(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）：
【化１】
0004812061.tif 000026
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、ＣＮ、ＮＯ2、ＣＯＯＲ’、ＳＯ2Ｒ’’（なお、Ｒ’は、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ’’は、ＯＨ、ハロゲン原子、ＯＮａ、ＯＫ、ＯＣＨ3、ＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す）から選択される基であり、また、ｘは、１〜８から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る）で示されるユニットをポリマー分子中に含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート。
【請求項２】
前記一般式（１）で示されるユニットに加えて、
下記一般式（２）：
【化２】
0004812061.tif 000027
（式中、ｙは、０〜８から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る）で示される３−ヒドロキシアルカン酸ユニット、
あるいは、下記一般式（３）：
【化３】
0004812061.tif 000028
（式中、ｚは、３および５から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る）で示される３−ヒドロキシアルカ−５−エン酸ユニットのうち、少なくとも１種類をもポリマー分子中に含むことを特徴とする請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート。
【請求項３】
ポリマー分子の数平均分子量は、５０００〜３０００００の範囲であることを特徴とする請求項１または２に記載のポリヒドロキシアルカノエート。
【請求項４】
下記化学式（４）：
【化４】
0004812061.tif 000029
で示される３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカノエート。
【請求項５】
下記一般式（５）：
【化５】
0004812061.tif 000030
で示される３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカノエート。
【請求項６】
下記一般式（６）：
【化６】
0004812061.tif 000031
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、ＣＮ、ＮＯ2、ＣＯＯＲ’、ＳＯ2Ｒ’’（なお、Ｒ’は、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ’’は、ＯＨ、ハロゲン原子、ＯＮａ、ＯＫ、ＯＣＨ3、ＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す）から任意に選択される基であり、また、ｘは、１〜８から選択される任意の整数を表す）
で示される化合物を少なくとも一種類以上含む培地中で、ポリヒドロキシアルカノエート産生能を有する微生物を培養する工程を有することを特徴とする、
下記一般式（１）：
【化７】
0004812061.tif 000032
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、ＣＮ、ＮＯ2、ＣＯＯＲ’、ＳＯ2Ｒ’’（なお、Ｒ’は、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ’’は、ＯＨ、ハロゲン原子、ＯＮａ、ＯＫ、ＯＣＨ3、ＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す）から選択される基であり、また、ｘは、１〜８から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る）で示されるユニットをポリマー分子中に含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項７】
前記ポリヒドロキシアルカノエートは、前記一般式（１）で示されるユニットに加えて、
下記一般式（２）：
【化８】
0004812061.tif 000033
（式中、ｙは、０〜８から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る）で示される３−ヒドロキシアルカン酸ユニット、
あるいは、下記一般式（３）：
【化９】
0004812061.tif 000034
（式中、ｚは、３および５から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る）で示される３−ヒドロキシアルカ−５−エン酸ユニットのうち、少なくとも１種類をもポリマー分子中に含むことを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記培地は、ポリペプトンを含んでいることを特徴とする請求項６または７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記培地は、酵母エキスを含んでいることを特徴とする請求項６または７に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記培地は、糖類を含んでいることを特徴とする請求項６または７に記載の製造方法。
【請求項１１】
培地中に含有される糖類は、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースからなる群から選択される１種類以上の化合物であることを特徴とする請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記培地は、有機酸またはその塩を含んでいることを特徴とする請求項６または７に記載の製造方法。
【請求項１３】
培地中に含有される有機酸またはその塩は、ピルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸、あるいはこれらの塩からなる群から選択される１つ以上の化合物であることを特徴とする請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記培地は、アミノ酸またはその塩を含んでいることを特徴とする請求項６または７に記載の製造方法。
【請求項１５】
培地中に含有されるアミノ酸またはその塩は、グルタミン酸、アスパラギン酸、あるいはこれらの塩からなる群から選択される１つ以上の化合物であることを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記培地は、炭素数４から１２の直鎖アルカン酸またはその塩を含んでいることを特徴とする請求項６または７に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記微生物の培養が、少なくとも二段階以上の培養で行うことを特徴とする請求項６〜１６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１８】
前記微生物の培養において、二段階目以降の培養がなされる培地中には、窒素源が含まれていないことを特徴とする請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記微生物の培養が、
（工程１−１）  下記一般式（６）：
【化１０】
0004812061.tif 000035
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、ＣＮ、ＮＯ2、ＣＯＯＲ’、ＳＯ2Ｒ’’（なお、Ｒ’は、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ’’は、ＯＨ、ハロゲン原子、ＯＮａ、ＯＫ、ＯＣＨ3、ＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す）から選択される基であり、また、ｘは、１〜８から選択される任意の整数を表す）
で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、かつポリペプトンを含む培地中で、ポリヒドロキシアルカノエート産生能を有する微生物を培養する工程と、これに続き、
（工程１−２）  前記一般式（６）で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、かつ有機酸またはその塩とを含む培地中で、工程１−１で培養された微生物を更に培養する工程とを少なくとも有する、請求項１７または１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記工程１−２で用いる培地中に含有される有機酸またはその塩は、ピルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸、あるいはこれらの塩からなる群から選択される１つ以上の化合物であることを特徴とする請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記微生物の培養が、
（工程１−３）  下記一般式（６）：
【化１１】
0004812061.tif 000036
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、ＣＮ、ＮＯ2、ＣＯＯＲ’、ＳＯ2Ｒ’’（なお、Ｒ’は、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ’’は、ＯＨ、ハロゲン原子、ＯＮａ、ＯＫ、ＯＣＨ3、ＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す）から選択される基であり、また、ｘは、１〜８から選択される任意の整数を表す）
で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、かつ糖類を含む培地中で、ポリヒドロキシアルカノエート産生能を有する微生物を培養する工程と、これに続き、
（工程１−４）  前記一般式（６）で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、且つ、糖類を含む培地中で、工程１−３で培養された微生物を更に培養する工程とを有する、少なくとも二段階以上の培養で行うことを特徴とする請求項１７または１８に記載の製造方法。
【請求項２２】
前記糖類が、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースからなる群から選択される１種類以上の化合物であることを特徴とする２１に記載の製造方法。
【請求項２３】
下記化学式（７）：
【化１２】
0004812061.tif 000037
で示される５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸を含む培地中で微生物を培養し、
下記化学式（４）：
【化１３】
0004812061.tif 000038
で示される３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産させることを特徴とする請求項６〜２２のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項２４】
下記化学式（８）：
【化１４】
0004812061.tif 000039
で示される４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸を含む培地中で微生物を培養し、
下記化学式（５）：
【化１５】
0004812061.tif 000040
で示される３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産させることを特徴とする請求項６〜２２のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項２５】
培養後の微生物細胞からポリヒドロキシアルカノエートを分離回収する工程を有することを特徴とする請求項６〜２４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２６】
前記ポリヒドロキシアルカノエート分離回収工程は、培養された微生物細胞中に蓄積されるポリヒドロキシアルカノエートを、溶媒により可溶化抽出する工程を含むことを特徴とする請求項２５に記載の製造方法。
【請求項２７】
前記溶媒は、クロロホルム、ジクロロメタン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトンから選択される１種類以上の溶媒であることを特徴とする請求項２６に記載の製造方法。
【請求項２８】
前記ポリヒドロキシアルカノエート分離回収工程が、微生物細胞を破砕する工程を含むことを特徴とする請求項２５に記載の製造方法。
【請求項２９】
前記微生物細胞を破砕する工程は、超音波破砕法、ホモジナイザー法、圧力破砕法、ビーズ衝撃法、摩砕法、擂潰法、凍結融解法のいずれかの方法で行われることを特徴とする請求項２８に記載の製造方法。
【請求項３０】
前記微生物は、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物であることを特徴とする請求項６〜２９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項３１】
前記シュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物が、シュードモナス・チコリアイ ＹＮ２株（Pseudomonas cichorii YN2；  FERM BP−7375）、シュードモナス・チコリアイ Ｈ４５株（Pseudomonas cichorii H45；  FERM BP−7374）、シュードモナス・ジェッセニイ  Ｐ１６１株（Pseudomonas jessenii P161；  FERM BP−7376）のうちから選択される微生物であることを特徴とする請求項３０に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な構成ユニットを含むポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）と、その製造方法に関する。より具体的には、側鎖末端に［（置換フェニル）メチル］スルファニル基を有する３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含む新規な生分解性ＰＨＡ及び、ＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物を利用し、末端にベンゼン環上に置換を有する（フェニルメチル）スルファニル基を有するアルカン酸を原料とする、前記PHAの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、多くの微生物がポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、ＰＨＢと略す）あるいはその他のＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積することが報告されてきた（「生分解性プラスチックハンドブック」，生分解性プラスチック研究会編，（株）エヌ・ティー・エス，P１７８−１９７（１９９５））。これらのポリマーは、従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。更に、生分解性であるがゆえに、自然界で微生物により完全に分解されるという利点を有していることから、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがない。また、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材料等としての応用も期待されている。
【０００３】
このように微生物産生ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られており、これまで主に、ＰＨＡの物性の改良という観点から、このような組成や構造の制御に関する研究がなされてきた。例えば、アルカリゲネス・ユウトロファスＨ１６株（Alcaligenes eutropus H16、 ATCC No.17699）及びその変異株は、その培養時の基質を変化させることによって、３−ヒドロキシ酪酸（以下、３ＨＢと略す）と３−ヒドロキシ吉草酸（以下、３ＨＶと略す）との共重合体を様々な組成比で生産することが報告されている（特表平６−１５６０４号公報、特表平７−１４３５２号公報、特表平８−１９２２７号公報 等）。
【０００４】
また、特許公報第２６４２９３７号には、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ  ２９３４７株（Pseudomonas oleovorans ATCC 29347）に基質として非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数６から１２までの３−ヒドロキシアルカノエートをモノマーユニットとするＰＨＡを生産することが開示されている。
【０００５】
特開平５−７４４９２号公報には、メチロバクテリウム属（Methylobacterium sp.）、パラコッカス属（Paracoccus sp.）、アルカリゲネス属（Alcaligenes sp.）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）の微生物を、炭素数３から７の第一級アルコールに接触させることにより、３ＨＢと３ＨＶとの共重合体を生産させる方法が開示されている。
【０００６】
特開平５−９３０４９号公報、及び特開平７−２６５０６５号公報には、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）をオレイン酸やオリーブ油を基質として培養することにより、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸との二成分共重合体を生産することが開示されている。
【０００７】
特開平９−１９１８９３号公報には、コマモナス・アシドボランス・ＩＦＯ  １３８５２株（Comamonas acidovorans IFO 13852）が、基質としてグルコン酸及び１，４−ブタンジオールを用いた培養により、３ＨＢと4−ヒドロキシ酪酸とをモノマーユニットに持つポリエステルを生産することが開示されている。
【０００８】
更に、ある種の微生物では、様々な置換基、例えば、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシドなどが導入されたＰＨＡを生産することが報告されており、このような手法によって微生物産生ＰＨＡの物性改良を目指す試みもなされている。例えば、Makromol. Chem., 191, 1957-1965, (1990)、Macromolecules, 24, 5256-5260, (1991)、Chirality, 3, 492-494, (1991)等では、シュードモナス・オレオボランスが３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（以下、３ＨＰＶと略す）をモノマーユニットをして含むＰＨＡを生産することが報告されており、３ＨＰＶが含まれる
ことに起因すると思われる、ポリマー物性の変化が認められている。
【０００９】
また、置換基を側鎖に導入したＰＨＡのうち、近年フェノキシ基を側鎖に有するＰＨＡの開発が盛んである。
【００１０】
Macromol. Chem. Phys., 195, 1665-1672 (1994)には、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）が、１１−フェノキシウンデカン酸から３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ならびに３−ヒドロキシ−９−フェノキシノナン酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００１１】
Macromolecules, 29, 3432-3435 (1996)には、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）を用いて、６−フェノキシヘキサン酸から、３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸と３−ヒドロキシ−６−フェノキシヘキサン酸をユニットとして含むＰＨＡを、８−フェノキシオクタン酸から、３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸、３−ヒドロキシ−６−フェノキシヘキサン酸及び３−ヒドロキシ−８−フェノキシオクタン酸をユニットとして含むＰＨＡを、１１−フェノキシウンデカン酸から、３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸と３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸をユニットとして含むＰＨＡを、それぞれ生産することが報告されている。
【００１２】
Can. J. Microbiol., 41, 32-43 (1995)には、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）ＡＴＣＣ  ２９３４７株及びシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４２２株を用いて、オクタン酸と６−（４−シアノフェノキシ）ヘキサン酸あるいは６−（ｐ−ニトロフェノキシ）ヘキサン酸を基質として、３−ヒドロキシ−６−（４−シアノフェノキシ）ヘキサン酸あるいは３−ヒドロキシ−６−（４−ニトロフェノキシ）ヘキサン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００１３】
また、置換基を側鎖に導入したＰＨＡのうち、スルフィド型（−Ｓ−）のイオウ原子を側鎖に有するＰＨＡの開発としては、Macromolecules., 32, 8315-8318 (1999)には、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）２７Ｎ０１株を用いて、オクタン酸と１１−（フェニルスルファニル）ウンデカン酸を基質として、３−ヒドロキシ−５−（フェニルスルファニル）吉草酸と３−ヒドロキシ−７−（フェニルスルファニル）へプタン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。ただし、その際、シュードモナス・プチダ  ２７Ｎ０１株は、予め、増殖基質としてオクタン酸のみを含む培地で前培養し、その培養液を基質として１１−（フェニルスルファニル）ウンデカン酸のみを含む培地にイノキュレートする方法が用いられている。
【００１４】
更に、Polymer Preprints, Japan Vol.49, No.5, 1034 (2000)では、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）  ２７Ｎ０１株を用いて、１１−［（フェニルメチル）スルファニル］ウンデカン酸を基質として３−ヒドロキシ−５−［（フェニルメチル）スルファニル］吉草酸及び３−ヒドロキシ−７−［（フェニルメチル）スルファニル］へプタン酸の２つのモノマーユニットからなるＰＨＡを生産することが報告されている。但し、この場合、シュードモナス・プチダ２７Ｎ０１株は、増殖基質としてオクタン酸のみを含む培地で前培養し、その培養液を基質として１１−［（フェニルメチル）スルファニル］ウンデカン酸のみを含む培地にイノキュレートする方法が用いられている。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
これら側鎖上に官能基を有するＰＨＡのうち、３−ヒドロキシ−ω−［（フェニルメチル）スルファニル］アルカン酸ユニットを含むＰＨＡに注目すると、その生合成に関しては、上に挙げた１例の報告があるに過ぎない。
【００１６】
また、末端の（フェニルメチル）スルファニル基のベンゼン環上に、種々の官能基などを置換する、３−ヒドロキシ−ω−｛［（置換フェニル）メチル］スルファニル｝アルカン酸ユニットを含むＰＨＡは、それ自体、新たな機能性を有するＰＨＡであり、物性の改良が見込まれ、これまでに応用し得なかった分野への展開を可能となり、その効率的な製造方法の開発が望まれる。
【００１７】
本発明は前記の課題を解決するもので、本発明の目的は、側鎖にスルフィド（−Ｓ−）構造を有するユニットを含む新規なポリヒドロキシアルカノエートと、その効率的な製造方法を提供することにある。より具体的には、本発明の目的は、側鎖末端に［（置換フェニル）メチル］スルファニル基を有する、３−ヒドロキシ−ω−｛［（置換フェニル）メチル］スルファニル｝アルカン酸ユニットを主な成分とする新規なＰＨＡ分子、ならびに、その効率的な製造方法を提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明の概要は、以下の通りである。
【００１９】
すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカノエートは、下記一般式（１）：
【００２０】
【化１６】
0004812061.tif 000002
【００２１】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、ＣＮ、ＮＯ2、ＣＯＯＲ’、ＳＯ2Ｒ’’（なお、Ｒ’は、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ’’は、ＯＨ、ハロゲン原子、ＯＮａ、ＯＫ、ＯＣＨ3、ＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す）から任意に選択される基であり、また、ｘは、１〜８から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る）で示されるユニットをポリマー分子中に含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートである。
【００２２】
なお、本発明のポリヒドロキシアルカノエートは、前記一般式（１）で示されるユニットに加えて、
下記一般式（２）：
【００２３】
【化１７】
0004812061.tif 000003
【００２４】
（式中、ｙは、０〜８から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る）で示される３−ヒドロキシアルカン酸ユニット、
あるいは、下記一般式（３）：
【００２５】
【化１８】
0004812061.tif 000004
【００２６】
（式中、ｚは、３および５から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る）で示される３−ヒドロキシアルカ−５−エン酸ユニットのうち、少なくとも１種類をもポリマー分子中に含んでいてもよい。また、そのポリマー分子の数平均分子量は、５０００〜３０００００の範囲である。
【００２７】
上記の構成を有する本発明のＰＨＡには、例えば、下記化学式（４）：
【００２８】
【化１９】
0004812061.tif 000005
【００２９】
で示される３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートが含まれる。
または、下記化学式（５）：
【００３０】
【化２０】
0004812061.tif 000006
【００３１】
で示される３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートが含まれる。
【００３２】
また、本発明は、
下記一般式（６）：
【００３３】
【化２１】
0004812061.tif 000007
【００３４】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、ＣＮ、ＮＯ2、ＣＯＯＲ’、ＳＯ2Ｒ’’（なお、Ｒ’は、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ’’は、ＯＨ、ハロゲン原子、ＯＮａ、ＯＫ、ＯＣＨ3、ＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す）から任意に選択される基であり、また、ｘは、１〜８から選択される任意の整数を表す）で示される化合物を少なくとも一種類以上含む培地中で、ポリヒドロキシアルカノエート産生能を有する微生物を培養する工程を有することを特徴とする、
下記一般式（１）：
【００３５】
【化２２】
0004812061.tif 000008
【００３６】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、ＣＮ、ＮＯ2、ＣＯＯＲ’、ＳＯ2Ｒ’’（なお、Ｒ’は、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ’’は、ＯＨ、ハロゲン原子、ＯＮａ、ＯＫ、ＯＣＨ3、ＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す）から任意に選択される基であり、また、ｘは、１〜８から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る）で示されるユニットを分子中に含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法である。
【００３７】
本発明の方法で製造されるポリヒドロキシアルカノエートは、前記一般式（１）で示されるユニットに加えて、
下記一般式（２）：
【００３８】
【化２３】
0004812061.tif 000009
【００３９】
（式中、ｙは、０〜８から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る）で示される３−ヒドロキシアルカン酸ユニット、
あるいは、下記一般式（３）：
【００４０】
【化２４】
0004812061.tif 000010
【００４１】
（式中、ｚは、３および５から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る）で示される３−ヒドロキシアルカ−５−エン酸ユニットのうち、少なくとも１種類をもポリマー分子中に含んでいてもよい。
【００４２】
また、本発明のＰＨＡの製造方法においては、培養工程において利用する前記培地は、ポリペプトンを含んでいることができる。あるいは、培養工程において利用する前記培地は、酵母エキスを含んでいることができる。さらに、培養工程において利用する前記培地は、糖類を含んでいることができる。この場合、培地中に含有される糖類は、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースからなる群から選択される１種類以上の化合物であることが好ましい。
【００４３】
加えて、本発明のＰＨＡの製造方法においては、培養工程において利用する前記培地は、有機酸またはその塩を含んでいるものでもよい。その際、培地中に含有される有機酸またはその塩は、ピルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸、あるいはこれらの塩からなる群から選択される１つ以上の化合物であることが好ましい。あるいは、培養工程において利用する前記培地は、アミノ酸またはその塩を含んでいることもできる。例えば、培地中に含有されるアミノ酸またはその塩は、グルタミン酸、アスパラギン酸、あるいはこれらの塩からなる群から選択される１つ以上の化合物であることが好ましい。
【００４４】
場合によっては、本発明のＰＨＡの製造方法においては、培養工程において利用する前記培地は、炭素数４から１２の直鎖アルカン酸またはその塩を含んでいることもできる。
【００４５】
また、本発明のＰＨＡの製造方法においては、前記微生物の培養において二段階以上の培養を行うことができる。この場合、二段階目以降の培養では培地中に窒素源が含まれていないことが好ましい。
【００４６】
更に、本発明のＰＨＡの製造方法において、前記微生物の培養において二段階以上の培養を行う場合、その培養工程において
（工程１−１）  下記一般式（６）：
【００４７】
【化２５】
0004812061.tif 000011
【００４８】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、ＣＮ、ＮＯ2、ＣＯＯＲ’、ＳＯ2Ｒ’’（なお、Ｒ’は、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ’’は、ＯＨ、ハロゲン原子、ＯＮａ、ＯＫ、ＯＣＨ3、ＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す）から任意に選択される基であり、また、ｘは、１〜８から選択される任意の整数を表す）で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、かつポリペプトンを含む培地中で、ポリヒドロキシアルカノエート産生能を有する微生物を培養する工程と、これに続き、
（工程１−２）  前記一般式（６）で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、かつ有機酸またはその塩とを含む培地中で、工程１−１で培養された微生物を更に培養する工程とを有する製造方法とすることができる。その際、前記工程１−２で用いる培地中に含有される有機酸またはその塩は、ピルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸あるいはこれらの塩からなる群から選択される１つ以上の化合物であることが好ましい。なお、前記工程１−２で利用する培地中には、窒素源が含まれていないことがより好ましい。
【００４９】
また更に、
（工程１−３）  下記一般式（６）：
【００５０】
【化２６】
0004812061.tif 000012
【００５１】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、ＣＮ、ＮＯ2、ＣＯＯＲ’、ＳＯ2Ｒ’’（なお、Ｒ’は、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ’’は、ＯＨ、ハロゲン原子、ＯＮａ、ＯＫ、ＯＣＨ3、ＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す）から任意に選択される基であり、また、ｘは、１〜８から選択される任意の整数を表す）で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、かつ糖類を含む培地中で、ポリヒドロキシアルカノエート産生能を有する微生物を培養する工程と、これに続き、（工程１−４）  前記一般式（６）で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、また、糖類を含む培地中で、工程１−３で培養された微生物を更に培養する工程とを有する製造方法を挙げることもできる。その際、前記工程１−３及び工程１−４で用いるそれぞれの培地中に含有される糖類は、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースからなる群から選択される１種類以上の化合物であることが好ましい。なお、前記工程１−４で利用する培地中には、窒素源が含まれていないことがより好ましい。
【００５２】
本発明のＰＨＡの製造方法には、例えば、下記化学式（７）：
【００５３】
【化２７】
0004812061.tif 000013
【００５４】
で示される５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸を含む培地中で微生物を培養し、
下記化学式（４）：
【００５５】
【化２８】
0004812061.tif 000014
【００５６】
で示される３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットをポリマー分子中に含むポリヒドロキシアルカノエートを生産させることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法が含まれる。
【００５７】
本発明のＰＨＡの製造方法には、例えば、下記化学式（８）：
【００５８】
【化２９】
0004812061.tif 000015
【００５９】
で示される４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸を含む培地中で微生物を培養し、
下記化学式（５）：
【００６０】
【化３０】
0004812061.tif 000016
【００６１】
で示される３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットをポリマー分子中に含むポリヒドロキシアルカノエートを生産させることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法もまた含まれる。
【００６２】
なお、本発明のＰＨＡの製造方法においては、前記の培養工程に加えて、培養細胞からポリヒドロキシアルカノエートを回収する工程を設けることができ、その際、このポリヒドロキシアルカノエート回収工程は、培養された微生物細胞中に蓄積されるポリヒドロキシアルカノエートを可溶化する工程を含むことを特徴とする製造方法、もしくは、培養された微生物細胞中に蓄積されるポリヒドロキシアルカノエートを分離する方法として、微生物細胞を破砕する工程を含むことを特徴とする製造方法とすることが望ましい。
【００６３】
一方、上述した種々の構成をとることが可能な本発明のＰＨＡの製造方法において、利用する微生物は、前記培養方法によって、本発明のＰＨＡを生産しうる微生物であれば如何なる微生物でもよく、その中でも特に、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物であることが好ましい。例えば、前記シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物が、シュードモナス・チコリアイ ＹＮ２株（Pseudomonas cichorii YN2；  FERM BP−7375）、シュードモナス・チコリアイ Ｈ４５株（Pseudomonas cichorii H45；  FERM BP−7374）、シュードモナス・ジェッセニイ Ｐ１６１株（Pseudomonas jessenii P161；  FERM BP−7376）のうちから選択される微生物であることがより好ましい。
【００６４】
【発明の実施の形態】
本発明の新規なポリヒドロキシアルカノエートは、含まれるヒドロキシアルカン酸のモノマーユニット中に、スルフィド構造（−Ｓ−）及び上記芳香環構造をその側鎖に有し、この構造によりこれまでに知られている微生物生産ポリヒドロキシアルカノエートとは著しく異なった物理化学的性質を有している。本発明の新規なポリヒドロキシアルカノエートは、例えば、ＰＨＡ生産能力を有する微生物を、原料となるω−｛［（置換フェニル）メチル］スルファニル｝アルカン酸に加えて、増殖基質を含んだ培地中で培養する工程、この培養工程において微生物により生産され、その細胞内に蓄積される、側鎖末端に［（置換フェニル）メチル］スルファニル基を有するユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを回収する工程、この二段階の工程を経て製造されるものである。また、かかる微生物により産生されるＰＨＡは、一般式（１）に示されるユニットを含め、全ての３−ヒドロキシアルカン酸ユニットの、３位の炭素は不斉炭素であるが、その絶対配置は、Ｒ体となり、生分解性を示すものである。
【００６５】
なお、上記一般式（１）、ならびに、一般式（６）における、ベンゼン環上の置換基Ｒにおけるハロゲン原子には、フッ素、塩素、臭素が含まれる。
【００６６】
以下に、本発明について、より詳細に説明する。
【００６７】
本発明のＰＨＡの製造方法では、目的とする一般式（１）で示されるユニットを含むＰＨＡの生産に用いる微生物は、原料化合物の一般式（６）で示されるω−｛［（置換フェニル）メチル］スルファニル｝アルカン酸を含む培地中で培養した際、対応する側鎖末端に［（置換フェニル）メチル］スルファニル基を有する３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを生産し、その細胞内に蓄積する微生物であれば、いかなる微生物であってもよい。例えば、ＰＨＡ産生能を有するシュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物が挙げられる。好適なシュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物の一例を挙げると、シュードモナス・チコリアイ ＹＮ２株（Pseudomonas cichorii YN2；  FERM BP−7375）、シュードモナス・チコリアイ Ｈ４５株（Pseudomonas cichorii H45；  FERM BP−7374）、シュードモナス・ジェッセニイ Ｐ１６１株（Pseudomonas jessenii P161；  FERM BP−7376）の三種の菌株が挙げられる。これら三種の微生物は、寄託者として本願出願人を名義として、先に国内寄託され、その後、その原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託へと移管され、国際寄託機関としての経済産業省  産業技術総合研究所  生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）よりそれぞれ、前記の受託番号を付与され、現在の、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。また、新規なＰＨＡ産生能を有する菌株として、既に、特願平１１−３７１８６３号に記載されている微生物である。
【００６８】
以下に、ＹＮ２株、Ｈ４５株及びＰ１６１株について、その菌学的性質を示す。
【００６９】
＜ＹＮ２株の菌学的性質＞
（１）形態学的性質
細胞の形と大きさ  ：桿菌、０．８μｍ×１．５〜２．０μｍ
細胞の多形性      ：なし
運動性            ：あり
胞子形成          ：なし
グラム染色性      ：陰性
コロニー形状      ：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、半透明
（２）生理学的性質
カタラーゼ                    ：陽性
オキシダーゼ                  ：陽性
Ｏ／Ｆ試験                    ：酸化型（非発酵性）
硝酸塩の還元                  ：陰性
インドールの生成              ：陽性
ブドウ糖酸性化                ：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ      ：陰性
ウレアーゼ                    ：陰性
エスクリン加水分解            ：陰性
ゼラチン加水分解              ：陰性
β−ガラクトシダーゼ          ：陰性
King's B寒天での蛍光色素産生  ：陽性
４％ＮａＣｌでの生育          ：陽性（弱い生育）
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積：陰性（＊）
Ｔｗｅｅｎ８０の加水分解      ：陽性
＊  nutrient agar培養コロニーをズダンブラックで染色することで判定。
（３）基質資化能
ブドウ糖                          ：陽性
Ｌ−アラビノース                  ：陽性
Ｄ−マンノース                    ：陰性
Ｄ−マンニトール                  ：陰性
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン    ：陰性
マルトース                        ：陰性
グルコン酸カリウム                ：陽性
ｎ−カプリン酸                    ：陽性
アジピン酸                        ：陰性
ｄｌ−リンゴ酸                    ：陽性
クエン酸ナトリウム                ：陽性
酢酸フェニル                      ：陽性
＜Ｈ４５株の菌学的性質＞
（１）形態学的性質
細胞の形と大きさ  ：桿菌、０．８μｍ×１．０〜１．２μｍ
細胞の多形性      ：なし
運動性            ：あり
胞子形成          ：なし
グラム染色性      ：陰性
コロニー形状      ：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、クリーム色
（２）生理学的性質
カタラーゼ                    ：陽性
オキシダーゼ                  ：陽性
Ｏ／Ｆ試験                    ：酸化型
硝酸塩の還元                  ：陰性
インドールの生成              ：陰性
ブドウ糖酸性化                ：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ      ：陰性
ウレアーゼ                    ：陰性
エスクリン加水分解            ：陰性
ゼラチン加水分解              ：陰性
β−ガラクトシダーゼ          ：陰性
King's B寒天での蛍光色素産生  ：陽性
４％ＮａＣｌでの生育          ：陰性
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積：陰性
（３）基質資化能
ブドウ糖                          ：陽性
Ｌ−アラビノース                  ：陰性
Ｄ−マンノース                    ：陽性
Ｄ−マンニトール                  ：陽性
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン    ：陽性
マルトース                        ：陰性
グルコン酸カリウム                ：陽性
ｎ−カプリン酸                    ：陽性
アジピン酸                        ：陰性
ｄｌ−リンゴ酸                    ：陽性
クエン酸ナトリウム                ：陽性
酢酸フェニル                      ：陽性
【００７０】
＜Ｐ１６１株の菌学的性質＞
0004812061.tif 000017
（２）生理学的性質
カタラーゼ                    ：陽性
オキシダーゼ                  ：陽性
Ｏ／Ｆ試験                    ：酸化型
硝酸塩の還元                  ：陽性
インドールの生成              ：陰性
ブドウ糖酸性化                ：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ      ：陽性
ウレアーゼ                    ：陰性
エスクリン加水分解            ：陰性
ゼラチン加水分解              ：陰性
β−ガラクトシダーゼ          ：陰性
King's B寒天での蛍光色素産生  ：陽性
(３)基質資化能
ブドウ糖                          ：陽性
Ｌ−アラビノース                  ：陽性
Ｄ−マンノース                    ：陽性
Ｄ−マンニトール                  ：陽性
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン    ：陽性
マルトース                        ：陰性
グルコン酸カリウム                ：陽性
ｎ−カプリン酸                    ：陽性
アジピン酸                        ：陰性
ｄｌ−リンゴ酸                    ：陽性
クエン酸ナトリウム                ：陽性
酢酸フェニル                      ：陽性
【００７１】
（培養工程）
本発明にかかるＰＨＡの製造方法は、原料の上記一般式（６）に示されるω−｛［（置換フェニル）メチル］スルファニル｝アルカン酸を含む培地中で、上記するＰＨＡ産生能を有する微生物を培養することで、対応する前記一般式（１）で表される、側鎖末端に（置換フェニルメチル）スルファニル基を有する３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを生産させ、細胞内に蓄積させる。
【００７２】
微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作製、ＰＨＡの生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地（肉汁培地、酵母エキスなど）や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。温度、通気、攪拌などの培養条件は、用いる微生物に応じて適宜選択する。
【００７３】
一方、前記したようなＰＨＡ生産微生物を用いて、目的とする一般式（１）で示される、側鎖末端に（置換フェニルメチル）スルファニル基を有する３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを製造する際には、培地として、ＰＨＡ生産用の原料として、このモノマーユニットに対応する、上記一般式（６）で示されるω−｛［（置換フェニル）メチル］スルファニル｝アルカン酸に加えて、微生物の増殖用基質を少なくとも含んだ無機培地などを用いることができる。原料の一般式（６）で示される化合物は、培地あたり０．０１％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲、より好ましくは、０．０２％〜０．２％（ｗ／ｖ）の範囲に初期の含有率を選択することが望ましい。原料の一般式（６）で示されるω−｛［（置換フェニル）メチル］スルファニル｝アルカン酸の水溶性は必ずしも良好ではないが、本発明においては、上記の微生物を用いる場合、培地中に懸濁された状態であっても何ら問題とはならない。
【００７４】
なお、原料の一般式（６）で示される化合物は、分散性を高めるため、場合によっては、１−ヘキサデセンやｎ−ヘキサデカンのような溶媒に溶解、あるいは、微細な懸濁物とした形状で培地中に添加することも可能である。その際には、利用する１−ヘキサデセンやｎ−ヘキサデカンのような溶媒の添加濃度は、培地に対して、その濃度は３％（ｖ／ｖ）以下にすることが必要である。
【００７５】
培地には、微生物が増殖に利用する増殖基質を別途添加することが好ましい。この増殖基質は、酵母エキスやポリペプトン、肉エキスといった栄養素を用いることが可能である。更に、糖類、ＴＣＡ回路中の中間体として生じる有機酸ならびにＴＣＡ回路から一段階ないしは二段階の生化学反応を経て生じる有機酸またはその塩、アミノ酸またはその塩、炭素数４〜１２の直鎖アルカン酸またはその塩などから、用いる菌株に応じて、増殖基質としての有用性を考慮して、適宜選択することができる。
【００７６】
これら種々の増殖基質のうち、糖類としては、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースといったアルドース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール等のアルジトール、
グルコン酸等のアルドン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースといった二糖等から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【００７７】
また、有機酸あるいはその塩としては、ピルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸またはそれらの塩からなる群から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。一方、アミノ酸またはその塩としては、グルタミン酸、アスパラギン酸あるいはそれらの塩からなる群から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【００７８】
一般に、これら種々の増殖基質の中でも、ポリペプトンや糖類を用いるのがより好ましい。原料化合物と共存させる、これらの増殖基質は、通常、培地あたり０．１％〜５％（ｗ／ｖ）の範囲、より好ましくは、０．２％〜２％（ｗ／ｖ）の範囲にその含有率を選択することが望ましい。
【００７９】
微生物にＰＨＡを生産・蓄積させる培養方法としては、一旦十分に増殖させた後に、塩化アンモニウムのような窒素源を制限した培地へ菌体を移し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた状態でさらに培養すると生産性が向上する場合がある。例えば、異なる培養条件からなる工程を複数段接続した多段方式の採用が挙げられる。
【００８０】
より具体的には、（工程１−１）として、一般式（６）で示される化合物、ならびに増殖基質となるポリペプトンを含む培地中で微生物を培養する工程を対数増殖後期から定常期の時点まで続け、一旦菌体を遠心分離等で回収した後、これに続き、（工程１−２）として、一般式（６）で示される化合物、ならびに増殖基質となる、上に例示したような有機酸またはその塩を含む（好ましくは、窒素源を含まない）培地中で、前段の工程１−１で培養・増殖した微生物の菌体をさらに培養する工程を行う二段階培養方法、あるいは、（工程１−３）として、一般式（６）で示される化合物、ならびに増殖基質となる糖類を含む培地中で微生物を培養する工程を対数増殖後期から定常期の時点まで続け、一旦菌体を遠心分離等で回収した後、これに続き、（工程１−４）として、一般式（６）で示される化合物、ならびに増殖基質となる糖類を含み、窒素源を含まない培地中で、前段の工程１−３で培養・増殖した微生物の菌体をされに培養する工程を行う二段階培養方法等を利用することが一層好ましい。この二段階培養方法では、前段において、原料の上記一般式（６）で示されるω−｛［（置換フェニル）メチル］スルファニル｝アルカン酸から、対応する前記一般式（１）で示される、側鎖末端に［（置換フェニル）メチル］スルファニル基を有する３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを生産させつつ、菌体の増殖を予め行い、後段では、窒素源を含まない培地中で、既に培養された菌体に、主にＰＨＡの生産を行わせる培養形態とすることで、細胞内に蓄積されるＰＨＡ量をさらに高くすることができる。
【００８１】
その際、培養温度は、上記の菌株が良好に増殖可能な温度であればよく、例えば、1５〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃の範囲、より好ましくは２０℃〜３０℃の範囲に選択することが適当である。
【００８２】
培養は、液体培養、固体培養など、利用する微生物が増殖し、培地中に含有される原料の一般式（６）の化合物から、前記一般式（１）で示されるユニットを含むＰＨＡを生産する培養方法ならば、いかなる培養方法をも用いることができる。さらには、原料、増殖基質、さらには酸素の供給が適正に行われるならば、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養などの種類も問わない。例えば、液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。
【００８３】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源（例えば、リン酸塩など）、窒素源（例えば、アンモニウム塩、硝酸塩など）等、微生物の増殖に必要な成分を含んでいる培地であればいかなるものでも良く、例えば、ＭＳＢ培地、Ｍ９培地等を挙げることができる。
【００８４】
例えば、後に述べる実施例において用いた無機塩培地：Ｍ９培地の組成を以下に示す。
【００８５】
［Ｍ９培地］
Ｎａ2ＨＰＯ4      ６．２ｇ
ＫＨ2ＰＯ4        ３．０ｇ
ＮａＣｌ          ０．５ｇ
ＮＨ4Ｃｌ          １．０ｇ
（培地１リットル中、ｐＨ７．０）
【００８６】
更に、良好な増殖と、それに伴うＰＨＡの生産のためには、上記の無機塩培地に、例えば、以下に示す微量成分溶液を０．３％（ｖ／ｖ）程度添加して、必須微量元素を補う必要がある。
【００８７】
［微量成分溶液］
ニトリロ三酢酸  ：１．５ｇ；
ＭｇＳＯ4      ：３．０ｇ；
ＭｎＳＯ4      ：０．５ｇ；
ＮａＣｌ        ：１．０ｇ；
ＦｅＳＯ4      ：０．１ｇ；
ＣａＣｌ2      ：０．１ｇ；
ＣｏＣｌ2      ：０．１ｇ；
ＺｎＳＯ4      ：０．１ｇ；
ＣｕＳＯ2      ：０．１ｇ；
ＡｌＫ（ＳＯ4）2：０．１ｇ；
Ｈ3ＢＯ3      ：０．１ｇ；
Ｎａ2ＭｏＯ4  ：０．１ｇ；
ＮｉＣｌ2      ：０．１ｇ
（溶液１リットル中、ｐＨ７．０）
【００８８】
（ＰＨＡの回収工程）
本発明に用いる微生物は、このような培養方法により、上記一般式（１）で示される、側鎖末端に［（置換ファニル）メチル］スルファニル基を有する３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを産生し、その菌体内に蓄積する。従って、本発明のＰＨＡの製造方法では、培養後、その培養菌体から、目的とするＰＨＡを回収する工程を設ける。
【００８９】
この菌体からのＰＨＡの回収には、溶媒抽出法を利用して、可溶化したＰＨＡを細胞由来の不溶成分と分離し、回収する手段を用いることができる。通常行われているクロロホルム抽出が最も簡便であるが、クロロホルム以外に、ジクロロメタン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトン等が用いられる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤処理、リゾチーム等の酵素処理によって、ＰＨＡ以外の菌体内成分を可溶化・除去することによって、不溶性画分として、ＰＨＡのみを回収する方法を採ることもできる。さらには、超音波破砕法、ホモジナイザー法、圧力破砕法、ビーズ衝撃法、摩砕法、擂潰法、凍結融解法等の微生物細胞を破壊する処理を行って、細胞中に蓄積されたＰＨＡのみを分離、回収する方法を採ることもできる。
【００９０】
なお、本発明のＰＨＡの製造方法において、微生物の培養、その間における、培養される微生物におけるＰＨＡの生産と菌体への蓄積を行う工程、ならびに、培養後、その菌体からのＰＨＡ回収を行う工程は、上記の方法に限定されるものではない。
【００９１】
本発明の方法により製造される、微生物産生のＰＨＡは、一般式（１）のユニットに加えて、培地中に添加する増殖基質を利用して、脂肪酸合成系を介して生合成する、一般式（２）で示される３−ヒドロキシアルカン酸ユニット、あるいは、一般式（３）で示される３−ヒドロキシアルカ−５−エン酸ユニットを含むこともある。なお、含まれる３−ヒドロキシアルカン酸ユニットは、いずれも、その３位の炭素原子は不斉炭素であるが、その絶対配置は同じくＲ−体であり、その生分解性を保持することは勿論のことである。一般式（１）のユニット中の、（フェニルメチル）スルファニル基部分に加えて、そのベンゼン環上に種々の置換基を有することで、ポリマーそのものに新たな物理化学的な性質が加わり、物性の改良が見込まれ、これまでに応用し得なかった分野への展開が期待できる。
【００９２】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。これら実施例は、本発明の最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、これら実施例により限定されうるものではない。なお、以下における「％」は特に表記した以外は重量基準である。
【００９３】
３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法
【００９４】
（実施例１）
ポリペプトン（販売元  和光純薬工業）０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【００９５】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ１０６ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【００９６】
得られたＰＨＡの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８２２０、カラム；東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算）により評価した。その結果、数平均分子量  Ｍｎ＝３２０００、質量平均分子量  Ｍｗ＝９６０００であった。
【００９７】
更に、得られたＰＨＡの構造を特定するため、以下の条件でＮＭＲ分析を行った。
＜測定機器＞  ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ ＤＰＸ４００共鳴周波数：1Ｈ＝４００ＭＨｚ、13Ｃ＝１００ＭＨｚ＜測定条件＞  測定核種：1Ｈ、13Ｃ使用溶媒：ＣＤＣｌ3測定温度：室温図１に、測定された1Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャートを示し、また、表１に、その同定結果を示す。図２に、測定された13Ｃ−ＮＭＲスペクトルチャートを示し、また、表２に、その同定結果を示す。
【００９８】
【表１】
0004812061.tif 000018
【００９９】
【表２】
0004812061.tif 000019
【０１００】
表１と表２に示す結果より、当該ＰＨＡは３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸モノマーユニットを含んでおり、加えて、それ以外のモノマーユニットとして、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸をも含んでおり、具体的には、その構成は
下記化学式（９）：
【０１０１】
【化３１】
0004812061.tif 000020
【０１０２】
に示されるＰＨＡであることが確認された。また、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、得られたＰＨＡは３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを７６．７mol%含んでいることがわかった。
【０１０３】
（実施例２）
ノナン酸０．１％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１０４】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ８９ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１０５】
得られたＰＨＡについて、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（９）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを２７．０mol%含むこともわかった。
【０１０６】
（実施例３）
酵母エキス（ＤＩＦＣＯ製）０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１０７】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ６９ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１０８】
得られたＰＨＡについて、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含み、さらに、それ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（９）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを７６．７mol%含むこともわかった。
【０１０９】
（実施例４）
グルタミン酸ナトリウム０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１１０】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ６８ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１１１】
得られたＰＨＡについて、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含み、さらに、それ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（９）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを９０．３mol%含むこともわかった。
【０１１２】
（実施例５）
Ｄ−グルコース０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ−グルコース０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含み、窒素源（ＮＨ4Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１１３】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ１６４ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１１４】
得られたＰＨＡについて、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（９）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを８５．９mol%含むこともわかった。
【０１１５】
（実施例６）
Ｄ−グルコース０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ−グルコース０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含み、窒素源（ＮＨ4Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１１６】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ１３８ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１１７】
得られたＰＨＡについて、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（９）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを９０．７mol%含むこともわかった。
【０１１８】
（実施例７）
Ｄ−グルコース０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・ジェッセニイ・ Ｐ１６１株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ−グルコース０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含み、窒素源（ＮＨ4Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１１９】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ１３８ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１２０】
得られたＰＨＡについて、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（９）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを８８．５mol%含むこともわかった。
【０１２１】
（実施例８）
ポリペプトン（販売元  和光純薬工業）０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含み、窒素源（ＮＨ4Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１２２】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ１２５ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１２３】
得られたＰＨＡについて、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（９）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを８９．５mol%含むこともわかった。
【０１２４】
（実施例９）
ポリペプトン（販売元  和光純薬工業）０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含み、窒素源（ＮＨ4Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１２５】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ１５４ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１２６】
得られたＰＨＡについて、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（９）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを９７．９mol%含むこともわかった。
【０１２７】
（実施例１０）
ポリペプトン（販売元  和光純薬工業）０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含み、窒素源（ＮＨ4Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１２８】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ１５８ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１２９】
得られたＰＨＡについて、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（９）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを９１．６mol%含むこともわかった。
【０１３０】
表３に、上記の実施例１〜１０における菌体乾燥重量、ポリマー乾燥重量、ポリマー乾燥重量／菌体乾燥重量比率、ならびに得られたＰＨＡポリマーの３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニット（３ＨＦＢｚｙＴＶ）ユニットの含有比率（mol%）をまとめて示す。
【０１３１】
【表３】
0004812061.tif 000021
【０１３２】
３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法
【０１３３】
（実施例１１）
酵母エキス（ＤＩＦＣＯ製）０．５％、４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１３４】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ４１ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１３５】
得られたＰＨＡの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８２２０、カラム；東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算）により評価した。その結果、数平均分子量  Ｍｎ＝１５３００、質量平均分子量  Ｍｗ＝３７１００であった。
【０１３６】
更に、得られたＰＨＡの構造を特定するため、以下の条件でＮＭＲ分析を行った。
0004812061.tif 000022
図３に、測定された1Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャートを示し、また、表４に、その同定結果を示す。
【０１３７】
【表４】
0004812061.tif 000023
【０１３８】
表４に示す結果より、当該ＰＨＡは３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸モノマーユニットを含んでおり、加えて、それ以外のモノマーユニットとして、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸をも含んでおり、具体的には、その構成は
下記化学式（１０）：
【０１３９】
【化３２】
0004812061.tif 000024
【０１４０】
に示されるＰＨＡであることが確認された。また、得られたＰＨＡは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを８９.８mol%含んでいることがわかった。
【０１４１】
（実施例１２）
ノナン酸０．１％、４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１４２】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ４５ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１４３】
得られたＰＨＡについて、実施例１１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（１０）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを１０．６mol%含むこともわかった。
【０１４４】
（実施例１３）
グルタミン酸ナトリウム０．５％、４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１４５】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ１１ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１４６】
得られたＰＨＡについて、実施例１１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（１０）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを８４．１mol%含むこともわかった。
【０１４７】
（実施例１４）
Ｄ−グルコース０．５％、４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ YN２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ−グルコース０．５％、４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸０．１％を含み、窒素源（ＮＨ4Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１４８】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ１５３ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１４９】
得られたＰＨＡについて、実施例１１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（１０）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを68.5mol%含むこともわかった。
【０１５０】
（実施例１５）
ポリペプトン（販売元  和光純薬工業）０．５％、４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・H４５株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム０．５％、４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸０．１％を含み、窒素源（ＮＨ4Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１５１】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ３８ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１５２】
得られたＰＨＡについて、実施例１１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（１０）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを43.1mol%含むこともわかった。
【０１５３】
（実施例１６）
Ｄ−グルコース０．５％、４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ−グルコース０．５％、４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸０．１％を含み、窒素源（ＮＨ4Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１５４】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ４７ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１５５】
得られたＰＨＡについて、実施例１１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（１０）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを48.7mol%含むこともわかった。
【０１５６】
表５に、上記の実施例１１〜１６における菌体乾燥重量、ポリマー乾燥重量、ポリマー乾燥重量／菌体乾燥重量比率、ならびに得られたＰＨＡポリマーの３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニット（３ＨＦＢｚｙＴB）ユニットの含有比率（mol%）をまとめて示す。
【０１５７】
【表５】
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【０１５８】
【発明の効果】
本発明のＰＨＡの製造方法においては、原料として、ω−｛［（置換フェニル）メチル］スルファニル｝アルカン酸含む培地中で微生物を培養し、対応する３−ヒドロキシ−ω−｛［（置換フェニル）メチル］スルファニル｝アルカン酸ユニットを含む新規な生分解性ＰＨＡが効率的に製造される。本発明のＰＨＡの側鎖における芳香環上には、種々な基を置換し、新たな特性の導入がなされ、機能性ポリマーとして有用なポリヒドロキシアルカノエートであり、デバイス材料や医薬材料等の各分野への応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られたＰＨＡについて測定された1Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
【図２】実施例１で得られたＰＨＡについて測定された13Ｃ−ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
【図３】実施例１１で得られたＰＨＡについて測定された1Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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