(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:1で示される配列から成るレトロ-インベルソペプチド。
【請求項２】
該ペプチドが、アミノ末端、カルボキシ末端または、アミノ末端およびカルボキシ末端の両方で、CH3CO、CH3(CH2)nCO、C6H5CH2COおよびH2N(CH2)nCO（n=1〜10）からなる群より独立して選択される部分を用いて修飾されている、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
該ペプチドがグリコシル化されている、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
その１つ以上のアミド結合が還元されている、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
該ペプチド中の１個以上の窒素がメチル化されている、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
該ペプチド中の１個以上のカルボン酸基がエステル化されている、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
SEQ ID NO:1で示される配列から成るレトロ-インベルソペプチドおよび製薬上許容される担体を含む、哺乳動物において軸索生長または髄鞘形成を促進するための組成物。
【請求項８】
該哺乳動物がヒトである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
哺乳動物において軸索生長または髄鞘形成を促進するための薬剤の製造における、SEQ ID NO:1で示される配列から成るレトロ-インベルソペプチドの使用。
【請求項１０】
該哺乳動物がヒトである、請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、インターロイキン-6(IL-6)から誘導されるレトロ-インベルソ(retro-inverso)ペプチドに関する。これらのペプチドは、本来の親タンパク質と同様の活性を有し、また神経栄養活性を有する。
【０００２】
発明の背景
サイトカインは、天然および特異的免疫のエフェクター相中に製造され、免疫および炎症応答を仲介しかつ調節するように働くタンパク質である。サイトカインは、他のポリペプチドホルモンのように、標的細胞の表面上の特異的レセプターに結合することによってその作用を開始する。サイトカインの最もよく知られている族の１つは、天然の免疫を仲介するインターロイキンである。インターロイキンの構造および機能の詳細な記載については、アバス(Abbas)ら、細胞および分子の免疫学(Cellular and Molecular Immunology), W.B.サンダース社(Saunders Company)、フィラデルフィア、pp.225-243、1991参照。
【０００３】
IL-6は、リンパ様と非リンパ様細胞の両者により生産され、そして免疫応答、急性反応、及び造血を調節する、26kDaの分子量をもつ多機能サイトカインである。このサイトカインの構造および機能の詳細な概説は、ザ  サイトカイン  ハンドブック(The Cytokine Handbook）、第３版、トムソン(Thomson),A.編、アカデミック  プレス(Academic Press)、サンディエゴ、CA、1998、及びBarton, Clin. Immunol. Immunopathol. 85 : 16-20, 1997に見出すことができる。
【０００４】
多くの細胞がIL-6を産生し、かつこれに応答することができるので、それは、多くの系において成長及び／又は分化のオートクリン調節物質であることができる。免疫系内では、それは、部分的に、IL-2を介して仲介される末梢Ｔ及びNK細胞のオートクリン活性化物質であることが示されている（Garman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 : 7629-7633）。胸腺発育過程においては、IL-6は、胸腺発達においてIL-2、IL-4、及びIL-7とともに重要であることができる。IL-6も、活性化されたＢ細胞によるIgG分泌を促進させる。さらに、IL-6は、肝臓が、急性タンパク質、例えば、Ｃ−反応性タンパク質を生産することを誘導し、そしてアルブミンの生産を阻害する（Morrone et al., J. Biol. Chem. 263 : 12554-12558, 1988）。
【０００５】
IL-6は、Ｔ細胞活性化、増殖、及び分化にも関わる。IL-6は、１のＴ細胞系（Noma et al., 1987）及び胸腺細胞内でのIL-3レセプター（Tac抗原）発現を誘導し、そしてＴ細胞によるIL-2生産のための第２のシグナルとして作用する（Garman et al., 1987）。IL-6は、PHAにより刺激されたヒトＴ細胞又はマウス末梢Ｔ細胞の増殖を促進させる。
【０００６】
IL-6は、インビトロ及びインビボにおいて、LPS誘導IL-1及びTNFの合成を含むいくつかの重要な炎症応答をも阻害する（Aderka et al., J. Immunol. 143 : 3517-3523, 1989 ; Ulich et al., J. Immunol. 146 : 2316-2323, 1991）。IL-6は、肺炎症の疾患モデルにおける肺損傷に対して保護することも発見されている（Chen et al., Infect, Immun. 61 : 97-102, 1993）。
【０００７】
ニューロトロフィン(neurotrophin)および神経栄養因子は、神経細胞母集団の生存、標的神経支配および／または機能に影響を及ぼすことができるタンパク質またはペプチドである（バルデ(Barde)、Neuron, 2:1525-1534, 1989）。ニューロトロフィンのイン  ビボ(in vivo)およびイン  ビトロ(in vitro)での効力はよく証明されている。例えば、毛様神経栄養因子(ciliary neurotrophic factor)(CNTF)は、鶏の胚毛様神経節(ciliary ganglia)の生存をイン  ビトロ(in vitro)で助長し、培養した交感神経、感覚および脊髄運動ニューロンの生存を助ける（イプ(Ip)ら、J. Physiol. Paris, 85:123-130, 1991）。
【０００８】
ペプチドのイン  ビボ(in vivo)での治療上の使用に対する主な障害は、それらがタンパク質分解を受けやすいことである。レトロ-インベルソペプチドは、配列の方向が逆（レトロ）で、各アミノ酸のキラリティー（DまたはL）が逆にされた（インベルソ）、線状ペプチドの異性体である。幾つかのペプチド結合だけが逆にされており、逆にされた部分におけるアミノ酸残基のキラリティーが逆にされた、線状ペプチドの部分的に修飾されたレトロ-インベルソ異性体がまたある。そのようなペプチドの主な利点は、タンパク質分解に対する改善された抵抗性の故に、それらのイン  ビボ(in vivo)での高められた活性である（概説のためには、チョレフ(Chorev)ら、Trends Biotech., 13:438-445, 1995参照）。そのようなレトロ-インベルソ類似体は、増加された代謝安定性を示すが、それらの生物活性はしばしば大きく妥協される（ギチャード(Guichard)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:9765-9769, 1994）。例えば、リッチマン(Richman)ら（J. Peptide Protein Res., 25:648-662）は、Gly3-Phe4アミド結合において修飾された線状および環状のリューエンケファリンの類似体は、本来のリューエンケファリンの6〜14％の範囲の活性を有することを決定した。チョレフ(Chorev)ら（同書）は、ビトロネクチン(vitronectin)のそのレセプターへの結合を阻害するペプチドのレトロ-反転が、50,000倍だけ親異性体より効かない１つのペプチドおよび、親環状ペプチドより4,000倍効く別のペプチドをもたらすことを示した。ギチャード(Guichard)ら（TIBTECH 14, 1996）は、レトロ-インベルソ（すべてD-レトロ）抗原擬態性が、ランダムコイル、ループまたは環状の配座のペプチドを用いてしか生じ得ないことを教示する。「らせん形」のペプチドの場合には、抗原擬態性を査定するのに使用される溶媒条件下で、らせん性が実際に不在でありさえしなければ、適切な機能の擬態性が期待される。
【０００９】
生物活性を保持しながら、増加された代謝安定性を示す、IL-6誘導の神経栄養ペプチドについての必要性がある。
【００１０】
発明の概要
本発明の１つの実施態様は、17〜約40個のアミノ酸を有する分離されたレトロ-インベルソペプチドであり、該ペプチドはSEQ ID NO:1で示される配列を含む。この好ましい実施態様の１つの態様においては、該配列の少なくとも１つの塩基性に荷電したアミノ酸が、別の塩基性に荷電したアミノ酸で置換される。この好ましい実施態様の別の態様においては、該配列の少なくとも１つの酸性に荷電したアミノ酸が、別の酸性に荷電したアミノ酸で置換される。有利には、該配列の少なくとも１つの非極性アミノ酸が、別の非極性アミノ酸で置換される。好ましくは、該配列の少なくとも１つの非荷電アミノ酸が、別の非荷電アミノ酸で置換される。この好ましい実施態様の別の態様においては、該配列の少なくとも１つの芳香族アミノ酸が、別の芳香族アミノ酸で置換される。有利には、ペプチドが、アミノ末端、カルボキシ末端またはアミノ末端とカルボキシ末端の両方にて、CH3CO、CH3(CH2)nCO、C6H5CH2COおよびH2N(CH2)nCO（n=1〜10）からなる群より独立して選択される部分で修飾される。好ましくは、ペプチドはグリコシル化されている。この好ましい実施態様の別の態様においては、ペプチドの１つ以上のアミド結合が還元されている。好ましくは、該ペプチド中の１つ以上の窒素がメチル化されている。この好ましい実施態様のなお別の態様においては、ペプチド中の１つ以上のカルボン酸基がエステル化されている。好ましくは、ペプチドは、SEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を有する。
【００１１】
本発明の他の態様は、約17〜約40アミノ酸をもつレトロ−インバーソ・ペプチド、及び医薬として許容される担体を含む組成物であって、上記ペプチドが、配列番号１に示す配列を含むものである。
【００１２】
本発明はまた、必要とする哺乳動物において、軸索生長または髄鞘形成を促進する方法を提供し、この方法は、哺乳動物に、軸索生長または髄鞘形成を促進するのに有効な量の、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むレトロ-インベルソペプチドを含む組成物を投与する段階を含む。好ましくは、ペプチドはSEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を有する。有利には、哺乳動物はヒトである。この好ましい実施態様の１つの態様においては、投与段階は、直接局所注入、全身、頭蓋内、脳脊髄内、局所または経口である。
【００１３】
本発明はまた、Ｔ細胞活性化を促進させる方法を提供し、この方法は、Ｔ細胞を、Ｔ細胞活性化促進有効量の、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むレトロ-インベルソペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【００１４】
本発明の別の態様においては、哺乳動物において軸索生長または髄鞘形成を促進するのに使用するための、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むレトロ-インベルソペプチドが提供される。好ましくは、ペプチドはSEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を有する。好ましい態様の１の局面においては、哺乳動物はヒトである。
【００１５】
本発明はまた、その必要な哺乳動物におけるＴ細胞活性化の促進に使用するための、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むレトロ-インベルソペプチドを提供する。好ましくは、ペプチドはSEQ ID NO:1で示される配列を有する。有利には、上記哺乳動物はヒトである。
【００１６】
本発明のさらに別の実施態様は、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むレトロ-インベルソペプチドを、必要とする哺乳動物において、軸索生長または髄鞘形成を促進するための薬剤の製造に使用することである。好ましくは、ペプチドはSEQ ID NO:1で示される配列を有する。有利には、哺乳動物はヒトである。
【００１７】
本発明はまた、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むレトロ-インベルソペプチドを、必要とする哺乳動物において、Ｔ細胞活性化を促進させるための薬剤の製造に使用することを提供する。好ましくは、ペプチドはSEQ ID NO:1で示される配列を有する。有利には、哺乳動物はヒトである。
【００１８】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、免疫応答、急性反応、及び造血の調節を含む天然IL-6と同様の効果を仲介する、インターロイキン-6(IL-6)から誘導されるレトロ-インベルソ(RI)ペプチドを提供する。「から誘導される」という語は、ペプチドが、インターロイキン-6または以下に定義するその類似体の活性領域を含むことを示す。
【００１９】
また、これらのRI  IL-6由来ペプチドは、末梢Ｔ及びNK細胞を活性化し、活性化されたＢ細胞によるIgG分泌を促進させ、肝臓が急性タンパク質を生産することを誘導し、ヒトＴ細胞の増殖を促進させ、そしてリポ多糖(LPS)-誘導IL-1及び腫瘍壊死因子(TNF)の合成を含む炎症応答を阻害する。これらのRI  IL-6由来ペプチドも、肺炎症における肺損傷に対して保護する。
【００２０】
これらのペプチドはまた、末梢神経および中枢神経系に対する、毒性の、外傷性の、虚血性の、変性の、かつ受け継がれた障害後の機能回復を促進することにおいて、治療上の用途を有する。これらのペプチドはまた、増加された髄鞘形成を促進し、かつ脱髄疾患の影響を打ち消すために有用である。これらのIL-6由来ペプチドは、天然IL-6と同様の効果の仲介においても有用である。特定のレトロ-インベルソペプチドの親ペプチドと同様の効果を仲介する能力は、以下の実施例に記載された標準のIL-6アッセイを用いて、当業者が決定することができる。これらのペプチドの使用は種々の疾患の治療を容易にする。というのは、それらは、本来のサイトカインまたは組換えサイトカインより安定であり、かつ合成が容易であるからである。
【００２１】
本発明の特定のRI  IL-6-誘導ペプチドおよび、それが誘導される親タンパク質を表１に示す。
【００２２】
【表１】
0004786843.tif 000002
【００２３】
先に論じたように、これらRI  IL-6-誘導ペプチドは、対応する全長のIL-6タンパク質と同じ活性を有し、また神経栄養および髄鞘栄養(myelinotrophic)活性を有する。本発明の１つの実施態様は、Ｔ細胞活性化有効量の、17〜約40個のアミノ酸を有しかつSEQ ID NO:1で示されるRIペプチドまたは同様の活性を有するその類似体を含むRIペプチドを、Ｔ細胞に投与することによる、Ｔ細胞活性化の促進方法である。
【００２４】
そのような類似体としては、例えば１個以上のリシンおよび／またはアルギニン残基のアラニンまたは別のアミノ酸での置換；１個以上のリシンおよび／またはアルギニン残基の欠失；１個以上のチロシンおよび／またはフェニルアラニン残基の置換；１個以上のフェニルアラニン残基の欠失；ならびにペプチド内の１個以上のアミノ酸の保存的置換を含む。リシン／アルギニンおよびチロシン／フェニルアラニン残基の置換または欠失は、トリプシンおよびキモトリプシンそれぞれによるペプチド分解の受けやすさを減らす。
【００２５】
本発明における使用のために企図されるこれらのペプチド配列の別の変更は、重要でない挿入および欠失を含む。保存的アミノ酸置換が企図される。そのような置換は、例えば、それらの側鎖の化学的性質に関連したアミノ酸の族内で生じる置換である。アミノ酸の族としては、塩基性に荷電したアミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性に荷電したアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）；非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；非荷電の極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）；ならびに芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）を包含する。特に、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの分離した置換または、アスパラギン酸のグルタミン酸での分離した置換または、スレオニンのセリンでの分離した置換または、アミノ酸の構造的に関連のあるアミノ酸での同様の保存的置換からなる保存的アミノ酸置換は、ペプチドの特性に大きな影響を与えないことが、一般に受け入れられる。SEQ ID NO:1で示される配列を含む任意のRIペプチドまたはその挿入物、欠失物または置換物の、軸索生長、髄鞘形成、脱髄逆転および神経細胞死の阻止を促進する能力は、以下に示される実施例において提供されるアッセイを用いて決定することができる。
【００２６】
種々の化学的修飾は、安定性、生物活性およびペプチドの血液脳障壁(blood brain barrier)を越える能力を改善する。１つのそのような修飾は、脂肪族または芳香族の酸の誘導体での脂肪族アミノ末端修飾であり、アミド結合を形成する。そのような誘導体としては、例えばCH3CO、CH3(CH2)nCO（n=1〜10）、C6H5CH2COおよびH2N(CH2)nCO（n=1〜10）を包含する。別の修飾は、アミド／エステル結合によりペプチドに結合される、脂肪族または芳香族アミン／アルコールの誘導体でのカルボキシ末端修飾である。そのような誘導体としては先に挙げたものを包含する。ペプチドはまた、アミノ末端およびカルボキシ末端の修飾の両方を有することができ、誘導体は、先に挙げたものから独立して選択される。ペプチドはまたグリコシル化されることができ、アルファアミノ基もしくはD-Asnまたはその両方が、グルコースまたはガラクトースで修飾される。別の企図される修飾においては、選択された主鎖アミド結合が還元される（NH-CH2）。他の修飾としては、アミド結合における選択された窒素のN-メチル化および、ペプチド上の酸基の少なくとも１つが芳香族または脂肪族のエステルとして修飾されるエステル化を含む。上記修飾の任意の組合せがまた企図される。
【００２７】
本発明の別の実施態様は、細胞を、軸索生長促進有効量の、17〜約40個のアミノ酸を有し、そしてSEQ ID NO:1で示される、RI  IL-6-誘導ペプチドまたは上記したのと同様の活性を有するその類似体を含むRIペプチドを投与することによる、分化しているかまたは分化していない神経細胞における軸索生長を促進する方法である。
【００２８】
任意のそのようなペプチドの軸索生長を刺激する能力は、以下の実施例１〜９に記載された方法を用いて、当業者が容易に決定することができる。任意の特定のIL-6-誘導ペプチドの本来のIL-6の同じ活性を仲介する能力は、実施例10〜12において論じられた親ペプチドについての標準アッセイを用いて決定することができる。
【００２９】
細胞増殖培地中での神経栄養活性のための、本発明のRIペプチドの典型的最小量は通常、少なくとも約５ng/mlである。イン  ビトロ(in vitro)での使用のために、この量またはそれ以上の量の本発明のRIペプチドが予想される。典型的には、0.1〜約10g/mlの範囲の濃度のこれらのペプチドが使用される。任意の特定の組織のための有効量は、実施例１にしたがって決定することができる。
【００３０】
Ｔ細胞、Ｂ細胞または神経細胞は、本発明のRIペプチドを細胞に直接投与することによって、イン  ビトロ(in vitro)またはイクス  ビボ(ex vivo)で処置されることができる。これは、例えば細胞を特定の細胞タイプのために適当な増殖培地中で培養し、次いでペプチドを培地に添加することによって行うことができる。典型的には脊椎動物、好ましくは哺乳動物において、処置されるべき細胞がイン  ビボ(in vivo)にあるときには、幾つかの技術のうちの１つによって組成物を投与することができる。最も好ましくは、組成物は、ペプチドの所望の局所濃度を与えるのに十分な量で、血液中に直接注射される。これらのRIペプチドは、Dペプチド結合の故に、イン  ビボ(in vivo)で長く持続する。リシンおよびアルギニン残基を欠くペプチドにおいては、タンパク質分解が減らされる。より小さいペプチド（すなわち、50-mer以下）は、血液脳障壁を最も多く越えるようであり、CNS疾患の治療のために中枢神経系に入る（バンクス(Banks)ら、Peptides, 13:1289-1294, 1992参照）。
【００３１】
神経疾患の治療のためには、直接頭蓋内注入または脳脊髄流体中への注入をまた、所望の局所濃度のニューロトロフィン(neurotrophin)を与えるのに十分な量で使用することができる。両方の場合に、製薬上許容される注射用担体が使用される。そのような担体としては、例えばホスフェート緩衝塩水およびリンゲル溶液が含まれる。あるいは、直接局所注入または全身投与によって、組成物を末梢神経組織へ投与することができる。種々の慣用の投与方式が予想され、静脈内、肺、筋肉内、皮内、皮下、頭蓋内、硬膜外、鞘内、局所および経口を含む。局所投与のための製薬上許容される担体としては、クリーム、ジェル、ペースト、軟膏、ローション、懸濁液、エマルジョンおよび分散液を含む。
【００３２】
本発明のペプチド組成物は、単位投与形態で、例えば注射用組成物または、患者へ投与される毎日の投与量と等価な投与量での局所調製物で、または制御された放出組成物として、包装され、投与されることができる。PBS中または凍結乾燥解形態で活性成分の毎日の投与量を含む中隔封止されたびんは、単位投与の例である。好ましい実施態様においては、IL-6効果、例えばＴ細胞活性化を促進するため、および神経変性疾患または脱髄疾患の治療のための、脊椎動物の体重に基づく、本発明のRIペプチドの毎日の全身投与量は、約0.01〜約10,000g/kgの範囲にある。より好ましくは、毎日の全身投与量は、約0.1〜1,000g/kgである。最も好ましくは、毎日の全身投与量は、約10〜100g/kgである。局所に投与される物質の毎日の投与量は、ほぼより少ない大きさのオーダーである。ペプチドが胃腸内系でのタンパク質分解に抵抗性であるので、経口投与が特に好ましい。
【００３３】
本発明の１つの好ましい実施態様においては、ペプチドは局所的に、神経細胞にイン  ビボ(in vivo)で、その移植により投与される。例えば、ポリ乳酸、ポリガラクト酸(polygalactic acid)、再生コラーゲン、多層リポソームおよび多くの他の慣用の蓄積処方物が、生物学的に活性な神経栄養ペプチド組成物と共に処方することができる生物侵食性または生物分解性物質を含む。これらの物質は、移植されると、徐々にこわれ、周囲の組織に活性物質を放出する。生物侵食性、生物分解性および他の蓄積処方物の使用は、本発明において特に企図される。注入ポンプ、マトリックス封鎖(entrapment)系および経皮デリバリー装置との組合せがまた企図される。ペプチドはまた、米国特許第5,529,914号に記載されているように、移植の前に、ポリエチレングリコール等角(conformal)コーティング中に封入されることができる。
【００３４】
本発明のペプチドはまた、ミセルまたはリポソーム中に封入されることができる。リポソーム封入技術はよく知られている。リポソームは、標的にした組織に結合することができるレセプター、リガンドまたは抗体の使用によって、特定の組織、例えば神経組織を標的にし得る。これらの処方物の製造は、当技術分野においてよく知られている（ラディン(Radin)ら、Meth. Enzymol., 98:613-618, 1983）。
【００３５】
目下、神経系の構造完全性の完全な機能再生および回復を促進することができる、入手可能な薬剤がない。これは特にCNSの場合に本当である。神経栄養因子の使用による末梢神経のどのような程度の再生も、本発明の範囲内にある。さらには、神経栄養因子は、神経母集団または脳の特定領域の変性に関連する神経変性疾患の治療において治療上有用であり得る。パーキンソン病の主な原因は、黒質のドーパミン作用性のニューロンの変性である。プロサポシンに対する抗体は、ヒト脳切片中の黒質のドーパミン作動性ニューロンを免疫組織学的に染色するので、本発明のRIペプチドは、パーキンソン病の治療において治療上有用であり得る。年をとると視野の喪失に至る視覚神経変性疾患である、網膜神経障害がまた、本発明のRIペプチドを用いて治療可能である。
【００３６】
脳のニューロン母集団に到達するために、神経栄養因子は、大脳内に投与されなければならない、というのは、これらのタンパク質は血液脳障壁を越えないからであると長く信じられてきた。米国特許第5,571,787号は、サポシンCから誘導される、ヨウ素化した神経栄養18-merフラグメントが血液脳障壁を越えることを開示する。このように、約22個までのアミノ酸を有するRIペプチドがまたこの障壁を越え、かくして、静脈内投与することができる。他のニューロン母集団、例えば運動ニューロンは、脳脊髄流体中への直接注入がまた代替経路として想像されるが、これはまた静脈内注射によって処置することができる。
【００３７】
細胞は、ミエリン形成を促進するかまたは脱髄を防止するように、イン  ビボ(in vivo)、イクス  ビボ(ex vivo)またはイン  ビトロ(in vitro)で、上記した方法で処置されることができる。神経繊維の脱髄をもたらす疾患［MS、急性転移性白質脳炎、脳および／または脊髄への外傷、進行性多焦点白質脳炎、異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィーおよび未成熟の幼児における白質の悪展開(maldevelopment)（室周囲白軟化症(periventicular leucomalacia)）を含む］は、本発明の神経栄養ペプチドを疾患に冒された細胞へ投与することによって、遅らせるか、または停止させることができる。
【００３８】
本発明のRI  IL-6誘導ペプチド組成物はまた、Ｔ細胞活性化を助け、培養された運動ニューロンの生存率を高め、かつ神経栄養因子およびミエリン促進物質の効果を決定するために使用することができる。しかしながら、より実際には、それらは、実験室試薬として、および造血を促進し、神経細胞をイン  ビトロ(in vitro)で維持するために、細胞増殖培地の成分としての即時用途を有する。
【００３９】
本発明のペプチドは、当技術分野でよく知られている自動化された固相プロトコールを用いて合成される。ペプチドはすべて、使用前に、逆相カラムでの高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により、約95％より上の純度まで精製される。
【００４０】
以下の実施例は説明的なものにすぎず、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００４１】
実施例１
軸索生長の刺激
NS20Y神経芽腫細胞を、10％子牛胎児血清(FCS)を含むDMEM中で増殖させる。細胞をトリプシンで除き、30mmペトリ皿中で、カバーガラス上で培養する。20〜24時間後、培地を、0.5%FCSおよび0、0.5、1、2、4または8ng/mlのRI  IL-6誘導ペプチド（17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含む）を含む2mlのDEMEと取り替える。細胞をさらに24時間培養し、PBSで洗浄し、ブワン溶液(Bouin's solution)（飽和水性ピクリン酸／ホルマリン／酢酸15:5:1）で30分間固定した。固定液をPBSで除き、位相差顕微鏡下で軸索生長について評点付けをした。１つの細胞直径以上長いと明らかに定義された１つ以上の軸索を示す細胞は、正であると評点をつけられた。各皿の異なる部分で、少なくとも200個の細胞について評点を付けて、軸索を有する細胞のパーセンテージを決定し、アッセイは二重に行った。
【００４２】
実施例２
細胞死の阻止
NS20Y細胞を実施例１のようにして培養し、８ng/mlのRI  IL-6誘導ペプチド（17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含む）の存在下または不在下にて0.5％ウシ胎児血清中のカバーグラス上で２日間増殖させる。培地を除き、PBS中の0.2％トリパンブルーを各ウェルに加える。青色に染色された死細胞を、倒立顕微鏡にて全体中のパーセンテージとして評点付けをし、各ウェルの４領域で400個の細胞を数える。二重アッセイでの平均誤差は５％であった。
【００４３】
実施例３
イクス  ビボ(ex vivo)での軸索生長の促進
クフラー(Kuffler)ら（J. Neurobiol. 25:1267-1282, 1994）により記載されたようにして、ラット成体から脊髄神経節を除き、感覚ニューロンを調製した。ニューロンを0.5ng/mlのRI  IL-6誘導ペプチド（17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含む）で処理する。処理の３日後、最長の軸索突出の長さをマイクロメーターのグリッドで測定する。RIペプチドで処理したニューロン中の最長の軸索は、対照（非-RI）ペプチドで処理したものまたは未処理の対照より約３倍長い。48時間の処理後、すべての細胞は、神経増殖因子(NGF)に同様に応答し、そこで、広範囲の分岐が観察される。これらの結果は、IL-3誘導ペプチドが感覚ニューロンの分化を促進することを示す。
【００４４】
実施例４
ラットモデルにおける脱髄の逆転
実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)は、ヒト多発性硬化症(MS)のラットモデルである。ラットにおいては、EAEは、外来タンパク質（モルモットの脊髄）を注入することによって誘発され、それは、11日後に、白質における炎症および脱髄をもたらす。この脱髄は、活発に脱髄しているヒトMS障害にみられるものと似ている（リュウ(Liu)ら、Multiple Sclerosis 1:2-9, 1995）。
【００４５】
モルモットの脊髄および完全フロイントアジュバント(CFA)のエマルジョンの注入によって、ルイス(Lewis)ラットにEAEが誘発される。14日目、弱っているのが明らかなときに、RI  IL-6誘導ペプチド（17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含む）での処置を開始し（200g/kg筋肉内）、毎日８日間続ける。６匹のラットは、賦形剤のみを注入される。14日および22日に、１歩の長さ（筋肉の弱りの尺度）を評点付けする。さらに、mm2当たりの脊髄における脱髄障害（斑）の数および大きさを、22日に評点付けする。最後に、脳中のコレステロールエステルの量（ミエリン破壊のマーカー）を、22日に評点付けする。
【００４６】
両群の１歩の長さは14日目に減少し、それに対して、８日間の処置後、IL-6誘導ペプチドで処置した動物は正常に戻ったが、賦形剤処置した動物は戻らない。コレステロールエステル含量の有意の減少が、処置群の脳において観察される。さらに、脊髄障害の数は、IL-6誘導ペプチドでの処置の10日後に有意に減少する。最後に、平均の障害の大きさは有意に減少する。対照動物と実験動物との間の体重減少の差はない。これらの結果は、IL-6誘導ペプチドでの全身処置後に、EAEの有意の臨床的生化学的かつ形態学的な逆転を示す。この作用は、ミエリン修復に直接作用しない、最近のMS薬の抗炎症効果とは違う。
【００４７】
実施例５
イクス  ビボ(ex vivo)の髄鞘形成アッセイ
新生児マウスの小脳外植片を、サトミ(Satomi)（Zool. Sci. 9:127-137, 1992）にしたがって調製する。軸索生長および髄鞘形成を、培養で22日間観察し、その期間中に、新生児マウスの小脳は普通ニューロン分化し、髄鞘形成が開始する。17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むRI  IL-6誘導ペプチドを、外植片の調製後第２日に加え（３つの対照および３つの処置外植片）、軸索の生長および髄鞘形成を、ビデオカメラの付いた明視野顕微鏡(bright field microscope)下で査定する。サポシンCを、約1〜10g/mlの濃度での正の対照として使用する。髄鞘形成は、IL-6誘導ペプチドによって、サポシンCを用いたときと同様の程度にまで刺激される。
【００４８】
あるいは、髄鞘形成は、35Sをスルホリピド（以下に記載するように、ミエリンに限定的である）に組み込むことによってアッセイすることができる。
【００４９】
実施例６
35Sのスルホリピドへの組み込み
初代のミエリン含有シュヴァン(Schwann)細胞を、0.5％ウシ胎児血清(FBS)を含む低サルフェート培地(DMEM)中で48時間インキュベートした後、35S-メチオニンおよび、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むRI  IL-6誘導ペプチドを添加する。サポシンCを正の対照として使用する。細胞をPBSですすぎ、採取し、100リットルの蒸留水中で超音波処理する。一定分量の細胞溶解物をタンパク質分析のために除き、残りを5mlのクロロホルム／メタノール（2:1、体積／体積）で抽出する。脂質抽出物をクロマトグラフィーにかけ、ヒライワ(Hiraiwa)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4778-4781に記載されているようにして、抗スルファチドモノクローナル抗体を用いて免疫染色する。ペプチドおよびサポシンC処置後、同様の量のスルファチドが観察される。
【００５０】
実施例７
外傷性虚血性CNS障害の治療におけるRIペプチドの使用
脳または脊髄に外傷性障害を有するヒトが、滅菌塩水溶液または蓄積形態での約100g/kgのRI   IL-6誘導ペプチド（17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含む）の全身注入を受ける。感覚または運動神経機能の獲得による改善が査定される（すなわち、増加された手足の動き）。さらなる改善が生じなくなるまで治療を続ける。
【００５１】
実施例８
脱髄疾患の治療におけるRIペプチドの使用
初期段階のMSと診断された患者に、実施例７と同じ投与量範囲を用いた全身注入によって、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むRI  IL-6誘導ペプチドが与えられる。投与は毎日または毎週繰り返され、筋肉の強度の改善、筋骨格協調および髄鞘形成（MRIにより決定）が観察される。慢性再発MSを有する患者を、次の再発が生じるときに、同じ方法で治療する。
【００５２】
実施例９
IL-6増殖アッセイ
IL-6に関するほとんどのバイオアッセイは、IL-6依存性ネズミ・ハイブリドーマ細胞系、例えば、MH60 B9、及び7TD1（ATCC CRL 1851）に対するこのサイトカインの増殖効果に依存する。IL-6アッセイに関する詳細なプロトコールは、Cytokines, a Practical a pproach, Balkwill, F., ed., IRL Press, New York, second edition, 1995, pp. 365-366中に見られる。この内容全体を本明細書中に援用する。IL-6依存性ネズミ・ハイブリドーマ細胞系B9は、哺乳動物IL-6のための信頼でき、かつ、感度のよいアッセイを提供する。B9細胞を、75cm2 フラスコ内で、５％ FCSと約 100pg／ml（10IU／ml）のIL-6を補ったRPMI 1640培地中で培養する。培養物を、２〜３日毎に、１：５〜１：10に分け、そしてその細胞密度が約５×105 細胞／mlに達するときに、IL-6を再供給する。培養物を、湿度調節されたCO2 インキュベーター内で37℃で維持する。
【００５３】
B9細胞を、供給（feeding）から２日後に洗浄し、そして５％ FCSを補ったRPMI 1640培地中に５×104 細胞／mlの密度に再懸濁させる。IL-6標準を、96ウェル・マイクロタイテーション・プレート内で 100ｌ容量中３連で順次２倍希釈シリーズとして、分配する。標準の力価測定を、 100pg／ml（10IU／ml）から開始し、そして 0.1pg／ml（0.01IU／ml）まで希釈する。IL-6活性について計測される予定の、17〜約40アミノ酸をもち、かつ、配列番号１に示す配列を含むRI  IL-6由来ペプチドの適当な希釈物を、 100ｌ容量において３連で作製する。ネガティブ・コントロールとして、培養基単独を含ませる。細胞懸濁液(100ｌ）を、各ウェルに添加し、そしてそのプレートを、湿度調節CO2 インキュベーター内で37℃で約72時間、インキュベートする。テトラゾリウム塩MTT(10ｌ）を各ウェルに添加し、そして上記プレートをさらに 4.5時間インキュベートする。酸ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）(25ｌ）を、ウェル当りに添加し、上記プレートを顕度調節CO2 インキュベーター内で一夜37℃でインキュベートし、そしてその吸収を、プレート・リーダーを用いて 620nmで測定する。吸収対IL-6の濃度の標準曲線をプロットする。RI  IL-6由来ペプチド・サンプル中の活性の測定のために、テスト結果を上記標準曲線と比較して、上記特定のペプチドがIL-6活性を有するかどうかを決定する。
【００５４】
実施例10
IL-6 IgG分泌アッセイ
IL-6を、EBV 形質転換ヒト・リンパ芽細胞系、例えば、CESS（ATCC TIB 190）内での分化及びIgG分泌を高めるその能力により、評価することができる。CESS細胞を、活発な長期増殖培養物から収穫する。上記細胞を、予め24〜48時間、サブ培養する。多くの死細胞を含み、又は遅く増殖している培養物は、上記アッセイにおいてよく働かないであろう。細胞を、１回洗浄し、そして培養基中に106 細胞／mlまで再懸濁させる。IL-6(100ｌ）、又は17〜約40アミノ酸をもち、かつ、配列番号１に示す配列を含むRI  IL-6由来ペプチドを、各細胞濃度において、６つの複製培養物に添加する。培地だけを、ネガティブ・コントロールとして６ウェルから成る１セットに添加する。細胞を、空気中５％ CO2の雰囲気中、37℃において５〜７日間、インキュベートする。細胞上清を収穫し、そして免疫グロブリン含量についてアッセイする。
【００５５】
アフィニティー精製されたヤギ抗−ヒトIgG(75ｌ）を、重炭酸塩コーティング・バッファー中に小分けし、そして室温で一夜インキュベートする。抗血清の個々のバッチを、事前滴定し、高、中、及び低濃度のIgG をもって、最適シグナル対ノイズ比を決定する。ウェルを、PBS／Tween-20 で３回洗浄する。残存タンパク質結合部位をブロックするために、100ｌ PBS／BSA／Tween-20を、各ウェルに添加し、そして30〜90分間室温でインキュベートする。PBS 中で希釈した正常ヤギ血清（４％）を、このステップにおいて使用することもできる。ウェルを、PBS／Tweenで３回洗浄し、そして75ｌのテスト上清と標準を２連で添加する。プールされた正常ヒト血清、又はPBS／BSA／Tween-20中 1,000ng／mlにおける部分精製されたIgG のいずれかの倍化希釈を用いた11点の標準曲線を、バッファーだけのゼロ標準とともに、各プレートに対して、２連で設定した。プレートを、１〜２時間室温でインキュベートする。ウェルをPBS／Tween-20で３回洗浄する。各ウェルに、PBS／BSA／Tween-20中で希釈された、アルカリ性ホスファターゼ（AP）−結合アフィニティー精製ヤギ抗−ヒトIgG のホースラディシュ・ペルオキシダーゼ(HPO）75ｌを添加する。抗血清の個々のバッチを滴定して、最適希釈を決定する。
【００５６】
実施例11
IL-6由来ペプチドによるTNF 放出の阻害
17〜約40アミノ酸をもち、かつ、配列番号１に示す配列を含むRIペプチドを、TNF のLPS 誘導放出を阻害するその能力についてアッセイする。マクロファージバクテリアのリポ多糖(LPS）の添加により活性化され、培養基中へのTNF の放出をもたらし、これは、酵素結合イムノソルベント・アッセイ(ELISA）を用いて、アッセイされることができる。IL-6は、TNF のLPS 誘導放出を阻害することが知られている（Aderka et al., J. Immunol. 143 : 3517-3523, 1989）。LPS 刺激前にIL-6由来ペプチドにより処理された培養物中、放出されたTNF の量は、上記ペプチドを与えなかった培養物に比較して、有意に低下される。
【００５７】
本発明は、上記詳細な説明中に記載されている態様のみに限定されるものではないことはいうまでもない。本発明の本質を保持する態様の全ては、本発明の範囲内にあると解釈されるべきである。しかしながら、本発明は、上記特許請求の範囲のみにより限定される。
【配列表】
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