(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブナシメジを水、炭素数１から４の低級アルコールもしくはこれらの混合溶媒で抽出し、次いで、分子フルイ法で処理することにより得られる、分子量６,０００〜６０,０００であり、水溶液中の紫外線吸収の極大値が２５５〜２６０ｎｍであり、赤外線吸収の極大吸収波数が１５６０、１３９６、１０３２ｃｍ-１（いずれも±５０ｃｍ-１以内の誤差を含む）であり、蛋白含量が２０％〜３０％であり、糖含量が２２％〜３２％であり、アミノ酸の組成（モル比）が、アスパラギン酸；９.０％、グルタミン酸；１６.１％、グリシン；９.１％、アラニン；１２.５％、バリン；５.７％、アルギニン；５.６％、オルニチン７.８％（いずれも±３％以内の誤差を含む）であり、構成糖としてグルコースを主とする生理活性物質ＥＥＭ−ＳＢ。
【請求項２】
エノキタケを水、炭素数１から４の低級アルコールもしくはこれらの混合溶媒で抽出し、次いで、分子フルイ法で処理することにより得られる、分子量６,０００〜６０,０００であり、水溶液中の紫外線吸収の極大値が２５５〜２６０ｎｍであり、赤外線吸収の極大吸収波数が３２５９、２９２７、１５７８、１４００、１０４３ｃｍ-１（いずれも±５０ｃｍ-１以内の誤差を含む）であり、蛋白含量が８％〜１８％であり、糖含量が５％〜１０％であり、アミノ酸の組成（モル比）が、アスパラギン酸；９.１％、グルタミン酸；１７.７％、グリシン；１４.８％、アラニン；２１.９％、バリン；１１.８％、アルギニン；６.８％、オルニチン；１２.６％（いずれも±３％以内の誤差を含む）であり構成糖としてグルコースを主とする生理活性物質ＥＥＭ−ＳＥ。
【請求項３】
ブナシメジを水、炭素数１から４の低級アルコールもしくはこれらの混合溶媒で抽出し、次いで、分子フルイ法で処理することを特徴とする、分子量６,０００〜６０,０００であり、水溶液中の紫外線吸収の極大値が２５５〜２６０ｎｍであり、赤外線吸収の極大吸収波数が１５６０、１３９６、１０３２ｃｍ-１（いずれも±５０ｃｍ-１以内の誤差を含む）であり、蛋白含量が２０％〜３０％であり、糖含量が２２％〜３２％であり、アミノ酸の組成（モル比）が、アスパラギン酸；９.０％、グルタミン酸；１６.１％、グリシン；９.１％、アラニン；１２.５％、バリン；５.７％、アルギニン；５.６％、オルニチン７.８％（いずれも±３％以内の誤差を含む）であり、構成糖としてグルコースを主とする生理活性物質ＥＥＭ−ＳＢの製造方法。
【請求項４】
分子フルイ法が、分子フルイ膜（平膜）、中空ろ過膜、透析膜または分子クロマトを用いる方法である請求項第３項記載の生理活性物質ＥＥＭ−ＳＢの製造方法。
【請求項５】
エノキタケを水、炭素数１から４の低級アルコールもしくはこれらの混合溶媒で抽出し、次いで、分子フルイ法で処理することを特徴とする、分子量６,０００〜６０,０００であり、水溶液中の紫外線吸収の極大値が２５５〜２６０ｎｍであり、赤外線吸収の極大吸収波数が３２５９、２９２７、１５７８、１４００、１０４３ｃｍ-１（いずれも±５０ｃｍ-１以内の誤差を含む）であり、蛋白含量が８％〜１８％であり、糖含量が５％〜１０％であり、アミノ酸の組成（モル比）が、アスパラギン酸；９.１％、グルタミン酸；１７.７％、グリシン；１４.８％、アラニン；２１.９％、バリン；１１.８％、アルギニン；６.８％、オルニチン；１２.６％（いずれも±３％以内の誤差を含む）であり構成糖としてグルコースを主とする生理活性物質ＥＥＭ−ＳＥの製造方法。
【請求項６】
分子フルイ法が、分子フルイ膜（平膜）、中空ろ過膜、透析膜または分子クロマトを用いる方法である請求項第５項記載の生理活性物質ＥＥＭ−ＳＥの製造方法。
【請求項７】
請求項第１項記載の生理活性物質ＥＥＭ−ＳＢまたは請求項第２項記載の生理活性物質ＥＥＭ−ＳＥを有効成分として含有する医薬。
【請求項８】
抗癌剤である請求項第７項記載の医薬。
【請求項９】
錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤または液剤である請求項第７項または第８項記載の医薬。
【請求項１０】
大豆ペプチド及び／または貝殻樹脂のフイルムコート剤でコートされた錠剤である請求項第７項ないし第９項の何れかに記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
技  術  分  野
本発明は、シイタケ、エノキタケ、ブナシメジ、ヒラタケ、マイタケ、フクロタケ、ナメコ、ハタケシメジ、エリンギ、マツタケや、サルノコシカケ類の霊芝、メシマコブ等から選ばれた少なくとも一つの食用茸から得られた、抗癌活性、抗アレルギー活性、免疫賦活性、抗酸化活性などの生理活性を持つ物質およびその製造方法並びに当該生理活性物質を含有する製剤に関するものである。
背  景  技  術
本発明者らは、永年にわたり茸類の生理活性について詳しく研究を行っており、その結果、ある種の茸類に、抗癌作用、免疫賦活作用、抗酸化作用、血圧及び血糖低下作用などの生理活性を示すことが知られるようになったいる。しかし、茸の種類によっては、それらの活性がないか、非常に弱いにも係わらず、よく効くと過度に効果が宣伝され、発売されている。
本発明者らは、膨大な研究データに基づく確実な研究結果から、特に茸の抗癌作用が、含まれる多糖類によるものであることを知り、茸の多糖類であるグルカンについて研究した。しかしながら、純粋な単純多糖類、グルカンは、注射によっては活性を示すが、経口では効果を示さないことが判明した。
注射による投与は、病院等でしか行い得ず、また、経口での投与の方が投与を受けるものにとって苦痛が遙かに少ないため、経口で有効な茸からの活性成分の提供が強く求められている。
本発明の課題は、経口投与によって抗癌作用、免疫賦活作用などの生理活性を有する物質を高濃度に含有する茸類を選択し、それらの生理活性物質を効率よく採取する方法を提供するとともに、それら得られた活性物質を使用に適するようにした製剤を提供するものである。
発  明  の  開  示
本発明者らは、上記の課題を解決するため種々検討した結果、食用に供されている茸類の子実体及び／または菌糸体が、経口で有効な活性物質を多量に含有し、それらの茸類の水もしくは水性溶媒またはこれらの混合溶媒での抽出物には経口で有効な活性物質が含有されており、これらの抽出物をさらに分子フルイ法により処理し、低分子部分及び高分子部分を除いた、一定分子量範囲のものは、優れた生理活性を示すことを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、シイタケ、エノキタケ、ブナシメジ、ヒラタケ、ナメコ、マイタケ、フクロタケ、ハタケシメジ、エリンギ、マツタケ、霊芝およびメシマコブから選ばれた少なくとも一つの茸を水、親水性溶媒もしくはこれらの混合溶媒で抽出し、次いで、この抽出物を分子フルイ法により処理し、分子量６，０００〜６０，０００の部分を採取することにより得られる生理活性物質ＥＥＭ−Ｓを提供するものである。
また本発明は、上記生理活性物質ＥＥＭ−Ｓの製造法を提供するものである。発明を実施するための最良の形態
本発明の、生理活性物質ＥＥＭ−Ｓは、シイタケ、エノキタケ、ブナシメジ、ヒラタケ、ナメコ、マイタケ、フクロタケ、ハタケシメジ、エリンギ、マツタケ、霊芝及びメシマコブのような食用に供される茸類の子実体及び／または菌糸体の少なくとも一つの微粉砕物（以下、「茸」と記載する）を水及び／または親水性溶媒を用いて抽出することにより得られる。この抽出に用いられる親水性溶媒としては、炭素数１から４の低級アルコールが好ましく使用される。
上記茸からの生理活性物質ＥＥＭ−Ｓを含む画分の抽出は、例えば、原料である茸に適量の水または低級アルコール等の親水性溶媒を添加し、例えば、８０ないし９８℃程度、好ましくは、水の場合は９０から９８℃の温度条件で、還流下に、１ないし４時間程度、好ましくは、２ないし４時間抽出することにより行われる。抽出にあたっては、茸の重量に対し、３ないし１０重量培程度の溶媒が使用される。
上記のようにして得られた抽出液は、必要によりろ過等で固型不純物を分離した後、減圧下に溶媒を溜去することにより、固形物として抽出物を採取することができる。
このようにして得られた固形物は、それ自体でも経口投与で活性を示し、そのままでも使用できるが、活性を高めるため、抽出液を分子フルイ処理して不要の部分を除去し、再度減圧下に濃縮して得られた分子量６，０００〜６０，０００の部分を、生理活性物質ＥＥＭ−Ｓとして使用することができる。
上記の目的のために使用される分子フルイとしては、分子フルイ膜（平膜）、中空ろ過膜、透析膜、分子フルイクロマト等を挙げることができ、生理活性物質ＥＥＭ−Ｓの分離取得は、これらを用いる方法を適宜応用することができる。
以下、モジュールタイプの中空ろ過を用いた場合を例にとって生理活性物質ＥＥＭ−Ｓの分離取得方法を説明すれば次の通りである。すなわち、前記のように抽出して得た茸の水及び／または親水性溶媒抽出液（生理活性物質ＥＥＭ−Ｓを含む画分）を、まず、低分子分画膜モジュール、例えば、ＡＩＰ−３０１３、ＡＩＰ−２０１３、またはＡＩＰ−１０１０（旭化成工業社製）で処理して低分子物質（分子量６，０００以下の物質）を除く。次いで、低分子物質が除去された濃縮液を高分子分画膜モジュール、例えばＡＨＰ−３０１３、ＡＨＰ−２０１３、またはＡＨＰ−１０１０（旭化成製）で処理して高分子物質（分子量６０，０００以上）を除き、外液を再び低分子分画膜モジュールを用いて濃縮する。かくすることにより、分子量が６，０００〜６０，０００の生理活性物質ＥＥＭ−Ｓを得ることができる。
なお、一般に分子フルイ法によるときは、分子の形状によってフルイにかかり方が異なり、他の方法で求めた分子量と異なる場合がある。従って、本発明における、分子量とは、分子フルイ法によるものを意味し、より正確にいうなら、低分子側の分子量は、ＡＩＰ−３０１３ないしはこれと同等の低分子分画膜モジュールを使用して測定した値である。同様、高分子側の分子量は、ＡＨＰ−３０１３ないしはこれと同等の低分子分画膜モジュールを使用して測定した値である。
このようにして得られた茸類の生理活性物質は、総括してＥＥＭ−Ｓと記したが、茸からの生理活性物質は、茸菌糸体を原料として使用する場合、培養条件によってその収率が異なり、培地、培養温度などを最適に選ぶ必要がある。また、茸の種類によっても若干異なる物理化学的性状を示すことがある。
例えば、ブナシメジを原料として製造した生理活性物質ＥＥＭ−Ｓ（以下、「ＥＥＭ−ＳＢ」といことがある）は、後記実施例１に示す物理化学的性状を示す。また、エノキタケを原料として製造した生理活性物質ＥＥＭ−Ｓ（以下、「ＥＥＭ−ＳＥ」ということがある）は、後記実施例５に示す物理化学的性状を示すものである。さらに、シイタケ、マイタケおよびナメコから得た生理活性物質ＥＥＭ−Ｓ（以下、それぞれ「ＥＥＭ−ＳＳ」、「ＥＥＭ−ＳＭ」、「ＥＥＭ−ＳＮ」ということがある）も、それぞれ図１から図５の紫外線可視吸収を示すものである。
このように、物理化学的性質においては、若干の相違があっても、いずれも後記実施例６に示すように、各茸の単純な熱水抽出物と比べより高い生理活性を有するものであって、共通な性質を保有するものといえる。
以上説明した生理活性物質ＥＥＭ−Ｓは、経口投与によりその生理活性を発揮しうるものであるが、所期の効果を発揮させるための経口摂取量は、人の年齢、体重、目的などにより異なるが、一般には、成人１日あたりＥＥＭ−Ｓとして２００〜５０００ｍｇの範囲、好ましくは、１０００〜３０００ｍｇの範囲が好ましく、この量を１日数回に分けて服用することが適当であろう。
なお、本発明の生理活性物質ＥＥＭ−Ｓは、常法により散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤として使用できるが、そのまま大気中に放置すると吸湿し変色、変質することがあるので、フイルムコートを施した錠剤として使用することが好ましい。この目的のために使用されるフイルムコート材としては、大豆ペプチド、貝殼樹脂材等が好ましく、他のフイルムコート材では十分に吸湿を防止し得ない場合があり、変色、変質を生じることもあり得る。
実  施  例
以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。なお実施例においては、生理活性として抗癌効果を示したが、本願物質は、抗癌性に限定されるものでなく、前記の生理活性を有するものであることはいうまでもない。
実施例  １
ブナシメジ１０００グラムを細かく粉砕した後、熱水抽出し、得られた抽出液から沈澱物をＰＳ−８８膜（大塚実業社製）で除去する。この熱水抽出液を低分子分画用モジュールタイプの中空ろ過膜、ＡＩＰ−３０１３（旭化成工業社製）を用いて、高分子物質（分子量６，０００以上）を含有する画分を濃縮した。その濃縮液を高分子分画用モジュールタイプの中空ろ過膜、ＡＨＰ−３０１３（旭化成工業社製）を用いて高分子物質（分子量５０，０００以上）を除き、その外液を再び低分子分画膜モジュールＡＩＰ−３０１３を用いて、濃縮する。このように連続的に処理して、分子量６，０００〜５０，０００の生理活性物質ＥＥＭ−ＳＢを得た。
［ＥＥＭ−ＳＢの物理化学的性質］
（１）紫外線吸収（水溶液中３７０〜１９０ｎｍのＵＶ吸収を測定）：
極大値：２５８．０ｎｍ（吸収曲線を図１として示す）
（２）赤外線吸収（ＡＴＲ法で測定）：
極大値（ｃｍ−１）：２１８、１５６０、１３９６、１０３２
（吸収曲線を図６として示す）
（３）１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ中で測定）：
チャートを図８として示す。
（４）１Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ中で測定）：
チャートを図１０として示す。
（５）蛋白含量：
２４．３％
（６）糖含量：
２７．０％
（７）主たる糖の構成比：
グルコース：ガラクトース：マンノース＝１８：２：１
（８）アミノ酸組成：
アスパラギン酸；９．０％、グルタミン酸；１６．１％、グリシン；９．１％、アラニン；１２．５％、バリン；５．７％、アルギニン；５．６％、オルニチン；７．８％。
（９）元素分析値：
Ｃ：３６．２％、Ｈ：６．０％、Ｎ：５．８％
こうして得られるＥＥＭ−ＳＢは、凍結乾燥することにより固形粉末とすることができ、更にそれを打錠することにより、経口投与可能な錠剤となしうる。
実施例  ２
シイタケ５００グラムを粉砕した後、熱水抽出し、得られた抽出液から沈澱物をＰＢ−８８膜（大塚実業社製）で除去する。この熱水抽出液から低分子分画用モジュールタイプの中空ろ過膜、ＡＩＰ−３０１３（旭化成工業社製）を用いて、高分子物質を含有する画分を濃縮した。その濃縮液から、高分子分画用モジュールタイプの中空ろ過膜、ＡＨＰ−３０１３（旭化成工業社製）を用いて高分子物質を除き、その外液を再び低分子分画膜モジュールＡＩＰ−３０１３を用いて、濃縮する。こうして得られた生理活性物質ＥＥＭ−ＳＳの水溶液中の紫外線吸収曲線を図２に示す。
こうして得られるＥＥＭ−ＳＳは、凍結乾燥することにより固形粉末とすることができ、更にそれを打錠することにより、錠剤となしうる。
実施例  ３
マイタケ１０００グラムを熱水抽出し、分子フルイ膜（ＰＭ−２、大塚実業社製）で吸引ろ過して、菌体を除く。次いで、透析膜で流水透析を行い、低分子分画（分子量６，０００以下）を除く。更に、その内液から、引き続き中空分子フルイ膜（ＡＨＰ−３０１３）をもちいて、高分子分画を除去し、活性物質ＥＥＭ−ＳＭを得る。
得られた生理活性物質ＥＥＭ−ＳＭの水溶液中の紫外線吸収曲線を図３に示す。
実施例  ４
ナメコ１０００グラムを熱水抽出し、分子フルイ膜（ＰＭ−２、大塚実業社製）で吸引ろ過して、菌体を除き、透析膜で流水透析を行い、低分子分画（分子量６，０００以下）を除く。次いで、その内液から、引き続き中空分子フルイ膜（ＡＨＰ−３０１３）で、高分子分画を除去して、活性物質ＥＥＭ−ＳＮを得る。  得られた生理活性物質ＥＥＭ−ＳＮの水溶液中の紫外線吸収曲線を図４に示す実施例  ５
エノキタケ１０００グラムを熱水で還流しながら抽出し、熱水抽出物１０７グラムを得る。これを水に溶解した後、透析チューブに入れて透析し、透析内膜の高分子物質（分子量６，０００以上）を含む画分を得た。この高分子物質を含む画分を分子フルイ膜ＰＭ−１０で処理して高分子物質（５０，０００以上）を除き、凍結乾燥して、分子量６，０００〜５０，０００のＥＥＭ−ＳＥ高含有物質を得た。これを粉末剤とした。
［ＥＥＭ−ＳＥの物理化学的性質］
生理活性物質ＥＥＭ−ＳＥの物理化学的性質：
（１）紫外線吸収（水溶液中３７０〜１９０ｎｍのＵＶ吸収を測定）：
極大値：２５８．４ｎｍ（吸収曲線を図５に示す）
（２）赤外線吸収（ＡＴＲ法で測定）
極大値（ｃｍ−１）：３２７９、２９２７、１５７８、１４００、１０４３（吸収曲線を図７に示す）
（３）１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ中で測定）：
チャートを図９に示す。
（４）１Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ中で測定）：
チャートを図１１に示す。
（５）蛋白含量：
１２．７％
（６）糖含量：
９．８％
（７）主たる糖の構成比：
グルコース：ガラクトース：マンノース＝１６：３：１
（８）アミノ酸組成
アスパラギン酸；９．１％、グルタミン酸；１７．７％、グリシン；１４．８％、アラニン；２１．９％、バリン；１１．８％、アルギニン；６．８％、オルニチン；１２．６％である。
（９）元素分析値：
Ｃ：３６．５％、Ｈ：６．６％、Ｎ：３．５％
実施例  ６
実施例１、２、３または５で得た生理活性物質ＥＥＭ−Ｓを用いて粉末剤を調製し、下記のような抗癌試験を行なった。抗癌試験における生存率を対照群と比較して抗癌活性を決定した。この結果を表１に示す。
（抗癌試験）
ルイス肺癌の生細胞をＢＤＦ１雌マウスの皮下に移植し、翌日よりそれぞれの実施例で得た生理活性物質ＥＥＭ−Ｓを１日１回５００ｍｇ／ｋｇを精製水に懸濁して２０日間経口投与した。そして精製水だけを投与した対照群と茸の熱水抽出物投与群及び実施例１、２、３及び５で得た活性物質を投与した群について、それぞれの群のマウスの平均生存日数から延命率を算出した結果を表１に示した。
（結  果）
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発  明  の  効  果
本発明により、効率良く生理活性の強い物質が食用茸から簡単に得られ、薬品または健康食品として有用な製品が得られる。
【図面の簡単な説明】
図１は実施例１で得られた生理活性物質ＥＥＭ−ＳＢの紫外可視吸収曲線の図である。溶媒は水である。
図２は実施例２で得られた生理活性物質ＥＥＭ−ＳＳの紫外可視吸収曲線の図である。溶媒は水である。
図３は実施例３で得られた生理活性物質ＥＥＭ−ＳＭの紫外可視吸収曲線の図である。溶媒は水である。
図４は実施例４で得られた生理活性物質ＥＥＭ−ＳＮの紫外可視吸収曲線の図である。溶媒は水である。
図５は実施例５で得られた生理活性物質ＥＥＭ−ＳＥの紫外可視吸収曲線の図である。溶媒は水である。
図６は実施例１で得られた生理活性物質ＥＥＭ−ＳＢのＡＴＲ法で測定した赤外線吸収曲線の図である。
図７は実施例５で得られた生理活性物質ＥＥＭ−ＳＥのＡＴＲ法で測定した赤外線吸収曲線の図である。
図８は実施例１で得られた生理活性物質ＥＥＭ−ＳＢの１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）のチャートである。
図９は実施例５で得られた生理活性物質ＥＥＭ−ＳＥの１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）のチャートである。
図１０は実施例１で得られた生理活性物質ＥＥＭ−ＳＢの１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）のチャートである。
図１１は実施例５で得られた生理活性物質ＥＥＭ−ＳＥの１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）のチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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