(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のサンプル中のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）特異的抗体を検出および／または定量する方法であって、
前記サンプル中の、
ａ）アミノ酸配列AIVCTRPNNNTRKSIRIGPGQVFYT（配列番号１）からなるペプチド、または
ｂ）KINCTRPNNNTRKSIRIGPGQVFYA（配列番号４３）、PINCTRPNNNTRKSIRFGPGQAFYT（配列番号４４）、EINCTRPNNNTRKSIRIGPGQAFYA（配列番号４５）、QINCTRPNNNTRKSIRIGPGQSFYA（配列番号４６）、TIKCIRPNNNTRKSIRIGPGQAFYA（配列番号４７）、LITCIRPNNNTRKSIRFGPGQAFYT（配列番号４８）、EIMCTRPDNNTRKSIRIGPGQTFYA（配列番号４９）、KINCTRPNNNTRKGIRIGPGQTFFT（配列番号５０）、NITCIRPNNNTRKSVRIGPGQTFYA（配列番号５１）、KINCTRPNNNTRTSIRIGPGQSFHA（配列番号５２）、TINCTRPNNNTRRSVRIGPGQTFYA（配列番号５３）、EINCTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVT（配列番号５４）、EINCTRPNNNTRKSIHIGPGRAFYA（配列番号５５）、EITCTRPSNNTRESIRIGPGQTFYA（配列番号５６）、QINCTRPNNNTRKRISLGPGRVFYT（配列番号５７）、QINCTRPNNNTRKSIHLGPGQAFYA（配列番号５８）、EINCTRPNNNTRRSVAIGPGQAFYT（配列番号５９）、EINCIRPNNNTRKSIPIGPGQAFYA（配列番号６０）、QINCTRTGNNTRKSIRIGPGQAFYA（配列番号６１）、EIVCTRPNNNTRKGIHMGPGQVLYA（配列番号６２）、QINCTRPNNNTRKSIHMGPGKAFYT（配列番号６３）、EINCTRPNNYTRKRITMGPGRVYYT（配列番号６４）、QINCTRPNNNTRKGIHLGPGQTFYA（配列番号６５）、IIDCRRPNNNTRKSIRIGPGQTFFA（配列番号６６）、KINCTRPNNNTRRSIHIGPGRAFYA（配列番号６７）、AINCTRPTNITRRSMRIGPGRVFYA（配列番号６８）、PITCARPSNNTRKSIRFGPGQAFYA（配列番号６９）、EITCTRPNNNTRKGIHFGPGQAFYA（配列番号７０）、EIVCYRPNNNTRKGIHMGPGQVLYA（配列番号７１）およびEINCTRPSNNTRKSIHIGPGRAFYA（配列番号７２）からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチドの断片
と結合している抗体の存在および／または量を決定する工程を含んでいる、方法。
【請求項２】
前記対象のサンプル中の、
ａ）アミノ酸配列LLGLWGCSGKLICTTAVHWNSSWSN（配列番号２）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチドの断片
と結合している抗体の存在および／または量がさらに決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
個体のサンプル中の、
ａ）アミノ酸配列NALFYRSDIVPLEKNSSEYILINCN（配列番号３）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチドの断片
と結合している抗体の存在および／または量がさらに決定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記個体のサンプル中の、
ａ）アミノ酸配列GIKQLQARVLAIERYLKDQQLLGLW（配列番号４）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチドの断片
と結合している抗体の存在および／または量がさらに決定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記個体のサンプル中の、
ａ）アミノ酸配列WRSELYKYKVVEIKPLGIAPTKAKRRVVEREKR（配列番号５）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜３２個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチドの断片
と結合している抗体の存在および／または量がさらに決定される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記個体のサンプル中の、ＨＩＶカプシドタンパク質ｐ２４に結合している抗体の存在および／または量がさらに決定される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記個体のサンプル中の、ＨＩＶインテグラーゼ、ＨＩＶ逆転写酵素＋ＲＮＡｓｅ Ｈ、ＨＩＶプロテアーゼおよびＨＩＶマトリクスタンパク質ｐ１７からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドと結合している抗体の存在および／または量がさらに決定される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
サンプル中のペプチドまたはポリペプチドと結合している抗体の存在および／または量は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイノムアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロットアッセイ、ドットブロットアッセイ、ペプチドチップおよびポリペプチドチップからなる群から選択される方法を使用して決定される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記対象の前記サンプルは血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、唾液、涙液、尿、鼻分泌物、生殖器分泌物、糞便、および／または母乳からなる群から選択されるサンプルである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
決定および／または定量される前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＭからなる群から選択され、特に好ましくはＩｇＧである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
固体担体であって、
前記固体担体上に固定化された、
ａ）アミノ酸配列AIVCTRPNNNTRKSIRIGPGQVFYT（配列番号１）からなるペプチド、または
ｂ）KINCTRPNNNTRKSIRIGPGQVFYA（配列番号４３）、PINCTRPNNNTRKSIRFGPGQAFYT（配列番号４４）、EINCTRPNNNTRKSIRIGPGQAFYA（配列番号４５）、QINCTRPNNNTRKSIRIGPGQSFYA（配列番号４６）、TIKCIRPNNNTRKSIRIGPGQAFYA（配列番号４７）、LITCIRPNNNTRKSIRFGPGQAFYT（配列番号４８）、EIMCTRPDNNTRKSIRIGPGQTFYA（配列番号４９）、KINCTRPNNNTRKGIRIGPGQTFFT（配列番号５０）、NITCIRPNNNTRKSVRIGPGQTFYA（配列番号５１）、KINCTRPNNNTRTSIRIGPGQSFHA（配列番号５２）、TINCTRPNNNTRRSVRIGPGQTFYA（配列番号５３）、EINCTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVT（配列番号５４）、EINCTRPNNNTRKSIHIGPGRAFYA（配列番号５５）、EITCTRPSNNTRESIRIGPGQTFYA（配列番号５６）、QINCTRPNNNTRKRISLGPGRVFYT（配列番号５７）、QINCTRPNNNTRKSIHLGPGQAFYA（配列番号５８）、EINCTRPNNNTRRSVAIGPGQAFYT（配列番号５９）、EINCIRPNNNTRKSIPIGPGQAFYA（配列番号６０）、QINCTRTGNNTRKSIRIGPGQAFYA（配列番号６１）、EIVCTRPNNNTRKGIHMGPGQVLYA（配列番号６２）、QINCTRPNNNTRKSIHMGPGKAFYT（配列番号６３）、EINCTRPNNYTRKRITMGPGRVYYT（配列番号６４）、QINCTRPNNNTRKGIHLGPGQTFYA（配列番号６５）、IIDCRRPNNNTRKSIRIGPGQTFFA（配列番号６６）、KINCTRPNNNTRRSIHIGPGRAFYA（配列番号６７）、AINCTRPTNITRRSMRIGPGRVFYA（配列番号６８）、PITCARPSNNTRKSIRFGPGQAFYA（配列番号６９）、EITCTRPNNNTRKGIHFGPGQAFYA（配列番号７０）、EIVCYRPNNNTRKGIHMGPGQVLYA（配列番号７１）およびEINCTRPSNNTRKSIHIGPGRAFYA（配列番号７２）からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチドの断片
を含んでいる、固体担体。
【請求項１２】
前記固体担体上に、
ａ）アミノ酸配列LLGLWGCSGKLICTTAVHWNSSWSN（配列番号２）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチドの断片
がさらに固定化されている、請求項１１に記載の固体担体。
【請求項１３】
前記固体担体上に、
ａ）アミノ酸配列NALFYRSDIVPLEKNSSEYILINCN（配列番号３）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチドの断片
がさらに固定化されている、請求項１１または１２に記載の固体担体。
【請求項１４】
前記固体担体上に、
ａ）アミノ酸配列GIKQLQARVLAIERYLKDQQLLGLW（配列番号４）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチドの断片
がさらに固定化されている、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の固体担体。
【請求項１５】
前記固体担体上に、
ａ）アミノ酸配列WRSELYKYKVVEIKPLGIAPTKAKRRVVEREKR（配列番号５）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜３２個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチドの断片
がさらに固定化されている、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の固体担体。
【請求項１６】
カプシドタンパク質ｐ２４が、前記固体担体上にさらに固定化されている、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の固体担体。
【請求項１７】
ＨＩＶインテグラーゼ、ＨＩＶ逆転写酵素＋ＲＮａｓｅ Ｈ、ＨＩＶプロテアーゼおよびＨＩＶマトリクスタンパク質ｐ１７からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドが、前記固体担体上にさらに固定化されている、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の固体担体。
【請求項１８】
前記固体担体は、カラム、ビーズ、試験管、マイクロタイターディッシュ、固体粒子、マイクロチップまたはメンブレンの形態である、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の固体担体。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、対象におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染を診断する手段および方法に関する。
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、エンベロープＲＮＡウイルスであり、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の代表的な病因因子である。この疾患の経過において、免疫システムは徐々に崩壊し、その結果、前々からの軽い微生物学的感染が致命的な結果をもたらし得る。ＨＩＶ感染の早期診断が、早期の抗ウイルス治療の開始のために重要であることが広く知られている。これにより、病気に侵された対象の予後を（疾病率および死亡率に関して）改善し、ウイルスの感染の進行を抑えることが期待される。さらに、病気の進行および治療の効果をモニターすることも有効である。ＨＩＶに対する抗体の検出は、感染を推測する証拠になるが、通常、ウエスタンブロット法、またはＲＴ  ＰＣＲによるウイルスＲＮＡの検出若しくはウイルスタンパク質の検出によって確認される。
【０００３】
Ｃａｓｓｅｂ  ｅｔ  ａｌ．（Braz J Med Biol Res 35(2002):369-375）には、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０タンパク質のＶ３領域由来の合成ペプチドが記載されている。
【０００４】
Ｎｏｖｉｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（J Virol 76(2002):10155-10168）には、ＨＩＶ−１  Ｃ型の免疫ドミナント領域の同定について記載されている。
【０００５】
Ｒｉａｂｉｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（Mol Gen Mikrobiol Virusol 3(2007):33-36）においては、ＨＩＶ−１  Ｃ型のｇｐ１２０のＶ３領域に対応するペプチドが最も高い免疫活性を示したことが見出されている。
【０００６】
Ｃａｒｄｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．（AIDS Res Human Retrovir 25(2009):441-450）は、ヒト抗Ｖ３モノクローナル抗体により認識されるＨＩＶ  １型エピトープの世界分布を調査している。
【０００７】
Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（J Medi Virol 78(2006):S24-S29）は、個々のＨＩＶ感染の検出に用いられ得る有益な分析を開発することの困難性に関する総論である。
【０００８】
ＨＩＶ残基を検出する抗体の検出を困難にしているのは、ＨＩＶが高い遺伝的可変性を有しているという事実である。例えば、最も一般的なウイルスの病原型であるＨＩＶ  １型（ＨＩＶ−１）は、いくつかの群に分割され得、これらのグループはさらに、グレードとしても知られている種々の型に分割される（例えば、グループＭはＡ〜Ｋの型を含む）。この遺伝的多様性が、ＨＩＶ感染した対象の１つ以上のＨＩＶの型を診断可能にする診断ツールの提供を困難にしている。このことは、ある試験システムは、ＨＩＶ  Ａ型感染を診断するために有効であるかもしれないが、ＨＩＶ  Ｄ型感染を診断するためには使用できないことを意味している。
【０００９】
それゆえに、本発明の目的は、１つ以上の型のＨＩＶ感染を診断するための方法および手段を提供することである。
【００１０】
本発明は、対象におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染を診断する方法に関し、当該方法は、対象のサンプル中の、
ａ）アミノ酸配列AIVCTRPNNNTRKSIRIGPGQVFYT（配列番号１）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）若しくはｂ）のペプチド断片、
に結合している抗体の存在を決定する工程と、上記サンプル中にそのような抗体の存在を確認したときに、上記対象におけるＨＩＶ感染を診断し、または、上記サンプル中にそのような抗体の不在を確認したときに、上記対象におけるＨＩＶ非感染を診断する工程と、を含む。
【００１１】
ＨＩＶ  Ｃ型のエンベロープタンパク質ｇｐ１２０由来のペプチド断片およびそのホモログが、１つ以上、好ましくは２つ以上、好ましくは３つ以上、好ましくは４つ以上、好ましくは５つ以上、好ましくは６つ以上、好ましくは７つ以上、好ましくは８つ以上、の型のＨＩＶ感染の診断に使用できるという驚くべきことが見出された。その理由は、これらの型の全てのｇｐ１２０に対する抗体であって、ＨＩＶに感染した対象から得られる抗体が、アミノ酸配列AIVCTRPNNNTRKSIRIGPGQVFYT（配列番号１）からなるペプチドまたはそのホモログまたは１５〜２４個のアミノ酸残基からなるその断片と結合するからである。それゆえに、本発明の方法は、ＨＩＶ  Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｆ型、Ｇ型、Ｈ型、Ｊ型および／またはＫ型のＨＩＶ感染の診断を可能にし、ＨＩＶ  Ｂ型およびＣ型の診断に最も好ましく用いられる。
【００１２】
本発明の方法は、ＨＩＶ感染の診断と、他の確立された従来の分析では失敗した、個々における抗体検出とを可能にする（実施例および図４を参照のこと）。従来のＨＩＶ感染の診断方法の個々における使用は、実際に完全には信頼できないことが示されているので、これは予想以上に驚くべき知見である。
【００１３】
本発明の方法は、上述した抗体が対象のサンプル中に確認できない場合に、対象がＨＩＶに感染していないと診断するためにも使用可能である。
【００１４】
本発明で用いられる、AIVCTRPNNNTRKSIRIGPGQVFYT（配列番号１）および／またはLLGLWGCSGKLICTTAVHWNSSWSN（配列番号２）の適した断片、または、配列番号１および／または２と少なくとも７０％の同一性を有するホモログは、それぞれ、配列番号１および／または２の１５〜２４個、好ましくは１６〜２４個のアミノ酸残基からなる。これらのフラグメントは、配列番号１および／または２の１〜２３、１〜２２、１〜２１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、２〜２４、２〜２３、２〜２２、２〜２１、２〜２０、２〜１９、２〜１８、２〜１７、２〜１６、３〜２４、３〜２３、３〜２２、３〜２１、３〜２０、３〜１９、３〜１８、３〜１７、４〜２４、４〜２３、４〜２２、４〜２１、４〜２０、４〜１９、４〜１８、５〜２４、５〜２３、５〜２２、５〜２１、５〜２０、５〜１９、６〜２４、６〜２３、６〜２２、６〜２１、６〜２０、７〜２４、７〜２３、７〜２２、７〜２１、８〜２４、８〜２３、８〜２２、９〜２４、９〜２３、２〜２５、３〜２５、４〜２５、５〜２５、６〜２５、７〜２５、８〜２５、９〜２５、または１０〜２５のアミノ酸残基からなり得る。
【００１５】
サンプル中の抗体の存在は、当該技術分野において公知の方法を用いて確定することができる（例えば、ＥＬＩＳＡのような免疫アッセイ）。例えば、本発明の１つ以上のペプチドを、固体担体上に固定化することができる。固体担体を、それから、ＵＩＶ感染が疑われる対象の抗体を含むサンプルと接触させる。本発明のペプチドに結合可能な抗体を、固体担体上に固定化してもよい。この固定化された抗体は、例えば、ＩｇＡ，ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４および／またはＩｇＭの１つ以上の抗体アイソタイプに対する抗体のような、他の抗体により検出できる。
【００１６】
対象のサンプル中の、ＨＩＶ由来ペプチドおよび／またはポリペプチドに対する抗体の存在は、この対象がＨＩＶ感染していることを示す。対象のサンプル中の、ＨＩＶ由来ペプチドおよび／またはポリペプチドに対する抗体の不在は、この対象がＨＩＶかんせんしていないことを示す。ＩｇＭ抗体は、急性感染中により多くの量が生じ、ヒトサンプル（例えば、血清、血漿）中のその存在を、感染早期の診断に使用する。ＩｇＧ抗体は感染の初期段階は少ないが、感染が確立した対象で生じる。ほとんどの抗体に基づくＨＩＶ診断試験は、ヒトサンプル（例えば、血清、血漿）中のＨＩＶ特異的ＩｇＧの存在を検出する。ＩｇＡは粘膜免疫のマーカーであり、血清と同様に、唾液、涙液等のヒトの分泌物中において検出される。このような抗体は、当業者に公知である。
【００１７】
本発明のポリペプチドおよびペプチドの固体担体上への固定化を円滑に行うために、このポリペプチドおよびペプチドのＣ末端および／またはＮ末端にシステイン残基または他の成分（例えば、リンカーまたはキャリアタンパク質、ビオチン、核酸）を付加することが有益である。これにより、固体担体上のペプチドおよび／またはポリペプチドの円滑な取り付けが可能である。ペプチド分子の固体担体上への取り付け方法および手段は、当業者に公知である。
【００１８】
本明細書において使用する場合、「ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）」は、ＨＩＶ  １型（ＨＩＶ−１）に関する。
【００１９】
本明細書において使用する場合、「対象」は、「ヒト個体」、「ヒト」または「個体」と交換可能に使用できる。
【００２０】
本明細書において使用する場合、「ペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ」または「ホモログ」は、例えば、AIVCTRPNNNTRKSIRIGPGQVFYT（配列番号１）またはLLGLWGCSGKLICTTAVHWNSSWSN（配列番号２）のアミノ酸配列からなるペプチドのような、本明細書中で定義したアミノ酸配列（配列番号１から４１のいずれか１つ）からなるペプチドと、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも８５％または９０％または９５％の同一性を有するペプチドに関する。配列の同一性は、BLOSUM62マトリクス、ギャップ存在ペナルティ１１、およびギャップ伸長ペナルティ１を利用したＢＬＡＳＴアライメント（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/; Altschul SF et al J. Mol. Biol. 215(1990):403-410）により決定する。
【００２１】
本明細書において使用する場合、「ホモログ」は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０または４１のアミノ酸配列のいずれか１つを有する、他の関連するペプチドと、１つ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する、本発明のペプチドの「変異体」とみなされる。「変異体」または「ホモログ」は、置換されたアミノ酸が同様の構造または化学的特性を有するような、「保存的」アミノ酸置換であり得る。保存的アミノ酸置換の１つの形式は、同様の側鎖を有する残基の交換可能性に関する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸グループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり、 脂肪族炭化水素側鎖を有するアミノ酸グループは、セリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸グループは、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸グループは、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基側鎖を有するアミノ酸グループは、リジン、アルギニンおよびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換グループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。よりまれであるが、「変異体」または「ホモログ」は、「非保存的」変異（例えば、トリプトファンによるグリシンの置換）を含んでもよい。
【００２２】
本発明の「ホモログ」または「変異体」は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０または４１のアミノ酸配列のいずれか１つを有するペプチドと比較して、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つのアミノ酸変異（置換または欠失）を含み得る。本発明の「ホモログ」または「変異体」は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つのアミノ酸変異の最大数を有し得る。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、ここに記載したペプチド断片（配列番号１から４１）は、１５〜２４個、好ましくは、１６〜２４個、１７〜２４個、１８〜２４個、１９〜２４個、２０〜２４個、２１〜２４個、２２〜２４個、２３〜２４個、１６〜２３個、１７〜２３個、１８〜２３個、１９〜２３個、２０〜２３個、２１〜２３個、２２〜２３個、１６〜２２個、１７〜２２個、１８〜２２個、１９〜２２個、２０〜２２個、２１〜２２個、１６〜２１個、１７〜２１個、１８〜２１個、１９〜２１個、２０〜２１個、１６〜２０個、１７〜２０個、１８〜２０個、１９〜２０個、１６〜１９個、１７〜１９個、１８〜１９個、１６〜１８個、または１７〜１８個のアミノ酸残基、特に１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４個のアミノ酸残基からなる。
【００２４】
本発明の他の局面は、対象のサンプル中のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）特異的抗体を検出および／または定量化する方法に関し、当該方法は、
ａ）アミノ酸配列AIVCTRPNNNTRKSIRIGPGQVFYT（配列番号１）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチド断片
と結合している抗体の存在および／または量を決定する工程を含む。
【００２５】
対象のサンプル中のＨＩＶ由来ペプチドおよび／またはポリペプチドに対する抗体の存在は、その対象がＨＩＶに感染していることを示す。対象のサンプル中のＨＩＶ由来ペプチドおよび／またはポリペプチドに対する抗体の不在は、その対象がＨＩＶに感染していないことを示す。
【００２６】
本発明のさらに他の局面は、対象のサンプル中のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）特異的抗体を検出および／または定量化する方法に関し、当該方法は、
ａ）アミノ酸配列AIVCTRPNNNTRKSIRIGPGQVFYT（配列番号１）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチド断片
と結合している抗体の存在および／または量を決定する工程を含む。
【００２７】
本発明のさらに他の局面は、対象におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の進行をモニターする方法に関し、当該方法は、
ａ）アミノ酸配列AIVCTRPNNNTRKSIRIGPGQVFYT（配列番号１）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチド断片
と結合している抗体の量を決定する工程を含む。
【００２８】
本発明のさらに他の局面は、抗ＨＩＶ薬による対象の治療効果をモニターする方法に関し、当該方法は、
（ｉ）抗ＨＩＶ薬の投与前の対象のサンプルにおいて、
ａ）アミノ酸配列AIVCTRPNNNTRKSIRIGPGQVFYT（配列番号１）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチド断片
と結合している抗体の量を決定する工程；
（ｉｉ）対象の１回以上の投与後のサンプル中の、対象のサンプルにおいて、
ａ）アミノ酸配列AIVCTRPNNNTRKSIRIGPGQVFYT（配列番号１）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチド断片
と結合している抗体の量を決定する工程；
（ｉｉｉ）抗ＨＩＶ薬の投与前の対象のサンプルにおける決定された抗体の量と、１回以上の投与後のサンプルにおける決定された抗体の量とを比較する工程；および
（ｉｖ）抗ＨＩＶ薬が、対象におけるＨＩＶ特異的抗体のレベルおよび／またはアイソタイプに影響するか否かを決定する工程
を含む。
【００２９】
本発明のペプチドを、抗ＨＩＶ薬（例えば、抗レトロウイルス薬）により治療された対象におけるＨＩＶ特異的抗体の存在を決定するために用いてもよい。これにより、抗ＨＩＶ薬が、対象におけるＨＩＶ特異的抗体のレベルおよび／またはアイソタイプに影響するか否かをモニターおよび決定することができる。例えば、工程（ｉｉ）で決定したＨＩＶ特異的抗体の量が、工程（ｉ）でと比較して（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％）より低い場合、ＨＩＶの負荷量の減少を示し得るため、抗ＨＩＶ薬は、疾患の経過に正に影響し得る。しかしながら、工程（ｉｉ）で決定したＨＩＶ特異的抗体の量が、工程（ｉ）と比較して（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも１００％）より高い場合、抗ＨＩＶ薬は疾患の経過になんら影響せず、ＨＩＶ感染の治療において有用であるとは最も考えにくい。
【００３０】
本発明の方法の情報的価値を高めるために、ＨＩＶゲノムによりコードされた他のポリペプチドまたはそのペプチド断片（例えば、配列番号１〜４１のいずれか１つからなるペプチド）と結合され得る他の抗体の存在をさらに決定することが有用である。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態において、対象のサンプル中の
ａ）アミノ酸配列LLGLWGCSGKLICTTAVHWNSSWSN（配列番号２）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチド断片
と結合している抗体の存在および／または量をさらに決定する。
【００３２】
アミノ酸配列LLGLWGCSGKLICTTAVHWNSSWSN（配列番号２）を有するペプチドは、ＨＩＶエンベロープタンパク質複合体の一部であるＨＩＶポリペプチドｇｐ４１（Ｃ型）由来である。驚くべきことに、ＨＩＶに感染した対象は、このペプチドまたはその断片と結合する抗体を顕著な量生成する。それゆえに、そのような抗体のさらなる検出および／または定量化は、ＨＩＶに感染した対象のさらに強力な診断を可能にする。
【００３３】
ＨＩＶ  Ｃ型のエンベロープタンパク質ｇｐ４１由来のペプチド断片もまた、１つ以上、好ましくは２つ以上、好ましくは３つ以上、好ましくは４つ以上、好ましくは５つ以上、好ましくは６つ以上、好ましくは７つ以上、好ましくは８つ以上のＨＩＶの型のＨＩＶ感染を診断するために使用できることは、予想外の発見である。このことは、これらの型の全てのｇｐ４１を対象とする抗体であって、ＨＩＶに感染した対象から得られる抗体が、アミノ酸配列LLGLWGCSGKLICTTAVHWNSSWSN（配列番号２）またはホモログまたは１５〜２４個のアミノ酸残基からなるその断片、からなるペプチドと結合するからである。それゆえに、本発明の方法は、ＨＩＶ  Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｆ型、Ｇ型、Ｈ型、Ｊ型および／またはＫ型のＨＩＶ感染を診断可能であり、ＨＩＶ  Ｂ型およびＣ型の診断に特に好ましい。
【００３４】
それゆえに、本発明のさらなる局面は、対象におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染を診断するための方法に関し、当該方法は、対象のサンプル中の
ａ）アミノ酸配列LLGLWGCSGKLICTTAVHWNSSWSN（配列番号２）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチド断片
と結合している抗体の存在を決定する工程と、対象中にそのような抗体の存在を確認したときに、対象におけるＨＩＶ感染を診断し、または、対象中にそのような抗体の不在を確認したときに、対象におけるＨＩＶ非感染を診断する工程と、を含む。本発明のさらなる局面によれば、LLGLWGCSGKLICTTAVHWNSSWSN（配列番号２）は、そのホモログおよびその断片も同様に、上述したような抗ＨＩＶ薬による対象の治療効果をモニターするための方法に使用することもできる。そのような方法は、上述したように、アミノ酸配列AIVCTRPNNNTRKSIRIGPGQVFYT（配列番号１）またはホモログまたは１５〜２４個のアミノ酸残基からなるその断片からなるペプチドと結合している抗体の存在を決定する工程と組み合わせて使用することもできる。
【００３５】
本発明の他の局面は、対象のサンプルにおけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）特異的抗体を検出および／または定量化するための方法に関し、当該方法は、サンプル中の、
ａ）アミノ酸配列LLGLWGCSGKLICTTAVHWNSSWSN（配列番号２）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチド断片
と結合している抗体の存在および／または量を決定する工程を含む。
【００３６】
本発明のさらなる局面は、対象のサンプルにおけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）特異的抗体を検出および／または定量化するための方法に関し、当該方法は、サンプル中の、
ａ）アミノ酸配列LLGLWGCSGKLICTTAVHWNSSWSN（配列番号２）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチド断片
と結合している抗体の存在および／または量を決定する工程を含む。
【００３７】
本発明のさらに他の局面は、対象におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の進行をモニターする方法に関し、当該方法は、サンプル中の、
ａ）アミノ酸配列LLGLWGCSGKLICTTAVHWNSSWSN（配列番号２）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチド断片
と結合している抗体の量を決定する工程を含む。
【００３８】
本発明のさらに他の局面は、抗ＨＩＶ薬による対象の治療効果をモニターする方法に関し、当該方法は、
（ｉ）抗ＨＩＶ薬の投与前の対象のサンプルにおいて、
ａ）アミノ酸配列LLGLWGCSGKLICTTAVHWNSSWSN（配列番号２）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチド断片
と結合している抗体の量を決定する工程；
（ｉｉ）対象の１回以上の投与後のサンプル中の、対象のサンプルにおいて、
ａ）アミノ酸配列LLGLWGCSGKLICTTAVHWNSSWSN（配列番号２）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチド断片
と結合している抗体の量を決定する工程；
（ｉｉｉ）抗ＨＩＶ薬の投与前の対象のサンプルにおける決定された抗体の量と、１回以上の投与後のサンプルにおける決定された抗体の量とを比較する工程；および
（ｉｖ）抗ＨＩＶ薬が、対象におけるＨＩＶ特異的抗体のレベルおよび／またはアイソタイプに影響するか否かを決定する工程
を含む。
【００３９】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、個体のサンプル中の
ａ）アミノ酸配列NALFYRSDIVPLEKNSSEYILINCN（配列番号３）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチド断片
と結合している抗体の存在および／または量をさらに決定する。
【００４０】
アミノ酸配列NALFYRSDIVPLEKNSSEYILINCN（配列番号３）を有するペプチドは、ＨＩＶポリペプチドｇｐ１２０（Ｃ型）由来である。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態によれば、個体のサンプル中の
ａ）アミノ酸配列GIKQLQARVLAIERYLKDQQLLGLW（配列番号４）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチド断片
と結合している抗体の存在および／または量をさらに決定する。
【００４２】
アミノ酸配列GIKQLQARVLAIERYLKDQQLLGLW（配列番号４）を有するペプチドは、ＨＩＶポリペプチドｇｐ１２０（Ｃ型）由来である。
【００４３】
これらのペプチドの断片またはこれらのペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログは、配列番号１〜４１のアミノ酸残基１〜２４、１〜２３、１〜２２、１〜２１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、２〜２４、２〜２３、２〜２２、２〜２１、２〜２０、２〜１９、２〜１８、２〜１７、２〜１６、３〜２４、３〜２３、３〜２２、３〜２１、３〜２０、３〜１９、３〜１８、３〜１７、４〜２４、４〜２３、４〜２２、４〜２１、４〜２０、４〜１９、４〜１８、５〜２４、５〜２３、５〜２２、５〜２１、５〜２０、５〜１９、６〜２４、６〜２３、６〜２２、６〜２１、６〜２０、７〜２４、７〜２３、７〜２２、７〜２１、８〜２４、８〜２３、８〜２２、９〜２４、９〜２３、２〜２５、３〜２５、４〜２５、５〜２５、６〜２５、７〜２５、８〜２５、９〜２５、または、１０〜２５からなり得る。
【００４４】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、個体のサンプル中の
ａ）アミノ酸配列WRSELYKYKVVEIKPLGIAPTKAKRRVVEREKR（配列番号５）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチド断片
と結合している抗体の存在および／または量をさらに決定する。
【００４５】
アミノ酸配列WRSELYKYKVVEIKPLGIAPTKAKRRVVEREKR（配列番号５）を有するペプチドは、ＨＩＶポリペプチドｇｐ１２０（Ｃ型）由来である。
【００４６】
このペプチドの断片またはこのペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログは、配列番号５のアミノ酸残基１〜３１、１〜３０、１〜２９、１〜２８、１〜２７、１〜２６、１〜２５、１〜２４、１〜２３、１〜２２、１〜２１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、２〜３２、２〜３１、２〜３０、２〜２９、２〜２８、２〜２７、２〜２６、２〜２５、２〜２４、２〜２３、２〜２２、２〜２１、２〜２０、２〜１９、２〜１８、２〜１７、２〜１６、３〜３２、３〜３１、３〜３０、３〜２９、３〜２８、３〜２７、３〜２６、３〜２５、３〜２４、３〜２３、３〜２２、３〜２１、３〜２０、３〜１９、３〜１８、３〜１７、４〜３２、４〜３１、４〜３０、４〜２９、４〜２８、４〜２７、４〜２６、４〜２５、４〜２４、４〜２３、４〜２２、４〜２１、４〜２０、４〜１９、４〜１８、５〜３２、５〜３１、５〜３０、５〜２９、５〜２８、５〜２７、５〜２６、５〜２５、５〜２４、５〜２３、５〜２２、５〜２１、５〜２０、５〜１９、６〜３２、６〜３１、６〜３０、６〜２９、６〜２８、６〜２７、６〜２６、６〜２５、６〜２４、６〜２３、６〜２２、６〜２１、６〜２０、７〜３２、７〜３１、７〜３０、７〜２９、７〜２８、７〜２７、７〜２６、７〜２５、７〜２４、７〜２３、７〜２２、７〜２１、８〜３２、８〜３１、８〜３０、８〜２９、８〜２８、８〜２７、８〜２６、８〜２５、８〜２４、８〜２３、８〜２２、９〜３２、９〜３１、９〜３０、９〜２９、９〜２８、９〜２７、９〜２６、９〜２５、９〜２４、９〜２３、１０〜３２、１０〜３１、１０〜３０、１０〜２９、１０〜２８、１０〜２７、１０〜２６、１０〜２５、１０〜２４、１１〜３２、１１〜３１、１１〜３０、１１〜２９、１１〜２８、１１〜２７、１１〜２６、１１〜２５、１２〜３２、１２〜３１、１２〜３０、１２〜２９、１２〜２８、１２〜２７、１２〜２６、１３〜３２、１３〜３１、１３〜３０、１３〜２９、１３〜２８、１３〜２７、１４〜３２、１４〜３１、１４〜３０、１４〜２９、１４〜２８、１５〜３２、１５〜３１、１５〜３０、１５〜２９、１６〜３２、１６〜３１、１６〜３０、１７〜３２、１７〜３１、２〜３３、３〜３３、４〜３３、５〜３３、６〜３３、７〜３３、８〜３３、９〜３３、１０〜３３、１１〜３３、１２〜３３、１３〜３３、１４〜３３、１５〜３３、１６〜３３、１７〜３３、１８〜３３または１９〜３３からなり得る。
【００４７】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明の方法は、本明細書で定義したペプチド、ホモログまたはフラグメントの１つ以上と結合している抗体の存在および／または量の決定を含む。好ましい組み合わせには、以下のペプチド、およびこれに対応する上述したホモログおよび断片が含まれる：配列番号１および配列番号２；配列番号１および配列番号３；配列番号１および配列番号４；配列番号１および配列番号５；配列番号２および配列番号３；配列番号２および配列番号４；配列番号２および配列番号５；配列番号１、配列番号２および配列番号３；配列番号１、配列番号２および配列番号４；配列番号１、配列番号２および配列番号５；配列番号２、配列番号３および配列番号４；配列番号２、配列番号３および配列番号５；配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４；配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号５；配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５；配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５。この組み合わせと、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０または４１を有するペプチドの少なくとも１個、２個、３個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個とを組み合わせることも、もちろん可能である。
【００４８】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、個体のサンプルにおいてＨＩＶカプシドタンパク質ｐ２４と結合している抗体の存在および／または量をさらに決定する。
【００４９】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、個体のサンプルにおいて、ＨＩＶインテグラーゼ、ＨＩＶ逆転写酵素＋ＲＮａｓｅＨ、ＨＩＶプロテアーゼおよびＨＩＶマトリクスタンパク質ｐ１７からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドと結合している抗体の存在および／または量をさらに決定する。
【００５０】
サンプルにおいてペプチドまたはポリペプチドと結合している抗体の存在および／または量は、種々の方法により決定することができる。酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイノムアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロットアッセイ、ドットブロットアッセイ、ビーズアッセイ、ペプチドアレイおよびポリペプチドアレイからなる群から選択される方法を用いることが特に好ましい。
【００５１】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、対象のサンプルは、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、唾液、涙液、尿、鼻分泌物、生殖器分泌物、糞便、および／または母乳からなる群から選択されるサンプルであり、血液、血清または血漿サンプルが特に好ましい。
【００５２】
ＨＩＶ感染が疑われるまたは判明した患者から得たサンプルは、ＨＩＶのポリペプチドおよびペプチドの種々のエピトープに対する種々の型の抗体のプールを含む。それゆえに、本発明の好ましい実施形態によれば、決定および／または定量化される抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＭからなる群から選択され、特に好ましくはＩｇＧおよびＩｇＭである。
【００５３】
対象のサンプルにおける抗体の存在および／または量は、本明細書で定義した単一のペプチド若しくはポリペプチドの１つを用いて、または、上述したペプチドまたはポリペプチドの１つ以上、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上、さらにより好ましくは４つ以上を用いて、決定することができる。これにより、異なる抗原およびエピトープと結合している抗体の存在および／または量を同時に決定することができる。
【００５４】
本発明のペプチドおよびタンパク質を、さらなる診断およびまたは予後情報を得る目的で、エピトープ特異性、ペプチドに対する抗体の部分、ペプチド総量、または、ペプチドとタンパク質との総量を決定するために、血清に含まれる抗体を前吸着するように、個体の血清の液相に添加することができ、この抗体は、少なくとも１個（好ましくは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、１０個またはそれ以上）の本明細書で定義したペプチドおよび／またはタンパク質に特異的または結合した後、ウイルスの完全にグリコシル化された抗原に対する残りの遊離抗体に続いて結合する。
【００５５】
本発明の他の局面は、AIVCTRPNNNTRKSIRIGPGQVFYT（配列番号1)、LLGLWGCSGKLICTTAVHWNSSWSN（配列番号2)、RVRGILRNWPQWWIWGILGFWMIII（配列番号6)、WMIIICRGEENSWVTVYYGVPVWTE（配列番号7)、PVWTEAKTTLFCASDAKAYEKEVHN（配列番号8)、KEVHNVWATHACVPTDPSPQELVLE（配列番号9)、ELVLENVTESFNMWENDMVDQMHED（配列番号10)、QMHEDIIGLWDESLKPCVKLTPLCV（配列番号11)、TPLCVTLNCNTTSHNNSSPSPMTNC（配列番号12)、PMTNCSFNATTELRDKTQKVNALFY（配列番号13)、NALFYRSDIVPLEKNSSEYILINCN（配列番号3)、LINCNTSTITQACPKVSFDPIPIHY（配列番号14)、IPIHYCAPAGYAILKCNNKTFNGTG（配列番号15)、FNGTGPCSNVSTVQCTHGIKPVVST（配列番号16)、PVVSTQLLLNGSLAEGEIIIRSENL（配列番号17)、RSENLTDNAKTIIVHLNKSVAIVCT（配列番号18)、QVFYTNEIIGNIRQAHCNISRELWN（配列番号19)、RELWNNTLEQVKKKLKEHFQNKTIE（配列番号20)、NKTIEFQPPAGGDLEVTTHSFNCRG（配列番号21)、FNCRGEFFYCNTSNLFNITASNASD（配列番号22)、SNASDANNNTITLPCKIKQIINMWQ（配列番号23)、INMWQEVGRAMYAPPIAGNITCNSS（配列番号24)、TCNSSITGLLLTRDGGNNNDTGNNN（配列番号25)、TGNNNDTEIFRPGGGNMKDNWRSEL（配列番号26)、AVGLGAVLLGFLGTAGSTMGAASIT（配列番号27)、AASITLTVQARQLLSGIVQQQSNLL（配列番号28)、QSNLLRAIEAQQHMLQLTVWGIKQL（配列番号29)、GIKQLQARVLAIERYLKDQQLLGLW（配列番号4)、SSWSNKSQDYIWGNMTWMQWDREIN（配列番号30)、DREINNYTDIIYTLLEESQSQQEKN（配列番号31)、QQEKNEKDLLALDSWNNLWNWFSIT（配列番号32)、WFSITKWLWYIKIFIMIVGGLIGLR（配列番号33)、LIGLRIILGVLSIVKRVRQGYSPLS（配列番号34)、YSPLSFQTLPPNPRGPDRLRGIEEE（配列番号35)、GIEEEGGEQDKDRSIRLVSGFLALV（配列番号36)、FLALVWEDLRSLCLFSYHRLRDFIL（配列番号37)、RDFILIAGRAAELLGRSSLRGLQTG（配列番号38)、GLQTGWQALKYLGSLVQYWGLELKK（配列番号39）およびLELKKSAINLFDTTAIVVAEGTDRL（配列番号40)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチド、または１５〜２４個のアミノ酸残基からなるその断片、またはアミノ酸配列WRSELYKYKVVEIKPLGIAPTKAKRRVVEREKR（配列番号5)からなるペプチドもしくは１５〜３２個のアミノ酸残基からなるその断片、または、アミノ酸配列GTDRLIEGLQGIGRAIYNIPRRIRQGFEAALL（配列番号41)からなるペプチドもしくは１５〜３１個のアミノ酸残基からなるその断片に係る。
【００５６】
本発明のペプチドは、当該技術分野において公知の化学的合成法を使用して合成的に生産することができる。また、ペプチドは安定性を増すためにポリペプチド担体（例えばスカシガイヘモシアニン）と結合していてもよい。加えて、ペプチドを担体分子と共に組み換え融合タンパク質として合成し、または既知の相互作用により担体分子と結合させてもよい（ビオチン−ストレプトアビジン−アビジン）。
【００５７】
ポリペプチドは微生物中で生産され、その後単離され、必要ならばさらに精製されてもよい。ポリペプチドは微生物、例えば細菌、酵母もしくは真菌中で、真核細胞、例えば哺乳類もしくは昆虫細胞中で、または組み替えウイルスベクター、例えばアデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、シムリキ森林ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウイルスもしくはセンダイウイルス中で生産されてもよい。化合物／ペプチドを生産するのに適した細菌は、E.coli、B.subtilisまたはペプチドを発現することができる他の任意の細菌を包含する。前記の化合物／ペプチドを発現するのに適した酵母のタイプは、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Candida、Pichia pastorisまたはペプチドを発現することができる他の任意の酵母を包含する。対応する方法は当該技術分野において公知である。組み換えにより生産されたポリペプチドを単離および精製する方法もまた当該技術分野において公知であり、例えばゲルろ過、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等を包含する。
【００５８】
ポリペプチドの単離を容易にするため、異種ペプチドまたはアフィニティクロマトグラフィーにより単離することを可能とするポリペプチドを融合（共有結合により結合）し、翻訳的にポリペプチドを製造する、融合ポリペプチドを製造してもよい。典型的な異種ペプチドまたはポリペプチドはヒスチジンタグ（例えばＨｉｓ６；６ヒスチジン残基）、ＧＳＴタグ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）等である。融合ポリペプチドは精製を容易にするのみならず、精製中に前記ペプチドが分解されにくくすることもできる。精製後に異種ペプチドを除去することが望まれる場合には、融合ポリペプチドは、ポリペプチドと異種ペプチドまたはポリペプチド間の接合部に切断サイトを含んでいてもよい。切断サイトは、その部位の配列におけるアミノ酸配列特異的な酵素（例えばプロテアーゼ）により切断されるアミノ酸配列からなる。
【００５９】
本発明の方法において使用されるポリペプチド（例えばＨＩＶカプシドタンパク質ｐ２４、ＨＩＶインテグラーゼ、ＨＩＶ逆転写酵素＋ＲＮＡｓｅＨ、ＨＩＶプロテアーゼおよびＨＩＶマトリクスタンパク質ｐ１７）は、当該技術分野において既知の手法を使用して組み換え生産されることが好ましい。
【００６０】
本発明の他の局面は、本明細書に開示された１つ以上のペプチドを含んでいる固体担体に関しており、当該固体担体は、当該固体担体上に固定化された、
ａ）アミノ酸配列AIVCTRPNNNTRKSIRIGPGQVFYT（配列番号１）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチドの断片
を含んでいる。
【００６１】
本発明の選択的な局面は、本明細書に開示されている１つ以上のペプチドを含む固体担体に関しており、当該固体担体は、当該固体担体上に固定化された、
ａ）アミノ酸配列LLGLWGCSGKLICTTAVHWNSSWSN（配列番号２）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチドの断片
を含んでいる。
【００６２】
本発明の選択的な局面は、サンプル中のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に結合した抗体の存在もしくは不在および／または量を決定するための、本明細書に開示される１つ以上のペプチドを含んでいる、固体担体に関しており、当該固体担体上に固定化された、
ａ）アミノ酸配列LLGLWGCSGKLICTTAVHWNSSWSN（配列番号２）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチドの断片
を含んでいる。
【００６３】
これらの固体担体は本発明に係る方法、例えば、特に
サンプル中のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に結合している抗体の存在もしくは不在および／または量を決定する
対象におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染を診断する
対象におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染の経過および進行をモニターする
対象における抗ＨＩＶ薬を用いた処置の効果をモニターする
または他の任意のＨＩＶと結合している抗体の決定に関連する方法において使用することができる。
【００６４】
本発明に係る固体担体は、ガラス、ポリスチレン、ＰＤＶＦメンブレン、ナイロン、ニトロセルロース、セファロースおよびアガロースからなる群より選択することができる。
【００６５】
本発明に係るペプチドおよびポリペプチドの固定担体への固定化は、直接的にペプチドまたはポリペプチドを固体担体に固定化することで達成してもよい。あるいは、ペプチドを、システイン残基、または分子を固体担体に固定化可能な他の既知の部分によりＣ末端および／またはＮ末端修飾しもよい。前記固定化は共有結合または非共有結合により行われてもよい。固体担体への前記共有結合または非共有結合は当該技術分野において公知の方法および試薬の使用により行ってもよい。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態によれば、アミノ酸配列LLGLWGCSGKLICTTAVHWNSSWSN（配列番号２もしくはAIVCTRPNNNTRKSIRIGPGQVFYT（配列番号１）それぞれからなるペプチド、または上記で規定したホモログ、またはその１５〜２４個のアミノ酸残基からなる断片が当該固体担体にさらに固定化される。
【００６７】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、
ａ）アミノ酸配列NALFYRSDIVPLEKNSSEYILINCN（配列番号３）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチドの断片
がさらに固体担体上に固定化されている。
【００６８】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、
ａ）アミノ酸配列GIKQLQARVLAIERYLKDQQLLGLW（配列番号４）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜２４個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチドの断片
が当該固体担体上にさらに固定化されている。
【００６９】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、
ａ）アミノ酸配列WRSELYKYKVVEIKPLGIAPTKAKRRVVEREKR（配列番号５）からなるペプチド、または
ｂ）ａ）のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するホモログ、または
ｃ）１５〜３２個のアミノ酸残基からなる、ａ）またはｂ）のペプチドの断片
が当該固体担体上にさらに固定化されている。
【００７０】
本発明に係る固体担体は、当該固体担体に固定化される、上記で規定されている、１つ以上のペプチド、ホモログまたは断片が固定化されていてもよい。当該分子の好ましい組み合わせは、以下のペプチドおよびそれぞれのホモログおよび断片である：配列番号２を伴う配列番号１；配列番号３を伴う配列番号１；配列番号４を伴う配列番号１；配列番号５を伴う配列番号１；配列番号３を伴う配列番号２；配列番号４を伴う配列番号２；配列番号５を伴う配列番号２；配列番号２および配列番号３を伴う配列番号１；配列番号２および配列番号４を伴う配列番号１；配列番号２および配列番号５を伴う配列番号１；配列番号３および配列番号４を伴う配列番号２；配列番号３および配列番号５を伴う配列番号２；配列番号２、配列番号３および配列番号４を伴う配列番号１；配列番号２、配列番号３および配列番号５を伴う配列番号１；配列番号３、配列番号４および配列番号５を伴う配列番号２；配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５を伴う配列番号１。もちろん配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０または４１を有するペプチドのうち、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個と、この組み合わせとを組み合わせることも可能である。
【００７１】
本発明に係る固体担体は、ＨＩＶに由来するポリペプチドを含んでいてもよい。それゆえ、好ましい実施形態によれば、カプシドタンパク質ｐ２４が当該固体担体にさらに固定化される。
【００７２】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、ＨＩＶインテグラーゼ、ＨＩＶ逆転写酵素＋ＲＮＡｓｅＨ、ＨＩＶプロテアーゼおよびＨＩＶマトリクスタンパク質ｐ１７からなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドが当該固体担体上にさらに固定化される。
【００７３】
固体担体は本発明に係る１つ以上のペプチドまたはポリペプチドを固定化するのに使用される。固体担体のさらなる使用に依存して、固体担体は様々な形態をとり得る。固体担体は好ましくはカラム、ビーズ、試験管、マイクロタイターディッシュ、固体粒子、マイクロチップまたは膜の形態において提供される。当該固体担体は様々なイムノアッセイに使用することができる。
【００７４】
本発明は以下の図および実施例によりさらに説明されるが、これらに限定されない。
【００７５】
図１は抗体がＨＩＶ−１クレードＣｇｐ１２０およびｇｐ１２０由来のペプチドに反応することを示す。（Ａ）アフリカ人（左）およびヨーロッパ人（右）の患者の、組み換えｇｐ１２０および２４個の重複するｇｐ１２０ペプチド（ｘ軸：ペプチド１〜２４）に対するＩｇＧ、ＩｇＧサブクラスＩｇＡおよびＩｇＭの反応の頻度（ｙ軸：反応性の血清の数）。（Ｂ）最適な配列アラインメントに必要である、ＨＩＶ−１クレードＣ南アフリカ株（クレードＣ＿ＺＡ）および参考株ＨＸＢ２（クレードＢ＿ＨＸＢ２）のｇｐ１２０における重複するｇｐ１２０ペプチドの部分。最適な配列アラインメントに必要である、クレードＣおよびＢ由来のｇｐ１２０におけるギャップ（欠落しているアミノ酸の数を表示）を示す。ｇｐ１２０クレードＢについて説明する関連するタンパク質ドメインを示す（ＳＰ：シグナルペプチド、Ｖ１−Ｖ５：可変領域１−５。）（Ｃ）ＨＩＶ−１クレードＣ南アフリカ株（Ｒｅｆ．Ｃ．ＺＡ）のペプチド１２０／１５と、対応するＨＩＶ−１参考株由来のペプチドとの多重配列アラインメント。右端にＲｅｆ．Ｃ．ＺＡペプチドとの配列の同一性のパーセンテージを示す。点線は保存されたアミノ酸である。破線はギャップである。Ｎ結合型グリコシル化サイトに下線を引いている。番号付けの方式はＨＩＶ−１株ＨＸＢ２（Ｒｅｆ．Ｂ．ＦＲ）を参照する。aaはアミノ酸を意味する。
【００７６】
図２は抗体がＨＩＶ−１クレードＣｇｐ４１由来のペプチドに反応することを示す。（Ａ）アフリカ人（左）およびヨーロッパ人（右）の患者の、１７個の重複するｇｐ４１ペプチド（ｘ軸：ペプチド１〜１７）に対するＩｇＧ、ＩｇＧサブクラスＩｇＡおよびＩｇＭの反応の頻度（ｙ軸：反応性の血清の数）。（Ｂ）最適な配列アラインメントに必要である、ＨＩＶ−１クレードＣ南アフリカ株（クレードＣ＿ＺＡ）および参考株ＨＸＢ２（クレードＢ＿ＨＸＢ２）のｇｐ４１における重複するｇｐ４１ペプチドの部分。最適な配列アラインメントに必要である、クレードＣおよびＢ由来のｇｐ４１におけるギャップ（欠落しているアミノ酸の数を表示）を示す。ｇｐ４１クレードＢについて説明する関連するタンパク質ドメイン／エピトープを示す（Ｆ：融合タンパク質、ＴＭ：トランスメンブレンタンパク質、ＩＤ：免疫優性領域、ＩＳ：免疫抑制領域、ＭＰＥＲ：膜近位外部領域）。
【００７７】
図３は、組み換えＨＩＶ−１クレードＣ構造、補助およびｐｏｌ由来タンパク質の純度および免疫反応性を示す。（Ａ）組み換えマトリクス（ＭＡ）、カプシド（ＣＡ）、ヌクレオカプシド（ＮＣ）、ＮＥＦ、ＴＡＴ、ＶＩＦ、プロテアーゼ（ＰＲ）、逆転写酵素＋ＲＮＡｓｅＨ（ＰＲ）、インテグラーゼ（ＩＲ）および分子量マーカー（Ｍ）を含むクマシー染色されたＳＤＳ  ＰＡＧＥ。分子量（ｋＤａ）を左に示す。（Ｂ）アフリカ人（左）およびヨーロッパ人（右）の患者の、構造、補助およびｐｏｌ由来タンパク質（ｘ軸）に対するＩｇＧ、ＩｇＧサブクラスＩｇＡおよびＩｇＭの反応の頻度（ｙ軸：反応性の血清の数）。
【００７８】
図４は、規定された従来の診断試験において陰性の結果を有する２個体の、ｇｐ１２０由来タンパク質およびペプチドに対するＩｇＧおよびＩｇＭの反応プロファイルを示す。ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の、ＨＩＶ−１クレードＣ抗原（ｒｇｐ１２０、ＭＡ：マトリクス；ＮＥＦ、ＴＡＴ、ＰＲ：プロテアーゼ、ＰＲ：逆転写酵素＋ＲＮＡｓｅＨ、ＩＮ：インテグラーゼ）およびペプチドに対する陽性反応が示される。ＩｎｎｏＬＩＡ  ＩｇＧイムノブロットで得られた、ＨＩＶ抗原ｇｐ１２０、ｇｐ４１、インテグラーゼ（ＩＮ）、カプシド（ＣＡ）、マトリクス（ＭＡ）およびＨＩＶ−２抗原ｇｐ１０５、ｇｐ３６陰性の試験結果を右端に示す。
【００７９】
図５Ａは、同一のアミノ酸を（＊）、置換を（．）およびギャップを（−）で表すアミノ酸配列アラインメントを示す。ペプチドの長さをアミノ酸の数として右端に示す。図５ＡにおけるペプチドアライメントはAIVCTRPNNNTRKSIRIGPGQVFYT（配列番号１)およびNTRKSIRIGPGQTFY(配列番号４２；Casseb et al. Braz J Med Biol Res 35(2002):369-375を参照）である。図５Ｂは、図５Ａにおける２つのペプチドの、アフリカ人およびヨーロッパ人のＨＩＶに感染した患者におけるＩｇＧ血清反応性を、ネガティブコントロールに対する反応を差し引いた、光学濃度（ＯＤ）として表す。さらに、アフリカ人（左）およびヨーロッパ人（右）の、配列番号１および４２を有するペプチドに対するＩｇＧ反応の頻度（ｙ軸：反応性の血清の数）を図５Ｃに示す。
〔実施例〕
（実施例１）
＜材料および方法＞
ＨＩＶ−１クレードＣエンベロープと重複するペプチドの合成
南アフリカのＨＩＶ−１クレードＣの参照用株（分離株ZA.04.04ZASK146、 Los Alamos HIV 配列データベース承認番号AY772699）由来のｇｐ１２０およびｇｐ４１の完全長アミノ酸配列をカバーする２４個および１７個のペプチドを、ＣＥＭ−Ｌｉｂｅｒｔｙ（ＣＥＭ、アメリカ合衆国）、またはApplied Biosystem peptide synthesizer（Life technologies、アメリカ合衆国）において、固相合成により生成した。それぞれ３３個および３２個のアミノ酸を含んでおりｇｐ１２０およびｇｐ４１のＣ末端ペプチドを除き、全てのペプチドはアミノ酸２５個の長さであり、５個のアミノ酸の重複を有している（次の表を参照）。ＨＩＶ−１クレードＣエンベロープペプチド：
【００８０】
【表１】
0006436919.tif 000002
0006436919.tif 000003
【００８１】
合成を、ＰＥＧ−ＰＳをプレロードしたレジンを用いた９−フルオレニル１−メトキシ−カルボニル（Ｆｍｏｃ）法により行った。合成されたペプチドを、ジクロロメタンで洗浄し、１９ｍｌのトリフルオロ酢酸、５００μｌのシランおよび５００μｌのＨ２Ｏの混合物中で樹脂から分離され、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル中に沈殿させた。ペプチドはアセトニトリルグラジエント（ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ Ｐｕｍｐ, Ｄｉｏｎｅｘ、アメリカ合衆国）における逆相ＨＰＬＣにより９０％より高い純度で副生成物から単離され、質量スペクトル（Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、 Ｂｒｕｋｅｒ、アメリカ合衆国）により同定した。ペプチドの化学的性質は、Expasy proteomics serverのProtParamにより予測し、可溶化の条件の最適化を検討した。疎水性の高いペプチドはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはアセトニトリル（ＡＣＮ）中で可溶化し、システインを豊富に含むペプチドにはジチオエリトリトール（ＤＴＥ）等の還元剤を、添加し、強度の酸性のペプチドにはＮａＯＨを添加した。
【００８２】
＜ＨＩＶ−１クレードＣタンパク質の発現および精製＞
組み換えマトリクス（ＭＡ）、カプシド（ＣＡ）、ヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質、ならびにＮＥＦ、ＴＡＴおよびＶＩＦ、およびｐｏｌ由来プロテアーゼ（ＰＲ）、逆転写酵素＋ＲＮａｓｅＨ（ＲＰ）およびインテグラーゼ（ＩＮ）をEscherichia coli (E.coli)において発現した。端的には、構造タンパク質および補助タンパク質ならびにプロテアーゼのｃＤＮＡ配列は、南アフリカのＨＩＶ−１クレードＣ参照用株（分離株ZA.04.04ZASK146、 Los Alamos HIV配列データベース承認番号AY772699）に由来する。逆転写酵素−ＲＮＡｓｅＨおよびインテグラーゼコンストラクトは、エチオピアのＨＩＶ−１クレードＣ分離株（Los Alamos HIV 配列データベース承認番号U46016)に由来する。タンパク質のｃＤＮＡはヘキサヒスチジンタグがその後に続いており、細菌による発現のためにコドン最適化され、pET17bベクター(ATG:biosynthetics、ドイツ)にクローニングした。１００ｍｇ／ｌアンピシリンを添加したＬＢ培地においてＯＤ６００＝０．４−０．６まで培養された、E.coli BL21(DE3)細胞における組み換えタンパク質の発現を０．５〜１．０ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導し、タンパク質をニッケルアフィニティクロマトグラフィーにより、未変性または変性の条件下で精製した。マトリクス、カプシドおよびヌクレオカプシドの未変性の条件下での精製については、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール  ｐＨ８．０、ＰＭＳＦ（１μｌ／ｍｌ）、リゾチーム（１ｍｇ／ｍｌ）中における連続的な凍結および融解のサイクルにより細胞を溶解し：ＤＮＡを５μｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩで開裂させ（２０分間、室温）：細胞の破片を除去（１８０００ｒｐｍｍ、２０分間、４℃で遠心）した後、透明な可溶化液をニッケルアガロース（QIAGEN、ドイツ）で２〜４時間、４℃でインキュベートした。ヒスチジンタグタ付加したンパク質の溶出を、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ８．０中の、イミダゾール勾配（２０、５０、１００、２５０ｍＭのイミダゾール）を用いて実施した。ＮＥＦ、ＴＡＴおよびプロテアーゼの、変性条件下における精製については、細胞を８Ｍの尿素または６Ｍの塩化グアニジアムバッファー中で少なくとも２時間または一晩室温で溶解した。細胞の破片を除去（１８０００ｒｐｍｍ、２０分間、４℃で遠心）し、透明な可溶化液をニッケルアガロース（QIAGEN、ドイツ）でインキュベート（室温で２〜４時間、または４℃で一晩）した後、ｐＨ勾配（ｐＨ６．３、５．６、４．５）を使用して組み換えタンパク質を８Ｍの尿素、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリス中に溶出させた。組み換えインテグラーゼの精製については、細胞をまず上述の未変性の状態で溶解し、タンパク質は遠心（１８０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）の後、不溶性画分に見られるため、この不溶性画分を不溶性画分は再度８Ｍの尿素、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０に懸濁し、一晩室温でインキュベートした。細胞の破片を除去（第２の工程の１８０００ｒｐｍ、２０分間、４℃の遠心により）した後、組み換えインテグラーゼを、変性条件下で８Ｍの尿素中で上述のとおり精製した。ＶＩＦおよび逆転写酵素＋ＲＮＡｓｅＨの精製は、封入体調製のプロトコルに従い達成した。変性条件下で精製された組み換えタンパク質の尿素の除去およびリフォールディングを、連続透析の工程により達成した。
【００８３】
タンパク質の同一性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色（図３Ａ）ならびにウエスタンブロットおよび質量分析により確認した。これらのタンパク質の二次構造および熱安定性を、Jasko J-810 分光偏光計 (Japan Spectroscopic、日本)において、円偏光二色性スペクトルにより解析した。組み換えＨＩＶ−１クレードＣタンパク質の生化学的性質は、Expasy proteomics serverのProtParamソフトウエアにより予測し、上述のように実験的に評価し、以下の表に概説した。
組み換えＨＩＶ−１クレードＣタンパク質の生化学的性質
【００８４】
【表２】
0006436919.tif 000004
【００８５】
１タンパク質の略称：ＭＡ：マトリクス、ＣＡ：カプシド、ＮＣ：ヌクレオカプシド、ＰＲ：プロテアーゼ、ＰＲ：逆転写酵素＋ＲＮＡｓｅＨ、ＩＮ：インテグラーゼ。２ＭＷ：ProtParamで予測し、および質量スペクトルで確認した分子量（ｋＤａ）３ｐＩ：ProtParamで予測さした等電点。４二次構造：円偏光二色性スペクトルにより決定される、α−ヘリカルまたはβ−シートいずれかの要素の優性。５熱安定性：円偏光二色性スペクトルにより決定される；Ｔｍ：融点；ｎ．ｄ．：実施せず。
＜研究の対象およびルーチンイムノアッセイ＞
１４人のアフリカ人のＨＩＶに感染した患者、２人の高度に曝露されたアフリカ人の個人、１５人のヨーロッパ人のＨＩＶに感染した患者、および１０人の感染していない個体から血清が採取された。各被験者のＨＩＶ血清学的陽性および陰性は、ルーチン分析により確認した。ＨＩＶ特異的ＩｇＧイムノブロットはラインイムノアッセイ（InnoLIA, Innogenetics、ベルギー）により実施され、また無症候の被験者をさらにAbbott Murex HIV Ag/Ab combination (Abbott、アメリカ合衆国）により試験した。
【００８６】
＜ＥＬＩＳＡによるＨＩＶ−１クレードＣタンパク質特異的ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭの決定＞
ＥＬＩＳＡプレート（Nunc Maxisorp, Thermo Fisher Scientific、アメリカ合衆国）を、１００ｍＭの重炭酸ナトリウムバッファーｐＨ９．６で希釈したＨＩＶ−１クレードＣ由来ペプチドおよびタンパク質（２μｇ／ｍｌ）を用いて４℃で一晩、被覆した。ＰＢＳ０．０５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０中で洗浄し、２％ｗ／ｖＢＳＡ、ＰＢＳ，０．０５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０中で少なくとも４時間室温でブロッキングした後、プレートを０．５％ｗ／ｖＢＳＡ、ＰＢＳ、０．０５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０で１：２００に希釈した血清を用いて４℃で一晩インキュベートした。結合した抗体をマウス抗ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ（ＢＤ、１：１０００、室温で２時間）またはマウス抗ヒトＩｇＧ３（１：５０００、室温で２時間、Sigma Aldrichst. Louis、MO）、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ（１：２０００、室温で１時間、GE Healthcare, Waukesha, WI）を用いて検出した。全ＩｇＧ抗体は直接的に標識されたＨＲＰ−抗ヒトＩｇＧ（１：５０００、室温で１時間、GE Healthcare、アメリカ合衆国）を用いて検出した。呈色反応を２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩によって誘導し、光学濃度（ＯＤ４０５ｎｍ−ＯＤ４９０ｎｍ）をSpectra Max 分光光度計（Molecular Devices、アメリカ合衆国）において測定した。エンベロープ特異的反応性の分析のためのコントロール抗原として、２９３個の細胞（#11233-V08H, Sino Biological、中国）で発現した、ＨＩＶ−１クレードＣ由来の組み換えヒスチジンタグｇｐ１２０、単離ＣＮ５４を使用した。プレート間の標準化のために、各プレートにおいて、各抗体のアイソタイプ／サブクラスに特異的なポジティブコントロール血清を分析した。加えて、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する各血清サンプルの反応性を、ネガティブコントロールとして試験した。抗原のコーティングを、ヒスチジンタグタンパク質の、マウス抗ヒスチジンタグ抗体（Dianova、ドイツ）を用いた検出、ならびにタグ付されていないタンパク質およびペプチドの、ＨＩＶ感染血清のプールを用いた検出によって確認した。コーティングされた抗原に対する検出抗体の非特異的結合を、バッファーのコントロールの分析によって排除した。全ての決定は２回行っており、結果はネガティブコントロール抗原に対する反応性を引いた生データの標準化された平均値として表される。閾値は、各抗体のアイソタイプ／サブクラスごとに、および各抗原について、ＨＩＶに感染していない被験者の結果の平均値＋３ＳＤとして計算した。
【００８７】
多重配列アラインメントのため、アミノ酸配列の同一性をＥＭＢＬ−ＥＢＩサーバー上のＣｌｕｓｔａｌＷ２を用いて計算し、Ｇｅｎｅ  Ｄｏｃプログラム（http://www.psc.edu/biomed/genedoc）を用いてアラインメントを生成した。配列は、国際的なＨＸＢ２のナンバリングスキーム（(http://www.hiv.lanl.gov/)）に従い、連続した文字が後に続く最後の対応するＨＸＢ２のアミノ酸の番号を有するアミノ酸の挿入によってナンバリングされる。
【００８８】
＜結果＞
ほぼ同一のＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭは、アフリカおよびヨーロッパのＨＩＶに感染した患者におけるＨＩＶ−１クレードＣ由来のｇｐ１２０エピトープに反応する。
【００８９】
ｇｐ１２０の詳細なエピトープマッピングのために、ＨＩＶ−１に感染した、クレードＣがＨＩＶ−１の主なサブタイプである、ジンバブエの患者由来の血清を試験し、また組み換えｇｐ１２０および２４個の重複するｇｐ１２０由来ペプチドとの抗体の反応性について、他のクレードのＨＩＶ−１株に感染したヨーロッパ人の患者由来の血清を試験した。これらのペプチドは、南アフリカのＨＩＶ−１サブタイプＣ参照用株に由来するｇｐ１２０の完全長アミノ酸配列をカバーした（図１Ａ、Ｂ）。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧ１−４サブクラスの反応性を測定した。
【００９０】
興味深いことに、ＩｇＧ、ＩｇＧサブクラス、ＩｇＡおよびＩｇＭの、ペプチドに対する反応プロファイルは、アフリカ人のＨＩＶに感染した患者（図１Ａ左パネル）およびヨーロッパ人のＨＩＶに感染した患者（図１Ａ右パネル）においてほぼ同一であった。ペプチドの認識パターンは、全ての抗体クラスおよびＩｇＧサブクラスで類似であった。しかしながら、抗体レベルおよび認識の頻度の分析により、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１の反応がどちらの集団においても支配的であることが示された。ペプチド１２０／１５は、アフリカ人およびヨーロッパ人の患者について、認識の頻度および強度の観点において主たる抗体反応性ペプチドであった。（図１Ａ）。ペプチド１２０／２４もまた、試験された個体の大多数によって認識された。ｇｐ１２０の全体像（図１Ｂ）は、ペプチド１２０／１５が、ＣＤ４細胞上のコレセプターＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４のための結合サイトを含んでいると考えられるＶ３ドメインに存在していることを示す。ペプチド１２０／２４はｇｐ１２０のちょうどＣ末端に位置している。
【００９１】
図１Ｃは、ペプチド１２０／１５と、異なる大陸からの様々なＨＩＶ−１参照用株における対応するペプチドとの配列アラインメントを含んでいる。ペプチド１２０／１５に対応する領域の相当程度の配列変異が、８８〜７２％の配列同一性の範囲で、前記株の間で発見された。株に依存して、ペプチド１２０／１５と定義される領域は、１つまたは２つのＮ結合型グリコシル化サイトを含んでいる。
【００９２】
＜アフリカ人およびヨーロッパ人の患者はＨＩＶ−１クレードＣ由来のｇｐ４１上の高度に類似したエピトープを認識する＞
次に、アフリカ人の患者およびヨーロッパ人の患者の、ＨＩＶ−１クレードＣのｇｐ４１由来のオーバーラップする１７個のペプチドに対するＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭの反応を分析した（図２Ａ、２Ｂ）。再び、アフリカ人の患者およびヨーロッパ人の患者が類似のペプチドを認識し、免疫反応においてＩｇＧ、および特にＩｇＧ１抗体が支配的であることがわかった。認識の頻度および強度の両方が、ｇｐ４１ペプチドに対するものよりも、ｇｐ１２０由来ペプチドに対するものの方が低かった。ＩｇＧ抗体およびＩｇＧ１抗体は、主にペプチド４１／４−８に定義される領域に向けられた（図２Ａ）。この領域は、「免疫抑制的」かつ「免疫優性」ドメインと呼ばれてきた、予測されるｇｐ４１のＮ結合型グリコシル化サイトの大部分を含んでいる領域を包含する（図２Ａ、Ｂ）。興味深いことに、ペプチド４１／１４−１７に定義される他の抗体反応性領域は、いわゆる「細胞質顆粒ドメイン」の一部である、ｇｐ４１のＣ末端部分に位置していた。
【００９３】
＜アフリカ人およびヨーロッパ人のＨＩＶに感染した患者はｐｏｌ由来構造タンパク質に一次応答するが、補助タンパク質には一次応答しない＞
表面抗原以外のウイルスタンパク質に対する抗体反応を特徴づけるために、ＨＩＶ−１クレードＣのｐｏｌ由来構造タンパク質および補助タンパク質をE.coliにおいて発現させて精製し、タンパク質特異的抗体のレベルをアフリカ人の血清（図３Ｂ、左パネル）およびヨーロッパ人の血清（図３Ｂ、右パネル）において測定した。エンベロープタンパク質と同様、免疫応答はＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１抗体が支配的であった。再び、両方の集団の患者は類似の認識プロファイルを示した：プロテアーゼ、逆転写酵素＋ＲＮＡｓｅＨ、インテグラーゼ、ならびにカプシドタンパク質およびマトリクスタンパク質が最も高頻度かつ強力に認識される抗体であった。ヌクレオカプシドタンパク質および補助タンパク質に対する抗体の反応はまれで低いものであった。
【００９４】
＜ＨＩＶタンパク質およびペプチドのＩｇＧサブクラス認識はＴｈ１／Ｔｈ２混合免疫応答の徴候である＞
ＩｇＧサブクラスの、ｇｐ１２０およびｇｐ４１ペプチドに対する反応ならびにｐｏｌ由来構造タンパク質および補助タンパク質に対する反応の測定を、同一の血清希釈物を使用して実施した。ＩｇＧ１は支配的なＩｇＧサブクラスであるので、ＩｇＧ１の反応はＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の反応よりも強力で高頻度であった。しかしながら、抗原およびエピトープ認識プロファイルは、アフリカ人の患者およびヨーロッパ人の患者において、全てのサブクラスで類似していた。ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の反応の頻度および強度は、Ｔｈ１／Ｔｈ２混合免疫応答の徴候であり、同等であった。
【００９５】
＜クレードＣプロテオームを構成する組み換えタンパク質およびペプチドに基づく診断試験の高い感度および特異度＞
抗体反応の包括的な分析により、ＨＩＶ−１クレードＣ由来の抗原およびペプチドのパネルが、ＨＩＶに感染しているアフリカおよびヨーロッパの患者それぞれにおいて、特異的ＩｇＧ抗体の確実な検出を可能にすることが示された。感染していない個体由来の血清を試験した場合に、偽陽性の試験結果が得られることはなかった。ペプチド１２０／１５は、ＩｇＧに基づくＨＩＶ感染患者の診断について、２９人の患者のうち２９人を同定することができたため、事実上完全なｒｇｐ１２０であった。同様に、ペプチド１２０／２４が２９人の患者のうち２１人で陽性であったのに対し、ペプチド４１／５は２９人の患者を同定することができた。カプシドタンパク質に対するＩｇＧ反応性試験は２９／２９の患者を同定し、逆転写酵素＋ＲＮＡｓｅＨに対するＩｇＧ反応性試験は２７／２９の患者を同定し、インテグラーゼは２７／２９、プロテアーゼに対するＩｇＧ反応性試験は２６／２９の患者を同定した。それゆえ、ペプチド１２０／１５および４１／５は、単独で個体におけるＨＩＶ感染の診断に利用することができる。ペプチド１２０／１５、１２０／２４、ｒｇｐ１２０、カプシドタンパク質およびｐｏｌ由来タンパク質のパネルを用いて、各感染患者をＩｇＧ試験によって診断した。
【００９６】
加えて、ＨＩＶに高度に曝露され感染しているアフリカ人の個体は、通常の抗原／ＩｇＧ＋ＩｇＭ判定（Abbott Murex HIV Ag/Ab combination、Abbott、アメリカ合衆国）ならびにイムノブロットに基づくアッセイ（InnoLIA, Innogenetics、ベルギー；図４右端に示す）において陰性であったが、ＨＩＶ−１クレードＣ由来抗原およびペプチドのパネルに対するＩｇＧおよびＩｇＭ試験によって診断することができた（図４）。
【００９７】
（実施例２）
本実施例において、アミノ酸配列AIVCTRPNNNTRKSIRIGPGQVFYT（配列番号１；１２０／１５）を有するペプチドおよびNTRKSIRIGPGQTFY（配列番号４２；Ｃｏｎｃ  Ｃ、Casseb et al. Braz J Med Biol Res 35(2002):369-375を参照）を有するペプチドの、ＨＩＶに感染した個体の血清との反応を検査する。この検査の結果を図５に示す。
【００９８】
図５Ａは、ペプチド１２０／１５と、Casseb et al. 2002に使用されたコンセンサスペプチドＣｏｎ  Ｃ（多くのサブタイプＣ配列に類似させるために１３番目にスレオニンが組み込まれている（１２０／１５においてはバリンが含まれている））との比較を示す。多くのサブタイプＣ配列に類似させるためにコンセンサスペプチドの配列が修正されているにも関わらず、２９個のうち１１個のＨＩＶ陽性血清サンプルがこのペプチドと反応せず、それゆえ診断テストにおいて偽陰性であった。一方、ペプチド１２０／１５は、２９個の各ＨＩＶ陽性血清サンプルを同定することができた（図５Ｃ参照）。
【００９９】
＜材料および方法＞
Casseb et al. 2002に使用されたペプチド「Ｃｏｎｓ  Ｃ」を、ｇｐ１２０由来ペプチドについて説明した（実施例１を参照）のと同様に、固相ペプチド合成を用いて製造した。ＥＬＩＳＡ実験のため、ペプチドをＨ２Ｏに可溶化し、ｇｐ１２０由来ペプチドについて説明したのと同様に免疫学的アッセイを行った。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１Ａ】抗体がＨＩＶ−１クレードＣｇｐ１２０およびｇｐ１２０由来のペプチドに反応することを示す。アフリカ人（左）およびヨーロッパ人（右）の患者の、組み換えｇｐ１２０および２４個の重複するｇｐ１２０ペプチド（ｘ軸：ペプチド１〜２４）に対するＩｇＧ、ＩｇＧサブクラスＩｇＡおよびＩｇＭの反応の頻度（ｙ軸：反応性の血清の数）。
【図１Ｂ】抗体がＨＩＶ−１クレードＣｇｐ１２０およびｇｐ１２０由来のペプチドに反応することを示す。最適な配列アラインメントに必要である、ＨＩＶ−１クレードＣ南アフリカ株（クレードＣ＿ＺＡ）および参考株ＨＸＢ２（クレードＢ＿ＨＸＢ２）のｇｐ１２０における重複するｇｐ１２０ペプチドの部分。最適な配列アラインメントに必要である、クレードＣおよびＢ由来のｇｐ１２０におけるギャップ（欠落しているアミノ酸の数を表示）を示す。ｇｐ１２０クレードＢについて説明する関連するタンパク質ドメインを示す（ＳＰ：シグナルペプチド、Ｖ１−Ｖ５：可変領域１−５）。
【図１Ｃ】抗体がＨＩＶ−１クレードＣｇｐ１２０およびｇｐ１２０由来のペプチドに反応することを示す。ＨＩＶ−１クレードＣ南アフリカ株（Ｒｅｆ．Ｃ．ＺＡ）のペプチド１２０／１５と、対応するＨＩＶ−１参考株由来のペプチドとの多重配列アラインメント。右端にＲｅｆ．Ｃ．ＺＡペプチドとの配列の同一性のパーセンテージを示す。点線は保存されたアミノ酸である。破線はギャップである。Ｎ結合型グリコシル化サイトに下線を引いている。番号付けの方式はＨＩＶ−１株ＨＸＢ２（Ｒｅｆ．Ｂ．ＦＲ）を参照する。aaはアミノ酸を意味する。
【図２Ａ】抗体がＨＩＶ−１クレードＣｇｐ４１由来のペプチドに反応することを示す。アフリカ人（左）およびヨーロッパ人（右）の患者の、１７個の重複するｇｐ４１ペプチド（ｘ軸：ペプチド１〜１７）に対するＩｇＧ、ＩｇＧサブクラスＩｇＡおよびＩｇＭの反応の頻度（ｙ軸：反応性の血清の数）。
【図２Ｂ】抗体がＨＩＶ−１クレードＣｇｐ４１由来のペプチドに反応することを示す。最適な配列アラインメントに必要である、ＨＩＶ−１クレードＣ南アフリカ株（クレードＣ＿ＺＡ）および参考株ＨＸＢ２（クレードＢ＿ＨＸＢ２）のｇｐ４１における重複するｇｐ４１ペプチドの部分。最適な配列アラインメントに必要である、クレードＣおよびＢ由来のｇｐ４１におけるギャップ（欠落しているアミノ酸の数を表示）を示す。ｇｐ４１クレードＢについて説明する関連するタンパク質ドメイン／エピトープを示す（Ｆ：融合タンパク質、ＴＭ：トランスメンブレンタンパク質、ＩＤ：免疫優性領域、ＩＳ：免疫抑制領域、ＭＰＥＲ：膜近位外部領域）。
【図３Ａ】組み換えＨＩＶ−１クレードＣ構造、補助およびｐｏｌ由来タンパク質の純度および免疫反応性を示す。組み換えマトリクス（ＭＡ）、カプシド（ＣＡ）、ヌクレオカプシド（ＮＣ）、ＮＥＦ、ＴＡＴ、ＶＩＦ、プロテアーゼ（ＰＲ）、逆転写酵素＋ＲＮＡｓｅＨ（ＰＲ）、インテグラーゼ（ＩＲ）および分子量マーカー（Ｍ）を含むクマシー染色されたＳＤＳ  ＰＡＧＥ。分子量（ｋＤａ）を左に示す。
【図３Ｂ】組み換えＨＩＶ−１クレードＣ構造、補助およびｐｏｌ由来タンパク質の純度および免疫反応性を示す。アフリカ人（左）およびヨーロッパ人（右）の患者の、構造、補助およびｐｏｌ由来タンパク質（ｘ軸）に対するＩｇＧ、ＩｇＧサブクラスＩｇＡおよびＩｇＭの反応の頻度（ｙ軸：反応性の血清の数）。
【図４】図４は、規定された従来の診断試験において陰性の結果を有する２個体の、ｇｐ１２０由来タンパク質およびペプチドに対するＩｇＧおよびＩｇＭの反応プロファイルを示す。ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の、ＨＩＶ−１クレードＣ抗原（ｒｇｐ１２０、ＭＡ：マトリクス；ＮＥＦ、ＴＡＴ、ＰＲ：プロテアーゼ、ＰＲ：逆転写酵素＋ＲＮＡｓｅＨ、ＩＮ：インテグラーゼ）およびペプチドに対する陽性反応が示される。ＩｎｎｏＬＩＡ  ＩｇＧイムノブロットで得られた、ＨＩＶ抗原ｇｐ１２０、ｇｐ４１、インテグラーゼ（ＩＮ）、カプシド（ＣＡ）、マトリクス（ＭＡ）およびＨＩＶ−２抗原ｇｐ１０５、ｇｐ３６陰性の試験結果を右端に示す。
【図５Ａ】同一のアミノ酸を（＊）、置換を（．）およびギャップを（−）で表すアミノ酸配列アラインメントを示す。ペプチドの長さをアミノ酸の数として右端に示す。図５ＡにおけるペプチドアライメントはAIVCTRPNNNTRKSIRIGPGQVFYT（配列番号１)およびNTRKSIRIGPGQTFY(配列番号４２；Casseb et al. Braz J Med Biol Res 35(2002):369-375を参照）である。
【図５Ｂ】図５Ａにおける２つのペプチドの、アフリカ人およびヨーロッパ人のＨＩＶに感染した患者におけるＩｇＧ血清反応性を、ネガティブコントロールに対する反応を差し引いた、光学濃度（ＯＤ）として表す。
【図５Ｃ】アフリカ人（左）およびヨーロッパ人（右）の、配列番号１および４２を有するペプチドに対するＩｇＧ反応の頻度（ｙ軸：反応性の血清の数）を図５Ｃに示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【配列表】
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