(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン感受性増強因子及びペプチド画分を含む、ＩＩ型糖尿病の治療用または糖尿病の予防用組成物であって、
前記ペプチド画分が、カゼインの加水分解により得られ、分子量５００未満のペプチドを７０モル％以上含むペプチド画分であり、前記インスリン感受性増強因子が、クロム、バナジウム、ナイアシン、コロソリン酸、バナバ葉抽出物、ジンセンベリー、ジンセノシドＲｅ、シナモン、メチルヒドロキシカルコンポリマー、プテロスチルベン、ビグアナイドまたはチアゾリジンジオンである、組成物。
【請求項２】
ペプチド画分がロイシン、フェニルアラニンまたはアルギニンのいずれかである遊離アミノ酸の少なくとも一種を含む請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記カゼイン中に存在するプロリンの少なくとも２０モル％が、前記ペプチド画分中のジペプチドおよび／またはトリペプチド中に存在している、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記カゼイン中に存在するプロリンの少なくとも３０モル％が、前記ペプチド画分中のジペプチドおよび／またはトリペプチド中に存在している、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
前記カゼイン中に存在するプロリンの少なくとも４０モル％が、前記ペプチド画分中のジペプチドおよび／またはトリペプチド中に存在している、請求項３記載の組成物。
【請求項６】
トリペプチドの３０モル％がカルボキシ末端プロリンを有する、請求項３〜５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
トリペプチドの３５モル％がカルボキシ末端プロリンを有する、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の組成物を含む医薬品。
【請求項９】
治療または診断によってヒトまたは動物の身体を処置する方法に使用される請求項１〜７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
ＩＩ型糖尿病の治療用または糖尿病の予防用医薬製造のための、請求項１〜７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１１】
ＩＩ型糖尿病の治療用または糖尿病の予防用医薬製造のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１２】
ペプチド画分がチロシン、ロイシン、フェニルアラニンまたはアルギニンのいずれかである遊離アミノ酸の少なくとも一種を含む、請求項１１記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインスリン感受性増強因子を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
II型（真正）糖尿病は、血中グルコースレベルの上昇を特徴とする臨床的および遺伝学的に不均質な症候群である。II型糖尿病は、膵臓のβ（ベータ）細胞により産生されるインスリンが不足しているか、または標的組織によって非効率的に利用され、その結果血中グルコースレベルが高くなるために発生する。食後の急上昇（食事後の体内グルコースの上昇）（通常高炭水化物食によりもたらされる）は高血中グルコースレベルの一因である。糖尿病により生じる合併症は通常長年にわたる過剰な血糖レベルに由来するであろう。
II型糖尿病の進行はしばしば以下の特徴を有する。まず初めにゆっくりであるが着実にインスリン耐性の増加が生じる。このことは、膵によるインスリン産生は疾患の初期段階では正常であるが、グルコースの取り込みを高めるインスリンの能力が低下することを暗示している。疾患初期段階におけるインスリン感受性の低下は、通常は膵によるインスリンの放出増加によって代償される。しかしながら、数年後には膵はグルコース摂取に対してもはや適切に反応しなくなり、インスリン感受性の低下は最適に達しないインスリン産生をもたらす。その結果生じる高血糖症（高血中グルコースレベル）は、前記疾患の急激な制御不能の進行をもたらし、経口薬剤の使用および最終的には外因性インスリン治療の開始が必要になる。
血中の異常に高いグルコースレベルは微小なおよび肉眼的な血管合併症の一因となるであろう。前記合併症には心脈管系疾患、網膜症、腎障害および神経障害が含まれる。これら高グルコースレベルによる重篤な身体の合併症には眼、心臓、腎臓および神経の損傷が含まれる。
【０００３】
糖尿病に対抗する手段は血糖レベルをモニターし、これを管理することによる。患者がその血糖レベルを初期段階で注意深くモニターし、これを管理するならば、患者は糖尿病に付随する多くの合併症を遅らせるか、または予防することができる。適切な食事および運動は糖尿病患者が健常な血中グルコースレベルを維持するのに役立つであろう。しかしながら、食事および運動が糖尿病の制御に不適切であるとき投薬が必要となる。この段階では治療はなお経口抗糖尿病薬のみの使用で足りるであろう（すなわち外因性インスリン治療はまだ必要とされない）。
基本的に三種類の経口抗糖尿病薬、すなわち“ブロッカー”型、“刺激因子”型および“感受性増強因子(sensitizer)”型が利用可能である。経口抗糖尿病薬の“ブロッカー”型は、糖尿病の更なる進行を遅延または予防することが示された。この型の薬剤の例はいわゆるα-グルコシダーゼ阻害剤であり、前記は摂取された炭水化物に由来するグルコースの吸収を遅らせることによって機能する。経口抗糖尿病薬の“刺激薬”型は、膵臓によるインスリン産生を刺激する。“刺激因子”型の例は、スルホニル尿素であり、インスリンの分泌を促進するために有効であることが知られている。経口抗糖尿病薬の“感受性増強因子”型はグルコースのより効率的な使用を助けるか、または組織細胞のインスリンに対する感受性を高めるために有効である。“インスリン感受性増強因子”の薬剤例はビグアナイド（biguanide）（例えばメトフォルミン（Metformin）（例えばグルコファージ（Glucophage 登録商標））およびチアゾリジンジオン（例えばピオグリタゾン（Pioglitazone）（例えばアクトス（Actos 登録商標））およびロシグリタゾン（Rosiglitazone）（例えばアバンジア（Avandia 登録商標）））である。驚くべきことではないが、これら経口抗糖尿病薬のいくつかは望ましくない副作用を有する。例えば、スルホニル尿素系抗糖尿病薬の副作用には低血糖、胃腸障害および高血圧反応が含まれる。インスリン感受性増強薬のビグアナイドの副作用には胃腸障害および乳酸アシドーシスが含まれる。
【０００４】
より穏やかな感受性増強作用は多数の天然の化合物を用いて得ることができる。そのような天然のインスリン感受性増強物質の明白な利点は、使用に便利で安全であるということである。天然のインスリン感受性増強物質は、例えば我々の通常の食事に添加するか、または食事療法用サプリメントおよび機能性食品に添加することができる。これら天然のインスリン感受性増強物質の１つはクロムである。クロムは正常なインスリン機能に必須の微量無機物である。食事調査は、米国および他の工業化諸国では殆どの人が十分なクロムを摂取せず、不足は糖尿病罹患者ではいっそう一般的ですらあることを示している。多くの臨床調査によって糖尿病罹患者におけるクロム補充の有用性および安全性が支持されている。クロム補充は、血中インスリンレベルを低下させ、グルコース耐性を改善し、さらにII型糖尿病罹患者のヘモグロビン糖化を低下させることが知られている。クロムはまた、健常な血中脂質レベル（特に特定のトリグリセリドおよびHDLコレステロール）の維持に役立つ。専門家、例えばRichard Anderson, Ph.D.（US Dept. of Agriculture, Beltsville Human Nutrition Research Center）は、日量200から1000μgのクロム補充を推奨した。臨床調査では、特に有機型またはキレート型、例えばポリニコチン酸クロム、ピコリン酸クロム、グリシン-ナイアシンキレート物、GTFクロムおよびクロム酵母が有効であることが示されている。さらにまた、クロムとビオチン（すなわちビタミンB8）の組み合わせは協調的に作用することが示された。
【０００５】
バナジウムは正常なインスリン機能の促進に必要なまた別の微量成分である。いくつかの研究によって、硫酸バナジルとして供給されたバナジウムはII型糖尿病のグルコース耐性を改善できることが示された。100μg/日までの補充は安全であり、インスリンおよびグルコース代謝に必要なものを含む身体のバナジウム栄養要求を充足させるであろう。
ナイアシンは糖尿病にとって特に重要なまた別のB-ビタミンである。100mg/日のナイアシンは、クロムと一緒に補充されたとき糖尿病のグルコース耐性および絶食時血中グルコースを改善することが示された。
コロハ（トリゴネラ・フェヌム-グレクム（Trigonella foenum-graecum））は東南ヨーロッパ、北アフリカおよび西アジアに自生する薬草である。前記薬草は、I型およびII型糖尿病の両方の治療に有益であることが示され、血清コレステロールレベルの低下に加え血糖制御に有益であると考えられる。わずか15mgの用量で絶食時血糖レベルの制御および食後の血糖レベルの急上昇の制御に有益であろう（“Gales Encyclopedia of Alternative Medicine”, J. Turner）。
【０００６】
バナバの葉抽出物は規格化された糖尿病薬草の中では新参であり、現在のところ“グルコソール（Glucosol）”の商品名で販売されている。グルコソール中の活性化合物、コロソリン酸(corosolic acid)は血中グルコースの細胞への輸送を促進することが示された。グルコソールは、最低で1％のコロソリン酸を提供するように規格化されている。前記抽出物は、人間および動物の実験で十分に寛容されることおよび安全であることが判明している。糖尿病罹患者に用いられる他の薬草抽出物と比較して、グルコソールは、低血糖を引き起こすことなく糖尿病患者で血糖を低下させることができるという利点を有する。さらにまた、臨床的に有効な用量はわずかに日量32から48mgである。まだ未発表である最近の一連の臨床試験（Southeastern Institute of Biomedical Research（Bradenton, FL）でDr. W. Judyにより1999年に実施されている）では、32から48mg/日で30日間毎日服用したときのグルコソールの顕著な効果が示された。これらの実験の1つは任意抽出された二重盲検交差実験で、12人の糖尿病対象者が前記抽出物の48mgを服用した。グルコソールは、II型糖尿病罹患者で絶食時血中グルコースを低下させ、前記作用は、補充を中断した後でさえも数週間持続した。調査報告は製造元のウェブサイトで利用可能である（www.glucosol.com/glucosol/default.htm）。
【０００７】
テロスチルベン（Pterostilbene）（ブドウで見出された化合物）はUSDAによって同定された。前記は、ストレス条件に対する反応でつる植物によって産生されるフィトアレキシンである。前記部門の研究では、前記化合物は血糖レベルを42％まで低下させることができるといわれている（抗糖尿病薬メトフォルミンの効果に匹敵する作用）。しかしながらぶどう酒の愛飲家には残念なことには、前記化合物の光および空気に対する不安定性のために前記化合物がぶどう酒に存在することはなさそうである。
II型糖尿病治療におけるシナモンの潜在能力は2000年8月に最初に観察された。前記報告は、シナモンに存在する活性化合物、メチルヒドロキシカルコンポリマー（MHCP）は糖尿病マウスで非常に高いグルコースレベルを正常化することができるということを示した未発表実験からもたらされた。別の実験で、MHCPのこの抗糖尿病作用はインスリンに対する細胞の応答を高めるその能力のためであると提唱され、この化合物の投与によりインスリンに対する感受性は約20倍増加すると概算された。この情報が公表された後、US Agriculture Research Service（米国農業研究局）の研究者は、糖尿病罹患者は1日に茶さじ１と1/4杯のシナモンを単独または食べ物と一緒に摂取することを推奨した。
ジンセノシドRe(Ginsenoside Re)（ジンセンベリー（ginseng berry）（チョウセンニンジンの実）中に見出される化合物）は、血糖レベルの正常化、インスリン感受性の改善および体重減少の促進に役立ち、糖尿病および肥満の治療に有用であることが示された。カリフォルニア大学の研究者らは、2つのグループのマウスで前記ジンセンベリーの作用を調べた（第一の群は非糖尿病群、第二の群は糖尿病となるように飼育された）。ジンセンベリーは血糖レベルの正常化、インスリン感受性の改善、コレステロールの低下および体重減少の促進に役立つことができる。ジンセノシドReは、インスリン感受性の改善に必要なジンセンベリー中の化合物の1つであることが判明した（BBC News, 2000年、4月10日（月曜日）；http://news.bbc.co.uk/hi/english/health/newsid_2004000/2004255.stm)。
【０００８】
本明細書では“インスリン感受性増強因子（insulin sensitizer）”または“インスリン感受性増強物質（insulin sensitizing agent）”という用語は、組織の好ましくはインスリンに対する反応性を高めることによって血糖レベルを低下させる化合物、好ましくは医薬化合物、または好ましくは天然の化合物を指す。
インスリン感受性増強因子は、標的組織のインスリンに対する反応性を高めることによって血糖レベルを低下させる効果があることが示された。しかしながら、疾患が進行するにつれ、II型糖尿病患者は十分なインスリンを産生する能力を徐々に消失する。インスリン産生のこの低下はインスリン感受性増強因子の有効性をゆっくりと低下させ、ある時点でこれらの患者は、天然の相対的に害の少ないインスリン感受性増強因子から製剤のインスリン感受性改善薬（例えばビグアナイドまたはチアゾリジンジオン）への変更を強いられ、最終的にはインスリン注射のような劇的な手段が血糖レベルの低下に要求される。
II型糖尿病患者のこのインスリン感受性増強製剤の必要性および最終的にはインスリン注射の必要性を予防または遅らせるために、効果的な血糖の低下をもたらす組成物が希求されている。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、インスリン感受性増強因子、好ましくは天然または製剤のインスリン感受性増強因子と一緒に、ペプチド画分、好ましくはジペプチドおよびトリペプチドに富むペプチド画分を含む組成物を提供する。本組成物は、医薬製剤または食品または補助食品として非常に適切である。特に本組成物はII型糖尿病に有用である。小型のペプチド、好ましくはジペプチドおよびトリペプチドを含む組成物はII型糖尿病の治療に有用であることが見出された。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、血中グルコースレベルを低下させることによる糖尿病の経口治療用組成物および前記組成物を製造する方法に関する。本組成物は、好ましくは1つまたは2つ以上のインスリン感受性増強因子とともにペプチド画分を含む。本発明の組成物の有益な作用はII型糖尿病に罹患している個人に限定されず、健常人に対しても示され、したがって本組成物は糖尿病の予防に利用することができる。さらにまた、本発明の組成物は健常人の運動後の回復を促進するために有用である。本組成物は、食品、飲料またはサプリメントの一部を構成することができ、したがって前記は多様な製品（食事療法用製品、ミルクセーキ、補助食品、幼児用栄養物、医療用栄養物、スポーツドリンクもしくは清涼飲料のような飲料物、または他の食品、食料品または発酵製品を含む）の製造で用いることができる。
インタクトなタンパク質の摂取は血中インスリンレベルに対する刺激的役割を有するという事実は新しいものではなく、1960年代に既に報告されていた。その後の実験によって、タンパク質の加水分解産物は、遊離アミノ酸（特に遊離アルギニン、ロイシン、チロシンおよびフェニルアラニン）と同様に、それらの血管内注射時に強いインスリン刺激性(insulinotropic)を有することが確認された。つい最近の実験によって、タンパク質加水分解産物は、その経口摂取時に遊離アミノ酸および炭水化物と組み合わされてin vivoでインスリン刺激性の潜在能力を示すことが明らかにされた（Van Loon et al, Am. J. Clin. Nutrition, 72:96-105, 2000）。
【００１１】
我々は、インタクトなタンパク質、またはタンパク質加水分解産物、または分子量500Da未満のペプチドに富むタンパク質加水分解産物、または分子量500Da未満のペプチドに富みさらに遊離アミノ酸が補充されたタンパク質加水分解産物の経口摂取はインスリン応答の強化をもたらすことを観察した。上記の選択肢のうち、完全なタンパク質と組み合わされた炭水化物の摂取はもっとも低いインスリン応答をもたらし、分子量500Da未満のペプチドに富むタンパク質加水分解産物を含みさらに遊離アミノ酸が補充された炭水化物の摂取はもっとも高いインスリン応答をもたらす。
前記観察に同調して、我々は本実施例1および4で最高のインスリン応答をもたらすタンパク質源（すなわち分子量500Da未満のペプチドに富むタンパク質加水分解産物および追加的に補充された遊離アミノ酸）を用いて、インスリン感受性増強因子との併用による有益な作用を示した。
II型糖尿病患者は、タンパク質加水分解産物、遊離アミノ酸および炭水化物を一緒に摂取することによって惹起される激しいインスリン分泌の刺激から利益を受けることは直ちに予想される。我々自身の実験はこのインスリン分泌の刺激を確認したが、非常に驚いたことには、このインスリン産生強化は、後期II型糖尿病患者の血中グルコースレベルの顕著な低下をもたらさなかった。したがってインスリン産生強化だけではグルコースレベルの低下を生じなかった。驚くべきことに、我々の実験は、適切なインスリン感受性増強因子と組み合わせたインスリン産生の強化によって血中グルコースレベルの所望の低下が確かにもたらされることを示した。さらにまた、本発明の組成物で観察された血中グルコースレベルの低下は、感受性増強薬単独の低下効果よりもきわめて強かった。
【００１２】
もっとも強力なグルコースレベル低下作用をもつ本発明の組成物は、インスリン感受性増強因子が特定のペプチド画分の有効量と適切に組み合わされることを必要とする。本発明の組成物の予防的態様での使用を容易にするためには、前記組成物がきわめて美味であることとコストが低いことを兼ね備えることは非常に重要である。すなわち、前記組成物は比較的安価で許容できる味をもたねばならない。
最適には、適切なペプチド画分は、高い含有量の疎水性アミノ酸残基を有するタンパク質源から得られる。疎水性アミノ酸残基に富むタンパク質の例は、乳漿またはカゼインのような牛乳タンパク質、獣肉タンパク質、卵のタンパク質、大豆タンパク質、小麦タンパク質、エンドウ豆タンパク質、ジャガイモタンパク質、ハウチワ豆（lupine）のタンパク質、コメのタンパク質およびトウモロコシのタンパク質である。好ましくは、前記タンパク質原料は牛乳タンパク質、大豆タンパク質またはトウモロコシタンパク質、またはその精製画分である。
本明細書では、“ペプチド画分”という用語は、長さが多様な全てのタイプのペプチドおよび場合によって遊離アミノ酸を含むことを示していると理解される。“ペプチド”とは、分子量が2000Da未満のタンパク質分子を意味する。したがって、“ペプチド画分”は遊離アミノ酸を含み得るが、遊離アミノ酸は“ペプチド”という用語には含まれない。好ましいペプチド画分は、小ペプチドクラス（すなわち分子量が500Da未満のペプチド）が過剰に存在するペプチドサイズ分布を特徴とする。本発明のペプチド画分では、これら小ペプチドは、2000Da未満の分子量をもつ存在する全ペプチドの少なくとも30モル％、好ましくは少なくとも50モル％、より好ましくは少なくとも70モル％の量で存在する。さらにまた、本発明の組成物中に含まれるペプチド画分はジペプチドおよび／またはトリペプチドに富む。ジペプチドおよび／またはトリペプチドに富むとは、2000Da未満の分子量をもつ全ペプチドの少なくとも20モル％、好ましくは少なくとも30モル％、より好ましくは少なくとも35モル％がジペプチドおよび／またはトリペプチドとして存在することを意味する。前記ペプチド画分を構成するペプチドのサイズ分布は材料と方法の項で詳述する方法を用いて決定することができる。
【００１３】
前記ペプチド画分は好ましくは適切なタンパク質基質の加水分解によって得られる。前記ペプチド画分は、小ペプチド（すなわち500Da未満の分子量を有するペプチド）を大きな割合で含むタンパク質の加水分解産物である。好ましくは、これらのペプチド画分は、植物または動物由来のタンパク質またはタンパク質画分の酵素による加水分解によって得られる。
タンパク質原料は1つまたは2つ以上の加水分解酵素によって加水分解することができる。前記加水分解酵素は動物、植物、酵母、細菌またはカビ類起源であり得る。好ましくは、遊離アミノ酸の遊離を最小限にするために、広い切断特異性および低いエキソペプチダーゼ活性を有する酵素調製物が用いられる。好ましい酵素はエンドプロテアーゼで、例えばスブチリシン（EC3.4.24.4、またはペスカラーゼ（Pescalase）（DSM Food Specialities（Seclin, France）より供給される）、またはアルカラーゼ（Alcalase）（NOVO（Bagsvaerd, Denmark）により供給される）、テルモリシン（EC3.4.24.28、またはブリューワーズプロテアーゼ2000（DSM Food Specialities（Seclin, France）より供給される）、またはニュートラーゼ（Neutrase）（NOVO（Bagsvaerd, Denmark）により供給される）、またはトリプシン（EC3.4.21.4）またはキモトリプシン（EC3.4.21.1）またはパパイン（EC3.4.22.2）またはペプシン（EC3.4.23.1）である。本発明で開示する組成物の製造に用いることができるペプチド画分は、文献に記載され当業界で公知の一般的な技術を用い酵素加水分解または化学的加水分解により得ることができる全てのタンパク質加水分解産物を含む。
【００１４】
タンパク質の強い加水分解で通常発生する苦味をもつ好ましくない味のレベルに限界を設けるために、前記ペプチド画分は、好ましくはアミノ酸特異的（例えばプロリン特異的）プロテアーゼを用いて得られる。プロリン特異的プロテアーゼは、プロリンのアミノ末端側またはカルボキシ末端側のどちらかにおける優先的な切断を意味する。プロリンのアミノ末端側で切断することができるエンドプロテアーゼが知られている（Nature(Jan/15), 391:301-304, 1998）。プロリンのカルボキシ末端側で優先的に切断するエンドプロテアーゼもまた知られている（EC3.4.21.26）。後者のタイプのプロリン特異的エンドプロテアーゼは、好ましくは食品等級の過剰産生リコンビナント株（例えばアスペルギルス（Aspergillus））から得られる。前記酵素の適切な産生体の例はWO02/45523に記載されている。さらにまた、プロリン特異的ジペプチジル-ペプチダーゼ（EC3.4.14.2）が知られている。本発明のペプチド画分の製造におけるこれらのプロリン特異的プロテアーゼの使用は多くの利点を有する。正常でない味（例えば苦味）を防ぐことができるという事実に加えて、ペプチド画分の水への可溶性が改善され、きわめて重要なことには、得られる最終ペプチドサイズを顕著に減少させることができる。特に比較的高いプロリン含有量をもつタンパク質基質（例えば小麦のグルテン（実施例1参照）およびカゼイン（実施例4参照））の場合、加水分解プロセスへのプロリン特異的プロテアーゼの包含によって、分子量500Da未満のペプチドを高率に含むペプチド画分が得られる。
【００１５】
我々の同時係属特許出願PCT/EP03/05876（前記は参照により本明細書に含まれる）に記載されているように、ジペプチジルペプチダーゼおよび／またはトリペプチジルペプチダーゼ（EC3.4.14）の加水分解産物の生成における使用は、これらが本発明のペプチド画分の製造に効率的な方法を提供するので特に重要である。したがって、好ましくは、前記ペプチド画分は、好ましくは顕著な量のジペプチドおよび／またはトリペプチドを含む加水分解産物である。
使用される種々のプロテアーゼの作用の結果として、前記ペプチド画分はおそらく遊離アミノ酸も同様に含むであろう。酵素による加水分解反応から生じる遊離アミノ酸の量は、2000Da未満の分子量を有する含有されるペプチドの1から10質量％（乾燥重量を基準に算出）の範囲であろう。
タンパク質の加水分解によってペプチド画分が得られることに加えて、前記ペプチド画分は化学的合成または酵素的合成によって得ることもできる。さらにまた、そのような合成ペプチドを加えた加水分解産物は本発明の組成物に存在するペプチド画分を構成することができる。
好ましくは前記ペプチド画分は、本発明の組成物の乾燥重量を基準に計算して0.5から99質量％、好ましくは1.0から90質量％、より好ましくは1.5から50質量％の量で本発明の組成物に存在する。
【００１６】
“インスリン感受性増強物質”または“インスリン感受性増強因子”とは、インスリンに対する組織の反応性を高めることによって血中グルコースレベルを低下させる化合物を指す。“天然の”インスリン感受性増強物質の例は鉱物（好ましくはクロム、バナジウム）またはナイアシンのようなB-ビタミンである。さらにまた、薬草または植物抽出物（好ましくはバナバの葉、ジンセンベリー、シナモン由来）およびブドウ中のある種の化合物も有効なインスリン感受性増強因子であることが示された。さらにまた、これらの薬草および植物抽出物で特定され、そのインスリン感受性増強作用に必要と考えられる以下の活性化合物も好ましくは天然の感受性増強物質として利用される：コロソリン酸、テロスチルベン、メチルヒドロキシカルコンポリマー（MHPC）およびジンセノシドRe。製剤の“インスリン感受性増強因子”の好ましい例は、ビグアナイド（例えばメトフォルミン（Metformin）（例えばグルコファージ（Glucophage登録商標））およびチアゾリジンジオン（例えばピオグリタゾン（Pioglitazone）（例えばアクトス（Actos登録商標））およびロシグリタゾン（Rosiglitazone）（例えばアバンジア（Avandia登録商標）））である。これらの天然のインスリン感受性増強因子は好ましくは、それらの摂取日量標準（”Reference Daily Intake”）に準じた量、またはそれよりも多い量で（対象者の栄養要求に応じて）生成物に添加される。摂取日量標準値のリストは、連邦政府規制21CF101.9（2001/4/1）のFDAコード（摂取日量標準が設定された栄養物を含む）に含まれている（http://vm.cfsan.fda.gov/~Ird/CFR101-9.1.HTML）。
本発明の組成物は単一のインスリン感受性増強物質またはそのような物質の組み合わせを含むことができる。好ましくは、本発明の組成物はこれらの物質をその推奨日量またはそれより多い量で含む。本発明の組成物は、前記ペプチド画分および前記インスリン感受性増強因子を混合形態で含んでいてもよいが、また前記ペプチド画分およびインスリン感受性増強因子を別個に梱包し1つのパッケージとして販売することもできる。インスリン感受性増強医薬製剤と組み合わせた本発明の組成物の使用もまた推奨されよう。
【００１７】
ペプチドおよびインスリン感受性増強物質に加えて、本組成物は場合によって遊離アミノ酸を含むことができる。ロイシンおよび／またはアルギニンおよび／またはフェニルアラニンおよび／またはチロシンのグループに属する遊離アミノ酸が特に重要である。これらの遊離アミノ酸を前記ペプチド画分に添加して本発明の組成物を得ることができる。いくつかの国では追加のアミノ酸添加は許可されていないので、結合アミノ酸と遊離アミノ酸との所望のバランスはまた、WO02/32232に概略されたようにエンドプロテアーゼおよびエキソプロテアーゼの選択的組み合わせを用いて得ることができる。この場合、含有される遊離アミノ酸はペプチド画分の更なるタンパク質分解性破壊によって得られ、前記ペプチド画分の全体として不可欠の部分を構成する。好ましい組成物はロイシンおよび／またはアルギニンおよび／またはフェニルアラニンおよび／またはチロシンのグループに由来するアミノ酸に富む。ロイシン、アルギニン、フェニルアラニンおよびチロシンのグループに属する遊離アミノ酸並びに結合アミノ酸の合計は、前記遊離アミノ酸および結合アミノ酸の合計の乾燥重量を基準に計算して少なくとも10質量％、好ましくは少なくとも20質量％、より好ましくは少なくとも30質量％、さらに好ましくは少なくとも50質量％、もっとも好ましくは少なくとも60質量％で本発明の組成物中に存在する。好ましくは前記グループに属するアミノ酸は、前記組成物の乾燥重量を基準に計算して0.5から99質量％、好ましくは1.0から90質量％、より好ましくは1.5から50質量％の量で前記組成物中に存在する。
最終的な組成物中に存在する遊離アミノ酸のレベルは、総アミノ酸含有量と同様に材料と方法の項に詳述した方法を用いて設定することができる。
【００１８】
アミノ酸に加えて、炭水化物が場合によって本発明の組成物に存在する。予想される使用に応じ、すなわちそのもの単独または他の食品との組み合わせとして、前記組成物は別個の炭水化物源を含むことができる。これらの炭水化物源は、個々の適用例について所望の糖血指数に応じてグルコースまたはマルトデキストリンもしくは澱粉のようなよりゆっくりと吸収される炭水化物であろう。本発明の組成物では、炭水化物は、組成物の乾燥重量を基準に計算して1.0から90質量％、好ましくは2から50質量％、より好ましくは6から35質量％の量で存在する。
本発明の組成物における炭水化物含有量の範囲の広さは、予想される組成物の種々の使用によって説明することができる。
一方で、炭水化物含有食と一緒に本組成物を摂取することを所望するか、または食間に本組成物を摂取することを所望する者にとって最適な配合物は、例えば錠剤、シロップまたはサシェの形態にあるほぼ純粋なペプチドとインスリン感受性増強因子のサプリメントである。
他方で、本組成物は、炭水化物を含有する通常食または“承認食”の一部とすることができるように配合することができる。
本発明の組成物における他の任意の成分はビタミン、ミネラル、香料、抗酸化剤、補助酵素および抗酸化剤特性を有する成分、脂質（乳化剤を含む）、着色剤および特別な栄養要求および／または生理学的要求に適合するタンパク質である。
【００１９】
本発明の組成物は医薬組成物、または食品組成物のいずれでもあり得る。
本発明の組成物は固体でも液体であってもよい。前記組成物は散剤、錠剤、カプセル、他のゼラチン形態、飲料または他の任意の食品の形態を有し得る。
本発明の組成物は、通常の食事の一部でも、承認食の一部でもよい。
“承認食”または“承認された食事療法食”とは、糖尿病罹患者の健康のために国の栄養機関、例えばアメリカ糖尿病協会（American Diabetes Association Inc., “ADA”）によって推奨または承認された食事を指す。例えば、“Maximizing the Role of Nutrition in Diabetes Management”（アメリカ糖尿病協会によって1994年に刊行）で推奨された食事は、“承認食”である。糖尿病罹患者のための食事を推奨または承認している他の西欧の機関は、International Diabetes Federation（国際糖尿病連合）；European Association For the Study of Diabetes（欧州糖尿病研究協会）；およびEuropean and Canadian Diebetic Association（欧州およびカナダ糖尿病協会）である。他の東または極東の機関は、Chinese Diabetes Federation（中国糖尿病連合）、Japanese Diabetes Federation（日本糖尿病協会）およびIndian Diabetes Federation（インド糖尿病連合）である。“承認食”は、糖尿病患者の属する文化および地理に応じて変動することは理解されよう。しかしながら、文化または地理がいずれであるかにかかわらず、医師の指示に従っている糖尿病患者はその患者のシステムにおける合理的要求を超える食事を摂取しないことは理解されよう。
【００２０】
実施例
材料と方法
90％のタンパク質を含むカゼインナトリウム塩をDMVインターナショナル（オランダ）から入手した。小麦のグルテンはカルギル（Cargill）から入手した。L-ロイシン、L-フェニルアラニン、ベータ-ラクトグロブリンおよび粗ラクトアルブミンはシグマ-アルドリッチ（Sigma-Aldrich）から入手した。
バチルス=リケニフォルミス（B. licheniformis）由来のスブチリシン、デルボラーゼ（Delvolase（登録商標））はDSMフードスペシャリティーズ（DSM Food Specialities, Seclin, France）から入手した。
酵素活性
アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）によるプロリン特異的エンドプロテアーゼの過剰産生およびクロマトグラフィー精製はWO02/45524に記載されたように実施した。後者の酵素の活性は、日本国特許JP5015314記載の方法にわずかの改変を加えて測定した。簡単に記せば、前記酵素活性は、クエン酸／リン酸二ナトリウム緩衝液（pH5）中で37℃でZ-Gly-Pro-pNAにより調べた。pH5を選択した理由は、前記酵素の至適pHはこの検査ではpH6より低いからである。反応生成物もまた分光光度計により410nMでモニターした。アスペルギルス=ニゲルの遺伝子12によってコードされるトリペプチジルペプチダーゼTPAP-Aの過剰産生およびクロマトグラフィー精製はEP02100667.1の記載にしたがって実施した。精製されたトリペプチジルアミノペプチダーゼの活性は同様な方法で測定した。しかしながら、この事例では、合成基質Ala-Ala-Phe-pNA（Bachem, Switzerland）を用い、0.1mol/mLのクエン酸緩衝液（pH4.0）中で60℃でインキュベートした。精製TPAP-Aは8ユニット/mLの活性を有していた。
1ユニットは、前記の条件下で1分間で1μmolのp-ニトロアニリドの遊離を惹起する酵素の量と定義される。
種々のタンパク質分解性混合物とのインキュベーション中に達成される加水分解度（DH）は、迅速OPA検査（JFS, Vol66, No5, 2001）を用いてモニターした。
種々のペプチド画分のペプチド鎖の平均の長さは、スーパーデクスペプチドHR1030カラムクロマトグラフィーによって決定した。
【００２１】
ペプチド画分の“苦味”の官能評価
種々のペプチド画分の官能評価は、種々のレベルの苦味の検出および等級付けで訓練された別々の検査員によって実施した。セッションの間、味覚試験は“盲検”で実施され、苦味は0（苦味なし）から4（非常に苦い）のスケールでスコアを付された。検査員は以下の溶液により硫酸キニーネで訓練された：
15ppmの硫酸キニーネ＞苦味度＝1
20ppmの硫酸キニーネ＞苦味度＝2
30ppmの硫酸キニーネ＞苦味度＝3
50ppmの硫酸キニーネ＞苦味度＝4
ペプチド画分のペプチドサイズ分布
500kDa未満の分子量をもつペプチドの含有量は、必要なリファレンス分子と組み合わせたスーパーデクスHR10/30アマーシャムファルマシア（Amersham Pharmacia）（100から7000Daの範囲）を用いHPSEC方法により概算した。ジペプチドおよびトリペプチドの含有量は、揮発性イオンペアリング試薬NFPAを用い、LC/MS分析の節で述べるように逆相液体クロマトグラフィーと組み合わせて概算される。
【００２２】
LC/MS分析
P4000ポンプ（テルモクェスト（Thermoquest（登録商標））、Breda, オランダ）と結合したイオントラップ質量分析計（テルモクェスト（登録商標）、Breda, オランダ）を用いたHPLCにより、本発明の酵素混合物によって生成された酵素によるタンパク質の加水分解産物の特徴を調べた。ペプチドはPEPMAP C18 300A（MIC-15-03-C18-PM, LC Packing, アムステルダム、オランダ）カラムを用い、溶出のためにMilli Q水中の0.1%ギ酸および1mMノナフルオロペンタン酸（NFPA）（Millipore, Bedford, MA, USA；溶液A）とアセトニトリル中の0.1％ギ酸（溶液B）とのグラジエントを組み合わせて分離した。前記グラジエントは95％の溶液Aで開始し、140分で40％の溶液Bまで増加させ、後者の割合でさらに5分維持した。用いた注入容積は50μLで、流速は50μL/分であった。カラムの温度は30℃で維持した。注入サンプルのタンパク質濃度は約50μg/mLであった。
個々のペプチドに関する詳細な情報は“スキャン依存”MS/MSアルゴリズムを用いることによって得た。前記アルゴリズムはイオントラップ質量分析計のための特徴的なアルゴリズムである。
【００２３】
全スキャン分析に続いてズームスキャン分析を実施し、全スキャン質量範囲で最も強いイオンの電荷状態を決定した。後者のイオンのその後のMS/MS分析によって部分的なペプチド配列情報がもたらされた。前記を用いXcalibur Bioworks（Thermoquest(登録商標), Breda, オランダ）のSEQUESTアプリケーションによるデータベース検索を実施した。使用したデータバンクは、使用されるアプリケーションのために、問題のタンパク質を含むOWL.fastaデータバンク（NCBI（National Center for Biotechnology informatics）（国立バイオテクノロジー情報センター）で利用可能）から抽出した。よく性状が調べられているタンパク質基質(例えば乳漿タンパク質またはカゼイン)を測定したこれらの実験では、分析技術の正確さは、50％未満の配列適合をもつMS/MSスペクトルを省くことによって高められた。
種々の酵素混合物を用いることによって、生成されたペプチドの質量範囲はジペプチドおよびトリペプチドで開始された。揮発性イオンペアリング試薬NFPAを逆相液体クロマトグラフィーと組み合わせて用いることによって、約200から2000ダルトンの範囲の質量をもつより小型でより親水性のペプチドをモニターすることができる。このことはMSシークェンシングによる更なる分析に適切であると考えられた。
アンギオテンシン（M＝1295.6）を用いて、MSモードにおける最適感度およびMS/MSモードにおける最適分断化のために調整を実施した。60mg/mLの定常注入を実施し、MSモードで主に二価および三価荷電種が生じ、MS/MSモードで約35％の最適衝突エネルギーがもたらされた。
【００２４】
アミノ酸の決定
正確に秤量したタンパク質性物質サンプルを希酸に溶解し、沈殿物をエッペンドルフ遠心機によって除去した。アミノ酸水性分析系（Amino Acid Analysis System of Waters; Milford MA, USA）の操作マニュアルに指定されたピコタグ法（PicoTag method）にしたがい、清澄な上清に対してアミノ酸分析を実施した。この目的のために適切なサンプルを前記液体から得て、希酸に添加し、さらに均質化させた。後者の溶液から新規なサンプルを採取し乾燥させ、フェニルイソチオシアネートを用いて誘導体化した。含有される種々の誘導体化アミノ酸をHPLC方法を用いて定量し、これらを合計して前記秤量サンプル中の全遊離アミノ酸レベルを計算した。
サンプル中のこの全遊離アミノ酸レベルを、前記サンプルから遊離させることができる全アミノ酸レベルと相関させるために、さらにまた前記サンプルを酸加水分解し続いて上記で詳述したように存在する全遊離アミノ酸を定量する。酸加水分解中にTrpおよびCysは破壊されるので、これらのアミノ酸は提示データには含まれていない。しかしながら、GlnおよびAsn残基は酸加水分解中にGluおよびAspに変換され、その結果GluとGlnおよびAspとAsnの値は通常一緒にまとめられ、酸加水分解の前に得られたデータとの比較が可能になる。
【００２５】
実施例１
ジペプチドおよびトリペプチド並びにアミノ酸に富むペプチドは、糖尿病患者で血漿インスリンレベルを高めるが、高グルコースレベルは低下させない
本実験の目的は遊離ロイシンおよびフェニルアラニンに富むペプチド画分がII型糖尿病患者で血中グルコースレベルを顕著に低下させることができるか否かを調べることであった。
対象者：10人の長期II型糖尿病の男性患者を本研究のために選択した。除外基準は、腎および肝機能障害、肥満（BMI＞30）、心疾患、高血圧、糖尿病合併症および（外因性）インスリン治療である。ほとんどの対象者（n=8）は経口抗糖尿病薬を服用していた。前記糖尿病患者は、この試験に参加する3日前から全実験期間を通して抗糖尿病薬を控えた。対象者は、1999年の世界保健機構基準にしたがい経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）によってグルコース非寛容／II型糖尿病についてスクリーニングされた。
実験デザイン：各対象者は1週間あけて2つの試験に参加した。前記試験では、2種の飲料組成物（CHOまたはCHO+PRO；定義については下記を参照されたい）の摂取に対するインスリン応答およびグルコース応答が決定された。飲料はランダムな順序および二重盲検で提供された。
プロトコル：実験は一晩絶食後8:30AMに実施した。テフロン（登録商標）のカテーテルを前肘静脈に挿入し、休止期血液サンプルを採取した（t=0分）。その直後に、対象者は、与えられたテスト飲料（CHOまたはCHO+PRO試験）の最初の一回分（3mL/kg）を服用した。反復服用（3mL/kg）はt=90分まで30分毎に実施された。血中グルコースおよびインスリン濃度の測定のために血液サンプルを15分間隔で採取した。
【００２６】
飲料：t=0、t=30、t=60およびt=90に、対象者には3mL/kg体重の体積の飲料を与え、更に0.4g/kg体重/時間のペプチド画分とともにまたはペプチド画分を含まない0.8g/kg体重/時間の摂取用量の炭水化物（50％グルコース；50％マルトデキストリン）（それぞれCHO+PROまたはCHO試験）を与えた。前記ペプチド画分は、遊離ロイシン（0.1g/kg体重/時間）および遊離フェニルアラニン（0.1g/kg体重/時間）を補充した、十分に加水分解された小麦のタンパク質（0.2g/kg体重/時間）からなる。したがって前記飲料によって供給される窒素の半分は小麦のタンパク質ペプチドから、1/4は遊離ロイシンから、さらに1/4は遊離フェニルアラニンから供給された。
分析：血液（10mL）をEDTA含有試験管に採集し、1000g、4℃で10分遠心した。血漿の一部を液体窒素で直ちに凍結し、-80℃で保存した。グルコース（ユニットキットIII,07367204）（Roche, Basel, Switzerland）はCOBAS FARA半自動分析装置（Roche, Basel, Switzerland）で分析した。インスリンは放射性イムノアッセイ（インスリンRIA100キット）（Pharmacia, Sweden）で分析した。
得られた結果によれば（図1参照）、II型糖尿病患者のインスリン反応は前記飲料にペプチド画分（PRO）混合物を混合することによって実質的に高められた。インスリンレベルは最初を100％として289％に増加した（P<0.01）。前記結果は、グルコース摂取を同じに維持しながら、ペプチド画分を付加することによってII型糖尿病患者のインスリン応答の正常化をもたらすことを示している（図1参照）。しかしながら、インスリン応答とは異なり、血漿グルコース濃度はこの時間枠内では試験間で結果に違いはなかった（図2参照）。
これらの観察は、長期II型糖尿病患者におけるインスリン応答は、ペプチド+遊離アミノ酸の添加によって実質的に強化されるが、血中グルコース濃度に対しては顕著な低下作用は観察されないという驚くべき結果をもたらした。
【００２７】
実施例２
プロリン特異的エンドプロテアーゼとトリペプチジルアミノペプチダーゼの組み合わせによって得られるβ-カゼイン加水分解産物は、高い割合のカルボキシ末端プロリン残基を含むペプチド及びにトリペプチドを含む
プロリン特異的エンドプロテアーゼとトリペプチジルペプチダーゼを組み合わせることによってプロリン富裕タンパク質基質（例えば小麦グルテンまたはカゼイン）で得られる種々の反応生成物のさらに厳密なLC/MS/MS分析を可能にするために、基質として純粋なウシのβ-カゼインを用いてまた別の加水分解実験を実施した。前記目的のために、純粋なβ-カゼイン（Sigma）を水に溶解させ、NaOHによりpHを8.0に調節することによって0.2％（タンパク質についてw/w）の溶液を調製した。続いてセリンプロテアーゼ、スブチリシン（デルボラーゼ）を5％（市販の酵素生成物の容積/ベータ-カゼインの重量）の濃度で添加し、前記混合物を非pHスタット条件下で1時間60℃でインキュベートした。前記反応は、乳酸の使用によりpHを5.5に低下させ、続いて10分間90℃で熱処理することによって停止させた。続いて前記混合物を50℃に冷却し、LC/MS/MS分析のためにサンプルを採取した。続いて、クロマトグラフィーにより精製したアスペルギルス=ニゲルの過剰産生プロリン特異的エンドプロテアーゼ溶液を20ユニット/gタンパク質の濃度で添加することによって、A. ニゲルのプロリン特異的エンドプロテアーゼ（EndoPro）とのインキュベーションを実施した。50℃で2時間、非pHスタット条件下でインキュベートした後、プロリン特異的エンドプロテアーゼをさらに熱処理して不活化し、さらにまた別のLC/MS/MS分析用サンプルを得た。最後にクロマトグラフィーにより精製されたTPAP-A（EP02100667.1）を4ユニット/g基質の濃度で添加し、60℃で2時間インキュベーションを継続し、続いて加熱により不活化してさらに別のLC/MS/MSサンプルを得た。その後のインキュベーションは、デルボラーゼ無しでプロリン特異的エンドプロテアーゼおよびTPAP-Aを単独または一緒に用い上記の条件下でベータ-カゼインに対して実施した。後者のサンプルもまたLC/MS/MS分析に付した。得られたデータは下記の表に示されている。
【００２８】
0004719465.tif 000002
【００２９】
使用したTPAP-A酵素（EP02100667.1参照）の広い特異性にもかかわらず、純粋なβ-カゼインをTPAP-A酵素とのみインキュベートした結果、ただ1つのペプチド（すなわちβ-カゼインのN-末端のトリペプチド、Arg-Glu-Leu）だけが遊離された。理由は不明であるが、使用したTPAP-A酵素は本基質の次のトリペプチドを除去することができず、これによりTPAP-Aをエンドプロテアーゼ（例えばスブチリシンまたはプロリン特異的エンドプロテアーゼまたは2つの組み合わせ）と組み合わせる必要が如実に示された。上記に示した結果は、トリペプチジルペプチダーゼと1つまたは2つ以上のエンドプロテアーゼとの組み合わせは生成されるトリペプチド数の顕著な増加をもたらすことを明確に示している。プロリン特異的エンドプロテアーゼを含む組み合わせは全て、カルボキシ末端のプロリン残基をもつペプチド数の強い増加を示した（前記ペプチドにより苦味の減少がもたらされるであろう（WO02/45523参照））。
【００３０】
実施例３
プロリンの少ない基質に対してプロリン特異的エンドプロテアーゼとトリペプチジルペプチダーゼを組み合わせる利点
本実施例では、プロリン特異的エンドプロテアーゼとトリペプチジルペプチダーゼとの酵素の組み合わせは、プロリン含有量の少ない基質の加水分解にも有利に使用できることが示される。
牛乳のラクトアルブミン粗画分（Sigma）を20g/Lの濃度で水に懸濁し、その後pHを8.0に調節した。セリンプロテアーゼのスブチリシン（デルボラーゼ）を4％（市販酵素製品の容積/基質重量）の濃度で添加し、混合物をpH非固定条件下で60℃2時間インキュベートした。続いて前記懸濁液のpHをクエン酸で4.5に下げ、4つに分割した。その1つを加熱してデルボラーゼ酵素を不活化し、続いてLC/MS/MS分析まで凍結した。残りの3部分に、A. niger由来のクロマトグラフィー精製プロリン特異的エンドプロテアーゼ（EndPro）（1ユニット/gラクトアルブミン）、またはトリペプチジルペプチダーゼ（TPAP-A；20ユニット/gラクトアルブミン）、またはプロリン特異的エンドプロテアーゼとTPAP-Aとの組み合わせ（1ユニット+20ユニット/gラクトアルブミン；ユニットの定義については材料と方法の項参照）を添加した。前記混合物を一晩50℃でインキュベートし、加熱処理して前記酵素を不活化し、-20℃で保存した。サンプルは最初に遠心し、清澄な上清をLC/MS/MS分析に使用した。α-ラクトアルブミンのアミノ酸配列と適合するペプチドのみを考慮に入れた。
得られたLC/MS/MSデータは図5、6、7および8に示されている。アミノ酸残基によるペプチドの長さはX軸に示され、分析ペプチド数はY軸に示されている。特定の長さをもつペプチドの総分析ペプチドに対する百分率に換算し直さなくても、プロリン特異的エンドペプチダーゼまたはトリペプチジルペプチダーゼまたは前記2つの酵素の組み合わせを用いたインキュベーションが有利であることは明白になった。先の実施例で得られた結果と合わせて、本データは、プロリン特異的エンドプロテアーゼとトリペプチジルペプチダーゼとの組み合わせは、プロリンに富む基質に対してであれ、他のタンパク質性基質に対してであれ、500Da未満の分子量をもつペプチドに富む、より好ましくはジペプチドおよびトリペプチドに富む加水分解産物を提供することを明白に示している。
【００３１】
実施例４
インスリン感受性増強因子と組み合わせたジペプチドおよびトリペプチドに富むペプチドは糖尿病患者で血漿インスリンレベルを上昇させ高グルコースレベルを低下させる
本実験の目的は、“インスリン感受性増強因子”と組み合わせた本発明のペプチド画分がII型糖尿病患者でインスリン反応を上昇させ、それによって血中グルコースレベルを低下させることができるか否かを調べることである。使用ペプチド画分は、カゼインナトリウム塩を十分に加水分解し、500Da未満の分子量をもつペプチドを70モル％以上含むペプチド画分を得て、これに実施例1で用いたレベルと同一のレベルの遊離ロイシンおよび遊離フェニルアラニンを補充することによって得られた。
対象者：6人の（長期）II型糖尿病の男性患者（全員が経口“インスリン感受性増強薬”を服用しているが外因性インスリンは服用していない）を本研究のために選択する。除外基準は、腎および肝機能障害、肥満（BMI＞30）、心疾患、高血圧、糖尿病合併症および（外因性）インスリン治療である。各対象者は1週間あけて2つの試験に参加する。前記の試験では、2種の飲料組成物（炭水化物（CHO）または炭水化物+本発明のペプチド画分（CHO+PRO））の摂取に対するインスリン反応およびグルコース反応を測定し、一方、前記糖尿病患者の通常の“インスリン感受性増強薬”治療を継続する。両試験は3時間続き、その間対象者は椅子にかけて休息状態を維持する。飲料はランダムな順序および二重盲検で提供する。
プロトコル：実験は一晩絶食後8:30AMに実施する。テフロン（登録商標）のカテーテルを前肘静脈に挿入し、休止期血液サンプルを採取する（t=0分）。その直後に、対象者は、与えられたテスト飲料（CHOまたはCHO+PRO試験）の最初の1回分（3mL/kg）を服用する。反復服用分（3mL/kg）は30分毎に摂取する。血漿グルコースおよびインスリン濃度の測定のために血液サンプルを15分間隔で採取する。
【００３２】
飲料：飲料体積並びに、炭水化物（CHO）および炭水化物+ペプチドと遊離アミノ酸（CHO+PRO）の用量は実施例１に記載した通りであった。
分析：血液サンプル（10mL）をEDTA含有試験管に採集し、1000g、4℃で10分遠心する。血漿の一部を液体窒素で直ちに凍結し、-80℃で保存する。グルコース（ユニットキットIII,07367204）（Roche, Basel, Switzerland）はCOBAS FARA半自動分析装置（Roche, Basel, Switzerland）で分析する。インスリンは放射性イムノアッセイ（インスリンRIA100キット）（Pharmacia, Sweden）で分析する。
実施例１で得られた結果とは対照的に、本発明のインスリン感受性増強因子とアミノ酸-タンパク質加水分解産物との組成物は、II型糖尿病患者で血中インスリン反応の強化（図3参照）に併せて、顕著な血中グルコースレベルの低下をもたらす（図4参照）。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】それぞれ炭水化物（CHO）または炭水化物＋ペプチドおよび遊離アミノ酸（CHO+PRO）を含む飲料を摂取した後のII型糖尿病患者の分単位における血漿インスリン応答（μユニット/mL）を示す。
【図２】それぞれ炭水化物（CHO）または炭水化物＋ペプチドおよび遊離アミノ酸（CHO+PRO）を含む飲料を摂取した後のII型糖尿病患者の分単位の血漿インスリン応答（mmol/mL）を示す。
【図３】インスリン感受性増強因子を同時に摂取しつつ、炭水化物（CHO+インスリン）または炭水化物＋ペプチドおよび遊離アミノ酸（CHO+PRO+インスリン）を含む飲料を摂取した後のII型糖尿病患者の分単位の血漿インスリン応答（μユニット/mL）を示す。
【図４】インスリン感受性増強因子を同時に摂取しつつ、炭水化物（CHO+インスリン）または炭水化物＋ペプチドおよび遊離アミノ酸（CHO+PRO+インスリン）を含む飲料を摂取した後のII型糖尿病患者の分単位の血漿インスリン応答（mmol/mL）を示す。
【図５】デルボラーゼを用いて得られたラクトアルブミン加水分解産物のLC/MS/MSデータを示す。
【図６】デルボラーゼ＋TPAP-Aを用いて得られたラクトアルブミン加水分解産物のLC/MS/MSデータを示す。
【図７】デルボラーゼ＋プロリン特異的エンドプロテアーゼ（EndoPro）を用いて得られたラクトアルブミン加水分解産物のLC/MS/MSデータを示す。
【図８】デルボラーゼ＋TPAP-A＋プロリン特異的エンドプロテアーゼ（EndoPro）を用いて得られたラクトアルブミン加水分解産物のLC/MS/MSデータを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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