(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在または非存在を決定する方法であって、
（ａ）試料を、膜貫通孔および２つ以上のプローブのパネルと接触させるステップであって、
パネル中のプローブは、孔にカップリングされておらず、
各プローブが、分析物メンバーの１つまたは複数を認識し、（ｉ）分析物メンバーの１つまたは複数と結合するアプタマーと、（ｉｉ）孔に侵入でき、プローブ中のアプタマーが分析物メンバーの１つと結合しているか否かに応じて孔を流れる電流に異なる影響を与える尾部とを含み、
各プローブが、孔を流れる電流に示差的な様式で影響し、
アプタマーが、３次元構造に折り畳まれているときには孔を通って移動するには大きすぎ、折り畳みがほどかれると孔を通って移動することが可能であり、
尾部が、孔に侵入し、孔を流れる電流に影響を与えることができる直鎖状の重合体を含み、
２つ以上の分析物の群中の各分析物メンバーが、パネル中の少なくとも１つのプローブにより認識されるステップと、
（ｂ）孔を流れる電流を測定して、存在するならばパネル中のどのプローブが分析物メンバーと結合したかを決定し、そのことにより試料中の１つまたは複数の分析物メンバーの存在または非存在を決定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
（ａ）各プローブが、そのアプタマーが分析物メンバーと結合していない場合に孔を流れる電流に示差的な様式で影響する；および／または
（ｂ）パネル中の少なくとも１つのプローブが、２つ以上の分析物の群内の分析物メンバーのあるクラスを認識し、前記クラス中の分析物メンバーと結合するアプタマーを含む；および／または
（ｃ）パネル中の少なくとも１つのプローブが、分析物メンバーの１つを特異的に認識し、前記分析物メンバーと特異的に結合するアプタマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
パネル中の各プローブが、分析物メンバーの１つを特異的に認識し、前記分析物メンバーと特異的に結合するアプタマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
尾部が、
（ａ）孔を流れる電流に異なる方式で影響する少なくとも２つの領域を含み、ある領域が、アプタマーが分析物メンバーの１つと結合していないときに孔の中にあり、異なる領域が、アプタマーが前記分析物メンバーと結合しているときに孔の中にある；および／または
（ｂ）ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む；および／または
（ｃ）少なくとも１つの１本鎖ポリヌクレオチドを含み、場合によって、孔を流れる電流に異なる方式で影響する異なるヌクレオチド配列を有する１本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも２つの領域を含み、ある領域が、アプタマーが分析物メンバーの１つと結合していないときに孔の中にあり、異なる領域が、アプタマーが前記分析物メンバーと結合しているときに孔の中にあり、および、場合によって、少なくとも２つの領域が、異なるヌクレオチドまたは異なるポリヌクレオチドバーコードの少なくとも２つのひと続きに相当する；および／または
（ｄ）孔を流れる電流に異なる方式で影響する異なる重合体の少なくとも２つの領域を含み、ある領域が、アプタマーが分析物メンバーの１つと結合していないときに孔の中にあり、異なる領域が、アプタマーが前記分析物メンバーと結合しているときに孔の中にある；および／または
（ｅ）配列番号７から２３の残基１から３０を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
尾部が、少なくとも１つの２本鎖ポリヌクレオチドを含む、および／または、尾部が、約７から約７０までのヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）パネル中の２つ以上のプローブが、同じアプタマーと異なる１本鎖ポリヌクレオチド尾部とを含む；または
（ｂ）パネル中の各プローブが、異なるアプタマーを含む；および／または
（ｃ）パネル中の各プローブが、異なる１本鎖ポリヌクレオチド尾部を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
パネル中の２つ以上のプローブが、異なるアプタマーと同じ１本鎖ポリヌクレオチド尾部とを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
パネル中のプローブの数が、２つ以上の分析物の群の分析物メンバーの数と同じである、請求項1から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
パネル中の２つ以上のプローブが、同じ分析物メンバーと特異的に結合する異なるアプタマーを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）パネル中の各プローブが、場合によってコレステロールを用いて、膜にカップリングされている；および／または
（ｂ）群が、約４から約１００までの分析物メンバーを有する；および／または
（ｃ）分析物メンバーが、金属イオン、無機塩、重合体、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、色素、漂白剤、医薬品、診断剤、レクリエーショナルドラッグ、爆発物および環境汚染物質から独立して選択される；および／または
（ｄ）２つ以上の分析物の群が、疾患または状態を診断または予後予測するために用いることができる２つ以上のバイオマーカーの群であり、場合によって、疾患または状態が、がん、冠動脈心疾患、循環器疾患または敗血症である；および／または
（ｅ）アプタマーが、ペプチドアプタマーまたはオリゴヌクレオチドアプタマーである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
孔が、前庭またはバレルを含み、場合によって、
（ａ）バレルが、２本鎖ポリヌクレオチドが孔を通過できないように十分に狭い；および／または
（ｂ）前庭およびバレルが、それぞれ少なくとも２ヌクレオチドを含有するように十分に長い；および／または
（ｃ）孔が、膜貫通タンパク質孔または固体状態の孔であり、場合によって、膜貫通タンパク質孔が、溶血素、ロイコシジン、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡに由来し、さらに場合によって、膜貫通タンパク質が、（ｉ）配列番号２に示す７つの同一のサブユニットで形成されている；（ｉｉ）そのバリアントであって、７つのサブユニットの１つまたは複数が、配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号２と少なくとも８０％の相同性を有する前記バリアントであって、孔活性を維持する前記バリアントである；（ｉｉｉ）配列番号４に示す４つの同一のサブユニットと配列番号６に示す４つの同一のサブユニットとで形成されるγ−溶血素である；あるいは（ｉｖ）そのバリアントであって、サブユニットの１もしくは複数が、配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号４と少なくとも８０％の相同性を有し、かつ／またはサブユニットの１つもしくは複数が、配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号６と少なくとも８０％の相同性を有し、かつ孔が孔活性を維持する前記バリアントである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）が、分析物メンバーの１つと結合するプローブについて、各プローブが結合しているときおよび未結合のときに孔を流れる異なる電流を比較することをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
試料中の２以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの濃度を決定する方法であって、
（ｉ）請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法を行うステップと、
（ｉｉ）試料中に存在することが示された１または複数の分析物メンバーについて、ステップ（ｂ）における孔を流れる電流を、各分析物メンバーについての対照または参照データと比較し、そのことにより試料中の１つまたは複数の分析物メンバーの濃度を決定するステップと
を含む方法。
【請求項１４】
試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在、濃度または非存在を決定するためのプローブのパネルであって、パネルが、２つ以上のプローブを含み、
各プローブが、分析物メンバーの１つまたは複数を認識し、（ｉ）分析物メンバーの１つまたは複数と結合するアプタマーと、（ｉｉ）膜貫通孔に侵入でき、プローブ中のアプタマーが分析物メンバーの１つと結合しているか否かに応じて孔を流れる電流に異なる影響を与える尾部とを含み、
パネル中のプローブは、孔にカップリングされておらず、
各プローブが、孔を流れる電流に示差的な様式で影響し、
アプタマーが、３次元構造に折り畳まれているときには孔を通って移動するには大きすぎ、折り畳みがほどかれると孔を通って移動することが可能であり、
尾部が、孔に侵入し、孔を流れる電流に影響を与えることができる直鎖状の重合体を含み、
２つ以上の分析物の群中の各分析物メンバーが、パネル中の少なくとも１つのプローブにより認識される、プローブのパネル。
【請求項１５】
パネルが、請求項２から９のいずれか一項で定義するとおりである、および／または、各プローブが、プローブと膜とのカップリングを可能にする化学基をさらに含む、請求項１４に記載のプローブのパネル。
【請求項１６】
試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在、濃度または非存在を決定するためのキットであって、（ａ）請求項１４または請求項１５に記載のプローブのパネルと、（ｂ）膜貫通孔とを含むキット。
【請求項１７】
試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在、濃度または非存在を決定するための分析装置であって、複数の膜貫通孔と、請求項１４または請求項１５に記載のプローブのパネルとを含む分析装置。
【請求項１８】
分析装置が、
複数の孔を支持でき、孔を用いて分析物メンバーの特徴決定を行うために作動可能なセンサデバイスと
特徴決定を行うための材料を保持するための少なくとも１の貯蔵器と、
少なくとも１つの貯蔵器からセンサデバイスに材料を制御可能に供給するように構成された流体システムと、
それぞれの試料を受容するための複数の容器と
を含み、流体システムが、容器からセンサデバイスに選択的に試料を供給するように構成されている、請求項１７に記載の分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在または非存在を決定する新しい方法に関する。従って、本発明は、複数の分析物の群における各分析物の存在または非存在を決定するための多重アッセイに関する。アッセイは、アプタマーおよび膜貫通孔を用いる。
【背景技術】
【０００２】
膜貫通孔（ナノポア）は、重合体および小分子などの多様な分析物についての直接的で電気的なバイオセンサとして大きい可能性を有する。ナノポアを横切って電位を印加すると、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドなどの分子がナノポアのバレルまたはチャネルにある期間一過的にある場合に、電流が変化する。特定のヌクレオチドおよび特定のポリヌクレオチドなどの特定の分子は、既知のサインおよび持続期間の電流変化をもたらす。このような電流変化を用いて、孔に存在するヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを同定できる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、多重アッセイにおいて膜貫通孔を用いて、２つ以上の分析物の群中の各分析物の存在または非存在を決定できることを実証する。より具体的には、本発明者らは、分析物の存在または非存在を、膜貫通孔とアプタマー含有プローブのパネルとを用いて決定できることを実証する。対象の各分析物は、パネル中の少なくとも１つのプローブにより認識される。各プローブは、孔に侵入して、孔を流れる電流に影響できる尾部も含む。各尾部は、プローブが対象の分析物の１つと結合しているか否かに応じて異なる示差的な方式で孔を流れる電流に影響する。パネル中の各プローブが孔を流れる電流に与える影響も、各プローブの正体を検出できるように示差的である。アプタマーと尾部とのこの組み合わせは、孔を流れる電流に与えるプローブ尾部の影響を分析することによりパネル中の１つもしくは複数または全てのプローブと対象の分析物との結合を驚くべきことに同定できるようなものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
従って、本発明は、試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在または非存在を決定する方法であって、
（ａ）試料を、膜貫通孔および２つ以上のプローブのパネルと接触させるステップであって、
各プローブが、分析物メンバーの１つまたは複数を認識し、（ｉ）分析物メンバーの１つまたは複数と結合するアプタマーと、（ｉｉ）孔に侵入でき、プローブ中のアプタマーが分析物メンバーの１つと結合しているか否かに応じて孔を流れる電流に異なる影響を与える尾部とを含み、
各プローブが、孔を流れる電流に示差的な様式で影響し、
２つ以上の分析物の群中の各分析物メンバーが、パネル中の少なくとも１つのプローブにより認識されるステップと、
（ｂ）孔を流れる電流を測定して、存在するならばパネル中のどのプローブが分析物メンバーと結合したかを決定し、そのことにより試料中の１つまたは複数の分析物メンバーの存在または非存在を決定するステップと
を含む方法を提供する。
【０００５】
本発明は、
−  試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの濃度を決定する方法であって、
（ｉ）本発明の方法を行うステップと、
（ｉｉ）試料中に存在することが示された１つまたは複数の分析物メンバーについて、ステップ（ｂ）における孔を流れる電流を、各分析物メンバーについての対照または参照データと比較し、そのことにより試料中の１つまたは複数の分析物メンバーの濃度を決定するステップと
を含む方法；
−  試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在、濃度または非存在を決定するためのプローブのパネルであって、パネルが、２つ以上のプローブを含み、
各プローブが、分析物メンバーの１つまたは複数を認識し、（ｉ）分析物メンバーの１つまたは複数と結合するアプタマーと、（ｉｉ）膜貫通孔に侵入でき、プローブ中のアプタマーが分析物メンバーの１つと結合しているか否かに応じて孔を流れる電流に異なる影響を与える尾部とを含み、
各プローブが、孔を流れる電流に示差的な様式で影響し、
２つ以上の分析物の群中の各分析物メンバーが、パネル中の少なくとも１つのプローブにより認識される、プローブのパネル；
−  試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在、濃度または非存在を決定するためのキットであって、（ａ）本発明のプローブのパネルと、（ｂ）膜貫通孔とを含むキット；ならびに
−  試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在、濃度または非存在を決定するための分析装置であって、複数の孔と、本発明のプローブのパネルとを含む分析装置
も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】結合した分析物の非存在下（ａ）および存在下（ｂ）でのナノポア内のプローブ配置の漫画での図を示す図である。結合した分析物の非存在（ｃ）および存在（ｄ）に対応する期待される事象トレースパターンをその下に示す（ｙ軸＝電流およびｘ軸＝（ｃ）および（ｄ）についての時間）。点線は、ポリ（ｄＡ）領域を表し、×印領域は、脱塩基領域を表す。この実施形態では、脱塩基領域が孔のβ−バレル内に保持される場合、ポリ（ｄＡ）領域がβ−バレル内にある場合よりも多くの電流がチャネルを流れる。高いレベルから低いレベルへの電流の移行は、アプタマー−分析物複合体の解離を示す。
【図２】トロンビンの存在下（ｂ）および非存在下（ａ）でアプタマー配列５Ａ１５ｘ１０Ａ＿ＴＢＡについて観察される異なるブロックレベルを示す図である（ｙ軸＝電流（ｐＡ）およびｘ軸＝（ａ）および（ｂ）についての時間（ｓ））。ａ）トロンビンが存在しない溶液中にアプタマー（配列５Ａ１５ｘ１０Ａ＿ＴＢＡ）が存在する場合は、レベル１のみが観察される。ｂ）アプタマー（配列５Ａ１５ｘ１０Ａ＿ＴＢＡ）およびトロンビンが溶液中に存在する場合は、レベル１および２が検出される（レベル間の違いは、３０．５ｐＡである）。レベル２の出現は、アプタマーとトロンビンとの結合を示し、レベル２からレベル１への移行は、アプタマー−トロンビン複合体の解離を示す。
【図３】トロンビン濃度と観察された事象比率（トロンビン結合および未結合事象を組み合わせた数と比較したトロンビン結合事象のみの数）との間の関係を示す図である。これらの２つのグラフは、トロンビン結合事象と事象の総数（トロンビン結合および未結合）との間の比率がトロンビンの濃度とともにどのように変動するかを示す。この実験において用いたプローブ配列は、５Ａ１５ｘ１０Ａ＿ＴＢＡであり、最終濃度は、１２５０ｎＭであった。これらの校正グラフを用いて、試料中のトロンビンの濃度を決定することが可能である（グラフ（ａ）ｙ軸＝比率（結合／未結合）、ｘ軸＝トロンビン濃度（ｎＭ）、グラフ（ｂ）ｙ軸＝比率、ｘ軸＝ｌｏｇ１０トロンビン濃度（ｎＭ））。
【図４】アプタマー配列１５Ｘ１５Ａ＿ＴＢＡ３’ＣｈｏｌＴＥＧ（３’端にコレステロールＴＥＧを有する配列番号１９）について観察される異なるブロックレベルが、トロンビンの存在（ｂ）および非存在（ａ）であることを示す図である（ｙ軸＝電流（ｐＡ）およびｘ軸＝（ａ）および（ｂ）についての時間（ｓ））。ａ）トロンビンが存在しない溶液中にアプタマー（配列１５ｘ１５Ａ＿ＴＢＡ＿３’ＣｈｏｌＴＥＧ）が存在する場合は、レベル１のみが観察される。ｂ）アプタマーをトロンビンの存在下でプレインキュベートした場合は、レベル１および２が検出される。レベル２の出現は、アプタマーとトロンビンとの結合を示し、レベル２からレベル１への移行は、アプタマー−タンパク質複合体の解離を示す。この実験は、実施例２において用いたよりもかなり低いアプタマーの濃度を用いて行った。
【図５】多くの異なるアプタマーをどのように用いてトロンビンの存在を検出できるかを示す図である（ここで、各アプタマーは、それ自体の示差的なステップレベルシグナルを生じる）。上の図（ａ）は、遊離アプタマーシグナル（区画Ａと表示する）と、トロンビンと結合した場合の異なるアプタマー尾部のそれぞれについてのシグナル（区画Ｂと表示する）とについて検出される事象の数を示す。トロンビンと結合したアプタマー１５ｘ１５Ａについての事象は１と表示し、トロンビンと結合したアプタマー１７ｘ１３Ａについての事象は２と表示し、トロンビンと結合したアプタマー１９ｘ１１Ａについての事象は３と表示し、トロンビンと結合したアプタマー５Ａ１５ｘ１０Ａについての事象は４と表示する。ｘ軸上に示す「比率」は、開放孔レベル（ビンサイズ＝０．００２５）で除したアプタマー尾部を用いて得られた電流レベルであり、ｙ軸は、カウントである。下の図（ｂ、ｙ軸＝電流（ｐＡ）およびｘ軸＝時間（ｓ））は、アプタマー尾部配列（１〜４）のそれぞれについて検出された４つの異なるブロックシグナルを示す。別々の区別可能なシグナルが、各アプタマーについてみられる。
【図６】ＰＤＧＦの存在下（ｂ）および非存在下（ａ）でアプタマー配列１７ｘ８Ａ＿ＰＤＧＦについて観察される異なるブロックレベルを示す図である（ｙ軸＝電流（ｐＡ）およびｘ軸＝（ａ）および（ｂ）についての時間（ｓ））。ａ）ＰＤＧＦが存在しない溶液中にアプタマー（配列１７ｘ８Ａ＿ＰＤＧＦ）が存在する場合は、レベル１のみが観察される。ｂ）アプタマー（配列１７ｘ８Ａ＿ＰＤＧＦ）およびＰＤＧＦが溶液中に存在する場合は、レベル１および２が検出される。レベル２の出現は、アプタマーとＰＤＧＦとの結合を示し、レベル２からレベル１への移行は、アプタマー−ＰＤＧＦ複合体の解離を示す。
【図７】ＰＤＧＦの存在下（ｂ）および非存在下（ａ）でアプタマー配列２５ｘ＿ＰＤＧＦについて観察される異なるブロックレベルを示す図である（ｙ軸＝電流（ｐＡ）およびｘ軸＝（ａ）および（ｂ）についての時間（ｓ））。ａ）ＰＤＧＦが存在しない溶液中にアプタマー（配列２５ｘ＿ＰＤＧＦ）が存在する場合は、レベル１のみが観察される。ｂ）アプタマー（配列２５ｘ＿ＰＤＧＦ）およびＰＤＧＦが溶液中に存在する場合は、レベル１および３が検出される。レベル３の出現は、アプタマーとＰＤＧＦとの結合を示し、レベル３からレベル１への移行は、アプタマー−ＰＤＧＦ複合体の解離を示す。
【図８】ＰＤＧＦ濃度と観察された事象比率（ＰＤＦＧ結合および未結合を組み合わせた事象と比較したＰＤＧＦ結合事象のみ）との間の関係を示す図である。このグラフ（ｙ軸＝ｌｏｇ１０事象割合、ｘ軸＝ｌｏｇ１０ＰＤＧＦ濃度（ｎＭ））は、ＰＤＧＦ結合事象と事象の総数（ＰＤＧＦ結合および未結合事象）との間の比率がＰＤＧＦの濃度とともにどのように変動するかを示す。この実験において用いたプローブ配列は、２５ｘ＿ＰＤＧＦであった。この校正グラフを用いて、試料中のＰＤＧＦの濃度を決定することが可能である。
【図９】ＡＴＰの存在下（ｂ）および非存在下（ａ）でアプタマー配列２５ｘ＿ＡＴＰについて観察される異なるブロックレベルを示す図である（ｙ軸＝電流（ｐＡ）およびｘ軸＝（ａ）および（ｂ）についての時間（ｓ））。ａ）ＡＴＰが存在しない溶液中にアプタマー（配列２５ｘ＿ＡＴＰ）が存在する場合は、レベル１のみが観察される。ｂ）アプタマー（配列２５ｘ＿ＡＴＰ）およびＡＴＰが溶液中に存在する場合は、レベル１および２が検出される。レベル２の出現は、アプタマーとＡＴＰとの結合を示し、レベル２からレベル１への移行は、アプタマー−ＡＴＰ複合体の解離を示す。
【図１０】ＡＴＰの存在下（ｂ）および非存在下（ａ）でアプタマー配列および１７ｘ８Ａ＿ＡＴＰについて観察される異なるブロックレベルを示す図である（ｙ軸＝電流（ｐＡ）およびｘ軸＝（ａ）および（ｂ）についての時間（ｓ））。ａ）ＡＴＰが存在しない溶液中にアプタマー（配列１７ｘ８Ａ＿ＡＴＰ）が存在する場合は、レベル３のみが観察される。ｂ）アプタマー（配列１７ｘ８Ａ＿ＡＴＰ）およびＡＴＰが溶液中に存在する場合は、レベル２および３が検出される。レベル２の出現は、アプタマーとＡＴＰとの結合を示し、レベル２からレベル３への移行は、アプタマー−ＡＴＰ複合体の解離を示す。
【図１１】ＡＴＰ濃度と観察された事象比率（ＡＴＰ結合および未結合を組み合わせた事象と比較したＡＴＰ結合事象のみ）との間の関係を示す図である。このグラフ（ｙ軸＝事象割合、ｘ軸＝ｌｏｇ１０ＡＴＰ濃度（μＭ））は、ＡＴＰ結合事象と事象の総数（ＡＴＰ結合および未結合事象）との間の比率がＡＴＰの濃度とともにどのように変動するかを示す。この実験において用いたプローブ配列は、１７ｘ８Ａ＿ＡＴＰであった。この校正グラフを用いて、試料中のＡＴＰの濃度を決定することが可能である。アプタマー１７ｘ８Ａ＿ＡＴＰを用いて、漸増トロンビン濃度について以前に観察されたことと同様に、ＡＴＰの濃度が増加するにつれて、事象割合の同様の増加が観察された。しかし、ＡＴＰのＫｄは、マイクロモル濃度範囲にあり、よって、同様の事象割合を得るためにはより高いＡＴＰ濃度が必要である。
【図１２】プローブのアレイをどのようにして用いて、同じ実験において１つより多い分析物を検出できるかを強調する図である。３つ全ての分析物、ＡＴＰ（ＡＴＰアプタマーのみ＝１、ＡＴＰと結合したＡＴＰアプタマー＝２）、ＰＤＧＦ（ＰＤＧＦアプタマーのみ＝３、ＰＤＧＦと結合したＰＤＧＦアプタマー＝４）（拡大バージョンを（ｂ）に示す）、およびトロンビン（トロンビンアプタマーのみ＝５、トロンビンと結合したトロンビンアプタマー＝６）についての結合および未結合アプタマーシグナルをともに観察することが可能である。異なる分析物は、それらの特徴的なブロックレベルおよびシグナル形状から検出できる。ｙ軸＝トレースパターンａ）およびｂ）についてのｐＡでの電流、ｘ軸＝トレースパターンａ）およびｂ）についての時間（（ａ）についての合計トレース時間＝４秒およびｂ）についての合計トレース時間＝０．１秒）。
【図１３】理論的に算出した値（黒線で示す）および実験で観察された値（灰色のバーチャートで示す）の校正プロット（トロンビン濃度（ｎＭ）（ｘ軸）に対する事象比率（ｙ軸））を示す図である。理論的値が、実験で決定された値と密接に一致することがグラフから明らかである。
【図１４】ストレプトアビジンの存在下（ｂ）および非存在下（ａ）でアプタマー配列ｓｔｒｅｐプローブ１（配列番号２４）について観察される異なるブロックレベルを示す図である（ｙ軸＝電流（ｐＡ）およびｘ軸＝（ａ）および（ｂ）についての時間（ｓ））。ａ）ストレプトアビジンが存在しない溶液中にアプタマー（ｓｔｒｅｐプローブ１）が存在する場合は、レベル１のみが観察される。ｂ）アプタマー（ｓｔｒｅｐプローブ１）およびストレプトアビジンが溶液中に存在する場合は、レベル２が検出される。
【図１５】ストレプトアビジンの存在下（２）および非存在下（１）でアプタマー配列ｓｔｒｅｐプローブ１（配列番号２４）について観察される異なるブロックレベルの拡大図である（ｙ軸＝電流（ｐＡ）およびｘ軸＝（ａ）および（ｂ）についての時間（ｓ））。このデータは、表示の目的のためにＢｅｓｓｅｌフィルタにかけた。
【図１６】Ｋ２  ＥＤＴＡ（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、コード−Ｓ．Ｂ−０００９）８０％緩衝剤（６２５ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、７５ｍＭフェロシアン化カリウム、２５ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０）中の２０％ウサギ全血溶液中のトロンビンの存在下でアプタマー配列２７ｘ３Ａ＿ＴＢＡについて観察された例示的なブロックレベルを示す図である（ｙ軸＝電流（ｐＡ）およびｘ軸＝時間（ｓ））。アプタマー（配列２７ｘ３Ａ＿ＴＢＡ）およびトロンビンが溶液中に存在する場合は、レベル１および２が検出される。レベル２の出現は、アプタマーとトロンビンとの結合を示し、レベル２からレベル１への移行は、アプタマー−トロンビン複合体の解離を示す。
【図１７】Ｋ２  ＥＤＴＡ（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、コード−Ｓ．Ｂ−０００９）８０％緩衝剤（６２５ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、７５ｍＭフェロシアン化カリウム、２５ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０）中の２０％ウサギ全血溶液中のＰＤＧＦの存在下でアプタマー配列１７ｘ８Ａ＿ＰＤＧＦについて観察された例示的なブロックレベルを示す図である（ｙ軸＝電流（ｐＡ）およびｘ軸＝時間（ｓ））。アプタマー（配列１７ｘ８Ａ＿ＰＤＧＦ）およびＰＤＧＦが溶液中に存在する場合は、レベル１および２が検出される。レベル２の出現は、アプタマーとＰＤＧＦとの結合を示し、レベル２からレベル１への移行は、アプタマー−ＰＤＧＦ複合体の解離を示す。
【図１８】Ｋ２  ＥＤＴＡ（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、コード−Ｓ．Ｂ−０００９）８０％緩衝剤（６２５ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、７５ｍＭフェロシアン化カリウム、２５ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０）中の２０％ウサギ全血溶液中のＡＴＰの存在下でアプタマー配列２５ｘ＿ＡＴＰについて観察された例示的なブロックレベルを示す図である（ｙ軸＝電流（ｐＡ）およびｘ軸＝時間（ｓ））。アプタマー（配列２５ｘ＿ＡＴＰ）およびＡＴＰが溶液中に存在する場合は、レベル１および２が検出される。レベル２の出現は、アプタマーとＡＴＰとの結合を示し、レベル２からレベル１への移行は、アプタマー−ＡＴＰ複合体の解離を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
開示する生成物および方法の異なる用途を、当該技術における具体的な必要性に応じて仕立てることができることが理解される。本明細書において用いる用語は、本発明の特定の実施形態を説明する目的だけのためであり、限定することを意図しないことも理解される。
【０００８】
さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明確にそうでないことを指図しない限り、複数形のものを含む。よって、「孔（a pore）」に対する言及は、２つ以上のそのような孔を含み、「尾部（a tail）」に対する言及は、２つ以上のそのような尾部を含み、「ポリヌクレオチド（a polynucleotide）」に対する言及は、２つ以上のそのようなポリヌクレオチドを含む、などである。
【０００９】
本明細書の上または下に引用する全ての出版物、特許および特許出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１０】
本発明の方法
本発明は、試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在または非存在を決定する方法を提供する。従って、本発明は、分析物の群の各分析物メンバーについての多重アッセイに関する。群中の２つ以上の分析物は、予め決定されるよって、。本発明は、具体的で予め決定された分析物の群の各分析物メンバーについての多重アッセイに関する。
【００１１】
本方法は、試料を、膜貫通孔および２つ以上のプローブのパネルと接触させるステップを含む。パネル中の各または全てのプローブは、分析物メンバーの１つまたは複数を認識し、（ｉ）１つまたは複数の分析物メンバーと結合するアプタマーと、（ｉｉ）孔に侵入でき、プローブ中のアプタマーが分析物メンバーの１つと結合しているか否かに応じて孔を流れる電流に異なる影響を与える尾部とを含む。言い換えると、各または全てのプローブ中の尾部は、アプタマーが分析物メンバーの１つと結合していない場合に孔を流れる電流にある方式で影響し、アプタマーが分析物メンバーと結合している場合に孔を流れる電流に異なる方式で影響する。このことは、以下でより詳細に論じる。パネル中の各または全てのプローブは、孔を流れる電流に示差的な様式でも影響する。このことにより、パネル中の特定のプローブを同定できる。プローブの正体および分析物メンバーとのその結合はともに測定できるので、該分析物メンバーの存在を決定できる。２つ以上の分析物の群の各または全ての分析物メンバーは、パネル中の少なくとも１つのプローブにより認識される。
【００１２】
本方法は、孔を流れる電流を測定して、存在するならばパネル中のどのプローブが分析物メンバーと結合したかを決定し、そのことにより試料中の１つまたは複数の分析物メンバーの存在または非存在を決定するステップも含む。電流は、当該技術において既知の任意の方法を用いて測定してよい。具体的な方法は、以下で論じる。
【００１３】
ステップ（ａ）および（ｂ）は、好ましくは、孔を横切って印加した電位を用いて行う。印加する電位は、電圧電位であってよい。代わりに、印加する電位は、化学電位であってよい。このことの例は、両親媒性の層を横切る塩勾配を用いることである。塩勾配は、Holdenら、J Am Chem Soc. 2007年7月11日；129(27)：8650〜5に開示されている。
【００１４】
本方法は、いくつかの利点を有する。本方法は、高い特異性をいまだに有しながら、現存するタンパク質アッセイと比較して迅速かつ安価である。アプタマーを含有するプローブは、例えば抗体と比較して、調製するのが速くかつ安価である。アッセイからの出力は、リアルタイムで分析されるので、十分な情報が得られたときにアッセイを停止できる。本方法は、最小限の試料調製または試料調製なしで、単一の試料から複数の分析物の検出を可能にし、例えば、試料は、患者から直接得られた血液であることができるので、最小限の訓練を受けたかまたは資格を有する他人が方法を行うことができる。方法を用いて、単一試料から多くの分析物を検出でき、よって、単一試料に対して複数の試験を行う必要がなく、分析物の数は、作製できるプローブの多様性および示差的な尾部の数によってのみ制限される。本方法は、全般的に、未結合のアプタマーおよび未結合の分析物の存在下で、洗浄ステップまたは未結合物体の除去を必要とすることなく行われる。
【００１５】
試料
試料は、任意の適切な試料であってよい。本発明は、２つ以上の分析物を含有することがわかっているかまたは含有することが疑われる試料に対して典型的に行われる。本発明は、その正体がわかっていない２つ以上の分析物を含有する試料に対して行うことができる。代わりに、本発明は、試料に対して行って、試料中のその存在がわかっているかまたは期待される２つ以上の分析物の正体を確認することができる。
【００１６】
試料は、生体試料であってよい。本発明は、任意の生物または微生物から得られたかまたは抽出された試料に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで行ってよい。生物または微生物は、典型的に、古細菌、原核生物または真核生物であり、典型的に、５界：植物界、動物界、真菌、原核生物界および原生生物界のうちの１つに属する。本発明は、任意のウイルスから得られたかまたは抽出された試料に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで行ってよい。試料は、好ましくは、流体試料である。試料は、典型的に、患者の体液を含む。試料は、尿、リンパ液、唾液、粘液または羊膜液であってよいが、好ましくは血液、血漿または血清である。典型的に、試料は、ヒトを起源とするが、代わりに、試料は、ウマ、ウシ、ヒツジもしくはブタのように商業的に飼育される動物などの別の哺乳動物からであってよいか、または代わりにネコもしくはイヌなどのペットであってよい。代わりに、植物起源の試料は、典型的に、穀類、マメ科植物、果実または野菜、例えばコムギ、オオムギ、オーツ、キャノーラ、トウモロコシ、ダイズ、コメ、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、インゲンマメ、レンズマメ、サトウキビ、カカオ、綿、茶、コーヒーなどの商業的作物から得られる。
【００１７】
試料は、非生体試料であってよい。非生体試料は、好ましくは、流体試料である。非生体試料の例は、外科的流体、飲用水、海水または川水などの水、および実験室試験のための試薬を含む。
【００１８】
試料は、典型的に、例えば遠心分離または赤血球などの不要な分子もしくは細胞をろ去するメンブレンを通すことにより、アッセイする前に処理される。試料は、採取して直ちに測定してよい。試料は、典型的に、アッセイの前に好ましくは−７０℃未満で貯蔵してもよい。
【００１９】
分析物
本発明の方法は、試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在または非存在を決定するためである。２つ以上の分析物の群は、２、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００以上の分析物などの任意の数の分析物を含んでよい。群は、好ましくは、約５から約８０までの分析物、約１０から約６０までの分析物または約２０から約５０までの分析物などの約４から約１００までの分析物を有する。
【００２０】
分析物メンバーの１つまたは複数の存在または非存在が決定される。言い換えると、２つ以上の分析物の群について、本方法は、群中の分析物メンバーのそれぞれが存在するかまたは非存在であるかを決定する。分析物メンバーの２、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００以上などの１つまたは複数が存在することがあり、群中の他の分析物メンバーの全てが非存在であることがある。分析物メンバーの全てが存在することがある。分析物メンバーのいずれも存在しないことがある（すなわち、分析物メンバーの全てが非存在であることがある）。存在する分析物メンバーの数および非存在の数は、本発明の方法を用いて決定される。
【００２１】
２つ以上の分析物は、好ましくは、金属イオン、無機塩、重合体、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、色素、漂白剤、医薬品、診断剤、レクリエーショナルドラッグ、爆発物および環境汚染物質から独立して選択される。群は、２つ以上のタンパク質、２つ以上のヌクレオチドまたは２つ以上の医薬品などの同じ型の２つ以上の分析物を含むことができる。代わりに、群は、１つまたは複数のタンパク質、１つまたは複数のヌクレオチドおよび１つまたは複数の医薬品などの異なる型の２つ以上の分析物を含むことができる。
【００２２】
群中の２つ以上の分析物は、細胞から分泌された分析物であり得る。代わりに、２つ以上の分析物は、本発明を行うことができる前に細胞から分析物メンバーを抽出しなければならないように、細胞の内部に存在する分析物であり得る。
【００２３】
群中の２つ以上の分析物は、好ましくは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質から選択される。アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、自然に存在するかまたは自然に存在しないものであり得る。ポリペプチドまたはタンパク質は、合成または改変アミノ酸をその中に含むことができる。アミノ酸に対する多くの異なる型の改変が当該技術において既知である。適切なアミノ酸およびその改変は、膜貫通孔に関して以下で論じる。本発明の目的のために、分析物は、当該技術において利用可能な任意の方法により改変できることが理解される。
【００２４】
タンパク質は、酵素、抗体、ホルモン、バイオマーカー、増殖因子またはサイトカインなどの増殖調節タンパク質であり得る。サイトカインは、インターロイキン、好ましくはＩＦＮ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＬ−１３、インターフェロン、好ましくはＩＬ−γおよびＴＮＦ−αなどのその他のサイトカインから選択してよい。タンパク質は、細菌タンパク質、真菌タンパク質、ウイルスタンパク質または寄生生物由来タンパク質であってよい。
【００２５】
２つ以上の分析物は、好ましくは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドから選択される。ヌクレオチドは、典型的に、ヌクレオ塩基、糖および少なくとも１つのリン酸基を含有する。ヌクレオ塩基は、典型的に、複素環式である。ヌクレオ塩基は、それらに限定されないが、プリンおよびピリミジン、より具体的にはアデニン、グアニン、チミン、ウラシルおよびシトシンを含む。糖は、典型的に、５炭糖である。ヌクレオチド糖は、それらに限定されないが、リボースおよびデオキシリボースを含む。ヌクレオチドは、典型的に、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは、典型的に、１リン酸、２リン酸または３リン酸を含有する。リン酸は、ヌクレオチドの５’または３’側に付着してよい。
【００２６】
ヌクレオチドは、それらに限定されないが、アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン１リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン２リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン３リン酸（ＧＴＰ）、チミジン１リン酸（ＴＭＰ）、チミジン２リン酸（ＴＤＰ）、チミジン３リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン１リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン２リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン３リン酸（ＵＴＰ）、シチジン１リン酸（ＣＭＰ）、シチジン２リン酸（ＣＤＰ）、シチジン３リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルシチジン１リン酸、５−メチルシチジン２リン酸、５−メチルシチジン３リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン１リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン２リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン３リン酸、サイクリックアデノシン１リン酸（ｃＡＭＰ）、サイクリックグアノシン１リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン１リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン２リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン３リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン１リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン２リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン３リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン１リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン２リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン３リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン１リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン２リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン３リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン１リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン２リン酸（ｄＣＤＰ）およびデオキシシチジン３リン酸（ｄＣＴＰ）、５−メチル−２’−デオキシシチジン１リン酸、５−メチル−２’−デオキシシチジン２リン酸、５−メチル−２’−デオキシシチジン３リン酸、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン１リン酸、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン２リン酸ならびに５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン３リン酸を含む。ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択される。ヌクレオチドは、脱塩基（すなわちヌクレオ塩基を欠く）であってよい。ヌクレオチドは、さらなる改変を含有してよい。特に、適切な改変ヌクレオチドは、それらに限定されないが、２’アミノピリミジン（例えば２’−アミノシチジンおよび２’−アミノウリジン）、２’−ヒドロキシルプリン（例えば２’−フルオロピリミジン（例えば２’−フルオロシチジンおよび２’フルオロウリジン）、ヒドロキシルピリミジン（例えば５’−α−Ｐ−ボラノウリジン）、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（例えば２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジンおよび２’−Ｏ−メチルウリジン）、４’−チオピリミジン（例えば４’−チオウリジンおよび４’−チオシチジン）を含み、ヌクレオチドは、ヌクレオ塩基の改変（例えば５−ペンチニル−２’−デオキシウリジン、５−（３−アミノプロピル）−ウリジンおよび１，６−ジアミノヘキシル−Ｎ−５−カルバモイルメチルウリジン）を有する。
【００２７】
オリゴヌクレオチドは、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下または５以下のヌクレオチドなどの５０以下のヌクレオチドを典型的に有する短いヌクレオチド重合体である。オリゴヌクレオチドは、脱塩基および改変ヌクレオチドを含む、上記の任意のヌクレオチドを含んでよい。
【００２８】
ポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖であってよい。ポリヌクレオチドの少なくとも一部は、２本鎖であってよい。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸であり得る。ポリヌクレオチドは、１本の鎖のＤＮＡとハイブリダイズした１本の鎖のＲＮＡを含むことができる。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）などの当該技術において既知の任意の合成核酸、またはヌクレオチド側鎖を有するその他の合成重合体であってよい。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチドを含む、上記の任意のヌクレオチドを含んでよい。
【００２９】
ポリヌクレオチドは、任意の長さであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の長さであり得る。ポリヌクレオチドは、１０００以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対、５０００以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対の長さ、または１０００００以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対の長さであり得る。
【００３０】
２つ以上の分析物の群は、分析物の任意の群であってよい。例えば、群は、特定の表現型と関連してよい。群は、特定の細胞の型と関連してよい。例えば、群は、細菌細胞を示すものであってよい。群は、ウイルス、真菌または寄生生物を示すものであってよい。群は、レクリエーショナルドラッグ（例えばＳＡＭＨＳＡ  ５パネル試験）、爆発物または環境汚染物質の具体的なパネルであってよい。
【００３１】
２つ以上の分析物の群は、好ましくは、疾患または状態を診断または予後予測するために用いることができる２つ以上のバイオマーカーの群である。バイオマーカーは、タンパク質またはポリヌクレオチドなどの上記の任意の分析物であってよい。バイオマーカーの適切なパネルは、当該技術において既知であり、例えばEdwards, A.V.G.ら(2008) Mol. Cell. Proteomics 7、1824〜1837頁；Jacquet, S.ら(2009)、Mol. Cell. Proteomics 8、2687〜2699頁；Anderson N.L.ら(2010) Clin. Chem. 56、177〜185頁に記載されるとおりである。疾患または状態は、好ましくは、がん、冠動脈心疾患、循環器疾患または敗血症である。
【００３２】
以下でより詳細に論じるように、群は、同じクラスの２つ以上の分析物を含んでよい。分析物は、それらが構造的類似性を有するならば、同じクラス内にある。分析物がタンパク質である場合、これらが同じタンパク質構造分類（ＳＣＯＰ）の分類中にあるならば、同じクラス内である。分析物は、それらが機能的に関連するかまたは系統学的に関連するならば、同じクラス内である。例えば、ヘロイン、コデインおよびモルヒネなどのオピエートは、同じ分析物のクラス内にあると考えることができる。同様に、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１ＲＡなどのインターロイキン１の異なる形は、同じ分析物のクラス内にあると考えることができる。本発明の関係では、分析物のクラスは、典型的に、構造的に異なるが１つのアプタマーと結合できる２つ以上の分析物である。本方法は、好ましくは、あるクラス中の分析物メンバーと結合するアプタマーを含む少なくとも１つのプローブの使用を含む。例えば、このような実施形態は、試料中の１つまたは複数のＩＬ−１分析物の存在または非存在の決定を可能にする。特定のクラス内の１つまたは複数の分析物メンバーの存在または非存在を検出できることは、利点を有する。例えば、初期の多重アッセイを、多様なクラスの分析物について行ってよい。１つまたはそれ以上のクラスの存在が一旦決定されると、これらのクラスと関連するより特異的な多重アッセイを行って、各クラス内の分析物メンバーの１つまたは複数の存在または非存在を決定してよい。
【００３３】
膜貫通孔
本発明の方法は、試料を膜貫通タンパク質孔と接触させるステップを含む。膜貫通孔は、印加された電位により駆動される水和イオンが膜の一方の側から膜の他方の側へと流れることを可能にする構造である。
【００３４】
任意の膜を本発明に従って用いてよい。適切な膜は、当該技術において公知である。膜は、好ましくは、両親媒性の層である。両親媒性の層は、少なくとも１つの親水性部分と少なくとも１つの親油性または疎水性部分とをともに有するリン脂質などの両親媒性分子から形成される層である。両親媒性分子は、合成または自然に存在するものであってよい。自然に存在しない両親媒性物質および単層を形成する両親媒性物質は、当該技術において既知であり、例えばブロック共重合体を含む（Gonzalez-Perezら、Langmuir、2009、25、10447〜10450頁）。ブロック共重合体は、２つ以上の単量体サブユニットが一緒に重合されて単一重合体鎖を創出する重合体材料である。ブロック共重合体は、各単量体サブユニットが寄与する特性を典型的に有する。しかし、ブロック共重合体は、個別のサブユニットから形成された重合体が有さない独自の特性を有することがある。ブロック共重合体は、単量体サブユニットの１つが疎水性（すなわち親油性）であるが、他のサブユニット（複数可）が水性媒体中で親水性であるように工学的に操作できる。この場合、ブロック共重合体は、両親媒性の特性を有してよく、生体膜を模倣する構造を形成してよい。ブロック共重合体は、ジブロック（２つの単量体サブユニットからなる）であってよいが、２つより多い単量体サブユニットから構築されて、両親媒性物質として挙動するより複雑な配置を形成してもよい。共重合体は、トリブロック、テトラブロックまたはペンタブロック共重合体であってよい。
【００３５】
両親媒性の層は、単層または２重層であってよい。両親媒性の層は、典型的に、平面状脂質２重層または支持２重層である。
【００３６】
両親媒性の層は、典型的に、脂質２重層である。脂質２重層は、細胞膜のモデルであり、ある範囲の実験的研究のための優れたプラットフォームを提供する。例えば、脂質２重層は、単一チャネル記録による膜タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ調査のために用いることができる。代わりに、脂質２重層は、バイオセンサとして用いて、ある範囲の物質の存在を検出できる。脂質２重層は、任意の脂質２重層であってよい。適切な脂質２重層は、それらに限定されないが、平面状脂質２重層、支持２重層またはリポソームを含む。脂質２重層は、好ましくは、平面状脂質２重層である。適切な脂質２重層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３号（ＷＯ２００８／１０２１２１として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に開示されている。
【００３７】
脂質２重層を形成するための方法は、当該技術において既知である。適切な方法を、実施例に開示する。脂質２重層は、MontalおよびMueller（Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、1972；69：3561〜3566頁）の方法により一般的に形成され、該方法では、脂質単層が、水溶液／空気界面に垂直な開口のいずれかの側を通過した水溶液／空気界面に担持される。
【００３８】
MontalおよびMuellerの方法は、タンパク質孔挿入のために適切な良質の脂質２重層を形成する経済的に有利で比較的単純な方法であるので、受け入れられている。２重層形成の他の一般的な方法は、２重層の先端浸漬、塗装およびリポソーム２重層のパッチクランプを含む。
【００３９】
好ましい実施形態では、脂質２重層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）に記載されるようにして形成される。
【００４０】
別の好ましい実施形態では、膜は、固体状態層である。固体状態層は、生体起源ではない。言い換えると、固体状態層は、生物または細胞などの生体環境または生物学的に入手可能な構造の合成されたバージョンに由来するものでもそこから単離されたものでもない。固体状態層は、超小型電子技術材料、Ｓｉ３Ｎ４、Ａ１２Ｏ３およびＳｉＯなどの絶縁材料、ポリアミドなどの有機および無機重合体、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）などのプラスチック、または２液付加硬化型シリコーンゴムなどのエラストマーならびにガラスを含む有機および無機の両方の材料から形成できるが、それらに限定されるものではない。固体状態層は、グラフェンなどの単原子層または数原子の厚さだけの層から形成できる。適切なグラフェン層は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０６３７号（ＷＯ２００９／０３５６４７として公開）に開示されている。両親媒性の層は、固体状態孔を横切って形成してよい。これは、当該技術において、ハイブリッド孔形成として記載されることがある（Hallら、Nat Nanotechnol.、2010、5、874〜877頁）。本方法は、（ｉ）孔を含む人工の両親媒性の層、（ｉｉ）孔を含む単離された自然に存在する脂質２重層または（ｉｉｉ）孔が挿入された細胞を用いて典型的に行われる。本方法は、人工脂質２重層などの人工の両親媒性の層を用いて典型的に行われる。層は、その他の膜貫通および／または膜内タンパク質ならびにその他の分子を孔に加えて含んでよい。適切な装置および条件は、以下に論じる。本発明の方法は、典型的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。
【００４１】
パネル中のプローブの１つまたは複数は、好ましくは膜にカップリングされている。パネル中の各プローブは、より好ましくは、膜にカップリングされている。このことは、任意の既知の方法を用いて行ってよい。膜が脂質２重層（上で詳細に論じるような）などの両親媒性の層であるならば、プローブは、好ましくは、膜中に存在するポリペプチドまたは膜中に存在する疎水性アンカーを介して膜にカップリングされる。疎水性アンカーは、好ましくは脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブまたはアミノ酸である。
【００４２】
プローブは、膜に直接カップリングされてよい。プローブは、好ましくは、リンカーを介して膜にカップリングされる。好ましいリンカーは、それらに限定されないが、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリペプチドなどの重合体を含む。
【００４３】
カップリングは、安定的または一過的であってよい。あるいくつかの用途について、一過的な性質のカップリングが好ましい。一過的なカップリングは、永続的な遮断を最小限にして、データがより短時間で蓄積されるようにする。なぜなら、孔の遮断を手動で解除するために時間をロスしないからである。永続的なカップリングを用いる場合、両親媒性の層を不安定化でき、そうでなければ、繋留されたアプタマーがシス側に蓄積されて、実験の平衡を変える原因になる。これらの影響は、一過的にカップリングさせることにより最小限にできる。膜と安定的または一過的な連結を形成する化学基については、以下でより詳細に論じる。プローブは、脂質２重層などの両親媒性の層に、コレステロールまたは脂肪酸アシル鎖を用いて一過的にカップリングさせることができる。ヘキサデカン酸などの約６から約３０までの炭素原子の長さを有する任意の脂肪酸アシル鎖を用いることができる。
【００４４】
好ましい実施形態では、１つまたは複数のプローブまたは各プローブは、両親媒性の層にカップリングされる。合成脂質２重層とのカップリングは、様々な異なる繋留方策を用いて以前に行われている。これらを以下の表１にまとめる。
【００４５】
【表１】
0006275052.tif 000002
【００４６】
プローブは、合成反応において改変ホスホロアミダイトを用いて官能化してよく、改変ホスホロアミダイトは、チオール、コレステロール、脂質およびビオチン基などの反応性基の付加に容易に適合できる。これらの異なる付着化学は、プローブのための一連の付着オプションを提供する。異なる各改変基は、わずかに異なる方式でプローブを繋留し、カップリングは、常に永続的ではなく、よって、プローブは、２重層での異なる滞留時間を有する。
【００４７】
プローブのカップリングは、反応性基をプローブに付加できることを条件として、いくつかの他の手段により達成することもできる。ＤＮＡのいずれかの端への反応性基の付加は、以前に報告されている。チオール基をｓｓＤＮＡの５’に、ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰγＳを用いて付加できる（Grant, G. P.およびP. Z. Qin (2007).「A facile method for attaching nitroxide spin labels at the 5' terminus of nucleic acids.」Nucleic Acids Res 35(10)：e77）。ビオチン、チオールおよび蛍光団などのより多様な選択の化学基を、末端転移酵素を用いて付加して、改変オリゴヌクレオチドをｓｓＤＮＡの３’に組み込むことができる（Kumar, A., P. Tchenら(1988).「Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminal deoxynucleotidyl transferase.」Anal Biochem 169(2)：376〜82頁）。
【００４８】
代わりに、反応性基は、２重層に既にカップリングされているものに相補的な短いＤＮＡ片の付加とみなすことができ、よって、付着は、ハイブリダイゼーションにより達成できる。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩを用いる短いｓｓＤＮＡ片のライゲーションが、報告されている（Troutt, A. B.、M. G. McHeyzer-Williamsら(1992).「Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity.」Proc Natl Acad Sci U S A 89(20)：9823〜5頁）。代わりに、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡのいずれかを未変性ｄｓＤＮＡにライゲーションし、次いで、２つの鎖を熱または化学変性により分けることができる。未変性ｄｓＤＮＡには、２重鎖の一方もしくは両方の端にｓｓＤＮＡ片または一方もしくは両方の端にｄｓＤＮＡを付加できる。次いで、２重鎖を融解させた場合に、各１本鎖は、ｓｓＤＮＡをライゲーションのために用いたときは５’または３’改変のいずれかを有し、ｄｓＤＮＡをライゲーションのために用いたときは５’端、３’端またはその両方に改変を有する。プローブが合成ポリヌクレオチドを含むならば、カップリング化学を、プローブの化学合成中に組み込むことができる。例えば、プローブは、反応性基が付着したプライマーを用いて合成できる。
【００４９】
ゲノムＤＮＡの区画の増幅のための一般的な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる。この技術では、２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＤＮＡの同じ区画の多くのコピーを作製でき、ここで、各コピーについて、２重鎖の各鎖の５’端は、合成ポリヌクレオチドになる。コレステロール、チオール、ビオチンまたは脂質などの反応性基を有するアンチセンスプライマーを用いることにより、増幅された標的ＤＮＡの各コピーは、カップリングのための反応性基を含有することになる。
【００５０】
膜貫通孔が下記のような膜貫通タンパク質孔であるならば、パネル中のプローブは、好ましくは、孔にカップリングされない。孔がタンパク質孔であるならば、パネル中のプローブは、より好ましくは、孔と共有結合的に付着しない。
【００５１】
膜貫通孔は、全般的に、前庭（vestibule）とバレルまたはチャネルとを含む。バレルまたはチャネルは、典型的に、実質的に円筒形の通路であり、その中を、水和イオンが膜を横切って流れることができる。前庭は、典型的に、バレルまたはチャネルへの入口を形成し、バレルまたはチャネルとは異なる横断面積を有する。典型的に、前庭は、バレルよりも大きい横断面積を有する。前庭とバレルまたはチャネルとを有する孔の良好な例は、α−溶血素（α−ＨＬ）であり、これについては、以下でより詳細に論じる。前庭とバレルまたはチャネルとを含む孔は、固体状態層中で形成できる。前庭は、存在することが好ましい。なぜなら、前庭は、以下でより詳細に論じるように本発明の方法を容易にするからである。
【００５２】
バレルまたはチャネルは、任意の幅を有することができる。典型的に、バレルまたはチャネルは、各プローブの尾部がバレルまたはチャネルに侵入して、孔を流れる電流に影響できるように十分に幅が広い。以下でより詳細に論じるように、尾部は、好ましくは、重合体を含む。バレルまたはチャネルは、好ましくは、重合体がバレルまたはチャネルに侵入して、孔を流れる電流に影響できるように十分に幅が広い。いくつかの場合では、尾部は、ポリヌクレオチドを含むことができる。バレルまたはチャネルは、好ましくは、１本鎖ポリヌクレオチドが孔に侵入して孔を通過できるが、２本鎖ポリヌクレオチドが孔に侵入できず孔を通過できないように十分に狭い。
【００５３】
以下でより詳細に論じる理由のために、前庭は、典型的に、プローブのパネル中の各アプタマーが侵入できるように十分に幅が広いが、各アプタマー／分析物メンバー複合体が侵入することを妨げるように十分に狭い。前庭およびバレルまたはチャネルは、それぞれ、典型的に、少なくとも２ヌクレオチド、例えば合計で少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０ヌクレオチド、例えば少なくとも８を前庭に、かつ少なくとも１２をバレルに含有するように十分に長い。
【００５４】
膜貫通孔は、好ましくは、膜貫通タンパク質孔である。膜貫通タンパク質孔は、分析物などの水和イオンが膜の一方の側から膜の他方の側まで流れることを可能にするポリペプチドまたはポリペプチドの収集物である。本発明では、膜貫通タンパク質孔は、印加された電位により駆動される水和イオンが膜の一方の側から他方の側まで流れることを可能にする孔を形成できる。膜貫通タンパク質孔は、下記のように、脂質２重層などの膜の一方の側から他方の側までプローブが流れることを可能にする。膜貫通タンパク質孔は、好ましくは、ｓｓＤＮＡまたはＲＮＡなどの１本鎖ポリヌクレオチドが孔を通って移動することを可能にする。
【００５５】
膜貫通タンパク質孔は、単量体またはオリゴマーであってよい。孔は、好ましくは、６、７、８または９サブユニットなどのいくつかの反復サブユニットで作られる。孔は、好ましくは、６量体、７量体、８量体または９量体孔である。
【００５６】
膜貫通タンパク質孔は、典型的に、そこを通ってイオンが流れることができるバレルまたはチャネルを含む。孔のサブユニットは、典型的に、中心軸を取り囲み、その鎖が、膜貫通βバレルもしくはチャネルまたは膜貫通αヘリックス束もしくはチャネルに寄与する。
【００５７】
膜貫通タンパク質孔のバレルまたはチャネルは、典型的に、尾部中の重合体単位のように、尾部との相互作用を容易にするアミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、好ましくは、バレルまたはチャネルのくびれ付近にある。膜貫通タンパク質孔は、典型的に、アルギニン、リシンもしくはヒスチジンなどの１つもしくは複数の正荷電アミノ酸またはチロシンもしくはトリプトファンなどの芳香族アミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、典型的に、孔と尾部中のヌクレオチドなどの負荷電重合体単位との間の相互作用を容易にする。
【００５８】
本発明に従って用いるための膜貫通タンパク質孔は、β−バレル孔またはα−ヘリックス束孔に由来できる。β−バレル孔は、β鎖から形成されるバレルまたはチャネルを含む。適切なβ−バレル孔は、それらに限定されないが、α−溶血素、炭疽毒素およびロイコシジンなどのβ−毒素およびスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（Ｍｓｐ）、例えばＭｓｐＡなどの細菌の外膜タンパク質／ポリン、外膜ホスホリパーゼＡならびにナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）を含む。α−ヘリックス束孔は、α−ヘリックスから形成されるバレルまたはチャネルを含む。適切なα−ヘリックス束孔は、それらに限定されないが、内膜タンパク質ならびにＷＺＡおよびＣｌｙＡ毒素などのα外膜タンパク質を含む。膜貫通孔は、好ましくは、α−溶血素（α−ＨＬ）またはロイコシジンに由来する。
【００５９】
孔は、ホモオリゴマー（全ての単量体単位が同一）またはヘテロオリゴマー（２つ以上の異なる型の単量体）であってよい。孔は、連結された単量体、例えば２量体を含んでよい。
【００６０】
孔は、少なくとも１つの２量体と、１、２、３、４、５、６、７または８つの単量体とを含んでよい。孔は、２、３、４つ以上の２量体を含んでよい。このような孔は、孔を形成するために十分な単量体をさらに含む。さらなる孔は、２量体だけを含み、例えば、孔は、４、５、６、７または８つの２量体を含んでよい。本発明に従う具体的な孔は、４つの２量体を含む。２量体は、２量体のうちの一方の単量体だけが孔のバレルまたは前庭に寄与するような構造を有する孔になるようにオリゴマー形成できる。典型的に、構築物の他の単量体は、孔のバレルまたは前庭の外側にある。例えば、孔は、５、６、７または８つの２量体を含んでよく、バレルまたは前庭は、８つの単量体を含む。
【００６１】
膜貫通タンパク質孔は、好ましくは、α−溶血素（α−ＨＬ）に由来する。野生型α−ＨＬ孔は、７つの同一の単量体またはサブユニットで形成される（すなわち、これは７量体である）。膜貫通タンパク質孔は、好ましくは、α−ＨＬに由来する７つの単量体を含む。α−溶血素−ＮＮ（すなわちα−ＨＬに由来する孔）の１つの単量体またはサブユニットの配列を、配列番号２に示す。α−溶血素−ＮＮは、置換Ｅ１１１ＮおよびＫ１４７Ｎを含有する。膜貫通タンパク質孔は、好ましくは、７つの単量体を含み、そのそれぞれは、配列番号２に示す配列またはそのバリアントを含む。配列番号４のアミノ酸１、７〜２１、３１〜３４、４５〜５１、６３〜６６、７２、９２〜９７、１０４〜１１１、１２４〜１３６、１４９〜１５３、１６０〜１６４、１７３〜２０６、２１０〜２１３、２１７、２１８、２２３〜２２８、２３６〜２４２、２６２〜２６５、２７２〜２７４、２８７〜２９０および２９４は、ループ領域を形成する。配列番号２の残基１１３および１４７は、α−ＨＬのバレルまたはチャネルのくびれの一部を形成する。
【００６２】
孔は、好ましくは、７つのタンパク質または単量体を含み、そのそれぞれは配列番号２に示す配列またはそのバリアントを含む。膜貫通タンパク質は、好ましくは、（ａ）配列番号２に示す７つの同一のサブユニット、あるいは（ｂ）そのバリアントであって、７つのサブユニットの１つもしくは複数または全てが配列番号２のバリアントであり、孔活性を維持する前記バリアントで形成される。７つのタンパク質は、同じ（ホモ７量体）または異なる（ヘテロ７量体）ことがある。
【００６３】
配列番号２のバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列から変動したアミノ酸配列を有し、その孔形成能力を維持するタンパク質である。孔を形成するバリアントの能力は、当該技術において既知の任意の方法を用いてアッセイできる。例えば、バリアントをその他の適当なサブユニットとともに脂質２重層などの両親媒性の層に挿入し、オリゴマー形成して孔を形成するその能力を決定できる。脂質２重層などの両親媒性の層にサブユニットを挿入するための方法は、当該技術において既知である。例えば、サブユニットは、脂質２重層に拡散し、脂質２重層と結合して機能的な状態に集合することにより挿入されるように脂質２重層を含有する溶液に精製形で懸濁できる。代わりに、サブユニットは、M.A. Holden、H. Bayley. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 6502〜6503頁および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に記載される「ピックアンドプレース」法を用いて膜に直接挿入してもよい。
【００６４】
配列番号２のある好ましいバリアントは、野生型サブユニット、すなわち１１１位にてＥが置き換えられ、１４７位にてＫが置き換えられているサブユニットである。
【００６５】
バリアントは、別の分子との共有結合的付着または相互作用を容易にする改変を含んでよい。バリアントは、好ましくは、付着を容易にする１つまたは複数の反応性システイン残基を含む。例えば、バリアントは、配列番号２の８位、９位、１７位、１８位、１９位、４４位、４５位、５０位、５１位、２３７位、２３９位および２８７位ならびに／またはアミノもしくはカルボキシ末端の１つまたは複数にてシステインを含んでよい。好ましいバリアントは、配列番号２の８位、９位、１７位、２３７位、２３９位および２８７位の残基のシステインへの置換を含む（Ａ８Ｃ、Ｔ９Ｃ、Ｎ１７Ｃ、Ｋ２３７Ｃ、Ｓ２３９ＣまたはＥ２８７Ｃ）。バリアントは、好ましくは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に記載されるバリアントのいずれか１つである。
【００６６】
バリアントは、ヌクレオチド、アミノ酸またはエチレンオキシドなどの尾部中の重合体単位との任意の相互作用を容易にする改変も含んでよい。
【００６７】
バリアントは、生物、例えばブドウ球菌（Staphylococcus）により自然に発現される、自然に存在するバリアントであってよい。代わりに、バリアントは、大腸菌（Escherichia coli）などの細菌によりｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは組換えにより発現できる。バリアントは、組換え技術により生成される自然に存在しないバリアントも含む。
【００６８】
配列番号２のアミノ酸配列全長にわたって、バリアントは、好ましくは、アミノ酸同一性に基づいてその配列と少なくとも５０％相同である。より好ましくは、バリアントは、配列番号２のアミノ酸配列全体にわたる該配列に対するアミノ酸同一性に基づいて、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であってよい。２００以上のひと続き、例えば２３０、２５０、２７０または２８０以上の連続アミノ酸にわたって、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性があってよい（「堅い相同性」（hard homology））。
【００６９】
当該技術における標準的な方法を用いて相同性を決定してよい。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供し、例えばこれをそのデフォルト設定で用いて、相同性を算出できる（Devereuxら(1984) Nucleic Acids Research 12、387〜395頁）。例えばAltschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290〜300頁；Altschul, S.Fら(1990) J Mol Biol 215：403〜10頁に記載されるように、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて相同性を算出または配列を整列させることができる（例えば等価な残基または対応する配列を同定する（典型的に、それらのデフォルト設定で））。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公共で入手可能である。
【００７０】
上記論じたものに加えて、アミノ酸置換、例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０までの置換を配列番号２のアミノ酸配列に対して行ってよい。保存置換は、アミノ酸を、同様の化学構造、同様の化学的特性または同様の側鎖容積の他のアミノ酸で置き換える。導入されるアミノ酸は、それらが置き換えるアミノ酸と同様の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性または電荷を有することができる。代わりに、保存置換は、既に存在する芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入してよい。保存アミノ酸変化は、当該技術において公知であり、下の表２で規定する２０種の主要アミノ酸の特性に従って選択してよい。アミノ酸が同様の極性を有する場合、このことは、表３のアミノ酸側鎖についての疎水性親水性指標の尺度を参照することによっても決定できる。
【００７１】
【表２】
0006275052.tif 000003
【００７２】
【表３】
0006275052.tif 000004
【００７３】
配列番号２のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上記のポリペプチドからさらに欠失してよい。１、２、３、４、５、１０、２０もしくは３０残基またはそれ以上までが欠失してよい。
【００７４】
バリアントは、配列番号２の断片を含んでよい。このような断片は、孔形成活性を維持する。断片は、少なくとも５０、１００、２００または２５０アミノ酸の長さであってよい。このような断片を用いて孔を生成できる。断片は、好ましくは、配列番号２の孔形成ドメインを含む。断片は、典型的に、配列番号２の残基１１９、１２１、１３５．１１３および１３９を含む。
【００７５】
１つまたは複数のアミノ酸を、代わりにまたはさらに、上記のポリペプチドに付加できる。配列番号２のアミノ酸配列またはそのポリペプチドバリアントもしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に伸長をもたらすことができる。伸長は、かなり短く、例えば約１から約１０までのアミノ酸の長さであってよい。代わりに、伸長は、より長く、例えば約５０または約１００までのアミノ酸であってよい。キャリアタンパク質を、本発明に従うアミノ酸配列と融合させてよい。
【００７６】
上記のように、バリアントは、配列番号２から変動するアミノ酸配列を有し、孔を形成するその能力を維持するポリペプチドである。バリアントは、典型的に、孔形成を担う配列番号２の領域を含有する。β−バレルを含有するα−ＨＬの孔形成能力は、各サブユニット中のβ鎖によりもたらされる。配列番号２のバリアントは、典型的に、β鎖を形成する配列番号２中の領域を含む。β鎖を形成する配列番号２のアミノ酸については、上記している。１つまたは複数の改変を、得られるバリアントが孔を形成するその能力を維持する限り、β鎖を形成する配列番号２の領域に作製できる。配列番号２のβ鎖領域に作製できる具体的な改変については、上記している。
【００７７】
配列番号２のバリアントは、好ましくは、そのα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の改変を含む。α−ヘリックスおよびループを形成するアミノ酸については、上記している。
【００７８】
膜貫通タンパク質孔は、好ましくは、ロイコシジンにも由来する。ロイコシジンは、１つがクラスＳサブユニットで１つがクラスＦサブユニットである２つの異なるサブユニットを有するヘテロオリゴマー孔である。適切なロイコシジンは、それらに限定されないが、ＬｕｋＦ（ＨｌｇＢ）およびＨｌｇ２（ＨｌｇＡ）を含むガンマ溶血素（γ−ＨＬ）、ＬｕｋＦ（ＨｌｇＢ）およびＬｕｋＳ（ＨｌｇＣ）を含むロイコシジン、ＬｕｋＦ−ＰＶおよびＬｕｋＳ−ＰＶを含むロイコシジンＰＶ、ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤを含むＬｕｋＥ／ＬｕｋＤ孔、ならびにＬｕｋＦ−ＩおよびＬｕｋＳ−Ｉを含むＬｕｋＳ−Ｉ／ＬｕｋＦ−Ｉを含む。
【００７９】
膜貫通タンパク質孔がロイコシジンである場合、これは、好ましくは、ガンマ溶血素（γ−ＨＬ）に由来する。野生型γ−ＨＬ孔は、８つのサブユニットで形成され（すなわち、これは、８量体である）、ＬｕｋＦの４つのサブユニットとＨｌｇ２の４つのサブユニットとを含有する。ＬｕｋＦの１つの単量体またはサブユニットの配列を、配列番号４に示す。Ｈｌｇ２の１つの単量体またはサブユニットの配列を、配列番号６に示す。膜貫通タンパク質孔は、好ましくは、それぞれが配列番号４に示す配列またはそのバリアントを含む４つの単量体と、それぞれが配列番号６に示す配列またはそのバリアントを含む４つの単量体とを含む。配列番号４のアミノ酸１０９〜１４７と配列番号６の１０３〜１３９とは、ループ領域を形成する。
【００８０】
γ−溶血素孔は、好ましくは、（ａ）配列番号４に示す４つの同一のサブユニットと配列番号６に示す４つの同一のサブユニットとで形成されるγ−溶血素、あるいは（ｂ）そのバリアントであって、サブユニットの１つもしくは複数または全てが配列番号４のバリアントであり、かつ／またはサブユニットの１つもしくは複数または全てが配列番号６のバリアントであり、かつ孔が孔活性を維持する前記バリアントである。このような孔は、ヘテロ８量体である。
【００８１】
配列番号４または６のバリアントは、配列番号４または６のアミノ酸配列から変異したアミノ酸配列を有し、その孔形成能力を維持するタンパク質である。孔を形成するバリアントの能力は、当該技術において既知の任意の方法を用いてアッセイできる。例えば、バリアントをその他の適当なサブユニットとともに脂質２重層などの両親媒性の層に挿入し、オリゴマー形成して孔を形成するその能力を決定できる。脂質２重層などの両親媒性の層にサブユニットを挿入するための方法は、当該技術において既知である。適切な方法については、上記している。
【００８２】
バリアントは、別の分子との共有結合的付着または相互作用を容易にする改変を含んでよい。バリアントは、好ましくは、付着を容易にする１つまたは複数の反応性システイン残基を含む。バリアントは、ヌクレオチド、アミノ酸またはエチレンオキシドなどの尾部中の重合体単位との任意の相互作用を容易にする改変も含んでよい。
【００８３】
バリアントは、生物、例えばブドウ球菌（Staphylococcus）により自然に発現される、自然に存在するバリアントであってよい。代わりに、バリアントは、大腸菌（Escherichia coli）などの細菌によりｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは組換えにより発現できる。バリアントは、組換え技術により生成される自然に存在しないバリアントも含む。配列番号４または６のアミノ酸配列全長にわたって、バリアントは、好ましくは、アミノ酸同一性に基づいてその配列と少なくとも５０％相同である。より好ましくは、バリアントポリペプチドは、配列番号４または６のアミノ酸配列全体にわたる該配列に対するアミノ酸同一性に基づいて、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であってよい。２００以上のひと続き、例えば２３０、２５０、２７０または２８０以上の隣接アミノ酸にわたって、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性があってよい（「堅い相同性」）。相同性は、上記のようにして決定できる。
【００８４】
上記のものに加えて、アミノ酸置換、例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０までの置換を配列番号４または６のアミノ酸配列に対して行ってよい。保存置換は、上記のようにして作製してよい。
【００８５】
配列番号４または６のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上記のポリペプチドからさらに欠失してよい。１、２、３、４、５、１０、２０もしくは３０残基またはそれ以上までが欠失してよい。
【００８６】
バリアントは、配列番号４または６の断片であってよい。このような断片は、孔形成活性を維持する。断片は、少なくとも５０、１００、２００または２５０アミノ酸の長さであってよい。断片は、好ましくは、配列番号４または６の孔形成ドメインを含む。
【００８７】
１つまたは複数のアミノ酸を、代わりにまたはさらに、上記のポリペプチドに付加できる。配列番号４もしくは６のアミノ酸配列またはそのバリアントもしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に伸長をもたらすことができる。伸長は、かなり短く、例えば約１から約１０までのアミノ酸の長さであってよい。代わりに、伸長は、より長く、例えば約５０または約１００までのアミノ酸であってよい。キャリアタンパク質を、孔またはバリアントと融合させてよい。
【００８８】
上記のように、配列番号４または６のバリアントは、配列番号４または６から変動するアミノ酸配列を有し、孔を形成するその能力を維持するサブユニットである。バリアントは、典型的に、孔形成を担う配列番号４または６の領域を含有する。β−バレルを含有するγ−ＨＬの孔形成能力は、各サブユニット中のβ鎖によりもたらされる。配列番号４または６のバリアントは、典型的に、β鎖を形成する配列番号４または６中の領域を含む。β鎖を形成する配列番号４または６のアミノ酸については、上記している。１つまたは複数の改変を、得られるバリアントが孔を形成するその能力を維持する限り、β鎖を形成する配列番号４または６の領域に作製できる。配列番号４または６のβ鎖領域に作製できる具体的な改変については、上記している。
【００８９】
配列番号４または６のバリアントは、好ましくは、そのα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の改変を含む。α−ヘリックスおよびループを形成するアミノ酸については、上記している。
【００９０】
いくつかの実施形態では、膜貫通タンパク質孔は、化学改変される。α−ＨＬ（すなわち配列番号２またはそのバリアント）またはγ−ＨＬ（すなわち配列番号４もしくは６またはそのバリアント）に由来する単量体を改変して、例えばヒスチジン残基（ｈｉｓｔタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグもしくはフラグタグの付加により、または細胞からのそれらの分泌を促進するシグナル配列（ポリペプチドがそのような配列を自然に含有しない場合）の付加により、それらの同定または精製を支援してよい。遺伝子タグを導入することの代替は、タグを孔上の天然または工学的に作製された位置に化学的に反応させることである。この例は、孔の外側に工学的に作製されたシステインにゲルシフト試薬を反応させることである。このことは、α−ＨＬヘテロオリゴマーを分離するための方法として証明されている（Chem Biol. 1997年7月; 4(7)：497〜505頁）。
【００９１】
α−ＨＬまたはγ−ＨＬに由来する単量体は、明示標識で標識されてよい。明示標識は、孔の検出を可能にする任意の適切な標識であってよい。適切な標識は、それらに限定されないが、蛍光分子、放射性同位体、例えば１２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびビオチンなどのリガンドを含む。
【００９２】
α−ＨＬまたはγ−ＨＬに由来する単量体は、Ｄ−アミノ酸を用いて生成することもできる。例えば、α−ＨＬまたはγ−ＨＬに由来する単量体は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含んでよい。このことは、このようなタンパク質またはペプチドを生成するために当該技術において慣習的である。
【００９３】
α−ＨＬまたはγ−ＨＬに由来する単量体は、１つまたは複数の特異的改変を含んで、尾部との相互作用を容易にしてよい。α−ＨＬまたはγ−ＨＬに由来する単量体は、孔形成に干渉しない限り、その他の非特異的改変も含有してよい。多くの非特異的側鎖改変は当該技術において既知であり、α−ＨＬまたはγ−ＨＬに由来する単量体の側鎖に対して作製してよい。このような改変は、例えば、アルデヒドとの反応とその後のＮａＢＨ４を用いる還元とによるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデートを用いるアミド化または無水酢酸を用いるアシル化を含む。
【００９４】
α−ＨＬまたはγ−ＨＬに由来する単量体は、当該技術において既知の標準的な方法を用いて生成できる。α−ＨＬに由来する単量体は、合成によりまたは組換え手段により作製してよい。例えば、孔は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）により合成してよい。孔を生成するための適切な方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）で論じられている。孔を膜に挿入するための方法が論じられている。
【００９５】
孔は、当該技術において既知の標準的な方法を用いて生成できる。孔をコードするポリヌクレオチド配列は、当該技術において標準的な方法を用いて導いて複製してよい。孔をコードするポリヌクレオチド配列は、当該技術において標準的な方法を用いて細菌宿主細胞において発現してよい。孔は、組換え発現ベクターからのポリペプチドのｉｎ  ｓｉｔｕ発現により細胞において生成してよい。発現ベクターは、場合によって、誘導性プロモーターを有して、ポリペプチドの発現を制御する。これらの方法は、Sambrook, J.およびRussell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYに記載されている。
【００９６】
孔は、タンパク質生成生物から任意のタンパク質液体クロマトグラフィーシステムによる精製の後または組換え発現の後に大規模で生成できる。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィーシステムは、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡシステム、Ｂｉｏ−Ｃａｄシステム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＢｉｏＬｏｇｉｃシステムおよびＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣシステムを含む。
【００９７】
プローブのパネル
本発明の方法は、試料を、２つ以上のプローブのパネルと接触させるステップを含む。言い換えると、本発明の方法は、試料を、２つ以上の型のプローブのパネルと接触させるステップを含む。パネルは、２、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００以上のプローブなどの任意の数の２つ以上のプローブを含んでよい。パネルは、好ましくは、約５から約８０までのプローブ、約１０から約６０までのプローブまたは約２０から約５０までのプローブなどの約４から約１００までのプローブを有する。
【００９８】
本方法は、パネル中の各または全てのプローブの複数の事例を用いる。なぜなら、分析物が試料中に存在するならば、そこには分析物の複数の事例がほぼ確実に存在するからである。言い換えると、本方法は、パネル中の各または全ての型のプローブの複数の事例を用いる。
【００９９】
２つ以上の分析物の群の各または全ての分析物メンバーは、パネル中の少なくとも１つのプローブ（すなわち少なくとも１つの型のプローブ）により認識される。プローブは、試料中に分析物が存在する場合に本発明の方法においてプローブが陽性シグナルをもたらすならば、分析物メンバーを認識する。言い換えると、プローブは、試料中に分析物が存在する場合にプローブが電流に示差的な様式で影響するならば、分析物メンバーを認識する。プローブは、典型的に、分析物メンバーを認識する。なぜなら、プローブは、分析物メンバーと結合するアプタマーを含むからである。各分析物メンバーが少なくとも１つのプローブにより認識されるという事実は、本発明の方法を用いて、群中の各分析物メンバーの存在または非存在を決定することを可能にする。プローブが分析物メンバーを認識する方式については、以下でより詳細に論じる。
【０１００】
パネル中の少なくとも１つのプローブ（すなわち少なくとも１つの型のプローブ）は、好ましくは、２つ以上の分析物の群内の分析物メンバーのあるクラスを認識し、そのクラス中の分析物メンバーと結合するアプタマーを含む。群内の分析物メンバーのあるクラスの存在または非存在を決定することに関連する利点については、上記している。１つより多い分析物メンバーと結合するアプタマーの生成については、以下で論じる。
【０１０１】
パネル中の少なくとも１つのプローブ（すなわち少なくとも１つの型のプローブ）は、好ましくは、分析物メンバーの１つを特異的に認識し、該分析物メンバーと特異的に結合するアプタマーを含む。プローブは、試料中に分析物が存在する場合に本発明の方法においてプローブだけが陽性シグナルをもたらすならば、分析物メンバーの１つを特異的に認識する。言い換えると、プローブは、試料中に分析物が存在する場合にプローブだけが電流に示差的な様式で影響するならば、分析物メンバーを特異的に認識する。プローブは、典型的に、分析物メンバーを特異的に認識する。なぜなら、プローブは、分析物メンバーと特異的に結合するアプタマーを含むからである。アプタマーの特異的結合は、以下でより詳細に論じる。本実施形態では、少なくとも１つのプローブは、１つの分析物メンバーだけを標的にする。パネル中の各プローブ（すなわちそれぞれの型のプローブ）は、より好ましくは、分析物メンバーの１つを特異的に認識し、該分析物メンバーと特異的に結合するアプタマーを含む。この実施形態では、各プローブは、１つの分析物メンバーだけを標的にする。本発明の多重アッセイは、分析物メンバーを検出するために１つのプローブだけを用いるならば、より単純である。特に、孔を流れる電流に対する１つのプローブの示差的な効果を測定することにより分析物メンバーの存在または非存在を決定することが、より簡単明瞭である。
【０１０２】
パネル中の各プローブ（すなわちそれぞれの型のプローブ）は、好ましくは、異なるアプタマーを含む。言い換えると、同じアプタマーを含むプローブは、パネル中に２つとない（すなわち、そのような２つの同じ型のプローブはない）。以下でより詳細に論じるように、異なるアプタマー間の差は、孔を流れる電流に各プローブが与える影響の示差性に寄与できる。異なるアプタマーは、典型的に、異なる分析物メンバーと結合するが、同じ分析物メンバーと結合することがある。好ましい実施形態では、パネル中の２つ以上のプローブは、同じ分析物メンバーと特異的に結合する異なるアプタマーを含む。パネル中の２つ以上のプローブは、好ましくは、異なるアプタマーと同じポリヌクレオチド尾部とを含む。この実施形態では、孔を流れる電流に各プローブが与える影響の示差性は、典型的に、アプタマー間の差によりもたらされる。
【０１０３】
パネル中の各プローブ（すなわちそれぞれの型のプローブ）は、好ましくは、異なる尾部を含む。以下でより詳細に論じるように、異なる尾部間の差も、孔を流れる電流に各プローブが与える影響の示差性に寄与する。パネル中の２つ以上のプローブは、好ましくは、同じアプタマーと異なる尾部とを含む。この実施形態では、孔を流れる電流に各プローブが与える影響の示差性は、典型的に、尾部間の差によりもたらされる。この実施形態では、２つ以上のプローブは、同じ１つまたは複数の分析物メンバーを標的にする。なぜなら、これらは同じアプタマーを共有するからである。このことにより、内部対照がもたらされる。なぜなら、１つまたは複数の分析物メンバーの１つが試料中に存在すると結論付けるために両方のプローブからの陽性シグナルが必要であるからである。
【０１０４】
パネル中の各プローブ（すなわちそれぞれの型のプローブ）は、異なるアプタマーと異なるポリヌクレオチド尾部とを含むことがある。言い換えると、言い換えると、同じアプタマーと同じ尾部とを含むプローブは、パネル中に２つとない（すなわち、そのような２つの同じ型のプローブはない）。実施形態では、異なるアプタマーと異なる尾部とはともに、典型的に、孔を流れる電流に２つ以上のプローブのそれぞれが与える影響の示差性に寄与する。
【０１０５】
パネル中のプローブ（すなわちプローブの型）の数は、典型的に、群の分析物メンバーの数と同じまたはそれより大きい。群の分析物メンバーの数よりもパネル中のプローブが少なくてよい。なぜなら、各プローブは、１つまたは複数の分析物メンバーを認識できるからである。パネル中のプローブの数が群の分析物メンバーの数よりも大きいならば、２つ以上のプローブは、同じ１つまたは複数の分析物メンバーを標的にし、本発明の方法は、上記のように内部対照を含む。パネル中のプローブの数は、好ましくは、２つ以上の分析物の群の分析物メンバーの数と同じである。これが本発明の最も単純な実施形態であるが、これは、内部対照を含まない。
【０１０６】
アプタマー
パネル中の各プローブ（すなわちそれぞれの型のプローブ）は、分析物メンバーの１つまたは複数を認識し、１つまたは複数の分析物メンバーと結合するアプタマーを含む。プローブによる分析物メンバーの認識については、上記している。
【０１０７】
アプタマーは、１つまたは複数の分析物メンバーと結合する小分子である。アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（Stoltenburg, R.ら、(2007), Biomolecular Engineering 24、381〜403頁；Tuerk, C.ら、Science 249、505〜510頁；Bock, L. C.ら、(1992)、Nature 355、564〜566頁）または非ＳＥＬＥＸ（Berezovski, M.ら(2006)、Journal of the American Chemical Society 128、1410〜1411頁）を用いて生成できる。
【０１０８】
アプタマーは、１つまたは複数の分析物メンバーと結合できる。この実施形態では、アプタマーを含むプローブは、１つまたは複数の分析物メンバーを認識できる。１つより多い分析物メンバーと結合するアプタマーは、トグル（Toggle）ＳＥＬＥＸ（White, R.ら、(2001)、Molecular Therapy 4、567〜573頁）を用いて生成できる。アプタマーは１つまたは複数の分析物と結合できるが、各アプタマーは、典型的に、本発明の方法において１つの分析物とだけ結合する。このことは、以下でより詳細に論じる。
【０１０９】
アプタマーは、好ましくは、２つ以上の分析物の群内の分析物メンバーのあるクラスと結合する。分析物メンバーのあるクラスについては、上記している。分析物メンバーのあるクラスと結合するアプタマーは、トグルＳＥＬＥＸを用いて生成できる。
【０１１０】
アプタマーは、好ましくは、ペプチドアプタマーまたはオリゴヌクレオチドアプタマーである。ペプチドアプタマーは、任意のアミノ酸を含んでよい。アミノ酸は、上記のもののいずれであってもよい。オリゴヌクレオチドアプタマーは、任意のヌクレオチドを含んでよい。ヌクレオチドは、上記のもののいずれであってもよい。
【０１１１】
アプタマーは、任意の長さであることができる。アプタマーは、典型的に、約１５から約５０まで、約２０から約４０までまたは約２５から約３０までのアミノ酸またはヌクレオチドの長さなどの少なくとも１５アミノ酸またはヌクレオチドの長さである。
【０１１２】
尾部
パネル中の各プローブ（すなわちそれぞれの型のプローブ）は、孔に侵入できる尾部を含む。尾部は、典型的に、孔のバレルまたはチャネルに侵入して、それを通過できる直鎖状分子である。尾部を形成するために適切な分子については、以下で論じる。尾部が孔に侵入すると、尾部は、バレルまたはチャネル中に存在する尾部の部分に特異的な様式で孔を流れる電流に影響する。
【０１１３】
尾部は、プローブ中のアプタマーが分析物メンバーの１つと結合しているか否かに応じて、孔を流れる電流に対して異なる影響を有する。各プローブ中の尾部は、アプタマーが分析物メンバーと結合していない場合に孔を流れる電流にある方式で影響し、アプタマーが分析物メンバーと結合している場合に孔を流れる電流に異なる方式で影響する。このことは、重要である。なぜなら、このことにより、方法を用いて群中の各分析物メンバーの存在または非存在を決定できるからである。
【０１１４】
プローブ中のアプタマーが分析物メンバーの１つと結合しているか否かに依存する孔を流れる電流に対する尾部の異なる影響は、プローブが孔を通って移動するのにかかる時間に基づいて測定できる。言い換えると、プローブ中のアプタマーが分析物メンバーの１つと結合しているか否かに依存する孔を流れる電流に対する尾部の異なる影響は、プローブが孔を流れる電流に影響する時間に基づいて測定できる。理論と結び付けられることを望まないが、各プローブの尾部は、パネルが孔と接触し、孔を流れる電流に影響するときに、孔のバレルまたはチャネルに侵入する。本発明の方法では、複数の事例の孔を用いる。短い時間の間に、孔を通るプローブ全体の移動は、アプタマーにより妨げられる（すなわち遅れる）。アプタマーは、典型的に、３次元構造に折り畳まれ、よって、孔のバレルまたはチャネルを通って移動するには典型的に大きすぎる。短い時間の後に、アプタマーは、電位の影響の下で折り畳みがほどかれ、プローブ全体が電位に沿って孔を通って移動する。プローブが一旦孔を通過すると、孔を流れる電流は、プローブのパネルの非存在下で見られるレベルに戻る。プローブの標的分析物メンバーが存在するならば、アプタマーは、分析物メンバーと結合し、アプタマー／分析物複合体は、孔を通って移動するプローブをさらに遅らせる。この実施形態では、プローブは、分析物メンバーの存在下で、分析物メンバーの非存在下よりもゆっくりと孔を通って移動する。言い換えると、プローブは、分析物メンバーの存在下で、分析物メンバーの非存在下よりも長い時間、孔を流れる電流に影響する。この実施形態では、プローブ間（すなわち異なる型のプローブ間）の示差性は、（１）異なる長さのプローブ、（２）各プローブの尾部中の１つまたは複数の２本鎖ポリヌクレオチド領域の存在または非存在、および（３）各プローブ中の異なるアプタマーの異なる結合親和性の１つもしくは複数または全てによるものであり得る。これら３つ全ては、各プローブが特定の量の時間（「滞留時間」）孔を流れる電流に影響するように変えることができる。１つまたは複数の２本鎖ポリヌクレオチド領域の存在を用いて、下記のように、バレルまたはチャネル中のプローブを示す特異的尾部領域を保持することもできる。
【０１１５】
尾部は、好ましくは、孔を流れる電流に異なる方式で影響する少なくとも２つの領域を含み、ある領域は、アプタマーが分析物メンバーの１つと結合していないときに孔の中にあり、異なる領域は、アプタマーが該分析物メンバーと結合しているときに孔の中にある。少なくとも２つの領域は、異なる組成を有し、よって、孔を流れる電流に異なる方式で影響する。例えば、ある領域は、ポリペプチドであり得、他の領域は、ポリヌクレオチドであり得るか、または少なくとも２つの領域は、異なるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり得る。このことは、以下でより詳細に論じる。
【０１１６】
対照実験を行って、プローブが分析物メンバーの１つと結合しているかまたは結合していない場合に尾部中の異なる領域が孔を流れる電流に与える影響を決定してよい。試験試料に対して本発明の方法を行うことにより得られる結果を、次いで、そのような対照実験に由来する結果と比較して、特定の分析物が試験試料中に存在または非存在であるかを決定できる。
【０１１７】
ここでもまた理論と結び付けられることを望まないが、各プローブの尾部は、パネルが孔と接触し、孔を流れる電流に影響するときに、孔のバレルまたはチャネルに侵入する。本発明の方法では、複数の事例の孔を用いる。短い時間の間に、孔を通るプローブ全体の移動は、アプタマーにより妨げられる。なぜなら、上記のように、折り畳まれたアプタマーは、孔のバレルまたはチャネルを通って移動するには典型的に大きすぎるからである。プローブの標的分析物メンバーが存在しないならば、アプタマーは、分析物メンバーと結合せず、尾部のある領域（第１領域）は、典型的に、アプタマーが孔を通るプローブの移動を妨げるので、バレルまたはチャネル中に保持される。この第１領域は、領域の組成に基づいて特定の方式で孔を流れる電流に影響する。短い時間の後に、アプタマーは、電位の影響の下で折り畳みがほどかれ、プローブ全体が電位に沿って孔を通って移動する。プローブが一旦孔を通過すると、孔を流れる電流は、プローブのパネルの非存在下で見られるレベルに戻る。
【０１１８】
プローブの標的分析物メンバーが試料中に存在するならば、各プローブの尾部は、上記のように、孔のバレルまたはチャネルにまだ侵入するが、アプタマー／分析物メンバー複合体は、典型的に、分析物メンバーが存在しない限り、尾部侵入を妨げる。従って、尾部の異なる領域（第２領域）は、バレルまたはチャネル中に保持され、第１領域とは異なる方式で孔を流れる電流に影響する。短い時間の後に、アプタマーは、電位の影響の下で折り畳みがほどかれ、分析物メンバーを遊離し、プローブ全体が孔を通って移動する。プローブが孔を通って移動するにつれて、第１領域は、バレルまたはチャネルを通って第２領域に続き、短い時間の間、分析物メンバーが存在しないかのように孔を流れる電流に影響する。プローブが一旦孔を通過すると、孔を流れる電流は、プローブのパネルの非存在下で見られるレベルに戻る。このことの例を、図１において漫画の形で示す。
【０１１９】
この実施形態では、プローブ間（すなわち異なる型のプローブ間）の示差性は、（１）異なる長さのプローブ、（２）各プローブの尾部中の１つまたは複数の２本鎖ポリヌクレオチド領域の存在または非存在、（３）各プローブ中の異なるアプタマーの異なる結合親和性、および（４）各プローブ中の少なくとも２つの領域間の差の１つもしくは複数または全てによるものであり得る。１から３は、各プローブが特定の量の時間（「滞留時間」）孔を流れる電流に影響するように変えることができる。１つまたは複数の２本鎖ポリヌクレオチド領域の存在を用いて、下記のように、バレルまたはチャネル中のプローブを示す特異的尾部領域を保持することもできる。各プローブ中の少なくとも２つの領域は、方法において用いる各（または全ての）プローブ間の区別が簡単明瞭であるように設計できる。
【０１２０】
上記のように、孔は、好ましくは、前庭を含む。このことは、前庭が、典型的に、アプタマーの侵入を可能にするが、アプタマー／分析物メンバー複合体の侵入を可能にしないので、有利である。このことは、尾部が、アプタマーが分析物メンバーの１つと結合しているか否かに応じて異なる程度で孔のバレルまたはチャネルに侵入できることを意味する。このことは、尾部の異なる領域が、アプタマーが分析物メンバーの１つと結合しているか否かに応じて、孔のバレルまたはチャネル中に存在することも意味する。特定の孔について、プローブのパネル中で用いるために適切な尾部を設計することが簡単明瞭である。例えば、孔の前庭およびバレルまたはチャネルの長さが既知であるならばプローブ尾部を設計することが簡単明瞭である。
【０１２１】
各アプタマー分子は、１つより多い分析物メンバーと結合することができるが、本発明の方法において分析物メンバー分子の１つだけと結合する。上記のように、プローブ全体は、典型的に、孔と接触したすぐ後に、電位に沿って孔を通って移動する。アプタマーが孔を通って移動する前に、アプタマーが１つの分析物メンバーと結合するために十分な時間がある。プローブの標的分析物メンバーが存在しないならば、アプタマーが分析物メンバーと結合することなくプローブは孔を通って移動する。プローブの標的分析物が存在するならば、孔を通るプローブの移動はわずかに遅れることがあるが、妨げられることはあり得ない。このことは、以下でより詳細に論じる。
【０１２２】
尾部は、好ましくは、重合体を含む。重合体は、孔に侵入して、孔を流れる電流に影響できる。重合体は、好ましくは、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【０１２３】
ポリヌクレオチドは、上記の任意のヌクレオチドを含んでよい。しかし、尾部中のポリヌクレオチドは、典型的に、アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン１リン酸（ＧＭＰ）、チミジン１リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン１リン酸（ＵＭＰ）、シチジン１リン酸（ＣＭＰ）、サイクリックアデノシン１リン酸（ｃＡＭＰ）、サイクリックグアノシン１リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン１リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン１リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン１リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン１リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシシチジン１リン酸（ｄＣＭＰ）および上記の任意の改変ヌクレオチドから選択されるヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択されるヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、好ましくは、１つまたは複数の脱塩基ヌクレオチドを含む。尾部中のポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖であってよい。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸であり得る。尾部中のポリヌクレオチドは、１本の鎖のＤＮＡとハイブリダイズした１本の鎖のＲＮＡを含むことができる。尾部中のポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）などの当該技術において既知の任意の合成核酸、またはヌクレオチド側鎖を有するその他の合成重合体であってよい。
【０１２４】
典型的に、尾部は、脱塩基リーダー配列を有し、このリーダー配列は、孔を通過する尾部の第１領域である。好ましくは、尾部は、少なくとも２つの隣接脱塩基残基、例えば３、４、５、６、７つ以上の隣接脱塩基残基を含む。
【０１２５】
尾部中の２本鎖ポリヌクレオチドは、典型的に、孔を通過できないが、本発明の方法において有用であり得る。例えば、尾部は、１つまたは複数の２本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域を含んでよい。このような２本鎖領域の存在は、プローブが孔を通って移動することを妨げないが、代わりに、領域中の鎖の１つが電位の影響の下でプローブから取り除かれるので、孔を通るプローブの移動を単純に遅らせる。このような遅れは、孔を流れる電流を測定することにより観察できる。分析物との結合が孔を通るプローブの移動を遅らせる実施形態については、上記している。従って、各尾部中に１つまたは複数の２本鎖ポリヌクレオチド領域を含めることは、尾部の集団から得ることができる可能性のあるシグナルの数を増加させ、よって、本発明の方法を用いてアッセイできる分析物メンバーの数を増加させる。２本鎖ポリヌクレオチド領域を用いて、孔のバレルまたはチャネル中のプローブを示すので本発明に従って読み取ることができるバーコードのような尾部の特定の領域を保持してもよい。１つまたは複数の２本鎖領域は、上記のように、分析物メンバーの存在または非存在を示す少なくとも２つの領域の前または後に孔に侵入するように、尾部上に位置決めされるものであってよい。従って、好ましい実施形態では、尾部は、２本鎖ポリヌクレオチド領域とプローブを示す特異的尾部領域とを、２本鎖ポリヌクレオチドが孔を通るプローブの移動を遅らせ、かつ孔のバレルまたはチャネル中に特異的尾部領域を保持するように含む。プローブ間（すなわち異なる型のプローブ間）の異なる特異的尾部領域は、典型的に、孔を流れる電流に対して異なる影響を有し、よって、互いに区別できる。特異的尾部領域は、好ましくは、重合体である。重合体は、上記または下記のもののいずれであってもよい。このような実施形態では、特異的尾部領域は、孔に侵入し、２本鎖ポリヌクレオチド領域によりバレルまたはチャネル中に保持される。このことにより、特異的尾部領域は、孔を流れる電流に対するその特異的影響により同定できる。短い時間の後に、２本鎖領域中の鎖の１つが取り除かれ、プローブは、電位の影響の下で孔を通って移動する。プローブと分析物メンバーとの結合を、次いで、上記のように、（ａ）孔を通るプローブの移動の遅れおよび／または（ｂ）尾部中の少なくとも２つの特異的領域の使用により測定できる。
【０１２６】
尾部は、好ましくは、少なくとも１つの１本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域を含む。１本鎖ポリヌクレオチドは、尾部中で有用である。なぜなら、これらは、孔を通過でき、孔を流れる電流に異なる方式で影響する異なる領域に容易に分割できるからである。例えば、異なる配列を有するポリヌクレオチドの異なる領域は、典型的に、孔を流れる電流に異なる方式で影響する。尾部は、好ましくは、孔を流れる電流に異なる方式で影響する異なるヌクレオチド配列を有する１本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも２つの領域を含み、ある領域は、アプタマーが１つまたは複数の分析物メンバーと結合していない場合に孔の中にあり、異なる領域は、アプタマーが該分析物メンバーと結合している場合に孔の中にある。少なくとも２つの領域は、好ましくは、異なるヌクレオチドの少なくとも２つのひと続きに相当する。例えば、ポリヌクレオチドは、アデニンヌクレオチドのひと続きと、脱塩基ヌクレオチドのひと続きとを含んでよい。各ひと続きは、孔を流れる電流に異なる方式で影響する。代わりに、異なるヌクレオチドの少なくとも２つのひと続きは、異なるポリヌクレオチドバーコードである。ポリヌクレオチドバーコードは、当該技術において公知である（Kozarewa, I.ら、(2011)、Methods Mol. Biol. 733、279〜298頁）。バーコードは、孔を流れる電流に特異的かつ既知の様式で影響するポリヌクレオチドの特異的配列である。
【０１２７】
尾部中のポリペプチドは、上記の任意のものを含む任意のアミノ酸を含んでよい。異なるアミノ酸配列は、孔を流れる電流に異なる方式で影響し、従って、特異的尾部は、ポリヌクレオチドについて上記のようにして設計してよい。ポリヌクレオチドについて上記の任意の実施形態は、ポリペプチドについて当てはまる（ヌクレオチドをアミノ酸で置換して）。
【０１２８】
尾部は、ＰＥＧを含んでよい。ＰＥＧは、孔を流れる電流に特異的様式で影響する。ＰＥＧを用いて、アプタマーが分析物メンバーの１つと結合しているかまたは結合していない場合に孔のバレルまたはチャネル中に存在する尾部中のある領域を形成してよい。ＰＥＧ以外のものを、アプタマーが分析物メンバーとそれぞれ結合していないかまたは結合している場合に孔のバレルまたはチャネル中に存在する尾部中の他の領域において用いてよい。
【０１２９】
尾部は、重合体の異なる組み合わせを含んでよい。尾部は、好ましくは、孔を流れる電流に異なる方式で影響する異なる重合体の少なくとも２つの領域を含み、ある領域は、アプタマーが分析物メンバーの１つと結合していない場合に孔の中にあり、異なる領域は、アプタマーが分析物メンバーと結合している場合に孔の中にある。以下の表４は、いくつかの好ましい組み合わせについてまとめる。
【０１３０】
【表４】
0006275052.tif 000005
【０１３１】
尾部は、任意の長さであってよい。尾部は、好ましくは、約１０から約６０まで、約２０から約５０までまたは約３０から約４０までのヌクレオチドの長さなどの約７から約７０までのヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドを含む。
【０１３２】
尾部は、実施例において用いる任意のポリヌクレオチドを含んでよい。特に、尾部は、好ましくは、配列番号７から２３のいずれかの残基１から３０を含む。プローブのパネルは、好ましくは、配列番号７から２３の残基１から３０に相当する尾部の集団を含む。
【０１３３】
示差的電流
各プローブ（すなわちそれぞれの型のプローブ）は、孔を流れる電流に示差的な様式で影響する。言い換えると、プローブは、孔を流れる電流に、異なるプローブが孔を流れる電流に影響する方式とは区別または識別できる様式で影響する。このことにより、本発明に従って各プローブ（すなわちそれぞれの型のプローブ）の正体を測定できる。プローブと分析物メンバーとの結合を、次いで、上記のようにして測定できる。各プローブの正体および各プローブと分析物メンバーとの結合を測定できるので、各分析物メンバーの存在または非存在を決定できる。
【０１３４】
各プローブ（すなわちそれぞれの型のプローブ）は、好ましくは、プローブが分析物メンバーの１つと結合している場合に孔を流れる電流に示差的な様式で影響する。言い換えると、分析物メンバーとプローブとの結合は、好ましくは、孔を流れる電流に、異なるプローブが分析物メンバーと結合している場合に異なるプローブが孔を流れる電流に影響する方式とは区別または識別できる様式で影響する。異なるプローブは、同じ分析物メンバーと結合してよい。
【０１３５】
示差的な様式は、孔を流れる電流が受ける影響の程度、すなわち、プローブが結合する場合の孔を流れる電流の量の変化および／またはプローブの結合により電流が影響される時間（「滞留時間」）に関することがある。電流混乱の値は、滞留時間よりも大きい値である。なぜなら、前者は、より示差的なサインを与え、滞留時間は、より広い分布を有するからである。この示差的な様式は、孔を流れる電流の変動が受ける影響の程度に関することがある。変動は、分析物メンバーとプローブとの結合の結果として増加または減少することがある。対照実験を行って、プローブが分析物メンバーの１つと結合する場合に異なるプローブが孔を流れる電流に対して異なる影響を有することを確認してよい。このような対照実験は、プローブが分析物メンバーと結合している場合に特定のプローブが孔を流れる電流に与える影響を決定する助けとなることもできる。試験試料に対して本発明の方法を行って得られる結果を、次いで、このような対照実験に由来するものと比較して、特定の分析物が試験試料中に存在または非存在であるかを決定できる。
【０１３６】
プローブ間の示差性は、それらの長さの差により達成できる。より長いプローブは、孔を流れる電流に対してより長い時間影響し、すなわち滞留時間がより長い。より短いプローブは、孔を流れる電流に対してより短い時間影響し、すなわち滞留時間がより短い。
【０１３７】
プローブ間の示差性は、それらのアプタマーおよび／または尾部の差により達成できる。例えば、異なるアプタマーは、分析物と異なる程度で結合し、すなわち、異なる結合定数を有する。分析物メンバーとより強く結合するアプタマーは、プローブの孔を通る移動をより長く妨げ、このことは、孔を流れる電流を測定することにより同定できる。逆もまた真であり、すなわち、分析物メンバーとより弱く結合するアプタマーは、プローブの孔を通る移動をより短い時間妨げ、このことは、孔を流れる電流を測定することにより同定できる。
【０１３８】
上記の好ましい実施形態では、尾部の特異的領域が、アプタマーが分析物メンバーの１つと結合している場合または尾部中の２本鎖ポリヌクレオチド領域が孔に侵入する場合に、孔のバレルまたはチャネルに短時間保持される。異なる重合体の存在などの異なるプローブ間のこのような特異的領域の差。例えば１本鎖および２本鎖ＤＮＡまたは同じ型の重合体の異なる配列、例えば１つの配列が２つ以上の隣接脱塩基残基である場合も、プローブ間の示差性の原因となることができる。要求される示差性を有するプローブのパネルを設計することが簡単明瞭である。
【０１３９】
各プローブ（すなわちそれぞれの型のプローブ）は、また、好ましくは、孔を流れる電流に、そのアプタマーが分析物メンバーの１つと結合していない場合に示差的な様式で影響する。言い換えると、分析物メンバーの非存在下では、プローブは、孔を流れる電流に、異なるプローブの分析物メンバーが非存在である場合に異なるプローブが孔を流れる電流に影響する方式とは区別または識別できる様式で影響する。異なるプローブは、同じ分析物メンバーと結合してよい。この「非存在」示差性は、異なるプローブ間、よって異なるプローブが同じ分析物メンバーと結合するならば特に分析物間を区別する能力にさらに加えることができ、よって、アッセイの多重の性質を増強する。この好ましい示差性は、上記のような対照実験を用いて決定することもできる。
【０１４０】
プローブ間のこの好ましい「非存在」示差性は、プローブの長さおよび／または尾部の差により達成できる。上記のように、プローブ全体は、分析物メンバーの非存在下で孔を通って移動し、それにつれて孔を流れる電流に影響する。異なるプローブ（すなわち異なる型のプローブ）は、孔を流れる電流に異なる量の時間影響し、すなわち、異なる滞留時間を有する。上記のように、アプタマーが分析物メンバーと結合していないかまたは２本鎖ポリヌクレオチド領域が孔に侵入する場合、尾部の特異的領域は、孔のバレルまたはチャネル中に一時的に保持される。異なる重合体または同じ型の重合体の異なる配列の存在などの異なるプローブ間のこのような特異的領域の差は、プローブ間の示差性の原因となることができる。上記のように、尾部は、２本鎖ポリヌクレオチドの１つまたは複数の領域を含むことができる。このことにより、異なるプローブを区別できる。例えば、異なる尾部は、異なる数のこのような領域および／または異なる長さのこのような領域を含むことができる。
【０１４１】
装置および条件
電気的測定は、Stoddart, D. S.ら、(2009)、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106、7702〜7707頁、Lieberman KRら、J Am Chem Soc. 2010；132(50)：17961〜72頁および国際出願ＷＯ−２０００／２８３１２に記載されるような標準的な１チャネル記録装置を用いて行ってよい。代わりに、電気的測定は、多重チャネル系、例えば国際出願ＷＯ−２００９／０７７７３４および国際出願ＷＯ−２０１１／０６７５５９に記載されるようなものを用いて行ってよい。
【０１４２】
本方法は、孔が膜に挿入されている膜／孔系を調べるために適切な任意の装置を用いて行ってよい。本方法は、膜貫通孔検知のために適切な任意の装置を用いて行ってよい。例えば、装置は、水溶液を含むチャンバと、チャンバを２つの区画に分けるバリアとを含む。バリアは、孔を含有する膜が形成される開口を有する。
【０１４３】
本方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２号（ＷＯ２００８／１０２１２０）に記載される装置を用いて行ってよい。
【０１４４】
本方法は、孔を流れる電流を測定するステップを含む。よって、装置は、電位を印加して、膜および孔を横切る電気的シグナルを測定できる電気回路も含んでよい。本方法は、パッチクランプまたはボルテージクランプを用いて行ってよい。本方法は、好ましくは、ボルテージクランプの使用を含む。
【０１４５】
本方法は、各アレイが１２８、２５６、５１２、１０２４以上のウェルを含むシリコンベースのウェルのアレイ上で行ってよい。
【０１４６】
本発明の方法は、孔を流れる電流の測定を含んでよい。膜貫通孔を通るイオン電流を測定するために適切な条件は、当該技術において既知であり、実施例に開示される。本方法は、典型的に、膜および孔を横切って印加される電圧を用いて行う。用いる電圧は、典型的に、＋２Ｖから−２Ｖまで、典型的に−４００ｍＶから＋４００ｍＶまでである。用いる電圧は、好ましくは、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限と、＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立して選択される上限とを有する範囲内にある。用いる電圧は、より好ましくは、１００ｍＶから２４０ｍＶまでの範囲、最も好ましくは１２０ｍＶから２２０ｍＶの範囲にある。印加する電位を増加することにより、孔による異なるヌクレオチド間の差別を増加できる。
【０１４７】
本方法は、典型的に、金属塩、例えばアルカリ金属塩、ハロゲン化物塩、例えば塩化物塩、例えばアルカリ金属塩化物塩などの任意の電荷担体の存在下で行われる。電荷担体は、イオン性の液体または有機塩、例えば塩化テトラメチルアンモニウム、塩化トリメチルフェニルアンモニウム、塩化フェニルトリメチルアンモニウムまたは塩化１−エチル−３−メチルイミダゾリウムを含んでよい。上記の例示的な装置では、塩は、チャンバ中の水溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）または塩化セシウム（ＣｓＣｌ）を典型的に用いる。ＫＣｌが好ましい。塩濃度は、飽和であってよい。塩濃度は、３Ｍ以下であってよく、典型的に０．１から２．５Ｍまで、０．３から１．９Ｍまで、０．５から１．８Ｍまで、０．７から１．７Ｍまで、０．９から１．６Ｍまでまたは１Ｍから１．４Ｍまでである。塩濃度は、好ましくは、１５０ｍＭから１Ｍまでである。本方法は、好ましくは、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍまたは少なくとも３．０Ｍなどの少なくとも０．３Ｍの塩濃度を用いて行われる。高い塩濃度は、高いシグナル対ノイズ比をもたらし、通常の電流変動のバックグラウンドに対して結合／非結合を示す電流を同定できるようにする。
【０１４８】
本方法は、典型的に、緩衝剤の存在下で行われる。上記の例示的な装置では、緩衝剤は、チャンバ中の水溶液中に存在する。任意の緩衝剤を、本発明の方法において用いてよい。典型的に、緩衝剤は、ＨＥＰＥＳである。別の適切な緩衝剤は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤である。本方法は、典型的に、４．０から１２．０まで、４．５から１０．０まで、５．０から９．０まで、５．５から８．８まで、６．０から８．７までまたは７．０から８．８までまたは７．５から８．５までのｐＨで行われる。用いるｐＨは、好ましくは、約７．５である。
【０１４９】
本方法は、０℃から１００℃まで、１５℃から９５℃まで、１６℃から９０℃まで、１７℃から８５℃まで、１８℃から８０℃まで、１９℃から７０℃までまたは２０℃から６０℃までで行ってよい。本方法は、典型的に、室温で行われる。本方法は、場合によって、約３７℃などの酵素機能を支持する温度にて行われる。
【０１５０】
試料およびプローブのパネルは、膜のいずれの側で孔と接触させてもよい。試料およびプローブのパネルは、典型的に、膜の同じ側で孔と接触させる。
【０１５１】
試料およびプローブのパネルは、任意の順序で孔と接触させてよい。試料を孔と接触させた後にパネルと接触させるか、またはパネルと同時に接触させることが好ましい。試料を孔と接触させる前にパネルを孔と接触させるならば、分析物メンバーとの結合のために十分なプローブが利用可能に残っていること（かつ全てが孔を通って膜を横切ってしまっていないこと）を確実にすることが必須である。
【０１５２】
濃度を測定する方法
本発明の方法は、好ましくは、１つまたは複数の分析物メンバーと結合するプローブについて、各プローブが結合しているときおよび未結合のときに孔を流れる異なる電流を比較するステップをさらに含む。このことは、全般的に、検量線を参照することにより、平衡定数を用いることによりまたは対照データを参照することにより、試料中に存在する分析物メンバーの濃度を決定するための助けとなる。濃度を算出する方法は、当該技術において公知である。
【０１５３】
本発明は、試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの濃度を決定する方法であって、
（ｉ）上記の本発明の方法を行うステップと、
（ｉｉ）試料中に存在することが示された１つまたは複数の分析物メンバーについて、ステップ（ｂ）における孔を流れる電流を、各分析物メンバーについての対照または参照データと比較し、そのことにより試料中の１つまたは複数の分析物メンバーの濃度を決定するステップと
を含む方法も提供する。ステップ（ｉ）は、好ましくは、１つまたは複数の分析物メンバーと結合するプローブについて、各プローブが結合しているときおよび未結合のときに孔を流れる異なる電流を比較することを含む。対照または参照データは、既知の濃度の分析物メンバーを用いてアッセイを校正する対照実験を行うことにより作製できる。このことについては、実施例２に記載する。
【０１５４】
パネルおよびキット
本発明は、試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在、濃度または非存在を決定するためのプローブのパネルも提供する。パネルは、２つ以上のプローブを含み、
各プローブは、分析物メンバーの１つまたは複数を認識し、（ｉ）１つまたは複数の分析物メンバーと結合するアプタマーと、（ｉｉ）膜貫通孔に侵入でき、プローブ中のアプタマーが分析物メンバーの１つと結合しているか否かに応じて孔を流れる電流に異なる影響を与える尾部とを有し、
各プローブは、孔を流れる電流に示差的な様式で影響し、
２つ以上の分析物の群中の各分析物メンバーは、パネル中の少なくとも１つのプローブにより認識される。本発明の方法に関して上記の任意の実施形態は、本発明のパネルに対して等しく当てはまる。パネル中の各プローブは、好ましくはプローブが膜にカップリングされることを可能にする化学基をさらに含む。化学基は、好ましくは、コレステロールである。
【０１５５】
本発明は、試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在、濃度または非存在を決定するためのキットも提供する。キットは、（ａ）本発明のプローブのパネルと、（ｂ）膜貫通孔とを含む。本発明の方法に関して上記の任意の実施形態は、キットに対して等しく当てはまる。
【０１５６】
キットは、脂質２重層などの両親媒性の層を形成するために必要なリン脂質などの膜の成分をさらに含んでよい。
【０１５７】
本発明のキットは、上記の任意の実施形態を行うことを可能にする１つまたは複数のその他の試薬または器具をさらに含んでよい。このような試薬または器具は、以下の１つまたは複数を含む：適切な緩衝剤（複数可）（水溶液）、対象から試料を得るための手段（例えば器または針を含む器具）、ポリヌクレオチドを増幅および／もしくは発現するための手段、上で定義する膜またはボルテージもしくはパッチクランプ装置。試薬は、流体試料が試薬を懸濁するように乾燥状態でキットに存在してよい。キットは、場合によって、キットを本発明の方法において用いることを可能にするための指示書またはどの患者に対して方法を用いてよいかに関する詳細を含んでもよい。キットは、場合によって、ヌクレオチドを含んでよい。
【０１５８】
装置
本発明は、試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在、濃度または非存在を決定するための装置も提供する。装置は、複数の孔と、本発明のプローブのパネルとを含む。装置は、好ましくは、本発明の方法を行うための指示書をさらに含む。装置は、アレイまたはチップなどのポリヌクレオチド分析のための任意の従来の装置であってよい。本発明の方法に関して上記の任意の実施形態は、本発明の装置に対して等しく当てはまる。
【０１５９】
装置は、好ましくは、本発明の方法を行うために設定される。
【０１６０】
装置は、好ましくは、
膜と複数の孔とを支持でき、孔を用いて分析物メンバーの特徴決定を行うために作動可能なセンサデバイスと
特徴決定を行うための材料を保持するための少なくとも１つの貯蔵器と、
少なくとも１つの貯蔵器からセンサデバイスに材料を制御可能に供給するように構成された流体システムと、
それぞれの試料を受容するための複数の容器と
を含み、流体システムは、容器からセンサデバイスに選択的に試料を供給するように構成されている。装置は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００７８９号（ＷＯ２０１０／１２２２９３として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２２０６号（未公開）または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５６７９号（ＷＯ００／２８３１２として公開）に記載されるもののいずれであってもよい。
【０１６１】
以下の実施例は、本発明を説明する。
【実施例１】
【０１６２】
本実施例は、ナノポアをどのようにして用いて、タンパク質トロンビンの存在を検出できるかを説明する。
【０１６３】
材料および方法
電気的測定は、銀めっきした（ＷＯ２００９／０７７７３４）標準的な１２８ウェルシリコンチップ（フォーマット直径７５μｍ、深さ２０μｍおよびピッチ２５０μｍ）を用いて得た。チップは、最初に、２０ｍＬのエタノール、次いで２０ｍＬのｄＨ２Ｏ、次いで２０ｍＬのエタノールを用いて洗浄した後にＣＦ４プラズマ処理した。用いたチップを、次いで、浸漬被覆により前処理し、真空シールして４℃にて貯蔵した。使用前に、チップを少なくとも２０分間室温まで温めた。
【０１６４】
２重層は、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５に溶解した３．６ｍｇ／ｍＬの１，２−ジフィタノイル−グリセロ−３−ホスホコリン脂質（ＤＰｈＰＣ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、ＡＬ、ＵＳＡ）の一連のスラグを、チップを横切って０．４５μＬ／ｓにて通過させることにより形成した。最初に、脂質スラグ（２５０μＬ）をチップを横切って流し、次いで１００μＬの空気のスラグを流した。１５５μＬおよび１５０μＬの脂質溶液のさらに２回のスラグと、その間の１００μＬの空気のスラグとを、次いで、チップ全体に通過させた。２重層形成の後に、チャンバに３ｍＬの緩衝剤を３μｌ／ｓの流速でフラッシュした。２重層形成の電気的記録は、１０ｋＨｚにて、１．０ｐＦの積算キャパシタンスを用いて行った。
【０１６５】
生物学的ナノポアの溶液は、１Ｍ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５中のαＨＬ−（Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ）７（ＮＮ）（配列番号２）（Stoddart, D. S.ら、(2009)、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106、7702〜7707頁）（１／８０，０００に希釈した１μＭ）を用いて調製した。＋１８０ｍＶの保持電位を印加し、溶液をチップ全体に流した。１０％の占有率（１２の単一孔）が達成されるまで、孔が２重層に侵入することを可能にした。標本抽出率を次いで７ｋＨｚに低減し、電位をゼロに低減し、積算キャパシタンスを１．０ｐＦに維持した。
【０１６６】
正の保持電位の期間と、電位を印加しない休止期間とを循環する制御プログラムを５分間運転した。制御プログラムは、０ｍＶの電位を１０秒間印加した後に、＋１７０ｍＶの電位をさらに５０秒間印加し、このサイクルを２０回まで反復した。
【０１６７】
５分後に、スクリプトを停止し、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５中の５Ａ１５ｘ１０Ａ＿ＴＢＡ（配列番号７、１．２５μＭ）をチャンバにピペットを用いて入れた。制御プログラムを、次いで、合計１５分間運転した。この後に、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５中で最小限で５分間一緒にプレインキュベートした５Ａ１５ｘ１０Ａ＿ＴＢＡ（１．２５μＭ）およびトロンビン（１μＭ）（Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｔ６８８４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）をチャンバに流し、制御プログラムをさらに１５分間運転した。実験の最後に、制御プログラムを停止した。
【０１６８】
考察
上記の方法を用いて、トロンビンの存在および非存在下で特徴的なブロックレベルを検出可能であった。プローブ５Ａ１５ｘ１０Ａ＿ＴＢＡ（配列番号７）の添加により、レベル１にて１つのブロックレベルのみが観察された（図２ａを参照されたい）。これに対して、プローブ５Ａ１５ｘ１０Ａ＿ＴＢＡをトロンビンとプレインキュベートした場合に、さらなるレベル（レベル２；図２ｂ）も検出された。トロンビンとプローブ５Ａ１５ｘ１０Ａ＿ＴＢＡとの結合により、平均電流より高い流れが測定され、このことは、脱塩基領域（ｘ）がβ−バレル内にあることを示した。２つのレベル間の差は、３０．５ｐＡであった（図２ｂ）。同じ実験を、配列番号８〜１８を用いて行った（８＝１１ｘ１９Ａ＿ＴＢＡ、９＝１３ｘ１７Ａ＿ＴＢＡ、１０＝１５ｘ１５Ａ＿ＴＢＡ、１１＝１７ｘ１３Ａ＿ＴＢＡ、１２＝１９ｘ１１Ａ＿ＴＢＡ、１３＝２１ｘ９Ａ＿ＴＢＡ、１４＝２３ｘ７Ａ＿ＴＢＡ、１５＝２５ｘ５Ａ＿ＴＢＡ、１６＝２７ｘ３Ａ＿ＴＢＡ、１７＝２９ｘ１Ａ＿ＴＢＡおよび１８＝３０ｘ０Ａ＿ＴＢＡ）。
【実施例２】
【０１６９】
本実施例は、ナノポアをどのようにして用いて、溶液中のタンパク質トロンビンの濃度を検出できるかを説明する。
【０１７０】
材料および方法
電気的測定は、銀めっきした（ＷＯ２００９／０７７７３４）標準的な１２８ウェルシリコンチップ（フォーマット直径７５μｍ、深さ２０μｍおよびピッチ２５０ｕｍ）を用いて得た。トロンビンの濃度の決定を可能にする実験を行うために、同じ実験構成手順を、実施例１に記載するようにして行い（ナノポアαＨＬ−（Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ）７（配列番号２）および緩衝剤１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ７．５を用いる）、同じ初期制御プログラム（０ｍＶにて１０秒、１７０ｍＶにて５０秒、２０回まで反復）を５分間運転した。
【０１７１】
５分後に、スクリプトを停止し、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５中の５Ａ１５ｘ１０Ａ＿ＴＢＡ（１．２５μＭ）をチャンバにピペットを用いて入れた。制御プログラムを、次いで、合計１５分間運転した。この後に、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５中で少なくとも５分間一緒にプレインキュベートした５Ａ１５ｘ１０Ａ＿ＴＢＡ（配列番号７、１．２５μＭ）およびトロンビン（１００ｎＭ）（Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｔ６８８４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）をチャンバに流し、制御プログラムをさらに１５分間運転した。チップの上の全容積の溶液を、次いで、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５中で最小限で５分間プレインキュベートした５Ａ１５ｘ１０Ａ＿ＴＢＡ（１．２５μＭ）およびトロンビン（２５０ｎＭ）の溶液で置き換え、制御プログラムをさらに１５分間運転した。このプロセスを、５００ｎＭ、７５０ｎＭおよび１２５０ｎＭの濃度のトロンビンについて反復した。実験の最後に、制御プログラムを停止した。
【０１７２】
考察
上記の方法を用いて、プローブ５Ａ１５ｘ１０Ａ＿ＴＢＡ（配列番号７）と結合するトロンビンに相当する事象の頻度を測定することが可能であった（図２を参照されたい）。このデータを次いで用いて、トロンビンの濃度対遮断事象の総数（結合と未結合とを組み合わせたもの）と比較したトロンビン結合事象の比率の校正プロットを作成した。図３を参照されたい。これらの校正プロットを次いで用いて、トロンビンの未知試料の濃度を決定できる。
【実施例３】
【０１７３】
本実施例は、ナノポアをどのようにして用いて、著しくより低い濃度のトロンビン結合プローブを利用して、タンパク質トロンビンの存在を検出できるかを説明する。
【０１７４】
材料および方法
電気的測定は、銀めっきした（ＷＯ２００９／０７７７３４）標準的な１２８ウェルシリコンチップ（フォーマット直径７５μｍ、深さ２０μｍおよびピッチ２５０ｕｍ）を用いて得た。より低い濃度のコレステロールタグ付加プローブ（コレステロールＴＥＧを３’端に有する配列番号１９）を用いるトロンビンの検出を可能にする実験を行うために、同じ実験構成手順を、実施例１に記載するようにして行い（ナノポアαＨＬ−（Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ）７（ＮＮ）（配列番号２）および緩衝剤１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５を用いる）、初期制御プログラム（０ｍＶにて１０秒、１７０ｍＶにて５０秒、２０回まで反復）を５分間運転した。
【０１７５】
異なるアプタマーをより低い濃度で用いた以外は実施例１と同じ手順ステップに従った（アプタマーのみの運転＝１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５中の１５ｘ１５Ａ＿ＴＢＡ＿３’ＣｈｏｌＴＥＧ（１００ｐＭ）、ならびにアプタマープラストロンビンの運転＝１５ｘ１５Ａ＿ＴＢＡ＿３’ＣｈｏｌＴＥＧ（１００ｐＭ）およびトロンビン（１００ｎＭ）（Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｔ６８８４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ））。
【０１７６】
考察
上記の方法を用いて、著しくより低い濃度のプローブ１５ｘ１５Ａ＿ＴＢＡ＿３’ＣｈｏｌＴＥＧ（コレステロールＴＥＧを３’端に有する配列番号１９）を用いて、トロンビンの存在および非存在下で特徴的なブロックレベルを検出可能であった。上記の例では、プローブ１５ｘ１５Ａ＿ＴＢＡ＿３’ＣｈｏｌＴＥＧを用いてレベル１を、そしてプローブ１５ｘ１５Ａ＿ＴＢＡ＿３’ＣｈｏｌＴＥＧをトロンビンとプレインキュベートした場合にレベル１および２を観察できた（図４）。ステップレベルの変化が、１００ｐＭ濃度だけのコレステロールタグ付加プローブ１５ｘ１５Ａ＿ＴＢＡ＿３’ＣｈｏｌＴＥＧを用いて観察された。この濃度は、実施例２で試験したものよりもかなり低い。
【実施例４】
【０１７７】
本実施例は、ナノポアをどのようにして用いて、それぞれ独自の示差的なステップレベルシグナルを生じるいくつかの異なるトロンビン結合プローブを利用して、タンパク質トロンビンの存在を検出できるかを説明する。
【０１７８】
材料および方法
電気的測定は、銀めっきした（ＷＯ２００９／０７７７３４）標準的な１２８ウェルシリコンチップ（フォーマット直径７５μｍ、深さ２０μｍおよびピッチ２５０ｕｍ）を用いて得た。多様な異なるプローブを用いてトロンビンの検出を可能にする実験を行うために、同じ実験構成手順を、実施例１に記載するようにして行い（ナノポアαＨＬ−（Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ）７（ＮＮ）（配列番号２）および緩衝剤１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５を用いる）、同じ初期制御プログラム（０ｍＶにて１０秒、１７０ｍＶにて５０秒、２０回まで反復）を５分間運転した。
【０１７９】
５分後に、スクリプトを停止し、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５中のプローブ５Ａ１５ｘ１０Ａ＿ＴＢＡ（配列番号７、３１０ｎＭ）、１９ｘ１１Ａ＿ＴＢＡ（配列番号１２、３１０ｎＭ）、１７ｘ１３Ａ＿ＴＢＡ（配列番号１１、３１０ｎＭ）および１５ｘ１５Ａ＿ＴＢＡ（配列番号１０、３１０ｎＭ）をチャンバにピペットを用いて入れた。制御プログラムを、次いで、合計２０分間運転した。この後に、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５中で最小限で５分間全て一緒にプレインキュベートした分析物５Ａ１５ｘ１０Ａ＿ＴＢＡ（３１０ｎＭ）、１９ｘ１１Ａ＿ＴＢＡ（３１０ｎＭ）、１７ｘ１３Ａ＿ＴＢＡ（３１０ｎＭ）および１５ｘ１５Ａ＿ＴＢＡ（３１０ｎＭ）ならびにトロンビン（１．２５μＭ）（Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｔ６８８４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）をチャンバに流し、制御プログラムをさらに２０分間運転した。実験の最後に、制御プログラムを停止した。
【０１８０】
考察
上記の方法を用いて、トロンビンの存在下および非存在下の両方で用いたプローブのそれぞれについての示差的ステップレベルを検出することが可能であった（図５）。この実験は、観察されるステップレベルが、プローブ尾部配列に特異的であり、よって、複数のプローブ尾部を用いて１つより多いタンパク質を検出できたことを示す。
【実施例５】
【０１８１】
本実施例は、ナノポアをどのようにして用いて、溶液中の血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を検出できるかを説明する。
【０１８２】
材料および方法
電気的測定は、１，２−ジフィタノイル−グリセロ−３−ホスホコリン脂質（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）２重層中に挿入された単一αＨＬ−（Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ）７（ＮＮ）（配列番号２）ナノポアから得た。２重層を、２０μｍ厚のＰＴＦＥフィルム（カスタムＤｅｌｒｉｎチャンバ中）中の直径およそ１００μｍの開口を横切ってＭｏｎｔａｌ−Ｍｕｅｌｌｅｒ技術により形成して、２つの１ｍＬ緩衝溶液（１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５）を分けた。単一チャネル電流を、１４４０Ａデジタイザを備えるＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を緩衝溶液に接続して、シス区画（ナノポア、プローブおよびＰＤＧＦの両方が添加された）をＡｘｏｐａｔｃｈヘッドステージの接地と接続し、トランス区画をヘッドステージの活性電極と接続した。
【０１８３】
２重層中の単一孔を達成した後に、＋１８０ｍＶの印加電位にて対照を５分間運転した。スクリプトを次いで停止し、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５緩衝剤中のプローブ１７ｘ８Ａ＿ＰＤＧＦ（配列番号２０、０．５μＭ）を電気生理学的チャンバのシス区画に加え、実験を２０分間運転した。長い遮断事象（＞１５ｓ）が検出された場合、電位を−１８０ｍＶに即座に切り替えて、遮断している分析物を手動で排出した。スクリプトを次いで停止し、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５緩衝剤中で最小限で５分間一緒にプレインキュベートしたプローブ１７ｘ８Ａ＿ＰＤＧＦ（０．５μＭ）およびＰＤＧＦ（１μＭ）（Ｂｉｏｒｂｙｔ、Ｃａｔ  Ｎｏ：ｏｒｂ８０５４４、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）をシス区画に次いで加えて、実験をさらに２０分間運転した。長い遮断事象は、ここでもまた、印加電位を即座に切り替えることにより排除した。実験の最後に、制御プログラムを停止した。
【０１８４】
考察
上記の方法を用いて、ＰＤＧＦの存在下および非存在下で特徴的なステップレベルを検出可能であった。プローブ１７ｘ８Ａ＿ＰＤＧＦ（配列番号２０）を採用して、レベル１にてブロックレベルが観察された（図６ａを参照されたい）。これに対して、１７ｘ８Ａ＿ＰＤＧＦとプレインキュベートしたＰＤＧＦを実験溶液に加えた場合に（レベル２）も検出された（図６ｂを参照されたい）。図７ａおよび７ｂは、別のプローブ２５ｘ＿ＰＤＧＦ（配列番号２１）を用いた場合に、ＰＤＧＦの存在下および非存在下で生じるステップレベルを示す。
【実施例６】
【０１８５】
本実施例は、ナノポアをどのようにして用いて、溶液中のＰＤＧＦの濃度を検出できるかを説明する。
【０１８６】
材料および方法
電気的測定は、銀めっきした（ＷＯ２００９／０７７７３４）標準的な１２８ウェルシリコンチップ（フォーマット直径７５μｍ、深さ２０μｍおよびピッチ２５０ｕｍ）を用いて得た。ＰＤＧＦの濃度の決定を可能にする実験を行うために、実験構成手順を、実施例１に記載するようにして行い（ナノポアαＨＬ−（Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ）７（ＮＮ）（配列番号２）および緩衝剤１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５を用いる）、同じ初期制御プログラム（０ｍＶにて１０秒、１７０ｍＶにて５０秒、２０回まで反復）を５分間運転した。
【０１８７】
５分後に、スクリプトを停止し、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５中の２５ｘ＿ＰＤＧＦ（配列番号２１、０．５μＭ）をチャンバにピペットを用いて入れた。制御プログラムを、次いで、合計１０分間運転した。この後に、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５中で最小限で５分間一緒にプレインキュベートした２５ｘ＿ＰＤＧＦ（０．５μＭ）およびＰＤＧＦ（１０ｎＭ）（Ｂｉｏｒｂｙｔ、Ｃａｔ  Ｎｏ：ｏｒｂ８０５４４、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）をチャンバに流し、制御プログラムを１０分間運転した。チップの上の全容積の溶液を、次いで、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５中で最小限で５分間一緒にプレインキュベートした２５ｘ＿ＰＤＧＦ（０．５μＭ）およびＰＤＧＦ（３３ｎＭ）の溶液で置き換え、制御プログラムをさらに１０分間運転した。このプロセスを、１００ｎＭ、３３０ｎＭおよび１μＭの濃度のＰＤＧＦについて反復した。実験の最後に、制御プログラムを停止した。
【０１８８】
考察
上記の方法を用いて、プローブ２５ｘ＿ＰＤＧＦ（配列番号２１、図７ａおよびｂを参照されたい）と結合するＰＤＧＦに相当する事象の頻度を測定することが可能であった。このデータを次いで用いて、ＰＤＧＦの濃度対遮断事象の総数（ＰＤＧＦ結合と未結合とを組み合わせたもの）と比較した場合のＰＤＧＦ結合事象のみの比率の校正プロットを作成した。図８を参照されたい。この校正プロットを次いで用いて、ＰＤＧＦの未知試料の濃度を決定できる。
【実施例７】
【０１８９】
本実施例は、タンパク質ナノポアをどのようにして用いて、溶液中のＡＴＰの存在を検出できるかを説明する。
【０１９０】
材料および方法
電気的実験は、脂質２重層に挿入された単一孔（ナノポアαＨＬ−（Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ）７（ＮＮ）（配列番号２）および緩衝剤１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５を用いる）を達成するために実施例５に記載するようにして設定し、次いで、＋１８０ｍＶの印加電位にて対照を５分間運転した。ＰＤＧＦの代わりにＡＴＰを検出するために異なるアプタマーを用いた以外は、実施例５と同じ手順ステップを行った。アプタマーのみの運転について、本実施例で用いたアプタマーは、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５中の２５ｘ＿ＡＴＰ（配列番号２２、０．５μＭ）であり、アプタマープラスＡＴＰの運転について、以下の濃度の試薬を用いた：２５ｘ＿ＡＴＰ（配列番号２２、０．５μＭ）およびＡＴＰ（１０ｍＭ）（Ｃａｔ  Ｎｏ：Ａ６５５９、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）。
【０１９１】
考察
上記の方法を用いて、ＡＴＰの存在下および非存在下で特徴的なブロックレベルを検出可能であった。プローブ２５ｘ＿ＡＴＰ（配列番号２２）を採用して、レベル１にてブロックが観察された（図９ａを参照されたい）。これに対して、プローブ２５ｘ＿ＡＴＰをＡＴＰとプレインキュベートした場合に、さらなるレベル（レベル２；図９ｂ）も検出された。ＡＴＰの場合、プローブ転位により生じる事象は非常に短く、結合したＡＴＰに相当する事象は著しく長い（図９ｂ）。図１０ａおよび１０ｂは、プローブ１７ｘ８Ａ＿ＡＴＰ（配列番号２３）を用いた場合に、ＡＴＰの存在下および非存在下で生じるステップレベルを示す。
【実施例８】
【０１９２】
本実施例は、タンパク質ナノポアをどのようにして用いて、溶液中のＡＴＰの濃度を検出できるかを説明する。
【０１９３】
材料および方法
電気的実験は、脂質２重層に挿入された単一孔（ナノポアαＨＬ−（Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ）７（ＮＮ）（配列番号２）および緩衝剤１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５を用いる）を達成するために実施例５に記載するようにして設定し、次いで、＋１８０ｍＶの印加電位にて対照を５分間運転した。スクリプトを次いで停止し、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ７．５緩衝剤中のプローブ１７ｘ８Ａ＿ＡＴＰ（配列番号２３、０．５μＭ）を電気生理学的チャンバのシス区画に加え、実験を２０分間運転した。長い遮断事象（＞１５ｓ）が検出された場合、電位を−１８０ｍＶに即座に切り替えて、遮断している分析物を手動で排出した。スクリプトを次いで停止し、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ７．５緩衝剤中で最小限で５分間一緒にプレインキュベートしたプローブ１７ｘ８Ａ＿ＡＴＰ（０．５μＭ）およびＡＴＰ（１μＭ）（Ｃａｔ  Ｎｏ：Ａ６５５９、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）をシス区画に次いで加えて、実験をさらに１０分間運転した。このプロセスを、３．３μＭ、１０μＭおよび１００μＭの濃度のＡＴＰについて反復した。実験の最後に、制御プログラムを停止した。
【０１９４】
考察
上記の方法を用いて、プローブ１７ｘ８Ａ＿ＡＴＰ（配列番号２３、図１０ａおよびｂを参照されたい）と結合するＡＴＰに相当する事象の頻度を測定することが可能であった。このデータを次いで用いて、ＡＴＰの濃度対遮断事象の総数（ＡＴＰ結合と未結合とを組み合わせたもの）と比較した場合のＡＴＰ結合事象の比率の校正プロットを作成した。図１１を参照されたい。この校正プロットを次いで用いて、ＡＴＰの未知試料の濃度を決定できる。マイクロモル範囲においてＫｄ値を有するのでより高い濃度のＡＴＰを加えることが必要であった以外は、同様の事象比率の増加が、トロンビンと同様にＡＴＰについて観察された（図１１）。
【実施例９】
【０１９５】
本実施例は、ナノポアをどのようにして用いて、溶液中の１つより多い分析物（例えばＡＴＰ、ＰＤＦＧおよびトロンビン）の存在を検出できるかを説明する。
【０１９６】
材料および方法
電気的実験は、脂質２重層に挿入された単一孔（ナノポアαＨＬ−（Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ）７（ＮＮ）（配列番号２）および緩衝剤１Ｍ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５を用いる）を達成するために実施例５に記載するようにして設定し、次いで、制御プログラム（０ｍＶにて１０秒、＋１８０ｍＶにて５０秒、２０回まで反復）を５分間運転した。スクリプトを次いで停止し、１Ｍ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ７．５緩衝剤中のプローブ１５ｘ１５Ａ＿ＴＢＡ（配列番号１０、１６６ｎＭ）、１７ｘ８Ａ＿ＰＤＧＦ（配列番号２０、１６６ｎＭ）および１７ｘ８Ａ＿ＡＴＰ（配列番号２３、１６６ｎＭ）を電気生理学的チャンバのシス区画に加え、制御プログラムを１０分間運転した。ＡＴＰ（１０ｍＭ）（Ｃａｔ  Ｎｏ：Ａ６５５９、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）を次いでシス区画に加え、制御プログラムをさらに１０分間運転した。このプロセスを、１μＭ、ＰＤＧＦ（Ｂｉｏｒｂｙｔ、Ｃａｔ  Ｎｏ：ｏｒｂ８０５４４、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）および０．５μＭトロンビン（Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｔ６８８４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）について反復した。実験の最後に、制御プログラムを停止した。
【０１９７】
考察
上記の方法を用いて、３つの分析物全てについて溶液中に存在する場合に特徴的なステップレベル変化を検出可能であった。個別に試験した場合に分析物のそれぞれについて観察された３つ全てのステップシグナルを、上記の実験においてみることができた（図１２を参照されたい）。ＡＴＰおよびＰＤＧＦはともに、トロンビンよりも短い結合事象を生じるが、このことは、これらの分析物を用いて４重鎖構造が欠如していることによる可能性がある。よって、本方法を用いて、未知の混合物中の３つの分析物のいずれも検出可能である。
【実施例１０】
【０１９８】
本実施例は、いくつかの濃度のトロンビンについて決定された実験的事象比率と、理論的に算出された事象比率とをどのようにして比較できるかを説明する。
【０１９９】
材料および方法−実験データ取得
電気的実験は、脂質２重層に挿入された単一孔（ナノポアαＨＬ−（Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ）７（ＮＮ）（配列番号２）および緩衝剤１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５を用いる）を達成するために実施例５に記載するようにして設定し、次いで、制御プログラム（０ｍＶにて１０秒、＋１８０ｍＶにて５０秒、２０回まで反復）を５分間運転した。この後に、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５中で少なくとも５分間一緒にプレインキュベートした５Ａ１５ｘ１０Ａ＿ＴＢＡ（配列番号７、１．２５μＭ）およびトロンビン（１０ｎＭ）（Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｔ６８８４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）をチャンバに流し、制御プログラムをさらに１５分間運転した。チップの上の全容積の溶液を、次いで、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５中で最小限で５分間プレインキュベートした５Ａ１５ｘ１０Ａ＿ＴＢＡ（１．２５μＭ）およびトロンビン（３３ｎＭ）の溶液で置き換え、制御プログラムをさらに１５分間運転した。このプロセスを、１００ｎＭ、３３０ｎＭおよび１０００ｎＭの濃度のトロンビンについて反復した。実験の最後に、制御プログラムを停止した。
【０２００】
理論的算出
解離定数は、以下の等式を用いて算出できる：
【０２０１】
【数１】
0006275052.tif 000006
（式中、［Ｐ］＝タンパク質のモル平衡濃度、［Ｌ］＝アプタマーのモル平衡濃度および［Ｃ］＝タンパク質−アプタマー複合体のモル平衡濃度）
【０２０２】
トロンビンとそのアプタマーとの結合についてのＫｄは、およそ５０ｎＭであることが知られている。ＰおよびＬの開始濃度の値がわかっており、これらを用いて、以下の等式を解くことによりモル平衡濃度を算出できる（式中、ｘ＝タンパク質−アプタマー複合体のモル数）。
【０２０３】
【数２】
0006275052.tif 000007
上記の２次方程式は、ＰおよびＬのいくつかの開始濃度について並べ替えて解く（ｘの値を決定するため）ことができる。これらの値を、次いでプロットして、トロンビン濃度に対する事象比率の理論的校正プロットを得ることができる。図１３の校正プロットは、理論的に算出された値（黒の線で示す）および実験で観察された値（灰色のバーチャートで示す）を示す。理論的値が、実験で決定された値と密接に一致することがグラフから明らかである。
【実施例１１】
【０２０４】
本実施例は、ナノポアをどのようにして用いて、タンパク質ストレプトアビジンの存在を検出できるかを説明する。
【０２０５】
材料および方法
電気的測定は、各ウェル構造中に白金電極を有する標準的な１２８ウェルシリコンチップ（フォーマット直径７５μｍ、深さ２０μｍおよびピッチ２５０ｕｍ）を用いて得た。プローブを用いるストレプトアビジンの検出を可能にする実験を行うために、同じ実験構成手順を、実施例１に記載するようにして行い（ナノポアαＨＬ−（Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ）７（ＮＮ）（配列番号２）および緩衝剤６２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、７５ｍＭフェロシアン化カリウム、２５ｍＭフェリシアン化カリウム、ｐＨ８．０を用いる）、同じ初期制御プログラム（０ｍＶにて１０秒、１７０ｍＶにて５０秒、２０回まで反復）を５分間運転した。
【０２０６】
異なるアプタマーを用いた以外は、実施例１と同じ手順ステップを行った（アプタマーのみの運転＝６２５ｎｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、７５ｍＭフェロシアン化カリウム、２５ｍＭフェリシアン化カリウム、ｐＨ８．０中のＳｔｒｅｐプローブ１（配列番号２４、１．０μＭ）、およびアプタマープラスストレプトアビジンの運転＝ｓｔｒｅｐプローブ１（配列番号２４、１．０μＭ）およびストレプトアビジン（５．０ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））。
【０２０７】
考察
上記の方法を用いて、ストレプトアビジンの存在下（図１４ｂ）および非存在下（図１４ａ）で特徴的なブロックレベルを検出可能であった。ｓｔｒｅｐプローブ１（配列番号２４）の添加により、レベル１のブロックレベルだけが観察された（図１４ａを参照されたい）。これに対して、ｓｔｒｅｐプローブ１をストレプトアビジンとプレインキュベートした場合に、さらなるレベル（レベル２；図１４ｂ）も検出された。図１５は、ストレプトアビジンの存在下（２）および非存在下（１）でアプタマー配列ｓｔｒｅｐプローブ１（配列番号２４）について観察される異なるブロックレベルの拡大図を示す（ｙ軸＝電流（ｐＡ）およびｘ軸＝（ａ）および（ｂ）についての時間（ｓ））。これは、表示の目的のために、Ｂｅｓｓｅｌフィルタにかけた。
【実施例１２】
【０２０８】
本実施例は、ナノポアがどのようにして、Ｋ２  ＥＤＴＡ（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、コード−Ｓ．Ｂ−０００９）中に２０％ウサギ全血を含有する試料中でタンパク質トロンビン、ＰＤＧＦおよびＡＴＰの存在を検出できるかを説明する。
【０２０９】
材料および方法
電気的測定は、白金めっきした（ＷＯ２００９／０７７７３４）標準的な１２８ウェルシリコンチップ（フォーマット直径７５μｍ、深さ２０μｍおよびピッチ２５０ｕｍ）を用いて得る。Ｋ２  ＥＤＴＡ（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、コード−Ｓ．Ｂ−０００９）中に２０％ウサギ全血を含有する試料中でタンパク質トロンビン、ＰＤＧＦおよびＡＴＰの存在の検出を可能にする実験を行うために、同じ実験構成手順を、実施例１に記載するようにして行い（ナノポアαＨＬ−（Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ）７（ＮＮ）および緩衝剤６２５ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、７５ｍＭフェロシアン化カリウム、２５ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０を用いる）、同じ初期制御プログラム（０ｍＶにて１０秒、１７０ｍＶにて５０秒、２０回まで反復）を３分間運転する。
【０２１０】
３分後に、スクリプトを停止し、Ｋ２  ＥＤＴＡ（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、コード−Ｓ．Ｂ−０００９）８０％緩衝剤（６２５ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、７５ｍＭフェロシアン化カリウム、２５ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０）中の２０％ウサギ全血中でチャンバに加える前に最小限で５分間一緒にプレインキュベートした２７ｘ３Ａ＿ＴＢＡ（配列番号１６、１２５ｎＭ）、１７ｘ８Ａ＿ＰＤＧＦ（配列番号２０、１２５ｎＭ）および２５ｘ＿ＡＴＰ（配列番号２２、１２５ｎＭ）、トロンビン（１μＭ）（Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｔ６８８４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）、ＰＤＧＦ（１μＭ）およびＡＴＰ（１０ｍＭ）をチャンバに流し、制御プログラムを運転する。実験の最後に、制御プログラムを停止する。
【０２１１】
考察
上記の方法を用いて、Ｋ２  ＥＤＴＡ（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、コード−Ｓ．Ｂ−０００９）８０％緩衝液中の２０％ウサギ全血中に存在する場合に、３つ全ての分析物についての特徴的なステップレベル変化を検出することが可能である。
本発明は、以下の態様を包含する。
［１］
試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在または非存在を決定する方法であって、
（ａ）試料を、膜貫通孔および２つ以上のプローブのパネルと接触させるステップであって、
各プローブが、分析物メンバーの１つまたは複数を認識し、（ｉ）分析物メンバーの１つまたは複数と結合するアプタマーと、（ｉｉ）孔に侵入でき、プローブ中のアプタマーが分析物メンバーの１つと結合しているか否かに応じて孔を流れる電流に異なる影響を与える尾部とを含み、
各プローブが、孔を流れる電流に示差的な様式で影響し、
２つ以上の分析物の群中の各分析物メンバーが、パネル中の少なくとも１つのプローブにより認識されるステップと、
（ｂ）孔を流れる電流を測定して、存在するならばパネル中のどのプローブが分析物メンバーと結合したかを決定し、そのことにより試料中の１つまたは複数の分析物メンバーの存在または非存在を決定するステップと
を含む方法。
［２］
各プローブが、そのアプタマーが分析物メンバーと結合していない場合に孔を流れる電流に示差的な様式で影響する、上記［１］に記載の方法。
［３］
パネル中の少なくとも１つのプローブが、２つ以上の分析物の群内の分析物メンバーのあるクラスを認識し、前記クラス中の分析物メンバーと結合するアプタマーを含む、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］
パネル中の少なくとも１つのプローブが、分析物メンバーの１つを特異的に認識し、前記分析物メンバーと特異的に結合するアプタマーを含む、上記［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］
パネル中の各プローブが、分析物メンバーの１つを特異的に認識し、前記分析物メンバーと特異的に結合するアプタマーを含む、上記［１］に記載の方法。
［６］
尾部が、孔を流れる電流に異なる方式で影響する少なくとも２つの領域を含み、ある領域が、アプタマーが分析物メンバーの１つと結合していないときに孔の中にあり、異なる領域が、アプタマーが前記分析物メンバーと結合しているときに孔の中にある、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［７］
尾部が、重合体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［８］
重合体が、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、上記［７］に記載の方法。
［９］
尾部が、少なくとも１つの１本鎖ポリヌクレオチドを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［１０］
尾部が、孔を流れる電流に異なる方式で影響する異なるヌクレオチド配列を有する１本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも２つの領域を含み、ある領域が、アプタマーが分析物メンバーの１つと結合していないときに孔の中にあり、異なる領域が、アプタマーが前記分析物メンバーと結合しているときに孔の中にある、上記［９］に記載の方法。
［１１］
少なくとも２つの領域が、異なるヌクレオチドまたは異なるポリヌクレオチドバーコードの少なくとも２つのひと続きに相当する、上記［１０］に記載の方法。
［１２］
尾部が、孔を流れる電流に異なる方式で影響する異なる重合体の少なくとも２つの領域を含み、ある領域が、アプタマーが分析物メンバーの１つと結合していないときに孔の中にあり、異なる領域が、アプタマーが前記分析物メンバーと結合しているときに孔の中にある、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［１３］
尾部が、少なくとも１つの２本鎖ポリヌクレオチドを含む、上記［８］から［１２］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］
尾部が、約７から約７０までのヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドを含む、上記［８］から［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］
尾部が、配列番号７から２３の残基１から３０を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［１６］
パネル中の各プローブが、異なるアプタマーを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［１７］
パネル中の各プローブが、異なる１本鎖ポリヌクレオチド尾部を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［１８］
パネル中の２つ以上のプローブが、異なるアプタマーと同じ１本鎖ポリヌクレオチド尾部とを含む、上記［１］から［１６］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］
パネル中のプローブの数が、２つ以上の分析物の群の分析物メンバーの数と同じである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［２０］
パネル中の２つ以上のプローブが、同じアプタマーと異なる１本鎖ポリヌクレオチド尾部とを含む、上記［１］から［１５］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］
パネル中の２つ以上のプローブが、同じ分析物メンバーと特異的に結合する異なるアプタマーを含む、上記［１］から［１８］のいずれか一項に記載の方法。
［２２］
パネル中の各プローブが、膜にカップリングされている、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［２３］
各プローブが、コレステロールを用いて膜にカップリングされている、上記［２２］に記載の方法。
［２４］
群が、約４から約１００までの分析物メンバーを有する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［２５］
分析物メンバーが、金属イオン、無機塩、重合体、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、色素、漂白剤、医薬品、診断剤、レクリエーショナルドラッグ、爆発物および環境汚染物質から独立して選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［２６］
２つ以上の分析物の群が、疾患または状態を診断または予後予測するために用いることができる２つ以上のバイオマーカーの群である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［２７］
疾患または状態が、がん、冠動脈心疾患、循環器疾患または敗血症である、上記［２６］に記載の方法。
［２８］
アプタマーが、ペプチドアプタマーまたはオリゴヌクレオチドアプタマーである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［２９］
孔が、前庭またはバレルを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［３０］
バレルが、２本鎖ポリヌクレオチドが孔を通過できないように十分に狭い、上記［２９］に記載の方法。
［３１］
前庭およびバレルが、それぞれ少なくとも２ヌクレオチドを含有するように十分に長い、上記［２９］または［３０］に記載の方法。
［３２］
孔が、膜貫通タンパク質孔または固体状態の孔である、上記［２９］から［３１］のいずれか一項に記載の方法。
［３３］
膜貫通タンパク質孔が、溶血素、ロイコシジン、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡに由来する、上記［３２］に記載の方法。
［３４］
膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号２に示す７つの同一のサブユニット、あるいは（ｂ）そのバリアントであって、７つのサブユニットの１つまたは複数が、配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号２と少なくとも５０％の相同性を有する前記バリアントであって、孔活性を維持する前記バリアントで形成されている、上記［３３］に記載の方法。
［３５］
膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号４に示す４つの同一のサブユニットと配列番号６に示す４つの同一のサブユニットとで形成されるγ−溶血素、あるいは（ｂ）そのバリアントであって、サブユニットの１もしくは複数が、配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号４と少なくとも５０％の相同性を有し、かつ／またはサブユニットの１つもしくは複数が、配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号６と少なくとも５０％の相同性を有し、かつ孔が孔活性を維持する前記バリアントである、上記［３３］に記載の方法。
［３６］
ステップ（ｂ）が、分析物メンバーの１つと結合するプローブについて、各プローブが結合しているときおよび未結合のときに孔を流れる異なる電流を比較することをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［３７］
試料中の２以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの濃度を決定する方法であって、
（ｉ）上記［１］から［３６］のいずれか一項に記載の方法を行うステップと、
（ｉｉ）試料中に存在することが示された１または複数の分析物メンバーについて、ステップ（ｂ）における孔を流れる電流を、各分析物メンバーについての対照または参照データと比較し、そのことにより試料中の１つまたは複数の分析物メンバーの濃度を決定するステップと
を含む方法。
［３８］
試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在、濃度または非存在を決定するためのプローブのパネルであって、パネルが、２つ以上のプローブを含み、
各プローブが、分析物メンバーの１つまたは複数を認識し、（ｉ）分析物メンバーの１つまたは複数と結合するアプタマーと、（ｉｉ）膜貫通孔に侵入でき、プローブ中のアプタマーが分析物メンバーの１つと結合しているか否かに応じて孔を流れる電流に異なる影響を与える尾部とを含み、
各プローブが、孔を流れる電流に示差的な様式で影響し、
２つ以上の分析物の群中の各分析物メンバーが、パネル中の少なくとも１つのプローブにより認識される、プローブのパネル。
［３９］
上記［２］から［２１］のいずれか一項で定義するとおりである、上記［３８］に記載のプローブのパネル。
［４０］
各プローブが、プローブと膜とのカップリングを可能にする化学基をさらに含む、上記［３８］または［３９］に記載のプローブのパネル。
［４１］
試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在、濃度または非存在を決定するためのキットであって、（ａ）上記［３８］から［４０］のいずれか一項に記載のプローブのパネルと、（ｂ）膜貫通孔とを含むキット。
［４２］
試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在、濃度または非存在を決定するための分析装置であって、複数の膜貫通孔と、上記［３８］から［４０］のいずれか一項に記載のプローブのパネルとを含む分析装置。
［４３］
複数の孔を支持でき、孔を用いて分析物メンバーの特徴決定を行うために作動可能なセンサデバイスと
特徴決定を行うための材料を保持するための少なくとも１の貯蔵器と、
少なくとも１つの貯蔵器からセンサデバイスに材料を制御可能に供給するように構成された流体システムと、
それぞれの試料を受容するための複数の容器と
を含み、流体システムが、容器からセンサデバイスに選択的に試料を供給するように構成されている、上記［４２］に記載の分析装置。
【符号の説明】
【０２１２】
配列番号１は、α−溶血素−Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ（α−ＨＬ−ＮＮ；（Stoddart, D. S.ら、(2009)、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106、7702〜7707頁）の１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号２は、α−ＨＬ−ＮＮの１つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、γ−溶血素のＬｕｋＦサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号４は、γ−溶血素のＬｕｋＦサブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、γ−溶血素のＨｌｇ２サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号６は、γ−溶血素のＨｌｇ２サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号７から２４は、実施例において用いた配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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