマーを意味する。
【００１９】
用語「誘導体」は、本明細書において使用される場合、親化合物と同じ基本炭素骨格および官能基性を含む物質でありながら、更に親化合物に対する一つ以上の置換基の追加または置換を有することが可能な物質を意味する。用語「誘導体」は、ヒアルロン酸の一部のN-アセチルグルコサミンのN-アセチル基が別のアシル基または水素で置換される化学修飾を含む。更に、誘導体という用語は、一部のN-アセチル基が再アセチル化された化合物も含む。他の誘導体としては、例えば、エステル誘導体および、一つの態様において、ヒアルロン酸の遊離ヒドロキシル基がエステル化された（メチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステル等）任意の化合物が挙げられる。
【００２０】
用語「架橋された」は、本明細書において使用される場合、二つ以上のヒアルロン酸誘導体が、適切な架橋化合物もしくは架橋剤またはクロスリンカーを介して分子間共有結合を形成していることを意味する。あるいは、同一のヒアルロン酸誘導体における複数部位の間において分子内架橋が起こる。架橋化合物は、ヒアルロン酸誘導体の遊離ヒドロキル基、遊離カルボキシル基、および／または、遊離アミノ基と反応することにより架橋されたヒアルロン酸誘導体を形成する。
【００２１】
用語「クロスリンカー」または「架橋化合物」または「架橋剤」は、本明細書において使用される場合、本開示に記載のとおり、ヒアルロン酸誘導体上の少なくとも2つの遊離ヒドロキル基、遊離カルボキシル基、および／または、遊離アミノ基と反応した後、2度目の反応を起こすことで架橋されたヒアルロン酸誘導体を形成することが可能な化合物を表す。クロスリンカーは、分子間反応により2つ以上の異なるヒアルロン酸誘導体を架橋することも、分子内反応により同一のヒアルロン酸誘導体における2つの異なる位置を架橋することも可能である。
【００２２】
用語「置換」または「置き換え」は、本明細書において使用される場合、ヒアルロン酸のN-アセチルグルコサミンのN-アセチル基が、示された基より選択されたものに置き換えられていることを意味する。
【００２３】
用語「一部」は、本明細書において使用される場合、別のアシル基または水素原子に置換されるか、クロスリンカーに結合している、N-アセチルグルコサミンのN-アセチル基の内の一部または割合を表す。例えば、1％から100％のN-アセチル基が置き換えられている。
【００２４】
本明細書において使用される用語「N-アセチル基」は、当技術分野において公知であり、N-アセチルグルコサミンのN-アセチル官能基を意味し、化学式-N-C(O)-CH3で表される。
【００２５】
用語「アルキル」は、本明細書において使用される場合、直鎖または分岐鎖の飽和アルキル基を表す。用語「(C2-Cn)-アルキル」とは、少なくとも2個から、「n」の値に応じて「n個」の炭素原子を有するアルキル基を意味する。例えば、(C2-C20)-アルキルは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の炭素原子を有するアルキル基を含み、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec-ブチル、イソブチル、などを含む。
【００２６】
用語「アルケニル」は、本明細書において使用される場合、単独または別の基の一部分として利用される場合でも、直鎖または分岐鎖の不飽和アルケニル基を意味する。用語「(C2-Cn)-アルケニル」とは、少なくとも2個から、「n」の値に応じて「n個」の炭素原子を有するアルケニル基を意味する。例えば、(C2-C20)-アルケニルは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の炭素原子を有するアルケニル基を含み、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、sec-ブテニル、イソブテニル、などを含む。
【００２７】
用語「アルキニル」は、本明細書において使用される場合、単独または別の基の一部分として利用される場合でも、直鎖または分岐鎖の不飽和アルキニル基を意味する。用語「(C2-Cn)-アルキニル」とは、少なくとも2つの炭素原子から、「n」の値に応じて「n個」の炭素原子を有するアルキニル基を意味する。例えば、(C2-C20)-アルキニルは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の炭素原子を有するアルキニル基を含み、エチニル、プロピニル、イソプロピニル、ブチニル、sec-ブチニル、イソブチニル、などを含む。
【００２８】
用語「薬学的に許容される塩」とは、例えば、本開示の化合物の所望の生物学的活性を維持し、かつ望ましくない毒性作用を与えない塩を表し、酸付加塩または塩基付加塩を意味し得る。
【００２９】
用語「酸付加塩」は、本明細書において使用される場合、任意の塩基性化合物の非毒性有機または無機塩を意味する。酸付加塩を形成する塩基化合物としては、例えば、アミンを含む化合物が挙げられる。例えば、酸付加塩は、本開示の任意の塩基化合物の非毒性のいかなる有機または無機塩をも含む。適切な塩を形成し得る無機酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、およびリン酸、ならびに、オルトリン酸一水素ナトリウムや硫酸水素カリウムなどの金属塩が挙げられるが、これらに限定されない。適切な塩を形成する有機酸には、モノ、ジ、およびトリカルボン酸が含まれるが、これらに限定されない。そのような酸の例としては、たとえば、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、安息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸、および、サリチル酸、ならびに、p-トルエンスルホン酸、およびメタンスルホン酸などのスルホン酸が挙げられる。一塩基酸または二塩基酸塩が形成されてもよく、このような塩は、水和もしくは溶媒和した形態、または実質的に無水の形態のどちらで存在してもよい。一般に、酸付加塩は、水および種々の親水性有機溶媒によりいっそう可溶性であり、通常、その遊離塩基の形態と比較して高い融点を示す。適切な塩の選択は、当業者ならばわかるであろう。
【００３０】
用語「塩基付加塩」は、本発明において使用される場合、任意の酸性化合物の非毒性有機または無機塩基付加塩のいかなるものも意味する。塩基付加塩を形成する酸性化合物としては、例えば、カルボン酸基を含む化合物が挙げられる。例えば、塩基付加塩は、本開示の任意の酸性化合物の非毒性の有機または無機塩いかなるものも含む。適切な塩を形成し得る無機塩基としては、水酸化リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、バリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。適切な塩を形成し得る有機塩基としては、メチルアミン、トリメチルアミン、ピコリンなどの、脂肪族、脂環式、または芳香族有機アミン、ならびに、アンモニアが挙げられるが、それらに限定されない。適切な塩の選択は、当業者ならばわかるであろう。
【００３１】
当業者ならば、本明細書中で提供される化合物のための追加の薬学的に許容される塩を認識するであろう。一般に、薬学的に許容される酸付加塩または塩基付加塩は、塩基性または酸性部分を含む親化合物より、任意の一般的な化学的方法により合成される。例えば、中性化合物を適切な溶媒中、酸または塩基で処理し、形成された塩を濾過、抽出、またはその他の任意の適切な方法により単離する。
【００３２】
本開示の態様において、本明細書中に記載の化合物は少なくとも一つの不斉中心を有する。これらの化合物は鏡像異性体として存在する。化合物が複数の不斉中心を有する場合、それらはジアステレオマーとして存在し得る。全てのその様な異性体や任意の比率を有するそれらの混合物は、本開示の範囲に含まれることが理解されるべきである。化合物の立体化学は、本明細書にリストされた任意の化合物に示された通りであってよく、それらの化合物は特定の量（例えば、20％未満、適切には10％未満、更に適切には5％未満）の他の立体化学を有する開示された化合物を含み得ることが、更に理解されるべきである。例えば、いかなる立体化学的指定も無く表示される本開示の化合物は、ラセミ体であると理解される（即ち、可能な鏡像異性体やジアステレオマーが各々同量含まれる）。しかし、全ての鏡像異性体およびジアステレオマーが本開示の範囲内に含まれ、いかなる比率を有するそれらの混合物も含まれると理解されるべきである。
【００３３】
用語「治療する」または「治療」等とは、本明細書において使用される場合、臨床結果を含む、有益または所望の結果を得るためのアプローチを表す。有益または所望の臨床結果としては、これらに限定されないが、一つ以上の症状または状態の軽減または緩和、疾患の程度の軽減、疾患の状態を安定化（即ち、悪化させない）、疾患発生の予防、病気の蔓延の阻止、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患の発症または進行の遅延または緩徐化、疾病状態の緩和または一時的な緩和、疾患再発率の減少、および（部分的または完全な）寛解を含み得、これらは検出可能であるかに関わらない。「治療する」または「治療」とは、治療を行わない場合に予想される対象の生存期間と比べて、対象の生存期間を延長することも意味し得る。「治療する」または「治療」とは、疾病進行の抑制、一時的な疾患進行の遅延、または永久的に疾患進行を阻止することも意味し得る。
【００３４】
用語「投与した」は、本明細書において使用される場合、治療的に有効な用量の本開示の化合物または組成物を対象へ投与したことを意味する。
【００３５】
用語「有効量」または「治療的有効量」は、本明細書において使用される場合、所望の結果を達成するために必要な期間および用量において有効な量を意味する。例えば、癌に罹患した対象を治療する場合において、有効量は、例えば、本開示の化合物を投与しない場合の腫瘍体積と比較して、腫瘍体積が低下する用量である。有効量は、疾病の状態、対象の年齢、性別、および／または、体重により変化し得る。そのような量に相当する特定の化合物の量は、特定の薬や化合物、医薬製剤、投与経路、状態の種類、疾病または疾患、治療を受ける対象の個性など、様々な要素に応じて変化するが、それにもかかわらず、当業者であれば日常的に決定することが可能である。
【００３６】
用語「対象」は、本明細書において使用される場合、哺乳動物を含む動物界に属する全ての生物を指し、適切には人を意味する。動物界に属する生物としては、これらに限定されないが、哺乳動物（ヒト、霊長類、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ科、ウマ、ラクダ、イヌ科、犬、ネコ科、ネコ、トラ、ヒョウ、レイビョウコウ、ミンク、胸白貂、フェレット、家で飼うペット、家畜、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、またはその他の齧歯動物、アザラシ、クジラ、等）、魚、両生動物、爬虫類、および、鳥類（水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、家禽類、ニワトリなど）が挙げられる。本開示の一態様において、対象は本開示の化合物または組成物を必要としている。
【００３７】
本開示の範囲を理解する上で、本明細書において用いる場合の用語「含むこと（comprising）」およびその派生語は、述べている特徴、要素、成分、基、整数、および/または段階の存在を指定するが、他の述べていない特徴、要素、成分、基、整数および/または段階の存在を除外しない、非限定的な用語である事が意図される。前述のことは、同様の意味を有する語、例えば用語「含むこと(including)」、「有すること(having)」およびそれらの派生語にもあてはまる。本明細書において用いる場合の用語「〜からなる（consisting）」およびその派生語は、述べている特徴、要素、成分、基、整数、および/または段階の存在を指定するが、他の述べていない特徴、要素、成分、基、整数および/または段階の存在を除外する、排他的な用語である事が意図される。本明細書において用いる場合の用語「本質的に〜からなる（consisting essentially of）」は、述べている特徴、要素、成分、基、整数、および/または段階、ならびに特徴、要素、成分、基、整数および/または段階の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を与えないものの存在を指定する事が意図される。
【００３８】
本明細書において用いる場合の「約」および「およそ」などの程度に関する用語は、最終結果を有意に変えないような、修飾される用語の妥当な偏差量を意味する。程度に関するこれらの用語は、修飾される用語の少なくとも±5％、または少なくとも±10％の偏差を、修飾する語の意味をこの偏差が否定しない場合、含むと解釈すべきである。
【００３９】
（II）本開示のヒアルロン酸誘導体
本開示は、ヒアルロン酸のN-アセチル基が除去または別のアシル基で置換されたヒアルロン酸誘導体に関する。従って、一つの態様においては、D-グルクロン酸およびD-N-アセチルグルコサミン部分を含む二糖単位の繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体であって、一部の二糖単位のD-N-アセチルグルコサミンのN-アセチル基が水素または式-N-C(O)-(C2-C20)-アルキル、-N-C(O)-(C2-C20)-アルケニル、もしくは-N-C(O)-(C2-C20)-アルキニル基で置換または置き換えられ、かつ当該ヒアルロン酸誘導体が少なくとも約20kDaである分子量を有する、ヒアルロン酸誘導体、またはその薬学的に許容される塩、エステル、もしくはグルコシドが含まれる。
【００４０】
一つの態様において、ヒアルロン酸誘導体の二糖類繰り返し単位は、式（I）
0006363119.tif 000017
の構造を有し、
ここで、該ヒアルロン酸誘導体において一部の式（I）の二糖単位は、式（II）
0006363119.tif 000018
の二糖類単位で置換または置き換えられ、
式中、RはH、-C(O)-(C2-C20)-アルキル、-C(O)-(C2-C20)-アルケニル、または-C(O)-(C2-C20)-アルキニルである。
【００４１】
一つの態様において、Rは、H、-C(O)-(C2-C16)-アルキル、-C(O)-(C2-C16)-アルケニル、または-C(O)-(C2-C16)-アルキニルである。別の態様において、Rは、H、-C(O)-(C2-C10)-アルキル、-C(O)-(C2-C10)-アルケニル、または-C(O)-(C2-C10)-アルキニルである。更なる態様において、Rは、H、-C(O)-(C2-C6)-アルキル、-C(O)-(C2-C6)-アルケニル、または-C(O)-(C2-C6)-アルキニルである。一つの態様において、Rは、Hまたは-C(O)-(C2-C6)-アルキルである。請求項6記載のヒアルロン酸誘導体は、RがHまたは-C(O)-(C2-C5)-アルキルである。別の態様において、Rは、H、-C(O)-プロピル、-C(O)-ブチル、-C(O)-ペンチル、-C(O)-イソペンチル、または-C(O)-ヘキシルである。
【００４２】
本開示の別の態様において、一部の置換されたN-アセチル基（または、式（II）の単位で置換された一部の式（I）の二糖単位）は、少なくとも約10％、または少なくとも約20％である。別の態様において、一部の置換されたN-アセチル基は、約10％から100％、または任意で約20％から約80％の間である。別の態様において、一部の置換されたN-アセチル基は、少なくとも約1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、または100％である。
【００４３】
別の態様において、本開示のヒアルロン酸誘導体の分子量は、一般に、親ヒアルロン酸と比較して低い。一般に、ヒアルロン酸の分子量は少なくとも約1,000kDaである。一つの態様において、本開示のヒアルロン酸誘導体の分子量は、少なくとも約25kDa、または、少なくとも約30kDaである。別の態様において、当該誘導体の分子量は、約20kDaから約500kDaの間、約20kDaから約250kDaの間、または、約50kDaから約250kDaの間である。
【００４４】
本開示の別の態様において、ヒアルロン酸誘導体は、再アセチル化された誘導体も含む。従って、一つの態様においては、D-グルクロン酸およびD-N-アセチルグルコサミンを含む二糖類の繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体であって、一部のD-N-アセチルグルコサミンのN-アセチル基がN-アセチル官能基性により置換され、かつ当該ヒアルロン酸誘導体が少なくとも約20kDaである分子量を有する、ヒアルロン酸誘導体、またはその薬学的に許容される塩、エステル、もしくはグルコシドが含まれる。
【００４５】
一つの態様において、本開示のヒアルロン酸誘導体における遊離ヒドロキシル基、遊離カルボキシル基、および／または遊離アミノ基（RがHの場合）は、適切なクロスリンカーと反応して架橋されたヒアルロン酸誘導体を形成し、ここで、これら本開示のヒアルロン酸誘導体の一つ以上が架橋されて、ゲル化の様々な程度を有する架橋ポリマーを形成する。
【００４６】
別の態様において、RがHの場合、一部の式（II）の二糖単位は、式（III）の二糖単位で置換され、ここで、遊離アミン基（-NH2）は適切なクロスリンカーと反応して式（III）
0006363119.tif 000019
の構造を形成し、
式中、Xは任意の適切なクロスリンカーである。
【００４７】
一つの態様において、クロスリンカーは生体適合性である。別の態様において、クロスリンカーは、ジビニルスルホン（DVS）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)(グルタルアルデヒド)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）、ポリ(エチレングリコール)ジグリシジルエーテル（EX810）、3,3¢-ジチオビス(プロパン酸ジヒドラジド)（DTPH）、1,3,5-ベンゼン(トリカルボン酸トリヒドラジド)、または、ポリ(エチレングリコール)-ジアミンテトラプロパン酸テトラヒドラジドである。別の態様において、クロスリンカーは、（1R,4aS,5,7aS-テトラヒドロ-1-ヒドロキシ-7-（ヒドロキシメチル）-シクロペンタ[c]ピラン-4-カルボン酸メチルエステル（ゲニピン））である。架橋反応は、例えば、ヒアルロン酸誘導体（RがHの場合）の上記遊離アミンとクロスリンカー（ゲニピン等）との間で生じて、ゲル化の様々な程度を有するヒアルロン誘導体ポリマーが得られる。このようなポリマーは、コラーゲンならびに他のマトリックスタンパク質および糖タンパク質などの結合組組織成分と混和または更に架橋してもよく、それにより、異なる組成や生体力学的特徴を有するゲルが形成される。
【００４８】
別の態様において、本開示のヒアルロン酸誘導体は、キトサンやコラーゲンなどの生体高分子、合成ポリマー、または生分解性ポリマーと架橋される。別の態様において、本開示のヒアルロン酸誘導体は、糖タンパク質、プロテオグリカン、タンパク質、ペプチド、または、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)と架橋される。
【００４９】
一つの態様において、ヒアルロン酸誘導体は、式（I）
0006363119.tif 000020
の構造を有する二糖類の繰り返し単位を含み、
ここで、該ヒアルロン酸誘導体における一部の式（I）の二糖単位は式（II）
0006363119.tif 000021
の二糖単位で置換されるかまたは置き換えられ、
式中、RはH、-C(O)-(C2-C20)-アルキル、-C(O)-(C2-C20)-アルケニル、または-C(O)-(C2-C20)-アルキニルであり、かつ一部の式（II）の二糖単位が式（III）
0006363119.tif 000022
の二糖単位で置換もしくは置き換えられ、
式中、Xは任意の適切なクロスリンカーである。
【００５０】
一つの態様において、ヒアルロン酸誘導体は、式（I）
0006363119.tif 000023
の構造を有する二糖類の繰り返し単位を含み、
ここで、該ヒアルロン酸誘導体における一部の式（I）の二糖単位は式（II）
0006363119.tif 000024
の二糖単位で置換されるかまたは置き換えられ、
式中、RはH、-C(O)-(C2-C20)-アルキル、-C(O)-(C2-C20)-アルケニル、または-C(O)-(C2-C20)-アルキニルであり、かつ一部の式（II）の二糖単位が式（III）
0006363119.tif 000025
の二糖単位で置換されるかまたは置き換えられ、
式中、Xは任意の適切なクロスリンカーであり、式（III）の二糖単位は架橋結合して、式（IV）
0006363119.tif 000026
の構造を形成する。
【００５１】
一つの態様において、架橋されたヒアルロン酸誘導体は、式（IV）
0006363119.tif 000027
の構造を有し、
式中、
0006363119.tif 000028
は、当該ヒアルロン酸誘導体の式（I）、（II）および（III）の繰り返し二糖単位を示し、少なくとも一部の式（III）の単位は、別のヒアルロン酸誘導体と架橋することにより式（IV)の架橋構造を形成する。
【００５２】
本開示の別の態様において、ヒアルロン酸誘導体は、本明細書に記載のヒアルロン酸誘導体および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む医薬品組成物として製剤化される。様々な態様において、医薬品組成物は一つ以上の本開示の化合物、ならびに一つ以上の非毒性の薬学的に許容される担体および／または希釈剤および／またはアジュバントおよび／または賦形剤、ならびに任意に治療薬を含む。
【００５３】
本開示のヒアルロン酸誘導体は、当該誘導体が溶解または懸濁される適切なビヒクルとの混合に適合している。当該誘導体は、水、塩類溶液、その他の薬学的に許容される溶媒に、単独で、または、適切な栄養素や抗生物質と組み合わせて、またはその他の医薬品と組み合わせて溶解してもよい。
【００５４】
一つの態様において、本開示のヒアルロン酸誘導体は、溶液または懸濁液において親ヒアルロナン（ヒアルロン酸）調製物と混和させることができ、有効成分が溶解または懸濁された適切なビヒクルとの混合に対応するようになる。親ヒアルロナンは、哺乳動物または細菌由来のものでも、合成されたものでもよい。
【００５５】
本開示のヒアルロン酸誘導体は、様々な投与経路により有効量および治療用量で動物に投与することができる。投与経路としては、これらに限定されないが、経口、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、関節内、経直腸、結腸浣腸による、口腔洗浄による、歯肉軟膏による、または膀胱内投与が挙げられる。本開示のヒアルロン酸誘導体は、食品または飼料と混合してもよく、または、有効成分が溶解または懸濁されている適切なビヒクル中に含有させて投与してもよい。溶液組成物は水溶液、塩類溶液、その他の溶媒単独で、または適切な栄養素、抗生物質、哺乳動物の病状などの状態に適した薬との組み合わせであってもよい。
【００５６】
本開示のヒアルロン酸誘導体は、経口投与されてもよく、例えば、不活性な希釈剤または吸収可能な食用の担体と共に、硬もしくは軟ゼラチンカプセル中に封入、錠剤の形態に圧縮、または食事の食品に直接含ませてもよい。経口治療投与のためには、当該誘導体は、賦形剤と合わされ、例えば、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、およびウェーハ剤の形態で使用され得る。経口投与形態には、放出が改良された即時放出型および除法性製剤も含まれる。放出改良型製剤としては、持続放出（SR）剤、持続放出性（ER、XR、またはXL）剤、徐放剤、制御放出（CR）剤、連続放出（CRまたはContin）剤などが挙げられ、例えばコーティング錠の形態で利用される。
【００５７】
また、本開示のヒアルロン酸誘導体は、非経口投与されてもよい。本開示の誘導体の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合された水において調製することができる。また、分散物をグリセロール、液体ポリエチレングリコール類、DMSO、およびその混合物中で調製することもでき、アルコールを含んでいてもよく、また更に油中で調製することもできる。通常の保存および使用条件下、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐため、保存料を含む。適切な製剤の調製方法は、当業者には公知であろう。
【００５８】
哺乳動物の慢性もしくは急性の炎症状態または退行性状態を治療する方法として、本開示のヒアルロン酸誘導体は、上記の任意の経路により哺乳動物に投与することを目的として天然のヒアルロナン（ヒアルロン酸）と混和してもよく、天然ヒアルロナンは、任意の分子量および粘度であり、哺乳動物または細菌由来であってよい。
【００５９】
本明細書に記載の治療、診断、および研究への応用のために使用されるキットおよび市販のパッケージも本開示の範囲内である。一つの態様において、キットもしくは市販のパッケージは、キットの使用説明書と共に、本開示のヒアルロン酸誘導体もしくは本開示の誘導体を含む組成物を含んでいてよい。更に、キットは、一つ以上の試薬、緩衝剤、梱包材、およびキットの構成物を入れる為の容器を含み得る。
【００６０】
（III）誘導体を調製する手順
本開示の態様において、ヒアルロン酸誘導体はヒアルロン酸から調製され、N-アセチル基（-C(O)CH3）の除去より、遊離アミノ基（-NH2）を有する脱アセチル化ヒアルロン酸が本開示の誘導体として得られる。一つの態様において、アセチル基は、例えばヒアルロン酸をヒドラジンまたはヒドラジン含有反応物質と反応させることにより、ヒドラジン分解反応を利用して除去される。
【００６１】
本開示の他のアシル置換された誘導体は、脱アセチル化ヒアルロン酸に、例えばアシル供与反応物質を用いることでアシル基を付加して調製することができる。アシル供与反応物としては、無水ブチリル、塩化ブチリル等の無水アシルや塩化アシルが挙げられる。本開示のアシル置換されたヒアルロン酸誘導体は、脱アセチル化ヒアルロン酸とアシル供与基との反応より単離される。
【００６２】
特定の態様において、除去されかつ後に他のアシル基または水素で置換されるN-アセチル基の割合は、脱アセチル化反応に使用されるヒドラジン（またはヒドラジン含有反応物質）の量、および反応させた時間の長さに応じて変化する。ヒドラジン（またはヒドラジン含有反応物質）濃度が高くなる、および／または反応時間が長くなるにつれ、ヒアルロン酸より除去されるアセチル基の割合が増え、その結果本開示のヒアルロン酸誘導体の収率が増加する。更なる態様において、他のアシル基または水素で置換される（または再度アセチル化される）アセチル基の割合は、アシル置換された誘導体を形成する反応に用いられるアシル供与基の量、および反応させた時間の長さに応じて変化する。アシル供与反応物質の濃度が高くなる、および／または、反応時間が長くなるにつれ、ヒアルロン酸誘導体におけるアシル置換された基の割合が増加する。
【００６３】
別の態様において、架橋されたヒアルロン酸誘導体は、クロスリンカーを本開示のヒアルロン酸誘導体に加えることで調製される。一つの態様において、架橋されたヒアルロン酸誘導体（またはポリマー）のゲル化率は、ヒアルロン酸誘導体および／またはクロスリンカーの濃度の調節、またはクロスリンカーの選択により制御される。一つの態様において、クロスリンカーはゲニピンである。
【００６４】
別の態様において、架橋は、架橋剤がオリゴマーまたはマクロマーであるように、ヒアルロン酸誘導体の存在下でゲニピン等の架橋剤を重合化することにより達成される。別の態様において、架橋反応は、コラーゲン、他のマトリックスタンパク質、および糖タンパク質などの結合組織成分存在下で行われる。
【００６５】
（IV）治療方法
本開示のヒアルロン酸誘導体は、炎症誘発性サイトカインの産生を制御または抑制することが有益な疾病または状態に有用である。増加したサイトカイン産生が、炎症が関わる疾病や状態において重要な役割を果たすことは、当業者には理解されるであろう。本開示の誘導体は、低分子量ヒアルロナン、リポ多糖またはその他の微生物由来刺激物による刺激の結果として起こる炎症性サイトカインの産生を制御または抑制できる。
【００６６】
マクロファージ細胞を用いた培養試験において、本開示のヒアルロン酸誘導体は、細胞に対して非毒性であり、一般に免疫反応を誘発しないことが確認された。
【００６７】
本開示の一態様においては、本明細書に記載のヒアルロン酸誘導体または組成物を、その必要のある患者に投与することを含む、炎症を治療するための方法が含まれる。別の態様においては、炎症を治療するための、本明細書に記載のヒアルロン酸誘導体または組成物の使用が含まれる。一つの態様において、炎症は、患者における炎症誘発性サイトカインの産生によるものである。一つの態様において、炎症誘発性サイトカインは、IL1-β、IL6、IL8、MCP1、およびTNF-αより選択される。
【００６８】
別の態様においては、本明細書に記載のヒアルロン酸誘導体または組成物を、その必要のある患者に投与することを含む、炎症状態または変性リウマチ状態を治療するための方法が含まれる。別の態様においては、炎症状態または変性リウマチ状態を治療するための、本明細書に記載のヒアルロン酸誘導体または組成物の使用が含まれる。リウマチ状態としては、例えば、関節リウマチ、乾癬性関節炎、慢性結節性痛風、急性痛風、強直性脊椎炎、結合組織病、脈管炎、または骨関節炎が挙げられる。
【００６９】
また、本開示には、本明細書に記載のヒアルロン酸誘導体または組成物を、その必要のある患者に投与することを含む、胃腸の炎症状態を治療するための方法も含まれる。別の態様においては、胃腸の炎症状態を治療するための、本明細書に記載のヒアルロン酸誘導体または組成物の使用が含まれる。胃腸の炎症状態としては、例えば、炎症性腸疾患、クローン病、または潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【００７０】
本開示には、本明細書に記載のヒアルロン酸誘導体または組成物を、その必要のある患者に投与することを含む、歯茎または歯周構造の炎症性疾患を治療するための方法も含まれる。別の態様においては、歯茎または歯周構造の炎症性疾患を治療するための、本明細書に記載のヒアルロン酸誘導体または組成物の使用が含まれる。歯茎または歯周構造に関連する疾患としては、例えば、炎症性疾患が歯肉炎または炎症性歯周病が挙げられる。
【００７１】
別の態様において、本開示には、本明細書に記載のヒアルロン酸誘導体または組成物を、その必要のある患者に投与することを含む、膀胱の炎症性疾患を治療するための方法も含まれる。別の態様においては、膀胱の炎症性疾患を治療するための、本明細書に記載のヒアルロン酸誘導体または組成物の使用が含まれる。膀胱の炎症性疾患としては、例えば、急性間質性膀胱炎または慢性間質性膀胱炎が挙げられる。
【００７２】
更なる態様において、本開示には、本明細書に記載のヒアルロン酸誘導体または組成物を、その必要のある患者に投与することを含む、呼吸器の炎症性疾患を治療するための方法も含まれる。別の態様においては、呼吸器の炎症性疾患を治療するための、本明細書に記載のヒアルロン酸誘導体または組成物の使用が含まれる。呼吸器の炎症性疾患としては、例えば、急性喘息、慢性喘息、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、または閉塞性細気管支炎性器質化肺炎が挙げられる。
【００７３】
本開示のヒアルロン酸誘導体および架橋された誘導体は、炎症誘発性サイトカインが関与する状態の治療に有用である。例えば、当該誘導体は、炎症状態、変性リウマチ状態、胃腸の炎症状態、歯茎もしくは歯周構造の炎症性疾患、膀胱の炎症性疾患、呼吸器の炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、または脳血管疾患に関連する炎症、乾癬を含む皮膚の炎症状態、または敗血症性ショック等のサイトカインの大量放出に関連する疾患の治療に有用である。
【００７４】
別の態様において、単独、またはコラーゲンなど結合組織マトリックスのその他の分子との混合物としての架橋されたヒアルロン酸誘導体は、ゲル化や粘性の増加が追加のまたは回復に役立つ望ましい特性である状態の治療に有用である。その様な状態としては、例えば、骨病変または骨折の修復、軟骨またはその他関節内の病変または損傷、医学的または美容的理由による皮膚構成物質の損失などの老化の状態、またはドライアイなどの眼の状態、シェーグレン症候群、または硝子体剥離における硝子体の成分の回復、白内障発症、または角膜の疾患もしくは損傷、または眼水晶体の製造もしくは機能への追加が挙げられる。一つの態様において、架橋されたヒアルロン酸誘導体は、火傷を覆うため、および整形外科や美容外科的手術用の植皮としての使用に必要な大きさや幅のシートの形状とすることができる。
【００７５】
別の態様において、本開示には、本明細書に記載のヒアルロン酸誘導体または組成物を、その必要のある患者に投与することを含む、サイトカインの放出に関連する疾患を治療するための方法も含まれ、該サイトカインは、哺乳動物の臓器に損傷を与える可能性がある。一つの態様において、サイトカインの放出に関連する疾患は、敗血症性ショックなどの細菌感染である。
【００７６】
本開示の別の態様において、架橋されたヒアルロン酸誘導体は、注入されるか、または、関節鏡的、内視鏡的手順およびコンピューター誘導式の撮像などの外科的手順により、軟骨または骨などの軟組織または硬組織に導入される。このような外科的手順には、美容整形および再建手術が含まれる。
【００７７】
別の態様において、架橋されたヒアルロン酸誘導体（ゲル）は、広い表面積を覆う用途に用いられる為のシートとして調製される。例えば、ゲルは、望ましい大きさと軟度を有するシートとして調製され、該シートは火傷の治療または皮膚の移植手術のために用いられる。別の態様において、架橋されたヒアルロン酸誘導体は、火傷や皮膚移植手術に使用される人工皮膚を作製するため、皮膚繊維芽細胞または他の皮膚細胞などの細胞を増殖させるための人工マトリックスとして使用される。
【００７８】
別の態様において、架橋されたヒアルロン酸誘導体は、光学レンズに適した人工ポリマーと架橋するかまたはそれに導入することが可能であり、該光学レンズの製造に使用される。
【実施例】
【００７９】
下記の非限定的な例は、本開示を説明するものである。
【００８０】
材料および方法：
ストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）由来のヒアルロン酸ナトリウム塩（HA）、ヒドラジン一水和物、硫酸ヒドラジン塩、ヨードメタン、ヨウ素酸、無水酢酸、および無水酪酸は、全てSigma Aldrich（登録商標）より入手した。エタノールおよびアセトンはFishers（登録商標）より入手した。ヒトIL-1B ELISAキット（プレコート）はCedarlane（登録商標）より入手した。RPMI-1640培地はATCC（登録商標）より入手した。AGAROSE（バイオテクノロジー等級）はBioShop（登録商標）より入手した。ゲル電気泳動を実施するためのシステム（小さい水平ユニット）は、Fisher scientific（登録商標）より入手した。ゲルを流す為のパワーパックは、E-C apparatus Corporation（登録商標）より入手し、モデル番号はFB-EC600-90であった。ヒト急性単球性白血病（THP-1細胞）はATCC（登録商標）より入手した。リポサッカリド（LPS）およびTriza塩基は、Sigma Aldrich（登録商標）より入手した。ホウ酸は、Fishers（登録商標）より入手した。全ての染色剤（95％）は、シグマアルドリッチより入手した。
【００８１】
実施例1：N-アシル化ヒアルロナンの合成、評価、および分析
(a)ヒアルロン酸の部分的脱アセチル化
6gのヒアルロン酸に300mLのヒドラジン一水和物（2％w/Vのポリマー溶液）を加えた。この溶液に3gの硫酸ヒドラジンを加え、得られた溶液を55℃で72〜96時間攪拌した。その後、冷却したエタノールを120mL加えて、ヒアルロン酸ポリマー生成物を沈殿させた。沈殿物を回収し、エタノールで洗浄後、真空下で24時間乾燥させた。
【００８２】
100mLの酢酸（5％）を60mLの0.5Mヨウ素酸（HIO3）に加えた。上記の沈殿物をこの溶液に加え、4℃の冷浴中で少なくとも1時間攪拌した。攪拌後、この混合物に17.5mLのHI（CH3I）水溶液を加え、15分間攪拌した。
【００８３】
次に、この青紫色の溶液を分液漏斗に移し、そこに150mLのジエチルエーテルを加えた。この混合物を、数分間激しく撹拌し、水層を回収した。有機層から青紫色が消失するまでジエチルエーテルを用いて分離を繰り返した。次に、水溶液のpHが7〜7.5となるよう0.2M NaOHを用いて調節した。その後、溶液にエタノールを加えることによりポリマーを沈殿させ、次に蒸留水に対して2回透析を行い、これを凍結乾燥させることにより、脱アセチル化ヒアルロナンを得た。次に、1HNMR、13CNMR、H-H COSY、およびH-H TOSCYを用いて凍結乾燥したサンプルを分析した。
【００８４】
(b)部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸のN-アシル化
(a)より得られた生成物0.1gを30mLの水に溶解し、そこに6mLの飽和NaHCO3溶液および6mLの5％v/v無水酪酸の無水エタノール溶液を加えた。酸無水物の臭いが減少するまで、この溶液を5〜10分間、断続的に撹拌した。これを100℃の温浴に3〜5分浸すことで反応を停止させた後、室温まで冷却した。その後、この溶液に対してエールリッヒ効力検定を行った。次に、溶液をアンバーライトで精製し、その上清を凍結乾燥することで生成物を得た。次に、1HNMR、13CNMR、H-H COSY、およびH-H TOSCYを用いて、凍結乾燥サンプルを分析した。
【００８５】
実施例2：アガロースゲルによるN-アシル化ヒアルロナンの分析
記号の意味：(i)HA：細菌由来の天然型高分子親ヒアルロナン（ヒアルロン酸）；(ii)AHA：（再）N-アセチル化ヒアルロナン；(iii)BHA：N-ブチリル化ヒアルロナン；(iv)DHA：脱アセチル化ヒアルロナン。
【００８６】
10mg/mLのポリマー溶液を蒸留水（HAo、AHAo、BHAoおよびDHAo）中で調製した。500uLのこの溶液を、分子量カットオフ値300kDaのNANOSEP（商標）マイクロ濃縮器を使用して、14,000gで10分間遠心分離した（HA1、AHA1、BHA1、および、DHA1）。200uLの上記の濾過液を、分子量カットオフ値100kDaのNANOSEP（商標）マイクロ濃縮器を使用して、14,000gで10分間遠心分離した（HA2、AHA2、BHA2、および、DHA2）。300kDa NANOSEP（商標）マイクロ濃縮器を通過しなかった残渣は、全て500uLの水に溶解した（HA3、AHA3、BHA3、および、DHA3）。20uLの溶液を4uLの充填用色素と混合した。その結果得られた溶液20uLを1％アガロースゲルに充填し、100Vで1時間泳動を行った。0.005％の色素を50％（v/v）エタノールに完全に溶解した溶液中で、ゲルを一晩染色した。
【００８７】
アガロースゲルを用いて得た、Sigmaより入手したヒアルロン酸（HA）、脱アセチル化HA（DHA）、再アセチル化HA（AHA）、およびブチリル化HA（BHA）の分子量は、半定量的であり、サンプルの推定される分子量の範囲は表1のとおりである。
【００８８】
実施例3：炎症モデルとなる培養細胞に対する合成N-アシルヒアルロナンの効果
単球/マクロファージTHP-1細胞株は、ATCCのカナダにおける販売代理店であるCedarlaneより購入した。カタログ番号はATCC TIB-202である。
【００８９】
細胞系は懸濁培養（=単球）により、RPMI-1640（Cedarlaneカタログ番号30-2001）において維持された。この培地に50μMβ-メルカプトエタノール、100nm PMA、および10％FBSを加えた。培地に2〜4x105細胞/mLで播種し、細胞密度が8〜10x105に達した時点で継代培養を行った。細胞密度は、10x105細胞/mLを超えないようにした。新たな継代培養は、必要とされる細胞/mLまで新鮮な培地で希釈することにより準備されたものであり、合成ヒアルロナン（500μg/mL）またはLPS（1μg/mL）を加えた遠心分離によるものではない。24時間後、サイトカインELISAを行うため、下記のとおり培地を回収した。市販のアッセイキットを利用し、XTT/PMS細胞増殖アッセイにより細胞数を測定した。
【００９０】
DHA、AHA、およびBHAの存在下、ならびにLPSの存在または非存在下におけるサイトカイン形成
図１に示すように、細胞数についてのアッセイによると、細胞数は変化せず、これはAHA（（再）N-アセチル化ヒアルロナン）濃度の増加による細胞毒性が認められないことを示唆する。
【００９１】
図2に示すように、トリパンブルー排除法による細胞生存試験結果は陰性であったため、DHA、AHA、もしくはBHA単独の、またはそのLPSとの組み合わせを加えることによる細胞毒性は認められなかった。また、化合物は、-20℃で3か月置かれた後も安定であることが示された。
【００９２】
図3に示すように、HA、AHA、またはAHAおよびBHAの組み合わせの添加による細胞毒性は認められなかった。
【００９３】
図4は、IL1βの、450nmにおける標準的なELISA検量線を示す。
【００９４】
図5は、IL1β形成の用量反応棒グラフを示し、AHA濃度の増加がIL1β産生の増加をもたらすことを表す。AHAは、脱アセチル化ヒアルロナンから調製される、比較的低分子量の再アセチル化ヒアルロナンであるため、AHAは、同様の分子量の天然ヒアルロナンと同等であると考えられる。
【００９５】
図6は、IL6形成に対する本開示の様々な化合物の効果を表す棒グラフを示す。DHAおよびBHAの添加はIL6の合成をほぼ刺激しないが、AHAの添加はわずかなIL6の合成をもたらした。LPSは最高レベルの刺激を示す陽性対照として用いられた。LPSと共にDHA、AHA、またはBHAを加えた結果、IL6合成に対するLPS刺激はわずかな減少を見せた。
【００９６】
図7は、IL8形成に対する本開示の様々な化合物の効果を表す棒グラフを示す。DHAおよびBHAの添加は非常に低レベルのIL8合成をもたらすが、AHAの添加はある程度高レベルのIL8合成をもたらした。LPSは最高レベルの刺激を示す陽性対照として用いられた。LPSと共にDHA、AHA、またはBHAを加えた結果、IL8合成に対するLPS刺激はわずかな減少を見せた。
【００９７】
図8は、IL1β形成に対する本開示の様々な化合物の効果を表す棒グラフを示す。DHAおよびBHAの添加はIL1βの合成レベルをほぼ刺激しないが、AHAの添加も刺激をもたらさなかった（図示せず）。LPSは最高レベルの刺激を示す陽性対照として用いられた。LPSと共にDHAまたはBHAを加えた結果、IL1β合成に対するLPS刺激はわずかな減少を見せたが、AHAの添加は有意な効果を示さなかった。
【００９８】
図9は、MCP-1形成に対する本開示の様々な化合物の効果を表す棒グラフを示す。DHAおよびBHAの添加は低レベルのMCP-1合成をもたらすが、AHAの添加は幾分緩和したレベルの刺激をもたらした。LPSは最高レベルの刺激を示す陽性対照として用いられた。LPSと共にDHAまたはBHAを加えた結果、MCP-1合成に対するLPS刺激はわずかな減少を見せたが、AHAの添加は有意な効果を示さなかった。
【００９９】
図10は、TNF-α形成に対する本開示の様々な化合物の効果を表す棒グラフを示す。DHAおよびBHAの添加はTNF-α合成に対し非常に低レベルの刺激を与えた。AHA、LPS、およびLPSと任意の化合物の添加は、高い（1000倍を超える）レベルの合成をもたらした。LPSは最高レベルの刺激を示す陽性対照として用いられた。LPSと共にDHAまたはBHAを加えた結果、IL-1β合成に対するLPS刺激はわずかな減少を見せたが、AHAの添加は有意な効果を示さなかった。
【０１００】
HA、AHA、ならびにAHAおよびBHAの存在下におけるサイトカイン形成
図11は、IL1βの合成に対するHA、AHA、およびAHA＋BHAの効果を表す棒グラフを示す。対照と比較してHAの添加はIL1β形成に対して非常に小さな効果を見せたが、AHAの添加はIL1β形成に対して大きな効果をもたらした。AHAおよびBHAの添加は、AHA単独の添加によるIL1β刺激を低下させた。
【０１０１】
図12は、IL6の合成に対するHA、AHA、およびAHA＋BHAの効果を表す棒グラフを示す。対照と比較してHAの添加はIL6形成に対して非常に小さな効果を見せたが、AHAの添加はIL6形成に対して大きな効果をもたらした。AHAおよびBHAの添加は、AHA単独の添加によるIL6刺激を低下させた。
【０１０２】
図13は、IL8の合成に対するHA、AHA、およびAHA＋BHAの効果を表す棒グラフを示す。対照と比較してHAの添加はIL8形成に対して非常に小さな効果を見せたが、AHAの添加はIL8形成に対して大きな効果をもたらした。AHAおよびBHAの添加は、AHA単独の添加によるIL18刺激を低下させた。
【０１０３】
図14は、TNF-αの合成に対するHA、AHA、およびAHA＋BHAの効果を表す棒グラフを示す。対照と比較してHAの添加はTNF-α形成に対して非常に小さな効果を見せたが、AHAの添加はTNF-α形成に対して大きな効果をもたらした。AHAおよびBHAの添加は、AHA単独の添加によるTNF-α刺激を低下させた。
【０１０４】
実施例4：アガロースゲルによるN-アセチル化ヒアルロナンの分析
実施例1の方法に従い、様々なヒアルロン酸誘導体が合成され、それらの分析は実施例2に従いアガロースゲルにて行った。図15に示すように、下記の誘導体が合成された。
レーン1はAHAo
レーン2はBHAo
レーン3はDHAo
レーン4はHAo
レーン5は分子量125〜175kDaの標準
レーン6はHAラダー標準
レーン7はHHAo（ヘキサノイル置換されたHA）
レーン8はIVHAo（イソバレリル置換されたHA）
レーン9はPHAo（プロピオニル置換されたHA）
レーン10はVHAo（バレリル置換されたHA）
【０１０５】
表1は、遊離アミノ基とグルクロン酸基の比率を示す。無水酢酸または無水酪酸による再アセチル化は、使用された酸無水物の濃度の増加と共に増加した。
【０１０６】
実施例5：様々な方法によるHAの脱アセチル化
図16は、ヒドラジン分解反応を用いて72時間脱アセチル化したHA（DHA）と、NaOHを脱アセチル化剤として脱アセチル化したHA（DHA-NaOH）の比較を示す。2gのHAを200mLの2.5N NaOHに溶解し、その溶液を室温で72時間攪拌した。反応混合物に水（140mL）を加え、氷浴中で撹拌しながら濃塩酸で溶液のpHを10.0に調整し、その後800mLの7:1アセトン-H2O混合物中0℃で沈殿させた。形成された白色の繊維状沈殿物を濾過することにより回収し、これを水に溶解し、pHを7.0に調整した。アセトンをロータリーエバポレーターで蒸発させた後、溶液を凍結乾燥した。このポリマーを水に再溶解し、溶解した塩を透析により除去し、サンプルを再度凍結乾燥した。図16（A）には、TAEランニングバッファーを用いて、1時間100V定電圧にて0.75％w/vアガロースゲルにHA、DHA、BHA、AHA、およびSelect-HA LoLadderを通し、0.005％w/v「Stains-All」を用いて可視化した結果を示す。図16B（B）にはHA-消化済、AHA-NaOH、AHA、HA、およびSelect-HA LoLadderを0.75％w/vアガロースゲルに通した結果を示す。
【０１０７】
考察
NaOH処理の際に、最初のHA鎖（分子量1500〜1800kDa）のグリコシド結合が切断されたことは明らかであり、その結果、分子量が30〜214kDa減少したことが、アガロースゲル電気泳動より推測される（図16A）。再アシル化反応はポリマーの分子量範囲に有意な影響を与えなかった。用いられた条件下において、AHAの分子量の範囲は、HA-消化済およびAHA-NaOHの分子量と類似している（図16B）。
【０１０８】
図17に示すように、AHAによるIL-1β刺激の度合いは、HAをウシ精巣ヒアルロニダーゼで消化することで得られたLMHA（HA-消化済）およびHAをNaOHで脱アセチル化した後に無水酢酸で再アセチル化することで得られたLMHA（AHA-NaOH）より見られるものと同等である。
【０１０９】
図18が示すように、消化されたヒアルロン酸の内30kDa未満のものは、分画化されていないAHAのヒアルロン酸調製物と同じ濃度（12.5μg/mL）で使用された場合、THP-1 IL-1β分泌を刺激しない。IL-1β分泌の為の全ての刺激活性は、30kDaを超える消化産物の分画に存在し、これは、精巣ヒアルロニダーゼまたはヒドラジン分解、またはNaOHを用いた処理方法によりHAを消化することで得られた。分画は、カットオフ値30kDaのPESを用いたゲル濾過スピンカラムを使用して行った。
【０１１０】
実施例6：再アシル化ヒアルロン酸ポリマーの核磁気共鳴分析
図19は、再アシル化ポリマーの1H-NMRスペクトルを示す。ヒドラジン分解反応により脱アセチル化されたHAについては、適切な無水物を用いて幾つかのN-アシル誘導体を合成した。D2OにおけるAHA、BHA、およびDHAの1H-NMRスペクトルからは、ポリマー骨格に関連する予想された主要なピークが確認された。表2は、1H-NMRスペクトルから算出されたAHA、BHA、およびDHAを構成するグルコサミン、N-アセチル-グルコサミン、およびN-ブチリルグルコサミンの比率を示す。
【０１１１】
実施例7：再アシル化ポリマーの質量分析による特徴づけ
質量分析は以下のように実施した。3mLのHA（5mg/mL）を、1mLの800〜2000単位/mLのウシ精巣ヒアルロニダーゼと37℃で24時間インキュベートし、HAの消化を行った。HA誘導体に関しては、30mg/mLの濃度のものを500μL用いて、1mLの800〜2000単位/mLのウシ精巣ヒアルロニダーゼで消化した。酵素の沈殿は、5分間の沸騰、および2050rpmで10分間遠心分離することで行った。上清の回収と分離は、分子量カットオフ3000Daのミクロン遠心式フィルタ装置（ミリポア社）を用いて行った。この消化工程より得られた濾過液を凍結乾燥し、MS分析に使用した。MSおよびMS/MS分析は、エレクトロスプレーイオン化（ESI）源を備えた四重極/飛行時間型（QqTOF）ハイブリッドタンデム質量分析計QSTAR-XL（Applied Biosystems/MDS SCIEX）を用いて実施し、更に、加熱式エレクトロスプレーイオン化（HESI）源を備えたThermo LTQ Orbitrap Velos Proを負イオンモードで用いて確認を行った。負イオンモードにおけるESI分析には、次のイオン源条件を使用した：カーテンガス設定は25、イオンスプレー電圧は-4000V、Q0デクラスタリング電位は-90V、収束電位は-350V。TOF MSおよびMS/MSスキャンの両方において、窒素をコリジョンガスとして用いた（CAD設定5）。
【０１１２】
表2に示すように、エンド-β-N-アセチルヘキソサミニダーゼである精巣ヒアルロニダーゼにより、HAおよびその誘導体を消化した結果、（4GlcUAβ1-3GlcNAcβ1-）の繰り返し単位を有する同族列のオリゴ糖が得られた。得られたオリゴ糖の分離は、分子量カットオフ3000Daのミクロン遠心式フィルタ装置を用いて行った。測定M/Z値は予測M/Z値と、よく類似していることが認められた。濾過液のイオンスプレーマススペクトルは、ナトリウムを引き抜くことにより、一重荷電二糖類（396.1159）、ならびに一重荷電四糖類（797.2095）および二重荷電四糖類（387.1104）の産生を示した。確認された荷電イオンの数は、オリゴ糖中に含まれるグルクロン酸ナトリウム塩部分の数に対応する。AHAおよびDHAの酵素的分解により生じた分子イオンに加えて、BHAから得られたスペクトルは、N-ブチリルグルコサミン（GlcNBU）およびGlcUAの一重荷電二糖類（424.1473）、GlcNBUおよびGlcUAの一重荷電四糖類（853.2743）および二重荷電四糖類（415.1405）、ならびにGlcNBU、GlcNACおよびGlcUAの一重荷電四糖類（825.2433）および二重荷電四糖類（401.1260）（4GlcUAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcUAβ1-3GlcNBUβ1）と一致する更なる分子イオンを示した。これは、DHA中のグルコサミン部分が上手くN-ブチリル化されたこと（BHA）を示す1H-NMRスペクトルを更に検証するものである。
【０１１３】
実施例8：N-ブチリル化ヒアルロン酸（BHA）の細胞表面受容体の特定
図20Aは、500μg/mLのBHAの存在下（□）または非存在下（■）でTLR-4アゴニスト（LPS-EC）濃度を増加させながらTHP-1マクロファージを処理した際に測定したTHP-1およびIL-1β分泌を示す。図に示された様々なTLR-4濃度において、500μg/mLのBHAとの共培養を行った際、THP-1細胞によるIL-1β産生は抑制された。IL-1β分泌に対するAHA依存性刺激のBHAによる抑制は、0.1〜1000ng/mLの範囲で認められた（p<0.05、スチューデントt検定）。図20Bは、BHAの存在下および非存在下においてAHA処理を行った際のTHP-1サイトカイン分泌を示す。THP-1は未処理、または500μg/mLのAHAのみ（□）、もしくは500μg/mLのBHAと共に500μg/mLのAHA（■）で処理した。サイトカインレベルは、未処理のもの（AHAまたはBHAのいずれのものにも処理されていないTHP-1）との相対値として表した。500μg/mLのAHAでTHP-1を処理した結果IL-1β、IL6、IL8、およびTNF-αの分泌が刺激され、これらの分泌は500μg/mLのBHAとの共培養においては抑制された。
【０１１４】
図20Cに示すように、おそらくBHAの作用はTLR-2受容体を介さない。500μg/mLのBHAの存在下（□）または非存在下（■）でTLR-2アゴニストであるPG.PS濃度を増加させながらTHP-1と培養した結果、これらの処理の結果は統計学的に異ならないことが示された。全体的に見て、これらのデータは、BHAがTLR-4を介して抗炎症作用を発揮することを示唆する。
【０１１５】
実施例9：N-アシル化ヒアルロン酸誘導体のゲニピンとの架橋
HAの脱アセチル化：ヒドラジン分解反応を用いて部分的に脱アセチル化されたHAを形成するために、3gのHAを150mLのヒドラジン一水和物および1.5gの硫酸ヒドラジンに55℃で溶解し、48時間（DHA48）および144時間（DHA144）反応させた。ポリマー産物を沈殿させ、エタノールで洗浄し、25℃で24時間乾燥させた。サンプルを50mLの5％v/v酢酸および30mLの0.5Mヨウ素酸の混合液に溶解し、4℃の冷浴中に少なくとも1時間置いた。8.75mLの57％v/vCH3I水溶液を加え、15分間攪拌した。溶液の濃い青紫色は、エチルエーテルを用いた液液抽出により取り除かれた。脱アセチル化HAを含む水層のpHは、pHが7.0〜7.5に調節され、エタノールによる沈殿を行った。ポリマーは、水に溶解し、二次蒸留水に対して透析を行い、凍結乾燥させた。
【０１１６】
DHA144のブチリル化：DHA144のブチリル化は、1％無水ブチリル酸の無水エタノール溶液（BHA144）を用いて、グルコサミン単量体のN-プロピオニル化に用いられる方法に従って行った。0.1gのDHA144を30mLの蒸留水に短時間溶解し、6mLの飽和NaHCO3水溶液を加えた。60uLの無水ブチル酸を5.94mLの無水アルコールに加え、反応混合物に加えた。反応混合物を10分間攪拌し、沸騰水浴中で5分間加熱することで反応を停止させた。残留エタノールは、ロータリーエバポレーターを用いて蒸発させ、その後サンプルを凍結乾燥させることで水を除去した。凍結乾燥されたサンプルは、分子量カットオフ値6000の透析チューブを用いて蒸留水に対して透析を行い、再度凍結乾燥した。
【０１１７】
ポリマーの特徴づけ
比色アッセイ：HAの継時的な脱アセチル化の度合いを定量し、BHA144サンプル中の未修飾のグルコサミン部分を定量するために、ポリマーのグルコサミンおよびグルクロン含有量の比色定量を行った。グルコサミン含有量の測定は、その一級アミノ基（グルコサミン由来）のo-フタルデヒドを用いた誘導体化反応、およびN-アセチル-L-システインのチオール基の誘導体化反応に基づく。グルクロン含有量は、カルバゾール反応に従って定量化された。結果は、グルコサミン対グルクロン酸のモル比として表された。
【０１１８】
分子量の推定：サンプルの分子量の範囲の推定値は、HAをTAEバッファー（pH8.0）中100Vで90分間0.75％w/vアガロースゲルキャストに流す電気泳動を行うことにより得られた。この間、ブロモフェノールブルートラッキング色素は、ゲルの端近くまで移動した。泳動直後、室温遮光条件下で0.005％w/v Stains-Allを50％v/vエタノール中に含む溶液約100mL中にゲルを一晩浸した。次にゲルを10％v/vエタノール溶液に移し、遮光下で一日保存しながら脱染色液を二回以上交換することで脱色を行った。
【０１１９】
ゲル化時間：ポリマーは、pH7.4の0.1M PBS溶液中に40mg/mLの濃度で溶解した。ゲニピンは、pH7.4の0.1M PBS溶液中に30mMの濃度で溶解した。ゲニピン溶液は1週間室温に置き、溶解させた。30mMのゲニピン溶液は、更に15mMおよび7.5mMとなるよう0.1M PBSで希釈した。40mg/mLのポリマー300μLを300μLの30mM、15mM、7.5mMゲニピン溶液に加え、37℃で2時間反応させた。一部の実験において、I型コラーゲンはDHA48溶液と20:80の比率で混合し、その結果、重量比は1:20となった。サンプルにおいてロードされたゲニピンの総量は、それぞれ0.34、0.17、および0.085％w/vであり、ロードされたポリマーの総量は2％w/vであった。
【０１２０】
サンプルをレオメーターに移し、ゲル化時間を測定した。レオメーターには、0.5DEG、直径4cmステンレススチール製コーンからなるコーン／プレート構造を備えたTA Instruments AR2000（商標）レオメーター（TAインスツルメント、米国デラウェア州ニューキャッスル）が使用された。実験中サンプルの乾燥を防ぐため、直径約6cmのスチール製リングを測定される構造を囲むように配置した。ハイドロゲルの源位置でのゲル化挙動は、1Hzの一定周波数、37℃の一定温度、20Paの一定圧力、および生理的pH7.4におけるタイムスイープモードで研究した。この研究により、時間に対する貯蔵弾性率G'および損失粘性率（G"）などの粘弾性特性の進化を観察することが可能となった。いずれの特徴的な粘弾性機能の動力学も用いることで、G"とGの交点として概算されるゲル化時間が決定された。
【０１２１】
結果：
脱アセチル化：HAのGlcNAc単位の幾つかは、55℃における48時間および144時間にわたるヒドラジン分解反応によりグルコサミンに変換された。図21は、グルコサミンとグルクロン酸のモル比に対する反応時間の増加を示す。ポリマーの分子量の範囲は減少し、同時にグルコサミンとグルクロン酸のモル比は、比色アッセイにより測定されたとおり、DHA48における0.138±0.001からDHA144における0.351±0.017に増加した。DHA144と1％無水ブチル酸を10分間反応させることによりBHA144を形成した場合、その分子量の範囲は変化しなかったが、1％無水ブチル酸と反応させた場合、DHA144におけるグルコサミンとグルクロン酸の比率（0.351±0.017）は、0.099±0.002に減少した。
【０１２２】
ゲル化時間：ゲル化速度およびゲル物性を測定するために、G"およびG'などのレオロジー挙動を観察した。ゲル化時間は、G'およびG"の交点に基づく。図22a、22bおよび22cは、それぞれ0.34、0.17、および0.085％w/vゲニピン添加におけるDHA48のゲルポイント付近のG'およびG"のスイープ特性を示す。図22aは、0.34％w/vゲニピン添加でクロスリンクされたDHA144のゲルポイント付近のG'およびG"のスイープ特性を示し、図22bおよび22cは、それぞれ0.34および0.17％w/vゲニピン添加でクロスリンクされたBHA144のゲルポイント付近のG'およびG"のスイープ特性を示す。サンプルは、最初は未だ液体の状態であり、その時点では粘稠性が優勢であった為、予想通りにG"値はG'値よりも大きかった。時間と共に溶液がゲル状になるにつれ、架橋されたネットワークが形成されることから、G'およびG"は共に増加した。この時点で、弾性性質が有意になった為、G"と比較してG'の増加の割合が増した。G'およびG"の増加の割合が異なったことにより、これらは交差した。この交差に要する時間がゲル化時間である。図22は、1HZ(A)DHA48におけるゲルポイント付近の弾性率（G'）および粘性率（G"）がクロスした場合の、（A）0.34w/v％ゲニピン、（B）0.17w/v％ゲニピン、および（C）0.085w/v％ゲニピンにおける動態を示す。
【０１２３】
表3は、各サンプルのゲル化時間、および試した条件を示す。0.34％w/vゲニピンを添加したDHA48のサンプルは、1.6時間のゲル化時間を示し、0.17％w/vゲニピンを添加したサンプルは、2.4時間のゲル化時間を示した。一方、0.085％w/vゲニピンを添加したサンプルは、5時間の試験後もゲルポイントに到達しなかった。これらの結果は、ゲル化時間がゲニピン濃度と反比例することを示す。
【０１２４】
（表１）ヒアルロン酸およびその誘導体の分子量
0006363119.tif 000029
【０１２５】
（表２）1H NMRスペクトルより算出されたDHA、AHA、およびBHAにおける-NH2、N-アセチル、およびN-ブチリル部分の百分率
0006363119.tif 000030
【０１２６】
（表３）AHA、BHA、およびDHAにおいて観察された分子イオン種、およびそれらの相対的な強度
0006363119.tif 000031
【０１２７】
（表４）ゲル化時間
0006363119.tif 000032
＊5時間の試験後、ゲル化せず
Col＝1型コラーゲン
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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