(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のエストロゲンレセプターをコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するエストロゲンレセプター。
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有するエストロゲンレセプター。
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するエストロゲンレセプター。
（ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有するエストロゲンレセプター。
【請求項２】
配列番号２で示される塩基配列の塩基番号４２４〜１９４１で表される塩基配列、または配列番号５で示される塩基配列の塩基番号７４〜１８１９で表される塩基配列を有するエストロゲンレセプター遺伝子。
【請求項３】
請求項１または２記載のエストロゲンレセプター遺伝子を含有するベクター。
【請求項４】
エストロゲンレセプター遺伝子にプロモーターが機能可能な形で結合されてなる請求項３記載のベクター。
【請求項５】
ベクターがウイルスである請求項３または４記載のベクター。
【請求項６】
請求項５記載のベクターを含有するウイルス粒子。
【請求項７】
宿主細胞内で複製可能なベクターに請求項１または２記載のエストロゲンレセプター遺伝子を組込むことを特徴とするベクターの製造方法。
【請求項８】
請求項１または２記載のエストロゲンレセプター遺伝子が宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
【請求項９】
請求項３〜５のいずれかに記載のベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
【請求項１０】
エストロゲンレセプター遺伝子が宿主細胞の染色体に導入されてなる請求項８または９記載の形質転換体。
【請求項１１】
宿主細胞が動物細胞である請求項８〜１０のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項１２】
宿主細胞が哺乳類動物細胞である請求項８〜１１のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項１３】
宿主細胞が昆虫類動物細胞である請求項８〜１１のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項１４】
宿主細胞が酵母細胞である請求項８〜１０のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項１５】
請求項１もしくは２記載の遺伝子または請求項３〜５のいずれかに記載のベクターを宿主細胞に導入することを特徴とする形質転換体の製造方法。
【請求項１６】
請求項８〜１４のいずれかに記載の形質転換体を培養してエストロゲンレセプターを産生させることを特徴とするエストロゲンレセプターの製造方法。
【請求項１７】
配列番号１または配列番号４のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するエストロゲンレセプター。
【請求項１８】
配列番号１または配列番号４のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有するエストロゲンレセプター。
【請求項１９】
請求項１または２記載のエストロゲンレセプター遺伝子を発現し、エストロゲン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子が導入されている形質転換体と、被験物とを接触させ、該形質転換体における前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程を含む被験物のエストロゲンレセプター活性調節能の評価方法。
【請求項２０】
リガンド依存的にエストロゲンレセプターに結合可能な転写共役因子または該転写共役因子のレセプター結合領域と、エストロゲンレセプターまたは該レセプターのリガンド結合領域とがリガンド依存的に複合体を形成することによりレポーター遺伝子の転写が活性化されるツーハイブリッドシステムにおいて、被験物のエストロゲンレセプター活性調節能を測定するための請求項１または２記載のいずれかに記載のエストロゲンレセプター遺伝子の使用。
【請求項２１】
請求項１７または１８記載のエストロゲンレセプターと被験物とを接触させ保温する工程を含むレセプターバインディングアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エストロゲンレセプター遺伝子およびその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
近年、環境中の幾つかの化学物質がエストロゲン様活性を示すことが報告され、例えばある種の化学物質による野生の魚類等の雌性化の報告がなされている（Ｔ．Ｃｏｌｂｏｒｎ，Ｄ．Ｄｕｍａｎｏｓｋｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｐ．Ｍｙｅｒｓ著：Ｏｕｒ  Ｓｔｏｌｅｎ  Ｆｕｔｕｒｅ，１９９６，Ｄｕｔｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ発行）。かかる化学物質の活性はヒトを含めた各種生物のホルモンバランスを崩し、異常や疾患の原因となることが危惧されることから、化学物質の安全性評価の一環として化学物質のエストロゲン様活性を測定する試みがなされている。
エストロゲンが、エストロゲンの標的細胞に存在するエストロゲンレセプターに結合すると、該レセプターは活性化されて染色体上のエストロゲン応答配列に結合し、そこへさらに、エストロゲンとエストロゲンレセプターとの複合体を認識する転写共役因子群が結合して、該応答配列の下流に在する遺伝子の発現を促進する。そこで、化学物質のエストロゲン様活性を測定するための方法として、化学物質のエストロゲンレセプター活性調節能を評価するための試験系の開発が求められており、該試験系に利用することのできるエストロゲンレセプター遺伝子が切望されている。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況の下、鋭意検討した結果、水生動物のモデル動物であるブルーギルからエストロゲンレセプター遺伝子を単離することに成功し、本発明に至った。
すなわち、本発明は、
１）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のエストロゲンレセプターをコードする遺伝子（以下、本発明遺伝子と記す。）、
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するエストロゲンレセプター。
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有するエストロゲンレセプター。
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するエストロゲンレセプター。
（ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有するエストロゲンレセプター。
２）配列番号２で示される塩基配列の塩基番号４２４〜１９４１で表される塩基配列、または配列番号５で示される塩基配列の塩基番号７４〜１８１９で表される塩基配列を有するエストロゲンレセプター遺伝子、
３）本発明遺伝子を含有するベクター（以下、本発明ベクターと記す。）
４）宿主細胞内で複製可能なベクターに本発明遺伝子を組込むことを特徴とするベクターの製造方法、
５）本発明遺伝子が宿主細胞に導入されてなる形質転換体（以下、本発明形質転換体と記す。）、
６）本発明遺伝子または本発明ベクターを宿主細胞に導入することを特徴とする形質転換体の製造方法、
７）本発明形質転換体を培養してエストロゲンレセプターを産生させることを特徴とするエストロゲンレセプターの製造方法、
８）配列番号１または配列番号４のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するエストロゲンレセプター、
９）配列番号１または配列番号４のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有するエストロゲンレセプター、
１０）本発明遺伝子を発現し、エストロゲン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子が導入されている形質転換体と、被験物とを接触させ、該形質転換体における前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程を含む被験物のエストロゲンレセプター活性調節能の評価方法、
１１）リガンド依存的にエストロゲンレセプターに結合可能な転写共役因子または該転写共役因子のレセプター結合領域と、エストロゲンレセプターまたは該レセプターのリガンド結合領域とがリガンド依存的に複合体を形成することによりレポーター遺伝子の転写が活性化されるツーハイブリッドシステムにおいて、被験物のエストロゲンレセプター活性調節能を測定するための本発明遺伝子の使用、
１２）前項８）または９）記載のエストロゲンレセプターと被験物とを接触させ保温する工程を含むレセプターバインディングアッセイ
を提供するものである。
【０００４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明遺伝子としては、具体的には例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するエストロゲンレセプターをコードする遺伝子、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するエストロゲンレセプターをコードする遺伝子、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有するエストロゲンレセプターをコードする遺伝子、配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有するエストロゲンレセプターをコードする遺伝子、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号４２４〜１９４１で表される塩基配列を有するエストロゲンレセプター遺伝子、配列番号５で示される塩基配列の塩基番号７４〜１８１９で表される塩基配列を有するエストロゲンレセプター遺伝子等をあげることができる。ここで、「配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有するエストロゲンレセプター」としては、例えば、約４００アミノ酸残基以上からなる領域において配列番号１で示されるアミノ酸配列と約９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるエストロゲンレセプターと実質的に同等の特性のレセプター機能を有するエストロゲンレセプターをあげることができる。また、「配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有するエストロゲンレセプター」としては、例えば、約４００アミノ酸残基以上からなる領域において配列番号４で示されるアミノ酸配列と約９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるエストロゲンレセプターと実質的に同等の特性のレセプター機能を有するエストロゲンレセプターをあげることができる。レセプター機能は、例えば、後述のレポーターアッセイ、ツーハイブリッドシステム、レセプターバインディングアッセイ等に基づき評価することができる。また、かかるエストロゲンレセプターのアミノ酸配列において認められる、配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号４で示されるアミノ酸配列とのアミノ酸の相違とは、アミノ酸の欠失、置換、付加等であって、これらには、動物の系統、個体、器官、組織等の違いに基づくアミノ酸配列の違いなどの天然に生ずる多型変異も含まれる。このようなエストロゲンレセプターをコードする遺伝子としては、天然の遺伝子であってもよいし、例えば、部位特異的変異導入法や突然変異処理等によって、天然の遺伝子に変異を導入することにより作出された遺伝子であってもよい。
【０００５】
本発明遺伝子は、例えば、魚類ブルーギル（学名：Ｌｅｐｏｍｉｓ  ｃｅｎｔｒａｒｃｈｉｄａｅ）等の組織から、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー  クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリングハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ発行、１９８９年）等に記載の遺伝子工学的方法に準じて取得することができる。具体的には例えば、まず、ブルーギルの組織由来の全ＲＮＡを調製する。ブルーギルの肝臓等の組織を塩酸グアニジンやグアニジンチオシアネート等の蛋白質変性剤を含む溶液中で粉砕し、さらに該粉砕物にフェノール、クロロホルム等を加えることにより蛋白質を変性させる。変性蛋白質を遠心分離等により除去した後、回収された上清画分から塩酸グアニジン／フェノール法、ＳＤＳ−フェノール法、グアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法等の方法により全ＲＮＡを抽出する。なお、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えばＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン製）やＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）がある。
得られた全ＲＮＡを鋳型としてオリゴｄＴプライマーをＲＮＡのポリＡ配列にアニールさせ、逆転写酵素により一本鎖ｃＤＮＡを合成し、次いで該一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、かつ大腸菌ＲＮａｓｅＨを用いてＲＮＡ鎖にニックとギャップを入れることにより得られるＲＮＡ断片をプライマーとして大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩを用いて二本鎖のｃＤＮＡを合成する。更に該二本鎖ｃＤＮＡの両末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化する。得られたｃＤＮＡはフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿等の通常の方法により精製、回収する。なお、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えばｃＤＮＡ合成システムプラス（アマシャムファルマシアバイオテク社製）やＴｉｍｅＳａｖｅｒ  ｃＤＮＡ合成キット（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等がある。次に、得られたｃＤＮＡを例えば、プラスミドｐＵＣ１１８やファージλｇｔ１０などのベクターにリガーゼを用いて挿入することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。このようなｃＤＮＡライブラリーから、例えば、配列番号２または配列番号５のいずれかで示される塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法や、配列番号２または配列番号５のいずれかで示される塩基配列の部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲ法により、本発明遺伝子を取得することができる。
ハイブリダイゼーション法に用いられるプローブとしては、例えば、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号４２４〜４８３、８７１〜９２４または１８６３〜１８８１で表される塩基配列を有するＤＮＡや、配列番号５で示される塩基配列の塩基番号１８２〜２１７で表される塩基配列を有するＤＮＡ等があげられる。また、ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム）、５×デンハルト溶液［０．１ｗ／ｖ％フィコール４００、０．１ｗ／ｖ％ポリビニルピロリドン、０．１％ＢＳＡ］、０．５ｗ／ｖ％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ存在下、または１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むＤＩＧ  ＥＡＳＹ  Ｈｙｂ溶液（ベーリンガーマンハイム社）中で、６５℃で保温し、次いで１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）および０．５％ＳＤＳ存在下に、室温で１５分間の保温を２回行い、さらに０．１×ＳＳＣ（０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム）および０．５％ＳＤＳ存在下に、６８℃で３０分間保温する条件等をあげることができる。
ＰＣＲ法に用いられるプライマーとしては、例えば、約２０ｂｐから約４０ｂｐ程度の長さでかつＧまたはＣ塩基の割合が約４０％から約６０％程度の塩基配列を、配列番号２または配列番号５のいずれかで示される塩基配列の５'非翻訳領域および３'非翻訳領域からそれぞれ選択し、５'非翻訳領域から選択した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび３'非翻訳領域から選択した塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成するとよい。具体的には例えば、フォワードプライマーとして配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして配列番号７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用する組み合わせがあげられる。ＰＣＲの条件としては、例えば、反応液５０μｌ中に、１０ｘＬＡＴａｑ緩衝液（宝酒造社製）５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液（各２．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを含む。）８μｌ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ各々の終濃度が０．４ｍＭ）、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2溶液５μｌ、１０μＭプライマー  各０．５〜２．５μｌ（終濃度が０．１〜０．５μＭ）、鋳型ｃＤＮＡ  ０．１〜１μｇ、ＬＡＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）２．５ユニットを含む組成の反応液にて、９４℃で１分間次いで５５℃で２分間更に７２℃で２．５分間の保温を１サイクルとしてこれを全３０サイクル行う等の条件が挙げられる。
このようにして得られた本発明遺伝子は、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー  クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリング  ハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年等に記載の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。具体的には例えば、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）やｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）などの市販のプラスミドベクターを用いてクローニングすることができる。
尚、本発明遺伝子は、配列番号２や配列番号５で示される塩基配列に基づいて、例えばホスファイト・トリエステル法（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１０，１０５，１９８４）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製することもできる。
得られた本発明遺伝子の塩基配列は、Ｍａｘａｍ  Ｇｉｌｂｅｒｔ法（例えば、Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ  ＆  Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５６０，１９７７等に記載される）やＳａｎｇｅｒ法（例えばＳａｎｇｅｒ，Ｆ．＆  Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９４，４４１，１９７５、Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．＆  Ｎｉｃｋｌｅｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３，１９７７等に記載される）等により確認することができる。
【０００６】
このようにして取得された本発明遺伝子を、形質転換させる宿主細胞において利用可能なベクター、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主細胞からの単離、精製が可能であり、検出可能なマーカーをもつベクター（以下、基本ベクターと記す。）に、通常の遺伝子工学的手法を用いて組み込むことにより本発明ベクターを構築することができる。
本発明ベクターの構築に用いることができる基本ベクターとしては、具体的には微生物である大腸菌を宿主細胞とする場合、例えばプラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造社製）や、ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等を上げることができる。出芽酵母を宿主細胞とする場合は、プラスミドｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などをあげることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合はｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のプラスミド、ウシパピローマウイルスプラスミドｐＢＰＶ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ＥＢウイルスプラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイルス等のウイルスなどをあげることができ、昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスをあげることができる。
自律複製起点を含むベクター、例えば、上記の酵母用プラスミドｐＡＣＴ２や、ウシパピローマウイルスプラスミドｐＢＰＶ、ＥＢウイルスプラスミドｐＣＥＰ４などを用いて本発明ベクターを構築すると、該ベクターは宿主細胞に導入された際にエピソームとして細胞内に保持される。
バキュロウイルスやワクシニアウイルス等のウイルスに本発明遺伝子を組み込むには、使用するウイルスのゲノムと相同な塩基配列を含有するトランスファーベクターを用いることができる。このようなトランスファーベクターの具体的例としては、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社から市販されているｐＶＬ１３９２，ｐＶＬ１３９３（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．，Ｓｕｍｍｅｒｓ  Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２１５６−２１６５（１９８３））、ｐＳＦＢ５（Ｆｕｎａｈａｓｈｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，５５８４−５５８８（１９９１））などのプラスミドをあげることができる。本発明遺伝子を前記のようなトランスファーベクターに挿入し、該トランスファーベクターとウイルスゲノムとを同時に宿主細胞に導入すると、トランスファーベクターとウイルスゲノムとの間で相同組換えが起こり、本発明遺伝子がゲノム上にくみこまれたウイルスを得ることができる。ウイルスゲノムとしては、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，Ｖａｃｃｉｎｉａｖｉｒｕｓなどのゲノムを用いることができる。
より具体的には、例えばバキュロウイルスに本発明遺伝子を組み込む場合、トランスファーベクターｐＶＬ１３９３，ｐＶＬ１３９２等のマルチクローニング部位に本発明遺伝子を挿入した後、該トランスファーベクターのＤＮＡとＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ（Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）とを昆虫細胞Ｓｆ２１（ＡＴＣＣから入手可能）株にリン酸カルシウム法等により導入し、該細胞を培養する。前記Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ  ＤＮＡを用いると、本発明遺伝子の挿入されたウイルスＤＮＡを含有するウイルス粒子のみが宿主細胞の培養液中へ放出される。かかる組換えウイルス粒子を培養液から回収しこれをフェノール等で除蛋白処理することにより、本発明遺伝子を含有するウイルスのＤＮＡを得ることができる。さらに、該ウイルスのＤＮＡを、昆虫細胞Ｓｆ２１株などのウイルス粒子形成能を有する宿主細胞にリン酸カルシウム法等により導入し、該細胞を培養することにより、前記組換えウイルス粒子を増やすことができる。
一方、マウス白血病レトロウイルスなどの比較的小さなゲノムへは、トランスファーベクターを利用せずに、本発明遺伝子を直接組み込むこともできる。例えばウイルスベクタ−ＤＣ（Ｘ）（Ｅｌｉ  Ｇｉｌｂｏａ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４，５０４−５１２（１９８６））などは、該ベクター上のクローニング部位に本発明遺伝子を組み込むとよい。このようにして構築した組換えウイルスを例えばＡｍｐｌｉ−ＧＰＥ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，３７５５（１９９２））などのパッケージング細胞に導入すれば、本発明遺伝子の挿入されたウイルスＤＮＡを含有するウイルス粒子を得ることができる。
【０００７】
本発明遺伝子の上流に、宿主細胞で機能可能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これを上述のような基本ベクターに組み込むことにより、本発明遺伝子を宿主細胞で発現させることの可能な本発明ベクターを構築することができる。ここで、「機能可能な形で結合させる」とは、本発明遺伝子が導入される宿主細胞において、プロモーターの制御下に本発明遺伝子が発現されるように、該プロモーターと本発明遺伝子とを結合させることを意味する。使用されるプロモーターは、形質転換する宿主細胞内でプロモーター活性を示すものであって、例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター（ｌａｃＰ）、トリプトファンオペロンのプロモーター（ｔｒｐＰ）、アルギニンオペロンのプロモーター（ａｒｇＰ）、ガラクトースオペロンのプロモーター（ｇａｌＰ）、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、λファージのプロモーター（λ−ｐＬ、λ−ｐＲ）等をあげることができ、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）の初期または後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター等をあげることができる。宿主細胞が出芽酵母である場合にはＡＤＨ１プロモーターなどをあげることができる。
また、宿主細胞において機能するプロモーターをあらかじめ保有する基本ベクターを使用する場合には、ベクター保有のプロモーターと本発明遺伝子とが機能可能な形で結合するように、該プロモーターの下流に本発明遺伝子を挿入すればよい。例えば、前述のプラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ等は、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられており、該クローニング部位に本発明遺伝子を挿入し動物細胞へ導入すれば、本発明遺伝子を発現させることができる。これらのプラスミドにはあらかじめＳＶ４０の自律複製起点（ｏｒｉ）が組み込まれているため、ｏｒｉ（−）のＳＶ４０ゲノムで形質転換された培養細胞、例えばＣＯＳ細胞等に該プラスミドを導入すると、細胞内でプラスミドのコピー数が非常に増大し、結果として該プラスミドに組み込まれた本発明遺伝子を大量発現させることもできる。また前述の酵母用プラスミドｐＡＣＴ２はＡＤＨ１プロモーターを有しており、該プラスミドまたはその誘導体のＡＤＨ１プロモーターの下流に本発明遺伝子を挿入すれば、本発明遺伝子を例えばＣＧ１９４５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等の出芽酵母内で大量発現させることが可能な本発明ベクターが構築できる。
【０００８】
構築された本発明ベクターを宿主細胞に導入することにより、本発明形質転換体を取得することができる。本発明ベクターを宿主細胞へ導入する方法としては、形質転換される宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用することができる。例えば、微生物である大腸菌を宿主細胞とする場合は、「モレキュラー・クローニング」（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、コールド・スプリング・ハーバー、１９８９年）等に記載される塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等の通常の方法を用いることができる。また、哺乳類動物細胞、魚類動物細胞または昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、またはリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法により前記細胞に導入することができる。酵母菌を宿主細胞とする場合は、例えばリチウム法を基にしたＹｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などを用いて導入することができる。
尚、ウイルスをベクターに用いる場合には、上述のように一般的な遺伝子導入法によりウイルスＤＮＡを宿主細胞に導入できるほか、ウイルスＤＮＡを含有する組み換えウイルス粒子を、宿主細胞へ感染させることによってもウイルスＤＮＡを宿主細胞に導入することができる。
【０００９】
本発明形質転換体を選抜するには、例えば、導入された本発明ベクターが有するそれぞれのマーカー遺伝子の性質に応じた方法を用いればよい。例えば、マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子である場合には、該薬剤を添加した培地を用いて、本発明ベクターが導入された宿主細胞を培養すれば良い。薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤の組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせなどをあげることができる。また、マーカー遺伝子が宿主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、該栄養素を含まない最少培地を用いて、本発明ベクターが導入された細胞を培養すればよい。さらに、本発明遺伝子を宿主細胞で発現させることの可能な本発明ベクターを導入した場合には、エストロゲン結合活性に基づく検出方法を用いることもできる。
本発明遺伝子が宿主細胞の染色体に導入されてなる本発明形質転換体を取得するには、例えば、本発明ベクターを制限酵素等で消化することにより直鎖状にした後、これを前述の方法で宿主細胞へ導入して該細胞を通常数週間培養し、導入された本発明ベクターにコードされるマーカー遺伝子の発現を指標にして目的とする形質転換体を選抜すればよい。例えば、上記のような選抜薬剤に対する耐性付与遺伝子をマーカー遺伝子として有する本発明ベクターを前述の方法で宿主細胞に導入し、該細胞を選抜薬剤が添加された培地で数週間以上該細胞を継代培養して、コロニー状に生き残った選抜薬剤耐性クローンを純化培養することにより、本発明遺伝子が宿主細胞の染色体に導入されてなる本発明形質転換体を選抜することができる。該形質転換体は、凍結保存が可能であり必要に応じて起眠して使用することができるので、一過性に本発明遺伝子を導入した株と比較して、実験毎の形質転換体作製の手間を省くことができ、また、あらかじめ性質や取扱い条件の確認された形質転換体を用いて試験を実施することが可能となる。
【００１０】
上述のようにして得られた本発明形質転換体を培養することによりエストロゲンレセプターを産生させることができる。
例えば、本発明形質転換体が微生物である場合、該形質転換体は、一般微生物における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養される。培養は、一般微生物における通常の方法に準じて行い、固体培養、液体培養（試験管振とう式培養、往復式振とう培養、ジャーファーメンター（ＪａｒＦｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養、タンク培養等）などが可能である。培養温度は、微生物が生育する範囲で適宜変更できるが、例えば、約１５℃〜約４０℃の培養温度、約６〜約８の培地ｐＨで培養するのが一般的である。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通常約１日間〜約５日間である。温度シフト型やＩＰＴＧ誘導型等の誘導型のプロモーターを有する発現ベクターを用いた場合には誘導時間は１日以内が望ましく、通常数時間である。
また、上記形質転換体が哺乳類、魚類、昆虫類等の動物細胞である場合、該形質転換体は一般の培養細胞における通常の培養に使用される培地を用いて培養することができる。選抜薬剤を利用して当該形質転換体を作製した場合は、該選抜薬剤の存在下に培養するのが望ましい。哺乳類動物細胞の場合、例えば終濃度が１０ｖ／ｖ％となるようＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地（ニッスイ社製等）を用いて３７℃、５％ＣＯ2存在下等の条件で数日ごとに新しい培養液に交換しながら培養すればよい。細胞がコンフルエントになるまで増殖したら、例えば０．２５ｗ／ｖ％程度のトリプシンＰＢＳ溶液を加えて個々の細胞に分散させ、数倍に希釈して新しいシャーレに播種し培養を続ける。昆虫類動物細胞の場合も同様に、例えばＧｒａｃｅ'ｓ  ｍｅｄｉｕｍ  ＋１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ＋２ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔｌａｔｅ等の昆虫細胞用培養液を用いて培養温度２５℃から３５℃で培養すればよい。この際、Ｓｆ２１細胞などのシャーレからはがれやすい細胞の場合は、トリプシン液を用いずピペッテイングにより分散させ継代培養を行なうことができる。また、Ｂａｃｕｌｏ  ｖｉｒｕｓ等ウイルスベクターを含む形質転換体の場合は、培養時間は細胞質効果が現れて細胞が死滅する前、例えばウイルス感染後７２時間までとするのが好ましい。
本発明形質転換体により産生されたエストロゲンレセプターの回収は、適宜、通常の単離、精製の方法を組み合わせて行えば良く、例えば、培養終了後、形質転換体の細胞を遠心分離等で集め、集められた該細胞を通常のバッファー、例えば２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．５ｍＭ  ＰＭＳＦからなるバッファーに懸濁した後、ポリトロン、超音波処理、ダウンスホモジナイザー等で破砕し、破砕液を数万ｘｇで数十分間から１時間程度超遠心分離し、上清画分を回収することにより、エストロゲンレセプターを含む画分を得ることができる。さらに、前記上清画分をイオン交換、疎水、ゲルろ過、アフィニティ等の各種クロマトグラフィーに供することにより、より精製されたエストロゲンレセプターを回収することもできる。この際、エストロゲン応答配列すなわちエストロゲンレセプターが結合する塩基配列を含む１５ｂｐから２００ｂｐ程度の長さのオリゴヌクレオチドをプローブとしたＤＮＡ結合アッセイなどにより、本発明のエストロゲンレセプターを含む画分を見分けることもできる。
このようにして製造された本発明のエストロゲンレセプターは、例えば、被験物のエストロゲンレセプターに対する結合能・結合量を評価するためのレセプターバインディングアッセイ等に用いることができる。
【００１１】
本発明遺伝子は、例えば、被験物のエストロゲンレセプター活性調節能を評価するためのレポーターアッセイに利用することができる。エストロゲンレセプター活性調節能としては、エストロゲンレセプターに対するアゴニスト活性、アンタゴニスト活性等があげられる。
本発明遺伝子を用いたレポーターアッセイにおいて使用される「エストロゲン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子」とは、具体的には、例えばエストロゲン応答配列を含むアフリカツメガエルのビテロジェニン遺伝子の転写制御領域等の下流にレポーター遺伝子を結合させたキメラ遺伝子、またはエストロゲン応答配列の下流に転写開始に必要な塩基配列とレポーター遺伝子とを連結させたキメラ遺伝子などであり、宿主細胞内でのエストロゲンレセプターの転写調節能をモニターするために利用される遺伝子である。このようなキメラ遺伝子作製に用いられるレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、成長ホルモン遺伝子、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、ＢＦＰ（Ｂｌｕｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子などを利用することができ、宿主細胞における安定性が比較的高いレポーター蛋白質をコードする遺伝子が好ましい。
例えば、まず、本発明遺伝子と、エストロゲン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子とを、エストロゲンレセプター非内在性宿主細胞、具体的には例えばＨｅＬａ細胞、ＣＶ−１細胞、Ｈｅｐａ１細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＣＯＳ１細胞、ＢＦ−２細胞、ＣＨＨ−１細胞等に導入し形質転換体を取得する。ここで、本発明遺伝子は、例えば、宿主細胞で機能可能なプロモーターと機能可能な形で結合してベクターに組み込み、上記細胞に導入する。エストロゲン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子も、ベクターに組み込んで導入するとよい。また例えば、エストロゲン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子が組み込まれたベクター、本発明ベクターおよびマーカー遺伝子を同時に宿主細胞に導入し、マーカー遺伝子の発現を指標にして形質転換体を選抜することにより、エストロゲン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子、及び本発明遺伝子が宿主細胞の染色体に導入されてなる形質転換体を取得しても良い。該形質転換体は凍結保存が可能であり必要に応じて起眠して使用することができるので、これをいったん取得すると、アッセイのたび毎にこれらの遺伝子を宿主細胞に導入して新たな形質転換体を取得する必要がなく、また、形質転換体の性能も一定に保つことができることから、例えば自動化されたロボットによる大規模スクリーニングを実施する際にも有用である。
上述のように作製された形質転換体を、例えば１日間から数日間培養する間に、被験物を培地中に加えて前記形質転換体と接触させ、該形質転換体における前記レポーター遺伝子の発現量を測定する。該形質転換体が産生するエストロゲンレセプターが被験物中のエストロゲン様活性物質の結合により活性化された場合は、レポーター遺伝子の転写が促進され、レポーター遺伝子にコードされた蛋白質が形質転換体の細胞内などに蓄積されるかもしくは培地中に分泌される。この蛋白質の量を測定することにより、該形質転換体の細胞あたりのレポーター遺伝子の発現量を測定する。具体的には、例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合は、細胞粗抽出物にルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを加えると、細胞抽出物中のルシフェラーゼ量に比例した強度で発光する。従って、この発光強度をルミノメーターなどの測定装置で測定することにより、ルシフェラーゼの量、ひいては、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を知ることができる。同様にして、形質転換体に被験物を接触させない条件下におけるレポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量と、被験物を接触させた条件下におけるレポーター遺伝子発現量とを比較することにより、被験物中のエストロゲン様活性物質のエストロゲンレセプターに対するアゴニスト活性、すなわち、該レセプターの活性化能を評価することができる。また、例えば、上記の形質転換体に１７β−エストラジオール（以下、Ｅ２と記す。）等のエストロゲンを接触させた条件下、および、該エストロゲンと被験物とを同時に接触させた条件下にそれぞれ上記と同様の方法でレポーター遺伝子の発現量を測定する。形質転換体にエストロゲンを接触させた条件下におけるレポーター遺伝子の発現量と比較して、エストロゲンと被験物とを接触させた条件下におけるレポーター遺伝子の発現量が低ければ、この被験物はエストロゲンレセプターに対するアンタゴニスト活性、すなわち、該レセプターの抗活性化能を有すると評価することができる。
【００１２】
また、本発明遺伝子を、細胞内のレポーター遺伝子の発現量を指標として、該細胞における２種の融合蛋白質（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）の複合体形成能および形成された複合体の転写調節能を測定することのできる試験系（ツーハイブリッドシステム；  Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１５４，７６−８３（１９９９））に利用することができる。具体的には例えば、本発明遺伝子にコードされるエストロゲンレセプターまたは該レセプターのリガンド結合領域と、リガンド依存的に該レセプターに結合可能な転写共役因子または該転写共役因子のレセプター結合領域とがリガンド依存的に結合することにより、レポーター遺伝子の転写が活性化されるツーハイブリッドシステムにおいて、被験物の添加によるレポーター遺伝子の発現量の増減を測定することにより、被験物のエストロゲンレセプター活性調節能を評価することができる。エストロゲンレセプター活性調節能としては、エストロゲンレセプターに対するアゴニスト活性、アンタゴニスト活性等があげられる。
かかるツーハイブリッドシステムとしては、例えば、以下の（ｅ）〜（ｇ）記載の遺伝子が宿主細胞に導入されてなる形質転換体をあげることができる。
（ｅ）宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下流に接続されており、宿主細胞内で機能可能な転写調節因子のＤＮＡ結合領域と、本発明のエストロゲンレセプターまたは該レセプターのリガンド結合領域との融合蛋白質をコードする塩基配列からなるキメラ遺伝子。
（ｆ）宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下流に接続されており、宿主細胞内で機能可能な転写調節因子の転写活性化領域と、本発明のエストロゲンレセプターにリガンド依存的に結合可能な転写共役因子または該転写共役因子のレセプター結合領域との融合蛋白質をコードする塩基配列からなるキメラ遺伝子。
（ｇ）（ｅ）記載のＤＮＡ結合領域が結合可能な塩基配列および（ｆ）記載の転写活性化領域により活性化され得るプロモーターの下流に接続されてなるレポーター遺伝子。
宿主細胞としては、例えば、出芽酵母細胞や、ＨｅＬａ細胞などの哺乳類動物細胞等があげられる。本発明のエストロゲンレセプターに対する被験物の活性調節能を精度よく測定するためには、エストロゲンレセプター非内在性の細胞を使用することが好ましい。
上記（ｅ）記載の「宿主細胞内で機能可能な転写調節因子の転写活性化領域」としては、例えば、宿主細胞として出芽酵母細胞を使用する場合には、酵母由来の転写調節因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域、バクテリア由来のリプレッサーＬｅｘＡ等をあげることができる。これらをコードするＤＮＡと、本発明遺伝子または本発明のエストロゲンレセプターのリガンド結合領域をコードするＤＮＡとを、その塩基配列の読み枠を合わせて連結することにより、（ｅ）記載の「宿主細胞内で機能可能な転写調節因子のＤＮＡ結合領域と、本発明のエストロゲンレセプターまたは該レセプターのリガンド結合領域との融合蛋白質をコードする塩基配列からなるキメラ遺伝子」が得られる。また、（ｆ）記載の「宿主細胞内で機能可能な転写調節因子の転写活性化領域」としては、例えば、ＧＡＬ４の転写活性化領域、大腸菌由来のＢ４２酸性転写活性化領域等があげられる。「本発明のエストロゲンレセプターにリガンド依存的に結合可能な転写共役因子」とは、本発明のエストロゲンレセプターとリガンドとの複合体を認識してこれに結合可能な転写共役因子であって、具体的にはＳＲＣ１／ＮＣｏＡ１（Ｏｎａｔｅ，Ｓ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０，１３５４）、ＴＩＦ２／ＧＲＩＰ１（Ｖｏｅｇｅｌ，Ｊ．Ｊ．ら、ＥＭＢＯ，Ｊ．，１９９６，１５，３６６７）などがあげられる。前記のような転写活性化領域をコードするＤＮＡと、前記転写共役因子をコードするＤＮＡまたは該転写共役因子のレセプター結合領域をコードするＤＮＡとを、その塩基配列の読み枠を合わせて連結することにより、（ｆ）記載の「宿主細胞内で機能可能な転写調節因子の転写活性化領域と本発明のエストロゲンレセプターにリガンド依存的に結合可能な転写共役因子または該転写共役因子のレセプター結合領域との融合蛋白質をコードする塩基配列からなるキメラ遺伝子」を得ることができる。尚、前記キメラ遺伝子の構成を互いに入れ替えて、「宿主細胞内で機能可能な転写調節因子のＤＮＡ結合領域と、本発明のエストロゲンレセプターにリガンド依存的に結合可能な転写共役因子または該転写共役因子のレセプター結合領域との融合蛋白質をコードする塩基配列からなるキメラ遺伝子」および「宿主細胞内で機能可能な転写調節因子の転写活性化領域と、本発明のエストロゲンレセプターまたは該レセプターのリガンド結合領域との融合蛋白質をコードする塩基配列からなるキメラ遺伝子」の組合せとしてもよい。これらのキメラ遺伝子は、それぞれ「宿主細胞内で機能可能なプロモーター」の下流に接続されており、このようなプロモーターとしては、例えば、宿主細胞が出芽酵母細胞である場合には、ＧＡＬ１プロモーターのような誘導型プロモーターや、ＡＤＨプロモーターのような恒常的に発現するプロモーター等が使用される。
（ｆ）記載のレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、成長ホルモン遺伝子などを利用することができ、宿主細胞における安定性が比較的高いレポーター蛋白質をコードする遺伝子が好ましい。かかるレポーター遺伝子は、上記ＤＮＡ結合領域が結合可能な塩基配列および上記転写活性化領域により活性化され得るプロモーターの下流に接続される。例えば、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域が結合可能な塩基配列としては、ＧＡＬ１プロモーターのＧＡＬ４結合領域をあげることができ、ＬｅｘＡが結合可能な塩基配列としては、ＬｅｘＡ結合領域があげられる。また、ＧＡＬ４の転写活性化領域により活性化され得るプロモーターとしては、例えば、酵母由来の最小ＴＡＴＡｂｏｘ配列があげられる。
上述のようなキメラ遺伝子およびレポーター遺伝子を、例えばそれぞれベクターに挿入し、それらを宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。尚、宿主細胞が、利用可能な内在性のレポーター遺伝子を有する場合はそれを利用しても良く、レポーター遺伝子の導入を省略することができる。また、ツーハイブリッドシステムを調製するための市販のキット、例えばＭａｔｃｈｍａｋｅｒ  Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ＣｈｅｃｋＭａｔｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）等を利用して形質転換体を調製することもできる。本発明遺伝子にコードされるエストロゲンレセプターまたは該レセプターのリガンド結合領域と、リガンド依存的に該レセプターに結合可能な転写共役因子または該転写共役因子のレセプター結合領域とがリガンド依存的に結合することにより、レポーター遺伝子の転写が活性化されるツーハイブリッドシステムの構成の一例としては、例えば、下記の（ｈ）および（ｉ）記載の遺伝子が、内在性のＧＡＬ１  ＵＡＳ（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）および酵母由来の最小ＴＡＴＡ  ｂｏｘ配列の下流に接続されてなるＬａｃＺ遺伝子（レポーター遺伝子）を有する出芽酵母Ｙ１９０株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に導入された形質転換体をあげることができる。
（ｈ）ＡＤＨ１プロモーターの下流に接続されており、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域と、本発明のエストロゲンレセプターまたは該レセプターのリガンド結合領域との融合蛋白質をコードする塩基配列からなるキメラ遺伝子。
（ｉ）ＡＤＨ１プロモーターの下流に接続されており、ＧＡＬ４の転写活性化領域と、本発明のエストロゲンレセプターにリガンド依存的に結合可能な転写共役因子ＴＩＦ２またはＴＩＦ２のレセプター結合領域との融合蛋白質をコードする塩基配列からなるキメラ遺伝子。
上述のように作製された形質転換体を、例えば数時間から数日間培養する間に、被験物を培地中に加えて前記形質転換体と接触させ、エストロゲンレセプターまたは該レセプターのリガンド結合領域と、転写共役因子または該因子のレセプター結合領域との結合を惹起させ、その結果形成される上記２種の融合蛋白質の複合体の転写調節能を前記レポーター遺伝子の発現量を指標にして測定する。具体的には、例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合には、被験物を接触させた形質転換体から調製された細胞粗抽出物にルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを加えると、細胞粗抽出物中のルシフェラーゼ量に比例した強度で発光する。従って、この発光強度をルミノメーターなどの測定装置で測定することにより、ルシフェラーゼの量、ひいては、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を知ることができる。同様にして、形質転換体に被験物を接触させない条件下におけるレポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量と、被験物を接触させた条件下における発現量とを比較することにより、被験物中のエストロゲン様活性物質のエストロゲンレセプターに対するアゴニスト活性、すなわち、該レセプターの活性化能を評価することができる。また、例えば、上記の形質転換体にＥ２等のエストロゲンを接触させた条件下、および、該エストロゲンと被験物とを同時に接触させた条件下にそれぞれ上記と同様の方法でレポーター遺伝子の発現量を測定する。形質転換体にエストロゲンを接触させた条件下におけるレポーター遺伝子の発現量と比較して、エストロゲンと被験物とを接触させた条件下におけるレポーター遺伝子の発現量が低ければ、この被験物はエストロゲンレセプターに対するアンタゴニスト活性、すなわち、該レセプターの抗活性化能を有すると評価することができる。
【００１３】
本発明のエストロゲンレセプターを用いたレセプターバインディングアッセイは、該エストロゲンレセプターに対する化学物質の結合能の測定や結合量の定量のほか結合特異性、結合力の分析などが可能な試験方法である。例えば、上述のようにして本発明形質転換体から回収された本発明のエストロゲンレセプターに、標識されたリガンド（以下、標識リガンドと記す。）が結合しているところへ、被験物を共存させると、被験物と標識リガンドとの競合から、両者のレセプターへの親和性に応じて、標識リガンドがレセプターから遊離し、レセプターに結合した標識リガンドの量が減少し、よってレセプターに結合した標識量が減少する。従って、遊離型の標識リガンドの標識量または結合型の標識リガンドの標識量をモニターすることにより、被験物のレセプターへの結合能が間接的にわかる。
標識リガンドとしては、例えば、トリチウム標識されたＥ２等を用いることができる。標識リガンドの結合型／遊離型の分離はヒドロキシアパタイト法やグリセロール密度勾配超遠心法などで行うことができる。反応系は大きく３群にわけられる。一つの系は、エストロゲンレセプターに標識リガンドが結合しているところへ溶媒のみが添加される群であり、被験物の濃度がゼロの系に相当し、この系から得られる結合型の標識リガンドの標識量は、標識リガンドのエストロゲンレセプターに対する総結合量を示す。もう一つの系は、エストロゲンレセプターに標識リガンドが結合しているところへ、例えば、標識されていないＥ２が、レセプターを十分飽和し標識リガンドが結合できなくなるだけの濃度（例えば１０μＭ）となるよう添加された系であり、この系から得られる結合型の標識リガンドの標識量は、標識リガンドのエストロゲンレセプターに対する非特異的な結合量と判断される。したがって、エストロゲンレセプターへの標識リガンドの特異的結合量は、総結合量からこの非特異的結合量を引いた値となる。３番目の系は、エストロゲンレセプターに標識リガンドが結合しているところへ、被験物が、例えば最終濃度１０μＭ（この濃度は目的により任意に変更する。）となるよう添加された系である。被験物がエストロゲンレセプターへの結合能を有する場合は、この系から得られる結合型の標識リガンドの標識量は、上記のようにして求めた被験物濃度がゼロの時のエストロゲンレセプターへの標識リガンドの特異的結合量より小さくなる。このようにしてレセプターバインディングアッセイを行うことにより、本発明のエストロゲンレセプターに対する被験物の結合能を調べることができ、被験物が複数の物質を含む場合にはその中にエストロゲンレセプターに親和性を示す物質が存在するかどうかを調べることもできる。さらに、本発明のエストロゲンレセプターに対する被験物の結合能をより詳細に評価するには、例えば前記の３番目の系における被験物の添加濃度を変えて同様にアッセイを行い結合型の標識リガンドの標識量を測定する。該測定値に基づき、各アッセイにおける結合型と遊離型のリガンド量を算出して、例えばスキャッチャード解析を行うことにより、被験物と本発明のエストロゲンレセプターとの結合親和性、結合特異性、結合容量等を評価することができる。
【００１４】
本発明のレポーターアッセイ、ツーハイブリッドシステムおよびレセプターバインディングアッセイは、化学物質の安全性評価や、環境中のエストロゲン様活性物質の検出等に利用することができる。
【００１５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００１６】
実施例１（本発明遺伝子の取得）
（１）本発明遺伝子の取得用プローブの作製
ブルーギルの肝臓約１００ｍｇから、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて添付マニュアルに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡの約１μｇとＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。
次に配列番号８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。該オリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、上記のように調製されたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（９４℃  １分間次いで５５℃  １分間さらに７４℃  ２．５分間の保温を１サイクルとしてこれを３０サイクル）を行った。増幅された約１ｋｂｐのＤＮＡを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＥｃｏＲＶ部位を用いて作製したＴＡクローニングベクターにサブクローニングし、ベクターに挿入されたＤＮＡの塩基配列を解析した。その結果から、配列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡを取得した。該ＤＮＡが挿入されたベクターのＤＮＡ約２μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動に供して分離した後、約１ｋｂのＤＮＡをゲルから回収した。得られたＤＮＡに、ＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて耐熱性アルカリフォスファターゼを直接標識することにより、プローブを調製した。
【００１７】
（２）ｃＤＮＡライブラリーの作製
ブルーギル肝臓組織より、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール法（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３６（１）：ｐｐ８５−９３（１９９５））に準じて全ＲＮＡを調製した。全ＲＮＡの収量は約２．８ｍｇであった。全ＲＮＡ約５００μｇより、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（ｄＴ）30−Ｓｕｐｅｒ（宝酒造社製）を用いて、ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを調製した。ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡの収量は約１０μｇであった。次にＧｕｂｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎ法に基づいて  ｃＤＮＡライブラリーを作製した。まず２．４μｇのｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡ、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）18−リンカープライマー（（ＧＡ）10ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＣＣＧ（Ｔ）18、ＸｈｏＩ認識配列を含む。）、ＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅ（宝酒造製）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＴａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）を用い、５−ｍｅｔｈｙ１  ｄＣＴＰを添加して１本鎖ｃＤＮＡを合成した。得られた１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成した後、その末端を平滑化し、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩアダプター（宝酒造社製  ｃｏｄｅ  ４５１０）をライゲーションした。該ＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩで消化して、スピンカラムに供して低分子量ＤＮＡを除去した後、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化したλＺＡＰＩＩとライゲーションを行った。得られたＤＮＡとｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐａｃｋａｇｉｎｇを行い、ｃＤＮＡライブラリーを得た。該ライブラリーについて、宿主に大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてタイトレーションを行ったところ、青色コロニーと白色コロニーの出現率からインサート含有率は約９５％と推定された。
【００１８】
（３）本発明遺伝子ｂｇｅｒαの取得
実施例１（２）で調製されたｃＤＮＡライブラリーを大腸菌ＸＬ１  ＢｌｕｅＭＲＦ’株に導入し、直径１５０ｍｍのＬＢプレート（１％  Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｉｐｔｏｎｅ、０．５％  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，０．５％  ＮａＣｌ、１．５％  ａｇａｒ）に約５０，０００クローンずつプレーティングしてプラークを形成させた。このプレートを合計６枚準備して、合計３００，０００クローンを以下のスクリーニングに供した。各プレートから、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋メンブレン（アマシャムファルマシアバイオテク社製）にファージＤＮＡをうつしとり、該メンブレンを変性液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５Ｎ  ＮａＯＨ）に５分間、次いで中和液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２），１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に１０分間浸した後、乾燥させた。このメンブレンを８０℃で２時間保温した後、上記のプローブを用いて、ＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｓｙｓｔｅｍのプロトコールにしたがってハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。すなわち、前記メンブレンをＯ．５Ｍ  ＮａＣｌを含むハイブリダイゼーション溶液（アマシャムファルマシアバイオテク社製、５ｎｇプローブ／ｍｌ）に浸し、５５℃、１６時間保温した。次いで、メンブレンを、一次洗浄バッファー（２Ｍ尿素、０．１％ＳＤＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2および０．２％ブロッキング試薬を含む５０ｍＭ  ナトリウムリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）中にて６０℃、１０分間保温した後、再度、一次洗浄バッファー中にて６５℃、１０分間保温した。さらに、二次洗浄バッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む５０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液）中にて室温、５分間の洗浄を２回行った。洗浄後のメンブレンについて、ＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｓｙｓｔｅｍに含まれるＣＤＰ−Ｓｔａｒを基質として、アルカリフォスファターゼ酵素による化学発光システムにより、シグナルの検出を行った。フィルムにはＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いた。シグナルの強いものから順に１０個の陽性クローンを選択し、それぞれ滅菌済チップを用いて採取し、ＳＭバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，ＭｇＳＯ4・Ｈ2Ｏ，０．０１％ゼラチン）に懸濁して、４℃にて保存した。該陽性クローンをそれぞれ培養して直径約９０ｍｍのＬＢプレートに１，０００〜１，５００クローンずつプレーティングして（合計１０プレート）プラークを形成させ、前記と同様に、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング作業を行った。その結果、前記の１０陽性クローンのうち、３クローンについて陽性のシグナルが得られたため該陽性クローンを採取した。次いで、これら３陽性クローンを培養して直径約９０ｍｍのＬＢプレートに約２００クローンずつプレーティングしてプラーク形成させ、前記と同様に、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング作業を行った。このスクリーニングでも陽性のシグナルが得られたクローンを単一クローンとして単離した。該陽性クローンの保有するベクターから、λＺＡＰＩＩベクターキット（ストラタジーン社製）添付のプロトコールに従ってｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍを用いることにより、該ベクターに挿入されたＤＮＡがｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）のＥｃｏＲＩ部位とＸｈｏＩ部位との間にクローニングされたプラスミドを得た。該プラスミドにクローニングされたＤＮＡについて、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｗａｌｋｉｎｇ法により、塩基配列の解析を行った。その結果、該ＤＮＡは配列番号２で示される塩基配列を有し、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードしていることが判明した（以下、該アミノ酸配列を有するエストロゲンレセプターをＢＧＥＲαと記し、当該レセプターをコードする遺伝子を本発明遺伝子ｂｇｅｒαと記す。また、前記プラスミドをｐＢＳＢＧＥＲαと名付けた。）。プラスミドｐＢＳＢＧＥＲαが導入された大腸菌ＤＨ５α株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＢＳＢＧＥＲα）は、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号；ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８７６として寄託されている。
【００１９】
（４）本発明遺伝子ｂｇｅｒα２の取得
ブルーギルの肝臓約１００ｍｇから、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて添付マニュアルに従い全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡの約１μｇとＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。一方、配列番号１０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＬＡ−Ｔａｑ（宝酒造製）を用いてＰＣＲ（９４℃  １分間次いで６０℃  １分間さらに７４℃  ０．５分間の保温を１サイクルとしてこれを３０サイクル）を行いＤＮＡを増幅した。増幅されたＤＮＡは、３％  ＮｕＳｉｅｖｅ３：１アガロースゲル（ＦＭＣバイオプロダクツ社製）を用いて電気泳動した。その結果、長さの異なる２種のＤＮＡが検出された。それぞれのＤＮＡをゲルから回収しダイレクトシークエンスに供した。長い方のＤＮＡは、配列番号２で示される塩基配列の部分塩基配列を有しており、一方、短い方のＤＮＡは、該部分塩基配列から配列番号１２で示される塩基配列が欠失した塩基配列を有していた。そこで、上記のブルーギル肝臓由来のｃＤＮＡを鋳型として、配列番号１３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーとして、ＬＡ−Ｔａｑ（宝酒造製）を用いてＰＣＲ（９４℃  １分間次いで５５℃  １分間さらに７４℃  ２．５分間の保温を１サイクルとしてこれを３０サイクル）を行った。増幅された約２．０ｋｂｐのＤＮＡをＴＡクローニングベクター（ｐＧＥＭ−Ｔ、プロメガ社製）を用いて当該製品マニュアルに準じてクローニングを行い、得られた複数個のクローンの保有するベクターＤＮＡの塩基配列を確認した。その結果、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号４２４〜１９４１で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および配列番号５で示される塩基配列の塩基番号７４〜１８１９で表される塩基配列を有するＤＮＡが得られた。配列番号５で示される塩基配列の配列番号７４〜１８１９で表される塩基配列は、配列番号４で示されるアミノ酸配列をコードしていることが判明した（以下、該アミノ酸配列を有するエストロゲンレセプターをＢＧＥＲα２と記し、当該レセプターをコードする遺伝子を本発明遺伝子ｂｇｅｒα２と記す。）。
【００２０】
実施例２（本発明遺伝子ｂｇｅｒαを含有する動物細胞発現用の本発明ベクターの構築）
ＲＳＶプロモーターを有する発現プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２μｇを、制限酵素Ｘｂａ  Ｉ（１０Ｕ）で、３７℃にて終夜消化し、さらにアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）５Ｕを６５℃にて１時間反応させた。これをアガロース（アガロースＳ；ニッポンジーン社製）ゲルを用いた電気泳動に供し、５〜６ｋｂｐの長さを示すバンド部分からジーンクリーン（フナコシ社製）を用いてＤＮＡを回収し、ベクターＤＮＡとした。一方、実施例１（３）で取得されたプラスミドｐＢＳＢＧＥＲαのＤＮＡを鋳型として、配列番号１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、ＬＡ−Ｔａｑ（宝酒造製）を用いてＰＣＲ（９４℃  １分間次いで５５℃  ２分間さらに７４℃  ２．５分間の保温を１サイクルとしてこれを３０サイクル）を行いＤＮＡを増幅した。増幅されたＤＮＡをクロロホルム／フェノール処理の後、エタノール沈殿し、７０％エタノールにより遠心洗浄した後乾燥させ、ＴＥを加えて溶解させた後、制限酵素ＸｂａＩで３７℃で５時間消化した。次いで、該消化物を１％アガロースゲル電気泳動に供して分離し、約１．５ｋｂｐのＤＮＡを含むゲル部分を切り出し、これに含まれるＤＮＡをジーンクリーン（フナコシ社製）を用いて精製した。その約１００ｎｇを上記のように調製したベクターＤＮＡ５０ｎｇと混合し、５ＵのＴ４ｌｉｇａｓｅを添加して１６℃にて３時間保温した。この反応液を大腸菌  ＤＨ５α株コンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付説明書に記載の方法に従って導入し、アンピシリン耐性を示すコロニーからプラスミドＤＮＡをアルカリ法で調製した。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を解析し、ＲＳＶプロモーターの下流に連結された本発明遺伝子ｂｇｅｒαを有するプラスミドをｐＲｃ／ＲＳＶ−ＢＧＥＲαと名付けた。
【００２１】
実施例３（本発明遺伝子ｂｇｅｒα２を含有する動物細胞発現用の本発明ベクターの構築）
実施例２で作製されたＢＧＥＲα発現プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−ＢＧＥＲαのうち２μｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（１０Ｕ）で、３７℃にて終夜消化し、さらにアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）５Ｕを６５℃  １時間反応させた。これをアガロース（アガロースＳ；ニッポンジーン社製）を用いたゲル電気泳動に供し、５〜６ｋｂｐの長さを示すバンド部分からジーンクリーン（フナコシ社製）を用いてＤＮＡを回収しベクターＤＮＡとした。一方、実施例１（４）で調製されたｃＤＮＡを鋳型として、配列番号１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてＬＡ−Ｔａｑ（宝酒造製）にてＰＣＲ（９４℃１分間次いで５５℃２分間さらに７４℃２．５分間の保温を１サイクルとしてこれを３０サイクル）を行い本発明遺伝子のＤＮＡを増幅した。これをクロロホルム／フェノール処理の後、エタノール沈殿し、７０％エタノールにより遠心洗浄した後乾燥させ、ＴＥを加えて溶解させた後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで３７℃で終夜消化した。次いで、該消化物を１％アガロースゲル電気泳動に供して分離し、約１．０ｋｂｐのＤＮＡを含むゲル部分を切り出し、これに含まれるＤＮＡをジーンクリーン（フナコシ社製）を用いて精製した。その約１００ｎｇを上記のように調製したベクターＤＮＡ  ５０ｎｇと混合し、５ＵのＴ４  ｌｉｇａｓｅを添加して１６℃にて３時間保温した。この反応液を大腸菌  ＤＨ５α株コンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付説明書に記載の方法に従って導入し、アンピシリン耐性を示すコロニーからプラスミドＤＮＡをアルカリ法で調製した。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を解析し、ＲＳＶプロモーターの下流に、配列番号５で示される塩基配列の塩基番号７４〜１８１９で表される塩基配列を含むプラスミドを選択して、これをｐＲｃ／ＲＳＶ−ＢＧＥＲα２と名付けた。
【００２２】
実施例４（本発明遺伝子を用いたレポーターアッセイ）
（１）レポーターアッセイ用のレポータープラスミドの作製
Ｉｓｏｇｅｎ試薬（ニッポンジーン社製）を用いて該試薬に添付のプロトコールに記載の方法で、アフリカツメガエルのゲノムＤＮＡを精製した。該ゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｗａｌｋｅｒらの報告（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．（１９８４）  １２，８６１１−８６２６）に準じてＰＣＲを行なうことにより、アフリカツメガエルビテロゲニン遺伝子上流のＴＡＴＡ  ｂｏｘからエストロゲンレセプター応答配列までを含むＤＮＡを増幅した。増幅されたＤＮＡを回収し、その末端をＢｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑化した（該ＤＮＡを、以下、ＥＲＥ  ＤＮＡと記す。）。
配列番号１７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド［マウスメタロチオネインＩ遺伝子のＴＡＴＡ  ｂｏｘ近傍の塩基配列とリーダー配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ００６０５）に由来する］をアニーリングさせて２本鎖ＤＮＡとし、これにＴ４ポリヌクレオチドカイネースを作用させてその両末端をリン酸化した（該ＤＮＡを、以下、ＴＡＴＡ  ＤＮＡと記す）。一方、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＧＬ３（プロメガ社製）を制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化した後、これにＢａｃｔｅｒｉａｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＢＡＰ）を加えて６５℃で１時間保温した。次いで、該保温液を低融点アガロース（ＡｇａｒｏｓｅＬ；ニッポンジーン社製）を用いた電気泳動に供し、ｐＧＬ３由来のルシフェラーゼ遺伝子を含むＢｇｌ  ＩＩ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片の長さに相当する泳動度を示すＤＮＡを回収した。該ＤＮＡ約１００ｎｇと、前記のＴＡＴＡ  ＤＮＡ  １μｇとを混合し、Ｔ４リガーゼで結合させることによりプラスミドｐＧＬ３−ＴＡＴＡを作製した。次に、ｐＧＬ３−ＴＡＴＡを制限酵素Ｓｍａ  Ｉで消化した後、ＢＡＰを加えて６５℃で１時間保温した。該保温液を低融点アガロースゲル電気泳動に供し、バンド部分のゲルからＤＮＡを回収した。該ＤＮＡ約１００ｎｇと、上記  ＥＲＥ  ＤＮＡ約１μｇとを混合してＴ４リガーゼを反応させた後、該反応液をＤＨ５αコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）へ導入した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのＤＮＡを調製し、これらを制限酵素Ｋｐｎ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで消化して該消化液をアガロースゲル電気泳動で分析した。ｐＧＬ３−ＴＡＴＡのＳｍａ  Ｉ部位にＥＲＥ  ＤＮＡが１コピー導入された構造を有するプラスミドをｐＧＬ３−ＴＡＴＡ−ＥＲＥと名付け、また、前記部位にＥＲＥ  ＤＮＡが５コピー導入された構造を有するプラスミドをプラスミドｐＧＬ３−ＴＡＴＡ−ＥＲＥｘ５とした。
【００２３】
（２）一過性発現系によるレポーターアッセイ
ＨｅＬａ細胞  約２ｘ１０6細胞を１０ｃｍプレートに播種し、チャコールデキストラン処理済みＦＢＳ（以下、ＦＢＳと記す。）が１０ｖ／ｖ％となるよう添加されたＥ−ＭＥＭ培地で、５％ＣＯ2条件下３７℃にて１日間培養を行った。次いで、細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いてそのプロトコールに従い、３．７５μｇのｐＲｃ／ＲＳＶ−ＢＧＥＲαまたはｐＲｃ／ＲＳＶ−ＢＧＥＲα２と、３．７５μｇのｐＧＬ３−ＴＡＴＡ−ＥＲＥｘ５とを同時に導入した。３７℃にて１６時間培養後、培地を交換しさらに３時間培養した。その後、細胞を集めてＦＢＳが１０ｖ／ｖ％となるよう添加されたＥ−ＭＥＭ培地に懸濁して均一化し、予めＤＭＳＯで溶解した様々な濃度のＥ２（和光純薬社製）、ジエチルスチルベステロール（ＤＥＳ）（ナカライテスク社製）、ビスフェノールＡ（和光純薬社製）、ゲニステイン（和光純薬社製）またはｏ，ｐ’−ＤＤＴ（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ社製）を添加した９６穴プレート（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）に播種した。また、抗エストロゲン作用を測定するために、同様に様々な濃度の４−ヒドロキシタモキシフェンと１０ｎＭのＥ２とを同時に添加した９６穴プレート（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）に上記細胞を播種した。細胞が播種された９６穴プレートは３７℃にて約４０時間培養した後、５倍に希釈した細胞溶解剤ＰＧＣ５０（ニッポンジーン社製）を５０μｌ／ｗｅｌｌずつ加えて、時々軽くゆすりながら室温にて３０分間放置して細胞を溶解させた。このように調製された細胞溶解液を１０μｌずつ９６穴白色サンプルプレート（ベルトールド社製）に採取し、基質自動インジェクター付きのルミノメーターＬＢ９６ｐ（ベルトールド社製）で５０μｌ／ｗｅｌｌずつ酵素基質液ＰＧＬ１００（ニッポンジーン社製）を添加しながら直ちに発光量を５秒間測定した。ｐＲｃ／ＲＳＶ−ＢＧＥＲαを導入した細胞を用いた結果を図１〜６に示し、ｐＲｃ／ＲＳＶ−ＢＧＥＲα２を導入した細胞を用いた結果を図７〜１１に示す。上記のように、本発明遺伝子を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイによって、被験物のエストロゲンレセプター活性化能または活性化阻害能を測定することができた。さらに、他の被験物を同様に試験することにより、エストロゲンレセプター活性化能を有する物質またはエストロゲンレセプター活性化阻害能を有する物質を検出することができる。
【００２４】
（３）本発明遺伝子が染色体に導入されたレポーターアッセイ用形質転換体の作製
プラスミドｐＵＣＳＶ−ＢＳＤ（フナコシ社から購入）をＢａｍＨＩで消化し、ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子発現カセットをコードするＤＮＡを調製する。該ＤＮＡと、実施例４（１）記載のプラスミドｐＧＬ３−ＴＡＴＡ−ＥＲＥをＢａｍＨＩで消化しＢＡＰ処理して得られたＤＮＡとを混合して、Ｔ４リガーゼを反応させた後、該反応液を大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）に導入する。得られたアンピシリン耐性の大腸菌クローンからプラスミドＤＮＡを調製し、それぞれを制限酵素ＢａｍＨＩで消化して該消化液をアガロースゲル電気泳動で分析する。ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子発現カセットがプラスミドｐＧＬ３−ＴＡＴＡ−ＥＲＥのＢａｍＨＩ切断部位に挿入された構造を有するプラスミドを選択し、プラスミドｐＧＬ３−ＴＡＴＡ−ＥＲＥ−ＢＳＤとする。
次に、ヒト由来のＨｅＬａ細胞に、上記のように作製されたプラスミドｐＧＬ３−ＴＡＴＡ−ＥＲＥ−ＢＳＤのＤＮＡ、および、本発明遺伝子がｐＲｃ／ＲＳＶに組込まれた発現ベクターのＤＮＡを、それぞれ直鎖化して実施例４（２）のようにして導入し、これらのＤＮＡが宿主細胞の染色体に導入されてなる形質転換体を取得する。
まず、プラスミドｐＧＬ３−ＴＡＴＡ−ＥＲＥ−ＢＳＤのＤＮＡ、および、本発明遺伝子がｐＲｃ／ＲＳＶに組込まれた発現ベクターのＤＮＡをそれぞれＳａｌ  Ｉで消化する。
ＨｅＬａ細胞は、１０ｖ／ｖ％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）を用いて３７℃にて５％  ＣＯ2存在下に、直径約１０ｃｍのシャーレ（ファルコン社製）を用いて培養する。約５ｘ１０5の細胞を培養し、翌日、該細胞にリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ社製）を用いたリポフェクション法で、上記の直鎖化されたプラスミドのＤＮＡを同時に導入する。リポフェクション法の条件はリポフェクチンに添付されたマニュアルの記載に従って、処理時間５時間、直鎖化されたプラスミドＤＮＡの総量７μｇ（各々３．５μｇ）／シャーレ、リポフェクチン量は２０μｌ／シャーレとする。リポフェクション後、１０ｖ／ｖ％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中でそのまま３日間培養する。次に、細胞をトリプシン処理でシャーレから剥がし、１／１０量ずつ新しい１０枚のシャーレに播種し、そのまま翌日まで培養する。次に、Ｇ４１８（ＳＩＧＭＡ社製）を最終濃度４００μｇ／ｍｌとなるように、および、ブラストサイジンＳを最終濃度８μｇ／ｍｌとなるように培養液に添加し、培養を継続する。一週間後、Ｇ４１８およびブラストサイジンＳを前記と同じ濃度含む新しい培地に交換し、更に培養を継続する。一週間後、同じ操作を再度行う。さらに一週間後、倒立型顕微鏡でシャーレを観察し、出現した直径数ｍｍのコロニーを３０コロニー、あらかじめ培地を分注しておいた９６穴ビュープレート（ベルトールド製）にコロニーごと移し、さらに培養を続ける。細胞をコンフルエントになる前にトリプシン処理により剥がして回収し、３等分して３枚の新しい９６穴ビュープレートに播種する。１枚はそのまま継代と培養を続け、残り２枚の内の一方には最終濃度５０ｎＭとなるようＥ２を加え、もう一方には未添加とし、それぞれを２日間培養する。２日後、それぞれの培養上清を除き、２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳ（−）で細胞を２回洗浄した後、５倍に希釈したＰＧＣ５０（ニッポンジーン社製）を２０μｌずつ加えて、室温に３０分間放置し細胞を溶解させる。このプレートを、酵素基質自動インジェクター付きルミノメーターＬＢ９６ｐ（ベルトールド社製）にそれぞれセットし、５０μｌの基質液ＰＧＬ１０００（ニッポンジーン社製）を自動分注しながら、ルシフェラーゼ活性を測定する。Ｅ２が添加された系の方が、Ｅ２が添加されていない系に比べ、２倍以上高いルシフェラーゼ活性を示す形質転換体を選抜する。
【００２５】
（４）本発明遺伝子が染色体に導入された形質転換体を用いるレポーターアッセイ
実施例４（３）に記載のようにして作製されるＨｅＬａ細胞の形質転換体を２４穴プレートに約４ｘ１０4細胞／ｗｅｌｌずつ播種し、チャコールデキストラン処理済みの１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８および８μｇ／ｍｌのブラストサイジンＳを含むＥ−ＭＥＭ培地（以下、ＦＢＳおよび抗生物質含有Ｅ−ＭＥＭ培地と記す。）で、５％ＣＯ2条件下３７℃にて１日培養を行う。被験物をＤＭＳＯ（和光純薬社製）に溶解させ最終濃度が１ｎＭから５０μＭとなるよう添加したＦＢＳおよび抗生物質含有Ｅ−ＭＥＭ培地、前記の被験物溶解液と同量のＤＭＳＯを添加したＦＢＳおよび抗生物質含有Ｅ−ＭＥＭ培地、及びＥ２をＤＭＳＯに溶解させ最終濃度１μＭとなるよう添加したＦＢＳおよび抗生物質含有Ｅ−ＭＥＭ培地を調製し、これを前記の細胞の培養上清と交換する。該細胞をＣＯ2インキュベーター中で培養し、２４時間後に培養上清を除き、ウェルに接着している細胞を剥がさないように１ｍｌ／ウェルのＰＢＳ（−）でウェルを２回洗浄し、５倍に希釈した細胞溶解剤ＰＧＣ５０（ニッポンジーン社製）を５０μｌ／ｗｅｌｌずつ加えて、時々軽くゆすりながら室温にて３０分間放置して細胞を溶解させる。このように調製された細胞溶解液を１０μｌずつ９６穴白色サンプルプレート（ベルトールド社製）に採取し、基質自動インジェクター付きのルミノメーターＬＢ９６ｐ（ベルトールド社製）で５０μｌ／ｗｅｌｌずつ酵素基質液ＰＧＬ１００（ニッポンジーン社製）を添加しながら直ちに発光量を５秒間測定する。
このような本発明遺伝子が染色体に導入された形質転換体を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイによって、エストロゲンレセプター活性化能を有する物質を含む被験物を見出すことができる。
【００２６】
実施例５（本発明遺伝子を利用したツーハイブリッドシステム）
（１）本発明のエストロゲンレセプターのリガンド結合領域と転写調節因子のＤＮＡ結合領域との融合蛋白質をコードするキメラ遺伝子を含有するベクターの作製
本発明遺伝子ｂｇｅｒαを含有するプラスミドｐＢＳＢＧＥＲαを鋳型として、配列番号１９で示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２０で示される塩基配列からなるプライマーとＬＡ−Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いて添付マニュアルに従いＰＣＲ（９４℃  １分間次いで５５℃  １分間さらに７４℃  １．５分間の保温を１サイクルとしてこれを３０サイクル）を行い、本発明のエストロゲンレセプターのリガンド結合領域をコードするＤＮＡを増幅した。増幅されたＤＮＡは、クロロホルム／フェノール処理の後、エタノール沈殿し、７０％エタノールにより遠心洗浄した後乾燥させた。このＤＮＡにＴＥを加えて溶解させた後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩとで３７℃で約５時間消化した。消化物を１％アガロースゲル電気泳動に供して分離し、約１１００  ｂｐのＤＮＡを含むゲル部分を切り出し、これに含まれるＤＮＡをジーンクリーン（フナコシ社製）を用いて添付マニュアルに従い回収した。一方、ＧＡＬ４蛋白のＤＮＡ結合領域との融合蛋白質作製用ベクターｐＧＢＴ９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）（約５０ｎｇ）をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動に供して、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化されたベクターＤＮＡをジーンクリーン（フナコシ社製）を用いて回収した。該ベクターＤＮＡと前記回収ＤＮＡ約１０ｎｇとを混合し、同容量のライゲーション液（宝酒造製ライゲーションキット）を加え、１６℃で約１時間保温し、次いでコンピテントセルＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付説明書に記載の方法に従って導入し、アンピシリン耐性を示すコロニーを単離して該コロニーからプラスミドＤＮＡをアルカリ法で調製した。得られたプラスミドは、塩基配列を確認した後、ｐＧＢＴ９−ＢＧＥＲαＬＩＤと名付けた。
上記のプラスミドは、宿主細胞として出芽酵母細胞を用いたツーハイブリッドシステムに使用することができる。
【００２７】
（２）転写共役因子のレセプター結合領域と転写調節因子の転写活性化領域との融合蛋白質をコードするキメラ遺伝子を含有するベクターの作製
ヒト脳由来ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）とＲＴ−ＰＣＲキット（宝酒造製）を用いて製品添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを作製した。作製されたｃＤＮＡを鋳型として、ＬＡ−Ｔａｑ（宝酒造社製）と配列番号２１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに用いてＰＣＲ（９４℃で１分間次いで５５℃で１分間さらに７２℃で２．５分間の保温を１サイクルとしてこれを３０サイクル）を行い、転写共役因子ＴＩＦ２のアミノ末端から６２４番目のアミノ酸から１２８７番目のアミノ酸までのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを増幅した。増幅されたＤＮＡは、クロロホルム／フェノール処理の後、エタノール沈殿し、７０％エタノールにより遠心洗浄した後乾燥させた。このＤＮＡにＴＥを加えて溶解させた後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌ  ＩＩとで３７℃で５時間消化した。消化物を１％アガロースゲル電気泳動に供して分離し、約２．０ｋｂｐのＤＮＡを含むゲル部分を切り出し、これに含まれるＤＮＡをジーンクリーン（フナコシ社製）を用いて精製した。一方、ＧＡＬ４蛋白の転写活性化領域とのキメラ蛋白作製用ベクターｐＧＡＤ４２４（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）（約５０ｎｇ）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動に供して消化されたベクターＤＮＡをジーンクリーン（フナコシ社製）を用いて回収した。回収されたベクターＤＮＡと前記精製ＤＮＡ約１０ｎｇとを混合し、同容量のライゲーション液（宝酒造製ライゲーションキット）を加え、１６℃で約１時間保温し、次いでコンピテントセルＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付説明書に記載の方法に従って導入した。アンピシリン耐性を示すコロニーを単離して該コロニーからプラスミドＤＮＡをアルカリ法で調製した。得られたプラスミドは、塩基配列を確認した後、ｐＧＡＤ４２４−ＴＩＦ２ＲＩＤと名付けた。このプラスミドは、宿主細胞として出芽酵母細胞を用いたツーハイブリッドシステムに使用することができる。
【００２８】
（３）出芽酵母細胞を宿主細胞とするツーハイブリッドシステムの作製
酵母Ｙ１９０（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をＭａｔｃｈｍａｋｅｒ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のマニュアルに従いＹＰＤ培地で終夜３０℃で振盪培養した。該酵母を集菌後、その細胞内に、実施例５（１）記載のｐＧＢＴ９−ＢＧＥＲαＬＩＤおよび実施例５（２）記載のｐＧＡＤ４２４−ＴＩＦ２ＲＩＤを、Ｙｅａｓｔｍａｋｅｒ  ｙｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて導入した。前記プラスミドの導入された酵母細胞は、トリプトファンおよびロイシンを含まないＳＤプレート上に播き、３０℃で約２日間培養する。培養後、３コロニーを選択し再びトリプトファンおよびロイシンを含まないＳＤプレート上に塗布し、３０℃で約２日間培養した。
【００２９】
（４）酵母ツーハイブリッドシステムを用いた被験物のエストロゲンレセプター活性調節能の測定
実施例５（３）で調製された酵母の一部をトリプトファンおよびロイシンを含まないＳＤ培地１ｍｌに植菌し、３０℃で終夜振盪培養し、得られた培養液をトリプトファンおよびロイシンを含まないＳＤ培地で約８０倍に希釈した。９６穴のディープウェルプレートの各ウェルに、ＤＭＳＯに溶解した様々な濃度のＥ２（和光純薬社製）、エストリオール（和光純薬社製）、エストロン（和光純薬社製）、１μＭのジエチルスチルベステロール（ＤＥＳ）（ナカライテスク社製）、１ｍＭのビスフェノールＡ（和光純薬社製）、１００μＭのｐ−ノニルフェノール（関東化学社製）、１００μＭのゲニステイン（和光純薬社製）、１００μＭのクメステロール（ＩＮＤＯＦＩＮＥ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）、１ｍＭのダイゼイン（シグマ社製）、１ｍＭのメトキシクロル（和光純薬社製）、または１ｍＭのｏ，ｐ’−ＤＤＴ（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ社製）２．５μｌを加え（ＤＭＳＯ終濃度１％とする）、ここへ上記培養酵母希釈液を２５０μｌを添加して、３０℃で４時間振盪培養した。培養後、各ウェルから酵母液１００μｌを回収しこれに１００μｌのβガラクトシダーゼ活性測定用発光反応液（Ｇａｌ−Ｓｃｒｅｅｎ、Ｔｒｏｐｉｘ社製）を加え、約１．５時間室温で保温した後、ルミノメーターＬＢ９６ｐ（ベルトールド社製）で発光量を測定した。図１２にＥ２（和光純薬社製）、エストリオール（和光純薬社製）、エストロン（和光純薬社製）の濃度依存的な活性誘導の結果を示す。また図１３に終濃度１０ｎＭのジエチルスチルベステロール（ＤＥＳ）、１０μＭのビスフェノールＡ、１μＭのｐ−ノニルフェノール、１μＭのゲニステイン、１μＭのクメステロール、１０μＭのダイゼイン、１０μＭのメトキシクロルおよび１０μＭのｏ，ｐ’−ＤＤＴの活性誘導結果を示す。
【００３０】
実施例６（本発明遺伝子を含有する組換えウイルスベクター及び組換えウイルス粒子の作製）
本発明ベクターｐＲｃ／ＲＳＶ−ＢＧＥＲαのＤＮＡ  ２μｇを１０Ｕの制限酵素ＸｂａＩで、ｐＲｃ／ＲＳＶ−ＢＧＥＲα２のＤＮＡ  ２μｇを１０Ｕの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで、それぞれ３７℃にて１時間消化した後、それぞれ低融点アガロースゲル電気泳動に供し約１．５〜１．７  ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収する。ｐＲｃ／ＲＳＶ−ＢＧＥＲα２由来のＤＮＡはその約１μｇを、ＤＮＡ  ｂｌｕｎｔｉｎｇキット（宝酒造社製）で処理してその末端を平滑化し、これに次にＴ４ポリヌクレオチドカイネースを反応させてその末端をリン酸化する。該ＤＮＡをフェノール処理した後、エタノール沈殿法により精製し、その全量を下記の発現プラスミド作製用のインサートＤＮＡとして用いる。一方、２μｇのｐＶＬ１３９２ベクターＤＮＡを１０Ｕの制限酵素ＸｂａＩまたはＳｍａＩで消化し、１０Ｕのアルカリフォスファターゼで６５℃にて１時間処理後、低融点アガロースゲル電気泳動に供しＤＮＡを回収しそれぞれｐＶＬ１３９２−ＸｂａＩおよび  ｐＶＬ１３９２−ＳｍａＩとする。このｐＶＬ１３９２−ＸｂａＩベクターＤＮＡ  １００ｎｇに、上記のようにｐＲｃ／ＲＳＶ−ＢＧＥＲαから調製した約１．５  ｋｂｐのＤＮＡを約１００ｎｇ加え、５ＵのＴ４  Ｌｉｇａｓｅを用いて１６℃にて３時間保温する。これをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株のコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付説明書に記載の方法に従って導入し、得られたコロニーからプラスミドＤＮＡをアルカリ法で調製する。それぞれのプラスミドＤＮＡ約１μｇを１０Ｕの制限酵素ＸｂａＩで３７℃にて１時間消化した後アガロースＳ（ニッポンジーン社製）を用いたアガロース電気泳動で分析し、約１．５  ｋｂｐのバンドが検出されるクローンを選択する。また、ｐＶＬ１３９２−ＳｍａＩベクターＤＮＡ１００ｎｇに、上記のようにｐＲｃ／ＲＳＶ−ＢＧＥＲα２から調製した約１．７  ｋｂｐのＤＮＡを約１００ｎｇ加え、５ＵのＴ４  Ｌｉｇａｓｅを用いて１６℃にて３時間保温する。これをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株のコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付説明書に記載の方法に従って導入し、得られたコロニーからプラスミドＤＮＡをアルカリ法で調製する。それぞれのプラスミドＤＮＡ約１μｇを１０Ｕの制限酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで３７℃にて１時間消化した後アガロースＳ（ニッポンジーン社製）を用いたアガロース電気泳動で分析し、約１．７  ｋｂｐのバンドが検出されるプラスミドを選択する。該プラスミドのＤＮＡをアルカリ法にて調製し、組換えＢａｃｕｌｏ  ｖｉｒｕｓ作製に用いるトランスファーベクターｐＶＬ１３９２−ＢＧＥＲαおよびｐＶＬ１３９２−ＢＧＥＲα２とする。
１ｘ１０6個のＳｆ２１細胞（ＡＴＣＣから入手）を７５ｃｍ2のＴ型フラスコ（ファルコン社製）中で１０％  ＦＢＳおよび２％  Ｙｅａｓｔｌａｔｅを含むＧｒａｃｅ'ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（以下、ＦＢＳ含有Ｇｒａｃｅ培地と記す。）を用いて２７℃にて一晩培養する。一方、上記のようにして作製されるトランスファーベクターｐＶＬ１３９２−ＢＧＥＲαまたはｐＶＬ１３９２−ＢＧＥＲα２のＤＮＡ１０μｇと、直鎖状に調製されたウイルスゲノムＤＮＡ  Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）２０ｎｇとをＧｒａｃｅ'ｓ  ｍｅｄｉｕｍ  １００μｌに添加し、滅菌水で２倍に希釈したリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ社製）１０μｌを加え、室温にて３０分間放置する。一晩培養された前記のＳｆ２１細胞の培養上清を除き、血清を含まないＧｒａｃｅ'ｓ  ｍｅｄｉｕｍ少量で細胞を洗った後、同培地５ｍｌを細胞に添加し、これに前記のリポフェクチン−ＤＮＡ混合液を全量加え、２７℃にて３時間保温する。次いで、ＦＢＳ含有Ｇｒａｃｅ培地で細胞を洗った後、ＦＢＳ含有Ｇｒａｃｅ培地２０ｍｌを細胞に添加し、５日間２７℃にて培養する。５日目に培養上清を回収して５０ｍｌ容の遠心チューブに採り、５０００ｘｇで１５分間遠心分離することにより細胞の破片を沈殿させ、遠心上清を回収する。この上清全量を１００，０００ｘｇで２４時間超遠心分離し、ウイルス粒子をペレットとして得る。このペレットを１００μｌのＴＥに懸濁し、当量のＴＥ飽和フェノールを加え、穏やかに室温にて２４時間混合する。これを１０，０００ｘｇ、１０分間遠心分離した後、水層を回収し、これに当量のクロロホルムを加え１０分間穏やかに混合し、再度１０，０００ｘｇ、１０分間の遠心分離を行う。水層を回収し、該水層に終濃度０．２Ｍとなる量のＮａＣｌと２．５倍量のエタノールを加え、本発明遺伝子を保有するウイルスベクターのＤＮＡを沈殿として回収する。
【００３１】
実施例７（本発明の組換えウイルスベクターがＳｆ２１細胞へ導入された形質転換体の作製と本発明のエストロゲンレセプターの製造）
Ｓｆ２１細胞（ＡＴＣＣから入手）を７５ｃｍ2のＴ型フラスコ（ファルコン社製）に１ｘ１０6個ずつ計１０枚播種し、２７℃にてＦＢＳ含有ＧＲＡＣＥ培地で培養する。この細胞に、実施例６のように調製される組換えウイルス粒子を含む培養上清を１０μｌ／フラスコの割合で加え、そのまま４日間培養する。この培養上清を採取し、前記と同様に７５ｃｍ2のＴ型フラスコ（ファルコン社製）１０枚に培養した前Ｓｆ２１細胞へ、該培養上清をフラスコ一枚あたり１ｍｌずつ加え、６０時間培養する。６０時間後、細胞をピペッテイングにより懸濁してフラスコより回収し、得られた細胞懸濁液を５，０００  ｘｇで１５分間遠心分離しペレットとする。この細胞のペレットを２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．５ｍＭ  ＰＭＳＦバッファーに懸濁した後、得られる細胞懸濁液をダウンス型ガラスホモジナイザーで上下に３０回ホモジナイズし細胞を破砕する。この破砕液を３０，０００ｘｇで１時間超遠心分離して上清画分を回収することにより、本発明のエストロゲンレセプターを含む画分を得る。
【００３２】
実施例８（レセプターバインディングアッセイ）
結合反応バッファーは、最終組成が２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．９，１０ｍＭモリブデン酸ナトリウム，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ（いずれも和光純薬社製）となるように調製する。反応系は総容量を１００μｌとし、本発明のエストロゲンレセプターを含む細胞抽出物を１０μｇ蛋白質添加し、トリチウム標識されたＥ２を１ｐＭから１００ｎＭ程度になるよう添加する。非特異的結合を調べるための試験区には標識されていないＥ２を最終濃度１０μＭになるようにさらに加える。
結合反応は、以下のように行う。反応液を氷上で１５時間保温した後、チャコールデキストラン液［組成：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２％の酸洗活性炭（ナカライテスク社製ＮｏｒｉｔＡ）、０．００５％ファルマシアＤｅｘｔｒａｎ  Ｔ７０］を１００μｌ加え、１０分間氷上に放置する。この反応液を低速遠心機で１，０００ｘｇで１０分間遠心分離して活性炭を沈殿させ、上清を１００μｌ分取し、その放射能量を液体シンチレーションカウンターで測定する。この測定値を基に、該上清画分中の標識Ｅ２量、すなわち、レセプターに結合した標識Ｅ２量（結合型標識リガンド量）を求める。標識Ｅ２のみが添加された試験区の結合型標識リガンド量は、標識Ｅ２のレセプターに対する全結合量に相当する。一方、標識Ｅ２に加え標識されていないＥ２が添加された試験区の結合型標識リガンド量は、標識Ｅ２のレセプターに対する非特異的結合量に相当する。各種濃度の標識Ｅ２が添加された反応系それぞれについて、全結合量から非特異的結合量を差し引いて、その反応系における標識リガンドのレセプターに対する特異的結合量を求める。次いで、Ｙ軸に（特異的結合標識リガンド濃度／遊離標識リガンド濃度）、Ｘ軸に特異的結合標識リガンド濃度をプロットし、スキャッチャード解析することにより、本発明のエストロゲンレセプターのＥ２に対するＫｄ値を求める。
エストロゲンレセプターに対する被験物の親和性を測定するには、上記と同様にして１ｎＭ程度のトリチウム標識Ｅ２が入っているバインデイングアッセイ結合反応液へ被験物を終濃度が１％程度となるよう添加する。なお被験物が添加されない系には、被験物と同量の溶媒を系に加える。被験物添加によりレセプターに対する標識Ｅ２の結合量が低下する場合は、その被験物にはエストロゲンレセプターに結合するような物質が含まれると判断される。
【００３３】
【発明の効果】
本発明により、化学物質のエストロゲンレセプター活性調節能を評価するための試験系に利用することのできる新たなエストロゲンレセプター遺伝子等が提供可能となる。
【００３４】
[配列表フリーテキスト]
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７
プロモーターDNAを作製するために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１８
プロモーターDNAを作製するために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【００３５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明遺伝子bgerαを用いたレポーターアッセイにより、E2のエストロゲンレセプター活性化能を測定した結果（N=6）を示す図である。横軸には、各試験区におけるE2の濃度を付記した。左端の０のカラムは、E2のDMSO溶液に換えてDMSOを終濃度0.1%となるように添加した区（E2無添加区）を示す。縦軸には、ルシフェラーゼ活性値を、E2無添加区のルシフェラーゼ活性値を１として示す。
【図２】本発明遺伝子bgerαを用いたレポーターアッセイにより、ビスフェノールＡのエストロゲンレセプター活性化能を測定した結果（N=6）を示す図である。横軸には、各試験区におけるビスフェノールＡの濃度を付記した。左端の０のカラムは、ビスフェノールＡのDMSO溶液に換えてDMSOを終濃度0.1%となるように添加した区（ビスフェノールＡ無添加区）を示す。縦軸には、ルシフェラーゼ活性値を、ビスフェノールＡ無添加区のルシフェラーゼ活性値を１として示す。
【図３】本発明遺伝子bgerαを用いたレポーターアッセイにより、ジエチルスチルベステロール（ＤＥＳ）のエストロゲンレセプター活性化能を測定した結果（N=6）を示す図である。横軸には、各試験区におけるＤＥＳの濃度を付記した。左端の０のカラムは、ＤＥＳのDMSO溶液に換えてDMSOを終濃度0.1%となるように添加した区（ＤＥＳ無添加区）を示す。縦軸には、ルシフェラーゼ活性値を、ＤＥＳ無添加区のルシフェラーゼ活性値を１として示す。
【図４】本発明遺伝子bgerαを用いたレポーターアッセイにより、ゲニステインのエストロゲンレセプター活性化能を測定した結果（N=6）を示す図である。横軸には、各試験区におけるゲニステインの濃度を付記した。左端の０のカラムは、ゲニステインのDMSO溶液に換えてDMSOを終濃度0.1%となるように添加した区（ゲニステイン無添加区）を示す。縦軸には、ルシフェラーゼ活性値を、ゲニステイン無添加区のルシフェラーゼ活性値を１として示す。
【図５】本発明遺伝子bgerαを用いたレポーターアッセイにより、o,p'-DDTのエストロゲンレセプター活性化能を測定した結果（N=6）を示す図である。横軸には、各試験区におけるo,p'-DDTの濃度を付記した。左端の０のカラムは、o,p'-DDTのDMSO溶液に換えてDMSOを終濃度0.1%となるように添加した区（o,p'-DDT無添加区）を示す。縦軸には、ルシフェラーゼ活性値を、o,p'-DDT無添加区のルシフェラーゼ活性値を１として示す。
【図６】本発明遺伝子bgerαを用いたレポーターアッセイにより、４-ヒドロキシタモキシフェン（4-OH-HTM）のエストロゲンレセプター抗活性化能を測定した結果（N=6）を示す図である。横軸には、各試験区において10nMのE2と共存させた4-OH-HTMの濃度を付記した。左端の０のカラムは、4-OH-HTMのDMSO溶液に換えてDMSOを終濃度0.1%となるように添加した区（4-OH-HTM無添加区）を示す。縦軸には、ルシフェラーゼ活性値を、4-OH-HTM無添加区のルシフェラーゼ活性値を１として示す。
【図７】本発明遺伝子bgerα2を用いたレポーターアッセイにより、E2のエストロゲンレセプター活性化能を測定した結果（N=6）を示す図である。横軸には、各試験区におけるE2の濃度を付記した。左端の０のカラムは、E2のDMSO溶液に換えてDMSOを終濃度0.1%となるように添加した区（E2無添加区）を示す。縦軸には、ルシフェラーゼ活性値を、E2無添加区のルシフェラーゼ活性値を１として示す。
【図８】本発明遺伝子bgerα2を用いたレポーターアッセイにより、ビスフェノールＡのエストロゲンレセプター活性化能を測定した結果（N=6）を示す図である。横軸には、各試験区におけるビスフェノールＡの濃度を付記した。左端の０のカラムは、ビスフェノールＡのDMSO溶液に換えてDMSOを終濃度0.1%となるように添加した区（ビスフェノールＡ無添加区）を示す。縦軸には、ルシフェラーゼ活性値を、ビスフェノールＡ無添加区のルシフェラーゼ活性値を１として示す。
【図９】本発明遺伝子bgerα2を用いたレポーターアッセイにより、ジエチルスチルベステロール（ＤＥＳ）のエストロゲンレセプター活性化能を測定した結果（N=6）を示す図である。横軸には、各試験区におけるＤＥＳの濃度を付記した。左端の０のカラムは、ＤＥＳのDMSO溶液に換えてDMSOを終濃度0.1%となるように添加した区（ＤＥＳ無添加区）を示す。縦軸には、ルシフェラーゼ活性値を、ＤＥＳ無添加区のルシフェラーゼ活性値を１として示す。
【図１０】本発明遺伝子bgerα2を用いたレポーターアッセイにより、ゲニステインのエストロゲンレセプター活性化能を測定した結果（N=6）を示す図である。横軸には、各試験区におけるゲニステインの濃度を付記した。左端の０のカラムは、ゲニステインのDMSO溶液に換えてDMSOを終濃度0.1%となるように添加した区（ゲニステイン無添加区）を示す。縦軸には、ルシフェラーゼ活性値を、ゲニステイン無添加区のルシフェラーゼ活性値を１として示す。
【図１１】本発明遺伝子bgerα2を用いたレポーターアッセイにより、o,p'-DDTのエストロゲンレセプター活性化能を測定した結果（N=6）を示す図である。横軸には、各試験区におけるo,p'-DDTの濃度を付記した。左端の０のカラムは、o,p'-DDTのDMSO溶液に換えてDMSOを終濃度0.1%となるように添加した区（o,p'-DDT無添加区）を示す。縦軸には、ルシフェラーゼ活性値を、o,p'-DDT無添加区のルシフェラーゼ活性値を１として示す。
【図１２】本発明遺伝子を用いたツーハイブリッドシステムにより、E2、エストロン、エストリオールのエストロゲンレセプター活性化能を測定した結果（N=4）を示す図である。横軸には、化合物の濃度を付記した。縦軸には、βガラクトシダーゼ活性値を、化合物無添加区のβガラクトシダーゼ活性値を１として示す。
【図１３】本発明遺伝子を用いたツーハイブリッドシステムにより、各種化合物のエストロゲンレセプター活性化能を測定した結果（N=4）を示す図である。横軸には、βガラクトシダーゼ活性値を、1nMのE2添加区のβガラクトシダーゼ活性値を１として示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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