(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子を含む細胞中で条件付きノックアウト対立遺伝子を生成する方法であって、
ａ）前記細胞内にドナーコンストラクトを導入するステップであって、前記ドナーコンストラクトが、５’相同領域、５’リコンビナーゼ認識部位、ドナー配列、３’リコンビナーゼ認識部位、および３’相同領域を含み、前記ドナー配列は、ドナー配列が１００より多い連続する非変更塩基対を含まないように、その配列の長さに沿って離れている３以上の中立突然変異を含み、ドナー配列および標的配列の間の配列相同性が９０％以下である、ステップ、及び
ｂ）前記細胞内に前記標的遺伝子内の配列を切断する配列特異的ヌクレアーゼを導入し、それによって前記細胞中に条件付きノックアウト対立遺伝子を生成するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記配列特異的ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記配列特異的ヌクレアーゼが転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記配列特異的ヌクレアーゼが前記標的遺伝子を一度だけ切断するＺＦＮ二量体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記配列特異的ヌクレアーゼがＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記配列特異的ヌクレアーゼが、タンパク質、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡとして導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記リコンビナーゼ認識部位が、ｌｏｘＰ部位、ｆｒｔ部位、またはｒｏｘ部位である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ドナー配列が７つのサイレント突然変異を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ドナー配列と前記標的配列との間の配列相同性が７８％である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ドナーコンストラクトが、配列番号３０、３１、４４、４５、または４６の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記５’相同領域が少なくとも１．１ｋｂを含み、前記３’相同領域が少なくとも１ｋｂを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的遺伝子が、Ｌｒｐ５、Ｕｓｐ１０、Ｎｎｍｔ、およびＮｏｔｃｈ３からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が哺乳動物から単離されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物が、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウマ、ウシ、サル、およびヒトからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、接合体または多能性幹細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
条件付きノックアウト非ヒト動物を生成する方法であって、
ａ）標的遺伝子を含む細胞内にドナーコンストラクトを導入するステップであって、前記ドナーコンストラクトが、５’相同領域、５’リコンビナーゼ認識部位、ドナー配列、３’リコンビナーゼ認識部位、および３’相同領域を含み、前記ドナー配列は、ドナー配列が１００より多い連続する非変更塩基対を含まないように、その配列の長さに沿って離れている３以上の中立突然変異を含み、ドナー配列および標的配列の間の配列相同性が９０％以下である、ステップ、
ｂ）前記細胞内に配列特異的ヌクレアーゼを導入するステップであって、前記ヌクレアーゼが前記標的遺伝子を切断する、ステップ、及び
ｃ）キャリア非ヒト動物内に前記細胞を導入し、前記細胞から前記条件付きノックアウト非ヒト動物を生成するステップを含む、方法。
【請求項１８】
前記細胞が、接合体または多能性幹細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ノックアウト非ヒト動物を生成する方法であって、
ａ）標的遺伝子を含む細胞内にドナーコンストラクトを導入するステップであって、前記ドナーコンストラクトが、５’相同領域、５’リコンビナーゼ認識部位、ドナー配列、３’リコンビナーゼ認識部位、および３’相同領域を含み、前記ドナー配列は、ドナー配列が１００より多い連続する非変更塩基対を含まないように、その配列の長さに沿って離れている３以上の中立突然変異を含み、ドナー配列および標的配列の間の配列相同性が９０％以下である、ステップ、
ｂ）前記細胞内に配列特異的ヌクレアーゼを導入するステップであって、前記ヌクレアーゼが前記標的遺伝子を切断する、ステップ、
ｃ）キャリア非ヒト動物内に前記細胞を導入し、前記トランスフェクトされた細胞から遺伝子導入非ヒト動物を生成するステップ、及び
ｄ）前記５’および３’リコンビナーゼ認識部位において組換えを触媒するリコンビナーゼタンパク質をコードする導入遺伝子を有する遺伝子導入非ヒト動物と、前記条件付きノックアウト非ヒト動物を交配させるステップを含む、方法。
【請求項２０】
前記細胞が接合体または多能性幹細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記リコンビナーゼ認識部位がｌｏｘＰ部位であり、前記リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記リコンビナーゼ認識部位がｆｒｔ部位であり、前記リコンビナーゼがＦＬＰリコンビナーゼである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記リコンビナーゼ認識部位がｒｏｘ部位であり、前記リコンビナーゼがＤｒｅリコンビナーゼである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記リコンビナーゼをコードする前記導入遺伝子が、組織特異的プロモーターまたは誘導型プロモーターの制御下にある、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
標的遺伝子の条件付きノックアウト対立遺伝子を生成するための組成物であって、
ａ）５’相同領域、５’リコンビナーゼ認識部位、ドナー配列、３’リコンビナーゼ認識部位、および３’相同領域を含むドナーコンストラクトであって、前記ドナー配列は、ドナー配列が１００より多い連続する非変更塩基対を含まないように、その配列の長さに沿って離れている３以上の中立突然変異を含み、ドナー配列および標的配列の間の配列相同性が９０％以下である、ドナーコンストラクト、及び
ｂ）前記標的遺伝子を認識する配列特異的ヌクレアーゼを含む、組成物。
【請求項２６】
前記配列特異的ヌクレアーゼが、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、およびＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
配列番号３０、３１、４４、４５、または４６の配列を含む、ドナーコンストラクト。
【請求項２８】
請求項２７に記載のドナーコンストラクトを含む、細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年６月１２日に出願した米国仮特許出願第６１／６５８，６７０号の利益を主張するものであり、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１３年６月１２日に作製されたそのＡＳＣＩＩ複製は、Ｐ４９０５Ｒ１ＷＯ＿ＰＣＴＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名付けられており、４９，２１４バイトの大きさである。
【０００３】
本発明は、遺伝子操作された条件付きノックアウト対立遺伝子を生成する新規の方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
個々の遺伝子発現の選択的阻害または強化は、インビトロおよびインビボでの遺伝子機能の研究に大きく貢献してきた。相同的組換えを用いたマウス胚性幹（ＥＳ）細胞の遺伝子ターゲティングは、マウスゲノムを操作するための確立した方法であり、研究中の遺伝子に関連した欠損または「ノックアウト」マウスの作製を可能にした。より最近になって、条件付きまたは誘導型ノックアウト技術は、全身的に欠失させると、胚性または周産期致死性をもたらす遺伝子の研究を進歩させた（例えば、Ｌａｋｓｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２−３６（１９９２）；Ｊａｃｋｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：２９５−３００（１９９２））。また、条件付きノックアウトマウスを用いて、他の組織ではその機能を無傷のまま残しながら、特定の組織における遺伝子を選択的に欠失させる効果を研究することもできる。しかしながら、条件付きノックアウト動物を作製するための従来の方法は、大変な労力を要し、非効率的であり、また胚性幹細胞が利用可能であることを必要とする。
【０００５】
操作された配列特異的ヌクレアーゼを用いて、ノックアウト対立遺伝子が作製されている。そのような配列特異的エンドヌクレアーゼの例には、エンドヌクレアーゼエフェクタードメインに融合したドメインに結合する配列特異的ＤＮＡで構成されるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が挙げられる（Ｐｏｒｔｅｕｓ，Ｍ．Ｈ．ａｎｄ  Ｃａｒｏｌｌ，Ｄ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，９６７−９７３（２００５））。配列特異的ヌクレアーゼの別の例は、ＴＡＬエフェクタータンパク質に融合したヌクレアーゼドメインで構成される転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９，１４３−１４８（２０１１）；Ｃｅｒｍａｋ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３９，ｅ８２（２０１１））。配列特異的エンドヌクレアーゼは、本来モジュラーであり、ＤＮＡ結合特異性は１つ以上のモジュールを配置することによって得られる。例えば、ＺＦＮ中のジンクフィンガードメインは、それぞれ３つの塩基対を認識し（Ｂｉｂｉｋｏｖａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１，２８９−２９７（２００１））、その一方、ＴＡＬＥＮ中の個々のＴＡＬドメインは、一意のコードを介して１つの塩基対を認識する（Ｂｏｃｈ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，１５０９−１５１２（２００９）。）配列特異的ヌクレアーゼの別の例には、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が挙げられる。
【０００６】
ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、およびごく最近ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性の遺伝子編集が、効率的かつ直接的に遺伝子ノックアウト対立遺伝子を生成するために使用されている（Ｇｅｕｒｔｓ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５，４３３（２００９）；Ｍａｓｈｉｍｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５，ｅ８８７０（２０１０）；Ｃａｒｂｅｒｙ，Ｉ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８６，４５１-４５９（２０１０）；Ｔｅｓｓｏｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９，６９５−６９６（２０１１））。ノックアウト対立遺伝子は、エンドヌクレアーゼ媒介性二重鎖切断（ＤＳＢ）の誤りがちな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって生成されるものと考えられる。
【０００７】
最近では、ＺＦＮが、マウスおよびラットの両方においてドナーＤＮＡを有する、標的とされる染色体座の相同的組換えによってレポーター遺伝子の標的を定めた挿入（ノックイン）にうまく使用された（Ｍｅｙｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０７，１５０２２−１５０２６（２０１０）；Ｃｕｉ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（１），６４−６７（２０１０））。ドナー配列の配列特異的な挿入は、ドナーと二重鎖切断が生じる遺伝子座との間の相同的組換えによる二重鎖切断修復の合成依存性鎖アニーリング（ＳＤＳＡ）モデルを介して生じることが提唱されてきた（Ｍｏｅｈｌｅ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４，３０５５−３０６０（２００７））。このモデルによれば、エンドヌクレアーゼ媒介性二重鎖切断および鎖切除の後、一本鎖の染色体末端をドナーＤＮＡ上に存在する相同領域とアニールし、その後、ドナー挿入を鋳型として用いる合成が続く。
【０００８】
これらの進歩にもかかわらず、当該技術分野において、条件付きノックアウト対立遺伝子を作製し、この技術を他の種に発展させるための新たな方法の必要性が依然として存在する。本発明はこの必要性を満たし、また他の便益を提供する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、条件付きノックアウト対立遺伝子を生成するための新規の方法および組成物に関する。具体的には、本発明は、配列特異的ヌクレアーゼと共に特異的ドナーコンストラクトを用いて、条件付きノックアウト対立遺伝子を生成することに関する。
【００１０】
１つの態様では、標的遺伝子を含む細胞中に条件付きノックアウト対立遺伝子を生成する方法が提供される。本方法は、
１．細胞内にドナーコンストラクトを導入するステップであって、ドナーコンストラクトが、５’相同領域、５’リコンビナーゼ認識部位、ドナー配列、３’リコンビナーゼ認識部位、および３’相同領域を含み、そのドナー配列が、少なくとも１つの中立突然変異を有する標的配列を含む、ステップと、
２．細胞内に標的遺伝子内の配列を切断する配列特異的ヌクレアーゼを導入し、それによってその細胞中に条件付きノックアウト対立遺伝子を生成するステップと、を含む。
【００１１】
ある特定の実施形態において、配列特異的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ある特定の実施形態において、配列特異的ヌクレアーゼは、標的遺伝子を一度だけ切断する。ある特定の実施形態において、配列特異的ヌクレアーゼは、細胞内にタンパク質、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡとして導入される。
【００１２】
ある特定の実施形態において、リコンビナーゼ認識部位は、ｌｏｘＰ部位、ｒｏｘ部位、またはｆｒｔ部位である。ある特定の実施形態において、ドナー配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の中立突然変異を含む。ある特定の実施形態において、ドナー配列と標的配列との間の相同性は、５１〜９９％である。ある特定の実施形態において、ドナー配列と標的配列との間の相同性は、７８％である。ある特定の実施形態において、ドナーコンストラクトは、図４Ａまたは図４Ｂに示される配列を含む。ある特定の実施形態において、５’相同領域は少なくとも１．１ｋｂを含み、３’相同領域は少なくとも１ｋｂを含む。ある特定の実施形態において、標的遺伝子は、Ｌｒｐ５である。
【００１３】
さらなる実施形態において、細胞は、哺乳類細胞である。ある特定の実施形態において、哺乳類細胞は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウマ、ウシ、サル、またはヒト細胞である。ある特定の実施形態において、細胞は、非ヒト動物由来である。ある特定の実施形態において、細胞は、体細胞、接合体、または多能性幹細胞である。
【００１４】
さらなる態様において、条件付きノックアウト動物を生成する方法が提供され、その方法は、
１．標的遺伝子を含む細胞内にドナーコンストラクトを導入するステップであって、ドナーコンストラクトが、５’相同領域、５’リコンビナーゼ認識部位、ドナー配列、３’リコンビナーゼ認識部位、および３’相同領域を含み、そのドナー配列が、少なくとも１つの中立突然変異を有する標的配列を含む、ステップと、
２．細胞内に配列特異的ヌクレアーゼを導入するステップであって、ヌクレアーゼが、標的遺伝子を切断する、ステップと、
３．キャリア動物内に細胞を導入し、その細胞から条件付きノックアウト動物を生成するステップと、を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、動物は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、またはサルである。ある特定の実施形態において、細胞は、非ヒト動物由来である。いくつかの実施形態において、細胞は、接合体、または多能性幹細胞である。
【００１６】
さらなる態様において、ノックアウト動物を生成する方法が提供され、その方法は、
１．標的遺伝子を含む接合体内にドナーコンストラクトを導入するステップであって、ドナーコンストラクトが、５’相同領域、５’リコンビナーゼ認識部位、ドナー配列、３’リコンビナーゼ認識部位、および３’相同領域を含み、そのドナー配列が、少なくとも１つの中立突然変異を有する標的配列を含む、ステップと、
２．接合体内に配列特異的ヌクレアーゼを導入するステップであって、そのヌクレアーゼが標的遺伝子を切断する、ステップと、
３．キャリア動物内にその接合体を導入し、その接合体から条件付きノックアウト動物を生成するステップと、
４．５’および３’リコンビナーゼ認識部位において組換えを触媒するリコンビナーゼタンパク質をコードする導入遺伝子を有する遺伝子導入動物と、条件付きノックアウト動物を交配させ、それによりノックアウト動物を生成するステップと、を含む。
【００１７】
ある特定の実施形態において、リコンビナーゼ認識部位は、ｌｏｘＰ部位であり、リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼである。ある特定の実施形態において、リコンビナーゼ認識部位は、ｆｒｔ部位であり、リコンビナーゼは、フリッパーゼである。ある特定の実施形態において、リコンビナーゼ認識部位は、ｒｏｘ部位であり、リコンビナーゼは、Ｄｒｅリコンビナーゼである。ある特定の実施形態において、リコンビナーゼをコードする導入遺伝子は、組織特異的プロモーターの制御下にある。
【００１８】
本発明のさらなる態様において、
１．５’相同領域、５’リコンビナーゼ認識部位、ドナー配列、３’リコンビナーゼ認識部位、および３’相同領域を含むドナーコンストラクトであって、そのドナー配列が少なくとも１つの中立突然変異を有する標的配列を含む、ドナーコンストラクトと、
２．標的遺伝子を認識する配列特異的ヌクレアーゼと、を含む、標的遺伝子の条件付きノックアウト対立遺伝子を生成するための組成物が提供される。
【００１９】
ある特定の実施形態において、配列特異的ヌクレアーゼは、ＺＦＮ、ＺＦＮ二量体、ＺＦニッカーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ある特定の実施形態において、リコンビナーゼ認識部位は、ｌｏｘＰ部位、ｆｒｔ部位、またはｒｏｘ部位である。
【００２０】
本発明のさらなる態様において、図４Ａ（配列番号３０）、図４Ｂ（配列番号３１）、または図１４Ｃ（配列番号４４〜４６）に示される配列を含むドナーコンストラクトが提供される。
【００２１】
本発明のさらなる態様において、図４Ａ（配列番号３０）、図４Ｂ、または図１４Ｃ（配列番号４４〜４６）に示される配列を含むドナーコンストラクトを含む細胞が提供される。ある特定の実施形態において、細胞は、哺乳類細胞である。ある特定の実施形態において、哺乳類細胞は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウマ、ウシ、サル、またはヒト細胞である。ある特定の実施形態において、細胞は、非ヒト動物由来である。ある特定の実施形態において、細胞は、体細胞、接合体、または多能性幹細胞である。
【００２２】
本発明のさらなる態様において、本明細書に記載される方法に従って調製される条件付きノックアウト非ヒト動物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】生産マウスにおけるＺＦＮ媒介性突然変異Ｌｒｐ５対立遺伝子の分布を示す。欠失および挿入の大きさは、ｘ軸上に塩基対で示される。混成ＫＯ：同一の遺伝子の２つの独立した突然変異対立遺伝子および検出できない遺伝子の野生型対立遺伝子を有する動物、複対立遺伝子：２つ以上の対立遺伝子を保有するキメラ動物、ＳＫＧ→ＷＴＤ：ＴＣＣＡＡＧＧＧＴ（ＺＦＮ切断部位に下線が引かれている）の欠失。
【図２Ａ−Ｅ】Ｌｒｐ５においてフレーム内およびフレーム外の欠失の混成を有する２月齢マウスの血管形質を示す。５４２：無変化のように見える３ｂｐのフレーム内欠失を有する対立遺伝子および１ｂｐのフレーム外欠失を有する対立遺伝子を保有させたキメラ機能性ヘテロ接合性マウス（対照）、４９５：４ｂｐのフレーム外欠失対立遺伝子および１ｂｐのフレーム外欠失対立遺伝子を保有させたマウス、５１９：２９ｂｐのフレーム外欠失対立遺伝子および１７ｂｐのフレーム外欠失対立遺伝子を保有させたマウス、５５５：３ｂｐのフレーム内欠失対立遺伝子および１ｂｐのフレーム外欠失対立遺伝子を保有させた、機能性ヘテロ接合体である機能性ヘテロ接合性マウス、ＦＡ：蛍光血管造影法、ＩＢ４：イソレクチンＢ４、ＮＦＬ：神経線維層、ＩＰＬ：内網状層、ＯＰＬ：外網状層。
【図３Ａ−Ｂ】Ｌｒｐ５エクソン２  ＺＦＮおよびドナープラスミドの共マイクロインジェクションまたは共エレクトロポレーションから得た条件付きノックアウト対立遺伝子を示す。図３Ａは、合成依存性鎖アニーリングによる二重鎖切断修復の概略図を示す。矢印はリコンビナーゼ認識部位を表し、ステップ１における大きい矢印は標的配列を表し、星印の付いた大きい矢印はドナー配列を表し、星印は中立突然変異を表し、半分の矢印は、プライマー位置を示す。図３Ｂは、仔マウス（左パネル）の尾試料またはＥＳ細胞（右パネル）から単離されているＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析の結果を示す。この分析に使用したそれぞれのプライマー対は、左に示される（プライマー位置は図３Ａに示される）。
【図４Ａ−Ｃ】正しい配向および挿入を挟む配列でプラスミドにおいて使用されたドナー配列（見かけ上の順でそれぞれ、配列番号３０〜３２）を示す。
【図５Ａ−Ｂ】５’ｌｏｘＰ〜３’ｌｏｘＰ部位からの３つのＬｒｐ５ＣＫＯ  ＤＮＡドナーの配列アライメント（見かけ上の順でそれぞれ、配列番号３３〜３５）を示す。大文字の太字はｌｏｘＰ部位を示し、小文字はイントロン配列を示し、大文字は（野生型または変更された）エクソン２配列を示し、破線の枠はＺＦＮ結合部位を示し、実線の枠はサイレント突然変異を示し、下線の付いた文字は、そこで野生型エクソン２がＺＦＮによって切断される配列を示す。
【図６Ａ−Ｅ】コドン変更Ｌｒｐ５条件付きノックアウト対立遺伝子を担持するマウスの正常な網膜形質を示す。図６Ａ〜Ｄは、イソレクチンＢ４で染色された網膜の全組織標本の共焦点投影を示す（スケールバー：５０μｍ）。図６Ｅは、ＩＢ４、ＭＥＣＡ３２、およびＤＡＰＩで染色された、図６Ａ〜Ｄに示されるものと反対の目の網膜の断面図を示す。矢印は、示されるように染色例を指す。＋／＋：野生型対照、ＫＯ／ＫＯ：Ｌｒｐ５ホモ接合性ノックアウト、ＫＯ／＋：Ｌｒｐ５ヘテロ接合性ノックアウト、ＣＫＯ／ＫＯ：Ｌｒｐ５条件付きノックアウト／Ｌｒｐ５ノックアウト混成ヘテロ接合性、ＩＢ４：イソレクチンＢ４、ＮＦＬ：神経線維層、ＩＰＬ：内網状層、ＯＰＬ：外網状層。
【図７Ａ−Ｄ】観察されるドナーに由来するＬｒｐ５対立遺伝子のそれぞれを生成した可能な機構の図式表現を示す。結果として生じる対立遺伝子に結合するプライマーが示される。中立突然変異は、星印で示される。
【図８】Ｌｒｐ５エクソン２（ｐ＿ｇＲＮＡ  Ｔ２、ｐ＿ｇＲＮＡ  Ｔ５もしくはｐ＿ｇＲＮＡ  Ｔ７）または対照プラスミド（ＰＭＡＸＧＦＰ）を標的とするガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）と共にジンクフィンガー対（ｐＺＦＮ１＋ｐＺＦＮ２）またはＣａｓ９（＋ｐＲＫ５−ｈＣａｓ９）のいずれかのＮＩＨ／３Ｔ３細胞またはＨｅｐａ１−６細胞内への導入後の、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を示す。
【図９Ａ−Ｂ】Ｈｅｐａ１−６マウスの肝癌細胞のＬｒｐ５エクソン２ゲノム遺伝子座におけるｇＲＮＡ／Ｃａｓ９突然変異率（図９Ａ）および欠失の大きさ（図９Ｂ）の要約を例示する。細胞は、ｍＲＮＡと共に（Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ＋ｇＲＮＡ  Ｔ２、黒いバー）もしくはプラスミドと共に（Ｃａｓ９プラスミド＋ｇＲＮＡ  Ｔ２、白いバー）Ｌｒｐ５を標的とするｇＲＮＡ、またはＬｒｐ５のエクソン２を標的とするジンクフィンガー対をコードする２つのプラスミド（ＺＦＮプラスミド、灰色のバー）を受容した。
【図１０】ＣＯエクソン２配列に特異的な順方向プライマーおよびゲノム遺伝子座における相同性アームの外側の逆方向プライマーを用いて、Ｌｒｐ５遺伝子座におけるドナーエクソンの組込みを同定するＰＣＲ分析の結果を示す。マウスＨｅｐａ１−６細胞は、ガイドＲＮＡ単独（ｐ＿ｇＲＮＡ  Ｔ２）、ガイドＲＮＡおよびドナープラスミド（ｐ＿ｇＲＮＡ  Ｔ２＋ｐ＿ドナー１）、もしくは対照プラスミド（ＰＭＡＸＧＦＰ）のいずれかと共に、プラスミド（ｐＲＫ５−ｈＣａｓ９）、またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡ（ｈＣａｓ９  ｍＲＮＡ）を受容した。いくつかの細胞は、Ｌｒｐ５ジンクフィンガー対と共にドナーを受容した（ｐＺＦＮ１＋ｐＺＦＮ２＋ｐ＿ドナー１）。
【図１１】Ｌｒｐ５ゲノム遺伝子座への５’（上、プライマーＰ９およびＰ１０）ならびに３’（下、プライマーＰ１１およびＰ１２）ｌｏｘＰ部位組込みを検出するプライマーを用いたＰＣＲ分析の結果を示す。処置群は、図１０に示される。ヘテロ接合性Ｌｒｐ５条件付きノックアウト（マウスＣＫＯ／ｗｔ）からのＤＮＡを陽性対照として用いた。
【図１２】ガイドＲＮＡおよびＬｒｐ５（Ｌｒｐ５エクソン２；ｐ＿ｇＲＮＡ  Ｔ７＋ｐ＿Ｌｒｐ５＿ドナー１）、Ｕｓｐ１０（Ｕｓｐ１０エクソン３；ｐ＿ｇＲＮＡ  Ｔ１＋ｐ＿Ｕｓｐ１０＿ドナー１）、またはＮｏｔｃｈ３（Ｎｏｔｃｈ３エクソン３；ｐ＿ｇＲＮＡ  Ｔ１＋ｐ＿Ｎｏｔｃｈ３＿ドナー１）を標的とするそれぞれのドナーコンストラクトと共にＣａｓ９（ｐ＿ｈＣａｓ９）のＨｅｐａ１−６細胞内への導入後の、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を示す。
【図１３】Ｃａｓ９／ｇＲＮＡおよびドナー投与後の、Ｎｎｍｔエクソン２ゲノム遺伝子座への５’ｌｏｘＰ部位組込み（左パネル、プライマーＰ２６およびＰ２７）またはＮｏｔｃｈ３エクソン３ゲノム遺伝子座への３’ｌｏｘＰ部位組込み（右パネル、プライマーＰ２５およびＰ２８）を検出するプライマーを用いたＰＣＲ分析の結果を示す。
【図１４Ａ−Ｄ】マウスＬｒｐ５、Ｕｓｐ１０、Ｎｎｍｔ、およびＮｏｔｃｈ３ゲノム遺伝子座を標的とするＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲの配列（見かけ上の順でそれぞれ、配列番号３６〜４６）を示す。Ｌｒｐ５、Ｕｓｐ１０、Ｎｎｍｔ、およびＮｏｔｃｈ３に特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列の配列、ならびにＵｓｐ１０、Ｎｎｍｔ、およびＮｏｔｃｈ３に対するドナープラスミド配列が示される。さらに、哺乳類発現およびインビトロ転写（ｍＲＮＡ）に関するＣａｓ９  ｃＤＮＡ配列が示される。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
Ｉ．定義
この明細書を解釈するために、以下の定義が適用され、また適切な場合には、単数形で用いられる用語は複数形を含み、逆もまた同様である。以下に記載する任意の定義が、参照により本明細書に組み込まれる任意の文献と矛盾が生じる場合、以下に記載する定義が優先する。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「ドナーコンストラクト」という用語は、別途具体的な指示がない限り、５’相同領域、５’リコンビナーゼ認識部位、ドナー配列、３’リコンビナーゼ認識部位、および３’相同領域を含むポリヌクレオチドを指す。ドナーコンストラクトは、ドナーコンストラクトの増殖またはコンストラクトを持つ細胞の選択を支持する配列等の追加の配列をさらに含んでもよい。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「ドナー配列」という用語は、別途具体的な指示がない限り、標的遺伝子の配列の一部分と比較して、少なくとも１つの中立突然変異を有する標的配列を含む配列を有する核酸を指す。したがって、ドナー配列は、標的遺伝子の部分によってコードされるものと機能上は実質的に類似の、または識別できないポリペプチドをコードする核酸を含む。その結果、ドナー配列は、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の機能特性を実質的に変化することなく、標的遺伝子中のその位置において標的遺伝子の同族の部分を置き換えることができる。ドナー配列は、イントロンまたは制御配列等のある特定の非コード配列を含むことができる。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「相同領域」という用語は、別途具体的な指示がない限り、標的配列に隣接する核酸に対して相同であるドナーコンストラクト中の核酸を指す。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「リコンビナーゼ認識部位」という用語は、別途具体的な指示がない限り、リコンビナーゼによって認識される配列を有するドナーコンストラクト中の核酸を指す。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「リコンビナーゼ」という用語は、別途具体的な指示がない限り、介在するポリヌクレオチドを挟む特異的ポリヌクレオチド配列（リコンビナーゼ認識部位）を認識し、相互鎖（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｓｔｒａｎｄ）交換を触媒し、介在するポリヌクレオチドの反転または切除をもたらす酵素を指す。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「標的遺伝子」という用語は、別途具体的な指示がない限り、細胞内のポリペプチドをコードする核酸を指す。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「標的配列」という用語は、別途具体的な指示がない限り、標的遺伝子の部分、例えば、標的遺伝子のエクソン配列、標的遺伝子のイントロン配列もしくは制御配列、またはエクソンおよびイントロン配列、イントロンおよび制御配列、エクソンおよび制御配列の組み合わせ、または標的遺伝子のエクソン、イントロン、および制御配列のうちの１つ以上を指す。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「配列特異的エンドヌクレアーゼ」または「配列特異的ヌクレアーゼ」という用語は、別途具体的な指示がない限り、特異的なヌクレオチド配列においてポリヌクレオチド、例えば、標的遺伝子を認識および結合し、ポリヌクレオチドの一本鎖または二重鎖切断を触媒するタンパク質を指す。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ」または「ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ」または「ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ」という用語は、別途具体的な指示がない限り、特異的ヌクレオチド配列においてガイドＲＮＡおよびポリヌクレオチド、例えば、標的遺伝子を認識および結合し、ポリヌクレオチドの一本鎖または二重鎖切断を触媒するタンパク質を指す。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「条件付きノックアウト対立遺伝子」という用語は、別途具体的な指示がない限り、リコンビナーゼ認識部位で挟んだポリヌクレオチド配列を含むが、同族の野生型対立遺伝子によって生成されるものからは識別できない表現型を生成する対立遺伝子を指す。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「中立突然変異」という用語は、別途具体的な指示がない限り、ドナー配列と標的配列との間の全体相同性を減少させるが、機能性ポリペプチドをコードすることができるドナー配列を残す、ドナー配列における突然変異を指す。中立突然変異の例には、サイレント突然変異、すなわち、ヌクレオチド配列を変化させるが、コードされるポリペプチド配列は変化させない突然変異が挙げられる。さらに、中立突然変異の例には、点突然変異（例えば、置換）、挿入、および欠失、すなわち、ヌクレオチド配列およびコードされるポリペプチド配列を変化させるが、結果として生じるポリペプチドの機能は実質的に変化させない突然変異等の保存的突然変異も挙げられる。保存的置換突然変異の例は、表８に示される。また、中立突然変異は、サイレント突然変異の組み合わせ、保存的突然変異の組み合わせ、またはサイレントおよび保存的突然変異の組み合わせを含むこともできる。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「動物」という用語は、別途具体的な指示がない限り、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長動物（例えば、サル等の非ヒト霊長動物）、ウサギ、魚、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、ならびに非脊椎動物（例えば、キイロショウジョウバエおよび線虫）が挙げられるが、これらに限定されない、任意の非ヒト動物を指す。
【００３７】
「単離」核酸は、別途具体的な指示がない限り、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離核酸には、核酸分子を通常含有する細胞内に含有される核酸分子が含まれるが、その核酸分子は、染色体外に、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に、存在する。
【００３８】
「タンパク質をコードする単離核酸」は、別途具体的な指示がない限り、タンパク質（またはそれらの断片）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、それには単一のベクターまたは別個のベクターにおけるかかる核酸分子（複数可）が含まれ、かかる核酸分子（複数可）は、宿主細胞内の１つ以上の位置に存在する。
【００３９】
「配列相同性」という用語は、ドナーおよび標的遺伝子ポリヌクレオチド配列に関連して本明細書で使用する場合、配列をアライメントし、配列同一性最大パーセントを得るために必要な場合はギャップを導入した後に、標的遺伝子配列におけるヌクレオチド残基と同一である、ドナー配列におけるヌクレオチド残基の割合として定義される。ヌクレオチド配列相同性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、当該技術分野における技術の範囲内である種々の方式で、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者であれば、比較されている配列の完全長にわたる最大のアライメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアライメントするために適切なパラメータを決定することができる。
【００４０】
ＩＩ．本発明の実施形態
本発明は、部分的に、リコンビナーゼ認識配列で挟んだドナー配列と組み合わせて配列特異的エンドヌクレアーゼを用いた条件付きノックアウト対立遺伝子の作製に関連付けられる技術的課題の認識および解決に関する。この過程は、かかる配列を認識および結合し、核酸分子中の二重鎖切断を誘発するエンドヌクレアーゼを用いて、染色体等の核酸分子の特異的配列を標的化することに依拠する。二重鎖切断は、誤りがちな非相同末端結合または相同的組換えのいずれかによって修復される。通過中に相同的組換えのための鋳型が提供される場合、二重鎖切断は、その提供された鋳型を用いて修復され得る。最初の二重鎖切断は、従来の相同的組換えに基づく遺伝子標的化と比較して、標的化の頻度を数桁増加させる。原理上は、二重鎖切断に近い配列に対して相同性である適切な領域で挟まれている限り、この方法を使用して修復の部位において任意の配列を挿入することができる。しかしながら、この手法は、条件付きノックアウト対立遺伝子の作製に適用する場合、ある特定の課題と関連する。条件付きノックアウト対立遺伝子は、典型的には、条件付きノックアウト対立遺伝子が非変更対立遺伝子と実質的に類似の機能性ポリペプチドを生成するが、認識配列を認識するリコンビナーゼの存在により、ある特定の時において、またはある特定の組織内において非機能的にされ得るように、遺伝子または遺伝子の部分を挟むがその機能を無傷のまま残すｌｏｘＰ部位等のある特定のリコンビナーゼ認識配列を含む。
【００４１】
条件付きノックアウト対立遺伝子を作製するための上述の手法に関連付けられる第１の課題は、配列特異的エンドヌクレアーゼによって触媒された二重鎖切断に続いて、それらの互いに対する配列同一性のため、リコンビナーゼ認識配列で挟んだドナーの外側の相同領域の代わりにドナーエクソンと染色体（標的）エクソンとの間で望ましくない組換えが起こり得るという事実にある。これは、片方または両方のリコンビナーゼ認識配列を欠く対立遺伝子をもたらすことになる。第２の課題は、配列特異的エンドヌクレアーゼが、標的遺伝子だけではなく、修復のための鋳型として作用する前にドナーエクソンも認識および切断し得るという事実にある。本明細書に記載される方法および組成物は、これらの課題の解決策を提供する。
【００４２】
Ａ．例示的方法
本発明の種々の態様において、標的遺伝子を含む細胞中に条件付きノックアウト対立遺伝子を生成する方法が提供される。本方法は、標的遺伝子を有する細胞内に、ドナーコンストラクトと、標的遺伝子内の配列を切断するが、ドナーコンストラクトの機能を阻害しない配列特異的ヌクレアーゼとを導入し、それによって細胞中に条件付きノックアウト対立遺伝子を生成するステップを含む。本発明のこれらの、およびさらなる態様が以下に記載される。
【００４３】
本発明の特定の態様において、条件付きノックアウト対立遺伝子は、５’相同領域、５’リコンビナーゼ認識部位、ドナー配列、３’リコンビナーゼ認識部位、および３’相同領域を含むドナーコンストラクトを細胞内に導入することによって、標的遺伝子を含む細胞中に生成される。ドナー配列は、少なくとも１つの中立突然変異を有する標的配列の配列を含む。ある特定の実施形態において、ドナー配列および標的配列は、その少なくとも１つの中立突然変異を除いて同一である。中立突然変異は、ドナー配列と標的配列との間の相同性を減少させるが、機能性ポリペプチドのためのドナーのコーディング能力を無傷のまま残す、ドナー配列のヌクレオチド配列における任意の突然変異を意味する。中立突然変異は、野生型配列と比較して、条件付きノックアウト対立遺伝子をもたらさないドナー配列と標的配列との間の望まれない相同的組換え事象の数を減少させる（図７Ｂ、Ｃ、Ｄ）。いくつかの実施形態において、中立突然変異はまた、配列特異的ヌクレアーゼのドナー配列への結合を抑制する。
【００４４】
中立突然変異の例には、サイレント突然変異、すなわち、ヌクレオチド配列を変化させるが、コードされるポリペプチド配列は変化させない突然変異が挙げられる。中立突然変異はまた、保存的突然変異、すなわち、すなわち、ヌクレオチド配列およびコードされるポリペプチド配列を変化させるが、結果として生じるポリペプチドの機能は実質的に変化させない突然変異を含む。これは、例えば、あるアミノ酸が、同様の特性（大きさ、電荷等）を有する別のアミノ酸で置換される場合である。例えば、アミノ酸は、次の一般的な側鎖特性に従って分類されてもよい：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００４５】
保存的突然変異の例は、表８に示される。ある特定の実施形態において、ドナー配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または５０個のサイレント突然変異を含む。ある特定の実施形態において、ドナー配列と標的配列との間の相同性は、９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、８０％、７８％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％である。ある特定の実施形態において、ドナーと標的配列との間の配列相同性は、５０％未満である。標的とされる分子上の相同領域とそれらの同族の配列との間ではなく、ドナー配列と標的配列との間の相同的組換え事象の数を減少させるか、または阻害するが（図７Ｂ−Ｄ）、機能性ポリペプチドをコードするドナー配列の能力を維持する任意の数の中立突然変異が導入され得る。ある特定の実施形態において、ドナーは、図４Ａ（配列番号３０）、図４Ｂ（配列番号３１）、または図１４Ｃ（配列番号４４〜４６）に示される配列を含む。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの中立突然変異は、配列特異的ヌクレアーゼのドナー配列への結合を抑制する。ある特定の実施形態において、いくつかの中立突然変異は、ドナー配列の長さに沿って離れており、ドナー配列の任意の位置で連続する非変更塩基対の数を２０〜１００塩基対未満に減少させる。
【００４６】
ドナー配列内の突然変異が中立のため、ドナー配列は、標的配列によってコードされるものと機能上は実質的に類似の、または識別できないポリペプチドをコードする。ペプチドまたはタンパク質の機能性は、機能アッセイ、酵素アッセイ、および生化学アッセイ等の当該技術分野において周知の方法によって評価され得る。ドナー配列は、標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの機能特性を実質的に変化させることなく、標的遺伝子中のその位置で標的配列を置き換えることができる。しかしながら、標的遺伝子中にいったん組み込まれると、その後の標的遺伝子からのドナー配列の除去は、標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの機能の変化、減少、または喪失をもたらし得る。
【００４７】
ドナーコンストラクト内において、ドナー配列は、リコンビナーゼ認識部位で挟まれた５’および３’である。これらのリコンビナーゼ認識部位は、リコンビナーゼによって認識され、その後、組換え認識部位において組換えを触媒するドナーコンストラクト内の核酸配列である。配列特異的組換えは、当該技術分野において周知であり、リコンビナーゼ媒介性の配列特異的切断およびリコンビナーゼ認識部位で挟まれたポリヌクレオチドの連結を含む。リコンビナーゼ認識部位の例には、ｌｏｘＰ（Ｐ１から乗り換えたＸの遺伝子座）部位（Ｈｏｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：３３９８−３４０１（１９８２））、ｆｒｔ部位（ＭｃＬｅｏｄ，Ｍ．，Ｃｒａｆｔ，Ｓ．＆  Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６，３３５７−３３６７（１９８６））、およびｒｏｘ部位（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．ａｎｄ  ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｊ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ３２，６０８６−６０９５（２００４）．）が挙げられる。
【００４８】
５’相同領域は、５’リコンビナーゼ認識部位の５’または「上流」に位置し、そのヌクレオチド構成において標的配列を挟む核酸に対して相同性である。同様に、３’相同領域は、３’リコンビナーゼ認識部位の３’または「下流」に位置し、標的配列を挟む核酸に対して相同性である。１つの実施形態において、相同領域は３０ｂｐを超え、好ましくは数ｋｂの長さである。例えば、相同領域は、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、５００ｂｐ、８００ｂｐ、１ｋｂ、１．１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、および５ｋｂの長さであり得る。ある特定の実施形態において、５’相同領域は１．１ｋｂを含み、３’相同領域は１ｋｂを含む。相同領域は、標的遺伝子の領域に対して相同性であってもよく、また、あるいはその代わりに、標的遺伝子の上流または下流の領域に対して相同性であってもよい。１つの実施形態において、相同領域は、標的配列の真横に隣接する染色体領に対して相同性である。例えば、５’相同領域の場合、相同領域は、標的配列の第１の（５’最末端）ヌクレオチドの真横に隣接する、その最も３’側のヌクレオチドを有する配列に対して相同性である。１つの実施形態において、相同領域は、染色体上の標的配列の真横に隣接しない染色体領域に対して相同性である。いくつかの実施形態において、５’および３’相同領域はそれぞれ、標的配列を挟む同族の核酸配列に対して９５〜１００％相同性である。
【００４９】
上述の構成要素配置を要約するために、ドナーコンストラクトは、５’から３’の順で、５’相同領域、５’リコンビナーゼ認識部位、ドナー配列、３’リコンビナーゼ認識部位、および３’相同領域を含む。ドナーコンストラクトは、プラスミドまたはドナーコンストラクトの増殖を支持する他のベクター（例えば、ｐＵＣ１９ベクター）の配列等の構造的または機能的補助を提供するある特定の配列をさらに含んでもよい。またドナーコンストラクトは、任意に、ある特定の選択可能マーカーまたはレポーターを含んでもよく、それらのいくつかは、その後の活性化、不活性化、または欠失のためにリコンビナーゼ認識部位で挟まれ得る。任意のマーカーまたはレポーターを挟むリコンビナーゼ認識部位は、ドナー配列を挟むリコンビナーゼ認識部位と同じか、または異なっていてもよい。ある特定の実施形態では、一種類のドナーコンストラクトを使用して、条件付きノックアウト対立遺伝子を生成する。
【００５０】
ドナーコンストラクトの導入と同時に、または順次、配列特異的ヌクレアーゼが細胞内に導入される。配列特異的ヌクレアーゼは、標的遺伝子内で特異的配列を認識および結合し、標的遺伝子中に二重鎖切断を導入する。上述のように、ドナー配列は、少なくとも１つの中立突然変異によって変更され、条件付きノックアウト対立遺伝子をもたらさない相同的組換え事象を減少させる。ある特定の実施形態において、配列特異的ヌクレアーゼは、標的遺伝子を一度だけ切断する、すなわち、本明細書に記載される方法の間に、単一の二重鎖切断が標的遺伝子中に導入される。
【００５１】
配列特異的ヌクレアーゼの例には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が挙げられる。ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質ドメインおよびエフェクターヌクレアーゼドメインで構成される組換えタンパク質である。ジンクフィンガータンパク質ドメインは、例えば、特異的ＤＮＡ配列を認識および結合する転写因子に関連付けられる、遍在性のタンパク質ドメインである。「フィンガー」ドメインのうちの１つは、亜鉛と複合した不変ヒスチジン残基を含む約３０個のアミノ酸で構成され得る。これまで１０，０００を超えるジンクフィンガー配列が同定されているが、ジンクフィンガータンパク質のレパートリーは、目的とする特異的ヌクレオチド配列を認識するように設計された新たなジンクフィンガータンパク質を作製するジンクフィンガードメイン中の標的とされるアミノ酸置換によって、さらに拡大している。例えば、所望の配列特異性のためのジンクフィンガーコンビナトリアルライブラリを選別するために、ファージディスプレイライブラリが使用されている（Ｒｅｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：６７１−６７３（１９９４）；Ｊａｍｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：５６８９−５６９５（１９９４）；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９１：１１１６３−１１１６７（１９９４）、そのそれぞれは、それらの全体が示されているのと同様に本明細書に組み込まれる）。所望の配列特異性を有するジンクフィンガータンパク質は、例えば、そのそれぞれは、それらの全体が示されているのと同様に参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ１９９５／０９２３３号および同第ＷＯ１９９４０１８３１３号に記載されるＦｏｋＩ等の第６，８２４，９７８号に記載されるように、次いで、エフェクターヌクレアーゼドメインに連結され得る。
【００５２】
配列特異的ヌクレアーゼの別の例には、特異的ヌクレオチド配列に結合するＴＡＬエフェクタードメインおよび標的部位において二重鎖切断を触媒するエンドヌクレアーゼドメインを含む、転写活性化因子様エフェクターエンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられる。ＴＡＬＥＮならびに作製および使用方法の例は、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１１０７２２４６号に記載されており、その全体が示されているのと同様に参照により本明細書に組み込まれる。
【００５３】
本明細書に記載される方法および組成物と共に使用され得る配列特異的ヌクレアーゼ系の別の例には、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ系が挙げられる（Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８２，３３１−３３８（２０１２）；Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，８１６−８２１（２０１２）；Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８２３-８２６（２０１３）；Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９-８２３（２０１３））。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）系は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合および標的ＤＮＡの配列特異的切断を利用する。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、標的ゲノムＤＮＡ配列上流のゲノムＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ）部位（ＮＮＧ）および定常ＲＮＡスキャフォールド領域に相補的である２０ヌクレオチドを含有する。Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲに関与する）９タンパク質は、ｇＲＮＡおよびそこにｇＲＮＡが結合し、ＰＡＭ部位の上流の規定位置に二重鎖切断を導入する標的ＤＮＡに結合する。Ｃａｓ９は、ＨＮＨおよびＲｕｖＣエンドヌクレアーゼに対して相同性の２つの独立したヌクレアーゼドメインを内部に持ち、その２つのドメインのいずれかを突然変異させることによって、Ｃａｓ９タンパク質は一本鎖切断を導入するニッカーゼに変換され得る（Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９−８２３（２０１３））。本発明の方法および組成物が、一本鎖または二重鎖誘発型のＣａｓ９と共に、ならびに他の細菌性Ｃａｓ９様系等の他のＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼと共に使用されてもよいことが具体的に意図される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法において使用されるガイドＲＮＡは、見かけ上の順でそれぞれ、配列番号３６〜４２のものである。本明細書に記載される方法および組成物の配列特異的ヌクレアーゼは、操作され得るか、キメラであるか、または生物から単離され得る。
【００５４】
配列特異的ヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、またはｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡ等の配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸の形態で、細胞内に導入され得る。核酸は、プラスミドもしくはウイルスベクター等のより大きいコンストラクトの一部として、または直接、例えば、エレクトロポレーション、脂質小胞、ウイルス輸送体、マイクロインジェクション、および遺伝子銃によって送達され得る。同様に、ドナーコンストラクトは、細胞内に核酸を導入するために適切な任意の方法によって送達され得る。
【００５５】
いかなる特定の機構または理論に制限されるものではないが、配列特異的ヌクレアーゼに導入される標的配列中の二重鎖切断（例えば、ＺＦＮ誘導型ＤＳＢ；図３Ａ、ステップ１）に続く鎖切除が、３’一本鎖染色体末端を生成する（図３Ａ、ステップ２）。修復を開始するため、一本鎖染色体末端は、ストランド侵入によるドナーコンストラクト上に存在する相同領域内の相補的塩基対とアニールする（図３Ａ、ステップ３）。次いで、ドナー配列を鋳型として用いて、ＤＮＡポリメラーゼ媒介性鎖延長により３’一本鎖末端を延ばすことができる。鎖延長に続いて、延長された鎖は、元の二重鎖切断の他の側面上にある一本鎖染色体末端とアニールし、延長した鎖を鋳型として使用するＤＮＡ合成および連結によって修復が完了する。結果として生じる二重鎖ＤＮＡは、リコンビナーゼ認識部位で挟まれたドナー配列を含有する（図３Ａ、ステップ４）。
【００５６】
二重鎖切断修復のこの合成依存性鎖アニーリングモデルは、レポーター遺伝子等の内在性配列とほとんどまたは全く相同性がない外来性ＤＮＡの非常に大きな伸長が、二重鎖切断の時点で正確に挿入され得るという所見と一致する。その結果、ドナーコンストラクト上の相同領域に対して実質的に相同性である標的配列の周りの領域を曝露するように、遊離染色体末端の切除による二重鎖切断時にリコンビナーゼ認識部位で挟まれたドナー配列を組み込むことができる（図３Ａ）。相同領域は、上述のようにドナーコンストラクト中の配置に適しており、鎖アニーリングの媒介において有効である任意の長さ、例えば、合体した長さは、１０〜５０００ｂｐ、１００〜１０００ｂｐ、５００〜６００ｂｐ、または５３７ｂｐであり得る。このようにして、これらのステップは、標的遺伝子の部位において条件付きノックアウト対立遺伝子、すなわち、同族の標的遺伝子の対立遺伝子によって生成されるものと実質的に類似の、または識別できない表現型を生成するリコンビナーゼ認識部位で挟まれたドナー配列を含む対立遺伝子を作製する。当業者による標準検査時に、標的遺伝子の根底にある対立遺伝子の性質を検出することができない場合、２つの表現型は実質的に類似または識別不能である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、ヘテロ接合性条件付きノックアウト対立遺伝子またはホモ接合性条件付きノックアウト対立遺伝子を保有する、すなわち、すべてではない、またはすべての内在性対立遺伝子が条件付きノックアウト対立遺伝子と置き換えられた、細胞を生成する。
【００５７】
標的遺伝子は、遺伝子の条件付きノックアウト型を生成するためにドナーコンストラクトによって標的とされている細胞の遺伝物質内のタンパク質（またはその断片）をコードする任意の核酸分子であり得る。例えば、標的遺伝子は、未知の機能のタンパク質をコードするか、または細胞過程に関与する真核細胞の染色体上に位置する遺伝子であり得る。そのような遺伝子は、一連のエクソンおよびイントロンで構成され得る。標的配列は、標的遺伝子のエクソン、イントロン（人工イントロンを含む）、もしくは制御配列、またはそれらの種々の組み合わせを含み得る。標的配列は、全標的遺伝子を含み得る。
【００５８】
細胞は、任意の真核細胞、例えば、全能性、多能性、もしくは成体幹細胞等の動物の単離細胞、接合体、または体細胞であり得る。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される方法において使用するための細胞は、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長動物（例えば、サル等の非ヒト霊長動物）、ウサギ、魚、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、ハエ、ならびに虫等の非ヒト動物の細胞である。ある特定の実施形態において、本方法において使用するための細胞は、ヒト細胞である。本明細書に記載される方法および組成物は、任意のゲノム遺伝子座を標的とするために使用され得る。異なる遺伝子座を標的とするいくつかの具体的な例が、本明細書に記載されている。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物は、細胞内の２つ以上のゲノム遺伝子座を標的とするために、すなわち、多重遺伝子標的化に使用することができる。
【００５９】
本発明のさらなる特定の態様において、条件付きノックアウト動物は、本明細書に記載される方法を使用して生成される。条件付きノックアウト動物を生成するために、接合体または胚性幹細胞もしくは誘発型多能性幹細胞等の多能性幹細胞、または成体幹細胞等の細胞内にドナーコンストラクトおよび配列特異的ヌクレアーゼが導入され、細胞中に少なくとも１つの条件付きノックアウト対立遺伝子を作製する。所望の遺伝子型を選別するための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、特定の実施例において本明細書に記載されるようなＰＣＲ分析を含む。次いで、例えば、その全体が示されているのと同様に参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，１３，６０８号に開示されているように、細胞は雌性キャリア動物に導入され、細胞から条件付きノックアウト動物を生成する。ある特定の実施形態において、細胞は、２つの細胞期に発展し、キャリア動物への導入前に、胚盤胞内に導入されるか、またはさもなければ、培養されるかもしくは追加の細胞に関連付けられる。ある特定の実施形態において、結果として生じる条件付きノックアウト動物は、条件付きノックアウト対立遺伝子を将来の生成に伝えることができるように、その生殖系列内に条件付きノックアウト対立遺伝子を保有する。
【００６０】
本発明のさらなる特定の態様において、本明細書に記載される方法および組成物を使用して、ノックアウト対立遺伝子を生成することができる。この方法は、リコンビナーゼ認識部位で挟んだドナー配列の正常な発現が、いったん条件付きノックアウト対立遺伝子としてゲノム内に組み込まれると、それを切除するか、反転するか、またはさもなければ阻害することを含む。条件付きノックアウト対立遺伝子は、リコンビナーゼ認識部位を特異的に認識する細胞内にリコンビナーゼを導入することによって、ノックアウト対立遺伝子に変換される。例えば、Ａｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１６０−１６４（１９９５）。リコンビナーゼは、介在するポリヌクレオチドを挟む特異的ポリヌクレオチド配列（リコンビナーゼ認識部位）を認識し、介在するポリヌクレオチドの反転または切除をもたらす相互鎖交換を触媒する酵素である。当業者であれば、本明細書に記載される方法において使用するための、ドナーコンストラクト内のリコンビナーゼ認識部位を特異的に認識するリコンビナーゼを選択する有利な効率を認識する。
【００６１】
リコンビナーゼは、タンパク質またはリコンビナーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列の形態で、任意の方法によってドナーコンストラクトを含有する細胞内に導入され得る。ノックアウト動物を生成するために、上述のように生成される条件付きノックアウト動物は、５’および３’リコンビナーゼ認識部位における組換えを触媒するリコンビナーゼタンパク質をコードする導入遺伝子を有する遺伝子導入動物と交配される。リコンビナーゼ導入遺伝子を保有する動物の例は、当該技術分野において既知であり、例えば、その全体が示されているのと同様に参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，１３５，６０８号に開示されている。いくつかの実施形態において、リコンビナーゼをコードする導入遺伝子は、かかる組織内でのみリコンビナーゼが発現され、その結果ノックアウト対立遺伝子が生成されるように、組織特異的プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、リコンビナーゼをコードする導入遺伝子は、リコンビナーゼの発現が特定の時点で誘発されるように、誘導型プロモーターの制御下にある。例えば、Ｔｅｔ−オンまたはＴｅｔ−オフプロモーターの活性化は、テトラサイクリンまたはその誘導体のうちの１つによって制御され得る。いくつかの実施形態において、リコンビナーゼをコードする導入遺伝子は、ある特定の発生段階でのみ、または動物へ投与された化合物に応じて発現する。本明細書で開示される方法における使用に適したリコンビナーゼの例には、Ｐ１  Ｃｒｅリコンビナーゼの任意の型、ＦＬＰリコンビナーゼ（フリッパーゼ）の任意の型、およびＤｒｅリコンビナーゼの任意の型が挙げられ、これらのリコンビナーゼの任意の誘導可能型（例えば、ＣｒｅＥＲＴ２およびＣｒｅ−ＰＲ等のホルモン応答ドメインとの融合、またはテトラサイクリン調節リコンビナーゼ）を含む。
【００６２】
Ｂ．例示的組成物
本発明のさらなる特定の態様において、標的遺伝子の条件付きノックアウト対立遺伝子を生成するための組成物が提供される。そのような組成物は、本明細書に記載されるように、５’相同領域、５’リコンビナーゼ認識部位、ドナー配列、３’リコンビナーゼ認識部位、および３’相同領域を含むドナーコンストラクトを含む。ドナー配列は、本明細書に記載されるように、少なくとも１つの中立突然変異を有する標的配列を含む。組成物は、標的遺伝子を認識する配列特異的ヌクレアーゼをさらに含む。
【００６３】
ある特定の実施形態において、配列特異的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼである。ある特定の実施形態において、リコンビナーゼ認識部位は、ｌｏｘＰ部位またはｆｒｔ部位である。任意に、組成物はまた、本明細書に記載されるようにリコンビナーゼを含み得る。
【００６４】
本発明のさらなる態様において、ドナーコンストラクトは、図４Ａ（配列番号３０）、図４Ｂ（配列番号３１）、または図１４Ｃ（配列番号４４〜４６）に示される配列を含む。
【００６５】
本発明のさらなる態様において、図１４Ａ（配列番号３６−４２）に示される配列を含むガイドＲＮＡが提供される。
【００６６】
本発明のさらなる態様において、図４Ａ（配列番号３０）、図４Ｂ（配列番号３１）、または図１４Ｃ（配列番号４４〜４６）に示される配列を含むドナーコンストラクトを含む細胞が提供される。この細胞は、本明細書に記載される方法によって生成された動物から単離され得る。
【００６７】
本発明は、以下の本発明のある特定の実施形態の非限定的な実施例を参照してさらに理解され得る。
【００６８】
ＩＩＩ．実施例
以下は、本発明の方法および組成物の実施例である。上で提供される一般的な説明を考慮して、様々な他の実施形態が実践されてよいことが理解される。
実施例１：Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ受精卵内へのＬｒｐ５  ＺＦＮ  ｍＲＮＡの前核マイクロインジェクション
【００６９】
マウス低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質５（Ｌｒｐ５）のエクソン２を標的とするカスタムｅＨｉ−Ｆｉ  ＣｏｍｐｏＺｒ（登録商標）ＺＦＮ対をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。ＺＦＮは、５’−ｇａｃｔｔｃｃａｇｔｔｃｔｃｃａａｇｇｇｔｇｃｔｇｔｇｔａｃｔｇｇａｃａｇａｔ−３’（配列番号２９）（ＺＦＮ切断部位に下線が引かれている）に、二重鎖切断を導入するその効率を著しく増大させる最適化された（ｅＨｉ−Ｆｉ）ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼインターフェースを持つ（Ｄｏｙｏｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ  ８，７４−７９（２０１１））。有意な潜在的場外標的活性は、観察されなかった。使用する前に、ＺＦＮ対をコードする伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を−８０℃で保管した。ｍＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を前核マイクロインジェクションに使用し、ＺＦＮ対をコードする２つのプラスミドをＥＳ細胞エレクトロポレーションに使用した。
【００７０】
エンドヌクレアーゼ活性を決定するために、種々の濃度のＬｒｐ５ＺＦＮをコードするｍＲＮＡをＣ５７ＢＬ／６Ｎ接合体の前核内にマイクロインジェクトした（表１）。Ｌｒｐ５ＺＦＮ  ｍＲＮＡ（５μｌ中２μｇの各ＺＦＮ）を解凍し、ＲＮａｓｅ−およびＤＮａｓｅを含まないマイクロインジェクション緩衝液（１０  ｍＭのＴｒｉｓおよび１ｍＭのＥＤＴＡ、ＰＨ８．０）中で５０ｎｇ／μｌに希釈した。ＺＦＮマイクロインジェクション、Ｌｒｐ５ＺＦＮ  ｍＲＮＡを２、３、４、または５ｎｇ／μｌの作業濃度に希釈した。マイクロインジェクションの前日に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雄（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）と交配させた過排卵したＣ５７ＢＬ／６Ｎ雌からマウス接合体を得た。Ｍ２培地で接合体を収集し、定法（Ｎａｇｙ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＵＳＡ，（２００２））に従ってＭ２でマイクロインジェクトし、偽妊娠ＩＣＲ雌（Ｔａｃｏｎｉｃ）のＥ０．５の卵管に移植した（偽妊娠雌１匹当たり３０胚）。ＩＣＲ雌は、胚移植手術後から仔マウスが離乳するまで９％高脂肪食（Ｈａｒｌａｎ、カタログ番号２０１９）を与えられた。
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表１. Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ受精卵内へのＬｒｐ５  ＺＦＮ  ｍＲＮＡの前核マイクロインジェクション。ＫＯ突然変異体は、１つ以上の突然変異対立遺伝子を有するマウスを含む。ＫＯ＝ノックアウト。
【００７１】
結果として生じた仔マウスからのＤＮＡを尾組織から単離し、大きいおよび小さい突然変異を確認するためにＰＣＲ増幅およびその後のシークエンシグによって分析した。Ｅｘｔｒａｃｔ−Ｎ−Ａｍｐ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＰＣＲキット（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＸＮＡＴ２）を使用して、またはＱｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  ９６  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ  カタログ番号６９５８２）を使用して、ゲノムの尾ＤＮＡを精製した。ＺＦＮ媒介性突然変異の効率を決定するため、およびＮＨＥＪ修復によって突然変異の型を特徴付けるために、３ステップのＰＣＲ手法を実施した。第１のステップにおいて、プライマーＰ１およびＰ２を使用して外側のＰＣＲを実施し、大きい欠失または挿入を検出した。第２のステップにおいて、プライマーＰ３およびＰ４を使用して内側のＰＣＲを実施し、培地の大きさに対して小さい欠失または挿入を検出した。第３のステップにおいて、プライマーＰ３およびＰ４を使用して内側のＰＣＲ反応生成物のダイレクトシークエンシグを実施し、１〜２０塩基対の変化を同定した。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ４．１０．１（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を使用して、個々のクロマトグラムを分析した。２つのはっきりと異なるトレースが検出された場合、個々の対立遺伝子を要求する塩基対を手動で決定した。ＰＣＲ  ＴＯＰＯサブクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｋ４５７５−Ｊ１０）によって、突然変異体のサブセットからの対立遺伝子をさらに分析した。Ｍ１３ＦおよびＭ１３Ｒプライマーを使用して、マウス１匹当たり１２〜２４個のＴＯＰＯクローンをシークエンシグした。
【００７２】
生産仔マウスの最大６３％の突然変異率が観察された（５ｎｇ／μｌ  ＺＦＮ  ｍＲＮＡ）。突然変異は、１〜３ｂｐの挿入および１ｂｐから最大約１００ｂｐの範囲の欠失、ならびに１つの大きい約８００ｂｐの欠失（図１に要約される）の広範囲に及んだ。恐らく、第１の細胞分裂後の連続するＺＦＮ活性の結果である、２つ以上の対立遺伝子を保有する多重キメラ動物を同定した。さらに、５匹の動物は混成突然変異体であり、すなわち、これらの動物は、同じ遺伝子の２つの独立した突然変異対立遺伝子を保有し、かつ遺伝子の検出可能な野生型対立遺伝子を保有せず、１つの細胞期において両方の染色体上でＺＦＮ活性を示す。
【００７３】
実施例２：配列特異的エンドヌクレアーゼのマイクロインジェクションによる機能性ホモ接合性突然変異対立遺伝子の直接的生成
ＬＲＰ５は、ＮＯＲＲＩＮの共受容体として作用することによって網膜血管発達における必須の役割を果たす。ＮＯＲＲＩＮシグナル伝達が妨害されると、網膜の深層における毛細血管床の形成の失敗、ならびに血管漏出に特徴付けられる血管異常を引き起こす（Ｘｉａ，Ｃ．−Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７，１６０５-１６１２（２００８）；Ｘｉａ，Ｃ．−Ｈ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ５，ｅ１１６７６（２０１０）；Ｊｕｎｇｅ，  Ｈ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ１３９，２９９−３１１（２００９））。このため、実施例１に示されるように、Ｌｒｐ５においてフレーム内およびフレーム外の欠失の混成を有する２月齢マウスを生成し、網膜血管発達を検査した。動物５４２番は、対照として働くキメラ機能性ヘテロ接合性である。この動物は、１つの野生型対立遺伝子（サイレントように見える小さい３ｂｐのフレーム内欠失）および１ｂｐのフレーム外欠失を有する対立遺伝子を保有した。動物４９５番は、４ｂｐのフレーム外欠失対立遺伝子および１ｂｐのフレーム外欠失対立遺伝子を含有する。動物５１９番は、２９ｂｐのフレーム外欠失対立遺伝子および１７ｂｐのフレーム外欠失対立遺伝子を含有する。動物５５５番は、３ｂｐのフレーム内欠失対立遺伝子および１ｂｐのフレーム外欠失対立遺伝子を有し、機能性ヘテロ接合体である。
【００７４】
表現型分析のために、Ｌｒｐ５突然変異を保有する動物をフルオレセイン血管造影法で分析した。マウスにケタミン／キシラジン（８０ｍｇ／ｋｇ；７．５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、１％のトロピカミド（Ａｋｏｒｎ，Ｉｎｃ．）で目を散大した。無菌性１０％フルオレセイン溶液（１００μｌ、ＡＫ−Ｆｌｕｏｒ；Ａｋｏｒｎ，Ｉｎｃ．）を腹腔内注入した後、フルオレセイン血管造影法を実施した。焦点０および感度５０の撮像設定を用いて、フルオレセイン注入の１分後に画像を取り込んだ。
【００７５】
組織学的分析のため、血管造影の２日後にマウスを屠殺し、眼球除去し、および組織診断のために処理した。全組織標本の組織診断のために、網膜の解剖の前に目を４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に固定するか、または凍結切片用に３０％の蔗糖で一晩凍結を防止し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）ＯＣＴ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ）に埋め込んだ。前に記載されたように、全組織標本および切片のイソレクチンＢ４染色を実施した（Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６１，１１６３−１１７７（２００３））。凍結切片のために、角膜および水晶体を除去し、残留したＰＦＡを除去するために目をＰＢＳ中で広範囲に洗浄した。凍結した１２μｍの切片を調製し、基本的にＪｕｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  １３９，２９９−３１１（２００９）に記載のように、有窓内皮細胞マーカーＰＬＶＡＰの抗原であるＭＥＣＡ３２に対して染色した。
【００７６】
３つの混成突然変異体マウス（４９５、５１９、および５５５）ならびに１つの野生型対立遺伝子を保有する対照のヘテロ接合性突然変異体マウス（５４２）の網膜形質が、図２に示される。混成突然変異を保有するマウスは、Ｌｒｐ５欠損表現型を示した。蛍光血管造影は、マウス５４２および５５５が、明白な新生血管異常または血管漏出を示さなかったことを明らかにした（図２Ａ）。対照的に、Ｌｒｐ５の両方の対立遺伝子中に混成フレーム外欠失を含有するマウス４９５および５１９は、多数の前毛細血管細動脈閉塞（図２Ａ、矢印は前毛細血管細動脈閉塞の例を指している）および網膜全体にわたって拡散したフルオレセインシグナルによって示されるように著しい血管漏出を示した。図２の右下パネル中のスケールバーは、図２Ａ中のすべてのパネルに対する２００μｍを表す。
【００７７】
イソレクチンで染色された全組織標本の網膜の共焦点投影は、混成突然変異体マウス４９５および５１９のＬｒｐ５欠損表現型を確信させた。各マウスに対して、全３つの血管層（図２Ｂ）を含む網膜の最大深度の投影、および神経線維層（ＮＦＬ、図２Ｃ）、内網状層（ＩＰＬ、図２Ｄ）、および外網状層（ＯＰＬ、図２Ｅ）に存在する単一の血管層の投影から得られた画像を分析した。機能性ヘテロ接合性網膜（５４２および５５５）は、高密度の組織化された血管の３層網を含有するが、混成ノックアウト網膜（４９５および５１９）は、減少した密度の不規則な脈管構造を有する（図２Ｂ、Ｃ）。加えて、５４２および５５５は、ＩＰＬ（図２Ｄ）およびＯＰＬ（図２Ｅ）に正常な毛細血管網を含有するのに対して、混成ＫＯマウス（４９５および５５５）は、ＩＰＬ（図２Ｄ）に異常な新生血管クラスターを有し、ＯＰＬ（図２Ｅ）に少数の内皮細胞クラスターを有する。図２の右下パネル中のスケールバーは、図２Ｂ〜Ｅ中のすべてのパネルに対する１００μｍを表す。
【００７８】
要約すると、１ｂｐの欠失を有する機能対立遺伝子および３ｂｐのフレーム内欠失を有する機能性対立遺伝子の損失を保有する突然変異体５５５は、正常な網膜形質を示したが、一方、４ｂｐおよび１ｂｐの欠失を保有する突然変異体４９５ならびに２つの大きな欠失（１７および２９ｂｐ）を保有する突然変異体５１９は、表現型的に、以前に報告されているものを反復する表現型を持つホモ接合性欠損である（Ｘｉａ，Ｃ．−Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７，１６０５−１６１２（２００８））。これらの結果は、これらの動物がすべての細胞において混成突然変異体であるかどうかは定かではないが、配列特異的エンドヌクレアーゼのマイクロインジェクションが、機能性ホモ接合（混成突然変異体）を直接生成できることを示す。
【００７９】
実施例３：Ｌｒｐ５エクソン２  ＺＦＮ  ｍＲＮＡおよびドナーコンストラクトの共マイクロインジェクションによる条件付きノックアウト対立遺伝子の生成
図３Ａは、エクソン２を標的とするＬｒｐ５の条件付きノックアウト対立遺伝子を生成するために用いられた戦略の概略図を示す（Ｇｕ，Ｈ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５，１０３−１０６（１９９４））。ＺＦＮ対は、Ｌｒｐ５エクソン２に二重鎖切断を導入する（中断された矢印で示される）。切断は、ストランド侵入を介したドナープラスミドの侵入、ならびにドナープラスミドの５’と３’との間のＬｒｐ５相同領域と、エクソン２のそれぞれの相同性配列５’および３’との相同的組換えによって修復される。結果として生じる遺伝子座は、２つのｌｏｘＰ部位で挟まれたコドン最適化されたＬｒｐ５エクソン２を含有する（図１Ａ、下）。
【００８０】
ドナープラスミド中の５’および３’Ｌｒｐ５相同領域は、それぞれ１．１および１ｋｂの長さであった。Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ／Ｏｒｉｇｅｎｅ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）によって、コドン変更（ドナー１、図４Ａ）および野生型（ドナー３、図４Ｃ）ドナー配列を変更ｐＵＣ１９ベクター中に合成した。３００ｂｐのＭｓｃＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ＺＦＮ認識を抑制するために７つのサイレント突然変異を含有する合成された断片と置き換えることによって、ドナー３からドナー２（図４Ｂ）を生成した。ドナー１への挿入は、ドナー２および３との挿入に比べて逆の配向である。ゆえに、Ｌｒｐ５遺伝子座特異的プライマーと組み合わせてプラスミド骨格に結合するプライマーを使用するＰＣＲ増幅を、逆の配向のプライマーの組み合わせを使用して行った。ドナー配列は、ｌｏｘＰ部位を除外すると、マウスゲノムアセンブリＮＣＢＩ３７／ｍｍ９  ｃｈｒ．１９：３６５８１７９−３６６０８１５と一致する。すべての実験において環状のドナープラスミドを用いた。
【００８１】
野生型Ｌｒｐ５エクソン２配列にサイレント突然変異を導入し、エクソンのタンパク質コーディング可能性を維持するが、野生型Ｃ５７ＢＬ／６とドナーＬｒｐ５エクソン２との間の全体相同性をほんの７８％まで減少させるコドン最適化された型を生成した（ドナー１、図４Ａ；図５）。正常なＲＮＡスプライシングを保存するため、エクソン２の最初の１３ｂｐまたは最後の１１ｂｐを変更から除外した。図５は、１．１ｋｂの５’相同性および１ｋｂの３’相同領域を除外する３つのＬｒｐ５条件付きノックアウトＤＮＡドナーの配列アライメントを示す。アライメントは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／から利用可能なアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ２を使用して完了した。ドナー１（コドン変更されている）とドナー３（野生型）エクソン２との間の全体相同性は、３１１／３９７＝７８％である。ドナー２（ＺＦＮ結合部位のみ変更されている）とドナー３エクソン２との間の全体相同性は、３９０／３９７＝９８％である。ＬｏｘＰ部位は大文字の太字で示され、イントロン配列は小文字で示され、および（野生型または変更された）エクソン２配列は大文字で示される。ＺＦＮ結合部位は破線で囲まれており、  ここで野生型エクソン２が切断される配列には下線が引かれている。サイレント突然変異は、実線で囲まれている。
【００８２】
ＺＦＮ  ｍＲＮＡおよびドナーコンストラクトを共に作業濃度まで希釈した（ＺＦＮ  ｍＲＮＡに関して２．５〜５ｎｇ／μｌおよびドナーコンストラクトに関して２．５または３ｎｇ／μｌ）ことを除いて、基本的には実験１に記載されるように、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ前核中に、ＺＦＮ  ｍＲＮＡおよびドナーコンストラクトの異なる組み合わせを共マイクロインジェクトした（表２）。
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表２. Ｌｒｐ５ＺＦＮ  ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびＣＫＯドナー１プラスミドの共マイクロインジェクションＫＯ突然変異体は、１つ以上の突然変異対立遺伝子を有するマウスを含む。ＫＯ＝ノックアウト、ＣＫＯ＝条件付きノックアウト。ａ１匹のマウス（９５番）は、偽陽性であった（Ｌｒｐ５遺伝子座中に組み込まれたドナー１プラスミド）。ｂマウス１４０番および１５５番。
【００８３】
１６８匹の結果として生じた仔マウスからの尾試料から単離されたＤＮＡを分析し、条件付きノックアウト対立遺伝子を保有するマウスを同定した（図３Ｂ）。ドナープラスミドの不在（Ｐ１〜Ｐ４）または存在（Ｐ５〜Ｐ１２）下での突然変異体の分析に使用したそれぞれのプライマー対は、図３Ｂに示される。実験１および２において記載されたように、最初に全体のＺＦＮ突然変異頻度を決定した。５’ヌクレアーゼアッセイを使用して５’ＬｏｘＰ部位の存在をアッセイすることにより、潜在的条件付きノックアウト対立遺伝子を保有するマウスを同定するための最初の選別を実施した（ＴａｑＭａｎ（登録商標），Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１４，１４３−１４９（１９９９））。簡潔に、２０μｌの反応物は、２Ｘ  Ｑｉａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ−ｉｔ  Ｆａｓｔ  ＳＮＰ  プローブ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ、５０〜１２０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、４００ｎＭのプライマー、および２００ｎＭのＬｏｘＰ部位認識に特異的な蛍光発生ロックド核酸（ＬＮＡ）系プローブで構成されていた（Ｗｅｉｓ，Ｂ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０，７５（２０１０））。反応物をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で熱循環した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、バージョン２．３（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた分析によって、複数成分中の蛍光放出の可視化、および増幅プロットによって５’ＬｏｘＰの存在を決定した。次いで、プライマーＰ５／Ｐ６を使用したＬｒｐ５遺伝子座特異的ＰＣＲ分析を実施し、ドナー１および２の両方の上に存在するコドン変更Ｌｒｐ５エクソン２配列に対して特異的な５’生成物を検出した（しかしドナー３は実施例４のＥＳ細胞実験に使用した）。同様に、プライマーＰ７／Ｐ８を使用したＰＣＲを実施し、３’末端を分析した。５’および３’ｌｏｘＰの両方の存在を検証するために、Ｌｒｐ５遺伝子座に適切なｌｏｘＰ配列が存在する場合のみ生成物をもたらす、それぞれ、プライマーＰ９／Ｐ１０およびＰ１１／Ｐ１２を使用したＰＣＲ分析を実施した。ＤＮＡがキメラサブクローンの混合物から単離されたため、偽陽性の結果が観察された、すなわち、ＰＣＲ生成物はかかる真の条件付きノックアウト対立遺伝子が不在であっても、５’−３’にｌｏｘＰが導入されたＬｒｐ５対立遺伝子に対して陽性であるように見えた。偽陽性の結果は、例えば、ある対立遺伝子が５’ｌｏｘＰ部位のみ保有し、別の対立遺伝子が３’ｌｏｘＰ部位のみ保有する場合に生成され得た。偽陽性とは反対の条件付きノックアウト対立遺伝子の存在を確認するために、プライマーＰ５／Ｐ８（両方のプライマーはドナー相同性アームの外側でアニールする）を使用して約２．８ｋｂのＬｒｐ５エクソン２  ＰＣＲ生成物を増幅し、ＴＯＰＯクローニング（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してクローン化し、完全にシークエンシグした。この分析は、条件付きノックアウト対立遺伝子、単一のｌｏｘＰ部位のみを有する対立遺伝子、およびドナーに由来するエクソン２配列のみを有する（すなわち、ｌｏｘＰ部位を有さない）対立遺伝子を同定した。ドナープラスミド骨格特異的プライマーと組み合わせて隣接プライマーＰ５およびＰ８を使用する追加のＰＣＲによって、Ｌｒｐ５対立遺伝子中の全ドナーベクターの組み込まれた複製の存在に関して、配列解析によって偽陽性として同定された対立遺伝子を分析した。ドナープラスミド骨格特異的プライマー（Ｐ１３−Ｐ１４）と組み合わせてプライマーＰ６およびＰ７（ドナー１およびドナー２）を用いて、ゲノムのランダム挿入の存在を決定した。ドナー３のランダム挿入に関しては、野生型Ｌｒｐ５配列に結合するドナー３のプライマーＰ１５およびＰ１６と組み合わせて、ドナープラスミド骨格特異的プライマー（Ｐ１３〜Ｐ１４）を使用した。すべてのプライマー配列および反応条件を表３に示す。すべてのＰＣＲ研究の条件を表７に示す。
【００８４】
２匹のマウス（１４０番および１５５番）を、相同領域の外側に位置するプライマーを使用して得たクローン化されたＰＣＲ生成物の完全なシークエンシグによって条件付きノックアウト対立遺伝子を保有するものとして確認した。両方のマウスに対して、条件付きノックアウト対立遺伝子をそれらの子孫に伝達した。条件付きノックアウト対立遺伝子に加えて、動物１５５番はまた、５’ｌｏｘＰ部位のみを有する１つの低頻度の対立遺伝子（子孫には伝達されない）も有した。動物９５番は、条件付きノックアウト対立遺伝子を示唆する最初のＰＣＲ分析では偽陽性を示唆したが、より詳細な分析によって、Ｌｒｐ５エクソン２に完全長ドナープラスミドが代わりに組み込まれていたことが明らかになった。ＺＦＮ  ｍＲＮＡおよびドナーＤＮＡのそれぞれの組み合わせに対するノックアウト突然変異率は、２８〜６７％の範囲であった（表２）。
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表３. プライマーヌクレオチド配列。プライマーＰ１９：Ｆ＝フルオロフォア（フルオレセイン）、Ｑ＝消光剤（Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＩＱ＝内部消光剤（ＺＥＮ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＬＮＡ  ｂｐに下線が引かれている。
【００８５】
Ｌｒｐ５  ＺＦＮ  ｍＲＮＡと、ドナー１、またはドナーのＺＦＮ結合および切断を抑制する野生型配列に関する７つのサイレント突然変異を保有する、ｌｏｘＰが導入されたコドン最適化エクソン２ドナー（ドナー２、図４Ｂ；図５）のいずれかとの共インジェクションによって、マウス接合体（４．５ｎｇ／μｌのＺＦＮ  ｍＲＮＡおよび３ｎｇ／μｌのドナーＤＮＡ）における共インジェクション実験を繰り返した。これらの実験の結果を表４に要約する。ドナー１とＬｒｐ５  ＺＦＮ  ｍＲＮＡとの共インジェクションは、１２匹の仔マウスのうち１匹に条件付きノックアウト対立遺伝子を保有させた（２４３番、条件付きノックアウト率８．３％）。ドナー２とＬｒｐ５  ＺＦＮ  ｍＲＮＡとの共インジェクションは、３５匹の仔マウス中３匹（８．６％）のＬｒｐ５遺伝子座にドナー２エクソン配列を保有させた。しかしながら、これらのうちの１匹はその後、低頻度の条件付きノックアウト対立遺伝子を保有することが確認された（２５０番）。３匹の動物のうちの２匹目は３’ｌｏｘＰ部位のみを有する対立遺伝子を保有させ（２７４番）、最後の動物（２８０番）はドナー２エクソン配列のみを有する１つの対立遺伝子を有し（ｌｏｘＰ部位は有さない）、また完全に組み込まれたドナー２プラスミドを有する別の対立遺伝子を有した（偽陽性）。これらの結果は、内在性Ｌｒｐ５エクソン２配列に対して最も低い配列相同性のドナープラスミド（ドナー１、図４Ａ）が、条件付きノックアウト対立遺伝子の生成においてより効率的であったことを示唆する。
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表４. Ｌｒｐ５  ＺＦＮ  ｍＲＮＡとＣＫＯドナー１またはドナー２プラスミドとの共マイクロインジェクション。４．５ｎｇ／μｌのＺＦＮ  ｍＲＮＡおよび３ｎｇ／μｌのドナープラスミドＤＮＡを使用してすべての実験を実施した。全体のＣＫＯ率は、ドナー１に関しては１／１２（８．３％）であり、またドナー２に関しては１／３５（２．９％）であった。ａマウス２４３番、ｂマウス号２５０番、ｃ３’ｌｏｘＰ部位のみの対立遺伝子を保有させた１匹のマウス（２７４番）、ｄドナー２エクソンのみを有する（ｌｏｘＰ部位を有さない）１つの対立遺伝子ならびに１つの偽陽性対立遺伝子（Ｌｒｐ５遺伝子座内に組み込まれたドナー２プラスミド）を保有させた１匹のマウス（２８０番）。
【００８６】
実施例４：Ｌｒｐ５エクソン２  ＺＦＮとドナープラスミドとの共エレクトロポレーションによる条件付きノックアウト対立遺伝子の生成
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ  ＥＳ細胞に、２つのＬｒｐ５  ＺＦＮ対成分をコードするプラスミドを単体で、またはマイクロインジェクション実験に用いたドナープラスミドもしくは変更されていないｌｏｘＰが導入された野生型Ｌｒｐ５エクソン２プラスミド（ドナー３）のいずれかと共に、エレクトロポレーションによって共トランスフェクトした。Ｃ２  ＥＳ細胞（Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ５，ｅ１１２６０（２０１０））を培養し、増殖し、確立された方法（Ｎａｇｙ，Ａ．，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．，Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ，Ｋ．ａｎｄ  Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．８００（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：２００２））を使用して電気穿孔した。簡潔に、１５００万個の細胞に、１５μｇのドナープラスミドを伴ってまたは伴わずに、それぞれ１５μｇのＺＦＮプラスミドを電気穿孔した。培地で電気穿孔された細胞を回収し、段階希釈を支持細胞層上の１０ｃｍプレート上に平板培地した。７〜８日かけて細胞を成長させた後、各実験から１４４個のクローン（１．５  ９６ウェルプレート）を採取し、増殖のための支持細胞と共に９６ウェルプレート中に播種した、。播種の２日後、細胞を支持細胞と共に新たな９６ウェルプレートに１：２に分割した。次いで、一方のプレートを−８０℃で保管し、他方のプレートをＤＮＡ分析のために支持細胞なしで１％のゼラチンのみと共に新たな９６ウェルプレートに分割した。ＥＳ細胞を一晩溶解したことを除いて実施例１に記載されるようにＤＮＡを単離し、ＤＮＡを沈殿し、洗浄し、翌日、基本的にＲａｍiｒｅｚ−Ｓｏｌｉｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０１，３３１−３３５（１９９２）に記載されるように、ＴＥ緩衝液中で再懸濁した。
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表５. Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ  ＥＳ細胞中への、単体またはＣＫＯドナー１、２、または３と組み合わせてＬｒｐ５  ＺＦＮ対をコードするプラスミドのエレクトロポレーション。１５μｇのドナーＤＮＡならびに／またはそれぞれ１５μｇのＺＦＮ１およびＺＦＮ２を使用してすべての実験を実施した。ａドナー１ＥＳクローンＣ８番、ｂ５’ｌｏｘＰのみの対立遺伝子およびドナー２エクソンのみの（ｌｏｘＰ部位を有さない）対立遺伝子を保有させた１つのドナー２クローン（Ｆ５）、３’ｌｏｘＰのみの対立遺伝子を保有させたクローンＨ１０、ｃ５’ｌｏｘＰのみを有する対立遺伝子を保有させた２つのドナー３クローン（Ｅ３およびＥ４）。クローンＥ３はまた、偽陽性対立遺伝子を保有した（ドナー３プラスミド組込み）。クローンＥ４はまた、真のＣＫＯマイナー対立遺伝子（シークエンシグされた２４０個のＴＯＰＯクローンのうちの１陽性）を保有した。ＮＤ：調査なし、ＮＡ：該当なし。
【００８７】
ＤＮＡ分析の結果を図３Ｂ、右に示し、結果を表５に要約する。エレクトロポレーションを使用してＥＳ細胞において観察されたノックアウト対立遺伝子の全体の頻度（１７％）は、前核インジェクションを介してインビボで得たものよりも低かった。ＥＳ細胞エレクトロポレーション実験からの遺伝子の変化パターンは、マイクロインジェクション後に観察されたものに類似していた。ドナー１とＬｒｐ５  ＺＦＮプラスミドとの共エレクトロポレーションは、分析された１４４個のうち１つの条件付きノックアウトクローン（クローンＣ８）をもたらした。ドナー２とＬｒｐ５  ＺＦＮプラスミドとの共エレクトロポレーションは、ドナーに由来する対立遺伝子を有する分析された１４４個のうち２つのＥＳ細胞クローンをもたらした。これらのクローンのうちの一方（Ｈ１０）は、３’ｌｏｘＰ部位のみの対立遺伝子を保有し、他方（Ｆ５）は、ドナー２配列のみの１つの対立遺伝子（ｌｏｘＰ部位を有さない）ならびに５’ｌｏｘＰ部位のみを有する１つの対立遺伝子を保有した。ドナー３（野生型）とＬｒｐ５  ＺＦＮ  ｍＲＮＡとの共エレクトロポレーションは、２つの標的とされるＥＳ細胞クローン（Ｅ３およびＥ４）をもたらした。両方が、５’ｌｏｘＰ部位のみを有する１つの対立遺伝子を含有した。加えて、Ｅ３は、ドナー３プラスミド（偽陽性）の組込みから生じた別の対立遺伝子を保有した。興味深いことに、クローンＥ４もまた、両方のｌｏｘＰ部位（条件付きノックアウト対立遺伝子）に対して非常に稀なサブクローン陽性を有し、恐らく、すでに標的とされた対立遺伝子のその後の再標的化の結果である。これらの結果は、内在性エクソンに対して低い相同性のドナーを使用することが、条件付きノックアウト対立遺伝子の生成において最も効率的であることを確信させる。表６は、マイクロインジェクションおよびＥＳ細胞実験のデータの全体的な要約を提供する。
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表６. ＣＫＯドナープラスミドに由来するＬｒｐ５対立遺伝子の概要。
【００８８】
実施例５：条件付きノックアウト対立遺伝子の正常な遺伝子機能
ドナー１（図４Ａ、図５）から得られた条件付きノックアウト対立遺伝子におけるサイレント突然変異がＬｒｐ５遺伝子の正常な機能に影響したかどうかを決定するために、１つのノックアウト対立遺伝子（１４０番）および１つの条件付きノックアウト対立遺伝子（１５５番）を保有するマウスを実施例３のＺＦＮ対を使用して生成されたＬｒｐ５ノックアウトホモ接合性マウスと交配させた。年齢を対応させた生後１６日（Ｐ１６）の対照マウス（図６Ａ、＋／＋）をＬｒｐ５ヘテロ接合性交配から得た。実験に使用した他のマウスは、Ｌｒｐ５  ＫＯ／ＫＯ雌性とＬｒｐ５  ＣＫＯ／＋雄性との交配から得た。Ｌｒｐ５  ＫＯ／ＫＯ雌性（図６Ｂ）は、ＫＯ／＋（図６Ｃ、Ｐ１６）およびＣＫＯ／ＫＯ（図６Ｄ、Ｐ１６）の成体の母である。図６Ａ−Ｄは、イソレクチンＢ４（ＩＢ４）で染色された網膜の全組織標本の代表的な共焦点投影を示す（スケールバー：５０μｍ）。図６Ａ−Ｄに示される各投影に関して、左画像は最大ＸＹ投影を示し、右画像は、神経線維層（ＮＦＬ）、内網状層（ＩＰＬ）、および外網状層（ＯＰＬ）中の脈管構造を表すＺ投影を示す（図６Ｄの右下パネル上に標識する）。Ｌｒｐ５欠損動物は、ＸＹ投影において減少した血管複雑性ならびに深い血管層の不在（図６Ｂ）を示した。欠損背景（ｎｕｌｌ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）上に条件付きノックアウト対立遺伝子を保有するマウスは、条件付きノックアウト対立遺伝子が機能性であることを示唆する正常な血管形質（図６Ｄ）を示す。図６Ｅは、ＩＢ４、ＭＥＣＡ３２、およびＤＡＰＩで染色された、図６Ａ〜Ｄに示されるものと反対の目の網膜の断面図を示す。ホモ接合性ノックアウトマウスが有窓内皮細胞マーカーＭＥＣＡ３２を異所的に発現したのに対して、ＣＫＯ／ＫＯ、ＫＯ／＋、および＋／＋マウスはＭＥＣＡ３２陰性である。要約すると、ホモ接合性ノックアウト動物が上述の網膜形質（図６）を示すのに対して、１つのノックアウト対立遺伝子および１つの条件付きノックアウト対立遺伝子を保有するマウスの網膜形質は、野生型マウスまたは条件付きノックアウト対立遺伝子が機能性対立遺伝子であることを示す１つのノックアウト対立遺伝子および１つの野生型対立遺伝子のいずれかを有するマウスのものからは識別できなかった（図６）。まとめると、これらの結果は、中立突然変異を有するリコンビナーゼ認識部位で挟んだドナー配列を配列特異的ヌクレアーゼと共に用いて、インビトロおよびインビボで完全機能性条件付きノックアウト対立遺伝子を生成できることを示す。
【００８９】
図７は、これらの研究において観察されたＬｒｐ５対立遺伝子を生じさせる可能性のある機序を例示する。Ｌｒｐ５ゲノム配列とドナー１との間の全体相同性は、複数のサイレント突然変異（図７Ａ、星印）によって減少する。染色体末端の切除後、ストランド侵入がｌｏｘＰ部位の外側の１００％相同性のより大きい領域で行われ、両方のｌｏｘＰ部位を有する条件付きノックアウト対立遺伝子をもたらす。ｌｏｘＰ部位間の領域における制限された相同性のため、ｌｏｘＰ部位の内側での交差事象は稀である。ドナー２は、ストランド侵入がｌｏｘＰ部位の内側で行われることを可能にするようにｌｏｘＰ部位間に１００％相同性のより大きい領域を含有し、３’ｌｏｘＰ部位のみを有する（図７Ｂ）、５’ｌｏｘＰ部位のみを有する（図７Ｃ）、またはｌｏｘＰ部位を有さない（図７Ｄ）対立遺伝子をもたらす。Ｐ９＋Ｐ１０およびＰ１１＋Ｐ１２両方のプライマーの組み合わせが、図７Ａに従う事象に対してＰＣＲ生成物を生じさせた。プライマー対Ｐ９＋Ｐ１０の仕様は、図７Ｃに示される事象に対して生成物をもたらしたが、図７ＢまたはＤに示される事象に対してはなかった。同様に、プライマー対Ｐ１１＋Ｐ１２は、図７Ｂに示される事象に対して生成物を生じさせたが、図７ＣまたはＤに示される事象に対してはなかった。Ｐ５＋Ｐ６およびＰ７＋Ｐ８のプライマーの組み合わせは、ｌｏｘＰ状態にかかわらずＰＣＲ生成物をもたらした。
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表７. 上述の実施例で使用したＰＣＲ反応の条件
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表８. 保存的置換。
【００９０】
実施例６：異なるガイドＲＮＡを用いたＬｒｐ５エクソン２のＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ媒介性変異誘発
本明細書に記載される方法および組成物と共に他の配列特異的エンドヌクレアーゼが使用され得るかを確認するために、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ系を用いてＬｒｐ５の変更対立遺伝子を生成した。１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、および抗生物質を追加したＲＰＭＩ中でＨｅｐａ１−６マウス肝癌細胞を培養した。トリプシン処理およびペレット化の後、製造業者の指示に従って、ＡＭＡＸＡ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ｐｒｏｇｒａｍ  Ｔ−０２８と共にＡＭＡＸＡ  ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＶ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、プラスミド１つ当たり２μｇを含有するｈＣａｓ９をコードするｃＤＮＡまたはＣａｓ９をコードする１５μｇのｍＲＮＡ（図１４、配列番号４３）を、１０６細胞に電気穿孔し、６ウェルプレート中に播種した。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ効率は、ＧＦＰ発現（ＰＭＡＸＧＦＰ）によって評価されるように、８０〜９５％に達した。ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎの２４時間後に新鮮な培地を交換し、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎの７２時間後にＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製したゲノムＤＮＡを収集した。ポリＡテーリング反応を含む製造業者のプロトコルに従って、ＭＭＥＳＳＡＧＥ  ＭＭａｃｈｉｎｅ  Ｔ７  Ｕｌｔｒａキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＨＣａｓ９  ｍＲＮＡをインビトロで転写した。ｍＲＮＡを精製し、標準フェノール（クロロホルム抽出物およびＲＮＡの沈殿物）を使用して濃縮した。
【００９１】
マウスＬｒｐ５エクソン２を標的とする３つの特有のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を生成した（図１４Ａ、Ｌｒｐ５  ｇＲＮＡ  Ｔ２、Ｌｒｐ５  ｇＲＮＡ  Ｔ５、およびＬｒｐ５  ｇＲＮＡ  Ｔ７；配列番号３６〜３８）。
【００９２】
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞またはＨｅｐａ１−６細胞に、ジンクフィンガー対（ｐＺＦＮ１＋ｐＺＦＮ２）をコードするＤＮＡ、またはＬｒｐ５エクソン２（ｐ＿ｇＲＮＡ  Ｔ２、ｐ＿ｇＲＮＡ  Ｔ５、またはｐ＿ｇＲＮＡ  Ｔ７）もしくは対照プラスミド（ＰＭＡＸＧＦＰ）を標的とするガイドＲＮＡと共にＣａｓ９（＋ｐＲＫ５−ｈＣａｓ９）を共トランスフェクトした。ｇＲＮＡ  Ｔ７配列は、右ＺＦＮタンパク質結合部位配列の３’末端と重複する。
【００９３】
Ｃａｓ９媒介性切断およびその後の修復を示す共トランスフェクション後のＬｒｐ５遺伝子座における突然変異を検出するために、基本的に製造業者の指示に従ってＳＵＲＶＥＹＯＲ  Ａｓｓａｙｓ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）を実施した。このアッセイにおいて、ＰＣＲ生成物は交配種を形成される。突然変異の事象において、交配種形成複合体は、ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼによって切断されるミスマッチを含有する。この実施例において、以下のパラメータを使用するプライマーＰ９およびＰ１２（配列番号９および１２）およびＬＡ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を使用して、Ｌｒｐ５エクソン２ゲノム遺伝子座に対して特異的な約２．７ｋｂのＰＣＲ生成物を増幅した：９５℃で３分、９５℃で４５秒の３５サイクル、５７℃で４５秒、７０℃で２分３０秒、続いて７２℃で７分。ＰＣＲ生成物の３分の１をＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイに使用した。結果として得られる消化された生成物を１．５％アガロースゲル上での電気泳動によって分離した。野生型とアニールした突然変異対立遺伝子の存在を示すより短い断片の存在によって、ヌクレアーゼ切断を同定した。
【００９４】
マウスＬｒｐ５エクソン２を標的とする３つすべてのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、Ｃａｓ９誘導型突然変異を効率的に媒介した（図８）。各ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９対合の活性は、これらの実験におけるＺＦＮ媒介性変異誘発よりも数倍大きいように思われる。Ｌｒｐ５エクソン２ゲノム遺伝子座の２．７ｋｂのＰＣＲ生成物からのＴＯＰＯクローン化対立遺伝子のシークエンシグから突然変異率を計算した。野生型に対する個々の配列のアライメントは、（上で定量化された）正確な欠失または挿入の大きさ（データは示されない）を決定した。上述のようにプライマーＰ９およびＰ１２を用いたＰＣＲによって、２．７ｋｂのゲノム領域を増幅した。可能性のあるすべての欠失の大きさを捕捉するために、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＰＣＲ生成物を直接クローン化した。形質転換および単一のコロニーへの播種後、クローンを選択し、プラスミドＤＮＡを単離し、プライマーＰ２０およびＰ２１を用いて、Ｓａｎｇｅｒ法に従ってシークエンシグした。図９Ａ−Ｂは、Ｈｅｐａ１−６マウス肝癌細胞におけるｇＲＮＡ／Ｃａｓ９突然変異率（図９Ａ）および欠失の大きさ（図９Ｂ）の概要を例示する。
【００９５】
実施例７：コドン最適化条件付きノックアウトドナーベクターを使用するＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ媒介性遺伝子標的化
Ｈｅｐａ１−６細胞に、Ｃａｓ９プラスミドまたはｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびコドン最適化エクソン配列を含むＬｒｐ５  ＣＫＯドナー１を共トランスフェクトした。比較のため、いくつかの細胞にＬｒｐ５  ＺＦＮプラスミドおよびドナープラスミドを共トランスフェクトした（図１０）。７２時間後、トランスフェクトした細胞からのゲノムＤＮＡを、コドン最適化Ｌｒｐ５ドナーエクソンに特異的なプライマー（Ｐ７；配列番号７）および３’相同性アームの外側の領域に特異的なプライマー（Ｐ１２；配列番号１２）を用いたＰＣＲによって分析した。プライマーＰ７およびＰ１２は、以下の条件でＲＥＤＥｘｔｒａｃｔ−Ｎ−Ａｍｐ  ＰＣＲ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｓｉｇｍａ）を用いたＰＣＲ反応に使用した：９５℃で３分、９５℃で４５秒の３８サイクル、６３℃で４５秒、７２℃で１分３０秒、続いて７２℃で７分。ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル上での電気泳動によって分離した。上述のように、Ｌｒｐ５エクソン２ドナー１ベクターは、最初の１３ｂｐおよび最後の１１ｂｐ、ならびに外因性隣接ｌｏｘＰ部位の突然変異を除く、多くの中立突然変異を持つコドン最適化エクソン（ＣＯエクソン２）を含有する。上述のＰＣＲは、ＣＯエクソン２配列に対して特異的な順方向プライマーおよびゲノム遺伝子座の相同性アームの外側の逆方向プライマーを使用し、ゆえに、ドナーエクソン配列が正しいＬｒｐ５遺伝子座に組み込まれた場合のみ、ＰＣＲ生成物を生成する。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９の使用は、ＺＦＮ系および同じドナーベクター戦略を使用するときに観察されるものを上回る優れた効率で、Ｌｒｐ５遺伝子座にドナー配列組込みをもたらした（図１０）。
【００９６】
実施例８：ｌｏｘＰ部位のＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ媒介性の標的を定めた導入
ドナー設計戦略およびＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ系を用いてゲノム遺伝子座にｌｏｘＰ部位を導入することができるかどうか決定するために、実施例７に記載されるようにトランスフェクトされた細胞からのゲノムＤＮＡを、相同性アームの外側に位置する１つのプライマーおよびドナーからの５’または３’ｌｏｘＰ部位のいずれかに固定される１つのプライマーを使用するＰＣＲ分析によって分析した。５’ゲノムから５’ｌｏｘＰの反応に関して、２％の最終濃度へのＤＭＳＯの添加を除いて標準Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）プロトコルを用いてプライマーＰ９およびＰ１０（配列番号９および１０）を使用した。ＰＣＲパラメータは以下の通りであった：９５℃で３分、９５℃で４５秒の４５サイクル、６３℃で４５秒、７２℃で１分３０秒、続いて７２℃で７分。３’ｌｏｘＰから３’ゲノムの反応に関して、標準ＲＥＤＥｘｔｒａｃｔ−Ｎ−Ａｍｐ  ＰＣＲ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｓｉｇｍａ）プロトコルに従って、プライマーＰ１１およびＰ１２を使用した。ＰＣＲパラメータは以下の通りであった：９５℃で３分、９５℃で４５秒の４０サイクル、６２．５℃で４５秒、７２℃で１分３０秒、続いて７２℃で７分。ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル上での電気泳動によって分離した。２つの異なるＬｒｐ５  ｇＲＮＡおよびＣＫＯドナーのうちのいずれかをトランスフェクトされた細胞から単離された試料から、３’ｌｏｘＰ部位のためにＰＣＲ生成物を得た（図１１、ｐ＿ｇＲＮＡ  Ｔ２）。同様に、５’ｌｏｘＰ部位に関してｇＲＮＡ  Ｔ７をトランスフェクトされた細胞から単離された試料からＰＣＲ生成物を得た（図１１）。このため、図１１は、Ｈｅｐａ１−６細胞において、Ｌｒｐ５  ｇＲＮＡ  Ｔ２／Ｃａｓ９、およびＬｒｐ５  ｇＲＮＡ  Ｔ７／Ｃａｓ９媒介性二重鎖切断が、コドン最適化エクソンドナーベクター戦略を使用して、Ｌｒｐ５遺伝子座にｌｏｘＰ部位の導入をもたらしたことを示す。Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、およびドナーを電気穿孔された細胞のみが、ゲノム遺伝子座における５’（図１１、上）および３’（図１１、下）ｌｏｘＰ部位の証拠を発現する。組み込まれたｌｏｘＰ部位がＺＦＮで検出可能ではなかったのに対して、ｇＲＮＡ  Ｔ７は、より顕著な５’ｌｏｘＰの存在をもたらした。Ｈｅｐａ１−６細胞を用いたこれらの実験において、ＺＦＮ試料における検出可能なｌｏｘＰ部位の不在およびｇＲＮＡ試料における低レベルは、細胞株中の低い相同的組換え率およびクローンのサブセットではなく、トランスフェクトされた完全な細胞プールを分析したという事実の両方によって説明され得る。Ｌｒｐ５ＣＫＯ／ｗｔ遺伝子型を有する単一のマウスゲノムＤＮＡ試料を陽性対照として使用した。これらの結果は、ＣＫＯ設計戦略を体細胞において使用することができ、それは、二重鎖切断と５’および３’ｌｏｘＰ部位の両方の位置との間の望ましくない交差事象の頻度を効果的に減少させることを示す。要約すると、操作されたコドン最適化ＣＫＯドナー配列を使用してその後修復されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ媒介性ＤＮＡ切断を導入することによる特異的ゲノム遺伝子座の標的化を使用して、ｌｏｘＰ部位を挿入し、��れによって条件付きノックアウト対立遺伝子を生成することができる。
【００９７】
実施例９：Ｕｓｐ１０、Ｎｎｍｔ、およびＮｏｔｃｈ３ゲノム遺伝子座の標的化
他の遺伝子が本発明の方法で標的とされ得るかを確認するために、Ｕｓｐ１０、Ｎｎｍｔ、およびＮｏｔｃｈ３ゲノム遺伝子座に対するドナーおよびｇＲＮＡを生成した。それぞれの遺伝子座にＤＮＡ二重鎖切断を導入し、その後、鋳型としてコドン最適化ドナーを用いて修復するために、実施例６に記載されるように、および図１２において示されるように、Ｈｅｐａ１−６細胞にこれらのＣａｓ９／ｇＲＮＡおよびドナーを導入した。基本的に上述のように、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを実施した。プライマーＰ９、Ｐ１２、Ｐ２２、Ｐ２３、Ｐ２４、Ｐ２５（それぞれ、配列番号９、１２、２２、２３、２４、および２５）および以下のパラメータをＬＡ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）と共に使用して、Ｌｒｐ５、Ｕｓｐ１０、およびＮｏｔｃｈ３ゲノム遺伝子座に対して特異的な２．２〜２．７ｋｂの大きさのＰＣＲ生成物を増幅した：９５℃で３分、９５℃で４５秒の３５サイクル、Ｔａで４５秒（Ｌｒｐ５＝５７Ｃ、Ｕｓｐ１０＆Ｎｏｔｃｈ３＝６３）、７０℃で２分３０秒、続いて７２℃で７分。それぞれ、７分の１、１／３、およびすべてのＰＣＲ生成物を製造業者の指示（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）に従ってＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイにおいて使用した。野生型の鎖および突然変異対立遺伝子がアニールされたヌクレアーゼ切断を表す結果として得られる消化された生成物を１．５％アガロースゲル上での電気泳動によって分離した。
【００９８】
図１２および図１３は、Ｌｒｐ５遺伝子座において観察されるように、Ｕｓｐ１０、Ｎｎｍｔ、およびＮｏｔｃｈ３ゲノム遺伝子座が特異的ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体によって効率的に標的とされたこと（図１２）、ならびにｌｏｘＰ部位が組み込まれたこと（図１３）を示す。
【００９９】
実施例１０：ＲＮＡ誘導型配列特異的エンドヌクレアーゼおよびコドン最適化ドナーを使用するＬｒｐ５の条件付きノックアウトおよびノックアウト対立遺伝子の生成
Ｌｒｐ５遺伝子座を、本明細書に記載されるＬｒｐ５特異的ｇＲＮＡによって標的とし、ｌｏｘＰが導入されたコドン最適化エクソンを導入し、それによって、条件付きノックアウト対立遺伝子を作製することができる。条件付きノックアウト対立遺伝子を持つ細胞におけるその後のＣｒｅリコンビナーゼタンパク質の発現は、ノックアウト対立遺伝子をもたらすｌｏｘＰが導入されたエクソンを切除し得る。
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表９. プライマーヌクレオチド配列。
【０１００】
上述の発明は、明確な理解のための例示説明および例としてある程度詳細に記載されたが、これらの説明および例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書で引用されるすべての特許および科学文献の開示は、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ−１】
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【図４Ｂ−２】
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【図４Ｃ−１】
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【図４Ｃ−２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【配列表】
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