(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）で示されるエラスチン産生作用を呈するケルセチン誘導体。
【化１】
0006436337.tif 000004
【請求項２】
シソの新芽由来のカルス培養物をプロテアーゼ処理する工程からなるエラスチン産生作用を呈する請求項１記載の式（１）で示されるケルセチン誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明はエラスチン産生作用を呈するケルセチン誘導体及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
エラスチンは細胞間隙を構成する大切なタンパク質である。皮膚においては皮膚の弾力を増す働きがあり、毛髪においては弾力性を与えている。
【０００３】
エラスチンは皮膚の角質層において角質バリアを構成し、皮膚を細菌感染から保護している。炎症を制御する働きがある機能性タンパク質である。しかし、加齢とともにエラスチン含量は低下し、加齢に伴う皮膚の弾力の低下やシワの原因となる。
【０００４】
皮膚のエラスチンを維持させる発明としてエラスターゼの活性阻害剤および化粧品の発明があるものの具体的な物質の同定には至っておらず、産業への利用は限定される（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
また、エラスチン産生に関する発明として例えば、皮膚外用剤に関する発明があるものの（例えば、特許文献２参照。）、その応用は限られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４２２２９７３号
【特許文献２】特許第３８８６１１７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
既存の物質によるエラスチン産生作用は軽度であり、産業上への利用が限定されるという課題があり、また、化学合成された物質では安全性に問題があり、利用が限られている。
【０００８】
そこで、副作用が弱く優れたエラスチン産生作用を呈する天然物及びそれを効率良く製造する製造方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明は下記の式（１）で示されるエラスチン産生作用を有するケルセチン誘導体に関するものである。
【００１０】
【化１】
0006436337.tif 000002
【００１１】
上記の目的を達成するために、請求項２に記載の発明はエラスチン産生作用を有する請求項１記載の式（１）で示されるケルセチン誘導体の製造方法に関するものである。
【発明の効果】
【００１２】
この発明は、以上のように構成されているため、次のような効果を奏する。
【００１３】
請求項１に記載のケルセチン誘導体はエラスチン産生作用に優れている。
【００１４】
請求項２に記載の製造方法によれば、効率良くケルセチン誘導体を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、この発明を具体化した実施形態について詳細に説明する。
【００１６】
エラスチン産生作用を呈するケルセチン誘導体とは、下記の式（１）で示される構造からなるものである。
【００１７】
【化２】
0006436337.tif 000003
【００１８】
前記の式（１）のようにケルセチンの１分子にチロシン１分子とグアニン１分子が結合している。
【００１９】
ケルセチンはポリフェノールの一種であり、ＩＵＰＡＣ名は、２−(３，４−ジヒドロキシフェニル)−３，５，７−トリヒドロキシ−４Ｈ−クロメン−４−オンである。
【００２０】
炭素１５個、水素１０個及び酸素７個より形成され、分子量は３０２．２４である。
【００２１】
ケルセチンはそば、かい花、クランベリー、シソ、葡萄、桂皮、ブルーベリー、アサイーなどの植物に含有されている。ケルセチンは抗酸化作用に優れており、遺伝子にも作用が確認されている。
【００２２】
このケルセチン誘導体はケルセチンの１分子にＬ−チロシンの１分子とグアニンの１分子が結合している。
【００２３】
さらに、ケルセチンの７位の水酸基とチロシンのカルボキシル基がエステル結合して、誘導体を形成している。さらに、ケルセチンのベンゼン核の４位にグアニンの９位の窒素が結合している。結合の窒素とベンゼン環との結合である。
【００２４】
すなわち、このケルセチン誘導体は核酸塩基を含有する有機化合物である。これらの物質は全て天然由来であり、その安全性は確認されている。
【００２５】
さらに、このケルセチン誘導体の過剰量と人が接触した場合、または飲んだ場合には、体内のエステラーゼなどの酵素により分解されて、ケルセチンとチロシンとグアニンに分解されることから安全性が高い。
【００２６】
このケルセチン誘導体は土壌においては微生物により分解されやすく、環境に対する負担もなく、蓄積性もないことから好ましい。
【００２７】
このケルセチン誘導体は細胞膜を通過し、さらに、核膜を通過して遺伝子に働くことから、その作用が直接的で効率的であることから好ましい。
【００２８】
このケルセチン誘導体はエラスチン生成酵素の遺伝子を活性化し、増幅させることからエラスチン生成酵素が誘導され、エラスチン産生が増加する。
【００２９】
このケルセチン誘導体は皮膚細胞に働き、エラスチンの分解を抑制することから、エラスチンが維持されることから好ましい。
【００３０】
さらに、このケルセチン誘導体は皮膚の上皮細胞の増殖を活性化する。このケルセチン誘導体による皮膚細胞の増殖は遺伝子レベルでの刺激作用による。
【００３１】
このケルセチン誘導体は皮膚細胞のターンオーバーを活性化し、皮膚細胞の増殖をもたらすことから好ましい。
【００３２】
得られたケルセチン誘導体を医薬品素材として利用する場合、目的とするケルセチン誘導体を分離精製することは、目的とするケルセチン誘導体の純度が高まり、不純物を除去できる点から好ましい。
【００３３】
医薬品として、注射剤または経口剤または塗布剤などの非経口剤として利用され、医薬部外品としては、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、石鹸、塗布剤、ゲル剤、歯磨き粉等に配合されて利用される。
【００３４】
経口剤としては、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、ドリンク剤等が挙げられる。前記の錠剤及びカプセル剤に混和される場合には、結合剤、賦形剤、膨化剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤等とともに用いることができる。前記の錠剤は、シェラックまたは砂糖で被覆することもできる。
【００３５】
また、前記のカプセル剤の場合には、上記の材料にさらに油脂等の液体担体を含有させることができる。前記のシロップ剤及びドリンク剤の場合には、甘味剤、防腐剤、色素香味剤等を添加することができる。
【００３６】
非経口剤としては、軟膏剤、クリーム剤、水剤等の外用剤の他に、注射剤が挙げられる。外用剤の基材としては、ワセリン、パラフィン、油脂類、ラノリン、マクロゴールド等が用いられ、通常の方法によって軟膏剤やクリーム剤等とすることができる。
【００３７】
注射剤には、液剤があり、その他、凍結乾燥剤がある。これは使用時、注射用蒸留水や生理食塩液等に無菌的に溶解して用いられる。
【００３８】
食品製剤としてエラスチン産生と美容を目的とした健康食品、美容食品などに利用される。また、保健機能食品として、栄養機能食品や特定保健用食品に利用することは好ましい。
【００３９】
得られた食品製剤をイヌやネコなどのペットや家畜動物に利用する場合、エラスチンの産生と皮膚の健康を維持する目的として飼料やサプリメントとして利用される。
【００４０】
化粧料として常法に従って界面活性化剤、溶剤、増粘剤、賦形剤等とともに用いることができる。例えば、クリーム、毛髪用ジェル、洗顔剤、美容液、化粧水等の形態とすることができる。
【００４１】
化粧料の形態は任意であり、溶液状、クリーム状、ペースト状、ゲル状、ジェル状、固形状または粉末状として用いることができる。
【００４２】
得られた化粧料はエラスチン産生により、シワの改善やタルミの防御、アトピー性皮膚炎の皮膚バリア形成に利用される。
【００４３】
次に、シソの新芽由来のカルス培養物をプロテアーゼ処理する工程からなるエラスチン産生作用を呈する式（１）で示されるケルセチン誘導体の製造方法について説明する。
【００４４】
ここでいうケルセチン誘導体とはケルセチン１分子とチロシン１分子とグアニン１分子から、前述の式（１）で示される誘導体である。このケルセチン誘導体は生体内で酵素により分解されて排泄されるため安全性が高い。
【００４５】
このケルセチン誘導体のケルセチンは天然に存在し、食経験も豊富であり、安全性が認められていることから好ましい。
【００４６】
この誘導体は皮膚細胞の遺伝子に直接作用し、エラスチン産生作用を発揮する。
【００４７】
この製造方法とはシソの新芽由来のカルス培養物をプロテアーゼ処理する工程からなる。
【００４８】
原料となる物質はシソの新芽のカルス培養物とプロテアーゼである。
【００４９】
シソとは学名Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓであり、シソ科シソ属の植物であり、種子を介して増殖する。シソには紫シソ、青シソ、緑シソが存在しているが、この場合、いずれのシソも用いることができる。
【００５０】
シソの種子は、サカタのタネなどにより市販されており、品質の安定した種子を利用することは好ましい。
【００５１】
シソは清浄な水分を含んだシートの上で発芽される。発芽２〜５日の新芽が用いられる。この時期は、種子の栄養素が新芽に移行し、成長因子が豊富であることから好ましい。
【００５２】
発芽した新芽はブドウ糖を添加した寒天培地の上でカルス培養される。カルス培養は新芽の生長を促進し、種々の酵素を誘導して遺伝子的にも活性化されることから好ましい。
【００５３】
カルス培養は、３０〜４０℃の恒温下で実施される。カルス培養の期間は、７日〜２０日が好ましい。
【００５４】
カルス培養されたシソの新芽は、洗浄され、清浄な精製水により分散される。
【００５５】
このシソの新芽にはケルセチンが含有されていることからこの誘導体の原料として好ましい。
【００５６】
３マイクロメーター以下の粒子サイズの粉末が発酵の工程を実施しやすくすることから好ましい。
【００５７】
プロテアーゼはタンパク質を分解し、ペプチドやアミノ酸を生成する加水分解の酵素であり、食用としても利用されている。アマノ製薬のプロテアーゼＮは酵素活性が高いことから好ましい。
【００５８】
前記の発酵物にプロテアーゼを添加して加温することによりケルセチンとタンパク質が分解され、ペプチド型のケルセチン誘導体になる。
【００５９】
カルス培養物の１重量に対してプロテアーゼの添加量は０．００２〜０．０６重量が好ましい。加温温度は３３〜４５℃が好ましい。加温時間は１時間から８時間が好ましい。
【００６０】
前記のプロテアーゼ処理した分解物は含水エタノールで抽出されることは、生成物を効率良く回収でき、プロテアーゼを失活でき、次の工程が実施しやすいことから、好ましい。
【００６１】
また、得られた発酵物を超音波処理することは、生成物が分離しやすいことから、好ましい。また、凍結乾燥などにより、濃縮することは、以下の工程が短時間に実施できることから好ましい。
【００６２】
前記の還元反応物から、目的とするケルセチン誘導体を分離し、精製することは純度の高い物質として摂取量を減少させることができる点から好ましい。この精製の方法としては、分離用の樹脂などの精製操作を利用することが好ましい。
【００６３】
例えば、分離用担体または樹脂により分離され、分取されることにより目的とするケルセチン誘導体が得られる。分離用担体または樹脂としては、表面が後述のようにコーティングされた、多孔性の多糖類、酸化珪素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン−ビニルベンゼン共重合体等が用いられる。０．１〜３００μｍの粒度を有するものが好ましく、粒度が細かい程、精度の高い分離が行なわれるが、分離時間が長い欠点がある。
【００６４】
例えば、逆相担体または樹脂として表面が疎水性化合物でコーティングされたものは、疎水性の高い物質の分離に利用される。陽イオン物質でコーティングされたものは陰イオン性に荷電した物質の分離に適している。また、陰イオン物質でコーティングされたものは陽イオン性に荷電した物質の分離に適している。特異的な抗体をコーティングした場合には、特異的な物質のみを分離するアフィニティ担体または樹脂として利用される。
【００６５】
アフィニティ担体または樹脂は、抗原抗体反応を利用して抗原の特異的な調製に利用される。分配性担体または樹脂は、シリカゲル（メルク社製）等のように、物質と分離用溶媒の間の分配係数に差異がある場合、それらの物質の単離に利用される。
【００６６】
これらのうち、製造コストを低減することができる点から、吸着性担体または樹脂、分配性担体または樹脂、分子篩用担体または樹脂及びイオン交換担体または樹脂が好ましい。さらに、分離用溶媒に対して分配係数の差異が大きい点から、逆相担体または樹脂及び分配性担体または樹脂はより好ましい。
【００６７】
分離用溶媒として有機溶媒を用いる場合には、有機溶媒に耐性を有する担体または樹脂が用いられる。また、医薬品製造または食品製造に利用される担体または樹脂は好ましい。
【００６８】
これらの点から吸着性担体としてダイヤイオン（三菱化学（株）社製）及びＸＡＤ−２またはＸＡＤ−４（ロームアンドハース社製）、分子篩用担体としてセファデックスＬＨ−２０（アマシャムファルマシア社製）、分配用担体としてシリカゲル、イオン交換担体としてＩＲＡ−４１０（ロームアンドハース社製）、逆相担体としてＤＭ１０２０Ｔ（富士シリシア社製）がより好ましい。
【００６９】
これらのうち、ダイヤイオン、セファデックスＬＨ−２０及びＤＭ１０２０Ｔはさらに好ましい。
【００７０】
得られた抽出物は、分離前に分離用担体または樹脂を膨潤化させるための溶媒に溶解される。その量は、分離効率の点から抽出物の重量に対して１〜３５倍量が好ましく、４〜２５倍量がより好ましい。分離の温度としては物質の安定性の点から４〜３０℃が好ましく、１０〜２５℃がより好ましい。
【００７１】
分離用溶媒には、水、または、水を含有する低級アルコール、親水性溶媒、親油性溶媒が用いられる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが用いられるが、食用として利用されているエタノールが好ましい。
【００７２】
セファデックスＬＨ−２０を用いる場合、分離用溶媒には低級アルコールが好ましい。シリカゲルを用いる場合、分離用溶媒にはクロロホルム、メタノール、酢酸またはそれらの混合液が好ましい。
【００７３】
ダイヤイオン及びＤＭ１０２０Ｔを用いる場合、分離用溶媒はメタノール、エタノール等の低級アルコールまたは低級アルコールと水の混合液が好ましい。
【００７４】
ケルセチン誘導体を含む画分を採取して乾燥または真空乾燥により溶媒を除去し、目的とするケルセチン誘導体を粉末または濃縮液として得ることは溶媒による影響を除外できることから、好ましい。
【００７５】
また、最終抽出を食用油や化粧料に用いる油脂で実施することは、得られるケルセチン誘導体が安定に維持されることから好ましい。例えば、大豆油、米ぬか油、グレープシード油、オリーブ油、ホホバ油で抽出することは好ましい。
【００７６】
また、このケルセチン誘導体を粉末化することは防腐の目的から好ましい。
【００７７】
以下、前記実施形態を実施例及び試験例を用いて具体的に説明する。なお、これらは一例であり、素材、原料や検体の違いに応じて常識の範囲内で条件を変更させることが可能である。
【実施例１】
【００７８】
サカタのタネで購入した紫シソの種子を清浄な水を敷いた発芽用シートに播種した。これを恒温槽の中で３５℃、５日間、水分を補充して栽培した。
【００７９】
発芽を確認した後、発芽したシソの新芽を採取して水洗した。これを清浄なメスで裁断した。裁断されたシソの新芽はカルス培養用寒天培地の上に設置した。
【００８０】
この寒天培地を３８℃〜４０℃で７日間カルス培養した。
【００８１】
生育したカルスを採取し、清浄な精製水で洗浄した。
【００８２】
得られたカルス１ｋｇに対してアマノ製薬のプロテアーゼＮを１０ｇ添加し、４０℃で２時間加温した。
【００８３】
この処理物を加温し、エタノールを添加して目的とするケルセチン誘導体含有エキス３５５ｇを得た。
【００８４】
前述のケルセチン誘導体含有エキスの３００ｇに６％エタノール含有精製水１Ｌを添加し、ダイアイオン（両イオンタイプ、三菱化学製）３００ｇを５％エタノール液に懸濁して充填したカラムに供した。
【００８５】
これに３Ｌの５％エタノール液を添加して清浄し、さらに、５５％エタノール液を１Ｌ添加して目的とするケルセチン誘導体を溶出させ、精製した。精製されたケルセチン誘導体を減圧蒸留により、エタノール部分を除去し、水溶液とした。これをケルセチン誘導体の検体１とした。
【００８６】
以下に、ケルセチン誘導体の構造解析に関する試験方法及び結果について説明する。
（試験例１）
【００８７】
上記のように得られた検体１をエタノールに溶解し、質量分析器付き高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、島津製作所）で分析した。
【００８８】
さらに、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ、ブルカー製、ＡＣ−２５０）で解析した。構造解析の結果、検体１からケルセチンとグアニンとチロシンが検出された。また、ケルセチン１分子にチロシンが１分子結合し、さらに、グアニンが１分子結合していることが確認された。さらなる構造解析によりこのケルセチン誘導体の構造が同定された。
【００８９】
すなわち、ケルセチンの１分子の７位の水酸基とチロシンのカルボキシル基がエステル結合していた。
【００９０】
さらに、ケルセチンのベンゼン環の４位の水酸基とグアニンの９位の窒素分子が結合していた。
【００９１】
以下にヒト皮膚上皮細胞を用いた確認試験について述べる。
（試験例２）
【００９２】
倉敷紡績株式会社より購入したヒト皮膚細胞（エピダーセル）を用いた。培養液としては、５％牛胎児血清含有ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ製）を用いて培養した、１０００個の細胞を３５ｍｍ培養シャーレに播種し、５％炭酸ガス下、３７℃で培養した。これに、前記の実施例１で得られた検体１及び対照としてＥＧＦ（上皮細胞増殖因子）の０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。これを４８時間培養した。
【００９３】
細胞を剥離後、細胞数を計数した後、細胞懸濁液を調製し、細胞内のエラスチン量をＥＬＩＳＡ法（和光純薬）にて測定した。なお、シャーレは５枚を用いてその平均値を算出した。
【００９４】
その結果、検体１の０．１ｍｇ／ｍｌの添加により皮膚の上皮細胞数が対照群に比して平均値として２１０％に増加した。ＥＧＦでは１８０％の増加であり検体１の方が優れていた。
【００９５】
エラスチン量については検体１により対照群に比して３９２％に増加した。ＥＧＦでは２０３％となり、検体１による増加が著しかった。なお、細胞には障害はなく、安全性が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明で得られるケルセチン誘導体はエラスチンを増加させることにより、細胞の組織を保護し、組織を保護することから国民の健康維持に貢献する。
【００９７】
本発明で得られるケルセチン誘導体は皮膚の上皮細胞とエラスチンを改善する作用を有することから、化粧料として炎症やアトピー、肌トラブルに悩む方の改善に貢献し、化粧品業界の発展に寄与する。
【００９８】
本発明で得られるケルセチン誘導体は食品としても利用できることから、食品業界の発展に寄与する。