(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物質を含む生体関連物質を生化学的に反応させて、該測定対象物質の活性を測定する臨床検査方法において、
測定対象物質と反応させる生体関連物質を固定し、該測定対象物質と反応させるにあたり、下記の式［１］
【化１】
0004622054.tif 000014
｛ただし、式中、Ｘは２価の有機残基を示し、Ｙは炭素数１〜６のアルキレンオキシ基を示し、Ｚは水素原子またはＲ5−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ただし、Ｒ5は炭素数１〜１０のアルキル基または炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基を示す）を示す。Ｒ1は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基またはヒドロキシアルキル基を示す。ｍは０または１を示す。ｎは１〜４の整数である。｝で表されるＡ成分のホスホリルコリン類似基含有単量体２０〜１００ｍｏｌ％と、
下記の式［２］
【化２】
0004622054.tif 000015
｛ただし、式中、Ｒ6は、水素原子またはメチル基を示し、Ｌ1は、−Ｃ6Ｈ4−、−Ｃ6Ｈ10−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−および−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−から選ばれる基を示し、Ｌ2は、水素原子、−（ＣＨ2）g−Ｌ3および−（（ＣＨ2）p−Ｏ）h−Ｌ3から選ばれる疎水性官能基を示す。（ｇおよびｈは１〜２４の整数を、ｐは３〜５の整数を示し、Ｌ3は、水素原子、メチル基、−Ｃ6Ｈ5および−Ｏ−Ｃ6Ｈ5から選ばれる官能基を示す。）｝で表されるＢ成分の疎水性単量体０〜８０ｍｏｌ％とからなる単量体組成物を重合して得られる重合体からなる生化学的反応促進剤を溶液状態で存在させて反応させることを特徴とする臨床検査方法。
【請求項２】
Ａ成分のホスホリルコリン類似基含有単量体が、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２'−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェートである請求項１記載の臨床検査方法。
【請求項３】
下記の式［１］
【化３】
0004622054.tif 000016
｛ただし、式中、Ｘは２価の有機残基を示し、Ｙは炭素数１〜６のアルキレンオキシ基を示し、Ｚは水素原子またはＲ5−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ただし、Ｒ5は炭素数１〜１０のアルキル基または炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基を示す）を示す。Ｒ1は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基またはヒドロキシアルキル基を示す。ｍは０または１を示す。ｎは１〜４の整数である。｝で表されるＡ成分のホスホリルコリン類似基含有単量体２０〜１００ｍｏｌ％と、
下記の式［２］
【化４】
0004622054.tif 000017
｛ただし、式中、Ｒ6は、水素原子またはメチル基を示し、Ｌ1は、−Ｃ6Ｈ4−、−Ｃ6Ｈ10−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−および−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−から選ばれる基を示し、Ｌ2は、水素原子、−（ＣＨ2）g−Ｌ3および−（（ＣＨ2）p−Ｏ）h−Ｌ3から選ばれる疎水性官能基を示す。（ｇおよびｈは１〜２４の整数を、ｐは３〜５の整数を示し、Ｌ3は、水素原子、メチル基、−Ｃ6Ｈ5および−Ｏ−Ｃ6Ｈ5から選ばれる官能基を示す。）｝で表されるＢ成分の疎水性単量体０〜８０ｍｏｌ％とからなる単量体組成物を重合して得られる重合体からなる請求項１記載の臨床検査方法用の生化学的反応促進剤。
【請求項４】
Ａ成分のホスホリルコリン類似基含有単量体が、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２'−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェートである請求項３記載の臨床検査方法用の生化学的反応促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検査の分野で、検体中の測定対象物を測定する際の生化学的反応を促進する生化学的反応促進剤、それを用いた臨床検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査の分野では、高感度に抗原量を測定する検査方法としてポリスチレン等のラテックスの凝集反応による検査が行われている。ラテックス凝集法は、ラテックス表面に抗原（または抗体）を物理的あるいは化学的に結合させ、検出対象である抗体（または抗原）との免疫反応によりラテックスが凝集する際に変化する濁度、粒径分布等を検出し、被測定物質量を評価する方法である。
【０００３】
また、別の方法として、酵素免疫測定法が使われている。例えば、酵素免疫測定法の一種であるサンドイッチ測定法は、測定対象物（被検物質、Ａｇ）のエピトープを異にする２種類の抗体（Ａｂ１、Ａｂ２）を用いる方法である。まず、合成高分子等からなる固相の表面にＡｂ１を物理的あるいは化学的に固定化し、これにＡｇを加え結合させる。次いで、標識したＡｂ２（Ａｂ２の標識を付したものをＡｂ２*と表す。）を反応させた後、洗浄して遊離Ａｂ２*を除去し、最後に、固相に結合したＡｂ２*の活性を測定する方法である。これらの標識には通常、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質等が用いられている。
【０００４】
更に別の方法として、ＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子関連物質のハイブリダイゼーション法が使われている。この方法は、測定対象物であるＤＮＡ等の遺伝子関連物質と相補的な配列を有するＤＮＡを固定化した固相に、測定対象物であるＤＮＡを含む検体を標識したものを反応させた後、洗浄して測定対象物であるＤＮＡ以外のものを除去し、最後に固相に結合した標識物質の活性を測定する方法である。これらの標識には通常、蛍光物質、酵素、発光物質、放射性物質等が用いられる。
【０００５】
臨床検査の分野では、上記のラテックス凝集法、酵素免疫測定法およびハイブリダイゼーション法等を用いて測定対象を測定する場合、高感度で短時間で測定することが求められている。従来より、ラテックス凝集法、サンドイッチ測定法およびハイブリダイゼーション法を用いて検体を測定する際には、各測定対象物質あるいは、標識物質が容器等へ非特異的に吸着することを抑制することを目的として、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す）や、カゼイン等の蛋白質を添加することが広く知られている。しかしながら、これらの蛋白質は非特異的な吸着を抑制するものの、抗原−抗体反応、酵素−基質反応、ＤＮＡ−ＤＮＡ反応等を促進することはできなかった。つまりこれらの反応を短時間で終了させることはできなかった。
【０００６】
一方、ホスホリルコリン基含有重合体は、生体膜に由来するリン脂質類似構造に起因して、血液適合性、補体非活性化、生体物質非吸着性等の生体適合性に優れ、また防汚性、保湿性等の優れた性質を有することが知られており、それぞれの機能を生かした生体関連材料の開発を目的とした重合体の合成及びその用途に関する研究開発が活発に行われている。
【０００７】
その中でも特開平７−５１７７号公報、特開平７−８３９２３号公報、特開平１０−１１４８００号公報には、ホスホリルコリン基含有重合体が容器等への蛋白質の吸着を抑制することができることを利用して、高精度で臨床検査できる技術が公開されている。
しかしながら、ホスホリルコリン基含有重合体を、抗原−抗体反応、酵素−基質反応、ＤＮＡ−ＤＮＡ反応等の生化学的な反応の系内に添加することにより、反応が短時間で終了し、且つ、高感度な測定が可能となることは知られていなかった。
【０００８】
【化５】
0004622054.tif 000002
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記問題点に鑑み鋭意検討した結果、特定のホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を重合し、その得られた重合体を臨床検査の生化学的反応に用いると、生化学的反応を促進することの知見を得て、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明によれば、測定対象物質を含む生体関連物質を生化学的に反応させて、該測定対象物質の活性を測定する臨床検査方法において、
測定対象物質と反応させる生体関連物質を固定し、該測定対象物質と反応させるにあたり、下記の式［１］
【００１１】
【化３】
0004622054.tif 000003
【００１２】
｛ただし、式中、Ｘは２価の有機残基を示し、Ｙは炭素数１〜６のアルキレンオキシ基を示し、Ｚは水素原子またはＲ5−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ただし、Ｒ5は炭素数１〜１０のアルキル基または炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基を示す）を示す。Ｒ1は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基またはヒドロキシアルキル基を示す。ｍは０または１を示す。ｎは１〜４の整数である。｝で表されるＡ成分のホスホリルコリン類似基含有単量体２０〜１００ｍｏｌ％と、
下記の式［２］
【化６】
0004622054.tif 000004
｛ただし、式中、Ｒ6は、水素原子またはメチル基を示し、Ｌ1は、−Ｃ6Ｈ4−、−Ｃ6Ｈ10−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−および−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−から選ばれる基を示し、Ｌ2は、水素原子、−（ＣＨ2）g−Ｌ3および−（（ＣＨ2）p−Ｏ）h−Ｌ3から選ばれる疎水性官能基を示す。（ｇおよびｈは１〜２４の整数を、ｐは３〜５の整数を示し、Ｌ3は、水素原子、メチル基、−Ｃ6Ｈ5および−Ｏ−Ｃ6Ｈ5から選ばれる官能基を示す。）｝で表されるＢ成分の疎水性単量体０〜８０ｍｏｌ％とからなる単量体組成物を重合して得られる重合体からなる生化学的反応促進剤を溶液状態で存在させて反応させることを特徴とする臨床検査方法が提供される。
また本発明によれば、上記式［１］で表されるＡ成分のホスホリルコリン類似基含有単量体２０〜１００ｍｏｌ％と、上記式［２］で表されるＢ成分の疎水性単量体０〜８０ｍｏｌ％とからなる単量体組成物を重合して得られる重合体からなる上記臨床検査方法用の生化学的反応促進剤が提供される。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明の生化学的反応促進剤は、特定のホスホリルコリン類似基含有単量体（以下、ＰＣ単量体と略す）を含む単量体組成物を重合して得られる重合体（以下、ＰＣ重合体）を主成分とするものである。ＰＣ単量体を含む単量体組成物は、ＰＣ単量体のみでもよいし、上記式［２］で表されるＢ成分の疎水性単量体を含んでもよい。さらに、前記のＰＣ重合体は、具体的には、Ａ成分としてＰＣ単量体２０〜１００ｍｏｌ％、Ｂ成分として疎水性単量体０〜８０ｍｏｌ％とからなる単量体組成物を重合してなる重合体である。より好ましくは、Ａ成分としてＰＣ単量体４０〜８０ｍｏｌ％、Ｂ成分として疎水性単量体２０〜６０ｍｏｌ％とからなる単量体組成物を重合してなる重合体でである。
【００１９】
Ｂ成分の疎水性単量体が８０ｍｏｌ％より多いとホスホリルコリン類似基（以下、ＰＣ基と略す）の効果を発揮させるのが困難であるので好ましくない。ここで、前記のＰＣ単量体は、下記の式［１］
【００２０】
【化５】
0004622054.tif 000005
【００２１】
｛ただし、式中、Ｘは２価の有機残基を示し、Ｙは炭素数１〜６のアルキレンオキシ基を示し、Ｚは水素原子もしくはＲ5−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ただし、Ｒ5は炭素数１〜１０のアルキル基または炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基を示す）を示す。また、Ｒ1は水素原子もしくはメチル基を示し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基またはヒドロキシアルキル基を示す。ｍは０または１を示す。ｎは１〜４の整数である。｝
【００２２】
式［１］中のＸの２価の有機残基としては、例えば、−Ｃ6Ｈ4−、−Ｃ6Ｈ10−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−、−ＣＨ2−Ｏ−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ6Ｈ4−Ｏ−、−Ｃ6Ｈ4−ＣＨ2−Ｏ−、−Ｃ6Ｈ4−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−等の基が挙げられる。
【００２３】
式［１］のＹは、炭素数１〜６のアルキレンオキシ基であり、例えば、メチルオキシ基、エチルオキシ基、プロピルオキシ基、ブチルオキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基等の基が挙げられる。
【００２４】
式［１］中のＺは、水素原子もしくはＲ5−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−基を示す。ただし、Ｒ5は炭素数１〜１０のアルキル基または炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基を示す。
ここで、炭素数１〜１０のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等が挙げられる。
【００２５】
また、炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基としては、例えば、ヒドロキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル基、２−ヒドロキシブチル基、５−ヒドロキシペンチル基、２−ヒドロキシペンチル基、６−ヒドロキシヘキシル基、２−ヒドロキシヘキシル基、７−ヒドロキシヘプチル基、２−ヒドロキシヘプチル基、８−ヒドロキシオクチル基、２−ヒドロキシオクチル基、９−ヒドロキシノニル基、２−ヒドロキシノニル基、１０−ヒドロキシデシル基、２−ヒドロキシデシル基等が挙げられる。
【００２６】
ＰＣ単量体としては、具体的には例えば、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、３−（（メタ）アクリロイルオキシ）プロピル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、４−（（メタ）アクリロイルオキシ）ブチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、５−（（メタ）アクリロイルオキシ）ペンチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、６−（（メタ）アクリロイルオキシ）ヘキシル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、
【００２７】
２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリプロピルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリブチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリシクロヘキシルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリフェニルアンモニオ）エチルホスフェート、
【００２８】
２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリメタノールアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）プロピル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）ブチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）ペンチル−２’（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）ヘキシル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、
【００２９】
２−（ビニルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（アリルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ｐ−ビニルベンジルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ｐ−ビニルベンゾイルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（スチリルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ｐ−ビニルベンジル）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ビニルオキシカルボニル）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、
【００３０】
２−（アリルオキシカルボニル）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（アクリロイルアミノ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ビニルカルボニルアミノ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、エチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）フマレート、ブチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）フマレート、ヒドロキシエチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）フマレート、
【００３１】
エチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）マレート、ブチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）マレート、ヒドロキシエチル−（２‘−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）マレート等を挙げることができる。
【００３２】
この中でも２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェートが好ましく、さらに２−（メタクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート｛＝２−（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリンという場合もある、以下、ＭＰＣと略す｝が入手性等の点でより好ましい。
【００３３】
ＰＣ単量体を重合する際には、前記のＰＣ単量体の１種を単独で、もしくは２種以上を混合物として用いることができる。
ＰＣ単量体は、公知の方法で製造できる。例えば、特開昭５４−６３０２５号公報、特開昭５８−１５４５９１号公報等に示された公知の方法等に準じて製造することができる。
ＰＣ単量体と共重合するＢ成分の疎水性単量体は、式［２］
【００３４】
【化６】
0004622054.tif 000006
【００３５】
｛ただし、式中、Ｒ6は、水素原子またはメチル基を示し、Ｌ1は、−Ｃ6Ｈ4−、−Ｃ6Ｈ10−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−および−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−からなる群より選ばれる基を示し、Ｌ2は、水素原子、−（ＣＨ2）g−Ｌ3および−（（ＣＨ2）p−Ｏ）h−Ｌ3から選ばれる疎水性官能基を示す。（ｇおよびｈは１〜２４の整数を、ｐは３〜５の整数を示し、Ｌ3は、水素原子、メチル基、−Ｃ6Ｈ5および−Ｏ−Ｃ6Ｈ5から選ばれる官能基を示す。）｝
で表される。
【００３６】
具体的には例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート等の直鎖または分岐アルキル（メタ）アクリレート；シクロヘキシル（メタ）アクリレート等の環状アルキル（メタ）アクリレート；ベンジル（メタ）アクリレート、フェノキシエチル（メタ）アクリレート等の芳香環（メタ）アクリレート；ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート等のポリアルキレングリコール（メタ）アクリレート；スチレン、メチルスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレン系単量体；メチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル等のビニルエーテル系単量体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル系単量体等が挙げられる。これらの１種または２種以上が用いられる。
【００３８】
ＰＣ重合体は、前記Ａ成分のＰＣ単量体とＢ成分の疎水性単量体との単量体組成物を重合したものであればよく、通常のラジカル共重合により製造することができる。
【００３９】
本発明のＰＣ重合体の分子量は、重量平均で、５，０００〜５，０００，０００の範囲がよく、さらに望ましくは１００，０００〜２，０００，０００の範囲である。
重合体の分子量が５，０００未満では十分に生化学的反応を促進することが困難であり、重合体の分子量が５，０００，０００より大きいとＰＣ重合体の水性溶液の粘性が高くなりすぎて生化学的反応を阻害するおそれがあるため好ましくない。
【００４０】
本発明における生化学的反応とは、臨床検査で用いる各種反応を示し、具体的には例えば、抗原−抗体反応、抗体−抗体反応等の蛋白質と蛋白質の反応；酵素−基質反応等の酵素とその特定の基質との反応；ＤＮＡ−ＤＮＡ反応、ＤＮＡ−ＲＮＡ反応、ＤＮＡ−酵素反応、ＲＮＡ−酵素反応等の遺伝子関連物質同士の反応あるいは、遺伝子関連物質と蛋白質の反応等が挙げられる。
【００４１】
抗原、抗体等の免疫反応活性物質としては、例えば、免疫グロブリン、血漿蛋白質、ホルモン関連物質、腫瘍関連物質、ウイルス関連物質、薬剤に対する抗体、酵素に対する抗体等が挙げられ、またこれらの物質に対する抗体も挙げられる。
血漿蛋白質としては例えば、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、アポ蛋白質関連物質、リューマチ因子（ＲＦ）、トランスフェリン等が挙げられる。
ホルモン関連物質としては、例えば、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、サイロキシン（Ｔ４）、チロキシン結合蛋白質（ＴＢＧ）等が挙げられる。
【００４２】
腫瘍関連物質としては、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β２−マイクログロブリン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）等が挙げられる。
ウイルス関連物質としては、例えば、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗体、ムンプス、ヘルペス、麻疹、風疹、抗エイズ抗体等が挙げられる。
薬剤に対する抗体としては、例えば、フェノバルビタール、アセトアミノフェノン、サリチル酸、シクロスポリン等の抗体が挙られる。
酵素としては、具体的には例えば、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム等が挙られる。
蛍光物質としては、例えば、フルオロセインイソチオシアネート、４−クロロ−７−ニトロベンゼンゾフラザン、４−フルオロ−７−ニトロベンゼンゾフラザン、スルホローダミン１０１酸クロライド等が挙られる。
【００４３】
発光物質としては、例えば、１０−メチル−９−［４−｛２−（スクシンイミジルオキシカルボニル）エチル｝フェニルオキシカルボニル］アクリジニウムフルオロサルフェート等が挙げられる。
【００４４】
本発明のＰＣ重合体により生化学的反応を促進する方法としては、生化学的反応系内にＰＣ重合体を０．０００１〜１０重量％となるように添加する方法である。
ＰＣ重合体が、０．０００１重量％より低い濃度では生化学的反応を促進する効果を十分に発揮させることができず、１０重量％より高い濃度であると水性溶液の粘性が高くなりすぎて生化学的反応を阻害するおそれがあるため好ましくない。
【００４５】
本発明のＰＣ重合体を生化学的反応促進剤として使用する際は、生化学反応している反応系内にＰＣ重合体を添加し、溶液状態とするだけでよい。ＰＣ重合体を添加する際は、前記の蛋白質と蛋白質の反応、酵素とその特定の基質との反応、遺伝子関連物質同士の反応あるいは遺伝子関連物質と蛋白質の反応の反応系内のどちらか一方、あるいは、双方にＰＣ重合体を生化学的反応をさせる前に添加してもよいし、生化学反応している系内に後から添加してもよい。更に、添加するＰＣ重合体の状態は、溶液状態でも、粉末状態でもよく、好ましくは反応系と速やかに均一になる溶液状態を挙げることができる。
【００４６】
本発明における臨床検査などで用いる生化学的反応とは、前記の生化学的反応を指し、特に限定されない。臨床検査薬とは、先に記載した抗原−抗体反応、抗体−抗体反応、酵素−基質反応、ＤＮＡ−ＤＮＡ反応、ＤＮＡ−ＲＮＡ反応、ＤＮＡ−酵素反応、ＲＮＡ−酵素反応などの生化学的反応を用いて、血清、血漿、尿、涙液、組織などの検体中の測定対象物（検査対象物）である、蛋白質、酵素、遺伝子関連物質等を測定するに際して、前記の蛋白質、酵素、遺伝子関連物質等と前記の生化学的反応促進剤とを含有する測定試薬である。蛋白質、酵素、遺伝子関連物質と前記の生化学的反応促進剤の配合割合は、前記の反応において、測定対象の特性により特に限定されないが、好ましくは、ＰＣ重合体／蛋白質、酵素あるいは、遺伝子関連物質の重量／重量比で、１．０×１０-12〜１．０×１０18で、特に好ましくは１．０×１０-9〜１．０×１０15である。前記の重量比が１．０×１０-12より小さいと生化学反応を促進するのに効果を十分に発揮することが困難であり、１．０×１０18より大きいと、反応系内のＰＣ重合体濃度が高く、粘度が高くなり生化学反応を阻害する恐れがあり好ましくない。
【００４７】
本発明の臨床検査方法とは、具体的には、前記の生化学的反応促進剤を用いて、前記の生化学的反応系で、生体関連物質を測定する方法である。生体関連物質とは、前記の抗原、抗体等の免疫活性物質等の蛋白質など、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸関連物質等の遺伝子関連物質あるいは、酵素や酵素反応に用いる対象とする基質などが挙げられる。
【００４８】
本発明の生化学的反応促進剤には、本発明の効果を損なわない範囲において、界面活性剤、溶剤、防腐剤等の他の成分を添加してもよい。
【００４９】
【発明の効果】
本発明の生化学的反応促進剤は、特定のホスホリルコリン類似基含有単量体に基づく構成成分を含有する重合体であり、臨床検査を実施する際の生化学的反応を促進するものであり、それにより短時間に高感度で測定が可能になる。また、本発明の臨床検査方法は、前記の臨床検査薬を用いた方法であり、反応を促進するので、短時間に高感度で測定を容易に実施することができる方法である。
【００５０】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明する。
合成例１
ＭＰＣ３５．７ｇ、ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）４．３ｇを、エタノール１６０ｇに溶解して、４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ後に、６０℃でアゾビスイソブチロニトリル（以下、ＡＩＢＮと略記する）；０．８２ｇを加えて８時間重合反応させた。重合液を３Ｌのジエチルエーテル中にかき混ぜながら滴下し、析出した沈殿を濾過し、４８時間室温で真空乾燥を行って、粉末２９．６ｇを得た。
なお、分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により分析した。
分析条件は２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を溶離液とし、ポリエチレングリコールを標準物質とし、ＵＶ（２１０ｎｍ）及び、屈折率にて検出した。  ＧＰＣにより評価した分子量は、重量平均分子量１５３，０００であった。これをポリマー１（Ｐ−１）とする。結果を表１に示す。
ポリマー１（Ｐ−１）；ｐｏｌｙ（ＭＰＣ０．８−ｃｏ−ＢＭＡ０．２）、重量平均分子量１５３，０００。
【００５１】
合成例２、３
合成例１で用いた単量体の種類、組成比率、溶媒種を変え、合成例１と同様の操作により下記の共重合体組成のポリマーを得た。
合成例２；ポリマー２（Ｐ−２）；ｐｏｌｙ（ＭＰＣ０．３−ｃｏ−ＢＭＡ０．７）、重量平均分子量１３０，０００であった。
なお、重合条件は、ＭＰＣ；１４．１ｇ、ＢＭＡ；１５．９ｇ、エタノール；１２０ｇ、ＡＩＢＮ；０．３５ｇに変更した以外は、合成例１に準じて反応した。
合成例３；ポリマー３（Ｐ−３）；ｐｏｌｙ（ＭＰＣ）、重量平均分子量５２９，０００であった。
なお重合条件は、ＭＰＣ；５０．０ｇ、エタノール；１００ｇ、ＡＩＢＮ；０．２４ｇに変更した以外は、合成例１に準じて反応した。結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】
0004622054.tif 000007
【００５３】
実施例１：抗原−抗体反応の促進効果−１
１０μｇ／ｍＬのヤギ抗（マウス抗体）抗体｛和光純薬工業（株）製｝溶液（１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５）をポリスチレン製９６穴タイタープレート（イムノプレートＦ９６、マキシソープ、Ｎｕｎｃ社製）に１００μＬ／ウェルで加え、４℃、一晩インキュベートして物理的に吸着させた後に、生理的リン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと略記する）で４回洗浄を行った。次いで、１％のウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す）を添加したＰＢＳを３００μＬ／ウェルで加え、４℃、一晩インキュベートした後に、ＢＳＡ溶液を除去し抗体吸着固相を調製した。
次いで、抗体吸着固相にポリマー１（Ｐ−１）を１．０重量％含む０μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬの各濃度のマウス抗体｛和光純薬工業（株）製｝溶液（ＰＢＳ）を１００μＬ／ウェルで加え、２５℃、１５分間インキュベートし抗原−抗体反応を行い、ＰＢＳで４回洗浄した。次いで、パーオキシダーゼ標識−抗（マウス抗体）抗体｛和光純薬工業（株）製｝溶液を１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１００００倍希釈して、１００μＬ／ウェルで加え、２５℃、２時間インキュベートし、ＰＢＳで４回洗浄した。次いで、ペルオキシダーゼ発色キットＴ｛住友ベークライト（株）製｝にて各ウェルを室温で、１０分間発色させた後に、ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ２５０（マイクロプレートリーダー、モレキュラーデバイス社製）を用いて、各ウェルの４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定個数（ｎ）は８で、平均値、標準偏差、ＣＶ値（％）｛（平均値／標準偏差）×１００｝を結果として示した。結果を表２に示す。
【００５４】
実施例２、３：抗原−抗体反応の促進効果−２、３
実施例１で用いたポリマー１（Ｐ−１）の代わりに合成例で得たポリマー２（Ｐ−２；実施例２）およびポリマー３（Ｐ−３；実施例３）を用いた以外は実施例１と同様に操作を行った。結果を表２に示す。
比較例１
実施例１で用いたポリマー１（Ｐ−１）の代わりにＢＳＡを用いた以外は実施例１と同様に操作を行った。結果を表２に示す。
【００５５】
【表２】
0004622054.tif 000008
【００５６】
実施例４：抗原−酵素標識抗体反応の促進効果−１
実施例１で調製した抗体吸着固相にＢＳＡを１重量％含む０μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬの各濃度のマウス抗体｛和光純薬工業（株）製｝溶液（ＰＢＳ）を１００μＬ／ウェルで加え、２５℃、２時間インキュベートし、ＰＢＳで４回洗浄した。次いで、ポリマー１（Ｐ−１）を１．０重量％含むパーオキシダーゼ標識−抗（マウス抗体）抗体｛和光純薬工業（株）製｝溶液をＰＢＳで１００００倍希釈して、１００μＬ／ウェルで加え、２５℃、１５分間インキュベートし抗原−酵素標識抗体反応を行い、ＰＢＳで４回洗浄した。次いで、ペルオキシダーゼ発色キットＴ｛住友ベークライト（株）製｝にて各ウェルを室温で、５分間発色させた後に、ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ２５０（マイクロプレートリーダー、モレキュラーデバイス社製）を用いて、各ウェルの４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定個数（ｎ）は８で、平均値、標準偏差、ＣＶ値（％）を結果として示した。結果を表３に示す。
【００５７】
実施例５、６：抗原−酵素標識抗体反応の促進効果−２、３
実施例４で用いたポリマー１（Ｐ−１）の代わりにポリマー２（Ｐ−２；実施例５）および、ポリマー３（Ｐ−３；実施例６）を用いた以外は実施例４と同様に操作を行った。結果を表３に示す。
比較例２
実施例４で用いたポリマー１（Ｐ−１）の代わりにＢＳＡを用いた以外は実施例４と同様に操作を行った。結果を表３に示す。
【００５８】
【表３】
0004622054.tif 000009
【００５９】
実施例７：ハイブリダイゼーション（ＤＮＡ−ＤＮＡの反応）の促進効果−１
用いたオリゴＤＮＡ｛エスペックオリゴサービス（株）｝の名称、配列および、末端修飾を表４に示す。
【００６０】
【表４】
0004622054.tif 000010
【００６１】
なお、アデニンをＡ、グアニンをＧ、シトシンをＣ、チミンをＴと略す。
【００６２】
２５０ｐｍｏｌ（＝ピコモル：１０-12）／ｍＬのＰＵＣ−ａｍｉｎｏ溶液｛１ｍＭＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．５（以下、ＥＤＴＡ−ＮａＰＢと略す）｝を９６穴のＤＮＡ−ＢＩＮＤ（商標、コーニングコースター社製）に１００μＬ／ウェルで加え、３７℃、１時間インキュベートして化学的にＰＵＣ−ａｍｉｎｏを吸着させた後に、ＰＢＳで４回洗浄を行った。次いで、３％のＢＳＡを添加したＥＤＴＡ−ＮａＰＢを３００μＬ／ウェルで加え、３７℃、１時間インキュベートした後に、ＢＳＡ溶液を除去しＰＵＣ−ａｍｉｎｏ結合固相を調製した。
次いで、ＰＵＣ−ａｍｉｎｏ結合固相にポリマー１（Ｐ−１）を１．０重量％含む０ｆｍｏｌ（フェムトモル：１０-15）／ｍＬ、１０ｆｍｏｌ／ｍＬ、４０ｆｍｏｌ／ｍＬの各濃度のＰＵＣ−ｂｉｏｔｉｎ溶液（７５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む７５ｍＭクエン酸ナトリウム）を１００μＬ／ウェルで加え、５５℃、１５分間インキュベートしハイブリダイゼーション（ＤＮＡ−ＤＮＡ反応）を行い、０．１％ＳＤＳ及び、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む３０ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液で４回洗浄した。次いで、パーオキシダーゼ標識−アビジン（シグマ社製）溶液を３％のＢＳＡを含むＥＤＴＡ−ＮａＰＢで１００００倍希釈して、１００μＬ／ウェルで加え、３７℃、１時間インキュベートし、ＰＢＳで４回洗浄した。
次いで、ペルオキシダーゼ発色キットＴ｛住友ベークライト（株）製｝にて各ウェルを室温で、１０分間発色させた後に、ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ２５０（マイクロプレートリーダー、モレキュラーデバイス社製）を用いて、各ウェルの４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定個数（ｎ）は８で、平均値、標準偏差、ＣＶ値（％）を結果として示した。結果を表５に示す。
【００６３】
実施例８、９：ハイブリダイゼーション（ＤＮＡ−ＤＮＡの反応）の促進効果−２、３
実施例７で用いたポリマー１（Ｐ−１）の代わりにポリマー２（Ｐ−２；実施例８）およびポリマー３（Ｐ−３；実施例９）を用いた以外は、実施例７と同様に操作を行った。結果を表５に示す。
比較例３
実施例７で用いたポリマー１（Ｐ−１）の代わりにカゼイン｛和光純薬工業（株）製｝を用いた以外は実施例７と同様に操作を行った。結果を表５に示す。
【００６４】
【表５】
0004622054.tif 000011
【００６５】
実施例１０：アビジン−ビオチン反応の促進効果−１
実施例７で調製したＰＵＣ−ａｍｉｎｏ結合固相にカゼインを１．０重量％含む０ｆｍｏｌ／ｍＬ、１０ｆｍｏｌ／ｍＬ、４０ｆｍｏｌ／ｍＬの各濃度のＰＵＣ−ｂｉｏｔｉｎ溶液（７５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む７５ｍＭクエン酸ナトリウム）を１００μＬ／ウェルで加え、５５℃、１時間インキュベートし、０．１重量％ＳＤＳ、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む３０ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液で４回洗浄した。次いで、パーオキシダーゼ標識−アビジン溶液を１％のポリマー１（Ｐ−１）を含むＥＤＴＡ−ＮａＰＢで１００００倍希釈して、１００μＬ／ウェルで加え、３７℃、１５分間インキュベートしアビジン−ビオチン反応を行い、ＰＢＳで４回洗浄した。次いで、ペルオキシダーゼ発色キットＴ｛住友ベークライト（株）製｝にて各ウェルを室温で、１０分間発色させた後に、ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ２５０（マイクロプレートリーダー、モレキュラーデバイス社製）を用いて、各ウェルの４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定個数（ｎ）は８で、平均値、標準偏差、ＣＶ値（％）を結果として示した。結果を表６に示す。
【００６６】
実施例１１、１２：アビジン−ビオチン反応の促進効果−２、３
実施例１０で用いたポリマー１（Ｐ−１）の代わりにポリマー２（Ｐ−２；実施例１１）およびポリマー３（Ｐ−３；実施例１２）を用いた以外は、実施例１０と同様に操作を行った。結果を表６に示す。
比較例４
実施例１０で用いたポリマー１（Ｐ−１）の代わりにＢＳＡを用いた以外は実施例１０と同様に操作を行った。結果を表６に示す。
【００６７】
【表６】
0004622054.tif 000012
【００６８】
実施例１３：酵素−基質反応の促進効果−１
ポリマー１（Ｐ−１）を０．１重量％含む０μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬのパーオキシダーゼ｛和光純薬工業（株）製｝溶液（ＰＢＳ）を９６穴タイタープレート｛ＥＬＩＳＡ用プレートＳ、住友ベークライト（株）製｝に１００μＬ／ウェルで加えた。パーオキシダーゼの基質として２，２’−アジノ−ジ（３−エチル−ベンゾチアゾリン−６−スルフォネート）（ＡＢＴＳ）を含む１  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＡＢＴＳ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００μＬ／ウェルで加え、２５℃、１０分間インキュベートし酵素−基質反応を行った。次いで、１重量％ＳＤＳ溶液を１００μＬ／ウェルで加え反応停止を行った。次いで、ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ２５０を用いて生じた４０５ｎｍの吸光度を測定した。結果を表７に示す。
【００６９】
実施例１４、１５：酵素−基質反応の促進効果−２、３
実施例１３で用いたポリマー１（Ｐ−１）の代わりにポリマー２（Ｐ−２；実施例１４）およびポリマー３（Ｐ−３；実施例１５）を用いた以外は、実施例１３と同様に操作を行った。結果を表７に示す。
比較例５
実施例１３で用いたポリマー１（Ｐ−１）の代わりにＢＳＡを用いた以外は実施例１３と同様に操作を行った。結果を表７に示す。
【００７０】
【表７】
0004622054.tif 000013
【００７１】
以上の結果より、比較例１〜５に対して、実施例１〜１５の場合は測定値が高くなっていることがわかる。つまり、短時間で各反応が終了し、短時間で高感度な分析が可能なことがわかる。