(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝実質細胞増殖因子、アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、及びこれらの薬理上許容される塩からなる群から選ばれる安定化剤、塩化ナトリウム、及びリン酸バッファー、クエン酸バッファー、および酢酸バッファーから選ばれる緩衝剤を含有する凍結乾燥製剤であって、肝実質細胞増殖因子を５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で含有する水溶液から調製される製剤。
【請求項２】
肝実質細胞増殖因子、アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、及びこれらの薬理上許容される塩からなる群から選ばれる安定化剤、塩化ナトリウム、及びリン酸バッファー、クエン酸バッファー、および酢酸バッファーから選ばれる緩衝剤を含有する凍結乾燥製剤であって、再溶解により肝実質細胞増殖因子を５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で含有する水溶液を調製するための製剤。
【請求項３】
肝実質細胞増殖因子、アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、及びこれらの薬理上許容される塩からなる群から選ばれる安定化剤、塩化ナトリウム、及びリン酸バッファー、クエン酸バッファー、および酢酸バッファーから選ばれる緩衝剤を含有する凍結乾燥製剤であって、肝実質細胞増殖因子を５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で含有する水溶液から調製され、かつ再溶解により肝実質細胞増殖因子を５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で含有する水溶液を調製するための製剤。
【請求項４】
安定化剤がアルギニン、リジン、ヒスチジン、及びこれらの薬理上許容される塩からなる群から選ばれる請求項１〜３のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項５】
緩衝剤がリン酸バッファーである請求項１〜４のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項６】
凍結乾燥前の水溶液のｐＨが５〜６．５の範囲である請求項１〜５のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項７】
再溶解後の水溶液のｐＨが５〜６．５の範囲である請求項１〜６のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項８】
さらにポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＨＣＯ−４０、ＨＣＯ−６０、プルロニックＦ−６８、ポリエチレグリコールから選ばれる１または２以上の界面活性剤を含有する請求項１〜７のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項９】
界面活性剤がポリソルベート８０である請求項８に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１０】
バイアル又はアンプル中に調製された請求項１〜９のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１１】
凍結乾燥時及び／又は凍結乾燥後の保存時における肝実質細胞増殖因子の重合体生成を防止するために十分な量の安定化剤を含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、肝実質細胞増殖因子を含有する凍結乾燥製剤に関する。
背景技術
肝実質細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：以下、本明細書において「ＨＧＦ」と略す場合がある。）は肝実質細胞の増殖活性を有するタンパク質であり、種々の動物種においてその存在が知られており、異なったアミノ酸配列を有するものが報告されている。ヒト肝実質細胞増殖因子（以下、本明細書において「ｈＨＧＦ」と略す場合がある。）は、大工原らにより劇症肝炎患者血漿より見出され（特開昭６３−２２５２６号公報）、その後、喜多村らによりｈＨＧＦタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）配列が明らかにされた（特開平３−７２８８３号公報）。さらにこのｃＤＮＡを用いたｈＨＧＦタンパク質の生産方法及び形質転換体が報告されるにいたり（特開平３−２８５６９３号公報）、ｈＨＧＦタンパク質の大量生産が可能となり医薬品としての応用が期待されている。
ｈＨＧＦは糖タンパク質の一種であり、分子量は非還元状態では約８０〜９０ＫＤａ、還元状態では約５２〜５６ＫＤａのαサブユニットと約３０〜３６ＫＤａのβサブユニットからなるヘテロダイマーである。ｈＨＧＦは、肝細胞増殖因子としての活性のほか、スキャター因子（ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ；ＳＦ）活性、腎臓尿細管上皮細胞増殖因子活性、損傷組織修復因子活性、血管内皮細胞増殖因子活性など多様な生物活性を有しており、肝臓疾患治療薬、腎臓疾患治療薬、脳神経障害治療剤、育毛促進剤、創傷治療薬、抗腫瘍治療薬などの医薬としての開発が期待されている。
ＨＧＦの製剤については、ＷＯ９０／１０６５１公報、特開平６−２４７８７２号公報、及び特開平９−２５２４１号公報に記載がある。上記ＷＯ９０／１０６５１公報には、ＨＧＦと比較してアミノ酸５残基が欠失したデリーションタイプのＨＧＦ（ＴＣＦ）の水溶液製剤が開示されており、アルブミン、ヒト血清、ゼラチン、ソルビトール、マンニトール、キシリトール等がＴＣＦを水溶液中で安定化することが教示されている。特開平６−２４７８７２号公報には、塩基性アミノ酸等とＴＣＦを共存させることにより、ＴＣＦを５〜１０ｍｇ／ｍＬの高濃度に含有させた注射剤が開示されている。この刊行物にはＴＣＦの水溶液での溶解性が言及されており、ＴＣＦを高濃度に含有させた水溶液が開示されているが、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン）は注射液剤の「溶解補助剤」として用いられている。
しかしながら、ＨＧＦの水溶液製剤は、中性ｐＨにおいて溶解性が急激に低下し、低温又は室温で数日間保存すると凝集、白濁、ゲル化が進行するという問題を有している。また、類縁体・重合体が形成されるなど物理化学的安定性が低く、生物活性が低下するなど製剤安定性が低く、生物学的活性の点からも長期間の保存には適しない。さらに、ＨＧＦの水溶液製剤は、振とう攪拌による泡立ち等により凝集、白濁、ゲル化を引き起こし、長期間の保存及び流通運搬の際に製剤品質の低下、薬効の低減がもたらされる。このため、ＨＧＦの製剤としては、凍結乾燥製剤が好適である。
特開平９−２５２４１号公報にはＨＧＦ（ＴＣＦ）の凍結乾燥製剤が開示されているが、本発明とは異なり、クエン酸塩を緩衝液として用い、安定化剤としてグリシン、アラニン、ソルビトール、マンニトール等を用いることにより、長期間にわたり安定な高濃度ＨＧＦ（ＴＣＦ）凍結乾燥製剤を提供できることが教示されている。しかしながら、この凍結乾燥製剤は、緩衝液としてクエン酸を用いるために再溶解後のｐＨが酸性条件であり、また溶液の浸透圧が高いために、注射投与の際の痛み、投与部位での炎症反応、溶血現象を誘起するなどの問題を有している。
また、ＨＧＦは極めて生理活性の強い物質であり、医薬として使用する場合には非常に低濃度の製剤として臨床の場に提供される必要があるが、本発明者らの研究によれば、特開平９−２５２４１号公報に記載されたグリシン又はアラニンを含むＨＧＦ（ＴＣＦ）の凍結乾燥製剤では、高濃度のＨＧＦを含む水溶液から製造した凍結乾燥製剤は保存時に重合体の生成は少ないものの、臨床適用にあたり望まれる低濃度のＨＧＦ（一般的にはＨＧＦが５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度であり、例えば２ｍｇ／ｍＬ程度である。）を含む水溶液をグリシン又はアラニンの存在下で凍結乾燥した製剤は保存時に重合体の生成が認められた。従って、特開平９−２５２４１号公報に記載されたグリシン又はアラニンは高濃度のＨＧＦを凍結乾燥する場合の安定化剤としては有用であるものの、低濃度のＨＧＦを凍結乾燥する場合の安定化剤としては不十分であり、低濃度のＨＧＦを含む水溶液から重合体の生成しにくい、長期保存安定性に優れた凍結乾燥製剤を製造する方法の開発が求められていた。
発明の開示
本発明の課題は、低濃度のＨＧＦを含む水溶液を調製可能なＨＧＦ凍結乾燥製剤を提供することにある。より具体的には、保存安定性に優れ、再溶解時に凝集、白濁、ゲル化などを生じないＨＧＦ凍結乾燥製剤を提供することが本発明の課題である。また、凍結乾燥時に良好なケーキ形成性を有し、再溶解性に優れた凍結乾燥製剤を提供することも本発明の課題である。さらに、注射剤として望ましいｐＨおよび浸透圧比を有する上記製剤を提供することも本発明の課題である。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ＨＧＦの濃度を５ｍｇ／ｍＬ未満として安定化剤、塩化ナトリウム、及び緩衝剤の存在下で凍結乾燥を行うと、ケーキ形成性、溶解性、長期保存安定性の良好な凍結乾燥製剤を製造することができること、及び該凍結乾燥製剤の製造時及び凍結乾燥製剤の保存時に重合体が生成せず、該凍結乾燥製剤が極めて高い安定性を有していることを見出した。また、この凍結乾燥製剤から調製された水溶液には凝集、白濁、ゲル化などが生じないこと、及びこのように希薄なＨＧＦを含む水溶液が臨床的に十分な薬効を発揮できることも見出した。本発明は、上記の知見を基にして完成されたものである。
すなわち、本発明により、
肝実質細胞増殖因子、肝実質細胞増殖因子の重合体生成を防止するための安定化剤、塩化ナトリウム、及び緩衝剤を含有する凍結乾燥製剤であって、肝実質細胞増殖因子を５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で含有する水溶液から調製される製剤；
肝実質細胞増殖因子、肝実質細胞増殖因子の重合体生成を防止するための安定化剤、塩化ナトリウム、及び緩衝剤を含有する凍結乾燥製剤であって、再溶解により肝実質細胞増殖因子を５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で含有する水溶液を調製するための製剤；及び、
肝実質細胞増殖因子、肝実質細胞増殖因子の重合体生成を防止するための安定化剤、塩化ナトリウム、及び緩衝剤を含有する凍結乾燥製剤であって、肝実質細胞増殖因子を５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で含有する水溶液から調製され、かつ再溶解により肝実質細胞増殖因子を５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で含有する水溶液を調製するための製剤
が提供される。
これらのＨＧＦ凍結乾燥製剤は凍結乾燥時及び凍結乾燥後の長期保存に際してもＨＧＦの重合体が生成せず、優れた安定性を有している。また、凍結乾燥製剤から調製された水溶液には凝集、白濁、ゲル化などの生成がなく、かつ該水溶液を保存した場合にも重合体が生成しにくいという特徴を有している。
通常、バイアル中に凍結乾燥製剤を調製するために用いられる水溶液と、得られた凍結乾燥製剤をバイアル中で溶解して調製される水溶液には、同濃度の有効成分が含まれることが望ましい。従って、本発明の製剤は、好ましくはＨＧＦを５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で含有する水溶液をバイアル中又はアンプル中で凍結乾燥することにより製造できる。また、本発明の製剤は、凍結乾燥前及び／又は再溶解後の水溶液が注射剤として望ましい５から６．５の範囲のｐＨを有することが好ましく、さらに、本発明の製剤は、凍結乾燥前及び／又は再溶解後の水溶液が、注射剤として望ましい浸透圧、例えば、生体とほぼ等張又は注射剤の浸透圧比として許容される浸透圧比（１〜２）を有することが好ましい。
本発明の好ましい態様によれば、安定化剤がアルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、硫酸化多糖類、及びこれらの薬理上許容される塩からなる群から選ばれる安定化剤である上記ＨＧＦ凍結乾燥製剤；安定化剤がアルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、及びこれらの薬理上許容される塩からなる群から選ばれる上記ＨＧＦ凍結乾燥製剤；安定化剤がアルギニン、リジン、ヒスチジン、及びこれらの薬理上許容される塩からなる群から選ばれる上記ＨＧＦ凍結乾燥製剤；安定化剤がアルギニン、リジン、及びこれらの薬理上許容される塩からなる群から選ばれる上記ＨＧＦ凍結乾燥製剤が提供される。これらの安定化剤は、好ましくは凍結乾燥時及び／又は凍結乾燥後の保存時におけるＨＧＦの重合体生成を防止するのに十分な量で上記製剤中に配合される。
また、本発明の別の好ましい態様によれば、緩衝剤がリン酸塩である上記ＨＧＦ凍結乾燥製剤；さらに界面活性剤を含有する上記ＨＧＦ凍結乾燥製剤；界面活性剤が非イオン性界面活性剤である上記ＨＧＦ凍結乾燥製剤；非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンエーテル系界面活性剤である上記凍結乾燥製剤が提供される。
また、別の観点からは、ＨＧＦを５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で含有する水溶液を凍結乾燥するために用いるＨＧＦの安定化剤であって、アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、硫酸化多糖類、及びこれらの薬理上許容される塩からなる群から選ばれる安定化剤が本発明により提供される。好ましい安定化剤は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、及びこれらの薬理上許容される塩からなる群から選ばれ、特に好ましい安定化剤はアルギニン、リジン、及びこれらの薬理上許容される塩からなる群から選ばれる。この安定化剤は、ＨＧＦを５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で含有する水溶液の凍結乾燥時及び凍結乾燥後の保存時におけるＨＧＦの重合体生成を防止することができる。
さらに、本発明により、上記安定化剤及び５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度のＨＧＦを含有する水溶液を凍結乾燥して得ることができ、再溶解により５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度のＨＧＦを含有する水溶液を調製するためのＨＧＦ凍結乾燥製剤が提供される。上記の凍結乾燥製剤の好ましい製剤は、上記安定化剤（好ましくはアルギニン、リジン、及びこれらの薬理上許容される塩からなる群から選ばれる安定化剤）、５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度のＨＧＦ、塩化ナトリウム、及び緩衝剤を含有する水溶液をバイアル中で凍結乾燥して得ることができる。
発明の実施するための最良の形態
本発明の凍結乾燥製剤に含まれるＨＧＦの種類は特に限定されない。例えば、ＨＧＦを含有することが知られているヒトやラット等のほ乳動物由来の体液や組織、または自発的にＨＧＦを産生する細胞から天然のＨＧＦを単離してもよいが、遺伝子組換え法により該増殖因子ｃＤＮＡを細胞に導入して得られる組換えＨＧＦを用いてもよい。組換えＨＧＦを産生させる宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。具体例には、組換えＨＧＦとして、例えば、上記ほ乳動物由来の胎盤、肝障害患者肝組織及び血液、ＭＲＣ−５細胞、ＩＭＲ−９細胞などの線維芽細胞株、あるいは特開平３−２８５６９３号公報に記載された方法に従いｈＨＧＦをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターをＣＨＯ細胞等の宿主に導入した産生株などから得られたものを挙げることができる。
また、ＨＧＦとしては、シグナル配列を有する蛋白質などの前駆体蛋白質や、肝実質細胞を増殖させる活性を損なわない範囲において一部のアミノ酸を置換、欠失、及び／又は挿入した修飾蛋白質や糖類を欠失又は置換した改変体を用いてもよい。改変体としては、例えば、特開平２−２８８８９９号公報、ＷＯ９０／１０６５１号公報、特開平３−１３００９１号公報、同３−２５５０９６号公報、同４−３００００号公報、Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０−４４３（１９８９）等に記載されたものを挙げることができる。
本発明の凍結乾燥製剤に好適に用いられるＨＧＦとして、以下の理化学的性質を有する蛋白性因子を挙げることができる。またＨＧＦはヒト由来のものであることが好ましく、特に好ましいＨＧＦとして、特開平３−７２８８３号公報及び特開平４−８９４９９号公報に記載のアミノ酸配列で表されるものを挙げることができる。
１）  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元条件下）による推定分子量が約７６，０００〜９２，０００である、
２）  肝実質細胞を増殖させる活性を有する、及び
３）  ヘパリンに対して強い親和性を有する。
さらに、好ましいＨＧＦは、上記の理化学的性質に加えて、
４）  ８０℃、１０分間の加熱処理により上記活性が失活する、及び
５）  トリプシンによる消化処理及びキモトリプシンによる消化処理により上記活性が失活する、
を有する。
ＨＧＦ、緩衝剤、及び塩化ナトリウムの３成分を含むＨＧＦ凍結乾燥製剤（特開平６−２４７８７２号公報又は特開平９−２５２４１号公報に記載のもの：ＨＧＦ濃度は５〜２０ｍｇ／ｍＬ）において、ＨＧＦの沈殿などの問題を回避するためにＨＧＦの含有量を低下させると、凍結乾燥工程において良好なケーキが得られないという問題があり、さらに、上記３成分から得られた凍結乾燥製剤を再溶解した水溶液では、凝集、白濁、ゲル化が認められ、十分な物理化学的安定性を達成できないという問題もある。従って、凍結乾燥により良好なケーキ形状を与え、かつ長期間の保存安定性に優れた水溶液を製造できる凍結乾燥製剤を調製するためには、ケーキ形成性および水溶液における保存安定性の改善を目的とした添加剤の添加が必須である。
本発明の凍結乾燥製剤は、ＨＧＦを５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で含む水溶液から調製され、及び／又は凍結乾燥製剤から製造される水溶液がＨＧＦを５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で含むように調製される。好ましくは、凍結乾燥前及び／又は再溶解後の水溶液が、注射剤として望ましいｐＨと、生体とほぼ等張又は注射剤の浸透圧比として許容される浸透圧比（１〜２）を有するように調製することができる。本発明の凍結乾燥製剤は、保存安定性に優れるという特徴を有している。また、凍結乾燥工程により良好な凍結乾燥ケーキを形成することができ、凍結乾燥製剤を再溶解した水溶液では、凝集、白濁、ゲル化などの問題がなく、十分な物理化学的安定性を達成できるという特徴がある。さらに、臨床適用した場合には、所望の薬理作用を十分に発揮することができる。
安定化剤としては、アルギニン；リジン；ヒスチジン；グルタミン；プロリン；グルタミン酸；アスパラギン酸；ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケタラン硫酸、デキストラン硫酸等の硫酸化多糖類；およびこれらの薬理上許容される塩を挙げることができる。薬理上許容される塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩等を挙げることができる。これら安定化剤は、二種類以上を組み合わせて用いてもよい。好ましい安定化剤としては、アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸等を挙げることができる。これらのうち、アルギニン、リジン、ヒスチジン、又はこれらの組み合わせが特に好ましい。安定化剤の添加量は、ＨＧＦの保存安定性を達成できる量であれば特に制限はされないが、好ましくはＨＧＦの重量に対して０．０１〜１００倍の重量であり、特に好ましくは０．１〜３０倍の重量が挙げられる。
緩衝剤としては、凍結乾燥前及び再溶解後の水溶液のｐＨを調整し、ＨＧＦの溶解性を保つ作用を有するものであれば特に限定されないが、例えば、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、酢酸バッファーなどを用いることができる。緩衝剤として、好ましくは、リン酸バッファーを用いることができ、特に好ましくはリン酸ナトリウムバッファーを用いることができる。緩衝剤の添加量は、例えば、再溶解後の水量に対して１〜１００ｍＭ程度である。
塩化ナトリウムは、凍結乾燥前及び再溶解後の水溶液においてＨＧＦの溶解性を向上させるが、必要以上に添加すると浸透圧を高めるので好ましくない。一般的には、生体と等張となるような浸透圧を達成できる量を添加すればよく、特に注射剤の浸透圧比として許容される浸透圧比１〜２が好ましく、例えば再溶解後の水量に対して１４０ｍＭとすることが好ましい。
ＨＧＦは、中性ｐＨにおいてＨＧＦの等電点（ｐＩ＝７〜８）と重なるために溶解度が急激に低下するという問題を有している。例えば、１４０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ；室温）においてｐＨ７．０〜７．５付近では１．０ｍｇ／ｍＬ弱の低い溶解度を示すが、ｐＨ５．０付近では５ｍｇ／ｍＬ以上の溶解度を示し、ＨＧＦの溶解度は低ｐＨ側で高くなる。また、塩化ナトリウム濃度０．１４ＭではＨＧＦの溶解度は１ｍｇ／ｍＬ程度であり、０．３Ｍ以上とするとＨＧＦは５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で溶解する。従って、ＨＧＦの溶解度を上昇させるためには、ｐＨを５以下の酸性条件とするか、あるいは塩化ナトリウム濃度を０．３Ｍ以上に上げることも考えられる。本発明の製剤においては、凍結乾燥前及び／又は再溶解後の水溶液のｐＨを弱酸性領域、具体的にはｐＨ４．０〜６．５、好ましくはｐＨ５．０〜６．５に調整することが好ましい。このようなｐＨ領域においては、重合体生成が抑制される。
本発明のＨＧＦ凍結乾燥製剤には、さらに界面活性剤を添加することが望ましい。ＨＧＦは容器の材質であるガラスや樹脂などに吸着しやすく、特に低濃度においてはＨＧＦの容器への吸着は投与薬液中の薬物含量の低下につながる。界面活性剤を添加することによって、再溶解後のＨＧＦの容器への吸着を防止することができる。界面活性剤としては、例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＨＣＯ−４０、ＨＣＯ−６０、プルロニックＦ−６８、ポリエチレグリコール等の非イオン性界面活性剤を挙げることができ、これらを二種以上組み合わせて用いてもよい。界面活性剤として特に好ましくは、ポリオキシエチレンエーテル系界面活性剤（ポリソルベート８０等）を用いることができる。界面活性剤の添加量は、例えば、再溶解後の水重量に対して０．００１〜２．０％の範囲である。
本発明のＨＧＦ凍結乾燥製剤は、ＨＧＦを含有する水溶液を通常の方法で凍結乾燥することにより製造できる。例えば、ＨＧＦ、安定化剤、塩化ナトリウム、及び緩衝剤を注射用蒸留水に溶解し、必要に応じて界面活性剤を添加した後、濾過滅菌してバイアル又はアンプル等の容器に分注して凍結乾燥することができる。本発明のＨＧＦ凍結乾燥製剤は、製剤化に必要な他の添加剤、例えば、酸化防止剤、防腐剤、賦形剤、無痛化剤などを含んでいてもよい。凍結乾燥方法としては、例えば、（１）常圧下で冷却凍結する凍結過程、（２）溶質に拘束されない自由水を減圧下で昇華乾燥する一次乾燥過程、（３）溶質固有の吸着水や結晶水を除去する２次乾燥過程の３つの単位操作による方法が挙げられるが（Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈ．Ｊａｐａｎ，８（１），７５−８７，１９９２）、本発明の凍結乾燥製剤の製造方法はこの方法に限定されることはない。本発明の凍結乾燥製剤は、使用に際して、ＨＧＦ濃度が５ｍｇ／ｍＬ未満となるように注射用蒸留水などの溶媒を加えて溶解すればよい。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
例１：低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤の作製（比較例）
１４０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）にＨＧＦ  １ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、無菌濾過した後にＨＧＦ水溶液を得る。本水溶液のｐＨを調整した後に、無菌的にバイアル瓶に２ｍＬずつ充填し、表１に示す条件に従って凍結乾燥して、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。なお、表中「→」は、温度を変化させることを示す。
0004635340.tif 000002
例２：低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤の作製（比較例）
１４０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）にＨＧＦ５ｍｇ／ｍＬとなるように加温溶解し、無菌濾過した後にＨＧＦ水溶液を得る。本水溶液のｐＨを調整した後に、無菌的にバイアル瓶に２ｍＬずつ充填し、表１に示す条件に従って凍結乾燥して、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例３：高濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤の作製（比較例）
１４０ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭアルギニン、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）にＨＧＦ１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、無菌濾過した後にＨＧＦ水溶液を得る。本水溶液のｐＨを調整した後に、無菌的にバイアル瓶に２ｍＬずつ充填し、表１に示す条件に従って凍結乾燥して、高濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例４：低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤の作製（比較例）
３００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）にＨＧＦ  １ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、無菌濾過した後にＨＧＦ水溶液を得る。本水溶液のｐＨを調整した後に、無菌的にバイアル瓶に２ｍＬずつ充填し、表１に示す条件に従って凍結乾燥して、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例５：低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤の作製（比較例）
３００ｍＭ塩化ナトリウム、５％グリシン、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）にＨＧＦ  １ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、無菌濾過した後にＨＧＦ水溶液を得る。本水溶液のｐＨを調整した後に、無菌的にバイアル瓶に２ｍＬずつ充填し、表１に示す条件に従って凍結乾燥して、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例６：低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤の作製（比較例）
３００ｍＭ塩化ナトリウム、５％アラニン、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）にＨＧＦ  １ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、無菌濾過した後にＨＧＦ水溶液を得る。本水溶液のｐＨを調整した後に、無菌的にバイアル瓶に２ｍＬずつ充填し、表１に示す条件に従って凍結乾燥して、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例７：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
１４０ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭアルギニンを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）にＨＧＦ  １ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、無菌濾過した後にＨＧＦ水溶液を得る。本水溶液のｐＨを調整した後、無菌的にバイアル瓶に２ｍＬずつ充填し、例１の凍結乾燥の条件と同様の条件により低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。この製剤は使用時に２ｍＬの注射用蒸留水に溶解することによりＨＧＦを１ｍｇ／ｍＬ含有し、注射剤として許容されるｐＨおよび浸透圧比（１．５；ほぼ等張）を有する注射液とすることができる。
例８：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
１４０ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭアルギニン、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）にＨＧＦ  １ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、無菌濾過した後にＨＧＦ水溶液を得る。本水溶液のｐＨを調整した後、無菌的にバイアル瓶に２ｍＬずつ充填し、例１の凍結乾燥の条件と同様の条件により低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例９：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
１４０ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭアルギニン、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）にＨＧＦ  ２ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、無菌濾過した後にＨＧＦ水溶液を得る。本水溶液のｐＨを調整した後、無菌的にバイアル瓶に２ｍＬずつ充填し、例１の凍結乾燥の条件と同様の条件により低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例１０：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
１４０ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭアルギニン、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）にＨＧＦ  ３ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、無菌濾過した後にＨＧＦ水溶液を得る。本水溶液のｐＨを調整した後、無菌的にバイアル瓶に２ｍＬずつ充填し、例１の凍結乾燥の条件と同様の条件により低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例１１：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
１４０ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭアルギニン、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）にＨＧＦ  ４ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、無菌濾過した後にＨＧＦ水溶液を得る。本水溶液のｐＨを調整した後、無菌的にバイアル瓶に２ｍＬずつ充填し、例１の凍結乾燥の条件と同様の条件により低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例１２：低濃度凍結乾燥製剤の作製（比較例）
１４０ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭアルギニン、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）にＨＧＦ  ５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、無菌濾過した後にＨＧＦ水溶液を得る。本水溶液のｐＨを調整した後、無菌的にバイアル瓶に２ｍＬずつ充填し、例１の凍結乾燥の条件と同様の条件により低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例１３：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
例８において、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）の代わりに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、ＨＧＦ  １ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例１４：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
例８において、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）の代わりに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて、ＨＧＦ  １ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例１５：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
例８において、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）の代わりに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて、ＨＧＦ  １ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例１６：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
例８において、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）の代わりに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて、ＨＧＦ  １ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例１７：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
例８において、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）の代わりに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、ＨＧＦ  １ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例１８：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
例８において、１００ｍＭアルギニンの代わりに５０ｍＭアルギニンを用いて、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例１９：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
例８において、アルギニンの代わりにリジンを用いて、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例２０：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
例８において、アルギニンの代わりにヒスチジンを用いて、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例２１：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
例８において、アルギニンの代わりにグルタミンを用いて、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例２２：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
例８において、アルギニンの代わりにシステインを用いて、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例２３：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
例８において、アルギニンの代わりにプロリンを用いて、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例２４：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
例８において、アルギニンの代わりにグルタミン酸ナトリウムを用いて、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例２５：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
例８において、アルギニンの代わりにアスパラギン酸ナトリウムを用いて、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例２６：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
例８において、アルギニンの代わりにグリシンを用いて、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例２７：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
例８において、バイアル瓶への充填量２１ｍＬの代わりに５ｍＬを用いて、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
例２８：低濃度凍結乾燥製剤の作製（本発明）
１４０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）にデキストラン硫酸ナトリウム５０ｍｇ／ｍＬおよびＨＧＦ１ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、無菌濾過した後にＨＧＦ水溶液を得る。本水溶液のｐＨを調整した後に、無菌的にバイアル瓶に２ｍＬずつ充填し、例１の凍結乾燥の条件と同様な条件により低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得ることができる。
試験例１：ＨＧＦの溶解度に関する評価
（１）ＨＧＦの溶解度の評価方法
ＨＧＦをポリプロピレン製チューブに秤量し、種々の濃度の塩化ナトリウムおよび安定化剤、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を添加後、直ちにチューブを一定温度に２４時間保持し、ＨＧＦを溶解した。溶解後直ちに遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分間、一定温度）を行い、ＨＧＦ飽和溶液と未溶解ＨＧＦを完全に分離し、上清をサンプリングした。低タンパク吸着性フィルター；ミリポアＧＶ（親水性デュラポア；０．２２μｍ）で濾過し、得られた飽和溶液中のＨＧＦ濃度をＨＰＬＣ法（ゲル濾過法）により定量し、ＨＧＦの飽和溶解度を求めた。
ＨＰＬＣによる分析条件
カラム：ＴＯＳＯＨ  ＴＳＫ  Ｇ−３０００ＳＷＸＬ（φ０．７８×３０ｃｍ）流速  ：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：ＯＤ  ２８０ｎｍ
温度：３０℃
キャリアー：０．３Ｍ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｎａ，０．１％  ＳＤＳ，ｐＨ７．５
アプライ：５０μｌ
ＨＧＦの保持時間：２４．０ｍｉｎ
（２）ＨＧＦの溶解度におよぼすｐＨの影響
１４０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で、ｐＨの異なる溶液を調製し、４℃および２０℃におけるＨＧＦの溶解度を（１）の方法で検討し、その結果を表２に示した。ｐＨの低下に伴い、ＨＧＦの溶解度は徐々に増加し、ｐＨ５．０以下で顕著な溶解度の向上が確認された。また、いずれの場合も温度上昇に依存した溶解度の増加を認めた。
0004635340.tif 000003
（３）ＨＧＦの溶解度におよぼす塩化ナトリウム濃度の影響
種々の濃度の塩化ナトリウム、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を調製し、４℃および２０℃におけるＨＧＦ溶解度を（１）の方法で検討し、その結果を表３に示した。塩化ナトリウム濃度を上昇させるにしたがって、ＨＧＦの顕著な溶解度の増加を認めた。また、いずれの場合にも、温度上昇に依存したＨＧＦの溶解度の増加を認めた。
0004635340.tif 000004
（４）ＨＧＦの溶解度におよぼす各種安定化剤の影響
各種医薬品添加剤のＨＧＦ溶解度におよぼす影響について検討した。種々の濃度の添加剤、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８〜７．５）に、ＨＧＦ  １ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、ＨＧＦ水溶液を得た。９６穴マイクロタイタープレートに各ウェルあたり２００μＬずつ分注し、４℃にて４８時間保存した後、プレートリーダーにてＯＤ  ４５０ｎｍを測定しＨＧＦ水溶液の濁度を求めた。ＨＧＦの溶解度が低下し、ＨＧＦが凝集・沈澱するにともない溶液の濁度が上昇した。
添加物として、Ｌ−アミノ酸２０種類（アルギニン、リジン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、バリン）、糖類７種類（マンニトール、果糖、トレハロース、ブドウ糖、ソルビトール、ショ糖、乳糖）、高分子類３種類（デキストラン硫酸、デキストラン、ＰＥＧ）、タンパク質類３種類（ヒト血清アルブミン、酸性ゼラチン、塩基性ゼラチン）、界面活性剤３種類（ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＨＣＯ−４０、ＨＣＯ−６０）についてＨＧＦの溶解度におよぼす影響を評価したところ、下記の物質にＨＧＦの溶解度を保持する安定化作用が認められた。
▲１▼アミノ酸類；アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸ナトリウム、
アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン、システイン、プロリン              （０．０５Ｍで効果が確認された）
▲２▼多糖類；デキストラン硫酸（０．１％で効果が確認された）
顕著な効果が認められたアミノ酸について、種々の濃度のアミノ酸、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を調製し、４℃におけるＨＧＦの溶解度を（１）の方法で検討し、その結果を表４に示した。
0004635340.tif 000005
試験例２
凍結乾燥前後のＨＧＦ水溶液の性状
凍結乾燥過程におけるＨＧＦの物理的安定性の変化を確認するため、凍結乾燥前のＨＧＦ水溶液及び凍結乾燥後そのまま精製水で再溶解したＨＧＦ水溶液を、４℃にて２４時間保存後、溶解後の溶液の性状（濁り）を目視により観察した。凍結乾燥製剤の再溶解にかかる時間および浸透圧比についても評価した。その結果を表５に示す。
実施例１および２２の製剤において、凍結乾燥製剤を再溶解した後に４℃にて２４時間保存することにより白濁したが、その他の実施例の製剤の性状に関しては安定であった。
0004635340.tif 000006
試験例３
凍結乾燥製剤溶解後の性状
実施例で作製した凍結乾燥製剤を、凍結乾燥直後および２５℃、４０℃、５０℃にて１ヶ月間保存後、再溶解にかかる時間、再溶解後の溶液の性状（濁り）を評価した。凍結乾燥製剤の溶解は精製水で行い、室温にて性状を評価した。その結果を表６に示す。
２５℃保存において、実施例２２の製剤において、凍結乾燥製剤を再溶解直後に白濁したが、その他のいずれの実施例の製剤も性状に関して安定であった。また、４０℃および５０℃の保存においては、実施例１，２２，２３，２４および２５の製剤は溶解直後に白濁したが、その他のいずれの実施例の製剤も性状に関して安定であった。
0004635340.tif 000007
試験例４
凍結乾燥製剤における重合体含量変化
実施例で作製した凍結乾燥製剤を、凍結乾燥直後（イニシャル）、および２５℃、４０℃、５０℃にて１ヶ月間保存し、その凍結乾燥製剤に含まれる重合体含量とＨＧＦ含量の比を測定した。試験例１（１）の方法（ゲル濾過法）を使用した。その結果を表７および表８に示す。
重合体の保持時間：２０．４ｍｉｎ，２１．８ｍｉｎ
ＨＧＦの保持時間：２４．０ｍｉｎ
保存温度の上昇にともない重合体生成に増加傾向が観察されるものの、特に実施例８，１９および２０の凍結乾燥製剤は重合体の生成は極端に少なく物理化学的に安定であった。アルギニン、リジンおよびヒスチジンを添加することにより、高温保存しても重合体の生成は少なく（重合体生成率：４０℃において約３％以下、５０℃において約５〜９％以下）、保存安定性が向上することが判明した。また、比較例として、アルギニンを含まない点以外は同様な成分及び方法により調製されている実施例１の凍結乾燥製剤を用いて同様な試験を実施したが、保存温度の上昇に伴い重合体生成の大幅な増加が観察された。
また表８に示されるように、ＨＧＦ濃度を低濃度化（５ｍｇ／ｍＬ未満）することにより、重合体生成は促進され、保存安定性が低下することが示された。凍結乾燥製剤の安定化剤として特開平９−２５４１１号公報に記載されたグリシンおよびアラニンを用いた場合には、高濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤（特開平９−２５４１１号公報の実施例５および６：２０ｍｇ／ｍＬ）に比べ、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤（実施例５，６および２６：１ｍｇ／ｍＬ）では重合体生成が促進され、保存安定性が低下することが判明した。
一方、凍結乾燥製剤の安定化剤としてアルギニン、リジンおよびヒスチジンを用いた実施例８，１９および２０の凍結乾燥製剤は、低濃度ＨＧＦ凍結乾燥製剤（１ｍｇ／ｍＬ）でも重合体の生成が顕著に抑制され、保存安定性が向上することが示された。
0004635340.tif 000008
0004635340.tif 000009
試験例５
凍結乾燥製剤における重合体含量変化−ｐＨの重合体生成に与える影響
実施例８，１３，１４，１６及び１７で調製した各種ｐＨを有する凍結乾燥製剤を、凍結乾燥直後（イニシャル）および５０℃にて１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間保存した後に、その凍結乾燥製剤に含まれる重合体含量とＨＧＦ含量の比を測定した。試験例１（１）の方法（ゲル濾過法）を使用した。その結果を表９に示す。
重合体の保持時間；２０．４ｍｉｎ，２１．８ｍｉｎ
ＨＧＦの保持時間；２４．０ｍｉｎ
ｐＨ７．０および７．２を有する実施例１６および１７の凍結乾燥製剤は、５０℃の保存において経時的に重合体生成が増大するものの、ｐＨ６．５以下のｐＨを有する実施例８，１３および１４の製剤では重合体の生成は少なく、弱酸性のｐＨにおいて安定性が向上することが判明した。
0004635340.tif 000010
試験例６
凍結乾燥製剤の生物活性変化（比活性）
実施例１，８で作製した凍結乾燥製剤を、２５℃、５０℃にて２ヶ月間保存、あるいは１０℃、２５℃にて１．５年間保存し、その凍結乾燥製剤を再溶解した水溶液の生物活性を、下記に示す生物活性測定方法で測定した。その結果を表１０に示す。
生物活性測定方法
ヒト肝細胞株ＰＬＣ／ＰＲＦ／５を対数増殖期まで培養し、細胞生存率を確認後、０．７×１０５個／ｍＬとなるように細胞溶液を調製する。ＨＧＦサンプル及び標準品を添加した９６穴アッセイプレートに細胞溶液を１００μＬずつ添加し、細胞数が０．７×１０４／ウェルとなるように播種した（ｎ＝４）。５％炭酸ガスインキュベータ内、３７℃で２０時間プレインキュベーション後、さらに、［３Ｈ−チミジン」を添加し、６時間培養を続けた。培養完了後、ファルマシア社ベータプレートシステムを使用して、細胞の回収し、細胞内に取り込まれた「３Ｈ］量を測定した。測定結果を平行線検定法にかけ、ＨＧＦサンプルの比活性を標準品の比活性で除し、力価（％）を求めた。
実施例８のアルギニンを添加した凍結乾燥製剤においては、高温保存しても生物活性に殆ど変化はなく、生物活性の面で安定であった。また、比較例として、アルギニンを含まない点以外は同様な成分及び方法により調製されている実施例１の凍結乾燥製剤を用いて同様な試験を実施したが、保存温度の上昇に伴い生物活性の大幅な低下が観察された。
0004635340.tif 000011
産業上の利用可能性
本発明の凍結乾燥製剤は、臨床上有用な低濃度のＨＧＦを含む水溶液を調製可能であり、凍結乾燥時及び凍結乾燥後の保存時に重合体の生成が少なく、安定性に優れている。また、凍結乾燥時に良好なケーキ形成性を有し、再溶解性に優れるという特徴を有しており、注射剤として望ましいｐＨおよび浸透圧比を有する製剤として調製することも可能である。