(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腹膜透析液を製造するためのグルコースポリマーがそれから調製される、デンプン加水分解物を汚染除去する方法であって、
１）デンプン加水分解物を調製するステップと、
２）酵母、カビまたは細菌タイプの微生物のサイズを有する汚染物質を除去するように、前記デンプン加水分解物を濾過するステップであって、
当該ステップは、孔径が０．２２μｍの膜濾過からなる精密濾過、および、カットオフ閾値が３０００００Ｄａである膜限外濾過からなる限外濾過、からなる群から選択される技術によって実施され、
３）「メソ細孔」タイプ活性炭および「ミクロ細孔」タイプ活性炭からなる群から選択される活性炭によって、前記ステップ２）を経たデンプン加水分解物を処理するステップであって、前記ステップ２）を経たデンプン加水分解物に対して０．１２５％以上１％以下の当該活性炭で処理するステップ、と、
４）前記ステップ３）を経たデンプン加水分解物を、前記ステップ３）を経たデンプン加水分解物に対して０．１２５％以上１％以下の「ミクロ細孔」タイプ活性炭によって処理するステップと、
５）前記ステップ４）を経たデンプン加水分解物を収集するステップと、
を含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項２】
ステップ１）のデンプン加水分解物が、２０未満のデキストロース当量（ＤＥ）を達成するようにデンプンの酵素的または化学的加水分解によって調製されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ１）のデンプン加水分解物が、８〜１５のＤＥを与えるワキシーデンプンミルクの酸加水分解によって、そして任意選択的に、１１〜１８のＤＥを与える細菌α−アミラーゼを使用した酵素的加水分解によって、調製されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ２）で用いられる前記精密濾過するステップは、孔径が０．４５μｍの膜
濾過が先行することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、それから腹膜透析液を製造するためのグルコースポリマーが調製される、デンプン加水分解物を汚染除去する方法に関する。
【０００２】
本発明の目的で、「汚染除去する方法」という用語は、デンプン加水分解物から、汚染微生物（酵母、カビ、および細菌などの生きたおよび／または胞子形成微生物）と、腹膜透析の主要合併症である腹膜炎（無菌性であってもなくてもよい）を引き起こすことができる物質とを取り除くことができる方法を意味することが意図され、これらの物質は、場合により以下である。
−全てのグラム陰性細菌の外膜中に恒常的に存在する、毒性高分子複合体であるリポ多糖類（ＬＰＳ）。構造的観点から、ＬＰＳは、脂質Ａと、外膜を越えて伸びる多糖類構成要素とからなる。脂質Ａは毒性特性を有し、それはグラム陰性細菌の内毒素に相当し、それは細菌が溶解して初めて大量に放出される。
−Ｄ−グルコースのポリマーであるβ−グルカンは、β−グルコシド結合を介して連結する。β−グルカンは、変わりやすい分子量、溶解度、粘度、および三次元構造がある、多様な分子群である。β−グルカンは、植物細胞、酵母、および特定のカビと細菌の細胞壁の特定の構成物である。
−グラム陽性細菌壁の多糖類成分である、ペプチドグリカン（ＰＧｓ）。ムレイン、またはムコ複合体、またはムコペプチドとしてもまた知られているペプチドグリカンは、多糖類成分とペプチド成分で構成される。多糖類は、その中でＮ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミン酸がβ−１，４オシド結合によって連結している、グリコサミノペプチドのポリマーである。
【０００３】
本発明は、より具体的には、任意選択的に酵素処理ステップと連結している、逐次濾過ステップまたは特定の活性炭処理ステップが、前記従来法に追加されるという意味で、デンプン加水分解物を製造する従来法が実施される方法の改良に関する。
【０００４】
したがってこれらの追加的ステップは、このようにして調製されたデンプン加水分解物の無害を保証すること、すなわち前記汚染物質をアッセイするための従来法の定量化閾値を十分下回る汚染物質の含有量を保証することを目的としている。
【背景技術】
【０００５】
腹膜透析は、腎臓が血漿から浄化できない、またはもはや浄化できない、尿素、クレアチニン、過剰なカリウムまたは余剰水などの老廃物の除去を目的とする透析の一種である。この内科療法は、慢性腎不全末期に指示される。
【０００６】
これは、透析膜として腹膜を使用する体内浄化である。血液からの毒性老廃物は、腹膜の半透膜を越えて、透析液として知られる溶液に入る。透析液は、恒久的なカテーテルを介して腹腔に装入される。２種類の腹膜透析がある。
−ＣＡＰＤ（携行式連続腹膜透析）、医療処方に従った、毎日４袋の透析液を通過させることに基づく処置、
−ＡＰＤ（自動腹膜透析）、医療処方に従った、８時間あたりおよそ１５リットルの透析液に相当する継続夜間処置。
【０００７】
最も一般的に使用される透析液は、電解質（ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、塩素）および浸透圧剤（Ｂａｘｔｅｒ社によって販売されるＥｘｔｒａｎｅａｌ（登録商
標）携行式腹膜透析溶液中に存在する「イコデキストリン」などのグルコースまたはグルコースポリマー）がそれに添加された、ｐＨ酸性（５．２〜５．５）または生理学的ｐＨ（７．４）の（乳酸または重炭酸塩）緩衝溶液から構成される。
【０００８】
電解質および浸透圧剤は、それぞれの物理化学的特性に従って、交換機序においてそれぞれの役割を果たす。
−腎臓が尿道および尿によってもはや除去しない、または不十分に除去する代謝老廃物（尿素またはクレアチニンなど）またはその他の過剰な電解質は、透析液への構成要素の拡散によって血漿から抽出されて、同構成要素の濃度レベルが低下する。
−腎臓が、血漿体積を調節するために、常態では除去する余剰水は、透析液中のグルコースまたはグルコースポリマー濃度次第で、モル浸透圧濃度に引きつけられる。溶液濃度が高いほど、より多くの体内に存在する水が透析液によって取り込まれる。
【０００９】
グルコースは比較的安全で安価であるという利点を有するものの、それにはいくつかの欠点があるために、浸透圧剤としては、上述のイコデキストリンなどのグルコースポリマーが、グルコースよりも好ましい。
【００１０】
グルコースはその小さなサイズのために、迅速に腹膜を通過して、輸液の２〜４時間以内に浸透圧勾配の喪失がもたらされる。
【００１１】
そのため腹膜透析液の限外濾過特性は、以下で実証されるように、グルコースがグルコースポリマーなどの高分子量物質で置換されていれば、より良いと見なされる。
【００１２】
標準的グルコースポリマーは、穀物からまたは塊茎植物からのデンプンの酸または酵素的加水分解によって生成される。
【００１３】
デンプンの完全にランダムな酸加水分解、またはわずかにより規則的な酵素加水分解は、低重合度（またはＤＰ）の非常に短い分子（オリゴマー）と高ＤＰの非常に長い分子（ポリマー）とを含んでなる、グルコース（モノマー）およびグルコース鎖の混合物を提供する。さらにグルコースポリマーは、極めて多様な分子量を有する。
【００１４】
携行式連続腹膜透析用グルコースポリマーのより特殊な使用分野では、これらのデンプン加水分解物（グルコースとグルコースオリゴマーおよびポリマーの混合物）それ自体は、使用できないことが非常に速やかに明白となった。
【００１５】
欧州特許第２０７６７６号明細書は、水中１０％で透明無色の溶液を形成し、５０００〜１０００００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）および８０００ダルトン未満の数平均分子量（Ｍｎ）を有するグルコースポリマーが好ましいことを教示する。
【００１６】
このようなグルコースポリマーはまた、好ましくは、分子量が５０００〜５００００ダルトンである少なくとも８０％のグルコースポリマー、ＤＰが３以下である（分子量５０４）わずかまたは皆無のグルコースまたはグルコースポリマー、および分子量が１０００００（約６００のＤＰ）を超えるわずかまたは皆無のグルコースポリマーも含んでなる。
【００１７】
換言すれば、好ましいグルコースポリマーは、多分散指数が低いグルコースポリマーである（値はＭｗ／Ｍｎ比を計算することで得られる）。
【００１８】
したがってこの用途では、浸透圧勾配を作り出す上で、低分子量モノマーまたは腹膜壁を迅速に越えるポリマーには長続きする価値がなく、浸透圧力を欠く超高分子量ポリマーは回避され、それらが老化に引き続いて沈殿すると潜在的に危険であることから禁止すら
されることは、事実上容易に想像できる。
【００１９】
この欧州特許第２０７６７６号明細書において、デンプン加水分解物から多分散指数の低いグルコースポリマーを得るために提案された方法は、
−水混和性溶媒によってマルトデキストリンの分別沈殿を実施するステップ、
−または適切なカットオフまたは排除閾値を有する様々なメンブランを通過させて、同マルトデキストリンの分子濾過を実施するステップ
のいずれかからなる。
【００２０】
どちらの場合も、これらの方法は、超高分子量ポリマーと低分子量モノマーまたはオリゴマーを同時に除去することを目的としている。
【００２１】
しかしこれらの方法は、それらの具体化の観点と、それによって得られる生成物の収率および質の観点の双方から、満足のいくものではない。
【００２２】
先行技術の欠点がない、優先的に２．５未満の低多分散指数で、好ましくは８０００ダルトン未満のＭｎを有し、１２０００〜２００００ダルトンのＭｗを有する、完全に水溶性のグルコースポリマーを製造する方法を開発するために、出願人は、出願人に付与された欧州特許第６６７３５６号明細書において、加水分解デンプンからでなくマルトデキストリンから出発することで、この問題の解決を試みた。
【００２３】
この方法は、
−ワキシーデンプンミルクに酸加水分解を実施して、８〜１５のＤＥを得るステップと；−この酸加水分解に、細菌α−アミラーゼによる酵素的加水分解手段を任意選択的に追加して１１〜１８のＤＥを得るステップと；
−この酸酵素二重加水分解物をアルカリ金属またはアルカリ土類金属形態のマクロ孔質強力カチオン性樹脂上で、クロマトグラフィーにかけるステップと；
−このクロマトグラフィーステップにおいて排除された、グルコースポリマーを収集するステップと
からなる。
【００２４】
欧州特許第６６７３５６号明細書では、２．５未満の多分散指数を有するグルコースポリマーを得るために、このクロマトグラフィーステップにおいて排除された、グルコースポリマーをクロマトグラフィーステップ上流で処理されたデンプン加水分解物の約６０％の歩留まりで収集する。
【００２５】
次にこのグルコースポリマーは、好ましくは３以下のＤＰを有する３％未満のグルコースおよびグルコースポリマーと、６００を超えるＤＰを有する０．５％未満のグルコースポリマーとを含有する。
【００２６】
国際公開第２００７／０９９２１２号パンフレットもまた、腹膜透析に適したグルコースポリマーを調製する方法について記載する。方法は、低分子量画分、特に９０００未満の分子量を有するものが排除される一方で、その他の高分子量画分が回収される分画ステップで終了する。より具体的には、方法は、活性炭（Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ＋）によって処理するステップと、９０００ダルトンのカットオフ閾値で分画するステップと、残余分を回収するステップと、次に脱ミネラル化して活性炭（Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ＋）処理するステップとを含んでなる。
【００２７】
浸透圧力のために使用されるこれらのグルコースポリマーが、完全に満足できるものであることは、今や最終的に腹膜透析分野の専門家によって認められた。
【００２８】
しかし残念なことに腹膜透析を意図するこれらの調製品には、微生物汚染のリスクがある。
【００２９】
例えば腹膜腔へのカテーテル埋め込みは、微生物にとって好ましい侵入門戸である。輸液および排液段階におけるカテーテル上の多数の操作が、局所性または全身感染症のリスクを増大させる。
【００３０】
さらに追加的な汚染のリスク因子は、浸透圧剤として使用されるグルコースポリマーを汚染し得る、不純物と直接結びつくこともある。
【００３１】
グルコースポリマー製造回路は、微生物、または前記微生物を含有する炎症促進性物質によって汚染され得ることが、事実上知られている。
【００３２】
例えば酵母、カビ、および細菌タイプの微生物による、より具体的にはアリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）タイプの好酸好熱性細菌（回路の高温酸性区域で増殖する好極限性細菌）による、トウモロコシまたは小麦デンプン類の汚染が、デンプン産業で記述される。
【００３３】
これらの汚染された製品を投与された患者にとっての主要リスクは、腹膜炎である。
【００３４】
腹膜炎の臨床上の疑いは、変わりやすい臨床徴候、すなわち腹痛、悪心、嘔吐、下痢、および発熱と共に、濁った透析液がある場合に診断される。
【００３５】
これらの腹膜炎の症状発現は腹腔内細菌感染によって引き起こされ、診断は、通常、陽性透析液培養物を通じて容易に確立される。
【００３６】
無菌化学的または培養陰性腹膜炎とも記述される、「無菌性腹膜炎」の方は、典型的に化学的刺激物または異物によって引き起こされる。
【００３７】
腹膜透析液調製品へのイコデキストリンの導入以来、様々な原因と、特に潜在的に存在する炎症促進性物質による誘導と結びつけ得る、無菌性腹膜炎の孤立した症例が報告されている。
【００３８】
しかしこれらの炎症促進性物質は、このような調製品の無害を判定するために通常実施される試験によっては検出されない。
【００３９】
今日、発熱性物質検出のために、薬局方に記載される試験は、事実上、以下の通りである。
−グラム陰性細菌の主要構成要素である細菌内毒素（ＬＰＳ）を検出するための「ＬＡＬ」試験、
−細菌内毒素（ＬＰＳ）と、真菌微生物叢（酵母およびカビ）壁構成要素であるβ−グルカンとを検出するためのウサギ発熱性物質試験。
【００４０】
概して信頼できるものの、これらの２つの試験には限界がある。
【００４１】
ウサギ発熱性物質試験は、これらの物質を含有する製品を注射されたウサギの体温上昇の測定による、発熱性物質の間接的検出に基づいている（発熱反応）。
【００４２】
この試験は、望ましくない物質が、全身性の発熱性応答を引き起こすのには、弱すぎる
生物学的活性、または低すぎる濃度を有する場合に、偽陰性を生じ得る。
【００４３】
しかしこの物質は、局所性炎症反応を生じるのに、十分な生物学的活性または濃度を有することもある。
【００４４】
その他の生物学的不純物（ＤＮＡなど）は、検出されない。グラム陽性細菌の細胞膜の主要構成要素であるペプチドグリカンについても同じことが言える。
【００４５】
したがってイコデキストリンを含有する腹膜透析液で観察された無菌性腹膜炎の症状発現は、場合により、ある物質が薬局方に記載される試験を免れ得て、望ましくない臨床効果の原因になり得ることを証明する。
【００４６】
この状況を正すべく、Ｂａｘｔｅｒ社は、その腹膜透析液中で、または前記腹膜透析液の組成物の一部になることが意図される精製グルコースポリマー上で直接、グラム陽性微生物汚染物質を検出するために、努力することを提案した。
【００４７】
特にＢａｘｔｅｒ社は、同社に付与された欧州特許第１７２０９９９号明細書で、ペプチドグリカン検出に基づく方法を開発することを提案する。
【００４８】
次にこの検出は、腹膜透析調製品上で直接、または精製グルコースポリマー上で実施することが推奨される。
【００４９】
この方法は、グルコースポリマー上で、
−好酸性好熱性グラム陽性微生物アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）を検出するための「汚染微生物数」試験、次に
−前記グルコースポリマーの滅菌、次に
−セリンプロテアーゼカスケード反応を誘発するように、ペプチドグリカンと反応できる試薬を添加することを含む試験、
−前記ペプチドグリカンの定量化
を実施することからなる。
【００５０】
換言すれば、第１のステップは、グルコースポリマー精製回路を汚染したかもしれない生きた微生物の存在を検出し、第２のステップは、滅菌によってそれらを排除し、第３のステップは、先行する滅菌ステップで排除されなかった細胞残骸から生じるペプチドグリカンを検出する。
【００５１】
グルコースポリマー中で求めたこれらのペプチドグリカンの量が、特定の閾値（１０ｎｇ／ｍｌグルコースポリマー７．５％溶液、すなわち１３３ｎｇ／ｇグルコースポリマー）を十分下回ると判定された場合、次にこれらのグルコースポリマーは、実際の腹膜透析溶液を調製するのに使用される。
【００５２】
換言すれば、これらの無菌性腹膜炎症状発現を防止するために、Ｂａｘｔｅｒ社は、同社に付与された欧州特許第１７２０９９９号明細書で、腹膜透析溶液中のペプチドグリカンを検出するプロトコルによって、腹膜透析液の製造と使用を試験することを提案する。
【００５３】
Ｂａｘｔｅｒ社はまた、腹膜透析液を製造するための構成要素中、または腹膜透析液それ自体の中のペプチドグリカンの存在を検出しまたは回避するための、４つ以上のその他の方法も提案した。
【００５４】
同社の国際公開第２００９／１１７３０２号パンフレットで、Ｂａｘｔｅｒ社は、イオン交換樹脂を通過させることによる汚染物質除去を記載する。
【００５５】
しかし残念なことにこの技術は、部分的にのみ効果的であり、この樹脂上への吸着が、グルコースポリマーと最終腹膜透析溶液の双方の中に存在する微生物汚染物質の「一部」のみを保持することから、その目的が汚染リスクの「低下」であることを発明者ら自身が認識している。
【００５６】
いくつかのイオン交換樹脂に、グルコースポリマーまたは腹膜透析溶液を逐次通過させ、それによって特に骨の折れる汚染除去方法を構成することさえ推奨されている。
【００５７】
さらにこのようにして得られた溶液の無害を確認するために、ペプチドグリカンを検出する試験（ＩＬ６分析）が実施される。
【００５８】
同社の国際公開第２００９／１１７３０３号パンフレットでは、基準とされる炎症促進性物質濃度の関数として確立されたＩＬ−６応答を判定するステップと、様々な濃度の炎症促進性物質と比較して、ＩＬ６応答の用量／応答曲線を確立するステップとを含んでなる、グルコースポリマー中の、または直接腹膜透析調製品中のペプチドグリカンを検出する方法が提案される。
【００５９】
したがってこの方法は、欧州特許第１７２０９９９号明細書で開発された検出法の改善を構成する。
【００６０】
しかしこの方法は、目下の論点ではペプチドグリカンである、特定の炎症促進性物質に過敏症の個人から単離されたＩＬ６産生細胞の使用を要する。
【００６１】
この場合も、この診断方法は、汚染されたバッチを高感度で不合格にできるようにするが、前記汚染の防止はできない。
【００６２】
同社の国際公開第２００９／１１７３０４号パンフレットでは、グルコースポリマー溶液または腹膜透析調製品が、カットオフ閾値３０ｋＤａの限外濾過膜上で濾過される。
【００６３】
Ｂａｘｔｅｒ社は、このようにして３０〜１００ｋＤａのサイズの汚染物質がより高い確実性で無菌性腹膜炎を引き起こす一方、サイズのより小さな汚染物質が有害効果を及ぼさないことを確立した。
【００６４】
したがってＢａｘｔｅｒ社によって同特許出願に記載される方法は、あらゆるグルコースポリマー溶液または腹膜透析調製品をこの限外濾過膜上で濾過するステップと、このようにして得られた残余分および濾液を国際公開第２００９／１１７３０３号パンフレットに記載されるのと同じ検出試験を使用して試験するステップとを含む。
【００６５】
原理は次の通りである。限外濾過後に、残余分が炎症促進反応を引き起こし、濾液がそれを引き起こさない場合、グルコースポリマー溶液は排除される。
【００６６】
他方、残余分および濾液が炎症促進反応を引き起こし、濾液応答が残余分応答を上回る場合、グルコースポリマー溶液は保持される。
【００６７】
残余分および濾液が炎症促進反応を引き起こし、濾液応答が残余分応答を下回る場合、濾液応答の性質を調べる。
−濾液応答が残余分応答の５０％以上である場合、溶液は保持される。
−濾液応答が残余分応答の５０％を下回る場合、溶液は不合格とされる。
【００６８】
しかしこの方法は、サイズの小さな断片が無害であるという前提に基づいており、その結果、それらを排除するいかなる技術も提案されていないので、それは十分でない。
【００６９】
同社の国際公開第２００９／１１７５５８号パンフレットで、Ｂａｘｔｅｒ社は分解のための酵素の手段によって微生物汚染物質の細胞壁構成要素に対処する。
【００７０】
可溶性または固定化形態で使用される、リゾチームなどのこれらの酵素は、微生物汚染物質を分解するために単独でまたはその他の酵素と組み合わせて用いられ、このようにして処理されたグルコースポリマーまたは透析調製品は、それらのサイトカイン応答について試験される。
【００７１】
次に最終製品に対するまたは透析調製品に対するこの酵素処理は、実際にはいかなるサイトカイン応答も検出されない場合に、患者に処方される。
【００７２】
しかしこの場合も、このようにして加水分解された細胞壁構成要素の残骸の排除、または使用される酵素製剤を自然に汚染する物質の排除については、何も提案されない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００７３】
全ての前述の事柄から、腹膜透析液調製品のためのグルコースポリマーを安全にする、または腹膜透析溶液それ自体を安全にするいかなる技術的解決策も完全に十分でないということになる。
【００７４】
出願人は、その業績として、解決策が、何よりもまず腹膜透析液を調製するためのグルコースポリマーを調製するのに使用される原料の品質管理に基づくべきであることを見出し、すなわちデンプン加水分解物それ自体の汚染物質を除去する、単純で効果的な方法を提案した。
【００７５】
換言すれば、最終製品または最終腹膜透析溶液だけでなく、その起源で汚染問題に対処する。
【００７６】
したがって本発明は、それから前記グルコースポリマーが調製されるデンプン加水分解物を汚染除去するステップを含んでなる、腹膜透析液を製造するためのグルコースポリマーを調製する方法に関する。
【００７７】
この汚染除去は、残留汚染物質を有するはずのないデンプン加水分解物の製造を保証し、すなわち次の値以下の含有量を保証することを目標としている。
−生きた微生物：全ての中温性微生物叢：＜５０ｇ／ｇ；カビおよび酵母：＜１５ｇ／ｇ；好酸好熱性桿菌：＜１０ｇ／ｇ；
−Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ−Ｅｎｄｏｓａｆｅによって製造される試薬を使用したＬＡＬ試験（エンドポイントゲル化法）による内毒素（ＬＰＳ）およびβ−グルカン（ＬＡＬ溶解産物の感度０．０１５Ｅ．Ｕ／ｍｌ；カタログ番号ＯＲ１５０１５、ＣＳＥ内毒素５００ｎｇまたはバイアルあたり１０ｎｇ；カタログ番号Ｅ１１０またはＥ１２０）：≦０．６ＥＵ／ｇ；
−出願人により開発された高感度試験によるペプチドグリカンおよびβ−グルカン：＜８ｎｇ／ｇのグルコースポリマー。
【００７８】
「出願人により開発され検証された高感度試験」という表現は、和光純薬工業株式会社
により製造販売されるＳＬＰ−ＨＳシングル試薬セット（カタログ番号２９３−５８３０１）を適合させることで、出願人により開発され検証された高感度試験を意味することが意図される。
【００７９】
この試験は、「ＳＬＰ−ＨＳ」（カイコガ幼虫血漿−高感度）試薬を使用することからなり、前記試薬はカイコガ幼虫血漿から調製されて、以下を成し得る。
−水（例えばＬＡＬ試験専用水）中の５％溶液に調製されたグルコースポリマー中に含有される、ペプチドグリカンおよびβ−グルカンと反応する。
−セリンプロテアーゼカスケード反応を誘導する。
−和光純薬工業株式会社によって製造販売されるＴｏｘｉｎｏｍｅｔｅｒチューブリーダーの手段によって、前記ペプチドグリカンおよびβ−グルカンを以下のような非常に低い閾値で検出および／または定量する。
・およそ０．０５ｎｇ／ｍｌ（すなわち１ｎｇ／ｇグルコースポリマー）の閾値の検出限界（ＬＤ）、および
・およそ０．１５ｎｇ／ｍｌ（３ｎｇ／ｇグルコースポリマー）の閾値の定量化限界（ＬＱ）
（ＬＤおよびＬＱは、試験されたグルコースポリマー製品中で測定される）。
【００８０】
より具体的には、ＳＬＰ−ＨＰ試験は
−試験グルコースポリマーを適切な質の水（例えばＬＡＬ試験専用水）の中で５％溶液に調製するステップと、
−直線検量線（対数目盛り直線回帰Ｔａ＝ｆ（ＰＧ含有量））を確立するために、ＳＬＰ−ＨＳシングル試薬セットのペプチドグリカン標準（スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）から抽出される）を用いて、０．０４〜２．５ｎｇ／ｍｌ（目標値）の適応範囲において、ペプチドグリカン水溶液の較正範囲を作成するステップと、
−（上述の試薬セットで提供される）１００μｌの希釈剤の添加による水戻し後、調製された１００μｌの試験溶液をＨＳ−ＳＬＰチューブに装入するステップと、
−ＳＬＰ−ＨＳチューブをＴｏｘｉｎｏｍｅｔｅｒチューブリーダー（和光純薬工業株式会社）のインキュベーションウェルに装入するステップと、サーモスタットで３０℃に調温して、製造会社により推奨される条件に従った設定で、確立された直線検量線の手段によって、試験溶液のＰＧ含有量を計算するステップと
からなる。
【００８１】
結果は、ｎｇ／ｍｌ  ５％試験溶液で、次にｎｇ／ｇグルコースポリマーで表される。
【課題を解決するための手段】
【００８２】
本発明に従った方法の第１の優先的な様式では、腹膜透析用グルコースポリマーを調製するためのデンプン加水分解物を汚染除去するための方法は、
１）デンプン加水分解物を調製するステップと、
２）酵母、カビまたは細菌タイプの微生物のサイズを有するあらゆる汚染物質を除去するように、前記デンプン加水分解物を濾過するステップと、
３）汚染微生物が除去された、すなわち濾過された、前記デンプン加水分解物をリゾチームおよびラミナリナーゼからなる群から選択される、細胞壁多糖類構成物を分解する酵素、好ましくはラミナリナーゼで処理するステップと、
４）酵素的に処理されたデンプン加水分解物を限外濾過するステップと、
５）得られたデンプン加水分解物を高吸着容量活性炭上で処理するステップと、
６）汚染除去されたデンプン加水分解物を収集するステップと
を含んでなることを特徴とする。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
本発明に従った方法の第１の変法の最初のステップでは、
−マルトデキストリンに特徴的な２０未満のデキストロース当量（ＤＥ）を達成するような、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、エンドウマメ、米、キャッサバなどの様々な植物原料からのデンプンの従来の酵素的または化学的加水分解によって、
−または上述の欧州特許第６６７３５６号明細書の教示に従った、１１〜１８のＤＥを与える細菌α−アミラーゼを使用した酵素的加水分解が任意選択的に追加される、８〜１５のＤＥを与えるワキシーデンプンミルクの酸加水分解によって
デンプン加水分解物を調製し得る。
【００８４】
以下で述べるように、汚染除去方法の安定性を試験するために、出願人は、コーンスターチ加水分解物またはマルトデキストリンを
−上掲の４つのカテゴリーの汚染物質によって、
−内毒素ありまたはなしの（遊離形態、または結合形態、すなわち生きた細胞表面に結合した）ペプチドグリカンによって、
−内毒素ありまたはなしのβ−グルカンおよびペプチドグリカンによって
任意選択的に人工的に汚染した。
【００８５】
本発明に従った方法のこの第１の変法の第２のステップでは、前記デンプン加水分解物を汚染できる微生物、すなわち酵母、カビ、および細菌、特にアリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）タイプの好酸好熱性細菌は、それらのサイズが濾過孔径を上回り、除去される。
【００８６】
それ自体が当業者に公知のあらゆる方法が使用可能であるが、出願人は、以下のいずれかを実施することを推奨する。
−適切な場合は、０．４５μｍの孔径による予備膜濾過が先行する、０．２２μｍの孔径の膜濾過から主になる滅菌濾過。
【００８７】
デンプン加水分解物がそれに向けて装入される、垂直のケーシング中に挿入された、いくつかのカートリッジフィルターを使用して濾過を実施する。これらのカートリッジフィルターは、Ｐａｌｌ社またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社によって提供される。カートリッジのサイズは、１０、２０または３０インチであってもよく、１〜２０  ｌ／分／ｍ２の流速で生成物を通過させるのに十分な濾過表面積が得られる数のカートリッジを設置する。
【００８８】
これらのカートリッジフィルターは、約７５℃の高温における連続稼働で、７００時間以上にわたり上述の流速で通過させる、抵抗能力を有する。７５℃の温度で稼働させることで、あらゆる微生物の増殖、特に好熱性微生物叢の増殖を制限できるようになる。
【００８９】
それらの耐熱性はまた、それらを使用に供する前に滅菌できるようにする。この滅菌は、ケーシングに２バールの蒸気を２０分間通過させることからなる。この滅菌には、精製水による５分間の水洗が続く。
【００９０】
これらのフィルターはまた、装置浄化のために使用される特定の化学製品、特に５‰濃度の過酢酸に耐える能力を有する。
【００９１】
例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社からのｉｎｔｅｇｒｉｔｅｓｔを使用して、これらのカートリッジに対して完全性試験を実施し得る。この完全性試験は、そのアセンブリーを確認するためにカートリッジを設置する際に実施される。次にこの試験は、生産段階中の前記カートリッジの正しい機能を検証するために、装置の各浄化前に、そして最後に分解する前に実施される。
【００９２】
これらのフィルターの完全性を保証するために、それらの作動圧力差（ΔＰ）は２バールを超えてはならない。この値を超えた場合、これらのフィルターは新品で交換しなくてはならない。
−またはカットオフ閾値が３０００００Ｄａの膜上の限外濾過。
【００９３】
カットオフ閾値は、あらゆる細胞汚染物質が、残余分中に保持されるように選択される。
【００９４】
カットオフ閾値は、微生物、すなわち酵母、カビ、および細菌、特にアリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）タイプの好酸好熱性細菌を保持できるようにする。
【００９５】
フィルター表面積は、流体の性質および処理される流速の関数として判断される。
【００９６】
限外濾過膜は、セラミックまたは有機タイプであってもよい。これらの２種類の膜は、異なる耐熱と化学製品耐性を有するので、７５℃を超える温度で作業できるようにするセラミックタイプの膜が好ましい。
【００９７】
それらの耐熱性は、それらを使用に供する前に蒸気滅菌できるようにする。この滅菌は、ハウジングに２バールの蒸気を２０分間通過させることからなる。この滅菌には、精製水による２０分間の水洗が続く。
【００９８】
あらゆる微生物の増殖を回避するために、約７５℃の温度で作業することが推奨される。
【００９９】
これらのフィルターはまた、装置浄化のために使用される特定の化学製品、特に５‰濃度の過酢酸および１％濃度の水酸化ナトリウムに耐える能力を有する。
【０１００】
デンプン加水分解物供給圧力は２〜２０バールであり、このモジュールに供給するポンプによって調節される。最大圧力に達してもデンプン加水分解物の流速が低すぎる場合は、完全な効率が復元するように、膜を水酸化ナトリウムでクリーニングすべきである。
【０１０１】
汚染物質レベル低下のモニタリングは、透過液からの周期的サンプル採取によって分析し得る。
【０１０２】
濾液から採取されたサンプルが、従来のアッセイ法の定量化閾値未満のレベルを示せば、微生物は効率的に除去されたと見なされる。
【０１０３】
本発明に従った方法のこの第１の変法の第３のステップでは、汚染微生物がこのようにして除去された前記デンプン加水分解物を、リゾチームおよびラミナリナーゼ、好ましくはラミナリナーゼからなる群から選択される、細胞壁多糖類構成物分解のための酵素で処理する。
【０１０４】
生きた微生物の除去後、このようにしてこのステップは、残留毒性分子（微生物によって放出され、さもなければ細胞膜残骸中に存在する）を除去できるようにする。
【０１０５】
細胞壁多糖類構成物の分解のためのこれらの酵素は、先行する濾過ステップを逃れたかもしれない、デンプン加水分解物の２つの主要汚染微生物（酵母およびグラム陽性細菌）の細胞膜を分解するように、特に前記デンプン加水分解物中の遊離形態であってもよい、
それらのβ−グルカンおよびペプチドグリカンを加水分解するように選択される。
【０１０６】
ラミナリナーゼは、酵母および特定のカビの細胞壁を破壊する、エンド−β−１，３−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．６）活性を有する。
【０１０７】
リゾチーム、酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．１７）は、前記細胞壁の構成物グリコサミノグリカンの加水分解を触媒することによって、グラム陽性細菌の細胞壁を破壊する。それは、ペプチドグリカンのＮ−アセチルムラミン酸と、Ｎ−アセチルグルコサミンの４番目の炭素原子との間の共有結合を加水分解する。細菌細胞壁ペプチドグリカン「主鎖」は、事実上、これらの２つの分子の交互の共有結合の連結からなる共重合体であり、ポリマー鎖を架橋するペプチドがそれに付着する。
【０１０８】
これらの酵素は、デンプン加水分解物の乾燥重量を基準にして、０．００１‰〜１％、好ましくは０．１％〜０．５％の濃度でデンプン加水分解物に装入される。
【０１０９】
ラミナリナーゼは、以下に例示されるように、ｐＨ４．６および温度５０℃で、デンプン加水分解物に対して乾燥質量の１０％で、５〜２４時間、好ましくは２０時間使用される。
【０１１０】
リゾチームの方は、以下に例示されるように、ｐＨ７および温度３７℃で、デンプン加水分解物に対して乾燥物質の１０％で、５〜２４時間、好ましくは２０時間使用される。
【０１１１】
本発明に従った方法のこの第１の変法の第４のステップでは、このようにして酵素的に処理されたデンプン加水分解物の接線限外濾過が実施される。
【０１１２】
限外濾過膜のカットオフ閾値は、残余分中にあらゆるβ−グルカンおよびペプチドグリカン分解生成物が保持され、特に先行するステップで使用される酵素が保持できるように選択される。
【０１１３】
限外濾過膜は、２００００〜５００００ダルトン、好ましくは約３００００ダルトンのカットオフ閾値を有する。
【０１１４】
本発明に従った方法のこの第１の変法の第５のステップでは、得られたデンプン加水分解物、すなわち透過液または濾液を高吸着容量の活性炭に通過させる。
【０１１５】
出願人は、本発明に従った方法のこの第１の変法の重要なステップを構成する、この活性炭処理ステップを実施する上で、特に注意を払うことを推奨する。
【０１１６】
出願人は、事実上、最後のステップで使用される、適切な質の活性炭の選択が、このようにして処理されたデンプン加水分解物中に検出できる汚染物質の実質的な不在に影響を及ぼすことを発見した（「実質的な」は、従来のアッセイ法の定量化閾値を十分下回る濃度を意味すると理解される）。
【０１１７】
活性炭が、多孔性網状組織からなる、材料１グラムあたり最高１５００ｍ２に達するかなりの表面積に広がる不活性炭素ベースの材料吸着材であることが、当業者には知られている（孔径は、４〜１０００００Åの範囲にわたる）。
【０１１８】
したがって効果的であるために、活性炭は、その上に除去が所望される不純物が吸着される、多孔性構造内に広がる一定の内部表面積を有さなくてはならない。
【０１１９】
この吸着容量をモデル化するために、当業者は、通常、吸着等温線（ラングミュア等温式、ラングミュア−ヒンシェルウッド等温式、ＢＥＴ等温式またはフロイントリッヒ等温式）の手段によって吸着過程を記述する。
【０１２０】
吸着等温線は、溶液中の不純物の残留濃度の関数として、活性炭質量単位当たり吸着される不純物の量を表す曲線である。
【０１２１】
この等温式を構築するために、既知の増大する量の活性炭を処理される一定体積の溶液に装入し、所与の接触時間後、吸着された不純物の残留濃度を測定する。
【０１２２】
したがって出願人は、腹膜透析用グルコースポリマーを調製するためのデンプン加水分解物の汚染除去を終了させることが意図される、あらゆる活性炭の使用の前に（第５の最後のステップ）、その吸着等温線のモデル化によって、活性炭の質を正確に選択することを推奨する。
【０１２３】
したがって最も効率的な活性炭を選択するために予備試験が実施され、その試験は、市販の活性炭が、参照とされる既知量の細菌内毒素およびペプチドグリカンタイプの汚染物質を吸着する能力と比較して、様々な性質に対するそれらのフロイントリッヒ吸着等温線をプロットする（または全く同一タイプの活性炭の様々なバッチを試験することすらある）ステップからなる。
【０１２４】
したがってこの重要なデンプン加水分解物仕上げステップで使用することが意図される、全てのバッチの正確な特性解析が実施される。
【０１２５】
出願人は、ここで特に「メソ」タイプ、すなわち高いメチレンブルー脱色力を有するタイプの質を検査し、または「ミクロ」タイプ、すなわち高いヨウ素価を有するタイプの質を検査することを推奨する。
【０１２６】
したがっていくつかの方法は、活性炭、特に「メソ」タイプのもの、または「ミクロ」タイプのものの吸着等温線を判定し、最も適切な活性炭を選択する、先行ステップを含んでなってもよい。
【０１２７】
したがって従来法で所与の活性炭の比表面積の測定を可能にする吸着等温線は、ここで−それらのサイズに関係なく、先行するステップ中に生成した全てのβ−グルカンおよびペプチドグリカン分解生成物を吸着すること、
−特にデンプン加水分解物を汚染し得る内毒素、また使用される酵素によって導入される内毒素を吸着すること（残念なことに市販されるこれらの酵素の工業的調製品でそれらを欠くものはない）
ができるようにする活性炭の選択に寄与する。
【０１２８】
以下で例示されるように、出願人によって推奨されるフロイントリッヒ吸着等温線を求める手順は、装入されるデンプン加水分解物を活性炭の各バッチ（処理される乾燥物質に対して０．１２５％〜２％で増大する５つの量、すなわち０．１２５％、０．２５％、０．５％、１％、および２％）と共に、温度７５℃で１時間混合するステップからなる。
【０１２９】
７５℃の温度は、吸着動態について検証された、市販される活性炭の従来の作業温度である。
【０１３０】
システムの熱力学に対する動的制約なしで済ませるように、接触時間は１時間と決定された。
【０１３１】
ｐＨについては、出願人は、ペプチドグリカンと内毒素不純物の最適吸着を確実にするためには、前もってデンプン加水分解物サンプルを酸性ｐＨ価、すなわち約４．５に調節することが必要であると断定したので、４．５の値に固定された。
【０１３２】
以下で例示されるように、この第５の仕上げステップのための活性炭の質は、高ヨウ素価の「ミクロ」タイプ活性炭であることが確認された。
【０１３３】
Ｎｏｒｉｔ社によって販売されるＮｏｒｉｔ（登録商標）ＳＸ＋タイプの活性炭は、この質に完全に適する。
【０１３４】
本発明に従った方法のこの第１の優先的な様式の最終ステップでは、得られたデンプン加水分解物が次に収集され、その汚染物質含量が分析される。
【０１３５】
本発明に従った方法の第２の優先的な様式では、腹膜透析用グルコースポリマーを調製するためのデンプン加水分解物を汚染除去する方法は、
１）デンプン加水分解物を調製するステップと、
２）酵母、カビまたは細菌タイプの微生物のサイズを有するあらゆる汚染物質を除去するように、前記デンプン加水分解物を濾過するステップと、
３）活性炭、正面精密濾過または接線限外濾過からなる群から選択される技術によって、５０Åの最小サイズを有するあらゆる汚染物質を除去するように、前記デンプン加水分解物、すなわち濾液を処理するステップと、
４）得られたデンプン加水分解物を高吸着容量活性炭上で処理するステップと、
５）汚染除去されたデンプン加水分解物を収集するステップと
を含んでなることを特徴とする。
【０１３６】
本発明に従った方法のこの第２の優先的な様式では、最初の２つのステップは、上で提示される第１の優先的な様式において既に記載されているものと同じである。
【０１３７】
本発明に従った方法のこの第２の優先的な様式の第３のステップでは、それを汚染し得る微生物が除去されたデンプン加水分解物を活性炭、正面精密濾過または接線限外濾過からなる群から選択される技術によって処理する。
【０１３８】
このステップは、細菌、酵母またはカビ起源の全ての高分子量多糖類（ＬＰＳ、β−グルカン、ペプチドグリカン）を除去するように実施される。
【０１３９】
活性炭による処理は、第１の技術として選択され得る。
【０１４０】
上述したのと同じように、出願人は、吸着等温線を判定することによって、この大型不純物（内毒素タイプの生きた細胞からの残骸）を除去するステップを実施するのに最も効率的な活性炭の質を選択することを推奨する。
【０１４１】
したがっていくつかの方法は、活性炭、特に「メソ」タイプのもの、または「ミクロ」タイプのものの吸着等温線を判定し、最も適切な活性炭を選択する、先行ステップを含んでなり得る。
【０１４２】
以下で例示されるように、この最終ステップのための活性炭の質は、「メソ」タイプの活性炭であることが確認されている。
【０１４３】
Ｃｅｃａ社によって販売されるＥＮＯ−ＰＣタイプの活性炭は、この質に完全に適する
。
【０１４４】
さらにそれは、直径１５〜１００Åの孔（「メソ細孔」と称される）を有することから、この活性炭はまた、高分子量分子を保持できるようにする（１００Åの空隙率は、約２０ｋＤａの分子量を保持できるようにする）。
【０１４５】
正面精密濾過による処理は、第２の技術として選択し得る。
【０１４６】
正面精密濾過は、濾過する液体をフィルター表面に垂直に通過させるステップからなる、濾過法である。
【０１４７】
従来法で３種類の正面精密濾過がある。
−中性表面電荷がある、カットオフ閾値０．４５μｍを有する「中性」正面濾過、
−正の表面電荷があり、したがって負に帯電した分子を交換する、これもまたカットオフ閾値０．４５μｍを有するアニオン性正面濾過、
−負の表面電荷があり、したがって正に帯電した分子を交換する、これもまたカットオフ閾値０．４５μｍを有するカチオン性正面濾過。
【０１４８】
出願人は、正のゼータ電位の濾過システムの手段によって（ペプチドグリカンはｐＨ７で負電荷を有する）、乾燥物質１０％に希釈された、デンプン加水分解物溶液の正面濾過を実施することを推奨する。
【０１４９】
接線限外濾過による処理は、第３の技術として選択され得る。
【０１５０】
接線限外濾過は、その中の駆動力が、処理される液体の圧力である、従来の濾過法である。
【０１５１】
モジュールと生成する液体間の加圧液体（濾液または透過液と称される）は、膜から構成されるバリアを越える。
【０１５２】
保持される物質は、使用されるシステムに応じてバッチ式または連続式で、濃縮物中または逆洗溶出物中においてモジュールから取り出し得る。
【０１５３】
本発明に従った方法のカットオフ閾値は約３００００Ｄａであり、これは非常に小さな粒子を保持できるようにする。
【０１５４】
使用される膜の多孔性構造は、最小孔が位置する極微厚の濾過層を有する一方、厚さの残り（１００μｍを超える）または支持層は、約数ミクロンの孔を有し、それは容易な濾液通過を確実にし、アセンブリーに機械的強度を与える。
【０１５５】
したがって深層濾過でない表面濾過が実施される。
【０１５６】
出願人は、約１０の体積濃縮係数を得るように、ｐＨ４．５および温度６０℃で、カットオフ閾値３００００ＤａのＰａｌｌ  Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ有機カートリッジ膜上で、乾燥物質１０％に希釈された、デンプン加水分解物溶液のバッチ様式の接線限外濾過を実施することを推奨する。
【０１５７】
本発明に従った方法の第２の優先的な様式の第４のステップでは、この汚染除去方法の仕上げ処理が、活性炭の手段によって実施される。
【０１５８】
使用される活性炭の吸着能力の分析から、出願人は、本発明に従ったこの第２の優先的な様式の第３のステップが、活性炭処理ステップから既になる場合、デンプン加水分解物処理のために「メソ」、次に「ミクロ」タイプの２種類の活性炭を優先的に組み合わせることとした。
【０１５９】
「微孔性」活性炭を用いたこの第２の処理は、仕上げ処理として機能し、デンプン加水分解物から全ての残留汚染物質を排除できるようにする。
【０１６０】
以下で例示されるように、この仕上げステップはまた、同一目的で、先行する正面精密濾過または接線限外濾過処理後に実施される。
【０１６１】
本発明に従った方法のこの第１の変法の最終ステップでは、得られたデンプン加水分解物が次に収集され、その汚染物質含量が分析される。
【０１６２】
したがってこの第２の優先的な様式の特定の一実施形態では、方法は、
１）デンプン加水分解物を調製するステップと、
２）酵母、カビまたは細菌タイプの微生物のサイズを有するあらゆる汚染物質を除去するように、前記デンプン加水分解物を濾過するステップと、
３）好ましくはカットオフ閾値が約２００００Ｄａ〜５００００Ｄａ、好ましくは３００００Ｄａである接線限外濾過の手段によって、５０Åの最小サイズを有するあらゆる汚染物質を除去するように、前記デンプン加水分解物、すなわち濾液を処理するステップと、４）得られたデンプン加水分解物、すなわち濾液を、好ましくはＮｏｒｉｔ  ＳＸ＋などの「ミクロ細孔」タイプの、高吸着容量活性炭上で処理するステップと；
５）汚染除去されたデンプン加水分解物を収集するステップと
を含んでなる。
【０１６３】
したがって別の第２の優先的な様式の特定の一実施形態では、方法は、
１）デンプン加水分解物を調製するステップと、
２）酵母、カビまたは細菌タイプの微生物のサイズを有するあらゆる汚染物質を除去するように、前記デンプン加水分解物を濾過するステップと、
３）特に「メソ細孔」または「ミクロ細孔」タイプ、好ましくはＥＮＯ−ＰＣタイプの１つなどの「メソ細孔」タイプの活性炭上の処理によって、最小サイズ５０Åを有するあらゆる汚染物質を除去するように、前記デンプン加水分解物、すなわち濾液を処理するステップと；
４）得られたデンプン加水分解物を、好ましくはＮｏｒｉｔ  ＳＸ＋などの「ミクロ細孔」タイプの、高吸着容量活性炭上で処理するステップと；
５）汚染除去されたデンプン加水分解物を収集するステップと
を含んでなる。
【０１６４】
本発明は、処理によって汚染除去できる、デンプンの酵素的または酸加水分解物またはマルトデキストリンからなる群から選択される、デンプン加水分解物にも関する。
【０１６５】
最後に、本発明は、腹膜透析液を製造するためのグルコースポリマーを調製するためのこのデンプン加水分解物の使用に関する。
【０１６６】
本発明は、限定ではなく例示を意図する以下の実施例の手段によって、より明確に理解される。
【実施例】
【０１６７】
実施例１：欧州特許第６６７３５６号明細書の教示に従ったデンプン加水分解物の調製  
本発明に従ったグルコースポリマーを得るための原料は、ワキシーコーンスターチから次のようにして作られる。
−トウモロコシ穀粒全体のみを残すようなトウモロコシの浄化、
−このようにして浄化されたトウモロコシの穀粒を軟化させる、乳酸存在下の浸漬、
−湿式磨砕、次に様々な構成物、すなわち胚芽、セルロース外皮、タンパク質、およびデンプンの分離、
−物理化学的にそして細菌学的にデンプンを精製する、消毒水を用いた向流様式のデンプン浄化、
−デンプンの遠心分離および乾燥、
−最終乾物含量４０％で温度４５℃〜５０℃における、消毒水中のデンプンの懸濁、
−ｐＨ＜２のＨＣｌ添加によるデンプン懸濁液の酸性化、および６〜８分間の１１５〜１２０℃への温度上昇、
−このｐＨにおけるタンパク質と脂肪の軟凝集、
−ｐＨ５での濁液の中和、
−（残留タンパク質、脂肪、およびセルロースを保持するような）珪藻土を通した懸濁液の濾過、
−強カチオン性樹脂と弱アニオン性樹脂上の脱ミネラル化、
−標準活性炭上の脱色、
−Ｎｉｒｏ社により販売されるＭＳＤ−タイプ噴霧乾燥機内における濃厚溶液の噴霧乾燥。
【０１６８】
具体的には、本発明に従った方法の有効性を試験するために、「Ａ−５２５０」および「Ｂ−３０６３」と称される汚染されたバッチを別々に選択した（これらの様々なペプチドグリカン、β−グルカン、および内毒素汚染物質の性質とサイズ次第で、汚染除去の困難性は上下する）。
【０１６９】
以下の表Ｉは、これらの様々なバッチ中で同定された汚染物質の性質を示す。
【０１７０】
比較のために、市販のマルトデキストリンの６つのバッチ「Ｃ」に見出し得る汚染物質の性質もまた示す。
【０１７１】
【表１】
0006436958.tif 000002
【０１７２】
したがってこれらの様々なバッチは、可能な汚染に３つの選択肢を提供する。
−ペプチドグリカン（遊離形態の多糖類）とβ−グルカンによって本質的に汚染された６バッチの「Ａ−５２５０」、
−ペプチドグリカン（生きた細胞または形遊離態の多糖類）および内毒素によって本質的に汚染され、β−グルカンの形跡がない６バッチの「Ｂ−３０６３」、
−その汚染プロファイルが広域スペクトルであり、すなわち全カテゴリーの汚染物質を含有する６バッチの「Ｃ」。
【０１７３】
実施例２：バッチＡ−５２５０およびＢ−３０６３および市販のマルトデキストリンＣのデンプン加水分解物中に見られることもある、β−グルカンおよびペプチドグリカン汚染物質の性質と量に従った活性炭の性質の選択
上述の通り、内毒素、β−グルカン、およびペプチドグリカンタイプの細胞残骸を吸着するために、活性炭処理ステップが特に実施される。
【０１７４】
活性炭の質の選択は、汚染除去されるデンプン加水分解物の直上の各活性炭についてプロットされた、フロイントリッヒ吸着等温式の分析に基づく。
【０１７５】
下で実証されるように、活性炭の選択は、処理されるデンプン加水分解物中に存在する（性質と量の観点からの）汚染物質負荷に直接左右される。
【０１７６】
上述の通り、フロイントリッヒ吸着等温線を求める手順は、（乾燥物質の１０％の）デンプン加水分解物を各タイプの活性炭（処理される乾燥物質に対して０．１２５％〜２％で増大する５つの量、すなわち０．１２５％、０．２５％、０．５％、１％、および２％）と共に、温度７５℃で１時間、ｐＨ４．５で混合するステップからなる。
【０１７７】
次に（１時間の反応後）溶液中の不純物の残留濃度の関数として、活性炭の単位質量当たり吸着された不純物の量を測定することにより、各バッチの汚染物質の性質に従って、「メソ」および「ミクロ」タイプの活性炭の相対効率を判定する。
【０１７８】
２．１  ２バッチのＡ−５２５０を比較したＮｏｒｉｔ  ＳＸ＋およびＥＮＯ−ＰＣタイプの活性炭のフロイントリッヒ吸着等温式の判定
全てのバッチＡは、ペプチドグリカン（遊離形態の多糖類）およびβ−グルカンで本質的に汚染されている、同様のプロファイルを有する。
【０１７９】
以下の表ＩＩは、５つの増大する量の活性炭、２種の質の活性炭処理後における、実施例１のバッチＡ−５２５０のＮｏ．１およびＮｏ．２のβ−グルカンの残留レベルおよび残留ペプチドグリカンを示す。
【０１８０】
【表２】
0006436958.tif 000003
【０１８１】
参照とされる（無菌性腹膜炎の原因である）ペプチドグリカンの吸着曲線を分析すると、以下が観察される。
【０１８２】
活性炭Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ＋の吸着曲線は次をプロットし、
【数１】
0006436958.tif 000004
式中、
Ｃｏ＝汚染物質の初期量
Ｃ＝残留汚染物質の量である。
これは、次の数学方程式によって示され、
ｙ＝２５８８ｘ０．２７７１、相関係数ｒ２は０．９９１４である。
【０１８３】
ＥＮＯ−ＰＣの方は吸着曲線が、次の方程式によって示され、
Ｙ＝１０４５．ｘ０．４１５６
ｒ２（相関係数）は０．９１９０である。
【０１８４】
別々に計算されたこれらの２つの曲線の直線性は、明らかにこれらの２種の性質の活性炭による、ペプチドグリカンの吸着効率を反映する。
【０１８５】
しかし２つの方程式を比較すると、次のようである。
−例えば２０００ｎｇ／ｇである「ｘ」量のペプチドグリカンでは、Ｎｏｒｉｔ／ＥＮＯ−ＰＣ活性炭質の相対効率は８６％である一方、
−例えば１０ｎｇ／ｇである「ｘ」量のペプチドグリカンでは、Ｎｏｒｉｔ／ＥＮＯ−ＰＣ活性炭質の相対効率は１８０％である。
【０１８６】
これから、ＥＮＯ−ＰＣ「メソ細孔」質は、大量のペプチドグリカン汚染物質の吸着に非常に適し、Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ＋「ミクロ細孔」質は、少量の残留ペプチドグリカンの吸着に非常に適することが推定される。
【０１８７】
この結果、バッチＡ−５２５０では、デンプン加水分解物のこの特定のバッチの汚染を除去するステップにおける、活性炭の使用順序を決めることができる。ＥＮＯ−ＰＣ活性炭で処理するステップと、それに続いてＮｏｒｉｔ  ＳＸ＋活性炭で処理するステップ。
【０１８８】
２．２  ２バッチのＢ−３０６３を比較したＮｏｒｉｔ  ＳＸ＋およびＥＮＯ−ＰＣタイプの活性炭のフロイントリッヒ吸着等温式の判定
全てのバッチＢは、ペプチドグリカンと内毒素で本質的に汚染されている、同様のプロファイルを有する。
【０１８９】
以下の表ＩＩＩは、５つの増大する量の活性炭、２種の質の活性炭処理後における、実施例１のバッチＢ−３０６３のＮｏ．１およびＮｏ．２のβ−グルカンの残留レベルおよび残留ペプチドグリカンを示す。
【０１９０】
【表３】
0006436958.tif 000005
【０１９１】
（無菌性腹膜炎の原因である）ペプチドグリカンの吸着曲線を分析すると、以下が観察される。
【０１９２】
Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ＋活性炭の吸着曲線は、以下の数学方程式で表される。
ｙ＝３２５４３ｘ０．４０８８、相関係数ｒ２は０．９７１１である。
【０１９３】
ＥＮＯ−ＰＣの方は吸着曲線が、次の方程式によって示される。
Ｙ＝６５４３．ｘ０．４８４９
ｒ２（相関係数は０．９８１３である。
【０１９４】
別々に計算されたこれらの２つの曲線の直線性は、明らかにこれらの２種の性質の活性炭による、ペプチドグリカンの吸着効率を反映する。
【０１９５】
しかし２つの方程式を比較すると、次のようである。
−例えば２０００ｎｇ／ｇである「ｘ」量のペプチドグリカンでは、Ｎｏｒｉｔ／ＥＮＯ−ＰＣ活性炭質の相対効率は２７９％である一方、
−例えば１０ｎｇ／ｇである「ｘ」量のペプチドグリカンでは、Ｎｏｒｉｔ／ＥＮＯ−ＰＣ活性炭質の相対効率は４１７％である。
【０１９６】
これから、ＥＮＯ−ＰＣ「メソ細孔」質は、このバッチＢ−３０６３のペプチドグリカンの吸着に適さず、Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ＋「ミクロ細孔」質は、ここで少量および大量のペプチドグリカンの吸着のために使用し得ることが推定される。
【０１９７】
この結果、バッチＢ−３０６３では、デンプン加水分解物のこの特定のバッチの汚染を除去するステップにおける、活性炭の使用順序を決めることができる。この場合、逐次のＮｏｒｉｔ  ＳＸ＋タイプの活性炭の２つのステップ。
【０１９８】
２．３  ２バッチのＣを比較したＮｏｒｉｔ  ＳＸ＋およびＥＮＯ−ＰＣタイプの活性炭のフロイントリッヒ吸着等温式の判定
以下の表ＩＶは、５つの増大する量の活性炭、２種の質の活性炭処理後における、実施例１のバッチＣのＮｏ．１およびＮｏ．２のβ−グルカン／内毒素の残留レベルおよび残留ペプチドグリカンを示す。
【０１９９】
【表４】
0006436958.tif 000006
【０２００】
（無菌性腹膜炎の原因である）ペプチドグリカンの吸着曲線を分析すると、以下が観察される。
【０２０１】
Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ＋活性炭の吸着曲線は、以下の数学方程式で表される。
ｙ＝６３７７ｘ０．４１３２、相関係数ｒ２は０．９８７４である。
【０２０２】
ＥＮＯ−ＰＣの方は吸着曲線が、次の方程式によって示される。
Ｙ＝７８３．９７．ｘ０．６５５９
ｒ２（相関係数は０．９３５３である。
【０２０３】
別々に計算されたこれらの２つの曲線の直線性は、明らかにこれらの２種の性質の活性炭による、ペプチドグリカンの吸着効率を反映する。
【０２０４】
しかし２つの方程式を比較すると、次のようである。
−例えば２０００ｎｇ／ｇである「ｘ」量のペプチドグリカンでは、Ｎｏｒｉｔ／ＥＮＯ−ＰＣ活性炭質の相対効率は１２８％である一方、
−例えば１０ｎｇ／ｇである「ｘ」量のペプチドグリカンでは、Ｎｏｒｉｔ／ＥＮＯ−ＰＣ活性炭質の相対効率は２３４９％である。
【０２０５】
これから、ＥＮＯ−ＰＣ「メソ細孔」質は、これらのバッチＣのペプチドグリカンの吸着に適さず、Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ＋「ミクロ細孔」質は、ここで少量および大量のペプチドグリカンの吸着のために使用し得ることが推定される。
【０２０６】
実施例３：リゾチームまたはラミナリナーゼの使用、それに続く外濾過ステップ、次に活性炭により、デンプン加水分解物を汚染除去する方法
バッチＡ−５２５０のＮｏ．３およびＮｏ．５、バッチＢ−３０６３のＮｏ．３およびＮｏ．５、ならびに市販のマルトデキストリンのバッチＣのＮｏ．３およびＮｏ．５をここで選択する。
【０２０７】
０．２μｍの精密濾過モジュール上で、またはカットオフ閾値３００ｋＤａの限外濾過モジュール上で、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）および酵母タイプの微生物を除去することは比較的容易である一方、上で説明された条件下においては、内毒素、β−グルカンおよび／またはペプチドグリカンの除去はかなり特殊な処理ステップの組み合わせの実施を要する。
【０２０８】
上述のように、この組み合わせは、
−サイズを顕著に低下させるための、内毒素、β−グルカン、およびペプチドグリカンを分解するリゾチームまたはラミナリナーゼタイプの特異的酵素を使用するステップと、
−工業酵素それ自体によって導入された、酵素画分および残留不純物を除去する限外濾過ステップと、
−全ての残留する小型の残骸を吸収するための活性炭による処理の最終ステップとからなる。
【０２０９】
活性炭による処理のこの最終ステップに関しては、実施例２で確立されたフロイントリッヒ吸着等温曲線が、Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ＋質が使用すべきものであることを教示する。
【０２１０】
以下の表Ｖは、次によるバッチＡ−５２５０の処理後の残留β−グルカンおよびペプチドグリカン汚染物質の測定を示す。
−リゾチーム（Ｆｌｕｋａ社により販売される酵素、７００００Ｕ／ｍｇの活性を有する）、または
−ラミナリナーゼ（商標名Ｃｙｔｏｈｅｌｉｃａｓｅ（登録商標）の下にＳｉｇｍａ社により販売される酵素、１Ｕ／ｍｇの活性を有する）。
【０２１１】
これらの酵素調製品は、汚染物質がないように留意することが重要である。
【０２１２】
したがって次のように判定される。
−Ｆｌｕｋａリゾチームは＞９．６ＥＵ／ｍｌの内毒素レベルと、３１０００ｎｇ／ｇのペプチドグリカンレベルを有し、
−Ｓｉｇｍａ  Ｃｙｔｏｈｅｌｉｃａｓｅ（登録商標）の方は、＞９．６ＥＵ／ｍｌの内毒素レベルと、３８０００ｎｇ／ｇのペプチドグリカンレベルを有する。
【０２１３】
【表５】
0006436958.tif 000007
【０２１４】
結果は、活性炭で処理された限外濾過透過液中で回収されるバッチＡ−５２５０では、リゾチーム処理がバッチＡ−５２５０に対して作用すらしないという意味で、β−グルカンおよびペプチドグリカン排除のために、ラミナリナーゼによる先行処理が、リゾチームよりもはるかに効率的であることを示す。
【０２１５】
以下の表ＶＩは、バッチＢ−３０６３の処理後の残留内毒素およびペプチドグリカン汚染物質の測定を示す。
【０２１６】
【表６】
0006436958.tif 000008
【０２１７】
結果は、活性炭で処理された限外濾過透過液中で回収されるバッチＢ−３０６３では、ペプチドグリカン排除のために、ラミナリナーゼによる先行処理が、リゾチームよりもはるかに効率的であることを示す。
【０２１８】
以下の表ＶＩＩは、バッチＣの処理後の残留β−グルカン／内毒素およびペプチドグリカン汚染物質の測定を示す。
【０２１９】
【表７】
0006436958.tif 000009
【０２２０】
結果は、活性炭で処理された限外濾過透過液中で回収されるバッチＣでは、リゾチーム処理がバッチＡ−５２５０に対して作用すらしないという意味で、内毒素／β−グルカンおよびペプチドグリカン排除のために、ラミナリナーゼによる先行処理が、リゾチームよりもはるかに効率的であることを示す。
【０２２１】
これらの結果は、ここでは細胞壁分解のための酵素の選択が些細なことでなく、これらの様々なバッチ内に存在する汚染物質の性質に確かに左右されることを実証する。
【０２２２】
Ｃｙｔｏｈｅｌｉｃａｓｅ（登録商標）による処理は、リゾチームよる処理よりも明らかに好ましい。
【０２２３】
実施例４：限外濾過次に活性炭による処理
実証されるように、特定の状況では、限外濾過単独による処理が、内毒素、β−グルカン、およびペプチドグリカンの完全に十分な低下を可能にする。
【０２２４】
方法は、実施例３に記載されるのと同様に実施されるが、酵素の使用はない（したがってｐＨおよび温度の変更はない）。
【０２２５】
４．１  バッチＡ−５２５０の処理
表ＶＩＩＩは、バッチＡ−５２５０のＮｏ．４について、各ステップ後の残留β−グル
カンおよびペプチドグリカン汚染物質の含有量を示す。
【０２２６】
【表８】
0006436958.tif 000010
【０２２７】
限外濾過と活性炭仕上げステップの組み合わせは、バッチＡ−５２５０のデンプン加水分解物を汚染除去できるようにする。
【０２２８】
しかし表Ｖの方法の値を比較すると（リゾチーム処理によって得られる値の他に）、Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ＋活性炭による仕上げ処理後に結果が同一であっても、限外濾過ステップ前にＣｙｔｏｈｅｌｉｃａｓｅ（登録商標）による処理を実施すれば、β−グルカンおよびペプチドグリカンがさらに低下することに留意する。
【０２２９】
したがってＣｙｔｏｈｅｌｉｃａｓｅ（登録商標）によるこの先行処理が、汚染除去処理の効率（本発明に従った汚染除去法の能力、すなわち汚染物質が除去されたデンプン加水分解物を正確に繰り返し生成するその能力）を最適化するために、推奨される。
【０２３０】
４．２  バッチＢ−３０６３の処理
表ＩＸは、バッチＢ−３０６３のＮｏ．４について、各ステップ後の残留内毒素およびペプチドグリカン汚染物質の含有量を与える。
【０２３１】
【表９】
0006436958.tif 000011
【０２３２】
限外濾過と仕上げ活性炭ステップの組み合わせは、バッチＢ−３０６３のデンプン加水分解物を汚染除去できるようにする。
【０２３３】
しかし表ＶＩの方法の値を比較すると（リゾチーム処理によって得られる値の他に）、Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ＋活性炭による仕上げ処理後に結果が同一であっても、限外濾過ステップ前にＣｙｔｏｈｅｌｉｃａｓｅ（登録商標）による処理を実施すれば、内毒素およびペプチドグリカンがさらに低下することに留意する。
【０２３４】
４．３  バッチＣの処理
表Ｘは、バッチＣのＮｏ．４について、各ステップ後の残留内毒素およびペプチドグリカン汚染物質の含有量を与える。
【０２３５】
【表１０】
0006436958.tif 000012
【０２３６】
限外濾過と仕上げ活性炭ステップの組み合わせは、バッチＣのデンプン加水分解物を汚染除去できるようにする。
【０２３７】
しかし表ＶＩＩの方法の値を比較すると（リゾチーム処理によって得られる値の他に）、Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ＋活性炭による仕上げ処理後に結果が同一であっても、限外濾過ステップ前にＣｙｔｏｈｅｌｉｃａｓｅ（登録商標）による処理を実施すれば、内毒素／β−グルカンおよびペプチドグリカンがさらに低下することにに留意する。
【０２３８】
実施例５：一連の活性炭ステップを使用してデンプン加水分解物を汚染除去する方法
実施例３に記載される様式で、汚染微生物が除去されたバッチ「Ａ−５２５０」Ｎｏ．６、「Ｂ−３０６３」Ｎｏ．６、および「Ｃ」Ｎｏ．６に以下の処理を実施する。
【０２３９】
５．１．同一質の活性炭による逐次の２つの処理
これは、目下の論点では乾燥ベースで０．２５％のＮｏｒｉｔ  ＳＸ＋である、同一活性炭を用いた二重処理を適用することを伴い、「ミクロ細孔」タイプの処理が特徴的である。
【０２４０】
以下の表ＸＩは、得られた結果を示す。対照として、２倍量の活性炭Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ＋による一段処理もまた実施する。
【０２４１】
【表１１】
0006436958.tif 000013
【０２４２】
特にペプチドグリカンの除去では、活性炭による二段処理が、２倍量の一段処理よりも効率的であることが明白である。
【０２４３】
５．２．異なる質の活性炭による逐次の２回の処理
第１の処理：化学的炭素：Ｎｏｒｉｔからの０．２５％の「メソ細孔」タイプのＥＮＯ−ＰＣ；
第２の仕上げ処理：０．２５％の「ミクロ細孔」タイプのＮｏｒｉｔ  ＳＸ＋。
【０２４４】
以下の表ＸＩＩは、得られた結果を示す。対照として、２種の活性炭質の混合物である活性炭による一段処理もまた実施した（参照「ミックス」ＴＮ）。
【０２４５】
【表１２】
0006436958.tif 000014
【０２４６】
二段処理が、２種の活性炭質の混合による一段処理より効率的であることが、ここでもまた明白である。
【０２４７】
バッチＡ−５２５０では、第１のメソ細孔処理がミクロ細孔処理よりも効率的に低下させて、（実施例２の教示に従った）従来のアッセイ法による定量化閾値未満の汚染物質レベルを確実にする、ミクロ細孔処理による仕上げを提供することが明白である。
【０２４８】
バッチ３０６３およびＣでは、実施例２で見られるように、Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ＋「ミクロ細孔」質による二重処理が最も効率的である。