(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞における代謝フラックスの解析方法であって、
（ａ）同位体で標識された基質を含まない培地で、代謝フラックス解析の対象とする状態となるまで細胞を培養する工程、
（ｂ）同位体で標識された基質を培地に添加し、培養を継続するとともに経時的に培養液から試料を採取する工程、
（ｃ）経時的に採取された試料に含まれる細胞内代謝物における同位体分布を測定する工程、
（ｄ）測定されたデータに対して下記一般式（Ｉ）で示される特異関数を用いて回帰分析を実行し、定常状態の重量分布ベクトルを算出する工程、および
【数１】
0004802507.tif 000015
（ｅ）算出された重量分布ベクトルを含む細胞の分析値から、解析する細胞内代謝フラックスに関して構築された細胞内代謝フラックスモデルに基づいて、培養細胞の代謝フラックスを解析する工程、を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
添加される基質の量が、試料を採取する時間内に全てが分解されない量である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｅ）における代謝フラックスの解析が最適化アルゴリズムの実行を含む方法により行われる請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
最適化アルゴリズムが進化アルゴリズムである請求項３項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞内代謝フラックスモデルを表す関数に、菌体構成成分の物質と菌体内プールの同物質間の交換係数を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
細胞が、有用化合物の生産能を保持する微生物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
有用化合物がアミノ酸および／または有機酸である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
培養が回分培養または流加培養である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
細胞内代謝物がアミノ酸および／もしくは有機酸並びに／またはその主要代謝中間体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
同位体分布が質量分析により測定される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞における代謝フラックス解析方法に用いるプログラムであって、
（Ｉ）下記（ａ）〜（ｃ）の工程により測定された同位体分布を記憶する手段、
（ａ）同位体で標識された物質を含まない培地で、代謝フラックス解析の対象とする状態となるまで細胞を培養する工程、
（ｂ）同位体で標識された基質を培地に添加し、培養を継続すると共に経時的に培養液から試料を採取する工程、および、
（ｃ）経時的に採取された試料に含まれる細胞内代謝物における同位体分布を測定する工程、
（II）記憶されたデータに対して下記一般式（Ｉ）で示される特異関数を用いて回帰分析を実行し、定常状態の重量分布ベクトルを算出する手段、並びに、
【数２】
0004802507.tif 000016
（III）算出された重量分布ベクトルを含む細胞の分析値から、解析する細胞内代謝フラックスに関して構築された細胞内代謝フラックスモデルに基づいて、培養細胞の代謝フラックスを解析する手段、としてコンピューターを機能させるためのプログラム。
【請求項１２】
請求項１１記載のプログラムを記録したことを特徴とするコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は代謝フラックス（流束）を解析する方法、すなわち代謝フラックス解析方法、プログラムおよび記録媒体に関する。更に詳しくは、同位体標識物質を用いる代謝フラックス解析方法、プログラムおよび記録媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
代謝フラックス解析方法は、細胞内での代謝物質や同位体標識化合物のバランスを解析すること、より具体的には、核磁気共鳴法（NMR）あるいは質量分析（MS）などの分析手法を用いて、同位体化合物のトレース実験を行うことによって、定量的に細胞内の代謝フラックスの決定を行う方法であって、対象細胞の代謝反応経路中での各代謝物の量比（カーボンバランス）を化学量論的に解析する手法として近年注目されている（非特許文献１）。
【０００３】
代謝フラックス解析に適用する、正確な解析手法を開発すべく、種々の研究が行われている。同位体標識をした基質を用いた代謝フラックス解析に関する理論については、多くの研究報告があり、確立してきている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。代謝フラックス解析法の確立のために多くの実験が行われているが、正確な解析精度を得るため、理想的条件である合成培地を使用した連続培養法による研究が一般的である（非特許文献６）。また、より実用的な培養法である回分培養で代謝フラックス解析をしている例も一部には報告されているが、培地中に排出された幾つかの物質の同位体分布の測定が行われているのみであり、菌体内物質の同位体分布測定に基づく計算は全くなされていない（非特許文献７）。一般的に同位体基質は高価であり、従来の方法で実験を実施すると実験費用が著しく高価になるという問題点があった（非特許文献８、非特許文献９）。
【非特許文献１】メタボリック・エンジニアリング(Metabolic Engineering), 2001年, 第3巻, p.265-283
【非特許文献２】バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング(Biotechnology and Bioengineering), 1997年, 第55巻, p.101-117
【非特許文献３】バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング(Biotechnology and Bioengineering), 1997年, 第55巻, p.118-135
【非特許文献４】バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング(Biotechnology and Bioengineering), 1999年, 第66巻, p.69-85
【非特許文献５】バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング(Biotechnology and Bioengineering), 1999年, 第66巻, p.86-103
【非特許文献６】ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry), 2000年, 第275巻, p.35932-35941
【非特許文献７】ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(European Journal of Biochemistry), 2001年, 第268巻, p.2441-2455
【特許文献１】国際公開第WO 00/46405号パンフレット
【特許文献２】国際公開第WO 02/061115号パンフレット
【特許文献３】国際公開第WO 02/055995号パンフレット
【非特許文献８】ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー(Journal of Biotechnology), 2002年, 第94巻, p.37-63
【非特許文献９】メタボリック・エンジニアリング(Metabolic Engineering), 2001年, 第3巻, p.195-205
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これまでの同位体標識化合物を用いて行う代謝フラックス解析は、同位体標識化合物を基質として多量に使用するため非常に高価になるという欠点があり、また、主に連続培養のように全体が定常状態の培養の解析には適しているが、回分培養や流加培養には適当ではないという問題がある。実際の研究開発あるいは生産においては、より安価で、解析する培養時期や培養法を選ばない代謝フラックス解析手法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記問題点に鑑み、鋭意検討を行った結果、同位体標識化合物を用いて行う代謝フラックス解析において、代謝フラックス解析に必要な、同位体で標識された化合物における同位体分布比率を、少量の同位体標識化合物を用いて算出する方法を見出した。すなわち、代謝フラックス解析の対象とする状態まで培養した後、炭素源として同位体で標識された基質を少量添加した培地中で培養した細胞の代謝物を経時的に分析することにより得られる測定値に対して、特定の回帰分析を実行することにより、代謝フラックス解析の対象とする状態における、同位体で標識された化合物の同位体分布比率を算出することが可能であることを見出した。
【０００６】
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、下記のものを提供する。
（１）細胞における代謝フラックスの解析方法であって、
（ａ）同位体で標識された基質を含まない培地で、代謝フラックス解析の対象とする状態となるまで細胞を培養する工程、
（ｂ）同位体で標識された基質を培地に添加し、培養を継続するとともに経時的に培養液から試料を採取する工程、
（ｃ）経時的に採取された試料に含まれる細胞内代謝物における同位体分布を測定する工程、
（ｄ）測定されたデータに対して回帰分析を実行し、
定常状態の同位体分布比率を算出する工程、および、
（ｅ）算出された同位体分布比率を用いて培養細胞の代謝フラックスを解析する工程、を有することを特徴とする方法。
【０００７】
（２）添加される基質の量が、試料を採取する時間内に全てが分解されない量である、（１）記載の方法。
【０００８】
（３）回帰分析が、下記一般式（Ｉ）で示される特異関数を用いて実行される、（１）または（２）記載の方法。
【０００９】
【数１】
0004802507.tif 000002
【００１０】
（４）代謝フラックスの解析が最適化アルゴリズムの実行を含む方法により行われる（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
【００１１】
（５）最適化アルゴリズムが進化アルゴリズムである（４）に記載の方法。
【００１２】
（６）代謝フラックスの解析が、解析する細胞内代謝フラックスに関して構築された細胞内代謝フラックスモデルを用いる方法であり、細胞内代謝フラックスモデルを表す関数に、菌体構成成分の物質と菌体内プールの同物質間の交換係数を含む（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
【００１３】
（７）細胞が、有用化合物の生産能を保持する微生物である、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
【００１４】
（８）有用化合物がアミノ酸および／または有機酸である、（７）記載の方法。
【００１５】
（９）培養が回分培養または流加培養である、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の方法。
【００１６】
（１０）細胞内代謝物がアミノ酸および／もしくは有機酸並びに／またはその主要代謝中間体である、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法。
【００１７】
（１１）同位体分布が質量分析により測定される、（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法。
【００１８】
（１２）細胞における代謝フラックス解析方法に用いるプログラムであって、
（Ｉ）下記（ａ）〜（ｃ）の工程により測定された同位体分布のデータを記憶する手段、（ａ）同位体で標識された物質を含まない培地で、代謝フラックス解析の対象とする状態となるまで細胞を培養する工程、
（ｂ）同位体で標識された基質を培地に添加し、培養を継続すると共に経時的に培養液から試料を採取する工程、および、
（ｃ）経時的に採取された試料に含まれる細胞内代謝物における同位体分布を測定する工程、
（II）記憶されたデータに対して回帰分析を実行し、定常状態の同位体分布比率を算出する手段、並びに、
（III）算出された同位体分布比率を用いて培養細胞の代謝フラックスを解析する手段、としてコンピューターを機能させるためのプログラム。
【００１９】
（１３）（１２）記載のプログラムを記録したことを特徴とするコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【発明の効果】
【００２０】
この方法によれば、同位体標識化合物基質の使用量が少ないため、安価に代謝フラックスを解析できる。また、短時間で同位体分布の動的変化を解析して代謝フラックスを算出
することができるため、回分培養や流加培養などにおける非定常状態の培養解析にも有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明における代謝フラックスとは、細胞内の化学反応の化学量論モデルと代謝物間の質量作用則から導かれる細胞内の代謝物の流速（フラックス）である。
【００２２】
本発明における解析対象となる細胞としては、どのようなものも対象となるが、とりわけ物質生産に用いられる細胞、例えば、各種培養細胞、カビ、酵母、各種バクテリア等が挙げられる。好ましくは、有用化合物、例えばアミノ酸、核酸、または有機酸を産生する能力を保持する微生物である。アミノ酸、核酸、または有機酸の生産能を保持する微生物としては、例えば、大腸菌、バチルス属細菌、コリネ型細菌などが好適に用いられる。
【００２３】
以下、工程（ａ）〜（ｅ）について工程毎に説明する。
工程（ａ）は、同位体で標識された物質を含まない培地で、代謝フラックス解析の対象とする状態となるまで細胞を培養する工程である。代謝フラックス解析の対象とする状態とは、細胞内の代謝が停止していない状態である。回分培養や流加培養などにおける定常状態、非定常状態にかかわらず、培養の如何なるフェーズでも解析の対象となる。中でも流加培養が好ましい対象である。
【００２４】
同位体で標識された基質における同位体とは、工程（ｂ）において用いられる同位体である。同位体で標識された基質とは、その同位体により、自然に存在する物質と区別できる物質、すなわち、自然に存在する同位体比率と異なる同位体比率で同位体を含む物質を意味する。したがって、同位体で標識された基質を含まない培地とは、工程（ｂ）において添加される基質が添加前の培地に含まれる場合に、当該基質が自然に存在する同位体比率と同じ同位体比率でその同位体を含む基質のみである培地を意味する。
【００２５】
培地および培養条件は、培養する細胞、および、代謝フラックス解析の対象とする状態に合わせて適宜選択するが、例えば使用される培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養源を含有する通常の培地が挙げられる。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース、でんぷん加水分解物などの糖類、グリセロール、ソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素源、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。無機イオン又はその源としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。これらの他に、有機微量栄養源として、ビタミンＢ1、または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。培養は、通常好気的条件下で行い、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜９に制御する。尚、ｐＨ調整には無機または有機の酸性またはアルカリ性物質、例えばアンモニアガス等を使用することが出来る。これにより、代謝フラックス解析の対象とする状態となるまで細胞を培養することができる。
【００２６】
工程（ｂ）は、同位体で標識された基質を、工程（ａ）の培養の培地に添加し、培養を継続するとともに経時的に培養液から試料を採取する工程である。
【００２７】
この工程は、工程（ａ）の培養により、代謝フラックス解析の対象とする状態が達成されている時に行う。培養液からの試料の採取は、工程（ｃ）で同位体分布を測定するのに必要な量採取すればよい。通常、質量分析器で分析を行う場合は、一検体あたり菌体量として１００ｍｇ程度あればよく、この量は分析する化合物の数に応じて調節する。
【００２８】
本発明における同位体とは、通常には安定同位体であるが、放射性の同位体も同様の目的に使用することができる。同位体で標識された基質としては、同位体で標識されたグルコース、シュクロース、フルクトース、酢酸、各種アミノ酸などが挙げられる。同位体で標識された基質が炭素源として用いられる場合の基質としては、一位の炭素が安定同位体で標識されたグルコースおよび／またはすべての炭素が安定同位体で標識されたグルコースが挙げられる。同位体としては、13Ｃ、14Ｃ、17Ｏ、18Ｏ、15Ｎ、32Ｐ、33Ｐ、33Ｓ、34Ｓ、35Ｓ、36Ｓ、2Ｈ、3Ｈなどが挙げられる。グルコースなどの炭素源を基質として用いる場合は、13Ｃや18Ｏの使用が好ましい。
【００２９】
標識に用いる同位体、及び、標識の態様は、工程（ｅ）における解析方法に合わせて適宜選択する。代謝フラックス解析方法が解析モデルを用いるものである場合、解析モデルの感度分析を行って、同位体で標識された基質の条件（標識部位や、標識部位の異なる基質の混合比等）を決定することが好ましい。感度分析の方法としては、例えばMollney, M., W. Wiechert, D. Kowanatzki, and A. A. de Graaf. Biotechnology and Bioengineering 66, 86-103に記載の方法が挙げられるが、基質の条件検討が出来るものである限り、特にこれに限定されない。
【００３０】
同位体で標識された基質の添加量は、工程（ｄ）で回帰分析を行うのに十分なデータが工程（ｃ）で測定されるのに十分な量であればよい。好ましくは、添加量は、試料を採取する時間内に全てが分解されない量である。
【００３１】
同位体で標識された基質を添加する際には、培地中の基質における同位体で標識された基質の割合が高く（例えば９０モル％以上に）なるように、添加前に培地中の基質を枯渇に近い量まで減少させることが好ましい。例えば、流加培養のように基質を培養中に加える培養の場合には、基質の添加を停止することにより基質の量を減少させることができる。
【００３２】
基質を枯渇させてしまうと、細胞の状態が変化し、目的の状態について代謝フラックスの解析ができなくなるので、基質量を直接的または間接的にモニターすることが好ましい。例えば、基質が枯渇すると培地中の溶存酸素濃度が上昇するので、溶存酸素濃度の変化をモニターすることにより、枯渇直前の時点を決定することができる。
【００３３】
試料を採取する時間および回数は、工程（ｄ）の回帰分析で信頼性のある値が算出されるのに十分なものであればよい。添加基質の種類、回帰分析の方法、培養条件等に合わせて適宜選択すればよいが、通常には、添加後０〜６０分間に、３〜５回という条件が挙げられる。また、添加直後の採取間隔をその後の採取間隔より短くすることが好ましい。
【００３４】
工程（ｃ）は、工程（ｂ）で経時的に採取された試料に含まれる細胞内代謝物における同位体分布を測定する工程である。
【００３５】
本発明における細胞内代謝物とは、基質が細胞内で代謝されてできる最終産物又は中間体である。細胞内代謝物については、その生化学反応とともに多くの知見が得られており、データベース化されている（例えば、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）を参照のこと（http://www.genome.ad.jp/kegg/）。
【００３６】
同位体分布としては、アイソトポマー分布ベクトル（Biotechnology and Bioengineering 55, 831-840）、重量分布ベクトル（Biotechnology and Bioengineering 62, 739-750）などが挙げられる。質量分析（マススペクトロメトリー）で測定できる点では、重量分布ベクトルが好ましい。測定方法としては、高速液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ−Ｍ
Ｓ）、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ−ＭＳ）等の質量分析、核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）等が挙げられ、質量分析が特に好ましい。
【００３７】
試料に含まれる細胞内代謝物における同位体分布の測定は通常の方法によって行うことができ、例えば、重量分布ベクトルの場合には、試料から細胞内代謝物を抽出し、抽出物を質量分析により分析する方法が挙げられる。試料からの細胞内代謝物の抽出方法としては、超音波破砕や酸による菌体内物質抽出などの、通常用いられる手法が挙げられる。
【００３８】
測定においては、天然に存在する同位体による影響を補正することが好ましい。補正の方法としては、WittmannとHeinzleの方法（Biotechnology and Bioengineering 62, 739-750）が挙げられるが、天然に存在する同位体の存在比率を利用し、分析データを補正することの出来る手法であれば、特にこれに限定されない。
【００３９】
工程（ｄ）は、工程（ｃ）で測定されたデータに対して回帰分析を実行し、定常状態の同位体分布比率を算出する工程である。
【００４０】
回帰分析の方法は、定常状態の同位体分布比率を算出できる限り、特に限定されず、非線形回帰分析などの方法が挙げられる。好ましくは、一般式（Ｉ）で示される特異関数を用いる回帰分析である。この特異関数を用いる回帰分析では、測定されたデータからの回帰により定数ａ、ｂ、ｃ及びｄを求め、定数の求められた一般式（Ｉ）においてｔを無限大にすることにより算出された同位体分布比率が定常状態の同位体分布比率となる。一般式（Ｉ）において、ηおよびλは、測定されたデータにより回帰誤差が最小となるように選択する。ｔは、同位体基質を添加した時点をゼロとし、各測定時までの経過時間を表す。
【００４１】
工程（ｅ）は、工程（ｄ）で算出された同位体分布比率を用いて培養細胞の代謝フラックスを解析する工程である。
【００４２】
工程（ｅ）は、同位体分布比率を用いて培養細胞の代謝フラックスを解析する工程であれば、特に限定されないが、通常には、解析する細胞内代謝フラックスに関して構築された細胞内代謝フラックスモデルに基づいて、炭素原子、窒素原子、酸素原子、水素原子、リン原子、硫黄原子等が同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の分析値から細胞内代謝フラックスを解析する方法により行われる。
【００４３】
細胞内代謝フラックスモデルは、解析する代謝フラックスに関して構築されたものであれば、特に限定されず、通常の構築方法に従って構築された細胞内代謝フラックスモデルでよい。代謝フラックスに関して構築されるとは、解析する代謝フラックスの反応（反応経路）が、構築された細胞内代謝フラックスモデルに含まれることを意味する。
【００４４】
代謝フラックスに関する細胞内代謝フラックスモデルの構築方法の例としては、Metabolic Engineering 3, 265-283, 2001（非特許文献１）、Wiechert, W. and de Graaf, A. A. Biotechnology and Bioengineering 55, 101-117, 1997（非特許文献２）、Metabolic
Engineering 3, 195-205, 2001（非特許文献９）、Metabolic Engineering 3, 173-191,
2001、Biotechnology and Bioengineering 55, 831-840, 1997等の方法が挙げられる。
【００４５】
代謝フラックスを解析する反応経路としては、細胞内主要代謝経路であればいずれでもよいが、とりわけ、糖代謝経路、TCA回路、ペントースリン酸経路、各種アミノ酸合成固有経路については微生物醗酵による有用化合物生産の実用性から重要であることから、これらを含めることが好ましい。
【００４６】
細胞内代謝フラックスモデルの構築においては、分岐のない一連の反応を一つの反応として扱う、代謝速度の速い反応により変換される反応前後の代謝物を一つの代謝物として扱うなど、反応経路の簡略化を行ってもよい。
【００４７】
細胞の分析値とは、炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の測定可能な分析値であり、例えば、代謝物における同位体分布の分析値の他、菌体生成速度、有用物質生産速度などが挙げられる。同位体分布の分析値は、同位体分布を反映する分析値であればよく、例えば、アイソトポマー分布ベクトル（Biotechnology and Bioengineering 55, 831-840）、重量分布ベクトル（Biotechnology and Bioengineering 62,
739-750）などが挙げられる。質量分析で測定できる点では、重量分布ベクトルが好ましい。
【００４８】
炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の分析値から細胞内代謝フラックスを決定する工程は、通常に用いられる決定方法に従って決定することができる。分析値が同位体分布の分析値を含む場合には、通常には、アイソトポマーのバランス式を用いて決定が行われる（例えば、Biotechnology and Bioengineering 66, 69-85, 1999（非特許文献４）参照）。
【００４９】
細胞の分析値が、代謝フラックスモデルにおける変数を計算する（代謝フラックスモデルが化学量論行列で表されるときには解を得る）のに十分な場合には、細胞の分析値に基づき代謝フラックスモデルにおける変数を決定し、これにより代謝フラックスを決定することができる。細胞の分析値が、代謝フラックスモデルにおける変数を計算するのに十分でない場合には、通常、代謝フラックスモデルにおける同位体分布の他の変数の一部を自由変数とする。次に、自由変数、同位体分布の分析値以外の細胞の分析値、および、用いた基質における標識の様式（同位体の位置および数ならびにこれらが異なる複数の基質を用いる場合にはそれら基質の割合）に基づいて代謝フラックスモデルから同位体分布を計算する。次に、同位体分布の分析値と前記計算値の比較に基づく最適化を行い、代謝フラックスモデルにおける変数を決定し、これにより代謝フラックスを決定することができる。このような最適化の方法の例としては、Metabolic Engineering 3, 265-283, 2001（非特許文献１）、Biotechnology and Bioengineering 55, 118-135, 1997（非特許文献３）、Biotechnology and Bioengineering 66, 69-85, 1999（非特許文献４）等に記載された方法が挙げられる。
【００５０】
炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞における代謝物の同位体分布の分析値から細胞内代謝フラックスを決定する工程における、基質の標識パターンの決定は通常の方法により行うことができる（例えば、Biotechnology and Bioengineering 66, 86-103, 1999（非特許文献５）参照）。
【００５１】
解析する細胞内代謝フラックスに関して構築された細胞内代謝フラックスモデルに基づいて、炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の分析値から細胞内代謝フラックスを解析する方法においては、下記の（ｅ-ａ）〜（ｅ-ｃ）の条件の少なくとも一つを満たすことが好ましい。
【００５２】
（ｅ-ａ）細胞の分析値は、細胞内代謝フラックスモデルに含まれる細胞内代謝物の同位体分布の分析値を含み、細胞内代謝物の同位体分布の分析値は、細胞内代謝物と細胞内代謝物が取り込まれて生じる細胞構成成分との間の合成と分解の度合いにより補正される。
【００５３】
（ｅ-ｂ）細胞内代謝フラックスモデルは、有用化合物および／またはその主要代謝中間体を含み、細胞の分析値は、培地中の、細胞内代謝物と同じ化合物であって、同位体で標識されていない化合物の細胞への取り込み速度、並びに、有用化合物および／またはその
主要代謝中間体の同位体分布の分析値を含み、有用化合物および／またはその主要代謝中間体の同位体分布の分析値は、取り込み速度から細胞構成成分に取り込まれる速度を減じた速度を代謝経路への速度と仮定し、その代謝経路への速度による有用化合物および／またはその主要代謝中間体の同位体分布に及ぼす影響により補正される。
【００５４】
（ｅ-ｃ）細胞内代謝フラックスモデルは、二酸化炭素の固定反応および二酸化炭素の発生反応を含み、固定反応で使用される二酸化炭素を、発生反応で発生した二酸化炭素と仮定する。
【００５５】
この好ましい態様における細胞構成成分とは、細胞を構成する物質であって、細胞内代謝物が取り込まれて生じる物質である。例えば、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質等の物質である。また、細胞構成成分の分解物とは、それに取り込まれる細胞内代謝物と同じレベルの分解物を意味する。例えば、細胞構成成分が、アミノ酸が取り込まれて生じるタンパク質である場合には分解物はアミノ酸である。本明細書においては、細胞構成成分が、アミノ酸が取り込まれて生じるタンパク質である場合、特に、それを細胞タンパク質ともいう。また、細胞タンパク質の分解物であるアミノ酸を細胞タンパク質加水分解アミノ酸ともいう。
【００５６】
以下、各条件について説明する。
（ｅ-ａ）は、代謝フラックスの計算に際して、細胞内代謝物（例えばアミノ酸）の同位体分布を、細胞生育期に構成された細胞内構成成分（例えば細胞タンパク質）の分解により生成される細胞内代謝物から受ける影響、すなわち、細胞内代謝物プールと細胞内構成成分の分解により生成される細胞内代謝物との交換反応を考慮して補正するものである。補正の方法は、細胞内代謝物の同位体分布の分析値を交換反応に基づき補正したものとしてもよいし、細胞内代謝フラックスモデルに交換反応を含ませてもよい。細胞内代謝フラックスモデルに交換反応を含ませる場合には、細胞内代謝フラックスモデルは、細胞内代謝物とその細胞内代謝物が取り込まれて生じる細胞構成成分との交換反応を含み、細胞の分析値は、細胞内代謝物および細胞構成成分の分解物の同位体分布の分析値を含む。細胞内代謝フラックスモデルに交換反応を含ませる場合には、細胞内代謝物の同位体分布の分析値の補正値を直接的に使用するものではないが、代謝フラックスモデルに基づいて細胞内代謝フラックスを決定することにより、結果として細胞内代謝物の同位体分布の分析値が補正されたことになる。交換反応は、菌体構成成分の物質と菌体内プールの同物質間の交換係数(例えばタンパク質分解係数Pex)により表すことができる。また、この交換係数は、各物質ごとに独立に設定して計算した方が解析精度の向上が見込まれる。
【００５７】
細胞内代謝物の同位体分布の補正の方法の具体例としては、細胞内代謝フラックスモデルを、細胞内代謝物とその細胞内代謝物が取り込まれて生じる細胞構成成分との交換反応を含むものとし、細胞の分析値に、細胞内代謝物および細胞構成成分の分解物の同位体分布の分析値を含ませることが挙げられる。
【００５８】
また、１）細胞内代謝物の同位体分布と細胞構成成分の分解物の同位体分布を測定する工程、２）工程１）で得られた結果から最適化アルゴリズムを用いて、細胞内代謝物と細胞構成成分との合成と分解との度合いを最適化する工程により補正することが挙げられる。この態様においては、合成と分解の度合いを交換反応係数で定義される変数として表現することが好ましい。また、最適化の方法としては、線形計画法、焼きなまし法、遺伝的アルゴリズム（"Genetic Algorithms in Search, Optimization and Machine Learning",
Addison Wesley(1989)）、進化アルゴリズム（Journal of theoretical Biology 199, 45-61, 1999）等が挙げられるが、遺伝的アルゴリズムや進化アルゴリズムの使用が好ましい。この態様では、細胞内代謝物がアミノ酸および／または有機酸であり、かつ細胞構成成分がタンパク質であることが好ましい。
【００５９】
細胞構成成分の分解物の同位体分布の分析値を用いる態様においては、細胞構成成分の分解物の同位体分布の分析値を、培地中の、細胞内代謝物と同じ化合物であって、同位体で標識されていない化合物の細胞構成成分への取り込みの影響を考慮して補正することが好ましい。例えば、細胞構成成分がタンパク質である場合には、細胞タンパク質加水分解アミノ酸の同位体分布の分析値を用いて代謝フラックスを計算する際に、培地中の、同位体で標識されていないアミノ酸の細胞タンパク質への取り込みを補正する。
【００６０】
（ｅ-ｂ）は、培地中に、同位体で標識されていない、細胞内代謝物と同じ化合物が含有されるときに、それらが細胞に取り込まれる速度を分析し、取り込み速度から細胞構成成分に使用される速度を差し引いた残りの速度が分解経路に流れる流束であると仮定して、細胞内の有用化合物および／または主要代謝中間体の同位体分布に及ぼす影響を補正するものである。補正の方法は、細胞内代謝物の同位体分布の分析値を分解経路に流れる流束に基づき補正したものとしてもよいし、細胞内代謝フラックスモデルに上記流速を含ませてもよい。この態様では、同位体で標識されていない化合物がアミノ酸（好ましくはイソロイシン）であることが好ましい。
【００６１】
（ｅ-ｃ）は、培養液中の二酸化炭素分圧は全てが、細胞が同位体標識基質を消費して排出した二酸化炭素に由来すると仮定してカーボンバランスを算出するものである。
【００６２】
本発明の好ましい態様では、以上のような条件を満たすことにより補正または仮定が行われる。これにより、同位体標識化合物を用いて行う代謝フラックス解析における解析誤差を小さくすることができる。
【００６３】
代謝フラックスが解析される細胞は、有用化合物の生産能を保持する微生物であることが好ましい。このような細胞としては、大腸菌、コリネ型細菌、バチルス属細菌が挙げられる。有用化合物とは、調味料や食品添加物、医薬品などとして有用な化合物であって、アミノ酸、有機酸、核酸などが挙げられる。
【００６４】
また、主要代謝中間体とは、代謝フラックス解析モデルに含まれるすべての代謝中間体を意味し、ピルビン酸、グルコース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸、オキザロ酢酸等が挙げられる。
【００６５】
細胞の培養は回分培養または流加培養であることが好ましい。回分培養とは、培養系において注入培地と最終培地量が一致している培養法であり、流加培養とは、培養系において注入培地に連続的または間欠的に基質を添加する培養法である。本発明の解析方法は、培養が回分培養または流加培養である場合であっても適用が可能である。
【００６６】
同位体分布が測定される細胞内代謝物はアミノ酸および／もしくは有機酸並びに／またはその主要代謝中間体であることが好ましい。
【００６７】
本発明は、本発明の解析方法を実施するためのプログラムも提供する。本発明のプログラムは、
（Ｉ）下記（ａ）〜（ｃ）の工程により測定された同位体分布のデータを記憶する手段、（ａ）同位体で標識された物質を含まない培地で、代謝フラックス解析の対象とする状態となるまで細胞を培養する工程、
（ｂ）同位体で標識された基質を培地に添加し、培養を継続すると共に経時的に培養液から試料を採取する工程、および、
（ｃ）経時的に採取された試料に含まれる細胞内代謝物における同位体分布を測定する工程、
（II）記憶されたデータに対して回帰分析を実行し、定常状態の同位体分布比率を算出する手段、並びに、
（III）算出された同位体分布比率を用いて培養細胞の代謝フラックスを解析する手段、としてコンピューターを機能させることを特徴とする。
【００６８】
（ａ）〜（ｃ）の工程（ラベル基質パルス添加系）により測定された同位体分布のデータは、通常には、キーボード等のデータ入力手段、または、記憶媒体からもしくは伝送媒体を介して転送する手段により入力される。
【００６９】
記憶されたデータに対して回帰分析を実行し、定常状態の同位体分布比率を算出する手段は、本発明の解析方法に関して説明した算出の工程を行うのに適した手段であればよい。
【００７０】
算出された同位体分布比率を用いて培養細胞の代謝フラックスを解析する手段は、本発明の解析方法に関して説明した解析の工程を行うのに適した手段であればよい。解析の結果は、通常には、ディスプレイ等の表示手段、または、記憶媒体へまたは伝送媒体を介して転送する手段により出力される。
【００７１】
好ましい態様のプログラムは、上記（Ｉ）〜（III）の手段に加えて、解析する細胞内代謝フラックスに関して構築された細胞内代謝フラックスモデルを記憶する手段、炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の分析値を入力する手段、細胞内代謝フラックスモデルおよび細胞の分析値に基づき細胞内代謝フラックスモデルの変数を決定し、細胞内代謝フラックスを決定する手段、ならびに、決定された細胞内代謝フラックスを出力する手段としてもコンピューターを機能させるためのプログラムであって、上記（ｅ-ａ）〜（ｅ-ｃ）の少なくとも一つを満たすように、細胞内代謝フラックスモデルが構築され、および／または、細胞内代謝フラックスモデルの変数が算出されることを特徴とする。
【００７２】
解析する細胞内代謝フラックスに関して構築された細胞内代謝フラックスモデル、および、炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の分析値については本発明の解析方法に関し説明した通りである。細胞内代謝フラックスモデルは、通常には、細胞内代謝フラックスモデルの表現に通常に使用されるデータの形式で記憶される。例えば、代謝フラックスモデルが化学量論行列で表されるときには、モデルのデータは行列として記憶される。分析値を入力する手段は、記憶媒体からまたは伝送媒体を介して転送する手段を包含する。
【００７３】
細胞内代謝フラックスモデルおよび細胞の分析値に基づき細胞内代謝フラックスモデルの変数を決定し、細胞内代謝フラックスを決定する手段は、本発明の解析方法に関して説明した決定の工程を行うのに適した手段であればよい。
【００７４】
決定された細胞内代謝フラックスを出力する手段は、記憶媒体へまたは伝送媒体を介して転送する手段を包含する。細胞内代謝フラックスの出力は、代謝フラックスモデルが構築された代謝ネットワークを図で示し、図中の代謝ネットワークの各反応に対応する位置にフラックスの値を表示するものであってもよい。
【００７５】
本発明のプログラムのフローチャートを図７に示す。上記（I）の（ａ）〜（ｃ）およびそれらの好ましい態様については、本発明の解析方法について工程（ａ）〜（ｃ）に、上記（II）およびその好ましい態様については、本発明の解析方法について工程（ｄ）に、上記（III）およびその好ましい態様については、本発明の解析方法について工程（ｅ）に、それぞれ、説明した通りであり、これらを満たすように、細胞内代謝フラックスモ
デルが構築され、および／または、細胞内代謝フラックスモデルの変数が算出されるようにする他は、通常のプログラム化の方法に従って本発明のプログラムを作成することができる。
【００７６】
また、本発明の別の態様は上記プログラムを記録したことを特徴とするコンピューター読み取り可能な記録媒体に関する。すなわち、本発明にかかるプログラムを、コンピューター読み取り可能な記録媒体に格納することができる。ここで、この「記録媒体」は、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤ等の任意の「可搬用の物理媒体」や、各種コンピュータシステムに内蔵されるＲＯＭ、ＲＡＭ、ＨＤ等の任意の「固定用の物理媒体」、あるいは、ＬＡＮ、ＷＡＮ、インターネットに代表されるネットワークを介してプログラムを送信する場合の通信回線や搬送波のように、短期にプログラムを保持する「通信媒体」を含むものとする。
【００７７】
また、「プログラム」は、任意の言語や記述方法にて記述されたデータ処理方法であり、ソースコードやバイナリコード等の形式を問わない。なお、「プログラム」は必ずしも単一的に構成されるものに限られず、複数のモジュールやライブラリとして分散構成されるものや、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）に代表される別個のプログラムと協働してその機能を達成するものをも含む。なお、実施の形態に示した各装置において記録媒体を読みとるための具体的な構成、読み取り手順、あるいは、読み取り後のインストール手順等については、周知の構成や手順を用いることができる。
【実施例１】
【００７８】
以下に示す菌株および培地を使用した。
（ａ）大腸菌株とプラスミド
菌株：WYK050（Escherichia coli野生株W3110のS-(2-アミノエチル)システイン耐性かつリジン分解系遺伝子ldcおよびcadA遺伝子欠損株（Kikuchi, Y. et al. J. Bacteriol. 179, 4486-4492, 1997））。
プラスミド：pCAB1（ベクターRSF1010にE. coli由来lysC、dapA、dapB 遺伝子を搭載）
培養には、WYK050にpCAB1を導入した菌株を使用した。
【００７９】
（ｂ）培地
LB寒天培地：1.0％バクトトリプトン、0.5％バクトイーストエキストラクト、1％NaCl、1.5％寒天。必要に応じてストレプトマイシンを20μg/ml添加した。
主培養培地：硫酸アンモニウム 16g/L、リン酸二水素一カリウム 3g/L、酵母抽出物 4g/L、硫酸鉄七水和物 10mg/L、硫酸マンガン五水和物 10mg/L、イソロイシン 400mg/L、グルコース 40g/L、硫酸マグネシウム七水和物 1g/L。pHは、水酸化カリウムで7.0に調整した。必要に応じてストレプトマイシンを20μg/ml添加した。主培養培地は大腸菌の液体培養に使用した。
流加溶液：グルコース 500g/L、硫酸アンモニウム 80g/L
【００８０】
（１）代謝フラックス解析モデルの構築
細胞内代謝中間体の擬定常状態を仮定して、代謝フラックスを計算する化学量論式を構築した(Savinell and Palsson, Journal of Theoretical Biology 154, 421-454, 1992; Vallino and Stephanopoulos, Biotechnology and Bioengineering 41, 633-646, 1993)。このモデルに含まれる反応式は、第２表に示した通りであり、各略号の説明については第１表に記載する。分岐のないいくつかの反応は、式を単純化するため一つにまとめた。ペントースリン酸経路は複雑なため、２つの式にまとめて表記した。バイオマスの構成比率については以前報告されているデータを使用した(Neidhardt et al., Physiology of the Bacterial Cell, 1990)。また、細胞内タンパク質のアミノ酸の構成比は、実際に細胞内タンパク質を加水分解して得たアミノ酸の濃度比より求めた。このモデルの化学量論行
列は自由度が８であり、解を得るためには、糖消費速度のほかに７つのフラックスを決めなければならない。７つのフリーフラックスとして、次のものを定義した。菌体生成速度、リジン生産速度、酢酸生成速度、蟻酸生成速度、ICLフラックス、G6PDHフラックス、リンゴ酸酵素(Malic Enzyme)フラックスである。菌体生成速度および各種生成速度については、培養実験より結果を得た。そして、残りの３つのフラックスについては、アミノ酸などの同位体分布の測定値を元に最適化アルゴリズムにより決定した。また、構築したモデルは１４の可逆反応を含む。その可逆性は、０から１の数値を取りうる交換係数として定義した(Dauner et al., Biotechnology and Bioengineering 76, 144-156, 2001; Wiechert and de Graaf, Biotechnology and Bioengineering 55, 101-117, 1997)。これらの交換係数もまた、先の３つのフリーフラックスと同様に同位体分布の測定値を元に決定する変数である。解糖系、ペントースリン酸経路、TCAサイクルの隣り合う反応の可逆性は簡便性のため等しいと仮定した。感度分析の結果、第２表の反応リスト中の反応９，２８，２９については、同位体分布に影響をほとんど与えないことが明らかとなったため、０と仮定した。以上より、決定しなければならない可逆反応は６つとなった。
【００８１】
モデル内のすべての物質の アイソトポマー分布ベクトル(Isotopomer Distribution Vector:IDV)を計算するために、フリーフラックスと交換係数および基質のアイソトポマー分布の関数としてアイソトポマーバランス式を構築した。IDVという列ベクトルは、アイソトポマーの割合を表し、要素の合計は１となるものである(Schmidt et al., Biotechnology and Bioengineering 55, 831-840, 1997; Wittmann and Heinzle, Biotechnology and Bioengineering 62, 739-750, 1999)。アイソトポマーバランス式は、Schmitらにより詳細に説明されているアイソトポマーマッピングマトリックス（IMM）を用いて記述されている(Schmidt, et al., Biotechnology and Bioengineering 55, 831-840, 1997)。アトムマッピングマトリックス（AMM）は、反応物から生成物への炭素原子の移動を表記した行列で、これを元に、数値計算ソフトであるMATLAB(The MathWorks, Natick, MA)を用いて、反応物から生成物へのアイソトポマーの移動を表記する行列であるアイソトポマーマッピングマトリックス（IMM）を計算する。
【００８２】
アイソトポマーのバランス式は、フリーフラックスと交換係数を入力としてGause-Seidelの繰り返し法を用いて解くことができる。
【００８３】
グルコースの消費に加えて、微生物細胞は二酸化炭素を取り込み、生育の途中で酢酸を消費する。二酸化炭素は、同位体標識グルコースの代謝からも発生するため何割かは13C-二酸化炭素である。この割合は、二酸化炭素を発生するすべての反応を考慮した二酸化炭素のバランス式により計算された。正確な値は細胞内代謝フラックス分布に依存して異なるが、概して32%程度であった。この計算をするにあたり、大気中からの二酸化炭素を消費することはないと仮定した。なぜならば、細胞が同位体標識グルコースを消費して発生した二酸化炭素の濃度は非常に高く（実験では、排出二酸化炭素の濃度は、４〜５％に及んだ）、発酵槽中の二酸化炭素分圧はすべて細胞が排出した二酸化炭素と考えて差し支えないからである。
【００８４】
マススペクトロメトリーによる分析から各物質すべてのアイソトポマー分布を求めることはできないが、重量の分布は求めることができる。この情報は、重量分布ベクトル（MDV）として表すこととし、各要素は同じ重量からなるアイソトポマーを含んでいる（Wittman and Heinzle, Biotechnology and Bioengineering 62, 739-750, 1999）。従って、炭素数nの物質には、MDVの要素数はn+1個存在することとなる。MDVは、IDVから同じ重量の要素を合計して計算することができる。こうして計算されたMDVは、実験よりもとめたMDVと比較することにより、モデルの結果がどれだけ実験値とあっているかを評価することができる。
【００８５】
【表１−１】
0004802507.tif 000003
【００８６】
【表１−２】
0004802507.tif 000004
【００８７】
【表２−１】
0004802507.tif 000005
【００８８】
【表２−２】
0004802507.tif 000006
【００８９】
（２）天然に存在する炭素、水素、窒素、酸素、各原子の同位体による影響の補正
Heizleらの論文(Wittman and Heinzle, Biotechnology and Bioengineering 62, 739-750, 1999)に従い、プログラムを作成して全分析データに対して水素、炭素、窒素、酸素の自然同位体による影響の補正を実施した。
【００９０】
天然に存在する水素、炭素、窒素、酸素の同位体の比率はそれぞれ、1H=0.99985、2H=0.015、12C=0.98893、13C=0.01107、14N=0.99634、15N=0.00366、16O=0.99759、17O=0.00037、18O=0.00204として計算した。αを低質量同位体の存在比率、βを高質量同位体の存在比率とし（α+β=1を満たす）、ρniを対応する二項係数とすると、水素、炭素、窒素の自然同位体補正行列は以下のように記述できる。E1は物質名とする。
【００９１】
【数２】
0004802507.tif 000007
【００９２】
【数３】
0004802507.tif 000008
【００９３】
（３）代謝フラックス最適化
アイソトポマーのバランス式を用いてフリーフラックスと交換反応のフラックスを入力値としてMDVを計算し、実験で得たMDVとの差の2乗和が最小となるように先に入力したフリーフラックスと交換反応のフラックスの値を進化的アルゴリズム(Stephani et al, Journal of theoretical Biology 199, 45-61, 1999)により最適化するというプログラムを構築した。このプログラム中において、比較対照とした同位体基質初期添加系については
、最適化の対象とする変数は、ICL、Malic Enzyme、ペントースリン酸経路（G6PDH）のフラックス、6つの交換反応の値並びにタンパク質と細胞内アミノ酸プールとの交換反応を表すPexである。
【００９４】
同位体基質パルス添加系では、上記プログラムにおいて、Pexをすべてのアミノ酸に固有の変数として設定し、上記の（１）に記載のアイソトポマーバランス式内に組み込んだ。菌体収率、リジン収率については、入力値に対して20%の誤差を許容するように設定した。これは、実験の際の測定誤差を加味するためである。計算時間を短縮するために、一般的な進化的アルゴリズムに対していくつかの変更を加えた。種々検討した結果、解の空間内で最小値を探索するには要素数が50000、世代数が200という設定が最適であることがわかったので、解析にはそれらの設定値を用いた。
【００９５】
（４）感度分析
フリーフラックスの信頼区間は、各測定値の分散だけでなくヤコビアン行列にも依存する。ヤコビアン行列とは、最適値付近でフリーフラックスが変化したときの各IDVの変化しやすさを表現するものである。構築した代謝解析モデルを元にヤコビアン行列を作成し、Mollneyら(Biotechnology and Bioengineering 66, 86-103)の方法に従って、ラベルグルコースの最適な混合比を見つけるために感度解析を実施した。使用ラベルグルコースは1-13C-GlcとU-13C-Glcに限定して計算した結果、それぞれ50%(mol%)ずつの混合比が最適であるという結果を得た。
【００９６】
（５）培養実験
LB寒天培地上にWYK050/pCAB1菌株溶液を塗布し、37℃で24時間静置培養した。その静置培養プレート2枚の細胞を種培地に植菌した。種培養は初糖を完全に消費した時点で終了とし、その培養液を主培地に植菌して主培養を行った。種培地および主培地の組成は同じであり、上記の主培養培地の通りである。培養には1Lジャーファーメンターを使用し、同位体標識基質パルス添加系では、基質には非標識のグルコースを使用した。同位体基質初期添加系は、標識グルコースを使用した（1-13C-Glc：U-13C-Glc＝５：５）。培養の初発液量は300mlで、温度、pHはそれぞれ37℃、6.7に制御した。pHの制御には、アンモニアガスを使用した。通気は、300ml/minに制御した。培養液の溶存酸素濃度は常に5%以上を維持するように撹拌数を適宜制御した。糖液（流加溶液）の流加は、培養17時間に開始した。流加速度は、培地の糖濃度が5g/L以下になるように適宜調節した。発酵サンプルの取得は、培養17時間目と培養25時間目に実施した。比較対照である同位体基質初期添加系では、補正用に菌体タンパク質加水分解アミノ酸の測定も各サンプルで実施した。同位体基質パルス添加系では、サンプルを取得する時間直前に、非標識のグルコースの流加を停止し糖の枯渇を待機した。糖が枯渇して溶存酸素濃度が上昇に転じる瞬間に、予め準備していた標識グルコース（1-13C-Glc：U-13C-Glc＝５：５）を2 g添加し、添加時を0分として、1分後、5分後、10分後、30分後にサンプリングを実施した。サンプルは、サンプリング後、直ちに菌体内アミノ酸の抽出を行った。各アミノ酸の同位体分布測定は、LC-MSを用いて行った。
【００９７】
（６）パルス添加実験系における同位体定常状態のアミノ酸同位体比率の予測
同位体基質をパルス添加した後の各時間のアミノ酸の同位体分布比のMS分析データをもとに、
【００９８】
【数４】
0004802507.tif 000009
の関数を用いて回帰分析を実施した。ξは物質名で、ａ、ｂ、ｃ、ｄは対応する回帰パラメータ、λ及びηは外部パラメータである。MDV (Mi)は物質ξの質量M＋ｉの存在比を表
す。このとき、物質ξの炭素数をnとするとｉは０からｎの整数値からなり、ΣMDV (Mi)=1を満たす。外部パラメータλ及びηは、探索範囲をそれぞれ０．１刻みで０．１から２までと１刻みで１から２０までの合計４００個で実施し、アミノ酸ごとに非線形回帰誤差が最小となる回帰パラメータを計算により求めた。その結果を第３表に示す。代表例として、アラニンとグリシンについて、得られた回帰パラメータを使用した培養１７時間目と培養２５時間目の回帰分析結果を図１に示す。非線形回帰分析により得られた回帰パラメータａ、ｂ、ｃ、ｄより、時間ｔを無限大としたときのMDV (Mi)ξを計算して、同位体分布が定常状態の各アミノ酸MDVを予測した。その結果得られた同位体分布定常状態のアミノ酸MDV実験値を第６表に示す。
【００９９】
（７）代謝フラックス解析
上述した（６）の方法により求めた各アミノ酸のMDVを用いて、前述の（３）の方法で代謝フラックスの計算を実施した。代謝フラックス最適化の際に使用した、菌体外のリジン生成速度および酢酸生成速度並びに菌体生成速度を糖消費速度で規格化した値を第４表に示す。
【０１００】
同位体標識グルコース初期添加系および同位体標識グルコースパルス添加系における培養１７時間と培養２５時間目の解析の結果得られた自由フラックスを第５表に示し、その自由フラックスを基に計算したすべての代謝フラックス分布を図２〜５に示す。代謝フラックス解析により得られた各アミノ酸のMDV計算値を第６表に示す。ＭＤＶ計算値は、前記（６）で得られたＭＤＶ実験値とよく符合した。
【０１０１】
【表３】
0004802507.tif 000010
【０１０２】
【表４】
0004802507.tif 000011
【０１０３】
【表５】
0004802507.tif 000012
【０１０４】
【表６−１】
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【０１０５】
【表６−２】
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【０１０６】
（８）同位体基質初期添加系と同位体基質パルス添加系の解析結果の比較
同位体基質初期添加系の解析結果と、本発明の同位体基質パルス添加系の解析結果のフリーフラックスの値を比較したグラフを図６に示す。培養１７時間及び培養２５時間の解析データは、それぞれ相関係数０．９７及び０．９９と良い相関を示した。従って、同位体基質パルス添加系での解析においても初期添加系と同様の傾向の結果を得ることができたと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１−１】回帰分析結果（同位体基質パルス添加、培養開始後１７時間）を示す。
【図１−２】回帰分析結果（同位体基質パルス添加、培養開始後２５時間）を示す。
【図２】代謝フラックス解析結果（同位体基質初期添加、培養開始後１７時間）を示す。
【図３】代謝フラックス解析結果（同位体基質初期添加、培養開始後２５時間）を示す。
【図４】代謝フラックス解析結果（同位体基質パルス添加、培養開始後１７時間）を示す。
【図５】代謝フラックス解析結果（同位体基質パルス添加、培養開始後２５時間）を示す。
【図６】同位体基質初期添加系と同位体基質パルス添加系の解析結果の比較を示す。
【図７】代謝フラックスの解析プログラムのフローチャートを示す。
【図１−１】
0004802507.tif 000017
【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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