(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の単一ヌクレオチドがメチル化されているか否かを決定する方法であって、
（ａ）前記単一ヌクレオチドを１つ以上のハイブリダイゼーションプローブ種と接触させるステップであって、前記ハイブリダイゼーションプローブ種は、それぞれ、未使用形態において、（１）１つ以上の第１の検出可能なエレメントが実質的に検出不可能な状態で結合し、かつ、さらに、（ｉ）二本鎖領域および一本鎖領域、ならびに、（ｉｉ）エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域を含む第１のオリゴヌクレオチドであって、前記第１のオリゴヌクレオチドは、折り返されて、一本鎖ヌクレオチドのループ領域と、前記二本鎖領域と、陥凹末端とが形成され、前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域は前記第１のオリゴヌクレオチドの陥凹末端に結合し、前記１つ以上の第１の検出可能なエレメントは前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域と前記一本鎖ヌクレオチドのループ領域との間に位置する前記第１のオリゴヌクレオチドと、（２）１つ以上の第２の検出可能なエレメントが実質的に検出不可能な状態で結合し、かつ、前記第１のオリゴヌクレオチドの陥凹末端を超えて２ヌクレオチドの出発点からアラインした場合に少なくとも部分的に前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖領域とヌクレオチド配列が相補的な鎖となるようにされた第２の一本鎖オリゴヌクレオチドとを含む、ステップ；
（ｂ）関連する前記ハイブリダイゼーションプローブ種について、（ｉ）前記単一ヌクレオチドを、前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域および前記一本鎖領域に結合させ、かつ、（ｉｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドを、前記単一ヌクレオチドおよび前記一本鎖領域に結合させて、実質的に二本鎖の使用済プローブを形成するステップ；
（ｃ１）前記単一ヌクレオチドがメチル化されている場合、前記使用済みプローブが前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域に隣接して２つの二本鎖オリゴヌクレオチド生成物に切断される条件で、前記使用済みプローブをメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼで処理するステップ、または、（ｃ２）前記単一ヌクレオチドがメチル化されていない場合、前記使用済みプローブが前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域に隣接して２つの二本鎖オリゴヌクレオチド生成物に切断される条件で、前記使用済みプローブをメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで処理するステップ；および、
（ｄ１）ステップ（ｃ１）の前記生成物をエキソヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼで処理し、前記単一ヌクレオチドがメチル化されている場合、前記第１の検出可能なエレメントのみを、または、前記第１の検出可能なエレメントおよび前記第２の検出可能なエレメントの両方を検出可能な状態で遊離させるか、あるいは、前記単一ヌクレオチドがメチル化されていない場合、前記第２の検出可能なエレメントのみを遊離させるステップ、または、（ｄ２）ステップ（ｃ２）の前記生成物をエキソヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼで処理し、前記単一ヌクレオチドがメチル化されていない場合、前記第１の検出可能なエレメントのみを、または、前記第１の検出可能なエレメントおよび前記第２の検出可能なエレメントの両方を検出可能な状態で遊離させるか、あるいは、前記単一ヌクレオチドがメチル化されている場合、前記第２の検出可能なエレメントのみを遊離させるステップを含む、方法。
【請求項２】
前記第１のオリゴヌクレオチドの形状がｊ型であり、前記第２のオリゴヌクレオチドの形状がｉ型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単一ヌクレオチドが結合する部位に隣接する前記第１のオリゴヌクレオチドの陥凹末端が３’末端である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域が、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
二本鎖の使用済みの前記プローブが、一本鎖のオーバーハング領域を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
２つ以上のプローブが使用され、それぞれ、エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域のすぐ隣の一本鎖領域上のヌクレオチドが異なる種類である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
２種類の第１のオリゴヌクレオチドを含む２種類のプローブが使用され、エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域のすぐ隣の一本鎖領域上の２種類のヌクレオチドが、グアニンとシトシンのヌクレオチド塩基の対、および、アデニンとチミンまたはアデニンとウラシルのヌクレオチド塩基の対のうちの１つを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
４種類の第１のオリゴヌクレオチドを含む４種類のプローブが使用され、エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域のすぐ隣の一本鎖領域上の４種類のヌクレオチドが、（ａ）グアニン、シトシン、アデニン、および、チミンの４つのヌクレオチド塩基のうちの１つ、または、（ｂ）グアニン、シトシン、アデニン、および、ウラシルの４つのヌクレオチド塩基のうちの１つを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、それぞれ、自身に特徴的な検出可能なエレメントを含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
使用する前記第１のオリゴヌクレオチド種の少なくとも一部が、複数の第１の検出可能なエレメントを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２のオリゴヌクレオチドが、それぞれ、複数の第２の検出可能なエレメントを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
様々な前記第１の検出可能なエレメントおよび前記第２の検出可能なエレメントが、それぞれ異なる検出特性を示す異なる蛍光体または量子ドットを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出可能なエレメントが蛍光体であり、当該蛍光体が、プローブ内において、クエンチャーの存在によりまたは互いの自己消光により検出不可能とされている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記エキソヌクレアーゼが、３’→５’二本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有するが、５
’→３’エキソヌクレアーゼ活性および一本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有さない、請求
項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｄ１）またはステップ（ｄ２）で使用される前記エキソヌクレアーゼが、熱により活性化されるものである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記メチル化依存性またはメチル化感受性制限酵素が、前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域が前記第２のオリゴヌクレオチドを含む切断プローブ部分に結合したままとなるように使用済みの前記プローブを切断する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
（ｅ）ステップ（ｄ１）またはステップ（ｄ２）で遊離した前記様々な検出可能なエレメントを検出するステップを更に含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記単一ヌクレオチドが、ポリヌクレオチド検体のプログレッシブな加ピロリン酸分解またはエキソヌクレアーゼ分解に由来する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ヌクレオチド三リン酸を含む単一ヌクレオチドを含む液滴中で実施される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
液滴のストリームに適用され、前記液滴の少なくとも一部がポリヌクレオチド検体に由来する単一のヌクレオチド三リン酸を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記液滴のストリームにおける前記液滴中の前記単一のヌクレオチド三リン酸の順序は、前記検体のヌクレオチド配列に対応する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
未使用状態でエキソヌクレアーゼ分解に対して耐性がある２成分ハイブリダイゼーションプローブであって、
１つ以上の第１の検出可能なエレメントが実質的に検出不可能な状態で結合し、かつ、さらに、（ｉ）二本鎖領域および一本鎖領域、ならびに、（ｉｉ）エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域を含むｊ型の第１のオリゴヌクレオチドであって、前記ｊ型の第１のオリゴヌクレオチドは、折り返されて、一本鎖ヌクレオチドのループ領域と、前記二本鎖領域と、３’陥凹末端と、５’突出末端とが形成されており、前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域は前記ｊ型の第１のオリゴヌクレオチドの３’陥凹末端に結合し、前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域は、ホスホロチオエート結合で結合している、前記３’陥凹末端に隣接する少なくとも一部のヌクレオチドであり、前記１つ以上の第１の検出可能なエレメントは前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域と前記一本鎖ヌクレオチドのループ領域との間に位置するｊ型の第１のオリゴヌクレオチドと、
前記３’陥凹末端を超えて２ヌクレオチドの出発点からアラインした場合に、ヌクレオチド配列が前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ヌクレオチド領域と少なくとも部分的に相補的であり、かつ、前記第１のオリゴヌクレオチド上に、単一ヌクレオチドを補足することができる部位を構成する、ハイブリダイズされていない単一ヌクレオチドのキャビティを前記３’陥凹末端のすぐ隣に残すように、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ヌクレオチド領域にハイブリダイズする第２の一本鎖オリゴヌクレオチドであって、１つ以上の第２の検出可能なエレメントが実質的に検出不可能な状態で結合している第２の一本鎖オリゴヌクレオチドとを含む、２成分ハイブリダイゼーションプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチド検体由来の所定のヌクレオチドがメチル化されているか否かを決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝物質の次世代シーケンシングは、より高速なシーケンス装置の市場への登場に伴う単位当たりのシーケンスコストの低減により、一般的には生物科学、特には医学において、多大な影響を既に及ぼしている。このような装置の１つでは、二本鎖のＤＮＡ検体は最初に複数の小さなポリヌクレオチド断片に破壊されて間接的にシーケンスされる。各ポリヌクレオチド断片は、まず、一本鎖の両端がアデニル化され、その結果、一本鎖の第１のオリゴヌクレオチドが、対を形成していない当該アデニン塩基へのハイブリダイゼーションによってその相補鎖の両端と結合することができる。次いで、得られた処置断片は、サイズ選択され、第１のオリゴヌクレオチドと配列が相補的である結合した一本鎖の第２のオリゴヌクレオチドでコートされた表面上に補足される。その結果、更にハイブリダイゼーションされ、表面に結合された二本鎖断片のライブラリーを事実上作製することができる。その後のクラスター化工程では、伸長反応および等温ブリッジ反応を使用して表面上でこれらのライブラリー成分が数百万倍にクローン増幅され、未使用状態の第２のオリゴヌクレオチドが利用される。これにより、事実上、一方の鎖を介して表面に結合した高濃度のポリヌクレオチド断片が形成される。次いで、各断片の未結合相補鎖を除去すると、結合した一本鎖断片のシーケンスの準備が整う。シーケンス段階では、各一本鎖断片がプライマーとなり、ポリメラーゼ連鎖反応、および、ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）形態の４つの特徴的なＤＮＡのヌクレオチド塩基の混合物を使用した伸長によって、その相補鎖が再形成される。各ｄｄＮＴＰ種は、異なる波長で蛍光発色する異なる蛍光体で標識された部分構造により末端ブロックされている。伸長反応では３つのステップがサイクルする。すなわち、まず、関連するｄｄＮＴＰが成長鎖に結合する。次に、サンプルを照射して蛍光波長を測定し、ｄｄＮＴＰに含まれるヌクレオチド塩基を特定する。そして最後に、末端ブロックおよびそれに結合した蛍光体を除去して、次の成長を発生させる。これにより、相補鎖の配列を塩基毎に積み上げることができる。かかるアプローチは高度に自動化することができ、かつ、高精度の配列リードを発生することができるものの、動作スピードは伸長サイクルの速度により制限されることが理解されよう。そのため、実際上、本技術では、平行して比較的短いポリヌクレオチド断片を加工したり、これらから得られる様々なリードから全体配列をアセンブルする必要がある傾向がある。そのため、コンピュータ計算が複雑となることや、エラーが発生する虞がある。
【０００３】
近年、代わりとなる直接シーケンス法を開発する取り組みがなされている。例えば、出願人は先の出願（特許文献１〜３）において、ポリヌクレオチド検体をプログレッシブに加ピロリン酸分解またはエキソヌクレアーゼ分解させ、液滴ストリームの対応する液滴中に１つずつ補足可能な単一ヌクレオチドが整列したヌクレオチドストリームを発生させる新規なシーケンス法を記載している。各液滴は、その後、元来含まれていた特定の単一ヌクレオチドを明らかにするために、化学的にかつ／または酵素的に操作することができる。一実施形態において、これらの化学的および／または酵素的な操作には、１つ以上の２成分オリゴヌクレオチドプローブ種であって、それぞれが、検体を構成する単一ヌクレオチド種を選択的に補足できるようになされているものを使用する方法が含まれる。典型的には、このようなプローブ種のそれぞれにおいて、２つのオリゴヌクレオチド成分のうちの１つが特徴的な蛍光体を含み、プローブが未使用な状態では、これらの蛍光体の蛍光発色性は近接配置されたクエンチャーの存在によりまたは自己消光により失われている状態に維持されている。使用に際して、プローブが対応する単一ヌクレオチドを補足すると、制限酵素により切断されてその後エキソヌクレアーゼ分解し易くなり、そのため、クエンチャーおよび／または蛍光体同士から蛍光体が遊離され、これらを自由に蛍光発色させる。これにより、各液滴に存在する元の単一ヌクレオチドを分光手段により間接的に同定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】英国特許出願第１２１７７７２．１号明細書（国際公開第２０１４／０５３８５４号）
【特許文献２】英国特許出願第１３０６４４４．９号明細書（国際公開第２０１４／１６７３２３号）
【特許文献３】英国特許出願第１３０６４４５．６号明細書（国際公開第２０１４／１６７３２４号）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
出願人は、遺伝物質のメチル化の有無を検出し、かつ、我々の液滴技術に適用できるように設計された上記方法の変形方法を開発した。哺乳類などのＤＮＡサンプルにおいて、シトシンまたはアデニンを含む所定のヌクレオチドがメチル化されているか否かを理解することは医学では非常に重要な事項である。かかる現象は遺伝物質の転写の重要なレギュレータであることが知られているからである。例えば、基準よりも高いレベルのメチル化は、悪性腫瘍に罹患する傾向と関連付けられている。したがって、人のゲノムのメチル化度を知ることは、このような問題の早期同定や早期改善を促進すると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】メチル化ｄＣＴＰおよび非メチル化ｄＣＴＰの両方についてのステップ１〜３の結果を示すゲル電気泳動写真を示す図である。
【図２】ｄＣＴＰの存在下（破線）および非存在下（実線）でステップ１〜３から得られた生成物をポリメラーゼによりエキソヌクレアーゼ分解した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
したがって、本発明の第１の態様によれば、所定の単一ヌクレオチドがメチル化されているか否かを決定する方法であって、（ａ）前記単一ヌクレオチドを１つ以上のハイブリダイゼーションプローブ種と接触させるステップであって、前記ハイブリダイゼーションプローブ種は、それぞれ、未使用形態において、（１）１つ以上の第１の検出可能なエレメントが実質的に検出不可能な状態で結合し、かつ、さらに、（ｉ）二本鎖領域および一本鎖領域、ならびに、（ｉｉ）前記一本鎖領域に隣接する前記二本鎖領域の端部に結合した、エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域を含む第１のオリゴヌクレオチドと、（２）１つ以上の第２の検出可能なエレメントが実質的に検出不可能な状態で結合し、かつ、少なくとも部分的に前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖領域とヌクレオチド配列が相補的な鎖となるようにされた第２の一本鎖オリゴヌクレオチドとを含む、ステップ；（ｂ）関連する前記ハイブリダイゼーションプローブ種について、（ｉ）前記単一ヌクレオチドを、前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域および前記一本鎖領域に結合させ、かつ、（ｉｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドを、前記単一ヌクレオチドおよび前記一本鎖領域に結合させて、実質的に二本鎖の使用済プローブを形成するステップ；（ｃ１）前記単一ヌクレオチドがメチル化されている場合、前記使用済みプローブが前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域に隣接して切断されて２つの二本鎖オリゴヌクレオチド生成物になる条件で、前記使用済みプローブをメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼで処理するステップ、または、（ｃ２）前記単一ヌクレオチドがメチル化されていない場合、前記使用済みプローブが前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域に隣接して２つの二本鎖オリゴヌクレオチド生成物に切断される条件で、前記使用済みプローブをメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで処理するステップ；および、（ｄ１）ステップ（ｃ１）の前記生成物をエキソヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼで処理し、前記単一ヌクレオチドがメチル化されている場合、前記第１の検出可能なエレメントのみを、または、前記第１の検出可能なエレメントおよび前記第２の検出可能なエレメントの両方を検出可能な状態で遊離させるか、あるいは、前記単一ヌクレオチドがメチル化されていない場合、前記第２の検出可能なエレメントのみを遊離させるステップ、または、（ｄ２）ステップ（ｃ２）の前記生成物をエキソヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼで処理し、前記単一ヌクレオチドがメチル化されていない場合、前記第１の検出可能なエレメントのみを、または、前記第１の検出可能なエレメントおよび前記第２の検出可能なエレメントの両方を検出可能な状態で遊離させるか、あるいは、前記単一ヌクレオチドがメチル化されている場合、前記第２の検出可能なエレメントのみを遊離させるステップを含む、方法が提供される。
【０００８】
本発明の一実施形態において、測定対象の単一ヌクレオチドは、前駆体であるポリヌクレオチド検体を加ピロリン酸分解またはエキソヌクレアーゼ分解などして得られる。本実施形態および他の実施形態で使用されるこのような検体は、遺伝物質の断片、例えば、ヒトまたは他の哺乳類のＤＮＡまたはＲＮＡの断片を好適に含み得る。好適には、かかる断片は多ヌクレオチド長であり、例えば、５００、１０００、５０００よりも長く、さらには、１００００ヌクレオチドよりも長い。他の一実施形態において、加ピロリン酸分解またはエキソヌクレアーゼ分解は、検体のヌクレオチド配列に対応する単一ヌクレオチドのストリームがフローシステムで発生するようにプログレッシブに行われる。さらに他の一実施形態において、このストリームの単一ヌクレオチドは、液滴のストリームの対応する空の液滴中に、各液滴が２個以上の単一ヌクレオチドを含まないように１つずつ挿入される。好ましくは、充填された液滴のストリームにおける単一ヌクレオチドの順序は検体のヌクレオチド配列に対応しており、また本発明の方法は、単一ヌクレオチドが導入される前、後または同時に、個々の液滴に対して様々なプローブ種を挿入することにより行われる。好適には、液滴のストリームは油中水滴のストリームを含み、好ましくは、例えば上述の我々の先の出願に開示されているように、油中のマイクロ水滴である。
【０００９】
本発明のステップ（ａ）では、測定対象の単一ヌクレオチドを１つ以上のプローブ種と接触させる。使用する各プローブ種は、塩基対形成ルールの結果、異なる単一ヌクレオチド種と結合することができる。したがって、ＤＮＡの場合、Ｃ−ＧおよびＡ−Ｔのように相補的に対を作るグアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、および、チミン（Ｔ）のヌクレオチド塩基に対応する４種類の単一ヌクレオチド種が存在し；ＲＮＡの場合、グアニン、シトシン、アデニン、および、ウラシル（Ｕ）に対応する４種が存在し、ＡとＵが対を作る。一実施形態において、本発明の方法ではこれらの単一ヌクレオチド種の１つに対応する１つのプローブ種が使用され、シトシンまたはアデニンが好ましい。他の一実施形態において、上述の単一ヌクレオチド種の任意の２つの対に対応する２つのプローブ種が使用される。さらに他の一実施形態において、これらの単一ヌクレオチド種の任意のトリプレットに対応する３種類が使用される。最後に、他の一実施形態では４つプローブ種全てが使用される。
【００１０】
本発明の方法で使用されるハイブリダイゼーションプローブは、それら自体、未使用状態において、２つのオリゴヌクレオチド成分を含む。第１のオリゴヌクレオチドは、二本鎖領域および一本鎖領域を含み、かつ、１つ以上の第１の検出可能なエレメントが検出不可能な状態で結合したものである。第１のオリゴヌクレオチドの１つの好適なクラスでは、これらの二本鎖領域および一本鎖領域は、３’末端が部分的に折り返されて相補的なヌクレオチドハイブリダイゼーションによって自身と部分的に結合した一本鎖の前駆体オリゴヌクレオチドから由来したもの、または、由来可能であるとみなされるものとすることができる。構造上の外観により「ｊ型」とも称され得る、このように得られる生成物は、３’末端を超えた位置に文字「ｊ」の幹部から構成される一本鎖領域を保持する。
【００１１】
第１のオリゴヌクレオチドは、一本鎖領域に隣接する二本鎖領域の端部に結合したエキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域を含むことを更に特徴とする。上述のｊ型の第１のオリゴヌクレオチドの場合、これは３’末端に位置し、最後のヌクレオチド間、好ましくは最後の２つのヌクレオチド間の結合を当該個所において修飾し、通常のホスホジエステルの代わりにホスホロチオエートなどの耐性のある部分構造を含むようにすることにより得られる。このようなホスホロチオエート結合は２種類の異性体が存在するため、本発明の一実施形態では、より分解に耐性がある方のみを第１のオリゴヌクレオチドに使用する。
【００１２】
したがって、本発明の第２の態様によれば、未使用状態でエキソヌクレアーゼ分解に対して耐性があるハイブリダイゼーションプローブ成分であって、３’末端および５’末端、ならびに、一本鎖ヌクレオチド領域および二本鎖ヌクレオチド領域を有し、３’末端に隣接する少なくとも一部のヌクレオチド同士がホスホロチオエート結合で結合しているｊ型オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするハイブリダイゼーションプローブ成分が提供される。一実施形態において、３’末端に隣接する２つのヌクレオチドがこのように結合している。他の一実施形態において、ｊ型オリゴヌクレオチドには、蛍光体などの検出可能なエレメントと、任意で、蛍光体を検出不可能にするためのクエンチャーとが結合している。
【００１３】
第２のオリゴヌクレオチドは、一本鎖であり、かつ、１つ以上の第２の検出可能なエレメントが上記と同様に検出不可能な状態で結合したものである。この第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも部分的に第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖領域とヌクレオチド配列が相補的な鎖となるようにされており、それにより、単一ヌクレオチドを補足するプロセス中、両者はハイブリダイズして実質的に二本鎖の使用済みプローブが形成される。ｊ型の第１のオリゴヌクレオチドと共に使用する場合、第２のオリゴヌクレオチドは「ｉ型」と称されることもあり、第２のオリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖領域とは、第２のオリゴヌクレオチドの５’末端を第１のオリゴヌクレオチドの３’末端を超えて２ヌクレオチドの地点からアラインした場合に配列相補的になる。これによる正味の効果は、第１のオリゴヌクレオチド上に、ハイブリダイズされていない単一ヌクレオチドのキャビティを３’末端のすぐ隣に残し、単一ヌクレオチドを補足することができる部位を構成することと捉えられる。ヌクレオチドの塩基対が形成される結果、キャビティのこの単一の未ハイブリダイズヌクレオチドの性質がプローブの選択特性を決定することが理解されるだろう。例えば、キャビティの単一ヌクレオチドがグアニン塩基を含む場合、プローブはシトシン塩基を含む単一ヌクレオチドに対して選択的となり；チミンの場合、プローブはアデニンに対して選択的となる。
【００１４】
一実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドおよび第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖領域の長さは、独立して、最大５０ヌクレオチド、好ましくは最大４５ヌクレオチド、より好ましくは５〜４０ヌクレオチド、特に好ましくは１０〜３０ヌクレオチドである。他の一実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドは第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖領域よりも短く、その結果、ハイブリダイゼーション後、後者の５’末端は前者の３’末端を超えて伸びている。これにより生じるオーバーハングは、典型的には、２〜３ヌクレオチド長であり、例えば、最大１５ヌクレオチドである。
【００１５】
したがって、本発明の第３の態様によれば、未使用状態でエキソヌクレアーゼ分解に対して耐性がある２成分ハイブリダイゼーションプローブであって、３’末端および５’末端、ならびに、一本鎖ヌクレオチド領域および二本鎖ヌクレオチド領域を有し、前記３’末端に隣接する少なくとも一部のヌクレオチド同士がホスホロチオエート結合で結合しているｊ型の第１のオリゴヌクレオチドと、前記３’末端を超えて２ヌクレオチドの出発点からアラインした場合に、ヌクレオチド配列が第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチド領域と少なくとも部分的に相補的である第２の一本鎖オリゴヌクレオチドとを含むことを特徴とする２成分ハイブリダイゼーションプローブが提供される。
【００１６】
プローブの第１のオリゴヌクレオチド成分および第２のオリゴヌクレオチド成分にそれぞれ結合される第１の検出可能なエレメントおよび第２の検出可能なエレメントに関しては、原則的に、これらは、容易に区別できる異なる特徴的な検出特性を有する任意エレメントとすることができる。好適には、全ての第１の検出可能なエレメントは同一種類であり、全ての第２の検出可能なエレメントは他の１種類である。第１の検出可能なエレメントおよび第２の検出可能なエレメントは、プローブが未使用な状態のときに実質的に検出不可能な状態となるように、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドとそれぞれ結合される。
【００１７】
一実施形態において、検出される性質は蛍光であり、第１の検出可能なエレメントおよび第２の検出可能なエレメントは、異なる特性波長で蛍光発色する異なる蛍光体種を含む。かかる場合、第１の蛍光体種および第２の蛍光体種は、これらが通常検出されるように設計される波長域では実質的に蛍光発色しないように、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドに結合される。例えば、蛍光体は、電磁放射スペクトルの広範囲にわたって全体的に低レベルのバックグランド蛍光を発し得るが、通常、蛍光強度が極大となる特定の波長または波長領域が１つまたは少数存在する。実質的に蛍光発色が発生すべきではないのは、まさに蛍光体が特徴的に検出されるこれら極大点の１つ以上の箇所なのである。本発明の文脈において、「実質的に蛍光発色しない」またはこれに相当する用語は、当該オリゴヌクレオチドに結合した蛍光体全数の蛍光強度が、当該（１つまたは複数の）特性波長または特性波長領域において、これに相当する数の遊離蛍光体の対応蛍光強度の２５％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは１％未満、特に好ましくは０．１％未満であることを意味する。
【００１８】
原則、任意の方法を使用して、プローブ未使用状態において第１の蛍光種および第２の蛍光種の蛍光発色を遊離状態の場合よりも小さくすることができる。１つのアプローチでは、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれに、蛍光体に近接させてクエンチャーを更に結合する。他のアプローチは、複数の蛍光体を同一のオリゴヌクレオチド成分に互いに近接させて結合すると、クエンチャーを必要とせずに上記段落で記載した基準を十分に達成することができる程度に、互いに良く自己消光する傾向があるという観察に基づくものである。本願の文脈において、何をもって蛍光体同士間または蛍光体とクエンチャーとの間が「近接」というかは、使用する特定の蛍光体およびクエンチャーに依存し、また、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの構造上の特徴にも依存し得る。そのため、かかる用語は、オリゴヌクレオチド上の任意の特定の構造的な配置ではなく必要とする結果を参照して解釈されることを意図するものである。しかしながら、また、例示することのみを目的として、隣接する蛍光体同士または隣接する蛍光体およびクエンチャーが、最大で、それらの特徴的なフェルスター距離（典型的には５ｎｍ未満）に相当する距離離れていると、十分な消光が一般的に得られることに注目されたい。
【００１９】
好ましくは、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、最大２０個、好ましくは最大１０個、特に好ましくは最大５個の蛍光体で標識される。最大限のメリットを得るために、各オリゴヌクレオチドは少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個の蛍光体で標識されることが好ましい。その結果、これらの最大値および最小値の全ての順列から構築される範囲が本願明細書において具体的に考えられる。クエンチャーを使用する場合、同様に、一方または両方のオリゴヌクレオチドを最大２０個、好ましくは１０個、特に好ましくは最大５個のクエンチャーで標識することが好ましい。２種以上の蛍光体をプローブに結合して、例えば、特徴的なフィンガープリントをプローブに付与することができると考えられるが、所定の１つのプローブに結合される全ての蛍光体は同一種であることが好ましい。しかしながら、本発明の方法に複数のハイブリダイゼーションプローブを使用する場合、各プローブ成分の蛍光体は、分析可能であり、かつ、予定される測定結果の範囲を識別できるシグナルが得られるように、注意深く選ぶ必要があることが理解されよう。
【００２０】
蛍光体自身に関しては、原則、当該技術分野で従来使用されている任意のものから選ぶことができる。それらの例には、限定されないが、フルオレセイン、ローダミン、および、それらの誘導体、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンＢなどのキサンテン系；クマリン系（例えば、ヒドロキシマリン、メチルクマリン、アミノクマリン）；Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７などのシアニン系が含まれる。具体例には、以下の一般的に使用されている色素由来の蛍光体が含まれる：Ａｌｅｘａ色素、シアニン色素、Ａｔｔｏ  Ｔｅｃ色素、ローダミン色素。さらに、Ａｔｔｏ  ６３３（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ  ＧｍｂＨ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ａｔｔｏ  ７４０（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ  ＧｍｂＨ）、ローズベンガル、Ａｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＴＭ  ７５０  Ｃ５−マレイミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＴＭ  ５３２  Ｃ２−マレイミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ローダミンレッド  Ｃ２−マレイミド、および、ローダミングリーンや、Ｑｕａｓａｒ  ５７０などのホスホルアマダイト色素が例として挙げられる。あるいは、量子ドットまたはＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから供給されているものなどの近赤外色素を使用することもできる。蛍光体は、通常、当該技術分野で公知の化学法を使用して、ヌクレオチド塩基を介してオリゴヌクレオチドに結合される。
【００２１】
好適なクエンチャーは、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）メカニズムにより作用するものである。上述の蛍光体と共に使用できる市販のクエンチャーの非限定的な例には、限定されないが、ＤＤＱ−１、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ、ＩＲ  Ｄｙｅ−ＱＣ１、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３、ＱＳＹ−７、ＱＳＹ−２１が含まれる。
【００２２】
本発明の方法で使用される第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは、原則、当該技術分野で公知の任意のヌクレオチド構築法で製造することができ、これには、Ｈ−ホスホネート法、ホスホジエステル合成、ホスホトリエステル合成、亜リン酸トリエステル合成が含まれる。反応性の観点から、ヌクレオチドであるホスホルアマダイト構成単位を使用する方法が好ましい。かかる方法では、脱ブロック、カップリング、キャッピング、および、酸化の４つのステップをサイクルするプロセスで、選択されたホスホルアマダイトヌクレオチドを成長ヌクレオチド鎖の５’位置で順次付加することにより合成が起こる。このプロセスはサイクルして行われるため特に自動化し易く、これを行う装置は市販されており容易に入手できる。クエンチャーおよび／または蛍光体を導入する場合、適切に標識したホスホロアミダイトヌクレオチドを必要なポイントで使用する。第１のオリゴヌクレオチドがｊ型である場合、ホスホルアマダイト法を使用して、まず、急速加熱および除冷のサイクルによって折り返された、所望の構造特性を有する一本鎖のオリゴヌクレオチド前駆体を作ることが好ましい。
【００２３】
本発明の方法のステップ（ｂ）の間、検出対象の単一ヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域および第２のオリゴヌクレオチドの両方と結合するように、プローブの第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドと、または、２種以上のプローブを使用する場合、関連するプローブの第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドと、反応する。これにより、二本鎖の使用済みプローブが形成する。上述のｊ型／ｉ型オリゴヌクレオチドプローブの場合、これは、例えば、ポリメラーゼおよびリガーゼを使用して、単一ヌクレオチドを第１のオリゴヌクレオチドの３’末端および第２のオリゴヌクレオチドの５’末端に結合させて行う。これを達成するために広範囲のポリメラーゼおよびリガーゼを使用することができる。ポリメラーゼおよびリガーゼには、限定されないが、バクテリオファージＴ４、大腸菌、好熱菌（Ｔａｑ）などの入手が容易なバクテリア源に由来するものが含まれる。かかるステップは、過剰量のプローブの存在下、水性媒体中で行うことが好ましく、好適には、関連するプローブに対する単一ヌクレオチドのモル比は１：１〜１：２０００、好ましくは１：１〜１：２００、より好ましくは１：２〜１：５０であり、１：５〜１：２０が特に好ましい。上記２つの酵素を、ターゲットを超えて化学量論過剰量でそれぞれ使用することも好適である。一実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドは、ライゲーションが起こるまで第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖領域とハイブリダイズしないように選択される。本発明の方法で２種以上のプローブを使用する場合、当該単一ヌクレオチドに選択性のあるプローブのみがステップ（ｂ）を受け、その他のプローブは実質的に不活性な状態のままであり、更なる役割は果たさないことが理解されよう。
【００２４】
本発明の方法のステップ（ｃ）では、ステップ（ｂ）で形成した二本鎖の使用済みプローブは、これを特徴的な認識部位で切断することができる制限エンドヌクレアーゼで処理される。一実施形態（以下、ステップ（ｃ１）という）において、使用済みプローブは、補足された単一ヌクレオチドがメチル化されている場合にのみ、単一ヌクレオチドの第２のオリゴヌクレオチドが結合した側とは反対側で、エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域に隣接してまたは実質的に隣接して使用済みプローブが切断されて２つの二本鎖オリゴヌクレオチド断片になる条件で、メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼで処理される。これにより、エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域は、第２のオリゴヌクレオチドを含む切断プローブ部分に結合したままの状態となる。
【００２５】
メチル化依存性エンドヌクレアーゼに着目すると、これは、例えば、認識部位５’--Ｃ*ＣＤＧ--３’（ＤはＡまたはＴであり、Ｃ*は５−メチルシトシンまたは５−ヒドロキシメチルシトシンである）において二本鎖ヌクレオチドを切断するＬｐｎＰｌとすることができる。ここで、単一ヌクレオチドが挿入されるキャビティ周辺の第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドが正しく選択されていると仮定すると、必要な認識部位はプローブが使用された形態にある場合にのみ形成され、また、使用されたプローブは、挿入された単一ヌクレオチドがメチル化されている場合（つまり、この特定のケースではＣ*である場合）にのみ、分離した二本鎖断片に切断される。そうでない場合、ステップ（ｂ）で形成した二本鎖の使用済みプローブは元の状態のままである。
【００２６】
他の一実施形態（以下、ステップ（ｃ２）という）において、代替的に、使用済みプローブは、補足された単一ヌクレオチドがメチル化されていない場合にのみ、単一ヌクレオチドの第２のオリゴヌクレオチドが結合した側とは反対側で、エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域に隣接してまたは実質的に隣接して使用済みプローブが切断されて２つの二本鎖オリゴヌクレオチド断片になる条件で、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで処理される。これにより、エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域は、第２のオリゴヌクレオチドを含む切断プローブ部分に結合したままの状態となる。例えば、メチル化感受性エンドヌクレアーゼであるＭｓｐｌおよびＨｐａｌｌは、認識配列５’--ＣＣ*ＧＧ--３’においてのみ二本鎖オリゴヌクレオチドを切断し、ＤｎｐｌおよびＤｎｐｌｌエンドヌクレアーゼは、認識配列５’--ＧＡ*ＴＣ--３’（Ａ*はメチル化アデニン）においてのみ切断する。これらの場合において、同様に、単一ヌクレオチドが挿入されるキャビティ周辺の第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドが正しく選択されていると仮定すると、必要な認識部位はプローブが使用された形態にある場合にのみ形成され、そのため、使用されたプローブは、挿入された単一ヌクレオチドが、場合に応じて、メチル化されていないＣまたはＡである場合にのみ、分離した二本鎖断片に切断される。そうでない場合、ステップ（ｂ）で形成した二本鎖の使用済みプローブは元の状態のままである。
【００２７】
制限エンドヌクレアーゼによる使用済みプローブ上の切断部位はエキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域の５’側に位置し、その結果、この領域は、元の第２のオリゴヌクレオチドを有する断片内に存在することとなる。一実施形態において、この切断は、生じる断片の両方に５’一本鎖オーバーハングを残す。一般的に、ステップ（ｃ）はまた、過剰量のエンドヌクレアーゼを含む水系媒体中で行われる。使用するエンドヌクレアーゼは、認識部位から欠損しているヌクレオチドがある場合に使用済みプローブを切断しないものとすべきである。
【００２８】
本発明の方法の最終ステップは、ステップ（ｃ１）またはステップ（ｃ２）の生成物をエキソヌクレアーゼ、好適には３’→５’二本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有するが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および一本鎖エキソヌクレアーゼ活性のいずれも有さないエキソヌクレアーゼで処理し、使用済みプローブまたは使用済みプローブ断片から様々な検出可能なエレメントを消光されてない検出可能な状態で遊離させるステップに対応する、ステップ（ｄ１）およびステップ（ｄ２）の２つ選択肢のいずれかを含む。ステップ（ｄ１）およびステップ（ｄ２）のそれぞれについて、２つのシナリオがある。よって、使用済みプローブに補足された単一ヌクレオチドがメチル化され、その後、ステップ（ｃ１）が適用された場合は、使用済みプローブはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼによって、第１の検出可能なエレメントおよび第２の検出可能なエレメントをそれぞれ有する２つの二本鎖断片に切断されている。ステップ（ｄ１）に従ってこれらの断片をエキソヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼで処理すると、３’→５’方向のエキソヌクレアーゼ分解が起こり、そして、第１の検出可能なエレメントおよび第２の検出可能なエレメントを有する個々のヌクレオチドが放出するため消光または自己消光効果が除去される結果、一連の第１の検出可能なエレメントおよび第２の検出可能なエレメントが検出可能な形態で遊離される。そのため、第１の検出可能なエレメントおよび第２の検出可能なエレメントが異なる蛍光体である場合、２種類の異なる蛍光シグナルの増加が観察される。代替的な一実施形態において、ステップ（ｃ１）では、構成単位である一本鎖への脱ハイブリダイゼーションに対して不安定である、第２の検出可能なエレメントを有する断片が生じることがあり、かかる場合、当該断片のエキソヌクレアーゼ分解は起こらず、対応する第２の検出可能なエレメントの未消光形態での遊離は発生せず、第１の検出可能なエレメントに特徴的なシグナルのみが観察される。一方、使用済みプローブ内に補足された単一ヌクレオチドがメチル化されていない場合、ステップ（ｃ１）の適用は使用済みプローブに対してなんら影響せず、その後ステップ（ｄ１）を適用しても、エキソヌクレアーゼ分解はエキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域まで使用済みプローブを消化させるだけであり、その結果、第２の検出可能なエレメントの遊離のみが観察される。
【００２９】
同じ理屈がステップ（ｃ２）の生成物をステップ（ｄ２）で処理する逆の場合に適用できることが容易に理解されよう。全ての様々な結果は下記表に纏められ得る。
【００３０】
【表１】
0006381659.tif 000002
【００３１】
ステップ（ｄ１）またはステップ（ｄ２）における２つの結果は異なる観測値を与えるため、本発明の方法によれば、その様々な形態において、ユーザはメチル化ヌクレオチドと非メチル化ヌクレオチドとを確実に識別することができることが明らかであろう。
【００３２】
ポリメラーゼまたはエキソヌクレアーゼは、反応混合液に任意の時点で添加することができ、例えば、ステップ（ｃ１）またはステップ（ｃ２）の前または後に添加することができる。好適な一実施形態において、ポリメラーゼまたはエキソヌクレアーゼはステップ（ｂ）におけるポリメラーゼおよびリガーゼと同時に導入される。後者のケースでは、エキソヌクレアーゼは熱で活性化されるものであることが好ましく、また、ステップ（ｄ１）または（ｄ２）は、これを加熱により活性化させる追加のサブステップを含むことが好ましい。任意のエキソヌクレアーゼまたは上述のエキソヌクレアーゼ挙動を示す任意のポリメラーゼを使用することができる。
【００３３】
一実施形態において、本発明の方法は、ポリヌクレオチド検体のプログレッシブな加ピロリン酸分解またはエキソヌクレアーゼ分解に由来する単一ヌクレオチドの分析に好適である。典型的には、分析される単一ヌクレオチドは、ヌクレオチド三リン酸であって、好ましくは、デオキシリボース構造（ｄＮＴＰ）を含むものである。エキソヌクレアーゼを使用して単一ヌクレオチドを生成する場合、最初に形成されるヌクレオチド一リン酸およびヌクレオチド二リン酸は、キナーゼなどを使用して対応する三リン酸に変換され得る。
【００３４】
他の一実施形態において、本発明の方法は、出願人の上記特許出願（本願明細書にその内容を援用する）に記載されている液滴シークエンス技術と共に使用される。かかるシーケンス技術の好適な一例において、少なくとも一部が単一ヌクレオチド三リン酸を含む液滴のストリームが、プログレッシブな加ピロリン酸分解により前駆体の検体から生成される。他の一実施形態において、液滴のストリームにおけるヌクレオチド三リン酸の順序は、検体におけるヌクレオチド配列に対応する。さらなる一実施形態において、本発明の方法は、必要とされるハイブリダイゼーションプローブ、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、および、エキソヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼを、液滴のストリームにおける適切なポイントで各液滴内に挿入することにより、各液滴に適用される。検出可能なエレメントが蛍光体である場合、各液滴を検査して出射蛍光の性質を決定してもよい。これは、例えば、光検出器により行うことができる。光検出器は、ミクロプロセッサおよび関連するコンピュータアルゴリズムにより更に加工・分析することができる電気信号を発生させることができる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明の方法を、下記実施例および図面により説明する。
【００３６】
実施例１
下記ヌクレオチド塩基配列の１１３個のヌクレオチドからなる一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体（ＡＴＤＢｉｏなどから入手）を、これを含む水溶液を９５℃に加熱し、次いで１０分／℃の速度で室温まで除冷することにより、７０番目の塩基を軸に折りたたんだ。
【００３７】
（５’）ＧＴＡＧＧＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＡＡＡＡＡＣＧＧＡＧＧｍＣＣＡＧＡＡＧＣＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＴＧＴＴＣＣＡＴＧＡＣＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＧＴＣＡＴＧＧＡＡＣＡＴＣＡＣＧＴＣＣＣＴＧＣＸＸＱＸＸＧＣＴＴＣＴＧ−Ｇ（３’）（ＸはＱｕａｓａｒ  ５７０（蛍光体）で標識したＴ塩基、ＱはクエンチャーＢＨＱ−２で標識したＴ塩基、ｍＣは５−メチルシトシンヌクレオチド、「−」はホスホロチオエート結合である）。この処理の終わりに、６７番目〜７４番目の塩基（ここでは全てＴ）が一本鎖ヌクレオチドのループ領域を含む、本発明に係る閉じループ終端プローブが形成される。
【００３８】
下記ヌクレオチド塩基配列の２０個のヌクレオチドからなる第２の一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体（ＡＴＤＢｉｏなどから入手）を、溶液中、等モル濃度の第１のオリゴヌクレオチド前駆体、ならびに、ＨａｅｍｏｋｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ａｘｏｌ制限エンドヌクレアーゼ、および、ＫＯＤ  Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼと混合した。
【００３９】
（５’）ＣＴＣＣＧＹＹＱＹＹＣＧＴＴＴＣＣＡＧＡ（３’）（ＹはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３（蛍光体）で標識したＴ塩基、ＱはクエンチャーＢＨＱ−２で標識したＴ塩基である）。次いで、メチル化ｄＣＴＰ（デオキシシチジン三リン酸）または非メチル化ｄＣＴＰを含む溶液を添加した。
【００４０】
調製したミックスを１時間５０℃でインキュベートし、下記の酵素ステップを行った。
１．ＨａｅｍｏｋｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、ｄＣＴＰヌクレオチドを第１のオリゴヌクレオチドの３’陥凹末端に取り込むステップ。
２．Ｔａｑリガーゼが、ｄＣＴＰを取り込んだ第１のオリゴヌクレオチドのみについて、３’陥凹末端に第２のオリゴヌクレオチドをライゲートし、「完成型」の補足分子を形成するステップ。
３．取り込まれたｄＣＴＰがメチル化されていた場合、Ａｘｏｌ制限エンドヌクレアーゼが完成型の補足分子のそれぞれを２つに切断するステップ。取り込まれたｄＣＴＰがメチル化されていない場合、切断は起こらない。
【００４１】
上記ステップに続いて、温度を７０℃に上昇させてＫＯＤ  Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔポリメラーゼを活性化させ、当該温度を１５分間保持した。取り込まれたｄＣＴＰがメチル化されていなかった場合、完成型の補足分子は、ポリメラーゼにより３’→５’方向に消化されてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３蛍光体が溶液中に放出され、自由に蛍光発色する。取り込まれたｄＣＴＰがメチル化されていた場合、第２のオリゴヌクレオチドを含む、切断された完全型の補足分子の半分は融解するため、ポリメラーゼにより分解されない。かかる場合、完全型の補足分子の他方の半分が分解を受けて溶液中にＱｕａｓａｒ  ５７０蛍光体を放出し、自由に蛍光発色する。得られた溶液の特徴的な蛍光スペクトルを検出することにより、元の混合液に添加されたｄＣＴＰヌクレオチドが元々メチル化されていたかメチル化されていなかったかを推測することができる。
【００４２】
メチル化ｄＣＴＰおよび非メチル化ｄＣＴＰの両方について、ステップ１〜３の結果を図１に示す。このゲル電気泳動写真において、「１」とマークされたレーンは、ステップ１〜３の完全な反応結果を示し；「２」とマークされたレーンは、ヌクレオチド非存在下での反応結果を示し；「３」とマークされたレーンは、Ａｘｏｌ制限エンドヌクレアーゼ非存在下での反応結果を示し；「４」とマークされたレーンは、リガーゼ非存在下での反応結果を示す。非メチル化ｄＣＴＰの存在下で完全な反応（左端のレーン１）が起こると、２つのオリゴヌクレオチド前駆体とｄＣＴＰとが組み合わされて単一のコンストラクトになることに相当する（構造配置が異なることに起因すると考えられる）一対のバンドが生じることが明らかにわかる。Ａｘｏｌ存在下での反応および非存在下での反応（レーン１および３）に違いは観察されず、制限エンドヌクレアーゼの活性がこの場合はゼロであったことを示している。メチル化ｄＣＴＰ存在下での反応の場合（右側の４つのレーン）、Ａｘｏｌの非存在下（レーン３）では同じ結果が得られたものの、Ａｘｏｌ存在下（レーン１）では、生じたＤＮＡ断片が制限エンドヌクレアーゼにより効率的に切断され、それにより生じたＤＮＡ断片に対応する多数のバンドが生じた。
【００４３】
図２は、ｄＣＴＰの存在下（破線）および非存在下（実線）でステップ１〜３から得られた生成物をポリメラーゼによりエキソヌクレアーゼ分解させた結果を示す。このポリメラーゼを時間Ｔ＝２０分における温度上昇により活性化させたところ、ｄＣＴＰが存在する場合は蛍光の大幅な増加が観察され、ｄＣＴＰが存在しない場合はほとんど変化が観察されなかった。
【００４４】
実施例２
下記ヌクレオチド塩基配列の１１３個のヌクレオチドからなる一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体（ＡＴＤＢｉｏから入手）を、これを含む水溶液を９５℃に加熱し、次いで１０分／℃の速度で室温まで除冷することにより、７０番目の塩基を軸に折りたたんだ。
【００４５】
（５’）ＧＴＡＧＧＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＡＡＡＡＡＣＧＧＡＣＧＴＡＣＧＡＡＧＣＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＧAＣＧＴＧＡＴＧＴＴＣＣＡＴＧＡＣＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＧＴＣＡＴＧＧＡＡＣＡＴＣＡＣＧＴＣＣＣＴＧＣＸＸＱＸＸＧＣＴＴＣＧＴ−Ａ（３’）（ＸはＱｕａｓａｒ  ５７０（蛍光体）で標識したＴ塩基、ＱはクエンチャーＢＨＱ−２で標識したＴ塩基、ｍＣは５−メチルシトシンヌクレオチド、「−」はホスホロチオエート結合である）。この処置の終わりに、６７番目〜７４番目の塩基（ここでは全てＴ）が一本鎖ヌクレオチドのループ領域を含む、本発明に係る閉じループ終端プローブが形成される。
【００４６】
下記ヌクレオチド塩基配列の２０個のヌクレオチドからなる第２の一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体（ＡＴＤＢｉｏなどから入手）を、溶液中、等モル濃度の第１のオリゴヌクレオチド前駆体、ならびに、ＨａｅｍｏｋｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、ＢｓｉＷｌ制限エンドヌクレアーゼ、および、ＫＯＤ  Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼと混合した。
【００４７】
（５’）ＧＴＣＣＧＹＹＱＹＹＣＧＴＴＴＣＣＡＧＡ（３’）
（ＹはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３（蛍光体）で標識したＴ塩基、ＱはクエンチャーＢＨＱ−２で標識したＴ塩基である）。次いで、メチル化ｄＣＴＰまたは非メチル化ｄＣＴＰを含む溶液を添加した。
【００４８】
調製したミックスを１時間５０℃でインキュベートし、下記の酵素ステップを行った。
１．ＨａｅｍｏｋｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、ｄＣＴＰヌクレオチドを第１のオリゴヌクレオチドの３’陥凹末端に取り込むステップ。
２．Ｔａｑリガーゼが、ｄＣＴＰを取り込んだ第１のオリゴヌクレオチドのみについて、３’陥凹末端に第２のオリゴヌクレオチドをライゲートし、「完成型」の補足分子を形成するステップ。
３．取り込まれたｄＣＴＰがメチル化されていなかった場合、Ａｘｏｌ制限エンドヌクレアーゼが完成型の補足分子のそれぞれを２つに切断するステップ。取り込まれたｄＣＴＰがメチル化されていた場合、切断は起こらない。
【００４９】
上記ステップに続いて、温度を７０℃に上昇させてＫＯＤ  Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ポリメラーゼを活性化させ、当該温度を１５分間保持した。取り込まれたｄＣＴＰがメチル化されていた場合、完成型の補足分子は、ポリメラーゼにより３’→５’方向に消化されてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３蛍光体が溶液中に放出され、自由に蛍光発色する。取り込まれたｄＣＴＰがメチル化されていなかった場合、第２のオリゴヌクレオチドを含む、切断された完全型の補足分子の半分は融解するため、ポリメラーゼにより分解されない。かかる場合、完全型の補足分子の他方の半分が分解を受けて溶液中にＱｕａｓａｒ  ５７０蛍光体を放出し、自由に蛍光発色する。得られた溶液の特徴的な蛍光スペクトルを検出することにより、元の混合液に添加されたｄＣＴＰヌクレオチドが元々メチル化されていたかメチル化されていなかったかを推測することができる。
【図１】
0006381659.tif 000003
【図２】
0006381659.tif 000004
【配列表】
0006381659000001.app