(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
百日咳菌遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意し、検体からＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供し、増幅操作後に、産物中に、増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを確認する、ことを含む検体中に含まれる百日咳菌遺伝子を検出する方法であって、
前記プライマーセットとして、配列表に示された配列番号１〜４の塩基配列からなる４つのプライマーと配列表に示された配列番号５〜６の塩基配列からなる２つのループプライマーを用いる、前記方法。
【請求項２】
増幅産物中に増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを、増幅産物の濁度を測定することで確認するか、または蛍光色素を用いて確認する請求項1に記載の方法。
【請求項３】
検体中の菌体に含まれる百日咳菌遺伝子をLAMP法により検出するために用いられる、配列表に示された配列番号１〜４の塩基配列からなる４つのプライマー及び配列表に示された配列番号５〜６の塩基配列からなる２つのループプライマーを含むプライマーセット。
【請求項４】
請求項３に記載のプライマーセットを含む、検体中に含まれる百日咳菌遺伝子をLAMP法により検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＡＭＰ法を用いた百日咳菌遺伝子検出方法およびこの方法に用いるプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
百日咳は百日咳菌（Bordetella pertussis）の感染によって引き起こされる小児の急性呼吸器感染症である。世界の百日咳患者数は年間2,000〜4,000万人、死亡数は約20〜40万人と見積もられおり、罹患者は主にワクチン接種前と未接種の乳幼児である。報告患者数をもとにしたわが国の年間罹患数の推計値は、2000年が2.8万人、2001年が1.5万人とされている。百日咳の確定診断には細菌学的または血清学的診断を必要とするが、臨床現場では主に臨床症状による診断（臨床診断）が実施されている。その理由は、菌分離や抗体価測定による確定診断法はいずれも数日以上の検査日数を必要とするため、臨床現場では事後診断となるためである。臨床診断は長期の咳嗽といった典型的な百日咳症状を示す患者に対しては容易であるが、その一方、非典型的な症状を示す感染初期の患者に対しては診断できないという問題点がある。
【０００３】
近年、感染症の検査法として遺伝子診断が広く導入されるようになり、百日咳でも菌の挿入配列（IS481）や百日咳毒素遺伝子（ptx）を標的としたPCRが実験室診断法として検討されている。(Houard et al., Res Microbiol, 140: 477-487, 1989(非特許文献1)、Dragsted et al., J Med Microbiol, 53: 749-754, 2004(非特許文献2))
【非特許文献１】Houard et al., Res Microbiol, 140: 477-487, 1989
【非特許文献２】Dragsted et al., J Med Microbiol, 53: 749-754, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、PCRを用いた実験室診断法は菌培養検査に比較して、その陽性率は高いもののまだ十分とは言い難く、より高感度で簡便な診断技術の開発が望まれていた。近年、PCR法に代わる遺伝子診断法として、簡便かつ迅速な診断を可能とするLAMP法（Loop mediated isothermal Amplification）が開発され、多くの感染症でその応用研究が進められている。LAMP法はPCR反応に必須な遺伝子増幅装置を必要とせず、短時間に判定できる利点を有し、さらに反応系に蛍光色素を添加することで目視による判定を可能とする。そのため機器類が十分に整備されていない病院などの検査室にも導入可能な検査技術として注目されている。しかし、百日咳菌に対するLAMP法プライマーは開発されていないため、百日咳菌を特異的に検出するLAMP法プライマーの設計とその評価が必要であった。
【０００５】
そこで本発明は、LAMP法により百日咳菌遺伝子を高感度および特異的に検出できるプライマー配列を提供し、このプライマー配列を用いた百日咳菌遺伝子の検出方法を提供することを目的とする。
【０００６】
さらに、本発明は、上記プライマー配列を用いた百日咳菌遺伝子検出用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決する本発明は以下の通りである。
［１］百日咳菌遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意し、検体からＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供し、増幅操作後に、産物中に、増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを確認する、ことを含む検体中に含まれる百日咳菌遺伝子を検出する方法であって、
前記プライマーセットとして、配列表に示された配列番号１〜４の塩基配列からなる４つのプライマーと配列表に示された配列番号５〜６の塩基配列からなる２つのループプライマーを用いる、前記方法。
［２］増幅産物中に増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを、増幅産物の濁度を測定することで確認するか、または蛍光色素を用いて確認する［１］記載の方法。
［３］検体中の菌体に含まれる百日咳菌遺伝子をLAMP法により検出するために用いられる、配列表に示された配列番号１〜４の塩基配列からなる４つのプライマー及び配列表に示された配列番号５〜６の塩基配列からなる２つのループプライマーを含むプライマーセット。
［４］［３］に記載のプライマーセットを含む、検体中に含まれる百日咳菌遺伝子をLAMP法により検出するためのキット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、百日咳菌遺伝子を高感度かつ特異的に検出することができる。LAMP法はPCR法のような煩雑な操作を必要しないため、病院などの検査室に導入可能な技術である。そのため、本発明により簡便かつ迅速な百日咳診断が臨床現場で可能となる。また、近年成人が百日咳菌を保菌することにより、乳幼児への感染源となっている可能性が指摘されている。成人が百日咳菌を保菌した場合、乳幼児のような症状を示さないため、臨床診断は極めて困難である。そのため、本発明は乳幼児のみならず成人に対する百日咳診断も可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、検体中の菌体に含まれる百日咳菌遺伝子を検出する方法に関する。この方法は、以下の工程を含む。
(1)百日咳菌遺伝子の少なく一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意する。
(2)検体からＤＮＡを抽出する。
(3)抽出したＤＮＡを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供する。
(4)増幅操作後に、産物中に、増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを確認する。
【００１０】
[プライマーセット]
本発明の方法では、百日咳菌遺伝子の少なく一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意する。百日咳菌は、Bordetella属に属する細菌であり、Bordetella属に属する類似の細菌としてパラ百日咳菌および気管支敗血症菌などがある。そこで、本発明者らは、これらの細菌との間で、百日咳菌遺伝子に特異的な配列を探索した。その結果、図1に示すように、百日咳菌の百日咳毒素プロモーター配列に、他のBordetella属細菌（パラ百日咳菌、気管支敗血症菌）と異なる配列が存在することを見いだし、この点に着目して、同配列に対しLAMP法プライマーの設計を行なった。設計にはLAMP法プライマー設計支援ソフト（PrimerExplorer Ver.3、栄研化学）を使用し、設計されたプライマーセット(162種類)の中から本発明者らが、候補となり得ると考えた7種類のプライマーセットを選択した。そして、選択されたプライマーセットを合成し、各プライマーセットについて、その検出感度と特異性を各種Bordetella属細菌から精製したDNAを用いて検討した。その結果、本発明のプライマーセット(実施例ではID2)が最も高い感度を示し、さらに百日咳菌以外のBordetella属細菌（５菌種、８株）を検出しない(特異性が極めて高い)ことが判明した。
【００１１】
本発明は、百日咳菌と類似する多種類のBordetella属細菌が存在するにも関わらず、百日咳菌遺伝子のみを確実に検出することを目的とする。このような目的を達成するという観点からは、百日咳菌遺伝子の少なく一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットとしては、以下の配列番号1〜4の4種類のＤＮＡからなるプライマーセットを用いることが好ましい。
【００１２】
百日咳菌遺伝子の塩基配列（部分）を図2に示す。図2に示す塩基配列を配列番号7に示す。図2には、百日咳菌遺伝子の塩基配列と本発明のプライマーセットの各ＤＮＡとの関係を示す。配列番号1〜4の4種類のＤＮＡからなるプライマーセットを用いることで、百日咳菌遺伝子の一部のＤＮＡをLAMP法により増幅することができる。増幅されるＤＮＡの最小単位は156 bpと計算されるが、LAMP法ではＤＮＡがカリフラワー様に増幅するので、実際には156 bp以外の様々なサイズの遺伝子が増幅される。
【００１３】
BP-F3 (F3): 5'-CCGCATACGTGTTGGCA-3'(配列番号1)
BP-B3 (B3c): 5'-TGCGTTTTGATGGTGCCT-3' (配列番号2)
BP-FIP (F2-F1c):
5'-TTGGATTGCAGTAGCGGGATGTGCATGCGTGCAGATTCGTC-3' (配列番号3)
BP-BIP (B1-B2c):
5'-CGCAAAGTCGCGCGATGGTAACGGATCACACCATGGCA-3' (配列番号4)
【００１４】
本発明の方法では、上記4種類のプライマーは、それぞれ上記で示した全配列を有することが、検体中に百日咳菌遺伝子が存在する場合、百日咳菌遺伝子を菌株の種類によらず確実に増幅するという観点から好ましい。但し、各プライマーともその一部の塩基を欠失または置換したもの、あるいは、他の塩基が付加されたものでも、同様のプライマーとしての機能を発揮するものはあり得る。即ち、配列番号1〜4のいずれかの塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ百日咳菌遺伝子の少なく一部をLAMP法によって増幅することができるプライマー機能を有するＤＮＡを、プライマーセットの一部または全部のＤＮＡとして含むプライマーセットも、本発明の方法で使用できる。
【００１５】
本発明のプライマーセットは、前記４種類のＤＮＡに加えて、以下のＤＮＡ（ｌｏｏｐプライマー）をさらに含むことができる。
BP-LF (LFc): 5'-ACGGAAGAATCGAGGGTTTTGTAC-3' (配列番号5)
BP-LB (LB): 5'-GTCACCGTCCGGACCGTG-3' (配列番号6)
【００１６】
本発明の方法において、プライマーセットは、上記ｌｏｏｐプライマーを含まなくても、百日咳菌遺伝子の少なく一部をLAMP法によって増幅することはできる。しかし、上記ｌｏｏｐプライマーを含む場合の方が、増幅時間を大幅に短縮でき、好ましい。
【００１７】
上記ｌｏｏｐプライマーにおいても、各プライマーの一部の塩基を欠失または置換したもの、あるいは、他の塩基が付加されたものでも、ｌｏｏｐプライマーとしての機能を発揮するものはあり得る。即ち、配列番号５または６の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ百日咳菌遺伝子の少なく一部をLAMP法によって増幅する際のｌｏｏｐプライマー機能を有するＤＮＡを、プライマーセットの一部のＤＮＡとして含むプライマーセットも、本発明の方法で使用できる。
【００１８】
尚、本明細書で言う「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から１０個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から４個、より好ましくは１から３個、さらに好ましくは１から２個、特に好ましくは１個を意味する。
【００１９】
本発明の上記プライマーセットを構成する各ＤＮＡは、前記塩基配列に基づいて、既知のＤＮＡ調製方法により適宜入手することができる。
【００２０】
本発明は、上記プライマーセットを用いる、百日咳菌遺伝子の検出方法に関するが、本発明は、上記プライマーセット自体を発明として包含する。さらに本発明は、上記本発明のプライマーセットを含む、検体中の菌体に含まれる百日咳菌遺伝子をLAMP法により検出するためのキットも包含する。
【００２１】
本発明のプライマーセットは、例えば、1回のLAMP法による遺伝子の増幅に必要な量の前記4種類または6種類のプライマー(ＤＮＡ)を含む形態であることができる。1回のLAMP法による遺伝子の増幅に必要な量のプライマー(ＤＮＡ)量は、例えば、5 〜 40 pmol / 反応チューブの範囲である。
【００２２】
[ＤＮＡ抽出]
本発明の方法では、検体からＤＮＡを抽出する。具体的には、検体中の菌株から市販のDNA抽出キットを用いて直接DNAを抽出する。DNA抽出キットとしては例えば、QIAamp DNA Micro Kit （Cat. No. 56301、Qiagen社）を挙げることができる。
【００２３】
[LAMP法による増幅]
本発明の方法では、抽出したＤＮＡ（DNAテンプレイト）を、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供する。LAMP法による増幅操作は、例えば、以下のように行うことができる。試薬（例えば、Bst DNAポリメラーゼ、反応バッファー、dNTPs、プライマーセット、蒸留水）を混合し、反応チューブに分注した後にDNAテンプレイト(抽出したＤＮＡ)を加える。次いで、例えば、65℃にてインキュベートする。インキュベート時間は、例えば、30分〜90分の範囲である。
【００２４】
[増幅されたＤＮＡの確認]
本発明の方法では、増幅操作後に、産物中に、増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを確認する。検体中に含まれる菌体中に百日咳菌遺伝子が含まれている場合、増幅操作により百日咳菌遺伝子が増幅される。逆に、検体中に含まれる菌体中に百日咳菌遺伝子が含まれていなければ、増幅操作によっても増幅されるＤＮＡはない。
【００２５】
増幅産物中に増幅されたＤＮＡが含まれるか否かは、例えば、増幅産物の濁度を測定すること、または蛍光目視検出で確認することができる。増幅産物の濁度の測定は、具体的には、以下のように行うことができる。リアルタイム濁度測定装置により経時的に、あるいは濁度測定装置により最終増幅産物の濁度を測定する。蛍光目視検出は、蛍光目視試薬を添加して反応させ、UVランプを当てることにより目視で反応液の蛍光発色を観察することで行うことができる。
【００２６】
本発明のプライマーセットを用いたLAMP検出系は反応温度65℃で最大感度を示し、その検出限界は百日咳菌DNAにして10 fg/tubeであった。なお、このDNA量は百日咳菌ゲノムDNAにして 2.3 copyに相当する。既存のPCR法（PTp1/p2-PCR, IS481-PCR）と検出感度を比較したところ、最も感度が高いとされるIS481-PCRの検出限界は1,000 fg/tubeであり、本発明のプライマーセットID2(配列番号1〜6)を用いたLAMP検出系はIS481-PCRよりも約100倍感度が高いことが判明した。なお、IS481-PCRは他のBordetella属細菌も検出するという欠点があり、一方、PTp1/p2-PCRは特異性に優れるものの感度が悪い（>100 pg/tube）という欠点がある。
【００２７】
本発明は、前記方法で説明したプライマーセットを包含する。さらに、本発明は、本発明のプライマーセットを含むキットも包含する。キットに含まれるものは、例えば、以下の物であることができる。
1.Bst DNAポリメラーゼ
2.反応バッファー
3.dNTPs
4.プライマーセット(本発明のプライマー)
5.コントロールDNA（陽性コントロール）
6.反応チューブ
7.説明書
【００２８】
前述のように、本発明の方法では、ＤＮＡの増副産物の有無を濁度測定または蛍光目視検出により行うことができる。蛍光目視で検出する場合は、上記キットに蛍光目視試薬を含めることができる。濁度測定装置を使用する場合には、キットには蛍光目視検出試薬は含めない。
【実施例】
【００２９】
以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
【００３０】
菌株
LAMPプライマーの特異性確認のため、百日咳菌（Bordetella pertussis）、パラ百日咳菌（B. parapertussis）、気管支敗血症菌（B. bronchiseptica R05）、B. hinzii ATCC51730、B. holmesii ATCC51541、B. avium ATCC35086の６菌種（計17株）を供試した。百日咳菌はB. pertussis 東浜株、山口株および国立感染症研究所保存菌株（BP256〜260、BP289〜290）の９株、パラ百日咳菌はB. parapertussis ATCC15237, ATCC15311, BAA-587および保存菌株（BPP01）の４株を使用した。
【００３１】
DNA調製
Bordetella属細菌はBordet-Gengou寒天培地で３６℃、１〜２日間培養した後、菌体からDNAを抽出・精製した。精製には市販のQiagen genomic tip 20/G（Qiagen社）を使用し、得られたDNAの濃度は波長260 nmの吸光度から求めた。
尚、本実施例では、LAMPプライマーの特異性と感度を評価するためには精製DNAを必要とするため、上記は、その評価に用いるDNAの調製法を示す。しかし、実際の検査（例えば、臨床検体）では、菌培養はせず、直接検体からDNAを抽出することができる。
【００３２】
PCR
LAMPプライマーセットの感度と特異性は、既存のPCR法（PTp1/p2-PCR, IS481-PCR）と比較することにより実施した。PTp1/p2-PCRはHouardら（Houard et al., Res Microbiol, 140: 477-487, 1989）の方法に従い、IS481-PCRはDragstedら（Dragsted et al., J Med Microbiol, 53: 749-754, 2004）の方法に従った。遺伝子増幅の有無は、PCR産物を３％アガロースゲル電気泳動で分離後、エチジウムブロマイド染色により確認した。
【００３３】
LAMPプライマーの設計
百日咳菌の百日咳毒素プロモーター配列には他のBordetella属細菌と異なる配列が存在することから、同配列に対しLAMPプライマーの設計を行なった（図１）。設計にはLAMP法プライマー設計支援ソフト（Primer Explorer Ver.3、栄研化学）を使用し、設計されたプライマーセットの中から候補となる７種のプライマーセット（ID1〜7）を選択した。予備実験においてプライマーセットID2が最も高い感度を示したことから、特異性評価はプライマーセットID2についてのみ実施した。なお、プライマー合成は北海道システム・サイエンス社に依頼し、HPLC精製グレードのプライマーを使用した。
【００３４】
図１にBordetella属細菌の百日咳毒素プロモーター配列の比較を示す。百日咳菌（B. pertussis）(配列番号7)、気管支敗血症菌（B. bronchiseptica）(配列番号8)、パラ百日咳菌（B. parapertussis）(配列番号9)の百日咳毒素プロモーター配列を比較した。図１に示す配列中の塩基番号-186〜-177において、百日咳菌と気管支敗血症菌には遺伝子の欠損が認められる。さらに、その配列周辺には百日咳菌と気管支敗血症菌との間に異なる塩基の存在が確認される。この配列比較から、同領域に対しLAMP法プライマーの設計を行なった。なお、coding regionは百日咳毒素S1サブユニットの翻訳領域を示す。
【００３５】
LAMP検出系
Loopamp DNA増幅試薬キット（栄研化学）を用いて、LAMPプライマーセットの検出感度と特異性を評価した。LAMP検出系は反応液25 μl中に、0.2 μM の各outer primer (BP-F3, BP-B3)、1.6 μMの各inner primer (BP-FIP, BP-BIP)、0.8 μMの各loop primer (BP-LF, BP-LB)、1 μlのBst-DNA polymerase、12.5 μlの２×反応液、1 μlのDNA溶液を含み、65℃で１時間反応させた。その後、80℃で2分間の反応停止処理を行なった。反応チューブにはLoopamp反応チューブ（栄研化学）を使用し、遺伝子増幅に伴う濁度の増加はリアルタイム測定装置（Loomamp LA-320C、栄研化学）を用いて測定した。また、遺伝子の増幅は２％アガロースゲル電気泳動によっても確認を行なった。表1にLAMP検出系の反応組成を示す。
【００３６】
【表１】
0004806749.tif 000002
【００３７】
図3にプライマーセットID2を用いたLAMP検出系の感度の結果を示す。精製百日咳菌DNAを連続希釈し、LAMP検出系の検出限界を測定した。A）は遺伝子の増幅反応によって生じる濁度の増加曲線である。リアルタイム測定装置（Loopamp LA-320C、栄研化学）を用いて濁度の増加を測定した。B）は反応60分後の増幅産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果である。
【００３８】
表２に、プライマーセットID2を用いたLAMP法とPCR法との感度の比較を示す。精製百日咳菌DNAを用いて、既存のPCR法（PTp1/p2-PCR、IS481-PCR）との感度比較を行なった。LAMP法、PTp1/p2-PCR、IS481-PCRの検出限界はそれぞれ10、1×105、1,000 fg/tubeを示した。
【００３９】
【表２】
0004806749.tif 000003
【００４０】
表３にBordetella属細菌に対するLAMP検出系の特異性試験結果を示す。百日咳菌と他のBordetella属細菌（５菌種、８株）に対する特異性を検討した。LAMP法とPTp1/p2-PCRはすべての百日咳菌を検出し、他のBordetella属細菌を検出しないことが示された。一方、IS481-PCRは一部のパラ百日咳菌とB. holmesiiを検出することが示された。なお、B. holmesiiがIS481遺伝子を持つことはすでに報告されているが、IS481を持つパラ百日咳菌の存在が確認されたのは本臨床株が初めてである。
【００４１】
【表３】
0004806749.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明によるプライマーセットを用いたLAMP検出系は、百日咳感染症の体外診断薬としての実用化が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】Bordetella属細菌の百日咳毒素プロモーター配列の比較。
【図２】百日咳菌の百日咳毒素プロモーター配列に対する本発明のプライマーセットID2の設計位置を示す。LFcとLBはloop プライマーを示し、LAMP法による増幅領域はF2からB2cである。
【図３】プライマーセットID2を用いたLAMP検出系の感度試験結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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