(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ペプチドの各位置のアミノ酸について、その前後のアミノ酸を１〜５個ずつ、末端アミノ酸の場合は０個を加えて、疎水性値の平均値を算出して、その疎水性値が逆の値になっていることで評価して、＋３．０であれば、−３．０をそのアミノ酸の位置での疎水性評価を満点とする演算手段と、
対応するアミノ酸同士のα炭素が５オングストローム近くに相互に接近することを阻害しない側鎖容積になっていることを評価し、容積阻害を起こさない場合を満点とし、阻害の程度により減点評価する演算手段と、
ペプチド骨格のバックボーン並列性の一致度を評価指標として、評価点をつける演算手段と、
を有することを特徴とするペプチド評価システム。
【請求項２】
（ア）  標的ペプチドに対して同一アミノ酸からなる任意に設計したペプチドを候補ペプチドとして標的ペプチドに対する相補性を評価して評価値を記録する第１の手段と、
（イ）  上記候補ペプチドのアミノ酸配列をスクランブルして別の配列に変えたり、アミノ酸の置換を任意に行い別の候補ペプチドを設計し、標的ペプチドに対する相補性を評価して、その評価値を記録すると共に、この評価及び記録を繰り返して満点値のペプチドが得られるまで連続して行う第２の手段と、
（ウ）  評価したペプチドの得点の高いものからソートして一覧表を作成する手段と、
を有するペプチド評価システムであって、
更に、前記（ア）の第１の手段および前記（イ）の第２の手段の各々は、標的ペプチドに対する相補性を評価するために、下記ａ、ｂ及びｃの演算手段、即ち、
ａ：標的ペプチドの各位置のアミノ酸について、その前後のアミノ酸を１〜５個ずつ、末端アミノ酸の場合は０個を加えて、疎水性値の平均値を算出して、その疎水性値が逆の値になっていることで評価して、＋３．０であれば、−３．０をそのアミノ酸の位置での疎水性評価を満点とする演算手段と、
ｂ：対応するアミノ酸同士のα炭素が５オングストローム近くに相互に接近することを阻害しない側鎖容積になっていることを評価し、容積阻害を起こさない場合を満点とし、阻害の程度により減点評価する演算手段と、
ｃ：ペプチド骨格のバックボーン並列性の一致度を評価指標として、評価点をつける演算手段と、
を備えていることを特徴とするペプチド評価システム。
【請求項３】
ペプチド評価システムの全体を制御するとともにペプチドの相補性部位に係る処理を実行する制御ユニット（１０）と、配列情報の対象となる標的ペプチドの配列情報がセットされる配列情報バッファ（２０）と、前記配列情報バッファに格納された各アミノ酸残基について相補性部位評価に必要な情報が格納される相補性部位評価バッファ（３０）と、前記制御ユニットが実行すべきプログラムおよび処理の過程で得られたデータを記憶するメモリユニット（４０）とを備え、ペプチドの相補性部位評価システムを構成することになるコンピューターによって読取り可能な記録媒体であって、
当該記録媒体には、ペプチドの相補性部位の評価処理を記述したプログラムコードにより構成されるプログラムと、各アミノ酸とそれに割り付けられた相補性パラメータとの関係を示すデータが格納されており、
前記プログラムおよび前記アミノ酸と相補性パラメータとの関係を示すデータが前記コンピューターにインストールされたとき、前記プログラムは、前記アミノ酸と相補性パラメータとの関係を示すデータを用いながら、前記コンピューターの制御ユニット（１０）に下記Ａ，Ｂ及びＣの演算処理を行わせること、即ち、
Ａ：ペプチドの各位置のアミノ酸について、その前後のアミノ酸を１〜５個ずつ、末端アミノ酸の場合は０個を加えて、疎水性値の平均値を算出して、その疎水性値が逆の値になっていることで評価して、＋３．０であれば、−３．０をそのアミノ酸の位置での疎水性評価を満点とする演算処理と、
Ｂ：対応するアミノ酸同士のα炭素が５オングストローム近くに相互に接近することを阻害しない側鎖容積になっていることを評価し、容積阻害を起こさない場合を満点とし、阻害の程度により減点評価する演算処理と、
Ｃ：ペプチド骨格のバックボーン並列性の一致度を評価指標として、評価点をつける演算処理と、
を行わせることを特徴とするコンピューター読み取り可能な記録媒体。
【請求項４】
ペプチド評価システムの全体を制御するとともにペプチドの相補性部位に係る処理を実行する制御ユニット（１０）と、配列情報の対象となる標的ペプチドの配列情報がセットされる配列情報バッファ（２０）と、前記配列情報バッファに格納された各アミノ酸残基について相補性部位評価に必要な情報が格納される相補性部位評価バッファ（３０）と、前記制御ユニットが実行すべきプログラムおよび処理の過程で得られたデータを記憶するメモリユニット（４０）とを備え、ペプチドの相補性部位評価システムを構成することになるコンピューターによって読取り可能な記録媒体であって、
当該記録媒体には、ペプチドの相補性部位の評価処理を記述したプログラムコードにより構成されるプログラムと、各アミノ酸とそれに割り付けられた相補性パラメータとの関係を示すデータが格納されており、
前記プログラムおよび前記アミノ酸と相補性パラメータとの関係を示すデータが前記コンピューターにインストールされたとき、前記プログラムは、前記アミノ酸と相補性パラメータとの関係を示すデータを用いながら、前記コンピューターの制御ユニット（１０）に下記（ア）、（イ）及び（ウ）の演算処理、即ち、
（ア）  標的ペプチドに対して同一アミノ酸数からなる任意に設計したペプチドを候補ペプチドとして標的ペプチドに対する相補性を評価してその評価値をメモリに記録する演算処理と、
（イ）  上記候補ペプチドのアミノ酸配列をスクランブルして別の配列に変えたり、アミノ酸の置換を任意に行い別の候補ペプチドを設計し、標的ペプチドに対する相補性を評価して、その評価値をメモリに記録すると共に、この評価及び記録を繰り返して満点値のペプチドが得られるまで連続する演算処理と、
（ウ）  評価したペプチドの得点の高いものからソートして一覧表を作成する処理と、
を行わせるものであり、
更に、前記（ア）の演算処理および前記（イ）の演算処理の各々においては、標的ペプチドに対する相補性を評価するために、下記ａ、ｂ及びｃの演算処理、即ち、
ａ：ペプチドの各位置のアミノ酸について、その前後のアミノ酸を１〜５個ずつ、末端アミノ酸の場合は０個を加えて、疎水性値の平均値を算出して、その疎水性値が逆の値になっていることで評価して、＋３．０であれば、−３．０をそのアミノ酸の位置での疎水性評価を満点とする演算処理と、
ｂ：対応するアミノ酸同士のα炭素が５オングストローム近くに相互に接近することを阻害しない側鎖容積になっていることを評価し、容積阻害を起こさない場合を満点とし、阻害の程度により減点評価する演算処理と、
ｃ：ペプチド骨格のバックボーン並列性の一致度を評価指標として、評価点をつける演算処理と、
が行われることを特徴とするコンピューター読み取り可能な記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的ペプチドのアミノ酸配列について、任意に設計したアミノ酸からなるペプチドの相補性を評価して相補性値を算出するシステム及びそれを格納した記録媒体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質の標的部位のペプチドのアンチセンスペプチドが相互反応をするという知見があるが、アンチセンスペプチドが必ず反応するわけではなく、むしろ反応性を示さない場合の方が多い。
【０００３】
大型のコンピューターを用い、タンパク質の高次構造を分子内の原子や電子などの情報も組み入れて解析する技術が展開されているが、解析作業に膨大な時間と労力を必要とするにも関わらず、必ずしも具体的に応用可能なペプチドを任意に設計できる段階には至っていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記事実に鑑み、標的ペプチドに反応性を持つペプチドを効率よく設計できるようにするとともに、設計したペプチドを合成して標的タンパク質に対する制御作用を発揮する新規活性ペプチドを提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の特徴は、ペプチドの各位置のアミノ酸について、その前後のアミノ酸を５個ずつ若しくは数個ずつ（１個〜４個）、末端アミノ酸の場合は０個を加えて（末端アミノ酸の場合は加えない）、疎水性値の平均値を算出して、その疎水性値が逆の値になっていることで評価して、＋３．０であれば、−３．０をそのアミノ酸の位置での疎水性評価を満点とする演算手段と、対応するアミノ酸同士のα炭素が５オングストローム近くに相互に接近することを阻害しない側鎖容積になっていることを評価し、容積阻害を起こさない場合を満点とし、阻害の程度により減点評価する演算手段と、ペプチド骨格のバックボーン並列性の一致度を評価指標として、評価点をつける演算手段と、を有することを特徴とするペプチド評価システムである。
【０００６】
本発明の別の特徴は、標的ペプチドに対して同一アミノ酸数からなる任意に設計したペプチドを候補ペプチドとして標的ペプチドに対する相補性を評価して評価値を記録する第１の手段と、上記候補ペプチドのアミノ酸配列をスクランブルして別の配列に変えたり、アミノ酸の置換を任意に行い別の候補ペプチドを設計し、標的ペプチドに対する相補性を評価して、その評価値を記録する第２の手段と、上記手段を繰り返して満点値のペプチドが得られるまで連続して行う手段と、評価したペプチドの得点の高いものからソートして一覧表を作成する手段と、を有することを特徴とするペプチド評価システムである。
【０００７】
本発明の別の特徴は、ペプチドの各位置のアミノ酸について、その前後のアミノ酸を５個ずつ若しくは数個ずつ（１個〜４個）、末端アミノ酸の場合は０個を加えて（末端アミノ酸の場合は加えない）、疎水性値の平均値を算出して、その疎水性値が逆の値になっていることで評価して、＋３．０であれば、−３．０をそのアミノ酸の位置での疎水性評価を満点とする演算手段と、対応するアミノ酸同士のα炭素が５オングストローム近くに相互に接近することを阻害しない側鎖容積になっていることを評価し、容積阻害を起こさない場合を満点とし、阻害の程度により減点評価する演算を行わせるプログラムと、ペプチド骨格のバックボーン並列性の一致度を評価指標として、評価点をつける演算を行わせるプログラムと、を格納したことを特徴とする記録媒体である。
【０００８】
本発明の別の特徴は、標的ペプチドに対して同一アミノ酸数からなる任意に設計したペプチドを候補ペプチドとして標的ペプチドに対する相補性を評価して評価値を演算するプログラムと、上記候補ペプチドのアミノ酸配列をスクランブルして別の配列に変えたり、アミノ酸の置換を任意に行い別の候補ペプチドを設計し、標的ペプチドに対する相補性を評価して、その評価値を演算するプログラムと、上記手段を繰り返して満点値のペプチドが得られるまで連続して行うプログラムと、評価したペプチドの得点の高いものからソートして一覧表を作成するプログラムと、を格納することを特徴とする記録媒体である。
このコンピュータープログラムソフトをMIMETICと呼ぶ。
【０００９】
本発明の別の特徴は、請求項１から請求項４に記載のペプチド評価システム、及びその記録媒体を用いて得られる標的とする部位のアミノ酸配列に相互反応をするペプチドである。本発明のペプチド評価システム、及びその記録媒体を用いることによって、例えば、HIVの逆転写酵素を阻害することを特徴とするペプチド、あるいは、プロカルボキシペプチダーゼの活性化を抑制することを特徴とするペプチド等、標的とする部位のアミノ酸配列に相互反応をする有用なペプチドを得ることができる。
【００１０】
【本発明の実施の態様】
以下、本発明の形態を図面に基づいて説明する。天然には、２０種類のアミノ酸が存在し、この２０種類のアミノ酸はアルキル基の構造によって、親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸及び中間型アミノ酸に分けることができる。親水性アミノ酸は、グルタミン（Gln;Q）、グルタミン酸（Glu;E）、リジン（Lys;K）、アスパラジン（Asn;N）、アスパラジン酸（Asp;D）、タイロシン（Tyr;Y）及びヒスチジン（His;H）である。疎水性アミノ酸としてはバリン（Val;V）、ロイシン（Leu;L）、イソロイシン（Ile:I）、フェニルアラニン（Phe;F）、及びメチオニン（Met;M）が含まれる。
中間型のアミノ酸は、トリプトファン（Trp;W）、アルギニン（Arg;R）、グリシン（Gly;G）、システイン（Cys;C）、セリン（Ser;S）、プロリン（Pro;P）、アラニン（Ala;A）、及びスレオニン（Thr;T）である。
【００１１】
タンパク質、又はタンパク質より比較的短いペプチドは、上記アミノ酸残基が一次元的に配列し、それぞれの機能を発揮しているものである。以下に示す本発明の解析プログラムソフト（MIMETIC）、及びその記録媒体によって任意のペプチド分子について、そのペプチド分子中の標的とする部位のアミノ酸配列に相互反応を期待できるペプチドを速やかに設計することができる。
【００１２】
図１は、本発明の実施の形態に係るペプチドの相補性部位評価システムが構成されるコンピュータ（例えば、パーソナルコンピュータ）のハードウェアの構成を示す。図１において、このシステムは、いわゆるCPUを含む制御ユニット１０，配列情報バッファ２０，相補性部位評価バッファ３０，メモリユニット４０，CD-ROMドライブユニット５０，表示ユニット６０及び入力ユニット７０を有している。これらのユニット及びバッファはシステムバスBを介してそれぞれ後続されている。さらに、ディスクユニット（ハードディスク）９０が１／０インターフェースユニット８０を介してシステムバスBに接続されている。
【００１３】
制御ユニット１０は、システム全体を制御するとともに、後述するように、ペプチドの相補性部位に係る処理を実行する。配列情報バッファ２０には、配列情報の対象となる標的ペプチドの配列情報がセットされる。相補性部位評価バッファ３０は、例えば図３に示すような構造を有している。この相補性部位評価バッファ３０には、配列情報バッファ２０に格納された各アミノ酸残基について相補性部位評価に必要な情報が格納されている。メモリユニット４０は、RAM、ROM等のメモリを含み、制御ユニット１０が実行すべきプログラム、処理の過程で得られたデータ等を記憶する。
【００１４】
CD-ROM１００には、ペプチドの相補性部位の評価処理を記述したプログラムコードにより構成されるプログラムと、各アミノ酸とそれに割り付けられた相補性パラメータとの関係を表すデータが格納されている。CD-ROMドライブユニット５０にセットされたCD-ROM１００から当該プログラム及びアミノ酸と相補性パラメータとの関係を示すデータが、ディスクユニット９０にインストールされる。そしてペプチドの相補性部位を評価する演算処理を実行する際に、ディスクユニット９０から読み出された当該プログラムとデータがメモリユニット４０に格納される。この状態で、制御ユニット１０（CPU)は、メモリユニット４０に格納されたプログラムに従って、ペプチドの相補性部位の評価処理を行う。その処理の過程で、制御ユニット１０は、メモリユニット４０に格納したアミノ酸と相補性パラメータとの関係を示すデータを用いる。
【００１５】
表示ユニット６０は、CRTやLCD（液晶パネル）等で表示され、制御ユニット１０にて行われた処理の結果等を表示する。入力ユニット７０は、キーボード、マウス等で構成され、研究者が当該システムに情報を入力するために使用される。上記のようにしてメモリユニット４０に格納されたプログラムは、図２に示す手順を記述しており、制御ユニット１０は、この手順に従って処理を行う。
【００１６】
本発明は、標的ペプチドのアミノ酸配列について、実験結果等を元に選定しておき、制御ユニット１０が処理を開始する前に、この配列情報が入力ユニット７０を用いて当該システムに提供される。そしてこの標的ペプチドの配列情報がディスクユニット９０に格納されている。図２において、制御ユニット１０は、ｎ個のアミノ酸残基で構成される相補性を有するペプチドの評価すべき情報をディスクユニット９０から読み出し、配列情報バッファー２０にセットする。その後、制御ユニット１０は、メモリユニット４０に格納した各ペプチドと相補性パラメータを任意に設計した同じ数のアミノ酸からなるペプチドの相補性を評価して相補性値を算出する。
【００１７】
相補性値の評価指標の一つは、疎水性値である。（図３参照）ペプチドの各位置のアミノ酸について、その前後のアミノ酸を５個ずつ若しくは数個ずつ（１個〜４個）、末端アミノ酸の場合は０個を加えて（末端アミノ酸の場合は加えない）、疎水性値の平均値を算出して、その疎水性値が逆の値になっていることで評価して、＋３．０であれば、−３．０をそのアミノ酸の位置での疎水性評価を満点とする演算手段と、対応するアミノ酸同士のα炭素が５オングストローム近くに相互に接近することを阻害しない側鎖容積になっていることを評価し、容積阻害を起こさない場合を満点とし、阻害の程度により減点評価する演算手段と、ペプチド骨格のバックボーン並列性の一致度を評価指標として、評価点をつけることで評価する。
【００１８】
第二の評価指標は、対応する位置のアミノ酸側鎖の容積(bulkiness)の対応性である。対応するアミノ酸同士のα炭素（アミノ酸の側鎖が結合している基部の炭素原子）が5オングストローム近くに相互に接近することを阻害しない側鎖容積になっていることを評価し、容積阻害を起こさない場合を満点とし、阻害の程度により減点評価する。
【００１９】
第三の評価指標は、ペプチド骨格のバックボーン並列性(Backbone alignment)の一致度を評価指標として、評価点をつける。
【００２０】
標的ペプチドに対して同一アミノ酸数からなる任意に設計したペプチドを候補ペプチドとして標的ペプチドに対する相補性を評価してその評価値をコンピュータメモリーに記録する。
【００２１】
次いで上記候補ペプチドのアミノ酸配列をスクランブルして別の配列に変えたり、アミノ酸の置換も任意に行い別の候補ペプチドを設計し、標的ペプチドに対する相補性を評価してその評価値をコンピュータメモリーに記録する。これを連続して繰り返し、理想的には満点値のペプチドが得られるまで繰り返しを連続して行う。
【００２２】
それぞれのペプチドを評価した記録を得点の高いものからソートして並べて一覧表を作り、上位のもの（例えば上位300のペプチド）を記録として残し一覧表にする。
【００２３】
最も高い得点を示したペプチドを候補ペプチドとして選択する。
【００２４】
上記のようにして得られた候補ペプチドをペプチド合成機で合成し、通常の液体クロマトグラフィーなどを用いて精製する。精製したペプチドは必要に応じ、NMRやペプチドシークエンサなどを用いて、目的のアミノ酸配列になっていることを確認する。
【００２５】
上記で作製したペプチドを標的蛋白質と反応させ、標的蛋白質の機能に与える作用を調べ、制御活性等を示したペプチドを新規ペプチドとする。このペプチドに化学修飾や若干のアミノ酸置換などを行い、より活性が高く安定なペプチドに改良することも出来る。
【００２６】
ペプチドを薬剤として用いることも出来るが、これをプロトタイプペプチドとして高次構造を解析し、それにもとっずいて類似の構造を持つ化学合成薬剤の開発などに用いることもできる。
【００２７】
【実施例１】
満点あるいはそれに近いペプチドを合成して、標的ペプチドに対する反応性を検証する。
【００２８】
エイズの病原ウイルスであるHuman immunodeficiency virus-1 (HIV-1) の逆転写酵素(reverse transcriptase：以下RTと略す) の各部位のペプチドに対する相補的ペプチドを本発明の解析プログラム(MIMETIC) によって自動設計した結果、それぞれ、表１に示したペプチドを設計することが出来た。
【００２９】
設計したペプチドの合成はABiMED社製ペプチド合成機（AMS 422 Multiple Poptide Synthesizer）を用て、9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) アミノ酸を順次結合させる通常の固相法で行った。合成したペプチドを型の如く切りだすとともに、残基のブロックをはずした。得られたペプチドはエーテルで沈殿させて回収し、エーテルを乾燥除去して逆相HPLCで精製した。
【００３０】
HIV-1 を感染させたPLB細胞（株化したヒトリンパ球細胞株）の培養上清を65%と15%の蔗糖液を重ねた超遠心機用試験管の上層部の上に載せて26,500 回転で１時間の超遠心でHIV-1粒子を回収した。ウイルスのRNAはグアニジンイソチオシアネート法(Chomezynski, P. & Sacchi, N.  RNA isolation from cultured cells.  Analytical Biochemistry, 162: 156 159, 1987) により抽出し、これを 5 mM Tris buffer (pH7.5) に溶解して用いた。
【００３１】
Total RNA 試料に含まれる全長のウイルスゲノムRNAの量は、型のごとくリボヌクレアーゼプロテクション法(Kaye, J.F., et al.  Cis-acting sequences involved in human immunodeficiency virus type 1 RNA packaging.   J. Virol. 69: 6588 6592, 1995 及び Huang, Y., et al.  The role of  nucleocapsid and U5 stem/A rich loop sequences in tRNA (3Lys) genomic placement and initiation of reverse transcriptation in human immunodeficiency virus type 1.  J. Virol. 72: 3907-3915, 1997) で定量した。そのウイルスゲノムRNAは細胞内でtRNALys3 を結合しており、RT活性の測定に供することができる。約5000万分子のウイルスゲノムRNAを20 ul のRT buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 60mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT) 中で、50 ng HIV-RT、10 単位RNase及びdNTP's（デオキシ核酸）と37度Ｃで15分間反応させた。先頭の６個の塩基配列はCTGCTAとなる。tRNALys3 は５マイクロキューりーの32P-dCTPで１塩基のばし、６塩基延ばすために、0.2 mM dCTP, 0.2 mM dTTP, 5uCi 32P-dGTP及び0.05 mM ddATPを反応させた。延長されたプライマーはエタノールで沈殿させて回収したあと、7 M urea を含む6% ポリアクリルアミドゲルで電気泳動をして延長したプライマーをオートラジオグラフィーにより検出して解析した。
【００３２】
このRTの反応系にRT活性に対する作用を調べる被検ペプチドを添加して、RTによって付加される塩基配列の有無と多寡を検定した。その結果、TLMA2993、PSTW1594 及びESLA2340の３種のペプチドが20 マイクロモル 程度で50% のRT活性を抑制した。残りの７種のペプチドには抑制活性を認めなかったが、設計したペプチドの30% が抑制活性を持ち、これは極めて高い確率で目的の活性を持つペプチドを設計できたことになる。その結果は表１にまとめた。
【００３３】
［表１］HIV-1 の逆転写酵素（reverse transcriptase: RT) の活性に関わると考えられる種々の部位のアミノ酸配列とそれらに対してMIMETIC で自動設計したペプチドのアミノ酸配列。１０種のペプチドの内、３種のペプチドがRT 活性を抑制した。
0004712282.tif 000002
RTに対する50%抑制濃度はESLA2340が17 mM、TLMA2993が 15 mM、 PSTW1594が15 mM。
それら以外の相補性ペプチドにはRTに対する抑制作用は認めなかった。
【００３４】
最も強い抑制活性を示したTLMA2993ペプチドを細胞内に発現させるために、それをコードする人工的cDNAを設計して、これをプラスミッドに組み込んだ、TLMA2993/pCXN2 を作製した。これをヒト培養細胞であるU937細胞に遺伝子導入して、細胞内でTLMA2993ペプチドを発現させた。作製した20クローンのトランスフェクタントの内、RT-PCR法でTLMA2993のmRNAが十分に発現していたのは、U937/TLMA-8, U937/TLMA-15, U937/TLMA-18 及びU937/TLMA-20 の４クローンであった。HIV-1 の感染には、CD4 やCXCR4 及びCCR5などの感染性に関わるレセプター等の発現量が大きく影響する。そこで、これらのトランスフェクタントにおけるCD4 やCXCR4 及びCCR5の発現量を調べたところ、U937/TLMA-15 及び U937/TLMA-18のCD4 やCXCR4 及びCCR5などの発現程度は、対照のU937/N2 (空のベクターのみをトランスフェクトしたU937細胞)と同程度であった。そこで、U937/TLMA-15 及びU937/TLMA-18をHIV-1 感染実験に用いることにし、U937/N2を対照細胞として用いた。U937/TLMA-８ 及び U937/TLMA-20は、これらのレセプターなどの発現に差を認めたので使用しなかった。実験に用いた、U937/TLMA-15 及び U937/TLMA-18の細胞内で作られているTLMA2993の濃度は、それぞれ、1.8 uM 及び1.3 uM であった。この濃度は、ELISA (enzyme linked immunosobent assay) の競合阻害実験により測定した。
【００３５】
U937/TLMA-15とU937/TLMA-18 は、HIV-1 (HIV-IIIB) を感染させた少量のU937 (U937/IIIB) と混合培養させたとき、U937/N2 が示すような感染の広がりが強力に抑えられ、U937/N2 では培養開始から48日後には95% の細胞に感染が認められたのに、U937/TLMA-15とU937/TLMA-18 では16% 程度に止まっていた。また、HIVIIIB (U937/IIIBの培養上清）を感染させたときにも、U937/TLMA-15とU937/TLMA-18 は感染抵抗性を示し、PCRで検出されるプロウイルスの形成も抑えられていた。これらのことから、設計合成したTLMA2993などのペプチドは細胞内でも有効に働くことがわかった。
【００３６】
【実施例２】
プロカルボキシペプチダーゼＲ(Pro-carboxypeptidase R：以降ProCPRと略す)は、アミノ末端から92番目のアルギニンまでがトロンビンやプラスミン等のトリプシン様の酵素で切除されて活性型のカルボキシペプチダーゼＲ(carboxypeptidase R：以下CPRと略す) となる。このProCPRのアミノ末端から87番目のアミノ酸から３０個、２４個、２０個、１５個あるいは１１個からなるアミノ酸配列に対する相補的ペプチドを本発明の解析プログラム(MIMETIC) によって自動設計を実施し、それぞれ表２に示したペプチドを設計することが出来た。
【００３７】
それらの相補的ペプチドの内から、２０個及び１５個のアミノ酸からなるペプチド（表２の（注１）および（注２）のペプチド）についてProCPRのT/TM による活性化反応に及ぼす作用を解析した。
【００３８】
設計したペプチドの合成はABiMED社製ペプチド合成機（AMS 422 Multiple Poptide Synthesizer）を用て、9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) アミノ酸を順次結合させる通常の固相法で行った。合成したペプチドを型の如く切りだすとともに、残基のブロックをはずした。得られたペプチドはエーテルで沈殿させて回収し、エーテルを乾燥除去して逆相HPLCで精製した。
【００３９】
精製した２０個および１５個から成るペプチドをProCPR と室温で１０分間反応させたあと、トロンビン・トロンボモジュリン複合体（Thrombin/thrombomodulin complex: 以降T/TM と略す）を作用させ、CPRの基質であるHippuril-L-arginine を加えて３７度Ｃで４５分間反応させた後、遊離した馬尿酸を既報の方法（Komura, H. et al.  Effect of anticoagulants in colorimetric assay for basic carboxypeptidases.  Microbiol. Immunol. 46: 115-117, 2002）に準じて測定した。
【００４０】
20マーのペプチドと15マーのペプチドを添加しておいた場合には、それぞれ1 uM のペプチドでT/TM によるProCPR のCPRへの活性化が抑制された。この様に、調べた２種類のペプチドが両方ともターゲットのProCPRに対して抑制効果を発揮したので、我々がMIMETICと呼ぶ相補的ペプチド設計プログラムソフトの効率の良さを示していると考えられる。ProCPRはエラスターゼやトリプシンなどによっても活性化されるが、これらのペプチドはT/TMによる活性化だけを抑制し、エラスターゼやトリプシンによる活性化は阻害しなかった。設計したProCPRに対する相補的ペプチドを表２に纏めた。
【００４１】
［表２］ProCPRの87番目のアミノ酸以降の11、15、20、24 及び 30個のアミノ酸配列に対してMIMETIC で自動設計された相補性ペプチド。86番目のアスパラギンには糖鎖が付加されていると考えられるので、それを除いた87番目のアミノ酸以降のペプチドを標的とした。92番目のアルギニンのカルボキシル基側がトロンビンによる切断場所であるので、それをまたぐ形で相補性ペプチドの設計を試みた。そのうち、15個と20個のアミノ酸からなる２種類のペプチドを選んでトロンビン・トロンボモジュリン複合体によるProCPRの活性化作用に対する作用を調べたところ、両方とも1 uMで阻害効果を発揮した。
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（注１）及び（注２）は実際にペプチドを合成して検討を行いProCPRの活性化を抑制することが確かめられたペプチド
【００４２】
【発明の効果】
本発明の解析プログラムソフトであるMIMETICで任意のペプチド分子について、標的とする部位のアミノ酸配列に相互反応を期待できるペプチドを速やかに設計することができる。
【００４３】
従って、目標として選んだペプチドの相補性部位のアミノ酸配列に対して相互反応をするペプチドを設計することができ、これを用いて目標としたペプチドの機能や活性を制御する手段として活用することができる。
【００４４】
これはペプチド分子を標的とした薬剤開発としての意義を持ち、MIMETICで設計合成したペプチドをそのまま薬剤として用いたり、あるいは化学修飾や若干のアミノ酸置換などの処置により、より薬剤効果を高めたり、安定性を高めたりすることも可能である。
【００４５】
薬剤効果をもつことが明らかとなったペプチドの高次構造をシュミレートして、その構造を模倣した化学合成薬剤を作製するプロトタイプとして応用することもできる。
【００４６】
標的蛋白質に働くペプチドを設計合成してその作用を確認できたものを細胞内で働かせるためには、そのペプチドをコードする塩基配列を持ったcDNAを人工的に設計合成し、これをベクタープラスミッドや、ベクターウイルスに組込んで細胞内に導入し、細胞内で当該ペプチドを遺伝子発現により合成させて働かせることもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ペプチドの相補性評価システムの一形態を表すブロック図である。
【図２】ペプチドの相補性評価システムの手順を示すフローチャートを示す図である。
【図３】相補性評価バッファの構成の例を示す図である。
【符号の説明】
１０：制御ユニット
２０：配列情報バッファ
３０：相補性評価バッファ
４０：メモリユニット
５０：CD-ROMドライブユニット
６０：表示ユニット
７０：入力ユニット
８０：インターフェースユニット
９０：ディスクユニット
１００：CD-ROM
【図１】
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【図２】
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【図３】
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