(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質又はペプチドを含む溶液に、蛋白質又はペプチドを構成する特定の修飾アミノ酸の安定同位体を添加し、次に蛋白質又はペプチドの酸分解又はアルカリ分解操作を行って後に得られるその修飾アミノ酸量と、添加した安定同位体の残存する量との比を質量分析法で測定し、別に目的の修飾アミノ酸量とその安定同位体量の比について求めた検量線より、その修飾アミノ酸量を求め、蛋白質又はペプチド１分子を構成する特定修飾アミノ酸数から逆算して、目的の蛋白質又はペプチド量を求める蛋白質・ペプチドの定量方法。
【請求項２】
前記分解方法が、酸分解又はアルカリ分解であり、かつ修飾基を水素化物又はシアン化物で還元又はシアノ化した後に、分解操作を行う請求項１記載の蛋白質・ペプチドの定量方法。
【請求項３】
前記修飾基がグルコースである請求項２記載の蛋白質・ペプチドの定量方法。
【請求項４】
請求項１の操作によって特定のアミノ酸量及びそのアミノ酸の修飾アミノ酸量を求めて両者の比もしくは、修飾アミノ酸量と両者の和との比を計算し、当該蛋白質又はペプチドのうち、修飾したものの割合を求める蛋白質・ペプチドの定量方法。
【請求項５】
前記溶液が混合蛋白質又はペプチドを含む場合、目的の蛋白質又はペプチドと、他の共存する蛋白質又はペプチドとをあらかじめ分離精製後、請求項１ないし４の操作を行う蛋白質又はペプチドの定量方法。
【請求項６】
分離精製法が、イオン交換分離法、ゲルろ過法、沈殿法、電気泳動法、薄層クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーのいずれか又は組合せである請求項５記載の蛋白質・ペプチドの定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、蛋白質又はペプチドを構成する特定アミノ酸量から、その蛋白質又はペプチド量を精度良く求める方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  蛋白質を定量する方法としては、ゲルクロマトグラフィーがある。本発明に近い定量方法として、蛋白質を分解して、アミノ酸から求める方法が知られている。この例として、先行文献  Ｎｏ．１）Ｊｏｈｎ  Ｗ．Ｂａｙｎｅｓ，Ｓｕｚａｎｎｅ  Ｒ．Ｔｈｏｒｐｅ，Ｍａｒｔｈａ  Ｈ．Ｍｕｒｔｉａｓｈａｗ：Ｎｏｎｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｙｓｉｎｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  Ａｌｂｕｍｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０６：８８−９８，１９８４．がある。しかし、この方法を修飾アミノ基を有する蛋白質又はペプチドに適用するとした場合、修飾アミノ酸の相当量も様々な形の化合物に分解されてしまうため、修飾基を有する蛋白質又はペプチドを正しく、かつ精度良く定量する方法は、筆者らが、文献調査した限り見当たらない。また、分解による効率は立体障害等に影響を受け、生成したアミノ酸量から蛋白量を一義的に決められるわけではない。さらに、臨床検査でグリコアルブミン測定キットとして用いられている、プロテアーゼとケトアミンオキシダーゼによる酵素的測定法がある。しかし、この方法での蛋白質の酵素分解生成物は、アミノ酸とペプチドが混在したものであるため、糖化アミノ酸である糖化リジンだけを得ることができず、かつ、分解も不完全であるため正確な定量が困難である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】  本発明の最終目的としては、ヘモグロビン、アルブミン等の血中蛋白質の糖化割合が糖尿病診断の指標となることから、その糖化率を高精度に測定する方法を開示することにある。
又、この目的を達成するための技術から、蛋白質、ペプチド等を高精度に測定することができることがわかったので、その方法を開示することにある。【０００４】  本発明で対象とする試料は血液、血漿、血清、尿などが主であり、その中のグリコヘモグロビン、グリコアルブミン、アルブミン、グロブリン、Ｃ−ペプチド、インシュリンなどが主な測定対象となる。
【発明が解決しようとする手段】
【０００５】  本発明の骨格をなすものは、蛋白質を分解して、それを構成するアミノ酸を得、その中から特定の修飾アミノ酸量を測定するのであるが、分解時に、目的の修飾アミノ酸の安定同位体を加えておき、得られた修飾アミノ酸と残存する安定同位体との比を質量分析法で測定し、別に求めた検量線から目的の修飾アミノ酸を定量することを基本とする。この時、アミノ酸がグルコースにより修飾されており、その糖化アミノ酸量を同様にして同位体比を質量分析法により求めれば、糖化蛋白質が求められる。修飾基がグルコース以外であっても本発明を適用できる。
【０００６】  本発明では蛋白質をアミノ酸に分解しなければならないが、その分解方法には酵素分解、酸分解、アルカリ分解等がある。そのいずれも適用できるが、酵素分解は、特異性が高いものの、分解が不十分なため多くの場合、目的とするアミノ酸又は糖化アミノ酸が得られても、それから逆算して蛋白質、ペプチドを求められない。  そこで多くは、酸分解又はアルカリ分解が用いられているが、これらの方法では、修飾アミノ酸の修飾基が分解するため、一般に水素化又はシアノ化して分解率を減少させる方法がとられる。それでも分解が起きるため、目的とする修飾アミノ酸の測定の糖度は極めて悪い。そこで発明者らは、分解時に修飾アミノ酸の安定同位体を加えて、分解を補償してやれば、それとの比を測定することによって精度が格段に高くなることを見い出した。修飾蛋白質量は一般には、目的蛋白の総量との比で求められる。本発明では、この比を高精度に求める方法についても開示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】  血清蛋白質の主成分であるアルブミンの本発明による定量例について述べる。
ゲルろ過クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより血清からアルブミンをリン酸塩等の溶離液を用いて分離した後、限外ろ過法により溶離液成分を水で洗浄除去してアルブミンの精製溶液を得る。この溶液にアルブミンを構成する主たるアミノ酸の安定同位体を一定量添加して十分に混和、均一化したものを封管用のガラス管に移し、塩酸を加えて窒素等の不活性ガスでパージしてから減圧状態で封管後、加温して加水分解する。【０００８】  加水分解が終了した封管内の塩酸と水を減圧除去した得られた乾固物をギ酸等の液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）に適した溶液に溶解したものについて、アルブミン中に含まれていたアミノ酸と添加した安定同位体のアミノ酸それぞれに由来する質量のイオンの同位体強度比をＬＣ／ＭＳで測定する。自然界の同位体組成からなるアミノ酸の標準液にアミノ酸の安定同位体を一定量添加して調製した複数の同位体比組成の検量溶液について、同様に同位体強度比をＬＣ／ＭＳで測定して得られた検量線からアルブミン精製溶液中のアミノ酸のモル濃度を求める。
測定したアミノ酸のモル濃度を、アルブミン１分子を構成するそのアミノ酸の個数で除してアルブミン精製溶液中のアルブミンのモル濃度が求まる。【０００９】  アルブミンを構成するアミノ酸の１種であるリジンにグルコースが修飾された糖化アルブミンの本発明による定量例について述べる。【００１０】  ゲルろ過クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより血清からアルブミンをリン酸塩等の溶離液を用いて分離した後、限外ろ過法により溶離液成分を水で洗浄除去してアルブミンの精製溶液を得る。この溶液に糖化リジンの安定同位体を一定量添加して十分に混和、均一化したものに、水素化ホウ素ナトリウムのアルカリ溶液を加え室温で４時間かけて水素化する。これを封管用のガラス管に移し、塩酸を加えて窒素等の不活性ガスでパージしてから減圧状態で封管後、加温して加水分解する。【００１１】  加水分解が終了した封管内の塩酸と水を減圧除去した得られた乾固物をギ酸等のＬＣ／ＭＳに適した溶液に溶解したものについて、アルブミン中に含まれていた糖化リジンと添加した安定同位体の糖化リジンそれぞれに由来する質量のイオンの同位体強度比をＬＣ／ＭＳで測定する。自然界の同位体組成からなる糖化リジンの標準液に糖化リジンの安定同位体を一定量添加して調製した複数の同位体比組成の検量溶液について、同様に同位体強度比をＬＣ／ＭＳで測定して得られた検量線からアルブミン精製溶液中の糖化リジンのモル濃度を求める。【００１２】  測定した糖化リジンのモル濃度をアルブミン精製溶液中のアルブミンのモル濃度で除して、糖化アルブミンをアルブミン１分子当たりの糖化リジン数として求める。
【発明の実施態様】
【００１３】  アフィニティクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、薄相クロマトグラフィー、電気泳動法等により、目的蛋白質（又はペプチド）を他の蛋白質から分離精製する。  そこから、数ｍｇ相当量の目的蛋白質を含む液を密封容器に量り取り、定量しようとする修飾アミノ酸の安定同位体を、すでに量り取った目的たんぱく質に含まれる修飾アミノ酸相当量を加える。修飾アミノ酸量は市販日常法の測定値から推定できる。その後、水素化ホウ素ナトリウムを加えて修飾アミノ酸をより安定な水素化物にする。  そこに、終濃度が４〜６Ｍになるように塩酸を加え、窒素ガス下で封管し、１１０〜１２０℃にて、１５〜２４時間加熱分解する。  分解後、容器を開封し、温浴中、減圧下で塩酸を含む水を蒸発乾固する。５ｍＭヘプタフルオロ酪酸（ＬＣ／ＭＳの感度が得られ、妨害がなければ他の溶媒でもよい）に溶解し、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）に注入し、測定する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】図１  アルブミン中糖化リジンの測定手順カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃ  ＨＰ−５（５μｍ，０．２ｍｍ  ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ  Ｌ）溶離液：（Ａ）０．０５％ＨＦＢＡ  （Ｂ）アセトニトリル  を混合する溶媒グラジエント流量：０．２ｍＬ／ｍｉｎ  試料注入量：１μＬ  イオン化法：ＥＳＩ同位体比の測定：ＳＩＭモードでの面積比測定  Ｒ＝３１１Ｍ＋／３１７Ｍ＋ Ｒ＝１４７Ｍ＋／１５１Ｍ＋図２  本法と、市販測定法（酵素法）との一致の度合いＧ／Ａ比はアルブミン結合糖化リジンとアルブミンのモル比を示す。Ｇ及びＡは実施例１により求めた。
【実施例１】
【００１５】  ゲルろ過クロマトカラムに溶離液（１５０ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４を含む３０ｍＭ  りん酸緩衝液，ｐＨ６．８７）を０．８ｍｌ／ｍｉｎ流した条件で、血清２５ｕＬを注入して波長２８０ｎｍでモニターしながら分子量６万から７万のアルブミンを含む約８ｍＬの分取液を得た。次に遠心限外ろ過フィルターによりその分取液中の分子量５千以下の溶離液成分を水で洗浄除去して、アルブミンの精製溶液１８０ｕＬを得た。【００１６】    封管用のガラス管に上記アルブミンの精製溶液（アルブミンの推定量１ｍｇ相当量）を量り取り、リジンの安定同位体である４，４，５，５−Ｄ４−リジン溶液（アルブミン１ｍｇ中のリジン量相当分）及び１３Ｃ６−グルコースで糖化した糖化リジン安定同位体用（アルブミン１ｍｇ中の糖化リジン推定量）を添加して、十分に混和、均一化したものに、水素化ホウ素ナトリウムのアルカリ溶液を加え室温で４時間かけて水素化する。そこに終濃度が５Ｍになるように１０Ｍ塩酸を加えガスバーナーによりＮ２ガス減圧下で封乾後、１１０度に設定した加温器内で２０時間保持してアルブミンのペプチド結合を加水分解する。【００１７】  加水分解が終了した封管を開封して４５℃の水浴中に保ち、水流減圧ポンプに接続して塩酸と水を揮発除去した得られた乾固物を、５ｍＭ  ＨＦＢＡ（ヘプタフルオロ酪酸）５００ｕＬに溶解したものをＬＣ／ＭＳ測定溶液とした。【００１８】  アルブミン中に含まれていた自然界の同位体組成のリジン及び糖化リジンと添加した安定同位体の４，４，５，５−Ｄ４−リジン及び１３Ｃ６−グルコースで糖化したリジンの各々がイオン化したプロトン付加分子イオンの同位体強度比をＬＣ／ＭＳで測定した。高純度のリジン（シグマ社、純度９８％以上）及び糖化リジン（自家合成、精製品）の混合標準液に４，４，５，５−Ｄ４−リジン及び１３Ｃ６−グルコースで糖化したリジンを添加して調製した３種の同位体比組成（同位体比０．８，１．０，１．２）の検量溶液について、同様に同位体強度比を測定して得られた検量線からアルブミン精製溶液中のリジン及び糖化リジンのモル濃度を求めた。測定したリジンのモル濃度を、アルブミン１分子を構成するリジンの個数５９で除してアルブミン精製溶液中のアルブミンのモル濃度を求めた。これらの結果と測定条件をそれぞれ図２、図１に示した。図２は、酵素的方法により、糖化アルブミン量を求める従来技術と、本法による比較を示したもので、本法と従来法の間に根源的な矛盾は見られない。  この実施例では、糖化アルブミン量と総アルブミン量とを同時に求めたが、糖化アルブミンのみ、又は総アルブミン量のみを別々に求めることもできる。また、この場合アミノ酸はリジンに限ることはなく、他のアミノ酸を測定対象としてもよい（例えば、アラニン、ロイシンなど安定なアミノ酸がよい）。
【図１】
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【図２】
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