(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化されたＴｏｓ１７レトロトランスポゾンをイネのゲノムに導入し、当該トランスポゾンがスターチシンターゼＩ型遺伝子の位置に挿入されたものを選抜することからなる、イネのスターチシンターゼＩ型遺伝子がノックアウトされたミュータントを製造する方法。
【請求項２】
活性化されたＴｏｓ１７トランスポゾンをイネのゲノムに導入し、当該トランスポゾンがスターチシンターゼＩ型遺伝子の位置に挿入されたものを選抜することにより製造された、スターチシンターゼＩ型遺伝子がノックアウトされたミュータント。
【請求項３】
スターチシンターゼＩ型の酵素活性が、野生型に比べてその４分の１以下である請求項２に記載のミュータント。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のミュータントを用いて、スターチシンターゼＩ型の酵素活性が低下したことに起因するデンプンを製造する方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法により製造される、胚乳アミロペクチンの鎖長の８〜１５の頻度が野生型に比べて減少している、イネ胚乳デンプン。
【請求項６】
野生型イネにより製造されるデンプンと比べて、糊化粘度特性が異なることを特徴とする請求項５に記載のイネ胚乳デンプン。
【請求項７】
野生型イネにより製造されるデンプンと比べて、熱糊化特性が異なることを特徴とする請求項５又は６に記載のイネ胚乳デンプン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、活性化されたレトロトランスポゾンを植物のゲノムに導入し、当該トランスポゾンがスターチシンターゼＩ型遺伝子の位置に挿入されたものを選抜することからなる、植物のスターチシンターゼＩ型遺伝子がノックアウトされたミュータント、及びその製造方法に関する。また、本発明は当該ミュータントを用いて野生型とは物性の異なる新規なデンプン、及びそれを製造する方法を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
デンプンは植物のエネルギー貯蔵物質であり、α−ポリグルコースからなる多糖類の１種で、アミロースとアミロペクチンからなっている。グリコーゲンもデンプンと同様にα−ポリグルコースからなる多糖類であるが、これは主として動物のエネルギー貯蔵物質として利用されている。
デンプンは穀物の主成分として食品や飼料として使用されるだけでなく、デキストリン、オリゴ糖、異性化糖などに加工されて加工食品などにも利用され、また、糊や添加剤などとして工業製品やその原材料としても利用されている。
【０００３】
デンプンと一言でいっても、稲のデンプン、じゃがいものデンプン、小麦のデンプン、とうもろこしのデンプンなど、その由来によりデンプンの形、味、糊化したときの物性などが微妙に異なり、我々はその用途に応じて各種の植物由来のデンプンを使い分けてきている。このようなデンプンの性質の違いはデンプンの化学構造による違いから来ていると説明されてきている。
デンプンは主としてアミロースとアミロペクチンからできているものであり、その化学構造の相違は主として枝分かれ構造を有するアミロペクチンに由来ところが大きいとされている。
デンプン(Starch)は高等植物の貯蔵器官に蓄積するα‐ポリグルカンである。その貯蔵組織中でデンプン粒は「アミロプラスト」と呼ばれるプラスチドの中に含まれている。デンプンは２種類のグルコース・ホモポリマー、アミロペクチン（Amylopectin）とアミロース（Amylose）の混合物である。アミロースは、貯蔵デンプン中の２０〜３０％を占めているが、デンプン粒の形成には必須ではない。グルコース・ユニットがα−１，４グルコシド結合で繋がっており、少量のα‐１，６グルコシド結合の枝を含む線状のらせん状の分子である。一方、アミロペクチンはデンプン粒中の７０‐８０％を占め、グルコース・ユニットがα‐１，４グルコシド結合で伸び、主鎖と平行にα‐１，６グルコシド結合で枝が繋がった構造をとっている。特徴的なこの構造は”クラスター”構造と呼ばれている。  動物やバクテリアの貯蔵炭素、グリコーゲン(Glycogen)もアミロペクチンと同じくグルコース・ホモポリマーで構成されているが、クラスター構造は持っていない。グリコーゲンは”tree like”や”bush like”構造を持つと報告されている。
【０００４】
図１にアミロース、アミロペクチン、及びグリコーゲンの構造を示す。図１に示される線はα−グルコースの連鎖であり、アミロース（図１の（Ｃ））は枝分かれがほとんど無くα−１，４−グルコースのほぼ１本鎖の構造をしている。アミロペクチン（図１の（Ｂ））は規則正しい枝分かれ構造を有し、α−１，４−グルコースの連鎖とα−１，６−グルコースの枝分かれ構造（クラスター）を一定の間隔で規則正しく有している。また、動物などのエネルギー貯蔵物質であるグリコーゲン（図１の（Ａ））は、全く不規則な枝分かれ構造からなるものである。グリコーゲンはアミロペクチンに比べて分子も小さく、枝も短く、その多くは水溶性の物質である。これに対してアミロペクチンは、枝も長く、かつグルコースが高密度で充填されており、一般に水不溶性の物質である。
【０００５】
このようなアミロペクチンのクラスター構造は、結晶構造を造る際に有利であり、結晶構造によるデンプン粒が形成される。アミロペクチンのクラスター構造は、ほぼ９ｎｍの規則正しい繰り返し構造であり、この９ｎｍのサイズは組織や種が異なっても余りばらつきが見られない。
アミロペクチンの構造をさらに詳細に見てゆくと、３タイプのα‐１，４−グルコシド鎖を持っている（図２参照）。Ａ鎖は最も外側の鎖で鎖の中に分岐結合を持たない鎖である。Ｂ鎖は一つの鎖あたり１つ以上の鎖が分岐結合している鎖であり、Ｂ鎖はさらに、１つのクラスターにとどまるＢ１鎖、２つのクラスターに及んでいるＢ２鎖、３つのクラスターに及ぶＢ３鎖などがある。Ｃ鎖は還元末端を持っている鎖であり、アミロペクチン１分子あたり１つのＣ鎖を持っている。
【０００６】
このように、アミロペクチンの構造はほぼ一定ではあるが、植物の種類によりアミロペクチンの構造も微妙に異なってきている。最近の研究によれば、ねっとりとしたデンプンを有するジャポニカの稲と、パサパサとしたデンプンを有するインディカの稲のアミロペクチンの構造上の相違が報告されている。図３の上段（図３の（ａ））はジャポニカ米のアミロペクチン、図３の下段（図３の（ｂ））はインディカ米のアミロペクチンの構造を模式的に示したものである。クラスターの枝の長さを比べるとインディカ米の方が比較的長く、その密度も比較的密になっている。このためにインディカ米のデンプンの方が糊化が難しくなっていると考えられている。
このようなアミロペクチンの微細な構造上の相違は、アミロペクチンを合成する際の合成方法の相違により生起してくると考えられている。
【０００７】
アミロペクチンは次の４種類の酵素の連続反応で合成されると考えられている。
（１）ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ADPglucose pyrophosphorylase（ＡＧＰａｓｅ））、
（２）デンプン合成酵素（Starch synthase（ＳＳ））、
（３）デンプン枝作り酵素（Starch  branching enzyme（ＢＥ））、
（４）デンプン枝切り酵素（Starch debranching enzyme（ＤＢＥ））
である。
【０００８】
ＡＧＰａｓｅは、デンプン・ポリマーの原材料であるＡＤＰグルコースを合成する酵素である。スターチシンターゼ（ＳＳ）は、アミロペクチンの非還元末端にＡＤＰグルコースをα‐１，４グルコシド結合で繋ぎ、鎖を伸ばす役割をする。ＳＳがアミロペクチンの鎖を伸ばすのに対し、ＢＥは、アミロペクチンのα‐１，６グルコシド結合を形成する酵素であり、枝分かれ構造の枝分かれ部分を形成させる酵素である。
スターチシンターゼ（ＳＳ）は、デンプンの鎖を伸ばす役割をする重要な酵素であり、Ｉ型、II型、III型が存在することが知られている。スターチシンターゼ（ＳＳ）は際限なくデンプンの鎖を伸ばし続けるのではなく、植物に応じたクラスターの形成に必要な長さだけの鎖を伸ばしている。また、アイソザイム間でどの鎖長を伸ばすかを機能分担している。このようなスターチシンターゼ（ＳＳ）の各アイソザイムの特異的な機能について現在まで十分な解明がなされてきていない。
このようなアイソザイムの機能の解明には、当該酵素の遺伝子がノックアウトされたミュータントの利用が必要である。ジャガイモのＳＳＩＩ及びＳＳＩＩＩのアンチセンス形質転換体(Edwards et al., 1999. Plant J, 17, 251-261)や、エンドウのＳＳＩＩミュータントであるｒｕｇ−５(Craig et al., 1998. Plant Cell, 10, 413-426)や、トウモロコシのＳＳＩＩＩミュータントであるｄｕｌｌ−１(Inouchi et al., 1987. Starch, 39, 259-266)などが報告されているが、スターチシンターゼＩ型（以下、ＳＳＩと略称する。）のミュータントは、現在までいかなる植物でも発見されておらず、この酵素の機能解明にはそのミュータントの発見が必要不可欠であった。
【０００９】
遺伝子をノックアウトする方法としては各種の手法が開発されてきるが、その多くは動物の遺伝子に関するものである。植物については、Ａｃ／ＤｓやＴ−ＤＮＡや、トランスポゾンを用いる方法などが知られている。
トウモロコシでは、１０種類以上の転移活性を有する内在性のトランスポゾンが同定されている。このようなトランスポゾンに対応する配列はイネゲノム上にも存在することが知られているが、これらのトランスポゾン様の配列はイネでは転移活性を失っているようであり、そのままではトランスポゾンの活性を示さない。このようなレトロトランスポゾンが、イネから４０種類以上単離されており、そのうち５種類が培養によって活性化され、最も活性の高いＴｏｓ１７が効率的遺伝子破壊に利用できることが知られている。
本発明者らは、Ｔｏｓ１７によりイネのＳＳＩ遺伝子をノックアウトすることができることを見出し、ＳＳＩの機能解析及び当該ミュータントにより製造されるデンプンの物性を検討した。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、イネのスターチシンターゼＩ型（ＳＳＩ）遺伝子がノックアウトされたミュータントを提供することを目的とし、それによるＳＳＩの機能の解明、それによる新規なデンプン、及びその製造方法を提供することを目的としている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、トランスポゾンを植物のゲノムに導入し、当該トランスポゾンがスターチシンターゼＩ型遺伝子の位置に挿入されたものを選抜することにより製造され得るスターチシンターゼＩ型遺伝子がノックアウトされたミュータントに関する。より詳細には、イネのスターチシンターゼＩ型遺伝子の中にトランスポゾンが挿入されて、スターチシンターゼＩ型遺伝子がノックアウトされたミュータントに関する。
また、本発明は、活性化されたレトロトランスポゾンをイネのゲノムに導入し、当該トランスポゾンがスターチシンターゼＩ型遺伝子の位置に挿入されたものを選抜することからなる、イネのスターチシンターゼＩ型遺伝子がノックアウトされたミュータントを製造する方法に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明のミュータントにより製造される野生型とは異なる物性を有する新規なデンプン、及びその製造方法に関する。
【００１２】
レトロトランスポゾンの１種であるＴｏｓ１７は、組織培養によって活性化され、再分化によって不活性化され、培養期間にほぼ比例して、移転コピー数が増加することから、トランスポゾンとしての活性を人為的に制御できるという大きな特徴を持っている。また、Ｔｏｓ１７は、染色体上にランダムに転移するが、誘発された変異は比較的安定であり、さらに組換えＤＮＡ実験の制約を受けないため、圃場での実験が可能であるという特徴を持っている。
Ｔｏｓ１７による遺伝子の破壊は、必ずしも目的の遺伝子の位置に挿入されるものではないが、Ｔｏｓ１７は染色体上にランダムに転移し、Ｔｏｓ１７が挿入された個体をうまく選抜することができれば目的の遺伝子のみが破壊されたミュータントを作出することができる。そして、このようにして作出されたミュータント中のＴｏｓ１７は、再分化により不活性化され比較的安定な変異体として使用することができる。
【００１３】
本発明者らは、（独）農業生物資源研究所によって開発されたＴｏｓ１７が挿入されたイネ集団ミュータントパネルから、ＳＳＩ遺伝子にＴｏｓ１７トランスポゾンが挿入された系統を、その挿入領域の塩基配列とイネＳＳＩ遺伝子の塩基配列（Tanaka et al., 1995. Plant Physiol, 108, 677-683)の相同性により選抜した。そして、このようにして得られたＳＳＩ遺伝子にＴｏｓ１７トランスポゾンが挿入された系統を、ＮＣ０２８７と命名した。
図５に示されるように、ＮＣ０２８７系統のカルスから再分化させた個体（Ｍ０世代）に稔った種子（Ｍ１種子）を得た。このＭ１種子１５粒を播種し、これについた登熟種子（Ｍ２種子）を得た。図５ではカルスからＭ１種子までの状況を模式的に示している。
【００１４】
ミュータントホモ個体を選抜するため，それらの各個体の登熟種子（Ｍ２種子）１粒のＳＳ活性を以下のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法（activity staining）で行った。結果を図６に図面に代わる写真で示す。図６の左側のレーンは野生型（日本晴）であり、その右側の１５個のレーンは１５系統からの種子のものである。野生型ではスターチシンターゼIII型（ＳＳIII）及びスターチシンターゼＩ型（ＳＳＩ）の２カ所にバンドが見られる。ミュータントの１５系統のうちの右側から３番目と２番目のミュータント＃２２及び＃２３ではスターチシンターゼIII型（ＳＳIII）のバンドは明瞭に出ているが、スターチシンターゼＩ型（ＳＳＩ）のバンドは薄く発色しているに過ぎないことがわかる。
トウモロコシ（Gao et al., 1998. Plant Cell, 10, 399-412）、及びジャガイモ（Marshall et al., 1996. Plant Cell, 8, 1121-1135）などの文献によれば、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにおいては移動度の遅いバンドがＳＳIIIで、速いバンドがＳＳＩであるとされていることから、図６における下側のバンドが速いＳＳＩによるものであり、図６の上側のバンドが遅いＳＳIIIによるものと考えられる。Ｍ２種子１５系統のうち、前記した＃２２と＃２３では明かに図６の下側のバンドは薄くしか発色しておらずＳＳＩの活性の低下がみられた。さらに、これらの＃２２及び＃２３の系統では、他の登熟種子４粒についても同様のＳＳＩの活性の低下が見られた。
これらのことから、ミュータントの＃２２及び＃２３は、ホモ型のＳＳＩミュータントであると判断された。このホモ型のミュータントを以下「ＴｏｓＳＳＩミュータント」という。
【００１５】
得られたＴｏｓＳＳＩミュータントにおけるトランスポゾンＴｏｓ１７の挿入位置を調べた。
イネのＳＳＩ遺伝子（OsSSIgene）は、図７に示されるように１５個のエキソンから構成されている（Tanaka, et al., 1995, Plant Physiol., 108, 677-683）。図７の四角枠で示される部分がエキソン領域を示している。図７の右側に塩基長を示すスケールを示しておく。Ｔｏｓ１７は数ｋｂの長さがあり、ＴｏｓＳＳＩミュータントでは、Ｔｏｓ１７の挿入領域の塩基配列から、Ｔｏｓ１７がＳＳＩ遺伝子の第２エキソン終了地点から５７３ｂｐ地点の第２イントロンに挿入されていることが明確になった。
【００１６】
次に、ＴｏｓＳＳＩミュータントのＳＳＩ活性がどの程度低下したかを知るためにＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法（activity staining）により、ＴｏｓＳＳＩミュータントにおけるＳＳＩの活性を定量した。Ｍ３種子（登熟）を用いて、電気泳動するサンプルの量を１／４μＬ〜８μＬに変化させた結果を図８に図面に変わる写真で示す。図８の左側は野生型（日本晴）であり、真ん中は＃２２のミュータントであり、右側は＃２３のミュータントをそれぞれ示す。各々左からサンプル量が８，４，２，１，１／２．１／４μＬの場合を示す。図８の上側のバンドはＳＳIIIの位置を示し、下側はＳＳＩの位置を示す。
野生型では２μＬでも威嚇にバンドが見られるが、ＴｏｓＳＳＩミュータントではわずかに８μＬの場合にのみバンドを観察することができた。特に＃２２では８μＬにおいてもバンドはわずかに発色しているだけであった。＃２２と＃２３を８μＬ用いた場合のバンドが、野生型の８μＬの場合のバンドの着色が薄いことから、＃２２と＃２３は野生型である日本晴の１／４以下にＳＳＩ活性が低下していることがわかった。
【００１７】
このようにトランスポゾンＴｏｓ１７を用いることにより、初めてＳＳＩ遺伝子が破壊された植物のミュータントを作出することに成功した。このトランスポゾンＴｏｓ１７は前述したようにイントロン中に挿入されたものであったが、ＳＳＩの活性が極度に低下したミュータントがえられることがわかった。これがエキソンに入れることにより更に活性の低下ないしは活性の無いミュータントを作出することも可能であろう。
次に、このようなＳＳＩの活性の低下により当該ミュータントがどのようなデンプンを製造するかということを調べた。これによりＳＳＩの機能の解析が可能となるからである。まず、製造されるデンプンのアミロペクチンの鎖長分布を解析するために、胚乳アミロペクチンを採取し、これをオセアとモレルの方法（O`Shea and Morell(1996. Electrophoresis, 17, 681-688）に準じて行った。この分析結果を図９及び図１０に示す。図９は鎖長分布を示し、横軸は鎖の長さを示し、縦軸は頻度（％）を示し、黒色は野生型の日本晴の分布をしめし、灰色はミュータント＃２２の分布を示す。図１０は野生型の日本晴と比較した場合の差分、即ち各鎖長におけるミュータント＃２２の頻度から野生型の日本晴の頻度を引いた差分を示している。マイナスは野生型のほうが頻度が高いことを示す。
【００１８】
この結果、ミュータント＃２２の鎖長分布は、野生型の日本晴に比べてグルコース重合度（ＤＰ）が５〜７と１６〜１９のα−１，４鎖が増加しており、８〜１５のものが減少していた（図１０参照）。また、ミュータント＃２３についても図９及び図１０に示した結果と同様の結果を示した。このことから、イネのＳＳＩは鎖長が８〜１５のものを選択的に伸長する働きがあると考えられた。
【００１９】
次にデンプンの糊化粘度特性を検討した。
胚乳デンプンの糊化粘度特性をラピッドビスコアナライザー（RVA, Newport Scientific Pty社製）で測定した結果を図１１に示す。測定における温度プログラムは、図１１に灰色で示すように、約５分後の５０℃から９５℃の上昇させて、約１２分後に約５０℃に下げた。図１１の横軸は時間（分）であり、左側は粘度（ｃＰ）を示し、右側は温度プログラムにおける温度（℃）を示す。
この結果、ミュータント＃２２及び＃２３のデンプンは、野生型の日本晴に比べて立ち上がり方が遅く、かつその勾配も小さく、そして最大粘度もやや小さかった。
【００２０】
さらに、デンプンの熱糊化特性を検討した。
胚乳デンプンの熱糊化特性を示差走査熱量測定（ＤＳＣ，セイコーインスツルメンツ社製）を用いて測定した。昇温速度は２℃／分で５℃〜１００℃までで糊化開始温度、糊化ピーク温度、糊化終了温度、及び糊化熱量を測定した。この結果を次ぎの表１に示す。
【００２１】
【表１】
0004703919.tif 000002
【００２２】
ミュータント＃２２及び＃２３のデンプンは、糊化開始温度、糊化ピーク温度、糊化終了温度はともに野生型の日本晴よりも約１〜２℃高く、糊化熱量は１ｍＪ／ｍｇ程度高かった。
【００２３】
以上の結果から，ＴｏｓＳＳＩミュータントはＳＳＩの低下が原因でグルコース重合度（ＤＰ）８〜１６の頻度が減少し，それに伴って糊化ピーク粘度がやや低下し，糊化温度，糊化熱量がやや上昇するなど、野生型とは熱特性などの物性の異なる新たなデンプンを製造することがわかった。
ジャガイモのＳＳII、ＳＳIIIのアンチセンス形質転換体の解析実験（Edwards et al., 1999. Plant J, 17, 251-261）や、エンドウのＳＳIIミュータントであるｒｕｇ−５の解析実験（Craig et al., 1998. Plant Cell, 10, 413-426），トウモロコシのＳＳIIIミュータントであるｄｕｌｌ−１の解析実験（Inouchi et al., 1987. Starch, 39, 259-266）などのデンプン合成酵素（ＳＳ）と比較して、本発明のＴｏｓＳＳＩミュータントのアミロペクチンの鎖長分布の変化は他のデンプン合成酵素（ＳＳ）のアイソザイムとは異なるＳＳＩ特異的なものであり、それに伴いデンプンの物性もＳＳＩミュータント独自のものであった。また、このことはＳＳＩの活性を制御することにより鎖長分布の異なる新しいデンプンを製造し得る素材としてとしての植物を提供できることを示している。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以上のように本発明は、ミュータントパネルを用いることにより、植物のＳＳＩ遺伝子を選択的に破壊することができ、ＳＳＩ遺伝子がノックアウトされたミュータントを提供することができることをすべての植物種において初めて見出したものである。
本発明の用いるミュータントパネルとしては、トランスポゾンにより遺伝子が破壊されたものミュータントの群であり、このような群を製造するためのトランスポゾンとしてはいずれのものであってもよいが、制御のしやすや安全性の点からレトロトランスポゾンが好ましい。
植物には多数のレトロトランスポゾンが存在し、特にイネでは約４０種以上が存在していることが知られている。これらのレトロトランスポゾンのうちのいくつかのものは、培養などにより活性を復活させることができるものがある。本発明の好ましいレトロトランスポゾンとしてはイネから得られるＴｏｓ１７トランスポゾンが挙げられる。
【００２５】
ＳＳＩ遺伝子を破壊するためのトランスポゾンの挿入位置としては、ＳＳＩの活性を低下させることができれば、イントロン領域であってもよいしエキソン領域であってもよい。ＳＳＩの活性は、野生型の活性を１００としたときに、その活性が５０％以下、好ましくは３０％以下、更に好ましくは２５％以下になるようになればよい。エキソン領域を完全に破壊してＳＳＩの活性を全く無くしたものであってもよい。
本発明の植物としては、前記した例示ではイネの場合を示したが、イネに制限されるものではなく、コムギ、オオムギやトウモロコシなどのデンプンを製造する植物に広く適用することができる。イネには多数のレトロトランスポゾンが存在することが知られており、またイネはデンプン源として貴重な植物であることから、本発明の植物としては、イネが好ましい。
【００２６】
本発明のＳＳＩ遺伝子がノックアウトされたミュータントの選抜方法としては、使用するトランスポゾンの塩基配列と目的の遺伝子の塩基配列に基づいて、目的の遺伝子の領域にトランスポゾンが挿入されたものを選抜することによって行うことができるが。この方法に限定されるものではない。得られたミュータントのカルスを再分化させることによりミュータントの個体をえることができる。通常のレトロトランスポゾンは再分化によりトランスポゾンとしての活性を失うためにこの方法は安全性も高く好ましい。
【００２７】
また、本発明はＳＳＩの活性が野生型に比べて低下した新しい植物体を提供するものであり、これによりスターチシンターゼＩ型の酵素活性が選択的に低下したことに起因する野生型が産生するデンプンとはアミロペクチンの鎖長分布が異なり、かつ熱的な物性などの物性の異なる新規なデンプン、及びその製造方法を提供するものである。本発明のデンプンとしては、植物体のいずれのところから得られるものであってもよいが、好ましくは胚乳デンプンが挙げられる。
本発明のデンプンは、野生型の植物により製造されるデンプンと比べて、アミロペクチンの鎖長分布の異なるものであり、好ましくはグルコース重合度（ＤＰ）８〜１６の頻度が野生型に比べて減少したものが挙げられる。
また、本発明のデンプンは、野生型の植物により製造されるデンプンと比べて、糊化粘度特性が異なるものであり、好ましくは温度上昇時の糊化の立ち上がりが遅く、その勾配が緩やかものである。そして、野生型の植物により製造されるデンプンと比べて、熱糊化特性が異なるものであり、好ましくは糊化開始温度などにおいてその温度が約０．５〜１℃以上高くものであり、糊化熱量も約０．５〜１ｍＪ／ｍｇ以上多くなるものである。
【００２８】
このように本発明は、野生型の植物が産生しない新規なデンプンを提供するものであり、本発明のデンプンは糊化粘度特性や熱糊化特性などの野生型が産生するデンプンとは異なる物性を有するものであり、食品工業や紙工業などの各種の産業分野に広く応用可能な有用なデンプンを提供するものである。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００３０】
実施例１  （ミュータントパネルからＳＳＩ遺伝子にＴｏｓ１７トランスポゾンが挿入された系統の選抜）
ミュータントパネルは、（独）農業生物資源研究所によって開発されたイネ集団であり、このミュータントパネルを用いて、Ｔｏｓ１７が挿入された領域のシーケンスを決定したミュータントパネルの系統の中から、その挿入領域の塩基配列がイネＳＳＩ遺伝子に相同性のある系統を選抜し、この選抜した系統をＮＣ０２８７と命名した。
【００３１】
実施例２  （ミュータントホモ個体の選抜法）
前記した実施例１で得られたＮＣ０２８７系統の再分化世代（Ｍ０）に稔った種子（Ｍ１種子）１５粒を播種した。ミュータントホモ個体を選抜するため，それらの各個体の登熟種子（Ｍ２種子）１粒のＳＳ活性を以下のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法（activity staining）で行った。
開花後１０日くらいの登熟種子１粒のもみ，胚，果皮を除去し、４倍体積の抽出バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０％グリセロール，１０ｍＭＥＤＴＡ−Ｎａ，５ｍＭジチオスレイトール，０．４ｍＭＰＭＳＦ／ＥｔＯＨ）でエッペンドルフチューブ内でプラスチック製ホモジナイザー（グライナー社製）を用いてホモジナイズし、１５，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃で遠心分離して得た上清にＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（０．３Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０），０．１％ブロモフェノールブルー，５０％グリセロール）を１／２体積加えて電気泳動に用いた。電気泳動には７．５％アクリルアミドゲルを用いた。フロントが濃縮ゲルを通過するまで７．５ｍＡ、通過してから１５ｍＡの定常電流で４℃下で電気泳動し、フロントが出てから３０分で電流を止めた。その後、ＡＤＰグルコースを除いた反応液（クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５、０．５Ｍｃｉｔｒａｔｅ−Ｎａ、１００ｍＭバイシン（Bicine）−ＮａＯＨ、ｐＨ７．５、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、２ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ  ＡＤＰグルコース）で２回洗浄し（各１５分）、ＡＤＰＧを加えて２０時間３０℃でシーソーで反応させた。反応後、ヨードヨードカリ液（１％ＫＩ／０．１％Ｉ２）で染色した。
この結果を図６に示す。
【００３２】
実施例３  （ＳＳＩ活性の定量）
ＴｏｓＳＳＩミュータントのＳＳＩ活性がどの程度低下したかを知るため、前記実施例２に記載したＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法（activity staining）で行った。電気泳動するサンプルの量を１／４〜８μｌと変化させて行った。ＳＳＩバンドの発色度合いから＃２２および＃２３ともに野生型である日本晴の１／４以下に低下していることが分かった。
結果を図８に示す。
【００３３】
実施例４  （胚乳アミロペクチンの鎖長分布解析法）
胚乳デンプンのアミロペクチンの鎖長分布は、オセアとモレルの方法（O'Shea and Morell(1996. Electrophoresis, 17, 681-688）を参考に以下のように行った。
日本晴、ＴｏｓＳＳＩミュータントである＃２２および＃２３のＭ３種子１粒から外内穎および胚を取り除き、ペンチで胚乳を粉砕した後、エッペンドルフチューブ内でプラスチック製ホモジナイザー（グライナー社製）を用いてさらに磨砕し、５ｍｌのメタノールを加え、１０分間煮沸した。２，５００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を除去し、９０％メタノールを５ｍｌ加え二度洗浄した。沈殿に１５  μｌの５Ｎ水酸化ナトリウムを加え、５分間煮沸してデンプンを糊化させた。糊化液を氷酢酸９．６μｌで中和した後、蒸留水１０８９μｌ、０．６Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）１００μｌ、２％アジ化ナトリウム１５μｌ、Ｐ．ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ  イソアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６８，林原生物化学研究所）３μｌ（約２１０ｕｎｉｔ）を加え、スターラーバーで撹拌しながら３７℃、８時間以上反応した。さらにイソアミラーゼ３μｌを追加して８時間以上反応した後、常温で１０，０００ｘｇで遠心分離し、上清を脱イオンカラム（ＡＧ５０１−Ｘ８（Ｄ），Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で濾過した。
α−グルカン鎖の非還元末端を蛍光標識するため、ヒズクリら（Hizukuri, et al., 1981. Carbohydrate Reserch, 94, 205-213）の方法により試料中の糖含量を定量し５ｎｍｏｌ相当の還元末端をもつα−グルカン鎖を遠心濃縮機で乾燥させ、２μｌの１−アミノピレン−３，６，８−三硫酸塩（ＡＰＴＳ）溶液（７％  ＡＰＴＳ，１５％酢酸）、２μｌのシアン化ホウ素ナトリウム溶液（１Ｍシアン化ホウ素ナトリウム，１００％テトラヒドロフラン）を添加し、５５℃で９０分間反応させた。分析時には１２．５倍に蒸留水で希釈して用いた。鎖長分布解析は、キャピラリー電気泳動装置（Ｐ／ＡＣＥ５０００，Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて行った。
結果を図９及び図１０に示す。
【００３４】
実施例５  （胚乳デンプンの糊化粘度特性）
胚乳デンプンの糊化粘度特性は、以下の方法で行った。日本晴、ミュータントの＃２２および＃２３のＭ３種子のもみを除去し、小型精米器（ケット社製）で３０秒精米した後、コーヒーミルで種子を粉砕した。１００μｍのメッシュに通したデンプン３．５ｇに２５ｍｌの蒸留水を加えたものの糊化粘度をラピッドビスコアナライザー（RVA,Newport Scientific Pty社製）で測定した。温度プログラムは図１１に示す通りである。この結果を図１１に示す。
ミュータント＃２２，＃２３は日本晴に比べて立ち上がりの勾配が小さく，最大粘度もやや小さかった。
【００３５】
実施例６  （胚乳デンプンの熱糊化特性）
胚乳デンプンの熱糊化特性は、日本晴、ミュータントの＃２２および＃２３のＭ３種子のもみ、胚を除去し、乳鉢で粉砕したもの約５ｍｇに蒸留水４５μｌを加えたものを銀容器に入れて示差走査熱量測定（ＤＳＣ，セイコーインスツルメンツ社製）に用いた。昇温速度は２℃／ｍｉｎで５℃〜１００℃を測定した。
この結果を表１に示す。ミュータント＃２２及び＃２３の糊化開始温度，糊化ピーク温度、糊化終了温度はともに日本晴より１〜２℃高く、糊化熱量は１ｍＪ／ｍｇ程度高かった。
【００３６】
【発明の効果】
本発明は、デンプンの合成に必要なＳＳＩ遺伝子が破壊された植物を提供するものであり、さらにＳＳＩがデンプンのアミロペクチンの鎖長の分布を影響を与えるものであることを明らかにすると共に、野生型の植物が本来産生するデンプンとは異なる新規な構造及び物性を有するデンプンを産生することができることことを明らかにした。
本発明の方法により、植物による新規な構造及び物性を有するデンプン、及びその製造方法が提供されると共に、これを産生することができる植物、及び当該植物の製造方法が提供された。また、本発明は、デンプンの種類の豊富化のみならず目的や用途に応じた物性を有するデンプンの製造方法についての基本的な手法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、生物における貯蔵性ポリグルカンの構造を示す概念図である。
【図２】図２は、アミロペクチンのクラスター構造を示すものである。
【図３】図３は、イネ胚乳におけるジャポニカとインディカとのアミロペクチンのクラスター構造の相違を示すものである。
【図４】図４は、生物における貯蔵性ポリグルカンである、アミロース、アミロペクチン、及びグリコーゲンの生合成経路の概要を示すものである。
【図５】図５は、本発明のミュータントのカルスからＭ１種子までの状況を模式的に示したものである。
【図６】図６は、本発明のミュータントの登熟種子（Ｍ２種子）を用いたＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法の結果を示す図面に代わる写真である。図６の左側のレーンは野生型（日本晴）であり、その右側の１５個のレーンは１５系統からの種子のものである。図６の上側はスターチシンターゼIII型（ＳＳIII）の位置を示し、下側はスターチシンターゼＩ型（ＳＳＩ）の位置を示す。
【図７】図７は、イネのＳＳＩ遺伝子（OsSSIgene）に挿入されたトランスポゾンＴｏｓ１７の位置を示すものである。図７の四角枠で示される部分がエキソン領域を示している。図７の右側に塩基長を示すスケールを示しておく。
【図８】図８は、本発明のＴｏｓＳＳＩミュータントにおけるＳＳＩの活性を定量した結果を示す図面に変わる写真である。図８の左側は野生型（日本晴）であり、真ん中は＃２２のミュータントであり、右側は＃２３のミュータントをそれぞれ示す。各々左からサンプル量が８，４，２，１，１／２．１／４μＬの場合を示す。図８の上側のバンドはＳＳIIIの位置を示し、下側はＳＳＩの位置を示す。
【図９】図９は、本発明のミュータント＃２２と野生型の日本晴のデンプンのアミロペクチンの鎖長分布を解析した結果の鎖長分布を示す。図９の横軸は鎖の長さを示し、縦軸は頻度（％）を示し、黒色は野生型の日本晴の分布を示し、灰色はミュータント＃２２の分布を示す。
【図１０】図１０は、本発明のミュータント＃２２と野生型の日本晴のデンプンのアミロペクチンの鎖長分布を解析し、両者の分布の差分を算出した結果を示す。横軸は鎖の長さを示し、縦軸は頻度（％）を示し、各鎖長におけるミュータント＃２２の頻度から野生型の日本晴の頻度を引いた差分を示している。
【図１１】図１１は、本発明のミュータント＃２２及び＃２３並びに野生型の日本晴の胚乳デンプンの糊化粘度特性をラピッドビスコアナライザーで測定した結果を示す図面に変わる写真である。測定における温度プログラムは、図１１に灰色で示すように、約５分後の５０℃から９５℃の上昇させて、約１２分後に約５０℃に下げた。図１１の横軸は時間（分）であり、左側は粘度（ｃＰ）を示し、右側は温度プログラムにおける温度（℃）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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