(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生マイタケ、乾燥マイタケ及びマイタケ乾燥粉末のいずれか１以上を水又は熱水で抽出して得られる抽出液に、沈殿が生じない程度にアルコールを加え、放置後液面若しくは液中に浮遊又は容器の壁面に付着する物質を取り除き、得られた抽出物を含有することを特徴とする抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項２】
生マイタケ、乾燥マイタケ及びマイタケ乾燥粉末のいずれか１以上を水又は熱水で抽出して得られる抽出液に、沈殿が生じない程度にアルコールを最終容量濃度が３０〜６０％を目安に加え、放置後液面若しくは液中に浮遊又は容器の壁面に付着する物質を取り除き、次いで該溶液を乾燥したものを含有することを特徴とする抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載の抗インフルエンザウイルス剤を配合してなる抗インフルエンザウイルス用医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマイタケ由来の抗インフルエンザウイルス活性化物質並びに該抗ウイルス活性化物質を含有する食品若しくは医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザはインフルエンザウイルス（A型，B型，C型）の感染によって生ずる急性炎症であり、上気道よりさらに気管支などの下気道の炎症に及ぶことが多く、又気道の症状と共に高熱、倦怠感、頭痛、筋肉痛、関節痛などの全身症状が著明なことである。A型インフルエンザは他の2型に比べ世界的大流行を惹起することで知られている。近年は両型インフルエンザが混在して流行することも少なくないといわれ、A型，B型インフルエンザは肺炎、気管支炎と合併することも少なくなく、又５才以下の年少者では脳炎・脳症を併発する例も報告されている。一方、わが国においては老齢者の増加に伴い，A型，B型インフルエンザの流行の影響は大きく、心・肺疾患保有者も同様に重症化する危険が高い。インフルエンザワクチンの効果についても、インフルエンザウィルスの抗原性が変わりやすいため、効果に揺れを生じ必ずしも所期効果が期待できない場合もあると言われている。
【０００３】
従って、安全かつ入手が容易な天然物若しくはその抽出物から抗インフルエンザウイルス活性物質が得られることが切望されているところである。
【０００４】
【特許文献１】特開平７−６９９１３号公報
【特許文献２】特開平９−２３８６９７号公報
【特許文献３】特開２０００−１１９６５０号公報
【特許文献４】特開２００１−１７２１９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、天然物若しくはその抽出物から抗インフルエンザウイルス活性化物質を取得することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は上記課題を解決するために、各種天然物の抽出物について検討を試み、最近入手が容易になったキノコの一種であるマイタケに注目した。
【０００７】
マイタケ抽出物については、本出願人等の開発努力により多彩な作用が知られており、例えばAIDS症改善効果については特開平７−６９９１３号公報（特許文献１）抗腫瘍作用については、特開平９−２３８６９７号公報(特許文献２)に、活性酸素消去活性については特開２０００−１１９６５０号公報(特許文献３)に、ＮＯ産生誘導作用については特開２００１−１７２１９４号公報(特許文献４)等で報告されている。
【０００８】
本発明者等は、鋭意研究の結果、マイタケの抽出物に抗インフルエンザウイルス活性があることを見出し本発明を完成した。
【０００９】
即ち本発明は
(１)  生マイタケ、乾燥マイタケ及びマイタケ燥乾粉末のいずれか１以上を水乃至熱水で抽出して得られる抽出物からなるマクロファージ存在下における抗インフルエンザウイルス活性化物質、
(２)  生マイタケ、乾燥マイタケ及びマイタケ乾燥粉末のいずれか１以上を水乃至熱水で抽出して得られる抽出液に、アルコールを加え生成する沈殿からなるマクロファージ存在下における抗インフルエンザウイルス活性化物質、
(３)  生マイタケ、乾燥マイタケ及びマイタケ乾燥粉末のいずれか１以上を水乃至熱水で抽出して得られる抽出液に、沈殿が生じない程度にアルコールを加え、放置後液面若しくは液中に浮遊又は容器の壁面に付着する物質を取り除き、次いで該溶液を乾燥したものからなるマクロファージ存在下における抗インフルエンザウイルス活性化物質、
(４)  生マイタケ、乾燥マイタケ及びマイタケ乾燥粉末のいずれか１以上を水乃至熱水で抽出して得られる抽出液に、沈殿が生じない程度にアルコールを加え、放置後液面若しくは液中に浮遊又は容器の壁面に付着する物質を取り除き、次いで更にアルコールを加え生成する沈殿からなるマクロファージ存在下における抗インフルエンザウイルス活性化物質、
(５)  活性発現の機序がTNF-α産生誘導を介してなるものであることを特徴とする(１)乃至(４)記載のマクロファージ存在下における抗インフルエンザウイルス活性化物質、
(６)(１)乃至(５)のいずれか記載の抗インフルエンザウイルス活性化物質を配合してなる食品、
(７)  (１)乃至(５)のいずれか記載の抗インフルエンザウイルス活性化物質を配合してなる医薬品
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、安全かつ容易に入手可能なマイタケ抽出物を用いて、インフルエンザ等感冒の予防或いは罹患後の症状を軽減することができ、食品若しくは薬品として用いることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下本発明について詳述する。
【００１２】
本発明において、マイタケは（Grifola  frondosa）、白マイタケ（Grifola  albicans）、チョレイマイタケ（Dendropolyporus   umbellatus）、トンビマイタケ（Grifola  gigantia）等いづれも用いることが出来る。又これらマイタケ類の子実体、菌糸体いずれも用いることが出来るが、最近ではマイタケの子実体の人工栽培が可能となり、安定した原料確保の面から該マイタケの子実体を使用することが好ましい。
【００１３】
生マイタケは収穫後、出来るだけ新鮮なものを使用することが好ましいが、食に供する状態であれば用いることができる。使用部位は特に特定されることなく茎部以上すべて使用しうる。乾燥マイタケとしては天日、熱風乾燥或いは凍結乾燥したもの等いずれも用いることが出来る。マイタケ乾燥粉末は粒子の粗いものから微細なものまで使用することが出来る。
【００１４】
抽出の方法は水乃至熱水で行う。「水乃至熱水」とは水から熱水に至るまでを意味し、温水も当然包含される。従って抽出は、常温、加温乃至加熱下、常圧乃至加圧下、常法に準じて適宜行いうる。
【００１５】
例えば常温〜１２０℃で５分〜数時間行う。短時間で効率よく行うためには、圧力下、１００℃以上、例えば圧力釜を用いて加圧下１２０℃前後で３０分〜１時間前後抽出を行うのが好ましい。
【００１６】
水としては蒸留水、イオン交換水、逆浸透膜（RO）水、水道水、天然水いずれも使用しうる。乾燥マイタケ若しくは乾燥マイタケ粉末１重量に対して水を４〜３０倍重量程度使用する。生マイタケを使用する場合は１重量に対して２〜１０倍重量程度の水を使用する。
【００１７】
以上の様に水乃至は熱水抽出液はそのまま、更に濃縮して濃縮エキス若しくは濃縮エキスを乾燥して乾燥抽出エキス末として使用することが出来る。
【００１８】
水乃至熱水抽出液はアルコール沈殿法により精製することが可能である。例えばアルコールを抽出液に加え沈殿する物質を採取する。沈殿物はマイタケ中に含まれる高分子多糖体β−グルカンを主体にした画分であり、このまま利用できる。また必要に応じて更に精製することも可能である。例えばアルコールを水乃至熱水抽出液に沈殿が生じない程度に加え、望ましくは1〜２５℃で、放置し生ずる液面、液中に浮遊する物質或いは容器の壁に付着する物資を除去して精製することができる。除去は濾過、吸引或いは網状のもので掬うなど適宜行いうる。
【００１９】
沈殿が生じない程度のアルコールの添加量は、抽出液の濃度や温度により異なり、一概には決めがたいが、アルコールの最終容量濃度が比較的低濃度、即ち約３０〜６０容量％を目安にする。
尚アルコールとしては低級アルコールが使用しうるが、特にエタノールが好ましい。
【００２０】
この様にして得られた溶液は乾燥しても良いし、必要に応じて、アルコールを比較的高濃度、即ち最終容量濃度が６０容量％以上になるよう加え、沈殿する物質を採取する様な手段をとることにより精製することもできる。尚上記乾燥は噴霧乾燥、濃縮乾燥若しくは凍結乾燥等何れの手段も用いうるが、特に噴霧乾燥が好ましい。
【００２１】
以上のように得られた乾燥物若しくは沈殿物は水に可溶で、多糖体であるβ-グルカンを含有する。水溶液とし上述の様にアルコール沈殿法を繰り返すことにより更に精製することも出来るし、更にクロマトグラフイーにより、β-グルカンの純度を高めることも可能である。例えば ゲル濾過法、イオンクロマト法、アフィニティクロマト法等使用することが出来る。
【００２２】
以上のようにして得られた特定のマイタケ抽出物を、インフルエンザウイルスを接種したイヌ腎臓由来のMDCK細胞に、マクロファージ非存在下直接種々の濃度で加え、培養後インフルエンザウイルスの定量を行ったが増殖抑制は殆ど認められなかった。
【００２３】
しかしながら、マクロファージ由来のRAW細胞とマイタケ抽出物を種々時間培養後採取した培養上清を、インフルエンザウイルスを接種したMDCK細胞に加え培養を行ったところ、時間経過とともに、インフルエンザウイルスが濃度依存的に減少していることが認められた。
【００２４】
そして更にマイタケ抽出物で、RAW細胞を刺激したのちTNF-αmRNA発現がマイタケ抽出物の濃度依存的に誘発されていることが、RT-PCR法で明らかになった。また実際にTNF-αmRNAが翻訳されTNF-αが経時的に増加していることがELISA kit を用いて検討して判明した。
【００２５】
以上の結果より、マイタケ抽出物がマクロファージを刺激し、TNF-αを誘発し、抗インフルエンザウイルス活性が惹起されていることが判明した。従って、インフルエンザ等感冒の予防或いは罹患後の症状軽減のための食品若しくは薬品としての応用が可能である。
【００２６】
本発明のマイタケ抽出物質は、毒性がないことが確認されており新しい形の食品として利用できるし又医薬品としても応用できる。
【００２７】
その経口摂取量は成人１日当たり（濃縮乾燥粉末で）５０〜５００ｍｇを目安とするが、必要に応じ増減することができる。
【００２８】
例えば食品として応用する場合は、健康食品、サプリメント、機能性食品として用いることができるが、一般的な食品、例えば菓子・パン類、麺類、調味料、香辛類、食用粉類、乳製品、肉製品、加工水産物、加工果実・野菜、各種飲料・ジュース類、お茶、インスタント食品等に配合することができる。
【００２９】
健康食品、サプリメント、機能性食品又は医薬品として用いる場合は適宜、賦形剤、増量剤を加え錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤、丸剤、液剤、懸濁液剤等各種製剤に加工することができる。
以下に実施例を示すが、本発明はそれらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
抗インフルエンザウイルス活性物質の製造
（１）  乾燥マイタケ子実体の粉末２．５ｋｇにイオン交換水３０Ｌを加圧釜に入れ、加圧下１１５〜１２０℃で約０．５時間処理し、その後濾過して褐色液(A)約２０Ｌを得た。該褐色液（A）５Ｌを取り、減圧下濃縮してBrix濃度２０％の濃縮液を得、該濃縮液をスプレードライ装置を用いて噴霧乾燥して褐色乾燥粉末（マイタケ抽出物［１］）約１５２ｇを得た。
（２）上記（１）で得られた褐色液（A）３Ｌを取り、減圧下、０．５Ｌまで濃縮し室温で９９％エタノールを同容量加え、約１０時間放置して褐色沈殿を回収し、それを減圧乾燥して褐色物質（マイタケ抽出物［2］）５ｇを得た。
（３）上記（１）で得られた褐色液（A）を１０Ｌをとり減圧下約１Ｌまで濃縮し、室温で９９％エタノールを同容量加え、１０℃以下で約１０時間放置すると液面、液中に浮遊及び容器の壁面に付着する茶褐色の物質が生成した。これら物質を除去し、褐色の溶液を得る。該褐色の液約１．９Ｌを減圧下エタノールを除去し、更に濃縮してBrix濃度３５％の濃縮液を得た。該濃縮液をスプレードライ装置を用いて噴霧乾燥して褐色乾燥粉末（マイタケ抽出物［3］）約２３０ｇを得た。
【００３１】
マイタケ抽出物［3］についてラットを用いた急性経口毒性試験において、ＬＤ５０値は２ｇ／ｋｇ以上を示し、毒性を示さなかった。
又Salmonella typhimurium及びEscherichia coli 等細菌を用いた復帰突然変異試験を行った結果、全く変異原性を有しないことが確認された。
【実施例２】
【００３２】
（１）材料の調整
抗インフルエンザウイルス活性検討の実験に用いた材料は以下の通りである。
被験物刺激細胞：マウスマクロファージ由来RAW264.7細胞〔１０％非働化牛胎仔血清加Dulbecco’s MEMで培養したもの〕（以下RAW細胞と称す）を使用。
インフルエンザウイルス感染細胞：MDCK細胞〔8%非働化牛胎仔血清加MEMで培養したもの〕を用いた。
【００３３】
インフルエンザウイルス：infulenza virus A/Aich/2/68(H3N2)〔発育鶏卵漿尿膜腔に接種し、得られた感染漿尿液を活性ウイルス液としてPBSで適宜希釈したもの〕を使用。
被験物質：  実施例１で製造したマイタケ抽出物［1］乃至マイタケ抽出物［3］
以下マイタケ抽出物［3］についての結果を例示する。
【００３４】
（２）抗インフルエンザウイルス活性
Conditioned mediumとして、６ センチデイシュにコンフルエントに培養したRAW細胞を１回serum free DMEDにて洗浄後、種々の濃度のマイタケ抽出物［3］(以下、マイタケ抽出物と省略。)含有培地で培養後、適宜採取した培養上清をConditioned medium(以下ＣＭと省略)として用いた。
【００３５】
増殖試験は、24穴プレートに培養したMDCK細胞に、インフルエンザウイルス液をMOI  5 PFU/cellで接種し、室温にて60分吸着させた後、PBS で３回洗浄し未吸着ウイルスを洗浄除去した。その後種々濃度のマイタケ抽出物を添加して培養したＣＭを加え37℃で培養を開始した。
此の培養開始時を感染０時間とし培養１２時間後のウイルス量をplaque法で定量した。
【００３６】
試験に先立ちマイタケ抽出物のRAW細胞への細胞毒性をMTT法にて検討した。その結果は図１に示す。グラフに示すとおり、RAW細胞をマイタケ抽出物1mg/mlで12時間刺激した場合、コントロールのserum free DMEMに比し、細胞毒性が認められた。しかしながらマイタケ抽出物300μg/ml以下の濃度では細胞毒性は認められなかった。又図には示さないが、マイタケ抽出物300μg/mlはMDCK細胞にも細胞毒性を示さなかった。これらの結果より、以後実験ではマイタケ抽出物の濃度として300μg/ml以下を用いることにした。
【００３７】
結果を図２及び図３に示す。    
図２の左側のグラフで示される様に12時間刺激後のCMを用いた群では、マイタケ抽出物300μg/mlのCM添加のウイルス量は47.7×104PFU/ml、100μg/mlのCM添加のウイルス量は2.5×10６PFU/mlであり、無刺激対照CMのウイルス量を100%とした場合、それぞれ12%,  64%とウイルス量は濃度依存的に減少を示した。
【００３８】
これに対して、右側のグラフは感染したMDCK細胞に直接マイタケ抽出物を添加し、培養後のウイルス量をplaque法で定量した結果で、マイタケ抽出物が300μg/ml、100μg/mlともにDMEMのみのコントロールのウイルス量に比し有意な差は認められなかった。
【００３９】
図３はマイタケ抽出物300μg/mlで刺激し、時間経過に従って採取したCMで同様に増殖実験を行った結果を示す。
【００４０】
この場合、30分及び１時間後に採取したCMを用いた場合、対照コントロールＣＭに対して、有意なウイルス増殖抑制は認められなかった。しかしながら、刺激時間が長くなるにつれて徐々にウイルス量は減少して行き、刺激後20時間のCMを用いたときにはそのウイルス量は50×104PFU/mlとなり、対照の0.6%にまで減少していた。
【００４１】
（３）TNF-αmRNA発現
マイタケ抽出物300μg/ml及び100μg/ml で12時間刺激後のTNF-αmRNA発現の誘発をRT-PCR法で見たところ、図4に示される様に、マイタケ抽出物は濃度依存性にTNF-αmRNAの発現を誘発していることが明らかになった。    
【００４２】
更に、マイタケ抽出物の濃度を300μg/mlと固定してRAW細胞を刺激した時のTNF-αmRNA発現レベルの経時的変化を検討した。
結果を示すと図5の様になる。グラフに示されるように、TNF-αmRNA発現レベルを内部標準として使用したGAPDHにおけるmRNAの発現レベルとの比で見ると、刺激後30分のRAW細胞では、TNF-αmRNA発現は認められなかったが、1時間後より急激に増加し、2時間目でピークに達し、その後徐々にその発現は減少した。
【００４３】
（４）TNF-αの産生
次に、実際にTNF-αmRNAが翻訳され、TNF-αが産生されているかELISA Kitを用いて検討した。
結果を示すと図6のようになる。
【００４４】
グラフ一番右の対照コントロールであるマイタケ抽出物300μg/mlのみの場合において、TNF-α量は僅かながら増加を示した。これに対してマイタケ抽出物300μg/mlでRAW細胞を刺激したCM中のTNF-α量は経時的に増加しており、最大800pg/ml迄増加している。
この結果は先に示したTNF-αｍRNAの発現の経時的変化に一致している。
【００４５】
すなわち、本願発明のマイタケ抽出物がRAW細胞を刺激することによって、TNF-αの産生を誘導し、ひいては抗インフルエンザウイルスの活性を高めることが認められた。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】マイタケ抽出物の細胞毒性を示す図。
【図２】マイタケ抽出物−CM及びマイタケ抽出物直接添加のウイルス増殖抑制効果を示す図。
【図３】マイタケ抽出物−CMにおけるウイルス増殖抑制の経時的変化を示す図。
【図４】マイタケ抽出物刺激RAW細胞におけるTNF-αmRNA発現の検出を示す図。
【図５】マイタケ抽出物刺激RAW細胞におけるTNF-αmRNA発現の経時的変化を示す図。
【図６】RAW細胞におけるTNF-α産生の経時的変化を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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