(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面増強分光法(SES)-活性分子が付着した金属ナノ粒子を含む粒子であって、前記金属ナノ粒子が、Au、Ag及びCuからなる群から選択される金属から構成され、前記金属ナノ粒子およびそれと共に付着した前記SES-活性分子が、ガラスである被包材料により取り囲まれていることを特徴とする粒子。
【請求項２】
前記金属ナノ粒子がAuから構成される、請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
前記金属ナノ粒子がAgから構成される、請求項１に記載の粒子。
【請求項４】
前記金属ナノ粒子の直径が200nm未満である、請求項１に記載の粒子。
【請求項５】
前記金属ナノ粒子の直径が20〜200nmである、請求項１に記載の粒子。
【請求項６】
前記金属ナノ粒子の直径が40〜100nmである、請求項１に記載の粒子。
【請求項７】
前記金属ナノ粒子が、球体である請求項１に記載の粒子。
【請求項８】
前記金属ナノ粒子が、扁平な長球である請求項１に記載の粒子。
【請求項９】
前記金属ナノ粒子が、扁長な長球である請求項１に記載の粒子。
【請求項１０】
前記被包材料の厚さが１ミクロン未満である、請求項１に記載の粒子。
【請求項１１】
前記被包材料の厚さが１〜40nmである、請求項１に記載の粒子。
【請求項１２】
前記被包材料の厚さが３〜10nmである、請求項６に記載の粒子。
【請求項１３】
前記SES-活性分子が前記金属ナノ粒子上に下塗りの単層コーティングを形成する、請求項１に記載の粒子。
【請求項１４】
前記SES-活性分子が前記金属ナノ粒子上に単層コーティングを形成する、請求項１に記載の粒子。
【請求項１５】
前記SES-活性分子が前記金属ナノ粒子上に多層コーティングを形成する、請求項１に記載の粒子。
【請求項１６】
前記SES-活性分子の検出、同定、または定量化の単数または複数種類の方法が、群：SERS、SERRS、SEHRS、SEHRRS、またはSEIRAの中から選択される、請求項１に記載の粒子。
【請求項１７】
分子、細胞、ビーズまたは固体キャリヤを光学的にタグ付けする方法であって、請求項１〜１６の何れか１項に記載の粒子を、前記分子、細胞、ビーズまたは固体キャリヤに付けることを含む方法。
【請求項１８】
前記分子が生体高分子である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体高分子が核酸である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体高分子がタンパク質である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
分子、細胞、ビーズまたは固体キャリヤを光学的にタグに付けるために請求項１〜１６の何れか１項に記載の粒子を使用する方法。
【請求項２２】
サンドイッチイムノアッセイ中の光学的タグとして請求項１〜１６の何れか１項に記載の粒子を使用する方法。
【請求項２３】
多重化学アッセイのための光学的タグとして請求項１〜１６の何れか１項に記載の粒子を使用する方法。
【請求項２４】
ミクロボリューム・レーザー・スキャニング・サイトメトリーのための光学的タグとして請求項１〜１６の何れか１項に記載の粒子を使用する方法。
【請求項２５】
新規化合物のライブラリの固体キャリヤ-ベースのコンビナトリアル化学における光学タグとして請求項１〜１６の何れか１項に記載の粒子を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、表面増強分光法-活性複合体ナノ粒子、前記粒子の製造法、及び前記粒子の使用(分子または細胞の光学タグとしてのその使用を含む)に関する。特に本発明は、定量化、局在化(localization)、同定、及び／または追跡の目的に関して注目する物体に共有結合的にまたは非共有結合的に付着させ得るサブミクロンサイズのタグまたはラベルの分野に関する。
【０００２】
発明の背景
光を分子に向けると、その入射光子の大部分は周波数が変化することなく弾性的に散乱する。これをレイリー散乱(Rayleigh  scattering)という。しかしながら、入射光子のエネルギーの幾らか(107個の入射光子につき約１個)は結合して、その分子結合の別の振動モードになる。そのような結合によって、入射光の幾らかは入射光の範囲とは異なる周波数範囲の分子によって非弾性的に散乱してしまう。これをラマン効果という。その強度に対してそのように非弾性的に散乱した光の周波数をプロットすることによって、観察中の分子の特徴的なラマンスペクトルが得られる。未知サンプルのラマンスペクトルを分析すれば、そのサンプルの分子組成についての情報を得ることができる。
【０００３】
分光器が顕微鏡型で構築されていれば、通常レーザーによって与えられるラマン分光法の入射照明(incident  illumination)を小さな点に集中させることができる。このラマンシグナルはレーザー力により線形的に増減するので、そのサンプルの光強度が非常に高ければ装置の感度を最適化できる。さらに、分子のラマン応答が本質的に瞬間的に(永続的な高エネルギー中間体状態が全くなく)起きるといっても、この高強度の光では、ラマン-活性分子の光退色(photobleaching)は耐え難い。このため、蛍光分光法はラマン分光法とは著しい対照をなし、光退色は多くの用途を大きく制限している。
【０００４】
このラマン効果は、(単数または複数の)ラマン-活性分子を構造金属表面に(＜50Å)近づけることによって顕著に増強させることができ；この領域は表面から離れる程、急激に減衰する。好適に粗面化した金、銀、若しくは銅または他の遊離電子金属にラマン-活性分子を吸着させることによって、通常、金属表面に分子を接近させる。ラマン活性の表面-増強効果は、金属コロイド粒子、誘電体上の金属フィルム、及び金属粒子合金で観察される。この表面-増強ラマン散乱(SERS)が起きるメカニズムは研究されており、(i)光の局所強度を増強させる金属内の表面プラスモン共鳴、並びに(ii)金属表面とラマン-活性分子との間の電荷-移動錯体の形成及び続く転移、との組合せに起因すると考えられている。
【０００５】
SERSによって、１個の金または銀のナノ粒子表面に付着した分子を検出することができる。(単数または複数の)ラマン-活性分子を付着または結合させたラマン増強金属を、SERS-活性ナノ粒子という。かかるSERS-活性ナノ粒子は光学タグとして有用である。たとえば、注目するターゲット分子に対して抗体を結合させたときのイムノアッセイで、SERS-活性ナノ粒子を使用することができる。注目するターゲットが固体キャリヤ上に固定されている場合、１個のターゲット分子と１個のナノ粒子-結合抗体との間の相互作用はそのラマン-活性分子の特徴的なラマンスペクトルを探すことによって検出することができるだろう。さらに、１つのラマンスペクトル(100〜3500cm-1)で多くの異なるラマン-活性分子を検出することができるので、SERS-活性ナノ粒子は多重(multiplexed)アッセイフォーマットで使用することができる。
【０００６】
化学的アッセイで光学タグとして使用すると、SERS-活性ナノ粒子は無比の感度、安定性及び官能基の多重化の可能性を提供する。しかしながら、かかるアッセイで使用する際に金属から製造したSERS-活性ナノ粒子には、侮りがたい実際的な問題がある。金属ナノ粒子は水溶液中での凝集に対して非常に感受性であるので；一度凝集してしまうと、これらを再分散させるのは不可能だという点である。さらに幾つかのラマン-活性分子の化学組成は、金属ナノ粒子に他の分子(たとえばタンパク質)を付着させるのに使用する化学反応と適合しない。このため、ラマン-活性分子、付着させる化学反応、及び金属ナノ粒子に付着させるべき他の分子の選択が制限されてしまう。
【０００７】
ラマンタグとして金属ナノ粒子を使用する際の最も大きな問題は、ナノ粒子に結合させるべき分子のラマンスペクトルの類似性である。たとえば、多重サンドイッチイムノアッセイでは、ナノ粒子が結合している二次抗体のラマンスペクトルが酷似しているので、逆重畳させるのは不可能である。さらに、異なる二次抗体の一部、則ち抗原-結合ドメインは通常、大きく増強させるべき金属表面から離れすぎている。
【０００８】
従来技術では、その分子のラマン分散の横断面が十分に大きければ、ラマンタグとして分子自体を使用することができると教示している。従って、たとえば抗体に染料を直接付着させると、イムノアッセイ用のタグとして使用できることになる。しかしながらこのアプローチは非常に制限されている：強烈なラマンスペクトルを生みだす分子構造/特徴(たとえば、分極化、芳香族性、共役、ヘテロ原子、及び最も顕著には有意吸着横断面)もラマンスペクトルを複雑にするからである。分子ラマンタグを使用するには共鳴ラマン散乱を利用するのにスペクトルの可視領域で非常に高い吸光度(extinction)がなければならず、これによってラマンシグナルは次数が３オーダーまで増強する。可視光を十分に吸収する分子と簡単なラマンスペクトルを示す分子との間には根本的に物理的非適合性がある。かくして、上記染料のラマンスペクトルは非常に複雑で、これらのアッセイを多重化できなかった。
【０００９】
ラマンベースのタグを使用する際の第二の根本的な問題は、そのラマンシグナルが弱いということである；表面増強効果を使用しないでラマンによって１個の分子(または数千もの分子でさえも)検出するのは不可能である。SERSに関連する増強因子と、自由に拡散する種(巨視的SERS-活性表面では可能ではない)にそのようなタグを付着させる能力とを示すタグが理想的である。
【００１０】
本発明の目的は、特に化学的アッセイまたは生体高分子アッセイで、光学的にアドレス可能なラベル(標識)またはタグとしてラマン散乱物体を使用したときに直面する上記のような問題に対する解決策を提供することである。本発明のさらなる目的は、ビーズベースのコンビナトリアル化学合成で「開裂しない(cleaveless)」光学タグとして使用するための少なくとも20種類の異なるSERS-活性ナノ粒子の一群を提供することである。本発明のさらなる目的は、多重アッセイ用の光学検出系について記載することである。
【００１１】
本発明は、SERS-活性金属ナノ粒子(SACN)を含む表面増強分光法-活性複合ナノ粒子に関する。本発明の範囲には、前記粒子の製造法及び、(分子または細胞の光学タグとしての使用を含む)前記粒子の使用も含まれる。本発明のサブミクロンサイズのタグまたはラベルは、定量化、局在化、同定、及び／または追跡するための(分子から巨視的物体のサイズに及び得る)注目する物体に共有結合的または非共有結合的に付着させることができる。
【００１２】
発明の概要
本発明は、光学タグとしてラマン散乱種などの表面増強分光法-活性(SES-活性)種を使用する際に直面する問題を克服する。本発明は、SERS-活性金属ナノ粒子(SACN)を含む、新規SES-活性複合ナノ粒子を提供する。かかる粒子はそれぞれSES-活性金属ナノ粒子と、その金属表面に近いSES-活性種の下塗りの単層(submonolayer)、単層または多層と、ポリマー、ガラスまたは任意の他の誘電性材料を含む被包シェル(encapsulating  shell)とを含む。これによって前記金属ナノ粒子と被包材料との間の界面にSES-活性分子(あるいは「分析物：analyte」として本明細書中で参照されるもの；最後に定量される溶液中の種と混同しない)を設置する。
【００１３】
好ましい態様では、前記被包材料はガラスである。得られたガラス・コーティング化分析物充填ナノ粒子(GAN)はSES-活性金属ナノ粒子の活性を保持するが、ナノ粒子の外部表面からはこの活性をしっかり隔離する。かくして、表面活性ラマン散乱(SERS)の場合には、得られたGANはSERSを示すが、そのSERS-活性分析物は金属ナノ粒子と被包材料との界面に配置されている。
【００１４】
可視光を吸収する種である必要はないので、前記分析物分子は、非常に簡単なラマンスペクトルを示すように選択することができる。これによって今度は異なる種類のGAN粒子の混合物中でそれぞれの分析物のラマンスペクトルが識別できるように、それぞれ異なる分析物分子を持つ複数のGAN粒子を作ることができる。
【００１５】
GANは取り扱い及び貯蔵が容易である。これらは耐凝集性で、溶液及び空気中における分析物の分解に対して安定化されており、化学的不活性でもあり、SERS活性を損なうことなく遠心分離及び再分散させることができる。
【００１６】
より重要なことには、GANのガラスシェルは標準的な方法によって容易に誘導体形成(derivatize)することができる。これによってGANは、(たとえばタンパク質及び核酸などの生体高分子を含む)分子に、またはGANのラマン活性と干渉することなく固体キャリヤに結合させることができる。金属ナノ粒子と異なり、GANは蒸発乾涸させ、次いで溶媒中に完全に再分散させることができる。本明細書中に提供する方法を使用して、SERSを用いて個別に検出可能なGANを製造することが可能である。
【００１７】
本発明により提供されるSACNは、独自に同定可能なナノ粒子である。これらは、光学タグと一緒に、(固体キャリヤの他のタイプとビーズとを含む)物体または分子を標識するのが必要な実質的に全ての状況で使用することができる。生体高分子は、標準的な方法によってSACNの外側に容易に結合できるので、この粒子は生物学的アッセイで光学タグとして機能することができる。SACNは、蛍光ラベルなどの光学タグを使用する実質的に全てのアッセイで使用することができる。しかしながら、光学タグとしてのSACNには、蛍光ラベルよりも明らかに有利な幾つかの点がある。これらの有利な点としては、非常に感受性の検出性、化学的均一性、及び光退色または光分解に対するSERS活性の絶対的耐性が挙げられる。光学タグとしてSACNを使用するもう１つの有利な点は、異なるSERS-活性を持つ個々のSACNを互いに分割できるということである。単純なラマン分光法を使用して、少なくとも20種類の異なるSACNが分割可能である。これによって、それぞれが特徴的且つ識別可能なSERS-活性をもつ、異なるSACNの一群を使用して多重アッセイを実施することができる。
【００１８】
さらに、SACNは、ビーズベースのコンビナトリアル化学合成において新規な「開裂しない」光学タグとして機能することができる。この態様において、スキーム中のそれぞれの合成段階は、特徴的なSACNをビーズに結合させることによって実施することができる。ビーズの反応履歴、従って合成された化合物の識別情報(identity)は、ビーズからSACNを最初に開裂する必要なく、ビーズのSERSスペクトルを読みとることによって明らかにすることができる。
【００１９】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、SERS-活性金属ナノ粒子(SACN)を含む表面増強分光法-活性複合ナノ粒子に関する。本発明の範囲には、前記粒子の製造法及び、(分子または細胞の光学タグとしての使用を含む)前記粒子の使用も含まれる。本発明のサブミクロン-サイズのタグまたはラベルは、定量化、局在化、同定、及び／または追跡目的のために(分子から巨視的物体までの範囲を変動し得る)注目する物体に共有結合的または非共有結合的に付着させることができる。
【００２０】
好ましい態様
SERS-活性複合ナノ粒子(SACN)は、金属ナノ粒子表面に一種以上のラマン-活性分子(あるいは本明細書中「分析物：analyte」という)を付着させた金属ナノ粒子から構成される。次いでラマン増強性金属と分析物とのこの複合体(SERS-活性金属ナノ粒子という)を被包材料によってコーティングまたは封入する。好ましい態様では、上記被包材料はガラス材料であり、上記SACNをガラス-コーティング化分析物充填ナノ粒子(GAN)という。
【００２１】
好ましい態様において、SACNは、SERS-活性金属ナノ粒子コア上に好適な被包材料のシェルを成長させるか、設置することによって提供する。この金属ナノ粒子コアは、直径20〜200nmの金または銀の球体であるのが好ましい。同一材料の扁平または扁長な金属長球が最も好ましい。赤い入射光線(〜633nm)を使用するSERSの場合には、最適SERS応答は直径63nmの金のナノ粒子コアで得られる。所望のサイズの金属ナノ粒子は、当業界で公知の種々の方法により金属コロイドとして成長させることができる。たとえば任意の種類の還元剤を使用して溶液中で金属イオンを化学的または光化学的に還元させることが記載されている。同様に、ナノ粒子合成は、小容積、たとえば小胞内でナノ粒子合成を実施する。ナノ粒子は溶液中で放電によって製造することができる。1800年代中頃まで遡ると、他に数十の方法が記載されている。
【００２２】
上記被包材料は、金属ナノ粒子のSERS活性を測定できる程度まで変えてしまわないのが好ましい。しかしながら、上記被包材料がSERS活性を干渉しないか、またはラマンスペクトルに有意な複雑性を与えないのであれば、上記被包材料が幾らか測定可能な効果を持っていても、まだ本発明の好都合な点は得られる。さらに、上記被包材料は、その外部表面に生体高分子を含む分子を付着させるために容易に変形できなければならない。好適な被包材料としては、ガラス、ポリマー、金属、金属酸化物(たとえばTiO2及びSnO2)、及び金属硫化物が挙げられるが、これらに限定されない。上記被包化(封入化)は、SACNのSERS活性を提供するためのラマン-活性分析物のコア・ナノ粒子の吸着後またはその間に実施する。このようにして、上記ラマン-活性分析物は金属ナノ粒子コアの表面のコーティングとして周囲の溶媒から隔離(sequester)される。かかる構造体は、安定なSERS活性を持つ金属ナノ粒子コアを提供する。ラマン-活性分析物は、上記金属ナノ粒子コアの表面に下塗りの単層、完全単層、または多層アセンブリを形成することができる。ラマン-活性分析物はラマン-活性分子の単一種を含むことができるか、または異なる数種のラマン−活性分子の混合物であることができる。
【００２３】
特に好ましい態様では、上記被包材料はガラス(たとえばSiOx)である。ガラスに封入するために、上記金属ナノ粒子コアを最初にガラスプライマー(すなわち、ガラスの均一コーティングを誘導するか、または前記粒子にガラスコーティングの付着を促進し得るか、あるいはそのいずれもである材料)で最初に処理するのが好ましい。次いで当業界で公知の標準的な方法により、ガラスを前記金属ナノ粒子上に成長させる。得られたSACNを、ガラス分析物-充填ナノ粒子(GAN)という。
【００２４】
ガラス及び他の多くの材料は、分子付着しやすい官能基を含むことを特記する。たとえば、塩基中にガラスを浸漬すると、アルキルトリクロロシラン類またはアルキルトリアルコキシシラン類を共有結合で付着させることができ、アルキル基の末端に追加の利用可能な官能基が得られる。このように、ガラス表面は、細胞、並びに酸化物、金属、ポリマー類などを含む生体高分子及び生体高分子高次構造の全ての形態で変形することができる。同様に、ガラス表面は十分に組織化された単層で変形することができる。要するに、ガラスコーティングは本質的に、全ての形の化学的機能的分化(functionalization)(誘導体形成：derivatization)を支持する。これは等しく被包材料の多くの異なる形態についても当てはまる。要するに、化学的に反応性の官能基を持つ任意の種にSACN粒子を固定できるということである。全ての化学官能基は特定の条件下で反応性である。かくして、上記被包材料表面上に固定化し得る種には制限がない。
【００２５】
上記被包材料の厚さは、SACNに必要な物理的特性に依存して容易に変動させることができる。たとえば、１ミクロン以上のオーダーの厚すぎるコーティングでは、強いラマンスペクトルを得られないだろう。薄すぎるコーティングでは、上記被包材料表面上の分子によって分析物のラマンスペクトルが干渉されるたろう。同時に、沈降係数などの物理的特性は、被包材料の厚さによって明らかに影響を受ける。通常、被包材料が厚ければ厚いほど、金属ナノ粒子コア上の(単数または複数の)ラマン-活性分析物はより効果的に周囲の溶液から隔離される。
【００２６】
GANに関しては、好ましいガラスの厚さは１〜40nmである。特に好ましい態様では、前記GANは16nm厚さのガラス球によって封入された直径60nmの金の粒子を含む。前記SACNの寸法の最適化は、当業者により容易に実施することができる。従って、本発明に従って前記粒子の組成、またはそのサイズ及び形を変更して、タグとして使用するラマン分析物分子の強度を最適化することができる。実際、コア-シェル・ナノ粒子(則ち、Au/AuS)はSERSを支持し、純粋な金属ナノ粒子とは非常に異なる光学的特性をもつ。同様に、長球体(prolate  spheroid)由来のSERSは、同一主軸を持つ球体と比較して増強化されているのは公知である。さらに、単一粒子増強化(single  particle  enhancement)は波長依存性が強いことは公知である。かくして、粒径を「調整」して所定の励起波長に対して最大シグナルが得られるようにできるだろう。
【００２７】
金属ナノ粒子の周囲で核形成しなかった被包材料の粒子を含まない真のSACNを分離することが望ましい。遊離被包材料粒子はSERS-活性ではないので、かかる分離によってナノ粒子調製品のSERS活性を強化できる。たとえば、50%グリセロール中のサイズ排除遠心分離によって、GANをガラス粒子から分離することができる。
【００２８】
本発明は特に、それぞれが特徴的なSERSスペクトルを持つ、少なくとも20種類の異なるSACNの一群を形成することを包含する。多くの分子のラマンバンドは非常に狭い(たとえば、CN-はFWHMで１nm未満である)ので、その最も近傍からスペクトル中で20波長離れているラマン分析物をそれぞれ含む、SACNの一群を合成することが可能である。たとえば、分析物として13CNを含むGAN粒子は、分析物として12CNを持つGANとは容易に区別することができ、同様にC15Nをもつものとも容易に区別することができる。このようにして、検出器としてCCDカメラと光子を散布するスペクトルグラフとを使用して300〜3000cm-1で633nmで単一ラマンスペクトルで540の別個で且つ容易に分割可能なピークを形成することができる。しかしながら、本発明の実施は、上記の器具の使用に限定されるものではない：GANまたはSACNを使用するラマン実験は、可視または近IR線で実施することができ、100cm-1から5000cm-1のラマンバンドを使用でき、空間的にまたは一時的に光子を分離するため任意の形態の単色光分光器または分光器及び任意の形態の光子検出器を使用することができる。このような配置により少なくとも10種類の分割可能なSACNの一群の合成が可能になり、文字通り数百ものSACN群の広いバンド幅を提供することができる。
【００２９】
バックグラウンドのラマン活性から群の中の個々のSACN集団を識別する能力をさらに高めるために、本発明は自然界で豊富な種とは異なる放射性同位体組成物をもつラマン-活性分析物の使用を含む。たとえば上記の如く13CNはバックグラウンド中に存在するであろう全ての天然の12CNと完全に分割できる。むろん、当業者は放射性同位体の組合せ並びに放射性同位体の割合を有効利用して特徴的なSACNを同定することができることを理解するだろう。
【００３０】
一群中のSACNのそれぞれの集団のSERS活性は特徴的であるので、SACNの他の特性も一群全体で特徴的なままに保持されている。それぞれのSACNのSERS活性は被包材料によって周囲環境から隔離されているので、それぞれの集団には異なる溶媒または貯蔵要件がない。また、それぞれのSACNは同一外部シェルをもつので、SACNへの分子の付着またはSACNの固体キャリヤへの付着の化学反応の選択が簡単になる。
【００３１】
上記の例はラマン散乱、特に検出メカニズムとして表面増強散乱に注目してきたが、種々の類似方法を等しく適用することができ、本発明の範囲内に包含される。たとえば、共鳴的に励起された分析物を使用して、表面増強共鳴ラマン散乱(SERRS)方法を創出できよう。また、ナノスケールで粗面化した表面から増強赤外吸収スペクトル(SEIRA)で公表された方法を利用できよう。同様に、Van  Duyneらは、表面増強ハイパー・ラマン散乱(SEHRS)がナノスケールで粗面化金属表面(並びに共鳴類似体SEHRRS)でも起きることを示した。3N-5または3N-6(ここで、Nは原子数である)の特徴的な振動を持つ所定の分子に関しては、ラマン、ハイパー・ラマン、または赤外線スペクトルのいずれでも全ての振動を知見し得ることを特記する。実際、特定のSACNの同定は、SERS、SERRS、SEIRA、SEHRA及びSEHRRSを含む光学疑問法(optical  interrogation  method)の組合せを基礎とする。
【００３２】
(レイリー)光散乱の有意量は、励起波長の少なくとも1/10の寸法を持つ粒子から発生し、SACNの同定でレイリーまたはハイパー・レイリー散乱を使用し得る可能性を生みだしていることも特記すべきである。さらに、弾性散乱(たとえばレイリー)、非弾性散乱(たとえばラマン)、及び吸収(たとえばIR)の組合せも粒子の同定に使用し得る。
【００３３】
SACNの使用
本発明により提供されるSACNは、検出可能なタグまたはラベルが必要な実質的に全てのアッセイで使用することができる。幾つかの態様では、SACNを標準的な蛍光タグの代わりに生物学的及び化学的アッセイで使用する。実際、SACNは、蛍光体をベースとする従来の化学タグよりもずっと優れたものとする多くの特徴をもつ。たとえば、蛍光体検出法を利用するアッセイは、自発蛍光及び他のバックグラウンド効果の存在によって通常、妨害されてしまう。さらに、多くのアッセイでは多くの異なる蛍光体が必要である；異なる蛍光体には通常異なる付着方法が必要であり、環境要件及び感度も異なる。数種の蛍光体をタンパク質に結合させるときに知見される蛍光活性の消失は特に著しい。最終的に、三重項または一重項励起状態の創出で得られる不可逆性光分解、その後励起状態を永久に排除する非可逆的化学反応によって、検出感度は厳しく制限されている。対照的に、SACNは光退色または光劣化できないので、均一の化学的及び物理的特性をもち、バックグラウンドから容易に分割することができる。おそらく最も重要なことには、SACN検出法は蛍光体検出法よりも顕著に感受性が強い。実際、１個のSACNで１個の分子をタグ付けし、次いでラマン分光法を使用してその分子の存在を検出することが可能である。そのようにたった１個の分子の分割は、蛍光体検出技術では匹敵するものがない。
【００３４】
SACNを光学タグとして使用し得る生物学的アッセイの一例としては、サンドイッチイムノアッセイがある。サンドイッチアッセイでは、検出すべきターゲットは固体表面に捕捉されている。同一ターゲットに対する抗体(または他のリガンド)をSACNに付着させ、次いで固体キャリヤ(support)と接触させる。固体キャリヤでのSACNのSERSシグナルの存在によって抗原の存在が示される。通常、SACNは、アッセイで特異的ターゲットの存在を検出するのに用いられる任意の分子に結合させることができる。
【００３５】
特に熟考された態様では、SACNを核酸分子に結合させる。このようにSACNは、光学的にタグ付けされた核酸プローブを使用する特異的核酸配列を検出する当業界で公知の実質的に任意のアッセイで使用することができる。
【００３６】
SACNは、SACNの識別情報がアッセイのターゲットの識別情報をエンコードする多重化学アッセイに特に好適である。ターゲット識別情報をエンコードするのに蛍光体を使用する従来の多重アッセイは、その蛍光体の物理的及び化学的特性によって課せられた過酷な多くの制約に支配されている。具体的には、異なる蛍光体は異なる励起最大をもつので、多重蛍光体タグの同時励起は不可能である。さらに、蛍光放出は広いスペクトルバンドで起きるので、一つの蛍光体からのバンドが他の蛍光体からのバンドと重なってしまうことが多い。結果として、たった３種類の異なる蛍光体の活性を分割するのには、個々の放出波長を分割し、検出するのに精巧な光学機器が必要となる。これらの問題点により、蛍光体を用いる多重アッセイではターゲット識別情報を明らかにするために位置情報に依存している。蛍光体を使用する多重アッセイは、所定の位置にリガンドが配置されている固体キャリヤを使用することが多い。蛍光体シグナルの位置がターゲットの識別情報を明らかにし；その位置での蛍光体シグナルのサイズがターゲットの量を示す。しかしながら、特定の位置に局在化された試薬をもつ固体キャリヤの合成には費用がかかり、且つ多大な時間を必要とする。一つの表面上で画定し得る多くの特徴には制限がある。
【００３７】
対照的に、本発明のSACNは顕著なスペクトル多様性及び分割性(resolvability)を提供する。結果として、SACNを多重アッセイで使用して、試薬の位置-特異的局在化を必要とすることなく、定量的且つ定性的情報を得ることができる。ターゲット特異的試薬に結合したそれぞれのSACNは特異的ターゲットの識別情報をエンコードし、特定のラマンシグナル強度はそのターゲットの量を示す。たとえば、上記のサンドイッチイムノアッセイでは、固体キャリヤ上に捕捉されたターゲットの識別情報は、それぞれのターゲットに関するSACNの異なるフレーバーを使用することによって決定することができる。
【００３８】
SACNは多重化用途で使用するのに全くもって適しているが、これらはこの方法で識別情報をエンコードする必要がない。固体キャリヤ上の特定の位置に試薬を局在化させた多重アッセイにおける蛍光体の代替物として単に使用することができる。このようにして使用すると、SACNは蛍光体よりも非常に感受性でターゲット検出することができる。
【００３９】
フローサイトメトリーは、SACNの多様性及び分割性が十分に利用された多重アッセイフォーマットの一例である。この用途の一態様では、検出すべきターゲットに対して一次抗体を結合したビーズ集団を提供する。ターゲットを含有するアッセイ溶液と、ターゲットに対して第二のセットの抗体とに、このビーズを接触させる。それぞれの二次抗体を、それに結合するターゲットの識別情報をエンコードするGANに結合させる。次いでこのビーズを、それぞれのビーズのラマンスペクトルを得るフローサイトメーターに通す。ラマン分光器はそれぞれのビーズの全周波数スペースをサンプリングするので、１個のビーズに多くの異なる一次抗体を設置することさえも可能である；それぞれのビーズのラマンスペクトルをデコードしてSACNの存在及び量を検出することができる；これによって１個のビーズにそれぞれのターゲットがどれだけ結合しているかが解る。注目するターゲットに結合させる抗体以外の試薬の使用を含む、この基本スキームの多くの変形が理解できよう。従って、SACNは、試薬をタグ付けするのに有用且つ必要なこのスキームの多くの変形で使用することができる。
【００４０】
好ましい態様では、SACNはフローサイトメトリーよりもむしろ、ミクロボリューム・レーザー・スキャニング・サイトメトリー(MLSC)用の光学タグとして使用する。MLSCは、いずれもその全体が本明細書中、参照として含まれる、1999年８月20日出願の米国特許出願第09/378,259号及び2000年４月26日出願の同米国特許出願第09/558,094号に記載されている。この系の一態様では、ラマン顕微鏡は、フローサイトメトリー用途に関し上述した試薬を含有するキャピラリーをスキャンする。このラマン顕微鏡は、キャピラリー中のそれぞれのビーズのラマンスペクトルを測定し、それによって検出すべきそれぞれのターゲットの定量データを得る。これがターゲット識別情報をエンコードするそれぞれのSACNのラマンシグナルであり；位置特異的試薬は必要ない。
【００４１】
別の態様では、SACNを新規化合物のライブラリの固体キャリヤ-ベースのコンビナトリアル化学(コンビ-ケム)における光学タグとして使用する。そのような方法の一つは「スプリット&プール」合成として公知である。この方法では、好適に誘導体形成した樹脂ビーズの調製品を複数の集団にランダム分割し、次いでそれぞれの集団を異なる反応混合物に導入する。異なる反応混合物は異なる試薬を含むか、または同一の試薬を含むが異なる反応条件であることができる。反応の後、ビーズを洗浄し、再混合し、再び一連の反応混合物に分割する。ビーズはランダムに分散されるため、それぞれのビーズは特徴的な反応履歴を経験する。こうして反応混合物の異なる順序を使用して合成した化合物を全て含むビーズベースのライブラリーが得られる。次いでこのライブラリーをスクリーニングして、所望の活性を持つリード化合物を同定する。順にこのリード化合物を分析してその組成及び構造を決定することができる。コンビ-ケム方法を使用して、ペプチド類、ベンゾジアゼパン類などのライブラリーを合成した。
【００４２】
個々のビーズの反応履歴が既知である場合、それに結合させた化合物の化学的組成及び構造を決定することができる。その反応履歴を持つビーズをエンコードするには幾つかの方法が公知である。幾つかの方法では、それぞれの反応混合物は、反応段階の間にビーズに結合した特徴的な識別子(identifier)を含有する。合成が完了したら、その識別子分子を注目するビーズから開裂させて、ビーズの反応履歴は、そのビーズから遊離した個々の識別子分子を検出することによって決定することができる。たとえば、従来法では、反応履歴をエンコードするのに短いオリゴヌクレオチドを使用していた。これらのオリゴマーをビーズから開裂させ、増幅し、次いでシークエンシングして、反応履歴をデコードしなければならない；これは多大な時間のかかるプロセスである。かかる識別子分子は最初にビーズから開裂させなければならないので、(a)ビーズからの識別子の開裂によって、ビーズからリード化合物を開裂または変形させない；及び／または(b)ビーズからのリード化合物の開裂によって、識別子分子を変形または開裂させない化学的方法を選択しなければならない。さらに、識別子を結合させるのに使用した化学的方法及び、しばしばビーズ表面上の識別子分子それ自体の存在が、実際のコンビ-ケム反応を妨害してしまう。このようなことが、エンコードされたコンビ-ケム合成で使用した化学的方法の全ての側面を大きく制約する。
【００４３】
本発明により提供されるSACNを使用してかかるコンビナトリアル・スキームにおいてビーズの反応履歴をエンコードすることができる。コンビナトリアル合成を実施するビーズに多くのSACNを結合させることによってそのそれぞれの反応段階を実施するように、それぞれの反応混合物は特徴的な種類のSACNを含むことができる。たとえば、反応混合物Ａは、合成スキーム中の段階１で使用するときはSACN1により、そして合成スキームの段階２で使用するときはSACN2により、そして合成スキームの段階で使用するときはSACNnまでエンコードすることができる。合成スキームの終了時には、個々のビーズを所望のリード化合物の活性に関してスクリーニングすることができる。所望のリード化合物活性を持つビーズをラマン分光法により調べる。それぞれのビーズのラマンスペクトルを自動的にデコードして、それぞれのビーズに結合した個々のSACN種を検出する。この情報により、ビーズの反応履歴、従ってリード化合物の構造が明らかになる。
【００４４】
コンビ-ケム合成スキームをエンコードするためのSACNの利用は、従来法よりも大きく前進している。１個のビーズの全反応履歴は、そのビーズが全く物理的または化学的操作を受ける必要なく、１回のスペクトル測定を実施することによって測定することができる。実際、ラマンスペクトルは、ミクロ滴定ウェル中でも得ることができる。SACNのラマン活性はビーズからこれらSACNを開裂しなくても測定することができるので、上記に概説した化学的反応の選択での制約はずっと少なくなる。同様に、SACNがビーズ表面上で暴露する化学基だけが、ビーズ及び安定な被包材料にSACNを付着させる誘導体形成基(derivatizing  group)である。繰り返しになるが、これによって、コンビ-ケム合成の識別子分子の妨害問題はずっと軽減される。最後に、SACNにより提供される新規なスペクトル多様性によって、従来法のエンコード法によって得られるよりももっとずっと複雑なコンビ-ケムスキームを多様にエンコードすることができる。
【００４５】
【実施例】
実施例１
ガラス分析物-充填ナノ粒子(GAN)の合成
材料：全ての調整品に関して使用した水は、バーンステッド(Barnstead)ナノポアシステムを通して蒸留した18.2MΩであった。スネークスキン透析管、3,500MWCOはピアス(Pierce)製であった。3-アミノプロピルトリメトキシシラン(APTMS)、2-メルカプトトリメトキシシラン(MPTMS)、及び3-メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン(MPMDMS)は、ユナイテッド・ケミカル(United  Chemical)製であった。HAuCl4・３H2O、クエン酸三ナトリウム二水和物、水酸化ナトリウム、trans-1,2-ビス(4-ピリジル)エチレン(BPE)、ピリジン、2-メルカプトピリジン、珪酸ナトリウム、オルト珪酸テトラエチル(TEOS)、及びアンモニアは、シグマ-アルドリッチ(Sigma-Aldrich)製であった。BPEは使用前に数回、再結晶した。ドュエックス(Dowex)カチオン交換樹脂(16〜40メッシュ)はJ.T.ベーカー(J.T.Baker)製であった。純粋なエチルアルコール(EtOH)は、ファーマコ(Pharmco)製であった。
【００４６】
コロイド調製：12-nmコロイドAu(２nm未満の標準偏差の殆ど球体)を、本明細書中、その全体が参照として含まれる、GrabarらのAnalytical  Chemistry、67巻：735〜743頁(1995年)に記載の如くクエン酸塩から還元したHAuCl4・３H2Oから製造した。コロイド＞12nmは以下の如く製造した：12mM  HAuCl4  ３mlをH2O  97ml毎に添加した。次いでこの溶液を激しく撹拌しながら沸騰させ、次いで12-nmのAuコロイド１mlを種として、そしてHAuCl4溶液100ml当たり１%クエン酸ナトリウム0.5mlを添加して、10分間沸騰させた。得られた粒子のサイズは、GatanまたはNIH画像ソフトウエアを使用する透過電子顕微鏡検査で測定した。最終的に、Auコロイドを取り囲んでいるクエン酸イオンを透析により除去し、少なくとも４時間毎に７回交換した。
【００４７】
GAN製造：全ての反応はプラスチック製エルレンマイヤーフラスコ中で実施した。任意量のコロイドを製造で使用することができ、次の反応体をAuコロイドの濃度及び表面積をベースとする好適量で添加した。
【００４８】
典型的な実験では、透析した、50-nm、0.17nMのAuコロイド25mlを使用した。このコロイドのpHを、0.1M  NaOH50μLを添加して５〜７に調節した。0.5mM  MPTMS(あるいはAPTMS、あるいはMPMDMS)125μLを添加して、このコロイドをガラス親和性(vitreophilic)とした。マグネティックスターラーで15分間撹拌した後、ラマンタグ(BPE、ピリジン、または2-メルカプトピリジン)の0.5mM溶液167μLを添加した。さらに15分間撹拌する間に、活性シリカ0.54%溶液を、３M  NaOH  50mlと珪酸ナトリウム１gとを撹拌し、次いでカチオン交換樹脂でpHを10に下げることによって製造した。活性シリカ１mlを添加し、得られた溶液はほぼpH９であった。この溶液を15分間撹拌したままにし、次いで放置した。
【００４９】
24時間後、EtOH100mlをこの溶液に添加して、本明細書中、その全体が参照として含まれるStoberらのJ.Colloid  Interface  Sci.26巻：62頁(1968年)に記載の方法によってシリカ成長を進めた。TEOS  15μLとアンモニア125μLとを添加して、さらにガラスシェル〜４nmを成長させた。この反応物を15分間撹拌し、次いで少なくとも12時間静置した。所望のシェル厚さが得られるまで、TEOSとアンモニアを添加し続けた。
【００５０】
実施例２
GANの透過電子顕微鏡検査
GAN調製品の透過電子顕微鏡(TEM)画像を撮った。これらのTEM画像から、GAN調製品が均一であることが判明した。図１Aは40nmガラスと共に35nmのAuコアを含むGANを示す。図1Bは16nmガラスと共に60nmのAuコアを示す。図２は、50%グリセロール溶液で遠心分離した後の35nmAu、８nmガラスのGANを示す。
【００５１】
実施例３
溶媒から金属コアの隔離の実施
多様な化学的環境でGANを機能させるためには、周囲溶媒からラマン-活性分析物を隔離することが重要である。この隔離を実施するのに、ガラス網状構造体を通る拡散速度を調べることができる。これは王水(３HCl：１HNO3)がGANのAuコアをエッチングできるような速度をモニターすることによって実施する。図３は、35nmAuコアとガラスの８nmシェルとをもつGAN粒子のバッチのそのような実験一つを示す。〜0.17nM  GAN500μLに、エッチング溶液(50μl  HNO3と150μL  HCl)200μlを添加した。この溶液の吸光度を、エッチング溶液の添加後の種々の時間で測定した(λmax546nm)。金のコアのエッチングによって吸光度が減少した；これを図３Ａにプロットした(エッチング溶液の添加後の時間を示す)。Auエッチング速度を、エッチング溶液中の時間に対する吸光度のプロットとして図３Bに示す(右側)。本発明者らによって実施した追加の研究から、王水によるAuコアのエッチングは、20nmのガラスシェルをもつものについては４時間たっても起きなかったことが判明した。
【００５２】
実施例４
GAN粒子のSERSスペクトル
ガラス４nm中に封入したtrans-4,4'-ビス(ピリジル)エチレン(BPE)でコーティングした40nmAuコアを含むGANを合成し、ラマン分光法で試験した。632.8nm励起20mW、３mmレンズと30秒の積分によって得たラマンスペクトルを図４に示す。グラフのトレースＡは特徴的なBPEラマンシグナルを示し；トレースBはBPE分析物のない同一粒子のラマンシグナルを示す。BPE分析物を含まないGANは本質的にラマンシグナルを与えないことが解る。
【００５３】
実施例５
ガラス封入化によるGANの金属コアへのラマン-活性分析物の封じ込め
図５は、trans-4,4'-ビス(ピリジル)エチレン(BPE)/４nmガラスでコーティングした40nmAuを含むGANの懸濁液(トレースA)；GANの一回目の遠心分離からの上清(トレースB)；及びGANの二回目の遠心分離からの上清(トレースC)のラマンスペクトルを示す。それぞれの遠心分離段階の間にBPEシグナルはGANと離れないことが解る。このことは、BPEがAuに接着し、ガラス封入化によってきちんと中に隔離されていることを示している。
【００５４】
実施例６
GANと他のSERS基体上のラマン-活性分析物のSERSスペクトルの比較
ラマン-活性分析物として2-メルカプトピリジンを含有するGAN(80nmAuコア/20nmガラス)を、３mmレンズと積分60秒で632.8nm励起の25mWを使用してラマン分光法により分析した。次いでGAN調製品のラマンスペクトルを、慣用の三層SERS基体(25mW  632.8nm励起、３mmレンズ、30秒間積分)に2-メルカプトピリジン50mM溶液を吸着させたときに得られたラマンスペクトルと比較した。図６はこの二種類のラマンスペクトルを示す。この二つのスペクトルは、全く同じ特徴及び強度を持っていることが解るが、このことはGANが効果的なSERS基体であることを示している。
【００５５】
実施例７
ラマン-活性分析物の混合物を使用するGANのSERSスペクトル
GAN粒子の以下の４つのフレーバー：(A)フロニトリルでタグ付けしたGAN；(B)フロニトリル(66%)とシアノ酢酸(33%)とでタグ付けしたGAN；(B)フロニトリル(33%)とシアノ酢酸(66%)とでタグ付けしたGAN；及び(D)シアノ酢酸でタグ付けしたGANのSERSスペクトルを、632.8nm励起の26mW、３mmレンズ、及び30秒の積分を使用して得た。示されたパーセンテージは、添加したタグ付け溶液中のそれぞれの化合物の相対濃度である。図７は、フロニトリルとシアノ酢酸が比較的同一のシグナル強度をもち、似たようなスペクトルプロフィールを持つことを示す。Ｂ及びＣのスペクトルがＤのスペクトルと非常に似ているということは、シアノ酢酸が、フロニトリルよりもAuナノ粒子に対して強い親和性を持つことを示す。
【００５６】
実施例８
イミダゾール(IM)とtrans-4,4'-ビス(ピリジル)エチレン(BPE)でタグ付けしたGANのSERSスペクトル
(a)trans-4,4'-ビス(ピリジル)エチレンで(BPE-GAN)または(b)イミダゾール(IM-GAN)で、GAN(40nmAuコア/４nmガラス)をタグ付けした。これらのラマン-活性分析物のSERSスペクトルを、同一寸法のタグ付けしていないGAN(c)のSERSスペクトルと一緒に図８に示す。BPE-GANとIM-GANのいずれもが、そのそれぞれのラマン-活性分析物の特徴的なラマンバンドを示し；タグ付けしていないGANはこれらのバンドを示さなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Aは40nmガラスと共に35nmAuコアを含むGANの透過電子顕微鏡を示す。図１Ｂは、16nmガラスと共に60nmAuコアを示す。
【図２】  図２は、50%グリセロール溶液を通して遠心分離した後の、35nmAu、8nmガラスのGANの透過電子顕微鏡写真を示す。
【図３】  図３は、35nmAuコア、及び８nmガラスシェルをもつGAN粒子の金のコアの酸エッチングに対する耐性を示す。金のコアのエッチングによって吸光度が低下する。これを図３Ａ（エッチング溶液の添加後の時間が示されている）にプロットする。Auエッチング速度を、エッチング溶液中の時間に対する吸光度のプロットとして図３Ｂに示す。
【図４】  図４は、４nmガラス中に封入されたトランス-4,4'-ビス(ピリジル)エチレン(BPE)でコーティングされた40nmAuコアを含むGANのラマンスペクトルを示す。トレースＡは特徴的なBPEラマンシグナルを示し、トレースＢはBPE分析物のない同一粒子由来のラマンシグナルを示す。
【図５】  図５は、trans-4,4'-ビス(ピリジル)エチレン(BPE)/４nmガラスでコーティングした40nmAuを含むGANの懸濁液(トレースA)；GANの最初の遠心分離の上清(トレースB)；及びGANの二回目の遠心分離の上清(トレースC)のラマンスペクトルを示す。
【図６】  図６は、GAN(80nmAuコア/20nmガラス/分析物として2-メルカプトピリジン)と、慣用の三層SERS基体に吸着させた2-メルカプトピリジンの50mM溶液とのラマンスペクトルを示す。
【図７】  図７は、以下の４種類の(フレーバー)GAN粒子：(A)フロニトリル(furonitrile)でタグ付けしたGAN；(B)フロニトリル(66%)とシアノ酢酸(33%)とでタグ付けしたGAN；(B)フロニトリル(33%)とシアノ酢酸(66%)とでタグ付けしたGAN；及び(D)シアノ酢酸でタグ付けしたGANのラマンスペクトルを示す。
【図８】  図８は、(a)trans-4,4'-ビス(ピリジル)エチレンでタグ付けした(BPE-GAN)または(b)イミダゾールでタグ付けした(IM-GAN)または(c)タグ付けしていないGAN(40nmAuコア/４nmガラス)のラマンスペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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