(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リゾチームを含んでなる水溶液の安定化剤であって、下記一般式（１）で表される化合物（Ａ）及び／又はその塩酸塩（Ｂ）を含んでなるリゾチーム含有水溶液の安定化剤。
【化１】
0004812807.tif 000015
［式（１）中、有機基Ｘは、下記一般式（２）で表されるエステル基又は一般式（３）で表されるＮ−メチルアミド基を表す。有機基Ｙは、下記一般式（４）で表されるＮ−アセチルアミド基又は一般式（５）で表されるジメチルイミノ基を表す。Ｒ1はアルギニン、ヒスチジン又はリシンのα−アミノ酸の側鎖を表す。Ｒ2はメチル基又はエチル基を表し、Ｒ3〜Ｒ6はそれぞれメチル基を表す。］
【化２】
0004812807.tif 000016
【化３】
0004812807.tif 000017
【化４】
0004812807.tif 000018
【化５】
0004812807.tif 000019
【請求項２】
アミノ酸がアルギニンである請求項１に記載のリゾチーム含有水溶液の安定化剤。
【請求項３】
リゾチームを含んでなる水溶液に、下記一般式（１）で表される該化合物（Ａ）及び／又はその塩酸塩（Ｂ）を、リゾチームの水溶液の体積に基づいて（Ａ）及び（Ｂ）の合計濃度が０．００１〜０．５ｍｏｌ／Ｌで含有させることからなるリゾチーム含有水溶液の安定化方法。
【化６】
0004812807.tif 000020
［式（１）中、有機基Ｘは、下記一般式（２）で表されるエステル基又は一般式（３）で表されるＮ−メチルアミド基を表す。有機基Ｙは、下記一般式（４）で表されるＮ−アセチルアミド基又は一般式（５）で表されるジメチルイミノ基を表す。Ｒ1はアルギニン、ヒスチジン又はリシンのα−アミノ酸の側鎖を表す。Ｒ2はメチル基又はエチル基を表し、Ｒ3〜Ｒ6はそれぞれメチル基を表す。］
【化７】
0004812807.tif 000021
【化８】
0004812807.tif 000022
【化９】
0004812807.tif 000023
【化１０】
0004812807.tif 000024
【請求項４】
リゾチームを含んでなる水溶液に、下記一般式（１）で表される該化合物（Ａ）及び／又はその塩酸塩（Ｂ）を、リゾチームの水溶液の体積に基づいて（Ａ）及び（Ｂ）の合計濃度が０．００１〜０．５ｍｏｌ／Ｌで含有させてなるリゾチーム含有水溶液。
【化１１】
0004812807.tif 000025
［式（１）中、有機基Ｘは、下記一般式（２）で表されるエステル基又は一般式（３）で表されるＮ−メチルアミド基を表す。有機基Ｙは、下記一般式（４）で表されるＮ−アセチルアミド基又は一般式（５）で表されるジメチルイミノ基を表す。Ｒ1はアルギニン、ヒスチジン又はリシンのα−アミノ酸の側鎖を表す。Ｒ2はメチル基又はエチル基を表し、Ｒ3〜Ｒ6はそれぞれメチル基を表す。］
【化１２】
0004812807.tif 000026
【化１３】
0004812807.tif 000027
【化１４】
0004812807.tif 000028
【化１５】
0004812807.tif 000029
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶液に含まれるタンパク質の安定化に関する。さらに詳しくは、酵素、組み換えタンパク質、糖タンパク質、ペプチドなどのタンパク質を含有する水溶液に含まれるタンパク質の安定化剤、この安定化剤を共存させるタンパク質の安定化方法、および安定化剤を共存させたタンパク質含有水溶液に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素、糖タンパク質、ペプチドなどのタンパク質は、診断・検査薬、医薬品として広く利用されており、これらの製品においては、製造工程および保存期間中に生理活性（力価）が損なわれないことが重要である。
製造工程及び保存期間中において、安定してタンパク質を取り出し精製するための一つの方法として凍結乾燥が一般的に行われている。タンパク質の多くは熱によって失活しやすい性質を有するが、凍結乾燥法では、熱をかけずにタンパク質を安定化することができる。
しかしながら、凍結乾燥法は、脱水により変性するタンパク質には使用できないこと、凍結乾燥工程中に吸湿や酸化による変質が起こりやすいこと等の難点がある。また、凍結乾燥製剤は使用時に溶媒（溶解液）に溶解して用いられるため、溶媒（溶解液）と組み合わせて供給される場合、試薬をその都度に必要量を調製しなければならないという煩雑さの問題がある。
このような理由からタンパク質を水溶液中で安定化させる技術が公開されている。たとえば、ウレアーゼパーオキシターゼの水溶液の安定化剤として、グリセリンなどの多価  アルコールを含有させたり（たとえば、特許文献１）、コレステロールオキシターゼを含む水溶液に、牛血清アルブミンやグルコース等の糖類あるいはリジン等のアミノ酸を添加する（たとえば、特許文献２）等が挙げられる。
しかし、これらはいずれも特定のタンパク質を安定化させるための方法であり汎用性があるとは言いがたく、タンパク質全般に適用して活性を長期間維持できる汎用的な安定化剤及び安定化方法はなかった。
【０００３】
【特許文献１】特開平６−７０７９８号公報
【特許文献２】特開平８−１８７０９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、水溶液中のタンパク質の変性、変質及び凝集を抑制し、タンパク質の水溶液を長期的に安定化させることができるタンパク質の安定化剤を提供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、リゾチームを含んでなる水溶液の安定化剤であって、下記一般式（１）で表される化合物（Ａ）及び／又はその塩酸塩（Ｂ）を含んでなるリゾチーム含有水溶液の安定化剤；その安定化剤でリゾチームの水溶液を安定化する方法；安定化剤で安定化されたリゾチーム水溶液である。
【０００６】
【化１】
0004812807.tif 000002
【０００７】
［式（１）中、有機基Ｘは、下記一般式（２）で表されるエステル基又は一般式（３）で表されるＮ−メチルアミド基を表す。有機基Ｙは、下記一般式（４）で表されるＮ−アセチルアミド基又は一般式（５）で表されるジメチルイミノ基を表す。Ｒ1はアルギニン、ヒスチジン又はリシンのα−アミノ酸の側鎖を表す。Ｒ2はメチル基又はエチル基を表し、Ｒ3〜Ｒ6はそれぞれメチル基を表す。］
【０００８】
【化２】
0004812807.tif 000003
【０００９】
【化３】
0004812807.tif 000004
【００１０】
【化４】
0004812807.tif 000005
【００１１】
【化５】
0004812807.tif 000006
【発明の効果】
【００１２】
本発明のタンパク質含有水溶液の安定化剤は、水溶液中のタンパク質を安定化し、水溶液中のタンパク質の生理活性が低下しないので医薬品、および生化学の分野において有効に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、酵素、組み換えタンパク質、糖タンパク質及びペプチドからなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質を含んでなる水溶液の安定化剤であって、上記一般式（１）で表される化合物（Ａ）及び／又はその塩（Ｂ）を含んでなるタンパク質含有水溶液の安定化剤である。
【００１４】
すなわち、α−アミノ酸のα−アミノ基とα−カルボキシル基の両方が置換された化学構造のα−アミノ酸誘導体、及び／又はその塩を安定化剤として使用することを特徴とする。
【００１５】
酵素、ペプチドなどのタンパク質を水溶液として保存する際にそのまま保存すると、これらが凝集や加水分解等を起こし力価が著しく低下するという問題点があるが、本発明では、特定の化学構造を有する上記の化合物（Ａ）、及び／又はその塩（Ｂ）を水溶液の安定化剤として添加することにより解決することを見出した。
【００１６】
本発明のタンパク質含有水溶液の安定化剤において、安定化剤として作用させるために存在させる下記一般式（１）で表される化合物（Ａ）は、α−アミノ酸のα−アミノ基とα−カルボンキシル基を置換した誘導体であり、アミノ基の置換は、下記一般式（４）で表されるＮ−アルカノイルアミド基又は一般式（５）で表されるイミノ基への置換であり、カルボキシル基の置換は下記一般式（２）で表されるエステル基又は下記一般式（３）で表されるＮ−アルキルアミド基への置換である。
【００１７】
【化６】
0004812807.tif 000007
【００１８】
式（１）中、有機基Ｘは、下記一般式（２）で表されるエステル基又は一般式（３）で表されるＮ−アルキルアミド基を表す。有機基Ｙは、下記一般式（４）で表されるＮ−アルカノイルアミド基又は一般式（５）で表されるイミノ基；Ｒ1はα−アミノ酸の側鎖を表す。
【００１９】
【化７】
0004812807.tif 000008
【００２０】
式（２）中、Ｒ2は、炭素数１〜３６の炭化水素基、又は多価アルコールもしくは糖から１つの水酸基を除いた残基を表す。
【００２１】
【化８】
0004812807.tif 000009
【００２２】
式（３）中、Ｒ3は、水素原子又は炭素数１〜３６の炭化水素基を表し、この炭化水素基はその一部が他の官能基に置換されていてもよい。
【００２３】
【化９】
0004812807.tif 000010
【００２４】
有機基Ｙは、下記一般式（４）で表されるＮ−アルカノイルアミド基又は一般式（５）で表されるイミノ基である。
【００２５】
式（４）中、Ｒ4は、水素原子、または炭素数１〜３６の炭化水素基を表し、この炭化水素基はその一部が他の官能基に置換されていてもよい。
【００２６】
【化１０】
0004812807.tif 000011
【００２７】
式（５）中、Ｒ5とＲ6はそれぞれ独立に、水素原子、または炭素数１〜３６の炭化水素基を表し、これらの炭化水素基はその一部が他の官能基に置換されていてもよい。
【００２８】
上記一般式（１）中のＲ1は、α−アミノ酸の側鎖を表す。
このα−アミノ酸としては、特に限定されるものではなく、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸などが挙げられる。力価の保持率の観点から、好ましくはアルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン及びグルタミンであり、さらに好ましくはアルギニンである。
【００２９】
上記一般式（１）中の有機基Ｘは、上記一般式（２）で表されるエステル基（Ｘ１）又は一般式（３）で表されるＮ−アルキルアミド基（Ｘ２）を表す。
【００３０】
上記一般式（２）で表されるエステル基（Ｘ１）において、Ｒ2は、炭素数１〜３６の炭化水素基、又は多価アルコールもしくは糖から１つの水酸基を除いた残基を表す。この炭化水素基はその一部が他の官能基、例えば、水酸基、メトキシル基、エトキシル基、ニトロ基、ヒドロキシフェニル基などで置換されていてもよい。
【００３１】
エステルはアルコール性水酸基を持つ物質とのエステルであれば良く、アルコールとのエステル以外に、多価アルコール、糖類とのエステル等も含む。
【００３２】
Ｒ2は、炭素数１〜３６の炭化水素基であり、直鎖もしくは分岐の脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基、並びに芳香族炭化水素基が含まれる。
直鎖の脂肪族炭化水素基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ラウリル基、パルミチル基、ステアリル基、オレイル基及びベヘニル基等が挙げられる。
分岐の脂肪族炭化水素基としては、イソプロピル基、ターシャリーブチル基及びシクロヘキシル基等が挙げられる。
脂環式炭化水素基としては、シクロヘキシル基、メチルシクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基等が挙げられる。
芳香族炭化水素基としては、フェニル基、メチルフェニル基、ベンジル基、フェニルエチル基及びメチルベンジル基等が挙げられる。
これらの炭化水素基のうち、タンパク質含有水溶液の安定化の観点から、直鎖の脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくはメチル基及びエチル基、最も好ましくはエチル基である。
【００３３】
多価アルコールとしては、エチレングリコール及びグリセリン等が挙げられる。
糖としては、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール及びトレハロース等が挙げられる。
【００３４】
上記一般式（３）で表されるＮ−アルキルアミド基（Ｘ２）において、Ｒ3は水素原子、または炭素数１〜３６の炭化水素基を表し、これらの炭化水素基はＲ2と同様に、その一部が他の官能基に置換されていてもよい。
【００３５】
Ｒ3の炭化水素基としては、上記Ｒ2と同様のものが含まれ、これらの炭化水素基のうち、タンパク質含有水溶液の安定化の観点から、直鎖の脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくはメチル基及びエチル基、最も好ましくはメチル基である。
【００３６】
上記一般式（１）中の有機基Ｙは、上記一般式（４）で表されるＮ−アルカノイルアミド基（Ｙ１）又は一般式（５）で表されるイミノ基（Ｙ２）を表す。
上記一般式（４）で表されるＮ−アルカノイルアミド基（Ｙ１）において、Ｒ4は水素原子又は炭素数１〜３６の炭化水素基を表し、これらの炭化水素基はＲ2と同様に、その一部が他の官能基に置換されていてもよい。
【００３７】
Ｒ3の炭化水素基としては、上記Ｒ2と同様のものが含まれ、これらの炭化水素基のうち、タンパク質含有水溶液の安定化の観点から、直鎖の脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくはメチル基及びエチル基、最も好ましくはメチル基である。
【００３８】
Ｎ−アルカノイルアミド基（Ｙ１）としては、ホルムアミド基、アセチルアミド基、プロピオン酸アミド基、ブチル酸アミド基、ヘキシル酸アミド基、シクロヘキシル酸アミド基、オクチル酸アミド基、ベンゾイルアミド基などが挙げられる。
【００３９】
上記一般式（５）で表されるイミノ基（Ｙ２）において、Ｒ5とＲ6はそれぞれ独立に、水素原子、または炭素数１〜３６の炭化水素基を表し、これらの炭化水素基はＲ2と同様に、その一部が他の官能基に置換されていてもよい。
【００４０】
Ｒ3の炭化水素基としては、上記Ｒ2と同様のものが含まれ、これらの炭化水素基のうち、タンパク質含有水溶液安定化の観点から、直鎖の脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくはメチル基及びエチル基、最も好ましくはメチル基である。
【００４１】
イミノ基（Ｙ２）としては、メチルイミノ基などが挙げられる。
【００４２】
本発明における安定化剤として作用する化合物は、前述の化合物（Ａ）以外に、この（Ａ）の塩（Ｂ）であってもよい。たとえば、アルギニン、ヒスチジン、リシン等の、α−アミノ酸の側鎖｛すなわち、式（１）におけるＲ1｝に塩基性のイオン性基を含有する場合は、化合物（Ａ）の無機酸塩又は有機酸塩であってもよい。
また、α−アミノ酸の側鎖に酸性のイオン性基を含有する場合は、化合物（Ａ）の無機塩基塩又は有機塩基塩であってもよい。
【００４３】
無機酸としては、塩酸、硫酸、硝酸及びリン酸等が挙げられる。
有機酸としては、１価の有機酸（例えば乳酸、酢酸及び蟻酸等）、２価の有機酸（例えばアジピン酸及びフタル酸等）及び３価以上の有機酸（例えばクエン酸、トリメリット酸及びピロメリット酸等）等が挙げられる。
無機塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化アンモニウム等が挙げられる。
有機塩基としては、１価のアミン（例えばメチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミン、エタノールアミン及びジエタノールアミン等）、２価のアミン（例えばエチレンジアミン等）及び３価以上のアミン（例えばジエチレントリアミン及びトリエチレンテトラアミン等）等が挙げられる。
【００４４】
塩（Ｂ）の中和度は特に限定されず、完全中和の塩であっても、一部が中和された部分中和塩であっても良い。また、酸又は塩基は１種だけを用いても複数種の混合物を用いても良い。
【００４５】
本発明の安定化剤には緩衝剤及び多価アルコールを含んでもよい。
緩衝剤としては、公知（特開平０８−１８７０９５号公報等に記載）の緩衝剤を使用できる。多価アルコールとしては、グリセリン、ソルビトール及び公知（特開平０８−１８７０９５号公報等に記載）の糖類を使用できる。
【００４６】
化合物（Ａ）及び／又はその塩（Ｂ）を、酵素、組み換えタンパク質、糖タンパク質及びペプチドなどのタンパク質を含有する水溶液に含有させることでタンパク質含有水溶液のタンパク質を安定化できる。
【００４７】
化合物（Ａ）及び／又はその塩（Ｂ）を、酵素、組み換えタンパク質、糖タンパク質、ペプチドなどのタンパク質を含有する水溶液に含有させる場合、（Ａ）及び（Ｂ）の合計含有量は、タンパク質の水溶液の体積に基づいて、タンパク質の活性を長期間にわたって高い保持率で保持できる観点及びコストの観点から、０．００１〜０．５ｍｏｌ／Ｌの濃度で含有することが好ましく、さらに好ましくは０．０１〜０．１、特に好ましくは０．０３３〜０．０４６である。
【００４８】
本発明のタンパク質含有水溶液におけるタンパク質の含有量（重量％）は、タンパク質の安定化の観点からタンパク質含有水溶液の重量に基づいて、０．００１〜１０が好ましく、０．０１〜２がさらに好ましい。
【００４９】
本発明のタンパク質含有水溶液における化合物（Ａ）及びその塩（Ｂ）の合計含有量（重量％）は、タンパク質の安定化の観点から、タンパク質含有水溶液中のタンパク質の重量に基づいて、８〜５０００が好ましく、さらに好ましくは５０〜１０００である。
【００５０】
本発明のタンパク質含有水溶液には、安定化効果を損なわない範囲で、緩衝剤、多価アルコール、金属塩、ゼラチン及び界面活性剤等を添加してもよい。
【００５１】
緩衝剤及び多価アルコールとしては前述のものが使用できる。金属塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム等が使用できる。ゼラチンとしては変性コラーゲンであれば特に限定することなく使用することができる。界面活性剤としては公知（特開２００７−２０４４９８号公報等）に記載の非イオン性界面活性剤等が使用でき、市販のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０等が容易に入手できる。
【００５２】
本発明のタンパク質含有水溶液の安定化剤の使用方法及び本発明の安定化方法の例を以下に説明するが、化合物（Ａ）及び／又はその塩（Ｂ）又は本発明の安定化剤をそのまま、あるいは水に溶かしてタンパク質含有水溶液に加えてもよいし、タンパク質を化合物（Ａ）及び／又はその塩（Ｂ）の水溶液又は本発明の安定化剤の水溶液に加えてもよいし、タンパク質と、化合物（Ａ）及び／又はその塩（Ｂ）又は本発明の安定化剤と、水とを同時に混ぜてもよい。
分離精製工程で分離された酵素の安定化水溶液を作成する場合の一例を以下に挙げる。
１．化合物（Ａ）及び／又はその塩（Ｂ）又は本発明の安定化剤を水に加え、水溶液を作製する。
２．分離精製後の酵素水溶液を上記水溶液に加える。
３．常温（１０〜２５℃）もしくは冷蔵（４℃〜１０℃程度）で密封保存する。
【００５３】
本発明のタンパク質水溶液安定化剤が適用できるタンパク質としては、酵素（Ｐ１）、組み換えタンパク質（Ｐ２）、糖タンパク質（Ｐ３）及びペプチド（Ｐ４）などが含まれる。
【００５４】
酵素（Ｐ１）としては、加水分解酵素、異性化酵素、酸化還元酵素、転移酵素、合成酵素及び脱離酵素などが含まれる。
加水分解酵素としては、リゾチーム、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、グルコアミラーゼなどが挙げられる。
異性化酵素としては、グルコースイソメラーゼが挙げられる。
酸化還元酵素としては、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
転移酵素としては、アシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼなどが挙げられる。
合成酵素としては、脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ、クエン酸シンターゼなどが挙げられる。
脱離酵素としては、ペクチンリアーゼなどが挙げられる。
【００５５】
組み換えタンパク質（Ｐ２）としては、タンパク製剤、ワクチン等が含まれる。
タンパク製剤としては、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン、カルシトニン等が挙げられる。
ワクチンとしては、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン及びインフルエンザワクチン等が挙げられる。
【００５６】
糖タンパク質（Ｐ３）としては、抗体及びホルモン等が含まれる。抗体としてはモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体等が挙げられ、モノクローナル抗体には、パーオキシターゼやアルカリ性フォスファターゼで標識した酵素標識抗体も含まれる。
ホルモンとしては甲状腺刺激ホルモン及び黄体形成ホルモン等が挙げられる。
【００５７】
ペプチド（Ｐ４）としては、アミノ酸の個数が２〜５０個の化合物であり、特にアミノ酸組成を限定するものではなく、ジペプチド、トリペプチドなどが含まれる。
【００５８】
これらのうち、本発明は、タンパク質の安定化の観点から、酵素（Ｐ１）及び組み換えタンパク質（Ｐ２）に好適に適用され、特に（Ｐ１）に適している。
【実施例】
【００５９】
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。なお、以下の記載において、実施例１９〜３８はそれぞれ参考例１〜２０である。
実施例１  （Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステルの合成）
２００ｍＬコルベンにＮ−アセチルアルギニン（エムピー・バイオ社製）１２．６ｇ（
０．０５モル）に、触媒としてメタンスルホン酸１．０ｇと、エタノール９２．０ｇ（２
．０モル）を加え、８０℃で５時間加熱攪拌して反応させた。エバポレーターで濃縮後、
水から再結晶して０．２Ｔｏｒｒで３時間減圧乾燥し、Ｎ−アセチルアルギニン−エチル
エステル８．７ｇ（収率７２％）を得た。核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）で測定した純
度は９９％であった。
【００６０】
実施例２  （Ｎ−アセチルアルギニン−メチルエステルの合成）
実施例１において、エタノールをメタノール６．４ｇ（２．０モル）に変更する以外は実施例１と同様におこない、Ｎ−アセチルアルギニン−メチルエステル８．２ｇ（収率７５％）を得た。純度は９９％であった。
【００６１】
実施例３  （Ｎ−アセチルアルギニン−メチルアミドの合成）
２００ｍＬコルベンにＮ−アセチルアルギニン（エムピー・バイオ社製）１２．６ｇ（０．０５モル）に、触媒として濃塩酸１０ｇを加えて撹拌し、均一化した。ここでＮ−メチルアミン６２ｇ（２．０モル）を加え、６０℃で３時間加熱攪拌して反応させた。エバポレーターで濃縮後、水から再結晶して０．２Ｔｏｒｒで３時間減圧乾燥し、Ｎ−アセチルアルギニン−メチルアミド７．４ｇ（収率６８％）を得た。核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）で測定した純度は９９％であった
【００６２】
実施例４  （Ｎ−ジメチルイミノアルギニン−エチルエステルの合成）
２００ｍＬコルベンにアルギニン（和光純薬製）８．１ｇ（０．０５モル）に、触媒として濃塩酸１．０ｇと、アセトン１１６ｇ（２．０モル）を加え、６０℃で３時間加熱攪拌して反応させた。エバポレーターで濃縮後、水から再結晶して０．２Ｔｏｒｒで３時間減圧乾燥し、Ｎ−ジメチルイミノアルギニン８．２ｇ（収率８１％）を得た。その後、Ｎ−ジメチルイミノアルギニン６．１ｇ（０．０３モル）に、触媒としてメタンスルホン酸１．０ｇと、エタノール９２ｇ（２．０モル）を加え、８０℃で５時間加熱攪拌して反応させた。エバポレーターで濃縮後、水から再結晶して０．２Ｔｏｒｒで３時間減圧乾燥し、Ｎ−ジメチルイミノアルギニン−エチルエステル５．５ｇ（収率８０％）を得た。核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）で測定した純度は９９％であった。
【００６３】
実施例５  （Ｎ−ジメチルイミノアルギニン−メチルアミドの合成）
２００ｍＬコルベンにＮ−ジメチルイミノアルギニン１０．１ｇ（０．０５モル）に、触媒として濃塩酸１０ｇを加えて撹拌し、均一化した。ここでＮ−メチルアミン６２ｇ（２．０モル）を加え、６０℃で３時間加熱攪拌して反応させた。エバポレーターで濃縮後、水から再結晶して０．２Ｔｏｒｒで３時間減圧乾燥し、Ｎ−ジメチルイミノアルギニン−メチルアミド７．１ｇ（収率６６％）を得た。核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）で測定した純度は９９％であった
【００６４】
実施例６  （Ｎ−アセチルヒスチジン−エチルエステルの合成）
２００ｍＬコルベンにヒスチジン（和光純薬製）７．８ｇ（０．０５モル）に、触媒として酢酸７０ｇと、無水酢酸３０．６ｇ（０．３モル）を加え、１０５℃で３時間加熱攪拌して反応させた。エバポレーターで濃縮後、水から再結晶して０．２Ｔｏｒｒで３時間減圧乾燥し、Ｎ−アセチルヒスチジン７．１ｇ（収率７２％）を得た。その後、Ｎ−アセチルヒスチジン５．９ｇ（０．０３モル）に、触媒としてメタンスルホン酸１．０ｇと、エタノール９２ｇ（２．０モル）を加え、８０℃で５時間加熱攪拌して反応させた。エバポレーターで濃縮後、水から再結晶して０．２Ｔｏｒｒで３時間減圧乾燥し、Ｎ−アセチルヒスチジン−エチルエステル５．４ｇ（収率７６％）を得た。核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）で測定した純度は９９％であった。
【００６５】
実施例７  （Ｎ−アセチルリシン−エチルエステルの合成）
２００ｍＬコルベンにリシン（和光純薬製）７．３ｇ（０．０５モル）に、触媒として酢酸７０ｇと、無水酢酸３０．６ｇ（０．３モル）を加え、１０５℃で３時間加熱攪拌して反応させた。エバポレーターで濃縮後、水から再結晶して０．２Ｔｏｒｒで３時間減圧乾燥し、Ｎ−アセチルリシン７．６ｇ（収率８１％）を得た。その後、Ｎ−アセチルリシン５．６ｇ（０．０３モル）に、触媒としてメタンスルホン酸１．０ｇと、エタノール９２ｇ（２．０モル）を加え、８０℃で５時間加熱攪拌して反応させた。エバポレーターで濃縮後、水から再結晶して０．２Ｔｏｒｒで３時間減圧乾燥し、Ｎ−アセチルリシン−エチルエステル５．３ｇ（収率７８％）を得た。核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）で測定した純度は９９％であった。
【００６６】
実施例８  （Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル・塩酸塩の合成）
２００ｍＬコルベンにＮ−アセチルアルギニン−エチルエステル１２．１ｇ（０．０５モル）にイオン水１００ｇを加え溶解させ、３５ｗｔ％濃塩酸２１ｇ（０．２モル）を加えて、３０分撹拌した。エバポレーターで濃縮後、水から再結晶して０．２Ｔｏｒｒで３時間減圧乾燥し、Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル・塩酸塩１２．６ｇ（収率９０％）を得た。核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）で測定した純度は９９％であった。
【００６７】
実施例９
リゾチーム（市販品「リゾチーム」和光純薬製、力価２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）１０ｍｇを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）０．９ｍＬに溶解させ、さらに、予め実施例１のＮ−アセチルアルギニンエチルエステル１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液０．１ｍＬを加え、１分間かき混ぜ本発明のタンパク質含有水溶液（Ｒ−１）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に１．０重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４１ｍｏｌ／Ｌであった。
この（Ｒ−１）の酵素活性（力価）を後述の方法で測定した。
【００６８】
実施例１０
実施例９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例２のＮ−アセチルアルギニン−メチルエステル１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−メチルエステル水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例９と同様に行い、本発明のリゾチーム含有水溶液（Ｒ−２）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に１．０重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルアルギニン−メチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４６ｍｏｌ／Ｌであった。
【００６９】
実施例１１
実施例９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例３のＮ−アセチルアルギニン−メチルアミド１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−メチルアミド水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例９と同様に行い、本発明のリゾチーム含有水溶液（Ｒ−３）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に１．０重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルアルギニン−メチルアミドの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４６ｍｏｌ／Ｌであった。
【００７０】
実施例１２
実施例９において、１０％重量Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例４のＮ−ジメチルイミノアルギニン−エチルエステル１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−メチルイミノアルギニン−エチルエステル水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例９と同様に行い、本発明のリゾチーム含有水溶液（Ｒ−４）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に１．０重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−ジメチルイミノアルギニン−エチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４３ｍｏｌ／Ｌであった。
【００７１】
実施例１３
実施例９において、１０％重量Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例５のＮ−ジメチルイミノアルギニン−メチルアミド１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−ジメチルイミノアルギニン−メチルアミド水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例９と同様に行い、本発明のリゾチーム含有水溶液（Ｒ−５）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に１．０重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−ジメチルイミノアルギニン−メチルアミドの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４７ｍｏｌ／Ｌであった。
【００７２】
実施例１４
実施例９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例６のＮ−アセチルヒスチジン−エチルエステル１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−アセチルヒスチジン−エチルエステル水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例９と同様に行い、本発明のリゾチーム含有水溶液（Ｒ−６）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に１．０重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルヒスチジン−エチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４３ｍｏｌ／Ｌであった。
【００７３】
実施例１５
実施例９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例７のＮ−アセチルリシン−エチルエステル１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−アセチルリシン−エチルエステル水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例９と同様に行い、本発明のリゾチーム含有水溶液（Ｒ−７）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に１．０重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルリシン−エチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４４ｍｏｌ／Ｌであった。
【００７４】
実施例１６
実施例９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例８のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステル・塩酸塩１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル・塩酸塩水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例９と同様に行い、本発明のリゾチーム含有水溶液（Ｒ−８）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に１．０重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステル・塩酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０３６ｍｏｌ／Ｌであった。
【００７５】
実施例１７
実施例９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例１のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステル０．１ｇをイオン交換水４９．９ｇに撹拌混合して溶解させておいた０．２重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例９と同様に行い、本発明のリゾチーム含有水溶液（Ｒ−９）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に１．０重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．００１ｍｏｌ／Ｌであった。
【００７６】
実施例１８
実施例９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、実施例１のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステル１．２１ｇをそのまま使用する以外は実施例９と同様に行い、本発明のリゾチーム含有水溶液（Ｒ−１０）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に１．０重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．５０ｍｏｌ／Ｌであった。
【００７７】
比較例１
実施例９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させた牛血清アルブミン（和光純薬製）の水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例９と同様に行い、リゾチーム含有水溶液（Ｒ’−１）を得た。
【００７８】
比較例２
実施例９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたグルコース（和光純薬製）の水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例９と同様に行い、リゾチーム含有水溶液（Ｒ’−２）を得た。
【００７９】
比較例３
実施例９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたグリセリン（和光純薬製）の水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例９と同様に行い、リゾチーム含有水溶液（Ｒ’−３）を得た。
【００８０】
比較例４
実施例９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたアルギニン・塩酸塩（和光純薬製）の水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例９と同様に行い、リゾチーム含有水溶液（Ｒ’−４）を得た。
【００８１】
比較例５
実施例９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたアルギニンエチルエステル（エムピーバイオ社製）の水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例９と同様に行い、リゾチーム含有水溶液（Ｒ’−５）を得た。
【００８２】
＜リゾチーム含有水溶液の酵素活性（力価）の測定＞
実施例９〜１８及び比較例１〜５で得られたリゾチーム含有水溶液（Ｒ−１）〜（Ｒ−１０）及び（Ｒ’−１）〜（Ｒ’−５）が入った容積１．５ｍＬのエッペンドルフチューブを８０℃に温調した振とう器付き恒温槽で３０分インキュベートし、各溶液５０μＬを、２％枯草菌懸濁液（２０％枯草菌懸濁液２ｍｌに５０ｍＭリン酸緩衝液１８ｍＬを加えて前もって調製したもの）１ｍＬと５０ｍＭリン酸緩衝液２ｍＬとが入った試験管に加えた。加えた直後の４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ0）を分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定し、さらに測定開始から５分後にもう一度吸光度（Ａ5）を測定し、これらの４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化（ΔＡ）を以下の式で算出した。
ΔＡ＝Ａ5−Ａ0
【００８３】
また、実施例９〜１８及び比較例１〜５のリゾチーム水溶液のリゾチーム濃度と同濃度の市販品「リゾチーム」の水溶液で他に添加剤を加えないブランクの水溶液を調製し、これを用いて上記と同様に測定し、４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化（ΔＡb）を測定し算出した。
ΔＡb＝Ａb5−Ａb0
【００８４】
８０℃で３０分間保管後の各リゾチーム含有水溶液の「力価の保持率」は以下の式を用いて算出した。
【００８５】
力価の保持率（％）＝（ΔＡ／ΔＡb） ×１００
【００８６】
上記実施例及び比較例の力価の保持率を表１に示す。
【００８７】
【表１】
0004812807.tif 000012
【００８８】
従来から使用されている安定化剤を用いた比較例１〜３は、酵素含有水溶液の安定化効果がまだ不十分であることがわかる。また、アルギニンやアルギニンアルキルエステルを使用した比較例４及び比較例５では、安定化効果が高まり、比較例１〜３に比べて力価の保持率が改善されるものの、依然として十分な効果が得られなかった。一方、アルギニン等のα−アミノ酸のα−アミノ基及びα−カルボキシル基を置換した本発明の化合物及びその塩を使用した実施例９〜１８の安定化剤の力価の保持率は非常に高いことがわかる。
【００８９】
実施例１９
遺伝子組換えインターフェロンβ（和光純薬工業製、マウス由来）１００μｇをイオン水１００μＬに溶解させ、この水溶液１００μＬに、予め実施例１のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステル１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液１０μＬを加えて軽く振り混ぜて均一化し本発明のインターフェロンβ水溶液（Ｉ−１）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０３８ｍｏｌ／Ｌであった。
この（Ｉ−１）の活性（力価）を後述の方法で測定した。
【００９０】
実施例２０
実施例１９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例２のＮ−アセチルアルギニン−メチルエステル１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−メチルエステル水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１９と同様に行い、本発明のインターフェロンβ水溶液（Ｉ−２）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルアルギニン−メチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４２ｍｏｌ／Ｌであった。
【００９１】
実施例２１
実施例１９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例３のＮ−アセチルアルギニン−メチルアミド１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−メチルアミド水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１９と同様に行い、本発明のインターフェロンβ水溶液（Ｉ−３）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルアルギニン−メチルアミドの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４２ｍｏｌ／Ｌであった。
【００９２】
実施例２２
実施例１９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例４のＮ−ジメチルイミノアルギニン−エチルエステル１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−ジメチルイミノアルギニン−エチルエステル水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１９と同様に行い、本発明のインターフェロンβ水溶液（Ｉ−４）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−ジメチルイミノアルギニン−エチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４０ｍｏｌ／Ｌであった。
【００９３】
実施例２３
実施例１９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例５のＮ−ジメチルイミノアルギニン−メチルアミド１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−ジメチルイミノアルギニン−メチルアミド水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１９と同様に行い、本発明のインターフェロンβ水溶液（Ｉ−５）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−ジメチルイミノアルギニン−メチルアミドの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４２ｍｏｌ／Ｌであった。
【００９４】
実施例２４
実施例１９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例６のＮ−アセチルヒスチジン−エチルエステル１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−アセチルヒスチジン−エチルエステル水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１９と同様に行い、本発明のインターフェロンβ水溶液（Ｉ−６）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルヒスチジン−エチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０３９ｍｏｌ／Ｌであった。
【００９５】
実施例２５
実施例１９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例７のＮ−アセチルリシン−エチルエステル１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−アセチルリシン−エチルエステル水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１９と同様に行い、本発明のインターフェロンβ水溶液（Ｉ−７）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルリシン−エチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４０ｍｏｌ／Ｌであった。
【００９６】
実施例２６
実施例１９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例８のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステル・塩酸塩１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル・塩酸塩水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１９と同様に行い、本発明のインターフェロンβ水溶液（Ｉ−８）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステル・塩酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０３３ｍｏｌ／Ｌであった。
【００９７】
実施例２７
実施例１９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例１のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステル０．１ｇをイオン交換水４９．９ｇに撹拌混合して溶解させておいた０．２重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例１９と同様に行い、本発明のインターフェロンβ水溶液（Ｉ−９）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．００１ｍｏｌ／Ｌであった。
【００９８】
実施例２８
実施例１９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、実施例１のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステル１．２１ｇをそのまま使用する以外は実施例１９と同様に行い、本発明のインターフェロンβ水溶液（Ｉ−１０）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．５０ｍｏｌ／Ｌであった。
【００９９】
比較例６
実施例１９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させた牛血清アルブミン（和光純薬製）の水溶液０．１ｍLを使用する以外は実施例１９と同様に行い、インターフェロンβ水溶液（Ｉ’−１）を得た。
【０１００】
比較例７
実施例１９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたグルコース（和光純薬製）の水溶液０．１ｍLを使用する以外は実施例１９と同様に行い、インターフェロンβ水溶液（Ｉ’−２）を得た。
【０１０１】
比較例８
実施例１９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたグリセリン（和光純薬製）の水溶液０．１ｍLを使用する以外は実施例１９と同様に行い、インターフェロンβ水溶液（Ｉ’−３）を得た。
【０１０２】
比較例９
実施例１９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたアルギニン・塩酸塩（和光純薬製）の水溶液０．１ｍLを使用する以外は実施例１９と同様に行い、インターフェロンβ水溶液（Ｉ’−４）を得た。
【０１０３】
比較例１０
実施例１９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたアルギニンエチルエステル（エムピーバイオ社製）の水溶液０．１ｍLを使用する以外は実施例１９と同様に行い、インターフェロンβ水溶液（Ｉ’−５）を得た。
【０１０４】
＜インターフェロンβ水溶液の活性（力価）の測定＞
実施例１９〜２８及び比較例６〜１０で得られたインターフェロン水溶液（Ｉ−１）〜（Ｉ−１０）及び（Ｉ’−１）〜（Ｉ’−５）を恒温槽中で３７℃、３時間インキュベートし、この水溶液５０μＬを、インターフェロンβ  ＥＬＩＳＡキット（「インターフェロンβ  ＥＬＩＳＡキット」、鎌倉テクノサイエンス社製）を用いて、力価を測定した。力価はインターフェロンに作用する酵素標識抗インターフェロンモノクローナル抗体の酵素活性で評価した。酵素活性はキットに添付の説明書に従い、分光光度計で吸光度読み取り検量線を作成し、検量線から各サンプルの力価を算出した。
また、インターフェロン水溶液（Ｉ−１）〜（Ｉ−１０）及び（Ｉ’−１）〜（Ｉ’−５）を恒温槽でインキュベートする前に上記と同様に測定し、別途力価を算出した。
力価の保持率は、以下の式で計算した。
力価の保持率＝（インキュベート後の力価）／（インキュベート前の力価）×１００
【０１０５】
上記実施例及び比較例の力価の保持率を表２に示す。
【０１０６】
【表２】
0004812807.tif 000013
【０１０７】
従来から使用されている安定化剤を用いた比較例６〜８は、組換えタンパク質含有水溶液の安定化効果がまだ不十分であることがわかる。また、アルギニンの無機酸塩を使用した比較例９及びアルギニンのアルキルエステルを使用した比較例１０では、安定化効果が高まり、比較例６〜８に比べて力価の保持率が改善されるものの、依然として十分な効果が得られなかった。一方、アルギニン等のα−アミノ酸のα−アミノ基及びα−カルボキシル基を置換した本発明の化合物及びその塩を使用した実施例１９〜２８の安定化剤の力価の保持率は非常に高いことがわかる。
【０１０８】
実施例２９
西洋ワサビ由来ペルオキシターゼ標識抗ヒトインターフェロンβマウスモノクローナル抗体溶液（鎌倉テクノサイエンス社製１００μＬに、予め実施例１のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステル１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液を１０μＬを加えて軽く振り混ぜて均一化して本発明のモノクローナル抗体水溶液（Ｍ−１）を得た。
この（Ｍ−１）の活性（力価）を後述の方法で測定した。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０３８ｍｏｌ／Ｌであった。
【０１０９】
実施例３０
実施例２９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例２のＮ−アセチルアルギニン−メチルエステル１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−メチルエステル水溶液１０μＬを使用する以外は実施例２９と同様に行い、本発明のモノクローナル抗体水溶液（Ｍ−２）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルアルギニン−メチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４２ｍｏｌ／Ｌであった。
【０１１０】
実施例３１
実施例２９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例３のＮ−アセチルアルギニン−メチルアミド１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−メチルアミド水溶液１０μＬを使用する以外は実施例２９と同様に行い、本発明のモノクローナル抗体水溶液（Ｍ−３）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルアルギニン−メチルアミドの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４２ｍｏｌ／Ｌであった。
【０１１１】
実施例３２
実施例２９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例４のＮ−ジメチルイミノアルギニン−エチルエステル１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−ジメチルイミノアルギニン−エチルエステル水溶液１０μＬを使用する以外は実施例２９と同様に行い、本発明のモノクローナル抗体水溶液（Ｍ−４）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中の  Ｎ−ジメチルイミノアルギニン−エチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４０ｍｏｌ／Ｌであった。
【０１１２】
実施例３３
実施例２９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例５のＮ−ジメチルイミノアルギニン−メチルアミド１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−ジメチルイミノアルギニン−メチルアミド水溶液１０μＬを使用する以外は実施例２９と同様に行い、本発明のモノクローナル抗体水溶液（Ｍ−５）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−ジメチルイミノアルギニン−メチルアミドの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４２ｍｏｌ／Ｌであった。
【０１１３】
実施例３４
実施例２９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例６のＮ−アセチルヒスチジン−エチルエステル１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−アセチルヒスチジン−エチルエステル水溶液１０μＬを使用する以外は実施例２９と同様に行い、本発明のモノクローナル抗体水溶液（Ｍ−６）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中の  Ｎ−アセチルヒスチジン−エチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０３９ｍｏｌ／Ｌであった。
【０１１４】
実施例３５
実施例２９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例７のＮ−アセチルリシン−エチルエステル１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−アセチルリシン−エチルエステル水溶液１０μＬを使用する以外は実施例２９と同様に行い、本発明のモノクローナル抗体水溶液（Ｍ−７）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルリシン−エチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４０ｍｏｌ／Ｌであった。
【０１１５】
実施例３６
実施例２９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例８のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステル・塩酸塩１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル・塩酸塩水溶液１０μＬを使用する以外は実施例２９と同様に行い、本発明のモノクローナル抗体水溶液（Ｍ−８）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステル・塩酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０３３ｍｏｌ／Ｌであった。
【０１１６】
実施例３７
実施例２９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、予め実施例１のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステル０．１ｇをイオン交換水４９．９ｇに撹拌混合して溶解させておいた０．２重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例２９と同様に行い、本発明のモノクローナル抗体水溶液（Ｍ−９）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．００１ｍｏｌ／Ｌであった。
【０１１７】
実施例３８
実施例２９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、実施例１のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステル１．２１ｇをそのまま使用する以外は実施例２９と同様に行い、本発明のモノクローナル抗体水溶液（Ｍ−１０）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。
得られたタンパク質含有水溶液中のＮ−アセチルアルギニン−エチルエステルの濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．５０ｍｏｌ／Ｌであった。
【０１１８】
比較例１１
実施例２９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させた牛血清アルブミン（和光純薬製）の水溶液１０μＬを使用する以外は実施例２９と同様に行い、モノクローナル抗体水溶液（Ｍ’−１）を得た。
【０１１９】
比較例１２
実施例２９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたグルコース（和光純薬製）の水溶液１０μＬを使用する以外は実施例２９と同様に行い、モノクローナル抗体水溶液（Ｍ’−２）を得た。
【０１２０】
比較例１３
実施例２９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたグリセリン（和光純薬製）の水溶液１０μＬを使用する以外は実施例２９と同様に行い、モノクローナル抗体水溶液（Ｍ’−３）を得た。
【０１２１】
比較例１４
実施例２９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたアルギニン・塩酸塩（和光純薬製）の水溶液１０μＬを使用する以外は実施例２９と同様に行い、モノクローナル抗体水溶液（Ｍ’−４）を得た。
【０１２２】
比較例１５
実施例２９において、１０重量％Ｎ−アセチルアルギニン−エチルエステル水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたアルギニンエチルエステル（エムピーバイオ社製）の水溶液０．１ｍLを使用する以外は実施例２９と同様に行い、モノクローナル抗体水溶液（Ｍ’−５）を得た。
【０１２３】
＜モノクローナル抗体水溶液の活性（力価）の測定＞
実施例２９〜３８及び比較例１１〜１５で得られたモノクローナル抗体水溶液（Ｍ−１）〜（Ｍ−１０）及び（Ｍ’−１）〜（Ｍ’−５）を恒温槽中で３７℃、３時間インキュベートし、この水溶液５０μＬを、インターフェロンβ  ＥＬＩＳＡキット（「インターフェロンβ  ＥＬＩＳＡキット」、鎌倉テクノサイエンス社製）を用いて、力価を測定した。力価はインターフェロン標準液（キットに付属）に作用する酵素標識抗インターフェロンモノクローナル抗体の酵素活性で評価した。酵素活性はキットに添付の説明書に従い、分光光度計で吸光度を読み取り検量線を作成し、検量線から各サンプルの力価を算出した。
また、モノクローナル抗体水溶液（Ｍ−１）〜（Ｍ−１０）及び（Ｍ’−１）〜（Ｍ’−５）を恒温槽でインキュベートする前に上記と同様に測定し、別途力価を算出した。
力価の保持率は、以下の式で計算した。
力価の保持率＝（インキュベート後の力価）／（インキュベート前の力価）×１００
【０１２４】
上記実施例及び比較例の力価の保持率を表３に示す。
【０１２５】
【表３】
0004812807.tif 000014
【０１２６】
従来から使用されている安定化剤を用いた比較例１１〜１３は、抗体含有水溶液の安定化効果がまだ不十分であることがわかる。また、アルギニンの無機酸塩を使用した比較例１４及びアルギニンのアルキルエステルを使用した比較例１５では、安定化効果が高まり、比較例１１〜１３に比べて力価の保持率が改善されるものの、依然として十分な効果が得られなかった。一方、アルギニン等のα−アミノ酸のα−アミノ基及びα−カルボキシル基を置換した本発明の化合物及びその塩を使用した実施例２９〜３８の安定化剤の力価の保持率は非常に高いことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明のタンパク質含有水溶液のの安定化剤は、水溶液中のタンパク質を安定化し活性を長期間低下させないので、医薬品、食品、および生化学の分野において有効に使用することができる。たとえば、タンパク医薬品液体製剤、酵素液体製剤、工業用酵素水溶液、液体洗剤、飲料、診断薬用の測定試薬、タンパク質の標準液などに使用できる。