(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１０レセプター１の細胞外領域をヒト抗体の定常領域に結合させた融合蛋白質であって、前記ヒト抗体の定常領域がヒトＩｇＧ１のＦｃ領域からヒンジ部を欠失させた又はヒンジ部の３個のシステインの内少なくとも２個のシステインをシステイン以外のアミノ酸に改変したヒトＩｇＧ１のＦｃ領域である、２量体構造を形成しない融合蛋白質をコードする遺伝子を発現させるように構成された組み換えベクター。
【請求項２】
下記（ａ）又は（ｂ）から選択されるＩＬ−１０レセプターの細胞外領域及び下記（ｅ）で表されるヒト抗体の定常領域からなるＩＬ−１０阻害活性を有する融合蛋白質をコードする遺伝子を発現させるように構成された組み換えベクター。
（ａ）配列番号１３で表されるＩＬ−１０レセプター１のアミノ酸配列中第１〜２３５のアミノ酸又は１〜２２８のアミノ酸からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１３で表されるＩＬ−１０レセプター１のアミノ酸配列１〜２３５で表されるポリペプチドに対して、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたポリペプチドであって、ＩＬ−１０レセプター活性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号１２で表されるＩｇＧ１遺伝子配列中の第７０〜１１５塩基に始まり第７６８塩基に至る遺伝子配列によりコードされるポリペプチドに対し１〜２０個のアミノ酸が、欠失、置換、又は／及び付加された、２量体を形成しない可溶性の変異型ＩｇＧ１のＦｃ領域であるポリペプチド。
【請求項３】
（１）配列番号１３で表されるＩＬ−１０レセプター１のアミノ酸配列中第１〜２３５のアミノ酸又は１〜２２８のアミノ酸からなるポリペプチド及び
（２）配列番号１２で表されるＩｇＧ１遺伝子配列中の第１１５〜７６８塩基、８２〜７６８塩基又は第７０〜７６８塩基であって８３番目、１０１番目及び１１０番目のＧの内少なくとも２つのＧをＣに代えた遺伝子によりコードされるポリペプチドからなる融合蛋白質をコードする遺伝子を発現させるように構成された請求項１記載の組み換えベクター。
【請求項４】
配列番号７、配列番号９、配列番号１７又は配列番号１９で表わされる遺伝子を発現させる請求項１記載の組み換えベクター。
【請求項５】
ＩＬ−１０レセプター１の細胞外領域をヒト抗体の定常領域に結合させた融合蛋白質であって、前記ヒト抗体の定常領域がヒトＩｇＧ１のＦｃ領域からヒンジ部を欠失させた又はヒンジ部の３個のシステインの内少なくとも２個のシステインをシステイン以外のアミノ酸に改変したヒトＩｇＧ１のＦｃ領域である、２量体構造を形成しない融合蛋白質。
【請求項６】
下記（ａ）又は（ｂ）から選択されるＩＬ−１０レセプターの細胞外領域及び下記（ｅ）で表されるヒト抗体の定常領域からなるＩＬ−１０阻害活性を有する融合蛋白質。
（ａ）配列番号１３で表されるＩＬ−１０レセプター１のアミノ酸配列中第１〜２３５のアミノ酸又は１〜２２８のアミノ酸からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１３で表されるＩＬ−１０レセプター１のアミノ酸配列１〜２３５で表されるポリペプチドに対して、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたポリペプチドであって、ＩＬ−１０レセプター活性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号１２で表されるＩｇＧ１遺伝子配列中の第７０〜１１５塩基に始まり第７６８塩基に至る遺伝子配列によりコードされるポリペプチドに対し１〜２０個のアミノ酸が、欠失、置換、又は／及び付加された、２量体を形成しない可溶性の変異型ＩｇＧ１のＦｃ領域であるポリペプチド。
【請求項７】
（１）配列番号１３で表されるＩＬ−１０レセプター１のアミノ酸配列中第１〜２３５のアミノ酸又は１〜２２８のアミノ酸からなるポリペプチド及び
（２）配列番号１２で表されるＩｇＧ１遺伝子配列中の第１１５〜７６８塩基、８２〜７６８塩基又は第７０〜７６８塩基であって８３番目、１０１番目及び１１０番目のＧの内少なくとも２つのＧをＣに代えた遺伝子によりコードされるポリペプチドからなる請求項５記載の融合蛋白質。
【請求項８】
配列番号１８で表わされる請求項５記載の融合蛋白質。
【請求項９】
ヒト抗体の定常領域がヒトＩｇＧ１のＦｃ領域からヒンジ部を欠失させた又はヒンジ部の３個のシステインの内少なくとも２個のシステインをシステイン以外のアミノ酸に改変することにより改変されたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域である、２量体構造を形成しない融合蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項１０】
下記（ａ）又は（ｂ）から選択されるＩＬ−１０レセプターの細胞外領域及び下記（ｅ）で表される抗体の定常領域からなるＩＬ−１０阻害活性を有する融合蛋白質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１３で表されるＩＬ−１０レセプター１のアミノ酸配列中第１〜２３５のアミノ酸又は１〜２２８のアミノ酸からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１３で表されるＩＬ−１０レセプター１のアミノ酸配列１〜２３５で表されるポリペプチドに対して、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたポリペプチドであって、ＩＬ−１０レセプター活性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号１２で表されるＩｇＧ１遺伝子配列中の第７０〜１１５塩基に始まり第７６８塩基に至る遺伝子配列によりコードされるポリペプチドに対し１〜２０個のアミノ酸が、欠失、置換、又は／及び付加された、２量体を形成しない可溶性の変異型ＩｇＧ１のＦｃ領域であるポリペプチド。
【請求項１１】
（１）配列番号１３で表されるＩＬ−１０レセプター１のアミノ酸配列中第１〜２３５のアミノ酸又は１〜２２８のアミノ酸からなるポリペプチド、及び
（２）配列番号１２で表されるＩｇＧ１遺伝子配列中の第１１５〜７６８塩基、８２〜７６８塩基又は第７０〜７６８塩基であって８３番目、１０１番目及び１１０番目のＧの内少なくとも２つのＧをＣに代えた遺伝子によりコードされるポリペプチドからなる融合蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項１２】
配列番号７、配列番号９、配列番号１７又は配列番号１９で表わされる請求項９記載の遺伝子。
【請求項１３】
請求項９〜１２いずれか１項記載の遺伝子を発現させる組み換えベクターを導入した宿主。
【請求項１４】
請求項１３記載の宿主を用いてＩＬ−１０レセプター１の細胞外領域をヒト抗体の定常領域を結合させた融合蛋白質を生産する方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法で生産された融合蛋白質。
【請求項１６】
（１）プライマー＃１（ＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＴＣＧ）及びプライマー＃３（ＡＴＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＴＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＡＡＡＴＡＣＴＧＣ）を用いて、Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ（Ｊｕｒｋａｔ）から採取した全ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲすることによって，得ることができるＩＬ−１０Ｒ１領域をコードする遺伝子並びに
（２）（ｉ）ＩｇＧ−Ｆｃ＿１（領域１：ヒンジ部なし）切り出し用フォーワードプライマーを＃４（ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧ）、リバースプライマーを＃７（ＡＴＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧ）を用いて、ＳＲα−ｎｅｏ１−ＣＤ８０／ＣＤ８６／ＩｇＦｃに対してＰＣＲすることにより得ることができるヒンジを欠失させたＩｇＧ１のＦｃ領域をコードする遺伝子、
（ｉｉ）ＩｇＧ１−Ｆｃ＿２（領域２：変異型ヒンジ部）切り出し用フォーワードプライマーを＃５（ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＣＣ）、リバースプライマーを＃７（ＡＴＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧ）を用いて、ＳＲα−ｎｅｏ１−ＣＤ８０／ＣＤ８６／ＩｇＦｃに対してＰＣＲすることにより得ることができるＩｇＧ１のＦｃ領域をコードする遺伝子をさらに，修正用フォーワードプライマーを＃８（ＣＴＣＡＣＡＣＡＴＣＣＣＣＡＣＣＧＴＣＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧ），リバースプライマーを＃９（ＡＣＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＡ）を用いて修正を加えた変異型ヒンジを有するＩｇＧ１のＦｃ領域をコードする遺伝子、又は
（ｉｉｉ）ＩｇＧ１−Ｆｃ＿２（領域３：野生型ヒンジ部）切り出し用フォーワードプライマーを＃６：ＩｇＧ１＿２＿Ｆ＿ＢａｍＨ（ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＣＣ）、リバースプライマーを＃７（ＡＴＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧ）を用いて、ＳＲα−ｎｅｏ１−ＣＤ８０／ＣＤ８６／ＩｇＦｃに対してＰＣＲすることにより得ることができるＩｇＧ１のＦｃ領域をコードする遺伝子をさらに，修正用フォーワードプライマーを＃１０（ＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣ），リバースプライマーを＃１１（ＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＡＣＴＣ）を用いて修正を加えた野生型ヒンジを有するＩｇＧ１のＦｃ領域をコードする遺伝子をｐＶＡＸに組込んで発現させることにより得られる融合蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、抗体を利用した医薬、抗体医薬、抗体医薬を発現させるベクターの技術に関連する。より具体的には、ヒト抗体のＦｃ領域とがＩＬ−１０レセプター１の断片とを結合させた融合タンパク質をコードする遺伝子を発現させる発現ベクターに関連する。
【背景技術】  ［キメラ抗体、ヒト化抗体］
モノクローナル抗体は特異性が高く、ガン細胞などの標的細胞を特異的に排除することが期待された。しかしながら、モノクローナル抗体調製に好適なミエローマ細胞が、ヒトでは見つからなかったこともあり、マウスなど、ヒト以外の動物の抗体が調製されてきた。
しかしながら、異種動物抗体は、抗体中に異種動物特異的な部分が多く、そのままヒトに医薬として投与すると、異種動物抗体に対する免疫反応を引き起こすという問題があった。
そのため、キメラ抗体の調製が試みられた。マウスの免疫グロブンリン可変領域のｃＤＮＡと、ヒト由来免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ領域）とを結合して発現させられた（非特許文献１：Ｎａｔｕｒｅ．（１９８４）Ｖｏｌ．３１２，Ｐ．６４３−６．）。しかしながら、ヒト由来の領域が７０％程度で、依然として、免疫反応を引き起こすものであった。
その後、Ｗｉｎｔｅｒ等は、免疫グロブリン中可変領域の３つのループ（ＣＤＲ，ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）が抗体を抗原に結びつける機能を果たしていることを見出した。
そこで、可変領域から、この３つのループ以外の部分をヒト遺伝子由来に設計することにより、５−１０％の領域を除き、ヒト由来の抗体とすることを可能にした（非特許文献２：Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）Ｖｏｌ．３２１，ｐ．７８３−７９２、）。また、この設計に、マウス抗体に由来抗原結合部位をヒトの抗体のフレームワーク領域に移植するｒｅｓｈａｐｅと呼ばれる方法も開発され（非特許文献３：Ｎａｔｕｒｅ  １９８８  Ｖｏｌ．３３２，３２３−）、更にヒト化に伴う親和性の低下の改善も図られた（特許文献１：米国特許６１８０３７０号）。実質的に免疫反応を引き起こさない、親和性の高いヒト化抗体が調製されており、これにより、抗体を医薬として活用する道が開かれてきた。
［イムノアドヘシン］
他方、ヒト抗体の遺伝子配列の解明に伴い、遺伝子組み換え法を用いて、目的のタンパク質の断片とヒト抗体のＦｃ領域を融合タンパク質［イムノアドヘシン：Ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ］として発現させる試みがなされてきた。
例えば、ＴＮＦＲ（ＴＮＦリセプター）の細胞外領域とヒトＩｇＧ重鎖のヒンジ部分とＦｃ領域とを融合したイムノアドヘシンがＴＮＦアンタゴニストとして働くことが示された（非特許文献４：ＰＲＯＮＡＳ  Ｖｏｌ．８８，ｐ．１０５３５−１９５３９）。
［ＩＬ−１０Ｒインターロイキン１０  リセプター］
ＩＬ−１０（インターロイキン１０）は、主にヘルパーＴ細胞（２型）により産生される。一方では、ＩＬ−１０は、ヘルパーＴ細胞（１型）に由来するさまざまなサイトカイン、インターフェロンγ、ＩＬ−２、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）の合成を阻害する免疫抑制的活性がある。他方では、活性化されたＢ細胞の成長及び分化を刺激する活性を有している。また、炎症反応の抑制に多くの面で関与しているといわれている。
［ＩＬ−１０レセプター］
細胞表面のＩＬ−１０レセプターは、ＩＬ−１０の活動を仲介する。ＩＬ−１０レセプターは、サイトカインレセプターファミリーのインターフェロンレセプター様サブグループのメンバーである。ヒト及びマウスのイーターロイキン−１０レセプターをコードするｃＤＮＡは、すでにクローニングされている（非特許文献５：Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１５２，ｐ．１８２１−１８２９，非特許文献６：ＰＲＯＮＡＳ  Ｖｏｌ．９０，ｐ．１１２６７−１１２７１、非特許文献７：Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｖｏｌ．１６，ｐ．５８９４−５９０３）。ＩＬ−１０レセプターは、ＩＬ−１０と高親和性のＩＬ−１０Ｒ１及びＩＬ−１０とは低親和性のＩＬ−１０Ｒ２の２種類のポリペプチドからなっている。
更にＩＬ−１０Ｒ１の細胞外領域のみの発現、調製がされている（非特許文献８：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７０，Ｐ．１２９０６−１２９１１）。
【特許文献１】  米国特許６１８０３７０号
【非特許文献１】  Ｎａｔｕｒｅ．（１９８４）Ｖｏｌ．３１２，ｐ．６４３−６．
【非特許文献２】  Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）Ｖｏｌ．３２１，ｐ．７８３−７９２
【非特許文献３】  Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）Ｖｏｌ．３３２，３２３−
【非特許文献４】  ＰＲＯＮＡＳ  Ｖｏｌ．８８，ｐ．１０５３５−１９５３９
【非特許文献５】  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１５２，ｐ．１８２１−１８２９，
【非特許文献６】  ＰＲＯＮＡＳ  Ｖｏｌ．９０，ｐ．１１２６７−１１２７１
【非特許文献７】  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｖｏｌ．１６，ｐ．５８９４−５９０３
【非特許文献８】  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７０，Ｐ．１２９０６−１２９１１
【発明の開示】
（１）従来の抗体医薬は、融合タンパク質を人体に投与するため、あらかじめ、多量の融合たんぱく質を調整しておく必要があるが、融合たんぱく質の発現には、依然相当のコストを要している。
本発明においては，抗体医薬のような融合タンパク質を発現するベクターを作製し，それを遺伝子治療に用いることで，低コストの治療を実現することを課題とする。
（２）また、本発明は、ＩＬ−１０が免疫抑制的な側面も有し、特に腫瘍などでは、この免疫抑制的な側面が、治療を阻害している面もあると考えられ、このＩＬ−１０に対する効果的なアンタゴニストの開発をも課題としている。
本発明者らは、抗体医薬を効率的に投与できるように、抗体医薬を遺伝子治療用ベクターに抗体医薬をコードする遺伝子を組み込んで、体内で、抗体医薬を産生できる組換え遺伝子治療用ベクターを開発した。
更に具体的には、ＩＬ−１０レセプター１の細胞外領域をＩｇＧ１のＦｃ領域と融合させた抗体医薬（イムノアドヘシン）を開発した。
本発明は、抗体医薬を用いた治療を、抗体医薬をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを提供することにより、従来からの抗体医薬治療のコストを低減するものである。
更に、本発明は、ＩＬ−１０レセプター１とＩｇＧ１、具体的にはＩｇＧ１の定常領域とを結合した融合タンパク質を提供することにより、ＩＬ−１０が介在する病気の治療薬を提供するものである。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−３１０６０１号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明で使用するプライマーリストＩ。
図２は、ＩＬ−１０Ｒ１／ＩｇＧ１＿１−Ａの配列。
図３は、ＩＬ−１０Ｒ１／ＩｇＧ１＿２−Ａの配列。
図４は、ＩＬ−１０Ｒ１／ＩｇＧ１＿１−Ａの３次元構造予測図。
図５は、ＩＬ−１０Ｒ１／ＩｇＧ１＿２−Ａの３次元構造予測図。
図６は、プライマーリストＩＩ。
図７は、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ＊）の配列図。
図８は、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｖ５１：ヒンジなし）の配列図。
図９は、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｖ５２：変異型ヒンジ＊＊）の配列図。
図１０は、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｖ５５：野生型ヒンジ＊＊＊）の配列図。
図１１は、＃０は、ｐＶＡＸ１を、＃１は、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（Ｖ１２：ＥＣ＊）を、＃２は、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１（Ｖ５１：ヒンジなし），＃３は、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１（Ｖ１５：ＳＳＣ型ヒンジ），＃４は、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１（Ｖ５４：ＣＳＣ型ヒンジ）をあらわし、それぞれのＩＬ−１０活性の阻害活性を示す。
図１２は、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｖ５４：ＣＳＣ型変異型ヒンジ＊＊）の配列図
図１３は、ＩＬ−１０Ｒ１＿Ｖ１２の３次元構造予測図。
図１４は、ＩｇＧ１（Ｈｉｎｇｅ＋ＣＨ２＋ＣＨ３）＿ＷＴの３次元構造予測図。
図１５は、ＩＬ１０Ｒ１−ＩｇＧ１（Ｖ５１：ヒンジなし）の３次元構造予測図。
図１６は、ＩＬ１０Ｒ１−ＩｇＧ１（Ｖ５２：ＳＳＳ型変異型ヒンジ）の３次元構造予測図。
図１７は、ＩＬ１０Ｒ１−ＩｇＧ１（Ｖ５４：ＣＳＣ型変異型ヒンジ）の３次元構造予測図。
図１８は、ＩＬ１０Ｒ１−ＩｇＧ１（Ｖ５５：ＣＣＣ型野生型ヒンジ）の３次元構造予測図。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、抗体医薬若しくは抗体医薬候補、抗体医薬若しくは抗体医薬候補をコードする遺伝子及び抗体医薬若しくは抗体医薬候補をコードする遺伝子を組み込んだ抗体医薬若しくは抗体医薬候補発現ベクターを提供する。本組み換え発現ベクターは、抗体医薬産生、及び遺伝子治療用に用いることができる。
［融合蛋白質：抗体医薬］
本発明で用いる抗体医薬又は抗体医薬候補としては、ヒト化抗体、更には、ヒト抗体の定常領域と細胞表面レセプターのリガンド結合部位を結合させた融合タンパク質（イムノアドヘシン）を挙げることができる。
本発明において、イムノアドヘシンとしては、ヒトの抗体の定常領域を抗体以外のタンパク質、例えば、レセプター、接着因子、リガンド等の他の分子との結合作用を有する分子を融合させた融合タンパク質を包含する。より具体的には、ヒトの抗体の定常領域を細胞膜レセプターの細胞外領域、好適には、リガンド結合領域に融合させた融合抗体タンパク質、更に好適には、ＩＬ−１０レセプター若しくはその細胞外領域、又はＩＬ−１０レセプター１の細胞外領域に融合させた融合タンパク質を包含する。
イムノアドヘシンを構成するヒト抗体の定常領域としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡの定常領域が利用できる。好適には、ＩｇＧの定常領域を用いることができる。ＩｇＧの定常領域としては、（イ）Ｆｃ部分、（ロ）ＣＨ２及びＣＨ３からなる領域、（ハ）ヒンジ部分、ＣＨ２及びＣＨ３からなる領域、又はＣＨ１〜ＣＨ３の連続する領域等並びに、これら領域に、１〜数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入した部分又は領域であって、抗体の定常領域としても機能を有する部分又は領域を用いることができる。具体的には、ＩｇＧ１の定常領域、更に具体的には、たとえば、Ｂ細胞のＴｏｔａｌＲＮＡ又はＳＲα−ｎｅｏ１−ＣＤ８０／ＣＤ８６／ＩｇＦｃからクローニングできるＩｇＧ１の定常領域を用いることができる。
イムノアドヘシンを構成する抗体以外のタンパク質としては、レセプター、接着因子、又はリガンド等の他の分子との結合作用（結合能力）を有する分子、又は他の分子との結合能力を維持した、レセプター、接着因子、又はリガンドの断片、並びに、これらの可溶性の断片が挙げられる。好適には、細胞膜レセプター又はその細胞外領域の断片が挙げられる。細胞膜レセプターとしては、種々の膜タンパク質レセプターを用いることができるが、好適には、ＩＬ−１０レセプター及びその細胞外領域、更に好適にはＩＬ−１０レセプター１の細胞外領域を用いることができる。
ＩＬ−１０レセプター１の細胞外領域としては、好適には、配列番号１３の配列について１〜２３５アミノ酸又は１〜２２８のアミノ酸の断片を選ぶことができる。
更に、ＩＬ−１０レセプター１細胞外領域には、細胞外領域を含む任意の断片であって、ＩＬ−１０と結合能力を有する断片を包含し、更に、配列番号１３のアミノ酸番号１〜２３５（配列番号１４の位置番号６２〜７６６の断片によりコードされるポリペプチド）に１乃至数個のアミノ酸〔好適には、１〜５０，更に好適には、１〜２０，より好適には、１〜１０又は１〜５のアミノ酸〕が欠失、置換、付加又は挿入の変異を有するポリペプチドであってかつ当該ポリペプチドがＩＬ−１０と結合活性を有しているポリペプチド、及び配列番号１３のアミノ酸番号１〜２２８（配列番号１４の位置番号６２〜７４５の断片によりコードされるポリペプチド）に１乃至数個のアミノ酸〔好適には、１〜５０個，更に好適には、１〜２０個，より好適には、１〜１０個又は１〜５個のアミノ酸〕が欠失、置換、付加又は挿入の変異を有するポリペプチドであって、かつ当該ポリペプチドがＩＬ−１０と結合活性を有しているポリペプチド、を包含する。
抗体の定常領域部分としては、ＩＬ−１０レセプター１との融合タンパク質を調製する場合には、具体的には、ＩｇＧ１のＦｃ部分、ＣＨ２（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ２）及びＣＨ３（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ３）からなる領域、又はヒンジ部及びＣＨ２並びにＣＨ３からなる領域、並びに、これらの領域に、１−数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入した領域であって、抗体の定常領域としても機能を有する部分又は領域が含まれ、好適には、抗体の定常領域部分が２量体を形成しないように構成したもの、特に好適には、ＩｇＧ１のＦｃ部分でヒンジ部分を欠失又はヒンジ部分のシステインをダイマー形成しないように他のアミノ酸（好適にはセリン）に変異させた変異型ヒンジを有するＩｇＧ１のＦｃ領域が含まれ、具体的には、（イ）ヒンジ部分の３個のシステイン内少なくとも２個のシステインをセリンに変異させた変異型ヒンジを有するＩｇＧ１の定常領域、（ロ）ＣＨ２（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ２）及びＣＨ３（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ３）からなる領域が含まれる。
イムノアドヘシンとしては、好適には、ＩＬ−１０レセプター１の細胞外領域をＩｇＧ１（重鎖）の定常領域（ＣＨ２，ＣＨ３及びヒンジ部、又はＣＨ２及びＣＨ３）とを融合させた融合たんぱく質、特に好適には、ＩＬ−１０レセプター１の細胞外領域をＩｇＧ１（重鎖）の定常領域（ＣＨ２及びＣＨ３、又はＣＨ２、ＣＨ３及び変異ヒンジ部（融合蛋白質が２量体とならないように改変したヒンジ部））との融合蛋白質を挙げることができる。このようなイムノアドヘシンは、ＩＬ−１０をトラップするＩＬ−１０阻害剤として用いることができるほか、ＩＬ−１０活性の調整に用いることができる。
更に、本願発明の融合蛋白質には、次の（１）及び（２）から構成されるＩＬ−１０阻害活性を有する融合蛋白質が包含される。
（１）次の（ａ）又は（ｂ）で表されるＩＬ−１０レセプター１の細胞外領域ポリペプチド；
（ａ）配列番号１３で表されるＩＬ−１０レセプター１のアミノ酸配列中第１〜２３５のアミノ酸又は１〜２２８のアミノ酸からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列１〜２３５で表されるポリペプチドに対して、１〜数個のアミノ酸〔好適には、１〜５０個，更に好適には、１〜２０個，より好適には、１〜１０又は１〜５個のアミノ酸〕が欠失、置換及び／又は付加されたポリペプチドであって、ＩＬ−１０レセプター活性を有するペプチド、及び
（２）次の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）で表されるＩｇＧ１のＦｃ領域
（Ｃ）配列番号１２で表されるＩｇＧ１遺伝子配列中の第７０乃至１１５塩基から始まり７６８塩基に至る遺伝子配列でコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号１２で表されるＩｇＧ１遺伝子配列中の第７０〜１１５塩基に始まり第７６８塩基に至る遺伝子配列によりコードされるポリペプチドに対し１〜数個のアミノ酸〔好適には、１〜５０個，更に好適には、１〜２０個，より好適には、１〜１０又は１〜５個のアミノ酸〕が、欠失、置換、又は／及び付加された、ＩｇＧ１−Ｆｃフラグメントとしての活性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号１２で表されるＩｇＧ１遺伝子配列中の第７０〜１１５塩基に始まり第７６８塩基に至る遺伝子配列によりコードされるポリペプチドに対し１〜数個のアミノ酸〔好適には、１〜５０個，更に好適には、１〜２０個，より好適には、１〜１０又は１〜５個のアミノ酸〕が、欠失、置換、又は／及び付加された、２量体を形成しない可溶性の変異ＩｇＧ１−Ｆｃフラグメントであるポリペプチド。
更に、具体的には、本願発明の融合蛋白質には、次の融合蛋白質が包含される。（ａ）配列番号１３で表されるＩＬ−１０レセプター１のアミノ酸配列中第１〜２３５のアミノ酸又は１〜２２８のアミノ酸からなるポリペプチド及び（ｂ）配列番号１２で表されるＩｇＧ１遺伝子配列中の第１１５〜７６８塩基又は第８２〜７６８塩基であって８３番目、１０１番目及び１１０番目のＧの内少なくとも２つのＧをＣに代えた遺伝子によりコードされるポリペプチドからなる融合蛋白質。
［融合蛋白質（抗体医薬）の有用性：対象疾病］
また、本発明の、ＩＬ−１０レセプター１とＩｇＧ１の定常領域とを結合した融合タンパク質は、ＩＬ−１０が介在する病気の治療薬又は治療薬候補として用いることができる。具体的には、例えば、本発明の（１）ＩＬ−１０レセブター１細胞外領域と（２−１）ＩｇＧ１のヒンジ部を除いた定常領域又は（２−２）ヒンジ部分のシステインを他のアミノ酸に変異させ２量体を形成しないようにした変異ヒンジ部を有するＩｇＧ１定常領域を融合させた抗体医薬（融合蛋白質）は、キラーＴ細胞の活性化を促進、更には、メラノーマをはじめ種々の癌の治療に用いることができる。
［抗体医薬遺伝子］
本発明でベクターに組み込むことができる抗体医薬をコードする遺伝子としては、上記した［抗体医薬］、具体的には、ヒト化抗体、更には、ヒト抗体の定常領域と細胞表面レセプターのリガンド結合部位を結合させた融合タンパク質（イアミュノアドヘシン）をコードするＤＮＡ等の核酸又はヌクレオチドをあげることができる。
具体的には、ヒトの抗体の定常領域を細胞膜レセプターの細胞外領域、好適には、リガンド結合領域に融合させた融合抗体タンパク質をコードする遺伝子を包含する。  更に、細胞膜レセプターとしては、種々の膜タンパク質レセプターを用いることができるが、好適には、ＩＬ−１０レセプターを用いることができる。
本願発明の遺伝子には、例えば、以下の（１）−（４）の遺伝子も包含される。
（１）図２又は８〜１０（配列番号７、１７，１９又は２１）のいずれか、好適には、図８〜９（配列番号７、１７又は１９）のいずれかに記載される遺伝子。
（２）図２又は８〜１０（配列番号８、１８，２０又は２２）のいずれかに記載されるポリペプチドに対して、１〜１００個，好適には１〜２０個，更に好適に１〜１０個のアミノ酸が、欠失、置換、及び／又は付加したポリペプチドであって、ＩＬ−１０阻害活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
（３）図２又は８〜１０（配列番号７、１７，１９又は２１）いずれか、好適には、図８〜９（配列番号７、１７又は１９）のいずれかに記載の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＬ−１０阻害活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。なお、ストリンジェントな条件は、周知のストリンジェント条件を用いることができるが、例えば、（イ）低イオン強度、高温で洗浄する条件、例えば、０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳで５０℃洗浄する条件、（ニ）５０％  ホルムアルデヒド、５ＸＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ  クエン酸）、５．Ｘデンハルト溶液、サケ精子ＤＮＡ（５０ｇ／ｍｌ）、０．１％  ＳＤＳ、及び１０％  硫酸デキストラン、４２℃、更に０．２ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、４２℃で洗浄などの条件が挙げられる。
及び
（４）図２又は８〜１０（配列番号配列番号７、１７，１９又は２１）いずれか、好適には、図２又は８〜９（配列番号７、１７又は１９）のいずれかに記載の遺伝子と６０％同一性、好適には８０％同一性、更に好適には９０％同一性、特に好適には、９５％同一性を有し、２量体を形成しないポリペプチドをコードし、かつＩＬ−１０阻害活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
［ベクター］
本発明で用いる、人へ投与するベクター（発現ベクター）としては、遺伝子治療で用いられている種々のベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペプシンプレックスウイルス、センダイウイルス又は、レンチウイルスを元にして、調製されたベクター、例えば、複製機能を欠損させたベクターを用いることができる。更に、原核生物で複製増殖し、哺乳細胞でトランジエントな発現を起こすプラスミドを用いることもできる。
好適には、ヒトに対する遺伝子治療を可能にするため、既に、ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎにおいて認証を得ているインビトロジェン社のｐＶＡＸ１をホストベクターとして用いることができる。
本発明の抗体医薬遺伝子は、上記発現ベクター（ホストベクター）に組み換えて、組み換えベクターを調製できる。当該組み換えベクターは、抗体医薬を発現させる及び／又は遺伝子医療に用いることができる。
［投与方法］
（１）  調製された抗体医薬は、例えば、静脈注射により投与することができる。
（２）  調製された遺伝子治療用の抗体医薬発現組み換えベクターは、例えば、そのままで、又はリポソームなどの脂質小胞膜内に導入し、若しくはリン脂質と共存させ、通常の注射用緩衝液に懸濁して、筋肉注射、静脈注射、又は皮下注射等で投与することができる。投与量としては、通常遺伝子治療で用いられる量のベクターを用いることができ、例えば組み換えアデノベクターをヒトに投与する場合は、１ｘ１０９〜１ｘ１０１２Ｐｆｕを投与できる（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００２  Ｍａｒ  １５；２０（６）：１５６２−９．）。
例えば、ｐＶＡＸ１に組み込んだ抗体医薬発現組み換えベクターは、適切な注射用緩衝液で希釈し、筋肉注射して用いることができる。
以下実施例は、例示のためであって、本願発明は実施例に限定されるものではない。なお、実施例１〜４が実施例系統Ａを構成し、実施例５〜８が実施例系統Ｂを構成する。実施例系統Ａに係るプライマーと実施例系統Ｂに係るプライマーでは、それぞれの対応する図面（実施例系統Ａは、図１、実施例系統Ｂは図６）に記載されたプライマーを意味する。
【実施例１】  ＩＬ−１０Ｒ１細胞外領域のｃＤＮＡの調製
（１）プライマーの調製
ＩＬ１０Ｒ１細胞外領域を切り出すためのプライマーを、（１）細胞外領域１としてＩＬ−１０レセプターをコードするｃＤＮＡ配列番号１４の位置番号６２〜７６６を切り出せるように、（２）領域２としては、配列番号の位置番号６２〜７４５を切り出せるように設計した。
設計したプライマーは、図１に、（１）ＩＬ−１０Ｒ１＿１−Ａ（領域１）切り出し用フォーワードプライマーを＃１（配列番号１）、リバースプライマーを＃２（配列番号２）、（２）ＩＬ−１０Ｒ１＿２−Ａ（領域２）切り出し用フォーワードプライマーを＃１（配列番号１）、リバースプライマーを＃３（配列番号３）として示されている。
（２）ｃＤＮＡの調製
Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ（Ｊｕｒｋａｔ）のｔｏｔａｌ  ＲＮＡを採取した。ＲＴ−ＰＣＲ法によって，プライマーの＃１と＃２を用いてＩＬ−１０Ｒ１＿１−Ａ領域，＃１と＃３を用いてＩＬ−１０Ｒ１＿２−Ａ領域のｃＤＮＡを得た。
【実施例２】  ＩｇＧ１（Ｆｃ）部位の調製
（１）プライマーの調製
ＩｇＧ１のＦｃ領域を切り出すためのプライマーを、（イ）Ｆｃ領域１はＩｇＧ１（配列番号１２）の位置番号７０〜７６８を切り出せるように、（ロ）Ｆｃ領域２は、配列番号１２の位置番号１１５〜７６８を切り出せるように設計した。
設計したプライマーは、図１に、（イ）ＩｇＧ−Ｆｃ＿１−Ａ（領域１）切り出し用フォーワードプライマーを＃４（配列番号４）、リバースプライマーを＃６（配列番号６）、（ロ）ＩｇＧ１−Ｆｃ＿２−Ａ（領域２）切り出し用フォーワードプライマーを＃５（配列番号５）、リバースプライマーを＃６（配列番号６）、として示されている。
（２）ｃＤＮＡの調製
ＩｇＧ１＿Ｆｃ部位（ＩｇＧ１−Ｆｃ＿１−Ａ領域とＩｇＧ１−Ｆｃ＿２−Ａ領域）は，ＳＲα−ｎｅｏ１−ＣＤ８０／ＣＤ８６／ＩｇＦｃ（ペンシルバニア大学医学部病理学教室  Ｄａｖｉｄ  Ｂ．Ｗｅｉｎｅｒ助教授より入手）から，プライマーの＃４と＃６を用いてＩｇＧ１−Ｆｃ＿１−Ａ領域のｃＤＮＡ（ＩｇＧ１＿１−Ａ）を、＃５と＃６を用いてＩｇＧ１−Ｆｃ＿２−Ａ領域のｃＤＮＡ（ＩｇＧ１＿２−Ａ）をそれぞれ得た。
【実施例３】  ＩＬ−１０Ｒ１／ＩｇＧ１−Ａの遺伝子治療用発現ベクターの作製
ホストベクターであるｐＶＡＸ１（インビトロジェン社）に，制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩとＥｃｏＲ  Ｉによって結合サイトを作製した。実施例１で調製したＩＬ１０Ｒ１細胞外領域（ＩＬ−１０Ｒ１＿１−ＡとＩＬ−１０Ｒ１−２＿Ａ）を制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩとＢａｍＨ  Ｉで末端処理し、実施例２で調製したＩｇＧ１＿Ｆｃ部位（ＩｇＧ１−Ｆｃ＿１−Ａ領域とＩｇＧ１−Ｆｃ＿２−Ａ領域）を制限酵素ＢａｍＨ  ＩとＥｃｏＲ  Ｉで末端処理した。（１）ＩＬ−１０Ｒ１＿１−ＡとＩｇＧ１＿１−ＡをｐＶＡＸの結合サイトに結合させてｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１／ＩｇＧ１＿１−Ａ（Ｖ１５：ＳＳＣ型ヒンジ）を、（２）ＩＬ−１０Ｒ１＿２とＩｇＧ１＿２をｐＶＡＸの結合サイトに結合させてｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１／ＩｇＧ１＿２−Ａ（Ｖ５０：ヒンジなし）構成した。なお、上記ＳＳＣ型ヒンジとは、ヒンジ部分の３個のシステインの内２個のシステインがセリンに変異されていることを示す。
こうして、遺伝子治療用発現ベクター（ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１／ＩｇＧ１＿１−ＡとｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１／ＩｇＧ１＿２−Ａ）を構築した。ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１／ＩｇＧ１＿１−Ａから発現するタンパク質は配列番号８に、その遺伝子配列は配列番号７に、更に両者を併記して図２示す。また、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１／ＩｇＧ１＿２−Ａから発現するタンパク質は、配列番号１０に、その遺伝子配列は配列番号９に、更に両者を併記して図３に示す。
構築した遺伝子治療用発現ベクターの塩基配列の確認は、シークエンス・アナライザーにより行い、１００％の一致が得られた。
【実施例４】  ＩＬ−１０Ｒ１／ＩｇＧ１の３次元構造予測
構築した２種類の発現ベクター（ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１／ＩｇＧ１＿１−ＡとｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１／ＩｇＧ１＿２−Ａ）から発現するタンパク質（ＩＬ１０Ｒ１／ＩｇＧ１＿１−ＡとＩＬ１０Ｒ１／ＩｇＧ１＿２−Ａ）の３次元構造を図４と図５に示す。これらの３次元構造は、化学計算ソフトウェア（ＭＯＥ，Ｖｅｒ．２００３．０２，ＣＣＧ  Ｉｎｃ．，Ｍｏｔｒｅａｕｌ）によって作製した。
【実施例５】  ＩＬ−１０Ｒ１細胞外領域のｃＤＮＡの調製
（１）プライマーの調製
設計したプライマーは、図６に、
（１）ＩＬ−１０Ｒ１（ＥＣ＊：細胞外領域のみを発現するように，ストップコドンを導入してある）切り出し用フォーワードプライマーを＃１：ＩＬ１０Ｒ１＿Ｆ＿Ｈｉｎｄ３−Ｂ（配列番号１：ＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＴＣＧ）、リバースプライマーを＃２：ＩＬ１０Ｒ１＿１＿Ｒ＿ＥｃｏＲ１−Ｂ（配列番号２３：ＡＴＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＴＴＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＡＡＡＴＡＣＴＧＣ）、
（２）ＩＬ−１０Ｒ１（ＥＣ：ＩｇＧ１のＦｃ領域との結合に用いる）切り出し用フォーワードプライマーを＃１：ＩＬ１０Ｒ１＿Ｆ＿Ｈｉｎｄ３−Ｂ（配列番号１：ＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＴＣＧ）、リバースプライマーを＃３：ＩＬ１０Ｒ１＿２＿Ｒ＿ＢａｍＨ１（配列番号２：ＡＴＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＴＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＡＡＡＴＡＣＴＧＣ）、として示されている。
（２）ｃＤＮＡの調製
Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ（Ｊｕｒｋａｔ）のｔｏｔａｌ  ＲＮＡを採取した。ＲＴ−ＰＣＲ法によって，プライマーの図６中の＃１と＃２を用いてＩＬ−１０Ｒ１（ＥＣ＊），＃１と＃３を用いてＩＬ−１０Ｒ１（ＥＣ）のｃＤＮＡを得た。
【実施例６】  ＩｇＧ１（Ｆｃ）部位の調製
（１）プライマーの調製
ＩｇＧ１のＦｃ領域を切り出すためのプライマーを、（ｉ）Ｆｃ領域１（ヒンジ部なし）は、ＩｇＧ１（配列番号１２）の位置番号１１５〜７６８を切り出せるように設計した。
（ｉｉ）Ｆｃ領域（ＳＳＳ型変異型ヒンジ部）は、ＩｇＧ１（配列番号１２）の位置番号８２〜７６８を、システイン（８２−８５のコドン、１００−１０２及び１０９−１１１のコドン）をセリンに変異させてＳＲα−ｎｅｏ１−ＣＤ８０／ＣＤ８６／ＩｇＦｃから切り出せるように設計した。
（ｉｉｉ）ｆｃ領域（ＣＳＣ型変異型ヒンジ部）は、ＩｇＧ１（配列番号１２）の位置番号８２〜７６８を，システイン（８２−８５のコドン及び１０９−１１１のコドン）をセリンに変異させてＳＲα−ｎｅｏ１−ＣＤ８０／ＣＤ８６／ＩｇＦｃから切り出せるように設計した。
（ｉｖ）Ｆｃ領域（野生型ヒンジ部）はＩｇＧ１（配列番号１２）の位置番号８２〜７６８を、ＳＲα−ｎｅｏ１−ＣＤ８０／ＣＤ８６／ＩｇＦｃから切り出せるように設計した。
設計したプライマーは、図６に、
（イ）ＩｇＧ−Ｆｃ＿１（領域１：ヒンジ部なし）切り出し用フォーワードプライマーを＃４：ＩｇＧ１＿１＿Ｆ＿ＢａｍＨ１−Ｂ（配列番号５：ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧ）、リバースプライマーを＃７：ＩｇＧ１＿Ｒ＿ＥｃｏＲ１−Ｂ（配列番号６：ＡＴＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧ）、
（ロ）ＩｇＧ１−Ｆｃ＿２−Ｂ（領域２：ＳＳＳ型変異型ヒンジ部）切り出し用フォーワードプライマーを＃５：ＩｇＧ１＿２＿Ｆ−ＢａｍＨ−Ｂ（配列番号２４：ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＣＣ）、リバースプライマーを＃７：ＩｇＧ１＿Ｒ＿ＥｃＲ１−Ｂ（配列番号６：ＡＴＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧ，さらに，修正用フォーワードプライマーを＃８：Ｔａｉｌｏｒ＿Ｆ＿Ｍｕｔ−Ｂ（配列番号２５：ＣＴＣＡＣＡＣＡＴＣＣＣＣＡＣＣＧＴＣＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧ），リバースプライマーを＃９：Ｔａｉｌｏｒ＿Ｒ＿Ｍｕｔ−Ｂ（配列番号２６：ＡＣＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＡ）、
（ハ）ＩｇＧ１−Ｆｃ＿３（領域３：ＣＳＣ型ヒンジ部）切り出し用フォーワードプライマーを＃６：ＩｇＧ１＿３＿Ｆ＿ＢａｍＨ−Ｂ（配列番号２７：ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣ）、リバースプライマーを＃７：ＩｇＧ１＿Ｒ＿ＥｃｏＲ１−Ｂ（配列番号６：ＡＴＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧ）として示されている。
（ニ）ＩｇＧ１−Ｆｃ＿３（領域３：野生型ヒンジ部）切り出し用フォーワードプライマーを＃６：ＩｇＧ１＿３＿Ｆ＿ＢａｍＨ−Ｂ（配列番号２７：ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣ）、リバースプライマーを＃７：ＩｇＧ１＿Ｒ＿ＥｃｏＲ１−Ｂ（配列番号６：ＡＴＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧ），さらに，修正用フォーワードプライマーを＃１０：Ｔａｉｌｏｒ＿Ｆ＿Ｗｔ−Ｂ（配列番号２８：ＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣ），リバースプライマーを＃１１：Ｔａｉｌｏｒ＿Ｒ＿Ｗｔ−Ｂ（配列番号２９：ＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＡＣＴＣ）、として示されている。
（２）ｃＤＮＡの調製
ＩｇＧ１＿Ｆｃ部位（ＩｇＧ１−Ｆｃ（ヒンジなし）、ＩｇＧ１−Ｆｃ（変異型ヒンジ）及びＩｇＧ１−Ｆｃ（野生型ヒンジ））は，ＳＲα−ｎｅｏ１−ＣＤ８０／ＣＤ８６／ＩｇＦｃからプライマーの図６中の＃４と＃７を用いてＩｇＧ１−Ｆｃ（ヒンジなし）のｃＤＮＡ、図６中の＃５と＃７，さらに図６中の＃８と＃９を用いてＩｇＧ１−Ｆｃ（ＳＳＳ型変異型ヒンジ）のｃＤＮＡ、図６中の＃６と＃７を用いてＩｇＧ１−Ｆｃ（ＣＳＣ型ヒンジ）のｃＤＮＡ及び図６中の＃６と＃７，さらに図６中の＃１０と＃１１を用いてＩｇＧ１−Ｆｃ（野生型ヒンジ）のｃＤＮＡを得た。
【実施例７】  ＩＬ−１０Ｒ１／ＩｇＧ１の遺伝子治療用発現ベクターの作製
ホストベクターであるｐＶＡＸ１（インビトロジェン社）に，制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩとＥｃｏＲ  Ｉによって結合サイトを作製した。実施例５で調製したＩＬ１０Ｒ１細胞外領域（ＩＬ−１０Ｒ１（ＥＣ＊）１とＩＬ−１０Ｒ１（ＥＣ））を制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩとＢａｍＨ  Ｉで末端処理し、実施例６で調製したＩｇＧ１＿Ｆｃ部位（ＩｇＧ１−Ｆｃ（ヒンジなし）、ＩｇＧ１−Ｆｃ（変異型ヒンジ）及びＩｇＧ１−Ｆｃ（野生型ヒンジ））を制限酵素ＢａｍＨ  ＩとＥｃｏＲ  Ｉで末端処理した。
（イ）Ｖ１２：ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ＊）はｐＶＡＸ１に上記制限酵素処理したＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ＊）を組み込んで調製した。（利用したプライマーは、図６中の＃１及び＃２である。）Ｖ５２：（ロ）Ｖ５１：ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｖ５１：ヒンジなし）はｐＶＡＸ１に上記制限酵素処理したＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）及びＩｇＧ１−Ｆｃ（ヒンジなし）を組み込んで調製した。
（ハ）Ｖ５２：ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｖ５２：ＳＳＳ型変異型ヒンジ＊＊）はｐＶＡＸ１に上記制限酵素処理したＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）及びＩｇＧ１−Ｆｃ（ＳＳＳ型変異型ヒンジ＊＊）を組み込んで調製した。なお、ＳＳＳ型変異型ヒンジとはヒンジ部の３個システインを３個のセリンに変異させたヒンジのことを意味する。
（ニ）Ｖ５４：ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｖ５４：ＣＳＣ型変異型ヒンジ＊＊）はｐＶＡＸ１に上記制限酵素処理したＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）及びＩｇＧ１−Ｆｃ（ＣＳＣ型変異型ヒンジ＊＊）を組み込んで調製した。なお、ＣＳＣ型変異型ヒンジとは、ヒンジ部の３個のシステインの内上流側および下流側の２個のシステインがセリンに変異させられたヒンジを意味する。
（ホ）Ｖ５５：ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｖ５５：野生型ヒンジ＊＊＊）はｐＶＡＸ１に上記制限酵素処理したＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）及びＩｇＧ１−Ｆｃ（野生型ヒンジ＊＊＊）を組み込んで調製した。
こうして、遺伝子発現ベクター（ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ＊）、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｖ５１：ヒンジなし）、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｖ５２：ＳＳＳ型変異型ヒンジ＊＊）、Ｖ５４：ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１−Ｆｃ（ＣＳＣ型変異型ヒンジ＊＊）、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｖ５５：野生型ヒンジ＊＊＊）、）を構築した。
ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ＊）から発現する蛋白質は、配列番号１５に、その遺伝子は配列番号１６、更に両者を併記して図７（図７−１〜図７−３）に示す。
ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｖ５１：ヒンジなし）から発現するタンパク質は配列番号１８に、その遺伝子配列は配列番号１７に、更に両者を併記して図８（図８−１〜図８−４）示す。
ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｖ５２：ＳＳＳ型変異型ヒンジ＊＊）から発現するタンパク質は、配列番号２０に、その遺伝子配列は配列番号１９に、更に両者を併記して図９（図９−１〜図９−４）に示す。
ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｖ５４：ＣＳＣ型変異型ヒンジ＊＊）から発現するタンパク質は、配列番号３０に、その遺伝子配列は配列番号３２に、更に両者を併記して図１２（図１２−１〜図１２−５）に示す。
ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｖ５５：野生型ヒンジ＊＊＊）から発現する蛋白質は、配列番号２２、その遺伝子は配列番号２１に、そして両者を併記して図１０（図１０−１〜図１０−４）に示す。
構築した遺伝子発現ベクターの塩基配列の確認は、シークエンス・アナライザーにより行い、１００％の一致が得られた。
【実施例８】    （１）イムノアドヘシンの調製
１Ｘ１０５細胞のＩＬ−１０産生性のメラノーマ細胞株（ＪＢ）及びＩＬ−１０非産生性の細胞株（ＺＡ）が完全ＲＰＭＩ培地で培養された。完全ＲＰＭＩ培地はＲＰＭＩ１６４０に１０％加熱不活化（不働化）ＦＣＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、非必須アミノ酸、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン及び１００ｐｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加して調製した。）
トランスフェクション２４時間前に、メラノーマ細胞は１２穴プレートに０．５ｍｌ培地中に播かれた。
ｐＶＡＸ１、実施例４又は７で調製された遺伝子発現ベクター（ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（Ｖ１２：ＥＣ＊）、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｖ５１：ヒンジなし）、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１／ＩｇＧ１＿１−Ａ（Ｖ１５：ＳＳＣ型変異型ヒンジ＊＊）及びｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｖ５４：ＣＳＣ型ヒンジ＊＊＊））、それぞれ、１μｇで上記メラノーマ細胞株はトランスフェクトされた。
（２）ＩＬ−１０阻害活性の測定
トランスフェクション３日後に、上清が回収され、ＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）でＩＬ−１０の生産性がテストされた。ＩＬ−１０非産生細胞の７５μｌの培地上清と７５μｌの希釈組み換えＩＬ−１０が混合（最終濃度５０，１００，２００および５００ｐｇ／ｍｌ）され、９６穴プレートに加えられた。
上記プレートは３７度で１時間インキュベートされた。インキュベーション後、基質が各穴に加えられ、上清中のＩＬ−１０の活性がＥＬＩＳＡで測定された。結果を図１１に示す。なお、図１１中の＃０は、ｐＶＡＸ１を、＃１は、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（Ｖ１２：ＥＣ＊）を、＃２は、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１（Ｖ５１：ヒンジなし），＃３は、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１／ＩｇＧ１＿１−Ａ（Ｖ１５：ＳＳＣ型ヒンジ），＃４は、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１（Ｖ５４：ＣＳＣ型ヒンジ）をあらわす。
この結果、ヒンジ部を持たず、したがってＩｇＧ  １部分で２量体を形成することがない、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１（Ｖ５１：ヒンジなし）が一番良くＩＬ−１０活性を阻害し、次に、ヒンジ部のシステインをセリンに変異させることにより２量体形成を阻害した、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１／ＩｇＧ１＿１−Ａ（Ｖ１５：ＳＳＣ型ヒンジ）が良くＩＬ−１０活性を阻害した。ＩＬ−１０は２量体として機能することから、ＩＬ−１０をトラップするイムノアドヘシンも２量体が望ましいとの一般には予想されていたが、ｐＶＡＸ１−ＩＬ１０Ｒ１（ＥＣ）／ＩｇＧ１（Ｖ５４：ＣＳＣ型ヒンジ）のＩＬ−１０阻害活性は上記２者よりも低かった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】  本発明は、抗体医薬、及び遺伝子治療剤として産業上利用することができる。
【配列表フリーテキスト】  配列番号１〜６及び配列番号２３〜２９は、プライマーである。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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