(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小血管の透過率の評価のための、少なくとも一種の胆汁酸残基をその構造中に含み、５，０００ダルトン以下の分子量を有する造影剤を含む診断用造影組成物であって、該造影剤が、（ａ）二または三価の常磁性金属イオンのキレート化錯体単位、あるいは（ｂ）それと、第一級、第二級、第三級アミンもしくは塩基性アミノ酸から選ばれる生理学的に適合しうる有機塩基との塩、または（ｃ）それと、陽イオンがナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムもしくはそれらの混合物から選ばれる無機塩基との塩を、１個もしくは２個その構造中に含み、キレート化錯体のキレート化単位が、ポリアミノポリカルボン酸残基よりなる、診断用造影組成物。
【請求項２】
該造影剤の分子量が、４，５００〜５００ダルトンである、請求項１記載の診断用造影組成物。
【請求項３】
該造影剤の分子量が、３，０００〜５００ダルトンである、請求項１または２記載の診断用造影組成物。
【請求項４】
キレート化錯体単位を、１個だけその構造中に含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の診断用造影組成物。
【請求項５】
キレート化錯体単位を、２個その構造中に含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の診断用造影組成物。
【請求項６】
キレート化錯体のキレート化単位が、
−  〔３β（Ｓ），５β〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕（カルボキシメチル）アミノ〕コラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕コラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−１２−オキソコラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β，７α〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−７−ヒドロキシコラン−２４−酸；
−  ２−〔〔〔３β（Ｓ），５β〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−ｌ−オキソブチル〕アミノ〕−２４−オキソコラン−２４−イル〕アミノ〕エタンスルホン酸；
−  〔３β（Ｓ），５β，１２α〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３α（Ｓ），５β〕−３−〔２−〔〔５−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−５−カルボキシペンチル〕アミノ〕−２−オキソエトキシ〕コラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β，７α，１２α〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β，７α，１２α〕−３−〔〔４−〔〔５−ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−５−カルボキシペンチル〕アミノ〕−１，４−ジオキソブチル〕アミノ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  （３β，５β，７α，１２α）−３−〔〔〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕アセチル〕アミノ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  （３β，５β）−３−〔〔〔〔〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕アセチル〕アミノ〕アセチル〕アミノ〕−コラン−２４−酸；
−  （３β，５β，７α，１２α）−３−〔〔〔〔〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕アセチル〕アミノ〕アセチル〕アミノ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  （３β，５β，７α，１２α）−３−〔〔６−〔〔〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕アセチル〕アミノ〕−１−オキソヘキシル〕アミノ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  （３β，５β，７α，１２α）−３−〔〔Ｎ−〔Ｎ−〔２−〔〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕−Ｎ−（カルボキシメチル）グリシル〕グリシル〕アミノ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  １８−〔〔（３β，５β，７α，１２α）−２３−カルボキシ−７，１２−ヒドロキシ−２４−ノルコラン−３−イル〕アミノ〕−３，６，９−トリス（カルボキシメチル）−１１，１８−ジオキソ−３，６，９，１２−テトラアザオッタデカン酸；
−  １０−〔３−〔〔（３α，５β，７α，１２α）−２３−カルボキシ−７，１２−ヒドロキシ−２４−ノルコラン−３−イル〕オキシ〕−２−ヒドロキシプロピル〕−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−三酢酸；
−  〔３β（Ｓ），５β，７α，１２α〕−３−〔〔４−〔〔５−〔〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕（カルボキシメチル）アミノ〕−５−カルボキシペンチル〕アミノ〕−１，４−ジオキソブチル〕アミノ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β〕−３−〔２−〔〔５−〔〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕（カルボキシメチル）アミノ〕−５−カルボキシペンチル〕アミノ〕−２−オキソエトキシ〕コラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β，１２α〕−３−〔〔４−〔〔２−〔〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕（カルボキシメチル）アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β〕−３−〔〔４−〔〔２−〔〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕（カルボキシメチル）アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−１２−オキソコラン−２４−酸；
−〔３β（Ｓ），５β，７α，１２α〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β，７α，１２α〕−３−〔〔４−〔〔５−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−５−カルボキシペンチル〕アミノ〕−１，４−ジオキソブチル〕アミノ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕（カルボキシメチル）アミノ〕コラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕コラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−  １２−オキソコラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β，７α〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−７−ヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔〔〔３β（Ｓ），５β〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−ｌ−オキソブチル〕アミノ〕−２４−オキソコラン−２４−イル〕アミノ〕エタンスルホン酸；
−  〔３β（Ｓ），５β，７α〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３α（Ｓ），５β〕−３−〔２−〔〔５−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−５−カルボキシペンチル〕アミノ〕−２−オキソエトキシ〕コラン−２４−酸；
−  〔３α〔３（Ｓ），４（Ｓ）〕，５β，１２α〕−３−〔〔〔トランス−３，４−ビス〔〔〔５−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−５−カルボキシペンチル〕アミノ〕カルボニル〕−１−ピロリジニル〕カルボニル〕オキシ〕−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３α〔３（Ｓ），４（Ｓ）〕，５β，１２α〕−３−〔〔〔トランス−３，４−ビス〔〔〔２−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−２−カルボキシエチル〕アミノ〕カルボニル〕−１−ピロリジニル〕カルボニル〕オキシ〕−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸；
−  （３α，５β，１２α）−３−〔〔〔トランス−３，４−ビス〔〔〔２−〔〔〔４，７，１０−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イル〕アセチル〕アミノ〕エチル〕アミノ〕カルボニル〕−１−ピロリジニル〕カルボニル〕オキシ〕−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸
−  〔３α〔３（Ｓ），４（Ｓ）〕，５β，１２α〕−３−〔〔〔トランス−３，４−ビス〔〔〔５−〔〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕（カルボキシメチル）アミノ〕−５−カルボキシペンチル〕アミノ〕−カルボニル〕−１−ピロリジニル〕カルボニル〕オキシ〕−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３α〔１（Ｓ），２（Ｓ）〕，５β，７α，１２α〕−３−〔〔〔〔シス−１，２−ビス〔〔〔５−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−５−カルボキシペンチル〕アミノ〕カルボニル〕−４−シクロペンチル〕アミノ〕カルボニル〕オキシ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３α〔１（Ｓ）〕，５β，７α，１２α〕−３−〔〔〔〔シス−１−〔〔〔５−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−５−カルボキシペンチル〕アミノ〕カルボニル〕−２−〔〔〔２−〔〔〔４，７，１０−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イル〕アセチル〕アミノ〕エチル〕アミノ〕カルボニル〕−４−シクロペンチル〕アミノ〕カルボニル〕オキシ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；及び
−  〔３β〔３（Ｓ），５（Ｓ）〕，５β，７α，１２α〕−３−〔〔〔３，５−ビス〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕フェニル〕カルボニル〕アミノ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸
から選択されるポリアミノポリカルボン酸残基よりなる、請求項１〜５のいずれか１項記載の診断用造影組成物。
【請求項７】
キレート化単位にキレート化される、二または三価の常磁性金属イオンが、ガドリニウム（III）、鉄（III）、鉄（II）、マンガン（II）、マンガン（III）、クロム（III）、銅（II）、ジスプロシウム（III）、イッテルビウム（III）、テルビウム（III）およびユウロピウム（III）よりなる群から選ばれる、請求項１〜６のいずれか１項記載の診断用造影組成物。
【請求項８】
胆汁酸が、コレステロールの生物的変換または合成改質によって得られる胆汁酸から選ばれる、請求項１〜７のいずれか１項記載の診断用造影組成物。
【請求項９】
胆汁酸が、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、リトコール酸自体、あるいは、ヒドロキシル基が官能化されているか、またはタウリンおよびグリシンがコラン骨格の２４位のカルボキシル基と共役しているその誘導体である、請求項８記載の診断用造影組成物。
【請求項１０】
微小血管の健全性を診断評価するための、請求項１〜３のいずれか１項記載の診断用造影組成物。
【請求項１１】
微小血管の透過率を決定するための、請求項１〜３のいずれか１項記載の診断用造影組成物。
【請求項１２】
ヒトまたは動物組織の分画血漿量を決定するための、請求項１〜３のいずれか１項記載の診断用造影組成物。
【請求項１３】
微小血管透過率および分画血漿量の特性と相関するヒトまたは動物組織の病理学的状態を画定するための、請求項１〜３のいずれか１項記載の診断用造影組成物。
【請求項１４】
血管新生の診断評価のための、請求項１３記載の診断用造影組成物。
【請求項１５】
腫瘍塊の組織病理学的等級を決定するための、請求項１３記載の診断用造影組成物。
【請求項１６】
炎症状態の診断評価を実施するための、請求項１３記載の診断用造影組成物。
【請求項１７】
心筋および脳虚血状態の診断評価を実施するための、請求項１３記載の診断用造影組成物。
【請求項１８】
血管新生阻害剤に対する悪性応答を追跡するための、請求項１４記載の診断用造影組成物。
【請求項１９】
血管新生阻害剤がヒト抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である、請求項１８記載の診断用造影組成物。
【請求項２０】
化学療法または放射線療法に対する悪性応答を追跡するための、請求項１４記載の診断用造影組成物。
【請求項２１】
微小血管透過率および分画血漿量の特性と相関するヒトまたは動物組織の生理学的状態を画定するための、請求項１〜３のいずれか１項記載の診断用造影組成物。
【請求項２２】
胚形成、創傷治癒、黄体形成および成長の画定化を実施するための、請求項２１記載の診断用造影組成物。
【請求項２３】
診断用画像化段階を、ＭＲＩを利用して実施する、請求項１〜２２記載の診断用造影組成物。
【請求項２４】
診断用画像化を、コントラスト強調動的磁気共鳴画像化（ＤＣＥ  ＭＲＩ）技術を用いて実施する、請求項２３記載の診断用造影組成物。
【請求項２５】
該造影剤が、〔３β（Ｓ），５β，１２α〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸のガドリニウム錯体である、請求項２３または２４記載の診断用造影組成物。
【請求項２６】
該錯体が、三ナトリウム塩の形態である、請求項２５記載の診断用造影組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、微小血管系を診断評価する医薬用配合物の製造のための金属イオンキレート化錯体の使用に関する。
【０００２】
充実腫瘍（Solid tumor）の構造は、正常な組織および器官の整然として、秩序立てられた解剖学的構成とは対照的に、概して一定せず基本的に無秩序である。充実腫瘍、特に悪性腫瘍の微小循環系は、正常な器官のそれと著しく異なる。毛細血管の密度の変異は、主として血管透過性因子（ＶＰＦ）としても知られる、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）によるものであり、腫瘍細胞または腫瘍関連炎症性細胞によって作り出される。この因子は、宿主の内皮細胞を活性化して、血管新生として知られる過程に従って、既存の血管から出発して新たな微小血管を形成する。血管新生過程の促進に加えて、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ因子は、さらに新たな小血管の成熟に影響することが示されており、該現象は、血管形成として知られる。
【０００３】
充実腫瘍の存在によって導かれる主な改変は、特に、微小血管構造の流動特性および／または血液量に関するものであり、正常な器官および組織の効率的で、均一な潅流よりも、血流は、空間および時間の両方において不均一である。これらの異常に加えて、腫瘍における微小血管の透過性は顕著に改変されることが多い。実際にＶＥＧＦ／ＶＰＦ因子は、血漿の巨大分子成分に対する微小血管透過性を顕著に増大させることができ、腫瘍では、血管および細胞内画分より異常に高い、血管外−細胞外体積画分の改変の原因にもなる。
【０００４】
その上、腫瘍が存在するときは、一般に毛細血管内皮も損傷を受ける。
【０００５】
核磁気共鳴の原理に基づく診断用画像化は、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）として知られ、日々の臨床検査の強力な支援手段を構成する、既知の画像化法である。特に、何らかの適切な造影剤の投与後に診断用画像化を実施するとき、この診断法は、機能性の診断評価はもとより、検査される器官および組織の形態学的評価をも許容する。
【０００６】
磁気共鳴画像化が提供するもう一つの好機は、動的画像、すなわち、問題の器官または組織における、シグナル強度の経時的変動の視覚化を許す、診断技術である。特に、造影剤の投与と結びつけて適用されたとき、この技術は、検査される器官および／または組織の生理学的特性や状態に関して有用な情報を与える。
【０００７】
巨大分子の溶質に対する微小血管の透過性亢進は、腫瘍微小血管の既知の特徴である〔Am. J. Pathol., 146:1029-1039, 1995；Microvasc. Res., 1986, 13:288-305〕。
【０００８】
巨大分子造影媒体は、健康な組織では、そのほとんどが血管空間内に閉じ込められたまま残るが、変化もしくは発病した内皮および／または悪性腫瘍の透過性亢進された血管内皮からは間質空間へと拡散して、組織強化を、すなわち該組織で記録されたシグナルの強度を累積的に高める。組織で記録されたシグナル強度とは、画像化された組織の輝度を意味し、組織の輝度が高ければそれだけ、該組織のシグナル強度は高くなる。
【０００９】
腫瘍の磁気共鳴画像化は、特に巨大分子造影剤の使用によって強化されたときに微小血管透過率の間に現れる前記の相違に基づいており、かつそれを利用している。
【００１０】
特に、造影剤の投与と結合された動的磁気共鳴画像化は、動的コントラスト強調ＭＲ画像化（ＤＣＥ  ＭＲI）としても知られ、非侵襲的なin vivoの腫瘍追跡と、腫瘍の血管新生活性または腫瘍塊の組織病理学的格付けのいずれにも密接に相関する定量的尺度の形成と、を可能にする有望な方法である。
【００１１】
動的コントラスト強調ＭＲ画像化は、好都合にも抗血管新生（たとえば抗ＶＥＧＦ抗体）薬物に対する悪性腫瘍の応答を検出かつ測定することもでき、さらに化学療法剤の最も効果的な用量および強力な照射時間の評価を可能にし、化学療法剤の薬効を完成する有効な支援を構成することができる。
【００１２】
現時点では、これらの目的に適する唯一の造影剤は、巨大分子薬剤である。
【００１３】
毛細血管内皮が、正常組織が示すよりも高い透過性を示す、損傷した組織および腫瘍では、造影剤は、内皮壁から間質空間へと受動的に拡散し、そこに徐々に蓄積されて、組織強化を累積的に増大させる。強化増大の率は、適切な動態モデルを用いて、この特定の組織における造影剤に対する微小血管透過率に相関付けられる。特定の組織におけるシグナル強化と、血液によって全体的に構成される領域（たとえば下大静脈）における同じ時点で記録された強化との間の定量的比率は、該組織における分画血漿量（ｆＰＶ）と相関させ得るパラメーターである。
【００１４】
ＤＣＥ  ＭＲIによる腫瘍の評価は、基本的にこのＭＲ画像化から推論される特徴性、すなわち組織の血管等級または分画血漿量（ｆＰＶ）と、内皮伝達係数または巨大分子透過率（ＫPS）の定量的評価とに基づき、悪性腫瘍ではこれらは異常であり、軟らかく新生物でない組織で得られるものよりも有意に高い。
【００１５】
実験的試験では、微小血管分布系の動的ＭＲI画像化は、通常巨大分子造影剤の投与後に実施される。特に好ましいのは、２０，０００ダルトンより高い分子量を有する造影剤である。
【００１６】
これまでは、アルブミン−（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）30（分子量≒９２kD）およびポリリシン−Ｇｄ−ＤＴＰＡが最も多く用いられている。
【００１７】
最近、同様の研究が、２４個のＧｄイオンを含む巨大分子造影剤である、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−２４−カスケード重合体（その分子量が３０，０００ダルトンである）でも実施されている。
【００１８】
特に、米国特許第６，００９，３４２号明細書は、調査中の動物への巨大分子造影媒体の投与を含む、腫瘍の病理学的等級を決定する画像化法に関する。クレームされた方法に好適な巨大分子薬剤は、アルブミン−（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）30である。
【００１９】
しかし、これらの巨大分子造影剤は、排出の不完全さ、毒性の可能性または免疫原の応答のために、どれ一つとして臨床試験に入る可能性があるものはない〔JMRI, 1997; 7:331-338〕。
【００２０】
この文献は、実験的ＤＣＥ  ＭＲIから推論される微小血管透過率の定量、および低分子量ガドリニウムキレート、特にＧｄ−ＤＴＰＡ（分子量：５００ダルトン）の投与後に実施される腫瘍の組織学的格付けも記載しているが、このキレートは、逆に、Magnevist（登録商標）として既に認可され、市販されている剤である。これらの研究の結果から明らかとなる教示は、低分子量造影剤は、健常組織を、病理学的組織（損傷または透過性亢進した微小血管を含む）から、区別できないということである。低分子量造影剤は、実際、正常な血管および新生毛細血管の双方で内皮壁越しに容易に拡散し、いずれの場合も器官の血管内区画と間質区画との間で急速に平衡に達する。
【００２１】
低分子量造影剤増強のデータによって推計される透過率の尺度は、悪性腫瘍の存在との有意ないかなる相関も示さず、腫瘍自体の組織学的格付けとも、診断上で役立つ程度には全く相関しない〔Magn. Reson. Med., 2000, 55(6):915-924；AJR:171, 1998, 941-949；JMRI, 1997, 7:82-90〕。
【００２２】
また、ＦＩＴＣ−デキストラン（分子量：３kD）を用いて、不特定の結果も得られた。
【００２３】
腫瘍は、ヒトの最も重要かつ破壊的な疾病であり、したがって、この病理に冒される患者を取扱うために用いられる造影剤の特異性と感度との双方の改良は、医療上の要求であり、科学研究の対象である。
【００２４】
ここに、上記で検討された最新技術から推論される教示と反対に、本発明者らは、意外にも、非常に低分子量の造影剤の特定の群は、好都合にも、微小血管形成系の動的評価のための医薬用配合物の製造に用い得ることを見出した。
【００２５】
本発明は、特に相対組織血漿量が決定され、かつ／または微小血管の透過率はもとより、健全性も測定される、微小血管系の診断用視覚化におけるコントラストグラフィー用配合物の製造のための、少なくとも一つの胆汁酸残基をその構造中に含む、５，０００ダルトン以下、好ましくは４，５００〜５００ダルトン、より好ましくは３，０００〜５００ダルトンの分子量を有する特定の選択範囲の化合物の新規な使用に関する。
【００２６】
とりわけ、本発明は、微小血管形成系の健全性および微小血管透過率のＭＲI動的画像化のため、かつ動物またはヒトの器官および／もしくは組織の血管等級を決定するための、少なくとも一つ、好ましくは一つの胆汁酸残基、ならびに少なくとも１個であるが、２個を越えない、二もしくは三価の常磁性金属イオンのキレート化錯体単位、および、第一級、第二級、第三級アミンもしくは塩基性アミノ酸から選ばれる生理学的に適合できる有機塩基、または陽イオンがナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムもしくはその混合物から選ばれる無機塩基とのその塩を、その構造中に含む一群の化合物の、新規な使用に関する。
【００２７】
本発明の化合物およびその製造方法は、やはり米国特許第５，６４９，５３７号明細書、ＷＯ−Ａ−００／３８７３８および米国をも指定するＰＣＴ／ＥＰ／０１／０１９７１に出願人によって既に詳細に開示されている（本明細書に参照として組み込まれる）。
【００２８】
本発明の化合物では、胆汁酸残基は、コレステロールの生物的変換または合成改質によって得られる胆汁酸から、好ましくは選ばれる。特に好ましいのは、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、リトコール酸自体又は、それらの誘導体（たとえばヒドロキシル基が官能化されているもの、もしくはタウリンおよびグリシンがコラン骨格の２４位のカルボキシル基と共役しているものを包含する）から誘導される、胆汁酸残基である。
【００２９】
好ましくは、本発明のキレート化単位は、直鎖または環状ポリアミノポリカルボン酸残基であり、該キレート化単位にキレート化される、常磁性である二または三価金属イオンは、好ましくは、ガドリニウム（III）、鉄（III）、鉄（II）、マンガン（II）、マンガン（III）、クロム（III）、銅（II）、ジスプロシウム（III）、イッテルビウム（III）、テルビウム（III）およびユウロピウム（III）よりなる群から選ばれ、最も好ましくはガドリニウム（III）およびマンガン（II）である。
【００３０】
本発明のキレート化錯体を塩化するのに適切な無機塩基の好適な陽イオンは、カリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウムもしくはそれらの混合物のような、アルカリ金属またはアルカリ土類金属のイオンを、特に含む。
【００３１】
この目的に適する有機塩基の好適な陽イオンは、とりわけエタノールアミン、ジエタノールアミン、モルホリン、グルカミン、Ｎ−メチルグルカミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグルカミンのような、第一級、第二級および第三級アミンのプロトン化によって得られるものである。
【００３２】
場合により同じ目的に適する無機酸の陰イオンは、たとえば塩化物、臭化物、ヨウ化物のようなハロゲンの酸のイオン、またはたとえば硫酸イオンのような、異なるイオンを好ましくは包含する。
【００３３】
場合により本発明のキレート化錯体を塩化するのに適する有機酸の陰イオンは、たとえばアセテート、スクシネート、フマレート、シトレートおよびマレエートのような塩基性物質を塩化するのに製剤上で通常用いられる酸の類を、特に包含する。
【００３４】
好適なアミノ酸の陽イオンおよび陰イオンは、たとえばタウリン、グリシン、リシン、アルギニンもしくはオルニチン、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸の類を含む。
【００３５】
好ましくは、本発明による造影剤の使用であって、前記剤がキレート化錯体単位を１個だけその構造中に含み、そこでキレート化単位が、直鎖ポリアミノポリカルボン酸残基であり、前記剤の胆汁酸残基がコール酸またはデオキシコール酸から誘導され、かつキレート化単位にキレート化される金属イオンがガドリニウム（III）またはマンガン（II）の常磁性イオンであることを特徴とする。
【００３６】
より好ましくは、そのキレート化剤が下記の群から選ばれる、本発明による化合物の使用である：
【００３７】
−  〔３β（Ｓ），５β〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕（カルボキシメチル）アミノ〕コラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕コラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−１２−オキソコラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β，７α〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−７−ヒドロキシコラン−２４−酸；
−  ２−〔〔〔３β（Ｓ），５β〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−ｌ−オキソブチル〕アミノ〕−２４−オキソコラン−２４−イル〕アミノ〕エタンスルホン酸；
−  〔３β（Ｓ），５β，１２α〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３α（Ｓ），５β〕−３−〔２−〔〔５−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−５−カルボキシペンチル〕アミノ〕−２−オキソエトキシ〕コラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β，７α，１２α〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β，７α，１２α〕−３−〔〔４−〔〔５−ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−５−カルボキシペンチル〕アミノ〕−１，４−ジオキソブチル〕アミノ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  （３β，５β，７α，１２α）−３−〔〔〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕アセチル〕アミノ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  （３β，５β）−３−〔〔〔〔〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕アセチル〕アミノ〕アセチル〕アミノ〕−コラン−２４−酸；
−  （３β，５β，７α，１２α）−３−〔〔〔〔〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕アセチル〕アミノ〕アセチル〕アミノ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  （３β，５β，７α，１２α）−３−〔〔６−〔〔〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕アセチル〕アミノ〕−１−オキソヘキシル〕アミノ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  （３β，５β，７α，１２α）−３−〔〔Ｎ−〔Ｎ−〔２−〔〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕−Ｎ−（カルボキシメチル）グリシル〕グリシル〕アミノ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  １８−〔〔（３β，５β，７α，１２α）−２３−カルボキシ−７，１２−ヒドロキシ−２４−ノルコラン−３−イル〕アミノ〕−３，６，９−トリス（カルボキシメチル）−１１，１８−ジオキソ−３，６，９，１２−テトラアザオッタデカン酸；
−  １０−〔３−〔〔（３α，５β，７α，１２α）−２３−カルボキシ−７，１２−ヒドロキシ−２４−ノルコラン−３−イル〕オキシ〕−２−ヒドロキシプロピル〕−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−三酢酸；
−  〔３β（Ｓ），５β，７α，１２α〕−３−〔〔４−〔〔５−〔〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕（カルボキシメチル）アミノ〕−５−カルボキシペンチル〕アミノ〕−１，４−ジオキソブチル〕アミノ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β〕−３−〔２−〔〔５−〔〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕（カルボキシメチル）アミノ〕−５−カルボキシペンチル〕アミノ〕−２−オキソエトキシ〕コラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β，１２α〕−３−〔〔４−〔〔２−〔〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕（カルボキシメチル）アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β〕−３−〔〔４−〔〔２−〔〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕（カルボキシメチル）アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−１２−オキソコラン−２４−酸；
−〔３β（Ｓ），５β，７α，１２α〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β，７α，１２α〕−３−〔〔４−〔〔５−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−５−カルボキシペンチル〕アミノ〕−１，４−ジオキソブチル〕アミノ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕（カルボキシメチル）アミノ〕コラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕コラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−  １２−オキソコラン−２４−酸；
−  〔３β（Ｓ），５β，７α〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−７−ヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔〔〔３β（Ｓ），５β〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−ｌ−オキソブチル〕アミノ〕−２４−オキソコラン−２４−イル〕アミノ〕エタンスルホン酸；
−  〔３β（Ｓ），５β，７α〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３α（Ｓ），５β〕−３−〔２−〔〔５−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−５−カルボキシペンチル〕アミノ〕−２−オキソエトキシ〕コラン−２４−酸；
−  〔３α〔３（Ｓ），４（Ｓ）〕，５β，１２α〕−３−〔〔〔トランス−３，４−ビス〔〔〔５−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−５−カルボキシペンチル〕アミノ〕カルボニル〕−１−ピロリジニル〕カルボニル〕オキシ〕−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３α〔３（Ｓ），４（Ｓ）〕，５β，１２α〕−３−〔〔〔トランス−３，４−ビス〔〔〔２−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−２−カルボキシエチル〕アミノ〕カルボニル〕−１−ピロリジニル〕カルボニル〕オキシ〕−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸；
−  （３α，５β，１２α）−３−〔〔〔トランス−３，４−ビス〔〔〔２−〔〔〔４，７，１０−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イル〕アセチル〕アミノ〕エチル〕アミノ〕カルボニル〕−１−ピロリジニル〕カルボニル〕オキシ〕−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸
−  〔３α〔３（Ｓ），４（Ｓ）〕，５β，１２α〕−３−〔〔〔トランス−３，４−ビス〔〔〔５−〔〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕（カルボキシメチル）アミノ〕−５−カルボキシペンチル〕アミノ〕−カルボニル〕−１−ピロリジニル〕カルボニル〕オキシ〕−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３α〔１（Ｓ），２（Ｓ）〕，５β，７α，１２α〕−３−〔〔〔〔シス−１，２−ビス〔〔〔５−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−５−カルボキシペンチル〕アミノ〕カルボニル〕−４−シクロペンチル〕アミノ〕カルボニル〕オキシ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３α〔１（Ｓ）〕，５β，７α，１２α〕−３−〔〔〔〔シス−１−〔〔〔５−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−５−カルボキシペンチル〕アミノ〕カルボニル〕−２−〔〔〔２−〔〔〔４，７，１０−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イル〕アセチル〕アミノ〕エチル〕アミノ〕カルボニル〕−４−シクロペンチル〕アミノ〕カルボニル〕オキシ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
−  〔３β〔３（Ｓ），５（Ｓ）〕，５β，７α，１２α〕−３−〔〔〔３，５−ビス〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕フェニル〕カルボニル〕アミノ〕−７，１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸
【００３８】
特に好ましくは、〔３（Ｓ），５，１２〕−３−〔〔４−〔ビス〔２−〔ビス（カルボキシメチル）アミノ〕エチル〕アミノ〕−４−カルボキシ−１−オキソブチル〕アミノ〕−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸のキレート化リガンドのガドリニウム錯体、ならびに、たとえば三ナトリウム塩のような生理学的に適合するその塩の、本発明による使用である。
【００３９】
この特定の化合物の三ナトリウム塩を、以降Ｂ２２９５６／１とも言及する。
【００４０】
その使用が本発明の目的を形成する化合物は、血管構造内での増大された滞留時間を示している（ＷＯ−Ａ−００／３８７３８）。
【００４１】
この特性は、造影剤を、一般的な血管系の診断用画像化における臨床的使用に、より具体的には微小血管の無欠性および微小血管系の毛細血管透過率をも決定する、微小血管系の動的画像化に提案する際に、特に重要である。
【００４２】
充分意外なことに、本発明による化合物は、その比較的低い分子量にも拘わらず、好都合には、微小血管生理機能における非侵襲性のin vivo強化に用いることができる。それらは、特に、微小血管系透過率または分画血漿量のいずれの定量をも可能にし、その結果、血管新生の評価のため、および血管形成が亢進した系の微小血管の特徴付けのために、有利に用いることができる。この最後のケースでは、本発明による化合物の使用によって得られる、ＤＣＥ  ＭＲIから推論される尺度は、たとえば胚発生、創傷治癒、黄体形成および成長のような生理学的状態と病理学的状態との双方とに充分相関することが示されている。特に好都合であるのは、そのＤＣＥ−ＭＲIから推論される微小血管透過率の特徴の定量的検定に基づく、腫瘍塊の血管新生の診断用視覚化と組織病理学的格付けとに、本発明による化合物を用いることである。この本発明の剤の使用は、特に、悪性腫瘍からの良性腫瘍の非侵襲的区別を可能にし、患者にとって常に侵襲的であり、外傷を生じる外科生検の必要性を低減する。
【００４３】
本発明の薬剤の特定の使用によれば、実際、腫瘍塊の微小血管透過率の測定値（ＫPSとして表される）と、Scarff-Bloom-Richardson格付け体系〔Cancer, 64(9), 1989:1914-1921〕を用いて得られた特徴付けとの間に、単純で、実質的に直線上の好都合な相関が観察された。この目的に採用された動態モデルは、腫瘍塊の特徴付けを得るのに用いられた、ＭＲIから推論される推計の数学的処理とともに、文献中に既に開示されたもの〔たとえば、MRM, 1993;29:616-622およびAJR:171,1998ならびに引用文献を参照されたい〕と類似し、実験に関するセクションで充分に説明されている。
【００４４】
従来の技術による巨大分子薬剤であるアルブミン−Ｇｄ−（ＤＴＰＡ）３0、または本発明の化合物のいずれかを用いて実施された、ラットでの実験の結果は、首尾一貫する動的強化の挙動を示し、同じ結論へと導く。すなわち、大静脈で記録された強化の低下と一致する、腫瘍組織における当初の強い強化とその後の経時的な低下は、良性腫瘍が存在するときに観察され、反対に、血液における強化が低下する際に、組織における強化が経時的に増大するのは、悪性であることを示している。
【００４５】
反対に、ガドテリドール（Gadoteridol）としても知られる、低分子量造影剤（分子量：５５８．７ダルトン）であるProHance（登録商標）の投与後に得られた透過率の実験的推計は、得られた動的シグナル応答と腫瘍塊の存在との間はもとより、その組織学的性質とのいかなる有意な相関もないことを確認する。これらの指標は、Ｇｄ−ＤＴＰＡの薬効を試験したときに得られた結果と一致する。
【００４６】
特に、上記に概説したとおり、アルブミン−Ｇｄ−（ＤＴＰＡ）30、ProHanceおよびＢ−２２９５６／１を用い、同種の腫瘍担持ラットからの動的ＭＲIデータセットを得、比較した、本発明者らが実施した実験からは、いくつかの事実が明らかになる。腫瘍における強化のシグナルは、Ｂ−２２９５６／１による方が、ProHanceによるよりも約１０倍大きい。加えて、透過率の測定値は、ProHanceについては、その抽出が速やかであるため有意ではないのに対し、アルブミン−Ｇｄ−（ＤＴＰＡ）30のような巨大分子については、前記測定は、正確に決定される可能性はあるが、微小血管構造からのこれらの薬剤の抽出が非常に遅いため、得られた値はあまりにも低く、そのためＭＲシグナル検出のノイズ中に埋没する傾向にある。Ｂ−２２９５６／１が優れた兼ね合いを表して、アルブミン−Ｇｄ−（ＤＴＰＡ）30によるより、おそらく単純な挙動を示すが、それで観察されるはずのものより、確実にはるかに容易に観察され、同時にProHanceによるより有意に強い量を生じる。
【００４７】
血管新生の過程は、腫瘍の進行の枢要な部分であることから、血管新生を遮断することを目的とする処置は、腫瘍の発達を停止させるか、または少なくとも遅延させる可能性が最も高いと思われる。
【００４８】
本発明による薬剤の使用は、抗血管新生処置によって誘導される微小血管の応答を追跡するのに役立つ手段をさらに構成し、特にヒト抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体による薬物投与に対する悪性の応答を予測するか、または非侵襲的に評価することになる。本発明者らが実施した特定の実験では、Ｂ−２２９５６／１に対する微小血管透過率は、未処置腫瘍におけるシグナル強度を９日間の期間にわたって敏感に増大させることが認められた。同じ期間にわたって、そのような増大は、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を投与された動物では観察されなかった。
【００４９】
これらの薬剤を、胸部の悪性腫瘍（たとえばヒト乳癌（ＭＡＤＡ−ＭＢ−４３５））の存在に関連した上向調節された血管新生過程を追跡するのに用いたときに、特に有益性を評価することができるが、これらを、異なる多くの種類の組織、ならびに腫瘍（口腔腫瘍、膀胱、脳、乳腺、子宮頸部、卵巣、膵臓、肺、前立腺、軟組織および中枢神経系の腫瘍や癌腫を包含するが、これらに限定されない）の診断評価に用いたときについても、同等に好ましい結果が得られる。
【００５０】
同等に価値ある尺度および情報は、化学療法または放射線療法に対する悪性の応答の追跡から導出される。
【００５１】
本発明による薬剤の投与は、さらに、異なる病理学的状態、すなわち炎症、心筋および虚血状態における微小血管の特徴の信頼できる画定化を与える。実際、それらは、心筋毛細血管の透過率亢進、および虚血組織の存在による血液の血管外溢出の評価を可能にする。
【００５２】
核磁気共鳴画像化は、本発明による化合物の新たな使用に選ばれた診断手法である。
【００５３】
分画血漿量（ｆＰＶ）はもとより、内皮透過率係数（ＫPS）の画像化から演繹される推計を決定するときは、動的画像化が、それに限られることはないにしても、好適な画像化法である。
【００５４】
巨大分子化合物は、動物で行った実験的試験に用いたときに良好な結果を与えたが、不幸にも、身体からのそれらの不完全な排出、ならびに毒性の可能性および不都合な免疫性の副作用に起因する、関連のいくつかの臨床的問題を示した。
【００５５】
反対に、本発明による化合物を用いてラットで実施されたスクリーニング試験の結果は、通常は投与後７日の最大期間内の、しかしより一般的には、かつ好ましくは３日以内に、投与された薬剤が完全な排出されることを示す。通常、投与された薬剤は、糞便または尿のいずれかにより、注入された薬剤、または注入された用量のいずれかに応じて排泄される。ラットにおける、本発明による使用に好適な化合物、Ｂ−２２９５６／１の投与後に得られた尿および糞便による排出の結果は、下記の実験のセクションに含まれている。検査されたすべての器官および組織、すなわち血漿、肝臓、脾臓、大腿骨および腎臓における、化合物の投与７日後のガドリニウム残渣のほとんど完全な不存在は、注入された薬剤の完全な排出の強力な指標である。排出試験は、たとえばサルおよびブタのような、異なる動物種でも実施され、類似の排泄値を回収して、注入された薬剤の実質的に完全な排出を確認した。
【００５６】
その上、Ｂ−２２９５６／１の投与とと殺との間の期間に、最高の注入用量でさえ、何らかの臨床的兆候を示した動物は、皆無であった。
【００５７】
本発明による薬剤は、実際、毒物学的および免疫性の観点のいずれからも、充分に許容され、安全であることが示されている。
【００５８】
本発明の使用のためには、該薬剤は、好ましくは、非経口的、すなわち静脈内、腹腔内、皮下、皮内または筋内に投与するが、必要なときは異なる投与経路も除外されない。
【００５９】
非経口投与向けの医薬用配合物は、慣用的には、造影剤を、適切量の許容され得る担体、好ましくは適切な薬理学的純度の水性担体に溶解または懸濁させ、場合により、代表的にはガレノス製剤賦形剤、添加剤および／または塩化剤を加えることによって製造し、０．０１〜１．０Mにわたる濃度で投与することができる。
【００６０】
これらの配合物は、慣用的には、習熟者には周知の手法を用いて滅菌することができ、そのままでか、または凍結乾燥して用いることができるが、後者の場合、凍結乾燥された配合物は、通常、使用前に、製薬上許容され得る水性媒体へのその溶解によって再構成される。
【００６１】
本発明による造影剤は、診断上の必要性に応じて様々な、しかし一般的には０．００１〜１．０mmol／体重kgにわたる用量で投与するが、好適な用量は、０．０１〜０．５mmol／体重kgにわたる。
【００６２】
ラット乳腺腫瘍モデルにおける微小血管透過率亢進のＭＲ評価
動物
実験は、Harlan, Indianapolis, INから購入した、雌の無胸腺同型接合ラット２６匹で実施した。
【００６３】
腫瘍細胞の培養、および移植片の調製
ヒトのＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌（UCSF Cell Culture Facility）を、雌の６〜８週齢の無胸腺同型接合ヌードラットに導入した。
【００６４】
ヒトＭＤＡ−ＭＢ−４３５腺癌細胞系を、１０％ウシ胎児血清で強化し、加湿５％ＣＯ2雰囲気中で３７℃に保った培地内で培養した。細胞は、エチレンジアミン四酢酸／トリプシン中でのトリプシン処理によって採集し、ＰＢＳ中で洗浄し、２００Gで数回遠心分離した。ほぼ５ｘ１０6個の腫瘍細胞を、０．３mlの総量（滅菌生理食塩水１部：Matrigel（登録商標）１部）として懸濁させ、２５ゲージの針で乳腺脂肪パッドに注入した。
【００６５】
腫瘍の成長を、２日ごとに、二次元でのカリパス測定で追跡した。
【００６６】
実験のプロトコル
第１日に、Ｂ−２２９５６／１を一群のラット６匹に投与し、第２日に、ProHance（１０−（２−ヒドロキシプロピル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロデカン−１，４，７−三酢酸Ｇｄ錯体）およびアルブミン−Ｇｄ−（ＤＴＰＡ）30を投与した（検査の間隔は３時間）。次いで、動物を、画像化して、投与された造影剤の薬理動態間に存在する差を評価かつ理解し、そのＭＲIから推論される微小血管の特性（ＫPS、ｆＰＶ）の推計を比較した。ProHanceおよびアルブミン−Ｇｄ−（ＤＴＰＡ）30で推論された結果を、参照値として用いた。
【００６７】
残余のラット２０匹を、薬物または対照群に無作為に割り振った。
【００６８】
特に、抗ＶＥＧＦ（またはプラセボ）０．２mlの用量を、最初の画像化（＝第２日）後に始めて、腹腔内注射によって投与し；この処置を、全部で３回（＝第２、５および８日）適用した。ＭＲ画像化を、第９および１０日に薬物／プラセボ処置後に実施した。
【００６９】
最後のＭＲIの時期の直後に、動物を、ペントバルビタールの静脈内過剰用量、およびその後の両側開胸によってと殺した。次いで、腫瘍を再切除し、１０％ホルマリン中で固定し、その後のあり得る分析（たとえば、微小血管密度の決定のためのＣＤ３１染色、組織学的腫瘍特徴付け）に用いた。
【００７０】
画像化のプロトコル
ＭＲ画像化は、移植したＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳腺癌腫が、１０〜１５mmの直径に達したときに実施した。ＭＲ画像化の前に、ペントバルビタールの腹腔内投与（５０mg/kg）で動物を麻酔し、ＭＲ画像化の際に、２３ゲージのバタフライ針を尾静脈に挿入して、造影媒体を静脈内注射した。
【００７１】
画像化は、Acuster S-150という自己遮蔽勾配付きコイル（±２０G/cm、内径１５cm）を備えた、２．０Tで作動するCSI-II Omega分光計を用いて実施した。希釈した０．０１mmol/lのガドペンテタート＝ジメグルミンを満たしたファントムを、視野に定置することになる。
【００７２】
画像化は、たとえば、この排他的ではないプロトコルに従って、実施した：
【００７３】
１．プレコントラストの領域Ｔ1の測定を、三次元ＳＰＧＲ（ＴＲ＝５０ミリ秒、ＴＥ＝１．４ミリ秒、フリップ角＝１０〜９０°）によって実施した。マトリックス：１２８ｘ１２８ｘ１６、スライス肉厚：３mm、ＦＯＶ：５０ｘ５０ｘ４８。異なる５通りのフリップ角を用い、方程式：
【００７４】
SI＝kM0（1−exp(−TR／T1)sin（α）／（1−cos（α）exp(−TR／T1)）
【００７５】
〔式中、ＳＩは、シグナル強度、αは、フリップ角、ＴＲは、配列反復時間、ｋＭ0は、磁化密度に関する定数である〕
に当てはまる曲線によって決定した。
【００７６】
２．初期プレコントラスト画像３葉、および動的ポストコントラスト画像１７葉よりなる、動的「鍵穴」（key hole）（マトリックス：１２８ｘ１６ｘ８）三次元ＳＰＧＲ配列（ＴＲ＝３０ミリ秒、ＴＥ＝１．４ミリ秒、フリップ角＝９０°、取得時間＝４秒）、直後に、高い空間解像力、および同一のパラメーター（取得時間＝１分２秒）を有する、動的三次元ＳＰＧＲ（「フルマトリックス：１２８ｘ１２８ｘ１６」）のポストコントラスト画像２０葉。
【００７７】
３．高解像力Ｔ1加重付き三次元ＳＰＧＲ（ＴＲ＝３０ミリ秒、ＴＥ＝１．４ミリ秒、フリップ角＝９０°）による「後期ポストコントラスト」測定。
【００７８】
ＭＲIデータおよび動態解析：
画像を、MRVisionソフトウェアパッケージ（The MRVision Co, Menlo Park, CA）を用いたSun Sparc Ultra 1ワークステーション（Sun Microsystems, Mountain View, CA）に移し、処理し、解析した。各ラットについて各時点で、問題の点領域（ＲＯＩ）をファントム、下大静脈（ＩＶＣ）、および腫瘍周辺内で掃引した。腫瘍のＲＯＩは、「後期ポストコントラスト」像上の最も強化する画素を特定する、半自動化された、シグナル閾値に基づく取組み方を用いて選んだ。これにより、腫瘍の最も攻撃的な（最も血管新生の活性に富む）部分の評価が得られた。
【００７９】
動的シグナル応答は、分光計の潜在的な時間的変動については、ガドリニウムファントムのシグナル強度（ＳＩ）に正規化することによって補正されることになる。
【００８０】
ポストコントラストＲ１（＝１／Ｔ１）値を、ポストコントラストシグナル強度ＳＩ、およびプレコントラストＴ１値の知識に基づいて算出した。あらゆる時点でのプレコントラストとポストコントラストのＲ１値の差は、血液、または問題の組織のいずれかでの造影媒体の濃度に、方程式：
【００８１】
SIpost／SIpre＝（1−exp（−TR／T1post））／（1−exp（−TR／T1pre））
【００８２】
に従って比例すると仮定した（プレコントラスト後の状態の間でシグナル減衰要因に半価はないと仮定）。
【００８３】
これから、下式を得た：
【００８４】
【表１】
0004786112.tif 000002
【００８５】
血液および腫瘍から得られたΔＲ１のデータを、たとえば、巨大分子薬剤〔AJR: 171(4):941-9〕で広く用いられる二区画双方向モデル、またはたとえば薬剤の排出を考慮したその適切な変更のような、しかしそれらに限定されない、適切なモデルを用いることによって内皮透過率係数ＫPS（ml・分-1・組織１００cc-1）、および分画血漿量ｆＰＶ（ml・組織cc-1）を推計するための動態分析に用いた。
【００８６】
ｆＰＶ、ＫPSおよびｋ2〔二区画双方向モデルにおけるｋ2は、間質の水から血漿に戻る造影媒体の還流の分別率を意味する速度定数である〕の値を、造影剤濃度Ｃ（ｔ）の推計量としての動的ΔＲ１（ｔ）のデータを、下記の簡単な方程式：
【００８７】
【表２】
0004786112.tif 000003
【００８８】
〔式中、Ｃt＝トレーサーの血漿（血管の）濃度、Ｃi＝その間質濃度であり、αは、血管分画を表す（式１）〕から誘導される適切な微分方程式に当てはめることによって、造影剤ごとに、かつ腫瘍ごとに決定した。間質濃度の変化率は、血漿からの造影剤の流入、および間質からの流出に依存した（式２）。Ｃp（血漿濃度）は、体クリアランスを反映する２項指数関数（式３）によって与えられた。ヘマトクリット、分別量および時間単位についての尺度的補正は、適宜行った。このモデルは、動的なトレーサー動態のデータの追跡で充分に確立されている。曲線のプロッティング、および非線形最小二乗適合には、適切なソフトウェア／パッケージを用いることになる。
【００８９】
統計：
各造影剤についてのＫPSおよびｆＰＶの平均値を、対応のないｔ検定を用いて比較した。ＫPSおよびｆＰＶについて導出された値を、同じ腫瘍における異なる造影媒体と比較して、ピアソン相関分析を実施した。＜０．０５のｐ値を、統計的に有意であると見なされた。
【００９０】
一方におけるｆＰＶと微小血管透過率ＫPSとの値間の相関、および他方におけるScarff-Bloom-Rychardsonの格付け体系による腫瘍の組織学的特徴付けを、線形回帰分析を用いて得た。
【００９１】
静脈内投与された造影剤の尿および糞便排泄スクリーニングのための実験的モデル
実験は、ラット６匹で実施した。動物に、０．１および１．０mmol/kgのＢ−２２９５６／１造影剤の単発用量を、６ml／分の注入率で静脈内注射した。
【００９２】
ラットを、代謝用ケージ内で個別に飼育し、尿および糞便を、投与後７日間、毎日捕集した。特に、糞便および尿は、下記の期間：７日目まで、０〜２４時にわたり、２４時間ごとに捕集した。
【００９３】
投与７日後に、動物を断頭によって殺し、動物の血液を、ヘパリン添加試験管に捕集し、次いで３，５００ｇで１５分間遠心分離して、血漿を分離した。採血後に、肝臓、脾臓、大腿骨および腎臓を採集し、秤量して、器官内のＧｄの残留含量を評価した。器官標本中の残留ガドリニウム濃度は、Jobin-Yvonモデル２４分光計を用いた高周波誘導結合プラズマ原子発光分光分析（ＩＣＰ−ＡＥＳ）によって決定した。
【００９４】
Ｂ−２２９５６／１を注射したラットの排泄スクリーニング
スクリーニングは、対照化合物を０．２５Mで用いて実施した。薬剤は、０．１および１．０mmol／動物体重kgの単発用量でラット６匹に静脈内注射した。
【００９５】
０．１mmol/kgのＢ−２２９５６／１の静脈内投与後に、Ｇｄは、主として糞便により、かつより少ない程度で尿によって排除された。特に、糞便および尿中に回収されたガドリニウムの平均累積量は、それぞれ、注入された用量（ＩＤ）の８８．２±７．９％、およびＩＤの９．０±３．７％に相当した。注入用量の約８７％が、注射後２４時間以内に糞便中に回収された。
【００９６】
０．１mmol/kgの用量の投与後７日以内の累積尿および糞便排除は、ＩＤの９４〜１０２％であった。１．０mmol/kgという比較用１０倍用量では、Ｇｄは、尿および糞便によって同じ程度に排除された。平均すると、ガドリニウムは、投与後０〜７日の期間内に、それぞれ、ＩＤの３９．７±１．４％および５２．７％に相当する累積量で、糞便および尿中に回収された。注入用量の約４８％は、尿中に、またＩＤの約３７％は、糞便中に、注射後２４時間以内に回収された。
【００９７】
１．０mmol/kgの用量の投与後７日以内の累積尿および糞便排除は、ＩＤの８９〜９２％であった。
【００９８】
０．１mmol/kgまたは１．０mmol/kgのいずれかのＢ−２２９５６／１の投与の７日後には、血漿、肝臓、脾臓、大腿骨および腎臓における残留Ｇｄは、非常に低いか、または無視することができた。特に、血漿中のＧｄの残留含量は、双方の投与用量について、ＩＣＰ−ＡＥＳによる０．０５μgのガドリニウムの検出限度未満であった。
【００９９】
ラットにおける４０ml/kgという血漿量を考慮すると、投与の７日後の血漿中の残留Ｇｄは、いずれの場合にも、注入用量の０．０４％未満であった。