(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カロテノイドを蓄積する植物細胞の産生方法であって、前記細胞はカロテノイドを通常は含まず、
（ａ）該細胞中で機能的なプロモーター、及び該プロモーターの制御下に配置された植物由来のフィトエンシンターゼ遺伝子を含み、該細胞中でフィトエンシンターゼ産生することができる発現カセット、及び
（ｂ）該細胞中で機能的なプロモーター、及び該プロモーターの制御下に配置された細菌由来のフィトエンデサチュラーゼ遺伝子を含み、該細胞中でフィトエンデサチュラーゼを産生することができる発現カセット
を含むヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子で植物材料を形質転換することを含む、方法。
【請求項２】
前記フィトエンデサチュラーゼは、Erwinia uredovoraのCrtI遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フィトエンデサチュラーゼは、安定な色素体トランジットペプチドと融合している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記フィトエンデサチュラーゼは、組織特異的プロモーターまたは構成的プロモーターの制御下で発現される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記フィトエンデサチュラーゼは、構成的プロモーターの制御下で発現される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記フィトンエンシンターゼは、組織特異的プロモーターの制御下で発現される、請求項請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記フィトンエンシンターゼは、Narcissus pseudonarcissusに由来する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡは、選択マーカーを提供するポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記植物材料は、前記ＤＮＡを含むAgrobacteriumにより形質転換される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記植物細胞は、イネ植物細胞である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞は、胚乳細胞である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって得られる形質転換植物細胞。
【請求項１３】
イネ胚乳細胞である、請求項１２に記載の植物細胞。
【請求項１４】
（ａ）カロテノイドを通常は含まない植物細胞中で機能的なプロモーター、及び該プロモーターの制御下に配置された植物由来のフィトエンシンターゼ遺伝子を含み、該細胞中でフィトエンシンターゼ産生することができる発現カセット、及び
（ｂ）該細胞中で機能的なプロモーター、及び該プロモーターの制御下に配置された細菌由来のフィトエンデサチュラーゼ遺伝子を含み、該細胞中でフィトエンデサチュラーゼを産生することができる発現カセット
を含むヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１５】
前記フィトエンデサチュラーゼは、Erwinia uredovoraのCrtI遺伝子である、請求項１４に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１６】
前記フィトエンデサチュラーゼは、安定な色素体トランジットペプチドと融合している、請求項１４または１５に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１７】
前記フィトエンデサチュラーゼは、組織特異的プロモーターまたは構成的プロモーターの制御下で発現される、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１８】
前記フィトエンデサチュラーゼは、構成的プロモーターの制御下で発現される、請求項１７に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１９】
前記フィトンエンシンターゼは、組織特異的プロモーターの制御下で発現される、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
【請求項２０】
前記フィトンエンシンターゼは、Narcissus pseudonarcissusに由来する、請求項１９に記載のＤＮＡ分子。
【請求項２１】
前記ＤＮＡは、選択マーカーを提供するポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
【請求項２２】
前記ヌクレオチド配列は、植物中での発現に最適化されている、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、植物細胞、種子、組織、および全植物体を形質転換する分野に関する。さらに詳細には、本発明は、植物の農学的価値および栄養学的価値を改善するために、その植物材料に、カロテノイド生合成経路に特有の酵素の１または複数をコードする組換えヌクレオチド配列を挿入することに関する。
【０００２】
発明の背景
プロビタミンＡ（β−カロテン）欠乏症は、主食またはほとんど唯一の主食として米を食べて生きている世界人口の一部において重篤な臨床症状につながる非常に重い健康上の問題である。東南アジアだけで、毎年、５百万人の子供が眼疾患である眼球乾燥症を発症し、このうち２５万人が最終的に盲目になると見積もられている（Ｓｏｍｍｅｒ，１９８８；Ｇｒａｎｔ，１９９１）。さらに、ビタミンＡ欠乏症は死亡の決定要因ではないが、下痢、呼吸疾患、および小児期の疾患（例えば、麻疹）などの死に到る可能性のある苦痛の罹患率増加と相関している（Ｇｒａｎｔ，１９９１）。ＵＮＩＣＥＦによりまとめられた統計によれば、プロビタミン栄養の改善により、１〜４歳の子供で毎年１００万〜２００万件の死亡を、学童期ではさらに２５万〜５０万件の死亡を防ぐことができた（Ｈｕｍｐｈｒｅｙら，１９９２）。これらの理由から、主食中のカロテノイド量を高めることが非常に望ましい。さらに、カロテノイドは、数種類のガンの予防の助けになることが知られており、ルテインおよびゼアキサンチンは網膜の黄斑変性を予防するという役割が証明されている（例えば、Ｂｒｏｗｎら，１９８８；Ｓｃｈａｌｃｈ，１９９２を参照のこと）。
【０００３】
さらに、カロテノイドは、ヒト用食品および動物用飼料ならびに医薬品の着色料として広範に使用されている。さらに、「機能性食品」に含まれる栄養補給化合物としてのカロテノイドの関心が高まっている。これは、カロテノイドの中には哺乳動物においてプロビタミンＡ特性を示すもの（例えば、β−カロテン）もあるからである。
【０００４】
カロテノイドは、生合成前駆体イソペンテニル二リン酸から誘導される８個のイソプレン単位の縮合により形成される４０炭素（Ｃ４０）イソプレノイドである（図１を参照のこと）。命名法により、カロテノイドは、２種類に分類される（すなわち、炭化水素からなるものをカロテンと呼ぶのに対して、酸化された誘導体をキサントフィルと呼ぶ）。植物におけるこれらの基本的な機能は、色素体の光合成装置における光酸化損傷から保護することである。さらに、カロテノイドは、光合成間の集光に関与し、光合成反応中心の必須成分である。カロテノイドは、植物ホルモンであるアブシジン酸の直接の前駆体である。
【０００５】
図１に模式的に示すカロテノイド生合成が調べられてきており、その経路が、細菌、菌類、および植物において明らかにされてきた（例えば、Ｂｒｉｔｔｏｎ，１９８８を参照のこと）。植物では、カロテノイドは色素体で形成される。
【０００６】
カロテノイド生合成経路の初期中間体は、酵素ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼによりイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ、図１を参照のこと）から形成されるゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＤＰ）である。次の酵素段階もまた第１のカロテノイド特異的反応であり、酵素フィトエンシンターゼにより触媒される。この反応は、ＧＧＤＰ２分子の頭部と頭部が縮合して、最初の（まだ色のついていない）カロテン産物であるフィトエンが形成される２段階反応からなる（Ｄｏｇｂｏら，１９８８，Ｃｈａｍｏｖｉｔｚら，１９９１；Ｌｉｎｄｅｎら，１９９１；Ｐｅｃｋｅｒら，１９９２）。フィトエンシンターゼは、可溶性／不活性と膜結合性／活性の２形態で存在し、色素体ガラクトリピド含有膜の表面に存在する場合、活性のためにビシナルヒドロキシ官能基を必要とする（Ｓｃｈｌｅｄｚら，１９９６）。
【０００７】
細菌および植物ではフィトエン形成は似ているが、フィトエン代謝は明らかに異なる。植物では、色のついたカロテンであるリコペンを産生するために、２つの遺伝子産物が連続して働く（Ｂａｙｅｒら，１９８９）。これらは、酵素フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ，例えば、Ｈｕｇｕｅｎｅｙら，１９９２を参照のこと）とζ−カロテンデサチュラーゼ（ＺＤＳ，例えば、Ａｌｂｒｅｃｈｔら，１９９６を参照のこと）により表される。それぞれの遺伝子産物は２つの二重結合を導入し、それぞれ、フィトフルエンを経てζ−カロテンを、ノイロスポレンを経てリコペンを産生する。ＰＤＳは、プラストキノン（Ｍａｙｅｒら，１９９０；Ｓｃｈｕｌｚら，１９９３；Ｎｏｒｒｉｓら，１９９５）を利用する膜結合酸化還元鎖（Ｎｉｅｖｅｌｓｔｅｉｎら，１９９５）に機構的に関連していると考えられているが、一方、ＺＤＳは、機構的に異なったやり方で作用する（Ａｌｂｒｅｃｈｔら，１９９６）。植物では、経路全体がｃｉｓ配置中間体を必要とすると思われる（Ｂａｒｔｌｅｙ，１９９９）。対照的に、多くの細菌（例えば、Ｅｒｗｉｎｉａ属）では、４つ全ての二重結合を形成する不飽和化順序の全てが、フィトエンをリコペンに直接変換する１つの遺伝子産物（ＣｒｔＩ）により達成される（例えば、Ｍｉａｗａら，１９９０；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，１９９０；Ｈｕｎｄｌｅら，１９９４を参照のこと）。このタイプの細菌デサチュラーゼは、植物型フィトエンデサチュラーゼを効率的に阻害する、ある漂白除草剤（ｂｌｅａｃｈｉｎｇ  ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ）に耐性であることが知られている。
【０００８】
植物では、２つの遺伝子産物がリコペンの環化を触媒する（すなわち、α（ε）−リコペンシクラーゼおよびβ−リコペンシクラーゼが、それぞれ、α（ε）−イオノン末端基およびβ−イオノン末端基を形成する）（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，１９９３；ＳｃｏｌｎｉｋおよびＢａｒｔｌｅｙ，１９９５；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，１９９６を参照のこと）。植物では、通常、２つのβ−イオノン末端基を有するβ−カロテンと、１つのα（ε）−イオノン末端基と１つのβ−イオノン末端基を有するα−カロテンが形成される。
【０００９】
植物キサントフィルの形成は、最初に、２つの遺伝子産物α−ヒドロキシラーゼおよびβ−ヒドロキシラーゼ（Ｍａｓａｍｏｔｏら，１９９８）（それぞれ、α−カロテンおよびβ−カロテンのカロテンバックボーンのＣ３位およびＣ３’位に作用する）により媒介される。結果として生じるキサントフィルは、ルテインおよびゼアキサンチンと呼ばれる。
【００１０】
さらなる酸化反応は、エポキシ官能基を、ゼアキサンチンバックボーンのＣ５位、Ｃ６位およびＣ５’位、Ｃ６’位への導入を触媒するゼアキサンチンエポキシダーゼにより触媒される（Ｍａｒｉｎら，１９９６）。これは、アンテラキサンチンおよびビオラキサンチンの形成につながる。この反応を、異なる遺伝子産物であるビオラキサンチンデエポキシダーゼの作用により逆転することができる（ＢｕｇｏｓおよびＹａｍａｍｏｔｏ，１９９６）。
【００１１】
ネオキサンチンの形成につながる遺伝子産物はまだ同定されていない。
【００１２】
カロテノイド生合成遺伝子をコードする遺伝子およびｃＤＮＡが、細菌から植物に及ぶ様々な生物からクローニングされている。細菌およびシアノバクテリアの遺伝子として、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ（出願ＷＯ９１／１３０７８，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，１９９０）、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｕｒｅｄｏｖｏｒａ（Ｍｉｓａｗａら，１９９０）、Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，１９９０）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｈｏｓｈｉｎｏら，１９９３）、シアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ６３８７３）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｒ１５３４株（Ｐａｓａｍｏｎｔｅｓら，１９９７）が挙げられる。公共データベースから推定できるように、高等植物におけるカロテノイド生合成経路の酵素をコードする遺伝子およびｃＤＮＡが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ、Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍなどを含む様々な供給源からクローニングされている。
【００１３】
現在、高等植物形質転換体における前記クローニング遺伝子の使用と、結果として生じる効果についてはあまり何も知られていない。トマト由来フィトエンシンターゼの発現は、果実のカロテノイド量に影響を及ぼすことができる（Ｂｉｒｄら，１９９１；Ｂｒａｍｌｅｙら，１９９２；ＦｒａｙおよびＧｒｉｅｒｓｏｎ，１９９３）。形質転換トマト植物におけるフィトエンシンターゼの構成的発現は、ジベレリン生合成経路に由来する代謝産物ＧＧＰＰの方向を変えるために矮性をもたらすことも報告されている（Ｆｒａｙら，１９９５）。イネ胚乳においてＮａｒｃｉｓｓｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ由来フィトエンシンターゼを構成的に発現させた際には、このような問題は認められなかった（Ｂｕｒｋｈａｒｄｔら，１９９７）。Ｅｒｗｉｎｉａ  ｕｒｅｄｏｖｏｒａ  ＣｒｔＩが細菌デサチュラーゼとして植物において機能し、漂白除草剤耐性を付与することが知られている（Ｍｉｓａｗａら，１９９３）。
【００１４】
長年にわたって、栄養組織または種子などの様々な植物組織あるいは細菌においてカロテノイド生合成経路を変えるか、または増強しようという試みがなされてきた。例えば、ＷＯ９６／１３１４９、ＷＯ９８／０６８６２、ＷＯ９８／２４３００、ＷＯ９６／２８０１４、および米国特許第５，６１８，９８８号を参照のこと。これらの全てが、細胞における既存のカロテノイド生合成反応の操作に限られている。油が豊富な種子におけるカロテノイド生合成を変えることを目的とした他の出願は、形質転換により引き起こされる増加により形成される過剰なカロテノイドを調節するためのシンクを提供するので異なる。
【００１５】
目的のカロテンおよびキサントフィルを産生するのに必要なカロテノイド生合成経路の全酵素を発現することができる形質転換体を作成するために植物材料を形質転換する方法が必要とされることは明らかである。
【００１６】
発明の要約
本発明は、標的宿主植物が目的のカロテンおよび／またはキサントフィルを蓄積するのに必須であるカロテノイド生合成経路の全酵素を発現することができる形質転換体を作成するために、植物細胞、種子、組織、または全植物体を形質転換する手段および方法を提供する。本発明はまた、本発明の方法の実施に適するように設計されたＤＮＡ分子、およびこの分子を含むプラスミドまたはベクター系を提供する。さらに、本発明は、改善した栄養学的特性を示し、かつかかるＤＮＡ分子を含み、および／または本発明の方法を用いることにより作成されたトランスジェニック植物細胞、種子、組織、および全植物体を提供する。
【００１７】
従って、本発明は、本質的にカロテノイドを含まないことが知られている植物材料（例えば、イネ胚乳および他の多くの穀類の種子）について特に重要であるカロテノイド生合成のｄｅ  ｎｏｖｏ導入および発現、ならびに目的のある特定の中間体または産物の蓄積をアップレギュレートまたはダウンレギュレートするための既存のカロテノイド生合成の改良を提供する。
【００１８】
明細書全体を通して用いられる略語
本明細書中で挙げられる関連するカロテノイドの系統名は以下の通りである。
フィトエン：７，８，１１，１２，７’，８’，１１’，１２’−オクタヒドロ−ψ，ψ−カロテン
フィトフルエン：７，８，１１，１２，７’，８’−ヘキサヒドロ−ψ，ψ−カロテン
ζ−カロテン：７，８，７’，８’−テトラヒドロ−ψ，ψ−カロテン
ノイロスポレン：７，８−ジヒドロ−ψ，ψ−カロテン
リコペン：ψ，ψ−カロテン
β−カロテン：β，β−カロテン
α−カロテン：β，ε−カロテン
ゼアキサンチン：β，β−カロテン−３，３’−ジオール
ルテイン：β，ε−カロテン−３，３’−ジオール
アンテラキサンチン：５，６−エポキシ−５，６−ジヒドロ−β，β−カロテン−３，３’−ジオール
ビオラキサンチン：５，６，５’，６’−ジエポキシ−５，６，５’，６’−テトラヒドロ−β，β−カロテン−３，３’−ジオール
ネオキサンチン：５’，６’−エポキシ−６，７−ジデヒドロ（ｄｉｄｅｈｄｒｏ）−５，６，５’，６’−テトラヒドロ−β，β−カロテン−３，５，３’−トリオール
酵素：
ＰＳＹ：フィトエンシンターゼ
ＰＤＳ：フィトエンデサチュラーゼ
ＣｒｔＩ：細菌カロテンデサチュラーゼ
ＺＤＳ：ζ（ゼータ）−カロテンデサチュラーゼ
ＣＹＣ：リコペンβ−シクラーゼ
非カロテン中間体：
ＩＰＰ：イソペンテニル二リン酸
ＤＭＡＰＰ：ジメチルアリル二リン酸
ＧＧＰＰ：ゲラニルゲラニル二リン酸
【００１９】
本明細書中で使用する用語「植物」として、一般に、真核藻類、有胚植物（Ｂｒｙｏｐｈｙｔａ、Ｐｔｅｒｉｄｏｐｈｙｔａ、ならびにＳｐｅｒｍａｔｏｐｈｙｔａ（例えば、ＧｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅおよびＡｎｇｉｏｓｐｅｒｍａｅ）を含む）が挙げられる。Ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍａｅとして、Ｍａｇｎｏｌｉｏｐｓｉｄａ、Ｒｏｓｏｐｓｉｄａ（真「双子葉植物」）、Ｌｉｌｉｏｐｓｉｄａ（「単子葉植物」）が挙げられる。代表的な、および好ましい例として、穀類種子（例えば、イネ、コムギ、オオムギ、オートムギ、アマランス、アマ、ライコムギ、ライムギ、トウモロコシ、および他のイネ科植物）；脂肪種子（例えば、脂肪種子Ｂｒａｓｓｉｃａ種子、綿実、ダイズ、ベニバナ、ヒマワリ、ココナッツ、ヤシなど）；他の食用種子または食べられる部分のある種子（カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、ゴマ、ケシ、ブドウ、ヤエナリ、ラッカセイ、エンドウマメ、ラディッシュ、アルファルファ、ココア、コーヒー、アサ、ツリーナッツ（例えば、クルミ、アーモンド、ペカン、ヒヨコマメ）などを含む）が挙げられる。さらに、ジャガイモ、ニンジン、サツマイモ、トマト、コショウ、キャッサバ、ヤナギ、オーク、ニレ、カエデ、リンゴ、バナナ；観賞用の花（例えば、ユリ、ラン、スゲ、バラ、キンポウゲ、ペチュニア、フロックス、スミレ、ヒマワリなど）などがある。一般に、本発明は、観賞用の種ならびに食品、繊維、木製品、なめし剤、染料、色素、ゴム、樹脂、ラテックス製品、脂肪、油、薬品、飲料などのために栽培された種に適用可能である。形質転換のために選択された標的植物は、食品用に栽培されることが好ましい（例えば、穎果、根、豆果、堅果、野菜、塊茎、果実、香辛料など）。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明によれば、標的宿主植物が目的のカロテンおよび／またはキサントフィルを蓄積するのに必須であるカロテノイド生合成経路の全酵素を発現することができる形質転換体を作成するために、植物細胞、種子、組織、または全植物体を形質転換する手段および方法が提供される。本発明の別の態様によれば、前記方法を用いて、目的のある特定の中間体または産物の蓄積をアップレギュレートまたはダウンレギュレートするために既存のカロテノイド生合成を改良することもできる。さらに、
−植物、菌類、または細菌に由来するフィトエンシンターゼ、
−植物、菌類、または細菌に由来するフィトエンデサチュラーゼ、
−植物またはシアノバクテリアに由来するζ−カロテンデサチュラーゼ、および
−植物、菌類、または細菌に由来するリコペンシクラーゼ、
からなる群から選択されるカロテノイド生合成経路に特有の１または複数の酵素を産生することができる１または複数の発現カセットを有するヌクレオチド配列を含む特異的ＤＮＡ分子が提供される。
【００２１】
好ましい実施態様によれば、前記発現カセットは、植物、菌類、または細菌のフィトエンシンターゼ、植物、菌類、または細菌のフィトエンデサチュラーゼ、植物ζ−カロテンデサチュラーゼ、あるいは植物、菌類、または細菌のリコペンシクラーゼをコードする１または複数の遺伝子またはｃＤＮＡを含む。前記それぞれの遺伝子またはｃＤＮＡは、植物細胞、種子、組織、または全植物体においてその発現を可能にする適切な構成的、誘導性、または組織特異的プロモーターに作動可能に連結される。特に好ましい遺伝子またはｃＤＮＡは、植物フィトエンシンターゼ、細菌フィトエンデサチュラーゼ、または植物リコペンシクラーゼをコードする。フィトエンシンターゼ（植物および細菌）、ＣｒｔＩ型カロテンデサチュラーゼ（細菌）、ならびにリコペンシクラーゼ（植物および細菌）の多数の、まだ増加している遺伝子が単離されており、データベースから利用することができる。これらは様々な供給源に由来し、全て本発明の方法に使用することができる。
【００２２】
前記ＤＮＡ分子は、適切な構成的、誘導性、または組織特異的プロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つの選択マーカー遺伝子またはｃＤＮＡをさらに含むことが好ましく、構成的プロモーターの制御下にあるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼが選択マーカーとして最も好ましい。当業者は、植物材料において機能的に活性である任意の入手可能なプロモーターを選択してもよいが、本発明による適切な発現カセットの設計では、フィトエンデサチュラーゼ、ζ−カロテンデサチュラーゼ、またはリコペンシクラーゼをコードするそれぞれのヌクレオチド配列を、組織特異的または構成的プロモーターに作動可能に連結することが好ましいのに対して、フィトエンシンターゼをコードするヌクレオチド配列は、ジベレリン形成の妨害を避けるために組織特異的プロモーターの制御下で発現されることが好ましい。
【００２３】
本発明によるＤＮＡ分子の機能要素としてのヌクレオチド配列は、前記遺伝子またはｃＤＮＡの１または複数の任意の組み合わせを含むことができることが理解されるべきである。本発明の特に好ましい実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、フィトエンシンターゼと細菌または菌類フィトエンデサチュラーゼの両方の機能的発現カセットを含み、適切なプラスミドまたはベクター系（プラスミドＡ）に組み込んだ後に、単独でまたはリコペンシクラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第２のベクター（プラスミドＢ）と共に、標的植物材料に導入することができる。
【００２４】
本発明は、好ましくはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに由来する、前記ＤＮＡ分子またはヌクレオチド配列の１または複数を含むプラスミドまたはベクター系をさらに提供する。
【００２５】
本発明は、改善した栄養学的特性を示し、かつ前記ＤＮＡ分子、プラスミドもしくはベクターの１または複数を含み、および／または本発明による方法を用いることにより作成されたトランスジェニック植物細胞、種子、組織、および全植物体をさらに提供する。
【００２６】
本発明は、初期中間体であるゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）がカロテン生成に役立つだけでなく、いくつかの異なる生合成経路（図２）に役立つ分岐点でもあることに基づいている。従って、この前駆体は、カロテノイド含有にかかわらず全ての植物組織（例えば、イネ胚乳）の色素体に存在すると推定されている。従って、ＧＧＰＰの供給源を使用して、本発明の目的（すなわち、部分的もしくは全体的なカロテノイド生合成経路の導入および／または既存のカロテノイド生合成経路の増強もしくは促進）を達成することができる。
【００２７】
ある特定の標的植物細胞または組織を区別するために本明細書全体を通して用いられる用語「カロテノイドを含まない」は、本発明により形質転換されていない各植物材料が、例えば、イネ胚乳などの貯蔵器官のように、通常、本質的にカロテノイドを含まないことが知られていることを意味するものとする。「カロテノイドを含まない」は、ほとんど検出不可能な量でカロテノイドを蓄積する細胞または組織が除外されることを意味しない。好ましくは、前記用語は、０．００１％ｗ／ｗ以下のカロテノイド量を有する植物材料を定義するものとする。
【００２８】
カロテノイド経路酵素を得ることができる適切な供給源の選択について、それぞれの植物配列に相同なシアノバクテリアに由来するコード配列も本発明に従って使用することができることが理解されるべきである。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様では、高等植物フィトエンシンターゼが、組織特異的発現を付与するプロモーターに作動可能に連結される。これは、細菌（Ｃｒｔ−Ｉ型）フィトエンデサチュラーゼと共に同じプラスミド（プラスミドＡ）上に一体化される。後者は、トランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列に融合され、構成的発現を可能にするプロモーターに作動可能に連結される。適切なベクター中のこの構築物で植物を形質転換することにより、フィトエンシンターゼを制御するプロモーターにより選択された組織（例えば、カロテノイドを含まない穀類種子）内でリコペンが形成される。驚くことに、カロテノイドを含まない組織（例えば、イネ胚乳）でさえも、この形質転換だけで、リコペン形成より先に進んで、下流キサントフィル（例えば、ルテイン、ゼアキサンチン、アンテラキサンチン、ビオラキサンチン、およびネオキサンチン）に向けてカロテノイド合成を開始することができる。さらに、α−カロテンの形成が観察される。従って、緑葉に存在するものに似たカロテノイド相補物が形成される。この思いがけない現象（本明細書では「オーバーシュート」機構と呼ぶ）は、形質転換により媒介される基質供給により、あるいは形質転換により引き起こされたカロテノイド生合成遺伝子の発現誘導により活性化されるようになった、それぞれの後期遺伝子（リコペンシクラーゼ、β−カロテンヒドロキシラーゼ、エポキシダーゼ）の構成的発現によるものかもしれない。「オーバーシュート」機構が機能しない場合、リコペンシクラーゼをコードする遺伝子またはｃＤＮＡとの同時形質転換（プラスミドＢ）がこの問題を克服することができ、少なくともα−またはβ−カロテン（プロビタミンＡ）の形成を可能にする。「オーバーシュート」機構が機能する場合、この同時形質転換は、フィトエンシンターゼおよびＣｒｔＩ型カロテンデサチュラーゼにより引き起こされる効果を増大することができる。従って、本発明は、プラスミドＡまたはＡ＋Ｂで形質転換することにより遺伝的に与えられる点より先のカロテノイド生合成経路を導入することを含む。
【００３０】
プラスミドＡはまた、カロテノイドを含む組織においてカロテノイド産生を増強することができる。これらの形質転換は、ヒト用食品および動物用飼料の栄養学的価値を高める。形質転換においてｃｒｔＩ型細菌フィトエンデサチュラーゼを使用するさらなる利点は、この酵素が葉の葉緑体でも発現され、それにより、漂白除草剤耐性を標的植物のフィトエンデサチュラーゼに付与することである。従って、本発明はまた、少なくともプラスミドＡを有するトランスジェニック植物に関連する除草剤耐性を利用することを含む。
【００３１】
第２のプラスミドＢは、植物リコペンシクラーゼ遺伝子を有してもよい。あるいは、トランジット配列を備える細菌リコペンシクラーゼ遺伝子を使用してもよい。これは、プロモーター（好ましくは、プラスミドＡ中のフィトエンシンターゼと同じ発現組織特異性を付与する）に作動可能に連結される。プラスミドＡおよびＢの同時形質転換により、根、果実、塊茎、または種子などの標的組織が、ゲラニルゲラニル二リン酸から出発してβ−カロテンを形成するカロテノイド生合成経路を実施するための全情報で補われる。この経路の後期反応が既にある場合、または誘導される場合、この同時形質転換（前記参照のこと）は、カロテノイド含有量を増加させ、β−カロテン由来キサントフィルの形成を増加させることができる。
【００３２】
使用される全ての遺伝子には、色素体輸送を可能にするトランジット配列をコードするＤＮＡ配列が作動可能に備わっている。これは組換えＤＮＡ技術によりなされるか、またはトランジット配列は使用する植物ＤＮＡに存在する。そのために、形質転換により、色素体に局在する前駆体ゲラニルゲラニル二リン酸プールを利用してカロテノイドを形成することができる。この中心化合物はカロテノイドでもなく、カロテノイド生合成だけに関わる前駆体でもない（図２を参照のこと）。
【００３３】
前記植物は、導入された１または複数の遺伝子を発現するはずであり、その発現についてホモであることが好ましい。一般に、遺伝子は、特定の植物の標的宿主細胞で機能的に活性であるプロモーターに作動可能に連結される。その発現は、その遺伝子に望ましい特徴が得られるようなレベルであるべきである。例えば、選択マーカー遺伝子の発現により、本発明の方法により作成された形質転換体が適切に選択されるはずである。同様に、栄養学的特性を強化するために、カロテノイドおよびキサントフィル生合成経路の１または複数の遺伝子を発現することにより、本発明による形質転換法に供されていない同じ種のものと比較して比較的高い含有量の経路中間体または産物の１または複数が得られるはずである。他方では、植物の正常な生理機能に著しく悪影響を及ぼすことを避けるために、一般に、目的の１または複数の遺伝子の過度な発現を（すなわち、その栽培が困難になる程度まで）制限することが望ましい。
【００３４】
形質転換植物組織において発現するために、目的の１または複数の酵素をコードする１または複数の遺伝子を発現カセット中で使用することができる。本発明の目的を達成するために（すなわち、目的の標的植物におけるカロテノイド生合成経路を導入するか、または補うために）、植物は、目的の遺伝子に連結された転写開始領域を含む少なくとも１つの発現カセットで形質転換される。
【００３５】
前記転写開始は、宿主に天然にあるか、類似するものでもよく、または宿主に対して外来するものか、異種のものでもよい。外来は、転写開始領域が、その転写開始領域を導入する野生型宿主に見出されないことを意図する。
【００３６】
貯蔵タンパク質（例えば、グルテリン、パタチン、ナピン、クルシフェリン、β−コングリシニン、ファセオリンなど）に関連する転写開始領域が特に興味深い。
【００３７】
転写カセットは、５’−３’方向の転写では、植物において転写開始領域および翻訳開始領域、目的のＤＮＡ配列、ならびに機能的な転写終結領域および翻訳終結領域を含む。終結領域は、転写開始領域と共に天然にあるものでもよく、目的のＤＮＡ配列と天然にあるものでもよく、または他の供給源に由来してもよい。オクトピンシンターゼ終結領域およびノパリンシンターゼ終結領域などの便利な終結領域が、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドから入手することができる（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら，１９９１；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，１９９１；Ｓａｎｆａｃｏｎら，１９９１；Ｍｏｇｅｎら，１９９０；Ｍｕｎｒｏｅら，１９９０；Ｂａｌｌａｓら，１９８９；Ｊｏｓｈｉら，１９８７もまた参照のこと）。
【００３８】
本発明の目的の１または複数の遺伝子は、多くは、発現のために色素体（例えば、葉緑体）に標的化される。このように、目的の遺伝子が色素体に直接挿入されない場合、発現カセットは、目的の遺伝子を色素体に指向するためにトランジットペプチドをコードする配列をさらに含む。このようなトランジットペプチドは当該分野で周知である（例えば、Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅら，１９９１；Ｃｌａｒｋら，１９８９；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら，１９８７；Ｒｏｍｅｒら，１９９３；およびＳｈａｈら，１９８６を参照のこと）。本発明で有用な任意のカロテノイド経路遺伝子が、天然または異種のトランジットペプチドを利用することができる。
【００３９】
前記構築物はまた、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された任意の他の必要なレギュレーター（例えば、植物翻訳コンセンサス配列（Ｊｏｓｈｉ，１９８７）、イントロン（ＬｕｅｈｒｓｅｎおよびＷａｌｂｏｔ，１９９１）など）を含んでもよい。導入されるのに望ましい遺伝子内のイントロン配列は、転写物を安定化し、核からの効果的な移行を可能にすることにより、遺伝子の発現レベルを増加させる可能性がある。既知のこのようなイントロン配列の中には、植物ユビキチン遺伝子のイントロン（Ｃｏｒｎｅｊｏ，１９９３）がある。さらに、ゲノムの異なる遺伝子座に挿入された同じ構築物が、植物における発現レベルの点で異なることがあると観察されている。この効果は、少なくともある程度は染色体上での遺伝子の位置によるものであると考えられている。すなわち、個々の単離物は異なる発現レベルを有する（例えば、Ｈｏｅｖｅｒら，１９９４を参照のこと）。発現カセットの構築に使用することができるさらなる調節ＤＮＡ配列として、例えば、誘導または抑制を認識して植物組織において結合したＤＮＡ配列の転写を調節することができる配列が挙げられる。
【００４０】
例えば、様々な内部因子および外部因子（例えば、植物ホルモン、熱ショック、化学物質、病原体、酸素不足、光、ストレスなど）により誘導されることが知られている、ある特定の植物遺伝子がある。
【００４１】
調節することができるＤＮＡ配列のさらなるグループは、例えば、タバコのＰＲ（感染特異的）タンパク質遺伝子に存在する化学的に動かされる配列を含み、ＥＰ−Ａ  ０  ３３２  １０４に記載のような化学調節物質により誘導することができる。
【００４２】
植物における外来遺伝子の発現のさらに別の考慮すべき事項は、トランスジェニックゲノムの安定性のレベル（すなわち、外来遺伝子が集団から分離する傾向）である。選択マーカーが目的の遺伝子または発現カセットに連結されているのであれば、トランスジェニック植物を維持するために選択を施すことができる。
【００４３】
５’リーダー配列を発現カセット構築物に含めることが有益な場合がある。このようなリーダー配列は、翻訳を増強するように働くことができる。翻訳リーダーは当該分野で周知であり、ピコルナウイルスリーダー（例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域；Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎら，１９８９））；ポティウイルスリーダー（例えば、ＴＥＶリーダー（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ；Ａｌｌｉｓｓｏｎら，１９８６））；およびヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ，ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ，１９９１）；アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡに由来する非翻訳リーダー（ＡＭＶ  ＲＮＡ  ４；ＪｏｂｌｉｎｇおよびＧｅｈｒｋｅ，１９８７）；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ；Ｇａｌｌｉｅら，１９８９）；ならびにｍａｉｚｅ  ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓリーダー（ＭＣＭＶ；Ｌｏｍｍｅｌら，１９９１；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら，１９８７もまた参照のこと）が挙げられる。
【００４４】
目的のＤＮＡ配列を発現しようとする場所に応じて、植物優先コドン（ｐｒｅｆｅｒｅｄ  ｃｏｄｏｎ）または葉緑体優先コドンを有する配列を合成することが望ましい場合がある。植物優先コドンは、目的の特定の植物種において最も多量に発現されるタンパク質における最高頻度のコドンから決定することができる（ＥＰ−Ａ  ０  ３５９  ４７２；ＥＰ−Ａ  ０  ３８６  ９６２；ＷＯ９１／１６４３２；Ｐｅｒｌａｋら，１９９１；およびＭｕｒｒａｙら，１９８９を参照のこと）。このように、ヌクレオチド配列を、任意の植物における発現のために最適化することができる。遺伝子配列の全てまたは任意の部分が最適化されてもよく、合成であってもよいことが理解される。すなわち、合成または部分的に最適化された配列も使用してよい。葉緑体に好ましい遺伝子の構築には、ＵＳＰＮ５，５４５，８１７を参照のこと。
【００４５】
転写カセットの調製では、適切な方向および適宜、適切なリーディングフレームのＤＮＡ配列を用意するために、様々なＤＮＡフラグメントを操作してもよい。このような目的で、アダプターまたはリンカーを使用してＤＮＡフラグメントを結合してもよく、または便利な制限部位の用意、余分なＤＮＡの除去、制限部位を除去などのために他の操作を伴ってもよい。この目的のために、挿入、欠失、または置換（例えば、トランジションおよびトランスバーション）が必要とされ得る場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、切除、連結などを用いてもよい。
【００４６】
目的の遺伝子を有する発現カセットを、標準的な方法により発現ベクターに配置する。適切な発現ベクターの選択は、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法によって決まる。代表的な発現ベクターは、発現ベクターを細菌宿主内で増殖させ、選択するための、細菌複製起源をコードする原核生物ＤＮＡエレメントおよび抗生物質耐性遺伝子；（ここでは、カロテノイド生合成経路の１または複数の特有の酵素をコードする）外因性ＤＮＡ配列を挿入するためのクローニング部位；外因性遺伝子の転写開始を制御する原核生物ＤＮＡエレメント（例えば、プロモーター）；ならびに転写物のプロセシングを制御するＤＮＡエレメント（例えば、転写終結配列／ポリアデニル化配列）を含む。これはまた、ベクターを染色体に最後に組み込ませるのに必要な配列を含んでもよい。
【００４７】
好ましい実施態様では、発現ベクターはまた、例えば、プロモーターに機能的に連結された、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｌｚｅｎら，１９８５）などの選択マーカーをコードする遺伝子を含む。抗生物質耐性を付与し、従って、選択マーカーとして適切な遺伝子の他の例として、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼカナマイシン耐性（Ｖｅｌｔｅｎら，１９８４）をコードする遺伝子；Ｔｎ５に由来するカナマイシン耐性（ＮＰＴＩＩ）遺伝子（Ｂｅｖａｎら，１９８３）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９８７）に記載のＰＡＴ遺伝子；およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が挙げられる。本発明に適した植物発現ベクターおよび選択マーカー遺伝子の概要については、Ｇｒｕｂｅｒら（１９９３）を参照のこと。前記で概説したように、細菌ｃｒｔＩ（この遺伝子産物は漂白除草剤耐性を付与することが知られている）を含む発現カセットから、さらなる選択マーカーを省くことも可能である。この特定の実施態様では、ｃｒｔＩは、構成的または組織特異的プロモーターの制御下にあることが好ましい。非常に好ましい実施態様では、ｃｒｔＩは、緑色の光合成が活発な組織または細胞に特異的であり、その組織または細胞において機能的に活性であるプロモーターにより制御される。
【００４８】
目的の遺伝子およびマーカー遺伝子の発現を制御するために用いられるプロモーターエレメントは、それぞれ、任意の植物に適合するプロモーターでよい。これは、植物遺伝子プロモーター（例えば、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（ＲＵＢＩＳＣＯ）小サブユニットプロモーターまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの腫瘍誘導（ｔｕｍｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ）プラスミドに由来するプロモーター（例えば、ノパリンシンターゼプロモーターおよびオクトピンシンターゼプロモーター）でも、ウイルスプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓおよび３５Ｓプロモーターまたはゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）でもよい。本発明で使用するのに適した周知の植物プロモーターの概説については、例えば、国際出願ＷＯ９１／１９８０６を参照のこと。
【００４９】
「組織特異的」プロモーターを用いると、前記遺伝子産物の１または複数が、カロテノイドまたはキサントフィル生合成経路の産物を発現させる組織において特に多く蓄積される。発現の中には、植物の他の部分で起こるものもあってよい。周知の組織特異的プロモーターの例として、グルテリンＩプロモーター（Ｋｉｍら，１９９３；Ｏｋｉｔａら，１９８９；Ｚｈｅｎｇら，１９９３）、塊茎特異的クラスＩパタチンプロモーター（Ｂｅｖａｎら，１９８６）；ジャガイモ塊茎ＡＤＰＧＰＰ遺伝子に結合するプロモーター（Ｍｕｌｌｅｒら，１９９０）；種子特異的転写を動かすダイズβ−コングリシニン（７Ｓタンパク質としても知られる）プロモーター（Ｂｒａｙ、１９８７）；およびトウモロコシ胚乳ゼイン遺伝子に由来する種子特異的プロモーター（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら，１９８２）が挙げられる。本発明に使用することができるプロモーターのさらなるタイプは、植物ユビキチンプロモーターである。植物ユビキチンプロモーターは、Ｋａｙら（１９８７）およびＥＰ−Ａ  ０  ３４２  ９２６により証明されているように当該分野で周知である。同様に、アクチンプロモーター、ヒストンプロモーター、およびチューブリンプロモーターが本発明に適している。タバコＰＲ−１ａプロモーターなどの好ましい化学物質誘導性プロモーターの例は、ＥＰ−Ａ  ０  ３３２  １０４に詳述されている。プロモーターの別の好ましいカテゴリーは、傷誘導性プロモーターである。この種類の好ましいプロモーターとして、Ｓｔａｎｆｏｒｄら（１９８９）、Ｘｕら（１９９３）、Ｌｏｇｅｍａｎｎら（１９８９）、ＲｏｈｒｍｅｉｅｒおよびＬｅｈｌｅ（１９９３）、Ｆｉｒｅｋら（１９９３）、およびＷａｒｎｅｒら（１９９３）により記載されるプロモーターが挙げられる。
【００５０】
本発明で意図される植物細胞、種子、組織、および全植物体を、いくつかの方法のいずれでも得ることができる。当業者は、方法の選択が、形質転換の標的にされた植物のタイプ（すなわち、単子葉植物または双子葉植物）によって決まる場合があることを理解している。このような方法は、一般に、直接遺伝子導入、化学的に誘導される遺伝子導入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙら，１９８６；Ｎｅｕｈａｕｓら，１９８７）、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入、例えば、Ａｇｒａｃｅｔｕｓ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ａｎｄ  Ｄｕｐｏｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅから入手可能な装置を用いたバリスティック粒子加速（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄら，米国特許第４，９４５，０５０号およびＭｃ  Ｃａｂｅら，１９８８を参照のこと）などが挙げられる。
【００５１】
本発明の形質転換植物またはその一部を得る１つの方法は直接遺伝子導入である。直接遺伝子導入では、植物細胞を、植物またはその一部に導入しようとするヌクレオチド配列を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下で適切な条件下で培養するか、別の方法で増殖させる。ドナーＤＮＡ源は、一般に、所望の１または複数の遺伝子を含むプラスミドまたは他の適切なベクターである。所望の１または複数の遺伝子を含む他の適切なベクターもまた意図されることを理解した上で、便宜上、本明細書中ではプラスミドについて言及する。
【００５２】
プラスミドを取り込む任意の適切な植物組織を、直接遺伝子導入により処理することができる。このような植物組織として、例えば、発生の初期段階（特に減数分裂前、とりわけ減数分裂１〜２週間前）の生殖構造が挙げられる。一般に、例えば、プラスミド溶液を、生殖器官でまたは生殖器官近くで植物に直接注入することにより、減数分裂前の生殖器官をプラスミド溶液に浸す。次いで、この植物を自家受粉させるか、または同様に処理した別の植物の花粉と他家受粉させる。このプラスミド溶液は、一般に、花構造１個あたり約０．１〜１０ｍｌ中に約１０〜５０μｇのＤＮＡを含むが、特定の花構造の大きさに応じて、これより多いまたは少ないものを使用してよい。溶媒は、一般に、滅菌水、食塩水、または緩衝化食塩水、あるいは従来の植物培地である。所望であれば、プラスミド溶液はまた、プラスミドの取り込みを化学的に誘導または増強するための薬剤（例えば、ＰＥＧ、Ｃａ２＋など）を含んでもよい。
【００５３】
生殖器官をプラスミドに暴露した後に、花構造を成熟するまで成長させ、種子を採取する。プラスミドマーカーに応じて、マーカー感受性培地または好ましくはマーカー耐性培地において植物を発芽または成長させることにより、マーカー遺伝子を有する形質転換植物を選択する。例えば、カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドで処理された植物から得られた種子は緑色のままであるのに対して、このマーカー遺伝子を有さないものはアルビノである。遺伝子からの所望のｍＲＮＡ遺伝子転写とペプチド発現の存在を、従来のサザン、ノザン、およびウェスタンブロッティング技術によりさらに証明することができる。
【００５４】
本発明を実施するのに適した別の方法では、プラスミドの取り込みを誘導するように植物プロトプラストを処理する。プロトプラスト調製は当該分野で周知であり、一般に、細胞壁を除去するのに十分な期間で植物細胞をセルラーゼおよび他の酵素で消化することを伴う。一般に、プロトプラストを、ふるい分けおよび洗浄により消化混合物から分離する。次いで、プロトプラストを、一般に１０４〜１０７細胞／ｍｌで適切な培地（例えば、培地Ｆ、ＣＣ培地など）に懸濁する。次いで、この懸濁液に、前記のプラスミド溶液と誘導物質（例えば、ポリエチレングリコール、Ｃａ２＋、センダイウイルスなど）を添加する。あるいは、プラスミドをリポソームに封入してもよい。次いで、プラスミドおよびプロトプラストの溶液を、適切な期間（一般に、約１時間）約２５℃でインキュベートする。場合によっては、約４５℃まで短時間（例えば、２〜５分間）加熱し、インキュベーション温度まで急速に冷却することにより、混合物に熱ショックをかけることが望ましい場合もある。次いで、処理されたプトロプラストを冷却し、例えば、マーカー遺伝子の発現および従来のブロッティング技術により、所望の１または複数の遺伝子の発現について選択する。次いで、従来どおりに、全植物体をクローンから再生する。
【００５５】
一般に、電流を、エレクトロポレーションチャンバ内で、ポリエチレングリコール、Ｃａ２＋などの非存在下または存在下で裸のプラスミドとプロトプラストの混合物に加えることを除いて、エレクトロポレーション技術は似ている。代表的なエレクトロポレーションは、１〜２０００μｓの持続時間で４０〜１０，０００ＤＣボルトの１〜１０パルスを伴い、一般に、パルス間の間隔は０．２秒である。同様の強度の交流パルスも使用することができる。さらに一般には、充電されたコンデンサを、プラスミドプロトプラスト懸濁液を含むエレクトロポレーションチャンバの全体にわたって放電させる。この処理により、生体膜の透過性が可逆的に増加し、従って、本発明によるＤＮＡの挿入が可能になる。エレクトロポレーションされた植物プロトプラストは新しい細胞壁を再生し、分裂し、カルス組織を形成する（例えば、Ｒｉｇｇｓら，１９８６を参照のこと）。
【００５６】
標的細胞を形質転換するのに適した別の方法は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの使用を伴う。この方法では、所望の１または複数の遺伝子カセットを有するプラスミドを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを使用して、植物細胞に感染させ、プラスミドを標的細胞のゲノムに挿入する。次いで、所望の遺伝子を発現する細胞を選択し、前記のようにクローニングする。例えば、プラスミド（例えば、Ｒｉプラスミド）およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓまたはＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）により目的の遺伝子を標的組織（例えば、塊茎、根、穎果、または豆果）に導入する１つの方法は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉでのクローニングに適した小さな組換えプラスミド（これにはＴ−ＤＮＡフラグメントが挿入されている）を利用することである。この組換えプラスミドを、Ｔ−ＤＮＡ内の１つの部位で切断する。この開口部に１本の「パッセンジャー」ＤＮＡを挿入する。パッセンジャーＤＮＡは、植物ＤＮＡに組み込もうとする本発明の１または複数の遺伝子と選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）からなる。次いで、このプラスミドを、さらに大きなプラスミドに再クローニングし、次いで、非改変Ｒｉプラスミドを有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株に導入する。細菌の増殖中に、そのＴ−ＤＮＡにインサート（すなわちパッセンジャーＤＮＡ）がある細菌をもたらす、希な二重組換えが時々起こる。このような細菌を、抗生物質を含む培地上での生存により同定および選択する。これらの細菌は、そのＴ−ＤＮＡ（パッセンジャーＤＮＡによって改変されている）を植物ゲノムに挿入するために使用される。Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓまたはＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを利用するこの手順により、健康で成長可能な植物に再生することができる形質転換植物細胞が得られる（例えば、Ｈｉｎｃｈｅｅら，１９８８を参照のこと）。
【００５７】
別の適切なアプローチは、細胞に、形質転換用ＤＮＡでコートされたマイクロプロジェクタイルを打ち込むこと（Ｗａｎｇら，１９８８）、または加圧衝撃により、形質転換しようとする細胞の方向へＤＮＡ含有溶液を通って加速され、それにより加圧衝撃の結果として溶液と共に細かく分散されて霧状になるマイクロプロジェクタイルを打ち込むことである（ＥＰ−Ａ  ０  ４３４  ６１６）。
【００５８】
マイクロプロジェクタイルボンバードメントは、植物細胞を含む細胞の効果的な形質転換技術として改善されてきた。Ｓａｎｆｏｒｄら（１９８７）では、マイクロプロジェクタイルボンバードメントは、核酸をＡｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ（タマネギ）植物細胞の細胞質に送達するのに効果的であることが報告された。Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９８８）は、マイクロプロジェクタイルボンバードメントによるカナマイシン耐性遺伝子を用いたダイズカルスの安定な形質転換を報告した。同じ著者らは約０．１％〜５％の細胞での貫通を報告し、４００ｍｇ／ｌカナマイシンまでの、形質転換カルスにおけるＮＰＴＩＩ酵素活性および耐性の観察可能なレベルを発見した。ＭｃＣａｂｅら（１９８８）は、マイクロプロジェクタイルボンバードメントを用いたＧｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（ダイズ）の安定な形質転換を報告している。ＭｃＣａｂｅらは、Ｒ０キメラ植物からの形質転換Ｒ１植物の再生をさらに報告している（Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒら，１９８８；Ｄａｔｔａら，１９９０（イネ）；Ｋｌｅｉｎら，１９８８ａ（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎら，１９８８ｂ（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍら，１９９０；およびＧｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら，１９９０（トウモロコシ）もまた参照のこと）。
【００５９】
あるいは、植物色素体を直接形質転換することができる。葉緑体の安定な形質転換が高等植物において報告されている（例えば、ＳＶＡＢら（１９９０）；ＳＶＡＢおよびＭａｌｉｇａ（１９９３）；ＳｔａｕｂおよびＭａｌｉｇａ（１９９３）を参照のこと）。この方法は、選択マーカーを含むＤＮＡのパーティクルガン送達と、相同組換えによるＤＮＡの色素体ゲノムへの標的化を頼りにしている。このような方法では、色素体遺伝子プロモーターを使用するか、または選択的プロモーター配列（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼにより認識される配列）からの発現のために配置された、色素体に含まれるサイレントトランスジーンのトランス活性化により、色素体遺伝子発現を達成することができる。このサイレント色素体遺伝子は、核発現構築物からの特異的ＲＮＡポリメラーゼの発現と、トランジットペプチドの使用によるポリメラーゼの色素体への標的化により活性化される。適切な植物組織特異的プロモーターから発現される、核にコードされ、色素体に向けられる特異的ＲＮＡポリメラーゼを使用することにより、このような方法で組織特異的発現を得ることができる。このような系は、ＭｃＢｒｉｄｅら（１９９４）に報告されている。
【００６０】
一例として前記に示された可能な形質転換法のリストは、完全であることが要求されず、どのようにも本発明の主題を制限することが意図されない。
【００６１】
従って、本発明はまた、本発明による方法により形質転換されているプロトプラスト、細胞、カルス、組織、器官、種子、胚、胚珠、接合子など、特に、全植物体からなる群から選択されるトランスジェニック植物材料を含み、発現可能な形態の本発明の組換えＤＮＡおよび前記トランスジェニック植物材料を作成するためのプロセスを含む。
【００６２】
当該分野で周知の以下の手順を用いて、ポジティブな形質転換体を植物に再生させる（例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら，１９８６を参照のこと）。次いで、これらの植物を成長させ、同じ形質転換株または異なる株と受粉させてもよく、その後で、所望の性質の存在および／または所望の性質が発現される程度、ならびに結果として得られる、同定される所望の表現型特徴を有するハイブリッドについて、子孫を評価することができる。第１の評価は、例えば、形質転換植物の細菌耐性／菌類耐性のレベルを含んでもよい。表現型特徴が安定に維持および遺伝されることを確実にするために、２世代以上を生育してもよく、次いで、所望の表現型または他の性質が実現されていることを確実にするために、種子を採集してもよい。
【００６３】
本発明の方法により形質転換されたトランスジェニック植物（特に、トランスジェニック稔性植物）、ならびにその無性子孫および／または有性子孫（これらは、母植物の形質転換による新規なかつ望ましい性質をなお示す）が、本発明の範囲内にさらに含まれる。
【００６４】
用語「子孫」は、トランスジェニック植物の「無性生殖」による子孫と「有性生殖」による子孫の両方を含むことが理解される。この定義はまた、周知のプロセス（例えば、細胞融合または変異体選択）により得ることができ、最初の形質転換植物に特有の性質をなお示す全ての変異体およびバリアントを、形質転換植物材料の全ての交配および融合産物と共に含むことを意味する。
【００６５】
本発明の方法により以前に形質転換されたトランスジェニック植物またはその子孫に生じ、従って、少なくとも一部分がトランスジェニック細胞からなる植物の一部（例えば、花、茎、果実、葉、根）もまた、本発明の目的である。
【００６６】
以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明を限定しない。
【００６７】
生物学的材料の寄託
本発明による発現カセットを有するＥ．ｃｏｌｉ株は、ブダペスト条約により、以下のアクセッション番号で、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ），Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙに寄託されている。
株                                                  アクセッション番号
ＰＲｉｃｅＣＹＣ  ＴＯＰ１０（プラスミドＢカセット）  ＤＳＭ１２７１４
Ｐｂａａｌ４２  ＴＯＰ１０（プラスミドＡカセット）    ＤＳＭ１２７１３
【００６８】
実施例
プロビタミンＡ（β−カロテン）およびキサントフィル生合成の、カロテノイドを含まないイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）胚乳への導入
フィトエン形成（Ｂｕｒｋｈａｒｄｔら，１９９７）
放射性標識イソペンテニル二リン酸を用いた以前の生化学的研究から、イネ胚乳には、重要なカロテノイド生合成前駆体を供給する酵素的に活性なＧＧＰＰシンターゼがあることが分かっている。従って、ジャポニカ米モデル品種Ｔａｉｐｅｉ３０９を、マイクロプロジェクタイルボンバードメントにより、構成的プロモーターの制御下と、胚乳特異的プロモーターの制御下にあるラッパズイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ；Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ７８８１４，ＳｃｈｌｅｄｚおよびＢｅｙｅｒ，１９９６、Ｓｃｈｌｅｄｚら，１９９６）由来フィトエンシンターゼをコードするｃＤＮＡで形質転換した。トランスジェニックイネ植物では、ラッパズイセン酵素は、色のついていないカロテンであるフィトエンがイネ胚乳にｉｎ  ｖｉｖｏ蓄積することにより活性であることが示された。従って、カロテノイドを欠く非光合成組織において、カロテノイド生合成における第１のカロテノイド特異的酵素段階を操作することが原理的に可能であることが始めて証明された。
【００６９】
リコペン、β−カロテン（プロビタミンＡ）、およびキサントフィルに向かうカロテノイド生合成経路のイネ胚乳への導入
プラスミド構築
（標準的な分子生物学技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９を参照のこと。構築物の模式図については、図４を参照のこと）。カロテノイド生合成酵素をコードする構造遺伝子は以下の通りであった。
Ｐｓｙ：Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ由来フィトエンシンターゼ（Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ７８８１４）。
ｃｒｔＩ：エンドウＲｕｂｉｓｃｏのトランジットペプチドに融合された細菌Ｅｒｗｉｎｉａ  ｕｒｅｄｏｖｏｒａ由来カロテンデサチュラーゼ（Ｍｉｓａｗａら，１９９３）。
ｃｙｃ：Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ由来リコペンシクラーゼ（Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ９８７９６）。
【００７０】
ｐＢ１９ｈｐｃ（本文では「プラスミドＡ」と呼ぶ）の構築：
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター下流に、およびｎｏｓ３’ポリアデニル化シグナル上流に、インタクトなＥｒｗｉｎｉａ  ｕｒｅｄｏｖｏｒａ由来フィトエンデサチュラーゼ遺伝子（ｃｒｔＩ）とエンドウＲｕｂｉｓｃｏ小サブユニットのトランジットペプチド配列（ｔｐ）を有するＤＮＡフラグメントがＭｉｓａｗａら（１９９３）により構築されており、これをＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１９に連結して、プラスミドｐＵＣＥＴ４を得た。ｃｒｔＩ発現カセットを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＵＣＥＴ４から切り出し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳに連結して、プラスミドｐＢａａｌ１を得た。イネグルテリン１プロモーター（Ｇｔ１；Ｋｉｍら，１９９３；Ｏｋｉｔａら，１９８９；Ｚｈｅｎｇら，１９９３）の制御下にあるＮａｒｃｉｓｓｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ由来フィトエンシンターゼｃＤＮＡ（Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ７８８１４）とｎｏｓ３’ポリアデニル化シグナルからなるｐｓｙ発現カセットを有するプラスミドｐＧｔ１ＰｓｙＨ（Ｂｕｒｃｋｈａｒｄｔら，１９９７）をＳａｃＩＩで消化し、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼを用いることにより平滑末端にした。ｐｓｙ発現カセットを得るために、ＫｐｎＩを用いて第２の消化を行った。次いで、ＳａｃＩＩ（平滑化）／ＫｐｎＩフラグメントを、ＸｈｏＩ（平滑化）／ＫｐｎＩで消化したｐＢａａｌ１に連結して、ｃｒｔ１およびｐｓｙ発現カセットを有するプラスミドｐＢａａｌ２を得た。
【００７１】
ｐＵＣ１８のポリリンカー部位を、以下の順番の以下の制限部位：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＫｐｎＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＩｓｃｅＩ、ＥｃｏＲＩを含むように交換した。結果として得られたプラスミドｐＵＣ１８Ｍを、ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで消化した。ｃｒｔ１およびｐｓｙ発現カセットを有するＤＮＡフラグメントを、ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩを用いてｐＢａａｌ２から切り出し、前記の消化されたｐＵＣ１８Ｍに連結した。得られたプラスミドｐＢａａｌ３は、２つのメガヌクレアーゼ制限部位（Ｉ−ＳｃｅＩ）に隣接された二重発現カセットを含む。
【００７２】
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にあるａｐｈＩＶとＣａＭＶ３５Ｓポリアデニル化シグナルを含むハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子ａｐｈＩＶ発現カセットを、ＫｐｎＩフラグメントとしてｐＲｉｓｅ（プラスミドＢの構築を参照のこと）から切り出し、ＫｐｎＩで消化したｐＢａａｌ３に連結した。得られたプラスミドｐＢａａｌ４２およびｐＢａａｌ４１は、ｐｓｙ発現カセットと同じ方向に（ｐＢａａｌ４２）または反対の方向に（ｐＢａａｌ４１）、ハイグロマイシン耐性カセットを含む。
【００７３】
ベクターｐＢｉｎ１９（Ｂｅｖａｎ，１９８４）をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、以下の順番の以下の制限部位：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＫｐｎＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＩｓｃｅＩ、ＥｃｏＲＩを含む合成オリゴヌクレオチド配列を標準的なプロトコールを用いて導入して、ｐＢｉｎ１９Ｍを作成した。
【００７４】
ｃｒｔＩ、ｐｓｙ、およびａｐｈＩＶからなる発現カセットを、メガヌクレアーゼ部位Ｉ−ｓｃｅＩを用いてｐＢａａｌ４２から切り出し、Ｉ−ｓｃｅＩで消化した後にｐＢｉｎ１９Ｍに連結した。次いで、結果として得られたプラスミドｐＢ１９ｈｐｃを形質転換に使用した。
【００７５】
ｐＺＣｙｃＨ（本文中では「プラスミドＢ」と呼ぶ）の構築：
グルテリン１プロモーターＧｔ１を、ＥｃｏＲＩ／ＢａｌＩＩを用いてｐＳＫ１（Ｏｋｉｔａら，１９８９）から切り出し、ＢａｍＨＩ／ＭｕｎＩで消化したｐＶ３４（ＦｕｅｔｔｅｒｅおよびＰｏｔｒｙｋｕｓ，未発表）へ２つのＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ部位間に連結して、プラスミドｐＶ３４Ｇｔ１を得た。ＣａＭＶ３５Ｓポリアデニル化シグナルに続いて、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター制御下にあるａｐｈＩＶと、第２のＣａＭＶ３５Ｓポリアデニル化シグナルを含むハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子ａｐｈＩＶ発現カセットを、ＳａｌＩおよびＳａｃＩを用いてｐＣＩＢ９００（Ｗｕｅｎｎら，１９９６）から切り出した。得られたフラグメントのＳａｌＩ部位にＸｈｏＩアダプターを連結した後に、カセットをｐＶ３４Ｇｔ１に連結して、プラスミド（ｐＲｉｃｅ）を得た。Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ由来リコペンシクラーゼｃｙｃ（Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ９８７９６）を、Ｅｃｌ１３６ＩＩおよびＢａｍＨＩを用いてプラスミドｐＧＥＭ４ＣＹＣ（Ｂｏｎｋら，１９９７）から切り出した。クレノウフラグメントで処理した後、ｃｙｃをＥｃｌ３６ＩＩで消化したｐＲｉｃｅに連結して、ｐＲｉｃｅＣＹＣを得た。
【００７６】
ベクターｐＰＺＰ１００（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚら，１９９４）を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、以下の順番の以下の制限部位：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＫｐｎＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＩｓｃｅＩ、ＥｃｏＲＩを含む合成オリゴヌクレオチド配列を標準的なプロトコールを用いて導入し、ｐＰＺＰ１００Ｍを作成した。
【００７７】
ｃｙｃ  ａｐｈＩＶ二重カセットを、ＩｓｃｅＩメガヌクレアーゼを用いてｐＲｉｃｅＣＹＣから切り出し、ＩｓｃｅＩで消化したｐＰＺＰ１００Ｍに連結して、形質転換プラスミドｐＺＣｙｃＨを得た。
【００７８】
カルス誘導および形質転換
カルス誘導：ミルクステージにあるジャポニカ米栽培品種ＴＰ３０９の未熟種子を、温室で生育した植物から収集し、７０％エタノール（ｖ／ｖ）で１分間、表面滅菌し、振盪機の上で６％次亜塩素酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）中で１時間インキュベートし、滅菌蒸留水で３〜５回洗浄した。次いで、未熟胚を、エアフロークリーンベンチ内で両眼顕微鏡下で滅菌種子から単離し、ＮＢ培地（Ｎ６塩およびＢ５ビタミン。３０ｇ／ｌマルトース、５００ｍｇ／ｌプロリン、３００ｍｇ／ｌカゼイン加水分解物、５００ｍｇ／ｌグルタミン、および２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄを添加した。ｐＨ５．８）上で培養した。４〜５日後に子葉鞘を除去し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種まで、膨張した胚盤を新鮮なＮＢ培地上で３〜５日間、二次培養した。
【００７９】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換：１週齢の前培養未熟胚を、記載されているように（Ｕｚｅら，１９９７）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４細胞懸濁液に浸した。２つ別々のベクターｐＺＰｓＣおよびｐＺＣｙｃＨの同時形質転換のために、アセトシリンゴン誘導の後に、等容量のＬＢＡ４４０４／ｐＺＣｙｃＨ（ＯＤ６００＝１．０）と混合したＬＢＡ４４０４／ｐＺＰｓＣ（ＯＤ６００＝２．０）を接種に使用した。接種される前培養胚を、２００ｍＭアセトシリンゴンを添加したＮＢ培地上で３日間、共培養し、再生培地（２５０ｍｇ／ｌセフォタキシムを含むＮＢ）上で１週間、二次培養し、次いで、３０ｍｇ／ｌハイグロマイシンおよび２５０ｍｇ／ｌセフォタキシムの存在下でＮＢ選択培地上に４〜６週間、移した。植物を、０．５ｍｇ／ｌ  ＮＡＡおよび３ｍｇ／ｌ  ＢＡＰを添加したＮＢ培地上で、回収した耐性カルスから４週間で再生させ、発根させ、温室に移した。
【００８０】
サザンブロッティング
トランスジーンの存在を調べるために、サザンブロットを、標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９））に従って、シトエンシンターゼ、ＣｒｔＩ、およびシクラーゼから得られた相同な標識プローブを用いて行った。
【００８１】
カロテノイド色素分析
Ｒ０植物からの種子（１ｇ）の殻をとり、振盪機上でエメリー紙で８時間処理して、種皮を除去した。目視検査により、形質転換された系統は、カロテノイドの存在のために、はっきりと検出できる黄色がかった色を示した。さらに、分離パターンが検出可能であり、場合によっては、期待される３（黄色）：１（白色）の比に非常に近かった。
【００８２】
個々の系統からの種子の合計（各５０個）を、ミクロディスメンブレーター（Ｂｒａｕｎ，Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ）を用いて微粉になるまで粉砕した。これを、完全に脱色するまでアセトンで繰り返し抽出した。混合抽出物を、窒素流下で乾燥させた。残渣をクロロホルムに溶解し、フォトダイオードアレイ検出器とＣ３０逆相カラム（ＹＭＣ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）を備えたＷａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣ装置を用いて定量的にＨＰＬＣ分析にかけた。溶媒系Ａ：ＭｅＯＨ：ｔｅｒｔブチルメチルエーテル（１：１，ｖ／ｖ）Ｂ：ＭｅＯＨ：ｔｅｒｔブチルメチルエーテル：Ｈ２Ｏ（６：１．２：１．２，ｖ／ｖ／ｖ）を使用した勾配（２５分以内で１００％Ｂ〜４３％Ｂ、次いで、さらに７５分以内で４３％Ｂ〜０％Ｂ）を用いて分離を行った。これらの最終条件を、再平衡の前にさらに１０分間維持した。得られた結果の例を、非形質転換対照については図３Ａ、プラスミドＡのみを有する系統については図３Ｂ、プラスミドＡを有する系統については図３Ｃに示す。明らかに、カロテノイドは形質転換体において蓄積される。対照は、時々、微量のカロテノイドを示した。このカロテノイドは、大部分が、完全に除去することが難しい種皮に由来している可能性がある。形質転換種子において検出されたカロテノイドのうち、β−カロテン（プロビタミンＡ）が主な産物（６０％まで）である。さらに、キサントフィル形成経路が活発になり、ルテインおよびゼアキサンチンと若干のエポキシ化カロテノイドの形成につながった。経路の後半部分が形質転換により、または形質転換に由来する産物により誘導されたと結論づけられる。あるいは、キサントフィル形成経路はイネ胚乳において構成的に発現され、キサントフィルであるゼアキサンチンおよびルテインと、その他のより少ない成分であるエポキシ化キサントフィルの形成をもたらした。
【００８３】
プラスミドＡのみで形質転換された系統は、基本的に同じカロテノイドパターンを示した。しかしながら、カロテノイド含有量は、前記の結論がイネ胚乳におけるリコペンシクラーゼに広げられるように、おおむね少なかった。
【００８４】
とりわけ、ルテインおよびゼアキサンチンの存在は、そのプラスの効果（例えば、視覚）のため予想外の付加価値とみなされる（例えば、Ｂｒｏｗｎら，１９８８；Ｓｃｈａｌｃｈ，１９９２を参照のこと）。
【００８５】
本発明の多くの変更および変化は、前記の教示を考慮して明らかに可能である。従って、添付の特許請求の範囲内で、本発明を、詳細に説明された以外に実施できることが理解されるべきである。
【００８６】
植物材料に広範に存在する前駆体ゲラニルゲラニル二リン酸
イネ以外の他の組織におけるＧＧＰＰの存在を試験するために、インキュベーション実験を、２種類のコムギ実験品種、２種類のオオムギ品種、およびＣａｖｅｎｄｉｓｈバナナ果実から単離された胚乳を用いて、イネ胚乳について記載されたものと同様に行った。コムギおよびオオムギの未熟種子の殻をとり、胚乳を押しつぶし、胚を取り出した。インキュベーション実験を、０．５μＣｉ［１−１４Ｃ］イソペンテニル二リン酸の存在下で、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、３ｍＭ  ＡＴＰ中で、２５℃で６時間行った。個々のアッセイに、形成されたプレニル二リン酸の脱リン酸を可能にするアルカリホスファターゼを添加した。３〜６時間後に、対応するプレニルアルコールを含む脂溶性材料を、クロロホルム／メタノール（２／１，ｖ／ｖ）抽出により単離した。この後に、前記のようにＨＰＬＣ分析を行った。
【００８７】
調査したコムギ品種（両方とも本質的にカロテノイドを含まない）からの胚乳では、本物の脱リン酸されたＧＧＰＰ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ由来組換えＧＧＰＰシンターゼを使用して産生された）を用いることによりゲラニルゲラニオールであることが証明された、非常に顕著なシグナルが観察された。従って、プロビタミンＡ生合成の形質転換によるコムギへの導入は、イネと同じくらい実行可能であると思われる。オオムギ胚乳はカロテノイド生合成のいくらか小さなバックグラウンドを示すので、オオムギでは、より少ないが検出可能な量の対応するアルコール形態のＧＧＰＰが観察された。同様に、Ｃａｖｅｎｄｉｓｈバナナはカロテノイドを産生し、従って、成熟段階で際立って観察されるＧＧＰＰ形成活性の存在は驚くべきことではなかった。
【００８８】
ＣＰＴＡ誘導性カロテノイド生合成遺伝子
長く知られているリコペンシクラーゼ阻害剤ＣＰＴＡ（塩酸２−（４−クロロフェニルチオ（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏ））トリエチルアミン）および関連化合物（例えば、Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ  Ｏｓｍａｎら，１９８４；ＦｏｓｋｅｔおよびＲａｄｉｎ、１９８２を参照のこと）は、リコペン蓄積に関して、プラスミドＡによる形質転換を模倣する。カロテノイド生合成遺伝子のアップレギュレーションを証明しようとして、本発明者らは、ＳｃｈｅｕｔｚおよびＢａｌｄｗｉｎ（１９５７）により示された方法に従ってＣＰＴＡを合成し、この化合物を１ｍＭ水溶液でラッパズイセンに加えた。予想通り、この光合成活動をしない組織は、リコペンを蓄積することにより反応を示した。しかしながら、ＣＰＴＡ（阻害剤）の主な作用により説明がつかないが、カロテノイド含有量はほぼ２倍になった。従って、カロテノイド生合成酵素をコードする多量の転写物または多量の酵素の予想される誘導を証明するために、ノザンブロットおよびウェスタンブロット分析を行った。
【００８９】
図５Ａは、ノザンブロットの結果を示す。総ＲＮＡを、未処理（レーン１）およびＣＰＴＡ処理の花から単離した。固定化されたＲＮＡを、フィトエンシンターゼ（Ｂ）、フィトエンデサチュラーゼ（Ｃ）、ζ−カロテンデサチュラーゼ、およびリコペンシクラーゼのプローブとの後のハイブリダイゼーションを可能にするように繰り返しストリップした。ζ−カロテンデサチュラーゼを除く全ての特有のカロテン生成ＲＮＡ（リコペンシクラーゼを含む）が豊富に増加したことは明らかである。
【００９０】
ウェスタンブロット分析（図５Ｂを参照のこと）のために、総タンパク質を未処理およびＣＰＴＡ処理の花から単離し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（１レーンあたり３０μｇタンパク質）の後に、ニトロセルロース膜に移した。ブロットを、フィトエンシンターゼ（Ａ）、フィトエンデサチュラーゼ（Ｂ）、ζ−カロテンデサチュラーゼ（Ｃ）、およびリコペンシクラーゼに対する抗体を用いて発色させた。タンパク質レベルでは、ＣＴＰＡ処理により酵素量が増加することは明らかである。
【００９１】
前記のイネのデータにより、本発明者らは、カロテノイド（またはその誘導産物）が、一種のフィードバック機構においてカロテノイド形成を遺伝的に誘導する可能性があると結論付けている。
【００９２】
従って、本発明は、遺伝子操作により、カロテノイド生合成経路を、カロテノイドを含まない組織に導入するための手段、または既存のカロテノイド生合成経路の生産性を増強するための手段を提供する。前記方法を使用して、種子、果実、塊茎、花、または葉の栄養学的価値、薬理学的性質、または外観を改善することができる。
【００９３】
主として、本発明は、多量のカロテノイドを産生することが特に問題のない場合、栄養上の必要性を改善するのに有用である。例えば、イネは、精米された形では、検出可能な色のついているカロテノイドを含まない胚乳からなる。カロテノイドは、加工中に除去される種皮に存在している。この加工は、イネ穀粒の長期貯蔵を可能にするために必要とされる。
【００９４】
本発明は、カロテノイド生合成経路のｄｅ  ｎｏｖｏ操作の第１の例を示し、カロテノイドを含まない農学上重要な作物の他の組織（例えば、他の穀類種子）、あるいは色のついた、または色のついていないカロテノイドを含まない根組織に適用可能である。これは、既存のカロテノイドを増加させるか、または改善する方法の可能性を除外しない。
【００９６】
引用参照文献
Albrecht ら(1996) Eur. J. Biochern. 236, 115-120
Allisson ら(1986) Virology 154, 9-20
Armstrong ら(1989) Mol. Gen. Genet. 216, 254-268
Armstrong ら(1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9975-9979
Bartley ら(1999) Eur J. Biochem. 259, 396-403
Ballas ら(1989), Nucl. Acids Res. 17, 7891-7903
Bevan ら(1983) Nature 304, 184-187
Bevan (1984) Nucl. Acid Res. 3, 138-140
Bevan ら(1986) Nucl. Acids Res. 14, 4625-4638
Beyer ら(1989) Eur. J. Biochem. 184, 141-150
Bird ら(1991) Biotechnology 9, 635-639
Bonk ら(1997) Eur. J. Biochem, 247, 942-950
Bouvier ら(1989) Biochim. Biophys. Acta 1391 : 320-328
Bouvier ら(1996) J. Biol. Chem. 271, 28861-28867
Bramley ら(1992) Pland J. 2, 343-349
Bray, (1987) Planta 172, 364-370
Britton (1988) Biosynthesis of carotenoids p. 133-182, In T. W. Goodwin (ed.). Plant Pigments, 1988. Academic Press, Inc. (London)
Brown ら(1998) Eye 12, 127-33
Bugos and Yamamoto (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 6320-6325
Burkhardt ら(1997) Plant J. 11, 1071-1078
Chamovitz ら(1991) Plant Mol. Biol. 16, 967-974
Christou ら(1988) Plant Physiol. 87, 671-674
Clark ら(1989), J. Biol. Chem. 264, 17544-17550
Cornejo ら(1993) Plant Molec. Biol. 23, 567-581
Crossway ら(1986) BioTechniques 4, 320-334
Cunningham ら(1996) Plant Cell 8, 1613-26
Cunningham らFEBS Lett. 238, 130-138
Datta ら(1990) Biotechnology 8, 736-740
Della-Cioppa ら(1987) Plant Physiol. 84 : 965-968
Dogbo ら(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 : 7054-7058
Elroy-Stein ら(1989) PNAS USA 86, 6126-6130
El-Sayed ら(1984) Ann. Bot. 53, 21-27
Firek ら(1993) Plant Molec. Biol. 22, 129-142
Fosket and Radin, (1983) Plant Sci. Lett. 30, 165-175
Fray and Grierson (1993) Plant Mol. Biol. 22, 589-602
Fray ら(1995) Plant J. 8, 693-701
Fromm ら(1990) Biotechnology 8, 833-839
Gallie ら(1989) Molecular Biology of RNA, 237-256 (1989)
Gordon-Kamm ら(1990) Plant Cell 2, 603-618
Grant, (1991) The State of the World's Children. Oxford University Press, Oxford
Gruber ら(1993) in: Methods In Plant Molecular Biology And Biotechnology 89-119 (CRC Press).
Guerineau ら(1991) Mol. Gen. Genet. 262, 141-144
Hajdukiewicz ら(1994) Plant Mol. Biol. 25, 989-994
Hinchee ら(1988) Biotechnology 6, 915-921Hoekemann ら. (1983) Nature 303, 179-180
Hoever ら(1994) Trarrsgenle Res. 3, 159-66
Hoshino ら(1993) Appl. Environ. Microbiol. 59, 3150-3153
Hugueney ら(1992) Eur. J. Biochem. 209, 39-407
Humphrey ら(1992). WHO Bulletin 70 : 225-232
Hundle ら(1994) Mol. Gen. Genet. 214, 374-385
Jobling and Gehrke (1987) Nature 325, 622-625
Joshi ら(1987) Nucl. Acids Res. 15, 9627-9639
Kay ら(1987) Science 236, 1299
Kim ら., (1993) Plant Cell Physiol. 34, 595-603
Klein ら(1988a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4305-4309
Klein ら(1988b) Plant Physiol. 91, 440-444
Linden ら(1991) Z. Naturforsch. 46c, 1045-1051
Logemann ら(1989) Plant Cell 1, 151-158
Lommel ら(1991) Virology 81, 382-385
Luehrsen and Walbot (1991) Mol. Gen. Genet. 225, 81-93
Macejak and Sarnow (1991) Nature 353, 90-94
Marin, ら(1996) EMBO J. 15, 2331-2342
Masamoto ら(1998) Plant Cell Physiol 39, 560-4
Mayer ら(1990) Eur. J. Biochem. 191, 359-363
McBride ら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7301-7305
Mc Cabe ら(1988) Biotechnology 6, 923-926
McCormick ら(1986) Plant Cell Reports 5, 81-84
Misawa ら(1990), J. Bacteriol. 172, 6704-6712
Misawa ら(1993) Plant J. 4, 833-840
Mogen ら(1990) Plant Cell 2, 1261-1272
Muller ら(1990) Mol. Gen. Genet. 224, 136-146
Munroe ら(1990); Gene 91, 151-158
Murray ら(1989) Nucl. Acids Res. 17, 477-498
Neuhaus ら(1987) Theor. Appl. Genet. 75, 30-36
Nievelstein ら(1995) Eur. J. Biochem 233, 864-872
Norris ら(1995) Plant Cell 7, 2139-2149
Okita ら(1989) J. Biol. Chem. 264, 12573-12581
Pasamontes ら(1997) Gene 185, 35-41
Pecker ら. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4966-4966
Pedersen ら(1982) Cell 29, 1015-1026
Perlak ら(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3324-3328
Proudfoot, (1991) Cell 64, 671-674
Riggs ら(1986) Proc. Natl. Acad. Sci USA 83, 5602-5606
Rohrmeier and Lehle (1993) Plant Molec. Biol. 22, 783-792
Romer ら(1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196, 1414-1421
Sambrook ら(1989) Molecular Cloning: A Lab. Manual, 2nd, Cold Spring Lab. Press, Cold Spring Harbor
Sanford ら(1987) Particulate Science and Technology 5, 27-37
Sanford らUS-Patent 4,945,050
Sanfacon ら(1991); Genes Dev. 5, 141-149
Schalch W (1992) EXS62, 280-98
Scheutz and Baldwin (1957) Proc. Acad Chenr. USA 80, 162-164
Schledz M. and Beyer P. (1996) Plant Physiol. 110, 336
Schledz ら(1996) Plant J. 10, 781-792
Schulz, ら(1993) FEBSLett. 318, 162-166
Scolnik and Bartley (1995) Plant Physiol. 108, 1342
Shah ら(1986). Science 233, 478-481
Stanford ら(1989), Mol. Gen. Genet. 215, 200-208
Staub and Maliga (1993) EMBO J. 12, 601-606
Sommer (1988) J. Nutr. 119, 96-100
Sun ら(1996) J. Biol. Chem. 271, 24349-52
Svab ら(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530
Svab and Maliga, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917
Thompson ら(1987); EMBO J. 6, 2519-2523
Uze ら(1997) Plant Sci 130, 87-95
Van den Elzen ら(1985) Plant Molecular Biology 5, 299-392
Velten ら(1984) EMBO J. 3, 2723-2730
Von Heijne ら(1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9, 104-126
Wang ら(1988) Plant Mol. Biol. 11, 433-439
Warner ら(1993) Plant J. 3, 191-201
Weissinger ら(1988) Annual Rev. Genet. 22, 421-477
Wuenn ら(1996) Bio Technol. 14, 171-176
Yanish-Perron ら(1985) Gene 33, 103-109
Xu ら(1993) Plant Molec. Biol. 22, 573-588
【図面の簡単な説明】
【図１】  植物カロテノイド生合成の一般経路を示す図である。酵素名を太字で示す。細菌ＣｒｔＩ型カロテンデサチュラーゼにより触媒される反応も示す。
【図２】  中間体ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）はカロテノイド生合成に関与するだけでなく、プレニル化反応を介して異なる化合物（例えば、トコフェロール、キノン、クロロフィル）につながる、または非プレニルアクセプター分子を使用しない別の反応により異なる化合物（例えば、ジベレリン、香料、および芳香物質）につながる経路の構成要素として役立つことも示す図である。
【図３】  形質転換されてない（図３Ａ）イネ植物、および形質転換された（プラスミドＡを使用，図３Ｂ；プラスミドＡとＢを使用，図３Ｃ）イネ植物に由来する精米イネ種子（胚乳）のＨＰＬＣ分析を示す図である。カロテノイド、環状カロテン、およびキサントフィルの出現は、形質転換種子を示すトレースにおいて明らかである。
【図４】  「プラスミドＡ」および「プラスミドＢ」に用いられる発現カセットを模式的に示す図である。ＬＢ，レフトボーダー；ＲＢ、ライトボーダー；ｐｓｙ，Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓに由来するフィトエンシンターゼｃＤＮＡ；ｃｒｔＩ，Ｅｒｗｉｎｉａ  ｕｒｅｄｏｖｏｒａに由来するカロテンデサチュラーゼ遺伝子；ｃｙｃ，Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓに由来するリコペンシクラーゼｃＤＮＡ；ａｐｈＩＶ，ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ；Ｇｔ１，イネグルテリン１プロモーター；３５Ｓ，  ＣａＭＶ  ３５Ｓ  プロモーター；ｎｏｓ，ノパリンシンターゼターミネーター；ＮｐｔＩＩ，カナマイシン耐性遺伝子。
【図５】  Ａ，未処理（レーン１）およびＣＰＴＡ処理（レーン２）ラッパズイセン花に由来するＲＮＡを用いたノザンブロット。Ｂ，フィトエンシンターゼ；Ｂ，フィトエンデサチュラーゼ；Ｃ，ζ−カロテンデサチュラーゼ；Ｅ，リコペンシクラーゼの標識プローブを用いたハイブリダイゼーションを可能にするように、固定化ＲＮＡを繰り返しストリップした。Ｂ，未処理（レーン１）および処理（レーン２）のラッパズイセン花に由来するタンパク質抽出物を用いたウェスタンブロット。ブロットを、Ａ，フィトエンシンターゼ；Ｂ、フィトエンデサチュラーゼ；Ｃ，ζ−カロテンデサチュラーゼ；Ｄ，リコペンシクラーゼに対する抗体を用いてプローブした。
【図１】
0004727043.tif 000002
【図２】
0004727043.tif 000003
【図３】
0004727043.tif 000004
【図４】
0004727043.tif 000005
【図５】
0004727043.tif 000006