(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤感受性試験に使用する培地であって、ブロスと、カルシルムイオンおよびマグネシウムイオンと、精製水と、並びに加熱変性およびフィルタ処理を行って赤色成分および赤血球由来の膜画分を除いた脱線維血とを含有することを特徴とする培地。
【請求項２】
薬剤感受性試験に使用する培地であって、赤色成分および赤血球由来の脱線維血に、加熱変性およびフィルタ処理を行うことにより膜画分を除いた栄養成分を抽出することと、この抽出液から抽出残渣を除去することと、および得られた透明な液体と、ブロス並びに塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含有する水溶液とを混合し、透明な培地を得ることとを具備する製造方法により製造した培地。
【請求項３】
前記脱線維血が血液をヘパリン処理することにより得られる請求項１または２に記載の培地。
【請求項４】
前記ブロスがミューラーヒントブロスである請求項１〜３の何れか１項に記載の培地。
【請求項５】
前記血液がウマ血液である請求項１〜４の何れか１項に記載の培地。
【請求項６】
前記薬剤感受性試験が、最小発育阻止濃度を測定することにより試験である請求項１〜５の何れか１項に記載の培地。
【請求項７】
被検薬剤を含ませた請求項１〜６の何れか１項に記載の培地に被検菌を接種および培養し、当該菌のコロニーの大きさを測定することにより薬剤感受性を判定することを具備する最小発育阻止濃度を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
薬剤感受性試験に使用するための培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床微生物検査では、起因菌の薬剤感受性検査の結果を少しでも迅速に報告することが要求される。しかしながら、微量液体希釈法により最小発育阻止濃度（以下、MICと称する）を測定する場合、正確な結果を得るためには、菌種毎に適切な培地を選択する必要がある。適切な培地を選択する場合、同定検査の終了を待ち、その結果に応じて培地を選択した上で感受性検査を行わなくてはならい。このような段階的な検査を必要とする従来の培地では、十分に迅速な検査結果の報告は期待できない。
【０００３】
現在、一般的に使用される培地は、主に、日本化学療法学会推奨培地（以下、化療培地と略す）と米国臨床検査標準委員会推奨培地（以下、ＮＣＣＬＳ培地と略す）であり、検査する菌種の栄養要求性に応じて、夫々、３種類の培地を用意している。これらのうち、高栄養要求性の菌種の検出用培地には、検査の迅速性を得るために、溶血処理により赤血球を破壊し、そこに含まれる成分を溶出させた血液が使用されている。そのため、培地の透明度が十分ではない。そのため、菌の発育状態の観察が行いにくく、目視判定における個人差が生じ易い。また、吸光度計を使用した場合には、血液添加による培地の着色は、正確な判定を困難する原因となっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記の状況に鑑み、本発明は、全ての菌種に対して良好な発育を保証する薬剤感受性試験用の培地を提供することを目的とする。また、本発明は、透明度の高い薬剤感受性試験用の培地を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明者らは、以下の手段を見出した。即ち、薬剤感受性試験に使用する培地であって、ブロスと、カルシルムイオンおよびマグネシウムイオンと、精製水と、並びに赤色成分および赤血球由来の膜画分を除いた脱線維血とを含有することを特徴とする培地である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の薬剤感受性試験用の培地は、ブロスと、カルシルムイオンと、マグネシウムイオンと、精製水と、並びに赤色成分および赤血球由来の膜画分を除いた脱線維血とを含有することを特徴とする培地である。
【０００７】
本発明で使用するブロスは、一般的に使用される何れのブロスでよいが、日本化学療法学会推奨培地（以下、化療培地と称する）および米国臨床検査標準委員会推奨培地（以下、ＮＣＣＬＳ培地と称する）のＭＩＣ値との相互比較を容易にするため、ミュラーヒントンブロス（ミューラーヒントンブロスまたはミュラーヒントン培地と称することもある。Mueller,et al.:Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,48:330,1941を参照されたい）を使用することが望ましい。本培地中でのブロス含有量は、使用するブロスに応じて適切な濃度で使用すればよい。
【０００８】
カルシウムイオン（Ca2+）は、塩化カルシウムとして添加すればよく、添加濃度の例は、本培地中で塩化カルシウムとして５０ｍｇ／Ｌである。また、マグネシウムイオン（Ma2+）は、塩化マグネシウムとして添加すればよく、添加濃度の例は、本培地中で塩化マグネシウムとして２５ｍｇ／Ｌである。また、培地の調製に使用される精製水は、一般的に培地に使用する際に使用されるグレードで精製された水を使用すればよい。
【０００９】
赤色成分および赤血球由来の膜画分を除いた脱線維血は、以下のような処理により得られた脱線維血を加熱変性およびフィルタ処理を行うことにより、赤色成分および赤血球由来の膜画分を除くことにより得られる。脱線維血は、ウマおよびウサギ等、何れかの動物から採取した血液に対して、全血中のフィブリンの働きを不活化するためのヘパリン処理を行うことにより、非凝固処理した血液をいう。例えば、ウマ血液である場合、採取した血液にでヘパリン処理し、得られた脱線維血を後述する工程に処することにより、目的とする赤色成分および赤血球由来の膜画分を除いた脱線維血を含有する本培地を得ることが可能である。
【００１０】
実施例にて試験結果を示す通り、本発明の培地は、生血液を添加することなく、栄養要求の厳しい菌、例えば、ヘモフィルス菌、肺炎球菌、ナイセリア菌およびブランハメラ菌等の菌に対しても良好な発育を保証する。ここで「生血液」の語は、血液採取の後に如何なる処理も行っていない血液をいう。また、実施例に詳細に記載するが、何れの栄養要求性の菌の本培地における発育、および薬剤存在下での発育は、化療培地およびＮＣＣＬＳ培地と同等である。
【００１１】
また、本発明の培地は、淡黄色透明である。従って、従来の培地に比較して、菌の発育状態を明瞭に観察することが可能である。従って、観察時の個人差や、吸光度計による判定に誤差が生じにくい。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例を示し本発明を更に説明する。
【００１３】
１．培地の製造方法
（１）少量を調製する方法
少量の本発明の培地を製造する方法の例を図１のスキームを用いて説明する（図１）。精製水を用いてミュラーヒントンブロスを１Ｌ調製し、そこにヘパリン処理したウマ脱線維血液の１００ｍＬを添加する。これを混合した後に、加熱変性し、一部分のタンパク変性を行う。冷却した後に精製水を添加し、更にｐＨ６．６に調整する。これを粗濾過し、更に、０．４５μｍのミリポアフィルタにより濾過滅菌する。次に、予め調製し滅菌した５０ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム溶液と、同様に予め調製し滅菌した２５ｍｇ／Ｌの塩化マグネシウム溶液を添加する。これらを混合した後に、０．４５μｍのミリポアフィルタにより濾過滅菌しながら滅菌した所望の瓶に分注し、冷蔵庫内で保存する。
【００１４】
（２）量産する方法
本発明の培地を量産する方法を例を図２のスキームを用いて説明する（図２）。多量に製造する場合には、ウマ脱線維血液とミュラーヒントンブロスを含有する濃縮液と、その他の成分とを別個に調製して混合する。
【００１５】
まず、濃縮液を調製する。ここでは、例として１０倍濃縮液を調製するが、これに限られるものではない。ミュラーヒントンブロスを、使用時の最終濃度の１０倍濃度予め調製し、これと、ヘパリン処理したウマ脱線維血液の最終濃度の１０倍量とを混合し、加熱変性して粗濾過する。続いて、０．４５μｍのミリポアフィルタにより濾過滅菌する。これを濃厚原液として保存する。また、製品化する場合には、精製水により所望する濃度に希釈して出荷することが好ましい。
【００１６】
上記の濃厚原液を用いて、以下の通り、本培地を調製する。上記濃厚原液を、例えば、１０倍濃縮液であれば、１０倍希釈することにより所望する濃度に希釈する。
【００１７】
予め調製し濾過滅菌した５０ｍｇ／Ｌの塩化カルシウムと、同様に予め調製し滅菌した２５ｍｇ／Ｌの塩化マグネシウム溶液とを添加して混合する。これをｐＨ６．６に調整する。これらを混合して溶解する。上記、希釈した濃厚原液を添加する。これらを混合し、０．４５μｍのミリポアフィルタにより濾過滅菌しながら滅菌した所望の瓶に分注し、冷蔵庫内で保存する。
【００１８】
ここで、濃厚原液の調製において、ミュラーヒントンブロスに代わり、塩化ナトリウム溶液を使用すれば、コストを低くすることが可能である。我々は、塩化ナトリウム溶液を使用して調製した培地を用いて菌株を培養した。この結果、ヘモフィルス属菌、連鎖球菌（腸球菌を除く）、ナイセリア菌、ブランハメラ菌等では発育の得られない菌があった。この理由は、塩化ナトリウム溶液では、ウマ血液から赤血球内の成分が抽出できないので栄養要求の厳しい菌にとっての栄養分が足りないことによると考えられた。即ち、塩濃度の上昇に伴って浸透圧も上昇したため、加熱変性を行っても赤血球がパンクしないのである。従って、この場合、浸透圧を低くして赤血球をパンクさせることが必要である。
【００１９】
また、塩化ナトリウム溶液では、培地の濾過滅菌の工程後で不要物が析出して沈殿が生じる。これにより細菌のための栄養物が減ってしまうため、ヘモフィルス属菌、連鎖球菌（腸球菌を除く）、ナイセリア菌およびブランハメラ菌等で発育が得られない菌が生じるという欠点がある。
【００２０】
２．最小発育阻止濃度測定
（１）実験材料および実験方法
上述の（１）または（２）に示した製造方法により調製した本発明の培地を使用して、最小発育阻止濃度（以下、MICと称す）を測定した。同時に、化療培地およびＮＣＣＬＳ培地を使用しての測定も実施し、夫々の結果を比較した。使用した本発明の培地、化療培地およびＮＣＣＬＳ培地の組成の比較を表１に示す。
【００２１】
【表１】
0004779069.tif 000002
【００２２】
ここで、化療培地およびＮＣＣＬＳ培地において、各成分は次の通りである。即ち、ミュラーヒントンブロス１Ｌに対して、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）が２０から２５ｍｇ／Ｌ、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）が１０から１２．５ｍｇ／Ｌ、ウマ溶血液が５０ｍＬ／Ｌ、酵母エキスが５ｇ／Ｌ、ＮＡＤが１５ｍｇ／Ｌおよびウシ血清１５ｍｇ／Ｌである。また、ウマ溶血液は、赤血球を破壊し、赤血球に含まれる成分を溶出させた血液をいう。
【００２３】
薬剤感受性用標準菌株および臨床分離株は、以下の菌株を使用した。また、菌株名の後の括弧内のＡ、ＢおよびＣの語は、表１の栄養要求性による分類の何れの群に属するかを示す。ここでは、便宜的にＡ群はヘモフィルス菌群を示し、Ｂ群は連鎖球菌群、リステリア菌群、ブランハメラ菌群および腸球群を示し、並びにＣ群はその他の菌種を示す。
【００２４】
薬剤感受性用標準菌株は、ヘモフィールス  インフルエンザ(H.influenzae,ATCC49247)(A)、エンテロコッカス  フェカーリス(E.faecalis,ATCC29212)(B)、エッシェリヒア  コリ(E.coli,ATCC25922)(C)、シュードモナス  エルギノーサ(P.aeruginosa,ATCC27853)(C)、スタヒロコッカス  アウレウス(S.aureus,ATCC29213)(C)を使用した。
【００２５】
臨床分離株は、ヘモフィールス  インフルエンザ(H,influenzae)(A)、ストレプトコッカス  ニューモニエ(S.pneumoniae)(B)、リステリア  モノサイトゲネス(L.monocytogenes)(B)、ブランハメラ  カタラーリス(B.catarrhalis)(B)、エンテロコッカス  フェカーリス(E.faecalis)(B)、スタヒロコッカス  アウレウス(S.aureus)(C)、スタヒロコッカス  エピデルミディス(S.epidermidis)(C)、シュードモナス  エルギノーサ(P.aeruginosa)(C)、エッシェリヒア  コリ(E.coli)(C)、サイトロバクター  フレウンディー(C.freundii)(C)、エンテロバクター  クロアカ(E.cloacae)(C)、クレブシエラ  ニューモニエ(K.pneumoniae)(C)、セラチア  マルセッセンス(S.marcescens)(C)、プロテウス  ミラビリス(P.mirabilis)(C)、プロテウス  ブルガリス(P.vulgariss)(C)を使用した（以下、夫々の菌種の属名は、その頭文字により表記することもある）。
【００２６】
使用した薬剤は、アンピシリン(ABPC)、チカルシリン(TIPC)、セファゾリン(CEZ)、セフチゾキシム(CZX)、ゲンタマイシン(GM)、イミペネム(IPM)、エリスロマイシン(EM)、ミノサイクリン(MINO)およびクロラムフェニコール(CP)である。ここで、各薬剤名の後の括弧内のアルファベットは夫々の略語であり、以下、これらの略語により記す。各薬剤は、ドライプレート（栄研化学社製）を使用し、夫々の薬剤に応じて０．０３〜３２μｇ／ｍＬの２倍段階希釈を行って各々の培地に溶解した。
【００２７】
菌株の接種は、ＭＩＣ２０００−ＤＰ１００（長瀬産業社製）を用いて行い、培養は、３５℃で１６から２０時間行った。また、判定は、直径１ｍｍ以下の微小コロニーを菌発育マイナスとして行った。
【００２８】
（２）成績
本培地を用いた薬剤感受性標準株のＭＩＣは、化療標準値に対しては、該３培地共に、±１管差以内の範囲内であり、ＭＩＣが１００％で一致した。また、ＮＣＣＬＳ標準値に対しても、同様に±１管差以内で１００％で一致した。
【００２９】
菌種別での、本培地の化療培地に対するＭＩＣ一致率は、B.カタラーリス(B.catarrahalis)で９１．１％であり、H.インフルエンザ(H.influenzae)で９２．８％であり、更に他の菌種では、９７．２から１００％であった。また、ＮＣＣＬＳ培地の化療培地に対するＭＩＣ一致率は、何れの菌株の場合も、９７．４から１００％であった。
【００３０】
菌種別での、本培地のＮＣＣＬＳ培地に対するＭＩＣ一致率は、B.カタラーリス(B.catarrahalis)で９１．１％であり、H.インフルエンザ(H.influenzae)で９３．７％であり、更に他の菌種では、９５．３から９９．７％であった。また、化療培地のＮＣＣＬＳ培地に対するＭＩＣ一致率は、何れの菌株の場合も、９７．４から１００％であった。
【００３１】
薬剤別での化療培地とのＭＩＣ一致率は、本培地およびＮＣＣＬＳ培地、共に、栄養要求性の非常に高いH.インフルエンザで最も低く、特に、本培地においてはＣＥＺを用いた場合の８２．５％、ＮＣＣＬＳ培地においてはＣＥＺを用いた場合の７９．４％が最低であった。更に、その他の薬剤については、８２．８から１００％で一致した。
【００３２】
更に、３種類の培地の発育支持力を比較した。栄養要求の厳しい３菌種について、経時的に菌数測定を行った結果、菌量のピークは、本培地が最も高かった。使用した３菌種は、H.インフルエンザ、B.カタラーリスおよびS.ニューモニエにである。
【００３３】
以上の結果を纏める。本願の薬剤感受性試験用培地における薬剤感受性用標準菌株のＭＩＣは、化療培地およびＮＣＣＬＳの夫々の３培地に対して１００％で一致した。また、菌種別の一致率は、本培地と化療培地を比較した場合、B.カタラーリスで９１．１％であり、ＮＣＣＬＳ培地と化療培地を比較した場合、H.インフルエンザで９１．１％であった。また、薬剤別では、化療培地と、本発明の培地またはＮＣＣＬＳ培地との一致率は、各培地とも、ＣＥＺを使用した場合に、H.インフルエンザに対して最も低く、６５．５から８２．５％であった。
【００３４】
また、全ての判定において、他の何れの推奨培地と比べても、本培地における発育は明瞭であり、判定を容易に行うことができた。これは、本培地が無色透明に近い淡黄色であることによる。これに対して、他の２種類の推奨培地では、対象となる菌種によっては発育が不明瞭なものがありしばしば判定が困難であった。また、他の２種類の標準培地では、テーリング（tailing）現象も観察され、エンドポイントの判定が困難であった。本培地においては、エンドポイントの判定が容易であり、テーリング現象も少なく判定が容易であった。
【００３５】
【発明の効果】
本発明の薬剤感受性試験用培地は、無色透明に近い淡黄色であるため、発育した菌が明瞭に観察できる。更に、テーリング現象も少ないので、日常検査での判定が容易に行うことが可能である。また、種々の栄養要求性の菌株について同様に発育を可能にするため、同定検査の結果を待たずして、感受性検査を開始でき、検査を効率的且つ迅速に行うことが可能である。従って、本発明の薬剤感受性試験用培地は、栄養要求性に影響されることなく種々の菌種に対し、従来の推奨培地に同等またはそれ以上の発育効果を有し、且つ生育した菌を明瞭に観察することが可能である。
【００３６】
更に、酵母エキスやＮＡＤを添加する必要がないため、低コスト化が実現できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本培地を少量で製造する方法を示すスキーム図。
【図２】本培地を多量で製造する方法を示すスキーム図。
【図１】
0004779069.tif 000003
【図２】
0004779069.tif 000004