(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体上のグルタチオン合成酵素遺伝子によってコードされるグルタチオン合成酵素が、３７０位のアルギニン残基以降のＣ末端側の領域を欠失していることを特徴とするサッカロマイセス・セレビシエ。
【請求項２】
請求項１に記載のサッカロマイセス・セレビシエを好適な培地で培養し、得られた菌体を用いて製造された酵母エキス。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、γ−グルタミルシステイン含量の高い酵母及び酵母エキス、並びに同酵母を育種する方法に関する。γ−グルタミルシステイン、及びそれから製造されるシステインは、食品分野で有用である。
背景技術
システインは、食品の風味改善などを目的に用いられている。システインの製法については蛋白分解法や半合成法などが知られているが、現在主に用いられている方法は蛋白分解法と半合成法である。システインを食品の風味改善に用いることを目的として、システイン含量の高い天然食品素材が求められているが、そのような天然食品素材は従来ほとんど知られていなかった。
一方、システインにグルタミン酸及びグリシンが結合したトリペプチドであるグルタチオンも、食品の風味改善に用いることが知られている。グルタチオンは、システインから、γ−グルタミルシステインを介して合成される。しかし、γ−グルタミルシステインを食品の風味改善に用いることはほとんど行われていない。
γ−グルタミルシステインは、γ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ１）により、システインとグルタミン酸から合成される。そして、グルタチオンは、γ−グルタミルシステインとグリシンから、グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ２）により合成される。
γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子のプロモーターが強転写プロモーターΔＰ８で交換された酵母サッカロマイセス・セレビシエＹＨＴ１７８株は、菌体内でγ−グルタミルシステイン合成酵素を大量に生産することが報告されている（大竹康之ら、バイオサイエンスとインダストリー、第５０巻第１０号、第９８９〜９９４頁、１９９２年）。また、大竹らは、別の報告で、サッカロマイセス・セレビシエのグルタチオン合成酵素遺伝子欠損株ＹＬ１株では、グルタチオンが検出されなかったと報告している（大竹康之ら、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１２巻、第５４号、第３１４５〜３１５０頁、１９９０年）。
井上らは、染色体上のグルタチオン合成酵素遺伝子の遺伝子破壊について報告している（Ｙｏｓｈｉｈａｒｕ  Ｉｎｏｕｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、第１３９５号、第３１５〜３２０頁、１９９８年）。この破壊遺伝子は、３９６位のアミノ酸残基までは正確に翻訳され、３９７位以降のＣ末端側領域を欠失したグルタチオン合成酵素をコードしていると考えられる。井上らは、遺伝子破壊株のグルタチオン含量を測定したがグルタチオンは検出されなかったと報告している。
ところで、γ−グルタミルシステインに糖類を添加して加熱することによりフレーバー組成物が得られることが知られている（特開平４−９１７６２号公報）が、γ−グルタミルシステインを加熱するとシステインが遊離することは知られていない。
発明の開示
上記のように、γ−グルタミルシステイン合成酵素の発現の増強、及び、グルタチオン合成酵素遺伝子の破壊に関する報告がある。しかし、いずれの場合にも、取得されたサッカロマイセス・セレビシエは、γ−グルタミルシステイン含量が低いか、あるいは生育がよくないものであり、工業生産に必要な条件を十分に満足するものとはいえない。
γ−グルタミルシステイン合成酵素の発現が増強されたＹＨＴ１７８株は、最小合成培地において最大１．６９％のγ−グルタミルシステインを菌体内に蓄積し得ると報告されている（前出、大竹ら、バイオサイエンスとインダストリー）。この培地における酵母の増殖速度は報告されておらず、最小合成培地よりも栄養源に富んだＹＰＤ培地での増殖速度が報告されているが、ＹＰＤ培地においてさえ工業レベルで必要な増殖速度に達しているとはいえない。
また、グルタチオン合成酵素遺伝子が破壊されたＹＬ１株の報告されているγ−グルタミルシステイン含有量は０．５３３％と少なく、工業レベルの実用に耐え得るものでもない（前出、大竹ら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）。なお、クリスら（Ｃｈｒｉｓ  Ｍ．Ｇｒａｎｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第８巻、第１６９９〜１７０７頁、１９９７年）は、ＹＬ１株の表現型がグルタチオン合成酵素を部分的に弱めたものと一致するので、グルタチオン合成酵素を完全に欠落させたものではないと指摘している。しかし、ＹＬ１株は、グルタチオンを含む培地と含まない培地における対数増殖期の増殖能が大きく異なっているので、本件発明のグルタチオン合成酵素弱化株とは本質的に異なる。
また、井上ら（前出）が作製したグルタチオン合成酵素遺伝子破壊株についてグルタチオン含有量を測定した結果、グルタチオンは検出されなかったと報告されている。
このような技術背景の下に、本発明は、システインと同様に食品の風味改善に実用的に用いることができる天然食品素材を提供すること、具体的には、工業レベルでの生産にも適用可能であり、かつ、γ−グルタミルシステインの蓄積量の多い酵母及びその酵母を用いて製造される酵母エキスを提供することを課題とする。
本発明者らは、γ−グルタミルシステインを加熱するとシステインが遊離することを見出し、γ−グルタミルシステインを含有する天然食品素材を加熱すれば、システインを含有する天然食品素材と同様に用いられる天然食品素材を製造することができると考えた。そこで、γ−グルタミルシステインを高含有する酵母を育種することを目指し、グルタチオン合成酵素遺伝子の破壊を試みたが、満足できる結果は得られなかった。さらに、鋭意検討を行った結果、γ−グルタミルシステインを高含有し、かつ、生育の良好な菌株を得ることに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）サッカロマイセス・セレビシエの野生株よりもグルタチオン合成酵素欠損株の生育が遅い培地で培養したとき、その対数増殖期に、γ−グルタミルシステインを１重量％以上含有することができ、かつ、グルタチオンを０．００４重量％〜０．１重量％の範囲で含有するサッカロマイセス・セレビシエ。
（２）前記サッカロマイセス・セレビシエの野生株よりもグルタチオン合成酵素欠損株の生育が遅い培地が、グルタチオンを含まない培地、又は、グルタチオン、γ−グルタミルシステイン、Ｌ−システイン及びシスチンを含まない培地である（１）のサッカロマイセス・セレビシエ。
（３）前記培地が最小培地である（２）のサッカロマイセス・セレビシエ。
（４）染色体上のグルタチオン合成酵素遺伝子によってコードされるグルタチオン合成酵素が、３７０位のアルギニン残基以降のＣ末端側の領域を欠失していることを特徴とするサッカロマイセス・セレビシエ。
（５）（１）〜（４）のいずれかのサッカロマイセス・セレビシエを好適な培地で培養し、得られた菌体を用いて製造された酵母エキス。
（６）サッカロマイセス・セレビシエのグルタチオン合成酵素遺伝子を遺伝子組換え法によって改変した組換え体を作製し、サッカロマイセス・セレビシエの野生株よりもグルタチオン合成酵素欠損株の生育が遅い培地で培養したとき、その対数増殖期にグルタチオンを０．００４重量％〜０．１重量％の範囲で含有する組換え体を選択することを特徴とするγ−グルタミルシステインを含有するサッカロマイセス・セレビシエの育種方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
前記したように、本発明は第一に、γ−グルタミルシステインを加熱するとシステインが得られるという知見に基づいている。γ−グルタミルシステインをｐＨ１〜７において５０〜１２０℃で３〜３００分加熱すると、γ−グルタミルシステインはシステインとＰＣＡ（ピロリドンカルボン酸）に分解するため、システインが全体として高収率で得られる。尚、以降、「システイン」というときは、Ｌ−システインとその酸化型ジスルフィドであるシスチンの両者をいうことがある。
本発明のサッカロマイセス・セレビシエは、上記知見に基づき、食品の風味改善用等を目的として作製されたものである。本発明のサッカロマイセス・セレビシエは、サッカロマイセス・セレビシエの野生株よりもグルタチオン合成酵素欠損株の生育が遅い培地で培養したとき、その対数増殖期に、γ−グルタミルシステインを固形成分に占める割合で１重量％以上含有する。尚、本発明において、γ−グルタミルシステイン又はグルタチオンの含有量は、菌体の固形成分、例えば、１０５℃で４時間加熱した後の菌体重量に対するγ−グルタミルシステイン又はグルタチオンの含有量（％）をいう。
また、本発明のサッカロマイセス・セレビシエは、サッカロマイセス・セレビシエの野生株よりもグルタチオン合成酵素欠損株の生育が遅い培地で培養したとき、その対数増殖期に、γ−グルタミルシステインを１重量％以上、好ましくは１．７重量％以上含有することができ、かつ、グルタチオンを０．００４重量％〜０．１重量％の範囲、好ましくは０．００４重量％〜０．０１重量％の範囲で含有する。後記実施例に示すように、本発明のサッカロマイセス・セレビシエは、グルタチオンを微量産生し、グルタチオンを含まない培地においてグルタチオン合成酵素欠損株よりも良好な生育を示す。ここで、本発明のサッカロマイセス・セレビシエのごとく、前記培地で０．００４重量％〜０．１重量％のグルタチオンを産生する程度の微弱なグルタチオン合成酵素活性を有する株を、「グルタチオン合成酵素弱化株」ということがある。これに対し、「グルタチオン合成酵素欠損株」とは、グルタチオン合成酵素活性を実質的に欠損し、最小培地でグルタチオンを産生できない株をいう。また、本発明において、「対数増殖期」とは、培養中におけるサッカロマイセス・セレビシエの細胞数が培養時間に対して対数的に増加する時期をいう。尚、γ−グルタミルシステイン含有量は、対数増殖期のすべてにわたって１重量％以上である必要はなく、少なくとも対数増殖期の任意の時点において、好ましくは、対数増殖期の次に述べる状態で１重量％以上であればよい。即ち、前記状態とは、対数増殖期から定常状態になったときの培養液の吸光度の１／２以上の吸光度を有する対数増殖期である。
上述したように、本発明のサッカロマイセス・セレビシエは、γ−グルタミルシステインを一定量以上産生し、かつ、グルタチオンが存在しないような工業的に用いられる培地における生育も良好であるので、単位時間あたりのγ−グルタミルシステインの生産能に優れ、γ−グルタミルシステインを含有する酵母エキスの効率的な製造に適している。また、得られた酵母エキスを加熱することによって、システイン高含有酵母エキスを製造することができる。
サッカロマイセス・セレビシエの野生株、すなわちグルタチオン合成酵素活性を有し、グルタチオンを産生する株よりも、グルタチオン合成酵素欠損株の生育が遅い培地としては、例えば、グルタチオンを含まない培地、あるいは、グルタチオン、γ−グルタミルシステイン、Ｌ−システイン及びシスチンを含まない培地が挙げられる。具体的には、ＳＤ培地等の各種の最小培地が挙げられる。本発明のサッカロマイセス・セレビシエが上記の性質以外の栄養要求性を有する場合は、前記培地は、栄養要求性に応じた栄養成分、例えばシステイン以外の各種アミノ酸、ヌクレオチド、ビタミン等を必要に応じて含む。
本発明のサッカロマイセス・セレビシエとして具体的には、染色体上のグルタチオン合成酵素遺伝子によってコードされるグルタチオン合成酵素が、３７０位のアルギニン残基以降のＣ末端側の領域を欠失したサッカロマイセス・セレビシエ、つまり、３７０位以下を欠失したグルタチオン合成酵素を産生するサッカロマイセス・セレビシエが挙げられる。
前出の井上らの報告（Ｙｏｓｈｉｈａｒｕ  Ｉｎｏｕｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、第１３９５号、第３１５〜３２０頁、１９９８年）からは、３９６番目のアミノ酸残基までを含み、３９７番目のアミノ酸残基以降を欠失したグルタチオン合成酵素は、活性を欠損していると考えられた。したがって、グルタチオン合成酵素構造遺伝子の３９６番目のコドンよりも上流のコドンを終始コドンに置換した場合は、発現産物はグルタチオン合成酵素活性を示さないと予想された。しかしながら、後記実施例に示すように、３７０番目のコドンを終始コドンに置換したグルタチオン合成酵素遺伝子を用いて作製した遺伝子置換株は、微量のグルタチオンを産生したことから、微弱なグルタチオン合成酵素活性を有していることが示唆された。
本発明のサッカロマイセス・セレビシエは、上記知見にしたがって、菌体のグルタチオン合成酵素活性を弱化させることによって取得することができる。グルタチオン合成酵素活性を弱化させるには、例えば、グルタチオン合成酵素遺伝子のプロモーターを、同遺伝子固有のプロモーターから他の遺伝子由来の弱いプロモーターに置換する、グルタチオン合成酵素遺伝子のプロモーター又はコード領域を改変して発現もしくは活性又はその両方を弱める、あるいは、同遺伝子の転写因子活性を弱める、等の方法が挙げられる。
グルタチオン合成酵素遺伝子配列の改変は、通常の変異処理、例えばＵＶ照射、あるいはＮ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、亜硝酸、アクリジン等の変異剤による処理によって、又は、遺伝子組換え技術を利用した遺伝子置換によって、行うことができる。
遺伝子置換は、以下のようにして行うことができる（図４参照）。微弱な活性を有するグルタチオン合成酵素をコードするように改変したグルタチオン合成酵素遺伝子、例えば３７０番目のコドンを終始コドンに改変したグルタチオン合成酵素遺伝子（弱化型グルタチオン合成酵素遺伝子）を含む組換えＤＮＡでサッカロマイセス・セレビシエを形質転換し、弱化型グルタチオン合成酵素遺伝子と染色体上のグルタチオン合成酵素遺伝子との間で組換えを起こさせる。その際、プラスミドには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。また、前記組換えＤＮＡは、プラスミドを用いて作製した後に制限酵素で切断して直鎖状にし、さらに、サッカロマイセス・セレビシエで機能する複製制御領域を除いておくと、染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株を効率よく取得することができる。
上記のようにして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在するグルタチオン合成酵素遺伝子配列との組換えを起こし、正常なグルタチオン合成酵素遺伝子と弱化型グルタチオン合成酵素遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分及びマーカー遺伝子）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。したがって、この状態では正常なグルタチオン合成酵素遺伝子が機能する。
次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型グルタチオン合成酵素遺伝子のみを残すために、２個のグルタチオン合成酵素遺伝子の組換えにより１コピーのグルタチオン合成酵素遺伝子を、ベクター部分（マーカー遺伝子を含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる。その際、正常なグルタチオン合成酵素遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、弱化型グルタチオン合成酵素遺伝子が切り出される場合と、反対に弱化型グルタチオン合成酵素遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、正常なグルタチオン合成酵素遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合もマーカー遺伝子が脱落するので、２回目の組換えが生じたことは、マーカー遺伝子に対応する表現形質によって確認することができる。また、目的とする遺伝子破壊株は、ＰＣＲによりグルタチオン合成酵素遺伝子を増幅し、その構造を調べることによって、選択することができる。
サッカロマイセス・セレビシエの形質転換は、プロトプラスト法、ＫＵ法、ＫＵＲ法、エレクトロポレーション法等、通常酵母の形質転換に用いられる方法を採用することができる。
上記と同様にして、プロモーターなどの発現調節配列を改変することもできる。また、本発明のサッカロマイセス・セレビシエは、微弱なグルタチオン合成酵素活性を有することに加えて、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が増強されていてもよい。
本発明のサッカロマイセス・セレビシエ又はその作製に用いる親株は、１倍体でも２倍体でも、それ以上の倍数体でもよい。
上記のようにして改変したサッカロマイセス・セレビシエについて、サッカロマイセス・セレビシエの野生株よりもグルタチオン合成酵素欠損株の生育が遅い培地で培養したとき、その対数増殖期にグルタチオンを０．００４重量％〜０．１重量％の範囲で含有する組換え体を選択することにより、本発明のサッカロマイセス・セレビシエを取得することができる。
本発明のサッカロマイセス・セレビシエを好適な培地で培養し、得られた菌体を用いて、γ−グルタミルシステインを含有する酵母エキスを製造することができる。また、得られた酵母エキスを加熱することにより、システイン含量の高い酵母エキスを製造することができる。
酵母エキスの製造に用いる培地は、本発明のサッカロマイセス・セレビシエが良好に生育し、かつ、γ−グルタミルシステインを効率よく産生するものであれば特に制限されない。特に、本発明のサッカロマイセス・セレビシエは、グルタチオンを含まない培地でも良好に生育することができるので、通常、工業的に用いられる培地を用いることができる。尚、必要に応じて、用いる菌株の形質にしたがって必要な栄養素を培地に添加する。
培養条件及び酵母エキスの調製は、通常のサッカロマイセス・セレビシエの培養、及び酵母エキスの調製と同様にして行えばよい。酵母エキスは、酵母菌体を熱水抽出したものを処理したものでもよいし、酵母菌体を消化したものを処理したものでもよい。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
＜１＞加熱処理によるγ−グルタミルシステインからのシステインの遊離
還元型γ−グルタミルシステインの１ｍｍｏｌ濃度の水溶液（ｐＨは３又は５に調整した）を９８℃で加熱し、生成物を経時的に調べた。その結果、図１、２に示すように、加熱によりγ−グルタミルシステインがシステインとピロリドンカルボン酸（図１及び図２中、「ＰＣＡ」と示す）に分解し、システインが高収率で得られることが判明した。
＜２＞グルタチオン合成酵素遺伝子破壊株の構築
次に、グルタチオン合成酵素遺伝子破壊株の構築を行った。
（１）ウラシル要求性のサッカロマイセス・セレビシエの単離
自然界より単離したサッカロマイセス・セレビシエから、常法に従って１倍体Ｎα株を取得した。Ｎα株から、ウラシルを含むＳＤＦＯＡプレート（２％精製寒天、最終濃度で５０ｍｇ／Ｌのウラシル及び１ｇ／Ｌの５−フルオロオロチン酸−水和物を含むＳＤ培地）を用いて、ウラシル要求性株Ｎα１株を取得した。後述するように、Ｎα１株のウラシル要求性はＵＲＡ３遺伝子で相補されたことから、ＵＲＡ３遺伝子の変異株であると考えられる。
（ＳＤ培地組成）
グルコース      ２％
Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  １倍濃度
（１０倍濃度Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅは、１．７ｇのＢａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ社）と５ｇの硫酸アンモニウムを混合したものを１００ｍｌの滅菌水に溶解し、ｐＨを５．２程度に調整し、フィルター濾過滅菌したもの）
（２）グルタチオン合成酵素欠損用カセットの作製
Ｎα１株を親株として、グルタチオン合成酵素遺伝子破壊株を構築した。
まず、Ｎα１株の染色体ＤＮＡを鋳型として、グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ２）遺伝子の上流領域から末端領域までをＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は、下記に示す組成の反応液を用いて、９４℃  １分の後、９４℃  ３０秒、６０℃  ４０秒、７４℃  １分３０秒を３０サイクル繰り返すことにより行った。（ＰＣＲ反応液組成）
染色体ＤＮＡ溶液                                    １μｌ
１０Ｘ  ＰＣＲ緩衝液                              １０μｌ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                              １０μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌＧＡＬ１１Ｆ（配列番号１）        １μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌＧＳＨ２Ｒ３（配列番号２）        １μｌ
精製水                                            ７６μｌ
ＫＯＤ  Ｄａｓｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）＊                １μｌ
合計                                            １００μｌ
（＊：ＰＣＲ用ポリメラーゼ）
上記のようにして増幅したＧＳＨ２遺伝子断片を、製造者の指示に従ってプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に連結し、ＧＳＨ２／ｐＧＥＭを得た。
一方、選択遺伝子マーカーとして、ＵＲＡ３遺伝子を、同遺伝子を含むプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を鋳型とするＰＣＲによって取得した。ＰＣＲ反応は、下記に示す組成の反応液を用いて、９４℃  １分の後、９４℃  ３０秒、５２℃  ３０秒、７４℃  ４０秒を３０サイクル繰り返すことにより行った。
（ＰＣＲ反応液組成）
１０ｎｇ／μｌ  ｐＹＥＳ２                          １μｌ
１０Ｘ  ＰＣＲ緩衝液                              １０μｌ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                              １０μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ  ＵＲＡ３Ｆ２（配列番号３）      １μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ  ＵＲＡ３Ｒ２（配列番号４）      １μｌ
精製水                                            ７６μｌ
ＫＯＤ  Ｄａｓｈ                                    １μｌ
合計                                            １００μｌ
続いて、ＧＳＨ２／ｐＧＥＭを制限酵素ＭｕｎＩで切断し、末端を平滑化した。その切断末端に、制限酵素ＳｍａＩで末端を平滑化したＵＲＡ３遺伝子断片を連結し、プラスミドＵＲＡ３−ＧＳＨ２／ｐＧＥＭを作製した。このＵＲＡ３−ＧＳＨ２／ｐＧＥＭを鋳型として、ＧＳＨ２遺伝子の両端に相当する配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行い、カセット１を調製した。ＰＣＲ反応は、下記に示す組成の反応液を用いて、９４℃  １分の後、９４℃  ３０秒、５６℃  ３０秒、７４℃  １分を３０サイクル繰り返すことにより行った。
（ＰＣＲ反応液組成）
１０ｎｇ／μｌ  ＵＲＡ３−ＧＳＨ２／ｐＧＥＭ        １μｌ
１０Ｘ  ＰＣＲ緩衝液                              １０μｌ
１０ｍＭｄＮＴＰｓ                                １０μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ  ＧＡＬ１１Ｆ（配列番号１）      １μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ  ＧＳＨ２Ｒ  （配列番号５）      １μｌ
精製水                                            ７６μｌ
ＫＯＤ  Ｄａｓｈ                                    １μｌ
合計                                            １００μｌ
（３）グルタチオン合成酵素遺伝子欠損株の取得
以上の方法で作製したカセット１を用いて、Ｎα１株のグルタチオン合成酵素遺伝子の破壊を行った。Ｎα１株を前培養した後に、培養物を５０ｍｌのＹＰＤ培地に植え継ぎ、対数増殖期まで培養した。培養菌体を１Ｍソルビトールに懸濁し、カセット１を混和して、エレクトロポレーションにより形質転換を行った。形質転換株を１ｍＭのグルタチオンを含むＳＤプレートで培養し、生育する株を選択した。ＰＣＲ、及び後述するように菌体のグルタチオン含量を測定することによって、グルタチオン合成酵素遺伝子がカセット１で置換された株を選択し、Ｎα２株を得た。
上記のようにして作製されたＮα２株は、グルタチオン合成酵素遺伝子のコード領域の１１番目のコドン以降にＵＲＡ３遺伝子断片由来の配列が付加されているため、グルタチオン合成酵素遺伝子は１１番目のアミノ酸残基までしか正確に翻訳されない。
＜３＞グルタチオン合成酵素弱化株の構築
次に、弱化型グルタチオン合成酵素遺伝子置換株の作製を行った。
（１）弱化型グルタチオン合成酵素遺伝子置換用カセットの作製
Ｎα１株のグルタチオン合成酵素遺伝子断片を、ＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は、下記に示す組成の反応液を用いて、９８℃  １０秒の後、９８℃  １０秒、６０℃  ３０秒、７２℃  １分を３０サイクル繰り返すことにより行った。
（ＰＣＲ反応液組成）
酵母染色体                                                    １μｌ
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）  ０．５μｌ
１０Ｘ  ＰＣＲ緩衝液                                        １０μｌ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                          ８μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ  ＧＳＨ２Ｆ７（配列番号６）                ２μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ  ＧＳＨ２Ｒ７（配列番号７）                ２μｌ
精製水                                                  ７６．５μｌ
合計                                                      １００μｌ
上記のようにして増幅した遺伝子断片を精製し、以下の条件で７２℃で１０分間酵素反応を行うことにより、末端にＡを付加した。
（反応液組成）
遺伝子断片溶液                                                ５μｌ
１０Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（ＭｇＣｌ２フリー）                    １０μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                                          ３μｌ
２．５ｍＭ  ｄＡＴＰ                                          ５μｌ
Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）            ０．５μｌ
精製水                                                  ３１．５μｌ
合計                                                        ５０μｌ
この反応産物を、製造者の指示に従ってブラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のに連結し、プラスミドＧＳＨ２ｄａｓｈ／ｐＧＥＭを得た。
次に、部位特異的変異法によって、ＧＳＨ２ｄａｓｈ／ｐＧＥＭに含まれるグルタチオン合成酵素遺伝子の３７０番目のアミノ酸に対応するコドンを終止コドンに置換した。この操作は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用い、製造者のプロトコルに従って行った。プライマーは、ＧＳＨ２Ｍ−Ｆ１（配列番号８）、ＧＳＨ２Ｍ−Ｒ１（配列番号９）を用いた。このようにしてプラスミドＧＳＨ２Ｍｄａｓｈ／ｐＧＥＭを作製した。
一方、プラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から２μｏｒｉを除去したプラスミドを作製した。ｐＹＥＳ２を制限酵素ＳｓｐＩ、ＮｈｅＩで切断し、切断末端を平滑化した後、連結させ、プラスミドｐＹＥＳ２ｄａｓｈを得た。ｐＹＥＳ２ｄａｓｈ及びＧＳＨ２Ｍｄａｓｈ／ｐＧＥＭを、いずれも制限酵素ＳａｃＩ及びＳｐｈＩで切断し、ｐＹＥＳ２ｄａｓｈからはＵＲＡ３遺伝子を含む断片を、ＧＳＨ２Ｍｄａｓｈ／ｐＧＥＭからは変異を有するグルタチオン合成酵素遺伝子断片を切り出し、これらを連結した。このようにしてプラスミドＧＳＨ２Ｍｄａｓｈ／ｐＹＥＳ２ｄａｓｈを作製した。ＧＳＨ２Ｍｄａｓｈ／ｐＹＥＳ２ｄａｓｈを制限酵素ＭｕｎＩで切断し、カセット２を得た（図３）。
（２）弱化型グルタチオン合成酵素遺伝子置換株の構築
上記のようにして作製したカセット２を用いて、Ｎα１株のグルタチオン合成酵素遺伝子の遺伝子置換を行った（図４）。Ｎα１株を前培養した後に、培養物を５０ｍｌのＹＰＤ培地に植え継ぎ、対数増殖期まで培養した。培養菌体を１Ｍソルビトールに懸濁し、カセット２を混和して、エレクトロポレーションにより形質転換を行った。形質転換株を１ｍＭのグルタチオンを含むＳＤプレートで培養し、生育する株を選択した。カセット２が染色体上の目的の位置に組み込まれたことをＰＣＲによって確認し、得られた株をＮα３中間体とした。
次に、図４に示すとおり、弱化型グルタチオン合成酵素遺伝子のみを染色体に残すため、以下の操作を行った。Ｎα３中間体をＹＰＤ培地で培養し、培養産物を１ｍＭのグルタチオンを含むＳＤＦＯＡプレートに蒔いた。プレート上に生育してきた株のグルタチオン合成酵素遺伝子の配列を決定し、目的の部位の配列が正しく置換されていることを確認し、Ｎα３株を得た。
＜４＞Ｎα２株及びＮα３株の生育及びγ−グルタミルシステインの産生
上記のようにして取得したＮα２株及びＮα３株の対数増殖期における増殖能を調べた。Ｎα２株及びＮα３株をＹＰＤ培地で前培養した後、培養物を５０ｍｌのＳＤ培地（５０ｍｇ／Ｌのウラシルを含む）又は１ｍＭのグルタチオンを含むＳＤ培地（５０ｍｇ／Ｌのウラシルを含む）培地に植え継ぎ、３０℃で振とう培養した。結果を図５及び６に示す。図５に示されるように、Ｎα３株は、グルタチオンを含まない培地においてもグルタチオンを含む培地における増殖能とあまり差違がみられなかった。また、グルタチオンを含まない培地における対数増殖期における生育は、Ｎα２株よりもＮα３株の方が良好であった（図６）。
次に、Ｎα２株とＮα３株の対数増殖期における単位時間あたりのγ−グルタミルシステイン及びグルタチオンの生産量を調べた。Ｎα２株及びＮα３株をＹＰＤ培地で前培養した後、培養物を５０ｍｌのＳＤ（必要量のウラシルを含む）培地に植え継ぎ、３０℃で振とう培養した。
γ−グルタミルシステイン及びグルタチオンの生産量は、次のようにして測定した。培養物を遠心することにより菌体を取得し、この菌体を蒸留水で２回洗浄した後、７０℃で１０分間の熱水抽出処理に付し、細胞内容物を得た。これを遠心処理し、得られた上清中のγ−グルタミルシステイン及びグルタチオン含量を測定した。また、一定培地中に含まれる酵母菌体を濾紙上に取り、１０５℃で４時間加熱した後に残った菌体重量を測定し、乾燥菌体重量とした。表１に、乾燥菌体重量当たりのγ−グルタミルシステイン及びグルタチオンの含有量を示す。
0004622204.tif 000002
これらの結果から、各々の株の単位時間あたりのγ−グルタミルシステイン生産量を測定した。Ｎα２株に対するＮα３株の優位性を示すため、Ｎα２株においてはγ−グルタミルシステインの含有量が高い方（Ｎα２株Ｎｏ．１）を、Ｎα３株においてはγ−グルタミルシステインの含有量が低い方（Ｎα３株Ｎｏ．１）を用いて計算した。すなわち、Ｎα２株においては最大値、Ｎα３株においては最小値が算出される。その結果、Ｎα２株は０．１１６ｍｇ／時間であり、Ｎα３株は０．１２４ｍｇ／時間であった。
産業上の利用可能性
本発明のサッカロマイセス・セレビシエは、γ−グルタミルシステインを一定量以上産生し、かつ、グルタチオンが存在しないような工業的に用いられる培地における生育も良好であり、γ−グルタミルシステインを含有する酵母エキスの効率的な製造に適している。
【配列表】
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0004622204.tif 000004
0004622204.tif 000005
【図面の簡単な説明】
図１は、ｐＨ３における加熱処理によるγ−グルタミルシステインからのシステインの遊離を示す図である。ＰＣＡはピロリドンカルボン酸を、Ｔｏｔａｌ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅは総システイン量を、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓはγ−グルタミルシステインを、各々示す（図２も同様）。
図２は、ｐＨ５における加熱処理によるγ−グルタミルシステインからのシステインの遊離を示す図である。
図３は、弱化型グルタチオン合成酵素遺伝子置換用カセット（カセット２）を含むプラスミドＧＳＨ２Ｍｄａｓｈ／ｐＹＥＳ２ｄａｓｈの構築を示す図である。
図４は、カセット２を用いたグルタチオン合成酵素遺伝子の遺伝子置換を模式的に示す図である。
図５は、Ｎα３株のＳＤ培地又は１ｍＭのグルタチオンを含むＳＤ培地（必要量のウラシルを含む）での生育（ＯＤ６６０）を示す図である。
図６は、Ｎα２株及びＮα３株のＳＤ培地（必要量のウラシルを含む）における生育を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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