(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、
前記光源からの光を観察物体に照射する照明光学系と、
前記観察物体を拡大投影する拡大光学系と、を備え、
前記照明光学系は、リングスリットを備え、
前記拡大光学系は、位相膜を有する対物レンズを備え、
前記リングスリットは、前記照明光学系の瞳位置に配置され、
前記位相膜は、前記照明光学系の瞳位置と共役な位置に配置され、
以下の条件式（１）を満足する対物レンズを１つ以上有し、
それらの対物レンズの１つが以下の条件式（３）を満足することを特徴とする位相差顕微鏡。
ｒ／Ｉ≦０．２５      （１）
３．５＜Ｔ／［β×（Ｒout−Ｒin）］＜７．５      （３）
ここで、
ｒは、前記位相膜の中心半径、
Ｉは、前記対物レンズの瞳の半径、
Ｔは、前記位相膜の膜幅、
βは、前記リングスリットを前記位相膜の位置へ投影したときの投影倍率、
Ｒinは、前記リングスリットの開口部の内径、
Ｒoutは、前記リングスリットの開口部の外径、
である。
【請求項２】
複数の対物レンズを搭載し、
前記複数の対物レンズのうち前記条件式（１）を満足する対物レンズを１つ以上有し、
前記条件式（１）を満足する対物レンズを含む複数の対物レンズが前記条件式（３）を満足することを特徴とする請求項１に記載の位相差顕微鏡。
【請求項３】
前記複数の対物レンズにおける最高倍率と最低倍率の比が１０倍以下であることを特徴とする請求項２に記載の位相差顕微鏡。
【請求項４】
所定の対物レンズと、
前記所定の対物レンズと共に用いられる所定のリングスリットと、を有し、
前記リングスリットと前記所定のリングスリットが交換可能であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の位相差顕微鏡。
【請求項５】
保持部材を有し、
前記リングスリットと前記所定のリングスリットは、前記保持部材に保持されていることを特徴とする請求項４に記載の位相差顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は位相差顕微鏡に関し、特に、標本の厚みが厚い場合でもコントラストが高い位相差像が得られる位相差顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
位相差顕微鏡は照明光学系（コンデンサーレンズ）の瞳位置にリングスリットを配置し、観察光学系（対物レンズ）の瞳位置に円環状の位相膜を配置して、リングスリットと位相膜とを共役な位置関係にすることで、標本の位相分布を像コントラストに変える顕微鏡である。
【０００３】
位相差顕微鏡で形成される標本の像は、標本の位相分布に比例する像成分以外に標本を通常の明視野観察した明視野成分など複数の像成分から構成されている。更に、標本の厚みや形状などに応じてこれら複数の像成分の構成比率等が変化する。
【０００４】
標本の位相分布に比例する像成分のコントラストを高くするためには、対物レンズ内の位相膜とコンデンサーレンズ内のリングスリットとの共役関係が適切に保たれた状態にする必要がある。また、対物レンズ内に配置されている円環状の位相膜の半径と膜幅に応じて位相分布に比例する像成分のコントラストが変化することから、現状では位相膜の半径を対物レンズの瞳の半径の半分程度に設定することが良いとされている。
【０００５】
通常の位相差顕微鏡に使用される対物レンズでは、各倍率での位相差像のコントラストがほぼ同じになるように、位相膜の半径は対物レンズの瞳の半径の半分程度に設定されている。観察倍率を変えるために観察倍率に合った対物レンズに交換すると、コンデンサーレンズ内のリングスリットが対物レンズの瞳位置に投影される倍率が変わる。
【０００６】
位相差観察を行うためには、位相膜とリングスリットの共役関係を保つ必要があり、リングスリットの径を各倍率の対物レンズ内の位相膜に合わせて変えることが必要である。これにより、対物レンズの倍率に対応させたリングスリットを予め用意する必要がある。
【０００７】
位相差顕微鏡は、例えば、培養細胞の育成状況の観察に用いられる。培養細胞の育成状況の観察では、予め決められた手順に従って観察が行われ、観察倍率等を変えることも多い。このような観察では、使用する対物レンズに対応させてリングスリットを同時に交換すると、作業効率が低下する。そこで、共通のリングスリットを用いた位相差観察を可能にした顕微鏡が特許文献１に開示されている。
【０００８】
特許文献１に開示されている位相差顕微鏡は、使用する対物レンズの倍率が異なっていても、同一のリングスリットを用いて位相差観察ができるように構成されている。この位相差顕微鏡では、共通のリングスリットの像の半径と対物レンズの瞳の半径が、所定の条件を満足するように設定することで、対物レンズの倍率を変えたときの位相分布に比例する像成分のコントラストの変化を小さくしている。
【０００９】
ここで、標本の位置が対物レンズの合焦位置と一致している状態を合焦状態（以下「合焦状態」という）とし、標本の位置が対物レンズの合焦位置からずれた状態を非合焦状態（以下、「非合焦状態」という）とする。
【００１０】
標本が無色透明で位相分布を持つ位相物体の場合、標本を明視野観察すると合焦状態では位相分布に比例する像成分のコントラストは発生しない。このため、このような位相物体の観察には位相差観察などが用いられる。しかし、標本を合焦状態から移動（デフォーカス）させて非合焦状態で観察すると、位相分布に比例した像成分のコントラストが発生する。この像コントラストは、標本の位相分布に対してデフォーカスによって発生する波面収差が位相差顕微鏡の位相膜のように作用することで発生する。位相分布とデフォーカスによる波面収差が作用して発生する位相物体の像を相互作用像と呼ぶ（以下「相互作用像」という）。
【００１１】
この相互作用像を利用して培養細胞を観察する顕微鏡が特許文献２に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平１１−０８４２６０号公報
【特許文献２】特開２００５−１７３２８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
位相差顕微鏡によって形成される標本の像は、標本の位相分布に比例する位相差像成分と位相物体を明視野観察した像成分から構成されることを示した。標本が非合焦状態にある場合には位相分布に比例する像成分に相互作用像が重畳されることになり、位相差像のコントラストが低下する。
【００１４】
また、標本が非合焦状態であるので、位相分布に比例する像成分もデフォーカスの影響を受けてボケた位相差像になりコントラストが低下することから、位相差顕微鏡で観察した像のコントラストは更に低下する。
【００１５】
位相差顕微鏡の観察対象として、上述したように培養細胞がある。従来の培養細胞は、厚みが薄い細胞（以下、「薄い細胞」という）であった。薄い細胞では、細胞の表面に合焦すると、表面から裏面までほぼ合焦状態になる。薄い細胞では、相互作用像は発生しない。
【００１６】
このように、薄い細胞では、細胞の表面から裏面までの間のいずれの位置においても、形成される像は全て位相分布に比例した像成分のみになる。そのため、標本の厚みが薄い場合は、特許文献１に開示された位相差顕微鏡で、像コントラストの高い位相差像が得られる。
【００１７】
近年、盛んに研究が進められている培養細胞として、ｉＰＳ細胞がある。ｉＰＳ細胞は１つの細胞自体も厚く、更にコロニーと呼ばれる集合体を形成するため、全体としては厚みが厚い細胞（以下、「厚い細胞」という）になる。厚い細胞では、特定の細胞の表面に合焦すると、観察している細胞の前後にも細胞が存在し、それらの細胞が非合焦状態になる。よって、厚い細胞では、合焦位置以外にある細胞の相互作用像が発生する。
【００１８】
この場合、細胞表面の像は位相分布に比例する像成分になるが、観察している細胞の前後の細胞の像はボケた位相差像と相互作用像になる。よって、厚い細胞の観察像は、合焦位置にある細胞の位相差像に非合焦位置にある細胞のボケた位相差像と相互作用像が重畳された像となる。そのため、標本が厚い細胞の場合は、特許文献１に開示された位相差顕微鏡では、コントラストの高い位相差像を得ることは難しい。
【００１９】
本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであって、標本の厚みが厚い場合であっても、コントラストが高い位相差像が得られる位相差顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明の位相差顕微鏡は、
光源と、
光源からの光を観察物体に照射する照明光学系と、
観察物体を拡大投影する拡大光学系と、を備え、
照明光学系は、リングスリットを備え、
拡大光学系は、位相膜を有する対物レンズを備え、
リングスリットは、照明光学系の瞳位置に配置され、
位相膜は、照明光学系の瞳位置と共役な位置に配置され、
以下の条件式（１）を満足する対物レンズを１つ以上有し、
それらの対物レンズの１つが以下の条件式（３）を満足することを特徴とする。
ｒ／Ｉ≦０．２５      （１）
３．５＜Ｔ／［β×（Ｒout−Ｒin）］＜７．５      （３）
ここで、
ｒは、位相膜の中心半径、
Ｉは、対物レンズの瞳の半径、
Ｔは、位相膜の膜幅、
βは、リングスリットを位相膜の位置へ投影したときの投影倍率、
Ｒinは、リングスリットの開口部の内径、
Ｒoutは、リングスリットの開口部の外径、
である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の位相差顕微鏡によれば、標本の厚みが厚い場合であっても、コントラストが高い位相差像が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】位相差顕微鏡の概観を示す図であって、（ａ）は正面図、（ｂ）は側面図である。
【図２】位相差観察時の光学系の構成を示す図である。
【図３】位相膜と開口部の像を示す図であって、（ａ）は非回折光によって形成された開口部の像と位相膜を示す図、（ｂ）は回折光によって形成された開口部の像と位相膜を示す図、（ｃ）は回折光によって形成された開口部の像における２つの領域を示す図である。
【図４】位相膜の中心半径と対物レンズの瞳の半径を示す図である。
【図５】デフォーカス量Δと瞳面内の波面収差の関係を、対物レンズの瞳の半径を１に規格化した座標を用いて示した図である。
【図６】シミュレーションで求めた相互作用像の発生量を示す図であって、（ａ）はｒｃ＝０．２５、Δ＝０．５δのときの図、（ｂ）はｒｃ＝０．４５、Δ＝０．５δのときの図、（ｃ）はｒｃ＝０．２５、Δ＝０．７５δのときの図、（ｄ）はｒｃ＝０．４５、Δ＝０．７５δのときの図、（ｅ）はｒｃ＝０．２５、Δ＝δ、（ｆ）はｒｃ＝０．４５、Δ＝δのときの図である。
【図７】リングスリットの開口部の径を示す図である。
【図８】保持部材を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下に、本発明に係る位相差顕微鏡の実施形態を、図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施形態によりこの発明が限定されるものではない。
【００２５】
第１実施形態の位相差顕微鏡は、光源と、光源からの光を観察物体に照射する照明光学系と、観察物体を拡大投影する拡大光学系と、を備え、照明光学系は、リングスリットを備え、拡大光学系は、位相膜を有する対物レンズを備え、リングスリットは、照明光学系の瞳位置に配置され、位相膜は、照明光学系の瞳位置と共役な位置に配置され、以下の条件式（１）を満足することを特徴とする。
ｒ／Ｉ≦０．２５      （１）
ここで、
ｒは、位相膜の中心半径、
Ｉは、対物レンズの瞳の半径、
である。
【００２６】
図１は、顕微鏡の概観を示す図であって、（ａ）は正面図、（ｂ）は側面図である。顕微鏡１は、顕微鏡本体２と、標本載置台３と、照明支柱４と、レボルバ５と、を有する。
【００２７】
標本載置台３は顕微鏡本体２に保持されている。標本載置台３の上方には、ランプハウス６、スライダ８及びコンデンサ筒１０が配置されている。スライダ８は、ランプハウス６とコンデンサ筒１０との間に配置されている。ランプハウス６、スライダ８及びコンデンサ筒１０は、照明支柱４を介して保持されている。
【００２８】
ランプハウス６には光源７が格納されている。スライダ８には開口素子９が格納されている。コンデンサ筒１０にはコンデンサレンズ１１が格納されている。開口素子９としては、例えば、開口部の形状が円形の開口絞りや、開口部の形状が円環状のリングスリットがある。明視野観察では円形の開口絞りが用いられ、位相差観察ではリングスリットが用いられる。
【００２９】
標本載置台３の下方には、レボルバ５が配置されている。レボルバ５には、対物レンズ１２が装着されている。レボルバ５には複数の対物レンズが装着可能になっている。レボルバ５を回転させることで、対物レンズの交換が容易に行える。
【００３０】
顕微鏡本体２には鏡筒部１３が設けられている。鏡筒部１３内に、結像レンズ１４が配置されている。また、鏡筒部１３には、観察鏡筒１５が接続されている。観察鏡筒１５には接眼レンズ１６が装着されている。
【００３１】
光源７は照明光を発生する。照明光は開口素子９を通過して、コンデンサレンズ１１に入射する。照明光はコンデンサレンズ１１を介して、標本載置台３に到達する。標本載置台３には標本１７が載置されている。照明光は標本１７に照射される。このように、コンデンサレンズ１１は、照明光学系を構成する光学部材である。
【００３２】
標本１７からの光は対物レンズ１２に入射し、結像レンズ１４によって集光される。集光された位置に標本１７の像が形成される。対物レンズ１２と結像レンズ１４によって、標本１７の像は拡大された像になっている。このように、対物レンズ１２は、拡大光学系を構成する光学部材である。
【００３３】
標本１７の像は、観察鏡筒１５を介して、接眼レンズ１６で観察することができる。顕微鏡１において位相差観察を行う場合、開口素子９としてリングスリットが用いられ、対物レンズ１２として位相差用対物レンズが用いられる。
【００３４】
位相差観察時の光学系について説明する。図２は、位相差観察時の光学系の構成を示す図である。リングスリット２０は、円環状の開口部２０ａを有する。リングスリット２０は、コンデンサレンズ２１の焦点位置に配置されている。コンデンサレンズ２１の焦点位置は、照明光学系の瞳位置である。よって、リングスリット２０は、照明光学系の瞳位置に配置されていることになる。円環の中心、すなわち、開口部２０ａの中心は、照明光学系の光軸上に位置している。
【００３５】
標本２２を挟んでコンデンサレンズと対向する位置に、位相差用対物レンズ２３が配置されている。位相差用対物レンズ２３は、位相板２４を有する。位相板２４には、位相膜２４ａが円環状に形成されている。位相膜２４ａは、位相差用対物レンズ２３の焦点位置に配置されている。位相差用対物レンズ２３の焦点位置は、リングスリット２０の位置、すなわち、照明光学系の瞳位置と共役である。よって、位相膜２４ａは、照明光学系の瞳位置と共役な位置に配置されていることになる。
【００３６】
また、位相差用対物レンズ２３の焦点位置は、拡大光学系の瞳位置である。よって、位相膜２４ａは、拡大光学系の瞳位置に配置されているということもできる。円環の中心、すなわち、位相膜２４ａの中心は、拡大光学系の光軸上に位置している。
【００３７】
本実施形態の位相差顕微鏡では、照明光学系の瞳位置が、対物レンズの瞳位置にリレーされている。よって、リングスリット２０と位相膜２４ａは光学系の瞳位置に配置されている。しかしながら、光学系によって収差が発生するので、照明光学系の瞳の像位置と対物レンズの瞳位置とは必ずしも一致しない。このようなことから、リングスリット２０と位相膜２４ａは、瞳位置の近傍に配置されていても良い。光学系の瞳位置と共役な位置にリングスリット２０と位相膜２４ａが配置された場合についても、同様のことがいえる。
【００３８】
開口部２０ａを通過した照明光は、コンデンサレンズ２１を介して標本２２に照射される。標本２２からは、非回折光と回折光が生じる。回折光としては、＋１次の回折光、−１次の回折光がある。更に高次の回折光も生じる。図２では、＋１次の回折光のみが破線で示されている。
【００３９】
非回折光２５は、照明光の入射方向と同じ方向に進む。非回折光２５は位相差用対物レンズ２３に入射し、位相板２４上に集光する。集光位置には、非回折光２５によって開口部２０ａの像２５ａが形成される。像２５ａは円環状の像で、円環の中心は光軸と一致している。一方、位相膜２４ａも円環状で、円環の中心は光軸と一致している。よって、非回折光２５については、像２５ａの中心と位相膜２４ａの中心とが一致した状態になる。
【００４０】
＋１次の回折光２６（以下、「回折光」という）は、照明光の入射方向とは異なる方向に進む。回折光２６は位相差用対物レンズ２３に入射し、位相板２４上に集光する。集光位置には、回折光２６によって開口部２０ａの像２６ａが形成される。像２６ａは円環状の像であるが、円環の中心は光軸と一致していない。よって、回折光２６については、像２６ａの中心と位相膜２４ａの中心とが一致しない状態になる。
【００４１】
位相膜と開口部の像の関係について説明する。図３は位相膜と開口部の像を示す図であって、（ａ）は非回折光によって形成された開口部の像と位相膜を示す図、（ｂ）は回折光によって形成された開口部の像と位相膜を示す図、（ｃ）は回折光によって形成された開口部の像における２つの領域を示す図である。
【００４２】
上述のように、非回折光２５については、像２５ａの中心と位相膜２４ａの中心とが一致した状態になる。この場合、図３（ａ）に示すように、位相膜２４ａと像２５ａとが重なった状態になる。非回折光２５は位相膜２４ａを通過した後に、結像レンズで集光される。この集光位置は標本２２と共役な位置である。よって、非回折光２５による像が、標本２２と共役な位置に形成される。この像は背景成分を表している。背景成分の明るさは、非回折光の明るさと位相膜２４ａにおける透過率との積で表される。
【００４３】
回折光２６については、像２６ａの中心と位相膜２４ａの中心とが一致しない状態になる。この場合、図３（ｂ）に示すように、位相膜２４ａに対して像２６ａがずれた状態になる。また、図３（ｃ）に示すように、像２６ａは領域２７と領域２８に分かれる。領域２７では、位相膜２４ａと像２６ａが重なっていない。領域２８では、位相膜２４ａと像２６ａが重なっている。
【００４４】
領域２７を通過した回折光２６は、結像レンズで集光される。これにより、領域２７を通過した回折光２６と非回折光２５の干渉による像が、標本２２と共役な位置に形成される。この像は位相膜による位相変化を受けるので、標本の位相分布情報を含んでいる。
【００４５】
一方、領域２８を通過した回折光２６も、結像レンズで集光される。これにより、領域２８を通過した回折光２６と非回折光２５が干渉した像が、標本２２と共役な位置に形成される。この像は回折光２６による像ではあるが、位相膜２４ａを通過しているため、非回折光２５と同じ位相の変化を受ける。そのため位相膜の実質的な効果が無くなり、明視野像成分となる。位相物体の明視野像成分は、合焦状態では位相分布にデフォーカスによる波面収差が作用していないが、非合焦状態では位相分布にデフォーカスによる波面収差が作用している。
【００４６】
このように、位相差像には、背景成分、標本の位相分布情報（位相分布に比例した像成分）及び明視野像成分が含まれている。標本２２が位相物体の場合、合焦状態では、位相分布にデフォーカスによる波面収差は作用していないので、明視野像成分は０になる。しかしながら、非合焦状態では、位相分布にデフォーカスによる波面収差が作用しているので、明視野像成分は０にならずに相互作用像として像コントラストが発生する。
【００４７】
標本２２が薄い細胞では、細胞の表面に合焦すると、表面から裏面までほぼ合焦状態になっている。この場合、相互作用像は発生しないので、標本の背景成分と位相分布情報から標本２２の位相差像が形成される。よって、コントラストの高い位相差像が得られる。
【００４８】
一方、標本２２がｉＰＳ細胞のような厚い細胞では、１つの細胞自体も厚く、集合体を形成するため、全体としては厚みが厚い細胞になる。このため、特定の細胞の表面に合焦すると、合焦位置から離れた細胞の内部構造や合焦位置の前後の細胞は非合焦状態になる。この場合、非合焦状態にある部分の相互作用像が発生するので、標本の背景成分と位相分布情報に相互作用像が重畳されるかたちで標本２２の位相差像が形成される。よって、位相差像のコントラストは低下する。
【００４９】
ここで、本実施形態の位相差顕微鏡は、上述の条件式（１）を満足している。そのため、本実施形態の位相差顕微鏡では、標本の厚みが厚い場合であっても、コントラストが高い位相差像が得られる。
【００５０】
条件式（１）は、位相膜の中心半径と対物レンズの瞳の半径との比に関する条件式である。図４は、位相膜の中心半径と対物レンズの瞳の半径を示す図である。対物レンズの瞳位置には、位相膜２４ａが位置している。位相膜２４ａの中心半径ｒは、以下の式（Ａ）で表される。
ｒ＝（ｒin＋ｒout）／２      （Ａ）
ここで、
ｒinは、位相膜２４ａの内側の半径、
ｒoutは、位相膜２４ａの外側の半径、
である。
【００５１】
条件式（１）の上限値を上回ると、相互作用像の発生量が大きくなる。そのため、標本の厚みが厚い場合、コントラストが高い位相差像を得ることが困難になる。
【００５２】
ｉＰＳ細胞のような厚い細胞の場合、合焦位置から離れたところに細胞の内部構造があることや対物レンズの合焦位置の前後にも細胞が存在することから、それらの細胞の内部構造や前後の細胞からの光も対物レンズに入射する。特許文献２に開示されているように、対物レンズの合焦位置からデフォーカスした位置からの光が対物レンズに入射すると、対物レンズの瞳面内にデフォーカス量Δに対応した波面収差を発生する。
【００５３】
図５は、デフォーカス量Δと瞳面内の波面収差の関係を、対物レンズの瞳の半径を１に規格化した座標を用いて示したものである。ここで、位置Ｐ１は瞳の中止から離れた位置で、Ｐ２は瞳の中心に近い位置を表している。
【００５４】
厚い標本では、対物レンズの合焦位置からデフォーカスした位置の細胞からも、光が対物レンズに入射する。このとき、特許文献２に開示されているように対物レンズの瞳面における波面収差は、対物レンズの合焦位置からのデフォーカス量（以下、「デフォーカス量Δ」という）に対応して変化する。
【００５５】
デフォーカス量がΔＡ、ΔＢ、ΔＣのときに対物レンズの瞳内に発生する波面収差（以下、「波面」という）を波面ＷＡ、波面ＷＢ及び波面ＷＣとして表す。
各デフォーカス量Δに
ΔＡ＜ΔＢ＜ΔＣ
の関係が有るとき、特許文献２から各波面には以下のような関係ある。
波面ＷＡ＜波面ＷＢ＜波面ＷＣ
【００５６】
対物レンズの瞳内の各座標位置での波面の値（以下、「波面量」という）を波面ＷＡ、波面ＷＢ及び波面ＷＣのそれぞれについて比べると、位置Ｐ１における波面量と位置Ｐ２における波面量は、各々以下のような関係になる。
ＷＡＰ１＜ＷＢＰ１＜ＷＣＰ１
ＷＡＰ２＜ＷＢＰ２＜ＷＣＰ２
【００５７】
このように、対物レンズの瞳の中心以外では、どの位置であっても、デフォーカス量Δが大きくなるにつれて波面も大きくなる。
【００５８】
一方、同一の波面で比較すると、位置Ｐ１と位置Ｐ２における波面量は、各々以下のようになる。
ＷＡＰ１＞ＷＡＰ２
ＷＢＰ１＞ＷＢＰ２
ＷＣＰ１＞ＷＣＰ２
【００５９】
このように、どのデフォーカス量Δにおいても、位置Ｐ１における波面量の方が、位置Ｐ２における波面量よりも大きくなる。
【００６０】
上述のように、デフォーカス量Δと相互作用像の発生量とは比例の関係になっている。また、図５に示すように、デフォーカス量Δと波面量との間とも比例の関係になっている。よって、波面量と相互作用像の発生量との間にも比例関係が成立する。
【００６１】
このようなことから、波面量を少なくすることで、相互作用像の発生量を少なくすることができる。位置Ｐ１と位置Ｐ２における波面量の比較から分かるように、波面量は対物レンズの瞳の中心に近づくほど小さくなる。よって、相互作用像の発生量を少なくするには、対物レンズの瞳の中心に近い光を結像に用いれば良いことになる。
【００６２】
相互作用像は、領域２８を通過する回折光によって生じる。そうすると、相互作用像の発生量を抑えるためには、領域２８を対物レンズの瞳の中心に近づければ良い。
【００６３】
領域２８は、位相膜２４ａと像２６ａとが重複する領域である。像２６ａは回折光によって形成された像であるが、回折光の回折方向は標本に依存するため、像２６ａの位置は自由に変えられない。一方、位相膜２４ａの位置は自由に変えることができる。よって、相互作用像の発生量を抑えるためには、位相膜２４ａの位置を対物レンズの瞳の中心に近づければ良いことになる。
【００６４】
相互作用像の量は、シミュレーションによって算出することができる。相互作用像は、以下の式（Ｂ）で表すことができる。
【数１】
0006381437.tif 000002
ここで、
ＭＴＦ（ｆ）は、光学系の変調伝達関数、
ｐｔｆ（ｆ）は、光学系の位相伝達関数、
Φ（ｆ）は、標本（位相物体）における位相分布のフーリエ変換、
である。
【００６５】
シミュレーションで求めた相互作用像の発生量を図６に示す。図６において、（ａ）はｒｃ＝０．２５、Δ＝０．５δのときの図、（ｂ）はｒｃ＝０．４５、Δ＝０．５δのときの図、（ｃ）はｒｃ＝０．２５、Δ＝０．７５δのときの図、（ｄ）はｒｃ＝０．４５、Δ＝０．７５δのときの図、（ｅ）はｒｃ＝０．２５、Δ＝δ、（ｆ）はｒｃ＝０．４５、Δ＝δのときの図である。δは焦点深度であって、δ＝λ／ＮＡ２で表される。λは波長、ＮＡは光学系の物体側開口数である。
【００６６】
図６では、縦軸のＭＴＦ・ｓｉｎ｛ｐｔｆ（ｄｅｆ）｝が、相互作用像の発生量を表している。ｒｃは、位相膜の中心半径ｒを対物レンズの瞳の半径Ｉで規格化したときの半径である。ｒｗは、規格化した位相膜の幅である。
【００６７】
図６（ａ）と図６（ｂ）は、デフォーカス量Δが光学系の焦点深度の０．５倍の場合である。図６（ａ）と図６（ｂ）を比較すると、位相膜は、図６（ａ）の方が図６（ｂ）よりも対物レンズの瞳の中心側に位置している。そして、相互作用像の発生量は、図６（ａ）の方が図６（ｂ）よりも少なくなっている。
【００６８】
図６（ｃ）と図６（ｄ）は、デフォーカス量Δが光学系の焦点深度の０．７５倍の場合である。図６（ｃ）と図６（ｄ）を比較すると、位相膜は、図６（ｃ）の方が図６（ｄ）よりも対物レンズの瞳の中心側に位置している。そして、相互作用像の発生量は、図６（ｃ）の方が図６（ｄ）よりも少なくなっている。
【００６９】
図６（ｅ）と図６（ｆ）は、デフォーカス量Δが光学系の焦点深度と等しい場合である。図６（ｅ）と図６（ｆ）を比較すると、位相膜は、図６（ｅ）の方が図６（ｆ）よりも対物レンズの瞳の中心側に位置している。そして、相互作用像の発生量は、図６（ｅ）の方が図６（ｆ）よりも少なくなっている。
【００７０】
このように、どのデフォーカス量Δにおいても、位相膜が対物レンズの瞳の中心の近くに位置している場合（図６（ａ）、（ｃ）、（ｅ））の方が、位相膜が対物レンズの瞳の中心から遠くに位置している場合（図６（ｂ）、（ｄ）、（ｆ））に比べて、相互作用像の発生量が少なくなっている。
【００７１】
このように、シミュレーションの結果からも、相互作用像の発生量を少なくするには、位相膜を対物レンズの瞳の中心側に位置させれば良いことがわかる。
【００７２】
また、図６（ｅ）と図６（ｂ）とでは、相互作用像の発生量はほぼ同じである。しかしながら、デフォーカス量Δは、図６（ｅ）では光学系の焦点深度と等しく、図６（ｂ）では光学系の焦点深度の半分である。図６（ｂ）における相互作用像の発生量を許容できると仮定すると、図６（ｅ）では、標本の位置と対物レンズの合焦位置とのデフォーカスを、図６（ｂ）に比べて約２倍の範囲まで許容することができることになる。
【００７３】
図６（ｂ）におけるずれ量Δはλ／２ＮＡ２である。よって、相互作用像の発生量を許容できる範囲は、合焦位置の両側のλ／ＮＡ２の範囲になる。λ／ＮＡ２は光学系の焦点深度である。よって、図６（ｂ）では、標本が焦点深度を超えない厚みを持つ場合は、コントラストが高い位相差像が得られる。ただし、標本が焦点深度を超える厚みを持つ場合は、コントラストが高い位相差像は得られない。
【００７４】
図６（ｅ）におけるずれ量Δは２×λ／２ＮＡ２である。よって、相互作用像の発生量を許容できる範囲は、合焦位置の両側の２λ／ＮＡ２の範囲になる。２λ／ＮＡ２は光学系の焦点深度の２倍である。よって、図６（ｂ）では、標本が焦点深度を超えない厚みを持つ場合は、コントラストが高い位相差像が得られる。また、標本が焦点深度を超える厚みを持つ場合であっても、標本の厚みが焦点深度の２倍の範囲内であれば、コントラストが高い位相差像が得られる。
【００７５】
図６（ｅ）では、ｒｃ＝０．２５である。ｒｃ＝ｒ／Ｉであるので、ｒ／Ｉ＝０．２５になる。このようなことから、本実施形態の位相差顕微鏡では、条件式（１）を満足するようにしている。条件式（１）を満足することで、標本の厚みが厚い場合であっても、標本の合焦位置前後の部位で発生する相互作用像の発生量を小さくできるので、コントラストが高い位相差像が得られる。
【００７６】
条件式（１）に代えて、以下の条件式（１’）を満足することが好ましい。
０．０５≦ｒ／Ｉ≦０．２５      （１’）
【００７７】
条件式（１’）の下限値を下回ると、位相差観察像の明るさが暗くなってしまう。また、条件式（１’）の下限値を下回る例としては、レーザ光源からの光を照明光学系の瞳位置に集光させ位相差観察する場合がある。このような観察では、レーザ光によって発生するコヒーレントノイズによる影響で、高いコントラストの観察は困難になる。
【００７８】
第２実施形態の位相差顕微鏡は、光源と、光源からの光を観察物体に照射する照明光学系と、観察物体を拡大投影する拡大光学系と、を備え、照明光学系は、リングスリットを備え、拡大光学系は、位相膜を備え、リングスリットは、照明光学系の瞳位置に配置され、位相膜は、照明光学系の瞳位置と共役な位置に配置され、以下の条件式（２）を満足することを特徴とする。
β×Ｒ／Ｉ≦０．２５      （２）
ここで、
βは、リングスリットを位相膜の位置へ投影したときの投影倍率、
Ｒは、リングスリットの中心半径、
Ｉは、対物レンズの瞳の半径、
である。
【００７９】
条件式（２）の技術的意義は、条件式（１）の技術的意義と同じなので、詳細な説明は省略する。
【００８０】
図７は、リングスリットの開口部の径を示す図である。リングスリット２０には、円環状の開口部２０ａが形成されている。開口部２０ａの中心半径Ｒは、以下の式（Ｃ）で表される。
Ｒ＝（Ｒin＋Ｒout）／２      （Ｃ）
ここで、
Ｒinは、リングスリットの開口部の内径、
Ｒoutは、リングスリットの開口部の外径、
である。
【００８１】
条件式（２）を満足する場合、リングスリットの開口部の像が位相膜上に形成される。よって、条件式（１）を満足した場合と同様に、標本の厚みが厚い場合であっても、標本内部や裏面で発生する相互作用像の発生量を小さくできるので、コントラストが高い位相差像が得られる。
【００８２】
条件式（２）に代えて、以下の条件式（２’）を満足することが好ましい。
０．０５≦β×Ｒ／Ｉ≦０．２５      （２’）
【００８３】
条件式（２’）における下限値の技術的意義は、条件式（１’）における下限値の技術的意義と同じである。
【００８４】
また、第１実施形態の位相差顕微鏡は、条件式（１）を満足する対物レンズを１つ以上有しそれらの対物レンズの１つが、以下の条件式（３）を満足することが好ましい。
３．５＜Ｔ／［β×（Ｒout−Ｒin）］＜７．５      （３）
ここで、
Ｔは、位相膜の膜幅、
βは、リングスリットを位相膜の位置へ投影したときの投影倍率、
Ｒinは、リングスリットの開口部の内径、
Ｒoutは、リングスリットの開口部の外径、
である。
【００８５】
複数の対物レンズが条件式（１）を満足する場合、これらの対物レンズについては、同一のリングスリットを使用することができる。どの対物レンズを用いても位相差像が形成されるためには、非回折光によって形成されたリングスリットの開口部の像（以下、「開口部の像」という）が位相膜上に形成されなければならない。しかしながら、位相膜の幅は対物レンズの倍率によって異なる。また、製造上、位相膜の位置や幅にばらつきが生じる。同様に、スリットの位置や幅についても、製造上によってばらつきが生じる。
【００８６】
位相差顕微鏡では、開口部の像が位相膜からはみ出さなければ、位相差観察が可能である。そこで、位相膜の幅を広くして、位相膜やリングスリットの開口部において製造誤差によるばらつきが生じても、開口部の像が位相膜からはみ出さないようにすれば、位相差像が形成される。しかしながら、位相膜の幅を広くしすぎると、位相差像のコントラストの低下を招くことになる。そこで、リングスリットや位相膜の製造誤差と、位相差像のコントラスト低下とを考慮して、位相膜の膜幅を設定することが好ましい。
【００８７】
条件式（３）の下限値を下回ると、製造誤差を非常に小さくしなければならない。そのため、位相差顕微鏡の生産性が著しく低下する。
【００８８】
条件式（３）の上限値を上回ると、製造誤差の影響は小さくなるが、位相差像のコントラストの低下が大きくなる。
【００８９】
また、第１実施形態の位相差顕微鏡は、複数の対物レンズを搭載し、複数の対物レンズのうち条件式（１）を満足する対物レンズを１つ以上有し、条件式（１）を満足する対物レンズを含む複数の対物レンズが条件式（３）を満足することが好ましい。
【００９０】
また、第１実施形態の位相差顕微鏡は、複数の対物レンズにおける最高倍率と最低倍率の比が１０倍以下であることが好ましい。
【００９１】
位相差顕微鏡は、条件式（１）を満足する対物レンズを少なくとも１つ含み、複数の対物レンズを有することで、これらの対物レンズを使用する際のリングスリットを共通にすることができる。よって、作業効率を向上させることができる。最高倍率と最低倍率の比は、正確に１０倍でなくても良く、約１０倍であれば良い。また、最高倍率は４０倍で、最低倍率は４倍であることが好ましい。
【００９２】
また、第１実施形態の位相差顕微鏡と第２実施形態の位相差顕微鏡は、所定の対物レンズと、所定の対物レンズと共に用いられる所定のリングスリットと、を有し、リングスリットと所定のリングスリットが交換可能であることが好ましい。
【００９３】
所定の対物レンズは、条件式（１）を満足しない対物レンズである。所定の対物レンズでは、位相膜の位置や幅が条件式（１）を満足する対物レンズと異なる。そのため、所定の対物レンズでは、条件式（１）を満足する対物レンズに用いるリングスリットは使用できない。
【００９４】
そこで、所定のリングスリット、すなわち所定の対物レンズと共に用いられるリングスリットを用意する。そして、リングスリットと所定のリングスリットを交換可能にする。このようにすることで、使用する対物レンズに応じて、最適なリングスリットを選択することができる。その結果、どの対物レンズを使用しても、コントラストが高い位相差像を得ることができる。
【００９５】
また、第１実施形態の位相差顕微鏡と第２実施形態の位相差顕微鏡は、保持部材を有し、リングスリットと所定のリングスリットは、保持部材に保持されていることが好ましい。
【００９６】
図８は保持部材を示す図である。図８では、保持部材としてスライダ８が示されている。スライダ８には、３つの保持部が設けられている。１つ目の保持部にはリングスリット２０が配置されている。２つ目の保持部にはリングスリット３０が、３つ目の保持部には円形の開口部３１が形成されている。スライダ８を光軸と直交する面内で移動させることで、リングスリット２０、リングスリット３０及び開口部３１のいずれか１つを、光路中に位置させることができる。
【００９７】
リングスリット２０は、条件式（１）を満足する対物レンズと共に使用される。リングスリット３０は所定のリングスリットであって、所定の対物レンズと共に用いられる。開口部３１は、たとえば、明視野観察用の対物レンズに用いられる。このようにすることで、使用する対物レンズに応じて、最適な開口素子を選択することができる。その結果、位相差観察ではコントラストが高い位相差像を得ることができる。また、位相差観察以外の観察も行うことができる。
【００９８】
また、本実施形態の対物レンズは、複数のレンズと、位相膜と、を備えた対物レンズであって、以下の条件式（１）を満足することを特徴とする。
ｒ／Ｉ≦０．２５      （１）
ここで、
ｒは、位相膜の中心半径、
Ｉは、対物レンズの瞳の半径、
である。
【００９９】
条件式（１）の技術的意義は既に説明したので、ここでの説明は省略する。条件式（１）を用いることで、標本の厚みが厚い場合であっても、標本の合焦位置前後の部位で発生する相互作用像の発生量を小さくできるので、コントラストが高い位相差像が得られる。
【０１００】
本実施形態の位相差顕微鏡に用いられる対物レンズの例を表１に示す。この例では、対物レンズ２本を組合せて、共通リングスリットを使用している。また、条件式（１）を１本の対物レンズ（４０倍対物レンズ）が満たしている。
【表１】
0006381437.tif 000003
【０１０１】
この例の場合、４倍対物レンズで対物瞳の外側へ位相膜が必要となるが、低倍の為に焦点深度が深くなるので（λ=０．５５μｍ、ＮＡ０．１において±２７．５μｍ）、既に議論している様に、デフォーカス成分による悪影響は小さい。高倍対物レンズは焦点深度が浅いことから相互作用像を考慮する必要がある。
【０１０２】
本実施形態の位相差顕微鏡に用いられる対物レンズの別の例を表２に示す。この例では、対物レンズ３本を組合せて、共通リングスリットを使用している。また、条件式（１）を１本の対物レンズ（４０倍対物レンズ）が満たしている。
【表２】
0006381437.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
以上のように、本発明は、標本の厚みが厚い場合であっても、コントラストが高い位相差像が得られる位相差顕微鏡に有用である。
【符号の説明】
【０１０４】
１  顕微鏡
２  顕微鏡本体
３  標本載置台
４  照明支柱
５  レボルバ
６  ランプハウス
７  光源
８  スライダ
９  開口素子
１０  コンデンサ筒
１１  コンデンサレンズ
１２  対物レンズ
１３  鏡筒部
１４  結像レンズ
１５  観察鏡筒
１６  接眼レンズ
１７  標本
２０  リングスリット
２０ａ  開口部
２１  コンデンサレンズ
２２  標本
２３  位相差用対物レンズ
２４  位相板
２４ａ  位相膜
２５  非回折光
２５ａ  非回折光による開口部の像
２６  回折光（＋１次の回折光）
２６ａ  回折光による開口部の像
２７  位相膜と像が重なっていない領域
２８  位相膜と像が重なっている領域
【図１】
0006381437.tif 000005
【図２】
0006381437.tif 000006
【図３】
0006381437.tif 000007
【図４】
0006381437.tif 000008
【図５】
0006381437.tif 000009
【図６】
0006381437.tif 000010
【図７】
0006381437.tif 000011
【図８】
0006381437.tif 000012