(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳卒中を罹患する疑いのある患者から採取された体液サンプルにおいて、脳卒中または脳卒中の可能性を分析するのに使用するための分析方法であって、
前記分析方法は、
前記サンプル中の心臓脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ）または脳脂肪酸結合タンパク質（Ｂ−ＦＡＢＰ）の濃度を決定する工程と、
決定した濃度が、非脳卒中の患者から取得された体液のサンプルにおける濃度と比較して、増加していることを脳卒中の可能性を分析するための指標として用いる工程、を包含する、
分析方法。
【請求項２】
前記決定した濃度が、非脳卒中の患者から取得された体液のサンプルにおける濃度と比較して増加している患者から、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）に対する第２の分析の結果が陽性であった患者を除外する工程を、さらに含み、
ここで、前記濃度を決定する工程が、Ｈ−ＦＡＢＰの濃度を決定する、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
ＡＭＩに対する前記第２の分析が、血漿、血液または血清中の、トロポニン−ＩまたはクレアチンキナーゼＭＢの濃度を決定する工程を包含する、請求項２に記載の分析方法。
【請求項４】
Ｈ−ＦＡＢＰに対する抗体が、Ｈ−ＦＡＢＰに対する前記分析方法において使用される、請求項１、２または３に記載の分析方法。
【請求項５】
ポリクローナル抗ヒトＦＡＢＰ抗体が、使用される、請求項４に記載の分析方法。
【請求項６】
Ｈ−ＦＡＢＰに対する前記分析方法が、サンドイッチＥＬＩＳＡを包含する、請求項４または５のいずれかに記載の分析方法。
【請求項７】
Ｂ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰに対する抗体が、その組み合わせにおいてＡＭＩに対する分析を用いないで、使用される、請求項１に記載の分析方法。
【請求項８】
Ｈ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰに対する前記分析方法が、血液サンプル、血清サンプル、または血漿サンプルにおいて実行される、請求項１から７のいずれか一項に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、タンパク質またはそれに対する抗体を用いる診断アッセイの分野にある。
【０００２】
（関連技術の説明）
脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）は、工業国において３番目に高い死亡率を持つ。これは、大脳の血流の恒久的な減少または一時的な減少のいずれか起因する。この血流の減少は、ほとんど場合、塞栓または局所的な血栓症のいずれかに起因する動脈の閉塞により生じる。脳の損傷の場所および壊死した神経細胞の強度に依存して、脳卒中症状は、患者にとって生活上の障害となり得、そして脳卒中がおこることによる死亡率は、３０％に達する。
【０００３】
近年、Ｓ１００Ｂが、脳卒中の診断のための可能性のある生化学的マーカーとして記載されている（Ｕ．Ｍｉｓｓｌｅｒら、「Ｓ１００ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｏｌａｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ａｓ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｏｆ ｉｎｆｒａｃｔ ｖｏｌｕｍｅ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｓｉｃｈｅｍｉａ ｓｔｒｏｋｅ」、Ｓｔｒｏｋｅ １９９７；２８：１９５６−６０を参照のこと）。しかし、Ｓ１００Ｂはまた、黒色腫の転移および脳損傷および心臓手術の由来する大脳の合併症の早期検出にとって有用なマーカーであると報告されている。したがって、Ｓ１００試験による感度および特異性は、それぞれ４４％および６７％に限定されている（Ｍ．Ｔａｋａｈａｓｈｉら、「Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｅｒｕｍ Ｓ１００Ｂ ｕｓｉｎｇ ｉｓｏｆｏｒｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ」、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９９；４５：１３０７−１１を参照のこと）。新たな脳卒中のマーカーを開発することは、臨床家が早期診断を達成するための助けとなり、従ってこの患者における潜在的な再発を回避するための助けとなる。
【０００４】
（発明の要旨）
この度、驚くべきことに、心臓脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ）および脳脂肪酸結合タンパク質（Ｂ−ＦＡＢＰ）のとして知られている、２つの脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）が、脳卒中のマーカーであることが発見された。これにより、本発明は、脳卒中または、脳卒中に罹患していると疑われる患者から採取した体液サンプル中での脳卒中の可能性についての診断アッセイの方法を提供し、この方法は、サンプル中の、心臓脂肪酸結合タンパク質または脳脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰ）の濃度を決定する工程を包含する。このようにして決定された濃度を使用して、診断をするか、または診断をする補助をする。
【０００５】
好都合なことに、この方法は、Ｈ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰに対する抗体を用いて施行され、これにより、抗体とサンプル中の間のＦＡＢＰの反応の程度がアッセイされ、そしてサンプル中のＦＡＢＰの濃度と関連付けられる。
【０００６】
本発明は、脳卒中に対する、高感度、高特異性、および施行された高い予測的な陽性値をもつアッセイを実行することを可能にする。「感度」とは、臨床的な試験により脳卒中であることが確認された患者から採取したサンプルに対するアッセイによって得られる、真陽性の百分率として定義される。これは、（（真陽性）／（真陽性＋偽陰性））％として算出される。「特異性」は、コントロールサンプル（すなわち、臨床的な試験において、脳卒中であると示されなかった患者からのサンプル）において得られた、真陰性の百分率を意味する。これは、（（真陰性）／（偽陽性＋真陰性））％として算出される。「予測的な陽性値」は、比率（（真陽性）／（真陽性＋偽陽性））％を意味する。
【０００７】
Ｈ−ＦＡＢＰは、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の公知のマーカーである（Ｊ．Ｉｓｈｉｉら、「Ｓｅｒｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ ｖｓ ｈｕｍａｎ ｈｅａｒｔ−ｔｙｐｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｆａｔｔｙ−ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９７；４３ １３７２−１３７８を参照のこと）。それゆえ、脳卒中に対するＨ−ＦＡＢＰについてアッセイを用いて、より良い利点を得るためには、脳卒中に対する診断から、ＡＭＩアッセイで陽性なった患者を取り除く目的で、ＡＭＩに対する別の種類のアッセイ（マーカーがＦＡＢＰでないアッセイ）を施行することが所望される。
【０００８】
従って、特定の実施形態では、上記で定義されたように、第一のアッセイでＨ−ＦＡＢＰの濃度を決定し、これにより陽性の結果が脳卒中または急性心筋梗塞のいずれかの可能性を示す工程を含み、そしてさらに、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）のみに対して、第二の診断アッセイを実施して、これにより、Ｈ−ＦＡＢＰアッセイで陽性の結果およびＡＭＩに対するアッセイで陰性の結果は、この患者が脳卒中に罹患している可能性を示す工程を含む、方法を、本発明は提供する。トロポニン−ＩおよびクレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）を、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の初期の生化学的マーカーとして用いるアッセイは、周知であり、そして上記の目的について適切である。これらは、血漿、血清、または血液において、施行され得る。当然ながら、用語「第一に」、「第二に」とは、単なる便宜上の標記である：この２つのアッセイは、いずれの順序でも実行し得る。
【０００９】
類似のＨ−ＦＡＢＰおよび、また、脳特異的な脂肪酸結合タンパク質（Ｂ−ＦＡＢＰ）は、マウスの脳内で見つかっている（Ｐｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９；１９８ ６９−７８を参照のこと）。脳Ｈ−ＦＡＢＰ（Ｂ−ＦＡＢＰと混同しないように）は、心臓のＨ−ＦＡＢＰと、一つのアミノ酸残基置換だけ違うと考えられている。しかしながら、Ｂ−ＦＡＢＰは、相当に違っている。Ｐ．Ａ．Ｓｅｌｌｎｅｒらは、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｒｏｌｅ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ」（Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １９９５年；８９：３３−４６）で、６９％のＤＮＡ相同性であると見積もっており、一方、Ａ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒｒは、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｅａｒｔ−ｔｙｐｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ｓｔａｎｄａｒｄ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｓｓａｙｓ」で６４％のアミノ酸配列相同性であり、そしてヒトＨ−ＦＡＢＰに対するモノクローナル抗体が、わずか１．７％の程度で、ヒトＢ−ＦＡＢＰと交叉反応的であると述べている。
【００１０】
本発明者がＨ−ＦＡＢＰが脳卒中のマーカーであると見出した以上は、Ｂ−ＦＡＢＰもまた、マーカーであるとするのは、大変妥当な予測である。Ｂ−ＦＡＢＰは、脳組織にとって特異的であり、そしてＨ−ＦＡＢＰに対するモノクローナル抗体と有意に反応しないようなので、これは、ＡＭＩについて陽性を示さず、ＡＭＩに対する別のアッセイを不必要にする。
【００１１】
（好ましい実施形態の説明）
アッセイの方法のために、サンプルは、患者の血液、血漿または血清から採取し得る。マーカーは、Ｈ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰであり、Ｈ−ＦＡＢＰについて特異的な抗体を用いて、そして抗原（Ｈ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰ）／抗体相互作用の程度を測定し、好ましくはイムノアッセイにより、測定される。ヒト患者の診断について、抗体は、好ましくは、抗ヒトＨ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰである。同様に、患者が動物である場合、抗体は、同じ動物種のＨ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰに対するものであるべきである。例えば、患者がウマである場合は、抗ウマＨ−ＦＡＢＰまたは抗ウマＢ−ＦＡＢＰである。それが、モノクローナル抗体または操作された抗体であり得る。都合の良いことには、マウスの抗ヒト、抗ウマなどのモノクローナル抗体が使用される。Ｈ−ＦＡＢＰに対する抗体は公知であり、例えば、６６Ｅ２および６７Ｄ３（Ｒｏｏｓら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｔｙｐｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９５年；１８３ １４９−１５３によって記載される）は、商業的に入手可能である。また、通常のＫｏｅｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ法を使用して、Ｈ−ＦＡＢＰ抗体またはＢ−ＦＡＢＰ抗体を惹起し得る。この目的のためのタンパク質の供給源は、天然由来、または組換えＤＮＡ調製タンパク質（ＤＮＡ−ｐｒｅｐａｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）であり得る。組換えヒトＨ−ＦＡＢＰおよびＢ−ＦＡＢＰは、Ａ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ（前出）およびＦ．Ｓｉｍｉｚｕら（「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｂ−ＦＡＢＰ）」、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９９７；１３５４：２４−２８）により、それぞれ記載されている。より好ましくはないが、この抗体はポリクローナルであり得る。
【００１２】
任意の公知なイムノアッセイの方法を使用し得る。サンドイッチアッセイが、好ましい。この方法にて、ＦＡＢＰに対する抗体（例えば、ポリクローナル）は、固相、例えば、プラスチックマイクロタイタープレートのウェルに結合し、そして検出されるべきサンプルとともにインキュベートされ、そしてＨ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰに特異的な、標識化した第二の抗体とともにインキュベートされる。あるいは、抗体捕捉アッセイ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃａｐｔｕｒｅ ａｓｓａｙ）（また、「間接アッセイ」とも呼ばれる）が、使用され得る。ここで、試験サンプルは固相に結合することを可能にされ、そして抗ＦＡＢＰ抗体（ポリクローナルまたモノクローナル）が、ついで加えられ、結合が可能にされる。この状況でポリクローナル抗体が使用された場合、それは、望ましくは、ＦＡＢＰの他の形態に対して、低い交差反応性を提示する抗体であるべきである。結合していない物質を洗浄した後、固相に結合している抗体の量は、標識された第二の抗体を用いて、決定される。
【００１３】
直接アッセイは、標識された抗ＦＡＢＰ抗体を使用することにより、実施され得る。試験サンプルは、固相に結合することを可能にされ、そして抗ＦＡＢＰ抗体が加えられる。結合していない物質を洗浄した後、固相に結合している抗体の量が、決定される。抗体は、第二の抗体を介するのでなく、直接的に標識化され得る。
【００１４】
別の実施形態において、競合アッセイは、サンプルと、標識化されたＦＡＢＰまたはそれらに由来するペプチドとの間で、実施され得、これら２つの抗原は固体支持体に結合している抗ＦＡＢＰ抗体の限定された量に対して、競合関係にある。標識されたＦＡＢＰまたはペプチドは、固相上の抗体とともにプレインキュベートされ、これにより、サンプル中のＦＡＢＰは、抗体に結合しているＦＡＢＰまたはそれらのペプチドの部分を置換える。
【００１５】
さらに別の実施形態としては、２つの抗原は、抗体との単一の共インキュベーション（ｃｏ−ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）の中で競合することが可能である。結合していない抗原を、洗浄により、支持体から取り除いた後、支持体に結合している標識の量が決定され、そしてサンプル中のタンパク質の量が、事前に定めておいた標準滴定曲線を参照することにより、決定される。
【００１６】
全体を通じて、この標識は、好ましくは、酵素である。この酵素に対する基質は、発色性、蛍光性、また化学発光性であり得る。あるいは、この標識は、放射性同位体または蛍光を発するものであり得、例えば、結合されたフルオレセインである。
【００１７】
酵素は、好ましくはアルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼであり、そして都合の良いことには、酵素は比色分析的に使用され得、例えば、アルカリホスファターゼとともに、黄色形成基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸塩を用いる。
【００１８】
化学発光アッセイについては、この抗体は、アクリジニウムエステルまたは西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて標識され得る。後者は、増強化学発光（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）（ＥＣＬ）アッセイとして使用される。ここで、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗体は、ルミノール、過酸化物基質および、放出する光の強度および持続を増強する化合物（代表的には、４−ヨードフェノールまたはオキシ桂皮酸）とともに化学発光反応に加わる。
【００１９】
増幅されたイムノアッセイ、例えばイムノ−ＰＣＲ（ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ）を使用し得る。この技術において、抗体はＰＣＲプライマーを含む任意のＤＮＡの分子に共有結合的に結合され、ここで抗体が結合するＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応により、増幅される。Ｅ．Ｒ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９５；２３、５２２−５２９（１９９５）またはＴ．Ｓａｎｏら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」編、Ｒｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ．（１９９５）、頁４５８−４６０を参照のこと。このシグナルは前と同様に読み取られる。
【００２０】
特に好ましい手順は、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）が開発されて、Ｈ−ＦＡＢＰが検出できるようになった。Ｈ−ＦＡＢＰがＡＭＩについても同様にマーカーであるので、トロポニン−ＩまたはＣＫ−ＭＢの濃度を、いずれの心臓に対する損傷も排除するために、アッセイした。実施例に記述されたように、これらのアッセイは、ＡＭＩおよび脳卒中に罹患してない２２人の患者、ＡＭＩに罹患した２０人の患者および脳卒中に罹患していることが確認された２２人の患者から、医療センターに入院した後の４回にわたって、連続的な血漿サンプルの中で評価された。脳卒中における、Ｈ−ＦＡＢＰについての感度、特異性および予測的な陽性値は、それぞれ、５９．１％、９０．０％、および８６．７％であった。２２の脳卒中患者のうち一人だけが、Ｈ−ＦＡＢＰおよびトロポニン−Ｉの発現を上昇させた。従って、トロポニン−ＩアッセイまたはＣＫ−ＭＢアッセイを組み合わせた、Ｈ−ＦＡＢＰ検出は、脳卒中診断または脳損傷の有用なマーカーを提供する。
【００２１】
高速微粒子増強濁度分析イムノアッセイ（ｒａｐｉｄ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）はＡＭＩの場合においてＨ−ＦＡＢＰ用に開発されたのだが（Ｍ．Ｒｏｂｅｒｔら「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｒａｐｉｄ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｌａｓｍａ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、ａｎ ｅａｒｌｙ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９８；４４：１５６４−１５６７）、この使用は、劇的にアッセイの時間を減少させた。したがって、広範に使用されている臨床化学分析装置（例えば、Ｍ．Ｒｏｂｅｒｓら（前出）に記載されているような、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ製のＣＯＢＡＳＴＭ ＭＩＲＡ Ｐｌｕｓ システム、または、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のＡｘＳＹＭＴＭシステム）における全自動化は、可能であり、そして脳卒中の日常的な臨床診断に適応されるはずである。
【００２２】
Ｈ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰの濃度は、イムノアッセイの他の手段により測定され得る。例えば、このサンプルは２Ｄ−ゲル電気泳動を受け得、そしてこのＦＡＢＰの量は、ゲルのデンシトメトリースキャニングまたはそれからのブロットにより見積もられ得る。しかしながら、患者が迅速に処置されように高速で、アッセイを実行されることが所望される。
【００２３】
以下の実施例は本発明を明示する。
【００２４】
（実施例）
（材料および方法）
（患者）
研究群は、２２名の年齢と性別を適合させたコントロール患者（コントロール群）、２０名の確認されたＡＭＩ患者（ＡＭＩ群）および２２名の確認された脳卒中患者（脳卒中群）からなる。コントロール群は、１４人の男性、平均年齢６６歳、３４〜８６歳の範囲および８人の女性、平均年齢６３歳、５１〜８１歳の範囲を含んだ。ＡＭＩ群は、１６人の男性、平均年齢６５歳、２９〜９０歳の範囲および４人の女性、平均年齢７２歳、６６〜８１歳の範囲を含んだ。脳卒中群は、１４人の男性、平均年齢６５歳、３０〜８７歳の範囲および８人の女性、平均年齢６４歳、５１〜８５歳の範囲を含んだ。４つの血液サンプルを、入院後、脳卒中群の各患者から集めた（ｔ０＝０時間；ｔ１＝１日；ｔ３＝３日；ｔ７＝７日）。血液サンプルを、乾燥ヘパリン含有チューブに採血した。４℃、１５００ｇで、１５分間の遠心分離後、血漿サンプルを、分析まで、−２０℃でアリコートとして保存した。脳卒中の診断を確証するために、脳卒中群からの患者は、神経内科医によって連続して臨床評価を受けた。ＡＭＩ群からの患者は、慢性ＡＭＩ（ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ＡＭＩ）（トロポニン−Ｉ濃度＞２ｎｇ／ｍｌ）で病院に入院した。臨床評価は、脳卒中およびＡＭＩを除くために、コントロール群からのすべての患者において実行した。
【００２５】
（脳および心臓Ｈ−ＦＡＢＰの測定）
Ｈ−ＦＡＢＰの濃度を、血漿において、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。９６ウェル ポリスチレンマイクロプレート（ＮＵＮＣ）に、４℃、一晩、０．１Ｍ、ｐＨ９．６ 炭酸緩衝液中２０．４ｎｇ／ｍｌのポリクローナル ヤギ 抗ヒト筋肉−ＦＡＢＰ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ＢＣ、Ｏｎｔａｒｉｏ，ＵＳＡ）を１００μｌ／ウェルでコートした。このプレートを、自動的に、ＢｉｏＲａｄ ＮＯＶＡＰＡＴＨＴＭｗａｓｈｅｒにおいて、ＰＢＳ（１５ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４−１２０ｍＭ ＮａＣｌ−２．７ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ７．４，Ｓｉｇｍａ）で洗浄した。すべての洗浄工程を、新しいＰＢＳで行った。非特異的結合部位を、２００μｌ／ウェルで、炭酸緩衝液中２％カゼインで、３７℃、２時間ブロッキングした。洗浄工程の後、サンプルを、１００μｌ／ウで２連にピペットで移した。このプレートを、３７℃で２時間インキュベートした。洗浄工程の後、振盪しながら室温（Ｒ．Ｔ．）で、１００μｌ／ウェルの、ＰＢＳ―１％ＢＳＡ中０．３ｎｇ／ｍｌのマウス 抗ヒト心臓ＦＡＢＰ（ｃｌｏｎｅ ６６Ｅ２，ＨｙＣｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＢＶ，Ｕｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、１時間インキュベートした。洗浄工程の後、ＰＢＳ中１５ｎｇ／ｍｌのホスファターゼ標識化抗マウス免疫グロブリン（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）１００μｌ／ウェルを、室温で、振盪しながら１時間３０分間インキュベートした。洗浄工程の後、５０μｌ／ウェルのジエタノールアミン中ホスファターゼ基質、１．５ｍｇ／ｍｌのパラ−ニトロフェニルリン酸を、３０分間インキュベートした。この反応を、１００μｌ／ウェル １Ｍ ＮａＯＨで止めた。発色を、４０５ｎｍの波長で、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。
【００２６】
（ＣＫ−ＭＢ測定およびトロポニン−Ｉ測定）
ＡＭＩを、臨床評価およびトロポニン−Ｉ測定ならびにＣＫ−ＭＢ測定によって診断した。サンプルを、１５００ｇで１５分間遠心分離し、そして−２０℃で保存した。血清ＣＫ−ＭＢ濃度および血清トロポニン−Ｉ濃度を、自動化化学分析機 ＡｘＳＹＭＴＭ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いた蛍光微小粒子酵素免疫アッセイ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（ＭＥＩＡ）を使用して決定した。蛍光産生物の形成比は、サンプル中のトロポニン−Ｉの量に比例した。トロポニン−Ｉの検出限界は、０．３μｇ／ｌであった。ＣＫ−ＭＢ測定は、蛍光プローブの量に比例し、検出限界は、０．７μｇ／ｌであった。
【００２７】
（統計的解析）
Ｈ−ＦＡＢＰ濃度を、平均±ＳＤとしてかまたはメジアンおよび四分位数間範囲としてかのいずれかとして、光学的濃度（ＯＤ）値で表現する。トロポニン−Ｉ濃度およびＣＫ−ＭＢ濃度を、濃度単位（ｎｇ／ｍｌ）で表現する。非母数マン−ホイットニーＵ検定（ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ−ｔｅｓｔ）を、使用して、群間の血漿Ｈ−ＦＡＢＰ濃度、血清トロポニン−Ｉ濃度および血漿ＣＫ−ＭＢ濃度を比較した。ＰＲＩＳＭＴＭソフトウェアを使用して、ボックス／ホイスカー（ｂｏｘ／ｗｈｉｓｋｅｒ）および散乱プロットを作成した。９５％の信頼区間およびＲｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）曲線（Ａｎａｌｙｓｅ−ｉｔＴＭ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥＸＣＥＬＴＭにより規定される）を、使用して、指標の差別的時点（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒｙ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔ）を評価した。Ｊ．Ｍ．Ｍｕｒｐｈｙら、「Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｓｔｓ」、Ａｒｃｈ．Ｇｅｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １９８７；４４：５５０−５５５を参照のこと。
【００２８】
単変量Ｚ検定（ｕｎｉｖａｒｉａｔｅ Ｚ−ｔｅｓｔ）を使用して、Ｈ−ＦＡＢＰのＲＯＣ曲線下の面積と比較した。各時点での感度、特異性およびＨ−ＦＡＢＰ濃度の推定陽性値における差異を評価した。Ｐ＜０．０５を、統計学的有意と見なした。
【００２９】
（結果）
（臨床的特徴）
脳卒中群の患者に、完全な臨床評価を与えた。虚血および出血を、コンピューター断層撮影（ＣＴ）走査ならびに大脳のＩＲＭ応答およびそれらの局在（データは示していない）の助けを借りて診断した。脳卒中の診断を、脳卒中群の各患者について確認した。傷害の型および局在は、Ｈ−ＦＡＢＰ濃度（データは示していない）と相関しなかった。
【００３０】
コントロール群の患者を、病院に入院させ、そして、脳卒中およびＡＭＩを臨床評価によって除外した。
【００３１】
ＡＭＩ群の患者を、高トロポニン−Ｉレベル（＞２ｎｇ／ｍｌ）を有する慢性ＡＭＩで、病院に入院させた。
【００３２】
アッセイの結果は、下の表１に示す。
【００３３】
【表１】
0004751555.tif 000002
ＡＭＩ群におけるＨ−ＦＡＢＰ血漿濃度（ＯＤ測定）は、コントロール群（表１）におけるＨ−ＦＡＢＰ血漿濃度（ＯＤ測定）より有意に高かった。ＡＭＩ群は、２．６５（２．２７〜２．８６）のＨ−ＦＡＢＰメジアン濃度（範囲２５〜７５％）を有し、一方で、コントロール群は、０．１９（０．１４〜０．３５）の濃度を有した。脳の急性的な現象が増大した後、Ｈ−ＦＡＢＰ濃度は、時間とともに低下する。脳卒中群におけるＨ−ＦＡＢＰメジアン濃度（範囲２５〜７５％）は、ｔ０（０．２８〜１．０１）では０．６４、ｔ１（０．２５〜０．９８）では０．４６、ｔ３（０．２０〜０．７６）では０．３７およびｔ７（０．１８〜０．７３）では０．３３であった。いくつかの重複が、偽陰性の存在により脳卒中群とコントロール群との四分位数間範囲の間に存在する。Ｈ−ＦＡＢＰ濃度分布は、図の散乱プロットによって視覚化された。Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ曲線プロットを、異なる時間（すなわち、患者の入院時および入院後１日目、３日目および７日目において）における特異性に対する感度から作成した。ＲＯＣ曲線を用いて、感度および特異性の最適化し、そしてＨ−ＦＡＢＰ濃度を示す、光学濃度の単位における適切なカットオフ値を選択することにより感度および特異性の合計を最大化し、このプロットは、患者のこの群に対する最高の感度および特異性が、ＯＤ０．５３のカットオフ値で、患者の入院時に得られたことを示した。これらの条件下で、Ｈ−ＦＡＢＰ濃度の感度、特異性および推定陽性値は、それぞれ、５９．１％、９０．９％および８６．７％であった。入院時におけるＲＯＣ曲線と入院時以後の時間において作成されたＲＯＣ曲線との間の比較は、入院時に得られた感度値および特異性値を越える感度および特異性値の増大を全く示さなかった。
【００３４】
ＡＭＩ群とコントロール群と間のＨ−ＦＡＢＰ濃度における差異を確認するために、ＣＫ−ＭＢおよびトロポニン−Ｉをアッセイした。さらに、ＡＭＩと脳卒中を区別するために、これらをまた、脳卒中サンプルにおいてアッセイした。トロポニン−Ｉ濃度およびＣＫ−ＭＢ濃度を、各群において測定した。ＡＭＩ群におけるトロポニン−Ｉ濃度およびＣＫ−ＭＢ濃度は、コントロール群より有意に（Ｐ＞０．０１）高かった。コントロール群と脳卒中群との間で、これら指標の濃度の有意差は、見られなかった。アボット（ＡＢＢＯＴＴ）研究所は、ＡＭＩ診断に対するＡｘＳＹＭＴＭトロポニン−ＩアッセイおよびＡｘＳＹＭＴＭＣＫ−ＭＢアッセイを使用した予想値を、それぞれ、カットオフ値２ｎｇ／ｍｌおよびカットオフ値９．３ｎｇ／ｍｌと決めることを示した。コントロール群に対して予想されるＣＫ−ＭＢ値は、３．８ｎｇ／ｍｌまでである。トロポニン−Ｉ濃度＞２ｎｇ／ｍｌで、ＭＥＩＡトロポニン−Ｉアッセイの感度および特異性は、ｔ１で、それぞれ、９３．３％および９４．４％であった。血漿におけるメジアントロポニン−Ｉ濃度およびメジアンＣＫ−ＭＢ濃度（２５％〜７５％）を、計算し、そして表１に示す。
【００３５】
【表２】
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コントロール群において、２名の偽陰性を、検出した。Ｈ−ＦＡＢＰを、ｔ０で増加した（表２）。偽陰性のうちの１名は、健康的と心筋の苦痛（３．８ｎｇ／ｍｌ）との間の境界におけるトロポニン−Ｉ濃度およびＣＫ−ＭＢ濃度を有し、このことは、この人は、心筋欠損ＡＭＩ（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｌａｃｋｉｎｇ）を被っているはずであることを示す）。確かに、偽陰性のうちの１つは、癲癇を有し、両方ともに幾つかの骨折を被った。脳卒中群において、１３名の真陽性を検出した（１０名は虚血を有し、そして３名は出血を有した）。高Ｈ−ＦＡＢＰ濃度を測定し、そして脳卒中の診断を確認した。健康的なトロポニン−Ｉ濃度およびＣＫ−ＭＢ濃度を測定し、そして１名の患者を除いて、ＡＭＩ診断の除外を可能にした。この例外に関して、臨床評価は、心筋の苦痛を検出せず、そしてＡＭＩに対するトロポニン−Ｉ濃度と関連しなかった。測定されたＨ−ＦＡＢＰは、脳の苦痛と心筋の苦痛との間の区別を可能にしなかった。脳卒中群において、９名の偽陰性を、低Ｈ−ＦＡＢＰレベルで、検出した（６名は虚血を有し、そして３名は出血を有した）。これらの症例については、説明がつかなかった。低Ｈ−ＦＡＢＰ濃度と臨床評価との間の相関性は、見つけられなかった。
【００３６】
（考察）
上記の結果は、Ｈ−ＦＡＢＰが、脳卒中の診断のための潜在的なマーカーであることを示す。Ｈ−ＦＡＢＰが、数年前、急性心筋梗塞のマーカーとして存在していたので、脳卒中およびＡＭＩは、例えばトロポニン−ＩまたはＣＫ−ＭＢといった別のＡＭＩの生化学的なマーカーによって区別されるべきであった。脳卒中患者に対するＡＭＩの区別後、血清Ｈ−ＦＡＢＰ濃度は、脳卒中の特異的なマーカーとして使用され得た。
【００３７】
入院で、Ｈ−ＦＡＢＰアッセイにより、それぞれ、５９．１％、９０．９％および８６．７％の感度、特異性および推定陽性値（ＯＤ測定＞０．５３１）が可能になった。これらの値は、脳卒中の検出のためのＳ１００Ｂタンパク質の値より有意に高かった。脳卒中のためのＳ１００Ｂアッセイの感度および特異性は、それぞれ、４４％および６７％であった。Ｓ１００Ｂ分析の利点は、３時間未満の素早いイムノアッセイの開発であった。しかし、Ｓ１００Ｂの特異性は、脳卒中に限られず、黒色腫の転移、頭部傷害からの大脳の合併症および心臓の外科手術をも含んだ。血流におけるＨ−ＦＡＢＰの速度論を、慢性脳卒中の各患者に対する入院後の臨床的なスクリーニングの４つの異なる時点で（ｔ０（０時間）、ｔ１（１日）、ｔ３（３日）およびｔ７（７日））のＨ−ＦＡＢＰの測定によって研究した。最大Ｈ−ＦＡＢＰ濃度は、主にｔ０で観察された。Ｈ−ＦＡＢＰ濃度は、ｔ１で高いままであったので、脳での発症と入院との間の変動時間は、結果に干渉しなかった。ＲＯＣ曲線面積は、ｔ３およびｔ７と比較して、ｔ０およびｔ１において、より高いＨ−ＦＡＢＰ濃度と確認された。このアッセイの最もよい特徴（感度、特異性）は、ｔ０において得られた。
【００３８】
急性心筋梗塞を、例えば、心臓のトロポニン−Ｉ、クレアチン−キナーゼＭＢ、ミオグロブリンおよび最近では、Ｈ−ＦＡＢＰアッセイといった生化学的マーカーアッセイの助けを借りて診断する。Ｈ−ＦＡＢＰ濃度は、ＡＭＩを示したので、ＡＭＩと脳卒中との間の区別は、別のＡＭＩマーカーの使用によって行った。
【００３９】
トロポニン−Ｉは、ＡＭＩまたは虚血傷害の初期マーカーである（ＡＭＩ後、数日間、上昇したままという利点を有する）。遊離されたトロポニン−Ｉの濃度は、入院後、１２〜２４時間で最大に達するので、脳卒中群を、ｔ０およびｔ１で分析した。ＡＭＩ群におけるトロポニン−Ｉ濃度は、２ｎｇ／ｍｌのカットオフ値より有意に高かった。大部分の脳卒中群の患者は、カットオフ値より下の正常トロポニン−Ｉ濃度を示した。これは、１名の患者を除いて、この研究のＡＭＩ患者を除外した。彼の臨床評価は、全く心筋の苦痛を診断せず、そしてこれは、彼のトロポニン−Ｉ濃度と相関しなかった。この１症例において、Ｈ−ＦＡＢＰ測定は、脳の苦痛と心筋の苦痛との間の区別を可能にしなかった。
【００４０】
並行して、血漿におけるクレニチンキナーゼＭＢの濃度を、各患者について測定した。このマーカーにより、任意の筋肉の苦痛の型が検出されるので、トロポニン−Ｉよりあまり特異的ではない。兆候の発症後、２時間と６時間との間に始まる場合、ＣＫ−ＭＢは、血流に遊離され、そして血中でのＣＫ−ＭＢの濃度は、兆候の発症後、１８時間までに上昇する。徴候の発生後、約２日間まで、高い濃度のままであり、その後正常にまで低下する。
【００４１】
コントロール群において、２名の偽陰性を検出した。偽陰性のうち１名は、脳卒中に干渉しない癲癇を有した。両方ともに、床への倒れこみそして大腿および足を骨折した。増加したＣＫ−ＭＢは、Ｈ−ＦＡＢＰの増加と非常に相関した。癲癇は、Ｈ−ＦＡＢＰレベルの上昇で説明し得た。Ｈ−ＦＡＢＰは、ＣＫ−ＭＢアッセイと９８．６％の相関を可能にした。トロポニン−Ｉは、これら偽陰性の検出が可能でなかったので、トロポニン−Ｉ測定およびＨ−ＦＡＢＰ測定は、９５．３％の相関を与えた。
【００４２】
上記に引用された各刊行物は、本明細書中に対して信頼される範囲まで、参考として本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１が、唯一の図あり、４０５ｎｍの光学密度測定で示したＨＦＢＰ濃度をｙ軸としてグラフ表示しており、これは本発明の方法によって以下について、入院後４回（０時間、１日、３日、７日）、決定された：（ａ）脳卒中もＡＭＩにも罹患してないコントロール群、（ｂ）ＡＭＩに罹患している群、および（ｃ）脳卒中の群。
【図１】
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