(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の浸潤能を評価するための被覆膜であって、
ａ）多孔膜と、
ｂ）前記膜の表面上にある組成物と
を含み、前記組成物が、Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス腫瘍由来の再構成凝集細胞外基質、ｐＨ７．８〜８．２の緩衝液、およびポリオールを含むことを特徴とする被覆膜。
【請求項２】
さらに塩を含むことを特徴とする請求項１に記載の被覆膜。
【請求項３】
乾燥されていることを特徴とする請求項１に記載の被腹膜。
【請求項４】
細胞の浸潤能を評価するための被覆膜であって、
ａ）ポリエチレンテレフタレート多孔膜と、
ｂ）前記膜の表面上にある組成物と
を含み、前記組成物が、Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス腫瘍由来の再構成凝集細胞外基質、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含むｐＨ７．８〜８．２の緩衝液、塩、およびスクロースを含むことを特徴とする被覆膜。
【請求項５】
細胞の浸潤能を評価するためのアセンブリであって、
ａ）ウェルを有する組織培養プレートと、
ｂ）前記プレート用のインサートであって、デッキを貫く壁によって画定された開口を有するデッキ部分を有し、前記壁は前記ウェル内に収容されるように寸法設定されたインサートと、
ｃ）前記開口の底壁となる請求項１に記載の被覆膜と
を備えることを特徴とするアセンブリ。
【請求項６】
前記インサートに密封して被さるように寸法設定された蓋をさらに備えることを特徴とする請求項５に記載のアセンブリ。
【請求項７】
前記インサートを収容するように寸法設定されたフィーダトレイをさらに備えることを特徴とする請求項５に記載のアセンブリ。
【請求項８】
細胞の浸潤能を評価するための膜を製造する方法であって、
ａ）スクロースを含むｐＨ７．８〜８．２の緩衝液中における、Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス腫瘍からの再構成細胞外基質の溶液を調製するステップと、
ｂ）前記溶液を多孔膜の表面に塗布して、被覆膜を生成するステップと、
ｃ）前記溶液の成分の凝集を引き起こして、前記膜上に凝集コーティングを生成するステップとを含むことを特徴とする製造方法。
【請求項９】
前記溶液はさらに塩を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記凝集コーティングを前記膜上で安定化させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養に関し、特に凝集重合細胞外基質中へ細胞が浸潤するのを測定する改良された装置、およびこの装置を形成する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
浸潤とは、基底膜障壁を通過する、および／または間質組織中への細胞の運動のプロセスである。浸潤は、悪性腫瘍細胞の転移中、および血管形成や創傷治癒などの正常な生理的プロセス中に起こる。
【０００３】
細胞の浸潤性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価は、従来、自然基底膜のバリア機能に似せた再構成基底膜の構成要素を消化する細胞の能力を定量的に測定することによって行われている。浸潤の測定に広く使用されている再構成基底膜は、Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス腫瘍から単離されており、Ｋｌｅｉｎｍａｎｎ他の米国特許第４，８２９，０００号、および「改良されたマトリゲル（登録商標）浸潤チャンバー」（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．）と題する技術速報４２７に開示されている。但し、マトリゲル（登録商標）は、ＥＨＳ調製用のＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．の登録商標である。
【０００４】
支持表面上、通常は多孔膜上に塗布した、従来技術のＥＨＳ組成物を用いた浸潤アッセイは、様々な欠陥があり、その大部分は多孔質支持表面上の従来技術のコーティング溶液が不均一に乾燥することに関連している。不均一乾燥に伴う具体的な問題は、浸潤細胞の斑点や同心輪紋などのパターン形成効果として表れる不連続な細胞浸潤である。不均一乾燥はまた、表面張力効果によって膜の外端に塩の結晶を析出させ、許容できないほど多くの未塗布のポアを生じる。従来技術のコーティングにおける、これらおよびその他の欠陥のために、浸潤性細胞と非浸潤性細胞の区別がつかないことがある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
当技術分野では、多孔支持体上に、浸潤性細胞によってよく消化され、非浸潤性細胞の通過に対して実質的に抵抗性がある均一なコーティングを形成し、これによって、浸潤性細胞と非浸潤性細胞を容易にかつ正確に区別することができる組成物が求められている。本発明は、この要求を満たすことを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
細胞の浸潤性を測定するための多孔膜は、ＥＨＳマウス腫瘍由来の再構成細胞外基質を含む成分のコーティングをその上に有する。この組成物を、ｐＨ７．８〜８．２の緩衝液中にポリオールを含むコーティング溶液として塗布する。好ましい緩衝剤はトリスであり、好ましいポリオールはスクロースである。
【０００７】
本発明の第２の態様は、マルチウェル組織培養プレートと、貫通するスリーブを有するインサートを備えたアセンブリである。スリーブはプレートのウェルに嵌め込まれ、塗布された膜がスリーブの底壁となる。アセンブリは、任意選択で、プレートの蓋およびフィーダトレイを備えることができる。
【０００８】
本発明の他の態様は、塗布された膜を調製する方法である。この方法は、ＥＨＳの諸成分の凝集を引き起こし、多孔膜上にこの組成物を乾燥させて安定化させることを含む。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、異なる形の多くの実施形態によって実施されるが、本開示は、本発明の原理の例とみなすべきであり、図示および記述された実施形態に本発明を限定するものではないという了解のもとに、ここに本発明の実施形態を詳細に記述することとする。本発明の範囲は、頭記の特許請求の範囲およびその均等物によって決まる。
【００１０】
基底膜は、多くの器官の上皮組織の下にある繊細な結合組織である。本発明の組成物は、自然膜の活性に似せた再構成基底膜であり、増殖、付着、または浸透を促す環境を細胞に与える。下記のように、適当な支持体上に塗布し、市販の細胞培養装置を用いて使用すると、この組成物は、生物学的利用能試験、毒性試験、移動試験において、手動またはロボット式の細胞のスクリーニングに好適であり、細胞の浸潤能の評価に最適である。
【００１１】
本発明の組成物は、細胞と接触させるためのどんな多孔表面（以下支持表面と呼ぶ）にも、緩衝溶液で塗布することができる。多孔支持表面は、ガラスやセラミックなど、任意の適当な材料からなる。好ましい支持表面は、ポリ塩化ビニル、ポリオレフィン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネートなどの重合体からなり、好ましくはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）製である。重合体支持表面は、多孔フィルムの形にすることができ、これ自体が他の材料の支持体上に被覆されてもよい。最も好ましい支持表面は多孔重合体膜であり、以下に、本発明を、多孔ＰＥＴ膜支持表面について詳細に記述する。最も好ましい多孔膜は、トラックエッチＰＥＴの膜であり、約０．５〜３０、好ましくは約８μｍの厚み、および直径３〜１２μｍのポアを有することができる。
【００１２】
この組成物の第１の成分は、ＥＨＳマウス腫瘍由来の再構成細胞外基質である。この基質（本開示では、以下ＥＨＳと呼ぶ）は、当技術分野において周知であり、前述の米国特許第４，８２９，０００号に十分に開示されており、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．からマトリゲル（登録商標）の商標で販売されている。
【００１３】
ＥＨＳは、ｐＨ７．８〜８．２、好ましくは約８．０の緩衝液に溶解される。このｐＨ値を与えるものであれば、当技術分野において既知のどんな緩衝剤、例えば、ジエタノールアミン、Ｎ−エチルモルホリン、トリエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチルグリシン）、ジメチルロイシルグリシンなどを用いてもよい。好ましい緩衝剤は、トリス［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＴＲＩＺＭＡ（登録商標）］であり、濃度０．０１〜０．０５Ｍで使用される。この緩衝液に溶解するＥＨＳの濃度は、被覆する膜表面１ｃｍ２あたり６０〜１００μｇである。
【００１４】
この組成物はまた、ＥＨＳを溶液に保つために緩衝液に加えた塩（好ましくは塩化ナトリウム）を含む。この塩は、緩衝液中に０．０８〜０．１５Ｍで用いられる。
【００１５】
このＥＨＳ溶液に、２〜８ｇｍ％のポリオールを加える。好ましいポリオールは、単糖類、二糖類、オリゴ糖、デキストリン、ポリアルキレングリコール、これらの重合体および共重合体などの糖、グリコール、その重合体および共重合体である。好ましいポリオールは、スクロースである。
【００１６】
上記の溶液は、０〜１０℃に保ち、好ましくはマイクロピペットを用いて、膜表面１ｃｍ２あたり１０〜１５０、好ましくは６５〜１０５μｇの濃度で、膜表面全体を覆うように、膜の上面および下面の一方または両方に塗布する。
【００１７】
次いで、塗布膜を温度１５〜４０、好ましくは３３〜４０℃、相対湿度４０〜６０％で、１〜４時間インキュベ−トして、ＥＨＳ成分を凝集させ凝集体を膜へ接着させる。最後に、膜表面上の凝集体は、安定化され乾燥されて、凝集体の分解を防止し均一なコーティングを保持することができる。このステップには、当技術分野で周知の、コーティングの振動性外乱を回避するどんな手順を用いることもできる。好ましい技術は、制御された環境、好ましくは、温度２０〜３２℃、相対湿度４０〜６０％で乾燥することである。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態を、以下のチャートに、様々なパラメータを最も近い従来技術と比べて示す。
【００１９】
【表１】
0004774176.tif 000002
【００２０】
本発明の他の態様においては、本発明の組成物を被覆した膜を、細胞付着、増殖、浸潤の試験用アセンブリに含めることが有利である。このアセンブリは、マルチウェル組織培養プレートおよびそのためのインサートを備えている。インサートは、垂直な側壁によって画定された開口を有し、これがプレートのウェル内にはめ込まれて末端が開口したスリーブを形成する。組織培養プレートアセンブリは当技術分野において通常用いられており、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．からファルコン（登録商標）の商標で販売されているマルチウェルプレートとインサートのシステムがその一例である。このアセンブリでは、上記のように本発明の組成物を塗布した膜が、インサートスリーブの底壁となる。
【００２１】
図に注目すると、同様の要素には同じ参照番号と小文字の接尾辞が付けてある。図１および図２は、細胞分析用のマルチウェルアセンブリ１０を図示している。アセンブリ１０は、略長方形のプレート１２を備えている。プレート１２は、側壁１４、頂端１６、および水平底壁１８を有する。インサート２０が、プレート１２にはめ込まれ、デッキ２４内に複数の開口２２を有する。
【００２２】
図２において、垂直壁２８によって画定された複数のウェル２６が、水平底壁１８から上方に突出している。インサートの開口２２は、デッキ２４から下方に突出している垂直壁３０によって画定されている。垂直壁３０は、二つの開口端を有するスリーブ３１を形成する。ウェル２６は、デッキ２４がウェル壁２８の頂部３２に載った状態で、スリーブ３１をその中に収容するように寸法設定されている。
【００２３】
図３および図４は、図２のアセンブリの、１つのウェル（２６ａ）の拡大図であり、内部にポア３６を有し、全体に延在し、スリーブ３１ａの底壁となる多孔膜３４を示す。図４は、膜３４ｂの表面およびポア３６ｂ上の本発明の凝集コーティング組成物３８を示す。目視検査によれば、本発明のコーティングは滑らかで光沢があってむらがなく、ポア３６ｂは実質的に閉じている。
【００２４】
図５は、従来技術の組成物を用いてコーティングした場合の、膜の被覆表面を示す。このコーティング（３９）の検査によれば、濁ってむらがある表面と、相当数の開いた（閉じていない）ポアがある。
【００２５】
このアサンブリは、インサートを収容するように寸法設定されたプラスチック製、好ましくはＰＳ製のフィーダトレイ４０（図６）を備えることができ、これによってすべてのウェルの膜を同時に同じ媒体の浴に浸けることができる容器を提供することができる。さらに、このアセンブリに、プレート内またはフィーダトレイ内のインサートを覆うように寸法設定された、好ましくはＰＥＴ製の蓋（図７、４２）を設けて、貯蔵またはインキュベーション期間のあいだ密閉環境を提供することができる。
【００２６】
本発明によれば、細胞の浸潤能力は、本発明の被覆膜中への浸潤の程度によって定量的に測定することができる。ＮＩＨ細胞系３Ｔ３を代表的な非浸潤性細胞、ＨＴ−１０８０を代表的な浸潤性細胞として用いて、本発明の被覆膜は、これら２種の細胞型をよく区別することができ、以下の所望の性能仕様を満たした。
３Ｔ３  −  １０％以下の浸潤
ＨＴ−１０８０  −  ２５％以上の浸潤で、浸潤細胞は表面全体にむらなく分布し顕著なパターン形成がない。
【００２７】
本発明の組成物中のスクロースは塩の結晶化を防止して、膜の上面に塩およびタンパク質（ＥＨＳ）をより均一に分布させることが判明した。タンパク質のこの均一な分布が、細胞の膜中へのむらのない浸潤をもたらし、その結果、浸潤細胞が膜の下面でむらなく分布するようになる。このデータは、実施例２の表１に示してある。
【００２８】
コーティング溶液のｐＨは、膜表面に付着しかつ膜ポアを閉塞する凝集体の生成に対して劇的な制御効果を有することが判明した。低ｐＨでは、よりアルカリ性のｐＨよりも、この組成物によるポアの閉塞ははるかに少なかった。必ずしも明白ではないが、この効果は、凝集体のサイズによると思われる。このデータは、実施例２の表２にまとめて示してある。
【００２９】
本発明の被覆膜のさらなる利点は、従来技術の膜に比べて貯蔵寿命が著しく向上することである。
【００３０】
実施例
実施例１
膜の調製
Ａ．コーティング溶液の調製
２〜８ｇｍ％のスクロースを、０．０８〜０．１５ｍのＮａＣｌを含むｐＨ７．８〜８．２のトリス緩衝液（０．０１〜０．０５ｍ）に加えた。この溶液を０〜１０℃に保ちながら、被覆する膜表面１ｃｍ２あたり１０〜１５０、好ましくは６５〜１０５μｇとなるのに十分なＥＨＳを加えた。このようにして調製したコーティング溶液を、０〜１０℃に保った。
【００３１】
Ｂ．コーティング手順
上で調製したコーティング溶液を、８μｍのポアを有するトラックエッチＰＥＴ膜上にマイクロピペットで塗布した。ファルクロン（登録商標）インサートのスリーブ部分の開口端全体に膜を張り付ける前または後に、溶液が膜表面全体をむらなく被覆するように注意して、コーティングを行った。被覆した膜を３３〜４０℃、相対湿度４０〜６０％で、１〜３時間保って、ＥＨＳ成分を凝集させた。凝集したコーティングを、２５〜３０℃、４０〜５０％ＲＨで乾燥することにより安定化させ、インサートを４℃以下、好ましくは−２０℃で貯蔵した。
【００３２】
実施例２
細胞浸潤のアッセイの方法
本発明の組成物を被覆した膜および従来技術の膜について、上記の技術速報４２７に記載された手順により、細胞浸潤の試験を行った。（好ましくはクマシーブルーで）染色を行い、通常のＱＰＣ−１７２またはＤＮＡ測定により膜の下面の細胞数をカウントすることによって浸潤パーセントを求め、以下の結果を得た。
【００３３】
スクロースの効果（浸潤細胞％）
【００３４】
【表２】
0004774176.tif 000003
【００３５】
ａ）マトリゲル（登録商標）のロット
ｂ）ＨＴ−１０８０
ｃ）ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のリン酸塩緩衝生理食塩水−４％スクロース
ｄ）トリス生理食塩水−スクロース
【００３６】
ｐＨの効果
【００３７】
【表３】
0004774176.tif 000004
【００３８】
＋＋＋  高％の浸潤
＋＋  中浸潤
＋  低浸潤
−  微浸潤または非浸潤
【００３９】
実施例３−比較例
スクロースなしでトリス緩衝液を用いた従来技術による膜は、３Ｔ３およびＨＴ１０８０による細胞浸潤に関しては性能仕様を満たしたが、著しくむらがある浸潤細胞の分布をもたらし、細胞のカウントは困難であった。
【００４０】
実施例４−比較例
リン酸塩緩衝液調合物（ｐＨ７．４）中にスクロースを用いた従来技術による膜は、非浸潤細胞系のポア中の移動で測定して、未被覆ポアのパーセントが許容できないほど高かった。
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞外基質中への細胞浸潤を測定するための浸潤チャンバとして有用な、マルチウェル分析アセンブリの頂部の斜視図である。
【図２】図１のアセンブリの、図１の線２−２に沿った断面図である。
【図３】図２のアセンブリの、１個のウェルの拡大断面図である。
【図４】本発明の組成物でコーティングした後の、図３のウェルの拡大断面図である。
【図５】従来技術の組成物でコーティングした後のアセンブリの、１個のウェルの拡大断面図である。
【図６】アセンブリのフィーダトレイの頂部斜視図である。
【図７】アセンブリの蓋の頂部斜視図である。
【符号の説明】
１０  アセンブリ
１２  プレート
１４  側壁
１６  頂端
１８  水平底壁
２０  インサート
２２  開口
２４  デッキ
２６  ウェル
２８  ウェル壁
３０  垂直壁
３１  スリーブ
３２  頂部
３４  多孔膜
３６  ポア
３８  凝集コーティング組成物
３９  コーティング
４０  フィーダトレイ
４２  蓋
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0004774176.tif 000009
【図６】
0004774176.tif 000010
【図７】
0004774176.tif 000011