(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の塩基配列からなるＲＮＡ分子。
5'-GGGAGAACCAGCUGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUUUUUUUUUUUUUU-3'（配列番号１０）
【請求項２】
請求項１記載のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡをプロモーターの制御下に含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項１記載のＲＮＡ分子または請求項２記載の発現ベクターを有効成分として含む、ＮＳ３プロテアーゼおよび／またはＮＳ３ヘリカーゼを阻害するための薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼおよびヘリカーゼを標的とする新規機能性核酸、該核酸をコードするＤＮＡを含む発現ベクター、および前記核酸または発現ベクターを含む医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）は非Ａ非Ｂ型肝炎の病原体で、慢性肝炎の主要原因であるＲＮＡウイルスである。ＨＣＶ由来の慢性肝炎の約20%は肝硬変、肝臓癌へと移行するため、重篤な肝疾患の要因となっており、その感染者および患者は世界各国において急増している。現在までのところ、Ｃ型肝炎の治療にはインターフェロンが主に用いられている。しかしながら有効な治療薬が存在していないため、その開発が急務とされている。
【０００３】
ＨＣＶは約9,600ヌクレオチドからなるプラス鎖RNAを遺伝子としてもち、フラビウイルス科に分類される。ＨＣＶ遺伝子はまず、3,010アミノ酸からなる前駆蛋白質に変換され、この前駆蛋白質がプロセシングをうけて、ＨＣＶ増殖に必要な構造蛋白質（コア蛋白質；C、外被蛋白質；E1、E2）ならびに非構造蛋白質（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）に変換される。
【０００４】
非構造蛋白質の一つであるNS3の、N末端側の約1/3にコードされているセリンプロテアーゼ（以下、「NS3プロテアーゼ」という）は非構造蛋白質間の切断（４箇所；NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、NS5A/NS5B）に関与している。この蛋白質のプロセシングは、ウイルスの増殖に必要なステップである。また、NS4Aはコファクターとして、すべての切断部位においてNS3プロテアーゼのはたらきを促進している。立体構造解析により、NS3プロテアーゼは、2つのβバレルを有するトリプシン様の構造を持っていることが明らかとなっている。さらにNS4Aとの複合体の構造解析の結果、NS4AはNS3プロテアーゼの活性中心であるN末端側のβバレルに、必須な因子として結合していることが報告されている。
【０００５】
これに対し、NS3のC末端側の約2/3にはヘリカーゼドメイン（以下、「NS3ヘリカーゼ」という）がコードされている。NS3ヘリカーゼは、ヌクレオチド三リン酸に依存して、DNAあるいはRNAの二本鎖をほどくはたらきをする。この酵素は、フラビウイルスファミリーに属するすべての種において見い出されており、ウイルスゲノムの複製に重要なはたらきをしていると考えられている。また、NS3ヘリカーゼは、Poly(U)配列によく結合することが報告されており、この配列はHCV RNAの3'末端にも存在している。また、構造解析により、NS3ヘリカーゼは3つのドメイン（ドメインI、II、III）からなり、それらが割れ目により隔てられた構造をとっていることが明らかにされている。また、デオキシウリジンのオクタマー（dU8）との複合体の構造解析の結果、dU8がこの割れ目に結合することが報告されており、この部分が基質の結合部位と考えられる。
【０００６】
以上のことから、NS3はHCVの増殖に重要な酵素であると考えられる。そのため、NS3プロテアーゼやNS3ヘリカーゼの活性を阻害できるようなものは、強力な抗HCV薬となりうる。すでに本発明者らは、in vitro selection法によって、NS3プロテアーゼに対するアプタマーを得ており、それらはG9-I、G9-II、G9-IIIの3種である（図１）。また、これらは共通配列（5'-GA(A/U)UGGGAC-3'）を持っており、これがループ構造を形成しているものと思われる（図１）。さらに本発明者らは、これらのアプタマーがin vitroにおいて、ΔNS3プロテアーゼに対して特異的に、かつ高い親和性でもって結合し（Kd約10nM）、さらにMBP-NS3（アミノ酸985-1647、110 kDa）のプロテアーゼ活性を約90%阻害することを明らかにしている（特開平11-137252号）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、G9-Iアプタマーの種々の領域に変異を導入した各種変異体を作成し、その機能を解析することにより、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼおよびヘリカーゼを標的とする新規機能性核酸を得ることを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
今回、G9-Iの変異体を数種類作成し、その機能を解析したところ、ステムIとステム-ループIII構造が、ΔNS3のプロテアーゼ活性を阻害するために必要であることが明らかとなった。この領域には、共通配列（5'-GA(A/U)UGGGAC-3'）が含まれている。
【０００９】
本発明者らは、さらにG9アプタマーの機能構造を解析するために、ステムII領域における変異体を作成し、その機能構造相関を調べた。その結果、G9-Iと同等にNS3プロテアーゼを阻害できる最小のアプタマー（ΔNEO-III）を得ることに成功した。そして、最終的にΔNEO-IIIに14U配列を付加させ、新たなRNA分子であるNEO-III-14Uを構築した結果、HCVのNS3プロテアーゼとNS3ヘリカーゼの両方を阻害することに成功した。本発明は、上記の知見に基づき、完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記の塩基配列(1)を有し、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼおよび／またはＮＳ３ヘリカーゼを阻害することができるＲＮＡ分子を提供する。
5'-Ａ−Ｙ−Ｎ−Ｘ−Ｂ-3'    (1)
（配列中、Ａは5'-GGGAGA-3'であり、ＸおよびＹは互いに相補的な塩基数が３〜９個の塩基配列であり、Ｎは塩基数が３〜７個の塩基配列であり、Ｂは5'-UUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCU-3'であるが、但し、Ｎ、ＸおよびＹの塩基配列の塩基数の合計は２２個以下である。）
本発明のＲＮＡ分子は、下記の二次構造(I)をとることができる。
【００１１】
【化２】
0004779089.tif 000002
（二次構造中、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Uはウラシルであり、iは３〜９のいずれかの整数であり、jは３〜７のいずれかの整数であるが、但し、２i＋j≦２２であり、ｎ1〜ｎjは、それぞれ独立に、いずれかの核酸塩基であり、ｘ1〜ｘiおよびｙ1〜ｙiは、それぞれ独立に、いずれかの核酸塩基であるが、但し、ｘkとｙk(ｋ＝1〜i)は互いに相補的な塩基であり、核酸塩基間をつなぐ実線は相補的塩基対の形成を示し、核酸塩基間の黒丸はワブル塩基対の形成を示す。）
ＲＮＡ分子の二次構造は、一般の遺伝情報処理ソフトウェア(Mulfoldプログラム（Zuker, M. (1989) Computer prediction of RNA structure, Methods Enzymol. 180, 202-287.）など）に塩基配列を入力して予測することができ、このような方法で、あるＲＮＡ分子が二次構造(I)をとることが予測された場合に、そのＲＮＡ分子は二次構造(I)をとることができるものとする。あるいはまた、ＲＮＡ分子の二次構造は、RNA分解酵素による限定分解法、化学試薬による修飾法、修飾ヌクレオチド導入と限定分解を組み合わせた修飾干渉法のような実験的な手法で確認してもよい。
【００１２】
上記の塩基配列（１）のＮは塩基数が３〜７個の塩基配列であるが、好ましくは、塩基数が4〜7個の塩基配列である。塩基配列（１）のＸおよびＹは互いに相補的な塩基数が３〜９個の塩基配列であるが、好ましくは、互いに相補的な塩基数が3〜9個の塩基配列である。Ｎ、ＸおよびＹの塩基配列の塩基数の合計は２２個以下であるが、好ましくは、10〜13個である。
【００１３】
上記の二次構造(I)のｎ1ｎ2・・・ｎjは塩基数が３〜７個の塩基配列であるが、好ましくは、塩基数が4〜7個の塩基配列である。二次構造(I)のｘ1ｘ2・・・ｘiおよびy1y2・・・yiは互いに相補的な塩基数が３〜９個の塩基配列であるが、好ましくは、互いに相補的な塩基数が3〜9個の塩基配列である。２ｉ＋ｊは２２以下であるが、好ましくは、10〜13である。
【００１４】
塩基配列（１）および二次構造(I)の３'末端のUの後に、さらに少なくとも14個のU（Uはウラシルである。）を有してもよい。
【００１５】
塩基配列（１）および二次構造(I)の３'末端のUの後に、さらに１個のU（Uはウラシルである。）を有してもよい。
【００１６】
塩基配列（１）および二次構造(I)の３'末端のUの後に、さらに5'-UCCUCUUCU-3'（配列中、Uはウラシルであり、Cはシトシンである。）の塩基配列を有してもよい。
【００１７】
本発明のＲＮＡ分子の例としては、下記の(i)〜(vii)のいずれかの塩基配列を有するものが挙げられる。
(i)  ΔLoopII
5'-GGGAGAAUUCCGAGCUUCGGGAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号４）
(ii) ΔStemII
5'-GGGAGAACCGACCAGAAGCUUCGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号５）
(iii) NEO-I
5'-GGGAGAACCGAGCUUCGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号６）
(iv) NEO-III
5'-GGGAGAACCAGCUGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号７）
(v)  NEO-II
5'-GGGAGAACCGGCUCGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号８）
(vi) ΔNEO-III
5'-GGGAGAACCAGCUGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUU-3'（配列番号９）
(vii) NEO-III-14U
5'-GGGAGAACCAGCUGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUUUUUUUUUUUUUU-3'（配列番号１０）
また、本発明は、上記のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを転写因子の制御下に含む発現ベクターを提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、上記のＲＮＡ分子または上記の発現ベクターを有効成分として含む、医薬組成物を提供する。
【００１９】
本発明の医薬組成物は、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼおよび／またはＮＳ３ヘリカーゼを阻害するために使用することができる。
【００２０】
本発明の医薬組成物は、Ｃ型肝炎を予防および／または治療するために使用することができる。
【００２１】
本発明は、上記のＲＮＡ分子を有効成分として含み、Ｃ型肝炎を診断するための医薬組成物も提供する。
【００２２】
本明細書において、「相補的な塩基配列」とは、互いに塩基対を形成しうるような核酸の塩基配列をいう。塩基対として、ＲＮＡでは、アデニン(A)とウラシル(U)との対合、グアニン(G)とシトシン(C)との対合を例示することができ、また、GとUのワブル塩基対も含まれる。
【００２３】
「アプタマー」とは、アミノ酸のような小分子から蛋白質、さらにはウイルスのような高分子を認識する核酸分子を意味する。
【００２４】
「ステム構造」とは、塩基対合により二本鎖を形成した核酸のステム状の構造をいう。
【００２５】
「ループ構造」とは、一本鎖の核酸によるループ状の構造をいう。例えば、図１にはRNAアプタマーG9-I、G9-IIおよびG9-IIIの二次構造が示されているが、ステム構造の末端に見られるリング状部分がループ構造である。
【００２６】
「ループ−ステム構造」とは、一本鎖のRNAがループとステムを形成した構造をいう。
【００２７】
「転写因子」とは、DNA遺伝情報がRNAへ転写される過程で転写を調節する因子をいう。この因子には、例えば、プロモーターやエンハンサーが含まれる。プロモーターはTATAボックス、GCリッチ反復配列などからなり、ゲノム上のそれらの位置は真核細胞、原核細胞、ウイルスによって異なる。エンハンサーは真核細胞、ウイルスに存在し、プロモーターの上流に存在して、プロモーターからの転写を著しく促進する働きを有する。転写因子にはオペレーターも含むことができ、この場合、任意の誘導物質によって転写をコントロールすることができる。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明を詳細に説明する。
【００２９】
Full-NS3導入ベクターの構築
まず、NS3を完全にカバーする領域である、HCV前駆蛋白質のアミノ酸1027〜1657番をコードするcDNA断片を、pMAN34NSH（Kakiuchi,N. ら (1995) Bacterial expression and analysis of cleavage activity of HCV serine proteinase using recombinant and synthetic substrate, Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 1059-1065.）を鋳型としてPCR法により得た。次にこの断片をベクターpGEMEX-1(Promega)に挿入した。以上のようにして得られたpT7Full-NS3からは、ヒスチジン６残基が付加した完全長NS3が得られ、以下に説明するアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００３０】
蛋白質の発現と精製
NS3プロテアーゼ（ΔNS3; アミノ酸  1027-1218、25 kDa）とマルトース結合性蛋白質を付加させた完全長NS3（MBP-NS3; アミノ酸  985-1647、110 kDa）はすでに報告されている方法（Kakiuchi, N.ら (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 1059-1065.）で大腸菌HB101内で発現させ、精製した。NS3プロテアーゼの基質として用いた、NS5A-5B切断部位を含む17アミノ酸からなるペプチド（S1; Dns GEAGDDIVPC*SMSYTWT  Dns：ダンシル残基、*：切断部位）およびNS4Aペプチド（P41; アミノ酸  1673-1692）も、すでに報告されている方法（Kakiuchi, N.ら (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 1059-1065.）で精製した。
pT7Full-NS3をBL21(DE3)に導入したのち、100 μg/mlのアンピシリンを含むL-ブロース培地中で、600 nmでの吸光度が0.5に達するまで30℃で培養し、さらにその時点から8時間培養した。Full-NS3はT7 RNA polymeraseプロモーターにより発現を調節されている。つぎに培養した大腸菌を遠心（6000回転、15分）し、ペレットをバッファーA[20 mM Tris-HCl (pH7.6)、0.5 M NaCl、5 mMイミダゾール]で懸濁し、さらにマイクロチップ-ホーンを用いてソニケーション（0℃、30秒、10回、インターバルを各回ごとに2分）した。この菌体溶液を遠心（12000回転、30分、4℃）し、上清をバッファーAで平衡化させたNi-NTAカラムにロードした。カラムをバッファーAで洗浄し、5 mMから1 Mのイミダゾールを含むバッファーAで溶出を行った。各フラクション中のFull-NS3は10% SDS-PAGEを行った後、クマシーブリリアントブルー染色により確認した。つぎにFull-NS3を含んだフラクションをTNEバッファー[10 mM Tris-HCl (pH7.6)、50 mM NaCl、1 mM EDTA] で透析し、これをTNEバッファーで平衡化させたポリ(U)-セファロース4Bカラムにロードし、TNEバッファーで洗浄した。溶出は、溶出バッファー[10 mM Tris-HCl (pH7.6)、1 M NaCl、1 mM EDTA]によって行い、先に述べた方法で、Full-NS3を含んだフラクションを選別し、TNEバッファーで透析した。さらにこれをAmicon Centriprep-10を用いて濃縮し、等量のグリセロールを加え、これを以下の実験に用いた。得られたFull-NS3は純度99%以上の高純度なものである。
【００３１】
フィルターバインディングアッセイによる平衡解離定数の決定
機能性RNA（ΔNEO-III、NEO-III-14U）の平衡解離定数（Kd）は、32Pでラベルした一定量のRNAに対し、0.1から700 nMのFull-NS3を結合させて算出した。RNAとFull-NS3を含んだバインディングバッファー[50 mM Tris-HCl (pH7.8)、30 mM NaCl、5 mM CaCl2、10 mM DTT]をニトロセルロース膜に通過させ、膜をバインディングバッファーで1回洗浄した。ニトロセルロース膜の放射活性をもとに、スキャッチャードプロットを行い、解離平衡定数を決定した。
【００３２】
プロテアーゼ活性の測定
まず、RNAとΔNS3とP41をバッファー[50 mM Tris-HCl (pH7.8)、30 mM NaCl、5 mM CaCl2、10 mM DTT]中で、25℃で15分プレインキュベーションした。つぎに、基質であるS1を加え、25℃で、40分（ΔNS3）または80分 (Full-NS3)インキュベートし、最終濃度0.25 NとなるようにNaOH溶液を加えて反応を停止させた。この反応溶液をアセトニトリルの濃度勾配を用いた、逆相クロマトグラフィーカラムにロードした。切断された基質の蛍光シグナルにより、プロテアーゼ活性を算出した。
【００３３】
Full-NS3のヘリカーゼ活性の測定
ヘリカーゼ活性を測定する際にもちいる基質は、バクテリオファージM13mp18 1本鎖DNAと、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて5'末端を[γ-32P]ATPでラベルした30塩基からなる相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることで得た。アニーリングは20 mM Tris-HCl (pH7.8)、0.5 M NaCl、1 mM EDTAの溶液中で、94℃で3分変性させ、その後緩やかに25℃にすることで行った。さらに、Microcon Centrifugal Filter Device YM-50 (MILLIPORE) をもちいたゲルフィルトレーションにより精製し、これをヘリカーゼ活性の測定に使用した。
Full-NS3 1.8 μMをRNAインヒビターとともに、反応液[25 mM MOPS-NaOH (pH7.0)、2.5 mM DTT、100 μg/ml BSA（ウシ血清アルブミン）、3 mM MgCl2、3 mM ATP]中で、室温で20分プレインキュベーションした。このあと2.6 fmolの基質を加え、37℃で30分インキュベーションした。反応の停止は、停止溶液[0.1 M Tris-HCl (pH7.6、20 mM EDTA、0.5% SDS、0.1% Nonidet P-40、0.1% bromophenol blue、 0.1% xylene cyanol、25% glycerol)を加えることで行った。このようにして得られた反応液を0.5xTris-borate-EDTAを含む8% PAGEを行い、BAS2000で基質の2重鎖がほどかれている様子を解析することによりヘリカーゼ活性を算出した。
【００３４】
G9-I RNAの作製
G9-I、およびΔNEO-III-14Uの変異体は、ミュータジェニックプライマーを用いたPCRにより、増幅し、シークエンシングを行うことにより配列を確認した。
【００３５】
G9-Iアプタマーのステム-ループ領域の変異体の解析
G9-I、G9-II、G9-III（G9アプタマー）の二次構造は、Mulfoldプログラムにより推測し、G9アプタマーのステムIとループIIIが共通であることがわかった（図1）。これまでに本発明者らは、ステムIとステム-ループIIIがNS3プロテアーゼ活性の阻害に必須であることを明らかにしている。また、これらの領域中には、ループIIIにおける共通配列（5'-GA(A/U)UGGGAC-3'）を含んでいた（図1、2）。ステムIIの2つの2重鎖を欠失させたΔSII、およびループIIの大半を削除したΔLIIはG9-Iと同等にNS3プロテアーゼに対する阻害活性を持っていた（図2）。このことは、ステム-ループIIがNS3プロテアーゼに対する阻害に関しては、必須でないことを示唆している。しかしながら、ステム-ループIIIがステムIと直接連結しているdRIIは、G9-Iに比べて45%の阻害活性しか保持していなかった。本発明者らはG9-Iをもとに、G9-Iの阻害活性を維持するために最低限必要な共通構造を明らかにするため、さらに3つの変異体（dRII-Δ7A、dRII-Δ7A8U、dRII-Δ7A8U9U；図3）を作製し、その機能を解析した。これらのNS3プロテアーゼ阻害活性はdRIIと同様、G9-Iに比べて弱い阻害活性を示した（図4A）。この結果より、G9-Iと同等のNS3プロテアーゼ阻害活性を持つ変異体は、ステム-ループIIのスペーサー配列の長さを変化させても得られないことが示された。
さらにステム-ループIIの機能について解析するために、この領域に変異を加えたものを作製した。まず、ΔSIIとΔLIIのG9-Iから削除した部分の両方を削除した変異体であるNEO-Iを作製した（図2）。さらにNEO-IのステムIIの2本鎖部を1つずつ欠失させたものであるNEO-IIとNEO-IIIを作製した（図2）。これら3種の変異体のNS3プロテアーゼ阻害活性をしらべたところ、すべてが95％阻害し、G9-Iと同等の機能を維持していることがわかった（図4B）。以上の結果から、G9-Iの機能維持には、ステムIIの領域にいくつかの2重鎖構造が配列非依存的に必要であることが示された。
すでに本発明者らは、G9アプタマーの3'末端の11ヌクレオチドは、ΔNS3の結合には関与していないことを明らかにしている。そこで、今回得たNEO-IIIの3'端の1本鎖部を削除してΔNEO-IIIとし（図2）、その阻害活性を調べた。その結果、G9-Iと同等にΔNS3のプロテアーゼ活性を阻害することがわかった（図4A）。こうして、G9アプタマーと同等の機能をもつ最小のアプタマーが得られた。
【００３６】
NEO-III-14Uの構築とそのターゲットへの結合性
これまでアプタマーのターゲットとして用いてきたFull-NS3は、NS2のC末端側の一部を有し、NS3のC末端側の一部を欠いているものであった。最近になって、NS3ヘリカーゼドメインの最後尾のβ鎖が、プロテアーゼドメインの活性部位と接しており、重要なはたらきをしている可能性があることが報告されたため、より生理的条件に近づけるためには完全なFull-NS3を用いる必要性が示唆された。そのため、本発明者らは今回完全長Full-NS3を精製し、用いた。
NS3ヘリカーゼは、3個のドメインからなり、1本鎖のオリゴヌクレオチドが、ドメインI、IIと、ドメインIIIのあいだの割れ目に結合することが報告されている。中でもホモリボポリマー、特にPoly(U)配列がよく結合し、しかもヘリカーゼ活性を阻害することが報告されている。そこで本発明者らは、HCVのNS3プロテアーゼとNS3ヘリカーゼの両方を阻害することを目的としてΔNEO-IIIの3'端に14U配列を付加させたNEO-III-14Uを構築した。
NEO-III-14Uに付加した(U)14配列の効果を調べるため、ΔNEO-IIIとNEO-III-14UのFull-NS3に対する結合を比較し、Kd値を算出した（図5）。その結果、NEO-III-14U（マル；約10 nM）がG9-I（シカク；約90 nM）とΔNEO-III（ヒシガタ；約90 nM）に比べて、9倍もFull-NS3に対する親和性が高いことが明らかとなった。よって、NEO-III-14Uの(U)14配列は、Full-NSに対する親和性を高めるはたらきをすることが示された。
【００３７】
NEO-III-14UのFull-NS3プロテアーゼ活性阻害効果
NEO-III-14Uに付加した(U)14配列の、Full-NS3プロテアーゼ阻害における効果をしらべるため、ΔNEO-IIIとNEO-III-14UのFull-NS3プロテアーゼに対する阻害活性を測定した（図6）。その結果、NEO-III-14U（マル）がΔNEO-III（ヒシガタ）よりもFull-NS3プロテアーゼ活性を阻害し、Full-NS3の2倍のモル量で約80%阻害することがわかった。また、poly(U)20存在下における同様の反応を解析した結果、Full-NS3プロテアーゼ活性に対する影響は見られなかった（サンカク）。さらにヘリカーゼ活性が、NEO-III-14Uのプロテアーゼ活性阻害効果に対して、負の調節を行うという可能性を否定するために、ATPおよびMg2+の存在下というヘリカーゼが活性化する条件で、NEO-III-14UのFull-NS3プロテアーゼ阻害活性を測定した（シカク）。その結果、NEO-III-14Uは高いプロテアーゼ阻害活性を保持していた。
以上のことから、今回新たに作製したNEO-III-14Uは、in vitroにおいてFull-NS3プロテアーゼを強力に阻害するものであることが示された。
【００３８】
NEO-III-14UによるFull-NS3ヘリカーゼ活性阻害効果
バクテリオファージM13mp 18 1本鎖DNAと、5'末端を[γ-32P]ATPでラベルした30塩基の相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることで得た基質をもちいて、Full-NS3のヘリカーゼ活性を測定した。その結果、基質濃度2.6 fmolに対して、Full-NS3の濃度100 nMでほぼ完全に基質は1本鎖となることがわかった（図7A；レーン2）。つぎにpoly(U)20のFull-NS3ヘリカーゼ活性阻害効果をしらべたところ、poly(U)20がFull-NS3に対して2,000倍量で、Full-NS3ヘリカーゼ活性を50%阻害することがわかった（図7A；レーン7）。さらに、NEO-III-14Uの(U)14配列の、Full-NS3ヘリカーゼ活性阻害における効果をしらべるため、ΔNEO-IIIとNEO-III-14UのFull-NS3ヘリカーゼに対する阻害活性を測定した（図7B）。その結果、NEO-III-14UをFull-NS3の20〜50倍量加えることで、ヘリカーゼ活性をほぼ完全に抑制した（図7B；レーン13、14）。これに対してΔNEO-IIIは、NEO-III-14Uと同量を加えても低い阻害効果しかなかった（図7B；レーン6、7）。これらの結果から、NEO-III-14Uは、NS3プロテアーゼ活性とNS3ヘリカーゼ活性の両方を阻害し、強力にHCVの増殖を抑制できるものと期待できる。
【００３９】
NEO-III-14Uによる、Full-NS3とHCV RNAの3'末端のプラスおよびマイナス鎖との結合の阻害
Full-NS3のヘリカーゼドメインは、HCV RNAの3'末端のプラス鎖およびマイナス鎖と特異的に強く結合することが報告されている。NS3ヘリカーゼは、HCVゲノムの複製にかかわっていると思われていることから、この結合は、ヘリカーゼがHCVの2重鎖をほどくにあたって、重要なステップとなっていることが考えられる。よってこのステップを阻害すればHCVの増殖を抑えることができると思われる。そこでNEO-III-14Uによる、Full-NS3とHCV RNAの3'末端のプラス鎖およびマイナス鎖との結合の阻害を調べた（図8）。
Full-NS3のヘリカーゼドメインは、HCV RNAの3'末端のプラス鎖およびマイナス鎖と特異的に強く結合することが報告されている。NS3ヘリカーゼは、HCVゲノムの複製に関わっていると考えられていることから、この結合は、NS3ヘリカーゼがHCVゲノムの2重鎖をほどくにあたって、重要なステップとなっていることが考えられる。よってこのステップを阻害すればHCVの増殖を抑えることができると思われる。そこでNEO-III-14Uによる、Full-NS3とHCV RNAの3'末端のプラス鎖およびマイナス鎖との結合の阻害能を調べた（図8A、8B）。
まずプローブとして、32p-ラベルしたプラス鎖におけるvariable region-poly(U/C) stretch-3'X region (164ヌクレオチド；3'(+) UTRプローブ)とプラス鎖の1-127に対して相補的な3'(-) UTRプローブを調整した。NEO-III-14U（図 8A. 3'(+) UTRに対して5, 25, 50 and 100 μM、 図8B. 3'(-) UTRに対して10, 50, 100 and 200 μM)を含む反応液（Full-NS3；3'(+) UTRに対して0.2 μM、3'(-) UTRに対して0.4 μM）を、室温で30分間プレインキュベーションした。次に3'(+) UTRプローブ（図 8A. 2.0 μM）もしくは3'(-) UTRプローブ（図 8B. 4.0 μM）をそれぞれの反応液に加えて、30℃で15分間インキュベーションした。反応液をニトロセルロース膜に通過させ、結合活性を解析した。その結果、3'(+) UTRおよび3'(-) UTRに対するFull-NS3の結合は、NEO-III-14Uの濃度上昇とともに阻害された。特に3'(+) UTRにおいては、プローブに対して50当量過剰のNEO-III-14Uを加えると約１５％に抑制された。
【００４０】
アプタマー発現ベクター
上記のG9-I変異体アプタマーをコードするDNAを作製し、これを転写因子を含むベクターに組み込むことによって、G9-I変異体アプタマー発現ベクターを得ることができる。
G9-I変異体アプタマーをコードするDNAは、当業界で周知の核酸の化学的合成法により、例えば、DNA/RNA合成機を用いて製造することができる。また、合成したDNAを鋳型にしてポリメラーゼ連鎖反応（PCR)技術を利用して、あるいは、該DNAを含むベクターによって形質転換された培養宿主細胞中での発現を利用して、該DNAを増幅することができる。PCR技術、形質転換および発現技術は、例えば、J. Sambrookら(Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second edition, 1989)に記載されている。発現系を構築するためのベクターとしては、pUCI9（宝酒造、京都）、pGREEN LANTERN（ライフテックオリエンタル（株）、東京）、pHaMDR(HUMAN GENE THERAPY 6:905-915 (July 1995))などのプラスミドベクター、遺伝子治療用ベクターとしてのアデノウイルスベクターやレトロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス等）などを使用できる。
上記ベクターにおいて、G9-I変異体アプタマーをコードするDNAの上流にはプロモーター配列を含むことができる。プロモーター配列は、G9-I変異体アプタマーの発現を調節する要素であり、ウイルスプロモーター（アデノウイルスVA1プロモーター、SV40プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス即時型初期プロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルスプロモーターなど）、ファージプロモーター（λPLプロモーターなど）、pol IIIプロモーター（ヒトtRNAプロモーター（例えば、tRNAvalプロモーター）など）、β−アクチンプロモーターなどが含まれる。pol IIIプロモーター（特に、tRNAプロモーター）、β−アクチンプロモーターが好ましく使用できる。さらに、転写因子としてプロモーターとエンハンサーの組み合わせを使用してもよい。エンハンサーとしては哺乳類由来、ウイルス由来のものが使用できる。
また、本発明のベクターにおいては、G9-I変異体アプタマーをコードするDNAの下流にターミネーター配列をさらに含むことができる。ターミネーターは、転写を終結させる配列であれば、いずれの配列も使用でき、ターミネーター配列としてUUUUUを使用できる。ベクターは、必要に応じて、抗生物質耐性遺伝子（例えば、Ampr,、Neor)、栄養要求性を相補する遺伝子などの選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子を含むことができる。
【００４１】
医薬組成物
本発明のアプタマーおよび発現ベクターは、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼおよび／またはＮＳ３ヘリカーゼを阻害するために用いることができ、具体的には、Ｃ型肝炎を予防および／または治療するために用いることができる。
HCVに感染した被験者の組織または細胞（例えば、肝臓）に、本発明のアプタマーまたは発現ベクターを導入することによって、細胞中のHCVのＮＳ３プロテアーゼおよび／またはヘリカーゼを阻害し、HCVの増殖を阻止することができる。アプタマーまたは発現ベクターの導入は、例えば、それらをリポソームに封入し、細胞内に取り込む方法（"Lipidic vector systems for gene transfer"(1997) R.J. Lee and L. Huang Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst 14, 173-206；中西守ら、蛋白質  核酸  酵素  Vol.44, No.11, 1590-1596 (1999))、リン酸カルシムム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃による方法などで行うことができる。ベクターを細胞に導入する場合には、例えば、疾患部位の細胞を一部取り出し、in vitroで遺伝子導入を行った後、該細胞を再び組織に戻すことも可能であるし、あるいは、疾患部の組織に直接ベクターを導入することもできる。ウイルスベクターで感染させる場合のウイルスタイターは通常約１０７pfu/ml以上である。遺伝子治療にウイルスベクターを用いる方法については、例えば、"Viral vectors in gene therapy" (1997) A.E. Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807-838に記載されている。
本発明のアプタマーまたは発現ベクターを有効成分として含む医薬組成物は、必要により、医薬上許容される担体（例えば、生理食塩水、緩衝液などの希釈剤）を含むことができる。投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性によるが、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。
また、本発明のアプタマーを用いて、Ｃ型肝炎を診断することができる。本発明のアプタマーを抗体の代わりに利用することができる。本発明のアプタマーを蛍光などで標識しておき、HCVに感染している細胞の抽出液又は細胞をつぶした物と混ぜ、ニトロセルロース膜で濾過する。HCVが細胞内に存在すれば、膜上にトラップされ、検出できる。
【００４２】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４３】
［実施例１］  G9-I変異体アプタマーの作製
変異体アプタマーは後記の各鋳型DNAを用い、試験管内転写法により調製した。試験管内転写は、鋳型DNA（2.5μg）を40 mM Tris-HCl(pH 7.5)、4.0 mM スペルミジン、10 mM DTT、15 mM MgCl2、 0.05% Triton X-100、7.5 mM づつの４種類のNTPの存在下、T7RNAポリメラーゼ（0.08 μg/μl）に加え、全量20 μlで37℃で３時間反応した。反応後、７M尿素−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単離精製した。
(i)ΔloopII
ΔloopII forwardプライマー、
5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAATTCCGAGCTTCGGGATTTGAGGG-3'（配列番号１５）と
reverseプライマー、 5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3'（配列番号１６）を用いた。
G-9IをコードしたDNAを鋳型とし、上記のプライマーを用いてPCRを行った（94℃, 75 sec -> 45℃, 75 sec -> 72℃-> 135 secのサイクルを5回、次いで94℃, 75 sec -> 65℃, 75 sec -> 72℃, 135 secのサイクルを20回）。得られたDNA断片を精製およびクローン化し、配列の確認を行った（M13 universal primerを用い、ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Reaction Kit を用いた）。目的の配列を持ったクローンを鋳型としてPCR断片を獲得し、これらを試験管内転写によりRNAに転写して以下の実験に用いた。
(ii)ΔstemII
ΔstemII forwardプライマー、
5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCGACCAGAAGCTCTGGTTTGAGGG-3'（配列番号１７） と reverseプライマー、5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3'（配列番号１６）を用い、上記 (i) と同様の操作にて変異アプタマー遺伝子を作成し次いで、RNAに転写して以下の実験に用いた。
(iii)NEO-I
合成NEO-I template DNA、
5'- GGGAGAACCGAGCTTCGGTTTGAGGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCTTCCTCTTCT-3'（配列番号１８）とNEO-I forwardプライマー、
5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCGAGCTTCGG-3'（配列番号１９）とreverseプライマー、5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3'（配列番号１６）を用い、PCRを行った（94℃, 75 sec -> 45℃, 75 sec -> 72℃-> 135 secのサイクルを6回、次いで94℃, 75 sec -> 65℃, 75 sec -> 72℃, 135 secのサイクルを12回）。得られたDNA断片を精製およびクローン化し、配列の確認を行った（M13 universal primerを用い、ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Reaction Kit を用いた）。目的の配列を持ったクローンを鋳型としてPCR断片を獲得し、これらをRNAに転写して以下の実験に用いた。
(iv)NEO-III
合成NEO-III template DNA、
5'- GGGAGAACCAGCTGGTTTGAGGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCTTCCTCTTCT-3'（配列番号２０）とNEO-III forwardプライマー、
5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCAGCTGGTTT-3'（配列番号２１） とreverseプライマー、 5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3'（配列番号１６）を用い、上記(iii) と同様の操作にて変異アプタマー遺伝子を作成し次いで、RNAに転写して以下の実験に用いた。
(v)NEO-II
合成NEO-II template DNA、
5'- GGGAGAACCGGCTCGGTTTGAGGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCTTCCTCTTCT 3'（配列番号２２）とNEO-II forwardプライマー、
5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCGGCTCGGTT-3'（配列番号２３） とreverseプライマー、 5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3'（配列番号１６）を用い、上記 (iv) と同様の操作にて変異アプタマー遺伝子を作成し次いで、RNAに転写して以下の実験に用いた。
(vi)ΔNEO-III
合成NEO-III template DNA、
5'- GGGAGAACCAGCTGGTTTGAGGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCT-3'（配列番号２４） とNEO-III forwardプライマー、
5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCAGCTGGTTT-3'（配列番号２１）とΔNEO-III reverseプライマー、 5'-AGGAGAGAGGAAAGGTAGTCC-3'（配列番号２２）を用い、上記(iii) と同様の操作にて変異アプタマー遺伝子を作成し次いで、RNAに転写して以下の実験に用いた。
(vii)NEO-III-14U
合成NEO-III-14U template DNA、
5'- GGGAGAACCAGCTGGTTTGAGGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号２５）とNEO-III forwardプライマー、
5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCAGCTGGTTT-3'（配列番号２１） とΔNEO-III-14U reverseプライマー、 5'- AAAAAAAAAAAAAAGGAGAGAGGAAAGG -3'（配列番号２６）を用い、上記(iii) と同様の操作にて変異アプタマー遺伝子を作成し次いで、RNAに転写して以下の実験に用いた。
【００４４】
［実施例２］  G9-I変異体アプタマーのFull-NS3に対する結合性の測定
機能性RNA（ΔNEO-III、NEO-III-14U）の平衡解離定数（Kd）は、32Pでラベルした一定量のRNAに対し、0.1から700 nMのFull-NS3を結合させて算出した。RNAとFull-NS3を含んだバインディングバッファー[50 mM Tris-HCl (pH7.8)、30 mM NaCl、5 mM CaCl2、10 mM DTT]をニトロセルロース膜に通過させ、膜をバインディングバッファーで1回洗浄した。ニトロセルロース膜の放射活性をもとに、スキャッチャードプロットを行い、解離平衡定数を決定した。
【００４５】
［実施例３］  G9-I変異体アプタマーのFull-NS3プロテアーゼ活性阻害効果の測定
まず、RNAアプタマーとFull-NS3プロテアーゼとP41をバッファー[50 mM Tris-HCl (pH7.8)、30 mM NaCl、5 mM CaCl2、10 mM DTT]中で、25℃で15分プレインキュベーションした。つぎに、基質であるS1（最終濃度49.8 μM）を加え、全量15 μlとし、25℃で、80分インキュベートした。反応は最終濃度0.25 NとなるようにNaOH溶液を加えて停止させた。この反応溶液を逆相HPLC（TSKgel ODS-120T; 4 ml）にロードし、50 mM酢酸アンモニウムバッファー（pH 6.5）を含むアセトニトリルの濃度勾配を用い、溶出、分析した。切断された基質の蛍光シグナルにより、プロテアーゼ活性を算出した。
【００４６】
［実施例４］  G9-I変異体アプタマーのFull-NS3ヘリカーゼ活性阻害効果の測定
ヘリカーゼ活性を測定する際にもちいる基質は、バクテリオファージM13mp18 1本鎖DNAと、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて5'末端を[γ-32P]ATPでラベルした30塩基からなる相補的なオリゴヌクレオチド
5'-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCG-3'（配列番号２７）
をアニーリングさせることで得た。アニーリングは20 mM Tris-HCl (pH7.8)、0.5 M NaCl、1 mM EDTAの溶液中で、94℃で3分変性させ、その後緩やかに25℃にすることで行った。さらに、Microcon Centrifugal Filter Device YM-50 (MILLIPORE) をもちいたゲルフィルトレーションにより精製し、これをヘリカーゼ活性の測定に使用した。
Full-NS3 1.8 μMをRNAインヒビターとともに、反応液[25 mM MOPS-NaOH (pH7.0)、2.5 mM DTT、100 μg/ml BSA（ウシ血清アルブミン）、3 mM MgCl2、3 mM ATP]中（全量20μl）で、室温で20分プレインキュベーションした。このあと2.6 fmolの基質を加え、37℃で30分インキュベーションした。反応の停止は、停止溶液[0.1 M Tris-HCl (pH7.6、20 mM EDTA、0.5% SDS、0.1% Nonidet P-40、0.1% bromophenol blue、 0.1% xylene cyanol、25% glycerol)を加えることで行った。このようにして得られた反応液を0.5xTris-borate-EDTAを含む8% PAGEを行い、BAS2000（富士フィルム）で基質の2重鎖がほどかれている様子を解析することによりヘリカーゼ活性を算出した。
【００４７】
［実施例５］  G9-I変異体アプタマーによる、Full-NS3とHCV RNAの3'末端のプラスおよびマイナス鎖との結合の阻害効果の測定
まずプローブ作製を以下の手順で行った。3'(+) UTRプローブの作製のために、プラス鎖のvariable region-poly U/C stretch-98 nucleotide X region (164ヌクレオチド) に相当するcDNAを、プラスミドp5'IL-3'Xを鋳型として5'-AGTAATACGACTCACTATAGGAACGGGGAGCTAAACACTCC-3'（配列番号２８）と5'-ACATGATCTGCAGAGAGGCC-3'（配列番号２９）のプライマーを用いて増幅した。3'(-) UTRプローブの作製ために、HCV ゲノムの5'UTR (1-127) に相当するcDNAを、プラスミドp5'IL-3'X由来の配列を鋳型として、 5'-TGTAATACGACTCACTATAGGGAGGGGGGGTCCTGGAGG-3'（配列番号３０）と5'-GCCAGCCCCCGATTGGGGG-3'（配列番号３１）のプライマーを用いて増幅した。プライマー配列中の下線は、T７RNA プロモーター配列を意味する。得られた二つのDNA断片を鋳型として、α-32p-CTP (Amersham)の存在下、T7 Ampliscribe kit (Epicentre Technologies)を用いて転写反応を行った。得られたそれぞれの断片を回収し、以下の実験操作に用いた。
NEO-III-14U（図 8A. 3'(+) UTRに対して5, 25, 50 and 100 μM、 図8B. 3'(-) UTRに対して10, 50, 100 and 200 μM)を含む反応液（5 mM HEPES (pH 7.9), 20 mM DTT, 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 0.5% glycerol, 2 mM ATP、15 μg E. coli tRNAそしてFull-NS3；3'(+) UTRに対して0.2 μM、3'(-) UTRに対して0.4 μM）を室温で30分間プレインキュベーションした。次に3'(+) UTRプローブ（図 8A. 2.0 μM）もしくは3'(-) UTRプローブ（図 8B. 4.0 μM）をそれぞれの反応液に加えて（全量25 μl）、30℃で15分間インキュベーションした。反応液をニトロセルロース膜に通過させ、結合活性をBAS2000によって解析した。
【００４８】
【発明の効果】
本発明により、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼおよびヘリカーゼを標的とする新規機能性核酸が提供された。本発明の新規機能性核酸は、Ｃ型肝炎の診断、予防および／または治療に有効である。
【００４９】
【配列表】
0004779089.tif 000003
0004779089.tif 000004
0004779089.tif 000005
0004779089.tif 000006
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0004779089.tif 000011
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0004779089.tif 000015
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【００５０】
【配列表フリーテキスト】
【配列番号１】
配列番号１は、G9-Iの塩基配列を示す。
【００５１】
【配列番号２】
配列番号２は、G9-IIの塩基配列を示す。
【００５２】
【配列番号３】
配列番号３は、G9-IIIの塩基配列を示す。
【００５３】
【配列番号４】
配列番号４は、ΔLoopIIの塩基配列を示す。
【００５４】
【配列番号５】
配列番号５は、ΔStemIIの塩基配列を示す。
【００５５】
【配列番号６】
配列番号６は、NEO-Iの塩基配列を示す。
【００５６】
【配列番号７】
配列番号７は、NEO-IIIの塩基配列を示す。
【００５７】
【配列番号８】
配列番号８は、NEO-IIの塩基配列を示す。
【００５８】
【配列番号９】
配列番号９は、ΔNEO-IIIの塩基配列を示す。
【００５９】
【配列番号１０】
配列番号１０は、NEO-III-14Uの塩基配列を示す。
【００６０】
【配列番号１１】
配列番号１１は、dRIIの塩基配列を示す。
【００６１】
【配列番号１２】
配列番号１２は、dRII-Δ7Aの塩基配列を示す。
【００６２】
【配列番号１３】
配列番号１３は、dRII-Δ7A8Uの塩基配列を示す。
【００６３】
【配列番号１４】
配列番号１４は、dRII-Δ7A8U9Uの塩基配列を示す。
【００６４】
【配列番号１５】
配列番号１５は、ΔloopII forwardプライマーの塩基配列を示す。
【００６５】
【配列番号１６】
配列番号１６は、reverseプライマーの塩基配列を示す。
【００６６】
【配列番号１７】
配列番号１７は、ΔstemII forwardプライマーの塩基配列を示す。
【００６７】
【配列番号１８】
配列番号１８は、NEO-Iを合成するための鋳型DNAの塩基配列を示す。
【００６８】
【配列番号１９】
配列番号１９は、NEO-I forwardプライマーの塩基配列を示す。
【００６９】
【配列番号２０】
配列番号２０は、NEO-IIIを合成するための鋳型DNAの塩基配列を示す。
【００７０】
【配列番号２１】
配列番号２１は、NEO-III forwardプライマーの塩基配列を示す。
【００７１】
【配列番号２２】
配列番号２２は、NEO-IIを合成するための鋳型DNAの塩基配列を示す。
【００７２】
【配列番号２３】
配列番号２３は、NEO-II forwardプライマーの塩基配列を示す。
【００７３】
【配列番号２４】
配列番号２４は、NEO-IIIを合成するための鋳型DNAの塩基配列を示す。
【００７４】
【配列番号２５】
配列番号２５は、NEO-III-14Uを合成するための鋳型DNAの塩基配列を示す。
【００７５】
【配列番号２６】
配列番号２６は、ΔNEO-III-14U reverseプライマーの塩基配列を示す。
【００７６】
【配列番号２７】
配列番号２７は、ヘリカーゼ活性を測定する際に用いた基質の塩基配列を示す。
【００７７】
【配列番号２８】
配列番号２８は、3'(+) UTRプローブの作製のために用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００７８】
【配列番号２９】
配列番号２９は、3'(+) UTRプローブの作製のために用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００７９】
【配列番号３０】
配列番号３０は、3'(-) UTRプローブの作製のために用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００８０】
【配列番号３１】
配列番号３１は、3'(-) UTRプローブの作製のために用いたプライマーの塩基配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  G9-I、G9-IIおよびG9-IIIアプタマーの二次構造を示す。
【図２】  G9-Iアプタマーの変異体の二次構造を示す。
【図３】  G9-Iアプタマーの変異体の二次構造を示す。
【図４】  G9-I変異体のプロテアーゼ活性阻害効果を示す。
【図５】  Full-NS3に対するRNAリガンドの結合曲線を示す。
【図６】  NEO-III-14Uのプロテアーゼ活性阻害効果を示す。
【図７】  NEO-III-14Uのヘリカーゼ活性阻害効果を示す。
【図８】  G9-I変異体アプタマーによる、Full-NS3とHCV RNAの3'末端のプラスおよびマイナス鎖との結合の阻害効果を示す。
【図１】
0004779089.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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