(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液中に含まれる核酸配列上の少なくとも１種類の塩基部位を判定する方法において、判定したい該塩基部位を含む、判定したい該塩基部位当たり１種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、オリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）及び（Ｃ）の同時存在下において、ＰＣＲによる遺伝子増幅反応をＫＯＤ−ｐｌｕｓ（商標）  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて行う工程を含むことを特徴とする塩基判定方法であって、
該プライマー（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）が下記の（１）〜（３）のいずれかの組み合わせから選択される：
（１）プライマー（Ａ）がセンスプライマーもしくはアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー（Ｂ）と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー（Ｃ）との組合せ；
（２）プライマー（Ａ）がセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の下流領域と相同的なセンスプライマー（Ｂ）と、下流領域と相補的なアンチセンスプライマー（Ｃ）との組合せ（但し、プライマー（Ｃ）はプライマー（Ｂ）よりも下流にある）；
（３）プライマー（Ａ）がアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域と相同的なセンスプライマー（Ｂ）と、上流領域と相補的なアンチセンスプライマー（Ｃ）との組合せ（但し、プライマー（Ｃ）はプライマー（Ｂ）よりも下流にある）。
【請求項２】
判定したい該塩基部位が、変異、置換、一塩基多型、挿入又は欠失を含むことを特徴とする請求項１に記載の塩基判定方法。
【請求項３】
塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）の３’末端より１番目の塩基が判定したい塩基部位の予想される塩基と同じ、または相補的な塩基であることを特徴とする請求項１または２に記載の塩基判定方法。
【請求項４】
塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）の３’末端より２番目の塩基が判定したい塩基部位の予想される塩基と同じ、または相補的な塩基であることを特徴とする請求項１または２に記載の塩基判定方法。
【請求項５】
塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）の３’末端より３から５番目の少なくとも１つの塩基が鋳型となる核酸配列と相補的または相同的でない塩基に置換されていることを特徴とする請求項３または４記載の塩基判定方法。
【請求項６】
塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）のＴｍ値が、判定したい該塩基部位の上流および／または下流領域と相補的または相同的な配列を有する少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ、Ｃ）のＴｍ値よりも高いことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の塩基判定方法。
【請求項７】
塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）の使用時における濃度が、判定したい該塩基部位の上流および／または下流領域と相補的または相同的な配列を有する少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ、Ｃ）の使用時における濃度よりも高いことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の塩基判定方法。
【請求項８】
塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）および判定したい該塩基部位の上流および／または下流領域と相補的または相同的な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ、Ｃ）のいずれか１種類を用いて得られる増幅核酸断片長が、判定される塩基によって異なることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の塩基判定方法。
【請求項９】
塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と判定したい該塩基部位の上流および／または下流領域と相補的または相同的な配列を有する少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ、Ｃ）の５´末端が標識されていることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の塩基判定方法。
【請求項１０】
標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである請求項１〜９のいずれかに記載の塩基判定方法。
【請求項１１】
試料溶液中に含まれる核酸配列上の少なくとも１種類の塩基部位を判定する方法において、判定したい該塩基部位を含む、判定したい該塩基部位当たり１種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、オリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）及び（Ｃ）の同時存在下において、さらに、該塩基部位を含む核酸配列と相同または相補的な少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）を用いて、ＰＣＲによる遺伝子増幅反応をＫＯＤ−ｐｌｕｓ（商標）  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて行い、融解曲線解析を行う工程を含むことを特徴とする塩基判定方法であって、
該プライマー（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）が下記の（１）〜（３）のいずれかの組み合わせから選択される：
（１）プライマー（Ａ）がセンスプライマーもしくはアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー（Ｂ）と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー（Ｃ）との組合せ；
（２）プライマー（Ａ）がセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の下流領域と相同的なセンスプライマー（Ｂ）と、下流領域と相補的なアンチセンスプライマー（Ｃ）との組合せ（但し、プライマー（Ｃ）はプライマー（Ｂ）よりも下流にある）；
（３）プライマー（Ａ）がアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域と相同的なセンスプライマー（Ｂ）と、上流領域と相補的なアンチセンスプライマー（Ｃ）との組合せ（但し、プライマー（Ｃ）はプライマー（Ｂ）よりも下流にある）。
【請求項１２】
試料溶液中に含まれる核酸配列上の少なくとも１種類の塩基部位を判定する方法において、判定したい該塩基部位を含む、判定したい該塩基部位当たり１種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、オリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）及び（Ｃ）の同時存在下において、さらに、該塩基部位を含む核酸配列と少なくとも１塩基異なる配列を有する相同または相補的な少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｅ）を用いて、ＰＣＲによる遺伝子増幅反応をＫＯＤ−ｐｌｕｓ（商標）  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて行い、融解曲線解析を行う工程を含むことを特徴とする塩基判定方法であって、
該プライマー（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）が下記の（１）〜（３）のいずれかの組み合わせから選択される：
（１）プライマー（Ａ）がセンスプライマーもしくはアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー（Ｂ）と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー（Ｃ）との組合せ；
（２）プライマー（Ａ）がセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の下流領域と相同的なセンスプライマー（Ｂ）と、下流領域と相補的なアンチセンスプライマー（Ｃ）との組合せ（但し、プライマー（Ｃ）はプライマー（Ｂ）よりも下流にある）；
（３）プライマー（Ａ）がアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域と相同的なセンスプライマー（Ｂ）と、上流領域と相補的なアンチセンスプライマー（Ｃ）との組合せ（但し、プライマー（Ｃ）はプライマー（Ｂ）よりも下流にある）。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）または（Ｅ）が標識されていることを特徴とする請求項１１または１２記載の塩基判定方法。
【請求項１４】
標識が、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかであることを特徴とする請求項１３記載の塩基判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異を含む領域を増幅させるオリゴヌクレオチド、DNAポリメラーゼおよび変異核酸配列を特異的に増幅させるオリゴヌクレオチドを用いた変異、置換、多型、挿入又は欠失の検出ないし判定方法及び塩基判定用キットに関するものである。本発明は、遺伝病の診断、点突然変異による疾患の検査に際して特に有用である。なお、変異には、後天的な遺伝子の突然変異とSNPの両方が包含される。
【背景技術】
【０００２】
本発明において、核酸配列の変異とは野生型とは異なる塩基配列を有することをいう。遺伝子の変異は疾患の原因となりうる働きまたは、薬剤に対する抵抗性を示すことが知られている。それゆえ、これら核酸配列の変異の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとって特に推奨される（非特許文献１および非特許文献２参照）。また、原因となる変異型遺伝子の同定に続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所望される。【０００３】
従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定することができるが、鋳型核酸の調製、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は可能であるが、高価な装置が必要であるという問題がある。【０００４】
一方、遺伝子の点突然変異により引き起こされる遺伝病が種々知られており、それらの中には、遺伝子のどの部位がどのように点突然変異することにより遺伝病が引き起こされるかわかっているものも少なくない。【０００５】
このような予想される点突然変異を検出する方法として、従来より、ＰＣＲ（polymerase chain reaction)法（特許文献１および特許文献２参照）などの遺伝子増幅法を利用した遺伝子の点突然変異の検出方法が知られている。増幅された遺伝子断片に対し、特定の核酸配列を切断する制限酵素により処理し、生じるフラグメントの大きさで判断する方法(PCR-RFLP)法が用いられている。同じくPCR法を用いた検出方法としては、使用するprimerの特異性を利用した
Alelle specific amplification法が用いられる。この方法では、遺伝子増幅法に用いる一対のオリゴヌクレオチドのうちの一方のオリゴヌクレオチドとして、野生型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な野生型用オリゴヌクレオチドと、変異型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な変異型用オリゴヌクレオチドとを用いる。変異型のオリゴヌクレオチドは、その３’末端が予想される点突然変異を起こしたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドになっている。このような野生型及び変異型用オリゴヌクレオチドを同時にまたはそれぞれ別個に用いて試料遺伝子を遺伝子増幅法に供する（非特許文献１Cynthia
D.K.Bottema and Steves S.Sommer、Mutation Research、第２８８巻、第９３−１０２頁、（１９９３））。【０００６】
試料遺伝子が野生型であれば、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には核酸の増幅が起きるが、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には、オリゴヌクレオチドの３’末端が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミスマッチ）ので伸長反応が起きず、核酸の増幅は起きない。一方、試料遺伝子が変異型であれば、逆に、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には増幅が起きず、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きる。従って、各オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きるか否かを調べることにより、試料遺伝子が野生型か変異型かを判別することができ、それによって試料遺伝子中の点突然変異を同定することができる。この時増幅がおきたか否かを調べる方法として、増幅産物をアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイド等の核酸特異的結合蛍光試薬を用いて染色の後、UV照射して増幅核酸の有無を検出できる。またほかの様式として、ナイロン膜上に増幅核酸を固定し、標識プローブを用いて検出するサザンブロット法、個体担体上に固定した補足プローブで捕捉した後検出プローブを作用させて検出するサンドイッチハイブリダイゼーション法などが開発されてきた。しかし、実際には、操作は煩雑であり、迅速かつ大量の試料を解析するためには、多大な労力を要するか大規模なラボオートメーションシステムを構築する必要がある。【０００７】
たとえばＰＣＲ−ＲＦＬＰ法では、PCR後制限酵素処理を行った上、電気泳動を行う必要がいる。Alelle specific amplification法ではPCR後の操作は簡略化できるが、電気泳動で検出する場合、野生型検出および変異型検出を別個に実施する必要がある。またサザンブロット法やサンドイッチハイブリダイゼーション法ではプローブとのハイブリダイゼーション反応が必要であり、その条件を厳密に整える必要がある。更には過剰なプローブを除去する工程が必要であり、操作は非常に煩雑である。【０００８】
また、野生型検出および変異型検出を行うため、別個に増幅する場合、変異の数に合わせて増幅コストも増大する。複数の増幅を一つの反応系で増幅し、ＤＮＡチップで検出する方法もあるが、ＤＮＡチップはいまだコストがかかり、医療の最前線では使用が難しい状況にある。
【特許文献１】特公平４−６７９６０号公報
【特許文献２】特公平４−６７９５７号公報
【非特許文献１】GramおよびBrsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics.Commission of the European Communities, Luxembourg, 1990,第８７〜９６頁
【非特許文献２】Balantら、Eur. J. Clin. Pharmacol. 第３６巻、第５５１〜５５４頁、(1989)
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】少なくとも２種の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマーとオリゴヌクレオチドプライマー（B、C）の位置関係
【図２】「変異」又は「置換」の場合の、基本的なプライマー設定方法
【図３】「一塩基多型」の場合の、基本的なプライマー設定方法
【図４】「挿入」の場合の、基本的なプライマー設定方法
【図５】「欠失」の場合の、基本的なプライマー設定方法
【図６】PCR法によるbcr-ablキメラ遺伝子のabl遺伝子ATP結合領域の（E255K）変異遺伝子の解析結果
【図７】PCR法によるbcr-ablキメラ遺伝子のabl遺伝子ATP結合領域の（T315I）変異遺伝子の解析結果
【図８】PCR法によるCYP２C19遺伝子の681（G→A）一塩基変異多型の解析結果
【図９】PCR法によるCYP２C19遺伝子の636（G→A）一塩基変異多型の解析結果
【図１０】PCR法によるCYP２C9遺伝子の1075（A→C）一塩基変異多型の解析結果
【図１１】ヒトEGFR遺伝子のエクソン19 Del E746-A750欠損変異の検出結果
【図１２】ヒトEGFR遺伝子のエクソン19 Del L747-S752欠損変異の検出結果
【図１３】ヒトEGFR遺伝子のエクソン19 Del E746-T751 ins I欠損変異の検出結果
【図１４】ヒトEGFR遺伝子のエクソン19 Del L747-T751del P753欠損変異の検出結果
【図１５】ヒトEGFR遺伝子のエクソン19 Del L747-A750 substitution P欠損変異の検出結果
【図１６】ヒトEGFR遺伝子のエクソン19 Del L747-S752、Del E746-T751 ins I、Del L747-T751delP753、Del L747-A750 substitution P欠損変異の検出結果
【図１７】CYP２C9遺伝子の1075（A→C）一塩基変異多型のプローブを用いた解析結果
【図１８】PCR法によるH.pylori  CagA遺伝子の型の解析
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記のような方法により増幅核酸を検出し、容易に核酸配列中の変異、置換、一塩基多型、挿入又は欠失の同定が行えるように思われるが、実際には、操作は煩雑であり、迅速かつ大量の試料を解析するためには、多大な労力を要するか大規模なラボオートメーションシステムを構築する必要がある。また、操作が非常に煩雑であるという問題点があった。【００１１】
本発明の目的は、上記のような課題を解決して、明確にかつ再現性よく核酸配列中の変異、置換、一塩基多型、挿入又は欠失を検出することができる方法及びそのための試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、試料溶液中に含まれる核酸配列上の少なくとも１種類の塩基部位を判定する方法において、判定したい該塩基部位を含む少なくとも１種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）と、オリゴヌクレオチドプライマー(B)及び(C)とが、以下の（１）〜（３）：
（１）プライマー（A）がセンスプライマーもしくはアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ；
（２）プライマー（A）がセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の下流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）；
（３）プライマー（A）がアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、上流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）；
のいずれかから選択される組み合わせを用いて、遺伝子増幅反応させ、該増幅産物を（例えば電気泳動、電気泳動法、ハイブリによる検出方法、蛍光検出方法、融解曲線解析法、熱溶出クロマトグラム法等、既存の方法により）検出することで簡便に判定したい塩基の存在を判定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
１．  試料溶液中に含まれる核酸配列上の少なくとも１種類の塩基部位を判定する方法において、判定したい該塩基部位を含む少なくとも１種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）と、オリゴヌクレオチドプライマー(B)及び(C)と、を用いて遺伝子増幅
反応を行う工程を含むことを特徴とする塩基判定方法であって、
該プライマー(A)、(B)及び(C)が下記の(１)〜(３)のいずれかの組み合わせから選択される：
（１）プライマー（A）がセンスプライマーもしくはアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ；
（２）プライマー（A）がセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の下流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）；
（３）プライマー（A）がアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、上流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）。
２．    判定したい該塩基部位が、変異、置換、一塩基多型、挿入又は欠失を含むことを特徴とする項１に記載の塩基判定方法。
３．  塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）の３’末端より１番目の塩基が判定したい塩基部位の予想される塩基と同じ、または相補的な塩基であることを特徴とする項１または２に記載の塩基判定方法。
４．  塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）の３’末端より２番目の塩基が判定したい塩基部位の予想される塩基と同じ、または相補的な塩基であることを特徴とする項１または２に記載の塩基判定方法。
５．  塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）の３’末端より３から５番目の少なくとも１つの塩基が鋳型となる核酸配列と相補的または相同的でない塩基に置換されていることを特徴とする項３または４記載の塩基判定方法。
６．  塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）のＴｍ値が、判定したい該塩基部位の上流および／または下流領域と相補的または相同的な配列を有する少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（B、C）のＴｍ値よりも高いことを特徴とする項１〜５のいずれかに記載の塩基判定方法。
７．  塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）の使用時における濃度が、判定したい該塩基部位の上流および／または下流領域と相補的または相同的な配列を有する少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（B、C）の使用時における濃度よりも高いことを特徴とする項１〜６のいずれかに記載の塩基判定方法。
８．  塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー(A)および判定したい該塩基部位の上流および／または下流領域と相補的または相同的な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー（B、C）のいずれか1種類を用いて得られる増幅核酸断片長が、判定される塩基によって異なることを特徴とする項１〜７のいずれかに記載の塩基判定方法。
９．  塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）と判定したい該塩基部位の上流および／または下流領域と相補的または相同的な配列を有する少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（B、C）の5´末端が標識されていることを特徴とする項１〜８のいずれかに記載の塩基判定方法。
１０．  標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである項１〜９のいずれかに記載の塩基判定方法。１１．  遺伝子増幅法が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれるということを特徴とする項１〜１０のいずれかに記載の塩基判定方法。
１２．  遺伝子増幅法がＰＣＲであり、該ＰＣＲに用いられるＤＮＡポリメラーゼが５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないことを特徴とする項１〜１１のいずれかに記載の塩基判定方法。
１３．  試料溶液中に含まれる核酸配列上の少なくとも１種類の塩基部位を判定する方法において、
判定したい該塩基部位を含む少なくとも１種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）と、オリゴヌクレオチドプライマー(B)及び(C)、並びに、該塩基部位を含む核酸配列と相同または相補的な少なくとも1種類のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）を用いて、遺伝子増幅反応を行う工程を含むことを特徴とする塩基判定方法であって、
該プライマー(A)、(B)及び(C)が下記の(１)〜(３)のいずれかの組み合わせから選択される：
（１）プライマー（A）がセンスプライマーもしくはアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ；
（２）プライマー（A）がセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の下流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）；
（３）プライマー（A）がアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、上流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）。
１４．  試料溶液中に含まれる核酸配列上の少なくとも１種類の塩基部位を判定する方法において、判定したい該塩基部位を含む少なくとも１種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）と、オリゴヌクレオチドプライマー(B)及び(C)、並びに、該塩基部位を含む核酸配列と少なくとも１塩基異なる配列を有する相同または相補的な少なくとも1種類のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｅ）を用いて、遺伝子増幅反応を行う工程を含むことを特徴とする塩基判定方法であって、
該プライマー(A)、(B)及び(C)が下記の(１)〜(３)のいずれかの組み合わせから選択される：
（１）プライマー（A）がセンスプライマーもしくはアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ；
（２）プライマー（A）がセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の下流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）；
（３）プライマー（A）がアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、上流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）。
１５．  オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）または（Ｅ）が標識されていることを特徴とする項１３または１４記載の塩基判定方法。
１６．  標識が、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかであることを特徴とする項１５記載の塩基判定方法。
１７．  判定したい該塩基部位を含む少なくとも１種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）と、オリゴヌクレオチドプライマー(B)及び(C)を含むことを特徴とする
塩基判定用キットであって、
該プライマー(A)、(B)及び(C)が下記の(１)〜(３)のいずれかの組み合わせから選択される：
（１）プライマー（A）がセンスプライマーもしくはアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ；
（２）プライマー（A）がセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の下流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）；
（３）プライマー（A）がアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、上流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）。
１８．  さらに、該塩基部位を含む核酸配列と相同または相補的な少なくとも1種類のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）が含まれることを特徴とする項１７に記載の塩基判定用キット。
１９．  さらに、該塩基部位を含む核酸配列と少なくとも１塩基異なる配列を有する相同または相補的な少なくとも1種類のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｅ）が含まれることを特徴とする項１７に記載の塩基判定用キット。
２０．  さらに、ＤＮＡポリメラーゼが含まれることを特徴とする項１７〜１９のいずれかに記載の塩基判定用キット。
【発明の効果】
【００１３】
上述したように、本発明により、試料核酸中の特定の塩基の存在を明確にまた簡便に判定できる方法が提供される。本発明の方法では、これまでの方法のように煩雑な操作を必要としないので、迅速で容易に再現性の良い結果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
試料中に含まれる変異、置換、一塩基多型、挿入又は欠失に関係する特定の塩基部位を含む染色体又はその断片は、目的の遺伝子の情報を担う塩基部位を含む標的核酸であれば、特に制限されない。該標的核酸の例としては、Alu配列、蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。より具体的には、遺伝病を含む各種疾患、薬物代謝、生活習慣病（高血圧、糖尿病等）に関連する遺伝子が挙げられる。例えば、慢性骨髄性白血病の原因遺伝子としてbcr-ablキメラ遺伝子の点突然変異、チトクロームＰ４５０遺伝多型、サイトカイン遺伝多型などが挙げられる。【００１５】
本発明において、核酸配列を単に核酸ということがある。また、特定の塩基が存在する配列のことを変異型、そうでないものを野生型ということがある。変異型とは野生型の塩基配列のうち少なくとも１つ、好ましくは１つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレオチドに置換されているものや、野生型核酸の一部に挿入、欠失配列等を含む核酸のことである。このような塩基配列の相違により体質等が異なっていることが解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸がこのような予想される配列の変化を有しているか否かを検査する方法である。【００１６】
本発明において、該判定したい塩基部位は、別の染色体にあってもよく、同一の遺伝子内の離れた位置にあってもよく、隣接していてもよい。【００１７】
本発明の方法塩基判定方法において、プライマー(A)〜(C)は、同時に使用して遺伝子増幅反応を行ってもよく、いずれか２種の使用を組み合わせて遺伝子増幅反応を行ってもよい。好ましくはプライマー(A)〜(C)の同時存在下で遺伝子増幅反応を行う。また、プローブ（D）、プローブ（E）は各々プライマー(A)〜(C)と同時に又は別々に組み合わせて使用できる。【００１８】
本発明に用いられるプライマーは、既知の増幅方法であるＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰおよびＩＣＡＮ法により、少なくとも１種類の判定したい塩基を含むように増幅産物が得られるように設計する。プライマー鎖長は、9〜３５塩基であればよく、好ましくは、１1〜３０塩基、より好ましくは１５〜２８塩基、さらに好ましくは１８〜２５塩基である。【００１９】
「判定したい塩基部位」には、「変異」、「置換」、「一塩基多型」、「挿入」又は「欠失」などが含まれる。これらの判定したい塩基部位を含んだ塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定すればよい。また、「判定したい塩基部位」とは、「変異」
、「置換」、「一塩基多型」、「挿入」又は「欠失」を有する部位を意味ずる。かならずしも、プライマー(A)に 挿入配列又は欠失配列が含まれている必要はなく、「変異」、「置換」、「一塩基多型」、「挿入」又は「欠失」が生じる前後の塩基部位を含んでいても良い。【００２０】
本発明の説明では、プライマーの向きを説明するにあたって、当該業者が常用するフォワードプライマーをセンスプライマー、リバースプライマーをアンチセンスプライマーと記すことがある。【００２１】
「変異」又は「置換」を判定するためには、変異後の塩基、又は置換後の塩基と同じ、または相補的な塩基を含むように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定すればよい。好ましくは、塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）の３’末端より１番目または２番目の塩基が「変異」又は「置換」の予想される塩基と同じ、または相補的な塩基であればよい。より好ましくは、塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）の３’末端より２番目の塩基が「変異」又は「置換」の予想される塩基と同じ、また
は相補的な塩基であるのがよい。さらに、塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）の３’末端より３から５番目の少なくとも１つの塩基が鋳型となる核酸配列と相補的または相同的でない塩基に置換されているのが好ましい。このプライマー（A）からの伸長物が確認されたときは、「変異」又は「置換」があると判断される。【００２２】
「一塩基多型」を判定するためには、変異型の塩基と同じ、または相補的な塩基を含むように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定すればよい。好ましくは、塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）の３’末端より１番目または２番目の塩基が「一塩基多型」の予想される塩基の変異型と同じ、または相補的な塩基であればよい。より好ましくは、塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）の３’末端より２番目の塩基が「一塩基多型」の予想される塩基の変異型と同じ、または相補的な塩基であるのがよい。さらに、塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）の３’末端より３から５番目の少なくとも１つの塩基が鋳型となる核酸配列と相補的または相同的でない塩基に置換されているのが好ましい。この変異型を判定するためのプライマー（A）からの伸長物が確認されたときは、多型分析において少なくとも変異型があると判断される。【００２３】
また、「一塩基多型」を判定するために、野生型の塩基と同じ、または相補的な塩基を含むように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定してもよい。好ましくは、塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）の３’末端より１番目または２番目の塩基が「一塩基多型」の予想される塩基の野生型と同じ、または相補的な塩基であればよい。より好ましくは、塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）の３’末端より２番目の塩基が「一塩基多型」の予想される塩基の野生型と同じ、または相補的な塩基であるのがよい。さらに、塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）の３’末端より３から５番目の少なくとも１つの塩基が鋳型となる核酸配列と相補的または相同的でない塩基に置換されているのが好ましい。この野生型を判定するためプライマー（A）からの伸長物が確認されたときは、多型分析において少なくとも野生型があると判断される。【００２４】
さらに、一塩基多型を判定する場合、変異型の塩基と同じまたは相補的な塩基を含むように設定した塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）と、野生型の塩基と相補的な塩基または同じ塩基を含むように設定した塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）とを同時に用いてもよい。ただし、変異型を判定するためのオリゴヌクレオチドプライマー（A）をセンスプライマーにした場合は、野生型を判定するためのオリゴヌクレオチドプライマー（A）はアンチセンスプライマーにする。または、変異型を判定するためのオリゴヌクレオチドプライマー（A）をアンチセンスプライマーにした場合は、野生型を判定するためのオリゴヌクレオチドプライマー（A）はセンスプライマーにする。この場合、変異型を判定するためのオリゴヌクレオチドプライマー（A）からのみの伸長物が確認された時には変異型のホモ、野生型を判定するためのオリゴヌクレオチドプライマー（A）からのみの伸長物が確認された時には野生型のホモ、変異型及び野生型を判定するためのオリゴヌクレオチドプライマー（A）の両者からの伸長物が確認された時には、ヘテロであると判断できる。【００２５】
２種の変異型が存在する場合には、それに対応するオリゴヌクレオチドプライマー（A）を使用することができる。この場合、上記の変異型と野生型の組み合わせと同様に一方をセンスプライマー、他方をアンチセンスプライマーにする。【００２６】
なお、一塩基多型もしくは変異の検出において、野生型および変異型を合わせて三種以上のプライマーを使用する場合、センスプライマー及び／またはアンチセンスプライマー）を二種類以上（一方のプライマーが二種類で他方のプライマーが一種類（合計三種）、或いは両方のプライマーが二種類ずつ（合計四種））を使用することになるが、この場合には、得られる伸長物の長さを変えることにより、全ての伸長物の同時検出が可能である。【００２７】
「挿入」を判定するためには、「挿入」の予想される部位の上流と下流の塩基もしくは塩基配列と同じ又は相補的な塩基もしくは塩基配列を含み、かつ、挿入される塩基もしくは塩基配列と同じ又は相補的な塩基もしくは塩基配列を含まないように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定してもよい。このプライマー（A）からの伸長物が確認されたときには、「挿入」がないと判断される。【００２８】
また、「挿入」を判定するためには、「挿入」する塩基もしくは塩基配列と同じ又は相補的な塩基もしくは塩基配列を含むように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定してもよい。この場合、プライマー（A）の３’末端の１〜５塩基は、「挿入」されない場合の塩基もしくは塩基配列の下流の塩基もしくは塩基配列と一致しないように設計するのが好ましい。このプライマー（A）からの伸長物が確認されたときには、「挿入」があると判断される。【００２９】
「欠失」を判定するためには、「欠失」の予想される部位の上流と下流の塩基もしくは塩基配列と同じ又は相補的な塩基もしくは塩基配列を含み、かつ、欠失する塩基もしくは塩基配列と同じ又は相補的な塩基もしくは塩基配列を含まないように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定してもよい。このプライマー（A）からの伸長物が確認されたときには、「欠失」があると判断される。【００３０】
また、「欠失」を判定するためには、「欠失」する塩基もしくは塩基配列と同じ又は相補的な塩基もしくは塩基配列を含むように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定してもよい。この場合、プライマー（A）の３’末端の１〜５塩基は、「欠失」する塩基もしくは塩基配列の下流の塩基もしくは塩基配列と一致しないように設計するのが好ましい。このプライマー（A）からの伸長物が確認されたときには、「欠失」がないと判断される。【００３１】
塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）のTm値は判定したい該塩基部位の上流および／または下流領域と相補的または相同的な配列を有する少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（B、C）のTm値よりも高いことが好ましい。オリゴヌクレオチドプライマーのTm値は、ハイブリッドを形成した２本鎖ＤＮＡ分子の５０％が解離する温度のことであり、その計算方法としては、既知の方法であれば特に限定されないが、Ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｍｅｔｈｏｄ、Ｗａｌｌａｃｅ法、ＧＣ％法のいずれかにより求められたもので、本発明の特性を満たしていることが望ましい。これらいずれかの方法により算出されたＴｍ値の比較によって、用いられるオリゴヌクレオチドプライマー（A)、（B）、（C）の配列が決定される。なお、特に好ましいＴｍ値はＮｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｍｅｔｈｏｄで計算されたものである。Tm値の差は０．５℃以上であれば特に限定されるものではないが、好ましくは１℃以上である。【００３２】
さらに、判定したい塩基配列を有する核酸分子が微量のため、検出感度を向上させたい場合は判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）の使用時における濃度を判定したい該塩基部位の上流および／または下流領域と相補的または相同的な配列を有する少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（B、C）の使用時における濃度より高いことが好ましい。使用時におけるオリゴヌクレオチドプライマーの濃度は特に限定されるものではないが、好適には0.5〜50μＭの範囲で用いられ、特に好適には1〜20μＭで用いられる。この範囲において、塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマーの濃度が判定したい該塩基部位の上流および／または下流領域と相補的または相同的な配列を有する少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（B、C）の濃度より高いことが好ましい。濃度の差は特に限定されるものではなく、オリゴヌクレオチドプライマーの配列によって、1倍より高く100倍より低い範囲で適宜選択されうる。
判定したい塩基部位が、１カ所の場合には、
判定したい該塩基部位を含む少なくとも１種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）と、オリゴヌクレオチドプライマー(B)及び(C)が、
（１）プライマー（A）がセンスプライマーもしくはアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ；
（２）プライマー（A）がセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の下流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）；
（３）プライマー（A）がアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、上流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）；
のいずれかから選択される組み合わせとによるプライマー（Ａ，Ｂ，Ｃ）から形成されるセットが必要になる。例えば判定したい塩基部位が２カ所あれば、該プライマー（A,B,C）は、通常２セット必要になる。【００３３】
但し、判定したい塩基部位が隣接或いは近傍にある場合、オリゴヌクレオチドプライマー（B、C）は２種以上の判定したい塩基部位に対し共通のものを使用可能である。この場合、判定したい該塩基部位を含む塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）は、２種以上の判定したい塩基部位に対し、それぞれ用意しても構わない。【００３４】
例えば、判定したい塩基部位が「変異」、「置換」、「一塩基多型」であり、該塩基が野生型と変異型の２種の塩基の可能性がある場合、塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）は２種類使用してもよく、野生型または変異型の１種類のみを使用しても塩基の判定を行うことができる。【００３５】
この２種類のプライマーは、同じ方向（両方ともセンスプライマー或いは両方ともアンチセンスプライマー）であってもよく、異なる方向（一方がセンスプライマーで、他方がアンチセンスプライマー）であってもよい。【００３６】
判定したい塩基が複数箇所（例えば、２〜１００箇所、好ましくは２〜５０箇所、さらに好ましくは２〜２０箇所、特に２〜１０箇所）存在する場合、所望により、それぞれの判定箇所を特異的に増幅することが可能な、判定したい該塩基部位の上流および下流領域と相補的または相同的な配列を有する少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（B、C）を複数対と判定したい塩基を含むまたは欠失した塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を複数設計してもよい。複数設計したプライマーを、一つの反応系で増幅反応を行わせることができる。この場合、判定したい塩基の位置から上流または下流のプライマー（BまたはC）までの距離を考慮し、得られる増幅産物の鎖長がそれぞれ異なるように設計することで、増幅産物鎖長により判定したい複数（例えば、２〜１００箇所、好ましくは２〜５０箇所、さらに好ましくは２〜２０箇所、特に２〜１０箇所）の塩基の存在を同時に判定できる。また各判定箇所に相同または相補的なオリゴヌクレオチドプローブを用いれば、増幅産物鎖長に関わらず、特定の塩基の存在を判定することもできる。【００３７】
また、判定したい塩基部位が「挿入」または「欠失」の場合、本発明で検出できる「挿入」または「欠失」塩基数は１個である必要はなく、２以上の任意の数、例えば２〜１０００個、特に２〜５００個であってもよい。もちろん、「挿入」または「欠失」した塩基が飛び飛びに（不連続で）あり、一連の「挿入」または「欠失」を構成している場合には、１セットのプライマー(A,B,C)で検出可能であるが、「挿入」または「欠失」部位の相互の関係が無い場合には、近傍の位置にある「挿入」または「欠失」でも２以上のプライマー(A,B,C)のセットを使用することができる。【００３８】
本発明に用いる判定したい該塩基部位の上流および／または下流領域と相補的または相同的な配列を有する少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（B、C）は、プライマー（A）との関係で、
（１）プライマー（A）がセンスプライマーもしくはアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ；
（２）プライマー（A）がセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の下流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）；
（３）プライマー（A）がアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、上流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）；
のいずれの組み合わせについても適用することができる。【００３９】
少なくとも２種の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を使用する場合、プライマー（Ａ）が同じ方向である場合には、該プライマー（Ａ）は、オリゴヌクレオチドプライマー（B、C）の間（該プライマー（Ａ）がプライマー（Ｂ）とプライマー（Ｃ）に挟まれる位置）にあってもよく（図１の１を参照）、プライマー（Ｂ）とプライマー（Ｃ）の外側にあってもよい（図１の２，３を参照）。なお、図1において、Ｘ、Ｘ’は塩基を判定したい部位を示す。右向きプライマーはフォワードプライマー、左向きはリバースプライマー示す。（Ａ）及び（Ａ’）は少なくとも２種の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を簡易的に図示しており、２種類に限定されるものではない。また、プライマー（A）は、同じ方向（両方ともセンスプライマー或いは両方ともアンチセンスプライマー）の例を出したが、図１の１では異なる方向（一方がセンスプライマーで、他方がアンチセンスプライマー）であってもよい。【００４０】
一方、少なくとも２種の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）が異なる方向である場合には、該プライマー（Ａ）は、オリゴヌクレオチドプライマー（B、C）の間（該プライマー（Ａ）がプライマー（Ｂ）とプライマー（Ｃ）に挟まれる位置）にある。【００４１】
なお、判定したい該塩基部位は、野生型と変異型を合わせて合計４つの塩基の可能性がある。従って、プライマー（Ａ）は１〜４種類の可能性がある。判定したい該塩基部位が３種の塩基を有する可能性があるとき、プライマー（Ａ）は２種または３種を使用でき、判定したい該塩基部位が４種の塩基を有する可能性があるとき、プライマー（Ａ）は３種または４種を使用できる。
「欠失」の場合、「欠失」する塩基もしくは塩基配列と同じ又は相補的な塩基もしくは塩基配列を含むように設計された塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）と、「欠失」の予想される部位の上流と下流の塩基もしくは塩基配列と同じ又は相補的な塩基もしくは塩基配列を含み、かつ、欠失する塩基もしくは塩基配列と同じ又は相補的な塩基もしくは塩基配列を含まないように設計された塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）の２種類を同時に使用してもよい。また、欠失が予想される塩基もしくは塩基配列の存在を判定すれば良いので、すくなくとも１種のプライマー（Ａ）を使用してもよい。
「挿入」の場合、「挿入」する塩基もしくは塩基配列と同じ又は相補的な塩基もしくは塩基配列を含むように設計された塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）と、「挿入」の予想される部位の上流と下流の塩基もしくは塩基配列と同じ又は相補的な塩基もしくは塩基配列を含み、かつ、挿入される塩基もしくは塩基配列と同じ又は相補的な塩基もしくは塩基配列を含まないように設計された塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）の２種類を同時に使用してもよい。また、挿入が予想される塩基もしくは塩基配列の存在を判定すればよいので、少なくとも１種のプライマー（A）を使用してもよい。【００４２】
本発明において、プライマー（A），(B)、(C)は、下記の（１）〜（３）のいずれかの組み合わせから選択される：
（１）プライマー（A）がセンスプライマーもしくはアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ；
（２）プライマー（A）がセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の下流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）；
（３）プライマー（A）がアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流
領域と相同的なセンスプライマー(B)と、上流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）。【００４３】
これらの組み合わせは、効果的に複合し、組み合わされても良い。つまり、例を挙げれば、（１）の組み合わせにおいて、センスプライマー（B）の上流領域に判定したい塩基部位があれば、別途、新規にセンスプライマーのプライマー（A）を追加しても良い。また、アンチセンスプライマー（C）の下流領域に判定したい塩基部位があれば、新規にアンチセンスプライマーのプライマー（A）を追加しても良い。（２）の組み合わせにおいて、アンチセンスプライマー（C）の下流領域に判定したい塩基部位があれば、新規にアンチセンスプライマーのプライマー（A）を追加しても良い。（３）の組み合わせにおいて、センスプライマー（B）の上流領域に判定したい塩基部位があれば、別途、新規にセンスプライマーのプライマー（A）を追加しても良い。【００４４】
本発明においては、もっとも重要な発明の開示は、判定したい該塩基部位を含む少なくとも１種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）と、オリゴヌクレオチドプライマー(B)及び(C)が、
（１）プライマー（A）がセンスプライマーもしくはアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ；
（２）プライマー（A）がセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の下流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）；
（３）プライマー（A）がアンチセンスプライマーであって、判定したい塩基部位の上流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、上流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組合せ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）；
のいずれかから選択される組み合わせとによるプライマー（Ａ，Ｂ，Ｃ）を同時に遺伝子増幅反応に供しても、非特異的な増幅反応が意外にも生じず、増幅産物長により判定したい塩基の有無及び箇所を簡便に特定できることを見いだしたことにある。【００４５】
本発明を、例を挙げて説明する。すなわち、上記（１）に記載のオリゴヌクレオチドプライマー（BおよびC）を用いて核酸増幅法を利用した方法では、増幅される領域内の塩基の有無に関わらずオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）と（Ｃ）により挟まれた配列が特異的に増幅されると認識される。この反応において、判定したい該塩基部位を含む少なくとも１種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）が加えられた場合、試料中
の核酸配列に標的となる塩基が存在する場合は、塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）とオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）または（Ｃ）によって標的塩基を有する核酸配列も特異的に増幅され、前述の増幅産物に加え、さらにもう1種類の増幅産物が得られることは容易に認識される。しかしながら、試料中の核酸配列に標的となる塩基が存在しない場合でも、オリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）と（Ｃ）によりはさまれた配列が特異的に増幅され鋳型となる核酸断片が幾何級数的に増加するため、塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）による非特異的な増幅反応が生じ、結果として前述の増幅産物に加え、さらにもう1種類の増幅産物が得られることが予想されていた。この場合、特定の塩基の存在の如何に関わらず、常に２種類以上の増幅核酸断片が得られるため、該塩基部位の上流および下流領域と相補的または相同的な配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（BおよびC）と塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）の存在下、特定の塩基を判定することは困難と考えられていた（ＰＣＲ
ＣＬＡＭＰＩＮＧ」
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ，
ＵＫ． １９９９， ｐ．１９３−２００）。【００４６】
ところが実際に実験を行なった結果、意外にも、試料中の核酸配列に特定の塩基がある場合、塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）及び該塩基部位の上流および下流領域と相補的または相同的な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー（BまたはC）によって得られた遺伝子断片が選択的に生じ、かつ核酸配列中に変異がない場合でも、塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）は、非特異的な増幅反応を生じないことが確認された。このような結果が得られたことは全く予想できないことであった。【００４７】
このことは、これまでアレル特異的オリゴヌクレオチドを用いた変異型核酸配列検出において、必要不可欠とされていた野生型核酸配列検出と変異型核酸配列検出を別々に実施する必要がなくなることを意味する。従って、検出に要する労力・試薬は半減するなどの経済的効果はもちろんのこと、試料に起因する増幅不良等の検出エラーの低減にも有効な手段を提供することが可能になる。
判定したい該塩基部位を含む塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）と、上記オリゴヌクレオチドプライマー（B、C）の組み合わせにより、「判定したい塩基部位」である「変異」、「置換」、「一塩基多型」、「挿入」又は「欠失」が容易に判定できる。以下、一例として、検出方法を場合分けして図を用いて説明するが、これに限定されるものではない。
「判定したい塩基部位」が「変異」又は「置換」の場合を、図２を用いて説明する。
図２において、Ｘは「変異」又は「置換」の塩基を示す。右向きプライマーはフォワードプライマー、左向きはリバースプライマー示す。
図２−１
「変異」又は「置換」を判定するために、変異後の塩基、又は置換後の塩基と同じ塩基を含むように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（１）判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせを選択した場合である。
プライマー（Ａ，Ｃ）の増幅産物が得られれば、「変異」又は「置換」があると判断する。
図２−２
「変異」又は「置換」を判定するために、変異後の塩基、又は置換後の塩基と相補的な塩基を含むように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（１）判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせを選択した場合である。
プライマー（Ａ，Ｂ）の増幅産物が得られれば、「変異」又は「置換」があると判断する。
図２−３
「変異」又は「置換」を判定するために、変異後の塩基、又は置換後の塩基と同じ塩基を含むように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（２）判定したい塩基部位の下流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）を選択した場合である。
プライマー（Ａ，Ｃ）の増幅産物が得られれば、「変異」又は「置換」があると判断する。
図２−４
「変異」又は「置換」を判定するために、変異後の塩基、又は置換後の塩基と相補的な塩基を含むように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（３）判定したい塩基部位の上流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、上流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）を選択した場合である。
プライマー（Ａ，Ｂ）の増幅産物が得られれば、「変異」又は「置換」があると判断する。
「判定したい塩基部位」が「一塩基多型」の場合を、図３を用いて説明する。
図３において、Ｘと、Ｙは異なる塩基を示す。右向きプライマーはフォワードプライマー、左向きはリバースプライマー示す。（Ａ）と（Ａ’）は異なる塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を示す。
図３−１
「一塩基多型」を判定するために、Ｘの塩基と同じ塩基を含むように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、また、Ｙの塩基と相補的な塩基を含むように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A’）を設定し、（１）判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせを選択した場合である。
Ｘが変異型、Ｙが野生型の場合には、プライマー（Ａ，Ｃ）の増幅産物のみ得られれば、Ｘ（変異型）のホモ、プライマー（Ａ’，Ｂ）の増幅産物のみ得られれば、Ｙ（野生型）のホモ、プライマー（Ａ，Ｃ）の増幅産物とプライマー（Ａ’，Ｂ）の増幅産物が得られれば、Ｘ（変異型）とＹ（野生型）のヘテロと判断する。Ｘが変異型、Ｙが別の変異型の場合には、プライマー（Ａ，Ｃ）の増幅産物が得られれば、Ｘへの変異型であると判断でき、プライマー（Ａ’）の増幅産物が得られれば、Ｙへの変異型であると判断できる。
図３−２
「一塩基多型」を判定するために、Ｙの塩基と相補的な塩基を含むように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（１）判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせを選択した場合である。
Ｘが変異型、Ｙが野生型の場合には、プライマー（Ｂ，Ｃ）の増幅産物のみ得られれば、Ｘ（変異型）のホモ、プライマー（Ａ，Ｂ）の増幅産物のみ得られれば、Ｙ（野生型）のホモ、プライマー（Ｂ，Ｃ）の増幅産物とプライマー（Ａ，Ｂ）の増幅産物が得られれば、Ｘ（変異型）とＹ（野生型）のヘテロと判断する。
図３−３
「一塩基多型」を判定するために、Ｘの塩基と同じ塩基を含むように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（１）判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせを選択した場合である。
Ｘが変異型、Ｙが野生型の場合には、プライマー（Ａ，Ｃ）の増幅産物のみ得られれば、Ｘ（変異型）のホモ、プライマー（Ｂ，Ｃ）の増幅産物のみ得られれば、Ｙ（野生型）のホモ、プライマー（Ａ，Ｃ）の増幅産物とプライマー（Ｂ，Ｃ）の増幅産物が得られれば、Ｘ（変異型）とＹ（野生型）のヘテロと判断する。
図３−４
「一塩基多型」を判定するために、Ｘの塩基と同じ塩基を含むように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（２）判定したい塩基部位の下流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）を選択した場合である。Ｘが変異型、Ｙが野生型の場合には、プライマー（Ａ，Ｃ）の増幅産物が得られれば、少なくともＸへの変異型があると判断する。プライマー（Ｂ，Ｃ）の増幅産物のみ得られれば、少なくともＸへの変異型がないと判断する。
図３−５
「一塩基多型」を判定するために、Ｙの塩基と相補的な塩基を含むように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（３）判定したい塩基部位の上流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、上流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）を選択した場合である。
Ｘが変異型、Ｙが野生型の場合には、プライマー（Ａ，Ｂ）の増幅産物が得られれば、少なくとも野生型があると判断する。プライマー（Ｂ，Ｃ）の増幅産物のみ得られれば、少なくとも野生型がないと判断する。
「判定したい塩基部位」が「挿入」の場合を、図４を用いて説明する。
図４において、「i」は塩基ではなく「挿入」の予想される部位を示す。「IIIIIIIIII」は挿入された塩基または塩基配列を示す。右向きプライマーはフォワードプライマー、左向きはリバースプライマー示す。
図４−１
「挿入」を判定するためには、「挿入」の予想される部位（i）の上流と下流の塩基もしくは塩基配列と同じ塩基もしくは塩基配列を含み、かつ、挿入される塩基もしくは塩基配列（IIIIIIIIII）と同じ塩基もしくは塩基配列を含まないように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（１）判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせを選択した場合である。
プライマー（Ａ，Ｃ）の増幅産物しか得られなければ、「挿入」がないと判断する。
図４−２
「挿入」を判定するためには、「挿入」の予想される部位（i）の上流と下流の塩基もしくは塩基配列と相補的な塩基もしくは塩基配列を含み、かつ、挿入される塩基もしくは塩基配列（IIIIIIIIII）と相補的な塩基もしくは塩基配列を含まないように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（１）判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせを選択した場合である。
プライマー（Ａ，B）の増幅産物しか得られなければ、「挿入」がないと判断する。
図４−３
「挿入」を判定するためには、「挿入」の予想される部位（i）の上流と下流の塩基もしくは塩基配列と同じ塩基もしくは塩基配列を含み、かつ、挿入される塩基もしくは塩基配列（IIIIIIIIII）と同じ塩基もしくは塩基配列を含まないように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（２）判定したい塩基部位の下流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）を選択した場合である。
プライマー（Ａ，Ｃ）の増幅産物しか得られなければ、「挿入」がないと判断する。
図４−４
「挿入」を判定するためには、「挿入」の予想される部位（i）の上流と下流の塩基もしくは塩基配列と相補的な塩基もしくは塩基配列を含み、かつ、挿入される塩基もしくは塩基配列（IIIIIIIIII）と相補的な塩基もしくは塩基配列を含まないように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（３）判定したい塩基部位の上流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、上流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）を選択した場合である。
プライマー（Ａ，B）の増幅産物しか得られなければ、「挿入」がないと判断する。
図４−５
「挿入」を判定するためには、「挿入」の予想される部位（i）の上流もしくは下流の塩基もしくは塩基配列と同じ塩基もしくは塩基配列を含み、かつ、挿入される塩基もしくは塩基配列（IIIIIIIIII）と同じ塩基もしくは塩基配列を含むように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（１）判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせを選択した場合である。
プライマー（Ａ，Ｃ）の増幅産物が得られれば、「挿入」があると判断する。
図４−６
「挿入」を判定するためには、「挿入」の予想される部位（i）の上流もしくは下流の塩基もしくは塩基配列と相補的な塩基もしくは塩基配列を含み、かつ、挿入される塩基もしくは塩基配列（IIIIIIIIII）と相補的な塩基もしくは塩基配列を含むように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（１）判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせを選択した場合である。
プライマー（Ａ，B）の増幅産物が得られれば、「挿入」があると判断する。
図４−７
「挿入」を判定するためには、「挿入」の予想される部位（i）の上流もしくは下流の塩基もしくは塩基配列と同じ塩基もしくは塩基配列を含み、かつ、挿入される塩基もしくは塩基配列（IIIIIIIIII）と同じ塩基もしくは塩基配列を含むように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（２）判定したい塩基部位の下流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）を選択した場合である。
プライマー（Ａ，Ｃ）の増幅産物が得られれば、「挿入」があると判断する。
図４−８
「挿入」を判定するためには、「挿入」の予想される部位（i）の上流と下流の塩基もしくは塩基配列と相補的な塩基もしくは塩基配列を含み、かつ、挿入される塩基もしくは塩基配列（IIIIIIIIII）と相補的な塩基もしくは塩基配列を含むように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（３）判定したい塩基部位の上流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、上流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）を選択した場合である。プライマー（Ａ，B）の増幅産物が得られれば、「挿入」があると判断する。
「判定したい塩基部位」が「欠失」の場合を、図５を用いて説明する。
図５において、「DDDDDDDDDD」は欠失が予想される塩基または塩基配列を示す。「ｄ」は塩基ではなく「欠失」後の部位を示す。右向きプライマーはフォワードプライマー、左向きはリバースプライマー示す。
図５−１
「欠失」を判定するためには、「欠失」の予想される部位の上流と下流の塩基もしくは塩基配列と同じ塩基もしくは塩基配列を含み、かつ、欠失する塩基もしくは塩基配列「DDDDDDDDDD」と同じ塩基もしくは塩基配列を含まないように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（１）判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせを選択した場合である。
プライマー（Ａ，Ｃ）の増幅産物が得られれば、「欠失」があると判断する。
図５−２
「欠失」を判定するためには、「欠失」の予想される部位の上流と下流の塩基もしくは塩基配列と相補的な塩基もしくは塩基配列を含み、かつ、欠失する塩基もしくは塩基配列「DDDDDDDDDD」と相補的な塩基もしくは塩基配列を含まないように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（１）判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセン
スプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせを選択した場合である。
プライマー（Ａ，B）の増幅産物が得られれば、「欠失」があると判断する。
図５−３
「欠失」を判定するためには、「欠失」の予想される部位の上流と下流の塩基もしくは塩基配列と同じ塩基もしくは塩基配列を含み、かつ、欠失する塩基もしくは塩基配列「DDDDDDDDDD」と同じ塩基もしくは塩基配列を含まないように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（２）判定したい塩基部位の下流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）を選択した場合である。
プライマー（Ａ，C）の増幅産物が得られれば、「欠失」があると判断する。
図５−４
「欠失」を判定するためには、「欠失」の予想される部位の上流と下流の塩基もしくは塩基配列と相補的な塩基もしくは塩基配列を含み、かつ、欠失する塩基もしくは塩基配列「DDDDDDDDDD」と相補的な塩基もしくは塩基配列を含まないように塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（３）判定したい塩基部位の上流領域と相同的なセン
スプライマー(B)と、上流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）を選択した場合である。
プライマー（Ａ，B）の増幅産物が得られれば、「欠失」があると判断する。
図５−５
「欠失」を判定するためには、「欠失」する塩基もしくは塩基配列（DDDDDDDDDD）と相補的な塩基もしくは塩基配列を含み、３’末端の１〜５塩基は、「欠失」する塩基もしくは塩基配列の下流の塩基もしくは塩基配列と一致しないようにした塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（１）判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせを選択した場合である。
プライマー（Ａ，B）の増幅産物が得られれば、「欠失」がないと判断する。
図５−６
「欠失」を判定するためには、「欠失」する塩基もしくは塩基配列（DDDDDDDDDD）とおなじ塩基もしくは塩基配列を含み、３’末端の１〜５塩基は、「欠失」する塩基もしくは塩基配列の下流の塩基もしくは塩基配列と一致しないようにした塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（１）判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせを選択した場合である。
プライマー（Ａ，C）の増幅産物が得られれば、「欠失」がないと判断する。
図５−７
「欠失」を判定するためには、「欠失」する塩基もしくは塩基配列（DDDDDDDDDD）と同じ塩基もしくは塩基配列を含み、３’末端の１〜５塩基は、「欠失」する塩基もしくは塩基配列の下流の塩基もしくは塩基配列と一致しないようにした塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（２）判定したい塩基部位の下流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）を選択した場合である。
プライマー（Ａ，C）の増幅産物が得られれば、「欠失」がないと判断する。
図５−８
「欠失」を判定するためには、「欠失」する塩基もしくは塩基配列（DDDDDDDDDD）と相補的な塩基もしくは塩基配列を含み、３’末端の１〜５塩基は、「欠失」する塩基もしくは塩基配列の下流の塩基もしくは塩基配列と一致しないようにした塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を設定し、（３）判定したい塩基部位の上流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、上流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）を選択した場合である。
プライマー（Ａ，B）の増幅産物が得られれば、「欠失」がないと判断する。【００４８】
本発明では、増幅反応の正否までも一度に判定できる。本発明では、プライマー（A）からの伸長反応による増幅産物が得られない場合でも、少なくともプライマー（B）とプライマー（C）の組み合わせによる増幅産物が得られる仕組みになっている。本発明に従い、塩基の判定を実施した際に、何の増幅産物も得られなかったときは、増幅反応そのものが不成功であったことを示している。これは、従来の判定方法において、何の増幅産物も得られなかった場合、変異、置換、一塩基多型、挿入又は欠失が存在しないのか、増幅反応が不成功に終わったのか判別できないという問題点を克服するものである。【００４９】
該塩基部位を含む核酸配列と相同または相補的な少なくとも1種類のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）としては、該塩基部位（野生型または変異型）を含み且つ生成物の核酸配列と相同または相補的な塩基配列を備えたオリゴヌクレオチドが広く包含される。【００５０】
また、該塩基部位を含む核酸配列と少なくとも１塩基異なる配列を有する相同または相補的な少なくとも1種類のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｅ）としては、前記オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）とさらに少なくとも１塩基（好ましくは１塩基）異なる配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。プローブは、標識プローブとして使用される。標識プローブは新たに生成した配列に対してハイブリダイズするように設計されているので、既に存在している核酸の影響を受けることなく、伸長反応により新たに生成した伸長生成物を、効率よく検出することができる。プローブの標識としては、プライマーの標識と同様のものが使用され、プライマーとプローブの両方を標識する場合には、異なる標識を好ましく使用できる。【００５１】
蛍光色素で予め標識されたオリゴヌクレオチドプローブと、５´ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを利用したいわゆるＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイであれば、ＰＣＲ反応と共に一塩基変異（多型）の検出が可能な試料を解析する上では極めて有効な方法である。あるいは、オリゴヌクレオチドプローブを用いた融解曲線解析を行なうことによっても、配列を特定することができる。他の方法としては、得られた核酸断片をＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩやエチレンブロマイドなどのインターカレーターを用いて蛍光検出することも可能であり、電気泳動にて増幅断片を検出しても良い。
点突然変異部位に実質的に相同あるいは相補的なオリゴヌクレオチドプローブは水不溶性単体に固定されていてもよい。水不溶性担体としては、合成高分子、生体高分子、金属、ガラスなどが例示される。すなわち、水不溶性担体に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブに予め1本鎖にされたPCR産物を添加することにより、担体上にPCR産物が結合され
る。結合されたPCR産物が予め標識されていれば、その標識を検出することによって、PCR産物の配列を特定することが可能である。
オリゴヌクレオチドプローブは、これらの水不溶性担体にアレイ状に配置し、ＤＮＡアレイとして用いてもよい。【００５２】
本発明において、上記オリゴヌクレオチドプライマーの伸長方法は、基本的には、従来の方法を用いて行うことができる。通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼを共に、作用させることで、標的核酸を鋳型としてオリゴヌクレオチドが伸長する。該伸長反応は、Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (Sambrookら、１９８９)に記載の方法に従って行うことができる。【００５３】
核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-basedamplification method；Ｎａｔｕｒｅ 第３５０巻、第９１頁(1991)）、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand
Displacement Amplification：Nucleic acid research 第２０巻、第１６９１頁(1992)）、ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Transcription
mediated amplification method；J.Clin.Microbiol. 第３１巻、第３２７０頁(1993)）ＬＡＭＰ（loop-mediated
isothermal amplification method :J Clin Microbiol. 2004 第42巻:第1,956頁）、ＩＣＡＮ（isothermal
and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids: Kekkaku. 2003 第78巻、第５３３頁）などが挙げられる。【００５４】
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各オリゴヌクレオチドを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２n倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。【００５５】
遺伝子増幅法がＰＣＲの場合、判定したい塩基の存在は、得られる増幅核酸断片長によって簡単に判定することができる。すなわち得られた増幅核酸断片が、判定したい該塩基部位の上流および下流領域と相補的または相同的な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー（B、C）のいずれか１種類と判定したい塩基を含むまたは欠失した塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）によるものか、または判定したい該塩基部位の上流および下流領域と相補的または相同的な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー（B、C）による前述の増幅核酸断片より鎖長の長い増幅核酸断片であるかを、電気泳動法などの既知の方法によって検出することによって、該塩基の存在を判定することができる。PCR増幅に使用されるDNAポリメラーゼは特に限定されず、任意のDNAポリメラーゼを使用することが出来る。
（１）判定したい塩基部位の上流領域に相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域に相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせの場合、好適には５´エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼを使用できる。５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼとしては、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus
furiosus) 由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ (Pfuポリメラーゼ 、WO92/09689、特開平5-328969公報）、サーマス・リトラリス(Thermococcus
litoralis)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ(Tliポリメラーゼ 、特開平6-7160号公報）パイロコッカス(Pyrococcus)ｓｐ．ＫＯＤ１由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
(KODポリメラーゼ 、特開平7-298879号公報)などが挙げられる。
（２）判定したい塩基部位の下流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、下流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）；（３）判定したい塩基部位の上流領域と相同的なセンスプライマー(B)と、上流領域と相補的なアンチセンスプライマー(C)との組み合わせ（但し、プライマー（C）はプライマー（B）よりも下流にある）との組み合わせの場合、好適には５´エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用できる。５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Bst
DNAポリメラーゼなどがある。なおこれらの酵素はあくまで例示であり、なんら限定されるものではなく、同様の作用を有するポリメラーゼも本発明において使用しうる。【００５６】
本発明によって得られた核酸断片（増幅産物）の検出方法としては、特に限定されるものではないが、電気泳動法、ハイブリによる検出方法、蛍光検出方法、融解曲線解析法、熱溶出クロマトグラム法等、既存の方法を適宜使用することができる。【００５７】
電気泳動法は極めて簡便な検出方法として使用することができる。すなわち得られた増幅核酸断片が、判定したい該塩基部位の上流および下流領域と相補的または相同的な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー（B、C）のいずれか１種類と判定したい塩基を含むまたは欠失した塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）による増幅核酸断片と、判定したい該塩基部位の上流および下流領域と相補的または相同的な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー（B、C）による前述の増幅核酸断片の鎖長の長さが異なれば、簡単に区別することができる。【００５８】
塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）による増幅核酸断片が得られた場合、野生型の配列と少なくとも１塩基は異なっているため、ハイブリによる検出方法、融解曲線解析法、熱溶出クロマトグラム法を用いることが可能である。さらに、好適には塩基判定用オリゴヌクレオチドの３´末端より３から5番目に少なくとも１箇所の非相補的な塩基を導入した場合、野生型の核酸配列とは少なくとも２塩基以上異なった配列となるためハイブリ検出における特異性も極めて高いものとなる。【００５９】
また使用するプライマーは場合により標識されたものを使用することも可能である。また、プローブは標識したものが好ましく使用される。使用される標識としては、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群より選ぶことができる。【００６０】
標識の検出は既知の方法であれば特に限定されるものではないが、標識が蛍光化学物質または蛍光蛋白質の場合、特定波長の光を照射し蛍光化学物質または蛍光蛋白質を励起させ、基底状態に変換される際に生じる特定波長の蛍光量を測定することが可能である。これらに用いられる蛍光化学物質としては、FITC、FAM、TAMRA、TexasRed、VIC、Cy3、Cy5、HEX等が挙げられ、蛍光蛋白質としては、GFP、YFP、RFP等を挙げることができる。標識が酵素である場合、酵素の基質を添加することによって生成される反応生成物を検出することによって測定が可能である。これらに用いられる酵素と基質の組み合わせとしては、アルカリフォスファターゼとパラニトロフェニルリン酸、CDP-star、AMPPD、DDAOphospate、BCIP-NBT等の組み合わせ、パーオキシダーゼとTMB、Lumi-Light（ロッシュ・ダイアグノスティックス）、SAT-1（同仁化学）等の組み合わせ、ジアホラーゼとNTB等の組み合わせ、各種オキシダーゼと基質、各種デヒドロゲナーゼと基質の組み合わせ等、反応生成物が検出されるものであれば、これらに限定されることはなく用いることが可能である。標識が磁性体の場合、磁気を検出することによって測定が可能である。標識が導電性物質の場合、電流値を検出することによって測定が可能である。【００６１】
本発明において、キットとしては、ＤＮＡポリメラーゼと、判定したい該塩基部位の上流および下流領域と相補的または相同的な配列を有する少なくとも2種類のオリゴヌクレオチドプライマー（B、C）と判定したい塩基を含むまたは欠失した少なくとも1種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（A）を少なくとも含んでおればよい。さらに、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸を含んでいてもよい。【００６２】
アッセイに用いる試料は、生体材料（血液、血漿、粘膜、爪、毛髪、体液、粘液、組織または組織片など）、環境試料（河川水、汚泥、排水、土壌または大気）、または食品（農産物、畜産物、加工食品又は海産物など）、ウイルス、細菌またはその培養液などがあげられるがこれらに限定されるものではない。これらの試料から、既知の方法により調製してもよい。代表的なものとして、フェノール／クロロホルム抽出法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ
第７２巻、第６１９〜６２９頁、１９６
３年）、アルカリＳＤＳ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第７巻、第１５１３〜１５２３頁、１９７９年）等の液相で行う方法がある。また、核酸の単離に核酸結合用担体を用いる系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウム溶液を使用する方法（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ）ＵＳＡ 第７６−２巻、第６１５〜６１９頁、１９７
９年）、ハイドロキシアパタイトを用いる方法（特開昭６３−２６３０９３号公報）等がある。その他の方法としてはシリカ粒子とカオトロピックイオンを用いた方法（Ｊ）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
第２８−３巻、第４９５〜５０３頁、１９９０年、特開平２−２８９５９６号公報）が挙げられる。【００６３】
本発明により、検出に要する労力・試薬は半減するなどの経済的効果はもちろんのこと、試料に起因する増幅不良等の検出エラーの低減にも有効な手段とキットを提供することが可能になる。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
（１）bcr-ablキメラ遺伝子のabl遺伝子ATP結合領域の変異を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号1〜4に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ1〜4と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、オペロン（株）、プロリゴ（株）、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。オリゴ１が共通センスプライマー（Ｂ）であり、オリゴ2が共通アンチセンスプライマー（Ｃ）であり、両共通プライマーを組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ3はbcr-ablキメラ遺伝子のabl遺伝子ATP結合領域の（E255K）変異遺伝子を増幅するためのプライマー（Ａ）である。オリゴ４はbcr-ablキメラ遺伝子のabl遺伝子ATP結合領域の（T315I）遺伝子変異を増幅するためのプライマー（Ａ）である。【００６５】
［実施例１］
（２）PCR法によるbcr-ablキメラ遺伝子のabl遺伝子ATP結合領域の（E255K）遺伝子変異の解析 
（トータルＲＮＡの調製）
白血病 細胞株から抽出したトータルＲＮＡをカラム（ＱＩＡａｍｐＲＮＡ  Ｂｌｏｏ
ｄ Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ; ＱＩＡＧＥＮ社製）に吸着させ、カラムを洗浄後、吸着したＲＮ
ＡをＤＥＰＣ水（ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ａｎｄ  ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  ｗａｔｅｒ）で溶出した。ＲＮＡの濃度と純度は、吸光度Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍの比で確認した。【００６６】
（ｃＤＮＡの調製）
上記で得られたトータルＲＮＡ２μｇを、５００ｎｇのランダムプライマー、２００ユニットの逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ; ＧＩＢＣＯ社製）、４０ユニットのＲＮａｓｅ阻害剤（ＧＩＢＣＯ社）及び１ｍＭ
ｄＮＴＰを含む４５μｌの反応液中で逆転写して調製した。【００６７】
（ＰＣＲの実施）
上記で調製したｃＤＮＡ２.２５μｌ、オリゴ１（配列番号１）、オリゴ２（配列番号２）、オリゴ３（配列番号３）を各５ｐmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ
ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃で２分、次いで９４℃−１５秒のデナチュレーション工程、及び６２．５℃−３０秒のアニーリング及び６８℃−３０秒のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計３５サイクル行うことにより実施した。【００６８】
（電気泳動を用いた検出）
増幅反応液5μｌを１0％アクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行なった。結果を、図６に示す。【００６９】
［実施例2］
PCR法によるbcr-ablキメラ遺伝子のabl遺伝子ATP結合領域の（T315I）遺伝子変異の解析（トータルＲＮＡの調製）
白血病 細胞株から抽出したトータルＲＮＡをカラム（ＱＩＡａｍｐＲＮＡ  Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ; ＱＩＡＧＥＮ社製）に吸着させ、カラムを洗浄後、吸着したＲＮＡをＤＥＰＣ水（ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ａｎｄ  ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  ｗａｔｅｒ）で溶出した。ＲＮＡの濃度と純度は、吸光度Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍの比で確認した。【００７０】
（ｃＤＮＡの調製）
上記で得られたトータルＲＮＡ２μｇを、５００ｎｇのランダムプライマー、２００ユニットの逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ; ＧＩＢＣＯ社製）、４０ユニットのＲＮａｓｅ阻害剤（ＧＩＢＣＯ社）及び１ｍＭ
ｄＮＴＰを含む４５μｌの反応液中で逆転写して調製した。【００７１】
（ＰＣＲの実施）
上記で調製したｃＤＮＡ２.２５μｌ、オリゴ１（配列番号１）、オリゴ２（配列番号２）、オリゴ４（配列番号４）を各５ｐmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ
ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃で２分、次いで９４℃−１５秒のデナチュレーション工程、及び６２．５℃−３０秒のアニーリング及び６８℃−３０秒のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計３５サイクル行うことにより実施した。【００７２】
（電気泳動を用いた検出）
増幅反応液5μｌを１％アクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行なった。結果を図７に示す。【００７３】
上記のように、変異を含む領域を増幅させる少なくとも１対のオリゴヌクレオチド、DNAポリメラーゼおよび変異核酸配列を特異的に増幅させる少なくとも１本以上のオリゴヌクレオチドを同時に用いることで、容易にかつ迅速に遺伝子型を明確に判定することができた。【００７４】
［実施例3］
（１）CYP２C19遺伝子の681（G→A）一塩基変異多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号5〜8に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ5〜8と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、オペロン（株）、プロリゴ（株）、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。オリゴ5（配列番号５）が共通センスプライマー（Ｂ）であり、オリゴ6（配列番号６）が共通アンチセンスプライマー（Ｃ）であり、両共通プライマーを組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ7（配列番号７）はCYP2C19遺伝子の681G遺伝子（野生型）を増幅するためのプライマー（Ａ）である。オリゴ8（配列番号８）はCYP2C19遺伝子の681A遺伝子（変異型）を増幅するためのプライマー（Ａ）である。【００７５】
PCR法によるCYP２C19遺伝子の681（G→A）一塩基変異多型の解析
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトCYP2C19遺伝子の塩基多型
(681G→A)を解析した。【００７６】
（ＰＣＲの実施）
上記で調製した試料1μｌ、オリゴ５〜８を各５ｐmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃で２分、次いで９４℃−１５秒のデナチュレーション工程、及び６０℃−３０秒のアニーリング及び６８℃−３０秒のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計３５サイクル行うことにより実施した。【００７７】
（電気泳動を用いた検出）
増幅反応液5μｌを３％アガロースゲルを用いて電気泳動を行なった。結果を図８に示す。
電気泳動結果が示す通り、試料によって得られる増幅断片が異なっていることから、容易に配列を判定することができる。【００７８】
［実施例4］
（１）CYP２C19遺伝子の636（G→A）一塩基変異多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号9〜12に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ9〜12と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、オペロン（株）、プロリゴ（株）、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。オリゴ9が共通センスプライマー（Ａ）であり、オリゴ10が共通アンチセンスプライマー（Ｂ）であり、両共通プライマーを組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ11はCYP2C19遺伝子の636G遺伝子（野生型）を増幅するためのプライマーである。オリゴ12はCYP2C19遺伝子の636A遺伝子（変異型）を増幅するためのプライマーである。【００７９】
PCR法によるCYP２C19遺伝子の636（G→A）一塩基変異多型の解析
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトCYP2C19遺伝子の塩基多型
(636G→A)を解析した。【００８０】
（ＰＣＲの実施）
上記で調製した試料1μｌ、オリゴ9を10ｐmoles、オリゴ10を5pmoles、オリゴ11を30pmoles、オリゴ12を7.5pmolesおよび１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ
ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃で２分、次いで９４℃−１５秒のデナチュレーション工程、及び６０℃−３０秒のアニーリング及び６８℃−３０秒のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計３５サイクル行うことにより実施した。【００８１】
（電気泳動を用いた検出）
増幅反応液5μｌを３％アガロースゲルを用いて電気泳動を行なった。結果を図９に示す。
ＧＧまたはＧ／Ｇは野生型のホモ、Ａ／Ａは変異型のホモ、Ｇ／Ａはヘテロを示す。電気泳動結果が示す通り、試料によって得られる増幅断片が異なっていることから、容易に配列を判定することができる。【００８２】
[実施例5]
（１）CYP2C9遺伝子の1075（A→C）一塩基変異多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１3〜16に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ13〜16と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、オペロン（株）、プロリゴ（株）、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。オリゴ１3が共通センスプライマー（Ｂ）であり、オリゴ14が共通アンチセンスプライマー（Ｃ）であり、両共通プライマーを組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ15はCYP2C9遺伝子の1075A遺伝子（野生型）を増幅するためのプライマー（Ａ）である。オリゴ16はCYP2C9遺伝子の1075C遺伝子（変異型）を増幅するためのプライマー（Ａ）である。【００８３】
PCR法によるCYP２C9遺伝子の1075（A→C）一塩基変異多型の解析
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液（試料１、２）および変異型遺伝子をクローニングしたプラスミドDNA溶液（試料３）をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトCYP2C9遺伝子の塩基多型
(1075A→C)を解析した。【００８４】
（ＰＣＲの実施）
上記で調製した試料1μｌ、オリゴ１3を１０pmoles、オリゴ14を２．５pmoles、オリゴ15および16を各３０pmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ
ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃で２分、次いで９４℃−１５秒のデナチュレーション工程、及び６０℃−３０秒のアニーリング及び６８℃−３０秒のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計３５サイクル行うことにより実施した。【００８５】
（電気泳動を用いた検出）
増幅反応液5μｌを３％アガロースゲルを用いて電気泳動を行なった。結果を図１０に示す。ＡＡは野生型のホモ、ＣＣは変異型のホモ、ＡＣはヘテロを示す。電気泳動結果が示す通り、試料によって得られる増幅断片が異なっていることから、容易に配列を判定することができる。【００８６】
[実施例6]
（１）ヒトEGFR遺伝子のエクソン19 Del E746-A750欠損変異を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１7〜20に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１7〜20と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、オペロン（株）、プロリゴ（株）、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。オリゴ１7がエクソン21共通センスプライマー（Ｂ）であり、オリゴ18がエクソン21共通アンチセンスプライマー（Ｃ）であり、両共通プライマーを組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ19はエクソン19共通センスプライマーであり、オリゴ20はEGFR遺伝子のエクソン19
Del E746-A750欠損変異遺伝子（変異型）を増幅するためのプライマー（Ａ）である。【００８７】
（２）PCR法によるヒトEGFR遺伝子の欠損変異の解析
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液（試料１）、およびヒトEGFRエクソン19
Del E746-A750欠損変異遺伝子を含むプラスミドDNA溶液（試料2）、以下、Del L747-S752（試料3）、Del E746-T751 ins
I（試料4）、Del L747-T751del P753（試料5）、Del L747-A750 substitution P（試料6）の各欠損変異遺伝子を含むプラスミドDNA溶液とヒトEGFRエクソン21野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液と混合したDNA溶液、およびヒトEGFRエクソン19野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液とヒトEGFRエクソン21野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液と混合したDNA溶液（試料７）をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトEGFR遺伝子の欠損変異を解析した。【００８８】
（ＰＣＲの実施）
上記で調製した試料1μｌ、オリゴ１7を２０pmoles、オリゴ18を1pmole、オリゴ19を３０pmoles、オリゴ20を２０pmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ
ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃で２分、次いで９４℃−１５秒のデナチュレーション工程、及び６０℃−３０秒のアニーリング及び６８℃−３０秒のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計３５サイクル行うことにより実施した。【００８９】
（電気泳動を用いた検出）
増幅反応液5μｌを３％アガロースゲルを用いて電気泳動を行なった。結果を図１１に示す。
電気泳動結果が示す通り、試料２のみ変異型が増幅された。【００９０】
[実施例7]
（１）ヒトEGFR遺伝子のエクソン19 Del L747-S752欠損変異を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１7〜19および21に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１7〜19および21と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、オペロン（株）、プロリゴ（株）、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。オリゴ１7がエクソン21共通センスプライマー（Ｂ）であり、オリゴ18がエクソン21共通アンチセンスプライマー（Ｃ）であり、両共通プライマーを組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ19はエクソン19共通センスプライマーであり、オリゴ21はEGFR遺伝子のエクソン19
Del L747-S752欠損変異遺伝子（変異型）を増幅するためのプライマー（Ａ）である。【００９１】
（２）PCR法によるヒトEGFR遺伝子の欠損変異の解析
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液（試料１）、およびヒトEGFRエクソン19
Del E746-A750欠損変異遺伝子を含むプラスミドDNA溶液（試料2）、以下、Del L747-S752（試料3）、Del E746-T751 ins
I（試料4）、Del L747-T751del P753（試料5）、Del L747-A750 substitution P（試料6）の各欠損変異遺伝子を含むプラスミドDNA溶液とヒトEGFRエクソン21野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液と混合したDNA溶液、およびヒトEGFRエクソン19野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液とヒトEGFRエクソン21野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液と混合したDNA溶液（試料７）をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトEGFR遺伝子の欠損変異を解析した。【００９２】
（ＰＣＲの実施）
上記で調製した試料1μｌ、オリゴ１7を２０pmoles、オリゴ18を1pmole、オリゴ19を３０pmoles、オリゴ21を３０pmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ
ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃で２分、次いで９４℃−１５秒のデナチュレーション工程、及び６０℃−３０秒のアニーリング及び６８℃−３０秒のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計３５サイクル行うことにより実施した。【００９３】
（電気泳動を用いた検出）
増幅反応液5μｌを３％アガロースゲルを用いて電気泳動を行なった。結果を図１２に示す。
電気泳動結果が示す通り、試料３のみ変異型が増幅された。【００９４】
[実施例8]
（１）ヒトEGFR遺伝子のエクソン19 Del E746-T751 ins I欠損変異を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１7〜19および22に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１7〜19および22と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、オペロン（株）、プロリゴ（株）、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。オリゴ１7がエクソン21共通センスプライマー（Ｂ）であり、オリゴ18がエクソン21共通アンチセンスプライマー（Ｃ）であり、両共通プライマーを組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ19はエクソン19共通センスプライマーであり、オリゴ22はEGFR遺伝子のエクソン19
Del E746-T751 ins I欠損変異遺伝子（変異型）を増幅するためのプライマー（Ａ）である。【００９５】
（２）PCR法によるヒトEGFR遺伝子の欠損変異の解析
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液（試料１）、およびヒトEGFRエクソン19
Del E746-A750欠損変異遺伝子を含むプラスミドDNA溶液（試料2）、以下、Del L747-S752（試料3）、Del E746-T751 ins
I（試料4）、Del L747-T751del P753（試料5）、Del L747-A750 substitution P（試料6）の各欠損変異遺伝子を含むプラスミドDNA溶液とヒトEGFRエクソン21野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液と混合したDNA溶液、およびヒトEGFRエクソン19野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液とヒトEGFRエクソン21野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液と混合したDNA溶液（試料７）をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトEGFR遺伝子の欠損変異を解析した。【００９６】
（ＰＣＲの実施）
上記で調製した試料1μｌ、オリゴ１7を２０pmoles、オリゴ18を1pmole、オリゴ19を３０pmoles、オリゴ22を４０pmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ
ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃で２分、次いで９４℃−１５秒のデナチュレーション工程、及び６０℃−３０秒のアニーリング及び６８℃−３０秒のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計３５サイクル行うことにより実施した。【００９７】
（電気泳動を用いた検出）
増幅反応液5μｌを３％アガロースゲルを用いて電気泳動を行なった。結果を図１３に示す。
電気泳動結果が示す通り、試料４のみ変異型が増幅された。【００９８】
[実施例9]
（１）ヒトEGFR遺伝子のエクソン19 Del L747-T751del P753欠損変異を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１7〜19および23に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１7〜19および23と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、オペロン（株）、プロリゴ（株）、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。オリゴ１7がエクソン21共通センスプライマー（Ｂ）であり、オリゴ18がエクソン21共通アンチセンスプライマー（Ｃ）であり、両共通プライマーを組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ19はエクソン19共通センスプライマーであり、オリゴ23はEGFR遺伝子のエクソン19
Del L747-T751del P753欠損変異遺伝子（変異型）を増幅するためのプライマー（Ａ）である。【００９９】
（２）PCR法によるヒトEGFR遺伝子の欠損変異の解析
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液（試料１）、およびヒトEGFRエクソン19
Del E746-A750欠損変異遺伝子を含むプラスミドDNA溶液（試料2）、以下、Del L747-S752（試料3）、Del E746-T751 ins
I（試料4）、Del L747-T751del P753（試料5）、Del L747-A750 substitution P（試料6）の各欠損変異遺伝子を含むプラスミドDNA溶液とヒトEGFRエクソン21野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液と混合したDNA溶液、およびヒトEGFRエクソン19野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液とヒトEGFRエクソン21野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液と混合したDNA溶液（試料７）をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトEGFR遺伝子の欠損変異を解析した。【０１００】
（ＰＣＲの実施）
上記で調製した試料1μｌ、オリゴ１7を２０pmoles、オリゴ18を1pmole、オリゴ19を３０pmoles、オリゴ23を３０pmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ
ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃で２分、次いで９４℃−１５秒のデナチュレーション工程、及び６０℃−３０秒のアニーリング及び６８℃−３０秒のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計３５サイクル行うことにより実施した。【０１０１】
（電気泳動を用いた検出）
増幅反応液5μｌを３％アガロースゲルを用いて電気泳動を行なった。結果を図１４に示す。
電気泳動結果が示す通り、試料５のみ変異型が増幅された。【０１０２】
[実施例１０]
（１）ヒトEGFR遺伝子のエクソン19 Del L747-A750 substitution P欠損変異を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１7〜19および24に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１7〜19および24と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、オペロン（株）、プロリゴ（株）、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。オリゴ１7がエクソン21共通センスプライマー（Ｂ）であり、オリゴ18がエクソン21共通アンチセンスプライマー（Ｃ）であり、両共通プライマーを組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ19はエクソン19共通センスプライマーであり、オリゴ24はEGFR遺伝子のエクソン19
Del L747-A750 substitution P欠損変異遺伝子（変異型）を増幅するためのプライマー（Ａ）である。【０１０３】
（２）PCR法によるヒトEGFR遺伝子の欠損変異の解析
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液（試料１）、およびヒトEGFRエクソン19
Del E746-A750欠損変異遺伝子を含むプラスミドDNA溶液（試料2）、以下、Del L747-S752（試料3）、Del E746-T751 ins
I（試料4）、Del L747-T751del P753（試料5）、Del L747-A750 substitution P（試料6）の各欠損変異遺伝子を含むプラスミドDNA溶液とヒトEGFRエクソン21野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液と混合したDNA溶液、およびヒトEGFRエクソン19野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液とヒトEGFRエクソン21野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液と混合したDNA溶液（試料7）をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトEGFR遺伝子の欠損変異を解析した。【０１０４】
（ＰＣＲの実施）
上記で調製した試料1μｌ、オリゴ１7を２０pmoles、オリゴ18を1pmole、オリゴ19を３０pmoles、オリゴ24を３０pmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ
ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃で２分、次いで９４℃−１５秒のデナチュレーション工程、及び６０℃−３０秒のアニーリング及び６８℃−３０秒のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計３５サイクル行うことにより実施した。【０１０５】
（電気泳動を用いた検出）
増幅反応液5μｌを３％アガロースゲルを用いて電気泳動を行なった。結果を図１５に示す。
電気泳動結果が示す通り、試料６のみ変異型が増幅された。【０１０６】
[実施例11]
（１）ヒトEGFR遺伝子のエクソン19 Del L747-S752、Del E746-T751 ins
I、Del L747-T751del P753、Del L747-A750 substitution P欠損変異を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１7〜19および21〜24に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１7〜19および21〜24と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、オペロン（株）、プロリゴ（株）、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。オリゴ１7がエクソン21共通センスプライマー（Ｂ）であり、オリゴ18がエクソン21共通アンチセンスプライマー（Ｃ）であり、両共通プライマーを組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ19はエクソン19共通センスプライマーであり、オリゴ21〜24はEGFR遺伝子のエクソン19欠損変異遺伝子（変異型）を増幅するためのプライマー（Ａ）である。【０１０７】
（２）PCR法によるヒトEGFR遺伝子の欠損変異の解析
ヒトEGFRエクソン19 Del E746-A750欠損変異遺伝子を含むプラスミドDNA溶液（試料1）、以下、Del
L747-S752（試料2）、Del E746-T751 ins I（試料3）、Del L747-T751del P753（試料4）、Del
L747-A750 substitution P（試料5）の各欠損変異遺伝子を含むプラスミドDNA溶液とヒトEGFRエクソン21野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液と混合したDNA溶液、およびヒトEGFRエクソン19野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液とヒトEGFRエクソン21野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液と混合したDNA溶液（試料6）、およびヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液（試料7）をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトEGFR遺伝子の欠損変異を解析した。【０１０８】
（ＰＣＲの実施）
上記で調製した試料1μｌ、オリゴ１7を２０pmoles、オリゴ18を1pmole、オリゴ19を３０pmoles、オリゴ21を３０pmoles、オリゴ22を４０pmoles、オリゴ23を３０pmoles、オリゴ24を３０pmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ
ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃で２分、次いで９４℃−１５秒のデナチュレーション工程、及び６０℃−３０秒のアニーリング及び６８℃−３０秒のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計３５サイクル行うことにより実施した。【０１０９】
（電気泳動を用いた検出）
増幅反応液5μｌを３％アガロースゲルを用いて電気泳動を行なった。結果を図１６に示す。
電気泳動結果が示す通り、試料２〜５の変異型が増幅された。【０１１０】
[実施例12]
（１）CYP2C9遺伝子の1075（A→C）一塩基変異多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号13、14、16、25に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ13、14、16、25と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、オペロン（株）、プロリゴ（株）、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。オリゴ13が共通センスプライマー（Ｂ）であり、オリゴ14が共通アンチセンスプライマー（Ｃ）であり、両共通プライマーを組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ16はCYP2C9遺伝子の1075C遺伝子（変異型）を増幅するためのプライマー（Ａ）である。オリゴ25は検出部位を含むプローブであり3´末端がテキサスレッド標識されている。【０１１１】
（２）PCR法によるCYP２C9遺伝子の1075（A→C）一塩基変異多型の解析
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液（試料１、２）および変異型遺伝子をクローニングしたプラスミドDNA溶液（試料３）をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトCYP2C9遺伝子の塩基多型
(1075A→C)を解析した。【０１１２】
（ＰＣＲの実施）
上記で調製した試料1μｌ、オリゴ13を１０pmoles、オリゴ14を２．５pmoles、オリゴ16を各３０pmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ
ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、SYBR GreenI (1/10000)をミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃で２分、次いで９４℃−１５秒のデナチュレーション工程、及び６０℃−３０秒のアニーリング及び６８℃−３０秒のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計３５サイクル行うことにより実施した。【０１１３】
（プローブを用いた検出：融解曲線解析）
増幅反応液25μｌにオリゴ25を10pmoles添加し後、９５℃で5分間インキュベート後、４０℃にし、0.5℃/sec.の速度で８０℃まで温度を上昇させ各温度にて蛍光シグナルを検出し、単位時間当たりの蛍光強度の変化を測定した。結果を図１７に示す。ＡＡは野生型のホモ、ＣＣは変異型のホモ、ＡＣはヘテロを示す。
融解曲線解析結果が示す通り、試料によって得られるピーク位置が異なっていることから、容易に配列を判定することができる。【０１１４】
[実施例13]
（１）H.pylori  CagA遺伝子の型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号26〜28に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ26、27、28と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、オペロン（株）、プロリゴ（株）、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。オリゴ26が共通センスプライマー（Ｂ）であり、オリゴ27が共通アンチセンスプライマー（Ｃ）であり、両共通プライマーを組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ28はH.pylori CagA遺伝子の西欧型を増幅するためのプライマー（Ａ）である。【０１１５】
（２）PCR法によるH.pylori  CagA遺伝子の型の解析
ヒト胃生検組織からDneasy Tissue Kit(Quiagen社製)により抽出したDNA溶液（試料16）およびH.pylori東アジア型遺伝子、H.pylori西欧型遺伝子をクローニングしたプラスミドDNA溶液（試料２〜15）をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりH.pylori
CagA遺伝子の型を解析した。【０１１６】
（ＰＣＲの実施）
上記で調製した試料1μｌ、オリゴ26を１０pmoles、オリゴ27を10pmoles、オリゴ28を2０pmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ
ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃で２分、次いで９４℃−１５秒のデナチュレーション工程、及び６０℃−３０秒のアニーリング及び６８℃−３０秒のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計３５サイクル行うことにより実施した。【０１１７】
（電気泳動を用いた検出）
増幅反応液5μｌを３％アガロースゲルを用いて電気泳動を行なった。結果を図１８に示す。電気泳動結果が示す通り、CagA東アジア型は１０４Copyより、CagA西欧型は１０３Copyより増幅されることが確認され、胃生検組織より抽出された試料からも検出が可能であった。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明により、これまで変異、置換、一塩基多型、挿入又は欠失の検出において、電気泳動による検出では必要不可欠とされていた野生型核酸配列検出と変異型核酸配列検出を別々に実施する必要がなくなり、検出に要する労力・試薬は半減するなどの経済的効果はもちろんのこと、試料に起因する増幅不良等の検出エラーの低減にも有効な手段を提供することが可能になることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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