(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
物理的外傷、低血圧、敗血症および／または敗血症ショック症候群の後、対象において腎機能不全が発症する発症のしやすさを試験する方法であって、
ａ．物理的外傷後、低血圧事象後、敗血症後、および／または敗血症ショック症候群後の対象から採取したサンプル中に存在する抗炎症性サイトカインのレベルを決定する工程；
ｂ．工程ａ）のみにおいて決定された抗炎症性サイトカインのレベルに基づき、対象において腎機能不全が発症する発症のしやすさを試験する工程を含む方法において、
抗炎症性サイトカインはＩＬ−１ｒａおよび／またはＴＮＦｓｒ２であり、
工程ｂ）の試験する工程は、工程ａ）で決定した抗炎症性サイトカインのレベルが抗炎症性サイトカインの正常レベルよりも低いかどうかを試験する、
方法。
【請求項２】
物理的外傷の前、低血圧事象の前、敗血症の前および／または敗血症ショック症候群の前に対象から採取されたサンプル中に存在する抗炎症性サイトカインのレベルを決定する工程を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腎機能不全が、急性腎機能不全である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
腎機能不全が、物理的外傷、低血圧事象、敗血症および／または敗血症ショック症候群の５日後以降に現れる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
腎機能不全が、正常糸球体濾過率からの２５％以上の低下として規定される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
サンプルが、尿サンプルである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程ａ）において分析されるサンプルが、物理的外傷、低血圧事象、敗血症および／または敗血症ショック症候群の２４時間以内に対象から得られる、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ａ’）物理的外傷後、低血圧事象後、敗血症後および／または敗血症ショック症候群後に対象から採取されたサンプル中に存在する１種または複数のさらなる抗炎症性サイトカインのレベルを決定する工程；
ｂ’）工程ａ）およびａ’’）のみにおいて決定された抗炎症性サイトカインのレベルに基づき、対象において腎機能不全が発症する発症のしやすさを試験する工程をさらに含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
サイトカインがＩＬ−１ｒａである場合、工程ｂ）におけるサイトカインの正常レベルが２２７００ｐｇｍｌ−１である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
サイトカインがＴＮＦｓｒ２である場合、工程ｂ）において決定されるサイトカインの正常レベルが２００００ｐｇｍｌ−１である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
さらなる抗炎症性サイトカインが、少なくとも抗炎症性サイトカインＩＬ−１ｒａおよびＴＮＦｓｒ２が組み合わせて提供されるように選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
ａ’’）物理的外傷後、低血圧事象後、敗血症後および／または敗血症ショック症候群後に対象から採取されたサンプル中に存在する１種または複数の炎症誘発性メディエータのレベルを決定する工程；
ｂ’’）工程ａ）およびａ’’）のみにおいて決定された抗炎症性サイトカインのレベルに基づき、対象において腎機能不全が発症する発症のしやすさを試験する工程をさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
工程ｂ’’）は、工程ａ）、ａ’）、およびａ’’）のみにおいて決定された炎症誘発性メディエータおよび抗炎症性サイトカインのレベルに基づき、対象において腎機能不全が発症する発症のしやすさを試験する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
炎症誘発性メディエータが、ＮＧＡＬ、ＩＬ−１８およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
切迫した腎機能不全が発症すると予測された対象において腎機能不全を処置または防ぐための治療的手段を適用するため、物理的外傷、低血圧、敗血症および／または敗血症ショック症候群の後、対象において腎機能不全が発症する発症のしやすさを試験する方法であって、
（ｉ）請求項１〜１４に記載の方法のいずれかにより、腎機能不全が発症する発症のしやすさを試験する工程、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎機能不全の発症を予測するための方法、およびこのような予測を行う際の使用のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
身体における物理的外傷の直接的な悪影響（例えば、外科手術もしくは自動車事故によって生じる病変、または人工心肺を通る血液バイパスなどの外科的手順）とは別に、物理的外傷を受けた対象は、しばしば、急性腎機能不全を発症する。類似の急性腎機能不全の他の原因としては、長期的な低血圧状態（例えば、粘膜消化管虚血および消化管から循環への内毒素移動に関連する）、敗血症および敗血症ショック症候群が挙げられる。
【０００３】
正常な腎機能を有する患者の集団において、外傷後、低血圧誘導性、敗血症誘導性、および／または敗血症ショック症候群誘導性の腎機能不全の診断は、正常または基線のＧＦＲと比較した糸球体濾過率（ＧＦＲ）の下落に基づいて、行われ得る；これは、例えば、ＭＤＲＤ試験（下でより詳細に説明される）によって測定される。このような測定に基づく診断または予後の制限は、通常、ＭＤＲＤ推定ＧＦＲ値が下がるまでに数日かかることである。ＧＦＲ下落が検出された場合、腎機能におけるさらなる悪化を予防するために治療的手段を開始するには、しばしば遅すぎる。例えば、手術前後の医師または集中治療の医師の立ち向かう挑戦は、このような機能不全が現れる４８時間前の腎機能不全の生物学的マーカーを同定することである（すなわち、予防的手段が集中治療室において取られる可能性が依然としてある場合；例えば、このような患者が正常値を超える血圧の際、本発明に従う試験によって同定され得るような切迫した腎不全のより大きなリスクの存在によって根拠を示されない限り、術後の状況において本来無リスクでない介入を行う）。
【０００４】
身体への外傷は、急性の（多くの場合一過性の）血漿炎症誘発応答を誘導することは、十分に文書化されている。この急性血漿炎症誘発応答の大きさが外傷後腎機能不全と相関していることが、示されている（Ｇｏｒｍｌｅｙら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ、２０００、９３）。類似の急性腎毒性炎症誘発応答の他の原因としては、長期的な低血圧状態（粘膜消化管虚血および消化管から循環への内毒素移動に伴う）または敗血症および敗血症ショック症候群が挙げられ、これらの全ては、通常、血液中の炎症メディエータの急性増加によって特徴付けられる全身性炎症応答（ＳＩＲＳ）が先行するか、またはこれを伴う。血液から濾過されたときのこのような急性炎症誘発応答がいかにして尿細管を損傷するかについての機序は、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅによって示唆され、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅは、培養細胞中の腎近位尿細管に適用されたＴＮＦ−［アルファ］が細胞損傷を導くことを、インビトロで実証した（Ｍａｒｋｅｗｉｔｚ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９３；９１；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、Ｅｘｐ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １９９９；７：４３８〜８）。炎症性サイトカインＩＬ−１ベータ、ＴＮＦ−アルファ、およびＩＦＮ−ガンマの組み合わせによるチャレンジの後、インビトロ腎近位尿細管細胞は、誘導性ＮＯシンターゼ誘導の時間依存性増加および細胞毒性濃度までの対応するＮＯ産生を示し、その効果は、Ｌ−ＮＭＭＡによって阻害された（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、Ｅｘｐ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １９９９；７：４３８〜８）。ラット腎臓表皮細胞のＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマによる刺激は、誘導性一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡのレベルを劇的に上昇させた（Ｍａｒｋｅｗｉｔｚ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９３；９１）。
【０００５】
多くの刊行物が、尿中抗炎症性サイトカインのレベルが外傷後劇的に増加し、実際に炎症誘発応答のレベルにおける上述の増加を反映することを示す。例えば：Ｇｏｒｍｌｅｙら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、Ｊａｎ  ２００２、２１  １７（２）を参照されたい。これに加え、抗炎症性サイトカインにおける外傷後増加の大きさは、腎損傷および腎機能不全の大きさと相関することが実証されている。例えば：Ｌｉｔａｌｉｅｎら、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．、Ｎｏｖ  １９９９、１３（９）；Ｇｒｅｔｃｈｅｎら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ、Ｎｏｖ  ２０００、Ｇｏｒｍｌｅｙら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ、２０００、９３、および；欧州特許出願公開１９６２０９２  Ａ（Ｒｅｎｏｖａｒ，Ｉｎｃ．）を参照されたい。上述の刊行物におけるこれらの結果の提示から、比較的大きな外傷後抗炎症性サイトカインレベルが、腎機能不全についての直接的な比例的マーカーとして提唱されることが明らかである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１９６２０９２号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｏｒｍｌｅｙら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ、２０００、９３
【非特許文献２】Ｍａｒｋｅｗｉｔｚ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９３；９１
【非特許文献３】Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、Ｅｘｐ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １９９９；７：４３８〜８
【非特許文献４】Ｇｏｒｍｌｅｙら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、Ｊａｎ  ２００２、２１  １７（２）
【非特許文献５】Ｌｉｔａｌｉｅｎら、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．、Ｎｏｖ  １９９９、１３（９）
【非特許文献６】Ｇｒｅｔｃｈｅｎら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ、Ｎｏｖ  ２０００
【非特許文献７】Ｍｉｓｈｒａら、Ｌａｎｃｅｔ、２００５；３６５：１２３１〜３８
【非特許文献８】Ｋｏｐｐｌｅら、Ｋｉｄｎｅｙ  ｌｎｔ  Ｓｕｐｐｌ  １９８９；２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
代替の研究は、代わりに、腎機能不全が物理的外傷の前から物理的外傷の後までの抗炎症性サイトカインのレベルにおける変化を測定することによって決定され得ることを示唆している。この分析は、明らかに、物理的外傷事象の前および後の両方の抗炎症性サイトカインレベルのサンプリングおよび評価を必要としている。
【０００９】
本発明者らは、外傷後対象の大きな群の抗炎症性サイトカイン応答を分析した際、驚くべきことに、以前に報告されかつ対象の大部分が経験していたごとき大きな抗炎症性サイトカインレベルが予期されていたのとは裏腹に、これらの対象の一集団が、物理的外傷後比較的低い抗炎症性サイトカインレベルしか提示しなかったことを見出した。この下位集団のさらなる分析において、驚くべきことに、このメンバーは、物理的外傷後に予期された大きな抗炎症性サイトカインレベルを示したメンバーと比較して、腎機能不全を発症するリスクが高かったことを見出した。このような知見は、大きな外傷後尿中抗炎症性サイトカインレベルが腎損傷および腎機能不全の大きさと相関しているという以前に受け入れられた結論と相反する。
【００１０】
本発明者らの驚くべき発見は、また、１点のみ、すなわち物理的外傷後における抗炎症性サイトカインのサンプリングおよび分析により、腎機能不全を予測可能であることも実証する。したがって、このような分析は、抗炎症性サイトカインレベルの外傷前および後の両方の変化の測定が求められることを示す研究よりも、実施が単純である。外傷後の抗炎症性サイトカインレベルのみの測定は、自動車事故によって誘導された物理的外傷などの不測の事象後の腎機能不全の発症を予測しようとする際；すなわち、外傷前の抗炎症性サイトカインレベルの測定が不可能である際に、特に有用である。
【００１１】
本発明者らは、広範囲な実験の後に、外傷または低血圧の後の対象の低いレベルの抗炎症性サイトカインについてのモニタリングによって、または敗血症もしくは敗血症ショック症候群を罹患する対象において、腎機能不全についての予後診断方法に到達し得るという概念を支持する証拠を提供している。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本発明の第１の態様において、物理的外傷、低血圧、敗血症および／または敗血症ショック症候群の後の対象における腎機能不全の発症を予測するための方法であって、
ａ．物理的外傷後、高血圧事象後、敗血症後および／または敗血症ショック症候群後の対象から採取されたサンプル中に存在する抗炎症性サイトカインのレベルを決定する工程；
ｂ．工程ａ）において決定された抗炎症性サイトカインのレベルに基づいて、上記対象における腎機能不全の発症を予測する工程
を含む方法が提供される。
【００１３】
本発明の方法は、対象が事象後（すなわち、物理的外傷後、低血圧事象後、または敗血症もしくは敗血症ショック症候群の発症後）腎機能不全を発症する可能性を予測する。したがって、本方法は、予後診断方法である。対象は、抗炎症性サイトカインの正常レベルよりも低い、工程ａ）によって決定される抗炎症性サイトカインのレベルを提示する場合に、腎機能不全を発症する正常な可能性よりも高い可能性を有することが決定され得る。対象は、抗炎症性サイトカインの正常レベルよりも高い、工程ａ）によって決定される抗炎症性サイトカインのレベルを提示する場合に、腎機能不全を発症する正常な可能性よりも低い可能性を有することが決定され得る。
【００１４】
抗炎症性サイトカインの正常レベルは、物理的外傷の５日後、低血圧事象の後もしくは間、敗血症の後もしくは間、および／または敗血症ショック症候群の後もしくは間に、腎機能不全を有さない個体の対照群によって提示される、事象後レベルである。対照の個体の全ては、上述の事象ゆえに、持続性の、ある程度の無症状性の腎損傷を有するが、臨床的に有為な腎損傷は有さない。個体が腎機能不全を有するか否かを決定することは、十分に当業者の能力範囲内の臨床的問題である。しかし、明確にするために、腎機能不全は、全身的に蓄積する代謝産物を排出する能力の低下によって特徴付けられ、そして腎機能試験によって臨床病理学的に検出可能である（進行した状態において、腎機能不全は、急性の腎不全、尿毒症または慢性的腎損傷であり得る）。例えば、腎機能を決定するＭＤＲＤ方法が、以下に説明される。対照群は、診断される対象と同じまたは類似の事象（すなわち、同じまたは類似の外傷、低血圧事象、敗血症および／または敗血症ショック症候群）を経験し得る。対照群は、３０以上の個体を含み得る。対照群は、３００以上の個体を含み得る。
【００１５】
正常レベルは、事前に決定され得る（すなわち、正常な事象後レベル）。さらに限定されることを望まないが、明確さのために、ＩＬ１ｒａの正常レベルは、２２７００ｐｇｍｌ−１以上であり得る。ＴＮＦｓｒ２の正常レベルは、２００００ｐｇｍｌ−１以上であり得る。ＴＮＦｓｒ１の正常レベルは、２００００ｐｇｍｌ−１以上であり得る。
【００１６】
抗炎症性サイトカインについての正常レベルの１００％より段々と下回る、工程ａ）において決定される抗炎症性サイトカインレベルを提示する対象は、腎機能不全を発症するリスクが正常よりも段々と高くなる。したがって、工程ａ）において決定される抗炎症レベルが正常レベルの９５％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、または１０％以下である場合、対象は、腎機能不全を発症するリスクが正常より高くなる。このような対象は、物理的外傷の５日後、低血圧事象の後もしくは間、敗血症の後もしくは間、および／または敗血症ショック症候群の後もしくは間に、腎機能不全を有するリスクが正常よりも高い場合がある。
【００１７】
工程ａ）において決定されるＩＬ１ｒａのレベルが１２０００ｐｇｍｌ−１よりも低い場合、対象は腎機能不全を発症すると予測される。工程ａ）において決定されるＴＮＦｓｒ２のレベルが１１５００ｐｇｍｌ−１よりも低い場合、対象は腎機能不全を発症すると予測される。
【００１８】
物理的外傷、低血圧、敗血症および／または敗血症ショック症候群によって誘導される腎機能不全は、これらの事象後に誘導された炎症誘発応答によってさらに特徴付けられ得る。このような炎症応答は、一般に、古典的な全身性炎症応答（ＳＩＲＳ）のパターンを辿る。したがって、本発明に従って予後診断される腎機能不全は、急性（恐らく一過性）の尿中炎症誘発応答（例えば、ＩＬ−１８および／または好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の尿中レベルの上昇）によって誘導されるものであり得る。
【００１９】
予後診断される腎機能不全は、初期腎機能不全、後期腎機能不全、または一般的腎機能不全であり得る。初期腎機能不全は、腎機能不全を誘導する事象の２日以内に起こる。後期腎機能不全は、このような事象の５日後以降に起こる。腎機能不全は、正常糸球体濾過率からの２５％以上の低下として規定され得る。正常糸球体濾過率は、事象前率である。糸球体濾過率は、ＭＤＲＤ研究群式に従って確立され得る。腎機能不全のこのような急性形態は、自己免疫状態と同時に長期に亘り臨床的に明らかである状態である、自己免疫媒介型慢性腎機能不全（すなわち、数日後に起こる腎機能不全の発症を予測するための生物学的マーカーの必要性がない、何故なら、この腎機能不全は既に十分に確立されているからである）とは区別され得る。
【００２０】
対象から採取したサンプルは、その中の抗炎症性サイトカインのレベルについて分析され得る任意のサンプルであり得る。例えば、このサンプルは、尿サンプル、血液サンプルまたは血漿サンプルであり得る。尿サンプルが、特に好ましい。
【００２１】
工程ａ）において分析されるサンプルは、事象（すなわち、物理的外傷、低血圧事象、敗血症の発症および／または敗血症ショック症候群の発症）の２４時間以内に対象から得られ得る。このサンプルは、最適には、事象の１２〜２４時間以内に得られる。
【００２２】
工程ａ）の前に、対象からサンプルを得る工程が先行し得る。
【００２３】
本発明における腎機能不全の対象における発症の予測は、挙げられた事象後のサンプル中に存在する抗炎症性サイトカインのレベルの決定に基づく。結果として、挙げられた事象後のサンプル中に存在する抗炎症性サイトカインのレベルは、本発明に従って予測するために決定される必要がある唯一のサイトカインレベルであり得ることは明らかである。したがって、本発明の方法は、本発明に従って予測するために、挙げられた事象前のサンプル中に存在する抗炎症性サイトカインのレベルを決定することを必要としないことも明らかである。
【００２４】
物理的外傷は、身体に加えられた外部の力からの身体への衝撃、例えば：外科手術によって、または身体への打撃または切り傷によって生じた病変（例えば、自動車事故の間に経験し得るもの）；または血液が人工心肺バイパスの外来性の表面と相互作用する際の血液における衝撃によって生じた病変である。物理的外傷によって誘導される腎機能不全は、手術後腎機能不全であり得る。手術後腎機能不全は、心臓、心血管または心肺手術の後であり得る。
【００２５】
個体が低血圧を有するか否かは、臨床的問題であり、したがって、十分に当業者の技術範囲内である。しかし、疑いを避けるために、成人における低血圧は、８０ｍｍＨｇ未満の収縮期血圧、または５０ｍｍＨｇ未満の平均動脈圧（ＭＡＰ）として規定され得る。低血圧は、例えば、２時間以上にわたって持続し得る。
【００２６】
個体が敗血症を有するか否かは、臨床的問題であり、したがって、十分に当業者の技術範囲内である。しかし、疑いを避けるために、敗血症は、感染が大いに疑われるかまたは証明される場合、および２以上の以下の全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）基準が適合する場合に存在すると考えられ得る：
１．１分間に９０回を超える心拍数（瀕脈）；
２．３６℃（華氏９７度）未満または３８℃（華氏１００度）を超える体温（低体温または発熱）；
３．１分間あたり２０回を超える呼吸速度、または血液ガスにおいて、３２ｍｍＨｇ（４．３ｋＰａ）未満のＰａＣＯ２（瀕呼吸または呼吸過多による低炭酸ガス血症）；および
４．４，０００細胞／ｍｍ３未満または１２，０００細胞／ｍｍ３（４×１０９細胞／Ｌ未満または１２×１０９細胞／Ｌを超える）を超える白血球数、または１０％を超えるバンドフォーム。
【００２７】
個体が敗血症ショックを有するか否かは、臨床的問題であり、したがって、十分に当業者の能力範囲内である。しかし、疑いを避けるために、敗血症ショックは、以下の２つの基準の存在によって規定され得る：
１．感染の証拠、陽性の血液培養を通して；および
２．治療抵抗性低血圧−適切な輸液蘇生および血液拍出量にも拘らない低血圧。成人において、必要とされる蘇生変力支持の開始前の９０ｍｍＨｇ未満の収縮期血圧または６０ｍｍＨｇ未満のＭＡＰ、または収縮期血圧の基線からの４０ｍｍＨｇの低下として規定される。小児においては、正常血圧のＢＰ＜２ＳＤである。
【００２８】
個体がＳＩＲＳを有するか否かは、臨床的問題であり、したがって、十分に当業者の能力範囲内である。しかし、疑いを避けるために、ＳＩＲＳは、以下の２以上が存在する場合に診断され得る：
１．１分間あたり９０回を超える心拍数
２．３６℃未満または３８℃を超える体温
３．１分間あたり２０回を超える瀕呼吸（高呼吸速度）、または血液ガスにおいて、４．３ｋＰａ（３２ｍｍＨｇ）未満のＰａＣＯ２
４．４０００細胞／ｍｍ３未満または１２０００細胞／ｍｍ３（４×１０９細胞／Ｌ未満または１２×１０９細胞／Ｌを超える）を超える白血球数、または１０％を超える未熟好中球の存在。
【００２９】
抗炎症性サイトカインは、体内で炎症性応答を抑制でき、サンプル（例えば、尿）中に検出され得る、任意のサイトカインであり得る。抗炎症性サイトカインは、腎臓組織中で局所的に放出されるものであり得る。抗炎症性サイトカインは、ＴＮＦｓｒ１であっても、ＴＮＦｓｒ２であっても、またはＩＬ−１ｒａであってもよい。
【００３０】
本方法は、２種以上の抗炎症性サイトカインのレベルの分析を含み得る。例えば、本発明に従う方法は、
ａ’）物理的外傷後、低血圧事象後、敗血症後および／または敗血症ショック症候群後に、対象から採取したサンプル中に存在する１種または複数のさらなる抗炎症性サイトカインのレベルを決定する工程；
ｂ’）工程ａ）およびａ’’）において決定される抗炎症性サイトカインのレベルに基づき、腎機能不全を発症する対象における発症を予測する工程
をさらに含み得る。
【００３１】
対象が腎機能不全を発症するリスクは、（ｉ）工程（ａ）によって決定される抗炎症性サイトカインのレベルが正常レベルより低い場合、および（ｉｉ）工程（ａ’）によって決定される抗炎症性サイトカインのレベルの両方が正常レベルより低い場合に、より高い。
【００３２】
上述の抗炎症性サイトカインの任意の組み合わせが、このような方法において使用され得る。例えば、工程ａ）において決定される抗炎症性サイトカインは、ＩＬ−１ｒａであってもよく、そして工程ａ’）において決定される１種または複数の抗炎症性サイトカインは、ＴＮＦｓｒ２であってもよい。
【００３３】
切迫した腎機能不全の炎症誘発性マーカーは、同定されている；炎症誘発性メディエータであるＮＧＡＬおよびＩＬ−１８（Ｍｉｓｈｒａら、Ｌａｎｃｅｔ、２００５；３６５：１２３１〜３８）である。小児の尿におけるこれらの物質の上昇は、数日後に腎機能不全を発症するリスクの増大と関連付けられている。しかし、本発明者らによって提唱される仮説に基づくと、個体が上昇した炎症誘発応答のみを有することを確立することは、腎機能不全を発症するリスクを確立するために十分ではない可能性がある。
【００３４】
本方法は、１種（または２種以上の）抗炎症性サイトカインおよび１種または複数の炎症誘発性メディエータのレベルの、事象後分析を含み得る。
【００３５】
炎症誘発性メディエータは、腎機能不全の発症に関与し、尿中で検出され得る、体内で炎症応答を誘導可能な任意のメディエータであり得る。炎症誘発性メディエータは、ＩＬ−１８および／またはＮＧＡＬであってもよい。
【００３６】
本発明のさらなる態様において、上述の請求項の方法における使用のためのキットが提供され、ここで、このキットは、以下を含む：
（ａ）１種または複数の抗炎症性サイトカインの量の検出のための１種または複数の試薬；
（ｂ）１種または複数の抗炎症性サイトカインを検出するための１種または複数の試薬を使用するための指示書。
【００３７】
このキットは、１種または複数の炎症誘発性メディエータの検出のための１種または複数の試薬、および１種または複数の炎症誘発性メディエータを検出するための１種または複数の試薬を使用するための指示書を、さらに含み得る。
【００３８】
このキットは、腎機能不全についての予後診断に到達するために、１種または複数の抗炎症性サイトカインの検出を使用するための指示書をさらに含み得る。この指示書は、本発明の第１の態様において提供される腎機能不全の予後診断についての工程に従い得る。このキットは、腎機能不全についての予後診断に到達するために、１種または複数の炎症誘発性メディエータの検出を使用するための指示書を、さらに含み得る。この指示書および試薬は、本発明の第１の態様に従って、上述された方法を実施するために使用され得るものであるので、文脈が許す場合、本発明の第１の態様の全ての特徴が、本発明の第２の態様に含まれ得る。したがって、例えば、本発明の第１の態様において述べられた抗炎症性サイトカイン（またはその組み合わせ）および炎症誘発性メディエータは、本発明の第２の態様において上で挙げられたものであり得る。
【００３９】
本発明の第３の態様において、物理的外傷、低血圧、敗血症および／または敗血症ショック症候群によって誘導される腎機能不全を処置する方法であって、（ｉ）本発明の第１の態様の方法のいずれかに従って腎機能不全を予後診断する工程；および（ｉｉ）対象が、腎機能不全を発症するリスクが高いと同定される場合、差し迫った腎機能不全を処置するかまたは防ぐために、治療的手段を適用する工程、を含む方法が提供される。現行の治療的介入をしのぐこのような方法の利点は、治療が、完全な腎不全が予防され得る段階にて投与され得ることである。工程（ｉｉ）において適用される治療的手段は：正常値を超える血圧を維持すること；適切な組織酸素送達を確実にすること；ステロイドの投与；腎代替療法；透析；またはこれらの任意の組み合わせであり得る。本発明のさらなる利点は、集中治療管理者が、集中治療室の滞在の初期に、他の様式で予測されるよりも長く集中治療室で過ごす可能性が高い患者を同定することができ、職員の配置のより早い計画を提供することである。
【００４０】
本発明の態様のそれぞれについて任意選択の特徴が提供されるいくつかのリストが、上で提示される。リストの各メンバーは、本発明の潜在的な特徴として個々に企図される。
【００４１】
本発明は、ここで、例として添付の図面を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、術後の尿中ＴＮＦｓｒ２についての受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を示し、これは、手術後５日目にて手術前値から２５％を超えて低下するＭＤＲＤ  ｅＧＦＲによって規定される、腎機能不全を有する患者および有さない患者を識別するための感受性および特異度を示す。
【図２】図２は、術後の尿中ＩＬ１ｒａについての受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を示し、これは、手術後５日目にて手術前値から２５％を超えて低下するＭＤＲＤ  ｅＧＦＲによって規定される、腎機能不全を有する患者および有さない患者を識別するための感受性および特異度を示す。
【図３】図３は、以下で議論される研究の各日における、正常腎機能（ＮＦ）を有した患者、もしくはこの日の基線から２５％を超えるＭＤＲＤの低下によって規定される腎機能不全（ＲＤ）を有した患者、または腎機能データが分からなかった患者（ＮＫ）についての数を実証する表を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
実験方法
待機的心臓手術を受けている４０８人の継続的な患者を研究した。患者らを、北アイルランドにおけるＲｏｙａｌ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｂｅｌｆａｓｔ（ｎ＝３０４）および英国、ケンブリッジにおけるＰａｐｗｏｒｔｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ＮＨＳ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｔｒｕｓｔ（ｎ＝１０４）の心臓手術ユニット内に集めた。地元の倫理委員会の承認を受け、そして書面で患者のインフォームドコンセントを得た。排除基準は、術前透析依存腎不全、顕著な腎疾患（ｅＧＦＲ＜４０ｍｌ／分）または糖尿病を含んだ。術前アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター治療中の患者を、この研究から排除しなかった。両センターにおける麻酔技術は、プロポフォールおよびフェンタニルの使用に基づいた。多くの患者において、麻酔剤補助剤としてまたは血圧を制御するために、イソフルランを使用した。パンクロニウムを、筋肉弛緩を与えるために使用した。術後無痛覚症は、モルヒネ注入に依った。
【００４４】
４０８人の待機的心臓手術患者において、術後２４時間の尿中ＩＬ１ｒａおよびＴＮＦｓｒ２を測定した。術後尿中応答を、推定糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）基線からの２５％を超える低下（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｅｔ  ｉｎ  Ｒｅｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ（ＭＤＲＤ）の方法によって計算した場合）と規定される腎機能不全の有無（（１）術後最初の２４時間以内および（２）４８時間以内に起こるか（初期腎機能不全）、（３）術後５日目に起こるか（後期腎機能不全）、または（４）術後５日間の間の任意の時点で起こる（初期と後期との併発））に従ってグループ分けした患者において、各サイトカインについて比較した。
【００４５】
サイトカイン分析（ＥＬＩＳＡ）
サイトカインを、Ｒ＆ＤシステムズのＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ固相ＥＬＩＳＡ技術によって測定する。このシステムは、結合体、標準液、アッセイ希釈液、キャリブレーター希釈液、洗浄緩衝液濃縮物、着色試薬Ａ、着色試薬Ｂ、および停止液から成る。試薬は、アッセイを開始する前には室温でなければならない。マイクロプレートは、９６ウェルから成る。このマイクロプレートは、捕捉抗体によってコーティングされる。各ウェルに対し、アッセイ希釈液を添加する。二連の標準液およびサンプルをプレートに添加し、そして２時間室温にてインキュベートする。サンプル中に存在する何らかの分析物を、捕捉抗体（固定した抗体）によって結合する。インキュベーション後、このプレートを吸引し、そして４回、供給した洗浄緩衝液にて洗浄して何らかの未結合物質を洗い流す。洗浄後、西洋ワサビプロテアーゼ（ＨＲＰ）標識した検出抗体（結合体）をプレートに添加し、さらに室温でインキュベートする。再び、インキュベーション後、プレートを吸引し、そして４回洗浄する。何らかの未結合検出抗体を洗い流す。次の工程において、調製した基質溶液テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をウェルに添加し、そしてサンプル中に存在する分析物の量に比例して青色を発色させる。２０分のインキュベーション後、色（青）は、サイトカイン濃度に比例して発色する。分析のために、発色を止め、ウェル中の色を黄色にする。４５０ｎｍで色の吸光度を測定し、マイクロプレートリーダーで読み取る。
【００４６】
尿中ＩＬ−１ｒａおよびＴＮＦｓｒ２の測定のための尿サンプルを、心肺バイパスまたは血行再建の中止の２４時間後に得た。
【００４７】
腎機能不全の測定
１９８９年に、Ｋｏｐｐｌｅらは、Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｅｔ  ｉｎ  Ｒｅｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ研究群の一部として、９５人の患者における慢性腎不全症における栄養状態の影響を調査した彼らの知見を公表した。腎疾患の進行における、穏やかな食餌タンパク質制限のみの対照食餌の影響を、異なる程度のタンパク質制限および減らしたリン摂取の３つの研究食餌と比較した。著者らは、栄養失調およびより低いエネルギー摂取がより低いＧＦＲレベルを有する患者を特徴付けることを見出した。いくらかの性差があり、男性は、特に実験食餌の始めに、ＧＦＲと腕筋肉面積および標準体重百分率との間に相関性を示した。女性においては、ＧＦＲは、食餌エネルギー摂取と相関した（Ｋｏｐｐｌｅら、Ｋｉｄｎｅｙ  ｌｎｔ  Ｓｕｐｐｌ  １９８９；２７）。ＭＤＲＤ群からのこの研究の論理展開は、血清クレアチニンと共に、患者の年齢、体重、性および人種の分析は、ＧＦＲの推定を可能にするという考え方であった。この仮説は、血清クレアチニン濃度のみでは、腎機能を適切に反映せず、Ｋｏｐｐｌｅの研究において腎機能に影響すると同定された要因と共に考慮しなければならないことを認めた。
【００４８】
予測等式を開発するために、１６２８人の患者を、基線段階に含め、その１０７０人を、トレーニングサンプルとして無作為に選択し、他方で、残りの５５８人の患者は、評価サンプルを構成した。次いで、著者らは、トレーニングサンプルに対しステップワイズ回帰を用いて等式を開発し、この等式を、次いで、試験してＣｏｃｋｃｒｏｆｔおよびＧａｕｌｔ式、ならびに評価サンプルのクレアチニンクリアランス測定値と比較した。
【００４９】
いくつかの測定された変数が、低ＧＦＲと関連したことが見出された。これらは、高い血清クレアチニンレベル濃度、高い血清尿素レベル濃度および低い血清アルブミンレベル濃度を含んだ。低ＧＦＲに関連する独立した変数は、高齢の群、女性および非黒人種を含んだ（全ての要因についてＰ＜０．００１）。
【００５０】
複数の回帰モデルは、評価サンプルにおけるＧＦＲの対数において９０．３％の分散を明らかにした。測定したクレアチニンクリアランスは、ＧＦＲを１９％過剰評価し、Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔ−Ｇａｕｌｔ式によって予測されたクレアチニンクリアランスは、ＧＦＲを１６％過剰評価した。この過剰評価についての調整後、測定されたクレアチニンクリアランスまたはＣｏｃｋｃｒｏｆｔ−Ｇａｕｌｔ式によって予測されたＧＦＲの対数の分散の百分率は、それぞれ８６．６％および８４．２％であった。
【００５１】
ＭＤＲＤ研究群推定ＧＦＲを、以下の式から計算する：
Ｘ＝３２７８８×クレアチニン−１．１５４×年齢−０．２０３×定数、ここで、この定数は、白人男性について１、女性について０．７２４、およびアフリカ系米国人について１．２１である。
【００５２】
本研究におけるＭＤＲＤ推定ＧＦＲを、上記の式から計算した。上記の式に従い、ＭＤＲＤ  ＧＦＲを、術前０日目および術後１、２および５日目に計算した。各別々の術後日について、ならびに全ての術後日について、患者を正常および異常な腎機能群に分類し得る。ここで、「正常」および「異常」は、それぞれの基線の２５％未満またはこれを超えるＭＤＲＤ  ＧＦＲに持続的に当てはまる者として規定した。
【００５３】
次いでまとめにおいて、正常および異常が以下に述べられる４つの定義に従って規定された正常群と異常群との間で、術後について、サイトカイン値を比較した。
【００５４】
定義１：「異常」を、１日目に基線から２５％を超えて低下したＭＤＲＤを有すると定義する（初期腎機能不全）。
定義２：「異常」を、２日目に基線から２５％を超えて低下したＭＤＲＤを有すると定義する（初期腎機能不全）。
定義３：「異常」を、５日目に基線から２５％を超えて低下したＭＤＲＤを有すると定義する（後期腎機能不全）。
定義４：「異常」を、１、２および５日目の間に、基線から２５％を超えて低下したＭＤＲＤ値を少なくとも１つ有すると定義する（一般的腎機能不全）。
【００５５】
統計学的方法
定量的変数を、非常に歪んだ分散を有したもの（これらについては、中央値および四分位数範囲を用いた）を除き、平均値および標準偏差としてまとめた。群の間の比較を、独立のサンプル、定量的変数についてｚ検定またマンホイットニーのＵ検定、および分類別変数についてχ自乗検定またはフィッシャー直接検定を用いて得た。サイトカイン測定の、術後期間に腎機能不全を有する患者および有さない患者を識別する能力を、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて試験した。この曲線下の面積は、識別能力の尺度を提供する；１の値は完全な識別を示し、他方で、０．５の値は、偶然予測されるのと何ら変わらない識別能力を示す。
【００５６】
結果
１．腎機能不全の患者の数およびその特徴
術後１、２および５日目に腎機能不全を発症した患者の数を、図３に図示する。表１は、術後５日の間の任意の時点で基線ｅＧＦＲから２５％を超える低下によって規定された腎機能不全の有無に従って分類された患者の特徴を示す。腎機能不全は、体重増の男性または術中ドパミン注入を受けていない患者においてより起こり易かった（表１）。出血／心タンポナーデのための術後再胸骨切開または術後アドレナリン注入の必要性を、腎機能不全と関連づけた。腎機能不全の発症は、集中治療／高度治療室における滞在の期間を有意に延長した（表１）。
【００５７】
【表１】
0006279561.tif 000002
* P<0.05 ** P<0.01; # 362人の患者中CPBにある者; † 359人の患者中クロスクランプのある者; ‡中央値(四分位数範囲)
【００５８】
表１．表は、術後期間の任意の時点で基線ｅＧＦＲから２５％を超える低下によって規定された腎機能不全を有する患者および有さない患者の術前および周術期特徴を示す（平均＋／−ＳＤまたはｎ（％））。この表中で使用された略語：標準偏差（ＳＤ）；新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）；濃厚赤血球（ＰＲＢＣ）；動脈内バルーンポンプ（ＩＡＢＰ）；心臓手術集中治療室（ＣＳＩＣＵ）；心肺バイパス（ＣＰＢ）；アンギオテンシン変換酵素インヒビター（ＡＣＥＩ）；アンギオテンシン−２（ＡＧ−ＩＩ）。
【００５９】
２．サイトカイン結果
サイトカイン結果を、表２に図示する。後期（５日目）腎機能不全を発症した患者には、有意に低い術後２４時間尿中ＩＬ１ｒａおよびＴＮＦｓｒ２レベルがあった（表２）。５日目（後期）腎機能不全を予測する際の正常術後尿中ＩＬ１ｒａおよびＴＮＦｓｒ２よりも低い相対値は、図１および２において示される関連する受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線において実証される。
【００６０】
３．考察
この研究の主な知見は：
術後５日目に患者が腎機能不全を有する患者および有さない患者に分類される場合、異常な腎機能群は、正常腎機能群よりも有意に低い２４時間尿中ＩＬ１ｒａおよびＴＮＦｓｒ２を有した。
【００６１】
【表２】
0006279561.tif 000003
【００６２】
【表３】
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【００６３】
【表４】
0006279561.tif 000005
【００６４】
【表５】
0006279561.tif 000006
【００６５】
表２：術後任意の時点（任意のＭＤＲＤ＞２５％低下）、ならびに術後１日目（ＭＤＲＤ  Ｄ１＞２５％低下）、術後２日目（ＭＤＲＤ  Ｄ２＞２５％低下）、および術後５日目（ＭＤＲＤ  Ｄ５＞２５％低下）における術前基線からのＭＤＲＤ推定での２５％のｅＧＦＲ百分率低下に従って分類された、患者における術後２４時間尿サイトカイン濃度（中央値および四分位数範囲）ＩＱＲ）を示す表（＊  Ｐ＜０．０５）。
【図１】
0006279561.tif 000007
【図２】
0006279561.tif 000008
【図３】
0006279561.tif 000009