(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本から発せられる蛍光を検出して蛍光画像を取得する検出光学系と、
該検出光学系の光軸に交差する平面に沿う２以上の方向から、入射方向を択一的に切り替えて前記標本に平面状の励起光を順次入射させるシート照明光学系と、
該シート照明光学系により入射される前記励起光ごとに、前記検出光学系の光軸方向に前記標本を段階的に移動させる駆動部と、
前記検出光学系により取得された前記励起光の入射方向が異なる複数の前記蛍光画像の内、前記駆動部による前記標本の移動に伴って変化する前記検出光学系の光軸方向における前記標本に対する前記励起光の入射平面の位置が略一致する前記蛍光画像を合成する画像処理部とを備える顕微鏡。
【請求項２】
前記シート照明光学系が、前記検出光学系の光軸方向における前記入射方向ごとの前記入射平面のずれ量が前記検出光学系の焦点深度よりも小さくなるように構成されている請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記駆動部が、前記シート照明光学系の前記励起光の厚さよりも小さく、かつ、前記ずれ量を割り切れるピッチで前記標本を移動させる請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
標本を通過する互いに平行な平面に沿う複数の入射方向からいずれかの方向に択一的に切り替える切替ステップと、
該切替ステップにより切り替えられた方向から前記平面に沿って平面状の励起光を前記標本に入射させる入射ステップと、
該入射ステップにより入射される前記励起光ごとに、検出光学系による前記平面に交差する検出方向に沿って前記標本を段階的に移動させる移動ステップと、
該移動ステップによる前記標本の移動ごとに、前記標本において発生する蛍光を前記検出光学系により検出して蛍光画像を取得する検出ステップと、
該検出ステップにより取得される前記励起光の入射方向が異なる前記蛍光画像の内、前記移動ステップによる前記標本の移動に伴って変化する前記検出方向における前記標本に対する前記励起光の入射平面の位置が略一致する前記蛍光画像を合成する合成ステップとを含む顕微鏡画像取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡および顕微鏡画像取得方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、標本からの蛍光を検出する検出光学系の光軸に対して直交する平面に沿って、標本を挟んで対向する２方向から異なる波長の平面状の励起光を標本に入射させて、各方向からの励起光ごとに標本において発せられる蛍光に基づいて得られる蛍光画像を合成するシート照明方式の顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
落射照明方式あるいは透過照明方式においては、共焦点光学系により１点または複数点に集光させた励起光を２次元的に走査させることにより、光軸方向のボケ像の少ない２次元的な画像を取得する。これに対し、シート照明方式によれば、シート照明の検出光軸方向の厚さが検出光学系の焦点深度に略等しいか、または焦点深度より小さくなるように照明され、かつ広い範囲にわたってシート照明の厚さがほぼ一定とみなせるために、焦点深度以下の広い範囲が一度に励起され、かつそれ以外の部分は励起されないために、画像の取得に要する時間を短縮することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１／１１５８９５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来の顕微鏡のように、異なる方向から入射された励起光ごとに取得される蛍光画像を合成する場合、鮮明な合成画像を生成するためには各方向からの励起光が同一の入射平面に沿って入射される必要がある。しかしながら、各方向からの励起光の入射平面が一致するように光学系を調整するには、複雑で高価な調整機構が必要になるという問題がある。
【０００６】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、シート照明方式により、安価な構成で鮮明な合成画像を取得することができる顕微鏡および顕微鏡画像取得方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、標本から発せられる蛍光を検出して蛍光画像を取得する検出光学系と、該検出光学系の光軸に交差する平面に沿う２以上の方向から、入射方向を択一的に切り替えて前記標本に平面状の励起光を順次入射させるシート照明光学系と、該シート照明光学系により入射される前記励起光ごとに、前記検出光学系の光軸方向に前記標本を段階的に移動させる駆動部と、前記検出光学系により取得された前記励起光の入射方向が異なる複数の前記蛍光画像の内、前記駆動部による前記標本の移動に伴って変化する前記検出光学系の光軸方向における前記標本に対する前記励起光の入射平面の位置が略一致する前記蛍光画像を合成する画像処理部とを備える顕微鏡を提供する。
【０００８】
本発明によれば、シート照明光学系により検出光学系の光軸に交差する入射平面に沿って平面状の励起光が標本に入射されるので、その入射平面に検出光学系の光軸方向の焦点面を一致させることにより、焦点面に沿う広い範囲において発生した蛍光を検出光学系によって１度に検出することができる。また、２以上の方向から入射方向を択一的に切り替えて励起光を標本に入射させることにより、各方向からの励起光の標本への入射深度を浅くして標本における散乱の影響を抑制し、鮮明な蛍光画像を取得することができる。
【０００９】
この場合において、各入射方向から入射される励起光ごとに、駆動部による標本の移動に応じて検出光学系の光軸方向に間隔を空けて複数の蛍光画像が取得される。そして、画像処理部により、励起光の入射方向が異なるそれら複数の蛍光画像の内の検出光学系の光軸方向における標本に対する励起光の入射平面の位置が略一致する蛍光画像が合成されることで、入射方向ごとに励起光の入射平面が検出光学系の光軸方向にずれている場合であっても、画質が略同等の蛍光画像どうしで合成画像を作成することができる。したがって、シート照明方式により、検出光学系の光軸方向に標本を段階的に移動させるだけの安価な構成で、鮮明な合成画像を取得することができる。
【００１０】
上記発明においては、前記シート照明光学系が、前記検出光学系の光軸方向における前記入射方向ごとの前記入射平面のずれ量が前記検出光学系の焦点深度よりも小さくなるように構成されていることとしてもよい。
このように構成することで、励起光の入射方向ごとに、検出光学系の光軸方向にボケ像が少ない蛍光画像を取得することができる。
【００１１】
上記発明においては、前記駆動部が、前記シート照明光学系の前記励起光の厚さよりも小さく、かつ、前記ずれ量を割り切れるピッチで前記標本を移動させることとしてもよい。
このように構成することで、駆動部による検出光学系の光軸方向への標本の段階的な移動中に、標本に対する各入射方向からの励起光の入射平面を略一致させることができる。
【００１２】
本発明は、標本を通過する互いに平行な平面に沿う複数の入射方向からいずれかの方向に択一的に切り替える切替ステップと、該切替ステップにより切り替えられた方向から前記平面に沿って平面状の励起光を前記標本に入射させる入射ステップと、該入射ステップにより入射される前記励起光ごとに、検出光学系による前記平面に交差する検出方向に沿って前記標本を段階的に移動させる移動ステップと、該移動ステップによる前記標本の移動ごとに、前記標本において発生する蛍光を前記検出光学系により検出して蛍光画像を取得する検出ステップと、該検出ステップにより取得される前記励起光の入射方向が異なる前記蛍光画像の内、前記移動ステップによる前記標本の移動に伴って変化する前記検出方向における前記標本に対する前記励起光の入射平面の位置が略一致する前記蛍光画像を合成する合成ステップとを含む顕微鏡画像取得方法を提供する。
【００１３】
本発明によれば、切替ステップにより切り替えられた入射方向から、入射ステップにより標本を通過する平面に沿って平面状の励起光が標本に入射され、検出ステップにより、各入射方向から入射される励起光ごとに、標本面において発生した蛍光が検出光学系により検出されて蛍光画像が取得される。
【００１４】
この場合において、各入射方向から入射される励起光ごとに、移動ステップによる標本の移動に応じて検出ステップにより検出光学系の光軸方向に間隔を空けて複数の蛍光画像が取得される。そして、合成ステップにより、励起光の入射方向が異なるそれら複数の蛍光画像の内の検出方向における標本に対する励起光の入射平面の位置が略一致する蛍光画像が合成されることで、入射方向ごとに励起光の入射平面が検出方向にずれている場合であっても、画質が略同等の蛍光画像どうしで合成画像を作成することができる。したがって、シート照明方式により、安価な構成で鮮明な合成画像を取得することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、シート照明方式により、シート照明方式により、安価な構成で鮮明な合成画像を取得することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施形態に係る顕微鏡を示す概略構成図である。
【図２】（ａ）は図１の顕微鏡の照明装置からの励起光を標本に対して一方向から入射させる場合をそれぞれ示す側面図であり、（ｂ）は図１の顕微鏡の照明装置からの励起光を標本に対して他方向から入射させる場合を示す側面図である。
【図３】検出光学系の光軸方向における一方の入射方向からの励起光の入射平面と他方の入射方向からの励起光の入射平面の位置関係の一例を示す図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る顕微鏡画像取得方法を説明するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の一実施形態に係る顕微鏡および顕微鏡画像取得方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、図１に示されるように、顕微鏡本体３と、顕微鏡本体３に接続される照明装置（シート照明光学系）５と、照明装置５および顕微鏡本体３を制御する制御装置７とを備えている。制御装置７には、ユーザに指示を入力させるマウスやキーボード等の入力装置９と、顕微鏡本体３により取得された画像等を表示するモニタ１１とが接続されている。
【００１８】
顕微鏡本体３は、標本Ｓを載置するステージ１３と、ステージ１３を駆動する駆動部１４と、ステージ１３に載置された標本Ｓにおいて発せられる蛍光を検出する検出光学系１５とを備えている。
【００１９】
ステージ１３は、検出光学系１５の光軸方向およびこれに直交する２次元方向に移動することができるようになっている。
駆動部１４は、制御装置７により制御されてステージ１３を移動させるようになっている。また、駆動部１４は、検出光学系１５の光軸方向にステージ１３を段階的に移動させることができるようになっている。
【００２０】
検出光学系１５は、ステージ１３の載置面に対して垂直な方向において標本Ｓに対向して配置される対物レンズ１７と、対物レンズ１７により集光された標本Ｓからの蛍光を結像させる結像レンズ１９と、結像レンズ１９により結像された蛍光を撮影する撮像素子２１とを備えている。図中、符号２３は、蛍光に含まれる励起光を除去するバリアフィルタを備えるフィルタホイールである。
【００２１】
照明装置５は、図２（ａ），（ｂ）に示されるように、略平行光からなる励起光を射出する励起光源２５と、励起光源２５から射出された励起光を２つの光路に分岐するハーフミラー２７と、分岐された２つの光路を経由した励起光を標本Ｓを挟んで対向する２方向から略平面状の励起光として標本Ｓを通過する平面に沿って入射させる２つのシリンドリカルレンズ２９Ａ，２９Ｂとを備えている。
【００２２】
シリンドリカルレンズ２９Ａ，２９Ｂは、光軸Ｐに直交する一方向にパワーを有し、略平行光からなる励起光をその光束径寸法と同じ所定の幅寸法を有するシート状に集光させるようになっている。各シリンドリカルレンズ２９Ａ，２９Ｂによりシート状に集光される２つの励起光の各入射平面は、検出光学系１５の光軸Ｑに直交する方向に沿って互いに平行な平面上に延びるように配置されている。図中、符号３１は光路を形成するミラーであり、符号３３は２つの光路に設けられ、択一的に開閉されるシャッタである。
【００２３】
この照明装置５は、シリンドリカルレンズ２９Ａにより標本Ｓに入射される励起光の入射平面とシリンドリカルレンズ２９Ｂにより標本Ｓに入射される励起光の入射平面との検出光学系１５の光軸方向のずれ量が、検出光学系１５の焦点深度よりも小さくなるように調整されている。これにより、励起光の入射方向ごとに、検出光学系１５の光軸方向にボケ像が少ない蛍光画像を取得することができる。
【００２４】
制御装置７は、図１に示すように、照明装置５を制御する照明制御部（制御部）３５と、顕微鏡本体３を制御する顕微鏡制御部（制御部）３７と、撮像素子２１により取得された画像信号を処理する画像処理部３９とを備えている。
【００２５】
この制御装置７は、コンピュータにより構成され、画像処理部３９、顕微鏡制御部３７および照明制御部３５の動作、例えば、画像の生成、入力装置９からの指示入力の処理、各種電動部（例えば、ステージ１３、レンズ切替器またはズーム機構、フィルタホイール１９、シャッタ３３など。）やモニタ１１の表示の制御、各種パラメータの記憶などがこのコンピュータの演算処理装置とメモリにより実行されるようになっている。
【００２６】
メモリには、画像処理プログラム、顕微鏡制御プログラムおよび照明制御プログラム等が記憶されており、演算処理装置は、メモリに記憶されているこれらのプログラムに従って、画像処理部３９、顕微鏡制御部３７および照明制御部３５の動作を実行させるようになっている。また、メモリには、ユーザが事前に測定した検出光学系１５の光軸方向における２つの入射方向の励起光の入射平面のずれ量を記憶させることができるようになっている。
【００２７】
照明制御部３５および顕微鏡制御部３７は、コンピュータからの制御信号に基づいて各種電動部を駆動する制御基板を備えている。
照明制御部３５は、シャッタ３３を開閉することにより、図２（ａ）に示されるように、標本Ｓに対して一方向（図２（ａ）の紙面に対して標本Ｓの左側）からシリンドリカルレンズ２９Ａを介して励起光を入射させる光路（以下、左側光路Ｌという。）と、図２（ｂ）に示されるように、標本Ｓに対して他方向（図２（ｂ）の紙面に対して標本Ｓの右側）からシリンドリカルレンズ２９Ｂを介して励起光を入射させる光路（以下、右側光路Ｒという。）とを切り替えて、蛍光画像の取得を行うようになっている。
【００２８】
顕微鏡制御部３７は、入力装置９からの入力によって駆動部１４を作動させてステージ１３を移動させたり、対物レンズ１７や結像レンズ１９を交換あるいは倍率調節したり、フィルタホイール２３を作動させてフィルタを交換したりする等の顕微鏡本体３の制御を行うようになっている。
【００２９】
この顕微鏡制御部３７は、照明装置５から標本Ｓに入射される励起光ごとに駆動部１４を作動させて、検出光学系１５の光軸方向にステージ１３を段階的に移動させることができるようになっている。具体的には、顕微鏡制御部３７は、図３に示すように、照明装置５から発せられるシート状の励起光の厚さと略同じかあるいはそれよりも小さいピッチで、かつ、左側光路Ｌと右側光路Ｒの励起光の入射平面のずれ量（Ｄ）を割り切れるピッチ（ａ）で標本Ｓを移動させるよう、駆動部１４を制御するようになっている。これにより、駆動部１４による検出光学系１５の光軸方向への標本Ｓの段階的な移動中に、標本Ｓに対する左側光路Ｌからの励起光の入射平面と右側光路Ｒからの励起光の入射平面とを略一致させることができる。図３は、標本Ｓを段階的に移動させる方向（Ｚ移動方向）と、その標本Ｓに対してシリンドリカルレンズ２９Ａ，２９Ｂからシート状の励起光が入射される様子を分かり易くするために誇張して示している。
【００３０】
画像処理部３９は、撮像素子２１から送られてくる画像信号を処理してモニタ１１に表示させるようになっている。この画像処理部３９は、撮像素子２１からの画像信号を一時的に保存可能なＦＩＦＯ画像バッファ（記憶領域）を有している。ＦＩＦＯ画像バッファのサイズ（Ｈ)は、Ｈ＞（ＩＮＴ（Ｄ／ａ）＋１）×画像サイズを満たすようになっている。
【００３１】
また、画像処理部３９は、合成画像を生成することができるようになっている。具体的には、画像処理部３９は、検出光学系１５により取得された励起光の入射方向が異なる複数の蛍光画像の内、駆動部１４による標本Ｓの移動に伴って変化する検出光学系１５の光軸方向における標本Ｓに対する励起光の入射平面の位置が略一致する蛍光画像の画像信号を合成するようになっている。
【００３２】
次に、本実施形態に係る顕微鏡画像取得方法について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡画像取得方法は、図４のフローチャートに示されるように、標本Ｓを通過する互いに平行な平面に沿う２つの入射方向からいずれかの方向に択一的に切り替える切替ステップＳ３と、切替ステップＳ３により切り替えられた方向から入射平面に沿ってシート状の励起光を標本Ｓに入射させる入射ステップＳ４と、入射ステップＳ２により入射される励起光ごとに、検出光学系１５の光軸方向に沿って標本Ｓを段階的に移動させる移動ステップＳ６と、移動ステップＳ６による標本Ｓの移動ごとに、標本Ｓにおいて発生する蛍光を検出光学系１５により検出して蛍光画像を取得する検出ステップＳ５と、検出ステップＳ５により取得される入射方向が異なる蛍光画像の内、移動ステップＳ６による標本Ｓの移動に伴って変化する検出光学系１５の光軸方向における標本Ｓに対する励起光の入射平面の位置が略一致する蛍光画像を合成する合成ステップＳ８とを含んでいる。
【００３３】
このように構成された顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法の作用について、図４のフローチャートを参照して説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法により標本Ｓを観察するには、まず、照明装置５の左側光路Ｌと右側光路Ｒの励起光の入射平面のずれ量（Ｄ）をユーザが事前に測定して入力装置９により入力し、制御装置７のメモリに記憶させる。
【００３４】
画像処理部３９により、制御装置７のメモリに記憶された入射平面のずれ量（Ｄ）に基づき、標本Ｓに対する左側光路Ｌと右側光路Ｒの励起光の入射平面が一致するまでに、一方の入射方向からの励起光に対してステージ１３を段階的に移動させて取得する蛍光画像の枚数（ＩＮＴ（Ｄ／ａ）＋１）が算出される。例えば、図３は、蛍光画像を５枚取得する必要がある場合を例示したものである。
【００３５】
続いて、入力装置９によりユーザが標本Ｓの観察領域を指定する。観察領域が指定されると、顕微鏡制御部３７により駆動部１４が作動させられてステージ１３が移動し、指定された観察領域に観察範囲が合せられる。
【００３６】
次いで、照明制御部３５により、メモリに記憶されているプログラムに基づいて、シャッタ３３が開閉され、例えば、図２（ａ）に示すように、照明装置５の左側光路Ｌが開放されて右側光路Ｒが閉鎖される。そして、励起光源２５から励起光が射出される。
【００３７】
励起光源２５から射出されてハーフミラー２７を透過した励起光は、そのままシリンドリカルレンズ２９Ａによりシート状に集光され、図２（ａ）に示すように、左側光路Ｌから入射平面に沿って標本Ｓに入射される。一方、ハーフミラー２７により反射された励起光は、シャッタ３３により遮断される。図３に示すように、左側光路Ｌからの励起光が標本Ｓの観察面Ａ上に入射されることにより、励起光の入射平面に沿って標本Ｓ内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。
【００３８】
標本Ｓにおいて発生した蛍光の内、検出光学系１５の光軸に沿う方向に放射された蛍光は、対物レンズ１７により集光されてフィルタホイール２３のバリアフィルタを通過した後、結像レンズ１９により結像されて撮像素子２１により撮影される。これにより、左側光路Ｌによって標本Ｓにおける観察面Ａの蛍光画像が取得される（ステップＳ１）。撮像素子２１により取得された観察面Ａの蛍光画像は画像処理部３９のＦＩＦＯ画像バッファに保存される（ステップＳ２）。
【００３９】
次に、照明制御部３５により、シャッタ３３が開閉されて、図２（ｂ）に示すように、照明装置５の右側光路Ｒが開放されて左側光路Ｌが閉鎖され、標本Ｓに対する励起光の入射方向が切り替えられる（切替ステップＳ３）。この段階では、右側光路Ｒによって取得された蛍光画像の枚数（ｋ）は０枚である（ｋ＝０）。
【００４０】
この状態で励起光源２５から射出されてハーフミラー２７により反射されたレーザ光は、ミラー３３を介してシリンドリカルレンズ２９Ｂによりシート状に集光され、図２（ｂ）に示すように、右側光路Ｒから入射平面に沿って標本Ｓに入射される（入射ステップＳ４）。
【００４１】
図３に示すように、右側光路Ｒからの励起光が標本Ｓの観察面Ｂ上に入射されることにより発生した蛍光は、左側光路Ｌからの励起光により発生する蛍光と同様に、対物レンズ１７により集光されて撮像素子２１により撮影される。これにより、右側光路Ｒによって標本Ｓにおける観察面Ｂの蛍光画像が取得される（検出ステップＳ５）。右側光路Ｒでの蛍光画像の取得により、ｋ＝１となる。
【００４２】
次いで、顕微鏡制御部３７により駆動部１４が作動させられ、ステージ１３が検出光学系１５の光軸方向に１ステップ上昇させられる（移動ステップＳ６）。また、画像処理部３９により、右側光路Ｒによって取得した蛍光画像の枚数（ｋ）が、ｋ≧ＩＮＴ（Ｄ／ａ）＋１の条件式を満たすか否かが判断される（ステップＳ７）。
【００４３】
上述したように、この段階ではｋ＝１なのでステップＳ４に戻る。
ステージ１３が１ステップ上昇していることにより、ステージ１３上の標本Ｓに対して観察面Ｂの１ピッチ分下の観察面に右側光路Ｒからの励起光が入射される（入射ステップＳ４）。そして、これにより発生した蛍光が撮像素子２１により撮影されて蛍光画像が取得される（検出ステップＳ５）。右側光路Ｒでの２枚目の蛍光画像の取得により、ｋ＝２となる。
【００４４】
次いで、顕微鏡制御部３７により、ステージ１３が検出光学系１５の光軸方向に１ステップ上昇させられ（移動ステップＳ６）、画像処理部３９により、取得した蛍光画像の枚数（ｋ）が上記条件式を満たすか否かが判断される（ステップＳ７）。この段階でもｋ＝２なのでステップＳ４に戻る。このようにして、上記条件式を満たすまでステップＳ４〜ステップＳ７の動作が繰り返される。
【００４５】
右側光路Ｒからの励起光が標本Ｓの観察面Ａ上に入射される位置までステージ１３が上昇し、右側光路Ｒにより観察面Ａの蛍光画像が取得されると（ｋ＝５）、上記条件式が満たされる。この場合、画像処理部３９により、最初に左側光路Ｌにより取得した観察面Ａの蛍光画像がＦＩＦＯ画像バッファの先頭から読み出され、右側光路Ｒにより取得された観察面Ａの蛍光画像と合成される（合成ステップＳ８）。合成された観察面Ａの蛍光画像はモニタ１１に表示される。
【００４６】
ここで、左側光路Ｌからの励起光の入射平面と右側光路Ｒからの励起光の入射平面は検出光学系１５の光軸方向にずれているが、標本Ｓに対するこれら左側光路Ｌおよび右側光路Ｒからの励起光の各入射平面が略一致する蛍光画像どうしを合成することで、ムラがない鮮明な合成画像を生成することができる。
【００４７】
次に、顕微鏡制御部３７により、設定されているスキャンの上限（あるいは下限）までステージ１３が移動したか否かが判断され（ステップＳ９）、上限（あるいは下限）まで移動していない場合は、ステップＳ１に戻る。ステージ１３がスキャンの上限（あるいは下限）まで移動した場合は、標本Ｓの観察が終了となる。
【００４８】
以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法によれば、異なる２方向から入射方向を択一的に切り替えて励起光を標本Ｓに入射させることにより、各方向からの励起光の標本Ｓへの入射深度を浅くして標本Ｓにおける散乱の影響を抑制し、鮮明な複数の蛍光画像を取得することができる。そして、各入射方向からの励起光の入射により取得される蛍光画像を合成することで、標本Ｓの広範囲にわたる蛍光観察を行うことができる。
【００４９】
この場合において、画像処理部３９により、励起光の入射方向が異なるそれら複数の蛍光画像の内の検出光学系１５の光軸方向における標本Ｓに対する励起光の入射平面の位置が略一致する蛍光画像が合成されることで、入射方向ごとに励起光の入射平面が検出光学系１５の光軸方向にずれている場合であっても、画質が略同等の蛍光画像どうしで合成画像を作成することができる。したがって、シート照明方式により、検出光学系１５の光軸方向に標本Ｓを段階的に移動させるだけの安価な構成で、鮮明な合成画像を取得することができる。
【００５０】
本実施形態においては、標本Ｓを移動させて標本Ｓにおける右側光路Ｒからの励起光の入射平面の位置を対物光学系１５の光軸方向にずらしていくことにより、標本Ｓにおける左側光路Ｌからの励起光の入射平面の位置に一致させる場合を例示して説明したが、これに代えて、標本Ｓを移動させて標本Ｓにおける左側光路Ｌからの励起光の入射平面の位置を対物光学系１５の光軸方向にずらしていくことにより、標本Ｓにおける右側光路Ｒからの励起光の入射平面の位置に一致させることとしてもよい。
また、本実施形態では、励起光の切り替えを２つのシャッタ３３で行っているが、シャッタ３３をなくし、ハーフミラー２７を通常のミラーとして、これを光路から出し入れするようにしてもよい。こうすることで、励起光源２５の光量をどちらか一方の光路のみに使うことができる。
【００５１】
また、本実施形態においては、標本Ｓを挟んで対向する２方向から励起光を入射させる場合を例示して説明したが、これに代えて、異なる３以上の方向から標本Ｓに励起光を入射させることとしてもよい。また、本実施形態においては、ステージ１３を段階的に上昇させながら標本Ｓに対する励起光の入射平面をずらしていくこととしたが、これに代えて、ステージ１３を段階的に下降させながら標本Ｓに対する励起光の入射平面をずらしていくこととしてもよい。
【符号の説明】
【００５２】
１    顕微鏡
５    照明装置（シート照明光学系）
１４    駆動部
１５    検出光学系
３５    照明制御部（制御部）
３７    顕微鏡制御部（制御部）
３９    画像処理部
Ｓ３    切替ステップ
Ｓ４    入射ステップ
Ｓ５    検出ステップ
Ｓ６    移動ステップ
Ｓ８    合成ステップ
【図１】
0006436862.tif 000002
【図２】
0006436862.tif 000003
【図３】
0006436862.tif 000004
【図４】
0006436862.tif 000005