(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
１．ヒト歯基質に対する脱灰処理を行うことによって歯基質の顆粒剤または凍結乾燥粉末を得る；
２．その後、外因性活性タンパク質ＢＭＰと前記歯基質の顆粒剤または前記凍結乾燥粉末とを、それぞれｐＨ＝７．２のリン酸塩緩衝液で溶解させ、その後両者を混合し、ミキサーに入れて等速でゆっくりと撹拌を行い、前記撹拌の速度を２０〜１２０ｒｐｍとし、前記撹拌と同時に温度が変動する水浴バスに置き、前記水浴バスの温度の変動順次は、２６℃下で８時間、３０℃下で６時間、２８℃下で８時間、２８℃下で１２時間とし、その後、定温３０℃下で引き続き撹拌を行う、
を含む、骨誘導骨形成製剤の調製方法。
【請求項２】
前記撹拌の際に、３時間ごとに１回混合溶液中の外因性活性タンパク質ＢＭＰの濃度を測定し、濃度が初期ＢＭＰ濃度の２０％〜２５％以下になる時点で撹拌を中止する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記撹拌を中止した後、遠心分離によって上清液を除去し、残りの粉末をろ過し、低温で乾燥することによって、骨誘導骨形成製剤を得る、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記外因性活性タンパク質ＢＭＰは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７中の一種または数種である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記外因性活性タンパク質ＢＭＰは、ＢＭＰ−２である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記脱灰処理は、以下の方法で行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（１）機械的な方法で骨格組織を顆粒剤または凍結乾燥粉末になるように粉砕する；
（２）得られた骨格組織顆粒剤または凍結乾燥粉末を０．６５〜０．７２当量の塩酸液に浸し、３６℃下で２４〜４８時間浸して脱灰処理を完了させる；
（３）脱灰済みの製品を低温で乾燥させて凍結乾燥粉末を得る。さらに、３５℃下で、過酸化水素水に３０分間浸して、脱灰基質を得るか、または前記基質を５℃の条件下でアルコール液中に貯蔵して使用に備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は骨損傷を修復する製剤に関するものであり、特に骨生成を誘導し、骨組織の形成を促進するまたは骨損傷を修復する製剤、およびその調製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨誘導骨形成技術は、現在外科復元と歯周再建に良く使われる技術であり、主に骨誘導因子を利用して、骨増殖と成長機能をアクティブ化して新しい骨を形成することである。骨誘導因子はかなり多く、現在その研究は主に骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ。ＢＭＰ）ファミリーのタンパク質の研究に集中されており、骨形成タンパク質は低分子の糖タンパク質類であり、すでに１〜１４種のタンパク質成分が発見されている。その中、骨形成タンパク質２の骨誘導活性が最も強く、その他の骨形成タンパク質は骨形成タンパク質２に対する協力役割があって、共同に骨形成誘導のプロセスに参与する。ある学者は、骨形成タンパク質が形質転換成長因子１３（ＴＧＦ−１３）スーパーファミリーの一種であり、著しい骨再生と骨整合能力を有し、軟骨と骨の形成を誘導することができ、血管周辺の間葉系細胞を骨幹細胞に転化させることができ、骨幹細胞と細胞外基質高分子との相互作用によって形成される骨形成タンパク質は骨形成役割を調節する基礎となると考えている。骨形成タンパク質は、哺乳動物の骨基質および歯基質中に広く存在しており、種特異性がない局所成長因子に属する酸性糖タンパク質である。骨中の骨形成タンパク質は年齢が増えるにつれ段々減って来るに対し、歯基質中の骨形成タンパク質は減らない。また、研究によれば、脱灰歯基質（ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｄｅｎｔａｌ  ｍａｔｒｉｘ，ＤＤＭ）中の骨形成タンパク質の粗抽出物は、同質量脱灰骨基質（ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｔｒｉｘ，ＤＢＭ）中の１０倍であり、言い換えると、脱灰歯基質の筋肉中における骨形成誘導量は同質量脱灰骨基質の１０倍もあると言うことである。ところが、単なる骨形成タンパク質の場合は、体内での拡散が速過ぎで、プロティナーゼに分解され易いため、有効な時間内により多くの標的細胞に作用することができず、その誘導活性を十分発揮することができない。そして、骨形成タンパク質の純化・製作はなかなか難しく、原価も高いので、臨床上の広い普及利用が難しい。研究によれば、純化程度の高い骨形成タンパク質であっても高い生物誘導活性を得ることができず、対応する骨基質と一緒に使用する場合のみ、効果的に骨形成を誘導することができる。なぜならば、コラーゲンと基質がヒドロキシアパタイト結晶中のカルシウムとリン酸塩基イオンに影響を与え、有機物も結晶化のコア役割をしたかも知れないからである。骨形成タンパク質のキャリアに関する研究には、ヒドロキシアパタイトやリン酸三カルシウム、ポリエステル、コラーゲン、脱灰骨基質、酸化チタン、血餅などのキャリアに関する多くの報道があるものの、骨形成タンパク質とキャリアとの間の結合方式や、複合方法、複合比率については、まだ統一的な結論はない。そのため、現在の研究方向は複合性骨誘導材料の研究製作に転化されている。
【０００３】
また、研究によれば、脱灰歯基質（ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｄｅｎｔｉｎ  ｍａｔｒｉｘ，ＤＤＭ）は、骨形成タンパク質やコラーゲンおよびその他のプロテオグリカンを多く含有する複合物で、新型の骨誘導作用のあるヒト同源性生物活性材料で、多くの骨誘導タンパク質およびそのキャリアの複合物を含有しており、骨形成タンパク質の天然の徐放システムを形成していると認めている。例えば、中国発明特許９５１１２４１６．１、または中国発明特許出願番号２０１３１０６０２８３０．７、出願番号２０１３１０６０２８７８．８中には歯の処理によって骨の傷口の癒合または再生を促進できる材料を得ることを紹介している。また、歯基質中にある成分を加えることによって、歯基質効果を改善することも出願番号２０１５１００８９３９１．３と出願番号２０１１１０１２９４５７．９中に記載されている。
【０００４】
勿論、ＢＭＰタンパク質を体外で発現した後、骨格粉末またはその他の粉末と混合して使用する方法もあるが、かような方法で調製された修復材料は、実際効果はあまり良くない。その主な原因は、ＢＭＰタンパク質は体外で活性を失い易く、これらの粉末と混合した後、損傷を受けた骨格の中に加えられても、酵素によって分解され易いので、やはり活性を失ってしまうからである。そのため、体内でＢＭＰの活性を維持する場合のみ、骨組織の成長をより良く促すことができる。
【０００５】
上記方法は、骨格損傷の修復に一定の効果があるが、依然として多くの固有欠陥が存在しており、主に以下幾つかの欠点がある：（１）歯は、活性ＢＭＰの本源として限りがあり、益々増えつつある市場のニーズを満たすことができず、歯基質だけを原料とすると、業界の発展に限りがある。（２）歯、骨格を粉砕処理してから、通常酸性溶液の中で脱灰処理を行って、活性タンパク質ＢＭＰを含有する粉末が得られるが、酸・アルカリなどの処理によってカルシウムイオンが放出され、ＢＭＰタンパク質が露出されると同時に、ＢＭＰタンパク質に対する損傷も大きい。なぜならば、ＢＭＰは酸性条件下で変性されて活性を失ってしまい、これによってＢＭＰタンパク質の利用率が低くなるからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】中国特許第９５１１２４１６．１号明細書
【特許文献２】中国特許出願公告第２０１３１０６０２８３０．７号明細書
【特許文献３】中国特許出願公告第２０１３１０６０２８７８．８号明細書
【特許文献４】中国特許出願公告第２０１５１００８９３９１．３号明細書
【特許文献５】中国特許出願公告第２０１１１０１２９４５７．９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そのため、現在の方法を改善するか、または新しい方法を使って骨修復材料を得る必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、骨誘骨形成製剤を調製する方法を提供する。本発明の当該方法は、以下ステップを含む：１．歯基質に対する脱灰処理を行う；２．その後、脱灰処理済みの歯基質の中に外因性活性タンパク質ＢＭＰ、すなわち骨形成タンパク質を添加し、骨形成誘導製剤を形成する。
【０００９】
また、本発明は、骨誘導骨形成製剤の他の調製方法も提供する。本発明の当該方法は、以下ステップを含む：１．２部の歯基質に対する脱灰処理を行う；２．その後、脱灰処理済みの２部の歯基質に対して、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の除去（抽出）処理を行う；３．最後に、抽出済みのＢＭＰと、前記脱灰処理済みの歯基質の１部と、を混合させることによって、骨形成誘導製剤を形成する。
【００１０】
また、本発明は骨誘導骨形成製剤の他の調製方法も提供する。本発明の当該方法は、以下ステップを含む：１．外因性の骨基質に対する脱灰処理を行う；２．その後、脱灰処理済みの骨基質に対するタンパク質除去処理を行う；３．外因性骨形成タンパク質（ＢＭＰ）と、前記ステップ２で処理済みの骨基質と、を混合させることによって、骨形成誘導製剤を形成させる。
【００１１】
好ましい実施形態において、ヒト歯（ヒトから得た歯）に対する脱灰処理の方法は、以下ステップを含む：（１）機械的な方法で歯組織を顆粒剤または凍結乾燥粉末になるように粉砕する；（２）得られた歯組織顆粒剤または凍結乾燥粉末を０．６５〜０．７２当量の塩酸液に浸し、３６℃下で１２時間浸して脱灰処理を完了させる；（３）脱灰済みの製品を低温で乾燥させて、凍結乾燥粉末を得る。
【００１２】
好ましくは、凍結乾燥粉末を３５℃で３％過酸化水素水の中で３０分間浸すことによって脱灰処理済みのヒト歯基質を得る。
【００１３】
好ましくは、前記ヒト歯基質凍結乾燥粉末または顆粒を５℃の条件下で７０％アルコール液中に貯蔵して使用に備える。
【００１４】
好ましくは、脱灰済みの製品であるヒト歯基質顆粒をアルコール液中に貯蔵して使用に備える。この際、アルコール液の濃度は特に限定されず、任意の濃度であることができ、例えば、７０％、６０％、５０％、７５％、７８％、８０％、８５％または９５％である。なお、本明細書において、アルコール液の濃度とは、水中におけるアルコールの濃度である。
【００１５】
好ましい形態において、まず、原料歯を、５０％の消毒液（例えば有効成分１．２％を含有する次亜塩素酸ナトリウム）で、浸漬・消毒し、この際、浸漬・消毒の時間は好ましくは４５分間とする。前記浸漬・消毒の温度は、好ましくは３６℃とする。より好ましくは、機械的な方法で歯上の使用価値のない部分を除去し、１．２％次亜塩素酸ナトリウムで浸漬・消毒してから顆粒剤または凍結乾燥粉末に粉砕された歯組織を粉砕すし、この際、浸漬・消毒の時間は、好ましくは４５分間である。浸漬・消毒の温度は、好ましくは３６℃である。その後、歯に対する粉砕処理を行う。
【００１６】
本発明に用いられる歯は、ヒトの歯であってもよく、またはいずれかの哺乳動物の歯であってもよい。好ましくはヒトの歯を使用する。
【００１７】
ある好ましい形態において、脱灰済処理済みの歯基質に外因性ＢＭＰタンパク質（「外因性活性タンパク質ＢＭＰ」とも称し、または単に「外因性ＢＭＰ」とも称する）を添加するが、当該外因性ＢＭＰの添加方法は、以下のとおりである。まず、脱灰済みの歯基質粉末をＰＨ＝６．０〜７．５のリン酸塩緩衝液中（１００ｇの歯基質粉末に対して１Ｌの緩衝液を使用する）に懸濁させ、その後、外因性ＢＭＰを前記と同じＰＨ＝６．０〜７．５のリン酸塩緩衝液中（濃度は１．０Ｍ／Ｌ）に入れて、両者を混合させて、ミキサー中に入れて等速でゆっくりと撹拌を行い、前記撹拌の速度を１２〜１２０ｒｐｍとすることができ、２０〜１２０ｒｍｐとすることが好ましい。室温下で１２〜２４時間同時に撹拌する。この際、撹拌の際に３時間ごとに１回混合溶液中のＢＭＰタンパク質の濃度を測定し、濃度が初期ＢＭＰ濃度の２０％〜３５％（０．２〜０．３５Ｍ／Ｌ）以下になる時点で撹拌を中止する。その後、遠心分離によって上清液を除去し、残りの粉末をろ過し、低温で乾燥することによって、ヒト歯基質が得られるが、５℃条件下で７０％のアルコール液中に貯蔵して使用に備える。
【００１８】
ある好ましい形態において、２部のヒト歯基質に対する脱灰処理を行い、その後、脱灰処理済みの基質に対するタンパク質（ＢＭＰ活性タンパク質またはその他の雑タンパク質）抽出を行い、その後、抽出されたＢＭＰタンパク質と、１部のヒト歯基質と、を混合処理させる。当該処理方法としては、まず、脱灰、脱タンパク質（ＢＭＰ活性タンパク質またはその他の雑タンパク質）によって抽出された歯基質粉末を、ＰＨ７．０のリン酸塩緩衝液（１２０ｇの前記歯基質粉末に対して１Ｌの緩衝液を使用する）に懸濁させ、その後、外因性ＢＭＰ（２部の基質から抽出されたＢＭＰタンパク質）をリン酸塩緩衝液（ＰＨ＝７．０）溶解させ、その後、両者（すなわち、前記リン酸塩緩衝液中に懸濁された前記歯基質の粉末と、前記リン酸塩緩衝溶液中に溶解された前記ＢＭＰと）を混合して、ミキサーに入れて等速でゆっくりと撹拌を行い、前記撹拌の速度は１５〜１２０ｒｐｍであり、好ましくは２０〜１２０ｒｐｍである。室温下で１２〜２４時間撹拌し、撹拌の際に、３時間ごとに１回混合溶液中のＢＭＰタンパク質の濃度を測定し、濃度が初期ＢＭＰ濃度の２０％〜３５％以下になる時点で撹拌を中止する。その後、遠心分離によって上清液を除去し、残りの粉末をろ過し、低温で乾燥することによって、ヒト歯基質が得られる。好ましくは、５℃条件下でアルコール液中に貯蔵して使用に備える。
【００１９】
ある好ましい形態において、新鮮な外因性骨格（ヒト骨または哺乳動物の骨）（ここでのヒト骨は、主に医者が患者の体から採った人体骨格または寄付者の新鮮な人体骨格である）に対する脱灰処理を行うことである。当該脱灰処理方法は、以下のとおりである。（１）機械的な方法で骨格組織を顆粒剤または凍結乾燥粉末になるように粉砕する；（２）得られた骨格組織顆粒剤または凍結乾燥粉末を０．６５〜０．７２当量の塩酸液に浸し、３６℃下で２４〜４８時間浸して脱灰処理を完了させる；（３）脱灰済みの製品を低温で乾燥させて凍結乾燥粉末を得る。さらに、３５℃下で、過酸化水素水に３０分間浸して、脱灰基質を得るか、または前記基質を５℃の条件下でアルコール液中に貯蔵して使用に備える。好ましくは、脱灰済みの製品はヒト歯基質顆粒であり、アルコール液中に貯蔵して使用に備える。この際、アルコールの濃度は、任意濃度のアルコール溶液であることができ、例えば、７０％、６０％、５０％、７５％、７８％、８０％、８５％または９５％のアルコール溶液である。
【００２０】
その後、脱灰済みの骨格粉末に対する脱タンパク質処理を行うことが好ましい。なお、本明細書において、「脱タンパク質」は、「タンパク質除去」または「タンパク質抽出」とも称する。当該脱タンパク質処理のプロセスは以下のとおりである。脱灰済みの骨格粉末に適当量の水を加え、水浴バスの中で３５〜４０℃温度下で５６〜７２時間加熱処理を行い、遠心後上清を除去し。前記上清液に対するＢＭＰタンパク質抽出、濃縮および雑タンパク質の除去を行う。または、当該骨格粉末をパンクレアチンまたはパパイン緩衝溶液中に入れて、３７〜４０℃下で３〜４日以上処理し、遠心後上清を除去し、酵素処理によってタンパク質を分解し、遠心後の沈殿物を留保することによって、脱タンパク質済みの骨格粉末を得る。
【００２１】
好ましくは、脱灰・脱タンパク質処理済みの骨格粉末と、外因性ＢＭＰタンパク質と、を混合処理させることである。当該処理ステップは以下のとおりである。まず脱灰後ＢＭＰタンパク質抽出済みの骨格粉末をＰＨ＝７．０のリン酸塩緩衝液（１２０ｇの前記骨格粉末に対して緩衝液を１Ｌ使用）中に懸濁させ、その後、外因性ＢＭＰをリン酸塩緩衝溶液で（１．２Ｍ／Ｌ）溶解し、両者を混合させ、ミキサーに入れて等速でゆっくりと撹拌を行い、前記撹拌の速度は３０〜８０ｒｐｍとし、室温下または２５〜３０℃下で１２〜２４時間撹拌し、撹拌の際は３時間ごとに１回混合溶液中のＢＭＰタンパク質の濃度を測定し、濃度が初期ＢＭＰ濃度の２０％〜２５％（０．２４〜０．２５Ｍ／Ｌ）以下になる時点で撹拌を中止し、その後、遠心分離によって上清液を除去し、残りの粉末をろ過し、低温で乾燥することによって、基質が得られる。好ましくては、５℃条件下で７０％のアルコール液中に貯蔵して使用に備える。
【００２２】
好ましくは、外因性活性タンパク質ＢＭＰは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７中の一種または数種であり、より好ましくはＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７（上海麦倉生物技術有限公司）であり、さらに好ましくはＢＭＰ−２である。これらの商業用ＢＭＰ活性タンパク質はいずれも市販の商品から入手できるものである。
【００２３】
本発明において、粉末または製剤はいずれも凍結乾燥粉末またはその他の形式の製剤である。本発明において、製剤は、試料、成分または物質と同じ意味である。
【００２４】
本発明によって提供される骨格組織の成長または修復を促進する製剤は通常のヒト歯基質の効果とあまり変わらず、ひいては既存のヒト歯基質よりも優れているので、一部の代替製品を提供することができ、製品の減価を低減し、益々増えつつある市場のニーズを満たすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例１〜３と対照ＣＫの骨形成細胞増殖に対する影響を比較した結果図である。
【図２】実施例１，４，５と対照ＣＫの骨形成細胞増殖に対する影響を比較した結果図である。
【図３】実施例１〜３と対照ＣＫのＭＣ−３Ｔ３細胞ＡＬＰ活性に対する影響を比較した試験結果図である。
【図４】実施例１，４，５と対照ＣＫのＭＣ−３Ｔ３細胞ＡＬＰ活性に比較した試験結果図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
実施例１  ヒト歯基質の脱灰処理および外因性ＢＭＰタンパク質の添加。
【００２７】
１．ヒト歯基質の脱灰処理工程（ステップ）：
【００２８】
（１）収集したヒト歯（原料歯）を水の入った容器の中に入れて、５℃以下の条件下で貯蔵する。
（２）１．２％の次亜塩素酸ナトリウムで原料歯を浸漬・消毒するが、時間を５５分間、温度を３０℃（またはその他の温度：３５℃、３０℃、３８℃、４０℃）とする。
（３）歯上の使用価値のない部分を除去する。
（４）機械的な方法で歯組織を顆粒剤または凍結乾燥粉末になるように粉砕する。その平均粒径は０．２５ｍｍ（なお、０．２ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、１．０ｍｍ、１．２ｍｍにしても良い）である。
（５）さらに、１．２％の次亜塩素酸ナトリウムで顆粒剤または凍結乾燥粉末に粉砕した歯組織を浸漬・消毒するが、浸漬・消毒時間を４５分間、温度を３５〜４５℃とする。
（６）歯組織顆粒剤または凍結乾燥粉末を０．６５（または０．６７、０．６８．０．７２）当量の塩酸液に浸漬するが、３８℃下で１６時間浸して脱灰を完了させる。
（７）低温にて乾燥させ、さらに、３５℃、３％の過酸化水素水で３０分間浸漬する。測定の結果、当該方法によって脱灰処理された歯基質顆粒剤または凍結乾燥粉末は細かくて、均一で、形態が一致した、丸棒状で、長さは約１００〜２００ｎｍ、直径は約５０〜１００ｎｍである。
【００２９】
２．外因性ＢＭＰタンパク質を添加。
【００３０】
ａ．前記ステップ（７）によって処理された脱灰処理済みの歯基質１０００ｇに外因性ＢＭＰタンパク質を添加するが、外因性タンパク質の添加方法は以下のとおりである。
ｂ．まずステップ（７）によって処理された脱灰済み歯基質の過酸化水素水を除去し、滅菌水で過酸化水素水がなくなるまで複数回洗い流すことによって、１００ｇのヒト歯基質粉末が得られる。
ｃ．その後、脱灰済み歯基質粉末を１ＬのＰＨ＝７．２のリン酸塩緩衝液中に懸濁させる。
ｄ．外因性ＢＭＰ−２（１．０ｇ、上海麦倉生物技術有限公司から購入）を前記リン酸塩緩衝液と同じ体積のＰＨ＝７．２のリン酸塩緩衝液で溶解させてから、両者を混合して、ミキサーに入れて等速でゆっくりと撹拌するが、撹拌速度を３０〜８０ｒｐｍとし、同時に温度が変動する水浴バスに入れるが、温度の順次は、２６℃下で８時間、３０℃下で６時間、２８℃下で８時間、２８℃下で１２時間とする。その後、定温の３０℃下で引き続撹拌し、３時間ごとに１回混合溶液中のＢＭＰ−２タンパク質の濃度を測定し、濃度が初期ＢＭＰ−２濃度の２０％〜２５％以下になる時点で撹拌を中止し、その後、遠心分離によって上清液を除去し、残りの粉末をろ過し、低温で乾燥することによって、ヒト歯基質凍結乾燥粉末が得られる。測定の結果、当該方法で脱灰処理された歯基質顆粒剤または凍結乾燥粉末は細かくて均一で、形態が一致し、丸棒状で、長さは約１００〜２２０ｎｍ、直径は約４０〜１１０ｎｍである。
【００３１】
実施例２  ヒト歯基質に対する脱灰処理を行い、外因性ＢＭＰタンパク質を添加する。
【００３２】
実施例１との相違点は、外因性タンパク質がＢＭＰ−７であることであり、その他の条件は同じである。
【００３３】
実施例３  ヒト歯基質に対する脱灰処理を行い、外因性ＢＭＰタンパク質を添加する。
【００３４】
実施例１との相違点は、同時に定温の水浴バスに入れるが、温度を１５、２０、３５、３８℃とし、時間を３４時間以上とし、３時間ごとに１回混合液中に合溶液中のＢＭＰ−２タンパク質の濃度を測定し、初期ＢＭＰ−２濃度の２０％〜２５％以下になる時点で撹拌を中止する。その後、遠心分離によって上清液を除去し、残りの粉末をろ過し、低温で乾燥することによって、ヒト歯基質が得られるが、５℃条件下で７０％のアルコール液中に貯蔵して使用に備える。測定の結果、当該方法によって脱灰処理された歯基質顆粒剤または凍結乾燥粉末は細かくて、均一で、形態が一致し、丸棒状で、長さは約１００〜２２０ｎｍ、直径は約４０〜１１０ｎｍである。
【００３５】
実施例４  ２部のヒト歯基質に対する脱灰・脱タンパク質（ＢＭＰ）処理を行い、抽出されたＢＭＰタンパク質を脱灰・脱タンパク質処理済みのヒト歯基質粉末の１部と混合させる。
【００３６】
１．ヒト歯基質の脱灰処理ステップ：
【００３７】
（１）収集したヒト歯を水の入った容器の中に入れて、５℃以下の条件下で貯蔵する。
（２）１．２％の次亜塩素酸ナトリウムで原料歯を浸漬・消毒するが、時間は５５分間、温度は３０℃（またはその他の温度、３５℃、３０℃、３８℃、４０℃）。
（３）歯上の使用価値のない部分を除去する。
（４）機械的な方法で歯組織を顆粒剤または凍結乾燥粉末に粉砕する。その平均粒径は０．２５ｍｍ（なお、０．２ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、１．０ｍｍ、１．２ｍｍにしても良い）である。
（５）さらに、１．０％の次亜塩素酸ナトリウムで顆粒剤または凍結乾燥粉末に粉砕した歯組織を浸漬・消毒するが、浸漬・消毒時間は４５分間、温度は３５〜４０℃とする。
（６）歯組織顆粒剤または凍結乾燥粉末を０．６５（または０．６７、０．６８．０．７２）当量の塩酸液に浸漬するが、３８℃下で２０時間浸して脱灰を完了させる。
（７）低温にて乾燥させ、さらに、３５℃、３％の過酸化水素水で３０分間浸漬する。
【００３８】
２．ＢＭＰタンパク質の抽出処理
【００３９】
前記ステップ（７）によってすでに脱灰処理された歯基質１０００ｇ粉末に対するタンパク質抽出処理を行うが、ＢＭＰタンパク質の抽出方法は以下のとおりである。
【００４０】
ａ．まず前記ステップ（７）によって処理された脱灰済み歯基質の過酸化水素水を除去し、滅菌水で過酸化水素水がなくなるまで複数回洗い流すことによって、１０００ｇのヒト歯基質粉末が得られる。
ｂ．その後、脱灰済み歯基質粉末１０００ｇを５ＬのＰＨ＝７．２のリン酸塩緩衝液中に懸濁させる。
ｃ．水浴バス中でステップｂのリン酸塩緩衝液を２８０時間加熱処理し、温度を４０℃とし、加熱中は絶えずに撹拌する。その後、遠心分離を行い、上清液と沈澱物を分離し、上清液に対し分子篩で目的のタンパク質を分離し、さらに純化・濃縮することによって、最終的にＢＭＰタンパク質の活性抽出物が得られるが、測定の結果、ＢＭＰ分子量は２０〜５０ｋｄａである。沈澱粉末に対するろ過、乾燥、回収を行うことによって、９８０ｇの脱灰処理済みの歯基質粉末が得られる。
ｄ．脱灰・脱タンパク質済み歯基質粉末を抽出されたＢＭＰタンパク質と混合処理をさせるが、その処理ステップは以下のとおりである。まず脱灰且つＢＭＰタンパク質抽出済み歯基質をＰＨ＝７．０のリン酸塩緩衝液中に懸濁させてから（１００ｇ／Ｌで、５Ｌの溶液を作り、合計５００ｇ）、１０００ｇのヒト歯基質から抽出されたＢＭＰタンパク質（ステップｃ）をリン酸塩緩衝液で溶解させて、両者を混合して、ミキサーに入れて等速でゆっくりと撹拌するが、撹拌速度を３０〜８０ｒｐｍとし、同時に室温または２５〜３０℃下で、１２〜２４時間撹拌するが、撹拌の際は３時間ごとに１回ＢＭＰタンパク質の濃度を測定し、濃度が初期ＢＭＰ濃度の１０％〜１５％以下になる時点で撹拌を中止し、その後、遠心分離によって上清液を除去し、残りの粉末をろ過し、低温で乾燥することによって、基質が得られるが、５℃の条件下で７０％のアルコール液中に貯蔵して使用に備える。
【００４１】
測定の結果、当該方法によって脱灰処理された歯基質顆粒剤または凍結乾燥粉末は細かくて、均一で、形態が一致し、丸棒状で、長さは約８０〜１８０ｎｍ、直径は約３０〜７０ｎｍである。
【００４２】
実施例５  外因性ヒト骨格に対する脱灰・脱タンパク質処理を行い、その後外因性ＢＭＰタンパク質を添加する。
【００４３】
１．ヒト骨の脱灰処理ステップ：
【００４４】
（１）収集したヒトヒト骨を水の入った容器の中に入れて、５℃以下の条件下で貯蔵する。
（２）２．０％の次亜塩素酸ナトリウムで原料骨格を浸漬・消毒するが、時間を５５分、温度を３７℃（またはその他の温度、３５℃、３０℃、３８℃、４０℃）とする。
（３）骨格上の使用価値のない部分を除去する。
（４）機械的な方法で骨格組織を顆粒剤または凍結乾燥粉末に粉砕する。その平均粒径は０．２５ｍｍ（なお、０．２ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、１．０ｍｍ、１．２ｍｍ、またはその他の粒径のナノメートル顆粒にしても良い、例えば５０〜１００ｎｍ、１２０〜２００ｎｍ）である。
（５）さらに、１．５％の次亜塩素酸ナトリウムで粉砕された顆粒剤を浸漬・消毒するが、浸漬・消毒時間は４５分、温度は３５〜４０℃とする。
（６）骨組織顆粒剤を０．６５（または０．６７、０．６８．０．７２）当量の塩酸液に浸漬するが、３８℃下で１６時間浸して脱灰を完了させる。
（７）低温にて乾燥させることによって、凍結乾燥粉末または顆粒剤を獲得し、さらに、３５℃、３％の過酸化水素水で３０分間浸漬する。
【００４５】
測定の結果、当該方法によって脱灰処理された骨格基質顆粒剤または凍結乾燥粉末は細かくて、均一で、形態が一致し、丸棒状で、長さは約１２０〜２４０ｎｍ、直径は約６０〜１２０ｎｍである。
【００４６】
２．ＢＭＰタンパク質に対する生分解処理を行う。
【００４７】
前記ステップ（７）によってすでに脱灰処理された骨格基質１０００ｇ粉末に対するタンパク質抽出処理を行うが、その処理方法は以下のとおりである。
【００４８】
ａ．まずステップ（７）によって処理された脱灰済み骨格基質の過酸化水素水を除去し、滅菌水で過酸化水素水がなくなるまで複数回洗い流すことによって、１０００ｇの骨格基質粉末が得られる。その後、１０００ｇの脱灰済み骨格粉末を２ＬのＰＨ＝７．２のリン酸塩緩衝液中に懸濁させる。
ｂ．酵素分解反応を理想的な効果に達成させるために、そして、生産投入原価を考慮して、試験中はパンクレアチンを使用し、酵素分解温度を４８〜５０℃に調節し、ｐＨ値を８．５に調節してからパンクレアチン０．３５ｇを入れる。酵素反応時間はいずれも１２−５６時間とし、タンパク質生分解処理を行う。処理が終わると、遠心分離によって上清液と沈澱物を分離し、上清液除去し、沈殿物を留保し、乾燥することによって、９００ｇの脱灰・脱タンパク質済み骨格粉末が得られる。
ｃ．その後、脱灰・脱タンパク質済み骨格粉末１０００ｇを５ＬのＰＨ＝７．２のリン酸塩緩衝液中に懸濁させる。
ｄ．外因性ＢＭＰ−２（１．０ｇ、上海麦倉生物技術有限公司から購入）を同じ体積のＰＨ＝７．２のリン酸塩緩衝液で溶解させてから、両者を混合して、ミキサーに入れて等速でゆっくりと撹拌するが、撹拌速度を３０〜８０ｒｐｍとし、同時に温度が変動する水浴バスに入れるが、温度の順次は、２６℃下で８時間、３０℃下で６時間、２８℃下で８時間、２８℃下で１２時間とする。その後、定温の３０℃下で引き続撹拌し、３時間ごとに１回混合溶液中のＢＭＰ−２タンパク質の濃度を測定し、濃度が初期ＢＭＰ−２濃度の５％〜６％以下になる時点で撹拌を中止し、その後、遠心分離によって上清液を除去し、残りの粉末をろ過し、低温で乾燥することによって、骨格基質が得られるが、５℃の条件下で７０％のアルコール液中に貯蔵して使用に備える。
【００４９】
測定の結果、当該方法で脱灰処理された骨格基質顆粒剤または凍結乾燥粉末は細かくて均一で、形態が一致し、丸棒状で、長さは約１２２〜２４０ｎｍ、直径は約６０〜１１０ｎｍである。
【００５０】
実施例６  骨誘導骨形成製剤の効果認証
【００５１】
１．材料と方法
１．１  試験器機
マイクロプレート（２４穴、９６穴）、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ５５０）、電動遠心機（８０−２型）、細胞培養箱（Ｈｅｒａｅｕｓ  ＢＢ６２２０型）、両方向磁力加熱ミキサー（江蘇省金壇市医療儀器工場）、酸度計（上海精密科学儀器有限公司）、定温水浴バス（江蘇省金壇市医療儀器工場）、医用超浄作業台（蘇州浄化設備工場）。
【００５２】
１．２  試験材料
本発明の実施例１〜５によって得られる材料と深セン市光明創博生物製品発展有限公司の商用歯基質との平行対照（ＣＫ）処理試験、準標準ウシ胎児血清（杭州四季青）、ＤＭＥＭ培養基（Ｓｉｍａ）、０．２５％トリプシン（Ｓｉｍａ）、Ｔｒｉｔｏｎｘ−１００（上海生工）、ＡＬＰ標準製剤キット（上海生工）。
【００５３】
２．試験方法
２．１  ＭＣ−３Ｔ３骨形成細胞を１０％ウシ胎児血清含有の培養基中で通常蘇生を行い、５０ｍｌ／Ｌの二酸化炭素、飽和湿度、３７℃の環境下で培養し、２４時間後に培養液を換え、８０％成長した後、２．５／Ｌ  のトリプシンで消化させてから、代を換えて、３−４代の細胞で試験を行う。
【００５４】
２．２  ＭＣ−３Ｔ３骨形成細胞の増殖研究
試験の前に、本発明の実施例１〜５によって得られる基質粉末と深セン市光明創博生物製品発展有限公司の商用歯基質粉末をそれぞれ０．１ｇを量り取って２４穴プレートに入れ、それぞれのサンプルを平均３穴ずつ入れて、紫外線で３０分間照射して滅菌する。幾つかの成長期間の細胞消化を経て得られた細胞を懸濁させて、濃度を調整し、接種密度を１×１０４／ｍｌとし、２４穴プレートに入れて、穴ごとに１ｍｌとし、５０ｍｌ／Ｌ二酸化炭素、飽和湿度、３７℃環境下で２、４、６ｄ培養した後、各培養プレートで順次に４穴を選定して、ＭＴＴ液１６０μｌを入れて、引き続き４ｈ培養し、培養液を捨てて、ＤＭＳＯ１．２ｍｌを入れて、１０ｍｉｎ振動をかけ、２００μｌを９６穴プレートに入れて、それぞれ平均３穴ずつとし、エライサ（ＥＬＩＳＡ）システムを利用して４９０ｎｍ波長で吸光度Ａを測定し、ＭＴＴ法細胞カウント標準グラフを利用して細胞密度を推算する。ＳＰＳＳ統計ソフトウェアのシングル従属変数マルチ因子分散分析法を通じて、上記試験結果に対する分析を行う。
【００５５】
その結果は以下のとおりである。
異なる処理方法のＭＴＴテスト結果は図１〜２を参照。培養時間が長くなるにつれ、各組の細胞数量も増えてくる。本発明の実施例１、３、４、５によって得られる材料接種組の細胞増殖数は対照組ＣＫに比べて顕著に多く、統計分析の結果、実施例１、３、４、５によって得られる材料と対照ＣＫとの間は統計学的意義（Ｐ＜０．０５）がある（図１と図２）。上記結果は、本発明によって得られる骨形成基質が従来技術中の商業用基質に比べてもっと高い活性を有することをさらに実証し、極めて明るい応用の前途がある。
【００５６】
２．３  ＭＣ−３Ｔ３細胞ＡＬＰ活性測定
細胞接種方法は同上で、２、４、６ｄ培養後、培養液を捨てて、ＰＢＳ（０．０１  ｍｏｌ／Ｌ）で３回洗い流し、２  ｍｌ／Ｌ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  ８００  μｌを入れて、４℃の冷蔵庫に入れて宵越し、さらに３００μｌのＡＬＰ基質を入れて、３７℃下で４０ｍｉｎ維持し、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＫＯＨで反応を中止させ、２００μｌを９６穴プレートに移して、それぞれ平均３穴とし、エライサ（ＥＬＩＳＡ）システムを利用して４１０ｎｍ波長で吸光度Ａを測定するが、これは細胞のアルカリホスファターゼ活性を代表する。異なる増殖率のアルカリホスファターゼ活性に対する影響を排除するために、以下補正を行う。骨形成細胞の平均アルカリホスファターゼ活性＝測定の吸光度Ａ値／同期骨形成細胞増殖率。ＳＰＳＳ統計ソフトウェアのシングル従属変数マルチ因子分散分析法を通じて、上記試験結果に対する分析を行う。
【００５７】
その結果は以下のとおりである。
図３、４を参照。図３から見れば、本発明の実施例１および３によって得られた歯基質の活性は、従来技術中の歯基質の活性に比べて明らかに高い。また、ＢＭＰ−２タンパク質は主な活性タンパク質として、骨格の修復または成長に重要な役割があると言うことをさらに実証した。培養時間が長くなるにつれ、各組細胞のアルカリホスファターゼ活性もある程度増え、実施例１、３のアルカリホスファターゼ活性は対照組に比べて高く、統計分析の結果、実施例１と対照ＣＫ、実施例３、４、５と対照ＣＫの２組の間は統計的意義（Ｐ＜０．０５）があり、顕著な差異がある。これは本発明によって得られる骨形成基質が従来技術中の商業用基質に比べてもっと高い活性を有することをさらに実証する。
【００５８】
また、我々のその他の試験によれば（試験方法は実施例１中に添加される外因性タンパク質と実施例５中に転化される外因性タンパク質）、すべての外因性ＢＭＰタンパク質中、例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７中の１種または複数種において、単独に１種の外因性タンパク質を使用する場合、外因性タンパク質ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３とＢＭＰ−７の方がその他のタンパク質に比べて活性が優れていた。
【００５９】
そして、我々は実施例１、３、４、および５によって得られる基質顆粒または乾燥粉末と深セン市光明創博生物製品発展有限公司の商業用歯基質に対する平行対照（ＣＫ）処理試験を行い、老年性骨折、二次骨折および３期、４期大腿骨頭壊死に対する修復効果を調べて見た。その結果、既存の商業用歯基質材料（骨形成顆粒または製剤）に比べて、本発明の実施例１、３、４、および５によって得られる基質顆粒または乾燥粉末の治療効果は既存の商業用歯基質材料に比べて明かに優れており、特に実施例１、３、および４によって得られる歯基質材料の治療効果がより良く、実施例１および４の効果が最も良かった。その可能な原因としては、既存の歯基質材料は直接脱灰処理をしたもので、その中に含有される活性タンパク質が比較的少なく、酸性脱灰処理中、活性ＢＭＰタンパク質に大量の変性損害をもたらして、効果が悪くなり、しかも脱灰処理は比較的大きな随意性があるので、製品の性能も大きなロット間の差異が出るからである。これに対し、本発明は簡単な処理によって、治療効果を著しく向上することができる。また、２０１４年１月〜２０１６年１月まで常温下で保存したものに対する活性試験を行ったが、その結果、常温にて約２年間保存しても、活性がある程度下がっていたが（約５〜１０％低下）（具体的な試験ステップと具体的なデータは省略）、依然として比較的高い活性を保ち、貯蔵２年後も、その活性は現在の商業用製品活性の２〜４倍であった。これは標準化・商業化の大量生産や効果がより優れた骨形成誘導製品に新しいルートを提供する。
【図１】
0006381743.tif 000002
【図２】
0006381743.tif 000003
【図３】
0006381743.tif 000004
【図４】
0006381743.tif 000005