(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌリンアセテート（ＩｎＡｃ）のマイクロ粒子またはナノ粒子と活性抗原薬剤とを含み、水相／油相／水相のエマルジョンによって製造される組成物であって、前記活性抗原薬剤が、個々のマイクロ粒子またはナノ粒子中に含まれているか物理的に結合されている、組成物。
【請求項２】
前記活性抗原薬剤が、個々のマイクロ粒子またはナノ粒子中に含まれている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
約１μｍから約３０μｍの直径を有しているマイクロ粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ナノ粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
約１０ｎｍから約１０００ｎｍの直径を有しているナノ粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＩｎＡｃが、約４ｋＤａから約１６ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
１または複数の免疫変調成分をさらに含んでおり、前記１または複数の免疫変調成分が、リンフォカイン、サイトカイン、胸腺細胞刺激物質、単球もしくはマクロファージ刺激物質、エンドトキシン、またはそれらの組合せである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記活性抗原薬剤が、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原ペプチド、免疫原、または免疫グロブリンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記活性抗原薬剤が、細菌性もしくはウイルス性病原体の溶菌液、癌細胞、または病原体または疾病と関連するその他の生物学的成分を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記生物学的成分が、ペプチド、タンパク質、脂質、ＤＮＡ、または多糖類を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
有効量の第２の活性抗原薬剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
免疫反応をインビボまたはインサイチュ（in situ）で刺激し、前記免疫反応がＴｈ１（ＩｇＧ−２ａ）もしくはＴｈ２（ＩｇＧ−１）タイプの免疫反応、またはそれらの組合せを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
イヌリンアセテート（ＩｎＡｃ）粒子と活性抗原薬剤とを含んでいる組成物であって、前記活性抗原薬剤が、ＩｎＡｃの個々の前記粒子中に含まれているかＩｎＡｃの前記粒子と物理的に結合されており、前記組成物が、水相／油相／水相のエマルジョンによって製造され、ヒトまたは動物において前記活性抗原薬剤に対する免疫反応を刺激する、組成物。
【請求項１４】
イヌリンアセテートを含んでいるワクチンであり、前記イヌリンアセテートのアセチル化度が約０．１％から１００％である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
感染症、自己免疫疾患、遺伝性疾患、アレルギー、糖尿病、免疫不全疾患、腫瘍性疾患、退行性または老齢疾患の治療において使用するための、イヌリンアセテート（ＩｎＡｃ）のマイクロ粒子またはナノ粒子と活性抗原薬剤とを含んでいる組成物であって、前記組成物が、水相／油相／水相のエマルジョンによって製造され、前記活性抗原薬剤が、個々のマイクロ粒子またはナノ粒子中に含まれている、組成物。
【請求項１６】
動物においてＴＬＲを通して免疫原性反応を誘発する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ワクチンである、請求項１５、または１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記マイクロ粒子または前記ナノ粒子をアジュバントとして使用する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
ａ）イヌリンアセテート（ＩｎＡｃ）のマイクロ粒子またはナノ粒子を含んでおり、前記組成物が、水相／油相／水相のエマルジョンによって製造されている組成物と、
ｂ）随意に活性抗原薬剤と、
ｃ）容器と、
ｄ）１または複数の緩衝剤と、
ｅ）活性抗原薬剤を前記組成物と合体するための説明書と、
ｆ）ラベルと
を含んでいる、キット。
【請求項２０】
前記活性抗原薬剤が、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原ペプチド、免疫原、または免疫グロブリンからなる群から選択される、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
動物またはヒトにおいて抗血清を生成させるための取扱い説明書をさらに含んでいる請求項１９に記載のキット。
【請求項２２】
前記活性抗原薬剤が、細菌性もしくはウイルス性病原体の溶菌液、癌細胞、または病原体または疾病と関連するその他の生物学的成分を含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
前記生物学的成分が、ペプチド、タンパク質、脂質、ＤＮＡ、または多糖類を含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記組成物が、ＩｎＡｃのマイクロ粒子を含む、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概してワクチンおよびアジュバントに関し、より詳細には、β−イヌリンおよびβ−イヌリン誘導体を含むワクチンおよびアジュバントであって、β−イヌリンおよびβ−イヌリン誘導体は送達デバイスおよびアジュバントとして機能し、それらβ−イヌリンおよびβ−イヌリン誘導体を含むナノ粒子およびマイクロ粒子組成物を含んでいる、ワクチンおよびアジュバントと、その組成物を使用する治療の方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン接種の目的は、投与された抗原に対して強い免疫反応を発生させることによって感染に対する長期保護を提供することである。ワクチンは、抗原に対する特定の免疫反応の効力および長寿命をブーストするためにアジュバントと呼ばれる免疫促進剤の追加をしばしば必要とする。理想的なワクチンアジュバントは、混注された抗原に対して体液性（Ｔｈ２タイプ）および細胞性（Ｔｈ１タイプ）の両方の免疫反応を刺激すべきである。体液性反応は、細胞外の病原体を取り除くために必要である。細胞性反応は細胞内病原体を除去するために重大な意味を持つ。
【０００３】
ミョウバン（アルミニウム塩）は、米国においてヒトの使用に対して認可された唯一のアジュバントであり、体液性免疫反応のみを刺激する。Ｂ型肝炎およびヒトパピローマウイルスに対するものを含めたいくつかの組換えタンパク質系ワクチンが、防御抗体反応を引き出すために、アジュバントとしてミョウバンのみを使用して成功裏に開発されてきたが、癌、マラリア、ヘルペス、インフルエンザ、結核、ヒト免疫不全ウイルスおよび／またはエイズ等の疾病に向けられた次世代の組換え型ワクチンは、非常に強力で長持ちする抗体反応のみでなく有力な細胞媒介性免疫反応もまた必要とする。
【０００４】
したがって、患者における抗体反応を促進することができる新たな組成物に対する必要性が存在する。体液性および細胞性免疫反応の両方を促進することができる新たなワクチンアジュバント、抗原送達システム、および組成物に対する必要性もまた存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、マイクロ粒子またはナノ粒子として送達されたとき、免疫システムを活性化させる可溶性または不溶性の多糖ポリマーを提供する。イヌリンのβイソ型（β−イヌリン）およびその半合成誘導体のイヌリンアセテート（ＩｎＡｃ）は、マイクロ粒子またはナノ粒子として製剤化されたとき、新しいワクチンアジュバントおよび抗原輸送システムとして機能することができる。これら粒子は、感染症、自己免疫疾患、免疫不全疾患、腫瘍性疾患、退行性疾患、または老齢疾患を予防または抑制することを目的として、患者における免疫反応を活性化させるために使用され得る。
【０００６】
複数の実施形態において、β−イヌリンまたはイヌリンアセテートのマイクロ粒子またはナノ粒子と活性薬剤とを含んでいる組成物であって、活性薬剤が、個々のマイクロ粒子またはナノ粒子中に包含され得る組成物が開示される。活性薬剤としては、抗原、抗原ペプチドもしくはそれの配列、免疫原、免疫グロブリン、またはそれらの組合せが挙げられる。関連する態様において、この活性薬剤は、ハプテンまたはそれに対して免疫反応が求められる任意の薬剤であり得る。
【０００７】
複数の実施形態において、β−イヌリンまたはイヌリンアセテート粒子と活性薬剤とを含んでいる組成物であって、活性薬剤が、β−イヌリンまたはイヌリンアセテートの個々の粒子中に包含されるか、またはβ−イヌリンまたはイヌリンアセテートの粒子と物理的に結合されることができ、組成物が、ヒトまたは動物に投与されたとき、ヒトまたは動物におけるその活性薬剤に対する免疫反応を促進するのに効果的である組成物が開示される。
【０００８】
１つの態様において、このワクチン組成物は、抗原および有効なアジュバント量のイヌリンアセテートを含み、そのイヌリンアセテートのアセチル化度は、約０．１％から１００％である。
【０００９】
別の態様において、組成物はβ−イヌリンまたはイヌリン誘導体のマイクロ粒子またはナノ粒子と活性薬剤とを含み、その活性薬剤には、抗原、抗原ペプチド配列、または免疫グロブリンが含まれ、その組成物には、有効なアジュバント量のβ−イヌリンまたはイヌリン誘導体が含まれ、そのイヌリン誘導体には、抗原が粒子中に封入され、粒子上にコートされまたは結合された、エステル化イヌリン、エーテル化イヌリン、ジアルデヒドイヌリン、イヌリンカルバメート、イヌリンカーボネート、酸化型または還元型のイヌリン、イヌリンまたはその酸化型もしくは還元型のさらなる活性薬剤との錯体化物、イヌリンのカチオン／アニオン／非イオン変性物、あるいはイヌリンホスフェートが粒子製剤の形で含まれ、あるいはそれらの組合せが含まれ得る。
【００１０】
複数の実施形態において、感染症、自己免疫疾患、免疫不全疾患、腫瘍性疾患、遺伝性疾患、退行性または老齢疾患を治療または抑制するために患者における免疫反応を刺激する方法であって、それを必要としている患者に本明細書に記載されている組成物の有効量を投与するステップを含む方法が開示される。
【００１１】
複数の実施形態において、感染症、自己免疫疾患、免疫不全疾患、腫瘍性疾患、遺伝性疾患、退行性または老齢疾患を治療または抑制するために患者における免疫反応を高める方法であって、それを必要としている患者に本明細書に記載されている組成物の有効量を投与するステップを含む方法が開示される。
【００１２】
複数の実施形態において、患者において免疫原性反応を誘発する方法であって、患者に本明細書に記載されている組成物の有効量を投与するステップを含む方法が開示される。
【００１３】
別の実施形態においては、感染症を治療する方法であって、それを必要としている患者に本明細書に記載されている組成物の有効量を投与するステップを含む方法が開示される。その感染症は、バクテリア、マイコプラズマ、真菌、ウイルス、原生動物、またはその他の微生物、あるいはそれらの組合せによって引き起こされ得る。
【００１４】
複数の実施形態において、動物またはヒトにおける侵襲を処置する方法であって、侵襲により苦しめられている動物またはヒトに本明細書に記載されている組成物の有効量を投与するステップを含む方法が開示される。その侵襲は、微生物、虫、寄生虫、またはそれらの組合せによって引き起こされ得る。
【００１５】
複数の実施形態において、抗体を産生するためまたは免疫細胞を刺激するための方法であって、動物またはヒトを本明細書に記載されている組成物を含んでいる製剤により免疫付与するステップと、免疫付与された動物またはヒトから抗体または免疫細胞を収集するステップとを含む方法が開示される。その抗体は、例えば、モノクロナール抗体またはポリクローナル抗体あるいはそれらの機能的な断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、抗体複合体または同様のもの）であり得る。
【００１６】
複数の実施形態において、抗血清を産生するための方法であって、動物またはヒトを本明細書に記載されている組成物を有している製剤により免疫付与するステップと、免疫付与された動物またはヒトから、あるいはその免疫付与された動物またはヒトの産物（例えば動物の卵など）からその抗血清を収集するステップとを含む方法が開示される。その抗血清は、抗体を包含することができ、その抗体は、モノクロナール抗体またはポリクローナル抗体であり得る。その動物は、霊長類、イヌ、ネコ、乳牛、子羊、ブタ、雄ブタ、家禽、ウマ、雌馬、ラバ、雄ロバ、雌ロバ、雄子ウマ、子ウシ、当歳馬、種ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、バイソン、バッファロー、子羊、子ヤギ、子ブタ、めんどり、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、野鶏、ウサギ、野ウサギ、モルモット、ハムスターマウス、ラット、げっ歯類、魚、水生動物、または両生類であり得る。
【００１７】
組成物は、注射、吸入、経口、直腸、経膣、経鼻で、または局所的に投与され得る。活性薬剤は、カプセル化または粒子との結合の前に生理的に受け入れられる毒性のないビヒクルと組み合わせて調製することができ、あるいはその粒子は、その活性薬剤とのカプセル化または結合後に生理的に受け入れられる毒性のないビヒクル（vehicle）と組み合わせることができる。
【００１８】
１つの態様において、本明細書に記載されているマイクロ粒子またはナノ粒子は、アジュバントとして使用することができる。関連する態様において、本明細書に記載されている組成物の粒子は、マイクロ粒子であり得る。そのマイクロ粒子は、約１ｇｍから約３０μｍ、約１．５ｇｍから約２５μｍ、または約２μｍから約２０μｍの直径を有することができる。その粒子は、またナノ粒子であり得る。そのナノ粒子は、約１０ｎｍから約１０００ｎｍ、約１０ｎｍから約９５０ｎｍ、約１０ｎｍから約９００ｎｍ、約５０ｎｍから約９００ｎｍ、約１００ｎｍから約８００ｎｍ、約１０ｎｍから約４００ｎｍ、約４００ｎｍから約９００ｎｍ、または約２０ｎｍから約７５０ｎｍの直径を有することができる。
【００１９】
別の態様において、β−イヌリンまたはイヌリンアセテートは、約４ｋＤａから約２５ｋＤａの分子量を有することができる。
【００２０】
１つの態様において、組成物は、１または複数の免疫変調成分、例えば、リンフォカイン、サイトカイン、胸腺細胞刺激物質、単球またはマクロファージ刺激物質、内毒素、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＳ）、パターン認識受容体（ＰＲＲ）のための配位子、またはそれらの組合せなどをさらに含むことができる。
【００２１】
別の態様において、活性薬剤は、抗原、抗原ペプチド、または抗原配列、あるいは免疫グロブリンであり得る。関連する態様において、この抗原は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡを含む生物学的成分であり得る。さらなる関連する態様において、この活性薬剤は、また、細菌性もしくはウイルス性病原体の溶菌液、癌細胞、またはその他の病原体または疾病と関連する生物学的成分を含むこともできる。例えばその生物学的成分は、ペプチド、タンパク質、脂質、ＤＮＡ、または単独の多糖類であり得る。
【００２２】
１つの態様において、組成物は、カプセル化されたまたはその粒子と結合した、あるいはその粒子と共に製剤中に含められた第２の活性薬剤の有効量をさらに含むことができる。
【００２３】
別の態様において、本明細書に記載されている組成物の投与は、免疫反応を刺激することができる。その免疫反応としては、Ｔｈ１（ＩｇＧ−２ａ、細胞傷害性Ｔ細胞）もしくはＴｈ２（ＩｇＧ−１、ＩｇＡ）タイプの免疫反応、またはそれらの組合せを挙げることができる。関連する態様において、動物またはヒトへのその投与は、その活性薬剤によって引き起こされる症状、またはその活性薬剤と関連する疾病もしくは状態の少なくとも１つを減じることができる。
【００２４】
１つの態様において、免疫学的組成物は、薬剤的に受け入れられる担体、希釈剤、または賦形剤と一緒に本明細書に記載されている組成物を含む。関連する態様において、その免疫学的組成物は、液体、半固体、コロイド状、または固形の剤形として処方され得る。さらなる関連する態様において、担体は、液体ビヒクルであり得、または希釈剤は、例えば乾燥粉末吸入剤については固体の希釈剤であり得る。
【００２５】
複数の実施形態において、β−イヌリンまたはイヌリンアセテート等のβ−イヌリン誘導体のマイクロおよびナノ粒子製剤、および免疫刺激剤としてのそれらの使用が開示される。関連する態様において、その製剤は、患者に投与後最初の３０分以内にカプセル化または物理的に結合された分子の約３０％未満のバースト放出を有することができる。
【００２６】
複数の実施形態において、その製剤は、患者に投与後最初の３０分以内に、約２０重量％未満のバースト放出、約１５重量％未満のバースト放出、または約１０重量％未満のバースト放出を有することができる。関連する態様において、カプセル化された材料の約９０重量％を超える放出は、約２０日を超える。
【００２７】
複数の実施形態において、本明細書に記載されている組成物の医学的、獣医学的、および人獣共通感染症の治療または疾病の予防のための使用が開示される。１つの態様において、その医学的治療は、乳癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、脳腫瘍、または結腸癌、ならびにリンパ腫および白血病、そして骨、血液、またはリンパ系の癌を含むがこれらに限定されない癌またはその他の悪性腫瘍を予防および治療するものであり得る。
【００２８】
複数の実施形態において、哺乳動物における疾病、例えば、ヒトにおける癌を治療するための薬剤を製造するための本明細書に記載されている組成物の使用が開示される。１つの態様においては、哺乳動物ではない種における疾病を治療するための薬剤を製造するための本明細書に記載されている組成物の使用が開示される。関連する態様において、薬剤は、薬剤的に受け入れられる希釈剤、賦形剤、または担体を含むことができる。
【００２９】
複数の実施形態において、β−イヌリンまたはイヌリンアセテートのマイクロ粒子またはナノ粒子を含んでいる組成物と、場合によって、活性薬剤と、容器と、１または複数の緩衝剤と、活性薬剤を組成物と合体するための説明書と、ラベルとを含んでいるキットが開示される。
【００３０】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の実施形態またはさまざまな態様をさらに明らかにするために含まれる。いくつかの事例において、本開示の実施形態は、本明細書に示されている詳細な説明と一緒に添付の図面を参照することによって最もよく理解され得る。
【００３１】
その説明および添付の図面は、一定の具体例、または本開示の一定の態様を明らかにするものであり得る。しかしながら、当業者であれば、その例または態様の部分が、本開示のそのほかの例または態様と組み合わせて使用され得ることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＦＴＩＲ分光法によるβ−イヌリンとイヌリンアセテートのＩＲスペクトルの比較を示す図である。
【図２】ＩｎＡｃマイクロ粒子からのオボアルブミンのインビトロの放出特性を示す図である。放出試験は、ｐＨ７．４の１ｍｌの１００ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に３７℃における１００ｒｐｍでの振盪により分散した１０ｍｇのマイクロ粒子により実施された。さまざまな時間間隔で試料は採取され、等容量の新鮮なＰＢＳと交換された。オボアルブミン濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイ（ｎ＝３）により測定された。
【図３】樹状細胞による抗原（ｏｖａ）の摂取を示す図である。（Ａ）溶液中またはイヌリンマイクロ粒子中のいずれかでフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）ｏｖａによるＤＣ２．４細胞の培養後のフローサイトメトリー。（Ｂ）ＤＣ２．４細胞の細胞核がジアミジノフェニルインドール（ＤＡＰＩ）により染色され、蛍光顕微鏡によって示されている３Ａにおけるものと同じ結果。
【図４】（Ａ）は、ＩｎＡｃがＭｙＤ８８依存Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）またはＭａｌ依存ＴＬＲによりマクロファージを活性化し、（Ｂ）はＩｎＡｃマイクロ粒子がＴＬＲ−４と相互作用することを示す図である。＊は、結果がスチューデントｔ検定を用いて統計的に有意である（Ｐ＜０．０５）ことを示す。
【図５】免疫付与されたマウス血清中のｏｖａ特異性のＩｇＧ全体、ＩｇＧ−１およびＩｇＧ−２ａの抗体価を示す図である。マウス（ｎ＝群当たり４〜５）は、１日目および２１日目に、一次および追加抗原投与量として、ｏｖａ（１００μｇ）単独、ミョウバン（２００μｇ）と一緒のｏｖａ、ブランクのβ−イヌリンマイクロ粒子と一緒のｏｖａ、またはβ−イヌリンマイクロ粒子中に充填したｏｖａが皮内に注射された。血清は、間接的な酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いる抗ｏｖａ抗体力価の分析のために免疫付与の１週間後および３週間後に採取された。
【図６】β−イヌリンマイクロ粒子からのオボアルブミン（ｏｖａ）の放出特性を示す図である。放出試験は、ｐＨ７．４の１ｍｌの１００ｍＭのＰＢＳ（リン酸緩衝液生理食塩水）中に３７℃における１００ｒｐｍでの振盪により分散した１０ｍｇのマイクロ粒子により実施された。さまざまな時間間隔で試料は採取され、等容量の新鮮なＰＢＳと交換された。ＦＩＴＣ−Ｏｖａ濃度は、蛍光分析（ｎ＝３）により測定された。
【図７】免疫付与されたマウス血清中のｏｖａ特異性のＩｇＧ全体、ＩｇＧ−１およびＩｇＧ−２ａの抗体力価を示す図である。マウス（ｎ＝群当たり４〜５）は、１日目および２１日目に、一次および追加の免疫付与として、ｏｖａ（１００μｇ）単独、ミョウバン（２００μｇ）と一緒のｏｖａ、ブランクのＩｎＡｃマイクロ粒子と一緒のｏｖａ、またはＩｎＡｃマイクロ粒子中に充填したｏｖａが皮内に注射された。血清は、間接的なＥＬＩＳＡ法を用いるＩｇＧ力価の分析のために一次および追加の免疫付与の１週間後および３週間後に採取された。
【図８】抗原（Ｏｖａ）に応えてのインビトロの脾細胞増殖を示す図である。脾細胞は、ｏｖａ単独、ミョウバンと一緒のｏｖａ、またはβ−イヌリンまたはＩｎＡｃマイクロ粒子中に充填されたｏｖａにより免疫付与されたマウスから用意され、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、２．５μｇ／ｍＬ）またはｏｖａ（１００μｇ／ｍＬ）またはＲＰＭＩ１６４０培地の存在下で７２時間にわたって培養された。脾細胞の増殖は、ＭＴＴアッセイにより測定され、刺激指数（ＳＩ）として示される。ＳＩは、抗原（ｏｖａ）または分裂促進因子（ＣｏｎＡ）で処理された培養物に対する吸光度値を、非誘導培養物（ＲＰＭＩ処理される）に対する吸光度値で割ったものである。ＣｏｎＡは、増殖に対する陽性対照である。＊は、値が、スチューデントｔ検定を用いて、ｏｖａで免疫付与された群と比較して、統計的に有意である（Ｐ＜０．００１）ことを示す。
【図９】Ｔｈ１（ＩＦＮ−ｇおよびＩＬ−２）およびＴｈ２（ＩＬ−４およびＩＬ−１０）サイトカインの測定を示す図である。脾細胞は、ｏｖａ単独、ミョウバンと一緒のｏｖａ、またはＩｎＡｃマイクロ粒子中に充填されたｏｖａにより免疫付与されたマウスから用意され、Ｏｖａ（１００μｇ／ｍＬ）の存在下で７２時間にわたって培養された。７２時間後、異なる処理群からの浮遊物が収集され、異なるサイトカインの濃度がサンドイッチＥＬＩＳＥ法を用いて測定された。＊は、値が、スチューデントｔ検定を用いて、ｏｖａで免疫付与された群と比較して、著しく高い（Ｐ＜０．００１）ことを示す。
【図１０】免疫付与されたマウスにおける遅延型過敏（ＤＴＨ）反応を示す図である。各免疫付与されたマウスの左の足蹠にＯｖａ（５μｇ）を、右の足蹠にＰＢＳを注射した。足蹠の腫脹度が、ｏｖａおよびＰＢＳ処理の２４時間後に測定された。データは、各群の３〜４匹の免疫付与されたマウスの平均腫脹度＋標準偏差を表す。＊は、値が、スチューデントｔ検定を用いて、ｏｖａで免疫付与された群と比較して、統計的に有意である（Ｐ＜０．００１）ことを示す。
【図１１】免疫付与されたマウス血清中のｏｖａ特異性のＩｇＧ全体の力価の発生に対するイヌリンアセテート粒子の大きさの影響を示す図である。マウス（ｎ＝群当たり４〜５）は、１日目および２１日目に、一次および追加の免疫付与として、ｏｖａ（１００、１０または１μｇ）を単独で、またはＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）と共に、あるいはＩｎＡｃマイクロ粒子またはナノ粒子中に充填されて皮下に注射された。血清は、間接的なＥＬＩＳＡ法を用いるＩｇＧの全体の力価の分析のために一次および追加の免疫付与の１週間後および３週間後に採取された。ＣＦＡが、陽性対照（最強のアジュバント）として使用された。
【図１２】免疫付与されたマウス血清中の血清ｏｖａ特異性のＩｇＧ−１の力価の発生に対するイヌリンアセテート粒子の大きさの影響を示す図である。マウス（ｎ＝群当たり４〜５）は、１日目および２１日目に、ｏｖａ（１００、１０または１μｇ）を単独で、またはＣＦＡと共に、あるいはＩｎＡｃマイクロ粒子またはナノ粒子中に充填されて皮下に注射された。血清は、間接的なＥＬＩＳＡ法を用いるＩｇＧ−１の力価の分析のために一次および追加の免疫付与の１週間後および３週間後に採取された。
【図１３】免疫付与されたマウス血清中のｏｖａ特異性のＩｇＧ−２ａの力価の発生に対するイヌリンアセテート粒子の大きさの影響を示す図である。マウス（ｎ＝群当たり４〜５）は、１日目および２１日目に、ｏｖａ（１００、１０または１μｇ）を単独で、またはＣＦＡと共に、あるいはＩｎＡｃマイクロ粒子またはナノ粒子中に充填されて皮下に注射された。血清は、間接的なＥＬＩＳＡ法を用いるＩｇＧ−２ａの力価の分析のために一次および追加の免疫付与の１週間後および３週間後に採取された。
【図１４】免疫付与されたマウス血清中のｏｖａ特異性のＩｇＧ力価の発生に対するＩｎＡｃマイクロ粒子中に充填された抗原の量の影響を示す図である。マウス（ｎ＝群当たり４〜５）は、１日目および２１日目に、ｏｖａ（１００、１０または１μｇ）を単独で、またはＣＦＡと共に、あるいはＩｎＡｃマイクロ粒子中に充填されて皮下に注射された。血清は、間接的なＥＬＩＳＡ法を用いるＩｇＧ−全体、ＩｇＧ−１およびＩｇＧ−２ａの力価の分析のために一次および追加の免疫付与の１週間後および３週間後に採取された。
【図１５】免疫付与されたマウス血清中のｏｖａ特異性のＩｇＧ力価の発生に対するＩｎＡｃナノ粒子中に充填された抗原の量の影響を示す図である。マウス（ｎ＝群当たり４〜５）は、１日目および２１日目に、ｏｖａ（１００、１０または１μｇ）を単独で、またはＣＦＡと共に、あるいはＩｎＡｃナノ粒子中に充填されて皮下に注射された。血清は、間接的なＥＬＩＳＡ法を用いるＩｇＧ−全体、ＩｇＧ−１およびＩｇＧ−２ａの力価の分析のために一次および追加の免疫付与の１週間後および３週間後に採取された。
【図１６】補体の第二経路（ＡＰＣ）の活性化試験の結果を示す図である。ヒト血清は、ウサギの赤血球（ＲＢＣ）の溶解を引き起こし、それは、７００ｎｍにおけるＯＤ値を測定することによって分析された。ヒト血清は、溶解のためにＲＢＣで培養する前にさまざまな試料により処理された。ＲＢＣ溶解の割合は、未処理のヒト血清によるＲＢＣ溶解を１００％とみなすことによって計算された。ザイモサン（陽性対照）は、ＡＰＣを活性化し、それ故、ウサギのＲＢＣ溶解を抑制した。
【図１７】アジュバント注射部位における皮膚組織のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す図である。（Ａ）は、ＩｎＡｃナノ粒子注射（左）、ＩｎＡｃマイクロ粒子注射（中央）、および完全フロイントアジュバント注射（ＣＦＡ）（右）の部位からの低倍率の３つの画像を示しており、（Ｂ）は、ＩｎＡｃマイクロ粒子（左）およびＣＦＡ（右）によるより高倍率の画像を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
定義
本明細書において使用される場合、列挙される用語は、次の意味を有する。この明細書において使用されている全てのその他の用語および語句は、当業者であれば理解するはずのそれらの普通の意味を有する。そのような普通の意味は、専門辞典、例えば、Ｒ．Ｊ．ＬｅｗｉｓによるＨａｗｌｅｙ’ｓ  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，１４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、２００１年、などを参照することによって得ることができる。
【００３４】
本明細書における「一実施形態（ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「１つの実施形態（ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」などと言うのは、記載されている実施形態が、特定の態様、特徴、構造、部分、または特色を含むことができるが、全ての実施形態が必ずしもその態様、特徴、構造、部分、または特色を含むのではないことを示唆する。さらに、そのような語句は、明細書の他の部分で言及された同じ実施形態を指すことができるが、必ずしもそうではない。さらにまた、特定の態様、特徴、構造、部分または特色が、１つの実施形態に関連して記載されているとき、はっきりと記載されていなくても、そのような態様、特徴、構造、部分または特色を、他の実施形態に影響を及ぼし、または関連付けることは当業者の認識の範囲内である。
【００３５】
単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことがはっきりと指示されない限りは複数の言及を含む。したがって、例えば、「ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ」と言えば、複数のそのような化合物を含み、そのため、ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｘは、複数の化合物Ｘを含む。特許請求の範囲は、どんな随意的要素も排除するように起草され得ることがさらに留意される。そのようなものとして、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙または「否定的な」限定の使用に関連して、排他的用語、例えば、「ｓｏｌｅｌｙ（もっぱら）」、「ｏｎｌｙ（唯一の）」などの使用のための先行詞として寄与することが意図される。
【００３６】
用語「および／または」は、この用語が関連付けられる事項の任意の１つ、事項の任意の組合せ、または事項の全てを意味する。語句「１つ（種）または複数」は、当業者には、特にそれが使用される文脈内において読まれるときは容易に理解される。例えば、１つ（種）または複数の任意成分が、特定の製剤中に含められ得るとは、それ故、１つ（種）または複数は、１つ（種）から約４つ（種）、または１つ（種）から約５つ（種）、または同じ数（種）だけの成分が特定の製剤中に要求されることを意味することができる。
【００３７】
用語「約」は、特定された値の±５％、±１０％、±２０％、または±２５％の変動を指すことができる。例えば、「約５０」パーセントは、いくつかの実施形態において、４５から５５パーセントまでの変動を含むことができる。整数範囲に対して、用語「約」は、範囲の各末端において挙げられた整数より大きいおよび／または小さい１つまたは２つの整数を含むことができる。本明細書に別なふうに示されていない限り、用語「約」は、個々の成分、組成物、または実施形態の機能に関して同等である挙げられた範囲に最も近い値、例えば、重量パーセントを含むことを目的としている。
【００３８】
当業者には理解されるように、成分の量、分子量のような特性、反応条件その他を表すものを含めた全ての数字は、近似値であり、全ての場合に用語「約」によって随意的に修正されるものと理解される。これらの値は、本明細書に記述されている教示を利用する当業者によって得られることが求められる望ましい特性によって変動し得る。また、そのような値は、それらのそれぞれの試験測定において見出される標準偏差に必然的に起因する変動性を本質的に含むことが理解される。
【００３９】
当業者によって理解されるように、任意のそして全ての目的に対して、特に明細書を提供することに関して、この中に列挙される全ての範囲は、任意のそして全ての可能な部分的範囲およびそれらの部分的な範囲の組合せ、ならびにその範囲を構成している個々の値、特に整数値を同様に含む。列挙される範囲（例えば、重量パーセントまたは炭素基）としては、それぞれの特定値、整数、小数、またはその範囲に入る一体性が挙げられる。リストアップされたどの範囲も、その同じ範囲が、少なくとも同等の半分、３分の１、４分の１、５分の１、または１０分の１に分解されることを十分に説明することおよび可能にすることが容易に認められ得る。非限定の例として、ここで論じられている各範囲は、下部の３分の１、中央部の３分の１および上部の３分の１などに容易に分解され得る。当業者には同様に理解されるように、「ｕｐ  ｔｏ（最大で）」、「ａｔ  ｌｅａｓｔ（少なくとも）」、「ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ（〜より大きい）」、「ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ（〜未満の）」、「ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ（〜より多い）」、「ｏｒ  ｍｏｒｅ（〜以上）」などのような全ての言語は、挙げられている数を含み、そのような用語は、上で論じた部分的な範囲にその後分解され得る範囲を指している。同様に、ここに挙げられている全ての比率もまた、より広い比率の範囲に含まれる全ての部分的な比率を含む。それ故、ラジカル、置換基、および範囲に対して挙げられる特定値は、単に説明のためだけであり、それらはその他の規定値またはラジカルおよび置換基に対して定義された範囲内のその他の値を排除しない。
【００４０】
当業者は、部材が、一般的なやり方で、例えばマーカッシュ群におけるように、一緒にされる場合、その発明は、全体としてリストアップされた全体の群だけでなく、その群の各部材も個別に、および主となる群の全ての可能な亜群も含むことを同様に躊躇なく認めるであろう。さらに、全ての目的に対して、本発明は、主要な群だけでなく、主要な群ではない１つ（種）または複数の群部材もまた含む。本発明は、それ故に、列挙された群の任意の１つ（種）または複数の部材の明確な排除を考える。
【００４１】
したがって、但書は、任意の開示されるカテゴリーまたは実施形態に利用することができ、それによって列挙される成分、種、または実施形態の任意の１つまたは複数は、例えば明白な消極的な限定において使用されるようなカテゴリーまたは実施形態から排除され得る。
【００４２】
用語「接触」は、細胞または分子の段階を含めて、触れさせ、接触させ、または直接もしくは緊密に接近させて、例えば、生理的反応、化学反応、または物理的変化を、例えば、溶液中、反応混合物中、インビトロ、またはインビボでもたらす行為を指す。
【００４３】
「有効量」とは、疾病、障害、および／または健康状態を治療するため、または列挙した効果をもたらすために有効な量を指す。例えば、有効量は、治療される健康状態または症状の進行または重症度を緩和するために有効な量であり得る。
【００４４】
治療効果のある量の決定は、当業者の能力の範囲内である。用語「有効量」は、例えば、ホストにおいて、疾病または障害を治療または予防するため、または疾病または障害の症状を治療するために有効である本明細書に記載されている化合物の量、または本明細書に記載されている化合物の組合せの量を含むことが意図されている。したがって、「有効量」とは、望ましい効果を提供する量を一般に意味する。
【００４５】
用語「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療する）」、「ｔｒｅａｔ（治療する）」および「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」は、（ｉ）疾病、病的または医療状態が起こることを防ぐこと（例えば、予防）；（ｉｉ）疾病、病的または医療状態を抑制することまたはその進行を抑制すること；（ｉｉｉ）疾病、病的または医療状態を軽減すること；および／または（ｉｖ）疾病、病的または医療状態と関連する症状を減少させることを含む。したがって、用語「ｔｒｅａｔ（治療する）」、「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」および「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療する）」は、予防にまでおよび、治療される状態または症状の進行または重症度を、ｐｒｅｖｅｎｔ（防ぐ）、ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（予防）、ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ（防ぐ）すること、低下すること、停止することまたは逆進させることを含む。そのようなものとして、用語「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」は、適宜、医療、治療のための投与、および／または予防的投与の両方を含む。
【００４６】
用語「ｉｎｈｉｂｉｔ（抑制する）」、「ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ（抑制する）」、および「ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（抑制）」は、疾病、感染症、健康状態、または細胞群の成長または発展を遅くする、停止させる、または逆進させることを指す。この抑制は、治療または接触がなくて起こる成長または進行と比較して、例えば、約２０％、４０％、６０％、８０％、９０％、９５％、または９９％を超えることが可能である。
【００４７】
用語「イヌリン」は、当技術分野では周知であり、α−Ｇ−グルコピラノシル−［α−Ｄ−フルクトフラノシル］（ｎ−１）−Ｄ−フルクトフラノシド、線状β−Ｄ（２→１）ポリフルクトフラノシルα−Ｄ−グルコースのファミリーからなる多糖であり、一般的に最大約１００のフルクトース部分の分枝していない鎖（ｎ＝植物由来の物質については約５から約１００、そして微生物由来の物質については約５から約１００，０００）が、単一の末端グルコースユニットに連結されている。
【００４８】
【化１】
0006363509.tif 000002
【００４９】
イヌリンは植物由来の多糖であり、比較的疎水性のポリオキシエチレンのような主鎖を有する。この構造およびそのイオン化されない性質は、再結晶および非常に純粋な状態での調製を可能にする。イヌリンは、最大約１６ｋＤａの分子量の分子的多分散物として調製され得る。適切なイヌリン粒子（例えば、本明細書に記載されているβ−ＩｎおよびＩｎＡｃ粒子）は、約２ｋＤａから約１２ｋＤａ、約３ｋＤａから約８ｋＤａ、約４ｋＤａから約６ｋＤａ、または約５ｋＤａの分子量を有する原料イヌリンから調製され得る。
【００５０】
イヌリンは、キク科（ＣｏｍｐｏｓｉｔａｅまたはＡｓｔｅｒａｃｅａｅ）の貯蔵炭水化物として作用し、ダリアの塊茎から高い分子量の状態で得られる。イヌリンはさまざまな供給業者、例えばＳｉｇｍａ（ミズーリ州、セントルイス）などから商業的に入手され得る。イヌリンは、α、β、γ、δ、およびεの形を含めたいくつかの異形（多形体）の状態で存在する（例えば、国際公開第２０１１／０３２２２９号（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｙら）参照）。これらの形は、それらの溶解パラメーターによって区別され得る。アルファイヌリン（α−Ｉｎ）およびベータイヌリン（β−Ｉｎ）は、それぞれ水およびエタノールからの沈殿によって調製され得る。αおよびβイソ型は、両方とも３７℃の水に実質的に溶解する。ガンマイヌリン（γ−Ｉｎ）は、３７℃の水には溶解しないが、高濃度（＞５０ｍｇ／ｍｌ）で７０〜８０℃では水に溶解する。β−多形相または何らかの水溶性の形の状態のイヌリンは、アジュバント／免疫増強効果を有することが示されたことは断じてない。
【００５１】
用語「イヌリンアセテート」（ＩｎＡｃ）は、アセチル化されたイヌリンを指す。一般的にはイヌリンの利用できるヒドロキシル基の少なくとも約９０％がアセチル化され、しばしば、少なくとも約９５％または少なくとも約９８％がアセチル化される。複数の実施形態において、より少ない程度までアセチル化されたイヌリン、例えば、利用できるヒドロキシル基の少なくとも約１０％がアセチル化されているイヌリンなどが使用され得る。複数の実施形態において、利用できるヒドロキシル基の少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％が、さまざまなイヌリンアセテート製剤のためにアセチル化され得る。複数の実施形態において、アセチル化イヌリンは、その赤外スペクトルのヒドロキシルピークが消えてアセチルピークが現れるとき、イヌリンアセテートであると考えられる。イヌリンアセテートは、水には高温であってさえも溶解しないが、さまざまな有機溶剤、例えば、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタンおよび同類のものなどには溶解する。
【００５２】
イヌリンアセテートは、補体の第二経路（ＡＰＣ）を活性化せず、ＩｎＡｃは、抗原と一緒に注射されるときワクチンアジュバントとして機能しない。ＩｎＡｃは、生理食塩水中に容易に分散できる。抗原は、ワクチンアジュバントとして機能するために、ＩｎＡｃ粒子の内側に封入されているか、またはＩｎＡｃ粒子と物理的に結びつけられていなければならない。ＩｎＡｃマイクロ粒子およびナノ粒子は、その抗原の取り込みを高め、その封入された抗原を活性化のために免疫細胞の関連する部分に送達することによってワクチンアジュバントとして機能することができる。ＩｎＡｃは、また、ここで初めて示される新しいＴＬＲアゴニストである。理論に縛られるわけではないが、これは、ＩｎＡｃがアセチル化されていないイヌリンの形とは異なる機構によるワクチンアジュバントとして機能することを示唆している。
【００５３】
他のイヌリン誘導体が、イヌリンアセテートに加えて、またはその代わりに使用され得る。一つのイヌリン誘導体は、イヌリンのヒドロキシル基が、アルキル、アリール、またはアシル基による化学的置換によるか、または既知の方法による酸化もしくは還元によって変性されたイヌリンであり得る。例えば、Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎにより、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９６）、に記載されている技術を参照されたい。
【００５４】
イヌリン誘導体には、エステル連鎖、エーテル連鎖、アミド連鎖、カルバメート連鎖、イヌリンおよびそれら誘導体の酸化または還元型、イヌリンのカチオン／アニオン／非イオン変態（アニオン：Ｏ−（カルボキシメチル）イヌリン、カチオン：Ｉｎｕｔｅｃ  Ｈ２５Ｐ）、およびイヌリンまたはその酸化／還元型の他の薬剤との錯体形成（例えば、酸化されたイヌリンの銅、亜鉛、カドミウム、または同種のもの等の重金属との錯体形成）が含まれる。
【００５５】
「イヌリンエステル」または「エステル化イヌリン」とは、カルボン酸のようなエステル形成性の基との縮合によりまたはカルボン酸無水物、または同種のもののような基によるアシル化によってヒドロキシル基のところでエステル化されたイヌリンを指す。イヌリンエステルの例としては、イヌリンプロパノイレート（propanoylate）、イヌリンブタノイレート（butanoylate）、イヌリンホスフェートなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５６】
「イヌリンエーテル」または「エーテル化イヌリン」とは、ハロゲン化物、酸ハロゲン化物などの適切な離脱基を有している基のようなエーテル形成性の基によって、ヒドロキシル基のところでエーテル化されたイヌリンを指す。イヌリンエーテルの例としては、メチル化イヌリン（例えばイヌリンペルメチルエーテル）、エチル化イヌリンなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５７】
イヌリンおよびそれらの誘導体の酸化または還元型の例としては、イヌリンカーボネート、ジアルデヒドイヌリンなどが挙げられる。使用され得るその他のイヌリン誘導体としては、シアノエチルイヌリン、アミノ−３−オキソプロピル−イヌリン、カルボキシエチルイヌリン、ヒドロキシアミノ−３−アミノプロピルイヌリン、イヌリンカルバメート（例えば、Ｉｎｕｔｅｃ  ＳＰＩ）、またはそれらの組合せが挙げられる。
【００５８】
これらイヌリン誘導体は、カーゴ分子（例えば抗原）が粒子中に封入されているか、あるいは粒子にコートまたは接合されている粒子製剤の形をしていることができる。イヌリンの利用できるヒドロキシル基の修飾は、イヌリンアセテートのアセチル化について上で説明したような程度までであり得る。
【００５９】
「活性薬剤」または「活性な」とは、薬、免疫学的薬剤（例えば、抗原）、またはβ−イヌリンもしくはＩｎＡｃ粒子に封入もしくは物理的に結合されたその他のカーゴ分子を指す。「物理的に結合された」とは、ポリマーに対する、もしくは粒子に対する親水性、疎水性相互作用、または水素結合を含めた静電的相互作用による結合を指す。「粒子と物理的に結合された」とは、粒子が薬剤によって被覆されていることのほかに粒子がその薬剤に共有結合的に接合されていることを指すことができる。
【００６０】
接合の方法は、当技術分野では周知であり、いくつかの技術が、Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎにより、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９６年）、に記載されている。活性薬剤は、粒子とカーゴ分子および／または物理的に結合された分子全てを含めたものの約１重量％から約２５重量％、約１重量％から約１０重量％、または約１重量％から約５重量％で、粒子中に充填することができる。
【００６１】
「抗原」とは、適切な条件下で、特定の免疫反応を誘発することおよびその反応の生成物と、即ち、特定の抗体または特異的に感作されたＴリンパ球あるいは両方と反応することができる任意の物質を指す。用語「抗原」、「免疫原」、および「活性薬剤」は、この文書の至るところで互換的に使用され得る。抗原類は、毒素および自己もしくは異種タンパク質／ペプチドのような可溶性物質、またはバクテリア、ウイルス、および組織細胞のような粒子状物質であり得、しかしながら、抗原決定基またはエピトープとして知られるタンパク質または多糖分子のごく一部のみがリンパ球上の特異受容体によって認識される。同様に、その反応によって生じた抗体またはエフェクターリンパ球は、１つの抗原決定基のみと結合する。細菌性細胞または巨大タンパク質は、何百もの抗原決定基を有することができ、そのいくつかは感染防御免疫において他よりもより重要である。
【００６２】
本明細書において提供されるアジュバントと共に使用され得る既知の抗原の一部のリストは、以下の通りである：同じ種の全ての個体ではないがいくらかの個体で発生する、同種異系抗原、例えば、かつては同種抗原と呼ばれた組織適合抗原および血液型抗原；細菌性抗原；赤血球の表面に存在し、同じ種の個体の間で変化し、血液型の判定のための基礎として使用される、抗原；莢膜抗原；Ｋ、ＬおよびＶ抗原；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；腫瘍胎児抗原；２種以上の異なる抗原分子中に存在する抗原決定基およびそれらの間の交差反応のための基礎である、共通抗原；これは、免疫反応の刺激と、その反応の生成物、例えば、抗体との反応の両方を行う抗原である、完全抗原；合成抗原；ハプテン；異なるけれども関連する抗原に応じて、抗原決定基の類似性、または２種の細菌の菌株中の同一抗原のせいで、１つの菌株に対して生成した抗体が他の抗体と反応するように生成された抗体と結合する抗原である、交差反応抗原；イヌの赤血球で見出された抗原であり、種において異なる血液型を区別するために使用される、イヌ赤血球抗原（ＤＥＡ）；環境抗原、花粉、菌類、ハウスダスト、食物および動物の鱗屑中に見出されるもの；ネコ白血病ウイルスに感染したネコにおいて細胞膜に存在する腫瘍特異性抗原である、ネコオンコルナウイルス細胞膜抗原（ＦＯＣＭＡ）；鞭毛抗原；細菌鞭毛に発生する抗原である、ＨまたはＨａｕｃｈ抗原；ノミの唾液のいくつかの成分、その上ノミの抽出物を含む、ノミ抗原；フォルスマン抗原；さまざまな関係のない種において、主として赤血球ではなく臓器において、または赤血球のみにおいて、あるいは時々、臓器と赤血球の両方において発生するそのような抗原である、異好性抗原；特定の生物群、例えば、連鎖球菌、オンコルナウイルスに共通している、群特異的（ｇｓ）抗原；異種遺伝子型抗原；異種抗原；異好性抗原；他の動物または植物からの組織と反応する抗体の生成を刺激することができる抗原を含む、異種抗原；循環リンパ球に、例えば、中枢神経組織、精巣組織および特定の細胞内成分中には通常さらされない抗原であり、したがって、それらは免疫反応を通常は引き起こさない、隠された抗原；組織適合抗原；細胞膜の組織適合抗原である、Ｈ−Ｙ抗原；Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、皮膚、および特定のマクロファージに位置づけられる主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のＩ領域によって支配される組織適合抗原である、Ｉａ抗原；同じ種の遺伝的に異なる個体においては免疫反応を引き出すことができるがそれを持っている個体においてはできない同じ近交系の個体またはメンバーによって保有される抗原である、同質遺伝子的抗原；Ｋ抗原；細菌性莢膜抗原；大腸菌の莢膜抗原である、Ｌ抗原；Ｌｙ１，Ｌｙ２およびＬｙ３として分類されるＴリンパ球の亜母集団の抗原細胞表面マーカーである、Ｌｙ抗原、；リンパ球限定（ＬＤ）抗原；リンパ球、マクロファージ、上皮細胞および精子中に見出される、クラスＩＩ抗原；細胞壁に主として位置づけられるようであり、化膿連鎖球菌の毒性が付随している型特異性の抗原である、Ｍ抗原；マレック病、ヘルペス・ウイルスによって感染された細胞の表面に見出される、マレック腫瘍特異抗原（ＭＡＴＳＡ）；死滅しており、乾燥してひいて粉末にした結核菌からアセトンおよびメチルアルコールを用いて調製した抗原である、Ｎｅｇｒｅ抗原；細胞核の成分であり、抗核抗体がそれと反応する、核抗原；バクテリアの細胞壁において発生する、０抗原；胎児の発達中に発現されるが、成人の特殊組織中で抑止され、特定の癌によっても発生される遺伝子産物であり、αフェトプロテインおよび癌胎児性抗原を含む、腫瘍胎児抗原；特定臓器中で独占的に発生する任意の抗原であり、他の臓器からそれを区別する働きをする、臓器特異抗原；部分抗原；植物の花粉の本質的なポリペプチドである、花粉抗原、；低頻度の血液型の抗原である、私有抗原；個体がすでにそれに感作されており、超過敏反応を引き出すための負荷用量としてその後投与される抗原である、リコール抗原；胚発生中に免疫システムから解剖学的に隔絶され、したがって、「自己」として認められないと考えられ、そのような抗原は成人期中に免疫システムにさらされるはずであり、自己免疫反応が引き出される特定の抗原である、隔絶抗原；特異抗血清の使用によって特定可能な主要組織適合複合体のクラスＩ抗原である、血清学的規定（ＳＤ）抗原；微生物抗原またはその他の抗原に見出される配列に基づいて、化学的に合成されるかまたは組換えＤＮＡ技術、ポリマーの合成によって製造される、合成抗原、；Ｔ依存性抗原（ほとんどの抗原の免疫反応は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）リンパ球を必要とし、Ｔリンパ球によって生じたリンフォカインは、生成した抗体の特徴を決定し、それは免疫反応中に変化し得る）；免疫反応が起こることができる前にＴリンパ球の関与を必要とする抗原である、胸腺依存性抗原；Ｔリンパ球の関与なしで抗体反応を引き出す抗原である、胸腺非依存性抗原；免疫寛容原性の抗原；腫瘍細胞中のみに見出される抗原である、腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ）；バクテリアの嚢内に含まれており、その毒性の一因となると考えられる抗原である、Ｖ抗原、Ｖｉ抗原；１つの種のメンバーに共通するが、その他の種のメンバーには共通しない、異種遺伝子型抗原とも呼ばれる異種抗原。
【００６３】
「補体経路」とは、不活性な酵素前駆体の形で通常存在する多数の血清糖タンパク質でできている複雑な酵素カスケードを指す。この系は、３つの個別経路：「古典経路」、「代替経路」および「レシチン経路」を有する。この補体系の古典経路は、ヒト免疫反応の体液性分岐部の主要なエフェクターである。この古典経路に対するトリガーは、抗原に結合されたＩｇＧまたはＩｇＭ抗体のいずれかである。抗体の抗原への結合は、第１の補体成分、Ｃｌ、に対する結合部位である抗体上の部位をさらす。
【００６４】
「補体第二経路」すなわちＡＰＣは、その活性化のために抗体を必要としない。それどころか、細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）およびウイルスの成分等のさまざまな抗原、ならびにその他の病原体は、この経路を活性化する能力を有する。理論に縛られるのではなく、古典的な補体経路より早く展開したことが考えられ、それは比較的最近発展した抗体分子に依存している。古典的経路のように、代替経路は、Ｃ３およびＣ５転換酵素の両方を生成し、それはＣ５ｂの生成および次いで細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）の形成をもたらす。けれども、特定の分子プレイヤーおよびその経路に沿った通路は、しかしながら、古典補体経路のそれと異なる。
【００６５】
各経路に対する刺激因子は、はっきりと区別できるが、それぞれの因子は、細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）、さまざまな細胞表面に穴をあける酵素複合体、を作り出す類似の末端配列を有する。加えて、その代替および古典経路は両方とも、それらの副産物として炎症反応の一因となるいくつかのアナフィラトキシン−低分子ペプチドを有する。
【００６６】
補体系に含まれる分子は、名称「Ｃ」と次に数字、例えば、「Ｃ１」が一般に与えられる。その数字は、それらがそのカスケード中で作用する順番を示すものではなく、それらが発見された順番を指している。補体タンパク質は、酵素前駆体の形で通常は存在し、さまざまな分子の継続的な開裂によって連続して活性化される。補体タンパク質が裂かれるとき、一般に「ａ」および「ｂ」と呼ばれる２つの断片が形成される。補体分子Ｃ５は、例えば、断片Ｃ５ａおよびＣ５ｂに開裂される。
【００６７】
オボアルブミン、または「ｏｖａ」は、水溶性アルブミンであり、鶏卵の白味の主成分である。卵の白身中のタンパク質全体のほぼ６０〜６５％はオボアルブミンである。オボアルブミンは、貯蔵タンパク質として作用することができ、鶏卵のオボアルブミンは被験者におけるアレルギー反応を刺激する抗原として使用され得る。
【００６８】
ここで使用される用語「動物」とは、１）セルロース壁のない細胞を有しており、２）葉緑素および光合成のための能力に欠けており、３）より複雑な食品材料、例えばタンパク質を必要とし、４）より高度の複雑さまで組織化されており、そして５）刺激に対する自発運動および素早い運動反応の能力を有している一般的に植物とは異なる多細胞生物、および単細胞生物を含めた動物界のメンバーを含むがこれらに限定されない任意の生物界を指す。ここで使用される用語の動物とは、任意の動物界の大規模な区分または亜界、およびそれらの下の主要な種類をも指し、以下に限定されないが：哺乳類または哺乳動物を含み、アイ類（Ａｙｅｓ）または鳥類、爬虫類、両生類、魚類、嚢鰓類（Ｍａｒｓｉｐｏｂｒａｎｃｈｉａｔａ（Ｃｒａｎｉｏｔａ））、およびナメクジウオ綱（無頭類）を含めた脊椎動物；サルバ綱、およびＡｓｃｉｄｉｏｉｄｅａまたはホヤ類を含む被嚢動物亜門；昆虫綱、多足類、Ｍａｌａｃａｐｏｄａ、蛛形綱、ウミグモ類、節口綱、甲殻綱（節足動物門）、およびＧｅｈｙｒｅａ（Ａｎａｒｔｈｒｏｐｏｄａ）を含む有関節綱またはＡｎｎｕｌｏｓａ；輪虫綱、毛顎動物門、Ｎｅｍａｔｏｉｄｅａ、鉤頭虫類、紐型動物、渦虫類、吸虫綱、条虫綱、中生動物を含む蠕虫類（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｅｓまたはｖｅｒｍｅｓ）；腕足類およびコケムシ類を含む擬軟体動物；頭足綱、腹足綱、翼足目、堀足綱、
弁さい類または無頭類を含む軟体動物門；ナマコ類、ウニ綱、ヒトデ綱、クモヒトデ類、およびウミユリ綱を含む棘皮動物門；花虫綱またはポリプを含む腔腸動物；有櫛動物門およびヒドロ虫綱またはハチクラゲ類；海綿動物を含むＳｐｏｎｇｉｏｚｏａまたは海綿動物門；および滴虫類および根足虫類を含む原生動物が挙げられる。ここで使用される用語の動物とは、以下の非限定の例をさらに指す：ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、乳牛、子羊、ブタ、雄ブタ、家禽、ウマ、雌馬、ラバ、雄ロバ、雌ロバ、雄子ウマ、子ウシ、当歳馬、種ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、バイソン、バッファロー、子羊、子ヤギ、子ブタ、めんどり、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、その他の鳥類または野鶏、ウサギ、野ウサギ、モルモット、ハムスターマウス、ラット、その他のげっ歯類、魚およびその他の水生動物種、ならびに両生類。ここで使用される用語「動物」は、遺伝子導入動物をさらに指す。
【００６９】
本明細書で使用される用語の「対象」とは、医学的または科学的研究の目的物である動物を意味する。
【００７０】
ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質測定は、溶液中のタンパク質の全体濃度（例えば０．５μｇ／ｍＬから１．５ｍｇ／ｍＬ）を測定するための生化学的分析である。全体のタンパク質濃度は、試料溶液のタンパク質濃度に比例する緑から紫への色の変化によって示され、それはそのとき、比色分析技術を用いて測定することができる。
【００７１】
１９２６年以来、米国においてはミョウバンがヒトへの使用に対して認可された唯一のアジュバントであったが、それは体液性免疫反応（Ｔｈ２タイプ）を生ずるのみである。その上、ミョウバンアジュバント・ワクチンは通常の凍結乾燥および冷凍の際の有効性の喪失を含めた多くの不都合を有する（Ｍａａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２００３年；９２（２）：３１９〜３２頁）。今日利用できる多数のワクチンの低温保存は、特に開発途上国において製薬会社および供給者にとっての重大な関心事である。
【００７２】
本明細書に記載されている実施形態において提供されるのは、体液性（細胞外病原体に対する）および細胞性（細胞内病原体に対する）を含む免疫システムの両方のアームを刺激することができる効果的なアジュバント製剤である。さらに、本開示は、周囲温度において物理的に安定であり、凍結−乾燥法に適しており、それ故コールドチェーン保存に対する必要性を取り除くことができるワクチンおよび送達製剤を提供する。その上、イヌリンアセテートは、新しいＴＬＲアゴニストであり、粒子として製剤化されたとき免疫システムを刺激する。ＩｎＡｃをワクチンアジュバントとして使用する多くのその他の利点のいくつかが本明細書に提供される。
【００７３】
下に提供されている開示は、イヌリン（β−Ｉｎ）の水溶性のβ多形相およびその合成誘導体イヌリンアセテート（ＩｎＡｃ）のナノ粒子およびマイクロ粒子製剤の調製ならびにこれらの製剤の免疫増強物質としての用途について詳しく述べる。オボアルブミン（ｏｖａ）は、モデル抗原として使用され得る。ｏｖａを含有しているβ−ＩｎまたはＩｎＡｃマイクロ粒子は、二重エマルジョン−溶媒蒸発法によって調製され得る。インビトロの遊離試験は、組み込まれたｏｖａの殆ど（＞９５％）がβ−Ｉｎ粒子およびＩｎＡｃ粒子からそれぞれ１６時間および５２８時間（２２日）のうちに遊離されることを示す。
【００７４】
マウスにおける免疫調査は、β−Ｉｎマイクロ粒子中に封入されたｏｖａが封入されていない（遊離の）ｏｖａよりも強い抗体反応を生じた（Ｔｈ２タイプのみ）ことを示している。この結果は、アジュバントとしてミョウバン（唯一のＦＤＡ認可のアジュバント）が使用される場合の群と比較して反応の型が似ており強度はより大きかった。例えば、その反応の強度は、ミョウバンがアジュバントとして使用される場合の群の反応の強度の最大で約４倍、または約２倍から約４倍であり得る。また一方、ｏｖａを含んでいるＩｎＡｃマイクロ粒子は、ミョウバンに結合したｏｖａよりも著しく高い抗体反応を生じた。
【００７５】
例えば、ｏｖａを含んでいるＩｎＡｃマイクロ粒子を受けるマウスにおける全体のＩｇＧ反応は、ミョウバンに結合したｏｖａを受けるマウスにおけるより最大約９０倍大きい。その上、ｏｖａを含んでいるＩｎＡｃマイクロ粒子を受けるマウスにおけるＩｇＧ１反応は、ミョウバンに結合したｏｖａを受けるマウスにおけるより最大約７５倍大きかった。さらにまた、ｏｖａを含んでいるＩｎＡｃマイクロ粒子を受けるマウスにおけるＩｇＧ２ａ反応は、ミョウバンに結合したｏｖａを受けるマウスにおけるより最大約１２００倍大きかった。それ故、ｏｖａを取り込んだＩｎＡｃ粒子は、ｏｖａに結合したその他のアジュバントより著しく高い抗体反応を生ずることができる。例えば、ｏｖａを取り込んだＩｎＡｃ粒子は、ミョウバンに結合したｏｖａより以下のように著しく高い力価を生ずることができる：全体のＩｇＧは、少なくとも約５〜１００倍高く、少なくとも約１０〜１５０倍高く、または少なくとも約１０〜２００倍高い；ＩｇＧ１は、少なくとも約１０〜１００倍高く、少なくとも約１５〜８５倍高く、または少なくとも約２０〜８０倍高い；そしてＩｇＧ２ａは、少なくとも約２〜１５００倍高く、少なくとも約１００〜１５００倍高く、または少なくとも約５００〜１５００倍高い。
【００７６】
意義深くも、ＩｎＡｃマイクロ粒子は、現代のワクチン送達技術において求められるＴｈ１およびＴｈ２タイプの両方の免疫反応を発生させた。開示された実施例が、皮内（ｉ．ｄ．）ルートによって行われた事実は、ワクチン供給技術、例えば、極微針またはｉ．ｄ．ルートを使用するその他の送達方法などにおけるアジュバントとしてのＩｎＡｃ粒子の使用の可能性をさらに際立たせる。
【００７７】
本開示は、また、投与量、粒径（ナノ粒子対マイクロ粒子）および投与ルートを調節することによって操作され得る免疫反応の程度を明らかにする。ＩｎＡｃ粒子のさまざまな大きさは、緩衝剤、界面活性剤、溶媒およびその他の賦形剤の精選された組合せの使用によって調製され得る。これらの複合的な製剤は、それらの免疫活性化作用のおかげで、幅広い使用の可能性を有する。本明細書に記載されている組成物は、著しく高い（細胞性のおよび体液性の）免疫反応特性および改善された安全性プロフィールを備えた新規なそして費用効率が高いワクチンアジュバントを提供するために使用され得る。
【００７８】
本明細書に記載されているアジュバント製剤は、アジュバントとしてのミョウバンより強い免疫反応を提供する。本発明のこのアジュバント製剤は、体液が媒介となる免疫性（Ｔｈ２；細胞外病原体に対する）および細胞が媒介となる免疫性（Ｔｈ１；細胞内病原体に対する）の両方の産生を刺激し、このことはミョウバンを含めたその他のアジュバントを超える大きな利点である。さらに、現行のワクチンは、従来続けられている凍結乾燥および冷凍保存の際に有効性を失い得る。開示されているワクチンおよび送達製剤は、周囲温度で物理的に安定であることができ、冷凍乾燥に適しており、それ故コールドチェーン保存または保存料の添加に対する必要性を取り除くことができる。
【００７９】
本明細書で提供されるアジュバント製剤は、生体適合性であり、生分解性である。イヌリンは、無毒性のプロフィールを有する利点によりヒトにおける安全な使用の長い歴史を有する。イヌリンの代謝産物は、フルクトースおよびグルコースであり、これらは容易に排泄され得る。イヌリンは、無毒であると報告されており、食品添加物として使用されてきている。
【００８０】
本明細書に記載されているアジュバント製剤は、植物から得られる。それらが植物を起源とするために、ＩｎＡｃを含めたこれらのアジュバント製剤は、普遍的に使用され得る。このことは、菜食主義者によって使用または消費されない動物に由来する物質とは際立って対照的である。その上、それらは植物から得られるために、ここで提供されるアジュバント製剤は、動物からの微生物または血液汚染の危険を伴うことはない。
【００８１】
ここに記載されているアジュバント製剤は、現在利用できる選択肢を超える高められた安定性を提供する。市販ワクチンは、低温貯蔵を必要とし、それは、ワクチンの低温の貯蔵および輸送に付随する高いコストおよび増加する物流手配をもたらす。アジュバントとしてのＩｎＡｃマイクロ粒子またはナノ粒子の使用は、周囲温度で物理的に安定であるほかに冷凍乾燥後も物理的に安定であるワクチン製剤を提供する。
【００８２】
この増加した安定性は、コールドチェーンモニタリングおよび貯蔵に対して費用がかかる複雑な要件を取り除く。γ−イヌリン等の特定のアジュバントは、免疫アジュバント効果のために抗原溶液の同時注入を必要とする。この抗原とアジュバントの同時注入は、その抗原を凝集または分解しやすくすることができる。光、酸素または湿気に対してそれらを不安定にする特性を有する抗原は、ＩｎＡｃマイクロ粒子またはナノ粒子アジュバント中への封入によって保護されて保存寿命を改善することもできる。
【００８３】
本明細書に記載されているアジュバント製剤は、産生するのに費用効率が高い。ＩｎＡｃは、市販の未加工のイヌリンを含めた任意の形のイヌリンから調製され得る。本明細書に記載されているアジュバント製剤は、その他の洗練されたワクチン供給システムより著しく低いコストで調製され得る。本明細書で提供されるＩｎＡｃを準備することによって、さまざまな形のイヌリンを調製する複雑な手順は避けることができ、いろいろなイソ型の間の多様な形を持つ転化は懸案事項ではない。ＩｎＡｃ調製の収率は、際立って１００％近くであり、これはγ−イヌリン調製の１０〜５０％の収率と比較して非常に好都合である。
【００８４】
本明細書に記載されているアジュバント製剤は、優れた分散性および動態ならびに均一な粒径を提供する。分散性は、ワクチン製剤の調製、取扱い、および複数の投与バイアルからの投与に対してその重要な特性である。ＩｎＡｃマイクロ粒子またはナノ粒子は、適切な界面活性剤および抗凍結剤を使用することによって容易な再分散性に向けて最適化された。それ故、ここで提供されるＩｎＡｃ製剤は、水性溶媒または緩衝液中で均一に分散され得る。このＩｎＡｃマイクロ粒子またはナノ粒子は、振盪時に水溶液中に均一に分散させることができ、それ故それらは、複数の投与バイアルから標準操作手順を用いて容易に投与することができる。
【００８５】
本明細書に記載されているアジュバント製剤は、抗原の持続放出を提供する。抗原は、本明細書に記載されているＩｎＡｃ製剤から長期間（１〜２ヶ月、２〜３ヶ月、またはそれ以上を含むがこれらに限定されない）にわたって放出され得る。長期間にわたる抗原放出のために、本発明の製剤は、追加抗原投与の必要性なしでの、シングル・ショット・ワクチンとして使用され得る。ワクチンの反復投与の必要性を取り除くことによって、本明細書に記載されている製剤は、コストの著しい削減を提供し、患者および医療提供者にとってより好都合である。１回を超えるワクチンの注射に対する必要性の排除によって引き起こされるその他の利点が存在する。例えば、患者コンプライアンスが増すと、予防接種キャンペーンはより支持され得る。さらにまた、本明細書に記載されている製剤の粒子の大きさは、操作する（ナノ粒子対マイクロ粒子）ことができるので、患者における望ましい送達先も、選択することができ、それは、言い換えると、結果として得られる免疫反応におけるより大きな正確さを可能にする。
【００８６】
本開示は、β−イヌリンおよびイヌリンアセテートを新たな毒性のない生体適合性のワクチンアジュバントおよび送達製剤として提供する。イヌリンは、ヒトでの安全な使用の長い歴史を有しており、その代謝産物（フルクトースおよびグルコース）は容易に排泄される。予備的な観察は、マウスにおける注射の部位でＩｎＡｃおよびＩｎＡｃ製剤と関連する目に見えるまたは組織学的な毒性は示さない。ヒトにおいて注射の部位で何らかの局所炎症または刺激が現れる場合は、組み込まれるアジュバントの量を減らすことによってこの問題は実質的に回避される。減少された量のβ−イヌリンまたはＩｎＡｃ粒子における必要な抗原用量に適応させるために、その抗原負荷は、そのナノ／マイクロ粒子を調製する間に、その製剤およびプロセスパラメーターを操作することによって増加させることができる。
【００８７】
いくつかの方法が、溶媒／無溶媒、単一エマルジョンおよび二重エマルジョン準備技術を含めて使用され得る。二重エマルジョン法によって調製されたマイクロ／ナノ粒子は、試験された類似の製剤条件の下で、高い抗原負荷、低いバースト放出（最初の３０分間に粒子から放出される抗原の割合）、および持続放出の増加の有利な組合せを有することが見出された。しかしながら、製剤パラメーターを変化させることによって、その抗原の負荷は、任意の既知の方法で達成される負荷を超えてさらに高めることができた。ＩｎＡｃマイクロ／ナノ粒子中への抗原の負荷は、その負荷条件を、約１００ｍｇのＩｎＡｃポリマー当たり約１００μｇの抗原から約１００ｍｇのＩｎＡｃポリマー当たり約２０ｍｇの抗原まで増やすことにより、その製剤中の抗原：ポリマー比を増やす（０．４μｇ／ｍｇ粒子から５１μｇ／ｍｇ粒子）ことによって、さらに増やすことができる。この比率は、最適化された処方因子により、約７５μｇ／ｍｇのＩｎＡｃ粒子または約１００μｇ／ｍｇのＩｎＡｃ粒子まで増やすことができる。ナノ／マイクロ粒子の内側の抗原の負荷は、装填手順において抗原と共にマンニトールを組み込むことによってさらに高めることができる。最大約１００μｇ／ｍｇのＩｎＡｃ粒子の抗原量が、マンニトールの存在下で装填され得る。同様に、その他の炭水化物または親水性物質（例えば、トレハロース）を、マイクロ／ナノ粒子の内側の抗原の負荷を高めるために製剤中に加えることができる。
【００８８】
β−イヌリン中への抗原装填効率は、著しく高い。１ｍｇ当たり抗原最大約５００μｇ（例えば、抗原１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、または５００μｇ／ｍｇ（β−イヌリン））の抗原の装填が達成され得る。それ故に、ここで提供される製剤は、治療の目的、抗原の特殊性、および／または患者の独特の必要性に合うように、必要に応じて抗原の送達を調整する能力を与える。
【００８９】
下記事項は、本発明の組成物および製剤のいくつかの研究および商業的応用の非限定の例として提供される。
【００９０】
イヌリンおよびＩｎＡｃ粒子は、ワクチン送達系およびワクチンアジュバントの両方として機能する。強力で安全なワクチンアジュバントはまれである。非限定の例として、癌ワクチンならびに細胞外の病原体および細胞内病原体（例えば、ウイルスおよび寄生虫など）に対するワクチンが、本発明の製剤の使用がＴｈ１およびＴｈ２タイプの両方の免疫反応を活性化するために有益であるごくわずかのワクチンの例である。この発明において提供される技術は、免疫反応の両腕を刺激することにおける既存の技術（ミョウバン）よりも優れており安全なやり方を提供する。この発明の組成物および製剤は、種々のそして非常に広範囲の疾病および健康状態に対するヒトまたは動物のワクチンアジュバントとして利用され得る。
【００９１】
本明細書に記載されているアジュバント製剤は、他の免疫賦活性および／または免疫調節性の薬剤、例えば、サイトカインなど、もしくはリンフォカインおよびインターロイキンを含むがこれらに限定されないその他の調節タンパク質、または免疫系細胞もしくはその他の細胞の産物、ならびに免疫反応のような反応の変調における細胞内媒介物として作用する免疫系細胞もしくはその他の細胞の産物、あるいは病原体関連分子パターン（ＰＡＭＳ）またはパターン認識受容体（ＰＲＲ）のための任意の配位子のような免疫システムを非特異的に刺激する病原体の産物と混合することができる。適切な例としては、ＣｐＧ、またはその他のＴＬＲアゴニスト、インターロイキンＩＬ−１からＩＬ−３５およびその他、インターフェロン（タイプ１およびタイプ２を含めた全てのタイプ）が挙げられル画これらに限定するものではなく、これらは、免疫反応をさらに調節し、高めるために、本明細書に記載されているアジュバント製剤と共に使用され得る。
【００９２】
本明細書に記載されているアジュバント製剤は、患者における薬物または薬剤の送達のために他の治療法と組み合わせることができる。例えば、アジュバント製剤は、癌治療のためには化学療法剤（例えば、ブレオマイシン、ドキソルビシン、パクリタキセル、５−フルオロウラシル、ビンクリスチンなど）、アルツハイマーの治療のためには、ドネペジル、ガランタミン、メマンチン、リバスティグミン、またはタクリン等の薬物と、またはその他の治療のためには、光線力学療法および／または栄養補助食品（例えば、クルクミン、ω−３脂肪酸、ビタミンＣなど）と組み合わせて投与することができる。
【００９３】
本明細書に記載されているアジュバント製剤は、ワクチンの目的で使用されて、さまざまな抗原の送達を提供することができる。本明細書に記載されている組成物および製剤は、ウイルス抗原、サブユニット・ワクチン、腫瘍抗原、アレルギー抗原（ａｌｌｅｒｇｉｅｓ  ａｓ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ＤＮＡまたはＲＮＡワクチンを含めた核酸ワクチン、組換えタンパク質および組換え抗原、ならびにタンパク質／炭水化物／多糖抗原を含むがこれらに限定されない抗原を送達するために使用され得る。
【００９４】
本明細書に記載されているアジュバント製剤は、幅広い種類の病気および健康状態の治療および予防のために、抗原、調合薬またはタンパク質、あるいは任意のその他の治療化合物または製剤と共に使用され得る。本明細書に記載されている新規な組成物および製剤は、ヒト、哺乳類およびその他の動物、ならびにその他の生物に影響を及ぼす状態に対する治療法、予防法、またはワクチンとして使用され得る。
【００９５】
本発明の組成物および製剤は、抗原、他の薬剤、調合薬、タンパク質、または任意のその他の適切な化合物もしくは製剤と組み合わせて、マラリア、インフルエンザＡおよびＢ、その他のインフルエンザおよびそれらの変種、例えば、季節性インフルエンザ、ブタインフルエンザ、パラインフルエンザ、汎発性インフルエンザ、抵抗性汎発性インフルエンザ、トリインフルエンザなど、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、炭疽、ジフテリア、ヘモフィルスインフルエンザｂ菌（Ｈｉｂ）、エイズ、脳炎、日本脳炎（ＪＥ）、ライム病、マラリア、マールブルグ病、麻疹、サル痘、流行性耳下腺炎、百日咳、風疹、灰白髄炎（ポリオ）、狂犬病、ロタウイルス、天然痘、破傷風（開口障害）、結核、腸チフス、黄熱病、熱帯病、寄生虫症、リーシュマニア症、コンフォメーション障害、肉胞子虫感染症、慢性疲労症候群、出血熱、レプトスピラ症、ボツリヌス中毒症、デング熱、Ｑ熱、バベシア症、レジオネラ症、トリパノソーマ症、ハンセン病、ライム病、およびロッキー山紅斑熱が挙げられるがこれらに限定されない疾病に対する治療、予防またはワクチンとして使用することができる。
【００９６】
本発明の組成物および製剤は、抗原、他の薬剤、調合薬、タンパク質、または任意のその他の適切な化合物もしくは製剤と組み合わせて、疾病のための治療または予防あるいはワクチンとして使用することができ、そのような疾病または健康状態としては、限定はされないが、ジアルジア種、連鎖球菌種、ブドウ球菌種、エシェリキア種、腸内細菌科種、腸球菌種、ヘモフィルス種、マイコバクテリウム種、粘液細菌種、ナイセリア種、プラスモジウム種、シュードモナス種、サルモネラ種、シゲラ種、髄膜炎菌種、レプトスピラ種、カンジダ種、コポデラ（Ｃｏｐｏｄｅｌｌａ）種、酵母種、真菌種、クリプトコッカス種、バルトネラ種、リケッチア種、ボレリア種、トリパノソーマ種、カンピロバクター種、ロタウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エイズ、トリインフルエンザウイルス、帯状疱疹（Ｈｅｒｐｅｓ  ｚｏｓｔｅｒ）およびＨＳＶ（単純疱疹ウイルス）を含めたヘルペス・ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヘンドラウイルス、ヒト・メタニューモウイルス、ライノウイルス、ボカウイルス、コロナウイルス、浸潤性サフォルドウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ハンタウイルス、出血熱ウイルス、ワクシニアウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ウエスト・ナイル・ウイルスによって引き起こされるもの；ウシ海綿状脳炎（ＢＳＥ）およびニパウイルス、ブルセラ症、狂犬病ならびに嚢虫症／条虫症およびエキノコックス症／包虫症を含むがこれらに限定されない寄生虫症、動物インフルエンザ、無視された人獣共通感染症、を含むがこれらに限定されない人獣共通感染症疾患、反芻動物疾患、ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）、ブタ流行性下痢、エーリキア症、ブルータング病、慢性消耗病、ブタコレラ、ウマ伝染性子宮炎、ウマヘルペスウイルス、ウマ伝染性貧血、ウマピロプラズマ病、ウマウイルス性動脈炎、口蹄疫、ヨーネ病、ピロプラズマ症、仮性狂犬病、スクレピー、春のウイルス血症コイ、水疱性口内炎；食品媒介疾患、プリオンによって引き起こされる疾患、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）および変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＪＤ）、コクサッキーウイルス種；ダニ媒介疾患、蚊媒介性疾患、コウモリ媒介性疾患、げっ歯類媒介性疾患、トリ媒介性疾患、ならびに抗真菌薬および抗菌薬に耐性を示す疾患、が挙げられる。
【００９７】
さらに、本明細書に記載されているアジュバント製剤は、抗原、他の薬剤、調合薬、タンパク質、または任意のその他の適切な化合物もしくは製剤と組み合わせて、癌の予防または治療のため、または癌症状および副作用の緩和のために使用することができ、例えば、自己免疫の不調および疾患、認知症およびアルツハイマー病を含むがこれらに限定されない記憶に影響を及ぼす疾患、運動機能に影響を及ぼす疾患、クローン病、消化管の疾患、ならびに遺伝的障害および疾患などの状態の治療においてなどで使用することができる。本明細書に記載されている製剤および組成物は、癌および／またはその他の悪性腫瘍の治療のため、あるいはその同じものと関連する症状および副作用の緩和のためにその腫瘍と関連する抗原を送達するために使用され得る。組換えＤＮＡ抗原は、有力なワクチン製剤として本発明の製剤および組成物と共に首尾よく送達することができる。
【００９８】
本発明の組成物、製剤および方法は、１つまたは複数のヒトまたは動物における１つの免疫反応または複数の免疫反応の産生において使用され得る。これら組成物および方法は、研究、商品、分析試料、医薬および医療、ワクチン、およびその他の関心領域において使用するための、動物から、または動物の産物（例えば卵）、または動物の構成成分（例えば、血液、リンパ液、組織、細胞および動物から生じるその他の構成成分）からの多数の抗体の産生において使用され得る。これら組成物および方法は、また、例えば、モノクロナール抗体、ポリクローナル抗体、および抗血清、ならびに免疫システムまたは免疫細胞の任意のその他の望ましい産物の産生においても使用され得る。
【００９９】
本発明のアジュバント製剤は、投与のさまざまなルートを可能にする。本発明の組成物および製剤は、非経口（例えば、皮下（ＳＣ）、筋肉内（ＩＭ）、または静脈内（ＩＶ））、経皮（ＴＤ）、直腸内（ＩＲ）、鼻腔内（ＩＮ）、肺、眼球内（ＩＯ）、胃内（ＩＧ）、膣内（ＩＶＧ）、気管内（ＩＴ）、舌下、頬側、および／または経口を含めた投与のさまざまな異なるルートによって投与され得る。
【０１００】
β−イヌリンおよびイヌリンアセテートマイクロ粒子およびナノ粒子
本明細書に記載されている組成物は、注射に適した形態、または経口、直腸、膣、局所、鼻、肺、または眼球投与に適した形態の薬剤的に受け入れられる担体、希釈剤または賦形剤中で処方することができる（例えば医薬品組成物）。これら組成物は、１または複数の、例えばワクチン接種抗原（組換え抗原を含む）、抗原ペプチド配列、または免疫グロブリンのような活性薬剤を含むことができる。
【０１０１】
複数の実施形態において、例えば、感染症、自己免疫疾患、免疫不全障害、腫瘍性疾患、変性疾患、または老齢疾患を予防、治療、または抑制することを目的として、患者における免疫反応を刺激する方法であって、患者に、本明細書に記載されている製剤の有効量を投与するステップを含む方法が開示される。
【０１０２】
複数の実施形態において、例えば、感染症、自己免疫疾患、免疫不全障害、腫瘍性疾患、または変性疾患、あるいは老齢疾患を予防、治療、または抑制することを目的として、患者における免疫反応を高める方法であって、患者に、本明細書に記載されている製剤の有効量を投与するステップを含む方法が開示される。
【０１０３】
本明細書で使用されている用語「十分に精製された」とは、他の多糖および／または他の外因的な生物学的物質（例えば、微生物または植物由来の物質）が本質的に含まれていないイヌリン製剤を指すと理解されるべきである。本明細書に記載されている製剤は、一般的には精製されまたは実質的に精製される。そのような製剤は、約１０％未満（重量で）または約５％未満（重量で）の外因性生物学的物質を含み、チコリーからのイヌリンの商業生産において採用されている周知の温水抽出および精製プロセスを含めた当業者にはよく知られている任意の方法によって調製され得る（Ｓｔｅｐｈｅｎ，Ａ．Ｍ．ら、（編者）、Ｆｏｏｄ  Ｐｏｌｙｓａｅｃｈａｒｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第２編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（２００６年））。
【０１０４】
これら組成物は、さまざまな活性薬剤、例えば、ワクチン接種抗原、抗原ペプチド配列、免疫グロブリン、またはそれらの組合せなどを含むことができる。そのほかに、またはさらに、この活性薬剤は、リンフォカインまたはサイトカイン、胸腺細胞刺激物質、マクロファージ刺激物質、内毒素、ポリヌクレオチド分子（例えば、ワクチン接種剤をコード化する）、ＣｐＧ、または組換えウイルス・ベクター、微生物全体（例えば、細菌溶解物）、ウイルス全体（例えば、不活性化されたまたは弱毒化されたウイルス）、またはそれらの組合せであり得る。本明細書に記載されている組成物は、活性成分として不活性化／弱毒化したウイルス全体と共に使用され得る。本明細書で提供される組成物と組み合わせることができる薬剤のさらなる例は、上でおよびこの文書を通して提供される。本明細書に記載されている組成物への包含に適する有利なワクチン接種抗原としては、バクテリア、ウイルス、酵母、菌類、原虫およびその他の微生物、またはヒト、動物もしくは植物起源の病原体ならびに花粉およびその他のアレルゲン、例えば、毒液（例えば、ハナバチおよびスズメバチの毒液）および喘息誘発アレルゲン、例えば、イエダニ、ネコまたはイヌのふけの全てまたは抗原部分が挙げられる。
【０１０５】
さらなる有利なワクチン接種抗原としては、上文に提供されているものならびに：赤血球凝集素タンパク質のようなインフルエンザウイルスのウイルス抗原（例えば季節性の不活性化インフルエンザウイルスの菌株、組換え型のＨＡ抗原、および季節性のＨＩ、Ｈ３ＢまたはパンデミックなＨ５抗原）、およびインフルエンザ核タンパク質、ロタウイルスの外側のカプシドタンパク質の抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のｇｐ１２０タンパク質のようなＨＩＶ抗原、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）の表面タンパク質、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の抗原Ｅ７、単純ヘルペス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、ＨＢｓＡｇ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の表面タンパク質、不活化日本脳炎ウイルス、リッサウイルスの表面タンパク質（狂犬病の原因となる）、ならびに、赤痢菌、ポルフィロモナス・ジンジバリス（例えば、プロテイナーゼおよびアドヘシンタンパク質）、ヘリコバクターピロリ（例えば、ウレアーゼ）、リステリア菌、ヒト型結核菌（例えばＢＣＧ）、マイコバクテリウム・アビウム（例えば、ｈｓｐ６５）、クラミジア・トラコマチス、カンジダ・アルビカンス（例えば、カンジダ・アルビカンスの外膜タンパク質）、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌（例えば、クラス１外側タンパク質）、炭疽菌（炭疽病の原因となる）、Ｑ熱コクシエラ（Ｑ熱の原因となるが、自己免疫性糖尿病（即ち、１型糖尿病）に対する長期保護を誘発することもできる）およびマラリア病原性の原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫など）などを含むがこれらに限定されない微生物からの抗原が挙げられる。
【０１０６】
そのほかの有利な抗原は、癌抗原（即ち、１または複数の癌と関連する抗原）、例えば：癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン−１（ＭＵＣ−１）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ｐ５３およびｒａｓの異常産物、およびメラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）である。そのほかの有利な抗原としては、免疫療法によってアレルギーを治療するためのアレルゲン（例えば、花粉、イエダニ、草の花粉、ピーナツアレルギー、および同類のもの）が挙げられる。
【０１０７】
本明細書に記載されている組成物がワクチン接種抗原を含む場合、その組成物は、また、抗原結合担体物質、例えば、マグネシウム、カルシウムまたはアルミニウムのリン酸塩、硫酸塩、水酸化物あるいはそれらの水和物（例えば、水酸化アルミニウムおよび／または硫酸アルミニウム）のような１または複数の金属塩または沈殿物など、および／または１または複数のタンパク質、脂質、硫酸化もしくはリン酸化多糖（例えば、ヘパリン、デキストランまたはセルロース誘導体）を含む有機酸、キチン（ポリＮ−アセチルグルコサミン）などの有機塩基およびそれの脱アセチル化誘導体または塩基性セルロース誘導体、および／またはその他の抗原も含むことができる。この抗原結合担体物質は、そのような物質の難溶性の粒子（例えば、水酸化アルミニウム（ミョウバン）ゲルまたはそれらの水和した塩錯体の粒子）を含むことができる。有利には、この抗原結合担体物質は、凝集する傾向はなく、および／または凝集を避けるために処理され得る。いくつかの実施形態において、この抗原結合担体物質は、水酸化アルミニウム（ミョウバン）ゲル、リン酸アルミニウムゲルまたはリン酸カルシウムゲルであり得る。
【０１０８】
本明細書に記載されている組成物がワクチン接種抗原を含むとき、その組成物は、薬剤的に受け入れられるビヒクルを含むこともできる。抗原のそのような組成物および製剤は、少なくとも０．１％の活性薬剤（例えば、本明細書に記載されているβ−ＩｎまたはＩｎＡｃ組成物の抗原）を包含すべきである。その組成物および製剤中の活性薬剤の割合は、勿論、変化させることができ、都合よくは、与えられた単位投薬形態の重量の約１％から約６０％、約１％から約１０％、または約２％から約５％までであり得る。そのような治療的に役立つ組成物中の活性化合物の量は、有効量のレベルが得られるようなものである。
【０１０９】
抗原結合担体物質が組成物中に存在するとき、それは、例えばそのような物質との共結晶のように、β−ＩｎまたはＩｎＡｃと本質的に結びついた形で存在することができる。β−ＩｎまたはＩｎＡｃと金属塩のような抗原と結合している担体物質との微粒子型の共結晶は、例えば、
【０１１０】
（ａ）β−Ｉｎ粒子を水中で加熱することによってイヌリン溶液を準備し、
【０１１１】
（ｂ）その溶液に１または複数の金属塩の一定量を添加し、
【０１１２】
（ｃ）溶液からβ−Ｉｎを再結晶させて、β−Ｉｎの金属塩との共結晶を提供し、
【０１１３】
（ｄ）形成されたβ−Ｉｎの１または複数の金属塩との共結晶を単離する
ことによって調製することができる。その金属塩は、例えば、マグネシウム、鉄、カルシウム、アルミニウム、または同種のもののリン酸塩、硫酸塩、水酸化物、または水和物であり得る。
【０１１４】
金属塩等の抗原結合担体物質と組み合わされているβ−Ｉｎの粒子の直径は、約１０ｎｍから５μｍ、または約１５０ｎｍから約３０ｍｍであり得る。より大きい粒子（例えば、直径が約２μｍより大きい）は、ゲル等の製剤中で使用され得る。抗原結合担体物質と組み合わされているβ−Ｉｎの粒子は、イヌリン材料対抗原結合担体物質の相対量（重量で）を約１：２０から約２００：１の比率で含むことができる。
【０１１５】
複数の実施形態において、例えば、感染症、自己免疫疾患、免疫不全疾患、腫瘍性疾患、変性または加齢疾患を予防、治療、または阻止するために、患者において免疫反応を刺激する、または患者において免疫反応を高める、引き出す、あるいは減少するまたは防止する方法が開示され、その方法は、本明細書に記載されている有効量の製剤を患者に投与することを含む。本明細書で提供される製剤は、上文で提供された抗原またはその他の化合物と組み合わされると、患者において免疫能力を生み出し、抗原またはその他の化合物の免疫認識を生み出し、ならびに患者の免疫システムの抗原またはその他の化合物に対する感受性を増すことができる。
【０１１６】
用語「有効量」とは望ましい効果を提供するために、無毒であり、しかし、十分な量の製剤／免疫組成物を一般的には指す。正確な必要量は、処理される種類、患者の年齢および全身状態、処理される状態の重症度、投与される特定の製剤／免疫組成物、および投与方法などによって患者ごとに変動し得る。したがって、正確な「有効量」を特定することは常に可能とは限らない。しかしながら、任意の与えられた場合に対して、しかるべき「有効量」は当業者によってルーチン的に決められ得る。
【０１１７】
約２〜５ミクロンの粒径を有するマイクロ粒子、および約１００〜４００ｎｍの粒径を有するナノ粒子は、本明細書の実施例に開示されるように一般的には調製され得る。しかしながら、本明細書に記載されているＩｎＡｃマイクロ粒子についての粒径範囲は、約１μｍから約３０μｍ、または約１．５μｍから約２５μｍであり得、本明細書に記載されているＩｎＡｃナノ粒子についての粒径範囲は、約１０ｎｍから約１０００ｎｍ、１５ｎｍから約９５０ｎｍ、または２０ｎｍから約９００ｎｍであり得る。
【０１１８】
本明細書に記載されている方法は、免疫反応を誘発または調節するために、ヒトまたはヒトでない動物の患者における単核免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、および／または樹枝状細胞）機能および／または補体経路の活性化または調節によって、患者において免疫反応を引き起こし、刺激し、引き出し、高め、増大し、生み出し、ブーストし、または改善することができる。この免疫反応の誘発または調節は、例えば、バクテリア、マイコプラズマ、真菌、ウイルス、原生動物またはその他の微生物による感染の、あるいは虫もしくは寄生虫または任意の上記の抗原もしくは病原体による寄生の、処置、抑制、または防止のため、あるいはそのような感染によって引き起こされた免疫病理を処理、抑制、または防止するため；免疫障害、例えば、アレルギー性もしくはリウマチ性疾患、自己免疫疾患、免疫不全症、または免疫システムの機能障害と関係する神経、皮膚、腎、呼吸または胃腸障害などの治療または抑制；あるいは腫瘍または癌細胞の処置または抑制、あるいはアルツハイマー病のような神経変性疾患におけるタンパク質凝集の防止または排除のためであり得る。そのようなものとして、本発明は、患者における癌を治療し、抑制し、または防止する方法であって、患者に本明細書に記載されている製剤の有効量を投与するステップを含む方法にまでおよぶことも理解されるべきである。
【０１１９】
以下の実施例は、上記の発明を説明することを意図し、その範囲を狭めるものとして解釈すべきではない。当業者であれば、これら実施例が本発明を実行し得る多くのその他の方法を示唆することを容易に認識するであろう。本発明の範囲から逸脱することなく多数の変形および変更を行い得ることを理解すべきである。
実施例
【実施例１】
【０１２０】
イヌリン調製
１．１．β−イヌリン（β−Ｉｎ）の調製。β−イヌリンは、原料イヌリンからエタノール沈殿法によって調製された。ダリア塊茎から得られた市販の原料イヌリン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）をエタノール中に懸濁させ、４℃で一晩そのまま放置した。翌日、沈殿したβ−イヌリンを遠心分離後分離し、凍結乾燥した。その乾燥したβ−イヌリンは、その後下記のさらなる調査のために使用された。
【０１２１】
１．２．イヌリンアセテート（ＩｎＡｃ）の合成。２グラムのβ−イヌリンを１５ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に加えて溶液を形成し、β−イヌリンの完全な溶解のために撹拌させた。次いで２５ｍＬの無水酢酸を加え、アセチル化反応を、窒素下の４０℃で２４時間行った。酢酸ナトリウム（０．１％，ｗ／ｖ）をその反応のための触媒として使用した。２４時間後、ＩｎＡｃが大過剰の冷水中で沈殿させられ、濾過後集められた。ＩｎＡｃをさらに２回水で洗浄して未反応のβ−イヌリンの痕跡を除去し、そのまま一晩乾燥させた。その調製されたＩｎＡｃは、下記のさらなる調査のために使用された。
【実施例２】
【０１２２】
抗原負荷（loaded：ロードされた）マイクロ粒子の調製
２．１  オボアルブミン（ｏｖａ）負荷β−イヌリンマイクロ粒子の調製。β−イヌリンマイクロ粒子が、片面（油中水滴型）エマルジョンナノ沈殿法によって調製された。β−イヌリン（１００ｍｇ）およびｏｖａ（１０ｍｇ）が、１０ｍＬの１０ｍＭでｐＨ７．４のリン酸緩衝液（水相）中に溶解された。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識付きのｏｖａが、ｏｖａの負荷および放出特性を判断するためにマイクロ粒子調製におけるｏｖａの代わりに使用された。水相が、安定な油中水滴型（ｗ／ｏ）エマルジョンを得るために、界面活性剤として１％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ−８０を含んでいる連続的に撹拌されている（１０００ｒｐｍ）３０ｍｌの軽油中に滴下方式で加えられた。そのエマルジョンは、４時間にわたって撹拌され、次いで３０ｍＬのアセトンを滴下方式で加えてβ−イヌリンマイクロ粒子を沈殿させた。そのエマルジョンは一晩中撹拌されたままにされ、β−イヌリンマイクロ粒子が、４℃での３０００ｇ、３０分の遠心分離により集められた。そのペレット化されたｏｖａ負荷β−イヌリンマイクロ粒子は、次にｎ−ヘキサンで２回洗浄され、−８０℃に１時間保たれ、４８時間にわたって凍結乾燥された。
【０１２３】
２．２．オボアルブミン負荷ＩｎＡｃマイクロ粒子の調製。ｏｖａ負荷ＩｎＡｃマイクロ粒子が、二重（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョン溶媒蒸発法によって調製された。手短に言えば、２００μＬの５０ｍｇ／ｍＬのｏｖａ溶液が、水相（Ｗ１）としての１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で５０μＬの１０ｍｇ／ｍＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８溶液（界面活性剤）と共に混合された。この水相は、１００ｍｇのＩｎＡｃを含んでいる油相（Ｏ）としての５ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）と共に乳化され、初期（ｗ／ｏ）エマルジョンの形成をもたらした。この初期エマルジョンは、次に界面活性剤として０．５％ｗ／ｖのポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含んでいる別の水（Ｗ２）相（３０ｍＬの水）中に連続的撹拌（８００ｒｐｍ）と共に滴下方式で加えられ、二重（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンの形成をもたらした。その撹拌は、有機溶媒の完全な蒸発のために一晩中続けられた。その後、マイクロ粒子は、４℃での３０分間にわたる５０，０００ｇでの遠心分離により集められた。その上澄み液は廃棄され、ペレット化されたｏｖａ負荷ＩｎＡｃマイクロ粒子は、１００ｍＭのクエン酸塩緩衝液ｐＨ７．４中に再び懸濁され、−８０℃で１時間にわたって保たれ、その後４８時間にわたって凍結乾燥された（ＶｉｒＴｉｓ、Ｇａｒｄｉｎｅｒ、ＮＹ）。
【０１２４】
２．３．オボアルブミン負荷ＩｎＡｃナノ粒子の調製。ｏｖａ負荷ＩｎＡｃナノ粒子が、二重（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョン溶媒蒸発法によって調製された。手短に言えば、２００μＬの５０ｍｇ／ｍＬのｏｖａ溶液が、水相としての１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で５０μＬの１０ｍｇ／ｍＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８溶液（界面活性剤）と共に混合された。  この水相は、１００ｍｇのＩｎＡｃを含んでいる油相としての５ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）と共に、１０Ｗで２０秒間プローブ超音波処理（Ｓｏｎｉｃｓ  Ｖｉｂｒａｃｅｌｌ、ニュータウン、コネティカット州）を用いることで乳化され、初期（ｗ／ｏ）エマルジョンの形成をもたらした。この初期エマルジョンは、次に界面活性剤として３．０％ｗ／ｖのポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含んでいる別の水相（３０ｍＬの水）と共に５０Ｗで１２０秒間プローブ超音波処理を用いることで乳化され、二重（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンの形成をもたらした。その二重エマルジョンは、有機溶媒の完全な蒸発のために一晩中、撹拌（８００ｒｐｍ）されるまま放置された。ｏｖａ負荷ＩｎＡｃナノ粒子は、次に、４℃での３０分間にわたる５０，０００ｇでの遠心分離により集められた。その上澄み液は廃棄され、ペレット化されたナノ粒子は、１００ｍＭのクエン酸塩緩衝液ｐＨ７．４中に再び懸濁され、−８０℃で１時間にわたって保たれ、その後４８時間にわたって凍結乾燥された（ＶｉｒＴｉｓ、Ｇａｒｄｉｎｅｒ、ＮＹ）。
【０１２５】
２．４．粒径およびオボアルブミン負荷。粒子は、１０ｍＭのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）中に分散され、それは０．２２μｍの細孔の大きさのフィルターを通してあらかじめ濾過され、粒径測定のために適切に希釈される。粒径は、サイズおよびゼータ電位アナライザー（Ｎｉｃｏｍｐ  ３６０  ＺＬＳ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を用いる動的光散乱法により測定された。ｏｖａ負荷β−イヌリンマイクロ粒子は、１．７４±０．１４μｍのサイズであり、ｏｖａ負荷ＩｎＡｃマイクロ粒子は、約２ｌａｍのサイズであった（表１）。
【０１２６】
β−イヌリンマイクロ粒子中のｏｖａ負荷を測定するために、既知量のＦＩＴＣ−ｏｖａ負荷β−イヌリンマイクロ粒子を１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液中に溶解した。ｏｖａ含量は、励起−４９０ｎｍおよび発光−５３０ｎｍにおけるＦＩＴＣ−ｏｖａの蛍光値を計測することによって測定された。ｏｖａ濃度は、既知濃度のＦＩＴＣ−ｏｖａを加えられたブランクのβ−イヌリンマイクロ粒子を用いて準備された標準曲線から計算された。このｏｖａ負荷は、β−イヌリンマイクロ粒子のｍｇごとに存在する（ｗ／ｗ）ｏｖａのラグとして報告した。オボアルブミン負荷は、７５．３％±４のカプセル化効率を伴って、７５．９±２．７μｇ／ｍｇであった（表１）。
【０１２７】
ＩｎＡｃマイクロまたはナノ粒子中のｏｖａ負荷を測定するために、  既知量のｏｖａ負荷ＩｎＡｃマイクロまたはナノ粒子が、アセトンに溶解され、次いで沈殿したタンパク質が１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液により抽出された。その抽出物中のオボアルブミン量は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質定量法により測定された。そのｏｖａ濃度は、アセトンに溶解され、既知濃度のｏｖａが加えられ、それが１％ＳＤＳ溶液中でさらに抽出され、ＢＣＡタンパク質定量法により分析されたブランクのＩｎＡｃマイクロまたはナノ粒子を用いて用意された標準曲線から計算された。この方法によって測定されたｏｖａ負荷は、ＩｎＡｃマイクロまたはナノ粒子のｍｇごとに存在する（ｗ／ｗ）オボアルブミンのラグとして報告した。ｏｖａの負荷は、およそ２０．０±５．４μｇ／ｍｇであった（表１）。
【０１２８】
【表１】
0006363509.tif 000003
0006363509.tif 000004
【０１２９】
いくつかの異なるサイズの粒子が調製された。プロセスおよび配合パラメーター、例えば、必要とされる超音波処理エネルギー、超音波処理の時間、界面活性剤のタイプ、界面活性剤濃度、相体積比、抗原の量などを変化させ、最適化させることによって、およびその他の成分の添加によって、異なるサイズ、異なる負荷および異なるバースト放出量（最初の３０分間に放出される抗原の割合）のナノおよびマイクロ粒子が調製された。約１００ｎｍから１０００ｎｍ、または約２２０ｎｍから８００ｎｍのナノ粒子は、さまざまな修正された条件を使用して調製され得る。粒子のサイズおよび多分散性もまた、マイクロ粒子またはナノ粒子調製の修正された条件によって制御され得る。
【０１３０】
ＩｎＡｃマイクロ粒子は、超音波処理エネルギーのない中および低濃度の界面活性剤の存在下で製造された。界面活性剤の濃度は、界面活性剤のタイプおよび所望されるマイクロ粒子のサイズに依存し得る。およそ８００ｒｐｍの撹拌スピードを用いる０．５％のポリビニルアルコールにより、得られたＩｎＡｃマイクロ粒子のサイズは約２〜３μｍであった。そのサイズは、界面活性剤のタイプ、界面活性剤の濃度、相体積比、溶媒蒸発時間および撹拌速度を変えることによって変動され得る。
【０１３１】
約１００μｍから約２００μｍの粒子は、成分のゆっくりの撹拌（例えば、約６０ｒｐｍ）により容易に調製され得る。界面活性剤の使用は、形成された粒子の凝集を減らすかまたは防ぐ助けとなり得る。したがって、重量で約０．０５％から約３％の界面活性剤が、配合物を調製するために使用され得る。いくつかの配合物において、一定量のＰＶＡなどの界面活性剤は、一旦形成された粒子中に留まることができる。抗凍結剤（例えば、マンニトールまたはトレハロース）が、粒子を凍結乾燥させるために使用され得る。
【０１３２】
界面活性剤の濃度を増すことにより、および粒子を破壊する超音波処理エネルギーを提供することにより、ナノメートルサイズ（２００〜６００ｎｍ）のＩｎＡｃ粒子を発生させることができる。この範囲は、提供される超音波処理エネルギーの量、超音波処理の時間、使用される界面活性剤のタイプと濃度、相体積比、溶媒蒸発速度および配合物の撹拌速度によって変動し得る。第２のエマルジョン中のより長い時間（最大５分までが試験された）にわたるより高い超音波処理エネルギー（最大５０ワットまでが試験された）は、より小さい粒径を生じた。評価したいくつかの界面活性剤の中では、ＰＶＡ（３％）の使用が、小さい粒子、直径２６０±２６ｎｍ、をもたらした。
【実施例３】
【０１３３】
インビトロ遊離試験
ＦＩＴＣ−ｏｖａ負荷β−イヌリンマイクロ粒子（１０ｍｇ）が、１ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に分散され、３７℃において１００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートされた。所定時間間隔で試験管が取り出され、２０，０００ｇで１０分間４℃において遠心分離された。上澄み液の５０μＬのアリコートを遊離したＦＩＴＣ−ｏｖａの測定のために採取し、同量の新たな緩衝液と置き換えた。上澄み液中の遊離したｏｖａ濃度は蛍光分析によって測定された。このインビトロ遊離試験は、９０％を上回るオボアルブミンが１６時間内に遊離されたことを示した（図６）。
【０１３４】
ｏｖａ負荷ＩｎＡｃマイクロまたはナノ粒子（１０ｍｇ）が、１ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に分散され、３７℃において１００ｒｐｍで振盪をしながらインキュベートされた。所定時間間隔で試験管が取り出され、２０，０００ｇで１０分間４℃において遠心分離された。上澄み液の５０μＬのアリコートを遊離したｏｖａの測定のために採取し、同量の新たなリン酸緩衝液と置き換えた。上澄み液中のｏｖａ濃度はＢＣＡ分析により測定された。このインビトロ遊離試験は、ｏｖａ遊離が２０日間を上回って持続されることを示した（図２）。負荷されたｏｖａの９０％を上回って遊離するためにはβ−イヌリンの場合の１６時間と比較して２０日間を上回ることを必要とした。
【実施例４】
【０１３５】
免疫付与試験：ワクチンアジュバントおよび送達システムとしてのｏｖａ負荷粒子。
イヌリンの不溶性のイソ型（γ、δおよびε）がワクチンに対するアジュバントとして試験された。しかしながら、β−多形相のようなその水溶性の形のイヌリンは、アジュバント／免疫増強効果を有することを示されることは決してなかった。以下の試験においては、ｏｖａ負荷β−イヌリンまたはＩｎＡｃマイクロ粒子およびナノ粒子の免疫増強能力が評価された。以下の免疫付与試験は、雄のＢａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝群当たり４〜５、６〜８週を経たもの）を使用して実施された。
【０１３６】
４．１．ｏｖａ負荷β−イヌリンマイクロ粒子免疫付与試験。マウスが、皮内（ｉ．ｄ．）ルートによって、以下の群：ｉ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のｏｖａ（マウス当たり１００ラグ）；ｉｉ）ＰＢＳ中のｏｖａ（マウス当たり１００ラグ）およびブランクのβ−イヌリンマイクロ粒子の物理的混合物；ｉｉｉ）ＰＢＳ中の２００μｇのミョウバン（水酸化アルミニウム）と一緒の１００ラグのｏｖａ；およびｉｖ）ＰＢＳ中のｏｖａ負荷β−イヌリンマイクロ粒子（１００μｇのｏｖａと同等）により免疫付与された。
【０１３７】
ワクチン製剤は、標準的な使い捨ての２７  １／２ゲージのシリンジを用いてマウスの毛を剃った背中の皮膚の２つの異なる部位に投与された（各部位で５０μＬ）。目に見える隆起した皮膚の腫脹、成功したｉ．ｄ．投与に対する証拠とみなされた。免疫手順の通り、マウスは「１日目」に一次投与量により、続いて「２１日目に」追加投与量によりワクチン接種された。血液試料は、一次投与および追加投与後第１週目および第３週目に後眼窩叢から血清ゲル試験管中に集められた。試料は３０分間３０００ｇで遠心分離され、血清は、さらなる分析まで−８０℃で保存された。
【０１３８】
ｏｖａ負荷β−イヌリンマイクロ粒子により生じた抗体力価（ＩｇＧ全体、ＩｇＧ−１およびＩｇＧ２ａ）は、追加免疫付与後、ミョウバンがアジュバント作用をしたｏｖａ群よりも著しく高かった（ｐ＜０．０５）（図５）。β−イヌリンマイクロ粒子は、ミョウバンより大きいＩｇＧ２ａ免疫反応を生じた（図５Ｃ）。
【０１３９】
４．１．１．樹枝状細胞による抗原（ｏｖａ）の取り込み。樹枝状細胞（ＤＣ２．４）が、３７℃で、溶液中でＦＩＴＣ−ｏｖａと共に１時間培養され、またはβ−イヌリンマイクロ粒子内部に入れられた。１時間の培養後、細胞は、徹底的に洗浄され、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド中に固定され、ＤＣ２．４細胞によるＦＩＴＣ−ｏｖａの摂取を測定するために、フローサイトメトリーを用いて分析された（図３（Ａ））。同様の結果が、蛍光顕微鏡検査法により示された。ＤＡＰＩは、細胞の核染色を示している（図３（Ｂ））。このデータの数量化は表２に示されている。
【０１４０】
【表２】
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【０１４１】
４．１．２．抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対するトール様受容体（ＴＬＲ）の刺激。Ｔｈ１およびＴｈ２反応を実証することに加えて、さまざまなポリマーが、ＡＰＣに対してのＴＬＲを刺激する候補を特定するためにふるいにかけられる。ＴＬＲは、パターン認識受容体（ＰＲＲ）の群であり、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰＳ）を通じて病原体によって活性化されると、Ｔｈ１およびＴｈ２タイプの方へ免疫反応を推進するいくつかのサイトカインを分泌する／放出する。ＴＬＲ活性化（ＴＬＲ３を除く）は、ＴＮＦ−αのようなサイトカインを放出するためにＭｙＤ８８またはＭａｌと呼ばれるアダプター分子を必要とする。
【０１４２】
４．１．２．１．イヌリンアセテート（ＩｎＡｃ）はＴＬＲ−４アゴニストである。野生型マウスのマクロファージ細胞およびＭａｌ／ＭｙＤ８８細胞（１×１０５細胞／ウェル）が、さまざまな製剤と共に１２時間にわたって培養された。その後、培養上清中のＴＮＦ−αの濃度がＥＬＩＳＡによって測定された（図４（Ａ）参照）。ＩｎＡｃは、Ｍｙ８８マクロファージからのサイトカインＴＮＦ−αの放出を刺激したが、ＭａｌおよびＭｙ８８を欠いているマクロファージからのＴＮＦ−αの放出を刺激することはできなかった。ＴＬＲ４（１×１０５細胞／ウェル）受容体が安定して移入されたＨＥＫ細胞が、さまざまな配合物：培地のみ、ＩｎＡｃマイクロ粒子（２５０μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）およびザイモサン（１μｇ／ｍｌ）、と共に培養された。細胞上清が、刺激作用の１６時間後に３つの部分からなるウェル中でのＥＬＩＳＡによってＩＬ−８分泌物について分析された（図４（Ｂ）参照）。
【０１４３】
このデータからわかるように、ＩｎＡｃは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を刺激してサイトカインを放出させる（図４（Ａ））。さらに、ＩｎＡｃは、ＴＬＲを通して、特にＴＬＲ４受容体の活性化を通して、ＡＰＣを活性化するようである（図４（Ｂ））。ＩｎＡｃマイクロ粒子は、通例（明白なＭｙＤ８８アダプタータンパク質）のマクロファージ細胞から著しく高められたＴＮＦ−αの分泌をもたらした。この分泌は、ＴＬＲアダプタータンパク質ＭｙＤ８８が同じ細胞から除去されたとき消滅された（図４（Ａ））。このことは、ＩｎＡｃがＴＬＲの助けによって免疫細胞を活性化することをはっきりと示唆している。複数のＴＬＲ受容体が存在する。ＩｎＡｃは、特にＴＬＲ−４と相互作用することが見出された（図４（Ｂ））。これはＩｎＡｃがＴＬＲ−４と相互作用することによって先天性免疫反応を活性化することを示した最初である。可溶性β−イヌリンまたはγ−イソ型のいずれもＴＬＲを活性化することはできなかった。ガンマイヌリンは、補体活性化第２経路（ＡＰＣ）を通して免疫システムを活性化することが知られている。ＡＰＣ活性化のアッセイは、健康人の血清中に存在するＡＰＣの活性化に基づいてウサギの赤血球（ＲＢＣ）の溶解を測定する。本明細書に示されているように、β−イヌリンまたはＩｎＡｃのマイクロもしくはナノ粒子のいずれもが、ＡＰＣを活性化することはできなかった。しかしながら本明細書に示されているように、γ−イヌリンおよびザイモサンは、ＡＰＣを活性化した（図１６参照）。
【０１４４】
これらのデータに基づいて、β−イヌリン／ＩｎＡｃ（マイクロまたはナノ粒子）は、免疫反応を活性化するアジュバントとして機能することにおいて、γ−イヌリンとは異なるメカニズムによって作用している可能性がある。さらに、ＴＬＲ−４アゴニスト（ＩｎＡｃ）を使用することによって、微粒子（ナノ／マイクロ）のワクチン送達システムが、確認され試験されており、そのシステムは、動物（例えばマウス）の免疫システムを刺激する能力を有する。主要な発見は、送達システムをつくるために使用されるポリマーが、それ自体ＴＬＲアゴニストであることである。この送達システムは、免疫反応を高めるためのその他のＰＡＭＰＳを加える必要がない。免疫システムについて、ＩｎＡｃに基づく微粒子送達システムは、病原体と、それらが微粒子であり、多糖に基づく疎水性表面からなり、多数の抗原を封入するために使用され得、そしてＰＡＭＰシグナル伝達を提供することによってＴＬＲを通してＡＰＣを活性化する（自然疫反応）という点で類似している。
【０１４５】
４．２．この試験の結果は、ｏｖａ負荷β−イヌリンマイクロ粒子が１６時間の間封入された抗原（オボアルブミン）を放出し、ＦＤＡ認可のミョウバンよりも著しく高い抗体力価（ＩｇＧ全体およびＩｇＧ−１）を生じたことを示した。
【０１４６】
次の試験においては、水不溶性のβ−イヌリン誘導体のイヌリンアセテート（ＩｎＡｃ）が使用された。この試験の目的は、抗原をＩｎＡｃマイクロ粒子中に封入することによって長期間にわたる抗原の放出をさらに維持すること、ならびにそれらの免疫を強化する能力を評価し、ＩｎＡｃを体液性および細胞性の両方の免疫応答を刺激する新たなＴＬＲ４アゴニストとして使用することであった。体液性応答は、細胞外の病原体を取り除くために必要であり、細胞性応答は細胞内病原体に対して必要である。
【０１４７】
ＩｎＡｃの構造において、β−イヌリンのヒドロキシル基は、アセチル基によって置換されている。ＩｎＡｃのＦＴＩＲスペクトルにおけるβ−イヌリンのＯＨストレッチバンド（〜３３２６ｃｍ−１）の消失、およびカルボニルバンド（Ｃ＝０〜１７４３ｃｍ−１）の出現は、β−イヌリンからの酢酸エステルＩｎＡｃの合成を裏付けている（図６）。カルボニルバンドに加えて、イヌリンアセテートは、アセテートＣ−Ｏバンド（〜１２２４ｃｍ−１）および−ＣＨ３バンド（〜１３６９ｃｍ−１）の出現によっても特徴づけられる。マウス（ｎ＝群ごとに４〜５）が、以下の群：ｉ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のｏｖａ（マウスあたり１００ラグ）；ｉｉ）ＰＢＳ中のｏｖａ（マウス当たり１００μｇ）およびブランクのＩｎＡｃマイクロ粒子の物理的混合物；ｉｉｉ）ＰＢＳ中の２００μｇのミョウバン（水酸化アルミニウム）と一緒の１００μｇのｏｖａ；およびｉｖ）ＰＢＳ中のｏｖａ負荷ＩｎＡｃマイクロ粒子（１００μｇのｏｖａに相当）を、皮内（ｉ．ｄ．）ルートにより、１日目および２１日目に、一次および追加の免疫付与として注射された。血清は、間接的なＥＬＩＳＡ法を用いるＩｇＧ力価の分析のために一次および追加の免疫付与の１週間後および３週間後に採取された。使用された免疫手順の残りは、４．１項に記載されているものと同じであった。
【０１４８】
ｏｖａ負荷ＩｎＡｃマイクロ粒子は、ミョウバンに結合したｏｖａよりも著しく高い（ｐ＜０．００１）抗体反応を生じた（全体のＩｇＧ、１２〜８７倍；ＩｇＧ１、２５〜６０倍；ＩｇＧ２ａ、７〜１０００倍）。図７は、免疫性を与えられたマウス血清中のｏｖａ特異性のＩｇＧ全体、ＩｇＧ−１およびＩｇＧ−２ａの抗体力価を描いている。最も興味深いのは、ＩｎＡｃマイクロ粒子が、最新のワクチンで必要とされるＴｈ１（ＩｇＧ−２ａ）およびＴｈ２（ＩｇＧ−１）タイプの両方の免疫反応を発生させたことである。ｏｖａのＩｎＡｃマイクロ粒子中への封入は、高められた免疫反応をもたらした。ｏｖａがブランクのＩｎＡｃマイクロ粒子またはナノ粒子と単に混注されたとき、ｏｖａに対する免疫反応の高まりは観察されなかった。しかしながら、従来技術のγ−イヌリンまたはその他の水不溶性の形のイヌリンは、アジュバントとして抗原と混注されると高められた免疫反応を提供するが、β−イヌリンまたはイヌリンアセテートとの混注は、高められた免疫反応を提供しなかった。
【０１４９】
４．３．ｏｖａ負荷ＩｎＡｃマイクロまたはナノ粒子の免疫付与試験：ワクチンアジュバントおよび送達システムとしての評価。この試験は、使用されるＩｎＡｃ粒子の粒径（マイクロ対ナノ）および抗原（オボアルブミン）の投与量（１００、１０または１μｇ）の免疫反応の発現に対する効果を評価するために実施された。さまざまな粒径およびさまざまなｏｖａ負荷を有する製剤が準備された。以下の製剤およびプロセスパラメーターが変更される要因設計手法を用いる最適化試験が実施された。
【０１５０】
１）ＩｎＡｃマイクロまたはナノ粒子調製の最初の乳化ステップ中に使用される抗原（ｏｖａ）の量。ｏｖａ負荷（μｇ／ｍｇ）は、粒子調製中に使用されるｏｖａの量を増すことによって（１００ｍｇのポリマー当たり５００μｇから２０ｍｇ）０．５μｇ／ｍｇから５０μｇ／ｍｇまで増加された。しかしながら、バースト放出もより高い（５０μｇ／ｍｇ）ｏｖａ負荷において増加した。
【０１５１】
２）ＩｎＡｃマイクロ粒子またはナノ粒子の調製において第２の水相量を４５ｍＬに増加することによって、バースト放出が約２０％まで制限された。
【０１５２】
３）ＩｎＡｃ粒子のサイズを小さくするために、超音波処理エネルギーが使用された。超音波処理の時間およびエネルギーを含めたプロセスパラメーターが、望ましい負荷（例えば、ＩｎＡｃ粒子については１０μｇから約１００μｇ／ｍｇそしてβ−イヌリン粒子については約１０μｇ／ｍｇから約５００μｇ／ｍｇ）および制限されたバースト放出（投与後最初の３０分において、約３０％未満、または約２０％未満）を有するナノメートルの粒径範囲の粒子（およそ１００〜６００ｎｍ）を提供するために最適化された。
【０１５３】
これらの３つのパラメーターを最適化することによって、さまざまなサイズ（ナノ粒子についてはほぼ１００ｎｍ〜１０００ｎｍ、そしてマイクロ粒子についてはほぼ１μｍ〜３０μｍ）および負荷を有する望ましい製剤が首尾よく調製され得る。
【０１５４】
刺激される免疫反応に対する粒径の効果を調査するために、多様な用量のｏｖａを有するｏｖａ負荷ＩｎＡｃマイクロ粒子（おおよそのサイズ：２μｍ）またはナノ粒子（おおよそのサイズ：２５０ｎｍ）によりマウスが免疫付与された。マウスは、以下の群：ｉ）ＰＢＳ中のｏｖａ（マウス当たり１００、１０または１μｇ）；ｉｉ）１００μｍのＣＦＡエマルジョンを含むｏｖａ（マウス当たり１００、１０または１μｇ）；およびｉｉｉ）ＰＢＳ中のｏｖａ負荷ＩｎＡｃマイクロまたはナノ粒子（１００、１０または１μｇのｏｖａに相当する）、により皮下（ｓ．ｃ．）ルートによって免疫付与された。免疫手順の残りは、４．１項に記載されているものと同じであった。
【０１５５】
図１１は、免疫性を与えられたマウス血清におけるｏｖａ特異性ＩｇＧ全体力価の発現に対するイヌリンアセテート粒子の大きさの影響を示している。マウス（ｎ＝群当たり４〜５）は、１日目および２１日目に、一次および追加の免疫付与として、ｏｖａ（１００、１０または１μｇ）が単独でまたはＣＦＡと共に、あるいはＩｎＡｃマイクロ粒子またはナノ粒子中に充填されて皮下に注射された。血清は、間接的なＥＬＩＳＡ法を用いるＩｇＧ全体力価の分析のために一次および追加の免疫付与の１週間後および３週間後に採取された。ＣＦＡが陽性対照（最強のアジュバント）として使用された。
【０１５６】
図１２は、免疫性を与えられたマウスの血清における血清ｏｖａ特異性ＩｇＧ−１力価の発現に対するイヌリンアセテート粒子の大きさの影響を示している。マウス（ｎ＝群当たり４〜５）は、１日目および２１日目に、ｏｖａ（１００、１０または１μｇ）が単独でまたはＣＦＡと共に、あるいはＩｎＡｃマイクロ粒子またはナノ粒子中に充填されて皮下に注射された。血清は、間接的なＥＬＩＳＡ法を用いるＩｇＧ−１力価の分析のために一次および追加の免疫付与の１週間後および３週間後に採取された。
【０１５７】
図１３は、免疫性を与えられたマウスの血清におけるｏｖａ特異性ＩｇＧ−２ａ力価の発現に対するイヌリンアセテート粒子の大きさの影響を示している。マウス（ｎ＝群当たり４〜５）は、１日目および２１日目に、ｏｖａ（１００、１０または１μｇ）が単独でまたはＣＦＡと共に、あるいはＩｎＡｃマイクロ粒子またはナノ粒子中に充填されて皮下に注射された。血清は、間接的なＥＬＩＳＡ法を用いるＩｇＧ−２ａ力価の分析のために一次および追加の免疫付与の１週間後および３週間後に採取された。
【０１５８】
ＩｎＡｃマイクロ粒子は、ｏｖａの１００および１０ラグ投与量においてナノ粒子より高い抗体力価を生じ、その抗体力価は、陽性対照のＣＦＡアジュバントを施した群よりさらに高かった。しかしながら、ナノ粒子は、１μｇ投与量の抗原で、マイクロ粒子より高い抗体力価を生じた（図１１、１２および１３）。このデータは、ＩｎＡｃマイクロ粒子が１０および１００μｇの抗原の投与量での免疫反応の発現においてＣＦＡより効能があることを示している。
【０１５９】
抗原の投与量の影響を調査するために、ＩｎＡｃマイクロまたはナノ粒子中に充填した１００、１０または１μｇのオボアルブミンによりマウスに免疫付与した。図１４は、免疫付与されたマウス血清中のｏｖａ特異性ＩｇＧ力価の発現に対するＩｎＡｃマイクロ粒子中に充填した抗原の量の影響を示している。マウス（ｎ＝群当たり４〜５）は、１日目および２１日目に、ｏｖａ（１００、１０または１μｇ）が単独でまたはＣＦＡと共に、あるいはＩｎＡｃマイクロ粒子中に充填されて皮下に注射された。血清は、間接的なＥＬＩＳＡ法を用いるＩｇＧ全体、ＩｇＧ−１およびＩｇＧ−２ａ力価の分析のために一次および追加の免疫付与の１週間後および３週間後に採取された。
【０１６０】
図１５は、免疫付与されたマウス血清中のｏｖａ特異性ＩｇＧ力価の発現に対するＩｎＡｃｎナノ粒子中に充填した抗原の量の影響を示している。マウス（ｎ＝群当たり４〜５）は、１日目および２１日目に、ｏｖａ（１００、１０または１μｇ）が単独でまたはＣＦＡと共に、あるいはＩｎＡｃナノ粒子中に充填されて皮下に注射された。血清は、間接的なＥＬＩＳＡ法を用いるＩｇＧ全体、ＩｇＧ−１およびＩｇＧ−２ａ力価の分析のために一次および追加の免疫付与の１週間後および３週間後に採取された。
【０１６１】
ｏｖａを充填したＩｎＡｃマイクロ粒子は、免疫反応が、ｏｖａの用量に依存し、１００μｇ用量の抗原で最高の抗体力価であり、１０μｇおよび１μｇの用量が後に続くことを示した（図１４）。ｏｖａを充填したＩｎＡｃナノ粒子もまた１００μｇの抗原において１０μｇおよび１μｇの抗体と比較してより強い抗体力価を発生したが１０μｇと１μｇの抗原用量においては抗体力価に著しい違いは見出されなかった（図１５）。
【０１６２】
４．４．酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いる抗ｏｖａ抗体の検出。免疫付与されたマウスからの血清が、ｏｖａに対して発生した抗体（全体ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）の存在について間接的ＥＬＩＳＡ検定法によって試験された。手短に言えば、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートが、ｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液中でｏｖａ（１μｇ／ウェル）により被覆され一晩４℃で培養された。そのプレートは、洗浄液（５０ｍＭのトリス、０．１４ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ８）により洗浄され、次いで２００μＬのブロッキング溶液（５０ｍＭのトリス、０．１４ＭのＮａＣｌ、１％のＢＳＡ、ｐＨ８）により室温（−２３℃）で３０分間ブロックされた。洗浄緩衝液によりプレートを洗浄後、そのプレート中のウェルは試験血清のさまざまな希釈物（１００μＬ）と共に室温で１時間培養された。そのプレートは洗浄され、その後１００μＬのペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウス抗体と共に室温で１時間培養された。培養後、そのプレートは洗浄され、着色のために、１００μＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液と共に室温で５分間培養された。その反応は２ＭのＨ２ＳＯ４を用いて停止され、光学密度（ＯＤ）が４５０ｎｍで測定された。結果は、ＯＤが平均のＯＤプラスＰＢＳ対照の２つの標準偏差より大きい最終血清希釈の逆数（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｅｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）と定義される血清免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）力価として表現された。
【０１６３】
４．５．脾細胞増殖アッセイ。メモリー応答の引き出しは、ワクチンが長続きする保護を与えるためである場合の本質的要素である。メモリー応答の発生を評価するために、追加の免疫付与の３週間後に、脾細胞がマウスの脾臓から準備された。
【０１６４】
追加の免疫付与に続く２１日目に、マウスを屠殺し、脾臓を取り除いた。脾細胞の単細胞浮遊液が、完全ＲＰＭＩ培地（１０％の加熱不活性化したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび５０μＭの２−メルカプトエタノールが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地））中で調製された。その細胞浮遊液は、２５℃で５分間、７００ｇで遠心分離された。上澄み液を廃棄後、赤血球（ＲＢＣ）は１００ｍＭのＮＨ４Ｃｌを用いて溶解された。その脾細胞は完全ＲＰＭＩ培地中に再懸濁され、細胞はＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ロレンス、マサチューセッツ州）を用いるトリパンブルー抽出法によりカウントされた。脾細胞（１０６細胞／ウェル）は、９６ウェルプレート中に蒔かれ、オボアルブミン（１００μｇ／ｍＬ）またはコンカナバリンＡ（２．５μｇ／ｍＬ）を含んでいる２００μＬの完全ＲＰＭＩ  １６４０培地のみと共に培養された。培養の７２時間後、その上澄み液は除去され、サイトカイン分析のために保存された。その細胞は、５０μＬの３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）と共に４時間にわたって培養された。最後に、そのプレートは、１５０μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と共に３７℃で１０分間培養された。その後プレートは、紫外−可視分光光度計を用いて５４０ｎｍで読み取られた。刺激指数（ＳＩ）は、カンカナバリンＡまたはｏｖａにより処理された細胞の吸光度値をＲＰＭＩ処理した細胞の吸光度値で割ることによって計算された。
【０１６５】
データは、結果として生じる露出の間に、ｏｖａを認識する記憶Ｔ細胞が、ｏｖａを充填したＩｎＡｃマイクロ粒子で処理したマウス中に著しく高い数で発生されることを示している（図８）。分裂促進因子のコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）は、陽性対照として寄与し、それは全ての群において非特異的に刺激指数（Ｓ．Ｉ．）を高めた。
【０１６６】
４．６．サイトカイン分析：Ｔｈ１（ＩＦＮ−ｇおよびＩＬ−２）およびＴｈ２（ＩＬ−４およびＩＬ−１０）サイトカイン測定。ｏｖａを充填したＩｎＡｃマイクロ粒子が選択的に体液性の免疫反応（Ｔｈ２）または細胞媒介性の免疫反応（Ｔｈ１）を誘発したかどうかを評価するために、脾細胞培養液の上澄み中の隠されたＴｈ１サイトカイン（ＩＬ−２およびＩＦＮγ）およびＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４およびＩＬ−１０）の存在がｏｖａによる再刺激後にチェックされた。
【０１６７】
脾細胞は、ｏｖａ単独、ミョウバンと一緒のｏｖａ、またはｏｖａを充填したＩｎＡｃマイクロ粒子により免疫付与されたマウスから準備され、ｏｖａ（１００μｇ／ｍＬ）の存在する中で７２時間にわたって培養された。７２時間後、さまざまな処理群からの上澄み液が集められ、さまざまなサイトカインの濃度がサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて測定された。図９を参照。星印（＊）は、その値がスチューデントのｔ検定を用いるｏｖａ免疫付与群（Ｐ＜０．００１）と比較して著しく高いことを示している。
【０１６８】
抗体反応データ（ＩｇＧ−１およびＩｇＧ−２ａの両方の高いレベル）を支持して、高レベルの両タイプ（Ｔｈ１およびＴｈ２）のサイトカインが、ｏｖａを充填したＩｎＡｃマイクロ粒子により免疫付与されたマウスの脾細胞上澄み液中に観察された（図９）。
【０１６９】
４．７．遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応。
ＤＴＨ反応は、それぞれ免疫付与されたマウスの左の足蹠に５μｇのｏｖａを、同量のＰＢＳを右の足蹠に注射することによって測定された。処置の２４時間後の足蹠の腫脹度は、左の足蹠から右の足蹠の厚さを差し引くことによって測定された。図１０におけるデータは、各群の３〜４匹の免疫付与されたマウスの平均腫脹度＋標準偏差を表す。星印（＊）は、値がスチューデントのｔ検定を用いるｏｖａ免疫付与群（Ｐ＜０．００１）と比較して統計的に重要であることを示している。
【０１７０】
ＤＴＨ反応の分析は、Ｔｈ１タイプの免疫反応の発生をさらに裏付けた。ｏｖａを充填したＩｎＡｃマイクロ粒子により免疫付与されたマウスは、ｏｖａで免疫付与されたマウスより著しく高い（Ｐ＜０．００１）ＤＴＨ反応を発生させた（図１０）。これらの結果は、ｏｖａを充填したＩｎＡｃマイクロ粒子により誘発されたＴｈ１タイプの免疫反応をさらに支持する。
【０１７１】
４．８．補体の第二経路（ＡＰＣ）の活性化試験。イヌリンの不溶性多形体（γ−イヌリン）は、ＡＰＣを活性化することによってワクチンアジュバントとして作用することが示されている（Ｓｉｌｖａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００４）８２、６１１〜６１６頁）。しかしながら、β−イヌリンは、ワクチンアジュバント／免疫増強物質として作用することは決して示されていない。β−イヌリン粒子、ＩｎＡｃマイクロ粒子およびＩｎＡｃナノ粒子のＡＰＣを活性化する可能性が、以下に記載されているように評価された。
【０１７２】
ヒト血清は、ウサギＲＢＣの溶解を引き起こし、それ故、ヒト血清およびウサギ赤血球（ＲＢＣ）は、ＡＰＣ活性化試験のために使用される。ウサギＲＢＣは、ＡＰＣ緩衝液（ゼラチンベロナール緩衝液（ＧＶＢ緩衝液）＋５ｍＭのエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ））を用いて洗浄された。ＡＰＣ活性化試験については、１ｍｇ／ｍＬのイヌリン、β−イヌリン、γ−イヌリン、ザイモサン（ＡＰＣ活性化のための陽性対照）、ＩｎＡｃマイクロ粒子およびＩｎＡｃナノ粒子を含んでいる１００μＬのヒト血清が、４００μＬのＧＶＢ緩衝液により希釈され、３７℃で３０分間培養され、遠心分離された。その上澄み液は、５００μＬのＲＢＣ（１×１０８細胞／ｍＬ）と共に３７℃で４５分間培養され、その後７００ｎｍにおけるＯＤ値が観測された。ＲＢＣ溶解パーセントが未処理のヒト血清についてのＲＢＣ溶解が１００％とみなすことによって計算された。データは、％１０溶解ＲＢＣ（％  １０  ｌｙｓｅｄ  ＲＢＣ’ｓ）として報告された。ＲＢＣと一緒の培養の際のＧＶＢ緩衝液中の希釈されたヒト血清は、１００％のＲＢＣ溶解をもたらした。ザイモサンはＡＰＣを活性化し、それ故ウサギのＲＢＣの溶解を阻止した。
【０１７３】
ＡＰＣ活性化の検定は、正常なヒト血清中に存在する補体の第二経路の活性化状態でウサギの赤血球（ＲＢＣ）の溶解を測定する。図１６に示されているデータは、β−イヌリン、ＩｎＡｃマイクロ粒子およびＩｎＡｃナノ粒子が、γ−イヌリンおよびザイモサンとは違って、ＡＰＣを活性化しなかったことを示している。それ故、β−イヌリン、ＩｎＡｃマイクロ粒子およびＩｎＡｃナノ粒子は、γ−イヌリンとは異なるメカニズムによって作動する。
【実施例５】
【０１７４】
安全性
マウス組織が、さまざまなアジュバント系（ＩｎＡｃナノ粒子、ＩｎＡｃマイクロ粒子および完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ））による免疫付与後にヘマトキシンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって分析された。画像が、ワクチン投与後２１日目に注射部位について現像された。ＩｎＡｃマイクロ粒子（直径２〜４ミクロン）の皮下注射は、注射の部位にミョウバンまたはＣＦＡに似た局所デポーを形成し、抗原の放出を２０日を越えて維持した。しかしながら、ＩｎＡｃナノ粒子（平均直径２００〜３００ｎｍ）は注射の部位から除去されおそらくリンパ系に向けられた。いずれの場合においても、炎症、組織の損傷または膿瘍形成は見られなかった（図１７（Ａ））。
【０１７５】
強いアジュバント活性はしばしば毒性と関係がある。例えば、ＦＤＡに認可されているワクチンアジュバントのミョウバンも、注射部位に、疼痛、炎症、リンパ節症、壊死、および肉芽腫を引き起こす。ワクチン製剤の安全性は、マウスの皮膚の注射部位における全体の構造的な損傷を見つけ出すことによるなどで解析された。
【０１７６】
ＣＦＡ処理とＩｎＡｃマイクロ粒子との間の明らかな違いを見ることができる。ｏｖａを充填したＩｎＡｃマイクロ粒子により処理した部位は、ＣＦＡ処理と比較して、非常に高い数の浸潤性の免疫細胞および皆無かそれに近い組織の損傷を注射部位に有する。予想通り、ＣＦＡの注射は、注射部位に重度の組織壊死をもたらした（黒の矢印で示されている）。それにひきかえ、ＩｎＡｃマイクロ粒子は、注射部位に際立った毒性は何ら引き起こさなかった。注射部位における浸潤性の免疫細胞（白い矢印で示されている）の数はＣＦＡ処理と比較してＩｎＡｃマイクロ粒子でより大きいことが見出された。再び、これらのデータは、ＩｎＡｃマイクロ粒子が、よく効くワクチンアジュバントであるばかりでなく、良好な安全性プロフィールも示すことをはっきりと示唆している。
【実施例６】
【０１７７】
薬の剤形
以下の配合物は、本明細書に記載されているβ−イヌリンまたはＩｎＡｃ組成物、本明細書に特に開示されるβ−イヌリンまたはＩｎＡｃ組成物、または本明細書に記載されているその他の成分と組み合わされたβ−イヌリンまたはＩｎＡｃ組成物（以後「組成物Ｘ」と称する）の治療のためまたは予防的投与に使用され得る代表的な薬の剤形を説明している：
【０１７８】
【表３】
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【０１７９】
これらの配合物は、製薬技術においては周知の従来の手順によって調製され得る。当然のことながら、上記の薬剤組成物は、周知の製薬技術に従って変化させ、活性成分「組成物Ｘ」の異なる量およびタイプに調整することができる。エーロゾル配合物（ｖｉ）は、標準的な計量式分配装置と連結して使用され得る。さらに具体的な成分および割合は、例証目的である。対象の剤形の望ましい特性に従って、成分は、適切な同等物と交換することができ、割合は変動させることができる。
【０１８０】
具体的な実施形態が開示された実施形態および実施例に関連して上文で説明されてきたが、そのような実施形態は単に説明のためであり本発明の範囲を限定することはない。以下の特許請求の範囲で明らかにされているそのより広い態様の中で本発明から逸脱することなく変化および修正が当技術分野の通常の技術によってなされ得る。
【０１８１】
全ての出版物、特許、および特許文献は、あたかも個々に参照によって組み込まれているかのように、本明細書に参照により組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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