(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換え異種タンパク質をコードする遺伝子と、ＯｐｐＡ、ＹｄｄＳ、ＦｌｉＣの群から選択される１つ以上のプロテアーゼではない宿主タンパク質をコードする突然変異された遺伝子とを有するエシェリキア・コリ種の菌株であって、その組み換え異種タンパク質を発酵中に発酵培地中に分泌し、かつ宿主タンパク質をコードする突然変異された遺伝子の突然変異が、その突然変異された遺伝子の基礎となる野生型遺伝子と比較して、宿主タンパク質の１００％だけ低減された発現をもたらすことを特徴とするエシェリキア・コリ種の菌株。
【請求項２】
請求項１記載のエシェリキア・コリ種の菌株であって、該菌株の出発菌株が、ＢＬＲ、ＷＣＭ１０５、ＭＭ２８＝Ｎ９９＝ＣＧＳＣ＃５８９２、Ｋ８０２＝ＣＧＳＣ＃５６１０＝ＷＡ８０２、ＲＶ３０８＝ＡＴＣＣ３１６０８の群から選択されることを特徴とするエシェリキア・コリ種の菌株。
【請求項３】
請求項１又は２記載のエシェリキア・コリ種の菌株の製造方法において、組み換え異種タンパク質をコードする遺伝子で形質転換されたエシェリキア・コリ種の菌株の宿主細胞を発酵において使用して、組み換え異種タンパク質を製造するが、該宿主細胞は、組み換え異種タンパク質と他の宿主タンパク質とを発酵培地に分泌するため、組み換え異種タンパク質と他の宿主タンパク質を含有する粗生成物が得られるものであり、前記他の宿主タンパク質を特性決定し、そして前記宿主タンパク質をコードする遺伝子の発現を１００％だけ低減させる製造方法。
【請求項４】
発酵培地中で、組み換え異種タンパク質をコードする組み換え遺伝子を含むエシェリキア・コリ種の菌株によって組み換え異種タンパク質を発酵により製造する方法において、請求項１又は２記載のエシェリキア・コリ種の菌株を発酵培地中で培養し、そして該発酵培地を発酵後にエシェリキア・コリ種の菌株の細胞から分離することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、発酵培地の分離後に、発酵培地から組み換え異種タンパク質を精製することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換えタンパク質の改善された製造を可能にする微生物菌株と、かかる菌株の製造方法と、前記菌株を使用した組み換えタンパク質の製造方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
組み換えタンパク質の大容量の経済的な製造方法は、生物工学的産業及び製薬産業のために重要性が増している。一般に、組み換えタンパク質は、哺乳動物細胞培養又は微生物系のいずれかで製造される。微生物系は、哺乳動物細胞培養に対して、こうすることで組み換えタンパク質がより短時間で、かつ少ないコストで製造できるという利点を有する。細菌である大腸菌は、組み換えタンパク質の製造のために最も広範に知られる微生物である。大腸菌において、タンパク質は、原則的に種々の様式で製造される：
１．可溶性タンパク質としての細胞内産生
２．封入小体（"インクルージョンボディー"）としての細胞内産生
３．ペリプラズム又は周囲の栄養培地中への分泌。
【０００３】
所望のタンパク質の製造の労力とコストは、発酵直後に、組み換えタンパク質と細胞によって必然的に分泌される宿主タンパク質とを含む混合物として存在する粗生成物の製造コストの他にも、実質的に、粗生成物を所望のタンパク質へと精製する精製コストによって決まる。その精製は、殆どの場合に、複数の工程を介してクロマトグラフィー法により行われる。この場合に、部分的に免疫原性又は毒性の不純物である宿主タンパク質の分離精製が重要な役割を担う。
【０００４】
大腸菌におけるタンパク質の分泌は、殆どの場合に、いわゆるｓｅｃ経路を介して行われる。このために、製造されるべきタンパク質についての遺伝子がシグナル配列と結合され、これによりシグナルペプチド−タンパク質−融合物の産生がもたらされる。該シグナルペプチドは、細菌固有のｓｅｃ系により細胞質膜を介してのペリプラズム中へのタンパク質の分泌を媒介する。この場合に、該シグナル配列は開裂されて、所望のタンパク質がペリプラズム中に得られる。タンパク質は、その後、ペリプラズムから精製することができる。所定の条件下で又は所定の細菌株において、タンパク質は、ペリプラズムから周囲の栄養培地中に放出し（例えばＲａｙ ｅｔ ａｌ．２００２；ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１；Ｎａｇａｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．１９８５；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、そしてそこから精製することができる。
【０００５】
その分泌は、別の製造方法と比較して有利なのは、本来の可溶性の、正しく折り畳まれたタンパク質が得られ、該タンパク質が"インクルージョンボディー"法に対して変性されていないので、それを復元（収率の高い損失を伴う工程）させる必要がないことである。更に、得られた生成物は、細胞内の可溶性の製法と比較して、宿主タンパク質であまり汚染されておらず、それは微生物のペリプラズムに含まれる宿主タンパク質は、細胞質よりはるかに少ないからである。
【０００６】
周囲の栄養培地へのタンパク質の分泌は、ペリプラズム中への分泌と比較して、その際タンパク質が更に純粋な形で存在するという更なる利点を提供する。更に、第一の精製工程として、ペリプラズムの費用のかかる調製を必要とせず、全細胞の分離は、はるかに簡単であり、再現可能に行われる。
【０００７】
分泌によるタンパク質の製造の場合に、粗生成物は、細胞内製造の場合よりも全体として少ない宿主タンパク質で汚染されている。それにもかかわらず、ここでも不純物である宿主タンパク質、とりわけ微生物から必然的に分泌されて、ペリプラズム中又は更なる外膜中に局在している宿主タンパク質は一つの要因である。これらのタンパク質は、それらの遺伝子が必然的に、この分泌を媒介するシグナル配列を有するという点で際だっている。前記の宿主タンパク質が粗生成物を汚染するという事実の他に、該タンパク質は産生されるべきタンパク質と分泌装置の成分をめぐって競合し、これにより産生されるべきタンパク質の分泌の低下をもたらす。粗生成物の汚染に導く前記の宿主タンパク質は、しかしながら当然のごとく生理学的役割を満たしている。該タンパク質は、例えば走化性及び特定の輸送過程に関与することがある。
【０００８】
文献では、ペリプラズムプロテアーゼをコードする遺伝子、例えばｄｅｇＰ、ｏｍｐＴ、ｐｔｒの欠失によって、分泌されるタンパク質分解感受性のタンパク質の製造を改善できることを記載している（ＵＳ５２６４３６５号；Ｂａｎｅｙｘ＆Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，１９９１；Ｗａｄｅｎｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。この効果は、出発細胞において生成されたタンパク質を分解するプロテアーゼの活性をオフにすることに起因する。とりわけ、細胞中で異種産生されたタンパク質は、しばしば宿主固有のプロテアーゼによって分解される。しかしながら、量的には、該プロテアーゼは不純物としてのいかなる要因にもならないが、それは該プロテアーゼが高い活性及び酵素的機能に基づいて宿主細胞中で非常に少量しか産生されないからである。従って、前記の遺伝子の欠失は、産生されるべきタンパク質の純度に影響をもたらさない。
【０００９】
ＷＯ２００４／０３５７９２号Ａ１は、所定の宿主タンパク質（例えばＰｈｏＳ／ＰｓｔＳ、ＤｐｐＡ、ＭＢＰ、Ｔｒｘ）を個々のアミノ酸の突然変異により改変して、生理学的あるいは生化学的特性（等電点、疎水性、サイズ）を改変に導くことを記載している。前記の生理学的あるいは生化学的特性の改変により、結果的に、生成する改変された不純物である宿主タンパク質は、そのつど製造が所望されるタンパク質と一緒に同時精製されなくなるが、それは、これらのタンパク質が例えばクロマトグラフィーカラムに対して異なる挙動をとるからである。該方法は、任意のタンパク質の製造のためには利用できない。それというのも、汚染する宿主タンパク質を、それぞれ産生すべきタンパク質について特別に改変せねばならないからであり、それは各タンパク質が種々異なる生化学的特性を有するためである。ＷＯ２００４／０３５７９２号Ａ１による方法では、汚染している宿主タンパク質の改変にもかかわらず、その生産性と機能性は保持されている。従って、産生されるタンパク質の粗生成物の純度は変わらないが、汚染している宿主タンパク質と該タンパク質との分離はそのつど軽減されない。
【００１０】
ＷＯ９８／１８９４６号は、産生されるべきタンパク質に加えて、Ｄｓｂタンパク質を同時発現し、かつ野生型のｐｓｔＳ遺伝子に欠失を有するが、同時にｐｓｔＳ変異体を発現する細胞を記載している。従って、ここでも、汚染している宿主タンパク質の量には変化はない。
【特許文献１】ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１
【特許文献２】ＵＳ５２６４３６５号
【特許文献３】ＷＯ２００４／０３５７９２号Ａ１
【特許文献４】ＷＯ９８／１８９４６
【非特許文献１】Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．２００２
【非特許文献２】Ｎａｇａｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．１９８５
【非特許文献３】Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８
【非特許文献４】Ｂａｎｅｙｘ＆Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，１９９１
【非特許文献５】Ｗａｄｅｎｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、組み換えタンパク質の製造を容易にする微生物菌株を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題は、組み換えタンパク質をコードする遺伝子と、プロテアーゼではない宿主タンパク質をコードする突然変異された遺伝子とを有する微生物菌株であって、その組み換えタンパク質を発酵中に分泌し、かつ宿主タンパク質をコードする突然変異された遺伝子が、その突然変異された遺伝子の基礎となる野生型遺伝子と比較して、宿主タンパク質の低減された発現をもたらすように突然変異されていることを特徴とする微生物菌株によって解決される。
【００１３】
タンパク質の経済的な製造のために、生産された組み換えタンパク質が、既に粗生成物中で、従って発酵直後に、組み換えタンパク質と汚染している宿主タンパク質とを含む混合物として存在する場合に、できる限り少ない宿主タンパク質でできる限り少量で汚染されていることが好ましい。それにより、つまりは組み換えタンパク質の比収率が高まる。組み換えタンパク質の後続の精製は、それにより容易になる。この利点は、本発明による微生物菌株が提供する。
【００１４】
低減された発現とは、本発明の範囲においては、有利には、当該タンパク質の産生量及び分泌量が、野生型細胞と比較して、２５〜１００％、特に有利には７５〜１００％だけ低減されていることを表す。殊に有利には、当該タンパク質の産生及び分泌は完全にオフにされている。有利には、宿主タンパク質は、ＯｐｐＡ、ＯｍｐＡ、ＤｐｐＡ、ＹｄｄＳ、ＦｌｉＣ、ＰｈｏＡ及びＰｈｏＳの群から選択される。
【００１５】
組み換えタンパク質は、発酵中に、有利にはペリプラズム又は発酵培地中に分泌される。特に有利には、組み換えタンパク質は、発酵培地中に分泌される。
【００１６】
組み換えタンパク質は、有利には異種タンパク質である。
【００１７】
微生物基株は、有利には細菌株、特に有利には腸内細菌科からの細菌株、特にエシェリキア・コリ種の菌株である。特に有利には、エシェリキア（Ｅ）・コリ菌株であり、該菌株は、発酵後に、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）よりも高濃度の組み換えタンパク質を、ペリプラズム中に、又は殊に有利には周囲の栄養培地中に有することに際だっている。かかる菌株を、以下に分泌菌株と呼称する。
【００１８】
特に、分泌菌株であって、発酵後に、５０ｍｇ／ｌより多く、特に有利には１００ｍｇ／ｌより多く、殊に有利には２００ｍｇ／ｌより多くの組み換えタンパク質を周囲の栄養培地中に有する菌株が好ましい。
【００１９】
本発明による菌株の更なる有利な特徴は、その製造の範囲において挙げている。以下に挙げられる出発菌株の特徴は、それと同様に、本発明による菌株についても言える。
【００２０】
本発明による微生物菌株は、組み換えタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された宿主細胞を発酵において使用して、組み換えタンパク質を製造するにあたり、宿主細胞が、組み換えタンパク質と更なる宿主タンパク質とを発酵培地中に分泌し、そうして組み換えタンパク質と更なる宿主タンパク質とを含有する粗生成物を得て、その更なる宿主タンパク質を特性決定して、前記宿主タンパク質の１つをコードする遺伝子の発現を低減又は阻害することを特徴とする方法によって得られる。
【００２１】
組み換えタンパク質をコードする遺伝子を、宿主タンパク質の発現の低減又は阻害のための方法の間に微生物菌株から取り出すことが好ましい。
【００２２】
宿主細胞は、微生物菌株、例えば酵母菌株又は細菌株の細胞である。有利には、それは、腸内細菌科からの細菌株、特に有利にはエシェリキア・コリ種の菌株である。特に有利には、エシェリキア（Ｅ）・コリ菌株であり、該菌株は、発酵後に、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）よりも高濃度の組み換えタンパク質を、ペリプラズム中に、又は殊に有利には周囲の栄養培地中に有することに際だっている。
【００２３】
特に有利には、発酵後に、１０ｍｇ／ｌより多く、特に有利には５０ｍｇ／ｌより多く、殊に有利には１００ｍｇ／ｌより多くの組み換えタンパク質を周囲の栄養培地中に有する分泌菌株である。
【００２４】
殊に有利には、以下の大腸菌株の１つである：
−  ＢＬＲ：Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．２００２、Ｎｏｖａｇｅｎ社から購入できる
−  Ｋ８０２＝ＣＧＳＣ*５６１０：Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８
−  ＷＣＭ１０５：ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１に従って製造可能
−  ＭＭ２８＝ＣＧＳＣ*＃５８９２：Ｎａｇａｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．１９８５
−  ＲＶ３０８＝ＡＴＣＣ**３１６０８；ＥＰ０６７７１０９号Ｂ１
−  ＲＲ１：ＡＴＣＣ**３１４３４：Ｎａｇａｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９８５
−  ＫＧ１００５ ｏｍｐＴ：Ｗａｄｅｎｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１
*大腸菌ストックセンターＣＧＳＣ（８３０ Ｋｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｏｗｅｒ，ＭＣＤ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，２６６ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ａｖｅ．，ＰＯ ｂｏｘ ２０８１０３，Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ）から購入できる
**ＬＧＣプロモケム（Ｍｅｒｃａｔｏｒｓｔｒ．５１，４６４８５ Ｗｅｓｅｌ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）から購入できる
分泌されるタンパク質は、宿主細胞から産生されかつ分泌される組み換えタンパク質である。有利には、タンパク質の分泌は、その遺伝子とシグナル配列との融合によって可能である。有利には、産生されるタンパク質は、工業的バッチで使用されるタンパク質又は医薬作用物質として使用されるタンパク質（生物製剤、生物薬剤）である。
【００２５】
産生されるタンパク質を汚染する宿主タンパク質の同定は、当業者に公知の方法に従って、例えば培養後の細胞不含の上清のＳＤＳポリアクリルアミドゲル中での分離と、それに引き続き個々のバンドのＮ末端配列決定又はペプチド−フィンガープリントによる分析によって行われる。
【００２６】
大腸菌において、分泌されたタンパク質を汚染するタンパク質の例は、ＯｐｐＡ、ＤｐｐＡ、ＯｍｐＡ、ＹｄｄＳ、ＦｌｉＣ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＳであり、更にこれらのタンパク質のそれぞれの組合せである：
−  オリゴペプチド結合タンパク質ＯｐｐＡ：Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ＃Ｐ２３８４３、６１ｋＤａ、ペリプラズム中の主タンパク質の１つ、オリゴペプチド−パーミアーゼ（結合タンパク質依存性の輸送系）の構成要素、５アミノ酸までのペプチドを高い親和性で結合し、ＳｅｃＢによって結合されて、アミノグリコシド系抗生物質の吸収に関与するシャペロン機能をも有する
−  ジペプチド結合タンパク質ＤｐｐＡ：Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ＃Ｐ２３８４７、６１ｋＤａ、ペプチド走化性やシャペロン類似機能（ロドバクターにおいて）に必要な輸送系のペリプラズム性のジペプチド結合タンパク質
−  外膜タンパク質Ｏｍｐ３ａ＝ＯｍｐＡ：ＮＣＢＩ＃ＮＰ＿２８６８３２、３７ｋＤａ、外膜中に局在する、コリシンＫ及びコリシンＬの作用や接合の間の安定化のために必要、ファージ用の受容体、小さい溶質に低い透過性を有するポリン
−  フラジェリンＦｌｉＣ：Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ＃Ｐ０４９４９、５１ｋＤａ、鞭毛のサブユニット
−  推定されるヘミン結合タンパク質ＹｄｄＳ：Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ＃Ｑ８ＸＡＵ４、５７ｋＤａ、推定されるジペプチド輸送タンパク質
−  アルカリ性ホスファターゼＰｈｏＡ：Ｅ．Ｃ．３．１．３．１、４９ｋＤａ、オルトリン酸モノエステルの分解を触媒するペリプラズム性タンパク質
−  リン酸結合タンパク質ＰｈｏＳ：３７ｋＤａ、ペリプラズム性タンパク質；ＰＴＳリン酸−取り込み系の構成要素
アルカリ性ホスファターゼＰｈｏＡ及びリン酸結合タンパク質ＰｈｏＳは、両者とも大腸菌のリン酸供給に関与している。
【００２７】
それに基づき、宿主細胞中では、前記タンパク質の遺伝子の発現が低減され又は阻害される。これらのタンパク質は当然のように細菌中で生理学的役割を満たすので、これらのタンパク質の形成の劇的な低減が、細胞の生存と該タンパク質の過剰生産に必要な効果的な代謝とを両立させるとは、当業者であっても全く予想しない。
【００２８】
遺伝子の発現が低減し又は阻害されて、出発細胞において前記遺伝子によってコードされる特定の宿主タンパク質がより少なく生産されるか又はもはや生産されない方法は公知である。
【００２９】
該遺伝子の１つの発現は、例えば以下の措置によって低減又は阻害することができる：
−  該遺伝子に付属するプロモーターを好適な塩基置換によって弱める
−  発現に必要な転写アクチベーターを不活性化／改変する
−  翻訳シグナル（例えばリボソーム結合部位、開始コドン）を好適な塩基置換によって弱める
−  該遺伝子のｍＲＮＡ安定化領域を除去する
−  特異的アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ領域を過剰発現する
−  全遺伝子又は少なくとも一部を欠失する
−  該遺伝子を、例えば抗生物質耐性カセットの挿入によって破壊する
−  相応の遺伝子にヌクレオチド欠失又は挿入に基づきリーディングフレームの変動を導入する。
【００３０】
任意の染色体ＤＮＡ配列を、相同であるが、塩基挿入、欠失又は置換によって改変された配列によって交換するための方法は、当業者に公知である。このように、大腸菌においては、例えばＬｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（１９９７）によって記載された系を使用して、組み込みプラスミドを用いて相同組み換えの機構を介して、汚染しているタンパク質についての遺伝子の野生型の染色体配列を突然変異されたアレルに交換することができる。
【００３１】
汚染している宿主タンパク質についての遺伝子に欠失を挿入することが好ましい。このことは、該遺伝子を、完全な遺伝子を対象する特異的プライマーを使用してＰＣＲにより増幅した後に、まずプラスミドベクター（例えばｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ＰＡＣＹＣ１８４）中にクローニングすることによって達成することができる。こうして得られたプラスミドを、遺伝子の範囲内でのみ切断しうる好適な制限エンドヌクレアーゼを用いて制限することによって、遺伝子の内部領域を除去することができる。前記のようにして、制限されたプラスミドの再ライゲーションの後に、遺伝子中に内部欠失を挿入することができる。遺伝子内で制限されたプラスミドの再ライゲーションの代わりに、抗生物質耐性カセットを該遺伝子中にクローニングすることもできる。
【００３２】
例えば、ＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒ（２０００，ＰＮＡＳ，９７（１２）、第６６４０〜６６４５頁）によるλ−Ｒｅｄレコンビナーゼ系を用いた遺伝子の欠失を行うことができる。
【００３３】
更に、本発明は、組み換えタンパク質をコードする組み換え遺伝子を有する細菌株を用いて発酵培地中で組み換えタンパク質を発酵的に製造する方法において、本発明による微生物菌株を発酵培地中で培養し、そしてその発酵培地を、発酵後に細菌株の細胞から分離することを特徴とする方法に関する。
【００３４】
有利には、発酵培地の分離後に、組み換えタンパク質は、発酵培地から精製される。本発明による方法によって、精製された組み換えタンパク質を発酵培地から精製することは容易となる。
【００３５】
有利には、産生されるべきタンパク質をコードする遺伝子は、前記宿主生物中で機能的な発現シグナル（プロモーター、転写開始、翻訳開始、リボソーム結合部位）を備えている。
【００３６】
付加的に、産生されるべきタンパク質をコードする遺伝子は、産生されるべきタンパク質が、まずはシグナル配列によってコードされるシグナルペプチドとの融合物として産生されることをもたらすシグナル配列と結合される。前記シグナルペプチドは、産生されたタンパク質の分泌を引き起こす。
【００３７】
シグナル配列としては、ｐｈｏＡ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＴ、ｌａｍＢ、ｍａｌＥ、スタフィロコッカスのプロテインＡ、ｓｔＩＩが使用される。
【００３８】
産生されたタンパク質の分泌は、例えば細胞のｓｅｃ装置によって行われる。ペリプラズム中に行われる分泌後に、シグナルペプチダーゼ（例えば大腸菌の場合のＬｅｐＢ）によってシグナルペプチドは分解されて、所望のタンパク質が生ずる。
【００３９】
産生されるべきタンパク質であって発現シグナルと分泌シグナルを含むタンパク質についての遺伝子は、宿主細胞中に組み込まれる。このことは、ベクター上で、例えば公知の発現ベクター、例えばｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３又はｐＥＴの誘導体のようなプラスミドを用いて行われる。該遺伝子は、宿主細胞の染色体からも発現しうる。
【００４０】
本発明によるタンパク質の製造のための細菌株の発酵は、有利には完全培地又は最少培地中で行われる。これらの培地は文献から公知である。
【００４１】
炭素源としては、原則的に、使用可能な全ての糖、糖アルコール、有機酸もしくはそれらの塩、デンプン加水分解物、糖蜜又は別の物質を使用することができる。この場合に、有利にはグルコース又はグリセリンが使用される。また、複数の種々異なる炭素源を組み合わせた栄養補給も可能である。窒素源としては、尿素、アンモニア及びそれらの塩、硝酸塩並びに別の窒素源を用いることができる。可能な窒素源には、複合アミノ酸混合物、例えば酵母エキス、ペプトン、麦芽エキス、大豆ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー及びＮＺアミン（例えばＫｅｒｒｙ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ、米国シカゴ在）も該当する。
【００４２】
更に、該培地に、更なる成分、例えばビタミン、塩、酵母エキス、アミノ酸及び微量元素を添加することができ、それにより細胞増殖は改善される。
【００４３】
菌株のインキュベーションは、有利には好気的な培養条件下で１６〜１５０時間の時間にわたり、それぞれの菌株に最適な増殖温度の範囲において行われる。
【００４４】
最適な温度範囲としては、１５〜５５℃が好ましい。特に、３０〜３７℃の温度が好ましい。
【００４５】
菌株の培養は、振盪フラスコ又は発酵器中で行うことができ、その際、容量に関する制限は与えられていない。培養は、回分法で、流加培養法で、又は連続法で行うことができる。
【００４６】
ペリプラズムあるいは培養培地からのタンパク質の精製は、当業者に公知の方法に従って、例えば培地を遠心分離して、細胞を分離して、引き続きタンパク質をクロマトグラフィーにより精製し、錯形成し、濾過又は沈殿させることによって行うことができる。
【００４７】
以下の実施例は、本発明の更なる説明に役立つものである。
【実施例】
【００４８】
実施例１：汚染している宿主タンパク質の同定
文献から公知の以下の一般的に入手可能であり、市販されている大腸菌−分泌菌株を、ＬＢ培地中で１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコにおいて３０℃で４８時間培養した：
−  ＢＬＲ：Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．２００２、Ｎｏｖａｇｅｎ社から購入できる
−  Ｋ８０２＝ＣＧＳＣ*５６１０：Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８
−  ＷＣＭ１０５：ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１に従って製造可能
−  ＭＭ２８＝ＣＧＳＣ*＃５８９２：Ｎａｇａｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．１９８５
−  ＲＶ３０８＝ＡＴＣＣ**３１６０８；ＥＰ０６７７１０９号Ｂ１
−  ＲＲ１：ＡＴＣＣ**３１４３４：Ｎａｇａｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９８５
−  ＫＧ１００５ ｏｍｐＴ：Ｗａｄｅｎｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１
*大腸菌ストックセンターＣＧＳＣ（８３０ Ｋｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｏｗｅｒ，ＭＣＤ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，２６６ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ａｖｅ．，ＰＯ ｂｏｘ ２０８１０３，Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ）から購入できる
**ＬＧＣプロモケム（Ｍｅｒｃａｔｏｒｓｔｒ．５１，４６４８５ Ｗｅｓｅｌ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）から購入できる。
【００４９】
次いで、細胞を、１３０００ｇで１０分間遠心分離することによって分離した。上清（培地）から、それぞれ３０μｌを、ＳＤＳサンプルバッファー（５×ＳＤＳサンプルバッファー：１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）；１０％のグリセロール；０．５％のＳＤＳ；０．０５％のブロモフェノールブルー；５％のβ−メルカプトエタノール）と混合し、そして１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（インビトロジェン社のカタログ番号ＮＰ０３４１）中で１×のＭＥＳ含有ランニングバッファー（２０×のＭＥＳ−ランニングバッファー、インビトロジェン社のカタログ番号ＮＰ０００２）を用いて分離した（電気泳動パラメータ：２００Ｖで４０分間）。次いで、ゲルを、クーマシーブルー染色溶液（１タブレットのＰｌｕｓＯｎｅクーマシータブレット、Ｐｈａｓｔ Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ Ｒ−３５０（アマシャム  １７−０５１８−０１）、８０ｍｌのＨ2Ｏ中に溶解されている、＋１２０ｍｌメタノール、＋２００ｍｌ酢酸２０％）で１時間染色し、そして脱色溶液（３００ｍｌのメタノール、１００ｍｌの酢酸、６００ｍｌの完全脱塩Ｈ2Ｏ）中で脱色した。と１２０ｍｌのメタノールと２００ｍｌの酢酸２０％完全脱塩水中で洗浄したあとに、際だったバンドがゲル上に同定された（図１を参照）。これらは、粗生成物によって汚染しているタンパク質をもたらす。相応のバンドを切り出し、そして交互にアセトニトリルと５０％の重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄した。必要であれば、ＤＴＴ及びヨードアセトアミドによるジスルフィド結合の還元を行った。トリプシンによるタンパク質分解の後に、生ずるペプチドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定した。理論上計算される質量（予想ペプチド）あるいはデータベースの登録データと比較することによって、試験されたタンパク質を同定した。７種の目立ったタンパク質が同定された：
−  オリゴペプチド結合タンパク質ＯｐｐＡ：Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ＃Ｐ２３８４５
−  ジペプチド結合タンパク質ＤｐｐＡ：Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ＃Ｐ２３８４７
−  外膜タンパク質Ｏｍｐ３ａ＝ＯｍｐＡ：ＮＣＢＩ＃ＮＰ＿２８６８３２
−  フラジェリンＦｌｉＣ：Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ＃Ｐ０４９４９
−  推定されるヘミン結合タンパク質ＹｄｄＳ：Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ＃Ｑ８ＸＡＵ４
−  アルカリ性ホスファターゼＰｈｏＡ：Ｅ．Ｃ．３．１．３．１ Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ＃Ｐ００６３４
−  リン酸結合タンパク質ＰｈｏＳ：Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ＃Ｐ０６１２８
実施例２：汚染している宿主タンパク質についての遺伝子の欠失
その都度の菌株における遺伝子の大きな内部領域の欠失を、ＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒ（２０００，ＰＮＡＳ，９７（１２）、第６６４０〜６６４５頁）によるλ−Ｒｅｄレコンビナーゼ系を用いて行った。このために、まず除去されるべき遺伝子領域をクロラムフェニコール耐性カセットと交換したが、それは引き続き酵母ＦＬＰレコンビナーゼとカセット側面の特定の"ＦＲＴ"フランキングを使用することによって再び排除することができる。
【００５０】
その欠失を以下のとおり実施した：
ＰＣＲ：
・  鋳型：
鋳型として、ｐＫＤ３（クロラムフェニコール耐性；大腸菌ストックセンターＣＧＳＣからＣＧＳＣ＃７６３１として得られる）を使用した。
【００５１】
・  オリゴプライマー（Ｏｌｉｇｏｓ）：
フォワードオリゴプライマー：除去されるべき遺伝子の最初の３６〜５０塩基対の相同配列＋２０塩基対の相同プラスミド配列：
５′−３６〜５０塩基対の染色体−ＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ−３′（配列番号１）
リバースオリゴプライマー：除去されるべき遺伝子の最初の３６〜５０塩基対の相同配列＋２０塩基対の相同プラスミド配列（反対鎖）：
５′−３６〜５０塩基対の染色体−ＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧ−３′（配列番号２）
・  ポリメラーゼ：
Ｐｆｕ又はＴａｑ
・  生成物長：
ｐＫＤ３：１．１ｋｂ
ＰＣＲ産物の精製：
ＰＣＲ産物を精製し（例えばＱｉａプレップ（Ｑｉａｐｒｅｐ）カラムを介して）、そしてＤｐｎＩで消化させ（付属のバッファー中３７℃で２時間）、次いでもう一度精製して、３０μｌの蒸留水中に溶出させた（＝ＰＣＲ調製物）。
【００５２】
・  エレクトロコンピテント細胞の調製：
・  ｐＫＤ４６＝λ Ｒｅｄレコンビナーゼ発現プラスミド（アラビノース誘導が可能）、これは大腸菌ストックセンターＣＧＳＣからＣＧＳＣ＃７７３９として得られる、Ａｍｐ耐性、温度感受性の複製起点：全ての工程は最大３０℃で
・  該プラスミドの改変されるべき目的菌株での形質転換（発現／３０℃でのインキュベーション）
・  目的菌株とプラスミドからエレクトロポレーション用のコンピテント細胞を製造する
・  細胞培養用の培地：ＳＯＢ培地：
２０ｇ／ｌのトリプトン
５ｇ／ｌの酵母エキス
０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ
２．５ｇ／ｌのＫＣｌ
１０ｍＭのＭｇＣｌ
＋０．２％のアラビノース
＋１００ｍｇ／ｌのアンピシリン
・  エレクトロポレーション用コンピテント細胞の製造：
−  ３０℃で培養する
−  ＯＤ600で０．６までで細胞を回収する
−  約１００倍に濃縮し、そして氷冷グリセリン（１０％）で３回洗浄する
組み換え：
・  １０μｌのＰＣＲ調製物（約１０〜１００ｎｇの精製されたＰＣＲ−ＤＮＡ）を、エレクトロコンピテント細胞中に形質転換させる
・  表現型発現：形質転換バッチを１ｍｌのＬＢ中に入れ、３７℃で１時間インキュベートし、そしてＬＢｃａｍプレート上で選別する。３７℃でインキュベート
ｐＫＤ４６（ＣＧＳＣ＃７７３９）のキュアリング：
・  こうして得られた耐性カセットを有するクローンを、２つのＬＢプレート上に塗抹し、並行して３７℃と４３℃で培養する
・  これらのプレートから、単一クローンをＬＢａｍｐ（１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを有するＬＢ）とＬＢ上に塗抹し、そして３０℃でインキュベートする
・  そのうちの約８つのクローンをＬＢｃａｍ（３０ｍｇ／ｌを有するＬＢ）（３７℃）上で浄化する
クローンのＰＣＲ制御：
・  好適なオリゴプライマー（上記したこととＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒ，２０００を参照）を用いて、耐性カセットが、染色体中の除去されるべき遺伝子の部位に実際にあるかどうかを試験する
染色体抗生物質耐性カセットの除去：
・  ｐＣＰ２０（大腸菌ストックセンターＣＧＳＣからＣＧＳＣ＃７６２９から得られる）＝"ＦＬＰ"レコンビナーゼ発現プラスミド、Ａｍｐ耐性、温度感受性の複製起点：全ての工程は最大３０℃で
・  ａｍｐ感受性のクローン（キュアリングによりｃａｍ耐性）を、ｐＣＰ２０で形質転換し、ＬＢａｍｐ上で３０℃において選別する
・  ８つの形質転換体を、ＬＢ上で浄化する、インキュベートは３７℃
・  個々のコロニーを、もう一度ＬＢ上に塗抹し、４３℃でインキュベートする
・  そのうち約１２つのクローンをｃａｍ感受性とａｍｐ感受性について試験する
・  ａｍｐ／ｃａｍ感受性クローンは、耐性カセットとｐＰＣ２９を失っている
＝＞導入されたＣａｍカセットを有さない欠失クローン
特に、個々の欠失突然変異体の構築のためには、以下のオリゴプライマーを使用して、以下のＰＣＲ産物が得られた：
ＯｍｐＡの欠失
ＰＣＲ用プライマー：
ＯｍｐＡ５：
【００５３】
【表１】
0004751347.tif 000002
【００５４】
ＯｍｐＡ６：
【００５５】
【表２】
0004751347.tif 000003
【００５６】
−＞ｐＫＤ３（大腸菌ストックセンターＣＧＳＣからＣＧＳＣ＃７６３１として得られる）によるＰＣＲ：産物：１１１４塩基対；ｏｍｐＡの５９８塩基対を、組み換えにおいて、１０１４塩基対のＣａｍ耐性によって置換する
プライマー：
ＯｍｐＡ３：ＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＡＧ（配列番号５）
ＯｍｐＡ４：ＧＣＴＧＡＧＴＴＡＣＡＡＣＧＴＣＴＴＴＧ（配列番号６）
を用いた組み込み／欠失の調査
産物：野生型：１０２２塩基対；挿入突然変異体：１４８６塩基対；欠失突然変異：約４３０塩基対
記載されるようにして、以下の菌株を製造した：
−  ＢＬＲΔｏｍｐＡ
−  Ｋ８０２ΔｏｍｐＡ
−  ＷＣＭ１０５ΔｏｍｐＡ
−  ＭＭ２８ΔｏｍｐＡ
−  ＲＶ３０８ΔｏｍｐＡ
−  ＲＲ１ΔｏｍｐＡ
−  ＫＧ１００５ｏｍｐＴΔｏｍｐＡ
ＯｐｐＡの欠失
ＰＣＲ用プライマー：
ＯｐｐＡ５：
【００５７】
【表３】
0004751347.tif 000004
【００５８】
ＯｐｐＡ６：
【００５９】
【表４】
0004751347.tif 000005
【００６０】
−＞ｐＫＤ３によるＰＣＲ：産物：１１１４塩基対；ｏｐｐＡの１３３１塩基対を、組み換えにおいて、１０１４塩基対のＣａｍ耐性により置換する
プライマー：
ＯｐｐＡ３：ＧＣＧＧＡＴＣＴＴＴＧＣＣＧＧＴＡＴＡＧ（配列番号９）
ＯｐｐＡ４：ＧＡＣＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＧＡＡ（配列番号１０）
を用いた組み込み／欠失の調査
産物：野生型：１５８７塩基対；挿入突然変異体：１２７０塩基対；欠失突然変異：約２６０塩基対
以下の菌株：
−  ＢＬＲΔｏｐｐＡ
−  Ｋ８０２ΔｏｐｐＡ
−  ＷＣＭ１０５ΔｏｐｐＡ
−  ＭＭ２８ΔｏｐｐＡ
−  ＲＶ３０８ΔｏｐｐＡ
−  ＲＲ１ΔｏｐｐＡ
−  ＫＧ１００５ｏｍｐＴΔｏｐｐＡ
が得られた
ＤｐｐＡの欠失
ＰＣＲ用プライマー：
ＤｐｐＡ１：
【００６１】
【表５】
0004751347.tif 000006
【００６２】
ＤｐｐＡ２：
【００６３】
【表６】
0004751347.tif 000007
【００６４】
−＞ｐＫＤ３によるＰＣＲ：産物：１１１４塩基対；ｄｐｐＡの１３８１塩基対を、組み換えにおいて、１０１４塩基対のＣａｍ耐性により置換する
プライマー：
ＤｐｐＡ３：ＧＴＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴＧ（配列番号１３）
ＤｐｐＡ４：ＴＧＴＴＴＧＣＣＴＡＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣ（配列番号１４）
を用いた組み込み／欠失の調査
産物：野生型：１５８７塩基対；挿入突然変異体：１１９３塩基対；欠失突然変異：約５６６塩基対
以下の菌株：
−  ＢＬＲΔｄｐｐＡ
−  Ｋ８０２ΔｄｐｐＡ
−  ＷＣＭ１０５ΔｄｐｐＡ
−  ＭＭ２８ΔｄｐｐＡ
−  ＲＶ３０８ΔｄｐｐＡ
−  ＲＲ１ΔｄｐｐＡ
−  ＫＧ１００５ｏｍｐＴΔｄｐｐＡ
が得られた
ＦｌｉＣの欠失
ＰＣＲ用プライマー：
ＦｌｉＣ１：
【００６５】
【表７】
0004751347.tif 000008
【００６６】
ＦｌｉＣ２：
【００６７】
【表８】
0004751347.tif 000009
【００６８】
−＞ｐＫＤ３によるＰＣＲ：産物：１１１４塩基対；ｆｌｉＣの１３３４塩基対を、組み換えにおいて、１０１４塩基対のＣａｍ耐性により置換する
プライマー：
ＦｌｉＣ３：ＴＡＴＣＡＡＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＣＴＧＣ（配列番号１７）
ＦｌｉＣ４：ＡＧＡＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧＴＡ（配列番号１８）
を用いた組み込み／欠失の調査
産物：野生型：１４３２塩基対；挿入突然変異体：１１１２塩基対；欠失突然変異：約１１０塩基対
以下の菌株：
−  ＢＬＲΔｆｌｉＣ
−  Ｋ８０２ΔｆｌｉＣ
−  ＷＣＭ１０５ΔｆｌｉＣ
−  ＭＭ２８ΔｆｌｉＣ
−  ＲＶ３０８ΔｆｌｉＣ
−  ＲＲ１ΔｆｌｉＣ
−  ＫＧ１００５ｏｍｐＴΔｆｌｉＣ
が得られた
ＹｄｄＳの欠失
ＰＣＲ用プライマー：
ＹｄｄＳ１：
【００６９】
【表９】
0004751347.tif 000010
【００７０】
ＹｄｄＳ２：
【００７１】
【表１０】
0004751347.tif 000011
【００７２】
−＞ｐＫＤ３によるＰＣＲ：産物：１１１４塩基対；ｆｌｉＣの１３５０塩基対を、組み換えにおいて、１０１４塩基対のＣａｍ耐性により置換する
プライマー：
ＹｄｄＳ３：ＡＴＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴＣＧＴＣＣＴＴＧ（配列番号２１）
ＹｄｄＳ４：ＣＣＴＧＴＴＣＣＡＧＣＡＴＧＧＧＡＴＴＧ（配列番号２２）
を用いた組み込み／欠失の調査
産物：野生型：１４３２塩基対；挿入突然変異体：１１５６塩基対；欠失突然変異：約１６０塩基対
以下の菌株：
−  ＢＬＲΔｙｄｄＳ
−  Ｋ８０２ΔｙｄｄＳ
−  ＷＣＭ１０５ΔｙｄｄＳ
−  ＭＭ２８ΔｙｄｄＳ
−  ＲＶ３０８ΔｙｄｄＳ
−  ＲＲ１ΔｙｄｄＳ
−  ＫＧ１００５ｏｍｐＴΔｙｄｄＳ
が得られた
ＰｈｏＡ及びＰｈｏＳの欠失
同様に行った。
【００７３】
以下の菌株：
−  ＢＬＲΔｐｈｏＡ
−  Ｋ８０２ΔｐｈｏＡ
−  ＷＣＭ１０５ΔｐｈｏＡ
−  ＭＭ２８ΔｐｈｏＡ
−  ＲＶ３０８ΔｐｈｏＡ
−  ＲＲ１ΔｐｈｏＡ
−  ＫＧ１００５ｏｍｐＴΔｐｈｏＡ
−  ＢＬＲΔｐｈｏＳ
−  Ｋ８０２ΔｐｈｏＳ
−  ＷＣＭ１０５ΔｐｈｏＳ
−  ＭＭ２８ΔｐｈｏＳ
−  ＲＶ３０８ΔｐｈｏＳ
−  ＲＲ１ΔｐｈｏＳ
−  ＫＧ１００５ｏｍｐＴΔｐｈｏＳ
が得られた
実施例３：多重欠失突然変異体の作製
多重突然変異体の作製に際して、実施例２で作製された幾つかの菌株において、実施例２に記載される工程に従って段階的に、他の６つの同定された遺伝子をも欠失させた。
【００７４】
とりわけ、以下の菌株：
−  Ｋ８０２ΔｏｐｐＡΔｆｌｉＣ
−  ＢＬＲΔｐｈｏＡΔｏｐｐＡ
−  ＢＬＲΔｐｈｏＡΔｏｐｐＡΔｙｄｄＳΔｐｈｏＡΔｐｈｏＳ
−  ＢＬＲΔｐｈｏＡΔｙｄｄＳ
−  ＢＬＲΔｐｈｏＡΔｏｐｐＡΔｙｄｄＳΔｆｌｉＣ
−  ＷＣＭ１０５ΔｏｐｐＡΔｏｍｐＡ
−  ＷＣＭ１０５ΔｏｍｐＡΔｆｌｉＣ
−  ＷＣＭ１０５ΔｏｐｐＡΔｐｈｏＡ
−  ＷＣＭ１０５ΔｏｐｐＡΔｙｄｄＳ
−  ＷＣＭ１０５ΔｆｌｉＣΔｙｄｄＳ
−  ＷＣＭ１０５ΔｏｐｐＡΔｆｌｉＣ
−  ＷＣＭ１０５ΔｏｐｐＡΔｆｌｉＣΔｙｄｄＳ
−  ＷＣＭ１０５ΔｏｐｐＡΔｆｌｉＣΔｙｄｄＳΔｐｈｏＡ
が得られた。
【００７５】
実施例４：増殖に関する欠失突然変異体の特性決定
種々の菌株の増殖を、３０℃で、１％のグルコースを有するＬＢ中で、６００ｎｍでのＯＤを増殖２４時間後と増殖４８時間後とで測定することで調査した。
【００７６】
全ての菌株は、通常の増殖を示した、つまりその増殖は、出発菌株と比較して制限されていなかった。従って、それらの欠失は、菌株の生存性と増殖とに悪影響を及ぼさなかった。
【００７７】
第１表は、選択された菌株での結果を示す：
【００７８】
【表１１】
0004751347.tif 000012
【００７９】
実施例５：上清中の汚染しているタンパク質に関する欠失突然変異体の特性決定
本発明による菌株の上清中の汚染しているタンパク質を分析するために、培養からアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色によって分析した。図２で選択された菌株について示されるように、欠失された遺伝子に相応するバックグラウンドタンパク質は、これらの菌株の場合にはもはや上清中に存在しない。汚染しているバックグラウンドバンドの全体は、それによって明らかに低減されている。
【００８０】
実施例６：シクロデキストリン−グリコシル−トランスフェラーゼの特異的な産生の増大
実施例２及び３に記載されるように作製した種々の菌株を、シクロデキストリン−グリコシル−トランスフェラーゼの産生のために使用した。そのために、これらの菌株を、プラスミドｐＣＭ３０１によって通常の方法（例えばＣａＣｌ2形質転換によって）形質転換した。このプラスミドは、クレブシエラ・オキシトカＭ５ａ１由来のシクロデキストリン−グリコシル−トランスフェラーゼの構造遺伝子を有しており、ｔａｃ−プロモーターの制御下にあり、該プラスミドはＥＰ０２２０７１４号に記載されている。
【００８１】
これらの本発明による菌株を、１％のグルコースを有するＬＢ培地中で１０ｍｌにおいて３０℃で培養する。ＯＤが０．５になったら、シクロデキストリン−グリコシル−トランスフェラーゼの産生を、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を添加して０．５ｍＭとすることによって誘導する。
【００８２】
これらの菌株の培養物の上清中で、全タンパク質含量（ブラッドフォード法により）を測定すると同時に、シクロデキストリン−グリコシル−トランスフェラーゼの収率を以下の活性試験によって測定した。
【００８３】
試験バッファー：５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（＞ｐＨ６．５）、５ｍＭのＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ
基質：試験バッファー（ｐＨ６．５）中１０％のＮｏｒｅｄｕｘ溶液
試験バッチ：１ｍｌの基質溶液＋１ｍｌの遠心分離された培養上清（１２０００ｒｐｍで５分）＋３ｍｌのメタノール
反応温度：４０℃
酵素試験：
・  溶液の予熱（４０℃で約５分）
・  酵素溶液の基質溶液への添加；高速混合（渦流混合機（Ｗｈｉｒｌ−Ｍｉｘｅｒ））
・  ４０℃で３分間のインキュベート
・  メタノールの添加による酵素反応の停止；高速混合（渦流混合機）
・  氷上でのバッチの冷却（約５分）
・  遠心分離（１２０００ｒｐｍで５分）と、澄明な上清のピペットによる分離
・  産生されたＣＤのＨＰＬＣによる分析
酵素活性：Ａ＝Ｇ*Ｖ１*Ｖ２／（ｔ*ＭＧ）（ユニット／ｍｌ）
Ａ＝活性
Ｇ＝ＣＤの含量（ｍｇ／ｌ）＝試験バッチ：単位面積×１０4／標準溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）／単位面積
Ｖ１＝希釈係数／試験バッチ（−＞５）
Ｖ２＝希釈係数／酵素溶液
ｔ＝反応時間（分）（−＞３）
ＭＧ＝分子量（ｇ／モル）（ＣＤ−＞９７３）
１ユニット＝１マイクロモルの産物／分
第２表は、選択された本発明による菌株のシクロデキストリン−グリコシル−トランスフェラーゼの比収率の増大を示している。
【００８４】
【表１２】
0004751347.tif 000013
【００８５】
実施例７：ＤｓｂＧの特異的産生の増大は、実施例２及び３に従って生ずる
７．１  ｄｓｂＧのクローニング
ｄｓｂＧ（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ＃Ｐ７７２０２）の過剰生産のためのベクターを、以下のようにして構築した：
−  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ＃２７３２５）由来の染色体ＤＮＡを鋳型として用い、そして以下のプライマー：
【００８６】
【表１３】
0004751347.tif 000014
を用いてＰＣＲを行う
−  ７８３塩基対のＰＣＲ産物をＸｂａＩとＥｃｏＲＩで制限する
−  ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３（ＩＢＡ社、ゲッティンゲン在）をＸｂａＩとＥｃｏＲＩで制限する
−  両方のＤＮＡ断片をライゲーションする。
【００８７】
得られたプラスミドをｐＡＳＫ−ｄｓｂＧ（３９６１塩基対）と呼称し、該プラスミドは、シグナル配列を含むｄｓｂＧについての遺伝子をｔｅｔ−プロモーターの制御下に有する。
【００８８】
７．２  ＤｓｂＧの生産の増大
実施例２と実施例３に従って製造された菌株を、プラスミドｐＡＳＫ−ｄｓｂＧで通常の方法（例えばＣａＣｌ2形質転換）に従って形質転換し、第３表に挙げられる本発明による菌株が得られた。
【００８９】
菌株Ｋ８０２ΔｏｐｐＡ／ｐＡＳＫ−ｄｓｂＧは、２００６年１月２６日にＤＳＭＺ（ドイツ細胞バンク社、ブラウンシュバイクＤ−３８１４２）で、ブタペスト条約に従って番号ＤＳＭ１７８９９として寄託した。
【００９０】
菌株Ｋ８０２ΔｆｌｉＣ／ｐＡＳＫ−ｄｓｂＧは、２００６年１月２６日にＤＳＭＺ（ドイツ細胞バンク社、ブラウンシュバイクＤ−３８１４２）で、ブタペスト条約に従って番号ＤＳＭ１７８９８として寄託した。
【００９１】
これらの菌株を、１％のグルコース及び１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを有するＬＢ培地中で１０ｍｌにおいて３０℃で培養する。ＯＤが０．５になったら、ＤｓｂＧの生産を、アンヒドロテトラサイクリンを添加して０．２ｍｇ／ｌとすることによって誘導する。
【００９２】
種々異なる時間後に、それぞれ細胞不含の上清を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、そしてクーマシーブリリアントブルーで染色した後に分析する。定量的な評価は、Ｂｉｏｒａｄ ＧＳ−８００型の校正濃度計（Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）でのスキャンによりＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ １−Ｄ−分析ソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ社）を用いてスタンダードと比較して行った。
【００９３】
図３と図４及び第３表の幾つかの例が示しているように、ＤｓｂＧの生産は、本発明による菌株中では出発菌株と比較して改善されている。
【００９４】
第３表：
【００９５】
【表１４】
0004751347.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、ＬＢ中での４８時間培養物の上清を、１２％のＮｕＰＡＧＥゲル（インビトロジェン）で分離したものを示しており、実施例１のタンパク質が同定されている
【図２】図２は、ＬＢ＋１％Ｇｌｃ中での培養物の上清を、１２％のＮｕＰＡＧＥゲルで分離して、クーマシーにより染色されたものを示し、これは実施例３と実施例５によるものである
【図３】図３は、ＬＢ＋１％Ｇｌｃ中での培養物の上清を、１２％のＮｕＰＡＧＥゲルで分離して、クーマシーにより染色されたものを示している。全ての上清から、それぞれ１μｌを載せた。矢印は、形成されたＤｓｂＧ（２６ｋＤａ）を示し、楕円は欠失したタンパク質を示している
【図４】図４は、ＬＢ＋１％Ｇｌｃ中での培養物の上清を、１２％のＮｕＰＡＧＥゲルで分離して、クーマシーにより染色されたものを示している。全ての上清から、それぞれ１０μｌを載せた。矢印は、形成されたＤｓｂＧ（２６ｋＤａ）を示し、楕円は欠失したタンパク質を示している
【図１】
0004751347.tif 000016
【図２】
0004751347.tif 000017
【図３】
0004751347.tif 000018
【図４】
0004751347.tif 000019
【配列表】
0004751347000001.app