(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２または配列番号：４に記載のTSG101蛋白質に結合する，単離された抗体（ただし，該TSG101蛋白質から高次コイルドメイン（231〜302位）を欠失させた変異型TSG101蛋白質または該高次コイルドメイン自体に結合する抗体を除く）。」
【請求項２】
ポリクローナル抗体である、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体である、請求項１記載の抗体。
【請求項４】
検出可能な標識を有する、請求項１記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
デノボでの同時ホモ接合不活化により、多対立遺伝子が不活化され、その不活化により野生型とは識別可能な表現型になることを確認することが容易な、明確な表現型に至る哺乳類細胞遺伝子を同定する方法の開発にはかなりの関心が集まっている。この方法の一つの利用法は、腫瘍易罹患性に関係する遺伝子の同定である。
【０００２】
腫瘍易罹患遺伝子は、腫瘍細胞では典型的にアップレギュレートされている発癌遺伝子であってもよく、腫瘍細胞においてダウンレギュレートされているかまたは存在しない腫瘍抑制遺伝子であってもよい。悪性腫瘍は、腫瘍サプレッサーが失われている場合および／または腫瘍遺伝子が不適当に活性化されている場合に生じる可能性がある。そのような変異が体細胞に起こると、散発性腫瘍の増殖が起こる。癌に対する家族性素因は、腫瘍抑制遺伝子をコードする対立遺伝子の喪失といった変異が個々の生殖細胞系DNAに存在する場合に、生じる可能性がある。最もよく特徴付けのなされた家族性癌症候群では、一次変異は増殖力と一致した機能の喪失であるが、同一の座で第二の体細胞変異を獲得すれば新生物変化が生じる。
【０００３】
早発型乳癌の家系に関する広範な試験により、２つの乳癌抑制遺伝子の候補、BRCA1およびBRCA2が最近同定された。BRCA1またはBRCA2の頻繁な変異は、家族性早発型乳癌において証明されているが、このタイプの癌は全ての悪性乳癌の約５〜10％を表しているに過ぎず、散発性乳癌の残る90〜95％ではBRCA1およびBRCA2について考えられる役割は明らかにされていない。
【０００４】
ヒト染色体バンド11p15におけるマーカーのヘテロ接合性（LOH）の欠失および喪失が、肺癌、睾丸癌および男性生殖細胞腫瘍、胃癌、ウィルムス腫瘍、卵巣癌、膀胱癌、骨髄性白血病、悪性星状細胞腫およびその他の原始神経外胚葉腫瘍、ならびに副腎および肝臓の初期腫瘍を含む、多様なヒト癌において示されている。散発性乳癌の約30％がこの領域にLOHを示す。LOHは、LOHが起こる位置での腫瘍抑制遺伝子の不活化を示すと考えられているため、多様なヒト癌において11p15で認められる頻繁なLOHにより、この領域における腫瘍抑制遺伝子のクラスターまたは単一の多面発現遺伝子のいずれかが存在することが示唆される。
【０００５】
これらの癌の臨床的重要性により、この仮の腫瘍抑制遺伝子の同定は、診断、治療、および薬物スクリーニングに関して非常に重要なものとなる。
【０００６】
関連文献
非特許文献１には、胎児幹細胞の相同的組換えによって、これまでにクローニングされた遺伝子からのアンチセンスRNAの発現を通じておよびP０遺伝子の挿入的不活化を通じて操作される機能変異の喪失、ならびにP０-欠損マウスの作製について記述されている。非特許文献２、３、４、５および６は、異なる細胞タイプにおけるアンチセンスRNAの発現に関連した細胞表現型における変化を記述している。非特許文献７には、トランスジェニックマウスにおける遺伝子の両コピーの不活化が記述されている。
ウィルムス腫瘍におけるLOHの試験により、11p15での腫瘍抑制座が同定されている（例えば非特許文献８参照）。２つの家族性乳癌遺伝子、非特許文献９のBRCA1および非特許文献１０のBRCA2がこれまでに記述されている。
スタスミンと高次コイルドメインとの相互作用は、非特許文献１１に記述されている。
【０００７】
【非特許文献１】レムケら（Lemke）（1993）Glia 7：263〜271
【非特許文献２】カマノら（Kamano）（1990）Leukemia Res.10:831〜839
【非特許文献３】ファンデルクロールら（van der Krol）（1988）Biotechniques 6:958
【非特許文献４】カツキら（Katsuki）（1988）Science 241:593〜595
【非特許文献５】オーウェンスら（Owens）（1991）Development 112:639〜649
【非特許文献６】オーウェンスら（Owens）（1991）Neuron 7:565〜575
【非特許文献７】ギースら（Giese）（1992）Cell 71:565〜576
【非特許文献８】ダウディら（Dowdy）（1991）Science 254:293〜295
【非特許文献９】ミキら（Miki）（1994）Science 266:66〜71
【非特許文献１０】ウースターら（Wooster）（1995）Nature 378:789〜792
【非特許文献１１】ソーベルら（Sobel）（1991）Trends Biochem.Sci. 16:301〜305
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
ヒトTSG101およびマウスtsg101 cDNAの完全なヌクレオチド配列を含む、哺乳類の腫瘍易罹患性遺伝子およびその同定法を提供する。TSG101の欠失は、ヒト癌、例えば乳癌の発生に関連する。癌は、リスク成分として遺伝性遺伝子素因を有する家族性であってもよく、または散発性であってもよい。TSG101核酸組成物は、相同または関係蛋白質およびそのような蛋白質をコードするDNA配列の同定に；蛋白質の発現または機能を調節する組成物の産生に；および関連する生理学的経路の研究に用いられる。さらに、インビボでの遺伝子活性の調節は、癌の治療のような予防および治療目的、発現に基づく細胞タイプの同定等に用いられる。DNAはさらに、癌に対する遺伝子素因の診断として、およびこの遺伝子に変異を有する特異的癌の同定に用いられる。
【０００９】
本発明は、もう一つの局面において、この座に対応する遺伝子の多対立遺伝子の発現を妨害することによって生じる表現型に基づいて、哺乳類細胞のランダムな染色体座の遺伝子をデノボで同定する方法を提供する。該方法には、遺伝子の全てのコピーおよび実質的に同様の配列を有するいかなる対立遺伝子も不活化することが含まれる。
もう一つの局面において、本発明は、その配列の少なくとも一部がこれまでに単離されている哺乳類細胞の遺伝子機能の迅速な確立法を提供する。この局面において、ゲノムに組み込まれる構築物には、標的部位での構築物の組み込みを可能にする２つの相同な組換え部位が含まれる。さらに本発明は、DNA構築物、ベクター、およびゲノム中にDNA構築物を含む哺乳類細胞を提供する。
【００１０】
特殊な態様の説明
哺乳類tsg101遺伝子組成物およびそれらの単離法を提供する。特に重要なのはヒトおよびマウス相同体である。特定のヒト癌はTSG101座に欠失を示す。そのような癌の多くは散発性で、腫瘍細胞はTSG101に体細胞変異を有する。TSG101遺伝子およびその断片、コードされている蛋白質、および抗TSG101抗体は、そのような癌の発症の素因を有する人の同定に、およびこの遺伝子に関連する散発性腫瘍の表現型の特徴付けに有用である。腫瘍は、TSG101の状態に関して、例えば変異配列の検出、異常な蛋白質産物の抗体検出、および変化したTSG101活性に関する機能的アッセイによって、タイプの分類、または病期分類してもよい。コードされているTSG101蛋白質は、特に腫瘍発生における腫瘍サプレッサーとしてのTSG101の機能に関して、TSG101の活性または発現を模する組成物に関する薬物スクリーニングに有用である。TSG101を用いて、スタスミンとの相互作用および細胞の制御においてその複合体が果たす役割を調べることができる。
【００１１】
ヒトTSG101およびマウスtsg101遺伝子配列および単離された核酸組成物を提供する。ヒトおよびマウスTSG101/tsg101遺伝子を同定するためには、新規遺伝子発見アプローチである「ランダムホモ接合ノックアウト」を利用した。リポーター遺伝子を有するレトロウイルス遺伝子探索ベクターを用いて、染色体プロモーターの後方の、標的とする転写的に活性な染色体DNA領域に組み込まれたベクターを含む細胞を選択し、同定した。リポーター遺伝子に対して5'方向および逆方向は、転写活性を有さない調節プロモーターであったが、これはトランス活性化因子によって高度に活性化させることができた。このシステムでは、標的遺伝子の両対立遺伝子と相互作用するアンチセンスRNAが大量に産生される。探索ベクターでトランスフェクトさせた細胞をさらに、トランス活性化因子をコードするプラスミドでトランスフェクトさせた。細胞を播種して、その不活化によって細胞の形質転換が起こった遺伝子を選択した。対照細胞集団は軟寒天上でコロニーを形成しないが、トランス活性化細胞は20個のコロニーを形成した。これらのクローンの一つはヌードマウスにおいて非常に腫瘍形成性であることが示された。リポーター遺伝子に特異的なプライマーを用いたmRNA選択を用いて、標的遺伝子からmRNAを単離した。次にmRNAを用いてcDNAクローンを産生し、これをさらに、ハイブリダイゼーションスクリーニングで用いて、完全な長さのマウスtsg101 cDNAを単離した。
【００１２】
マウスtsg101のヒト相同体を得るために、マウスcDNA配列を用いてdbESTを調べた。データベースに含まれる10個のヒトcDNA部分配列は、マウスtsg101と85％〜95％の同一性を示した。保存配列を用いて、鋳型としてヒトcDNAライブラリから単離した総DNAを用いて、ヒトTSG101 cDNAのセグメントを増幅するプライマーを設計した。TSG101遺伝子はヒト染色体サブバンド11p15.1〜15.2にマッピングされており、配列標識部位（STS）マーカーD11S921〜D11S1308に密接にリンクしている（ヒトゲノムマーカーの詳細なマップは、ディブら（Dib）（1996）Nature 280:152;http://www.genethon.frで見られると思われる）。
【００１３】
完全な長さのヒトcDNAには、380個のアミノ酸蛋白質をコードする1140 bpのオープンリーディングフレームが含まれる。ヒトおよびマウスcDNAはヌクレオチドレベルで86％同一である。予想される蛋白質は94％同一で、20個のアミノ酸ミスマッチおよび１つのギャップによって識別される。転写因子の活性化ドメインに典型的な高次コイルドメイン（ヒトTSG101 aa 231〜302）およびプロリンリッチドメイン（ヒトTSG101 aa 130〜205、32％プロリン）は、ヒトおよびマウス蛋白質の間で高度に保存されており、２つのドメインは互いに１つのアミノ酸ミスマッチがあるに過ぎない。ヒトTSG101蛋白質の高次コイルドメインにおけるロイシンジッパーモチーフは、マウス蛋白質のロイシンジッパードメインと同一である。
【００１４】
TSG101との関連が疑われる腫瘍からのDNAを、TSG101遺伝子における腫瘍遺伝子変異の有無に関して分析する。TSG101機能の喪失に関連する散発性腫瘍には、ヒト染色体11p15の領域に欠失を有することがわかっている多くの癌、例えば乳癌、肺癌、睾丸癌および男性生殖細胞腫瘍、胃癌、ウィルムス腫瘍、卵巣癌、膀胱癌、骨髄性白血病、悪性星状細胞腫およびその他の原始神経外胚葉腫瘍、ならびに副腎および肝臓の初期腫瘍が含まれる。
【００１５】
散発性腫瘍の特徴付けには、概して腫瘍細胞DNAの分析が必要であり、生検試料を用いて行うと都合がよい。転移が起こっている場合には、腫瘍細胞は血中に検出される可能性がある。特に重要なことは、例えば、領域の増幅および増幅産物のサイズ分画化；制限マッピング等による、TSG101遺伝子における欠失の検出である。腫瘍のスクリーニングも同様に、蛋白質の機能的または抗原的特徴に基づいてもよい。正常または異常なTSG101蛋白質を検出するために設計されたイムノアッセイをスクリーニングに用いてもよい。または、機能的アッセイ、例えば、TSG101によって媒介されるスタスミン経路の変化の検出に基づくアッセイを行ってもよい。
【００１６】
第11染色体の短腕全体の欠失を含む広範囲の変異が認められている。重要な特異的変異には、コード領域配列における挿入、置換および欠失、スプライシングに影響を及ぼすイントロン、蛋白質の活性および発現に影響を及ぼすプロモーターまたはエンハンサーを含む、発癌に至るいかなる変異も含まれる。TSG101の「正常な」配列を配列番号：３に提供する（ヒト）。多くの場合、変異は高次コイルドメインを破壊し、その結果、この領域で切断されたまたは欠失を有する蛋白質が得られる。重要なその他の変異は、プロリンリッチドメインまたは蛋白質の他の保存領域に影響を及ぼす可能性がある。高次コイルドメイン内のロイシンジッパーもまた、特に重要である。生化学試験を行って、TSG101コード領域または調節領域における候補配列変化が発癌性であるか否かを確認してもよい。例えば、変異TSG101蛋白質の発癌活性は、3T3細胞におけるTSG101活性の喪失を相補する能力によって、スタスミンとの結合試験等によって決定してもよい。
【００１７】
TSG101遺伝子はまた、変異TSG101配列の存在により癌に対する易罹患性が増加している、TSG101関連腫瘍に対する遺伝的素因を有することが疑われる患者のスクリーニングに用いてもよい。診断は、患者からのいかなる便利な試料、例えば、生検材料、血液試料、頬擦過試料等の蛋白質、DNA配列、PCRスクリーニング、またはハイブリダイゼーション分析によって実施する。典型的な患者の遺伝子型は、１つの染色体上に発癌変異を有すると思われる。TSG101の正常なコピーが失われている場合、機能の低下した変異コピーのみを残してその結果異常な細胞増殖が起こる。
【００１８】
特に、この疾患の家族の既往、例えば、罹患した親または兄弟がある場合には、出生前診断を行ってもよい。羊水穿刺試料、母体血液から単離した胎児有核または白血球細胞、絨毛膜絨毛試料等のような胎児DNA試料を、素因となる変異の有無に関して分析する。または、例えば、機能的アッセイまたはイムノアッセイのような蛋白質に基づくアッセイを、TSG101を発現することがわかっている胎児細胞上で実施する。
【００１９】
TSG101をコードするDNA配列は、cDNAもしくはゲノムcDNAまたはその断片であってもよい。「TSG101遺伝子」という用語は、特異的TSG101ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、ならびにコード領域のいずれかの方向に約１ kbまでの発現の制御に関係する隣接5'および3'非コードヌクレオチド配列を意味するものとする。遺伝子を、染色体外で維持するために、または宿主に組み込むために、適当なベクターの中に導入してもよい。
【００２０】
本明細書で用いられる「cDNA」という用語は、配列要素がエキソン、3'および5'非コード領域である、本来の成熟mRNA種において認められる配列要素の配列を共有する全ての核酸を含むものとする。通常、mRNA種は、介在イントロンが欠失している近接のエキソンを有し、TSG101をコードする連続的なオープンリーディングフレームを作製する。
【００２１】
ゲノムTSG101配列は非隣接オープンリーディングフレームを有し、イントロンがコード領域に割り込んでいる。重要なゲノム配列は、記載の配列において定義されるように、本来の染色体に通常存在する全てのイントロンを含む、開始コドンと停止コドンとの間に存在する核酸を含む。成熟mRNAに存在する3'および5'非翻訳領域をさらに含めてもよい。さらに、コード領域の5'または3'末端のいずれかでの約１ kbの隣接ゲノムDNAを含む、プロモーター、エンハンサー等の特異的転写および翻訳調節配列を含めてもよい。ゲノムDNAは、50 kbp以下の断片として単離してもよく、実質的に、隣接する染色体配列がなくてもよい。
【００２２】
本発明の核酸組成物は、本ポリペプチドの全てまたは一部をコードする。従来の方法に従ってオリゴヌクレオチドを化学的に合成することによって、制限酵素消化によって、PCR増幅等によって、DNA配列の断片を得てもよい。たいてい、DNA断片は少なくとも15 ntであり、通常少なくとも18 nt、より通常は少なくとも約50 ntである。そのような小さなDNA断片はハイブリダイゼーションスクリーニング等に有用である。より大きなDNA断片、すなわち100 bp以上、通常500 bp以上の断片は、コードされているポリペプチドの産生に有用である。長さが約18〜35 ntの１本鎖オリゴヌクレオチドはPCR増幅に有用である。PCRのような増幅反応に用いるためには、１対のプライマーが用いられる。プライマー配列の正確な組成は本発明にとって重要ではないが、ほとんどの出願において、プライマーは当技術分野で既知のように、ストリンジェントな条件下で本配列とハイブリダイズされる。少なくとも約50 nt、好ましくは少なくとも約100 ntの増幅産物を産生する１対のプライマーを選択することが好ましい。プライマー配列の選択のためのアルゴリズムは一般的に知られており、市販のソフトウェアパッケージで利用できる。増幅プライマーはDNAの相補鎖とハイブリダイズし、互いの方向へのプライマーとなる。
【００２３】
TSG101遺伝子は、実質的な純度で、一般に無傷の哺乳類染色体以外として単離され、得られる。通常DNAは、TSG101配列またはその断片を含まないその他の核酸配列を実質的に含まない形で得られ、一般に少なくとも約50％、通常少なくとも約90％純粋で、典型的には「組換え型」、すなわち天然の染色体上では通常関連しないような１つ以上のヌクレオチドが隣接しているものである。
【００２４】
DNA配列は様々な方面で利用される。それらはその他のtsg101遺伝子を同定するためのプローブとして用いてもよい。哺乳類の相同体は、本配列と実質的な配列類似性、すなわち本DNA配列のヌクレオチド配列と少なくとも75％、通常少なくとも90％、より通常は少なくとも95％の配列同一性を有する。配列類似性は参照配列に基づいて計算され、この参照配列は保存モチーフ、コード領域、隣接領域等のより大きな配列のサブセットであってもよい。参照配列は通常、長さが少なくとも約18 ntで、より通常は少なくとも約30 ntであり、比較する完全な配列に拡張してもよい。アルツシュルら（Altschul）（1990）J Mol Biol 215:403〜10に記述されるBLASTのような配列分析のアルゴリズムは、当技術分野で既知である。
【００２５】
配列類似性を有する核酸は、ストリンジェンシーの低い条件下、例えば50℃で10×SSC（0.9 M生理食塩水／0.09 Mクエン酸ナトリウム）で、１×SSCで55℃で洗浄してもなおも結合しているような条件下でのハイブリダイゼーションによって検出される。プローブ、特にDNA配列の標識プローブを用いることによって、相同または関係遺伝子を単離することができる。相同遺伝子の起源は、いかなる哺乳類種、例えば、霊長類；ラットおよびマウスのようなネズミ；イヌ；ネコ；ウシ；ヒツジ；ウマ等であってもよい。
【００２６】
DNAはまた、生物標本における遺伝子発現を同定するために用いてもよい。ゲノムDNAまたはRNAとして特定のヌクレオチド配列の有無について細胞を調べる方法は文献でよく確立されており、本明細書に詳述する必要はない。生物標本はmRNA源として用いると便利である。mRNAは、逆転写酵素を用いて相補的DNA鎖を形成し、その後、本DNA配列に特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応増幅を行うRT-PCRによって増幅してもよい。または、mRNA試料をゲル電気泳動によって分離し、適当な支持体、例えばニトロセルロースに転写し、次にプローブとして本DNAの断片を用いて調べる。その他の技法も利用することができる。本配列を有するmRNAが検出される場合、試料中にTSG101遺伝子が発現されていることを示している。
【００２７】
本核酸配列は、多くの目的のために、特に、例えば核酸開裂剤、例えば遺伝子の開裂のための鉄またはクロムのようなキレート化金属イオンと結合させることによって、細胞内で用いる場合；アンチセンス配列等として、修飾してもよい。修飾は、リン酸エステルの酸素をイオウまたは窒素と置換すること、リン酸をフォスフォルアミドに置換すること等を含んでもよい。
ゲノムDNA配列の変異の有無を分析するためには多くの方法が利用できる。大量のDNAが利用できる場合、ゲノムDNAを直接用いる。または、重要な領域を適したベクターにクローニングして、分析に十分な量を増殖させ、またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のような従来の技法によって増幅する。ポリメラーゼ連鎖反応の利用は、サイキら（Saiki）（1985）Science 239:487が記述しており、現在の技法の総説は、サムブルックら（Sambrook）の分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）、CSH Press 1989、pp 14.2〜14.33に認められる。
【００２８】
PCRは発癌性変異の検出に特に有用である。多くの場合、そのような変異はTSG101座の欠失を含む。例えば、TSG101に特異的なプライマーを用いて、遺伝子の全部または一部を増幅する。次に増幅産物のサイズを分析するが、この場合欠失が予想産物より小さくなると思われる。欠失が非常に大きい場合、特異的増幅産物が全くなくなる可能性がある。または、RNAをcDNAに変換した後、増幅させる（RT-PCR）場合、細胞試料からのmRNAについて分析を行ってもよい。
【００２９】
検出可能な標識を増幅反応に含めてもよい。適した標識には、例えば、フルオレセイン・イソチオシアネート（FITC）のような蛍光クロム化合物、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリスリン、アロフィコシアニン、6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM）、2',7'-ジメトキシ-4',5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン（JOE）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、6-カルボキシ-2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、5-カルボキシフルオレセイン（5-FAM）、またはN,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン（TAMRA）、例えば、３２P、３５S、３Hなどの放射活性標識等が含まれる。標識は、結合パートナーが検出可能な標識と結合している場合には、増幅したDNAが例えばアビジン、特異的抗体等の高親和性結合パートナーを有するビオチン、ハプテン等に結合している２段階システムであってもよい。標識は一方または両方のプライマーに結合してもよい。または、標識が増幅産物に取り込まれるように、増幅に用いるヌクレオチドのプールを標識する。
【００３０】
増幅またはクローニング断片は、ジデオキシ法またはその他の方法によってシークエンシングしてもよく、塩基配列を正常なTSG101配列と比較してもよい。変異体とのハイブリダイゼーション、発癌配列も同様に用いて、その存在をサザンブロット、ドットブロット等によって明らかにしてもよい。１本鎖構造多形（SSCP）分析、変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）、およびゲルマトリクス中でのヘテロ二本鎖分析を用いて、電気泳動移動度の変化としてDNA配列変化によって起こる構造変化を検出する。対照および変異配列と、国際公開公報第95/11995号に記述のように、固相支持体に固定した一連のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションパターンもまた、変異配列の存在を検出するための手段として用いてもよい。または、発癌性変異が制限エンドヌクレアーゼの認識部位を作製または破壊する場合には、断片をそのエンドヌクレアーゼで消化させ、断片が消化されたか否かを明らかにするために、産物のサイズを分画化する。分画は、ゲル電気泳動、特にアクリルアミドまたはアガロースゲルによって実施する。
【００３１】
本核酸を用いて、トランスジェニック動物を作製または細胞株における部位特異的遺伝子修飾を行ってもよい。修飾細胞または動物は、TSG101の機能および制御の研究に有用である。例えば、TSG101遺伝子に一連の小さな欠失および／または置換を作製して、発癌、シグナル伝達等における異なるエキソンの役割を明らかにしてもよい。また、通常は発現されていないまたは発達の異常な時期にある細胞または組織において、TSG101遺伝子またはその変異体を発現させてもよい。さらに、TSG101蛋白質の発現を、そうでなければ通常産生されていない細胞に提供することによって、細胞行動の変化を誘発することが可能である。
【００３２】
相同組換えのためのDNA構築物は、望ましい遺伝子修飾を有するTSG101遺伝子の少なくとも一部を含み、標的座と相同な領域を含む。または、本来の座を標的としないが、ゲノムのランダム部位に組み込まれる構築物でもよい。陽性および陰性選択のためのマーカーを含めると便利である。組換えによる標的遺伝子修飾を有する細胞の産生法は、当技術分野で既知である。哺乳類細胞をトランスフェクトさせる様々な方法に関しては、ケオウンら（Keown）（1990）Methods in Enzymology 185:527〜537を参照のこと。
【００３３】
胎児幹細胞（ES）に関しては、ES細胞株を用いてもよく、または例えば、マウス、ラット、モルモット等の宿主からのES細胞を新たに得てもよい。そのような細胞は、適当な繊維芽細胞のフィーダー層上で、または白血病阻害因子（LIF）の存在下で増殖する。ES細胞が形質転換されている場合には、それらを用いてトランスジェニック動物を作製してもよい。形質転換後、細胞を適当な培地中でフィーダー層上に播種する。選択的な培地を用いることによって、構築物を含む細胞を検出してもよい。コロニー増殖に十分な時間後、それらを採り、相同組換えの発生を分析する。次に、相同組換えを示すそれらのコロニーを、胎児操作および胚盤胞注入のために用いてもよい。胚盤胞細胞は排卵過度の４〜６週齢の雌から得る。ES細胞をトリプシン処理し、修飾細胞を胚盤胞の胞胚腔に注入する。注入後、胚盤胞を偽妊娠雌の各子宮角に戻す。次に雌の妊娠を継続させ、得られた仔を構築物を有する変異細胞に関してスクリーニングする。異なる表現型の胚盤胞およびES細胞を提供することによって、キメラ子孫を容易に検出できる。
【００３４】
キメラ動物の修飾遺伝子の有無をスクリーニングし、修飾を有する雌雄を交配させてホモ接合子孫を生じる。遺伝子変化により、発生の何らかの時点で致死となれば、組織または器官を異系もしくは同系のグラフトもしくは移植片として、またはインビトロ培養で維持することができる。トランスジェニック動物は、実験動物、家畜等のいかなる非ヒト哺乳類であってもよい。トランスジェニック動物を用いて、機能的試験、例えば候補薬の腫瘍細胞に及ぼす効果を明らかにするための薬物スクリーニング等に用いてもよい。
【００３５】
TSG101蛋白質の全部または一部を産生するために本遺伝子を用いてもよい。重要なペプチドは、高次コイルドメイン（aa 231〜302）およびプロリンリッチドメイン（aa 130〜205）を含む。発現のためには、誘導可能または構成的であってもよい転写および翻訳開始領域、転写開始領域の転写調節下にあるコード領域、ならびに転写および翻訳終結領域を提供する発現カセットを用いてもよい。発現宿主において機能的である様々な転写開始領域を用いてもよい。
【００３６】
ペプチドは、従来の方法に従って、発現の目的に応じて原核生物または真核生物で発現させてもよい。蛋白質の大規模産生のためには、単細胞生物または高等生物、例えば脊椎動物、特に哺乳類のような真核生物の細胞を、大腸菌、B.サブチリス（subtilis）、S.セレビジエ（cerevisiae）等のような発現宿主として用いてもよい。多くの状況では、それによってTSG101蛋白質がグリコシル化される哺乳類宿主でTSG101遺伝子を発現させることが望ましい。
【００３７】
発現宿主を用いることによって大量の蛋白質を利用できる場合、蛋白質は従来の方法に従って単離および精製してもよい。発現宿主の溶解物を調製し、HPLC、圧排クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、またはその他の精製技法を用いることによって溶解物を精製してもよい。精製蛋白質は一般に少なくとも約80％純粋で、好ましくは少なくとも約90％純粋であり、および100％以下の純度であってもよい。純粋とは、細胞の破片と共に他の蛋白質を含まないことを意味する。
【００３８】
TSG101ポリペプチドは、細胞増殖および分化に関連する多様なシグナルの制御および中継に関係するスタスミンシグナル伝達経路の研究に有用である。TSG101の高次コイルドメインはスタスミンと相互作用する。TSG101の構造は、それが転写因子であることを示し、これはスタスミンシグナル伝達の下流のイフェクターとして作用する可能性がある。この系路に影響を及ぼす可能性があるリン酸化の変化等を検出するために、TSG101ポリペプチドの正常型および変異型を他の蛋白質との結合アッセイに用いてもよい。酵母は、チーンら（Chien）（1991）P.N.A.S. 88:9578〜9582に記述されている２ハイブリッドシステムを通じて、蛋白質-蛋白質相互作用を研究するための強力な道具であることが示されている。
【００３９】
TSG101によって認識される配列モチーフを決定するために、DNAフットプリントの従来の技法に従って、TSG101とDNAとの結合アッセイを実施してもよい。ポリメラーゼおよび転写活性化因子を含む複合体がTSG101の存在によってどのような影響を受けるかを明らかにするために、インビトロ転写アッセイを用いてもよい。
【００４０】
ポリペプチドを抗体産生のために用い、この場合短い断片は特定のポリペプチドに特異的な抗体を提供し、長い断片または遺伝子全体は、ポリペプチドまたは蛋白質の表面を覆う抗体の産生を可能にする。正常型または変異型のTSG101に対する抗体を作製してもよい。蛋白質の高次コイル、ロイシンジッパーおよびプロリンリッチドメインは、エピトープとして、特に発癌性TSG101に認められる共通の変化を認識する抗体の作製に重要である。これらのドメインまたは本来の蛋白質に対応するペプチドを単離するために、抗体を作製してもよい。TSG101を認識する抗体は診断、ヒト腫瘍、例えば乳癌のタイピングおよび病期分類に有用である。
【００４１】
抗体を従来の方法に従って調製し、この場合発現されたポリペプチドまたは蛋白質は、そのまま、または既知の免疫誘発担体、例えば、KLH、プレ-SHBsAg、その他のウイルス蛋白質または真核細胞蛋白質等に結合させて、免疫原として用いてもよい。一連の注射の際に、適当であれば様々なアジュバントを用いてもよい。モノクローナル抗体に関しては、１回以上の追加免疫注射後、脾臓を単離し、脾細胞を固定し、その後高親和性抗体結合をスクリーニングしてもよい。次に、望ましい抗体を産生する固定化細胞、例えばハイブリドーマを増殖させてもよい。詳述は、モノクローナル抗体：実験マニュアル（Monoclonal Antibodies:A Laboratory Manual）ハーロウ&レーン（Harlow and Lane）編、Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, 1988を参照のこと。必要に応じて、重鎖および軽鎖をコードするmRNAを単離して、大腸菌にクローニングすることによって変異誘発させてもよく、重鎖と軽鎖を混合して抗体の親和性をさらに増強させてもよい。
【００４２】
抗体は、TSG101の変異に関連する癌およびその他の腫瘍の診断的アッセイに特に用いられる。腫瘍の病期分類、検出、およびタイピングは、正常なTSG101の有無を調べるために定量的イムノアッセイを利用してもよい。または、TSG101の変異型の有無を決定してもよい。正常TSG101が減少すれば、および／または異常なTSG101が存在すれば、腫瘍がTSG101関連性であることを示している。
【００４３】
TSG101関連性腫瘍を有することが疑われる患者から試料を採取する。本明細書で用いられる試料には、血液、脳脊髄液、涙液、唾液、リンパ、透析液等のような生体液；器官または組織培養由来液；および生理組織から抽出した液体が含まれる。また、そのような液体の誘導物および分画もこの用語に含まれる。生検試料、例えば、癌試料、器官組織断片等は特に重要である。転移が疑われる場合は、血液試料が好ましいことがある。試料中の細胞数は、一般に少なくとも約10３個、通常少なくとも10４個、より通常は少なくとも約10５個である。通常、細胞の溶解物を調製する。
【００４４】
診断は多くの方法によって実施してもよい。方法が異なっても全て、TSG101に変異を有することが疑われる患者の細胞における正常または異常なTSG101の有無を決定する。例えば、検出は、組織学的切片の染色を利用して、従来の方法に従って実施してもよい。重要な抗体を細胞試料に加え、エピトープとの結合を可能にするために十分な時間、通常少なくとも約10分間インキュベートする。抗体は放射性同位元素、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または直接検出のためのその他の標識で標識してもよい。または、第二抗体または試薬を用いてシグナルを増幅する。そのような試薬は当技術分野で周知である。例えば、一次抗体をビオチンに結合させ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合アビジンを第二試薬として加えてもよい。最終的な検出は、ペルオキシダーゼの存在下で色の変化を受ける基質を利用する。抗体結合の有無は、顕微鏡、分光測光法、シンチレーション計数を含む様々な方法によって決定してもよい。
【００４５】
診断に関するもう一つの方法は、溶解物における抗体とTSG101との結合のインビトロ検出に依存する。試料またはその分画におけるTSG101結合濃度の測定は、様々な特異的アッセイによって得てもよい。従来のサンドイッチ型のアッセイを用いてもよい。例えば、サンドイッチアッセイはまず、TSG101-特異的抗体を不溶性表面または支持体に接着させてもよい。詳細な結合様式は、それが試薬および本発明の全体的な方法と両立する限り、重要ではない。それらはプレートと共有的に、または非共有的に結合させてもよく、好ましくは非共有結合する。
【００４６】
不溶性支持体は、可溶性材料から容易に分離され、およびそれ以外は全体的な方法と両立する、ポリペプチドを結合させることが可能ないかなる組成物でもよい。そのような支持体の表面は、固体または多孔性およびいかなる都合のよい形状であってもよい。受容体が結合する適した不溶性支持体の実例には、ビーズ、例えば、磁性ビーズ、膜およびマイクロタイタープレートが含まれる。これらは典型的にガラス、プラスチック（例えばポリスチレン）、多糖類、ナイロン、またはニトロセルロースから作られる。マイクロタイタープレートは、少量の試薬および試料を用いて多数のアッセイを同時に実行できるため、特に便利である。
【００４７】
次に、患者試料の溶解物を個別に、抗体を含むアッセイ可能な支持体に加える（例えば、マイクロタイタープレートの別々のウェル）。好ましくは、既知濃度の正常および／または異常TSG101を含む一連の標準物質を、試料と平行して、そのアリコートを対照としてアッセイする。好ましくは、各試料および標準物質は、それぞれについて平均値が得られるよう、複数のウェルに加える。インキュベーション時間は結合に十分な時間でなければならず、一般的に0.1〜３時間で十分である。インキュベーション後、一般に不溶性支持体から非結合成分を洗い流す。一般に、適当なpH、一般的には７〜８の希釈した非イオン性洗浄培地を洗浄培地として用いる。試料中に存在する非特異的結合蛋白質を完全に洗浄するのに十分量で、１〜６回の洗浄を用いてもよい。
【００４８】
洗浄後、第二抗体を含む溶液を加える。抗体は、存在するその他の成分と識別できるように、TSG101に対して十分な特異性で結合する。直接または間接的な結合の定量を容易にするために、第二抗体を標識してもよい。受容体第二結合の直接測定を可能にする標識の実例には、３Hまたは１２５Iのような放射性標識、蛍光剤、色素、ビーズ、化学発光剤、コロイド粒子等が含まれる。結合の間接測定を可能にする標識の実例には、基質により着色または蛍光産物が提供されうるような酵素が含まれる。好ましい態様において、抗体は、適した基質を加えた後に検出可能な産物シグナルを提供することが可能な共有結合酵素で標識する。結合物に用いる適した酵素の実例には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ等が含まれる。市販されていない場合、そのような抗体酵素結合物は、当業者に既知の技術によって容易に作成される。インキュベーション時間は、標識リガンドが利用可能な分子に結合するために十分な時間でなければならない。一般に約0.1〜３時間で十分で、通常１時間で十分である。
【００４９】
第二結合段階の後、不溶性支持体から再度、非特異的結合材料を洗い流す。結合物によって生じるシグナルを従来の手段で検出する。酵素結合物を用いる場合、検出可能な産物が形成されるように適当な酵素基質を提供する。
【００５０】
その他のイムノアッセイは当技術分野で既知であり、診断に利用してもよい。オクタロニープレートにより、抗体結合の単純な定量法が提供される。ウェスタンブロットは、必要に応じてTSG101に特異的な検出システムを用いて、蛋白質ゲルまたはフィルター上の蛋白質スポットについて実施してもよく、サンドイッチアッセイに関して記述のような標識法を用いると都合がよい。
【００５１】
大量のTSG101蛋白質を産生させることによって、TSG101に結合し、その作用を調節または模するリガンドまたは基質を同定することができる。研究領域には、癌治療の開発が含まれる。薬物スクリーニングでは、異常細胞におけるTSG101機能の代用となる薬剤を同定する。腫瘍サプレッサーとしてのTSG101の役割は、その機能を模する薬剤が発癌の過程を阻害することを示している。ヒト細胞に対して毒性の低い薬剤のスクリーニングアッセイは特に重要である。標識したインビトロ蛋白質-蛋白質結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、蛋白質結合に対するイムノアッセイ等を含む、広く多様なアッセイをこの目的のために用いてもよい。精製蛋白質はまた、分子内相互作用、転写調節機能等のモデルとして用いることができる三次元結晶構造の決定に用いてもよい。
【００５２】
本明細書で用いられる「薬物」という用語は、TSG101の生理機能を変化または模する能力を有するいかなる分子、蛋白質、または薬剤をも表す。一般に、様々な濃度に対する異なる反応を得るために、多数のアッセイ混合物を異なる薬剤濃度で平行して実施する。典型的に、これらの濃度の一つを、陰性対照、すなわちゼロ濃度または検出レベル以下とする。
【００５３】
候補薬物は、無数の化学種を含み、典型的にはそれらは有機分子であるが、好ましくは分子量50以上約2,500ダルトン未満の小さな有機化合物である。候補薬物は蛋白質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基を含み、少なくとも化学官能基の少なくとも２つを含む。候補薬物はしばしば、環状炭素、またはヘテロサイクリック構造および／もしくは上記官能基の一つ以上が置換された芳香族もしくは多芳香族構造を有する。候補薬物はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはその組み合わせを含む生体分子にも認められる。
【００５４】
候補薬物は、合成または天然化合物のライブラリを含む広範囲の起源から得られる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、広範囲の有機化合物および生体分子のランダムな合成および指向合成には数多くの手段が利用できる。または、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形での天然の化合物のライブラリを利用でき、容易に産生される。さらに、天然または合成的に作製されたライブラリおよび化合物は、従来の化学、物理学、および生化学手段によって容易に修飾され、これを用いて組み合わせライブラリを作製してもよい。構造類似体を作製するため、既知の薬剤に、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等の指向性またはランダム化学修飾を行ってもよい。
【００５５】
スクリーニングアッセイが結合アッセイの場合、一つ以上の分子を、検出可能なシグナルを直接または間接的に提供することができる一つの標識に結合してもよい。様々な標識には、放射性同位元素、蛍光剤、化学発光剤、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば磁性粒子等が含まれる。特異的結合分子には、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンとアンチジゴキシン等のような対が含まれる。特異的結合物質に関しては、相補的物質は通常、既知の方法に従って検出される分子で標識される。
【００５６】
その他の多様な試薬をスクリーニングアッセイに含めてもよい。これらの中には、至適蛋白質-蛋白質結合を容易にし、および／または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を減少させるために用いられる塩、中性蛋白質、例えばアルブミン、洗浄剤等が含まれる。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等のような、アッセイ効率を改善する試薬を用いてもよい。必要な結合を提供する成分の混合物はいかなる順序でも加えられる。インキュベーションは適した温度で実施し、典型的には４〜40℃の間である。至適活性が得られるようインキュベーション時間を選択するが、同様に高速大量処理スクリーニングを容易にするために至適化してもよい。典型的には0.1〜１時間で十分である。
その他の重要なアッセイは、TSG101機能を模する薬物を検出する。例えば、機能的TSG101を欠如する細胞に候補薬物を加え、TSG101機能を再生する能力、例えば、軟寒天での3T3細胞の増殖阻害に関してスクリーニングする。
【００５７】
望ましい薬理活性を有する化合物は、生理学的に許容される担体において、tsg101機能の欠損に帰因する癌の治療のために宿主に投与してもよい。阻害剤は様々な方法で、経口、局所、非経口、例えば皮下、腹腔内、血管内等で投与してもよい。局所治療は特に重要である。投与様式に応じて、化合物は様々な方法で製剤化してもよい。治療的に活性な化合物の製剤中の濃度は、約0.1〜100重量％まで変化しうる。
【００５８】
薬学的組成物は、顆粒、錠剤、丸剤、座剤、カプセル剤、懸濁液、軟膏、ローション等の様々な形状に調製することができる。経口および局所使用に適した薬学等級の有機または無機担体および／または希釈剤を用いて、治療活性化合物を含む組成物を作製することができる。当技術分野で既知の希釈剤には、水性基剤、野菜および動物油ならびに脂肪が含まれる。安定化剤、湿潤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、または適当なpH値を確保するための緩衝液、および皮膚透過増強剤を、補助剤として用いることができる。
【００５９】
遺伝子はまた、遺伝子療法のために用いてもよい。遺伝子導入に有用なベクターにはプラスミドおよびウイルスベクターが含まれる。特に重要なのは、レトロウイルスに基づくベクターで、例えば、モロニーマウス白血病ウイルスおよび修飾ヒト免疫不全ウイルス；アデノウイルスベクター等である。正常な遺伝子を適した細胞にトランスフェクトさせることによって、遺伝子療法を用いて癌様病変、罹患胎児等を治療してもよい。広範囲のウイルスベクターを、トランスフェクションおよび細胞のゲノムへの遺伝子の安定的な組み込みのために用いることができる。または、遺伝子を宿主細胞に導入するために、微量注射法、融合等を用いてもよい。例えば、ダワンら（Dhawan）（1991）Science 254:1509〜1512およびスミスら（Smith）（1990）Molecular and Cellular Biology 3268〜3271を参照のこと。
【００６０】
遺伝子の同時破壊
本発明はまた、遺伝子機能のホモ接合不活化によって生じた表現型に基づいて、哺乳類細胞のランダム染色体座にある遺伝子の同定法を提供する。該方法には、遺伝子のその他のコピー、またはそれらのDNA配列において実質的に同様の遺伝子の対立遺伝子の同時不活化が含まれ、続いて、遺伝子およびその対立遺伝子の不活化の結果、野生型表現型と識別可能な細胞表現型が得られたか否かを決定することが含まれる。さらに、不活化遺伝子を含む染色体座を特定してもよい。
【００６１】
遺伝子の一つのコピーは、ランダムもしくは非選択染色体座または発現遺伝子とのその近位性のために選択される座でのDNA構築物の組み込みによって不活化される。ランダム染色体座に組み込まれる構築物には、トランス活性化因子に反応する転写開始領域配列が含まれる。転写は、プロモーターレス陽性選択マーカー遺伝子のコード領域とは反対方向に起こる。以降、転写開始領域に反応するトランス活性化因子を「TFプロモーター」と呼ぶ。この構築物が保有する陽性選択マーカー遺伝子は、構築物が内因性遺伝子プロモーターに関連して3'方向に組み込まれる場合に限って発現され、内因性プロモーターは陽性選択マーカー遺伝子方向の転写を指向する。陽性選択マーカー遺伝子の発現はまた、組み込みの座で内因性遺伝子の一部の発現産物との融合の有無によらず、活性な陽性選択マーカーを発現するためにはそれが正しいリーディングフレームにあることが必要であると思われる。
【００６２】
さらに、TFプロモーターは、培地に加えることができる因子によって活性化されるか、または宿主に導入される第二の構築物によってコードおよび発現されるトランス活性化因子によって活性化される。この因子は、TFプロモーターからのアンチセンスRNA転写を活性化させる働きをする。TFプロモーターからのアンチセンスRNA転写は、TFプロモーターの方向に対して3'方向に伸長し、マーカー遺伝子の挿入に対して5'方向の隣接染色体座の中に伸長する。TFプロモーターから始まるアンチセンスRNA転写産物の結合またはハイブリダイゼーションは、TFプロモーターから転写される染色体DNA配列およびアンチセンスRNAに相補的な配列と実質的に同様の配列を有するその他の対立遺伝子の発現を阻害する。（「同様の配列」とはメッセンジャーRNA配列の機能に認められ得る変化を提供するようメッセンジャーRNA配列に結合するのに十分な類似性を意味する）。このように、同一または酵素のイソ型を含む対立遺伝子蛋白質の全ての産生を阻害してもよい。
【００６３】
最初に、プロモーター不在マーカー遺伝子を有する構築物を導入することによって、構築物が活性に転写される遺伝子内に位置する可能性が高くなるように、マーカー遺伝子が発現されている細胞を選択することができる。これらの細胞を増殖させることによって、次にトランス活性化因子遺伝子を含む発現構築物の導入にこれらの細胞を用いてもよい。この発現構築物は、トランス活性化因子発現構築物を有する細胞を選択できるように、それ自身のマーカー遺伝子を有する。得られた細胞はたいてい、挿入構築物を含む遺伝子にコードされる構築物に対してアンチセンスの転写産物を転写する細胞であるはずで、その結果プロモーターレスマーカー遺伝子が組み込まれる座の全ての対立遺伝子によって、蛋白質の発現が阻害される。
【００６４】
次に、２つの構築物に関連するマーカーに関して選択された細胞を、遺伝子の不活化の結果野生型表現型とは識別可能な特に望ましい細胞表現型が得られるか否かを明らかにするためにスクリーニングしてもよく、または望ましい表現型を発現している細胞の選択を行うことができる。さらに、組み込まれた構築物の5'末端に隣接する染色体座を同定してもよい。
【００６５】
表現型について認められた変化がアンチセンス鎖の転写の結果としてであるか否かのさらなるチェックとして、アンチセンス鎖の転写は、表現型が修飾された細胞に第三の構築物を導入することによって逆転できる。この構築物は、リコンビナーゼ遺伝子によって認識される隣接コンセンサス配列がトランス活性化因子および／またはTFプロモーター構築物に存在すれば、その結果これらの要素の欠落が起こるようなトランス活性化因子遺伝子またはTFプロモーターを欠落させる役割を果たすリコンビナーゼ遺伝子配列を発現する発現構築物および適当と思われる構築物のその他の部分を含む。または、アンチセンスプロモーターのスイッチを切ることは、ホルモン、化学薬品、温度、またはその他の薬物によって制御されるプロモーターを用いることによって行うことができる。
【００６６】
方法は、TFプロモーターおよびトランス活性化因子蛋白質を発現する構築物を含む、通常導入が連続的である、遺伝子探索構築物の調製および哺乳類細胞への導入を含む。（「遺伝子探索構築物」とは、融合構築物が、内因性プロモーターと構築物の5'配列との間、構築物の5'配列とリポーター遺伝子の全体または機能的部分との間の内因性遺伝子のコード領域のいかなる部分も含むように、プロモーターレスリポーター遺伝子および、リポーター遺伝子に対して5'方向のDNAを起点とする融合転写物を産生しうる5'配列を意味する。「トランス活性化因子構築物」とは、転写開始領域、転写開始配列、TFプロモーターを活性化する蛋白質をコードするコード配列、ならびに翻訳および転写終結領域を含むDNA分子を意味する。この領域および配列の全てが、重要な宿主において機能的である）。プロモーターレスマーカー遺伝子およびトランス活性化因子反応性プロモーター（「TFプロモーター」）を含む第一の構築物（「遺伝子探索構築物」）は、プロモーターレスマーカー遺伝子のコード領域とは反対方向における転写を指向するが、これをまず細胞に導入して、細胞を増殖させ、プロモーターレスマーカー遺伝子を発現する細胞を選択する。この時、TFプロモーターは不活性で、プロモーターレスマーカー遺伝子の転写を妨害しないと考えられる。
【００６７】
マーカー遺伝子およびプロモーターを活性化するためにTFプロモーターに作用するトランス活性化因子を発現し、その結果アンチセンス鎖の転写が起こる第二の構築物もまた導入してもよい。アンチセンス鎖の転写は、遺伝子探索構築物に隣接する染色体DNAの中に伸長するため、隣接DNAのアンチセンス鎖と実質的に同様の配列を有するその他の遺伝子を不活化する働きをする。遺伝子探索構築物を有するそれらの細胞は、第一の構築物がプロモーターレスマーカー遺伝子を発現させる座に存在するため、表現型の変化に関してトランス活性化をスクリーニングまたは選択する条件下にある。
【００６８】
発現構築物の発現からトランス活性化因子によってTFプロモーターを活性化するより、例えば化合物のような薬物、または培地に加えられるもしくは例えば熱のような環境の変化として提供されるその他の刺激に反応するTFプロモーターを用いてもよい。例えばテトラサイクリンのような反応性要素、またはステロイドのようなホルモン性反応性要素を有する多くのプロモーターがあり、この場合、TFプロモーターのスイッチを入れる化合物、例えば、テトラサイクリン誘導体またはグルココルチコイドのようなホルモンを培地に加えることができる。
【００６９】
表現型の変化がアンチセンス配列の産生の結果としてであるか否かをさらに確立するため、欠落させる配列の間のDNA領域の欠落が起こる配列を有する少なくとも一つの構築物を提供することによって、アンチセンス配列の転写を逆転させてもよい。リコンビナーゼ発現構築物である第三の構築物を、マーカー遺伝子および欠落させるために欠落（excision）配列上で作用するリコンビナーゼをコードする遺伝子を含む宿主に導入する。次に細胞の表現型の逆転をスクリーニングし、その表現型がアンチセンス配列の産生の結果であったことを示してもよい。または、アンチセンスプロモーターまたはこのプロモーターのスイッチを入れるトランス活性化因子蛋白質の発現は、上記および下記の薬物の一つ以上を用いて制御することができる。
【００７０】
本発明で用いられるTFプロモーターまたはトランス活性化因子遺伝子の転写開始領域は、特定の出願によって必要とされるように、広範に変化しうる。TFプロモーターまたはトランス活性化因子遺伝子の転写開始領域は、適当に応じて誘導的または構成的のいずれであってもよく、シスもしくはトランスにおいて制御される可能性があるエンハンサー、リプレッサーまたはその他の制御配列を含んでもよい。制御はまた、培地に付加剤、例えば、テトラサイクリンまたは例えばグルココルチコイドのようなホルモンを加えた結果としてであってもよい。開始領域は、開始領域が宿主において機能的であるいかなる起源からのものであってもよい。このように、開始領域は、宿主の構造的遺伝子から、宿主において機能的なウイルス遺伝子から、またはそのようなプロモーター領域の組み合わせ、もしくは適当に応じて、合成プロモーター領域からのものであってもよい。プロモーター領域は、単一のプロモーター領域であってもよく（単一の遺伝子に関連する）または異なる遺伝子に関連する5'領域の組み合わせであってもよい。プロモーター領域は通常、特定のコード領域または遺伝子に望ましい転写レベルを提供するように選択される。哺乳類細胞において用いてもよいプロモーターには、SV40プロモーター、グルココルチコイド誘発性プロモーター、CMVプロモーター、β-アクチンプロモーター等が含まれる。コード領域または遺伝子は、開始領域の転写および翻訳制御下にある。同様に、遺伝子からの転写方向の下流に翻訳および転写終結領域がある。たいていの場合、終結領域は発現の機能には重要でないため、多様な宿主遺伝子、宿主において機能的なウイルス遺伝子等からの多様な終結領域を用いてもよい。
【００７１】
アンチセンスRNAを産生するため、トランス活性化因子もしくはその他の誘発剤と結合した場合またはプロモーターの活性化に必要な条件を除き、細胞内では活性でないプロモーターを用いる。（誘発可能プロモーターに関しては上記の考察を参照のこと）。この因子は転写の開始に必要で、宿主細胞に導入される第二の構築物によって、もしくは適当な薬剤を加えることによって、またはTFプロモーターの活性化に適当な条件を提供することによって、供給できる。転写の誘導がトランス活性化因子蛋白質を必要としない場合には必要でなくなる発現構築物では、望ましくはDNA結合ドメインと転写因子とを組み合わせ、直接または間接的にRNAポリメラーゼIIに結合するキメラ蛋白質を用いて、TFプロモーターに対するトランス活性化因子の強い結合を確実に得ることができる。DNA結合ドメインは、望ましくは、哺乳類細胞には存在しないDNA配列に結合し、したがって、内因性哺乳類プロモーターでは結合しないと予想される。DNA結合ドメインは、転写因子と宿主哺乳類細胞の転写機構との相互作用のためのRNAポリメラーゼII結合部位に近づくように転写因子を指向しながら、トランス活性化因子と独自のDNA配列との強力な結合を可能にする。
【００７２】
トランス活性化因子を発現している発現構築物のマーカー遺伝子は、単一の遺伝子であってもよく、または別に選択してもよい２つの異なるマーカーを含む融合遺伝子であってもよい。単一の遺伝子マーカーは、G418耐性を提供することができるneoを含む。組み合わせ遺伝子は、lacZおよびG418耐性、ヒグロマイシン耐性（hyg）を提供するアミノグリコシドフォスフォトランスフェラーゼ（aph）ならびにヒグロマイシンに対する耐性とガンシクロビルに対する感受性を提供する単純ヘルペスチミジンキナーゼ（TK）遺伝子を含んでもよい。
【００７３】
トランス活性化因子蛋白質のDNA結合ドメインは、通常標的宿主に対して異物である宿主からのもので、宿主においてDNA結合蛋白質によって認識されにくいように、通常単細胞微生物、昆虫、植物等からのものであり、一方転写活性化ドメインは、宿主、または標的宿主RNAポリメラーゼIIに結合する因子を提供するような他の起源からのものである。DNA結合ドメインは、細菌細胞から単離されたDNA-結合蛋白質に由来し、転写活性化ドメインは、共通の属、例えば哺乳類宿主では哺乳類細胞からのRNAポリメラーゼIIに結合する転写活性化ドメインに由来すると都合がよい。
好ましい態様において、トランス活性化因子は、lacリプレッサーのDNA結合ドメインをそのアミノ末端で含み、そのカルボキシ末端では単純ヘルペスウイルスビリオン蛋白質16（VP16）からの転写活性化ドメイン等を含む。
【００７４】
プロモーターレスマーカー遺伝子を含む第一のDNA構築物もまた、「ノックアウト」構築物と呼んでもよい。このノックアウト構築物には、トランス活性化因子によって結合されるDNA配列を含むTFプロモーターが含まれる。トランス活性化因子遺伝子または第二の構築物を含む発現構築物は、第一の構築物の一部となることができ、または最初に導入することができるが、この場合は、産生され、マーカーの発現を妨害する可能性があるアンチセンスRNAのために複雑になることなく、遺伝子座での適当な組み込みおよびその後の増殖ができるよう細胞を選択することができない。したがって、トランス活性化因子遺伝子が誘導可能でなければ、ノックアウト構築物の組み込みのために選択後にトランス活性化因子遺伝子の転写が開始されるように、プロモーターから下流に第一の構築物を組み込んだ細胞を選択した後、第二の構築物を導入することが望ましい。
【００７５】
TFプロモーターは典型的には、トランス活性化因子のDNA結合ドメインによって堅固に結合される、反復配列を含む領域を２個以上、通常約５個以上20以下、および好ましい態様では14個有する。さらに、TFプロモーターは、RNAポリメラーゼIIを転写開始ドメインと密接な関係に配置するために、宿主細胞のRNAポリメラーゼIIと結合するプロモーター配列を含む。好ましい態様において、トランス活性化因子に反応するプロモーター配列は、SV-40初期転写プロモーターでは典型的に認められるエンハンサー配列およびGCに富む配列を欠損しているが、なおもRNAポリメラーゼに結合することができる最小のSV40-プロモーター、およびプロモーターから上流に位置する、間隔をあけた一連のlacオペレーターを含む。
【００７６】
lacオペレーター配列は、転写開始領域でlacリプレッサーDNA-結合ドメインの強い結合を引き起こす。最小のSV-40プロモーターは、TFプロモーターからの転写を増強するためにキメラ蛋白質の転写因子にも結合しているRNAポリメラーゼIIに結合する。
転写開始領域は、転写開始領域から始まったRNA転写がその5'末端でノックアウト構築物と隣接する染色体座まで伸長し、そこからmRNAが転写されるセンス鎖と相補的になるように、非コード鎖上のアンチセンス転写物を提供するように指向する。
【００７７】
ノックアウト構築物はまた、陽性選択マーカーのためのコード領域配列を含む。「コード領域配列」という用語は本来、プロモーターを有さないポリペプチドのコード領域を指す。コード領域配列は、その中に遺伝子探索構築物が組み込まれる遺伝子のエキソンを有するコード領域配列の融合を可能にするように位置し、通常TFプロモーターの転写方向に関して上流（5'方向）である。コード領域配列は、TFプロモーターの下流にあると都合がよく、コード領域配列が染色体エキソンにスプライシングされる場合、TFプロモーターを除去するように位置するスプライシング部位を用いてもよい。陽性選択マーカーコード領域配列がプロモーターを欠損し、トランス活性化可能なアンチセンスプロモーター領域配列が反対方向を指向するため、選択マーカーコード領域配列は、ノックアウト構築物が内因性遺伝子プロモーターの下流に組み込まれた場合に発現されるに過ぎない。さらに、遺伝子の翻訳部分の中に組み込まれる場合には、コード領域は活性陽性選択マーカーおよび遺伝子の切断ポリペプチドを含む融合蛋白質を形成するために、正しいリーディングフレーム内にある必要がある。これは、１つ以上の翻訳リーディングフレームにおいて、陽性選択マーカーに対して5'方向にスプライシングアクセプター配列を含むことによって行うことができる。
【００７８】
選択的に、ノックアウト構築物は、TFプロモーターの中または下流に存在してもよいが、陽性選択マーカー領域の上流通常約20塩基対以下の位置にスプライシングアクセプター配列を含む。スプライシングアクセプター配列は、ノックアウト構築物が染色体遺伝子のイントロンまたは3'UTRで組み込まれる場合には有用で、前駆RNAをスプライシングしてmRNAに陽性選択マーカー遺伝子配列を組み入れるために用いられる。コード配列が5'UTRに組み入れられる場合、コード配列は開始コドンを含む。
【００７９】
3'スプライシング部位を有するノックアウト構築物は、3'-スプライシング部位から上流または下流（下流の場合、TFプロモーター配列はコード領域配列と同期して停止コドンを欠損すると思われる）；3'-スプライシング部位；およびコード領域配列のTFプロモーターで構成されるものでもよい。
【００８０】
組み込みを行うには、裸のDNAを宿主細胞に導入してもよい。好ましくは、例えば、自己不活化モロニーマウス白血病ウイルスのような組み込みウイルス、アデノウイルス、トランスポゾンおよびトランスポゾアーゼ等の、組み込みを増強する構築物が用いられる。または、DNAの組み込みは電気穿孔によって裸のDNAの導入後に達成することができる。組み込みに用いられる特定のベクターに応じて、ベクターが配列嗜好性を有するか否かに応じて、組み込みは多かれ少なかれランダムであってもよい。レトロウイルス挿入は、レトロウイルス組み込み配列を有する遺伝子への組み込みが幾分多くなるように、活性に転写される領域にいくぶん嗜好性を示すことに注目すべきである。
【００８１】
第一および第二構築物の哺乳類細胞における安定的な維持および上記のランダム染色体座でのノックアウト構築物の組み込みは、プロモーターレスマーカー遺伝子が内因性プロモーターの転写構築物の下で配置される場合には、（i）陽性選択マーカーコード領域配列の発現、および（ii）トランス活性化因子発現または利用率との組み合わせで、TFプロモーターに関連して遺伝子座の5'領域に伸長する転写開始領域配列活性化アンチセンスRNA転写と因子との結合、が起こる。
【００８２】
遺伝子の一つのコピーは、ノックアウト構築物のその配列への挿入によって不活化される。アンチセンス転写物と類似の、特に相補的な、遺伝子の他のコピーの発現は阻害される。アンチセンスRNAは、アンチセンスRNA転写物と類似の細胞RNAと二本鎖を形成する。二本鎖形成はそのような細胞RNAの機能を阻害する。関連遺伝子のそのような不活化は、細胞の表現型の変化を引き起こしてもよい。
【００８３】
表現型の変化がアンチセンスRNA産生に関連するか否かを調べるために、RNAアンチセンスの産生を逆転させる。選択的に、第一および／または第二構築物は、アンチセンス配列の産生に関連する領域範囲を定める２つの部位特異的組換え部位を含んでもよい。すなわち、それらは、TFプロモーターおよび／またはトランス活性化遺伝子配列の範囲を定めてもよい。好ましくは、これらの部位はトランス活性化因子遺伝子配列またはその機能的部分、例えば、プロモーターまたはコード領域の範囲を定める。アンチセンスRNAの産生に関連する配列を欠落させるため、リコンビナーゼ遺伝子を含む第三のDNA構築物（リコンビナーゼ発現構築物）を調製し、第一および第二構築物を含む宿主に組み込んでもよい。マーカー遺伝子もまた、その中にリコンビナーゼ構築物が組み込まれている細胞を選択するために、構築物の一部として提供されてもよい。これらの選択された細胞を増殖させ、表現型の変化に関してスクリーニングする。または、トランス活性化因子が細胞に外因性として提供される場合、培地または環境を変化させてアンチセンス配列の転写を停止させてもよい。もう一つの代法は、ホルモン、Tc等を用いることによってアンチセンス（TF）プロモーターを制御することである。
【００８４】
トランス活性化因子の除去による制御が望まい場合、欠失に対するコンセンサス配列間の配列は、特にトランス活性化因子を発現している遺伝子と結合した陰性選択マーカーを有する。リコンビナーゼ遺伝子の発現は典型的には、トランス活性化因子の遺伝子および陰性選択マーカーの遺伝子を含むトランス活性化因子構築物のDNAの断片の欠落を引き起こす。次に陰性選択マーカーの発現が欠如している細胞を選択してもよい。
【００８５】
リコンビナーゼは、部位特異的組換え部位によって範囲を定められるいかなるDNA配列の欠落をも引き起こす酵素である。これらの部位特異的組換え部位は、典型的に20〜100塩基対の配列で、通常約30〜50塩基対の配列であり、宿主細胞に対して外因性である。部位特異的組換え部位は、重複領域で逆方向に２つのリコンビナーゼ認識配列を含む。組換え部位は、反復配列としてセグメント欠落を引き起こすよう指向される。リコンビナーゼは、cre蛋白質、int蛋白質およびFLP蛋白質を含むインテグラーゼ蛋白質ファミリーのメンバーであってもよい。
【００８６】
哺乳類細胞にリコンビナーゼが発現されれば、２つの部位特異的組換え部位によって範囲が定められ、望ましくはトランス活性化因子コード領域配列を含むDNA断片の欠落を引き起こす。したがって、トランス活性化因子はもはや発現されず、アンチセンスRNA転写はノックアウト構築物によってもはや開始されない。典型的に、遺伝子の２つ以上のコピーが存在する場合、細胞表現型は野生型表現型に戻るはずで、そうすれば表現型のこれまでの変化はアンチセンス配列の産生の結果としてであった。
【００８７】
全てのDNA構築物は、異なる構築物遺伝子を有する哺乳類細胞において構築物の挿入をモニターする、および構築物配列を有さない他の細胞を実質的に含まないそのような細胞の選択を可能にする、選択マーカー遺伝子配列を含む。陽性選択マーカー遺伝子は、本構築物が導入される標的細胞の選択を可能にする遺伝子配列である。陽性選択マーカー遺伝子は、G418に対する耐性のためのneo遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子等が含まれる。陰性選択マーカー遺伝子は典型的に、機能的tk遺伝子を含む細胞に及ぼすその細胞障害効果のために、その発現がアシクロビルまたはガンシクロビルのようなヌクレオシド類似体の使用によって検出することが可能な、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（tk）遺伝子である。
【００８８】
先に考察したように、ノックアウト構築物は陽性選択マーカーを発現する細胞を選択するために、陽性選択マーカーに対するコード領域配列を含む。陽性選択マーカーは、それが内因性プロモーターに関して下流に位置する場合に限って発現され、またコード領域と融合されている場合には本来の蛋白質とインフレームで融合される。
【００８９】
トランス活性化因子構築物は陽性選択マーカーを発現する細胞を選択するために陽性選択マーカー遺伝子を含む。トランス活性化構築物はまた、リコンビナーゼの存在下で構築物から欠落されるDNA断片における陰性選択マーカー遺伝子を含んでもよい。このようにして、トランス活性化因子遺伝子配列を含むDNA断片の欠落をモニターする。
【００９０】
さらに、構築物は構築物の操作に必要なその他の配列を含んでもよい。例えば、制限部位は構築物における配列の操作に必要である。存在しうるその他の配列には、DNAを増幅するためのプライマー開始配列、クローニング起点、クローニング宿主のマーカー、宿主染色体への組み込みを助ける配列等が含まれる。
【００９１】
構築物は構築物を哺乳類細胞に導入するためのベクターに含めてもよい。ベクターをレトロウイルス感染によって細胞内に導入する場合、これらの配列は長い末端反復配列およびパッケージングシグナルを含む。導入ベクターが哺乳類細胞においてエピソーム的に複製するものであれば、ベクターは複製のウイルス起点を含む。
【００９２】
本発明によれば、ノックアウトおよびトランス活性化因子構築物のいずれも通例、標的哺乳類細胞に導入される。特に、哺乳類細胞は、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、例えば一連のヒト細胞、ウサギ細胞等である。植物細胞、昆虫細胞、魚細胞、真菌細胞等のその他の真核細胞宿主もまた用いてもよい。哺乳類細胞は正常細胞であってもよく、分化した状態または、例えば幹細胞のような未分化の状態であってもよい。または、細胞を裸のDNAでトランスフェクトさせてもよい。好ましくは、細胞は培養で維持可能で、新しい遺伝子材料の導入が可能である。
【００９３】
構築物は既知の方法に従って、標的細胞の中に導入してもよい。例えば、構築物はレトロウイルス感染、電気穿孔、融合、ポリブレン、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿DNA、またはその他の従来の技法によって導入してもよい。特に、ノックアウト構築物は、ゲノムにおける構築物の非常にランダムな組み込みのために、ウイルス感染によって導入される。トランス活性化構築物は、上記のいずれの方法によっても細胞内に導入される。各構築物を標的哺乳類細胞に導入後、選択培地で細胞を増殖させ、選択マーカーを発現していない細胞と実質的に遊離した、適当な選択マーカーを発現している細胞を選択する。例えば、ネオマイシンコード領域配列を含むノックアウト構築物を注入した細胞は、G418を含む培地中で増殖し、ヒグロマイシン耐性遺伝子配列を含むトランス活性化構築物を注入した細胞は、ヒグロマイシンを含む培地中で増殖する。
【００９４】
第一の陽性選択マーカーコード配列が安定的に発現されれば、ノックアウト構築物が内因性プロモーターの下流の染色体座に組み込まれていることが示される。第二の陽性選択マーカー遺伝子配列が安定に発現されれば、トランス活性化構築物が細胞に安定的に導入されていることが示される。
【００９５】
ノックアウト構築物を注入され、両陽性選択マーカーを安定的に発現している細胞を野生型表現型とは識別可能な細胞表現型に関してアッセイする。タイプの異なる表現型は、増殖パターンおよび必要条件の変化、感染剤または化学物質に対する感度または耐性、分化能力または分化特性の変化、形態変化、環境変化、例えば物理的変化または化学的変化に応答した変化、遺伝子修飾に応答した変化等を含んでもよい。
【００９６】
例えば、細胞表現型の変化は、正常細胞増殖から非調節細胞増殖への変化であってもよい。細胞は、非調節細胞増殖を検出するいかなる簡便なアッセイによってスクリーニングしてもよい。用いられる一つのアッセイは、ブロモデオキシウリジン（BrdU）によるメチルセルロースアッセイである。有効なもう一つのアッセイは、寒天での増殖の利用（0.3〜0.5％濃化剤）である。腫瘍形成性を調べる試験もまた用いてもよく、この場合、細胞を易感受性宿主、例えば免疫抑制性宿主に導入し、腫瘍の形成を調べてもよい。
【００９７】
または、細胞表現型の変化は、正常な代謝状態から、異常な代謝状態への変化であってもよい。この場合、アミノ酸、糖、共因子等の細胞の増殖のための代謝必要条件に関して細胞をアッセイする。まず、約10個の異なる代謝物を一度にスクリーニングして、異なる代謝物の利用度をアッセイしてもよい。そのような代謝物の非存在下では細胞は増殖しないような、細胞増殖を可能にする一群の代謝物を同定すれば、代謝物を個々にスクリーニングしてどの代謝物が同化可能か、または必須であるかを特定する。
または、細胞表現型の変化は、細胞構造の変化であってもよい。そのような場合、細胞は光学または電子顕微鏡下で目で見て調べてもよい。
【００９８】
細胞表現型の変化は細胞の分化プログラムの変化であってもよい。例えば、筋芽細胞から成熟筋繊維への分化を調べることができる。筋芽細胞の分化は、増殖培地の適当な変化によって誘発することが可能で、成熟筋繊維において高レベルで発現されているミオシンおよびトロポニンのような特異的ポリペプチドの発現を測定することによってモニターすることができる。
【００９９】
細胞表現型の変化は、細胞の特異的分化プログラムの実行の変化であってもよい。例えば、神経堤に由来する細胞は、グルココルチコイドに暴露すると、副腎クローム親和性細胞となる。しかし、その代わりに細胞を繊維芽細胞増殖因子または神経生長因子に暴露すると、細胞は最終的に交感神経アドレナリン作動性神経細胞となる。アドレナリン作動性神経細胞をさらに、毛様体神経栄養因子または白血病阻害因子に暴露すると、細胞はコリン作動性神経細胞になる。したがって、本発明の方法によってトランスフェクトさせた細胞は、グルココルチコイドまたはいかなる因子のいずれかに暴露することができ、異なる分化経路に対する細胞の実行の変化は、様々な細胞タイプに関連するポリペプチドの発現に関してアッセイすることによってモニターすることができる。
【０１００】
表現型の変化を確立した後、ノックアウト構築物DNAに隣接する染色体領域は、非方向性PCRの場合にはプライマーとして構築物配列を用いて、または双方向性PCRの場合には縮重プライマーと結合した構築物配列を用いて、PCRにより同定してもよい。次に配列を用いて、領域が単離およびシークエンシングされるように、その座のcDNAまたは染色体ライブラリを調べてもよい。または、アンチセンスRNAによってノックアウトされた領域をシークエンシングしてもよく、十分に大きい領域が同定されれば、コード領域をセンス方向に用いてポリペプチド配列を得てもよい。次に、得られたペプチドを抗体産生に用いて、特定の蛋白質を単離してもよい。同様に、ペプチドをシークエンシングして、ペプチド配列を既知のペプチド配列と比較して、その他の既知のポリペプチドとのいかなる相同性も決定してもよい。本方法によって、プローブとして用いることができる配列が得られるようなその座に位置するマーカーが提供されるため、およびある場合には、抗体産生のための蛋白質断片が発現されるため、その座にある遺伝子および該遺伝子によって発現される蛋白質を同定するのに、様々な技術が用いられうる。必要に応じて、蛋白質をさらなる特徴付けのために調製および精製してもよい。
【０１０１】
本方法は、もう一つの局面において、遺伝子配列の少なくとも一部が既知の場合に遺伝子の機能を同定するために用いられる。該方法には、遺伝子の特異的対立遺伝子の不活化に関連した、細胞表現型の変化または機能の喪失を調べるために、両遺伝子コピーを不活化すること含まれる。
【０１０２】
本方法には、プロモーター領域配列および陽性選択マーカーコード領域配列のいずれをも含むノックアウト構築物の調製が含まれる。さらに、構築物は、プロモーター領域配列および陽性選択マーカー配列の範囲を定める２つの相同な組換え部位を含む。これらの相同組換え部位は既知の遺伝子の配列と相同で、２つの組換え部位に隣接するノックアウト構築物配列の既知の遺伝子への挿入を可能にする。
【０１０３】
これらの相同組換え部位は、典型的に、約２ kbp以下、通常１ kbp以下であると考えられる。部位は典型的に0.05 kbp以上で、通常0.1 kbp以上であると考えられる。これらの組換え部位配列と標的配列との相同性の領域は、典型的に少なくとも約90％、通常95％以上であると考えられる。相同性領域は、好ましくは、エキソンのような遺伝子のコード領域内にある。
さらに、ノックアウト構築物は、その他の構築物が本発明の実施に必要とならないように、トランス活性化因子遺伝子配列を含んでもよい。
【０１０４】
遺伝子のコピーおよび関連する対立遺伝子は全て、発現を阻害されてもよいため、このアプローチを用いて、部分的配列のみが既知である場合、一つの遺伝子の対立遺伝子の発現を阻害してもよく、発現産物が表現型に対して効果を有するか否かを調べてもよい。このようにして、どの遺伝子かを知らなくとも、遺伝子の機能が重要であるか否かを簡便に調べることができる。
以下の実施例は、例示のために提供され、制限を目的とするものではない。
【０１０５】
実験
実施例１
下記の方法により、細胞増殖および分化の制御に関与する新しい遺伝子の同定および単離が可能となる。構築物の調製、哺乳類細胞形質転換法、非調節細胞増殖アッセイ、および新しい遺伝子の同定法を提供する。
【０１０６】
結果
遺伝子探索ベクターの実験的アプローチおよび構築
自己不活型モロニーマウス白血病ウイルス（MLV）（ホーレイら（Hawley）、PNAS USA（1987）84:2406〜2410；ブレナーら（Brenner）、PNAS USA（1989）86:5517〜5521）に由来するレトロウイルス遺伝子探索ベクターであるpLLGSVは、β-geo（フリードリッヒ&ソリアノ（Friedricha and Soriano）、Genes & Develop.（1991）5:1513〜1523）リポーター遺伝子を有する。このリポーターは、大腸菌lacZとアミノグリコシドフォスフォトランスフェラーゼ（aphまたは「neo」遺伝子）の融合体で、染色体プロモーターの後方の、転写的に活性な染色体DNA領域の中に組み込まれたウイルスを含む細胞を選択および特定するために用いられる、抗生物質G418に対する耐性をコードする。アデノウイルス由来スプライシングアクセプター（フリードリッヒ&ソリアノ（Friedricha and Soriano）、1991、前記）をβ-geoの5'末端に挿入して、染色体コードエキソンによってコードされる上流の転写物とβ-geo mRNAの融合を増強した。β-geoの5'方向および逆方向は、大腸菌lacZオペレーター14個（ラバウら（Labow）Mol.Cell Biol.（1990）10:3343〜3356）とのSV40初期T抗原最小プロモーターとの融合によって形成される制御プロモーターである；このプロモーターは転写活性を有さないが、大腸菌LacIリプレッサーのオペレーター結合ドメインおよび単純ヘルペスウイルストランス活性化ドメインVP16を含む、トランス活性化因子Lap348（ラバウら（Labow）上記（1990））によってトランスで非常に活性化することができる。システムは、挿入された遺伝子探索ベクターを有する対立遺伝子によってコードされるセンスRNAと相互作用するのみならず、同じ遺伝子の他の対立遺伝子によってコードされるセンスRNAとも相互作用するアンチセンスRNAを大量に産生するようにデザインされた。
【０１０７】
pLLGAVはまず、ヘルパー細胞（GP+E-86）にトランスフェクトし、感染性ウイルスを作製してNIH3T3細胞を感染させる。3T3細胞ゲノム全体において染色体プロモーター後方の転写的に活性部位で組み込まれたpLLGSVベクターを含むG418耐性NIH3T3細胞の集団を、トランス活性化因子ベクターpLLTXでトランスフェクトさせた。pLLTXは、Lap348および、ヒグロマイシン耐性（hyg）遺伝子と単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（TK）遺伝子（ラプトンら（Lupton）Mol.Cell.Biol.（1991）11:3374〜3378の融合体であるHyTKの双方をコードする。HyTKを発現しているトランフェクタントは、hygに耐性を示すが、ヘルペスTKを発現する細胞を特異的に殺すガンシクロビル（gcv）には感受性を示す。対照的に、HyTK発現の非存在下では、細胞はhyg-感受性およびgcv-耐性である。トランス活性化因子およびHyTK遺伝子に隣接するバクテリオファージP1からの２個のlox部位は、電気穿孔によってhyg耐性細胞の中に導入されたpRSV-creから発現されたlox-特異的リコンビナーゼ（ソウアー&ヘンダーソン（Sauer and Henderson）、Nature（1989）298:447〜451）であるCreによって細胞の染色体からLap348/HyTKセグメントの欠落を可能にする。Lap348/HyTKセグメントが欠落し、および制御プロモーターのスイッチがその後切られた細胞は、gcvに対するその耐性によって検出される。
【０１０８】
hyg耐性NIH3T3細胞を0.5％アガロースに播種し、形質転換表現型に関して選択、すなわちその不活化が細胞の形質転換に寄与している遺伝子を選択した。形質転換細胞からのCreによるLAP348の欠落により、トランス活性化因子欠失クローンを生じた。トランス活性化因子が存在する細胞の表現型とトランス活性化因子が欠失している細胞の表現型を比較すると、細胞の形質転換は、トランス活性化因子産生アンチセンスRNAに起因することがさらに確認される。トランス活性化因子欠失細胞を用いて、遺伝子探索ベクターを含む遺伝子のクローニングを行うことができる。
【０１０９】
形質転換表現型を示すクローンの単離
2.5×10８個のNIH 3T3細胞を、高力価の感染性ウイルスを産生する能力に関して選択したpLLGSV-トランスフェクトヘルパー細胞クローンの培養からのウイルス上清で感染させた。染色体に組み込まれたpLLGSVを含む感染細胞は、プレート上でG418耐性に関して選択するか、またはβーガラクトシダーゼ活性に関して蛍光活性化細胞ソーティング（ブレナーら（Brenner）1989、上記）によって回収した；細胞集団は、X-galによる深青染色の様々な程度を示すいずれかの方法によっても得られた。G418耐性に関して選択したレトロウイルス組み込みを含む５×10６個以上のクローンのプールを、電気穿孔によってトランス活性化因子ベクターpLLTXでトランスフェクトした；hyg耐性に関して選択したコロニーをプールし、0.5％アガロースに播種した。同様の大きさの非感染NIH 3T3集団の細胞は、この濃度のアガロース上にコロニーを形成しないが、pLLGSV感染集団は20個のコロニーを形成した。これらのクローンの一つ、SL6をトランス活性化因子を欠失する細胞を産生するためにpRSV-creでトランスフェクトさせた細胞株（SL6ΔT細胞）において増殖させた。SL6およびSL6ΔT細胞をいずれもヌードマウスの皮下に注入すると、SL6細胞のみが非常に腫瘍形成性であった。SL6ΔT細胞はマウス１例において小さい腫瘍を形成したが、対照NIH3T3細胞もpLLTXのみでトランスフェクトさせたNIH3T3細胞もいかなる腫瘍も形成しなかった。SL6細胞のみが肺への自然発生転移を生じた。SL6、SL6ΔTおよび対照細胞を0.5％アガロースに再度播種すると、SL6細胞のみが大きいコロニーを形成した。トランス活性化因子によるリポーター遺伝子発現の制御を調べるため、SL6およびSL6ΔT細胞をβ-ガラクトシダーゼ活性に関してアッセイした（表１）。トランス活性化因子がSL6細胞に存在する場合、リポーター遺伝子の発現は、バックグラウンド対照細胞と比較してシャットオフによってほぼ完全であった；トランス活性化因子をSL6Δ6細胞におけるcre-lox組換えによって除去すると、リポーター遺伝子は高度に発現された。これらの結果は、トランス活性化因子産生アンチセンスRNAが、遺伝子発現を有効に不活化することができることを示している。
【表１】
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a  トリプリケートの平均値。
b  トランス活性化因子を有さないSL6によって形成されたコロニーは、トランス活性化因子を有するSL6によって形成されたコロニーより有意に小さかった。
c  マウスを32日目に屠殺して、組織学によって肺転移を確認した。
【０１１０】
1.3 kb neo断片プローブを用いたSL6細胞のゲノムサザンブロットは、pLLGSV１個の染色体組み込みを示した；リポーター遺伝子および制御プロモーターのいずれも、レトロウイルスのライフサイクルに従って忠実に複製された。5'β-geoの550 bp断片をプローブとして用いてSL6ΔTから単離されたポリ(A) RNAのノザンブロットは、長さ７ Kbの主要な転写物、ならびに7.5 Kbおよび6.5 Kbの２つの転写物を少量示した。クローニングした遺伝子とのハイブリダイゼーションにより、７ Kbおよび6.5 Kb転写物は、リポーター遺伝子および、ベクター外部の染色体上に位置するプロモーターで始まるmRNAの融合転写物であった。cDNAクローニングの間（下記参照）、本発明者らはまた、その中でプロウイルス中のリポーター遺伝子の第二コピーのスプライシングアクセプター部位が、最初のリポーター遺伝子のいくつかの隠れたスプライシングドナーにスプライシングされる、代替的な多くのスプライシングされたcDNA産物を単離し、そのような異常スプライシングの結果、これまでに認められたように、ノザンブロットにおける多数の転写物が生じる可能性がある（フリードリッヒ&ソリアノ（Friedricha and Soriano）、1991、前記）。
【０１１１】
cDNAクローニングおよび配列分析
β-geoの5'末端に対応するビオチン標識オリゴデオキシリボヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーションによってSL6ΔT細胞からのβ-geo融合mRNAを選択した；ハイブリダイズさせたmRNAを、ストレプトアビジンコーティング常磁性粒子を用いて精製し、逆転写して、二本鎖cDNAに変換し、大腸菌プラスミドpAmp1にクローニングし、定法によってシークエンシングした。新規配列の70 bpを含む、クローニングされた120 bpのcDNAセグメントをβ-geoに対して5'のスプライシングアクセプター部位にインフレームで融合した。BLASTプログラムを用いたデータベース探索（アルトシュルら（Altshul）、J.Mol.Biol.（1990）215:403〜410）は、F9マウス胎児癌細胞の分化の間に発現されることによって特定される未知機能のマウス部分的cDNA配列と97％の同一性を示した（ニシグチら（Nishiguchi）（1994）J.Biol.Chem.116:128〜139）。
【０１１２】
マウスNIH 3T3細胞cDNAライブラリを70 bpのcDNAプローブでスクリーニングして完全長の遺伝子を得た。４個の陽性クローンを単離し、全てが43,108 kDaの予想されるアミノ酸381個の蛋白質をコードする1148 bpのオープン翻訳リーディングフレーム（ORF）を含んだ。この配列によって定義される遺伝子を腫瘍易罹患性遺伝子101（tsg101）と命名した。仮のATG翻訳開始コドンの上流にアデノシン残基３塩基が続く、翻訳開始のコンセンサス配列となりうる配列は、tsg101の5'末端近傍に位置した。スプライシングドナーコンセンサス配列（AG）は、分析したcDNA配列の72ヌクレオチドおよびATGのコドン４個下流に認められた。
【０１１３】
完全長のtsg101 cDNAの配列およびTsg101蛋白質の予想されるアミノ酸配列を用いて、BLASTプログラムを用いて、国立バイオテクノロジー情報センターの非重複DNAおよび蛋白質配列データベースを探索した。この分析により、tsg101のアミノ酸231〜301が、スタスミンと相互作用する蛋白質の発現能によって特定された部分的cDNAクローンによってコードされるヘリックスドメインである、cc2に２つのミスマッチがあることを除いては同一であることが示された（モーキュアーら（Maucuer）、PNAS USA（1995）92:3100〜3104）；進化的に保存されたリン酸蛋白質は、組み込みおよび細胞増殖を制御する多様なシグナルの中継に関係した（ソーベル（Sobel）、Trends Biochem.Sci.（1991）16:301〜305）。ストック（Stock）と彼の同僚のアルゴリズム（ラパスら（Lupas）、Science（1991）252:1162〜1164）は、〜99.8％の確率で、Tsg101のヘリックスドメインが高次コイル構造を形成すると予想する。完全長のTsg101の蛋白質パターン探索により、Tsg101の高次コイルドメイン内にロイシンジッパードメインを同定し、これはるcc2ドメインに関して認められたスタスミンと相互作用能と一致する。さらに、７個の考えられる蛋白質キナーゼCリン酸化部位（アミノ酸 11、38、85、88、215、225、357）、考えられる５個のカゼインキナーゼIIリン酸化部位（aa 38、210、249、265、290）、考えられる２個のN-ミリストイル化部位（aa 55、156）、および考えられる３個のN-グリコシル化部位（aa 44、150、297）がTsg101に存在した（バイロック&ブッチャー（Bairoch and Bucher）、Nucleic Acids Res.（1994）22:3583〜9）。蛋白質モチーフ探索（プリンツ（Prints）、リーズ大学、イギリス）により、Tsg101のアミノ酸37〜46が、バクテリオファージ1リプレッサーのヘリックス-ターン-ヘリックス特徴ドメイン（すなわち、HTHLAMBDA）に類似していること（ブレナン&マシューズ（Brennan and Matthews）、J.Biol.Chem.（1989）264:1903〜1906）およびアミノ酸73〜83が真菌のZn-cys双核集団特徴（FUNGALZCYS）（パン&コールマン（Pan and Coleman）、PNAS USA（1990）87:2077〜2081）に類似しているとが示された。
【０１１４】
tsg101センスおよびアンチセンスRNAの発現は無傷のNIH3T3細胞の形質転換を引き起こす
tsg101の細胞増殖における役割を確認するため、本発明者らは、無傷のNIH3T3細胞のセンスおよびアンチセンス方向におけるtsg101の過剰発現の効果を調べた。いずれの場合でも、tsg101配列は、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの調節下で安定にトランスフェクトされた細胞において発現された。センスまたはアンチセンス方向のいずれかにtsg101が発現されれば、0.5％アガロース上にコロニーを形成する能力によって示されるように、無傷のNIH3T3細胞の形質転換が起こった。インサートを欠くベクターでトランスフェクトさせた細胞または偽のトランスフェクト細胞ではコロニーが認められなかった。
【０１１５】
実験手順
ベクターの構築
自己不活化レトロウイルス遺伝子探索ベクターpLLGSVを構築するため、β-geoリポーター遺伝子およびリポーターの5'方向にスプライシングアクセプター配列を含む、pSAβ-geoからの4.3 kbのXhoI-XhoI断片（フリードリッヒ&ソリアノ（Friedrich and Soriano）、Genes & Develop.（1991）5:1513〜1523）を、Tth111IおよびXbaIで消化したpACYC184プラスミド（チャン&コーエン（Chang and Cohen）、J.Bacteriol.（1978）134:1141-1156）のXhoIリンカー部位にライゲーションした。次にpACYCのNheI部位を欠失させ、β-geoリポーター遺伝子に対して5'方向のXhoI部位をリンカー挿入によってNheI部位に変換した；14個のlacオペレーター反復配列およびpL14CATからのSV40最小プロモーター配列（ラバウら（Labow）、1990、前記）を含む1.45 kbのPvuII-StuI断片をスプライシングアクセプター部位の5'方向のSpeIおよびβ-geoとは反対方向のβ-geoに導入した。β-geoのポリアデニル化シグナルはXbaI消化によって欠失され、NheIリンカーで置換された。次に、5.4 kbのNheI-NheI断片をレトロウイルス転写と同じ方向の、NheI部分消化の後pHHAM（ホーレイら（Hawley）PNAS USA（1987）84:2406〜2410）の欠失した3' LTRのNheI部位にライゲーションした。
【０１１６】
トランス活性化因子ベクターpLLTXはpHCMVLAP348に由来した（ラバウら（Labow）、Mol.Cell.Biol.（1990）10:3343〜3356）。トランス活性化因子の3'末端のHindIII部位をまず欠失させ、HyTK遺伝子発現カセットを含む1952 bp SfiI断片（ラプトンら（Lupton）、Mol.Cell.Biol.（1991）11:3374〜3378）をトランス活性化因子の上流のHindIII部位にライゲーションして、pLAPHyTKを生じる。pBS30に由来する２つの直接的に繰り返すloxP部位を含む200 bpのDNA断片（ソウアー&ヘンダーソン（Sauer and Henderson）、Nucleic Acids Res.（1989）17:147〜161）をpLAPHyTKのClaI部位に導入するとpLLTXを生じた。pBS30をまずSalIおよびBamHIで消化させ、HindIIIリンカーとライゲーションした；次に、ベクターをAatIIおよびXhoIで消化させ、２つの直接的に繰り返すloxP部位を有するこの200 bp断片を産生する。この200 bp断片をpLAPHyTKのClaI部位にライゲーションすると、pLLTXを生じる。
【０１１７】
発現ベクターpLLEXP Iを構築するため、1410 bp断片[ヒトβ-アクチンプロモーター、プロマイシン耐性遺伝子pac、およびSV40ポリ(A)部位を含む]をまず、pBR332のBamH1部位クローニングし、pBR-β-pacを産生する。HyTK遺伝子発現カセットを含むSfiI断片（ラプトンら（Lupton）、1991、前記）を次に、pBR-β-pacのBamHI部位に挿入し、BamHIの部分消化後、pBR-β-pac-HyTKを生じた。発現ベクターpLLEXP IをpBR-β-pac-HyTKのNheIおよびBglII消化によって産生し、HyTK遺伝子を除去してcDNAインサートによって置換した。
【０１１８】
細胞培養およびトランスフェクション
NIH 3T3細胞（ATCC）およびGP+E-86細胞（マルコヴィッツら（Markowitz）J.Virol.（1988）62:1120〜1124）を、10％仔ウシ血清（3T3）または10％新生仔ウシ血清（GP+E-86）、100 U/mlペニシリン、および100 mg/mlストレプトマイシンを加えたダベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養した。DNAトランスフェクションは、製造元のプロトコルに従って、セルポレーター電気穿孔システムI（ライフテクノロジーズ、インク(Life Technologies, Inc.)）およびリポフェクタミン（ライフテクノロジーズ、インク）を用いて、電気穿孔（ポッターら（Potter）、PNAS USA（1984）81:7161〜7165）によって実施した。
【０１１９】
マウス繊維芽細胞NIH3T3細胞のレトロウイルス感染
感染性レトロウイルスを産生するため、pLLGSVをScaI処置によって直線にし、電気穿孔によってヘルパー細胞株GP+E-86にトランスフェクトさせた。トランスフェクトさせたGP+E-86細胞は３日目に再播種し、G418の800 μg/mlで２〜３週間選択した。G418耐性クローンを全て単離し、24ウェルプレートで増殖させた。各クローンの培養上清はポリブレンの存在下（８μg/ml）でNIH3T3細胞と共に８時間インキュベートし、染色体プロモーター後方の組み込み頻度をその後、感染NIH3T3細胞のX-Gal染色によって決定した。染色体プロモーター後方の組み込みの最高頻度を示すヘルパー細胞クローンを増殖させ、NIH 3T3細胞の大規模感染のために培養上清を回収した。
【０１２０】
形質転換クローンの単離と腫瘍形成性アッセイ
G418耐性NIH 3T3細胞培養をトリプシン処理して、電気穿孔によってHindIII直線化pLLTX DNAでトランスフェクトさせた。トランスフェクトさせた細胞をヒグロマイシン500 μg/mlで12〜18日間選択した。ヒグロマイシン耐性クローンを全て0.5％アガロース（リら（Li）J.Natl.Cancer Inst.（1989）81:1406〜1412）に播種し、４〜６週間後、0.5％アガロースに形成されたコロニーを単離して、細胞株に増殖させた。トランスフェクトさせた細胞の腫瘍形成性をアッセイするため、細胞10５個をヌードマウス（NIH nu/nu、雌性６週令）の胸部側部に皮下注入した。動物を週２回調べて５週間後に屠殺した。局所腫瘍の新生物特性および肺転移を、組織学的検査によって確認した（フィドラー（Fidler）、Cancer Metastasis Rev.（1986）5:29〜49）。
【０１２１】
cDNAクローニングおよびcDNAライブラリのスクリーニング
β-geoリポーター遺伝子の5'末端に対応するビオチン標識オリゴデオキシリボヌクレオチド（27 mer）を、SL6ΔT細胞からのポリアデニル化mRNAとハイブリダイズさせ、ストレプトアビジン常磁性粒子（プロメガ(Promega)）によって捕獲した。オリゴ-ハイブリダイズしたmRNAを溶出し、ビオチン標識オリゴの上流に位置する配列に対応する遺伝子特異的プライマーをcDNAの最初の鎖に逆転写した。cDNAクローニングを容易にするために、ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）クローニング部位（ブースら（Booth）、Gene（1994）146:303〜308）を遺伝子特異的プライマーに組み入れた。次にターミナルトランスフェラーゼによって、最初の鎖のcDNAに（dG）nの3'テール部をつけ、UDG-オリゴd(c)２０プライマーおよびDNAポリメラーゼを用いて、二本鎖cDNAに変換した。二本鎖cDNAをUDG-クローニングベクターpAMP1（ライフテクノロジーズ、インク）にクローニングし、β-geoとの融合に関してスクリーニングした。β-geoに対して5'方向のスプライシングアクセプター部位にインフレームで融合させた新規配列の70 bpのcDNAセグメントをプローブとして用いて、マウスNIH 3T3 cDNAライブラリ（ストラタジーン(Stratagene)）をスクリーニングした。陽性クローンは両鎖について、シーケナーゼ2.0（USB）によってシークエンシングした。
【０１２２】
サザンおよびノザンブロット分析
ゲノムDNAは定法によって単離した。総RNAはRNA STAT-60（TEL-TEST）によって単離し、ポリ(A)mRNAはポリATトラクト（プロメガ）によって単離した。両DNAおよびRNAブロットを、PCRによって産生した一本鎖DNAプローブを用いて調べた。
【０１２３】
実施例２
染色体マッピング試験により、TSG101は、主に乳癌で、しかし他のヒト悪性腫瘍においても、ヘテロ接合性の喪失を示す領域で、これまで腫瘍抑制遺伝子を含むと提唱されていたヒト第11染色体バンドp15に割付された。TSG101における遺伝子内欠失は、転移性乳癌細胞株14個中６個において同定され、原発性ヒト乳癌14個中６個が遺伝子に変異を示した。これらの変異の全てが、cc2ドメインの全部または一部を直接除去していた。これらの知見は、TSG101が異常な細胞増殖のサプレッサーであるという結論を支持し、さらに、この遺伝子がヒト乳癌において重要な役割を有することを証明している。
【０１２４】
結果
ヒトTSG101 cDNAのクローニングおよび特徴付け
tsg101は初め、これまで未知の遺伝子の多数のコピーの制御された機能的不活化およびそのような不活化の結果である表現型を示す細胞の選択を可能にする新規遺伝子発見アプローチによってマウス細胞において同定された。TSG101を得るため、マウスtsg101のヒト相同体である、1448 bpのマウスcDNA配列を用いてBLASTプログラムによって国立バイオテクノロジー情報Cancer（NCBI）のdbESTを調べた。データベースに含まれる10個のヒト部分的cDNA配列（発現配列Tags、EST）は、マウスtsg101 cDNAと85％〜95％の同一性を示した。ESTs H53754およびZ30135の間の100％同一性の領域内に含まれる27 bpの配列を用いて、UDGプライマーPa-UDGおよびPd-UDGをデザインした；これらのプライマープラスlgt10に基づくヒトcDNAライブラリのベクタークローニング部位をひとまとめにした配列に対応する２つの他のUDGプライマー（Pb-UDGおよびPc-UDG）を用いて、鋳型としてヒトcDNAライブラリから単離した総DNAを用いて、PCRによって、ヒトTSG101 cDNAの5'（Pc-UDGおよびPd-UDG）ならびに3'（Pa-UDGおよびPd-UDG）セグメントを増幅した。次に、最も長い5'および3'産物を、UDGクローニングベクターpAMP1に結合させた。
【０１２５】
クローニングした1494 bpのヒトcDNAインサートを完全長のTSG101 cDNAと命名した。このcDNAの配列分析により、分子量42.841 kDaおよびpI 5.87のアミノ酸380個の蛋白質をコードすると予想される1140 bpのオープンリーディングフレームが特定された。ヒトおよびマウスcDNAはヌクレオチドレベルで86％同一である。予想される蛋白質は94％同一で20個のアミノ酸ミスマッチと１個のギャップによって識別される。転写因子の活性化ドメインに典型的な、高次コイルドメイン（ヒトTSG101、アミノ酸231〜302）およびプロリンリッチドメイン（ヒトTSG101、アミノ酸130〜205、32％プロリン）は、ヒトおよびマウス蛋白質の間で高度に保存され、２つのドメインのそれぞれには１個のアミノ酸ミスマッチがあるに過ぎない。ヒトTSG101蛋白質の高次コイルドメインのロイシンジッパーモチーフは、マウス蛋白質の一つと同一である。ヒトTSG101において確認された保存された他の特徴は、７個の仮の蛋白質キナーゼCリン酸化部位（アミノ酸11、38、86、89、215、225、357）、キナーゼIIリン酸化部位では考えられる５個の部位（アミノ酸38、210、249、265、290）および考えられる３個のN-グリコシル化部位（アミノ酸44、150、297）を含む。NCBIデータベースのBLASTプログラム探索によるヒトTSG101 cDNAおよび蛋白質配列の分析は、他のヒト遺伝子との配列のいかなる有意な相同性も明らかにしなかった。
【０１２６】
ヒト組織におけるTSG101の発現を、完全長のtsg101 cDNAで調べた多組織ノザンブロット上で調べた。調べたヒト組織８個全てに単一の1.5 kb転写物が認められ、肝臓および膵臓から単離されたRNAではわずかにより顕著に認められた。この転写物のサイズは、1494 bp cDNAが完全長の無傷のTSG101 mRNAに対応することを示している。
【０１２７】
ヒトおよびマウスTSG101遺伝子の染色体での位置決定
ヒトTSG101配列を3'-非翻訳領域から特異的に増幅するPCRプライマーを用いて、18個のヒト×チャイニーズハムスターハイブリッド細胞株のパネルからゲノムDNAを分析した。予想される210 bp PCR産物は、ヒト第11染色体を保有するハイブリッド細胞株および総ヒトゲノムDNAからに限って得られ、ハムスターDNAからは得られなかった。ヒト特異的PCR産物はまた、第11染色体短腕（11p）のみを保有する細胞株（31-2A HAT）からも産生されるが、第11染色体の長腕（11q）のみを有する細胞株では同じプライマーを用いてもPCR増幅は認められなかった。調和的隔離および他の全ての染色体を除外することによって、ヒトTSG101遺伝子は第11染色体の11p腕に割付される。
【０１２８】
蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）によってマッピングに適したヒトTSG101ゲノムDNAプローブを得るために、ハイブリッド細胞株の分析に用いられる同じセットのPCRプライマーを用いて、ヒトゲノムDNAインサートを含むPACライブラリをスクリーニングした。それぞれが〜150 kbのインサートを含む２つの重複クローン、PAC1およびPAC2を単離し、プローブとして5'ヒトTSG101 cDNA断片を用いたサザンブロットによって、TSG101ヒトゲノムDNAを含むことを確認した。２個のPACクローンのヒト染色体スプレッドとの蛍光インサイチューハイブリダイゼーションによっても同一の結果が得られ、本発明者らの体細胞ハイブリッド分析によって第11染色体11p腕上のTSG101の位置を確認した。第11染色体の両コピーの両クロマチド上の蛍光シグナルは、分析した20個の分裂中期細胞において認められた。染色体Rバンドパターンに基づき、TSG101は、第11染色体バンドp15.1〜p15.2に割付される。
【０１２９】
放射線ハイブリッド（RH）マッピングは、ヒト遺伝子をマッピングし、連鎖マップ上の多形性マーカーと比較してそれらを配置する、もう一つの独立したアプローチを提供する。スタンフォードG3ヒトRHマッピングパネルのヒトTSG101のPCRタイピングにより、RH細胞株83個中11個において陽性結果が示された（保有頻度13.25％）。２点連鎖分析によって、TSG101は配列タッグ部位（STS）マーカーD11S291、D11S899、およびD11S1308に密接に連鎖していることが判明した。D11S921およびD11S1308はいずれも、ホワイトヘッド・インスチチュート組み込みマップおよび放射線ハイブリッドマップ上に存在し、その物理的位置はおおよそ11p15に対応する。
【０１３０】
マウスにおいてtsg101をマップするためには、マウス×齧歯類ハイブリッド細胞株のマッピングパネル22個を、マウス遺伝子特異的プライマーを用いたPCRによって分析した。ハイブリッド細胞株におけるマウス第７染色体の有無は、202 bpマウスtsg101 PCR産物と完全な調和を示した。他のマウス染色体は全て、少なくとも３個の不一致ハイブリッドによって除外された。PCR産物の一本鎖構造分析（SSCA）によって、C57BL/6とM.スプレタスパターンの間に差を検出できなかったため、種間戻し交配パネルをタイピングすることによって、遺伝子をマウス連鎖マップ上に配置しようとする試みは成功を収めなかった。既知の保存されたシンテニー領域がヒト第11p染色体およびマウス第７染色体上にあるとすれば、マウス遺伝子のマッピングは、本発明者らがクローニングしたヒトおよびマウス配列が真のTSG101遺伝子相同体であるというさらなる証拠を提供する。
【０１３１】
ヒト乳癌におけるTSG101変異の分析
広範な試験により、多様なヒト悪性腫瘍、特に乳癌、のみならずウィルムス腫瘍、および卵巣ならびに精巣悪性新生物において、11p15バンドまたはその近傍でのマーカーのヘテロ接合性の欠失または喪失が示され、このことはこの領域が１つ以上の腫瘍抑制遺伝子を含むことを示唆している。その上、分析した散発性乳房腫瘍171例の約30％では、11p15.4と11pcenの間をマッピングする領域が欠失していた。第11染色体が特にヒト乳癌の発病に関わる腫瘍抑制遺伝子を含むという考えは、正常な第11染色体またはこの染色体のセグメントを乳癌細胞に導入することによって、発癌性に関連したその他の特性とともに、それらの転移能が逆転するという証拠によって支持される。tsg101のホモ接合不活化は、マウス繊維芽細胞を転移性癌細胞に変換させるという知見は、この遺伝子が悪性細胞増殖のサプレッサーとして機能することを示唆している。ヒト乳癌におけるTSG101の役割を調べるために、乳癌細胞株10種および原発性ヒト乳房腫瘍14種から単離されたcDNAを、TSG101の変異に関して詳しく調べ、これらのcDNAを正常繊維芽細胞株３種、他のタイプの癌に由来する腫瘍細胞株11種および原発性乳癌源である個体から得られたマッチさせた正常な乳房組織から得られたcDNAと比較した。
【０１３２】
隠れた、またはTSG101蛋白質コード領域をひとまとめにする、または領域内にあるプライマーを用いたRT-PCRは、調べた乳癌細胞株10種中５種においてTSG101転写物の欠失を示した。これらを、遺伝子の異なるセグメントに対するプライマー対を用いたPCR増幅によって位置決定し、これらのプライマーによって生じた断片をシークエンシングのためにpCNTRプラスミドベクターにクローニングした。個々に単離および維持した細胞株からのクローニングしたTSG101 cDNAの配列は、85 bpの欠失が明らかになり、アミノ酸28個（コドン５〜32）を除去すると予想され、コドン32以降は10コドン後でTSG101蛋白質の未成熟終了に至ると予想されるフレームシフトを生じた。細胞株L7およびL8から増幅されたRT-PCR断片の配列分析は、高次コイルドメインのほとんどまたは全てを除去する欠失を示した。高次コイルドメインの5'方向に位置する490 bpのTSG101領域を増幅するプライマーを用いて、５番目の細胞株（MDA-MB-436）から生じたRT-PCR cDNAにおいて〜250 bpの欠失が認められたが、この細胞株の高度に不均一な特性のために、転写物のその後の分析が複雑となった。ヒト繊維芽細胞株３種、悪性黒色腫細胞株３種、ウィルムス腫瘍細胞株２種、神経芽細胞腫細胞株２種、肉腫細胞株２種、膀胱癌細胞株２種、およびベックウィズ・ウィーデマン症候群患者からの腫瘍細胞株１種は、RT-PCR分析によって、ごく正常な長さのTSG101転写物を示した。正常鎖長のTSG101転写物はまた、切断されたTSG101転写物を産生する乳癌細胞株の培養においても存在し、正常鎖長と切断されたTSG101転写物の比の異なる実験における変動は、これらの腫瘍細胞株における不均一性を示唆している。
【０１３３】
特異的にマップされたTSG101欠失を含む４種の乳癌細胞株のそれぞれから増幅されたRT-PCRによって生じた1389 bp断片をクローニングし、各細胞から生じたクローンのいくつかをシークエンシングによって分析した。これらのクローニングされたcDNAの配列を、ヒト正常株２種からおよび悪性黒色腫細胞株からのTSG101 cDNAの配列と比較すると、L8からの転写物のコドン107においてCからTへのトランジションが明らかになり、この乳癌細胞株には２つの別々のTSG101対立遺伝子が存在することを示している。
【０１３４】
得られた配列を、正常なヒト繊維芽細胞（細胞株０および１）ならびにヒト悪性黒色腫株（細胞株２および３）の転写物からのRT-PCR産物の配列と比較した。TSG101における点突然変異を乳癌細胞株８に特定した。このCからTへのトランジションの結果、コドン107でのトリプトファンからアルギニンへの変化が起こる。他の腫瘍細胞株の初回分析または悪性黒色腫もしくは正常繊維芽細胞のTSG101配列では、TSG101に点突然変異が認められなかった。
【０１３５】
TSG101の一つの対立遺伝子に欠失を含む細胞株内で、他のTSG101対立遺伝子における変異を探索するために、TSG101欠失を有する乳癌４種（細胞株、４、６、７、および８）からの、1389 bpのクローニングした完全長のRT-PCR断片をシークエンシングした。イントロンおよびエキソン配列に由来するプライマーを用いたTSG101のゲノムDNAの対応する領域のPCR増幅は、そのcDNAがシークエンシングによる特徴づけがなされている、４種全ての乳癌細胞株（L4、L6、L7、およびL8）のゲノムDNAにおいて予想された大きさの欠失を示した；322 bpゲノムPCR断片は細胞株L8から増幅し、192 bp断片は細胞株L7から増幅し、および約85 bpの欠失を含むゲノム断片は、細胞株L4およびL6から増幅した。TSG101-特異的DNAプローブを用いた増幅されたゲノム断片のサザンブロッティングは、特徴付けされたcDNA欠失がTSG101ゲノムDNAの欠失に起因したことを確認した。正常な繊維芽細胞対照から増幅されたTSG101ゲノムDNAでは欠失が認められなかった。
【０１３６】
原発性乳癌細胞は欠失されたTSG101転写物を生じる
上記実験は、TSG101が試験であった乳癌細胞株の重要な分画において変異していることを示している。これらの細胞株データによって示されるTSG101変異とヒト乳癌との関係は、これらの腫瘍源である個体から得たマッチさせた正常乳房組織と共に、原発性乳房腫瘍14種の分析によってさらに証明された：原発性乳癌14種中６種（P1、P2、P3、P4、P5およびP6）は、欠失を含むTSG101転写物を生じたが、マッチさせた正常乳房組織からの転写物では対応する欠失が認められなかった。欠失したTSG101転写物を含む原発性乳癌５種中２種は異なる切断された転写物２種を生じ、これらの癌細胞における２つのTSG101対立遺伝子に変異が存在することを意味している。非欠失TSG101転写物もまた、切断されたTSG101転写物を生じる原発性癌標本において異なる量が検出された；これらの転写物のいくつかは、以前に認められているように、分析した組織標本における非腫瘍細胞の同時存在に起因する可能性があるが、他の非欠失転写物は腫瘍細胞に由来してもよく、乳癌細胞株L8において認められるように、点突然変異を含んでもよい。
【０１３７】
原発性乳癌から増幅された切断されたcDNA断片の配列分析は、これらの原発性癌において欠失しているTSG101配列を特定した。原発性腫瘍３種（P1、P3およびP6）は、同じcDNA領域に欠失を示した。TSG101が欠失している１つの原発性腫瘍（P4）の転写物もまた、欠失接合部において63 bpの挿入を含んだ。シークエンシングされた欠失は全て、TSG101蛋白質コード配列に影響を及ぼし、スタスミン相互作用cc2ドメインの全てまたは一部を除去した。
【０１３８】
マウスおよびヒトTSG101蛋白質の間に認められる驚くべき保存性は、その重要な生物学的役割と一致している。高次コイルおよびプロリンリッチドメインはいずれも、ほぼ同一で、リン酸化およびN-グリコシル化を受けると思われる部位はヒトおよびマウス蛋白質の間で完全に保存されている。保存されたシンテニー領域を共有する、TSG101のヒト第11染色体およびマウス第７染色体に対する染色体マッピングは、ヒト遺伝子およびマウス遺伝子が相同であることを証明する。
【０１３９】
マウスおよびヒトTSG101蛋白質のいずれも、細胞増殖および分化を制御する多様なシグナルの協調および中継において機能すると提唱されているリン蛋白質である、スタスミンと相互作用することがこれまでに示されたものとほぼ同一の高次コイルドメインを含む。TSG101蛋白質における多DNA結合ドメインおよびこの蛋白質のロイシンジッパーDNA結合モチーフ近傍のプロリンリッチドメインの存在は、TSG101遺伝子産物が転写因子であり、したがって、スタスミン作用の下流のイフェクターであることを示している。
【０１４０】
TSG101における欠失は、分析した転移性乳癌細胞株の40％に、および原発性腫瘍でも同じ割合で検出された。点突然変異もまた、原発性腫瘍の一つ（MDA-MB-468；L8）では非欠失TSG101対立遺伝子において特定され、２つの異なるTSG101転写物種における欠失は、ゲル分析およびシークエンシングによって２つの原発性乳癌に関して証明された。データはこれが散発型乳癌を表す可能性があることを示している。
【０１４１】
乳癌細胞株および原発性乳房腫瘍の双方における欠失は全て、TSG101蛋白質のスタスミン相互作用高次コイルドメインに影響を及ぼした。癌細胞株MDA-MB-435（L7）およびMDA-MB-468（L8）における欠失は、高次コイルドメインの一部または全てを含むが、細胞株MDA-MB-231（L4）およびMDA-MB-453（L6）における蛋白質のN末端近傍に認められる欠失は、欠失点からフレームシフトを生じ、アミノ酸10個後方の停止コドンによって−高次コイルドメインの前で蛋白質を終了すると予想される。全ての変異の結果、cc2-コード配列の全体または部分的欠失が起こった。
【０１４２】
興味深いことに、p53遺伝子の変異もまた、２つのTSG101対立遺伝子における変異を含むMDA-MB-468（L8）において報告されているが、これは、p53およびTSG101が、乳癌の完全な悪性状態までの段階的進行に相加的役割を果たしている可能性を示唆している。
【０１４３】
TSG101遺伝子を含むDNA欠失を有する乳癌細胞株はまた、ヌードマウスにおいて高い転移能を示したことは注目に値する。株MDA-MB-435（L7）は、これまで、多くの細胞集団において11pの単一コピーを含むと報告されており、FISH分析によって大部分のMDA-MB-435細胞がTSG101の単一コピーのみを含むことが示された。この細胞株は高い転移能を有することが判明し、エストロゲンおよびプロゲステロン受容体のいずれも陰性である。正常第11染色体のコピーを導入すると、この転移能は有意に抑制された。これらの知見は、原発性ヒト乳房腫瘍における11p15でのLOHが、転移後の生存不良に関連するという知見、および腫瘍進行の後期病期では11p15でのLOHが関係しているという示唆と一貫している。
【０１４４】
TSG101遺伝子およびそれがコードする蛋白質は、ヒト乳癌および他のヒト癌の診断のみならず、腫瘍発生のメカニズムの理解をさらに深めるためにも有用である。
【０１４５】
実験手順
cDNAおよびゲノムDNAクローニング
ESTs H53754およびZ30135に由来する２つのUDGプライマーは、[配列番号：５]Pa-UDG（5'AGGUCAUGAUUGUGGUAUUUGGAGAUG3'）および[配列番号：６]Pd-UDG（5'CAUCUCCAAAUACCACAAUCAUGACCU3'）であった。lgt10クローニング部位に由来する２つのUDGプライマーは、[配列番号：７]Pb-UDG（5'CAUCAUCAUCAUGAGGTGGCTTATGAGTATTTCTTCCAG3'）および[配列番号：８]Pc-UDG（5'CUACUACUACUACACCTTTTGAGCAAGTTCAGCCTGGTT3'）である。5'（Pc-UDGおよびPd-UDG）ならびに3'（Pa-UDGおよびPb-UDG）セグメントは以下の条件でPCRによって増幅した：20 mMトリス塩酸、pH 8.55、3.3 mM MgCl２、16 mM（NH４）２SO４、150 μg/ml BSA、300 μM各dNTP、１μlヒト胎盤lgt cDNAライブラリ（力価10６/μl、ATCC） 、0.2μl KlentagLA（バーンス（Barnes）P.N.A.S.91：2216〜2220（1994））の最終容量100 μlを、パーキン-エルマー・シータスサーマルサイクラーにおいて：95℃で45秒間（変性のため）、アニーリングおよび伸長は72℃で１分間、を40サイクル。PCR産物をエチジウムブロマイド染色低融点アガロースゲルおいて可視化し、pAMP1クローニングベクター（ライフテクノロジーズ、インク）にクローニングした。多クローンを単離してcDNAインサートの両鎖を、シーケナーゼ2.0（USB）を用いてシークエンシングした。
【０１４６】
プライマー[配列番号：９]5'CTGATACCAGCTGGAGGTTGAGCTCTTC3'（フォワードプライマー）および[配列番号：10]5'ATTTAGCAGTCCCAACATTCAGCACAAA3'（リバースプライマー）を用いて、得られたPCR産物を用いて、ヒトゲノムDNAインサート（ゲノムシステムズ、インク(Genome Systems, Inc.)）を含むPACライブラリをスクリーニングし、それぞれが長さ約150 kbのインサートを含む２つの重複クローンPAC1およびPAC2を生じた。これらのインサートにおけるTSG101特異的配列の存在は、ヒトTSG101 cDNAの5'断片をプローブとして用いたサザンブロッティングによって確認した。
【０１４７】
細胞株および細胞培養
ヒト乳癌細胞株（MDA-MB231、MDA-MB-436、MDA-MB-435、MDA-MB-468、MDA-MB-157、MDA-MB-175VII、MDA-MB-361、BT-483、およびMCF-7）、ウィルムス腫瘍細胞株（G401およびSK-NEP-1）、およびヒト正常繊維芽細胞の初代培養（CCD-19LuaおよびMRC-9）は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから得た。２つの悪性黒色腫細胞株（A375PおよびA375SM）はI.J.フィドラー（Fidler）氏より提供された。２つの多形態（pliemorphic）肉腫細胞株（FB 309およびFB 310）、正常繊維芽細胞株（FB316）、膀胱癌（FB241）、２つの神経芽細胞腫細胞株（FB616およびFB617）およびベックマン・ウィーデマン症候群腫瘍細胞株（FB583）は、ウテ・フランケ（Ute Francke）のコレクションより得た。20％ウシ胎児血清を含むRPMI-1640培地で培養した乳癌BT-483細胞および10％ウシ胎児血清を加えたマッコイ5a培地で培養した２つのウィルムス腫瘍細胞株（G401およびSK-NEP-1）を除き、細胞株は全て、10％ウシ胎児血清、100 U/mlペニシリン、および100 μg/mlストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。フランケコレクションからの細胞株は、10％ウシ胎児血清を加えた最小必須培地で培養した。
【０１４８】
同じ患者からの原発性乳房腫瘍14種およびマッチさせた正常乳房組織は、協同ヒト組織ネットワークおよびバイオチェーン・インスチチュート、インク（サンレアンドロ(San Leandro)、CA）から得た。
【０１４９】
ノザンブロット分析
多数の正常組織mRNAのノザンブロットフィルター（クロンテック(Clontech)）を購入した。[３２P]dCTPを用いた、40サイクルのプライマー伸長による完全長のヒトTSG101 cDNAから得られた、放射活性標識アンチセンス一本鎖DNAプローブを、定法を用いてフィルターにハイブリダイズさせた。同じブロットを剥がし、内部負荷対照としてランダムプライミングによって合成したヒトβ-アクチンプローブとハイブリダイズさせた。
【０１５０】
体細胞ハイブリッド、PCR増幅、およびSSCA
いくつかの独立した融合実験（フランケら（Francke）がまとめた（1986）Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.2:855〜866）に由来するヒト×チャイニーズハムスターハイブリッド細胞株のパネル18個を用いて、ヒトTSG101遺伝子をヒト染色体に配置した。マウスtsg101遺伝子は、リら（Li）（1993）Genomics 18:667〜672が先に記述したように、４つの独立した融合実験に由来する20種のマウス×チャイニーズハムスターおよびマウス×ラット体細胞ハイブリッド株２種のマッピングパネルの分析によって、マッピングした。ヒトおよびマウスTSG101配列を増幅するために用いられるPCRプライマーは、3'非翻訳領域に由来した：ヒトプライマーは、上記のようにクローンTSG101ゲノムDNAについて用いられたものであった。マウスプライマーは：[配列番号：11]5'GAGACCGACCTCTCCGTAAAGCATTCTT3'（フォワードプライマー）および[配列番号：12]5'TAGCCCAGTCAGTCCCAGCACAGCACAG3'（リバースプライマー）であった。PCR条件は、95℃、２分；次に94℃、30秒；68℃、30秒；72℃、１分；これに続いて72℃、７分を35サイクルであった。ハイブリッド株のいくつかにおいて、ヒトおよびハムスター配列からのPCR産物を識別するため、先にリら（Li）（1995）Cytogenet Cell Genet 71:301〜305が記述したように、一本鎖構造多形分析（SSCA）を実施した。
【０１５１】
蛍光インサイチューハイブリダイゼーション
ヒトTSG101遺伝子の染色体位置決定は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）によって独立して調べた。重複するヒトTSG101配列をそれぞれが含む、〜150 kbインサートを保有する２つのゲノムPAC1およびPAC2クローンを、市販の試薬（ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim)）を用いたニックトランスレーションによってビオチン-1 1-UTPで標識した。各標識は、スライド当たり200 ng/50μlの濃度で、前処置して変性させた、ヒトリンパ球からの分裂中期染色体とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション、シグナル検出および増幅は、顕微鏡分析およびデジタル画像化と共に、先にリら（Li）（1995）Cytogenet Cell Genet 68:185〜191が記述したように実施した。
【０１５２】
ヒト放射性ハイブリッドマッピングパネル
スタンフォードG3放射性ハイブリッド（RH）マッピングパネルは、リサーチジェネティクス、インクから購入し、これを用いてヒト第11染色体上のヒトTSG101遺伝子の位置をさらに定義した。このパネルはヒト全ゲノムの83 RHクローンを含み、解析度は約500 kbである。83種の細胞株を全て、上記のようにプライマーおよびPCR条件を用いて、ヒトTSG101遺伝子に関してタイピングした。結果は、ボエンケら（Boehnke）（1991）によって記述された２点および多点最尤法に関するソフトウェアパッケージによる分析のためにスタンフォードヒトゲノムセンターに送付した。
【０１５３】
RT-PCRおよびcDNAのシークエンシング
総RNAは、RNA Stat-60（TEL-TEST）を用いて単離した。総RNAの10 μgをRNアーゼ不含DNアーゼI（ベーリンガー・マンハイム）10単位で10分処置し、フェノール-クロロホルムで２回抽出し、エタノールで沈殿させた。最初の鎖cDNAは、TSG101特異的プライマー[配列番号：13]P2（5'ATTTAGCAGTCCCAACATTCAGCACAAA3'）および対照としてヒトGAPDHアンチセンスプライマー[配列番号：14]（5'GTCTTCTGGGTGGCAGTGATGGCAT3'）を用いて、登録商標Superscript II RNアーゼ H-逆転写酵素（ライフテクノロジーズ）によって合成した。各産物の１〜２μlを用いて、示したプライマー対でPCR増幅を行った。用いたプライマーは、[配列番号：15]P1（5'CGGGTGTCGGAGAGCCAGCTCAAGAAA3'）、[配列番号：16]P3（5'CCTTACCCACCTGGTGGTCCATATCCTG3'）、[配列番号：17]P4（5'CCTCCAGCTGGTATCAGAGAAGTCGT3'）および[配列番号：18]P5（5'CACAGTCAGACTTGTTGGGGCTTATTC3'）であった。PCR増幅は、20 mMトリス塩酸、pH 8.55、3.3 mM MgCl２、16 mM（NH４）２SO４、150 μg/ml BSA、300 μM各dNTP、0.2μl KlentagLA（バーンス（Barnes）前記）の最終容量50 μlにおいて、パーキン-エルマー／シータスサーマルサイクラーにおいて：95℃で45秒間（変性のため）、65℃で30秒間（アニーリングのため）および伸長のために72℃で30秒〜１分間および30秒を、35サイクル実施した。PCR産物をエチジウムブロマイド染色低融点アガロースゲルおいて可視化し、pCNTRクローニングベクター（５プライム-３プライム、インク）にクローニングした。多クローンを単離してシーケナーゼ2.0（USB）を用いてシークエンシングした。
【０１５４】
原発性腫瘍およびマッチさせた正常乳房組織に関しては、P1およびP4プライマーを用いて、最初のPCR増幅を25サイクル行った。増幅された産物を50倍希釈して、希釈産物１ mlを用いて、２つのネステッドプライマーP6（配列番号：21）AGCCAGCTCAAGAAAATGGTGTCCAAGおよびP7（配列番号：22）TCACTGAGACCGGCAGTCTTTCTTGCTTを用いて、第二ラウンドPCR増幅を30サイクル行った。PCR産物はエチジウムブロマイドで染色した1.5％アガロースゲルに溶解し、DNA断片をゲルから切り取り、QIA迅速ゲル抽出キット（キアゲン）によって精製した。原発性乳癌およびマッチさせた正常乳房組織に由来するcDNA配列は、アプライド・バイオシステムズモデル310遺伝子アナライザーを用いて決定した。
【０１５５】
ゲノムDNAのPCR増幅
ゲノムDNAは定法によって単離した。RNアーゼA処置ゲノムDNA 50 μgをPCR増幅の鋳型として用いた。用いたプライマーは：細胞株８、（配列番号：23）TTCTGAAGGTTCCTGTGAGACAAATAG；および（配列番号：24）CCTCCAGCTGGTATCAGAGAAG；細胞株７、（配列番号：25）CAGTAGGGATGGCACAATCAGCGAGGAおよび（配列番号：26）GGTCAGTGCCTCTACAACCCAAGTTAA；細胞株４および６、（配列番号：27）CGGGTGTCGGAGAGCCAGCTCAAGAAAおよび（配列番号：28）TTTATTTTTTTACAAAGGTTTCTGTTCTCであった。PCR増幅は、20 mMトリス塩酸、pH 8.55、3.3 mM MgCl２、16 mM（NH４）２SO４、150 μg/ml BSA、300 μM各dNTP、0.2 ml KlentagLAの最終容量50 μlにおいて、パーキン-エルマー／シータスサーマルサイクラーにおいて：95℃で45秒間、65℃で30秒間、および伸長のために72℃で30秒〜１分間を40サイクル実施した。
【０１５６】
本明細書で引用されている全ての出版物および特許出願は、各出版物または特許出願が特におよび個々に参照として組み入れられていることが示されているように、本明細書に組み入れられる。
【０１５７】
上述の本発明は、理解を明確にするため例示および実施例によって、ある程度詳細に説明されているが、本発明の開示を鑑みて、添付の請求の範囲またはその精神から逸脱せずに、それに特定の改変および修飾が加えられることが、当業者には容易に明らかであると思われる。
【配列表】
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