(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質の加水分解反応または塩基交換反応に用いた酵素反応液から酵素を除去する方法であって、無機金属塩、水、および有機溶媒で該酵素反応液を処理し、該酵素を除去する工程を含む、方法。
【請求項２】
リン脂質と、アルコール類、糖類、およびヒドロキシ基を有する環状化合物からなる群より選択されるアルコール性水酸基を有する化合物とを、リン脂質中の塩基を該化合物に転移し得る酵素の存在下で反応させて、酵素反応液を得る工程、および、無機金属塩、水、および有機溶媒で該酵素反応液を処理し、該酵素を除去する工程を含む、リン脂質の塩基交換方法。
【請求項３】
水の存在下、リン脂質と、リン脂質を加水分解し得る酵素とを反応させて酵素反応液を得る工程、および、無機金属塩、水、および有機溶媒で該酵素反応液を処理し、該酵素を除去する工程を含む、リン脂質の加水分解方法。
【請求項４】
前記無機金属塩が、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および硫酸マグネシウムからなる群より選択される少なくとも一つの金属塩である、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項５】
前記有機溶媒が極性溶媒である、請求項１から４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項６】
前記極性有機溶媒が、アセトン、エタノール、メタノール、イソプロパノール、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも一つの溶媒である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
水と有機溶媒とが、容量比で３：７〜７：３の割合で混合され、無機金属塩が、該水と有機溶媒との混合溶媒中に３〜２５質量／容量％含有される、請求項１から６のいずれかの項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン脂質の改質または合成リン脂質の製造に用いられる酵素を反応液から分離・除去する方法、およびこの方法を用いる、リン脂質の塩基転移方法（すなわち、塩基交換方法）およびリン脂質の加水分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン脂質の加水分解または塩基交換反応は、一般に、酵素の存在下、適切な溶媒中で行われる。これらの反応では、通常、加熱などにより酵素を失活させ、反応を停止させる。例えば、特開平２−２７３５３６号公報には、ホスファチジン酸誘導体をリパーゼまたはホスホリパーゼＡ２（以下、ＰＬＡ２という）で処理して部分加水分解することによりリゾホスホリピドを製造する方法が開示されている。この方法では、適当な時期に反応混合物を加熱して酵素を失活させ、反応を打ち切る。特開２００１−１８６８９８号公報には、アシルグリセロリン脂質とセリンとの間でホスホリパーゼＤ（以下、ＰＬＤという）を用いてホスファチジル基交換反応を行い、ホスファチジルセリンを製造する方法が開示されている。この方法では、反応後、例えば、加熱やアルコール変性などの処理で酵素を失活させる。特開２００３−３１９７９３号公報には、ＰＬＤを用いたアシルグリセロリン脂質のホスファチジル基交換反応が開示されている。この反応では、上記交換反応後、加熱などの処理によりＰＬＤを失活させる。
【０００３】
しかし、特開昭６３−２３３７５０号公報によれば、ホスホリパーゼは耐熱性が強いので、例えば、９５℃で３０分程度加熱処理されても十分には失活しない。ホスホリパーゼが十分に失活していないために、例えば、リン脂質に共存する油脂などが加水分解されて異臭が発生するなどの、品質的な問題が生じるおそれがある。さらに、当該文献には、加熱の温度を１００℃以上、例えば、約１２０℃で失活させた場合には、リン脂質あるいはホスホリパーゼの処理で生じた遊離脂肪酸の劣化を引き起こしやすいという問題があると記載されている。このような問題を解決すべく、特開昭６３−２３３７５０号公報には、リン脂質を含有する原料をホスホリパーゼで処理した後、該ホスホリパーゼをプロテアーゼで処理し、次いで該プロテアーゼを加熱失活させる方法が開示されている。
【０００４】
さらに、特開２００３−９３０８６号公報には、蛋白質、ペプチド、酵素などがアレルギーの原因となり得ることが示唆されている。さらにこの公報には、特開昭６３−２３３７５０号公報に記載されている方法では、分解生成物であるペプチドおよびプロテアーゼがそのまま残存することになり、アレルギーを引き起こすなど、安全性に問題があることは明らかであると記載されている。このような問題を解決すべく、特開２００３−９３０８６号公報には、リン脂質を含有する原料をホスホリパーゼにて処理し、次いでプロテアーゼにて処理し、次いで、蛋白質、ペプチド、および酵素を除去する方法が開示されている。蛋白質などを除去する方法としては、濾過助剤を用いた濾過、吸着剤を用いた処理などが例示されている。使用済の吸着剤は、濾過助剤を用いた濾過により除去することができると記載されている。この方法は、蛋白質などは除去できるものの、反応後の濾過、吸着などの処理が必要となるため、工程が複雑化するという問題点がある。
【０００５】
また、特開２００２−１９３９８２号公報には、極性有機溶媒を酵素反応液に添加し、水抽出によって有機溶媒中のホスファチジルセリン溶液から親水性不純物、蛋白質および無機塩を除去する方法が開示されている。この方法により、ホスファチジルセリン溶液中のＰＬＤの活性が検出限界（０．１ＩＵ／ｇ）以下になることが記載されているが、当該溶液中の蛋白含有量については、全く記載されていない。
【発明の開示】
【０００６】
本発明者らは、酵素を用いるリン脂質の加水分解反応または塩基交換反応において、上述の種々の方法を用いて、実際に酵素失活の検討を行った。しかし、いずれの方法においても、酵素活性は低下するものの、満足な結果は得られないことがわかった（以下の比較例１〜７を参照）。
【０００７】
そこで、本発明者らは、酵素反応液から残存酵素活性をさらに効率よく除去する方法について鋭意検討を重ねた結果、酵素で反応させた液（以下、酵素反応液という）を、無機金属塩を含有する、水と有機溶媒との混合溶媒で洗浄することにより、酵素反応液中で残存酵素活性を効率よく除去させるとともに、蛋白含有量を減らすことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は、リン脂質の加水分解反応または塩基交換反応に用いた酵素反応液から酵素を除去する方法を提供し、該方法は、無機金属塩を含有する、水と有機溶媒との混合溶媒で該酵素反応液を処理し、該酵素を除去する工程を含む。
【０００９】
本発明はまた、リン脂質と、アルコール類、糖類、およびヒドロキシ基を有する環状化合物からなる群より選択されるアルコール性水酸基を有する化合物とを、リン脂質中の塩基を該化合物に転移し得る酵素の存在下で反応させて、酵素反応液を得る工程、および、無機金属塩を含有する、水と有機溶媒との混合溶媒で該酵素反応液を処理し、該酵素を除去する工程を含む、リン脂質の塩基交換方法を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、水の存在下、リン脂質と、リン脂質を加水分解し得る酵素とを反応させて酵素反応液を得る工程、および、無機金属塩を含有する、水と有機溶媒との混合溶媒で該酵素反応液を処理し、該酵素を除去する工程を含む、リン脂質の加水分解方法を提供する。
【００１１】
一つの実施態様では、上記無機金属塩は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および硫酸マグネシウムからなる群より選択される少なくとも一つの金属塩である。
【００１２】
別の実施態様では、上記有機溶媒は極性溶媒である。
【００１３】
また、別の実施態様では、上記極性有機溶媒は、アセトン、エタノール、メタノール、イソプロパノール、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも一つの溶媒である。
【００１４】
さらに、異なる実施態様では、上記混合溶媒は、３０〜７０容量％の水と７０〜３０容量％の有機溶媒とを含有し、該混合溶媒中に５〜２５質量／容量％の上記無機金属塩を含有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、まず、酵素によるリン脂質の塩基交換方法および加水分解方法について説明し、次いで、これらの酵素反応液から酵素を除去する方法について、説明する。
【００１６】
Ａ．酵素によるリン脂質の塩基交換方法
本発明のリン脂質の塩基交換方法は、リン脂質と、アルコール類、糖類、およびヒドロキシ基を有する環状化合物からなる群より選択される受容体アルコールとを、リン脂質の塩基を該アルコール化合物に転移し得る酵素の存在下で反応させ、酵素反応液を得る工程、および、無機金属塩を含有する、水と有機溶媒との混合溶媒で該酵素反応液を処理し、該酵素を除去する工程を含む。ここでは、まず、塩基交換反応により酵素反応液を得る工程について、説明する。
【００１７】
A-1  原料リン脂質
本発明に用いられるリン脂質（原料リン脂質）としては、特に制限はなく、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）などが挙げられる。
【００１８】
原料リン脂質としては、このような精製された化合物のほかに、これらの化合物を含む卵黄リン脂質、大豆リン脂質、菜種リン脂質、魚介類リン脂質などが用いられる。例えば、卵黄リン脂質には、ＰＣが７３．０％、ＰＥが１５．０％、およびＰＩが０．６％含まれている。また、大豆リン脂質にはＰＣが３８．２％、ＰＥが１７．３％、ＰＩが１６．０％含まれている（いずれも、新食品機能素材の開発、太田明監修、シーエムシー社、１９９６年）。従って、これらの化合物を含有する天然物由来のリン脂質は、出発材料として有用である。
【００１９】
このような卵黄リン脂質、大豆リン脂質、菜種リン脂質、魚介類リン脂質などは、高度に精製されたものでなくともよい。例えば、リン脂質以外にタンパク質、脂質、多糖、塩などの成分を含有している粗抽出物あるいは粗精製物を出発原料とする場合であっても、これらの成分が酵素反応を阻害しない量で含まれている限り、原料リン脂質として用いられる。また、化学的にあるいは酵素学的に合成されたＰＣやＰＥなども原料リン脂質として用いることができる。
【００２０】
A-2  アルコール性水酸基を有する化合物
本発明に用いられるアルコール性水酸基を有する化合物は、リン脂質の塩基転移においてアシルグリセロリン脂質のホスファチジル基などの塩基部位の受容体として用いられる。アルコール性水酸基を有する化合物としては、アルコール類、糖類、およびヒドロキシ基を有する環状化合物などが挙げられる。
【００２１】
アルコール類としては、一価のアルコール、多価アルコール（二価アルコールおよび三価アルコールを含む。ポリオール類ともいう）、含窒素アルコールなどが含まれる。一価のアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノールなどが挙げられ、そして多価アルコールとしては、グルセロール、エチレングリコール、プロピレングリコールなどが挙げられる。アスコルビン酸もアルコール類に含まれる。含窒素アルコールとしては、例えば、セリンなどのアミノ酸、１−アミノ−２−プロパノ−ルなどが挙げられる。
【００２２】
糖類としては、グルコースなどの単糖類、スクロースなどの二糖類を始めとするオリゴ糖、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンなどが含まれる。さらに、リボースあるいはデオキシリボースなどの糖を有する、アデノシン、グアノシン、イノシン、キサントシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシンなどのヌクレオシドなどが挙げられる。
【００２３】
ヒドロキシ基を有する環状化合物としては、例えば、麹酸、アルブチンなどが挙げられる。
【００２４】
A-3  酵素
本発明のリン脂質の塩基転移方法に用いる酵素としては、ＰＬＤなどが挙げられる。
【００２５】
ＰＬＤとしては、植物に由来するＰＬＤ、例えば、キャベツやピーナッツに由来するＰＬＤが挙げられる。また、ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物に由来するＰＬＤが挙げられる。中でも、ストレプトマイセス・シナモネウム（Streptomyces cinnamoneum）が生産するＰＬＤが好適に用いられる。この微生物が生産するＰＬＤは、分子量約５４，０００であり、至適ｐＨは約５〜６、至適温度は約４０〜６０℃である（Ｃｈｉａｋｉ  Ｏｇｍｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１２５巻、２６３−２６９頁（１９９９））。
【００２６】
また、ＰＬＤの生産株の生産性を向上させた変異株自体、および上記微生物から単離したＰＬＤ遺伝子を同種または異種の宿主に導入してＰＬＤの生産性を向上させた組換え微生物自体、ならびにそれらに由来するＰＬＤも、本発明に用いられる。
【００２７】
A-4  塩基交換反応
塩基交換反応は、原料リン脂質とアルコール性水酸基を有する化合物（以下、受容体アルコールということがある）とを、塩基転移活性を有する酵素（ＰＬＤ）の存在下で反応させることにより行われる。
【００２８】
原料リン脂質と受容体アルコールとのモル比は、特に制限はなく、原料リン脂質および受容体アルコールの種類に応じて適宜決定すればよい。一般的には、受容体アルコール／原料リン脂質（モル比）は、０．００１〜２００程度であることが好ましい。例えば、ＰＥの場合、受容体アルコール／ＰＥ（モル比）は、一般には、０．０１〜１００であることが好ましい。
【００２９】
塩基交換反応において、酵素の使用量には、特に制限はなく、原料リン脂質、受容体、および酵素の種類に応じて、決定すればよい。例えば、ＰＬＤの場合、ＰＥ１ｇに対し、２０〜８０００単位の範囲で使用することができる。なお、その酵素活性の１単位は、９５％大豆由来ＰＣ（Phosphatide Extract, Soybean (Granules) Avanti Polar Lipid Inc.社製）を基質とし、基質濃度０．１６％の４０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む）中で３７℃にて反応させた場合、１分間に１μｍｏｌのコリンを遊離する酵素量である。
【００３０】
塩基交換反応には、水系溶媒、有機溶媒、および水系溶媒と有機溶媒との混合溶媒を反応用溶媒として用いることができる。反応用水系溶媒とは、水および／または水性の緩衝液をいう。水としては、イオン交換水、精製水、または蒸留水を用いることが好ましいが、水道水も使用できる。水性の緩衝液としては、例えば、ｐＨ４〜６の酢酸緩衝液、ｐＨ７〜８のリン酸緩衝液などが好ましく用いられる。反応用有機溶媒としては、ｎ-ヘプタン、ｎ-ヘキサン、石油エーテル等の脂肪族炭化水素；シクロペンタン、シクロヘキサン等の環状脂肪族炭化水素；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；四塩化炭素、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類が挙げられる。反応用有機溶媒は、単独で用いてもよく、あるいは２種以上を混合して用いてもよい。これらの反応用水系溶媒や反応用有機溶媒に、さらに塩基交換反応を促進させる溶媒、例えば、アセトンなどと併用してもよい。
【００３１】
水系溶媒と有機溶媒との混合溶媒を反応に用いる場合、混合比は、使用する有機溶媒の種類に応じて適宜選択することができる。混合比率に特に制限はないが、一般的には、副反応であるリン脂質の塩基（ホスファチジル基）の加水分解反応を抑制し、目的の塩基（ホスファチジル基）交換反応を効率的に行うためには、反応系内の水系溶媒の含量を１０容量％以下で行うことが好ましい。
【００３２】
上記酵素反応に使用するリン脂質の量は、反応溶媒の容量に基づいて、好ましくは１〜５０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは５〜３０％（ｗ／ｖ）である。リン脂質の量が５０％（ｗ／ｖ）を超えると、原料リン脂質を溶解した溶液の粘度が高くなって反応効率の低下を招く場合があり、逆に１％（ｗ／ｖ）未満では、一度に処理し得るリン脂質の量がごく少量となり、処理効率が悪くなる。
【００３３】
塩基交換反応の温度は、１０〜７０℃が好ましく、２５〜５０℃がより好ましい。反応の所要時間は、酵素量や反応温度により変動するが、概ね０．５〜４８時間である。本発明の方法では、リン脂質の分散性を考慮し、また、反応用混合溶媒が水層と有機溶媒層との２相系である場合の混合性を考慮して、適宜撹拌、振とうなどの分散手段を施すことが好ましい。
【００３４】
上記反応により、リン脂質の塩基交換が行われ、受容体アルコールの種類に対応したリン脂質が生産される。例えば、アルコールとしてグリセロールを用いた場合には、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）が生産され、セリンを用いた場合には、ホスファチジルセリン（ＰＳ）が生産される。
【００３５】
次いで、この酵素反応液から酵素を除去し、反応生成物を精製するが、酵素を除去する工程については、「Ｄ．酵素反応液からの酵素除去方法」で説明する。
【００３６】
Ｂ．酵素によるリン脂質の加水分解方法
本発明のリン脂質の加水分解方法は、水の存在下、リン脂質と、リン脂質を加水分解し得る酵素とを反応させて酵素反応液を得る工程、および、無機金属塩を含有する、水と有機溶媒との混合溶媒で該酵素反応液を処理し、該酵素を除去する工程を含む。ここでは、まず、加水分解により酵素反応液を得る工程について説明する。
【００３７】
B-1  原料リン脂質
加水分解に用いられる原料のリン脂質は、上記A-1に記載したリン脂質が用いられる。
【００３８】
B-2  酵素
リン脂質の加水分解に用いられる酵素は、リン脂質の脂肪酸部位および／または塩基部位を加水分解し得る酵素であれば、特に制限はない。このような酵素としては、リパーゼ、ホスホリパーゼＡ１（以下ＰＬＡ１）、ＰＬＡ２、ホスホリパーゼＢ（以下ＰＬＢ）、ホスホリパーゼＣ（以下ＰＬＣ）、ＰＬＤ、スフィンゴミエナーゼなどが挙げられる。
【００３９】
ＰＬＤとしては、上記A-3に記載したＰＬＤが用いられる。
【００４０】
ＰＬＡ２としては、動物に由来するＰＬＡ２（例えば、豚膵臓由来のＰＬＡ２）が挙げられる。また、微生物に由来するＰＬＡ２（例えば、ストレプトマイセス属に属する微生物のＰＬＡ２）などが挙げられる。
【００４１】
ＰＬＡ１、ＰＬＢ、ＰＬＣ、およびリパーゼとしては、微生物に由来するリパーゼ、例えば、アスペルギルス属（Aspergillus）、ストレプトマイセス（Streptomyces）属などに属する微生物に由来するホスホリパーゼおよびリパーゼが挙げられる。
【００４２】
さらに、上記酵素の生産株の生産性を向上させた変異株自体、および上記微生物から単離した酵素の遺伝子を同種または異種の宿主に導入してこの酵素の生産性を向上させた組換え微生物自体、ならびにそれらに由来する酵素も、本発明に使用することができる。
【００４３】
B-3  加水分解反応
加水分解反応は、原料リン脂質に、水の存在下、加水分解酵素を作用させることによって行われる。リン脂質の加水分解反応におけるリン脂質と水とのモル比については、特に制限はない。リン脂質１モルに対して、０．０１〜１００倍モルの水を用いるのが適切である。
【００４４】
加水分解反応において、酵素の使用量には、特に制限はなく、原料リン脂質および酵素の種類に応じて適宜決定すればよい。例えば、ＰＬＤの場合は、上記A-4と同様、例えば、ＰＥ１ｇに対し、２０〜８０００単位の範囲で使用することができる。
【００４５】
ＰＬＡ２の場合、例えば、ＰＥ１ｇに対し、２０〜８０００単位の範囲で使用することができる。ＰＬＡ２の１単位は、大豆由来ペーストレシチン（Ｐ−３６４４  Ｓｉｇｍａ  ＰＣ含量４０％）を基質とし、基質濃度１．２５％の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、０．００２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む）中で３７℃にて反応させた場合、１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量である。
【００４６】
リパーゼの場合、ＰＥ１ｇに対し、２０〜５００００単位の範囲で使用することができる。リパーゼの１単位は、オリーブ油と２％ＰＶＡとマッキルベン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を容量比２：３：１で混合・乳化させたものを基質とし、基質４ｍｌに対し、リパーゼ希釈液１ｍｌ混和し、３７℃で６０分間反応させた場合、オレイン酸１μｍｏｌに相当する酸を遊離させる酵素量である。
【００４７】
加水分解反応に使用される反応溶媒としては、上記A-4の塩基転移反応に記載したものと同じ水系溶媒、あるいは水系溶媒と有機溶媒との混合溶媒を用いることができる。リン脂質の水への溶解性を考慮すると、水系溶媒と有機溶媒との混合溶媒が好ましく用いられる。なお、水系溶媒として、ｐＨ７〜９のトリス−塩酸緩衝液なども好ましく用いられる。
【００４８】
水系溶媒と有機溶媒との混合溶媒を用いる場合、混合比は、使用する有機溶媒の種類に応じて適宜選択することができる。水系溶媒と有機溶媒との容量比には特に制限はないが、反応系内の水系溶媒の含量を１０容量％以上にすることが、加水分解反応を促進する上で好ましい。
【００４９】
上記酵素反応に使用するリン脂質の量は、反応溶媒の容量に基づいて、好ましくは１〜５０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは５〜３０％（ｗ／ｖ）である。リン脂質の量が５０％（ｗ／ｖ）を超えると、原料リン脂質を溶解した溶液の粘度が高くなって反応効率の低下を招く場合があり、逆に１％（ｗ／ｖ）未満では、一度に処理し得るリン脂質の量はごく少量となり、処理効率が悪くなる。
【００５０】
加水分解反応の温度は、使用する酵素の物理化学的性質によって異なる。例えば動物由来のＰＬＡ２の場合、１０〜７０℃が好ましく、２５〜５０℃がより好ましい。反応の所要時間は、目的の反応や酵素量および反応温度により変動するが、概ね０．５〜４８時間である。本発明の方法では、リン脂質の分散性を考慮し、また、水系溶媒と有機溶媒との混合溶媒を用いる場合は水系溶媒と有機溶媒との混合性を考慮して、適宜攪拌、振とうなどの分散手段を施すことが好ましい。
【００５１】
上記反応により、リン脂質の加水分解が行われ、ホスファチジルコリン（ＰＣ）からリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）が、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）からリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）が、あるいはＰＣまたはＰＥからホスファチジン酸（ＰＡ）が生産される。
【００５２】
次いで、この酵素反応液から酵素を除去し、反応生成物を精製する。この酵素を除去する工程については、以下の「Ｄ．酵素反応液からの酵素除去方法」で説明する。
【００５３】
Ｃ．酵素除去前の酵素反応液の処理
上記Ａ．塩基交換方法またはＢ．加水分解方法において得られた酵素反応液は、（１）有機溶媒を含む系または（２）水系のいずれかである。それぞれの系において、酵素除去前の酵素反応液の処理について、以下に記載する。
【００５４】
（１）有機溶媒を含む系
酵素反応液が有機溶媒のみの系である場合、そのまま酵素除去を行ってもよい。
【００５５】
酵素反応液が有機溶媒と水系溶媒との混合溶媒系である場合、有機溶媒と水系溶媒とが分離する場合は、水系溶媒を除去しておくことが好ましい。しかし、有機溶媒と水系溶媒との分離が悪い場合、または有機溶媒と水系溶媒とが乳化状態になっている場合は、水系溶媒を除去することなく、そのまま酵素除去を行ってもよい。
【００５６】
（２）水系
酵素反応液が水系である場合、抽出用有機溶媒を添加して、溶媒分画し、分画した水系溶媒を除去しておくことが好ましい。ここで、抽出用有機溶媒は、上記Ａ−４に記載の反応用有機溶媒として列挙した有機溶媒を用いることができる。しかし、この場合も、抽出用有機溶媒と水系溶媒との分離が悪い場合、または抽出用有機溶媒と水系溶媒とが乳化状態になっている場合は、水系溶媒を除去することなく、そのまま酵素除去を行ってもよい。
【００５７】
Ｄ．酵素反応液からの酵素除去方法
上記Ｃ．で得られた酵素反応液から酵素を除去する方法は、無機金属塩を含有する、水と有機溶媒との混合溶媒（以下、単に洗浄用混合溶媒という）で、酵素反応液を処理して、酵素を除去する工程を含む。
【００５８】
上記Ｃ．で得られた酵素反応液には、酵素、原料リン脂質、反応生成物、および、水系溶媒および／または有機溶媒が含まれている。本発明の特徴は、これらの酵素反応液を、無機金属塩を含有する、水と有機溶媒との混合溶媒で処理することにより、酵素を除去する点にある。
【００５９】
D-1  無機金属塩
本発明に用いられる無機金属塩としては、一価の金属の無機塩、二価の金属の無機塩あるいは多価の金属の無機塩が挙げられる。
【００６０】
一価の無機金属塩としては、アルカリ金属の無機塩、無機アンモニア塩などが好ましく用いられる。アルカリ金属としては、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、およびリチウム（Ｌｉ）が好ましく用いられ、ナトリウムが最も好ましい。アルカリ金属あるいはアンモニアと塩を形成する無機化合物としては、塩酸、硫酸、炭酸などが好ましく用いられる。一価の無機金属塩としては、例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸カリウム（Ｋ２ＳＯ４）などが好ましく用いられる。
【００６１】
二価あるいはさらに多価の無機金属塩としては、アルカリ土類金属などが用いられる。好ましくは、マグネシウム（Ｍｇ）、カルシウム（Ｃａ）などが用いられ、これらの無機金属塩としては、例えば、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４）などが用いられる。
【００６２】
無機金属塩は、単独で用いてもよく、または２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６３】
D-2  洗浄用有機溶媒
酵素の除去に用いられる有機溶媒（洗浄用有機溶媒）は、極性を有していれば特に制限はない。アルコール（特に低級アルコール）、アセトンなどが好ましく用いられる。低級アルコールとしては、炭素数１〜７のアルコールが用いられ、特に、メタノール、エタノール、イソプロパノールおよびグリセロールが好ましく用いられる。
【００６４】
有機溶媒は、単独で用いてもよく、または２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６５】
D-3  無機金属塩を含む、水と有機溶媒との混合溶媒（洗浄用混合溶媒）
一般には、水と有機溶媒とは、容量比で１：９〜９：１の割合で、好ましくは３：７〜７：３の割合で、より好ましくは４：６〜６：４の割合で混合される。
【００６６】
無機金属塩は、この混合溶媒中に、３〜２５質量／容量％（以下、ｗ／ｖ％）、好ましくは５〜２０ｗ／ｖ％、さらに好ましくは５〜１０ｗ／ｖ％含まれる。
【００６７】
なお、この洗浄用混合溶媒の作成方法に特に制限はない。例えば、適切な濃度の無機金属塩水溶液を予め調製し、適切な量の有機溶媒と混合して調製してもよい。あるいは、水と有機溶媒との混合溶媒に適切な量の無機金属塩を添加してもよい。具体的には、例えば、アセトンと１５ｗ／ｖ％のＮａＣｌを含む水溶液との１：１（ｖ／ｖ）混合溶液（７．５ｗ／ｖ％のＮａＣｌを含有する５０ｖ／ｖ％アセトン−水混合溶媒）などが挙げられる。同様に、７．５ｗ／ｖ％ＮａＣｌを含有する５０ｖ／ｖ％エタノール−水混合溶媒、７．５ｗ／ｖ％ＮａＣｌを含有する５０ｖ／ｖ％イソプロパノール−水混合溶媒、７．５ｗ／ｖ％ＮａＣｌを含む５０ｖ／ｖ％メタノール−水混合溶媒などが例示される。これらは、単なる例示であることはいうまでもない。
【００６８】
D-4  酵素反応液の処理
酵素反応液の処理とは、上記Ｃ．で得られた酵素反応液を洗浄用混合溶媒で洗浄することを意味する。洗浄は、この酵素反応液と洗浄用混合溶媒とを十分に混合した後に、静置あるいは遠心分離によって、洗浄用混合溶媒を分離・除去することにより行われる。
【００６９】
洗浄用混合溶媒は、上記Ｃ．で得られた酵素反応液の容積の１／１０以上の割合で添加することができる。処理効率を考慮すると、用いる洗浄用混合溶媒の量は、酵素反応液の容積の３／１０〜３／１（ｖ／ｖ）であることが好ましく、より好ましくは、５／１０〜１／１（ｖ／ｖ）である。
【００７０】
洗浄後、リン脂質を含有する有機溶媒相を回収する。必要に応じて、洗浄用混合溶媒による処理を繰り返してもよい。
【００７１】
なお、酵素反応物の洗浄用混合溶媒による処理は、上記のような予め調製した混合溶媒を酵素反応物に添加する方法の他に、無機金属塩、水、および有機溶媒を、上記所定の添加量となるように酵素反応物に直接添加する方法もある。これらの成分の添加順序に特に制限はない。あるいは、所定量の無機金属塩を含有する水溶液と有機溶媒とを、酵素反応物に加えてもよい。すなわち、最終的に、酵素反応物中に、上記所定量の混合溶媒が含まれるようにすればよい。
【００７２】
また、酵素反応液自体に洗浄用混合溶媒の組成となる上記の無機金属塩、水、または極性溶媒が含まれている場合、それを洗浄用混合溶媒の構成物として利用してもよい。
【００７３】
この洗浄によって得られたリン脂質を含有する有機溶媒相に、洗浄用混合溶媒の組成である無機金属塩が含まれている場合は、水および極性有機溶媒の混合液でさらに洗浄することにより、容易にこの無機金属塩を除去することが可能である。
【００７４】
Ｅ．反応生成物の回収
上記Ｄ．で得られたリン脂質を含有する有機溶媒相から、目的生成物は、当業者が通常行う手段により回収される。例えば、反応生成物を溶解し得る有機溶媒による抽出、次いで有機溶媒の減圧下除去などの手段により回収され、必要に応じて、精製される。得られる生成物は、反応に使用した酵素を全く含んでいないか、または酵素含量が極めて低いため、安定に保存される。
【実施例】
【００７５】
以下に、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されることはない。
【００７６】
＜分析の方法＞
（反応の確認）
以下の調製例において、反応の進行は、以下の方法で確認した。反応液の一部を取り、全溶媒を減圧下にて留去し、乾燥物をクロロホルム：アセトニトリル＝７：３に溶解し、生成物のＰＳおよびＰＡ、ＬＰＡを下記の条件の高速液体クロマトグラフ法（以下、ＨＰＬＣ法という）にて検出した。
使用カラム：ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製  Ｕｎｉｓｉｌ  Ｑ  ＮＨ２
（内径４．６ｍｍ×２５ｃｍ）
移動相：アセトニトリル：メタノール：１０ｍＭリン酸二水素アンモニウム＝６１９：２９１：９０（ｖ/ｖ/ｖ）
流速：１．３ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：３７℃
検出：ＵＶ  ２０５ｎｍ
【００７７】
（酵素活性の定義および測定法）
以下の調製例および検討例で使用した酵素活性は、それぞれ下記のとおり定義した。また、残存酵素活性は、リン脂質の一部を取り、全溶媒を減圧下にて留去して、得られたレシチンを下記の方法で測定し、レシチン１ｇ当りの活性として表示した。
【００７８】
・ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）：
９５％大豆由来ホスファチジルコリン（ＰＣ）（Phosphatide Extract, Soybean (Granules), Avanti Polar Lipid Inc.製）を基質とし、基質濃度０．１６質量％の４０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む）中で３７℃にて反応させ、酵素活性を測定した。酵素活性は、１分間に１μｍｏｌのコリンを遊離する酵素量を１Ｕとする。
【００７９】
・ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）：
大豆由来ペーストレシチン（Ｐ−３６４４  Ｓｉｇｍａ  ＰＣ含量４０％）を基質とし、基質濃度１．２５ｗｔ％の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、０．００２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む）中で３７℃にて反応させた。１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量を１Ｕとする。
【００８０】
・リパーゼ：
オリーブ油と２％ＰＶＡとマッキルベン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とを容量比２：３：１で混合・乳化させたものを基質とし、基質４ｍｌに対し、リパーゼ希釈液１ｍｌを混和し、３７℃で６０分間反応させた。オレイン酸１μｍｏｌに相当する酸を遊離させる酵素量を１Ｕとする。
【００８１】
・プロテアーゼ：
０．６％ ミルクカゼイン(ｐＨ７．５、０．０４Ｍリン酸緩衝液)５ｍｌに１ｍｌの酵素液を加え、３０℃にて１０分間反応させた。１分間に１μｇのチロシンに相当するフォリン発色をＴＣＡ可溶性成分として遊離する活性を１Ｕとする。
【００８２】
（残存タンパク質の定量）
リン脂質画分を、減圧下で溶媒除去した後、クロロホルムに溶解させ、遠心分離して、タンパク質をクロロホルム不溶物として回収した。回収したタンパク質はさらに数回、クロロホルムで洗浄した後、減圧下でクロロホルムを除去して、タンパク質定量に供した。タンパクの定量は、Protein Quantification Kit-Wide Range（Dojindo Molecular Technologies, Inc.）を使用し、牛血清アルブミンを標品として定量した。
【００８３】
＜反応液の調製＞
（調製例１：塩基交換反応した酵素反応液の調製）
ヘキサン／アセトン／０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を７８／１４／８（容量比）の割合で混合した２相系の混合溶媒に、レシチン（ＳＬＰ−ＰＩパウダー：辻製油製）およびセリンを、レシチン：セリン＝１：７〜１０（重量比）となるように溶解し、ＰＬＤ（ＰＬＤナガセ（ナガセケムテックス社製））を添加して、３０℃にて攪拌しながら５時間反応させて、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を生成した。なお、反応の進行は、上記のＨＰＬＣ法で確認した。
【００８４】
反応終了後、静置して有機溶媒相と水相の二相に分離し、ＰＳを含有する有機溶媒を回収した。以下、このＰＳを含有する有機溶媒をリン脂質画分Ｉという。
【００８５】
（調製例２：加水分解反応した酵素反応液の調製−１）
０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）にレシチン（Ultralec Ｐ：ＡＤＭ社製）を５〜２５％になるように分散し、ＰＬＤ（ＰＬＤナガセ（ナガセケムテックス社製））を添加して、５０℃にて攪拌しながら１６時間反応させて、ホスファチジン酸（ＰＡ）を生成した。以下、このＰＡを含有する水系溶媒をリン脂質画分IIという。なお、反応の進行は、上記のＨＰＬＣ法で確認した。
【００８６】
（調製例３：加水分解反応した酵素反応液の調製−２）
上記調製例２で得たリン脂質画分IIの一部をとり、ヘプタン：アセトン＝１：２（ｖ／ｖ）の混合溶媒をこのリン脂質画分の２容量倍添加し、攪拌した後、水系溶媒を除去して、ＰＡを含有する有機溶媒相を回収した。以下、このＰＡを含有する有機溶媒相をリン脂質画分IIIという。
【００８７】
（調製例４：加水分解反応した酵素反応液の調製−３）
上記調製例３で得たリン脂質画分IIIに、水系溶媒として０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０  ４０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む）を加え、ＰＬＡ２（ＰＬＡ２ナガセ（ナガセケムテックス社製））を添加して、３０℃にて攪拌しながら１６時間反応させて、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を生成した。なお、反応の進行は、上記のＨＰＬＣ法で確認した。反応終了後、静置して水系溶媒を分離し、ＬＰＡを含有する有機溶媒相を回収した。以下、このＬＰＡを含有する有機溶媒相をリン脂質画分IVという。
【００８８】
（調製例５：加水分解反応した酵素反応液の調製−４）
上記調製例３で得たリン脂質画分IIIに、水系溶媒として０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０、４０ｍＭ ＣａＣｌ２を含む）を加え、リパーゼ（リリパーゼＡ−１０（ナガセケムテックス社製））を添加して、３０℃にて攪拌しながら１６時間反応させて、ＬＰＡを生成した。なお、反応の進行は、上記のＨＰＬＣ法で確認した。反応終了後、静置して水系溶媒を分離し、ＬＰＡを含有する有機溶媒相を回収した。以下、このＬＰＡを含有する有機溶媒相をリン脂質画分Ｖという。
【００８９】
（調製例６：プロテアーゼ処理した酵素反応液の調製）
生成物ＰＡおよび酵素ＰＬＤを含むリン脂質画分IIに、プロテアーゼ（商品名：ビオプラーゼコンク（ナガセケムテックス社製）をレシチン１ｇ当り２０Ｕ添加し、６０℃で１時間攪拌した後、ＰＡを含有する水系溶媒を回収した。以下、このＰＡを含有する水系溶媒をリン脂質画分VIという。
【００９０】
各リン脂質画分（Ｉ〜VI）における残存ＰＬＤ活性および残存ＰＬＡ２活性は、レシチン１ｇ当りに、１０〜６０Ｕであった。以後、上記のリン脂質画分Ｉ〜VIを使用して、以下の比較例・検討例を実施した。
【００９１】
＜従来手法による酵素失活の検討＞
（比較例１：加熱処理によるＰＬＤの除去の検討）
上記調製例１で得たリン脂質画分Ｉを表１に記載の温度で、１５時間加熱処理し、ＰＬＤの残存活性を測定した。なお、ＰＬＤの残存活性は、上記の方法で測定した。表１に結果を示す。
【００９２】
【表１】
0004650746.tif 000002
【００９３】
表１の結果から、１５時間の加熱処理によって、ＰＬＤ活性は低下したが、活性の半分以上が残存していることがわかる。このことから、ＰＬＤは、レシチン存在下では熱に対して非常に安定になると推測された。さらに、加熱により、ＰＳの酸価および過酸化物価が上昇し、生成したＰＳが熱により分解を受けていることがわかった。従って、加熱処理は、有効なＰＬＤ失活の手段とはなり得ないことがわかった。
【００９４】
（比較例２：プロテアーゼ処理によるＰＬＤの除去の検討−１）
表２に記載の種々のプロテアーゼを、レシチン１ｇ当り２０Ｕの割合でリン脂質画分Ｉに加え、６０℃にて１時間攪拌しながら反応させて、残存ＰＬＤ活性を上記の方法で測定した。結果を表２に示す。
【００９５】
【表２】
0004650746.tif 000003
【００９６】
表２の結果から、プロテアーゼ処理を有機溶媒中で行った場合、ＰＬＤの活性がほとんど低下しないことがわかった。
【００９７】
（比較例３：プロテアーゼ処理によるＰＬＤの除去の検討−２）
上記比較例２のプロテアーゼ処理は有機溶媒中で行ったため、プロテアーゼによるＰＬＤタンパク質の加水分解反応が進行しなかったと考えられる。そのため、リン脂質画分Ｉの一部をとり、減圧下で有機溶媒を除去した後、水に分散させて、プロテアーゼによる処理（プロテアーゼ添加量：レシチン１ｇ当り５Ｕ、６０℃、１時間）を再度行った。結果を表３に示す。使用したプロテアーゼの活性は、上記の方法で測定した。
【００９８】
【表３】
0004650746.tif 000004
【００９９】
この条件におけるプロテアーゼ処理においても、ＰＬＤの失活は約半分程度であり、十分なＰＬＤの失活効果が得られないことが明らかになった。
【０１００】
（比較例４：アセトン処理によるＰＬＤの除去の検討）
リン脂質画分Ｉに、アセトンを添加してＰＬＤを変性・凝集させて、濾過した後、残存ＰＬＤ活性を測定した。結果を表４に示す。
【０１０１】
【表４】
0004650746.tif 000005
【０１０２】
表４の結果からわかるように、アセトン処理によっても、ＰＬＤ活性が若干低下するに留まった。アセトンの量を増加すると、ＰＬＤが低下する傾向にあった。しかし、アセトンをリン脂質画分Ｉの容量の６／１０量以上添加すると、原料レシチンが沈殿するため、好ましくない。また、一般的に酵素そのものはアセトンなどの有機溶媒への耐性が低いが、この結果からはレシチン存在下でＰＬＤの溶剤耐性が高くなることが推測された。
【０１０３】
（比較例５：ＮａＣｌ水溶液洗浄によるＰＬＤの除去の検討）
リン脂質画分Ｉを、ＮａＣｌ水溶液で洗浄した後、残存ＰＬＤ活性を測定した。ＮａＣｌ水溶液の濃度および使用量、ならびに結果を表５に示す。なお、洗浄とは、リン脂質画分Ｉに、ＮａＣｌ水溶液を加え、充分に混合するよう攪拌した後、遠心分離や静置にて水相を分離および除去することをいう。以下の検討例においても、洗浄は同様の操作で行った。
【０１０４】
【表５】
0004650746.tif 000006
【０１０５】
次に、１５ｗ／ｖ％ＮａＣｌ水溶液（以下、単に１５％ＮａＣｌということがある）のｐＨを変えて洗浄を行って、残存ＰＬＤ活性を測定した。１５％ＮａＣｌの使用量は、リン脂質画分Ｉの１／１０（ｖ／ｖ）であった。結果を表６に示す。
【０１０６】
【表６】
0004650746.tif 000007
【０１０７】
さらに、１５％ＮａＣｌでの洗浄回数を増加させた場合についても、残存ＰＬＤ活性を測定した。使用量は、リン脂質画分Ｉの１／１０（ｖ／ｖ）であった。結果を表７に示す。
【０１０８】
【表７】
0004650746.tif 000008
【０１０９】
表５〜７の結果から、ＮａＣｌ水溶液による洗浄では、ＰＬＤ活性を約半分の量まで低下させることができた。しかし、ｐＨを変えても、また洗浄回数を増加しても、顕著なＰＬＤ除去効果はみられなかった。
【０１１０】
（比較例６：吸着剤によるＰＬＤの除去の検討）
リン脂質画分Ｉに吸着剤を加えて処理した後、残存ＰＬＤ活性を測定した。表８に記載の吸着剤を、リン脂質画分Ｉ１ｍｌ当り０．１ｇ加え、室温で１時間接触させ、濾過により吸着剤を除去した。また、比較のために、１５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌをリン脂質画分Ｉの１／１０（ｖ／ｖ）使用してリン脂質画分Ｉの洗浄も同時に実施した。結果を表８に示す。なお、表８におけるＮａＣｌ水溶液洗浄＋硫酸マグネシウムまたはＮａＣｌ水溶液洗浄＋活性白土は、リン脂質画分Ｉをリン脂質画分Ｉの１／１０（ｖ／ｖ）量の１５％ＮａＣｌで洗浄した後に、硫酸マグネシウムまたは活性白土を用いて吸着処理を行ったことを意味する。
【０１１１】
【表８】
0004650746.tif 000009
【０１１２】
表８の結果では、吸着剤処理においても、ＰＬＤの活性の顕著な低下はみられず、１５％ＮａＣｌ洗浄と同程度であった。活性白土処理では、ＰＬＤ活性が約２５％程度まで低下し、ＮａＣｌ洗浄よりも効果があると考えられる。しかし、ＮａＣｌ洗浄と活性白土処理とを併用しても、さらなるＰＬＤの活性の低下はみられなかった。
【０１１３】
（比較例７：含水有機溶媒洗浄によるＰＬＤの除去の検討）
リン脂質画分Ｉを、表９に記載の極性有機溶媒と水との混合溶媒を用いて洗浄した後、残存ＰＬＤ活性を測定した。洗浄に用いた混合溶媒量は、リン脂質画分Ｉの６／１０（ｖ／ｖ）であった。なお、比較のために、１５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌをリン脂質画分Ｉの１／１０（ｖ／ｖ）使用したリン脂質画分Ｉの洗浄も同時に実施した。結果を表９に示す。
【０１１４】
【表９】
0004650746.tif 000010
【０１１５】
６７％アセトン、６７％イソプロパノール、６７％エタノールおよび６７％メタノールによる洗浄では、ＮａＣｌ洗浄よりも効果があったが、ＰＬＤの活性の充分な低下はみられなかった。
【０１１６】
以上の比較例１〜７の結果のとおり、従来の方法ではＰＬＤの充分な失活が非常に困難であることが確認された。そこで、以下の検討例により、この問題を解決すべく、新規な酵素活性除去法について記載する。
【０１１７】
＜新規手法の開発＞
（検討例１：洗浄処理の組み合わせ）
リン脂質画分Ｉを、表１０に記載の溶媒の組み合わせにより洗浄した後、残存ＰＬＤ活性を測定した。洗浄に用いた溶媒量は、リン脂質画分Ｉの６／１０（ｖ／ｖ）であった。結果を表１０に示す。
【０１１８】
【表１０】
0004650746.tif 000011
【０１１９】
表１０の結果からわかるように、１５％のＮａＣｌ水溶液と極性溶媒とを等量混合した溶媒（７．５％ＮａＣｌ含有５０％アセトンまたはイソプロパノールまたはエタノールまたはメタノールまたはグリセリン）で洗浄した場合、ＰＬＤが検出限度以下になった。これに対して、ＮａＣｌ洗浄後に含水アセトンまたは含水エタノールで洗浄した場合は、ＰＬＤ活性は３３％〜４０％にまで低下したに過ぎなかった。この結果から、無機金属塩を含む、水と有機溶媒の混合溶媒による洗浄が、ＰＬＤの除去に有効であることがわかった。なお、ＰＬＤの検出限度はレシチン１ｇ当り０．０１Ｕであった。
【０１２０】
（検討例２：ＮａＣｌ以外の金属塩によるＰＬＤの除去の検討）
リン脂質画分ＩをＮａＣｌ以外の金属塩を含む５０％アセトンにより洗浄した後、残存ＰＬＤ活性を測定した。洗浄に用いた溶媒量は、リン脂質画分Ｉの６／１０（ｖ／ｖ）であった。結果を表１１に示す。
【０１２１】
【表１１】
0004650746.tif 000012
【０１２２】
表１１の結果は、ＮａＣｌの代わりに、無機金属塩としてＮａ２ＳＯ４、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、およびＭｇＳＯ４を用いても、ＮａＣｌと同様に、ＰＬＤを除去し得ることを示している。
【０１２３】
（検討例３：無機金属塩を含む含水極性溶媒による洗浄の最適化）
上記検討例の結果に基づき、極性溶媒濃度、無機金属塩濃度、およびリン脂質画分Ｉに対する使用量について、最適な処理条件を検討した。本検討では極性溶媒としてはアセトンを使用し、無機金属塩として、ＮａＣｌを使用した。結果を表１２に示す。
【０１２４】
【表１２】
0004650746.tif 000013
【０１２５】
表１２の結果では、洗浄に使用する混合溶媒の量が増加するに従って、残存ＰＬＤ活性が低くなった。また、リン脂質画分Ｉ容量の６／１０（ｖ／ｖ）量の混合溶媒で洗浄した場合は、ＮａＣｌ濃度が高いほど残存酵素の除去効率がよく、同じ塩濃度である場合、アセトン濃度が高い方が残存酵素の除去効率がよくなった。
【０１２６】
（検討例４：残存タンパク質の確認）
リン脂質画分Ｉをその容量の６／１０（ｖ／ｖ）量の混合溶媒７．５％ＮａＣｌ含５０％アセトンでの洗浄を１〜３回繰り返した後、リン脂質画分Ｉ中の残存タンパク質量を測定した。なお、タンパク質の定量は前記に記載の方法で行った。結果を表１３に示す。
【０１２７】
【表１３】
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【０１２８】
表１３に示した通り、無機金属塩を含む含水有機溶媒による洗浄を１〜３回繰り返し実施することによって、タンパク質が検出限度以下になることが確認できた。このことは、単に残存酵素によるリン脂質の変性を防ぐだけではなく、アレルギー性低減についても有用であることを意味する。
【０１２９】
以上の検討例１〜４の結果のとおり、新規に開発した無機金属塩を含む含水極性溶媒による洗浄方法は、残存ＰＬＤ活性を効率よくの除去できること、およびタンパク質を検出限度以下まで低減できることから、残存ＰＬＤ活性の除去および精製に有効な手段であることが確認された。
【０１３０】
＜加水分解反応およびその他酵素への応用＞
（検討例５：加水分解反応酵素液からの残存酵素活性除去の検討）
リン脂質画分IIおよびIIIには、生成物ＰＡと酵素ＰＬＤとが含まれている。リン脂質画分IVには、生成物ＬＰＡと酵素ＰＬＤおよびＰＬＡ２が含まれている。リン脂質画分Ｖには、生成物ＬＰＡと酵素ＰＬＤおよびリパーゼが含まれている。さらに、リン脂質画分VI中には生成物ＰＡとＰＬＤおよびプロテアーゼが含まれている。そこで、これらのリン脂質の加水分解物から、生成物を精製する方法、すなわち、生成物に残存する酵素を除去する方法を検討した。参考のために、塩基交換反応により得られたリン脂質画分Ｉも使用した。
【０１３１】
リン脂質画分ＩおよびIII〜Ｖの６／１０（Ｖ／Ｖ）の１５ｗ／ｖ％ＮａＣｌを含む５０％アセトンを添加して、上記検討例３と同様に洗浄処理した。なお、リン脂質画分IIおよびVIは、ＰＡを含有する水系溶媒であるため、リン脂質画分の容量の７．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌおよび２倍量（ｖ／ｖ）のアセトンおよび等量（ｖ／ｖ）のヘプタンをそれぞれ個別に添加し、攪拌することで検討例３と同様の処理を行い、ＰＡの抽出と洗浄を同時に行った。なお、ＰＬＤ、ＰＬＡ２、リパーゼ、およびプロテアーゼの各残存活性は、上記の方法で測定した。結果を表１４に示す。
【０１３２】
【表１４】
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【０１３３】
表１４の結果は、すべての酵素が、すべての反応形態（塩基交換反応もしくは加水分解）およびすべての反応系（有機溶媒を用いた反応または水系反応）において、ＮａＣｌを含む含水アセトンでの洗浄処理により、検出限界以下になったことを示す。なお、用いた酵素の検出限界は、それぞれレシチン１ｇ当り、ＰＬＤが０．０１Ｕ、ＰＬＡ２が２０．１Ｕ、リパーゼが１Ｕ、およびプロテアーゼが１Ｕであった。このことから、リン脂質の加水分解反応で得られる酵素反応液からの残存酵素活性の除去やそれらの酵素の失活を目的にプロテアーゼを加えた酵素反応液にも、塩基交換酵素反応液と同様に、本発明の方法が使用できることがわかった。特に、リン脂質画分IIやVIについてもＰＬＤが検出限度以下であったことから、水系溶媒からの抽出と洗浄とが同時に行い得ることを示し、さらに、洗浄用混合溶媒を構成する物質を個別に添加して、混合することが有効であることを示す。このことは、酵素反応液中に、洗浄用混合溶媒を構成する有機溶媒、水、または無機金属塩が含まれる場合は、これらを洗浄溶媒組成と考え、必要な量の有機溶媒、水、および無機金属塩の不足分を添加・攪拌して検討例３と同様の処理を行うことにより、ＰＬＤを始めとするリン脂質の塩基交換あるいは加水分解に用いた酵素あるいはこれらの酵素の失活に用いた酵素活性を除去できることを示している。
【０１３４】
以上の検討結果から、本発明の方法は、酵素の種類に関わりなく利用できる。また、本発明の方法は、塩基交換反応および加水分解反応のいずれにも適用可能であり、反応系が有機溶媒を含んでいる系であるか、含んでいない系（水系）であるかにかかわらず、適用可能であることがわかった。本発明の方法は、上述のような種々の反応系から酵素を含む蛋白質などの不純物を除去することができるため、酵素の除去方法およびリン脂質の精製方法として汎用性の高い方法であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明によれば、酵素を用いたリン脂質の塩基交換反応あるいは加水分解反応において、酵素反応液および反応生成物に含まれる酵素および蛋白質を、加熱などの方法を用いずに、簡単に除去できる。そのため、アレルギーを引き起こす可能性が低減し、高い品質が維持され、かつ保存安定性に優れた各種リン脂質が容易に製造される。このような高品質のリン脂質は食品用途をはじめ各種産業分野において使用できる。