(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースの酸化反応を触媒する酵素を固定化した固定化体とグルコース酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構と、フルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体とフルクトシルペプチドの酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構と、全ヘモグロビンを検知する機構と、糖化ヘモグロビンを含む検体をタンパク質分解酵素で処理する機構と、フルクトシルバリルヒスチジンの検知結果とヘモグロビンの検知結果に基づきＨｂＡ１ｃを得るための第一演算機構と、全血／血球グルコースとヘモグロビンの検知結果に基づき全血／血球グルコースを血漿グルコースに補正する第二演算機構を備えたことを特徴とするグルコースと糖化ヘモグロビンの分析装置。
【請求項２】
グルコースの酸化反応を触媒する酵素を固定化した固定化体とグルコース酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構と、フルクトシルＬ−バリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを固定化した固定化体またはフルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体とフルクトシルアミノ酸またはフルクトシルペプチドの酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構と、糖化ヘモグロビンを含む検体をタンパク質分解酵素で処理する機構と、全ヘモグロビンを検知する機構と、検体中グルコースとフルクトシルＬ−バリンまたは検体中グルコースとフルクトシルバリルヒスチジンの検知結果に基づき検体中グルコースの影響を排除したフルクトシルＬ−バリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの測定値を得る第三演算機構と、フルクトシルＬ−バリンの前記測定値とヘモグロビンの検知結果またはフルクトシルバリルヒスチジンの前記測定値とヘモグロビンの検知結果に基づきＨｂＡ１ｃを得るための第一演算機構と、全血／血球グルコースとヘモグロビンの検知結果に基づき全血／血球グルコースを血漿グルコースに補正する第二演算機構とを備えたことを特徴とするグルコースと糖化ヘモグロビンの分析装置。
【請求項３】
緩衝液を連続して送液する機構と、その下流の緩衝液に検体を注入する機構（４、５、７）を備え、検体を注入する機構（４、５、７）の下流にグルコースの酸化反応を触媒する酵素を固定化した固定化体とグルコース酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構（１７、１８）と、フルクトシルＬ−バリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを固定化した固定化体またはフルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体とフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構（１９、２０）を配置するとともに、検体を注入する機構（４、５、７）を含み、検体を注入する機構（４、５、７）の下流に全ヘモグロビン濃度を検知する機構（１６）を配置したことを特徴とする請求項１又は２記載のグルコースと糖化ヘモグロビンの分析装置。
【請求項４】
以下の工程を含む、検体中のグルコースと糖化ヘモグロビンの分析方法:
糖化ヘモグロビンを含む検体をタンパク質分解酵素で処理する工程；
グルコースの酸化反応を触媒する酵素を固定化した固定化体と、グルコース酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構を用いて検体中のグルコース濃度を電気化学的に検知する工程；
フルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体と、フルクトシルペプチドの酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構を用いて検体中のフルクトシルバリルヒスチジンを電気化学的に検知する工程；
全ヘモグロビンを検知する機構を用いて、検体中の全ヘモグロビンを検知する工程；
フルクトシルバリルヒスチジンの検知結果とヘモグロビンの検知結果に基づきＨｂＡ１ｃを得る工程；および
全血／血球グルコースとヘモグロビンの検知結果に基づき全血／血球グルコースを血漿グルコースに補正する工程。
【請求項５】
以下の工程を含む、検体中のグルコースと糖化ヘモグロビンの分析方法:
糖化ヘモグロビンを含む検体をタンパク質分解酵素で処理する工程；
グルコースの酸化反応を触媒する酵素を固定化した固定化体と、グルコース酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構を用いて検体中のグルコース濃度を電気化学的に検知する工程；
フルクトシルＬ−バリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを固定化した固定化体またはフルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体と、フルクトシルアミノ酸またはフルクトシルペプチドの酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構を用いて検体中のフルクトシルＬ−バリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンを電気化学的に検知する工程；
全ヘモグロビンを検知する機構を用いて、検体中の全ヘモグロビンを検知する工程；
検体中グルコースとフルクトシルＬ−バリンまたは検体中グルコースとフルクトシルバリルヒスチジンの検知結果に基づき検体中グルコースの影響を排除したフルクトシルＬ−バリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの測定値を得る工程；
フルクトシルＬ−バリンの前記測定値とヘモグロビンの検知結果またはフルクトシルバリルヒスチジンの前記測定値とヘモグロビンの検知結果に基づきＨｂＡ１ｃを得る工程；および
全血／血球グルコースとヘモグロビンの検知結果に基づき全血／血球グルコースを血漿グルコースに補正する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高速かつ高精度に血糖値と糖化ヘモグロビン量を測定する分析装置に関し、健康管理、臨床診断等に資するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病の診断ならびに治療を目的とした診断項目として血糖値と糖化ヘモグロビン比率が広く用いられている。糖尿病の発症により、血糖値が上昇する。ただし血糖値は食事等の摂取により上昇し、変動の激しい測定項目である。したがって空腹時血糖値は糖尿病の一次スクリーニング、日常の治療成果の確認には適しているが、血糖値のみで糖尿病の正確な病態を把握することは困難である。そのため数多くの診断指標が提案されている。中でもヘモグロビンの糖化率は有力な指標である。糖化ヘモグロビンとはヘモグロビンに糖が非酵素的に結合した糖化タンパク質の一種である。糖化ヘモグロビンの中でも特に、ＨｂＡ１ｃと呼ばれる画分はヘモグロビンＡのβ鎖Ｎ末端のバリン残基にグルコースがシッフ塩基を形成してアルジミン（不安定型）となり、さらにアマドリ転位を受けてケトアミン化合物を生成したものである。なおアルジミン構造をとるものを不安定糖化ヘモグロビン、ケトアミン構造をとる場合を安定糖化ヘモグロビンと呼ぶ。なお、アマドリ転位後の前記β鎖のＮ末端はフルクトシルバリン残基となる。
【０００３】
この反応過程に酵素の関与はなく、血漿中のグルコース濃度に応じてその量が増加し、いわゆる血漿中の血糖値が平均的に長期間高い値を示すとＨｂＡ１ｃは高値となる。安定型糖化ヘモグロビンはその赤血球の寿命が尽きるまで消滅しない。一般にヘモグロビン分子の生体内での寿命は２ヶ月程度とされており、その結果、ＨｂＡ１ｃの値は過去１〜２ヶ月間の平均血糖値を反映するとされている。そのためＨｂＡ１ｃは長期間の血糖値の平均値の指標として用いられる。ＨｂＡ１ｃは長期間の平均値であるため、糖尿病の確定診断、治療のための判断材料として用いるのに適しているとされている。
【０００４】
そのため、すでに糖化ヘモグロビンについて多種多様の測定方法が提案されている。その代表的なものとして、高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ）、免疫法、酵素法が挙げられる。
【０００５】
ＨＰＬＣ法は、現在最も多用される方法である。分離カラムによりヘモグロビンを分画し、ＨｂＡ１ｃに相当する保持容量に溶出したピークと、全ピーク面積の比率からＨｂＡ１ｃの存在比率を算出する。いわば相対面積法をとるため、注入容量の精度をある程度無視できるなどの利点がある。しかし装置が大型かつ複雑であり、メンテナンス負荷が大きい等の問題がある。また、不安定型ＨｂＡ１ｃと安定型ＨｂＡ１ｃが区別できないため、あらかじめ不安定型ＨｂＡ１ｃを除去後に分離分析を行わなければならないという欠点を有する（特許文献１）。同時に先天的なヘモグロビンの変異がある場合は、分離パターンが変化して異常値を示す場合がある。また他の生体成分が偶然ＨｂＡ１ｃのピークと重複することによる誤差を含む可能性がある。
【０００６】
免疫法はＨｂＡ１ｃのβ鎖のＮ末端付近の構造に対応した抗体を利用することにより、より高精度な分析を、より簡単な機構で達成できる可能性を有する。しかし一般的な免疫分析のように血清を対象とするのではなく、全血を溶血させた検体を対象とするため、非特異反応や、反応を検知するために用いる比色計を汚染し、必ずしも満足できる精度が得られないことが指摘されている。
【０００７】
一方で酵素法は、糖化タンパク質から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを何らかの手法で切り出した後、生じた糖化アミノ酸量または糖化ペプチド量をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ等の酵素を用いて検出するものである。酵素の選択性を利用することにより、より高精度の分析を実施できる可能性があり、種々の検討がなされている。
【０００８】
糖化アミノ酸を酵素により測定する方法は特許文献２に、また糖化ペプチドを酵素により測定する方法は特許文献３に記載されている。さらに糖化タンパク質から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを切り出す方法として、タンパク質分解酵素を利用する方法があり、糖化タンパク質に作用しうるタンパク質分解酵素の検討もされている（特許文献４、５、６、７）。
【０００９】
さらに、糖尿病の臨床診断に使用される指標値であるＨｂＡ１ｃは糖化ヘモグロビンとヘモグロビンとの比率で表されるため、試料中の糖化ヘモグロビン量を測定するとともにヘモグロビンを定量する必要がある。公知の方法でヘモグロビンを定量し、酵素法で測定した糖化ヘモグロビンとの比率を算出した例がある（特許文献８）。
【００１０】
このように糖化ヘモグロビンの測定に際して主にＨＰＬＣ法、免疫法、酵素法の３つが提案されているが、いずれも糖化ヘモグロビン比率のみを測定するものであった。臨床診断の立場からは血糖値と糖化ヘモグロビン比率が、実質的に同時に求められることが望ましい。
【００１１】
従来この２つの指標値を同時に算出する場合、まず適当な血糖計で血糖値を測定した後、血液試料をＨｂＡ１ｃ分析装置に搬送して別途ＨｂＡ１ｃ分析装置でＨｂＡ１ｃを測定するものであった。このような構成の元では、２種類の専用分析装置が必要であり、各装置に試料の注入機構や送液機構が存在するため、広い設置スペースを必要とする上、各分析装置で使用する溶液組成が全く異なるため、それぞれに応じた溶離液や緩衝液が必要であった。また、正確には２つの指標値を同時に算出しているとは言えない。
【００１２】
このように従来２つの指標値を同時に正確に算出する有効な方法は提案されていない。
【００１３】
また、糖化ヘモグロビンを酵素法で定量する際、血中成分またはタンパク質分解酵素処理後の生成物に由来する糖化アミノ酸オキシダーゼ等の酵素への妨害を除く有効な方法は提案されていない。
【特許文献１】特公平５−５９３８０号
【特許文献２】特公平５−３３９９７号
【特許文献３】特開２００１−９５５９８号
【特許文献４】特開平１１−１９６８９７号
【特許文献５】特開２００３−２３５５８５号
【特許文献６】特開２００４−３４４０５２号
【特許文献７】特開２００５−１１０６５７号
【特許文献８】ＷＯ２００３／０６４６８３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、検体中に含まれる血糖値と糖化ヘモグロビン比率を簡便かつ高精度で算出する装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、グルコースの酸化反応を触媒する酵素を固定化した固定化体とグルコース酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構と、フルクトシルＬ−バリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを固定化した固定化体またはフルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体とフルクトシルアミノ酸またはフルクトシルペプチドの酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構と、全ヘモグロビンを検知する機構を備え、フルクトシルＬ−バリンとヘモグロビンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの前記測定値とヘモグロビンの検知結果に基づきＨｂＡ１ｃを得るための第一演算機構と、全血／血球グルコースとヘモグロビンの検知結果に基づき全血／血球グルコースを血漿グルコースに補正する第二演算機構を備えたことを特徴とするグルコースと糖化ヘモグロビンの分析装置を開示する。
【００１６】
さらに好適な構成として、前記の機構を備えた分析装置に、検体中グルコースとフルクトシルＬ−バリンまたは検体中グルコースとフルクトシルバリルヒスチジンの検知結果に基づき検体中グルコースの影響を排除したフルクトシルＬ−バリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの測定値を得る第三演算機構を備えた糖化ヘモグロビンの分析装置を開示する。
【００１７】
また本発明では、緩衝液を連続して送液する機構と、その下流の緩衝液に検体を注入する機構（４、５、７）を備え、検体を注入する機構（４、５、７）の下流にグルコースの酸化反応を触媒する酵素を固定化した固定化体とグルコース酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構（１７、１８）と、フルクトシルＬ−バリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを固定化した固定化体またはフルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体とフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構（１９、２０）を配置するとともに、検体を注入する機構（４、５、７）の上流または下流に全ヘモグロビン濃度を検知する機構（１６）を配置したことを特徴とするグルコースと糖化ヘモグロビンの分析装置を開示する。
【００１８】
さらに本発明では、以下の工程を含む、検体中のグルコースと糖化ヘモグロビンの分析方法を開示する:
グルコースの酸化反応を触媒する酵素を固定化した固定化体と、グルコース酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構を用いて検体中のグルコース濃度を電気化学的に検知する工程；
フルクトシルＬ−バリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを固定化した固定化体またはフルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体と、フルクトシルアミノ酸またはフルクトシルペプチドの酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構を用いて検体中のフルクトシルＬ−バリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンを電気化学的に検知する工程；
全ヘモグロビンを検知する機構を用いて、検体中の全ヘモグロビンを検知する工程；
フルクトシルＬ−バリンとヘモグロビンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの検知結果とヘモグロビンの検知結果に基づき第一演算機構によりＨｂＡ１ｃを得る工程；および
全血／血球グルコースとヘモグロビンの検知結果に基づき第二演算機構により全血／血球グルコースを血漿グルコースに補正する工程。
【００１９】
さらに好適な構成として、前記の分析方法において、検体中グルコースとフルクトシルＬ−バリンまたは検体中グルコースとフルクトシルバリルヒスチジンの検知結果に基づき第三演算機構により検体中グルコースの影響を排除したフルクトシルＬ−バリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの測定値を得る工程をさらに含み、得られた測定値とヘモグロビンの検知結果に基づき第一演算機構によりＨｂＡ１ｃを得る。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、血液検体中の血漿グルコース濃度と糖化ヘモグロビン比率（すなわちＨｂＡ１ｃ）を簡便且つ高精度で定量することができる。
【００２１】
本発明の装置によれば、第一および第二の演算機構を用いてグルコースとＨｂＡ１ｃ を同時に算出できる。さらに検体中グルコース濃度は、ＨｂＡ１ｃの算出に必須のヘモグロビン濃度に基づき第二演算機構により血漿中グルコース濃度に変換され、検体中フルクトシルＬ−バリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの濃度はグルコースの影響を第三演算機構により排除された後、第二演算機構によりＨｂＡ１ｃに変換されるため、全体として血漿中グルコースとＨｂＡ１ｃを効率および精度よく測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の構成及び好ましい形態についてさらに詳しく説明する。
【００２３】
本発明におけるグルコースの測定は、グルコースの酸化反応を触媒する酵素を固定化して用いる。該当する酵素としては、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４）、ピラノースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．１０）、グルコース脱水素酵素（ＥＣ１．１．９９．１０）などがある。中でもグルコースオキシダーゼは耐久性が高く、基質選択性に優れるため望ましい。
【００２４】
また、臨床検査の分野におけるグルコース値は、通常血漿中のグルコースで評価されている。全血中にはヘモグロビン等の溶媒となりえない成分を含んでいるため、全血グルコース濃度値は血漿グルコース濃度値とは異なる。糖化ヘモグロビン比率の測定では、ヘモグロビンを含む検体が対象となり、使用する検体は全血もしくは血球である。全血を対象とし、糖化ヘモグロビン比率とグルコースを同時測定した際に検出されるグルコース値は、全血グルコース値である。
【００２５】
なお、全血グルコースと血球(赤血球)グルコースは、新鮮血ではほぼ等価であるので、本明細書では、全血グルコースと血球(赤血球)グルコースを「全血グルコース」と表現する場合がある。
【００２６】
全血グルコース値から血漿グルコース値を算出する方法としては、ヘマトクリット値を何らかの方法で測定して全血グルコース値を補正する方法（ヘマトクリット補正）があるが、別途ヘマトクリット値を測定する装置が必要であるため、分析装置が大型で複雑になり、望ましくない。本発明においては、糖化ヘモグロビン比率を測定する際に、必ずヘモグロビン濃度を測定するので、ヘモグロビン濃度から血球分の補正係数を算出して全血グルコース値を補正する第二演算機構を備えることで、装置を大型化することなく血漿グルコース値を算出できる。
【００２７】
糖化アミノ酸の測定は、糖化アミノ酸を酸化して過酸化水素を生成するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを固定化して使用する。糖化ヘモグロビンＮ末端の糖化アミノ酸であるフルクトシルバリンの検出の際にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼに要求される特性は、ε-アミノ基が糖化されたフルクトシルリジンには実質的に作用せず、フルクトシルバリンに特異的に作用することが好ましい。これは、血清中に含まれるアルブミンが糖化されたものからε-アミノ基が糖化されたリジンが遊離してくる場合や、ヘモグロビンに含まれるリジン糖化物が測定結果に正の誤差を生じる可能性があるためである。このような特性を有するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとしては、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが例示できる。
【００２８】
しかしながら、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、糖化アミノ酸だけでなく、わずかではあるがグルコースにも作用する場合があることを本発明者らは発見した。血中には、糖化ヘモグロビンの約１００倍濃度のグルコースが存在するので、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼがグルコースにも作用する場合、検出されたフルクトシルバリン値は血中のグルコースによる正の誤差を含んでおり、正確なフルクトシルバリン濃度が得られない。従って、検体中のグルコースのフルクトシルバリン検出値への妨害を除くため、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化体とともにグルコースオキシダーゼ固定化体を配置し、グルコースと同時にフルクトシルバリンを測定し、フルクトシルバリン検出値から検体中のグルコースによる妨害を第三演算装置により差演算する。
【００２９】
糖化ペプチドの測定は、糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化して使用する。糖化ヘモグロビンＮ末端の糖化ジペプチドであるフルクトシルバリルヒスチジンの検出の際に、フルクトシルペプチドオキシダーゼに要求される特性は、糖化ヘモグロビンα鎖Ｎ末端の糖化ジペプチドであるフルクトシルバリルロイシンやε-アミノ基が糖化されたε−フルクトシルリジンには実質的に作用せず、糖化ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端の糖化ジペプチドであるフルクトシルバリルヒスチジンに特異的に作用する酵素が好ましい。
【００３０】
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと同様に、フルクトシルペプチドオキシダーゼがグルコースにも作用する場合には、グルコースオキシダーゼ固定化体と同時に使用して糖化ペプチドとグルコースを同時に測定し、糖化ペプチドの検出値から検体中のグルコースによる妨害を第三演算機構により差演算する。
【００３１】
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼまたはフルクトシルペプチドオキシダーゼを用いた糖化アミノ酸または糖化ペプチド検出系で、検体中のグルコースが糖化アミノ酸または糖化ペプチド検出値に妨害を与える場合、これらの妨害を除くための、演算方法について説明する。具体的には、グルコース検出系で糖化アミノ酸または糖化ペプチドが応答し、糖化アミノ酸または糖化ペプチド検出系でグルコースが応答する場合、まず各検出系でグルコースと糖化アミノ酸または糖化ペプチドの検量線を作成する。その後各検出系で得られた試料に対する応答値を、各検量線を用いて差演算するものである。
【００３２】
グルコースオキシダーゼ固定化体と第1の過酸化水素電極を組み合わせたグルコース検出系で得られたグルコースの検量線を
ｙ＝ａ１１×ｘ＋ｂ１１
フルクトシルバリンの検量線を
ｙ＝ａ１２×ｘ＋ｂ１２
とし、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼまたはフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化体と過酸化水素電極を組み合わせた糖化アミノ酸または糖化ペプチド検出系で得られたグルコースの検量線を
ｙ＝ａ２１×ｘ＋ｂ２１
フルクトシルバリンの検量線を
ｙ＝ａ２２×ｘ＋ｂ２２
とすると、ｘ１の濃度のグルコースとｘ２の濃度のフルクトシルバリンによる応答値は、第１の過酸化水素電極では、
ｙ１＝ａ１１×ｘ１＋ｂ１１＋ａ１２×ｘ２＋ｂ１２
第2の過酸化水素電極では、
ｙ２＝ａ２１×ｘ１＋ｂ２１＋ａ２２×ｘ２＋ｂ２２
となる。
【００３３】
これらの値を元にグルコース、フルクトシルバリンの濃度をそれぞれ求めると、グルコースの濃度ｘ１は  
ｘ１＝（ａ１２×（ｙ２−ｂ２１−ｂ２２）−ａ２２×（ｙ１−ｂ１１−ｂ１２））／（ａ１２×ａ２１−ａ１１×ａ２２）
フルクトシルバリンの濃度ｘ２は
ｘ２＝（ａ１１×（ｙ２−ｂ２１−ｂ２２）−ａ２１×（ｙ１−ｂ１１−ｂ１２））／（ａ１１×ａ２２−ａ１２×ａ２１）
となる。
【００３４】
グルコース検出系でフルクトシルバリンが、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼまたはフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化体でグルコースが応答する場合でも、グルコースとフルクトシルバリンの濃度が算出でき、分別定量が可能である。
【００３５】
グルコース検出系でフルクトシルバリンが応答しない場合、上式の ａ１２、ｂ１２ は ０ となり、グルコースの濃度ｘ１は
ｘ１＝（ｙ１−ｂ１１）／  ａ１１
フルクトシルバリンの濃度ｘ２は
ｘ２＝（ａ１１×（ｙ２−ｂ２１−ｂ２２）−ａ２１×（ｙ１−ｂ１１））／（ａ１１×ａ２２）
となり、グルコース検出系と糖化アミノ酸または糖化ペプチド検出系でグルコースとフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの検量線を作製し、試料のフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジン検出値から、上式により試料中のグルコース濃度とフルクトシルバリン濃度が正確に算出できる。
【００３６】
さらに、糖化ヘモグロビン比率であるＨｂＡ１ｃの算出は、検体中のグルコースに由来する妨害を差演算して求められたフルクトシルバリン濃度またはフルクトシルバリルヒスチジン濃度と、検体中のヘモグロビン濃度との比率を第一演算機構により算出することで求められる。
【００３７】
グルコースオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ等の酵素固定化方法としては、物理吸着法、イオン結合法、包括法、共有結合法などタンパク質の固定化方法として公知の方法を利用できるが、中でも共有結合法が長期安定性に優れ望ましい。タンパク質を共有結合させる方法としては、ホルムアルデヒド、グリオキザール、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド基を有する化合物を用いるか、多官能基性アシル化剤を利用する方法、スルフヒドリル基を架橋させる方法など各種の方法を利用できる。酵素固定化体の形状としては、膜状に固定化し白金、金、カーボンなどからなる電極上にのせることもできるし、不溶性担体に固定化し担体をカラムリアクターに充填して用いることもできる。
【００３８】
さらに固定化の際に他種の酵素あるいはゼラチンや血清アルブミンなどのタンパク質、ポリアリルアミンやポリリジンなどの合成高分子を共存させ、酵素固定化体の特性、すなわち膜強度、基質透過特性などを変更することもできる。酵素を不溶性担体に固定化する場合の担体としては、粘土鉱物、ケイソウ土、活性炭、アルミナセラミックス、酸化チタン、架橋処理デンプン粒子、セルロール系高分子、キチンおよびキトサン誘導体などの公知の担体を利用できる。
【００３９】
検体中のグルコース、タンパク質分解酵素の作用によって糖化ヘモグロビンから生成した糖化ペプチド及び糖化アミノ酸は、順次グルコースオキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ及びフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（順序は問わない）で過酸化水素に変換し、各々のオキシダーゼにより生成した過酸化水素を電気化学的に検出することで、各物質濃度が測定できる。しかしながら、天然に存在するヘモグロビン糖化物の糖化率は約５％と低く、タンパク質分解酵素の処理によって生じたフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジン由来の過酸化水素量が通常よりも少ないことが十分に予想されるため、糖化ペプチド及び糖化アミノ酸を測定する場合には、過酸化水素を高感度で検出する。過酸化水素は公知の方法により直接、間接的に測定することができるが、ヘモグロビン自身が４００〜６００ｎｍ付近に吸収帯を有しているため、公知の方法の中でもこれらの波長領域での過酸化水素の吸光度検出はヘモグロビンの吸収による妨害が大きく、実際の糖化ヘモグロビン測定には適用できない可能性が高い。これらのことから過酸化水素の高感度計測には、アンペロメトリー等の電気化学的な手法を用いるのがより好ましい。
【００４０】
糖化ヘモグロビンをタンパク質分解酵素で処理する方法は、まず糖化ヘモグロビンを含む検体を界面活性剤含有緩衝液と混合し、次にタンパク質分解酵素を添加して所定時間反応させる、または糖化ヘモグロビンを含む検体を界面活性剤含有緩衝液と混合した試料をタンパク質分解酵素が固定化された担体と所定時間接触させる等の方法が挙げられ、何れの方法を用いてもよい。
【００４１】
糖化ヘモグロビンを含む検体を処理する際に使用する界面活性剤には、溶血作用とヘモグロビンの分子構造を変化させる２つの作用が必要である。ヘモグロビンは赤血球内に大部分が存在し、適切な濃度の界面活性剤存在下ではヘモグロビンが赤血球外に放出される。また、ヘモグロビンは通常折りたたまれた状態で存在するが、適切な濃度の界面活性剤中では緩んだ状態で存在し、この作用によりタンパク質分解酵素による分解が容易になると推測される。界面活性剤としては、非イオン系のポリオキシエチレンアルキルエーテル類[例えばポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル(トリトンＸ−１００)、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル等]やポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類[例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ツイーン２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ツイーン４０）等]、陰イオン系のポリオキシエチレンアルキルエーテル類やアルキル硫酸塩［ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等）］、陽イオン系、両性イオン系があるが、陰イオン系界面活性剤が先に述べた２つの効果が高く、望ましい。その濃度は０．０５〜１０％、好ましくは０．０５〜１％で、界面活性剤との反応時間は数秒〜１０分程度である。
【００４２】
糖化ヘモグロビンを含む検体を処理する際に使用する緩衝液は、ヘモグロビンが溶解できるｐＨ範囲の緩衝液であれば特に限定されず、リン酸緩衝液やトリス緩衝液等の公知の緩衝液及びその塩を使用すればよい。緩衝液には塩化ナトリウムや塩化カリウム等の塩を適宜添加してもよい。
【００４３】
使用しうるタンパク質分解酵素は、糖化ヘモグロビンのＮ末端から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを生じる作用が大きく、ヘモグロビンが十分に溶解できるｐＨ範囲に至適を有するタンパク質分解酵素が好ましく使用できる。具体的にはｐＨ６．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ６．０〜８．０に至適を有し、糖化ヘモグロビンのＮ末端から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを生じる作用の大きいタンパク質分解酵素であればよい。このような作用を有するタンパク質分解酵素として、糖化アミノ酸を生成する作用が大きい中性域またはアルカリ域に至適ｐＨを有するアスペルギルス属由来のタンパク質分解酵素と、糖化ペプチドを生成する作用が大きい中性域または酸性域に至適ｐＨを有するバチルス属由来のタンパク質分解酵素が例示できる。
【００４４】
本明細書において、「アスペルギルス属タンパク質分解酵素」あるいは「アスペルギルス属微生物由来のプロテアーゼ」または「バチルス属タンパク質分解酵素」あるいは「バチルス属微生物由来のプロテアーゼ」とは、アスペルギルス属またはバチルス属の微生物が産生するプロテアーゼ自体であってもよく、該プロテアーゼのアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸を置換、付加、欠失、挿入させることで得られる改変体であって、アスペルギルス属タンパク質分解酵素またはバチルス属タンパク質分解酵素のように、フルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジン濃度を高めることができる改変体は広く包含される。
【００４５】
ヘモグロビン濃度を測定する方法としては、シアンメトヘモグロビン法、メトヘモグロビン法、アザイドヘモグロビン法、ＳＬＳ−ヘモグロビン法等の公知の方法を用いればよいが、中でも種々の酵素に阻害や失活等の影響が少なく、試薬廃棄時に環境に対する負荷が小さいＳＬＳ−ヘモグロビン法が好ましい。ＳＬＳ−ヘモグロビン法は、血液試料を陰イオン系界面活性剤であるアルキル硫酸塩溶液（以後ヘモグロビン測定試薬と表記する）で処理した後、５４０ｎｍでの試料の吸光度変化から算出するものである。アルキル硫酸塩はラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）やポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等を適宜選択して使用し、ヘモグロビン測定試薬中には緩衝液や各種塩類を含んでいてもよい。アルキル硫酸塩の濃度は、反応溶液中の血球濃度０．２５〜２０体積％に対して０．０５〜１０％、好ましくは０．０５〜１％である。血液試料とヘモグロビン測定試薬の反応は数秒〜数分程度で完了する。
【００４６】
また、アルキル硫酸塩を含むヘモグロビン測定試薬中に、タンパク質分解酵素を作用させる際に使用する界面活性剤含有緩衝液を同時に共存させて、溶血、ヘモグロビンの変性、ＳＬＳ−ヘモグロビンの形成反応を同時に行ってもよく、検体のヘモグロビン測定試薬との反応後にタンパク質分解酵素処理用の界面活性剤含有緩衝液を加えてもよく、逆の順序でもよい。
【００４７】
ヘモグロビン測定試薬中の界面活性剤とタンパク質分解酵素処理用の界面活性剤は、上記の条件を満たすものであれば、異なっていてもよく、同一であってもよい。
【００４８】
ヘモグロビン濃度の測定は、検体とヘモグロビン濃度測定試薬の反応終了後で反応液の吸光度が安定である時間の範囲内であれば如何なる時間に測定してもよく、検体のタンパク質分解酵素の処理前後、グルコース及びフルクトシルバリン及びフルクトシルバリルヒスチジンの検出の前後のいずれでもよい。
【００４９】
ヘモグロビン測定試薬で処理した検体の吸光度を測定する方法としては、キュベットに該試料を分注して特定の波長の吸光度を測定するバッチ法、もしくはテフロン（登録商標）管をセルとして試料がテフロン（登録商標）管を通過する際の特定の波長の吸光度変化を測定するフロー法を用いればよく、操作が簡単であることからフロー法がより望ましい。
固定化された酵素に試料を一定時間接触させて反応を進行させるには、試料液を一定時間撹拌しながら反応を起こさせるバッチ方式でも可能であるが、より高精度の測定を実施するためにフロー方式の測定を用いることが望ましい。本発明ではより高精度の測定を行えるフロー方式の装置を開示する。
【００５０】
本発明の1つの好ましい実施形態を図１に示す。緩衝液の流れを形成する機構（１、２）と検体を注入する機構（４、５、７）、該試料注入機構の下流にタンパク質分解酵素固定化体（１４）、ヘモグロビン濃度検出用フロー型比色計（１６）と電気化学的活性物質濃度を検知できる電極（１８、２０）を配置し、ヘモグロビン濃度検出系（１６）、グルコース検出用電極系（１７、１８）と糖化アミノ酸または糖化ペプチド検出用電極系（１９、２０）で構成される。
【００５１】
具体的には、緩衝液槽（１）より緩衝液Ａをポンプ（２）により送液する。試料（６）にニードル（７）を挿入し、バルブ（１０）を閉じ、バルブ（１１）を開けて、シリンジポンプ（１２）を引くことにより検体を計量バルブ（４）の計量ループ（５）に引き込む。次に計量バルブ（４）を切り替え、緩衝液Ａによりループ（５）内に溜まった検体を押し出す。過剰の検体は一旦バルブ（１０）を開けてバルブ（１１）を閉じ、洗浄液（９）をシリンジポンプ（１２）に引き込んだ後、バルブ（１０）を閉じバルブ（１１）を開けて洗浄液を押し出すことにより、廃棄ポット（８）に押し出され、廃液ボトル（２２）に貯留される。注入された試料は緩衝液Ａの流れにのって恒温槽（１３）内に配置されたタンパク質分解酵素固定化体（１４）を通り、試料中の糖化タンパク質から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを生成する。タンパク質分解酵素の作用した試料は、緩衝液Ａの流れに従ってさらに下流のフロー型比色計（１６）を通り、試料が通過する際の一定波長の吸光度変化から試料中のヘモグロビン濃度が検知される。次に試料は、グルコースオキシダーゼ固定化体（１７）を通り、そこで生成した過酸化水素が過酸化水素電極（１８）で検知される。続いてフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化体またはフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化体（１９）を通り、そこで生成した過酸化水素が下流の過酸化水素電極（２０）で検知される。廃液は背圧コイル（２１）を通り、廃液ボトル（２２）に溜まる。
【００５２】
図２は、血液試料による測定系の汚染を連続的に除去可能な透析モジュールを組み込んだ、フロー型のグルコースと糖化アミノ酸または糖化ペプチド同時測定装置の例である。緩衝液槽（２４）より緩衝液Ｂをポンプ（２５）により送液し、試料注入機構（４、５、７）により試料（６）を緩衝液Ｂの流れに注入する。注入された試料は、緩衝液Ｂの流れにのって恒温槽（１３）内に設置されたフロー型比色計（１６）を通り、一定波長の吸光度変化からヘモグロビン濃度が検知された後、さらに下流に配置されたタンパク質分解酵素固定化カラム（１４）を通り、試料中の糖化タンパク質から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを生成する。タンパク質分解酵素の作用した試料はさらに下流に設置された透析モジュール（２７）に運ばれ、膜厚さ２０μｍ、分子量分画１２０００〜１４０００の再生セルロース膜で試料中の低分子成分のみがグルコースと糖化アミノ酸または糖化ペプチド検出機構（１７、１８、１９、２０）に導かれる。緩衝液槽（１）より緩衝液Ａがポンプ（２）により送液されているので、透析モジュール（２７）で透析された試料中の低分子成分はグルコースオキシダーゼ固定化体（１７）と過酸化水素電極（１８）を通過し、グルコースオキシダーゼ固定化体（１７）で生成した過酸化水素が検知される。続いてフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムまたはフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラム（１９）と過酸化水素電極（２０）を通過し、生成した過酸化水素を検知する。透析モジュール（２７）の透析膜を通過しなかった試料中の高分子成分は廃液ボトル（２２）に溜まる。
【００５３】
プロテアーゼ分解後の試料中の低分子成分分離機構で用いる膜（２７）は、タンパク質分解酵素による分解の過程で共存すると考えられるペンタペプチドやヘキサペプチドやさらに大きなペプチド類が透過し難いもしくは透過せず、フルクトシルバリン及びフルクトシルバリルヒスチジンが透過できるものであれば良い。用いる膜としては、再生セルロース製、アセチルセルロース製、ポリフッ化ビニリデン製などの透析膜が例示できる。透析膜の分子量分画は平衡透析を行った際に透過する最小分子量で表示される。一方分析用途に利用する場合は、透析の初速度の差で分離する場合が多く、必ずしも分画を希望する分子量と透析膜の性能表示が一致するとは限らない。本発明の目的には分画分子量３００以上５０万以下のものが利用できる。より好ましくは１０００以上１０万以下、さらに望ましくは１万以上２万以下のものが良い。
【００５４】
血液試料（６）は、ヘモグロビン測定試薬で処理した後、直接分析装置内に供給してもよいが、ヘモグロビン測定試薬で処理し、さらにタンパク質分解酵素で処理された後装置内に供給されてもよい。分析装置内にヘモグロビン測定試薬で処理し、さらにタンパク質分解酵素で処理された血液試料を供給する場合には、例えばタンパク質分解酵素とヘモグロビン測定試薬で処理した試料を一緒に供給し、緩衝液の流路内においてタンパク質分解酵素で処理されてもよい。フロー型比色計（１６）の一定波長での吸光度変化からヘモグロビン濃度を定量し、過酸化水素電極（１８）および（２０）の電流値の変化を検知することによりグルコース及び糖化アミノ酸または糖化ペプチド濃度を定量することができる。
【００５５】
これらの装置に流す緩衝液は特に限定されないが、固定化酵素(１４、１７、１９)の活性が高くなるようなｐＨ（例えばｐＨ７〜９）になるように選択すればよい。また固定化酵素（１４、１７、１９）と過酸化水素電極（１８、２０）に負の影響を与えない種類や濃度範囲の制菌剤や界面活性剤を含んでいてもよく、過酸化水素電極（１８、２０）に妨害を与えない固定化酵素（１４、１７、１９）の賦活剤を含んでいてもよい。
【実施例】
【００５６】
以下に実施例を挙げて、本発明の内容をさらに詳細に説明するが、もちろん本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
（１）フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムの製造
耐火レンガ（３０〜６０メッシュ）１５０ｍｇをよく乾燥し、１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸漬した後、よくトルエンで洗浄し、乾燥する。こうしてアミノシラン化処理した担体を５％グルタルアルデヒドに１時間浸漬した後、よく蒸留水で洗浄し、最後にｐＨ７．０、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で置き換え、この緩衝液をできるだけ除いておく。このホルミル化した耐火レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（キッコーマン株式会社製）を１８ユニット／ｍｌの濃度で溶解した溶液４００μｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのカラムに充填しフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムとする。
（２）過酸化水素電極の製造
直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロン（登録商標）で被覆し、その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金板を対極、飽和カロメル電極を参照極として、０．１Ｍ硫酸中、＋２．０Ｖで１０分間の電解処理を行う。その後白金線をよく水洗した後、４０℃で１０分間乾燥し、１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸漬後、洗浄する。牛血清アルブミン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）２０ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを０．２％になるように加える。この混合液を手早く先に用意した白金線上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥硬化する。これを過酸化水素電極とする。
【００５７】
また参照電極としてはＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を用い、対極には導電性の配管を用いた。
（３）グルコース電極の製造
（２）と同様の手順で過酸化水素電極を作製する。グルコースオキシダーゼ（シグマ社製、ＴｙｐｅII）を１００ｍｇ／ｍｌとなるように１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０に溶解する。グルコースオキシダーゼが２０ｍｇ/ｍｌ、牛血清アルブミンが５ｍｇ／ｍｌ、グルタルアルデヒドが０．２％となるように、１００ｍｇ/ｍｌグルコースオキシダーゼ溶液と牛血清アルブミン溶液とグルタルアルデヒド溶液と１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０を混合してグルコースオキシダーゼ固定化酵素溶液とする。このグルコースオキシダーゼ固定化酵素溶液を手早く先に用意した過酸化水素電極上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥硬化する。これをグルコースオキシダーゼ電極とする。
【００５８】
また参照電極としてはＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を用い、対極には導電性の配管を用いた。
（４）測定装置
図２の測定装置において、フロー型比色計（１６）とタンパク質分解酵素固定化カラム（１４）と第１の固定化酵素カラム（１７）は配置せず、過酸化水素電極（１８）にグルコース電極、第２の固定化酵素カラム（１９）にはフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラム、過酸化水素電極（２０）に過酸化水素電極を配置する。緩衝液槽（２４）より緩衝液Ｂをポンプ（２５）により送液し、計量バルブ（４）を用いて試料１００μｌを注入する。注入された試料は緩衝液Ｂの流れにのって恒温槽（１３）内に設置された透析モジュール（２７）に運ばれ、膜厚さ２０μｍ、分子量分画１２０００〜１４０００の再生セルロース膜で試料中の低分子成分のみがグルコース検知系（１８）と糖化アミノ酸検知系（１９、２０）に導かれる。緩衝液槽（１）より緩衝液Ａがポンプ（２）により送液されているので、透析モジュール（２７）で透析された試料中の低分子成分はグルコース電極（１８）とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラム（１９）と過酸化水素電極（２０）を通過し、試料中のグルコースと糖化アミノ酸から生成した過酸化水素が検知される。
【００５９】
この装置に流す緩衝液の組成は、緩衝液Ａが１００ｍＭのリン酸、５０ｍＭの塩化カリウム、１ｍＭのアジ化ナトリウムを含み、ｐＨが８．０で流速が０．８ｍｌ／分である。緩衝液Ｂは５０ｍＭのリン酸、０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを含み、ｐＨが８．０で流速が１．０ｍｌ／分である。
【００６０】
恒温槽の温度は３７℃であった。
（５）フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムの基質特異性
（４）の測定装置を使用して、緩衝液のｐＨが８．０の場合の各種糖化アミノ酸や糖化ペプチド、アミノ酸、糖に対するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムの基質特異性を調べた結果を表１に示す。表中の値はフルクトシルグリシンに対する応答を１００とした場合の相対値である。
【００６１】
フルクトシルグリシンとフルクトシルバリンに対して大きな応答を示した。またフルクトシルリジンと糖化ペプチドであるフルクトシルバリルヒスチジンにはほとんど応答しなかった。その他のアミノ酸や糖では、グルタミン、メチオニン、グルコースに非常に小さいが応答した。
【００６２】
本フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムは、実質的に糖化ペプチドとε位が糖化したフルクトシルリジンに作用しない。
【００６３】
しかし、グルコースに対して応答するため、試料中にグルコースが多量に含まれる場合には正の誤差を生じる可能性がある。正常人の血中でグルコースは１０ｍＭ程度、糖化アミノ酸は０．１ｍＭ程度であり、血中で約１００倍の濃度差があるので、血中グルコースによりフルクトシルバリンと同程度の大きさの妨害を与える可能性がある。このような妨害は、糖化アミノ酸と同時にグルコースを測定して差演算することで除くことができる。
【００６４】
【表１】
0004622836.tif 000002
【００６５】
（６）グルコースとフルクトシルバリンの同時測定
（４）の測定装置を使用して、２、５、１０ｍＭのグルコース及び２０、５０、１００μＭのフルクトシルバリンを各１００μｌ注入し、検出値を得た。
【００６６】
グルコースに対するグルコース電極と糖化アミノ酸電極の検出値は図３、フルクトシルバリンに対するグルコース電極と糖化アミノ酸電極の検出値は図４のようになり、次に示す検量線が得られた。ただしＹは検出値、Ｘは試料中の濃度、ｒは相関係数である。
【００６７】
グルコース電極
グルコース検量線
Ｙ（ｎＡ）＝２．４４Ｘ（ｍＭ）−０．２５  ｒ＝０．９９９８
フルクトシルバリン検量線
Ｙ（ｎＡ）＝０．００Ｘ（μＭ）−０．００
糖化アミノ酸電極
グルコース検量線
Ｙ（ｎＡ）＝０．０３０Ｘ（ｍＭ）＋０．０２９  ｒ＝０．９７７８
フルクトシルバリン検量線
Ｙ（ｎＡ）＝０．０１４Ｘ（μＭ）＋０．００７  ｒ＝０．９９９９
この測定装置を用いてグルコース５ｍＭとフルクトシルバリン８０μＭの混合標準液を測定したところ、グルコース電極では１１．９７ｎＡの応答値を、糖化アミノ酸電極では１．２９ｎＡの応答値を得た。
【００６８】
グルコースの濃度ｘ１は、式ｘ１＝（ｙ１−ｂ１１）／  ａ１１よりｘ１＝ ５．００ｍＭ、またフルクトシルバリンの濃度ｘ２は、式ｘ２＝（ａ１１×（ｙ２−ｂ２１−ｂ２２）−ａ２１×（ｙ１−ｂ１１））／（ａ１１×ａ２２）よりｘ２＝ ８０．０μＭ と求めることができた。
比較例１
実施例１（６）と同様にしてグルコースとフルクトシルバリンを含む試料を、糖化アミノ酸電極のみで測定を行った。
（１）フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムの製造
実施例１（１）と同様にしてフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムを製造した。
（２）過酸化水素電極の製造
実施例１（２）と同様に過酸化水素電極を作製した。
（３）測定装置
実施例１（４）と同様に図２の測定装置を利用して測定を行った。フロー型比色計（１６）とタンパク質分解酵素固定化カラム（１４）と第１の固定化酵素カラム（１７）と過酸化水素電極（１８）は配置せず、第２の固定化酵素カラム（１９）にはフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラム、過酸化水素電極（２０）に過酸化水素電極を配置した。試料は計量バルブにより１００μｌが注入される。
【００６９】
この装置に流す緩衝液の組成、緩衝液の流速、恒温槽の温度等の条件は、実施例１（４）と同様の条件で使用した。
（４）グルコースとフルクトシルバリン混合標準液の測定
（３）の測定装置を使用し、２０、５０、１００μＭのフルクトシルバリンを１００μｌ注入し、検出値を得た。フルクトシルバリンの検量線は、
Ｙ（ｎＡ）＝０．０１４Ｘ（μＭ）＋０．００７  ｒ＝０．９９９９
となった。ただしＹは検出値、Ｘは試料中の濃度、ｒは相関係数である。
【００７０】
この測定装置を用いてグルコース５ｍＭとフルクトシルバリン８０μＭの混合標準液を測定したところ、１．２８ｎＡの応答値が得られ、試料中のフルクトシルバリンの濃度ｘ２は、式ｘ２＝（ｙ２−ｂ２２）／  ａ２２よりｘ２＝ ９２．３μＭ と求めることができたが、グルコースによる正の誤差を含んでいる。
実施例2 
（１）フルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラムの製造
実施例１（１）と同様に耐火レンガ（３０〜６０メッシュ）１５０ｍｇをホルミル化する。このホルミル化した耐火レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液にフルクトシルペプチドオキシダーゼ（キッコーマン株式会社製）を１４０ユニット／ｍｌの濃度で溶解した溶液２００μｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのカラムに充填しフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラムとする。
（２）過酸化水素電極の製造
実施例１（２）と同様に過酸化水素電極を作製した。
（３）グルコース電極の製造
実施例１（３）と同様にしてグルコース電極を作製した。
（４）測定装置
図１の測定装置において、タンパク質分解酵素固定化カラム（１４）とフロー型比色計（１６）と第１の固定化酵素カラム（１７）は配置せず、過酸化水素電極（１８）にグルコース電極、第２の固定化酵素カラム（１９）にはフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラム、第２の過酸化水素電極（２０）に過酸化水素電極を配置する。緩衝液槽（１）より緩衝液Ａをポンプ（２）により送液し、計量バルブ（４）を用いて試料５μｌを注入する。注入された試料は緩衝液Ａの流れにのって恒温槽（１３）内に設置された混合用配管（１５）を通り、温度調整と緩衝液との混合が行われ、その下流のグルコース電極（１８）とフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラム（１９）と過酸化水素電極（２０）を通り、試料中のグルコースとフルクトシルバリルヒスチジンから過酸化水素を生成し、電流値の変化を検知する。
【００７１】
この測定装置に使用する緩衝液Ａの組成は、１００ｍＭのリン酸と５０ｍＭの塩化カリウムと1ｍＭのアジ化ナトリウムを含み、ｐＨが７．０である。
【００７２】
緩衝液の流速は１．０ｍｌ／分、恒温槽の温度は３０℃であった。
（５）フルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラムの基質特異性
（４）の測定装置を使用して、緩衝液ＡのｐＨが７．０の場合の各種糖化アミノ酸や糖化ペプチド、アミノ酸、糖に対するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムの基質特異性を調べた結果を表２に示す。表中の値はフルクトシルバリンに対する応答を１００とした場合の相対値である。
【００７３】
フルクトシルバリルヒスチジンとフルクトシルバリンに特異的で、α,ε−フルクトシルリジンにはほとんど応答せず、各種アミノ酸と糖類には全く応答しなかった。従って、糖化ヘモグロビン測定において、糖化ヘモグロビンのプロテアーゼによる分解がかなり進んだ場合にアミノ酸に由来する正の誤差や血中グルコースに由来する正の誤差が生じる可能性はないので、これらを補正する必要はない。
【００７４】
【表２】
0004622836.tif 000003
【００７５】
（６）グルコースとフルクトシルバリンの同時測定
（４）の測定装置を利用して、２、５、１０ｍＭのグルコース及び１０、２０、５０、１００μＭのフルクトシルバリンを各５μｌ注入し、検出値を得た。
【００７６】
それぞれの検量線を以下に示す。ただしＹは検出値、Ｘは試料中の濃度、ｒは相関係数である。
【００７７】
グルコース電極
グルコース検量線
Ｙ（ｎＡ）＝６．７４Ｘ（ｍＭ）−０．２８  ｒ＝１．００００
フルクトシルバリン検量線
Ｙ（ｎＡ）＝０．００Ｘ（μＭ）＋０．００
糖化ペプチド電極
グルコース検量線
Ｙ（ｎＡ）＝０．００Ｘ（ｍＭ）＋０．００  
フルクトシルバリン検量線
Ｙ（ｎＡ）＝０．０３５Ｘ（μＭ）＋０．０８７  ｒ＝０．９９９２
この測定装置を用いてグルコース５ｍＭとフルクトシルバリン８０μＭの混合溶液を測定したところ、グルコース電極では３４．１ｎＡの応答値を、フルクトシルペプチド電極では２．８７ｎＡの応答値を得た。
【００７８】
グルコースの濃度ｘ１は、式ｘ１＝（ｙ１−ｂ１１）／  ａ１１よりｘ１＝ ５．０１ｍＭ、またフルクトシルバリンの濃度ｘ２は、式ｘ２＝（ｙ２−ｂ２２）／  ａ２２よりｘ２＝ ８０．０μＭ と求めることができた。
【００７９】
フルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化体を用いた場合には、グルコースに対して応答しないため、差演算を行わずに正確に試料中のフルクトシルアミノ酸またはフルクトシルペプチドを測定できる。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明によれば、血液検体中の安定糖化ヘモグロビンとグルコースを簡便且つ正確に同時に定量することができ、糖尿病の検査を容易に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】測定装置の概略図
【図２】透析を行う測定装置の概略図
【図３】グルコース電極とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化体のグルコースの検量線
【図４】グルコース電極とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化体のフルクトシルバリンの検量線
【符号の説明】
【００８２】
１  緩衝液槽
２  緩衝液送液ポンプ
３  ダンパー
４  計量バルブ
５  計量ループ
６  試料管
７  試料吸引ニードル
８  廃棄ポット
９  洗浄液槽  
１０  バルブ
１１  バルブ
１２  シリンジポンプ
１３  恒温槽
１４  タンパク質分解酵素固定化カラム
１５  混合用配管
１６  フロー型比色計
１７  第１の固定化酵素カラム
１８  過酸化水素電極
１９  第２の固定化酵素カラム
２０  過酸化水素電極
２１  背圧コイル
２２  廃液ボトル
２３  廃液ボトル
２４  緩衝液槽
２５  緩衝液送液ポンプ
２６  恒温化用配管
２７  透析モジュール
【図１】
0004622836.tif 000004
【図２】
0004622836.tif 000005
【図３】
0004622836.tif 000006
【図４】
0004622836.tif 000007