(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者のＨＴＬＶ−１感染および／またはＡＴＬ発症の有無の検出方法であって、
被験者由来の細胞中のＮＤＲＧ２の発現レベルを測定し、コントロール細胞中のＮＤＲＧ２の発現レベルと比較する工程；および
該比較において、被験者由来の細胞中のＮＤＲＧ２の発現レベルが、コントロール細胞中のＮＤＲＧ２の発現レベルより低下していることを指標として、被験者がＨＴＬＶ−１の感染者および／またはＡＴＬ発症者であると決定する工程
を含む、検出方法。
【請求項２】
被験者のＨＴＬＶ−１感染および／またはＡＴＬ発症の有無の検出方法であって、
被験者由来の細胞中のＮＤＲＧ２プロモーターのメチル化を測定する工程；およびメチル化がされていることを指標として、被験者がＨＴＬＶ−１の感染者および／またはＡＴＬ発症者であると決定する工程
を含む検出方法。
【請求項３】
ＮＤＲＧ２タンパク質またはそのペプチド断片に対する抗体を含むＨＴＬＶ−１感染および／またはＡＴＬ診断薬。
【請求項４】
ＮＤＲＧ２をコードするポリヌクレオチドが細胞内に導入され得る形態で含まれる、ＡＴＬの予防および／または治療のための薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（human T-cell leukemia virus type 1 ; 以下、ＨＴＬＶ−１と称する）感染および／または成人Ｔ細胞白血病（以下、ＡＴＬと称する）の発症を検出する方法、ＨＴＬＶ−１感染またはＡＴＬの診断薬、ならびにＡＴＬの予防および治療の為の薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血病は、通常のがんと異なり、固形の腫瘍を形成しないため、外科手術が適用できず、以前は治療が困難であった。ところが近年、有効な抗がん剤や治療技術の研究開発が進み、白血病の種類によっては治療することも可能になって来ている。しかし、未だ有効な予防法・治療法もなく、極めて予後が悪い白血病としてＡＴＬが知られている。ＡＴＬは、ＨＴＬＶ−１がＴ細胞に感染することにより引き起こされるウイルス性白血病である。乳幼児期の授乳などを通じて、生体内のＴリンパ球にＨＴＬＶ−１が感染することでウイルスキャリアとなる。その後、数十年の長い歳月をかけて、ウイルスや宿主細胞の遺伝子に変異が蓄積し、最終的に感染細胞の中のごく一部が異常増殖能を獲得した結果、ＡＴＬを発症すると考えられている。
【０００３】
従って、発症までの数十年の間に日々の食餌によりＨＴＬＶ−１感染細胞の増殖を抑制すること、また、たとえＡＴＬを発症したとしても抗がん剤などでＡＴＬ細胞の増殖を抑制することがＡＴＬを予防および治療する上で重要となる。しかし、既存の抗がん剤では、ＡＴＬ細胞は速やかに耐性を獲得することから、ＡＴＬの治療は困難を極めているのが現状である。
【０００４】
これまで、ＡＴＬ細胞において、ＣＣＲ４が発現していることや、ＣＣＲ４のリガンドであるthymus and activation-regulated chemokine（ＴＡＲＣ）やmacrophage derived chemokine（ＭＤＣ）が多く発現している皮膚に高率にＡＴＬ細胞が浸潤することなどが解明され（非特許文献１）、抗体を用いた分子標的治療、新たな分子の発見による発症予防やＡＴＬの進展予防などの可能性も見出されている。しかしながら、ＨＴＬＶ−1の感染からＡＴＬ発症に至る機構の詳細はいまだ不明であり、それ故に、その早期診断法や治療方法も決定的な決め手がないままである。
【非特許文献１】Ishida T, Utsunomiya A, et al. Clin. Cancer Res. 9: 3625-3634, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＡＴＬ発症の機構に関する詳細は未だに明らかではなく、ＨＴＬＶ−１感染やＡＴＬ発症を簡便に且つ短時間に判断する正確な検出法確立が待望されている。また、ＡＴＬの診断、予防および治療の為の薬剤が待望されている。
【０００６】
本発明の目的は、ＨＴＬＶ−１感染あるいはＡＴＬ発症を簡便に且つ短時間に判断することを可能にする正確な検出法を提供することにある。
【０００７】
本発明の目的はまた、ＨＴＬＶ−１感染あるいはＡＴＬの診断、ＡＴＬの予防および治療の為の薬剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者らは、鋭意検討を行い、ＨＴＬＶ−１感染やＡＴＬ発症に、ＮＤＲＧ２の発現レベルの変化が関与すること、およびＮＤＲＧ２のプロモーター領域のメチル化が関与することを見出し、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち、本発明は、被験者のＨＴＬＶ−１の感染および／またはＡＴＬ発症の有無の検出方法であって、
被験者由来の細胞中のＮＤＲＧ２の発現レベルを測定し、コントロール細胞中のＮＤＲＧ２の発現レベルと比較する工程；および
該比較において、被験者由来の細胞中のＮＤＲＧ２の発現レベルが、コントロール細胞中のＮＤＲＧ２の発現レベルより低下していることを指標として、被験者がＨＴＬＶ−１の感染者および／またはＡＴＬ発症者であると決定する工程
を含む、検出方法、を提供する。
【００１０】
上記検出方法において、ＮＤＲＧ２の発現レベルは、タンパク質の発現レベルであるか、ｍＲＮＡの発現レベルであり得る。
【００１１】
上記検出方法において、上記被験者由来の細胞およびコントロール細胞は、血清Ｔ細胞であり得る。
【００１２】
上記ＡＴＬは、急性ＡＴＬであり得る。
【００１３】
本発明はまた、被験者のＨＴＬＶ−１の感染および／またはＡＴＬ発症の有無の検出方法であって、
被験者由来の細胞中のＮＤＲＧ２プロモーターのメチル化を測定する工程；およびメチル化がされていることを指標として、被験者がＨＴＬＶ−１の感染者および／またはＡＴＬ発症者であると決定する工程、を含む検出方法を提供する。
【００１４】
上記被験者由来の細胞は、末梢血リンパ球であり得る。
【００１５】
上記ＡＴＬは、急性ＡＴＬであり得る。
【００１６】
本発明はまた、ＮＤＲＧ２タンパク質またはそのペプチド断片に対する抗体を含むＨＴＬＶ−１の感染および/またはＡＴＬ診断薬を提供する。
【００１７】
本発明はまた、ＮＤＲＧ２をコードするポリヌクレオチドが細胞内に導入され得る形態で含まれる、ＡＴＬの予防および／または治療のための薬剤を提供する。
【００１８】
本発明はまた、ＮＤＲＧ２タンパク質を有効成分として含有するＡＴＬの予防および／または治療のための薬剤を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、ＨＴＬＶ−１感染および／またはＡＴＬ発症の有無を、被験者の細胞を用いて、早期に簡便に検出することができるようになる。さらに、これまで明確な発症機構が不明で、治療に決め手がなかったＡＴＬに対し、その早期診断、予防または治療を可能にする薬剤が提供され、ＡＴＬに関する医療に大いに貢献することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の方法により検出されるのは、ＨＴＬＶ−１感染および／またはＡＴＬ発症の有無である。ＡＴＬは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１）がＴ細胞に感染することにより引き起こされるウイルス性白血病をいい、ＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞が腫瘍化した疾患である。５０歳から６０歳代に発症のピークがあり、亜急性から慢性に経過し末期に急激に進行し予後は不良であり、腫瘍細胞の起源はT細胞で、末梢血中に切れ込みや分葉核を有する白血病細胞（花弁状細胞；flower like cell）が出現し、リンパ節腫大、肝腫大、脾腫大を認める頻度が高く、しばしば皮膚病変を有す、という特徴的な臨床所見を持つ。
【００２１】
ここで、ＨＴＬＶ−１は、ヒトレトロウィルスで、宿主であるヒトのＴ細胞内では核内に移行し、ＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写により生成し、ｃＤＮＡは宿主ゲノムＤＮＡへインテグレーションする。
【００２２】
本発明においては、被験者由来の細胞中のＮＤＲＧ２の発現レベルを測定し、コントロール細胞中のＮＤＲＧ２の発現レベルと比較し、比較において、被験者由来の細胞中のＮＤＲＧ２の発現レベルが、コントロール細胞中のＮＤＲＧ２の発現レベルより低下していることを指標として、被験者がＨＴＬＶ−１の感染者および／またはＡＴＬ発症者であると決定する。
【００２３】
ここで、本発明の上記方法に供される細胞は、容易に採取することができる体液由来であることが好ましく、特に疾患との関連が明らかな血液由来であることが好ましい。最も好ましくは、血清Ｔ細胞あるいは末梢血リンパ球である。
【００２４】
本発明の方法においては、ＮＤＲＧ２の発現レベルを測定する。ここで、「ＮＤＲＧ２」とは、N-myc downstream regulated gene 2（以下、ＮＤＲＧ２）のことで、アクセッション番号として、NP_057334.1、NP_963293.1、 NP_963294.1、NP_963831.1、NP_963832.1、NP_963833.1、NP_963834.1、またはNP_963835.1で示されるいずれのタンパク質でもよい。また、本明細書においては、「ＮＤＲＧ２」をコードする遺伝子もしくはｍＲＮＡ（GenBank登録番号 NM_016250.2、NM_201535.1、NM_201536.1、NM_201537.1、NM_201538.1、NM_201539.1、NM_201540.1、またはNM_201541.1）を表す記号も、ＮＤＲＧ２と表示する場合もあり、タンパク質、遺伝子、ｍＲＮＡのいずれに対しても互換可能に使用することとする。さらに、本発明者らにより、ＮＤＲＧ２ゲノム領域の塩基置換を解析した結果で、ＡＴＬ38症例中2例(MT2、ATL185でエキソン1上流-89塩基(C>T)、同様に38症例中2例(SO4、ATL202)、イントロン4中に147塩基目(T>C)を認めた。さらに38例中1例(HUT102)にエキソン5内  NDRG2 a型 第77塩基(A>G)、第26アミノ酸残基(グルタミン>グリシン)置換が認められ、これらも本発明においては、ＮＤＲＧ２であることが明確である。さらに、これらの遺伝子およびタンパク質、その他に見いだされ得る数個の塩基あるいは数個のアミノ酸の変異を含む遺伝子、タンパク質もＮＤＲＧ２の定義に入る。
【００２５】
ＮＤＲＧ２は、脳細胞、筋細胞、腎臓細胞など、様々な種類の組織細胞において発現している（Qu, et al., Mol. Cell. Biochem., 229: 35-44, 2002、Kokame, et al., J. Biol. Chem., 271: 29659-29665, 1996、およびUlrix, et al., FEBS Lett., 455: 23-26, 1999など）。ＮＤＲＧ遺伝子は４種類に分類される可能性があると報告されている。ＮＤＲＧ遺伝子群は相同性が高いが、個人の発達と成長によって発現が異なる。それぞれのＮＤＲＧ遺伝子が異なる役割を果たすと推測されており、このうちのＮＤＲＧ２は、遺伝子の細胞の分化、増殖、アポトーシスなどに関与し、固形の特定の癌に関与する癌抑制遺伝子である可能性があるとの研究結果が報告されている。例えば、浸潤性の髄膜腫などでＮＤＲＧ２の遺伝子発現の低下がゲノム解析によって認められている（Lusis, E. A. et al., Cancer Res., 65: 7121-6, 2005）。ＮＤＲＧ２のｍＲＮＡ量について、肝臓癌と膵臓癌で著しく低下しているとの報告もある（Hu, X. L. et al., World J. Gastroenterol., 10: 3518-21, 2004）。しかしながら、その機能の詳細は未だ明かでない点が多く、また、ＡＴＬ細胞との関係については、これまで一切言及された知見はない。
【００２６】
本発明において、コントロール細胞とは、ＨＴＬＶ−１非感染細胞であり、ヒトあるいは動物の正常細胞から樹立され、かつ正常であることが明らかな細胞；ＨＴＬＶ−１のキャリアではない健常者由来の血液由来細胞；または、ＨＴＬＶ−１非感染Ｔ細胞リンパ性白血病細胞株を指す。
【００２７】
ＮＤＲＧ２の発現レベルは、細胞中のタンパク質自体を定量することによって測定することができる。測定方法は、特に限定されず、当業者に公知の様々なタンパク質定量方法を用いることができる。例えば、二次元電気泳動を含むゲル電気泳動を組み込んだプロテオーム解析、ＬＣ−ＭＳを利用したショットガン法、ＮＤＲＧ２に対する抗体を使用してのウェスタンブロッティング法、免疫測定法などである。
【００２８】
これらのＮＤＲＧ２の発現レベルは、細胞中のタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡ転写物を定量することによって測定することも可能である。ｍＲＮＡ転写物を定量する方法は、特に限定されず、当業者に公知の様々な定量方法の１つまたは組合せを用いることができる。これらの方法には、例えば、ハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング法、ポリメラーゼ連鎖反応、およびＤＮＡアレイを用いる方法などやそれらの組合せである。このうち、ポリメラーゼ連鎖反応には、リアルタイムＰＣＲやマルチプレックスリアルタイムＰＣＲなどが含まれる。
【００２９】
さらに、連続的遺伝子発現解析法（ＳＡＧＥ）やその改良法、超並列的な遺伝子ビーズクローン解析法（ＭＰＳＳ）、ＥＳＴ法なども挙げられ、定性的かつ定量的にＮＤＲＧ２のｍＲＮＡ転写物の発現レベルを調べることが可能である。ＳＡＧＥでは、各転写物についての個々のハイブリダイゼーションプローブを提供する必要なく、多数の遺伝子転写物の同時定量分析が可能である。まず、ＮＤＲＧ２をコードする遺伝子の転写物を固有に同定するのに十分な情報を含む短配列タグ（約１０〜１４塩基対）が、このタグが各転写物中の固有の位置から得られるという条件で生成される。次いで、多数の転写物を連結させて、配列決定され得る長い連続分子を形成し、同時に多重タグの同一性を明らかにする。転写物の任意の集団の発現パターンが、個々のタグの存在量を決定し、そして各タグに対応する遺伝子を同定することによって定量的に評価され得る。
【００３０】
超並列的な遺伝子ビーズクローン解析法（ＭＰＳＳ）は、Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：６３０〜６３４（２０００）によって記載され、非ゲルベースのシグニチャー配列決定と個々の直径５μｍのマイクロビーズ上の何百万ものテンプレートのインビトロクローニングを組み合わせる配列決定アプローチである。まず、ＤＮＡテンプレートのマイクロビーズライブラリーが、インビトロクローニングによって構築される。続いて、高密度で（代表的には、３×１０６個のマイクロビーズ／ｃｍ２よりも高い密度で）フローセル中のテンプレート含有マイクロビーズの平面アレイを組み立てる。各マイクロビーズ上のクローン化テンプレートの自由端は、ＤＮＡフラグメント分離を必要としない蛍光ベースのシグニチャー配列決定法を用いて同時に分析される。この方法により、単一の操作で、酵母ｃＤＮＡライブラリーから数十万の遺伝子シグニチャー配列が同時にかつ正確にもたらされ得る。
【００３１】
遺伝子同定のための発現配列タグ（Expressed sequence tag: EST）法では、任意に断片を選択し、高速塩基配列決定を行うことによって、ｃDNAライブラリーの特徴を明らかにすることが可能で、これにより、ＮＤＲＧ２遺伝子の発現の有無や量を確認することもできる。
【００３２】
本発明においては、被験者由来の細胞中のＮＤＲＧ２の発現レベルとコントロール細胞中のＮＤＲＧ２の発現レベルとを測定した結果、見出されるＮＤＲＧ２の発現レベルの差異がある場合を、被験者のＡＴＬ発症の指標にするが、「発現レベルの差異」は、当業者に公知のいずれかの測定手段において、具体的な基準は適宜設定することができる。特に限定はされないが、例えば、被験者から採取した細胞中において、少なくともタンパク質かｍＲＮＡのどちらかの発現レベルが、コントロール細胞中の発現レベルと比較して、１／２程度以下であれば、明らかに差異があるということができる。
【００３３】
本発明ではまた、被験者由来の細胞中のＮＤＲＧ２プロモーターのメチル化を測定する工程；およびメチル化がされていることを指標として、被験者がＨＴＬＶ−１の感染者および／またはＡＴＬ発症者であると決定する。
【００３４】
ここで、本発明の上記方法に供される細胞は、特に限定はされないが、容易に採取することができる体液由来であることが好ましく、特に血液由来であることが好ましい。最も好ましくは、血清Ｔ細胞あるいは末梢血リンパ球である。
【００３５】
ＮＤＲＧ２遺伝子プロモーターのメチル化は、プロモーター領域のＣｐＧが存在する領域を重点的に調べることで検出できる。その手法は特に限定されないが、例えば、バイサルファイト処理後のゲノムＤＮＡを鋳型にし、シトシンからウラシルへの変化の有無を見る目的で、プロモーター配列に特異的な領域をＰＣＲ法で増幅させ、その後塩基配列を同定する方法；メチル化特異的認識プライマーセットと低（非）メチル化特異的認識プライマーセットを適宜設定して行うＰＣＲ法後、増幅産物の可視化により比較する方法；ＤＮＡのメチル化部位の検出を、メチル化感受性制限酵素で行う解析手法；および予想されるメチル化ＤＮＡのサイトにプローブを設計して解析する、マルチプレックスライゲーションプローブ増幅法（Multiplex Ligation Probe Amplification法）などが例示される。
【００３６】
メチル化は、正常細胞でも起こりうる。従って、ここで「メチル化がされていることを指標として」とは、プロモーターのＣｐＧの領域の塩基に一つでもメチル化があれば、それを直ちにＨＴＬＶ−1感染あるいはＡＴＬ発症と判断するのではなく、コントロール細胞中におけるメチル化の頻度と比較して、頻度が多い場合を指標とすることも含む。例えば、ＮＤＲＧ２のエキソン１の上流−１１２ｂｐから−４３２ｂｐにおけるＣｐＧの存在で図６aにおいて模式的に示した１６個のＣｐＧのうち、メチル化頻度が、７／１６以上、好ましくは、９／１６以上であればメチル化を指標としてＨＴＬＶ−１感染またはＡＴＬ発症を確認することが可能である。このような頻度の測定は、限定はされないが、例えば、ＮＤＲＧ２のエキソン１の上流−１１２ｂｐから−４３２ｂｐの領域を、この領域を挟むように適宜設定されるプライマーセットを用いたＰＣＲ手法により増幅させ、その塩基配列を決定することにより行うことができる。
【００３７】
あるいは、メチル化を指標とする場合には、本発明のメチル化特異的認識プライマーセットを用いて行うＰＣＲの結果を元に判断することも可能である。このようなメチル化特異的認識プライマーセットは、低（非）メチル化特異的認識プライマーセットと共に用いられることが好ましい。メチル化特異的認識プライマーセットは、ＮＤＲＧ２遺伝子のプロモーター領域のうち、限定はされないが、例えば、ＣｐＧの多い、エキソン１の上流−１２４から−２９８の領域を挟むように適宜設定することで、作成できる。低（非）メチル化特異的認識プライマーセットは、メチル化特異的認識プライマーセットと同じ配列のプライマーを、例えばフォワードプライマーのすべてのＣをＴに変更し、リバースプライマーのすべてのＧをＡに変更することで作成することができる。このようなプライマーセットを用いて、例えばバイサルファイト処理した鋳型をＰＣＲで増幅し、例えば検出バンドの有無でメチル化の有無を判断することができる。
【００３８】
本明細書においてはまた、ＮＤＲＧ２タンパク質に対する抗体を含むＨＴＬＶ−１の感染および／またはＡＴＬ発症の診断薬、ＮＤＲＧ２を細胞中で強制発現させる為のＮＤＲＧ２遺伝子を含む、ＡＴＬの予防および／または治療のための薬剤、ＮＤＲＧ２を含む、ＡＴＬの予防および／または治療のための薬剤が提供される。
【００３９】
本発明で使用する、抗体産生の為に使用する、あるいは予防、治療の為の薬剤に使用するＮＤＲＧ２は、公知のもの、例えば、ヒトtall由来の細胞株（ＭＯＬＴ４）、ヒト末梢血の単球あるいは臍帯血幹細胞から分化した樹状細胞に由来するＮＤＲＧ２（ＰＣＴ／ＫＲ２００４／０００６３４）等を使用することが出来るが、これに限定されない。また、ＮＤＲＧ２のタンパク質や断片ペプチドは、既知の情報を元に、化学的または遺伝子工学的に合成してもよい。
【００４０】
ＮＤＲＧ２タンパク質に対する抗体は、免疫反応において、ＮＤＲＧ２の抗原の刺激により生体内に作られ、ＮＤＲＧ２タンパク質と特異的に結合するタンパク質またはその改変体をいう。ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体でもどちらでも使用し得るが、特にモノクローナル抗体を好都合に使用し得る。さらに、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含むがそれらに限定されない。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。
【００４１】
抗体は、通常、ＮＤＲＧ２タンパク質あるいは抗原を含むそのペプチド断片を、適切な動物に投与して免疫することによって生成される。
【００４２】
モノクローナル 抗体には、全免疫グロブリン分子ならびにＦａｂ分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、およびもとのモノクローナル 抗体分子の免疫学的結合特性を示す他の分子を含む。ポリクローナル抗体およびモノクローナル 抗体を作製する方法は当該分野で周知である。
【００４３】
抗体の作製は、当該分野において周知である。例えば、ポリクローナル抗体の作製は、ＮＤＲＧ２タンパク質を構成するポリペプチドの全長または部分断片精製標品、タンパク質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドなどを抗原として用い、動物に投与することにより行うことができる。
【００４４】
抗体を生産する場合、投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。ＮＤＲＧ２タンパク質の断片であるペプチドを用いる場合には、スカシガイヘモシアニンまたはウシチログロブリン等のキャリアタンパク質に共有結合させたものを抗原とすることもできる。その抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに２〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に採血し、その血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法等で確認する。
【００４５】
血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、その血清より、周知技術を用いてポリクローナル抗体を分離、精製することができる。
【００４６】
モノクローナル抗体の作製もまた当該分野において周知の方法によって得ることができる。例えば、ＮＤＲＧ２タンパク質またはその断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として使用し、骨髄腫細胞との融合により、ハイブリドーマの作製を行う。その後、酵素免疫測定法になどによって、ＮＤＲＧ２タンパク質またはその断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。得られたハイブリドーマから、所望の性質のモノクローナル抗体を得て、本発明の診断薬に使用することができる。
【００４７】
診断薬とするには、抗体をそのままあるいはキットの形で緩衝液、使用説明書と共に供することが可能である。
【００４８】
次に、ＮＤＲＧ２をコードするポリヌクレオチドが細胞内に導入され得る形態で含まれているＡＴＬの予防および／または治療のための薬剤は、好ましくは、ＮＤＲＧ２をコードするポリヌクレオチドが細胞内に導入され得る形態でかつｍＲＮＡやタンパク質を強制発現させることができるものである。
【００４９】
より具体的には、このようなＮＤＲＧ２をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入可能な状態とするためには、当業者に公知のいずれの方法をも取ることができる。例えば、ポリヌクレオチドを直接導入したり（例えば、米国特許第5,580,859号参照）、あるいは組換えウイルスベクターの形態で製剤化して導入したりすることができる。あるいは非ウイルスの導入法も知られており、本発明で好ましく使用可能である。
【００５０】
細胞に導入するのにウイルスを使用する場合の好ましいウイルスベクターとしては、バキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、パラミクソウイルス科またはピコルナウイルス科から選ばれるウイルスのゲノムに由来するものを使用できる。各々の親ベクターの都合のよい長所を利用したキメラベクターもまた用いることができる。このようなウイルスゲノムは、複製欠損性か、条件により複製するか、または複製コンピテントへと改変され得る。より具体的には、ベクターがアデノウイルスの場合は、例えば、ヒトアデノウイルスゲノムに由来する複製非コンピテントベクター（米国特許第6,096,718号；6,110,458号；6,113,913号；5,631,236号参照）；アデノ随伴ウイルスなどが使用できる。レトロウイルスゲノムに由来するベクターである場合、レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（MuLV）、テナガザル白血病ウイルス（GaLV）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、およびそれらの組合せを主成分とするものが含まれる（例えば、米国特許第6,117,681号；6,107,478号; 5,658,775号; 5,449,614号；Buchscher（1992）J. Virol. 66:2731-2739; Johann（1992）J. Virol. 66:1635-1640参照）。パラミクソウイルス科に含まれるセンダイウイルス（ＨＶＪ）なども好都合に用いられる。
【００５１】
生体より取り出した組織あるいは細胞にポリヌクレオチド発現ベクターを導入した後に生体に戻すex vivo法を用いることもできる。この場合は、ポリヌクレオチドを組込んだ発現ベクターを、例えばマイクロインジェクション法やエレクトロポーレーション法等の公知のトランスフェクション法により細胞内に導入する方法を採用することができる。
【００５２】
ウイルスベクターや発現ベクターにおいて、ポリヌクレオチドは、それが全身性または血液細胞特異的に発現するような任意のプロモーター支配下に連結されるようにすることができる。
【００５３】
その他、エマルションＤＤＳ法、リポソーム法などの公知の薬剤送達法を用いることで、本発明のＮＤＲＧ２遺伝子を所望の細胞に送達させ、ＮＤＲＧ２を効率よく発現させることが可能である。
【００５４】
ＮＤＲＧ２タンパク質を有効成分として含有するＡＴＬの予防および／または治療のための薬剤の調製には、ＮＤＲＧ２タンパク質を抽出するか作成することが必要である。大量に安価に入手するには、ＮＤＲＧ２タンパク質（ポリペプチド）を、ＮＤＲＧ２をコードするポリヌクレオチドを用いた遺伝子工学的方法により作成することが好ましい。またポリヌクレオチドを公知の方法により適当な発現ベクターに組換えれば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞の発現産物としてＮＤＲＧ２ポリペプチドを得ることができる。
【００５５】
ＮＤＲＧ２ポリペプチドはまた、周知の化学合成法（例えば、Merrifield, R.B. J. Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of tetrapeptide. J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963； Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, W.C. and White, P.D., Oxford University Press, 2000）等に準じて合成することもできる。
【００５６】
ＮＤＲＧ２を含む薬剤として、ペプチド誘導体が含まれる。この誘導体は、体内に導入された場合の物理的化学的安定化を促進するための修飾や生体内の代謝に対する安定性と不安定性、条件付けの等の活性化修飾等を含む。
【００５７】
ペプチド誘導体とするための修飾には、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合、脱メチル化、交差架橋共有結合形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、脂質結合、硫酸化、セレノイル化等が含まれる。ＮＤＲＧ２ポリペプチドの活性を保持したまま、含有する組成物に毒性を与えない範囲において、アミノ酸残基の側鎖またはＮ末端基もしくはＣ末端基として生じる機能性基として調製することができる。例えば、血液あるいは細胞中でポリペプチドの残存を延長するポリエチレングリコール側鎖を含む誘導体、あるいはカルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアとまたは第１級もしくは第２級アミンと反応することによるカルボキシル基のアミド、アシル部分と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体またはアシル部分と形成される遊離の水酸基（たとえば、セリルまたはスレオニル残基の水酸基）のＯ−アシル誘導体等である。
【００５８】
ＮＤＲＧ２を含む薬剤のさらに別の形態は、薬理学的に許容し得る塩であり得る。この塩は、ポリペプチドのカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両者を意味する。カルボキシル基の塩は、当該技術分野における公知の方法によって形成することができ、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛などの無機塩、およびトリエタノールアミン、アルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカインなどのようなアミンを用いて形成されたような有機塩基との塩が含まれる。酸付加塩としては、たとえば塩酸または硫酸などの鉱酸との塩およびたとえば酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩を含む。このようなあらゆる塩は、ＮＤＲＧ２活性を保持した形で提供され得る。
【００５９】
このようなＮＤＲＧ２ポリペプチドを細胞内に導入可能な形態に製剤化するためには、公知の様々な手段を採用することができる。例えば、ポリペプチドのＮ末端側に細胞膜通過ペプチドを連結させた融合ポリペプチドの使用である。融合ポリペプチドは、融合ポリヌクレオチドを用いて、遺伝子工学的に作製することができる。
【００６０】
また、ex vivo法によるＮＤＲＧ２ポリペプチドの細胞内導入の場合には、脂質（BioPORTER：Gene Therapy Systems社、米国、Chariot：Active Motif社、米国等）による導入法を採用することもできる。
【００６１】
本明細書で、「治療」とは、完全治癒のほか、症状を改善させること、一定程度の進展防止、進展遅延も含む広い概念である。
【００６２】
本発明ではさらにまた、ＨＴＬＶ−１の感染者および／またはＡＴＬ発症者の検出をより簡易に実施する為に、以下のようなキットを作成することも可能である。
【００６３】
すなわち、ＮＤＲＧ２に由来する塩基配列に含まれる連続する少なくとも１０ヌクレオチド、又はそれらと相補的な塩基配列の少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を含んでなる、ＨＴＬＶ−１の感染者および／またはＡＴＬ発症者を検出する為のキットが提供される。
【００６４】
このようなキットに含まれるオリゴヌクレオチドをプローブとして、例えば、ノーザンブロッティング手法を用い、細胞におけるｍＲＮＡの解析を行うことで、細胞中に含まれるＮＤＲＧ２コード遺伝子に対応するＲＮＡ量の変化を簡便に調べることが可能である。キットに含まれる他の成分は、緩衝液、発現レベルの比較などを示す指示書などである。
【００６５】
さらに、これらのオリゴヌクレオチドを複数固体支持体上に固定化したＤＮＡアレイを作成することによって、効率的に検出を行うことも可能である。
【００６６】
また、他の態様では、ＨＴＬＶ−１の感染者および／またはＡＴＬ発症者を検出する為のキットであって、ＮＤＲＧ２の塩基配列に含まれる連続する少なくとも１０ヌクレオチド、又はそれらと相補的な塩基配列の少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマー、およびこれと同じ配列で、別の領域に含まれる連続する少なくとも１０ヌクレオチド、又はそれらと相補的な塩基配列の少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーとの対からなる群より選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーの対を含んでなる、ＨＴＬＶ−１の感染者および／またはＡＴＬ発症者を検出する為のキットが提供される。すなわち、上記各塩基配列から適宜選択し得るプライマーの対を含んでなる、ＨＴＬＶ−１の感染者および／またはＡＴＬ発症者を検出する為のキットが提供される。このようなキットに含まれる１つのそれぞれの対、あるいは２つ以上のそれぞれの対を、ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマー対として用い、細胞中に含まれるｍＲＮＡ量の発現レベルあるいはｃＤＮＡ量を測定し、比較することが可能である。
【００６７】
さらに、他の態様では、ＮＤＲＧ２のプロモーター領域のメチル化部位を検出できるようなプライマーセットを含む、ＨＴＬＶ−１の感染者および／またはＡＴＬ発症者を検出する為のキットが提供される。このようなプライマーセットは、限定はされないが、フォワード 5’-TTTTCGAGGGGTATAAGGAGAGTTTATTTT-3’（配列表の配列番号１）およびリバース5’-CCAAAAACTCTAACTCCTAAATAAACA-3’（配列表の配列番号２）が代表例として示される。
【００６８】
別のメチル化検出の態様では、メチル化特異的プライマーセットを含む、ＨＴＬＶ−１の感染者および／またはＡＴＬ発症者を検出する為のキットが提供される。このキットには、限定はされないが、比較対照用として、低（非）メチル化特異的プライマーセットが含まれることが好ましい。
【００６９】
ここで、メチル化特異的プライマーセットとしては、フォワード5’-TTTTTCGGGTATTGCATTTAGC-3’ （配列表の配列番号３）及び、リバース5’-TAAATAAACAAACGCAAAAACGAA-3’ （配列表の配列番号４）が代表例として示される。低（非）メチル化特異的認識プライマーセットとしては、フォワード5’-TTTTTTGGGTATTGTATTTAGT-3’ （配列表の配列番号５）およびリバース5’-TAAATAAACAAACACAAAAACAAA-3’（配列表の配列番号６）が代表例として示される。
【００７０】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。しかしながら、本実施例は、本発明の具体例を示すのみで、本発明は、下記実施例に限定されるものではない。
【００７１】
なお、実施例において使用した細胞は、次のように調製した。
（健常人由来ＣＤ４陽性細胞及び患者検体）
ＨＴＬＶ−１に感染していない健常人、もしくは、ＡＴＬ患者ヘパリン加末梢血をHistopaque (シグマアルドリッチ)による比重遠心法を用いて単核球を遠心分離した。急性型ＡＴＬ患者では、末梢血ＡＴＬ分画が90%異常の検体を解析に用いた。また健常人のＣＤ４陽性細胞はＣＤ４＋  Ｔ細胞 アイソレーションキットII (Miltenyi Biotec)によりＣＤ４＋Ｔ細胞以外の細胞をＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ  １６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＴＣＲγ/σ、Glycophorin Aに対するビオチン標識抗体カクテルによりAuto MACS (Miltenyi Biotec)を用いて分離した。
【００７２】
（細胞株及び培養法）
実験に用いた細胞株は次の通りである。ＨＴＬＶ−１非感染Ｔ細胞リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）細胞株としてJurkat、MOLT4、MKB-1、KAWAI、ＨＴＬＶ−１感染細胞株としてHUT102、MT2、ＩＬ２非依存性ＡＴＬ細胞株ED-40515(-)、Su9T-01、S1T、ＩＬ２依存性ＡＴＬ細胞株KOB、KK1、SO4を、それぞれＩＬ−２ (50 U/ml)添加もしくは無添加のfetal bovine serum (FBS)を10%添加したRPMI1640培養液で37 度、5%二酸化炭素下で培養した。
【実施例１】
【００７３】
（ＮＤＲＧ２をコードするｍＲＮＡ量測定によるＨＴＬＶ−１感染またはＡＴＬ発症の検出）
染色体１４ｑ１１領域のＮＤＲＧ２遺伝子近傍の遺伝子９個について、Ｔ−ＡＬＬ（Ｔリンパ性急性白血病）細胞株２株(Jurkat、MOLT4)とＨＴＬＶ−１感染細胞株3株（HUT102、MT2、OMT）及びＡＴＬ細胞株６株（ED-40515(-)、Su9T-01、S1T、KOB、KK1、SO4）を用いて半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて遺伝子発現を検討した。
【００７４】
まず、細胞1 x 107個からトリアゾール溶解液 (インビトロジェン)を用いてtotal RNAを抽出し、total RNA 1 μgを用いてRNA PCR Kit ver3.1 AMV-RT  （タカラバイオ）により逆転写反応を行い、cDNAを作製した。
【００７５】
次に、それぞれの細胞株、健常人由来CD4陽性リンパ球、患者由来ATL細胞より作製したcDNAを用いて遺伝子発現の検討を行った。遺伝子発現の検討に用いた遺伝子群に対してそれぞれに特異的なプライマーを作製し、1から10  ngのcDNAを鋳型としてそれぞれのPCR反応条件により遺伝子増幅を行なった。内部標準として β−アクチン遺伝子発現量を用いた。ＮＤＲＧ２遺伝子特異的プライマーとしては、フォワード5’-CTGGAACAGCTACAACAACC-3’（配列表の配列番号７） 、リバース 5’-TCAACAGGAGACCTCCATGG-3’ （配列表の配列番号８）を用い、アニーリング温度58℃、サイクル数37回で行った。β-アクチン遺伝子特異的プライマーは、フォワード 5’-GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT-3’（配列表の配列番号９）、リバース 5’-TGATCCACATCTGCTGGAAGGT-3’（配列表の配列番号１０）を用い、アニーリング温度55℃、サイクル数25回で行った。
【００７６】
その結果、ＮＤＲＧ２遺伝子は、Ｔ−ＡＬＬ細胞株２株において発現が認められ、一方、ＨＴＬＶ−１感染細胞株及びＡＴＬ細胞株全例において特異的な発現低下が認められた（図１）。
【００７７】
さらにＮＤＲＧ２遺伝子発現の低下を定量的リアルタイムＰＣＲ法により、Ｔ−ＡＬＬ細胞株４株(Jurkat、MOLT4、MKB-1、KAWAI)、ＨＴＬＶ−１感染細胞株２株（HUT102、MT2）及びＡＴＬ細胞株６株（ED-40515(-)、Su9T-01、S1T、KOB、KK1、SO4）を用いて定量した。
【００７８】
合成したcDNA 10  ngを鋳型としてＮＤＲＧ２遺伝子特異的プライマーとして、フォワード5’-CTGGAACAGCTACAACAACC-3’（配列表の配列番号７） 、リバース 5’-TCAACAGGAGACCTCCATGG-3’ （配列表の配列番号８）もしくはβ-アクチン遺伝子特異的プライマー(フォワード 5’-GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT-3’（配列表の配列番号９）、リバース 5’-TGATCCACATCTGCTGGAAGGT-3’（ 配列表の配列番号１０）とSYBR GREEN(R) PCR Master Mix (Applied biosystems) を混合し、ABI PRISM(R) 7000 Sequence Detection SystemでＰＣＲ反応４０  サイクル （95 度 10 秒、60 度 1 分)を行なった。データは増幅曲線と閾値の交点からCt(Threshold Cycle)値を求めるCrossing Point法を用いて解析した。得られたCt値と標準サンプル(Juraket細胞由来のcDNA)の段階希釈液を用いて作成した検量腺に基づいてＮＤＲＧ２遺伝子とβ-アクチン遺伝子の発現量を算出し、それぞれの検体で、ＮＤＲＧ２遺伝子の発現量/β−アクチン遺伝子の発現量を算出し、基準となる検体の値で割る事で補正した。
【００７９】
その結果Ｔ−ＡＬＬ細胞株4株と比較してＨＴＬＶ−１感染細胞株及びＡＴＬ細胞株8株では発現量が約10分の1以下に減少していた（図２）。さらに健常人由来CD4陽性T細胞9例と患者由来急性型ＡＴＬ細胞１３例を用いて定量的リアルタイムＰＣＲ法による遺伝子発現解析を行なったところ急性型ＡＴＬ細胞全例において有意に発現低下が認められた（T検定； p<0.001）（図３）。以上の結果から、ＮＤＲＧ２遺伝子は、ＡＴＬ細胞および急性型ＡＴＬ細胞において、転写抑制されていることがわかった。
【実施例２】
【００８０】
（ＮＤＲＧ２のタンパク質発現量測定によるＨＴＬＶ−１感染またはＡＴＬ発症の検出）
（１）抗体
ＮＤＲＧ２タンパク質発現を同定する目的で、ウサギ抗ヒトＮＤＲＧ２抗体を調製した。ＮＤＲＧ２ペプチド（ＮＤＲＧ２ Ｂ型 (NP_057334 ) １７−３１  アミノ酸残基 PGQTPEAAKTHSVET（配列表の配列番号１１）を合成し、家兎に免疫、さらに免疫後血清よりIgG分画を精製し、ペプチド固層カラムを用いた精製を行ない作製した。その他の抗体としてマウス抗β-アクチン(AC-15) モノクローナル抗体(A5441)、ウサギ抗ＦＬＡＧポリクローナル抗体 (F7425)、マウス抗ＦＬＡＧ (M2)モノクローナル抗体 (F1804) (シグマアルドリッチ)を使用した。また二次抗体としてワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウス IgG 抗体(NA931V) (GE Healthcare) ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギ IgG 抗体(P0399) (Dako Cytomation)、及びAlexaFluor 546標識抗ヤギ抗マウスIgG (重鎖、軽鎖)抗体 、フルオロセン標識ヤギ抗ウサギIgG (重鎖、軽鎖)抗体(Molecular Probe)を使用した。
【００８１】
（２）ＮＤＲＧ２タンパク質発現の検出
各種白血病細胞並びに健常人ＣＤ４陽性Ｔリンパ球、急性型ＡＴＬ白血病細胞を用いてＮＤＲＧ２タンパク質発現をβ−アクチンタンパク質発現を標準コントロールとしてウエスタン法により検討した。
【００８２】
ウエスタンブロット法は、細胞1 x 106  個を回収後PBSで洗浄し、1x SDS 緩衝液(62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% w/v SDS, 10% glycerol, 50 mM DTT, 0.01% w/v bromophenol blue)を150 μl加えて、95 度で5 分間煮沸後、遠心し8 x 104  細胞/レーンを 10％アクリルアミドゲル(アクリルアミド:ビスアクリルアミド=36.5:1)を作製し、ミニプロテアン3セル (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)により定電圧100  V・２ 時間時間泳動した。ゲルはミニトランスブロットセル(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) (400  mA・3 時間)を用いてPVDF 膜(Millipore, Bedford, MA) に転写し、転写膜は1％w/v Bovine Serum albumin (BSA)添加TBS/T緩衝液(150   mM NaCl,、100 mM Tris-HCl pH 7.4、0.1% w/v Tween20)によりで室温、２ 時間ブロッキング反応を行なった。 Can Get signal(R) Solution1(TOYOBO)で2000倍希釈後の一次抗体液を用いて4度で一晩反応させ、TBS/T 緩衝液にて５分×3回洗浄した。さらに Can Get signal(R) Solution2(TOYOBO)にて3000倍希釈後の二次抗体液にて室温で1時間反応させ、その後TBS/T緩衝液にて５分×3回洗浄した。洗浄後Lumi lightPLUS Western Blotting kit(Roche Applied Science)にて化学発光させ、ルミノイメージアナライザーLAS-3000 (富士フイルム(株))で画像解析を行った。
【００８３】
その結果、Ｔ−ＡＬＬ由来４細胞株(Jurkat、MOLT4、MKB-1、KAWAI )においては、43 kDaのＮＤＲＧ２と考えられる単一バンドが見られた。ＡＴＬ細胞株の多くはバンドを検出できなかったが、ED−40515(-)（図ではEDとのみ表記）及びSu9T-01（図ではSu9Tとのみ表記）細胞株において薄いバンドが検出され、mRNA発現低下に相関した結果が得られた（図４a）。さらに健常人由来CD4陽性Tリンパ球では、同様に43 kDaの単一バンドが見られたが、患者由来ATL細胞において5例中3例に弱いバンドが検出されたが、全体にＮＤＲＧ２タンパク質発現レベルの低下が見られた（図４b）。従って、ＡＴＬ細胞においてＮＤＲＧ２はｍＲＮＡ発現に相関したタンパク質発現が低下していた。
【実施例３】
【００８４】
（ＮＤＲＧ２のプロモータ領域のメチル化測定によるＡＴＬ発症の検出）
ＮＤＲＧ２遺伝子の発現抑制機構の解析
まずDNAメチル化阻害剤である5-aza-dC (5-aza-2’-deoxycytidine)もしくはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるTSA (Trichostatin A)をＡＴＬ細胞株に作用させ遺伝子発現の変化を検討した。コントロールとしてＴ−ＡＬＬ (Tリンパ性急性白血病)細胞株４株(Jurkat、MOLT4、MKB-1、KAWAI )、ＨＴＬＶ−１感染細胞株2株(HUT102、MT2)、ＡＴＬ細胞株6株(ED-40515(-)、Su9T-01、S1T, KOB、KK1、SO4 )を用いた。その結果Ｔ−ＡＬＬ細胞株では発現の変化が見られなかったがＨＴＬＶ−１感染細胞株及びＡＴＬ細胞株全８株中、5-aza-dc処理により７株(HUT102、ED-40515(-)、Su9T-01、S1T, KOB、KK1、SO4)、TSA処理により７株(MT2、ED-40515(-)、Su9T-01、S1T, KOB、KK1、SO4)において発現の回復が認められた(図５)。従ってＮＤＲＧ２遺伝子発現低下の原因の一つとしてエピジェネティックなゲノム異常が関係している可能性が示唆した。
【００８５】
次に、ＮＤＲＧ２遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡメチル化の証明を行なう目的でバイサルファイトシークエンス法を用いて検討した。ＮＤＲＧ２ エキソン1の上流−１１２ｂｐから−４３２ｂｐにはCpGが１６箇所存在する(図6a)。バイサルファイト処理することによりDNA中のシトシンがウラシルに変化するが、DNAメチル化されているシトシンは変化しない為、処理後の塩基配列を調べることでメチル化の状態を調べることができる。バイサルファイト・シークエンス(BSS)法を用いたDNAメチル化解析において、ゲノムDNAに対するバイサルファイト処理は幸田らの方法に準拠した（幸田  尚  実験医学 24,1793-1797(2006)）。200ngのゲノムDNAは10μlの200 mM NaOH溶液にて15 分間・室温でアルカリ変性を行ない、その後バイサルファイト溶液(2.5 M Sodium bisulfite、10 mM Hydroquinone、240 mM NaOH)を200 ・l加え、遮光下55 度で4 時間反応させた。さらにエタノール沈殿後90μlの蒸留水に溶解し10 μlの2 M NaOHを加え37 度で15 分反応させ再度エタノール沈殿を行ない10 μlのTE緩衝液(1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.6)に溶解させた。バイサルファイト処理したゲノム DNAを鋳型としNDRG2プロモーター領域 (エキソン1上流領域-112から-432 bp)を増幅した。このゲノム断片(Genbank NC_000014、20,564,110bp-20,563,790bp)にはCpGが16箇所存在する。バイサルファイト修飾後DNA断片はプライマーフォワード 5’-TTTTCGAGGGGTATAAGGAGAGTTTATTTT-3’（配列表の配列番号１）およびリバース 5’-CCAAAAACTCTAACTCCTAAATAAACA-3’（配列表の配列番号２）により、ＰＣＲ反応40サイクル (98度 10秒、60度 30秒、72度 30秒)で増幅した。さらにＰＣＲ産物はpTA2ベクター (TOYOBO)に挿入し、各10クローンの塩基配列を同定しＤＮＡメチル化の頻度を評価した。
【００８６】
その結果健常人リンパ球5症例(#1-#5)ではそれぞれ１０クローンの検討により全１６ CpG中、0個から5個の範囲で、CpG領域がメチル化されていた（図６ｂ）。それに対して急性型ＡＴＬ細胞5例(ATL144、ATL147、ATL148、ATL160、ATL162)では全10クローンを解析し、それぞれ１１から１６すべてのCpG領域で高頻度にメチル化を受けていた（図６ｃ)。この健常人リンパ球５症例と急性型ＡＴＬ５症例におけるＮＤＲＧ２遺伝子発現は、有意に遺伝子発現に差を認めている。従ってＡＴＬ細胞における高頻度DNAメチル化が見られ、診断の指標になることが示された。
【００８７】
次に、この結果を受けてメチル化特異的ＰＣＲ法(Methyl Specific PCR法)を開発した。ＮＤＲＧ２遺伝子発現量を反映して高メチル化状態と低(非)メチル化状態を区別できるメチル化特異的プライマーを作製し、PCRにより多数のDNAを用いてメチル化状態の検討を行った。ＮＤＲＧ２遺伝子プロモーター領域(エキソン1上流-124から-298  bp、Genbank NC_000014の20,564,128bp-20,563,929bp) にはCpGが10箇所存在するため、この領域に対するメチル化特異的PCRプライマーを設計した。メチル化特異的認識プライマーセットとして、フォワード 5’-TTTTTCGGGTATTGCATTTAGC-3’（配列表の配列番号３）およびリバース5’-TAAATAAACAAACGCAAAAACGAA-3’ （配列表の配列番号４）を、低（非）メチル化特異的認識プライマーセットとして、フォワード5’-TTTTTTGGGTATTGTATTTAGT-3’ （配列表の配列番号５）及び、リバース 5’-TAAATAAACAAACACAAAAACAAA-3’（配列表の配列番号６）を作製し、バイサルファイト処理後のゲノムDNAを鋳型としてPCR反応40サイクル(98度 10秒、メチル化反応 64度もしくは低（非）メチル化反応 60度 5秒、72度 30秒)を行なった。それぞれのプライマーにより増幅されたDNA断片をアガロース電気泳動により確認し、DNA完全メチル化(メチル化プライマー反応(+)、低（非）メチル化プライマー反応(-))、部分メチル化(メチル化プライマー反応(+)、低（非）メチル化プライマー反応(+))、低（非）メチル化(メチル化プライマー反応(-)、低（非）メチル化プライマー反応(-))により判別した。
【００８８】
その結果、健常人末梢血リンパ球6検体(#1-#6)において、すべて低（非）メチル化プライマー(UM)のみでDNAの増幅が見られ、メチル化プライマー(M)によるDNAの増幅は見られなかった。また急性型ＡＴＬ細胞6症例(ATL66、ATL144、ATL147、ATL148、ATL160、ATL162)低（非）メチル化プライマー(UM)ではDNAの増幅が見られなかったが、メチル化プライマー(M)によりDNAの増幅が見られ、プロモーター領域のメチル化が証明された。 （図6d）。さらに健常人末梢血リンパ球5検体、急性型ＡＴＬ 33症例を追加検討したところ健常人11例ですべて低（非）メチル化、急性型ＡＴＬ39例で部分メチル化4例及び完全メチル化35例の結果となった（表１）。
【表１】
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またT-ALL細胞株4株(Jurkat、MOLT4、MKB-1、KAWAI )においては低（非）メチル化であり、ＨＴＬＶ−１感染細胞株２株(HUT102、MT2、)、及びＡＴＬ細胞株６株(ED-40515(-)、Su9T-01、S1T, KOB、KK1、SO4 )の計8株においては部分メチル化が1株(MT2)、完全メチル化が残りの7株であった。この部分メチル化を示すＭＴ２細胞株は、ＮＤＲＧ２遺伝子発現が低下している。この結果から、ＮＤＲＧ２プロモーター領域のDNAメチル化の検出が、ATLの診断の指標になることが明確に示され、また、ＨＴＬＶ−１感染の指標にもなりうること、しかし、ＡＴＬとの区別も可能であり得ることが示された。
【実施例４】
【００８９】
（ＮＤＲＧ２強制発現によるＡＴＬ細胞の回復）
ヒトＮＤＲＧ２遺伝子は、MOLT4細胞株より抽出したtotal RNAを鋳型としてAMV-RT RNA PCR Kit ver3.1 (タカラバイオ) 中のオリゴdT プライマーを用いてcDNAを作成した。このcDNAを鋳型として、NDRG2-5’-HindIIIプライマー 5’-CCCAAGCTTATGGCGGAGCTGCAGGAGGTGC-3’（配列表の配列番号１２）及びNDRG2-3’-EcoRI プライマー 5’-GCGAATTCTCAACAGGAGACCTCCATG-3’（配列表の配列番号１３）を用いてＮＤＲＧ２  B型 (NM_016250)として PCR 30サイクル(98 度 10 秒、55 度 30 秒、72 度 1 分15 秒) で増幅した。PCR産物をTArget Clone (TOYOBO)中のpTA2ベクターに導入した (NDRG2/pTA2)。ＮＤＲＧ２ ｃＤＮＡ産物は塩基配列を確認した後、pCMV26ベクター(シグマアルドリッチ)のCMVプロモーター下流Hind III/EcoRI領域に3×FLAG tag融合タンパク質として導入した(pCMV26/NDRG2)。
【００９０】
ＮＤＲＧ２安定発現ATL細胞株の作成
ＡＴＬ細胞株KOB、KK1、Su9T-01細胞1 x 107 個に20 μgのpCMV26/NDRG2もしくはpCMV26/mockをGENE PLUSER II (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を用いて220 V、950 ・Fの条件で遺伝子導入を行なった。導入2 日後、培養液中にG418を800 μg/ml添加し、その1週間後限界希釈法によって細胞の株化を行なった。安定発現株樹立後はそれぞれの培地にG418を200μg/mlを添加し継代した。作製した細胞株はpCMV26/Mock発現ベクターを導入したKK1細胞株(KK1/pCMV26-#7、KK1/pCMV26-#11)、NDRG2/pCMV26発現ベクターを導入したKK1細胞株(KK1/NDRG2-#5、KK1/NDRG2-#6)、pCMV26/Mock発現ベクターを導入したSu9T-01細胞株(Su9T-01/pCMV26-#2、Su9T-01/pCMV26-#4)、pCMV26/NDRG2発現ベクターを導入したSu9T-01細胞株(Su9T-01/NDRG2-#5、Su9T-01/NDRG2-#6)である。
【００９１】
樹立後ＮＤＲＧ２のタンパク質発現をウエスタン法により検討した。ＫＫ１親細胞、Mockベクター導入細胞2株(pCMV26-#7、pCMV26-#11)においてはＮＤＲＧ２タンパク質のバンドが見られないが、ＮＤＲＧ２発現ベクター導入細胞２株(NDRG2-#5、NDRG2-#6)においては、２細胞株共に43 kDaのＮＤＲＧ２バンドが検出された。Su9T-01においても同様の結果が得られた(図7)。
【００９２】
ＮＤＲＧ２遺伝子導入による細胞内タンパク質の局在と核形の変化
ＡＴＬ細胞はＦｌｏｗｅｒ様核を有する特異的な性質を持っている。上記のようにして得られたNDRG2安定発現ATL細胞を、まず細胞内局在の検討に供した。核はDAPI染色(青)をNDRG2はNDRG2をウサギ抗ヒトNDRG2抗体と二次抗体としてフルオロセン蛍光標識ヤギ抗ウサギIgG抗体を用いて染色(緑)した。
【００９３】
免疫染色は、細胞を5 x 105個回収後PBSで3回洗浄を行なった。4%パラホルムアルデヒド溶液500 μlで細胞を室温で10分固定した後、遠心し上清を取り除き、5%スキムミルク添加TBS/T緩衝液 500μlを加え室温1時間浸透させ、ブロッキング反応を行なった。その後TBS/Tで3回洗浄後ウサギ抗ヒトＮＤＲＧ２ポリクローナル抗体 (1%BSA添加TBS/Tで400倍希釈)を50 μl加えて室温で2 時間反応させた。その後TBS/T緩衝液で3回洗浄後、フルオロセン蛍光標識ヤギ抗ウサギIgG(1000倍希釈)とDAPI (SIGMA ALDORICH) (0.2μg/mlを50μl加え遮光して室温で1時間反応させた。その後TBS/T緩衝液で3回洗浄後、蛍光封入剤(ダコ・ジャパン(株))を用いて封入し、倒立型落射型蛍光顕微鏡（HAL100）(Carl Zeiss)、もしくは倒立型共焦点レーザー顕微鏡(DMIRE2)(Leica)で観察した。
【００９４】
ＮＤＲＧ２遺伝子導入前には少量のＮＤＲＧ２タンパク質が細胞質に見られるのに対して、ＮＤＲＧ２遺伝子導入により多くのＮＤＲＧ２タンパク質は核内に見られ、小顆粒状の染色様式を示した。この細胞の核は、遺伝子導入前が空豆様にくびれや変形を有する細胞が多かったが、ＮＤＲＧ２導入によりやや丸い細胞が増加する傾向が見られた（図8）。
【００９５】
そこでさらに詳しく核の形について検討を行った。各変形の度合いを4種類にわけ（図９ａ）、遺伝子導入前後において、DAPI染色後、各々の細胞を蛍光顕微鏡下で100個ずつ２回、分類分けを行なった。ＡＴＬ細胞株であるKK1、Su9T-01細胞株は、KK1細胞の78%、Su9T-01細胞の68%に何らかの核の変形が見られた。それに対してＮＤＲＧ２安定発現細胞株において、正常に近い円形の核がKK1において22%から93%、Su9T-01において32%から53%と大幅に増加する傾向を示した(図９ｂ)。従ってＮＤＲＧ２を発現させることで、ＮＤＲＧ２タンパク質そのものの核への移行とＡＴＬ細胞の核形の正常化が証明された。
【実施例５】
【００９６】
細胞増殖解析
樹立したＡＴＬ細胞株を用いて、各細胞株(1 x 105 個/ml)をそれぞれの継代に使用する培養液中で培養し、24 時間間隔でトリパンブルー染色法により生細胞数を算出した。また2 日間隔で10分の１倍希釈継代にすることで２週間培養した。細胞は37  度、5% 二酸化炭素下で静置培養した。
【００９７】
インビボ腫瘍形成能の検討
生体内での白血病細胞の増殖能を検討するために、Su9T-01/pCMV26-#4細胞株 (1 x 107 個)及び Su9T-01/NDRG2-#6細胞株 (1 x 107 個)を免疫不全マウス(NOD/Shi-scid, IL-2Rγnull (NOG)) 17)の経静脈及び腹腔投与を行なった。マウスが死亡後病理解剖し、病理学的、組織免疫染色、生化学的解析を行なった。
【００９８】
ＡＴＬ細胞におけるＮＤＲＧ２遺伝子発現によるインビトロ細胞増殖能及びインビボ腫瘍形成能の検討
ＮＤＲＧ２とＡＴＬ細胞の増殖や悪性化との関連性をさらに検証し、その治療効果を確認するために、ＮＤＲＧ２導入細胞株を用いて、インビトロ細胞増殖能とインビボマウス移植による腫瘍死による生存機関の比較を行なった。KK1-NDRG2安定発現株(KK1/NDRG2-#5、KK1/NDRG2-#6)はコントロール細胞(KK1、KK1/pCMV26-#7、KK1/pCMV26-#11)と比較しインビトロ増殖能が有意に低下していた。Su9T-01細胞株において同様にSu9T-01-NDRG2安定発現株(Su9T-01/NDRG2-#5、Su9T-01/NDRG2-#6)はコントロール細胞(SuT-01、Su9T-01/pCMV26-#2、Su9T-01/pCMV26-#4)と比較し同様に増殖能が低下している事が分かった(図10a)。そこで、さらに、Su9T-01-NDRG2安定発現株(Su9T-01/NDRG2-#6)及び、コントロール細胞(Su9T-01/pCMV26-#4)をNOD/Shi-scid, IL-2Rγnull (NOG) マウスそれぞれ6匹に移植し、経過観察を行なった。その結果、コントロールマウス群では、平均50%生存期間が53日日に対して、NDRG2安定発現株を移植したマウス群で、平均50%生存期間が84日と有意に延長しており(p<0.02)、さらに3匹は200日以上の長期生存を果たしている(図10b)。以上の結果から、ＮＤＲＧ２安定発現ATL細胞は、インビトロにおける細胞増殖能が低下し、さらにインビボにおいて白血病進展が遅延することがわかり、ＮＤＲＧ２の治療への応用可能性が確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】ＮＤＲＧ２近傍２Ｍｂ領域９遺伝子における遺伝子発現を示す図である。
【図２】定量ＰＣＲ法によるＮＤＲＧ２遺伝子発現の比較を示す図である。
【図３】健常人と急性型ＡＴＬ細胞におけるＮＤＲＧ２遺伝子発現の比較を示す図である。
【図４】ウエスタンブロッティング法によるＮＤＲＧ２タンパク質発現の比較を示す図である。
【図５】ＡＴＬ細胞株に対するＤＮＡ脱メチル化反応およびヒストン脱アセチル化阻害剤によるＮＤＲＧ２遺伝子発現の回復を示す図である。
【図６ａ】ＮＤＲＧ２プロモーター領域のＣｐＧ集積を示す図である。
【図６ｂ】健常人由来末梢血リンパ球のＮＤＲＧ２プロモーター領域のＤＮＡメチル化を示す図である。
【図６ｃ】急性型ＡＴＬ細胞のＮＤＲＧ２ＮＤＲＧ２プロモーター領域のプロモーター領域のＤＮＡメチル化を示す図である。
【図６ｄ】ＭＳＰ法によるＮＤＲＧ２プロモーター領域のＤＮＡメチル化網羅解析の結果を示す図である。
【図７】ＮＤＲＧ２安定発現ＡＴＬ細胞の樹立に伴うＮＤＲＧ２タンパク質発現を示す図である。
【図８】ＡＴＬ細胞およびＮＤＲＧ２安定発現ＡＴＬ細胞におけるＮＤＲＧ２の局在を示す図である。
【図９ａ】ＡＴＬ細胞の核の変形とＮＤＲＧ２タンパク質発現との関連性をクラス分けした図である。
【図９ｂ】ＡＴＬ細胞の核の変形とＮＤＲＧ２タンパク質発現との関連性を示すグラフである。
【図１０ａ】ＮＤＲＧ２発現によるＡＴＬ細胞のインビトロ細胞増殖能を示すグラフである。
【図１０ｂ】インビボ白血病細胞移植後のマウスの生存曲線の変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【配列表】
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