(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  配列番号：２に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）  配列番号：５に記載のアミノ酸配列；
（ｃ）  配列番号：７に記載のアミノ酸配列；
（ｄ）  配列番号：９に記載のアミノ酸配列；
（ｅ）  配列番号：１１に記載のアミノ酸配列；
（ｆ）  配列番号：１３に記載のアミノ酸配列；
（ｇ）  配列番号：１５に記載のアミノ酸配列；
（ｈ）  配列番号：１７に記載のアミノ酸配列；
（ｉ）  配列番号：１９に記載のアミノ酸配列；
（ｊ）  配列番号：２１に記載のアミノ酸配列；及び
（ｋ）  （ａ）〜（ｊ）のいずれかと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドのフラグメントであって、該フラグメントは該ポリペプチドの少なくとも２０アミノ酸を含み、かつ、哺乳類において髄膜炎菌に対して免疫反応を誘発することができ、該免疫反応が殺菌抗体の産生を含む、該フラグメント。
【請求項２】
一又は複数のフラグメントが抗原決定基又はエピトープを含む、請求項１に記載の一又は複数のフラグメントを含む単離タンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載のフラグメント又は請求項２に記載の単離タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項４】
単離核酸が操作可能な状態で転写及び翻訳調節核酸に結合している、請求項３に記載の単離核酸を含む発現ベクター。
【請求項５】
融合パートナーをコードするヌクレオチド配列を更に含む、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
請求項４又は請求項５に記載の発現ベクターによってトランスフェクト又は形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
バクテリアである請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
髄膜炎菌である請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
（Ａ）宿主細胞中で組換え型ポリペプチドを発現させるように請求項６〜８のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する段階、及び
（Ｂ）該組換え型ポリペプチドを単離する段階を含む、
組換え型ポリペプチドを生成する方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のフラグメントに結合する抗体又は抗原結合抗体フラグメント。
【請求項１１】
抗体又は抗原結合抗体フラグメントが髄膜炎菌に結合する、請求項１０に記載の抗体又は抗原結合抗体フラグメント。
【請求項１２】
ヒトにおける髄膜炎菌感染症の検出薬又は診断薬の製造のための、請求項１に記載のフラグメント又は請求項２に記載の単離タンパク質の使用。
【請求項１３】
ヒトにおける髄膜炎菌感染症の検出薬又は診断薬の製造のための、請求項３に記載の単離核酸又は請求項４に記載の発現ベクターの使用。
【請求項１４】
ヒトにおける髄膜炎菌感染症の検出薬又は診断薬の製造のための、請求項１０又は請求項１１に記載の抗体又は抗原結合抗体フラグメントの使用。
【請求項１５】
ヒトにおける髄膜炎菌感染症の予防又は治療のための、薬学的に有効な量の請求項１に記載のフラグメント又は請求項２に記載の単離タンパク質、及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
ヒトにおける髄膜炎菌感染症の予防又は治療のための、薬学的に有効な量の請求項４又は５に記載の発現ベクター、及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１７】
免疫反応が、髄膜炎菌に特異的に結合するエレメント及び／又はポリペプチド、変種、もしくは誘導体の生成、及び／又は髄膜炎菌感染症に対する保護作用を含む、哺乳類においてフラグメントが免疫反応を誘発するかどうかを測定するための検出薬の製造のための、請求項１に記載のフラグメントの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、例えば髄膜炎菌から得られる新規ポリペプチド；このようなポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列；診断用薬剤、治療用ワクチン及び予防用ワクチン；並びに薬剤の設計及びスクリーニング或いはそのいずれかの目的で、当該ポリペプチド及びヌクレオチドを使用する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
髄膜炎菌はグラム陰性菌であり、これが髄膜炎菌性髄膜炎及び敗血症を引き起こす原因となっている。この菌に関して、すでに知られている唯一の宿主はヒトであり、集団の約１０％がこの菌を無症候状態で保菌している可能性がある（Ｃａｕｇａｎｔ，Ｄ．ら、１９９４，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３２：３２３−３０）。
【０００３】
髄膜炎菌は多糖カプセルを発現することができ、これにより、当該菌を発現カプセルの性質に従って分類することが可能となる。髄膜炎菌には、少なくとも１３種類の漿液グループが存在する。即ち、Ａ，Ｂ，Ｃ，２９−Ｅ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｗ１３５，Ｘ，Ｙ及びＺである。これらの中で、漿液グループＡ、Ｂ及びＣで、９０％の髄膜炎菌性の病気が引き起こされている（Ｐｏｏｌｍａｎ，Ｊ．Ｔ．ら、１９９５，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，４：１３−２８）。漿液グループＡ及びＣを対象としたワクチンがすでに市販されているが、漿液グループＢのカプセル状多糖の免疫原性は乏しく、これがヒトの体内で保護効果を誘発することは無い。
【０００４】
従って現在、その他の膜及び細胞外成分について、これらをワクチンに加えることの是非について検討しているところである。これらの例として、クラス１、２及び３の外膜タンパク質（ポリン）、並びにクラス４（Ｒｍｐ）及び５（混濁タンパク質）が存在する。しかし、現在に至るまで、これらの候補の中で完全な保護効果を、ヒト特に子供の体内で誘発するものは見いだされていない（Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．Ｄ．，１９９４，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗ，７：５５９−５７５；Ｐｏｏｌｍａｎ，Ｊ．Ｔ．ら、１９９５，ｓｕｐｒａ）。
【０００５】
有効なワクチンを創りだすためには、多くの菌株中に存在し、且つ保護免疫反応を誘発できる髄膜炎菌成分（殺菌抗体）が何であるかを突き止めることが必要である。この点に関して、Ｂｒｏｄｅｕｒら（国際特許公告ＷＯ９６／２９４１２）が参考になる。彼らは、現在知られている全ての髄膜炎菌株の９９％について高度に保全されている２２ｋＤａの表面タンパク質について開示を行っている。
【０００６】
精製組み替え２２ｋＤａ表面タンパク質をネズミに注射したところ、これらのネズミの８０％において、髄膜炎菌による致死感染に対して保護効果を発揮した。当該タンパク質が発見されたにも拘わらず、複数の菌株で高度に保全され、且つ髄膜炎菌に対して免疫保護プロフィールを有し、場合によっては髄膜炎菌のその他の成分と組み合わせて、髄膜炎菌に対する保護効果を高めることのできるような髄膜炎菌表面タンパク質を単離する努力をさらに続ける必要がある。
【０００７】
（発明の要約）
本発明者は、髄膜炎菌の試験対象菌株全ての中に存在し、予想分子量約６２ｋＤａを有する新規ポリペプチドをコード化するような新しい遺伝子を発見した。その配列特性及び相同性から、このポリペプチドはアドヘシンであると予想された。さらに実験データも考慮に入れると、このポリペプチドは、髄膜炎菌に対する治療及び予防ワクチンの製造に有用な、後述する表面タンパク質を構成していることが示唆される。
【０００８】
従って本発明は、その一側面において、単離ポリペプチド又はそのフラグメント或いはこれらの突然変異株又は誘導体を提供するものであり、当該ポリペプチドは下記で構成されるグループから選択される。
【０００９】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ番号２に従うポリペプチド
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ番号５に従うポリペプチド
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ番号７に従うポリペプチド
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ番号９に従うポリペプチド
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ番号１１に従うポリペプチド
（ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ番号１３に従うポリペプチド
（ｇ）ＳＥＱ  ＩＤ番号１５に従うポリペプチド
（ｈ）ＳＥＱ  ＩＤ番号１７に従うポリペプチド
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ番号１９に従うポリペプチド
（ｊ）ＳＥＱ  ＩＤ番号２１に従うポリペプチド
【００１０】
当該ポリペプチド、フラグメント、突然変異体又は誘導体は、下記で構成されるグループのメンバー１種類又は２種類以上に対して、免疫学的活性を示すものであることが好ましい：−
【００１１】
（ｉ）髄膜炎菌
（ｉｉ）当該ポリペプチド
（ｉｉｉ）当該フラグメント
（ｉｖ）当該突然変異体
（ｖ）当該誘導体
【００１２】
また他の側面によれば、本発明は、前述した第１の側面に基づくポリペプチド又はそのフラグメントをコード化するような単離核酸配列を提供するものである。当該配列は、下記で構成されるグループから選択されるのが適切である：−
【００１３】
（１）ＳＥＱ  ＩＤ番号１のヌクレオチド配列
（２）ＳＥＱ  ＩＤ番号３のヌクレオチド配列
（３）ＳＥＱ  ＩＤ番号４のヌクレオチド配列
（４）ＳＥＱ  ＩＤ番号６のヌクレオチド配列
（５）ＳＥＱ  ＩＤ番号８のヌクレオチド配列
（６）ＳＥＱ  ＩＤ番号１０のヌクレオチド配列
（７）ＳＥＱ  ＩＤ番号１２のヌクレオチド配列
（８）ＳＥＱ  ＩＤ番号１４のヌクレオチド配列
（９）ＳＥＱ  ＩＤ番号１６のヌクレオチド配列
（１０）ＳＥＱ  ＩＤ番号１８のヌクレオチド配列
（１１）ＳＥＱ  ＩＤ番号２０のヌクレオチド配列
（１２）ＳＥＱ  ＩＤ番号１、３、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０の中のいずれか一つのヌクレオチド配列フラグメント
（１３）上記いずれかのヌクレオチド配列相同体
【００１４】
当該配列は、下記で構成されるグループから選択される１種類又は２種類以上のメンバーに対して免疫学的活性を示す生成物を、コード化するようなものであることが好ましい：−
【００１５】
（ｉ）髄膜炎菌
（ｉｉ）第１の側面で述べたポリペプチド
（ｉｉｉ）第１の側面で述べたフラグメント
（ｉｖ）第１の側面で述べた突然変異体
（ｖ）第１の側面で述べた誘導体
【００１６】
さらに他の側面において、本発明は、上記第２の側面に基づく核酸配列を構成する発現ベクターであり、当該配列が転写及び翻訳調節核酸に結合することのできるようなベクターを提供するものである。
【００１７】
さらに他の側面において、本発明は、上記第３の側面に基づく発現ベクターを含む、宿主細胞を提供するものである。
【００１８】
さらに他の側面において、本発明は、上記第１の側面に基づく組み替えポリペプチドの製造方法であり、当該方法が下記のステップで構成される製造方法を提供するものである：
【００１９】
（Ａ）上記第３の側面に基づく発現ベクターをを含む宿主細胞を培養し、当該組み替えポリペプチドを当該核酸から発現させ、
（Ｂ）当該組み替えポリペプチドを単離する。
【００２０】
さらに他の側面において、本発明は、下記で構成されるグループから選択された、１種類又は２種類以上のメンバーに結合する抗体又はそのフラグメントを提供するものである：−
【００２１】
（１）髄膜炎菌
（２）第１の側面で述べたポリペプチド
（３）第１の側面で述べたフラグメント
（４）第１の側面で述べた突然変異体
（５）第１の側面で述べた誘導体
【００２２】
さらに他の側面において、本発明は、髄膜炎菌の存在が疑われる生物学的サンプルの中から、当該髄膜炎菌を検出する方法を提供するものであり、当該方法は下記のステップで構成される：−
【００２３】
（Ａ）当該生物学的サンプルを患者から単離する。
（Ｂ）上記抗体又はフラグメントを、当該生物学的サンプルに混合する。
（Ｃ）髄膜炎菌の存在を示す混合物中において、特定の結合を有する抗体又はフラグメントを検出する。
【００２４】
さらに他の側面において、本発明は、髄膜炎菌を含む疑いのある生物学的サンプル中から、当該髄膜炎菌を検出する方法を提供するものであり、当該方法は下記のステップで構成される。
（Ｉ）当該生物学的サンプルを患者から単離する。
（ＩＩ）髄膜炎菌の存在を示すサンプル中において、上記第２の側面に基づく核酸配列を検出する。
【００２５】
本発明は、さらに患者が髄膜炎菌に感染しているかどうかを診断する方法の提供を目論むものであり、当該方法は下記のステップで構成される：−
【００２６】
（１）患者から採取した生物学的サンプルを、本発明のポリペプチド、フラグメント、突然変異体又は誘導体に接触させ、
（２）当該ポリペプチド、フラグメント、突然変異体又は誘導体と、当該サンプル中の髄膜炎菌固有抗体の間で形成された錯体の有無を調べる。ここに、当該錯体が存在すれば、当該感染が発生していることが示される。
【００２７】
本発明は、上記第１の側面に基づく当該ポリペプチドの使用方法、上記第２の側面に基づく当該核酸の使用方法、又は上記キットで述べた、当該抗体又は抗体フラグメントを、生物学的サンプル中に存在する髄膜炎菌を検出する方法にまで拡張するものである。
【００２８】
本発明のさらに他の側面によれば、本発明は、上記第１の側面に基づく単離ポリペプチド又はそのフラグメント或いはこれらの突然変異体又は誘導体で構成される、医薬品組成物を提供するものである。
【００２９】
当該医薬品組成物は、ワクチンとして使用できるものであることが好ましい。
【００３０】
さらに他の側面において、本発明は、髄膜炎菌による患者の感染を予防する方法を提供するものであり、当該方法は、医薬品として有効量の上記ワクチンを投与するステップで構成される。
【００３１】
さらに他の側面において、本発明は、ポリペプチド、その突然変異体又は誘導体中において、その免疫反応フラグメントを同定する方法を提供するものであり、当該方法は下記のステップで構成される：−
（ａ）当該ポリペプチド、突然変異体又は誘導体のフラグメントを発生させる。
（ｂ）当該フラグメントを哺乳動物に投与する。
（ｃ）当該哺乳動物の体内において、特定様式で結合した髄膜炎菌並びに当該ポリペプチド、突然変異体又は誘導体に結合する要素が生成するなどの免疫反応の全て又は一部、或いは髄膜炎菌の感染に対する保護効果を検出する。
【００３２】
（発明の詳細な説明）
本明細書及びこれに付属する請求範囲を通じて、その文脈が他の要求を行うことが無い限り、「構成する」という言葉は、そこに述べられている単独完全体又は完全体グループを包含することを意味している。しかし、これにより、その他の単独完全体又は完全体グループを排除するものではない。
【００３３】
（ポリペプチド配列）
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ番号２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１に基づく単離ポリペプチド、又はこれら各々のフラグメントを提供するものである。その優先態様においては、本発明のポリペプチドはフラグメント、突然変異体及び誘導体は、髄膜炎菌、当該ポリペプチド、当該フラグメント、当該突然変異体及び当該誘導体で構成されるグループから選ばれた、いずれか１種類のメンバーに対して免疫学的活性を示すものである。
【００３４】
ＳＥＱ  ＩＤ番号２は、髄膜炎菌株ＭＣ５８から得られるｈｉａＮｍ遺伝子において、約６２ｋＤａの新規表面ポリペプチドに対応する。このポリペプチドに関しては、後でさらに詳細に説明する。ＳＥＱ  ＩＤ番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１は、髄膜炎菌株ＢＺ１０、ＢＺ１９８、ＥＧ３２７、ＥＧ３２９、Ｈ１５、Ｈ３８、Ｈ４１、Ｐ２０及びＰＭＣ２１から得られるヌクレオチド配列の相同体ポリペプチドにそれぞれ対応する。
【００３５】
本発明の目的に沿って、「免疫学的活性」という用語は、前述したポリペプチド、フラグメント、突然変異体又は誘導体が、これらを投与した哺乳動物の体内で免疫反応を造りだす能力を意味するものとする。ここに、当該反応とは、特に髄膜炎菌；或いは当該ポリペプチド、フラグメント、突然変異体又は誘導体要素の生成反応；或いは髄膜炎菌の感染に対する保護効果、もしくはこれら全ての反応を含むものとする。
【００３６】
「単離」という言葉は、本来共存する成分を事実上又は本質的に含まない状態で、ある物質を純粋に取り出すことを意味するものとする。
【００３７】
「ポリペプチド」という用語は、タンパク質などの長鎖ポリペプチドを意味するものとする。
【００３８】
本明細書で使用している「フラグメント」という用語は、遺伝子決失突然変異株；及び少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸を含む小型ポリペプチドも意味し、当該フラグメントは抗原決定基即ちエピトープを構成するものとする。このようなフラグメントを、５−６個つなげることもできる。このタイプのペプチドは、標準的な組み替え核酸技術或いは従来の液相又は固相合成技術を適用することにより合成することができる。例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ編Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社刊「合成ワクチン」第９章「ペプチド合成」（Ａｔｈｅｒｔｏｎ及びＳｈｅｐｈａｒｄ共著）で述べられている溶液合成法又は固相合成法が参考になる。これに代わる方法として、ペプチドは、本発明のポリペプチドを、ｅｎｄｏＬｙｓ−Ｃ、ｅｎｄｏＡｒｇ−Ｃ、ｅｎｄｏＧｌｕ−Ｃ及びブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼなどのプロテアーゼで消化することにより造ることができる。消化により得られたフラグメントは、例えば高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）法により、これを精製することができる。
【００３９】
「突然変異体」という用語は、１種類又は２種類以上のアミノ酸を他のアミノ酸で置換したポリペプチドを意味している。その性質を変えることなく、ある種のアミノ酸を、当該ポリペプチド活性の性格を変えることなく、これと類似の性質を有する他の広範囲のアミノ酸に変化させ得る（保守的置換できる）ことは、文献から明らかである。ポリペプチドにおける代表的な保守的置換の例を、下表に示す。
【表１】
0004651703.tif 000002
【００４０】
表１に示したものより保守性の度合いが低い置換基を選べば、その機能を大きく変えることができる。また、非保守性置換基を選ぶこともできるが、これらの基で許容されるものの数は比較的に少ない。一般に、ポリペプチドの性質に最も大きな変化をつくり出す可能性の高い当該置換には、下記のようなものがある。即ち、（ａ）親水性残基（例えばＳｅｒ又はＴｈｒ）を疎水性残基（例えばＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ又はＶａｌ）で置換する場合；（ｂ）システイン又はプロリンを他の残基で置換する場合；（ｃ）電気的に陽性の側鎖を有する残基（例えばＡｒｇ、Ｈｉｓ又はＬｙｓ）を電気的に陰性の残基（例えばＧｌｕ又はＡｓｐ）で置換する場合；又は（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基（例えばＰｈｅ又はＴｒｐ）を小さな側鎖を有する残基（例えばＡｌａ、Ｓｅｒ）又は側鎖を有しない残基（例えばＧｌｙ）で置換する場合。
【００４１】
一般に、突然変異体は、例えばＳＥＱ  ＩＤ番号２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１に示されるように、基本配列に対して少なくとも７５％が相同であることが適切であり、少なくとも８０％が相同であることがより適切であり、少なくとも９０％が相同であることが最も適切である。
【００４２】
相同性とは、「表１で定義した保守的置換と同一又はこれを構成するアミノ酸の割合」として定義される。
【００４３】
相同性は、本明細書に参考文献として引用したＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒａｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，３８７−３９５）のような配列比較プログラムを使用してこれを決定することができる。このようにして、本明細書に引用したのと類似又はこれと事実上異なる長さの配列を、配列の中にギャップを組み入れることにより比較することができる。当該ギャップは、例えばＧＡＰで使用される比較アルゴリズムにより決定することができる。適切な突然変異体の構成成分は、従来の手法によりこれを決定することができる。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ番号２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１に従ってポリペプチドをコード化するような核酸は、ランダム突然変異生成法、例えばトランスポゾン突然変異生成法又はサイト指向突然変異生成法を使用して、これを突然変異させることができる。
【００４４】
その結果得られるＤＮＡフラグメントを、次に従来の手法を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉのような適切な発現宿主の中へクローン化し、所望される活性を保持しているクローンを検出する。
【００４５】
ランダム突然変異生成法を使用してクローンを誘導した場合、当該突然変異を検出するためには、陽性クローンの配列決定を行わなければならない。「突然変異体」という用語には、天然に発生する対立突然変異体も含まれている。
【００４６】
「誘導体」という用語は、当該技術において容易に理解されるように、例えば他の化学基で基礎配列を共役化又は錯体化して修飾し、或いはこれを後翻訳修飾法により修飾して誘導したポリペプチドを意味している。
【００４７】
このような誘導体には、ＳＥＱ  ＩＤ番号２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１に従うアミノ酸の削除体又はポリペプチドへの付加体又はその免疫反応活性を維持した変異体、或いはこれらの両者が含まれる。ここに、当該誘導体は免疫活性を維持している。
【００４８】
アミノ酸の「付加体」には、ポリペプチド又はその変異体が他のポリペプチド又はタンパク質と融合した融合体を含めることができる。この点において、本発明のポリペプチド又は変異体を、これより大きなポリペプチドの中へ組み込むことができ、またこのような大きなポリペプチドも、例えば髄膜炎菌に対して免疫学的活性を維持できることも容易に理解されよう。前述したポリペプチドを、例えば髄膜炎菌から誘導されないような、さらに他のタンパク質に融合し得ることも期待できる。この他のタンパク質も、一例として、当該タンパク質の精製を助けることができる。例えば、この点において、ポリヒスチジン標識又はマルトース結合タンパク質を使用することができる。これに関しては、後で詳細に説明する。
【００４９】
その他に、髄膜炎菌に対して有効な免疫反応をつくり出すこともできる。或いは、他の病原体に対して免疫反応をつくり出すこともできる。その他に、免疫調節反応をつくり出す融合タンパク質を調製することも可能である。このようなタンパク質の例として、タンパク質Ａ又はグルタチオン  Ｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を挙げることができる。さらに、当該ポリペプチドをオリゴ糖を主体とするワクチン成分に融合させることもできる。この場合、当該ポリペプチドは単体タンパク質として作用する。
【００５０】
本発明により考えられるその他の誘導体として、側鎖を修飾したもの；ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の合成過程で天然には存在しないアミノ酸又はその誘導体或いはこれらの両者を組み込んだもの；架橋剤の使用又は本発明のポリペプチド、フラグメント及び変異体に構造的な制約を課したもの、及びその他の方法があるが、本発明で考えられる派生体は、これらに限定されるものではない。
【００５１】
本発明で考えられる側鎖の修飾例として、アミノ基を無水酢酸でアシル化する；アミノ基を無水コハク酸及び無水テトラヒドロフタル酸でアシル化する；メチルアセトイミダートでアミジン化する；シアネートでアミノ基をカルバモイル化する；ピリドキサール−５−ホスフェートでリシンをピリドキシル化し、次にＮａＢＨ４で還元する；アルデヒドと反応させて還元的にアルキル化し、次にＮａＢＨ４で還元する；アミノ基を２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）でトリニトロベンジル化するなどの修飾などが考えられる。
【００５２】
ｏ−アシルイソ尿素の形成を経てカルボジイミドを活性化し、次いで一例として対応するアミドに誘導化することにより、カルボキシル基を修飾することもできる。
【００５３】
２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサール及びグリオキサールなどの試薬で複素環縮合を行わせることにより、アルギニン残基のグアニジン基を修飾することもできる。
【００５４】
スルフィドリル基を過ギ酸でシステイン酸に酸化し；４−クロル水銀フェニルスルホン酸、４−クロル水銀安息香酸、２−クロル水銀−４−ニトロフェノール、塩化フェニル水銀、及びその他の水銀剤を使用して水銀誘導体を生成させ；他のチオール化合物で混合二硫化物を生成させ；マレイミド、無水マレイン酸、又はその他の置換マレイミドと反応させ；ヨード酢酸又はヨードアセトアミドでカルボキシメチル化させ；アルカリ性のｐＨにおいてシアネートでカルバモイル化するなどの方法により、修飾することもできる。
【００５５】
トリプトファン残基を、例えばインドール環を臭素化２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジル又はハロゲン化スルフォニルでアルキル化し、或いはＮ−ブロムスクシンイミドで酸化して修飾することもできる。
【００５６】
チロシン残基をテトラニトロメタンでニトロ化して３−ニトロチロシン誘導体として修飾することもできる。
【００５７】
ヒスチジン残基のイミダゾール環を、ジエチルピロカルボネートでＮ−カルベトキシル化し、又はヨード酢酸誘導体でアルキル化して修飾することもできる。
【００５８】
ペプチド合成の過程において天然には存在しないアミノ酸及び誘導体を組み込む例として、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサノイン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタノイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチオン、サクロシン、２−チエニルアラニン及びアミノ酸類のＤ−異性体を使用する場合もある。しかし、当該修飾方法は、これらの例に限定されるものではない。本発明の対象となるような、天然に存在しないアミノ酸のリストを表２に示す。
【表２】
0004651703.tif 000003
【表３】
0004651703.tif 000004
【００５９】
本発明は、ヒトに免疫性を持たせることを目的として、本発明のポリペプチド、フラグメント又は変異体をジニトロフェノールで共有結合的に修飾する場合についても、これを考慮するものである。
【００６０】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ番号２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１に基づくポリペプチドから選ばれたポリペプチドの一つで構成されることが好ましい。
【００６１】
本発明のポリペプチドは、本技術分野に精通している者に良く知られた適切な手順により調製できる。例えば、当該ポリペプチドは、下記のステップを含む手順によりこれを調製することができる：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ番号２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１に基づくポリペプチドの一つをコード化するようなヌクレオチド配列又はそのフラグメント、或いはこれらの変異体又は誘導体を含む組み替え核酸を調製する。ここに、当該ヌクレオチド配列は、転写及び翻訳調節核酸に結合させることもできる。
（ｂ）適切な宿主細胞に、当該組み替え核酸をトランスフェクト又は形質変換する。
（ｃ）当該宿主細胞を培養して、当該組み替え核酸から組み替えポリペプチドを発現させる。
（ｄ）当該組み替えポリペプチドを単離する。
【００６２】
当該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ番号１、３、４、６、８、１１、１２、１４、１６、１８及び２０で構成されるグループから適切に選択される。
【００６３】
「組み替えポリペプチド」という用語は、遺伝子組み替え手法、即ち遺伝子組み替え核酸を発現させる方法を使用して造られたポリペプチドを意味している。
【００６４】
本明細書で使用する「組み替え核酸」という用語は、通常天然には存在しないような形で核酸を組み込み、生体外で形成させた核酸を意味している。
【００６５】
この点において、組み替え核酸は、プラスミドのような自己複製染色体外ベクターか、又は宿主ゲノムに統合されるようなベクターである発現ベクターで構成されることが好ましい。一般に、このような発現ベクターは、当該ヌクレオチド配列に操作可能な状態で結合した転写調節核酸及び翻訳調節核酸を含んでいる。
【００６６】
「操作可能な状態で結合する」というフレーズは、転写及び翻訳調節核酸が、当該ポリペプチド、フラグメント、変異体又は誘導体をコード化するヌクレオチド配列に対して、このような転写が開始できるような位置に配置されていることを意味している。転写及び翻訳調節核酸は、通常、発現に使用される宿主細胞として適している。
【００６７】
当該技術においては、種々の宿主細胞に対して、適切な発現ベクター、及び適切な調節配列が、数多く知られている。
【００６８】
通常、転写及び翻訳調節核酸は、プロモーター配列、リーダー又は信号配列、リボソーム結合サイト、転写開始及び停止配列（訳者注：重複している）、及びエンハンサー又は活性化配列を含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
当該技術において知られている構造性又は誘発性プロモーターも、本発明の対象となる。当該プロモーターは、天然に存在するプロモーター、ハイブリッド  プロモーター、又は２つ以上のプロモーター要素を結合したハイブリッド  プロモーターである場合もある。
【００７０】
優先的態様においては、当該発現ベクターが、形質変換した宿主細胞の選択を可能にする選別可能標識遺伝子を含んでいる。選択遺伝子は、当該技術において良く知られており、使用する宿主細胞の種類により変化する。
【００７１】
当該発現ベクターには、融合パートナー（通常、発現ベクターにより与えられる）も含まれている。従って、本発明における組み替えポリペプチドは、当該融合パートナーとの融合ポリペプチドとして発現される。融合パートナーの主な利点は、これらのパートナーが当該融合ポリペプチドの同定及び精製を助けることである。
【００７２】
当該融合ポリペプチドを発現させるためには、本発明に従って、ヌクレオチド配列を発現ベクターの中へ縛り付け、本発明の融合パートナーの翻訳読み枠とヌクレオチド配列を一致させることが必要である。
【００７３】
融合パートナーの良く知られた例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒトＩｇＧのＦｃ部分、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）及びヘキサヒスチジン（ＨＩＳ６）などが存在し、これらは融合ポリペプチドをアフィニティクロマトグラフ法で単離する場合に特に有用であるが、これらに限定されるものではない。アフィニティクロマトグラフ法で融合ポリペプチドを精製する場合に使用するマトリックスとしては、グルタチオン、アミロース、及びニッケル又はコバルト共役樹脂がそれぞれ適している。このようなマトリックスが、「キット」の形で数多く市販されている。（ＨＩＳ６）融合パートナー及びＰｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システムとともに使用されるＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓＴＭシステム（Ｑｉａｇｅｎ社）などがその例である。
【００７４】
当技術において良く知られているその他融合パートナーは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。この融合パートナーは、本発明の融合ポリペプチドの同定を蛍光顕微鏡又はフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で行えるようにする「蛍光標識」として役に立つ。本発明における融合ポリペプチドの準細胞局在性を評価する場合、又は本発明における融合ポリペプチドの発現細胞を単離する場合にも、このＧＦＰ標識が役に立つ。蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）のようなフローサイトメトリーは、融合ポリペプチド発現細胞を単離する場合において特に有用である。
【００７５】
当該融合パートナーにも、因子Ｘａ又はトロンビンにおけるように、該当プロテアーゼに本発明の融合ポリペプチドを部分消化させ、これにより本発明の組み替えポリペプチドを遊離させるようなプロテアーゼ開裂サイトが存在することが好ましい。次に、この遊離ポリペプチドをクロマトグラフ法により分離して、融合パートナーから単離することができる。
【００７６】
本発明に基づく融合パートナーも、その範囲内に「エピトープ標識」を含んでいる。このエピトープ標識は、通常短いペプチド配列であり、これに対しては特定の抗体だけが作用する。特定のモノクロナール抗体が容易に作用するエピトープ標識の良く知られた例として、ｃ−ｍｙｃ、インフルエンザウィルスのヘマグルチニン、及びＦＬＡＧ標識がある。
【００７７】
本発明における組換えポリペプチドは、本発明に基づいて、先ず宿主細胞をポリペプチド、フラグメント、変異体又は誘導体をコード化する核酸を含む発現ベクターで形質変換し、次にこの宿主細胞を培養することにより調製することができる。タンパク質の発現に適した条件は、選んだ発現ベクター及び宿主細胞の種類により変化する。このことは、当技術に精通する者なら、日常的な実験を行うことにより、誰でも容易に確認することができる。
【００７８】
発現には、宿主細胞としてが原核生物又は真核生物が適しているものと考えられる。本発明に基づくポリペプチド発現用宿主細胞として好ましいものの一つは、バクテリウムである。
【００７９】
良く使用されるバクテリウムは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。これに代わる宿主細胞として、例えばＳＦ９細胞などの昆虫細胞を使用することもできる。ＳＦ９細胞は、バキュロウィルス発現系とともに使用することが可能である。
【００８０】
組換えタンパク質は、当技術に精通した者であれば、例えば下記の文献に記述されている標準的なプロトコルを使用して、誰でも容易にこれを調製することができる。即ち、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ社、１９８９；本明細書に引用）の特に第１６節及び第１７節；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４−１９９８；本明細書に引用）の特に第１０章及び第１６章；及びＣｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５−１９９７；本明細書に引用）の特に第１章、第５章及び第６章などが参考になる。
【００８１】
（ヌクレオチド配列）
本発明は、さらに、上記で定義したポリペプチド、フラグメント、変異体又は誘導体をコード化するヌクレオチド配列を提供するものである。
【００８２】
当該配列は、これを下記で構成するグループから選択するのが適切である：−ＳＥＱ  ＩＤ番号１、３、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０；ＳＥＱ  ＩＤ番号１、３、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０の中のいずれか一つのヌクレオチド配列フラグメント；及び上記配列のヌクレオチド配列相同体。
【００８３】
これらの配列は、上記に定義した、免疫活性を示すような生成物をコード化できることが好ましい。
【００８４】
後でさらに詳しく述べるが、ＳＥＱ  ＩＤ番号１は、髄膜炎菌株ＭＣ５８から得られるｈｉａＮｍ遺伝子に対応する。この遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ番号２の新規６２−ｋＤａ（概略値）表面ポリペプチドをコード化する。ＳＥＱ  ＩＤ番号３は、菌株ＭＣ５８のｈｉａＮｍ遺伝子における開放読取枠配列に対応する。ＳＥＱ  ＩＤ番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０は、それぞれ髄膜炎菌株ＢＺ１０、ＢＺ１９８、ＥＧ３２７、ＥＧ３２９、Ｈ１５、Ｈ３８、Ｈ４１、Ｐ２０及びＰＭＣ２１から得られるｈｉａＮｍ遺伝子の相同開放読取枠配列に対応する。
【００８５】
本明細書で使用する「ヌクレオチド配列」という用語は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＰＭＣ２１を意味している。
【００８６】
「ヌクレオチド配列相同体」という用語は、一般に、本発明に基づき、厳しい条件下で野性型ヌクレオチド配列によりハイブリッド化したヌクレオチド配列を意味している。その適切なハイブリッド化条件に関しては後述する。
【００８７】
本発明におけるヌクレオチド配列相同体は、下記手順に従って調製することができる：−
（ｉ）適切な宿主から核酸を抽出する。
（ｉｉ）任意に縮退し、各々が本発明の野性型ヌクレオチド配列部分で構成されるプライマーを調製する。
（ｉｉｉ）当該プライマーを使用し、核酸増幅手法で、当該核酸抽出物から採取した１種又は２種以上の増幅用生成物を増幅する。
【００８８】
当該宿主としては、バクテリウムが適切である。また当該宿主としては、ナイセリア属のものが好ましく、これが髄膜炎菌であればさらに好ましい。
【００８９】
当該プライマーとしては、下記で構成されるグループから選択したものが好ましい：−
【００９０】
【化１】
0004651703.tif 000005
【００９１】
適切な核酸増幅手法としては、当技術に精通した者に良く知られた方法が使用される。これらの手法には、例えばＡｕｓｕｂｅｌら（１９９４−１９９８，ｓｕｐｒａ，第１５章；本明細書に引用）の文献に述べられているポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、例えば米国特許第５，４２２，２５２号に述べられているストランド変位増幅法（ＳＤＡ；本明細書に引用）、例えばＬｉｕら（１９９６，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：１５８７−１５９４及び国際特許出願ＷＯ９２／０１８１３）及びＬｉｚａｒｄｉら（国際特許出願ＷＯ９７／１９１９３）（いずれも本明細書に引用）に述べられている回転円複写法（ＲＣＲ）、例えばＳｏｏｋｎａｎａｎら（１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１７：１０７７−１０８０；本明細書に引用）に述べられている核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ）、及び例えばＴｙａｇｉら（１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：５３９５−５４００；本明細書に引用）に述べられているＱ−βレプリケース増幅法などがある。
【００９２】
本明細書で使用されているように、「増幅生成物」とは、核酸増幅法により発生した核酸生成物を意味する用語である。
【００９３】
「ハイブリッド化する」又は「ハイブリッド化」という用語は、本明細書においては、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、又はＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを調製する目的で、塩基ペアリング則に基づいて、異なるヌクレオチド配列の相補的塩基をペアリングさせることを意味する用語として使用される。
【００９４】
ＤＮＡにおける相補的塩基は次の通りである：
（ｉ）Ａ及びＴ；並びに
（ｉｉ）Ｃ及びＧ。
ＲＮＡにおける相補的塩基は次の通りである：
（ｉ）Ａ及びＵ；並びに
（ｉｉ）Ｃ及びＧ。
ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドにおける相補的塩基は次の通りである：
（ｉ）Ａ及びＵ；
（ｉｉ）Ａ及びＴ；並びに
（ｉｉｉ）Ｇ及びＣ。
【００９５】
通常、事実上の相補的ヌクレオチド配列は、ブロッティング法によりこれを同定することができる。これらの方法には、ヌクレオチドをマトリックス（好ましくはニトロセルローズなどの合成膜）上で固定するステップ、ハイブリッド化するステップ、及びこれを検出するステップで構成されている。相補的ＤＮＡ配列の同定にはサザンブロッティング法が、また相補的ＲＮＡ配列の同定にはノーザンブロッティング法が使用される。相補的ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＲＮＡポリヌクレオチドの同定には、ドットブロッティング法及びスロットブロッティング法を使用することができる。このような手法は、当技術に精通した者には、良く知られている手法であり、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４−１９９８，ｓｕｐｒａ）の第２．９．１−２．９．２０に述べられている。
【００９６】
これらの方法において、サザンブロッティング法では、ＤＮＡ分子をそのサイズに基づいてゲル電気泳動法により分離し、サイズ毎に分離したＤＮＡを合成膜まで運び、膜に結合したＤＮＡを放射能、酵素又は蛍光色素で標識した相補的ヌクレオチド配列にハイブリッド化する。ドットブロッティング法及びスロットブロッティング法では、ＤＮＡサンプルを合成膜に直接塗布してから上記のハイブリッド化を行う。
【００９７】
ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリの中で相補的ヌクレオチド配列の同定を行うような場合には、これとは異なるプラーク又はコロニーハイブリッド化法によるブロッティングステップなどが使用される。この手順の代表的な例については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，ｓｕｐｒａ）第８−１２章に述べられている。
【００９８】
ハイブリッド化条件の決定には、通常、下記の一般手順を使用することができる。即ち、上記のようにしてヌクレオチド配列を合成膜にブロット又は転移させ、本発明の野性型ヌクレオチド配列を上記の方法で標識化し、この標識化したヌクレオチド配列が固定ヌクレオチド配列とハイブリッド化する能力を分析する。
【００９９】
当技術に精通した者であれば、多くの因子がハイブリッド化に影響を与え得ることを認識するであろう。放射能で標識化したポリヌクレオチド配列の検出可能な固有信号活性は、約１０８ｄｐｍ／ｍｇ以上であるのが普通である。１０８−１０９ｄｐｍ／ｍｇの固有活性を有する放射能標識化ヌクレオチド配列は、約０．５ｐｇのＤＮＡを検出することができる。検出を可能にするためには、充分な量のＤＮＡを膜上に固定しなければならないことは、当技術においては良く知られているところである。固定ＤＮＡは、その過剰量（通常は１０μｇ）が存在することが望ましい。１０％（ｗ／ｖ）硫酸デキストラン（ＭＷ５００，０００）又はポリエチレングリコール６０００のような不活性ポリマーをハイブリッド化の過程で添加することによっても、ハイブリッド化の感度を高めることができる（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｓｕｐｒａ第２．１０．１０節）。
【０１００】
膜上に固定されたヌクレオチド配列と標識化ヌクレオチド配列の間でハイブリッド化を行わせ、これから意味のある結果を得るためには、固定ヌクレオチド配列を洗浄した後に、これに充分な量の標識化ヌクレオチド配列をハイブリッド化しなければならない。洗浄することにより、標識化ヌクレオチド配列に対して所定の相補度を有する固定ヌクレオチド配列上に、標識化ヌクレオチド配列のハイブリッド化を確実に行わせることができるようになる。
【０１０１】
本明細書において、「厳しい（Ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」という用語は、ハイブリッド化過程における温度及びイオン強度、及びある種の有機溶媒の存在又は不存在に関して使用される。「厳しさ」が高ければ高い程、固定ヌクレオチド配列と標識化ポリヌクレオチド配列の間における相補性の程度も高くなる。
【０１０２】
「厳しい条件（Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」とは、相補的塩基の高頻度を有するヌクレオチド配列だけがハイブリッド化するような条件のことを指す用語である。
【０１０３】
代表的な「厳しい条件」とは、例えば、（１）４２℃で少なくとも約３０分間、０．７５Ｍ二塩基性燐酸ナトリウム／０．５Ｍ一塩基性燐酸ナトリウム／１ｍＭ  ＥＤＴＡ２ナトリウム／１％ザルコシルで処理する場合、又は（２）約４２℃で少なくとも約３０分間、６．０Ｍ尿素／０．４％硫酸ナトリウムラウリル／０．１ｘＳＳＣで処理するような場合、又は（３）約６８℃で少なくとも２０分間、０．１ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで処理する場合、又は（４）約５５℃で約６０分間、１ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで処理する場合、又は（５）約６２℃で約６０分間、１ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで処理する場合、又は（６）約６８℃で約６０分間、１ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで処理する場合、又は（７）約５５℃で約６０分間、０．２ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで処理する場合、又は（８）約６２℃で約１時間、０．２ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで処理する場合、又は（９）約６８℃で約６０分間、０．２ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで処理する場合などを指している。
【０１０４】
詳細な例については、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ｓｕｐｒａ，第２．１０．１−２．１０．１６頁；ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＯＡＴＩＮＧ中のＳａｍｂｒｏｏｋらの記述；Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｒｅｓｓ社、１９８９），第１．１０１−１．１０４節を参照のこと。これらは、いずれも本明細書に参考文献として引用した。
【０１０５】
通常、約４２℃−６８℃の温度で厳しい洗浄が行われるが、当技術に精通した者であれば、厳しい条件として、この他の温度も使用できることは容易に理解できる。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド化反応における最大ハイブリッド化度は、通常Ｔｍより約２０℃−２５℃低い温度で得られる。Ｔｍが融解温度、即ち２種類の相補的ポリヌクレオチド配列が解離する温度であることは、当技術において良く知られているところである。Ｔｍの推定方法も、当技術において良く知られているところである（ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ｓｕｐｒａ，第２．１０．８頁を参照のこと）。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドにおける最大ハイブリッド化度は、通常Ｔｍより約１０℃−１５℃低い温度で得られる。
【０１０６】
当技術においては、その他の「厳しい条件」についても知られている。当技術に精通した者であるなら、ハイブリッド化の特異性を最適化するために種々の因子を操作し得ることを認識していることであろう。最終洗浄条件の「厳しさ」を最適化することにより、高ハイブリッド化度を確保することが可能となる。
【０１０７】
固定ヌクレオチド配列にハイブリッド化した標識化ヌクレオチド配列を検出する方法は、当技術を実践する者には良く知られているところである。これらの方法には、オートラジオグラフ法、ケミルミネセンス法、蛍光法及び比色法などがある。
【０１０８】
（抗体）
本発明においては、前述したポリペプチド、フラグメント、変異体及び誘導体に対する抗体も対象となる。
【０１０９】
このような抗体には、本発明におけるポリペプチド、フラグメント、変異体又は誘導体に結合し又はこれと共役するのに適した抗体などが含まれる。
【０１１０】
例えば、当該抗体はポリクローン性抗体であることが可能である。このような抗体は、例えば本発明によるポリペプチド、フラグメント、変異体又は誘導体を、マウス又はウサギなどの製造種の中へ注入して、ポリクローン性抗血清を得ることにより調製することができる。ポリクローン性抗体を調製する方法については、当技術に精通した者には良く知られているところである。使用できる模範的なプロトコルについては、例えば、本明細書に引用したＣｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９１）、及びＡｕｓｕｂｅｌら、（１９９４−１９９８，ｓｕｐｒａ），特に第１１章第ＩＩＩ節に述べられている。
【０１１１】
製造種の体内で得られるポリクローン性抗血清の代わりに、例えばＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎによる方法（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７；本明細書に参考文献として引用）、又は例えばＣｏｌｉｇａｎら（１９９１，ｓｕｐｒａ）による最近の修正法の中で述べられているような本発明による１種類又は２種類以上のポリペプチド、フラグメント、変異体又は誘導体を接種した製造種から誘導された不滅脾臓又はその他抗体製造細胞による標準的な方法で、モノクローン性抗体を調製することもできる。
【０１１２】
本発明は、その適用範囲内に、上記ポリクローン性又はモノクローン性抗体のＦｃ又はＦａｂフラグメントで構成される抗体も包含するものである。或いは当該抗体は、本発明のペプチドに対する一本鎖Ｆｙ抗体（ｓｃＦｖｓ）で構成されることも可能である。このようなｓｃＦｖｓは、例えば米国特許第５，０９１，５１３号、欧州特許第２３９，４００号又はＷｉｎｔｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１，Ｎａｔｕｒｅ３４９，２９３）による記事にそれぞれ述べられている方法で調製することができる。これらの文献はいずれも本明細書に参考文献として引用した。
【０１１３】
本発明の抗体は、アフィニティクロマトグラフで天然又は組み替え髄膜炎菌ポリペプチドを単離する場合にも、これを使用することができる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、（１９９５−１９９７，ｓｕｐｒａ）の第９．５章に述べられている「免疫アフィニティクロマトグラフ法の手順」を参照すれたい。
【０１１４】
本発明の変異体ポリペプチドを発現ライブラリでスクリーニングする場合にも、当該抗体を使用することができる。本発明の抗体は、後述するように、髄膜炎菌による感染を検出する場合にもこれを使用することができる。
【０１１５】
（髄膜炎菌の検出）
ある患者の体内に髄膜炎菌が存在するかどうかは、当該患者から生物学的サンプルを採取し、当該生物学的サンプルに前述の抗体又は抗体フラグメントを混合し、当該混合物の中で固有結合を形成した抗体又は抗体フラグメントを検出することにより決定することができる。即ち、当該抗体又は抗体フラグメントが存在すれば、サンプル中に髄膜炎菌が存在したことになる。
【０１１６】
本明細書で使用する「生物学的サンプル」という用語は、未処理、処理、希釈又は濃縮状態で患者から抽出できるサンプルを意味している。当該生物学的サンプルは、全血、血清、血漿、唾液、尿、汗、腹液、腹膜液、滑液、羊膜液、脳脊髄液、皮膚生検液などで構成されるグループから選択されるのが適切である。
【０１１７】
免疫評価には、適切な錯体形成検出法を使用することもできる。例えば、本発明による標識化抗体又は抗体フラグメントを免疫測定に使用することもできる。このような免疫測定法には、当技術に精通する者には良く知られている放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着剤測定法（ＥＬＩＳＡ）及び免疫クロマトグラフ法（ＩＣＴ）などがあるが、免疫評価に使用できる方法はこれらには限定されない。例えばこれに関しては、本発明に基づいて使用し得る種々の免疫測定法を開示している“ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ”（１９９４，ｓｕｐｒａ）が参考になる。免疫測定法には、当技術で理解されているような競合測定法も含めることもできる。
【０１１８】
当該抗体又は抗体フラグメントの標識方法としては、下記のものがある：
ｉ．標識を抗体又は抗体フラグメントに直接付着させる方法。
ｉｉ．標識を抗体又は抗体フラグメントに間接的に付着させる方法：即ち、標識を先ず他の測定試薬に付着させ、次にこの試薬を抗体又は抗体フラグメントに付着させる方法。
ｉｉｉ．抗体又は抗体フラグメントの反応生成物を標識化する方法。
【０１１９】
当該標識は、クロモゲン、触媒、酵素、蛍光支持体、化学発光分子、ユーロピウム（Ｅｕ３４）のようなランタニド  イオン、放射性同位元素及び直接可視標識などのグループからこれを選択することができる。
【０１２０】
直接可視標識の場合、コロイド状の金属又は非金属粒子、染料粒子、酵素又は基質、有機ポリマー、ラテックス粒子、リポソーム、又はその他信号発信物質を含む小胞などを使用することができる。
【０１２１】
標識としての使用に適した多数の酵素が、米国特許第４，３６６，２４１号、第４，８４３，０００号、及び第４，８４９，３３８号に開示されており、これら全てを本明細書に参考文献として引用した。本発明で使用するのに適した酵素標識として、アルカリ性ホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロジェナーゼなどがある。酵素標識は、単独で又は第２の溶液中酵素と組み合わせて、これを使用することができる。
【０１２２】
当該蛍光支持体は、フルオレセイン  イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン  イソチオシアネート（ＴＲＩＴＬ）又はＲ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）を含むグループから選択するのが適切である。
【０１２３】
本発明は、患者が髄膜炎菌に感染したことを検出する方法にも拡張されるものであり、当該方法が、患者から採取した生物学的サンプルを本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体又は誘導体に接触させるステップ；及び当該ポリペプチド、フラグメント、変異体又は誘導体と髄膜炎菌固有抗体の間に形成された錯体が当該血清中に存在するかどうかを決定するステップで構成され、当該錯体が存在することにより、当該感染が確認される。
【０１２４】
一つの優先態様においては、当技術において良く知られている方法により適切な標識で当該ポリペプチド、フラグメント、変異体又は誘導体を修飾し、このような修飾化合物を前記の適切な免疫測定法に使用して、前記錯体を検出する。
【０１２５】
他の側面においては、本発明は、髄膜炎菌の存在が疑われる生物学的サンプル中において、当該バクテリアの検出方法を提供するものであり、当該方法は、生物学的サンプルを患者から採取するステップ；及び当該サンプル中で本発明に基づく核酸配列を検出するステップで構成される。当該核酸配列が検出されれば、当該バクテリアの存在が確認される。
【０１２６】
当該核酸配列の検出には、これに適切な方法ならどんな方法を使用しても良い。例えば、当技術で良く知られているように、患者から採取した核酸抽出物のサザンブロット法による分析において、本発明に基づく標識化核酸配列をプローブとして使用することもできる。或いは、患者から採取したＲＮＡ抽出物のノーザンブロット法による分析において、本発明に基づく標識化核酸配列をプローブとして使用することもできる。例えば国際特許出願第ＷＯ８９／０９３８５号（本明細書に参考文献として引用）に述べられているようなＰＣＲなどの核酸増幅反応又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）においては、患者から採取した核酸抽出物を、本発明に基づく核酸のセンス配列及びアンチセンス配列或いはそのフランキング配列に対応して、オリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせて使用するのが好ましい。種々の自動固相検出法も、この用途に適している。例えばＦｏｄｏｒら（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：７６７−７７７）及びＫａｚａｌら（１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２：７５３−７５９）に述べられているような核酸の検出には、非常に大規模な固定プライマー配列（ＶＬＳＴＰＳＴＭ）が使用される。上記の一般的な手法は、当技術に精通した者には良く知られているところである。
【０１２７】
（医薬品組成物）
本発明のさらなる特徴は、本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体又は誘導体を、患者を髄膜炎菌による感染に対して保護する目的で、医薬品組成物の活性成分（「免疫成分」）として使用する方法に関するものである。
【０１２８】
当該医薬品組成物には、医薬品に適した担体を使用することが好ましい。
【０１２９】
「医薬品に適した担体」というフレーズは、ある固体又は液体の充填剤、希釈剤又はカプセル化物質が、全身投与する場合に安全に使用し得ることを意味するフレーズである。
【０１３０】
投与ルートによって、当技術において良く知られている種々の「医薬品として使用し得る担体」を使い分けることができる。
【０１３１】
これらの担体は、砂糖、デンプン、セルロース及びその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸塩緩衝液、乳化剤、等浸透圧食塩水、及びピロゲンを含まない水などのグループから、これを選択することができる。
【０１３２】
患者に本発明の医薬品組成物を投与するルートは、それが適切なルートでさえあれば、どんなルートでもこれを使用することができる。例えば、経口、直腸、腸管外、舌下、ほお、静脈内、関節内、筋肉内、皮膚内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脳室内、経皮などでこれを投与することができる。例えば免疫付与組成物、ワクチン及びＤＮＡワクチンの投与法としては、筋肉内注射及び皮下注射が適している。
【０１３３】
投与形態としては、錠剤、分散液、懸濁液、注射、溶液、シラップ、トローチ、カプセル、座薬、アエロゾル、経皮パッチなどがある。これらの投与形態には、この目的のために放出速度制御装置を特に設計して、これを注入又はインプラントする方法もあり得る。或いは、このようにして追加作用するように修正した、その他の形態のインプラント法もあり得る。治療用薬剤の放出速度を制御する方法としては、例えばアクリル樹脂、ワックス、脂肪族高級アルコール、ポリ乳酸及びポリグリコール酸、並びにヒドロキシプロピルセルロースのような特定のセルロース誘導体など、疎水性ポリマーで当該薬剤をコーティングする方法もあり得る。さらに、放出速度の制御方法として、その他のポリマーマトリックス、リポソーム、及びミクロスフェア或いはこれらのいずれかを使用することも可能である。
【０１３４】
経口又は腸管外投与を行う場合には、本発明の医薬品組成物をカプセル、サシェイ（プラスチック製小容器）又は錠剤など、予め定めた量の本発明の治療用薬剤１種類又は２種類以上を収めた個別の単位で包装し、或いは粉体又は顆粒、水性液又は非水性液中の溶液又は懸濁液、或いは水中に油を浮かせた乳液又は油中に水を浮かせた乳液として、これを提供することができる。このような組成物は、通常調剤業で使用されている方法で調製することができるが、これらいずれの方法においても、１種類又は２種類以上の上記免疫付与剤を、１種類又は２種類以上の担体と組み合わせるステップを含んでおり、当該担体もまた本組成物の必要成分を構成するものである。一般に、当該組成物は、本発明の免疫付与剤を、液体状担体又は細かく粉砕した固体状担体或いはこれらの両方と均一且つ緊密に混合し、次に、必要なら得られた混合物を希望形態に成形することにより調製される。
【０１３５】
上記組成物は、髄膜炎菌による感染から患者を保護するために、当該投与処方に合った方法で免疫付与有効量を当該患者に投与することができる。本組成物の投与量に関して言えば、本発明の目的から、髄膜炎菌の濃度が減少して行く全期間に亘り有益な免疫反応を起こし得るように、又は髄膜炎菌による感染を阻止し得るように、充分な量の組成物を患者に投与することが望ましい。投与すべき免疫付与剤の量は、治療を受ける験体の年齢、性、体重及び一般的な健康状態などによっても変化する。この観点から、免疫付与剤の必要量は、専門医の判断によっても変ってくる。専門医は、血漿中の循環濃度、病気の進行度及び髄膜炎菌抗体の生成量を測定することにより、髄膜炎菌感染症の治療又は予防目的で投与する免疫付与剤の有効量を決定することができる。いずれの場合においても、当技術に精通した者であれば、本発明による免疫付与剤の適切な投与量を容易に決定することができる。このような本発明による免疫付与剤の投与量は、ナノグラムからミリグラムの範囲内にある。
【０１３６】
上記組成物は、治療用又は予防用のワクチンとして、これを使用することができる。従って、当該免疫付与剤の１種類又は２種類以上を活性成分として含有するワクチンを製造する方法としても本発明の範囲が拡張される。このようなワクチンの製造方法としては、これに適した手順なら何でも使用することができる。
【０１３７】
その例として、例えば、ＮＥＷ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ（１９９７，Ｌｅｖｉｎｅら、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｅｌ  Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ）に述べられている方法を例として挙げることができる（本明細書に参考文献として引用）。
【０１３８】
本発明に基づく免疫付与剤は、他の抗原のＢ又はＴ細胞エピトープなどにより他の抗原と混合し、これと共役させ又は融合させることもできる。さらに下記のようにして、これを担体に共役させることもできる。
【０１３９】
本発明のハプテン性ペプチド（即ち、同系の抗体とは反応するが、それ自体が免疫反応を引き出すことのできないペプチド）を使用する場合、これを免疫性付与担体と共役させることができる。この目的で使用できる担体は当技術において良く知られているところであり、これには例えば：サイログロブリン；ヒト血清アルブミンなどのアルブミン；トキシン、トキソイド又は破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス、Ｅ．ｃｏｌｉ、ブドウ球菌、及び連鎖球菌から採取したトキシンの突然変異体交差反応性物質（ＣＲＭ）；ポリ（リシン：グルタミン酸）などのポリアミノ酸；インフルエンザ；ロタウィルスＶＰ６、パルボウィルスＶＰ１及びＶＰ２；Ｂ型肝炎ウィルス核タンパク質；Ｂ型肝炎ウィルス組み替えワクチンなどがある。或いは、担体タンパク質のフラグメント又はエピトープ、或いはその他の免疫性付与タンパク質を使用することもできる。例えば、本発明におけるハプテン性ペプチドをバクテリア性トキシン、トキソイド又はＣＲＭのＴ細胞エピトープにカップリングさせることもできる。この観点から、米国特許第５，７８５，９７３が参考になる。当該特許も、本明細書に参考文献として引用した。
【０１４０】
さらに、本発明によるポリペプチド、フラグメント、変異体又は誘導体は、ナイセリア或いはその他バクテリア又はウィルスに対するワクチン組成物の担体タンパク質としてもこれを使用することができる。
【０１４１】
本発明による免疫付与剤は、多価サブユニットワクチンとして、髄膜炎菌の抗原、又は病原性バクテリアであるＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ，Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ，Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａなど、その他微生物の抗原と組み合わせてこれを投与することができる。これに代わり、或いはこれに加えて、本発明による免疫付与剤は、髄膜炎菌のオリゴ糖又は多糖成分と組み合わせて、これを投与することもできる。
【０１４２】
当該ワクチンは、水、リン酸塩緩衝食塩水及び生理的食塩水など、生理学的に無害な希釈剤又は添加物を含むこともできる。
【０１４３】
当該ワクチン及び免疫付与組成物は、当技術において良く知られているアジュバントを含むこともできる。適切なアジュバントの例として下記を挙げることができるが、適切なアジュバントはこれらだけに限定されるものではない：即ち、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リソレシチン、臭素化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジオクタデセニル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセリン、及び多価ポリオールなどの表面活性物質；ピラン、デキストランサルフェート、ポリＩＣカルボポールなどのポリアミン；ムラミルジペプチド及びその誘導体、ジメチルグリシン、タフトシンなどのペプチド；油性エマルション；及びリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム又はミョウバンなどの鉱物性ゲル；リンフォカイン、Ｑｕｉ１Ａ及び免疫刺激性錯体（ＩＳＣＯＭＳ）などである。
【０１４４】
本発明による免疫付与剤は、弱毒化したウィルス宿主に発現させることもできる。
【０１４５】
「弱毒化したウィルス宿主」とは、自然又は人工的に事実上無毒化されたウィルスベクターを表す言葉である。
【０１４６】
ウィルスは、適切な物理的手段（例えば熱処理）又は化学的手段（例えばホルムアルデヒド処理）により事実上無毒化することができる。「事実上無毒」とは、ウィルスの感染性が破壊されたことを示す言葉である。
【０１４７】
この場合、ウィルス免疫性を担うタンパク質に何ら影響を与えること無く、ウィルスの感染性を破壊するのが理想である。前述の内容から、弱毒化ウィルスの宿主が生ウィルス又は不活性化ウィルスで構成されることも容易に理解されよう。
【０１４８】
本発明によるワクチンに使用できるような弱毒化ウィルスの宿主は、アデノウィルス、シトメガロウィルス、及び好ましくはワクシニアなどの痘症ウィルスを含むウィルスベクター（例えばＰａｏｌｅｔｔｉ及びＰａｎｉｃａｌｉ，米国特許第４，６０３，１１２号を参照のこと；当該特許は本明細書に参考文献として引用）；及び弱毒化サルモネラ菌株（例えばＳｔｏｃｋｅｒ，米国特許第４，５５０，０８１号を参照；本明細書に参考文献として引用）で構成される。
【０１４９】
生ワクチンは長期間に亘り刺激を維持して永続性のある免疫を与えてくれるので、この場合特に有利である。
【０１５０】
多価ワクチンは、髄膜炎菌の異なるエピトープ（例えば他の表面タンパク質又は他の髄膜炎菌エピトープ）を発現する１種類又は２種類以上の微生物から調製することができる。さらに、他の病原体微生物のエピトープを当該ワクチンに組み込むこともできる。
【０１５１】
優先態様の１つでは、本発明の核酸配列を発現した組み替えワクシニア症ウィルスを構築する。これを宿主に導入すると、当該組み替えワクシニア症ウィルスは直ちに免疫付与機能を発現し、これにより宿主からＣＴＬ反応を引き出す。米国特許第４，７２２，８４８号（本明細書に参考文献として引用）にはワクシニアウィルスのベクター及び免疫化プロトコルに使用できる方法が述べられているが、本態様に関しては、例えばこの特許が参考になる。
【０１５２】
その他広範囲に亘るベクターで、本発明の免疫付与剤とともに治療投与又は免疫投与に使用できるものとしてどんなものがあるかについては、当技術に精通した者であれば、本開示内容から自ずと明らかであろう。
【０１５３】
さらに他の態様においては、当該ヌクレオチド配列を、当技術で知られている「裸ＤＮＡ」ワクチンの形で使用する。例えば、本発明の発現ベクターを哺乳類に導入すると、当該発現ベクターは生体内でポリペプチドの生成を促すことができる。これに対して当該宿主は、例えばＢａｒｒｙ，Ｍら、（１９９５，Ｎａｔｕｒｅ３７７：６３２−６３５；本明細書に参考文献として引用）に述べられているような免疫反応を引き起こす。
【０１５４】
（検出キット）
本発明は、生物学的サンプル中における髄膜炎菌検出に使用するようなキットを提供するものでもある。これらのキットは、使用する試験法の性格に従い、１種類又は２種類以上の上記特定試薬を含んでいる。この観点から、当該キットは、本発明に基づく１種類又は２種類以上のポリペプチド、フラグメント、変異体、誘導体、抗体、抗体フラグメント又は核酸を含むことができる。また当該キットはオプションとして、標識、正及び負の比較対照、洗浄液、希釈用緩衝液などの検出に適した試薬を含むこともできる。例えば、核酸を主体とする検出用キットでは、使用する核酸増幅手法により、（ｉ）本発明による核酸（正の比較対照として使用できる）、（ｉｉ）本発明によるオリゴヌクレオチドプライマー、及びオプションとしてＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼなどを含むことができる。
【０１５５】
（免疫反応性フラグメントの調製）
本発明は、また、本発明に基づくポリペプチド、変異体又は誘導体の免疫反応性フラグメントを同定する方法にも拡張される。この方法は、本質的にポリペプチド、変異体又は誘導体のフラグメントを発生させるステップ；当該フラグメントを哺乳類に投与するステップ；及び哺乳類の体内で発生した免疫反応を検出するステップで構成される。当該反応には、特に髄膜炎菌の結合要素及び当該ポリペプチド、変異体又は誘導体の一部或いは全部の生成、並びに髄膜炎菌感染に対する保護効果もしくはこれら生成又は保護効果のいずれかが含まれる。
【０１５６】
上記方法において、免疫反応性に対して特定フラグメントの試験を行う場合、その前に種々の予見手段を使用して、天然の抗原と交差反応を行うような抗体を得る目的で、ある特定フラグメントが使用できるかどうかを推定することもできる。これらの予見手段としては、例えばＡｕｓｕｂｅｌら、（１９９４−１９９８，ｓｕｐｒａ）の第１１−１４章に述べられているアミノ末端基又はカルボキシ末端基配列に基づく方法を使用することができる。
【０１５７】
或いは、これらの予見手段として、例えばＫｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２）並びにＨｏｐｐ及びＷｏｏｄｓ（１９８３，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４８３−４８９）に述べられている、親水性の予測値に基づく予見手段を使用することもできる。これらの参考文献は、いずれも本明細書に引用した。
【０１５８】
最適の結果を得るには、ペプチドフラグメントのサイズとしては、一般に１０−１５個の残基で構成されるものが好適である。ペプチドの大きさが６個程度の小さなもの、又は２０個程度の大きなものでも良好な結果を得ることは可能であった。このようなペプチドフラグメントを、例えばＡｕｓｕｂｅｌら、（１９９４−１９９８，ｓｕｐｒａ）の第１１．１４節及び第１１．１５節に述べられているように、次にキーホールカサガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）又はウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体分子に化学的にカップリングすることもできる。
【０１５９】
例えば上記で述べたように、当該ペプチドを使用して動物を免疫化することもできる。当該ペプチドの選択に使用した天然又は親ポリペプチドに対する抗体滴定値を、次に例えばＡｕｓｕｂｅｌら、（１９９４−１９９８，ｓｕｐｒａ）の第１１．１６節及び第１１４節に述べられている放射免疫測定法即ちＥＬＩＳＡにより測定することができる。
【０１６０】
次に抗体は、当技術分野において良く知られているように、適切な動物の生物学的液体から硫酸アンモニウム分画法又はクロマトグラフ法でこれを精製する。抗体精製用の模範プロトコルに関しては、Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９９４−１９９８，ｓｕｐｒａ）の第１０．１１節及び第１１．１３節に述べられている。
【０１６１】
抗体の天然又は親ポリペプチドに対する免疫反応性は、例えばウェスタンブロット法などの適切な手順で、これを測定することができる。
【０１６２】
（機能ブロッカー）
ＳＥＱ  ＩＤ番号２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１に基づくポリペプチドは、アドヘシンの性質を有するものと信じられている。
【０１６３】
事実、これらのポリペプチドは、表面抗原であるＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのアドヘシンといくつかの類似点を有している。
【０１６４】
特に、これらのポリペプチドは、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｎｚａｅのＨｉａタンパク質に対して約６７％の相同性を有し（Ｂａｒｅｎｋａｍｐ，Ｓ及びＳｔ．Ｇｅｍｅ  ＩＩＩ，Ｊ．１９９６  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９：１２１５−１２３３）、また、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＨｓｆタンパク質に対して７４％の相同性を有している（Ｓｔ．Ｂｅｍｅ  ＩＩＩ，Ｊ．ら、１９９６，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７８：６２８１−６２８７；及び米国特許第５，６４６，２５９号）。これらの比較結果から、ＧＡＰプログラムを使用し、その間隙ウェイトを３、長さウェイトを０．０１とした（Ｄｅｖｅｒａｕｘ，１９８４，ｓｕｐｒａ）。これらタンパク質の配列は図６に示した。この図から、これらポリペプチド機能の中断は治療効果に大きく貢献しているものと考えられる。ポリペプチド機能が中断されていることにより、髄膜炎菌が細胞に付着し、これに侵入する作用が防止されると考えられるからである。当該機能中断に影響を与える方法に関しては、いくつかの方法が考えられる。
【０１６５】
例えば、細胞表面はＳＥＱ  ＩＤ番号２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１のポリペプチドと相互作用を有するが、当該細胞表面でレセプターをブロックする化学反応部分又はポリペプチドなどの部分を患者に投与することができる。これらが感染性の微生物とレセプターサイトを求めて競争する。このような細胞表面部分を、例えば本発明のポリペプチド、特にフラグメント、又はこれらと同等な機能を有する成分並びに模倣物で構成させることができる。
【０１６６】
「模倣物」という用語は、本明細書において、タンパク質又はペプチドの特定機能領域に似せて設計した化学構造を表す用語である。抗イディオタイプの抗体は、バクテリアが細胞表面に結合する作用をブロックする作用を有しているので、この抗イディオタイプの抗体を上記抗体に対抗して育成し、これを使用することもできる。
【０１６７】
或いは、ＳＥＱ  ＩＤ番号２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１に基づくポリペプチド中において、レセプター結合サイトと相互作用を有する部分は、細胞の髄膜炎菌による感染を有効に阻止することができる。このような部分を、ブロック性抗体、ペプチド又はその他化学反応部分で構成させることができる。
【０１６８】
このような部分、その中で当該部分が医薬品として使用できる担体と結合しているような医薬品組成物、及び髄膜炎菌が感染した患者をこのような部分又は組成物を投与することにより治療する方法は、全て本発明の側面を形成するものである。
【０１６９】
本発明のポリペプチドは、上記の方法において、これを化合物のスクリーニングに使用することもできる。例えば、本発明のポリペプチドを標識と結合させ、これを試験対象の反応試薬の存在下で細胞培養物に暴露することができる。次に、当該標識化ポリペプチドの細胞表面結合を阻止する当該反応試薬の能力を観察することができる。このようなスクリーニングにおいて、標識化ポリペプチドを、Ｅ．ｃｏｌｉのような微生物に対して直接使用することもできる。或いは、髄膜炎菌自体を操作して、ポリペプチドの検出可能な修飾形態を発現させることもできる。当該タンパク質の第３級構造が、野性型菌の中で発現した第３級構造に一層似ている可能性が高いので、操作髄膜炎菌株をこのようにして使用する方法が好ましい。
【０１７０】
本発明を容易に理解し且つ実施できるように、いくつかの優先態様について下記に述べることとする。但し、これらの優先態様により、本発明の範囲に限定が加えられるようなことがあってはならない。
【０１７１】
（実施例１）
（分子のクローニングおよびサブクローニングならびにｈｉａＮｍ変異体の構築）
ｈｉａＮｍ遺伝子は当初、標準的な方法を用いたＰＣＲ増幅によって単離された。
【０１７２】
簡単に説明すると、大腸菌のＡＩＤＡ−Ｉタンパク質の相同体に関するわれわれのこれまでの研究により（ジェニングス（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｍ．）ら、１９９５、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，１９：３９１〜４０７、ピーク（Ｐｅａｋ，Ｉ．）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ印刷中）、われわれは相同性研究を行い、ＭＣ５８Ｃ３のゲノムをシークエンシングするためのプロジェクト（ゲノム研究所、（ｆｔｐ：／／．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｄａｔａ／ｎ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ／）からの予備的なデータにおいて当該配列を同定し、オリゴヌクレオチドＡ３Ａ（５’−ＴＴＴＧＣＡＡＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＡ−３’、配列番号：２８）および３ＡＢ（５’−ＴＡＴＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＡＴＣＧＧ−３’、配列番号：２９）を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって相同性領域を増幅した。
【０１７３】
得られた４４９塩基対（ｂｐ）産物をｐＴ７Ｂｌｕｅにクローニングして、プラスミドｐＮＭＡＩＤＡ３を作製した。
【０１７４】
完全長の遺伝子をクローニングするために、さらにオリゴヌクレオチドをデザインして逆ＰＣＲ反応において用いた。
【０１７５】
これらのオリゴヌクレオチドはＡ３Ｃ（配列番号：３０）およびＡ３Ｄ（配列番号：３１）であり、それぞれ、Ａ３Ａ（配列番号：２８）およびＡ３Ｂ（配列番号：３１）の相補的配列に相当する。
【０１７６】
この反応の鋳型は、ＥａｇＩで制限酵素消化して自己ライゲーションしたＭＣ５８の染色体ＤＮＡであった。
【０１７７】
得られた３ｋｂｐのＰＣＲ産物をベクターｐＣＲＩＩ（インビトロゲン社）にクローニングし、プラスミドｐｉＥａｇＡ３を生じた。これをＥａｇＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、クローニングされたＤＮＡを含む１．４ｋｂｐおよび１．６ｋｂｐの得られた断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ、Ｍ１３ｍｉｎｕｓ（ストラタジーン社）にクローニングすると、ｐｉＥａｇＡ３．８およびｐｉＥａｇＡ３．９が得られた。プラスミドｐＨｉａＮｍは、配列番号：１のそれぞれヌクレオチド１１３〜１３３位および２１０２〜２０８５位に対応するオリゴヌクレオチドプライマーＨｉａＮｍＰ（５’−ＴＴＡＧＡＴＴＣＣＡＣＧＴＣＣＣＡＧＡＴＴ−３’、配列番号：２２）およびＨｉａＮｍ：Ｍ（５’−ＣＴＴＣＣＣＴＴＣＡＡＡＣＣＴＴＣＣ−３’、配列番号：２３）を用いて、ｈｉａＮｍおよびそれに対する配列５’および３’をＰＣＲ増幅し、産物をｐＴ７Ｂｌｕｅにクローニングすることによって産生した。プラスミドｐＨｉａＮｍ△Ｋａｎは、配列番号：１のヌクレオチド６８０位に対応するｐＨｉａＮｍの独自のＢｇｌＩＩ部位にカナマイシン抵抗性カセットを挿入することによって作製した。カナマイシン抵抗性カセットはＢａｍＨＩによってｐＵＣ４Ｋａｎ（ファルマシア社）から切り出した。ｐＨｉａＮｍ△Ｋａｎを、１０％加熱処理ウマ血液を加えた（「ＢＨＩプレート」）脳心臓輸液寒天（アキュメディア・マニュファクチュアラーズインク）上で細菌をプラスミドＤＮＡと共に３７℃で５％ＣＯ２において３時間インキュベートすることによって髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓ）株ＭＣ５８に形質転換した。単一のコロニーを新鮮な選択培地上に取り出し、増殖させて、今後の研究に用いた。この株においてｈｉａＮｍ遺伝子が破壊されていることは、配列番号：１のヌクレオチド２７６〜２０５４位に対応するプローブを用いてサザンブロットによって確認した。
【０１７８】
（実施例２）
（ヌクレオチド配列分析）
ヌクレオチド配列分析は、製造元の説明書（パーキン・エルマー社）に提案されているように、モデル３７３ａ自動シークエンサー（アプライド・バイオシステムズ社）と共に、アンプリタックＤＮＡポリメラーゼＦＳを備えたプリズムダイ・ターミネーター・シークエンシングキットまたはビッグダイ・ターミネーター・シークエンシングキットを用いて実施した。それぞれの株について、図１に示すように、および配列番号：１のヌクレオチド２３０〜２４７位および２１１４〜２０９７位に対応する、プライマーＨｉａＮｍ５’Ａ２：５’−ＣＣＡＡＡＣＣＣＣＧＡＴＴＴＡＡＣＣ−３’（配列番号：２６）およびＨｉａＮｍ３’Ａ：５’−ＡＡＴＣＧＣＣＡＣＣＣＴＴＣＣＣＴＴＣ−３’（配列番号：２７）を用いて、異なる３つの独立したＰＣＲ反応においてｈｉａＮｍを増幅し、得られた産物を精製してプールした。これを両方の鎖を直接シークエンシングするための鋳型として用いた。データはＧＣＧプログラム（デベロウ（Ｄｅｖｅｒａｕｘ）ら、（１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，３８７〜３９５）およびＡｓｓｅｍｂｌｙＬＩＧＮ（オックスフォード・モレキュラー社）を用いて分析した。配列を完成させるために必要に応じて、幾つかのオリゴヌクレオチドを作製した。１０株のｈｉａＮｍの配列を配列番号：１、３、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０に示し、それらの遺伝子の導出アミノ酸配列を配列番号：２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１に示す。
【０１７９】
これらの株からのｈｉａＮｍを比較すると、それらがＭＣ５８のｈｉａＮｍと９０〜９９％同一性を有することが示された。さらに、ＭＣ５８のｈｉａＮｍは、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のｈｉａおよびｈｓｆと６２％および６８％相同である
【０１８０】
しかし、調べた株において、ｈｉａＮｍは１７７０〜１８００ｂｐの長さである。これは、長さがそれぞれ３２９４および７０５９ｂｐであるｈｉａおよびｈｓｆとは著しく異なる。
【０１８１】
ｈｉａＮｍの予想されるポリペプチド、ＨｉａＮｍはまた、下痢誘発性の大腸菌株２７８７（Ｏ１２６：Ｈ２７）の広汎な接着に関係するアドヘシンであるＡＩＤＡ−Ｉ、ＨＭＷ１、もう一つのヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）アドヘシン、ＵｓｐＡ１、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｔｈａｌｉｓ）の高分子量タンパク質およびフレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）の組織浸潤に関係するＳｅｐＡを含む幾つかの他の細菌タンパク質とも相同性を示す（ベンズ＆シュミット（Ｂｅｎｚ，Ｉ．ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．Ａ．）、１９９２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ６：１５３９〜１５４６、バレンカンプス＆ライニンガー（Ｂａｒｅｎｋａｍｐｓ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｅｉｎｉｎｇｅｒ，Ｅ．）、１９９２、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ６０：１３０２〜１３１３、アエビ（Ａｅｂｉ，Ｃ．）ら、１９９７、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ６５：４３６７〜４３７７、ベンジェロウン・トウイミ（Ｂｅｎｊｅｌｌｏｕｎ−Ｔｏｕｉｍｉ，Ｚ．）ら、１９９５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１７：１２３〜１３５）。これら（および他のタンパク質）に対する相同性は、ＨｉａＮｍの最初のアミノ酸５０個に対して起こる。この配列の分析から、予想されるシグナル配列が存在することが判明し、調べた全てのＨｉａＮｍ配列における切断部位はアミノ酸５０位であった。そのような長いシグナル配列はグラム陰性菌の外膜に存在するタンパク質に一般的である（ヘンダーソン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｉ．）ら、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ６：３７０〜８）。それに対してＨｉａＮｍの最初のアミノ酸５０個が相同である上記のタンパク質は全て、「自己輸送型」の外膜タンパク質ファミリーに属する（ヘンダーソン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｉ．）、上記）。このことは、ＨｉａＮｍが髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜に存在することを強く示唆している。
【０１８２】
（実施例３）
（サザンブロット分析）
サザンブロット分析は標準的な技法を用いて実施した（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上記、アウスユベール（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、上記）。簡単に説明すると、ゲノムＤＮＡをいくつかの血清群の髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）７０株から調製して、制限酵素消化して、アガロースゲル上で電気泳動によって分離した後に、ナイロンメンブレンに毛細管によって移した。これらのメンブレンを標識したプローブとハイブリダイズした。用いたプローブは配列番号：１のヌクレオチド２７６〜２０５４位に対応し、株ＭＣ５８のｈｉａＮｍの完全なオープンリーディングフレームを含む。これを、製造元の説明書（ベーリンガー・マンハイム社）に従ってＤＩＧ（ジゴキシゲニン）で標識した。ストリンジェントな洗浄を行った（２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で２２℃で５分の洗浄を２回行った後、６８℃、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で３０分の洗浄を２回行った）。ハイブリダイゼーションは、製造元が推奨するように、ニトロブルー・テトラゾリウム／ブロモクロリル・インドリル・フォスフェート（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）を用いて、比色定量によって検出した。調べた全ての株にシグナルを検出した（例えば、図２）。プロトタイプ株ＭＣ５８のほかに、以下の株を調べた：
【０１８３】
【表４】
0004651703.tif 000006
Ａ髄膜炎菌に関する世界保健機構基準研究共同研究センター、オスロ、ノルウェー
Ｂ髄膜炎菌基準研究所公衆衛生研究サービス、マンチェスター、イギリス
Ｃブリスベーン病院、現在はＭ．Ｐ．ジェニングス（Ｍ．Ｐ．Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）の株コレクション、クイーンズランド大学、微生物学、ブリスベーン、オーストラリア。
【０１８４】
（実施例４）
（ＭＢＰ−ＨｉａＮｍの発現および部分精製）
マルトース結合タンパク質とＨｉａＮｍとの融合（ＭＢＰ−ＨｉａＮｍ）を含むタンパク質を発現させるプラスミドベクターを構築した。プラスミドｐＨｉａＭＢＰは、プライマーＨｉａｎｍ−ＭＢＰＡ５’−ＧＧＴＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴＡＴＡＣＣＧＣＡＴ−３’（配列番号：２４）およびＨｉａＮｍ−ＭＢＰＢ  ５’−ＴＣＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＧＣＣＣＴＴＡＣＣＡＣＴＧＡＴＡＡＣ−３’（配列番号：２５）を用いて、ＨｉａＮｍをＭＣ５８から増幅することによって作製した。これらのプライマーは、クローニングを容易にするために髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株ＭＣ５８のＨｉａＮｍの開始および停止コドンならびに遺伝子操作された制限部位を含む。プラスミド制限マップおよびオリゴヌクレオチドの位置を図１に示す。得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素消化プラスミドｐＭＡＬＣ２（ニューイングランド・バイオラブス）にライゲーションし、得られたプラスミドｐＨｉａＭＢＰ（図１参照）を大腸菌株ＤＨ５αに再度導入した。ｐＨｉａＭＢＰを含むこの大腸菌株を、製造元（ニューイングランド・バイオラブス）の推奨条件でＨｉａＮｍ−ＭＢＰ融合タンパク質を発現するように誘導した。ｐＨｉＡＭＢＰを含む培養からの細胞抽出物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、製造元の説明書に従って融合タンパク質をミニゲル・エレクトロエリューター（バイオラド社）を用いた溶出によって部分精製した。ウサギ抗ＭＢＰ血清を用いたウェスタンブロットによって、ＨｉａＮｍ−ＭＢＰ融合タンパク質を含む分画を検出した（ニューイングランド・バイオラブス）。ＨｉａＮｍ−ＭＢＰ融合タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後にクーマシー染色を行って決定し、回収されたタンパク質の量をＢＣＡアッセイ（シグマ社）または波長２８０ｎｍでの吸光度によって推定した。
【０１８５】
（実施例５）
（ポリクローナル血清の作製）
実施例４において得られた部分精製したＨｉａＮｍ−ＭＢＰ融合タンパク質を用いて、ウサギにおいてポリクローナル血清を作製した。溶出したＨｉａＮｍＭＢＰ融合タンパク質の試料を滅菌燐酸緩衝生理食塩液、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）（シグマ社）に対して透析した。次にこれをアジュバント（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ、シグマ社）と共に混合して、５０〜１５０μｇ／ｍｌの濃度でニュージーランドホワイトウサギ２羽に２週間間隔で接種した。血液をこれらのウサギから採取した。室温で１時間凝固させた後血清を抽出して、４℃で一晩インキュベートした後、４℃で４０００×ｒｐｍで遠心した。上清を回収して、再度遠心した。血清をアリコットにして−８０℃で保存した。得られた血清を殺細菌アッセイおよびウェスタンブロットに用いた（下記参照）。
【０１８６】
得られた血清の特異性を調べるために、ウェスタンブロット分析を行った。簡単に説明すると、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株ＭＣ５８のタンパク質およびＭＣ５８△ＨｉａｎｍをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動によって分離した後、セミドライ・ブロッター（バイオラド社）を用いてニトロセルロースメンブレンに電気泳動によって移した。
【０１８７】
次にこれらを血清およびアルカリフォスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ（シグマ社）と共に連続的にインキュベートした後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（シグマ社）によって比色定量によって検出した。
【０１８８】
これらの実験は、ＭＣ５８に対して特異的であって、ＭＣ５８においてバンドを検出するがＭＣ５８△ＨｉａＮｍでは検出されない抗体が、ＨｉａＮｍ−ＭＢＰ融合タンパク質によって誘発されることを証明した（図４参照）。
【０１８９】
ＨｉａＮｍの導出ポリペプチドの予想される分子量は６２．３ｋＤａである。血清によって検出されるバンドは１５０ｋＤａを超える見かけの分子量に移動する。文献に報告される相同な「自己輸送型」タンパク質の少なくとも３個が同様に、そのような異常な移動を示す：モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）の高分子量の外膜タンパク質ＵｓｐＡ１およびＵｓｐＡ２はそれぞれ、予想分子量が６２．５ｋＤａおよび８８．３ｋＤａであるが、それぞれ８５ｋＤａおよび１２０ｋＤａに移動し、ＵｓｐＡ複合体は３５０ｋＤａと７２０ｋＤａの間に移動した（アエビ（Ａｅｂｉ，Ｃ．）ら、１９９７、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６５：４３６７〜４３７７、クリングマン＆マーフィー（Ｋｌｉｎｇｍａｎ，Ｋ．Ｌ．ａｎｄ  Ｍｕｒｐｈｙ，Ｔ．Ｆ．）、１９９４、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６２：１１５０〜１１５５）。同様に、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のＨｉａは予想分子量１１６ｋＤａであるが、ファージに発現させると、Ｈｉａは２００ｋＤａ以上に移動する（バレンカンプ＆セントジェムＩＩＩ（Ｂａｒｅｎｋａｍｐ  ａｎｄ  Ｓｔ．Ｇｅｍｅ  ＩＩＩ，Ｊ．）、１９９６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９：１２１５〜１２３３）。
【０１９０】
ＨｉａＮｍが髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜に会合しているか否かを確認するために、本質的にこれまでの記述通りに（ファンデルレイ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｙ，Ｐ．）ら、１９９１、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５９：２９６３〜７１）外膜複合体（ｏｍｃ）を調製した。簡単に説明すると、１０％加熱ウマ血液ＢＨＩプレートを加えた脳心臓輸液寒天（アキュメディア・マニュファクチャラーズインク）上で、細菌を一晩増殖させ、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０に再浮遊させ、熱によって殺菌して、超音波処理した後膜を破壊した。細胞の破片を１０，０００×ｇ（ｒｃｆ、相対遠心力）での遠心によって除去し、上清を５０，０００×ｇで再度遠心した。このペレットを１％サルコシル／１０ｍＭトリスｐＨ８．４に再浮遊させ、１０，０００×ｇで遠心した。上清を７５，０００×ｇで遠心して、ペレットをトリス、ｐＨ８．４に再浮遊させた後、波長２８０ｎｍで分光光度分析によって定量した。外膜タンパク質を含むサルコシル不溶性分画のアリコット（Ａ２８０＝３．７５の５０μｌ）に、上記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン・ブロットを行った。図４に示す結果は、抗ＨｉａＮｍＭＢＰ抗血清との反応性が野生型ＭＣ５８について認められるが、ｈｉａＮｍが不活化されているＭＣ５８△ＨｉａＮｍでは認められないことを証明している。細胞全体の試料と、ＭＣ５８培養において同量の総タンパク質を含むｏｍｃ試料との間に認められた抗ＨｉａＭＢＰ血清との反応性の増加は、ＨｉａＮｍが膜に会合していることと一致する。
【０１９１】
（実施例６）
（殺細菌アッセイ）
抗ＨｉａＭＢＰ抗血清がＨｉａＮｍに特異的な殺細菌抗体を含むか否かを調べるために、野生型ＭＣ５８およびＭＣ５８△ＨｉａＮｍに関して殺細菌アッセイを行った。このアッセイは、ホーゲルホウト（Ｈｏｏｇｅｒｈｏｕｔ）（１９９５、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６３：３４７３〜３４７８）らが記述した方法を改変して実施した。簡単に説明すると、ＭＣ５８およびＭＣ５８△ＨｉａＮｍをＢＨＩプレート上で３７℃で５％ＣＯ２で一晩増殖させた。この一晩培養から得た細菌を同じ条件で４〜６時間サブ培養した後、ＰＢＳ１ｍＬに浮遊させた。０．２Ｎ  ＮａＯＨ／１％ＳＤＳ中での試料の溶解、およびＡ２６０＝１＝１０９ｃｆｕ／ｍＬである、波長２６０ｎｍでの吸光度によって細菌数を推定した。細菌浮遊液をＰＢＳ中で約１０５ｃｆｕ／ｍｌに調節した。調べるウサギ血清を５６℃で４５分熱不活化した。
【０１９２】
４週齢のニュージーランドホワイトウサギからの血清をプールして、補体源として用いた（クイーンズランド大学、中央動物飼育施設）。
【０１９３】
アッセイは滅菌のポリスチレン平底９６ウェルマイクロタイタープレートで実施した。それぞれのウェルの総容積は２４μｌであった：ＰＢＳで２倍連続希釈した血清１２μｌおよび細菌浮遊液６μｌ（細菌３００〜９００個を含む）。血清および細菌を室温で１０分インキュベートしてから、８０％補体のＰＢＳ溶液６μｌを加えた（最終濃度２０％ｖ／ｖ）。
【０１９４】
対照はａ）ＰＢＳ、細菌および補体、ｂ）ＰＢＳ、細菌および血清であった。
【０１９５】
全ての成分を加えて混合した後、各対照ウェルからの７μｌアリコットをＢＨＩプレートに分散させた。次にマイクロタイタープレートを５％ＣＯ２中で３７℃で６０分インキュベートした。このインキュベーション終了後、各ウェルからの７μｌアリコットをＢＨＩプレート上に分散させた。次に、全てのＢＨＩプレートを５％ＣＯ２中で３７℃で１４〜１８時間インキュベートして、細菌コロニーを計数した。血清の殺細菌作用は少なくとも９０％の細菌が殺される最高希釈の逆数として報告される。用いた血清は、上記の実施例５に報告するようにウェスタンブロット実験に関して用いた場合と同じウサギおよび同じ試験から採取した。これらの実験は、野生型株ＭＣ５８と比較してＭＣ５８△ＨｉａＮｍに対する殺細胞の力価が減少していること（約３倍、表４）を一貫して示し、このことは抗ＨｉａＭＢＰ抗血清がＨｉａＮｍに対して特異的である殺細菌抗体を含むことを示した。
【０１９６】
【表５】
0004651703.tif 000007
【０１９７】
（考察）
反復ＤＮＡは、幾つかの病原性細菌においてビルレンス決定因子に関連している。そのような反復ＤＮＡモチーフを用いたサザンブロットにより、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株ＭＣ５８にはこのモチーフを含む少なくとも３つの座が存在することが判明した（ピーク（Ｐｅａｋ，Ｉ．）ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１３７：１０９〜１１４）。これらの遺伝子をクローニングして、座に関連するこれらの反復配列の２つの配列分析（ｎｍｒｅｐ２およびｎｍｒｅｐ３）を行ったところ、アミノ酸約６７０個のオープンリーディングフレームが存在することは判明した（ジェニングス（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）ら、１９９５、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，１９：３９１〜４０７；ピーク（Ｐｅａｋ，Ｉ．）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，印刷中）。これらは、互いに相同性を示し、大腸菌のアドヘシンＡＩＤＡ−１のカルボキシ末端と相同性を示した。ＡＩＤＡ−１は長さがアミノ酸１２８６個である。カルボキシ末端の領域は推定の外膜輸送ドメインとなり、成熟タンパク質のアミノ末端ドメインはアドヘシンドメインとなる。アミノ末端ドメインは推定の輸送ドメインを通じて膜を通過し、パッセンジャードメインと呼ばれる。
【０１９８】
Ｎｍｅｐ２およびＮｍｅｐ３はＡＩＤＡ−１の輸送物質ドメインとの配列相同性を有するため、それらは膜の孔を形成すると考えられる。
【０１９９】
Ｎｍｒｅｐ２およびＮｍｒｅｐ３はＡＩＤＡ−１の大きさの約半分であり、ＡＩＤＡ−１の膜貫通ドメインと相同である。
【０２００】
われわれは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）にＡＩＤＡ−１のアミノ末端ドメインとの相同性を有する座が存在するという仮説を立てた。われわれは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株ＭＣ５８Ｃ３をシークエンシングするプロジェクトからのデータにおいてそのような相同体を探索し、それが大腸菌のＡＩＤＡ−１と相同性であることから、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）株Ｒｄ（ＨＩ１７３２）においてＡＩＤＡ−１と呼ばれる遺伝子と相同性を有する一つの領域を発見した（フライシュマン（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ）ら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：４９６〜５１２）。上記の相同性に関して、出願人はさらに研究することにした。
【０２０１】
遺伝子は当初、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＭＣ５８  ３のｇｎｍａａ８４ｒと呼ばれる４７１塩基対の断片に対応するＤＮＡのＰＣＲ増幅によって単離され、配列が確認された。さらにＰＣＲ実験を行うと、より大きい断片を増幅することができた。これらをクローニングして、図１に示すように配列分析を実施した。遺伝子は大腸菌のＡＩＤＡ−１のアミノ末端領域との相同性を示し、これが髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）における第３のＡＩＤＡ−１相同体を表したことから、われわれは、これをａｉｄａ３と呼んだ（ｎｍｒｅｐ２およびｎｍｒｅｐ３）。以降、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）からさらに２つの遺伝子ｈｉａおよびｈｓｆの発見が発表され（バレンカンプ＆セントジェム（Ｂａｒｅｎｋａｍｐ，Ｓ．ａｎｄ  Ｓｔ．Ｇｅｍｅ  ＩＩＩ，Ｊ．）ら、１９９６、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７８：６２８１〜６２８７）、それに対してａｉｄａ３はより類似している。したがって、われわれはこの遺伝子をｈｉａＮｍと命名した。（ＨＩ１７３２、当初ＡＩＤＡ−１の相同体として同定されたインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）遺伝子も、バレンカンプ＆セントジェム（Ｂａｒｅｎｋａｍｐ，Ｓ．ａｎｄ  Ｓｔ．Ｇｅｍｅ  ＩＩＩ）の報告を考慮してｈｉａと再度命名されている）。
【０２０２】
明細書を通じて、目的は、本発明をいずれか１つの態様または特定の集団の特徴に制限することなく、本発明の好ましい態様を記述することである。したがって、当業者は、本開示を読むことによって、例示した特定の態様において様々な改変および変更を行うことができ、それらも本発明の範囲から逸脱しないことを理解するであろう。そのような改変および変更は全て、添付の請求の範囲内に含まれると解釈される。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】プラスミドマップおよびクローニング法を表したものである。プライマーＡ３ＡおよびＡ３Ｂ（各々、配列番号：２８および２９）は、初期の配列データからＡＩＤＡ−Ｉの相同体として同定されるＭＣ５８（後にＴＩＧＲによって放出される）から増幅するために用いられた。ＰＣＲ産物はクローン化され、ｐＮＭＡＩＤＡ３として与えられた。プライマーＡ３Ｃ（配列番号：３０）およびＡ３Ｄ（配列番号３１）は、インバースＰＣＲで用いられ、ｈｉａＮｍを含む３ｋｂｐ  ＥａｇＩフラグメントを増幅した。この産物はクローン化され、ｐｉＥＡＧＡ３を与えた。ｐｉＥＡＧＡ３はサブクローン化され、ｐｉＥａｇＡ３．８およびｐｉＥａｇＡ３．９を与えた。プライマーＨｉａＮｍ：ＭおよびＨｉａＮｍ：Ｐ（各々、配列番号：２２および２３）はＭＣ５８からの連続領域を増幅し、産物はｐＨｉａＮｍを造るためにクローン化された。プライマーＨｉａ−ＭＢＰＡ（配列番号２４）およびＨｉａ−ＭＢＰＢ（配列番号２５）は、ｈｉａＮｍのオープンリーディングフレームを増幅するために用いられ、産物はｐＭＢＰ−ＨｉａＮｍを造るためにｐＭＡＬＣ２にクローン化された。
【図２】多くの髄膜炎菌株のゲノムＤＮＡのサザンブロットである。２Ａ：セログループＢ株。レーン１  ＰＭＣ２８，レーン２  ＰＭＣ２７，レーン３  ＰＭＣ２５，レーン４  ＰＭＣ２４，レーン５  ＰＭＣ１６，レーン６  ＰＭＣ１３，レーン７  ＰＭＣ１２，レーン８分子量スタンダード，レーン９  ２９７０，レーン１０  １０００，レーン１１  ５２８，レーン１２  ＳＷＺ１０７，レーン１３  Ｈ４１，レーン１４  Ｈ３８，レーン１５  ＮＧＨ３６，レーン１６Ｈ１５，レーン１７ＮＧＥ２８  ２Ｂ：Ｂ以外セログループ株。レーン１  ＰＭＣ３，レーン２  ＰＭＣ１７，レーン３  ＰＭＣ２０，レーン４  ＰＭＣ２３，レーン５  ＰＭＣ８，レーン６  ＰＭＣ９，レーン７  ＰＭＣ１１，レーン８  ＰＭＣ１４，レーン９  ＰＭＣ１８，レーン１０  ＰＭＣ２１，レーン１１  ＰＭＣ２９，レーン１２  分子量スタンダード，レーン１３  ＰＭＣ１９，レーン１４  ＰＭＣ１，レーン１５  ＰＭＣ６，レーン１６  ＰＭＣ１０，レーン１７  ＰＭＣ２２，レーン１８  ＰＭＣ２６，レーン１９  ＰＭＣ２。分子量マーカーはキロベースペア（ｋｂ）を示す。ゲノムＤＮＡは配列番号１のｎｔｐ２７６−２０５４に対応するプローブとハイブリダイズした。
【図３】ＭＢＰ−ＨｉａＮｍのクーマシー染色ゲルを示す。ＩＰＴＧでの誘導後のｐＭＡＬＣ２（レーン２）またはｐＭＢＰ−ＨｉａＮｍ（レーン３）含有細胞。レーン１分子量スタンダード（ｋＤａ）。矢はＭＢＰおよびＭＢＰ−ＨｉａＮｍを示す。
【図４】ウサギ免疫血清とインキュベートしたＭＣ５８およびＭＣ５８△ＨｉａＮｍタンパク質のウェスタンブロットである。レーン１；ｋＤａを示す分子量スタンダード，レーン２ＭＣ５８の全細胞タンパク質，レーン３ＭＣ５８△ＨｉａＮｍの全細胞タンパク質，レーン４ＭＣ５８のＯＭＣプレパレーション，各レーンＡ２８０＝３．７５のタンパク質サスペンジョンの５０μＬを含む。
【図５】図４でウェスタンブロットされたゲルに平行して走らせたクーマシー染色ゲルを示す。レーンは図４と同じである。
【図６】ＨｉａＮｍ，Ｈｉａ，ＨｓｆのポリペプチドのＰＩＬＥＵＰアラインメントプログラムを用いる配列比較を示す。
【図７】髄膜炎菌１０株からのＨｉａＮｍのポリペプチドのＰＩＬＥＵＰプログラムを用いる配列比較を示す。
【図１】
0004651703.tif 000008
【図２】
0004651703.tif 000009
【図３】
0004651703.tif 000010
【図４】
0004651703.tif 000011
【図５】
0004651703.tif 000012
【図６−１】
0004651703.tif 000013
【図６−２】
0004651703.tif 000014
【図６−３】
0004651703.tif 000015
【図６−４】
0004651703.tif 000016
【図６−５】
0004651703.tif 000017
【図７−１】
0004651703.tif 000018
【図７−２】
0004651703.tif 000019
【図７−３】
0004651703.tif 000020
【図７−４】
0004651703.tif 000021