(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
空間の一点に収束する収束光を照明光として照射する照明手段と、前記照明光を被検査物の手前で略単色化する単色化装置と、前記照明光の前記収束点の手前で前記被検査物を載置する被検査物載置台と、前記照明光が前記被検査物において透過もしくは反射した光をひとたび前記収束点に収束させた後に入射するように配置された対物レンズと、対物レンズの前方であって、前記収束点を含み前記照明光の光軸に直交する回折像面上に設置され、かつ前記被検査物によって回折または散乱されることなく前記回折像面上に形成される回折像の中心付近に入射する直接光もしくは前記被検査物によって回折または散乱され前記回折像の中心付近以外に入射する回折光または散乱光の位相を遅らせる位相板（フェーズプレート）と、前記回折像面と前記被検査物との相対的な位置を任意に変更できる調整機構とを備えることを特徴とする光学顕微鏡装置。
【請求項２】
前記対物レンズは、前記回折像面および前記被検査物のいずれにも焦準を合わせることができるようになっていることを特徴とする請求項１に記載の光学顕微鏡装置。
【請求項３】
前記位相板の直後の位置に配置され、前記被検査物において透過もしくは反射した前記回折光の一部を選択的に遮蔽する空間絞りを備えることを特徴とする請求項１または２のいずれか一項に記載の光学顕微鏡装置。
【請求項４】
前記位相板が光の位相をπ／２遅らせることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の光学顕微鏡装置。
【請求項５】
前記位相板が前記直接光の強度を減衰させる機能も合わせ有することを特徴とする請求項４に記載の光学顕微鏡装置。
【請求項６】
前記略単色化装置がグリーンフィルターであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の光学顕微鏡装置。
【請求項７】
前記空間絞りを通過した光の方向と前記対物レンズの光軸とを略一致させる調整機構を備えていることを特徴とする請求項３〜６のいずれか一項に記載の光学顕微鏡装置。
【請求項８】
請求項１に記載の光学顕微鏡装置を用いた顕微鏡観察方法において、前記対物レンズの焦準を前記被検査物に合わせて前記被検査物を観察することを特徴とする顕微鏡観察方法。
【請求項９】
請求項１に記載の光学顕微鏡装置を用いた顕微鏡観察方法において、前記収束点を含み前記対物レンズの光軸に直交する回折像面に前記対物レンズの焦準を合わせることにより、前記被検査物の前記照明光による回折像を観察することを特徴とする顕微鏡観察方法。
【請求項１０】
請求項２に記載の光学顕微鏡装置を用いた顕微鏡観察方法において、最初に前記対物レンズの焦準を前記被検査物に合わせて前記被検査物を観察した後、前記対物レンズの焦準を前記回折像面上に形成された回折像に合わせて前記回折像を観察するか、もしくは、最初に前記対物レンズの焦準を前記回折面上に形成された回折像に合わせて前記回折像を観察した後、前記対物レンズの焦準を前記被検査物に合わせて前記被検査物を観察することを特徴とする顕微鏡観察方法。
【請求項１１】
請求項３〜７のいずれか一項に記載の光学顕微鏡装置を用いた顕微鏡観察方法において、前記空間絞りを用いて前記直接光および所望の回折光のみを通過させ、前記空間絞りを通過した光について前記対物レンズの焦準を前記被検査物に合わせて前記被検査物を観察することを特徴とする顕微鏡観察方法。
【請求項１２】
請求項３〜７のいずれか一項に記載の光学顕微鏡装置を用いた顕微鏡観察方法において、前記回折像面に前記対物レンズの焦準を合わせることにより、前記回折像面上に形成された前記被検査物の前記照射光による回折像を観察し、前記回折像の所望の領域のみの光を通過させるように前記空間絞りを調整した後、前記対物レンズの焦準を前記被検査物に合わせることにより、前記空間絞りを通過した光によって前記被検査物を観察することを特徴とする顕微鏡観察方法。
【請求項１３】
請求項３〜７のいずれか一項に記載の光学顕微鏡装置を用いた顕微鏡観察方法において、前記対物レンズが前記回折像面の近傍に位置したときに前記被検査物に焦準が合うように前記回折像面の位置を調整して前記被検査物を観察することを特徴とする顕微鏡観察方法。
【請求項１４】
前記空間絞りの形状または前記空間絞りの前記回折面上での位置を変えることにより、もしくは、前記対物レンズの光軸に対する前記照明光の光軸の角度を変えることにより、前記対物レンズによる前記被検査物の光学像形成にあずかる光を選択して前記被検査物を観察することを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項１５】
前記空間絞りを通過した光の方向と前記対物レンズの光軸とを略一致させて前記被検査物を観察することを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項１６】
前記照明光の収束点の位置を前記対物レンズの光軸方向において変えることにより前記回折像の大きさを調整することを特徴とする請求項８〜１２、１４、または１５のいずれか一項に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項１７】
前記被検査物が高分子材料であることを特徴とする請求項８〜１６のいずれか一項に記載の顕微鏡観察方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、各種材料の組織構造の観察に適した収束光位相差顕微鏡装置および収束光位相差顕微鏡観察方法に関するものである。本発明の収束光位相差顕微鏡装置および収束光位相差顕微鏡観察方法の観察対象となり得る材料のとして、ポリエチレンフィルム、ポリプロピレンフィルム等の高分子材料や、植物、病理組織等の生体材料や、塗液、乳液等の懸濁液や、半導体材料等が挙げられる。
【０００２】
【従来の技術】
各種材料の組織構造は、その物性と密接に相関していることから、その組織構造を正確に評価・解析することが重要となる。そのために、多くの手法が開発され活用されているが、光学顕微鏡装置はその中でも、利用のしやすさや得られる情報の多様性等から、材料の組織構造観察法として最も一般的に利用される手法となっている。
【０００３】
そして、従来の光学顕微鏡装置では、被検査物に対する照明法として、被検査物を一様に照射し、かつ像の分解能を高めるために、平行光を入射するケーラー照明法が通常用いられている。また、対物レンズの後ろ側焦点面上に位相板（フェーズプレート）を配置し、入射した光のうち直接光もしくは回折光の位相を変化させ両者の干渉によりコントラストをつける位相差顕微鏡装置も従来からしばしば用いられている。以下、これらを合わせて従来の顕微鏡装置と略称する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、従来の光学顕微鏡装置による観察は、対物レンズによって被検査物の拡大された光学像を単に形成し、それを接眼レンズでさらに拡大して行うだけである。すなわち、被検査物で反射あるいは透過した光の強度（振幅）に起因する像を観察するだけなので、ごくわずかな屈折率差しか有さない被検査物（位相物体）には適用できなかった。これを解決する手段として上記の位相差顕微鏡装置が利用されるわけであるが、従来の位相差顕微鏡装置では、試料によっては必ずしもコントラストが十分ではなかった。もちろん従来の位相差顕微鏡装置では位相物体の回折像を観察することはできなかった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の収束光位相差顕微鏡装置および収束光位相差顕微鏡観察方法はこのような課題を解決するためになされたものである。
【０００６】
本発明の収束光位相差顕微鏡装置は、空間の一点に収束する収束光を照明光として照射する照明手段と、前記照明光を被検査物の手前で略単色化する単色化装置と、前記照明光の前記収束点の手前で前記被検査物を載置する被検査物載置台と、前記照明光が前記被検査物において透過もしくは反射した光をひとたび前記収束点に収束させた後に入射するように配置された対物レンズと、対物レンズの前方であって、前記収束点を含み前記照明光の光軸に直交する回折像面上に設置され、かつ前記被検査物によって回折または散乱されることなく前記回折像面上に形成される回折像の中心付近に入射する直接光もしくは前記被検査物によって回折または散乱され前記回折像の中心付近以外に入射する回折光または散乱光の位相を遅らせる位相板（フェーズプレート）と、前記回折像面と前記被検査物との相対的な位置を任意に変更できる調整機構とを備えることを特徴とする。
【０００７】
このように、平行光に代わって単色化した収束光を照明光として用いると、極めてコントラストの高い、焦点深度の深い位相差顕微鏡像を得ることができる。さらに、直接光もしくは回折像の中心付近以外に入射する回折光の位相を遅らせる位相板を備えるため、屈折率の小さい被検査物（位相物体）に対しても明瞭な位相差顕微鏡像を得ることができる。
【０００８】
ここで位相物体とは、物体各部分を透過または反射した光に位相の差（光波の進行段階の差）を生じさせるが強度の差を生じさせないもののことである。強度の差が生じないために、そのままでは物体各部分を明暗の違いとして観察できない。この場合、位相板を用いて直接光の位相を回折光に対して変化させた後に回折光と干渉させるか、もしくは回折光の位相を直接光に対して変化させた後に直接光と干渉させることにより、物体各部分を透過または反射した光に強度の差が生じて観察することができるようになる。これが位相差顕微鏡の原理である。
【０００９】
従来の光学顕微鏡装置では、回折像は対物レンズの後側焦点面、すなわち、鏡筒内部に形成されるので、接眼レンズをはずさない限り観察できないし、いわんや操作を加えたりすることは不可能である。また、従来の位相差光学顕微鏡装置では、回折像が鏡筒内部に形成されるのにともない位相板が対物レンズに取り付けられており、位相差用の各種対物レンズを準備し交換しなければならない。さらに、位相物体を観察するためには位相板と絞り板の形状および大きさを共役にする必要があるが、従来の位相差顕微鏡装置では絞り板がコンデンサーに取り付けられているため、位相差用のコンデンサーを準備し交換しなければならない。そのうえ、対物レンズの倍率を変えるたびにそれに合わせてコンデンサーの絞り板も変えなければならない、等の不便さがあった。
【００１０】
一方、収束光位相差顕微鏡装置では、照明光の収束点を含み照明光の光軸に直交する面には、照明光による被検査物のフーリエ変換像すなわち回折像が形成される。この場合、対物レンズの前方にこの回折像を形成させることができるので、回折像そのものを観察したり、回折像に対して操作を加えて所望の処理を施したりすることができる。さらに、位相物体を観察するために、直接光もしくは回折像の中心付近以外に入射する回折光の位相を位相板により遅らせることができる。このとき、位相板が対物レンズの前方に配置されているため、従来の位相差顕微鏡装置に必ず必要な位相差用の対物レンズを準備し交換する必要がない。また、対物レンズの倍率を変えても位相板や位相板とともに用いる絞り板を変える必要がない。さらに、絞り板をコンデンサーに取り付けていないため、従来の位相差顕微鏡装置に必ず必要な位相差用のコンデンサーを準備し交換する必要もない。
【００１１】
回折像には被検査物の構造情報が集約されている。換言すると、被検査物の組織構造に応じた回折像が形成され、被検査物の組織構造が異なっていれば、その回折像も異なったものとなる。したがって、組織構造と回折像との関係が判っていれば、回折像から逆に被検査物の組織構造を知ることができる。本発明の収束光位相差顕微鏡装置は、微小なコントラストしか有さない位相物体の回折像と位相差像を同時に与えるものである。
【００１２】
対物レンズは、回折像面および被検査物のいずれにもに焦準（ピント）を合わせることができるようになっていることが望ましい。これにより、被検査物の光学像と回折像を共に観察することができ、被検査物の構造情報の取得を増やすことができる。
【００１３】
この収束光位相差顕微鏡装置は、回折像面の位置に配置され、照明光が被検査物において透過または反射した光の一部を選択的に遮蔽する空間絞りを備えることが望ましい。この場合、回折光の選択が自由にできるよう調整されているので、同一の被検査物について所望の回折光に応じた様々な位相差像を観察することができる。しかも位相板を備えているため、選択された回折光と直接光による被検査物の光学像の中の微小な屈折率分布を観察することができる。
【００１４】
この空間絞りは、所望の回折光を選択して対物レンズに入射させるためのものである。対物レンズの焦準を被検査物に合わせれば、選択された回折光と直接光の干渉によって形成された位相差像を観察することができる。しかも、回折光の選択が自由なので、同一の被検査物について所望の回折光に応じた様々な像を観察することができる。
【００１５】
この収束光位相差顕微鏡装置は、回折像面と被検査物との相対的な位置を任意に変更できる調整機構を備えている。通常は、収束する照明光の出射面となるコンデンサレンズの位置を変えることにより収束点の位置、すなわち回折像面の位置を変える。回折像面と被検査物との距離を変えると、回折像の大きさが変化する。距離を離すほど、回折像を大きくすることができ、回折像の微細なパターンを調べることができる。
【００１６】
この収束光位相差顕微鏡装置は、位相板が光の位相をπ／２すなわち波長にして四分の一波長遅らせるものであることが望ましい。光の位相を遅らせる量がπ／２でない場合に比べて屈折率分布によるコントラストを大きくすることができる。
【００１７】
さらにこの位相板が直接光の強度を減衰させる機能を合わせ有するとなお好ましい。直接光と回折光の干渉を調整して位相差像のコントラストをより高めることができるためである。
【００１８】
この収束光位相差顕微鏡装置は、単色化装置としてグリーンフィルターを用いると、本発明による位相差像を安価で簡便に得ることができる。
【００１９】
この収束光位相差顕微鏡装置は、空間絞りを通過した光の方向と対物レンズの光軸とを略一致させる調整機構を備えていることが望ましい。空間絞りにより光量が減少するが、この２つの光軸を略一致させることにより、ひずみの少ない明るい像を得ることができる。
【００２０】
このような収束光位相差顕微鏡装置を用いた本発明の顕微鏡観察方法の一つは、対物レンズの焦準を被検査物に合わせて被検査物を観察するものである。収束光を照明光として用いるので、極めてコントラストの高い、焦点深度の深い観察像を得ることができる。
【００２１】
本発明の他の収束光位相差顕微鏡観察方法は、収束点を含む対物レンズの光軸に直交する回折像面に対物レンズの焦準を合わせることにより、回折像面上に形成された被検査物の照射光による回折像を観察するものである。
【００２２】
被検査物について、回折像と組織構造との関係を予め取得しておけば、回折像を直接観察することにより、回折像のパターンの特徴から被検査物の組織構造を知ることができる。
【００２３】
本発明の他の収束光位相差顕微鏡観察方法は、最初に対物レンズの焦準を被検査物に合わせて被検査物を観察した後、対物レンズの焦準を回折像面上に形成された回折像に合わせて回折像を観察するか、もしくは、最初に対物レンズの焦準を回折面上に形成された回折像に合わせて回折像を観察した後、対物レンズの焦準を被検査物に合わせて被検査物を観察するものである。
【００２４】
光学像の観察だけでは分かりにくかった組織構造の全体的な特徴を把握したり、回折像の観察だけでは分かりにくかった回折像が由来する組織構造の詳細を知ることができる。
【００２５】
本発明の他の収束光位相差顕微鏡観察方法は、空間絞りを用いて回折像面上の所望の領域のみの光を通過させ、空間絞りを通過した光について対物レンズの焦準を被検査物に合わせて被検査物を観察するものである。
【００２６】
この結果、空間絞りで選択された回折光と直接光の干渉による被検査物の位相差像を観察することができる。回折光の選択が自由なので、同一の被検査物について回折光に応じた様々な像を観察することができる。これにより被検査物の組織構造をさらに詳しく知ることができる。
【００２７】
本発明の他の収束光位相差顕微鏡観察方法は、回折像面に対物レンズの焦準を合わせることにより、回折像面上に形成された被検査物の照射光による回折像を観察し、回折像の所望の領域と直接光の両者を通過させるように空間絞りを調整した後、対物レンズの焦準を被検査物に合わせることにより、空間絞りを通過した光によって被検査物を観察するものである。
【００２８】
回折像に基づいて回折光を選択してから像観察を行うので、いかなる回折光に基づく光学像かを知ることができる。これにより被検査物の組織構造をさらに詳しく知ることができる。
【００２９】
本発明の収束光位相差顕微鏡観察方法では、対物レンズが回折像面の近傍に位置したときに被検査物に焦準が合うように回折像面の位置を調整して被検査物を観察することが望ましい。回折像面は照射光が収束する位置なので、そこに対物レンズが置かれたときに回折光をロスすることなく最も像が明るくなるためである。
【００３０】
空間絞りの形状または回折像面上での位置を変えることにより、もしくは、対物レンズの光軸に対する照明光の光軸の角度を変えることにより、対物レンズによる被検査物の光学像形成にあずかる回折光を選択して被検査物を観察することができる。
【００３１】
本発明の顕微鏡観察方法では、空間絞りを通過した光の方向と対物レンズの光軸とを略一致させて被検査物を観察することが望ましい。空間絞りにより光量が減少するが、この２つの光軸を略一致させることにより、ひずみの少ない明るい像を得ることができる。
【００３２】
本発明の顕微鏡観察方法では、照明光の収束点の位置を対物レンズの光軸方向において変えることにより回折像の大きさを調整することができることが望ましい。距離を離すほど、回折像の大きさを大きくすることができ、回折像のより詳細な観察ができる。
【００３３】
本発明の顕微鏡観察方法は、高分子材料に対して好適に用いることができる。高分子材料の重要な組織構造について、従来の顕微鏡観察方法では得られなかった詳細な知見が得られる。
【００３４】
【発明の実施の形態】
図１は本発明の一実施形態である収束光位相差顕微鏡装置の基本構成を示す図である。光源１と単色化装置１７とコンデンサレンズ２によって、空間の一点４に収束する収束光を照明光として照射する照明手段３が構成されている。光源１から出力される光は、単色化装置１７により単色光となるようにする。
【００３５】
照明手段３の上方には、被検査物（標本）６を載置する被検査物載置台（ステージ）５が配置されている。ステージ５は、その中央に照明手段３からの照明光を透過する開口を有し、照明光はこの開口を通ってさらに上方の収束点４で収束する。これにより、収束点４を通り照明光の光軸７に垂直な平面８には、被検査物６の照明光によるフーリエ変換像すなわち回折像が形成される。ここでは、この平面８を回折像面と呼ぶことにする。
【００３６】
収束点４付近には位相板１５が設けられている。図２は位相板１５の平面図であり、回折光を透過する石英板等の中央にたとえば直径４５〜５０μｍの円板状の位相を変化させる材料が取り付けられている。この位相板１５は観察中でも容易に脱着可能となっている。
【００３７】
なお、位相板１５上の位相を変化させる材料の形状は必ずしも円板状でなくともよい。光源１とコンデンサレンズ２の間にある光源像結像位置付近に絞り板１６を挿入することにより、絞り板１６の形状に応じて方形、半円形、扇形、リング状等を適宜選択することができる。
【００３８】
コンデンサレンズ２は、ステージ５に対して光軸７の方向に移動可能となっている。コンデンサレンズ２を光軸７の方向に移動させることにより、ステージ５に載置された被検査物６と収束点４との距離、すなわち、被検査物６と回折像面８との距離を変化させることができる。
【００３９】
回折像面８上またはその近傍の位置には、回折像面８と平行に空間絞り９が設けられている。図３は空間絞り９の平面図であり、遮光板の中央に、たとえば直径数百ミクロンの円形開口が形成されている。この空間絞り９は、光軸７に直交する方向に移動可能となっており、回折像面８上に形成される回折像の観察視野を選択できる。また、この空間絞り９は観察途中でも、容易に脱着可能となっている。
【００４０】
なお、空間絞り９に形成する開口形状すなわち観察視野は、必ずしも円形でなくてもよい。目的に応じて方形、半円形、扇形等を適宜選択することができる。
【００４１】
空間絞り９のさらに上方には、対物レンズ１０、結像レンズ１１および接眼レンズ１２を備えた鏡筒１３が配置されている。この鏡筒１３の内部構成自体は、従来からある一般的なものであり、光軸７の方向に移動させることにより、焦準合わせを行うことができるようなっている。
【００４２】
しかし、焦準合わせのための鏡筒移動可能範囲は、従来の一般的な顕微鏡装置に比べて十分に長いことが必要である。すなわち、少なくとも被検査物６と回折像面８の両方に焦準合わせができるようになっている。
【００４３】
対物レンズ１０は、被検査物６に焦準を合わせたときの位置が空間絞り９よりも後方（上方）になるような焦点距離を有している。したがって、焦準合わせ動作において、空間絞り９が邪魔になることがない。
【００４４】
なお、図４に示すように、対物レンズ１０が空間絞り９に最も近づいたときに被検査物６に焦準が合うように、回折像面８の位置を調整すると、最も明るい像を得ることができる。
【００４５】
対物レンズ１０が捕らえた像は、結像レンズ１１の後方にある中間像位置１４に形成され、接眼レンズ１２はこの像を観察できるように焦準が調整されている。
【００４６】
本発明による被検査物としては、高分子材料（たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーフィルム）、生体材料、セラミックス、金属他を挙げることができるが、組織構造を観察し得るという点で、ポリマーフィルムは最も典型的な対象材料である。
【００４７】
【発明の効果】
以上のように、本発明の収束光位相差顕微鏡装置およびこれを用いた収束光位相差顕微鏡観察方法によれば、対物レンズの手前で一点に収束する照明光を用い、かつ収束点付近に位相板を配置しているので、被検査物の位相差顕微鏡像およびその回折像を対物レンズを光軸方向に移動するだけで選択的に観察できる。また、この収束光位相差顕微鏡装置は、回折像面と被検査物との相対的な位置を任意に変更できる調整機構を備えているので、回折像面と被検査物との距離を離すほど、回折像の大きさを大きくすることができ、回折像の微細なパターンを調べることができる。さらに、空間絞りを適当に挿入または移動させることにより、所望の回折光による被検査物の位相差顕微鏡像と回折像とを得ることができる。したがって、従来の光学顕微鏡装置では得られなかった微小な屈折率差しか有さない被検査物の構造に関する詳細な知見を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施形態である収束光位相差顕微鏡装置の構成を示す図
【図２】位相板１５を示す平面図
【図３】空間絞り９を示す平面図
【図４】対物レンズ１０を空間絞り９に近接させた状態の収束光位相差顕微鏡装置を示す図
【符号の説明】
１…光源、２…コンデンサレンズ、３…照明手段、４…収束点、５…被検査物載置台（ステージ）、６…被検査物、７…光軸、８…回折像面、９…空間絞り、１０…対物レンズ、１１…結像レンズ（必ずしも必要ではない）、１２…接眼レンズ、１３…鏡筒、１４…中間像位置、１５…位相板、１６…絞り板、１７…単色化装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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