(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト野生型Ｐｌｋ蛋白質のアミノ酸配列において、N496S、R512W、S487G、P509S、D457G、E569Kから選択される１つ以上の変異を有し、かつその変異がHsp90蛋白質との親和性を野生型と比較して低下させる変異であるPlk蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載のPlk蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項１に記載の蛋白質又は請求項２に記載の遺伝子をインビトロで検出する工程を含む悪性腫瘍細胞の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、変異を有するPlk蛋白質及び該蛋白質をコードする遺伝子に関するものである。
【従来の技術】
【０００２】
ハエ細胞の分裂期において活動するPolo遺伝子が報告されている。この遺伝子に抗体を結合させてその活性を失わせると、細胞分裂の異常が観察される (Lane, H.A. and Nigg, E.A., J. Cell Biol., 135, 1701-1713 (1996))。また、Polo遺伝子に類似のヒト遺伝子として、603アミノ酸配列の蛋白質をコードする1809塩基からなるコード領域を含む2137塩基（全cDNA配列）のPlk遺伝子が知られている(Golsteyn, R.M., et al., J. Cell Sci., 107, 1509-1517(1994); Hamanaka, R., et al., Cell Growth Differ., 5, 249-257 (1994))。
【０００３】
Plk遺伝子はリン酸化酵素であり、Ｎ末端にリン酸化部位（キナーゼドメイン）を有している。また、polo-boxと呼ばれる領域を遺伝子中央に有しており、このドメインが蛋白質の局在に関与していることが示されている(Lee, K.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14360-14365(1999))。さらに、Plk蛋白質の分解にはプロテアソームが関与しており(Ferris, D.K., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 252, 340-344 (1998))、Plk蛋白質が細胞骨格であるチューブリンと結合していることが示されている(Feng, Y., et al., Biochem. J., 339, 435-442 (1999))。このようにPlkは様々な調節を受けて細胞周期進行を制御していると考えられている。しかしながら、Plk遺伝子の生理的役割や機能などについては、依然として不明な点が多く、これらの解明が基礎科学研究分野、生物学的分野、医薬品分野などにおいて切望されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明者らは、Plk蛋白質の生理的機能を種々研究するうち、Plk蛋白質の安定化には、さまざまなタンパク質分子と相互作用する分子シャペロンであるHsp90蛋白質が関与していること、及びHsp90蛋白質はPlk蛋白質のC末端ドメインに結合してPlk蛋白質を安定化することを見出した。本発明者らはさらに研究を続けたところ、悪性腫瘍細胞中にC末端ドメインに変異を有するPlk蛋白質が存在しており、この変異Plk蛋白質ではHsp90蛋白質との親和性が低下し、その結果としてPlk蛋白質が不安定化されていることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
【０００５】
すなわち、本発明は、Plk蛋白質のアミノ酸配列の439番目から603番目のアミノ酸配列により特定されるC末端ドメインに変異を有し、かつその変異がHsp90蛋白質との親和性を低下させる変異であるPlk蛋白質、及び該Plk蛋白質をコードする遺伝子を提供するものである。このPlk蛋白質は細胞内においてHsp90蛋白質により安定化されないため、このPlk蛋白質をコードする遺伝子を有する細胞はその細胞内に生理学的必要量のPlk蛋白質を供給することができず、癌化などの細胞異常を引き起こす。本発明の一態様として、悪性腫瘍形成に関与する上記Plk蛋白質又は上記Plk遺伝子が提供される。
【０００６】
また、本発明により、Plk蛋白質のアミノ酸配列の439番目から603番目のアミノ酸配列により特定されるC末端ドメインに変異を有し、かつその変異がHsp90蛋白質との親和性を低下させる変異であるPlk蛋白質、又は該Plk蛋白質をコードする遺伝子を検出する工程を含む、異常細胞の検出方法；
異常細胞の検出のためのPlk蛋白質のアミノ酸配列の439番目から603番目のアミノ酸配列により特定されるC末端ドメインに変異を有し、かつその変異がHsp90蛋白質との親和性を低下させる変異であるPlk蛋白質、又は該Plk蛋白質をコードする遺伝子の使用；並びに、
Plk蛋白質のアミノ酸配列の439番目から603番目のアミノ酸配列により特定されるC末端ドメインに変異を有し、かつその変異がHsp90蛋白質との親和性を低下させる変異であるPlk蛋白質、又は該Plk蛋白質をコードする遺伝子の腫瘍マーカーとしての使用が提供される。異常細胞としては、悪性腫瘍細胞を挙げることができ、この異常細胞の検出により悪性腫瘍の診断を行うことができる。上記Plk遺伝子の使用形態には、該遺伝子と相互作用可能な遺伝子の検出などが含まれる。
【０００７】
さらに、本発明により、上記Plk蛋白質又は上記Plk蛋白質の相同物であって、ヒト以外の哺乳類動物において機能可能な相同物が提供される。また、本発明により、Plk蛋白質のアミノ酸配列の439番目から603番目のアミノ酸配列により特定されるC末端ドメインに変異を有し、かつその変異がHsp90蛋白質との親和性を低下させる変異であるPlk蛋白質をコードする遺伝子を細胞に導入する工程を含む、異常細胞の作出方法、及び上記方法により作出された異常細胞が提供される。異常細胞としては、悪性腫瘍細胞を挙げることができ、この異常細胞の作出により、抗腫瘍剤のスクリーニング系を確立することが可能になる。
【０００８】
別の観点からは、本発明により、Plk蛋白質のアミノ酸配列の439番目から603番目のアミノ酸配列により特定されるC末端ドメインに変異を有し、かつその変異がHsp90蛋白質との親和性を低下させる変異であるPlk蛋白質を特異的に認識する抗体、又は該Plk蛋白質をコードする遺伝子を特異的に認識する抗体が提供される。抗体としては、好ましくはモノクローナル抗体を挙げることができ、この抗体を用いて、上記の変異Plk蛋白質又は変異Plk遺伝子を有する悪性腫瘍細胞の検出を行うことができる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のPlk蛋白質は、野生型Plk蛋白質のアミノ酸配列の439番目から603番目のアミノ酸配列により特定されるC末端ドメインに変異を有し、かつその変異がHsp90蛋白質との親和性を低下させる変異であることを特徴としている（以下、本明細書において「変異Plk蛋白質」と呼ぶ場合がある）。また、本発明の遺伝子は、本発明の上記変異Plk蛋白質をコードする遺伝子である（以下、本明細書において「変異Plk遺伝子」と呼ぶ場合がある）。上記変異Plk蛋白質又は上記変異Plk遺伝子をその部分として含む蛋白質又は遺伝子も本発明の範囲に包含される。また、上記変異Plk蛋白質又は変異Plk遺伝子において、C末端ドメインを含む部分ポリペプチド又はC末端ドメインをコードする領域を含む部分ポリヌクレオチドも本発明の範囲に包含される。
【００１０】
野生型Plk蛋白質はGolsteyn, R.M., et al., J. Cell Sci., 107, 1509-1517 (1994); Hamanaka, R., et al., Cell Growth Differ., 5, 249-257 (1994)に記載されており、図４に示したように、N末端側にキナーゼドメイン (53-304)、polo-boxドメイン (410-438)、及びC末端ドメイン (439-603)を有している。本発明の変異Plk蛋白質は上記C末端ドメイン中に１又は２以上のアミノ酸残基による変異を含み、かつ該変異がHsp90蛋白質との親和性を低下させる変異であることを特徴としている。本明細書において、「変異」とは１又は２以上のアミノ酸残基が関与する変異を意味しており、変異には置換、挿入、及び／又は欠失が含まれる。
【００１１】
Hsp90蛋白質については、総説としてBuchner, J., TIBS, 24, 136-141, 1999; 蛋白質 核酸 酵素, 41, 883-887, 1996に詳細に説明されており、種々の蛋白質とHsp90蛋白質の相互作用の確認方法は当業者に周知されている。本明細書の実施例には、野生型Plk蛋白質及び本発明の変異Plk蛋白質とHsp90蛋白質との親和性の検定方法が具体的かつ詳細に記載されているので、当業者はこの方法を参照しつつ、必要に応じてこの方法に適宜の修飾又は改変を加えることにより、本発明のPlk蛋白質においては野生型Plk蛋白質と比べてHsp90蛋白質との親和性が低下していることを容易に確認することが可能である。本明細書において、「親和性の低下」とは実質的な親和性の低下を意味しており、物理化学的な結合力の低下のほか、質的又は量的な相互作用の低下を含むが、いかなる意味においてもこの用語を限定的に解釈してはならない。
【００１２】
本発明の変異Plk遺伝子によりコードされる変異Plk蛋白質の分子量は約64キロダルトンであり、異常細胞、特に悪性腫瘍細胞において特異的に発現されている。この変異Plk蛋白質はHsp90蛋白質との親和性が低下しており、細胞内での安定性に乏しい。その結果、変異Plk遺伝子を有する悪性腫瘍細胞は、細胞内に必要量のPlk蛋白質を確保できない。従って、本発明の変異Plk蛋白質又は変異Plk遺伝子を異常細胞、好ましくは悪性腫瘍マーカーとして検出することにより、異常細胞、好ましくは悪性腫瘍の診断が可能になる。例えば、細胞内における変異Plk蛋白質の発現量を測定することにより細胞の悪性度を検定することができ、体内における変異Plk蛋白質の分布を測定することによって、悪性腫瘍細胞の転移を確認することも可能である。また、上記の変異Plk遺伝子と相互作用可能な遺伝子を検出することにより、悪性腫瘍に関連する遺伝子を特定することが可能になる。
【００１３】
本発明の変異Plk蛋白質又は変異Plk遺伝子は、遺伝子工学の通常の手法により容易に製造することが可能であり（例えば、Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986 ）などを参照できる）、さらに、ヒト以外の哺乳類動物（例えばイヌ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジ、ネコなど）において機能可能な相同物としての蛋白質又は遺伝子も当業者が容易に製造して利用できる。本発明の遺伝子の使用形態の一つとして、例えば、本発明の変異Plk遺伝子を細胞に導入することにより、細胞分裂の異常などを伴う異常細胞を作出することができる。このような異常細胞として悪性腫瘍細胞を人工的に作出することができ、その細胞を抗腫瘍剤のスクリーニングに利用することができる。変異Plk遺伝子の細胞への導入方法は特に限定されず、当業者が利用可能な汎用の方法を適宜利用することができる。遺伝子導入された細胞が変異Plk蛋白質を産生しているか否かは、本明細書の実施例に具体的に記載された方法に従って容易に検定可能である。
【００１４】
具体的には、本発明の変異Plk遺伝子が発現される適当な起源より、常法に従ってcDNAライブラリーを調製し、該ライブラリーから上記遺伝子に特有の適宜のプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより本発明の変異Plk遺伝子を取得できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science, 222, 778 (1983)など〕。cDNAの起源としては、本発明の遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞などが例示できる。また、これらからの全RNAの分離、mRNAの分離や精製、cDNAの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。また、cDNAライブラリーは市販もされており、それらのcDNAライブラリーやマウス新生仔脳cDNAなどを用いることもできる。
【００１５】
変異Plk遺伝子をcDNAライブラリーからスクリーニングする方法も特に制限されず、通常の方法に従って行うことができる。具体的には、例えばcDNAによって産生される蛋白質に対して、該蛋白質の特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するcDNAクローンを選択する方法、目的のDNA配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーションなどやこれらの組合せなどを例示できる。用いられるプローブとしては、変異Plk遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたDNAなどを一般的に使用できるが、既に取得された変異Plk遺伝子やその断片を利用することも好ましい。また、変異Plk遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンス・プライマー、アンチセンス・プライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。
【００１６】
変異Plk遺伝子の取得に際しては、PCR法〔Science, 230, 1350 (1985)〕によるDNA/RNA増幅法が好適に利用できる。ライブラリーから全長のcDNAを得がたい場合には、RACE法〔Rapid amplification of cDNA ends ；実験医学, 12(6),35 (1994)〕、特に5'-RACE法〔M.A.Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,USA., 8, 8998 (1988)〕などの採用が好適である。かかるPCR法の採用に際して使用されるプライマーは、本発明によって明らかにされた変異Plk遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、これは常法に従って合成できる。なお、増幅させたDNA/RNA断片の単離精製は常法に従って行うことができ、例えばゲル電気泳動法などによればよい。また、上記で得られる変異Plk遺伝子又は各種DNA断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)〕やマキサム−ギルバート法〔Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)〕などに従って、また簡便には市販のシークエンスキットなどを用いて、その塩基配列を決定することができる。
【００１７】
このようにして得られる変異Plk遺伝子を用い、例えば該遺伝子の一部又は全部の塩基配列を利用することにより、個体もしくは各種組織における変異Plk遺伝子の発現の有無を特異的に検出することができる。かかる検出は常法に従って行うことができ、例えばRT-PCR-SSCPによる検出法を用いることができる。また、本発明の変異Plk遺伝子を用い、通常の遺伝子工学的手法により該遺伝子の発現産物（変異Plk蛋白質）又はこれを含む蛋白質を容易かつ大量に製造することができる。
【００１８】
本発明の変異Plk蛋白質は、本発明により提供されるPlk遺伝子の配列情報に基づいて、常法の遺伝子組換え技術〔例えば、Science, 224, 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985)；Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983)など参照〕に従って調製することができる。該蛋白質の製造は、より詳細には、該所望の蛋白質をコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えDNA（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的蛋白質を回収することにより行われる。
【００１９】
上記宿主細胞としては、原核生物及び真核生物のいずれをも用いることができる。原核生物の宿主としては、例えば大腸菌や枯草菌といった一般的に用いられるものが挙げられ、好適には大腸菌、とりわけエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K12株に含まれるものを例示できる。また、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、前者としては、例えばサルの細胞であるCOS細胞〔Cell, 23, 175 (1981)〕やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞及びそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77, 4216 (1980)〕などが、後者としては、サッカロミセス属酵母細胞などが好適に用いられるが、これらにに限定される訳ではない。
【００２０】
原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びSD（シャイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、さらに蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えばATG）を付与した発現プラスミドを好適に利用できる。上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えばpBR322、pBR325、pUC12、pUC13などがよく用いられるが、これらに限定されず既知の各種のベクターを利用することができる。大腸菌を利用した発現系に用い得る上記ベクターの市販品としては、例えばｐＧＥＸ −４Ｔ（Amersham Pharmacia Biotech 社）、ｐＭＡＬ −Ｃ２、ｐＭＡｌ −Ｐ２（New England Biolabs社）、ｐＥＴ２１、ｐＥＴ２１／ｌａｃｑ（Invitrogen 社）、ｐＢＡＤ ／Ｈｉｓ（Invitrogen社）等を例示できる。
【００２１】
変異変異Plk遺伝子の発現ベクターとしては、通常の融合蛋白質発現ベクターも好ましく利用できる。該ベクターの具体例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）との融合蛋白質として発現させるための、ｐＧＥＸ（Promega 社）などを例示できる。所望の組換えDNA（発現ベクター）の宿主細胞への導入法及びこれによる形質転換法は特に限定されず、一般的な各種方法を採用することができる。
【００２２】
本発明の変異Plk蛋白質は、その特異抗体を作成するための免疫抗原として好適に利用でき、この抗原を利用することにより、所望の抗血清（ポリクローナル抗体）及びモノクローナル抗体を常法に従って取得することができる。従って、本発明により変異Plk蛋白質を特異的に認識する抗体が提供される。抗体として好ましくは、変異Plk蛋白質の変異部分を特異的に認識し、かつ野生型Plk蛋白質に対して反応性を示さない抗体を挙げることができる。この抗体を用いて、上記の変異Plk蛋白質を有する悪性腫瘍細胞の検出を行うことができる。また、上記抗体は、例えば変異Plk蛋白の精製及びその免疫学的手法による測定や識別などに利用することができる。
【００２３】
例えば、変異Plk蛋白質に対する抗体を用いることによって、野生型Plk及び／又は変異Plkの測定が可能となり、該測定法によって悪性腫瘍を検出することも可能である。例えば、抗体(ポリクローナル又はモノクローナル抗体)を用いて、Plk蛋白質中に含まれる変異Plk蛋白質の量や、細胞中の変異Plk 蛋白質の有無を検出することができる。血液・血清などのヒトより採取した生体材料を含む試料溶液からPlk蛋白質を免疫沈降し、ポリアクリルアミドゲルのウェスタン・ブロット又はイムノブロット上で変異Plk蛋白質を認識する抗体をPlk 蛋白質と反応させることができる。また、変異Plk蛋白質を認識する抗体を用いて、免疫組織化学的技術によりパラフィン又は凍結組織切片中の変異Plk 蛋白質を検出することもできる。
【００２４】
本発明によれば、腫瘍形成を促す変異型Plk遺伝子の存在を検出するために、血液又は血清などの生物学的試料を調製し、所望により核酸を抽出し、変異Plk遺伝子が存在するか否かについて分析することが可能である。該検出方法は、例えば、予め悪性腫瘍を有する患者サンプルから得られた変異Pl k変異遺伝子に関する情報を基に、例えばその変異Plk遺伝子の変異部位及び変異配列情報に基づいて変異DNA断片を作成し、変異遺伝子のスクリーニング及び／又はその増幅に用いるプローブを設計することができる。より具体的には、例えばプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノーザンブロット法などにおけるプローブとしての性質を有するもの、核酸配列をポリメラーゼで増幅するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、増幅した変異DNA断片を得ることができるためのプローブとしての性質を有するものを作成できる。そのためにプライマーを作成し、スクリーニング用プローブとして用い、生物学的試料（核酸試料）と反応させることにより、該変異Plk配列を有する遺伝子の存在を確認することができる。該核酸試料は、標的配列の検出を容易にする種々の方法、例えば変性、制限消化、電気泳動、又はドットブロッティングで調製してもよい。
【００２５】
プライマーとして使用されるDNA断片は、化学合成したオリゴDNAであり、これらオリゴDNAの合成は自動DNA合成装置など、例えばDNA合成装置(PharmaciaLKB Gene Assembler Plus:ファルマシア社製)を使用して合成することができる。合成されるプライマー(センスプライマー又はアンチセンスプライマー)の長さは約10〜30ヌクレオチド程度が好ましく例示できる。上記スクリーニングに用いられるプローブとしては通常は標識したプローブを用いるが、非標識であってもよく、直接的又は間接的に標識したリガンドとの特異的結合によって検出してもよい。適当な標識、並びにプローブ及びリガンドを標識する方法は、本発明の技術分野で知られており、ニック・トランスレーション、ランダム・プライミングム又はキナーゼ処理のような、既知の方法によって取り込ませることができる放射性標識、ビオチン、蛍光性基、化学発光基、酵素、抗体などがこれらの技術に包含される。
【００２６】
検出のために用いるPCR法としては、例えばRT-PCR法が例示されるが、当該分野で用いられる種々の変法を適応することができる。PCR法を用いて、野生型Plk遺伝子及び／又は変異Plk遺伝子の存在とこれら遺伝子のDNAを定量することも可能である。該方法としては、MSSA法のような競合的定量法(Kinoshita, M., et al., CCA, 228, 83-90 (1994))、または一本鎖DNAの高次構造の変化に伴う移動度の変化を利用した突然変異検出法として知られるPCR-SSCP法(Orita, M., et al., Genomics, 5, 874-879 (1989))を例示できる。
【００２７】
上記の検出において、測定対象となる変異Plk遺伝子(DNA)を含む被検試料は、該DNAを含むものであれば特に限定なく使用でき、例えば、血液、血清、尿、切除組織などの生体生物材料を例示できる。変異Plk遺伝子DNAは、これら被検試料より常法に従い抽出、精製、及び調製できる。
【００２８】
また、本発明によれば、新生物、悪性の前駆障害への進行、または予後指標としての存在を検出するために、障害を有する生物学的な試料を調製し、Plkの新生物変異遺伝子が存在するか否かについて分析できる。この方法を用いることにより、例えば悪性腫瘍の診断、治療効果の判定、及び予後の予測が可能となる。
【００２９】
また、薬剤スクリーニングに関する方法としては、変異Plk遺伝子のうち非機能性の変異Plk 蛋白質をコードする遺伝子を含有する宿主真核細胞系、又は変異Plk遺伝子のうち低安定性の変異Plk蛋白質をコードする遺伝子を含有する細胞を使用する方法が挙げられる。宿主細胞系または細胞を被検薬剤の存在下において一定期間増殖させた後、分裂期に作用する薬剤を処理してPlk活性を測定することにより、その薬剤がPlk活性を促進できるか否かを判定することができる。
【００３０】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
(A)方法
(a)ウェスタンブロッティング
細胞はTENSVバッファー(Schulte, T.W., et al., J. Biol. Chem., 270, 24585-24588, 1995; Hutchison, K.A., et al., J. Biol. Chem., 267, 13952-13957, 1992)を用いて4℃でソニケーターにかけて溶解した。細胞溶解物をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。蛋白をイモビロンPVDFメンブレン（Millipore）に移し、抗Plk抗体（Zymed及びSanta Cruz）、抗Hsp90抗体（AC88；Stressgen）、抗GST抗体（Santa Cruz）、抗α-チューブリン抗体（Amersham）又は抗Raf-1抗体（Santa Cruz）を用いてイムノブロットを行なった。検出は強化化学ルミネセンス試薬（Pierce）を用いて行なった。
【００３１】
(b)Plk mRNAレベルの検出
Plk mRNAの発現レベルを検出するために、製造元のプロトコールに従ってRT-PCRアッセイを行なった。RT反応の効率及びRT-PCRに用いるRNAの量はヒトグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) mRNAをRT-PCRで検出することにより確認した(Togashi, K., et al., Oncol. Res., 10, 449-453, 1998)。PCR反応混合液としてはセンス及びリバースプライマー並びに1ユニットのAmpli Taq GoldTM (Perkin Elmer)を含むものを用いた。増幅は保温サイクラー中で22サイクル（94℃ 45秒、60℃ 45秒、及び72℃ 2分）行なった。
【００３２】
(c)Plkに対する代謝ラベリング
10%透析済みFBS及び100μCi ml-1 [35S]メチオニン（ICN BiomedicalsIns.）を含むRPMI 1640培地中で細胞を2時間培養した。続いて非放射性メチオニンを含む培地で細胞を洗浄し、ゲルダナマイシンで3-12時間処理した。薬剤処理の後、TENSVバッファーを用いて細胞を4℃で2時間溶解した。ライセートをプロテインA-セファロース（Amersham）で予め非特異的な結合蛋白を除去して、抗Plk抗体とともに4℃で2時間インキュベートした。免疫沈降によって免疫複合体を回収して電気泳動にかけた。放射性ラベル化された蛋白をフルオログラフィーによって可視化した。バンドの強度をFujix BAS2000イメージアナライザーを用いて計量した。
【００３３】
(d)Plk-Hsp90複合体の検出
細胞をTENSVバッファーを用いて細胞を4℃で2時間溶解した。細胞溶解物の一部をプロテインA-セファロース又はプロテインG PLUS-アガロース（Santa Cruz）で予め非特異的な結合蛋白を除去して、それぞれ抗Hsp90抗体又は抗Plk抗体とともにインキュベートした。遠心により免疫複合体を回収して電気泳動にかけ、イモビロンメンブレンに移して抗Hsp90抗体又は抗Plk抗体でイムノブロットを行なった。
【００３４】
(e)プラスミド構築
ヒト全長Plk cDNAをRT-PCRによって幾つかのヒト癌細胞系から単離した。Plkを増幅するために以下のプライマーを使用した：
5'-CATGAGTGCTGCAGTGACTGCAG-3'及び
5'-GACAAGGCTGTAGAACCCACAC-3'
PCR増幅産物をpGEM-T Easyベクター（Promega）中にクローニングし、Applied Biosystems社製自動シーケンサーでジデオキシヌクレオチド連鎖-停止法を用いてヌクレオチド配列分析を行なった。配列は既報のもの(Golsteyn, R., et al., J. Cell Sci., 107, 1509-1517, 1994)と一致することが確認された。Plk cDNAをpGEX-2T中に挿入し、0.1 mMイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシドを用いてDH5α中にGST融合Plkを発現させた。
【００３５】
(f)In vitro結合アッセイ
結合アッセイ用に、1μgのGST融合蛋白をTENSVバッファー中でHL-60細胞（1 mg）とともにインキュベートした。GST融合Plk蛋白をグルタチオン-アガロース（Sigma）で沈殿させた。GST融合Plk蛋白に結合したHsp90又はα-チューブリンを抗Hsp90抗体又は抗α-チューブリン抗体を用いたウェスタンブロットにより検出した。
【００３６】
(B)結果
(a)ヒト癌細胞系におけるPlkのC末端変異
チェックポイント遺伝子の機能消失又は発現レベルの低さがヒト癌における腫瘍形成に寄与しているらしいことが示唆されている。そこで、本発明者らはまずヒト癌細胞系におけるPlk蛋白の発現をウェスタンブロッティングにより分析した。Plk蛋白の高発現レベルは白血病（U937、HL-60、Jurkat及びK562）及びHeLa細胞に観察され（図1a）、他の固形癌細胞系ではPlk蛋白のレベルは比較的低い（A431、Hep G2、A549及びMKN74；図1a）。しかしながら、Plk mRNAのレベルはU937、Hep G2及びA431細胞で同等であった（図1b）。従って、ヒト癌細胞におけるPlk蛋白の安定性は転写後のメカニズムによって調節されているものと推論される。
【００３７】
Plk蛋白の発現レベルの低さがPlk蛋白の変異と相関しているのかどうかを調べるために、本発明者らは次にヒト癌細胞系におけるPlk変異を分析した。本発明者らは癌細胞系、Hep G2、A431、MKN74及びA549ではPlkの変異がC末端に生じていることを見出した（表１）。一方、キナーゼドメインやpolo-box領域には変異はみられなかった。白血病細胞系（U937、HL-60、Jurkat及びK562）及びHeLa細胞ではC末端に変異は見られなかった（表１）。これらの結果はPlkのC末端中の変異がPlk蛋白の発現レベルの低さと相関していることを示している。
【００３８】
【表１】
0004711487.tif 000002
【００３９】
(b)Hsp90によるPlk蛋白の安定性の調節
本発明者らはPlk蛋白の安定化にはおそらく分子シャペローンが必要との仮説を立てた。我々は、10種以上のプロテインキナーゼのようなシグナル変換蛋白の折り畳みに関係する分子シャペローンであるHsp90に注目した(Caplan, A., Trends Cell Biol., 9, 262-268, 1999; Buchner, J., Trends Biochem. Sci., 24, 136-141, 1999)。ベンゾキノンアンサマイシン、ゲルダナマイシンはHsp90に特異的かつ直接に結合してv-Src (Whitesell, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 8324-8328, 1994)、Raf-1 (Schulte, t.W., et al., J. Biol. Chem., 270, 24585-24588, 1995; Schulte, T.W., et al., Mol. cell. Biol., 16, 5839-5845, 1996)、及びCdk4 (Dai, K., et al., J. Biol. Chem., 271, 22030-22034, 1996)の不安定化をもたらすことが示されている。そこで我々は次にHsp90がPlk蛋白の安定性を調節するのかどうかを調べた。
【００４０】
野生型Plkを有するヒト白血病U937細胞を100 nMゲルダナマイシンで処理するとPlkレベルが低下した（図2a）。100 nMゲルダナマイシンは12時間後では細胞生存能力を低下させることなくU937細胞におけるRaf-1の不安定化をもたらしたが、2日後には細胞の大部分が死滅した（15.4±3.2%）。ゲルダナマシシン処理によってPlk蛋白レベルが低下するのに要する時間はRaf-1の不安定化に要する時間と密接に関係していた（図2a）。ゲルダナマシシン処理したU937細胞から採取した全RNAのRT-PCR分析からこの薬剤が12時間後でもなおPlk mRNAのレベルを変化させないことが明らかになった（図2b）。代謝ラベル実験から、対照のU937細胞におけるPlk蛋白の半減期は約7時間であり、一方ゲルダナマシシン処理した細胞では約4時間であることがわかった。すなわち、ゲルダナマシシンはPlk蛋白の半減期を短くしていた（図2c）。同様の結果が、別のHsp90阻害剤であるラディシコール(Sharma, S., et al., Oncogene, 16, 2639-2645, 1998)で処理した細胞でも観察された。
【００４１】
これらの結果はゲルダナマシシンに誘導された細胞Plk蛋白の減少はPlk蛋白の不安定化によるものであってmRNAの遺伝子発現減少の結果ではないことを証明している。さらに、Plk蛋白のゲルダナマイシン誘導による不安定化はプロテアソーム阻害剤であるMG132によって阻害され、このことはプロテアソームがゲルダナマイシン誘導によるPlk蛋白の分解経路に関与していることを示唆した。Raf-1蛋白の場合、ゲルダナマイシン誘導による不安定化はプロテアソームに依存している(Shulte, T.W., Biochem. Biophys. Res. Commun., 239, 655-659, 1997)。
【００４２】
Plkが細胞中のHsp90に直接結合するのかどうかを見るために、免疫沈降アッセイを利用した。Plkの免疫沈降はHsp90の共沈降をもたらし（図2d、上パネル）、一方Hsp90の免疫沈降はPlkを共沈降させた（図2d、中パネル）。Hsp90のPlkとの共沈降はゲルダナマイシン処理の後は消失した（図2d）。細胞Plk蛋白はゲルダナマイシン処理細胞では有意に減少したが、薬剤処理は免疫沈降によりPlkの量を2分の1に減少させた（図2d）。免疫沈降は、ゲルダナマイシンがPlk-Hsp90複合体を分裂させることを証明する質的データも与えた。同様の結果がHsp90-Raf-1複合体(Schulte, T.W., J. Biol. Chem., 270, 24585-24588, 1995)でも観察されている。従って、PlkがHsp90に直接結合し、この複合体がゲルダナマイシンにより分裂させられると結論でき、細胞中の遊離Plk蛋白が分解の標的となるものと考えられる。
【００４３】
(c)ヒト癌細胞系におけるPlk蛋白の安定性に対するゲルダナマイシンの作用
Plkの変異がPlk分解のゲルダナマイシンに対する感受性を変化させるかどうかを分析するために、ゲルダナマイシン処理したヒト癌細胞系におけるPlk蛋白のレベルを調べた。これらの癌細胞系はすべてゲルダナマイシン処理の後、Raf-1蛋白の顕著な減少を示した（図3）。野生型のPlk発現細胞（Jurkat、HL-60、K562及びHeLa細胞）ではゲルダナマイシン処理後にPlkの蛋白レベルは減少したが、変異型Plk発現細胞（Hep G2、A431、A549及びMKN74細胞）ではPlkのレベルは減少しなかった（図3）。従って、変異型Plk発現癌細胞ではPlk蛋白はHsp90による調節を受けないことが証明された。
【００４４】
(d)Hsp90への結合におけるPlk蛋白C末端の関与
変異型Plk発現細胞におけるPlk蛋白の低発現レベルはPlkとHsp90の複合体の不安定性によってもたらされるPlk蛋白の不安定性によるものと思われる。PlkのC末端中の変異がPlkのPlk-Hsp90複合体を形成する能力に影響を与えるかどうかを直接調べるために、幾つかの異なるGST融合Plk構造体のHL-60細胞全溶解物との相互作用を測定した（図4a）。これらの免疫沈降試験からHsp90はキナーゼ陰性Plk変異体、K82R (Golsteyn, R.M., J. Cell Biol., 129, 1617-1628, 1995)と同様に全長Plkに結合することができるが、Plk/Hep G2及びPlk/A431変異体はHsp90に結合できなかった（図4b）。
【００４５】
従って、これらの結果は、PlkのC末端中の変異はHsp90との結合を阻害し、細胞中のPlkの蛋白レベルはPlkとHsp90の間の相互作用によって決まると考えられる（図1a）。Hsp90との相互作用に必要なPlkの領域を確定するために幾つかのPlkの欠失変異体を作製し、in vitro結合アッセイを用いてそれらを試験した。Hsp90はPlkΔ185（キナーゼドメインの半分を所有）とは相互作用を示したが、Plk408（polo-box及びC末端ドメインが少ない）やPlk440（C末端ドメインが少ない）には見られなかった（図4b）。これらの結果はPlk蛋白のC末端がそれのHsp90との相互作用に必要であることを証明している。最近、Plkのキナーゼドメインがそれのチューブリンとの結合に必要であることが報告されている(Feng, Y. et al., Biochem. J. 339, 435-442, 1999)。予想したように、Plk/Hep G2、Plk/A431、Plk408及びPlk440はチューブリンのPlkとの会合にほとんど影響を示さなかったが、PlkΔ185変異体との複合体には極僅かな痕跡量のα-チューブリンが検出された（図4b）。
【００４６】
図１はヒト癌細胞系におけるPlk蛋白及びPlk mRNAの発現を示した図である。ａ，種々の癌細胞系におけるPlk蛋白レベルの検出。指数関数成長期にある細胞を溶解させて、セルライセートに表示の抗体を用いてイムノブロッティングを行なった。ｂ,U937、Hep G2及びA431細胞におけるPlk mRNAレベル。細胞から全RNAを単離して、Plk及びGAPDH mRNAをRT-PCR法で検出した。
【００４７】
図２はHsp90によるPlk蛋白の安定性の調節を示した図である。ａ．ゲルダナマイシンによるPlk蛋白レベルの低下。U937細胞を表示の時間、100 nMゲルダナマイシンで処理した。セルライセートに種々の抗体を用いてイムノブロッティングを行なった。ｂ. Plk mRNAレベルに対するゲルダナマイシンの効果。U937細胞を表示の時間、100 nMゲルダナマイシンで処理した。全RNAを抽出して、Plk及びGAPDH mRNAをRT-PCR法で検出した。ｃ. ゲルダナマイシン処理によるPlkの不安定化。U937細胞を[35S]メチオニンでラベルし、100 nMゲルダナマイシンの有る無しで3-12時間処理した。抗Plk抗体を用いて免疫沈降で免疫複合体を回収してSDS-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。放射性ラベル化された蛋白をフルオログラフィーによって可視化し、バンドの強度を計量した。ｄ.ゲルダナマイシン処理によるPlk-Hsp90複合体の分裂。U937細胞を100 nMゲルダナマイシンの有る無しで12時間処理した。セルライセートに抗Plk抗体又は抗Hsp90抗体を用いて免疫沈降を行なった。同様に、免疫沈降していないセルライセートもウェスタンブロッティングに用いた。
【００４８】
図３は種々のヒト癌細胞系におけるPlkの分解に対するゲルダナマイシンの作用を示した図である。細胞を表示の時間、種々の濃度のゲルダナマイシンで処理した。セルライセートに表示の抗体を用いてイムノブロッティングを行なった。図４はHsp90への結合におけるPlkのC末端ドメインの関与を示した図である。ａ．in vitro結合アッセイに用いたGST融合Plk構造体のダイアグラム。○はGST蛋白を表し、点線バーはキナーゼドメイン（53-305残基）を表し、黒い囲み部分はpolo-box（410-439残基）を表す。ｂ.E.coli中に発現されたGST融合Plkをグルタチオン-アガロースで回収し、HL-60細胞のライセートとともにインキュベートした。インキュベート後、GST融合Plkをグルタチオン-アガロースで沈殿させた。GST融合Plkに結合したHsp90又はα-チューブリンを抗Hsp90抗体又は抗α-チューブリン抗体を用いたウェスタンブロットにより検出した。
【００４９】
【発明の効果】
本発明により提供される変異Plk蛋白質又は変異Plk遺伝子を用いることにより、悪性腫瘍細胞などの異常細胞を容易に検出でき、悪性腫瘍の遺伝子診断などを行うことができる。また、変異Plk 蛋白質は、悪性腫瘍やアポトーシスに関連する疾患などの病態解明や診断及び治療などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ヒト癌細胞系におけるPlk蛋白及びPlk mRNAの発現を示した図である。図ａは種々の癌細胞系におけるPlk蛋白レベルの検出結果を示し、図ｂはU937、Hep G2及びA431細胞におけるPlk mRNAレベルを示す。
【図２】  Hsp90によるPlk蛋白の安定性の調節を示した図である。図ａはゲルダナマイシンによるPlk蛋白レベルの低下を示し；図ｂは Plk mRNAレベルに対するゲルダナマイシンの効果を示し；図ｃは ゲルダナマイシン処理によるPlkの不安定化を示し；図ｄはゲルダナマイシン処理によるPlk-Hsp90複合体の分裂を示す。
【図３】  種々のヒト癌細胞系におけるPlkの分解に対するゲルダナマイシンの作用を示した図である。
【図４】  Hsp90への結合におけるPlkのC末端ドメインの関与を示した図である。図ａはin vitro結合アッセイに用いたGST融合Plk構造体のダイアグラムを示し、図ｂはGST融合Plkに結合したHsp90又はα-チューブリンを抗Hsp90抗体又は抗α-チューブリン抗体を用いたウェスタンブロットにより検出した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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