(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロでのmRNAの転写および／またはポリペプチドの翻訳のための方法であって、
転写および／または翻訳のための水溶性薄膜（thin film）の外形である反応溶液中で、前記mRNAおよび／またはポリペプチドを合成する段階を含み、
ここで、
前記反応溶液が、ポリペプチドおよび／またはmRNAの合成装置；前記mRNAの転写および／または前記ポリペプチドの翻訳のためのテンプレート；前記mRNAおよび／またはポリペプチドの合成のためのモノマー；ならびに、前記転写および／または翻訳のために必要なコファクター、酵素および他の試薬、を含む生物学的抽出物を含み、
前記薄膜は、ガス交換のための表面積と体積の比（ガス交換のための表面積／体積）が少なくとも500mm2/mlであり、かつ厚さが2mm以下である、方法。
【請求項２】
合成が、DNAテンプレートからのmRNAの転写、およびポリペプチドを生成するための前記mRNAの翻訳を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
反応溶液が15μlより大きい体積を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
反応溶液が100μlより大きい体積を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
反応が、相当する15μl以下の小規模反応の収率の少なくとも90%の収率を有する、請求項3記載の方法。
【請求項６】
インビトロでのmRNAの転写および／またはポリペプチドの翻訳のためのリアクターであって、
酸素を含有するガスで満たされたヘッドスペースを囲むチャンバを含み、
前記チャンバは、平面基質、および該平面基質の上に薄膜を形成した反応混合物を含み、かつ更にカバーで密閉されていてもよく；ならびに
前記反応混合物は、
(i)ポリペプチドおよび／またはmRNAの合成装置；前記mRNAの転写および／または前記ポリペプチドの翻訳のためのテンプレート；前記mRNAおよび／またはポリペプチドの合成のためのモノマー；ならびに、前記転写および／または翻訳のために必要なコファクター、酵素および他の試薬、を含み、酸化的リン酸化が活性化された生物学的抽出物を含み；
(ii)薄膜の外形である反応溶液であり；かつ
(iii)前記薄膜は、ガス交換のための表面積と体積の比（ガス交換のための表面積／体積）が少なくとも500mm2/mlであり、かつ厚さが2mm以下である、
リアクター。
【請求項７】
反応溶液が15μlより大きい体積を含む、請求項6記載のリアクター。
【請求項８】
反応溶液が100μlより大きい体積を含む、請求項6記載のリアクター。
【請求項９】
反応が、相当する15μl以下の小規模反応の収率の少なくとも90%の収率をもたらす、請求項7記載のリアクター。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
タンパク質合成は、ポリペプチド療法、診断および触媒の開発の基礎をなす基本的な生物学的過程である。組換えDNA（rDNA）技術の出現によって、所望のタンパク質を産生するために細胞の触媒装置を利用することが可能となった。これは、細胞環境内で、またはインビトロで細胞に由来する抽出物を使用することにより、達成できる。
【０００２】
過去10年にわたって、無細胞系の生産性は約5μg/ml-hrから約500μg/ml-hrへと2桁の規模で改善した。この成果により、実験室規模の研究において、インビトロタンパク質合成が実用的な技術となり、かつハイスループットタンパク質発現のためのプラットフォーム技術が提供されることとなった。このことにより、タンパク質製剤のインビボ大規模生産の代替手段として無細胞技術を使用することの実現可能性も提案され始めている。
【０００３】
無細胞タンパク質合成は、従来のインビボタンパク質発現法に勝るいくつかの利点を提供する。無細胞系は、1つのタンパク質の排他的な生産のために、細胞の代謝資源の全てではないにしても、ほとんどを指し向けることができる。さらに、合成環境のより良好な制御を可能にすることから、インビトロでの細胞壁の欠如は有利である。例えば、tRNAレベルは、発現されている遺伝子のコドン利用を反映させるために変えることができる。また、酸化還元電位、pHまたはイオン強度は、細胞成長または細胞生存度についての懸念がないため、インビボと比較してより大きな可動性によって変えることができる。さらにまた、精製され、適切に折りたたまれたタンパク質産物の直接的な回収が容易に達成されうる。
【０００４】
インビトロ翻訳はまた、インビボで不安定、不溶性、または細胞障害性であるタンパク質を産生する可能性があると共に、非天然で、かつ同位体標識されたアミノ酸を組み込む能力があることも認識されている。加えて、無細胞タンパク質合成は、タンパク質工学およびプロテオームスクリーニング技術において、革命的な役割を果たし得る。無細胞方法は、インビボでの新規遺伝子産物の発現のために細胞のクローニングおよび形質転換を行うにあたり必要とされる困難な過程を回避し、この分野のプラットフォーム技術となってきている。
【０００５】
無細胞タンパク質合成の有望な全ての特徴にもかかわらず、その実用および大規模な実施は、いくつかの障害により制限されてきた。それらの中で最たるものは、短い反応時間および低いタンパク質産生率による、低いタンパク質合成収率および過大な試薬コストである。スピーリン(Spirin)ら(1988)、Science 242：1162〜1164の先駆的な研究は、短い反応時間の問題を連続フロー系の開発により当初回避していた。多くの研究室はこの研究を再現し、かつ改善したが、それら全てが主に、反応チャンバに基質を常に供給する方法を使用した。このアプローチは、回分系と比較して、翻訳反応の持続時間およびタンパク質収率を増加させる。しかしながら、これは、高価な試薬の使用には非効率的で、一般に希釈された産物を産生し、産性率の有意な改善をもたらさなかった。
【０００６】
従来の回分系は、これらの連続的および半継続的な方式に勝るいくつかの利点を提供する。これらには、スケールアップの容易性、再現性、増加したタンパク質産生率、便宜性、ハイスループット発現のための多重化フォーマットに対する適用可能性、およびより効率的な基質の使用が含まれる。これらの利点は、無細胞タンパク質合成の工業利用のために重要な回分系生産性の改善をもたらす。しかしながら、現在の方法論を使用しながら反応がスケールアップされると、効率が低下する。より大きな反応中での産物の収率を増加させることは、この必要性を満たす必須要素である。
【０００７】
関連する文献
米国特許第6,337,191号 B1, Swartz et al. Kim and Swartz (2000) Biotechnol Prog. 16:385-390; Kim and Swartz (2000) Biotechnol Lett. 22:1537-1542; Kim and Choi (2000) J Biotechnol. 84:27-32; Kim et al. (1996) Eur J Biochem. 239: 881-886; Tao and Levy (1993) Nature 362: 755-758; Hakim et al. (1996) J Immun. 157:5503-5511; Pratt (1984) Coupled transcription-translation in prokaryotic cell-free systems. In: Hames BD, Higgins SJ. Ed. In transcription and translation: a practical approach. New York: IRL press: 179-209; Danvanloo et al. (1984) PNAS 81:2035-2039; Cock et al. (1999) Biochemistry 259: 96-103; Gill and Hippel (1989) Anal. Biochem. 182:319-326; Kim et al. (1999) Europ. J. Biochem. 239: 881-886。 
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
組成物および方法は、水溶性の薄い膜（film）における生体分子のインビトロ合成のために提供される。反応の外形は、ガス交換のための高表面積を提供する。薄い膜において、反応体積がスケールアップされるにつれて、反応は収率を維持できる。本発明の一態様において、静的な薄い膜は無制限滴下の使用により達成され、ここで、反応培地は平面基質上に引き延ばされ、薄い水溶性層を作製することができる。
【０００９】
態様の詳細な説明
水溶性薄膜フォーマット（aqueous thin film format）における、生体分子のインビトロ合成のための組成物および方法が提供される。薄膜（thin film）は、ガス交換のための高表面積を提供し、かつ、反応体積がスケールアップされるにつれて、反応収率が維持されるという付加的な利点をも提供し得る。対照的に、反応が試験管または類似の容器において実行されるときには、反応体積が増加するにつれて、収率が劇的に減少し得る。
【００１０】
本明細書において使用されるように、インビトロ合成とは生物学的抽出物および／または規定された試薬を含む反応ミックス中における生体高分子の無細胞合成を指す。反応ミックスは、高分子（例えばDNA、mRNAなど）の産生のためのテンプレート、合成される高分子のためのモノマー（例えばアミノ酸、ヌクレオチドなど）、および合成のために必要なコファクター、酵素および他の試薬（例えばリボソーム、tRNA、ポリメラーゼ、転写因子など）を含む。この種の合成反応系は、当技術分野において周知であり、文献に記載されている。本発明の方法において、ポリペプチド合成のための多くの反応化学を使用することができる。例えば、反応化学は、2002年1月8日に発行された米国特許第6,337,191号および2001年1月2日に発行された米国特許第6,168,931号に記載され、本明細書において、参照として組み入れられる。
【００１１】
本発明の一態様において、2002年8月19日に出願された同時係属中の米国特許出願第60/404,591号に記載されている反応化学は、本明細書において参照として組み入れられる。酸化的リン酸化は活性化され、増加した収率とエネルギー源の増強された利用とが提供される。改良された収率は、グルコース含有培地で増殖させた細菌に由来する生物学的抽出物の使用、ポリエチレングリコールの欠如、およびマグネシウム濃度の最適化を含む、複数の因子の組合せによって得られる。これは、恒常性の系を提供し、この系において、合成は二次的なエネルギー源が欠如した場合にも起こり得る。
【００１２】
反応の外形
本発明の反応混合物は、反応用に薄い膜の外形で設置されており、特に従来の試験管反応と比較すると、体積に対する表面積の比が高い。本発明のいくつかの態様において、薄膜は静的な薄い膜であり、それは実質的に平面的である表面上への反応混合物の堆積により作成される。
【００１３】
例示的なリアクターの概略図は、図1に示される。反応混合物10は、平面基質15の上に薄膜を形成する。薄い膜の領域は（25）に示される。平面的な表面は、平坦でもよく、わずかに凸状でもよく、またはわずかに凹状でもよい。基質はこの例ではチャンバ40と一体化しているが、チャンバ壁は必要でない。反応混合物がチャンバ壁によって、その周辺を囲まれていないことが特筆される。薄い膜に接触しているのはヘッド空間20であり、ガスであって、通常、有気条件を提供する。チャンバは、カバー30で任意に密閉される。
【００１４】
反応はいかなる体積であってもよいが、方法はスケールアップされた反応において最も有利であり、反応体積は、少なくとも約15μl、通常少なくとも約50μl、より通常には少なくとも約100μlであって、さらに、500μl、1000μl、またはそれより大きくてもよい。ほとんどの場合、個々の反応は約10mlを超えないが、多数の反応を平行して行うことができる。反応混合物が、例えば反転小胞といった脂質を含んでもよいが、通常、脂質二重層によって表面を囲まれていない。
【００１５】
本明細書中において使用されるように、「小規模」という用語は、約15μl、またはそれより少ない体積を有する反応を指す。本発明の方法によって、上述のように、「スケールアップされた」反応が小規模反応と比較して実質的に一貫した収率を維持することが可能となる。反応間で一貫して適応される限りは、収率は任意の都合の良い方法によっても算出することができる：例えば、反応混合物1ml当りの総タンパク質合成、反応混合物1ml当りの可溶性タンパク質合成、反応混合物1ml当りの生物学的活性タンパク質合成など。相当する小規模反応と比較したスケールアップ反応（すなわち、反応は同一の反応物を含み、体積においてのみ異なる）の収率は、通常少なくとも約90%であり、より通常には少なくとも約95%であり、かつ少なくとも約99%にもなり得る。）場合によっては、本発明のスケールアップ反応混合物において、収率が実際に増加することが観察されている。
【００１６】
水溶液の液面張力により形成されるメニスカスが、非常に小さい体積の場合はほぼ球面の形状を提供し、かつ、より大きい体積を有する場合にはより平坦な形状を提供することは、体積に対する表面積の比を考慮することにおいて、当業者によって理解されると考えられる。一般的に、本発明の反応は、少なくとも約500の表面積/体積比（mm2/mlにおいて算出）を有すると考えられ、かつ750またはそれより高い比率を有し得る。対照的に、試験管における500μlの従来の反応は、200mm2/ml未満の表面積/体積比を有し得る。薄い膜は、通常厚さ約2mmを超えず、より通常には厚さ約1mmを超えない。
【００１７】
系は、有気的および無気的条件下、好ましくは有気的条件下で実行することができる。反応物の乾燥を防止するために、ヘッドスペースは、通常、反応温度における少なくとも約80%飽和に、より通常には反応温度における少なくとも約90%飽和に加湿され得る。これは通常、実験室条件下でヘッドスペースを囲んでいるチャンバを封入するのに十分である。反応チャンバのヘッドスペースは酸素で満たすことができ、または、酸素は反応混合物中に注入することができる。酸素は連続的に供給してもよく、または、より長い反応時間のタンパク質発現の過程の間、反応チャンバのヘッドスペースに酸素を補充してもよい。酸素の他に、例えば硝酸塩のような他の電子受容体を、適切な呼吸経路に対して予め誘導を行った細胞抽出物に供給することもできる。
【００１８】
平面基質とは、薄い膜が堆積し得る任意の表面を意味する。種々の固体支持体または基質が本発明の目的のために適切であり、可撓性および剛性基質のどちらをも含む。可撓性とは、支持体が曲げられるか、たたまれるか、または破損することなく同じように操作することが可能であることを意味する。可撓性固体支持体の例は、ナイロン、ニトロセルロース、ポリプロピレン、ポリエステルフィルム、例えばポリエチレンテレフタラートなどを含む。剛性支持体は容易には曲がらず、ガラス、融解シリカ、石英、アクリルアミド、プラスチック（例えばポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、およびそれらの混合物など）、金属（例えば金、プラチナ、銀など）、その他を含む。基質は通常、平面であり、または実質的に平面的な表面である。
【００１９】
反応化学
無細胞タンパク質合成のテンプレートは、mRNAかDNAのいずれかであり得る。安定化mRNAを翻訳すること、または転写および翻訳を組み合わせることにより、貯蔵された情報をタンパク質に変換する。一般に大腸菌系で利用される複合系は、認識可能なプロモータを有するDNAテンプレートから、連続的にmRNAを生成する。内因性RNAポリメラーゼが用いられるか、または外因性ファージRNAポリメラーゼ（典型的にはT7またはSP6）が反応混合物に直接加えられるかのいずれかである。または、mRNAは、メッセージをQBレプリカーゼ（RNA依存性RNAポリメラーゼ）に対するテンプレートに挿入することによって、継続的に増幅することができる。精製されたmRNAは一般的に、反応混合物に加えられる前に、化学修飾によって安定化される。mRNAレベルを安定化するのを助けるために、ヌクレアーゼを抽出物から除去することができる。テンプレートは、関心対象の任意の特定遺伝子をコードし得る。
【００２０】
他の塩、例えばマンガンのように特に生物学上関連する塩が加えられてもよい。カリウムは一般的に、50〜250mM の間で、かつアンモニウムは0〜100mMの間で加えられる。反応のpHは一般的に、pH 6〜9の間で行われる。反応の温度は一般的に、20℃から40℃の間にある。これらの範囲は拡張できる。
【００２１】
望ましくない酵素活性に対する代謝阻害剤を、反応混合物に加えてもよい。または、望ましくない活性の原因となる酵素もしくは因子を抽出物から直接除去してもよく、または、望ましくない酵素をコードする遺伝子を不活性化させるか、もしくは染色体から欠失させてもよい。
【００２２】
宿主生物から精製した小胞、または合成の小胞のいずれも、系に加えられ得る。これらは、タンパク質合成および折りたたみを増強するために使用され得る。この細胞模倣技術(cytomim technology)は、酸化的リン酸化の活性化のために呼吸鎖構成要素を含む膜小胞を利用するプロセスを活性化することが示されている。本方法は、他の膜タンパク質のセットを活性化するための無細胞発現に使用されてもよい。
【００２３】
関心対象の合成系は、DNA複製を含み、DNAの増幅、DNAまたはRNAテンプレートからのRNAの転写、RNAのポリペプチドへの翻訳、および単糖からの複合多糖の合成を含んでもよい。
【００２４】
反応は、大規模、小規模であるか、または同時合成を複数実行するために多重的であってもよい。活性的な合成期間を延長するために、さらなる試薬が導入され得る。合成された産物は、通常リアクターにおいて蓄積され、その後、系操作の完了後、タンパク質精製のための通常の方法に従って単離され、かつ精製される。
【００２５】
特に関心対象となるのは、タンパク質を産生するmRNAの翻訳であり、この翻訳はDNAテンプレートからmRNAのインビトロ合成に共役し得る。このような無細胞系は、mRNAの翻訳のために必要な全ての因子（例えばリボソーム、アミノ酸、tRNA、アミノアシル合成酵素、伸長因子および開始因子）を含む。当技術分野において公知の無細胞系は、大腸菌抽出物などを含み、活性化内因性mRNAを除去するために適切なヌクレアーゼで処理することができる。
【００２６】
無細胞抽出物、遺伝的テンプレートおよびアミノ酸のような上記成分に加えて、タンパク質合成のために特に必要な材料が反応に加えられ得る。これらの材料は、塩、高分子化合物、環状AMP、タンパク質分解酵素または核酸分解酵素に対する阻害剤、タンパク質合成の阻害剤またはレギュレータ、酸化/還元調整剤、非変性界面活性剤、バッファー成分、スペルミン、スペルミジンなどを含む。
【００２７】
塩は好ましくはカリウム、マグネシウム、アンモニウムおよびマンガンの酢酸塩または硫酸塩を含み、かつ、これらのいくつかは対アニオンとしてアミノ酸を有してもよい。高分子化合物はポリエチレングリコール、デキストラン、ジエチルアミノエチルデキストラン、第四級アミノエチルおよびアミノエチルデキストランなどであり得る。酸化/還元調整剤は、ジチオスレイトール、アスコルビン酸、グルタチオンおよび／またはそれらの酸化物であり得る。また、トリトンX-100のような非変性界面活性剤も0〜0.5Mの濃度で使用され得る。スペルミンおよびスペルミジンはタンパク質合成能を改善するために使用されてもよく、かつ環状AMPは遺伝子形質発現レギュレータとして使用されてもよい。
【００２８】
反応培地の特定の成分の濃度が変化する際、それに従って別の成分の濃度も変化し得る。例えば、ヌクレオチドおよびエネルギー源化合物のようないくつかの成分の濃度は、他成分の濃度の変化に従って同時に制御され得る。また、リアクター中の成分の濃度レベルも、時間とともに変動し得る。
【００２９】
好ましくは、反応は、pH 5〜10および20〜50℃の温度の範囲で維持され、より好ましくはpH 6〜9および25〜40℃の温度の範囲で維持される。
【００３０】
翻訳反応において産生されたタンパク質の量は、さまざまな方法で測定できる。1つの方法は、翻訳されている特定のタンパク質の活性を測定するアッセイ法の有効性に依存する。タンパク質活性測定のアッセイ法の例は、ルシフェラーゼアッセイ系、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼアッセイ系である。これらのアッセイ法は、翻訳反応から産生される機能的に活性のあるタンパク質の量を測定する。活性アッセイ法は、不適当なタンパク質の折りたたみ、またはタンパク質の活性に必要な他の翻訳後修飾の欠如のために不活性である完全長タンパク質を測定しない。
【００３１】
インビトロ転写および翻訳反応の組み合わせにおいて産生されるタンパク質の量を測定するもう1つの方法においては、既知量の放射標識アミノ酸（例えば35S-メチオニンまたは14C-ロイシン）を用いて反応を行い、その後、新しく翻訳されたタンパク質に取り込まれた放射標識アミノ酸の量を測定する。取り込みアッセイ法は、切断されたタンパク質産物を含む、インビトロ翻訳反応において産生される全てのタンパク質中の放射標識アミノ酸の量を測定する。放射標識されたタンパク質は、タンパク質ゲル上で更に分離されてもよく、かつオートラジオグラフィーによって、産物が適当な大きさであって、かつ副次的タンパク質産物が産生されていないことが確認される。
【００３２】
本発明が特定の方法論、プロトコール、細胞系、動物種または属、構築物および記載されている試薬（これらは、もちろん、多様であってもよい）に限定されるものではないと理解される。また、本明細書において用いられる用語は、特定の態様のみ記載するためのものであり、本発明の範囲を限定することを目的とせず、これは添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるということも理解される。
【００３３】
他に定められない限り、本明細書において用いられる全ての専門用語および科学用語は、本発明が帰属する当業者に共通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものに類似した、または等価な任意の方法、装置および材料は、本発明の実施または試験において使用することができ、好ましい方法、装置、および材料をこれより記載する。
【００３４】
本明細書において言及される全ての刊行物は、本明細書に記載される本発明と関連して使用され得る、例えば、刊行物に記載されている細胞系、構築物、および方法論を記載および開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。上記および本明細書の全体にわたって論述される刊行物は、本願の出願日以前のそれら刊行物の開示のためのみに提供される。従来の発明の効力によって、本発明者がこのような開示に先行する権利を有さないということの承認として、本明細書の記述が解釈されることはない。
【００３５】
以下の実施例は、本発明を製作し、かつ使用する方法の完全な開示および記載を当業者に提供するために記述されており、本発明であるとみなされる範囲を限定することを目的としない。使用される数値（例えば、量、温度、濃度など）に関して精度を確実にするために努力したが、ある程度の実験誤差および偏差は考慮されなければならない。特に明記しない限り、割合は重量による割合であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、かつ、圧は大気圧またはその近似値である。
【００３６】
実験的実施例1
無制限滴下を使用するタンパク質合成の効率的なスケールアップ
本発明の目的は、15μl規模より大きな体積で無細胞タンパク質合成系を使用し、特異的生産性を少しも失うことなくタンパク質を産生することである。我々は、この新規の方法を使用して、1mlまでの、しかしそれに限定されない反応規模でのタンパク質の合成を実証した。
【００３７】
図2および3は、異なる2つの無細胞合成法を使用し、異なる規模でのGMCSF-VL-VHの合成を比較する。反応が試験管においてスケールアップされる際に、グラフの左の部分は総タンパク質収率および可溶型タンパク質収率を示す。右の部分は、本発明により提供されるスケールアップ生産能を示す。図4および5は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）の発現に関する類似したデータを示す。手順は以下に述べる。
【００３８】
細胞模倣系のために、表1に列挙される成分は、2002年8月19日に出願された米国仮出願第60/404,591号に従って所定の濃度で混合される。PANOx系のために、表2に列挙される成分は、スワルト(Swartz)およびキム(Kim), Biotechnology and Bioengineering, Vol. 74, August, 2001に記載されるように、所定の濃度で混合される。加えて、酸化型および還元型グルタチオンは、各混合物にそれぞれ4mMおよび1mMの濃度で添加される。S30抽出物も、混合物への添加に先立って、1mMのヨードアセトアミド（IAM）により室温で30分間、前処理されている。
【００３９】
GMCSF-VL-VHのテンプレートとして使用されるDNAは、T7プロモーター、それに続く、5アミノ酸リンカー（グリシン4 +セリン）により抗体38C13（Hakim, 1996）のscFv断片コード遺伝子に融合したGMCSFタンパク質コード遺伝子（Mi-Hua Tao, 1993）を含む、pK7-GMCSF-VL-VHである。構造遺伝子の後に、T7ターミネータが続く。CAT発現は、CAT構造遺伝子がT7プロモータの後ろ、T7ターミネータの前に置かれたプラスミドpK7-CATによってコードされる。
【００４０】
S30細胞抽出物は、プラット(Pratt)（1984）の手順に従って大腸菌K12（A19株）から調製された。DL-ジチオスレイトールは、ホモジナイズの後の細胞溶解物に加えられなかった。T7 RNAポリメラーゼは、ダバンルー(Davanloo)ら（1984）の手順に従って、大腸菌BL21株(pAR1219)の培養物から調製された。大腸菌DsbCは、BL21株(DE3)(pETDsbC)を過剰発現することにより調製され、かつコバルトIMACカラムにより精製された。選択された画分は、DsbCの活性部位を還元するために5mMのDTTを含むS30バッファー（Pratt, 1984）に対して透析された。大腸菌Skpは、コック(Cock)ら（1999）のプロトコールをわずかに改変したプロトコールに従って、BL21(DE3)plys(pK7Skp)の培養物から精製された。Skpの回収は、CMセファロースカラムのためのより低いイオン強度を有する洗浄バッファーを使用することにより増強された。バッファーAは、50mMのトリス、15mMの酢酸マグネシウムを含んだ(pH 9.0)。バッファーBは、バッファーAに350mMの酢酸カリウムを加えることにより調製された。バッファーAによって3総体積分洗浄した後、Skpを溶出させるためにバッファーBを添加した。溶出体積およびSkpの純度は、SDS-PAGEで判定された。精製されたSkpの濃度は、280 nmにおける吸光度により算出された。Skpの吸光係数は、アミノ酸配列データ（Gill and von Hippel, 1989）から評価された。
【００４１】
エッペンドルフ試験管法のために、1.5mlのエッペンドルフ試験管の底部に適切な体積の混合物がピペットで入れられる。その後、チューブは適切な時間（PANOxのために3時間、細胞模倣のために6時間）、37℃でインキュベートされる。
【００４２】
薄膜法のために、適切な体積の混合物が、6ウェルポリスチレン培養プレート（Falcon Multiwell 6 well）のウェル底部へ、ウェルの中央に滴状の形の薄膜を形成するようにピペットで入れられる。その後、ウェルはテープ（E&K Scientific）で封入され、かつ適切な時間（PANOxのために3時間、細胞模倣のために6時間）、37℃でインキュベートされる。ウェル中のヘッドスペース/反応溶液体積比は、30を超える。
【００４３】
合成されたタンパク質の量は、液体シンチレーションカウンター（LS3801, Beckman Coulter, Inc.）中において、TCA沈殿放射活性を測定することにより評価された。試料を4℃、15000RCFで15分間遠心分離した後に、上清を採取し、かつTCA沈殿およびシンチレーションカウンターにより可溶型の収率を判定するために使用した。詳細な手順は、以前に記載されている（Kim el al, 1996 b）。
【００４４】
この方法は、総反応体積が15μlより大きい規模で無細胞タンパク質合成系を使用する際の、タンパク質の総収率および可溶型の収率の減少を防止するために開発された。方法がいくつかの無細胞系のスケールアップのために存在する一方、これらの戦略は複雑なリアクター、付加的処理、処置段階および支持体溶液(Kigawa et al., Cell-free Production and Stable-isotope Labeling of Milligram Quantities of Proteins, FEBS Letters 442 (1999) 15-19)に関わる。さらに、これらのアプローチは、系特異的な傾向がある。
【００４５】
本方法は、現在実施されている任意のいくつかの無細胞タンパク質合成系への応用に一般的な、簡潔なスケールアップ・アプローチを提供する。このアプローチは、いかなる前処置段階も、または複雑なリアクターも必要としない。この新規アプローチは、反応規模が増加するにつれて、効果的に産生収率の低下を回避する。
【００４６】
本発明の利点は、以下の通りである：特定のタンパク質収率は（総収率および可溶型の収率のいずれも）、反応容器に試験管を使用した無細胞タンパク質合成系でのスケールアップの間、15μlを超える規模では急激に減少するにもかかわらず、無制限滴下（薄膜）を使用するアプローチでは、特定の収率を維持し、かつ体積の増加とともに収率を増加させさえする。これは、それぞれ酸素非依存性の系および依存性の系である、PANOx系および細胞模倣系を使用して実証されている。
【００４７】
図4は、この方法がタンパク質特異的ではないことを実証する。この方法は、小さい規模（15μl）でよく発現する任意のタンパク質のスケールアップ問題を解決する。加えて、図6は15μlおよび500μl規模の試験管反応、および薄膜法を使用した500μl規模の反応の時間経過データを示す。500μl滴下におけるタンパク質産生の反応速度は、15μl試験管における反応速度と本質的に同一である。500μl試験管反応においては、このような事実はない。
【００４８】
本方法は、実践的な応用（例えば、動物モデルにおける臨床前テスト、または有用タンパク質のより大規模な産生のため）に有用な、無細胞系を使用したタンパク質の大量産生能力を提供する。15μl規模での従来法の使用では、分析的量のタンパク質しか産生することができない。新規の方法を使用することにより、これを超えることができ、かつ動物実験、および核磁気共鳴実験のような応用にとって十分なタンパク質を容易に産生できる。これは、無細胞系（特にガス交換および酸素供給を必要とする系）の有用性を非常に増加させる。
【００４９】
加えて、この開示により教示される原理は、さまざまな幾何学的特性を有し、かつ静的または可動的な薄い膜のいずれかを採用する、より大規模な薄膜リアクターの開発を導くために使用され得る。
【００５０】
（表１）細胞模倣無細胞タンパク質合成系のための試薬組成および濃度
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【００５１】
（表２）PANOx無細胞タンパク質合成系のための試薬組成および濃度
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【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】薄い膜の反応の外形の概略図である。
【図２】2つの異なるスケールアップ法による細胞模倣系におけるGMCSF-VL-VH融合タンパク質の合成を表しているグラフである。左側では、試験管がリアクターとして用いられる。全収率および可溶型の収率は、異なる体積で示される。右側では、薄膜を生成する無制限滴下法が、示された反応体積で用いられる。
【図３】2つの異なるスケールアップ法によるPANOx系におけるGMCSF-VL-VH融合タンパク質の合成を表しているグラフである。左側では、試験管がリアクターとして用いられる。全収率および可溶型の収率は異なる体積で示される。右側では、薄膜を生成する無制限滴下法が、示された反応体積で用いられる。
【図４】2つの異なるスケールアップ法による細胞模倣系におけるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの合成を表しているグラフである。左側では、試験管がリアクターとして用いられる。全収率および可溶型の収率は、異なる体積で示される。右側では、薄膜を生成する無制限滴下法が、示された反応体積で用いられる。
【図５】2つの異なるスケールアップ法によるPANOx系におけるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの合成を表しているグラフである。左側では、試験管がリアクターとして用いられる。全収率および可溶型の収率は、異なる体積で示される。右側では、薄膜を生成する無制限滴下法が、示された反応体積で用いられる。
【図６】3つの異なる反応中におけるGMCSF-VL-VH融合タンパク質の合成に関する時間経過データを表しているグラフである。反応は、500μl薄膜、15μl試験管、および、500μl試験管である。500μl薄膜におけるタンパク質合成は、15μl試験管における合成をよく模倣することが見出された。500μl試験管の反応の収率は、（示されているように）非常に低かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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