(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
補欠因子として要求される複数の銅の一部又は全部が欠損しているマルチ銅酵素を活性化する方法であって、
前記マルチ銅酵素を導電性基材上に固定する酵素固定化工程と、
前記マルチ銅酵素を固定した前記導電性基材に2価の銅イオンを含む溶液を接触させる接触工程と、
前記導電性基材に前記2価の銅イオンが1価の銅イオンに還元される還元電位を印加する電位印加工程、とを有し、
ここで、前記マルチ銅酵素は、枯草菌（Bacillus subtilis）の芽胞由来のラッカーゼ又はサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）ＨＢ２７由来のラッカーゼである、マルチ銅酵素の活性化方法。
【請求項２】
前記電位印加工程が、前記マルチ銅酵素を固定した前記導電性基材を前記2価の銅イオンを含む溶液中に浸漬させた状態で、前記導電性基材に電位を印加することにより行われる請求項１に記載のマルチ銅酵素の活性化方法。
【請求項３】
前記還元電位が、-0.1〜0.2 Vである請求項１又は２に記載のマルチ銅酵素の活性化方法。
【請求項４】
前記電位印加工程が、前記還元電位よりも高電位側から前記還元電位よりも低電位側へ、及び前記低電位側から前記高電位側へ変動する電位を印加する請求項１〜３の何れか一項に記載のマルチ銅酵素の活性化方法。
【請求項５】
前記電位印加工程が、前記高電位側の電位の上限が0.6 Vであり、前記低電位側の電位の下限が-0.1 Vである請求項４に記載のマルチ銅酵素の活性化方法。
【請求項６】
前記導電性基材が、多孔性炭素基材である請求項１〜５の何れか一項に記載のマルチ銅酵素の活性化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマルチ銅酵素の活性化方法に関し、詳細には、電気化学的手法を利用したマルチ銅酵素の活性化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
銅酵素は、活性発現に銅を必要とする酵素の総称であり、当該酵素の基本構造であるタンパク質部分と補欠因子である銅が結合してタンパク質−銅複合体を形成することにより、その触媒活性を発揮する。つまり、銅酵素の触媒活性は、当該酵素の活性中心に銅が配位結合により捕捉されることによって発揮し得る。このような銅酵素の中でも、タンパク質１分子に複数の銅を含むものはマルチ銅酵素と称し、ラッカーゼ，アスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、セルロプラスミン、大腸菌の銅排出系に関与する一価銅オキシダーゼ（以下、「CueO」と称する）や枯草菌（Bacillus subtilis）の芽胞由来のラッカーゼ（以下、「CotA」と称する）等のマルチ銅オキシダーゼ等が知られている。かかるマルチ銅オキシダーゼは、基質から電子を受け取り酸素の4電子還元反応を触媒する。このとき、酸素の還元反応中間体を遊離しないことから、バイオ燃料電池のカソード側の電極触媒等の様々な技術分野への応用が期待されている。
【０００３】
そのため、活性向上を期待して、マルチ銅酵素の構造解析や反応機構解析を含めた種々の研究が進められている。特には、マルチ銅酵素はその触媒活性の発揮に複数の銅を必要とするが、かかる銅の全部又は一部の欠落により活性が低下するケースが本発明者らの研究により確認された。このことからも、かかる銅を効率的に取り込んでマルチ銅酵素を十分に活性化できる技術の構築が求められていた。
【０００４】
例えば、非特許文献１に、大腸菌細胞内で産生された枯草菌由来の組換えCotAの銅の取り込みに関する研究が報告されている。詳細には、活性中心である銅が欠損したCotA（以下、「アポCotA」）の溶液に1価の銅イオンを添加することで、当該アポCotAの活性中心に銅が配位され活性化（ホロ化）されることが確認されている。大腸菌細胞によって生産される枯草菌由来の組換えCotAの銅の含量は、培地中の銅と酸素の存在に強く依存すること、更には好気的条件に比べて嫌気的条件下で銅の細胞内蓄積が80倍程度増加することも確認されている。また、2価の銅イオンはアポCotA内にほとんど取り込まれないが、1価の銅イオンとの接触により効率的に銅を取り込み再構成（ホロ化）されることも確認されている。これらの事象は、1価の銅イオンの取り込みによってCotAが大腸菌の細胞質中で合成されることを示唆し、これは、1価銅イオンが、嫌気条件下で蓄積する細胞内銅の原子価状態で有るという証拠とも一致していることも報告されている。
【０００５】
つまり、非特許文献１の技術によれば、CotAは1価の銅イオンにより効率的に活性化されるという利点があるものの、1価の銅イオンとしては[Cu(CH3CN)4]PF6等の高価な試薬の使用が必要でありコストが嵩むという問題点があった。また、1価の銅イオンは水溶液中では不安定であることに加え、CotAの銅の取り込みは嫌気的条件下で飛躍的に促進されるがため、嫌気的条件若しくは微好気的条件下での実験操作が求められた。しかしながら、嫌気的条件の達成のためは、培地中から酸素を追い出すと共に培地と大気との接触を遮断する等の煩雑な操作が必要となるという問題点もあった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Durao P.,他著、“Copper incorporation into recombinant CotA laccase from Bacillus subtilis: characterization of fully copper loaded enzymes.”、J. Biol. Inorg. Chem. 2008, 13, 183-193.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決することができるマルチ銅酵素の活性化方法の提供を目的とする。すなわち、高価な試薬類や煩雑な操作を必要としない、簡便かつ安価なマルチ銅酵素の活性化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者らは、遺伝子組換え技術等により取得したマルチ銅酵素や市販のマルチ銅酵素には銅の結合が完全でないものが含まれることを見出すと共に、電気化学的手法を利用して2価の銅イオンを1価の銅イオンに還元させ、これをマルチ銅酵素に取り込ませることで簡便かつ安価にマルチ銅酵素を活性化できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔７〕に関する。
【００１０】
〔１〕補欠因子として要求される複数の銅の一部又は全部が欠損しているマルチ銅酵素を活性化する方法であって、
前記マルチ銅酵素を導電性基材上に固定する酵素固定化工程と、
前記マルチ銅酵素を固定した前記導電性基材に2価の銅イオンを含む溶液を接触させる接触工程と、
前記導電性基材に前記2価の銅イオンが1価の銅イオンに還元される還元電位を印加する電位印加工程、とを有するマルチ銅酵素の活性化方法。
〔２〕前記電位印加工程が、前記マルチ銅酵素を固定した導電性基材を2価の銅イオンを含む溶液中に浸漬させた状態で、前記導電性基材に電位を印加することにより行われる上記〔１〕のマルチ銅酵素の活性化方法。
〔３〕前記還元電位が、-0.1〜0.2 Vである上記〔１〕又は〔２〕のマルチ銅酵素の活性化方法。
〔４〕前記電位印加工程が、前記還元電位よりも高電位側から前記還元電位よりも低電位側へ、及び前記低電位側から前記高電位側へ変動する電位を印加する上記〔１〕〜〔３〕の何れかのマルチ銅酵素の活性化方法。
〔５〕前記電位印加工程が、前記高電位側の電位の上限が0.6 Vであり、前記低電位側の電位の下限が-0.1 Vである上記〔４〕のマルチ銅酵素の活性化方法。
〔６〕前記導電性基材が、多孔性炭素基材である上記〔１〕〜〔５〕の何れかのマルチ銅酵素の活性化方法。
〔７〕前記マルチ銅酵素が、ラッカーゼである上記〔１〕〜〔６〕の何れかのマルチ銅酵素の活性化方法。
【００１１】
上記〔１〕〜〔７〕の構成によれば、電気化学的手法により導電性基材上で産生した1価の銅イオンは、同じく導電性基材上に固定された触媒活性の発現に補欠因子として要求される銅の全部又は一部が欠損しているマルチ銅酵素の分子内に速やかに取り込まれて当該酵素を活性化（ホロ化）する。これにより、前記銅が欠損しているマルチ銅酵素の分子内に銅が完全若しくはほぼ完全に取り込まれ、触媒的に活性な完全若しくはほぼ完全なホロ酵素の状態となる。本発明の方法は、全て大気環境中で実施することができることから、嫌気的雰囲気の調整等の特殊な操作を必要とせず、簡便な操作でマルチ銅酵素を触媒的に活性化できる。また、安価な2価の銅イオンを含有する溶液を使用するため、コスト面でも有利である。従来においては、2価の銅イオンは酵素分子同士の凝集による酵素失活を招く可能性があったこと等の理由から、2価の銅イオンを含む溶液を酵素電極及びバイオ燃料電池等の構築及び作動の際の緩衝液として使用することはなかった。更には、マルチ銅酵素のホロ化を印加電位によって制御できるため、銅配位のメカニズム解明にも貢献することが期待できる。
【００１２】
特には、上記〔２〕の構成によれば、溶液中をイオン分子は自由に移動することができることから、電気化学的手法により導電性基材上で生成した1価の銅イオンは、同じく導電性基材上に固定され、かつ当該溶液中に浸漬しているマルチ銅酵素分子内に極めて速やかに移動する。これにより、マルチ銅酵素の銅の取り込み効率が向上し、酵素の活性化効率が向上する。
【００１３】
上記〔３〕〜〔５〕の構成によれば、印加電位を2価の銅イオンが1価の銅イオンに効率的に還元されるよう好適化したことから、マルチ銅酵素の銅の取り込み効率が向上し、当該酵素の活性化効率が向上する。特に〔４〕及び〔５〕の構成によれば、2価の銅イオンを1価の銅イオンに還元する還元電位を挟んで高電位側と低電位側間との間を電位掃引させて印加することにより、マルチ銅酵素を活性化する。これにより、マルチ銅酵素の銅の取り込み効率、ひいては酵素の活性化効率の更なる向上を図ることができる。
【００１４】
上記〔６〕の構成によれば、多孔性炭素基材等の多孔質基材の使用は、各細孔内に酵素をほぼ分子単位で固定することができる。これにより、2価の銅イオンとの接触により生じる可能性のある酵素の失活を招く酵素分子同士の凝集が生じにくくなるという利点があり、マルチ銅酵素の銅の取り込み効率、ひいては酵素の活性化効率の更なる向上を図ることができる。
【００１５】
上記〔７〕の構成によれば、ラッカーゼを効率的に活性化することができる。ここで、ラッカーゼ等のマルチ銅オキシダーゼは、活性発現に際して分子内に合計4個の銅を要求するため、精製等の過程により銅が欠損し活性が低下するケースが想定される。そのため、本発明のマルチ銅酵素の活性化方法を特に適用することができ、これらの酵素の利用価値を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ラッカーゼの発現と精製を検討した実施例１の結果を示す電気泳動図であり、KCl濃度が550 mM前後で溶出された酵素画分（酵素画分１、２）、及びKCl濃度が650 mM前後で溶出された酵素画分（酵素画分３）の電気泳動結果である。
【図２】ラッカーゼの発現と精製を検討した実施例１の結果を示す電気泳動図であり、溶出した酵素画分１〜３を加熱した後に電気泳動を行った結果である。
【図３】サイクリックボルタンメトリー測定によるアポ酵素のホロ化を検討した実施例２の結果を示す電流密度（mA/cm2）-電位（V vs. Ag|AgCl）曲線のグラフ。
【図４】定電位測定によるアポ酵素のホロ化を検討した実施例３の結果を示すグラフであり、縦軸に電流密度（mA/cm2）、横軸に時間（秒）を示す。
【図５】MELACと従来酵素MvBODの電極性能の経時変化比較検討した実施例４の結果を示すグラフであり、縦軸が0時間での各酵素電極の電流密度を100％としたときの残余電流密度（％）、横軸が時間（分）を示す。
【図６】別種カーボン微粒子でのアポ酵素のホロ化効果の確認（１）を検討した実施例５の結果を示す電流密度（mA/cm2）-電位（V vs. Ag|AgCl）曲線のグラフ。
【図７】別種カーボン微粒子でのアポ酵素のホロ化効果の確認（１）を検討した実施例５の結果を示すグラフであり、印加電位0.1 Vでの各掃引サイクルの電流密度（mA/cm2）を示す。
【図８】別種カーボン微粒子でのアポ酵素のホロ化効果の確認（２）を検討した実施例６の結果を示すグラフであり、CA測定の結果を示し、縦軸に電流密度（mA/cm2）、横軸に時間（分）を示す。
【図９】別種カーボン微粒子でのアポ酵素のホロ化効果の確認（２）を検討した実施例６の結果を示すグラフであり、CV測定の結果を示した電流密度（mA/cm2）-電位（V vs. Ag|AgCl）曲線である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に、本発明を実施するための実施の形態を詳細に説明する。しかしながら、本発明は、当該実施の形態に限定されるものではない。
【００１８】
本発明のマルチ銅酵素の活性化方法における活性化の対象となるのは、触媒発現に際して補欠因子として要求される複数の銅の全部又は一部が欠損しているマルチ銅酵素である。
【００１９】
「マルチ銅酵素」とは、触媒活性の発現に複数の銅を要求する酵素であり、当該酵素の基本構造であるタンパク質部分と補欠因子である複数の銅が結合してタンパク質−銅複合体を形成することにより、その触媒活性を発揮する。本発明の方法の対象となるマルチ銅酵素は、かかる構造的性質を有する限りその種類を特に限定するものではない。例えば、マルチ銅酵素に含まれる銅は、分光学的及び磁気的性質によって、タイプ１銅、タイプ２銅、タイプ３銅、CuA、CuB等に分類されるが、何れを分子内に含むものであってもよいし、また何れの組み合わせを分子内に含むものであってもよい。例えば、マルチ銅オキシダーゼに分類されるラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、セルロプラスミン、CueOやCotA等が挙げられる。好ましくはラッカーゼであり、特に好ましくはサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus） HB27由来のラッカーゼ（Agbo P.,他著, “Catalysis of dioxygen reduction by Thermus thermophilus strain HB27 laccase on ketjen black electrodes”, J Phys Chem B., 2013, 117(2), 527-34、及びGenBank：AB200322.1（ HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB200322.1" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB200322.1）を参照のこと）である。ただし、これらに限定するものではない。
【００２０】
また、マルチ銅酵素の由来についても制限はなく、組換えDNA技術を用いて産生されたものであっても、天然源から精製されたものであってもよい。特には、組換えDNA技術を用いて産生された組換え体酵素である。また、市販のマルチ銅酵素の活性化に本発明の方法を利用することもできる。
【００２１】
「銅が欠損しているマルチ銅酵素」とは、当該酵素の触媒活性の発現に補欠因子として要求される複数の銅が当該酵素の分子内に１以上欠損しているマルチ銅酵素を意味する。したがって、銅の欠損には、複数の銅のうちの一部又は全部の欠損を含む。つまり、当該酵素の分子内に銅が結合しているものの要求される複数の銅の一部が不足している「不完全なホロ酵素の状態のマルチ銅酵素」の他、当該酵素の分子内に銅が１つも結合していない「アポ酵素の状態のマルチ銅酵素」をも含む。
【００２２】
一方、「銅が欠損していないマルチ銅酵素」とは、当該酵素の触媒活性の発現に補欠因子として要求される銅が分子内に全て結合しているマルチ銅酵素を意味する。言い換えると、銅を補欠因子として複数個要求するマルチ銅酵素において、要求される複数個の銅の全てが分子内に結合した「完全なホロ酵素の状態のマルチ銅酵素」であることを意味する。
【００２３】
「ホロ酵素」とは、酵素の基本構造であるタンパク質部分と補欠因子が結合して、触媒的に活性なタンパク質−補欠因子複合体を形成した状態にある酵素を意味する。「アポ酵素」とは、酵素から補欠因子が除かれてタンパク質部分のみの状態にある酵素を意味し、触媒的に不活性な状態にあるものを意味する。
【００２４】
例えば、ラッカーゼ等のマルチ銅オキシダーゼは分子内にタイプ１銅と、タイプ２銅と、２個のタイプ３銅の合計4個の銅を有することが知られている。かかるマルチ銅オキシダーゼにおいては、「銅が欠損していないマルチ銅酵素」、「銅が完全に結合しているマルチ銅酵素」及び「完全なホロ酵素の状態のマルチ銅酵素」とは、当該酵素１分子内に上記4個全ての銅を含んでいる状態にあることを意味する。一方、「銅が欠損しているマルチ銅酵素」とは、当該酵素１分子内に1〜3個の銅が含まれるか、銅が１つも含まれていない状態を意味する。特に、当該酵素１分子内に1〜3個の銅が含まれる状態が「不完全なホロ酵素の状態」であり、当該酵素１分子に銅が１つも含まれていない状態が「アポ酵素の状態」であることを意味する。
【００２５】
「マルチ銅酵素を活性化する」とは、マルチ銅酵素の触媒機能を活性化することである。マルチ銅酵素は、酵素の基本構造であるタンパク質部分に銅が結合することによって酵素としての触媒活性を発揮するものである。したがって、ここでの活性化は、「銅が欠損しているマルチ銅酵素」分子内に銅が取り込まれ両者が結合することによって、当該酵素が触媒的に活性な状態になることを意味する。「ホロ化」と称する場合もある。ここでの活性化には、触媒活性の発現に要求される複数個の銅が全て結合した「完全なホロ酵素の状態」になる場合の他、「完全なホロ酵素の状態」には至らないが酵素１分子に結合した銅の数が増える場合も含む。
【００２６】
なお、本明細書において、単に「銅」と称する場合には、「銅」との文言に「銅原子」の他、あらゆる価数の「銅イオン」等を包括するものとする。
【００２７】
本発明のマルチ銅酵素の活性化方法は、以下の工程を有する。
１．前記マルチ銅酵素を導電性基材上に固定する酵素固定化工程。
２．マルチ銅酵素を固定した導電性基材に2価の銅イオンを含む溶液を接触させる接触工程。
３．導電性基材に2価の銅イオンが1価の銅イオンに還元される還元電位を印加する電位印加工程。
【００２８】
以下、各工程について詳細に説明する。
【００２９】
「マルチ銅酵素を導電性基材上に固定する工程」
マルチ銅酵素を固定する「導電性基材」としては、グラファイト、グラッシーカーボン等の炭素基材、アルミニウム、銅、金、白金、銀、ニッケル、パラジウム等の金属又は合金、SnO2、In2O3、WO3、TiO2等の導電性酸化物等、従来公知の材質の導電性基材を使用することができる。また、これを単層又は２種以上の積層構造をもって構成してもよい。導電性基材の大きさ及び形状等は特に限定されるものではなく、使用目的や活性化対象となるマルチ銅酵素の種類や量等に応じて適宜調整することができる。
【００３０】
導電性基材は、多数の細孔を有する多孔性基材であってもよい。多孔性基材としては、上記導電性を有し多数の細孔を有する限り特に制限はないが、好ましくは多孔性炭素基材であり、特にはカーボン微粒子の使用が好ましい。例えば、メソポーラスカーボン等のカーボン微粒子をグラッシーカーボン等の上述の導電性基材等の公知の基材に塗布して構成することができる。細孔の直径は、酵素の種類や分子量によって適宜設定することができる。好ましくは20〜40 nm、又は20〜35 nmに調製することができるが、これに限定するものではない。多孔性炭素基材等の多孔性基材の使用は、各細孔内に酵素をほぼ分子単位で固定することができることから、2価の銅イオンとの接触により生じる可能性のある酵素の失活を招く酵素分子同士の凝集が生じにくいという利点もある。
【００３１】
導電性基材への酵素の固定は、例えば、物理的吸着、イオン結合，共有結合を介して固定化する担体結合法を利用することができる。例えば、物理的吸着による固定化の場合、マルチ銅酵素を含む溶液に導電性基材を接触させ、これを乾燥させることによって簡便に酵素を固定できる。また、グルタルアルデヒドなどの2価性官能基をもつ架橋試薬で架橋固定する架橋法をも利用できる。更には、アルギン酸，カラギーナン等の多糖類、導電性ポリマー、酸化還元ポリマー、光架橋性ポリマー等の網目構造をもつポリマー、透析膜等の半透性膜内に封入して固定化する包括法等をも利用することができる。また、これらを組み合わせて用いてもよい。
【００３２】
「マルチ銅酵素を固定した導電性基材に2価の銅イオンを含む溶液を接触させる接触工程」
「2価の銅イオンを含む溶液」とは、2価の銅イオンを適当な溶媒に含む溶液である限り、その種類に制限はない。例えば、硫酸銅（II）、塩化銅 （II）、硝酸銅（II）や酢酸銅（II）等を適当な溶媒に溶解させた溶液が挙げられ、これらを１種又は２種以上で用いることができる。ただし、これらに限定するものではない。2価の銅イオンを含む溶液は、マルチ銅酵素接触時に終濃度で0.1〜1 mMに調製することが好ましい。
【００３３】
ここで、溶媒としては、固定されたマルチ銅酵素の触媒活性、及び当該酵素と導電性基材上への固定を阻害しない限り、公知の液体を用いることができる。マルチ銅酵素の触媒活性を阻害しないとは、当該酵素のタンパク質部分の立体構造の変化や当該酵素からの銅の欠落等により、当該酵素の触媒活性が低下若しくは消失しないことを意味する。好ましくは水であり、緩衝成分を含有して構成されていてもよい。緩衝成分としては、特に制限はなく、水性環境下において酸または塩基と反応する無機および有機化合物であってよい。例えば、炭酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）、4-（2-ヒドロキシエチル）-ピペラジン-1-エタン スルホン酸（HEPES）、3-モルフォリノプロパン スルホン酸（MOPS）等を例示することができる。これらは単独で用いてもよいが、2種以上を組み合わせて使用することができる。
【００３４】
「マルチ銅酵素を固定した導電性基材」と「2価の銅イオンを含む溶液」との「接触」は、マルチ銅酵素及び導電性基材に2価の銅イオンが接触できる限り、公知のいずれの手段を用いてもよい。例えば、マルチ銅酵素を固定化した導電性基材に2価の銅イオンを含む溶液を滴下、若しくは噴霧する等によって行うことができる。また、マルチ銅酵素を固定化した導電性基材を2価の銅イオンを含む溶液に浸漬する等によっても行うことができる。
【００３５】
「導電性基材に2価の銅イオンが1価の銅イオンに還元される還元電位を印加する電位印加工程」
電位印加工程により生じた1価の銅イオンは、銅が欠損しているマルチ銅酵素内に速やかに取り込まれ、マルチ銅酵素をホロ化することができる。ここで、「電位を印加する」とは、導電性基材に電位を印加できる限り、公知の電位印加手段を何れをも用いて行うことができる。例えば、2価の銅イオンを含む溶液と接触している導電性基材を作用電極として、対電極、及び必要に応じて参照電極を設け、前記作用電極と対電極との間に電位を印加することによって行うことができる。例えば、マルチ銅酵素を固定した導電性基材に2価の銅イオンを含む溶液中に浸漬させた状態で電位を印加することにより行うことが好ましい。このように構成することで、溶液中をイオン分子は自由に移動することができることから、電気化学的手法により導電性基材上で生成した1価の銅イオンは、同じく導電性基材上に固定され、かつ当該溶液に浸漬しているマルチ銅酵素分子内に極めて速やかに移動する。これにより、マルチ銅酵素の銅の取り込み効率が向上し、酵素の活性化効率が向上する。
【００３６】
電位印加の方式は、所定の電位範囲内において所定の掃引速度で変化させてもよく、あるいは一定電位を所定時間にわたって連続的に印加するようにしてもよい。
【００３７】
導電性基材に印加する電位は、2価の銅イオンを1価の銅イオンに還元でき、かつマルチ銅酵素の触媒活性を低下させない範囲内であれば特に制限されない。このような2価の銅イオンを1価に還元できる還元電位は、例えば、所定の電位から徐々に電位を下げながら印加し、2価の銅イオンの還元に由来する還元電流が観察される電位、又は当該電位よりも負の電位、若しくはこれらを含むように印加電位を設定することができる。
【００３８】
例えば、還元電位として、-0.1〜0.2 Vであることが好ましく、特に好ましくは0〜0.1 Vであることが好ましい。また、所定の電位範囲内で掃引する場合には、前記電位印加工程が、前記還元電位よりも高電位側から前記還元電位よりも低電位側へ、及び／又は前記低電位側から前記高電位側へ変動する電位を印加することが好ましい。好ましくは、電位掃引速度を0.001〜0.1 V／秒の範囲内に調整し、-0.1〜0.7 Vの範囲内で電位を変化させ、より好ましくは、電位掃引速度を0.01〜0.1 V／秒の範囲内に調整し、-0.1〜0.6 Vの範囲内で電位を変化させる。一定電位を連続的に印加する場合には、好ましくは、-0.1〜0.2 V の範囲内、より好ましくは、0〜0.1 Vの範囲内の一定電位であることがより好ましい。
【００３９】
電位掃引を行う場合の掃引サイクル数は、印加される電位、酵素の種類、2価の銅イオンを含む溶液の種類及び濃度等に応じて適宜設定することができるが、例えば1〜4サイクルの範囲とすることができる。また、一定電位を印加する場合の印加時間についても同様に適宜設定できるが、例えば5〜60秒間の範囲とすることができる。上記数値は、参照電極に銀・塩化銀電極を用いた場合を表示しているが、銀・塩化銀電極以外の参照電極を用いて表示することも可能である。
【００４０】
電位を印加することにより、2価の銅イオンは1価の銅イオンに還元される。1価の銅イオンは、マルチ銅酵素の分子内に銅が取り込まれやすい。したがって、電気化学的手法により導電性基材上で産生した1価の銅イオンは、同じく導電性基材上に固定された触媒活性の発現に要求される補欠因子としての銅の全部又は一部が欠損しているマルチ銅酵素分子内に速やかに取り込まれて当該酵素を活性化（ホロ化）する。これにより、当該マルチ銅酵素分子内に銅が完全若しくはほぼ完全に取り込まれ、触媒的に活性な完全若しくはほぼ完全なホロ酵素の状態となる。ラッカーゼ等のマルチ銅オキシダーゼは、触媒活性の発現に際して分子内に合計4個の銅を要求するため、His-Tag融合酵素のアフィニティー精製や、イオン交換クロマト精製等の過程により銅が欠損し活性が低下するケースが想定される。そのため、本発明のマルチ銅酵素の活性化方法を特に適用することができ、これらの酵素の利用価値を高めることができる。
【００４１】
上記工程は全て大気環境中で実施することができ、先行技術の項で提示した非特許文献１で要求されたような特殊な嫌気的雰囲気の調整等の特殊な操作を必要としない。つまり、不安定な1価の銅イオンは産生直後に、速やかにマルチ銅酵素分子に取り込まれ安定な状態となる。これにより、嫌気的条件下での操作を必要とせず、簡便な操作でマルチ銅酵素を活性化できる。また、安価な2価の銅イオンを含有する溶液を使用するため、コスト面でも有利である。更には、マルチ銅酵素のホロ化を印加電位によって制御できるため、銅配位のメカニズム解明にも貢献することが期待できる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。本実施例では、マルチ銅酵素としてサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）HB27由来のラッカーゼについて説明するが、これに限定するものではなく、他のマルチ銅酵素についても同様に本発明の方法を適用することができる。
【００４３】
実施例１．ラッカーゼの発現と精製
本実施例では、活性化の対象となるマルチ銅酵素の一種であるラッカーゼを大腸菌内で発現させ、これを精製した。ここでは、サーマス・サーモフィラス HB27由来のラッカーゼ活性を有するタンパク質（以下、「MELAC」と称する）を対象とした。J Phys Chem B., 2013, 117(2), 527-34を参照のこと。
【００４４】
上記J Phys Chem B., 2013, 117(2), 527-34の“Experimental”の“Cloning”の項の記載に基づいて調製したMELACのタンパク質発現プラスミドを、大腸菌BL21（DE3）pLysS株に形質転換した大腸菌を37℃で培養し、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加して20℃で培養することで、MELACを発現誘導した。具体的には、大腸菌を吸光度OD600=0.2になるまで培養し、0.2 mM IPTG、0.5 mM CuCl2を加え20 時間培養した。発現菌体を回収し、20 mM Tris-HCl pH7.4に懸濁、0.4％ Brij-58を加え、氷中で30分間放置した。続いて、菌体を超音波破砕し、遠心分離（42,000 × g）後の上澄み液を分取した。
【００４５】
次に、アフィニティー担体を用いてMELACを精製した。具体的には、ヒスチジンタグ融合タンパク質精製用金属アフィニティー担体TALON（クロンテック）をオープンカラムに適当量充填し、50 mM リン酸ナトリウム、0.3 M NaCl溶液で前洗浄後、発現菌体破砕液に0.3 M NaClを加えた後、カラムにアプライした。50 mM リン酸ナトリウム、5 mMイミダゾール、0.3 M NaCl溶液で洗浄後、50 mM リン酸ナトリウム、150 mMイミダゾール、0.3 M NaCl溶液で酵素を溶出した。溶出に用いた塩類を除去するため、25 mM Tris-HCl pH 7.4緩衝液に対して透析した。
【００４６】
更に、イオン交換クロマトグラフィーを用いて酵素MELACを精製した。ここで発現させたMELAC（C末端His Tag付）は、分子量49.1 KDa、pI 4.7 のタンパク質である。MELACの緩衝液をpH 7.4 とすると、pI値よりも高いため陰イオン交換体に吸着する物性を考慮し、陰イオン交換体RESOURCE-Q（GEヘルスケア）をイオン交換クロマトグラフィー担体として使用した。RESOURCE-Qによる精製は、25 mM リン酸カリウム pH 7.4、1 mM EDTAをベース緩衝液として、担体の前洗浄、タンパク質吸着、担体の洗浄を行い、タンパク質の溶出は、ベース緩衝液に0 mM 〜 750 mM KClのグラジエントをかけ溶出を行った。溶出した酵素画分にSDS-PAGE loading dyeを非加熱で混ぜ電気泳動（SDS-PAGE）で解析した。
【００４７】
なお、ここで発現及び精製したMELACの配列情報を配列表の配列番号１（塩基配列）、及び配列番号２（アミノ酸配列）に開示する。GenBank：AB200322.1を参照のこと。
【００４８】
電気泳動結果を図１に示す。図中パネル１及びパネル２は、KCl濃度が550 mM前後で溶出された酵素画分（酵素画分１、２）、パネル３は、KCl濃度が650 mM前後で溶出された酵素画分（酵素画分３）の結果である。
【００４９】
電気泳動パターンから、約50 kDaの分子量を持つMELACのバンドシグナルが認められた。また酵素画分１及び２では、低分子側にMELACと予想されるバンドシグナルが見られ、酵素画分３でそのバンドシグナルは減少した。これは、酵素分子への補欠因子（銅イオン）の結合状態の差に起因すると推察でき、それを確認するために、溶出した酵素画分にSDS-PAGE gel loading bufferを混ぜて加熱した後、電気泳動（SDS-PAGE）にて解析した。
【００５０】
電気泳動結果を図２に示す。レーン１〜３は、それぞれ酵素画分１〜３の結果を示す。酵素画分１〜３の何れもで、低分子側のバンドシグナルは認められなかった。これは、加熱によって補欠因子の銅が酵素分子から脱離してMELACの分子量に収束したと考えられる。
【００５１】
したがって、図１の上方の矢印のバンドシグナルは、銅が結合していないアポ酵素の状態のMELAC由来であり、下方の矢印のバンドは、一分子当たり4個の銅が結合した完全なホロ酵素の状態のMELAC由来であり、双方の矢印の間のバンドシグナルは、一分子当たり1〜3個の銅が結合した不完全なホロ酵素の状態のMELAC由来であると予想される。
【００５２】
図１及び図２の結果から、酵素画分１及び２には、補欠因子の銅の結合が完全でないMELACが混在していること、酵素画分３は、補欠因子の銅が結合していないMELACが大半を占めると考えられる。したがって、遺伝子組換えにより発現させ精製したMELACには、１分子当たりに担持する銅の個数が異なるものが混在していることが理解できた。
【００５３】
かかるMELACの銅結合状態を確認するため、原子吸光解析を行ったところ、酵素画分1及び2では、酵素１分子当たり2.3〜3.2であり、酵素画分3では、酵素1分子当たり0.4〜0.5であった。この結果は、上記図１及び図２の電気泳動結果と合致するものであった。ここで実験結果を示さないが、酵素画分3の方が夾雑物が少なく高純度であることから、高純度精製を行うことにより当該酵素分子内の銅が欠落したことが考えられる。なお、以下の実施例では、特に明記のない限り高純度精製品である酵素画分3を用いて実験を行った。
【００５４】
実施例２．サイクリックボルタンメトリー（CV）測定によるアポ酵素のホロ化
本実施例では、電気化学的手法を用いたアポ酵素のホロ化について検討した。ここでは、電気化学的手法として、電位掃引を規則的に繰り返して応答電流を測定するサイクリックボルタンメトリー（以下、「CV」と略する）測定を用いた。
【００５５】
電気化学的手法によるホロ化に際して、多孔質炭素材料（MgO鋳型メソポーラスカーボン（東洋炭素社製））を塗布した電極をアポ酵素の担体とした。アポ酵素のホロ化過程は、アポ酵素のホロ化に伴って生成するホロ酵素の酸素還元電流を検出することにより観察した。
【００５６】
ここでホロ化を検討したアポ酵素は、実施例１の酵素画分3として取得したものであり、原子吸光測定により酵素１分子当たり平均0.4〜0.5個の銅しか有しない。ラッカーゼは活性中心に4個の銅を有するものであることから鑑みて、ここで検討した酵素は、1〜4個の銅を含有する不完全若しくは完全なホロ状態のものをも含むが、大半が銅を全く含まないアポ酵素の状態にあることが理解できる。そのため、アポ酵素と称した。
【００５７】
詳細には、多孔質炭素材料の電極への塗布は電着法を利用した。カーボン微粒子（15 mg）とPVDF KF#9305（90 mg）をアセトニトリル（15 ml）中に超音波分散器を用いて分散させた。その分散液中にグラッシーカーボン電極（直径3 mm、ビー・エー・エス株式会社）と対極（5 mm×20 mm、炭素板、三菱鉛筆株式会社）を浸し、それぞれ、電源の陽極と陰極につないだ。この2電極間に50 Vの電位を1分間印加し、グラッシーカーボン電極上にカーボン微粒子を電着させた。電着後の電極は常温下で溶媒が完全に揮発するまで乾燥させた。乾燥後の電極に、酵素溶液（20 mg/mL、PIPES緩衝液（50 mM、pH 7.0））を滴下し電極に含浸させた。
【００５８】
上記で作製したアポ酵素電極をクエン酸緩衝液（100mM、pH5.0、25℃）中に浸しCV測定（走査速度：10mV/s、電位：0.7〜-0.1 V、参照電極：Ag|AgCl）を行った。結果を図３の電流-電位曲線の波形１に示し、縦軸は電流密度（ｍA/cm2）、横軸は電位（V vs. Ag|AgCl）である。その結果、ホロ酵素に由来する酸素還元電流は観察されなかった。なお、0〜-0.1 Vで観察された急激な還元電流は、酵素を介さない炭素電極での酸素の還元反応由来の電流であった。
【００５９】
続いて、クエン酸緩衝液中に終濃度1.0 mMとなるように硫酸銅を添加したこと以外は、上記と同様してCV測定を行った。1回目の掃引結果を図３の波形２に示す。その結果、+0.1 V付近から2価の銅イオンの還元に由来する還元電流が流れ始めた。次に、2回目の掃引結果を図３の波形３に示す。その結果、約＋0.5 V付近から還元電流が流れ始めた。この還元電流は、ホロ酵素による酸素還元に由来するものである。かかる結果から、アポ酵素のホロ化を電気化学的に実施できることが確認できた。
【００６０】
実施例３．定電位測定によるアポ酵素のホロ化
実施例２では電位を掃引しながら応答電流を観察するCV測定を利用してアポ酵素のホロ化を行ったが、本実施例では、一定電位を連続して印加する定電位測定によるアポ酵素のホロ化について検討を行った。
【００６１】
実施例２と同様に、多孔質炭素材料を塗布した電極をアポ酵素の担体とし、アポ酵素のホロ化に伴って生成するホロ酵素の酸素還元電流を観察した。まず、アポ酵素電極をクエン酸緩衝液（100 mM、pH 5.0、25℃）中に浸し、+0.5 Vを起点として120秒ごとに-0.1 Vずつ印加電位を下げ、0 Vまでの電極応答を観察した。なお、参照電極としてはAg|AgClを用いた。
【００６２】
結果を図４の波形１に示し、縦軸は電流密度（ｍA/cm2）、横軸は時間（分）である。なお、各時間における印加電位は下記表１に要約した。その結果、+0.5〜0 Vの範囲で電位を印加しても、ホロ酵素に由来する酸素還元電流は観察されなかった。
【００６３】
続いて、クエン酸緩衝液中に終濃度1.0 mMとなるように硫酸銅を添加したこと以外は、上記と同様にして定電位測定を行って応答電流を観察した。結果を図４の波形２に示す。その結果、印加電位が0.2 Vの時に還元電流が時間に対して直線的に増加し始め、印加電位が0.1 Vの時に還元電流が大きく増加した。この還元電流は、2価の銅イオンの還元過程で生じた1価の銅イオンがアポ酵素に配位することで生成したホロ酵素による酸素還元に由来するものであった。かかる結果から、定電位測定によっても、アポ酵素のホロ化を電気化学的に実施できることが確認できた。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
実施例４．MELACと従来酵素MvBODの電極性能の経時変化比較
本実施例では、MELACと従来酵素MvBODの電極性能の経時変化を観察した。MvBODは天野エンザイム（カタログ番号：BO3）から購入したビリルビンオキシダーゼである。
【００６６】
実施例２と３では、アポ酵素のホロ化を行うために親水的な炭素電極にアポ酵素を担持させた。本実施例では、ホロ酵素であるMELACと従来酵素MvBODの電極性能の経時変化を観察するために、ケッチェンブラックを利用した撥水的な電極面に酵素を担持させ、酸素を大気から取り込む空気極を作製した。空気極の作製法としては、カーボン微粒子（ケッチェンブラック：50 mg）と、2-プロパノール（1.0 ml）、PTFE 6-J（50 mg）を混ぜ超音波処理を行い、カーボンペーストを作製した。そのスラリー（100μl）をカーボンペーパー（10 mm x 10 mm）の片面に塗布し、60℃で数時間乾燥させた。乾燥後、MELAC溶液（実施例１の酵素画分3のアポ酵素：10 mg/mL、PIPES緩衝液（50 mM、pH 7.0））とMvBOD（10 mg/mL、PIPES緩衝液（50 mM、pH 7.0））をそれぞれ別々の電極に滴下し含浸させた。
【００６７】
作製した電極をリン酸緩衝液（500 mM, pH 7.0）に浸し、CV測定（走査速度：10 mV/s、電位：+0.7〜0 V）にて触媒電流密度の経時変化を観察した。なお、参照電極として銀・塩化銀電極（Ag|AgCl）を使用した。0時間での、印加電位0.1 Vのときの触媒電流密度を100 ％とし、それと比較した各時間における印加電位0.1 Vでの残余電流密度（％）を算出した。
【００６８】
結果を図５に示し、縦軸が0時間での各酵素電極の電流密度を100 ％としたときの残余電流密度（％）、横軸が時間（分）を示す。波形１がMELAC電極の結果、波形２がMvBOD電極の結果を示す。MELAC電極では、連続6時間以上にわたって触媒電流性能を90％程度保持できることが判明した（波形１）。一方、MvBOD電極では、6時間後には触媒電流性能は約65％まで低下した（波形２）。これは酵素自体の耐久性に起因しているものと考えられる。また、MvBODも活性発現に酵素１分子当たり４個の銅を要求する酵素である。しかし、ここでは図示しないが、原子吸光測定の結果、MvBODは１分子当たり平均３個程度の銅しか含まず、市販の酵素であっても完全な活性体であるホロ酵素の状態ではないことも判明した。
【００６９】
実施例５．別種カーボン微粒子でのアポ酵素のホロ化効果の確認（１）
実施例２〜３では、カーボン微粒子としてMgO鋳型メソポーラスカーボンを、実施例４では、ケッチェンブラックを使用し、これに酵素を吸着して電流応答を確認することにより酵素のホロ化を確認したが、本実施例では、別種のカーボン材を使用し同様の効果を得られるか否かを検討した。
【００７０】
カーボンゲル（特開2014-3970号（特願2013-39643）を参照のこと）10 mg、2％ポリフッ化ビニリデン（Polyvinylidene difluoride）（平均分子量534k、溶媒はN-メチルピロリドン（N-methylpyrrolidone））（0.45 ml）、N-メチルピロリドン（1.2 ml）を混ぜ合わせてカーボンペーストを作製し、スクリーン印刷電極（DropSens社製、型番150）の作用極（カーボン、φ4 mm)にカーボンペースト（2μl）に塗布し、60℃で数時間乾燥させた。乾燥後、MELAC溶液（実施例１の酵素画分3のアポ酵素：10 mg/mL、PIPES緩衝液（50 mM, pH 7.0））を作用極に滴下し、4℃で12時間含浸させた。
【００７１】
なお、カーボンゲルの調製について簡単に説明すると、カーボンゲルは、レゾルシノール（和光純薬）22 gおよび炭酸ナトリウム0.106 gをミリQ（Milli-Q）水66 mlに溶解した後、37 ％ホルムアルデヒド溶液32.4 mlを加えて撹拌した。この混合液から、未希釈、水で50 ％希釈、40 ％、33.3 ％希釈したものを調製した。夫々の溶液を、順次25 ℃で24時間、50 ℃で24時間、90 ℃で72時間静置して反応させて水和溶液(有機ゲル)を得た。次にアセトン中に有機ゲルを浸漬してゲル中の水分をアセトン置換した。この操作を数回繰り返した。アセトン置換後の有機ゲル8gを超臨界乾燥機を使い、18 ℃で1時間 L-CO2洗浄、35 ℃で1時間SC-CO2洗浄し、乾燥有機ゲルを得た。続いて、乾燥有機ゲルをセラミクス電気管状炉で、窒素気流下(流量500 ml/分)で、 順次250℃で1時間、500 ℃で1時間、1,000 ℃で1時間加熱し炭化させることにより、カーボンゲルを作製した。なお、カーボンゲルは40〜50 μmの粒径を有していた。
【００７２】
作製した電極を緩衝液（100 mMクエン酸、1 mM 硫酸銅、pH 5.0、25℃）中に浸し、CV測定（走査速度：5 mV/s、印加電位：+0.6〜-0.1 Vの範囲で掃引、参照電極Ag|AgCl）を行った。
【００７３】
結果を図６に示す。1〜5サイクル行い、それぞれの結果を波形1〜5に示す。また、各サイクルの電位印加0.1 V時の電流密度を図７に示す。その結果、2〜4サイクル目で酵素触媒電流の向上効果がみられた。これらの結果から、カーボン微粒子としてカーボンゲルを使用した場合でも、MgO鋳型メソポーラスカーボンを使用した時と同様の効果が得られることがわかった。
【００７４】
実施例６．別種カーボン微粒子でのアポ酵素のホロ化効果の確認（２）
本実施例でも、実施例５と同じカーボン材を使用し、実施例２〜４と同様の効果を得られるか否かを検討した。
【００７５】
実施例５と同じMELAC電極と緩衝液を使い、定電位で電流応答を観察するクロノアンペロメトリ測定（以下「CA」と略する）を0 V印加にて行った。続いて、CV測定（走査速度：5 mV/s、印加電位0.6〜-0.2 Vの範囲で掃引、参照電極Ag|AgCl）を行った
【００７６】
結果を図８及び図９に示す。図８はCA測定の結果を、図９はCV測定の結果を示し、CVの1サイクル目は波形１に、2サイクル目は波形２に、3サイクル目は波形３に示す。その結果、CAでは約0.2 mA/cm2の一定電流が認められた。一方、CVでは１サイクル目から電流が認められたが、2サイクル目、3サイクル目において酵素触媒電流の向上効果が認められた。かかる結果から、MELACの活性化には、一定電位を連続的に印加するより、電位掃引を3回程度繰り返した方が高い効果が得られることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は、簡便かつ安価なマルチ銅酵素の活性化方法を提供でき、バイオ燃料電池のカソード側電極の構築等の多種多様な技術分野において利用価値が高いものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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