(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコイダン部分の還元末端と１つ以上のアミノ基を含む化学基との間の共有結合によりアミノ化される、フコイダン部分からなるｔ−ＰＡ結合特性を有する媒介物。
【請求項２】
式（Ｉ）：
ＦＵＣＯ−Ｃ１−［ＮＨ］ｙ−［Ｌ］ｚ−［ＮＨ］ｘ−Ｒ１（Ｉ）
（式中、
−  「ＦＵＣＯ」が、フコイダン鎖に共有結合した１つ以上の１級アミン基を場合により含有する、フコイダン部分を意味し、
−  ｘ、ｙ、及びｚが、０又は１を意味する独立した整数であり、
−  Ｃ１が、フコイダン部分の還元末端に位置する糖単位の１位の炭素原子であり、
−  Ｌが、リンカーであり、
−  Ｒ１が、１つ以上のアミノ基を含むか、又は１つのアミノ基に存する化学基であり、
−  Ｌ及びＲ１が、独立し、等しいか又は異なっていてもよい）
の化合物である、請求項１記載の媒介物。
【請求項３】
式（Ｉ）（式中、
−  Ｒ１が、１級アミン末端の直鎖又は分岐炭化水素鎖を含むか、又はこれに存する化学基、アミノ酸、ポリアミノ酸、及び／又はリジン、ポリリジン、アルギニン、ポリアルギニン、オルニチン、ポリオルニチン、γ−アミノ酪酸、ポリアミン、ポリエーテルアミン、又はグアニジン基若しくは１級アミンを含む任意の他の化学基を含むか、又はこれに存するリストにおいて選択される化学基であり、
ここで、
−  当該化学基が、５つ又は６つの炭素原子を有する１つ以上の非芳香族炭化水素環により場合により中断され、
−  当該化学基が、１つ以上のヘテロ原子により場合により中断され、
−  当該化学基が、１つ以上のアミド基及び／又は１つ以上のエステル基を場合により含有し、
−  当該化学基が、１つ以上のアミン基により場合により置換されており、
−  当該化学基が、（ａ）直鎖又は分岐炭化水素鎖、（ｂ）アミノ酸又はポリアミノ酸、（ｃ）ポリアミン又はポリエーテルアミン、（ｄ）γ−アミノ酪酸、（ｅ）グアニジン基、及び（ｆ）１級アミンから選択される同一又は異なる１つ以上の基により場合により中断されるか、及び／又は置換される）
の化合物である、請求項１又は２記載の媒介物。
【請求項４】
フコイダンが、フコイダン鎖に共有結合した基を含有する１級アミンを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の媒介物。
【請求項５】
Ｒ１又はＬが１〜４個のアミン基により置換されている、請求項１〜４のいずれか一項記載の媒介物。
【請求項６】
［ＮＨ］ｘ−Ｒ１が、式（ＶＩ）又は（ＶＩＩ）：
【化１５】
0006363693.tif 000017
（式中、
−  <<Ｌｙｓ>>が、リジン又はリジン誘導体であり、
−  ｘが、少なくとも１に等しいか又はそれより大きい）
のものである、請求項１〜５のいずれか一項記載の媒介物。
【請求項７】
【化１６】
0006363693.tif 000018
からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項記載の媒介物。
【請求項８】
フコイダン部分が、１０００００Da未満である平均分子量を有する、請求項１〜７のいずれか一項記載の媒介物。
【請求項９】
フコイダン部分がポリ硫酸化される、請求項１〜８のいずれか一項記載の媒介物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項記載の媒介物のｔ−ＰＡとの複合体を含む、媒介物化されたｔ−ＰＡ。
【請求項１１】
４０：１〜１：１の範囲にある媒介物のｔ−ＰＡに対するモル比を有する、請求項１０記載の媒介物化されたｔ−ＰＡ。
【請求項１２】
医薬として使用するための、請求項１０〜１１のいずれか一項記載の媒介物化されたｔ−ＰＡ。
【請求項１３】
対象における血栓を予防又は治療するための有効成分として使用するための、請求項１０〜１２のいずれか一項記載の媒介物化されたｔ−ＰＡ。
【請求項１４】
ａ）請求項１〜９のいずれか一項記載の媒介物を用意すること、
ｂ）ｔ−ＰＡを用意すること、及び
ｃ）ステップａ）で用意された媒介物をステップｂ）で用意されたｔ−ＰＡと接触させて、当該媒介物とｔ−ＰＡの間の複合体を得ること
のステップを含む、媒介物化されたｔ−ＰＡを製造する方法。
【請求項１５】
−  請求項１〜９のいずれか一項記載の媒介物を含む第１の容器、及び
−  ｔ−ＰＡを含む第２の容器
を含む、キット。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか一項記載の媒介物及びｔ−ＰＡを含み、当該媒介物及び当該ｔ−ＰＡが無水形態である、容器。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか一項記載の媒介物のｔ−ＰＡとの複合体を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか一項記載の媒介物を含む非経口投与のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性血管性血栓性疾患の予防及び治療のための改良されたシステム及び分子ストラテジーに関する。
【０００２】
より詳細には、本発明は、組織プラスミノーゲンアクチベーターに結合するアミン含有部分、及び静脈内注射されたｔ−ＰＡをその血漿輸送中に保護すること、及びそれを血管内血栓に媒介することの両方をすることができる媒介システムを行う、血栓に結合するフコイダン部分を含むキメラ双極分子により、組織プラスミノーゲンアクチベーター（本明細書においてｔ−ＰＡとしても言及される）の血栓への媒介を用いた、静脈内組換え組織プラスミノーゲンアクチベーターにより誘導されるフィブリン溶解に関する。
【０００３】
従って、この態様の１つにより、本発明は、フコイダン部分の還元末端と１つ以上のアミノ基を含む化学基との間の共有結合によりアミノ化される、フコイダン部分からなるｔ−ＰＡ結合特性を有する媒介物に関する。
【０００４】
この態様の別のものにより、本発明は、媒介物化されたｔ−ＰＡ、及び／又はそれを含む医薬組成物、並びに当該血栓に媒介物化されたｔ−ＰＡ又は医薬組成物を製造する方法に関する。
【０００５】
発明の背景
止血は、止血性血餅の形成を導く本質的な恒常システムとして定義される。止血は、出血、又は放血、及び本明細書において血栓症としても言及される病的な閉塞性の血液の血餅の出現のリスクを回避するために、微調整されなければならない。急性血栓性現象は、西洋諸国における死亡率及び罹患率の主要な原因のままである。
【０００６】
血餅の形成は、凝固カスケード及び血小板の協調された活性化に由来する。これは、凝固酵素複合体のアセンブリーをサポートする血小板、及び凝固の最終酵素を活性化する拡大されたプロセスであり、トロンビンは、血小板の強力なアクチベーターである。最終産物は、表面上かつ重合フィブリン線維の特異的部位を発現する血小板の凝集を含む。凝固及び血小板のそれぞれの役割は、血管床及びレオロジー状態により変動し得、血小板及びフィブリンは、それぞれ、動脈性血栓及び静脈性血栓においてより優勢である。
【０００７】
動的プロセスとしての凝固のより良好な理解のため、当業者はまた、補完的な情報のため、Kottke-Marchant及びLefkowitz（KOTTKE-MARCHANT & LEFKOWITZ, 2008, Chapter 1 - Coagulation Pathway and Physiology. An Algorithmic Approach to Hemostasis Testing）に言及し得る。
【０００８】
止血性血餅が形成されるとき、組織修復（治癒）を可能にする、第２の血餅吸収を誘発する更なる生物学的機序を熟考しなければならない。これらの第２の機序は、血餅除去システム、又は<<フィブリン溶解>>として一般に言及され得る。
【０００９】
血餅が構築と破壊の間の永久的平衡にあることを熟考しなければならない。血栓性血餅が動脈又は静脈において形成されるとき、血餅の自然吸収は、下流組織を不可逆的虚血から保護するのに効率的であるにはあまりに遅い。従って、２つのストラテジーを現在用いて、血栓症を治療する、（ｉ）抗血小板薬物及び抗凝固薬物により血餅の増加性形成を制限すること、及び（ｉｉ）フィブリン溶解を誘導することにより、血餅破壊を増強すること。
【００１０】
本発明は、この第２のストラテジーに言及する。
【００１１】
フィブリン溶解剤経路は、アクチベーターとインヒビターの両方を含む。従って、フィブリン溶解剤経路の<<アクチベーター>>は、フィブリンの溶解を誘発する能力を有し得る一方、フィブリン溶解剤経路の<<インヒビター>>は、逆の作用を有し得る。
【００１２】
形成中、血餅は、その吸収に必要とされる成分にさらされ、フィブリンは、結合部位を循環する酵素前駆体プラスミノーゲン及びそのアクチベーターである組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）にさらす。フィブリン、プラスミノーゲン及びｔ−ＰＡが関連する３つからなる複合体の形成は、フィブリン溶解の有効性を確かにし、血流へのその拡大を妨げる（線溶現象）。フィブリン結合プラスミノーゲンは、Ａｒｇ−５６１−Ｖａｌ５６２にてそのアクチベーターｔ−ＰＡにより切断され、２本鎖タンパク質分解酵素プラスミンに結合したジスルフィド結合を生じる。
【００１３】
ｔ−ＰＡ及びプラスミンが、フィブリンネットワーク上で発現したリジン残基のカチオン残基、主にアミン（ＮＨ２）基に結合することは、周知である（Lijnen et al., 2001, Elements of the fibrinolytic system. Ann N Y Acad Sci, 936, 226-236）。
【００１４】
更に、プラスミノーゲンは、高い親和性でカルボキシ末端のリジン（Ｌｙｓ）に結合する。フィブリンのプラスミン切断は、新規カルボキシ末端Ｌｙｓにさらされ、更なるプラスミノーゲン結合部位及び更なるプラスミンを形成させる（増幅プロセス）。対照的に、ＴＡＦＩ（トロンビン活性化線溶阻害因子）、カルボキシペプチダーゼは、カルボキシ末端Ｌｙｓを取り除き、プラスミノーゲンの結合を妨げ、フィブリン溶解を阻害する。ｔ−ＰＡはまた、側鎖遊離アミンに結合する。
【００１５】
リジン模倣物、例えば、□−アミノカプロン酸又はトラネキサム酸（Royston, 1995, Blood-sparing drugs: Aprotinin, tranexamic acid, and epsilon-aminocaproic acid, Int Anesthesiol Clin）は、プラスミノーゲンをＣ末端リジン残基から移し、これにより、フィブリン溶解を制限する。他方、アミン結合ｔ−ＰＡは、セルピン、主に、内皮プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター又はセルピンＥ１としても公知のプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（ＰＡＩ−１）により阻害から保護される。
【００１６】
急性の非介入性処置は、本明細書においてｒｔ−ＰＡ（Alteplase、Actilyse（登録商標）又はTenecteplase、Metalyse（登録商標）、Boehringer Ingelheim）としても言及される、主に組換え組織プラスミノーゲンアクチベーターの静脈注射のままである。例えば、国際的なガイドラインは、急性脳卒中における組換えｔ−ＰＡの超早期ＩＶ注射を推奨する（group IST et al., 2012, The benefits and harms of intravenous thrombolysis with recombinant tissue plasminogen activator within 6 h of acute ischaemic stroke （the third international stroke trial ［ist-3］）: A randomised controlled trial, Lancet）。しかし、組換えｔ−ＰＡ抹消注射の有効性は、
−  全血中の強力な化合物の希釈化、
−  キレート剤、例えば、ＰＡＩ−１をその血漿輸送中に循環させることによる組換えｔ−ＰＡの阻害、
−  血栓へのｒｔ−ＰＡ結合の低い初期レベル、
−  高用量及び遅延した注射のための出血のリスクの増大
に起因して１０％に制限される。
【００１７】
更に、ｔ−ＰＡの血栓溶解作用は有益であるが、現在用いられる、必要とされる高用量範囲でその神経毒性が問題になる。
【００１８】
ｒｔ−ＰＡを血漿インヒビターから仮に保護するために、Ａｒｇの存在下（Alteplase形成）であることが条件付けられる。アミン残基の保護作用はまた、シャペロンとしてのアネキシン２の使用で利用される。実に、細胞表面でのプラスミノーゲンとｔ−ＰＡの共存は、細胞がフィブリン溶解において制御的役割を果たすことを可能にする。アネキシン２−Ｓ１００Ａ１０複合体は、ｔ−ＰＡ及びプラスミノーゲンの認識のため正しい３次元配向性のＣ末端Ｌｙｓの提示のおかげで、プラスミノーゲンの活性化のためのかかるプラットフォームを提供する（Madureira et al., 2011 The role of the annexin A2 heterotetramer in vascular fibrinolysis, Blood）。この文脈において、アネキシンＡ２は、ｔ−ＰＡのＩＶ注射のためのシャペロンとして首尾よく提案されている（Zhu et al., 2010, Annexin 2 combined with low-dose t-PA improves thrombolytic therapy in a rat model of focal embolic stroke, J Cereb Blood Flow Metab）。このストラテジーに対する制限は、ｔ−ＰＡ媒介の不存在、及びアネキシンＡ２が産生するには非常に高価な組換えタンパク質であるという事実である。
【００１９】
急性血管性血栓性疾患に関連する改善された治療についての一般的な需要が存在する。従って、この有効成分の毒性副作用を少なくとも穏やかにするために、現在投与されるものより少ないｔ−ＰＡ量でより治療上有効なｔ−ＰＡの新規形態又はｔ−ＰＡに由来する活性な化合物についての緊急の需要が存在する。
【００２０】
従って、血漿循環中のｔ−ＰＡの保護、及び血栓へのその効率的媒介は、重要な挑戦を表す。
【００２１】
発明の概要
本発明は、ｔ−ＰＡ及び血栓の両方に結合する能力を有し、治療的ｔ−ＰＡをその生物学的標的に媒介することができる、化合物に関する。
【００２２】
本発明は、ｔ−ＰＡ結合特性及びｔ−ＰＡ保護特性を有する基を含有するアミンに共有結合した血栓標的化フコイダンを含む媒介物化合物に関する。
【００２３】
フコイダン部分の血栓結合特性を用いて、治療的化合物を血餅に標的化する。
【００２４】
従って、本発明は、フコイダン部分の還元末端と１つ以上のアミノ基（−ＮＨ２）、例えば、１級アミン基又はグアニジン基を含む化学基との間の共有結合によりアミノ化される、フコイダン部分からなるｔ−ＰＡ結合特性を有する媒介物に関する。
【００２５】
ある種の実施態様において、当該媒介物は、式（Ｉ）：
ＦＵＣＯ−Ｃ１−［ＮＨ］ｙ−［Ｌ］ｚ−［ＮＨ］ｘ−Ｒ１（Ｉ）
（式中、
−  「ＦＵＣＯ」は、フコイダン鎖に共有結合した１つ以上の１級アミン基を場合により含有する、フコイダン部分を意味し、
−  ｘ、ｙ、及びｚは、０又は１を意味する独立した整数であり、
−  Ｃ１は、フコイダン部分の還元末端に位置する糖単位の１位の炭素原子であり、
−  Ｌは、リンカーであり、
−  Ｒ１は、１つ以上のアミノ基を含むか、又は１つのアミノ基に存する化学基であり、
−  Ｌ及びＲ１は、独立し、等しいか又は異なっていてもよい）
の化合物である。
【００２６】
いくつかの実施態様において、当該媒介物は、式（Ｉ）（式中、
−  Ｒ１は、１級アミン末端の直鎖又は分岐炭化水素鎖を含むか、又はこれに存する化学基、アミノ酸、ポリアミノ酸、及び／又はリジン、ポリリジン、アルギニン、ポリアルギニン、オルニチン、ポリオルニチン、γ−アミノ酪酸、ポリアミン、ポリエーテルアミン、又はグアニジン基若しくは１級アミンを含む任意の他の化学基を含むか、又はこれに存するリストにおいて選択される化学基であり、
ここで、
−  当該化学基は、５つ又は６つの炭素原子を有する１つ以上の非芳香族炭化水素環（複数を含む）、好ましくは、５つ又は６つの炭素原子を有する多くとも１つの非芳香族炭化水素環により場合により中断され、
−  当該化学基は、１つ以上のヘテロ原子により場合により中断され、
−  当該化学基は、１つ以上のアミド基及び／又は１つ以上のエステル基、特に、１つ以上のアミド基を場合により含有し、
−  当該化学基は、１つ以上のアミン基により場合により置換されており、
−  当該化学基は、（ａ）直鎖又は分岐炭化水素鎖、（ｂ）アミノ酸又はポリアミノ酸、（ｃ）ポリアミン又はポリエーテルアミン、（ｄ）γ−アミノ酪酸、（ｅ）グアニジン基、及び（ｆ）１級アミンから選択される同一又は異なる１つ以上の基（複数を含む）により場合により中断されるか、及び／又は置換される）
の化合物である。
【００２７】
当該媒介物のいくつかの実施態様において、フコイダン部分は、１０００００Da未満であり、好ましくは、２００００Da未満であり、特に、２０００Da〜１５０００Daの範囲にある、平均分子量を有する。
【００２８】
本発明はまた、上で定義された媒介物のｔ−ＰＡとの複合体を含む媒介物化されたｔ−ＰＡに関する。
【００２９】
いくつかの実施態様において、当該媒介物化されたｔ−ＰＡは、４０：１〜１：１、好ましくは、２０：１〜３：１、最も好ましくは、１５：１〜５：１の範囲にある、媒介物のｔ−ＰＡに対するモル比を有する。
【００３０】
本発明はまた、
ａ）上で定義された媒介物を用意すること、
ｂ）ｔ−ＰＡを用意すること、及び
ｃ）ステップａ）で用意された媒介物を、ステップｂ）で用意されたｔ−ＰＡと接触させて、当該媒介物とｔ−ＰＡの間の複合体を得ること
のステップを含む、媒介物化されたｔ−ＰＡを製造する方法に関する。
【００３１】
本発明はまた、
−  上で定義された媒介物を含む第１の容器、及び
−  ｔ−ＰＡを含む第２の容器
を含むキットに関する。
【００３２】
本発明はまた、上で定義された媒介物のｔ−ＰＡとの複合体を含む医薬組成物、並びに当該医薬組成物の治療上の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】アミノフコイダンに媒介物化されたｔ−ＰＡによる血小板リッチ血栓のインビトロ溶解。血小板リッチ血餅を、ｒｔ−ＰＡ（対照、第１のカラム）、又はアミノフコイダンに対して複合体化されたｒｔ−ＰＡ（２番目、３番目及び４番目のカラム）、又は非アミノ化フコイダン（カラム７）、又はフコイダン単独（カラム６）と共にインキュベーションした。フィブリン溶解を測定し、ｙ軸において百分率として表す。平均値を水平の棒（１条件当たりｎ＝３）で示す。Ｄｉ−ｌｙｓ及びＴｒｉ  ｌｙｓ（２番目のカラム及び３番目のカラム）は、それぞれ、ジ−リジン及びトリ−リジンの略語である。Ａｃ−Ｔｒａｎ（４番目のカラム）はトラネキサム酸の略語であり、ＤＥＴＡ（５番目のカラム）はジエチレントリアミンの略語である。
【図２】マウスにおける媒介物化されたｔ−ＰＡによる腸間膜血栓のインビボ溶解。時間０にて、ＦｅＣｌ３への暴露により、腸間膜血管の血栓症を誘導し、Ｔ＝１０／１５分にて発生させた。ｒ−ｔＰＡ（対照）又はアミノフコイダン結合ｒｔＰＡにより、血栓溶解を誘導した。４０〜５０分においてアミノフコイダンにより誘導したときのみ、溶解を観察した。腸間膜の暴露した血管を、可視光（左カラム）、及びｔ−ＰＡ−ＦＩＴＣを用いて蛍光（右カラム）の両方で観察する。
【００３４】
発明の詳細な説明
フコイダンは、褐海藻から主にもたらされる硫酸化多糖類（ポリアニオン）の一種に言及し、Sialyl-LewisX（Li et al., 2008, Fucoidan: Structure and bioactivity, Molecules）の天然に存在する模倣物である。
【００３５】
sialyl LeX及びSLeXとしても公知のSialyl LewisXは、細胞の表面上のＯ−グリカン又はＮ−グリカンに結合され得、細胞と細胞の認識に重要である四糖類炭水化物である。
【００３６】
これは、血小板Ｐ−セレクチン（Bachelet, 2009, Affinity of low molecular weight fucoidan for P-selectin triggers its binding to activated human platelets, Biochim Biophys Acta）、及びインビボの腔内血栓（Rouzet et al., 2011, Radiolabeled fucoidan as a P-selectin targeting agent for in vivo imaging of platelet-rich thrombus and 内皮 activation, J Nucl Med）を結合することができる。
【００３７】
アミノフコイダンが、腔内血管性血餅に対する組織プラスミノーゲンアクチベーターのための媒介する剤として作用し得ることが、ここで示される。特に、アミノフコイダンが、対象及び／又は血栓性疾患において腔内血栓の出現と関連する病態の予防及び／又は処置のための媒介物として作用し得ることが示される。
【００３８】
本発明により、<<媒介物>>又は<<媒介物化剤>>は、フコイダン又はフコイダン部分を、分子、特に、タンパク質を血液の血餅に運ぶためのビークルとして含む、生物学的剤に言及する。
【００３９】
<<対象>>又は<<生物学的標的>>は、セレクチンを産生し、及び／又は含有し得る任意の生物学的実体であり得る。例えば、生物学的標的は、細胞、生体液、又は生物学的組織であり得る。生物学的標的は、生きている対象（例えば、これは、採血により、又は生検により得られ得る）、又は死亡した対象（例えば、これは、検死時に得られ得る）に由来し得る。対象は、ヒト又は別の哺乳類であり得る。ある種の好ましい実施態様において、生物学的標的は、血管内血栓の出現と関連する臨床状態を有することが疑われる患者に由来する。特に、当該対象は、慢性又は急性血栓性疾患又は血栓性障害に罹患し得る。
【００４０】
本発明により、用語<<プラスミノーゲンのアクチベーター>>、又はｔ−ＰＡはまた、天然ｔ−ＰＡ及び組換えｔ−ＰＡ、例えば、２本鎖ｔ−ＰＡ又は１本鎖組換えｔ−ＰＡも包含する。ヒトにおいて、ｔ−ＰＡは、配列番号１のタンパク質であるか、又はHarrisら（Harris et al., 1986, Cloning of cDNA coding for human tissue-type plasminogen activator and its expression in Escherichia coli, Mol. Biol. Med. 3 (3), 279-292）に記載される。
【００４１】
本発明により、フコイダンは、褐海藻及びいくつかの他の海洋無脊椎動物から主にもたらされる、実質的百分率のＬ−フコース及び硫酸エステル基を含有する、多糖類の一種に言及する。当該フコイダンは、当該技術分野で公知の種々の方法により得られることができ、更に以下で開発される。フコイダンの構造及び生物活性のより完璧な抄録について、当業者は、Liら（Li et al., 2008, Fucoidan : Structure and Bioactivity, Molecules）に言及し得る。
【００４２】
用語<<フコイダン>>、<<フコイダン部分>>、<<フカン>>、<<フコサン>>及び<<硫酸化フカン>>は、本記載の目的上均等である。
【００４３】
好ましい実施態様により、本発明は、セレクチン、それ故、血栓に対する高親和性、特異性、及び／又は選択性を発揮する任意のフコイダン実体に言及する。本発明の文脈において、フコイダン部分が媒介する剤として用いられるとき、これは、分子へのその特異性／選択性／親和性特性を確かにし、分子は、「血栓に標的化」される（すなわち、分子が、セレクチン及びフィブリンと特異的及び／又は効率的に相互作用し、及び／又は結合する）。用語「結合親和性」及び「親和性」は、本明細書において互換的に用いられ、分子実体間の引力のレベルに言及する。親和性は、解離定数（ＫＤ）、又はその逆の結合定数（ＫＡ）として定量的に表され得る。
【００４４】
本発明により、用語<<約>>は、１０％より多いか、又は少ないと理解され得る。
【００４５】
本発明により、<<血栓性疾患>>及び<<血栓性障害>>は、不所望の血管内血液血餅及び／又は血栓の出現、又は根強さと関連する疾患及び／又は障害である。
【００４６】
本発明による血栓性障害及び疾患は、例えば、静脈血栓症、例えば、深部静脈血栓症、門脈血栓症、腎静脈血栓症、頸静脈血栓症、又は脳静脈洞血栓症の形成をもたらす。いくつかの場合において、当該血栓症は、本明細書において<<血栓性静脈炎>>としても言及される静脈炎、時に肺塞栓症を導き得る。これはまた、心不整脈と関連する心房性血栓及び心室性血栓を含む。
【００４７】
これらはまた、しばしば動脈硬化プラークの破裂の結果である、動脈血栓症をもたらし得、この場合において、これは<<アテローム血栓症>>としても言及され得る。動脈血栓症は、例えば、脳卒中、心筋梗塞及び／又は動脈性塞栓を導き得る。
【００４８】
血栓性疾患は当該技術分野で周知であり、種々の原因を有し得る。これらは、原因疾患又は後天性疾患であり得る。特に、これらは、遺伝性であるか、及び／又は遺伝的素因と結び付けられ得る。かかる疾患の例は、例えば、血友病、フォン・ヴィルブランド病、並びに凝固性亢進及び凝固性低下と結び付けられる他の凝固障害を含む。
【００４９】
フコイダンは、優れた感受性及び特異性で血小板及びフィブリン含有血栓をインビボで標的にすることができる（Rouzet et al., 2011, Radiolabeled fucoidan as a P-selectin targeting agent for in vivo imaging of platelet-rich thrombus and endothelial activation. J Nucl Med）。
【００５０】
本発明により、<<アミノフコイダン>>は、フコイダン部分の還元末端と１つ（モノ−アミンフコイダン）又はそれ以上のアミノ基（−ＮＨ２）（ポリ−アミンフコイダン）、例えば、１級アミン基又はグアニジン基を含む化学基の間の共有結合によりアミノ化される、フコイダン部分である。好ましくは、当該化学基は、末端置換基（複数を含む）として１つ以上のアミノ基（−ＮＨ２）を含むだけである。
【００５１】
なおより好ましくは、当該化学基は、末端置換基（複数を含む）として１つ以上の１級アミンを含むだけである。
【００５２】
本発明により、アミノ基（−ＮＨ２）は、遊離（−ＮＨ２）基を有する任意の化学基、特に、１級アミン基及びグアニジン基、より詳細には、１級アミン基に言及する。非限定的な方法において、化学基は、リジン、アルギニン、オルニチン、又はγ−アミノ酪酸に存する群において選択され得る。
【００５３】
本発明により、「末端置換基」は、炭化水素鎖の末端の任意の置換基に言及する。
【００５４】
本発明により、<<炭化水素鎖>>は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、又は４４個の炭素原子を含む、１〜４４個の間の炭素原子、より詳細には、１〜２２個の間の炭素原子、なおより詳細には、１〜１０個の間の炭素原子を特に含み得る。
【００５５】
好ましい実施態様により、当該化学基は、末端置換基（複数を含む）として１級アミン基に存する末端置換基（複数を含む）のみを含む。従って、当該アミノフコイダンは、本明細書において「リジン様／リジン模倣１級アミン末端修飾フコイダン」としても言及され得る。
【００５６】
本発明により、アミノフコイダンは、その還元末端にて修飾されるフコイダンである。このため、その鎖に沿った硫酸塩基の量及び分布に依存する当該フコイダンの生物学的活性は、妨げられない。しかしながら、更なる１級アミンを、当該鎖を構成するフコースのヒドロキシル基に直接導入することも可能である。
【００５７】
従って、特定の実施態様により、当該フコイダンは、フコイダン鎖に共有結合した基を含有する１級アミンを含む。
【００５８】
特定の実施態様により、当該鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０個の１級アミン含有基を含む、１つのフコイダン鎖当たり平均１〜１０個の１級アミン含有基を含む。
【００５９】
本発明により、「ヘテロ原子」は、好ましくは、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）及び酸素（Ｏ）、なおより好ましくは、窒素及び酸素から選択される原子に言及する。
【００６０】
従って、本発明は、本明細書においてアミノフコイダンとしても言及される、当該双極媒介物を製造する双極分子プラットフォーム及び方法を提供する。
【００６１】
本発明により、当該双極媒介物は、２つの主な特徴
−  １つの極（アニオン性フコイダン）は、血栓へ媒介することができる、
−  １つの極は、少なくとも１つの１級アミン結合機能を介してｔ−ＰＡと相互作用し、保護することができる、
を有することが示されている。
【００６２】
従って、本発明は、アミノフコイダンと組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）の間の複合体に関する。当該複合体は、非共有結合複合体である。
【００６３】
特に、Ｐ−セレクチン（血小板の表面で発現される）をフコイダン部分により標的にすることは、血栓における又は近くでのｔ−ＰＡの局所濃度を有利に増大し、次に、フィブリン溶解の速度の増大に関与する。
【００６４】
有利には、アミノフコイダンの１つの極における１級アミンは、アミノ酸又はポリ−アミノ酸、特に、リジン、ポリ−リジン、又はリジン誘導体の一部、あるいは模倣物である。かかるリジン、ポリリジン、又はリジン誘導体は、ｔ−ＰＡ、プラスミノーゲン及びフィブリンの間のアンカー残基として作用する。
【００６５】
特に特定されない限り、「アミノ酸」、例えば、「リジン」は、アミノ酸及びその誘導体の両方に言及する。
【００６６】
非限定的な方法で、アミン極はまた、ｔ−ＰＡを結合することができる１級アミン含有部分、例えば、リジン、アルギニン、オルニチン、又はγ−アミノ酪酸を含み得る。
【００６７】
もちろん、得られたアミノフコイダンが、少なくとも１つの遊離アミノ基（−ＮＨ２）、例えば、１級アミン又はグアニジン基を、末端置換基として含む限り、アミノ酸、又はポリアミノ酸は、当該技術分野で公知の任意の方法によりフコイダンに結合され得る。
【００６８】
好ましい実施態様により、アミノ酸又はポリアミノ酸は、フコイダン、又はリンカーＬにアミド基を介して結合される。
【００６９】
任意の特定の理論により結び付けられることを望むことなく、本出願人は、化合物のアミン部分へのｔ−ＰＡの非共有結合が、これをセルピンから保護し、これがフィブリンにデリバリーされることを可能にすることが想定されると考える。
【００７０】
本出願人はまた、フコイダン部分をｔ−ＰＡにアミノ基、例えば、１級アミン、特に、アミノ酸及びアミノ酸誘導体を介して結合することは、ｔ−ＰＡ内の立体構造の変化を誘導すると考える。次に、この構造の変化は、その活性部位を循環するインヒビターから保護し得、従って、血栓に対するｔ−ＰＡ／アミノフコイダン複合体の半減期及びバイオアベイラビリティの両方を増大する。
【００７１】
本発明により、アミノ酸及び／又はそれらの誘導体は、Ｌ配置又はＤ配置、特に、Ｌ−配置を有し得る。
【００７２】
本発明により、<<アミノ酸誘導体>>は、Ｌ配置又はＤ配置、特に、Ｌ配置、及び少なくとも１つの遊離アミノ基、特に、遊離１級アミン、好ましくは、２つ以上の遊離１級アミンを有する修飾されたアミノ酸である。
【００７３】
修飾されたアミノ酸は、アミノ酸（ここで、側鎖は、同一又は異なる１つ以上の化学基（複数を含む）により、場合により中断されるか、又は置換される）である。
【００７４】
特定されない限り、本発明による<<アミノ酸>>は、当該<<アミノ酸>>及びその誘導体の両方を包含し得る。
【００７５】
有利には、アミノ酸は、ポリアミノ酸を形成するために、ペプチド結合（又はアミド基）により一緒に共有結合され得る。
【００７６】
ポリアミノ酸（複数を含む）は、１、２、３、４、５つ又は６つのアミノ酸、特に、２又は４つのアミノ酸を有利に含む。
【００７７】
特に、ポリアミノ酸は、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン、ポリシトルリン、ポリオルニチン、及び好ましくは、ポリリジンからなるリストにおいて選択され得る。
【００７８】
フコイダン部分が、ｔ−ＰＡにポリ−リジン（複数を含む）を介して結合されるとき、当該ポリ−リジン（複数を含む）は、１、２、３、４、５つ又は６つのリジン、特に、２又は４つのリジンを有利に含む。
【００７９】
従って、リジンのデンドリマーはまた、本発明により「リジン誘導体」として考えられ得る。それらが市販で入手可能でないなら、Kim及びZimmermanら（Y. Kim and SC Zimmerman, 1998, << Applications of dendrimers in bioorganic chemistry >>, Current Opinion in Chemical Biology, vol. 2, pp 733-742）において記載されるプロトコールにより合成され得る。
【００８０】
上述の通り、当該アミノフコイダンでの媒介は、血栓における又は近くでのｔ−ＰＡ濃度の増大を可能にし、当該ｔ−ＰＡをその血漿デリバリー中に保護する。従って、当該媒介は、ｔ−ＰＡの局所濃度を増大させること、またｔ−ＰＡを他の化合物、及び／又はインヒビター、例えば、ＰＡＩ−１から保護することという２重の利点を有する。
【００８１】
従って、１つの実施態様により、本発明は、フコイダン部分の還元末端と１つ以上のアミノ基を含む化学基との間の共有結合によりアミノ化される、フコイダン部分からなるｔ−ＰＡ結合特性を有する媒介物に関する。
【００８２】
本発明により、用語<<還元末端>>は、アノマー炭素原子（ヘキソース、例えば、グルコースについてＣ１、及びペントース、例えば、フルクトースについてＣ２）は、遊離であり、グリコシド結合を形成するために用いられない末端である。
【００８３】
特定の実施態様により、当該媒介物は、式（Ｉ）：
ＦＵＣＯ−Ｃ１−［ＮＨ］ｙ−［Ｌ］ｚ−［ＮＨ］ｘ−Ｒ１（Ｉ）
（式中、
−  「ＦＵＣＯ」は、フコイダン鎖に共有結合した１つ以上の１級アミン基を場合により含有する、フコイダン部分を意味し、
−  ｘ、ｙ、及びｚは、０又は１を意味する独立した整数であり、
−  Ｃ１は、フコイダン部分の還元末端に位置する糖単位の１位の炭素原子であり、
−  Ｌは、リンカーであり、
−  Ｒ１は、１つ以上のアミノ基を含むか、又は１つのアミノ基に存する化学基であり、
−  Ｌ及びＲ１は、独立し、等しいか又は異なっていてもよい）
の化合物である。
【００８４】
<<リンカー>>Ｌは、任意の化学基に言及し得、１級アミンを有するか、又は有さない化学基を含む。
【００８５】
より特定の実施態様により、当該媒介物は、式（Ｉ）（式中、ｙ及びｚは０を意味する）の化合物である。
【００８６】
従って、当該実施態様により、当該媒介物は、式（Ｉ’）：
ＦＵＣＯ−Ｃ１−［ＮＨ］ｘ−Ｒ１（Ｉ’）
（式中、
−  「ＦＵＣＯ」は、フコイダン鎖に共有結合した１つ以上の１級アミン基を場合により含有する、フコイダン部分を意味し、
−  ｘは、０又は１を意味する整数であり、
−  Ｃ１は、フコイダン部分の還元末端に位置する糖単位の１位の炭素原子であり、
−  Ｌは、リンカーであり、
−  Ｒ１は、１つ以上のアミノ基を含むか、又は１つのアミノ基に存する化学基であり、
−  Ｌ及びＲ１は、独立し、等しいか又は異なっていてもよい）
の化合物である。
【００８７】
いくつかの実施態様において、当該媒介物は、式（Ｉ）又は（Ｉ’）
（式中、
−  Ｒ１は、１級アミン末端の直鎖又は分岐炭化水素鎖を含むか、又はこれに存する化学基、アミノ酸、ポリアミノ酸、及び／又はリジン、ポリリジン、アルギニン、ポリアルギニン、オルニチン、ポリオルニチン、γ−アミノ酪酸、ポリアミン、ポリエーテルアミン、又はグアニジン基若しくは１級アミンを含む任意の他の化学基を含むか、又はこれに存するリストにおいて選択される化学基であり、
ここで、
−  当該化学基は、５つ又は６つの炭素原子を有する１つ以上の非芳香族炭化水素環（複数を含む）、好ましくは、５つ又は６つの炭素原子を有する多くとも１つの非芳香族炭化水素環により場合により中断され、
−  当該化学基は、１つ以上のヘテロ原子により場合により中断され、
−  当該化学基は、１つ以上のアミド基及び／又は１つ以上のエステル基、特に、１つ以上のアミド基を場合により含有し、
−  当該化学基は、１つ以上のアミン基により場合により置換されており、
−  当該化学基は、（ａ）直鎖又は分岐炭化水素鎖、（ｂ）アミノ酸又はポリアミノ酸、（ｃ）ポリアミン又はポリエーテルアミン、（ｄ）γ−アミノ酪酸、（ｅ）グアニジン基、及び（ｆ）１級アミンから選択される同一又は異なる１つ以上の基（複数を含む）により場合により中断されるか、及び／又は置換される）
の化合物である。
【００８８】
１つの実施態様により、Ｌは、１級アミン末端の直鎖又は分岐炭化水素鎖を含むか、又はこれに存するリンカー、アミノ酸、ポリ−アミノ酸、及び／又はリジン、ポリリジン、アルギニン、ポリアルギニン、グルタミン、ポリグルタミン、シトルリン、ポリシトルリン、オルニチン、ポリオルニチン、γ−アミノ酪酸、ポリアミン、ポリエーテルアミン、又はグアニジン基若しくは１級アミンを含む任意の他の化学基を含むか、又はこれに存するリストにおいて選択される化学基であり、
ここで、
−  当該化学基は、５つ又は６つの炭素原子を有する１つ以上の非芳香族炭化水素環（複数を含む）、好ましくは、５つ又は６つの炭素原子を有する多くとも１つの非芳香族炭化水素環により場合により中断され、
−  当該化学基は、１つ以上のヘテロ原子により場合により中断され、
−  当該化学基は、１つ以上のアミド基及び／又は１つ以上のエステル基、特に、１つ以上のアミド基を場合により含有し、
−  当該化学基は、１つ以上のアミン基により場合により置換されており、
−  当該化学基は、（ａ）直鎖又は分岐炭化水素鎖、（ｂ）アミノ酸又はポリアミノ酸、（ｃ）ポリアミン又はポリエーテルアミン、（ｄ）γ−アミノ酪酸、（ｅ）グアニジン基、及び（ｆ）１級アミンから選択される同一又は異なる１つ以上の基（複数を含む）により場合により中断されるか、及び／又は置換される。
【００８９】
別の特定の実施態様により、当該媒介物は、式（Ｉ）又は（Ｉ’）（式中、
−  Ｒ１は、１級アミン末端の直鎖又は分岐炭化水素鎖を含むか、又はこれに存する化学基、アミノ酸、ポリ−アミノ酸、及び／又はリジン、ポリリジン、アルギニン、ポリアルギニン、グルタミン、ポリグルタミン、シトルリン、ポリシトルリン、オルニチン、ポリオルニチン、γ−アミノ酪酸、ポリアミン、ポリエーテルアミン、又はグアニジン基若しくは１級アミンを含む任意の他の化学基を含むか、又はこれに存する化学基である）の化合物である。
【００９０】
別の特定の実施態様により、当該媒介物は、式（Ｉ）又は（Ｉ’）（式中、Ｒ１又はＬは、１つ、２つ、３つ又は４つのアミン基を意味する１〜４つのアミン基により置換される）の化合物である。
【００９１】
別の特定の実施態様により、当該媒介物は、式（Ｉ）又は（Ｉ’）（式中、Ｒ１及び／又はＬは、１、２、３又は４つのアミン基及び／又は１つ、２つ、３つ、又は４つのエステル基を意味する１〜４つのアミド基及び／又は１〜４つのエステル基により置換される）の化合物である。
【００９２】
より詳細な実施態様により、当該媒介物は、式（Ｉ）又は（Ｉ’）（式中、Ｌは、１〜２２個の炭素原子、特に、１〜１０個の炭素原子、より詳細には、１〜５個の炭素原子の直鎖又は分岐炭化水素鎖、特に、直鎖炭化水素鎖を意味し、ここで、
−  当該炭化水素鎖は、１つ以上のヘテロ原子により場合により中断され、
−  当該炭化水素鎖は、１つ以上のアミド基を場合により含有し、
−  当該炭化水素鎖は、１つ以上のアミン基により場合により置換される）の化合物である。
【００９３】
特定の実施態様により、Ｌは、（ＣＨ２）２、（ＣＨ２）３及び（ＣＨ２）２−ＮＨ−（ＣＨ２）２、好ましくは、（ＣＨ２）３及び（ＣＨ２）２−ＮＨ−（ＣＨ２）２に存する群において選択される。
【００９４】
有利には、Ｒ１が、アミノ酸又はポリアミノ酸のリストにおいて選択される化学基であるとき、当該アミノ酸又はポリアミノ酸は、フコイダンに当該アミノ酸の（ａ）Ｃ末端の末端（−ＣＯＯＨ）、又は（ｂ）Ｎ末端の末端（−ＮＨ２）のいずれかを介して結合され得る。
【００９５】
好ましくは、アミノ酸又はポリアミノ酸は、フコイダンに当該アミノ酸のＣ末端の末端（−ＣＯＯＨ）を介して結合される。
【００９６】
本発明により、アミノ酸又はポリアミノ酸の「Ｎ末端の末端」又は「Ｃ末端の末端」は、このアミノ酸のα炭素により生じた、それぞれ、１級アミン（−ＮＨ２）及びカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）として理解されなければならない。
【００９７】
もちろん、アミノ酸又はポリアミノ酸が、そのＮ末端の末端（−ＮＨ２）を介して結合されるとき、血栓に対する媒介物化されたｔ−ＰＡに適当な少なくとも１つの遊離アミノ基を生じるアミノフコイダンを得るために、少なくとも１つの更なる遊離１級アミン又は遊離グアニジン基を末端置換基として生じるアミノ酸、又は誘導体を選択しなければならない。
【００９８】
別の特定の実施態様により、当該媒介物は、式（Ｉ）又は（Ｉ’）（式中、−［ＮＨ］ｘ−Ｒ１は、
【化１】
0006363693.tif 000002
からなる群から選択される）の化合物である。
【００９９】
好ましい実施態様により、当該媒介物は、
【化２】
0006363693.tif 000003
（式中、
−  「ＦＵＣＯ」は、フコイダン鎖に共有結合した１つ以上の１級アミン基を場合により含有する、フコイダン部分を意味し、
−  Ｃ１は、フコイダン部分の還元末端に位置する糖単位の１位の炭素原子である）
からなる群より選択される。
【０１００】
特定の実施態様により、当該媒介物は、ポリ−リジン又はリジン誘導体、特に、ポリ−リジンを含む、式（Ｉ）又は（Ｉ’）の化合物である。
【０１０１】
この特定の実施態様により、−［ＮＨ］ｘ−Ｒ１は、式（ＶＩ）：
【化３】
0006363693.tif 000004
（式中、
−  <<Ｌｙｓ>>は、リジン又はリジン誘導体、好ましくは、リジンであり、
−  ｘは、少なくとも１に等しいか又はそれより大きく、好ましくは、２、３、４、５又は６、最も好ましくは、２又は４と等しい）
のものであり得る。
【０１０２】
従って、好ましい実施態様により、当該媒介物は、式（ＶＩ’）：
【化４】
0006363693.tif 000005
（式中、
−  「ＦＵＣＯ」は、フコイダン鎖に共有結合した１つ以上の１級アミン基を場合により含有する、フコイダン部分を意味し、
−  Ｃ１は、フコイダン部分の還元末端に位置する糖単位の１位の炭素原子であり、
−  <<Ｌｙｓ>>は、リジン又はリジン誘導体であり、好ましくは、リジンであり、
−  ｘは、少なくとも１に等しいか又はそれより大きく、好ましくは、２、３、４、５又は６に等しく、最も好ましくは、２又は４に等しい）
の化合物である。
【０１０３】
好ましい実施態様により、アミノ酸、例えば、リジンは、アミド基を介して共有結合して、ポリリジン又はデンドリマーを形成する。当該ポリリジン又はデンドリマーは、当該技術分野で公知の任意の方法により得られ得る。
【０１０４】
別の特定の実施態様により、−［ＮＨ］ｘ−Ｒ１及び／又はリジン誘導体は、式（ＶＩＩ）：
【化５】
0006363693.tif 000006
（式中、
−  <<Ｌｙｓ>>は、リジン又はリジン誘導体であり、好ましくは、リジンであり、
−  ｘは、少なくとも１に等しいか又はそれより大きく、好ましくは、２、３、４、５又は６に等しく、最も好ましくは、２又は４に等しい）
のものであり得る。
【０１０５】
従って、当該式（ＶＩＩ）は、リジンのデンドリマーの一部であり得る。
【０１０６】
リジン及びポリリジンは別に、他のアミノ酸及びポリアミノ酸は、フコイダンに結合され得る。特に、本発明はまた、一般式（Ｉ）又は（Ｉ’）（式中、Ｒ１は、アルギニン、ポリアルギニン、及び／又は任意の他のグアニジン含有化学基からもたらされる）の媒介物に関する。
【０１０７】
ポリアミン及びポリエーテルアミン
別の実施態様により、当該媒介物は、式（Ｉ）又は（Ｉ’）（式中、Ｒ１は、ポリアミン又はポリエーテルアミンからもたらされる）の化合物である。ポリエーテルアミンは、いずれかのモノアミンポリエーテルアミン、又はポリアミンポリエーテルアミン、例えば、ジアミン又はトリアミンポリエーテルアミン、好ましくは、ポリアミンポリエーテルアミンであり得る。
【０１０８】
有利には、ポリアミン及び／又はポリエーテルアミンは、フコイダン又はリンカーＬにその遊離１級アミンのいずれか１つを介して結合され得る。
【０１０９】
特定の実施態様により、当該媒介物は、式（Ｉ）又は（Ｉ’）（式中、Ｒ１は、ポリエーテルアミンからなる群より選択される）の化合物である。
【０１１０】
かかるポリエーテルアミンは、当該技術分野において周知であり、JEFFAMINE（登録商標）ポリエーテルアミンの名称の下販売され得る。
【０１１１】
ポリエーテルアミンは、ポリエーテル骨格の末端に結合した１級アミン基を含有する。ポリエーテル骨格は、いずれかのプロピレンオキシド（ＰＯ）単位、エチレンオキシド（ＥＯ）単位、又は混合ＰＯ／ＥＯ単位に基づく。
【０１１２】
従って、かかるポリエーテルアミンのポリエーテル骨格は、所定のＰＯ／ＥＯ単位比に依存して変動し得る。ポリエーテルアミンは、１つの末端に１級アミン基（本明細書においてモノアミンとしても言及される）、２つの末端に１級アミン基（ジアミン）又は３つの末端に１級アミン基（トリアミン）を含み得る。
【０１１３】
本発明に適当なモノアミンポリエーテルアミンの一般式（ＶＩＩＩ）は、本明細書において以下：
【化６】
0006363693.tif 000007
（式中、Ｒは、（ＥＯ）についてＨ、又は（ＰＯ）についてＣＨ３であり、好ましくは、ＣＨ３であり、
式中、ｘ及びｙは、等しいか又は異なっていてもよい）
で付与される。
【０１１４】
かかるモノアミンは、モノ−アルコール開始剤のＥＯ及び／又はＰＯとの反応、続いて得られた末端ヒドロキシル基のアミンへの変換により調製され得る。
【０１１５】
当該実施態様により、ＲがＣＨ３と等しいとき、ｙ／ｘ比は、特に、０．１〜１０、特に、０．１５〜９の範囲にあり得る。
【０１１６】
有利には、式（ＶＩＩＩ）のモノアミンポリエーテルアミンは、５００〜５０００g/mol-1、特に、６００〜２０００g/mol-1の範囲にある平均分子量を有し得る。
【０１１７】
上述の一般式に対応するモノアミンポリエーテルアミンは、JEFFAMINE（登録商標）モノアミン（Ｍシリーズ）、例えば、Ｍ−６００、Ｍ−１０００、Ｍ−２００５及びＭ−２０７０として販売される。
【０１１８】
本発明に適当なジアミンポリエーテルアミンの第１の一般式（ＩＸ）は、本明細書において以下：
【化７】
0006363693.tif 000008
（式中、ｘは、１〜１００、特に、２〜７０の範囲にあり得る整数である）
で付与される。
【０１１９】
有利には、式（ＩＸ）のジアミンポリエーテルアミンは、１００〜５０００g/mol-1、特に、２００〜４０００g/mol-1の範囲にある平均分子量を有し得る。
【０１２０】
本発明に適当なジアミンポリエーテルアミンの第２の一般式（Ｘ）は、本明細書において以下：
【化８】
0006363693.tif 000009
（式中、ｘ、ｙ、及びｚは、等しいか又は異なっていてもよく、
式中、ｙは、１〜５０、特に、２〜４０の範囲にあり得、
式中、ｘ及びｚは、０〜１０、特に、０〜６の範囲にあり得、
式中、ｘとｚの合計は、場合により１〜６の範囲にあり得る）
で付与される。
【０１２１】
有利には、式（Ｘ）のジアミンポリエーテルアミンは、１００〜５０００g/mol-1の範囲にある、特に、２００〜２０００g/mol-1の範囲にある平均分子量を有し得る。
【０１２２】
本発明に適当なジアミンポリエーテルアミンの第３の一般式（ＸＩ）は、本明細書において、以下：
【化９】
0006363693.tif 000010
（式中、ｘは、１〜５、特に、１〜３、好ましくは、２又は３の範囲にあり得る）
で付与される。
【０１２３】
有利には、式（ＸＩ）のジアミンポリエーテルアミンは、１００〜５００g/mol-1の範囲にある、特に、１００〜２００g/mol-1の範囲にある平均分子量を有し得る。
【０１２４】
ジアミンポリエーテルアミンは、JEFFAMINE（登録商標）ジアミン（Ｄ、ＥＤ、ＥＤＲシリーズ）、例えば、Ｄ−２３０、Ｄ４００、Ｄ−２０００、Ｄ−４０００、ＨＫ−５１１、ＥＤ−６０Ｄ、ＥＤ−９０Ｄ、ＥＤ−２０Ｄ３、ＥＤＲ−１４８、ＥＤＲ−１７６として市販され得る。
【０１２５】
本発明に適当なトリアミンポリエーテルアミンの一般式（ＸＩＩ）は、本明細書において以下：
【化１０】
0006363693.tif 000011
（式中、ｎは、０又は１に等しくあり得、
式中、Ｒは、Ｈ又はＣ２Ｈ５を表し得、
式中、ｘ、ｙ及びｚは、等しいか又は異なっていてもよく、０〜１００、特に、０〜８５の範囲にあり得、
式中、ｘ、ｙとｚの合計は、５〜１００、特に、５〜８５の範囲である）
で付与される。
【０１２６】
トリアミンポリエーテルアミンは、JEFFAMINE（登録商標）トリアミン（Ｔシリーズ）、例えば、Ｔ−４０３、Ｔ−３０００、Ｔ５０００として市販され得る。
【０１２７】
好ましくは、ポリエーテルアミンは、式（式中、ｘ、ｙ及びｚは、２〜１０の範囲にある）のポリアミンポリエーテルアミン、より好ましくは、ジアミン又はトリアミンポリエーテルアミン、例えば、ポリエーテルアミンに存する群において選択され得る。
【０１２８】
あるいは、当該媒介物は、式（Ｉ）又は（Ｉ’）（式中、Ｒ１は、ポリアミン、例えば、スペルミン又はスペルミジン、ジアミノプロパン又はジエチレントリアミンからもたらされる）の化合物である。
【０１２９】
スペルミンは、式（ＸＩＩＩ）：
【化１１】
0006363693.tif 000012
のポリアミンである。
【０１３０】
スペルミジンは、式（ＸＩＶ）：
【化１２】
0006363693.tif 000013
のポリアミンである。
【０１３１】
ポリアミン又はポリエーテルアミンは、当該技術分野において公知の任意の方法、又は本明細書において後述されるか、又は実施例において示される任意の方法を用いて、フコイダン又はリンカーＬに結合される。
【０１３２】
例えば、ポリアミン又はポリエーテルアミンは、例えば、Belbekhoucheら（Belbekouche S. et al., 2013, Carbohydrate Polymers, http://dx.doi.org/10.1016/j.carbpol.2013.02.032）において、フコイダンに還元的アミノ化を介してフコイダンの還元糖のアルデヒド官能基とポリエーテルアミンのアミン官能基との間の末端と末端のカップリング反応により結合され得る。
【０１３３】
有利には、本発明の化合物は、本明細書において以下で定義されるか、又は実施例１、２、３及び４において説明される方法により更に得られ得る。
【０１３４】
媒介物化されたｔ−ＰＡ
従って、本発明はまた、
ａ）本発明の媒介物を用意すること、
ｂ）ｔ−ＰＡを用意すること、及び
ｃ）ステップａ）で用意された媒介物をステップｂ）で用意されたｔ−ＰＡと接触させて、当該媒介物とｔ−ＰＡの間の複合体を得ること
のステップを含む、媒介物化されたｔ−ＰＡを製造する方法に関する。
【０１３５】
１つの実施態様により、本発明は、本発明による媒介物のｔ−ＰＡとの複合体を含む媒介物化されたｔ−ＰＡに更に関する。
【０１３６】
１つの実施態様により、本発明の媒介物又は媒介物化されたｔＰＡを含む組成物は、実質的に純粋な形態で考慮される。
【０１３７】
上で定義され、本発明による媒介物又は媒介物化されたｔ−ＰＡを含む実質的に純粋な組成物は、当該組成物におけるフコイダンの総量、又は当該組成物におけるアミノ化フコイダンの総量のいずれかと比較して、主要な形態として、フコイダンがその還元末端にてアミノ化される媒介物又は媒介物化されたｔ−ＰＡを含有し得る。
【０１３８】
当該実施態様により、実質的に純粋な組成物は、その還元末端にてアミノ化される媒介物のモル比において少なくとも５０％を含有し得、ここで、当該モル比は、当該組成物におけるフコイダンの総量に基づく。
【０１３９】
あるいは、実質的に純粋な組成物は、その還元末端にてアミノ化される媒介物のモル比において少なくとも５０％を含有し得、ここで、当該モル比は、当該組成物におけるアミノ化フコイダンの総量に基づく。
【０１４０】
従って、上で定義される実質的に純粋な組成物は、モル比において５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％でさえ含む、その還元末端にてアミノ化される媒介物のモル比において少なくとも５０％、好ましくはそれより多くを含有し得る。
【０１４１】
上述の通り、双極媒介物の１つの極におけるアミン官能基の存在は、これがｔ−ＰＡ及びプラスミノーゲンと相互作用すること、及び保護することを可能にする。
【０１４２】
有利には、複合体として、又は医薬組成物の環境においてｔ−ＰＡと相互作用し得る媒介物の平均量を変動することを可能にする。
【０１４３】
特定の実施態様により、媒介物化されたｔ−ＰＡは、４０：１〜１：１、好ましくは、２０：１〜３：１、最も好ましくは、１５：１〜５：１の範囲にある媒介物のｔ−ＰＡに対するモル比を有し得る。
【０１４４】
好ましい実施態様により、媒介物のｔ−ＰＡに対するモル比は、媒介物がモノ−アミンフコイダンであるとき、約１０：１であり、媒介物がポリ−アミンフコイダンであるとき、約５：１である。
【０１４５】
従って、本発明による媒介物化されたｔ−ＰＡは、医薬としての使用が意図され得る。特に、当該媒介物化されたｔ−ＰＡは、対象における血栓を予防又は治療するための有効成分として使用することが意図され得る。
【０１４６】
上記から、当業者は、本発明の媒介物又は媒介物化されたｔ−ＰＡ、あるいは本発明の媒介物又は媒介物化されたｔ−ＰＡを含む医薬組成物が、これを必要とする対象への投与に適当であるべきでることを理解する。
【０１４７】
特に、かかる医薬組成物は、これを必要とする対象への非経口投与に適当であり、及び／又は適合すべきである。
【０１４８】
好ましくは、本発明の医薬組成物は、無菌であり、及び／又は微生物を欠くべきである。
【０１４９】
フコイダン部分
フコイダン（ｆｕｃｏｓ、フコサン又は硫酸化フカンとも呼ばれる）は、抗凝固活性、抗血栓症活性、抗ウイルス活性、抗腫瘍活性、免疫調節活性、抗炎症活性、及び酸化防止活性を含む、広範囲の生物学的活性を有する硫酸化多糖類である。フコイダンは、主に褐海藻の種々の種において見出される（B. Li et al, Molecules, 2008, 13: 1671-1695; M. Kusaykin et al, Biotechnol. J., 2008, 3: 904-915）。
【０１５０】
特定の実施態様により、本発明に適当なフコイダン又はフコイダン部分は、海藻、特に、褐海藻から得られる。
【０１５１】
フコイダンの変異体形態は、ナマコを含む海洋動物種においても見出されている。従って、他の硫酸化多糖類と比較して、フコイダンは、種々の種類の安価な供給源から広く入手可能であり、当該技術分野において公知の抽出方法（C. Colliec et al, Phytochemistry, 1994, 35(3):697-700）を用いて容易に得られる。
【０１５２】
これらの抽出方法は、７０〜８００kDaの範囲の分子量を有するフコイダンを一般的に生じる。プロセスはまた、例えば、約２０kDa未満（欧州特許第０４０３３７７Ｂ号、米国特許第５，３２１，１３３号）、又は約１０kDa未満（欧州特許第０８４６１２９Ｂ号、米国特許第６，０２８，１９１号、A. Nardella et al, Carbohydr. Res., 1996, 289: 201-208）の低分子量フコイダンにおいて高分子量フコイダンを脱重合するよう開発されている。
【０１５３】
特定の実施態様により、本発明に適当なフコイダン又はフコイダン部分は、実施例１に記載される抽出方法及び脱重合化方法により得られる。
【０１５４】
他の実施態様により、フコイダンは、以下の会社から商業的に得られ得る：Sigma-Aldrich社（米国）のフコイダン：粗フコイダン（フカス・ベシキュロサス（Fucus vesiculosus））ｒｅｆ  Ｆ５６３１、ＣＡＳ番号９０７２−１９−９、ＭＭ＝２０，０００〜２００，０００g/mol、Algues-et-Mer社（フランス）のフコイダン：Asphyscient（登録商標）（アスコフィラム・ノドサム（Ascophyllum nodosum）由来）、依頼に基づき、ＭＭ＝５，０００〜１０，０００g/mol、Kraeber GmbH（ドイツ）のフコイダン：依頼に基づき、ＬＭＷＦ、８，５００g/mol、ＨＭＷＦ、６００，０００g/mol、異なる褐藻類由来。
【０１５５】
フコイダンは、骨格分岐に存在し得るα−１，３−Ｌ  Ｆｕｃ又は交互のα−１，３−Ｌ  Ｆｕｃ、α−１，４−Ｌ  Ｆｕｃ、又はα−１，２−Ｌ  Ｆｕｃでできている直鎖骨格から一般的に作られる。硫酸塩基は、フコースのＣ−２及び／又はＣ−３又はＣ−４を占める。
【０１５６】
特定の実施態様により、フコイダンは、グリコシド結合後に４位及び２位又は３位にて主に硫酸化されるα−１，２−結合Ｌ−フコースポリマー又はα−１，３−結合Ｌ−フコースポリマーである。しかしながら、フコース及び硫酸塩残基に加えて、フコイダンはまた、他の単糖（例えば、マンノース、ガラクトース、グルコース、キシロースなど）及びウロン酸基を含有する。異なる褐藻類由来のフコイダンの構造は、種から種で変動することは、当該技術分野において公知である。
【０１５７】
フコイダンが、ウロン酸（ＵＡ）及び他のヘキソースを含有するとき、当該フコイダンの構造は、ウロン酸、ヘキソース（１単位）、硫酸塩基、及びアセチル基からなる群において選択される置換基を生じるポリ硫酸化ポリ−Ｌフコース直鎖骨格の周りで構築され得る。例として、褐海藻アスコフィラム・ノドサムから抽出されたフコイダンの模式的に広く認められた構造は、Berteau及びMulloy、又はPomin及びMourao（O. Berteau and B. Mulloy, 2003, Glycobiology, 13(6) 29-40, DOI: 10.1093/glycob/cwg058、V. Pomin and PAS Mourao, 2008, Glycobiology 18(12) 1016-1027, review, DOI:10.1093/glycob/cwn085）において付与される。
【０１５８】
好ましい実施態様により、フコイダンは、式（ＩＸ）：
【化１３】
0006363693.tif 000014
（式中、
−  Ｒ１及びＲ２は、独立して、他のＨ、硫酸塩基、アセチル基、ヘキソース及び／又はウロン酸に由来するものを意味し、
−  ｎは、１に等しいか又はそれより大きい）
の繰返し単位を含み得る。
【０１５９】
更に、フコイダンの構造はまた、化学的に修飾され得る。例えば、方法は、過硫酸化フコイダン又は過硫酸化フコイダン断片を得るために、フコイダンの硫酸塩基の百分率を増大させるよう開発されている（T. Nishino et al, Carbohydr. Res., 1992, 229: 355-362; S. Soeda et al, Thromb. Res., 1993, 72: 247- 256）。
【０１６０】
特定の実施態様により、フコイダン又はフコイダン部分は、ポリ硫酸化される。
【０１６１】
より特定の実施態様により、当該ポリ硫酸化フコイダンは、１より高い、特に、１．２より高い、好ましくは、又は１．９以上の硫酸塩対糖の比を有する。
【０１６２】
特定の実施態様により、フコイダン又はフコイダン部分は、フコイダン鎖に共有結合するが、当該フコイダンの還元末端に共有結合しない、１級アミンを含む。
【０１６３】
あるいは、フコイダンがアミノフコイダンであるとき、当該アミノフコイダンは、フコイダン鎖に共有結合した１級アミンを更に含む。
【０１６４】
当該実施態様により、当該フコイダン又はアミノフコイダンは、１本のフコイダン鎖当たり平均で１〜１０個の間の１級アミンを含み得る。
【０１６５】
より特定の実施態様により、当該フコイダン又はアミノフコイダンは、フコイダン鎖、例えば、フコースの遊離ヒドロキシル基にて１級アミンによりアミノ化される。
【０１６６】
当該フコイダンの還元末端におけるアミノ化と異なる当該アミノ化は、例えば、実施例１において記載されるプロトコールを用いて達成され得る。
【０１６７】
本発明における使用に適当なフコイダン部分は、媒介する剤の一部であるとき、セレクチン、特に、Ｐ−セレクチンに対してある程度の引力を有し、標的化する役割を果たし得るフコイダン部分である。好ましくは、フコイダン部分は、インビトロ及びインビボの条件下でそれらの親和性／特異性／選択性特性を保持する安定な無毒性実体である。好ましい実施態様において、フコイダン部分は、セレクチン対して高い親和性及び特異性を発揮し、すなわち、それらは、セレクチンと特異的及び効率的に相互作用し、結合し、又は関連する。適当なフコイダン部分は、セレクチンの１つのみに対して（すなわち、Ｌ−セレクチン、Ｅ−セレクチン又はＰ−セレクチンに対して）親和性及び特異性を発揮するフコイダン、並びに全３つのセレクチンと効率的に相互作用し、結合し、又は関連し得る部分を含む、１つより多いセレクチンに対して親和性及び特異性を発揮するフコイダンを含む。好ましくは、セレクチンと、媒介する剤の一部としてのフコイダン部分の間の相互作用は、少なくとも、ｔ−ＰＡを血栓に媒介するのに必要な時間、十分に強力である。ある種の実施態様において、適当なフコイダン部分は、解離定数（ＫＤ）約０．１nM〜約５００nMの間、好ましくは、約０．５nM〜約１０nMの間、より好ましくは、約１nM〜約５nMの間でセレクチンと相互作用する。
【０１６８】
フコイダンは、高分子量又は低分子量のものであり得る。
【０１６９】
本発明による<<分子量>>は、<<重量平均分子量>>、又はＭｗに関する。
【０１７０】
本発明による<<低分子量フコイダン>>は、２００００Da以下、特に、２０００〜２００００Daの間の範囲内の平均分子量を有する任意のフコイダンに関する。
【０１７１】
本発明による<<高分子量フコイダン>>は、２００００Daより多い、特に、２００００〜６０００００Daの間の範囲内の平均分子量を有する任意のフコイダンに関する。
【０１７２】
ある種の実施態様において、フコイダン部分は、平均分子量約２０００〜約８０００Daを有する。他の実施態様において、フコイダン部分は、平均分子量約２００００〜約７００００Daを有する。なお他の実施態様において、フコイダン部分は、平均分子量約１０００００〜約５０００００Daを有する。
【０１７３】
１つの実施態様により、フコイダン部分は、１０００００Da未満、好ましくは、２００００Da未満、例えば、２０００〜２００００Daの間である平均分子量を有する。
【０１７４】
別の実施態様により、フコイダン部分は、２０００Da〜１５０００Daの範囲にある平均分子量を有する。
【０１７５】
特定の実施態様により、フコイダンは、低分子量フコイダン、例えば、国際公開公報第２０１０１１６２０９号に記載されるものから選択される。
【０１７６】
アミノ−フコイダンを得る方法
本発明によるアミノフコイダンを得る方法が後述される。当業者は、特定のアミノフコイダンを得るため、当該方法を便宜的に容易に適応し得る。
【０１７７】
非限定的な方法において、本明細書において<<アミノフコイダン>>としても言及されるフコイダンのアミン誘導体を合成するストラテジーは、２ステップのプロセスであり得る。
【０１７８】
１．還元末端におけるフコイダンの還元的アミノ化
ａ．多糖類のアルデヒドとスペーサーの１級アミンの間のシッフ塩基（イミン）形成、すなわち、<<架橋化合物>>、例えば、ジアミノプロパン（ＤＡＰ）。この反応は、水性媒体において可逆的である。
ｂ．当該反応の可逆性を阻害するためのイミンのアミンへの還元。
【０１７９】
２．Ｃ末端の先端におけるカルボキシル官能基（−ＣＯＯＨ）とステップ１においてフコイダン部分に固定されたジアミノプロパンの１級アミンを反応させることによる、アミノ酸残基又は誘導体の結合。
【０１８０】
この第２のステップは、例えば、活性化結合試薬、例えば、ＮＨＳ及びＥＤＣを用いることにより達成される。当該ＮＨＳ及びＥＤＣ試薬は、市販されており、会社、例えば、Sigma Aldrich（Ref.130672又はRef.03449）により販売される。
【０１８１】
この２ステップのプロトコールは、多糖類鎖の還元末端由来のアルデヒド基とスペーサーの１級アミンの間の反応に特異的であるという利点を有する。これは、（ｉ）単純かつ頑強であること、及び（ｉｉ）化学修飾が鎖内で行われるとき、生物学的活性を損なうリスクを回避するために、多糖類部分のその末端への構造的修飾を制限するという利点を有する（O. Roger et al., 2002, << Polysaccharide labelling: impact on structural and biological properties >>, Carbohyd. Pol., 50(3)273-278）。第２のステップは、水性媒体における１級アミン官能基とカルボキシル官能基の間の古典的カップリング反応であり、従って、進めるのが容易である（G.T. Hermanson, << Bioconjugate Techniques >> Academic Press, 2008）。
【０１８２】
更に、当該プロトコールの頑強さは、その末端に少なくとも１つの遊離アミノ基、特に、１級アミンを含む任意のアミノフコイダンを得るために、他の<<スペーサー>>、又はリンカーＬによりジアミノプロパン（ＤＡＰ）を置換することを有利に可能にする。
【０１８３】
本発明による<<スペーサー>>は、少なくとも２つの遊離アミノ基、例えば、遊離１級アミンを有する任意の化合物を含み、好ましくは、これに存する。
【０１８４】
有利には、当該ジアミノプロパン（ＤＡＰ）は、２つの遊離１級アミンを含む任意の化合物により置換され得る。
【０１８５】
従って、本発明は、スペーサーがジアミノプロパン（ＤＡＰ）でなく、及び／又は還元末端がジアミノプロパンにより官能基を持たされないアミノフコイダンを更に熟考する。
【０１８６】
従って、本発明はまた、フコイダン部分の還元末端と１つ以上のアミノ基を含む化学基（ここで、当該化学基は、当該フコイダン部分の還元末端とジアミノプロパンとの間の共有結合から得られない）との間の共有結合によりアミノ化される、フコイダン部分からなるｔ−ＰＡ結合特性を有する媒介物に関する。
【０１８７】
特定の実施態様により、式（ＮＨ２−（ＣＨ２）３−ＮＨ２）のジアミノプロパン（ＤＡＰ）は、第１のステップにおいて、遊離１級アミン、例えば、ポリアミン、及び特に、ジエチレントリアミン、式（ＮＨ２−（ＣＨ２）２−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２）の（ＤＥＴＡ）を含有する他の化合物により置換され得る。
【０１８８】
本発明はまた、スペーサーがジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）ではなく、及び／又は還元末端がジエチレントリアミンにより官能基を持たされないアミノフコイダンも熟考することは理解される。
【０１８９】
従って、本発明はまた、フコイダン部分の還元末端と１つ以上のアミノ基を含む化学基（ここで、当該化学基は、当該フコイダン部分の還元末端とジエチレントリアミンの間の共有結合から得られない）との間の共有結合によりアミノ化される、フコイダン部分からなるｔ−ＰＡ結合特性を有する媒介物に関する。
【０１９０】
特定の実施態様により、反応の第２のステップにおいて結合され得るアミノ酸残基又は誘導体は、アミノカプロン酸、トラネキサム酸、リジン又はポリ／オリゴリジン、又はリジン誘導体を含み、好ましくは、これに存する群において選択され得る。
【０１９１】
「代替のストラテジー」として定義され得る他のストラテジーも報告されている。これらは、上で定義される２ステップの方法と置き換わることができるが、これらはまた、２、３の制限により妨げられる。
【０１９２】
これらの「代替のストラテジー」のうち３つが、本明細書において以下で開発される。
【０１９３】
Ａ．ラクトンの形成
１つの特定の実施態様において、アミノフコイダンは、例えば、Hernandezら（Hernandez et al., 2007, "Synthesis, reactivity, and pH-responsive assembly of new double hydrophilic block copolymers of carboxymethyldextran and poly (ethylene glycol)", Polymer 48, pp921-930）におけるラクトンの形成を介して得られ得る。
【０１９４】
この特定の実施態様により、方法は、
１．ジ−ヨウ化物とカリの混合物での還元糖の酸化によるフコイダンの還元末端でのラクトンの形成
２．アミド結合を形成するための、１級アミン、例えば、アミノ酸残基又は誘導体を生じる分子の、当該アミンを介したラクトンとの反応
のステップを含む。
【０１９５】
当該実施態様により、酸化糖は、酸化が効率的なままであるように、任意の置換基の遊離でなければならず、そしてこれは全ての硫酸化フコイダンにとって必ずしも真実ではない。ラクトンと反応するアミン誘導体はまた、大幅な過剰でなければならない。更に、反応は６０℃で数日間続き、Hernandezらにおいて教示されるデキストランとは反対に、フコイダン自体の構造を変え得る。
【０１９６】
Ｂ．セミカルバゾン又はチオセミカルバゾンの形成
別の特定の実施態様において、アミノフコイダンは、例えば、Zhangら（Zhang et al., 2011, "One-pot fluorescent labeling of saccharides with fluorescein-5-thiosemicarbazide for imaging polysaccharides transported in living cells", Carbohyd. Res.,346 pp2156-2164）におけるセミカルバゾン又はチオセミカルバゾンの形成を介して得られ得る。当該セミカルバゾンは、例えば、アルデヒド又はアセトンでのセミカルバジドの縮合により得られ得る。
【０１９７】
セミカルバゾンが、アルデヒドの縮合（例えば、多糖類の還元末端）を介して得られるとき、反応は以下である：
Ｒ−ＣＨＯ＋ＮＨ２−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ’２→Ｒ−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ’２
（式中、Ｒは、多糖類、例えば、フコイダンであり、
式中、Ｒ’は、炭素構造、例えば、フルオロフォアである）。
【０１９８】
セミカルバゾンは、２重結合Ｃ＝Ｎの還元により安定化される。
【０１９９】
当該実施態様により、セミカルバジドは、Ｒ’基が、ＥＤＣ／ＮＨＳを介して他の化合物、例えば、アミノ酸、及び／又はアミノ酸誘導体のカルボキシル官能基で更に結合され得る遊離アミン官能基（−ＮＨ２）、特に、アミン官能基（−ＮＨ２）を含有するような方法で合成され得る。
【０２００】
Ｃ．オキシムの形成
別の特定の実施態様において、アミノフコイダンは、例えば、Novoa-Carballal及びMuller（Novoa-Carballal and Muller, 2012, "Synthesis of polysaccharide-b-PEG block copolymers by oxime click", Chem Comm, 48 pp3781-3783）におけるオキシムの形成を介して得られ得る。
【０２０１】
当該特定の実施態様は、１つの単一ステップにおいて多糖類、例えば、フコイダンの還元末端（アルデヒド）をＲ−Ｏ−ＮＨ２誘導体で縮合することを可能にする、いわゆる「クリックケミストリー」に頼る。
【０２０２】
当該実施態様により、Ｒ−Ｏ−ＮＨ２誘導体は、複合体有機合成（Mitsonobu反応）によりＲ−ＯＨ前駆体から調製されなければならない。オキシムは、pH３及び４５℃にて効率的に形成される。これらの条件において、pH５未満に認識可能であるフコイダンは、迅速に低下する傾向を有する。
【０２０３】
従って、カルボン酸官能基を有し、水中でさらに溶解可能であるアミノ酸、例えば、リジン、ポリリジン及びリジン誘導体である全ての化合物が、このストラテジーのため考慮され得る。
【０２０４】
また、リジンのデンドリマーを含むアミノフコイダンの合成が考慮され得る。この特定の実施態様により、当該デンドリマーは、別々に、かつフコイダンへの結合ステップに先立ち、合成されるべきである。
【０２０５】
好ましくは、ポリ−アミノ酸、例えば、オリゴリジン及び／又はデンドリマーが考慮されるとき、アニオンの多糖類へのカチオン性ペプチド鎖のフォールディングをもたらし（アミノフコイダンの場合）、当該アミノフコイダンの水溶解度を低減し得る相互の高分子電解質の形成を防ぐよう注意しなければならない。
【０２０６】
従って、本発明はまた、当該方法により得られ得るアミノフコイダン、特に、式（Ｉ）、（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）、（Ｖ’）及び（ＶＩ’）の化合物に関する。
【０２０７】
フコイダン及びアミノフコイダンは、本発明により、それらの物理化学的特性、特に、それらのアミノ化の程度、それらのフコースの程度又は質量百分率、それらのウロン酸又はグルクロン酸の程度又は質量百分率、それらの硫酸化の程度又は質量百分率、及びそれらの分子量により更に特徴付けられ得る。
【０２０８】
当該特性は、平均値として理解されなければならない。質量百分率は、％、並びにg/100gで表され得る。従って、当業者はまた、フコイダン及びアミノフコイダンの調製物を、必ずしも１つの単一種のフコイダン、又はアミノフコイダンを含まないが、平均的物理化学的特性により互いに関連する一連の化合物を含む均一な混合物又は調製物とみなすだろう。
【０２０９】
特定の実施態様により、当該アミノフコイダンは、約０．１ＮＨ２/mol〜約３ＮＨ２/molの範囲にある、特に、約１ＮＨ２/mol〜約３ＮＨ２/molの範囲にある、好ましくは、約１〜約２ＮＨ２/molの範囲にあるアミノ化の程度を有する。
【０２１０】
特定の実施態様により、当該フコイダンは、約３０％〜約６０％の範囲にある、特に、約３０％〜約５０％の範囲にあるフコースの質量百分率を有する。
【０２１１】
特定の実施態様により、当該フコイダンは、約５％〜約４０％の範囲にある、特に、約１０％〜約３０％の範囲にあるグルクロン酸の質量百分率を有する。
【０２１２】
特定の実施態様により、当該フコイダンは、１０％〜約４５％の範囲にある、特に、約１５％〜約４０％の範囲にある硫酸塩の質量百分率を有する。
【０２１３】
特定の実施態様により、当該フコイダンは、１０００００Da未満、好ましくは、２００００Da未満である平均分子量を有する。好ましい実施態様により、当該フコイダンは、２０００Da〜１５０００Daの範囲にある平均分子量を有する。
【０２１４】
医薬組成物
既に上述された通り、本発明は、
ａ）本発明の媒介物を用意すること、
ｂ）ｔ−ＰＡを用意すること、及び
ｃ）ステップａ）で用意された媒介物をステップｂ）で用意されたｔ−ＰＡと接触させて、当該媒介物とｔ−ＰＡの間の複合体を得ること
のステップを含む、媒介物化されたｔ−ＰＡを製造する方法に関する。
【０２１５】
従って、本発明はまた、本発明による媒介物のｔ−ＰＡとの複合体を含む医薬組成物に関する。
【０２１６】
有利には、当該複合体を含む医薬組成物は、当該方法により得られ得る。
【０２１７】
特定の実施態様により、本発明はまた、４０：１〜１：１、好ましくは、２０：１〜３：１、最も好ましくは、１５：１〜５：１の範囲にある、媒介物のｔ−ＰＡに対するモル比を含む医薬組成物に関する。
【０２１８】
好ましい実施態様により、当該医薬組成物における媒介物のｔ−ＰＡに対するモル比は、媒介物がモノ−アミンフコイダンであるとき、約１０：１であり、媒介物がポリ−アミンフコイダンであるとき、約５：１である。あるいは、本発明は、
−  本発明の媒介物を含む第１の容器、及び
−  ｔ−ＰＡを含む第２の容器
を含むキットに関する。
【０２１９】
本発明に適当な<<容器>>は、当該技術分野で公知の任意の医薬容器、好ましくは、無菌容器であり得、注射に直接的に適当であるか、単独で又は本発明による第２の容器と混合されるとき、注射可能な試料を調製するのに適当であり得るかのいずれかである。当該容器の例は、ピル、タブレット、カプセル、瓶、シリンジ、針、カテーテル、注入ポンプ、膨大部を含む群において選択され得、より一般的には、試料を含有し、保存するために用いられ得る任意の小さな密封バイアルである。当該容器は、ガラス又はプラスチック、例えば、ポリプロピレンから作られ得る。
【０２２０】
有利には、当該容器は、本発明により特定の医薬組成物を達成するために、続いて混合される。
【０２２１】
この特定の実施態様により、それぞれの容器における媒介物及びｔ−ＰＡの量は、媒介物のｔ−ＰＡに対する特定の比に達するように、当業者により容易に調節され得る。
【０２２２】
しばしば、医薬組成物は、注射により投与されるだろう。注射による投与のため、血栓溶解剤の医薬組成物は、無菌の水性溶液若しくは非水性溶液として、又は無菌の注射可能な溶液の即時調製のための無菌粉末として製剤化され得る。かかる医薬組成物は、製造及び保存の条件下で安定であるべきであり、微生物、例えば、細菌及び真菌の混入作用に対して保存されなければならい。
【０２２３】
本発明は、本発明の媒介物、及びｔ−ＰＡを含む容器に更に関する。有利には、当該媒介物及び当該ｔ−ＰＡが、無水形態、例えば、無菌粉末で処方されるとき、次に、医薬組成物は、１つの単一容器において、適当な組成を有し、更なる混合ステップを有することなく、再構成され得る。
【０２２４】
注射による投与のための薬学的に許容し得る担体は、溶媒又は分散媒、例えば、水溶液（例えば、ハンクス溶液、アルコール性／水性溶液、又は食塩水溶液）、並びに非水性担体（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及び注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチル）である。注射可能な医薬組成物はまた、非経口ビークル（例えば、塩化ナトリウム及びリンゲルデキストロース）、及び／又は静脈内ビークル（例えば、体液及び栄養補充薬）、並びに塩、緩衝液、及び保存剤、例えば、抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）を含む他の従来の薬学的に許容し得る無毒性の賦形剤及び添加剤を含有し得る。注射可能な組成物の遅延した吸収は、吸収を遅延し得る剤（例えば、モノステリン酸アルミニウム及びゼラチン）を加えることによりもたらされ得る。組成物のpH及び濃度は、当業者により容易に決定され得る。
【０２２５】
好ましい実施態様により、アミノフコイダンを含む組成物のpHは、５〜８の間に含まれるべきである。
【０２２６】
無菌の注射可能な溶液は、活性化合物（複数を含む）及び他の成分を必要量の適切な溶媒に取り込むことにより、及び次に、得られた混合物を、例えば、濾過又は照射により無菌化することにより調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌の粉末の調製方法は、当該技術分野で周知であり、真空乾燥技術及び凍結乾燥技術を含む。
【０２２７】
一般的に、媒介物化されたｔ−ＰＡ（又はその医薬組成物）の投薬量は、考慮事項、例えば、患者の年齢、性別及び体重、並びに患者に影響することが疑われる特定の病態、疾患の程度、又は調べられるべき身体の範囲（複数を含む）に依存して変動するだろう。要因、例えば、禁忌、治療、及び他の変動するものがまた、投与されるべき剤の投薬量を調節するために考慮される。しかしながら、これは、訓練を受けた医師により容易に達成され得る。一般的に、媒介物化されたｔ−ＰＡ（又はその医薬組成物）の適当な１日用量は、対象における血栓の予防又は治療を可能にするのに十分であるｔ−ＰＡ（又は医薬組成物）の最小量に対応する。
【０２２８】
ｔ−ＰＡ、例えば、媒介物化された及び媒介されないｔ−ＰＡの投与のための１日用量は、モル濃度で、又は質量として表され得る。１日用量が投与されるｔ−ＰＡの質量として表されるとき、それは、「ｔ−ＰＡの均等な用量」の観点から理解されなければならない。
【０２２９】
本発明により、「ｔ−ＰＡの均等な用量」は、２つの分子が同一分子量を有するなら、媒介されないｔ−ＰＡに比較して、投与される媒介物化されたｔ−ＰＡの質量を意味する。参照のｔ−ＰＡ（すなわち、非媒介物化ｔ−ＰＡ）の平均分子量及び本発明による媒介物化されたｔ−ＰＡの平均分子量を考慮するとき、例えば、かかる換算は、当業者により容易に計算され得る。
【０２３０】
この用量を最小にするために、投与は静脈内であることが好ましい。静脈内投与は、標的部位（静脈内）に対して近位（すなわち、血餅内注射）又は遠位であり得る。有利には、媒介物化されたｔ−ＰＡ（又はその医薬組成物）は、遠位投与に適当である。
【０２３１】
１日用量は、多くの要因、例えば、患者の体重及び年齢、標的にされる血液の血餅の局在性及び投与頻度又は経路、すなわち、近位又は遠位に依存し得る。例えば、組換えｔ−ＰＡの血餅内注射は、Changら（Chang et al., 2011, Low Dose Once Daily, Intraclot Injections of Alteplase for Treatment of Acute Deep Venous Thrombosis, J. Vasc. Interv. Radiol., 22(8):1107-1116）において教示される通り、急性深部静脈血栓症の処置のため提案されている。当該プロトコールにより、血餅内注射は、平均２．１の治療又は治療日数を伴い、１人の患者当たりｔ−ＰＡ ７．１mgの平均総用量で効率的であり得る。
【０２３２】
急性心筋梗塞（ＭＩ）のため、媒介物化されたｔ−ＰＡは、例えば、加速注射（１〜１／２時間）として、又は３時間の注射として投与され得る。
【０２３３】
他の実施態様において、例えば、急性虚血性脳卒中を治療するため、総用量は、例えば、９０mgに達し得る。
【０２３４】
従って、１日用量は、患者の体重及び注射の長さに主に依存するだろう。比較のため、媒介されないｔ−ＰＡが、６７kg未満の患者に、急性ＭＩを処置するため、１〜２分間（１５mg）かかるボーラスにおいて１〜１時間３０分間抹消投与され、次に、最大５０mgの用量で３０分間投与され（０．７５mg/kg）、最終ステップにおいて、０．５mg/kg ｔ−ＰＡが、次の６０分間かかり、好ましくは、３５mgを超えない用量で注射される。したがって、注射され得るｔ−ＰＡの最終用量は、例えば、１００mgに達し得る。有利には、ｔ−ＰＡのアミノフコイダンでの媒介は、最小の１日用量を低減することにより高用量の投与に関連する問題を解決しやすく、従って、必要な１日用量の観点で、特定の実施態様は、少なくとも１−ｌｏｇの低減を可能にし、特定の実施態様は少なくとも２−ｌｏｇの低減を可能にする。
【０２３５】
従って、特定の実施態様において、媒介物化されたｔ−ＰＡは、急性深部静脈血栓症を処置又は予防するための血餅内注射として、効率的な血餅血栓溶解のため、７mgに等しいか又はそれより少ない最小１日用量、特に、５mgに等しいか又はそれより少ない最小１日用量、特に、２mgに等しいか又はそれより少ない最小１日用量、特に、１mgに等しいか又はそれより少ない最小１日用量で、投与され得る。
【０２３６】
他の実施態様において、媒介物化されたｔ−ＰＡは、通常又は増大した１日用量で、ｔ−ＰＡ注射と通常関連する２次的症状を経験することなく、投与され得る。あるいは、当該症状は、１日用量が一定に維持されるとき、媒介されないｔ−ＰＡと比較して、低減されるか又は予防され得る。
【０２３７】
従って、特定の実施態様において、媒介物化されたｔ−ＰＡは、より高い１日用量で投与され得る。有利には、当該１日用量は、１００mgに等しいか又はそれより多く、１５０mgに等しいか又はそれより多くあり得る。特定の実施態様において、１日用量は、２００mg又は３００mgに等しいか又はそれより多くさえあり得る。
【０２３８】
当業者は、患者の要求により、及び処置されるべき状態に依存して、当該１日用量を調整することができる。
【０２３９】
実施例
以下の実施例において用いる出発フコイダンを、本明細書において後述の市販の供給源から得た：
１）Sigma-Aldrich社（米国）のフコイダン：粗フコイダン（フカス・ベシキュロサス由来）ｒｅｆ  Ｆ５６３１、ＣＡＳ番号９０７２−１９−９、ＭＭ＝２０，０００〜２００，０００g/mol。
２）Algues-et-Mer社（フランス）のフコイダン：Asphyscient（登録商標）（アスコフィラム・ノドサム由来）、依頼に基づき、ＭＭ＝５，０００〜１０，０００g/mol。
３）Kraeber GmbH（ドイツ）のフコイダン：依頼に基づき、ＬＭＷＦ、８，５００g/mol、ＨＭＷＦ、６００，０００g/mol、異なる褐藻類由来。
【０２４０】
実施例１：
フコイダンのヒドロキシル基のアミノ化
フコイダン（５００mg、５kDaの１mmol）を水１５mLに溶解し、２．５Ｍ ＮａＯＨ ５mL及びエピクロロヒドリン ０．１mL（１．３mmol）と混合した。混合物を４０℃で２時間撹拌し、２５℃で２日間水に対して透析する。透析液を凍結乾燥した後、残渣を水中の３０%(v/v) アンモニア ３mLに溶解し、４０℃で９０分間アミノ化する。反応混合物を水に対して透析し、凍結乾燥して、アミノ化フコイダンを得る。
【０２４１】
当該プロトコールにより、１級アミンの量は、反応において誘導されるエピクロロヒドリンの量に依存する。エピクロロヒドリン ０．１mLに対応し得るエピクロロヒドリンの最小量について、導入される１級アミンの平均数は、フコイダンの１つの鎖当たり１〜１０個の１級アミンの範囲である。
【０２４２】
反応を以下の通り記載することができる。
【化１４】
0006363693.tif 000015
式中、Ｆｕｃｏはフコイダンを意味する。
【０２４３】
しかしながら、反応が、フコイダン、特に、フコースにより生じるヒドロキシル（−ＯＨ）官能基のいずれか１つにて生じ得るので、当該反応の主要な弱点は、置換が鎖内で発生する場所を正確に制御することが可能でないことである。
【０２４４】
従って、当該方法は、当該フコイダンの還元末端を標的にするのに適当ではない。
【０２４５】
実施例２：
２ステップストラテジーを用いた双極分子又はシステムの構築
主要な化学ステップは、分子、すなわち、リジン、オリゴリジン、又はリジン模倣物を生じる１級アミンでのフコイダン還元末端の結合、及び基本的な有機化学の書籍に広く記載される、イミンの２級アミンへの還元である。アミノ化分子の種類（すなわち、ＤＡＰ及びＤＥＴＡ−ｆｕｃｏ）に依存して、２つの異なるストラテジーを本明細書において説明する。
【０２４６】
ストラテジー１：
第１のステップにおいて、フコイダン（Ｆ）をジアミノプロパン（ＮＨ２−（ＣＨ２）３−ＮＨ２）に結合させて、Ｆ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２（すなわち、Ｆ−ＮＨ２）を得る。これにより、当該アミノフコイダンをＤＡＰ−ｆｕｃｏとして定義する。
【０２４７】
強化ガラス試験管において、乾燥フコイダン ５００mgを、再蒸留水中の１．５Ｍ ジアミノプロパン溶液 ５．４mLに溶解する。試験管に封をし、９０℃で３時間加熱する。冷却後、氷酢酸中の３Ｍの新たに調製したジメチルボラン １．４mLを加え、混合物を９０℃で３時間加熱する。
【０２４８】
溶液を中和し、透析し（４５mM 炭酸緩衝液（pH９．６）中の１Ｍ ＮａＣｌ ５×１Ｌ、水／エタノール８０／２０(v:v)中０．５Ｍ ＮａＣｌ ５×１Ｌ、再蒸留水 ５×１Ｌで、透析チャンバーにおいて、３０００Daのカットオフで）、凍結乾燥する。Ｆ−ＮＨ２を、フワフワした白色の固体として収率６０%(w/w)で得る。
【０２４９】
その後、以下で示す通り、本明細書において「アミノ酸誘導体」としても言及するリジン、オリゴリジン（２〜４つのリジン）、ε−アミノカプロン酸又はトラネキサム酸を、第２のステップにおいてＦ−ＮＨ２に場合により結合する。
【０２５０】
再蒸留水中の１０．４mM アミノ酸誘導体５mLの溶液に、ＥＤＣ ２０mg及びＮＨＳ １２mgを室温にて連続的に加える。混合物を、撹拌下で１５分間維持し、その後、Ｆ−ＮＨ２ ７６．４mgを加える。
【０２５１】
撹拌下室温にて２時間後、溶液を、透析し（４５mM 炭酸緩衝液（pH９．６）中の１Ｍ ＮａＣｌ ５×１Ｌ、水／エタノール８０／２０(v:v)中の０．５Ｍ ＮａＣｌ ５×１Ｌ、再蒸留水 ５×１Ｌで、カットオフ３０００Ｄ）、凍結乾燥する。
【０２５２】
ストラテジー２：
フコイダン（Ｆ）を、以下に示す通り、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ＝ＮＨ２−（ＣＨ２）２−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２）に直鎖上に結合する。従って、合成するアミノフコイダンを、ＤＥＴＡ−ｆｕｃｏとして定義する。
【０２５３】
強化ガラス試験管において、乾燥フコイダン５００mgを、再蒸留水中の１．５Ｍ ＤＥＴＡ溶液５．４mLに溶解する。試験管に封をし、９０℃で３時間加熱する。冷却後、氷酢酸中の３Ｍの新たに調製したジメチルボラン １．４mLを加え、混合物を９０℃で３時間加熱する。
【０２５４】
溶液を中和し、透析し（４５mM 炭酸緩衝液（pH９．６）中の１Ｍ ＮａＣｌ ５×１Ｌ、水／エタノール８０／２０(v:v)中の０．５Ｍ ＮａＣｌ ５×１Ｌ、再蒸留水 ５×１Ｌで、カットオフ３０００Ｄ）、凍結乾燥する。
【０２５５】
その後、ストラテジー１に示す通り、リジン、オリゴリジン（２〜４つのリジン）、ε−アミノカプロン酸又はトラネキサム酸をＦ−ＮＨ２に結合する。
【０２５６】
再蒸留水中の１０．４mM アミノ酸誘導体の溶液５mLに、ＥＤＣ ２０mg及びＮＨＳ １２mgを室温で連続して加える。混合物を、撹拌下で１５分間維持し、その後、Ｆ−ＮＨ２ ７６．４mgを加える。
【０２５７】
撹拌下室温にて２時間後、溶液を透析し（４５mM 炭酸緩衝液（pH９．６）中の１Ｍ ＮａＣｌ ５×１Ｌ、水／エタノール８０／２０(v:v)中の０．５Ｍ ＮａＣｌ ５×１Ｌ、再蒸留水 ５×１Ｌで、カットオフ３０００Ｄ）、凍結乾燥する。
【０２５８】
結論：いくつかのアミン及びアミノ酸誘導体、例えば、ｆｕｃｏ−ジアミノプロパン（ＤＡＰ−ｆｕｃｏ）、ｆｕｃｏ−ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ−ｆｕｃｏ）、ｆｕｃｏ−トラネキサム酸（ｔｒａｎ−ｆｕｃｏ）、ｆｕｃｏ−モノ／ポリリジン（Ｌｙｓ−ｆｕｃｏ、ｄｉＬｙｓ−ｆｕｃｏ、ｔｒｉＬｙｓ−ｆｕｃｏ…）を得て、試験した。
【０２５９】
実施例３：
フコイダン及びアミノフコイダンの物理化学的特性
Ａ．材料及び方法
アミノ化定量化
ブロモプロピルアミンをRothの研究（M. Roth, 1971 "Fluoroscence reaction for amino acids." Analytical Chemistry, 43, 880-882）に従った標準として用いたフタルアルデヒド比色アッセイで、１級アミンの量を決定する。
【０２６０】
フコース定量化
フコース定量化を、Dische（Z. Dische, 1955, New color reactions for determination of sugars in polysaccharides. Methods Biochem. Anal. 313-358）により決定した。
【０２６１】
グルクロン酸定量化
グルクロン酸定量化を、Bitter及びMuir（T. Bitter et H.M. Muir, 1962, A modified uronic acid carbazole reaction. Anal. Biochem. 4 330-334）により決定した。
【０２６２】
硫酸塩定量化
硫酸塩定量化を、Gustafsson（L. Gustafsson, 1960, Determination of ultramicro amounts of sulphate as mthylene blue--II: The reduction, Talanta 4, 236）出典の、Bacheletら（Bachelet et al, 2009, Affinity of low molecular weight fucoidan for P-selectin triggers its binding to activated human platelets. Biochim Biophys Acta., 1790(2) 141-146）に記載されるプロトコールにより決定し得る。
【０２６３】
酢酸溶液中のヨウ化水素酸及び次亜リン酸を用いて、硫酸塩を硫化水素として還元し、次に、Ｚｎ２＋により複合体化し、芳香族ジアミンと反応させる。メチレンブルーの形成を、６７０nm及び７４４nmでの吸収で定量する。
【０２６４】
分子の質量分析
分子の質量分析を、ＭＡＬＬＳ技術（Multi Angle Laser Light Scattering）を用いて決定することができる。簡単に言うと、１０mM トリス緩衝液、pH７．４、１５０mM ＮａＣｌ、０．０２％ アジ化ナトリウムにおいて平衡化したゲル濾過クロマトグラフィーカラム（ＴＳＫｇｅｌのＧＭＰＷｘｌ）に０．５mL/分にて添加する（HPLC pump Dionex Ultimate 3000）。屈折率検出器（Iota2、Precison Instrument）及び光散乱検出器（TREOS、Wyatt）を用いて、シグナルを更に検出する。
【０２６５】
赤外線（ＩＲ）スペクトル分析
Omnic（Nicolet）プログラム一式を用い、Nicoletアバター装置にてFourier変換赤外線分光学を用いて、ＩＲスペクトルを記録する。臭化カリウム（ＫＢｒ）中、凍結乾燥産物の重量において２％の範囲で、試料を調製し、３２回のスキャンで記録する。同様の条件下でＫＢｒ単独のスペクトルも記録し、自動的に減じる。
【０２６６】
ＮＭＲ−１Ｈ分析
３回の凍結乾燥後、NMR Bruker 500 Avance III（プローブ：５mm PAQXI 1H/X）にてＤ２０溶媒（９９．９％）中で１Ｈスペクトルを記録する：ＴＤ  ３２ｋ、１６回のスキャン、ＳＷ：１０ppm/５００Hz、Ｐ９０°：９．５μs、温度３００Ｋ、Ｄ１、１ｓ。
【０２６７】
Ｂ．結果
本発明による一連のフコイダン及びアミノフコイダンの物理化学特性を測定し、以下の表において要約した。
【０２６８】
【表１】
0006363693.tif 000016
【０２６９】
それぞれの分析を、３〜８回繰り返した。
【０２７０】
フコイダン−ＤＡＰ及びｆｕｃｏ−ＤＡＰ−ジリジン／トリリジン／テトラリジン化合物のＩＲスペクトルは、１２００cm-1にて特徴的な硫酸塩ピークを含む、硫酸化多糖類に対応する一致スペクトルを強調する。ＤＡＰ−アミノ化フコイダンとリジン−アミノ化フコイダンの間の有意差の欠如は、オリゴリジン（ジ−リジン、トリ−リジン及びテトラ−リジン）間の結合条件が、当該フコイダンの構造を変えないことを示す。１５４０cm-1における振れるバンドは、多糖類とオリゴ−リジンの間のアミド結合（ＣＯ−ＮＨ）、及びリジン自体の特徴である。
【０２７１】
ＩＲ分光学に対する補完として、アミノフコイダン及び対応するフコイダン調製物のＮＭＲプロファイルは、アミノ化後にフコイダン構造が保存されることを確かにする。
【０２７２】
実施例４：分子構築物のインビトロ薬理評価
Ａ．材料及び方法
血餅形成及びエクスビボフィブリン溶解
ヒト血小板リッチ血漿、及びヒト血小板プア血漿（ＰＲＰ及びＰＰＰ）を、２ステップの遠心分離：１２０ｇにて１５分間、続いて１２００ｇにて１２分間の第２の遠心分離ステップ後、クエン酸塩添加血から得た。プア血小板血漿（ＰＰＰ）で、ＰＲＰを１mL当たり３×１０８血小板に調整し、７５μg/mL フルオレセインイソチオシアネート−フィブリノーゲンを添加した。ガラス試験管において、１０mmol/L ＣａＣｌ２を加えることにより、血餅形成を誘導し、３７℃で１時間インキュベーションした。退縮後、血餅をハンクス緩衝液（Sigma）において洗浄し、吸収紙にて迅速に乾燥させ、計量した。フィブリン溶解を評価するために、ＰＲＰ又はＰＰＰ血餅を、媒介物化されたｔ−ＰＡ複合体（ｔ−ＰＡ  １０UI、又は１．７２μg/mLに対応する）を含有するハンクス緩衝液において、室温で１時間インキュベーションした。血餅を、１μM ヒトプラスミノーゲンを添加したハンクス緩衝液５００μlを含有する新しいエッペンドルフに移した。血餅から上清への蛍光の放出を分光蛍光光度計（４８５nm／５２０nm）で測定することにより、フィブリン溶解の動態を評価した。１７時間後、血餅を再計量して、総フィブリン溶解に対応する重量の喪失を計算した。
【０２７３】
この実験において試験するアミノフコイダンを、実施例２に記載する、ストラテジー１（トラネキサム酸−ｆｕｃｏ、ジリジン−及びトリリジン−ｆｕｃｏｓ）及びストラテジー２（ＤＥＴＡ−ｆｕｃｏ）により調製した。
【０２７４】
アミノフコイダンを、ｔ−ＰＡ（１０UI（１．７２μg/mlに対応する）に対する変動可能な分子比にて用いた：モノ−アミンフコイダンについて比１／１０を、ポリ−アミンフコイダンについて比１／５を用いた。評価基準は、開始溶解動態（上清における蛍光の出現）、及び１７時間／３７℃のインキュベーションにおける最終血栓重量喪失であった。
【０２７５】
アミノフコイダン媒介物化されたｔ−ＰＡ
ｔ−ＰＡ １molをアミノフコイダン １０molと、０．１％ ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及び０．０１％ Tween20を添加したリン酸緩衝食塩水において、４℃で２時間混合することにより、アミノフコイダンとの１本鎖組換えｔ−ＰＡ（American diagnostica）複合体を形成し、血餅溶解のため直ちに用いるか、又は将来的な使用のため−８０℃で保存した。最大１０molまで増大する量のアミノフコイダンを加えることにより、他の調製物を作製した。
【０２７６】
１本鎖組換えｔ−ＰＡは、ヒトメラノーマ細胞株（American diagnosticの製品番号１７３）から得たヒトｔ−ＰＡのｃＤＮＡで遺伝子導入した、チャイニーズハムスター卵巣細胞株の分泌産物である。
【０２７７】
１本鎖組換えｔ−ＰＡの調製物の特徴：
−  分子量は約７００００ダルトンであり、
−  純度は９８％より高く、
−  特異的活性は、約５８００００UI/mgである。
【０２７８】
０．２２μmで濾過した脱イオン水 １００μlで、この凍結乾燥したｔ−ＰＡ担体−遊離タンパク質標準 ５０μgを再構成し、１０μg/ml 溶液にリン酸緩衝食塩水において希釈した。
【０２７９】
Jonesら（Jones CI, Payne DA, Hayes PD, Naylor AR, Bell PR, Thomson MM, Goodall AH. The antithrombotic effect of dextran-40 in man is due to enhanced fibrinolysis in vivo. J Vasc Surg. 2008; 48:715-722）において記載される通り、溶解動態実験を実施した。
【０２８０】
Boulaftaliら（Boulaftali Y, Ho Tin Noe B, Pena A, Loyau S, Venisse L, Francois D, Richard B, Arocas V, Collet JP, Jandrot-Perrus M, Bouton MC. PLatelet Protease Nexin-1, a Serpin that Strongly Influences Fibrinolysis and Thrombolysis. Circulation. 2011;123:1326-1334）において記載される通り、血栓重量の測定を実施した。
【０２８１】
Boulaftaliら（Boulaftali Y, Ho Tin Noe B, Pena A, Loyau S, Venisse L, Francois D, Richard B, Arocas V, Collet JP, Jandrot-Perrus M, Bouton MC. PLatelet Protease Nexin-1, a Serpin that Strongly Influences Fibrinolysis and Thrombolysis. Circulation. 2011;123:1326-1334）及びMalletら（Mallet SV, Cox DJA. Thromboelastograph（登録商標）Analysis. British J of anaest. 1992;69:307-313）において記載される通り、トロンボエラストグラフィ実験を回転血栓弾性描写器（Rotem（登録商標））にて実施した。
【０２８２】
Ｂ．結果
第１のステップにおいて、フコイダンは、活性化及び凝集した血小板にて発現したＰ−セレクチンに結合するので、本発明者らは、蛍光フィブリノーゲン（Ｆｇ−ＦＩＴＣ７５μg/血漿ml）を用いて、異なるアミノフコイダンの血小板リッチ血栓及び血小板プア血栓に結合する能力をインビトロで評価した。
【０２８３】
まず、ｔ−ＰＡ単独は、血小板リッチ血栓におけるものより血小板プア血栓の開始溶解及び最終溶解においてより活性であり、これは、血小板の抗フィブリン溶解活性を示す。それ故、１７時間における血栓重量喪失を含む血小板プア血栓の溶解においてｔ−ＰＡ単独とアミノフコイダンによる媒介物化されたｔ−ＰＡの間の差はなく、ｔ−ＰＡ単独で既に最大（９７％）であった。対照的に、アミノフコイダンでの媒介物化されたｔ−ＰＡは、ｔ−ＰＡ単独と比較して、血小板リッチ血栓の開始溶解を有意に増大することができた（＋５０％、ｐ＜０．０１）。試験したアミノフコイダンのうち、トラネキサム酸−ｆｕｃｏ、ＤＡＰ−ｆｕｃｏ及びジリジン−ｆｕｃｏが、血小板リッチ血栓溶解の開始速度を増大するのに最も効率的であった。
【０２８４】
並行して、アミノフコイダン及び媒介物化されたｔ−ＰＡはまた、ｔ−ＰＡ単独と比較して、血小板リッチ血栓重量の喪失を増大した（それぞれ、６５％対３０％（ｐ＜０．０１））（図１）。中でもジリジン−フコイダンが最も効率的であった。
【０２８５】
第３の一連のインビトロ実験において、赤血球を含む全血において行った血栓の溶解を促進するアミノフコイダンの能力を、回転血栓弾性描写（Rotem（登録商標））で試験した。この実験において、１／５又は１／１０の比（ｔ−ＰＡ／ｆｕｃｏ）のジリジン−フコイダン媒介物化されたｔ−ＰＡは、ｔ−ＰＡ単独（５５％）と比較して、血栓溶解を７５％まで増大した。この実験において、血漿ＰＡＩ−１が存在した。
【０２８６】
結論：インビトロのシステムにおいて、アミノ−フコイダンは、拡散によってのみ、及びＰＡＩ−１の不存在下で標的にする（血栓弾性描写実験以外）ので、これらの試験は、アミノ−フコイダンのｔ−ＰＡを血栓にインビボで媒介する能力を評価することができない。しかしながら、これらのインビトロの薬理実験は、アミノ−フコイダンがｔ−ＰＡの血栓にアクセスする能力を有意に制限しないことを示す（右の最後の２つのカラム）。更に、それらは、ｔ−ＰＡのための媒介物としてのアミノ−フコイダンが、インビトロでｔ−ＰＡによる血栓溶解を有意に促進すること、及びこの作用が活性化／凝集した血小板の存在に依存することを示す。
【０２８７】
実施例５：
アミノ−フコイダンによるｔ−ＰＡ媒介のインビボ検証：血栓形成及び血栓溶解のリアルタイム生体内イメージング
Ａ．材料及び方法
この実験において試験するジリジン−フコイダンを、実施例２に記載されるストラテジー１により調製した。
【０２８８】
グループは、生体内顕微鏡のインビボで血栓の溶解を追跡する能力を最近公開した。従って、Boulaftaliら（Boulaftali et al., 2011, Platelet protease nexin-1, serpin that strongly influences fibrinolysis and thrombolysis. Circulation ; Boulaftali et al., 2012, The mouse dorsal skinfold chamber as a model for the study of thrombolysis by intravital microscopy. Thromb Haemost）において記載されるプロトコールにより、生体内顕微鏡でのアミノ−フコイダンによるｔ−ＰＡ媒介の検証を実施した。
【０２８９】
マウスにおいて暴露した血管における酸化鉄の局所適用により、血栓を誘導する。酸化鉄の局所適用後、蛍光ｔ−ＰＡ又はアミノ−フコイダンとｔ−ＰＡの混合物を静脈内注射する。ｔ−ＰＡの蛍光及び血栓溶解を、腸間膜組織の生体内透視により追跡した。
【０２９０】
より正確には、麻酔（１００mg/kg ケタミン、１０mg/kg キシラジン）及び開腹後、マウス腸間膜血管を血栓症の誘導及びビデオ顕微鏡生体内観察のため暴露した。１０％ ＦｅＣｌ３（Sigma、St. Louis、MO）で飽和した濾紙片（１×０．５mm）を２分３０秒間置くことにより、血管損傷を誘導した。次に、濾紙を取り除き、暴露した領域を食塩水で洗浄し、損傷後の血栓形成を、ＣＣＤカメラ（Hamamatsu）につなげた５×対象での蛍光顕微鏡（Axio Observer、Carl Zeiss MicroImaging）を用いて、ローダミン６Ｇ標識血小板及び白血球（ローダミン６Ｇ ３mg／マウスkg、Sigma、St. Louis、MO）の蓄積、及びAlexa 647ヒト結合フィブリノーゲン（１０mg／マウスkg、Invitrogen Life Technologies、Paisley、UK）の蓄積をモニターすることによりリアルタイムで調べた。血管損傷の導入に先立ち、全ての蛍光マーカーを逆眼窩静脈叢に静脈内投与した。血小板沈着及び血栓成長を、損傷後１５分間モニターし、次に、部分的に閉塞性に形成させた血栓の血栓溶解するために、蛍光ｔ−ＰＡ±ジリジン−フコイダンを静脈内注射した。次に、血栓発展を処置後少なくとも１時間リアルタイムで調べた。
【０２９１】
Ｂ．結果
ＦｅＣｌ３で誘導した損傷の１時間後（処置後約４５分）、損傷した血管の閉塞性血栓症は、蛍光ｔ−ＰＡ単独で処置した全３匹のマウスにおいて発生した。対照的に、ジリジン−フコイダンと合わせてｔ−ＰＡで処置した全てのマウスにおいて、血管灌流を維持した。更に、これらのマウスにおいて、処置後、血栓サイズの低下を観察した（図２）。
【０２９２】
結論：インビボ実験は、媒介物としてのアミノ−フコイダンの血栓溶解に対する有益な作用を示す。特に、これらの実験は、アミノ−フコイダンが、抹消注射したｔ−ＰＡのインビボ血栓溶解活性を強めることを示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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