(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジンセノサイドＦ1を有効成分として含有し、一定レベルの転写調節因子Ｂrn−３aを維持することを特徴とする転写調節因子Ｂrn−３aの発現調節剤。
【請求項２】
ジンセノサイドＦ1が、一定レベルの転写調節因子Ｂrn−３aを維持するようにBrn-3aの発現を調節することによって、細胞死滅を抑制するBcl-2の発現を調節することを特徴とする請求項１に記載の発現調節剤。
【請求項３】
ジンセノサイドＦ1が、Ｂcl−２の発現減少を抑制することによって、低線量の紫外線照射により誘導される細胞死滅を抑制することを特徴とする請求項２に記載の発現調節剤。
【請求項４】
ジンセノサイドＦ1が、高線量の紫外線照射の下でＢcl−２の発現減少を誘導することによって、細胞死滅を促進することを特徴とする請求項２に記載の発現調節剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下記化学式１で表されるジンセノサイドＦ1（20-O-β‐D‐グルコピラノシル‐20(S)-プロトパナクサトリオール）を有効成分として含有し、一定レベルの転写調節因子Ｂrn−３aを維持する転写調節因子Brn-3aの発現調節剤に関する。
【化１】
0004654040.tif 000002
【背景技術】
【０００２】
紫外線（Ultraviolet radiation）は、２００〜４００ｎｍの波長を有している太陽光線の一部であって、電磁場スペクトルの一部を構成しているが、この中で、特に２８０〜３２０ｎｍの波長を有するＵＶＢ（Ultraviolet-B）は、皮膚老化の最も重要な要因であって、皮膚火傷や皮膚癌を誘発する。皮膚が紫外線に露出すれば、ＤＮＡ、蛋白質、脂質のような細胞成分が損傷され、日光火傷（Sunburn）細胞が生成される。日光火傷細胞は、ＤＮＡ断片化現象やカスパーゼ（Caspase）酵素の活性化などを伴う細胞死滅を起こす。高線量の紫外線に露出された細胞は、復旧できない深刻なＤＮＡ損傷を受けるようになるが、この場合、細胞死滅現象は、このような細胞の死を誘導して、これらが腫瘍に発展するのを防ぐ。したがって、細胞損傷程度によって特異的に細胞死滅を誘導したり防止したりすることが、癌の発生を抑制しつつ、細胞の恒常性を維持するのに非常に重要である。
【０００３】
Ｂｃｌ−２は、このような皮膚細胞死滅過程で重要な役目をする。Ｂｃｌ−２遺伝子は、核膜とミトコンドリアの外膜に存在する２６ｋＤａの蛋白質を暗号化する。Ｂｃｌ−２は、細胞死滅を抑制する蛋白質であって、細胞死滅を促進するＢａｘのような蛋白質に付着してこれらの機能を妨害する。したがって、Ｂｃｌ−２とＢａｘ蛋白質間の濃度比によって細胞が死滅されるべきか否かが決定される。
【０００４】
今までＢｃｌ−２は、皮膚細胞において紫外線照射によりその発現が急激に減少すると報告されており、Ｂｃｌ−２を過発現させた細胞は、紫外線照射による細胞死滅が妨害されることが報告された。しかし、Ｂｃｌ−２の過発現は、深刻なＤＮＡ損傷を有する細胞の死滅をも妨害するので癌を誘発できる。したがって、Ｂｃｌ−２の発現を特異的に調節することが非常に重要である。
【０００５】
今までＢｃｌ−２の機能に比べてその発現調節についてはほとんど知られていないが、神経細胞では、いくつかの転写調節因子が明らかにされ、ｐＲｂ、ｃ−ｍｙｂ、Ｂｒｎ−３ａなどが既に知られている。特に、Ｂｒｎ−３ａは、ｔｙｐｅ  ＩＶ  ＰＯＵ  ｄｏｍａｉｎ転写調節因子であって、Ｂｃｌ−２のＰ２プロモータ（promoter）に付着してＢｃｌ−２遺伝子の発現を調節することによって、細胞死滅から神経細胞を保護する。
【０００６】
しかしながら、未だヒト皮膚から由来するＨａＣａＴ細胞においてＢｃｌ−２の発現を調節する機作や調節因子についてはほとんど知られていない。
また、前記Ｂｃｌ−２の発現を調節できる物質であって、人体に無害で且つヒトに適用が容易なＢｃｌ−２調節物質についても特に知られていない。
【発明の開示】
【０００７】
［発明の要約］
このような状況において、本発明者らは、人参精製サポニンから分離したジンセノサイドＦ1を、有効な濃度にヒト皮膚細胞株であるＨａＣａＴ細胞に処理した時、転写調節因子Ｂrn−３aの発現が調節され、紫外線照射により減少したBcl-2遺伝子の発現が正常な濃度に維持されるという事実と、これにより、細胞死滅が抑制されるという事実を確認した。すなわち、ジンセノサイドＦ1がＢrn−３aの発現を調節することによって、細胞死滅を抑制するという事実を知見し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、ジンセノサイドＦ1を有効成分として含有し、一定レベルの転写調節因子Ｂrn−３aを維持する転写調節因子Ｂrn−３aの発現調節剤を提供することにある。
【０００９】
［発明の詳細な説明］
本発明では、下記化学式１で表されるジンセノサイドＦ1を有効成分として含有し、一定レベルの転写調節因子Ｂrn−３aを維持する転写調節因子Ｂrn−３aの発現調節剤を提供する。
【化２】
0004654040.tif 000003
【００１０】
ジンセノサイドＦ１は、紫外線に起因してＢｒｎ−３ａの発現が減少することを抑制し、これにより、Ｂｃｌ−２の発現が減少することを抑制することによって、低線量の紫外線に起因して皮膚細胞が死滅されることを防止する。すなわち、ジンセノサイドＦ１自体は、Ｂｃｌ−２の発現を増加させないものの、紫外線照射に起因してＢｃｌ−２の発現が減少することを抑制する。一方、高線量の紫外線が照射される場合には、Ｂｃｌ−２の発現減少を誘導することによって、細胞死滅を促進する。
【００１１】
したがって、ジンセノサイドＦ１は、 低線量の紫外線が照射された時には、Ｂｃｌ−２の発現が減少することを抑制することによって、皮膚細胞が死滅されることを防止し、高線量の紫外線が照射された時には、細胞死滅を誘導することによって、皮膚癌を誘発させ得る危険性を招くことなく、細胞損傷を防止する皮膚老化抑制物質として使用することができる。
【００１２】
本発明では、ジンセノサイドＦ１がＢｃｌ−２の転写調節因子であるＢｒｎ−３ａの発現を調節することによって、Ｂｃｌ−２の発現濃度を正常細胞の水準に維持させるという事実を確認した。
【００１３】
したがって、ジンセノサイドＦ１は、細胞内に常に一定量のＢｃｌ−２の濃度が維持されるようにすることで、細胞が死滅されることを防止した。しかしながら、ジンセノサイドＦ１自体は、Ｂｃｌ−２遺伝子の発現を増加させなかった。このような結果は、ジンセノサイドＦ１が癌発生の副作用を招くことなく、紫外線に起因した細胞死滅を抑制し、細胞損傷を防止する効能を有することを示す。
【００１４】
［発明の効果］
本発明は、ジンセノサイドＦ1が、転写調節因子Ｂrn−３aの発現を調節するので、低線量の紫外線照射時に発生するＢcl−２の発現減少を抑制することによって、紫外線照射に起因した細胞死滅を防止することができるほか、高線量の紫外線照射時には、細胞死滅を促進することによって、癌を発生させ得る危険性を除去することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は、ただ一例に過ぎないもので、本発明がこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００１６】
［参照例１］人参精製サポニンの製造
紅参（韓国タバコ人参公社、６年根紅参）２ｋｇに、水を含んだメタノール４Ｌを入れ、３回還流抽出した後、１５℃で６日間沈積させた。その後、濾過袋を用いた濾過及び遠心分離により残渣と濾液を分離した。分離した濾液を減圧濃縮し、得られたエキスを水に懸濁した後、エーテル１Ｌで５回抽出して色素を除去し、水層を１−ブタノール５００ｍＬで３回抽出した。得られた総１−ブタノール層を５％ＫＯＨで処理した後、蒸留水で洗浄し、減圧濃縮して、１−ブタノールエキスを得た。これを少量のメタノールに溶解した後、大量のエチルアセテートに追加して、生成された沈殿物を乾燥することによって、人参精製サポニン抽出物７０ｇを得た。
【００１７】
［参照例２］ジンセノサイドＦ１の製造
参照例１の人参精製サポニン１０ｇを、シトレート緩衝溶液（ｐＨ４.０）１０００ｍＬに溶解し、これにペニシリウム属から分離したナリンジナーゼ 酵素１５ｇを添加し、４０℃で攪拌させながら４８時間反応させた。反応が終了すれば、１０分間加熱して酵素を不活性化させ、反応液は、同量のエチルアセテートで３回抽出して濃縮した。得られた生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）を用いて分離し、ジンセノサイドＦ１ １.５ｇを得た。
【実施例１】
【００１８】
〔［実施例１］ジンセノサイドＦ１の処理により、紫外線照射時に誘導されたＨａＣａＴ細胞の死滅抑制〕
［１段階］細胞株と細胞培養
ヒト皮膚細胞株（human keratinocyte）であるＨａＣａＴ（German Cancer Research Center(DKFZ)のDr.Fusenigから入手）を、１０％牛血清（fetal bovin serum）を含んだＤＭＥＭ培地（Dulbecco's modified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038)で培養し、培養は、いずれも３７℃、５％ＣＯ2培養器で行った。
【００１９】
［２段階］ジンセノサイドＦ１の処理により、紫外線照射時に誘発された細胞死滅の抑制効果
段階１で培養された細胞株をトリプシン処理して、単一細胞懸濁液を作り、６−ウェルに２ｘ１０5個ずつ分株し、２４時間培養した。その後、牛血清が含まれていないＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した後、１、５、１０μＭ濃度のジンセノサイドＦ１を処理した。ジンセノサイドＦ１は、１００％エタノールに溶解して、常に培地の１／１０００の濃度が含まれるようにした。２４時間ジンセノサイドＦ１を処理した後、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、リン酸緩衝溶液を入れた状態で６０〜１２０ｍＪ／ｃｍ2濃度のＵＶＢを照射した。リン酸緩衝溶液を廃棄し、さらに同じ濃度のジンセノサイドＦ１が含まれた培地に交換した。ジンセノサイドＦ１を処理しない細胞を対照群にして同様に培養した。紫外線照射２４時間後、ジンセノサイドＦ１を処理した細胞及び処理しない細胞に、それぞれ３−［４、５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２、５−ジ−フェニルテトラゾリウムブロマイド（3-(4,5-dimethylthiazole-2-y1)-2,5-di-phenyltetrazolium bromide）（MTT, Sigma）溶液を入れ、３７℃で４時間培養した。その後、ジメチルスルホキシドを入れ、溶解した後、ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒ（Thermo Max, Molecular Devices Co.）を用いて５４０ｎｍの波長で形成されたホルマザンダイ(formazan dye)の光学的濃度（ＯＤ）を測定した。紫外線を照射しない細胞のＯＤ値を１００％に計算して、相対的な値を細胞の生存数として図１に示した。ジンセノサイドＦ１を処理した細胞では、処理しない細胞に比較して、紫外線に露出された時、約１.５倍程度細胞死滅が抑制された。しかし、１２０ｍＪ／ｃｍ2濃度の紫外線照射時には、ジンセノサイドＦ１を処理した細胞が、処理しない細胞に比べて多くの数が死んだ。
【実施例２】
【００２０】
〔［実施例２］ジンセノサイドＦ１の処理により、紫外線照射時に誘発されるＨａＣａＴ細胞のＤＮＡ断片化抑制〕
［１段階］細胞株と細胞培養
実施例１の１段階と同様の方法で培養した。
【００２１】
［２段階］ジンセノサイドＦ１の処理により、紫外線照射時に誘発されるＨａＣａＴ細胞のＤＮＡ断片化抑制
段階１で培養された細胞株をトリプシン処理して、単一細胞懸濁液を作り、６−ウェルに２ｘ１０5個ずつ分株し、２４時間培養した。その後、牛血清が含まれていないＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した後、５μＭ濃度のジンセノサイドＦ１を処理した。２４時間ジンセノサイドＦ１を処理した後、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、リン酸緩衝溶液を入れた状態で６０ｍＪ／ｃｍ2濃度のＵＶＢを照射した。リン酸緩衝溶液を廃棄し、さらに同じ濃度のジンセノサイドＦ１が含まれた培地に交換した。ジンセノサイドＦ１を処理しない細胞を対照群にして同様に培養した。紫外線照射２４時間後、ジンセノサイドＦ１を処理した細胞及び処理しない細胞を、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドが含まれたリン酸緩衝溶液で１５分間処理して、細胞を固定した。リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、０.０５％ツイーン（tween）２０と０.２％ＢＳＡが含まれたリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で１５分間反応させた。ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（Terminal deoxynucleotide transferase）反応溶液（TUNEL Apoptosis detection kit, Upstate, USA）を入れ、１時間反応した。反応中断バッファ（TUNEL Apoptosis detection kit, Upstate, USA）を添加して反応を中止し、ブロッキング溶液（TUNEL Apoptosis detection kit, Upstate, USA）を入れ、２０分間反応させた。アビジン−ＦＩＴＣ（TUNEL Apoptosis detection kit, Upstate, USA）を添加した後、３０分間反応させ、リン酸緩衝溶液で洗浄した。５００ｎＭプロピジウムアイオダイド溶液を用いて対比染色(counterstain)した後、蛍光顕微鏡で観察した。約２００個の細胞を観察し、全体細胞のうちＤＮＡ断片化が生じた細胞を計算した。ジンセノサイドＦ１を処理した細胞が、処理しない細胞より紫外線照射により生じるＤＮＡ断片化現象が２.４倍程度減少した。その結果を図３に示した。
【実施例３】
【００２２】
〔［実施例３］ジンセノサイドＦ１の処理により、紫外線照射時に生じるＰＡＲＰ蛋白質の切断抑制効果〕
［１段階］細胞株と細胞培養
実施例１の１段階と同様の方法で培養した。
【００２３】
［２段階］ジンセノサイドＦ１の処理により、紫外線照射時に生じるＰＡＲＰ蛋白質の切断抑制
段階１で培養された細胞株をトリプシン処理して、単一細胞懸濁液を作り、６−ウェルに２ｘ１０5個ずつ分株し、２４時間培養した。その後、牛血清が含まれていないＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した後、５μＭ濃度のジンセノサイドＦ１を処理した。２４時間ジンセノサイドＦ１を処理した後、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、リン酸緩衝溶液を入れた状態で６０ｍＪ／ｃｍ2のＵＶＢを照射した。リン酸緩衝溶液を廃棄し、さらに５μＭ濃度のジンセノサイドＦ１が含まれた培地に交換した。ジンセノサイドＦ１を処理しない細胞を、対照群にして同様に培養した。紫外線照射２４時間後、ジンセノサイドＦ１を処理した細胞及び処理しない細胞を、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、トリプシンを処理して、細胞を回収し、これを８Ｍウレア、２％ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ  ＤＴＴ、２Ｍチオウレア、２ｍＭ  ＰＭＳＦ、１００μｇ／ μＬ  ロイペプチン（leupeptine）よりなる蛋白質抽出緩衝溶液５００μｇを処理した後、１０分間常温で放置した。その後、４℃で１０分間１５，０００ｇの重力加速度で遠心分離し、上層液を回収した後、ＢＩＯ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｙｅ  ＲｅａｇｅｎｔTMを用いて蛋白質を定量した。２０μｇの蛋白質を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてサイズ別に分離し、５０Ｖで１２時間ＰＤＦ（ＢｉｏＲａｄ）膜にブロッティングした。このブロット（blot）を５％無脂肪牛乳溶液で１時間ブロッキングした後、一次抗体として、ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＰＡＲＰ（SantaCruz）を、二次抗体として、ホースラディシュペルオキシダーゼ(Horse Radish Peroxidase)が結合されたａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Amersham）を利用し、Ａｍｅｒｓｈａｍ社の 高感度ケミルミネッセンス (enhanced chemiluminescence, ＥＣＬ）キットを利用した。反応させたブロットは、Ｘ線ＦＵＪＩフィルムに感光させた後、現像して、蛋白質発現程度を確認した。フィルム上のバンドは、ＰｏｗｅｒＬｏｏｋ２１００  ＸＬ（Umax）を用いてスキャニングした後、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ  ２Ｄ  Ｅｌｉｔｅ（Amersham Bioscience）イメージ分析プログラムを用いて分析した。ＰＡＲＰ蛋白質の切断された量は、対照群の切断された量を基準にして相対的な値として表した。ジンセノサイドＦ１を処理した細胞の場合が、処理しない細胞より紫外線照射により生じるＰＡＲＰ蛋白質の切断化現象が１.４倍程度減少した。その結果を図４に示した。
【実施例４】
【００２４】
〔［実施例４］ジンセノサイドＦ１の処理により、紫外線照射時に生じるＢｃｌ−２遺伝子の発現減少の抑制〕
［１段階］細胞株と細胞培養
実施例１の１段階と同様の方法で培養した。
【００２５】
［２段階］ジンセノサイドＦ１の処理により、紫外線照射時に生じるＢｃｌ−２遺伝子の発現現象の抑制
段階１で培養された細胞株をトリプシン処理して、単一細胞懸濁液を作り、６−ウェルに２ｘ１０5個ずつ分株し、２４時間培養した。その後、牛血清が含まれていないＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した後、５μＭ濃度のジンセノサイドＦ１を処理した。２４時間ジンセノサイドＦ１を処理した後、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、リン酸緩衝溶液を入れた状態で６０ｍＪ／ｃｍ2のＵＶＢを照射した。リン酸緩衝溶液を廃棄し、さらに５μＭ濃度のジンセノサイドＦ１が含まれた培地に交換した。
ジンセノサイドＦ１を処理しない細胞を、対照群にして同様に培養した。紫外線照射２４時間後、または紫外線を照射せずに時間別に、ジンセノサイドＦ１を処理した細胞と処理しない細胞をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｍＲＮＡ  ｋｉｔｓ（QIAGE, Hilden, Germany）を用いてｍＲＮＡを抽出し、定量的な逆転写ＰＣＲを行った。定量的な逆転写ＰＣＲを行うためのＢｃｌ−２とグリセルアルデヒドリン酸脱水素酵素（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase （ＧＡＰＤＨ））遺伝子の各対のプライマー配列は、表１に示す通りである。
【００２６】
【表１】
0004654040.tif 000004
【００２７】
ｍＲＮＡ  １μｇを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０.１Ｍ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、４０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ阻害剤よりなる逆転写反応緩衝液２５μＬに入れ、０.５μｇ ／ｍｌ  ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）16のプライマーと２００ｕｎｉｔｓ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（GiboBRL）の逆転写重合酵素を添加し、４２℃で１時間反応させた。その後、逆転写反応溶液２.５μＬを５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１００μＭ  ｄＮＴＰよりなるＰＣＲ反応緩衝液５０μＬに混合し、１０μＭのプライマーと０.５ＵのＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を添加し、９５℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３０秒の３０サイクルを行った。ＰＣＲ結果をアガロースゲルに電気泳動し、これをスキャニングした後、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ  ２Ｄ  Ｅｌｉｔｅ（Amersham Bioscience）イメージ分析プログラムを用いて分析した。Ｂｃｌ−２遺伝子の発現程度は、ＧＡＰＤＨ発現量に対する相対的な値として表した。ジンセノサイドＦ１だけを処理した場合、時間によるＢｃｌ−２遺伝子の発現は、処理しない細胞のそれと差異がなかった。紫外線を照射した時、ジンセノサイドＦ１を処理しない細胞の場合、Ｂｃｌ−２遺伝子の発現が減少し、紫外線照射２４時間後には、ほとんど発現されなかった。しかし、ジンセノサイドＦ１を処理した細胞の場合、紫外線を照射した時にも、照射しない場合と比較してほとんど差異がない程度に発現が維持された。すなわち、ジンセノサイドＦ１を処理する場合、処理しない場合に比較してＢｃｌ−２遺伝子の発現が３倍程度増加した。その結果を図５に示した。
【実施例５】
【００２８】
〔［実施例５］ジンセノサイドＦ１の処理により、紫外線照射時に生じるＢｒｎ−３ａの発現減少抑制効果〕
［１段階］細胞株と細胞培養
実施例１の１段階と同様の方法で培養した。
【００２９】
［２段階］ジンセノサイドＦ１の処理により、紫外線照射時に生じるＢｒｎ−３ａの発現減少抑制効果
段階１で培養された細胞株をトリプシン処理して、単一細胞懸濁液を作り、６−ウェルに２ｘ１０5個ずつ分株し、２４時間培養した。その後、牛血清が含まれていないＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した後、５μＭ濃度のジンセノサイドＦ１を処理した。２４時間ジンセノサイドＦ１を処理した後、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、リン酸緩衝溶液を入れた状態で６０ｍＪ／ｃｍ2のＵＶＢを照射した。リン酸緩衝溶液を廃棄し、さらに５μＭ濃度のジンセノサイドＦ１が含まれた培地に交換した。ジンセノサイドＦ１を処理しない細胞を対照群にして同様に培養した。紫外線照射２４時間後、ジンセノサイドＦ１を処理した細胞及び処理しない細胞を、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、トリプシンを処理し、細胞を回収した。これを８Ｍウレア、２％ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ  ＤＴＴ、２Ｍチオウレア、２ｍＭ  ＰＭＳＦ、１００μｇ／μＬ ロイペプチンよりなる蛋白質抽出緩衝溶液５００ μＬを処理した後、１０分間常温で放置した。その後、４℃で１０分間１５,０００ｇの重力加速度で遠心分離し、上層液を回収した後、ＢＩＯ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｙｅ  ＲｅａｇｅｎｔTMを用いて蛋白質を定量した。２０ μｇの蛋白質を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてサイズ別に分離し、５０Ｖで１２時間ＰＤＦ（BioRad）膜にブロッティングした。
このブロットを５％無脂肪牛乳溶液で１時間ブロッキングした後、一次抗体として、ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−Ｂｒｎ−３ａ（SantaCruz）を、二次抗体として、ホースラディシュペルオキシダーゼ(Horse Radish Peroxidase)が結合されたａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Amersham）を利用し、Ａｍｅｒｓｈａｍ社の高感度ケミルミネッセンス (enhanced chemiluminescence, ＥＣＬ)キットを利用した。反応させたブロットは、Ｘ線ＦＵＪＩフィルムに感光させた後、現像して、蛋白質発現程度を確認した。フィルム上のバンドは、ＰｏｗｅｒＬｏｏｋ  ２１００  ＸＬ（Umax）を用いてスキャニングした後、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ  ２Ｄ  Ｅｌｉｔｅ（Amersham Bioscience）イメージ分析プログラムを用いて分析した。Ｂｒｎ−３ａ蛋白質は、紫外線照射によりその発現が減少したが、ジンセノサイドＦ１を処理すれば、さらに発現が回復した。その結果を図６に示した。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ジンセノサイドＦ１をＨａＣａＴ皮膚細胞に処理し紫外線を照射した時、処理しない対照群と比べてどれほど細胞死滅を防止するかを、ＭＴＴ還元反応実験を通じて調査した結果を示すグラフである。
【図２】ジンセノサイドＦ１を処理し紫外線を照射した場合及び処理しない対照群に紫外線を照射した場合において、細胞形状の変化を示す図である。
【図３】ジンセノサイドＦ１を処理した細胞及び処理しない対照群に紫外線を照射した場合に現れるＤＮＡの断片化程度を示す図である。
【図４】ジンセノサイドＦ１を処理した細胞及び処理しない対照群に紫外線を照射した場合、ＰＡＲＰの切断程度を、ウエスタンブロット(Western blot)を実行して示す結果である。
【図５】ジンセノサイドＦ１を処理した細胞及び処理しない対照群に紫外線を照射し、細胞死滅を調節するＢｃｌ−２の発現程度を、ｍＲＮＡ水準で調査した図である。
【図６】ジンセノサイドＦ１を処理した細胞及び処理しない対照群に紫外線を照射し、Ｂｃｌ−２の転写調節因子であるＢｒｎ−３ａの発現変化を、ウエスタンブロット(Western blot)を実行して示す結果である。Ｈｓｐ７０は、同じ蛋白質量が使われたことを示す。
【図１】
0004654040.tif 000005
【図２】
0004654040.tif 000006
【図３】
0004654040.tif 000007
【図４】
0004654040.tif 000008
【図５】
0004654040.tif 000009
【図６】
0004654040.tif 000010
【配列表】
0004654040000001.app