(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の鎖中に配列された複数の第１のペプチドモノマー単位および第２の鎖中に配列された複数の第２のペプチドモノマー単位を含むタンパク質構造体であって、前記第１及び第２のモノマー単位は複数の７残基反復モチーフ（ａｂｃｄｅｆｇ）を含み、
対応する第１及び第２のモノマー単位中の相補的な７残基反復モチーフ中の相補的な位置「ａ」に一対のアスパラギン残基が存在し、
それぞれの第１のペプチドモノマー単位上の位置「ｅ」および「ｇ」が荷電アミノ酸残基であり、
それぞれの対応する第２のペプチドモノマー単位上の位置「ｅ」および「ｇ」が逆荷電アミノ酸残基であり、
前記第２の鎖の対応する第２のペプチドモノマー単位を越えて延びるおのおのの第１のペプチドモノマー単位の末端部分に、少なくとも１つの荷電アミノ酸残基が存在することにより、
前記第１及び第２の鎖が互い違いの平行へテロ二量体超らせん構造を確実に形成することを特徴とし、
前記第１及び第２のモノマー単位中の、残りの位置「ａ」および全ての位置「ｄ」が疎水性残基であることを特徴とする、
タンパク質構造体。
【請求項２】
少なくとも１つの鎖はそれぞれ第１のまたは第２のペプチドモノマー単位だけからなる、請求項１に記載のタンパク質構造体。
【請求項３】
前記第１及び第２のモノマー単位の、残りの位置「ａ」はイソロイシンまたはバリンから選択される、請求項１又は２に記載のタンパク質構造体。
【請求項４】
前記第１及び第２のモノマー単位の、１又は複数の位置「ｄ」にロイシンを有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質構造体。
【請求項５】
前記逆荷電残基はグルタミン酸およびリジン残基、あるいはこれらのアミノ酸残基の合成誘導体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質構造体。
【請求項６】
管状構造を形成するよう配列される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質構造体。
【請求項７】
前記反復モチーフは配列中の２又はそれ以上のアミノ酸位置によりオフセットされ、それにより前記ペプチドモノマー単位が円筒体を形成する、請求項６に記載のタンパク質構造体。
【請求項８】
前記第１のおよび第２のペプチドモノマー単位は以下の配列
ａ）ＫＩＡＡＬＫＱＫＩＡＳＬＫＱＥＩＤＡＬＥＹＥＮＤＡＬＥＱ（ＳＡＦ−ｐ１Ｃ）および
ｂ）ＫＩＲＡＬＫＡＫＮＡＨＬＫＱＥＩＡＡＬＥＱＥＩＡＡＬＥＱ（ＳＡＦ−ｐ２Ｄ）をそれぞれ有するか、または
ｃ）ＫＩＡＡＬＫＱＫＩＡＡＬＫＱＥＩＤＡＬＥＹＥＮＤＡＬＥＱ（ＳＡＦ−ｐ１Ａ）および
ｄ）ＫＩＲＡＬＫＷＫＮＡＨＬＫＱＥＩＡＡＬＥＱＥＩＡＡＬＥＱ（ＳＡＦ−ｐ２Ｃ）をそれぞれ有するか、または
ｅ）ＫＩＡＡＬＫＱＫＩＡＳＬＫＱＥＩＤＡＬＥＹＥＮＤＡＬＥＱ（ＳＡＦ−ｐ１Ｃ）および
ｆ）ＫＩＲＡＬＫＷＫＮＡＨＬＫＱＥＩＡＡＬＥＱＥＩＡＡＬＥＱ（ＳＡＦ−ｐ２Ｃ）をそれぞれ有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質構造体。
【請求項９】
以下の配列
ａ）ＫＩＡＡＬＫＱＫＩＡＳＬＫＱＥＩＤＡＬＥＹＥＮＤＡＬＥＱ（ＳＡＦ−ｐ１Ｃ）、
ｂ）ＫＩＲＡＬＫＡＫＮＡＨＬＫＱＥＩＡＡＬＥＱＥＩＡＡＬＥＱ（ＳＡＦ−ｐ２Ｄ）、
ｃ）ＫＩＡＡＬＫＱＫＩＡＡＬＫＱＥＩＤＡＬＥＹＥＮＤＡＬＥＱ（ＳＡＦ−ｐ１Ａ）、
および
ｄ）ＫＩＲＡＬＫＷＫＮＡＨＬＫＱＥＩＡＡＬＥＱＥＩＡＡＬＥＱ（ＳＡＦ−ｐ２Ｃ）、
から選択されるアミノ配列を有する、タンパク質構造体の調製に用いるためのペプチドモノマー単位。
【請求項１０】
少なくとも１つのアミノ酸残基が誘導体化される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質構造体又は請求項９に記載のペプチドモノマー単位。
【請求項１１】
２又はそれ以上の、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質構造体を含み、それらは同時に結合してＴ字型複合構造を形成することを特徴とする、分枝自己集合繊維。
【請求項１２】
前記タンパク質構造体の少なくとも１つは、１又は複数の中央システイン残基を含み、かつ少なくとも１つの残りのタンパク質構造体は末端システイン残基を含む、請求項１１に記載の分枝自己集合繊維。
【請求項１３】
タンパク質構造体の製造方法であって、会合して請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質構造体を形成する第１及び第２のモノマー単位の混合物を提供することを含み、第１及び第２のモノマー単位は７残基反復モチーフ（ａｂｃｄｅｆｇ）を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１４】
前記タンパク質構造体は誘導体化される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質構造体は架橋により安定化される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質構造体の会合により生成されるタンパク質繊維。
【請求項１７】
タンパク質構造体の製造のためのキットであって、会合して請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質構造体または請求項１６に記載のタンパク質繊維を形成する第１のおよび第２のペプチドモノマー単位を含み、第１のおよび第２のモノマー単位は７残基反復モチーフ（ａｂｃｄｅｆｇ）を含むことを特徴とする、キット。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質構造体または請求項１６に記載のタンパク質繊維を含む二次元グリッド。
【請求項１９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質構造体または請求項１６に記載のタンパク質繊維を含む三次元マトリックス。
【請求項２０】
溶液中で集合するよう配列される請求項１９に記載のマトリックス。
【請求項２１】
前記タンパク質構造体に１又は複数の結合剤が融合され、１又は複数の結合剤は１又は複数の標的存在物に対する強い親和力が生じるように配列される、請求項１９または２０に記載のマトリックス。
【請求項２２】
１又は複数の標的存在物を結合するよう配列される、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のマトリックス。
【請求項２３】
ウイルスを結合するよう配列される、請求項２２に記載のマトリックス。
【請求項２４】
第１のおよび第２の、それぞれ異なるモノマー単位の混合物が提供され、第１のおよび第２のモノマー単位は７残基反復モチーフ（ａｂｃｄｅｆｇ）を含み、それらは会合して請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質構造体を複数形成し、それらのタンパク質構造体は会合して三次元マトリックスを形成する、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のマトリックスの形成方法。
【請求項２５】
前記マトリックスはインシトゥで形成される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
合成ポリマーの製造を制御する方法であって、該ポリマーと共に、請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質構造体を集合させることを含む方法。
【請求項２７】
前記タンパク質構造体は前記ポリマーの合成後に除去される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質構造体を含む、原子間力顕微鏡に用いるためのチップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、タンパク質構造、それらのタンパク質構造の製造方法、ならびにそれらのタンパク質構造を用いて生成されるタンパク質繊維およびその他の物質および集合体に関する。
【０００２】
分子自己集合の過程は全ての生物学的系にとって中枢的であり、バイオテクノロジー（L.Q.Gu, et al(1999)Nature 398, 686）およびナノテクノロジー（K.E.Drexler,(1999)TIBTECH 17, 5）における重要性および用途が漸増していると考えられる。天然生体分子集合体の特性化は、モデル自己集合系の開発を動機付け、導き、次いでこれらは生物学についてのわれわれの理解を前進させる。タンパク質に関しては少なくとも、超らせん(coiled coil)は恐らく間違いなく最も簡単な自己集合系である。超らせんは、広範な種々のタンパク質−タンパク質相互作用を導き、かつ堅く結びつけるタンパク質フォールディングモチーフ（motif）である（A.Lupas,(1996)Trends Biochem. Sci. 21, 375）。構造的にいえば、超らせんは相対的に真っ直ぐに向かう．それらは、平行、逆平行または混合トポロジーで配列され得る２〜５鎖によるαへリックスバンドルである。ペプチドから超らせんの形成を導く基本配列特徴は、合理的に十分に理解されている（P.B.Harbury et al(1993)Science 262, 1401; D.N.Woolfson and T.Alber(1995)Protein Sci. 4,1596）。例えば、ほとんどの超らせん配列は、「７残基反復」として既知の、疎水性（Ｈ）および極性（Ｐ）残基の７残基反復（ＨＰＰＨＰＰＰ）nにより支配される。αへリックスを形づくる場合、このパターンは両親媒性構造を示し、その疎水性面はオリゴマー集合を導く。さらに、超らせんバンドル内の鎖の数および方向はともに、疎水性コアを形成するか、または疎水性コアと側面を接する残基、すなわち７残基反復の第１、第４、第５および第７位置の残基により主に確定される。例えば、二量体（すなわち２本鎖集合体）を形成する超らせんは、; 通常は、第１位置にイソロイシンまたはバリン残基、そして第４位置にロイシン残基を有する。対照してみると、三量体（すなわち３本鎖集合体）を形成する超らせんは、両「Ｈ」位置に同一残基（すなわち、ともにイソロイシンまたはともにロイシン）をしばしば有する。最後に、ヘテロオリゴマー（すなわち、異なるアミノ酸配列を有する鎖から作られる超らせん）は、疎水性コアと側面を接する相補的荷電相互作用により導かれ得る。この理由のために、超らせんに基づいた多数の新規タンパク質デザインが首尾よくなされてきた。これらは、超らせんモチーフの天然レパートリーを伸長するいくつかの意欲的な構造を含む（S.Nautiyal et al(1995) Biochemistry 34, 11645; A.Lombardi et al(1996) Biopolymers 40, 495; D.H.Lee et al(1996) Nature 382, 525; P.B.Harbury et al(1998) Science 282, 1462; J.P.Schneider et al(1998) Folding Des. 3, R29）。
【０００３】
単一連続７残基反復を有する一般に認められた構造のほかに、本発明者等は、超らせんにおけるオリゴマー状態を詳しく説明するのに役立つ多重オフセット(offset)７残基反復を有する配列を同定した。例えば、２つの７残基反復を有する配列は、２つの残基によりオフセットする。すなわち、ａ／ｆ−ｂ／ｇ’−ｃ／ａ’−ｄ／ｂ’−ｅ／ｃ’−ｆ／ｄ’−ｇ／ｅ’は、形成されるらせんの反対側に２つの疎水性シームを生じさせる。このようならせんは、２つの異なる方法でこれらの疎水性表面を隠すために併合して、２つの別個の構造、すなわち開放性「αシート」および閉鎖性「α円筒体」を形成し得る。
【０００４】
超らせん構造のその他の関連の態様は、ＷＯ９９／１１７７４に記載されている（この開示は、参照により本明細書中に援用される）。
【０００５】
超らせんのこの理解、ならびに結果的に生じるタンパク質デザインは、種々の転写因子に見出されるロイシンジッパーモチーフにより例示されるような短構造を中心としている（E.K.O'Shea et al(1989) Science 243, 538; E.K.O'Shea et al(1991) Science 254, 539）。これに対比して、ほとんどの天然超らせんは数百のアミノ酸にわたって延びて（A.Lupas(1996) 同上; J.Sodek et al(1972) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 69, 3800）、そして多くが集合して、より厚い多重鎖フィラメントをさらに形成する（H.Herrmann and U.Aebi(1998) Curr. Opin. Struct. Biol. 8, 177）。
【０００６】
超らせんについてのわれわれの理解を改善するために、そしてタンパク質デザイン研究を発展させるために伸長構造を作製するという目的を持って、われわれは最初に２つの２８残基ペプチド−平坦化（dubbed)自己集合繊維ペプチドＳＡＦ−ｐ１およびＳＡＦ−ｐ２をデザインし、混合してフォールディングし、伸長繊維を生成した。構造の隠された疎水性コアの位置に集中する場合、平行二量体形成を導き、代替的オリゴマーおよびトポロジーから護るために規則が組入れられた（P.B.Harbury et al(1993)同上; D.N.Woolfson and T.Alber(1995) 同上; L.J.Gonzalez et al(1996) Nature Struct. Biol. 3, 1011）。当該デザインの構成単位は、突出末端または「付着」末端を有する互い違い(staggered)へテロ二量体であった。これは、今日までに特性化されている天然およびデザイナー超らせん集合体と対比し、区別するが、この場合、ポリペプチド鎖はレジスター(register)中では一列をなし、すなわちそれらは平滑末端（blunt ends)または「平滑」末端("flush" ends)を有する。相補的コア相互作用および側面に位置するイオン対が突出部に組入れられて、ヘテロ二量体の縦方向の会合を促す（図１および２）。「付着末端」使用のこの原理は、ＤＮＡを集合するための分子生物学において十分に開発され（S.J.Palmer et al(1998) Nucleic Acids Res. 26, 2560）、複雑なＤＮＡ結晶をデザインするために用いられてきた（E.Winfree et al(1998) Nature 394, 539）。しかしながら、われわれの知る限りでは、付着末端特異的分子集合のペプチドへのわれわれの適用は、新規である。しかし、らせんの頭部−尾部パッキングは、２つのデザイナーペプチドに関して、近年解明された結晶構造で観察されている（N.L.Ogihara et al(1997) Protein Sci. 6, 80; G.G.Prive et al(1999) Protein Sci. 8, 1400）。これらは、固体状態で擬似連続らせんを生成するために、接触した状態で、それらのらせん末端で結晶化したらせんペプチドであった。言い換えれば、それらは「平滑末端」配列を形成した。
【０００７】
本発明の一態様によれば、第１の鎖中に配列された複数の第１のペプチドモノマー単位および第２の鎖中に配列された複数の第２のペプチドモノマー単位を含み、この両鎖が好ましくは超らせん構造を形成するタンパク質構造であって、第１の鎖中の第１のペプチドモノマー単位が第２の鎖中の対応する第２のペプチドモノマー単位を超えて両鎖の方向に伸びるタンパク質構造が提供される。本発明のタンパク質構造は、多数の利点を有する。例えば、相対的に長いタンパク質繊維は、細かな物質で形成され得る。すなわち、ペプチドモノマーの１００μＭ溶液１μｌは、５０ｎｍ厚の繊維１０ｍを生成するのに十分な物質を提供し得る。
【０００８】
第１のペプチドモノマー単位の少なくとも１つの荷電アミノ酸残基は、第２のペプチドモノマー単位の逆荷電アミノ酸残基を引き付けるよう配列され得る。好ましくは、荷電アミノ酸残基は、第２の鎖中の対応する第２のペプチドモノマー単位を超えて延びる第１のペプチドモノマー単位の末端部分に存在する。少なくとも１つの鎖は、それぞれ第１のまたは第２のペプチドモノマー単位だけから成る、すなわち同種鎖であり得る。異種鎖も意図される。ペプチドモノマー単位は、反復構造単位を含み得る。好ましくは、反復構造単位は、以下のパターン：
hpphppp
abcdefg
を有する７残基反復モチーフを含む。
【０００９】
好ましくは、反復構造単位は、位置ａにイソロイシンまたはアスパラギンを、そして位置ｄにロイシンを含み得る。その他の反復（例えば１１残基−ａｂｃｄｅｆｇｈｉｊｋ）およびアミノ酸組成も用いられ得る（ＷＯ９９／１１７７４参照）。
【００１０】
好ましくは、７残基反復は、それぞれ位置ｅおよびｇに逆荷電残基を含む。逆荷電残基は、例えばグルタミン酸およびリジン残基またはアスパラギンおよびアスパラギン酸であり得る。合成アミノ酸、例えばオルニチンの使用も想定される。
【００１１】
本発明のタンパク質構造は、対応する第１のおよび第２のペプチドモノマー単位により提供される「ａ」位置のアスパラギン残基の対によっても明示され得る。
【００１２】
好ましいタンパク質構造では、第１のおよび第２のペプチドモノマー単位は、以下の配列：
ａ）KIAALKQKIASLKQEIDALEYENDALEQ（ＳＡＦ−ｐ１Ｃ）および
ｂ）KIRALKAKNAHLKQEIAALEQEIAALEQ（ＳＡＦ−ｐ２Ｄ）をそれぞれ有し、または
ｃ）KIAALKQKIAALKQEIDALEYENDALEQ（ＳＡＦ−ｐ１Ａ）および
ｄ）KIRALKWKNAHLKQEIAALEQEIAALEQ（ＳＡＦ−ｐ２Ｃ）をそれぞれ有し、または
ｅ）KIAALKQKIASLKQEIDALEYENDALEQ（ＳＡＦ−ｐ１Ｃ）および
ｆ）KIRALKWKNAHLKQEIAALEQEIAALEQ（ＳＡＦ−ｐ２Ｃ）をそれぞれ
有する。
【００１３】
これらは４つの７残基構造の例だけであり、本発明に用いるためにはその他の長さが可能であり、想定される。
【００１４】
本発明の別の態様によれば、タンパク質構造の製造方法であって、会合して本発明のタンパク質構造を形成する第１のおよび第２のペプチドモノマー単位の混合物を提供することを含む方法が提供される。当該構造は、誘導体化されおよび／または架橋により安定化され得る。
【００１５】
集合前および集合後のペプチドモノマー単位の、本発明のタンパク質構造への誘導体化が実施され得る。例えば、ＷＯ９９／１１７７４に記載されているように、蛍光部分（フルオロフォア）が超らせんに結合されてもよい。蛍光部分の付加は、タンパク質構造の可視化を補助してもよい。７残基反復における「ｆ」位置の官能基による置換は、その位置がらせんの外側にあるので、特に好ましい（図１Ｃおよび１Ｅ参照）。その他の誘導体は、例えば他の存在物を結合し得る単位が生成され得るよう、ペプチドモノマー単位への結合剤の取付けを含み得る。
【００１６】
第１のおよび第２のペプチドモノマーならびに当該鎖は、上記の特徴を有し得る。
【００１７】
本発明は、本発明のタンパク質構造の会合により生成されるタンパク質繊維も提供する。
【００１８】
タンパク質構造は、管状構造を形成するようにも配列され得る。特に当該構造は、ナノチューブを形成するよう配列され得る。
【００１９】
本発明の別の態様によれば、タンパク質構造の製造のためのキットであって、会合して本発明のタンパク質構造またはタンパク質繊維を形成する第１のおよび第２のペプチドモノマー単位を含むキットが提供される。
【００２０】
本発明のタンパク質構造は、二次元および三次元アレイに集合され得る。例えばフィルターとして機能し得る二次元マットが、形成され得る。例えばふるいまたはフィルターとして用いるための、あるいは三次元のその他の会合および共役分子を組織化するための三次元グリッドまたはマトリックスも形成され得る。
【００２１】
好ましい実施形態では、マトリックスはインシトゥ（in situ）で集合される。例えばマトリックスは、溶液中に夾雑物を閉じ込めるために溶液中に形成され、次にマトリックスは夾雑物と一緒に、例えば遠心分離により溶液から除去され得る。
【００２２】
高温でのタンパク質構造の安定性は、対応する第１のおよび第２のモノマー単位残基間の重複が増大されるように、ペプチドモノマーをより長くすることにより改善され得る。モノマー長の増大は、超らせん構造を安定化することが以前から示されている。あるいは、安定性は、同一鎖中の隣接ペプチドモノマー単位間に結合を導入することにより改善され得る。例えば、Kent（Dawson et al(1994) Science 266:776）と共同研究者等は、カップリング、およびその後の、１つのポリペプチド単位のＮ末端のシステイン残基を別の単位のチオエステル誘導体化Ｃ末端へ転位することにより隣接ポリペプチド単位間にペプチド結合を生成した。
【００２３】
さらに、タンパク質構造は、合成ポリマーの重合のための鋳型にそれらを用いることにより、安定化され、誘導化され得る。
【００２４】
定義
本明細書中で用いられる用語は、当業者により普通に用いられている意味である。以下に説明を示す。
【００２５】
アミノ酸
この用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびにある種の特性（例えば電荷）を変えるためになんらかの方法により修飾された天然アミノ酸のいずれもを含む。全ての場合に、天然アミノ酸に対する内容は、それに代わって置換され得る合成アミノ酸を含むと考えられ得る。
【００２６】
超らせん
超らせんは、通常は、３および４残基間隔の疎水性残基の連続パターンを有するペプチド／タンパク質配列であって、これは集合（フォールド）してらせんの多量体バンドルを形成する。多重オフセット反復を有する配列を含めた超らせんも意図される。
【００２７】
二量体
二量体は、二本鎖構造物である。
【００２８】
ヘテロ二量体
ヘテロ二量体は、２つの異なる鎖により形成される二量体構造物である。
【００２９】
互い違いへテロ二量体
互い違いへテロ二量体は、２つの鎖が集合して、ヘテロ二量体内で相互作用していない重複末端を残す。
【００３０】
平滑末端集合
平滑末端集合は、２つの鎖が併合して、平らにされた、すなわち非重複の末端を生じる会合である。
【００３１】
プロトフィブリル
プロトフィブリルは、それらの突出末端を介して相互作用する互い違いへテロ二量体から縦方向に集合されるタンパク質構造である。
【００３２】
繊維
繊維は、２つまたはそれ以上のプロトフィブリルの側面会合により形成される構造である。
【００３３】
本発明によるタンパク質構造およびタンパク質構造の製造方法を、添付の図面１〜８を参照しながら、もっぱら実施例を通じてここに説明する。
【００３４】
１）ペプチドデザインおよび合成
上記のように種々のペプチドモノマー単位をデザインした。モノマーおよびキャッピングペプチド（平滑末端を生成し、そして縦方向繊維集合を阻止するためにモノマーの付着末端を補足するようデザインされる）を表１に記載する。
【００３５】
【表１】
0004703079.tif 000002
【００３６】
図１（Ａ）は、自己集合に関するメカニズムを示す。「コンパニオン」ペプチドにおける相補的電荷は、互い違いの平行へテロ二量体の形成を導く。その結果生じる「付着」末端も相補的で、伸長構造への縦方向会合を促す。図１（Ｂ）は、デザインされたアミノ酸配列を示す。各々のペプチドは、ａ位置のイソロイシンおよびｄ位置のロイシンを有する最も簡単な７残基反復（ａｂｃｄｅｆｇ）を含んで、超らせん二量体の形成を導いた。逆荷電残基は、ｅおよびｇ位置に組入れられて、付着末端を有する互い違い二量体を付与した。アスパラギン残基（ａ部位で互いに優先的に対合する（Gonzalez L et al(1996) Nature Structural Biology 3, 13:1011-1018））が含入されて、指示レジスターをさらに堅く結びつけ、平行構造を付与した。図１（Ｃ）は、らせん−ホイール表示であって、本文中のデザイン配列を要約する。図は、７残基部位標識ａ−ｇを有するＮ末端から見たもので、３．５残基／らせん回転を想定して、７残基反復を強調する。
【００３７】
固相法およびＦｍｏｃ化学を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３２Ａペプチド合成機でペプチドを合成した。逆相ＨＰＬＣを用いてペプチド試料を精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によりそれらの同一性を確証した。
【００３８】
表２に記載するように、ペプチドモノマーおよびキャッピングペプチドの種々の組合せを試験した。
【表２】
0004703079.tif 000003
【００３９】
さらに、そして対照として、ＳＡＦ−ｐ１ｃ配列を並べ替えて（ＮおよびＣ末端半分を交換した）、ペプチドＳＡＦ−ｐ３を生成した：
E IDALEYE NDALEQK IAALKQK IASLKQ
【００４０】
このデザインは、ＳＡＦ−ｐ２Ｄと組合せて平滑末端構造を形成すべきであって、繊維を形成すべきものではない。
【００４１】
２）タンパク質繊維構造のモデリング
クリックの方程式を用いて生成され、理想的にパックされた界面を有したモデル超らせん３５量体（ＬＡＡＬＡＡＡ）5の最小化構造から、ＳＡＦ−ｐ１およびＳＡＦ−ｐ２の集合に起因するデザインタンパク質繊維の三次元構造のモデルを作製した（G.Offer and R.Sessions, J. Mol. Biol. 249, 967(1995)）。３５量体のコピーを１つの７残基反復のオーバーラップと重ね合わせて構造鋳型を伸長し、重複セグメントの除去後に、主鎖を再結合した。二重鎖鋳型中の残基をＳＡＦペプチドの配列と置き換えて、図１Ｂの配列にしたがって２つの７残基反復により互いに対して互い違いにした。構造物を５Å層の水に浸漬させて、エネルギーに関して座標の平均絶対導関数が０．０１kcａｌÅ-1より低下するまで、エネルギーを最小限にした。構造を構築し、Insight II 97.0(Molecular Simulations Inc.)を用いて可視化し、一貫した原子価場でDiscover 2.9.8(Molecular Simulations Inc.)を用いてエネルギー最小化した。図２（Ａ）では、ＳＡＦ−ｐ１およびＳＡＦ−ｐ２（各々、Ｎ末端から暗灰色−明灰色に着色された）は、アスパラギン対（中間灰色に着色）を含めたコア残基を介して相互作用して、互い違いの平行超らせん繊維の２つの鎖を形成する。図２（Ｂ）では、負荷電グルタメート側鎖（明灰色に着色）および正荷電リジン側鎖（黒色に着色）は、ＳＡＦペプチド間の相補的電荷相互作用を生じる。
【００４２】
３）円二色性実験
１０ｍＭのＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ｐＨ７、５℃中で、ペプチド試料をインキュベートした。試料濃度は、２８０ｎｍ（ＳＡＦ−ｐ１）および２１４ｎｍ（ＳＡＦ−ｐ２）でのそれらのＵＶ吸光度から測定した。ベースライン補正後、ペプチド結合の濃度に関する標準化により、楕円率（ｍｄｅｇ）をモル楕円率（ｄｅｇ  ｃｍ2ｄｍｏｌ−ｒｅｓ-1）に変換した。２０５〜２６０ｎｍの範囲で全ｎｍを５秒間（新鮮な１００μＭペプチド混合物に関しては１秒）の信号を積分することにより、１ｍｍ路長のセル中でデータを記録した。ＣＤ測定は、ペルティエ温度制御装置を装備したＪＡＳＣＯ  Ｊ−７１５分光旋光計を用いて実行した。
【００４３】
図３に示したＣＤデータは、ＳＡＦペプチドによるらせん構造の形成に関する分光学的証拠を提供する。図３（Ａ）は、ＳＡＦ−ｐ１（----）、ＳＡＦ−ｐ２（- -）、これらのスペクトルの平均（- - -）、および実験的ＳＡＦペプチド混合物（ｏ）に関する１０μＭでの円二色性（ＣＤ）スペクトルを示す。図３（Ｂ）は、１００μＭでのＣＤスペクトルを示す。鍵となるのは図３（Ａ）の場合と同様であるが、しかしさらなるスペクトル（・）は、１時間の「熟成」後のＳＡＦペプチド混合物に関するものである。
【００４４】
われわれのデザインと一致して、ＳＡＦ−ｐ１もＳＡＦ−ｐ２も、ｐＨ７および５℃の水性溶液中で高度に構造化されなかった（図３）。しかしながら、等比率で混合すると、円二色性（ＣＤ）スペクトルは変化し、さらに、単離ペプチドに関するスペクトルを平均して出した理論的スペクトルと顕著に異なった。特に、混合物に関するスペクトルは、αへリックス構造の形成と一致する２０８および２２２ｎｍで強度最小を有したが、これらの特徴は、個々のペプチドのスペクトルにおいては顕著でなかった。これは、２つのペプチドが相互作用して、デザインどおりのαへリックス構造を生成したという明らかな証拠であった。さらに、そして多量体化事象に関して予測されたように、これらのスペクトル変化の大きさはペプチド濃度に依存している：１０μＭの各ペプチドとのＳＡＦ混合物は、多少のαへリックス構造を示す弱い信号を示したが、１００μＭ混合物は非常に強い信号を生じた（図３ＡおよびＢ）。
【００４５】
ＳＡＦペプチドの１００μＭ混合物からのスペクトルの形状および強度は、時間とともに変化した（図３Ｂ）。「新鮮な」試料を混合直後に記録されたスペクトルは、多少のαへリックス構造を示した。しかしながら５℃で１時間、混合物をインキュベーション後（熟成）、２２２ｎｍでの信号はより強く、約７５％αへリックスを示したが、これはその後の超らせん形成と一致した。
【００４６】
１００μＭのＳＡＦペプチド混合物の熟成は、試料のわずかな曇りも伴った。このような試料からの散乱作用は、ＣＤスペクトルの減衰および歪を生じ得る（D.Mao and B.A.Wallace,(1984) Biochemistry 23, 2667）。しかしながら、試料と、ＣＤ計器の検出器との間の距離の変更はスペクトルの形状または強度に影響を及ぼさなかったため、われわれはこの可能性を無視できた。さらに、熟成１００μＭ  ＳＡＦ混合物の遠心分離により回収された懸濁物質を伴わない上清から得られた混合物からの大多数のＣＤ信号は、１０μＭ混合物と同様の弱ＣＤ信号のみを生じた。
【００４７】
したがって、ＣＤデータは、所望のαへリックスＳＡＦデザインと全体的に一致し、さらに、大集合体の形成を示した。
【００４８】
対照として、ＳＡＦ−ｐ３（ＳＡＦ−ｐ１の互換物（ＳＡＦ−ｐ１ｃと同一））をデザインして、さらに繊維に集合すべきでないＳＡＦ−ｐ１との平滑末端ヘテロ二量体を生成した。分析用超遠心機での沈降平衡により、ＳＡＦ−ｐ２（ＳＡＦ−ｐ２Ｄと同一）およびＳＡＦ−ｐ３の１００μＭ混合物を分析した。その結果生じたデータは溶液中の単一理想種と仮定して、最良に適合され、適合中に分子量を変化させた。６４２２のＭr（５９２４および６９１１の９５％信頼限界を有する）を得たが、これは、個々のペプチドの質量（分光）分析から算定された６３０３という予測へテロ二量体値に非常に近い。１００μＭ繊維生成混合物（ＳＡＦ−ｐ１とＳＡＦ−ｐ２との）に関する、ならびに平滑二量体生成混合物（ＳＡＦ−ｐ２とＳＡＦ−ｐ３との）に関するＣＤスペクトルを記録した。平滑二量体生成混合物に関しては、ＣＤスペクトルの形状および強度は、デザインされたような超らせん形成と完全に一致した。繊維形成混合物と対比して、平滑二量体生成混合物は熟成の兆候を示さない、すなわち、インキュベーション中は無視してよいほどのスペクトル変化が起こり、溶液の曇りは生じなかった。興味深いことに、αへリックス構造およびαへリックスフォールディングの一般に認められた指標である２２２ｎｍ近くで最小の強度は、両混合物に関して同様であった。これは、熟成時に観察されたスペクトルシフトにもかかわらず、繊維生成混合物でデザインされたようなαへリックス構造の形成を強く支持する。
【００４９】
４）直線二色性（ＬＤ）実験
伸長構造がデザインどおりに形成されつつあるか否かを試験するために、直線二色性（ＬＤ）分光分析も用いた。ＤＮＡ分子のような長いポリマーは、剪断流により配向され得る。この作用はＬＤ分光分析によりモニタリングされ得るが、ただし、発色団もその流れにより一列になる（aligned)（M.Bloemendal (1994) Chem. Soc. Rev. 23, 265; A.Rodger and B.Norden (1997) Oxford Chemistry Masters(Oxford University Press, Oxford）,vol.1)。
【００５０】
ＣＤの場合と同様に、ＬＤに関してペプチド試料を調製した。ＪＡＳＣＯ  Ｊ−７１５分光旋光計を用いて、２１０〜３２０ｎｍの範囲で全ｎｍを２秒間の信号を積分することにより、クエットフローセル中で回転する試料に関して、データを収集した。ベースライン補正後、ペプチド結合の濃度に関する標準化により、吸光度をモル吸光係数（１ｍｏｌ−ｒｅｓ-1ｃｍ-1）に変換した。傾斜ベースラインに関する線状補正を、１００μＭのＳＡＦペプチド混合物からのデータに対して行なった。
【００５１】
結果を図３Ｄに示す。これは、２０μＭのトロポミオシン（- - -）、１０μＭでのＳＡＦペプチド混合物（----）、ならびに０．５ＭのＫＦの非存在下（・）および存在下（ｏ）での１００μＭのＳＡＦペプチド混合物に関する直線二色性（ＬＤ）スペクトルを示す。
【００５２】
例えば、長さ約４２ｎｍの二量体超らせんを形成するトロポミオシンは、一列になってＬＤ信号を生じることを、われわれは見出した（図３Ｄ）。われわれのデザインおよびＣＤデータ、１０μＭのＳＡＦ混合物（図３Ｄ）を用いた、１００μＭの個々のペプチドに関する（データは示されていない）実験に対照をなして、そして一致して、ＬＤ信号は検出されなかった。しかしながら、熟成１００μＭのＳＡＦペプチド混合物は、ペプチド主鎖からの強い吸光度（２１０〜２４０ｎｍ）、ならびに流れ配向中の芳香族領域（２６０〜２９０ｎｍ）における何らかの信号を生じた（図３Ｄ）。この技術により長い構造のみが列を成す（aligned)ので、データは、少なくとも５００ｎｍの長さの長い繊維が熟成１００μＭのＳＡＦペプチド混合物の溶液中に存在することを実証した。
【００５３】
５）電子顕微鏡
繊維集合を確証するために、電子顕微鏡を用いてペプチド調製物中の構造を直接可視化した。ＴＥＭ実験のために、ペプチド試料を、濾過（された）１０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７、５℃下で１時間インキュベートした。ペプチド溶液１滴を炭素被覆銅検体グリッド（Agar Scientific Ltd, Stansted, UK）に適用し、０．５％水性酢酸ウラシルによるネガティブ染色の前に濾紙で乾燥させて、その後５℃で乾燥させた。検体グリッド上に直接、２００μＭで個々のペプチドの予備インキュベート溶液を混合することにより、「新鮮な」ＳＡＦペプチド混合物を調製した後、上記と同様に乾燥させ、ネガティブ染色した。１００ｋＶで日立７１００ＴＥＭでグリッドを検査して、（８００ｘ１２００画素）電荷結合装置カメラ（charge-coupled device camera)（Digital Pixel Co. Ltd., Brighton, UK）でデジタル画像を取得して、分析した（Kinetic Imaging Ltd., Liverpool, UK）。
【００５４】
走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）検査のために、ネガティブ染色検体グリッドを金でスパッター被覆して、Ｌｅｏ  Ｓｔｅｒｅｏｓｃａｎ  ４２０ＳＥＭで、２０ｋＶで、１０ｐＡのプローブ電流を用いて検査した。
【００５５】
１０μＭのＳＡＦ混合物に関して、または１００μＭの濃度の個々のペプチドに関して、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による１００，０００倍の倍率まで、構造は見えなかった（データは示されていない）。しかしながら、５０，０００倍の倍率での１００μＭのＳＡＦ混合物のＴＥＭは、長い繊維性構造の時間依存性形成を明示し、これはＣＤおよびＬＤデータと一致した。新鮮な混合物は、種々の幅の多数の伸長繊維を示した。これらの大多数は、約２０ｎｍの直径を有した（図４Ａ（１００μＭの新鮮な混合物）および図４Ｄ）。より細い繊維が存在したが、しかしそれらの太さは信頼性高く測定されることはできなかった。熟成混合物に関して記録された画像は、新鮮な混合物で観察されたよりも少ない繊維を示したが、これらはより明確で、かつより厚みがあった（図４ＢおよびＤ）。
【００５６】
熟成混合物の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）は、繊維分枝の証拠を示さなかった。むしろ、繊維は、あたかも互いの上に積層されたように、単に絡み合わされた（図４Ｃ）。絡まり合っているために、繊維の全長を追跡検査できなかったが、しかしそれらは少なくとも数百ミクロンの長さであった。繊維の密度はＥＭグリッドの表面全体で変化したが、少なくとも熟成試料に関しては、それらの直径は全く均一で、４３．３（ＳＤ＝９．３）ｎｍの平均太さを有した。本来のデザインは縦方向伸長型に関してであったので、そうでない場合、われわれが予測し得た二本鎖超らせんの平均直径は、約２ｎｍであった。したがって、ＥＭデータは、デザインされた二本鎖超らせん繊維が高次集合体と側面で会合することを示唆した。
【００５７】
６）Ｘ線繊維回析
１０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７中の５００μＭでのＳＡＦペプチドの混合物を、氷上で少なくとも１時間インキュベートした後、６５００ｇで５分間遠心分離した。遠心分離管の底から採取した繊維含有溶液の小滴を、２つの蝋充填毛管の末端間に懸濁し、４℃で一夜、ゆっくり乾燥させて、部分的整列化（aligned)繊維の小集団を得た。ＲｉｇａｋｕＣｕＫα回転陽極光源（波長１．５４１８Å）およびＲ−ＡＸＩＳ  ＩＶ検出器を用いて、Ｘ線繊維回析画像を収集した。データ収集中は、クリオストリーム（Oxford Cryo-systems）からの冷風を用いて、試料を５℃で保持した。ＳＡＦペプチド繊維から収集されたＸ線繊維回析パターンは、以下の特徴を示した（図６）：（１）５．１１±０．０３Åでの短い子午線方向（すなわち、繊維長軸と平行）の反射、（２）１０．１９±０．０５Åでのこの５．１１反射の調波、（３）赤道上で８．８±０．１５Åで集中させたより強力な、より拡散性の反射。これらの特徴は、繊維軸と一列をなすαへリックス超らせんと一致する。５．１Å子午線反射は、超らせん内のらせんのピッチに対応する。子午線上のその他の予測される反射（すなわち１．５Åでの、そして残基当たりの上昇に対応する）は、最新データ組によって解決できないが、一方、赤道反射は、αへリックス軸間の平均距離を明示する。８．８Åでのこの値は、ケラチンに関して観察された値より低いが、二量体超らせんペプチドに関して報告された範囲内にある。
【００５８】
７）タンパク質繊維集合に及ぼすフッ化カリウムの作用
伸長二本鎖超らせんへのＳＡＦ配列の分子モデリングは、プロトフィブリルの表面での潜在的相補的電荷相互作用も際立たせる（図１および２）。これにしたがって、実験的には、中等度濃度の塩がプロトフィブリルおよび厚い繊維集合体を抑制することが判明した。第一に、個々のペプチドおよびＳＡＦペプチド試料の０．５Ｍのフッ化カリウムとの１００μＭ混合物の両方に関して記録したＣＤスペクトルは、らせんＣＤ信号低減を示し、混合試料における「熟成」の証拠は認められなかった（図３Ｃ）。第二に、熟成１００μＭのＳＡＦペプチド混合物に関して前に記載したＬＤ信号も、塩の存在下で実験を反復すると、失われた（図３Ｄ）。最後に、１００μＭのＳＡＦ混合物のＴＥＭ画像も、０．５ＭのＫＦの存在下では繊維が形成されなかったことを実証した（図４Ｅ）。図４Ｅは、０．５ＭのＫＦの存在下でインキュベートした１００μＭでの熟成ＳＡＦペプチド混合物のＴＥＭの結果を示す。
本発明者等は、二本鎖超らせんのさらなる会合を助長するためにＳＡＦペプチドに対するいかなる特徴も承知の上でデザインしたわけではなかった。したがって、ＳＡＦペプチド調製物中の厚みのある繊維の観察は、問題を提起した。すなわち、これらの高次集合体を導き、かつ安定化する相互作用は何かという問題である。したがって、本発明者等は、それらがデザインされた種類の反復構造に固有の特徴は、このような繊維集合（原繊維発生）を自然に促進する、ということを提唱する。
【００５９】
図１Ｂおよび２Ａに示したようなプロトフィブリルを考えていただきたい。構成ペプチドのいずれかまたは両方によりその表面に認められるあらゆる配列特徴は、プロトフィブリルに沿って一定間隔で反復される。反復長は、ペプチドの長さに等しい（ＳＡＦ−ｐ１およびＳＡＦ−ｐ２に関しては、これは２８残基または約４．２ｎｍであった）。さらに、当該モチーフは超らせんの超らせんの跡をたどるプロトフィブリル周囲をらせん状に進み、これは、連続７残基ベースの二量体構造に関しては約１５ｎｍのピッチを有する。このシナリオにおいては、プロトフィブリル−プロトフィブリル相互作用は、第一のものと相補的なもうひとつの配列モチーフが考え得る相手中に存在する場合、促進され得る。これは、各プロトフィブリル上の相補的モチーフのピッチが正確に適合するためである。したがって、いったん開始されると、プロトフィブリルの側面的会合−すなわち原繊維発生−は，結晶中の場合のような多数の一定間隔の相互作用により堅く結び付けられる。その結果、プロトフィブリル−プロトフィブリル相互作用の安定性は少数の強力な相互作用よりむしろ親和性作用に基づいているので、相補的相互作用はもっぱら弱い必要がある。集合体の構成成分がある種類の相補的表面より多くなされ得るとすれば、非常に広範な分子集合体が生じ得る。
本発明者等は、静電相互作用を用いて、ヘテロ二量体形成を指図し、そしてプロトフィブリルの伸長を促進した（図１および２）。これらの特徴は、プロトフィブリル中の電荷の周期的および交互的パッチも作製するが、但し、それらは包含される場合には規則的である（図１Ｂおよび２Ｂ）。これらの荷電パッチは、高次集合体を導きかつ安定化し得る。実際、同様の特徴が、いくつかの天然繊維性タンパク質において認められており、多タンパク質フィラメントの集合（J.J.Meng et al(1994) Biol. Chem. 269, 18679; A.D.McLachlan and M.Stewart(1976) Mol. Biol.103,271)および小合成ペプチド系（S.G.Zhang et al(1993) Proc. Natl. Sc. U.S.A.90, 3334）に関連付けられている。塩（ＫＦ）を用いた上記実験は、塩橋（静電相互作用）が少なくとも一部分、原繊維発生の原因であることを示唆する。
【００６０】
８）超らせんデザイン
ａ．２つの重ね合わせられる７残基に関して、それぞれ６、５および４残基オフセットと等価である１、２および３残基の３つの考え得る配列オフセットが存在する。規則的３．６−残基／αへリックス１回転に関しては、これらは、らせんの外側の周囲にそれぞれ１００°、１６０°（３６０−２００）および６０°（３６０−３００）の角度オフセットを有する２つの疎水性面を生じさせる。これは、らせんホイールに関して最良に観察される。らせんスーパーコイル化を説明し−すなわち３．５残基／回転と仮定し、超らせんに関する一般に認められたらせん−ホイール表示を用いて、これらの角度オフセットをそれぞれ１０３°、１５４°および５１度に変える。しかしながら、いずれの組の角度も、側鎖サイズ、幾何学形状およびパッキングもらせん界面に影響を及ぼすため、実際の超らせん系におけるらせん−らせん相互作用を考えた場合、過度の単純化である（Harbury, P.B.et al(1993) Science 262, 1401-1407; Harbury,P.B. et al(1994) Nature 371, 80-83; Malashkevich, V.N.et al(1996) Science 274, 761-765）。それにもかかわらず、多数の天然超らせん集合は、少なくとも、ほぼ角度オフセットと一致することを、われわれは見出した。三量体は、３つの残基により分離された重複７残基を有すると考えられる（角度オフセット＝５１／６０°）。一方、四量体および五量体超らせんはしばしば、１残基による２つの７残基反復オフセットに関する主題の変形体であった（１００／１０３°）。
【００６１】
ｂ．２つの残基による２つの７残基反復オフセット：α円筒体構築物
２残基の配列オフセットは、可能性として、１および３残基オフセットより興味深い。これは、ａ、ｃ、ｄおよびｆの疎水性（Ｈ）残基をｃおよびｆに渡して、第二のオフセット７残基のａ’およびｄ’位置を有効に作り上げる可能性のためである。これは以下に示されるが、この場合、Ｐは極性（非コア）残基を意味する。
ａｂｄｅｆｇａｂｃｄｅｆｇ                          反復１
ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰ                        ２進パターン１
ＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰ                        ２進パターン２
ｆ’ｇ’ａ’ｂ’ｃ’ｄ’ｅ’ｆ’ｇ’ａ’ｂ’ｃ’ｄ’ｅ’    反復２
ａｂｃｄｅｆｇａｂｃｄｅｆｇ                        割当レジスター
ＨＰＨＨＰＨＰＨＰＨＨＰＨＰ                    全体的二成分パターン
【００６２】
このような配列パターンは、広い角度分離（１５４／１６０°）を伴う２つの疎水性シーム（seam）を生じ、これはらせんのほぼ反対側にそれらを配置する。さらに、それは、平行らせん−らせんパッキング配列に関する２つの可能性を提供する。「シン(ｓｙｎ)」。この場合、隣接らせんからの２つの同様の面−すなわちａ／ｄとａ／ｄ、またはｃ／ｆとｃ／ｆが併合して、開放αシートを生じる。図６ａ；「アンチ（ａｎｔｉ）」。この場合、ａ／ｄ面対とｃ／ｆ。アンチ配列では、構造は閉じて、α円筒体を形成し得る。らせんの逆平行対に関しては、シン定型的会合は円筒体を生じるべきであるが、一方、シートは、アンチ定型的逆平行界面から形成されるべきである。
【００６３】
ｃ．天然α円筒体
ＴｏｌＣは、２つのα樽様ドメインを有する（Koronakis,V. et al(2000) Nature 405, 914-919）。ともに、３つのモノマーが関与する１２らせんを有する。樽下部では、各らせんは同一プロトマーからのもう１つのものと対合して、別個のスーパーコイル化逆平行超らせんを形成する。ＳＯＣＫＥＴ分析は、これらの対内（それらの間ではない）での広範な逆平行孔へのノブ（ＫＩＨ）相互作用を明示した。対照するものとして、樽上部のらせんは、傾斜してはいるがより均一にパックして、α円筒体を示すように思われる。構造のこの部分のＳＯＣＫＥＴ出力は、樽下部で見出されたよりもより少ないＫＩＨ相互作用を多数明示した。さらに、ＫＩＨ相互作用は、円筒体周囲で連続的でなく、特にそれらは同一モノマー中のらせん間でより広大であるが、しかしモノマーに接するらせん間では規則性が低い。われわれの見解では、樽状ＴｏｌＣは、本発明のタンパク質構造により形成される円筒体の変形体を示す。
【００６４】
それにもかかわらず、本発明者等は、樽上部のらせんに関する７残基目録を明瞭に割当て得ることができた。これは、相対的ａ、ｃ、ｄおよびｆ位置でのノブ、ならびに２つのシーム隣接らせんのシン定型的会合を明示し、すなわち、上記の理論と完全に一致した。
【００６５】
らせんを平行に用いて、αシートおよびα円筒体を構築することが可能である、とわれわれは考える。平行らせんの使用は、α円筒体の構築に関する１つの興味深い結果を有するが、これらの構造の対合はアンチ定型的であるので、１つのらせん上のａ残基は、構造内の同一レベルの隣接らせんのｃ残基と組む。同様に、ｄおよびｆ残基は、介在レベルで対合する。その結果は、連続らせんが２つの残基によりらせんおよび円筒体軸に変形仕上げられ、これは？３Åと等価であるというものである。したがって、平行らせんからα円筒体を構築する試みは、閉じることも閉じ得ないこともあるらせんの渦巻を生じる。しかしながらこれは、上記のようなペプチドベースのナノチューブ作製の可能性を切り開くので、潜在的に非常に興味深いものである。
【００６６】
α円筒体構築に関する第二の考察は、らせんおよび超らせんスーパーコイル化の結果である。ＴｏｌＣの上部バレルは、１２のらせんを有する。標準スーパーコイル化を伴う平行らせんの構造、すなわち各らせん中の２つのシーム間の１５４°の角度の隔たりに基づいて、円筒体は１４のらせんで閉じるべきである、とわれわれは算定した。しかしながら、らせん数の変動が予測される。これに関する１つの理由は、らせんが２方向に同時にスーパーコイル化できず、そして両界面でのパッキングを保持するためには何らかの歪を要することである。堅い孔へのノブパッキングが保持されるタンパク質データブックＰＤＢにおけるこのための構造的先例をわれわれは見出した（Walshaw & Woolfson、未発表）。実際、３らせんαシートの中心らせんは、真っ直ぐである（図７ｂ）（ｎ．ｂ．ＴｏｌＣの樽上部におけるらせんの傾斜は真っ直ならせんとスーパーコイル化らせん間の妥協を提供し得る）。完全に真っ直ぐならせんのパッキングを仮定すると、角度オフセットは１６０°になり、１８のらせんが円筒体を閉じることになる。しかしながら、３−、４−および５本鎖超らせんの場合と同様に、側鎖がらせん−らせん接触角を媒介すると仮定すると、その他のオリゴマー化状態が考えられ得る（Harbury, P.B.et al(1993) Science 262, 1401-1407; Harbury,P.B. et al(1994) 371, 80-83; Malashkevich, V.N.et al(1996) Science 274, 761-765）。１４４°〜１６２°の角度オフセットの小調整がらせん数を１０から２０に変える、とわれわれは算定する。
【００６７】
９）タンパク質構造の形成
上記のように、本発明のタンパク質構造は、以下のような種々の用途を有し得る：
【００６８】
ナノチューブ
ａ．これは、例えば配列中にオフセットを有する上記の７および１１残基反復を併合することにより達成され得る。当該作用は、全体的疎水性置換を排除することである。言い換えれば、交互的７残基および１１残基反復は、１８残基反復を生じて、αへリックス反復を適合させる。αへリックスにおいて、１８残基は正確に５つのらせん回転に亘る。したがって、完全閉鎖ペプチドナノチューブを作製し得る（図５は、ナノチューブの一部を示す）。平行直鎖らせんの場合には、「円筒体」の１回転当たり１８のらせんが存在し、回転当たりの上昇は、３６残基である。したがって、２つの残基による７−１１−７−１１反復オフセットを有する３６残基ペプチドは、その末端がチューブを閉鎖するために合流するらせんの渦巻きを形成すべきである。このようなナノチューブは、ナノスケールのパイプおよび鉛管の製造に特に有用であり得る。チューブの内部は、異なる小（２〜４０Å）分子の流れを制御するために誘導化され得る。
【００６９】
ｂ．誘導化および分枝ペプチドならびにペプチド鋳型
本発明の自己集合ペプチドは、相対的に小型で、合成的に入手し易い。したがって、非標準誘導化可能側鎖が、それらに組入れられ得る。例えば、モノマー単位は、ｆ位置の外側に単一システイン残基を用いて作製され得る。これらは、チオールベースの化学を用いて、小分子およびその他のペプチドをカップリングするために用いられ得る。広範な種々のチオール反応性プローブが利用可能である。特に、ペプチドはフルオロフォアで標識され得る。例えば、フルオレセインで標識された一方のペプチド、ならびに共焦点顕微鏡により可視化されたローダミン繊維を有する他方のペプチドは、それぞれ緑色および赤色に見える（図７）。繊維中にしっかりパックされ得るプローブ間のＦＲＥＴの可能性があり、これは解釈を混乱させ得る。これを避けるために、標識ペプチドが新鮮な集合ＳＡＦ混合物にドープされ得る。利用可能な蛍光標識ペプチドを用いると、繊維は、繊維／網状構造集合および配向を追跡する別の経路を提供する。
【００７０】
分枝自己集合繊維を生成するために、「Ｔ字形」複合ペプチドが作製され得る。これらは、２つのＳＡＦペプチドの変異体を一緒に混合し、カップリングすることにより作製された共有へテロ二量体である。一方は末端システインを有し、他方は中央システイン残基を有する。所望の生成物は、ＰＨＬＣによりジスルフィド結合ペプチドのミックスから精製され得る。「Ｔ」の「バー」と「幹」の両方が繊維中に組入れられるようになるか、または繊維に着手し得るので、新鮮なＳＡＦ混合物への複合（「Ｔ」）ペプチドのドーピングは、三次元での繊維集合を広げるだろう。その結果生じる網状構造は、ＥＭにより可視化され、特性化され得る。
【００７１】
ペプチド合成二ブロックコポリマーハイブリッドが生成され得る。原子伝達ラジカル重合を用いた水溶性二ブロックコポリマーの調製のための適切な方法は、X.S.Wang et al Chemical Communications 1817(1999)およびX.S.Wang et al Macromolecules 33, 257(2000)に記載されている。
【００７２】
本発明のタンパク質繊維は、この重合の鋳型を作り、これを制御するために用いられて、ハイブリッド繊維を製造し得るか、あるいはペプチド鋳型がその後取り外され、印を消される場合には、水溶性「漁網」ナノチューブへの経路を提供される。その他の可能性としては、以下のものが挙げられる：プレ集合ペプチド繊維上へのポリマーの結合、繊維集合前のポリマーおよびペプチドの結合、ならびにプレ集合繊維上での重合の実行。
【００７３】
ｃ．マトリックスの形成
本発明のタンパク質繊維は、それぞれ二次元および三次元グリッドおよびマトリックスを形成するよう配列され得る。このようなマトリックスに対する一用途は、生物学的流体、例えば血液の精製においてである。親和性マトリックスは、血液夾雑物（例えばウイルス）を除去するために集合され得る（例えば血液中でその場に）。ウイルス除去の場合、標的夾雑物のための結合剤（例えば、ウイルスコートタンパク質に対する天然または工学処理親和性を有するペプチドまたはタンパク質）は、本発明のタンパク質構造中のペプチドモノマー単位と融合され得る。次にマトリックスは、軽い遠心分離により任意の結合夾雑物とともに血液から除去され得る。例えば、１００ｎｍ長の繊維は、容易に除去され得る(１２ＭＤａの質量を有すると概算される。このような親和性マトリックスは、大型天然タンパク質を上回る多数の利点を有する。集合マトリックスでは、任意の結合剤が整列化されて、標的化分子に対する非常に有効な親和性を提供する。
【００７４】
ｄ．その他の用途
本発明のタンパク質構造のその他の用途を以下に挙げる：
ｉ．Ｘ線結晶学のための生体分子の結晶化の核となるための組織化網状構造の調製、
ｉｉ．組織工学処理のための細胞成長を促すためのオーダー(ordered)繊維の使用、
ｉｉｉ．ナノスケール分子ふるいの構築、
ｉｖ．種々の機能性小分子または高分子のための支持体として用いられ得るナノスケール分子グリッド／骨格の調製、
ｖ．機能化グリッドおよび網状構造は、例えば触媒、生物学的流体およびその他の検査溶液の親和性ふるい／精製、概して組織修復および組織工学処理を促すための内在性分子および補因子の漸増、に用いられ得る。
ｖｉ．新規のラボオンチップ技術（lab-on-chip technology）を作成するために、ペプチド自己集合体は、以下のようにリソグラフィー(lithography)と組合され得る：
リソグラフィーおよび関連技法を用いて、ペプチド繊維を収容するために適切なサイズ（例えば、太さおよび深さが２０〜１００ｎｍ）を有して作られ得る溝を有する種々の表面をパターン化し得る。次にこれらを用いて、表面で直接混合された溶液からの繊維の集合を指図し得る。さらに、十分に確立された化学を用いて、本発明者等は、種々の小分子およびその他のタンパク質を用いてペプチド繊維の機能化を想定する。ペプチドデザイン、自己集合およびリソグラフィーのこの提唱された組合せは、特定表面での機能性ポリマーのオーダーアレイ(orderd array)の開発を可能にするはずである。
ｖｉｉ．集合繊維は、カーボンナノチューブを用いて、限流が約１０〜２５ｎｍであるＡＦＭ（原子間力顕微鏡）における微細（したがって、高解像度）チップとしても用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃは本発明の自己集合繊維（ＳＡＦ）ペプチドモノマーのデザインおよび配列を示す。
【図２】  図２Ａ、図２Ｂは本発明のデザインされた自己集合繊維のコンピューターモデルを示す。
【図３】  図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄは本発明のタンパク質構造に関する円二色性（ＣＤ）および直線二色性（ＬＤ）実験の結果を示す。
【図４】  図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、図４Ｅは透過型電子顕微鏡により直接可視化された合成タンパク質繊維の集合、および繊維太さの分析を示す。全パネルにおいて、白色スケールバーは、１００ｎｍを現す。図４Ｄは、１００μＭでのＳＡＦペプチドの新鮮な（白色バー）および熟成された（黒色バー）混合物に関してＴＥＭを用いて確定された繊維太さの分布を示すヒストグラムである（ヒストグラム上での「ｘ」の太さ値は、「（ｘ−５）〜ｘ」からなされた全測定値を含む）。
【図５】  図５は、ホモオリゴマーペプチドナノチューブに至る平行らせんペプチドの考え得るアンチ定型的会合を示すカートンである。
【図６】  図６は、本発明の整列化タンパク質繊維のｘ線回析パターンである。
【図７】  図７は、フルオロフォアの含入により誘導体化された繊維を示す電子顕微鏡写真である。
【図８】  図８は、平滑末端へテロ二量体を形成するようデザインされたアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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