(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性オリゴペプチド及びそれらの水溶性塩の中から選ばれた少なくとも１種を有効成分とする上皮系細胞増殖促進剤であって、
水溶性オリゴペプチドがプロリルイソロイシルグリシンである上皮系細胞増殖促進剤。
【請求項２】
水溶性オリゴペプチド及びそれらの水溶性塩の中から選ばれた少なくとも１種を有効成分とする上皮系細胞増殖促進剤であって、
水溶性オリゴペプチドがイソロイシルグリシルセリンである上皮系細胞増殖促進剤。
【請求項３】
プロリルイソロイシルグリシル単位を含むアミノ酸単位４個から７個までの水溶性オリゴペプチド及びそれらの水溶性塩の中から選ばれた少なくとも１種を有効成分とする上皮系細胞増殖促進剤であって、
水溶性オリゴペプチドがプロリルイソロイシルグリシル単位とグリシル単位又はセリル単位からなるものである上皮系細胞増殖促進剤。
【請求項４】
プロリルイソロイシルグリシル単位を含むアミノ酸単位４個の水溶性オリゴペプチド及びそれらの水溶性塩の中から選ばれた少なくとも１種を有効成分とする上皮系細胞増殖促進剤であって、
水溶性オリゴペプチドがプロリルイソロイシルグリシル単位とグリシル単位又はセリル単位からなるものである上皮系細胞増殖促進剤。
【請求項５】
水溶性オリゴペプチドがグリシルプロリルイソロイシルグリシンである請求項３記載の上皮系細胞増殖促進剤。
【請求項６】
水溶性オリゴペプチドがプロリルイソロイシルグリシルセリンである請求項３記載の上皮系細胞増殖促進剤。
【請求項７】
プロリルイソロイシルグリシル単位を含むアミノ酸単位５個から７個までの水溶性オリゴペプチド及びそれらの水溶性塩の中から選ばれた少なくとも１種を有効成分とする上皮系細胞増殖促進剤であって、
水溶性オリゴペプチドがグリシルプロリルイソロイシルグリシル単位とセリル単位又はトレオニル単位からなるオリゴペプチドである上皮系細胞増殖促進剤。
【請求項８】
水溶性オリゴペプチドがグリシルプロリルイソロイシルグリシルセリンである請求項７記載の上皮系細胞増殖促進剤。
【請求項９】
水溶性オリゴペプチドがグリシルプロリルイソロイシルグリシルトレオニンである請求項７記載の上皮系細胞増殖促進剤。
【請求項１０】
育毛のための請求項１〜９のいずれかに記載の上皮系細胞増殖促進剤。
【請求項１１】
毛髪休止期に作用する育毛のための請求項１０記載の上皮系細胞増殖促進剤。
【請求項１２】
イソロイシルグリシルセリンである水溶性オリゴペプチド及びその水溶性塩。
【請求項１３】
プロリルイソロイシルグリシルセリンである水溶性オリゴペプチド及びその水溶性塩。
【請求項１４】
グリシルプロリルイソロイシルグリシルセリンである水溶性オリゴペプチド及びその水溶性塩。
【請求項１５】
グリシルプロリルイソロイシルグリシルトレオニンである水溶性オリゴペプチド及びその水溶性塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、育毛促進効果、皮膚再生促進効果、皮膚潰瘍治療効果、粘膜損傷治療効果などの上皮系細胞増殖促進効果を有する新規な水溶性オリゴペプチド、さらに詳しくいえば特定のアミノ酸列を含む３〜７個のアミノ酸単位からなる水溶性オリゴペプチド、その水溶性塩及びそれらを有効成分とする上皮系細胞増殖促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近、発毛、脱毛の制御機構（メカニズム）が明らかにされるとともに、育毛剤に対する社会的関心が強まり、育毛作用を有する新規化合物、遺伝子研究に基づく成分、漢方の組合せなど種々の新しい育毛剤が提案されている。
【０００３】
図１は、発毛、脱毛を繰り返す毛髪の毛周期（ヘアサイクル）を示す説明図であるが、通常の毛髪はその本体１の毛根部２に毛乳頭３を有し、その上部に毛母細胞４を備えており、成長後毛髪本体１は退縮期（Ｃａｔａｇｅｎ）となり、約２〜３週間で成長が停止し、その後２〜３か月間休止期（Ｔｅｌｏｇｅｎ）に入る。その間に毛根部２は活動を続け、新しい毛髪本体１´を発生する。この新しい毛髪本体１´は引き続き成長期（Ａｎａｇｅｎ）に入り、古い毛髪本体１を脱毛させて、さらに成長を維持し、約５〜６年で元の毛髪を再生する。
【０００４】
育毛剤は、このようなヘアサイクルの各時期において、毛母細胞の増殖を促進し、休止期において成長期を誘導したり、成長期を延長したり、退縮期への移行を遅延させる作用を有し、発毛の促進又は脱毛の抑制を行わせるものである。
【０００５】
そして、このような育毛剤として、これまでに、例えば６‐（１‐ピペリジニル）‐２，４‐ピリミジンジアミン‐３‐オキシド（ミノキシジル）を有効成分とした育毛剤（米国特許第４１３９６１９号明細書参照）、ミノキシジル１〜６質量％と、多価アルコール、エタノール、塩酸ピリドキシン及び水を含有してなる育毛組成物（特開２００２−３２６９１３号公報参照）、繊維芽細胞増殖因子−１０（ＦＧＦ−１０）を有効成分として含む育毛剤（特開平１０−２７９５０１号公報参照）、特定の脂肪酸エステル、エーテル、モノグリセリド硫酸エステル塩又はモノアルキルグリセリルエーテル硫酸エステル塩を有効成分とする養毛剤（特開平１１−２４６３５９号公報参照）、ＣＲＦ１受容体アンタコニストを有効成分とする育毛剤（国際公開第０２／０１９９７５号パンフレット参照）、血行促進効果を有する生薬抽出物とビタミン又はその誘導体とを有効成分とし、水溶性高分子が配合されてゲル化されたエアゾール用組成物と、噴射剤とを含有する育毛用エアゾール製剤（特開平７−１０１８３４号公報参照）などが提案されている。
【０００６】
また、特殊なものとして、式  Ｒ１−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−ＸＲ２（式中、ＸはＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ、Ｔｙｒ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ｌｅｕであり、Ｒ１は水素原子、アミノ基の保護基、Ｒ２はヒドロキシ又はカルボキシル基の保護基である）で表わされるペプチド又は薬理的に許容される塩を有効成分とする経口育毛剤が知られている（国際公開第００／２９４２５号パンフレット参照）。
そのほか、極く最近の新聞情報として、６‐ベンジルアミノプリン（サイトプリン）とペンタデカンとを組み合わせた育毛剤の発売が報じられている（日経産業新聞、平成１６年３月２日号参照）。
【０００７】
これらの育毛剤は、それぞれ長所を有し、かなりの効果が認められているものもあるが、すべての症状に対して完全に対応し得るものではない上に、原料の入手が困難なものもあり、実用に供するには必ずしも満足できるものとはいえない。このため、この分野においてはさらに優れた効果を発揮する新規な育毛剤の出現が要望されている。
【０００８】
他方、オリゴペプチド又はその重合物を有効成分とする生理活性物質としては、コラーゲン又はゼラチンのコラーゲナーゼによる分解物中のグリシン残基１個とそれ以外のアミノ酸残基２個とから構成されるトリペプチドの、平均分子量２８０〜２００００をもつ重合物からなる老化防止のための皮膚外用剤（特開２０００−３０９５２１号公報参照）、（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ）、（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｙｐ）、（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ）、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ）、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）及び（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ）のトリペプチドの混合物を有効成分とするコラーゲン産生促進剤（特開２００３−１３７８０７号公報参照）などが知られているが、トリペプチドを有効成分とする上皮系細胞増殖促進剤はこれまで知られていない。
【発明の開示】
［０００９］  本発明は、比較的簡単に製造することができ、育毛作用のみではなく、皮膚再生のような上皮系細胞増殖促進作用を有する上に、角質層を容易に通過して所望のターゲット細胞に達して効果を発揮し得る新規な水溶性オリゴペプチドを提供することを目的としてなされたものである。
［００１０］  本発明者らは育毛剤として有用な化学物質を開発するために鋭意研究を重ねた結果、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属バクテリアの培養上清の抽出物中に、優れた育毛効果を示す活性物質が存在すること、及び、育毛作用がこの活性物質中の特定のオリゴペプチド構造に起因すること、しかもこのオリゴペプチド構造を有する特定のポリペプチドは、いずれも所望の育毛効果を示すだけでなく、皮膜移植、皮膚潰瘍や老化皮膚復元の際の細胞再生を促進する効果を示すことを見出した。さらに、特定のアミノ酸単位を有する水溶性オリゴペプチドが優れた上皮系細胞増殖促進作用を示すことを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
［００１１］  すなわち、本発明は、イソロイシルグリシルセリル単位を含むアミノ酸単位３〜７個、プロリルイソロイシルグリシル単位とセリル単位を含むアミノ酸単位４〜７個又はグリシルプロリルイソロイシルグリシル単位とセリル単位又はトレオニル単位を含むアミノ酸単位５〜７個を有する水溶性オリゴペプチド及びそれらの水溶性塩を提供するものである。また、本発明は、プロリルイソロイシルグリシル単位又はイソロイシルグリシルセリル単位を含むアミノ酸単位３〜７個を有する水溶性オリゴペプチド及びそれらの水溶性塩の中から選ばれた少なくとも１種を有効成分とする上皮系細胞増殖促進剤を提供するものである。
［００１２］  本発明の上皮系細胞増殖促進剤における水溶性オリゴペプチドの作用は、これらのオリゴペプチドそのものだけでなく、これらのオリゴペプチド単位をその分子構成単位として有するポリペプチドにおいても発揮されるが、分子量が５００以上になると水に難溶になるので育毛剤としては好ましくない。
［００１３］  このような水溶性オリゴペプチドの中で、トリペプチドとしては、イソロイシルグリシルセリン、プロリルイソロイシルグリシンがある。またテトラペプチドとしては、例えばこのトリペプチドの前後にグリシル、アラニル、アルギニル、アスパラギル、リジル、セリル、バリル又はグルタミル基などのアミノ酸残基が結合したものを挙げることができるが、好ましいのはグリシルプロリルイソロイシルグリシン（配列表配列番号１）及びプロリルイソロイシルグリシルセリン（配列表配列番号２）である。
【００１４】
ペンタペプチドとしては、例えば、グリシルプロリルイソロイシルグリシル（配列表配列番号１）基の前後にセリル基又はトレオニル基などのアミノ酸残基が結合したものを挙げることができるが、好ましいのはグリシルプロリルイソロイシルグリシルセリン（配列表配列番号３）及びグリシルプロリルイソロイシルグリシルトレオニン（配列表配列番号４）である。
【００１５】
また、ヘキサペプチドやヘプタペプチドとしては、上記ペンタペプチド単位をカルボキシル基末端に有するもの、例えばアラニルグリシルプロリルイソロイシルグリシルセリン（配列表配列番号５）、セリルグリシルプロリルイソロイシルグリシルセリン（配列表配列番号６）、グリシルセリルグリシルプロリルイソロイシルグリシルセリン（配列表配列番号７）などが好ましい。
【００１６】
本発明の水溶性オリゴペプチドは、遊離形のものであってもよいし、また水溶性塩であってもよい。この水溶性塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩などがある。
【００１７】
本発明のオリゴペプチドは、ポリペプチド合成の際にペプチド結合を形成する場合に慣用されている方法、例えば縮合剤法、活性エステル法、アジド法、混合酸無水物法などによりα‐アミノ基を保護した原料アミノ酸とカルボキシル基を保護したアミノ酸とを反応させてペプチドを形成したのち、保護基を脱離する工程を繰り返すことによって製造することができる。
【００１８】
この縮合剤法は、最も一般的なペプチド結合の形成方法であって、この際の縮合剤としては、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、Ｎ‐エチル‐Ｎ´‐３‐ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＷＳＣＩ）及びその塩酸塩（ＷＳＣＩ・ＨＣｌ）、ベンゾトリアゾール‐１‐イル‐トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリ化物塩（ＢＯＰ）、ジフェニルホスホリルジアジド（ＤＰＰＡ）などを単独で、或いは、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＮＳｕ）、１‐ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、又は３‐ヒドロキシ‐４‐オキソ‐３，４‐ジヒドロ‐１，２，３‐ベンゾトリアジン（ＨＯＯｂｔ）と組み合わせて用いる。
【００１９】
活性エステル法における活性エステルとしては、例えばｐ‐ニトロフェニルエステル（ＯＮｐ）、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＯＮＳｕ）、ペンタフルオロフェニルエステル（ＯＰｆｐ）などを用いる。
【００２０】
また、アジド法は、アミノ酸又はペプチドに無水ヒドラジンを反応させて対応するヒドラジドを形成させる方法であり、ラセミ化の少ないセグメント縮合法として知られている。
【００２１】
さらに、混合酸無水物法は、イソブチルオキシカルボニルクロリド、塩化ジエチルアセチル、塩化トリメチルアセチルなどを用いてアミノ酸のカルボキシル基の混合無水物を形成させる方法で、低温においてカルボキシル基を強力に活性化できるので有利である。
【００２２】
他方、アミノ酸の保護基としては、酸処理や加水分解や接触還元により容易に脱離するものが用いられる。このような保護基のうちα‐アミノ基の保護基としては、ベンジルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ‐ブトキシカルボニル基、９‐フルオレニルメトキシカルボニル基、３‐ニトロ‐２‐ピリジンスルフェニル基、メトキシベンジルオキシカルボニル基などがある。また、カルボキシル基の保護は、メチル又はエチルエステル、ベンジルエステル、ｔｅｒｔ‐ブチルエステル、フェナシルエステルなどによって行われる。
【００２３】
また、側鎖にヒドロキシル基をもつα‐アミノ酸の場合は、このヒドロキシル基を保護する必要があるが、この保護基としては、白金黒触媒による接触還元や強酸処理により容易に脱離されるベンジル基や弱酸処理により容易に脱離されるｔｅｒｔ‐ブチル基が好適である。
このようなα‐アミノ酸エステル、アミノ基やヒドロキシル基を保護された原料アミノ酸は、市販品として容易に入手可能である。
【００２４】
本発明のオリゴペプチドの製造は、原料アミノ酸又はその誘導体を溶媒中に均一に溶解して反応させる液相法、不溶性の樹脂上でペプチド鎖を伸長させていく固相法のいずれでも行うことができるが、自動固相合成装置を用いて行うのが有利である。この方法によると、所望のオリゴペプチドを短時間に、しかも高純度で得ることができる。
【００２５】
本発明の新規オリゴペプチド又はその水溶性塩は、ラセミ体として得られるが、所望ならば、慣用の方法により光学分割して光学活性を有するものとして得ることもできる。この光学分割は、ラセミ体のアミノ酸を適当な光学活性物質とのジアステレオマーを形成させ、これを分別結晶する方法、酵素を用いる方法又はキラルな担体を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法などで行うことができる。
【００２６】
本発明のオリゴペプチドは、水又はアルコール類に可溶である。このものは、質量分析、赤外吸収スペクトル又は高速液体クロマトグラフィーにより、同定することができる。
【００２７】
本発明のオリゴペプチドは、毛包上皮細胞、特に毛母細胞を直接的に増殖促進させる作用、すなわち育毛作用を有するほかに、表皮細胞を直接的に増殖促進させる作用、すなわち培養皮膚移植や、皮膚潰瘍及び皮膚欠損創の治療に有用であるので、上皮系細胞増殖促進剤として用いることができる。
【００２８】
本発明の上皮系細胞増殖促進剤の製剤は、有効成分となる前記オリゴペプチドを、水性媒質に０．０００１〜５質量％の濃度で溶解することにより得られる。この際用いる水性媒質としては、水と水溶性有機溶剤との混合溶媒が好ましい。
【００２９】
水溶性有機溶剤としては、例えばエチルアルコールのようなアルコール類、エチレングリコール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン、１，３‐ブチレングリコールのような多価アルコール類、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドのような極性有機溶剤などが用いられる。これらは単独で用いてもよいし、２種以上組み合わせて用いてもよい。好ましい水性溶媒は、水とプロピレングリコールとエチルアルコールとの混合溶媒である。
【００３０】
この本発明の上皮系細胞増殖促進剤には、所望に応じ、他の育毛作用を有する化合物、例えばミノキシジル、塩化カルプロニウム、ペンタデカン酸グリセリド、酢酸トコフェロール、ピロクトンオラミン、グリチルリチン酸、イソプロピルメチルフェノール、ヒノキチオール、センブリ抽出液、トウガラシチンキやビタミン類例えばビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＨ、ビタミンＫ、ビタミンＰ、ビタミンＵ、パントテニルアルコール、カルチニン、フェルラ酸、γ‐オリザノール、リポ酸、オロット酸又はそれらの誘導体を含有させることができる。これらの化合物は、本発明の上皮系細胞増殖促進剤中に０．００５〜１０質量％、好ましくは０．０１〜２．０質量％の範囲の量で配合される。
【００３１】
本発明の上皮系細胞増殖促進剤には、さらに所望に応じ、香料、着色剤、ｐＨ調整剤、殺菌剤、界面活性剤、噴射剤など、通常の外用液剤に慣用されている添加剤を加えることができる。これら添加剤の量としては、０．００１〜５質量％、好ましくは０．０１〜２．０質量％の範囲が好ましい。
［００３２］  本発明の上皮系細胞増殖促進剤は、頭部又は患部に、１日１〜５回程度塗布を繰り返して使用される。
本発明の上皮系細胞増殖促進剤は、毛包上皮細胞の増殖を用量依存的に促進させることからみて、この中の有効成分であるオリゴペプチドが上皮系細胞増殖促進効果を有することを確認することができた。
また、本発明のオリゴペプチドは上皮細胞に対して、選択的に増殖作用を示すので、他の細胞、例えばガン細胞を増殖するおそれがなく有利である。
【図面の簡単な説明】
［００３３］［図１］は、髪の発毛と脱毛のサイクルを示す説明図である。
［図２］は、実施例１で得られたトリペプチドのマススペクトルである。
［図３］は、参考例１で得られたトリペプチドのマススペクトルである。
［図４］は、実施例２で得られたテトラペプチドのマススペクトルである。
［図５］は、参考例２で得られたテトラペプチドのマススペクトルである。
［図６］は、実施例３で得られたペンタペプチドのマススペクトルである。
［図７］は、実施例５で得られたＩＧＳについての毛包上皮細胞の増殖率を示す棒グラフである。
［図８］は、実施例５で得られたＰＩＧについての毛包上皮細胞の増殖率を示す棒グラフである。
［図９］は、実施例５で得られたＰＩＧＳについての毛包上皮細胞の増殖率を示す棒グラフである。
［図１０］は、実施例５で得られたＧＰＩＧについての毛包上皮細胞の増殖率を示す棒グラフである。
［図１１］は、実施例６で得られた上皮系細胞増殖促進剤を塗布したグループ（Ｂ）及び対照グループ（Ａ）の１４日目の剃毛部位をデジタルカメラで撮影した写真図の画像をコンピューターに入力し、画像解析ソフトを用いて再生毛面積比を百分率で算出した図である。
［図１２］は、実施例７で得られた毛包上皮細胞の細胞増殖率を示す棒グラフである。
［図１３］は、実施例７で得られた表皮細胞の細胞増殖率を示す棒グラフである。
［図１４］は、実施例７で得られた真皮繊維芽細胞の細胞増殖率を示す棒グラフである。
［図１５］は、実施例７で得られた毛乳頭細胞の細胞増殖率を示す棒グラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
［００３４］  次に実施例によって本発明を実施するための最良の形態を説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
［００３５］
自動固相合成装置（マルチシンテック社製、製品名「Ｓｙｒｏ２０００」）を用い、かつ溶媒としてテトラヒドロフランを、縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミドをそれぞれ用い、トリエチルアミンの存在下、ヒドロキシル基をｔｅｒｔ−ブチル基で保護したセリンのベンジルエステルと、α−アミノ基を９−フルオレニルメトキシカルボニル基（以下Ｆｍｏｃ基と略す）で保護したグリシンと、α−アミノ基をＦｍｏｃ基で保護したイソロイシンとを順次反応させて、Ｎ−Ｆｍｏｃ−イソロイシルグリシルセリンのベンジルエステルを製造した。
［００３６］  反応終了後、生成中間体をメチルアルコールとジオキサンとの混合溶媒（体積比３：１）の中でフッ化水素酸で処理しクロマトグラフィーで精製することにより保護基の脱離とエステルの加水分解を行ったのち、ラセミ型イソロイシルグリシルセリンを得た。この場合の収率は約４６％であった。
［００３７］  次に、このトリペプチドをＣ１８カラム［ヒューレットパッカード社製、製品名「ＨＰ１１００」（３．０×２５０ｍｍ）］（以下実施例２〜４の純度解析に本カラムを用いた。）に通し、吸着した成分を０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの濃度０〜３０％の範囲の溶液により、流速０．４ｍｌ／分、２０分間で溶出させた。その結果、トリペプチドは保持時間１１．６７１分で溶出され、純度は９５．８７％であった。
［００３８］  また、このトリペプチドの質量を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ質量計［テルモバイオアナリシス社製、製品名「Ｄｙｎａｍｏ」（以下実施例２〜４の質量分析に本質量計を用いた。）で分析した結果、質量（ｍ／ｚ、ＭＨ＋）はｍ／ｚ２７５．３３９であることが分った。この質量分析の結果を図２に示す。
［００３９］参考例１
グリシンのベンジルエステルとα−アミノ基をＦｍｏｃ基で保護したイソロイシンと、α−アミノ基をＦｍｏｃ基で保護したプロリンとを用い、実施例１と全く同様に操作してラセミ型プロリルイソロイシルグリシンを製造したこの場合の収率は約４０％であった。［００４０］  次に、このトリペプチドをＣ１８カラムに通し、吸着した成分を０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの濃度０〜３０％の範囲の溶液により、流速０．４ｍｌ／分、２０分間で溶出させた。その結果、トリペプチドは保持時間１４．０５２分で溶出され、純度は９５．９３％であった。
［００４１］  また、このトリペプチドの質量を分析した結果、質量（ｍ／ｚ、ＭＨ＋）はｍ／ｚ２８５．１０２であった。この質量分析の結果を図３に示す。
【実施例２】
［００４２］
ヒドロキシル基をｔｅｒｔ−ブチル基で保護したセリンのベンジルエステルと、α−アミノ基をＦｍｏｃ基で保護したグリシンと、α−アミノ基をＦｍｏｃ基で保護したイソロイシンと、α−アミノ基をＦｍｏｃ基で保護したプロリンとを用い、実施例１と全く同様に操作して、ラセミ型プロリルイソロイシルグリシルセリン（配列表配列番号２）を得た。この場合の収率は約５４％であった。
［００４３］  次に、このテトラペプチドをＣ１８カラムに通し、吸着した成分を０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの濃度０〜４０％の範囲の溶液により、流速０．４ｍｌ／分、２０分間で溶出させた。その結果、テトラペプチドは保持時間１２．３１３分で溶出され、純度は９５．１１％であった。
［００４４］  また、このテトラペプチドの質量を分析した結果、質量（ｍ／ｚ、ＭＨ＋）はｍ／ｚ３７３．９６３であることが分った。この質量分析の結果を図４に示す。
［００４５］参考例２
グリシンのベンジルエステルと、α−アミノ基をＦｍｏｃ基で保護したイソロイシンと、α−アミノ基をＦｍｏｃ基で保護したプロリンと、α−アミノ基をＦｍｏｃ基で保護したグリシンとを用い、実施例１と全く同様に操作して、ラセミ型グリシルプロリルイソロイシルグリシン（配列表配列番号１）を製造した。この場合の収率は約４８％であった。
［００４６］  次に、このテトラペプチドをＣ１８カラムに通し、吸着した成分を０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの濃度５〜４０％の範囲の溶液により、流速０．４ｍｌ／分、２０分間で溶出させた。その結果、テトラペプチドは保持時間１１．６４８分で溶出され、純度は９９．６０％であった。
［００４７］  また、このテトラペプチドの質量を分析した結果、質量（ｍ／ｚ、ＭＨ＋）はｍ／ｚ３４３．９８６であった。この質量分析の結果を図５に示す。
【実施例３】
［００４８］
自動固相合成装置（マルチシンテック社製、商品名「Ｓｙｒｏ２０００」）を用い、かつ溶媒としてテトラヒドロフランを、縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミドをそれぞれ用い、トリエチルアミンの存在下、ヒドロキシル基をｔｅｒｔ−ブチル基で保護したセリンのベンジルエステルと、α−アミノ基をＦｍｏｃ基で保護したグリシンと、α−アミノ基をＦｍｏｃ基で保護したイソロイシンと、α−アミノ基をＦｍｏｃ基で保護したプロリンと、α−アミノ基をＦｍｏｃ基で保護したグリシンとを順次反応させて、Ｎ−Ｆｍｏｃ−グリシルプロリル−イソロイシルグリシルセリン（配列表配列番号３）のベンジルエステルを製造した。
［００４９］  反応終了後、生成中間体をメチルアルコールとジオキサンとの混合溶媒（体積比３：１）の中でフッ化水素酸で処理しクロマトグラフィーで精製することにより保護基の脱離とエステルの加水分解を行ったのち、ラセミ型グリシルプロリルイソロイシルグリシルセリンを得た。この場合の収率は約４０％であった。
［００５０］  次に、このペンタペプチドをＣ１８カラム［スペルコ社製、製品名「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ１８」（４．６×２５０ｍｍ）］に通し、吸着した成分を０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの濃度２〜２２％の範囲の溶液により、流速１．５ｍｌ／分、２０分間で溶出させた。その結果、ペンタペプチドは保持時間９．７６１分で溶出され、純度は９６．９％であった。
［００５１］  また、このペンタペプチドの質量を、エレクトロスプレー法を用いた正イオン測定によるＬＣ−ＭＳ質量計［ＬＣ部；アジレント社製、製品名「Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ」、ＭＳ部；サーモエレクトロン社製、製品名「Ｔｈｅｒｍｏｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱａｄｖａｎｔａｇｅ（ソフトウェアＸｃａｌｉｂｕｒ）」］で分析した結果、質量（ｍ／ｚ、ＭＨ＋）はｍ／ｚ４３０．１であることが分った。この質量分析の結果を図６に示す。
【実施例４】
［００５２］
ヒドロキシル基をｔｅｒｔ−ブチル基で保護したセリンのベンジルエステルの代りに、ヒドロキシル基をｔｅｒｔ−ブチル基で保護したトレオニンのベンジルエステルを用いること以外は、実施例１と全く同様に操作して、ラセミ型グリシルプロリルイソロイシルグリシルトレオニン（配列表配列番号４）を製造した。このものの質量（ｍ／ｚ、ＭＨ＋）はｍ／ｚ４４４．３であった。
【実施例５】
［００５３］
実施例１、２及び参考例１、２の上皮系細胞増殖促進剤について、マウスの毛包上皮細胞についての細胞増殖試験を行った。なお、培養培地、試験培地としては、以下のものを用いた。
［００５４］（ａ）培養培地
ＤＭＥＭ（シグマ社製、製品記号「Ｄ−５５２３」）
ＦＢＳ（カンセラ・インターナショナル・インコーポレーテッド社製、製品記号「１０１００７５６」）                                    １０％
ペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ社製、製品記号「１５１４０−１２２」）
１％
（ｂ）試験培地
ＭＣＤＢ１５３（シグマ社製、製品記号「Ｍ７４０３」）
インシュリン（シグマ社製、ウシ由来，製品記号「１６６３４」）
５μｇ／ｍｌ
アポ−トランスフェリン（シグマ社製、ヒト由来，製品記号「Ｔ１１４７」）
１０μｇ／ｍｌ
ＥＧＦ（アップステート・バイオテクノロジー社製、マウス由来，製品記号「０１−１０１」
５ｎｇ／ｍｌ
ＢＰＥ（ギプコ社製、ウシ下垂体抽出物，製品記号「１３０２８−０１４」）
３５μｇ／ｍｌ
水溶性ハイドロコーチゾン（ナカライ社製、製品記号「１７４−００」）
０．５μｇ／ｍｌ
１１
エタノールアミン（和光社製、製品記号「０１２−１２４５５」）
１００μＭ
ｏ−ホスホリルエタノールアミン（シグマ社製、製品記号「Ｐ０５０３」）
１００μＭ
［００５５］（１）毛包上皮細胞の分離及び培養
新生仔マウス（生後５日齢）の皮膚から手術メスを用いて約２ｍｍ幅の短冊状に皮膚片を切り出し、５％濃度でＦＢＳ（カンセラ・インターナショナル・インコーポレーテッド社製、製品記号「１０１００７５６」）を含むＤＭＥＭ（シグマ社製、製品記号「Ｄ−５５２３」）中に５００Ｕ／ｍｌの割合で、ディスパーゼ（合同酒精社製、ロット番号０１０１）を溶解した溶液中に浸漬し、４℃において１６時間静置した。次いでピンセットを用いて皮膚片から表皮を剥離除去し、真皮組織のみを採取し、このようにして得られた真皮組織をＰＢＳ（−）（シグマ社製、製品記号「Ｐ−４４１７」）に浸し、眼科バサミを用いて細切した。このようにして得られたストリップ片を、５％濃度でＦＢＳを含むＤＭＥＭ中に、０．２％濃度でコラゲナーゼ（新田社製、ロット番号００１０１４Ｗ）を溶解した溶液中に浸し、３７℃において１時間消化したのち、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去し、残分にＰＢＳ（−）を加えてゆるやかにピペッティングすることにより真皮懸濁液を調製した。
［００５６］  次いで、この真皮懸濁液中から真皮繊維芽細胞と毛球を分離するため、１５分間静置させて毛球のみを沈殿させた。この「静置→沈殿」の操作を３回行って得られた毛球を、２．６５ｍＭ  ＥＤＴＡ水溶液中に０．２５％濃度のトリプシンを溶かした液に浸し、３７℃において５分間処理することにより毛包上皮細胞の分散溶液を調製した。
次に、この分散液を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、遠心分離後上清を除去した。得られた毛包上皮細胞を培養培地に分散させ、コラーゲンコートした９６穴マイクロプレートに播種し、５％ＣＯ２を含む雰囲気中、３７℃で培養した。
［００５７］（２）細胞増殖試験
（ｉ）試料の調製
実施例１、２及び参考例１、２で得られたイソロイシルグリシルセリン（以下ＩＧＳと略記する）、プロリルイソロイシルグリシン（以下ＰＩＧと略記する）、プロリルイソロイシルグリシルセリン（配列表配列番号２）（以下ＰＩＧＳと略記する）及びグリシルプロリルイソロイシルグリシン（配列表配列番号１）（以下ＧＰＩＧと略記する）をそれぞれ試験培地に溶解し、いずれも０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ及び１００μＭの６種類の濃度の試料を調製した。また、対照として試験培地のみを用いた。
［００５８］（ｉｉ）毛包上皮細胞増殖試験
細胞を播種してから２４時間後、培養液を除去し、培養細胞をＭＣＤＢ１５３溶液で洗浄した。この培養細胞に前記の試料を１００μｌずつ各穴に加え、５％ＣＯ２含有雰囲気中、３７℃において培養した。
［００５９］  ４日後、アラマー・ブルー試薬（登録商標名、バイオソース社製、カタログ番号ＤＡＬ１１００、ロット番号ＡＢ０８３００２）を各穴ごとに１０μｌずつ添加し、再び５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃において培養を継続した。２時間培養したのち、マイクロプレートリーダー（ラボシステムズ社製、製品名「フルオロスキャンアセントＦＬ」）で蛍光強度（励起波長；５４４ｎｍ、測定波長；５９０ｎｍ）を測定し、細胞数を評価した。
［００６０］  なお、評価は、実施例１、２及び参考例１、２で得られたペプチドの細胞増殖度を、対照の細胞増殖度に対する比率（百分率）で算出し、細胞増殖比の平均値±標準偏差（ｎ＝５）で表わして行った。有意差の検定は、ダネットの多重比較検定（アバカスコンセプツ社製、ソフトウェア「スーパーアノーヴァ  Ｖ．１．１１」）により行い、危険率５％未満（ｐ＜０．０５）の場合、有意差ありとした。このようにして得られたＩＧＳの結果を図７に、ＰＩＧの結果を図８に、ＰＩＧＳの結果を図９に、ＧＰＩＧの結果を図１０に、それぞれ棒グラフとして示す。
［００６１］（ｉｉｉ）結果
図７より、ＩＧＳについては、０．３、１、３、１０、３０及び１００μＭの細胞増殖率は、対照群と比較してそれぞれ９８、１０３、１０６、１２４、１３４及び１３３％であり、１０μＭ以上の濃度で有意差（すべてｐ＜０．０１）が認められた。
［００６２］  図８より、ＰＩＧについては、０．３、１、３、１０、３０及び１００μＭの細胞増殖率は、対照群と比較してそれぞれ１０１、１０３、１１３、１３２、１３１及び１３４％であり、１μＭ以上の濃度で有意差（３μＭ：ｐ＜０．０５；１０、３０及び１００μＭ：ｐ＜０．０１）が認められた。
［００６３］  図９より、ＰＩＧＳについては、０．３、１、３、１０、３０及び１００μＭの細胞増殖率は、対照群と比較してそれぞれ１０４、１０３、１０８、１１０、１２７及び１３３％であり、３μＭ以上の濃度で有意差（３及び１０μＭ：ｐ＜０．０５；３０及び１００μＭ：ｐ＜０．０１）が認められた。
［００６４］  図１０より、ＧＰＩＧについては、０．３、１、３、１０、３０及び１００μＭの細胞増殖率は、対照群と比較してそれぞれ１０５、１０８、１１８、１３３、１３４及び１３８％であり、０．３μＭ以上の濃度で有意差（０．３μＭ：ｐ＜０．０５；１、３、１０、３０及び１００μＭ：ｐ＜０．０１）が認められた。
［００６５］  しかも、表皮細胞、真皮繊維芽細胞及び毛乳頭細胞に対する試験を行ったところ、本発明の上皮系細胞増殖促進剤は、表皮細胞に対しては毛包上皮細胞と同様に細胞増殖作用を示したものの、真皮繊維芽細胞及び毛乳頭細胞に対しては何らの影響も与えないことが分った。
【実施例６】
［００６６］
実施例３で得られたペンタペプチド１ｍｇを注射用水（大塚製薬社製、製品記号「０５７−００４５６」）３００μｌに溶解し、プロピレングリコール（和光社製、製品記号「１６１−０５００６」）２００μｌ及びエチルアルコール（和光社製、製品記号「０５７−００４５６」）５００μｌを加えて混合し、濃度１ｍｇ／ｍｌの上皮系細胞増殖促進剤を製剤した。
別に７週齢のＣ３Ｈ／Ｈｅ系雌マウス１０匹を１週間飼育し、馴化させたのち、毛周期が休止期にあるマウスの背部毛を電気バリカン及び電気シェーバーを用いて剃毛して実験用動物とした。
［００６７］  次に、この実験用動物を５匹ずつの２グループに分け、剃毛後３日目から第１グループには１日１回剃毛部位に１００μｌ／匹の上皮系細胞増殖促進剤を塗布し、第２グループには、対照用として注射用水とプロピレングリコールとエチルアルコールの混合物（体積比３：２：５）のみを塗布した。塗布後１４日目に剃毛部位をデジタルカメラで撮影したところ、本発明の上皮系細胞増殖促進剤を塗布したグループ（Ｂ）は、対照グループ（Ａ）に比べ明らかに発毛促進が認められた。
［００６８］  次に、この画像をコンピューターに入力し、画像解析ソフトを用いて再生毛面積比（再生毛部位のピクセル数／剃毛部位のピクセル数）を百分率で算出した。有意差の検定は、スチューデントのｔ検定（アバカスコンセプツ社製ソフトウェア「スタットビューＪ−４．０２」）により行い、危険率５％未満（ｐ＜０．０５）の場合、有意差ありとした。
［００６９］  その結果を図１１に示した。この図において、白い部分が毛が生えていない部分であり、黒い部分が毛が生えている部分である。この結果によると、対照グループ（Ａ）の再生毛面積比は、３６．９％±５．７％であるのに対し、本発明の上皮系細胞増殖促進剤を塗布したグループ（Ｂ）の再生毛面積比は６６．６±３．５％であり、有意（ｐ＜０．０１）に毛の再生が促進されることが分った。
【実施例７】
［００７０］
実施例３で得られたオリゴペプチドの上皮系細胞増殖促進剤としての細胞選択性を確認するために、以下のようにして皮膚組織に存在する細胞すなわち毛包上皮細胞、表皮細胞、真皮繊維芽細胞及び毛乳頭細胞に対する細胞増殖作用の有無を調べた。なお、培養培地、試験培地としては、実施例５と同じものを用いた。
［００７１］（１）毛包上皮細胞、表皮細胞、真皮繊維芽細胞及び毛乳頭細胞の調製
生後５日齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮ系新生仔マウスの皮膚を無菌的に採取し、手術用メスを用いて皮膚片を約２ｍｍ幅の短冊状のサンプルとした。５質量％のＦＢＳ（カンセラ・インターナショナル・インコーポレーテッド社製、ロット番号０１０１）を含むＤＭＥＭ（シグマ社製、製品記号「Ｄ−５５２３」）中に５００Ｕ／ｍｌのディスパーゼ（合同酒精社製、ロット番号０１０１）を溶かした溶液を調製し、この中に上記サンプルを浸し、４℃において１６時間静置したのち、ピンセットを用いて皮膚片から表皮組織を剥離し、真皮組織と分離した。得られた表皮組織は表皮細胞の分離に、また真皮組織は毛包上皮細胞及び真皮繊維芽細胞の分離に供した。
［００７２］  このようにして得られた真皮組織を（ＰＢＳ）（−）（シグマ社製、製品記号「Ｐ−４４１７」）に浸し、眼科バサミを用いて細切りし、５質量％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中に０．２質量％のコラゲナーゼ（新田社製、ロット番号００１０１４Ｗ）を溶かした液に浸し、３７℃において１時間消化した。このようにして得られた真皮消化液を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去したのち（ＰＢＳ）（−）を加えて緩やかにピペッティングし、真皮懸濁液を調製した。
［００７３］  次いで、この真皮懸濁液中から真皮繊維芽細胞と毛球を分離するため、１５分間静置させて毛球のみを沈殿させた。この「静置→沈殿」の操作を３回行った。得られた毛球を、２．６５ｍＭ  ＥＤＴＡ水溶液中に０．２５質量％のトリプシンを溶かした液に浸し、３７℃において５分間処理することにより毛包上皮細胞分散溶液を調製した。
［００７４］  次に、この分散液を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、遠心分離後上清を除去した。得られた毛包上皮細胞を培養培地に分散させ、コラーゲンコートした９６穴マイクロプレートに播種し、５％ＣＯ２を含む雰囲気中、３７℃で培養した。
［００７５］  他方、一回目の「静置→沈殿」の操作で上清に浮遊している真皮繊維芽細胞を回収し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、遠心分離後上清を除去した。得られた真皮繊維芽細胞を培養培地に分散させ、９６穴マイクロプレートに播種し、５％ＣＯ２を含む雰囲気中、３７℃で培養した。
［００７６］  上記の表皮組織を、２．６５ｍＭ  ＥＤＴＡ水溶液中に０．２５質量％のトリプシンを溶かした溶液に浸し、３７℃において５分間処理することにより、表皮細胞分散液を調製した。
次いで、この分散液を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。得られた表皮細胞を培養培地に分散させ、コラーゲンコートした９６穴マイクロプレートに播種し、５％ＣＯ２を含む雰囲気中、３７℃において培養した。
また、ヒト毛乳頭細胞（トーヨーボー社製，製品記号「６０２−０５」）を培養培地に分散させ、コラーゲンコートした９６穴マイクロプレートに播種し、５％ＣＯ２を含む雰囲気中、３７℃において培養した。
［００７７］（２）細胞増殖試験
（ｉ）試料の調製
実施例３で得られたペンタペプチド１ｍｇを、試験培地２３２．８μｌに加え、かきまぜて溶解することにより、１０ｍＭ溶液を調製した。次いで、この１０ｍＭ溶液を段階的に希釈し、１００μＭ（Ｎｏ．１）、３０μＭ（Ｎｏ．２）、１０μＭ（Ｎｏ．３）、３μＭ（Ｎｏ．４）、１μＭ（Ｎｏ．５）及び０．３μＭ（Ｎｏ．６）濃度の６種類の試料を調製し、また対照としては試験培地のみを用いた。
［００７８］（ｉｉ）毛包上皮細胞及び表皮細胞増殖試験
細胞を播種してから２４時間後、培養液を除去し、培養細胞をＭＣＤＢ１５３溶液で洗浄した。この培養細胞に前記の試料を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、５％ＣＯ２含有雰囲気中、３７℃において培養した。４日後、アラマーブルー試薬（登録商標名、バイオソース社製、カタログ番号ＤＡＬ１１００、ロット番号ＡＢ０８３００２）を各ｗｅｌｌに１０μｌずつ添加し、再び５％ＣＯ２含有雰囲気中、３７℃において培養した。２時間後、マイクロプレートリーダー（ラボシステムズ社製、製品名「フルオロスキャンアセントＦＬ」）で蛍光強度（励起波長；５４４ｎｍ、測定波長；５９０ｎｍ）を測定し、細胞数を評価した。有意差の検定は、ダネットの多重比較検定（アバカスコンセプツ社製、ソフトウェア「スーパーアノーヴァ  Ｖ．１．１１」）により行い、危険率５％未満（ｐ＜０．０５）の場合、有意差ありとした。
このようにして得られた毛包上皮細胞増殖試験結果を図１２に、また表皮細胞増殖試験の結果を図１３にそれぞれ棒グラフとして示す。
［００７９］（ｉｉｉ）真皮繊維芽細胞及び毛乳頭細胞増殖試験
細胞を播種してから２４時間後、培養液を除去し、培養細胞をＤＭＥＭ溶液で洗浄した。この培養細胞に前記の試料を１００μｌ／ｗｅｌｌを加え、５％ＣＯ２含有雰囲気中、３７℃において培養した。またこの際、陽性対照として培養培地を用いて同様に培養した。３日後、アラマーブルー試薬（バイオソース社製、製品記号「３４１−０７７６１２」）を各ｗｅｌｌに１０μｌずつ添加し、再び５％ＣＯ２含有雰囲気中、３７℃において培養した。２時間後、マイクロプレートリーダー（ラボシステムズ社製、製品名「フルオロスキャンアセントＦＬ」）で蛍光強度（励起波長；５４４ｎｍ、測定波長；５９０ｎｍ）を測定し、細胞数を評価した。
このようにして得られた真皮繊維芽細胞試験の結果を図１４に、毛乳頭細胞試験の結果を図１５にそれぞれ棒グラフとして示す。
［００８０］（ｉｖ）結果
図１２より、毛包上皮細胞では、各試料の細胞増殖率は対照と比較して、それぞれ１０１％（Ｎｏ．６）、１１１％（Ｎｏ．５）、１２４％（Ｎｏ．４）、１４１％（Ｎｏ．３）、１４２％（Ｎｏ．２）及び１４１％（Ｎｏ．１）であり、１μＭ濃度以上で有意差（ｐ＜０．０１）が認められた。
このことから、実施例３の上皮細胞増殖促進剤は１μＭから用量依存的な毛包上皮細胞増殖促進作用を示すことが分った。
［００８１］  図１３より、表皮細胞では、各試料の細胞増殖率は対照と比較して、それぞれ１０２％（Ｎｏ．６）、１１０％（Ｎｏ．５）、１１８％（Ｎｏ．４）、１２４％（Ｎｏ．３）、１２７％（Ｎｏ．２）及び１２７％（Ｎｏ．１）であり、１μＭ濃度以上で有意差（１μＭの場合ｐ＜０．０５、３μＭ以上の濃度の場合ｐ＜０．０１）が認められた。
このことから、実施例３の上皮細胞増殖促進剤は毛包上皮細胞に加えて表皮細胞に対してもまた１μＭから用量依存的な増殖促進作用を示すことが分った。
［００８２］  一方、図１４及び図１５から、真皮繊維芽細胞及び毛乳頭細胞に対しては何らの影響も与えないことが分かる。
これらの事実より、実施例３の上皮系細胞増殖促進剤は、上皮系細胞に分類される毛包上皮細胞及び表皮細胞に対して選択的に細胞増殖作用を示すことが分った。
［００８３］  このように、本発明の上皮系細胞増殖促進剤は、上皮系細胞に分類される毛包上皮細胞及び表皮細胞に対して選択的に細胞増殖作用を示すので、塗布剤例えばローション剤として用いた場合に、皮膚組織を構成する上皮系細胞以外の細胞に悪影響を及ぼさない。
【産業上の利用可能性】
［００８４］  本発明の化合物は、上皮系細胞増殖促進剤として、育毛用、皮膚再生用に利用することができる。また、本発明によると、育毛効果のみでなく、皮膚再生効果、アトピー性皮膚炎治療効果を奏する優れた新規な上皮系細胞増殖促進剤が提供される。
【図１】
0004654418.tif 000002
【図２】
0004654418.tif 000003
【図３】
0004654418.tif 000004
【図４】
0004654418.tif 000005
【図５】
0004654418.tif 000006
【図６】
0004654418.tif 000007
【図７】
0004654418.tif 000008
【図８】
0004654418.tif 000009
【図９】
0004654418.tif 000010
【図１０】
0004654418.tif 000011
【図１１】
0004654418.tif 000012
【図１２】
0004654418.tif 000013
【図１３】
0004654418.tif 000014
【図１４】
0004654418.tif 000015
【図１５】
0004654418.tif 000016
【配列表】
0004654418000001.app