(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のステップＡによって得たマウスの耳介におけるリンパ節の重量から、下記のステップＢによって得たマウスの耳介におけるリンパ節の重量を減じた数値と、下記のステップＡ２における塗布液中の被験物質の濃度から、皮膚感作性の強度を判定する皮膚感作性強度判定法であって、
前記の皮膚感作性強度判定法が、下記のステップＡによって得たマウスの耳介におけるリンパ節の重量から下記のステップＢによって得たマウスの耳介におけるリンパ節の重量を減じ、さらに下記のステップＡ２における塗布液中の被験物質の濃度で除し、その数値の大小により皮膚感作性の強度を判定する方法であるか、又は、
下記のステップＡ２における塗布液中の被験物質の濃度を、下記のステップＡによって得たマウスの耳介におけるリンパ節の重量から下記のステップＢによって得たマウスの耳介におけるリンパ節の重量を減じたもので除し、その数値の大小により皮膚感作性の強度を判定する方法である皮膚感作性強度判定法。
ステップＡ：マウスの一方の耳介に、被験物質を含む塗布液を塗布するステップＡ１と、ステップＡ１の一定期間後、前記の一方の耳介と他方の耳介とに、ステップＡ１と同じ被験物質を含む塗布液を塗布するステップＡ２と、ステップＡ２から３６〜８０時間後に前記の他方の耳介におけるリンパ節の重量の測定するステップＡ３とを含むステップ
ステップＢ：マウスの一方の耳介に被験物質を含む塗布液を塗布するステップＢ２と、ステップＢ２から３６〜８０時間後に前記の一方の耳介におけるリンパ節の重量を測定するステップＢ３とを含むステップ
【請求項２】
前記のステップＡ１の一定期間が７日以上２週間以内である、請求項１に記載の皮膚感作性強度判定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験物質の皮膚感作性強度を簡便に判定できる新規な手法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化粧品や洗剤等の開発において、その原料や添加剤等として材料を選択する場合、その材料に触れた消費者などにおいて皮膚免疫応答が惹起される性質を有する（「皮膚感作性」を有する）物質（皮膚感作性物質）は、消費者の感受性によっては重篤なアレルギー反応を引き起こしてしまう場合もあるため、皮膚感作性の有無の検出は特に重要である。
【０００３】
天然物、化学物質の皮膚感作性を検出する方法としては、従来、モルモット、マウスなどの動物を用いる方法、培養細胞を用いる方法、さらには、ペプチドとの結合性を調べる方法などが開発されている。これらの方法は、いずれも、ヒトにおける皮膚感作性と８０％程度の相関があることが明らかにされており、天然物、化学物質の皮膚感作性の検出に有効であることが示されている。
【０００４】
化学物質などによる感作の成立には、大きく分けて２つの段階があることが知られている。第一の段階は、化学物質が体内に入ることで生体内のタンパク質等と結合し、これを樹状細胞が異物として認識して一連の免疫応答を開始する「感作段階」である。第二の段階は、感作されたリンパ球が全身に広がり、同一の化学物質等が再度体内に入ったときに、よりすばやく、そして激しい応答を呈する「惹起段階」である。すなわち、上述した従来の皮膚感作性を検出する手法は、感作の成立のいずれかの段階を検出することを目的としている。
【０００５】
例えば、アジュバントを用いるＧＰＭＴ（Guinea Pig Maximization Test）法、アジュバントを用いないビューラー法は、「惹起段階」を検出する手法であり、これらの試験で陽性であるということは、原理的かつ原則的に感作が成立していると判断することができる（例えば、「経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の化学物質の試験に関するガイドライン」、４０６  皮膚感作性、［平成２６年８月１１日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/oecd/tgj/tg406j.pdf＞（非特許文献１）を参照。）。ただし、これらの試験は、惹起を確認するために、試験期間としては、４週間以上の時間を必要としてしまう。また、これらの方法はモルモットを用いる方法であり、動物愛護の観点から代替し得る方法を見出すことが課題とされていた。
【０００６】
近年では、皮膚感作性を検出する方法として、モルモットではなくマウスを用いたＬＬＮＡ（Local Lymph Node Assay、局所リンパ節試験）が主流となっている（例えば、「経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の化学物質の試験に関するガイドライン」、４２９  皮膚感作：局所リンパ節試験、［平成２６年８月１１日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/oecd/tgj/tg429j.pdf＞（非特許文献２）を参照30。）。ＬＬＮＡは、「感作段階」を検出する手法であり、化学物質の皮膚感作性強度をＥＣ３値という指標で比較することで、化学物質間の皮膚感作性の強度を比較することが可能かつ容易になった。ＥＣ３値とは、溶媒のみに暴露したマウスの耳介リンパ節のリンパ球に対して、被験物質を暴露したマウスのリンパ節のリンパ球が３倍に増殖する場合の、塗布液中の被験物質の濃度を意味する。具体的な方法としては、試験開始１日目、２日目、３日目に、マウスの両耳に被験物質を含む塗布液を塗布した後、６日目に、マウスから耳介リンパ節を採取する。被験物質が皮膚感作性物質であれば、耳介リンパ節においてリンパ球の増殖を惹起する。リンパ球の増殖は適用された用量（アレルゲンの効力）に比例するため、ＬＬＮＡでは、短い試験期間で、客観的かつ定量的に簡単に皮膚感作性の強度を検出することができる。
【０００７】
しかしながら、上述のＬＬＮＡは、感作性の検出にラジオアイソトープ（ＲＩ）である３H-thymidineを用いることから、日本においては実施できる施設に制限があった。このため、その改良法として、放射性物質を用いる代わりに生物発光によりＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を定量することで、リンパ球の増殖の指標とする、ＬＬＮＡ：ＤＡ（modified LLNA of Daicel based on ATP）が提案されている（例えば、「経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の化学物質の試験に関するガイドライン」、４４２Ａ  皮膚感作性：局所リンパ節試験：ＤＡ、［平成２６年８月１１日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/oecd/tgj/tg442aj.pdf＞（非特許文献３）を参照。）。
【０００８】
ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡのいずれの場合でも、一部の皮膚刺激性物質（皮膚に一過性の刺激を与える性質（皮膚刺激性）を有する物質）、界面活性剤などを試験に供した場合に、偽陽性（ある試験法で、被験物質が実際は陰性または非活性であるにもかかわらず、誤って陽性または活性と判定されること）になることが報告されている（例えば、Christine Garciaetal., "Comparative testing for the identification of skin-sensitizing potentials of nonionic sugar lipid surfactants", Regulatory Toxicology and Pharmacology, 58, 2010, p301-307（非特許文献４）を参照）。したがって、マウスを用いて皮膚刺激性物質や界面活性剤を評価するときには、試験濃度と皮膚刺激性の関係や、構造情報も含めて、総合的な判断が必要とされている（例えば、David Basketter et al., "Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitization datasets : Implications for REACH" Regulatory Toxicology and Pharmacology, 55, 2009, p90-96（非特許文献５）を参照）。また、ＬＬＮＡ、及びＬＬＮＡ：ＤＡにおいて、被験物質の皮膚感作性強度を比較するためにＥＣ３値を求める際、少なくとも２濃度の被験物質の暴露とコントロール群、ガイドラインに従えば３濃度の被験物質群とコントロール群の４群の動物群が必要であり、少なくとも１６匹以上のマウスが必要となるため、動物愛護の観点から必要な動物数を減少させる方法を見出すことが課題とされている。また、ＬＬＮＡ：ＤＡＥ法の判定基準では、各物質の皮膚感作性強度について判定することは困難である。
【０００９】
また、例えば、G. Frank Gerberick et al., "Use of a B Cell Marker (B220) to Discriminate between Allergens and Irritants in the Local Lymph Node Assay", Toxicological Sciences, 68, 2002, p420-428（非特許文献６）には、マウスを用いた試験法として、フローサイトメーターを用いて、細胞表層抗原を検出することにより、皮膚感作性物質と皮膚刺激性物質とを識別する手法が提案されている。しかしながら、このような非特許文献６に記載された手法を実施するためには、特別な装置が必要となってしまう。
【００１０】
こういった背景から、従来と異なり、惹起相を導入することで、より明確に皮膚感作性と皮膚刺激性を識別でき、更に交差感作性も判別可能なＬＬＮＡ：ＤＡＥ（特許文献１、特許文献１、非特許文献７）が提案されている。しかし、この方法は、試験群とコントロール群の左耳重量の統計学的解析により、簡便に皮膚感作性の有無を識別できるが、統計学的優位差のみでは感作性の強度について判定することは不可能であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１３−０７２６９２
【００１２】
【特許文献２】特開２０１４−１０２２４７
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】「経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の化学物質の試験に関するガイドライン」、４０６皮膚感作性、［平成２６年８月１１日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/oecd/tgj/tg406j.pdf＞
【非特許文献２】「経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の化学物質の試験に関するガイドライン」、４２９皮膚感作：局所リンパ節試験、［平成２６年８月１１日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/oecd/tgj/tg429j.pdf＞
【非特許文献３】「経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の化学物質の試験に関するガイドライン」、４４２Ａ皮膚感作性：局所リンパ節試験：ＤＡ、［平成２６年８月１１日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/oecd/tgj/tg442aj.pdf＞
【非特許文献４】Christine Garcia et al., "Comparative testing for the identification of skin-sensitizing potentials of nonionic sugar lipid surfactants", Regulatory Toxicology and Pharmacology, 58, 2010, p301-307
【非特許文献５】David Basketter et al., "Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitization datasets : Implications for REACH", Regulatory Toxicology and Pharmacology, 55, 2009, p90-96
【非特許文献６】G. Frank Gerberick et al., "Use of a B Cell Marker(B220) to Discriminate between Allergens and Irritants in the Local Lymph Node Assay", Toxicological Sciences, 68, 2002, p420-428
【非特許文献７】Kunihiko Y et al., "Development of LLNA : DAE : a new local lymph node assay that includes the elicitation phase, discriminates borderline-positive chemicals, and is useful for cross-sensitization testing", J. Toxicol・ Sci, vol.39, No.1, 147-161, 2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、簡便に、特別な機器を用いることなく、より少ない動物数で実施可能な皮膚感作性強度の判定法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の皮膚感作性強度判定法は、下記のステップＡによって得たマウスの耳介におけるリンパ節の重量から、下記のステップＢによって得たマウスの耳介におけるリンパ節の重量を減じた数値と、下記のステップＡ２における塗布液中の被験物質の濃度から、皮膚感作性の強度を判定することを特徴とする。
ステップＡ：マウスの一方の耳介に、被験物質を含む塗布液を塗布するステップＡ１と、ステップＡ１の一定期間後、前記の一方の耳介と他方の耳介とに、ステップＡ１と同じ被験物質を含む塗布液を塗布するステップＡ２と、ステップＡ２から３６〜８０時間後に前記の他方の耳介におけるリンパ節の重量の測定するステップＡ３とを含むステップ
ステップＢ：マウスの一方の耳介に被験物質を含む塗布液を塗布するステップＢ２と、ステップＢ２から３６〜８０時間後に前記の一方の耳介におけるリンパ節の重量を測定するステップＢ３とを含むステップ
【００１６】
本発明の皮膚感作性強度判定法は、好ましくは、前記のステップＡによって得たマウスの耳介におけるリンパ節の重量から前記のステップＢによって得たマウスの耳介におけるリンパ節の重量を減じ、さらに前記のステップＡ２における塗布液中の被験物質の濃度で除し、その数値の大小により皮膚感作性の強度を判定する方法であるか、又は、
前記のステップＡ２における塗布液中の被験物質の濃度を、前記のステップＡによって得たマウスの耳介におけるリンパ節の重量から前記のステップＢによって得たマウスの耳介におけるリンパ節の重量を減じたもので除し、その数値の大小により皮膚感作性の強度を判定する方法である。
【００１７】
前記のステップＡ１の一定期間は、７日以上２週間以内であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、簡便かつ短期間で、特別な装置を必要とせずに、より少ない動物数で皮膚感作性強度を判定することが可能となる。また、本発明の判定方法では、被験物質の濃度によるＤＩＬＬ  ｖａｌｕｅｓの誤差が少ないため、新規な化合物であっても簡便に皮膚感作性強度を判定することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の皮膚感作性強度判定法は、下記のステップＡによって得たマウスの耳介におけるリンパ節の重量から、下記のステップＢによって得たマウスの耳介におけるリンパ節の重量を減じた数値（単に、「耳介の重量差」と称する場合がある）と、下記のステップＡ２における塗布液中の被験物質の濃度（単に、「被験物質の濃度」と称する場合がある）から、皮膚感作性の強度を判定することを特徴とする。
ステップＡ：マウスの一方の耳介に、被験物質を含む塗布液（被験物質塗布液）を塗布するステップＡ１と、ステップＡ１の一定期間後に、前記の一方の耳介と他方の耳介とに、ステップＡ１と同じ被験物質を含む塗布液（被験物質塗布液）を塗布するステップＡ２と、ステップＡ２から３６〜８０時間後に前記の他方の耳介におけるリンパ節の重量の測定するステップＡ３とを含むステップ
ステップＢ：マウスの一方の耳介に、被験物質を含む塗布液（被験物質塗布液）を塗布するステップＢ２と、ステップＢ２から３６〜８０時間後に前記の一方の耳介におけるリンパ節の重量を測定するステップＢ３とを含むステップ
【００２０】
本発明の皮膚感作性強度判定法は、耳介の重量差と被験物質の濃度とを用いて、皮膚感作性の強度を判定することができれば、特にその方法は限定されない。例えば、耳介の重量差と被験物質の濃度の和、差、積、又は商を計算し、それらの値を用いて皮膚感作性の強度を判定しても良いし、耳介の重量差をｎ乗（ｎは０よりも大きい実数）したものと、被験物質の濃度をｎ乗（ｎは０よりも大きい実数）したものの、和、差、積、又は商を計算し、それらの値を用いて皮膚感作性の強度を判定しても良い。
【００２１】
具体的な皮膚感作性強度判定法としては、例えば、耳介の重量差を、被験物質の濃度で除し、その数値の大小により皮膚感作性の強度を判定する方法が挙げられる。なお、前記方法で得られた数値（計算値）をＤＩＬＬ  ｖａｌｕｅｓ（Ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｗｅｉｇｈｔ  ｏｆ  ｌｅｆｔ  ｅａｒ）と称することがある。
【００２２】
また、他の皮膚感作性強度判定法としては、例えば、被験物質の濃度を、耳介の重量差で除し、その数値の大小により皮膚感作性の強度を判定する方法が挙げられる。なお、前記方法で得られた数値（計算値）をＥＣ１ｍｇ（Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  １ｍｇ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）することがある。
【００２３】
［マウス］
本発明の皮膚感作性強度判定法に用いるマウスについては特に限定されないが、これまで世界的に多くの統計データが蓄積されてきたＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡ、及びＬＬＮＡ：ＤＡＥ（以下、「ＬＬＮＡ等」と称することがある）との相関性が高ければ、試験結果を照合しやすくなることから、例えばＣＢＡ／Ｊの系統の未経産で非妊娠の若齢（８〜１２週齢）の雌マウスなどの、ＬＬＮＡ等に用いられるマウスを用いることが好ましい。
【００２４】
本発明の皮膚感作性強度判定法に用いるマウスの総数は特に限定されないが、例えば、１種類の被験物質の判定に対して、４〜１４匹程度を用いることが好ましく、より好ましくは６〜１２匹、さらに好ましくは８〜１０匹用いることが好ましい。用いるマウスの数が４匹未満であると、得られるデータの信頼性が低くなる。また、１４匹よりも多くのマウスを用いて皮膚感作性強度を判定することも可能であるが、従来の試験（例えばＬＬＮＡ等）と比較して、より少ない動物数で皮膚感作性強度を判定することが可能となるというメリットが薄れてしまう。
【００２５】
本発明の皮膚感作性強度判定法の「マウスの耳介」とは、マウスの外耳のうち外側に張り出している部分を指す。被験物質塗布液を塗布する部分は耳介に含まれるいずれの領域であってもよいが、被験物質塗布液の塗布のしやすさ、ＬＬＮＡ等で蓄積されたデータと比較しやすいといった観点から、耳背部の領域が好ましい。
【００２６】
［被験物質］
本発明において用いられる「被験物質」は、溶媒または分散媒に溶解または分散させることでマウスの耳介に塗布することが可能となる物質であればよく、皮膚感作性物質、皮膚刺激性物質、皮膚感作性及び皮膚刺激性のいずれも示す物質、及び、皮膚感作性及び皮膚刺激性のいずれも示さない物質等が挙げられる。なお、被験物質は、非特許文献３に記載された定義に沿って、単一の化合物であってもよく、また、多成分（最終製品、調製物など）からなるものであってもよい。溶媒、分散媒などは、当分野において用いられている公知の溶媒、分散媒を被験物質に応じて用いればよく、例えば、アセトン／オリーブオイル（４：１（ｖ／ｖ））(ＡＯＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メチルエチルケトン、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシドなどを挙げることができる。中でも、陽性対照（ＰＣ）として用いた場合に一貫した応答を示すことから、アセトン／オリーブオイル（４：１（ｖ／ｖ））(ＡＯＯ）が好ましい。なお、上記被験物質を溶解又は分散させた溶媒または分散媒を「被験物質塗布液」と称することがある。
【００２７】
「皮膚感作性物質」とは、個体が誘導性アレルゲンに局所的に曝露された際に生じる免疫学的過程によって皮膚免疫応答を惹起し、その結果、接触感作性の発現に至る性質（皮膚感作性）を有する物質を指す。このような皮膚感作性物質としては、例えば、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾール−３−オン（ＣＭＩ）、２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）、ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）、パラベンゾキノン（ｐ−ＢＱ）、グルタルアルデヒド（ＧＡ）、ヒドロキノン（ＨＱ）、塩化コバルト（Ｃｏ）、パラフェニレンジアミン（ｐ−ＰＤ）、プロピルガレート（ＰＧ）、シンナミックアルデヒド（ＣＡＬ）、塩化ニッケル（ＮｉＣｌ2）、イソオイゲノール（ＩＥＵ）、シトラール（Ｃｉｔｒａｌ）、フェニルベンゾエート（ＰＢｚ）、アビエチン酸（ＡＢＡ）、２−メルカプトベンズチアゾール（２−ＭＢＴ）、シンナミルアルコール（ＣＡ）、硫酸ニッケル６水和物（ＮｉＳＯ4）、レゾルシノール（ＲＣ）、α−ヘキシルシンナミックアルデヒド（ＨＣＡ）、オイゲノール（ＥＵ）、ヒドロキシシトロネラール（ＨＣＮ）、イミダゾリジニルウレア（ＩＵ）、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＧ）、及びメチルメタクリレート（ＭＭ）等が知られている。
【００２８】
前記の皮膚感作性物質の中で、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾール−３−オン、２，４−ジニトロフルオロベンゼン、ジニトロクロロベンゼン、及びパラベンゾキノンは、ＥＣ３値が０．００１〜０．１％（ｗ／ｖ）程度の非常に高い皮膚感作性を有する物質である。また、グルタルアルデヒド、ヒドロキノン、塩化コバルト、パラフェニレンジアミン、及びプロピルガレートは、ＥＣ３値が０．１〜１．０％（ｗ／ｖ）程度の高い皮膚感作性を有する物質である。また、シンナミックアルデヒド、イソオイゲノール、及び２−メルカプトベンズチアゾール、硫酸ニッケル６水和物（ＮｉＳＯ4）は、ＥＣ３値が１％〜１０％（ｗ／ｖ）程度の中程度の皮膚感作性を有する物質である。また、フェニルベンゾエート、シトラール、シンナミルアルコール、メチルメタクリレート、α−ヘキシルシンナミックアルデヒド、オイゲノール、アビエチン酸、イミダゾリジニルウレア、エチレングリコールジメタクリレート、レゾルシノール、及びヒドロキシシトロネラールは、ＥＣ３値が１０％（ｗ／ｖ）以上である、弱い皮膚感作性を有する物質である。なお、上記のＥＣ３値はＬＬＮＡ等によって得られたものである。
【００２９】
さらに、「皮膚感作性を示さない物質」としては、例えば、スルファニルアミド（ＳｕｌＡ）、グリセロール（ＧＬＣ）、塩化ベンゼン（ＣＢ）、イソプロパノール（ＩＰＡ）、乳酸（ＬＡ）、サリチル酸メチル（ＭＳ）、サリチル酸（ＳＡ）、及びヘキサン（Ｈｅｘ）が挙げられる。なお、上記物質が皮膚感作性を示さないことはＬＬＮＡ等によって確認されている。
【００３０】
また、「皮膚刺激性物質」とは、皮膚に対し一過性の刺激を与える性質（皮膚刺激性）を有する物質を指し、このような皮膚刺激性物質として、例えば、サリチル酸、ヘキサンなどが知られている。なお、イソオイゲノール、２，４−ジニトロフルオロベンゼン、ジニトロクロロベンゼン、エチレングリコールジメタクリレートなどのように、皮膚感作性を有し、かつ、皮膚刺激性を有するものも知られている。
【００３１】
［ステップＡ］
ステップＡは、マウスの一方の耳介に被験物質塗布液を塗布するステップＡ１と、ステップＡ１の一定期間後に、前記の一方の耳介と他方の耳介とに、ステップＡ１で用いられたものと同じ被験物質塗布液を塗布するステップＡ２と、ステップＡ２から３６〜８０時間後に前記の他方の耳介におけるリンパ節の重量の測定するステップＡ３とを含むステップであることを特徴とする。
【００３２】
本発明のステップＡ１において、マウスの耳介に塗布する被験物質塗布液の量（投与量）は、特に限定されないが、ＬＬＮＡ等で採用される基準（非特許文献２、３、７などを参照）で調製することが好ましい。被験物質塗布液中の被験物質の濃度についても、耳介が欠損するなどの著しい毒性、腐食性を示さない濃度であれば特に制限されないが、例えば０．０００１〜１００％（ｗ／ｖ）の範囲内であることが好ましく、また、例えば、ＬＬＮＡ等で求めたＥＣ３値の０．０１倍から５０倍の範囲内であることが好ましい。
【００３３】
本発明のステップＡ１において、被験物質塗布液の塗布回数は、１回の塗布量、被験物質塗布液中の被験物質の濃度、感作性の強さにも依存するが、１〜１０回であることが好ましく、１〜３回であることがより好ましく、ＬＬＮＡ等との相関性を高めることができる観点からは３回であることが特に好ましい。なお、被験物質塗布液を塗布する耳介の領域は、複数回の塗布ごとに（例えば１回目の塗布と２回目の塗布とで）同じであってもよいし、同じ側の耳介であれば異なっていてもよい。また、前記の塗布の間隔についても特に制限されないが、ＬＬＮＡ等との相関性を高めることができることから、ＬＬＮＡ等で採用されているように１日目、２日目、３日目に塗布することが好ましい。この場合、各塗布の間に少なくとも１２時間以上の間隔をあけることが好ましく、同一の時刻に塗布するようにすることが特に好ましい。
【００３４】
なお、ＬＬＮＡ：ＤＡにおいて、被験物質塗布液を塗布する前に、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などを予め被験物質塗布液を塗布する耳介に塗布しておくことで、検出の感度が上昇することが知られており、本発明の方法においても、これを採用してもよい。ＳＤＳを用いる場合、その濃度は、０．０１〜１０％の範囲が好ましく、０．１〜１％の範囲がより好ましい。
【００３５】
本発明のステップＡ２において、マウスの耳介に塗布する被験物質塗布液の量（投与量）は、特に限定されないが、ＬＬＮＡ等で採用される基準（非特許文献２、３、７などを参照）で調製することが好ましい。また、被験物質塗布液中の被験物質の濃度についても、耳介が欠損するなどの著しい毒性、腐食性を示さない濃度であれば特に制限されないが、例えば０．００１〜１００％（ｗ／ｖ）の範囲内であることが好ましく、また、例えば、ＬＬＮＡ等で求めたＥＣ３値の０．０１倍から５０倍の範囲内であることが好ましい。なお、ステップＡ２における、一方の耳介と他方の耳介に塗布する被験物質塗布液の量は同量であり、被験物質塗布液中の被験物質の濃度は同濃度である。
【００３６】
本発明のステップＡ２において、「一定期間」とは、その期間は特に制限されないが、被験物質が皮膚感作性物質である場合には、この一定期間が当該皮膚感作性物質による感作開始から惹起までの期間となることから、７日以上２週間以内であることが好ましく、９日以上１２日以内であることがより好ましく、１０日以上１１日以内であることが特に好ましい。一定期間が７日未満であると、被験物質が皮膚感作性物質であった場合に、感作されたリンパ球の伝播による全身の感作が未だ起こっていないか起こっていたとしても検出には不十分であるという傾向にあり、また、２週間を超えても、皮膚感作性物質の検出は可能であるが、従来のモルモットを用いた試験と比較して、試験期間の短縮というメリットが薄れてしまう。
【００３７】
本発明のステップＡ２において、被験物質塗布液の量（投与量）や被験物質塗布液中の被験物質の濃度は特に制限はされないが、ＬＬＮＡ等の豊富なデータを活用するという観点からは、ステップＡ１において一方の耳介に塗布した１回分の被験物質塗布液の量、及び被験物質塗布液中の被験物質の濃度と同一であることが好ましい。また、ステップＡ２における被験物質塗布液の塗布回数は特に制限されないが、１回であることが好ましい。
【００３８】
本発明のステップＡ３は、ステップＡ２における被験物質塗布液を塗布した他方の耳介におけるリンパ節の重量を測定するステップである。本発明においては、このリンパ節の重量測定を、ステップＡ２から３６〜８０時間後に行なうことを特徴とする。惹起反応の検出がステップＡ２から３６時間未満である場合には、感作反応を検出するための耳介のリンパ節の増殖が不十分である場合があるためであり、８０時間を超える場合には、試験期間が十分な検出を行うのに必要以上に長期化するためである。感作期間を十分に確保し、なおかつ試験を２週間以内に実施することでモルモットを用いる方法より短期間で試験結果を得るという観点からは、好ましくはステップＡ２から４０〜７２時間後、特に好ましくはステップＡ２から４２〜５２時間後に惹起反応の検出を行なうことが好ましい。
【００３９】
マウスの耳介リンパ節の重量測定は、汎用されている安価な精密電子天秤を使用して行うことができる。
【００４０】
［ステップＢ］
ステップＢは、マウスの一方の耳介に被験物質塗布液を塗布するステップＢ２と、ステップＢ２から３６〜８０時間後に前記の一方の耳介におけるリンパ節の重量を測定するステップＢ３とを含むステップであることを特徴とする。
【００４１】
本発明のステップＢ２において、マウスの耳介に塗布する被験物質塗布液の量（投与量）及び被験物質塗布液中の被験物質の濃度は、ステップＡ２と同じ濃度である。
【００４２】
本発明のステップＢ３では、被験物質塗布液を塗布した他方の耳介におけるリンパ節の重量を測定する。本発明においては、このリンパ節の重量測定を、ステップＢ２から例えば３６〜８０時間後、好ましくは４０〜７２時間後、特に好ましくはステップＢ２から４２〜５２時間後に行なうことを特徴とする。なお、ステップＢ３における前記の期間は、ステップＡ３の期間と同じ期間である。
【００４３】
［ＤＩＬＬ  ｖａｌｕｅｓ］
本発明では、例えば、前記のステップＡによって得たマウスの耳介におけるリンパ節の重量から、前記のステップＢによって得たマウスの耳介におけるリンパ節の重量を減じ、さらに前記のステップＡ２（ステップＢ２）における塗布液中の被験物質の濃度で除することで、ＤＩＬＬ  ｖａｌｕｅｓ（Ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｗｅｉｇｈｔ  ｏｆ  ｌｅｆｔ  ｅａｒ）を求め、これを用いて皮膚感作性強度を判定することができる。ここで、リンパ節の重量の単位は、特に限定されないが、ＬＬＮＡ等の豊富なデータを活用するという観点からは、ｍｇであることが好ましい。また、塗布液中の被験物質の濃度の単位は、特に限定されないが、ＬＬＮＡ等の豊富なデータを活用するという観点からは、重量体積パーセント（％（ｗ／ｖ））であることが好ましい。なお、重量体積パーセント（％（ｗ／ｖ））は、溶質の質量（ｇ）を溶液の体積（ｍｌ）を除することで求めることができる。
【００４４】
本発明における被験物質のＤＩＬＬ  ｖａｌｕｅｓと、ＥＣ３値に基づく被験物質の皮膚感作性強度との間には、高い相関性が見られる。そのため、例えば新規の被験物質であっても、そのＤＩＬＬ  ｖａｌｕｅｓを測定することによって、皮膚感作性の強度を簡便且つ高い信頼性で評価することが可能である。例えば、リンパ節の重量の単位をｍｇ、塗布液中の被験物質の濃度の単位を％（ｗ／ｖ）とした際のＤＩＬＬ  ｖａｌｕｅｓが２．００以上である被験物質は、非常に高い皮膚感作性（ＥＣ３値が０．００１〜０．１％（ｗ／ｖ）程度）を有する物質であり、ＤＩＬＬ  ｖａｌｕｅｓが０．２０以上、２．００未満である被験物質は、高い皮膚感作性（ＥＣ３値が０．１〜１．０％（ｗ／ｖ）程度）を有する物質であり、ＤＩＬＬ  ｖａｌｕｅｓが０．０２以上、０．２０未満である被験物質は、中程度から弱い皮膚感作性（ＥＣ３値が１〜１００％（ｗ／ｖ）程度）を有する物質であり、０．０１以上、０．０２未満である被験物質は、弱い皮膚感作性または皮膚感作性を有さない物質であり、ＤＩＬＬ  ｖａｌｕｅｓが０．０１未満である被験物質は、皮膚感作性を有さないと判定することができる。
【００４５】
［ＥＣ１ｍｇ］
本発明では、例えば、前記のステップＡ２（ステップＢ２）における塗布液中の被験物質の濃度を、前記のステップＡによって得たマウスの耳介におけるリンパ節の重量から、前記のステップＢによって得たマウスの耳介におけるリンパ節の重量を減じた値で除することでＥＣ１ｍｇ（Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  １ｍｇ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を求め、これを用いて皮膚感作性強度を判定することができる。ここで、リンパ節の重量の単位は、特に限定されないが、ＬＬＮＡ等の豊富なデータを活用するという観点からは、ｍｇであることが好ましい。また、塗布液中の被験物質の濃度の単位は、特に限定されないが、ＬＬＮＡ等の豊富なデータを活用するという観点からは、重量体積パーセント（％（ｗ／ｖ））であることが好ましい。なお、重量体積パーセント（％（ｗ／ｖ））は、溶質の質量（ｇ）を溶液の体積（ｍｌ）を除することで求めることができる。
【００４６】
本発明における被験物質のＥＣ１ｍｇと、ＥＣ３値に基づく被験物質の皮膚感作性強度との間には、高い相関性が見られる。そのため、例えば新規の被験物質であっても、そのＥＣ１ｍｇを測定することによって、皮膚感作性の強度を簡便且つ高い信頼性で評価することが可能である。例えば、リンパ節の重量の単位をｍｇ、塗布液中の被験物質の濃度の単位を％（ｗ／ｖ）とした際のＥＣ１ｍｇが０．５以下である被験物質は、非常に高い皮膚感作性（ＥＣ３値が０．００１〜０．１％（ｗ／ｖ）程度）を有する物質であり、ＥＣ１ｍｇが０．５よりも大きく、５以下である被験物質は、高い皮膚感作性（ＥＣ３値が０．１〜１．０％（ｗ／ｖ）程度）を有する物質であり、ＥＣ１ｍｇが５よりも大きく、５０以下である被験物質である被験物質は、中程度から弱い皮膚感作性（ＥＣ３値が１〜１００％（ｗ／ｖ）程度）を有する物質であり、５０よりも大きく、１００以下である被験物質は、弱い皮膚感作性または皮膚感作性を有さない物質であり、ＥＣ１ｍｇが１００よりも大きい被験物質は、皮膚感作性を有さないと判定することができる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４８】
＜実施例１＞
ケージ１及び２に、ＣＢＡ／Ｊの系統の未経産で非妊娠の若齢（８〜１２週齢）の雌マウスを５匹ずつ、個体識別ができるように用意した。
【００４９】
また、溶媒としてアセトン／オリーブオイル（４：１（ｖ／ｖ））(ＡＯＯ）を用い、被験物質として５クロロ−２−メチル−４−イソチアゾール−３−オン（皮膚感作性を有する被験物質）を用い、０．０５％（ｗ／ｖ）ＣＭＩ／ＡＯＯ溶液（被験物質塗布液）を調製した。
【００５０】
以下のように、ケージごとに操作を行った。なお、１回の塗布量は２５μｌとした。被験物質塗布液の塗布には、ピペットマンを用いた。また、摘出した耳介リンパ節は精密電子天秤を用いてその重量を測定した。
【００５１】
ケージ１：１、２、３日目の１３時にマウスの右耳に０．０５％（ｗ／ｖ）のＣＭＩ／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の１３時に両耳に０．０５％（ｗ／ｖ）のＣＭＩ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の１３時に左耳の耳介リンパ節を摘出し、重量（ｍｇ）を測定
ケージ２：１０日目のみ、１３時にマウスの左耳に０．０５％（ｗ／ｖ）のＣＭＩ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の１３時に左耳の耳介リンパ節を摘出し、重量（ｍｇ）を測定（１、２、３、１０日目の右耳への塗布なし）
【００５２】
ケージ１で得た耳介リンパ節の重量（２．７０ｍｇ）を、ケージ２で得た耳介リンパ節の重量（１．９６ｍｇ）から減じ、ＣＭＩ／ＡＯＯ溶液の濃度（０．０５％（ｗ／ｖ））で除し、ＤＩＬＬ  ｖａｌｕｅｓを求めた。具体的には、（２．７０−１．９６）／０．０５＝１４．８となった。この結果を表１に示す。
【００５３】
以下に、表１における各項目を説明する。
「被験物質の濃度」：実験で用いられた塗布液中の被験物質の濃度（％（ｗ／ｖ））
「ケージ１のリンパ節の重量（ｍｇ）」：ケージ１で得た耳介リンパ節の重量（ｍｇ）
「ケージ２のリンパ節の重量（ｍｇ）」：ケージ２で得た耳介リンパ節の重量（ｍｇ）
「重量差（ｍｇ）」：ケージ１で得た耳介リンパ節の重量（ｍｇ）をケージ２で得た耳介リンパ節の重量（ｍｇ）から減じたもの
「ＤＩＬＬ  ｖａｌｕｅｓ」：リンパ節の重量差（ｍｇ）を塗布液中の被験物質の濃度（％（ｗ／ｖ））で除したもの
「ＥＣ１ｍｇ」：塗布液中の被験物質の濃度（％（ｗ／ｖ））をリンパ節の重量差（ｍｇ）で除したもの
「カテゴリ」：ＬＬＮＡ法におけるＥＣ３値で分類した各被験物質の皮膚感作性の強さを示したものであって、各記号は以下を意味する
「◎」：非常に高い皮膚感作性（ＥＣ３値が０．００１〜０．１％（ｗ／ｖ）程度）を有する物質であること
「○」：高い皮膚感作性（ＥＣ３値が０．１〜１．０％（ｗ／ｖ）程度）を有する物質であること
「△」：中程度〜弱い皮膚感作性（ＥＣ３値が１．０〜１００％（ｗ／ｖ）程度）を有する物質であること
「□」：皮膚感作性を有さない物質であること
【００５４】
＜実施例２〜３１＞
ＣＭＩの代わりに下記の被験物質を用い、濃度を調整したこと以外は実施例１と同様の操作を行った。その結果を表１に示す。
実施例２：２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）
実施例３：ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）
実施例４：パラベンゾキノン（ｐ−ＢＱ）
実施例５：グルタルアルデヒド（ＧＡ）
実施例６：ヒドロキノン（ＨＱ）
実施例７：塩化コバルト（Ｃｏ）
実施例８：パラフェニレンジアミン（ｐ−ＰＤ）
実施例９：プロピルガレート（ＰＧ）
実施例１０：シンナミックアルデヒド（ＣＡＬ）
実施例１１：イソオイゲノール（ＩＥＵ）
実施例１２：シトラール（ｃｉｔｒａｌ）
実施例１３：フェニルベンゾエート（ＰＢｚ）
実施例１４：アビエチン酸（ＡＢＡ）
実施例１５：２−メルカプトベンズチアゾール（２−ＭＢＴ）
実施例１６：シンナミルアルコール（ＣＡ）
実施例１７：硫酸ニッケル６水和物（ＮｉＳＯ4）
実施例１８：レゾルシノール（ＲＣ）
実施例１９：α−ヘキシルシンナミックアルデヒド（ＨＣＡ）
実施例２０：オイゲノール（ＥＵ）
実施例２１：ヒドロキシシトロネラール（ＨＣＮ）
実施例２２：イミダゾリジニルウレア（ＩＵ）
実施例２３：エチレングリコールジメタクリレート（ＥＧ）
実施例２４：メチルメタクリレート（ＭＭ）
実施例２５：スルファニルアミド（ＳｕｌＡ）
実施例２６：グリセロール（ＧＬＣ）
実施例２７：塩化ベンゼン（ＣＢ）
実施例２８：イソプロパノール（ＩＰＡ）
実施例２９：サリチル酸メチル（ＭＳ）
実施例３０：サリチル酸（ＳＡ）
実施例３１：ヘキサン（Ｈｅｘ）
【００５５】
【表１】
0006436713.tif 000002
【００５６】
実施例１〜３１の結果より得られた値が、ＬＬＮＡ等で得られた皮膚感作性の強度と相関性があることが明らかとなった。つまり、ＤＩＬＬ  ｖａｌｕｅｓが２．００以上である被験物質が非常に高い皮膚感作性を有する物質であること、ＤＩＬＬ  ｖａｌｕｅｓが０．２０以上、２．００未満である被験物質が高い皮膚感作性を有する物質であること、ＤＩＬＬ  ｖａｌｕｅｓが０．０２以上、０．２０未満である被験物質が中程度〜弱い皮膚感作性を有する物質であること、ＤＩＬＬ  ｖａｌｕｅｓが０．０１未満である被験物質は皮膚感作性を有さない物質であることが明らかとなった。したがって、例えば新規の被験物質であっても、そのＤＩＬＬ  ｖａｌｕｅｓを測定することによって、皮膚感作性の強度を簡便且つ高い信頼性で評価することが可能であることを示された。
【００５７】
また、実施例１〜３１の結果より得られた値が、ＬＬＮＡ等で得られた皮膚感作性の強度と相関性があることが明らかとなった。つまり、ＥＣ１ｍｇが０．５以下である被験物質が非常に高い皮膚感作性を有する物質であること、ＥＣ１ｍｇが０．５よりも大きく、５以下である被験物質が高い皮膚感作性を有する物質であること、ＥＣ１ｍｇが５よりも大きく、５０以下である被験物質が中程度〜弱い皮膚感作性を有する物質であること、ＥＣ１ｍｇが１００よりも大きい被験物質は皮膚感作性を有さない物質であることが明らかとなった。したがって、例えば新規の被験物質であっても、そのＥＣ１ｍｇを測定することによって、皮膚感作性の強度を簡便且つ高い信頼性で評価することが可能であることを示された。
【００５８】
＜実施例３２＞
ケージ１〜６に、ＣＢＡ／Ｊの系統の未経産で非妊娠の若齢（８〜１２週齢）の雌マウスを５匹ずつ、個体識別ができるように用意した。
【００５９】
また、溶媒としてアセトン／オリーブオイル（４：１（ｖ／ｖ））(ＡＯＯ）を用い、０．０６２５％（ｗ／ｖ）ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液、０．１２５％（ｗ／ｖ）ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液、及び０．２５％（ｗ／ｖ）ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液を調製した。
【００６０】
以下のように、ケージごとに操作を行った。なお、１回の塗布量は２５μｌとした。被験物質塗布液の塗布には、ピペットマンを用いた。また、摘出した耳介リンパ節は精密電子天秤を用いてその重量を測定した。
【００６１】
ケージ１：１、２、３日目の１３時にマウスの右耳に０．０６２５％（ｗ／ｖ）ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の１３時に、両耳に０．０６２５％（ｗ／ｖ）ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の１３時に左耳の耳介リンパ節を摘出し、重量を測定
ケージ２：１０日目のみ、１３時にマウスの右耳に０．０６２５％（ｗ／ｖ）ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の１３時に左耳の耳介リンパ節を摘出し、重量を測定（１、２、３、１０日目の右耳への塗布なし）
ケージ３：１、２、３日目の１３時にマウスの右耳に０．１２５％（ｗ／ｖ）ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の１３時に、両耳に０．１２５％（ｗ／ｖ）ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の１３時に左耳の耳介リンパ節を摘出し、重量を測定
ケージ４：１０日目のみ、１３時にマウスの右耳に０．１２５％（ｗ／ｖ）ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の１３時に左耳の耳介リンパ節を摘出し、重量を測定（１、２、３、１０日目の右耳への塗布なし）
ケージ５：１、２、３日目の１３時にマウスの右耳に０．２５％（ｗ／ｖ）ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の１３時に、両耳に０．２５％（ｗ／ｖ）ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の１３時に左耳の耳介リンパ節を摘出し、重量を測定
ケージ６：１０日目のみ、１３時にマウスの右耳に０．２５％（ｗ／ｖ）ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の１３時に左耳の耳介リンパ節を摘出し、重量を測定（１、２、３、１０日目の右耳への塗布なし）
【００６２】
ケージ１で得た耳介リンパ節の重量を、ケージ２で得た耳介リンパ節の重量から減じ、ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液の濃度で除した。また、同様の操作をケージ３及び４、ケージ５及び６でも行った。この結果を表２に示す。
【００６３】
＜実施例３３＞
ＤＮＣＢのかわりにＨＣＡを用い、濃度を調整したこと以外は実施例３２と同様の操作を行った。その結果を表２に示す。
【００６４】
なお、表２における各項目は、表１にて説明したものと同様である。
【００６５】
【表２】
0006436713.tif 000003
【００６６】
実施例３２及び３３の結果より、ＤＩＬＬ  ｖａｌｕｅｓ及びＥＣ１ｍｇが塗布液中の被験物質の濃度に依存しないことがわかった。つまり、ＤＩＬＬ  ｖａｌｕｅｓ及びＥＣ１ｍｇは幅広い塗布液中の被験物質の濃度域で一定の値を示し、かつＬＬＮＡ等で得られた皮膚感作性の強度と相関性があることが明らかとなった。
【００６７】
今回開示された実施の形態および実施例は全ての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内での全ての変更が含まれることが意図される。