(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電位センサーとして機能し得るポリペプチドであって：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜２３９位；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜２３９位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
電位センサーとして機能し得るポリペプチドであって：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜２５５位；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜２５５位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項６】
直接のイオン流を必要とすることなく電気的なシグナルを化学的なシグナルに変換し得るポリペプチドであって：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の第８５〜９６位を含むポリペプチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリペプチドに結合することを特徴とする抗体。
【請求項９】
イノシトールリン脂質ホスファターゼ活性を有するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２５６〜５７６位；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２５６〜５７６位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、直接のイオン流を必要とすることなく電気的なシグナルを化学的なシグナルに変換し得る単一ポリペプチドに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
イオンチャネルは、細胞膜上に存在して細胞へのイオンの透過を制御する。具体的には、イオンチャネルは、細胞膜を貫通する構造を有しており、さまざまな刺激によって開閉することによって、細胞内へのイオンの流入、または細胞外へのイオンの排出を司る。このようなイオンチャネルは、筋収縮、神経伝達物質の放出、インスリンの分泌など重要な生体反応を惹起する分子の１つである。例えば、神経細胞の電気的な情報伝達にはナトリウムチャネルやカリウムチャネルが必要であり、筋肉の収縮にはカルシウムチャネルが不可欠である。イオンチャネルとしては、細胞内外の電位差に応じて開閉する電位依存性イオンチャネル、レセプターと複合体化してそのリガンドの結合に応じて開閉するレセプター作動性イオンチャネルが挙げられる。
【０００３】
本発明者らは、これまで、原索動物であるホヤを用いてイオンチャネルを介した電気的活動を解析している。
【０００４】
ホヤは、尾索動物群に属する動物であって、頭索動物（例えば、ナメクジウオ）および脊椎動物（例えば、カエル、ヒトなど）とともに、脊索動物門を構成する。脊索動物であるホヤの遺伝子には、脊椎動物のような遺伝子の重複がなく、遺伝子重複前の脊索動物の基本型を保っている。また、ホヤのオタマジャクシ型幼生の体制は、脊索動物の体制の最も単純な型（原型）を表している。したがって、脊索動物であるホヤは、ヒトを含む脊椎動物全般の発生メカニズムの解明に最適のモデル動物であり、ホヤにおいて発現する遺伝子は、遺伝子治療および再生医療などの医療分野、さらには環境分野、食品分野などの種々の分野に、それら遺伝子は応用できると期待されている。
【０００５】
本発明者らは、以前、カタユウレイボヤの尾芽胚における遺伝子発現プロファイルを報告している（例えば、非特許文献１を参照のこと）。
【０００６】
また、本発明者らは、カタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）の受精卵、卵割期胚、尾芽胚、幼生、幼若体または精巣で発現する遺伝子のｍＲＮＡに対して、３’側７６，９２０および５’側７６，２５０のＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ：発現配列タグ）解析を行い、これらの中から約５，０００の遺伝子を選んでその発現をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって調べ、約５００の遺伝子がホヤの尾芽胚、幼生、または幼若体の組織あるいは器官において特異的に発現することを見出し、さらにそれらの中から２６１の遺伝子のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の全塩基配列を決定した（例えば、特許文献１を参照のこと）。
【０００７】
さらに本発明者は、カタユウレイボヤの尾芽胚および幼生で発現する遺伝子のｍＲＮＡに対して、３’側約２３，０００および５’側約２３，０００のＥＳＴ解析を行い、これらの中から約３，０００の遺伝子を選んでその発現をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって調べ、約２００の遺伝子が、ホヤの神経系（中枢神経系または末梢神経系）で発現することを見出し、さらにそれらの中から１０８の遺伝子のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の全塩基配列を決定した（例えば、特許文献２を参照のこと）。
【０００８】
〔特許文献１〕
特開２００４−５７１２９公報（平成１６年２月２６日公開）
〔特許文献２〕
特開２００４−５７１２７公報（平成１６年２月２６日公開）
〔非特許文献１〕
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８，２８９３−２９０４（２００１）。
【０００９】
イオンチャネルに関する研究において、アフリカツメガエルの卵母細胞などに遺伝子導入手法によってイオンチャネルを発現させ、電気生理学の手法で解析する実験系が確立している。このような実験系を用いて、イオンチャネルの機能およびその制御機構、またはイオンチャネル活性に与える薬剤の影響などが調べられている。
【００１０】
一般的に、薬剤がイオンチャネルに与える影響を調べるためには、細胞内外にイオンが出入りした際に発生するごく微量の電流を捉える必要があり、細胞膜の電圧を細胞から測定する際には、直接的な電気的測定、または電圧感受性色素などを用いた定量的解析が必要であったが、これらの手法では、細胞における局所の膜電位の情報を得ることは困難であった。特に、精子などの構造が小さく、電気生理学的手法が用いにくい材料については解析が不可能であった。また、このような実験を遂行するためには熟練した技術が必要でありかつ手間もかかる。
【００１１】
さらに、酵素またはレセプターに関する研究で用いられているスクリーニング方法は、イオンチャネルに関する研究にはそのまま適用することができない。従って、イオンチャネルに関する創薬の研究は、あまり進んでいない。実際に、イオンチャネルに作用する薬剤として知られているものは、降圧薬としてのカルシウム拮抗薬または局所麻酔薬などのみである。
【００１２】
このように、生体の生理機能とイオンチャネル分子との関係がこれまで広範に研究されているものの、全てのチャネル様タンパク質が同定されているとはいえず、解明されていないことが依然として多い。そのため、単純な生物においてゲノムレベルから個体レベルまでチャネル機能を網羅的に解析することは有用である。
【発明の開示】
【００１３】
イオンチャネル分子に基づく生理学的事象を理解するために、本発明者らは、原索動物に属する尾索類の動物であるカタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）のゲノム配列においてイオンチャネル遺伝子を網羅的に調べ、そのイオンチャネル分子種のレパートリーを、ショウジョウバエ、ヒトまたはフグのものと比較した。その結果、本発明者らは、電位依存的ナトリウムチャネルに有意な相同性を有する遺伝子を見出した。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、直接のイオン流を必要とすることなく電気的なシグナルを化学的なシグナルに変換し得る単一のタンパク質として新規の膜タンパク質である。このような性質を有する膜タンパク質はこれまで知られていない。さらに本発明者らは、この新規膜タンパク質の特定領域が単独で電位センサーとして機能し得ること、および、別の領域がホスファターゼ活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明に係るポリペプチドは、電位センサーとして機能し得るポリペプチドであって：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜２３９位；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜２３９位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなることを特徴としている。
【００１５】
本発明に係るポリペプチドは、電位センサーとして機能し得るポリペプチドであって：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜２５５位；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜２５５位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなることを特徴としている。
【００１６】
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記のポリペプチドをコードすることを特徴としている。
【００１７】
本発明に係るポリペプチドは、直接のイオン流を必要とすることなく電気的なシグナルを化学的なシグナルに変換し得るポリペプチドであって：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなることを特徴としている。
【００１８】
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記のポリペプチドをコードすることを特徴としている。
【００１９】
本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第８５〜９６位を含むことを特徴としている。
【００２０】
本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメントでありかつ配列番号１に示されるアミノ酸配列の第８５〜９６位を含むことが好ましい。
【００２１】
本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第８５〜９６位からなることが好ましい。
【００２２】
本発明に係る抗体は、上記のポリペプチドに結合することを特徴としている。
【００２３】
本発明に係るポリペプチドは、イノシトールリン脂質ホスファターゼ活性を有するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２５６〜５７６位；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２５６〜５７６位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなることを特徴としている。
【００２４】
新規電位センサー分子である本発明に係るポリペプチドを用いれば、細胞内局所の膜電位変化を化学的信号または光学的信号に変換して捉えることができるので、ガラス電極による従来の電気生理学では解析することが不可能であった精子、および／またはアクセスすることが困難な骨細胞などにおける生理機能の解析、ならびに非侵襲的な膜電位の測定または生理機能の解析が可能になる。
【００２５】
本発明を用いれば、精子の運動性を制御することが可能となり、避妊あるいは不妊症を治療または予防することができる。また、本発明に係るポリペプチドをコードする遺伝子の相同遺伝子が、マウス、ヒト、ゼブラフィッシュに存在し、ヒトにおける当該相同遺伝子は、肝細胞癌の腫瘍マーカー分子であることが知られている。従って、細胞膜電位を変化させる薬剤を用いれば、肝細胞癌の悪性度を制御することができる。
【００２６】
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記のポリペプチドをコードすることを特徴としている。
【００２７】
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】  ホヤ類タンパク質Ｃｉ−ＶＳＰのトポロジーおよび一次構造を示す。ａは、電位依存性でありかつ内向き整流性のカリウムチャネルと比較したＣｉ−ＶＳＰポリペプチドのモジュール構造を示す。ｂは、Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図２】  Ｃｉ−ＶＳＰの膜貫通ドメインが電位センサーとして作用することを示すグラフである。ａは、Ｃｉ−ＶＳＰを発現するアフリカツメガエルｃｕｔ−ｏｐｅｎ  ｏｏｃｙｔｅから記録した非対称の置換電流の代表例を示す。ｂは、ａで示したゲート電流の電位変化によって運ばれた電荷を各膜電位で比較したグラフである。ｃは、ｃｕｔ−ｏｐｅｎ  ｏｏｃｙｔｅ法で記録した、Ｃ末端部分全体を欠いた（Ｓ１〜Ｓ４のみにした）短縮型タンパク質の電流置換を示す。ｄは、Ｃｉ−ＶＳＰ  Ｒ２２９Ｑ／Ｒ２３２Ｑを発現するｃｕｔ−ｏｐｅｎ  ｏｏｃｙｔｅからの記録を示す。
【図３】  Ｃｉ−ＶＳＰの細胞内ドメインがホスファチジルイノシトールホスファターゼであることを示す図である。ａは、Ｃｉ−ＶＳＰのホスファターゼ活性中心のアミノ酸配列と、いくつかの種からのＰＴＥＮのホスファターゼ活性中心のアミノ酸配列との比較を示す図である。ｂは、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅとＣｉ−ＶＳＰのホスファターゼ様ドメインとの融合タンパク質のイノシトールリン脂質ホスファターゼ活性を示すグラフである。
【図４】  Ｃｉ−ＶＳＰの酵素活性を調べた結果を示す。ａは、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いてＣｉ−ＶＳＰの酵素活性を調べた結果であり、ｂ・ｃは、Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎアッセイによって算出した酵素活性速度を示す。
【図５】  Ｋ＋チャネル活性のプローブとしてのＣｉ−ＶＳＰによるイノシトールリン脂質ダイナミクスの電位依存的変化を示す。ａは、一過性の変化を示すＧＩＲＫ電流の軌跡および電流幅のプロットを示すグラフである。ｂは、Ｃｉ−ＶＳＰを同時発現させた場合のＩＲＫ１電流軌跡および電流幅の時間依存的な変化のプロットを示すグラフである。ｃは、Ｃｉ−ＶＳＰの野生型、Ｃ３６３Ｓ変異体またはＲ２２９Ｑ／Ｒ２３２Ｑ変異体を発現するｏｏｃｙｔｅからのＫＣＮＱ２／３電流軌跡および電流幅の時間依存的な変化のプロットを示すグラフである。ｄは、カリウムチャネルの量の電位依存的変化をまとめたグラフである。
【図６】  Ｋ＋チャネル活性によって検出したホスファターゼの電位依存性を示す図である。ａは、Ｃｉ−ＶＳＰおよびＧＩＲＫ２を発現するｏｏｃｙｔｅからのＧＩＲＫ電流の代表的な記録を示すグラフである。ｂは、試験パルス間インターバルの膜電位レベルに対するＧＩＲＫ電流の電流幅のプロットを示す図である。
【図７】  電位センサードメインとホスファターゼドメインとの間のリンカー領域がカップリングに重要であることを示す図である。ａは、Ｓ４様セグメントとホスファターゼ様ドメインとの間のリンカー領域（ＭＫＡＳＳＲＲＴＩＳＱＮＫＲＲＹ）を示す図である。ｂは、試験パルス間のインターバルの間での過分極または脱分極に対するＫｉｒ電流の一過性変化を示すグラフである。ｃは、種々の膜電位でのインターバルのシリーズに関するＧＩＲＫ２（左）またはＫＣＮＱ２／３（右）との発現についてのデータを要約したグラフである。
【図８】  精子尾部におけるＣｉ−ＶＳＰの局在を示す図である。ａは、心臓、体壁筋肉、生殖腺および精巣におけるＣｉ−ＶＳＰ転写物のＲＴ−ＰＣＲを示す図である。ｂ〜ｇは、Ｃｉ−ＶＳＰのペプチド配列に対するポリクローナル抗体を用いる、Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｓ精子に対する免疫組織化学を示す図である。ｈ〜ｋは、精子鞭毛の生体膜でのＣｉ−ＶＳＰの免疫電顕像を示す写真である。
【図９】  Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチドの特性に基づく応用を図式化したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の実施の一形態について以下に詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。
【００３０】
以下、本発明に係るポリペプチド、およびその利用について詳述する。
【００３１】
（１）ポリペプチド
本発明者らは、電位依存的ナトリウムチャネルに低い相同性を有する新規遺伝子のｃＤＮＡを、若いカタユウレイボヤ成体からＲＴ−ＰＣＲによってクローニングした後、コード領域全体を完全に配列決定した。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、４つの膜貫通領域の後に酵素様領域を含む。このタンパク質の４つの膜貫通セグメントは、３アミノ酸毎に周期的に位置する数個の正電荷のアミノ酸残基を含む電位依存的チャネルのＳ４セグメントに対して非常に高い相同性を示した。この電位依存的チャネルは、膜電位変化に従って膜を横切って移動することが知られている。従って、本発明者らは、このカタユウレイボヤ由来のタンパク質をＣｉ−ＶＳＰ（電位センサー含有タンパク質）と名付けた。
【００３２】
本発明に係るポリペプチドは、図１に示すようなモジュール構造およびアミノ酸配列を有する。図１ａに示すように、本発明に係るポリペプチドは、電位依存性チャネルおよび内向き整流性カリウムチャネルとは異なるモジュール構造を有している。また，図１ｂに示すように、本発明に係るポリペプチドは、電位依存性チャネルのＳ１〜Ｓ４セグメントに類似する４つの膜貫通セグメント（下線を付した）およびＰＴＥＮ様ホスファターゼドメインを含んでいる（ホスファターゼドメインのＰ−ループを四角で囲む）。
【００３３】
上述したように、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＣｉ−ＶＳＰタンパク質は、直接のイオン流を必要とすることなく電気的なシグナルを化学的なシグナルに変換し得る単一のタンパク質である。また、このＣｉ−ＶＳＰタンパク質の特定領域（すなわち、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜２３９位からなる４つの膜貫通セグメント）は、単独で電位センサーとして機能し得、そのＣ末端領域（すなわち、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２５６〜５７６位からなるポリペプチド）がホスファターゼ活性を有し、そしてこれらの領域を特定のリンカー領域（すなわち、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２４０〜２５５位（配列番号４）からなるポリペプチド）が連結する。本発明に係るＣｉ−ＶＳＰポリペプチドは、このような独特の構成を有することによって、電位センサーモジュールが感知した電気的シグナルの変化をリンカー領域が媒介して酵素ドメインでの酵素活性を調節する。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、組換え的に生成されてもよい。本明細書中において使用される場合、「Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチド」は「Ｃｉ−ＶＳＰタンパク質」と置換可能に使用され、Ｃｉ−ＶＳＰと称する場合もある。
【００３５】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００３６】
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、原核生物宿主および真核生物宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００３７】
１つの局面において、本発明は、ＶＳＰ活性を有するポリペプチドを提供する。本明細書中で使用される場合、「ＶＳＰ活性」は、直接のイオン流を必要とすることなく、電気的なシグナルを、リン酸化状態などを含む化学的なシグナルに変換する活性が意図される。
【００３８】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体でありかつＶＳＰ活性を有するポリペプチドが好ましい。本明細書中において使用される場合、「Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチド」は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその変異体が意図される。
【００３９】
このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。
【００４０】
ポリペプチドのアミノ酸配列中におけるいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００４１】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性のアミノ酸置換、欠失、または付加を有する。好ましくは、サイレント置換、付加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチドのＶＳＰ活性を変化させない。
【００４２】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中の１つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００４３】
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，  Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０  （１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
【００４４】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法（変異誘発法）に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望のＶＳＰ活性を有するか否かを容易に決定し得る。
【００４５】
１つの局面において、本実施形態に係るポリペプチドは、ＶＳＰ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなるポリペプチドであることが好ましい。このような変異ポリペプチドは、上述したように、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００４６】
他の局面において、本発明は、電位センサーとしての活性を有するポリペプチドを提供する。本明細書中で使用される場合、「電位センサーとしての活性」は、膜電位変化としての電気的シグナルを感知することができる、すなわち、電位センサーとして機能する活性が意図される。
【００４７】
１つの実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜２３９位からなるポリペプチドが好ましい。本実施形態に係るポリペプチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（リンカー領域）をさらに含んでもよい。
【００４８】
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜２３９位からなるポリペプチドの変異体でありかつ電位センサーとしての活性を有するポリペプチドが好ましい。本実施形態に係るポリペプチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをさらに含んでもよい。
【００４９】
上述した本発明に係る「Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチド」は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜２３９位を含むので、上述したＶＳＰ活性だけでなく電位センサーとしての活性を有する。すなわち、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメントでありかつ配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜２３９位を含むポリペプチドまたはその変異体もまた、本発明に係る「電位センサーとしての活性」を有するポリペプチドに包含されることを、当業者は容易に理解する。
【００５０】
別の局面において、本発明は、イノシトールリン脂質ホスファターゼ活性を有するポリペプチドを提供する。本明細書中において使用される場合、用語「ホスファターゼ活性」は、リン酸化イノシトールリン脂質を基質とする脱リン酸化酵素が意図される。
【００５１】
１つの実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２５６〜５７６位からなるポリペプチドが好ましい。
【００５２】
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２５６〜５７６位からなるポリペプチドの変異体でありかつ電位センサーとしての活性を有するポリペプチドが好ましい。
【００５３】
上述した本発明に係る「Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチド」は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２５６〜５７６位を含むので、上述したＶＳＰ活性だけでなくホスファターゼ活性を有する。すなわち、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメントでありかつ配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２５６〜５７６位を含むポリペプチドまたはその変異体もまた、本発明に係る「ホスファターゼ活性」を有するポリペプチドに包含されることを、当業者は容易に理解する。
【００５４】
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるリンカー領域は、電位センサーモジュールが感知した電気的シグナルの変化に基づいて酵素モジュールでの酵素活性を調節するために重要な領域である。従って、Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチドの酵素モジュールをホスファターゼドメイン以外の酵素ドメインと置換しても、電位センサーモジュールが感知した電気的シグナルの変化に基づいて新たな酵素ドメインの活性を調節することができる。
【００５５】
本発明に係るポリペプチドについて、ＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチドについて詳述してきたが、異なる局面において、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。本発明に係るポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、少なくとも６個、７個、８個、９個、１０個のアミノ酸を有するポリペプチドの部分を含むが、本発明に係るポリペプチドの全アミノ酸配列の長さまでの任意の長さ（全体を含む）のエピトープ保有部分ポリペプチドもまた含まれる。
【００５６】
さらに本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有ペプチドを提供する。本明細書から明らかなように、本発明のポリペプチドは免疫原性である。従って、本発明のポリペプチドの抗体応答を惹起するタンパク質のエピトープ部分は、当該分野で公知の方法により同定される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）は、酵素−結合免疫吸着アッセイにおける反応に十分に純粋な何百というペプチドの固体支持体上の迅速な同時合成の手順を開示する。合成ペプチドの抗体との相互作用は、次いで、それらを支持体から除去することなく容易に検出される。この様式において、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドは、当業者により日常的に同定され得る。例えば、口蹄疫ウイルスのコートタンパク質における免疫学的に重要なエピトープは、タンパク質の２１３のアミノ酸配列全体を覆う全ての２０８の可能なヘキサペプチドの重複セットの合成による７アミノ酸の解明によりＧｅｙｓｅｎらによって位置付けされた。次いで、全ての２０アミノ酸が順にエピトープ内の各位置で置換されたペプチドの完全な置換セットが合成され、そして抗体との反応のための特異性を与える特定のアミノ酸が決定された。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドのペプチドアナログは、この方法により日常的に作製され得る。Ｇｅｙｓｅｎ（１９８７）の米国特許第４，７０８，７８１号は、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドを同定するこの方法をさらに記載している。
【００５７】
「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。これらの免疫原性エピトープは、分子上の２、３の焦点に制限されると考えられている。一方では、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義され得る。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８−４００２（１９８４）を参照のこと。
【００５８】
本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドは、本発明に係るポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を惹起するのに有用である。従って、抗原エピトープ保有ペプチドで免疫化されたドナーからの脾臓細胞の融合により得られるハイブリドーマの大部分は、一般に天然のタンパク質と反応性がある抗体を分泌する。抗原性エピトープ保有ペプチドにより惹起された抗体は、模倣タンパク質を検出するのに有用であり、そして異なるペプチドに対する抗体が、翻訳後プロセシングを受けるタンパク質前駆体の種々の領域の末路を追跡するために使用され得る。免疫沈降アッセイにおいて、短いペプチド（例えば、約９アミノ酸）でさえ、より長いペプチドに結合しそして置換し得ることが示されているので、ペプチドおよび抗ペプチド抗体は、模倣タンパク質についての種々の定性的または定量的アッセイ、例えば、競合的アッセイにおいて使用され得る。例えば、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７−７７８（１９８４）７７７を参照のこと。本発明の抗ペプチド抗体もまた、模倣タンパク質の精製（例えば、当該分野で周知の方法を使用して、吸着クロマトグラフィーにより）に有用である。
【００５９】
上記のガイドラインに従って設計された本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドは、好ましくは本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる少なくとも７、より好ましくは少なくとも９、そして最も好ましくは約１５〜約３０アミノ酸の間の配列を含む。しかし、本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列の約３０〜約５０アミノ酸または全体までの任意の長さおよび全体を含む、本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列のより大部分を含むペプチドまたはポリペプチドもまた、本発明のエピトープ保有ペプチドであると考えられ、そしてまた模倣タンパク質と反応する抗体を誘導するのに有用である。好ましくは、エピトープ保有ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒中で実質的な溶解性を提供するように選択され（すなわち、その配列は、比較的親水性残基を含み、そして高度な疎水性配列は好ましくは回避される）；そしてプロリン残基を含む配列が特に好ましい。
【００６０】
好ましくは、本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第８５〜９６位を含む。より好ましくは、本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその変異体のフラグメントでありかつ配列番号１に示されるアミノ酸配列の第８５〜９６位を含む。最も好ましくは、本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第８５〜９６位からなる。
【００６１】
本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。
【００６２】
また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【００６３】
また、本発明に係るポリペプチドは、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製されてもよい。
【００６４】
他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加され得る。
【００６５】
本実施形態に係るポリペプチドは、例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）にＮ末端またはＣ末端へ付加され得る。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）（本明細書中に参考として援用される）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端にてＦｃに融合される本実施形態に係るポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。
【００６６】
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、下記で詳述されるように組換え生成されてもよい。
【００６７】
組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行うことができ、例えば、以下に詳述されるようなベクターおよび細胞を用いて行うことができる。
【００６８】
このように、本発明に係るポリペプチドは、ＶＳＰ活性を有するポリペプチドであって、少なくとも、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるかまたはその活性を保持した変異体であるポリペプチド、あるいは当該ポリペプチドのエピトープを保有するポリペプチドであればよいといえる。また、本発明に係るポリペプチドは、電位センサーとしての活性を有するポリペプチドであって、少なくとも、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜２３９位からなるかまたはその活性を保持した変異体であるポリペプチド、あるいは、ホスファターゼ活性を有するポリペプチドであって、少なくとも、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２５６〜５７６位からなるかまたはその活性を保持した変異体であるポリペプチドも含まれる。すなわち、上記ポリペプチドと特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とが連結されたポリペプチドも本発明に含まれることに留意すべきである。また、上記ポリペプチドと特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とは、それぞれの機能を阻害しないように適切なリンカーペプチドで連結されていてもよい。ただし、ＶＳＰ活性を発揮するためには、当該リンカーペプチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましい。
【００６９】
つまり、本発明の目的は、ＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチド、あるいは当該ポリペプチドのエピトープを保有するポリペプチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチド、あるいは当該ポリペプチドのエピトープを保有するポリペプチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００７０】
（２）ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド
１つの局面において、本発明は、ＶＳＰ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを提供する。他の局面において、本発明は、電位センサーとしての活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを提供する。別の局面において、本発明は、ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを提供する。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「ポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
【００７２】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００７３】
また本発明に係るポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに融合され得る。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個（または数百個以上）結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、合成されてもよい。
【００７５】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、少なくとも１２ｎｔ（ヌクレオチド）、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図される。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０  Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ  ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。
【００７６】
本発明に係るオリゴヌクレオチドがＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、本発明に係るポリヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして本発明に係るポリペプチドを作製するために使用され得ることを容易に理解する。本発明に係るポリペプチドをコードしない本発明に係るオリゴヌクレオチドの他の用途としては、以下が挙げられる：（１）ｃＤＮＡライブラリー中のＣｉ−ＶＳＰ遺伝子またはその対立遺伝子もしくはスプライシング改変体の単離；（２）Ｃｉ−ＶＳＰ遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッドへのインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）（Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される）；および（３）特定の組織におけるＣｉ−ＶＳＰのｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析。
【００７７】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった１本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡメカニズムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。アンチセンスＲＮＡ技術によって、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少が観察される。本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００７８】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法としては、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離する種々の公知の方法が挙げられる。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製して、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすれば、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得することができる。このようなプローブとしては、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）であればよい。このようなハイブリダイゼーションによって選択されるポリヌクレオチドとしては、天然のポリヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されない。
【００７９】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得する別の方法として、ＰＣＲを用いる方法が挙げられる。このＰＣＲ増幅方法は、例えば、本発明に係るポリヌクレオチドのｃＤＮＡの５’側および／または３’側の配列（またはその相補配列）を利用してプライマーを調製する工程、これらのプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等をテンプレートにしてＰＣＲ増幅する工程を包含することを特徴としており、本方法を使用すれば、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。
【００８０】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、カタユウレイボヤ成体の精巣組織のような生物材料であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。
【００８１】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを用いれば、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出することによって、ＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチドを発現する生物または組織（細胞を含む）を容易に検出することができる。
【００８２】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーションプローブ、あるいはＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することによって、ＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチドを発現する生物または組織を容易に検出することができる。好ましくは、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、配列番号２または３に示される塩基配列からなる。なおさらに、上記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用して、上記生物体またはその組織もしくは細胞におけるＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチドの発現を抑制することができる。
【００８３】
別の局面において、本発明は、ＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチドのエピトープを保有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００８４】
つまり、本発明の目的は、ＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または当該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、あるいは当該ポリペプチドのエピトープを保有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または当該ポリペプチドのエピトープを保有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００８５】
（３）本発明に係るポリペプチドまたはポリヌクレオチドの利用
（Ａ）ベクター
本発明は、本発明に係るポリペプチドを産生するために使用されるベクターを提供する。本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されないが、ＲＮＡポリメラーゼの認識配列を有するプラスミドベクター（ｐＳＰ６４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど）が好ましい。例えば、ＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチド（シグナル配列を含んでも含まなくてもよい）をコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００８６】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００８７】
本発明に係る発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。発現ベクターの作製は、制限酵素および／またはリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
【００８８】
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物などから慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）に従って、目的タンパク質を回収、精製することができる。
【００８９】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【００９０】
上記選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明に係るポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光ポリペプチドＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るポリペプチドをＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。
【００９１】
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）などが挙げられる。
【００９２】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドを昆虫で発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【００９３】
本発明に係るベクターを使用すれば、上記ポリヌクレオチドを生物または細胞に導入すれば、当該生物または細胞中にＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチドを発現させることができる。
【００９４】
このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現用ベクターであればよいといえる。
【００９５】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現用ベクターを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種およびベクター作製方法を用いて取得した発現用ベクターも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００９６】
（Ｂ）形質転換体
本発明は、上述したＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図される。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物が挙げられる。
【００９７】
本発明に係る形質転換体は、上述したＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチドが発現されていることを特徴とする。本発明に係る形質転換体は、ＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチドが安定的に発現することが好ましいが、一過性に発現してもよい。
【００９８】
一実施形態において、本発明に係る形質転換体は、本発明に係るベクターを、ポリペプチドが発現され得るように生物中に導入することによって取得される。好ましくは、本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリペプチドを安定して発現する細胞である。
【００９９】
（Ｃ）ポリペプチドの生産方法
本発明は、本発明に係るポリペプチドを生産する方法を提供する。本発明に係るポリペプチドの生産方法を用いれば、ＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチドを低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することが可能となる。また、本発明に係るポリペプチドの生産方法を用いれば、ＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチドを容易に生産することが可能となる。
【０１００】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るベクターを用いることを特徴とする。
【０１０１】
本実施形態の１つの局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、生物宿主を用いる組換え発現系を用いることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明に係るポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能に宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。
【０１０２】
このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。
【０１０３】
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを天然または組換え的に発現する細胞または組織から当該ポリペプチドを精製することを特徴とする。本発明に係るポリペプチドは、成熟形態で細胞から分泌されるので、本発明に係るポリペプチドを天然または組換え的に発現する細胞の培養上清から回収することができる。このような細胞を用いる場合、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、培養上清を回収する工程を包含する。また、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上述したポリペプチドを精製する工程をさらに包含してもよい。
【０１０４】
本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【０１０５】
つまり、本発明の目的は、ＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチドを生産する方法を提供することにあるのであって、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１０６】
（Ｄ）抗体
本発明は、本発明に係るポリペプチドに結合する抗体を提供する。本発明に係る抗体を用いれば、ＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチドの検出など広範な種々のアッセイを行うことが可能となる。また、本発明に係る抗体を用いれば、ＶＳＰ活性、電位センサーとしての活性またはホスファターゼ活性を有するポリペプチドを容易に精製することが可能となる。
【０１０７】
一実施形態において、本発明に係る抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合することが好ましい。より好ましくは、本発明に係る抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメントでありかつ配列番号１に示されるアミノ酸配列の第８５〜９６位を含むポリペプチドに結合する。もっとも好ましくは、本発明に係る抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第８５〜９６位からなるポリペプチドに結合する。
【０１０８】
本発明に係る抗体は、上述したようなエピトープ保有ペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用する組換え手段を包含するペプチドを作製するための任意の従来の手段により産生されたポリペプチドを抗原として用いて惹起され得る。このような抗原は、例えば、短いエピトープ保有アミノ酸配列は、組換え体産生および精製の間、ならびに抗ペプチド抗体を産生するための免疫化の間、キャリアとして作用するより大きなポリペプチドに融合され得る。抗原であるエピトープ保有ペプチドはまた、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。
【０１０９】
本発明に係る抗体は、上述したようなエピトープ保有ペプチドを当該分野に周知の方法に従って使用して誘導される。例えば、Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。一般には、動物は遊離ペプチドで免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価はペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にカップリングすることにより追加免疫され得る。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを使用してキャリアにカップリングされ得、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングされ得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離またはキャリア−カップリングペプチドのいずれかで、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびＦｒｅｕｎｄのアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および／または皮内注射により免疫化される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用してＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増加され得る。
【０１１０】
特定の局面において、本発明は、Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチドの機能を阻害する抗体を提供する。Ｃｉ−ＶＳＰのＳ１〜Ｓ４領域の細胞外領域であるアミノ酸第１２４〜１３４位、第１４５〜１６０位、第２００〜２１４位、第２１５〜２３０位の各領域の１０〜１５アミノ酸からなるペプチドを合成し、これらをウサギに免疫して、血清からＩｇＧ分画を精製する。アフリカツメガエル卵母細胞系にＶＳＰを発現させた後、当該細胞に得られた抗体を混合したＮＤ９６溶液を投与する。投与前後でＶＳＰの機能阻害の有無を調べることによって、Ｃｉ−ＶＳＰの機能阻害抗体を作製することができる。
【０１１１】
（Ｅ）スクリーニング方法および薬学的組成物
本発明は、Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチドの機能を調節する化合物をスクリーニングする方法および当該化合物を含む薬学的組成物（例えば、医薬）を提供する。
【０１１２】
抗Ｃｉ−ＶＳＰ抗体を用いた免疫組織染色の結果から、Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチドは精子の尾部に局在することが明らかになった。Ｃｉ−ＶＳＰは、膜電位依存的に酵素活性を変化させるので、電気的信号によって精子の運動を制御すると考えられる。
【０１１３】
精子におけるＣｉ−ＶＳＰポリペプチドの機能を調節する化合物のスクリーニング方法は、
（Ｉ）ツメガエル卵母細胞にＶＳＰとＧＩＲＫチャネルとを強制発現させる工程；
（ＩＩ）当該細胞に候補化合物を投与する工程；および
（ＩＩＩ）電位依存的Ｋチャネル活性またはゲート電流を検出する工程
を包含する。さらに精子の運動性を調べる場合は、当該スクリーニング方法によって同定された薬剤を、単離したマウス精子に適用して運動性の変化を調べればよい。
【０１１４】
具体的には、マウス精子をクレブスリンゲル液へ単離し、５０μＭ〜１ｍＭのｃＡＭＰアナログおよび１００μＭのＩＢＭＸを含むクレブスリンゲル液で希釈する。５％ＣＯ２／９５％Ｏ２の混合ガス下にて、３７℃で５〜１８０分間培養した後、最低５００匹の精子を８０μｍの深さの容器に入れて精子画像解析装置（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ−Ｔｈｏｒｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製のＩＶＯＳ  Ｓｐｅｒｍ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて、薬物存在下または非存在下で運動性が変化するか否かを調べればよい。また、このようなスクリーニング方法によって得られた化合物を、を用いれば、精子の運動性を制御することが可能となり、避妊あるいは不妊症を治療または予防することができる。
【０１１５】
また、本発明に係るポリペプチドをコードする遺伝子の相同遺伝子が、マウス、ヒト、ゼブラフィッシュに存在し、ヒトにおける当該相同遺伝子は、肝細胞癌の腫瘍マーカー分子であることが知られている。従って、細胞膜電位を変化させる薬剤を用いれば、肝細胞癌の悪性度を制御することができる。
【０１１６】
ガン細胞の悪性度を制御するための化合物は、以下のようにしてスクリーニングすることができる。
【０１１７】
ヒトＶＳＰ遺伝子を発現する肝癌細胞を、血清１０％を含むＤＭＥＭ培地中にて３７℃で培養する。ＶＳＰの遺伝子発現を、ヒトＶＳＰ特異的なＰＣＲプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ反応によって確認する。ヒト肝癌細胞から総ＲＮＡを抽出し、約１μｇのＲＮＡから逆転写してｃＤＮＡを合成する。ＰＣＲを、９４℃で６０秒間、５５℃  で４５秒間、７２℃で６０秒間を３０サイクル行う。
【０１１８】
細胞が５０％コンフルエントの状態になったら、培養皿の培地を、ＡＴＰ−Ｋチャネルの活性化薬であるＮｉｃｏｒａｎｄｉｌ（１００μＭ）またはＤｉａｚｏｘｉｄｅ（０．１ｍＭ）を含む培地と交換する。培地交換後、時間を追って、ＴＵＮＥＬ法およびトリパンブルー染色を行い、アポトーシスを生じた細胞数を計数する。また、種々の濃度のＮｉｃｏｒａｎｄｉｌまたはＤｉａｚｏｘｉｄｅを用いる条件下で同様の定量を行い、アポトーシスとＫチャネル活性化薬の濃度との関係を明らかにする。
【０１１９】
本発明に係る薬学的組成物は、薬理学的に活性な化合物に加えて、適切な薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。このキャリアは、薬学的に用いられ得る調製物中での活性な化合物の処理を容易にする賦形剤および助剤を含む。本発明に係る薬学的組成物中に使用される薬学的に受容可能なキャリアは、薬学的組成物の投与形態および剤型に応じて当業者が適宜選択することができる。
【０１２０】
経口剤の場合、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が薬学的に受容可能なキャリアとして利用される。また経口剤を調製する際、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合してもよい。
【０１２１】
非経口剤の場合、当該分野において公知の方法に従って、本発明の有効成分を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、所望により殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製することができる。
【０１２２】
本発明に係る薬学的組成物は、製薬分野における公知の方法により製造することができる。本発明に係る薬学的組成物における薬理学的に活性な化合物の含有量は、投与形態、投与方法などを考慮し、当該薬学的組成物を用いて後述の投与量範囲で活性な化合物を投与できるような量であれば特に限定されない。
【０１２３】
本発明に係る薬学的組成物は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与できる。例えば、本発明に係る薬学的組成物は、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経路による簡便な様式で投与され得る。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与することができる。
【０１２４】
本発明に係る薬学的組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。
【０１２５】
（Ｆ）エキソビボ治療のための方法、組成物およびキット
本発明はさらに、エキソビボで被験体由来の細胞を操作して、被験体を治療するための方法、組成物およびキットを提供する。
【０１２６】
抗Ｃｉ−ＶＳＰ抗体を用いた免疫組織染色の結果から、Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチドは精子の尾部に局在することが明らかになった。Ｃｉ−ＶＳＰは、膜電位依存的に酵素活性を変化させるので、電気的信号によって精子の運動を制御すると考えられる。被験体の精子中のＣｉ−ＶＳＰ遺伝子を操作することによって、Ｃｉ−ＶＳＰにおける変異に起因して生じる不妊症を治療または予防することができる。
【０１２７】
例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は当該分野で周知であり、本明細書中の教示から明らかである。例えば、細胞は、本発明に係るポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターの使用により操作され得る。
【０１２８】
同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によりインビボで操作され得る。例えば、パッケージング細胞は、本発明に係るポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質転換され、このようにパッケージング細胞は今や目的の遺伝子を含む感染性のウイルス粒子を産生する。これらのプロデューサー細胞は、インビボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチドの発現のために、患者に投与され得る。このような方法により本発明に係るポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本明細書の記載に基づけば当業者には明らかである。
【０１２９】
（Ｇ）人工血管および／または人工骨
Ｃｉ−ＶＳＰを公知の遺伝子導入法によって細胞に強制的に発現させれば、細胞内の局所ＰＩＰ３濃度を膜電位依存的に制御することができる。細胞の形態は、細胞内局所のＰＩＰ３の濃度変化によって制御されていることが知られているので、Ｃｉ−ＶＳＰ発現細胞を一定電場の条件下で培養した場合に、細胞の形態または配置を電気的に制御することができる。この手法を用いれば、移植手術などに用いる多様な形状の人工臓器を開発することができる。Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチドの特性に基づく応用を図式化したものを図９に示す。
【０１３０】
以下、実施例を示し、本発明についてさらに詳しく説明するが、もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１３１】
〔実施例１：実験手順〕
〔プラスミドの作製〕
カタユウレイボヤの成体より単離した総ＲＮＡをテンプレートとして、逆転写ＰＣＲを行った。プライマー（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＧＡＴＴＣＧＡＣＧＧＴＴＣＡＧ−３’（配列番号２）；５’−ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＡＡＴＧＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧ−３’（配列番号３））を用いて、９６℃１０秒間、６０℃５秒間、７２℃２分間を３０〜３５サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【０１３２】
ＰＣＲ産物をストラタジーン社のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ｖｅｃｔｏｒのＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入してＣｉ−ＶＳＰのｃＤＮＡをサブクローニングした。ストラタジーン社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いて、上記ｃＤＮＡに点変異または欠失変異を導入した。導入した変異を、配列決定によって確認した。
【０１３３】
Ｃｉ−ＶＳＰのｃＤＮＡをツメガエル卵母細胞に発現させるために、発現ベクターであるｐＳＤ６４ＴＲ、ｐＳＤ６４ＴＦ（Ｔ．Ｓｎｕｔｃｈ博士より供与）またはｐＧＥＭ  ＨＥ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。ｃＲＮＡの合成を、Ａｍｂｉｏｎ社のｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  ｋｉｔを製造業者の指示書に従って行った。
【０１３４】
〔アフリカツメガエル卵母細胞での電気生理実験〕
アフリカツメガエル雌成体を０．１５％トリカイン溶液で麻酔した後、卵細胞を外科的に単離した。ＧＩＲＫ２、またはＧ−タンパク質βサブユニットもしくはγサブユニットを、Ｃｉ−ＶＳＰ  ＲＮＡに対して、０．３〜０．５倍の濃度で卵細胞に注入した。ＩＲＫ１またはＩＲＫ１（Ｒ２２８Ｑ）を、０．１倍の濃度で注入した。
【０１３５】
卵細胞を、ＮＤ９６中にて１７±１℃で２〜４日間培養した。ＣＡ１−Ｂ（ダーガン社）を用いて、ｃｕｔ−ｏｐｅｎ  ｏｏｃｙｔｅ電位固定記録を行った。刺激およびデータ獲得を、クランペックス（アクソンインスツルメンツ社）とＤｉｇｉｄａｔａ  １３２２Ａ  ＡＤ／ＤＡ変換機を用いて行った。細胞外液として、１０５ｍＭ  ＮＭＤＧ−Ｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎａｔｅ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）からなる緩衝液を用いた。細胞内液として、１０５ｍＭ  ＮＭＤＧ−Ｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎａｔｅ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）からなる緩衝液を用いた。細胞内還流を、シリンジポンプを用いガラス管を介して、２μｌ／分の速度にて行った。
【０１３６】
Ｑ−ＯＦＦ電流を、ワーナーインスツルメント社のＯＣ−７２５Ｃを用いて二本微小電極法により計測した。リーク電流と対称性容量電流を、保持電位−８０ｍＶからＰ／−１０プロトコールによって差し引いて求めた。二本微小電極法においては、細胞外液として、９６ｍＭ  ＮＭＤＧ−Ｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎａｔｅ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）からなる緩衝液を用いた。
【０１３７】
Ｃｉ−ＶＳＰとＫｉｒ電流またはＫＣＮＱ２／３電流とを共発現させた場合、二本微小電極電位固定法には、“ｂａｔｈ−ｃｌａｍｐ“アンプであるＯＣ−７２５Ｃを用いた。データの取得を、マッキントッシュコンピューターによりＩＴＣ−１６  ＡＤ／ＤＡ変換機とＰｕｌｓｅソフトウェア（ＨＥＫＡ社）を用いて行った。微小電極の抵抗としては、０．１〜０．６メガオームのものを用いた。標準的細胞外液として、Ｋｉｒチャネルの記録には、９２ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＫＯＨ、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）からなる緩衝液を用いた。
【０１３８】
ＫＣＮＱ２／３チャネル電流の場合は、２ｍＭ  ＫＣｌ、９２ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＮａＯＨ、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）からなる緩衝液を用いた。
【０１３９】
全てのＧＩＲＫ  ｃＲＮＡを、Ｇタンパク質β１およびＧタンパク質γ１とともに注入した。Ｋｉｒ電流のリーク電流変化を、１００ｍｓのランプパルスによりモニタリングした。保持電位０ｍＶまたはランプパルス中に大きなリーク電流を示す細胞を、データから除外した。ＫＣＮＱ２／３の記録の場合には、−６０ｍＶの保持電位で１マイクロアンペア以上の電流を示した細胞を除外した。
【０１４０】
最終的な出力電流は、１ｋＨｚの４ポールのベッセルフィルターによってフィルターした。取り込み周波数は、微小電極電位固定法の場合は１３−２７．７ｋＨｚであり、ｃｕｔ−ｏｐｅｎ  ｏｏｃｙｔｅ法の場合は、５０ｋＨｚ〜１００ｋＨｚであった。全ての電気記録は、室温（２３±２℃）で行われた。Ｉｇｏｒ  Ｐｒｏ（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｘ社）により解析した。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔにおいてｐ＜０．０５の条件で統計的有為差を求めた。結果を、平均±ＳＤで示し、図における誤差バーはＳＤを示す。
【０１４１】
〔ホスファターゼ活性のインビトロアッセイ〕
Ｎ末端側にＧＳＴタンパク質を融合させたＣｉ−ＶＳＰの細胞内ドメインを発現させるために、Ｃｉ−ＶＳＰのアミノ酸２４８〜５７６位をコードするｃＤＮＡをｐＧＥＸ４Ｔ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。大腸菌ＪＭ１０９に発現させたＧＳＴ融合タンパク質を、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて精製した。Ｃｉ−ＶＳＰのホスファターゼ活性を、ＰＴＥＮホスファターゼ計測において用いられている手法に従って行った。
【０１４２】
〔イムノブロットおよび免疫染色〕
Ｃｉ−ＶＳＰのアミノ酸８５〜９６位（ＥＮＥＨＧＶＤＤＧＲＭＥ）のペプチド配列に対するウサギポリクローナル抗体を生成した。精子を免疫染色するために、カタユウレイボヤの精子を、０．１Ｍ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、４％パラホルムアルデヒドで固定した後、ＴｒｉｔｏｎＸで可溶化した。２％ヤギ血清でブロッキングした後、精子を、Ｃｉ−ＶＳＰ抗体（最終濃度２．５μｇ／ｍｌ）と反応させた。ペプチド抗原（最終濃度２．５μｇ／ｍｌ）を用いて、抗体を吸収した。二次抗体には、Ａｌｅｘａ  ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）を１：１０００の希釈で用いた。サンプルを、ＰｅｒｍａＦｌｕｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ社）でマウントし、ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＬＳＭ５１０，Ｚｅｉｓｓ社）を用いて観察した。免疫電顕観察においては、精子を遠心分離によって集めた後、１％  ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ、０．２３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中で固定し、アフィニティー精製した抗ＶＳＰ抗体（６０μｇ／ｍｌ）と反応させた後、５ｎｍサイズの金粒子（ＢｉｏＣｅｌｌ，Ｃａｒｄｉｆｆ社）結合体化ヤギ抗ウサギ二次抗体を反応させた。サンプルを、１％四酸化オスミウムで後固定した後、脱水し、プロピレンオキサイドを通してエポン８１２に包埋した後、７０ｎｍの厚みで切片を作製した。
【０１４３】
〔細胞表面タンパク質の検出〕
Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチド（野生型またはＲ２２９Ｑ／Ｒ２３２Ｑ変異体）が細胞表面に検出していることを、ビオチン化標識法およびウエスタンブロッティングによって行った。表面タンパク質のビオチン化について、Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチド（野生型またはＲ２２９Ｑ／Ｒ２３２Ｑ変異体）を発現するｏｏｃｙｔｅを、ＮＤ９６中０．５ｍｇ／ｍｌ  ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）の存在下にて室温で８時間インキュベートした。各ｃＲＮＡについて４０個のｏｏｃｙｔｅをホモジナイズした。ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｂｅａｄｓ（Ｓｉｇｍａ）３０μｌをこの上清に添加し、そして遠心分離によって回収した。このサンプルをさらに、１０％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、引き続いて抗Ｃｉ−ＶＳＰポリクローナル抗体（０．１ｎｇ／ｍｌ）およびｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いるウエスタンブロッティングを行った。
【０１４４】
〔実施例２：電位センサーとして機能するＣｉ−ＶＳＰの膜貫通ドメイン〕
Ｃｉ−ＶＳＰの推定の膜貫通領域でのアミノ酸配列が、電位依存性チャネルの電位センサーのものと非常に類似していることは、Ｃｉ−ＶＳＰが電位依存性チャネルと同様に膜電位変化を感知し得ることを示唆する。このことを検証するための重要な試験の１つとして、電位センサーの陽性に荷電したセグメントの膜貫通シフトに起因する電位依存的電荷移動を検出した。
【０１４５】
図２ａは、Ｃｉ−ＶＳＰを発現するアフリカツメガエルｃｕｔ−ｏｐｅｎ  ｏｏｃｙｔｅから記録した非対称の置換電流の代表例を示す。パルスを−８０ｍＶ〜＋１６０ｍＶの範囲で１０ｍＶずつ増大させて適用した。直線かつ対称な電流を−１１０ｍＶの保持電位を用いるＰ／−８手順によって差し引いた。図２ｂは、図２ａで示したゲート電流の電位変化によって運ばれた電荷を各膜電位で比較したグラフであり、電流オフ（■）およびオン（▲）によってｃｕｔ−ｏｐｅｎ  ｏｏｃｙｔｅから運ばれた電位依存的電荷、およびＴＥＶＣ（ｎ＝１０）下で記録したオフ電流（●）を示すグラフである。オン電流およびオフ電流の軌跡を、一次指数（Ｉ（ｔ）＝Ａｅ−ｔ／τ＋Ｃ）に従って描いた。ここで、Ａは、ピーク電流振幅である。運ばれた電荷を、パルスの開始点から３τの持続時間にわたる各電流を積分することによって算出した。ＴＥＶＣレコーディングからのＱ−オフを、再分極開始時から１５０ｍｓにわたる各オフ「ゲート」電流を積分することによって測定した。Ｑ−Ｖ曲線を、Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎによって描いた：Ｑ＝１／［１＋ｅｘｐ｛Ｚｅ（Ｖ−Ｖ１／２）／ｋＴ｝］（ｋは、Ｂｏｌｚｍａｎｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔであり、ｅは、最初の電荷である）。ｃｕｔ−ｏｐｅｎ  ｏｏｃｙｔｅにおいて、Ｑ−オンおよびＱ−オフについて、Ｖ１／２は、それぞれ６２．７ｍＶおよび７１．８ｍＶであり、Ｚは、それぞれ１．２６および１．０９８である。ＴＥＶＣレコーディング（ｎ＝１０）からのＱ−オフを、Ｖ１／２について６８．５ｍＶであり、Ｚについて１．０３で描いた。ＴＥＶＣ下でのオフ電流の最大電荷移動は、４０．２±１４．２ｎＣ（ｎ＝１０）であった。インセットは、図２ａと同一のｃｕｔ−ｏｐｅｎ  ｏｏｃｙｔｅからのＱ−オフおよびＱ−オンのＸ−Ｙプロットを示す。
【０１４６】
Ｃｉ−ＶＳＰのｃＲＮＡをＸｅｎｏｐｕｓ  ｏｏｃｙｔｅに微小注入し、２電極電位クランプ（ＴＥＶＣ）およびｃｕｔ−ｏｐｅｎ  ｏｏｃｙｔｅを用いて非対称置換電流を記録した。Ｃｉ−ＶＳＰを発現するｏｏｃｙｔｅは、脱分極工程の際に強い一過性の即時性外向き電流を示し、電位依存性チャネルのオン電流およびオフ電流に類似した過分極パルスの際に一過性の内向き電流を示した（図２ａ）。「ゲート」電流の特徴的な特性の１つは、電荷移動が電位依存的に生じることである。オン電流のＱ−Ｖ曲線を、Ｖ１／２について６２．７ｍＶおよびＺについて１．２６であるＢｏｌｔｚｍａｎｎ  ｅｑｕａｔｉｏｎで描いた。これらは、オフ電流についてのもの（Ｖ１／２＝７１．７ｍＶ、Ｚ＝１．１）と類似した（図２ｂ）。オフ電流またはオン電流のいずれかにおいて運ばれる電荷は、オフ電流について積分した総電荷に対するオン電流について積分した総電荷のＸ−Ｙプロットにおいて明確に示されているように、広範な膜電位にわたって互いに十分に一致する（図２ｂインセット）。従って、脱分極時の電荷移動の一因である同一分子構造は、再分極時の電荷移動の基礎となる。シェイカー型Ｋ＋チャネルのような電位依存性チャネルと比較する場合、電荷移動の電位依存性は、ポジティブ方向に有意にシフトされ（シェイカー型Ｋ＋チャネルについて−３７．９ｍＶに対してＣｉ−ＶＳＰについてＶ１／２＝＋６０ｍＶ）、進行（ｓｔｅｐｎｅｓｓ）は、緩やかである（シェイカー型Ｋ＋チャネルのオン電流におけるＺ＝１．８対Ｃｉ−ＶＳＰのオン電流におけるＺ＝１．１）。
【０１４７】
このようなチャネル様「ゲート」電流が膜貫通セグメントに由来することを確認するために、残基２５６において短縮化されたタンパク質（Ｃ末端酵素部分全体を欠失する）を発現させた。図２ｃは、ｃｕｔ−ｏｐｅｎ  ｏｏｃｙｔｅ法で記録した、Ｃ末端部分全体を欠いた（Ｓ１〜Ｓ４のみにした）短縮型タンパク質の電流置換を示す。Ｓ１〜Ｓ４のみにした短縮型タンパク質も、全長タンパク質と同様の電位センサーとしての性質を有することがわかった。しかし、Ｑ−Ｖ曲線は、わずかに右方向にシフトした（示さず）。
【０１４８】
Ｓ４セグメントにおける陽性電荷は電位センサーの電荷移動の基礎となりかつ電位依存性チャネルのゲーティングに不可欠であることが知られている。Ｓ４様セグメントにおける陽性電荷が電位依存性チャネルと同様にＣｉ−ＶＳＰの「ゲート」電流に必須であるか否かを試験するために、Ｓ４様セグメント中の陽性電荷にいくつかの変異を導入した。
【０１４９】
４つの陽性荷電残基中２つのアラニン（Ｒ２２３およびＲ２２６）を中性のグルタミンに変異させた場合、「ゲート」電流を全く検出することができなかった（図２ｄ）。図２ｄは、Ｃｉ−ＶＳＰ  Ｒ２２９Ｑ／Ｒ２３２Ｑを発現するｃｕｔ−ｏｐｅｎ  ｏｏｃｙｔｅからの記録を示す。Ｃｉ−ＶＳＰの電位センサーとしての性質は、Ｓ４中の塩基性アミノ酸での電荷に依存することがわかった。
【０１５０】
２つの変異の導入が細胞表面への発現を阻害していないことをチェックするために、細胞表面タンパク質のビオチン化を行った後、抗Ｃｉ−ＶＳＰ抗体を用いるウエスタンブロッティングによって特異的な検出を行った。Ｒ２２９Ｑ／Ｒ２３２Ｑタンパク質のシグナルを鮮明に検出した。このことは、Ｒ２２９Ｑ／Ｒ２３２Ｑ変異体におけるゲート電流の非存在が、このタンパク質の標的化しそこないに起因するのではないことを示す。
【０１５１】
以上のように、電位依存性を有する強いゲート電流をＣｉ−ＶＳＰから検出した。また、ＯＮ電流は、１００ｍＶを越えて飽和しなかった。この電圧クランプ技術において、内因性のイオン電流が夾雑したので、正確なＧ−Ｖ関係を評価することが困難であった。この問題を、細胞内灌流を伴う切開（ｃｕｔ−ｏｐｅｎ）卵母細胞電圧クランプ技術によって克服した。この方法を用いると、ＯＮ電流のＧ−Ｖ曲線は、ＯＦＦ電流のものと同程度であった。このことは、Ｃｉ−ＶＳＰは、ゲート電位の電位依存的固定を示さないことを示した。
【０１５２】
また、Ｃ末端の酵素ドメインを欠く短縮型タンパク質は、なおゲート電流を示したが、電位依存性の右方へのシフトを示した。さらに、Ｓ４様セグメント中の正電荷アミノ酸残基４つのうち２つを中性のアミノ酸に変異させた場合、ゲート電流は完全に排除された。これらの結果は、Ｃｉ−ＶＳＰが、電圧ゲートチャネル中に見出されるものと同様に作動する電位センサーを有することを示す。
【０１５３】
〔実施例３：イノシトールリン脂質ホスファターゼであるＣｉ−ＶＳＰの細胞内ドメイン〕
実施例１に記載の手順に従って、Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチドの細胞内ドメインがイノシトールリン脂質ホスファターゼであることを検証した（図３）。図３ａは、Ｃｉ−ＶＳＰのホスファターゼ活性中心のアミノ酸配列と、いくつかの種からのＰＴＥＮのホスファターゼ活性中心のアミノ酸配列との比較を示す図である。Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチドは、公知のホスファターゼと同様の活性中心を有する。
【０１５４】
図３ａに示すように、Ｃｉ−ＶＳＰのホスファターゼ様ドメインは、ＰＴＥＮにかなり相同である。ＰＴＥＮは、イノシトール環の３‘部位で脱リン酸化されるホスファチジルイノシトールを有する。
【０１５５】
Ｃｉ−ＶＳＰがＰＩ（３，４，５）Ｐ３を基質とするホスファターゼ活性を有するか否かを試験するために、Ｃｉ−ＶＳＰのＣ末端細胞内領域全体とＧＳＴとの融合タンパク質を作製した。図３ｂは、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３を基質として用いるｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ  ａｓｓａｙによる、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅとＣｉ−ＶＳＰのホスファターゼ様ドメインとの融合タンパク質のイノシトールリン脂質ホスファターゼ活性を示すグラフである。ＧＳＴと融合したＣｉ−ＶＳＰ細胞内ドメイン（ＧＳＴ−Ｃｉ−ＶＳＰΔＴＭ、２μｇ／チューブ）（■）との反応を２３℃で行い、示した時間で反応を停止し、次いで、放出された無機ホスフェートを、標準無機ホスフェートとの比較によって測定した。不活性な変異体であるＧＳＴ−Ｃｉ−ＶＳＰΔＴＭ（Ｃ３６３Ｓ）（●）、およびＧＳＴ（▲）を、ネガティブコントロールとして使用した。ＢＩＯＭＯＬ  ＧＲＥＥＮ（Ｂｉｏｍｏｌ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）をサンプルに添加して、Ｈ２Ｏを参照としてＯＤ６００を測定した。各データ点を２連でアッセイし平均をとった。図３ｂに示すように、Ｃｉ−ＶＳＰの細胞内ドメインは、イノシトールリン脂質ホスファターゼ活性を示した。また、この酵素活性は、時間依存的であることがわかった。実験を２回反復し、同様の結果を得た。
【０１５６】
このように、Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチドの酵素ドメインにおける酵素活性の基質は、リン脂質のＰＩＰ３（癌化、形態変化、細胞死などの、細胞内信号伝達に重要な役割を有する物質）であることがわかった。また、Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチドをＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌に発現させて、ＰＩＰ３ホスファターゼ活性を測定すると、ＰＩＰ３からＰＩＰ２への脱リン酸化反応を引き起こした。
【０１５７】
〔実施例４：Ｃｉ−ＶＳＰの酵素活性〕
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いてＣｉ−ＶＳＰの酵素活性を調べた。実施例３に示すＣｉ−ＶＳＰのＣ末端細胞内領域全体とＧＳＴとの融合タンパク質（ＧＳＴ−Ｃｉ−ＶＳＰ）を、蛍光標識された基質（ＮＢＤ６−ｄｉＣ６−ＰＩ（３，４，５）Ｐ３）とインキュベートした。ＰＩ（３，４，５）Ｐ３を基質とする酵素活性が存在すると、分解産物ＰＩＰ２（ＮＢＤ６−ｄｉＣ６−ＰＩ（４，５）Ｐ２）が検出される。
【０１５８】
図４ａに示すように、Ｃｉ−ＶＳＰは所望の活性を有しることが確認されたが、活性中心のシステインをセリンに置換したタンパク質（Ｃ３６３Ｓ）またはＧＳＴを基質とインキュベートした場合はＰＩＰ２のバンドは検出されなかった（図４ａ）。
【０１５９】
次いで、Ｃｉ−ＶＳＰの細胞内ドメインについて、イノシトールリン脂質を基質とする酵素活性の特性をさらに明らかにするために、Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎアッセイを用いて、種々の濃度のＰＩＰ３を基質とする酵素反応を行い、反応の時間依存性を検討した。
【０１６０】
Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎは無機リン酸非存在下では薄黄色を呈するが、ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｍｏｌｙｂｄａｔｅと一緒に無機リン酸を存在させると、濃度依存的に濃緑色を呈する。したがって、Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎの６２０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３がＰＩ（４，５）Ｐ２に分解される際に生じる無機リン酸を定量することが可能である。ｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ存在下で種々の基質濃度でのＣｉ−ＶＳＰの酵素活性を測定したところ、図４ｂに示すように、時間依存的に無機リン酸が遊離されることが確認された。
【０１６１】
図４ｂにおけるｔ＝０（分）でのグラフの傾きを算出して、各基質濃度での酵素反応の初速度Ｖ０を求め、Ｖ０を基質濃度に対してプロットした（図４ｃ）。Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎの式にフィットさせて、酵素反応最大速度Ｖｍａｘ、およびＶｍａｘの半分に達するのに必要な基質濃度Ｋｍを求めた結果、Ｖｍａｘは０．２９２ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ、Ｋｍは３６μＭであった。これらの値は、ＰＴＥＮにおいて報告されている値に近似し、よって、Ｃｉ−ＶＳＰの細胞内ドメインからなる領域の酵素活性がＰＴＥＮの酵素活性に類似することを示す。
【０１６２】
〔実施例５：Ｃｉ−ＶＳＰによるイノシトールリン脂質ダイナミクスの電位依存的変化〕
実施例２および３の結果は、Ｃｉ−ＶＳＰが電位センサーとして機能するだけでなく、イノシトールリン脂質ホスファターゼとして機能することを示す。そこで、このようなＣｉ−ＶＳＰの酵素活性が膜電位によって改変されるのか否かを調べるために、実施例１に記載の手順に従って、Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチドの有する脱リン酸化する活性（ＰＩＰ３→ＰＩＰ２）が膜電位によって変化することを検証した。
【０１６３】
具体的には、ＰＩＰ２感受性タンパク質であるＧＩＲＫ２、ＩＲＫ１またはＫＣＮＱ２／３のカリウムチャネルを、Ｃｉ−ＶＳＰの存在下または非存在下でウシＧタンパク質のβ１およびγ１とともに発現させ、ＴＥＶＣ法を用いて、Ｋｉｒ電流を記録し、Ｋ＋チャネル活性をプローブとしてＣｉ−ＶＳＰによるイノシトールリン脂質ダイナミクスの電位依存的変化を示した（図５）。
【０１６４】
図５ａは、一過性の変化を示すＧＩＲＫ電流の軌跡および電流幅のプロットを示すグラフである。代表的な４つの軌跡は、ＧＩＲＫ２のみ、ＧＩＲＫ２＋Ｃｉ−ＶＳＰ、ＧＩＲＫ２＋Ｃｉ−ＶＳＰ変異体（Ｃ３６３Ｓ）、またはＧＩＲＫ２＋Ｃｉ−ＶＳＰ変異体（Ｒ２２９Ｑ／Ｒ２３２Ｑ）を発現する細胞におけるものである。−１００ｍＶを１５０ｍｓ、−６０ｍＶ（左）または０ｍＶ（右）のいずれかでのインターバルを１０ｓに設定して、ＧＩＲＫ電流を活性化した。各軌跡の色の濃さは、一連の試験パルスでの記録の順番を示し、より濃い軌跡を後に記録した。図５ａに示すように、ＧＩＲＫ２は、野生型ＶＳＰと同時発現させたときにのみ、膜電位の変化に応じて電流量を変化させた（過分極で増大、脱分極で減少）。
【０１６５】
図５ｂは、Ｃｉ−ＶＳＰを同時発現させた場合のＩＲＫ１電流軌跡および電流幅の時間依存的な変化のプロットを示すグラフである。図５ａおよびｂの時間連続プロットにおいて、各試験パルス間のＫｉｒ電流の増幅を、試験パルス間インターバルを−６０ｍＶに保持した場合の一連の記録において得た最大増幅によって正規化した。図５ｂに示すように、ＰＩＰ２感受性の濃度依存性を変化させたＩＲＫ１変異体においても同様の変化を確認した。
【０１６６】
図５ｃは、Ｃｉ−ＶＳＰの野生型、Ｃ３６３Ｓ変異体またはＲ２２９Ｑ／Ｒ２３２Ｑ変異体を発現するｏｏｃｙｔｅからのＫＣＮＱ２／３電流軌跡および電流幅の時間依存的な変化のプロットを示すグラフである。時間連続プロットにおいて、＋２０ｍＶでの脱分極１００ｍｓの間の外向き電流ピークの増幅を、−１０ｍＶでのインターバル電位を用いたシリーズの第１の試験パルス間の外向き電流ピークの増幅によって正規化した。図５ｃに示すように、Ｍ電流を形成するＫＣＮＱ２／３チャネルにおいても、過分極で活性化し、脱分極で減少した。
【０１６７】
図５ｄは、カリウムチャネルの量の電位依存的変化をまとめたグラフである。Ｋｉｒチャネルについてのバー（左）は、同一細胞からの記録の中での最大増幅に対して−１００ｍＶでの工程によって刺激した最小内向き電流の平均値を示す。ＫＣＮＱ２／３についてのバー（右）は、第１の試験パルスによって誘起した外向き電流の増幅によって正規化した、試験パルス間のインターバルを−１０ｍＶで行った一連の実験における外向き電流の増幅を示す。星印は、各セットにおいてＣｉ−ＶＳＰを発現させなかった細胞の値と比較した場合の統計的有意差を示す。
【０１６８】
以上のように、Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチドをＰＩＰ２で活性化されることが知られているＧＩＲＫチャネルまたはＫＣＮＱ２／３チャネルをＶＳＰとともに発現させると、膜電位変化に応じてこれらのチャネル活性の程度が定量的に変化した。すなわち、膜電位を過分極にすると酵素活性が増加し、膜電位を脱分極にすると酵素活性が減少した。
【０１６９】
〔実施例６：ホスファターゼ活性の電位依存性〕
Ｋ＋チャネル活性によって検出したホスファターゼ活性の電位依存性を調べた（図６）。図６ａは、−８０ｍＶ〜２０ｍＶにわたる種々の試験パルス間インターバルの膜電位レベルを用いた、Ｃｉ−ＶＳＰおよびＧＩＲＫ２を発現するｏｏｃｙｔｅからのＧＩＲＫ電流の代表的な記録を示すグラフである。インターバルを６０ｓにセットした。なぜなら、電流幅は、図５に示したほとんどの場合においてこの期間内に一定レベルに達したからである。
【０１７０】
図６ｂは、試験パルス間インターバルの膜電位レベルに対するＧＩＲＫ電流の電流幅のプロットを示す図である。異なる４つの細胞からの記録を、異なる印で表す。−１００ｍＶに過分極させる試験パルスの終了時での内向き電流の関数を、試験パルス間インターバルの電位に対してプロットし、以下の式で描いた：Ｉ＝１／［１＋ｅｘｐ（Ｖ１／２−Ｖ）／ｋ］］＋Ｃ（ここで、Ｖ１／２、ｋおよびＣは、それぞれ半分不活性化電位、電位依存性の勾配、および電流の持続性要素である）。点線は、図２に示したものと同様に、電子センサー移動の正規化したＱ−Ｖ曲線である。
【０１７１】
〔実施例７：リンカー領域の役割〕
Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチドの電位センサードメインとホスファターゼドメインとの間のリンカー領域の役割を調べた。
【０１７２】
図７ａは、Ｓ４様セグメントとホスファターゼ様ドメインとの間のリンカー領域（ＭＫＡＳＳＲＲＴＩＳＱＮＫＲＲＹ：配列番号４）を示す図である。リンカー領域のＮ末端半分またはＣ末端半分を欠失させた（それぞれ、ΔＮ−Ｌ−Ｃｉ−ＶＳＰおよびΔＣ−Ｌ−Ｃｉ−ＶＳＰ）。そして、ＧＩＲＫ２またはＫＣＮＱ２／３とともにｏｏｃｙｔｅ中に同時発現させた。ＶＳＤおよびＰＤは、それぞれセンサードメインおよびホスファターゼドメインを示す。
【０１７３】
図７ｂは、試験パルス間のインターバルの間での過分極または脱分極に対するＫｉｒ電流の一過性変化を示すグラフである。
【０１７４】
図７ｃは、種々の膜電位でのインターバルのシリーズに関するＧＩＲＫ２（左）またはＫＣＮＱ２／３（右）との発現についてのデータを要約したグラフである。電流幅を、図５ｄと同様の様式で正規化した。星印は、ΔＮ−Ｌ−Ｃｉ−ＶＳＰを有する細胞が、Ｃｉ−ＶＳＰを発現しない細胞と比較して電流幅の有意差を示さないこと、すなわち、電位センサーとホスファターゼとの間にカップリングがないことを示す。
【０１７５】
図７ａ〜ｃに示すように、Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチドは、（１）電位センサーのモジュールと酵素モジュールの両方を含み、これらのモジュールが短いリンカー配列によって連結されていること、および、（２）Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチドの単一分子中に存在する２つのドメイン間のカップリングを介して電位依存的に酵素活性を調節すること、すなわち、電位センサーのモジュールが感知した電気的シグナルに基づいて酵素モジュール（ホスファターゼドメイン）における酵素活性を調節するためにはリンカー配列が必要であることがわかった。
【０１７６】
〔実施例８：Ｃｉ−ＶＳＰの局在〕
Ｃｉ−ＶＳＰの生理学的役割に関する知見を得るために、Ｃｉ−ＶＳＰの遺伝子発現パターンを調べた。心臓、体壁筋肉、生殖腺および精巣におけるＣｉ−ＶＳＰ転写物のＲＴ−ＰＣＲを行った結果、Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチドが精巣に特異的に発現することがわかった（図８ａ）。
【０１７７】
Ｃｉ−ＶＳＰのＣ末端ペプチド配列に対するポリクローナル抗体を用いて、カタユウレイボヤの精子の免疫組織化学を行った（図８ｂ〜ｇ）。
【０１７８】
図８ｂ〜ｄは、精子の鞭毛およびミトコンドリアにおいて観察した蛍光を示す。図８ｅ〜ｇは、抗原ペプチドで吸収した抗体を一次抗体として用いた場合を示す。スケールバーは１０μｍである。図８ｈ〜ｋは、精子鞭毛の生体膜でのＣｉ−ＶＳＰの局在を示す免疫電顕像である。鞭毛の横断切片（ｈおよびｉ）および縦断切片（ｊおよびｋ）を示す。
【０１７９】
図に示すように、鞭毛軸糸の辺縁部が標識された。別の抗体（Ｎ末端ペプチドに対する抗体）を用いた場合もまた、同様のパターンを得た（示さず）。ここで、生体膜の破片が結合している（矢印）。
【０１８０】
金粒子は、部分的に破壊された生体膜の破片上にのみ観察された（矢印）。しかし、明らかにインタクトな生体膜上には観察されなかった（ｉ中の矢頭）。このことは、Ｃｉ−ＶＳＰのＮ末端細胞内ドメインに対して惹起した抗体がアクセス可能であることを反映する。バーは、２００ｎｍである（ｈ〜ｊは同一解像度である）。
【０１８１】
このように、Ｃｉ−ＶＳＰポリペプチドは精子の尾部に局在することがわかった。
【０１８２】
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用の可能性】
【０１８３】
本発明に係るポリペプチドの有するホスファターゼドメインと電位センサーとの共役の原理を解明することによって、電気的に酵素活性を制御するツールとして利用することができる。このようなツールは、ナノバイオテクノロジーにおける基礎技術として利用することができる。また、新規電位センサー分子である本発明に係るポリペプチドを用いれば、バイオセンサーまたはバイオ素子として、電気的信号と化学的信号のインターフェースを確立することができる。その結果、生体信号と電子回路とをつなげる医用工学の発展に寄与することができる。すなわち、本発明に係るポリペプチドは、インターフェース的なバイオ素子を開発するための生物材料として非常に有用である。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Kyoto University
National Institutes of Natural Sciences
<120> Novel ion channel-like polypeptide and use thereof
<130> 656JP
<140> JP 2006-544779
<141> 2005-05-13
<150> JP 2004-332070
<151> 2004-11-16
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 576
<212> PRT
<213> Ciona intestinals
<400> 1
Met Glu Gly Phe Asp Gly Ser Asp Phe Ser Pro Pro Ala Asp Leu Val
1               5                  10                  15
Gly Val Asp Gly Ala Val Met Arg Asn Val Val Asp Val Thr Ile Asn
20                  25                  30
Gly Asp Val Thr Ala Pro Pro Lys Ala Ala Pro Arg Lys Ser Glu Ser
35                  40                  45
Val Lys Lys Val His Trp Asn Asp Val Asp Gln Gly Pro Ser Glu Lys
50                  55                  60
Pro Glu Thr Arg Gln Glu Glu Arg Ile Asp Ile Pro Glu Ile Ser Gly
65                  70                  75                  80
Leu Trp Trp Gly Glu Asn Glu His Gly Val Asp Asp Gly Arg Met Glu
85                  90                  95
Ile Pro Thr Thr Gly Val Gly Arg Val Gln Phe Arg Val Arg Ala Val
100                 105                 110
Ile Asp His Leu Gly Met Arg Val Phe Gly Val Phe Leu Ile Phe Leu
115                 120                 125
Asp Ile Ile Leu Met Ile Ile Asp Leu Ser Leu Pro Gly Lys Ser Glu
130                 135                 140
Ser Ser Gln Ser Phe Tyr Asp Gly Met Ala Leu Ala Leu Ser Cys Tyr
145                 150                 155                 160
Phe Met Leu Asp Leu Gly Leu Arg Ile Phe Ala Tyr Gly Pro Lys Asn
165                 170                 175
Phe Phe Thr Asn Pro Trp Glu Val Ala Asp Gly Leu Ile Ile Val Val
180                 185                 190
Thr Phe Val Val Thr Ile Phe Tyr Thr Val Leu Asp Glu Tyr Val Gln
195                 200                 205
Glu Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gly Arg Leu Val Val Leu Ala Arg Leu
210                 215                 220
Leu Arg Val Val Arg Leu Ala Arg Ile Phe Tyr Ser His Gln Gln Met
225                 230                 235                 240
Lys Ala Ser Ser Arg Arg Thr Ile Ser Gln Asn Lys Arg Arg Tyr Arg
245                 250                 255
Lys Asp Gly Phe Asp Leu Asp Leu Thr Tyr Val Thr Asp His Val Ile
260                 265                 270
Ala Met Ser Phe Pro Ser Ser Gly Arg Gln Ser Leu Phe Arg Asn Pro
275                 280                 285
Ile Gly Glu Val Ser Arg Phe Phe Lys Thr Lys His Pro Asp Lys Phe
290                 295                 300
Arg Ile Tyr Asn Leu Cys Ser Glu Arg Gly Tyr Asp Glu Thr Lys Phe
305                 310                 315                 320
Asp Asn His Val Tyr Arg Val Met Ile Asp Asp His Asn Val Pro Thr
325                 330                 335
Leu Val Asp Leu Leu Lys Phe Ile Asp Asp Ala Lys Val Trp Met Thr
340                 345                 350
Ser Asp Pro Asp His Val Ile Ala Ile His Cys Lys Gly Gly Lys Gly
355                 360                 365
Arg Thr Gly Thr Leu Val Ser Ser Trp Leu Leu Glu Asp Gly Lys Phe
370                 375                 380
Asp Thr Ala Lys Glu Ala Leu Glu Tyr Phe Gly Ser Arg Arg Thr Asp
385                 390                 395                 400
Phe Glu Val Gly Asp Val Phe Gln Gly Val Glu Thr Ala Ser Gln Ile
405                 410                 415
Arg Tyr Val Gly Tyr Phe Glu Lys Ile Lys Lys Asn Tyr Gly Gly Gln
420                 425                 430
Leu Pro Pro Met Lys Lys Leu Lys Val Thr Gly Val Thr Ile Thr Ala
435                 440                 445
Ile Gln Gly Val Gly Arg Gly Asn Gly Ser Asp Leu Ser Met Gln Ile
450                 455                 460
Val Ser Glu Arg Gln Glu Val Leu Leu Cys Lys Phe Ala Glu Gly Tyr
465                 470                 475                 480
Asn Cys Ala Leu Gln Tyr Asp Ala Thr Asp Asp Cys Val Thr Cys Glu
485                 490                 495
Val Lys Asn Cys Pro Val Leu Ala Gly Asp Ile Lys Val Arg Phe Met
500                 505                 510
Ser Thr Ser Lys Ser Leu Pro Arg Gly Tyr Asp Asn Cys Pro Phe Tyr
515                 520                 525
Phe Trp Phe Asn Thr Ser Leu Val Glu Gly Asp His Val Thr Leu Lys
530                 535                 540
Arg Glu Glu Ile Asp Asn Pro His Lys Lys Lys Thr Trp Lys Ile Tyr
545                 550                 555                 560
Arg Asp Asn Phe Thr Val Lys Leu Thr Phe Ser Asp Ala Glu Asp Ile
565                 570                 575
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
primer for amplifying CiVSP gene
<400> 2
cgggatccgc caccatggag ggattcgacg gttcag                           36
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
primer for amplifying CiVSP gene
<400> 3
atagtttagc ggccgcctaa atgtcttcag catctg                           36
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> Ciona intestinals
<400> 4
Met Lys Ala Ser Ser Arg Arg Thr Ile Ser Gln Asn Lys Arg Arg Tyr
1               5                  10                  15
【図１】
0004802331.tif 000002
【図２】
0004802331.tif 000003
【図３】
0004802331.tif 000004
【図４】
0004802331.tif 000005
【図５】
0004802331.tif 000006
【図６】
0004802331.tif 000007
【図７】
0004802331.tif 000008
【図８】
0004802331.tif 000009
【図９】
0004802331.tif 000010
【配列表】
0004802331000001.app