(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸中の１又は複数の配列変化のある配列を決定する方法であって：
ａ）（ｉ）標的核酸及び参照核酸をフラグメントに開裂し、（ｉｉ）フラグメントの質量シグナルを決定することに起因するフラグメントの質量シグナルを提供する工程；
ｂ）標的核酸フラグメントと参照核酸フラグメントとの間の質量シグナルの差を同定し、それにより異なるフラグメントを決定する工程；
ｃ）工程ｂ）において同定された各異なるフラグメントに対応する１又は複数のコンポマー・ウィットネスを生じさせる工程；
ｄ）コンポマー・ウィットネスに対する、参照配列と相対的な標的配列中に含まれる可能な配列変化を表す全ての配列を決定することによって配列変化候補の減少した組を同定する工程；及び
ｅ）標的配列に対応する候補配列変化を決定するための候補配列変化をスコア付けし、標的核酸における１又は複数の配列変化を決定する工程
を含む方法。
【請求項２】
工程ｂ）における質量シグナルの違いが、消失シグナル、追加シグナル、強度が異なるシグナル、及び異なるシグナル対ノイズ比を有するシグナルからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記質量シグナルを質量分析によって決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）標的核酸及び参照核酸を提供する工程；（ｉｉ）特異的開裂によって標的核酸及び参照核酸のフラグメントを生じさせる工程；及び（ｉｉｉ）前記フラグメントの質量シグナルを決定する工程をさらに含み、ここで、（ｉｉｉ）の質量シグナルが（ａ）において提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１つの特異的開裂試薬が、フラグメントを生じさせるために利用される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
コンポマー・ウィットネスが、異なるフラグメントの質量、質量がタイプ又は長さで単一ヌクレオチドだけ異なるフラグメント間のピーク分離、及び質量分光計の分解能からなる群から選択されるパラメータに基づいて生じる、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
標的及び参照核酸をフラグメントに切断することが、特異的開裂試薬との接触によって生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
配列変化候補の減少した組からの配列が、スコア付けアルゴリズムによって同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
標的核酸中の１又は複数の配列変化を決定する方法であって：
（ａ）（ｉ）複数の開裂反応によって、核酸混合物中にある標的核酸を含む試料の特異的開裂、及び同じ開裂反応によって参照核酸の特異的開裂；ならびに（ｉｉ）該断片の質量シグナルを決定すること、に起因する複数の断片化パターンを提供する工程；
（ｂ）標的核酸フラグメントの複数の断片化パターンと参照核酸フラグメントの複数の断片化パターンとの間の質量シグナルにおける違いを同定し、それにより異なるフラグメントを同定する工程；
（ｃ）標的核酸中の特定の配列変異と一致する異なるフラグメントを同定する工程；
（ｄ）（ｃ）の一致した異なるフラグメントを組み合わせて、異なるフラグメントのスペクトルを得る工程；
（ｅ）（ｄ）の異なるフラグメントのスペクトルから、異なるフラグメントの各々に対応する１又は複数のコンポマー・ウィットネスを生じさせる工程；
（ｆ）コンポマー・ウィットネスに対応する、参照配列と相対的な標的配列中に含まれる可能な配列変化を表す全ての配列を決定することによって候補配列である配列変化を決定する工程；
（ｇ）（ｆ）の候補配列をスコア付けする工程；及び
（ｈ）標的核酸における１又は複数の配列変化を決定する工程
を含む方法。
【請求項１０】
コンポマー・ウィットネスが、異なるフラグメントの質量、質量がタイプ又は長さで単一ヌクレオチドだけ異なるフラグメント間のピーク分離、及び質量分光計の分解能からなる群から選択されるパラメータに基づいて生じる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ｆ）の配列変化が、多くともｋ個の配列変化を有する１又は複数の候補配列に従って決定され、ここで、ｋは、１、２、３又はそれ以上である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
各異なるフラグメントについての１又は複数のコンポマー・ウィットネスが、異なるフラグメントの実際の質量との質量差の範囲内の質量を有する、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
２００２年１１月２７日に出願された「Fragmentation-based Methods and Systems for Sequence Variation Detection and Discovery」との表題の米国仮特許出願第６０／４２９，８９５号に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
２００３年４月２５日に出願された「Fragmentation-based Methods and Systems for de novo Sequencing」との表題の米国仮特許出願第６０／４６６，００６号及び２００３年１１月２６日に出願された「Fragmentation-based Methods and Systems for Sequence Variation Detection and Discovery」との表題の米国出願（代理人事件番号第２４７３６−２０７３号）も本出願に関連する。
【０００３】
許されるならば、上記の出願及び仮出願の各々の対象を参照により本明細書に全部取り入れる。
【背景技術】
【０００４】
背景
すべての生物（例えば、動物、植物、及び微生物）の遺伝子情報は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）にコードされている。ヒトにおいて、完全なゲノムは２４個の染色体上に位置する約１００，０００個の遺伝子からなる（The Human Genome, T. Strachan, BIOS Scientific Publishers, 1992）。各遺伝子は、転写及び翻訳を介して発現した後に生細胞内で特定の生物化学機能を果たす特異的なタンパク質をコードする。
【０００５】
遺伝子コードの変化（change）又は変化（variation）は、ｍＲＮＡの配列又は発現レベルの変化及び潜在的にｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の変化を生じさせることができる。多型又は変異として知られるこれらの変化は、疾患を生じさせることとなるｍＲＮＡ又はタンパク質の生物活性に対する有意な悪影響を有することができる。変異には、ヌクレオチド欠失、挿入、置換、又は他の変化（alterations）（すなわち、点変異）が含まれる。
【０００６】
遺伝子多型によって引き起こされる多くの疾患が既知であり、血友病、サラセミア、デュシェンヌ筋ジストロフィ（ＤＭＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、アルツハイマー病、及び嚢胞性繊維症（ＣＦ）が含まれる（Human Genome Mutations, D. N. Cooper and M.Krawczak, BIOS Publishers, 1993）。これらのような遺伝子疾患は、特定の遺伝子を形成するデオキシ核酸（ＤＮＡ）中の単一ヌクレオチドの単一の付加、置換、又は欠失から生じることができる。さらに、遺伝子疾患を生ずる変異した遺伝子に加えて、ある種の先天性異常は、トリソミー２１（ダウン症候群）、トリソミー１３（パトー症候群）、トリソミー１８（エドワーズ症候群）、モノソミーＸ（ターナー症候群）、及びクラインフェルター症候群（ＸＸＹ）などの他の性染色体異数性などの染色体異常の結果である。さらに、ある種のＤＮＡ配列が個体を糖尿病、動脈硬化症、肥満、種々の自己免疫疾患、及び癌（例えば、大腸癌、乳癌、卵巣癌、肺癌）などの多数の疾患のいずれにもかかりやすくすることができるという、ますます増大している証拠がある。
【０００７】
個体の間における遺伝性変化の原因となる２つ以上の同種個体（例えば、ヒト）のゲノム間の単一ヌクレオチド変化は、「単一ヌクレオチド多型」又は「ＳＮＰ」と称される。ＳＮＰがすべて、疾患を生じさせるわけではない。ＳＮＰは、その発生位置及び頻度に依存して、無害のものから致死に至るまで多岐にわたることができる。ある種の多型は、ある個体を疾患にかかりやすくすると考えられ、あるいはある種の疾患の罹患レベルに関係している。アテローム性動脈硬化症、肥満、糖尿病、自己免疫疾患、及び癌は、多型と相関（correlation）を有すると考えられているいくつかのそのような疾患である。さらに、疾患との相関に加え、多型は、疾患を治療するために与えられる治療剤に対する患者の反応の一因となるとも考えられている。例えば、多型は、薬物、照射線療法、及び他の治療形態に反応する患者の能力の一因となると考えられている。
【０００８】
多型を同定することによって、特定の疾患及びそのような疾患に対する潜在的に（potentially）より効果的な治療をより良く理解することができる。実は、患者の同定された多型に基づく個別的な治療の画一的管理は、救命医療行為をもたらすことができる。一度、多型が同定及び単離されれば、特定の多型を有する生成物と相互作用する新規な薬物又は化合物を発見することができる。多型に基づいてウイルス、細菌、プリオン、及び真菌を含む感染性生物の同定を行うこともでき、適切な治療反応を感染された宿主に与えることができる。
【０００９】
約１６個のヌクレオチドの配列は統計的根拠に基づけばヒトゲノムサイズにさえ特異であるので、比較的短い核酸配列を用いて高等生物中の正常及び欠損遺伝子を検出し、感染性微生物（例えば、細菌、真菌、原生生物、及び酵母）及びウイルスを検出することができる。ＤＮＡ配列は、同種内の異なる個体を検出するためのフィンガープリントとして働くことさえできる（Thompson, J. S. and M. W. Thompson, eds., Genetics in Medicine, W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA (1991)を参照のこと）。
【００１０】
いくつかのＤＮＡ検出方法が用いられる。例えば、核酸配列は、増幅核酸分子の移動を既知の標準物と比較することによってゲル電気泳動により、あるいは同定した配列と相補的であるプローブとのハイブリダイゼーションによって同定される。しかしながら、核酸分子を高感度のレポーター機能（例えば、放射性（３２ｐ、３５Ｓ）、蛍光、又は化学発光）を有するように標識した場合のみ、同定を行うことができる。放射性標識は有害であることができ、それらが生成するシグナルは長期にわたって減衰する。高強度レーザーを用いる場合、非同位体標識（例えば、蛍光）では感度の良さに欠けること及びシグナルのフェーディングの難儀を受ける。さらに、標識、電気泳動、及び続けて検出を行うことは、手間を要し、時間がかかり、かつ、間違いを起こしやすい手順である。電気泳動は、核酸のサイズ又は分子量がゲルマトリクス中の移動と直接に相関することができないので特に間違いを起こしやすい。配列特異的な効果、二次構造、及びゲルマトリクスとの相互作用は、人為的な結果を引き起こすことが知られている。さらに、ゲル電気泳動によって得られる分子量情報は、ゲルマトリクス中の移動などの関連パラメータの間接的測定の結果である。
【００１１】
生体高分子の質量分析による分析方法(Hillenkamp et al. (1991) Anal. Chem. 63:1193A-1202Aを参照のこと）及び生体高分子ラダーの作成及び分析方法（国際公開公報ＷＯ９６／３６７３２；米国特許第５，７９２，６６４号を参照のこと）を含む、生物科学での質量分析の適用が報告されている（Meth. Enzymol., Vol. 193, Mass Spectrometry (McCloskey, ed.; Academic Press, NY 1990); McLaffery et al., Acc. Chem. Res. 27: 297-386 (1994); Chait and Kent, Science 257: 1885-1894 (1992); Siuzdak, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91: 11290-11297 (1994)を参照のこと)。
【００１２】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、分析する高分子をマトリクス中に導入することを必要とし、固体（すなわち、結晶）マトリクス中で混合されたポリペプチドに対して及び核酸に対して行なわれてきた。これらの方法では、レーザーを用いてプローブ先端上で結晶化された生体高分子／マトリクス混合物を撃ち、それによって生体高分子の脱離及びイオン化を行う。さらに、ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、マトリクスとして水和水（すなわち、氷）又はグリセロールを用いてポリペプチドに対して行われてきた。水和水をマトリクスとして用いた場合、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを行う前にまずタンパク質を凍結乾燥又は空気乾燥することが必要とした（Berkenkamp et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7003-7007）。この方法における質量の上限は、限定された感度で３０ｋＤａと報告された（すなわち、少なくとも１０ｐｍｏｌのタンパク質が必要とした）。
【００１３】
ＳＮＰｓの検出を含む配列情報を得るため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析が慣用のサンガー配列決定又は同様のプライマー伸長をベースとした方法と組み合わせて用いられてきた（例えば、米国特許第５，５４７，８３５号；第６，１９４，１４４号；第６，２２５，４５０号；第５，６９１，１４１号、及び第６，２３８，８７１号; H. Koster et al, Nature Biotechnol, 14: 1123-1128, 1996; ＷＯ９６／２９４３１；ＷＯ９８／２０１６６；ＷＯ９８／１２３５５；米国特許第５，８６９，２４２号；ＷＯ９７／３３０００；ＷＯ９８／５４５７１; A. Braun et al., Genomics, 46: 18,1997 ; D. P. Little et al., Nat. Med., 3: 1413,1997 ; L. Haff et al., Genome Res., 7: 378,1997 ; P. Ross et al., Nat. Biotechnol., 16: 1347,1998 ; K. Tang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 10016,1999を参照のこと）。本明細書中ではＣ、Ｔ、Ａ、及びＧとも称するＤＮＡ中の４つの天然に存在するヌクレオチド塩基であるｄＣ、ｄＴ、ｄＡ、及びｄＧの各々はＭC＝２８９．２；ＭT＝３０４．２；ＭA＝３１３．２；ＭG＝３２９．２の異なる分子量を有するので（ＭC、ＭT、ＭA、ＭGは、それぞれ、ヌクレオチド塩基デオキシシチジン、チミジン、デオキシアデノシン、及びデオキシグアノシンのダルトンによる（天然同位体分布下での）平均分子量である）、単一の質量スペクトルで配列全体を読むことが可能である。単一スペクトルを用いて、各塩基位置においてジデオキシヌクレオチドを導入することによって鎖の終結を行う慣用のサンガー配列決定反応の生成物を分析する場合、隣接ピーク間の質量の違いを計算することによって塩基配列を決定することができる。ＳＮＰｓ、対立遺伝子、又は他の配列変化（例えば、挿入、欠失）の検出のため、変異体特異的プライマー伸長を標的核酸分子中の多型ＳＮＰ又は配列変化部位の直ぐ近くで行う。伸長生成物の質量並びに伸長された生成物及び伸長されていない生成物間の質量の違いは、対立遺伝子、ＳＮＰ、又は他の配列変化のタイプを示している。
【００１４】
米国特許第５，６２２，８２４号は、質量分析検出に基づくＤＮＡ配列決定方法を記載している。これを行うために、保護、酵素活性の特異性、又は固定化によって、エキソヌクレアーゼ消化によってＤＮＡを逐次形式で片側だけ分解し、ヌクレオチド又は誘導体を質量分析によって検出する。酵素分解前に、クローニングしたＤＮＡ配列の橋渡しをする規則正しい欠失の組を作成することができる。このように、エキソヌクレアーゼ及びＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼの組み合わせを用いて、質量修飾ヌクレオチドを導入することができる。これによって、多重処理質量分析検出又はエキソヌクレアーゼ活性の調節のいずれかが可能となり、分解プロセスが同時進行するようになる。
【００１５】
米国特許第５，６０５，７９８号及び第５，５４７，８３５号は、生物試料中の特定の核酸配列の検出方法を提供する。検出する配列に依存して、該プロセスを例えば診断方法で用いることができる。
【００１６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析をマイクロサテライトなどの遺伝子変化、挿入及び／又は欠失変異、及び単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）の分析に適用するための技術が工業的規模で開発されている。これらの技術を多数の個体試料又はプールした試料のいずれかに適用して、個体集団又は異種腫瘍試料中の対立遺伝子頻度又はＳＮＰｓ頻度を研究することができる。標的核酸又はプライマーがシリコン又はシリコンコーティング基体などの固体支持体に結合されているチップをベースとした形式で、好ましくはアレイの形態で、分析を行うことができる（例えば、K. Tang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 10016,1999を参照のこと）。一般的に、質量分析、特にＭＡＬＤＩを用いて分析を行う場合、得られるスポットがほぼレーザースポットのサイズであるかそれより小さいように、少量のナノリットル試料体積を基体に充填する。これを行った場合、質量分析結果は定量的であることが見出されている。得られた質量スペクトル中のシグナルの下部領域は、（バックグランドに対して規格化及び修正したときに）濃度と比例する。そのようなチップの調製及び使用方法は、米国特許第６，０２４，９２５号，同時係属米国特許出願第０８／７８６，９８８号，第０９／３６４，７７４号，第０９／３７１，１５０号、及び第０９／２９７，５７５号に記載されている。ＷＯ９８／２００２０として公開された米国特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／２０１９５も参照のこと。これらの分析を行うためのチップ及びキットは、セクエノム社（SEQUENOM，INC．）からマス・アレイ（Mass ARRAY）（登録商標）の商標で市販されている。マス・アレイ（登録商標）は、小型化アレイ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリクス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型）質量分析と組み合わせた質量スペクトル分析に依って、迅速に結果を出す。それは、標識のない遺伝変異体と関連するＤＮＡフラグメントサイズの単一塩基変化を正確に区別する。
【００１７】
特に上記のＤＮＡフラグメント由来の核酸配列情報を得るためにＭＡＬＤＩを使用することによって、高速でのシグナルの取得及び固体表面の自動化分析に因ったハイスループットの利点が与えられるが、その用途には制限がある。ＳＮＰ若しくは変異又は他の配列変化が不明である場合、変異体質量スペクトル又はゲル電気泳動の場合には移動などの他の質量指数を配列変化を含んでいない参照配列のすべての可能な配列変化についてシミュレートしなければならない。次いで、特定の配列変化又は配列変化の組に対応するシミュレーションした各変異体スペクトルを実際の変異体質量スペクトルに対してマッチングを行い、最も起こり得そうな配列変化又は変異体スペクトルを生ずる変化を決定しなければならない。そのような純粋にシミュレーションをベースとした手法は時間がかかる。例えば、１０００個の塩基の参照配列が与えらた場合、約９０００個の潜在的な単一塩基配列変化が存在する。すべてのそのような潜在的な配列変化について予測されるスペクトルをシミュレートし、それらを実験測定したスペクトルに対してマッチングを行わなければならない。単一の塩基又は配列変化のみではなく複数の塩基変化又は複数の配列変化が存在する場合、問題はさらに悪化する。
【００１８】
したがって、ＳＮＰ、変異、及び他の配列変化の検出及び発見の精度を向上させる必要性がある。したがって、本明細書での目的の１つは、ＳＮＰ、変異、及び他の配列変化の検出及び発見の精度を向上させることである。さらに、本明細書での目的の中の１つは、ＳＮＰ、変異、及び配列変化の検出及び発見のスピードを増すことである。
【発明の開示】
【００１９】
概要
非常に正確なＳＮＰ、変異、及び他の配列変化の検出及び発見用の方法及びシステムを本明細書中に提供する。本明細書での方法及びシステムによって、迅速で正確なＳＮＰ、変異、及び配列変化の検出及び発見が可能となる。
【００２０】
分子質量に基づく質量分析及びゲル電気泳動などの技術を用いて、核酸多型及び変異を含む配列変化の検出又は発見方法及びシステムを本明細書中に提供する。該方法及びシステムは、核酸配列変化に基づく種々の情報を提供する。例えば、そのような情報には、遺伝病又は染色体異常の同定；肥満、アテローム性動脈硬化症、又は癌を含むが限定するものではない疾患又は状態に対する素因の同定；病原菌による感染の同定；同一性、遺伝、又は組織適合性に関する情報の提供；病原体（例えば、細菌、ウイルス、及び真菌）の同定；抗生物質又は他の薬物耐性プロファイリングの提供；ハプロタイプの決定；マイクロサテライト配列及びＳＴＲ（ショートタンデムリピート）座の分析；対立遺伝子変化及び／又は頻度の決定；細胞のメチル化様式の分析；遺伝子型変化の疫学的分析；及び進化中の遺伝子変化が含まれるが、限定するものではない。
【００２１】
遺伝病、ある種の疾患の素因、癌、及び感染の診断における核酸配列変化の検出又は発見方法を本明細書中に提供する。
【００２２】
特異的開裂による既知の変異、ＳＮＰｓ、若しくは他の種類の配列変化（例えば、挿入、欠失、配列決定におけるエラー）の検出方法又は新たな変異、ＳＮＰｓ、若しくは配列変化の発見方法を提供する。これらの方法では、（ｉ）開裂試薬の配列特異性（例えば、核酸では、単一塩基であるＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、若しくはＵなどの塩基特異性、又は修飾された単一塩基若しくはヌクレオチドの認識、又は約２〜約２０塩基の間の短い非変性及び変性オリゴヌクレオチド配列の認識）；又は（ｉｉ）標的生物分子の構造；又は（ｉｉｉ）質量分析における衝突誘起解離によるイオン化などの物理的プロセス、又は（ｉｖ）それらの組み合わせに基づき、標的生物分子配列中の特定の位置で開裂されたフラグメントが標的生物分子から生じる。全長生物分子ではなくフラグメントの分析では、決定するイオンの質量がより低い質量範囲にシフトして質量分析検出が一般的にはより容易となる。例えば、より小さい質量にシフトすることによって、質量分解、質量精度、及び特にこれらの検出感度が増す。質量分析によって決定される標的生物分子のフラグメントの実際の分子量は、配列情報（例えば、変異の存在及び／又は同一性）を提供する。標的生物分子中の複数の配列変化を検出するのに本明細書中に提供する方法を用いることができる。
【００２３】
フラグメントの分子量パターン、すなわち、標的生物分子から生じたフラグメントの質量シグナルを、参照配列について同じ開裂条件下で生じさせたフラグメントの実際のパターン又はシミュレーションしたパターンと比較する。標的配列中で同定される配列変化（変異、多型）が参照配列中では存在しないことを除き、参照配列は、通常、標的配列に対応する。例えば、生物分子が核酸である場合、参照核酸配列は野生型対立遺伝子に由来することができるのに対し、標的核酸配列は変異体対立遺伝子に由来することができる。別の例として、参照核酸配列はヒトゲノム由来の配列であることができるのに対し、標的核酸配列は病原体などの感染性生物由来の配列であることができる。次いで、標的配列及び参照配列間の質量シグナルの違いを分析して、標的生物分子配列中に存在する可能性が最も高い配列変化を決定する。標的配列及び参照配列間の質量シグナルの違いは、絶対的であることができるし（すなわち、一方の配列の断片化シグナルには存在するが、他方には存在しない質量シグナル）、あるいは限定するものではないがシグナルのピーク強度（高さ、面積、シグナル対ノイズ、又はそれらの組み合わせ）の違いなど相対的であることができる。
【００２４】
本明細書中に提供する方法を用いて、参照配列と相対的な２０００個以下及び２０００個の塩基より大きい核酸配列を配列変化の存在についてスクリーニングすることができる。さらに、配列変化は、塩基コーリングエラーの発生の減少に因って高い精度で検出され、５％未満の対立遺伝子頻度を通常有する、アミノ酸変化を生じさせる遺伝子コード領域中のＳＮＰｓなどの「本物の」ＳＮＰｓの検出に特に有用であることが証明される（例えば、L. Kruglyak et al., Nat. Genet., 27: 234, 2001を参照のこと）．
【００２５】
本明細書中に提供する方法では、標的核酸配列の特異的開裂によって得られるフラグメントと同じ条件下で参照核酸配列の実際の又はシミュレーションした特異的開裂によって得られるフラグメントとの間の質量シグナルの違い（標的核酸フラグメントスペクトル中の「追加」又は「消失」質量シグナル）を同定し、これらの違いに対応するフラグメントの質量を決定する。違いの組には、標的断片化パターンにおける「消失」又は「追加」シグナルに加えて、標的及び参照配列間の異なる強度のシグナル又はシグナル対ノイズ比が含ませることができる。一度、標的配列及び参照配列間の違いに対応するフラグメント（「異なる」フラグメント）の質量が決定されれば、質量が各異なるフラグメントの実際の測定質量とは十分に小さい質量の違いより小さいかそれと等しい値だけ異なる１つ以上の核酸塩基組成物（コンポマー）が同定される。これらのコンポマーをウィットネス・コンポマーと呼ぶ。この十分に小さい質量の違いの値は、限定するものではないが、異なるフラグメントの質量、質量がタイプ又は長さで単一ヌクレオチドだけ異なるフラグメント間のピーク分離、質量分光計の絶対分解能などのパラメータによって決定される。４つの核酸塩基（ＲＮＡでは、Ａ、Ｇ、Ｃ、若しくはＵ、又はそれらの修飾物）の１つ以上に特異的な開裂反応を用いて、十分に小さい質量の違いより小さいかそれと等しい値だけ各異なるフラグメントの測定質量と近いか等しい特異的に開裂された各フラグメントについての可能なウィットネス・コンポマーを含むデータの組を作成することができる。
【００２６】
次いで、各異なるフラグメントについて作成されたウィットネス・コンポマーを用いて、標的核酸配列中のＳＮＰｓ又は他の配列変化（例えば、挿入、欠失、置換）の存在を決定することができる。
【００２７】
異なるフラグメントに対応する可能なウィットネス・コンポマーを手動で分析して、コンポマーに対応する配列変化を得ることができる。別の態様では、異なるフラグメントの可能なウィットネス・コンポマーから標的配列変化を再構築するための数学的アルゴリズムを提供する。第１の工程では、同じ開裂条件下で他方と相対的な標的核酸又は参照核酸開裂反応のいずれかで生じる各異なるフラグメントの実際の質量とは十分に小さい質量の違いより小さいかそれと等しい値だけ質量が異なるすべての可能なコンポマーを同定する。これらのコンポマーを「コンポマー・ウィットネス」と呼ぶ。次いで、アルゴリズムにより、同定されるコンポマー・ウィットネスを生ずるであろうすべての配列変化が決定される。アルゴリズムにより、変異、多型、又は生物間の配列変化、挿入、欠失、及び置換を含むが限定するものではない他の配列変化を多くともｋ個含む、参照配列と相対的な標的配列のそれらの配列変化が構築される。配列変化の位数であるｋの値は、限定するものではないが参照配列及び標的配列間の配列変化の予測されるタイプ及び数を含むパラメータの数に依存し、例えば、配列変化が単一塩基であるか複数塩基であるか、あるいは参照配列と相対的な配列変化が標的配列上の１つの位置で存在するか２つ以上の位置で存在するかに依存する。例えば、ＳＮＰｓの検出では、ｋの値は、必ずしもではないが通常は１又は２である。変異の検出及び再配列決定では、ｋの値は、必ずしもではないが通常は３以上である。参照配列と相対的な標的配列中に含まれる可能な配列変化を表す配列を配列変化候補と呼ぶ。標的配列中に検出される可能な配列変化は、通常、特異的開裂によって各配列変化に対応するウィットネス・コンポマーが生ずる配列変化すべての合計である。
【００２８】
計算処理した各出力配列変化候補についてシミュレーションしたスペクトルを生じるための第２のアルゴリズムを用いる。各配列変化候補についてのシミュレーションしたスペクトルを標的核酸配列についての実際のスペクトルに対してスコア付けするための第３の（スコア付け）アルゴリズムを用いる。次いで、スコアの値（スコアが高いほど、マッチングは良好であり、最も高いスコアは、通常、存在する可能性が最も高い配列変化である）を用いて、実際の標的核酸配列に対応する配列変化候補を決定することができる。配列変化候補の出力は、特異的開裂反応で異なるフラグメントを生ずる参照配列と相対的な標的配列のすべての配列変化を含む。互いに相互作用しない標的配列中の配列変化では、すなわち、各配列変化が特異的開裂反応で（参照配列と相対的な標的配列の）区別される異なるフラグメントを生ずるのに標的配列に沿った配列変化間の分離（距離）が十分である場合、参照配列と相対的な標的配列の断片化パターンの違いは参照配列と相対的な標的配列中のすべての配列変化の合計を表す。
【００２９】
複数の標的配列を同じ参照配列に対して分析する場合、アルゴリズムは、同じ配列変化候補に対応するそれらの標的配列のスコアを合わせることができる。したがって、実際の配列変化を表す配列変化候補の全スコアを決定することができる。この実施態様は、例えばＳＮＰ発見に特に有用である。
【００３０】
配列変化候補出力は、標的配列中の追加の配列変化を検出するための反復プロセスでさらに用いることができる。例えば、標的配列中の２つ以上の配列変化の反復検出プロセスでは、最も高いスコアを有する配列変化を実際の配列変化として受け取り、この配列変化に対応するシグナル又はピークを参照フラグメントスペクトルに加えて、アップデートした参照フラグメントスペクトルを作成する。次いで、残りのすべての配列変化候補をこのアップデートした参照フラグメントスペクトルに対してスコア付けし、次に最も高いスコアを有する配列変化候補を出力する。この第２の配列変化候補も、標的配列中の第２の実際の配列変化を表すことができる。したがって、これらの第２の配列変化に対応するピークを参照フラグメントスペクトルに加えて、第２のアップデートした参照スペクトルを作成することができ、該参照スペクトルに対する第３の配列変化をスコアに従って検出することができる。標的配列中の実際の配列変化を表す配列変化候補が同定されなくなるまで、この反復プロセスを繰り返すことができる。
【００３１】
一実施態様では、１つ以上の特異的開裂試薬を用いて、野生型及び変異体対立遺伝子の混合物を含有する試料中の標的核酸分子の混合物をフラグメントに開裂する工程；１つ以上の同じ開裂試薬を用いて、野生型対立遺伝子を含む核酸分子をフラグメントにする開裂を行うかシミュレーションする工程；フラグメントの質量を決定する工程；野生型核酸分子と相対的な標的核酸分子の混合物中の配列変化を表す標的核酸分子及び野生型核酸分子間のフラグメントの違いを同定する工程；コンポマー・ウィットネスである異なるフラグメントを決定する工程；各コンポマー・ウィットネスに対応する配列変化位数ｋの有界コンポマーの組を決定する工程；有界各コンポマーについて、候補対立遺伝子である対立遺伝子変異体を決定する工程；候補対立遺伝子をスコア付けする工程；及び試料中の変異体対立遺伝子の対立遺伝子頻度を決定する工程による、試料中の対立遺伝子頻度の決定方法を本明細書中に提供する。
【００３２】
他の実施態様では、本明細書中に提供する方法は、生物試料中の核酸混合物中における標的核酸中の配列変化の検出に用いることができる。生物試料には、個体のプール由来のＤＮＡ、又は単一の組織型若しくは細胞型に由来する均一な腫瘍試料、又は２つ以上の組織型若しくは細胞型を含有する不均一腫瘍試料、又は一次腫瘍に由来する細胞系が含まれるが、限定するものではない。同じ遺伝子中に２つの変異が検出されるハプロタイピング法などの方法も企図する。
【００３３】
他の実施態様では、各標的核酸及び１つ以上の参照核酸を１つ以上の開裂試薬を用いて同じ開裂反応で断片化することにより、複数の標的核酸を単一の反応測定で多重処理する（multiplexed）ことができる。これらの方法は、１つ以上の参照核酸と相対的な１つ以上の標的核酸の間の断片化パターンの違いを１つ以上の特異的開裂試薬を用いて同時に分析する場合に特に有用である。
【００３４】
一実施態様では、本明細書中に提供する方法によって生じたフラグメントを参照配列と相対的な配列変化の存在について分析し、より大きい標的核酸の配列を与えるように分析されるフラグメント配列を順序付ける。単一の特異的開裂反応又は相補的な特異的開裂反応を用いて、同じ標的生物分子配列の代替フラグメントが得られるよう、部分的又は全体的な開裂によってフラグメントを生じさせることができる。開裂部位を同定できる限り、開裂手段は酵素的、化学的、物理的、又はそれらの組み合わせであることができる。
【００３５】
標的核酸は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、及びＤＮＡ／ＲＮＡモザイク核酸の中から選択することができる。標的核酸を生物試料から直接単離することができ、あるいは生物試料由来の核酸配列を増幅又はクローニングすることによって得ることができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写に続いて行うポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅、及び転写をベースとしたプロセスによって増幅を行うことができる。
【００３６】
断片化の前に、開裂特異性が変わるように核酸、タンパク質、及びペプチドなどの標的生物分子を処理することができる。
【００３７】
一実施態様では、修飾したヌクレオシド三リン酸を用いて標的核酸を増幅する。修飾により、開裂試薬による標的核酸配列の開裂特異性が与されるかあるいは変わり、質量シグナル分離を増すことによって断片化スペクトルの分解能が向上する。修飾ヌクレオシド三リン酸は、同位体に富む（13Ｃ／15Ｎなど）又は同位体が枯渇したヌクレオチド、質量修飾デオキシヌクレオシド三リン酸、質量修飾ジデオキシヌクレオシド三リン酸、及び質量修飾リボヌクレオシド三リン酸の中から選択することができる。質量修飾三リン酸は、塩基、糖、及び／又はリン酸部分上で修飾することができ、酵素による工程によって、化学的に、あるいは双方の組み合わせによって導入される。一態様では、修飾には、ヒドロキシル基以外の２’置換基が含まれる。別の態様では、ヌクレオシド間の結合、例えば、ホスホロチオエート結合又はアルキル化剤とさらに反応させたホスホロチオエート結合を修飾することができる。さらに別の態様では、修飾ヌクレオシド三リン酸をメチル基、例えば、５−メチルシトシン又は５−メチルウリジンで修飾することができる。
【００３８】
別の実施態様では、天然に存在するが標的核酸の通常の前駆体ではないヌクレオシド三リン酸を用いて標的核酸を増幅する。例えば、通常のＤＮＡ前駆体ヌクレオチド（例えば、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＧＴＰ）及びｄＵＴＰの存在下でＤＮＡを増幅することよって、通常はＤＮＡ中に存在しないウリジン三リン酸を増幅するＤＮＡ分子中に導入することができる。増幅生成物をウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）で処理した場合、ウラシル残基が開裂する。ＵＤＧ反応からの生成物を続いて化学又は酵素処理することにより、リン酸骨格が開裂し、核酸塩基特異的フラグメントが生ずる。さらに、グリコシラーゼ処理の前に増幅生成物の相補鎖を分離することによって、相補的な断片化パターンを生じさせることが可能となる。したがって、ｄＵＴＰ及びウラシルＤＮＡグリコシラーゼを使用することによって、相補鎖用のＴ特異的フラグメントを生じさせることが可能となり、所与の配列内のＴ及びＡ位置に関する情報が提供される。同様に、両方の（相補）鎖に対するＣ特異的反応（すなわち、Ｃ特異的グリコシラーゼによる）により、両方の増幅鎖の断片化パターンを別々に分析する場合には、所与の配列内のＣ及びＧ位置に関する情報が与えられるであろう。グリコシラーゼ法及び質量分析法を用いれば、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ特異的断片化パターンのすべての系を分析することができる。特定の化学物質でＤＮＡを処理することにより、該塩基が特定のＤＮＡグリコシラーゼによって認識されるように存在する塩基を修飾するいくつかの方法が存在する。例えば、メチルニトロソ尿素などのアルキル化剤でＤＮＡを処理することにより、アルキルプリンＤＮＡ−グリコシラーゼによって認識及び開裂されるＮ３−メチルアデニン及びＮ３−メチルグアニンを含むいくつかのアルキル化塩基が生ずる。重亜硫酸ナトリウムでＤＮＡを処理することにより、ＤＮＡ中のシトシン残基の脱アミノ化が引き起こされてＤＮＡ中のウラシル残基を形成させることができ、該ウラシル残基はウラシルＮ−グリコシラーゼ（ウラシルＤＮＡ−グリコシラーゼとしても知られる）によって開裂させることができる。化学試薬によっても、グアニンをその酸化形態である８−ヒドロキシグアニンに変換することもでき、該８−ヒドロキシグアニンはホルムアミドピリミジンＤＮＡ  Ｎ−グリコシラーゼ（ＦＰＧタンパク質）によって開裂させることができる（Chung et al., "Anendonuclease activity of Escherichia coli that specifically removes 8-hydroxyguanine residues from DNA," Mutation Research 254: 1-12 (1991)）。
【００３９】
別の実施態様では、ゲノムＤＮＡの重亜硫酸塩処理を利用して、ＤＮＡ内のメチル化シトシン残基の位置を分析することができる。核酸を重亜硫酸塩で処理することにより、メチル化シトシンを未修飾としたまま、シトシン残基を脱アミノ化してウラシル残基にすることができる。したがって、本明細書中に提供する方法において、重亜硫酸塩で処理しない標的核酸の配列の開裂パターンを重亜硫酸塩で処理した標的核酸の配列の開裂パターンと比較することにより、核酸中のメチル化の程度及びシトシンがメチル化された位置を推定することができる。
【００４０】
本明細書中に提供する方法は、核酸の断片化に依存する又は該断片化を含む任意の配列決定方法又は検出方法に適用可能である。後でさらに論じる通り、ポリヌクレオチドの断片化は当該技術分野で既知であり、多くの方法で行うことができる。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びＲＮＡのアナログ、又はそれらの組み合わせからなるポリヌクレオチドは、物理的、化学的、酵素的に断片化することができる。フラグメントはそのサイズが種々異なることができ、好適な核酸フラグメントは典型的には約２０００個未満のヌクレオチドである。好適な核酸フラグメントは、限定するものではないが約１０００個未満の塩基、約１００〜約５００個の間の塩基、又は約２５〜約２００個の塩基を含むいくつかのサイズ範囲に属することができる。ある態様では、約１個のヌクレオチドのフラグメントが特異的開裂によって得られたフラグメントの組に存在していてもよい。
【００４１】
核酸のフラグメンテーショは、鎖終結用ヌクレオチドの存在下における鎖伸長に依存した配列決定方法と組み合わせることもできる。これらの方法には、サンガー配列決定に基づく配列決定方法、及び鎖伸長工程に依存し、かつ、該工程を含むプライマーオリゴ塩基伸長などの検出方法（例えば、米国特許出願第６，０４３，０３１号；許容されるならば米国特許出願第６，２５８，５３８号；及び第６，２３５，４７８号を参照のこと）が含まれるが、限定するものではない。
【００４２】
塩基特異的に終結されるフラグメントを核酸から生じる１つの方法は、適切な量の標的核酸を適切な量の特定のエンドヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸を部分又は完全消化することによって行う。エンドヌクレアーゼは、反応を行って完了した場合でさえ、典型的には配列を約５０〜７０個以下のヌクレオチドの片に分解する。一実施態様では、核酸はリボ核酸であり、エンドヌクレアーゼはＧ特異的ＲＮａｓｅＴ1、Ａ特異的ＲＮａｓｅＵ2、Ａ／Ｕ特異的ＲＮａｓｅＰｈｙＭ、Ｕ／Ｃ特異的ＲＮａｓｅＡ、Ｃ特異的ニワトリ肝臓ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅＣＬ３）、又はクサビチン（cusavitin）の中から選択されるリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）である。他の実施態様では、核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であり、開裂試薬はＤＮＡｓｅ又はグリコシラーゼである。別の実施態様では、エンドヌクレアーゼは、標的核酸内に含まれる少なくとも１つの部位を開裂する制限酵素である。塩基特異的に終結されるフラグメントを生ずる別の方法には、例えば、鎖終結用ヌクレオチドに対して比較的低い親和性である適切な量の第１のＤＮＡポリメラーゼを用いて標的を数関数的に増幅し、かつ、鎖終結用ヌクレオチドに対して比較的高い親和性を有するポリメラーゼを用いて重合を塩基特異的に終結させる、増幅及び塩基特異的終結反応の組み合わせを行うことが含まれる。
【００４３】
開裂及び未開裂標的配列フラグメントの質量は、限定するものではないが、質量分析、及びゲル電気泳動、好ましくはＭＡＬＤＩ／ＴＯＦを含む当該技術分野で既知である方法を用いて決定することができる。ハイスループット質量分析の分析を行うためのチップ及びキットは、セクエノム社（SEQUENOM, INC）からマス・アレイ（Mass Array）（登録商標）の商標で市販されている。マス・アレイ（登録商標）系を用いて、塩基特異的断片化によって発見され位置づけられるＳＮＰｓ及び他の変異を高速かつ高精度で分析することができる。
【００４４】
本明細書中に提供する方法は、シグナルをスクリーニングして標的核酸内の本物の配列変化を表す可能性が高いシグナルのみを選択するアルゴリズムを用いることにより、標的核酸のプライマー伸長ではなく塩基特異的断片化によって生じたフラグメントシグナルの同定の精度及び明瞭性の向上とこれらのシグナルの分析スピードの増加を併せ持つ。
【００４５】
本明細書中に提供する方法は、複数のゲノム（種）又は複数の個体由来の核酸混合物を含有する試料又は組織若しくは細胞の混合物に由来する腫瘍試料などの生物試料中の配列変化を分析するようにさらに適合させることができる。そのような「試料混合物」は、通常、非常に低い頻度で標的核酸を含む配列変化又は変異又は多型を大過剰の野生型配列とともに含有する。例えば、腫瘍では、腫瘍を引き起こす変異が、通常、２つ以上の組織型又は細胞型の不均一混合物である腫瘍試料中に存在する核酸の５〜１０％未満存在する。同様に、個体の集団では、例えば、疾患状態又は疾患の素因を決定付ける機能的因果関係を有するほとんどの多型は５％未満の低い対立遺伝子頻度で発生する。本明細書中に提供する方法は、約５〜１０％未満の範囲で存在する低い頻度の変異、配列変化、対立遺伝子、又は多型を検出するように適合させることができる。
【００４６】
本明細書中に提供する方法は、配列決定エラーを検出するように適合させることもできる。例えば、本明細書中に提供する方法で用いる参照核酸の実際の配列が（例えば、公表されたデータベースで）報告された配列とは異なる場合、本明細書中に提供する方法は、報告された配列中の配列変化を検出することによって報告された配列中のエラーを検出する。
【００４７】
本明細書の方法によって、任意のサイズ、具体的には約４０００ｎｔ未満の範囲、より典型的には約１００〜約１０００ｎｔの範囲でのオリゴヌクレオチドの配列決定が可能となる。
【００４８】
標的核酸中の変異（挿入、欠失、置換）及び多型の検出又は発見のための構成要素を含むキットも提供する。キットは、本明細書中に記載される試薬及び任意選択により反応を行うのに必要とされる任意の他の試薬を含む。そのような試薬及び組成物は、当業者に既知である標準のパッケージング中にパッケージングされる。追加のバイアル、容器、ぺピット、シリンジ、及び他の配列決定用製品も含ませることができる。反応を行うための指示書を含ませることができる。
【００４９】
本明細書中に提供する方法は、参照タンパク質又はペプチド配列と相対的な標的タンパク質又はペプチド配列中の配列変化を決定するように適合させることができる。化学開裂、酵素開裂、及びイオン化による断片化を含むいくつかの技術を用いて、タンパク質を特異的開裂によって断片化することができる。次いで、参照タンパク質又はペプチドと相対的な標的タンパク質又はペプチドの断片化スペクトル中の消失又は追加シグナルに対応する断片化の違いを同定する。本明細書中に記載の通り、一度、異なるフラグメントの質量が決定されれば、質量が各異なるフラグメントの実際の測定質量とは十分に小さい質量の違いより小さいかそれと等しい値だけ異なる１つ以上のアミノ酸組成物（コンポマー）が同定される。これらのコンポマーは、標的タンパク質又はペプチドについてのウィットネス・コンポマーであろう。２０個のアミノ酸のうちの１個以上又は配列モチーフに特徴的な１つ以上の構造的特徴に特異的な開裂反応を用いて、十分に小さい質量の違いより小さいかそれと等しい値だけ各異なるフラグメントの測定質量に近いかそれと等しい各々の特異的に開裂されたフラグメントについての可能なウィットネス・コンポマーを含むデータのセットを作成することができる。
【００５０】
次いで、参照配列と相対的な標的タンパク質又はペプチド配列の各異なるフラグメントについての可能なウィットネス・コンポマーを用いて、標的タンパク質又はペプチド配列中のＳＮＰｓ又は他の配列変化（例えば、挿入、欠失、置換）の存在を決定することができる。
【００５１】
その他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
詳細な説明
Ａ．定義
Ｂ．フラグメントの生成方法
Ｃ．多型、変異、及び配列変化の発見技術
Ｄ．適用
Ｅ．システム及びソフトウェア方法
Ｆ．実施例
【００５３】
Ａ．定義
別に定義しない限り、本明細書中で用いる技術及び科学用語はすべて、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中の開示全体にわたって言及される特許、特許出願、公開された出願、及び公表物、遺伝子バンク配列、ウエブサイト、並びに他の公表された資料はすべて、注記しない限り、参照により本明細書に全部取り入れる。本明細書中の用語について複数の定義がある場合には、本セクションの用語が優先する。ＵＲＬ又は他のそのような識別子若しくはアドレスを参照する場合、識別子は変わることができ、かつ、インターネット上の特定の情報が現れては消えることができるが、インターネットを検索することによって等価な情報を見出すことができると理解する。それらの参照は、そのような情報の有用性及び公衆への普及を立証するものである。
【００５４】
本明細書中で用いられる通り、分子とは、任意の分子的実体をいい、ペプチド、タンパク質、有機化合物、オリゴヌクレオチド、又はペプチド、有機物、核酸、及び他の高分子の単量体単位などの生体高分子、生物分子、高分子、又はそれらの成分若しくは前駆体を含むが、限定するものではない。単量体単位とは、得られる化合物を作っている構成物の１つをいう。したがって、単量体単位には、ヌクレオチド、アミノ酸、及びファルマコフォアが含まれ、これらから小さな有機分子が合成される。
【００５５】
本明細書中で用いられる通り、生物分子は天然に存在する任意の分子又はその誘導体である。生物分子には、限定するものではないが細胞、組織、プリオン、動物、植物、ウイルス、細菌、プリオン、及び他の生物を含む生物及びウイルスから単離することができる生体高分子、高分子、及びすべての分子が含まれる。生物分子には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、ステロイド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オリゴ糖及び単糖、酵素補助因子などの有機分子、ヘム、鉄硫黄クラスター、ポリフィリンなどの金属複合体及びそれらの金属複合体、銅、モリブデン、亜鉛などの金属なども含まれるが、限定するものではない。
【００５６】
本明細書中で用いられる通り、高分子とは、数千から数百万の分子量を有する任意の分子をいう。高分子には、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、核酸、炭水化物、及び一般的には生物によって合成されるが合成によりあるいは分子生物学的組換え方法を用いて調製することができる他のそのような分子が含まれるが、限定するものではない。
【００５７】
本明細書中で用いられる通り、生体高分子とは、結合又は高分子によって結合された２以上の単量体サブユニット又はその誘導体からなる高分子を含む生物分子をいう。生体高分子は、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物、若しくは脂質、又はそれらの誘導体若しくは組み合わせであることができ、例えば、ペプチド核酸部分又は糖タンパク質を含む核酸分子である。
【００５８】
本明細書中で用いられる通り、「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドをいう。該用語には、等価物、誘導体、変異体、及びヌクレオチドアナログで作られたＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかのアナログとして、一本鎖（センス又はアンチセンス）及び二本鎖ポリヌクレオチドも含まれると理解しなければならない。デオキシリボヌクレオチドには、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、及びデオキシチミジンが含まれる。ＲＮＡでは、ウラシル塩基はウリジンである。「ポリヌクレオチド」を核酸と称することは、一本鎖又は二本鎖分子を含む、共有結合で結合された２個以上のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを意味するために最も広い意味で用いられる。「オリゴヌクレオチド」との用語は、共有結合で結合された２個以上のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを意味するために本明細書中で用いるが、ＰＣＲプライマーなどのオリゴヌクレオチドは一般的に長さが約１５〜１００個未満のヌクレオチドであると当業者は認識している。「増幅」との用語は、核酸に関して用いる場合、特異的又は非特異的手段の使用によってＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列を繰り返しコピーして、コピーすることが意図された特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列の量を増加させることを意味する。
【００５９】
本明細書中で用いられる通り、「ヌクレオチド」には、天然に存在するヌクレオシド一リン酸、二リン酸、及び三リン酸；デオキシアデノシン一リン酸、二リン酸、及び三リン酸、及びデオキシアデノシン三リン酸；デオキシグアノシン一リン酸、二リン酸、及び三リン酸；デオキシチミジン一リン酸、二リン酸、及び三リン酸；並びにデオキシシチジン一リン酸、二リン酸、及び三リン酸（本明細書中ではそれぞれ、ｄＡ、ｄＧ、ｄＴ、及びｄＣ又はＡ、Ｇ、Ｔ、及びＣとも称する）が含まれるが、限定するものではない。ヌクレオチドには、デアザプリンヌクレオチド、例えば、７−デアザ−デオキシグアノシン（７−デアザ−ｄＧ）及び７−デアザ−デオキシアデノシン（７−デアザ−ｄＡ）一リン酸、二リン酸、及び三リン酸、重水素−デオキシチミジン（重水素−ｄＴ）一リン酸、二リン酸、及び三リン酸、メチル化ヌクレオチド、例えば、５−メチルデオキシシチジン三リン酸、l3Ｃ／l5Ｎ標識ヌクレオチド、並びにデオキシイノシン一リン酸、二リン酸、及び三リン酸などの修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログも含まれるが、限定するものではない。官能基及び結合位置の種々の組み合わせを用いて、修飾ヌクレオチド、同位体に富むヌクレオチド、同位体が枯渇したヌクレオチド、又は同位体標識ヌクレオチド、及びヌクレオチドアナログを得ることができることは当業者には明らかである。
【００６０】
本明細書中で用いられる通り、「鎖伸長用ヌクレオチド」との句は、当該技術分野で認識される意味に従って用いられる。例えば、ＤＮＡでは、鎖伸長用ヌクレオチドには、２’デオキシリボヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）が含まれ、鎖終結用ヌクレオチドには、２’，３’−ジデオキシリボヌクレオチド（例えば、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ）が含まれる。ＲＮＡでは、鎖伸長用ヌクレオチドには、リボヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰ）が含まれ、鎖終結用ヌクレオチドには、３’−デオキシリボヌクレオチド（例えば、３’ｄＡ、３’ｄＣ、３’ｄＧ、及び３’ｄＵ）及び２’，３’−ジデオキシリボヌクレオチド（例えば、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ）が含まれる。鎖伸長用ヌクレオチドの完全な組とは、ＤＮＡではｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰをいい、ＲＮＡではＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰをいう。「ヌクレオチド」との用語も当該技術分野で周知である。
【００６１】
本明細書中で用いられる通り、「ヌクレオチドターミネーター」又は「鎖終結用ヌクレオチド」との用語とは、ＤＮＡ又はＲＮＡ鋳型が配列決定される又は複製される本明細書中の手順中に核酸ポリマー（鎖）伸長を終結させるヌクレオチドアナログをいう。標準の鎖終結用ヌクレオチド、すなわち、ヌクレオチドターミネーターには、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド（本明細書中でジデオキシヌクレオチドターミネーターとも称するｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、及びｄｄＴＴＰ）が含まれる。本明細書中で用いられる通り、ジデオキシヌクレオチドターミネーターにはアナログも含まれる。標準のジデオキシヌクレオチドターミネーター、例えば、５−ブロモ−ジデオキシウリジン、５−メチル−ジデオキシシチジン、及びジデオキシイノシンは、それぞれ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、及びｄｄＧＴＰのアナログである。
【００６２】
本明細書中で用いられる「ポリペプチド」との用語は、修飾ペプチド結合であることができるペプチド結合によって結合された少なくとも２個のアミノ酸又は質量修飾アミノ酸を含むアミノ酸誘導体を意味する。ポリペプチドは、コード配列の少なくとも一部分であるヌクレオチド配列から翻訳することができ、あるいは例えばコード枠以外の読み枠中にあることに因ってあるいはイントロン配列、３’若しくは５’非翻訳配列、又はプロモーターなどの調節配列であることに因って天然では翻訳されないヌクレオチド配列から翻訳することができる。ポリペプチドは化学合成することもでき、翻訳又は化学合成後に化学的又は酵素的方法によって修飾することができる。「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」との用語は、翻訳される核酸、例えば、遺伝子産物に言及する場合に本明細書中で互換可能に用いられる。
【００６３】
本明細書中で用いられる通り、生体高分子などの生物分子のフラグメントを全体より小さい部分にすることができる。フラグメントは、１個から全部に満たない構成物を含むことができる。典型的には、フラグメントは開裂された場合に複数の異なるサイズを有し、ほとんどが構成モノマーなどの構成物を２つより多く含むこととなる。
【００６４】
本明細書中で用いられる通り、「標的核酸のフラグメント」との用語は、標的核酸の物理的、化学的、又は酵素的な特異的開裂によって生成した開裂フラグメントをいう。本明細書中で用いられる通り、特異的開裂によって得られるフラグメントとは、開裂試薬の塩基／配列特異性（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、若しくはＵ、又は修飾塩基若しくはヌクレオチドの認識）；又は標的核酸の構造；又は質量分析における衝突誘起解離によるイオン化などの物理的プロセス；又はそれらの組み合わせに基づいた標的核酸配列中の特異的位置で開裂されたフラグメントをいう。フラグメントは、１個から全部に満たない標的核酸分子の構成ヌクレオチドを含むことができる。そのような開裂から得られるフラグメントの収集物は、種々の異なるサイズのオリゴヌクレオチド及びヌクレオチドを含む。フラグメントはサイズが種々異なり、好適な核酸フラグメントは典型的には約２０００個未満のヌクレオチドである。好適な核酸フラグメントは、限定するものではないが約１０００個未満の塩基、約１００〜約５００個の間の塩基、又は約２５〜約２００個の塩基を含む、いくつかのサイズ範囲に属することができる。ある態様では、約１個のヌクレオチドのフラグメントが特異的開裂によって得られたフラグメントの組に存在してもよい。
【００６５】
本明細書中で用いられる通り、標的核酸とは試料中の任意の対象核酸をいう。これには１個以上のヌクレオチドが含まれる。標的ヌクレオチド配列とは標的核酸分子中のヌクレオチドの特定の配列をいう。そのような配列の検出又は同定によって標的が検出され、特定の変異、配列変化、又は多型の存在又は不存在を示すことができる。同様に、本明細書中で用いられる標的ポリペプチドとは、例えばポリペプチドの少なくとも一部分のアミノ酸配列を決定するために、あるいは例えば１つ以上のエンドペプチターゼによるポリペプチドの処理によって生成される標的ポリペプチドのペプチドフラグメントパターンを決定するために、質量分析を用いることによって質量が分析される任意の対象ポリペプチドをいう。「標的ポリペプチド」との用語は、本明細書中で開示される目的のために、例えば、多型又は変異の存在を同定するために質量分析が施される任意の対象ポリペプチドをいう。標的ポリペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸、一般的には少なくとも３個又は４個のアミノ酸、特に少なくとも５個のアミノ酸を含む。標的ポリペプチドは、特定の疾患又は状態と関連することができるタンパク質又はタンパク質の一部分をコードするヌクレオチド配列によってコードされていることができる。標的ポリペプチドは、通常は翻訳されるポリペプチドをコードしていないヌクレオチド配列によってコードされていることもできる。標的ポリペプチドは、例えば、（例えば染色体のテロメア領域中の）染色体核酸、例えば遺伝子のコード領域又は非コード領域に存在することができるジヌクレオチドリピート又はヌクレオチドリピートなどの配列からコードされていることができる。本明細書中で用いられる「標的配列」との句は、標的核酸配列又は標的ポリペプチド若しくはタンパク質配列のいずれかをいう。
【００６６】
本明細書で開示されるプロセスは、標的ポリペプチドのペプチドフラグメントの質量分析による分析によって標的ポリペプチドを同定するための手段も提供する。本明細書中で用いられる通り、「標的ポリペプチドのペプチドフラグメント」との用語は、ポリペプチドの特異的な化学又は酵素分解によって生成される開裂フラグメントをいう。化学的及び酵素的開裂は配列特異的な様式で起こるので、標的ポリペプチドのそのようなペプチドフラグメントの生成はポリペプチドの一次アミノ酸配列によって定義される。例えば、固体支持体に固定化することができるポリペプチドをメチオニン残基ポリペプチドを開裂する臭化シアンなどの化学的剤と接触させることにより、あるいは高ｐＨでＡｓｐ−Ｇｌｙペプチド結合を開裂することができるヒドロキシルアミンと接触させることにより、あるいはＬｙｓ又はＡｒｇ残基でポリペプチドを開裂するトリプシンなどのエンドペプチターゼと接触させることにより、標的ポリペプチドのペプチドフラグメントを生成することができる。
【００６７】
標的ポリペプチドの同一性は、参照又は既知ポリペプチドのものと分子質量又は配列を比較することによって決定することができる。例えば、標的及び既知ポリペプチドの質量スペクトルを比較することができる。
【００６８】
本明細書中で用いられる通り、「対応する又は既知のポリペプチド又は核酸」との用語は、例えば、標的ポリペプチド又は核酸が対応する既知のポリペプチド又は核酸の対立遺伝子の変異体であるかを決定するために対照として一般的に用いられる既知のポリペプチド又は核酸である。対応する既知のタンパク質又は核酸は、標的ポリペプチドと実質的に同じアミノ酸又は塩基配列を有することができるか、実質的に異なることができると認識しなければならない。例えば、標的ポリペプチドが対応する既知のタンパク質と単一のアミノ酸の違いだけ異なる対立遺伝子変異体である場合、ポリペプチドのアミノ酸配列は単一のアミノ酸違いを除いて同じであることができる。核酸中の変異が標的ポリペプチド変化をコードする場合、例えば、コード核酸の読み枠が停止コドンを導入又は欠失している場合、標的ポリペプチドの配列は対応する既知のポリペプチドの配列と実質的に異なることができる。
【００６９】
本明細書中で用いられる通り、参照生物分子とは、必ずしもではないが、一般的には、標的生物分子と比較される生物分子をいう。したがって、例えば、参照核酸は、参照核酸と相対的な標的核酸中の潜在的なあるいは実際の配列変化を同定するために標的核酸と比較される核酸である。参照核酸は、典型的には、既知の配列又は決定することができる配列である。
【００７０】
本明細書中で用いられる通り、参照ポリペプチドは、ポリペプチドの配列決定を伴わない方法でポリペプチドを同定するために標的ポリペプチドと比較されるポリペプチドである。参照ポリペプチドは、典型的には、既知のポリペプチドである。本明細書中で用いられる参照配列とは、参照核酸又は参照ポリペプチド若しくはタンパク質配列をいう。
【００７１】
本明細書中で用いられる通り、転写をベースとしたプロセスには、「in vitro転写系」が含まれる。ＲＮＡポリメラーゼ並びにＲＮＡポリメラーゼを特異的に結合するプロモーターに操作可能に結合されたＤＮＡ分子の転写に必要な他の因子及び試薬を含有する無細胞系をいう。in vitro転写系は、細胞抽出物、例えば、真核細胞抽出物であることができる。本明細書中で用いられる「転写」との用語は、ＲＮＡ分子の生成がＤＮＡ鋳型に基づいて開始し、伸長し、及び終結するプロセスを一般的に意味する。さらに、当該技術分野で周知である「逆転写」のプロセスとは、本明細書中で用いられる「転写」との用語の意味の範囲内に包含されるとみなす。転写は、ＤＮＡ依存性又はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって触媒される重合反応である。ＲＮＡポリメラーゼの例には、細菌ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼが含まれる。
【００７２】
本明細書中で用いられる通り、「翻訳」との用語は、ポリペプチドの生成がＲＮＡ鋳型に基づいて開始し、伸長し、終結するプロセスを表す。ＤＮＡから生成されるポリペプチドについては、ＤＮＡがＲＮＡに転写されなければならず、次いで種々の細胞の成分との相互作用に因ってＲＮＡがポリペプチドに翻訳されなければならない。原核細胞では、転写及び翻訳は「連動し」、ＤＮＡからＲＮＡが転写されている際中にＲＮＡがポリペプチドに翻訳されることを意味する。植物及び動物細胞を含む真核細胞では、ＤＮＡは細胞核中でＲＮＡに転写され、次いでＲＮＡはｍＲＮＡにプロセシングされ、該ｍＲＮＡは細胞質に輸送され、該細胞質でポリペプチドに翻訳される。
【００７３】
ＤＮＡ及びＲＮＡを含む核酸に関して本明細書中で用いられる「単離された」との用語は、通常は天然状態の核酸と関連する他の高分子から実質的に分離している核酸分子をいう。単離された核酸分子は、通常は細胞中の細胞材料と関連する細胞材料から実質的に分離しているか、場合に応じては細菌又はウイルス材料から実質的に分離しているか、組換えＤＮＡ技術によって生成される場合には培地から実質的に分離しているか、あるいは核酸が化学合成される場合には化学前駆体又は他の化学物質から実質的に分離していることができる。一般的に、単離された核酸分子は、その天然状態に関して少なくとも約５０％富んでおり（、一般的に約７０％〜約８０％富んでおり、特に約９０％又は９５％以上富んでいる。好ましくは、単離された核酸は、核酸を含む試料の少なくとも約５０％を構成し、試料中の材料の少なくとも約７０％又は８０％であることができ、特に試料の少なくとも約９０％〜９５％以上であることができる。単離された核酸は、天然には存在しない、したがって、天然状態で見出されない核酸分子であることができる。
【００７４】
「単離された」との用語は、本明細書中では、通常は天然状態のポリペプチドと関連した他の高分子から実質的に分離しているポリペプチドをいうのにも用いられる。単離されたポリペプチドは、それが「単離された」核酸について先に定義したものと同程度に天然で関連する材料に関して富んでいるかポリペプチドを含有する試料分画を構成すること、すなわち、それがその天然状態に関して少なくとも約５０％富んでいるかポリペプチドを含有する試料の少なくとも約５０％を構成することに基づいて、同定することができる。単離されたポリペプチドは、例えば、ポリペプチドを通常発現する細胞から精製することができ、あるいは組換えＤＮＡ方法論を用いて生成することができる。
【００７５】
本明細書中で用いられる通り、核酸の「構造」には、非ワトソン−クリック塩基対に起因する二次構造（例えば、Seela, F. and A. Kehne (1987) Biochemistry, 26, 2232-2238を参照のこと）、並びに塩基対が形成された塩基及び塩基対が形成されないかミスマッチである塩基の組み合わせによって核酸中で形成されたヘアピン、ループ、及びバブルなどの構造が含まれるが、限定するものではない。
【００７６】
本明細書中で用いられる通り、後成的変化とは、天然の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ／Ｕ）又は２０個の天然アミノ酸の同一性の変化に依存しない、参照配列と相対的な標的配列（例えば、野生型配列と相対的な変異体配列）中の変化いう。そのような変化には、例えば、標的核酸配列及び参照核酸配列間の修飾塩基又はメチル化塩基の存在の違いが含まれるが、限定するものではない。後成的変化とは、遺伝機能における有糸分裂及び／又は減数分裂による遺伝性変化又は核酸配列中の変化によっては説明することができないより高次の核酸構造の変化をいう。後成的変化又は変化を受ける系の例には、動物でのＤＮＡメチル化パターン、ヒストン修飾、及びポリコーム−トリソラックス群（Ｐｃ−Ｇ／ｔｘ）タンパク質複合体が含まれるが、限定するものではない。後成的変化は、必ずしもではないが通常は遺伝性である遺伝子発現の変化を必ずしもではないが通常もたらす。
【００７７】
本明細書中で用いられる通り、「プライマー」とは、ハイブリダイゼーション、鎖伸長、増幅、及び配列決定に好適なオリゴヌクレオチドをいう。同様に、プローブはハイブリダイゼーションに用いられるプライマーである。プライマーとは、十分に低い質量、典型的には約５個及び２００個の間のヌクレオチド、一般的には約７０個又は７０個未満のヌクレオチドであり、かつ、本明細書中に提供する増幅方法並びに検出及び配列決定方法を好都合に用いるのに十分なサイズである核酸をいう。これらのプライマーには、安定的な二重鎖を形成するのに十分な数のヌクレオチド、典型的には約６〜３０個のヌクレオチド、約１０〜２５個のヌクレオチド及び／又は約１２〜２０個のヌクレオチドを必要とする核酸の検出及び配列決定用のプライマーが含まれるが、限定するものではない。したがって、本明細書での目的のために、プライマーは、プライマーの配列及び用途に依存して、典型的には約６〜７０個のヌクレオチド、１２〜７０個のヌクレオチド、又は約１４個以上から上限約７０個のヌクレオチドを含む、任意の好適な長さのヌクレオチド含量の配列である。
【００７８】
本明細書中で用いられる通り、質量分析への言及は、当業者に既知である任意の好適な質量分析の形式を包含する。そのような型式には、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、エレクトロスプレー（ＥＳ）、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ（例えば、公開された国際ＰＣＴ出願第９９／５７３１８号、及び米国特許第５，１１８，９３７号を参照のこと）、イオンサイクロ（登録商標）トロン共鳴（ＩＣＲ）、フーリエ変換、及びそれらの組み合わせが含まれるが、限定するものではない。ＭＡＬＤＩ、特にＵＶ及びＩＲは、好ましい形式の中の１つである。
【００７９】
本明細書中で用いられる通り、質量スペクトルとは、生体高分子又はそのフラグメントの質量分析による分析から図式的にあるいは数値的にコードされる得られたデータの提示をいう。
【００８０】
本明細書中で用いられる通り、質量スペクトル又は質量分析による分析に関するパターン又は断片化パターン又は断片化スペクトルとは、シグナルの特徴的な分布及び数（そのピーク又はデジタル表示など）をいう。一般的に、本明細書中で用いられる断片化パターンとは、限定するものではないが核酸及びタンパク質などの生物分子の特異的開裂によって生じるフラグメントの組をいう。
【００８１】
本明細書中で用いられる通り、質量スペクトル又は任意の他の質量測定方法及びそれらの分析に関連するシグナル、質量シグナル、又は出力シグナルとは、特定の質量シグナルを有する分子の数又は相対数である出力データをいう。シグナルには、「ピーク」及びそのデジタル表示が含まれる。
【００８２】
本明細書中で用いられる通り、「ピーク」との用語は、フラグメントの質量及び強度に対応する質量分光計スペクトル（「質量スペクトル」）のベースラインシグナルからの隆起した上方への突出をいう。ピークは、手動のあるいは自動化された「ピーク発見」手順によって質量スペクトルから抽出することができる。
【００８３】
本明細書中で用いられる通り、質量スペクトル中のピークの質量とは、「ピーク発見」手順によって計算処理された質量をいう。
【００８４】
本明細書中で用いられる通り、質量スペクトル中のピークの強度とは、限定するものではないが質量スペクトル中のピークの高さ及びそのシグナル対ノイズ比を含む、パラメータに依存する「ピーク発見」手順によって計算処理された強度をいう。
【００８５】
本明細書中で用いられる通り、「分析」とは、単一のオリゴヌクレオチド若しくポリペプチド又はオリゴヌクレオチド若しくはポリペプチドの混合物のある種の性質の決定をいう。これらの性質には、ヌクレオチド又はアミノ酸の組成物及び完全な配列、単一ヌクレオチド多型及び２つ以上のオリゴヌクレオチド又はポリペプチド間での他の変異又は配列変化の存在、オリゴヌクレオチド又はポリペプチドの質量及び長さ、並びに試料中における分子又は分子内の配列の存在が含まれるが、限定するものではない。
【００８６】
本明細書中で用いられる通り、「多重処理」とは、単一の質量分析測定又は他の質量測定で、すなわち、単一の質量スペクトル又は他の配列読み取り方法で、２つ以上のオリゴヌクレオチド又はポリペプチド分子を同時に決定すること又２つ以上のオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチドを同時に分析することをいう。
【００８７】
本明細書中で用いられる通り、増幅とは、生体高分子、特に核酸の量の増加手段をいう。選択した５’及び３’プライマーに基づいて、増幅は、分析が施されるゲノム領域を限定し、区別することにも役立つ。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの使用を含む当業者に既知である任意の手段によることができる。多型の頻度を決定することが必要である場合、増幅、例えば、ＰＣＲを定量的に行わなければならない。
【００８８】
本明細書中で用いられる通り、「多型」とは、遺伝子又はその一部の形態が１つ以上同時に存在しているをことをいう。異なる形態が少なくとも２つある遺伝子の一部、すなわち、２個の異なるヌクレオチド配列を「遺伝子の多型領域」と称する。多型領域は単一ヌクレオチドであることができ、その同一性は異なる対立遺伝子において異なる。多型領域は、いくつかのヌクレオチドの長さであることもできる。したがって、多型、例えば、遺伝子変化(genetic variation）とは、生じるか観察される対立遺伝子変化及び他の変化などの集団の間におけるゲノムの遺伝子配列の変化をいう。したがって、多型とは、遺伝的に決定される代替の配列又は対立遺伝子が集団中に２つ以上存在していることをいう。これらの違いは、ゲノムのコード及び非コード部分に存在することができ、核酸配列の違い、例えば、転写、プロセシング、翻訳、輸送、タンパク質プロセシング、情報交換、ＤＮＡ合成、発現タンパク質、他の遺伝子産物、又は生物化学経路の生成物若しくは翻訳後修飾での産物を含む遺伝子発現の違い、及び集団のメンバーの間で示される任意の他の違いとして明らかにすることができるか検出することができる。単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）とは、塩基での挿入、欠失、又は変化（置換）などの単一塩基の変化の結果として生ずる多型をいう。
【００８９】
多型マーカー又は部位は、多様性が起こる座である。そのような部位は、１塩基対の小ささ（ＳＮＰ）であることができる。多型マーカーには、制限酵素断片長多型、可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、及び他の繰り返しパターン、単一配列リピート、及びＡｌｕなどの挿入エレメントが含まれるが、限定するものではない。多型形態は、遺伝子については異なるメンデル対立遺伝子しても明らかにされる。タンパク質、タンパク質修飾、ＲＮＡ発現修飾、ＤＮＡ及びＲＮＡメチル化、遺伝子発現及びＤＮＡ複製を変える調節因子、並びにゲノム核酸又は細胞内小器官の核酸におけるその他の任意の変化の出現の違いにより、多型を観察することができる。
【００９０】
本明細書中で用いられる通り、「多型遺伝子」とは、少なくとも１つの多型領域を有する遺伝子をいう。
【００９１】
本明細書中で用いられる通り、本明細書中で「対立遺伝子変異体」と互換可能に用いられる「対立遺伝子」とは、遺伝子又はその一部の代替の形態をいう。対立遺伝子は、相同染色体上で同じ座又は位置を占める。被検体が遺伝子の２つの同一の対立遺伝子を有する場合、被検体は遺伝子の遺伝子又は対立遺伝子についてホモ接合であると言う。被検体が少なくとも２個の異なる対立遺伝子を有する場合、被検体は遺伝子についてヘテロ接合であると言う。特定の遺伝子の対立遺伝子は、単一のヌクレオチド又はいくつかのヌクレオチドで互いに異なることができ、ヌクレオチドの置換、欠失、及び挿入を含むことができる。遺伝子の対立遺伝子は、変異を含む遺伝子の形態であることもできる。
【００９２】
本明細書中で用いられる通り、「優性対立遺伝子」とは、所与の集団について最大頻度で表れる対立遺伝子をいう。より少ない頻度で存在する対立遺伝子は、対立遺伝子変異体と称される。
【００９３】
本明細書中で用いられる通り、変異として知られる核酸配列の変化によって、生物化学活性が変化したかある場合には失われさえしたタンパク質を生ずることができ、これは次いで遺伝子疾患を引き起こすことができる。変異には、ヌクレオチドの欠失、挿入、又は変化／置換（すなわち、点変異）が含まれる。点変異は、タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる「ミスセンス」であるか、停止コドンをコードし、それによって切断されたタンパク質を生じさせる「ナンセンス」のいずれかであることができる。
【００９４】
本明細書中で用いられる通り、配列変化は、参照核酸又はタンパク質配列と比較した場合に標的核酸又はタンパク質配列において異なる１個以上のヌクレオチド又はアミノ酸を含む。配列変化には、変異、多型、又は異なる生物に属する標的配列及び参照配列間の配列の違いが含まれるが、限定するものではない。配列変化は、一般的に、常にではないが、標的配列及び参照配列間のヌクレオチド、アミノ酸、又はその他の生体高分子単量体単位の違いの完全な組のサブセットを含む。
【００９５】
本明細書中で用いられる通り、追加又は消失ピーク又はシグナルは、それぞれ、同じ開裂反応条件下における参照配列の実際の又はシミュレーションした開裂によって得られるフラグメントと相対的な存在している又は存在していない標的配列のフラグメントに対応するピーク又はシグナルである。消失又は追加シグナルの他に、標的フラグメント及び参照フラグメント間の違いは、限定するものではないがシグナルのピーク強度（高さ、面積、シグナル対ノイズ、又はそれらの組み合わせ）の違いを含む他の違いとして示すことができる。
【００９６】
本明細書中で用いられる通り、異なるフラグメントは、同じ開裂反応条件下における参照配列の実際の又はシミュレーションした開裂によって得られるフラグメントと相対的な異なる標的配列のフラグメントである。異なるフラグメントは、参照フラグメントパターンと相対的な標的フラグメントパターンで消失しているか、あるいは参照断片化パターンと相対的な標的断片化パターンに追加的に存在するフラグメントであることができる。消失又は追加フラグメントの他に、異なるフラグメントは、限定するものではないが異なるフラグメントに対応するシグナルのピーク強度（高さ、面積、シグナル対ノイズ、又はそれらの組み合わせ）の違いを生じさせる違いを含む、標的断片化パターン及び参照断片化パターン間の定性的である違いであることもできる。
【００９７】
本明細書中で用いられる通り、「コンポマー」との用語とは、その単量体構成要素単位に関する配列フラグメントの組成物をいう。核酸では、コンポマーとは、単量体単位が塩基であるフラグメントの塩基組成物をいう。各タイプの塩基の数はＢn（すなわち、ＡaＣcＧgＴt、Ａ0Ｃ0Ｇ0Ｔ0は「空の」コンポマー又は塩基を含まないコンポマーを表す）によって表すことができる。天然コンポマーは、すべての構成要素単量体単位（例えば、核酸では塩基、タンパク質ではアミノ酸）がゼロ以上であるコンポマーである。しかしながら、本明細書中に提供する方法においては、配列を比較して配列変化を決定する目的のため、負の数の単量体単位を含む非天然「コンポマー」をアルゴリズムによって生じさせることができる。ポリペプチドでは、コンポマーとはポリペプチドフラグメントのアミノ酸組成物をいい、各タイプのアミノ酸の数は同様に表される。配列中の塩基の数及びタイプを添えてコンポマーの組成物を得た場合、コンポマーは配列に対応する。例えば、コンポマーＡ2Ｇ3は配列ＡＧＧＡＧに対応する。一般的には、配列に対応するコンポマーは１つだけあるが、２つ以上の配列が同じコンポマーに対応することができる。例えば、配列ＡＧＧＡＧ、ＡＡＧＧＧ、ＧＧＡＧＡなどはすべて同じコンポマーＡ2Ｇ3に対応するが、これらの各配列について、対応するコンポマーは１つだけ、すなわち、Ａ2Ｇ3である。
【００９８】
本明細書中で用いられる通り、ウィットネス・コンポマー又はコンポマー・ウィットネスとは、質量が同じ参照開裂反応と相対的な標的開裂反応で生じた各異なるフラグメントの実際の質量とは十分に小さい質量の違いより小さいかそれと等しい値だけ異なるすべての可能なコンポマーをいう。十分に小さい質量の違いは、必要な場合には経験的に決定することができ、一般的には質量測定の分解能である。例えば、質量分析測定において、十分に小さい質量の違いの値は、限定するものではないが、ウィットネス・コンポマーに対応する異なるフラグメントの質量（そのシグナルによって測定される）、質量がタイプ又は長さにおいて単一ヌクレオチドだけ異なるフラグメント間のピーク分離、及び質量分光計の絶対分解能を含むパラメータの関数である。可能なウィットネス・コンポマーの質量が十分に小さい質量の違いより小さいかそれと等しい値だけ各異なるフラグメントの実際の測定質量に近いかそれと等しくなるように、４個の核酸塩基（ＲＮＡではＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、若しくはＵ、又はそれらの修飾物）又は２０個のアミノ酸若しくはそれらの修飾物の１つ以上に特異的な開裂反応を用いて、各異なるフラグメントについての可能なウィットネス・コンポマーを含むデータの組を作成することができる。
【００９９】
本明細書中で用いられる通り、特異的開裂反応についての標的配列及び参照配列の断片化パターン間の違いが標的配列中の各配列変化を表す違いの単純な合計でない場合、参照配列と相対的な標的配列の２つ以上の配列変化は互いに相互作用すると言う。互いに相互作用しない標的配列中の配列変化においては、標的配列に沿った配列変化間の分離（距離）は、各配列変化が特異的開裂反応において（参照配列と相対的な標的配列の）区別される異なるフラグメントを生ずるのに十分である。参照配列と相対的な標的配列の断片化パターンの違いは、参照配列と相対的な標的配列中のすべての配列変化の合計を表す。
【０１００】
本明細書中で用いられる通り、十分に小さい質量の違いは、同定された異なるフラグメントの測定質量及びコンポマーの質量の間の最大の質量の違いであり、該コンポマーを同定された異なるフラグメントについてのウィットネス・コンポマーとみなすことができる。十分に小さい質量の違いは、必要な場合には経験的に決定することができ、一般的には質量測定の分解能である。例えば、質量分析測定では、十分に小さい質量の違いの値は、ウィットネス・コンポマーに対応する異なるフラグメントの質量（そのシグナルによって測定される）、質量がタイプ又は長さにおいて単一ヌクレオチドだけ異なるフラグメントの間のピーク分離、及び質量分光計の絶対分解能を含むが限定するものではないパラメータの関数である。
【０１０１】
本明細書中で用いられる通り、副記号列又は副配列ｓ［ｉ，ｊ］は、全長核酸又はタンパク質配列を表す記号列ｓの開裂フラグメントを表す。本明細書中で用いられる通り、ｉ及びｊは、副記号列の出発及び終結位置を表す整数である。例えば、核酸の副記号列では、ｉ及びｊはそれぞれ副記号列が開始及び終結する核酸配列中の塩基の位置を表すことができる。本明細書中で用いられる通り、ｃ［ｉ，ｊ］とはｓ［ｉ，ｊ］に対応するコンポマーをいう。
【０１０２】
本明細書中で用いられる通り、配列変化の位数であるｋとは、本明細書中に提供する技術によって構築される標的配列の配列変化候補をいい、該配列変化候補は、参照配列と相対的な標的配列中に変異、多型、又は限定するものではないが生物間の配列変化、挿入、欠失、置換を含む他の配列変化を多くてもｋ個含む。ｋの値は、限定するものではないが参照配列及び標的配列間の配列変化の予測されるタイプ及び数を含む多くのパラメータに依存し、例えば、配列変化が単一塩基であるか複数塩基であるか、あるいは参照配列と相対的な配列変化が標的配列上の１つの位置で存在するか２つ以上の位置で存在するか、あるいは配列変化が標的配列中で互いに相互作用するかしないかに依存する。例えば、ＳＮＰｓの検出では、ｋの値は、必ずしもではないが通常は１又は２である。別の例として、変異の検出及び再配列決定では、ｋの値は、必ずしもではないが通常は３以上である。
【０１０３】
本明細書中で用いられる通り、記号列ｓ中の開裂試薬によって認識される塩基、アミノ酸、又は他の特徴Ｘの特異的開裂反応が与えられたとき、副記号列ｓ［ｉ，ｊ］又は対応するコンポマーｃ［ｉ，ｊ］の境界ｂ［ｉ，ｊ］とは、記号列ｓの開裂が副記号列ｓ［ｉ，ｊ］の直ぐ外で行われていないかを示すマーカーの組をいう。可能なマーカーは、「ｉの直前でｓが開裂されていない」かを示すＬ、及び「ｊの直後でｓが開裂されていない」かを示すＲである。したがって、ｂ［ｉ，ｊ］は、Ｘが記号列ｓのｉ−１位置に存在する場合に限りＬを含み、かつ、Ｘが記号列ｓの位置ｊ＋１に存在する場合に限りＲを含む、組｛Ｌ，Ｒ｝のサブセットである。＃ｂは、副記号列ｓ［ｉ，ｊ］が双方の直ぐ横の位置において（すなわち、ｉ−１及びｊ＋１の位置において）、あるいは片方の直ぐ横の位置において（すなわち、ｉ−１又はｊ＋１のいずれかの位置において）、あるいは直ぐ横の位置ではない位置において（すなわち、ｉ−１又はｊ＋１のいずれの位置でもない位置において）特異的に開裂されたかに依存して０、１、又は２であることができる組ｂ中の要素の数を表す。
【０１０４】
本明細書中で用いられる通り、コンポマー境界又は境界ｂは、ｂ［ｉ，ｊ］について先に定義した組｛Ｌ，Ｒ｝のサブセットである。ｂの可能な値は、空のセット｛｝（すなわちｂ中の要素の数（＃ｂ）が０である）、｛Ｌ｝、｛Ｒ｝（すなわち＃ｂが１である）、及び｛Ｌ，Ｒ｝（すなわち＃ｂは２がある）である。
【０１０５】
本明細書中で用いられる通り、有界コンポマーとは、開裂部位が各副配列の２つの末端に存在するか否かを示す境界を有する参照配列の副配列の組に対応するすべてのコンポマーｃの組をいう。有界コンポマーの組を可能なコンポマー・ウィットネスに対して比較し、参照配列と相対的な標的配列のすべての可能な配列変化を構築することができる。例えば、（ｃ，ｂ）とは、コンポマーｃ及び境界ｂを含む「有界コンポマー」をいう。
【０１０６】
本明細書中で用いられる通り、Ｃとは、記号列ｓ内のすべての有界コンポマーの組をいい、すなわち、すべての可能な副記号列ｓ［ｉ，ｊ］では、有界コンポマー（ｃ［ｉ，ｊ］，ｂ［ｉ，ｊ］）が見い出だされ、これらは組Ｃに属する。Ｃは、Ｃ：＝｛（ｃ［ｉ，ｊ］，ｂ［ｉ，ｊ］）：ｌ≦ｉ≦ｊ≦ｓの長さ｝と表すことができる。
【０１０７】
本明細書中で用いられる通り、ｏｒｄ［ｉ，ｊ］とは、副記号列ｓ［ｉ，ｊ］が特定の開裂反応で開裂される回数をいう。
【０１０８】
本明細書中で用いられる通り、フラグメントｆ、ｆ’に対応する所与のコンポマーｃ、ｃ’が与えられたとき、ｄ（ｃ，ｃ’）は、コンポマーｃ，ｃ’に対応するすべての潜在的なフラグメントｆ，ｆ’を受け継ぐｃをｃ’に変換するのに必要である配列変化、多型、又は変異（挿入、欠失、置換）の最小数を決定する関数であり、ここで、ｃは、参照生物分子のフラグメントｓのコンポマーであり、ｃ’は、フラグメントｓの配列変化から生じる標的生物分子フラグメントｓ’のコンポマーである。本明細書中で用いられる通り、ｄ（ｃ，ｃ’）は、ｄ（ｃ’，ｃ）と等価である。
【０１０９】
組Ｃから構築される有界コンポマー（ｃ，ｂ）について、関数Ｄ（ｃ’，ｃ，ｂ）は、コンポマー・ウィットネスｃ’を生ずるのに必要である参照配列と相対的な配列変化の最小数を測定する。Ｄ（ｃ’，ｃ，ｂ）は、Ｄ（ｃ’，ｃ，ｂ）：＝ｄ（ｃ’，ｃ）＋＃ｂと表すことができる。本明細書中で用いられる通り、Ｄ（ｃ’，ｃ，ｂ）は、Ｄ（ｃ，ｃ’，ｂ）と等価である。
【０１１０】
本明細書中で用いられる通り、Ｃkは、ｋ個を上回る数のカット記号列の配列変化を含む副記号列のコンポマーが組Ｃから除外されるようなＣのサブセットである。したがって、挿入、欠失、及び置換を多くてもｋ個含む配列変化があり、かつ、ｃ’がこの配列変化のピークウィットネスに対応するコンポマーである場合には、有界コンポマー（ｃ，ｂ）がＣk中にＤ（ｃ’，ｃ，ｂ）≦ｋとなるなるように存在する。Ｃkは、Ｃ：＝｛（ｃ［ｉ，ｊ］，ｂ［ｉ，ｊ］）：１≦ｉ≦ｊ≦ｓの長さ、及びｏｒｄ［ｉ，ｊ］＋＃ｂ［ｉ，ｊ］≦ｋ｝と表すことができる。本明細書中に提供するアルゴリズムは、可能な配列変化に対応したこのコンポマーの減少した組に基づく。
【０１１１】
本明細書中で用いられる通り、Ｌ△は又はＬ＿△は、同じ参照開裂反応と相対的な標的開裂反応が異なるフラグメントに対応するピーク又はシグナルのリストを表す。違いには、参照フラグメントシグナルと相対的な標的フラグメントシグナル中に存在する又は存在していないシグナル、並びに標的フラグメントシグナル及び参照フラグメントシグナル間の強度が異なるシグナルが含まれるが、限定するものではない。
【０１１２】
本明細書中で用いられる通り、配列変化候補とは、１又は複数の配列変化を含む標的配列の潜在的な配列をいう。配列変化候補が１又は複数の配列変化を含む標的生物分子の実際の配列である確率は、スコアによって測定される。
【０１１３】
本明細書中で用いられる通り、配列変化候補の減少した組とは、標的配列の特異的開裂の際に所与の組のフラグメントを生ずるであろう標的配列中のすべての可能な配列変化のサブセットをいう。配列変化候補の減少した組は、特定の特異的開裂反応において特定の断片化パターン（フラグメントの質量を測定することによって検出される）を生ずることができる標的配列のすべての可能な配列変化の組から、参照配列の実際の又はシミュレーションした同じ特異的開裂反応での開裂によって生じるフラグメントとは異なる標的配列のフラグメントを生ずるそれらの配列変化のみを含むサブセットを作り出すことにより、得ることができる。
【０１１４】
本明細書中で用いられる通り、標的分子中の特定の配列変化と一致するフラグメントとは、１超の開裂試薬を用いた１超の反応で標的分子の開裂によって得られるそれらの異なるフラグメントであって、限定するものではないが質量、強度、又はシグナル対ノイズ比を含む特徴が本明細書中に提供する方法に従って分析した場合に標的分子中に同じ配列変化の存在を示す該フラグメントをいう。
【０１１５】
本明細書中で用いられる通り、スコア付け又はスコアとは、特定の配列変化候補が標的核酸又はタンパク質配列中に実際に存在する確率の計算をいう。スコアの値を用いて、実際の標的配列に対応する配列変化候補を決定する。通常、標的配列の試料の組において、最も高いスコアは標的分子中の最も起こり得そうな配列変化を表すが、単一の標的配列が存在する場合には正のスコアを検出するなどの他の選択規則を用いることができる。
【０１１６】
本明細書中で用いられる通り、シミュレーション（又はシミュレーションする）とは、核酸又はタンパク質の配列及び特異的開裂試薬についての特定の核酸又はタンパク質配列中の予測開裂部位の断片化パターンの計算をいう。断片化パターンは、数の表として（例えば、参照生物分子のフラグメントの質量シグナルに対応するピークのリストとして）、質量スペクトルとして、ゲル上のバンドのパターンとして、又は任意の質量分布測定技術の表示として、シミュレーションすることができる。シミュレーションは、ほとんどの場合、コンピュータプログラムによって行うことができる。
【０１１７】
本明細書中で用いられる通り、開裂をシミュレーションするとは、標的分子又は参照分子を仮想的に開裂するイン・シリコ（in silico）プロセスをいう。
【０１１８】
本明細書中で用いられる通り、イン・シリコ（in silico）とは、コンピュータを用いて行う検索及び実験をいう。イン・シリコ（in silico）方法には、分子モデリング研究、生物分子ドッキング実験、及び分子構造の仮想表示、及び／又は分子相互作用などのプロセスが含まれるが、限定するものではない。
【０１１９】
本明細書中で用いられる通り、被検体には、動物、植物、細菌、ウイルス、寄生虫、及び核酸を有する任意の他の生物又は実体が含まれるが、限定するものではない。被検体の中の１つは、哺乳動物であり、必ずしもではないが、ヒトが好ましい。患者とは、疾患又は障害に悩んでいる被検体をいう。
【０１２０】
本明細書中で用いられる通り、表現型とは、生物の任意の識別可能な形質を含むパラメータの組をいう。表現型は、身体的形質であることができ、被検体が動物である場合には、情動的形質などの精神的形質であることができる。
【０１２１】
本明細書中で用いられる通り、「帰属」とは、核酸又はタンパク質フラグメントの位置が特定の分子量及び特定の末端ヌクレオチド又はアミノ酸を示す決定をいう。
【０１２２】
本明細書中で用いられる通り、「ａ」とは、１つ以上をいう。
【０１２３】
本明細書中で用いられる通り、「複数」とは、各々が異なる配列を有する２つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチドをいう。そのような違いは、配列の中の天然に存在する変化、例えば、ヌクレオチド又はコードされたアミノ酸中の対立遺伝子変化に起因することができ、あるいは特定の修飾が種々の配列に導入されたこと、例えば、質量修飾ヌクレオチドが各核酸又はタンパク質に差次的に複数導入されたことに起因することができる。
【０１２４】
本明細書中で用いられる通り、アレイとは、固体支持体上の３つ以上の座などの３つ以上の区分によって生成されるパターンをいう。
【０１２５】
本明細書中で用いられる通り、「明確な」とは、標的分子中の変異などの特定の配列変化に対応するピーク又はシグナルのたった１つの帰属をいい、分子又は変異の数が多重処理される（multiplexed）事象では、特定の配列変化を表しているピークを各変異又は各分子にたった１つ帰属することができることをいう。
【０１２６】
本明細書中で用いられる通り、データ処理ルーチンとは、取得データの生物学的有意性（すなわち、アッセイの最終結果）を決定するソフトウェアで具現化することができるプロセスをいう。例えば、データ処理ルーチンは、収集データに基づいて遺伝子型を決定する。本明細書でのシステム及び方法では、データ処理ルーチンは、決定された結果に基づいて機器及び／又はデータ収集ルーチンを制御することができる。データ処理ルーチン及びデータ収集ルーチンは組込まれて、機器によるデータの取得を操作するためにフィードバックを与え、ゆえに本明細書中に提供するアッセイをベースとした判断方法を提供する。
【０１２７】
本明細書中で用いられる通り、複数の遺伝子は、少なくとも２個、５個、１０個、２５個、５０個、１００個、２５０個、５００個、１０００個、２，５００個、５，０００個、１０，０００個、１００，０００個、１，０００，０００個以上の遺伝子を含む。複数の遺伝子は、生物の完全若しくは部分的なゲノム又はそれらの複数個さえ含むことができる。生物のタイプを選択することにより、ゲノムが決定され、該遺伝子調節領域が選択される。遺伝子をスクリーニングする代表的な生物には、ヒトなどの哺乳動物及びマウスなどの齧歯類を含む動物、昆虫、酵母、細菌、寄生虫、及び植物が含まれる。
【０１２８】
本明細書中で用いられる通り、「特異的にハイブリダイゼーションする」とは、プローブ又はプライマーの標的配列だけとのハイブリダイゼーション、優先的には非標的配列とのハイブリダイゼーションをいう。当業者は、温度、プローブ又はプライマーの長さ及び組成、緩衝液の組成及び塩濃度などのハイブリダイゼーションに影響を及ぼすパラメータに精通し、核酸の標的配列への特異的ハイブリダイゼーションを達成するためにこれらのパラメータを容易に調整することができる。
【０１２９】
本明細書中で用いられる通り、「試料」とは、検出する材料を含有する組成物をいう。好ましい実施態様では、試料は「生物試料」である。「生物試料」との用語は、例えば、ヒト又はその他の哺乳動物などの動物、植物、細菌、真菌、原生生物、又はウイルスなどの生物供給源から得られる任意の材料をいう。生物試料は、組織、細胞、細胞ペレット、細胞抽出物、若しくは生検などの固体材料、又は尿、血液、唾液、羊水、感染若しくは炎症領域由来の滲出物、又は口腔細胞を含有する口内洗浄液、尿、脳髄液、及び滑液などの生物液、及び器官を含む任意の形態であることができる。固体材料は、液体と混合することが好ましい。具体的には、本明細書中において、試料とは、質量分析による分析に用いられるマトリクス及び核酸分子の精製又は単離及び／又は増幅などの試料を加工することができる手段から得られる核酸などの生物材料の混合物をいう。
【０１３０】
本明細書中で用いられる通り、組成物とは、任意の混合物をいう。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性液、非水性液、又は任意のそれらの組み合わせであることができる。
【０１３１】
本明細書中で用いられる通り、組み合わせとは、２つ以上のものの間の任意の結合をいう。
【０１３２】
本明細書中で用いられる通り、「１と１／４カッター」との用語は、一方の塩基の位置の同一性が固定され、かつ、他方の塩基の位置の同一性が天然に存在する４つの塩基のうちの任意の３つである、核酸中の２個の塩基のストレッチを認識して開裂する制限酵素をいう。
【０１３３】
本明細書中で用いられる通り、「１と１／２カッター」との用語は、１つの塩基の位置の同一性が固定され、かつ、他方の塩基位置の同一性が天然に存在する４つの塩基のうちの任意の２つである、核酸中の２個の塩基のストレッチを認識して開裂する制限酵素をいう。
【０１３４】
本明細書中で用いられる通り、「２カッター」との用語は、２個の塩基の長さである特異的核酸部位を認識して開裂する制限酵素をいう。
【０１３５】
本明細書中で用いられる通り、「ＡＦＬＰ」との用語は増幅断片長多型をいい、「ＲＦＬＰ」との用語は制限酵素断片長多型をいう。
【０１３６】
本明細書中で用いられる通り、「単位複製配列」との用語は、複製することができるＤＮＡ領域をいう。
【０１３７】
本明細書中で用いられる通り、「完全開裂」又は「全体開裂」との用語は、特定の開裂試薬によって認識されるすべての開裂部位が完全に切断される開裂反応をいう。
【０１３８】
本明細書中で用いられる通り、「偽陽性」との用語は、バックグラウンドノイズに由来し、かつ、核酸又はタンパク質の実際の又はシミュレーションした特異的開裂によっては生じない質量シグナルをいう。
【０１３９】
本明細書中で用いられる通り、「擬陰性」との用語は、実際の断片化スペクトルから消失しているが対応するシミュレーションしたスペクトル中で検出することができる実際の質量シグナルをいう。
【０１４０】
本明細書中で用いられる通り、「部分開裂」との用語は、特定の開裂試薬の開裂部位の分画だけが開裂試薬によって実際に切断される反応をいう。
【０１４１】
本明細書中で用いられる通り、開裂は、核酸又はタンパク質分子が切断されてより小さい片になる任意の様式を意味する。開裂認識部位は、１個又は２個以上の塩基の長さであることができる。開裂手段には、物理的開裂、酵素的開裂、化学的開裂、及びより小さい片の核酸を生ずる任意の他の方法が含まれる。
【０１４２】
本明細書中で用いられる通り、開裂条件又は開裂反応条件とは、実際の又はシミュレーションした開裂反応を行うために用いられる１つ以上の開裂試薬の組、及び時間、温度、ｐＨ、又は緩衝液の選択を含むが限定するものではない他の反応パラメータをいう。
【０１４３】
本明細書中で用いられる通り、未開裂開裂部位とは、既知の開裂試薬認識部位であるが、切断試薬による開裂を妨げるための反応条件下、例えば、時間、温度、又は開裂認識部位での塩基修飾の下で開裂試薬によって切断されていない開裂部位を意味する。
【０１４４】
本明細書中で用いられる通り、相補的な開裂反応とは、異なる開裂試薬を用いて、あるいは同じ標的核酸若しくはタンパク質又は参照核酸若しくはタンパク質の代替開裂パターンを生じるように同じ開裂試薬の開裂特異性を変えることにより、同じ標的核酸若しくはタンパク質又は参照核酸若しくはタンパク質に対して行うかシミュレーションする開裂反応をいう。
【０１４５】
本明細書中で用いられる通り、組み合わせとは、２つ以上のもの又は要素の間の任意の結合をいう。
【０１４６】
本明細書中で用いられる通り、組成物とは、任意の混合物をいう。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性液、非水性液、又は任意のそれらの組み合わせであることができる。
【０１４７】
本明細書中で用いられる通り、液体とは、流動することができる任意の組成物をいう。したがって、液体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリーム、及び他のそのような組成物の形態の組成物を包含する。
【０１４８】
本明細書中で用いられる通り、細胞抽出物とは、溶解又は粉砕された細胞から作られる調製物又は分画をいう。
【０１４９】
本明細書中で用いられる通り、キットは、成分が任意選択により使用指示書及び／又は試薬及び併用される器具とともにパッケージングされた組み合わせである。
【０１５０】
本明細書中で用いられる通り、システムとは、ソフトウェアを有する要素及び本明細書中に提供する方法を制御及び指示する任意の他の要素の組み合わせをいう。
【０１５１】
本明細書中で用いられる通り、ソフトウェアとは、コンピュータによって実行される場合にコンピュータの操作を行うコンピュータ読み取り可能なプログラム命令をいう。典型的には、ソフトウェアは、限定するものではないが、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、及び磁気テープを含む磁気媒体、及びＣＤ−ＲＯＭディスク、ＤＶＤディスク、磁気光学ディスクを含む光学媒体、並びにプログラム指示を記録することができる他のそのような媒体などのコンピュータ読み取り可能媒体上に記録されたプログラム命令を含むプログラム製品で提供される。
【０１５２】
開示を明確にするため、かつ、何ら限定するものではないが、詳細な説明を以下のサブセクションに分ける。
【０１５３】
Ｂ．フラグメントの生成方法
核酸の断片化
核酸の断片化は当該技術分野で既知であり、多くの方法で達成することができる。例えば、標的核酸中の特異的部位における開裂によって断片化が得られる限り、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡのアナログ、又はそれらの組み合わせからなるポリヌクレオチドを、物理的、化学的、又は酵素的に断片化することができる。フラグメントは、（ｉ）開裂試薬の塩基特異性（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、若しくはＵ、又は修飾された塩基若しくはヌクレオチドの認識）；又は（ｉｉ）標的核酸の構造；、又は（ｉｉｉ）双方の組み合わせに基づき、標的核酸配列中の特異的位置で開裂することができ、標的核酸から生じる。フラグメントはサイズが種々異なることができ、好適なフラグメントは、典型的には、約２０００個未満の核酸である。好適なフラグメントは、約１０００未満の塩基、約１００〜約５００個の間の塩基、又は約２５〜約２００個の塩基を含むが限定するものではない、いくつかのサイズ範囲に属することができる。ある態様では、約１個の核酸のフラグメントが望ましい。
【０１５４】
ポリヌクレオチドは、例えば、塩基及び酸加水分解を含む加水分解反応を含む化学的反応によって断片化することができる。ＲＮＡはアルカリ条件下で不安定であるので、アルカリ条件を用いてＲＮＡを含むポリヌクレオチドを断片化することができる。例えば、Nordhoff et al (1993) ion stability of nucleic acids in infrared matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, Nucl. Acids Res., 21 (15):3347-57を参照のこと。ＤＮＡは、酸、典型的には６Ｍ  ＨＣｌなどの強酸の存在下で加水分解することができる。温度を室温より高くして加水分解を促進することができる。条件及び反応時間の長さに依存して、ポリヌクレオチドを単一塩基のフラグメントを含む種々のサイズに断片化することができる。加水分解は、厳しい条件下で、デオキシリボース並びにプリン及びピリミジン塩基の間のリン酸エステル結合及びＮ−グリコシド結合の双方を壊すことができる。
【０１５５】
ポリヌクレオチドフラグメントを生成するための代表的な酸／塩基加水分解プロトコルは、Sargent et al. (1988) Methods Enzymol, 152: 432に記載されている。簡単に言えば、ＤＮＡ１ｇを０．１Ｎ  ＮａＯＨ５０ｍＬに溶解する。濃ＨＣｌ１．５ｍＬを添加し、溶液をすばやく混合する。ＤＮＡは直ぐに沈殿し、大きな凝集物の形成を妨げるために数秒より長く攪拌してはならない。試料を室温で２０分間インキュベーションして、ＤＮＡを部分的に脱プリン化する。続いて、１０Ｎ  ＮａＯＨ２ｍＬを添加し（ＯＨ-濃度を０．１Ｎとする）、ＤＮＡが完全に再溶解するまで試料を攪拌する。次いで、試料を６５℃で３０分間インキュベーションし、ＤＮＡを加水分解する。典型的なサイズは、約２５０〜１０００個のヌクレオチドの範囲であるが、加水分解条件に依存してより少なく又はより多く変動ことができる。核酸分子を塩基特異的な様式で化学的に開裂する別のプロセスは、M. Maxam and W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560-64,1977によって提供され、参照により本明細書に取り入れられる。グアニン、アデニン、シトシン及びチミン、並びにシトシンにおいて単独で優先的に開裂するように、個々の反応を工夫した。
【０１５６】
ポリヌクレオチド、特にホスホロチオエート（phosphorothioate）が修飾されたポリヌクレオチドは、アルキル化によって開裂することもできる。K. A. Browne (2002) Metal ion-catalyzed nucleic Acid alkylation and fragmentation. J. Am. Chem. Soc. 124 (27): 7950-62。ホスホロチオネート修飾におけるアルキル化によって、ポリヌクレオチドが修飾部位における開裂に対して感受性となる。I. G. Gut及びS. Beckは、質量分析での検出のためのＤＮＡのアルキル化方法を記載している。I. G. Gut and S. Beck (1995) A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 23 (8): 1367-73。別の手法は、Ｐ３’−Ｎ５’−ホスホロアミデート含有ＤＮＡの酸の不安定性を用いる（Shchepinov et al., "Matrix-induced fragmentation of P3'-N5'-phosphoroamidate-containing DNA: high-throughput MALDI-TOF analysis of genomic sequence polymorphisms," Nucleic Acids Res. 25: 3864-3872 (2001)）。ｄＣＴＰ又はｄＴＴＰのいずれかをそれらのアナログであるＰ−Ｎ修飾されたヌクレオシド三リン酸によって置き換え、ＰＣＲに続いて行うプライマー伸長反応によって標的配列に導入する。続いて行う酸性反応条件によって、塩基特異的開裂フラグメントが生成される。必要な酸性開裂条件下でのアデニン及びグアニン残基の脱プリン化を最小限に抑えるために、ｄＡ及びｄＧの７−デアザアナログを用いることができる。
【０１５７】
四酸化オスミウム及びピペリジンを用いることによってＤＮＡヘテロ二重鎖中の単一ヌクレオチドミスマッチを開裂することができ、一般的に「ミスマッチ化学開裂（Mismatch Chemical Cleavage）」（ＭＣＣ）と呼ばれる単一塩基置換を検出するための代替戦略が提供される（Gogos et al., Nucl. Acids Res. , 18: 6807-6817[1990]）。
【０１５８】
ポリヌクレオチドを照射することにより、ポリヌクレオチド断片化も行うことができる。典型的には、ガンマ又はｘ線照射などの照射は、ポリヌクレオチドを断片化するのに十分である。照射への暴露の強度及び期間を調整することにより、フラグメントのサイズを調整することができる。紫外線照射も用いることができる。暴露の強度及び期間を調整して、ポリヌクレオチドに対する照射の望ましくない効果を最小限とすることもできる。ポリヌクレオチドをボイルさせることによってもフラグメントが生成される。典型的には、ポリヌクレオチド溶液を一定攪拌下で２〜３時間ボイルさせる。約５００ｂｐのフラグメントを得ることができる。フラグメントのサイズは、ボイル時間に伴って変化することができる。
【０１５９】
ポリヌクレオチドフラグメントは、一本鎖又は複数鎖のポリヌクレオチドの酵素開裂から生ずることができる。複数鎖のポリヌクレオチドには、例えば、二本鎖及び三本鎖のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド鎖を２つ以上含むポリヌクレオチド複合体が含まれる。使用する酵素に依存して、ポリヌクレオチドは非特異的に切断されるか、あるいは特定のヌクレオチド配列で切断される。エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、リボザイム、及びＤＮＡザイムを含む限定するものではない、ポリヌクレオチドを開裂することが可能である任意の酵素を用いることができる。ポリヌクレオチドの断片化に有用な酵素は当該技術分野で既知であり、市販されている。例えば、Sambrook, J., Russell, D. W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, the third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001を参照のこと（これを参照により本明細書に取り入れる）。酵素を用いて大きなポリヌクレオチドをより小さなフラグメントにすることもできる。
【０１６０】
エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドの断片化に有用な酵素の代表的なクラスである。エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内の結合を開裂する能力を有する。エンドヌクレアーゼは、二本鎖又は一本鎖ポリヌクレオチドのいずれかに特異的であることができる。開裂は、ポリヌクレオチド内でランダムに起こることができ、あるいは特定の配列で開裂することができる。二重鎖ポリヌクレオチドをランダムに開裂するエンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドの骨格としばしば相互作用する。ポリヌクレオチドの特異的断片化は、１つ以上の酵素を用いて逐次反応であるいは同時に達成することができる。相同性又は非相同性ポリヌクレオチドを開裂することができる。クレバーゼ（Cleavase）（登録商標）酵素、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、及び真核生物構造に特異的なエンドヌクレアーゼ、ネズミＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ［Harrington and Liener, (1994) Genes and Develop. 8:1344］、及び仔牛胸腺の５’から３’へのエキソヌクレアーゼ［Murante, R. S. , et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 1191]）を含む種々の供給源から提供されるヌクレアーゼ酵素による処理によって開裂を行うことができる。さらに、ＤＮＡ修復エンドヌクレアーゼファミリーのメンバー（例えば、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）由来のＲｒｐＩ酵素、酵母ＲＡＤ１／ＲＡＤ１０複合体、及び大腸菌ＥｘｏＩＩＩ）などの３’ヌクレアーゼ活性を有する酵素を酵素開裂に用いることができる。
【０１６１】
制限エンドヌクレアーゼは、二本鎖ポリヌクレオチド内の特定の配列を認識するエンドヌクレアーゼのサブクラスであり、典型的には認識配列内の鎖又は認識配列に近い鎖を開裂する。ＤＮＡ分析で汎用されている１つの酵素は、ＤＮＡを配列５’−ＧＧＣＣ−３’で切断するＨａｅＩＩＩである。その他の代表的な制限エンドヌクレアーゼには、ＡｃｃＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｌｕＩ、Ａｌｗ４４Ｉ、ＡｐａＩ、ＡｓｎＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｃｌＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｌｎＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＣｆｏＩ、ＣｌａＩ、ＤｄｅＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｌＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、ＫｐｎＩ、ＫｓｐＩ、ＭｌｕＩ、ＭｌｕＮＩ、ＭｓｐＩ、ＮｃｉＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｄｅＩＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｉＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｓａＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｃａＩ、ＳｃｒＦＩ、ＳｆｉＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＳｔｙＩ、ＳｗａＩ、ＴａｑＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩが含まれる。これらの酵素の開裂部位は当該技術分野で既知である。
【０１６２】
制限酵素は、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型に分けられる。Ｉ型及びＩＩ型酵素は、同じタンパク質中で修飾及びＡＴＰ依存性開裂を行う。ＩＩＩ型酵素は、認識部位でＤＮＡを切断し、次いでＤＮＡから解離する。Ｉ型酵素は、ＤＮＡ内のランダムな部位を開裂する。任意のクラスの制限エンドヌクレアーゼを用いてポリヌクレオチドを断片化することができる。使用する酵素に依存して、ポリヌクレオチド中の切断は、「粘着」末端として知られる他方を突出する１つの鎖を生ずることができる。ＢａｍＨＩは、付着５’突出末端を生ずる。ＫｐｎＩは、付着３’突出末端を生ずる。あるいは、該切断により、突出末端を有さない「ブラント」末端を生ずることができる。ＤｒａＩ開裂により、ブラント末端が生ずる。開裂認識部位は、必要な場合、例えばメチル化によってマスクすることができる。既知の制限エンドヌクレアーゼの多くは、４〜６塩基対の認識配列を有する（Eckstein and Lilley (eds.), Nucleic Acids and Molecular Biology, vol. 2, Springer-Verlag, Heidelberg [1988]）。
【０１６３】
８塩基対特異性を有するわずかな数の稀な切断を行う制限酵素が単離され、これらは遺伝子マッピングで広範に用いられているが、これらの酵素は数が少なく、Ｇ＋Ｃ−に富む配列の認識に限定され、非常に集合する傾向がある部位で開裂する（Barlow and Lehrach, Trends Genet. , 3: 167 [1987]）。最近では、１２を上回る塩基対の特異性を有しているであろうＩ群のイントロンによってコードされるエンドヌクレアーゼが発見されている（Perlman and Butow, Science 246: 1106 [1989]）。
【０１６４】
制限エンドヌクレアーゼを用いて、種々のポリヌクレオチドフラグメントサイズを生ずることができる。例えば、ＣｖｉＪ１は、２個及び３個の塩基のＤＮＡ配列間で認識する制限エンドヌクレアーゼである。ＣｖｉＪ１による完全な消化により、平均すると長さが１６〜６４個のヌクレオチドであるＤＮＡフラグメントを生じさせることができる。したがって、ＣｖｉＪ１による部分消化によって、剪断又は音波処理と同様の「準」ランダムな形式でＤＮＡを断片化することができる。ＣｖｉＪ１は、通常、ＲＧＣＹ部位をＧ及びＣ間で開裂し、容易にクローニングできるブラント末端が残ることになる（ここで、Ｒは任意のプリンであり、Ｙは任意のピリミジンである）。１ｍＭ  ＡＴＰ及び２０％ジメチルスルホキシドの存在下では、開裂の特異性は緩まり、ＣｖｉＪ１はＲＧＣＮ及びＹＧＣＹ部位も開裂する。これらの「優れた（star）」条件下では、ＣｖｉＪ１開裂によって準ランダムな消化が生じる。この時点で、消化又は剪断されるＤＮＡをサイズ選択することができる。
【０１６５】
ポリヌクレオチドを断片化するための制限エンドヌクレアーゼの使用方法は、当該技術分野で周知である。１つの代表的なプロトコルでは、ＤＮＡ１〜３μｇ；制限酵素緩衝液１×；及びＤＮＡ１μに対して制限エンドヌクレアーゼ２単位を含有する反応混合物２０〜５０μｌを調製する。好適な緩衝液は当該技術分野で同様に既知であり、酵素活性の最適条件を提供するための好適なイオン強度、補助因子、及び任意選択によりｐＨ緩衝液を含む。特定の酵素は、一般的に商業的な酵素供給者から入手可能な特定の緩衝液を必要とする。代表的な緩衝液は、グルタミン酸カルシウム緩衝液（ＫＧＢ）である。Hannish, J. and M. McClelland. (1988). Activity of DNA modification and restriction enzymes in KGB, a potassium glutamate buffer. Gene Anal. Tech. 5: 105; McClelland, M.et al. (1988) A single buffer for all restriction endonucleases. Nucleic Acid Res. 16: 364。反応混合物を、１時間又は所望のサイズ又はサイズ範囲のフラグメントを生成するために必要な任意の期間、３７℃でインキュベーションする。必要に応じて、６５℃又は８０℃で混合物を加熱することにより反応を停止することができる。あるいは、Ｍｇ2+などの二価のカチオンを例えばＥＤＴＡでキレート化することによって反応を停止することができる。
【０１６６】
２つ以上の酵素を用いてポリヌクレオチドを断片化することができる。酵素がイオン強度、温度、又はｐＨなどの同様の条件下で活性であるという条件下で、複数の酵素を逐次反応又は同じ反応で用いることができる。典型的には、複数の酵素をＫＧＢなどの標準の緩衝液と一緒に用いる。ポリヌクレオチドを部分又は完全消化することができる。部分消化とは、制限部位のサブセットだけが開裂されることを意味する。完全消化とは、すべての制限部位が開裂されることを意味する。
【０１６７】
エンドヌクレアーゼは、ある種のタイプのポリヌクレオチドに特異的であることができる。例えば、エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ又はＲＮＡに特異的であることができる。リボヌクレアーゼＨは、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖を特異的に分解するエンドリボヌクレアーゼである。リボヌクレアーゼＡは、一本鎖ＲＮＡをＣ及びＵ残基で特異的に攻撃するエンドリボヌクレアーゼである。リボヌクレアーゼＡは、ヌクレオチドの５’−リボース及び隣接するピリミジンヌクレオチドの３’−リボースに結合したリン酸基の間のホスホジエステル結合の開裂を触媒する。得られた２’，３’−環状ホスフェートを加水分解して対応する３’−ヌクレオシドホスフェートにすることができる。ＲＮａｓｅＴ１はＲＮＡをＧリボヌクレオチドでのみ消化し、ＲＮａｓｅＵ2はＲＮＡをリボヌクレオチドでのみで消化する。ＲＮａｓｅＴ１などの単一特異的ＲＮａｓｅｓ（Ｇ特異的）及びＲＮａｓｅＵ２（Ａ特異的）の使用は日常的である（Donis-Keller et al., Nucleic Acids Res. 4: 2527-2537 (1977); Gupta and Randerath, Nucleic Acids Res. 4: 1957-1978 (1977); Kuchino and Nishimura, MethodsEnzymol. 180: 154-163 (1989); and Hahner et al., Nucl. Acids Res. 25 (10): 1957-1964 (1997)）。別の酵素であるニワトリ肝リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅＣＬ３）はシチジンで優先的に開裂すると報告されているが、この塩基の酵素に対する性向は反応条件によって影響を受けると報告されている（Boguski et al., J.Biol. Chem. 255: 2160-2163 (1980)）。最近の報告は、キュウリＬ（Cucumis sativus L）の乾燥種から単離された別のリボヌクレアーゼであるクサビチンに対するシチジン特異性も主張されている（Rojo et al., Planta 194: 328-338 (1994)）。あるいは、ＲＮａｓｅＰｈｙＭ（Ａ及びＵ特異的）（Donis-Keller, H. Nucleic Acids Res. 8: 3133-3142 (1980)）及びＲＮａｓｅＡ（Ｃ及びＵ特異的）（Simoncsits et al., Nature 269: 833- 836 (1977); Gupta and Randerath, Nucleic Acids Res. 4: 1957-1978 (1977)）の使用によるピリミジン残基の同定も実証されている。配列決定における曖昧性を少なくするために、さらなるアルカリ限定加水分解を行うことができる。すべてのホスホジエステル結合がこれらの条件下で可能性として開裂されるので、省いた及び／又は非特異的な開裂に関する情報をこのようにして得ることができる（(Donis-Keller et al., Nucleic Acids Res. 4: 2527-2537 (1977)）。ベンゾナーゼ（Benzonase）（登録商標）、ヌクレアーゼＰ１、及びホスホジエステラーゼＩは、２００塩基対以下の範囲であるポリヌクレオチドフラグメントを生成するのに好適な非特異的エンドヌクレアーゼである。ベンゾナーゼは、多くの形態のＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖の双方を分解する遺伝子操作が施されたエンドヌクレアーゼであり、米国特許第５，１７３，４１８号に記載されている（これを参照により本明細書中に取り入れる）。
【０１６８】
ＤＮＡグリコシラーゼは、所与のＤＮＡフラグメントからある種のタイプの核酸塩基を特異的に取り除く。それにより、これらの酵素は、塩基がない部位において露出したリン酸骨格を特異的に開裂し、かつ、配列を示す核酸塩基特異的フラグメントの組を生成する別の開裂酵素により認識することができるあるいはアルカリ溶液などの化学的手段及び／又は加熱により認識することができる塩基がない部位を生成することができる。ＤＮＡグリコシラーゼ及びその標的とされるヌクレオチドの１つの組み合わせの使用は、任意の所与標的領域の塩基特異的シグネチャーパターンを生ずるのに十分であろう。
【０１６９】
多数のＤＮＡグリコシラーゼが既知である。例えば、ＤＮＡグリコシラーゼは、酵素の修飾ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ標的に対応する、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼII、ピリミジン水和物−ＤＮＡグリコシラーゼ、ＦａＰｙ−ＤＮＡグリコシラーゼ、チミンミスマッチ−ＤＮＡグリコシラーゼ、ヒポキサンチン−ＤＮＡグリコシラーゼ、５−ヒドロキシメチルウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＨｍＵＤＧ）、５−ヒドロキシメチルシトシンＤＮＡグリコシラーゼ、又は１、Ｎ６−エテノアデニンＤＮＡグリコシラーゼであることができる（例えば、米国特許第５、５３６，６４９号；第５、８８８，７９５号；第５，９５２，１７６号；第６，０９９，５５３号；及び第６，１９０，８６５Ｂ１号；国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９７／０３２１０号、第ＷＯ９９／５４５０１号を参照のこと；Eftedal et al. (1993) Nucleic Acids Res 21: 2095-2101, Bjelland and Seeberg (1987) Nucleic Acids Res. 15: 2787-2801, Saparbaev et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 3750-3755, Bessho (1999) Nucleic Acids Res. 27: 979-983も参照のこと）。
【０１７０】
通常のＤＮＡ前駆体ヌクレオチド（例えば、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＧＴＰ）及びｄＵＴＰの存在下でＤＮＡを増幅することによって、例えば、ウラシルを増幅したＤＮＡ分子に導入することができる。増幅生成物をＵＤＧで処理すると、ウラシル残基が開裂する。引き続いてＵＤＧ反応からの生成物を化学処理することによって、リン酸骨格が開裂し、核酸塩基特異的フラグメントが生ずる。さらに、グリコシラーゼ処理前に増幅生成物の相補鎖を分離することによって、相補的な断片化パターンを生じさせることが可能となる。したがって、ｄＵＴＰ及びウラシルＤＮＡグリコシラーゼを用いることによって、相補鎖についてのＴ特異的フラグメントの生成が可能となり、したがって、所与の配列内のＴ及びＡの位置についての情報が提供される。双方の（相補）鎖上のＣ特異的反応（すなわち、Ｃ特異的グリコシラーゼによる）によって、双方の増幅鎖の断片化パターンを別々が分析される場合には所与の配列内のＣ及びＧの位置についての情報が与えられる。グリコシラーゼ方法及び質量分析により、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ特異的断片化パターンのすべてのシリーズを分析することができる。
【０１７１】
特定の化学物質が存在する塩基を修飾して該塩基が特定のＤＮＡグリコシラーゼによって認識されるようにする、いくつかの方法が存在する。例えば、メチルニトロソ尿素などのアルキル化剤によるＤＮＡの処理によって、アルキルプリンＤＮＡ−グリコシラーゼによって認識され開裂されるＮ３−メチルアデニン及びＮ３−メチルグアニンを含むいくつかのアルキル化塩基を生ずる。重亜硫酸ナトリウムによるＤＮＡの処理によって、ＤＮＡ中のシトシン残基の脱アミノ化が引き起こされ、ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ウラシルＤＮＡ−グリコシラーゼとしても知られる）によって開裂することができるＤＮＡ中のウラシル残基が形成される。化学試薬によって、グアニンをその酸化形態であり、かつ、ホルムアミドピリミジンＤＮＡＮ−グリコシラーゼ（ＦＰＧタンパク質）によって開裂することができる８−ヒドロキシグアニンに変換することもできる（Chung et al., "An endonuclease activity of Escherichia coli that specifically removes 8- hydroxyguanine residues from DNA," Mutation Research 254: 1-12 (1991)）。点変異検出用にミスマッチのヌクレオチド部位でポリヌクレオチドを開裂するミスマッチのヌクレオチドグリコシラーゼの使用が報告されている（Lu, A-L and Hsu, I-C, Genomics (1992) 14, 249-255 and Hsu,I-C., et al, Carcinogenesis (1994) 14,1657-1662）。使用するグリコシラーゼには、Ａ／Ｇミスマッチの誤対合アデニンを効率的に放出し、かつ、効率は劣るがＡ／Ｃミスマッチを放出する大腸菌ＭｕｔＹ遺伝子産物、及びＧｆｒミスマッチで開裂するヒトチミジンＤＮＡグリコシラーゼが含まれる。フラグメントは、グリコシラーゼ処理し、引き続いて塩基がない部位を開裂することによって生成される。
【０１７２】
本明細書中に提供する方法での核酸の断片化は、ジヌクレオチド（「２カッター」）又は緩やかなジヌクレオチド（例えば、「１と１／２カッター」）開裂特異性によって行うこともできる。ジヌクレオチド特異的開裂試薬は当業者に既知であり、参照により本明細書に取り入れる（例えば、ＷＯ９４／２１６６３；Cannistraro et al, Eur J Biochem., 181: 363-370, 1989; Stevens et al, J Bacteriol, 164: 57-62, 1985;Marotta et al, Biochemistry, 12: 2901-2904,1973を参照のこと）。ストリンジェントな又は緩やかなジヌクレオチド特異的開裂は、標的核酸の酵素及び化学修飾によっても操作することができる。例えば、対象の標的核酸の転写物を通常用いる基質及びα−チオ−基質の混合物を用いて合成することができ、ハロゲン化アルキル（例えば、ヨードアセトアミド、ヨードエタノール）又は２，３−エポキシ−１−プロパノールなどの試薬を用いてアルキル化することによってホスホロチオネートヌクレオシド内結合を引き続き修飾することができる。そのような修飾によって形成されたリン酸トリエステル結合は、ＲＮＡｓｅの基質となることは期待されない。この手順を用い、どの基質が標的調製用にα−チオ体で用いられるかに依存して、ＲＮＡｓｅ−Ｔ１などの単一特異的ＲＮＡｓｅに４つの可能なＧｐＮ結合のうちの任意の３つ、２つ、又は１つを開裂させることができる。ＲＮＡｓｅ−Ｕ２及びＲＮＡｓｅ−Ａなどの追加のＲＮＡｓｅｓを用いることにより、有用なジヌクレオチド特異的開裂試薬のレパートリーをさらに広げることができる。例えば、ＲＮＡｓｅＡの場合、所望の開裂特異性に依存して適切なヌクレオチドの２’修飾体を酵素によって導入することにより、開裂特異性をＣｐＮ又はＵｐＮジヌクレオチドに限定することができる。したがって、ＲＮＡｓｅＡをＣｐＧヌクレオチドに特異的にするために、αＳ−ｄＵＴＰ、αＳ−ＡＴＰ、αＳ−ＣＴＰ、及びＧＴＰヌクレオチドを導入することによって転写物（標的分子）を調製する。これらの選択的修飾の戦略を用いて、修飾されたヌクレオチドが開裂に対してより耐性が少なくなるかあるいはより耐性になるようにホモポリマー区域内のいくつかのヌクレオチドを選択的に修飾することによって、ホモポリマー区域のすべての塩基における開裂を妨げることもできる。
【０１７３】
ＤＮＡｓｅｓを用いてポリヌクレオチドフラグメントを生ずることもできる。Anderson, S. (1981) Shotgun DNA sequencing using cloned DNase I-generated fragments. Nucleic Acids Res. 9: 3015-3027。ＤＮａｓｅＩ（デオキシリボヌクレアーゼＩ）は、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡを消化してポリヌクレオチド及びモノヌクレオチドにするエンドヌクレアーゼである。酵素は、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ並びにクロマチンに作用することができる。
【０１７４】
ＩＩ型デオキシリボヌクレアーゼは、ＤＮＡ配列決定を含む核酸検索及び酸性ｐＨでの消化における多くの用途に用いられる。ブタ脾臓由来のデオキシリボヌクレアーゼＩＩは、３８，０００ダルトンの分子量を有する。該酵素は、二量体構造を有する糖タンパク質エンドヌクレアーゼである。最適ｐＨ範囲は、イオン強度０．１５Ｍにおいて４．５〜５．０である。デオキシリボヌクレアーゼＩＩは、ネイティブ及び変性ＤＮＡ中のデオキシリボヌクレオチド結合を加水分解し、３’−ホスフェートを有する生成物を生ずる。これは、ｐＨ５．６〜５．９においてｐ−ニトロフェニルホスホジエステルにも作用する。Ehrlich, S. D. et al. (1971) Studies on acid deoxyribonuclease. IX. 5'-Hydroxy-terminal and penultimate nucleotides of oliaonucleotides obtained from calf thymus deoxyribonucleic acid. Biochemistry.10 (11): 2000-9。
【０１７５】
種々の長さの塩基をポリヌクレオチドの末端から取り除くヌクレアーゼを用いて、大きな一本鎖ポリヌクレオチドを小さいポリヌクレオチドに断片化することができる。一本鎖ポリヌクレオチドの末端を取り除くための代表的なヌクレアーゼには、Ｓ１、Ｂａｌ３１、及び大豆ヌクレアーゼが含まれるが、限定するものではない。例えば、大豆ヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡを分解して５’末端にリン酸基を有するモノヌクレオチド又はポリヌクレオチドにする。二本鎖核酸は、非常に多量のこの酵素に暴露された場合に完全消化することができる。
【０１７６】
エキソヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ分子の末端からヌクレオチドも開裂するタンパク質である。５’エキソヌクレアーゼ（ＤＮＡをＤＮＡ鎖の５’末端から開裂する）及び３’エキソヌクレアーゼ（ＤＮＡを鎖の３’末端から開裂する）がある。異なるエキソヌクレアーゼは、一本鎖及び／又は二重鎖ＤＮＡを加水分解することができる。例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩは、５’−モノヌクレオチドをＤＮＡ鎖の３’末端から放出する３’から５’へのエキソヌクレアーゼであり；３’末端のリン酸モノエステルを加水分解するＤＮＡ３’−ホスファターゼであり；ホスホジエステル結合をアプリン酸又はアピリミジン酸部位で開裂して塩基のないデオキシリボース５’−リン酸残基である５’末端を生成するＡＰエンドヌクレアーゼである。さらに、該酵素は、ＲＮａｓｅＨ活性を有し；それは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖中のＲＮＡ鎖をおそらくヌクレオチド鎖分解性で優先的に分解する。哺乳動物細胞では、主なＤＮＡ３’−エキソヌクレアーゼはＤＮａｓｅＩＩＩ（ＴＲＥＸ−１とも呼ぶ）である。したがって、エキソヌクレアーゼを用いてポリヌクレオチドの末端を消化することによって、フラグメントを形成することができる。
【０１７７】
触媒ＤＮＡ及びＲＮＡは、当該技術分野で既知であり、ポリヌクレオチドを開裂してポリヌクレオチドフラグメントを生成するのに用いることができる。Santoro, S. W. and Joyce, G. F. (1997) A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4262-4266。一本鎖分子としてのＤＮＡは折畳まれてＲＮＡと類似した三次元構造になることができ、２’−ヒドロキシ基は触媒作用に不可欠である。リボザイムのように、ＤＮＡザイムを選択によって補助因子に依存させることもできる。ＲＮＡ加水分解用のヒスチジン依存性ＤＮＡザイムについて、このことが実証されている。米国特許第６，３２６，１７４号及び６，１９４，１８０号は、核酸配列又は分子、特にＲＮＡを開裂することができるデオキシリボ核酸酵素−触媒又は酵素ＤＮＡ分子を開示している。米国特許第６，２６５，１６７号；第６，０９６，７１５号；第５，６４６，０２０号はリボザイム組成物及び方法を開示し、参照により本明細書に取り入れる。
【０１７８】
ＤＮＡニッカーゼ又はＤＮａｓｅを用いて、ＤＮＡ二重鎖のうちの１つの鎖を認識して開裂することができる。多数のニッカーゼが既知である。これらの中の１つは、例えば、以下の開裂部位を有するニッカーゼＮＹ２Ａニッカーゼ及びＮＹＳ１ニッカーゼ（メガベース）である。
ＮＹ２Ａ：５’．．．ＲＡＧ．．．３’
３’．．．ＹＴＣ．．．５’（Ｒ＝又はＧであり、Ｙ＝Ｃ又はＴである）
ＮＹＳ１：５’．．．ＣＣ［Ａ／Ｇ／Ｔ］．．．３’
３’．．．ＧＧ［Ｔ／Ｃ／Ａ］．．．５’
ニッカーゼ反応からの生成物を引き続き化学的処理することによって、リン酸骨格が開裂され、フラグメントが生成する。
【０１７９】
Ｆｅｎ−１断片化方法では、「フラップ」エンドヌクレアーゼとして知られる部位特異的ヌクレアーゼである酵素であるＦｅｎ−１酵素が関与する（米国特許第５，８４３，６６９号、第５，８７４，２８３号、及び第６，０９０，６０６号）。この酵素は、標的ＤＮＡ鎖とハイブリダイゼーションした２つのオリゴヌクレオチドの重複によって作り出されるＤＮＡ「フラップ」を認識して開裂する。この開裂は非常に特異的であり、単一塩基対変異を認識することができ、一方の対象ＳＮＰにおいて個々のヘテロ接合体から単一の同族体を検出し、次いでフラグメント内に存在する他方のＳＮＰｓにおいてその同族体をジェノタイピングすることが可能になる。Ｆｅｎ−１酵素は、Ｆｅｎ−１様ヌクレアーゼ、例えば、ヒト、ネズミ、及びツメガエルＸＰＧ酵素、並びに酵母ＲＡＤ２ヌクレアーゼ、又は例えばＭ．ジャナスキー（M. jannaschii）、Ｐ．フュリオス（P. furious）、及びＰ．ウォウセイ（P. woesei）由来のＦｅｎ−１エンドヌクレアーゼであることができる。
【０１８０】
結核菌（M. tuberculosis）の存在を検出するための診断ツールとして開発中の別の技術を用いて、DＮＡキメラを開裂することができる。三連ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡプローブを結核菌特異的配列などの標的核酸にハイブリダイゼーションする。ＲＮＡｓｅＨを添加すると、キメラのプローブのＲＮＡ部分が消化され、ＤＮＡ部分が放出される[Yule, Bio/Technology 12: 1335(1994)]。
【０１８１】
断片化方法の任意の組み合わせ及び酵素の任意の組み合わせを用いて、フラグメントを形成することもできる。特定のフラグメントの生成方法を、ランダムフラグメントの生成方法と組み合わせることができる。さらに、ポリヌクレオチドを特定の部位で開裂する１つ以上の酵素を、ポリヌクレオチドを異なる部位で特異的に開裂する１つ以上の酵素と組み合わせて用いることができる。別の例では、特定の種類のポリヌクレオチドを開裂する酵素を組み合わせて用いることができ、例えば、ＲＮａｓｅをＤＮａｓｅと組み合わせて用いることができる。さらに別の例では、ポリヌクレオチドをランダムに開裂する酵素をポリヌクレオチドを特異的に開裂する酵素と組み合わせて用いることができる。組み合わせて用いるとは、ポリヌクレオチドに対して１又は複数の方法を１つずつあるいは同時に行うことを意味する。
【０１８２】
ペプチド断片化
プロテオミクスへの関心が研究分野で増大するにつれ、タンパク質配列決定で使用するためのタンパク質断片化について多くの技術が開発されている。これらの中の１つは、化学的加水分解及び酵素加水分解、並びにイオン化エネルギーによる断片化である。
【０１８３】
タンパク質のＮ末端の逐次的開裂は当該技術分野で周知であり、エドマン分解を用いて行うことができる。このプロセスでは、Ｎ末端アミノ酸をフェニルイソチオシアナートと反応させてＰＴＣ−タンパク質とし、トリフルオロ酢酸と接触させたときにアニリノチアゾリノン中間体が形成する。中間体を開裂して、フェニルチオヒダントイン体に変換し、続いて分離し、標準物との比較によって同定する。タンパク質開裂を促進するために、タンパク質を還元し、ビニルピリジン又はヨードアセトアミドでアルキル化することができる。
【０１８４】
臭化シアンを用いたタンパク質の化学的開裂が当該技術分野で周知である（Nikodem and Fresco, Anal. Biochem. 97: 382-386 (1979); Jahnen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 166: 139-145 (1990)）。臭化シアン（ＣＮＢｒ）は、タンパク質の最初の開裂のための最良の方法の１つである。ＣＮＢｒは、タンパク質をメチオニル残基のＣ末端で開裂する。タンパク質中のメチオニル残基の数は、通常、少ないので、ＣＮＢｒは、通常、大きなフラグメントをわずかに生じさせる。反応は、通常、７０％ギ酸又は５０％トリフルオロ酢酸中で、メチオニンに対して５０〜１００倍モル過剰の臭化シアンを用いて行われる。開裂は、通常、１０〜１２時間では定量的であるが、反応は、通常、２４時間進行させる。あるＭｅｔ−Ｔｈｒ結合は開裂されず、メチオニンの酸化により開裂を妨げることができる。
【０１８５】
単一の末端アミノ酸を除去するための部分的な酸加水分解の方法を用いて、タンパク質を開裂することもできる。（Vanfleteren et al., BioTechniques 12: 550- 557(1992）。アスパラギン酸残基を含むペプチド結合はいずれかのアスパラギン酸残基部位上での酸開裂に対して特に感受性であるが、通常、非常に厳しい条件が必要である。加水分解は、通常、密封管内の濃塩酸又は定沸点塩酸中で、高温において、２〜１８時間の種々の時間間隔で行われる。Ａｓｐ−Ｐｒｏ結合は、８８％ギ酸で３７℃において開裂することができる。Ａｓｐ−Ｐｒｏ結合は、他のＡｓｐ含有結合が非常に安定的である条件下で感受性であることが見出されている。好適な条件は、タンパク質（約５ｍｇ／ｍｌ）をピリジンでｐＨ２．５に調整された１０％酢酸中で、４０℃において、２〜５日間インキュベーションすることである。
【０１８６】
ポリペプチド鎖を開裂するために、酸性媒体中の臭素化試薬が用いられている。Ｎ−ブロモスクシンイミドなどの試薬は、トリプトファン、チロシン、及びヒスチジンを含むポリペプチドを種々の部位で開裂するが、不溶性生成物を生じる副反応をしばしば与える。ＢＮＰＳ−スカトール［２−（２−ニトロフェニルスルフェニル）−３−メチルインドール］は、トリプトファン残基のＣ末端部位でポリペプチド開裂を生じさせる温和な酸化剤かつ臭素化試薬である。
【０１８７】
チロシン及びヒスチジンとの反応が起こることができるが、反応混合物中にチロシンを含めることによってこれらの副反応を顕著に低減することができる。典型的には、約１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質を７５％酢酸に溶解し、ＢＮＰＳ−スカトール及びチロシン（トリプトファン及びタンパク質チロシンより１００倍過剰をそれぞれ与える）の混合物を加え、１８時間インキュベーションする。ペプチドを含有する上清を遠心分離によって得る。
【０１８８】
ＢＮＰＳ−スカトール処理条件下においても直面するＡｓｐ−Ｐｒｏ結合の温和な酸開裂の問題は別として、唯一の他の潜在的な問題は、メチオニン残基がいずれもメチオニンスルホキシドに変換されてしまい、次いで該メチオニンスルホキシドを臭化シアンによって開裂することができないとの事実である。ＢＮＰＳ−スカトール開裂から得られるペプチドのＣＮＢｒ開裂が必要である場合、１５％メルカプトエタノールとともに３０℃で７２時間インキュベーションすることによってメチオニン残基を再生することができる。
【０１８９】
ｏ−ヨードソ安息香酸でタンパク質を処理することによって、非常に温和な条件下でトリプトファン−Ｘ結合が開裂される。ｐ−クレゾールとともに暗闇において室温で２４時間予めインキュベーションしておいたヨード安息香酸（約２ｍｇ／ｍｌのタンパク質）とともに、４Ｍ  塩酸グアニジンを含有する８０％酢酸中のタンパク質をインキュベーションする。ジチオエリスリトールを添加することにより、反応を終結することができる。汚染物質であるｏ−ヨードキシ安息香酸はチロシン−Ｘ結合及び可能性としてヒスチジン−Ｘ結合における開裂を引き起こすので、精製したｏ−ヨード安息香酸の使用には注意をしなければならない。反応混合物中のｐ−クレゾールの作用は、残留しているｏ−ヨードキシ安息香酸の捕捉剤として作用し、開裂の選択性を向上させることである。
【０１９０】
システイン残基含有ペプチドの開裂を生ずる２つの試薬が利用可能である。これらの試薬は、（２−メチル）Ｎ−１−ベンゼンスルホニル−Ｎ−４−（ブロモアセチル）キノンジイミド（さもなければ、「有機試薬によるシステイン特異的切断」用のシザー（Cyssor）として知られている）及び２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸（ＮＴＣＢ）である。いずれの場合も、開裂はシステインのアミノ末端部位で起こる。
【０１９１】
ヒドロキシルアミンとともにタンパク質をインキュベーションすることによって、ポリペプチド骨格が断片化される（Saris etal., Anal. Biochem. 132: 54-67 (1983)）。ヒドロキシルアミノ分解によって、任意のアスパラギニル−グリシン結合が開裂される。ｐＨ５．４の６Ｍ  塩酸グアニジン、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム、及び１％メルカプトエタノール中で約４〜５ｍｇ／ｍｌの濃度のタンパク質をインキュベーションし、ｐＨ９．０の６Ｍ  塩酸グアニジン中の等体積の２Ｍ  ヒドロキシルアミンを添加することにより、反応が起こる。得られた反応混合物のｐＨを０．１Ｎ  ＮａＯＨを添加することによって９．０で維持し、反応を４５℃において種々の時間間隔で進行させた。該反応は、０．１体積の酢酸を添加することによって終了することができる。ヒドロキシルアミンの不存在下で、環状イミド中間体の塩基によって触媒される再調整を行うことができ、α−アスパルチルグリシン及びβ−アスパルチルグリシンの混合物がペプチドが開裂することなく生ずる。
【０１９２】
当該技術分野で既知である加水分解酵素を用いることによるタンパク質加水分解方法が多くある（Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252: 1102-1106 (1977)）。すべてのペプチダーゼ又はプロテアーゼは、タンパク質又はその部分加水分解物に作用してペプチド結合を分解するヒドロラーゼである。ネイティブなタンパク質は、プロテアーゼの劣った基質であり、通常、酵素開裂前に尿素で処理することによって変性させる。従来技術は、ペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、及びその他の酵素活性を示す多数の酵素を開示し、酵素は、脊椎動物、細菌、真菌、植物、レトロウイルス、及びある植物ウイルスを含む多数の生物に由来することができる。プロテアーゼは、例えば組換えタンパク質の単離に有用なものとされている。例えば、種々のプロテアーゼ、及び融合タンパク質由来の所望成分の単離におけるそれらの使用を記載している米国特許第５，３８７，５１８号、第５，３９１，４９０号、及び第５，４２７，９２７号を参照のこと。
【０１９３】
プロテアーゼは、２つのカテゴリーに分けることができる。カルボキシペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼが含まれるエキソペプチダーゼは、ポリペプチドから１又は複数のアミノ末端残基を取り除く。ポリペプチド配列内で開裂させるエンドペプチターゼは、タンパク質配列中の特定の残基の間で開裂させる。種々の酵素は、イオン強度、温度、時間、及びｐＨを含む最適な活性のための異なる必要なものを提示する。中性エンドプロテアーゼ（ニュートラーゼ（Neutrase）（登録商標）など）及びアルカリエンドプロテアーゼ（アルカラーゼ（Alcalase）（登録商標）及びエスペラーゼ（Esperase）（登録商標）など）並びに酸耐性カルボキシペプチダーゼ（カルボキシペプチダーゼ−Ｐなど）がある。
【０１９４】
プロテアーゼについて、その活性を向上させ、かつ、その基質特異性を拡張するために、精力的な調査がされてきた（例えば、米国特許第５，４２７，９２７号；第５，２５２，４７８号；及び第６，３３１，４２７Ｂ１号を参照のこと）。プロテアーゼの標的を拡張するための１つの方法は、プロテアーゼによって必要とされる開裂配列を標的タンパク質中に挿入することである。最近では、タンパク質中のユーザーが定義する認識配列を開裂することが可能な部位特異的プロテアーゼ（「デザイナー・プロテアーゼ（designer proteases）」）の製造及び選択方法が開示されている（米国特許第６，３８３，７７５号を参照のこと）。
【０１９５】
異なるエンドペプダーゼ酵素は、多様に選択される開裂部位でタンパク質を開裂する。例えば、エンドペプチターゼであるレニンは、以下の配列中のロイシン残基間で開裂させる：Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（配列番号１）（Haffey, M. L. et al., DNA 6: 565 (1987)）。Ｘａ因子プロテアーゼは、以下の配列中においてＡｒｇの後で開裂させる：Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘ；Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘ；及びＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘ（Ｘは、プロリン又はアルギニン以外の任意のアミノ酸である）（それぞれ配列番号２〜４）（Nagai, K. and Thogersen, H. C., Nature 309: 810 (1984); Smith, D.B. and Johnson, K. S. Gene 67: 31 (1988)）。コラゲナーゼは、以下の配列においてＸ及びＹ残基の後で開裂させる：−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｙ−（Ｘ及びＹは、任意のアミノ酸である）（配列番号５）（Germino J. and Bastis, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4692 (1984)）。黄色ブドウ球菌（S．aureus）Ｖ８由来のグルタミン酸エンドペプチターゼは、酸条件又はグルタミン酸アルカリ条件下でのアスパラギン酸のカルボキシ側におけるペプチド結合の開裂に特異的なセリンプロテアーゼである。
【０１９６】
トリプシンは、アルギニン、リシン、及びＳ−アミノエチル−システイン残基のカルボキシ側で特異的に開裂させるが、アルギニル−プロリン又はリシル−プロリン結合での開裂は全くないかほとんどない。ペプシンは、フェニルアラニン、ロイシン、及びグルタミン酸に対してＣ末端側を優先的に開裂するが、バリン、アラニン、又はグリシンでは開裂しない。キモトリプシンは、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、及びロイシンのＣ末端側で開裂させる。アミノペプチダーゼＰは、プロリン残基に隣接する任意のＮ末端アミノ酸の放出を担う酵素である。プロリンジペプチダーゼ（プロリダーゼ）は、カルボキシル末端位置にプロピル残基を有するジペプチドを分裂させる。
【０１９７】
ペプチド又は核酸のイオン化断片化開裂
タンパク質又は核酸のイオン化断片化は、質量分光計（ＭＳ）のイオン化区域中でより高い電圧を用いてフラグメント化することにより、あるいはイオントラップ中で衝突誘起解離を用いたタンデム型ＭＳにより、質量分析による分析中に行われる（例えば、Bieman, Methods in Enzymology, 193: 455-479(1990)を参照のこと）。アミノ酸又は塩基配列は、ＭＳでの個々のアミノ酸残基又はヌクレオチド残基と関連する公表された質量を用いて、ペプチド又は核酸の得られたＭＳ断片化パターンで観察される分子量の違いから推定する。
【０１９８】
タンパク質の完全な配列決定は、ペプチド骨格に沿ったほとんどすべての残基でペプチドを開裂することによって成される。塩基性残基がＮ末端及び／又はＣ末端に位置している場合、正電荷は一般的に塩基性部位に局在しているので、衝突誘起解離（ＣＩＤ）スペクトルで生成されるほとんどのイオンはその残基を含む（Zaia, J. , in: Protein and Peptide Analysis by Mass Spectrometry, J. R. Chapman, ed. , pp. 29-41, Humana Press, Totowa, N. J., 1996; and Johnson, R. S. , et al., Mass Spectrom. Ion Processes, 86: 137-154 (1988)を参照のこと。）塩基性部位は断片化を限定された系の特定の娘イオンへと導くので、典型的には、塩基性残基の存在は得られたスペクトルを簡易なものとする。塩基性残基を欠くペプチドは、配列決定をより難しくするより複雑なフラグメントイオン混合物へと断片化する傾向がある。このことは、強い正電荷をＮ末端に結合することによって克服することができる。Johnson, R. S., et al., Mass Spectrom. ion Processes, 86: 137-154 (1988); Vath, J. E., et al., Fresnius Z Anal. Chem., 331: 248-252 (1988); Stults, J. T., et al., Anal. Chem., 65: 1703-1708 (1993); Zaia, J., et al., J Am. Soc. Mass Spectrom., 6: 423-436 (1995); Wagner, D.S., et al., Biol. Mass Spectrom., 20: 419-425 (1991); and Huang, Z. -H., et al., Anal. Biochem. , 268: 305-317 (1999)を参照のこと。タンパク質は、その分子量を変更する標識を含むように化学修飾することもでき、それによって、イオン化断片化によって生成される質量フラグメントの区別が可能になる。タンパク質を種々の作用物質で標識することは当該技術分野で既知であり、本明細書中の方法を実施するのに有用な非常に広範な標識化試薬及び技術が当業者に容易に利用可能である。例えば、Means et al., Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, San Francisco,1971; Feeneyet al., Modification of Proteins: Food, Nutritional and Pharmacological Aspects, Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D. C., 1982を参照のこと）。
【０１９９】
本明細書中で記載される方法を用いて、多型検出、ＳＮＰ走査、細菌及びウイルスのタイピング、病原体検出、抗生物質プロファイリング、生物同定、疾患マーカーの同定、メチル化分析、マイクロサテライト分析、ハプロタイピング、ジェノタイピング、対立遺伝子頻度の決定、多重処理、並びにヌクレオチド配列決定及び再配列決定を含むが限定するものではない種々の目的のために先に提供した特異的開裂によって得られる標的核酸又はペプチドフラグメントを分析することができる。
【０２００】
Ｃ．多型、変異、及び配列変化の発見ための技術
参照配列と相対的な標的配列中の変異、多型、又は他の配列変化を検出することができるスピードを増す技術を本明細書中に提供する。参照配列と相対的な標的配列中の既知の又は未知の配列変化を発見するための従前の方法は、参照配列のすべての可能な標的配列変化（置換、挿入、欠失、多型、及び種依存性変化を含む）について、その特定の標的配列のための所与の開裂試薬又は開裂試薬の組によって生じるであろう特定の断片化スペクトルをシミュレーションすることを伴うものであった。そのような従前の方法では、次いで、参照配列と相対的な標的配列中のすべての可能な配列変化によって生じるシミュレーションの各々を標的配列について得られる実際の断片化スペクトルに対して比較し、標的配列中に存在する実際の配列変化を決定する。そのような手法での問題は、すべての可能な配列変化のシミュレーションを生ずるために費やされる時間及び供給源が法外であり得ることである。
【０２０１】
この問題に対処する１つの方法は、標的配列の開裂によって生じる実際の断片化パターンに対して断片化パターンをシミュレートして比較する所与の標的配列の可能な配列変化の数を減らすことである。本明細書中に提供する方法では、標的配列の実際の断片化スペクトルを生じている可能性が最も高いそれらの配列変化候補のみを出力するためのアルゴリズムを用いる。次いで、第２のアルゴリズムは、実際の標的配列断片化スペクトルに対して比較するためにこのサブセットの配列変化候補のみをシミュレーションする。したがって、シミュレーション分析のための配列変化の数が劇的に減少する。
【０２０２】
本明細書中に提供する方法では、第１の工程において、標的配列の実際の開裂を同じ条件下における参照配列の実際の又はシミュレーションした開裂と相対的にすることによって得られる絶対的な違い（参照スペクトルと相対的な標的スペクトル中のシグナルの存在又は不存在）又は定量的な違い（シグナル強度又はシグナル対ノイズ比の違い）である標的配列及び参照配列間のシグナルの違いに対応するフラグメントを同定し、これらの「異なる」標的核酸フラグメントの質量を決定する。一度、異なるフラグメントの質量が決定されれば、質量が各異なるフラグメントの実際の測定される質量とは十分に小さい質量より小さいかそれと等しい値だけ異なる１つ以上の核酸塩基組成物（コンポマー）が同定される。これらのコンポマーをウィットネス・コンポマーと呼ぶ。この十分に小さい質量の違いの値は、質量がタイプ又は長さにおいて単一ヌクレオチドと同じだけ異なるフラグメント間のピーク分離などのパラメータ、及び質量分光計の絶対分解能によって決定される。４つの核酸塩基（ＲＮＡでは、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、若しくはＵ、又はそれらの修飾物、あるいはタンパク質では、アミノ酸若しくはそれらの修飾物）の１つ以上に特異的な開裂反応を用いて、十分に小さい質量の違いより小さいかそれと等しい値だけ各異なるフラグメントの測定質量と近いかそれと等しい特異的に開裂された各フラグメントについての可能なウィットネス・コンポマーを含むデータの組を生ずることができる。
【０２０３】
本明細書中に提供する技術は、参照核酸と相対的な標的核酸のフラグメント間の違いに対応する可能なウィットネス・コンポマーから標的配列変化を再構築することができる。
【０２０４】
アルゴリズム１：配列変化候補の発見
これは、標的核酸配列の１つ以上の特異的開裂反応の結果を分析するために用いる基礎技術である。第１の工程は、同じ参照核酸開裂反応と相対的な標的核酸開裂反応で生じる各異なるフラグメントの実際の質量とは十分に小さい質量の違いより小さいかそれと等しい値だけ質量が異なるすべての可能なコンポマーを同定する。これらのコンポマーを「コンポマー・ウィットネス」と呼ぶ。例えば、異なるフラグメントピークが２５０１．３Ｄａで検出されると仮定する。例えば、＋／−２Ｄａのピーク質量間隔内の質量を有する天然のコンポマーだけが２５０２．６ＤａでＡ1Ｃ4Ｇ2Ｔ1である。認識される塩基（ここではＴ）が開裂部位で除去されない開裂反応の場合には（例えば、ＵＤＧは開裂される塩基を除去するが、ＲＮＡｓｅＡは除去しない）、該認識塩基を差し引いて、コンポマーＡ1Ｃ4Ｇ2となる。このようにして検出されるすべてのコンポマーをコンポマー・ウィットネスと呼ぶ。
【０２０５】
次いで、変異、多型、又は生物間の配列変化を含むが限定するものではない他の配列変化を多くてもｋ個有する各コンポマー・ウィットネスｃ’に形質転換することができるすべてのコンポマーを基礎技術により決定する。配列変化の位数であるｋの値は、ユーザーによって予め定義され、限定するものではないが参照配列及び標的配列間の配列変化の予測されるタイプ及び数を含む多くのパラメータに依存し、例えば、配列変化が単一塩基であるか複数塩基であるか、あるいは配列変化が参照配列と相対的な標的配列上の１つの位置を表すか２つ以上の位置を表すかどうか、あるいは配列変化が標的配列中で互いに相互作用するかしないかに依存する。例えば、ＳＮＰｓの検出では、ｋの値は、必ずしもではないが、通常は１又は２である。別の例として、変異の検出及び再配列決定では、ｋの値は、必ずしもではないが、通常は３以上である。
【０２０６】
開裂部位が各副配列の２つの末端で存在しているか否かを示す境界ｂを有する参照配列の副配列の組に対応するすべてのコンポマーｃの組をいう、有界コンポマーの組を構築する。有界コンポマーの組を可能なコンポマー・ウィットネスに対して比較し、参照配列と相対的な標的配列のすべての可能な配列変化を構築することができる。次いで、コンポマー・ウィットネス及び有界コンポマーの構築された対を用いて、アルゴリズムにより、同じ開裂条件下における参照配列と相対的な標的配列の断片化パターンの得られる違いを生ずるであろうすべての配列変化候補が構築される。
【０２０７】
配列変化候補の決定により、参照配列の変化であるすべての可能な配列の断片化パターンをシミュレーションし、かつ、シミュレーションしたパターンを標的核酸配列の実際の断片化パターンと比較する従前の手法と相対的な、標的配列中の実際の配列変化を決定するために分析される配列変化の試料の組が有意に減る。
【０２０８】
２つの関数ｄ+及びｄ-は：
ｃ（ｂ）＞０のｂではｄ+（ｃ）：＝Σ｛A、C、G、T｝中のbｃ（ｂ）、
ｃ（ｂ）＜０のｂではｄ-（ｃ）：＝Σ｛A、C、G、T｝中のbｃ（ｂ）、
と定義され、関数ｄ（ｃ）は、ｄ（ｃ）：＝最大｛ｄ+（ｃ），ｄ-（ｃ）｝、及びｄ（ｃ，ｃ’）：＝ｄ（ｃ−ｃ’）と定義される。これは、あるフラグメント、例えば、参照フラグメントを別のもの、例えば、標的フラグメントに変異させるのに必要である挿入、欠失、置換、及び他の配列変化の数をより低い結合に与える測量用関数である。ｆ、ｆ’がフラグメントであり、かつ、ｃ、ｃ’が対応するコンポマーである場合、ｆをｆ’に変換するために少なくともｄ（ｃ，ｃ’）配列変化が必要である。
【０２０９】
記号列ｓ（全長配列）の副記号列（フラグメント）はｓ［ｉ，ｊ］と表され、ｉ、ｊは、１≦ｉ≦ｊ≦ｓの長さを満足する副記号列の出発及び終結位置を表す整数である。
【０２１０】
コンポマー境界又は境界は、組｛Ｌ，Ｒ｝のサブセットである。ｂの可能な値は、｛｝（空のセット）、｛Ｌ｝、｛Ｒ｝、｛Ｌ，Ｒ｝である。境界ｂについて、＃ｂはｂ中の要素の数、すなわち、０、１、又は２を表す。有界コンポマー（ｃ，ｂ）は、コンポマーｃ及び境界ｂを含む。有界コンポマーとは、開裂部位が各副配列の２つの末端に存在するか否かを示す境界を有する参照配列の副配列の組に対応するすべてのコンポマーｃの組をいう。有界コンポマーの組を可能なコンポマー・ウィットネスに対して比較して、参照配列と相対的な標的配列のすべての可能な配列変化を構築することができる。
【０２１１】
コンポマーｃ’及び有界コンポマー（ｃ，ｂ）の間の距離は：
Ｄ（ｃ’，ｃ，ｂ）：＝ｄ（ｃ’，ｃ）＋＃ｂ、
と定義される。関数Ｄ（ｃ’，ｃ，ｂ）は、コンポマー・ウィットネスｃ’を生ずるために必要である参照配列と相対的な配列変化の最小数を測定する。
【０２１２】
記号列ｓ中の開裂試薬によって認識される塩基、アミノ酸、又は他の特徴Ｘの特異的開裂反応が与えられたとき、副記号列ｓ［ｉ，ｊ］又は対応するコンポマーｃ［ｉ，ｊ］の境界ｂ［ｉ，ｊ］とは、記号列ｓの開裂が副記号列ｓ［ｉ，ｊ］の直ぐ外で行われていないかを示すマーカーの組をいう。可能なマーカーは、「ｉの直前でｓが開裂されていない」かを示すＬ、及び「ｊの直後でｓが開裂されていない」かを示すＲである。したがって、ｂ［ｉ，ｊ］は、Ｘが記号列ｓのｉ−１位置に存在する場合に限りＬを含み、かつ、Ｘが記号列ｓの位置ｊ＋１に存在する場合に限りＲを含む、組｛Ｌ，Ｒ｝のサブセットである。＃ｂは、副記号列ｓ［ｉ，ｊ］が双方の直ぐ横の位置において（すなわち、ｉ−１及びｊ＋１の位置において）、あるいは片方の直ぐ横の位置において（すなわち、ｉ−１又はｊ＋１のいずれかの位置において）、あるいは直ぐ横の位置ではない位置において（すなわち、ｉ−１ｎ又はｊ＋１のいずれの位置でもない位置において）特異的に開裂されたかに依存して０、１、又は２であることができる組ｂ中の要素の数を表す。ｂ［ｉ，ｊ］は、組｛Ｌ，Ｒ｝のサブセットであり、以下によって定義されるｓ［ｉ，ｊ］の境界を表す：
・ｂ［ｉ，ｊ］：＝｛Ｌ，Ｒ｝（ｓがｉの前及びｊの後で直接開裂されない場合）
・ｂ［ｉ，ｊ］：＝｛Ｒ｝（ｓがｉの前で直接開裂されるがｊの後で直接開裂されない場合）
・ｂ［ｉ，ｊ］：＝｛Ｌ｝（ｓがｊの後に直接開裂されるがｉの前に直接開裂されない場合）
・ｂ［ｉ，ｊ］：＝｛｝（ｓがｉの前及びｊの後で直接開裂される場合）。
＃ｂ［ｉ，ｊ］は、組ｂ［ｉ，ｊ］の要素の数を表す。
【０２１３】
ｓのすべての有界コンポマーの組は、Ｃ：＝｛（ｃ［ｉ，ｊ］，ｂ［ｉ，ｊ］）：１≦ｉ≦ｊ≦ｓの長さ｝と定義され、副記号列ｓ［ｉ，ｊ］に対応するコンポマーはｃ［ｉ，ｊ］と表される。
【０２１４】
変異、多型、又は生物間の配列変化、挿入、欠失、及び置換を含むが限定するものではない他の配列変化を含む標的配列の配列変化を多くてもｋ個含む標的配列のすべての配列変化があり（通常、核酸では、ｋは配列変化中の単一塩基の変化の数を表すであろう）、かつ、ｃ’がこの配列変化のコンポマー・ウィットネスである場合、有界コンポマー（ｃ，ｂ）がＣ中にＤ（ｃ’，ｃ，ｂ）≦ｋとなるように存在する。言い換えれば、参照配列と相対的な標的配列中の異なるシグナルに対応し、かつ、コンポマー・ウィットネスｃ’に対応する異なるフラグメントを生ずる変異、多型、又は生物間の配列変化、挿入、欠失、及び置換を含むが限定するものではない他の配列変化を多くてもｋ個含む標的配列のすべての配列変化のうち（通常、核酸では、ｋは配列変化中の単一塩基の変化の数を表すであろう）、Ｄ（ｃ’，ｃ，ｂ）≦ｋとの特性を有する有界コンポマー（ｃ，ｂ）がＣ中に存在する。したがって、考慮しているフラグメントの数を多くともｋ個の開裂点：Ｃk：＝｛（ｃ［ｉ，ｊ］、ｂ［ｉ，ｊ］）：１≦ｉ≦ｊ≦ｓの長さ、及びｏｒｄ［ｉ，ｊ］＋＃ｂ［ｉ，ｊ］≦ｋ｝（ｏｒｄ［ｉ，ｊ］とは、フラグメントｓ［ｉ，ｊ］が開裂される回数をいう）を含む数まで頂度減らすことができる。
【０２１５】
アルゴリズム１：配列変化候補の発見
入力：参照配列ｓ（又は２つ以上の参照配列）、修飾ヌクレオチド又はアミノ酸を配列のすべて又は一部に導入するかの開裂反応の記載、異なるフラグメントに対応するピークのリスト（消失シグナル、又は追加シグナル、又は参照配列と相対的な標的配列の定性的違いのいずれか）、最大の配列変化位数ｋ。
【０２１６】
出力：挿入、欠失、及び置換を多くてもｋ個含み、かつ、ウィットネスとして異なるピークを有する参照配列のリスト。
【０２１７】
・参照配列及び特異的開裂反応が与えられたとき、Ｃk中のすべての有界コンポマー（ｃ［ｉ，ｊ］、ｂ［ｉ，ｊ］）を計算処理し、それらを指数ｉ、ｊとともに保存する。これは、通常、分析される標的配列を含む試料に依存し、通常は１回行う。
【０２１８】
・すべての異なるピークについて、十分に小さい質量の違いだけピーク質量に近い質量を有するすべてのコンポマーを見つけ、それをコンポマー・ウィットネスとして保存する。
【０２１９】
・すべてのコンポマー・ウィットネスｃ’について、Ｄ（ｃ’，ｃ，ｂ）≦ｋであるようなＣk中のすべての有界コンポマー（ｃ，ｂ）を見つける。
【０２２０】
・指数ｉ、ｊを有するすべてのそのような有界コンポマー（ｃ，ｂ）について：
・ｂがＬである場合には位置ｉの直前で開裂された塩基又はアミノ酸に直接に挿入／置換し、
・ｂがＲである場合には位置ｊの直後で開裂された塩基又はアミノ酸に直接に挿入／置換するように、挿入、欠失、及び置換を多くてもｋ個用いて、ｓのすべての配列変化を計算処理して新しい参照配列ｓ’にする。
【０２２１】
・対応するコンポマーｃを有するフラグメントｆ＝ｓ［ｉ，ｊ］を対応するコンポマーｃ’を有するｓ’のいくつかのフラグメントｆ’に変換する＃ｂの挿入、欠失、及び挿入を多くてもｋ個用いる。
【０２２２】
・すべてのそのような配列変化を出力する。
【０２２３】
図１は、上記の基準を満たすそれらの配列変化候補を決定するためのデータ分析に従わるコンピュータシステムによって実行される操作を図示したフローチャートである。ボックス１０２によって示される第１の操作では、１つ以上の開裂試薬を用い、当業者に周知であり本明細書中に記載される技術を用いて、標的分子をフラグメントに開裂する。ボックス１０４によって表される次の操作では、同じ開裂試薬を１つ以上用いて、参照分子を実際に又は仮想的に（シミュレーションにより）フラグメントに開裂する。開裂反応によって生成されるフラグメントから、標的及び参照配列についての質量スペクトルなどのデータが生じる。生じたデータを用いて、標的配列及び参照配列間の違いを表すフラグメントに対応する配列データのピークのリストを抽出することができる。
【０２２４】
次の操作は、同定された異なるフラグメントに基づいて配列変化候補の減少した組を決定することである。この操作はボックス１０６によって表されている。次いで、配列変化候補をスコア付けし（ボックス１０８）、標的配列中の実際の配列変化に対応する配列変化候補をスコアの値に基づいて同定する。通常、標的配列の試料の組で、最も高いスコアは標的分子中の最も起こり得そうな配列変化を表すが、単一の標的配列が存在する場合には、正のスコアを検出するなどの他の選択規則を用いることもできる。
【０２２５】
本明細書中に記載される代表的な実施態様では、開裂反応から生じたデータは分子情報分析用の慣用の実験室装備の出力を含む。そのような出力は、平文など、あるいはワード処理フォーマットによる、あるいは所有コンピュータデータ表示による種々のデジタルデータフォーマットで容易に利用可能である。
【０２２６】
上記の通り、同定された異なるフラグメントに基づいて配列変化候補の減少した組を決定するプロセスは、プログラムされたコンピュータで行うことが好ましい。図２は、配列変化候補の減少した組を決定するためにコンピュータシステムによって実行される操作を図示したフローチャートである。
【０２２７】
ボックス２０２によって表される第１の操作では、上記の反応データをＣk中のすべての有界コンポマー（ｃ［ｉ，ｊ］，ｂ［ｉ，ｊ］）を計算処理するように処理し、参照配列ｓ及び上記の特異的開裂反応データに従って指数ｉ、ｊと一緒に保存する。ボックス２０４によって表される次の操作は、すべての異なるピークについて、ピーク質量に合理的に近い十分に小さい質量の違いだけピーク質量とは異なる質量を有するすべてのコンポマーを見つけることである。十分に小さい質量の違いの値は、限定するものではないが質量がタイプ又は長さにおいて単一ヌクレオチドだけ異なるフラグメント間のピーク分離及び質量分光計の絶対分解能を含むパラメータによって決定される。これらのコンポマーをコンポマー・ウィットネスとして保存する。コンポマー・ウィットネスを同定した後、次の操作は、ボックス２０４から同定されるすべてのコンポマー・ウィットネスｃ’について、Ｄ（ｃ’，ｃ，ｂ）≦ｋであるようなＣk中のすべての有界コンポマー（ｃ，ｂ）を見つけることである。有界コンポマーの操作は、ボックス２０６により表される。ボックス２０８は：
・ｂがＬである場合には位置ｉの直前の開裂された塩基又はアミノ酸に直接に挿入／置換し；
・ｂがＲである場合には位置ｊの直後の開裂された塩基又はアミノ酸に直接に挿入／置換し；
・対応するコンポマーｃを有するフラグメントｆ＝ｓ［ｉ，ｊ］を対応するコンポマーｃ’を有するｓ’のいくつかのフラグメントｆ’に変換する＃ｂの挿入、欠失、及び挿入を多くてもｋ個用いる
ように、挿入、欠失、及び置換を多くてもｋ個用いて、ｓのすべての配列変化を計算処理して新しい参照配列ｓ’にすることを伴う操作を表す。
【０２２８】
ボックス２１０によって示される最後の操作は、システム出力としてボックス２０８から計算処理されたすべてのそのような配列変化候補を生じさせることである。ここで、ｄ（ｃ，ｃ’）は、ｃをｃ’に変換するのに必要とされる配列変化、多型、又は変異（挿入、欠失、置換）の最小数を決定する本明細書中で定義される関数であり、ｃは、参照分子のフラグメントのコンポマーであり、ｃ’は、ｃフラグメントの変異から生じた標的分子のコンポマーである。
【０２２９】
記号列ｓ（全長配列）の副記号列（フラグメント）はｓ［ｉ，ｊ］と表され、ｉ、ｊは、副記号列の出発及び末端位置である。記号列ｓ中の開裂試薬によって認識される塩基、アミノ酸、又は他の特徴Ｘの特異的開裂反応が与えられたとき、副記号列ｓ［ｉ，ｊ］又は対応するコンポマーｃ［ｉ，ｊ］の境界ｂ［ｉ，ｊ］とは、記号列ｓの開裂が副記号列ｓ［ｉ，ｊ］の直ぐ外で行われていないかを示すマーカーの組をいう。可能なマーカーは、「ｉの直前でｓが開裂されていない」かを示すＬ、及び「ｊの直後でｓが開裂されていない」かを示すＲである。したがって、ｂ［ｉ，ｊ］は、Ｘが記号列ｓのｉ−１位置に存在する場合に限りＬを含み、かつ、Ｘが記号列ｓの位置ｊ＋１に存在する場合に限りＲを含む、組｛Ｌ，Ｒ｝のサブセットである。＃ｂは、副記号列ｓ［ｉ，ｊ］が双方の直ぐ横の位置において（すなわち、ｉ−１及びｊ＋１の位置において）、あるいは片方の直ぐ横の位置において（すなわち、ｉ−１又はｊ＋１のいずれかの位置において）、あるいは直ぐ横の位置ではない位置において（すなわち、ｉ−１ｎ又はｊ＋１のいずれの位置でもない位置において）特異的に開裂されたかに依存して０、１、又は２であることができる組ｂ中の要素の数を表す。ｂ［ｉ，ｊ］は、組｛Ｌ，Ｒ｝のサブセットであり、以下によって定義されるｓ［ｉ，ｊ］の境界を表す：
・ｂ［ｉ，ｊ］：＝｛Ｌ，Ｒ｝（ｓがｉの前及びｊの後で直接開裂されない場合）
・ｂ［ｉ，ｊ］：＝｛Ｒ｝（ｓがｉの前で直接開裂されるがｊの後で直接開裂されない場合）
・ｂ［ｉ，ｊ］：＝｛Ｌ｝（ｓがｊの後に直接開裂されるがｉの前に直接開裂されない場合）
・ｂ［ｉ，ｊ］：＝｛｝（ｓがｉの前及びｊの後で直接開裂される場合）。
＃ｂ［ｉ，ｊ］は、組ｂ［ｉ，ｊ］の要素の数を表す。
【０２３０】
ｏｒｄ［ｉ，ｊ］とは、副記号列ｓ［ｉ，ｊ］が特定の開裂反応で開裂される回数、すなわち、［ｉ，ｊ］中に存在するｓカット記号列の数をいう。
【０２３１】
Ｄ（ｃ’，ｃ，ｂ）：＝ｄ（ｃ，ｃ’）＋＃ｂとは、コンポマーｃ’及び有界コンポマー（ｃ，ｂ）’の間の距離、すなわち、必要な場合には、カット記号列中に副記号列ｓ［ｉ，ｊ］の境界の配列変化を含むコンポマーｃを有するフラグメントからコンポマーｃ’を有するフラグメントを作り出すために必要とされる変化の最小数の合計をいう。
【０２３２】
Ｃ：＝｛（ｃ［ｉ，ｊ］，ｂ［ｉ，ｊ］）：１≦ｉ≦ｊ≦ｓの長さ｝とは、記号列ｓ内のすべての有界コンポマーの組をいう。すなわち、すべての可能な副記号列ｓ［ｉ，ｊ］について、有界コンポマー（ｃ［ｉ，ｊ］，ｂ［ｉ，ｊ］）を見つけ、これらは組Ｃに属する。
【０２３３】
Ｃk：＝｛（ｃ［ｉ，ｊ］，ｂ［ｉ，ｊ］）：１≦ｉ≦ｊ≦ｓの長さ、及び／又はｄ［ｉ，ｊ］＋＃ｂ［ｉ，ｊ］≦ｋ｝は、カット記号列の配列変化をｋ個の数より多く含む副記号列についてのコンポマーが組から除外されること、すなわち、ＣkがＣのサブセットであることを除き、上記のＣと同じである。挿入、欠失、及び置換を多くてもｋ個含む配列変化があり、かつ、ｃ’がこの配列変化のピークウィットネスに対応するコンポマーである場合、（ｃ，ｂ）がＣk中にＤ（ｃ’，ｃ，ｂ）≦ｋとなるように存在することを示すことができる。アルゴリズムは、コンポマー・ウィットネスに対応する可能な配列変化のこの減少した組に基づく。
【０２３４】
このように構築されたすべての配列変化によって、異なる入力ピークのリストの中から少なくとも１つの異なるピークが作り出される。さらに、アルゴリズムによって構築されていない挿入、欠失、及び挿入を多くてもｋ個含むすべての配列変化は、構築された１つ以上の配列変化のまとまりのスーパーセットであるか、あるいはアルゴリズムの入力として働いた異なるピークのリストの中から異なるピークを何ら作り出さない。
【０２３５】
アルゴリズム１を、参照断片化パターンと相対的な２つ以上の標的断片化パターンを生ずる２つ以上の特異的開裂試薬及びコンポマー・ウィットネスの２つ以上のリストについて繰り返すことができる。一実施態様では、最終出力は、各開裂反応についての配列変化候補の組のまとまりである配列変化候補の組を含む。
【０２３６】
アルゴリズム２
第２のアルゴリズムを用いて、計算処理された各出力配列変化候補についてシミュレーションしたスペクトルを生ずる。以下に記載する第３の（スコア付け）アルゴリズムを用いて、各配列変化候補についてシミュレーションしたスペクトルを実際の標的スペクトルに対してスコア付けし、参照配列に参照スペクトルを適用する。次いで、スコアの値（スコアが高いほどマッチングが良好であり、最も高いスコアは、通常、最も存在する可能性の高い配列変化である）を用いて、標的核酸配列中に実際に存在する配列変化候補を決定する。
【０２３７】
検出する配列変化がＳＮＰｓである場合の代表的なアルゴリズムを以下に提供する。ホモ接合又はヘテロ接合対立遺伝子変化を含む他のタイプの配列変化を検出するためのアルゴリズムは、同様の様式で実行することができる。ａ）各開裂反応について、シミュレーションしたスペクトルを所与の配列変化候補についてアルゴリズム１から生じる。ｂ）シミュレーションしたスペクトルを実際の標的スペクトルに対してスコア付けする。ｃ）所与の標的配列についてのすべての開裂反応由来のスコア、好ましくは相補的な開裂反応由来のスコアを加える。２つ以上の特異的開裂反応を用いることによって、特定の配列変化を同定することができる精度が向上する。ｄ）すべてのスコアをすべての配列変化について計算した後、配列変化をそれらのスコアに従って保存する。
【０２３８】
アルゴリズム２：ＳＮＰｓの発見
入力：参照配列ｓ、１つ以上の開裂反応、すべての開裂反応についてのシミュレーションした又は実際の参照断片化スペクトル、すべての開裂反応についての対応する試料スペクトル中に見出されるピークのリスト、最大の配列変化位数ｋ。
【０２３９】
出力：挿入、欠失、及び置換を多くてもｋ個含む配列変化に対応し、かつ、ウィットネスとして異なるピークを有するすべてのＳＮＰ候補のリスト、すべてのそのようなＳＮＰ候補についてのスコア。
【０２４０】
・すべての開裂反応について、試料スペクトルをシミュレーションした参照スペクトルと比較することによって異なるピークのリストを抽出する。
【０２４１】
・すべての開裂反応について、配列変化候補の発見（アルゴリズム１）を入力ｓ、現在の開裂反応、異なるピークの対応リスト、及びｋとともに用いる。
【０２４２】
・配列変化候補の発見によって戻される配列変化候補のリストを合わせて単一のリストとし、重複を除く。
【０２４３】
・すべての配列変化候補について、配列変化候補を適用し、配列ｓ’を生ずる。
【０２４４】
・すべての開裂反応について、所与の開裂反応下でｓ’の参照スペクトルをシミュレーションする。
【０２４５】
・ＳＮＰのスコア付け（アルゴリズム３）を入力としてのｓ、ｓ’のスペクトルに対応するピークリスト及び測定される試料スペクトルについてのピークリストとともに用い、開裂反応についてこの配列変化（又はＳＮＰ）候補のスコア（ヘテロ接合体及びホモ接合体）を計算する。
【０２４６】
・すべての開裂反応のスコアを合計し、ヘテロ接合体及びホモ接合体変化についての別々のスコアを維持する。
【０２４７】
・配列変化候補を含むＳＮＰ候補及びそのスコアを保存する。ＳＮＰ候補の全スコアは、そのヘテロ接合体及びホモ接合体のスコアの最大値である。
【０２４８】
・ＳＮＰ候補をそのスコアに関して分類する。
【０２４９】
・ＳＮＰ候補をそのスコアと一緒に出力する。
スコア付け用アルゴリズムであるＳＮＰのスコア付けの代表的な実行は、以下の通りである。
【０２５０】
アルゴリズム３：
ＳＮＰのスコア付け
入力：参照配列に対応するピークリスト（Ｌと表される）、修飾参照配列に対応するピークリストｓ’（Ｌ’と表される）、及び試料スペクトルに対応するピークリスト（ＬSと表す）
【０２５１】
出力：ヘテロ接合体スコア、ホモ接合体スコア。
【０２５２】
・両方のスコアを０に設定する。
【０２５３】
・違いを示すｓ、ｓ’に対応するそれらのピークをリスト中に含む強度変化のリスト（Ｌ△と表される）を計算処理する。
【０２５４】
・ピークがＬに存在するがＬ’に存在しない場合、このピークをＬ△に加え、それを野生型としてマークする。
【０２５５】
・ピークがＬ’に存在するがＬに存在しない場合、このピークをＬ△に加え、それを変異体型としてマークする。
【０２５６】
・ピークがＬ及びＬ’において異なる予測強度を有する場合、このピークをＬからＬ’までの予測強度変化と一緒にＬ△に加える。
【０２５７】
・Ｌｓにも見出される変異体型としてマークされたＬ△中のすべてのピークについて、双方のスコアに＋１を加える。
【０２５８】
・Ｌsにも見出されない変異体型としてマークされたＬ△中のすべてのピークについて、双方のスコアに−１を加える。
【０２５９】
・Ｌｓにも見出される野生型としてマークされたＬ△中のすべてのピークについて、双方のスコアに＋１を加える。
【０２６０】
・Ｌsにも見出されない野生型としてマークされたＬ△中のすべてのピークについて、双方のスコアに−１を加える。
【０２６１】
・双方のスコアを出力する。
【０２６２】
スコア付け機能の他の実行は、当業者に明らかである。例えば、ある実行は、変異体又は野生型のいずれかとして区別されないピークを利用するであろう。別の実行は、さらにあるいは別々の特徴として、Ｌ、Ｌ△、及びＬsの強度を考慮する。他の代表的なパラメータには、「野生型」に指定されたピークを用いてヘテロ接合体スコアを修正すること、又は実際の（測定された）標的配列断片化スペクトルの信頼レベルに基づいた重み関数の導入が含まれる。好ましい実行は、対数尤度手法を用いてスコアを計算することができる。
【０２６３】
一実施態様では、潜在的なＳＮＰｓ出力のスコアをアルゴリズム２によって直接に用いる代わりに、同じＳＮＰを含むと予測されるあるいは実際に含む２つ以上の標的配列由来のスコアを合わせることができる。２つ以上の標的配列を同じ参照配列に対して同時に分析する場合、各標的配列についてＳＮＰスコアを独立して報告する代わりに、異なる標的配列についてスコア付けした同一の配列変化のすべてのスコアを合わせてＳＮＰについて合わせたスコアを計算してもよい。最大スコア、合計スコア、又はそれらの組み合わせが含むことができるが限定するものではない関数をスコアの組に適用することによって、合わせたスコアを計算することができる。
【０２６４】
スコアを有するすべてのＳＮＰ又は他の配列変化候補を計算した後、閾値スコアを決定し、閾値スコアと等しいかそれより高いスコア（したがって、本物である、すなわち、標的配列中の実際の配列変化に対応する合理的な見込み）を有するそれらのＳＮＰｓ又は配列変化だけを報告することができる。一般的に、最も高いスコアを有する配列変化は、標的配列中の実際の配列変化に対応する。次いで、本物として受け入れられる配列変化を用いて、最初の参照ピークリストＬを修正する。次いで、修正されたピークリストを用い、スコアＳＮＰアルゴリズムを用いてすべての他の可能性のある配列変化又はＳＮＰｓを再評価し（スコア付けし）、あるいはホモ接合ＳＮＰｓの場合には新しいウィットネスの検索さえすることができる。これにより、ＳＮＰ又は他の配列変化検出の反復プロセスに至る。例えば、標的配列中の２つ以上の配列変化を検出するための反復プロセスでは、最も高いスコアを有する配列変化は、実際の配列変化として受け取られ、この配列変化に対応するシグナル又はピークを参照フラグメントスペクトルに加え、アップデートした参照フラグメントスペクトルを生ずる。次いで、すべての残りの配列変化候補をこのアップデートした参照フラグメントスペクトルに対してスコア付けし、次に最も高いスコアを有する配列変化候補を出力する。この第２の配列変化候補は、標的配列中の第２の実際の配列変化を表すこともできる。したがって、第２の配列変化に対応するピークを参照フラグメントスペクトルに加えて第２のアップデートした参照スペクトルを生ずることができ、該第２のアップデートした参照スペクトルに対して第３の配列変化をそのスコアに従って検出することができる。この反復プロセスは、標的配列中の実際の配列変化を表す配列変化候補が同定されなくなるまで繰り返すことができる。提示した手法は、２、１と１／２、又は１と１／４の塩基のカッターを含む、任意のタイプ及び数の完全開裂反応に適用することができる。別の実施態様では、この手法を部分開裂実験に適用することができる。
【０２６５】
この手法は、ＳＮＰ及び変異検出に限定されるものではなく、多型、変異、及び配列決定エラーを含む任意のタイプの配列変化を検出するために適用することができる。
【０２６６】
提示したアルゴリズムは均一な試料を取り扱うことができるので、その使用を試料混合物の分析にまで拡大することができることは当業者に明らかである。そのような「試料混合物」は、通常、非常に低い頻度で配列変化又は変異又は多型を含む標的核酸を大過剰の野生型配列とともに含む。例えば、腫瘍では、腫瘍を引き起こす変異は、通常、２つ以上の組織型又は細胞型の不均一混合物である腫瘍試料中に存在する核酸の５〜１０％未満存在する。同様に、個体の集団では、例えば、疾患状態又は疾患の素因を決定付ける機能的因果関係を有するほとんどの多型は、５％未満の低い対立遺伝子頻度で発生している。本明細書中に提供する方法は、高い頻度の配列変化を検出することができ、あるいは約５〜１０％未満の範囲で存在する低い頻度の変異、配列変化、対立遺伝子、又は多型を検出するように適合することができる。
【０２６７】
Ｄ．用途
１．多型の検出
本明細書での目的は、疾患のゲノム主成分及びそれらのマーカーを同定するための改良方法を提供することである。本明細書中に提供する方法におよって同定される配列変化候補には、多型である配列変化を含む配列が含まれる。多型には、天然に存在する体細胞性配列変化及び変異から生ずるもの双方が含まれる。多型には、局在領域中の２個以上のヌクレオチドが個体ごとに種々異なる配列微小変異体、１個のヌクレオチドから数百万の塩基までサイズが種々異なる挿入及び欠失、及びマイクロサテライト又は多数のリピートによって種々異なるヌクレオチドリピートが含まれるが、限定するものではない。ヌクレオチドリピートには、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、又はより大きいリピートなどの同じ配列が複数回繰り返される均一なリピートが含まれ、配列モチーフが繰り返されているのが見られるへテロヌクレオチドリピートも含まれる。所与の座では、ヌクレオチドリピートの数は個体に依って種々異なる。
【０２６８】
多型マーカー又は部位は、多様性が起こる座である。そのような部位は、１塩基対の小ささ（ＳＮＰ）であることができる。多型マーカーには、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、及び他の繰り返しパターン、単一配列リピート、及びＡｌｕなどの挿入エレメントが含まれるが、限定するものではない。多型の形態は、遺伝子についての異なるメンデル対立遺伝子としても顕在化される。多型は、タンパク質の違い、タンパク質修飾、ＲＮＡ発現修飾、ＤＮＡ及びＲＮＡのメチル化、遺伝子発現及びＤＮＡ複製を変える調節因子、並びにゲノム核酸又は細胞小器官核酸における任意の他の変化の顕在化によって観察することができる。
【０２６９】
さらに、多数の遺伝子が多型領域を有する。個体は、多型領域のいくつかの対立遺伝子変異体の任意の１つを有するので、遺伝子の多型の領域の対立遺伝子変異体のタイプに基づいて個体を同定することができる。例えば法医学の目的のためにこれを用いることができる。他の状況において、個体が有する対立遺伝子変異体の同一性を知ることは極めて重大である。例えば、ある種の遺伝子、例えば、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）遺伝子における対立遺伝子の違いは、骨髄移植における移植片拒絶反応又は移植片対宿主病に関与している。したがって、遺伝子の多型領域の対立遺伝子変異体又は遺伝子傷害の同一性を決定するための迅速で、高感度で、かつ正確な方法を開発することは非常に望ましい。本明細書中に提供する方法又はキットを用いて、被検体の１つ以上の遺伝子又は染色体中の１つ以上の多型領域の１つ以上の対立遺伝子変異体の同一性を決定することによって被検体をジェノタイピングすることができる。本明細書中に提供する方法を用いて被検体をジェノタイピングすることは法医学又は同一性試験の目的に用いることができ、多型領域はミトコンドリア遺伝子中に存在することができ、あるいはショートタンデムリピートであることができる。
【０２７０】
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）は一般的に二対立遺伝子系であり、すなわち、個体が任意の特定マーカーについて有することができる２つの対立遺伝子がある。これは、１０個の対立遺伝子の上流を有することができるマイクロサテライトマーカーと比較した場合に、ＳＮＰマーカーあたりの情報内容が比較的低いことを意味する。ＳＮＰｓは、非常に集団特異的である傾向があり、ある集団中で多型であるマーカーは別ではあまり多型であることができない。およそキロベース毎に見出されるＳＮＰｓ（Wang et al. (1998) Science 280: 1077-1082を参照のこと）は、対象遺伝子又は領域についてのハプロタイピング系の開発に非常に有用な非常に高密度の遺伝子地図をジェノタイピングする可能性を提供し、ＳＮＰｓの性質に起因して、それらは、実は、研究中の疾患の表現型と関連する多型であることができる。ＳＮＰｓの変異率が低いことによって、それらは複雑な遺伝子形質を研究するための優れたマーカーとなる。
【０２７１】
ゲノムミクスの焦点はほとんど、種々の理由のために重要であるＳＮＰｓの同定に集中している。ＳＮＰｓによって、（ハプロタイプの関連性の）間接試験及び（機能性変異体の）直接試験が可能となる。ＳＮＰｓは、最も豊富で安定した遺伝子マーカーである。一般的な疾患は、一般的な遺伝子変化によって最も良く説明され、ヒト集団における生来的な変化は疾患、治療、及び環境的相互作用の理解を助ける。
【０２７２】
２．病原体タイピング
微生物株の同定プロセス又は方法を本明細書中で提供する。微生物は、限定するものではないが細菌、真菌、原生動物、繊毛虫類、及びウイルスを含む種々の生物から選択される。微生物は、特定の属、種、株、又は血清型に限定されない。１又は複数の参照配列と相対的な標的微生物配列中の配列変化を決定することによって、微生物を同定することができる。参照配列は、例えば、同じ又は異なる属、種株、若しくは血清型由来の他の微生物、又は宿主原核生物若しくは真核生物から得ることができる。
【０２７３】
細菌病原体の同定及びタイピングは、感染性疾患の臨床管理に非常に重要である。微生物の正確な同一性は、疾患状態を健康状態から区別するために用いられるだけではなく、どの抗生物質又は他の抗菌治療が治療に最も好適であるかを決定するための基礎とすることができる。病原体タイピングの伝統的方法は、増殖特性、色、細胞、又はコロニー形態、抗生物質感受性、染色、臭い、及び細菌を同定するための特異的抗体との反応性を含む種々の表現型の特徴を用いてきた。これらの方法はすべて、疑いのある病原体の培養を必要とし、材料費及び人件費が高いこと、働き手の暴露の危険性、取り扱いの誤りに起因した偽陽性、及び生存能力のある細胞の数が低いこと又は培養条件が面倒な培養での多くの病原体が必要とするものに起因した擬陰性を含む多くの深刻な欠点に苛まれる。さらに、培養方法は診断を行うために比較的長い時間を必要とし、そのような感染が生命を脅かす可能性のある性質があるために、結果が得られる前に抗菌治療をしばしば始める。
【０２７４】
多くの場合、病原体は正常なフロラを作る生物に非常に類似し、先に引用した方法によって無害の株と区別することができない。これらの場合、病原株の存在の決定には、本明細書中に提供する分子タイピング方法によって与えられるより高い分解能が必要となる。例えば、標的核酸配列をＰＣＲ増幅し、続いて特異的開裂（例えば塩基特異的）によって断片化を行い、続いてマトリクス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析を行い、続いて本明細書中に提供する配列変化についてスクリーニングすることにより、ヌクレオチドがたった１つだけ異なる配列の信頼できる区別が可能となり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳのスピードで生じる配列情報の識別力を併せ持つ。
【０２７５】
３．感染を示すウイルス又は細菌核酸配列の存在の検出
本明細書中に提供する方法を用いて、１つ以上の参照配列と相対的なウイルス又は細菌核酸配列中に存在する配列変化を同定することより、感染を示すウイルス又は細菌核酸配列の存在を決定する。参照配列には、関連する非感染性生物から得られる配列又は宿主生物由来の配列が含まれるが、限定するものではない。
【０２７６】
ウイルス、細菌、真菌、及び他の感染生物は、宿主細胞に含まれる配列とは異なる多型を含む区別される核酸配列を含む。標的ＤＮＡ配列は、例えば、細菌及びそのファージ、ウイルス、真菌、原生動物などを含む侵入微生物のゲノムなどの外来遺伝子配列の一部であることができる。本明細書中に提供するプロセスは、例えば適切な治療介入を選ぶための微生物の異なる変異体又は株の区別に特に適用可能である。ヒト及び動物に感染し、かつ、開示したプロセスによって検出することができる疾患を引き起こすウイルスの例には、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも呼ばれる；Ratner et al., Nature, 313: 227-284 (1985); Wain Hobsonet al., Cell, 40: 9-17 (1985)）、ＨＩＶ−２（Guyader et al., Nature, 328: 662-669 (1987)；欧州特許公開公報第０２６９５２０号；Chakrabarti et al., Nature, 328: 543-547(1987)；欧州特許出願第０６５５５０１号）、及びＨＩＶ−ＬＰなどの他の分離株（国際公開公報第Ｗ０９４／００５６２号）などのヒト免疫不全ウイルス；ピコルナウイルス科（Picornaviridae）（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（Guste et al., Intervirology, 20: 1-7 (1983)）；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（Calcivirdae）（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（Togaviridae）（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス｝；フラビウイルス科（Flaviridae）（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（Coronaviridae）（例えば、コロナウイルス）；ラプドウイルス科（Rhabdoviridae）（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（Filoviridae）（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス）；オルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）（例えば、インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（Bugnaviridae）（例えば、ハンターンウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルス、及びナイロウイルス）；アレナウイルス科（Arenaviridae）（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（Reoviridae）（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、及びロタウイルス）；ビルナウイルス科（Birnaviridae）；ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（Parvoviridae）（パルボウイルス）；パポバウイルス科（Papovaviridae）；ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（Parvoviridae）（ほとんどのアデノウイルス）；パポバウイルス科（Pavovaviridae）（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（Adenoviridae）（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス（Herpesviridae）（Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）及びＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；イリドウイルス科（Iridoviridae）（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；及び未分類のウイルス（例えば、海綿様脳症の病因作用物質、デルタ型肝炎の作用物質（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテラ���トであると考えられている）、非Ａ型非Ｂ型肝炎の作用物質（クラス１＝内部感染する；クラス２＝非経口的に感染する、すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォーク及び関連ウイルス、及びアストロウイルスが含まれるが、限定するものではない。
【０２７７】
感染性細菌の例には、ヘリコバクターピロリ（Helicobacter pyloris）、ボレリア・バーグドフェリ（Borelia burgdorferi）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、マイコバクテリア種（Mycobacteria sp.）（例えば、結核菌（M. tuberculosis）、鳥結核菌（M. avium）、Ｍ．イントラセルラー（M. intracellulare）、Ｍ．カンサイ（M. kansaii）、Ｍ．ゴルドナエ（M. gordonae）)、黄色ブドウ球菌、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクティー（Streptococcus agalactiae）（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌（ビリダンス群）、大便連鎖球菌（Streptococcus faecalis）、ウシ型連鎖球菌（Streptococcus bovis）、連鎖球菌種（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、病原体カンピロバクター種、腸球菌種、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、炭疽菌（Bacillus antracis）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、コリネバクテリウム種（Corynebacterium sp.）、豚丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、破傷風菌（Clostridium tetani）、エンテロバクター・アイロゲネス（Enterobacter aerogenes）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、パスツレラ・マルトシダ（Pasturella multocida）、バクテロイデス種（Bacteroides sp.）、フゾバクテリウム・ヌクレタム（Fusobacterium nucletum）、ストレプトバシラス・モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）、梅毒トレポネーマ（Treponema palridium）、フランベジアトレポネーマ（Treponema peitenue）、レプトスピラ、及びイスラエル放線菌（Actinomyces israelii）が含まれるが、限定するものではない。
【０２７８】
感染性真菌の例には、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）、ブラストミセス・デルマティティディス（Blastomyces dermatitidis）、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）、鵞口瘡カンジダ（Candida albicans）が含まれるが、限定するものではない。その他の感染性生物には、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）及びトキソプラスマ（Toxoplasma gondii）などの原生生物が含まれる。
【０２７９】
４．抗生物質プロファイリング
本明細書中に提供する特異的開裂断片化パターンの分析は、抗生物質耐性を含む薬物耐性に関与するヌクレオチド変化の検出スピード及び精度を向上させる。イソニアジド、リファンピン、ストレプトマイシン、フルオロキノロン、及びエチオナミドに対する耐性に関与する遺伝子座が同定されている［Heym et al., Lancet 344:293 (1994) and Morris et al., J. Infect. Dis. 171:954 (1995)］。ピラジナミド及びエタンブトール又はストレプトマイシンとともに用いるイソニアジド（ｉｎｈ）及びリファンピン（ｒｉｆ）の組み合わせは、結核菌（M. tuberculosis）が確認された場合に対する最初の攻撃系として日常的に用いられる［Banerjee et al., Science 263:227 (1994)］。そのような耐性株の発生が増加しているため、それらを検出し、かつ、それにより非効率的でおそらく有害な治療を推し進める費用及び地域健康被害を減らすための迅速なアッセイの開発が必要にする。薬物耐性に関与するいくつかの遺伝子座の同定は、薬物耐性を生ずるヌクレオチド変化を迅速にスクリーニングするための変異検出技術の採用を促進している。
【０２８０】
５．疾患マーカーの同定
疾患の予後を診断又は決定するために用いることができる疾患の遺伝子マーカーである配列変化の迅速で正確な同定方法を本明細書中に提供する。遺伝子マーカーによって特徴付けられる疾患には、アテローム性動脈硬化症、肥満、糖尿病、自己免疫疾患、及び癌が含まれるが、限定するものではない。すべての生物における疾患は、遺伝されたものであろうと環境ストレスに対する体の応答から生じたものであろうと、ウイルス及び毒素などの遺伝成分を有する。進行中のゲノム研究の最終目的は、この情報を用いてこれらの疾患を同定、治療、及び潜在的に治癒する新たな方法を開発することである。第１の工程は、疾患組織をスクリーニングし、個々の試料のレベルでゲノム変化を同定することである。これらの「疾患」マーカーの同定は、誤った遺伝子又は多型を同定するためには、ゲノムマーカーの変化を検出する能力に依存する。ゲノムマーカー（単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）、マイクロサテライト及び他の非コードゲノム領域、タンデムリピート、イントロン及びエキソンを含むすべての遺伝子座）をヒトを含むすべての生物の同定に用いることができる。これらのマーカーにより、集団を同定するだけではなく、疾患に対する反応、薬物治療、環境作用因子への耐性、及び他の要因に従って集団を階層に分けることも可能とする方法が提供される。
【０２８１】
６．ハプロタイピング
本明細書中に提供する方法を用いてハプロタイプを検出することができる。任意の二倍体細胞には、少なくとも１つの特徴的な変化を含む任意の遺伝子又は他の染色体セグメントにおいて２つのハプロタイプがある。多くのよく研究された遺伝系では、ハプロタイプは単一ヌクレオチド変化よりも強く表現型と相関している。したがって、ハプロタイプの決定は、疾患の素因又は感受性、治療介入に対する反応、並びに薬剤、動物畜産、及び農業におけるその他の対象の表現型を含む種々の表現型の遺伝の基礎の理解に有益である。
【０２８２】
本明細書中に提供するハプロタイピング手順によって、個体の２つの相同染色体の１つから配列の一部を選択し、かつ、その配列部分上の連鎖したＳＮＰｓをジェノタイピングすることが可能となる。ハプロタイプの直接分解によって情報内容が増加し、任意の連鎖した疾患遺伝子の診断が改善され、あるいはそれらの疾患と関連する関連性が同定される。
【０２８３】
７．マイクロサテライト
断片化をベースとした本明細書中に提供する方法により、マイクロサテライトである配列変化の迅速で明確な検出が可能となる。マイクロサテライト（可変数タンデムリピート又はＶＮＴＲと称することもある）は、１〜７個以上の塩基の直列的に反復する短いヌクレオチド単位であり、それらの中で最も著名なものはジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、及びテトラヌクレオチドリピートである。マイクロサテライトは、ゲノムＤＮＡ中に１００,０００ｂｐ毎に存在している（J. L. Weber and P. E. Can, Am. J. Hum. Genet. 44,388(1989); J. Weissenbach et al., Nature 359, 794 (1992)）。ＣＡジヌクレオチドリピートは、例えば、ヒトミトコンドリア外ゲノムの約０．５％を構成する。ＣＴ及びＡＧリピートは一緒に、約０．２％を構成する。ＣＧリピートは、ほぼおそらくＣｐＧ島の調節機能が原因となって、非常に少ない。マイクロサテライトは、長さに関して非常に多型であり、非コード配列内に主に存在しつつも全体ゲノムにわたって広範に分布しており、ゲノム内でのその機能は不明である。
【０２８４】
集団は、その集団に特徴的な種々のマイクロサテライトを維持し、同系交配していない他の集団から区別されるので、マイクロサテライトは法医学の用途に重要である。
【０２８５】
マイクロサテライト内の多くの変化はサイレントであることができるが、遺伝子産物又は発現レベルの有意な変化をもたらすことができるものもある。例えば、遺伝子のコード領域に見出されるトリヌクレオチドリピートはある腫瘍では影響を受け（C. T. Caskey et al., Science 256,784 (1992)）、マイクロサテライトの変化は癌の素因となる遺伝の不安定性を生じさせる（P. J. McKinnen, Hum. Genet 1 75,197 (1987); J. German et al., Clin. Genet. 35,57 (1989)）。
【０２８６】
８．ショートタンデムリピート
本明細書中に提供する方法を用いて、例えばＳＴＲ領域を含まないヒトゲノム中の参照配列と相対的なヒトゲノムのある標的配列中のショートタンデムリピート（ＳＴＲ）領域を同定することができる。ＳＴＲ領域は、疾患又は状態のいずれとも関連しない多型領域である。ヒトゲノム中の多くの座は、多型のショートタンデムリピート（ＳＴＲ）領域を含む。ＳＴＲ座は、長さが３〜７塩基対の短い反復配列エレメントを含む。ヒトゲノム中に１５ｋｂ毎に１つの頻度で存在する２００,０００個の予測される三量体及び四量体ＳＴＲがあると推測されている（例えば、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９２１３９６９Ａ１号、Edwards et al., Nucl. Acids Res. 19: 4791 (1991); Beckmann et al. (1992) Genomics 12: 627-631を参照のこと）。これらのＳＴＲ座のほぼ半分は、遺伝子マーカーの豊富な供給源を提供する多型である。特定の座における反復単位の数の変化は、可変ヌクレオチドタンデムリピート（ＶＮＴＲ）座（Nakamura et al. (1987) Science 235: 1616- 622）；及びより長いリピート単位を含むミニサテライト座（Jeffreys et al. (1985) Nature 314: 67-73）、並びにマイクロサテライト又はジヌクレオチドリピート座（Luty et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4308; Litt et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 4301; Litt et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18 : 5921;Luty et al. (1990) Am. J. Hum. Genet. 46: 776-783; Tautz (1989) Nucl. Acids Res. 17: 6463-6471; Weber et al. (1989) Am. J. Hum. Genet. 44: 388-396; Beckmann et al. (1992) Genomics 12: 627-631）を連想させる観察される多型の原因となっている。
【０２８７】
ＳＴＲ座の例には、ヒトＣＤ４座でのペンタヌクレオチドリピート（Edwards et al.,Nucl. Acids Res. 19: 4791 (1991)）；ヒトアロマターゼシトクロムＰ−４５０遺伝子中のテトラヌクレオチドリピート（ＣＹＰ１９；Polymeropoulos et al., Nucl. Acids Res. 19: 195 (1991)）；ヒト凝固因子ＸＩＩＩＡサブユニット遺伝子中のテトラヌクレオチドリピート（Ｆ１３Ａ１；Polymeropoulos et al.,Nucl. Acids Res. 19: 4306(1991)）；Ｆ１３Ｂ座におけるテトラヌクレオチドリピート（Nishimura et al., Nucl. Acids Res. 20: 1167 (1992)）；ヒトｃ−ｌｅｓ／ｆｐｓ原腫瘍遺伝子中のテトラヌクレオチドリピート（ＦＥＳ；Polymeropoulos etal.,Nucl. Acids Res. 19: 4018 (1991)）；ＬＦＬ遺伝子中のテトラヌクレオチドリピート（Zuliani et al, Nucl. Acids Res. 18: 4958 (1990)）；ヒト膵ホスホリパーゼＡ−２遺伝子中のトリヌクレオチドリピート多型（ＰＬＡ２；Nucl. Acids Res. 18: 7468 (1990)）；ＶＷＦ遺伝子中のテトラヌクレオチドリピート多型（Ploos et al., Nucl. Acids Res. 18: 4957 (1990)）；及びヒト甲状腺ペルオキシダーゼ（ｈＴＰＯ）座でのテトラヌクレオチドリピート（Anker etal., Hum. Mol. Genet. 1: 137 (1992)）が含まれるが、限定するものではない。
【０２８８】
９．生物の同定
多型ＳＴＲ座及び他の遺伝子多型領域は、ヒトの同定、父及び母であることの試験、遺伝子マッピング、移入及び遺伝論争、双子における接合生殖性試験、ヒトでの同系交配についての試験、ヒト培養細胞の品質管理、ヒト遺体の同定、並びに精液試料、血痕、並びに法医学における他の物質の試験に非常に有用なマーカーである配列変化である。そのような座は、商業的な動物の飼育及び血統分析並びに商業的な植物の育種において有用なマーカーでもある。植物作物及び動物における経済上重要な形質を、多型ＤＮＡマーカーを用いた連鎖分析によって同定することができる。そのような座の同一性を決定するための効率的かつ正確な方法を本明細書中に提供する。
【０２８９】
１０．対立遺伝子変化の検出
本明細書中に提供する方法により、対立遺伝子変異体の迅速かつ正確なハイスループット検出が可能となる。対立遺伝子変化の研究は、複雑なバックグランド中での特定配列の検出のみならず、数個又は単一のヌクレオチドの違いを有する配列間の区別も伴う。ＰＣＲによる対立遺伝子特異的変異体の１つの検出方法は、鎖鋳型及びプライマーの３’末端の間にミスマッチがある場合にはＴａｑポリメラーゼがＤＮＡ鎖を合成することは難しいとの事実に基づく。可能な対立遺伝子のうち１つだけと完全にマッチングするプライマーを用いることにより、対立遺伝子特異的変異体を検出することができる。他の対立遺伝子に対するミスマッチはプライマーの伸長を妨げるように作用し、それによりその配列の増幅が妨げられる。この方法は、ミスマッチの塩基組成がミスマッチを超える伸長を妨げる能力に影響を与え、かつ、ある種のミスマッチは伸長を妨げないか最小限の効果だけを有するという点において、実質的な制限を有している（Kwok et al., Nucl. Acids Res., 18: 999[1990])）。本明細書中に提供する断片化をベースとした方法は、プライマー伸長法の制限を克服するものである。
【０２９０】
１１．対立遺伝子頻度の決定
本明細書に記載される方法は、年齢、人種集団、性、又はある他の基準の関数として頻度が集団内で変わる１又は数個の遺伝子マーカーの同定に有益である。例えば、ＡｐｏＥ遺伝子型の年齢依存型の分布は当該技術分野で既知である（Schichter et al. (1994) Nature Genetics 6 : 29-32を参照のこと）。疾患とあるレベルで関連することが知られる多型の頻度を用いて、疾患状態の進行を検出又はモニタリングすることもできる。例えば、アミノ酸コドン２９１においてセリンがアスパラギンに置き換えられたリポタンパク質リパーゼ遺伝子のＮ２９１Ｓ多型（Ｎ２９１Ｓ）は、男性の動脈硬化症、特に具体的には心筋梗塞の危険性の増加と関連がある高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）のレベルを減少させる。（Reymer et al. (1995) Nature Genetics 10: 28-34を参照のこと）。さらに、対立遺伝子頻度の変化を決定することによって、従前には不明であった多型の同定が可能となり、疾患の開始及び進行に関与する遺伝子又は経路の同定が最終的には可能となる。
【０２９１】
１２．後生学
本明細書中に提供する方法を用いて、配列（例えば、核酸又はタンパク質の天然に存在する単量体単位である塩基又はアミノ酸の同一性）に基づかない参照核酸又はタンパク質と相対的な標的核酸又はタンパク質の変化を研究することができる。例えば、本明細書中に提供する方法で用いる特異的開裂試薬は、メチル化パターンなどの配列に依存しない特徴の違い、修飾塩基又はアミノ酸の存在、又は標的分子及び参照分子間のより高次の構造の違いを認識し、配列に依存しない部位で開裂されるフラグメントを生じさせることができる。後生学は、遺伝子配列の違いではなく遺伝子発現の違いに基づく情報の遺伝に関する研究である。後成的変化とは、遺伝子機能の有糸分裂（mitotically）及び／又は減数分裂による遺伝性変化又は核酸配列の変化によって説明することができないより高次の核酸構造の変化をいう。後生的変化又は変化を受ける特徴の例には、動物でのＤＮＡメチル化パターン、ヒストン修飾、及びポリコーム−トリソラックス群（Ｐｃ−Ｇ／ｔｘ）タンパク質複合体（例えば、Bird, A., GenesDev., 16: 6-21 (2002)を参照のこと）が含まれるが、限定するものではない。
【０２９２】
後生的変化は、必ずしもではないが通常は遺伝性である遺伝子発現の変化を必ずしもではないが通常は生ずる。例えば、以下にさらに論じるように、メチル化パターンの変化は、癌及び他の疾患の発達及び進行における初期の事象である。多くの癌においては、ある種の遺伝子は、異常型のメチル化が原因で不適切にスイッチがオフ又はオンとなる。転写を抑制又は活性化するメチル化パターンの能力は遺伝できる。Ｐｃ−Ｇ／ｔｒｘタンパク質複合体は、メチル化のように、転写を遺伝性の形式で抑制することができる。Ｐｃ−Ｇ／ｔｒｘタンパク質アセンブリは、それが遺伝子の胚遺伝子発現状態を遺伝子が活性であろうと不活性であろうと効率的に凍結し、かつ、発達を介してその状態を安定的に遺伝していくかにかかわらず、ゲノムの特定領域を標的とする。タンパク質のＰｃ−Ｇ／ｔｒｘ基のゲノムを標的とし、かつ、これに結合する能力は、ゲノムに含まれる遺伝子の発現レベルだけに影響を及ぼし、遺伝子産物の性質には影響を及ぼさない。本明細書中に提供する方法は、後生的変化などの配列に依存しない変化に基づく参照配列と相対的な標的配列中の変化を同定する特異的開裂試薬とともに用いることができる。
【０２９３】
１３．メチル化パターン
本明細書中に提供する方法を用いて、標的配列中のメチル化パターンの変化などの標的配列中の後生的変化である配列変化を検出することができる。細胞のメチル化の分析は、新たに生起した研究学問分野である。メチル基のシトシンへの共有結合による結合は、主にＣｐＧジヌクレオチド（マイクロサテライト）に存在する。プロモーター領域に位置していないＣｐＧ島の機能は調査が継続されているが、プロモーター領域中のＣｐＧ島は、そのメチル化状態が関連する遺伝子の転写及び発現を調節するので、特に関心がある。プロモーター領域のメチル化により、遺伝子発現のサイレンシングが生じる。このサイレンシングは、永続的であり、有糸分裂プロセスを介して継続する。遺伝子発現におけるその有意な役割に起因して、ＤＮＡメチル化は、発達プロセス、インプリンティング、及びＸ染色体不活化、並びに腫瘍の発生、老化、及びさらに寄生虫ＤＮＡの抑制に影響を与える。メチル化は、肺癌、乳癌、及び大腸癌などの多くの広範な腫瘍の発癌性、及び白血病に関与すると考えられている。メチル化及びタンパク質機能不全（長時間Ｑ−Ｔ症候群）又は代謝疾患（一過性新生児糖尿病、二型糖尿病）の間にも関連がある。
【０２９４】
ゲノムＤＮＡの重亜硫酸塩処理を利用して、ＤＮＡ内のメチル化シトシン残基の位置を分析することができる。核酸を重亜硫酸塩で処理することによって、メチル化シトシンを未修飾としたまま、シトシン残基が脱アミン化されてウラシル残基となる。したがって、本明細書中に提供する方法において、重亜硫酸塩で処理していない標的核酸の配列を重亜硫酸塩で処理した核酸の配列と比較することによって、核酸中のメチル化の程度及びシトシンがメチル化される位置を推定することができる。
【０２９５】
制限エンドヌクレアーゼ反応によるメチル化分析は、Ｈｐａｌｌ及びＭＳＰＩなどのメチル化特異的認識部位を有する制限酵素を用いることによって可能になる。基本原理は、ある種の酵素を認識配列中のメチル化シトシンによって遮断することである。一度、この区別（differentiation）が成されれば、本明細書中に提供する方法を用いて、得られるフラグメントの分析を続いて行うことができる。
【０２９６】
これらの方法は、組み合わせた重亜硫酸塩制限分析（ＣＯＢＲＡ）で一緒に用いることができる。重亜硫酸塩による処理によって増幅されたＰＣＲ生成物中のＢｓｔＵｌ認識部位が失くなり、未処理試料と比較して新たな検出可能なフラグメントが分析上に現れることとなる。本明細書中に提供する断片化をベースとした方法をメチル化部位の特異的開裂と組み合わせて用い、標的核酸配列中のメチル化パターンについての迅速かつ信頼できる情報を提供することができる。
【０２９７】
１４．再配列決定
種々の生物由来の利用可能なゲノム配列情報量が劇的に増大したことによって、配列情報を機能、表現型、又は同一性に関連づけるための大規模な比較配列分析を可能する技術の必要性が増している。ＳＮＰ発見及び病原体の配列特異的同定を含む比較配列分析のためのそのような技術の用途は広範にわたることができる。したがって、再配列決定及びハイスループット変異スクリーニング技術は、疾患の元になる変異及び差次的な薬物反応の元になる遺伝変異性の同定に非常に重要である。
【０２９８】
これらの必要性を満たすため、いくつかの手法が開発された。ハイスループットＤＮＡ配列決定のための現在の技術には、電気泳動及びレーザー誘起蛍光検出を用いたシーケンサーが含まれる。電気泳動をベースとする配列決定法は、異型接合体の検出に固有の制限を有し、ＧＣ圧縮により損なわれる。したがって、電気泳動を用いることなくデジタルデータを生ずるＤＮＡ配列決定プラットフォームは、これらの問題を克服する。マトリクス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）は、ＤＮＡフラグメントを測定し、デジタルデータ出力する。本明細書中に提供する特異的開裂断片化分析方法により、参照配列と相対的な配列変化の検出でのハイスループット、高速、及び高精度が可能になる。この手法により、乳癌の発達に関連するＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２中の創始者変異についてのスクリーニングなどの正確な変異検出用にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ配列決定を日常的に用いることが可能になる。
【０２９９】
１５．多重処理
本明細書中に提供する方法によって、１つ又は複数の参照配列と相対的な複数の標的配列中の配列変化のハイスループット検出又は発見が可能になる。多重処理とは、２つ以上の多型又は配列変化の同時検出をいう。特に質量分析と組み合わせた多重処理反応の実施方法が既知である（例えば、米国特許第６,０４３,０３１号、第５,５４７,８３５号、及び国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９７／３７０４１号を参照のこと）。
【０３００】
例えば、本明細書中に提供する異なる相補的な特異的開裂反応を用いて同じ標的核酸配列について、あるいは異なる標的核酸配列について多重処理を行うことができ、次に断片化パターンを複数の参照核酸配列に対して分析することができる。各配列変化が参照核酸配列断片化パターンと相対的な異なる開裂フラグメントに対応する場合、本明細書中に提供する方法を用いることにより、１つの標的配列に対していくつかの変異又は配列変化を同時に検出することもできる。多重処理は、個々の各配列変化について別々の質量分析による分析を行わなければならないことと比較して、単一の質量スペクトルで複数の配列変化を同定することができるという利点を与える。本明細書中に提供する方法は、高速かつ高精度で配列変化を分析するためのハイスループットで高度に自動化されたプロセスとなる。
【０３０１】
Ｅ．システム及びソフトウェア方法
標的核酸若しくはタンパク質中の配列変化の決定方法又は本明細書中に提供する検出方法を本明細書中に提供する方法に基づいて配列変化を同定するためにプログラミングされたコンピュータを用いて自動化するシステムも提供する。例えば、以下のコンピュータシステムを用い、かつ、以下の計算、システム、及び方法を用いることによって、本明細書での方法を実行ことができる。
【０３０２】
代表的な自動化試験システムは、ゲル電気泳動機器、又は質量分光計、又は試料中の核酸分子の質量を決定するための他の機器などの分析機器、並びに該分析機器と通信可能な断片化データ分析用のコンピュータを含む、核酸ワークステーションを含む（例えば、同時係属中の米国特許出願第０９／２８５,４８１号、第０９／６６３,９６８号、及び第０９／８３６,６２９号を参照のこと；代表的な自動化システムについては国際ＰＣＴ出願第ＷＯ００／６０３６１号も参照のこと）。代表的な実施態様では、コンピュータは、並列又はシリアルインターフェイスなどの既知の通信標準を用いて機器と通信するマイクロソフト社（Microsoft Corporation）の「マイクロソフト・ウインドウズ（Microsoft Windows（登録商標））」操作システム又は又はアップルコンピュータ社（Apple Computer, Inc.）の「マッキントッシュ（登録商標）（Macintosh（登録商標））」操作システムの制御下で操作するコンピュータなどのデスクトップコンピュータシステムである。
【０３０３】
例えば、核酸試料の分析システムを提供する。システムは、本明細書中で記載される塩基特異的又は他の特異的開裂反応を行う処理ステーション；得られた開裂フラグメントを処理ステーションから反応生成物の質量が決定される質量測定ステーションに移すロボットシステム；及び断片化データを用いて標的核酸配列中の配列変化を同定するためにプログラミングされたコンピュータなど、質量測定ステーションからのデータを処理して１つ又は複数の試料中の１個又は複数のヌクレオチドを同定するデータ分析システムを含む。該システムは、各ステーションでいつ処理が完了したかを決定し、かつ、それに則して、試料を次の試験ステーションに移し、制御システムが停止命令を受けるまで試料を次々と継続的に処理する制御システムも含むことができる。
【０３０４】
図３は、試料の処理を行い、かつ、図１及び図２に図示される操作を行うシステムのブロック線図である。システム３００は、核酸ワークステーション３０２及び分析コンピュータ３０４を含む。核ワークステーションにおいて、１つ以上の分子試料３０５を受け取り、上記の開裂反応が行われる処理ステーション３０６での分析用に調製する。次いで、試料を質量分光計などの質量測定ステーション３０８に移し、ここで試料の処理をさらに行うことができる。試料は、コンピュータによって制御されるロボット装置３１０によって試料処理ステーション３０６から質量測定ステーション３０８に移すことが好ましい。
【０３０５】
ロボット装置は、試料３０５の完全性を保持し、かつ、有効な試験結果を確実にする２つの処理ステーションである３０６、３０８の間の移動を確実にするサブシステムを含む。サブシステムは、例えば、試料を試料処理ステーション３０６から試料を取り上げ、質量測定ステーション３０８に移し、次いで質量測定操作用に処理試料を保管しておくことができる機械的ゆるめ装置又はアームを含む。次いで、ロボット装置３１０は、測定試料を移し、処理ステーション３０６から次の処理試料を移すための適切な措置をとる。
【０３０６】
質量測定ステーション３０８は、測定試料３０５の分子成分を同定し定量化するデータを作成する。当業者は、測定データの作成に用いることができる質量分光計などの分子測定システムに精通している。データは、手動で測定結果を分析コンピュータに入力することによるかあるいは質量測定ステーション及び分析コンピュータ間の通信によるかのいずれかにより、質量測定ステーション３０８から分析コンピュータ３０４に提供される。例えば、質量測定ステーション３０８及び分析コンピュータ３０４をネットワーク３１２を介して相互接続して、質量測定ステーションによって作成されるデータが分析コンピュータによって得られるようにすることができる。ネットワーク３１２は、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、又はワイアレス通信チャンネル、又はコンピュータ間データ交換に好適な任意の他の通信チャンネルを含むことができる。
【０３０７】
所望する場合には、分析コンピュータ３０４の測定処理機能及び核酸ワークステーション３０２の制御機能を単一のコンピュータ装置に導入することができる。その構成において、例えば、単一の多目的コンピュータを用いて、ロボット装置３１０を制御し、かつ、データ分析コンピュータ３０４のデータ処理を行うことができる。同様に、質量測定ステーションの処理操作及び試料処理ステーション３０６の試料処理操作を単一のコンピュータの制御下で行うことができる。
【０３０８】
したがって、計算処理装置が任意の適切なサブユニットシステム（ロボット装置３１０の機械アームなど）への好適なインターフェイスを有し、かつ、システムを制御しデータ処理を行うための好適な処理力を有する場合には、ステーション及びコンピュータ３０２、３０４、３０６、３０８、３１０の処理及び分析機能を種々の計算処理装置によって行うことができる。
【０３０９】
データ分析コンピュータ３０４は、分析機器又は別のシステム要素の一部であることができ、あるいは離れた位置にあることができる。機器と通信することができるコンピュータシステムは、例えば、広域ネットワーク、又はローカルエリア通信ネットワーク、又は他の好適な通信ネットワークを介して機器と通信することができる。コンピュータを有するシステムは、本明細書中の方法の工程及び必要な計算を自動的に行うようにプログラミングされている。使用される開裂試薬及び修飾塩基又はアミノ酸に基づく（参照又は標的配列の）予測される断片化パターンを用いる実施態様のためには、ユーザーは予測されるフラグメント質量を入力する。これらのデータは、ユーザーによって、キーボードから、あるいはネットワークに接続された他のコンピュータ又はコンピュータシステムから、あるいはデータＣＤ、ミニディスク（ＭＤ）、ＤＶＤ、フロッピー（登録商標）ディスクなどの取り外し可能な記録媒体又は他の好適な記録媒体上に直接入力することができる。次に、ユーザーは、標的核酸配列及び参照核酸配列間のフラグメントの違いを同定するシステムを操作する実行ソフトウェアを開始する。配列変化ソフトウェアにより、アルゴリズム１の工程が行われ、ある実施態様では本明細書中に記載するアルゴリズム２又は３が行われる。
【０３１０】
図４は、ステーション及びコンピュータ３０２、３０４、３０６、３０８の機能を提供することができるコンピュータに含まれるハードウェア構成要素を図示した図３のシステム３００中のコンピュータのブロック線図である。図３に図示したステーション及びコンピュータはすべて、同様のコンピュータ構成を有することができ、あるいは本明細書中に記載する能力及びそれぞれの機能に合致する代替の構成を有することができることを当業者は十分に理解している。図４の構成は、図３に図示されるデータ分析コンピュータ３０４に特に適している。
【０３１１】
図４は、ステーション及び分析コンピュータｓ３０２、３０４、３０６、３０８の任意の操作を制御するコンピュータを含むような代表的なコンピュータ４００を示す。各コンピュータ４００は、インテル社（Intel Corporation）（米国カリフォルニア州サンタクララ）から入手可能な「ペンティアム（登録商標）（Pentium（登録商標））」マイクロプロセッサーなどの中央処理装置（ＣＰＵ）４０２又は関連した集積回路チップの制御下で操作する。コンピュータユーザーは、キーボード及びコンピュータマウス４０４からコマンド及びデータを入力することができ、ディスプレー４０６で入力及びコンピュータ出力を見ることができる。ディスプレーは、典型的には、ビデオモニター又はフラットパネルディスプレーである。コンピュータ４００は、ハードディスクドライブなどの直接アクセス記憶装置（ＤＡＳＤ）４０８も含む。コンピュータは、典型的には揮発性半導体ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）を含むメモリー４１０を含む。各コンピュータは、プログラム製品記憶装置４１４を受け取るプログラム製品読取り機４１２を含むことが好ましく、プログラム製品読取り機は、該プログラム製品記憶装置４１４からデータを読み取ることができる（任意選択により、該プログラム製品記憶装置４１４にデータを書き込むことができる）。プログラム製品読み取り機は、例えば、ディスクドライブを含むことができ、プログラム製品記憶装置は、磁気フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−Ｒディスク、ＣＤ−ＲＷディスク、又はＤＶＤディスクなどの取り外し可能な記憶媒体を含むことができる。
【０３１２】
各コンピュータ４００は、ネットワーク４２０及びコンピュータ間の接続４２２を介して通信することができるネットワークインターフェイス４１８を通してコンピュータネットワーク４２０（例えば、ローカルネットワーク３１２又はインターネット又はイントラネットなど）を介し、他の図３のシステムと通信することができる。ネットワークインターフェイス４１８は、典型的には、例えば、種々のネットワークを介して通信を可能とするネットワークインターフェイスカード（ＮＩＣ）をモデムなどのネットワークアクセスサブシステムと一緒に含むことができる。
【０３１３】
ＣＰＵ４０２は、コンピュータ４００のメモリー４１０に一時的に記憶するプログラミング命令の制御下で操作する。プログラミング命令が実行されるとき、コンピュータはその働きを行う。したがって、プログラミング命令は、ワークステーション又はプロセッサーそれぞれの機能性を実行させる。プログラミング命令は、プログラム製品記憶装置４１４又はネットワーク接続４２２を介してＤＡＳＤ４０８から受け取ることができる。プログラム製品記憶装置４１２は、プログラム製品４１４を受け取り、その上に記録されているプログラミング命令を読み取り、プログラミング命令をＣＰＵ４０２による実行のためにメモリー４１０に転送することができる。上記の通り、プログラム製品記憶装置は、磁気フロッピー（登録商標）ディスク及びＣＤ−ＲＯＭ記憶ディスクを含むコンピュータ読み取り可能な記録された命令を有する複数の取り外し可能な媒体の任意の１つを含むことができる。他の好適なプログラム製品記憶装置には、磁気テープ及び半導体メモリーチップを含ませることができる。このように、本明細書中の方法及び開示に従った操作に必要な処理命令は、プログラム製品上で具現化することができる。あるいは、ネットワーク４２０を介して、プログラム命令を操作メモリー４１０中に受け取ることができる。ネットワーク方法では、当業者がさらなる説明を受けることなく理解することができる周知の方法によってネットワーク通信がネットワーク接続４２２を介して構築された後に、コンピュータ４００は、ネットワークインターフェイス４１８を介してプログラム命令を含むデータをメモリー４１０中に受け取ることができる。次いで、プログラム命令をＣＰＵ４０２によって実行し、それによってコンピュータプロセスを構成する。
【０３１４】
図３に図示するシステム３００のステーション及びコンピュータはすべて、図４に図示する構成と同様の構成を有することができると理解すべきであり、図４のコンピュータ４００に関して記載した詳細はシステム３００のすべてのコンピュータに適用されると理解する。通信及びコンピュータはいずれも、図３に図示する他の通信ステーション及びコンピュータと通信することができ、かつ、本明細書中に記載される機能性を裏付ける限り、代替の構成を有することができることを十分に理解すべきである。例えば、ワークステーションがプログラム製品装置からプログラム命令を受け取らない場合には、そのワークステーションがその能力を含む必要はなく、そのワークステーションはその能力に関連した図４に表される構成要素を有さない。
【０３１５】
以下の実施例は、例示目的のためだけに含めたものであり、本発明の範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【０３１６】
実施例１
ＲＮＡの塩基特異的開裂
対象標的核酸の配列変化を分析するために、ＲＮＡ転写を含む１つの管反応及び代表的なＲＮＡｓｅであるＲＮａｓｅＴ１によるＧ特異的ヌクレオチド結合分解性開裂反応の半自動化プロトコルを本明細書中で提供する。本明細書中に提供するＲＮＡｓｅ開裂方法によって生成されるフラグメントを本明細書中に提供する方法に従って分析することができる。ＲＮａｓｅＴ１反応を行い、標的核酸上のＧヌクレオチド部位で約１００％開裂させる。この開裂によって、対象標的配列中の配列変化を示すフラグメント質量の特徴的なパターンを生成する。
【０３１７】
材料及び方法
オリゴヌクレオチドは、メタビオン社（Metabion）（ドイツ）から購入した。５−メチルシチジン５’−三リン酸リチウム塩（Ｍｅ−ＣＴＰ）及び５−メチルウリジン５’−三リン酸リチウム塩（Ｍｅ−ＵＴＰ）をトリリンク社（Trilink）（米国）から得た。
【０３１８】
ＰＣＲ増幅
ＰＣＲ反応物５μｌは、ゲノムＤＮＡ５ｎｇ、ホット・スター（Hot Star）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（キアジェン社（Qiagen）、ドイツ）０．１単位、フォワード及び逆プライマー  各１ｐｍｏｌ、０．２ｍＭ  各ｄＮＴＰ、及び酵素製造元（キアジェン社（Qiagen）、ドイツ；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、及び（ＮＨ4）2ＳＯ4（ｐＨ８．７）を含有する）から供給される１×ホット・スター（Hot Star）ＴａｑＰＣＲ緩衝液を含有した。酵素活性及び最初の変性を９４℃で１５分間行い、続いて４５増幅サイクル（９４℃で２０秒間、５６℃で３０秒間、及び７２℃で６０秒間）を行い、及び７２℃で３分間最終伸長を行った。
【０３１９】
ＲＮＡ転写及びＲＮａｓｅＴ１開裂
ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物２．４μｌを、１×転写緩衝液（６ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  スペルミジン、及び４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２０℃）を含有する）中にＴ７（又はＳＰ６）ＲＮＡポリメラーゼ（エピセントレ社（Epicentre））１０単位、及び０．５ｍＭ  各ＮＴＰを含有する転写反応物６μｌ中で用いた。Ｍｅ−ＵＴＰ又はＭｅ−ＣＴＰを用いて転写を行ったときに、ＵＴＰ又はＣＴＰが修飾メチルヌクレオチドに完全に置き換わった。転写反応物を３７℃で２時間インキュベーションした。転写反応を行った後、ＲＮａｓｅＴ１  ２０単位を添加し、反応混合物を３０℃で３０分間インキュベーションした。３０℃でのインキュベーションにより、３’−リン酸基に対する開裂反応を起こさせることが見出され、質量スペクトル中での所与の各親フラグメントについての複数の質量シグナルによって生じる複雑さを失くなった。
【０３２０】
代替の手法は、異なるＲＮＡエンドヌクレアーゼを用いて塩基特異的フラグメントを生じさせることである。例えば、ＲＮａｓｅＵ２によってすべてのＡ位置において、ＲＮａｓｅＰｈｙＭによってすべてのＡ及びＵ位置において、あるいはＲＮａｓｅＡによってすべてのＣ及びＵ位置においてin vitro転写物を完全に消化することができる。
【０３２１】
試料コンディショニング及び質量分析
転写及び開裂後、２１μｌのＨ2Ｏを添加することによって各試料を希釈した。スペクトロ・クリーン（Spectro CLEAN）（登録商標）カチオン樹脂（アンモニウムイオンが充填されたカチオンイオン交換樹脂；セケノム社（Sequenom）、米国）６ｍｇにより、リン酸骨格のコンディショニングを行った。次に、得られた溶液１６ｎｌをシリコンチップ（スペクトロ・チップ（Spectro CHIP）（登録商標）、セケノム社（Sequenom））上にロボットにより分配した。すべての質量スペクトルは、ビフレックスＩＩＩ（Biflex III）質量分光計（ブルカー・ダルトニック社（Bruker Daltonik）、ドイツ）により記録された。陽イオンを分析し、約５０のシングルショットスペクトルを蓄積した。ディレイド・イオン・エクストラクション及び合計加速電圧２０ｋＶを用い、直線飛行時間型の形式ですべての試料を分析した。
【０３２２】
代替方法では、増幅、転写、及び消化反応を単一の管の中での実施（均一手法）の代わりに、転写物の３’末端に相補的である固定化オリゴヌクレオチド、例えば、Ｔ７又はＳＰ６プロモーターを含む固定化オリゴヌクレオチド上へのハイブリダイゼーションによって転写物を単離することができる。次いで、単離した転写物をＭＡＬＤＩ−ＭＳ適合条件下でＲＮＡｓｅにより消化することができる。
【０３２３】
結果及び議論
ＲＮａｓｅＴ１開裂は完全に行った。十分なＲＮａｓｅ濃度を有する反応条件は、検体／マトリクス結晶化を妨げる低量の変性試薬（尿素又はホルムアミドなど）さえも回避するように最適化した。限定的な／不完全な消化より優れた提示した均一手法の１つの利点は、より高い質量範囲（＞１２０００Ｄａ）でシグナルが失くなることなく５００ｎｔ以上の鋳型領域までそれを伸長することができることである。完全消化では、２つのＧ位置間の最大距離によって決定される通り、最も高い質量のフラグメントは配列依存性であるが、最も高い質量のフラグメントはＲＮＡ転写物の長さに依存しない。
【０３２４】
均一なアッセイの形式では洗浄又は液体の除去のいずれも用いないので、先に言及したすべての試薬及び試薬成分は下流のＭＡＬＤＩ分析及びその評価に対して影響を与える。最良のパフォーマンスは、ＰＣＲ５μｌの設定において得られた。これにより、フォワード鎖及び逆鎖を分析する２つの転写反応物に十分な体積が与えられる。十分なＰＣＲ産物の収量及び品質は、ゲノムＤＮＡ５ｎｇ及び必要な各プライマー１ｐｍｏｌで達成される。ＤＮＡ濃度の増加によって若干収率が高くなった。プライマー濃度の増加によってある場合にはプライマー二量体が有意に生成した。これらの反応条件を広範な標的領域に適用することができた。さらに、続いて行うＲＮＡ転写により、ＰＣＲ産物の収率における任意の変動を補足する。個々の質量スペクトルのデータの質を損なうことなく、すなわち、フラグメントシグナルのシグナル対ノイズ比及びフラグメントシグナルの質量精度を落とさずに、各ＲＮＡ転写物及び開裂反応物の全体積を最小限にした。再現性あるin vitro転写物の収率は、ＰＣＲ増幅標的領域の配列に依存せずに、反応物６μｌにつき野生型Ｔ７ＲＮＡ又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ８単位を用いることによって得られる。３８４ＭＴＰの形式での再現試験及びハイスループット分析は、自動化液体取り扱い装置を用いて行うことができる。
【０３２５】
３７℃以上の温度でのＲＮａｓｅ開裂反応によって３’−環状ホスフェートと３’−ホスフェートとの１：３混合物がほぼ常に生じたのに対し、３０℃でのインキュベーションにより、３’−リン酸基に対する開裂反応を起こさせることが見出された。これにより、質量スペクトル中での所与の各フラグメントについての複数のシグナルによる複雑さが失くなった。開裂条件に加えて、リボヌクレオシド三リン酸の濃度、転写緩衝液の組成、及びＲＮＡポリメラーゼの量により、再現性があり、かつ、均一なＲＮＡをベースとした開裂アッセイとなることが見出された。
【０３２６】
試料をチップアレイ上に移すナノ分配装置による小型化ＭＡＬＤＩ試料の調製は、標準の３−ＨＰＡのマクロ調製より改良点があることが示される。３−ＨＰＡマクロ調製でほぼ常に観察され、かつ、自動化ＭＡＬＤＩ測定を妨げるＭＡＬＤＩ試料中の均一でない検体の分布（ホットスポットの形成）は、チップアレイ上での小型化された均一な試料の結晶化によって大きく抑制された。さらに、検体質量の全スペクトルの低質量又は高質量ウインドウのみを表す試料の分配は観察されなかった。さらに、自動質量分析測定の取得時間を任意の単一試料につき５秒まで減らすことができた。
【０３２７】
シリコンチップ（スペクトロ・チップ（Spectro CHIP）（登録商標）））上での良好な試料結晶化を試料の最終希釈物を用いて行った。希釈をしないと、緩衝液成分及び界面活性剤によってＭＡＬＤＩ試料の結晶化プロセスが妨げられ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルで検出されるフラグメントシグナルが生じなかった。試料の希釈及びイオン交換樹脂の最終溶液への添加は、核酸フラグメントのリン酸骨格をコンディショニングするのに十分であることが証明され、これにより均一な断片化アッセイとチップアレイをベースとしたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析との効果的な組み合わせが可能になる。
【０３２８】
代表的な断片化スペクトルにより、観察されたすべてのフラグメントは５’−ＯＨ及び３’−リン酸基を有し、限定的な開裂条件下で安定的な中間体である２’,３’−環状リン酸基を有するフラグメントは観察されなかったことが実証された。これにより、スペクトル中のすべての主要なシグナルを予測されるフラグメントに明確に帰属することが可能となった。したがって、記載したプロトコルに従えば、該方法により再現性が高くかつ正確な結果が提供される。
【０３２９】
ＲＮＡをベースとした断片化手法の制限は、Ｕ及びＣ間の小さい質量の違い（１Ｄａ）によって生ずる。ある場合においては、同一の長さを有し、かつ、たった１個又は数個のＵ又はＣ残基だけ異なっている２つのＲＮＡフラグメントは直線ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ機器の現状の分解能では分離することができない。機器に関連するこの制限を回避するため、転写反応の際に１つのヌクレオチドのピリミジン残基を化学修飾された塩基に完全に置き換える代替方法を用いることができる。ＵＴＰ又はＣＴＰのいずれかを、転写収率を損なうことなく、それぞれの５−Ｍｅ−修飾リボヌクレオチドアナログに置き換えることができ、これにより対応するヌクレオチドの質量が１４Ｄａ増加する。
【０３３０】
質量修飾方法の別の利点は、従前のいずれの配列情報なしに任意のＲＮａｓｅＴ１フラグメントのＡ−Ｃ−Ｕ−組成を計算することができるとの事実から得られる。３つの異なるＲＮａｓｅＴ１開裂反応を、（ａ）ＣＴＰ、ＵＴＰ（ｂ）５−ＭｅＣＴＰ、ＵＴＰ、及び（ｃ）ＣＴＰ、５−ＭｅＵＴＰを含む核酸に対して別々に行うことができる。任意のＲＮＡ−フラグメントにつき、反応（ａ）及び（ｂ）の所与のフラグメント間の質量の違い並びに反応（ａ）及び（ｃ）間の違いを用いて、フラグメント中のＵ残基及びＣ残基の数を計算することができる。最後のフラグメントを除く各フラグメントはＧをたった１つだけ含んでいるので、Ａ残基の数も得ることができる。
【０３３１】
部分的な塩基特異的開裂では、塩基特異的ＲＮＡｓｅによって開裂されない修飾又は非天然ヌクレオチドを開裂される開裂部位の数を決定する比で転写反応混合物に添加する。代表的なプロトコルを以下に提供する。
【０３３２】
ＰＣＲプライマー及び単位複製配列
フォワードプライマー（配列番号６）：
５’ＣＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＣＣＣＣＡＧＣＡＡＧＡＣＧＧＡＣＴＴ−３’
逆プライマー（配列番号７）：
５’−ＡＧＧＡＡＧＡＧＡＧＣＧＣＣＴＣＧＧＣＡＡＡＧＴＡＣＡＣ−３’
単位複製配列（配列番号８）：
５’−ＧＧＧＡＧＡＡＧＧＣ  ＴＣＣＣＣＡＧＣＡＡ  ＧＡＣＧＧＡＣＴＴＣ  ＴＴＣＡＡＡＡＡＣＡ  ＴＣＡＴＧＡＡＣＴＴ  ＣＡＴＡＧＡＣＡＴＴ  ＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡ  ＴＴＣＣＴＴＡＴＴＴ  ＣＡＴＣＡＣＧＣＴＧ  ＧＧＣＡＣＣＧＡＧＡ  ＴＡＧＣＴＧＡＧＣＡ  ＧＧＡＡＧＧＡＡＡＣ  ＣＡＧＡＡＧＧＧＣＧ  ＡＧＣＡＧＧＣＣＡＣ  ＣＴＣＣＣＴＧＧＣＣ  ＡＴＣＣＴＣＡＧＧＧ  ＴＣＡＴＣＣＧＣＴＴ  ＧＧＴＡＡＧＧＧＴＴ  ＴＴＴＡＧＡＡＴＣＴ  ＴＣＡＡＧＣＴＣＴＣ  ＣＣＧＣＣＡＣＴＣＴ  ＡＡＧＧＧＣＣＴＣＣ  ＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧ  ＣＣＡＧＡＣＣＣＴＣ  ＡＡＡＧＣＴＡＧＴＡ  ＴＧＡＧＡＧＡＧＣＴ  ＡＧＧＧＣＴＧＣＴＣ  ＡＴＣＴＴＴＴＴＣＣ  ＴＣＴＴＣＡＴＣＧＧ  ＧＧＴＣＡＴＣＣＴＧ  ＴＴＴＴＣＴＡＧＴＧ  ＣＡＧＴＧＴＡＣＴＴ  ＴＧＣＣＧＡＧＧＣＧ  ＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴ−３’。
【０３３３】
ＲＮＡ転写及びＲＮａｓｅ開裂
各反応に転写混合物２μｌ及び増幅ＤＮＡ試料２μｌが必要であった。Ｔ特異的開裂ためには、転写混合物は、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ８）、４０ｍＭ  酢酸カルシウム、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、８ｍＭ  スペルミジン、１ｍＭ  各ＡＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰ、２．５ｍＭ  ｄＣＴＰ、５ｍＭ  ＤＴＴ、及びＴ７Ｒ＆Ｄポリメラーゼ（Epicentre）２０単位を含有する。Ｔ特異的部分開裂のためには、ｄＴＴＰとＵＴＰと４：１の比を用いる。転写反応を３７℃で２時間行った。転写後、ＲＮａｓｅＡ２μｌ（０．５μｇ）を各転写反応物に添加した。ＲＮａｓｅ開裂反応を３７℃で１時間行った。
【０３３４】
試料コンディショニング及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析
ＲＮａｓｅ開裂後、ｄｄＨ2Ｏ２０μｌを添加することにより、各反応混合物を管又は３８４ウェルのプレート内で希釈した。カチオン交換樹脂（スペクトロ・クリーン（Spectro CLEAN）、セケノム社（Sequenom））６ｍｇを各ウェルに添加し、５分間回転を行い、６４０×ｇで５分間遠心分離することによって（２０００ｒｐｍ、遠心機ＩＥＣ  Ｃｅｎｔｒａ  ＣＬ３Ｒ、ローターＣＡＴ．２４４）、リン酸骨格のコンディショニングを行った。遠心分離後、圧電ピペットを用いて試料１５ｎｌをスペクトロ・チップ（Spectro CHIP）に移した。試料をビフレックス（Biflex）直線ＴＯＦ質量分光計（ブルカー・ダルトニック社（Bruker Daltonik）、ブレーメン）上で分析した。
【０３３５】
実施例２
ＤＮＡの塩基特異的開裂
以下の実施例は、核酸中のＵ残基の存在に従う標的核酸の断片化方法を記載し、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ酵素による消化及びＮＨ3を用いたリン酸骨格の開裂によって該方法を行う。本明細書中に提供する断片化方法を用いて、塩基特異的に開裂された標的ＤＮＡフラグメントを生じさせることができ、次いで、該標的ＤＮＡフラグメントを本明細書中に提供する参照ＤＮＡと相対的な標的ＤＮＡ中の配列変化の同定方法によって分析することができる。
【０３３６】
ｄＴＴに代えてｄＵＴＰの存在下でＰＣＲを用いて、対象ＤＮＡ領域を増幅した。１×ホット・スター（Hot Star）ＴａｑＰＣＲ緩衝液中にゲノムＤＮＡ２５ｎｇ、ホット・スター（Hot Star）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（キアジェン社（Qiagen））１単位、０．２ｍＭ  各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰ、並びに０．６ｍＭ  ｄＵＴＰを含有するＰＣＲ反応物５０μｌを用いて、標的領域を増幅した。ビオチン化プライマー５ｐｍｏｌ及び非ビオチン化プライマー１５ｐｍｏｌの非対称な比で、ＰＣＲプライマーを用いた。温度プロフィールプログラムは、９４℃で１５分間の酵素の活性化、続いて４５増幅サイクル（９５℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間）、続いて、７２℃で５分間の最終伸長を含むものであった。
【０３３７】
マイクロサテライト分析のために、温度プロフィールを出発アニーリング温度が６２℃であり、かつ、最終アニーリング温度が５６℃に達するまで２サイクル毎にアニーリング温度が２℃下がるタッチダウン式のプログラムに変えた。この温度プロフィールは、マイクロサテライト座の増幅に一般的に適用可能であることが立証された。
【０３３８】
粗製のＰＣＲ生成物に２×Ｂ／Ｗ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＮａＣｌ）４５μ１中の予め洗浄した常磁性ストレプトアビジンビーズ（ダイナル社（Dynal））５０μｇを添加し、室温で２０分間インキュベーションした。次いで、固定化ＰＣＲ生成物を担持するストレプトアビジンビーズを０．１Ｍ  ＮａＯＨとともに室温で５分間インキュベーションした。非ビオチン化ＰＣＲ鎖を含有する上清を除去した後、ビーズを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）で３回洗浄した。
【０３３９】
一本鎖ビオチン化ＰＣＲ生成物を保持するビーズをＵＤＧ緩衝液（６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）１２μｌに再溶解し、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＭＢＩフェルメンタス社（MBI Fermentas））２単位を添加し、混合物を３７℃で４５分間インキュベーションした。開裂反応後、ビーズを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）で２回洗浄し、ｄｄＨ2Ｏで１回洗浄した。次いで、ビーズをＮＨ3水溶液１２μｌに再懸濁し、６０℃で１０分間インキュベーションし、４℃に冷却した。溶出された鎖を含有する上清を新しい管に移し、次いで９５℃で１０分間加熱し、続いて蓋を開けて８０℃で１１分間インキュベーションして、アンモニアを蒸発させた。
【０３４０】
部分開裂の代表的なプロトコルを以下に提供する。
ＰＣＲプライマー及び単位複製配列
フォワードプライマー（配列番号９）：
５’−ＢｉｏＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧ−３’
逆プライマー（配列番号１０）：
５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ−３’
単位複製配列（配列番号１１）：
５’−ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧ  ＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡ  ＡＣＧＴＣＣＡＧＧＧ  ＡＧＧＡＣＴＣＡＣＣ  ＡＴＧＧＧＣＡＴＴＴ  ＧＡＴＴＧＣＡＧＡＧ  ＣＡＧＣＴＣＣＧＡＧ  ＴＣＣＡＴＣＣＡＧＡ  ＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡ  ＧＴＣＡＣＣＴＧＴＧ  ＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴ  ＡＴＣＣＧＣＴ−３’
【０３４１】
部分開裂を行うために、ストレプトアビジンビーズ（ダイナル社（Dynal）、オスロ）７５μｇを１×Ｂ／Ｗ緩衝液５０μｌ中で２回予め洗浄し、２×Ｂ／Ｗ緩衝液４５μｌに再懸濁した（製造元の薦めに従うものである）。ＰＣＲ反応物５０μｌを再懸濁したストレプトアビジンビーズに添加し、室温で２０分間インキュベーションすることによって、ビオチン化ＰＣＲ生成物を固定化した。次いで、固定化ＰＣＲ生成物を担持するストレプトアビジンビーズを０．１Ｍ  ＮａＯＨとともに室温で５分間インキュベーションし、二本鎖ＰＣＲ生成物を変性させた。非ビオチン化ＰＣＲ鎖を含有する上清を除去した後、ビーズを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）で３回洗浄し、ｐＨを中和した。
【０３４２】
ビーズをＵＤＧ緩衝液（６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．９））１０μｌに再懸濁し、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ  ２単位を添加し（ＭＢＩフェルメンタス社（MBI Fermentas））、混合物を３７℃で４５分間インキュベーションした。反応後、ビーズを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）２５μｌで２回洗浄し、ｄｄＨ2Ｏ１０μｌで１回洗浄した。５００ｍＭ  ＮＨ4ＯＨ１２μｌを添加し、６０℃で１０分間インキュベーションすることにより、ビオチン化された鎖を溶出した。１０分間インキュベーションした後、上清をフレッシュなマイクロタイタープレート又は管に回収し、塩基がない部位におけるホスフェートを開裂し、続いて蓋を閉じて９５℃で１０分間インキュベーションした。アンモニアを蒸発させるために、蓋を開けて８０℃で１１分間インキュベーションを行う。
【０３４３】
質量分析分析
ＤＮＡ開裂後、試料１５ｎｌを圧電ピペットを用いてスペクトロ・チップ（Spectro CHIP）（登録商標）（セケノム社（Sequenom））に移した。ブルカービフレックス（Bruker Bilex）質量分光計（ブルカー・ダルトニック社（Bruker Daltonik）、ブレーメン）上で分析を行った。
【０３４４】
実施例３
増幅ＤＮＡの塩基特異的断片化によるＳＮＰの発見
ＳＮＰｓを含有する標的配列の塩基特異的に開裂されたフラグメントを本明細書中に提供する既知ＳＮＰｓの検出又は未知ＳＮＰｓの発見方法によって分析することができる。商標マス・アレイ（Mass Array）（登録商標）によって表される系などの系を用い、Rodi et al, Bio Techniques, 32: S62-S69 (2002)（これを参照により本明細書に取り入れる）に従って、ハイスループット塩基特異的断片化を行い、続いて質量分析による分析を行うことができる。マス・アレイ（Mass Array）（登録商標）は、小型化アレイ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリクス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型）質量分析と組み合わせた質量スペクトル分析に依り、迅速に結果を出す。本明細書中に提供する方法に従って生じた及びRodi et al, Bio Techniques, 32: S62-S69 (2002)で生じたフラグメントシグナルを本明細書中に提供する方法に従って分析することができる。
【０３４５】
標的配列の一本鎖コピーが塩基特異的断片化で作り出され、４つの別々の反応で４つの塩基の各々に対応する位置で完全に断片化される。これにより、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの正確性、精度、及び分解能で容易に分解可能なオリゴヌクレオチドの組のまとまりまで核酸が減る。参照配列を用いることによって、得られた各ピークを確実に同定することが可能となる。配列の変化は、生成されるピークのパターンに甚大かつ容易に識別可能な影響を与える。これは、以下の配列で示される：ＸＸＸＡＣＴＧＸＸＸＣ／ＡＸＸＸＴＧＡＣＸＸＸ（配列番号１２）。
【０３４６】
この実施例では、Ａ／Ｃ塩基転換を示す。既知（参照）配列がＡを含む配列であると仮定すると、表示した配列のＡ特異的開裂によって、７マー及び６マーの示した２つフラグメント（末端フラグメントは無視する）が生成することが予測されるであろう。ここで、試料が２番目のＡ位置においてＣを含む場合の結果を考慮する。Ａ残基が２個しかなくなり、切断によって１３マーの示した単一の大きなフラグメントが生じ、７マー及び６マーは現れなくなってしまうであろう（あるいは、ヘテロ接合体の場合には強度が弱くなるであろう）。Ｃ特異的開裂によっては、当然に、Ａ対立遺伝子については１３マー及びＣ対立遺伝子については６マーと７マーの反対の結果を生じるであろう。Ｃ対立遺伝子はＡ対立遺伝子よりも質量が２４Ｄａ小さいので、Ｔ特異的及びＧ特異的開裂によってさえ、識別可能な変化である質量スペクトルの低質量部分で容易に検出されるピークシフトを生ずる。この多型を検出するためにはこれらの反応の任意の１つで十分であろうが、ほとんどの場合ではすべての４つのピークパターンを満足させるには１つの方法しかないので、合わせれば正確な位置を決定することができる。
【０３４７】
一本鎖核酸は、信頼性が高く、経済的で、かつプロセス・フレンドリーな方法である転写によって生成される。３つのプライマー系を用いて、ＡＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをＤＮＡ増幅中に単位複製配列のどちらかの末端に結合することができる（Rodi et al, Bio Techniques, 32: S62-S69 (2002)を参照のこと）。５’末端に若干異なる配列標識を各々が有する標的特異的増幅プライマーを用いる。ユニバーサルフォワードＴ７プライマーを反応物中に含めることによって＋転写物を生成する単位複製配列が作られ、ユニバーサル逆Ｔ７プライマーを反応物中に代入することによって−転写物を生成する単位複製配列が作られる。ハイスループット型式では、転写物を生成後に分配する（distribute）のではなく、２つの＋鎖反応及び２つの−鎖反応を単に行うことが薦められている。一方のウェル中でＣ残基に特異的なＲＮａｓｅ反応を用い、かつ、他方のウェル中でＵ残基に特異的な第２の反応を用いて、２つの＋鎖を断片化する。Ｇ特異的及びＡ特異的開裂はそれぞれ、−鎖に対してＣ特異的及びＵ特異的反応を単に行うことにより推定する。
【０３４８】
遺伝子変化を発見するための断片化手法の大きな利点の１つは、生成されるシグナルの明瞭性である。これにより、単位複製配列（クローンではない）及び完全に自動化された結果の解釈を用いて標的とする発見が可能となる。この実施例をＣＥＴＰ遺伝子で示す（Rodi et al, Bio Techniques, 32: S62-S69 (2002)を参照のこと）。ＣＥＴＰ遺伝子（配列番号１３）のイントロン１０由来の５００ｂｐの単位複製配列を１２個の個体の各々から生成し、転写し、Ｔ特異的断片化を施した。部分スペクトルは、Ｅｎｓｅｍｂｌ配列に基づいた予測ピークパターンに正確に対応し、すべての予測ピークが存在し、予想外のピークは何も見られなかった。１２個の個体のうち２個は、３１５９Ｄａにおいて予想外のピークを示す異なるパターンを示し、さらに、２８３０．７Ｄａにおけるピークは有意に減少したシグナル強度を有していた。予測ピークが存在していないということではなかったゆえに、これはＴ残基にヌクレオチド置換を有するこの個体の同族体の１つと一致し、該置換によって該同族体は開裂に対して抵抗性になり、より高い質量において新しいシグナルを生じた。第２の個体は、３１５９Ｄａにおいて同じ予想外の予測ピークを有していたが、その相対強度はより大きく、２８３０．７Ｄａにおけるピークは完全に存在していなかった。したがって、この個体は、今までに知られていないＳＮＰについてのホモ接合体である。フラグメントシグナルが前述の断片化方法によって生じる際の明瞭性、精度、及び速さにより、該フラグメントシグナルは本明細書中に提供する方法による分析のための好ましいシグナルの中の１つとなる。
【０３４９】
Ｂ．塩基特異的断片化によるＳＮＰの発見の評価
本明細書中に提供する配列変化候補の減少した組の分析方法（「自動化」方法）をＣ++で実行した。該実行には、本明細書中に提供する方法による洗練されたＳＮＰスコア付けスキーム及び反復ＳＮＰ選択プロセスが含まれる。ある場合では、以下に提供する通り、Ｃ++で実行されるアルゴリズムによる分析を候補ＳＮＰｓリストの手動アセンブリと比較した。手動アセンブリは、相補的な開裂反応物の間の一致性及び／又は試料の組の中の表示フラグメントの回復（recurrence）を調べ、次いで、配列変化を含まない参照配列のすべての可能な配列変化について変異体質量スペクトル又は他の質量指数（ゲル電気泳動の場合には移動性など）をシミュレーションする（本明細書中に提供する方法に従って配列変化候補の減少した組を得るということではない）ことにより行った。手動による手法においては、次いで、特定の配列変化又は配列変化の組に対応するシミュレーションした各変異体スペクトルを実際の変異体質量スペクトルに対してマッチングし、最も起こり得そうな配列変化又は変異体スペクトルを生ずる変化を決定する。
【０３５０】
ヒトゲノムの種々の領域に由来する５００ｂｐの平均長さの１０個の単位複製配列（単位複製配列１〜単位複製配列１０；配列番号４５〜５４）の第１組及び３０個の単位複製配列（単位複製配列２．１〜２．３０；配列番号５５〜８４）の第２組の２組の試料を分析した。各単位複製配列について、１２人の白色人種の個体由来のＤＮＡ試料（Daussetet al., Genomics, 6 (3): 575-577 (1990)）を分析し、単位複製配列によって橋架けされている領域内のＳＮＰｓの存在について、対応する参照配列に対して比較した。
【０３５１】
方法
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写を行い、続いて本明細書中に提供するＲＮＡｓｅ開裂を用いて塩基特異的開裂を行った。すべてのＰＣＲプライマーをその５’末端にいてＴ７プロモーターで標識した。４０個の単位複製配列（その配列は、配列リスト中で配列番号４５〜８４として提供される）の５’末端及び３’末端における１８〜２２塩基と同一又は相補的な配列を有する２組のＰＣＲプライマーを各単位複製配列がセンス又はアンチセンス鎖のいずれかの転写が可能となるようした。センス転写物を用いてＴ特異的及びＣ特異的開裂を得るためにＲＮａｓｅＡを用い、アンチセンス転写物を用いてＡ特異的及びＧ特異的開裂を得るためにその等量を用いた（Ｃ（Ｔ）残基に対するＲＮａｓｅＡの活性は、ｄＣＴＰ（ｄＴＴＰ）を転写物に導入することでＲＮａｓｅＡをＵ又はＣ残基のいずれかに特異的にすることにより遮断した）。このようにして、等量のすべての４つの塩基特異的開裂を分析した。
【０３５２】
３８４ウェルプレート中においてＰＣＲ反応物５μｌを設定した。本明細書中に提供する通り、均一なＰＣＲ条件を用いた。ＰＣＲ後、転写混合物をマイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、転写を３７℃で２時間行った。転写に続き、ＲＮａｓｅＡを各ウェルに添加し、開裂を３７℃で６０分間進行させた。スペクトロ・クリーン（Spectro CLEAN）（登録商標）６ｍｇを各ウェルに添加することにより、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析のためのＲＮＡフラグメントのコンディショニングを行った。
【０３５３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析のために、検体１０ｎｌをピンツール装置によって３８４アレイチップ上に自動で分配した。ＰＣＲ後のピペット処理工程はすべて、ベックマン・マルチメク・ペピッター（Beckman Multimek pipettor）を用いて行った。
【０３５４】
結果
配列変化候補の減少した組を生じさせ、減少した組をシミュレーションし、本明細書中に提供する方法に従ってスコア付けする自動化分析により、ＳＮＰｓを同定した。ソフトウェアにおいて報告されている追加及び消失シグナルの手動分析により、結果をさらに検証した。同定したＳＮＰｓはすべて、続いて行われた鎖終結用プライマーの伸長反応によって有効であることが確認された。塩基特異的反応でＳＮＰの位置を正確に位置づけできなかった場合には、プライマー伸長反応を用いてＳＮＰの位置づけを行った。
【０３５５】
Ａ．第１組：１０個の単位複製配列
以下の表は、第１組の１０個の単位複製配列中で同定されたＳＮＰｓ（単位複製配列中の塩基の変化及び位置）を提供する。
【０３５６】
【表１】
0004786904.tif 000002
【０３５７】
本明細書中に提供する自動化方法によって同定された上記の１９個のＳＮＰｓのうち、確認用のプライマー伸長反応によって検出されなかった２つだけ（＊でマークされるもの）が本物の偽陽性であると決定された。さらに、２つの擬陽性は、ソフトウェアによって信頼性が非常に低いと報告された。
【０３５８】
Ｂ．第２組：３０個の単位複製配列
ＳＮＰｓ（単位複製配列中の塩基の変化及び位置）を第２組の３０個の単位複製配列中で度同様に同定した。さらに、本明細書中に提供する方法に従って配列変化候補の減少した組を生じさせて分析する自動化によって同定されたＳＮＰｓを、４つの相補的な塩基特異的開裂反応によって得られた開裂パターンの手動検査及び分析（すべての可能な配列変化候補の構築、シミュレーション、及びスコア付け）によって同定したＳＮＰｓと比較した。すべてＳＮＰｓは、手動分析により検出するかあるいは自動分析により検出するかに関わらず、鎖終結用プライマーの伸長反応によって本物の陽性であるか偽陽性であるかを検証した。
【０３５９】
３２８〜７９０塩基対の長さの３０個の「連結していない」単位複製配列（ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡの非重複小領域）をヒト染色体２２上の種々の領域から増幅し（Dunhamet al., Nature, 402 (6761): 489-495 (1999)）、該単位複製配列の平均の長さは４３３塩基対であった。全部で、１１７９３塩基対を分析した。質量分析による分析のために、ＲＮＡｓｅＡを用いて４つの塩基特異的開裂反応を行い、質量分析によって独立して測定した。
【０３６０】
質量分析データを手動で分析すると、５０個のＳＮＰｓが発見され、鎖終結用プライマーの伸長によって検証した。これらの５０個のＳＮＰｓのうち６個については、開裂質量分析データから正確な位置を決定することができなかった。質量分析データの手動分析は、非常に時間がかかり、完全な分析には数週間かかった。さらに、質量分析データの手動分析では無かった１つのＳＮＰが電気泳動データを用いて見出された。
【０３６１】
質量分析データの手動分析又は電気泳動データによって、全部で５１個のＳＮＰｓ（平均で２３１塩基対ごとに１個のＳＮＰ）が発見された。これは、ＳＮＰ発見用途の場合に達成される所望の閾値は必ずしもではないが通常は１又は２である配列変化の位数ｋであることを示している（位数２は、互いにより近接しているＳＮＰｓを包含する）。変異の発見又は再配列決定の場合、互いに近接している複数の塩基変化が観察される可能性がより高いので、ｋの値は必ずしもではないが通常は３又は４以上である。
【０３６２】
次いで、本明細書中に提供する自動化方法を実行することにより、開裂質量分析データを分析した。５１個のＳＮＰｓはすべて、本明細書中に提供する方法によって実行されたアルゴリズムを用いて構築された２２,４４７個の潜在的な配列変化候補の減少した組中に含まれていた。平均で試料あたり１８７１個の配列変化がスコア付けされるように、すべての試料について個々に分析を行った。自動化方法によって同定された５３個のＳＮＰｓのうち、７個は偽陽性であると検証され、４６個が本物の陽性であると検証された。ここでも、４６個の本物の陽性のＳＮＰｓのうち６個については、正確な位置を決定することができなった。
【０３６３】
自動化方法によって手動方法により５個少ないＳＮＰｓが同定されたが、この感度及び特異性レベルは、パッケージのパラメータを本実施例に適合させたものではなく、デフォルトのスコア付けスキーム及び閾値の分析パッケージを用いて行ったことに留意する。さらに、手動分析を完了するのに必要な数週間の時間とは対照的に、２２,４４７個の配列変化候補の減少した組を構築してスコア付けする自動化方法では、手動シミュレーションでは１１３２１２８個の配列変化候補の合計の組であることと比較して、分析データを処理するのに必要となる実行時間が有意に減少し、ゆえに合計の分析時間が減少した。
【０３６４】
１．０ＧＨｚ  ペンティアム（登録商標）ＩＩＩプロセッサーを用いた単一プロセッサーデスクトップコンピュータ上で、配列変化位数ｋ＝１、２、又は３に対応する実行時間測定を行った。ｋ＝１では、手動の実行時間は６２．６秒であったことと比較して、自動化実行時間は１．５秒であった。配列変化の位数が増すにつれ、実行時間の違いが大きく増した。したがって、ｋ＝２では、自動化実行時間は３２．２秒であったのに対し、手動実行時間は９１．９分であった。ｋ＝３では、自動化実行時間は４６７秒であったのに対し、手動実行時間は５７時間であった。したがって、本明細書中に提供する方法に従って実行されるアルゴリズムを用いることにより、さらにより高い位数の変化（ｋ＝３）についての配列変化分析を分析する質量スペクトルあたり０．３３秒で行うことができ、したがって、質量分析データのリアル・タイム分析に非常に適している。
【０３６５】
実施例４
塩基特異的断片化による細菌タイピング
この実施例は、細菌株の塩基特異的断片化方法を提供する。本明細書中に提供する断片化方法に従って及びvon Wintzingerode et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 99(10): 7039-7044(2002)（これを参照により本明細書に取り入れる）で生成されるフラグメントを本明細書中に提供する方法によって分析し、標的細菌株を同定することができる。
【０３６６】
材料及び方法
細菌株
ジャーマン・コレクション・オブ・マイクロオーガニズム・アンド・セル・カルチャー（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）（ＤＳＭＺ、ブラウンシュワイク、ドイツ）及びインスティチュート・フォー・スタンダライゼーション・アンド・ドキュメンターション・イン・メディカル・ラボラトリー（Institute for Standardization and Documentation in Medical Laboratory reg. ass）（Instand e. V.、デュッセルドル、ドイツ）によって提供されるマイコバクテリウム種の１２個の参照株（「基準」株）、及び２４個のマイコバクテリアの臨床分離株を本研究に用いた。強化サプリメント（ＭＧＩＴ系オレイン酸−アルブミン−デキストロース−クエン酸）及び抗菌サプリメント（ＭＧＩＴ系ＰＡＮＴＡ（ポリミキシンＢ、ナリジクス酸、トリメトプリム、及びアズロシリン））を有する液体培地（ＭＧＩＴ液体培地；ベクトン・ディッキンソン・ヨーロッパ社（Becton Dickinson Europe）、フランス）中でマイコバクテリアを増殖させた。３０℃で培養したマイコバクテリウム・マリナム（Mycobacterium marinum）を除き、マイコバクテリアを３７℃で培養した。細菌の増殖が示されたとき、３３００×ｇで２０分間遠心分離することによってマイコバクテリアをブロス０．５ｍｌ中で濃縮した。
【０３６７】
ＤＮＡ抽出
市販のキット（呼吸性検体調製キット（Respiratory Specimen Preparation Kit）、ＡＭＰＬＩＣＯＲ：ロッシュ・モレキュラー・システムズ社（Roche Molecular Systems, Inc.）、ブランチバーグ（Branchburg）、ニュージャージー州、米国）を用いてＤＮＡを抽出した。簡単に言えば、再懸濁したマイコバクテリアのペレット１００μｌをポリプロピレン管１．５ｍｌに移し、キットによって提供される洗浄溶液（５００μｌ）で洗浄し、１０分間遠心分離した（１４，０００×ｇ）。上清を捨て、細菌ペレットを溶解試薬（１００μｌ）に再懸濁した。６０℃の加熱区画中で４５分間インキュベーションした後、溶解物を与えられた中和試薬（１００μ１）で中和し、得られたＤＮＡ溶液を４℃で保存した。
【０３６８】
ＰＣＲによる同定及び配列決定
１２個のマイコバクテリウム参照株（配列番号１４〜２５を参照のこと）由来の全長１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列決定を記載の通りにして分析した（von Wintzingerode et al., Appl. Environ. Microbiol. 65: 283-286 (1999)を参照のこと）。簡単に言えば、真正細菌のプライマーＴＰＵ１（大腸菌の位置８〜２７に対応するＡＧＡ  ＧＴＴ  ＴＧＡ  ＴＣＭ  ＴＧＧ  ＣＴＣ  ＡＧ（配列番号３９）及びＲＴＵ８（大腸菌の位置１５４１〜１５２２に対応するＡＡＧ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＡＴＣ  ＣＡＫ  ＣＣＲ  ＣＡ（配列番号４０）（大腸菌由来の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列についての配列番号２９を参照のこと））を用いて１６ＳｒＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ生成物をベクターｐＣＲ２．１（ＴＡクローニングキット、インビトロゲン社（Invitrigen）、デ・シェルプ（de Schelp）、ネザーランド（Netherlands））と連結し、製造元の指示に従って大腸菌に形質転換した。ＧＦＸプラスミド調製キット（アマシャム・ファルマシア社（Amersham Pharmacia）、フライブルク、ドイツ）を用いて、組換えプラスミドＤＮＡを精製し、テルモセキエナーゼ（Thermosequenase）蛍光標識プライマーサイクル配列決定キット（アマシャム・ファルマシア社（Amersham Pharmacia）、フライブルク、ドイツ）によるサイクルシーケンシングに直接用いた。配列決定反応物をＬＩＣＯＲ４０００Ｌ自動化ＤＮＡシーケンサー（ＭＷＧ−バイオテック社（MWG-Biotech）、エーバースベルク、ドイツ）上で分析し、アラインメントをＡＲＢ−ソフトウェア（http://www.arb-home.de//）を用いて生成した。１２個の参照株の全長１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列をＥＭＢＬヌクレオチド配列データベースに寄託し（ＥＭＢＬ受託番号第ＡＪ５３６０３１−ＡＪ５３６０４２を参照のこと）、配列番号１４〜２５として配列リスト中に提供した。
【０３６９】
Springerら（J. Clin. Microbial 34: 296-303 (1996)）のプロトコルに従い、部分１６ＳｒＤＮＡのＰＣＲ増幅及び腸菌１６ＳｒＤＮＡ（配列番号２９）位置１２９〜２６７及び４３０〜５００にそれぞれ対応する超可変領域Ａ及びＢ上に焦点を当てた直接配列決定により、臨床供給源由来のマイコバクテリアの同定を行った。Ｈｕｓａｒプログラムパッケージ（バージョン４．０；ハイデルベルグ・ユニックス配列分析リソース（Heidelberg Unix（登録商標） Sequence Analysis Resources）、ＤＫＦＺ、ハイデルベルグ、ドイツ）のＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡプログラムを用いることにより、得られた配列をＥＭＢＬ及び遺伝子バンクデータベース中のすべての１６ＳｒＲＮＡ実体の配列と比較した。データベースにエントリーされている両方の超可変領域中の配列同一性に基づいて種レベルまで臨床分離株を同定し、全体の配列同一性は９９％を上回った。
【０３７０】
ＰＣＲ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦよる同定
すべてのマイコバクテリア株について３ッ組でＰＣＲ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を行った。ＰＣＲ増幅混合物は、全体積５０μｌ中に最終ＭｇＣｌ2濃度２．５ｍＭ、２００μＭ  （各）デオキシヌクレオシド三リン酸、ホット・スター（Hot Star）Ｔａｑ（キアジェン社（Qiagen）ＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ）１単位、プライマーＭｙｋｏ１０９−Ｔ７（５’−ｇｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇＡＣＧ  ＧＧＴ  ＧＡＧ  ＴＡＡ  ＣＡＣ  ＧＴ−３’（配列番号４１）１０ｐｍｏｌ；大腸菌１６ＳｒＲＮＡの位置１０５〜１２１に対応する）、プライマーＲ２５９−ＳＰ６（５’−ａｔｔｔａｇｇｔｇａｃａｃｔａｔａｇａａＴＴＴ  ＣＡＣ  ＧＡＡ  ＣＡＡ  ＣＧＣ  ＧＡＣ  ＡＡ−３’（配列番号４２）１０ｐｍｏｌ；大腸菌１６ＳｒＲＮＡの位置６０９〜５９０に対応する）、及びＤＮＡ５μｌを有するＰＣＲ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4、ＭｇＣｌ2（ｐＨ８．７））を含有した。ホット・スター（Hot Star）Ｔａｑ活性（１５分、９５℃）の最初の工程後における４０サイクルの変性（１分、９５℃）、アニーリング（１分、５８℃）、及び伸長（１分３０秒、７２℃）のサーマルサイクラー（ゴールドブロック（Goldblock）；バイオメトラ社（Biometra）、ゲッティンゲン、ドイツ）を用いて、ＰＣＲ増幅を行った。増幅をアガロースゲル電気泳動によって検証した。
【０３７１】
ＲＮＡ転写及びＲＮａｓｅＴ１開裂
１×転写緩衝液（６ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  スペルミジン、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ）（ｐＨ７．９）２０℃）中のＰＣＲ生成物２．４μｌ、Ｔ７（又はＳＰ６）ＲＮＡポリメラーゼ（エピセントレ社（Epicentre））１０単位、０．５ｍＭ  各ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、及び５−メチルリボ−ＣＴＰを３７℃で２時間インキュベーションすることにより、フォワード鎖ＲＮＡ転写を行った。リボ−ＣＴＰを化学修飾されたアナログである５−メチルリボ−ＣＴＰ（Trilink、ＵＳＡ）に置き換えて、Ｕ及びＣ間の質量の違いを生じさせた。転写を行った後、ＲＮａｓｅＴ１  ２０単位及びエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）１単位を添加し、３０℃で３０分間インキュベーションすることにより、完全なＧ特異的開裂が達成された。
【０３７２】
試料コンディショニング及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析
水２１μｌを添加することによって各試料を希釈した。スペクトロ・クリーン（Spectro CLEAN）ＴＭ樹脂（アンモニウムイオンが充填されたカチオンイオン交換樹脂；セケノム社（Sequenom）、米国）６ｍｇを添加することによって、リン酸骨格のコンディショニングを行った。コンディショニング後、試料１０ｎｌを、３−ＨＰＡマトリクスで予め充填したスペクトロ・チップ（Spectro CHIP）（登録商標）シリコンチップ（セケノム社（Sequenom）、米国）上にピンツール装置を用いて自動的に移した。質量スペクトルはすべて、ビフレックスＩＩＩ（Biflex III）質量分光計（ブルカー・ダルトニック社（Bruker Daltonik）、ブレーメン、ドイツ）を用いて記録した。専ら正に荷電したイオンを分析し、試料あたり約５０のシングルショットスペクトルを蓄積した。ディレイド・イオン・エクストラクション及び合計加速電圧２０ｋＶを用いた直線飛行時間型式で、すべての試料を分析した。スペクトル処理及びピーク評価は、製造元（ブルカー・ダルトニック社（Bruker Daltonik））によって提供されるソフトウェアパッケージＸＭＡＳＳ５．０、又は検出された質量シグナルパターンを参照配列に由来する基準株のイン・シリコ（in silico）パターンと比較し、かつ、公表された１６ＳｒＤＮＡ配列のイン・シリコ（in silico）質量パターンと比較することによって臨床分離株の株を同定するためのベースライン修正、ピークの同定、及び校正のための社内ソフトウェアを用いて行った。
【０３７３】
結果
マイコバクテリウムの単離
大腸菌１６ＳｒＤＮＡの位置１０５〜６０９（配列番号２９）に対応する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の約５００ｂｐの領域をすべての基準株及び臨床分離株からＰＣＲ増幅した。ＲＮＡ転写及び塩基特異的開裂によって、すべての試験した基準株について特有のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルが生じた。
【０３７４】
結核菌Ｈ３７Ｒｖ（配列番号２４）の代表的な質量スペクトルを評価した。主開裂主成物はピーク番号１〜２７に帰属され、その核酸組成及び開裂されたＰＣＲ単位複製配列内の正確な位置を決定した。参照質量シグナルは、すべてのグアニン位置におけるイン・シリコ（insilico）開裂によって参照配列から計算し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによって検出される質量シグナルと相関していた。４Ｄａ未満の質量の違いを有する計算されたフラグメントは、直線かつ軸型（axial）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによって分離することができなかった。対応する検出された開裂生成物は、１つのフラグメントだけであると評価された（ピーク番号２、３、４、８、９、１１、１２、１８）。
【０３７５】
質量シグナルは、「主」開裂生成物（単位複製配列の３’末端の前のもの）又は「最終」開裂生成物（単位複製配列の３’末端にあるもの）のいずれかに分類された。質量シグナル番号２２、２４、及び２５は、それぞれ１つの５−メチル−ＣＴＰ（３’フラグメント＋３１９．２Ｄａ）又は１つのＡＴＰ（３’フラグメント＋３２９．２Ｄａ）を添加することによって異なる転写物の３’末端における（すべて位置５１０における）開裂生成物を表しているので、「最終」に分類した。ヌクレオチドのＲＮＡ転写物の３’末端への鋳型なしでの付加は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼについて周知の特徴であるＴ７−ＲＮＡポリメラーゼのターミナルトランスフェラーゼ活性を示すものであった。ヌクレオチドの末端フラグメントへの鋳型なしの付加は、すべてのマイコバクテリア種についてソフトウェアによる自動化されたフラグメント同定に含まれ、解釈の誤りを回避するものであった。
【０３７６】
１５００〜２６００Ｄａの質量範囲における５つの代表のマイコバクテリア基準株の特徴的な質量スペクトルを分析した。結核菌（M. tuberculosis）（配列番号２４）、鳥結核菌（M. avium）（配列番号１５）、Ｍ．イントラセルラー（M. intracellulare）（配列番号１９）、Ｍ．カンサイ（M. kansaii）（配列番号２０）、及びＭ．セラタム（M.celatum）（配列番号１６）は、それらの特有の質量スペクトルによってはっきりと区別された。結核菌は、１８２８Ｄａでフラグメントを欠失している唯一の種であった。Ｍ．セラタム（M.celatum）は、すべての他の質量パターン内に存在しない１８８４Ｄａでシグナルを示した。Ｍ．カンサイ（M. kansaii）のスペクトルは、２１８０Ｄａでシグナルを示さなかった。鳥結核菌（M. avium）及びＭ．イントラセルラー（M. intracellulare）の質量スペクトルはそれぞれ、２５３２Ｄａ及び２１５７Ｄａでのフラグメントが他の種とは異なる。
【０３７７】
この研究で用いられるすべてのマイコバクテリア種のイン・シリコ（in silico）識別ピークパターンを編集した。結核菌（M. tuberculosis）の質量スペクトルと比較した消失及び追加ピークの数に従い、ランク付けを行った。すべてのマイコバクテリア種全体を通して存在しない識別ピークだけが含まれていた。結核菌（M. tuberculosis）は、複数の追加又は消失質量シグナルに基づいて他の種とはっきりと区別することができた。１つの消失ピーク及び３つの追加ピーク又は２つの消失ピーク及び２つの追加のピークをそれぞれ示すＭ．セラタム（M.celatum）及びＭ．カンサイ（M. kansaii）は、結核菌（M. tuberculosis）と比較して、最も近い種であった。Ｍ．マリナム（M. marinum）（配列番号２４）及びＭ．スクロフラセウム（M. scrofulaceum）（配列番号２２）は、２つのフラグメント（２４５３．５Ｄａ、２７９５．８Ｄａ）だけが異なっていた。すべての計算された質量パターンを実験によって確認した。すべての質量スペクトルを比較することによって、すべてのマイコバクテリア種が明確に同定された。
【０３７８】
Ｍ．キセノピ（M. xenopi）基準株ＤＳＭ４３９９５の場合、実験による及び計算された質量パターンの比較によって４４０８．８Ｄａでの追加質量ピークがＭＡＬＤＩＴＯＦ分析で明らかになった。それぞれのＭ．キセノピ（M. xenopi）１６ＳｒＤＮＡ単位複製配列（配列番号２５）をクローニングし、いくつかのプラスミドの配列決定を繰り返し行うことによって、大腸菌位置１９８（Ｔ／Ｃ）及び４３４（Ｔ／Ｃ）における１〜２塩基対が異なる３つの配列変異体が検出された。大腸菌位置１９８における配列変化は、Ｇ特異的開裂反応では検出されない。得られた二量体フラグメント（５０Ｈ−ＴＧ−３ｐ及び５０Ｈ−ＣＧ−３ｐ）は、単位複製配列中の異なる位置に由来する同じ組成の開裂生成物と共通していた。約５００ｂｐの単位複製配列の塩基特異的開裂によって、二量体のすべての可能な組み合わせが統計的に生じ、複数回示された。さらに、１０００Ｄａ未満の質量範囲は、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析における３−ヒドロキシピコリン酸マトリクス（３−ＨＰＡ）の使用に特異的な特徴であるマトリクス分子によって生じるバックグラウンドノイズシグナルによって影響され得ることができる。
【０３７９】
大腸菌位置４３４（Ｔ／Ｃ）における配列変化は、１４ｂｐのＧ特異的開裂生成物に影響を与える。Ｔ（開裂されたＲＮＡ中のＵに対応する）及びＣの間のヌクレオチド質量の違いによって、予測フラグメントの質量は１３Ｄａ小さくなる。４４０８．８Ｄａ及び４４２１．８Ｄａにおいて双方の質量シグナルが検出されることは、分析される基準株の単位複製配列が両方の配列変異体の混合物からなることを示している。
【０３８０】
１２個のマイコバクテリア基準株を含むデータベースを構築した後、２４個の臨床分離株をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で自動的に分析した。ＲＮＡ転写される１６ＳｒＤＮＡ増幅生成物のＧ特異的開裂及び質量分析によって、２１個の分離株が明瞭に同定された。２１個の分離株のうち、８個が結核菌（M. tuberculosis）（配列番号２４）と同定され、鳥結核菌（M. avium）（配列番号１５）、Ｍ．ゴルドナエ（M. gordonae）)（配列番号１８）、Ｍ．イントラセルラー（M. intracellulare）（配列番号１９）、及びＭ． キセノピ（M. xenopi）（配列番号２５）の各々から２個の分離株が同定された。残りの５個の分離株は、Ｍ．シェロナエ）（M.chelonae）（配列番号８５）、Ｍ．フォルティウム（M. fortuitum）（配列番号１７）、Ｍ．カンサイ（M. kansaii）（配列番号２０）、Ｍ．マリナム（M. marinum）（配列番号２１）、及びスメグマ菌（M. smegmatis）（配列番号２３）と同定された。
【０３８１】
基準株データベース由来の種を表すすべての分離株は、繰り返し行った実験で正確に同定された。３個の臨床分離株であるＭ．アウラム（M. aurum）（ＭＴ１３２３）、Ｍ．パラフィニウム（M. paraffinicum）（ＭＴ１４２３）、及びＭ．インタージェクタム（M. interjectum）（ＭＴ１２２３）は、それらのＲＮＡ開裂生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析後には同定することができなかった。データベースは、対応する３種のすべてのイン・シリコ（in silico）質量パターンを欠いていた。Ｍ．パラフィニウム（M. paraffinicum）（配列番号２６）、Ｍ．インタージェクタム（M. interjectum）（配列番号２７）、及びＭ．アウラム（M. aurum）（配列番号２８）の公表された１６ＳｒＤＮＡ配列から計算される種特異的質量シグナルパターンを有するデータベースの拡大によって、すべての対応する実験で正しく同定された。
【０３８２】
ボルデテラ株
３個の既知のボルデテラ種であるボルデテラ・アビウム（Bordetella avium）、ボルデテラ・テレマタム（Bordetella trematum）、及びボルデテラ・ペトリ（Bordetella petrii）、及びさらに嫌気性かつ有機塩素によって減少する微生物共同体の６個の未だ培養していない細菌（von Wintzingerode et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99(10) : 7039-7044 (2002)を参照のこと）を、真正細菌のプライマーＴＰＵ１（配列番号３９）及びＲＴＵ８（配列番号４０）を用いてそれらの可変１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域（配列番号３０〜３８を参照のこと）を増幅することにより、上記の方法によって分析した。記載の通り、リボ−ＣＴＰ及びリボ−ＵＴＰヌクレオチドの間の１Ｄａの質量の違いは、転写収率の検出可能な損失なく、いずれかのピリミジン塩基をその５Ｍｅ−アナログに置き換えることによって増した。ＲＮＡｓｅＴ１によるＧ特異的開裂により、個々の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子標的配列を示すフラグメント質量の特徴的なパターンが生じた。未だ培養してない６個のボルデテラ株すべてが明瞭に同定され、結果は標準の蛍光ジデオキシ配列決定によって得られるものと一致した。
【０３８３】
実施例５
塩基特異的断片化によるメチル化パターンの検出
メチル基のシトシンへの共有結合による結合が、ＣｐＧジヌクレオチドで主に観察される。これらのＣｐＧ島は、他のジヌクレオチドよりも観察される頻度が少なく、ランダム核酸配列について予測されるよりも観察される頻度が少ない。多数のＣｐＧジヌクレオチドが、プロモーター領域及び遺伝子の５’末端で観察される。配列中のメチル化パターン標的を研究するための断片化分析の使用のための代表的なプロトコルを本明細書中に提供する。本明細書中での代表的なプロトコルに従って生じたフラグメントを、参照配列と相対的な標的配列メチル化パターンの変化を研究するための本明細書中に提供する方法に従って分析することができる。
【０３８４】
メチル化シトシンを含むゲノムＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムで処理することができ、この場合、非メチル化シトシンはウラシルに変換されるが、メチル化シトシンはシトシンのままである。重亜硫酸塩処理後には、上部及び下部の鎖はもはや相補的ではない。このメチル化に依存した配列変化は、メチル化パターンの分析の基礎として役立つことができる。メチル化が影響を受けるフラグメントの質量シフトをもたらす場合には、質量分析を用いた関連する配列変化のメチル化の検出は定義されるフラグメントを作ることによって行うことができる。
【０３８５】
染色体１１．ｐ１５．５（配列番号４３）のＩｇｆ２／Ｈ１９座において、シトシンメチル化の検出を試験した。インプリンティング制御領域（ＩＣＲ）として知られるＨ１９及びＩｇｆ２間の配列を精液では完全にメチル化し、卵母細胞では完全に非メチル化した。成人血液試料では、ＩＧＦ２／Ｈ１９領域を一方の親対立遺伝子上のみでメチル化した。Ｉｇｆ２は、必要不可欠な胎児成長因子であり、その誤った調節はベックウィズ−ヴィーデマン症候群及びウィルムス腫瘍の一因となる。Ｈ１９は、機能が未だ不明である謎の非翻訳ＲＮＡである。Ｉｇｆ２／Ｈ１９については、区別してメチル化されるＩＣＲが双方の遺伝子のインプリンティングされる転写に必要である。
【０３８６】
ゲノムＤＮＡの重亜硫酸塩処理に続いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ用のプライマーは、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼのために５’末端で転写標識を含んでいるものとした。ある場合では、６個の塩基（ａｇａａｇｇ）を含む転写標識をポリメラーゼ標識及びオリゴのＤＮＡ結合部位の間に置く。このことは、転写反応を改善し、時期尚な終結の効果を抑制するのに役立つ。
【０３８７】
ＲＮＡ転写を３８４ウェルプレートフォーマット中で行った。転写マスターミックスをＰＣＲ生成物に添加した後、転写を３７℃で２時間行った。次に、開裂酵素混合物を転写反応物に添加した。その後、イオン交換体を添加し、反応溶液をチップ上にスポットで移し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析した。
【０３８８】
２個の異なる酵素であるエンドリボヌクレアーゼＲＮａｓｅＴ１及びＲＮａｓｅＡにより、ＲＮＡ開裂を行うことができる。両者は、ホスホジエステル結合を開裂することによって一本鎖ＲＮＡに対して作用するが、それらの標的ヌクレオチドにおいて異なる。ＲＮａｓｅＴ１は、隣接するヌクレオチドの３’−グアニル残基及び５’−ヒドロキシ残基の間を開裂する。この反応により、末端３’−ＧＭＰを有するオリゴヌクレオチドが生ずる。ＲＮａｓｅＡは、ＲＮＡをＣ及びＵ残基において特異的に攻撃する。ＲＮａｓｅＡは、ヌクレオチドの５’−リボース及び隣接するピリミジンヌクレオチドの３’−リボースに結合したリン酸基の間の開裂を触媒する。
【０３８９】
ＲＮａｓｅ処理後、ＳＡＰを開裂反応物に添加して環状一リン酸副生成物の量を減少させた。
【０３９０】
変異体ポリメラーゼＴ７を用いてｄＣＴＰ又はｄＴＴＰのいずれかを転写物に導入した。これにより、ｄＣＴＰ又はｄＴＴＰがそれぞれ導入されたときにＵ又はＣ残基における塩基特異的開裂が可能となり、ほとんど同一の質量のｒＣＴＰ及びｒＴＴＰから生ずる問題も解決した。
【０３９１】
したがって、１つの配列について６個の理論的に可能な開裂スキームがある。
【０３９２】
【表２】
0004786904.tif 000003
【０３９３】
一例では、ＴＡＡＡＣ(5’Me)ＧＣＡＴなどの重亜硫酸塩で処理したＤＮＡ配列は、５番目の位置のシトシンでメチル化された場合にはＴＡＡＡＣＧＴＡＴのままであり、メチル化されない場合にはＴＡＡＡＴＧＴＡＴへと変換する。
【０３９４】
Ｍ３２０５３標的領域の転写産物は、ｇｇｇ転写開始点及びａｇａａｇｇ標識並びに長さが４２１個のヌクレオチドの転写産物の双方を含む、長さが４３０個のヌクレオチドのフラグメントである。塩基特異的開裂後における得られたフラグメントの数は、開裂スキーム、転写方向、及びメチル化状態に依存する。
【０３９５】
結果
ＲＮＡｓｅＡ開裂
フォワード転写物：
メチル化試料のスペクトルは、非メチル化試料とはっきりと区別された。ＣｐＧメチル化のすべての場合で、それらのフラグメント中のメチル化に帰属することができる新たなフラグメントが作り出された。それらのフラグメントのうち５つは２ＣｐＧ部位を含み、２つのシグナルがＣｐＧ部位を１つ含む２つのフラグメントによって作り出された。ある場合には、ＣｐＧ部位のどちらの１つが検出シグナルの原因であるかをはっきりと区別できず、それらの場合において、非メチル化ＣｐＧ島から生じるシグナルが存在していないことは、メチル化状態の同定に役立った。
【０３９６】
逆転写物：
メチル化及び非メチル化試料は、はっきりと区別できた。フォワード転写とは対照的に、すべてのメチル化事象によって、対応するシグナルの質量がシフトした。シグナル強度は、フォワード反応物と比較してわずかに良好であった。
【０３９７】
ＲＮＡＳＥ  Ｔ１開裂：
全シグナル強度は、ＲＮＡｓｅＡ開裂試料の場合より低かった。転写の結果は、野生型Ｔ７ポリメラーゼを用いたときが最良であった。ＳＡＰを開裂反応に添加すること及びａｇａａｇｇ標識をプライマーに組み入れることによって、効率は改善しなかった。
【０３９８】
フォワード転写物：
フォワード反応物では、メチル化試料は非メチル化試料とはっきり区別できた。メチル化試料での１３ｄの質量シフトは、ピークが互いに近いゆえにシグナル群中で検出することが時々困難であった。
【０３９９】
逆転写物：
逆反応物は、他の転写と比較して、非メチル化試料においてより複雑であった。フォワード鎖中にシトシンがないので、逆転写物中にグアノシンがなく、したがって、酵素が切断する認識部位がなかった。したがって、シグナル強度は弱かった。
【０４００】
ＩＧＦ２／Ｈ１９インプリンティング領域であるＭ３２０５３のメチル化パターン
ｍ３２０５３領域のメチル化パターンは、メチル化及び非メチル化ＤＮＡではっきり区別できた。分析試料は、完全にメチル化したかあるいはメチル化しないかのいずれかとした。先行文献は、生殖系列でのメチル化及び非メチル化ＤＮＡの完全な分離及びさらに成熟段階を記載している。位置４７０におけるＤＮＡのＣｐＧ部位は、メチル化とはっきりタイピングされた。データにより、位置３４７におけるＣｐＮｐＧ部位のメチル化も確認された。
【０４０１】
メチル化の割合
ＤＮＡ試料中のメチル化の割合を決定するために、異なる量のメチル化及び非メチル化ＤＮＡをプールした。プラスミドＤＮＡの濃度の決定をピコ・グリーン（Pico Green）蛍光アッセイで行った。
【０４０２】
分析試料は、メチル化ＤＮＡの濃度が増加していくものとした。０％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％．．．９０％、９５％、９９％、９９．５％、及び１００％のメチル化ＤＮＡを含むＤＮＡプールを分析した。ＲＮＡｓｅＡ開裂を両方の転写方向で行った。フォワード及び逆反応を比較して、精度又は信頼性に有意な違いはなかった。ピーク面積を測定し、非メチル化に対するメチル化の割合を調べた。
【０４０３】
メチル化の割合は、１０〜９０％のメチル化ＤＮＡの範囲において±２％の精度で決定された。メチル化ＤＮＡの高い範囲及び低い範囲では精度は減少した。メチル化ＤＮＡの濃度が５％以内である試料では、対応するピークをバックグラウンドから分解するのは困難となる。したがって、検出限界は約１〜５％のメチル化ＤＮＡであった。
【０４０４】
ゲノムＤＮＡ
分析によって、メチル化及び非メチル化クローンが５０／５０の割合であることが示された。これは、ゲノムＤＮＡ中のメチル化及び非メチル化対立遺伝子のＰＣＲ増幅が等しいことを示している。
【０４０５】
適用範囲及び重複性
理論では、各メチル化ＣｐＧは、同じ質量スペクトルにおいて少なくとも１つの表示質量シグナルを生ずる特異的フラグメントを生ずることができる。これらのシグナルのいくつかは、それらの質量が高い又は低い質量カットオフに属するので、検出可能ではないであろう。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置により、長さがフラグメント約３〜３５個のヌクレオチドに等しい１０００〜１１０００Ｄａの質量を有する開裂生成物の検出が可能となる。標的核酸配列に依存して、１つの反応のみで、例えば、標的核酸内のすべてのＣｐＧ部位の約７５％のメチル化状態の決定が可能となる。ほぼすべてのＣｐＧ部位に関する情報を得るため、反応がフォワード又は逆転写産物のＣ又はＴ特異的開裂を含むことができる２〜４つの反応を用いることができる。逆鎖上のＣ特異的開裂はフォワード鎖上のＧ特異的開裂と等しく、逆鎖上のＴ特異的開裂はフォワード鎖上のＡ特異的開裂と等しいので、この組み合わせによってフォワード鎖上のすべてのヌクレオチドにおいて塩基特異的開裂が可能となる。２〜４つの開裂反応からの情報を合わせることによって、正確なメチル化パターンを編集すること可能となる。ＩＧＦ２／Ｈ１９領域については、各ＣｐＧ部位についてのメチル化状態を得るのに２つ反応でも十分である。４つの反応を用いることにより、すべてのＣｐＧ部位の９２％が２超のシグナルによって表される重複した情報が提供された。したがって、各メチル化の事象は、１つ以上の観察によって独立して確認された。
【０４０６】
ＲＮＡ断片化とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ検出とを組み合わせて用いるメチル化分析は、ハイスループット分析と質の劣ったＤＮＡを少量使用することとを組み合わる可能性を与える成功的な技術である。それは、定量的だけではなく、定量的方法でもある。代表的なプロトコルに従って生じたフラグメントを本明細書中で提供する方法による分析に用いることができる。
【０４０７】
実施例６
試料混合物中の配列変化の分析
この研究の目的は、異なるＤＮＡ比の野生型及び変異体ＤＮＡを有する試料での塩基特異的断片化により参照配列と相対的な標的配列中の配列変化の分析を行い、検出感度を評価することであった。
【０４０８】
材料及び方法
ＤＮＡは、腫瘍遺伝子Ｋ−Ｒａｓ（配列番号４４）に由来する２６９ｂｐ単位複製配列であった。ＤＮＡ試料は、野生型配列又は腫瘍細胞系に由来するＫ−Ｒａｓ変異体配列のいずれかを含有していた。ＤＮＡ試料（試料Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ）を野生型及び異型接合変異ＤＮＡの異なる比で混合した。以下の表に示す通り、混合物中の変異ＤＮＡの比は試料あたり０％〜５０％で変動した。
【０４０９】
【表３】
0004786904.tif 000004
【０４１０】
各ＤＮＡ試料は、５０ｎｇ（１０ｎｇ／μｌ・５μｌ）を含有した。実施例１に提供されるプロトコルに従った均一な塩基特異的開裂反応を異なる４日の間に４回行った。野生型単位複製配列と相対的な変異体単位複製配列の異なる開裂によって得られたフラグメントを、本明細書中に提供する方法に従い、質量分析に続いて質量スペクトルフラグメントピークの分析よって分析した。
【０４１１】
結果
位置２１６におけるＧ／Ａ置換を変異体単位複製配列中で検出した。Ｇ対立遺伝子中の２３１３ｄからＡ対立遺伝子中の２２９７ｄへのＣ特異的フォワード反応物での質量シフトによって、変異を確認した。このシグナルの検出は、変異体配列中のＳＮＰの存在を同定するのに必要であった。２２９７ｄ（Ａ対立遺伝子に対応する）におけるシグナルは、変異体対立遺伝子がたった５％のレベルで存在するときでさえ（ＤＮＡ試料Ｂ）、すべてのＤＮＡ試料Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤで検出された。
【０４１２】
変更は当業者に明らかであるゆえに、本発明は付随の特許請求の範囲によってのみ限定されないことを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０４１３】
【図１】図１は、本明細書に記載される方法及びプロセスによってデータ分析を行うコンピュータシステムによって実行される操作を図示したフローチャートである。
【図２】図２は、配列変化候補の減少した組を決定するためにコンピュータシステムによって実行される操作を図示したフローチャートである。
【図３】図３は、試料の処理を行い、かつ、図１及び図２に図示した操作を行うシステムのブロック線図である。
【図４】図４は、図３に図示するデータ分析コンピュータのブロック線図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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