(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物の幹細胞から腸管様組織を伴う膵臓の形態及び機能を有する組織をインビトロで形成する方法であって、脊椎動物の幹細胞(ただし該幹細胞は分化万能性を有する幹細胞である)由来の胚葉体を4-[(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-2-ナフタレニル）カルバモイル］安息香酸及びアクチビンで同時処理した後に培養する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は脊椎動物の未分化細胞から器官を形成する方法に関する。
【背景技術】  ヒトを含めて脊椎動物の生体には非常に沢山の器官や組織が存在しているが、それらはもともと１個の受精卵から細胞分裂（卵割）と細胞分化を経て形成され、バランスのとれた体制をもつ個体を構成するようになる。このような器官及び組織形成のプロセスはきわめて複雑であり、誘導現象と呼ばれる重要な細胞間の相互作用が多段階にわたって行われていると考えられている。
生体内で行われる器官形成のプロセスを試験管内（イン・ビトロ）で再現し、未分化細胞から所望の器官を形成する試みがなされている（例えば、「未分化細胞からの臓器形成」、炎症・再生、Ｖｏｌ．２２，２１，２００２、膵臓の器官形成については特開２００１−２９９３３５号公報及び特開２００１−３３３７７０号公報を参照のこと）。例えば、イモリの胞胚期のアニマルキャップ（多能性をもった細胞塊）である未分化細胞を高濃度のアクチビンで処理するとリズミカルに拍動する心臓を６０％の形成率で形成することができる。この心臓は、１ヶ月以上も正常な拍動数を維持することができ、心筋細胞に特異的な遺伝子の発現や心筋に特異的な介在板の存在なども確認できることから、機能的及び構造的にほぼ完全な心臓であると言える。
一方、レチノイン酸（ビタミンＡ酸）はビタミンＡの活性代謝産物であり、発生途上にある未熟な細胞を特有な機能を有する成熟細胞へと分化させる作用や、細胞の増殖促進作用や生命維持作用などの極めて重要な生理作用を有している。これまでに合成された種々のビタミンＡ誘導体、例えば、特開昭６１−２２０４７号公報や特開昭６１−７６４４０号公報記載の安息香酸誘導体、及びジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８８，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．１１，ｐ．２１８２）に記載の化合物なども、同様な生理作用を有することが明らかにされている。レチノイン酸及びレチノイン酸様の生物活性を有する上記化合物は「レチノイド」と総称されている。
レチノイン酸は前後軸に沿った胚のパターンニングに対する調節因子であり（Ｎａｔｕｒｅ  ３４０，１４０−１４４，１９８９、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１２，９４５−９５８，１９９１、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９２，１−１６，１９９７、Ｚｏｏｌ．Ｓｃｉ．１５，８７９−８８６，１９９８）、このレチノイン酸がツメガエル胚における前方神経組織を後方化させ、中胚葉の発達において影響を及ぼすことが知られている（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５，１７５−１８７，１９９１、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｇｒｏｗｔｈ．Ｄｉｆｆｅｒ．３５，１２３−１２８，１９９３）。また、ツメガエルアニマルキャップ細胞にアクチビンの投与量を変化させて処理することにより脊索、筋肉、間充織及び体腔上皮のようなほとんどの中胚葉組織を誘導することができること（Ｒｏｕｘ’ｓ  Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９８，３３０−３３５，１９９０、Ｎａｔｕｒｅ  ３４７，３９１−３９４，１９９０、Ｒｏｕｘ’ｓ  Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２００，２３０−２３３，１９９１）、及びアクチビンと共処理するレチノイン酸の投与量を変化させることにより、アニマルキャップ細胞から分化する脊索、筋肉及び前腎のような中胚葉組織を側後方化させること（Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｇｒｏｗｔｈ．Ｄｉｆｆｅｒ．３５，１２３−１２８，１９９３）が報告されている。
内胚葉性器官に対するレチノイン酸の作用については、発生段階２２〜３２のツメガエル胚をレチノイン酸で処理すると、腸、肝臓、胃などの消化器官の形態が異常になると、Ｄｉｘｏｎらにより報告されているが、レチノイン酸で処理した発生段階２２〜３２のツメガエル胚の膵臓は正常に形成され、内胚葉特異的マーカーであるＸｌＨｂｏｘ８の発現にも影響がみられないことも報告されている（Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｓ  Ｅｖｏｌ．２０８，３１８−３２６，１９９８）。
また、オール・トランス（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ）・レチノイン酸は、細胞核内に存在する核内受容体・スーパーファミリー（Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，ｐ．８８９，１９８８）に属するレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）にリガンドとして結合して、動物細胞の増殖・分化あるいは細胞死などを制御することが明らかにされている（Ｐｅｔｋｏｖｉｃｈ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３０，ｐｐ．４４４−４５０，１９８７）。このオール・トランス・レチノイン酸を用いて、あるいはオール・トランス・レチノイン酸とアクチビンを組み合わせて用いることによって膵臓をインビトロで形成できることが知られている（特開２００１−２９９３３５号公報及び特開２００１−３３３７７０号公報）。
レチノイン酸の生理活性の発現については、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ，９−ｃｉｓ−レチノイン酸を天然リガンドとする：本化合物はＲＡＲのリガンドでもある）の存在が証明されている。ＲＸＲはＲＡＲと二量体を形成し、遺伝子の転写を惹起ないし抑制してレチノイン酸の生理活性の発現を調節していることが明らかにされている（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４５，ｐｐ．２２４−２２９）。ＲＸＲに結合可能なアゴニスト又はアンタゴニストが種々知られているが（アゴニストとしては、例えば特開平１０−５９９５１号公報に記載されたＨＸ６００など、アンタゴニストとしては同公報に記載されたＨＸ６０３など）、ＲＸＲに結合するリガンドを用いて未分化細胞から器官を形成できるか否かは従来全く知られていない。
【発明の開示】
本発明の課題は、脊椎動物の未分化細胞から所望の器官を形成する手段を提供することにある。本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ＲＸＲに結合するリガンドを用いて未分化細胞から心臓や神経などの器官を形成できることを見出した。また、本発明者らは、ＲＡＲリガンドとしてレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）サブタイプγに実質的に結合しないＲＡＲリガンドとアクチビンとを用いると、未分化細胞から高度に分化した膵臓を形成できることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
すなわち、本発明により、脊椎動物の未分化細胞から器官及び／又は組織をインビトロで形成する方法であって、脊椎動物の未分化細胞をレチノイン酸Ｘ受容体リガンドの存在下で培養する工程を含む方法が提供される。この発明の好ましい態様によれば、レチノイン酸Ｘ受容体リガンドがレチノイン酸Ｘ受容体のアゴニスト又はアンタゴニストである上記の方法、形成される器官及び／又は組織が心臓、平滑筋組織、又は脂肪細胞組織である上記の方法が提供される。また、脊椎動物の未分化細胞から器官及び／又は組織をインビトロで形成するための分化誘導剤であって、レチノイン酸Ｘ受容体リガンドを含む分化誘導剤が本発明により提供される。
別の観点からは、脊椎動物の未分化細胞から膵臓をインビトロで形成する方法、又は脊椎動物の未分化細胞から膵臓の形態及び機能を有する組織をインビトロで形成する方法であって、脊椎動物の未分化細胞をレチノイン酸受容体サブタイプγに実質的に結合しないレチノイン酸受容体リガンド及びアクチビンの存在下で培養する工程を含む方法が提供される。この発明の好ましい態様によれば、上記のレチノイン酸受容体リガンドが４−［（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルバモイル］安息香酸である上記の方法が提供される。また、脊椎動物の未分化細胞から膵臓又は膵臓の形態及び機能を有する組織をインビトロで形成するための分化誘導剤であって、レチノイン酸受容体サブタイプγに実質的に結合しないレチノイン酸受容体リガンドを含む分化誘導剤も本発明により提供される。
また、別の観点からは、本発明により、上記の方法で形成された器官及び／又は組織が提供される。
【図面の簡単な説明】  第１図は、ＥＳ細胞のコロニーを示した写真である。
第２図は、バクテリアディシュで形成された胚様体を示した写真である。
第３図は、例１の方法で形成された心臓（心筋様細胞塊）を示した写真である。
第４図は、例２の方法で形成された平滑筋組織（平滑筋様細胞塊）を示した写真である。
第５図は、例２の方法で形成された脂肪細胞組織を示した写真である。
第６図は、例３の方法により胚葉体から分化誘導された膵臓導管や内分泌・外分泌細胞などを含む膵臓組織の写真である。
第７図は、例３の方法により誘導された膵臓の外分泌細胞を示した写真である。
第８図は、例３の方法により誘導された膵臓のβ細胞（内分泌細胞）を示した写真である。
【発明を実施するための最良の形態】  本明細書において「器官及び／又は組織」とは、脊椎動物を構成する器官、組織、及びそれらの結合物を意味している。例えば、本発明の方法により形成される器官には、通常は組織として分類される構造物が結合している場合もあるが、そのような結合物を形成する方法も本発明の範囲に包含される。また、本発明の方法により同時に形成される器官及び組織はそれぞれ２種以上であってもよい。器官としては、例えば心臓、膵臓、腎臓などを例示することができ、組織としては神経組織、平滑筋組織、脂肪細胞組織などを例示することができるが、これらに限定されることはない。器官としては心臓又は膵臓などが好ましく、組織としては平滑筋組織又は脂肪組織などが好ましい。
レチノイン酸Ｘ受容体リガンド（以下、ＲＸＲリガンドと呼ぶ場合がある）には、レチノイン酸Ｘ受容体のアゴニスト（以下、ＲＸＲアゴニストと呼ぶ場合がある）及びレチノイン酸Ｘ受容体のアンタゴニスト（以下、ＲＸＲアンタゴニストと呼ぶ場合がある）が包含される。ある物質がＲＸＲリガンドとなりうるか否かは、例えばＢｏｅｈｍ，Ｍ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７（１８），２９３０−２９４１，１９９４；Ｈｅｙｍａｎ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６８（２），３９７−４０６，１９９２；Ｌｅｖｉｎ，Ａ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５５（６３５８），３５９−３６１，１９９２；Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８２，８１９−８２２，１９９６などに記載された方法により当業者が容易に確認することができる。ＲＸＲリガンドとしては、例えば、特開平９−１００２７０号公報、特開平１０−５９９５１号公報、特開平１０−１１４７５７号公報、特開平１０−２３７０５０号公報、特開平１０−３３８６５８号公報、特開２０００−２７３０７９号公報、国際公開ＷＯ  ９９／２４４１５などに記載された化合物のうちＲＸＲリガンドとして作用可能な化合物を用いることができるが、これらに限定されることはない。ＲＸＲリガンドは２種以上を組み合わせて用いてもよい。ＲＸＲアゴニストとＲＸＲアンタゴニストとを組み合わせて用いることも可能である。
より具体的には、ＲＸＲアゴニストとしては、例えば、
４−［５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−メチルジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル］安息香酸（ＨＸ６００）；
４−［２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサ）ジベンゾ［ｂ，ｆ］［１，４］チアゼピン−１１−イル］安息香酸（ＨＸ６３０）；
４−［２，３−（２，５−ジメチ−２，５−ヘキサノ）ジベンゾ［ｂ，ｅ］アゼピン−１１−イル］安息香酸（ＨＸ６４０）；
４−［１，３−ジヒドロ−７，８−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−１−メチル−２−オキソ−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−５−イル］安息香酸（ＨＸ８０１）；
（Ｚ）−５−［４−［Ｎ−メチル−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）カルボキサミド］ベンジリデン］−２，４−チアゾリジンジオン（ＴＺ１９１）；
（Ｚ）−５−［４−［Ｎ−メチル−Ｎ−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）アミノ］ベンジリデン］−２，４−チアゾリジンジオン（ＴＺ３３５）；
４−［Ｎ−シクロプロピルメチル−Ｎ−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）アミノ］安息香酸（ＤＡ１２４）；
２−［Ｎ−シクロプロピルメチル−Ｎ−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）アミノ］ピリミジン−５−カルボン酸（ＰＡ０２４）；
４−［１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）−１，３−ジオキソラン−１−イル］安息香酸（ＳＲ１１２３７）；
４−［１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）エテン−１−イル］安息香酸（ＬＧＤ１０６９）；及び
６−［１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）シクロプロプ−１−イル］ピリジン−３−カルボン酸（ＬＧ２６８）などを挙げることができる。
ＲＸＲアンタゴニストとしては、
４−（５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−メチル−８−ニトロジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸（ＨＸ５３１）；
４−［５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−ｎ−プロピルジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル］安息香酸（ＨＸ６０３）；
４−（５Ｈ−１０，１１−ジヒドロ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５，１０−ジメチル−８−フェニル−ジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸（ＨＸ７１１）；
２−［Ｎ−（３−ｎ−ヘキシルオキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）−Ｎ−メチルアミノ］ピリミジン−５−カルボン酸（ＰＡ４５２）；
５−［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−ｙｌ）フェニル］トロポロン（Ｔｐ１８０）；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−３−メチル−７−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−３−ｎ−プロピルオキシナフタレン−２−イル）オクタ−２，４，６−トリエン酸（ＬＧ１００７５４）；及び
４−［Ｎ−［３−（２−エチル−ｏ−カルボラン−１−イル）フェニル］−Ｎ−メチルアミノ］安息香酸などが挙げられる。もっとも、ＲＸＲアゴニスト及びＲＸＲアンタゴニストはこれらの特定の化合物に限定されることはない。
本発明の方法に使用可能な脊椎動物の未分化細胞の種類は特に限定されないが、例えば、哺乳類動物のほか、鳥類、は虫類、両生類などの脊椎動物の未分化細胞を用いることができる。未分化細胞としては、胚性幹細胞、造血幹細胞、小腸クリプトの基底細胞などの幹細胞のほか、例えば中〜後期の胞胚のアニマルキャップや胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ）などの細胞集団を用いることもできる。本明細書において用いられる「未分化細胞」の用語は、２以上の細胞により形成される細胞集団や細胞塊を排除するものと解釈してはならない。
本発明の方法による器官及び／又は組織形成は、未分化細胞からの器官及び／又は組織形成方法として当業界で利用されている種々の方法で行うことができる。例えば、未分化細胞から膵臓を形成する方法について特開２００１−２９９３３５号公報及び特開２００１−３３３７７０号公報に詳細に記載されているので、当業者はこれらの刊行物を参照しつつ、本明細書の実施例の方法に従って、未分化細胞から所望の器官を形成させることができる。特開２００１−２９９３３５号公報及び特開２００１−３３３７７０号公報の開示のすべてを参照として本明細書の開示に含める。
例えば、胚性幹細胞から誘導した胚様体を用いて、適宜の濃度のＲＸＲリガンドの存在下で１ないし数日培養することにより器官形成を行うことができる。ＲＸＲリガンドの存在下で１ないし数日培養した後、ＲＸＲリガンドの非存在下でさらに培養を継続してもよい。ＲＸＲリガンドの濃度は特に限定されないが、例えば１×１０−１２〜１×１０−３Ｍ程度の範囲から適宜選択できる。本発明の方法はイン・ビトロの環境下で行うことができるが、本明細書においてイン・ビトロの用語は「生体外」の意味で用いられており、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）としては、Ｈｏｏｐｅｒによって樹立された１２９系マウスのＥ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＃；ＣＲＬ−１８２１）又はＬｅｄｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｉによって樹立されたＣ５７ＢＬ系マウスのＢ６（ＡＴＣＣ  ＃；ＳＣＲＣ−１００２）などを用いることができる。これらはマウス胚盤胞の内部細胞塊からライン化されたものである。もっとも、胚性幹細胞の種類はこれらに限定されることはない。なお、通常の場合、胚性幹細胞の継代数は器官及び／又は組織形成能に影響を及ぼさない。
例えば、胚性幹細胞から誘導した胚様体をゼラチンコートした培養皿に接着させた後、ＲＸＲリガンドの溶液を必要に応じて培地で希釈して培地に加えて１から数日処理する。ＲＸＲリガンドを溶解するための溶媒としては、水、生理食塩水、緩衝液などのほか、ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒又は水と有機溶媒との混合物を用いることもできる。胚様体の培養には、必要に応じてラミニン、コラーゲンＩやマトリゲルコート（Ｂｉｏｃｏａｔ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）したマルチウェルプレートを用いることもできる。この処理後、一定時間後の細胞分化状態を記録することが望ましい。上記の処理の前後に、骨形成因子（Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＭＰ）であるＢＭＰ２／４やＢＭＰ６／７のほか、ＦＧＦ、アクチビン、フォリスタチン、ビデロゲニン、インスリン、グルカゴン、コンカナバリン、サイトカラシン、カドベリンなどの誘導因子、細胞増殖因子、又はサイトカイン類などを用いて処理することもできる。このような処理を採用することにより、器官及び／又は組織形成の方向性や形成率を高めることができる場合がある。
別の観点から提供される本発明の方法は、脊椎動物の未分化細胞から膵臓をインビトロで形成する方法、又は脊椎動物の未分化細胞から膵臓の形態及び機能を有する組織をインビトロで形成する方法であって、脊椎動物の未分化細胞をレチノイン酸受容体サブタイプγに実質的に結合しないレチノイン酸受容体リガンド及びアクチビンの存在下で培養する工程を含むことを特徴としている。
レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）リガンド（以下、ＲＡＲリガンドと呼ぶ場合がある）は、オール−トランス−レチノイン酸または９−シス−レチノイン酸が生理作用を発現するために必要な受容体に結合する性質を有する化合物である。本発明の方法には、好ましくはレチノイン酸受容体アゴニスト（以下、ＲＡＲアゴニストと呼ぶ場合がある）としてレチノイン酸に類似する作用（例えば、細胞分化作用、細胞増殖促進作用、及び生命維持作用などの１種以上の作用）又はその一部の作用を発揮するＲＡＲリガンドを用いることができる。ＲＡＲリガンドであるか否かは、Ｍ．Ｓｐｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８４に記載された種々の方法により容易に判定できる。本発明の方法で用いられるＲＡＲリガンドは、ＲＡＲのサブタイプα（ＲＡＲα）及びサブタイプβ（ＲＡＲβ）に結合し、かつサブタイプγ（ＲＡＲγ）には実質的に結合しないＲＡＲリガンドである。レチノイン酸受容体・サブタイプへの結合については文献記載の方法により容易に確認することができる（Ｈ．ｄｅ  Ｔｈｅ，ａｎｄ  Ａ．Ｄｅｊｅａｎ，″Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ，１０  ｙｅａｒｓ  ｏｎ″，Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ，ｐｐ．２−９，１９９１）。
上記の性質を有するＲＡＲリガンドとしては、例えば、フェニル置換カルバモイル安息香酸又はフェニル置換カルボキサミド安息香酸を基本骨格とするＲＡＲアゴニストを用いることができる。フェニル置換カルバモイル安息香酸又はフェニル置換カルボキサミド安息香酸を基本骨格とするＲＡＲリガンドは種々知られている。基本骨格という用語は、１又は２以上の任意の置換基が結合するための主たる化学構造を意味する。通常は、カルバモイル基又はカルボキサミド基に置換するフェニル基が１個又は２個以上の置換基を有していることが好ましい。このような置換基としては、例えば、低級アルキル基を用いることができる（本明細書において低級とは炭素数１ないし６個程度、好ましくは炭素数１ないし４個を意味する）。低級アルキル基としては直鎖又は分枝鎖のアルキル基が好ましく、より具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、又はｔｅｒｔ−ブチル基などを挙げることができる。
また、上記のフェニル基上の置換基として、例えば、メトキシ基などの低級アルコキシ基、ハロゲン原子（ハロゲン原子としてはフッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよい）、例えばトリメチルシリル基などの低級アルキル置換シリル基などを挙げることができる。カルバモイル基に置換するフェニル基としては、例えば、２ないし４個の低級アルキル基で置換されたフェニル基、あるいは１又は２個のトリ低級アルキルシリル基で置換されたフェニル基などが好ましく、２ないし４個のアルキル基で置換されたフェニル基、又は２個のトリメチルシリル基で置換されたフェニル基などがより好ましい。
上記のフェニル基上に置換する２個の低級アルキル基が隣接する場合には、それらの２つの低級アルキル基は一緒になってそれらが結合するフェニル基の環構成炭素原子とともに５員環又は６員環を１個又は２個、好ましくは１個形成してもよい。このようにして形成される環は飽和でも不飽和でもよく、環上には１又は２個以上の低級アルキル基、例えばメチル基、エチル基などが置換していてもよい。上記の形成された環上には、好ましくは２〜４個のメチル基、さらに好ましくは４個のメチル基が置換していてもよい。例えば、フェニル環上に置換する２個の隣接する低級アルキル基が一緒になって５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン環や５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン環などが形成されることが好ましい。
好ましいＲＡＲリガンドとしては、例えば、下記の一般式（Ｉ）：
0004654126.tif 000002
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、低級アルキル基、又は低級アルキル置換シリル基を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうち隣接するいずれか２つの基が低級アルキル基である場合には、それらが一緒になってそれらが結合するベンゼン環上の炭素原子とともに５員環又は６員環を形成してもよく（該環は１又は２以上のアルキル基を有していてもよい）、Ｘは−ＣＯＮＨ−又は−ＮＨＣＯ−を示す〕で表されるＲＡＲリガンドを挙げることができる。
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５が示す低級アルキル基としては、炭素数１ないし６個程度、好ましくは炭素数１ないし４個の直鎖又は分枝鎖のアルキル基を用いることができる。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、又はｔｅｒｔ−ブチル基などを用いることができる。上記の低級アルキル基上には１個又は２個以上の任意の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えば、水酸基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子などを例示することができる。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５が示す低級アルキル置換シリル基としては、例えば、トリメチルシリル基などを挙げることができる。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５からなる群から選ばれる隣接する２つの低級アルキル基が一緒になって、それらが結合するベンゼン環上の炭素原子とともに５員環又は６員環を１個又は２個、好ましくは１個形成してもよい。このようにして形成される環は飽和、部分飽和、又は芳香族のいずれであってもよく、環上には１又は２以上のアルキル基を有していてもよい。環上に置換可能なアルキル基としては、炭素数１ないし６個程度、好ましくは炭素数１ないし４個の直鎖又は分枝鎖のアルキル基を用いることができる。例えば、メチル基、エチル基などを用いることができ、好ましくは２〜４個のメチル基、さらに好ましくは４個のメチル基が置換していてもよい。例えば、Ｒ２及びＲ３が置換するベンゼン環とＲ２及びＲ３とにより、５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン環や５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン環などが形成されることが好ましい。
より具体的には、本発明の方法に好適に用いられるＲＡＲリガンドとして、４−（２，４−ビストリメチルシリルフェニルカルボキサミド）安息香酸（Ａｍ５５５ｓ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３３，ｐｐ．１４３０−１４３７，１９９０）又は４−［（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルバモイル］安息香酸（Ａｍ８０，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｃｅｌｌｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．，１６，ｐｐ．１１３−１２３，１９９１；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６６，ｐｐ．１３００−１３０７，１９９０）などを挙げることができ、特に好ましいＲＡＲリガンドはＡｍ８０である。
本発明の方法は、脊椎動物の未分化細胞を上記のＲＡＲリガンド及びアクチビンの存在下で培養する工程を含んでいる。未分化細胞及び培養方法は上記に説明したものを用いることができる。本発明の方法では、例えばアクチビン以外の誘導因子（例えばＦＧＦ）を用いる必要がなく、膵臓として実質的に完成された器官、又は膵臓の形態及び機能を実質的に有する高度に分化した組織が得られるという特徴がある。ＲＡＲリガンド及びアクチビンの組み合わせ濃度は適宜選択可能であるが、例えば、ＲＡＲリガンドの濃度を１×１０−１２〜１×１０−３Ｍ程度の範囲とし、アクチビンの濃度を０．１〜１０００ｎｇ／ｍｌ程度の範囲とすることができる。また、より複雑な構造を有する器官の形成のために、ＲＡＲリガンドとＲＸＲリガンドとを組み合わせて用いることもできる。
本発明の方法により形成された器官及び／又は組織は、その器官及び／又は組織を直接又は間接の作用点とする医薬のスクリーニングに用いることができる。例えば、本発明の方法により心臓を形成させた場合、形成された心臓は長期に渡って一定の拍動リズムを有するが、例えばこの心臓を用いて心拍数の増減に作用する医薬をスクリーニングすることが可能である。
【実施例】  以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：ＲＸＲリガンドを用いた心臓の形成
ＥＳ細胞として２９系マウスのＥ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＃；ＣＲＬ−１８２１）又はＣ５７ＢＬ系マウスのＢ６（ＡＴＣＣ  ＃；ＳＣＲＣ−１００２）を用いた。０．１％のゼラチンでコートした培養皿に１３日胚のマウスから作成したマウス胎児繊維芽細胞を播種し、１２％牛胎児血清（Ｇｉｂｏｃｏ），１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｓｉｇｍａ），１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含む培地で２４時間培養した。この細胞を１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（ＭＭＣ；Ｓｉｇｍａ）で４時間処理し細胞分裂を阻害した後、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）で２回洗浄してＭＭＣを取り除いた。この繊維芽細胞（フィーダー）の上にＥＳ細胞を播種した。ＥＳ細胞用培地としては、１５％  ＥＳ用牛胎児血清（Ｇｉｂｏｃｏ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、ＭＥＭ  ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｏｃｏ）、０．０００７％  β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１０００Ｕ／ｍｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｓｉｇｍａ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース，Ｇｉｂｏｃｏ）を用い、ＣＯ２インキュベーター（５％  ＣＯ２、１００％湿度）で３７℃で培養し、培地交換は毎日行った。
継代培養は、ＥＳ細胞を播種してから７２時間後に行った。ゼラチンコートした培養皿に、ＭＭＣ処理したフィーダー細胞（マウス胎児繊維芽細胞）を２４時間前に播種しておき、この上に０．０５％トリプシン−０．０２％  ＥＤＴＡ処理によって完全に解離したＥＳ細胞を播種し、コロニーを形成させた（第１図参照）。ＥＳ細胞を播種してから３日間培養してコロニーを形成させ、このコロニーをピペッティングによって単離した後、細胞接着性の非常に弱いバクテリア用培養皿に播種した。培地としては１５％  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＳＲ（ＫＳＲ，Ｇｉｂｏｃｏ），１００Ｕ／ｍｌペニシリン，１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）を用いた。この状態でさらに３日間培養することにより胚様体を作成した（第２図）。
この胚様体を０．１％のゼラチンコートした２４ウェルプレート（ＴＰＰ社製）に４〜６個づづ播種し、ＲＸＲリガンドとして１×１０−５ＭのＰＡ０２４（２−［Ｎ−シクロプロピルメチル−Ｎ−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）アミノ］ピリミジン−５−カルボン酸）を添加して２日間培養した。処理開始時を０時間として４８〜７２時間後に自律的に拍動する心筋様細胞の細胞塊が形成された（第３図）。この細胞塊の出現頻度は、０．２細胞塊／胚様体であり、未処理群又は１×１０−５Ｍオールトランスレチノイン酸で処理した対照群では、処理後２週間以内ではほとんど心筋様細胞の分化は認められないため、有意にＰＡ０２４が作用していると考えられた。一方、２×１０−６ＭのＰＡ０２４で処理した胚様体では、出現時期は遅れるものの心筋様細胞塊の出現頻度が高く、７２〜９６時間で０．５細胞塊／胚様体の形成が認められた。これらの細胞塊は、骨格筋様細胞のように繊維状構造を取らず、細胞塊を形成して自立的拍動を続けた。
例２：ＲＸＲリガンドを用いた平滑筋及び脂肪細胞の形成
例１と同様にして１×１０−５〜２×１０−６ＭのＰＡ０２４で処理後、培養をさらに続けると約１〜２週間で平滑筋様細胞が形成された。この細胞塊は、ゆっくりとしたぜん動運動を示した。頻度は０．１〜０．２細胞塊／胚様体であった（第４図）。また、２週間程度で脂肪細胞が出現し始め、２０日間培養し続けると全体の３０〜４０％程度が脂肪細胞となった。胚様体あたりの数値に換算するとほぼ１００％であった。対照群（１×１０−５Ｍのオールトランスレチノイン酸処理）と比較してＰＡ０２４処理群では形成された脂肪細胞の量は２〜３倍多かった（第５図）。
例３：ＲＡＲリガンドであるＡｍ８０とアクチビンとの組み合わせによる膵臓の形成
０．１％ゼラチンで一晩コートした培養用１０ｃｍディッシュ（ＴＰＰ）に、マイトマイシン−Ｃ処理（１０μｇ／ｍｌ、３ｈｒ）して細胞分裂を阻害したマウス胚繊維芽細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＰＭＥＦ）を播種し，１日以上培養してフィーダーレイヤーとして用いた。マウスＥＳ細胞として広く用いられているＥＳ−Ｅ１４ＴＧ２ａ（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−１８２１）をフィーダーレイヤー上に播種し、培養を行った。ＥＳ細胞用培地は、１５％牛胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、非必須アミノ酸、０．００７％  β−メルカプトエタノール、１０００Ｕ／ｍｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（高グルコース、Ｇｉｂｃｏ）中で行った。培地交換は毎日行なった。
上記のＥＳ細胞を播種して７２時間後にコロニーからＥＢを形成した。ＥＳ細胞のコロニーをＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳで１回洗った後、１ｍｇ／ｍｌコラーゲナーゼ／ディスパーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を１０ｃｍディッシュ１枚あたり１ｍｌずつ加え、室温で３０〜４０秒処理した。約５０％のコロニーが溶液中に浮き上がってきたところでＥｍｂｒｙｏｉｄ  ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭ）、１５％  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ、Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（高グルコース）を１０ｃｍの培養用ディッシュ１枚あたり１３ｍｌ加えてコロニーを回収した。ＥＳ細胞のコロニーに物理的ダメージを与えないようにしながらメディウムごと１５ｍｌチューブに集め、約５分静置した。コロニーが沈殿したところで培地を除き、ＥＭに再懸濁した。このＥＳコロニーを低接着性の培養１０ｃｍディッシュ（ＣｏｒｎｉｎｇまたはＮｕｎｃ）に播種して浮遊系で培養を続けた。培地交換は２日に１回行い、４日目に胚葉体（ＥＢ）として実験に用いた。
ＥＢｓ形成開始から９６時間後に実体顕微鏡で観察しながら直径５００μｍ前後のＥＢｓを低接着性の２４ウェルプレート（ＣｏｒｎｉｎｇまたはＮｕｎｃ）に１００μｌの培地と共に１ウェルあたり１個づつ移した。その後で９００μｌのアクチビン／Ａｍ８０（４−［（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルバモイル］安息香酸）を含む分化誘導培地：１５％  ＫＳＲ，１０ｎｇ／ｍｌアクチビン、０．１μＭ  Ａｍ８０、０．１％  ＢＳＡ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（高グルコース）を加えて４８時間培養を続けた。
分化誘導培地で４８時間ＥＢ処理した後（ＥＢｓ形成６日後）、実体顕微鏡で観察しながらＥＢｓを０．１％ゼラチンで一晩コートした２４ウェル組織培養プレート（ＴＰＰ）に移し、１０％  ＫＳＲ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（高グルコース）中で３日に一度、培地交換をして培養を続けた。
培養１２日目（ＥＢ形成開始からの日数）から１６日目に腸管様構造が誘導形成され、この誘導形成はアクチビン／Ａｍ８０処理したＥＢのうち６０〜７０％の割合で認められた。培養２１日前後になると、その腸様構造が認められたＥＢのうち約６０％に膵臓組織特異的構造や特異的に分化した細胞が形成された。この膵臓組織では、膵臓導管構造の形成と共に、アミラーゼ分泌顆粒を含む多くの外分泌細胞やインスリンやグルカゴンを産性する内分泌細胞の形態が認められた。胚葉体から分化誘導された膵臓導管や内分泌・外分泌細胞を含む膵臓組織の写真を第６図に示す。第７図は誘導された膵臓の外分泌細胞を示した写真であり、第８図は誘導された膵臓のβ細胞（内分泌細胞）を示した写真である。また抗インスリン抗体や抗アミラーゼ抗体陽性であり、ＲＴ−ＰＣＲ法による解析では培養１０日目から１４日目にはＰＤＸ−１やＰＡＸ−４、ＮＧＮ−３などの膵臓特異的転写因子の発現が持続して観察された。
【産業上の利用可能性】  本発明の方法により、脊椎動物の未分化細胞から所望の器官、例えば心臓や神経、あるいは膵臓などの器官を形成する手段が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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