【手続補正書】
【提出日】令和3年10月12日(2021.10.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原結合領域を含む組換え抗原結合性タンパク質であって、
前記抗原結合領域は、
アミノ酸配列ＮＩＧＳＫＳ（配列番号３４）、ＹＤＳおよびＱＶＷＤＳＳＳＤＹＶ（配列番号４５）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号４６）、ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号４７）およびＡＲＮＹＩＳＭＦＤＳ（配列番号４８）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）
を含む抗原結合領域であって、
前記抗原結合性タンパク質はｓｃＦｖを含み、前記ｓｃＦｖはプログラム細胞死（ＰＤ−１）に特異的に結合し、ＰＤ−１とそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１との結合を阻害する、前記組換え抗原結合性タンパク質。
【請求項２】
前記抗原結合性タンパク質がＰＤ−１アンタゴニストである、請求項１に記載の抗原結合性タンパク質。
【請求項３】
前記抗原結合性タンパク質がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１に記載の抗原結合性タンパク質。
【請求項４】
前記抗原結合性タンパク質が分泌可能である、請求項１に記載の抗原結合性タンパク質。
【請求項５】
前記抗原結合性タンパク質がヒト抗体である、請求項１に記載の抗原結合性タンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質をコードする核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸を含むベクター。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質、請求項５に記載の核酸または請求項７に記載のベクターを含む細胞。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質、請求項６に記載の核酸、請求項７に記載のベクター、又は請求項８に記載の細胞を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え抗ＰＤ１抗原結合性タンパク質、請求項５に記載の核酸、請求項６に記載のベクター、請求項７に記載の細胞、または請求項８に記載の医薬組成物の、ＰＤ１リガンドへのＰＤ１結合を阻害することによる、ＰＤ１−陽性疾患の治療のための医薬の製造への、使用。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え抗ＰＤ１抗原結合性タンパク質、請求項６に記載の核酸、請求項７に記載のベクター、請求項８に記載の細胞、または請求項９に記載の医薬組成物の、ＰＤ−１シグナル経路を阻害することによる、免疫調節のための医薬の製造への、使用。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質をコードする核酸およびキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクターであって、前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質が、前記キメラ抗原受容体と同一ではない、ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質をコードする核酸およびキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む細胞であって、前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質が、前記キメラ抗原受容体と同一ではない、細胞。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質およびキメラ抗原受容体を含む細胞であって、前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質が、前記キメラ抗原受容体と同一ではない、細胞。
【請求項１６】
前記キメラ抗原受容体がＰＤ−１に特異的に結合するものではない、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
【請求項１７】
前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質が抗体である、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
【請求項１８】
前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質がヒト抗体である、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
【請求項１９】
前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質がＰＤ−１アンタゴニストである、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
【請求項２０】
前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質が、請求項１に記載の抗原結合領域を含む、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
【請求項２１】
前記キメラ抗原受容体がＣＤ−１９に特異的に結合する、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
【請求項２２】
前記キメラ抗原受容体が、ヒトＴ細胞膜に挿入されることができる、請求項１２〜２１のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
【請求項２３】
前記細胞がＴ細胞である、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４】
請求項１２〜２３のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１２〜２３のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞、または請求項２４に記載の医薬組成物の、ＰＤ１リガンドへのＰＤ１結合を阻害することによる、ＰＤ１−陽性疾患の治療のための医薬の製造への、使用。
【請求項２６】
請求項１２〜２３のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞、または請求項２４に記載の医薬組成物の、ＰＤ−１シグナル経路を阻害することによる、免疫調節のための医薬の製造への、使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
【図２Ａ−２Ｂ】ＰＤ−１とそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１との相互作用の破壊を示す。Ａ．は、ｓｃＦｖ−ＦｃがＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を破壊する能力を測定するために使用した競合的結合アッセイの模式図である。（１）ビオチン化ＰＤ−１−Ｆｃを、段階希釈したＥＴ９０１  ＳｃＦｖ−Ｆｃ（陰性対照）または抗ＰＤ１  ＳｃＦｖ−Ｆｃと混合し；（２）次いでＰＤ−Ｌ１−Ｆｃコートプレートに添加した。工程（３）において、コートＰＤ−Ｌ１に対するＰＤ−１−Ｆｃ結合を、ＨＲＰ−接合ストレプトアビジンを介して可視化した。Ｂ．競合的結合アッセイの結果を比較するために、ｓｃＦｖの濃度が１．７〜５．２５μｇ／ｍｌであった点を丸で囲む。クローン４０および２３が相互作用を破壊する最も弱い能力を有しており、クローン２６が最も強い能力を有していた（２６＞２７＝１６＞１８＞３１＞２３＝４０）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
【図５】抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖを分泌する腫瘍標的化Ｔ細胞からのＩＮＦ−γ分泌（ｐｇ／ｍｌ）。ＣＡＲを発現するＴ細胞またはＣＡＲを発現し、抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖを分泌するＴ細胞を、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ腫瘍細胞と共培養した。上清をＬｕｍｉｎｅｘ技術により分析し、Ｔ細胞から分泌されたサイトカインのレベルを検出した。１９２８ｚ  ＣＡＲを発現し、抗ＰＤ−１ｓｃＦｖクローン２３および２７を分泌するよう改変されたＴ細胞は、ＣＡＲのみを発現するよう改変された細胞と比較して、上昇したＩＦＮ−γの分泌を示した。１９２８ｚ  ＣＡＲを発現し、抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖクローン１６、１８、２６、３１または４０を分泌するよう改変された細胞は、ＣＡＲのみにより改変された細胞と比較してより少ないＩＦＮ−γを分泌した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
【図１０】抗ＰＤ−１特異的ｓｃＦｖから作成したモノクローナル抗体は、ヒトＴ細胞上のＰＤ−１に結合することを示す。ＰＤ−１特異的ｓｃＦｖからヒトモノクローナル抗体を作成し、ヒトＰＤ−１（１μｇ／ｍｌ）を過剰発現するよう改変されたヒトＴ細胞とともにインキュベートした。フローサイトメトリーを使用して、ヤギ抗ヒトＩｇ  ＦＩＴＣ接合抗体を用いて結合した抗体を検出した。クローン２３、２６および２７モノクローナル抗体は、それぞれ５１％、７８％および６７％にてＰＤ−１ヒトＴ細胞に結合した。対照抗体（クローン９０１）はＴ細胞上のヒトＰＤ−１に結合しなかった。示したデータは１回の実験の代表である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
【図１３Ａ−１３Ｄ】ＣＡＲを発現し、ＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖを分泌するよう改変されたＴ細胞は、インビトロでＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１相互作用からの阻害に耐えることを示す。Ａ．ＣＡＲのみ（１９２８ｚ）、またはＣＡＲおよびＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖ（１９２８ｚ−Ｅ２７）を発現するＴ細胞を、３Ｔ３空細胞またはヒトＰＤ−Ｌ１を発現するよう改変された３Ｔ３細胞上で培養した。３Ｔ３フィーダー細胞上での２４時間の後、細胞を、１：３のビーズ：Ｔ細胞比にて培養物に添加したＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにより刺激した。Ｔ細胞の増殖をトリパンブルーでの数え上げにより決定し、新しいビーズを２回培養物に添加した（矢印によって示す）。１９２８ｚ  Ｔ細胞は、３Ｔ３空フィーダー細胞上で増殖したが、しかし、３Ｔ３−ＰＤ−Ｌ１フィーダー細胞上では増殖しなかった。一方、１９２８ｚ−Ｅ２７  Ｔ細胞は、３Ｔ３空および３Ｔ３−ＰＤ−Ｌ１フィーダー細胞の両方の上で増殖し、ＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１に媒介される抑制に対する抵抗性を示した。Ｂ．図１３Ａに示されるように３Ｔ３空または３Ｔ３−ＰＤ−Ｌ１細胞上でインキュベートしたＴ細胞をフローサイトメトリーにより分析して、抑制性受容体である、ＰＤ−１、２Ｂ４およびＬＡＧ３についての発現を検出した。１９２８ｚ細胞は、１９２８ｚ−Ｅ２７細胞よりも上昇したレベルのＰＤ−１を発現した（示さず）。ＰＤ−１＋細胞でゲートをかけた場合、２Ｂ４およびＬＡＧ３の分析により、１９２８ｚ細胞は１９２８ｚ−Ｅ２７細胞と比較してＰＤ−１＋、２Ｂ４＋およびＬＡＧ３＋細胞のより高い割合を有していたことが明らかになった。Ｃ．形質導入されたＴ細胞を、Ｒａｊｉ−ＰＤＬ１またはＮａｌｍ６−ＰＤＬ１腫瘍細胞とともに、様々なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比（１：１、１：３、１：５）で７２時間培養した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ１９抗体での染色後のフローサイトメトリーおよびビーズの数え上げを使用して、腫瘍標的の溶解およびＴ細胞の増殖を経時的にモニターした。ＰＤＬ１＋腫瘍細胞とともに培養された場合、１９２８ｚ−Ｅ２７細胞（上側の曲線）は、１９２８ｚ  Ｔ細胞（下側の曲線）と比較してより高レベルに増殖し続けた。Ｄ．形質導入されたＴ細胞を図１３Ｃに示すようにＮａｌｍ６−ＰＤＬ１腫瘍細胞で刺激し、Ｎａｌｍ６−ＰＤＬ１腫瘍細胞で１：５のＴ  Ｅ：Ｔ比にて再刺激した。４８時間の共培養の後、フローサイトメトリーを使用して腫瘍標的の溶解を決定した。１９２８ｚ−Ｅ２７は、１９２８ｚ細胞と比較して、再刺激の際にＰＤ−Ｌ１腫瘍標的を溶解する能力を保持していた。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
【図１５Ａ−１５Ｄ】ＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖである、Ｅ２７の選択に関する。Ａ．ＰＤ−１ブロッキングｍＡｂ候補であるＥ２７、Ｅ２６およびＥ２３を競合的結合アッセイにおいて使用して、ヒトには存在しないハプテンを標的とする対照ｍＡｂと比較して、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合の妨害を様々な濃度にて検出した。Ｅ２３、Ｅ２６およびＥ２７  ｍＡｂはすべてＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を妨げた。Ｂ．Ａにおいて使用したＥ２３、Ｅ２６およびＥ２７  ｍＡｂから設計したＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖの設計の模式図であり、ここで、シグナルペプチドを可変重配列およびセリングリシンリンカーおよび可変軽配列に連結した。このＨＩＳ／ＨＡタグをｓｃＦｖの検出のために含めた。Ｃ．１９２８ｚ  ＣＡＲとともに分泌可能ｓｃＦｖを発現するように形質導入された２９３Ｇｌｖ９パッケージング細胞からのＳＮに対する、抗ＨＡ抗体により染色したウェスタンブロット。Ｅ２７  ｓｃＦｖは最高のレベルで検出され、それゆえ、本明細書の残りの部分において使用した。Ｄ．抗ＨＡ  ｍＡｂで染色した、ＰＢＭＣｓ＋４Ｈ１１２８ｚおよびＰＢＭＣｓ＋４Ｈ１１２８ｚＥ２７からのＳＮに対するウェスタンブロット。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
抗体ファージパニングに使用した抗原は、組換え融合タンパク質である、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合させたＰＤ−１細胞外ドメイン（ＰＤ−１  ＥＣＤ−Ｆｃドメイン）であった。ＰＤ−１  ＥＣＤおよびｈＩｇＧ１  ＦｃをコードするＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｅｗｉｚ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）により合成された。ＤＮＡ配列を次いでＥｕｒｅｋａの所有する哺乳類発現ベクターにサブクローニングし、これを次いで融合タンパク質発現のためにＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。ＰＤ−１  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質を細胞が死滅した後にＨＥＫ２９３細胞培地から標準的ＦＰＬＣ方法によって精製した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
実施例４
ＰＤ−１刺激がＴ細胞の増殖および機能を阻害する能力があるので、本発明者らは引き続いてＴ細胞増殖に対する抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖの効果を特徴決定する探索を行った。これを達成するために、ヒトＴ細胞を健康ドナーの末梢血から単離し、以前に記載されている方法を用いて、ＣＡＲを発現し、ＰＤ−１−特異的ｓｃＦｖを分泌するようレトロウイルス形質導入を介して改変した（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ、Ｓａｎｔｏｓら．２００７）。形質導入の後、改変されたＴ細胞をインビトロでの増殖についてモニターした（図４）。１９２８ｚ  ＣＡＲを発現し、ＰＤ−１特異的ｓｃＦｖクローン２３および２７を分泌するＴ細胞は、１９２８ｚ  ＣＡＲのみを発現するよう改変されたＴ細胞と同様に増殖した。ＣＡＲを発現し、ＰＤ−１−特異的ｓｃＦｖクローン１６、１８、２６、３１または４０を分泌するよう改変された細胞は増殖せず、これらのＰＤ−１−特異的ｓｃＦｖクローンがアゴニスト性であり、潜在的にＰＤ−１を刺激し、そしてＴ細胞増殖の低下をもたらしたことが示唆された。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
実施例５
増殖研究に加えて、本発明者らは、（ＣＡＲを発現する、またはＣＡＲを発現し、ＰＤ−１−特異的ｓｃＦｖを分泌する）Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋バーキットリンパ腫腫瘍細胞株、Ｒａｊｉと共培養し、Ｔ細胞からのサイトカイン分泌のレベルを決定した。図５に示されるように、１９２８ｚ  ＣＡＲを発現し、ＰＤ−１−特異的ｓｃＦｖクローン２３または２７を分泌するよう改変されたＴ細胞は、ＣＡＲのみを発現するよう改変された細胞と比較してＩＦＮ−γの分泌の上昇を示し、これらのｓｃＦｖクローンがＰＤ−１シグナル伝達に関してアンタゴニスト性であったことが示唆された。１９２８ｚ  ＣＡＲを発現し、ＰＤ−１−特異的ｓｃＦｖクローン１６、１８、２６、３１または４０を分泌するよう改変された細胞は、ＣＡＲのみにより改変された細胞と比較してより少ないＩＦＮ−γを分泌し、これらのｓｃＦｖがＰＤ−１に関してアゴニスト性であり、Ｔ細胞機能を阻害したことが示唆された。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
実施例１０
ＣＡＲを発現し、ＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖを分泌するよう改変されたＴ細胞は、ＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１相互作用からの阻害に、インビトロで耐える。ＣＡＲのみ（１９２８ｚ）、またはＣＡＲおよびＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖ（１９２８ｚ−Ｅ２７）を発現するＴ細胞を３Ｔ３空細胞またはヒトＰＤ−Ｌ１を発現するよう改変された３Ｔ３細胞上で培養した。３Ｔ３フィーダー細胞上での２４時間の後、細胞を、１：３のビーズ：Ｔ細胞比にて培養物に添加したＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにより刺激した。Ｔ細胞の増殖をトリパンブルーでの数え上げにより決定し、新しいビーズを２回培養物に添加した（矢印によって示す）。１９２８ｚ  Ｔ細胞は、３Ｔ３空フィーダー細胞上で増殖したが、しかし、３Ｔ３−ＰＤ−Ｌ１フィーダー細胞上では増殖しなかった。一方、１９２８ｚ−Ｅ２７  Ｔ細胞は、３Ｔ３空および３Ｔ３−ＰＤ−Ｌ１フィーダー細胞の両方の上で増殖し、ＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１に媒介される抑制に対する抵抗性が示された（図１３Ａ）。図１３Ａに示すように３Ｔ３空または３Ｔ３−ＰＤ−Ｌ１細胞上でインキュベートしたＴ細胞をフローサイトメトリーによって分析して、抑制性受容体である、ＰＤ−１、２Ｂ４およびＬＡＧ３についての発現を検出した。１９２８ｚ細胞は、１９２８ｚ−Ｅ２７細胞よりも上昇したレベルのＰＤ−１を発現した（示さず）。ＰＤ−１＋細胞でゲートをかけた場合、２Ｂ４およびＬＡＧ３の分析により、１９２８ｚ細胞は、１９２８ｚ−Ｅ２７細胞と比較してＰＤ−１＋、２Ｂ４＋およびＬＡＧ３＋細胞のより高い割合を有していたことが明らかになった（図１３Ｂ）。形質導入されたＴ細胞を、様々なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比（１：１、１：３、１：５）で７２時間、Ｒａｊｉ−ＰＤＬ１またはＮａｌｍ６−ＰＤＬ１腫瘍細胞とともに培養した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ１９抗体での染色後のフローサイトメトリーおよびビーズの数え上げを使用して、腫瘍標的の溶解およびＴ細胞の増殖を経時的にモニターした。１９２８ｚ−Ｅ２７細胞は、ＰＤＬ１＋腫瘍細胞とともに培養した場合、１９２８ｚ  Ｔ細胞と比較してより高いレベルで増殖し続けた（図１３Ｃ）。形質導入されたＴ細胞を図１３Ｃに示すようにＮａｌｍ６−ＰＤＬ１腫瘍細胞で刺激し、Ｎａｌｍ６−ＰＤＬ１腫瘍細胞で１：５のＴ  Ｅ：Ｔ比で再刺激した。４８時間の共培養の後、フローサイトメトリーを使用して腫瘍標的の溶解を決定した。１９２８ｚ−Ｅ２７は、１９２８ｚ細胞と比較して再刺激の際にＰＤ−Ｌ１腫瘍標的を溶解する能力を保持していた（図１３Ｄ）。