(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩＩ：
【化１】
0006275703.tif 000015
（式中、Ｘは−ＣｎＨ２ｎ−（式中、ｎは２から５である）の構造を有するアルカンジイルであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ個別に、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよい複素環式基、ハロゲン、アミノ又はヒドロキシであり、但し、Ｒ３又はＲ８の少なくとも１つが、５員又は６員Ｎ−複素環式基であり；
Ｎ−複素環式基は、ピロリル、Ｈ−ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソオキサゾリル、フラザニル、イソチアゾリル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、テトラゾリル、ジチアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペラジニル、又はトリアジニルから選択され、
Ｘが−ＣＨ２−ＣＨ２−であるか、又はＲ３及びＲ８がそれぞれピリミジニルであるか、又はＸが−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、かつＲ３及びＲ８がそれぞれピリミジニルである）
の構造を有する、化合物又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項２】
Ｒ３がピリミジニルであり、Ｒ８がピリミジニルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｎ−複素環式基が、イミダゾリル、ピリジル、ピラゾリル、オキサジアゾリル又はピリミジニルから選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｎ−複素環式基が、ピリミジニルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｘが、−ＣＨ２−ＣＨ２−である、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
化合物が、
【化２】
0006275703.tif 000016
【化３】
0006275703.tif 000017
から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの化合物、及び少なくとも１つの薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物。
【請求項８】
対象における炎症性障害の治療のための医薬組成物であって、
請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物を含み、
炎症性障害が喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、肺臓炎、肺炎、嚢胞性線維症、乾癬、関節炎／関節リウマチ、鼻炎、咽頭炎、膀胱炎、前立腺炎、皮膚炎、アレルギー、腎炎、結膜炎、脳炎、髄膜炎、眼球炎、ブドウ膜炎、胸膜炎、心膜炎、心筋炎、アテローム性動脈硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連炎症、糖尿病、骨関節症、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患、大腸炎、敗血症、脈管炎、滑液包炎、結合組織病、自己免疫疾患、ウイルス若しくはインフルエンザ誘導性炎症又は浮腫であるか、あるいは炎症性障害がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによる感染によって誘導される、前記医薬組成物。
【請求項９】
炎症性障害が、慢性閉塞性肺疾患、敗血症又は肺炎である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項３又は４に記載の化合物を含む、慢性閉塞性肺疾患、敗血症又は肺炎の治療のための医薬組成物。
【請求項１１】
請求項５に記載の化合物を含む、慢性閉塞性肺疾患の治療のための医薬組成物。
【請求項１２】
化合物が、
【化４】
0006275703.tif 000018
である、請求項１に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１２年６月８日に出願された米国特許仮出願第６１／６５７，４２３号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性障害は、毒性のある病原体に感染した後に、宿主細胞の傷害、又は免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞、マクロファージなど）上の受容体を活性化する関連した刺激物質に反応して多量の循環炎症性サイトカインの分泌をもたらす高度に活性化された免疫系を特徴とする、多くのヒト疾患の根底にある。例えば、敗血症は、米国で毎年５００，０００人以上の死亡をもたらし、肺炎は、感染症による死亡の主な原因である。さらに、非感染性疾病（大腸炎、関節炎）は、病因の主なメディエーターとしてサイトカインを必要とし得る。こうした感染性障害の主な特色は、マクロファージ、リンパ球及びＰＭＮを含めた炎症誘発性細胞からのサイトカイン放出のバースト、すなわちサイトカインストームである。多くの状態において、サイトカインストームが拡大されすぎ（高サイトカイン血症）、深刻な組織傷害をもたらす持続的及び超生理的なレベルのサイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−β及びＩＬ−６を含む）を産生する免疫エフェクター細胞の恒常的活性化を伴う致命的な免疫反応をもたらす。未検査のまま放置すると、この深刻な炎症カスケードは、宿主にとって壊滅的な結果になり得る。
【０００３】
サイトカインストームをブロックすることに関する従来の努力は、全身性コルチコステロイドの使用、又は特定のサイトカイン、例えばＴＮＦα及びＩＬ−１βに対する標的化抗炎症剤の開発に着目し、これは、敗血症の死亡率を改善しなかった。上流のＴ細胞中の表面受容体（例えばＴＬＲ４受容体）を阻害することに着目した他のアプローチは、決定的でなく、類似の薬剤は第３相臨床治験で成功しなかった。こうしたアプローチの多くは、１つの標的のみ（受容体又はサイトカイン）が阻害のために選択されているため限定的である。しかし、全身性炎症及び敗血症は、多くの炎症性メディエーターが複数の受容体の活性化により放出される、複雑な障害である。単一の分子標的に対する薬剤は、宿主の炎症反応の間、他の炎症性サイトカインの活性を妨げることができない。こうした知見は、より多様な炎症誘発性生体分子の合成及び分泌を支配し得る治療介入のためのさらに新しい標的を同定することの重要性を強調するものである。さらに、敗血症の療法の主力は抗菌剤であり、これは、完全な防御を与えず、且つ付随的毒性及び多剤耐性の急速な出現のために制限される。したがって、新規な標的を伴うより新しい小分子抗炎症治療法の発見は、敗血症などの炎症性疾病の重症度に多大な影響を与え得る。
【０００４】
ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）は、炎症、抗ウイルス応答及びアポトーシスの調節に主に関与するタンパク質ファミリーである。良く特徴づけされた６種のＴＲＡＦタンパク質（ＴＲＡＦ１〜６）が存在し、さらに新しい相同体のＴＲＡＦ７が最近同定された。すべてのＴＲＡＦメンバーは、膜貫通型ＴＮＦ受容体との相互作用を媒介する高度に保存されたＣ末端ドメインを共に有する。ＴＲＡＦタンパク質の同定は、ＴＮＦＲスーパーファミリー及びＴｏｌｌ様／インターロイキン−１受容体（ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒ）ファミリーから発するシグナル伝達の分子機構の解明に大きく寄与した。ＴＲＡＦファミリータンパク質は、ＩＬ−１受容体、ＴＬＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、Ｉ−ＴＡＣ、ｐ７５ＮＧＦ受容体などと相互作用する。具体的には、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５及びＴＲＡＦ６は、細胞表面レセプターを下流のキナーゼカスケードにつなげるアダプタータンパク質として働き、該カスケードは次に、主要な転写因子、例えば核内因子κＢ（ＮＦκＢ）を活性化して、サイトカイン遺伝子発現をもたらす。免疫反応が拡大しすぎると、ＴＲＡＦ媒介性サイトカイン放出は、浮腫、多臓器不全及びショックの重大な影響をもたらす。しかし、ＴＲＡＦタンパク質は、シグナル伝達を媒介して、幾つかの下流のサイトカインの転写活性化を惹起するという、中心的役割を果たす。こうした発見は、ＴＲＡＦタンパク質の存在量を選択的にモジュレートするように設計されている計略は、治療介入のための新規な戦略として働く可能性があることを示唆する。しかし現在までに、タンパク質安定性のレベルでのＴＲＡＦファミリーの分子的調節に関してはほとんどわかっていない。細胞中のＴＲＡＦタンパク質濃度のモジュレーションに向けられる戦略は、新しいクラスの抗炎症剤設計の基礎を成す可能性がある。
【０００５】
タンパク質のユビキチン化は、プロテアソームによる又はリソソームを介する分解のためにタンパク質に印をつけ、多様なプロセスを調節する。標的タンパク質へのユビキチンの結合は一連の酵素反応によって編成され、これは、Ｅ１ユビキチン活性化酵素と、Ｅ１−活性化酵素からＥ２−結合酵素へのユビキチンの移動と、最後に、Ｅ３−ユビキチンリガーゼによって触媒される、基質のε−アミノリジンとユビキチンのＣ末端との間のイソペプチド結合の生成とを含む。多くのＥ３リガーゼのうち、Ｓｋｐ−カリン１−Ｆボックス（ＳＣＦ）スーパーファミリーは、中でも最も研究されている。ＳＣＦ複合体は、Ｓｋｐ１、カリン１及びＥ２ユビキチン結合（Ｕｂｃ）酵素からなる触媒コア複合体を有する。ＳＣＦ複合体は、Ｆ−ボックスタンパク質と呼ばれるアダプター受容体サブユニットも含有し、これは、リン酸特異的ドメイン相互作用を通して何百もの基質を標的とする。Ｆ−ボックスタンパク質は、２つのドメイン、すなわちＮＨ２末端のＦ−ボックスモチーフ及びＣ末端のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）モチーフ又はＷＤリピートモチーフを有する。ＳＣＦ複合体は、Ｓｋｐ１に結合するのにＦ−ボックスモチーフを使用し、一方でロイシンリッチ／ＷＤリピートモチーフは、基質認識に使用される。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書に開示される一実施形態は、式ＩＩ：
【０００７】
【化１】
0006275703.tif 000002
【０００８】
（式中、Ｘは二価の連結部分であり、
Ｒ１〜Ｒ１０は、それぞれ個別に、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよい複素環式基、ハロゲン、アミノ又はヒドロキシであり、但し、Ｒ３又はＲ８の少なくとも１つが、置換されていてもよいアルキル、置換されたアルコキシ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよい複素環式基又はハロゲンである）
の構造を有する、化合物又は薬学的に許容されるその塩若しくはエステルである。
【０００９】
式ＩＩＩ：
【００１０】
【化２】
0006275703.tif 000003
【００１１】
又は
式ＩＶ：
【００１２】
【化３】
0006275703.tif 000004
【００１３】
（式中、Ｘは二価の連結部分であり、
Ｒ２〜Ｒ５及びＲ７〜Ｒ１０は、それぞれ個別に、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよい複素環式基、ハロゲン、アミノ又はヒドロキシである）
の構造を有する、化合物又は薬学的に許容されるその塩若しくはエステルが、さらに本明細書に開示される。
【００１４】
本明細書に開示される別の実施形態は、対象において炎症性サイトカイン放出を阻害するための方法であって、ＦＢＸＯ３阻害剤を対象に投与するステップを含む方法である。
本明細書に開示されるさらなる実施形態は、対象において炎症性障害を治療するための方法であって、治療有効量のＦＢＸＯ３阻害剤を対象に投与するステップを含む方法である。
【００１５】
本明細書に開示されるさらなる実施形態は、ＦＢＸＬ２の、ＦＢＸＯ３誘導性ユビキチン化及び分解を阻害するための方法であって、ＦＢＸＯ３を含有する組織又は細胞を、ベンザチン化合物、置換されていてもよいジアミノアルカン、置換されたキノリン、ヘマトキシリン、テトラメチレンビス、ナフサカイン（naphthacaine）、アンピシリン又はエリプチン（elliptine）と接触させるステップを含む方法である。
【００１６】
本明細書に開示される別の実施形態は、対象又は目的物の表面における細菌の増殖を阻害するための方法であって、有効量のＦＢＸＯ３阻害剤を対象又は目的物の表面に投与するステップを含む方法である。
【００１７】
本明細書に開示されるさらなる実施形態は、ＦＢＸＯ３タンパク質の生理活性を阻害するための方法であって、ＦＢＸＯ３を、ＦＢＸＯ３タンパク質のＡｐａＧドメインキャビティに存在するアミノ酸残基Ｙ３０８、Ｎ３３５、Ｅ３４１、Ｔ３６８及びＳ３７０と相互作用する化合物に接触させるステップを含む方法である。
【００１８】
前述は、添付の図面を参照して続けられる以下の詳細な説明から、さらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】ＦＢＸＬ２が、ＴＲＡＦをポリユビキチン化の標的にすることを示す図であり、コントロール（ＣＯＮ）プラスミド又は異所性のＦＢＸＬ２プラスミドを発現させた後のＴＲＡＦ及び陰性コントロールタンパク質のレベルを示す免疫ブロットである。
【図１Ｂ】ＦＢＸＬ２が、ＴＲＡＦをポリユビキチン化の標的にすることを示す図である。外因性のドキシサイクリンの制御下にある誘導性ＦＢＸＬ２プラスミドで細胞をトランスフェクトした。ドキシサイクリンで様々な時間細胞を処理し、次いで、細胞を集め、免疫ブロットによって、ＦＢＸＬ２、ＴＲＡＦ及びβ−アクチンについて細胞可溶化物を解析した。
【図１Ｃ】ＦＢＸＬ２が、ＴＲＡＦをポリユビキチン化の標的にすることを示す図である。内因性のＦＢＸＬ２を免疫沈降し、続いて、ＴＲＡＦ１〜６を免疫ブロットした。
【図１Ｄ】ＦＢＸＬ２が、ＴＲＡＦをポリユビキチン化の標的にすることを示す図であり、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイを示す。精製したＳＣＦ複合体成分をそれぞれのＶ５−ＴＲＡＦおよびユビキチン化反応成分の完全な補足物と共にインキュベートし（左から２番目のレーン）、これはポリユビキチン化したＴＲＡＦタンパク質を示す。
【図１Ｅ】ＦＢＸＬ２が、ＴＲＡＦをポリユビキチン化の標的にすることを示す図である。ＦＢＸＬ２を過剰発現した場合又はしない場合の、各ＴＲＡＦタンパク質の半減期を示す。
【図２Ａ】ＦＢＸＬ２がリジン２０１部位でポリユビキチン化されることを示す図である。ＦＢＸＬ２の幾つかの欠失変異体を設計し、ｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−ＨＩＳベクターにクローニングした（上部パネル）。ＦＢＸＬ２変異体をコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトし、続いて、ＭＧ１３２で処理した。細胞を集め、ビヒクル（左下部）又はＭＧ１３２（右下部）に細胞を曝露した後、免疫ブロットによってＶ５−ＦＢＸＬ２及びβ−アクチンについて細胞可溶化物を解析した。
【図２Ｂ】ＦＢＸＬ２がリジン２０１部位でポリユビキチン化されることを示す図である。ＦＢＸＬ２の幾つかの欠失変異体を設計し、ｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−ＨＩＳベクターにクローニングした（上部パネル）。ＦＢＸＬ２変異体をコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトし、続いて、ＭＧ１３２で処理した。細胞を集め、ビヒクル（左下部）又はＭＧ１３２（右下部）に細胞を曝露した後、免疫ブロットによってＶ５−ＦＢＸＬ２及びβ−アクチンについて細胞可溶化物を解析した。
【図２Ｃ】ＦＢＸＬ２がリジン２０１部位でポリユビキチン化されることを示す図である。ＦＢＸＬ２の幾つかの点変異体を設計し、ｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−ＨＩＳベクターにクローニングした（上部パネル）。ＦＢＸＬ２変異体をコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトし、続いて、ＭＧ１３２で処理した。細胞を集め、ビヒクル（左下部）又はＭＧ１３２（右下部）に細胞を曝露した後、免疫ブロットによってＶ５−ＦＢＸＬ２及びβ−アクチンについて細胞可溶化物を解析した。
【図２Ｄ】ＦＢＸＬ２がリジン２０１部位でポリユビキチン化されることを示す図であり、野生型（ＷＴ）ＦＢＸＬ２及びＦＢＸＬ２  Ｋ２０１Ｒの半減期に関する試験を示す。
【図３Ａ】ＦＢＸＬ２が、残基Ｔ４０４でリン酸化され、ＳＣＦ  Ｅ３リガーゼＦＢＸＯ３によって標的化されることを示す図であり、ＦＢＸＬ２中の潜在的なリン酸化部位（ＧＰＳ２．１予測）のスキームを示す。
【図３Ｂ】ＦＢＸＬ２が、残基Ｔ４０４でリン酸化され、ＳＣＦ  Ｅ３リガーゼＦＢＸＯ３によって標的化されることを示す図である。内因性のＦＢＸＬ２を免疫沈降し、続いて、リン酸化スレオニンの免疫ブロットを行った。
【図３Ｃ】ＦＢＸＬ２が、残基Ｔ４０４でリン酸化され、ＳＣＦ  Ｅ３リガーゼＦＢＸＯ３によって標的化されることを示す図である。内因性のＦＢＸＬ２を免疫沈降し、続いて、幾つかの候補キナーゼについて免疫ブロットを行った。
【図３Ｄ】ＦＢＸＬ２が、残基Ｔ４０４でリン酸化され、ＳＣＦ  Ｅ３リガーゼＦＢＸＯ３によって標的化されることを示す図である。内因性のＦＢＸＬ２を免疫沈降し、続いて、ＦＢＸＯ３の免疫ブロットを行った。
【図３Ｅ】ＦＢＸＬ２が、残基Ｔ４０４でリン酸化され、ＳＣＦ  Ｅ３リガーゼＦＢＸＯ３によって標的化されることを示す図であり、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイを示す。精製したＳＣＦＦＢＸＯ３複合体成分をＶ５−ＦＢＸＬ２およびユビキチン化反応成分の完全な補足物と共にインキュベートし（右側のレーン）、これはポリユビキチン化したＦＢＸＬ２を示す。
【図３Ｆ】ＦＢＸＬ２が、残基Ｔ４０４でリン酸化され、ＳＣＦ  Ｅ３リガーゼＦＢＸＯ３によって標的化されることを示す図である。ｈｉｓタグをつけたＦＢＸＬ２欠失変異体プラスミドで細胞をトランスフェクトし、続いてｈｉｓプルダウンを行った。コバルトビーズに結合したＦＢＸＯ３タンパク質を溶出し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、続いてＦＢＸＯ３の免疫ブロットを行った。
【図３Ｇ】ＦＢＸＬ２が、残基Ｔ４０４でリン酸化され、ＳＣＦ  Ｅ３リガーゼＦＢＸＯ３によって標的化されることを示す図であり、ＷＴ  ＦＢＸＬ２及びＦＢＸＬ２Ｃ末端欠失変異体の半減期試験を示す。
【図３Ｈ】ＦＢＸＬ２が、残基Ｔ４０４でリン酸化され、ＳＣＦ  Ｅ３リガーゼＦＢＸＯ３によって標的化されることを示す図であり、ＦＢＸＬ２中のＧＳＫ３βコンセンサス配列を示す。
【図３Ｉ】ＦＢＸＬ２が、残基Ｔ４０４でリン酸化され、ＳＣＦ  Ｅ３リガーゼＦＢＸＯ３によって標的化されることを示す図である。Ｖ５−ＷＴ  ＦＢＸＬ２又はＶ５−ＦＢＸＬ２  Ｔ４０４Ａ点変異体のいずれかをコードするプラスミドで細胞をトランスフェクトし、次いでトランスフェクトした細胞を、Ｖ５抗体を用いる免疫沈降にかけ、続いてリン酸化スレオニン免疫ブロットを行った。
【図３Ｊ】ＦＢＸＬ２が、残基Ｔ４０４でリン酸化され、ＳＣＦ  Ｅ３リガーゼＦＢＸＯ３によって標的化されることを示す図であり、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイを示す。精製したＳＣＦＦＢＸＯ３複合体成分をＶ５タグをつけたＷＴ  ＦＢＸＬ２又はＦＢＸＬ２  Ｔ４０４Ａ変異体およびユビキチン化反応成分の完全な補足物と共にインキュベートし（左から２番目のレーン）、これはポリユビキチン化したＦＢＸＬ２を示す。
【図３Ｋ】ＦＢＸＬ２が、残基Ｔ４０４でリン酸化され、ＳＣＦ  Ｅ３リガーゼＦＢＸＯ３によって標的化されることを示す図であり、ＦＢＸＬ２を標的化するＦＢＸＯ３のモデルを示す。
【図４Ａ】ＦＢＸＯ３がＶ２２０で自然発生変異を含有することを示す図であり、Ｖ２２０Ｉ変異を示すＦＢＸＬ２タンパク質のＳＮＰ解析を示す。
【図４Ｂ】ＦＢＸＯ３がＶ２２０で自然発生変異を含有することを示す図である。最初に、ゲノムＤＮＡを２０人の健康なコーカサス人ドナー由来のＰＢＭＣ細胞から抽出し、続いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＳＮＰプローブを使用するＳＮＰジェノタイピングをリアルタイムＰＣＲを用いて行った。
【図４Ｃ】ＦＢＸＯ３がＶ２２０で自然発生変異を含有することを示す図である。３つのＷＴ  ＰＢＭＣ細胞試料及び３つのヘテロ接合Ｖ２２０Ｉ変異含有ＰＢＭＣ細胞を２ｕｇ／ｍｌのＬＰＳで２４時間処理してから、ヒトサイトカインアレイ（Ｒ＆Ｄ）を使用して、サイトカイン放出についてアッセイした。
【図４Ｄ】ＦＢＸＯ３がＶ２２０で自然発生変異を含有することを示す図であり、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイを示す。精製したＳＣＦＦＢＸＯ３又はＳＣＦＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉ変異体の複合体成分をＶ５−ＦＢＸＬ２およびユビキチン化反応成分の完全な補足物と共にインキュベートし、これはポリユビキチン化したＦＢＸＬ２のレベルを示す。
【図４Ｅ】ＦＢＸＯ３がＶ２２０で自然発生変異を含有することを示す図である。Ｖ５−ＷＴ  ＦＢＸＯ３又はＶ５−ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉ変異体のプラスミドで細胞をトランスフェクトし、続いて、Ｖ５、ＦＢＸＬ２及びＴＲＡＦタンパク質について免疫ブロットを行った。
【図４Ｆ】ＦＢＸＯ３がＶ２２０で自然発生変異を含有することを示す図である。Ｕ９３７細胞をさらに２４時間ＬＰＳで処理してから、ヒトサイトカインアレイ（Ｒ＆Ｄ）を使用して、サイトカイン分泌についてアッセイした。
【図５Ａ】ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＢＸＯ３の機能喪失型変異体であることを示す図である。レンチウイルスによるＦＢＸＯ３遺伝子導入は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ誘導性の肺炎症及び傷害の重症度を増大する。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、レンチ−ＬａｃＺ、レンチ−ＦＢＸＯ３又はレンチ−ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉを１２０時間気管内（ｉ．ｔ．）投与し（１０７ＣＦＵ／マウス）、４匹のマウス／群に、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＰＡ１０３、１０４ＰＦＵ／マウス）を２４時間接種した。マウスをＦｌｅｘｉＶｅｎｔによってモニターして、肺機能を測定した。
【図５Ｂ】ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＢＸＯ３の機能喪失型変異体であることを示す図である。レンチウイルスによるＦＢＸＯ３遺伝子導入は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ誘導性の肺炎症及び傷害の重症度を増大する。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、レンチ−ＬａｃＺ、レンチ−ＦＢＸＯ３又はレンチ−ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉを１２０時間気管内（ｉ．ｔ．）投与し（１０７ＣＦＵ／マウス）、４匹のマウス／群に、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＰＡ１０３、１０４ＰＦＵ／マウス）を２４時間接種した。マウスをＦｌｅｘｉＶｅｎｔによってモニターして、肺機能を測定した。
【図５Ｃ】ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＢＸＯ３の機能喪失型変異体であることを示す図である。レンチウイルスによるＦＢＸＯ３遺伝子導入は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ誘導性の肺炎症及び傷害の重症度を増大する。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、レンチ−ＬａｃＺ、レンチ−ＦＢＸＯ３又はレンチ−ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉを１２０時間気管内（ｉ．ｔ．）投与し（１０７ＣＦＵ／マウス）、４匹のマウス／群に、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＰＡ１０３、１０４ＰＦＵ／マウス）を２４時間接種した。マウスをＦｌｅｘｉＶｅｎｔによってモニターして、肺機能を測定した。
【図５Ｄ】ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＢＸＯ３の機能喪失型変異体であることを示す図である。レンチウイルスによるＦＢＸＯ３遺伝子導入は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ誘導性の肺炎症及び傷害の重症度を増大する。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、レンチ−ＬａｃＺ、レンチ−ＦＢＸＯ３又はレンチ−ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉを１２０時間気管内（ｉ．ｔ．）投与し（１０７ＣＦＵ／マウス）、４匹のマウス／群に、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＰＡ１０３、１０４ＰＦＵ／マウス）を２４時間接種した。マウスをＦｌｅｘｉＶｅｎｔによってモニターして、肺機能を測定した。
【図５Ｅ】ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＢＸＯ３の機能喪失型変異体であることを示す図である。マウスを次いで屠殺し、肺を生理食塩水で洗浄し、回収し、次いでホモジナイズし、洗浄タンパク質を測定した。
【図５Ｆ】ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＢＸＯ３の機能喪失型変異体であることを示す図である。マウスを次いで屠殺し、肺を生理食塩水で洗浄し、回収し、次いでホモジナイズし、洗浄細胞数を測定した。
【図５Ｇ】ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＢＸＯ３の機能喪失型変異体であることを示す図である。（図５Ａ）の肺試料についてＨ＆Ｅ染色を実施した。
【図５Ｈ】ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＢＸＯ３の機能喪失型変異体であることを示す図である。ＰＡ１０３（１０５ＰＦＵ／マウス、群当たり７匹のマウス）をｉ．ｔ．投与したマウスの生存研究を判定した。マウスを注意深く経時的にモニターし、瀕死の、死亡する前の動物は直ちに安楽死させ、死亡したと記録した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、カプランマイヤー生存曲線を作成した。
【図５Ｉ】ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＢＸＯ３の機能喪失型変異体であることを示す図である。マウスを次いで屠殺し、肺を生理食塩水で洗浄し、回収し、次いでホモジナイズし、サイトカイン分泌を測定した。
【図６Ａ】ＦＢＸＯ３ノックダウンが、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ誘導性肺傷害を回復させることを示す図である。レンチウイルスのＦＢＸＯ３ノックダウンは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ誘導性肺炎症及び傷害の重症度を弱める。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、コントロール（ＣＯＮ）ｓｈＲＮＡ又はレンチ−ＦＢＸＯ３  ｓｈＲＮＡ（１０７ＣＦＵ／マウス）をコードするレンチウイルスを１２０時間ｉ．ｔ．投与し、４匹のマウス／群に、ＰＡ１０３（１０４ＰＦＵ／マウス）を２４時間接種した。マウスをＦｌｅｘｉＶｅｎｔによってモニターして、肺機能を測定した。
【図６Ｂ】ＦＢＸＯ３ノックダウンが、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ誘導性肺傷害を回復させることを示す図である。レンチウイルスのＦＢＸＯ３ノックダウンは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ誘導性肺炎症及び傷害の重症度を弱める。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、コントロール（ＣＯＮ）ｓｈＲＮＡ又はレンチ−ＦＢＸＯ３  ｓｈＲＮＡ（１０７ＣＦＵ／マウス）をコードするレンチウイルスを１２０時間ｉ．ｔ．投与し、４匹のマウス／群に、ＰＡ１０３（１０４ＰＦＵ／マウス）を２４時間接種した。マウスをＦｌｅｘｉＶｅｎｔによってモニターして、肺機能を測定した。
【図６Ｃ】ＦＢＸＯ３ノックダウンが、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ誘導性肺傷害を回復させることを示す図である。レンチウイルスのＦＢＸＯ３ノックダウンは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ誘導性肺炎症及び傷害の重症度を弱める。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、コントロール（ＣＯＮ）ｓｈＲＮＡ又はレンチ−ＦＢＸＯ３  ｓｈＲＮＡ（１０７ＣＦＵ／マウス）をコードするレンチウイルスを１２０時間ｉ．ｔ．投与し、４匹のマウス／群に、ＰＡ１０３（１０４ＰＦＵ／マウス）を２４時間接種した。マウスをＦｌｅｘｉＶｅｎｔによってモニターして、肺機能を測定した。
【図６Ｄ】ＦＢＸＯ３ノックダウンが、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ誘導性肺傷害を回復させることを示す図である。レンチウイルスのＦＢＸＯ３ノックダウンは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ誘導性肺炎症及び傷害の重症度を弱める。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、コントロール（ＣＯＮ）ｓｈＲＮＡ又はレンチ−ＦＢＸＯ３  ｓｈＲＮＡ（１０７ＣＦＵ／マウス）をコードするレンチウイルスを１２０時間ｉ．ｔ．投与し、４匹のマウス／群に、ＰＡ１０３（１０４ＰＦＵ／マウス）を２４時間接種した。マウスをＦｌｅｘｉＶｅｎｔによってモニターして、肺機能を測定した。
【図６Ｅ】ＦＢＸＯ３ノックダウンが、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ誘導性肺傷害を回復させることを示す図である。マウスを次いで屠殺し、肺を生理食塩水で洗浄し、回収し、次いでホモジナイズした。洗浄タンパク質を測定した。
【図６Ｆ】ＦＢＸＯ３ノックダウンが、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ誘導性肺傷害を回復させることを示す図である。マウスを次いで屠殺し、肺を生理食塩水で洗浄し、回収し、次いでホモジナイズした。洗浄細胞数を測定した。
【図６Ｇ】ＦＢＸＯ３ノックダウンが、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ誘導性肺傷害を回復させることを示す図である。（図６Ａ）の肺試料についてＨ＆Ｅ染色を実施した。
【図６Ｈ】ＦＢＸＯ３ノックダウンが、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ誘導性肺傷害を回復させることを示す図である。マウスを次いで屠殺し、肺を生理食塩水で洗浄し、回収し、次いでホモジナイズした。サイトカイン分泌を測定した。
【図６Ｉ】ＦＢＸＯ３ノックダウンが、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ誘導性肺傷害を回復させることを示す図である。ＰＡ１０３（１０５ＰＦＵ／マウス、群当たり６匹のマウス）をｉ．ｔ．投与したマウスの生存研究を判定した。マウスを注意深く経時的にモニターし、瀕死の、死亡する前の動物は直ちに安楽死させ、死亡したと記録した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、カプランマイヤー生存曲線を作成した。
【図７Ａ】ＦＢＸＯ３の構造解析が細菌様ＡｐａＧドメインを明らかにすることを示す図である。ＦＢＸＯ３の幾つかの欠失変異体を設計し、ｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−ＨＩＳベクターにクローニングした。
【図７Ｂ】ＦＢＸＯ３の構造解析が細菌様ＡｐａＧドメインを明らかにすることを示す図であり、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイを示す。精製したＳＣＦＦＢＸＯ３完全長（ＦＬ）又はトランケート型ＦＢＸＯ３タンパク質をＶ５−ＦＢＸＬ２およびユビキチン化反応成分の完全な補足物と共にインキュベートし（左から２番目のレーン）、これはポリユビキチン化したＦＢＸＬ２を示す。
【図７Ｃ】ＦＢＸＯ３の構造解析が細菌様ＡｐａＧドメインを明らかにすることを示す図であり、ＦＢＸＯ３−ＡｐａＧドメインの構造解析を示す。
【図７Ｄ】ＦＢＸＯ３の構造解析が細菌様ＡｐａＧドメインを明らかにすることを示す図であり、ＦＢＸＯ３−ＡｐａＧドメインと相互作用する候補化合物、ベンザチン、のドッキング研究を示す。
【図７Ｅ】ＦＢＸＯ３の構造解析が細菌様ＡｐａＧドメインを明らかにすることを示す図であり、ＦＢＸＯ３−ＡｐａＧドメインと相互作用する候補化合物、ベンザチン、のドッキング研究を示す。
【図７Ｆ】ＦＢＸＯ３の構造解析が細菌様ＡｐａＧドメインを明らかにすることを示す図であり、ＦＢＸＯ３−ＡｐａＧドメインと相互作用する候補化合物、ベンザチン、のドッキング研究を示す。
【図８Ａ】ＦＢＸＯ３阻害剤の生成及びドッキング解析を示す図であり、ベンザチン類似体合成の一般的テーマを示す。簡単に述べると、目的のベンザチン類似体は、ベンズアルデヒド誘導体及びジアミン誘導体、例えばエチレンジアミンから調製した。一般に、適切なベンズアルデヒド誘導体（０．０２ｍｏｌ）を、エチレンジアミン（０．０１ｍｏｌ、約７００ｕｌ）の無水エタノール溶液（２０ｍｌ）に加えた。得られた溶液を還流し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで６０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。添加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ベンザチン誘導体の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【図８Ｂ】ＦＢＸＯ３阻害剤の生成及びドッキング解析を示す図であり、ベンザチン類似体合成の一般的テーマを示す。新規ＦＢＸＯ３阻害剤、ＢＣ−１２１５の構造及びドッキング研究を示す。
【図８Ｃ】ＦＢＸＯ３阻害剤の生成及びドッキング解析を示す図であり、ベンザチン類似体合成の一般的テーマを示す。新規ＦＢＸＯ３阻害剤、ＢＣ−１２１５の構造及びドッキング研究を示す。
【図８Ｄ】ＦＢＸＯ３阻害剤の生成及びドッキング解析を示す図であり、ベンザチン類似体合成の一般的テーマを示す。新規ＦＢＸＯ３阻害剤、ＢＣ−１２１５の構造及びドッキング研究を示す。
【図９】ＢＣ−１２１５がＴｈ１パネルサイトカインの広域スペクトルを阻害することを示す図である。ＰＢＭＣ細胞（１．５＊１０６／ｍｌで０．６ｍｌ）を、１０ｕｇ／ｍｌのＢＣ−１２１５と共に２ｕｇ／ｍｌのＬＰＳで１６時間処理した。サイトカイン放出を、ヒトサイトカインアレイ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）によってモニターした。サイトカインアレイドットブロットの結果を定量化し、下にグラフ化した。
【図１０Ａ】ＢＣ−１２１５が、ＦＢＸＯ３を阻害し、ＴＲＡＦタンパク質レベルを低下させることを示す図である。ＰＢＭＣ細胞を２ｕｇ／ｍｌのＬＰＳを用いて各時点で処理してから、示したタンパク質について免疫ブロットを行った。
【図１０Ｂ】ＢＣ−１２１５が、ＦＢＸＯ３を阻害し、ＴＲＡＦタンパク質レベルを低下させることを示す図であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイを示す。精製したＳＣＦＦＢＸＯ３複合体成分を、Ｖ５−ＦＢＸＬ２およびユビキチン化反応成分の完全な補足物と共にインキュベートし、ＢＣ−１２１５の濃度の増大はポリユビキチン化したＦＢＸＬ２レベルの減少を示した。
【図１０Ｃ】ＢＣ−１２１５が、ＦＢＸＯ３を阻害し、ＴＲＡＦタンパク質レベルを低下させることを示す図である。ＭＬＥ細胞も様々な濃度のＢＣ−１２１５で１６時間処置した。細胞を集め、免疫ブロットに関するアッセイを行った。
【図１０Ｄ】ＢＣ−１２１５が、ＦＢＸＯ３を阻害し、ＴＲＡＦタンパク質レベルを低下させることを示す図である。Ｈｅｌａ細胞を様々な濃度のＢＣ−１２１５で２４時間処理してから、細胞周期を解析した（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。
【図１０Ｅ】ＢＣ−１２１５が、ＦＢＸＯ３を阻害し、ＴＲＡＦタンパク質レベルを低下させることを示す図である。ＭＬＥ細胞をＢＣ−１２１５（１０ｕｇ／ｍｌ）で２４時間処理してから、ＣＯＸ−２活性についてアッセイした（Ｃａｙｍａｎ）。
【図１１】ＢＣ−１２１５が、内毒素敗血症性ショックモデルにおけるサイトカイン放出を阻害することを示す図である。ＢＣ−１２１５を、酢酸を使用して１：２のモル比で水に可溶化した；ＢＣ−１２１５の保存液は５ｍｇ／ｍｌであった。Ｃ５７ＢＬ６マウスを、ケタミン（８０〜１００ｍｇ／ｋｇ腹腔内（ｉ．ｐ．））及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で深麻酔した。５００ｕｇ、１００ｕｇ、２０ｕｇ、４ｕｇ及び０．８ｕｇのＢＣ−１２１５を腹腔内（ＩＰ）注射によってマウスに投与した。１０分後に、マウスに１００ｕｇのＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ）をＩＰ注射によって与えた。９０分後にマウスを安楽死させ、採血し、ＩＬ１−β、ＩＬ−６及びＴＮＦαアッセイを試験した（各用量でｎ＝３／マウス群）。
【図１２】ＢＣ−１２１５が、盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）敗血症モデルにおいてサイトカイン放出を阻害することを示す図である。上記のようにＢＣ−１２１５を可溶化した。Ｃ５７ＢＬ６マウスを、ケタミン（８０〜１００ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で深麻酔した。１００ｕｇのＢＣ−１２１５をＩＰ注射によってマウスに投与した。３０分後にＣＬＰを実施した。６時間後にマウスを安楽死させ、採血し、ＩＬ１−β、ＩＬ−６及びＴＮＦαレベルについてアッセイした（ｎ＝４〜５マウス／群、ＣＬＰに対して＊ｐ＜０．０５）。
【図１３Ａ】ＢＣ−１２１５が緑膿菌肺炎において肺傷害を軽減させることを示す図である。ＢＣ−１２１５（１００ｕｇ）を、ＩＰ注射によってＣ５７ＢＬ６マウスに投与した。次いでマウスを、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（株ＰＡ１０３、１０４ＣＦＵ／マウス、ｉ．ｔ．）でさらに１８時間攻撃感染した。マウスをＦｌｅｘｉＶｅｎｔによってモニターして、肺機能を測定した（ｎ＝４〜６マウス／群、ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５）。
【図１３Ｂ】ＢＣ−１２１５が緑膿菌肺炎において肺傷害を軽減させることを示す図である。ＢＣ−１２１５（１００ｕｇ）を、ＩＰ注射によってＣ５７ＢＬ６マウスに投与した。次いでマウスを、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（株ＰＡ１０３、１０４ＣＦＵ／マウス、ｉ．ｔ．）でさらに１８時間攻撃感染した。マウスをＦｌｅｘｉＶｅｎｔによってモニターして、肺機能を測定した（ｎ＝４〜６マウス／群、ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５）。
【図１３Ｃ】ＢＣ−１２１５が緑膿菌肺炎において肺傷害を軽減させることを示す図である。ＢＣ−１２１５（１００ｕｇ）を、ＩＰ注射によってＣ５７ＢＬ６マウスに投与した。次いでマウスを、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（株ＰＡ１０３、１０４ＣＦＵ／マウス、ｉ．ｔ．）でさらに１８時間攻撃感染した。マウスをＦｌｅｘｉＶｅｎｔによってモニターして、肺機能を測定した（ｎ＝４〜６マウス／群、ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５）。
【図１３Ｄ】ＢＣ−１２１５が緑膿菌肺炎において肺傷害を軽減させることを示す図である。ＢＣ−１２１５（１００ｕｇ）を、ＩＰ注射によってＣ５７ＢＬ６マウスに投与した。次いでマウスを、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（株ＰＡ１０３、１０４ＣＦＵ／マウス、ｉ．ｔ．）でさらに１８時間攻撃感染した。マウスをＦｌｅｘｉＶｅｎｔによってモニターして、肺機能を測定した（ｎ＝４〜６マウス／群、ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５）。
【図１３Ｅ】ＢＣ−１２１５が緑膿菌肺炎において肺傷害を軽減させることを示す図である。マウスを次いで屠殺し、肺を生理食塩水で洗浄し、回収し、次いでホモジナイズした。洗浄タンパク質を測定した（ｎ＝４〜６マウス／群、ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５）。
【図１３Ｆ】ＢＣ−１２１５が緑膿菌肺炎において肺傷害を軽減させることを示す図である。マウスを次いで屠殺し、肺を生理食塩水で洗浄し、回収し、次いでホモジナイズした。洗浄細胞数を測定した（ｎ＝４〜６マウス／群、ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５）。
【図１３Ｇ】ＢＣ−１２１５が緑膿菌肺炎において肺傷害を軽減させることを示す図である。Ｈ＆Ｅ染色を肺試料について実施した（ｎ＝４〜６マウス／群）。
【図１３Ｈ】ＢＣ−１２１５が緑膿菌肺炎において肺傷害を軽減させることを示す図である。マウスを次いで屠殺し、肺を生理食塩水で洗浄し、回収し、次いでホモジナイズした。サイトカイン分泌を測定した（ｎ＝４〜６マウス／群、ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５）。
【図１４Ａ】ＢＣ−１２１５が、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ肺炎の重症度を減らすことを示す図である。Ｃ５７ＢＬ６マウスを、Ｈ１Ｎ１（１０６ＰＦＵ／マウス、ｉ．ｔ．）で９日間まで攻撃感染した。ＢＣ−１２１５処理については、保存液（５ｍｇ／ｍｌ）を飲料水（２％ショ糖を含有）に加えて、３０ｕｇ／ｍｌの終濃度にした。ＦｌｅｘｉＶｅｎｔを使用して、肺機能を５日目に測定した（ｎ＝５〜８マウス／群、Ｈ１Ｎ１に対して＊ｐ＜０．０５）。
【図１４Ｂ】ＢＣ−１２１５が、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ肺炎の重症度を減らすことを示す図である。Ｃ５７ＢＬ６マウスを、Ｈ１Ｎ１（１０６ＰＦＵ／マウス、ｉ．ｔ．）で９日間まで攻撃感染した。ＢＣ−１２１５処理については、保存液（５ｍｇ／ｍｌ）を飲料水（２％ショ糖を含有）に加えて、３０ｕｇ／ｍｌの終濃度にした。ＦｌｅｘｉＶｅｎｔを使用して、肺機能を５日目に測定した（ｎ＝５〜８マウス／群、Ｈ１Ｎ１に対して＊ｐ＜０．０５）。
【図１４Ｃ】ＢＣ−１２１５が、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ肺炎の重症度を減らすことを示す図である。Ｃ５７ＢＬ６マウスを、Ｈ１Ｎ１（１０６ＰＦＵ／マウス、ｉ．ｔ．）で９日間まで攻撃感染した。ＢＣ−１２１５処理については、保存液（５ｍｇ／ｍｌ）を飲料水（２％ショ糖を含有）に加えて、３０ｕｇ／ｍｌの終濃度にした。ＦｌｅｘｉＶｅｎｔを使用して、肺機能を５日目に測定した（ｎ＝５〜８マウス／群、Ｈ１Ｎ１に対して＊ｐ＜０．０５）。
【図１４Ｄ】ＢＣ−１２１５が、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ肺炎の重症度を減らすことを示す図である。Ｃ５７ＢＬ６マウスを、Ｈ１Ｎ１（１０６ＰＦＵ／マウス、ｉ．ｔ．）で９日間まで攻撃感染した。ＢＣ−１２１５処理については、保存液（５ｍｇ／ｍｌ）を飲料水（２％ショ糖を含有）に加えて、３０ｕｇ／ｍｌの終濃度にした。Ｈ１Ｎ１（１０５ＰＦＵ／マウス、８マウス／群）でｉ．ｔ．投与したマウスの生存を研究した。マウスを注意深く経時的にモニターし、瀕死の、死亡する前の動物は直ちに安楽死させ、死亡したと記録した（ｎ＝５〜８マウス／群、Ｈ１Ｎ１に対して＊ｐ＜０．０５）。
【図１４Ｅ】ＢＣ−１２１５が、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ肺炎の重症度を減らすことを示す図である。マウスを次いで屠殺し、肺を生理食塩水で洗浄し、回収し、次いでホモジナイズした。洗浄細胞数を測定した（ｎ＝５〜８マウス／群、Ｈ１Ｎ１に対して＊ｐ＜０．０５）。
【図１４Ｆ】ＢＣ−１２１５が、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ肺炎の重症度を減らすことを示す図である。マウスを次いで屠殺し、肺を生理食塩水で洗浄し、回収し、次いでホモジナイズした。洗浄タンパク質を測定した（ｎ＝５〜８マウス／群、Ｈ１Ｎ１に対して＊ｐ＜０．０５）。
【図１４Ｇ】ＢＣ−１２１５が、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ肺炎の重症度を減らすことを示す図であり、ビヒクル又はＢＣ−１２１５で処理したマウス由来の肺の写真である。
【図１４Ｈ】ＢＣ−１２１５が、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ肺炎の重症度を減らすことを示す図である。Ｈ＆Ｅ染色を肺試料について実施した。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃは、ＢＣ−１２１５が、ＴＰＡ誘導性耳浮腫を軽減させることを示す図である。図１５Ａ〜１５Ｃ．Ｃ５７ＢＬ６マウスをケタミン（８０〜１００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で深麻酔した。ＴＰＡ投与（２μｇ／耳）３０分後に、ＢＣ−１２１５の２０μｌエタノール溶液を８、４０、２００ｕｇ／耳で耳に塗った。比較は、等容量のエタノール（ビヒクルコントロール）を含んでいた。ＴＰＡ投与１８時間後にマウスを安楽死させ、マイクロメーターを使用して耳の厚さを測定した（図１５Ｂ）。耳のパンチ生検物も直ちに取得し、秤量し、グラフ化した（図１５Ｃ）。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃは、ＢＣ−１２１５が、カラゲナン誘導性足浮腫を軽減させることを示す図である。図１６Ａ〜１６Ｃ．Ｃ５７ＢＬ６マウスをケタミン（８０〜１００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で深麻酔した。マウスに２５ｕｌの生理食塩水又は２５ｕｌのカラゲナン（生理食塩水中１％）を足底下に投与し、続いて、１００ｕｇのＢＣ−１２１５を２日間毎日ＩＰ注射した。マウスを安楽死させ、足の厚さおよび体積を測定した（図１６Ｂ〜１６Ｃ）（ｎ＝４匹のマウス／群、ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５）。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｄは、ＢＣ−１２１５が、ＤＳＳ誘導性結腸炎症を軽減させることを示す図である。図１７Ａ〜１７Ｃ．Ｃ５７ＢＬ６マウスに、３．５％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を含有する水を５日間まで与えた。マウスを、ビヒクル又は１００ｕｇのＢＣ−１２１５のいずれかで毎日（ＩＰ注射によって）処理した。次いで、マウスを安楽死させた。結腸の長さを測定し、グラフ化した（図１７Ａ）。結腸組織はまた、ＥＬＩＳＡによって、ＩＬ１β（図１７Ｂ）およびＴＮＦα（図１７Ｃ）について解析した（ｎ＝４マウス／群、ＤＳＳに対して＊ｐ＜０．０５）。図１７Ｄ、Ｈ＆Ｅ染色を結腸試料について実施した（ｎ＝４マウス／群、ＤＳＳに対して＊ｐ＜０．０５）。
【図１８】ＦＢＸＯ３によって触媒される新規な提唱炎症経路を示す図である。感染症又は自己免疫障害は以下の経路：ＦＢＸＯ３┤ＦＢＸＬ２┤ＴＲＡＦ→サイトカイン産生→組織の炎症、傷害及び浮腫、を含み得る。特に、局部的及び全身的炎症は、以前に認識されていなかったＥ３リガーゼ成分、ＦＢＸＯ３が別のＥ３リガーゼサブユニット、ＦＢＸＬ２のユビキチン化及び分解を誘発し、それによって、炎症細胞からのサイトカイン分泌を媒介するＴＲＡＦタンパク質のレベルを増大させる独特な経路によって部分的に調節される。本質的に、ＦＢＸＬ２は、炎症のフィードバック阻害因子であるように思われる。ＴＲＡＦは、ＮＦ−κを介するサイトカイン遺伝子発現に対する重要な分子インプットであるので、ＦＢＸＯ３の変異又は阻害は、ＴＲＡＦタンパク質の誘導を妨げ、サイトカイン産生を抑制することになる。ＦＢＸＯ３は、Ｆボックスタンパク質ユビキチンＥ３リガーゼの阻害剤の生成を導いた、本発明の中核としての新規な分子標的として働く。
【図１９】Ｋｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒ抗生物質試験を示す図である。ＢＣ−１２１５を、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天培地を使用する抗生物質感受性試験で試験した。簡単に述べると、様々な量のＢＣ−１２１５又はゲンタマイシン（陽性コントロール）を含有する６ｍｍの濾紙をＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天培地上に加えてから、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに曝露した。このプレートを３７度で２４時間インキュベートした。ゾーンサイズを測定し、陽性の結果を示す赤丸で印をつけた。このデータは、ＢＣ−１２１５は、細菌性ＡｐａＧタンパク質との相互作用を通して細菌の増殖を阻害することができることを示唆する。
【図２０Ａ】ベンザチン化合物及びアッセイ結果を示す表である。ＰＢＭＣ細胞（１．５＊１０６／ｍｌで０．６ｍｌ）を、様々な濃度の各化合物と共に２ｕｇ／ｍｌのＬＰＳで１６時間処理した。ＩＬ１β及びＴＮＦαサイトカイン放出をＥＬＩＳＡによってモニターして、ＩＣ５０を計算した。Ｕ９３７単球（１．５＊１０６／ｍｌで０．６ｍｌ）を様々な濃度の各化合物で１６時間処理した。次いで、細胞をトリパンブルーで染色して、死細胞を識別し、ＬＤ５０を計算した。治療指数（ＴＩ）＝ＬＤ５０／ＩＣ５０。赤色で印をつけた化合物は、値が高い目的物（低ＩＣ５０、高ＬＤ５０）であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでのさらなる試験を必要とする。
【図２０Ｂ】ベンザチン化合物及びアッセイ結果を示す表である。
【図２０Ｃ】ベンザチン化合物及びアッセイ結果を示す表である。
【図２０Ｄ】ベンザチン化合物及びアッセイ結果を示す表である。
【図２０Ｅ】ベンザチン化合物及びアッセイ結果を示す表である。
【図２０Ｆ】ベンザチン化合物及びアッセイ結果を示す表である。
【図２０Ｇ】ベンザチン化合物及びアッセイ結果を示す表である。
【図２０Ｈ】ベンザチン化合物及びアッセイ結果を示す表である。
【図２０Ｉ】ベンザチン化合物及びアッセイ結果を示す表である。
【図２０Ｊ】ベンザチン化合物及びアッセイ結果を示す表である。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｅは、ＢＣ−１２６１が、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ誘導性肺炎症を軽減させることを示す図である。ＢＣ−１２６１をｉ．ｐ．注射によってマウスに投与し、次いでマウスを、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（株ＰＡ１０３、２．５＊１０４ｃｆｕ／マウス、ｉ．ｔ．）又はＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなし（コントロール、ＣＯＮ）でさらに１８時間直ちに攻撃感染した。次いでマウスを安楽死させ、肺を生理食塩水で洗浄し、回収し、次いでホモジナイズした。洗浄タンパク質、細胞数およびサイトカイン分泌を測定した（Ａ〜Ｃ）。Ｄ．洗浄細胞をシトシンで処理し、メイグリュンワルドギムザで染色した。Ｅ．Ｈ＆Ｅ染色を肺試料について実施した。データは、ｎ＝４マウス／群、ＰＡ１０３に対して＊Ｐ＜０．０５を表す。
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｃは、ＢＣ−１２６１が、喫煙誘導性慢性肺炎症を軽減させることを示す図である。マウスを巻タバコの煙に５週間曝露してから、１用量のＢＣ１２６１（１００ｕｇ）のｉ．ｐ．注射を行い、１８時間後に、マウスを安楽死させ、肺を生理食塩水で洗浄し、回収し、次いでホモジナイズした。洗浄タンパク質、細胞数およびサイトカイン分泌を測定した（Ａ〜Ｃ）。データは、ｎ＝３マウス／群、コントロールに対して＊Ｐ＜０．０５を表す。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｄは、ＢＣ−１２６１が、ＴＰＡ誘導性耳浮腫を軽減させることを示す図である。ＴＰＡ投与（２μｇ／耳）３０分後に、異なる用量のＢＣ−１２６１をマウスの耳に様々な用量で塗った。Ａ．ビヒクルコントロール（ＣＯＮ）としての等容量のエタノールとの肉眼的比較を行った。ＴＰＡ投与１８時間後にマウスを安楽死させ、マイクロメーターを使用して耳の厚さを測定した（Ｂ）。剖検試料も取得し、ＭＰＯ活性を測定し（Ｃ）、耳浮腫を計算した（Ｄ）。データは、ｎ＝６マウス／群、ＴＰＡに対して＊Ｐ＜０．０５を表す。
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｄは、ＢＣ−１２６１が、ＤＳＳ誘導性急性結腸炎症を軽減させることを示す図である。Ａ〜Ｄ．Ｃ５７ＢＬ６マウスに、３．５％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を含有する水を５日間まで自由に与えた。マウスを、ビヒクル（コントロール［ＣＯＮ］）又はＢＣ−１２６１（１５０μｇ）のいずれかで毎日（ｉ．ｐ．注射によって）処理するか、又はＢＣ−１２６１を３０μｇ／ｍｌで飲料水中に投与した（ｐｏ）。次いで、マウスを安楽死させ、結腸の長さを測定し、グラフ化した（Ａ〜Ｂ）。結腸組織を、ＴＮＦα（Ｃ）およびＩＬ６（Ｄ）についても解析した。Ｅ．Ｈ＆Ｅ染色を結腸の切片について実施した。データは、ｎ＝４マウス／群、ＤＳＳに対して＊Ｐ＜０．０５及びコントロールに対して＊＊Ｐ＜０．０５を表す。
【図２５】図２５Ａ〜２５Ｊは、ＢＣ−１２６１が、ＤＳＳ誘導性慢性結腸炎症を軽減させることを示す図である。Ａ．最高３サイクルまでにわたり、Ｃ５７ＢＬ６マウスに２％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を含有する水を６日間自由に与え、次いで水に切り替えた。ＢＣ−１２６１を３０μｇ／ｍｌで飲料水中に投与し、これは、７日目に開始した。実験の終わりにマウスを安楽死させ、結腸の長さを測定し、グラフ化した（Ｂ〜Ｃ）。疾患指数を測定し、グラフ化した（Ｄ）。血清サイトカインレベルを測定した（Ｅ〜Ｆ）。結腸組織サイトカインおよびＭＰＯ活性も解析した（Ｇ〜Ｊ）。データは、ｎ＝７マウス／群、コントロールに対して＊Ｐ＜０．０５を表す。
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｃは、ＦＢＸＯ３−ＡｐａＧドメインとの化合物ＢＣ−１２３４のドッキング研究を示す図である。Ａ．ＢＣ−１２３４の構造の構造を示す。Ｂ．ＢＣ−１２３４は、ＦＢＸＯ３のＡｐａＧモチーフ内のＧｌｕ６４及びＴｈｒ９１残基と相互作用する。Ｃ．ＦＢＸＯ３−ＡｐａＧモチーフと相互作用する、最高のドッキングスコアを有するＢＣ−１２３４の５ポーズを示す。Ｄ．ＢＣ−１２３４をＭＬＥ（マウス上皮細胞）でさらに試験した。簡単に述べると、ＭＬＥ細胞を様々な濃度のＢＣ−１２３４で１６時間処理した。次いで細胞を集め、オーロラＢ、サイクリンＤ３、ＦＢＸＬ２及びＦＢＸＯ３の免疫ブロットについてアッセイした。
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｇは、ＢＣ−１２５８が、癌細胞においてＧ２／Ｍ停止及びアポトーシスを誘導することを示す図である。Ａ．５つのコントロール、ＡＭＬ及びＡＬＬの対象由来のＰＢＭＣをＲＰＭＩ培地で１８時間培養した。次いで細胞を集め、溶解し、タンパク質免疫ブロットについてアッセイした。Ｂ〜Ｄ．ヒト白血病細胞（Ｕ９３７、Ｋ５６２およびＴＨＰ１細胞）を、様々な濃度のＢＣ−１２５８で１６時間処理した。細胞を集め、オーロラＢ、サイクリンＤ２、サイクリンＤ３及びＦＢＸＬ２の免疫ブロットについてアッセイした。Ｅ〜Ｆ．ＭＬＥ細胞を様々な濃度のＢＣ−１２５８で１６時間処理し、細胞を、ＢｒｄＵの取り込み及び７−ＡＡＤ染色によって処理し、続いてＦＡＣＳによる細胞周期解析を行い（Ｅ）、２Ｎ、４Ｎ及び８Ｎ  ＤＮＡのヒストグラムを定量化し、グラフ化した（Ｆ）。Ｇ．ＦＡＣＳ解析の定量化によって、各時点でのＢＣ−１２５８処理後のアポトーシス性ＭＬＥ細胞のレベルが示される。
【図２８】図２８Ａ〜２８Ｉは、ＢＣ−１２５８が、異種移植における腫瘍増殖を抑制することを示す図である。Ａ〜Ｅ．ヌードマウスにおけるＵ９３７腫瘍移植片の増殖に対するＢＣ−１２５８及び他の化合物の効果を示す（ｎ＝４マウス／群、薬物濃度は飲料水中に３０ｕｇ／ｍｌ）。パネルＡは、薬物処理後の３匹のヌードマウスにおける異種移植片（矢印）の代表的な可変サイズの画像を示した。Ｂ．経時的な腫瘍体積測定（ｎ＝４マウス／群、コントロールに対して＊Ｐ＜０．０５）。Ｄ．Ｃの腫瘍組織を秤量し、グラフ化した（ｎ＝４マウス／群、コントロールに対して＊Ｐ＜０．０５）。Ｅ．マウスにおける３つのコントロール及び３つの薬物処理したＵ９３７移植片由来の腫瘍をエンドポイントで集め、免疫ブロットによって、オーロラＢ、ＣａＭ及びＦＢＸＬ２タンパク質についてアッセイした。Ｆ〜Ｉ．各マウスの血清をエンドポイントで集め、クレアチニン、ＬＤＨ、ＡＬＴおよびクレアチンキナーゼ活性について処理した。
【図２９】ＡｐａＧの薬物結合モチーフを示す図である。
【図３０】化合物ＢＣ−１２６１及びＢＣ−１２３４とのＦＢＸＯ３−ＡｐａＧの相互作用を示す図である。
【図３１】化合物ＢＣ−１３０４とのＦＢＸＯ３−ＡｐａＧの相互作用を示す図である。
【図３２】化合物ＢＣ−１３０５とのＦＢＸＯ３−ＡｐａＧの相互作用を示す図である。
【図３３】化合物ＢＣ−１３０５とのＦＢＸＯ３−ＡｐａＧの相互作用（第２の位置）を示す図である。
【図３４】化合物ＢＣ−１３０６とのＦＢＸＯ３−ＡｐａＧの相互作用を示す図である。
【図３５】化合物ＢＣ−１３０７とのＦＢＸＯ３−ＡｐａＧの相互作用を示す図である。
【図３６】化合物ＢＣ−１３０８とのＦＢＸＯ３−ＡｐａＧの相互作用を示す図である。
【図３７】化合物ＢＣ−１３０９とのＦＢＸＯ３−ＡｐａＧの相互作用を示す図である。
【図３８】化合物ＢＣ−１２１５及びＢＣ−１２６１についての毒性スクリーニングを要約する表である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
配列表
添付の配列表に載せたアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義された、アミノ酸に関する標準的な３文字コードを使用して示される。この配列表は、２０１３年３月１１日に作成された４．４７ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出され、参考として本明細書に組み込まれる。
【００２１】
専門用語
本明細書で使用する場合、単数形の用語「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈において別段に明記しない限り、複数の指示物を含む。また、本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。
【００２２】
本明細書に記載のものと類似又は等価の方法及び材料を本開示の実施又は試験において使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。さらに、材料、方法及び例は例示にすぎず、制限を意図したものではない。
【００２３】
本開示の様々な例を検討しやすくするために、特定の用語についての以下の説明を提供する。
「アシル」は、構造−Ｃ（Ｏ）Ｒを有する基であって、式中Ｒが、例えば、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリール又は置換されていてもよいヘテロアリールでもよい基を指す。「低級アシル」基は、１から６個の炭素原子を含有するものである。
【００２４】
「アシルオキシ」は、構造−ＯＣ（Ｏ）Ｒ−を有する基であって、式中Ｒが、例えば、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリール又は置換されていてもよいヘテロアリールでもよい基を指す。「低級アシルオキシ」基は、１から６個の炭素原子を含有する。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「投与」は、別の人間による対象への投与又は対象による自己投与を含める。
用語「脂肪族」は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン化アルキル及びシクロアルキル基を含むと定義される。「低級脂肪族」基は、１から１０個の炭素原子を有する、分枝又は非分枝の脂肪族基である。
【００２６】
「アルカンジイル」、「シクロアルカンジイル」、「アリールジイル」、「アルカンアリールジイル」は、脂肪族、環状脂肪族、アリール及びアルカンアリール炭化水素に由来する二価の基を指す。
【００２７】
「アルケニル」は、炭素及び水素のみを含有する、環状、分枝又は直鎖の基を指し、結合していてもしていなくてもよい、１つ又は複数の二重結合を含有する。アルケニル基は、無置換でも、置換されていてもよい。「低級アルケニル」基は、１から６個の炭素原子を含有する。
【００２８】
用語「アルコキシ」は、結合点に酸素原子を含む、１から２０個の炭素原子、好ましくは１から８個の炭素原子（「低級アルコキシ」と称される）、より好ましくは１から４個の炭素原子を含む、直鎖、分枝又は環状の炭化水素構造及びそれらの組み合わせを指す。「アルコキシ基」の例は、式−ＯＲによって表され、式中Ｒは、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ又はヘテロシクロアルキル基で置換されていてもよい、アルキル基でもよい。適切なアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシシクロプロポキシ、シクロヘキシルオキシなどが挙げられる。
【００２９】
「アルコキシカルボニル」は、アルコキシ置換されたカルボニル基、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ（式中Ｒは、置換されていてもよいアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル又は類似の部分を表す）を指す。
【００３０】
用語「アルキル」は、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどの、１から２４個の炭素原子の分枝又は非分枝の飽和炭化水素基を指す。「低級アルキル」基とは、１から６個の炭素原子を有する分枝又は非分枝の飽和炭化水素である。好ましいアルキル基は、１から４個の炭素原子を有する。アルキル基は、１つ又は複数の水素原子がハロゲン、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、ヒドロキシル、アリール、アルケニル又はカルボキシルなどの置換基で置換されている「置換されたアルキル」でもよい。例えば、低級アルキル又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ペンチル、３−ペンチル又はヘキシルでもよく；（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル又はシクロヘキシルでもよく；（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルは、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、２−シクロプロピルエチル、２−シクロブチルエチル、２−シクロペンチルエチル又は２−シクロヘキシルエチルでもよく；（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｉｓｏ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ペントキシ、３−ペントキシ又はヘキシルオキシでもよく；（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニルは、ビニル、アリル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル又は５−ヘキセニルでもよく；（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルは、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル又は５−ヘキシニルでもよく；（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノイルは、アセチル、プロパノイル又はブタノイルでもよく；ハロ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルは、ヨードメチル、ブロモメチル、クロロメチル、フルオロメチル、トリフルオロメチル、２−クロロエチル、２−フルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル又はペンタフルオロエチルでもよく；ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルは、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１−ヒドロキシペンチル、５−ヒドロキシペンチル、１−ヒドロキシヘキシル又は６−ヒドロキシヘキシルでもよく；（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニルは、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ペントキシカルボニル又はヘキシルオキシカルボニルでもよく；（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルチオは、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、イソブチルチオ、ペンチルチオ又はヘキシルチオでもよく；（Ｃ２〜Ｃ６）アルカノイルオキシは、アセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシ、イソブタノイルオキシ、ペンタノイルオキシ又はヘキサノイルオキシでもよい。
【００３１】
「アルキニル」は、炭素及び水素のみを含有する環状、分枝又は直鎖の基を指し、１つ又は複数の三重結合を含有する。アルキニル基は、無置換でも、置換されていてもよい。「低級アルキニル」基は、１から６個の炭素原子を含有するものである。
【００３２】
用語「アミン」又は「アミノ」は、Ｒ及びＲ’が、独立に、水素又はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、ハロゲン化アルキル若しくはヘテロシクロアルキル基でもよい、式−ＮＲＲ’の基を指す。例えば、「アルキルアミノ」又は「アルキル化アミノ」は、−Ｒ又はＲ’の少なくとも１つがアルキルであるＮＲＲ’を指す。
【００３３】
「アミノカルボニル」は、単独又は組み合わせで、アミノ基が、例えばアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アラルコキシカルボニルなどで一又は二置換されていてもよい、アミノ置換されたカルボニル（カルバモイル）基を意味する。アミノカルボニル基は、−Ｎ（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ（式中Ｒは置換された基又はＨである）でもよい。適切なアミノカルボニル基はアセタミドである。
【００３４】
用語「アミド（ａｍｉｄｅ）」又は「アミド（ａｍｉｄｏ）」は、Ｒ及びＲ’が独立に、上記の水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、ハロゲン化アルキル又はヘテロシクロアルキル基である、式−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’によって表される。
【００３５】
「類似体」は、親化合物と化学構造が異なる分子であり、例えば、相同体（アルキル鎖の長さの違い又は１つ若しくは複数の同位体の含有など、化学構造若しくは質量における増分により異なる）、分子破片、１つ若しくは複数の官能基が異なる構造、又はイオン化の変化である。類似体は、親化合物から必ずしも合成されるとは限らない。誘導体は、基本構造に由来する分子である。
【００３６】
「動物」は、例えば哺乳動物及びトリを含むカテゴリーである、生きている多細胞脊椎生物を指す。用語、哺乳動物は、ヒトとヒト以外の哺乳動物の両方を含む。同様に、用語「対象」は、ヒトと非ヒト対象の両方を含み、トリ及びヒト以外の哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、伴侶動物（イヌ及びネコなど）、家畜（ブタ、ヒツジ、ウシなど）、並びに大形ネコ科動物などの非飼育動物が含まれる。用語、対象は、生物の生活環のステージにかかわらず適用する。したがって、用語対象は、生物（すなわち、生物が哺乳動物であるかトリ、例えば家禽又は野鳥であるか）に応じて、ｉｎ  ｕｔｅｒｏ又はｉｎ  ｏｖｏの生物に適用する。
【００３７】
「アリール」は、無置換でも置換されていてもよい、単環（例えば、フェニル）又は縮合多環（例えば、ナフチル又はアンスリル）を有する、一価の不飽和芳香族炭素環式基を指す。「ヘテロアリール基」は、芳香族基の環の中に組み込まれた少なくとも１つのヘテロ原子を有する芳香族基と定義される。ヘテロ原子の例としては、これらに限定されないが、窒素、酸素、硫黄及び亜リン酸が挙げられる。ヘテロアリールとしては、これらに限定はされないが、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、キノキサリニルなどが挙げられる。アリール又はヘテロアリール基は、これらに限定されないが、アルキル、アルキニル、アルケニル、アリール、ハライド、ニトロ、アミノ、エステル、ケトン、アルデヒド、ヒドロキシ、カルボン酸又はアルコキシを含めた１つ又は複数の基で置換されていてもよいし、アリール又はヘテロアリール基は無置換でもよい。
【００３８】
用語「アラルキル」は、アリール基がアルキル基の水素について置換されたアルキル基を指す。アラルキル基の例はベンジル基である。
「アリールオキシ」又は「ヘテロアリールオキシ」は、それぞれＡｒがアリール基又はヘテロアリール基である、式−ＯＡｒの基を指す。
【００３９】
原子座標又は構造座標は、タンパク質などの原子（散乱中心）によるＸ線の単色ビーム回折により得られたパターンに関する数学的方程式から導かれた数学的座標を指す。幾つかの例では、そのタンパク質は結晶状態のＦＢＸＯ３タンパク質であり得る。回折データを使用して、結晶の繰り返し単位の電子密度図を計算する。電子密度図を使用して、結晶の単位格子内のそれぞれの原子の位置を確定する。一例を挙げれば、用語「構造座標」は、結晶形態のＦＢＸＯ３タンパク質の原子などによるＸ線の単色ビーム回折により得られたパターンに関する数学的方程式から導かれるデカルト座標を指す。Ｘ線結晶解析により決定された構造座標セットは、標準誤差を伴わないことはないことを当業者なら理解する。本開示において、骨格原子を使用してスーパーインポーズした時に、約１．０オングストローム未満、例えば約０．７５、又は約０．５、又は約０．２５オングストロームのタンパク質骨格原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ及び０）の平均二乗偏差を有する任意の構造座標セットは、（そうでないとの明確な記述がない場合）同一とみなすべきである。
【００４０】
用語「カルボキシレート」又は「カルボキシル」は、基−ＣＯＯ−又は−ＣＯＯＨを指す。
用語「同時投与」又は「同時投与する」は、大体の同じ期間内での少なくとも１つの他の治療薬を伴うＦＢＸＯ３阻害剤の投与を指し、（同時投与は、正確な同じ時点で投与することを含めるが）正確な同じ時点での投与を必要としない。したがって、同時投与は、同一日、又は別の日、又は同一週、又は別の週でもよい。ＦＢＸＯ３阻害剤と同じ組成物にさらなる治療薬を含むことができる。
【００４１】
用語「シクロアルキル」は、少なくとも３個の炭素原子で構成される非芳香族の炭素を基本とする環を指す。シクロアルキル基の例としては、これらに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられる。用語「ヘテロシクロアルキル基」は、環の炭素原子の少なくとも１つがヘテロ原子、例えばこれらに限定されないが、窒素、酸素、硫黄又は亜リン酸で置換されている、上記で定義されたシクロアルキル基である。
【００４２】
用語「エステル」は、例えば、Ｃ１〜６アルキル基（「カルボキシルＣ１〜６アルキル」又は「アルキルエステル」）、アリール又はアラルキル基（「アリールエステル」又は「アラルキルエステル」）などで置き換えられた水素を有するカルボキシル基を指す。ＣＯ２Ｃ１〜３アルキル基が好ましく、例えば、メチルエステル（ＣＯ２Ｍｅ）、エチルエステル（ＣＯ２Ｅｔ）及びプロピルエステル（ＣＯ２Ｐｒ）などであり、これには、それらのリバースエステル（例えば−ＯＣＯＭｅ、−ＯＣＯＥｔ及び−ＯＣＯＰｒ）が含まれる。
【００４３】
用語「ハロゲン」は、フルオロ、ブロモ、クロロ及びヨード置換基を指す。
用語「ハロゲン化アルキル」又は「ハロアルキル基」は、これらの基に存在する１つ又は複数の水素原子がハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）で置換された、上記で定義されたアルキル基を指す。
【００４４】
用語「ヒドロキシル」は、式−ＯＨによって表される。
「阻害する」は、疾患又は状態の完全な発達を阻害することを指す。「阻害する」は、生物活性又は結合の、コントロールに対する任意の量的又は質的な低減も指す。
【００４５】
「Ｎ−複素環式基」又は「Ｎ−複素環」は、少なくとも１つの窒素ヘテロ原子を含む単環式又は二環式の環又は環系を指す。環又は環系は、ヘテロ原子（複数可）に加えて１から９個の炭素原子を一般に含み、飽和でも、不飽和でも、芳香族（擬似芳香族を含める）でもよい。用語「擬似芳香族」は、厳密には芳香族ではないが、電子の非局在化によって安定化し、芳香環と同様な方法で挙動する環系を指す。芳香族には、ピロリル環などの擬似芳香環系が含まれる。
【００４６】
５員単環式のＮ−複素環の例としては、ピロリル、Ｈ−ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、オキサゾリル、オキサジアゾリル（１，２，３及び１，２，４オキサジアゾリルを含める）、イソオキサゾリル、フラザニル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、トリアゾリル（１，２，３及び１，３，４トリアゾリルを含める）、テトラゾリル、チアジアゾリル（１，２，３及び１，３，４チアジアゾリルを含める）、並びにジチアゾリルが挙げられる。６員単環式のＮ−複素環の例としては、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペラジニル及びトリアジニルが挙げられる。複素環は、広い範囲の置換基で、好ましくは、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、トリフルオロメチル、アミノ、シアノ又はモノ若しくはジ（Ｃ１〜６アルキル）アミノで置換されていてもよい。Ｎ−複素環式基は、炭素環式環、例えばフェニル、ナフチル、インデニル、アズレニル、フルオレニル及びアントラセニルに縮合していてもよい。
【００４７】
８、９及び１０員の二環式複素環の例としては、１Ｈチエノ［２，３−ｃ］ピラゾリル、インドリル、イソインドリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、イソキノリニル、キノリニル、キノキサリニル、プリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾトリアジニルなどが挙げられる。これらの複素環は、例えば、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、トリフルオロメチル、アミノ、シアノ又はモノ若しくはジ（Ｃ１〜６アルキル）アミノで置換されていてもよい。別段定義しない限り、置換されていてもよいＮ−複素環式基は、ピリジニウム塩及び適切な環窒素のＮ−オキシド形態を含む。
【００４８】
「ニトロ」は、構造−ＮＯ２を有するＲ基を指す。
「Ｒ基」又は「置換基」は、典型的には水素原子の代わりに、原子又は分子中の原子に共有結合的に結合して、原子又は分子の原子の原子価要求を満たす、単一原子（例えばハロゲン原子）又は共有結合的に互いに結合した一群の２つ以上の原子を指す。Ｒ基／置換基の例としては、アルキル基、水酸基、アルコキシ基、アシルオキシ基、メルカプト基及びアリール基が挙げられる。
【００４９】
用語「対象」は、ヒト及び非ヒト対象の両方を含み、トリ及びヒト以外の哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、伴侶動物（イヌ及びネコなど）、家畜（ブタ、ヒツジ、ウシなど）、及び大形ネコ科動物などの非飼育動物が含まれる。用語、対象は、生物の生活環のステージにかかわらず適用する。したがって、用語、対象は、生物（すなわち、生物が哺乳動物であるかトリ、例えば家禽又は野鳥であるかであるか）に応じて、ｉｎ  ｕｔｅｒｏ又はｉｎ  ｏｖｏの生物に適用する。
【００５０】
「置換された」又は「置換」は、分子又はＲ基の水素原子を１つ又は複数のさらなるＲ基で置き換えることを指す。別段定義しない限り、本明細書で使用する場合、用語「置換されていてもよい」又は「随意の置換基」は、１、２、３、４又はそれ以上の基、好ましくは１、２又は３、より好ましくは１又は２の基でさらに置換されていても、されていなくてもよい基を指す。置換基は、例えば、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜８シクロアルキル、ヒドロキシル、オキソ、Ｃ１〜６アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ１〜６アルコキシアリール、ハロ、Ｃ１〜６アルキルハロ（ＣＦ３及びＣＨＦ２など）、Ｃ１〜６アルコキシハロ（ＯＣＦ３及びＯＣＨＦ２など）、カルボキシル、エステル、シアノ、ニトロ、アミノ、置換アミノ、二置換アミノ、アシル、ケトン、アミド、アミノアシル、置換アミド、二置換アミド、チオール、アルキルチオ、チオキソ、スルフェート、スルホネート、スルフィニル、置換スルフィニル、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルアミド、置換スルホンアミド、二置換スルホンアミド、アリール、ａｒＣ１〜６アルキル、ヘテロシクリル及びヘテロアリール（各アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール及びヘテロシクリル並びにそれらを含有する基は、さらに置換されていてもよい）から選択することができる。Ｎ−複素環の場合の随意の置換基には、これらに限定されないが、Ｃ１〜６アルキル、すなわちＮ−Ｃ１〜３アルキル、より好ましくはメチル、特にＮ−メチルも含まれ得る。
【００５１】
「治療有効量」は、その薬剤を用いて治療を受ける対象において所望の効果を得るのに十分な特定の薬剤の量を指す。例えば、治療量は、対象の炎症を阻害するのに十分なＦＢＸＯ３阻害剤の量でもよい。理想的には、治療有効量の薬剤は、対象において実質的な細胞傷害性作用を引き起こすことなく、疾患又は状態を阻害又は治療するのに十分な量である。治療有効量の薬剤は、治療を受ける対象、病気の重症度及び治療組成物の投与方式によって決まる。
【００５２】
「治療」は、疾患又は病態の徴候又は症状を、それが発生し始めてから回復させる治療介入を指す。本明細書で使用する場合、疾患又は病態に関する用語「回復させる」は、任意の観察可能な治療の有益効果を指す。有益効果は、例えば、感受性の高い対象における疾患の臨床症状発症の遅延、疾患の幾つかの若しくはすべての臨床症状の重症度の低減、疾患の進行遅延、対象の全体的な健康若しくは健康状態の改善、又は特定の疾患に特異的な、当技術分野で周知である他のパラメーターによって証明することができる。フレーズ「疾患を治療する」は、例えば、癌などの疾患の危険性がある対象において、疾患の完全な発達を阻害することを指す。疾患又は状態を「予防する」は、病状若しくは状態の発達の危険性を低下させる、又は病状若しくは状態の重症度を減じる目的で、疾患の徴候を示さない又は初期兆候のみを示す対象に、組成物を予防的に投与することを指す。本明細書に開示する特定の実施形態では、治療は、対象の炎症を阻害する。
【００５３】
「医薬組成物」とは、１つ又は複数の開示化合物の量（例えば単位投薬量）を、１つ又は複数の無毒性の薬学的に許容される添加物（担体、希釈剤及び／又はアジュバント並びに任意の他の生物学的に活性な処方成分が含まれる）と共に含む組成物である。そうした医薬組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（第１９版）に開示されているものなどの標準的な医薬製剤法によって調製することができる。
【００５４】
用語「薬学的に許容される塩又はエステル」は、例えば、これらに限定されないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、リンゴ酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、マレイン酸、サリチル酸、安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸などを含めた無機酸及び有機酸の塩を含む、従来の手段によって調製される塩又はエステルを指す。本明細書中に開示された化合物の「薬学的に許容される塩」としては、カチオン、例えばナトリウム、カリウム、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、亜鉛から形成されるもの、及び塩基、例えばアンモニア、エチレンジアミン、Ｎ−メチル−グルタミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及びテトラメチル水酸化アンモニウムから形成されるものも挙げられる。これらの塩は、標準的な手順によって、例えば、遊離酸を適切な有機塩基又は無機塩基と反応させることによって調製することができる。本明細書で詳述する任意の化学化合物を、それらの薬学的に許容される塩として代わりに投与することができる。「薬学的に許容される塩」は、遊離酸、塩基及び双性イオン性形態も含める。適切な薬学的に許容される塩に関する解説は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ、Ｗｉｌｅｙ  ＶＣＨ（２００２）に見出すことができる。本明細書に開示する化合物がカルボキシ基などの酸性官能基を含む場合は、そのカルボキシ基に適切な薬学的に許容されるカチオン対は当業者に周知であり、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウム、４級アンモニウムカチオンなどが挙げられる。そうした塩は当業者に知られている。「薬理学的に許容される塩」のさらなる例については、Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１（１９７７）を参照されたい。
【００５５】
「薬学的に許容されるエステル」としては、カルボキシル基を含むように改変された、本明細書に記載の化合物に由来するものが挙げられる。ｉｎ  ｖｉｖｏで加水分解性のエステルは、ヒト又は動物の体内で加水分解されて、親の酸又はアルコールを生成するエステルである。したがって代表的なエステルとしては、エステル基のカルボン酸部分の非カルボニル部分が、直鎖若しくは分枝鎖アルキル（例えば、メチル、ｎ−プロピル、ｔ−ブチル若しくはｎ−ブチル）、シクロアルキル、アルコキシアルキル（例えばメトキシメチル）、アラルキル（例えばベンジル）、アリールオキシアルキル（例えばフェノキシメチル）、アリール（例えばハロゲン、Ｃ１−４アルキル若しくはＣ１−４アルコキシ若しくはアミノなどによって置換されていてもよいフェニル）から選択される、カルボン酸エステル；スルホネートエステル、例えばアルキルスルホニル若しくはアラルキルスルホニル（例えばメタンスルホニル）；又はアミノ酸エステル（例えば、Ｌ−バリル又はＬ−イソロイシル）が挙げられる。「薬学的に許容されるエステル」としては、無機エステル、例えば、一、二又は三リン酸エステルも挙げられる。そうしたエステルでは、別段の指定がない限り、存在する任意のアルキル部分は、有利には、１から１８個の炭素原子、特に１から６個の炭素原子、より詳細には、１から４個の炭素原子を含有する。そうしたエステルに存在する任意のシクロアルキル部分は、有利には、３から６個の炭素原子を含有する。そうしたエステルに存在する任意のアリール部分は、有利には、上記のカルボシクリルの定義で示すように置換されていてもよいフェニル基を包含する。したがって、薬学的に許容されるエステルとしては、Ｃ１〜Ｃ２２脂肪酸エステル、例えばアセチル、ｔ−ブチル、又は長鎖直鎖若しくは分枝の不飽和若しくはω−６一不飽和脂肪酸、例えばパルモイル（ｐａｌｍｏｙｌ）、ステアロイルなどが挙げられる。代替のアリール又はヘテロアリールエステルとしては、ベンゾイル、ピリジルメチロイル（ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌｏｙｌ）など（これらのいずれも上記のカルボシクリルで定義されたように置換されていてもよい）が挙げられる。さらなる薬学的に許容されるエステルとしては、脂肪族Ｌ−アミノ酸エステル、例えばロイシル、イソロイシル及び特にバリルが挙げられる。
【００５６】
治療的使用については、化合物の塩は、対イオンが薬学的に許容されるものである。しかし、薬学的に許容されない、酸及び塩基の塩も、例えば、薬学的に許容される化合物の調製又は精製に使用され得る。
【００５７】
前述の薬学的に許容される酸付加塩及び塩基付加塩は、化合物が形成可能な、治療的に活性な無毒性の酸付加塩及び塩基付加塩形態を包含することが意図されている。薬学的に許容される酸付加塩は、好都合には、そうした適切な酸で塩基形態を処理することによって得ることができる。適切な酸は、例えば、無機酸、例えばハロゲン化水素酸、例えば塩酸若しくは臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など；又は有機酸、例えば、酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸（すなわちエタン二酸）、マロン酸、コハク酸（すなわちブタン二酸）、マイレン酸、フマル酸、リンゴ酸（すなわちヒドロキシブタン二酸）、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサルチル酸、パモン酸などを包含する。逆に、前記塩形態は、適切な塩基で処理することによって遊離塩基形態に変換することができる。
【００５８】
適切な有機塩基及び無機塩基で処理することによって、酸性プロトンを含有する化合物をその無毒性の金属又はアミン付加塩形態に変換することもできる。適切な塩基塩形態は、例えば、アンモニウム塩、アルカリ及びアルカリ土類金属塩、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム塩など、有機塩基を含む塩、例えばベンザチン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ヒドラバミン塩、及びアミノ酸、例えば、アルギニン、リジンなどを含む塩を包含する。
【００５９】
上記で使用される用語「付加塩」は、本明細書に記載の化合物が形成可能な溶媒和化合物も包含する。そうした溶媒和化合物は、例えば水和物、アルコラートなどである。
上記で使用される用語「４級アミン」は、化合物が、化合物の塩基性窒素と適切な４級化剤、例えば、置換されていてもよいアルキルハライド、アリールハライド又はアリールアルキルハライド、例えばメチルヨウ化物又はベンジルヨウ化物などとの間の反応によって形成可能な４級アンモニウム塩を定義する。アルキルトリフルオロメタンスルホン酸、アルキルメタンスルホン酸及びアルキルｐ−トルエンスルホネートなどの、好適な脱離基を有する他の反応体を使用することもできる。４級アミンは、正に帯電している窒素を有する。薬学的に許容される対イオンとしては、クロロ、ブロモ、ヨード、トリフルオロアセテート及びアセテートが挙げられる。選択した対イオンは、イオン交換樹脂を使用して導入することができる。
【００６０】
本明細書に記載の幾つかの化合物は、その互変異性型でも存在し得る。
開示化合物のプロドラッグも本明細書で企図される。プロドラッグは、対象へのプロドラッグの投与に続いて、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生理作用、例えば加水分解、代謝などを通して活性化合物へ化学的に変えられる、活性又は非活性の化合物である。本文全体を通して使用される用語「プロドラッグ」は、誘導体のｉｎ  ｖｉｖｏ生体内変換産物が本明細書に記載の化合物で定義された活性薬物をもたらすような、エステル、アミド及びホスフェートなどの薬理学的に許容される誘導体を意味する。プロドラッグは、好ましくは、水溶解度が優れ、生物学的利用能が増大され、ｉｎ  ｖｉｖｏで活性阻害剤に容易に代謝される。本明細書に記載の化合物のプロドラッグは、通常の操作又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで修飾が切断されて親化合物になるように、化合物に存在する官能基を修飾することによって調製することができる。プロドラッグの作製及び使用に関する適合性及び技法は、当業者に周知である。エステルを含むプロドラッグの一般的な議論については、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ及びＴｕｎｅｋ、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６５（１９８８）、並びにＢｕｎｄｇａａｒｄ、Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８５）を参照されたい。
【００６１】
用語「プロドラッグ」は、プロドラッグが対象に投与される時に本発明の活性な親薬物をｉｎ  ｖｉｖｏで放出する、任意の共有結合的に結合した担体を含むことも意図される。プロドラッグは、活性薬剤の医薬と比較して、溶解度及び生物学的利用能などの特質が高められていることが多いので、本明細書に開示する化合物は、プロドラッグ形態で送達することができる。したがって、本明細書中に開示された化合物のプロドラッグ、プロドラッグの送達方法及びそうしたプロドラッグを含有する組成物も企図される。典型的には、開示化合物のプロドラッグは、通常の操作又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで修飾が切断されて親化合物をもたらすように、１つ又は複数の化合物に存在する官能基を修飾することによって調製される。プロドラッグは、ｉｎ  ｖｉｖｏで切断されて、それぞれ対応するアミノ及び／又はホスホネート基を生じる任意の基で官能化された、ホスホネート及び／又はアミノ基を有する化合物を含む。プロドラッグの例としては、限定はされないが、アシル化されたアミノ基及び／又はホスホネートエステル若しくはホスホネートアミド基を有する化合物が挙げられる。特定例としては、プロドラッグは、低級アルキルホスホネートエステル、例えばイソプロピルホスホネートエステルである。
【００６２】
開示化合物の保護された誘導体も企図される。開示化合物と共に使用するための種々の適切な保護基が、Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；第３版；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９に開示されている。
【００６３】
一般に、保護基は、分子の残りの部分に影響を及ぼさない条件下で除去される。こうした方法は、当技術分野で周知であり、酸性加水分解、水素化分解などを含む。１つの好ましい方法は、例えば遊離ホスホネートをもたらすためのＴＭＳ−Ｂｒ媒介性エステル切断における、Ｌｅｗｉｓの酸性条件を使用するホスホネートエステルの切断などの、エステルの除去を含む。第２の好ましい方法は、アルコール、酢酸など又はそれらの混合物などの適切な溶剤系においてパラジウム炭素を利用する水素化分解によるベンジル基の除去などの、保護基の除去を含む。ｔ−ブトキシカルボニル保護基を含めたｔ−ブトキシ系の基は、水、ジオキサン及び／又は塩化メチレンなどの適切な溶剤系中で、ＨＣｌ又はトリフルオロ酢酸などの無機酸又は有機酸を利用して除去することができる。アミノ及びヒドロキシ官能アミノを保護するのに適した別の例示的な保護基はトリチルである。他の従来の保護基が知られており、適切な保護基は、Ｇｒｅｅｎｅ及びＷｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；第３版；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９を参照して、当業者が選択することができる。アミンが脱保護される場合は、得られた塩は容易に中和されて、遊離アミンをもたらすことができる。同様に、ホスホン酸部分などの酸部分が曝露される場合は、化合物は、酸化合物又はその塩として分離され得る。
【００６４】
本明細書中に開示された化合物の特定例としては１つ又は複数の不斉中心が挙げられ、したがって、これらの化合物は、異なる立体異性型で存在し得る。したがって、化合物及び組成物は、それぞれの純粋な鏡像異性体又はラセミ混合物を含めた、立体異性混合物として提供され得る。特定の実施形態では、本明細書に開示する化合物は、９０％鏡像体過剰率、９５％鏡像体過剰率、９７％鏡像体過剰率、又はさらに９９％を越える鏡像体過剰率などで、例えばエナンチオピュアな形態などで、実質的にエナンチオピュアな形態で合成されるか、又はその形態であるように精製される。
【００６５】
幾つかの実施形態では、置換されている基（例えば置換アルキル）は、置換されている基（例えば置換アリール）で置換されてもよい。幾つかの実施形態では、互いに連結している置換基の数が２個に限定される（例えば、置換アルキルが置換アリールで置換され、アリールに存在する置換基はこれ以上置換されない）。幾つかの実施形態では、置換基は別の置換基で置換されない（例えば、置換アルキルは無置換のアリールで置換される）。
【００６６】
概要
病原体が、比較的最近同定されたＦＢＸＯ３（配列番号１）と呼ばれるユビキチンＥ３リガーゼサブユニットを活性化し、これは、ＦＢＸＬ２と呼ばれる、比較的最近同定された別のユビキチンＥ３リガーゼサブユニットをユビキチン化し、プロテアソーム分解を媒介するのに十分であることが発見された。さらに、ＦＢＸＬ２が、タンパク質のＴＲＡＦファミリーを、上皮及び単球においてそれらを取り除くために標的化することによって、炎症における「ブレーク」として機能することも発見された。したがって、病原体は、ＦＢＸＯ３の活性化を介して、ＦＢＸＬ２をユビキチン化及び分解し、その結果、免疫反応性のＴＲＡＦを増加させ、サイトカイン産生を増大させ、肺安定性を損なわせる。特に、本明細書に開示するデータは、ｉ）ＦＢＸＬ２は、６つのＴＲＡＦファミリータンパク質（ＴＲＡＦ１〜６）をユビキチン化及び分解の標的にすること、（ｉｉ）ＦＢＸＯ３は、特異的に、ＦＢＸＬ２をユビキチン化及び分解の標的にすること、（ｉｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ３β）がＦＢＸＬ２をリン酸化し、その結果、ＦＢＸＯ３がＦＢＸＬ２をユビキチン化するための、新規な分子シグナルとして働くこと、及び（ｉｖ）野生型（Ｗｔ）ＦＢＸＯ３と比較して、天然に存在するＦＢＸＯ３点変異体（ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉ）の発現は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染後にサイトカイン産生を刺激せず、ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉの発現は、肺炎のマウスモデルにおいて炎症性肺傷害の重症度を減らすことを示す。
【００６７】
ＦＢＸＯ３の発見は、それが、哺乳類タンパク質で認められない細菌様の分子シグネチャーをその３次構造内に含有するので、特に重要である。ＡｐａＧと呼ばれるこのモチーフは、ＦＢＸＯ３活性をブロックし、ＴＲＡＦレベルを天然レベルまで低減させ、ヒト細胞からのサイトカイン放出を大きく阻害し、敗血症動物モデルにおいて炎症の重症度を減らす、本明細書中に開示された、非常に独特な、選択的な系統の小分子療法の開発につながった。試験時にヒト末梢血単核球からのリポ多糖（ＬＰＳ）誘導性サイトカイン分泌を弱める、ＦＢＸＯ３の一連の小分子阻害剤を生成した。一実施形態では、ＦＢＸＯ３阻害剤ＢＣ−１２１５は、幾つかの動物モデルにおいて、炎症を阻害し、組織損傷を予防する。
【００６８】
サイトカインシグナル伝達に関する先天免疫の新しい分子モデルを本明細書に提供する。ＴＲＡＦタンパク質シグナル伝達を通してサイトカイン応答に新しく関連づけられた、以前に十分に特徴づけされていない２種のタンパク質（ＦＢＸＯ３、ＦＢＸＬ２）が発見された。本明細書に開示する研究は、ＦＢＸＬ２−ＴＲＡＦ−サイトカイン系を活性化すると思われる酵素的挙動をするＦＢＸＯ３を明らかにする最初のものである。以前に認識されていなかった、ＴＲＡＦ炎症経路におけるＦＢＸＯ３の活性の新規な機構に基づいて、本明細書に開示する薬剤は、Ｆボックスタンパク質内の独特な原核生物の分子シグネチャーを標的にする。ＦＢＸＯ３の非常に選択的な小分子阻害剤として働き、且つ敗血症性ショック、肺炎及び他の炎症性状態の予防及び治療に有用であり得るベンザチン化合物を本明細書に開示する。
【００６９】
化合物
一実施形態では、ＦＢＸＯ３阻害剤が本明細書に開示される。例示的なＦＢＸＯ３阻害剤としては、ベンザチン化合物、置換されていてもよいジアミノアルカン（例えば１，１０−ジアミノデカン）、置換されたキノリン（例えば、キニジン、ヒドロキシクロロキン、プリマキン）、ヘマトキシリン、テトラメチレンビス、ナフサカイン、アンピシリン及びエリプチン並びに薬学的に許容されるそれらの塩及びエステルが挙げられる。
【００７０】
ベンザチン化合物は、ベンザチンでもよいし、ベンザチン類似体でもよい。特定の実施形態では、ベンザチン化合物はベンザチンペニシリンではない。特定の実施形態では、ベンザチン類似体は、二価のジアミンコア部分、二価のジアミンコア部分の第１末端における第１アリール含有部分、及び二価のジアミンコア部分の第２末端における第２アリール含有部分を含む。ジアミン基の各アミノ基は、個別に−ＮＨ−でも−ＮＲ−でもよく、式中Ｒは記載したような置換基、例えば低級アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アシル、アシルオキシ、アルコキシカルボニル、アリール、カルボキシル又はエステルである。二価のジアミンコア部分は、２つのアミノ基の間に位置する、置換されていてもよいアルカンジイル、置換されていてもよいシクロアルカンジイル、置換されていてもよいアリールジイル又は置換されていてもよいアルカンアリールジイルを含んでいてもよい。特定の実施形態では、ジアミンの２つのアミノ基は、炭素原子と共にヘテロアリールジイル基を形成することができる。末端アリール含有基は、それぞれ個別に、アラルキル基（好ましくはベンジル基）又はＮ−ヘテロアラルキル基、例えば−アルキル−ピラジニル、−アルキル−ピリミジニル、−アルキル−ピリダジニル又は−アルキル−ピリジニルでもよい。アラルキル基のアリール環は、置換されていてもよいＮ−複素環式基で置換されていてもよい。特定の実施形態では、置換されていてもよいＮ−複素環式基は、二価のジアミンコア部分へのアラルキル基の結合点とはパラの環位置に位置する。
【００７１】
例示的なベンザチン類似体としては、置換されていてもよいＮ−複素環式置換ベンザチンが挙げられる。特定の実施形態では、ベンザチン類似体は、２つのフェニル環を含み、これらのフェニル環の少なくとも１つ、好ましくは両方が、置換されていてもよいＮ−複素環式基で置換され、置換されていてもよいＮ−複素環式基は同じでも異なっていてもよい。特定の実施形態では、置換されていてもよいＮ−複素環式基は、ベンザチン分子スキャフォールドへのフェニル環の結合点とはパラの環位置に位置する。
【００７２】
例示的なＮ−複素環式基としては、例えば、ピロリル、Ｈ−ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、オキサゾリル、オキサジアゾリル（１，２，３；１，２，４；及び１，３，４オキサジアゾリルを含める）、イソオキサゾリル、フラザニル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、トリアゾリル（１，２，３及び１，３，４トリアゾリルを含める）、テトラゾリル、チアジアゾリル（１，２，３及び１，３，４チアジアゾリルを含める）、ジチアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペラジニル及びトリアジニルが挙げられる。特に好ましいＮ−複素環式基としては、イミダゾリル、ピリジル、ピラゾリル、オキサジアゾリル及びピリミジニルが挙げられる。
【００７３】
ベンザチン類似体又は薬学的に許容されるその塩若しくはエステルは、式Ｉ：
【００７４】
【化４】
0006275703.tif 000005
【００７５】
（式中、Ｘは二価又は四価の連結部分であり、
Ｒ１〜Ｒ１０は、それぞれ個別に、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよい複素環式基、ハロゲン、アミノ又はヒドロキシである）
の構造を有してもよい。
【００７６】
式Ｉの特定の実施形態では、Ｘは、置換されていてもよいアルカンジイル、置換されていてもよいシクロアルカンジイル、置換されていてもよいアリールジイル又は置換されていてもよいアルカンアリールジイルである。例えば、Ｘは、−ＣｎＨ２ｎ−（式中、ｎは１から１０、より好ましくは２から５である）の構造を有するアルカンジイルでもよく、Ｘは、−Ｃ６Ｈ１０−シクロアルカンジイルでもよく、又はＸは、−Ｃ６Ｈ４−アリールジイルでもよい。特に好ましいＸ部分は−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００７７】
式Ｉの特定の実施形態では、Ｘは、スピロ構造に由来する四価部分であり、ジアミンコアの窒素原子はスピロ構造のＮ−ヘテロ原子を形成する。例えばＸは、ジアミンと共にジアザスピロデカンを形成することができる。ジアザスピロデカンの例は以下の式ＶＩに示される。
【００７８】
式Ｉの特定の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１０の少なくとも１つはＨではない。式Ｉの特定の実施形態では、Ｒ３又はＲ８の少なくとも１つは、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよい複素環式基、ハロゲン、アミノ又はヒドロキシである。式Ｉの特定の実施形態では、Ｒ３又はＲ８の少なくとも１つ、好ましくはＲ３及びＲ８の両方は、無置換のアルコキシ、アリール置換アルコキシ、ハロ置換アルコキシ、アリール、置換されていてもよい複素環式基、ハロゲン、アミノ又はヒドロキシである。式Ｉの特定の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１０の少なくとも１つは、Ｎ−複素環式基、特に５員又は６員Ｎ−複素環式基である。式Ｉの特定の実施形態では、Ｒ３又はＲ８の少なくとも１つ、好ましくはＲ３及びＲ８の両方は、Ｎ−複素環式基、特に５員又は６員Ｎ−複素環式基である。例示的なＮ−複素環式基としては、例えば、ピロリル、Ｈ−ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、（１，２，３；１，２，４；及び１，３，４オキサジアゾリルを含める）イソオキサゾリル、フラザニル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、トリアゾリル（１，２，３及び１，３，４トリアゾリルを含める）、テトラゾリル、チアジアゾリル（１，２，３及び１，３，４チアジアゾリルを含める）、ジチアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペラジニル及びトリアジニルが挙げられる。特に好ましいＮ−複素環式基としては、イミダゾリル、ピリジル、ピラゾリル及びピリミジニルが挙げられる。特に好ましいＮ−複素環式基としては、イミダゾリル、ピリジル及びピラゾリルが挙げられる。式Ｉの特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９及びＲ１０はそれぞれＨである。式Ｉの特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９及びＲ１０はそれぞれＨであり、Ｘは、置換されていてもよいアルカンジイルであり、Ｒ３及びＲ８は、それぞれ個別に、置換されていてもよい５員又は６員Ｎ−複素環式基である。式Ｉの特定の実施形態では、Ｒ３及びＲ８はそれぞれ同じ基である。
【００７９】
さらなる実施形態では、式ＩＩ：
【００８０】
【化５】
0006275703.tif 000006
【００８１】
（式中、Ｘは二価の連結部分であり、
Ｒ１〜Ｒ１０は、それぞれ個別に、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよい複素環式基、ハロゲン、アミノ又はヒドロキシであり、但し、Ｒ３又はＲ８の少なくとも１つが、置換されていてもよいアルキル、置換されたアルコキシ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよい複素環式基又はハロゲンである）
の構造を有する、化合物又は薬学的に許容されるその塩若しくはエステルが本明細書に開示される。
【００８２】
式ＩＩの特定の実施形態では、Ｘは、置換されていてもよいアルカンジイル、置換されていてもよいシクロアルカンジイル、置換されていてもよいアリールジイル又は置換されていてもよいアルカンアリールジイルである。例えば、Ｘは、−ＣｎＨ２ｎ−（式中、ｎは１から１０、より好ましくは２から５である）の構造を有するアルカンジイルでもよく、Ｘは、−Ｃ６Ｈ１０−シクロアルカンジイルでもよく、Ｘは、−Ｃ６Ｈ４−アリールジイルでもよい。特に好ましいＸ部分は、−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００８３】
式ＩＩの特定の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１０の少なくとも１つは、Ｎ−複素環式基、特に５員又は６員Ｎ−複素環式基である。式ＩＩの特定の実施形態では、Ｒ３又はＲ８の少なくとも１つ、好ましくはＲ３及びＲ８の両方は、Ｎ−複素環式基、特に５員又は６員Ｎ−複素環式基である。例示的なＮ−複素環式基としては、例えば、ピロリル、Ｈ−ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、（１，２，３；１，２，４；及び１，３，４オキサジアゾリルを含める）イソオキサゾリル、フラザニル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、トリアゾリル（１，２，３及び１，３，４トリアゾリルを含める）、テトラゾリル、チアジアゾリル（１，２，３及び１，３，４チアジアゾリルを含める）、ジチアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペラジニル及びトリアジニルが挙げられる。特に好ましいＮ−複素環式基としては、イミダゾリル、ピリジル、ピラゾリル、オキサジアゾリル及びピリミジニルが挙げられる。特に好ましいＮ−複素環式基としては、イミダゾリル、ピリジル及びピラゾリルが挙げられる。式ＩＩの特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９及びＲ１０はそれぞれＨである。式ＩＩの特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９及びＲ１０はそれぞれＨであり、Ｘは、置換されていてもよいアルカンジイルであり、Ｒ３及びＲ８は、それぞれ個別に、置換されていてもよい５員又は６員Ｎ−複素環式基である。式ＩＩの特定の実施形態では、Ｒ３及びＲ８はそれぞれ同じ基である。
【００８４】
さらなる実施形態では、
式ＩＩＩ：
【００８５】
【化６】
0006275703.tif 000007
【００８６】
（式中、Ｘは二価の連結部分であり、
Ｒ２〜Ｒ５及びＲ７〜Ｒ１０は、それぞれ個別に、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよい複素環式基、ハロゲン、アミノ又はヒドロキシである）
の構造を有する、化合物又は薬学的に許容されるその塩若しくはエステルが本明細書に開示される。
【００８７】
式ＩＩＩの特定の実施形態では、Ｘは、置換されていてもよいアルカンジイル、置換されていてもよいシクロアルカンジイル、置換されていてもよいアリールジイル又は置換されていてもよいアルカンアリールジイルである。例えば、Ｘは、−ＣｎＨ２ｎ−（式中、ｎは１から１０、より好ましくは２から５である）の構造を有するアルカンジイルでもよく、Ｘは、−Ｃ６Ｈ１０−シクロアルカンジイルでもよく、Ｘは、−Ｃ６Ｈ４−アリールジイルでもよい。特に好ましいＸ部分は、−ＣＨ２−ＣＨ２−である。式ＩＩＩの特定の実施形態では、Ｒ２〜Ｒ５及びＲ７〜Ｒ１０は、それぞれ個別にＨである。
【００８８】
さらなる実施形態では、式ＩＶ：
【００８９】
【化７】
0006275703.tif 000008
【００９０】
（式中、Ｘは二価の連結部分であり、
Ｒ２〜Ｒ４及びＲ７〜Ｒ９は、それぞれ個別に、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよい複素環式基、ハロゲン、アミノ又はヒドロキシである）
の構造を有する、化合物又は薬学的に許容されるその塩若しくはエステルが本明細書に開示される。
【００９１】
式ＩＶの特定の実施形態では、Ｘは、置換されていてもよいアルカンジイル、置換されていてもよいシクロアルカンジイル、置換されていてもよいアリールジイル又は置換されていてもよいアルカンアリールジイルである。例えば、Ｘは、−ＣｎＨ２ｎ−（式中、ｎは１から１０、より好ましくは２から５である）の構造を有するアルカンジイルでもよく、Ｘは、−Ｃ６Ｈ１０−シクロアルカンジイルでもよく、Ｘは、−Ｃ６Ｈ４−アリールジイルでもよい。特に好ましいＸ部分は、−ＣＨ２−ＣＨ２−である。式ＩＶの特定の実施形態では、Ｒ２〜Ｒ５及びＲ７〜Ｒ１０は、それぞれ個別にＨである。
【００９２】
さらなる実施形態では、式Ｖ：
【００９３】
【化８】
0006275703.tif 000009
【００９４】
（式中、Ｘは上記の二価の連結部分であり、
Ｒ２０及びＲ２１は、それぞれ個別に、水素、低級アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アシル、アシルオキシ、アルコキシカルボニル、アリール、カルボキシル又はエステルから選択され、
Ｒ２２及びＲ２３は、それぞれ個別に、置換されていてもよいアリール又は置換されていてもよいＮ−複素環から選択され、但し、Ｒ２２又はＲ２３の少なくとも１つは、置換されていてもよいＮ−複素環である）
の構造を有する、化合物又は薬学的に許容されるその塩若しくはエステルも本明細書に開示される。
【００９５】
式Ｖの特定の好ましい実施形態では、Ｒ２３はＮ−複素環であり、Ｒ２２はＮ−複素環置換フェニル、特に、パラ置換されたＮ−複素環フェニルである。
さらなる実施形態では、式ＶＩ：
【００９６】
【化９】
0006275703.tif 000010
【００９７】
（式中、Ａｒ１及びＡｒ２は、それぞれ独立に、置換されていてもよいアリール又は置換されていてもよいＮ−複素環式基である。例示的なＮ−複素環式基としては、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペラジニル及びトリアジニルが挙げられる。アリール（特にフェニル）又はＮ−複素環式基（特にピリミジニル）は、アルキル（特に低級アルキル）、アルコキシ（特にメトキシ）、アミノカルボニル（特にアセタミド）、ハロゲン又はアルキル置換チオール（特に−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ３）で置換されていてもよい）
の構造を有する、化合物又は薬学的に許容されるその塩若しくはエステルも本明細書に開示される。
【００９８】
さらなる実施形態では、式ＶＩＩ：
【００９９】
【化１０】
0006275703.tif 000011
【０１００】
（式中、Ｘは二価又は四価の連結部分であり、
Ｒ３１〜Ｒ３５は、それぞれ個別に、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよい複素環式基、ハロゲン、アミノ又はヒドロキシであり、
Ｒ３６は、水素、置換されていてもよい低級アルキル、置換されていてもよいアルコキシ、ヒドロキシ、アシル、アシルオキシ、アルコキシカルボニル、置換されていてもよいアリール、カルボキシル又は置換されていてもよいエステルである）
の構造を有する、化合物又は薬学的に許容されるその塩若しくはエステルも本明細書に開示される。
【０１０１】
式ＶＩＩの特定の実施形態では、Ｘは、置換されていてもよいアルカンジイル、置換されていてもよいシクロアルカンジイル、置換されていてもよいアリールジイル又は置換されていてもよいアルカンアリールジイルである。例えば、Ｘは、−ＣｎＨ２ｎ−（式中、ｎは１から１０、より好ましくは２から５である）の構造を有するアルカンジイルでもよく、Ｘは、−Ｃ６Ｈ１０−シクロアルカンジイルでもよく、Ｘは、−Ｃ６Ｈ４−アリールジイルでもよい。特に好ましいＸ部分は、−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【０１０２】
式ＶＩＩの特定の実施形態では、Ｘは、スピロ構造に由来する四価部分であり、ジアミンコアの窒素原子はスピロ構造のＮ−ヘテロ原子を形成する。例えば、Ｘはジアミンと共に、ジアザスピロデカンを形成することができる。ジアザスピロデカンの例は上記の式ＶＩに示される。
【０１０３】
式ＶＩＩの特定の実施形態では、Ｒ３１〜Ｒ３５の少なくとも１つはＨではない。式ＶＩＩの特定の実施形態では、Ｒ３又はＲ８の少なくとも１つが、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよい複素環式基、ハロゲン、アミノ又はヒドロキシである。式Ｉの特定の実施形態では、Ｒ３４は、無置換のアルコキシ、アリール置換アルコキシ、ハロ置換アルコキシ、アリール、置換されていてもよい複素環式基、ハロゲン、アミノ又はヒドロキシである。
【０１０４】
式ＶＩＩの特定の実施形態では、Ｒ３６は、水素、低級アルキル（特にメチル、エチル又はブチル）、メトキシ、ヒドロキシ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４０（Ｒ４０は低級アルキルである）、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ４１−（Ｒ４１は低級アルキルである）、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ４２（Ｒ４２は低級アルキルである）、フェニル又は−ＣＯＯＨである。
【０１０５】
式Ｉ−ＶＩＩの特定の実施形態では、化合物は塩の形態でもよい。例えば、ベンザチン化合物構造内のジアミン部分は、アニオン、例えばアセテート（例えば、化合物ＢＣ−１２１５  ＨＡｃ）、カルボネート、ハライド、シトレート、ニトレート、ニトライト、ホスフェート、ホスホネート、スルフェート、スルホネート又は乳酸と共に塩を形成することができる。特定の実施形態では、式Ｉ−ＶＩＩの化合物は水溶性であるので、その塩形成を可能にする。化合物の水溶性はまた、肺、経口投与用のエアロゾル送達又は局所投与用の乳濁剤中への化合物の処方を可能にする。
【０１０６】
式Ｉ及びＩＩの例示的化合物を図２０の表１に示す。
例示的化合物を以下にも示す。
【０１０７】
【化１１】
0006275703.tif 000012
【０１０８】
【化１２】
0006275703.tif 000013
【０１０９】
【化１３】
0006275703.tif 000014
【０１１０】
使用方法
一実施形態では、本明細書に開示する化合物は、炎症性障害、特にサイトカイン放出、特にサイトカインストームによって媒介される炎症性障害を治療するために使用することができる。例えば、本明細書に開示する化合物は、毒性のある病原体に感染した後に、宿主細胞の傷害、又は関連した免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞、マクロファージなど）上の受容体を活性化する刺激物質に反応して多量の循環炎症性サイトカインの分泌をもたらす高度に活性化された免疫系を特徴とする多くのヒト疾患の根底にある炎症性障害を治療するために使用することができる。こうした感染性障害の主な特色は、サイトカイン放出のバースト、すなわちマクロファージ、リンパ球及びＰＭＮを含めた炎症誘発性細胞からのサイトカインストームである。多くの状態において、サイトカインストームは拡大され（高サイトカイン血症）、免疫反応を致命的にし、免疫エフェクター細胞を絶えず活性化し続け、深刻な組織傷害をもたらす、持続的及び超生理的なレベルのＴＮＦα、ＩＬ−β及びＩＬ−６を産生する。本明細書に開示する化合物は、炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−β、及び／又はＩＬ−６）の放出を阻害することができる。特定の実施形態では、本明細書に開示する化合物は、多くの傷害性サイトカインに汎反応性である。本明細書に開示する化合物は、対象において、炎症を阻害し、組織損傷（例えば肺傷害、特に、細菌性感染由来の肺傷害）を予防する。例えば、本明細書に開示する化合物は、高サイトカイン血症を阻害することができ、並びに／又は超生理的レベルのＴＮＦα、ＩＬ−β、及び／若しくはＩＬ−６、若しくは関連した傷害性分子を防止する又は減じることができる。
【０１１１】
本明細書に開示する化合物によって治療することができる炎症性障害としては、炎症性成分を持つ任意の障害が挙げられる。例示的な炎症性障害としては、急性及び慢性の炎症障害、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、肺臓炎（過敏性肺臓炎及び放射線肺臓炎を含める）、肺炎、嚢胞性線維症、乾癬、関節炎／関節リウマチ、鼻炎、咽頭炎、膀胱炎、前立腺炎、皮膚炎、枯草熱を含めたアレルギー、腎炎、結膜炎、脳炎、髄膜炎、眼球炎、ブドウ膜炎、胸膜炎、心膜炎、心筋炎、アテローム性動脈硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連炎症、糖尿病、骨関節症、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）／大腸炎、敗血症、脈管炎、滑液包炎、結合組織病、自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ性多発筋痛症、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、側頭動脈炎、脈管炎、クリオグロブリン血症、及び多発性硬化症、ウイルス若しくはインフルエンザ誘導性炎症、又は浮腫が挙げられる。本明細書に開示する化合物は、敗血症、肺炎、インフルエンザ誘導性炎症、浮腫、神経症、大腸炎、関節炎、クローン病、糖尿病、皮膚、眼及び耳の炎症（例えば、乾癬、ブドウ膜炎／眼球炎、外耳炎）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療するのに特に有効であり得る。本明細書に開示する化合物は、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによる病原性感染によって誘導される炎症及び組織損傷を治療するのに有用であり得る。本明細書に開示する化合物は、敗血症又は肺炎を治療するのに特に有効であり得る。
【０１１２】
本明細書に開示する特定の実施形態では、化合物は抗菌剤でもよい。この化合物は、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの細菌増殖を阻害する（静菌剤として機能する）ことができる。この化合物は、細菌性ＡｐａＧタンパク質との相互作用を通して細菌の増殖を阻害することができる。この化合物を対象に投与することによって、対象において細菌の増殖を阻害することができる。目的物の表面に化合物を投与又は適用することによって、目的物の表面（例えば、食品、手術用具、台所の表面、病院の表面）での細菌増殖を阻害することができる。
【０１１３】
特定の実施形態では、本明細書に開示する化合物は、他のＦＢＸＯ３媒介性障害又は傷害、例えば、マラリア、有毒な肺曝露、癌、アルツハイマー病又は熱傷関連傷害などを治療するために使用することができる。例示的な癌としては、白血病、リンパ腫、気管支癌、乳房、結腸、卵巣、甲状腺、膵臓、胃及び前立腺の腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、黒色腫、肉腫及び転移性の癌が挙げられる。ＦＢＸＯ３阻害剤はＦＢＸＬ２をアップレギュレートするので、ＦＢＸＯ３阻害剤治療の際に、ＦＢＸＬ２の他の基質、例えばサイクリンＤ２／３、オーロラＢタンパク質が分解されるであろう。サイクリンＤ２／３及びオーロラＢは、十分に説明されている腫瘍性タンパク質であるので、ＦＢＸＯ３阻害剤は、サイクリン及びオーロラＢタンパク質の阻害を通して癌増殖を阻害することができる。
【０１１４】
本明細書に開示される別の実施形態は、対象において炎症性サイトカイン放出を阻害するための方法であって、ＦＢＸＯ３阻害剤を対象に投与するステップを含む方法である。ＦＢＸＯ３阻害剤はＦＢＸＯ３活性を阻害し、細胞中のＴＲＡＦタンパク質のレベルを低減させ、細胞からのサイトカイン放出を阻害し、敗血症の対象において炎症の重症度を減らす。特定の実施形態では、ＦＢＸＯ３阻害剤は、感染症などのサイトカイン誘導性事象を被ったことがある対象において、細胞中のＴＲＡＦタンパク質（例えば、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５及びＴＲＡＦ６）の濃度を低減させる。ＴＲＡＦ媒介性サイトカイン放出を標的化することによって、ＦＢＸＯ３阻害剤は、複数の生物学的経路で炎症を抑制するが、単一のサイトカインを標的にする抗炎症剤と比較してより広範な全身作用を与える、コルチコステロイドの激しい長期の作用を回避することができる。特定の実施形態では、ＦＢＸＯ３阻害剤で治療した対象の炎症性血球の解析によって、ＴＲＡＦタンパク質のレベルの低減が示される。
【０１１５】
特定の実施形態では、本明細書に開示する化合物は、哺乳類宿主細胞内の他のタンパク質で同定されていない、ＦＢＸＯ３内に同定された「細菌様」の分子シグネチャー（ＡｐａＧドメイン（配列番号１、残基２７８〜４００））を標的にする。この特色は、オフターゲットの作用が制限された薬物選択性を与える可能性があるので、非常に魅力的である。特に、本明細書に開示する化合物などのＦＢＸＯ３阻害剤は、ＦＢＸＯ３タンパク質のＡｐａＧドメインキャビティをふさぐ。
【０１１６】
ＦＢＸＯ３−ＡｐａＧモチーフの３Ｄ構造を、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ  ｐｖ．Ｃｉｔｒｉ由来のＡｐａＧタンパク質（２Ｆ１Ｅ．ｐｄｂ）の結晶構造に基づく相同性モデルから作製した。特定の実施形態では、ＦＢＸＯ３阻害剤は、ＡｐａＧドメインキャビティに位置するアミノ酸残基Ｙ３０８、Ｎ３３５、Ｅ３４１、Ｔ３６８及びＳ３７０と接触及び相互作用する。例えば、ＦＢＸＯ３阻害剤は、水素結合、ファンデルワールス力、塩橋形成、又は共有結合を介してアミノ酸残基と結合することができる。特定の実施形態では、ＦＢＸＯ３阻害剤は、グルタミン酸３４１のカルボキシル基から４オングストローム以内に塩橋を形成する、少なくとも１つのアミン基、並びにスレオニン３６８の水酸基、セリン３７０の水酸基、アスパラギン３３５のカルボキサミド基、及びチロシン３０８の水酸基から３オングストローム以内に水素結合を形成する、少なくとも１つの窒素又は酸素を含有する基を含む。
【０１１７】
特定の実施形態では、対象は、ＦＢＸＯ３阻害剤を用いる治療を必要としているか、又はその治療を必要としていると認識されている。ＦＢＸＯ３阻害剤を用いる治療を受け入れやすいとして、対象を選択することができる。例えば、対象は、少なくとも２種の異なる炎症性サイトカインによって引き起こされる炎症を阻害する抗炎症剤を必要としている可能性がある。
【０１１８】
現在、合成グルココルチコイドが幅広い炎症性障害の治療において使用されており、その主な抗炎症性機構は、リポコルチン１合成をブロックすること、続いてホスホリパーゼＡ２作用を抑制すること、及び２クラスの炎症誘発性生成物、例えばプロスタグランジン及びロイコトリエンのレベルをモジュレートすることを含む。しかし、グルココルチコイドはｉｎ  ｖｉｖｏで多くの他の標的タンパク質を有するので、オフターゲットの作用を伴うその非特異性は、種々の有害作用、例えば高血糖症、インスリン抵抗性、真性糖尿病、骨粗鬆症、白内障、不安症、うつ病、大腸炎、高血圧、卒中、勃起不全、性腺機能低下症、甲状腺機能低下症、無月経及び網膜症を引き起こす可能性がある。ＦＢＸＯ３阻害剤の新規な選択的機構に基づいて、本明細書に開示する化合物は、強力なｉｎ  ｖｉｖｏ活性を伴うより優れた毒性プロファイルを提供することができる。
【０１１９】
本明細書に開示する化合物は、比較的新しいＥ３リガーゼサブユニット、ＦＢＸＯ３、及びその下流の標的、ＴＲＡＦタンパク質を通して炎症を調節する。したがって、これは、グルココルチコイド及び非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）などの現行の抗炎症剤と全く異なる作用機構を意味する。
【０１２０】
医薬組成物
本開示の別の態様は、対象に投与するために調製される医薬組成物を含み、これは、治療有効量の本明細書に開示する化合物の１つ又は複数を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、炎症、特にサイトカイン誘導性炎症を治療するのに有用である。開示化合物の治療有効量は、投与経路、対象の種及び治療を受ける対象の身体的特性によって決まる。考慮され得る特定の因子としては、疾患の重症度及びステージ、体重、食事及び併用薬物療法が挙げられる。開示化合物の治療有効量を決定するためのこれらの因子の関連性は、当業者が理解している。
【０１２１】
対象に投与するための医薬組成物は、選択した分子に加えて、少なくとも１つのさらなる薬学的に許容される添加物、例えば、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、保存剤、表面活性剤などを含むことができる。医薬組成物は、１つ又は複数のさらなる活性成分、例えば抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などを含むこともできる。これらの製剤に有用な薬学的に許容される担体は、慣用されている。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ．Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、第１９版（１９９５）に、本明細書に開示される化合物の医薬送達に適した組成物及び製剤が記載されている。
【０１２２】
一般に、担体の性質は、用いられる特定の投与様式によって決まる。例えば、非経口製剤は、ビヒクルとして、医薬として及び生理学的に許容される液体、例えば水、生理的食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどを含む注射可能な液体を通常含有する。固形組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤又はカプセル剤形態）については、従来の無毒性の固体担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン又はステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中性な担体に加えて、投与される医薬組成物は、少量の無毒性の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、保存剤及びｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレートを含有することができる。
【０１２３】
本明細書に開示する医薬組成物には、開示化合物の薬学的に許容される塩及び／又は溶媒和化合物から形成されるものが含まれる。薬学的に許容される塩には、薬学的に許容される無機又は有機の塩基及び酸に由来するものが含まれる。特定の開示化合物は、酸と共に酸−塩基塩を形成することができる少なくとも１つの塩基性基を有する。塩基性基の例としては、これらに限定されないが、アミノ及びイミノ基が挙げられる。そうした塩基性基と共に塩を形成することができる無機酸の例としては、これらに限定されないが、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸又はリン酸などの鉱酸が挙げられる。塩基性基はまた、有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ酸若しくはホスホ酸若しくはＮ−置換スルファミン酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボン酸、ニコチン酸又はイソニコチン酸と、加えて、アミノ酸、例えばα−アミノ酸と、さらに、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシメタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンジスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、２−若しくは３−ホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸若しくはＮ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートを形成する）と、又は他の酸性有機化合物、例えばアスコルビン酸と塩を形成することができる。特に、医薬分野で周知の多くの他の酸の中で、適切な塩としては、カリウム及びナトリウムなどのアルカリ金属、カルシウム及びマグネシウムなどのアルカリ土類金属に由来するものが挙げられる。
【０１２４】
特定の化合物は、無機塩基又は有機塩基と共に酸−塩基塩を形成することができる少なくとも１つの酸性基を含む。無機塩基から形成される塩の例としては、カリウム及びナトリウムなどのアルカリ金属、カルシウム及びマグネシウムなどを含めたアルカリ土類金属を有する本明細書中に開示された化合物の塩が挙げられる。同様に、有機塩基、例えばアミン（本明細書で使用する場合、アミンを指す用語は、遊離アミンが意図されることを文脈上明示しない限り、その共役酸を含むと理解されたい）を有する酸性化合物の塩が企図され、これには、塩基性アミノ酸、脂肪族アミン、複素環式アミン、芳香族アミン、ピリジン、グアニジン及びアミジンと共に形成される塩が含まれる。脂肪族アミンのうち、非環状の脂肪族アミン、並びに環状及び非環状のジ−及びトリ−アルキルアミンが、開示化合物で使用するのに特に適する。加えて、４級アンモニウム対イオンも使用することができる。
【０１２５】
本化合物で使用するのに適切なアミン塩基（及びその対応するアンモニウムイオン）の特定例としては、限定はされないが、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン、ジアザビシクロノナン、ジアザビシクロウンデセン、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、モノ−、ビス−又はトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、２−ヒドロキシ−ｔｅｒｔ−ブチルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミン、トリ−（２−ヒドロキシエチル）アミン及びＮ−メチル−Ｄ−グルカミンが挙げられる。「薬理学的に許容される塩」のさらなる例については、Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１（１９７７）を参照されたい。
【０１２６】
本明細書に開示する化合物は、結晶化することができ、単一の結晶形態で又は様々な結晶多形体の組み合わせとして提供することができる。そのため、１つ又は複数の物理的形態、例えば様々な結晶形態、結晶性、液晶性又は非結晶性の（アモルファスの）形態で化合物を提供することができる。化合物のそうした様々な物理的形態は、例えば、再結晶用の様々な溶剤又は様々な溶剤混合物を使用して調製することができる。あるいは又はさらに、様々な多形体を、例えば、様々な温度で再結晶化することによって、及び／又は再結晶の間の冷却速度を変化させることによって、調製することができる。多形体の存在は、Ｘ線結晶解析によって、又は場合によっては別の分光学的な技法、例えば固相ＮＭＲ分光法、ＩＲ分光法によって、又は示差走査熱量測定法によって決定することができる。
【０１２７】
医薬組成物は、経口、直腸、鼻腔内、肺内又は経皮送達を含めた種々の粘膜投与様式によって、又は他の表面への局所送達によって対象に投与することができる。場合により、組成物は、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、関節内、腹腔内、髄腔内、脳室内又は非経口的経路を含めた非粘膜経路によって投与することができる。他の別の実施形態では、対象由来の細胞、組織又は器官に直接曝露することによって、ｅｘ  ｖｉｖｏで化合物を投与することができる。
【０１２８】
医薬組成物を製剤化するために、化合物を、様々な薬学的に許容される添加物、及び化合物の分散用の基材又はビヒクルと組み合わせることができる。所望の添加物としては、これらに限定されないが、ｐＨ調整剤、例えばアルギニン、水酸化ナトリウム、グリシン、塩酸、クエン酸などが挙げられる。加えて、局所麻酔薬（例えば、ベンジルアルコール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール）、吸着阻害剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０又はＭｉｇｌｙｏｌ８１２）、溶解度増強剤（例えば、シクロデキストリン及びその誘導体）、安定化剤（例えば血清アルブミン）、及び還元剤（例えばグルタチオン）を含むことができる。当技術分野で周知である多くの他の適切なアジュバントのうち、水酸化アルミニウム（例えば、Ａｍｐｈｏｇｅｌ、Ｗｙｅｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＮＪ）、フロイントアジュバント、ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＩＮ）及びＩＬ−１２（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）などのアジュバントを組成物に含むことができる。組成物が液体である場合は、１とみなした０．９％（ｗ／ｖ）生理的食塩水の浸透圧を参照して測定した時の製剤の浸透圧を、典型的には、実質的な不可逆的な組織損傷が投与部位において誘導されない値まで調整する。一般に、約０．３から約３．０、例えば約０．５から約２．０、又は約０．８から約１．７の値に溶液の浸透圧を調整する。
【０１２９】
化合物を分散する能力を有する親水性化合物及び任意の所望の添加物を含み得る基材又はビヒクル中に、化合物を分散させることができる。基材は、幅広い適切な化合物から選択されることができ、それには、これらに限定されないが、ポリカルボン酸又はその塩、カルボン酸無水物（例えば無水マレイン酸）と他のモノマー（例えば、メチル（メタ）アクリレート、アクリル酸など）とのコポリマー、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどの親水性ビニルポリマー、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、及びキトサン、コラーゲン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、ヒアルロン酸などの天然ポリマー、並びにそれらの非中毒性金属塩が含まれる。しばしば、生分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−グリコール酸）コポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ（ヒドロキシ酪酸−グリコール酸）コポリマー及びそれらの混合物などが、基材又はビヒクルとして選択される。あるいは又はさらに、合成脂肪酸エステル、例えばポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなどをビヒクルとして用いることができる。親水性ポリマー及び他のビヒクルを単独で又は組み合わせて使用することができ、増強された構造的完全性を、部分結晶化、イオン結合、架橋結合などによってビヒクルに分け与えることができる。ビヒクルは、粘膜表面に直接適用するために、液体又は粘性溶液、ゲル、ペースト、粉末、マイクロスフェア及びフィルムを含めた種々の形態で提供することができる。
【０１３０】
種々の方法に従って化合物を基材又はビヒクルと組み合わせることができ、化合物の放出を、拡散、ビヒクルの崩壊、又は関連する水チャネルの形成によって行うことができる。状況によっては、化合物を、適切なポリマー、例えば、イソブチル２−シアノアクリレートから調製されるマイクロカプセル（マイクロスフェア）又はナノカプセル（ナノスフェア）中に分散し（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４３：１〜５、１９９１を参照されたい）、生体適合性の分散媒体中に分散し、これによって、長時間にわたって持続性の送達及び生物活性がもたらされる。
【０１３１】
あるいは本開示の組成物は、生理的条件に近づけるのに必要とされる薬学的に許容されるビヒクル物質として、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート及びトリエタノールアミンオレエートを含有することができる。固形組成物については、従来の非中毒性の薬学的に許容されるビヒクルを使用することができ、これには、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムなどが含まれる。
【０１３２】
化合物を投与するための医薬組成物は、溶液、マイクロエマルジョン又は高濃度の活性成分に適した他の規則構造として製剤化することもできる。ビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）及び適切なそれらの混合物を含有する、溶剤又は分散媒でもよい。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散可能な製剤の場合には所望の粒径を維持することによって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール及びソルビトール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含むのが望ましい。吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物中に含めることによって、化合物の持続性吸収をもたらすことができる。
【０１３３】
特定の実施形態では、持効性製剤において、例えば徐放性ポリマーを含む組成物において化合物を投与することができる。こうした組成物は、急速放出を防ぐビヒクル、例えば、ポリマー、マイクロカプセル化送達系又は生体付着性ゲルなどの制御放出ビヒクルを用いて調製することができる。本開示の様々な組成物の持続性送達を、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムヒドロゲル及びゼラチンを組成物中に含めることによって、もたらすことができる。制御放出製剤が望まれる場合は、本開示による使用に適した制御放出結合剤は、活性薬剤に不活性であり、化合物及び／又は他の生理活性物質を組み入れることができる、任意の生体適合性制御放出材料を含む。多くのそうした材料は当技術分野で知られている。有用な制御放出結合剤は、その送達に続いて（例えば、粘膜表面で又は体液の存在下で）生理的条件下で緩徐に代謝される材料である。適切な結合剤としては、これらに限定されないが、持続性製剤での使用について当技術分野で周知である、生体適合性ポリマー及びコポリマーが挙げられる。そうした生体適合性化合物は、周辺組織に対して無毒性且つ不活性であり、鼻腔刺激、免疫反応、炎症などの著しい有害な副作用を誘発しない。これらは、やはり生体適合性であり、容易に体から排出される代謝産物に代謝される。
【０１３４】
本開示で使用するための例示的なポリマー材料としては、これらに限定されないが、加水分解性のエステル結合を有するコポリマー及びホモポリマーのポリエステルに由来するポリマーマトリックスが挙げられる。これらの幾つかは、生分解性であり、無毒性又は低毒性の分解産物をもたらすことが当技術分野で知られている。例示的なポリマーとしては、ポリグリコール酸及びポリ乳酸、ポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（Ｄ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、及びポリ（Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）が挙げられる。他の有用な生分解性又は生体浸食性のポリマーは、これらに限定されないが、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（ε−カプロラクトン−ＣＯ−乳酸）、ポリ（ε−カプロラクトン−ＣＯ−グリコール酸）、ポリ（β−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（アルキル−２−シアノアクリレート）、ヒドロゲル、例えばポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリアミド、ポリ（アミノ酸）（例えば、Ｌ−ロイシン、グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸など）、ポリ（エステル尿素）、ポリ（２−ヒドロキシエチルＤＬ−アスパルトアミド）、ポリアセタールポリマー、ポリオルトエステル、ポリカルボネート、ポリマレアミド、多糖類及びそれらのコポリマーのようなポリマーが挙げられる。そうした製剤を調製するための多くの方法が当業者に周知である（例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８を参照されたい）。他の有用な製剤としては、制御放出マイクロカプセル（米国特許第４，６５２，４４１号及び第４，９１７，８９３号）、マイクロカプセル及び他の製剤の作製に有用な乳酸−グリコール酸コポリマー（米国特許第４，６７７，１９号１及び第４，７２８，７２１号）、並びに水溶性ペプチド用の持続性放出組成物（米国特許第４，６７５，１８９号）が挙げられる。
【０１３５】
本開示の医薬組成物は、典型的には、無菌であり、製造、保管及び使用の条件下で安定である。無菌溶液は、必要に応じて１種又は本明細書に列挙した処方成分の組み合わせ共に、必要とされる量で適切な溶剤に化合物を組み入れ、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散剤は、基本の分散媒及び本明細書に列挙したものから必要とされる他の処方成分を含有する無菌ビヒクル中に化合物及び／又は他の生理活性物質を組み入れることによって、調製される。無菌散剤の場合には、調製方法は、化合物と任意のさらなる所望の処方成分の粉末を、前もって無菌濾過したそれらの溶液からもたらす、真空乾燥及び凍結乾燥を含む。微生物作用の防止は、様々な抗菌材及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。
【０１３６】
本開示の様々な治療方法によれば、治療又は予防が求められる障害の管理に関係する従来の方法論と一致した方式で、化合物を対象へ送達することができる。本明細書中の開示によれば、予防的又は治療的有効量の化合物及び／又は他の生理活性物質が、選択された疾患又は状態又は１つ若しくは複数のそれらの症状（複数可）を予防する、阻害する及び／又は回復させるのに十分である時間及び条件下で、そうした治療を必要としている対象に投与される。
【０１３７】
本開示の化合物の投与は、予防的又は治療的目的のいずれかのためでもよい。予防的に提供する場合は、いかなる症状にも先立って化合物を与える。化合物の予防的投与は、いかなるその後の疾患過程も予防する又は回復させる働きをする。治療的に提供する場合は、疾患又は感染症の症状の発症時（又はその直後に）化合物を与える。
【０１３８】
予防的及び治療的目的に関しては、経口経路によって、又は単回ボーラス送達において、長期間にわたる連続的な送達（例えば、連続的な経皮、粘膜若しくは静脈内送達）を介して、又は反復投与プロトコル（例えば、１時間毎、毎日若しくは毎週の反復投与プロトコルによる）において、化合物を対象に投与することができる。治療的有効投薬量の化合物を、本明細書に記載されるような標的にされる疾患又は状態と関連する１つ又は複数の症状又は検出可能な状態を緩和するための臨床的に有意な結果をもたらす、長期的予防又は治療計画内の反復用量として提供することができる。この文脈における有効投薬量の決定は、典型的には、ヒト臨床治験によって追跡調査される動物モデル研究に基づき、対象において標的にされる疾患の症状又は状態の出現又は重症度を有意に低減させる投与プロトコルに導かれる。この点で適切なモデルとしては、例えば、マウス、ラット、トリ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ネコ、非ヒト霊長類及び他の受容される当技術分野で知られている動物モデル対象が挙げられる。あるいは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを使用して有効投薬量を決定することができる。そうしたモデルを使用すると、治療有効量の化合物（例えば、標的にされる疾患の１つ又は複数の症状を緩和するのに有効な量）を投与するための適切な濃度及び用量を決定するのに、通常の計算及び調整しか必要とされない。別の実施形態では、有効量又は有効量の化合物は、治療的又は診断的目的のいずれかで、本明細書に記載されるような疾患又は状態に関連する１つ又は複数の選択された生物活性を、単純に阻害又は増強し得る。
【０１３９】
化合物の実際の投薬量は、疾患の徴候及び対象の特定の状況（例えば、対象の年齢、サイズ、健康、症状の程度、感受性因子など）のような要因、投与の時間及び経路、同時に施される他の薬物又は治療、並びに対象において所望の活性又は生物学的反応を惹起する化合物の特定の薬理に従って変動する。投薬計画は、最適な予防的又は治療的応答を与えるように調整することができる。治療有効量は、化合物及び／又は他の生理活性物質の任意の有毒な又は有害な副作用を、治療的有益効果が臨床的観点から上回るものでもある。本開示の方法及び製剤内での治療有効量の化合物及び／又は他の生理活性物質に関する非限定的な範囲は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ体重、又は約０．２ｍｇ／ｋｇから約２ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１４０】
投薬量は、標的部位（例えば、肺又は体循環）で所望の濃度を維持するように主治医が変化させることができる。送達様式、例えば、経皮、直腸、経口、肺、骨内、又は鼻腔内送達対静脈内又は皮下又は筋肉内送達に基づいて、より高い又はより低い濃度を選択することができる。投薬量は、投与製剤の放出比率、例えば、肺内噴霧剤対散剤、徐放経口対注射された微粒子剤又は経皮送達製剤などの放出比率に基づいて調整することもできる。
【０１４１】
本明細書に開示する化合物は、さらなる治療薬と共に同時投与することもできる。そうした薬剤としては、これらに限定されないが、別の抗炎症剤、抗菌剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、サイトカインアンタゴニスト、免疫抑制剤、抗癌剤、抗ウイルス剤、サイトカイン、増殖因子、免疫調節薬、プロスタグランジン又は抗血管過剰増殖化合物が挙げられる。
【０１４２】
本開示はまた、哺乳類の対象における疾患及び他の状態の予防及び治療で使用するための、本明細書に記載の医薬組成物、活性成分及び／又はこれらを投与するための手段を含有する、キット、パッケージ及び多容器ユニットを含む。診断的に使用するためのキットも提供する。一実施形態では、これらのキットは、本明細書に記載の化合物の１つ又は複数を含有する容器又は製剤を含む。一例を挙げれば、この成分は、対象へ送達するための医薬調製物中に製剤化される。化合物は、バルク分配容器又は単位剤形若しくは多単位剤形中に含有されていてもよい。随意の分配手段、例えば肺又は鼻内噴霧塗布器を提供することができる。包装材料は、それによって包装される医薬品パッケージがどの治療目的及び／又はどの方式で使用することができるかについて示すラベル又は指示書を含んでいてもよい。
【実施例】
【０１４３】
結果
ＦＢＸＬ２はＴＲＡＦをポリユビキチン化の標的にする。マウスの肺上皮（ＭＬＥ）におけるＦＢＸＬ２の異所性発現がＴＲＡＦ１〜６のタンパク質レベル及びＮＦ−κｂ経路のｐ１０５サブユニットのリン酸化レベルを特異的に低減させることが、今や観察された（図１Ａ）。ＦＢＸＬ２を、ドキシサイクリン誘導性プラスミドを使用してＭＬＥ細胞で条件的にも発現させ、これによって、時間依存的にＴＲＡＦタンパク質が分解した（図１Ｂ）。細胞を溶解し、ＦＢＸＬ２免疫沈降（ｉ．ｐ．）にかけた免疫共沈降実験では、免疫ブロットによって、すべてのＴＲＡＦタンパク質がＦＢＸＬ２免疫沈降物中に検出された（図１Ｃ）。この結果は、ＦＢＸＬ２が細胞中でＴＲＡＦと相互作用することを示唆する。重要なことに、Ｅ１及びＥ２酵素とユビキチンの完全な補足物を有する精製したＳＣＦＦＢＸＬ２の混在物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ポリユビキチン化したＴＲＡＦ種を生成するのに十分であった（図１Ｄ）。最後に、ＦＢＸＬ２の異所性発現は、ＴＲＡＦタンパク質の半減期を低下させた（図１Ｅ）が、そのｍＲＮＡレベルは低下させなかった（データ非表示）。
【０１４４】
ＦＢＸＬ２は、リジン２０１部位でポリユビキチン化される。ＦＢＸＬ２はＴＲＡＦの重要な制御因子なので、ＦＢＸＬ２の安定性及び分解に関与する機構を調べた。最初に、特定のリジンユビキチン受容部位を欠く幾つかのＦＢＸＬ２欠失変異体（図２Ａ、上部のマップ）を構築し、２６Ｓプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２に細胞を曝露することによって、ポリユビキチン化に対するその脆弱性を試験した。完全長（ＦＬ）及び４種の他のＦＢＸＬ２欠失変異体はすべて、高分子量のユビキチン化産物の有意な蓄積を示した（図２Ａ、底部右）。さらなる欠失解析によって、ＦＢＸＬ２−Ｃ１５０変異体は、より遅く移動する種の有意な蓄積が認められなかったので（図２Ｂ、底部右）、ユビキチン化に抵抗性であることが示唆された。ＦＢＸＬ２のＣ１５０とＣ２００の間の５０残基内に潜在的なユビキチン化部位が２つある。これらの部位の部位特異的変異誘発、及びこれらの変異体をコードするプラスミドの発現によって、２６Ｓプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２に対するＦＢＸＬ２のＫ２０１Ｒ変異体の有意な抵抗性がもたらされた（図２Ｃ）。半減期（ｔ１／２）研究において、この変異体の安定性も試験し、この研究によって、ＷＴのＦＢＸＬ２と比較して有意に延びたｔ１／２が示された（２．５時間、図２Ｄ）。
【０１４５】
ＦＢＸＬ２は、残基Ｔ４０４でリン酸化され、ＳＣＦ  Ｅ３リガーゼのサブユニットのＦＢＸＯ３によって標的化される。ＳＣＦ系のＥ３リガーゼは、リン酸化タンパク質を標的にする。データベース解析によって、ＦＢＸＬ２内の多くの潜在的なリン酸化部位が示される（図３Ａ、ＧＰＳ２．１ソフトウェア予測）。ＦＢＸＬ２がリン酸化タンパク質であることを確認するために、細胞を溶解し、ＦＢＸＬ２のｉ．ｐ．にかけ、リン酸化スレオニン抗体を使用して、ＦＢＸＬ２の予想されるサイズに移動するバンドを認めることができた（図３Ｂ）。ＦＢＸＬ２をリン酸化の標的にする潜在的なキナーゼを同定するために、本発明者らは免疫共沈降（ｃｏ−ｉ．ｐ．）実験を実施した。ＭＬＥ細胞を溶解し、ＦＢＸＬ２のｉ．ｐ．にかけた。興味深いことに、試験した７種のキナーゼのうち、ＧＳＫ３βがＦＢＸＬ２の免疫沈降物中に認められた唯一のタンパク質であった（図３Ｃ）。ＦＢＸＬ２はＳＣＦ系のユビキチン化の標的にされ得るリン酸化タンパク質であるので、本発明者らは、ＦＢＸＬ２の分解を媒介し得るＦ−ボックスタンパク質を無作為に試験するバイアスのないスクリーニングを開始した。これらのタンパク質の過剰発現の際に、ＦＢＸＯ３のみが、免疫反応性ＦＢＸＬ２のレベルを低下させることができた（データ非表示）。ＦＢＸＯ３は明確なＣ末端モチーフを欠くＦ−ボックスタンパク質の大きなグループに属し、したがってＦ−ボックスドメインのみのタンパク質（ＦＢＸＯ）とみなされる。１つの研究のみがＦＢＸＯ３がｐ３００のユビキチン化を増大させることを示しており、ＳＣＦサブユニットとしてのその確実性及びその基質は、ほとんど不明のままである。ＦＢＸＬ２を標的とするＦＢＸＯ３の特異性を確認するためにｃｏ−ｉ．ｐ．実験を実施し、ＦＢＸＯ３がＦＢＸＬ２の免疫沈降物中に認められた（図３Ｄ）。さらに、ＳＣＦＦＢＸＯ３複合体は、ＦＢＸＬ２のポリユビキチン化を誘導することができた（図３Ｅ）。図２Ａに記載されているＦＢＸＬ２欠失変異体を使用して、ｈｉｓタグをつけたＦＢＸＬ２コンストラクトで細胞をトランスフェクトし、続いて細胞をｈｉｓプルダウンする予備的なマッピング研究を実施した。本発明者らの結果は、ＦＢＸＯ３は、ＦＢＸＬ２のＣ末端（残基３５０〜４２３）でドッキングすることを示す（図３Ｆ）。この領域がＦＢＸＬ２の安定性に重要であることを確認するために、野生型（ＷＴ）ＦＢＸＬ２及び幾つかのＦＢＸＬ２のＣ末端欠失変異体を安定性について試験した（図３Ｇ）。興味深いことに、ＦＢＸＬ２Ｃ３９０欠失変異体は、ＷＴのＦＢＸＬ２と比較して有意に延びたｔ１／２を示し、このことは、残基３９０〜４２３がその安定性に重要であることを示唆するものである。この領域中に、コンセンサスＧＳＫ３βリン酸化部位（図３Ｈ、ＧＰＳ２．１ソフトウェア予測）が存在する。Ｔ４０４がＦＢＸＬ２の確実なリン酸化部位であることを確認するために、ＷＴのＦＢＸＬ２又はＦＢＸＬ２Ｔ４０４Ａ変異体のいずれかでトランスフェクトした細胞を溶解し、Ｖ５−ＦＢＸＬ２のｉ．ｐ．にかけ、リン酸化スレオニン抗体を使用して免疫ブロットを行い、ＦＢＸＬ２Ｔ４０４Ａタンパク質のリン酸化レベルの有意な低下が認められた（図３Ｉ）。興味深いことに、この部位は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイを使用した場合、ＦＢＸＬ２Ｔ４０４ＡがＳＣＦＦＢＸＯ３に対する有意な抵抗性を示すので、ＦＢＸＯ３の相互作用に関する標的モチーフとしても働く（図３Ｊ）。要約すれば、ＦＢＸＯ３がＦＢＸＬ２中のＴ４０４リン酸化部位を標的にし、次にこれがＳＣＦ複合体を動員して、ＦＢＸＬ２をＫ２０１部位でポリユビキチン化する（図３Ｋ）。
【０１４６】
ＦＢＸＯ３は、Ｖ２２０に自然発生変異を含有する。興味深いことに、ＳＮＰデータベース解析によって、約１０％という非常に高い変異頻度を有するＦＢＸＯ３内の自然発生変異（Ｖａｌ２２０Ｉｌｅ）が示されるが、これは、コーカサス人においてだけである（図４Ａ）。Ｖ２２０Ｉがヒト細胞での適切なＦＢＸＯ３変異であることを確認するために、２０人の健康なコーカサス人ボランティア由来のＰＢＭＣ試料（Ｓａｎｇｕｉｎｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅから市販品として入手できる）を解析した。最初に、ＰＢＭＣ細胞からゲノムＤＮＡ抽出し、続いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＳＮＰプローブを使用するＳＮＰジェノタイピングをリアルタイムＰＣＲを用いて行った。ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉ変異を持つコーカサス人ＰＢＭＣ試料が３つ同定された（図４Ｂ）。このＦＢＸＯ３変異を含有するこれらのＰＢＭＣ細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用してサイトカイン放出について試験した。最初に、Ｗｔ又は変異体のＰＭＢＣ細胞を１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地中で培養し、次いで、細胞を２ｕｇ／ｍｌのＬＰＳで２４時間処理し、ヒトサイトカインアレイを使用して、培地中に放出されるサイトカインをアッセイした。興味深いことに、ＬＰＳ誘導性モデルでは、幾つかの主要な炎症性サイトカインの誘導が、ＷＴのＰＢＭＣ細胞と比較して、ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉ変異を持つＰＢＭＣ細胞において有意に抑制された（図４Ｃ）。したがって、ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉ変異は、感染症又は他の自己免疫疾患の対象において、炎症誘発性表現型を低減させる可能性がある。
【０１４７】
ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉ変異の性質を続いて試験した。ＷＴのＦＢＸＯ３と比較して、ＳＣＦ−ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉ複合体は、ＦＢＸＬ２をポリユビキチン化する能力が顕著に低減され、基質の多くがインタクトであることが示された（図４Ｄ、下部、低露光）。次いで、成熟したマクロファージの形態及び多くの特性を取り入れるＵ９３７単球でのＦＢＸＯ３の機能を研究した。予備的なデータは、ＦＢＸＬ２はＴＲＡＦタンパク質をユビキチン化し、その分解を媒介し、それによってサイトカイン発現を低減させる可能性があることを示す。したがって、細胞中のＦＢＸＬ２を除去することによって、ＦＢＸＯ３はＴＲＡＦタンパク質のレベルをアップレギュレートし、サイトカイン発現を刺激することができるはずであると仮定される。実際、この仮説と一致して、ＦＢＸＯ３の過剰発現はＦＢＸＬ２のタンパク質レベルを低下させることができ、さらにＴＲＡＦタンパク質の６メンバーすべてのレベルを有意に増大させることができた（図４Ｅ）。しかし、ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉの過剰発現は、幾つかのＴＲＡＦタンパク質において、基本的な増大又は増大なししかもたらさなかった。ＬＰＳ攻撃の際のＵ９３７細胞のサイトカイン放出をさらにモニターした。最初に、細胞を、ＬａｃＺ、ＦＢＸＯ３又はＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉで２４時間トランスフェクトしてから、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳへさらに２４時間曝露した。ヒトサイトカインアレイを使用して、３６種のサイトカインレベルを測定した。興味深いことに、ＦＢＸＯ３が、ＬＰＳ攻撃と相まって放出される多くのサイトカインを有意にアップレギュレートすることが観察された（図４Ｆ、赤色）が、ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉの発現は、ＬａｃＺコントロールと比較してサイトカイン放出を著しく変化させることはなかった（図４Ｆ）。これらの新規な結果は、２種のＦ−ボックスタンパク質を先天免疫応答へ最初に関連づけするものであり、ＦＢＸＯ３Ｖ２２０ＩがＦＢＸＯ３の機能喪失型変異であることを示唆する。この結果は、この天然に存在する低形質変異を有する個体は、感染症又は他の自己免疫疾患に対して鈍い応答を示し得る可能性を提起する。
【０１４８】
ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＢＸＯ３の機能喪失型変異である。ｉｎ  ｖｉｖｏでの上記の知見を広げるために、マウスに、空のレンチウイルス又はＦＢＸＯ３若しくはＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉのいずれかをコードするレンチウイルスを１２０時間感染させた（１０７ＣＦＵ／マウス、ｉ．ｔ．）。次いで、マウスを、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（株ＰＡ１０３、１０４ＣＦＵ／マウス、ｉ．ｔ．）でさらに２４時間攻撃感染した。次いで、マウスをＦｌｅｘｉＶｅｎｔでモニターして、肺機能を測定し、安楽死させて、洗浄液体を集めた。ＷＴのＦＢＸＯ３発現は、ＰＡ１０３誘導性肺傷害を有意に増大させたが、ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉは増大させなかった。特にＦＢＸＯ３の過剰発現は、肺抵抗及びエラスタンスを有意に増大させ、コンプライアンスを低下させた（図５Ａ〜Ｄ）。ＦＢＸＯ３の過剰発現は、洗浄タンパク質濃度、洗浄細胞数及び細胞浸潤を有意に増大させた（図５Ｅ〜Ｇ）。ＦＢＸＯ３はまた、ＰＡ１０３感染マウスの生存を低下させた（１０５ＣＦＵ／マウス、図５Ｈ）。ＦＢＸＯ３の過剰発現はまた、ＰＡ１０３の有無にかかわらず、空ベクターと比較してＰＡ１０３感染マウスにおける洗浄サイトカインレベルを有意に増大させた（図５Ｉ）。これらの効果は、ＦＢＸＯ３Ｖ２２０Ｉ変異体を使用した場合は観察されなかった。これらのｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、ＦＢＸＯ３Ｖ２２０ＩがＦＢＸＯ３の機能喪失型変異体であることを再度示唆する。
【０１４９】
ＦＢＸＯ３ノックダウンは、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ誘導性肺傷害をｉｎ  ｖｉｖｏで回復させた。肺炎におけるＦＢＸＯ３の役割を確認するために、マウスに、空のｓｈＲＮＡ又はＦＢＸＯ３  ｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスに１２０時間感染させた（１０７ＰＦＵ／マウス、ｉ．ｔ）、ｉｎ  ｖｉｖｏノックダウン研究を遂行した。次いで、マウスをＰＡ１０３（１０４ＣＦＵ／マウス、ｉ．ｔ．）でさらに２４時間攻撃感染した。興味深いことに、ＦＢＸＯ３ノックダウンは肺機能に対するＰＡ１０３の有害作用を有意に回復させた。特に、ＦＢＸＯ３ノックダウンはコンプライアンスを増大させ、肺抵抗及びエラスタンスを低下させた（図６Ａ〜Ｄ）。ＦＢＸＯ３ノックダウンはまた、洗浄タンパク質濃度、洗浄細胞数及び細胞浸潤を低下させた（図６Ｅ〜Ｇ）。さらに、ＦＢＸＯ３ノックダウンは、ＰＡ１０３感染マウスにおける洗浄サイトカインレベルを有意に低下させ（図６Ｈ）、その生存を増大させた（１０５ＣＦＵ／マウス、図６Ｉ）。これらのｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、ＦＢＸＯ３がサイトカインストームの調節において重要な役割を果たし、潜在的な医薬標的として働く可能性があることを示唆する。したがって、肺炎におけるＦＢＸＯ３の阻害の潜在的な適用を調べるために、ＦＢＸＯ３の構造を解析し、小分子阻害剤をスクリーニングした。
【０１５０】
ＦＢＸＯ３のＡｐａＧドメインの構造解析及び阻害剤スクリーニング。ＦＢＸＯ３は、ＡｐａＧと呼ばれる非常に独特なドメインをそのカルボキシル末端内に持つ。ＡｐａＧドメインは細菌で最初に同定され、コアを含む約１２５アミノ酸を含有する。しかし、細菌におけるＡｐａＧタンパク質の機能は知られていない。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍでは、ＡｐａＧドメインタンパク質、ＣｏｒＤは、Ｃｏ２＋抵抗性及びＭｇ２＋流出に関与する。様々なＡｐａＧタンパク質の構造解析によって、幾つかのβシートの折り畳み構造が示されている。Ｆ−ボックスタンパク質は、その基質を標的にするために、そのカルボキシル末端ドメインを利用することが多いので、ＦＢＸＯ３のＡｐａＧドメインはＦＢＸＯ３の基質認識に関与することが仮定された。これを試験するために、一連のＦＢＸＯ３欠失変異体を設計し、ＡｐａＧドメインを欠失させた（図７Ａ）。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳（ＴｎＴ）を使用してこれらの変異体を合成し、次いで、基質としてＦＢＸＬ２を使用して、変異体をｉｎ  ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイで試験した。興味深いことに、ＡｐａＧドメインを欠くＦＢＸＯ３−Ｃ２７８は、ＦＢＸＬ２のポリユビキチン化を誘導する能力を失っていた（図７Ｂ）。ＳＣＦ複合体と相互作用するのに必要とされるＮＨ２末端のＦ−ボックスドメインを欠くＦＢＸＯ３−Ｎ７０を陰性コントロールとして扱った。これらの実験により、ＦＢＸＯ３−ＡｐａＧドメインはＦＢＸＬ２の標的化に必要とされることが示唆される。次に、ＡｐａＧドメインの阻害は、その基質であるＦＢＸＬ２に対するＦＢＸＯ３の標的化を乱すことが仮定された。構造的相同性解析を実施して、ＦＢＸＯ３−ＡｐａＧドメインが高度に保存されていることを確認した（図７Ｃ）。分子ドッキング解析及び予想されるＦＢＸＯ３−ＡｐａＧの３−Ｄ構造モデルに関するスコア化ランキング操作を使用して、ＡｐａＧドメインキャビティに適合し得る潜在的なリガンドを評価した（図７Ｄ）。このドッキング実験は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｓｔｕｄｉｏ２．５のＬｉｇａｎｄＦｉｔ及びＣＤｏｃｋを使用して行った。６５０７種の認可された又は実験用の薬物を含有するライブラリーを最初に使用して、ＦＢＸＯ３−ＡｐａＧに対する潜在的なリガンドをスクリーニングした。このモデルでは、ＡｐａＧドメイン（１２３ＡＡ）内のＧｌｕ６４が、阻害剤と相互作用するのに重要な可能性がある。適切なリガンドのドッキング及び最適適合解析に基づいて、一連の新しい生体分子を開発するための骨格としてとしてベンザチンを選択して、ＡｐａＧの結合ポケット内で相互作用することによってサイトカイン分泌を阻害するそれらの能力を試験した（図７Ｅ〜Ｆ）。
【０１５１】
ＦＢＸＯ３阻害剤の調製及びドッキング解析。目的のベンザチン類似体は、ベンズアルデヒド誘導体及びジアミン誘導体、例えばエチレンジアミンから調製した（図８Ａ）。一般に、適切なベンズアルデヒド誘導体（０．０２ｍｏｌ）を、エチレンジアミン（０．０１ｍｏｌ、約７００ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を還流し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで６０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いでロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ベンザチン類似体の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１５２】
表１で示すように、４０の新しい化合物を構築し、それらのＩＣ５０、ＬＤ５０及び治療指数（ＴＩ）について試験した。簡単に述べると、ＬＰＳに曝露したヒトＰＢＭＣ細胞に様々な濃度で化合物を加え、サイトカイン分泌をＥＬＩＳＡによってモニターして、ＩＣ５０を決定した。Ｕ９３７単球にも様々な濃度で化合物を加え、細胞をトリパンブルーで染色して、ＬＤ５０を決定した。幾つかの化合物（ＢＣ−１２０７、ＢＣ−１２１５、ＢＣ−１２４１、ＢＣ−１２５０及びＢＣ−１２６１）は、ＦＢＸＯ３−ＡｐａＧドメインとのドッキング研究において高得点を獲得し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで高いＩＣ５０及び低いＬＤ５０を示した。重要なことに、図８Ｂ〜Ｄで示すように、ＢＣ−１２１５及びＢＣ−１２６１と呼ばれる幾つかの新しい小分子は、構造的解析及びドッキング解析に基づいて、ＦＢＸＯ−ＡｐａＧと至適な相互作用を示した。これらの特定の薬剤は、さらなる生物学的試験を是認する顕著な治療指数を示した。幾つかの機能性研究を試みて、ＢＣ−１２１５に着目して抗炎症性作用を評価した。
【０１５３】
ＢＣ−１２１５は、サイトカインの広域スペクトルを大きく阻害する。ＰＢＭＣ細胞を、１０ｕｇ／ｍｌのＢＣ−１２１５と共に２ｕｇ／ｍｌのＬＰＳで１６時間処理した。サイトカイン放出を、ヒトサイトカインアレイ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）によってモニターした。図９の結果は、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＲＯα、Ｉ−３０９、ＩＬ１−α、ＩＬ１−β、ＩＬ１ｒα、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＴＮＦαを含めたＴＨ１パネルサイトカインの大部分を有意に抑制する、ＢＣ−１２１５の顕著な能力を示す。これらのサイトカインは、多くの炎症誘発性疾患の発病に密接に関連しており、それらの幾つかは、疾患の重症度を低減させるための、サイトカインをブロックする抗体の使用を導いた。例えば、ＧＭ−ＣＳＦは、関節リウマチ（ＲＡ）の炎症を駆り立てる。現在、ＧＭ−ＣＳＦをブロックする抗体（ＭＯＲ１０３）が、ＲＡを罹患する患者において第１ｂ／２ａ相試験で試験されている。
【０１５４】
ヒトＩＬ１−β遮断抗体であるカナキヌマブは、クリオピリン関連周期性症候群の治療用に認可され、慢性閉塞性肺疾患に対する第１相試験で試験されている。ＩＬ−６は多くの自己免疫疾患及び癌と関連しており、最近、ＩＬ−６遮断抗体が非小細胞肺癌を罹患する患者において第２相試で試験された。ＩＬ−１２及びＩＬ−２３は、自己免疫と関連しており、ウステキヌマブ（商品名Ｓｔｅｌａｒａ）は、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３に対するヒトモノクローナル抗体であり、中度から重度の尋常性乾癬を治療するのに認可された。重要なＴＨ１サイトカインであるＴＮＦαも炎症反応を促進し、ＲＡ、炎症性腸疾患、乾癬及び難治性喘息などの多くの自己免疫障害と病原学的に関連づけされている。インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）又はセルトリズマブ（Ｃｉｍｚｉａ）などの幾つかのＴＮＦαをブロックする抗体が、これらの自己免疫障害を治療するのに認可された。しかし、上記のアプローチの多くは、これらが単一のサイトカインを標的にし、宿主タンパク質に対するものであるので、生理活性スペクトルが限られている。本明細書に開示するデータは、本明細書に記載のこの新しいファミリーのＦボックスタンパク質Ｅ３リガーゼアンタゴニスト（例えばＢＣ−１２１５）は、これらが幾つかの炎症誘発性分子に汎反応性であり、宿主細胞の独特な細菌様分子シグネチャーを標的にすることから炎症性障害においてより効果的であり得ることをデータが示唆するという点において、意味がある。Ｆボックスタンパク質Ｅ３リガーゼアンタゴニストのこうした独特な特質は、より大きな抗炎症活性を与え、さらにオフターゲットの作用が限られている。
【０１５５】
ＢＣ−１２１５はＦＢＸＯ３を阻害し、ＴＲＡＦタンパク質レベルを低下させる。感染症とサイトカイン放出の間の機構的関連を確立するために、ＰＢＭＣ細胞をＬＰＳで処理し、下流のシグナルタンパク質を免疫ブロットによってアッセイした。ＬＰＳは、ＦＢＸＯ３タンパク質のレベルを増大させ、ＦＢＸＬ２タンパク質のレベルを低下させ、ＴＲＡＦタンパク質のレベルを増大させることが見出された（図１０Ａ）。したがって、内毒素作用による炎症誘発性シグナル伝達は、ＦＢＸＯ３タンパク質を通して媒介され得る。最初に、基質としてＦＢＸＬ２を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイでＢＣ−１２１５を試験した。ＢＣ−１２１５は、ＦＢＸＯ３が触媒するＦＢＸＬ２のポリユビキチン化を阻害することができた（図１０Ｂ）。ＭＬＥ細胞も様々な濃度のＢＣ−１２１５で１６時間処置した。細胞を集め、タンパク質免疫ブロットについてアッセイした。図１０Ｃで示すように、ＢＣ−１２１５は、ＦＢＸＬ２タンパク質のレベルを用量依存的様式で増大させ、さらにはＴＲＡＦタンパク質のレベルを低下させた。サイクリンＤ２、サイクリンＤ３及びＣＣＴαを含めた他の知られているＦＢＸＬ２基質を、陽性コントロールとして扱った。本発明者らは、治療量において、ＢＣ−１２１５は、Ｈｅｌａ細胞の細胞周期の進行を有意に変化させないことも観察した（図１０Ｄ）。ＢＣ−１２１５は、陽性コントロールのＤｕＰ−６９７と比較して、ＣＯＸ−２活性を変化させなかった（図１０Ｅ）。これらの後者の結果は、ＢＣ−１２１５及び関連した薬剤は、ＣＯＸ−２阻害剤として機能する非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）によって使用される機構と独立して活性を発現する、機構的に新しい部類の抗炎症剤に相当することを強く示唆する。ＢＣ−１２１５の新規な作用機構に基づいて、幾つかの異なるマウス炎症モデルでこの薬剤の有効性を試験した。
【０１５６】
ＢＣ−１２１５は、ＬＰＳ誘導性敗血症性ショックモデルにおいてサイトカイン放出を強力に阻害する。最初に、化合物ＢＣ−１２１５を、酢酸を使用して１：２のモル比で水に可溶化し、ＢＣ−１２１５の保存液は５ｍｇ／ｍｌであった。５００ｕｇ、１００ｕｇ、２０ｕｇ、４ｕｇ及び０．８ｕｇのＢＣ−１２１５を腹腔内（ＩＰ）注射によってマウスに投与した。１０分後に、マウスに１００ｕｇのＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ）をＩＰ注射によって与えた。９０分後にマウスを安楽死させ、採血し、ＩＬ１−β、ＩＬ−６及びＴＮＦαサイトカインアッセイについて試験した。図１１の結果は、ＩＣ５０ＩＬ−１β＝１ｍｇ／ｋｇ、ＩＣ５０ＩＬ−６＝２．５ｍｇ／ｋｇ、ＩＣ５０ＴＮＦα＝１．２ｍｇ／ｋｇであることを示す。ＢＣ−１２１５に対して予想されるマウス経口ＬＤ５０用量が１．１３５ｇ／ｋｇであることを考慮すると、これらのＩＣ５０は、非常に低いと考えられる。したがって、ＢＣ−１２１５は、ｉｎ  ｖｉｖｏで予想される毒性用量よりかなり下で生理活性を発現する。
【０１５７】
ＢＣ−１２１５は、盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）敗血症モデルにおいてサイトカイン放出を阻害する。最初に、化合物ＢＣ−１２１５を上記のように可溶化した。１００ｕｇのＢＣ−１２１５をＩＰ注射によってマウスに投与した。３０分後に、ＣＬＰを実施した。６時間後に、マウスを安楽死させ、採血し、ＩＬ１−β、ＩＬ−６及びＴＮＦαサイトカインについて試験した。図１２で示すように、ＣＬＰ処理したマウスは、偽処理マウスと比較して、サイトカイン放出を有意に増大させた。しかし、ＢＣ−１２１５は、マウスにおいて、３種の循環炎症性サイトカインすべてのＣＬＰ誘導性分泌を有意に弱めることができた。
【０１５８】
ＢＣ−１２１５は、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ誘導性肺炎の肺傷害を低減させる。肺炎においてＦボックス阻害剤ＢＣ−１２１５を試験するために、１００ｕｇのＢＣ−１２１５をＩＰ注射によってマウスに投与し、次いで、マウスをＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株ＰＡ１０３（１０４ＣＦＵ／マウス、ｉ．ｔ．）でさらに１８時間攻撃感染した。興味深いことに、ＢＣ−１２１５は、肺機能に対するＰＡ１０３の有害作用を有意に回復させた。特に、ＢＣ−１２１５はコンプライアンスを増大させ、肺抵抗を低下させ、エラスタンスを低減させた（図１３Ａ〜Ｄ）。ＢＣ−１２１５はまた、洗浄タンパク質濃度、洗浄細胞数及び細胞浸潤を低下させた（図１３Ｅ、Ｆ、Ｇ）。さらに、ＢＣ−１２１５はまた、ＰＡ１０３感染マウスにおいて洗浄炎症性サイトカインレベルを有意に低下させた（図１３Ｈ）。
【０１５９】
ＢＣ−１２１５は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ誘導性肺傷害を回復させる。肺炎においてＢＣ−１２１５をさらに試験するために、マウスをＨ１Ｎ１（１０５ＰＦＵ／マウス、ｉ．ｔ．）で攻撃感染し、９日間観察した。ＢＣ−１２１５処理については、保存液（５ｍｇ／ｍｌ）を飲料水（２％ショ糖を含有）に加えて、３０ｕｇ／ｍｌの終濃度にした。肺機能を５日目に測定した。特に、ＢＣ−１２１５は、Ｈ１Ｎ１に感染したマウスにおいて、コンプライアンスを増大させ、肺抵抗を低下させ、エラスタンスを低減させた（図１４Ａ〜Ｃ）。さらに、ＢＣ−１２１５は、Ｈ１Ｎ１肺炎のマウスの生存を有意に増大させた（図１４Ｄ）。ＢＣ−１２１５はまた、洗浄タンパク質濃度、洗浄細胞数（図１４Ｅ、Ｆ）、肺水腫及び細胞浸潤を著しく低下させた（図１４Ｇ、Ｈ）。
【０１６０】
ＢＣ−１２１５は、ＴＰＡ誘導性耳浮腫を軽減させる。抗炎症剤としてのＢＣ−１２１５の局所適用を、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）誘導性耳浮腫のモデル（Ｂｒａｌｌｅｙら、Ｊ  Ｉｎｆｌａｍｍ（ＬＯｎｄ）、２００８．５：１頁）において試験した。簡単に述べると、ＴＰＡ投与（２μｇ／耳）３０分後に、ＢＣ−１２１５の２０μｌエタノール溶液を、８、４０及び２００ｕｇ／耳でマウスの耳に塗った。比較は、等容量のエタノール（ビヒクルコントロール）を含んでいた。ＴＰＡ投与１８時間後にマウスを安楽死させ、マイクロメーターを使用して耳の厚さを測定した。耳のパンチ生検物も直ちに取得し、秤量し、グラフ化した。図１５Ａで示すように、耳浮腫は、ＴＰＡ処理動物において、処理してから１８時間後に観察された。しかし、ＢＣ−１２１５は、浮腫を有意に消散させることができた。図１５Ｂ〜Ｃで示すように、ＢＣ−１２１５は、ビヒクルコントロールと比較して、耳の厚さ及び耳の重量を用量依存的様式で有意に低減させた。これらの研究は、ＦＢＸＯ３阻害剤ＢＣ−１２１５は、浮腫の発達を阻害することによって、局所適用性を有する可能性があり、それにより、皮膚科学的炎症性障害において役割を果たす可能性があることを初めて実証する。
【０１６１】
ＢＣ−１２１５は、カラゲナン誘導性足浮腫を回復させる。ＢＣ−１２１５はまた、その抗炎症活性を確認するために、マウス足浮腫モデルにおいても試験した。マウスに、２５ｕｌの生理食塩水又は２５ｕｌのカラゲナン（生理食塩水中１％）（Ｐｏｓａｄａｓら、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、２００４．１４２（２）：３３１〜８頁）を足底下に投与し、続いて、２００ｕｇのＢＣ−１２１５を毎日ＩＰ注射した。４８時間後に、マウスを安楽死させ、足の厚さ及び体積を測定した。図１６Ａで示すように、足浮腫が、カラゲナン処理動物で４８時間目に観察された。しかし、ＢＣ−１２１５は、この作用を有意に抑制することができた。図１６Ｂ〜Ｃで示すように、ＢＣ−１２１５は、ビヒクルコントロールと比較して、足の厚さ及び浮腫を有意に低減させる。したがって、ＦＢＸＯ３阻害剤ＢＣ−１２１５は、四肢に関する浮腫の肺外モデルでの炎症を抑制する。
【０１６２】
ＢＣ−１２１５は、ＤＳＳ誘導性大腸炎を回復させる。ＢＣ−１２１５は、その抗炎症活性を確認するために、マウス大腸炎モデルにおいても試験した。簡単に述べると、Ｃ５７ＢＬ６マウスに、３．５％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を含有する水を５日間まで与えた。マウスを、ビヒクル又は２００ｕｇのＢＣ−１２１５のいずれかで、（ＩＰ注射によって）毎日処理した。次いで、マウスを安楽死させ、結腸の長さを測定した。図１７Ａで示すように、ＤＳＳで処理したマウスで結腸の長さの有意な減少が観察され、これは結腸炎症と矛盾がない。しかし、ＢＣ−１２１５で処理したマウスは、コントロールと比較して、結腸の長さの有意な減少は示さなかった。結腸組織のサイトカインレベルを解析した。図１７Ｂ〜Ｃで示すように、ＢＣ−１２１５で処理したマウスは、ビヒクル処理したマウスと比較して、結腸組織のＩＬ１β及びＴＮＦαレベルにおいて顕著な低減を示した。さらにＢＣ−１２１５は、ＤＳＳ処理したマウスにおいて、結腸組織傷害を有意に低減させた（図１７Ｄ）。したがって、ＦＢＸＯ３阻害剤ＢＣ−１２１５は、マウスの化学物質誘導性大腸炎において、炎症を抑制する。
【０１６３】
要約すれば、以前に認識されていなかったＥ３リガーゼ成分、ＦＢＸＯ３が、別のＥ３リガーゼのサブユニット、ＦＢＸＬ２のユビキチン化及び分解を誘発し、それによって、ＴＲＡＦタンパク質のレベルを増大させる新規な経路によって炎症が部分的に媒介されるという、いかなる系においても最初の根拠が、本明細書に開示される。本質的に、ＦＢＸＬ２は、炎症のフィードバック阻害因子であるように思われる。ＴＲＡＦはＮＦ−κＢ駆動性サイトカイン遺伝子発現に対する重要な分子インプットであるので、ＦＢＸＯ３の抑止は、ＴＲＡＦタンパク質の誘導を妨げ、サイトカイン産生を抑制することができる（図１８）。それ故、この発見の中核としてのＦＢＸＯ３の独特な分子構造に基づいて、ヒト細胞及び組織炎症及び傷害の補完的な小動物モデルで抗炎症活性を大きく発現する、新しい系統のＦボックスユビキチン−Ｅ３リガーゼ系のＡｐａＧ小分子阻害剤を作り出した。
【０１６４】
ＢＣ−１２１５は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの増殖を阻害する。図１９で示すように、ＢＣ−１２１５を、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天培地を使用する抗生物質感受性試験で試験した。簡単に述べると、様々な量のＢＣ−１２１５又はゲンタマイシン抗生物質（陽性コントロール）を含有する６ｍｍの濾紙をＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天培地上に加えてからＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに曝露した。このプレートを３７度で２４時間インキュベートした。ゾーンサイズを測定し、陽性の結果を示す赤丸で印をつけた。本データはＢＣ−１２１５は、細菌性ＡｐａＧタンパク質を通して細菌の増殖を阻害し得ることを示唆する。
【０１６５】
ＦＢＸＯ３阻害剤の合成
ＢＣ−１２０２合成の一般的手順。４−（ベンジル−オキシ）ベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、２．１２ｇ）を、エチレンジアミン（０．００５ｍｏｌ、約３５０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで２０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２０２の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１６６】
ＢＣ−１２０３合成の一般的手順。４−（ジメチルアミノ）ベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．４９ｇ）を、エチレンジアミン（０．００５ｍｏｌ、約３５０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで２０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２０３の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１６７】
ＢＣ−１２０４合成の一般的手順。４−メトキシ−ベンズアルデヒド（０．０２ｍｏｌ、２．７２ｇ）を、エチレンジアミン（０．０１ｍｏｌ、約７００ｕｌ）の無水エタノール（４０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで４０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。次いで、生成物ＢＣ−１２０４をＥｔＯＡＣで抽出し、有機層を水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空中で濃縮した。
【０１６８】
ＢＣ−１２０５合成の一般的手順。４−（４−モルホリニル）ベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．９１ｇ）を、エチレンジアミン（０．００５ｍｏｌ、約３５０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで２０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２０５の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１６９】
ＢＣ−１２０６合成の一般的手順。４−（１−ピロリジノ）−ベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．７５ｇ）を、エチレンジアミン（０．００５ｍｏｌ、約３５０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで２０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２０６の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１７０】
ＢＣ−１２０７合成の一般的手順。４−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）ベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．７２ｇ）を、エチレンジアミン（０．００５ｍｏｌ、約３５０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで２０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２０７の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１７１】
ＢＣ−１２０８合成の一般的手順。４−アセチルベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．４８ｇ）を、エチレンジアミン（０．００５ｍｏｌ、約３５０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を還流し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで６０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２０８の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１７２】
ＢＣ−１２０９合成の一般的手順。２−ヒドロキシベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．２２ｇ）を、エチレンジアミン（０．００５ｍｏｌ、約３５０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで１０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２０９の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１７３】
ＢＣ−１２１０合成の一般的手順。４−ヒドロキシベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．２２ｇ）を、エチレンジアミン（０．００５ｍｏｌ、約３５０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで１０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２１０の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いてエタノールから再結晶化した。
【０１７４】
ＢＣ−１２１１合成の一般的手順。４−トリフルオロメトキシ）ベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．９ｇ）を、エチレンジアミン（０．００５ｍｏｌ、約３５０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで６０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。次いで、生成物ＢＣ−１２１１をＥｔＯＡＣで抽出し、有機層を水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空中で濃縮した。
【０１７５】
ＢＣ−１２１２合成の一般的手順。４−（ジメチルアミノ）ベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．４９ｇ）を１，２−フェニレンジアミン（０．００５ｍｏｌ、０．５４ｇ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、３０分間撹拌した。適切なシッフ塩基が沈殿するまで反応物を冷却した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２１２の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１７６】
ＢＣ−１２１３合成の一般的手順。４−（ジメチルアミノ）ベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．４９ｇ）を、（＋／−）−トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン（０．００５ｍｏｌ、０．５７ｇ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで２０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２１３の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１７７】
ＢＣ−１２１４合成の一般的手順。４−（１−ピペリジニル）ベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．８９ｇ）を、エチレンジアミン（０．００５ｍｏｌ、約３５０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を還流し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで３０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２１４の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１７８】
ＢＣ−１２１５合成の一般的手順。４−（２−ピリジニル）ベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．８３ｇ）を、エチレンジアミン（０．００５ｍｏｌ、約３５０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで３０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２１５の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１７９】
ＢＣ−１２１６合成の一般的手順。３，４，５−トリメトキシベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．９６ｇ）を、エチレンジアミン（０．００５ｍｏｌ、約３５０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、３０分間撹拌した。適切なシッフ塩基が沈殿するまで反応物を冷却した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２１６の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１８０】
ＢＣ−１２１７合成の一般的手順。４−（１−ピロリジノ）−ベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．７５ｇ）を、（＋／−）−トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン（０．００５ｍｏｌ、０．５７ｇ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで２０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２１７の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１８１】
ＢＣ−１２１８合成の一般的手順。４−（１−ピペリジニル）ベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．８９ｇ）を、（＋／−）−トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン（０．００５ｍｏｌ、０．５７ｇ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで２０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２１８の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１８２】
ＢＣ−１２２０合成の一般的手順。４−（４−モルホリニル）ベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．９１ｇ）を、（＋／−）−トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン（０．００５ｍｏｌ、０．５７ｇ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで２０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２２０の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１８３】
ＢＣ−１２３２合成の一般的手順。４−（１−ピロリジノ）−ベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．７５ｇ）を、１，２−フェニレンジアミン（０．００５ｍｏｌ、０．５４ｇ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を還流し、３０分間撹拌した。適切なシッフ塩基が沈殿するまで反応物を冷却した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２３２の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１８４】
ＢＣ−１２３３合成の一般的手順。４−（１−ピロリジノ）−ベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．７５ｇ）を、（１Ｓ，２Ｓ）−（＋）−１，２−ジアミノシクロヘキサン（０．００５ｍｏｌ、０．５７ｇ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで２０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２３３の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１８５】
ＢＣ−１２３４合成の一般的手順。４−（１−ピロリジノ）−ベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．７５ｇ）を、１，４−ジアミノブタン（０．００５ｍｏｌ、０．４４ｇ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで２０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２３４の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１８６】
ＢＣ−１２３９合成の一般的手順。４−（１−ピロリジノ）−ベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．７５ｇ）を、１，３−ジアミノプロパン（０．００５ｍｏｌ、０．３７ｇ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで２０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２３９の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１８７】
ＢＣ−１２４１合成の一般的手順。４−（２−ピリジニル）ベンズアルデヒド（０．００５ｍｏｌ、０．９２ｇ）、４−フルオロベンズアルデヒド（０．００５ｍｏｌ、０．６２ｇ）を、エチレンジアミン（０．００５ｍｏｌ、約３５０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を還流し、６０分間撹拌した。適切なシッフ塩基が沈殿するまで反応物を冷却した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２４１の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１８８】
ＢＣ−１２４８合成の一般的手順。４−（２−ピリジニル）ベンズアルデヒド（０．００５ｍｏｌ、０．９２ｇ）、２−ピリジンカルボキシアルデヒド（０．００５ｍｏｌ、０．５３ｇ）を、エチレンジアミン（０．００５ｍｏｌ、約３５０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を還流し、６０分間撹拌した。適切なシッフ塩基が沈殿するまで反応物を冷却した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２４８の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１８９】
ＢＣ−１２５０合成の一般的手順。４−（１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンズアルデヒド（０．００４ｍｏｌ、０．７ｇ）を、エチレンジアミン（０．００２ｍｏｌ、約１４０ｕｌ）の無水エタノール（１０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで２０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を１５ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、２０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２５０の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１９０】
ＢＣ−１２５１合成の一般的手順。５−クロロ−２−ヒドロキシベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．５６ｇ）を、エチレンジアミン（０．００５ｍｏｌ、約３５０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで２０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２５１の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１９１】
ＢＣ−１２５２合成の一般的手順。２−ヒドロキシ−４−メトキシベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．５２ｇ）を、エチレンジアミン（０．００５ｍｏｌ、約３５０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで２０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２５２の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１９２】
ＢＣ−１２５３合成の一般的手順。２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．３８ｇ）を、エチレンジアミン（０．００５ｍｏｌ、約３５０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで２０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２５３の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１９３】
ＢＣ−１２５４合成の一般的手順。４−（２−ピリジニル）ベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．８３ｇ）を、１，４−ジアミノブタン（０．００５ｍｏｌ、０．４４ｇ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで２０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２５４の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１９４】
ＢＣ−１２５５合成の一般的手順。４−（２−ピリジニル）ベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．８３ｇ）を、１，３−ジアミノ−２−プロパノール（０．００５ｍｏｌ、０．４５ｇ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで２０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２５５の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１９５】
ＢＣ−１２５６合成の一般的手順。２−（２−ヒドロキシエトキシ）ベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ、１．６６ｇ）を、エチレンジアミン（０．００５ｍｏｌ、約３５０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで４０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を３０ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、４０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２５６の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１９６】
ＢＣ−１２５７合成の一般的手順。４−トリフルオロメトキシ）サリックアルデヒド（4-Trifluoromethoxy)Salicaldehyde）（０．００４ｍｏｌ、０．８２ｇ）を、エチレンジアミン（０．００２ｍｏｌ、約１４０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで４０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を１５ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０１ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、２０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２５７の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１９７】
ＢＣ−１２５８合成の一般的手順。４−（１，３−チアゾール−２−イル）ベンズアルデヒド（０．００４ｍｏｌ、０．７６ｇ）を、エチレンジアミン（０．００２ｍｏｌ、約１４０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで２０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を１５ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０１ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、２０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２５８の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１９８】
ＢＣ−１２５９合成の一般的手順。４−（２−チエニル）ベンズアルデヒド（０．００４ｍｏｌ、０．７６ｇ）を、エチレンジアミン（０．００２ｍｏｌ、約１４０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで４０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を１５ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０１ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、２０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２５９の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０１９９】
ＢＣ−１２６０合成の一般的手順。４−（２−フリル）ベンズアルデヒド（０．００４ｍｏｌ、０．６９ｇ）を、エチレンジアミン（０．００２ｍｏｌ、約１４０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで４０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を１５ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０１ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、２０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２６０の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０２００】
ＢＣ−１２６１合成の一般的手順。４−（ピリミジン−２−イル）ベンズアルデヒド（０．００４ｍｏｌ、０．７４ｇ）を、エチレンジアミン（０．００２ｍｏｌ、約１４０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで３０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を１５ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０１ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、２０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２６１の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０２０１】
ＢＣ−１２６２合成の一般的手順。４−フェニルベンズアルデヒド（０．００４ｍｏｌ、０．７３ｇ）を、エチレンジアミン（０．００２ｍｏｌ、約１４０ｕｌ）の無水エタノール（２０ｍｌ）溶液に加えた。得られた溶液を加熱し、適切なシッフ塩基が沈殿するまで２０分間撹拌した。シッフ塩基を濾過し、冷エタノールで洗浄した。次いで、シッフ塩基を１５ｍｌの無水メタノールに加えた。水素化ホウ素ナトリウム（０．０１ｍｏｌ）の１０％溶液を無水メタノールに溶解し、シッフ塩基に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの滴加が完了したら、さらに１５分間反応溶液を還流した。次いで、ロータリーエバポレーションによって溶剤を除去し、２０ｍｌの冷水を加えて、２級アミンを遊離させた。ＢＣ−１２６２の沈殿物を集め、水で洗浄し、乾燥させ、続いて酢酸エチルから再結晶化した。
【０２０２】
開示された本発明の原理が適用され得る多くの可能な実施形態の点を考慮すると、例示される実施形態は、本発明の好適な例にすぎないと認識すべきであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきでない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
0006275703.tif 000021
【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
0006275703.tif 000023
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0006275703.tif 000025
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
0006275703.tif 000027
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0006275703.tif 000029
【図３Ｃ】
0006275703.tif 000030
【図３Ｄ】
0006275703.tif 000031
【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図６Ａ】
0006275703.tif 000054
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
0006275703.tif 000060
【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
0006275703.tif 000062
【図７Ａ】
0006275703.tif 000063
【図７Ｂ】
0006275703.tif 000064
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
0006275703.tif 000066
【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
0006275703.tif 000068
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
0006275703.tif 000070
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
0006275703.tif 000072
【図９】
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【図１０Ａ】
0006275703.tif 000074
【図１０Ｂ】
0006275703.tif 000075
【図１０Ｃ】
0006275703.tif 000076
【図１０Ｄ】
0006275703.tif 000077
【図１０Ｅ】
0006275703.tif 000078
【図１１】
0006275703.tif 000079
【図１２】
0006275703.tif 000080
【図１３Ａ】
0006275703.tif 000081
【図１３Ｂ】
0006275703.tif 000082
【図１３Ｃ】
0006275703.tif 000083
【図１３Ｄ】
0006275703.tif 000084
【図１３Ｅ】
0006275703.tif 000085
【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
0006275703.tif 000087
【図１３Ｈ】
0006275703.tif 000088
【図１４Ａ】
0006275703.tif 000089
【図１４Ｂ】
0006275703.tif 000090
【図１４Ｃ】
0006275703.tif 000091
【図１４Ｄ】
0006275703.tif 000092
【図１４Ｅ】
0006275703.tif 000093
【図１４Ｆ】
0006275703.tif 000094
【図１４Ｇ】
0006275703.tif 000095
【図１４Ｈ】
0006275703.tif 000096
【図１５】
0006275703.tif 000097
【図１６】
0006275703.tif 000098
【図１７】
0006275703.tif 000099
【図１８】
0006275703.tif 000100
【図１９】
0006275703.tif 000101
【図２０Ａ】
0006275703.tif 000102
【図２０Ｂ】
0006275703.tif 000103
【図２０Ｃ】
0006275703.tif 000104
【図２０Ｄ】
0006275703.tif 000105
【図２０Ｅ】
0006275703.tif 000106
【図２０Ｆ】
0006275703.tif 000107
【図２０Ｇ】
0006275703.tif 000108
【図２０Ｈ】
0006275703.tif 000109
【図２０Ｉ】
0006275703.tif 000110
【図２０Ｊ】
0006275703.tif 000111
【図２１】
0006275703.tif 000112
【図２２】
0006275703.tif 000113
【図２３】
0006275703.tif 000114
【図２４】
0006275703.tif 000115
【図２５】
0006275703.tif 000116
【図２６】
0006275703.tif 000117
【図２７】
0006275703.tif 000118
【図２８】
0006275703.tif 000119
【図２９】
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【図３０】
0006275703.tif 000121
【図３１】
0006275703.tif 000122
【図３２】
0006275703.tif 000123
【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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