(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的抗体を含むタンパク質製剤における抗体の凝集体の含有量を減少させる方法であって、
（ａ）前記タンパク質製剤を約０．００１〜約１％の濃度範囲で存在するチオ複素環カチオンと接触させて混合物を形成する工程と、
（ｂ）前記混合物を少なくとも１つの機能性固体である微粒子と接触させて過剰なチオ複素環カチオンを除去する工程と、
任意で（ｃ）前記混合物を、同時にまたは順次、少なくとも１つのさらなる機能性固体と接触させる工程と、
（ｄ）前記混合物から固体物質を沈降又は濾過によって除去する工程とを含む方法であって、前記チオ複素環カチオンがメチレンブルーである、方法。
【請求項２】
前記チオ複素環カチオンが、（ａ）約０．０１〜約１％、および（ｂ）約０．０２〜約０．０３％からなる群から選択される濃度範囲で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アラントインが（ａ）約０．６〜約５０％、（ｂ）約１〜約１０％、および（ｃ）約１〜約２％からなる群から選択される濃度範囲で存在する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）及び（ｂ）が、（ａ）約０．１〜約５０ｍＳ／ｃｍ、（ｂ）約１〜約３０ｍＳ／ｃｍ、および（ｃ）約５〜約１５ｍＳ／ｃｍからなる群から選択される範囲内の電気導電率で行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ａ）及び（ｂ）が、（ａ）約４〜約１０、（ｂ）約５〜約９、（ｃ）約６〜約８、および（ｄ）約６．５〜約７．５からなる群から選択される範囲のｐＨで行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記混合物が前記チオ複素環カチオン以外の抗ウイルス剤をさらに含み、前記抗ウイルス剤がクロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、エタクリジン、およびリン酸トリ（ｎ−ブチル）からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記混合物が、（ａ）約０．６〜約５０％、（ｂ）約０．７〜約２５％、（ｃ）約０．８〜約１０％、（ｄ）約０．９〜約５％、および（ｅ）約１〜約２％からなる群の１つの範囲の濃度のアラントインをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの機能性固体の表面が、静電的相互作用、疎水性相互作用、水素結合、および金属親和性からなる群から選択される化学的相互作用をもたらす、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質製剤が、細胞を含む細胞培養収集物、実質的に無細胞の細胞培養収集物、および部分的に精製されたタンパク質からなる群から選択される１つである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の明示
本願は２０１３年２月６日に出願された米国特許出願第６１／７６１，６４６号の優先権を主張し、その全体は参照することによって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本明細書に開示された実施形態は、抗体を含むタンパク質の精製を高める方法に関する。特に、実施形態は凝集体レベルを低下させる方法に関する。そのような方法は、細胞培養収集物の清澄化とともに（順次または同時に）行うことができる。本明細書に開示された実施形態は、さらに、最終のタンパク質純度の所望のレベルを達成するために、他の精製方法とこれらの機能を統合することに関する。
【０００３】
凝集体の除去は、タンパク質精製において価値があることが認識されている。低濃度の黄色蛍光複素環染料であるエタクリジンが、抗体製剤の凝集体含有量を減少させることが示された（非特許文献１）。エタクリジンはタンパク質精製分野で沈殿剤として用いられている。
【０００４】
チオ複素環カチオンメチレンブルーは、血漿の分画によって生成される治療用タンパク質製剤のウイルスを不活性化するのに用いられる。それはまた、抗マラリア薬として、ならびに、メトヘモグロビン血症および特定の癌の治療にも用いられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  １２９１（２０１３）３３−４０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
いくつかの態様において、本明細書に開示された実施形態は、標的タンパク質を含むタンパク質製剤における凝集体含有量を減少させる方法を提供し、その方法は、タンパク質製剤をチオ複素環カチオンと接触させて混合物を形成する工程と、その混合物を少なくとも１つの機能性固体と接触させて過剰なチオ複素環カチオンを除去する工程と、任意でその混合物を、同時にまたは順次、少なくとも１つのさらなる機能性固体と接触させて、タンパク質製剤の凝集体含有量をさらに減少させる工程とを含む。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
タンパク質の精製のための方法およびキットが提供される。特定の実施形態において、開示された方法は、そのような所望のタンパク質を１つまたは２つ以上のチオ複素環カチオンと接触させることによって、抗体または他のタンパク質の製剤から凝集体を減少させる。特定の実施形態において、開示された方法は、いわゆる生理的状態（約１２〜約１６ｍＳ／ｃｍ）の電気伝導度からそうした状態の３または４倍以上までの電気伝導値の範囲で実施することができる。そのような高い電気伝導度は、処理の間、酸性タンパク質が沈殿するリスクなくその方法が酸性タンパク質に適用されることを可能にし、それによって、開示された方法が適用される所望のタンパク質種の多様性を増すことができる。特定の実施形態において、開示された方法は、例えば約０．０１〜約０．０５％の超低濃度のチオ複素環カチオンを用いて実施されてもよい。開示された方法は、処理されたタンパク質製剤を、通常、宿主タンパク質の汚染を減少させると同時に凝集体含有量を減少させる処理の総合能力を高める固体物質と接触させることを含み、過剰なチオ複素環カチオンを除去する付加的な利点をもたらす。特定の実施形態において、チオ複素環カチオンはメチレンブルーである。
【０００８】
特定の実施形態において、開示された方法は、所望のタンパク質と比較して高い分子量を有する凝集体の濃度を低下させる。その凝集体は例えば、所望のタンパク質の複数または別の一種の複数からなるホモ凝集体、および少なくとも１つの他の種と組み合わせた所望のタンパク質の１つ以上または所望のタンパク質を欠いた複数の種の組み合わせからなるヘテロ凝集体である。特定の実施形態において、凝集体は、所望のタンパク質および汚染物質のヘテロ凝集体を含み、いくつかのそのような実施形態においては、汚染物質は、核酸、ヌクレオチド、エンドトキシン、金属イオン、タンパク質、脂質、または細胞培地成分である。特定の実施形態において、所望のタンパク質のホモ凝集体の存在は、実質的に除去される。特定の実施形態において、所望のタンパク質および汚染物質のヘテロ凝集体の存在は、実質的に除去される。特定の実施形態において、所望のタンパク質を含まないホモ凝集体およびヘテロ凝集体の存在は、実質的に除去される。
【０００９】
特定の実施形態において、開示された方法は、凝集体の減少とともに、ＤＮＡ、エンドトキシン、およびウイルス濃度などの汚染物質の減少をさらに提供する。特定の実施形態において、開示された方法は、チオ複素環カチオン以外に抗ウイルス剤をさらに含んで実施される。
【００１０】
特定の実施形態において、対象のタンパク質種（例えば、精製される所望のタンパク質）は、組換え起源のものであり、タンパク質製剤は、細胞を含む細胞培養収集物、細胞培養上清、清澄化された細胞培養上清、クロマトグラフィーカラムからの溶出液、または前の段階の精製で得られたタンパク質を含む溶液を含んでもよい。特定の実施形態において、タンパク質製剤は抗体を含み、そのような実施形態のいくつかにおいては、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、もしくはそれの断片状のもの、またはＦｃ融合タンパク質などの抗体または抗体断片の融合タンパク質である。特定の実施形態において、所望のタンパク質は、第ＶＩＩＩ因子などの凝固タンパク質であってもよい。特定の実施形態において、所望のタンパク質は、ヒト成長ホルモンなどのペプチドホルモンであってもよい。
【００１１】
特定の実施形態において、開示された方法は、試料の電気伝導率が試料から所望のタンパク質の沈殿を実質的に防ぐのに十分高度であるように実施されてもよい。電気伝導率は、当技術分野で既知の方法による塩または希釈剤の添加によって調整されてもよい。特定の実施形態において、電気伝導率は、所望のタンパク質の実質的な沈殿を防ぐのに必要と判定されたレベルより大きい約５ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ、または約２０ｍＳ／ｃｍである。特定の実施形態において、電気伝導率は、約２０ｍＳ／ｃｍ、約２５ｍＳ／ｃｍ、約３０ｍＳ／ｃｍ、約３５ｍＳ／ｃｍ、約４０ｍＳ／ｃｍ、約４５ｍｓ／ｃｍであり、または約４５ｍＳ／ｃｍより大きい。これらのシステムの電荷相互作用は、高い電気伝導率で低減されることがわかっているため、高い電気伝導率で汚染物資の一部を除去するこの方法の能力は、開示された方法の驚くべき特徴の１つを示す。例えば、約２５ｍＳ／ｃｍ以上の電気伝導率では、負荷電タンパク質の少数のみが陽性面に結合することがわかっている。本方法とは別に、多くの陽性因子のＩｇＧ抗体製剤への適用が、約５ｍＳ／ｃｍ未満の電気伝導率で行われ、通常、アルカリｐＨの使用要件が加えられる。そのような使用ｐＨは、本方法の要件ではない。高い電気伝導率が凝集体内の内部の静電気関係を弱める効果があり、それによって本方法の凝集体の解離および／または所望のタンパク質に伴う汚染物質の除去を達成する本方法の能力を高めることは当業者には明らかである。
【００１２】
特定の実施形態において、チオ複素環カチオンはメチレンブルー（ＩＵＰＡＣ名：［７−（ジメチルアミノ）フェノチアジン−３−イリデン］−ジメチルアザニウム）、その類似体または塩である。メチレンブルーの類似体もまた、チオ複素環カチオンとして機能することができ、そのような類似体は米国特許第７，１７６，３０８号に記載され、その全開示内容は参照することによってそのまま本明細書に組み込まれる。メチレンブルーはまた、ベーシックブルー９として知られる。他のチオ複素環カチオンのソースは、メチレングリーン、すなわちベーシックグリーン５、Ｌａｕｔｈ’ｓ  ｖｉｏｌｅｔ、すなわちチオニンを含む。メチレンブルーの酸化型もまた使用されてもよく、例えばチアジンメチレンアズールＡ、メチレンアズールＢ、およびメチレンアズールＣである。いくつかの実施形態において、チオ複素環カチオンは、任意の対アニオンを有するフェノチアジン−３−イリデン−ジメチルアザニウム構造分類の任意のメンバーであってもよい。
【００１３】
特定の実施形態において、チオ複素環カチオンは、所望の程度の凝集体の減少を促すのに十分な、実質的に最も低い濃度で供給されてもよい。特定の実施形態において、チオ複素環カチオンの濃度は、（体積当たりの重量に基づいて）１％、０．５％、０．２５％、０．１％、０．０５％、０．０４％、０．０２５％、または０．００１％未満であってもよい。特定の実施形態において、陽性有機添加剤は、０．０１〜０．０４％または０．０２〜０．０２５％の濃度で供給される。
【００１４】
特定の実施形態において、開示された方法は、試料中の凝集体の量を減少させる間、所望のタンパク質の沈殿を防ぐまたは制限するように選択されたｐＨ値で実施されてもよい。ｐＨ値は従来の方法によって調整されてもよく、電気伝導率の選択に関連して選択されてもよい。特定の実施形態において、試料のｐＨは約４〜約９、約５〜約８、または約６〜約７．５である。
【００１５】
特定の実施形態において、試料は、チオ複素環カチオン以外に抗ウイルス剤とさらに接触させてもよい。そのような実施形態のいくつかにおいては、抗ウイルス剤は、塩化ベンザルコニウム、クロルヘキシジン、エタクリジン、またはリン酸トリ（ｎ−ブチル）などの非多価有機カチオンであってもよい。そのような抗ウイルス剤は、約１％（ｗ／ｖ）未満、約０．１％（ｗ／ｖ）未満、または約０．０１％（ｗ／ｖ）未満、または約０．００１％（ｗ／ｖ）未満の量で存在してもよい。
【００１６】
特定の実施形態において、その方法は、試料とウレイドを、ウレイドが試料に溶解しないのに十分な量で、接触させる工程をさらに含む。次に、所望のタンパク質を含む上清を、沈殿した汚染物質を含む試料の残りの部分から分離することができる。そのような実施形態のいくつかにおいては、ウレイドは、試料を陽性有機添加剤と接触させる工程の前に供給され、また他の場合においては、ウレイドは、試料を陽性有機添加剤と接触させる工程とほぼ同時に供給され、またさらに他の場合においては、ウレイドは、試料陽性有機添加剤と接触させる工程の後に供給される。いくつかのそのような実施形態においては、ウレイドは、尿酸、ヒダントイン（イミダゾリジン−２，４−ジオン）、アラントイン（２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル）尿素、アルクロキサ、アルジオキサ、ヘモキャン（ｈｅｍｏｃａｎｅ）、ウレイドヒダントイン、５−ウレイドヒダントイン）、グリオキシルウレイド、グリオキシル酸ジウレイド、２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル尿素（アラントイン）、イミダゾリジニル尿素、ジイミダゾリジニル尿素、およびプリンのいずれかであってもよい。特定の実施形態において、ウレイドはアラントインであり、いくつかのそのような場合において、アラントインは、０．５６％（ｗ／ｖ）、１％、１．５％、２％、またはそれ以上より高い濃度で存在する。特定の実施形態において、ウレイドは尿酸であり、いくつかのそのような場合において、尿酸は、０．００２５％（ｗ／ｖ）、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、１％、またはそれ以上より高い濃度で存在する。
【００１７】
特定の実施形態において、方法は、試料とウレイドを、ウレイドが十分に溶解する量で接触させる工程をさらに含んでもよい。いくつかのそのような実施形態において、溶解性ウレイドは、尿素、イミダゾリジニル（ｉｍｉｄａｚｏｌｙｄｉｎａｌ）尿素、または他のウレイドであってもよい。特定の実施形態において、ウレイドは尿素で、いくつかのそのような場合において、尿素は、０．５Ｍより高い、または１Ｍより高い、または２Ｍより高い、または４Ｍより高い、または６Ｍより高い、または８Ｍより高い濃度で存在する。メチレンブルーを含む、チオ複素環カチオンとウレイドとを結合する本明細書の方法を行う能力は、沈殿を防ぐことがこの方法の特定の目的である場合に驚くべきものである。この結果は、既知のエタクリジン沈殿方法と対照をなす。尿素などの高溶解性ウレイドは、多くの化合物の溶解度を増す一般的効果を有し、すなわちその存在が沈殿物の形成を防ぐ。
【００１８】
特定の実施形態において、開示された方法の有用性は、細胞培養収集物中の細胞片の沈降を速めることによって高められてもよく、存在する場合に、ＤＮＡ、エンドトキシン、およびウイルスの量を実質的に減少させる。実験データは、いくつかのウレイドが優先的に凝集体、エンドトキシン、およびウイルスと相互作用する能力がこれらの結果に役立つこと、および低レベルの溶解されたウレイドが、ウレイドがない場合の多価カチオンの処理と比較して、より多くの抗体の回収に役立ち得ることを示している。処理の後、固体物質は沈降または濾過によって除去されてもよく、上清中で実質的に凝集体のないタンパク質にする。
【００１９】
特定の実施形態において、開示された方法は、試料を、非イオン性有機ポリマー、有機溶媒、界面活性物質、またはウレイドなどの溶解性有機調節因子と接触させる工程を加えて実施されてもよい。そのような実施形態のいくつかにおいて、試料を有機調節因子と接触させる工程は、試料を陽性有機添加剤と接触させる工程の前に行われる。他の場合においては、試料を有機調節因子と接触させる工程は、試料を陽性有機添加剤と接触させる工程とほぼ同時に行われる。さらに他の場合においては、試料を有機調節因子と接触させる工程は、試料を陽性有機添加剤と接触させる工程の後に行われる。特定の実施形態において、有機調節因子は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリブチレングリコールなどの非イオン性有機ポリマーであり、そのような実施形態のいくつかでは、非イオン性有機ポリマーは、平均分子量が約１０００Ｄ以下、５００Ｄ以下、２５０Ｄ以下、または１００Ｄ以下である。特定の実施形態において、有機調節因子は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、またはフェノキシエタノールなどの有機溶媒である。特定の実施形態において、有機調節因子は、約１％（ｗ／ｖ）以上の濃度で供給される。特定の実施形態において、有機調節因子は、Ｔｗｅｅｎ、トリトン、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、またはオクチルグルコシドなどの界面活性物質であり、そのような実施形態のいくつかでは、界面活性物質は、約１％（ｗ／ｖ）以下、約０．１％以下、または約０．０２％（ｗ／ｖ）以下の濃度で供給される。特定の実施形態において、有機調節因子は、亜飽和量で供給されたウレイドであり、そのような実施形態のいくつかでは、ウレイドは尿素、ヒダントイン、またはアラントインである。
【００２０】
特定の実施形態において、開示された方法は、開示された方法を行うように設計されたキットを用いて実施されてもよい。そのようなキットは、説明書および多価有機カチオン、ウレイド、有機調節因子、抗ウイルス剤、および電気伝導率の調整のための試薬のうちの１つ以上などの、開示された方法の実施のために有用な試薬を提供することができる。このキットは、タンパク質の精製における使用のために開示された方法を実施するのに適した量および濃度の物質を提供することができる。そのようなキットはＩｇＧまたはＩｇＭ抗体などの特定のタンパク質との使用に適合させられてもよく、特定の規模のタンパク質製剤および精製に適した量に適合させられてもよい。
【００２１】
特定の実施形態において、開示された方法は、付加的な処理の前に、試料から過剰なチオ複素環カチオンまたは他の試料成分を選択的に除去する効果を有する固体として、試料を固体物質と接触させることによって行われてもよい。そのような一実施例において、例えばカチオン交換クロマトグラフィー技術を行うために使用される負荷電固体が、過剰なチオ複素環カチオンを除去するために含まれてもよい。別のそのような実施例において、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィー技術を行うために使用される疎水性固体が使用されてもよい。別のそのような実施例において、負荷電疎水性クロマトグラフィー固体が使用されてもよい。別の種類の実施例において、正電荷を有する固体が、ＤＮＡ、またはｐＨ指示染料、またはリン脂質または他の成分を試料から除去するために使用されてもよい。
【００２２】
特定の実施形態において、開示された方法は、より高度な精製を達成するために、または他の汚染物質を除去するために、従来のタンパク質精製方法と組み合わされてもよい。例えば、開示された方法は、沈殿、クロマトグラフィー、および液液抽出方法を含む従来の精製方法に備えて実施されてもよい。これらの方法に適した状態をつくり、それらを本明細書に記載の開示された方法に組み込んで、生成物の所望の精製を達成することは当業者の能力の範囲内である。
【００２３】
特定の実施形態において、使用条件は、凝集体が減少し、所望のタンパク質が溶液に残る程度を調節するために、ｐＨに関して、および／または、キレート剤、有機ポリマーもしくは溶媒、界面活性物質、カオトロープ、および多様な種類の塩の存在によって、変えられてもよい。
【００２４】
いくつかの実施形態において、標的タンパク質を含むタンパク質製剤における凝集体含有量を減少させる方法が提供され、この方法は、タンパク質製剤をチオ複素環カチオンと接触させて混合物を形成する工程と、その混合物と少なくとも１つの機能性固体を接触させて過剰なチオ複素環カチオンを除去する工程と、任意でその混合物を、同時にまたは順次、少なくとも１つのさらなる機能性固体と接触させて、タンパク質製剤の凝集体含有量をさらに減少させる工程とを含む。そのような一実施形態において、高い疎水性および負電荷を与えるように官能化された固体粒子は、過剰なチオ複素環カチオンを除去するために含まれてもよく、それと同時に、正電荷を与えるように官能化された固体粒子が、組み込まれたＤＮＡ成分を含む凝集体を結合するために含まれてもよい。そのような一実施形態において、陽性度を与えるように官能化された固体は、水素結合、疎水性、および／または金属親和性などの他の化学官能性をさらに含んでもよい。
【００２５】
いくつかの実施形態において、チオ複素環カチオンはメチレンブルーである。
【００２６】
１つまたは２つ以上の前述の実施形態において、チオ複素環カチオンは、中間値または中間値の範囲も含む（ａ）約０．００１〜約１％、（ｂ）約０．０１〜約１％、および（ｃ）約０．０２〜約０．０３％からなる群から選択される濃度範囲で存在する。
【００２７】
１つまたは２つ以上の前述の実施形態において、アラントインは、中間値または中間値の範囲を含む（ａ）約０．６％〜約５０％、（ｂ）約１〜約１０％、および（ｃ）約１〜約２％からなる群から選択される濃度範囲で存在する。
【００２８】
１つまたは２つ以上の前述の実施形態において、使用電気伝導率は、中間値または中間値の範囲を含む（ａ）約０．１〜約５０ｍＳ／ｃｍ、（ｂ）約１〜約３０ｍＳ／ｃｍ、および（ｃ）約５〜約１５ｍＳ／ｃｍからなる群から選択される範囲内である。
【００２９】
１つまたは２つ以上の前述の実施形態において、使用ｐＨは、中間値または中間値の範囲を含む（ａ）約４〜約１０、（ｂ）約５〜約９、（ｃ）約６〜約８、および（ｄ）約６．５〜約７．５からなる群から選択される範囲である。
【００３０】
１つまたは２つ以上の前述の実施形態において、混合物は、チオ複素環カチオン以外の抗ウイルス剤をさらに含み、抗ウイルス剤は、クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、エタクリジン、およびリン酸トリ（ｎ−ブチル）からなる群から選択される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、チオ複素環カチオンは、アラントインと組み合わせて使用されてもよい。アラントインは、メチレンブルーの能力を向上させ、凝集体を減少させることができる。
【００３２】
１つまたは２つ以上の前述の実施形態において、混合物は、中間値または中間値の範囲を含む（ａ）約０．６〜約５０％、（ｂ）約０．７〜約２５％、（ｃ）約０．８〜約１０％（ｄ）約０．９〜約５％、および（ｅ）約１〜約２％からなる群の１つの範囲の濃度で、アラントインをさらに含む。
【００３３】
１つまたは２つ以上の前述の実施形態において、少なくとも１つの機能性固体の表面は、静電的相互作用、疎水性相互作用、水素結合、および金属親和性からなる群から選択される化学的相互作用をもたらす。
【００３４】
１つまたは２つ以上の前述の実施形態において、少なくとも１つの機能性固体は微粒子である。
【００３５】
１つまたは２つ以上の前述の実施形態において、標的タンパク質は、組換えタンパク質、抗体、成長ホルモン、および凝固因子からなる群から選択される１つ含む。
【００３６】
１つまたは２つ以上の前述の実施形態において、タンパク質製剤は、細胞を含む細胞培養収集物、実質的に無細胞の細胞培養収集物、および部分的に精製されたタンパク質からなる群から選択される１つである。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示された方法を簡便に実施するためのキットが提供される。そのようなキットは、説明書、試薬、および任意で予めパックされたクロマトグラフィー装置または試料容器の形態の予めパックされた装置を含んでもよい。
【００３８】
開示された方法をより容易に理解できるように、用語は以下のように定義される。追加の定義は詳細な説明中で記述される。
【００３９】
「凝集体」とは、生理的条件で安定し、広範囲のｐＨおよび電気伝導率の条件下で安定し得る、２つまたは３つ以上の分子の会合物をいう。凝集体は、タンパク質、核酸、または脂質などの少なくとも１つの生体分子、および他の分子または金属イオンをしばしば含む。その会合物は化学的相互作用の任意の種類または任意の組み合わせによって生じ得る。抗体の凝集体は２つのカテゴリーに分類することができる。「ホモ凝集体」は、同一の組成の２つまたは３つ以上のタンパク質の安定した会合物のことをいう。「ヘテロ凝集体」とは、同一または異なる組成の１つまたは２つ以上のタンパク質の安定した会合物で、任意で１つまたは２つ以上の非タンパク質分子と会合された会合物のことをいう。非タンパク質成分は、ヌクレオチド、エンドトキシン、金属イオン、脂質、または細胞培地成分からなる群からの１つまたは２つ以上の物質から構成され得る。
【００４０】
「抗体」とは、免疫グロブリン、複合体、またはそれらの断片状の形態をいう。その語は、限定されないが、ヒトまたは他の哺乳類細胞株由来のクラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含んでもよく、それらにはヒト化、ヒト、単鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、変異型、移植、およびインビトロ生成抗体などの天然型または遺伝的に修飾された形態を含む。「抗体」はまた、限定されないが、免疫グロブリン部分を含有する融合タンパク質を含む複合体形態を含んでもよい。「抗体」はまた、抗原結合機能を保持しているかどうかは関係なく、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、Ｆｃ、および他の組成などの抗体断片を含んでもよい。
【００４１】
「エンドトキシン」とは、溶解時に細胞から放出されるグラム陰性菌の外膜に存在する毒性熱安定性リポ多糖物質のことをいう。
【００４２】
「非イオン有機ポリマー」とは、荷電基のない結合反復型有機サブユニットからなる自然発生のまたは合成の炭化水素のことをいう。それはいくぶんか分枝した、または顕著に分枝した状態の、直鎖状、顕著に直鎖状であってもよい。開示された方法を実施するのに適した例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む。ＰＥＧは構造式がＨＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｈである。例は、限定されないが、平均ポリマー分子量が１００未満〜１０００超ダルトンの範囲の組成を含む。
【００４３】
「チオ複素環カチオン」とは、共平面配置の３環を含み、少なくとも１つのチオール基および少なくとも１つのアミノ基を有し、チオール基またはアミノ基とともに存在し得る少なくとも１つの正電荷を有する有機カチオンのことをいう。一例としてはメチレンブルーである。
【化１】
0006363621.tif 000002
【００４４】
「有機溶媒」とは、液体状に存在する自然発生のまたは合成の有機化合物のことをいう。開示された方法を実施するのに適した例としては、限定されないが、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、およびフェノキシエタノールを含む。
【００４５】
「有機ポリマー」とは、有機モノマーの自然発生のまたは合成のポリマーのことをいう。例としては、限定されないが、特にポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、デキストラン、またはセルロースを含む。
【００４６】
「ポリヌクレオチド」とは、鎖において共有結合された複数のヌクレオチドモノマーからなるバイオポリマーのことをいう。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）は、ポリヌクレオチドの例である。
【００４７】
「タンパク質」とは、炭素、水素、酸素、窒素、および通常は硫黄を含む複合有機高分子の群のいずれかのことをいい、ペプチド結合によってつながれたアミノ酸の１つまたは２つ以上の鎖から主に構成される。タンパク質は天然起源または組換え起源のものであってもよい。タンパク質は、例えばグリコシル化、ペグ化、または他の化学的部分との接合によって非アミノ酸部分を用いて修飾されてもよい。タンパク質の例としては、限定されないが、抗体、凝固因子、酵素、およびペプチドホルモンを含む。
【００４８】
「不溶解ウレイド」とは、特定のタンパク質製剤中に広がる条件下で最高溶解度を超えた量のウレイドを含む溶液のことをいう。特定の実施形態において、開示された方法は、いくらかの割合のウレイドが試料中で溶解しないで存在するような試料の条件下で、試料中のウレイドの溶解度を超えた量でウレイドが存在する試料を提供する。
【００４９】
「界面活性物質」は、概して疎水部分と親水部分とを含む有機分子のクラスなどの「界面活性剤」を含み、それによって両親媒性として見なされる。水溶液中の十分な濃度で界面活性物質は、水との接触を最小限にするために中央に集中した疎水部分と、水との接触を最大限にするために外向きに放射状に広がった親水部分とを有し、クラスター状に自己会合できる。生物学的製剤の存在下で、特に疎水性または疎水性の占有領域を有する物質を含む生物学的製剤の存在下で、界面活性物質の疎水部分は、自発的に疎水性物質のいくつかの部分と会合し、界面活性物質の親水部分の影響によって溶解度を向上させる傾向がある。それらはまた、水性溶媒中に溶解した異なる疎水性物質の間に生じる疎水性相互作用を調節するために用いられてもよい。開示された方法の特定の実施形態を実施するのに適した界面活性物質の例としては、限定されないが、ポリソルベート界面活性物質（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、およびＴｗｅｅｎ  ８０、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート）およびトリトン（例えば、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）などの非イオン性界面活性物質、ならびに、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）、およびオクチルグルコシド（例えば、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−６−オクトキシオキサン−３，４，５−トリオール）などの双性イオン界面活性物質を含む。
【００５０】
「ウイルス」または「ビリオン」とは、超微細で（直径約２０〜３００ｎｍ）、代謝的に不活性な感染病原体のことをいい、生きている宿主、主にバクテリア、植物、および動物の細胞内でのみ複製し、それらはＲＮＡまたはＤＮＡコアと、タンパク質膜と、より複雑な種類では周囲膜とからなる。
【００５１】
特定の実施形態によれば、開示された方法を用いるのに備えて、チオ複素環カチオンを選択することが必要である。実験データは、凝集体を減少させるのに有効でありウイルスを不活性化することができるためにメチレンブルーが望ましいことを示している。抗マラリア薬およびメトヘモグロビン血症（ｍｅｔｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｅｎｉａ）の治療のための治療薬としての使用は、生体内ヒト使用の適合性を強調し、米国薬局方に載せられている。
【００５２】
特定の実施形態で使用されるチオ複素環カチオンの評価の過程で、適用条件は次のとおり調査されてもよい。チオ複素環カチオンの使用は、特定の実施形態における方法を実施するのに使用され得る条件にいくつかの制限を課す可能性がある。例えば、チオ複素環カチオンと対象のタンパク質との間の強い相互作用を実質的に防ぐ条件を使用することが望ましい場合がある。そのような条件に近づくための簡単な方法は、対象のタンパク質をアニオン交換体に適用し、塩勾配でそれを溶出することである。タンパク質が溶出する閾値の少し高い塩の濃度は、この方法が有効に実施され得る最小電気伝導率を大まかに特定する。この濃度はｐＨによって影響され、それは同じ手段で合わせられ得る。この方法が細胞培養上清に適用されるならば、ＩｇＧ抗体は、かなりの減少を防ぐために塩の添加またはｐＨの変更を必要としなくてもよい。ＩｇＭ抗体は、３０ｍＳ／ｃｍ（生理的なものより約２倍高い）に近い電気伝導率値に対してさえ塩の添加を必要とし得る。特定の実施形態において、不溶解ウレイドおよび陽性有機添加剤の使用に関して、ＩｇＧの適用が生理的電気伝導率より低い電気伝導率で行われてもよく、その値は１ｍＳ／ｃｍ以下を含む可能性があり、その場合、凝集体の解離とともに相当量の宿主タンパク質が除去され得る。そのような適用は、チオ複素環カチオンの濃度を、宿主タンパク質との結合によって失われた量を補うために上げることを必要とし得る。そうした状況でのより低い使用電気伝導率はまた、ＤＮＡ、エンドトキシン、およびウイルスの除去を高め得る。特定の実施形態において、開示された方法は概して９５％超、大抵は９８〜９９％の抗体回収率をサポートする。試料の電気伝導率およびｐＨ状態は通常、ウレイドまたはチオ複素環カチオンのいずれかを添加する前に確立されるべきである。
【００５３】
特定の実施形態において、ＩｇＧモノクローナル抗体を含有する清澄化された細胞培養上清の状態を評価する１つの有効手段は、チオ複素環カチオンの範囲を０．０１〜０．１％とし、電気伝導率の範囲を生理的電気伝導率の１／２から２倍とすることである。この範囲は、結果がそうすることが有用だと示すならば、さらに広げられてもよいし、あるいは狭められさらに細かい刻み値で評価されてもよい。
【００５４】
特定の実施形態において、清澄化された細胞培養上清のための開示された方法による精製手順の展開の簡便な開始点は、０．０２５％メチレンブルーを使用することである。
【００５５】
特定の実施形態において、その実施が抗体回収を向上させ得るため、陽性有機添加剤を添加する前に、タンパク質製剤中に有機調節因子を分散させることから始めることが有利であり得る。陽性有機添加剤の添加の前に長時間インキュベートすることは、不必要であるように思われる。より長時間のインキュベーションは不利ではないと思われるが、１５分以下で十分である。実験データは、過飽和量約１％のアラントインの添加がＩｇＧの回収を向上させることを概して示している。
【００５６】
特定の実施形態において、チオ複素環カチオンは、タンパク質製剤中での急速な分配を促すために、試料に添加される前に、例えば水または緩衝液などで、溶解されることが推奨される。例えば溶解チオ複素環カチオンをよく混ぜた懸濁液に徐々に注入することによって、難分解性の局所的な過剰物とならないように注意すべきである。インキュベーション時間は、少なくとも１５分、または約３０分だが、約６０分を超える必要はない。
【００５７】
この方法は通常、大気温度で実施することができるが、これより高い温度または低い温度で行われてもよく、例えば４〜３７℃の範囲である。実験データは、この温度は得られた結果を実質的に変えていないことを示し、それはタンパク質自体の安定性要件を使用温度の選択における決定因子とする。
【００５８】
特定の実施形態において、チオ複素環カチオンは、例えば、水または緩衝液で溶解または分散され、試料への添加の前にｐＨが調整される。これは、遊離塩基の形態などのチオ複素環カチオンの特定の製剤がアルカリ性であり、意図しない方法で実質的に実験状態を変える可能性があるためである。
【００５９】
特定の実施形態において、過飽和ウレイドおよびチオ複素環カチオンの両方の使用に関し、ウレイドアラントインとの経験が、この実施は抗体の回収を向上させ得ることを示しているので、チオ複素環カチオンを添加する前にタンパク質製剤にウレイドを分散させることから始めることが通常有利であり得る。陽性有機添加剤の添加の前に長時間インキュベートすることは、不必要であるように思われる。より長時間のインキュベーションは不利ではないと思われるが、１５分以下で十分である。
【００６０】
方法の開発中であれ、製作中であれ、この方法によって達成される凝集体の解離または除去を監視するために複数の選択肢が存在する。最も簡単な方法は、適切な選択性を有するカラム上で分析サイズ排除クロマトグラフィーを行い、ＵＶ波長２８０ｎｍで監視することである。それらは通常、複数の非凝集生成物のサイズにかなり適合する流体力学寸法を含むので、これはＨＭＷ（高分子量）凝集体を表わすことができる。ヘテロ凝集体は、それらの流体力学寸法が非凝集生成物の流体力学寸法よりわずかに大きいだけであるので、この方法によってはよく見逃される。そのような場合、凝集体の異形組成物は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度に対する２５４ｎｍのＵＶ吸光度比を算出することによって明らかにされてもよく、次にその値と、随伴の汚染物質が完全にないと考えられる精製タンパク質の吸光度比を比較する。例えば、ＤＮＡを含むヘテロ凝集体は、上昇比２５４／２８０で表される。クロマトグラフが機能を与える場合、メチレンブルー含有量は、６５５ｎｍで同時に監視され得る。これは、次の精製プロセスによってメチレンブルーの除去を記録するのに有用であり得る。複数の波長監視がまた、他のクロマトグラフィー法とともに使用されてもよい。あるいは、メチレンブルーは逆相高速液体クロマトグラフィーによって監視されてもよい。
【００６１】
特定の実施形態において、開示された方法は、後続の精製の前に、チオ複素環カチオンおよび試料の潜在的な他の成分を除去する処理と統合されてもよい。そのような処理は、チオ複素環カチオンを試料の残りの部分から隔離することを目的に、試料を、チオ複素環カチオンの特性と性質上相補的である化学部分を有する固体に触れさせることを含んでもよい。チオ複素環カチオンは、正電荷を持ち疎水性と理解されているため、疎水性負荷電表面を含む負荷電表面が、過剰なチオ複素環カチオンを隔離するのに特に役立つ。他の表面組成の固体が、試料の他の成分を隔離するために含まれてもよい。
【００６２】
特定の実施形態において、開示された方法は、限定されないが、プロテインＡおよび他の形態の生物学的アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキアパタイト、または他の混合モードクロマトグラフィー、および／または沈殿および液液抽出などの非クロマトグラフィー法を含む１つまたは２つ以上の精製方法と統合されてもよい。特定の抗体の必要な精製を達成するためにさまざまな方法の適切な条件を開発し、本明細書の開示された方法に統合することは、当業者の範囲内である。
【実施例】
【００６３】
実施例１
メチレンブルー対エタクリジンの独立した作用。約２ｇ／Ｌの濃度でＩｇＧ１モノクローナル抗体を含む細胞培養収集物を、遠心分離および精密濾過で清澄化した。凝集体含有量は２１％で、宿主タンパク質含有量は、ＩｇＧの３７１，４５９ｐｐｍであった。実験の対照群シリーズにおいて、異なるアリコートの清澄化された収集物を０．０１％、０．０２％、または０．０４％のエタクリジンと混合し、撹拌しながら２時間インキュベートした。別のシリーズにおいて、アリコートを同じ濃度に分けるためにメチレンブルーを加えた。疎水性ブチル基（ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  ｔｂｕｔｙｌ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を有する負荷電ポリマーから合成された固体粒子を５％ｖｏｌ／ｖｏｌの濃度で加え、１６時間混合しながらインキュベートした。固体は遠心分離で除去した。凝集体含有量および宿主タンパク質含有量は、両方のシリーズで減少したが、より多くはメチレンブルーによってであった。エタクリジンに関して、凝集体は１７％まで減少し、メチレンブルーに関しては１６％であり、エタクリジンまたはメチレンブルーの濃度に関してはほとんど差がなかった。エタクリジンに関しては、宿主タンパク質は、０．０１〜０．０４％の範囲にわたって、３２７，６２１、３１５，１８０、および３０７，０１４ｐｐｍまで減少した。メチレンブルーに関しては、対応する値は２５９，３５７、２４０，０５９、２２１，８１０ｐｐｍであり、メチレンブルーによる成績の方が平均２４％良いことを示した。ＩｇＧ回収率は両方の群において９１％であった。別の差異は、エタクリジン処理収集物とメチレンブルー処理収集物との間で見られた。エタクリジンで処理された試料においては、遊離抗体軽鎖の一部は、自発的に二量体化するように見えた。これはメチレンブルーの場合は見られず、この現象をさらには調査しなかったが、メチレンブルー上の硫黄原子の存在が潜在的役割を果たしていることを想定した。
【００６４】
実施例２
アラントインと混合されたメチレンブルー。約２ｇ／Ｌの濃度でＩｇＧ１モノクローナル抗体を含む細胞培養収集物を、遠心分離および精密濾過で清澄化した。凝集体含有量は６．８％で、宿主タンパク質含有量は、ＩｇＧの４０６，２３９ｐｐｍであった。アラントインを１％ｗ／ｖの量で加えた。メチレンブルーを０．０２％の量で加え、混合物を２時間インキュベートした。正荷電粒子（Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ  ＴＲＥＮ  ｈｉｇｈ）を２．５％ｖ／ｖの量で加え、負荷電粒子（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ｈｉｇｈ  Ｓ）を同じ割合で加え、１６時間混合しながらインキュベートした。固体を遠心分離および精密濾過で除去した。凝集体は３．３％まで減少し、宿主タンパク質は、１４３，３６２ｐｐｍまで減少し、ＩｇＧの回収率は９１％であった。混合物は１組のデプスフィルター（ＰＢ１およびＰＣ１，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させた。凝集体は２．１％まで減少した。宿主タンパク質は４３，３６０ｐｐｍまで減少し、ＩｇＧ回収率は８６％であった。
【００６５】
実施例３
ＩｇＧを含む細胞培養収集物の凝集体の減少。約２１％の凝集体を含むＩｇＧ細胞培養収集物は、ｐＨを８．０まで滴定し、アラントインを最終濃度１％ｗ／ｖまで添加し、その後メチレンブルーを０．０２５％の量で添加して処理した。混合物を室温で撹拌しながら１時間インキュベートした。Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ  ＴＲＥＮ−ｈｉｇｈおよびＭａｃｒｏｐｒｅｐ  ｔ−Ｂｕｔｙｌ粒子の４：１の混合物を、５０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０に平衡化し、それらの粒子を沈降させ、ＩｇＧ製剤の体積の５％の量の混合粒子を製剤に加えた。混合物を４時間撹拌しながらインキュベートし、固体を遠心分離によって除去した。分析のために除去した試料は、凝集体が最初の２１％から２．１％に減少したことを示した。ＤＮＡは９９％超減少し（ＡｃｃｕＢｌｕｅ，Ｂｉｏｔｉｕｍ）、宿主タンパク質は８１％減少した（宿主タンパク質ＥＬＩＳＡ，Ｃｙｇｎｕｓ）。混合物は１組のデプスフィルター（ＰＢ１およびＰＣＩ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させた。凝集体はさらに０．５％未満まで減少し、宿主タンパク質は最初の収集物と比較して合計９１％減少した。
【００６６】
実施例４
ＩｇＭを含む細胞培養収集物の凝集体の減少。約２３％凝集体を含むＩｇＧ細胞培養収集物を、最終電気伝導率２０ｍＳ／ｃｍを生じる量のＮａＣｌを添加し、その後、最終比率１％のアラントインを添加し、その後、０．０２５％の量でメチレンブルーを添加して処理した。混合物は室温で撹拌しながら２時間インキュベートした。１：１：１：１のＭａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ｔ−Ｂｕｔｙｌ、およびＣｈｅｌｅｘ  １００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の混合物を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２に平衡化し、それらの粒子を沈降させ、ＩｇＭ製剤の体積の５％の量の混合粒子を製剤に加えた。製剤を撹拌しながら４時間インキュベートした。固体は遠心分離によって除去し、その後、０．２２ミクロン膜によって膜濾過を行った。凝集体含有量は最初の２３％から１％未満に減少した。ＤＮＡは９９％超減少し、宿主細胞タンパク質汚染は４７％減少した。
【００６７】
特定の要件を満たすのに必要などんな体積であろうと、上記の実施例に記載のような実験の結果をスケールアップしたりスケールダウンしたりする方法を、当業者は理解するであろう。
【００６８】
本明細書の全ての引用文献は、それぞれの個別の文献または特許または特許出願が、全ての目的のためにその全体を参照することによって組み込まれるように具体的に個別に示されるのと同じ程度まで、その全体を全ての目的のために参照することによって組み込まれる。参照によって組み込まれる文献および特許または特許出願が、本明細書に含まれる開示と矛盾するという点で、本明細書は、いかなるそのような矛盾する物質に取って代わり、および／または優先されることが意図される。
【００６９】
本明細書および請求項で使用される要素、クロマトグラフィー条件などの量を表す全ての数は、全ての例において、「約」の語で修飾されると理解されるものとする。したがって、反対に示されない限り、本明細書および添付の請求項に記載の数値パラメーターは、本開示の方法によって得られることが求められる所望の成績によって変わり得る近似値である。
【００７０】
本開示の方法の多くの修正および変形が、当業者には明らかであるように、その精神および範囲から逸脱しないでなされ得る。本明細書に記載の具体的な実施形態は、単なる例として示され、それはいかなる点においても限定を意図していない。本明細書および実施例は例示としてのみ見なされることが意図され、本開示の方法の正確な範囲および精神は以下の請求項によって示される。