(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体サンプル中のアナライトを、該アナライトに特異的に結合できるリガンドに結合させることを含むイムノアッセイにより定量的に測定する方法であって、該アナライトが少なくとも一部アナライト複合体として存在し、
ａ) 存在するアナライト複合体を少なくとも実質的に解離し、実質的に全てのアナライトを遊離形で提供するためにサンプルを約１.５〜約３.２の範囲の第１の酸性ｐＨに付し、
ｂ) 第１の酸性ｐＨを、複合体の再形成を阻止するがアナライトのリガンドへの結合が可能である約２.７〜約４.５の範囲の第２の酸性ｐＨまで上げ、
ｃ) サンプル中の該アナライトを定量的に測定するために、アナライトのリガンドへの結合を測定する
工程を含み、アナライトがプロテインＡまたはその誘導体であり、サンプルがＩｇＧを含む、方法。
【請求項２】
リガンドが抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リガンドが固体支持体に固定化されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第２の酸性ｐＨが約２.８〜約４.５の範囲から選択される、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
第１の酸性ｐＨが約２.３〜約２.５の範囲から選択され、および／または、第２の酸性ｐＨが約２.８〜約３.２の範囲から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第２の酸性ｐＨが、約３.０〜約３.２の範囲から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
アナライト濃度を決定するとき、応答 対 アナライト濃度の標準曲線を用いることを含み、標準曲線が、アナライト、および、アナライトと複合体形成できる少なくとも１つの種を含むサンプルを用いて作成される、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
微小流体系で行われる、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
微小流体系が回転可能なディスクを含み、液体輸送が遠心力によって達成され得る、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
液体サンプル中で少なくとも一部複合体形態で存在するアナライトのイムノアッセイを行うためのキットであって、
アナライトに結合できる検出試薬、
約１.５〜約３.２の範囲のｐＨを有する第１の酸性緩衝液、
約２.７〜約４.５の範囲のｐＨを有する第２の酸性緩衝液
を含み、
アナライトがプロテインＡであり、
第１の酸性緩衝液は、存在するアナライト複合体を少なくとも実質的に解離し、実質的に全てのアナライトを遊離形で提供するためにサンプルを約１.５〜約３.２の範囲の第１の酸性ｐＨに付すために用いられ、
第２の酸性緩衝液は、第１の酸性ｐＨを、複合体の再形成を阻止するが、アナライト用捕捉試薬としてのリガンドへのアナライトの結合が可能である約２.７〜約４.５の範囲の第２の酸性ｐＨまで上げるために用いられる、
キット。
【請求項１１】
キットがさらにリガンドを含み、リガンドが固相に固定化され、アナライトが固相に固定化されたリガンドに結合できる、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
リガンドがビオチン化されており、アビジンまたはストレプトアビジンが結合している固相に固定化される、請求項１０または１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、アナライトが少なくとも一部複合体形態で、典型的には免疫複合体として存在し得る液体サンプル中の当該アナライトの総濃度の測定に関する。より具体的には、本発明は、予め形成されたアナライト複合体がアナライト測定前に解離しているアッセイ方法および当該方法を行うためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
イムノアッセイを確実に行うためには、選択された抗体によって規定された、標的分子またはアナライト上の選択されたエピトープへの無制限の接近が、アナライトの定量的測定に必要である。生理的条件下で互いに相互作用できる２種以上の異なるタンパク質が複合体を形成しているならば、この２種の相互作用物の相互作用の性質および濃度に依存して、低濃度の成分が一部そのカウンターパートと複合体の形態をとる。このことは、アッセイに使用される幾つかのエピトープが複合体内に隠れ得るために、特に低濃度のカウンターパートの定量化において不都合であると証明されるかもしれない。
【０００３】
或るタイプのタンパク質は、アッセイに必須の決定的なエピトープがタンパク質凝集体で十分に接近できないホモ多量体、例えば細線維化タンパク質を形成し得る。モノマーのエピトープ数が限られているならば、これは、多量体化が起こる傾向があるときモノマータンパク質濃度を低く見積もる一因となり得る(１)。
【０００４】
恒常性を保存するために、タンパク質複合体は、活性な酵素とその阻害因子の間で予め決められた比で形成される可能性があり、酵素の正確な測定を複雑にする。これにより、イムノアッセイで特定のエピトープが接近不可能となり、それ故に、イムノアッセイの濃度見積もりが不正確となり得る(２)。
【０００５】
例えば心臓細胞(３)または腫瘍細胞(４)の細胞損傷による長時間に亘る細胞内タンパク質の断続的な放出は、細胞内タンパク質に対する免疫応答を生じ得る。このことは、後の段階で、標的分子と自己抗体からなる免疫複合体の形成に寄与し得る。免疫系の増幅特性を考えると、抗体は、標的タンパク質よりもはるかに高い相対濃度で形成され得て、標的タンパク質の正確な定量化を複雑にする免疫複合体の形成をもたらし得る。
【０００６】
上記の例は、標的アナライトの定量化が、標的アナライトの真の値から著しく外れる可能性がある状況、しばしば真の濃度を非常に低く見積もる状況を表す。
【０００７】
生化学的精製工程においても、同様の現象が起こり得る。近年、全く新しい治療薬群である組換えモノクローナル抗体が、炎症性疾患、癌および感染などの様々な障害の処置に導入されている(５)。最初の治療用モノクローナル抗体の多くは、細胞培養物から、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび場合によりゲル濾過を用いた連続的精製工程によって精製される(６)。非常に一般的には、アフィニティー精製工程は、ＩｇＧとスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)由来のプロテインＡの相互作用に基づく。適当な樹脂に固定化されたプロテインＡは、モノクローナル抗体を含む細胞培養物に対する捕捉試薬として使用される。この工程は、望ましい分子を富化するのに非常に効率が良い上に、細胞培養物由来の混入物を著しく減らせる。
【０００８】
残念ながら、精製に使用したリガンドは、この工程の間に樹脂から滲出し、最後には、精製された物質中の不純物となり得る。滲出は、細胞培養物由来の成分によるリガンドのタンパク質分解などの使用された解離条件、さらには使用された樹脂の性質、固定化化学およびアフィニティー樹脂の製造に係わる他の局面の結果として起こり得る。また、相互作用物間の生体分子特異的な相互作用に関与する力は、幾らかリガンドの滲出に寄与し得る。どの特異的メカニズムが関与するかに関係なく、リガンドは、アフィニティー樹脂で精製される製品に混入し得る。不純物リガンドの特異的な生物学的性質に依存して、これらの原理によって精製された生物学的に活性な不純物を含む可能性のある治療用タンパク質の投与は、アレルギー性ショックまたは補体活性化などの処置のリスクプロファイルを増大させる望まない副作用を誘発し得る。
【０００９】
スタフィロコッカス属によって生産される天然プロテインＡは、２種の原理的に異なる方法で免疫グロブリンと相互作用する：
・ヒトＩｇＧのＦｃ部分が関与する古典的相互作用(７)。
・免疫グロブリンクラス(８)と無関係に、重鎖の可変ドメインのVHIII(９)群に属する免疫グロブリンが関与する他の相互作用。
【００１０】
天然プロテインＡは、５個の免疫グロブリン結合ドメインを有し(１０)、その各々はそれぞれＩｇＧのＦｃγ部分およびＦａｂ部分と独立して相互作用できる。これは、ＩｇＧとプロテインＡの間の多くの相互作用の可能性を生じ、等モルの比率で沈殿物を形成しさえする(７)。しかし、相互作用物の比率が極めて異なる条件下では、複合体形成において可能性のある相互作用の幾つかが関与して不均一な複合体を形成する可能性もある。
【００１１】
天然プロテインＡは組換え法を使用して修飾されている(１１)。例として、天然のスタフィロコッカスのプロテインＡまたは同分子の組換え型である多量体型フラグメントＺ(１１)、または、反復定置洗浄手順における安定性を改善するために、アルカリ耐性に関して修飾されたプロテインＡ由来分子(クロマトグラフィー媒体 MabSelect SuRe(商標)のアガロース上に固定化)であるMabSelect SuRe(商標) リガンド(GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Sweden)(１２)を、精製工程でリガンドとして使用する場合である。このため、精製手順の間に、連続精製工程の間の緩衝液条件がプロテインＡとＩｇＧの複合体形成を可能にするｐＨに至ると、天然プロテインＡまたはその組換え類縁体がそれぞれ樹脂から滲出し、溶出したＩｇＧと複合体を形成する。中性ｐＨでＩｇＧに関してプロテインＡの量を定量する試み(ppmで表す)は、プロテインＡ上の関連するエピトープへの制限された接近に大きく影響される可能性がある。これにより、プロテインＡの真の濃度が低く見積もられる可能がある。患者が高濃度すぎる滲出プロテインＡに曝されることを回避するために、これらのレベルは１２〜１４ppm未満であるべきである(１３)。
【００１２】
２つの異なる原理が、プロテインＡ−ＩｇＧ複合体を破壊してプロテインＡを定量化のために接近可能とするために適用される：
・変性工程を助ける化合物の存在下で、プロテインＡの定量化に使用されるサンプル中に存在するＩｇＧ成分の熱変性(１４)。プロテインＡはこのような処理による変性に耐えると考えられる。複合体のＩｇＧ成分が変性すると、本工程は、正確な定量化のためにプロテインＡ部分を放出する(１５)。
・予め形成された複合体を解離するためのサンプルの酸処理、および、酸条件下でのイムノアッセイの実施(１６；WO 91/10911)。ここで、イムノアッセイに使用される免疫試薬は、選択された酸条件に耐える必要がある。最適には、選択されたｐＨは、一方でプロテインＡとＩｇＧの複合体を定量的に解離し(すなわちプロテインＡをＦｃおよび／またはＦａｂ領域から解離する)、他方でアッセイがなお機能すべきであるが、この組み合わせは実現が困難であることが証明されている。
【００１３】
多くの場合では、熱変性は実行可能でない。例としては、アッセイが回転可能なコンパクトディスク(ＣＤ)に提供される微小流体構造で行われる、Gyrolab(商標) system (Gyros AB, Uppsala, Sweden)によって例示されるタイプの分析系を使用する場合である。第１に、系中で利用可能な加熱装置が存在しないため、サンプルの熱処理をＣＤおよび装置の外側で行わなければならない。第２に、ＣＤ内熱処理は、ＣＤに組み込まれた重要な機能を破壊する可能性があり、また、微小流体をベースとするアッセイ原理に不適合なタンパク質凝集体を生じる可能性がある。ＣＤの外側で加熱を行うとき、適切に予防措置をしない限り、微小構造が詰まるリスクのあるタンパク質粒子が形成し得る。
【００１４】
WO 2008/033073 A1は、アナライトが少なくとも一部アナライト結合種との複合体として存在する、液体サンプル中のアナライトの総濃度を測定する方法を開示している。本方法は、ａ) サンプルを、アナライトとアナライト結合種の結合親和性を実質的に全てのアナライト複合体を解離させ、実質的に全てのアナライトを遊離形で提供するのに十分な程減らす条件に付し、ｂ) サンプルを、アナライトとアナライト結合種の結合親和性を回復させる条件に付し、そして、ｃ) 結合親和性が回復した直後でありかつアナライトの何らかの実質的な複合体再形成が起こる前に、サンプル中の遊離アナライトの濃度を測定する工程を含む。一つの態様において、本方法は、無標識検出を使用するフロー系、例えば表面プラズモン共鳴法(ＳＰＲ)で行われる。
【００１５】
WO 2009/022001 A1は、治療薬に対する抗薬物抗体(ＡＤＡ)を検出するための表面プラズモン共鳴法に基づく方法を開示する。分析する患者のサンプル中の薬物の存在下での薬物相互干渉作用は、サンプルを酸性(ｐＨ ２.５または３)にし、次いで分析前にサンプルを中性にすることによって克服される。
【００１６】
複合体形態のアナライトを含むサンプル中の総アナライトを定量化する方法であって、酸処理による複合体の解離に基づき、多様なアナライトと捕捉試薬、特に抗体に対して一般に機能的である方法を提供することが、本発明の目的である。
【発明の概要】
【００１７】
本発明の概要
上記の目的は、一方で液体サンプル中の予め形成された複合体(例えばプロテインＡ−ＩｇＧ複合体)を解離し、他方でイムノアッセイを行うための別々のｐＨで、すなわち、複合体の再形成が大部分阻止され、かつ大量の複合体形成成分の存在下でさえ、アナライトの用量応答を得るのに十分な程、捕捉分子、典型的には抗体が活性であるｐＨを使用する、改善された方法によって達成される。
【００１８】
一つの局面において、本発明は、それ故に、液体サンプル中のアナライトをアナライトに特異的に結合できるリガンドと結合させることを含むイムノアッセイによって定量的に測定する方法であって、該アナライトが少なくとも一部アナライト複合体として存在し、
ａ) 存在するアナライト複合体を少なくとも実質的に解離し、実質的に全てのアナライトを遊離形で提供するためにサンプルを第１の酸性ｐＨに付し、
ｂ) 第１の酸性ｐＨを、複合体の再形成を(少なくとも大部分)阻止するが、アナライトのリガンドへの結合を可能とする第２の酸性ｐＨまで上げ、
ｃ) サンプル中のアナライトを定量的に測定するために、アナライトのリガンドへの結合を測定する
工程を含む方法を提供する。
【００１９】
用語“アナライト複合体”は、本明細書で用いられるとき、特異的結合種および非特異的結合種との複合体を含み、また、アナライトの多量体、例えば二量体または三量体も含む。
【００２０】
リガンドは、例えば、抗体であってよい。用語“抗体”は、本明細書で用いられるとき、広い意味で解釈され、天然であっても、一部もしくは全合成されていてもよい免疫グロブリンをいい、Ｆａｂ抗原結合フラグメント、一価フラグメントおよび二価フラグメントを含む活性フラグメントも含む。また、用語は、免疫グロブリン結合ドメインと相同の結合ドメインを有するあらゆるタンパク質を包含する。このようなタンパク質は、天然ソースに由来しても、一部もしくは全合成により製造されてもよい。例示的な抗体は、免疫グロブリンアイソタイプ、および、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂおよびＦｄフラグメントである。
典型的には、リガンドは、固体支持体に固定化される。
【００２１】
一つの態様において、アナライトは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬまたはそれらの誘導体(天然変異体および組換えで生産されたタンパク質またはポリペプチドを含む)から選択され、サンプルはＩｇＧを含む。
【００２２】
他の態様において、第１の酸性ｐＨは約１.５〜約３.２(特に１.５〜３.２)の範囲から選択され、第２の酸性ｐＨは約２.７〜約４.５(特に２.７〜４.５)、より好ましくは約２.８〜約４.５(特に２.８〜４.５)の範囲から選択される。第２の酸性ｐＨは、例えば、約３.０〜約４.５(特に３.０〜４.５)の範囲から選択される。
【００２３】
一つの態様において、第１の酸性ｐＨは約２.３〜約２.５(特に２.３〜２.５)の範囲から選択され、および／または、第２の酸性ｐＨは約２.８〜約３.２(特に２.８〜３.２)の範囲から選択される。あるいは、第２の酸性ｐＨは、約３.３〜約３.５(特に３.３〜３.５)または約３.０〜約３.２(特に３.０〜３.２)の範囲から選択される。
【００２４】
本方法は、好都合には、微小流体系で行われ得る。
【００２５】
他の局面において、本発明は、液体サンプル中に少なくとも一部複合体形態で存在するアナライトのイムノアッセイを行うためのキットであって、
・アナライトに結合できる検出試薬、
・好ましくは約１.５〜約３.２の範囲のｐＨを有する第１の酸性緩衝液、
・第１の酸性緩衝液より高いｐＨを有する、好ましくは約２.７〜約４.５の範囲のｐＨを有する第２の酸性緩衝液
を含むキットを提供する。
【００２６】
一つのキットの態様において、アナライトは固相に固定化されたリガンドに結合でき、キットはさらに固相に結合できるアナライト用捕捉試薬を含む。
好ましくは、捕捉試薬はビオチン化され、リガンドはアビジンまたはストレプトアビジンである。
他の好ましい態様を従属項に示す。
【００２７】
本発明のより完全な理解および本発明のさらなる特徴および利点は、次の詳細な説明および図面の記載によって得られる。
簡潔にするため、用語“MabSelect SuRe(商標) リガンド”は、下でしばしば“MabSelect SuRe”という。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、本発明の方法の態様を行うための微小構造の平面図である。
【図２】図２は、プロテインＡ／ＩｇＧ複合体解離および遊離プロテインＡの分析のためのそれぞれのｐＨ範囲を示す。
【図３】図３は、５mg/mlのＩｇＧの存在下でのMabSelect SuRe(商標) リガンドの自動化された酸解離および分析の方法を示す。
【図４】図４は、(１) 緩衝液中のMabSelect SuReのみ；(２) ｐＨ ２.５および３.５で処理した後のMabselect SuRe＋５mg/mlのｈＩｇＧ；(３)(対照) MabSelect SuRe＋５mg/mlのｈＩｇＧ、ｐＨ ２.５で解離、ｐＨ ８.０で分析；および(４)(対照) ５mg/mlのｈＩｇＧでのMabSelect SuRe、解離せず、ｐＨ ７.４でアッセイについての標準曲線をアッセイした用量応答関係をオーバーレイ方式で示す図である。
【図５】図５は、５mg/mlのｈＩｇＧの存在下でのMabSelect SuReの標準曲線を示す図である。
【図６】図６は、５mg/mlのｈＩｇＧの存在下でのMabSelect SuReについての標準曲線を示す図である。
【図７】図７は、５mg/mlのポリクローナルヒトＩｇＧの存在下での天然のプロテインＡ(複合体解離についてのｐＨ ２.３、分析についてのｐＨ ３.３)についての標準曲線を示す図である。
【図８】図８は、５mg/mlの濃度のヒトポリクローナルＩｇＧ(Octagam(商標))の存在下での２つの異なる分子形態のプロテインＡ[天然(１)およびMabSelect SuRe(２)]について重ね合わせた標準曲線を示す図である。
【図９】図９は、種々の濃度のHumira(商標) (治療用モノクローナル抗体)の存在下でのMabSelect SuReについての標準曲線をオーバーレイ方式で示す図である。(１) 緩衝液のみ中のMabSelect SuRe；(２) １０mg/mlのHumira(商標)中のMabSelect SuRe；(３) ５mg/mlのHumira(商標)中のMabSelect SuRe；および(４) ２mg/mlのHumira(商標)中のMabSelect SuRe。
【図１０】図１０は、(１)緩衝液のみ；(２) ５mg/mlのHerceptin(商標)(治療用モノクローナル抗体)の存在下；および(３) ５mg/mlのHumira(商標)の存在下で残留MabSelect SuReについての標準曲線をオーバーレイ方式で示す図である。
【図１１】図１１は、５mg/mlのHumira(商標)の存在下でのMabSelect SuReについての標準曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の詳細な説明
上記のとおり、本発明は、サンプル中の予め形成された複合体を解離するためおよびイムノアッセイを行うための別々の酸性ｐＨを使用する原理に基づいており、より具体的には、最初に、複合体を効率的に解離するために相対的に低いｐＨを使用し、続いて、複合体の復元は大部分阻止されるが、捕捉試薬(典型的には抗体)は、定量化するアナライトを効率的に捕捉するのに十分活性である高目の酸性ｐＨでアッセイを行うことによるものである。
【００３０】
本方法は、多種多様なアッセイ系およびアッセイフォーマットを用いて行い得る。
好ましくは、固定化されたアナライト特異的リガンドを有する固体支持体表面を含む不均一アッセイ系を、固体支持体表面に結合したアナライト(サンドイッチアッセイを含む直接的アッセイまたはディスプレイスメントアッセイ)または検出可能なアナライトアナログ(競合アッセイ)の何れかの量を、直接的または間接的に検出することによってアナライト濃度を測定するために使用する。固体支持体表面は、それ自体当技術分野で知られている多様な形状を有してよく、例えば、典型的に微小流体チャネルまたはキャビティーで提供される充填床の粒子であっても、キュベットまたはウェルの、例えばマイクロウェルまたはフローセルまたはチャネルなどの表面領域であってもよい。
【００３１】
本発明の方法は、一般的に、多種多様なアナライトおよびアナライト複合体に適用可能であるが、以下では、主に液体サンプル中のＩｇＧ存在下でのプロテインＡおよびプロテインＡ誘導体の定量に関して、および、微小流体系、特に上記Gyrolab(商標) プラットホームにおけるアッセイの実施に関して記載する。
【００３２】
本発明の方法によって測定することが考慮される他のアナライトの、少なくとも一部複合体形態で存在する場合の例は、次に示すものを含む：
・トロポニンＩの分析においてＩｇＧ自己抗体から解離するトロポニンＩ
・癌をスクリーニングするとき、抗体の測定における癌抗原に対する自己抗体の解離
・アミロイドβを測定するとき、アミロイドβのホモマー(凝集体および原線維)の解離
・メタロプロテアーゼ／ＴＩＭＰ阻害の解離などの、免疫化学的方法による酵素の測定における酵素／酵素阻害剤の解離。
【００３３】
背景の章で記載された通り、複合体解離のために選択された酸性ｐＨを使用すること、および、同じｐＨでイムノアッセイを行うことが以前に提案された。本発明者らの経験では、少なくとも現在利用可能なアッセイに使用される免疫試薬で、解離および定量化のために１つの選択されたｐＨを使用して、予め形成されたプロテインＡ−ＩｇＧ複合体の非効率的解離が定量に与える影響を完全に除くことは難しい。
【００３４】
しかし、幾つかの場合では、例えば真の分析状況とかなりかけ離れた状況であるＩｇＧおよびプロテインＡの溶液を混合前に酸性にした場合、イムノアッセイのために選択されたｐＨは、複合体の形成の阻止に有効であることも示された。しかし、この観察は、一方では予め形成された複合体を解離するのに必要とされる条件、、他方では複合体の再形成を阻止するのに必要とされる条件に対する“ヒステリシス効果”を示す基本的生化学的原理と一致している(１７)。したがって、新しい複合体の形成を阻止するよりも、予め形成された複合体を解離することに、より多くのエネルギーをかける。
【００３５】
本発明は、上記観察を実践に移すことに基づいており、すなわち、第１の低ｐＨで複合体を定量的に解離し、使用される抗体の機能的性質と適合しているが複合体の再形成を(少なくとも実質的な程度で)阻止するよう選択された第２の高目の酸性ｐＨでアッセイを行うことは魅力的であろう。３.５のような弱酸性ｐＨでのイムノアッセイの実施でも、大部分の抗体でなお非常に厳しいことは重視すべきである。本発明は、天然の親和性を表す分子と、カウンターパートの少なくとも１種がイムノアッセイを使用した定量化の対象である分子の間の相互作用で見られるヒステリシスを利用する。
【００３６】
本発明の方法を、ここで、Gyrolab(商標) イムノアッセイプラットホーム(Gyros AB, Uppsala, Sweden)を使用する状況で記載する。Gyrolab(商標) 系またはワークステーションは、複数の微小流体構造を有するコンパクトディスク(ＣＤ)を使用する。このタイプの微小流体分析法についてのより詳細な情報のために、例えば、WO 99/058245、WO 02/074438 A2、WO 02/075312 A1、WO 03/018198 A1、WO 2004/083108 A1およびWO 2004/083109 A1 (これらの関連する開示はここに引用することによって組み込まれる)を参照し得る。
【００３７】
図１は、２個の液体注入口(１)、２個の容量規定ユニット(２)、オーバーフローチャネル(３)、混合チャンバー(４)、強制フィンガーバルブ(５)、および、反応が起こり、リガンド、ここでは典型的にはビオチン化捕捉抗体と結合するストレプトアビジン(ストレプトアビジン−ビオチン相互作用は、本方法で使用される酸性ｐＨ条件で安定である)と結合したビーズを含む場所である捕捉カラム(６)を含む、Gyrolab(商標) CDの微小構造の１つであるＣＤＭＸ１を図示している。疎水性バリア(示さず)が、混合チャンバー(４)を捕捉カラム(６)から隔てる。イムノアッセイを行うための試薬および緩衝液を左注入口(１)に注入し、サンプルとサンプル前処理用試薬を右注入口(１)に注入する。混合チャンバー(４)は捕捉カラム(６)の上流に位置し、すなわち、ＣＤの回転によって、液体を混合チャンバー(４)から捕捉カラム(６)に流す。
【００３８】
一定量のサンプルおよびサンプルの前処理を目的とした緩衝液を、ＣＤ内の容量規定後、連続して、少しずつ、典型的には２００nlずつ、混合チャンバー(４)に加えることができる。原理上、微小流体原理と適合するどんなタイプの液体も加えることができる。始めにサンプルを注入し、その後、適切な緩衝能を有する選択された酸性緩衝液と混合することによって、混合物のｐＨを劇的に変化させ、予め形成されたプロテインＡおよびＩｇＧの複合体を効率よく解離する。次の工程において、中性ｐＨ側のｐＨであるが複合体の再形成を完全に阻止するｐＨであってイムノアッセイが許容できるｐＨまでｐＨを上げる目的で他の緩衝液を加える。典型的に、効率のよい解離を目的とする緩衝液は最終１.５〜３.２のｐＨを生じさせるものであるのに対して、分析用サンプルを調製することを意図した緩衝液は、相互作用物の性質、相互作用物の濃度およびアッセイに用いられる試薬の酸性ｐＨに対する耐容性に依存して、最終２.７〜４.５、より具体的には２.８〜４.５、例えば３.０〜４.５のｐＨを生じさせるものである。これらの原理は、図２に概略的に図示されており、この図は、プロテインＡ／ＩｇＧ複合体の解離およびプロテインＡ−ＩｇＧ複合体の再結合を阻止する弱酸性ｐＨでの遊離プロテインＡの分析のための例示的なｐＨ範囲を示す。
【００３９】
酸性緩衝液添加の解離効果は、通常非常に迅速である。プロテインＡ−ＩｇＧ系では、最終２.５のｐＨとなった１〜５分後、解離は定量的であるようである。サンプルのｐＨをアッセイのためのランニング条件に調節する次の工程もまた非常に迅速である。
【００４０】
分析工程は、混合チャンバー(４)を捕捉カラム(６)(図１)から隔てる疎水性バリアの抵抗を克服するためにＣＤの回転速度を上げることによって開始される。捕捉カラムは、適切な捕捉抗体で機能付与され、瞬間的なプロテインＡ−ＩｇＧ複合体の再形成も全て阻止するために、捕捉カラムを、サンプルと同じ緩衝液組成物で前もって洗浄する必要があり得る。サンプルが捕捉カラムを通して処理されたら、この段階ではカラム上に捕捉されたプロテインＡと、処理中に利用される微小流体経路に存在する残留ＩｇＧの間のプロテインＡ−ＩｇＧ複合体の再形成を阻止するためにサンプルと同じｐＨの酸緩衝液で２〜４回洗浄する必要があり得る。最終的に、検出試薬の添加前に、サンドイッチイムノアッセイの形成を助けるために、捕捉カラムのｐＨを中性まで上げる。検出前に必要なカラムの洗浄によって、本工程は終わりとなる。
【実施例】
【００４１】
実験部
材料および試薬の調製
捕捉抗体
ポリクローナルニワトリ抗プロテインＡ抗体を、Cygnus Technologies, Southport, NC, U.S.A. (www.cygnustechnologies.com)から購入した。抗体の一定量を、ＥＺ−結合スルホＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン(21338, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA - www.piercenet.com)を用いて、製造者の指示書に従ってビオチンで標識した。Rexxip(商標) ADA 緩衝液(Gyros AB, Uppsala, Sweden)を用いた。
【００４２】
プロテインＡに対するビオチン化マウスモノクローナル抗体を、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, U.S.A. (カタログ番号 B3150; www.sigmaaldrich.com)から購入した。
【００４３】
プロテインＡに対するものであり、低ｐＨ条件を維持するよう設計された特製(proprietary)ポリクローナル抗体を得た。抗体のアリコートを、ＥＺ−結合スルホＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン(21338, Thermo Scientific)を用いてビオチンで標識した。
【００４４】
検出抗体
“捕捉抗体”の表題の下に、上に記載した抗プロテインＡ抗体(Cygnus Technologies)および特製抗プロテインＡ抗体の一定量を、それぞれ、Alexa Fluor(商標) 647 (A20186, Life Technologies, Carlsbad, CA, U.S.A.)を用いて、製造者の指示書に従って、フルオロフォアで標識した。Rexxip(商標) ADA 緩衝液(Gyros AB, Uppsala, Sweden)を用いた。
【００４５】
ＩｇＧ
静脈内投与用ポリクローナルヒトＩｇＧ(ｈＩｇＧ)であるOctagam(商標)(Octapharma AB, Stockholm Sweden) ５０mg/mlを処方に基づき薬局から購入した。この製剤をアルコール分画によって精製し、決してプロテインＡまたは何らかのプロテインＡ誘導体と接触させなかった。
Humira(商標) (治療用抗体, Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, USAが販売)を処方に基づき薬局から購入した。
Herceptin(商標) (治療用抗体, F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Switzerlandが販売)を処方に基づき薬局から購入した。
【００４６】
緩衝液
緩衝液を、固形化学物質から、適切な緩衝能およびｐＨで調製した。
【００４７】
プロテインＡ
プロテインＡ (天然, 17-0872-05)およびその誘導体(MabSelect SuRe(商標) リガンド, 28-4018-60)を、GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Sweden (www.gelifesciences.com)から購入した。
【００４８】
ＣＤ
ＣＤＭＸ１(P0020026)は、“Gyrolab ADA CD”ともいい、Gyros AB, Uppsala, Sweden (www.gyros.com)から得た。カラム充填は(１５μｍ)ストレプトアビジン誘導Dynospheres(商標) (Invitrogen Dynal A.S., Oslo, Norway)であった。
【００４９】
サンプルの調製
ＰＢＳ(ｐＨ ７.４)中５mg/mlのポリクローナルＩｇＧでプロテインＡを希釈して、プロテインＡとＩｇＧの複合体を形成させることによって、標準曲線サンプルを調製した。
クオリティーコントロール(ＱＣ)サンプルを、５mg/mlのポリクローナルまたはモノクローナルＩｇＧの存在下で、既知濃度のプロテインＡで別々の希釈で調製した。
【００５０】
Gyrolab(商標) 方法
分析前サンプルの自動化酸解離方法をＣＤＭＸ１で開発した。この５mg/mlのＩｇＧ存在下でのMabSelect SuRe(商標) リガンドの自動化された酸解離および分析方法は図３に記載されており、２つのパネルは、捕捉カラムと分析前サンプルでの処理を示している。Ｗ＝カラム洗浄、Ｃ＝捕捉試薬、Ｓ＝サンプル、１＝酸解離１、２＝酸解離２、ＳＡ＝サンプルの捕捉カラムへの適用、および、Ｄ＝検出試薬。矢印は、異なる処理工程がどのように連結されるかを示す。
【００５１】
実験は、プロテインＡのために３種の異なる捕捉抗体、すなわちそれぞれ市販ニワトリポリクローナル抗体、市販マウスモノクローナル抗体および特製ポリクローナル抗体、サンプル中多様な濃度のＩｇＧおよびプロテインＡまたはプロテインＡ誘導体(MabSelect SuRe)、ならびに捕捉カラムの多様な洗浄処理を使用する以外、基本的に図３に概説した通りに行った。結果を下に表す。
【００５２】
実験
下に記載する通り、ＣＤＭＸ１を用いて上に概説した通りに行った実験は、一方でサンプル中の予め形成されたプロテインＡ−ＩｇＧ複合体を解離し、他方で複合体の再形成が大部分阻止され、かつ５mg/mlのＩｇＧの存在下でMabSelect SuRe(商標) リガンドの用量応答を得るのに十分捕捉抗体が活性であるイムノアッセイを行うための、別々のｐＨを使用する原理を証明する。
【００５３】
得られたデータは、プロテインＡ誘導体MabSelect SuReが、５mg/mlのＩｇＧ濃度で、ｐｐｍ未満のレベルで測定できることを示す。従って、MabSelect SuReに使用されるアッセイは約１ng/mlから上に及び、約０.２ppm(w/w)の感度を生じた。
【００５４】
３種の異なる捕捉抗体を用いた上記の実験を記載する。
捕捉抗体および検出抗体としてニワトリポリクローナル抗プロテインＡ抗体(ｐＨ ２.５で解離、ｐＨ ３.５で捕捉)
MabSelect SuRe
早い段階で、MabSelect SuRe(商標) リガンドと比べて大過剰のＩｇＧの存在によるある小さな残留効果が、回収結果を多少悪化させる兆候があった。このことは、図４の曲線１および２の比較により見られる。図４は、MabSelect SuRe(商標) リガンドのみ(１)、および、本方法について記載された通りにｐＨ ２.５およびｐＨ ３.５で処理した後のMabselect SuRe＋５mg/mlのｈＩｇＧ(２)を含む標準曲線サンプルのアッセイの用量応答関係を図示している。対照として、５mg/mlのｈＩｇＧを含むMabSelect SuReの標準曲線サンプルをｐＨ ２.５で解離させるが、アッセイをｐＨ ８.０での中和後に行い(３)、最後に、５mg/mlのｈＩｇＧでのMabSelect SuReの標準曲線(用量応答曲線)サンプルは解離をさせず、アッセイをｐＨ ７.４で行った(４)。
【００５５】
上で認識された課題は、MabSelect SuRe 標準にＩｇＧを組み込むことによって解決される可能性があることが分かった。これを試したとき、逸脱した回収値は、下の図５および表１に示す通り、試験した大部分のMabSelect SuRe／ＩｇＧ比で期待されたレベルまで戻った。
【００５６】
図５は、５mg/mlのｈＩｇＧの存在下でのMabSelect SuReの標準曲線を示す。捕捉カラムを捕捉工程の前にグリシン−クエン酸緩衝液(ｐＨ ３.５)を使用して洗浄し、さらに、カラムを２回洗浄し、ＰＢＳを使用してカラムを中和して、分析工程を終了させた。
【００５７】
表１は、図５の標準曲線を使用したときのＱＣサンプルの平均バイアスを示す。
【表１】
0006279590.tif 000002
【００５８】
さらに、捕捉工程の前の捕捉カラムの別の酸性化を避け、かつ捕捉後最初の２回の洗浄時は中性ｐＨを使用するよう本方法を僅かに修正した後、下の図６および表２に示す通り、平均バイアスが僅かに改善した。
【００５９】
図６は、５mg/mlのｈＩｇＧの存在下でのMabSelect SuReについての用量応答曲線を示す。捕捉カラムを全工程の間ＰＢＳ(ｐＨ ７.４)中に維持した。
【００６０】
表２は、図６の標準曲線を使用したときのＱＣサンプルの平均バイアスを示す。
【表２】
0006279590.tif 000003
【００６１】
捕捉抗体としてマウスモノクローナル抗プロテインＡ抗体および検出抗体としてニワトリポリクローナル抗プロテインＡ抗体(ｐＨ ２.３で解離、ｐＨ ３.３で捕捉)
天然プロテインＡ
また、上と同じ原理の手順を用いて天然プロテインＡを分析する可能性を、評価した。この場合は、天然プロテインＡを含む標準曲線サンプルを、５mg/mlのポリクローナルヒトＩｇＧの存在下での３０〜０.１２ng/mlの範囲で調製した。解離工程をｐＨ ２.３で行い、分析工程をｐＨ ３.３で行った。他の全ての局面で MabSelect SuRe リガンドの分析に関する原理と同じ原理で行った。この実験のデータを下の図７および表３に示す。
【００６２】
図７は、５mg/mlのポリクローナルヒトＩｇＧの存在下での天然プロテインＡについての用量応答曲線を示す。プロテインＡ−ＩｇＧ複合体の解離のために選択されたｐＨは２.３であり、分析のために選択されたｐＨは３.３であった。
【００６３】
表３は、アッセイにおいて解離にｐＨ ２.３を、分析にｐＨ ３.３を用いた、５mg/mlのポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で種々の濃度の天然プロテインＡを含むＱＣサンプルの分析を示す。これから分かるように、２.５ng/mlを越えるプロテインＡ濃度で、バイアスは±２０％以内である。
【表３】
0006279590.tif 000004
【００６４】
捕捉抗体および検出抗体として特製ポリクローナル抗プロテインＡ抗体(ｐＨ ２.５で解離、ｐＨ ２.８で捕捉)
MabSelect SuRe
上に記載されたものと基本的に対応する実験を、ＣＤＭＸ１において、市販ニワトリポリクローナル抗体の代わりに特製捕捉ポリクローナル抗体を用いて、図３に示した手順、すなわちｐＨ ２.５およびｐＨ ２.８で処理するなどを行った。
【００６５】
図８は、(１) プロテインＡ、および、(２) ５mg/ml濃度のヒトポリクローナルＩｇＧ(Octagam(商標))の存在下でのMabSelect SuReについての標準曲線の重ね合わせたチャートを示す。
【００６６】
図９は、(１) 緩衝液のみ中のMabSelect SuRe、(２) １０mg/mlのHumira(商標)(治療用モノクローナル抗体)中のMabSelect SuRe、(３) ５mg/mlのHumira(商標)中のMabSelect SuRe、および、(４) ２mg/mlのHumira(商標)中のMabSelect SuReについての標準曲線の重ね合わせたチャートを示す。
【００６７】
図９の標準曲線を用いて、異なる濃度のHumira(商標)で調製した異なる濃度のMabSelect SuReを含むＱＣサンプルを、ＣＤＭＸ１において、MabSelect SuRe濃度について分析した。予測濃度に関する平均バイアスを決定した。結果を下の表４に示す。
【表４】
0006279590.tif 000005
CV＝変動係数
【００６８】
図１０は、(１) 緩衝液のみ、(２) ５mg/mlのHerceptin(商標)の存在下、および、(３) ５mg/mlのHumira(商標)の存在下での残留MabSelect SuReについての標準曲線の重ね合わせたチャートを示す。
【００６９】
図１０の標準曲線を用いて５mg/mlの組換え抗体(それぞれHerceptin(商標)およびHumira(商標))を含むサンプル中の残留MabSelect SuReを定量化した。結果を下の表５に表す。
【表５】
0006279590.tif 000006
【００７０】
サンプル中の未知濃度のMabSelect SuReの測定
残留MabSelect SuReが混入したＩｇＧ含有(Humira(商標))サンプルを提供した。最初にサンプルを５g/Lの濃度に希釈することによって標準化した。次いで、ｐＨ ２.５での酸解離およびｐＨ ２.８での捕捉を含む上で概説した手順を用いて、サンプルをプロテインＡについて分析した。用量応答 対 MabSelect SuReの濃度についての標準曲線を、図１１に示した通り作成した。次いで、元のサンプル中の残留MabSelect SuReの濃度を標準曲線を用いて決定し、希釈因子に対して補正することによって計算した。デュプリケートの測定の精度(ＣＶ％)を記載する。結果を下の表６に示す。
【００７１】
【表６】
0006279590.tif 000007
【００７２】
結論
上に示した通り、MabSelect SuRe(商標) リガンド、すなわち免疫グロブリンの親和性クロマトグラフィーからの潜在的浸出液が高濃度のＩｇＧの存在下で正確に定量できる完全自動化微小流体手順が、成功裏に実行された。
【００７３】
さらに、その手順を、標準化された方法で異なるｐＨの異なる緩衝液でサンプルを予め処理できる混合チャンバーを捕捉カラムの上流に有する微小流体構造を含むＣＤ内で行うことができることが証明された。
【００７４】
手順は、特定のセットアップに依存して、平均約１時間かかる。
検出できるMabSelect SuRe(商標) リガンドの相対濃度は、５mg/mlのＩｇＧ(w/w)で、０.２〜０.５ppmの範囲であり、不純物の規制許容レベル(１３)よりはるかに小さい相対濃度である。
また、主な解離および分析手順は、５mg/mlのポリクローナルヒトＩｇＧ中の天然プロテインＡに適合している。
【００７５】
キットの組成−残留プロテインＡについてのアッセイ
ＩｇＧ存在下で残留プロテインＡ(またはMabSelect SuRe)の分析を行うための典型的なキットは、下記の試薬Ａ〜Ｉを含む。試薬Ａ、ＢおよびＣをそれぞれ希釈試薬Ｇ、ＨおよびＩで希釈することを意図したストック溶液として提供する。キット全体は、２４０個のデータ点(４８個／ＣＤ)を得る５個のGyrolab(商標) ADA CD (Gyros AB)に十分な量の９種の異なるタイプの液体からなる。
試薬Ａ：  捕捉試薬, ビオチン化抗プロテインＡ抗体, ６２５μg/ml
試薬Ｂ：  検出試薬, フルオロフォア標識抗プロテインＡ抗体, ２００ｎＭ
試薬Ｃ：  天然のプロテインＡ, １０００μg/L
試薬Ｄ：  酸解離緩衝液１, ０.２５Ｍのグリシン−ＨＣｌ(ｐＨ ２.５)
試薬Ｅ：  酸解離緩衝液２, ０.１Ｍのクエン酸緩衝液(ｐＨ ３.４)
試薬Ｆ：  酸性洗浄緩衝液, １部の試薬Ｄを一部の試薬Ｅと混合
試薬Ｇ(２バイアル)：  中性洗浄緩衝液および捕捉試薬Ａ希釈用の緩衝液
試薬Ｈ(２バイアル)：  サンプル希釈用のサンプル希釈緩衝液, Rexxip(商標) ADA (P0020027, Gyros AB)
試薬Ｉ：  希釈検出試薬Ｂ(０.５ml)のための検出抗体緩衝液, Rexxip(商標) F (P0004825, Gyros AB)
【００７６】
サンプル用量が２００nlであるとき、２００nlの０.１Ｍのクエン酸緩衝液(ｐＨ ３.４)を２００nlのサンプルおよび２００nlの酸解離緩衝液１(ｐＨ ２.５)の混合物に加え、最終ｐＨ ２.８となったことに留意する。
【００７７】
本発明は、上記好ましい態様に限定されない。様々な代替物、修正および等価物を使用してよい。従って、上記態様は、請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものととるべきではない。
【００７８】
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【図１】
0006279590.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006279590.tif 000015
【図９】
0006279590.tif 000016
【図１０】
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【図１１】
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