(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的に活性のある外因性タンパク質をコードする少なくとも１種の転写可能なポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む遺伝子組換え真核微細藻類であって、前記発現される生物学的に活性のある外因性タンパク質は、前記微細藻類の細胞の液胞に標的化される、遺伝子組換え真核微細藻類。
【請求項２】
前記発現カセットが、液胞標的化ペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の遺伝子組換え微細藻類。
【請求項３】
前記液胞標的化ペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号１８に示される核酸配列を含む、請求項２に記載の遺伝子組換え微細藻類。
【請求項４】
前記発現カセットが、異種細胞または異種組織による、前記発現される外因性タンパク質の取り込みを促進するタンパク質ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の遺伝子組換え微細藻類。
【請求項５】
前記微細藻類が海洋性藻類である、請求項１に記載の遺伝子組換え微細藻類。
【請求項６】
前記微細藻類が、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ａｐｐ．、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐｐ．、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｐｐ．、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ、Ｐａｖｌｏｖａ  ｓｐｐ．、Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ  ｈｙａｌｉｎｅ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ、およびＮｅｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓからなる群から選択される、請求項５に記載の遺伝子組換え微細藻類。
【請求項７】
前記微細藻類が、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍである、請求項６に記載の遺伝子組換え微細藻類。
【請求項８】
前記生物学的に活性のある外因性タンパク質の分子量が１５０ｋＤａ以下である、請求項１に記載の遺伝子組換え微細藻類。
【請求項９】
前記生物学的に活性のある外因性タンパク質が治療的活性を有する、請求項８に記載の遺伝子組換え微細藻類。
【請求項１０】
前記生物学的に活性のある外因性タンパク質がホルモンである、請求項８に記載の遺伝子組換え微細藻類。
【請求項１１】
前記ホルモンが、成長ホルモン、食欲誘導ホルモンおよび放卵ホルモンからなる群から選択される、請求項１０に記載の遺伝子組換え微細藻類。
【請求項１２】
前記ホルモンが、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するサケ成長ホルモンである、請求項１１に記載の遺伝子組換え微細藻類。
【請求項１３】
前記ホルモンが、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する放卵ホルモンである、請求項１１に記載の遺伝子組換え微細藻類。
【請求項１４】
前記ホルモンが、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する食欲誘導ホルモンである、請求項１１に記載の遺伝子組換え微細藻類。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の遺伝子組換え微細藻類を含む、食用組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、動物用飼料組成物である、請求項１５に記載の食用組成物。
【請求項１７】
前記飼料組成物が、水生動物への給餌用である、請求項１６に記載の食用組成物。
【請求項１８】
前記飼料組成物が、陸生家畜への給餌用である、請求項１６に記載の食用組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、ヒトによる摂取用である、請求項１５に記載の食用組成物。
【請求項２０】
それを必要とする対象へのタンパク質の経口送達のための方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の遺伝子組換え微細藻類またはそれを含む組成物の有効量を対象に経口投与することを含み、前記対象は水生動物および陸生家畜から選択される、方法。
【請求項２１】
前記外因性の生物学的に活性のあるタンパク質が、治療的効果を有するタンパク質である、薬物として使用するための請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子組換え微細藻類。
【請求項２２】
前記外因性の生物学的に活性のあるタンパク質が、対象の成長を促進する、請求項２１に記載の遺伝子組換え微細藻類。
【請求項２３】
前記外因性の生物学的に活性のあるタンパク質が、対象の生存を向上させる、請求項２１に記載の遺伝子組換え微細藻類。
【請求項２４】
前記外因性の生物学的に活性のあるタンパク質が、対象の生殖率を向上させる、請求項２１に記載の遺伝子組換え微細藻類。
【請求項２５】
前記対象がヒトである、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の遺伝子組換え微細藻類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物ならびにヒトへの生物活性タンパク質の経口送達のための、外因性の生物活性タンパク質を発現する遺伝子組換え微細藻類およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生理活性タンパク質は、生物の細胞機能に必須であり、代謝過程の触媒反応、情報伝達、防御、運動、および輸送を含む細胞活動の大部分に関与する。生理活性タンパク質の経口送達は一般的に、治療タンパク質の送達ならびに、ヒトを含む動物に対する栄養学的効果または別の有益効果を有するタンパク質の送達という２つの主目的のために必要とされる。
【０００３】
世界中における食料、特に動物性タンパク質に対する需要の増加、ならびに動物の成育の環境への影響に対する認識により、陸生家畜ならびに水生家畜の生産性および重量増加を改善する、洗練された農業管理手段の発展が必要とされている。海生動物は、より健康的なタンパク源とみなされるため、魚類、甲殻類ならびに軟体動物を含む海生動物の成育のための水産養殖の発展は、特に重要である。
【０００４】
しかし、水産養殖は未だ、特に海生動物および魚を成育させるための完全に効率的なシステムではない。一般に、魚は、許容可能な大きさおよび重量に達するまでに比較的長い期間を要する。さらに、多くの品種の魚が非効率的な方法で成熟し、そのため、魚の個体群中で問題が起きることがあり、過度な成長の遅れに起因する個体群の一部の喪失、粗悪な形態（観賞魚の場合）などの結果が生じる。さらに、人工的な水産養殖環境においては、水生動物は、より感染症に罹患しやすくなり、疾患が生じた場合、高い死亡率を伴って、全個体群中で急速に広まる可能性がある。
【０００５】
従って、陸生の家畜ならびに水生の家畜に治療タンパク質または栄養タンパク質を投与するための、高価でなく、かつ手間のかかる労力を必要としない手段が必要とされる。また、ヒトへの治療タンパク質または栄養タンパク質の経口送達も非常に望ましく、これは、この投与形態が専門的な人員を必要とせず、かつ、患者の処方用量の遵守を著しく高めるためである。タンパク質の生物活性は、その配列および／またはコンフォメーションに依存し、これらは、タンパク質がその活性の標的に到達するまで維持されなければならない。経口送達を成功させるには、食品または飼料組成物へタンパク質を処理する間および動物の消化管を介した送達中に生じる可能性のある化学的分解および酵素的分解からタンパク質が保護されるべきである。さらに、タンパク質は、動物への侵入または標的となる到達場所への接近を妨げる構造的障壁を克服するべきである。
【０００６】
微細藻類（単細胞藻類または植物プランクトン）は、地球上で最大の、しかし最も解明されていない、微生物界を代表する。陸生動物に対する植物のように、微細藻類は、水中の食物連鎖において、全ての植物栄養素の天然の栄養基盤ならびに一次供給源となる。藻類における組換えタンパク質の発現が報告されており、藻類細胞内で、特に細胞プラスチド内で、外因性タンパク質を生産するために、様々な方法が利用可能である。国際（ＰＣＴ）出願公開第２０１１／０６３２８４号は、ラン藻などの原核生物および藻類ならびに植物などの真核生物を含む、光合成生物において治療タンパク質を発現する方法を開示する。真核生物の形質転換は、好ましくはプラスチドゲノムに対して、通常はクロロプラストゲノムに対して、行われる。この出願は、藻類細胞内での特定の治療タンパク質の発現を開示する。
【０００７】
タンパク質の送達手段として微細藻類を使用するために、様々な試みが為されている。例えば、国際（ＰＣＴ）出願公開第０１／９８３３５号は、宿主動物への生物活性タンパク質の送達のための送達システムおよび方法を開示する。提供されるシステムおよび方法は、プロモーターに機能可能に連結された生物活性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを形質転換した藻類細胞を得ることを含む。説明される一実施形態において、生物活性タンパク質は抗原エピトープであり、動物への投与後、藻類細胞は、宿主動物において免疫応答を誘導する。
【０００８】
国際（ＰＣＴ）出願公開第２００２／０７６３９１号は、水産養殖または農業において飼料成分として使用され、かつ、外因性のペプチド、タンパク質、および／または抗体も含有する微生物細胞であって、外因性のペプチド、タンパク質、および／または抗体がウイルス性病原体または細菌性病原体に対する耐性または免疫をもたらすか、さもなければ、該微生物細胞を摂取した種の健康状態およびパフォーマンスを改善する、微生物細胞の使用を開示する。微生物細胞は、酵母、真菌、細菌、または藻類であってよい。タンパク質および／または抗体は、微生物それ自体に対する直接的な遺伝子改変によって、または目的のタンパク質を発現するよう改変されたウイルスで微生物を感染させることによって、微生物細胞内で発現されてよい。
【０００９】
国際（ＰＣＴ）出願公開第２００８／０２７２３５号は、水生動物に感染する病原体の１種以上の重要なエピトープを特異的に標的とする組換え分子を発現する遺伝子改変された微細藻類を水生動物に直接的または間接的に与えることによる、水生動物における疾患または障害の予防、改善または治療のための方法を開示する。
【００１０】
米国特許出願公開第２０１１／００１４７０８は、遺伝子導入を促進するためにタンパク質酵素溶液によって藻類の細胞壁を弱体化または除去することを含む、外来の所望の遺伝子産物を藻類において生産する方法、および、遺伝子組換え藻類またはその後代を含む飼料組成物を開示する。またこの発明は、藻類におけるウシラクトフェリシン（ＬＦＢ）の発現のための修飾核酸も提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、生産および使用が容易で、タンパク質の生物活性を維持し、かつ生物活性タンパク質の吸収を全身的に促進する経口送達システムの必要性が未だ満たされずに存在し、このような経口送達システムを有することは非常に有利であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、生物活性タンパク質の、その活性型での全身的な吸収のために、生物への生物活性タンパク質の経口送達のための、藻類に基づいたプラットフォームを提供する。詳細には、本発明は、所定の細胞内コンパートメント内で少なくとも１種の外因性タンパク質を発現する遺伝子組換え微細藻類を提供する。タンパク質を発現する微細藻類は、水生動物および陸生動物に与えるために適用可能な、ならびにヒト用の栄養補助食品のために適用可能な、動物用飼料または食品添加物として使用される。外因性タンパク質は、生物学的に活性のあることを特徴とし、標的の生物に対する有益効果を有する少なくとも１種の特異的活性を発現する。
【００１３】
本発明は、藻類が水生動物（魚類および甲殻類を含む）ならびに陸生動物（マウスおよび家禽を含む）に経口的に摂取された場合に、発現されたタンパク質が活性を有したままであり、かつ、有益効果を有するその特異的活性を発現するという予想外の発見に部分的に基づく。一般に、タンパク質は、その完全な形態のままである。いかなる特定の理論または作用機構に束縛されることを望むものではないが、維持されるタンパク質の活性は、完全体の微細藻類内でのその局在に起因してよく、そのため、微細藻類細胞は、動物の消化管および／または酸性の胃における分解からタンパク質を保護する天然の封入材料としてはたらく。本発明の、ある典型的な実施形態によれば、タンパク質は、微細藻類の細胞内コンパートメントにおいて、特に液胞において、発現される。
【００１４】
従って、一態様によれば、本発明は、微細藻類細胞の細胞内コンパートメント内で発現される生物学的に活性のある外因性タンパク質をコードする少なくとも１種の転写可能なポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む遺伝子組換え真核微細藻類を提供する。
【００１５】
タンパク質が発現される細胞内コンパートメントは、微細藻類の種類、発現されるタンパク質のタイプおよび給餌される動物の種類に依存する。ある実施形態によれば、細胞内コンパートメントは、液胞、小胞体、ゴルジ系、リソソームおよびペルオキシソームからなる群から選択される。それぞれの可能性が本発明の別々の態様となる。
【００１６】
ある例示的な実施形態によれば、外因性タンパク質は微細藻類細胞の液胞内で発現される。これらの実施形態によれば、発現カセットは、液胞標的化ペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態によれば、外因性タンパク質を液胞内へ標的化するペプチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、短い液胞リーダー配列である。他の実施形態によれば、短い液胞リーダーペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１８に示される核酸配列を含む。
【００１７】
ある他の例示的な実施形態によれば、外因性タンパク質は、微細藻類細胞の小胞体（ＥＲ）内で発現される。これらの実施形態によれば、発現カセットは、ＥＲ標的化ペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態によれば、外因性タンパク質をＥＲ内へ標的化するペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ小胞体（Ｂｉｐ）リーダー配列である。他の実施形態によれば、ＥＲリーダーペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６に示される核酸配列を含む。
【００１８】
様々な種類の微細藻類が、本発明の教示に従って使用可能である。ある実施形態によれば、本発明の教示に従って使用される微細藻類は、海洋性微細藻類である。ある実施形態によれば、微細藻類は、限定されるものではないが、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ；Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．；Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓａｌｉｎａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａを含むＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．；Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐｐ．；Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｃｈｕｉｉを含むＴｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｐｐ．；Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ；Ｐａｖｌｏｖａ  ｓｐｐ．；Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ  ｈｙａｌｉｎｅ；Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ；およびＮｅｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓからなる群から選択される。それぞれの可能性が本発明の別々の態様となる。
【００１９】
ある特定の実施形態によれば、微細藻類は、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐｐ．、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．およびＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．からなる群から選択される。
【００２０】
他の特定の実施形態によれば、微細藻類はＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍである。
【００２１】
本発明の遺伝子組換え微細藻類は、これを摂取する標的の動物に対して効果を有する任意のタンパク質を発現するように形質転換され得る。
【００２２】
ある実施形態によれば、発現されるタンパク質の分子量は、１５０ｋＤａ以下である。他の実施形態によれば、発現されるタンパク質の分子量は、１４０ｋＤａ以下、１３０ｋＤａ以下、１２０ｋＤａ以下または１１０ｋＤａ以下である。他の実施形態によれば、発現されるタンパク質の分子量は、１〜１１０ｋＤａの範囲である。ある例示的な実施形態によれば、発現されるタンパク質の分子量は、１〜５０ｋＤａの範囲である。
【００２３】
ある実施形態によれば、タンパク質は、それを摂取する動物の成長、発達および生存のうちの少なくとも１つに対する有益効果を有する。それぞれの可能性が本発明の別々の態様となる。他の実施形態によれば、タンパク質は、遺伝子組換え微細藻類を摂取する動物に対する治療効果を有する。
【００２４】
さらなる追加の実施形態によれば、動物は水生動物であり、発現されるタンパク質は、水生動物の形態に影響する。一部の実施形態によれば、タンパク質は、水中での体の奇形という効果を有する。体の奇形には、限定されるものではないが、任意の形態不整、任意のタイプの体の非対称性、異常な体形状、異常なヒレ形状、異常な尾部形状、体／ヒレの異常な面積比、長さ比または幅比、体／尾部の異常な面積比、長さ比または幅比、尾部／ヒレの異常な面積比、長さ比または幅比、あるいは任意の体部位における不整が含まれる。ある現在の特定の実施形態によれば、発現されるタンパク質は、水生動物の体の奇形を低減または除去する。
【００２５】
さらなる、ある実施形態によれば、遺伝子組換え微細藻類はホルモンを発現する。一部の実施形態によれば、動物は水生動物であり、ホルモンは、成長ホルモン、食欲誘導ホルモンおよび放卵ホルモンからなる群から選択される。それぞれの可能性が本発明の別々の態様となる。
【００２６】
ある現在の特定の実施形態によれば、発現されるタンパク質は、魚類成長ホルモンである。一部の実施形態によれば、魚類成長ホルモンは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するサケ成長ホルモンである。ある特定の実施形態によれば、魚類成長ホルモンは、配列番号１に示される核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００２７】
さらなる実施形態によれば、発現されるタンパク質は、配列番号２４（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：Ｐ６８０７２）に示されるアミノ酸配列を有する放卵ホルモンである。ある特定の実施形態によれば、放卵ホルモンは、配列番号２５に示される核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００２８】
さらに別の実施形態によれば、発現されるタンパク質は、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する食欲誘導ホルモンである。ある特定の実施形態によれば、食欲ホルモンは、配列番号２１に示される核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００２９】
さらなる態様によれば、本発明は、本発明の遺伝子組換え微細藻類を含む食用組成物を提供する。一部の実施形態によれば、食用組成物は、動物用飼料組成物である。例示的な実施形態によれば、動物用飼料組成物は、水生動物への給餌用である。さらに他の実施形態によれば、食用組成物は、ヒトによる摂取用である。上述したように、食用組成物は、生物活性タンパク質の経口送達のために使用される。一部の実施形態によれば、特に食用組成物が動物による摂取用である場合、食用組成物は、本質的に遺伝子組換え藻類から構成される。さらなる実施形態によれば、食用組成物は、遺伝子組換え藻類から構成される。食用組成物は、それ自体で、あるいは、動物用飼料またはヒト用の食品への添加物として使用されてよい。
【００３０】
さらなる態様によれば、本発明は、動物に生物活性タンパク質を送達する方法であって、生物活性タンパク質をコードする少なくとも１種の転写可能なポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む遺伝子組換え真核微細藻類を動物の対象に経口投与することを含み、該生物活性タンパク質が微細藻類細胞の細胞内コンパートメント内で発現される、方法を提供する。
【００３１】
ある実施形態によれば、細胞内コンパートメントは、液胞、小胞体、ゴルジ系、リソソームおよびペルオキシソームからなる群から選択される。それぞれの可能性が本発明の別々の態様となる。
【００３２】
ある特定の実施形態によれば、外因性タンパク質は、微細藻類細胞の液胞内で発現される。他の特定の実施形態によれば、外因性タンパク質は、微細藻類細胞の小胞体内で発現される。
【００３３】
一部の実施形態によれば、遺伝子組換え真核微細藻類は、動物用飼料組成物内において、またはヒト用食品組成物内において投与される。
【００３４】
さらなる態様によれば、本発明は、動物の成長速度、成長パターン、生殖についての健康状態、生存またはそれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つを改善するための方法であって、本発明の遺伝子組換え微細藻類またはこれを含む組成物の有効量を動物に投与することを含み、これにより該動物の成長速度および／または成長パターンおよび／または生存および／または生殖についての健康状態を改善する、方法を提供する。
【００３５】
ある実施形態によれば、動物の対象は、陸生動物または水生動物である。任意選択で陸生動物は、限定されるものではないが、乳牛、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、家禽等を含む、食用目的または非食用目的（後者は、限定されるものではないが、労働用動物、ペット等を含む）で育成される任意の動物であってよい。任意選択で水生動物は、限定されるものではないが、魚類、甲殻類、およびサンゴを含む、食用目的または非食用目的（後者は、限定されるものではないが、観賞用等を含む）で育成される任意の動物であってよい。さらなる実施形態によれば、動物の対象はヒトである。
【００３６】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の説明および図面から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ｐＰｈａＴ１発現ベクターの全体の図を示す。
【図２】細胞内の異なる細胞小器官へ標的化されたサケ成長ホルモンを発現するＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ種の遺伝子組換え藻類から抽出したタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図３】ＥＲ（３５６）または液胞（３９８）へ標的化された魚類成長ホルモン（ｆＧＨ）を過剰発現する遺伝子組換え藻類を含む、市販の通常の魚用飼料を与えたエンゼルフィッシュの総成長パフォーマンスを、通常の魚用飼料を与えた魚（対照）と比較して示す。魚の成長は、最初の魚の重量に対する重量増加の割合として示される。
【図４】液胞へ標的化されたｆＧＨを発現する藻類（３９８）を含む通常の飼料を魚に与えると、通常の魚用飼料を与えた魚の場合と比較して、２グラムを超えた魚の数が増加したことを示す。
【図５】栄養補助飼料として投与されたｆＧＨを過剰発現する遺伝子組換え藻類の、エンゼルフィッシュの総重量に対する効果を示す。３９８−液胞へ標的化されたｆＧＨを発現する藻類を４％含む通常の魚用飼料。対照−通常の魚用飼料のみ。魚の成長は、最初の魚の重量に対する重量増加の割合として示される。
【図６】液胞へ標的化されたｆＧＨを過剰発現する遺伝子組換え藻類を含む通常の魚用飼料の摂取の、魚ニシキゴイの形状の奇形に対する効果を示す。３９８−ｆＧＨを発現する藻類を４％含む通常の魚用飼料。対照−通常の魚用飼料のみ。
【図７】ｆＧＨを過剰発現する遺伝子組換え藻類の摂取の、キンギョの総重量に対する効果を示す。３９８−液胞へ標的化されたｆＧＨを発現する藻類を４％含む通常の魚用飼料。対照−通常の魚用飼料のみ。
【図８】野生型Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ（図８Ａ）、野生型Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ（図８Ｂ）および液胞へ標的化された魚類成長ホルモンを発現するＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ（図８Ｃ）を与えたブラインシュリンプ（Ａｒｔｅｍｉａ）の写真を示す。飼料は、生きた藻類として補った。
【図９】野生型Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ（対照）、野生型Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ（ｗ．ｔ．）、または液胞へ標的化されたｆＧＨを発現するＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ（３９８）を与えたブラインシュリンプの体長を示す。飼料は、生きた藻類として補った。
【図１０】ｆＧＨを発現する微細藻類を含む飼料の、エビＭａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ  ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｉの重量に対する効果を示す。３９８−藻類の液胞へ標的化された魚類成長ホルモンを過剰発現する遺伝子組換え藻類を追加した通常飼料を与えたエビ。対照−通常の飼料のみを与えたエビ。エビの重量を６週間後に測定した。
【図１１】野生型藻類（図１１Ａ）または液胞へ標的化されたＧＦＰを発現する藻類（コンストラクト５２７、図１１Ｂ）を与えた魚ティラピアの胃の蛍光画像を示す。給餌から４時間後に蛍光下で写真を撮影した。
【図１２】野生型藻類（図１２Ａ）または液胞へ標的化されたＧＦＰを発現する藻類（図１２Ｂ）を与えた魚ティラピアの腸の蛍光画像を示す。給餌から５時間後に蛍光下で写真を撮影した。
【図１３】野生型（図１３Ａ）および液胞へ標的化されたＧＦＰを発現する藻類（図１３Ｂ）を与えたブラインシュリンプＡｒｔｅｍｉａの培養液の蛍光画像を示す。給餌から４時間後に蛍光下で写真を撮影した。
【図１４】明光下（図１４Ａ）および蛍光下（図１４Ｂ）で撮影した、野生型（ＷＴ）および液胞へ標的化されたＧＦＰを発現する藻類を与えたエビＭａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ  ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｉの写真を示す。
【図１５】給餌から６時間後に明光下（図１５Ａ）および蛍光下（図１５Ｂ）で撮影した、野生型（ＷＴ）および液胞へ標的化されたＧＦＰを発現する藻類を与えたヒヨコから単離した肝臓の写真を示す。
【図１６】藻類で発現されたｆＧＨの魚の血液への吸収を示す。魚ティラピアに液胞−ＧＦＰ発現藻類（コンストラクト５２７）または液胞−ｆＧＨ発現藻類（コンストラクト３９８）を強制給餌した。組換え体ｆＧＨに対して特異的であるＥＬＩＳＡを用いて血液中のｆＧＨレベルを測定した。結果を平均値±ＳＥＭとして示す。結果は、４つの独立した実験を表す。
【図１７】藻類の液胞内で発現されたＧＦＰの活性型が、完全かつ機能的な形態で魚の腸からその血中へと吸収されることを示す。魚ティラピアに液胞−ＧＦＰ発現藻類（コンストラクト５２７）または液胞−ｆＧＨ発現藻類（コンストラクト３９８）を強制給餌した。蛍光プレートリーダー（５１５ｎｍ）を用いて血液中のＧＦＰレベルを測定した。結果を平均値±ＳＤとして示す。結果は、３つの独立した実験を表す。
【図１８】藻類細胞の液胞へ標的化された外因性タンパク質が、魚の消化管における分解から保護されることを示す。図１８Ａは、液胞へ標的化されたＧＦＰを発現する藻類（コンストラクト５２７）、これらの藻類の総タンパク質抽出物（ＧＦＰ）、および液胞へ標的化されたｆＧＨを発現する藻類（コンストラクト３９８）から得られた最初のＧＦＰ蛍光を示す。図１８Ｂは、上記の藻類またはタンパク質抽出物のそれぞれを与えた魚ティラピアの血液試料から得られた蛍光を示す。蛍光プレートリーダー（５１５ｎｍ）を用いて血液中のＧＦＰレベルを測定した。結果を平均値±ＳＤとして示す。
【図１９】藻類細胞の液胞へ標的化された外因性ｆＧＨが、藻類を与えたマウスの血液および肝臓に到達することを示す。マウスに液胞−ｆＧＨ発現藻類（コンストラクト３９８）または液胞−ＧＦＰ発現藻類（コンストラクト５２７）を与えた。組換え体ｆＧＨに対して特異的であるＥＬＩＳＡを用いて肝臓中のｆＧＨレベルを測定した。結果を平均値±ＳＤとして示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、そのようなタンパク質を必要とする生物への生物活性タンパク質の経口送達のための組成物および方法を提供する。詳細には、本発明は、生物活性タンパク質を発現する微細藻類およびこれを含む食用組成物を提供する。本発明は、摂取される藻類中でタンパク質の生物活性が維持されることを示し、さらに、遺伝子組換え微細藻類を摂取した生物の細胞または組織において、タンパク質がその生物活性を発現することを示す。
【００３９】
定義
用語「微細藻類」または「微細藻類（複数）」は、本明細書において、最も広い範囲において使用され、淡水系および海洋系において一般に見出される単細胞微小真核藻類を指す。微細藻類のサイズは、その種類に応じて、数マイクロメートル（μｍ）から数百マイクロメートルの範囲にわたる可能性がある。ある現在の特定の実施形態によれば、該用語は海洋性真核微細藻類または海洋性真核微細藻類（複数）を指す。
【００４０】
用語「遺伝子」は、ＲＮＡまたはポリペプチドの生産に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。ポリペプチドは、完全長のコード配列またはそれらの任意の一部によってコードされ得る。用語「それらの一部」は、遺伝子に関連して使用される場合、その遺伝子の断片を指す。断片は、数ヌクレオチドのサイズから、遺伝子配列全体から１ヌクレオチドを引いたサイズまでの範囲にわたってよい。従って、「遺伝子の少なくとも一部を含む核酸配列」は、遺伝子の断片または遺伝子全体を含んでよい。
【００４１】
また任意選択で、用語「遺伝子」は、構造遺伝子のコード領域も包含し、かつ、５’端および３’端の両方においてコード領域に隣接して位置する、いずれかの端の約１ｋｂの距離の配列も含み、そのため遺伝子は、完全長のｍＲＮＡの長さに該当する。コード領域の５’側に位置し、かつ、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’側または下流に位置し、かつ、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と呼ばれる。
【００４２】
用語「タンパク質」、「タンパク質配列」および「アミノ酸配列」は、ペプチド結合により互いに結合したアミノ酸残基の直線状の列を示すために、本明細書の全体にわたって交換可能に使用される。また、該用語はペプチドも包含する。
【００４３】
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「核酸配列」は、本明細書において交換可能に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列等を包含する。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖、直線状または分枝状であり、および任意選択で、合成の、非天然のまたは変更されたヌクレオチド塩基を含む、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーまたはそれらの混成物であってよい。また、該用語は、ＲＮＡ／ＤＮＡ混成物も包含する。ある現在の例示的な実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、形質転換される特定の微細藻類の種のコドン使用頻度を用いて、目的のタンパク質のアミノ酸配列に基づいて設計される。
【００４４】
用語「発現カセット」および「コンストラクト」または「ＤＮＡコンストラクト」は、本明細書において交換可能に使用され、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、人工的に構築された核酸分子または単離された核酸分子を指す。コンストラクトは、一部の場合において目的のタンパク質をコードする可能性もあるマーカー遺伝子をさらに含んでよい。発現カセットは、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに機能可能に連結された適切な調節配列をさらに含む。コンストラクトへの調節配列の包含は任意であることが理解されるべきであり、例えば、宿主細胞の調節配列が使用されるべき状況においては、このような配列は必要でないことがある。
【００４５】
ある実施形態によれば、生物は、機能可能に連結された、プロモーター配列、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび終結配列を含む発現カセットを含む。
【００４６】
用語「機能可能に連結された」は、一方の機能がもう一方によって調節されるように、単一の核酸断片に核酸配列を結合することを指す。例えば、そのコード配列の発現をプロモーターが調節可能である場合（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、プロモーターはコード配列に機能可能に連結されている。コード配列は、センスまたはアンチセンスの向きで、調節配列に機能可能に連結され得る。
【００４７】
用語「プロモーターエレメント」、「プロモーター」、または「プロモーター配列」は、本明細書において使用される場合、ＤＮＡポリマーのタンパク質コード領域の５’端の上流に位置する（すなわち、進む）ＤＮＡ配列を指す。天然の既知のプロモーターの大部分の位置は、転写領域に先行する。プロモーターは、スイッチとして機能し、遺伝子またはその一部の発現を活性化する。遺伝子が活性化されると、それは転写されるか、または転写に参加すると言われている。転写は、遺伝子からのｍＲＮＡの合成を含む。従って、プロモーターは、転写調節エレメントとしてはたらき、また、ｍＲＮＡへの遺伝子の転写の開始のための場所も提供する。プロモーターは、天然の遺伝子からその全体が由来してよく、または、天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されてよく、あるいは、合成ＤＮＡ部分を含んでさえよい。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞型において、または発達の異なる段階において、または異なる環境条件に応答して、遺伝子またはその一部の発現を導いてよいことが当業者には理解される。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全には規定されていないため、複数のバリエーションのＤＮＡ断片が、同一のプロモーター活性を有してよいことがさらに認識される。大部分の細胞型で大部分の期間において遺伝子を発現させるプロモーターは、通常「恒常的プロモーター」と呼ばれる
【００４８】
本発明の教示によれば、プロモーターは、恒常的プロモーター、誘導性プロモーターまたは組織特異的プロモーターであってよい、その生物本来のプロモーターまたは異種プロモーターであり得る。
【００４９】
微細藻類において活性があることが当技術分野において公知の任意のプロモーターが、本発明の教示に従って使用され得る。非限定的な例としては、フコキサンチンクロロフィルタンパク質Ａ（ｆｃｐＡ）、Ｂ（ｆｃｐＢ）、Ｃ（ｆｃｐＣ）およびＥ（ｆｃｐＥ）のプロモーター、ならびに、任意の光収穫複合体（Ｌｈｃ）プロモーターが挙げられる。また、限定されるものではないが、ノパリンシンターゼプロモーター、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミド由来ポリアデニル化配列、ｔｕｂＢ２のプロモーター領域、バクテリオファージλ由来ＰＬプロモーター、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、細菌のｔφプロモーター、熱ショックタンパク質７０Ａプロモーター（ＨＳＰ７０Ａ）、およびルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニット２（ＲＢＣＳ２）のプロモーターを含む、非光収穫関連プロモーター（ｎｏｎ−ｌｉｇｈｔ  ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）も使用され得る。
【００５０】
本明細書において使用される場合、用語「食料（ｆｏｏｄ）」は、ヒト用の食料、または、陸生動物および水生動物を含む動物用の飼料を指す。
【００５１】
本明細書において使用される場合、用語「水産養殖」は、制御された状況下で養殖される水生生物を指す。「水生生物」は、淡水または海水のいずれかの水中で成長する生物である。水生生物には、限定されるものではないが、魚類、例えば、バス、シマスズキ、ティラピア、ナマズ、タイ、ニジマス、ゼブラフィッシュ、レッドドラム（ｒｅｄ  ｄｒｕｍ）、キンギョ、魚ニシキゴイ、エンゼルフィッシュ、およびコイ；甲殻類、例えば、クルマエビ、ブラインシュリンプ、淡水エビおよび海水エビ、およびＡｒｔｅｍｉａ；およびワムシが含まれる。
【００５２】
本発明を実施するための特定の実施形態
本発明の少なくとも一部の態様の実施のための非限定的な例として、動物、特に水産養殖で成長する動物およびモデルとなる陸生動物に関して、本発明の教示が以下に説明される。
【００５３】
現在利用可能な水産養殖システムは一般に、開放型または閉鎖型に分類される。開放型システムは一般に、湖または川などの水域において網囲いを築くことにより設けられる。閉鎖型システムは一般に、密閉タンク内において水を再循環させ、水はタンクから処理サイクルを通じてタンクに再度注入される。
【００５４】
水産養殖システムは、異なる用途、主に食料品としての用途だけでなく観賞用としての用途、のために販売可能なサイズになるまで、魚類、甲殻類および軟体動物などの水生動物を成長させるために使用される。少なくとも一部の実施形態によれば、本発明は、魚用または他の水生動物用の改良された飼料を提供する。適切な飼料は、水産養殖システムの重要な態様を形成する。本発明の教示は、成長の改善（体長および／または重量の増加の向上を含む）、成長パターンの改善（特に体の奇形を低減または除去すること）、性成熟または別の生活環段階までの期間の短縮、健康全般の改善（生存率の増加を含む）またはそれらの組み合わせを含む、向上した成果を伴う飼料の生産のための手段および方法を提供する。
【００５５】
生物活性タンパク質を含む食用組成物の経口投与は水産養殖ならびに農業において、非常に経済的価値があり、各動物に組成物を個別に投与する必要性を排除する。
【００５６】
また、治療的食用組成物はヒトにとっても非常に望ましく、これは、その投与が専門的な人員（例えば静脈内への、治療化合物の投与に必要な人員）を必要とせず、かつ、摂取しやすいためであり、従って、処方用量の摂取における患者の遵守を向上させる。
【００５７】
一態様によれば、本発明は、生物学的に活性のある外因性タンパク質をコードする少なくとも１種の転写可能なポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む遺伝子組換え真核微細藻類であって、生物学的に活性のある外因性タンパク質は微細藻類細胞の細胞内コンパートメント内で発現される、遺伝子組換え真核微細藻類を提供する。
【００５８】
様々な種類の藻類が本発明の教示に従って使用され得る。ある実施形態によれば、藻類は海洋性微細藻類である。本発明の教示に従って使用され得る海洋性微細藻類の例示的なリストには、限定されるものではないが、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ；Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．；Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓａｌｉｎａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａを含むＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．；Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐｐ．；Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｃｈｕｉｉを含むＴｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｐｐ．；Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ；Ｐａｖｌｏｖａ  ｓｐｐ．；Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ  ｈｙａｌｉｎｅ；Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ；およびＮｅｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓが含まれる。藻類は、種の分類学的大断面（表１）に由来し、かつ、これを代表する。
【表１】
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【００５９】
ある特定の実施形態によれば、本発明の教示に従って使用される遺伝子組換え微細藻類は、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍである。藻類Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍは、植物プランクトンの一部を形成し温暖な地方に由来する珪藻類の単細胞藻類である。この藻類は容易に形質転換され、形質転換された藻類は水産養殖において良く増殖する。さらに、この藻類は非毒性かつ非病原性であり、動物用の、特に魚用および海生無脊椎動物用だけでなく陸生動物用の、飼料源として使用できる。
【００６０】
本発明の遺伝子組換え微細藻類の主な用途は、食用組成物である。藻類細胞中で発現される外因性タンパク質は、組成物を摂取した対象の標的細胞または標的組織に、その活性型で到達すべきであり、ここで、対象は、ヒトを含む、水生動物または陸生動物である。生物活性タンパク質の経口送達における主な障害の一つは、経口送達製品の調製過程ならびにその保存過程の全体にわたる環境条件、およびその後の標的となる対象の体内の、消化管における環境条件、に対するタンパク質の感受性である。
【００６１】
本発明は本明細書において、微細藻類の細胞内コンパートメント内で発現される外因性タンパク質が、水生動物ならびに陸生動物に摂取された場合に、その活性を維持することを示す。いかなる特定の理論または作用機構に束縛されることを望むものではないが、タンパク質の活性は、藻類のバイオマスの増殖ならびに処理の全体にわたる外部の過酷な環境から、およびさらには、藻類を摂取した対象の動物の消化管の環境から、タンパク質を保護する封入形態としてはたらくことがある完全体の藻類細胞によって、特に細胞壁によって、維持される可能性がある。
【００６２】
ある実施形態によれば、細胞内コンパートメントは、液胞、小胞体、ゴルジ系、リソソームおよびペルオキシソームからなる群から選択される。それぞれの可能性が本発明の別々の態様となる。ある現在の特定の実施形態によれば、外因性タンパク質は微細藻類の液胞内で発現される。藻類のクロロプラスト内で外因性タンパク質を発現することは、本発明から明確に除外される。
【００６３】
タンパク質の経口送達における解決すべき別の問題は、タンパク質およびペプチドの侵入を厳しく制限する標的の動物対象の胃腸の上皮細胞膜を通じたタンパク質およびペプチドの侵入である。タンパク質が経細胞吸収で上皮細胞膜に分配されるには最小限レベルの親油性が必要である。予想外にも、本発明は、本明細書において、発現されるポリヌクレオチドを植物の液胞へ標的化することが、遺伝子組換え微細藻類を摂取した動物の血流への、発現される生物活性タンパク質の効率的な移行につながることを示す。タンパク質を液胞中へ標的化することは、クロロプラストを含む他の細胞コンパートメントへ標的化するよりも有利であった。液胞は、細胞の内膜系の一部であり、従って、単一の仮説または作用機構に制限されることを望むものではないが、内膜系の一部である微細藻類細胞の液胞へペプチドまたはタンパク質を標的化することは、藻類が摂取されてその壁が動物の対象によって分解された場合に動物の消化管を介した吸収を増加させるのかもしれない。このような吸収の増加は、上皮細胞膜によるペプチドおよびタンパク質分子の親油性の「感知」が増加して、腸を介した効率的な吸収が生じることに起因するのかもしれない。さらにまた、液胞を通じたタンパク質の提供がタンパク質の保存安定性を増加させる可能性もある。また、上記の様々な組み合わせも役割を果たすのかもしれない。いずれにせよ、以下でより詳細に例示が説明されるように、タンパク質を液胞へ標的化することは、経口投与されるタンパク質の機能的効果を明らかに増大させる。
【００６４】
さらに、微細藻類により発現される外因性タンパク質は、遺伝子組換え藻類を摂取する動物の対象の上皮細胞膜によるその取り込みを促進するように設計され得る。一部の実施形態によれば、本発明の発現カセットは、異種細胞または異種組織による、発現される外因性タンパク質の取り込みを促進するタンパク質ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
【００６５】
特定の取り込み促進ドメインは、遺伝子組換え微細藻類を摂取する対象の動物の種類に依存する異種細胞の種類に応じて選択される。ある実施形態によれば、発現カセットは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態によれば、ＣＰＰは、限定されるものではないが、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのコドン使用頻度に従って合成されるヒト免疫不全ウイルス１由来トランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）（配列番号９）またはその一部、およびＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのコドン使用頻度に従って合成される繊維芽細胞成長因子の膜移行配列（ＭＴＳ）（配列番号７）またはその一部からなる群から選択される。それぞれの可能性が本発明の別々の態様となる。
【００６６】
様々な生物学的活性を有するタンパク質が、本発明の教示に従って微細藻類細胞内で発現され得る。ある実施形態によれば、タンパク質は、遺伝子組換え微細藻類を摂取する対象に対する治療的効果を有する。他の実施形態によれば、タンパク質は、遺伝子組換え微細藻類を摂取する対象の成長を促進する。さらなる追加の実施形態によれば、タンパク質は、遺伝子組換え微細藻類を摂取する対象の生存を向上させる。さらなる追加の実施形態によれば、タンパク質は、遺伝子組換え微細藻類を摂取する対象の生殖率を向上させる。
【００６７】
ある例示的な実施形態によれば、遺伝子組換え微細藻類はホルモンを発現する。一部の実施形態によれば、ホルモンは、食欲誘導ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン（放卵ホルモン）および成長ホルモンからなる群から選択される。ある現在の特定の実施形態によれば、成長ホルモンは魚類成長ホルモンである。
【００６８】
本発明は、ワクチンのための外因性タンパク質源としての本発明の遺伝子組換え微細藻類の使用を排除することが理解されるべきである。
【００６９】
当技術分野において公知である、微細藻類を形質転換するための任意の方法が、本発明の教示に従って使用され得る。形質転換方法は、微粒子銃、エレクトロポレーション、マイクロポレーション、外因性ＤＮＡの存在下で細胞をボルテックスすること、酸洗浄ビーズおよびポリエチレングリコールを介した形質転換を含む。真核藻類の形質転換のための方法および手段を、例えば、国際（ＰＣＴ）出願公開第１９９７／０３９１０６号に見出すことができる。
【００７０】
一般に、遺伝子組換え藻類を作製するためのベクターを調製するために、藻類のゲノムに組み込まれることが可能なプラスミドである発現ベクターに、外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドがまずクローン化される。このような発現ベクターにおいて、外因性タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡの合成を導く発現制御配列、すなわちプロモーター、に機能可能に連結される。上記に記載されるように、プロモーターは、内因性プロモーター、すなわち藻類に通常存在する遺伝子の転写を導くプロモーター、であってよい。ある実施形態によれば、ベクターは、形質転換された藻類の選択を可能にする耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。ある現在の例示的な実施形態によれば、ベクターは、ゼオシンおよびフレオマイシンに対する耐性を与えるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００７１】
当業者にとって公知のように、および以下に例示するように、形質転換された藻類の培養条件は、使用される藻類の種類に依存する。一般に、藻類は、光合成の可能な条件下で増殖される。光合成には日光およびＣＯ２が必要であり、さらに微細藻類が、適切な肥料を混合した淡水、汽水または海水を増殖に必要とするため、微細藻類は、例えば、開放された池および湖で培養され得る。しかし、開放型システムは、閉鎖型システムよりも汚染に対して脆弱であり、さらに、開放された貯水池において増殖した遺伝子改変微細藻類は環境に対して危険であるとみなされる可能性がある。さらに、開放型システムにおいては、水温、ＣＯ２濃度、および照明条件が制御されにくい。増殖時季は、場所に大きく依存し、熱帯は別として、１年の内の温暖な月に限定される。しかし、開放型システムでは、閉鎖型システムよりも構築および／または維持が安価である。
【００７２】
従って、微細藻類を増殖させる別の方法は、池またはプールを構造で、例えば「温室型」構造で覆うような、半閉鎖型システムの使用である。これは、より小さなシステムになる可能性があるが、開放型システムに伴う多くの問題に対処する。半閉鎖型システムの利点は、目的の微細藻類を、その増殖に必要な栄養素について、侵入する生物との競合に勝たせることによって、所望の微細藻類を、侵入する生物に対して優占的であるようにすることが可能である点、および増殖時季を延ばすことが可能である点である。例えば、システムが加熱または冷却される場合、微細藻類は、一年を通して増殖できる。
【００７３】
あるいは、微細藻類を、開放型システムまたは半閉鎖型システムよりも厳密に環境が制御される光バイオリアクタなどの閉鎖型構造内で増殖させることができる。光バイオリアクタは、リアクタに光子エネルギーの投入を提供するために、ある種の光源を組み入れたバイオリアクタである。用語光バイオリアクタは、環境に対して閉鎖されており、かつ、環境との間で気体および汚染物質を直接的に交換しないシステムを指し得る。光バイオリアクタは、光栄養液体細胞懸濁培養液の、管理されたバイオマス生産のために設計された、閉じられた照明される培養容器として説明され得る。光バイオリアクタの例としては、例えば、ガラス容器、プラスチック／ガラス管、タンク、プラスチックスリーブ、および袋が含まれる。光合成の維持に必要なエネルギーを提供するために使用され得る光源の例としては、例えば、蛍光電球、ＬＥＤ、および自然光が含まれる。これらのシステムは閉鎖されているため、生物の増殖に必要な全てのもの（例えば、二酸化酸素、栄養素、水、および光）がバイオリアクタに導入されなければならない。その構築および維持のコストにもかかわらず、光バイオリアクタは、開放型システムに比べて有利な点をいくつか有する。例えば、光バイオリアクタは、汚染を防止または最小化すること、培養条件（例えば、ｐＨ、光、二酸化酸素、および温度）をより制御しやすくすること、水の蒸発を防ぐこと、脱気による二酸化酸素の喪失を低減すること、および、より高い細胞濃度を許容することが可能である。一方で、冷却、撹拌、酸素の蓄積ならびに生物付着の制御などの光バイオリアクタの一定の必要条件のために、これらのシステムの構築および稼働は、開放型システムまたは半閉鎖型システムよりも高価となる。光バイオリアクタは、（より大容量の培養システムの大部分のように）継続的に回収されるように、または（例えば、ポリエチレンの袋での培養のように）一度に１バッチを回収するように構築され得る。バッチ光バイオリアクタは、例えば、栄養素、微細藻類、および水で構築され、微細藻類は、バッチが回収されるまで増殖させられる。継続的光バイオリアクタは、例えば、継続的に、毎日、または一定の時間間隔で、回収され得る。
【００７４】
例えば、微細藻類を含む液体の表面の下からＣＯ２でバブリングすることによって、ＣＯ２は本明細書に記載のシステムのいずれかに送達され得る。また、スパージ（ｓｐａｒｇｅ）も液体へのＣＯ２の注入に使用され得る。スパージャは、例えば、バブラ（Ｂｕｂｂｌｅｒ）、カーボネータ（Ｃａｒｂｏｎａｔｏｒ）、エアレータ（Ａｅｒａｔｏｒｓ）、ポーラスストーン（Ｐｏｒｏｕｓ  Ｓｔｏｎｅ）およびディフューザ（Ｄｉｆｆｕｓｅｒ）とも呼ばれる多孔性の円盤状アセンブリまたは管状アセンブリである。
【００７５】
本明細書に記載のシステムにおいて使用され得る栄養素には、例えば、窒素（ＮＯ３−またはＮＨ４の形態）、リン、および微量金属（Ｆｅ、Ｍｇ、Ｋ、Ｃａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｚｎ、Ｖ、およびＢ）が含まれる。栄養素は、例えば、固体形態または液体形態で入れることができる。栄養素が固体形態の場合、それらは、微細藻類を含む液体に送達される前に、または光バイオリアクタに送達される前に、例えば、淡水または海水と混合され得る。
【００７６】
微細藻類は、大スケール培養で増殖され得る。ここで、大スケール培養とは、約６リットル超、または約１０リットル超、または約２０リットル超の体積での培養増殖を指す。また、大スケール増殖は、５０リットル以上、１００リットル以上、または２００リットル以上の体積での培養増殖である可能性もある。
【００７７】
最適増殖温度は一般に約２０℃〜約２５℃であるが、これは種類に依存する。ある実施形態によれば、微細藻類細胞の密度は、回収前に１０５〜１０８／ｍｌに達する。
【００７８】
経口摂取のための材料を調製するために、または食品組成物として調製するために、何らかの回収後処理が使用されてよい。従来の処理は一般に、藻類が増殖された液体培養液からの、少なくとも部分的な藻類バイオマスの分離を含む。任意選択で、標的対象および用途の態様に応じて多様なサイズのペレットを形成するために、藻類バイオマスはホモジナイズされ、および／または乾燥され得る。調製の他の態様は、スプレー乾燥、流動床乾燥を含み、または液体懸濁液として材料を提供することさえ含む。
【００７９】
回収された本発明の遺伝子組換え微細藻類は、それ自体で投与され得、食用の希釈剤、賦形剤または運搬体をさらに含む食用組成物へ製剤化され得る。微細藻類またはこれを含む組成物はさらに食品添加物として使用され得る。一部の実施形態によれば、食用組成物は、動物用飼料組成物である。ある現在の特定の実施形態によれば、動物用飼料組成物は、水生動物および陸生動物への給餌用である。さらに他の実施形態によれば、食用組成物は、ヒトにおける摂取用である。
【００８０】
さらなる態様によれば、本発明は、動物の成長速度、成長パターン、生殖についての健康状態、生存またはそれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも一つを改善するための方法であって、本発明の遺伝子組換え微細藻類またはこれを含む組成物を動物に投与して、それにより該動物の成長速度および／または成長パターンおよび／または生存および／または生殖についての健康状態を改善することを含む方法を提供する。
【００８１】
以下の実施例は、本発明の一部の実施形態をより完全に説明するために提示される。しかし、それらは決して、本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される原理に対する多くの変更および改変を容易に考案することができる。
【００８２】
実施例
これらの実施例は、本発明の実施形態の少なくとも一部の態様の特定の実施に関する。実施例は例示に過ぎず、決して限定することを意図するものではない。
【００８３】
材料および方法
サケ成長ホルモン遺伝子の合成
サケ成長ホルモンのアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＴ０２４０９）を、成熟したサケ成長ホルモン（配列番号１２、本明細書においては「魚類成長ホルモン」または「ｆＧＨ」と呼ぶ）をコードするポリヌクレオチドの合成のための基礎として使用した。「Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ  ＧｍｂＨ」のＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのコドン使用頻度を用いてポリヌクレオチドの合成をおこない、それにより配列番号１に示される新規のポリヌクレオチド配列を形成した。このコドン使用頻度は未だこのタンパク質に対しては使用されていないため、この新規の配列は、以前には開示されていなかった。さらに、以下でより詳細に考察されるように、この特定の配列は、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍによってより効率よく発現されるように設計された。
【００８４】
ＥＲへ標的化されるサケ成長ホルモン遺伝子の構築
以下に従って、ｆＧＨ成長ホルモン遺伝子を、その５’端においてＢｉｐ小胞体リーダー配列（Ｋｉｌｉａｎ  Ｏ  ａｎｄ  Ｋｒｏｔｈ  Ｐ．２００５．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ：４１：１７５−１８３）（核酸：配列番号１６；アミノ酸：配列番号２）に融合し、Ｂｉｐ−ｆＧＨ（核酸：配列番号１７；アミノ酸：配列番号３）を作製した。
【００８５】
以下のプライマーを用いてＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのゲノムＤＮＡからＢｉｐリーダー配列を増幅した。
順方向Ｂｉｐ（Forward Bip）  GGAATTCATGATGTTCATGAGAATTGC  （配列番号３６）。
逆方向Ｂｉｐ−ｆＧＨ−Ｖ２（Reverse Bip-fGH-V2）  ACGCTGGTTTTCAATCACGGTACCCATCTT  （配列番号３７）。
【００８６】
以下のプライマーを用いてＢｉｐリーダー配列産物を増幅した。
順方向Ｂｉｐ（Forward Bip）  GGAATTCATGATGTTCATGAGAATTGC  （配列番号３８）。
逆方向Ｂｉｐ−ｆＧＨ−Ｖ２（Reverse Bip-fGH-V2）  ACGCTGGTTTTCAATCACGGTACCCATCTT  （配列番号３９）。
【００８７】
以下のプライマーを用いてｆＧＨを増幅した。
順方向Ｂｉｐ−ｆＧＨ−Ｖ２（Forward Bip-fGH-V2）  AAGATGGGTACCGTGATTGAAAACCAGCGT  （配列番号４０）。
逆方向ｆＧＨ  ＢｇｌＩＩ（Reverse fGH BglII）  GAGATCTGAGGGTGCAGTTGG  （配列番号４１）。
【００８８】
増幅したＰＣＲ産物（Ｂｉｐ、ｆＧＨ）、および上記のプライマーfor BipとRevf BglIIを用いて、第３次のＰＣＲによりＢｉｐリーダー配列をｆＧＨに融合し、配列番号１７に示される核酸配列および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３５６と命名されたコンストラクトを得た。
【００８９】
液胞へ標的化されるサケ成長ホルモン遺伝子の構築
以下に従って、ｆＧＨをコードするポリヌクレオチドを、その５’端において液胞リーダー配列（核酸：配列番号１８；アミノ酸：配列番号４）に、およびその３’端においてＨＡタグ（核酸：配列番号４７；アミノ酸：配列番号５）に融合し、液胞−ｆＧＨ−ＨＡポリヌクレオチド（核酸：配列番号１９；アミノ酸：配列番号６）を作製した。
【００９０】
以下のプライマーを用いて合成ｆＧＨを増幅した。
順方向ｆＧＨ  ＥｃｏＲＩ（Forward fGH EcoRI）  GGAATTCATGGGCCAAGTCTTTCTCTTG  （配列番号４２）。
逆方向ｆＧＨ  ＢｇｌＩＩ（Reverse fGH BglII）  GAGATCTGAGGGTGCAGTTGG  （配列番号４１）。
【００９１】
ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩを用いて、産物をｐＰｈａＴ１−ＨＡプラスミドに連結した。
【００９２】
以下のプライマーを用いてｆＧＨ−ＨＡのテンプレートを増幅した。
順方向ｆＧＨ  ＢａｍＨＩ（Forward fGH BamHI）：  GGATCCATTGAAAACCAGCGTTTGTTCAAC  （配列番号４３）。
逆方向Ｈｉｎｄ  ＨＡ（Reverse Hind HA）：
AAGCTTTTACTGGGCGGCGTAGTCCGGGACGTCGTAGGGGTA  （配列番号４４）。
【００９３】
ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより、ＰＣＲ産物をｐＰｈａＴ１にクローン化した。
【００９４】
以下のプライマーを用いて、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのｃＤＮＡから液胞リーダー配列を増幅した。
EcoR1-Vac54681：  ATGAATTCATGTCGATTCGTCTCT  （配列番号４５）。
BamH1-Vac54681：  ATGGATCCAGTTTGGGCAGTTGCC  （配列番号４６）。
【００９５】
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いてｆＧＨ−ＨＡと液胞リーダー配列とを連結し、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、配列番号１９に示される核酸配列を有する３９８と命名されたコンストラクトを得た。
【００９６】
液胞へ標的化されるＧＦＰをコードするポリヌクレオチドの構築
上記のコンストラクトにおいて、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより、ＧＦＰをコードするポリヌクレオチド（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｐ４２２１２、配列番号２９に示される核酸配列を有し、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする）で魚類成長ホルモンをコードするポリヌクレオチドを置換し、液胞標的化ＧＦＰ（配列番号３０、アミノ酸配列；配列番号３１、核酸配列−Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのコドン使用頻度を用いて調製）をもたらし、配列番号３１に示される核酸配列および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する５２７と命名されたコンストラクトを得た。
【００９７】
液胞−ｆＧＨ−ＭＴＳ−ＨＡの構築
Ｂｉｏｍａｔｉｋにより、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのコドン使用頻度に従って繊維芽細胞成長因子由来の膜移行配列（ＭＴＳ）が合成された（配列番号７）。ＢｇｌＩＩを用いて、ｆＧＨの３’において移行配列を液胞−ｆＧＨ−ＨＡに連結し、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する液胞−ｆＧＨ−ＭＴＳ−ＨＡをコードするコンストラクトを作製した。
【００９８】
液胞−ＧＦＰ−ＭＴＳの構築
Ｂｉｏｍａｔｉｋにより、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのコドン使用頻度に従って繊維芽細胞成長因子由来の膜移行配列（ＭＴＳ）が合成された。ＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ＧＦＰの３’において移行配列を液胞−ＧＦＰに連結し、液胞−ＧＦＰ−ＭＴＳコンストラクト（核酸配列：配列番号３３；アミノ酸配列：配列番号３２）を作製した。
【００９９】
液胞−ｆＧＨ−ＴＡＴ−ＨＡの構築
Ｂｉｏｍａｔｉｋにより、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのコドン使用頻度に従ってヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ１）由来のトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）が合成された（配列番号９）。ＢｇｌＩＩにより、ｆＧＨの３’において液胞−ｆＧＨ−ＨＡにドメインを２回繰り返してタンデムに融合し、液胞−ｆＧＨ−ＴＡＴ−ＨＡコンストラクト（配列番号１０）を作製した。
【０１００】
液胞−ＧＦＰ−ＴＡＴ
Ｂｉｏｍａｔｉｋにより、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのコドン使用頻度に従ってヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ１）由来のトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）が合成された。ＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ＧＦＰの３’において液胞−ＧＦＰに遺伝子を連結し、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する液胞−ＧＦＰ−ＴＡＴタンパク質をコードする配列番号３５に示される核酸配列を有する液胞−ＧＦＰ−ＴＡＴコンストラクトを作製した。
【０１０１】
藻類発現ベクターへのコンストラクトのクローン化
Ａｐｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６．Ｍｏｌ．ＧｅｎＧｅｎｅｔ．２５２：５７２−５７９）に従い、プラスミドｐＰＨＡＴ１（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ２１９９４２）（配列番号１１）において、ｆｃｐＡプロモーターおよびｆｃｐＡターミネーターの制御下に、本発明の様々なポリヌクレオチドおよびコンストラクトをさらにクローン化した。ｆｃｐＡプロモーターは、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおいてはたらくことが現在知られている唯一のプロモーターである。しかし、他のプロモーターがＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍならびに他の藻類において使用され得ることが明白に理解されるべきである。
【０１０２】
ベクターは、
・その下流に目的の遺伝子がクローン化されるｆｃｐＡ（フコキサンチンクロロフィルタンパク質Ａ）プロモーター、
・ＭＣＰ−マルチクローニングサイト、
・ゼオシン耐性およびフレオマイシン耐性を与えるタンパク質をコードする、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ由来ｓｈ  ｂｌｅ遺伝子を制御するｆｃｐＢ（フコキサンチンクロロフィルタンパク質Ｂ）プロモーター、
・目的の遺伝子の後ろおよびゼオシン耐性遺伝子の後ろにあるｆｃｐＡターミネーター、
・アンピシリン耐性遺伝子、
・Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来複製開始点
を含んだ。
【０１０３】
図１は、ｐＰｈａＴ１発現ベクターの全体を示す。
【０１０４】
ｆｃｐＡプロモーターおよびｆｃｐＡターミネーターの下に、ｆＧＨをコードするポリヌクレオチド（配列番号１）をクローン化した。プラスミドは、ｆｃｐＢプロモーターおよびｆｃｐＡターミネーターの制御下に、選択可能マーカーであるブレオマイシンを含んだ。
【０１０５】
クローニングおよび分子的手法
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号ＦＺ−Ｆ−５３０Ｓ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ（Ｚｏｔａｌ））またはＲＥＤＴａｑ  ｒｅａｄｙ  ｍｉｘ  ＰＣＲ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘ（カタログ番号Ｒ２５２３−１００ＲＸＮ、Ｓｉｇｍａ）を用いてＰＣＲをおこなった。Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号Ａ９２８１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＰＣＲ反応を洗浄した。
【０１０６】
ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ）（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号６０２３（Ｏｒｎａｔ））またはＴ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  Ｍ０２０２Ｔ  ＮＥＢ（Ｅｌｄａｎ）を用いてライゲーションをおこなった。Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、番号ＥＰ００６１）を用いて５’または３’のオーバーハングのブランティングをおこなった。
【０１０７】
Ｐｕｒｅ  Ｙｉｅｌｄ（商標）  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ａ２４９２．（ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いてＤＮＡミディプレップをおこない、ＡｃｃｕＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＩＯＮＥＥＲ  Ｋ−３０３０）を用いてＤＮＡミニプレップをおこなった。Ｆａｗｌｅｙ＆Ｆａｗｌｅｙ（Ｆａｗｌｅｙ  Ｍ  Ｗ  ａｎｄ  Ｆａｗｌｅｙ  Ｋ  Ｐ．２００４．Ｊ  Ｐｈｙｃｏｌ  ４０：２２３−２２５）に従ってＤＮＡゲノムの単離をおこなった。全てのキットおよび酵素を、製造業者の指示に従って取り扱った。
【０１０８】
藻類の培養および回収
藻類の培養および回収を、本発明の出願人に属する米国特許出願公開第２０１１／００８１７０６号に記載されるようにおこなった。簡潔に説明すると、珪藻を増殖させるためのＦ／２栄養素で強化した濾過された海水中で藻類を培養した（「Ａｎｄｅｒｓｅｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｒｅｃｉｐｅｓ  ｆｏｒ  ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ  ａｎｄ  ｓｅａｗａｔｅｒ  ｍｅｄｉａ．  Ｉｎ：  Ａｌｇａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｒ．  Ａ．  Ａｎｄｅｒｓｅｎ，  ｅｄｓ），ｐｐ．４２９−５３８．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ」から改変）。７２時間ごとに最終培養体積に対して１：１０００の用量でＦ／２を加えた。一定の温度状況を２１℃に維持した。１００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２ｓ１の光強度で、明：暗を１６時間：８時間に設定した。ＣＯ２を空気と混合し、エアレーションシステムによって、制御された比率で培養液に送達した。藻類を、その最大培養密度付近にて実験のために回収した。藻類の凝集を促進するために水酸化カルシウムを、０．１５ｇ／ｍｌのＣａ（ＯＨ）２を含む水中粒子の微細懸濁液として培養液に加え、その後、培養液を濾過するか、または遠心分離した。得られた藻類沈殿物を凍結乾燥した。
【０１０９】
藻類の形質転換
Ｉ．微粒子銃による形質転換
上記に記載したように、人工海水（ＡＳＷ）Ｆ／２培地において、新しい藻類培養液を対数期の半ば（２〜５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）まで増殖させた。照射の２４時間前に細胞を回収し、新しいＡＳＷ＋Ｆ２で２回洗浄して、元の細胞体積の１／１０となるようにＡＳＷ＋Ｆ／２に再懸濁した。細胞懸濁液０．５ｍｌを、凝固させたＡＳＷ＋Ｆ／２培地を含む５５ｍｍのペトリ皿の中央にスポットする。プレートを放置して、通常の増殖条件下で乾燥させる。直径が２ミクロンより大きい細胞についてはＭ１７  ｔｕｎｇｓｔｅｎ  ｐｏｗｄｅｒ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて、および、より小さい細胞については０．６ミクロン未満の粒子からなるタングステンパウダー（ＦＷ０６，Ｃａｎａｄａ  Ｆｕｊｉａｎ  Ｊｉｎｘｉｎ  Ｐｏｗｄｅｒ  Ｍｅｔａｌｌｕｒｇｙ  Ｃｏ．，Ｍａｒｋｈａｍ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、ＰＤＳ  １０００／Ｈｅ  ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ  ＵＳＡ）を製造業者の指示に従って使用して照射をおこなった。タングステンを直鎖状ＤＮＡで被覆した。１１００または１３５０ｐｓｉのラプチャーディスクを使用した。使い捨て用品は全てＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃから購入した。照射後に、プレートを通常の増殖条件下で２４時間インキュベートし、その後、細胞を選択固体培地上にプレーティングして、単一のコロニーが出現するまで通常の増殖条件下で培養した。
【０１１０】
ＩＩ．エレクトロポレーションによる形質転換
上記に記載したように、人工海水（ＡＳＷ）＋Ｆ／２培地において、藻類培養液を対数期半ばまで増殖させた。その後、細胞を回収し、新しい培地で２回洗浄した。元の体積の１／５０となるように細胞を再懸濁した後、ＡＳＷ中４％のヘミセルラーゼ（Ｓｉｇｍａ）および２％のドリセラーゼ（Ｓｉｇｍａ）を等体積で加えることによりプロトプラストを調製し、３７℃で４時間インキュベートした。カルコフロールホワイトで染色されないことによりプロトプラストの形成を試験した。０．６ＭのＤ−マンニトールおよび０．６ＭのＤ−ソルビトールを含むＡＳＷでプロトプラストを２回洗浄し、同じ培地に再懸濁した。その後、ＤＮＡを加えた（プロトプラスト１００μｌごとに１０μｇの直鎖状ＤＮＡ）。冷えたエレクトロポレーションのキュベットにプロトプラストを移して、氷上で７分間インキュベートし、その後、ＥＣＭ８３０エレクトロポレーション装置（ＢＴＸ，Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）においてパルスした。１０００〜１５００ボルト、１パルスあたり１０〜２０ｍｓｅｃの範囲にわたる様々なパルスが通常使用される。各キュベットを５〜１０回パルスした。パルス後直ちにキュベットを氷上に５分間置き、その後、プロトプラストを２５０μｌの新しい増殖培地（非選択的）に加えた。２５℃にて低光量で２４時間プロトプラストを培養した後、細胞を選択固体培地上にプレーティングして、単一のコロニーが出現するまで通常の増殖条件下で培養した。
【０１１１】
ＩＩＩ.マイクロポレーションによる形質転換
新しい藻類培養液をＡＳＷ＋Ｆ／２培地において対数期の半ばまで増殖させた。培養液試料１０ｍｌを回収し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で２回洗浄して、２５０μｌのバッファＲ（マイクロポレーション装置およびキットの製造者であるＤｉｇｉｔａｌ  Ｂｉｏ，ＮａｎｏＥｎＴｅｋ  Ｉｎｃ．（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）により供給）中に再懸濁した。細胞１００μｌごとに直鎖状ＤＮＡを８μｇ加えた後、細胞をパルスした。細胞の種類に応じて、７００〜１７００ボルト、パルス長さ１０〜４０ｍｓｅｃの範囲にわたる様々なパルスが一般に必要である。各試料を１〜５回パルスした。パルス後直ちに細胞を２００μｌの新しい培地（非選択的）に移した。２５℃にて低光量で２４時間培養した後、細胞を選択固体培地上にプレーティングして、単一のコロニーが出現するまで通常の増殖条件下で培養した。
【０１１２】
タンパク質の抽出
５×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌの細胞を１０ｍｌ回収し、５００μｌの抽出バッファ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ＝７．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；０．５％  ＮＰ−４０；およびプロテアーゼインヒビター（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ９５９９））に再懸濁した。その後、１００μｌのガラスビーズ（４２５〜６００μπι、Ｓｉｇｍａ）を加え、ビーズビーター（ＭＰ  ＦａｓｔＰｒｅｐ−２４，ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ，ＵＳＡ）中で２０秒間細胞を破壊した。チューブの内容物を４℃にて１３０００×ｇで１５分間遠心分離した。定量およびウェスタンブロット解析のために、上清を新しいバイアルに移した。
【０１１３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の分離およびウェスタン解析
抽出したタンパク質を４−２０％グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｇｅｂａ  ｇｅｌｓ  ４−２０％  Ｂｉｏ−ｌａｂ，１０ＧＧ０４２０−８）上で１００Ｖにて１時間分離した。ブロッキングバッファ（５％スキムミルク、Ｄｉｆｃｏ）中で１時間インキュベートした後、タンパク質をクマシー（Ｓｉｇｍａ）で染色するか、あるいはトランスファーバッファ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシンおよび２０％メタノール）中でＰＶＤＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）膜上に１００ボルトで１時間ブロットした。ブロッキングバッファ中で１：１０００の比率に希釈した、抗ＨＡ抗体（Ｂｉｏｔｅｓｔ  ＭＭＳ−１０１Ｐ−５００）またはサケ成長ホルモン抗体（ＧｒｏＰｅｐ：ＰＡＮ１）のいずれかでタンパク質を検出した。ブロッキングバッファ中で１：１００００に希釈した、マウス（ＨＡ抗体用）またはウサギ（サケ成長ホルモン用）のホースラディッシュペルオキシダーゼ二次抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用した。製造業者の指示に従いＥＺ−ＥＣＬキット（Ｂｉｏ  Ｉｎｄ．Ｐｒｏｍｅｇａ：２０−５００−１２０）を用いて検出をおこなった。
【０１１４】
ＥＬＩＳＡ解析
ｐＨ９．６の炭酸塩／炭酸水素塩中において、モノクローナル抗ＨＡ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）でＥＬＩＳＡプレート（ｍｉｃｒｏｌｏｎ、Ｇｒｅｉｎｅｒ）を４℃にて一晩被覆した。次に、ＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）でプレートを洗浄し、ＰＢＳ中１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で室温（ＲＴ）にて４時間ブロッキングした。血清試料をＥＬＩＳＡ被覆バッファ中で段階希釈し、プレート上にロードした。血清試料で一晩インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、抗ＨＡ−ビオチン（Ｒｏｃｈｅ）で室温にて１時間インキュベートした。さらなる洗浄工程の後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合させたストレプトアビジンを加え、プレートを室温（ＲＴ）にて１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、テトラメチル−ベンジジン（ＴＭＢ）基質をプレートに加えた。十分に呈色したところで、０．１６Ｍの硫酸で反応を停止させた。Ｅｎｓｐｉｒｅ  ２３００  ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、各ウェルにおける吸光度を４５０ｎｍにて測定した。
【０１１５】
魚の維持管理および給餌
重量が７０〜１００グラムの１０匹の魚ティラピアのグループを、１００リットルの通気される水槽中で、２６〜２８℃の温度にて維持した。光周期は、明（１２時間）：暗（１２時間）とした。処置前に１週間、全ての魚を水槽中で順応させた。クローブの芽の抽出物（ｃｌｏｖｅ  ｂｕｄ  ｅｘｔｒａｃｔ）（Ｒｏｔｈ）１００ｐｐｍで軽度に麻酔した魚に対して藻類懸濁液の経口投与をおこなった。異なる藻類懸濁液の経口投与（経管栄養給餌）のために、注入シリンジに取り付けたポリエチレンチューブ（長さ６〜８ｃｍ、ｉ．ｄ．３ｍｍ）を使用した。
【０１１６】
給餌試験
凍結乾燥した、サケ成長ホルモンを発現する遺伝子組換え藻類を、終濃度１〜４％となるように通常の魚用飼料に添加した。魚は、それらの全体重の１０％〜１５％で給餌された。観賞魚、ニシキゴイ、Ｓｃａｌａｒｅおよびキンギョシュブンキンへの６週間の給餌には、遺伝子組換え藻類および通常の魚用飼料を使用した。温度、ｐＨ、アンモニア、亜硝酸レベルなどについて各試験をモニターした。各実験の終了時に、魚の総成長量、形態異常および生存率を解析した。
【０１１７】
実施例１：魚類（サケ）成長ホルモンを発現する藻類
ＥＲ（コンストラクト３５６と命名）または液胞（コンストラクト３９８と命名）へ標的化されたサケ成長ホルモンをコードするポリヌクレオチドを有するＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ種の遺伝子組換え藻類を培養し、遺伝子組換えタンパク質の発現について解析した。ウェスタンブロット解析のために等量の総可溶性タンパク質（２０μｇ）を遺伝子組換え藻類から抽出した。図２に示すように、抗サケ成長ホルモン抗体を用いて検出をおこなった。
【０１１８】
ＥＲ−標的化サケ成長ホルモンを発現する藻類の系統は、液胞−標的化サケ成長ホルモンを発現する藻類の系統に比べ、より高い遺伝子組換えタンパク質の発現レベルを示している。
【０１１９】
実施例２：エンゼルフィッシュの給餌試験
小胞体または液胞（それぞれコンストラクト３５６、３９８）へ標的化された魚類成長ホルモンを過剰発現する遺伝子組換えＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍを追加した魚用飼料、あるいは通常の非遺伝子組換えの魚用飼料（対照）を観賞用エンゼルフィッシュ（Ｓｃａｌａｒｅ）に６週間与えた。通常の魚用飼料に藻類を４％で追加した。それぞれ２０匹の魚を含む独立した反復（ｎ＝５）として水槽内で魚の成長を追跡した。図３は、遺伝子組換え藻類（魚用飼料に混合）で処置したエンゼルフィッシュの総成長パフォーマンスを、通常の魚用飼料を与えた魚と比較して示す。
【０１２０】
（成長ホルモンが液胞へ標的化された）コンストラクト３９８を有する遺伝子組換え藻類を含む飼料を与えた魚は、通常の飼料（対照）を与えた魚に比べ、より高い総魚バイオマス（〜１５％）をもたらしたが、一方で、（成長ホルモンがＥＲへ標的化された）コンストラクト３５６を有する遺伝子組換え藻類を含む飼料を与えた魚は、対照と比較して有意により良好に成長することはなかった。
【０１２１】
同じくエンゼルフィッシュでおこなった並列実験において、液胞へ標的化されたｆＧＨ（コンストラクト３９８）を発現する藻類を含む通常飼料を魚に与えると、通常の魚用飼料を与えた魚に比べて、２グラム超に達する魚の数が増加した（図４）。マーケティングの観点から、この結果は、液胞へ標的化されたｆＧＨを発現する藻類を通常の魚用飼料に追加することが、個体群における最初の魚の数を増加させることなく、またはそうでなければ、最初の魚の個体群の任意の態様を必ずしも調整することなく、市場での取引に好適な魚の数を増加させることを意味する。
【０１２２】
それぞれ魚が２５匹である５回の反復にて、エンゼルフィッシュを用いて８週間おこなった別の実験では、ｆＧＨ（液胞へと標的化されたｆＧＨ発現、コンストラクト３９８）を発現する藻類を４％追加した飼料を摂取した魚のバイオマスが、通常の魚用飼料を与えた魚に比べ有意に増加するという結果になった（図５）。
【０１２３】
これらの結果は、その発現レベルが、細胞のＥＲへ標的化されたｆＧＨの発現レベルよりも低いと示されたにもかかわらず、藻類細胞の液胞へのｆＧＨの細胞内での標的化が、より良好な機能的効果を生じさせるということを意味する。
【０１２４】
実施例３：魚ニシキゴイの給餌試験
後期仔魚の魚ニシキゴイ（それぞれ６００匹の後期仔魚の魚ニシキゴイを含む４回の独立した反復）に、通常の魚用飼料あるいは液胞へ標的化されたｆＧＨ（コンストラクト３９８）を発現する藻類を４％追加した通常の魚用飼料のいずれかを与えた。８週間にわたって給餌実験をおこなった。実験終了時に、（「Ｊｈａ  Ｐ  ｅｔ．  ａｌ．２００６．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｃｈｔｈｙｏｌｏｇｙ；２３（１）８７−９２」により定義されるように）体の奇形について魚をふるい分けした。体の奇形には、限定されるものではないが、任意の形態不整、体型の非対称性の任意のタイプ、異常な体型、異常なヒレ形状、異常な尾部形状、体／ヒレの異常な面積比、長さ比または幅比、体／尾部の異常な面積比、長さ比または幅比、尾部／ヒレの異常な面積比、長さ比または幅比、あるいは任意の体部位における不整が含まれる。図６は、通常の魚用飼料を与えた魚および液胞へ標的化されたｆＧＨを発現する藻類（コンストラクト３９８）を４％含む通常の飼料を与えた魚の、正常形状および奇形形状の割合を示す。
【０１２５】
図６から明らかなように、通常の魚用飼料を与えられた魚の個体群では、奇形の魚が４５％となり、一方で、ｆＧＨを発現する藻類（コンストラクト３９８）を追加した魚用飼料を与えられた魚の個体群では、奇形の魚は３８％に過ぎなかった。
【０１２６】
実施例４：キンギョの給餌試験
液胞へ標的化された魚類成長ホルモンを過剰発現する遺伝子組換えＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍを追加した魚用飼料（コンストラクト３９８）または通常の魚用飼料（対照）を、後期仔魚の観賞用キンギョ（Ｓｈｕｂｕｎｋｉｎ）に６週間にわたって与えた。通常の魚用飼料に藻類を４％で追加した。それぞれ４０匹の魚の、６回の独立した反復にて、処置を試験した。図７は、遺伝子組換え藻類を与えたキンギョの総重量が、通常飼料を与えた魚に比べて、約〜１５％高かったことを示す。
【０１２７】
成長パフォーマンスに加え、実験中の幼魚の生存は、対照の水槽では約６４％であった。ｆＧＨを発現する藻類（コンストラクト３９８）を追加した飼料を魚に与えた水槽では、生存率が約８０％まで上昇した。これは、ｆＧＨを発現する藻類が、その成長促進効果に加えて魚の生存にも寄与することを意味する。
【０１２８】
実施例５：Ａｒｔｅｍｉａの給餌試験
野生型Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、野生型Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、または魚類成長ホルモン（ｆＧＨ）を発現するＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ（コンストラクト３９８）をブラインシュリンプ（Ａｒｔｅｍｉａ）に１２日間与えた。野生型Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓまたは野生型Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍをそれぞれ与えたＡｒｔｅｍｉａと比較した場合、ｆＧＨを発現するＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍを与えたＡｒｔｅｍｉａは、有意により大きく（約４０％）、メスは３日早く性成熟に達した（図８および９）。
【０１２９】
詳細には、図８は、野生型Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ（図８Ａ）、野生型Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ（図８Ｂ）、または魚類成長ホルモンを発現するＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍをブラインシュリンプに与えた後の結果を示す。１２日後に写真を撮影した。
【０１３０】
図９は、単一飼料として異なる藻類を与えられた魚の、測定された平均体長を示す。体長の測定については、野生型Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ（対照）、野生型Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ（ｗｔ）、または魚類成長ホルモンを発現するＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ（コンストラクト３９８）を与えた２６匹の無作為に選択されたブラインシュリンプの体長を１２日後に測定した。ｆＧＨを発現する藻類を与えたブラインフィッシュ（Ｂｒｉｎｅ  ｆｉｓｈ）は、有意に、より長いことが見出された。まとめると、これらの結果は、ブラインシュリンプおよび甲殻類において、藻類の液胞へ標的化された魚類成長ホルモンを発現する藻類を飼料または飼料添加物として使用することは、それらの成長を、特に体長について、促進し、およびそれらの性成熟を促進することを示唆する。
【０１３１】
実施例６：Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ  ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｉの給餌試験
通常飼料（対照）、または藻類の液胞へ標的化された魚類成長ホルモンを過剰発現する遺伝子組換えＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍを追加した通常飼料（コンストラクト３９８）を淡水エビＭａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ  ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｉ、ＰＬ１０、に６週間にわたって与えた。通常飼料に藻類を８％で追加した。図１０は、遺伝子組換え藻類で処置したＭａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ  ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｉの総重量が、通常飼料を与えたエビに比べて、有意に２１％高かったことを示す。これは、ｆＧＨを発現する藻類が、エビの成長促進に寄与することを意味する。
【０１３２】
実施例７：魚によるＧＦＰの吸収
魚用飼料対藻類の比率が１：１となるように野生型Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍまたは液胞へ標的化されたＧＦＰを発現するＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍを混合した魚用飼料を、１週間飢餓状態にした５０〜１００グラムのサイズの魚ティラピアに与えた。給餌から１〜４時間後に、ティラピアの胃および腸を取り出し、蛍光双眼鏡下で解析した。図１１は、給餌から４時間後のティラピアの胃における、発現された外因性のＧＦＰの蛍光を明確に示す。これは、胃の酸性環境において蛍光タンパク質が分解されなかったことを意味する。さらに、タンパク質の明確な蛍光が腸においても観察された（図１２）。要するに、これらの結果は、タンパク質が胃の酸性環境において分解されないこと、それが微細藻類から魚の腸へと送達されること、およびさらに、これらの条件下でタンパク質がその生物学機能を維持することを示す。
【０１３３】
実施例８：エビによるＧＦＰの吸収
孵化後に３日間、野生型の藻類（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）のみ、または液胞へ標的化されたＧＦＰを発現する藻類（液胞−ＧＦＰ発現藻類）のみをブラインシュリンプＡｒｔｅｍｉａに与えた。１×ＡＳＷ培地で成長した８０００匹のＡｒｔｅｍｉａに１．５×１０９の藻類を与えた。給餌から４時間後に、Ａｒｔｅｍｉａを慎重に洗浄し、蛍光下で解析した。図１３は、藻類において発現されたＧＦＰタンパク質が、その完全な形態および生物学的形態でＡｒｔｅｍｉａの消化器系内に位置することを示す（図１３Ｂ）。これらの結果は、本発明に開示される微細藻類のシステムがタンパク質の経口送達に非常に好適であることを再度示し、タンパク質は、その完全な形態および生物学的に活性のある形態で微細藻類から受容者の消化器系へ送達される
【０１３４】
さらなる追加の実験において、飼料対藻類の比率が１：１となるように、野生型の藻類（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）の粉末または液胞−ＧＦＰ発現藻類の粉末を混合した通常の飼料からなるペレットを、飢餓状態の淡水エビ、Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ  ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｉ、ＰＬ１０、に与えた。給餌から４時間後に、蛍光下でエビを解析した。図１４は、ＧＦＰタンパク質がエビの肝膵臓腺に位置することを示す。これは、この動物におけるＧＦＰの経口送達を意味する。ここでも、タンパク質は、完全かつ活性のある状態で送達された。
【０１３５】
実施例９：ニワトリによるＧＦＰの吸収
野生型の藻類（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）の粉末１００ｍｇ、または、５ｍｌの０．５×人工海水（ＡＳＷ）に懸濁した、液胞へ標的化されたＧＦＰを発現する藻類を２週齢のニワトリに強制給餌した。給餌から２、４、６および２４時間後にニワトリを屠殺し、肝臓を取り出して蛍光の下で解析した。図１５は、ＧＦＰタンパク質が、給餌から６時間後に、その完全かつ機能的な形態でヒヨコの肝臓へと吸収されたことを示す。これは、ＧＦＰタンパク質が、酸性の消化管を通過し、その後、腸壁を通って血液へと吸収され、肝臓へ循環することを意味する。この結果は、ニワトリへのタンパク質の経口送達の全経路を示す。
【０１３６】
実施例１０：魚の血液へのタンパク質の経口送達
魚類成長ホルモンを発現する藻類（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）またはＧＦＰを発現する藻類（いずれも藻類の液胞へと標的化される；それぞれ、液胞−ｆＧＨ発現藻類および液胞−ＧＦＰ発現藻類）を魚ティラピアに与えた。８００ｍｇの藻類の粉末を３０ｍｌの０．５×ＡＳＷに懸濁した。２ｍｌの藻類懸濁液を各魚に強制給餌した。無菌のシリンジおよびチューブを用いて、尾静脈から血液試料を採取した。蛍光プレートリーダーにおける直接的な蛍光解析に５０マイクロリットル（μｌ）の各血液試料を割り当てた。残りの試料を室温で１５分間放置し、４℃にて一晩経過後、４℃にて１０分間２５０ｇで遠心分離することにより血清を分離して、ＥＬＩＳＡ解析のために−２０℃にて無菌のチューブ内で保存した。
【０１３７】
魚ティラピアにおけるｆＧＨの吸収
液胞−ｆＧＨ発現藻類（コンストラクト３９８）または液胞−ＧＦＰ発現藻類（コンストラクト５２７）を魚ティラピアに強制給餌した。給餌から１時間後に、ＥＬＩＳＡ解析のために血液試料を採取した。ｆＧＨに融合させたＨＡドメインの発現を抗ＨＡ抗体を用いて検出することによってｆＧＨタンパク質の存在を確認した（上記の材料と方法を参照のこと）。液胞−ｆＧＨ発現藻類を与えた魚から採取した血液試料は抗ＨＡ抗体に対して陽性反応を示すが、一方で、液胞−ＧＦＰ発現藻類を与えた魚から採取した血液試料は、有意なシグナルを示さなかった（図１６）。ＥＬＩＳＡの結果は、ｆＧＨタンパク質が血液中に存在することを支持し、藻類において発現されるタンパク質が、藻類を経口摂取する生物の血液に到達することを示す。
【０１３８】
魚ティラピアにおけるＧＦＰの吸収および活性
液胞−ＧＦＰ発現藻類（コンストラクト５２７）または液胞−ｆＧＨ発現藻類（コンストラクト３９８）を魚ティラピア（ｎ＝５）に強制給餌した。給餌から１時間後に血液試料を回収し、Ｅｎｓｐｉｒｅ  ２３００  ｍｕｌｔｉ−ｌａｂｅｌ  ｒｅａｄｅｒを用いて蛍光（励起４８０ｎｍ、発光５１５ｎｍ）下で解析した。液胞−ＧＦＰ発現藻類を与えた魚から回収した血液試料は、蛍光を示した。対照的に、液胞−ｆＧＨ発現藻類（コンストラクト３９８）を与えた魚の血液試料は、有意なシグナルを示さなかった（図１７）。この結果は、ＧＦＰが完全かつ機能的な形態で魚の腸から血液へと吸収されたことを示す。
【０１３９】
実施例１１：液胞へ標的化された外因性タンパク質は消化管において保護される
液胞−ＧＦＰ発現藻類ならびに液胞−ｆＧＨ発現藻類（それぞれコンストラクト５２７およびコンストラクト３９８を保有）および液胞−ＧＦＰ発現藻類の系統から抽出した総タンパク質を、強制給餌により魚に投与される前に（図１８Ａ）、および適用から１時間後に魚から採取した血液試料中において（図１８Ｂ）、ＧＦＰの蛍光について測定した。Ｅｎｓｐｉｒｅ  ２３００  ｍｕｌｔｉ−ｌａｂｅｌ  ｒｅａｄｅｒ（励起４８０ｎｍ、発光５１５ｎｍ）を用いて蛍光を測定した。見て分かるように、ＧＦＰを発現する藻類を与えた魚から採取した血液試料のみが蛍光を発し、液胞−ＧＦＰ発現藻類から抽出された分離されたタンパク質を与えた魚から採取した血液試料は、液胞−ｆＧＨ発現藻類を与えた魚から採取した血液試料中において観察されたように、全くシグナルを示さなかったか、あるいはバックグラウンドのシグナルしか示さなかった。これらの結果は、藻類細胞がＧＦＰタンパク質を保護し、藻類を摂取する生物の血液への、その完全かつ機能的な形態での送達を可能にすることを明確に示す。対照的に、蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を露出したまま経口投与すると、おそらくは消化管におけるその分解のために、その蛍光は消失する。
【０１４０】
実施例１２：マウスへのタンパク質の経口送達
マウス肝臓へのｆＧＨの送達
１２週齢のｂａｌｂ−Ｃのオスのマウスを実験前に１２時間飢餓状態にした。イソフルランでマウスを軽度に麻酔し、経管栄養給餌によって、１．５ｍｌの液胞−ｆＧＨ発現藻類（コンストラクト３９８）または液胞ＧＦＰ発現藻類（コンストラクト５２７）を与えた。
【０１４１】
藻類の投与から２時間後に、イソフルランの過量投与によりマウスを安楽死させた。肝臓を取り外して、液体窒素で凍結した。肝臓から総タンパク質を抽出し、その後、藻類において発現された組換え体のｆＧＨを特異的に認識する、ＨＡタグに対するＥＬＩＳＡ解析をおこなった。図１９に示されるＥＬＩＳＡの結果は、マウス肝臓において組換え体のｆＧＨが検出可能であったことを示し、マウス消化管を通じた血液および肝臓への、その経口通過を示す。
【０１４２】
血液へのＧＦＰの吸収
上記のようにマウスを処置し、給餌から２時間後に心臓から血液試料を採取した。その後、血液試料を遠心分離し、蛍光（励起４８０ｎｍ、発光５１５ｎｍ）下で血漿を解析した。液胞−ＧＦＰ発現藻類を与えたマウスの血液試料は、液胞−ｆＧＨ発現藻類を与えたマウスの血液試料に比べて、有意により高い蛍光を示した。これは、ＧＦＰが完全かつ機能的な形態で消化管から血液へと通過することを示す。
【０１４３】
実施例１３：促進された、魚およびマウスによるタンパク質吸収
ＣＰＰは、細胞による様々な分子カーゴの取り込みを促進する短鎖ペプチドである。ＣＰＰの例としては、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ１）由来トランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）および繊維芽細胞成長因子由来膜移行配列（ＭＴＳ）が含まれる。上記の「材料と方法」のセクションに記載されるように、液胞へ標的化されたｆＧＨをコードする遺伝子または液胞へ標的化されたＧＦＰをコードする遺伝子を含むコンストラクトが、ＣＰＰの１つを含むようにさらに設計された。
【０１４４】
上記に記載されるように給餌試験において魚に与えるために、液胞−ｆＧＨ−ＭＴＳ−ＨＡまたは液胞−ｆＧＨ−ＴＡＴ−ＨＡを発現する藻類の系統を使用する。ｆＧＨをＧＦＰで置き換えた上記のコンストラクト（液胞−ＧＦＰ−ＭＴＳ−または液胞−ＧＦＰ−ＴＡＴ−）を形質転換された藻類の系統をモデル系として使用する。さらに、これらの藻類の系統を、経管栄養によりマウスに与えるために使用する。給餌試験の終了時に、藻類を与えた魚またはマウスの血液において、ＨＡタグに対しておこなわれるＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット解析を用いて、藻類により発現されたタンパク質の存在を調べる。さらに、蛍光プレートリーダーによって血液試料のＧＦＰの蛍光を直接検出するか、または抗ＧＦＰ抗体を用いたＥＬＩＳＡによりＧＦＰタンパク質を検出する。
【０１４５】
上記に提示される結果は、藻類Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍが、様々な標的の動物に組換えタンパク質を経口的に送達するための効率の良い手段として機能することを示す。いかなる特定の理論または作用機構に束縛されることを望むものではないが、藻類は、藻類の細胞壁が組換えタンパク質を酸性の胃におけるその酵素的分解から保護する、天然の生物封入として機能する。ここでもいかなる特定の理論または作用機構に束縛されることを望むものではないが、液胞へ標的化されたタンパク質は腸から標的の細胞小器官へ効率良く吸収されることが可能であることを、これらの結果はさらに示唆する。
【０１４６】
要約すると、本願は、動物への組換えタンパク質の完全かつ機能的な形態での経口投与を可能にする、藻類に基づいたプラットフォームの確立を初めて明示する。
【０１４７】
上記の特定の実施形態の説明は、他者が、現在の知識を適用することにより、過度に実験をおこなうことなく、および一般的概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態を様々な用途のために容易に変更および／または適合できるように、本発明の一般的特徴を完全に明らかにするであろう。従って、そのような適合および変更は、開示される実施形態の均等物の意味および範囲内に包含されるべきであり、および、包含されることが意図される。本明細書で使用される語法または用語は説明を目的とするものであり、限定を目的としないことが理解されるべきである。開示される様々な機能を実施するための手段、材料、および工程は、本発明から逸脱することなく、様々な代替の形態をとってよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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