(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハウジングをもつ被検成分モニタリング装置において、該モニタリング装置が、
ａ．複数の中空針であって、その各々が先端と、引っ込み位置と、先端が皮膚を突き刺すようにされる距離だけハウジングから延び出した位置とをもって成る中空針と、
ｂ．電気的にまたはばねの動力を付与された針押し装置であって、前記各針を引っ込み位置から延び出し位置へ動かすために前記各針に個別に掛合するよう動くことができて成る針押し装置と、
ｃ．ハウジング内に置かれたエネルギー源と、
ｄ．分析製剤を含む複数の分析場所であって、各場所が分析製剤を湿らせるために前記中空針から液体を受け入れるようにされて成る分析場所と、
ｅ．分析場所に光を差し向けるようにされた１つ以上の光源と、
ｆ．分析場所から光を受けるようにされた１つ以上の光検出器と、そして
ｇ．プロセッサーと、
を含むことを特徴とする被検成分モニタリング装置。
【請求項２】
素子ａとｄはカセットの一部として被検成分モニタリング装置内に取り換え可能に挿入することができることを特徴とする請求項１に記載の被検成分モニタリング装置。
【請求項３】
ハウジングは逆戻り可能に開放されることができず、被検成分モニタリング装置は使い捨て可能とすることを特徴とする請求項１に記載の被検成分モニタリング装置。
【請求項４】
素子ａ，ｂ及びｃはハウジング内にあり、ハウジングは逆戻り可能に開放されることができず、該装置は使い捨て用とされることを特徴とする請求項１に記載の被検成分モニタリング装置。
【請求項５】
更に、ｈ．第２の外部プロセッサーと連絡するようにされるＲｆまたはＩＲ信号を送る送信機を含むことを特徴とする請求項１に記載の被検成分モニタリング装置。
【請求項６】
ハウジングをもつ被検成分モニタリング装置において、該モニタリング装置が、
（ａ）複数の中空針であって、その各々が先端と、引っ込み位置と、先端が皮膚を突き刺すようにされる距離だけハウジングから延び出した位置とをもって成る中空針と、
（ｂ）電気的にまたはばねの動力を付与された針押し装置であって、前記各針を引っ込み位置から延び出し位置へ動かすために前記各針に個別に掛合するよう動くことができて成る針押し装置と、
（ｃ）ハウジング内に置かれたエネルギー源と、
（ｄ）複数の排気された場所であって、各場所が、関連する中空針が延び出し位置にあるときに前記針の中空内部に真空を印加するために、前記針の移動中または移動後に前記針と掛合するようにされて成る場所と、
（ｅ）プロセッサーと、
を含むことを特徴とする被検成分モニタリング装置。
【請求項７】
該装置は再開放できないようにされるハウジングをもち、エネルギー源は取り換えることができないかまたは再チャージできないようになっていることを特徴とする請求項６に記載の被検成分モニタリング装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は2000年6月27日出願の暫定特許出願第60/214,334号の利益を請求するものである。
人体流体から取ったグルコースの如き被検成分を容易に定期的にモニターできるようになす努力がなされてきたが、提案された解決策は全く満足すべきものでないことが証明されている。本発明はかかるモニタリングを痛みを減らして便利にする新しいモニタリング装置を提供する。
【０００２】
糖尿病の糖尿症即ち膵臓がインシュリンを造るのに失敗するか、または細胞がグルコース細胞の代謝用のインシュリンに反応するのに失敗する病気は、生活の質のロス及び介護のそれ相応のコストに関する世界的な公衆衛生の問題である。
【０００３】
世界保険機構は1994年現在、世界中に110ミリオンそして米国に14乃至16ミリオンの糖尿病患者が存在すると見積もっている。この数は増加しており、2030年までに２倍になると予想している。ほぼ12乃至14ミリオンの糖尿病患者は、非インシュリン依存者、または生活様式を変えることによって、薬物の使用によって、またはインシュリンの稀な使用によって彼らのグルコースレベルを制御することができるType IIの 糖尿病患者として分類されている。Type Iの 糖尿病患者として分類されているほぼ1乃至2ミリオンの糖尿病患者については、グルコースレベルを維持するためにインシュリン注射が必要である。1993年に報告されたthe Diabetes Control and Complications Trial(DCCT)からのデータは、糖尿病をもつ人について、もし血糖（グルコース）レベルの良好な制御が維持されれば、生活の質はかなり改善され得ることを示している。かくして、グルコースの頻繁なかつ正確な自己テスティングが必要とされる。
【０００４】
この要求を満たすため、最も広く使用され、信頼性のある正確な方法は典型的には静脈血中の少量のグルコースの直接的な検定である。テストストリップ上に予め沈着された試薬とグルコースの相互作用に基づいてグルコースの量を測定する手持ち型器具が現在広く利用できる。典型的にはこれらの器具は、マイクロリットルの血液サンプルを使用する特定の酵素反応に基づいて 、血液中のグルコースの量をプラスまたはマイナス4％まで検出する。
【０００５】
これらのテストの化学作用及びテストストリップの製造者は良好な品質制御をデモンストレーションしているが、最近の自己−テスティングは、糖尿病患者が血液サンプルを取りそして手持ち型の器具選択のための検定のプロトコルをなす(do)ことを選択しなければならないという意識的プロセス留まっている。DCCTの結論により推奨される血液グルコースレベルについて頻繁に自己−テスティングをする糖尿病患者の主な失敗は、頻繁なスケデュールでの血液サンプルの採取に関連する痛み並びに特に公共の場所でこれを行うことの不便さによるものである。
【０００６】
この痛み及び不便さを減らすために、皮膚を通しての移送（イオン電気導入）時の及び埋め込まれたグルコースセンサ−による間質性流体に基づく血液グルコース検定は、目下提案されていて、開発中のものでありまたはFDAで承認された技術である。Cygnus,Inc.(Redwood,CA)は、“Gluco Watch”即ち、電極−駆動式イオン電気導入に基づく非侵入性のグルコーステスティング装置についてのFDA提案を受け入れた。MiniMed Inc.(Sylmar,CA)は３日までの間連続的にグルコースをモニターするために使用することができる侵入性グルコースセンサ−のFDA提案を発展させかつ受け入れた。
【０００７】
ここに、信頼性がありかつ痛みが減少したまたは実質上痛みの無い頻繁なグルコースモニタリングへのアプローチが、または任意の血液代謝産物のモニタリングのためのアプローチが提案される。自動化装置での代謝産物についての敏感なかつ信頼性のある化学テストと組み合わされた、非常に少ない、マイクロリットルまたはそれ以下のサンプルの使用は、便利さ、気楽さ、及び減少した痛みをもつ代謝産物モニタリングを見込む。このテスティングの出現は使用者には実質上知られていないため、グルコーステスティングの自動化は固有の心理学的利益を提供する。特定のプログラムは使用者の生活様式に基づく頻繁なテスティングのために適用されることができため、自動化は更なる利益を提供する。本発明によれば、多数の例えばユニット当たり120の血液テストが提供されることができ、かくして一カ月の期間まで頻繁なテスティングを可能となす。更に、小型化は例えば“ウオッチ”形にすることができる小型装置のデザインを見込んで、携帯性と珍しい便利さを見込む。
【０００８】
本発明は、ハウジングをもつ被検成分モニタリング装置において、該モニタリング装置が、 複数の針であって、その各々が先端と、引っ込み位置と、先端が皮膚を突き刺すようにされる距離だけハウジングから伸長した位置とをもって成る針と、 電気的にまたはばねの動力を付与された針押し装置であって、各針を引っ込み位置から延び出し位置へ動かすために各針に個別に掛合するよう動くことができて成る針押し装置と、 ハウジング内に置かれたエネルギー源と、分析製剤を含む複数の分析場所であって、各場所が分析製剤を湿らせるために針から液体を受け入れるようにされて成る分析場所と、分析場所に光を差し向けるようにされた１つ以上の光源と、分析場所から光を受けるようにされた１つ以上の光検出器と、そしてプロセッサーとを含むことを特徴とする被検成分モニタリング装置を提供する。
【０００９】
本発明は更に、ハウジングをもつ被検成分モニタリング装置において、該モニタリング装置が、(a) 複数の針であって、その各々が先端と、引っ込み位置と、先端が皮膚を突き刺すようにされる距離だけハウジングから延び出した位置とをもって成る針と、(b) 電気的またはばね動力を付与された針押し装置であって、各針を引っ込み位置から延び出し位置へ動かすために各針に個別に掛合するよう動くことができて成る針押し装置と、(c) ハウジング内に置かれたエネルギー源と、(d) 複数の排気された場所であって、各場所が、針が延び出し位置にあるときに針に真空を適用するために、針の移動中または移動後に関連する針と掛合するようにされて成る場所と、(e) プロセッサーとを含むことを特徴とする被検成分モニタリング装置を提供する。
【００１０】
ハウジングをもつ被検成分モニタリング装置は、 １つ以上の針であって、各針が先端と、引っ込み位置と、先端が皮膚を突き刺すようにされる距離だけハウジングから延び出した位置とをもって成る針と、針の延び出し位置を遮るように整列させられた組織を加熱するために整列させられたハウジングに固定された光源とを含む。
【００１１】
発明の詳細な説明
図１は比較的小型の被検成分モニタリング装置の内部図であり、この装置は生物学的流体を比較的短い、小さい直径の分析用の針を経て抜き取ることができる適切な組織にひも結びするか、又はテープ縛りして着用することができる。この装置は例えば直径２インチをやっと超えることができる。
【００１２】
モニタリング装置６０はこの場合、多数日（例えば２０又は４０又はそれ以上の日数）の各日に、多数の分析を行うのに十分な複数の針５３（例えば３個乃至２４個）を含む。針はチャンバ５０と関連させられ、そのチャンバ内で、この実施例では、分析が行われる。かかるチャンバは任意に窓付けされる。心棒６３はプラットフォーム６２とアーム６１を回転させ、アームを針５３と、そしてプラットフォーム上の検出器６４に関連したチャンバ５０と整列させる。検出器は例えば光源と光検出器を含む。検出された光は例えばチャンバ５０（ここで光路が検出器に反射される）内の吸収度又はサンプルからの蛍光を計算するために使用することができる。ステッパーモータ、適切な歯車装置をもつ巻きばね、ＤＣモータをもつジュネーブ(Gemeva)機構（間欠的回転運動を作る）、又は類似物は、夫々のチャンバと針に関してプラットフォームとアームを動かすために使用することができる。プロセッサー６５は検出器からデータを受け入れる。幾つかの実施例では、プロセッサーは標準値を引き出すためにデータを処理し、又はモニタリング装置の可動部品の位置決めをモニタリング及び制御する。チャンバの図示されたリングが例えば、アームの回転中心から１インチに置かれる場合、それらは丁度160mm下方の円周上に置かれるだろう。
【００１３】
図１に示された円形形式は便利な形式を提供するが、他の形式を使用することはできる。例えば、検出器は固体状態のLEDと、チャージ−結合装置（CCCs)を提供することができ、CCDの１つ以上の光源及び１つ以上のピクセルは各作動チャンバと永久的に整列させられることができ、そのため検出器の作動の制御は電子式となる。換言すれば、光源は必要に応じて連続的に作動されることができ、かつ適切なCCD内に収集されたチャージ(charge)の連続排出は今作動しているピクセル内に収集されたチャージを隔離するために使用することができる。また、通常の技能の１つはすべて（又は重大なサブセット(subset)）の光源を作動することができることを認めるだろう。検出器サイト(site)は特に適切な検出器の分析から得られる。しかし、たとえ蛍光検出に使用される異なった励振/放射波長を使用するときでさえ、クロストーク又は電子ノイズの可能な発生源を制限することは好ましい。針の動きはx-y方位のケーブル上の場所から場所へと動くことができるロボット装置によって、又は電磁的に作動されるソレノイドの如き永久的に割り当てられる装置によって行うことができる。
【００１４】
図２Ａ乃至Ｃはモニタリング装置の１実施例の作動を示す。チャンバ１０は隔膜１１によって針１２から分離される。針が皮膚５を刺し通した後（図２Ｂ）、針の他方の端が隔膜を刺し通す。チャンバ１０は真空内に納められることができ、真空は被検者から吸引した流体１３でチャンバを急速に満たすために吸引力を及ぼす。真空によって与えられる充填速度の増大は、チャンバ中の分析試薬が患者に移動しないことを更に保証するのを助ける。流体は典型的には、血液又は間質流体(ISF）とする。図示の如く、針とチャンバの両方はこの実施例では皮膚に対して相対的に動く。
【００１５】
図３Ａ乃至Ｃはモニタリング装置のもう１つの実施例の作動を示す。チャンバ２０は第１隔膜２１と第２（厚い）隔膜２４によって大気から隔離される。針２２は側部ポート２３をもつ。図示の如く、針の皮膚５内への挿入は側部ポート２３をチャンバ２０内の真空と連通させ、その真空は流体２５をチャンバ内へ引き入れる働きをする。針は寸法決めされかつ側部ポートは位置決めされていて、側部ポートが、針が被検者に挿入されるまで、チャンバに対して開放しないようにされている。この実施例で使用される真空は人が血液を引き出そうとする場合特に有用である。というのは、真空によって提供される引き出し時間の加速が血液の凝固による障害を回避するからである。それにもかかわらず、真空は本発明の作動には必要ない。図３の装置は使用前に針を隔離するために第２の隔膜又はより厚い第１隔膜２１を使用できることに注目されたい。この図示の実施例では、唯１つの針が皮膚に対して相対的に動く。
【００１６】
図４Ａ、Ｂはモニタリング装置のもう１つの実施例の作動を示す。針７２はプラットフォーム７０の孔を通して作動される。このプラットフォーム上には支持体７４（膜とすることができる）が置かれる。針が作動すると、それは保護膜/隔膜７５を、次いで被検者の皮膚５を突き通す。完全に作動されると、針のポート７３は被検者から支持体７４までの主として毛管流のための接触を提供する。１実施例では、支持体は膜であり、その上に分析反応を駆動するのに必要な試薬が配列される。反応容量は典型的には300nL以下の如く小さく、反応は主として膜の孔内で起こることができる。米国特許第6,118,126号、及びWO99/23492号に記載されている如く、適切な膜は、孔内に十分な量の蛍光体を提供するよう作られることができ、それによって蛍光体から検出される蛍光を著しく増強する。蛍光の増強は検出器が励起光源からの後方散乱と整列させられる所に適用される。
【００１７】
図５はモニタリング装置の別の実施例を示す。針８２はブラケット８６によって支持され、このブラケットはそれを保護膜/隔膜８５に、次いで被検者の皮膚５に向かって案内する。針は作動バー８７に掛合することによって作動され、このバーは溜め部８１上に着座するものとして図示されている。溜め部はこの場合ポート８３を通してより大きい容量の流体を引き抜く手段として役立つ。好適な針は狭い内径と外径をもつことに注目されたい。このことは、毛管作用によって針により引き抜かれた容量は典型的には小さいことを意味し、そのため図示の溜め部はその容量を増すために役立つことができるようになる。この実施例では、針が作動されたとき、流体は毛管作用によって引き抜かれる。作動力を除くと、針は引っ込み（下記の説明を参照）、その上部開口は多孔性支持体８４に接触し、この支持体はプラットフォーム８０によって支持される。
【００１８】
分析反応がその中で起こるチャンバ、又はその上に分析反応支持体が存在するプラットフォームは分析に使用される光の波長に対して半透明とすることができる。例えば図５に図示されたプラットフォーム８０は半透明とすることができる。かくして、図６に示す如くフィルタ９１をもつ光源９０は光をプラットフォーム８０を通して支持体８４に差し向けることができ、かつ反射した又は放射された光はフィルタ９３及び検出器９２に通じるプラットフォームを通して経路に沿って収集されることができる。この実施例でも、人は蛍光を増強する表面効果の利益を得ることができることに注目されたい。多孔性支持体８４の深さ、又は支持体-プラットフォームインタフェースから遠位のその多孔率は調節することができ、大部分の蛍光体が、有用な測定された蛍光を提供するために、インタフェースに十分隣接した孔内に発生させられる。例えば、≧90％の蛍光体が検出段階で存在する深さは約80ミクロンより大きくないか、又は約40、20又は10ミクロンより大きくないものとすることができる。
【００１９】
図６に示されたように使用される図５の実施例では、支持体８４の底面は赤い血液細胞の如き細胞をその上で分析化学と検出が行われる支持体の部分から隔離するよう使用することができる。例えばもし支持体８４が膜であれば、孔寸法は細胞を排除するよう選択することができる。たとえ比較的開いた孔が多孔性支持体にあっても、細胞は支持体−プラットフォームインタフェースに支持体を通して移動しないだろう。そのインタフェースは或る実施例では分析決定にはより重要である。
【００２０】
図７Ａ乃至Ｆに示すもう１つの実施例では、モニタリング装置はスペーサ、支持体３４によって分離された、より明確に確認されるチャンバ３０Ａ、３０Ｂ等の如きチャンバ３０のトレイ４０をもつ。これらのチャンバは関連する針３２をもち、これらは図７に破断線で表示されており、それらは最初はトレイ４０の前または背後で整列している。チャンバは隔膜層３１によって下を囲まれている。ここでは第２隔膜層３３Ａによって示される如く、隔膜層は針の突き刺しの間チャンバ内の真空をロスしないことを確実ならしめるため厚くすることができる。図７Ｂは関連する針３２Ａと共にあるチャンバ３０Ａの切除部の端面図である。針アクチュエータ３６は、針３２Ａに特定のものとすることができるか、または必要に応じて適切な針とロボットによりまたは回転可能に整列させられることができる。針はそれが所定位置に、例えば浮動整列ブラケット３９内のスロット内にロックされるまで、アクチュエータ３６によって押される。針３２Ａは斜角部(bevel)３５を備えることができる。トレイアクチュエータ３７はまた、垂直針アクチュエータとして役立つ。このトレイアクチュエータの更なる移動は針に被覆５とチャンバ３０Ａを突き刺させると同時に、浮動ブラケット３９は移動に備えて縮む。或る実施例では、チャンバ３０Ａ内の初期真空は生物学的流体３８でチャンバを充填するのを助ける。斜角部３５は作動力が除かれたとき被検者から針を持ち出すのを助けるよう作用することができる。
【００２１】
図示の如く、多数のチャンバが単一部片の材料に形成できる。例えばチャンバの頂壁をなす図７Ａに示すチャンバの部分はこの実施例ではキャビティを形成する同じ単一部片から形成することができる。それはまた、個別に形成することができ、かつ支持体３４に密封することができる。勿論、隔膜３１と第２隔膜３３Ａは個別に形成される。しかし、図示の如く、多数のチャンバ用に作用する隔膜は好適には一体の材料から形成される。
【００２２】
図８Ａに示すもう１つの実施例では、トレイ１１０は夫々第１隔膜１０４と第２隔膜１０５Ａによって頂部と底を囲まれた、特定のチャンバ１０１Ａ、１０１Ｂ等の如きチャンバ１０１をもつ。針１０２は側部ポート１０３をもつ。図８Ｂでは、針１０２Ｆは第１隔膜１０４が破られるように、しかし第２隔膜１０５Ａは破られないように、部分的に作動される。この段階で、針が蓄えられているハウジング内の真空はチャンバ１０１Ｆの内部と平衡させられる。ポンプはハウジング内の真空を造るため、維持するため、または補足するために必要に応じて作動される。針が、より厚い隔膜１０５Ａを使用することまたは第２と第３隔膜間の排気されたスペースによって補足された第３の隔膜１０５Ｂを使用することによって、それ以上作動される間、真空を保存するように注意される。スペース１０７は第３隔膜を支持する。針先端が被覆５を突き刺すために相対的に速やかに進行し、チャンバ１０１Ｆを満たす生物学的流体１０８に至る間、真空は実質上危うくされない。１実施例では、流体１０８は次いで、図８Ｄに示す如く毛管作用によって支持体１１１に移送されることができる。前述の如く、光学式測定は支持体のどちらの面からも行うことができ、逆の面からの測定は支持体が分光器によるデータを生じる区域から細胞を除去するフィルタとして作用することを可能ならしめる。
【００２３】
チャンバ
チャンバは、その材料が例えば血液分析サンプル及び試薬に対して安定であることが証明されておりかつ好適には１つ以上の殺菌プロセスと両立できるいる多数の材料から作ることができる。かかる材料には適切なプラスチック、ガラス、シリコン、石英等が含まれる。適切なプラスチックは例えば、ポリカーボネイト、ポリスルホン、アクリリック(acrylic)（例えばポリメチルメタクリレイト）、ポリスチレン、ポリスチレンとアクリリックのNASコポリマーの如きスチレニックコポリマー、スチレンアクリロニトリルコポリマー（例えば、SAN）、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレイト及び、4-メチル-1-ペンテン（例えば、TPX）プラスチックを含む。1995年4月のMedical Devices and Diagnostic Industry,の“Guide to Engneering Thermoplastics,”及び1983年のU.S. Precision Lens,のThe Handbook of Plastic Optics,第2版を参照されたい。チャンバ内の材料の分析分光器による測定をなすのはしばしば望ましいので、適切な光学的ウインドーを提供する簡単な方法は分析のために要求される波長の光を伝送する材料のチャンバを測定すべきである。多くの分析に必要な波長は十分に高いので、上記のものを含む多数のプラスチックが適切である。
【００２４】
プラスチックを用いれば、例えば構造物は射出成形、モールディング、機械加工、及び当業者に既知の他の方法によって形成することができる。共に微細な寸法を必要とする場合、LIGA（リトグラフィ(lithography)、電気メッキ及びモールディングについてのドイツ語の頭字語）モールディングを使用することができる。この場合型は比較的厚いホトレジスト(photoresist)層から光リトグラフィによって形成される。ガラス、ソシリコン等を用いる場合、エッチング技術、特に反応性イオンエッチングの如き良く限定された壁を生じる技術を使用することができる。
【００２５】
チャンバの寸法は典型的には、小さく、5,000nL、2,000nL、1,000nL、500nL、300nL、またはそれ以下の如く小さい容量を引き抜くのに十分とする。0.67mm(26mils)×0.67mm×0.67mmのスペースは約300nLの容量を提供することに注目されたい。勿論、所望容量を引き抜くために使用されるスペースの寸法は典型的には、普通の実験によって設定され得る如く、引き抜きプロセスによって得られる容量より大きくなるだろう。
【００２６】
該装置は例えば、約１カ月のコースにわたって１、２、３、４、５、またはそれ以上の日々のサンプリングを提供するために３２、６４、９６、１２８、１６０個またはそれ以上のチャンバ（及び関連する針）をもつ。
光学的検出が実質上光源の方向から行われる場合、（もし必要ならば）反射面は、例えばチャンバの外面上の如く、モニタリング装置内に合体することができる。
【００２７】
隔膜
本発明に使用される隔膜または保護膜は、シリコンゴム、テフロン（登録商標）（ポリパーフルオロエチレン）、ポリエチレン、またはエラストマーフイルム（天然ゴム、ABSゴム、またはポリウレタンエラストマーフイルムの如きもの）の如きポリマーから作ることができる。他の状況では、より大きい厚さは、真空が流体の引き抜きを助ける活動を始めるまで、関連する針を作動させる間関連するチャンバ内に真空を保存するために必要とされる。隔膜形成方法の制限、所定に方法によって作られた隔膜の上面の平坦さ、隔膜形成材料の硬度、隔膜によって密封すべき開放面積、及び適切な殺菌方法との適合性の如き、隔膜を選択する幾つかのファクターは当業者によって考えられるだろう。
【００２８】
隔膜を取り付ける１方法はスクリーン−印刷である。印刷された隔膜はシリコンまたは他の化学的耐性の弾性材料から作られる。好適には、隔膜は（ａ）Dow Corning, Midland, Michigan からSylgard184TMのブランドでまたはDow Corning からMDX4-4210TMのブランドで入手可能のものの如きシリコンゴム−形成材料と、（ｂ）M-5グレードのCab-O-silTM（Cabot Corp., Boston, MA)として販売されている無定形燻蒸(fumed)シリコンの如き不活性充填剤との混合物から作られる。Sylgard184とMDX4-4210は２つの構成成分として販売される。第１の構成成分は、シリコンゴムの粒子と重合触媒を含んだエマルジョンであり、第２の構成成分は、二価モノマーの製剤である。このモノマーはシリコンゴムを橋かけ結合し、それによってシリコンゴムを硬化させる働きをする。構成成分１のMDX4-4210、即ち“エラストマー成分”はジメチルシロキサンポリマー、補強シリカ、及び白金触媒から作られる。構成成分２のMDX4-4210、“硬化剤”はまた、重合抑制剤及びシロキサン橋かけ剤に加えて、ジメチルシロキサンポリマーを含む。これらの構成成分は一般的に製造者の推薦に従って混合される。例えば、MDX4-4210については、エマルジョン即ちエラストマーの重量で１０部がモノマー溶液即ち硬化剤の１部と混合される。
【００２９】
不活性充填剤の使用の例として、M-5グレードのCab-o-silの重量で約7.5％がSylgard 184に加えられることができる。またはM-5グレードのCab-o-silの重量で、約 2乃至3 ％がMDX4-4210に加えられることができる。そのスクリーン印刷性を改良するために充填剤は前重合された成分を厚くする働きをすることができる。隔膜形成材料は一般的に、室温で硬化させられることができ、または硬化は例えば熱で加速されることができる。硬化に先立ち、隔膜形成材料は、通常は粘性流であるが、流れることができ、その流れはスクリーン印刷プロセスを容易にするのに十分である。また、隔膜形成材料はそれが付けられれるプレートに、または隔膜形成材料の下にある第１層に付着するのに十分な粘着性を有する。
【００３０】
スクリーン印刷プロセスの１バージョンでは、隔膜形成材料の第１層はプレート上に印刷され、次いで硬化させられる。この第１印刷の後、隔膜形成材料の第２層が第１層の上に重ねられる。（通常は極めて平らな）適切な形状の平滑なプラテンが印刷された隔膜形成材料の上に重ねられて、（後述する如く、隔膜形成材料のプラテンへの破壊的付着(destructive adhesion)を防止するよう用心しながら）均等な重量が印刷された隔膜形成材料に付けられ、そして隔膜形成材料が硬化させられるようになす。隔膜形成材料の２つの印刷の使用は、第２印刷の後に行われる平滑化プロセスに先立ち、隔膜形成材料の基礎を形成するのを助ける。この平滑さと均等な厚さを得るために、最終硬化プロセスの間、隔膜に十分均等な圧力を加えることが重要である。この圧力は、特定の隔膜付着プロセスのために、硬化プロセス中必要な均等性を造るのに十分な高さとするよう選択すべきであるが、隔膜形成材料の硬化した部分を過度に圧縮して、その圧力を解放したときこれらの部分的が再膨張して不均等なシール(seal)厚さを生じるようになる程の高さにはしない。また、単一のプロセスを使用することができ、かかる単一のプロセスは通常は好ましい。それは簡単であり、製造プロセスへの適用がより容易であるからである。後述す単一印刷プロセスでは、プラテンは隔膜形成材料の第１の（かつ唯一の）印刷の後に直接に適用され、かつ機械的止めによって遠く成り過ぎないようかつ不均等になり過ぎないように据えられる。
【００３１】
好適には、スクリーン上の各印刷物の幅は均等である。というのは、幅の不均等性は該プロセスの終了時の厚さが不均等となる可能性を増すからである。印刷と処理の後、付着された隔膜パターンは広げられる。例えば、２−印刷プロセスと印刷スクリーン上の6 mil幅のパターンを使用する付着では、18 mil幅のパターンが作られた。
【００３２】
隔膜材料はチャンバを形成する開口を覆って付着されるので、ガスケットの初期形成はシリコンオイルまたはシリコン処理剤の如き釈放剤で処理されたガラスの如き隔膜形成材料に付着しないよう適用される平らな表面上に有効に行われる。隔膜形成材料の第２層は付着されることができ、かつ隔膜はキャビティが形成される表面に移送されることができ、同時に第２層の隔膜形成材料はまだ粘着するのに十分にねばねばしている。
【００３３】
針
本発明の重要な特徴は、十分な剛性と耐久性をもつ小尺度の針を備えることにある。小尺度は例えば１週間のコースにわたって多数の分析を行う負担を実質上軽減するのに必要とされる１つの装置で多数の分析をなすのに重要である。小寸法はまた、被検者の皮膚に突き刺すのを可能にする0.3mNの力に耐えることができる。
【００３４】
好適には、針は 8mils または200μm またはそれ以下の直径であり、好適には外径の少なくとも約50％の内径をもつ。6 mils(150μm）、４mils（100μm）、2mils（50μm）、または1mils(25μm）またはそれ以下の内径が予期される。針の長さはモニタリング装置の内部構成成分との連通と、所望の生物学的流体を得るための組織への十分な突入を提供するようにされる。典型的には、針は10mm またはそれ以下、4mmまたはそれ以下、2mmまたはそれ以下、1mmまたはそれ以下の長さとすることができる。ISF が目標にされる生物学的流体である場合、被検者に突き刺す長さは典型的には2乃至3mmの深さをもつ真皮を刺し通すのを回避するに十分な短さとする。
【００３５】
針は適当なプラスチックの小尺度の成形物によって作られる。かかる小尺度の成形技術の１つは小尺度の成形型を造るためのLIGA（リトグラフィ、電気メッキ及び成形のドイツ語頭字語）を使用する。適当なプラスチックはポリエーテルエーテルケトン(PEEK)及びポリエーテルスルホン(PES)を含む。ポリマーは補強物質を充填されることができ、例えばガラスまたはカーボン繊維を10乃至40％充填されることができる。
【００３６】
プラスチックは例えば4mils(100μm)またはそれ以下の外径、及び2mils(50μm）またはそれ以下の内径をもつよう押し出されることができる。
ガラスとプラスチックは適当な内径と外径に引き抜かれることができる。内径対外径の比は引き抜きプロセスの間維持される。ガラス針は蒸着によってダイヤモンド被覆されることができる。
シリコンウエファーは反応性イオンエッチングまたは他の高解像力エッチング技術によって針を造るために使用することができる。例えば、40:1 の高さ:幅比のものを造ることができる。針はウエファーから作られ、その際ウエファーから形成された針を連結するタブを残す。これらの針は例えば機械的に分離される。ウエファーは斜角付き(beveled)針先端を作るために或る角度をなしてエッチングされることができる。鋭い先端はまた、エチレン/ピロカテコール/水(EDP）またはKOHエッチングの如き異方性エッチング法を用いる初期エッチングで形成されることができる。
【００３７】
代案として、シリコンからこうして形成された針は、プラスチック針用の型を形成するための予備型として使用することができる。または、ウエファーは型を形成するために直接エッチングされることができる。
針はまた、例えばサファイア(Al2O3)または石英から作られることができる。例えば、溶融材料が毛管作用によって先縁を引き上げる初期型と接触させられる如きエッジ限定法を使用することができる。引き続き、該型は上方に引かれ、サファイアまたは石英材料が溶融材料から引かれる先縁に合う幾何学的形状に結晶化する。
針はまた、金属からなることができる。金属針は例えばより大きい尺度に形成された針を引き抜くことによって形成される。例えば電気化学的カッティングは、針をカッティングすると同時に電気化学的にバリまたは他の粗い縁を除去するのに使用されることができる。代案として、針は押し出しによって形成されて、適当な形状に研削されることができる。
斜角部(bevels)はまた、例えば針端のレーザーカッティングによって作られることができる。
【００３８】
支持体
或る実施例では、検定(assay)が検定試薬が前もって置かれている支持体の上で行われる。支持体は所望量の流体サンプルで湿るよう較正されることができる。
ここで説明される蛍光の増強結果を得るために重要な特徴は材料の表面または内部に空隙が存在することであると信じられている。かかる空隙は、基本的に励起放射エネルギーの経路長さを増し、それによって蛍光励起事象の確率を増すことによる現象に貢献する“ミクロキャビティ”または“散乱セル(scatter cells)”を提供すると信じられている。更に、空隙は、励起光のビームがかかるミクロキャビティまたは散乱セルの均等な密度を見る(sees)のに十分な密度で存在するべきであると信じられている。該材料は蛍光を誘発するのに使用されるべき励起波長の光を吸収するべきでない。もし広帯域の光を使用するべきであるならば、該材料は蛍光を誘発するのに有効な光の部分を吸収するべきでない。狭帯域の光は、或いはレーザ光源でさえも、励起光の発生源として好適である。それは吸収結果(issue)のためである。ナイロン膜が使用されるとき、例えばHe-Ne レーザによって励起される蛍光性試薬はアルゴンレーザによって励起されるものより好適である。
【００３９】
多くの織物材料(textured materials)では、放射(emissions)が励起光の反射率(reflectance)の角度に一致する軸線に及びその回りに置かれた比較的狭い収集面上に収集されたとき、増強効果は最も明白である。好適には、収集面は織物表面から延びるわずかなほぼ20°のコーン(cone)面積を覆い、そして上記軸線の回りに対称的に置かれる。更に好適には、収集面はわずかなほぼ10°または 5°のコーンの面積を覆う。好適には、励起光の入射角度は織物表面に関して90°であり、収集区域は図１に示すのと同じ軸線に沿うようになっている。これに関連して、“実質上”90°は 、90°の角度で入手できる蛍光歩留りの少なくとも70％、好適には少なくとも85％、90％または95％を維持するのを助ける角度を指す。
【００４０】
適当な織物材料はナイロン、ポリ（カーボネイト）、ポリ（ビニリデンジフルーオライド）(“PVDF”)、及びニトロセルローズ膜を含むが、これらに限定されない。好適には、Pall Grop.(East Halls, NY, または特に、Biosupport Division, Port Washington,NY)、Amersham Pharmacia Biotech, Inc. (Piscataway, NJ)及びCuno Inc. (Meriden, CT)から得られるものの如き市販のナイロン膜を含むナイロン膜が使用される。
【００４１】
検定試薬
被検成分に応答する蛍光信号を造るのに使用する試薬は典型的には酵素、酵素助因子、緩衝剤、塩、及び安定剤である。これらの試薬は乾燥形式で貯蔵され、かつ活性形式に動的に再水和(re-hydrate)することができる試薬から選択される。１つの共通の検定デザインは、還元形式(reduced form)のNAD+またはNADP+または他の電子キャリヤー(例えばFMN,FAD)を生じる生合成または異化作用経路内の１つ以上のステップを使用する。検定は被検成分当量当たり還元電子キャリヤーの１当量を超過して生じる酵素媒介反応のカスケードを使用することができる。還元電子キャリヤーは、例えばジアフォラーゼを使用して蛍光体を造るために、蛍光体前駆物質を還元するために使用される。
【００４２】
例えば、グルコースが被検成分である場合、ATPとグルコースはグルコース-6-フォスフェイト(G6P）を生成するために使用することができる。電子キャリヤーの参加形式、例えばNADP+G６Pが次いでホスホグルコネイト脱水素酵素によって作用させられて、還元形式の電子キャリヤーを生成する。次いで還元形式の電子キャリヤーと適当な蛍光体前駆物質が作用させられて、蛍光体を生成する。かかる方法は例えば米国特許第5,360,595号（比色計ストリップ検定）、米国特許第5,302,513号（ジアホラーゼを使用する蛍光計検定）、米国特許第5,912,139号に記載されている。
【００４３】
緩衝剤が、もし必要ならば、pHを検定に使用されるすべての酵素による有効な作用を可能ならしめる範囲内に安定させるのに適当な量提供される。同様に、塩が、もし必要ならば、使用されるすべての酵素を支持するために決定される量提供される。グリセロールの如き安定剤、及びPEGの如き不活性ポリマーが経験的に有用であると決定されたものとして、提供される。
【００４４】
還元状態にある増強された蛍光をもちかつジアホラーゼに対して有用であるとして示されかつ考えられる染料は7-ヒドロキシ-3H-フェノキサジンー3-one(Resazurin),ナチュラルレッド,4′，6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI),ビスベンシミド(bisbensimide)(Hoechst33258)等を含む。
検定薬剤は水和で溶解又は分散するポリマー支持体上に提供されることができる。他の所で説明した如く検定は行われる。検定薬剤がその上に沈積させられる更に安定した支持体上で行われることができる。沈積技術は当業者に認められるだろう。これらは液体形式から乾燥すること及び米国特許第6,045,753号(Loewy等）に記載された方法を含む。
【００４５】
光学的検出素子
個別にアドレス可能なLEDは各LED又はLEDのサブセット(subset)の何れかの個別の照明を可能ならしめる回路板上に適当な寸法の個別のLEDを納めることによって作成することができる。例えば Opto Power Corporation(Tucson,AZ)又はSDL,Inc.(San Jose,CA)から入手可能の半導体レーザダイオードが納められることができる。代案として、中心から中心までの寸法が14 マイクロメータ又は100 マイクロメータのエミッターをもつかかるLEDはSDL,INC,から４個づつ前包装されたものが入手可能である。かかる比較的小さな間隔離れた光エミッターについては、光学機器がより広い間隔離間した検出場所に向かって個別ビームを差し向けるために通常使用される。密接して納められたエミッターはコスト及びハウジング要件の簡単さにおて有利である。各エミッターが検出場所と直接整列する場合、好適には本願で使用される中心から中心までの寸法は約1mm 乃至約20mmの範囲である。種々の実施例では、好適範囲は約1mm 乃至約20mm、約1mm 乃至約10mm、又は約1mm 乃約5mmである。
【００４６】
検出器配列は、例えばDALSA,Inc.(Easton CT), Sarnoff Corporation(Princeton, NJ)，又はPrinceton Instruments(Trenton,NJ)から入手可能のものの如きチャージ結合装置(CCD)、(Princeton Instruments, Hamamatsu Corp.(Bridgewater,NJ)又はPhotometrics Ltd. of Tucson,AR)から入手可能のものの如き）強化CCD配列、（Scientific Imaging Techologies,Inc.(Beaverton,OR), Eastman Kodak Co.,Inc.(Rochestre,NT) 又はSarnoff corporation)から入手可能のものの如き）焦平面配列、（Reticon Corp.(Sunnyvale, CA), Sensors Unlimited, Inc,(Princeton,NJ)又はHamamatsuから入手可能のものの如き)ホトダイオード配列、又は（FLIR Systes Inc.(Portland),OR), Loral Corp.(New York,NY),又は(Hughes Electonic Corp.(Los Angeles, CA)から入手可能のものの如き）光検出器配列とすることができる。
【００４７】
制御器
モニタリング装置は内部制御器によって作動される。制御器は計算し続け、使用される針とチャンバの軌道を保ち続け、光検出器からの出力を収集する。また制御器は値が或る場合に高すぎるかまたは低すぎるかを決定するのに十分な原データかの成果を計算する。該成果は、或る比例尺での視覚アナログまたはデジタル表示器で、結果が１つ以上のカテゴリー（例えば a.満足、b. 警報; a. 満足、b.許容範囲外の境界線  c. 警報）に入ることを示す視覚または音響媒介の信号等で、考慮のために後でダウンロードされる記憶された値によって報告されることができる。
【００４８】
１実施例では、制御器は成果データまたは成果から得られた指令をもう１つの装置に伝達するための装置をもつ。かかる伝達は例えばワイヤ媒介の電子通信、Rf送信、IR送信等によって行うことができる。他の装置はモニターされた被検成分の測定量に応答して治療物質を送出する装置を含むことができる。該装置はまた、Palm,Inc.(Santa Clara, CA; 3Com の補助者）から入手可能のPDAsのPalmシリーズのうちの１つの如き個人のデジタルアシスタント(PDA)と一体化されるか、またはそれと結合されるようにされることができる。
【００４９】
制御器はタイミング装置を合体する。或る実施例では、モニタリングイベント(events)(針作動、等）は前設定されたタイムテーブルに従ってトリガされる。他の実施例では、使用者または医療員がタイムテーブルをプログラムすることができる。または２つ以上の前設定されたタイムテーブル間で選択することができる。
制御器との相互作用は、デジタル時計をプログラムするのに使用される如きスイッチの一層制限されたセットの如き装置の任意数を介することができる。例えばより丈夫な入力装置をもつことがででる外部装置と連絡することによって、モニタリング装置に合体された小型のキイパッドの如き、装置の任意数を介することができる。
上述した種々の制御器機能は例えば、１つの一体回路、または複数の一体回路、またはまたは他の電子装置に合体することができる。
【００５０】
他の装置の特徴
出力装置はモニタリング装置に合体される。これらは、LCDまたはLED媒介のディスプレー、単純なトーンまたは合成スピーチの何れかを放出できる音響発生装置、データ伝送用の電子装置等の如き、可視ディスプレーを含むことができる。
装置用のエネルギー源は例えば、バッテリー、または小型燃料電池とすることができる。
小型ソレノイドまたは同様の押し装置は例えば、Elan Corporation, WO99/62576号に記載されている。
【００５１】
モニタリング装置を取り付け/定着されることができる組織または人体部分は手首、前腕、上膊、胴、腿、カーブ(calves)、くるぶし等を含む。該装置は好適には、ストラップで定着される。また該装置はストラップで得られる保持力を補足するのに使用することができる接着剤で定着することができる。適当な接着剤、特にハイポアレルジェニック接着剤は例えば 3M Corporation から入手できる。モニタリング装置は前腕または腿の如き低密度の痛み感知神経をもつ組織に取り付けられることができる。
【００５２】
使用後に針を引っ込めるために、針の遠位端は当業者には既知の幾つかの装置のうちの任意のものを含むばねに取り付けられることができ、このばねは変位(displacement)から得られるポテンシャルエネルギーを貯蔵して、変位の逆転に有利な力を提供する傾向がある。かくして、アクチュエータは、それが針を延び出し位置に動かすために力を加えたとき、ばねを押すことができ、このばねは一旦アクチュエータからの力が除かれると、針を引っ込み位置に戻すのに有利な力を与えることができる。
【００５３】
もう１つの実施例では、ハウジングは相対的に開放することができず、被検成分モニタリング装置は使い捨て可能となす。例えば、針、押し装置、エネルギー源及び分析場所はハウジング内にあることができ、ハウジングは逆戻り可能に開放されることができずに、該装置は使い捨て可能として使用される。または、該装置は再開放できないようにされるハウジングをもち、エネルギー源は取り替えできないかまたは再チャージできないようにされる。
【００５４】
カセット
１実施例では、針、チャンバ、及び針が横切るモニタリング装置の下部部分は着脱自在のカセット内に据え付けられる。かくして、光検出装置及び制御器の如きモニタリング装置のより高価な部分は再使用可能であると同時に、生物学的流体に接触する部分は、カセットを取り換えることによって定期的に取り換えられる。１実施例では、電力源は定期的取り換えを保証するためにカセット内に据え付けられる。他の実施例では、電力源（例えばバッテリー、燃料電池）はアクセス可能の個別の区画内にあり、かつ個別に定期的に取り換えられる。
【００５５】
較正制御装置
１形態として、モニタリング装置は、モニターされるべき被検成分の一定濃度（プラス制御）、またはモニターされるべきサンプルのより少ない被検成分の材料成分を反映させるようデザインされた構成成分（マイナス制御）の如き、較正制御装置を含む１つ以上の制御パッケージを受け入れるためのスロットをもつ。モニタリング装置は、制御アルゴリズムを作動させるための制御パッケージの存在を感知するか、またはそのインタフェースは使用者が制御アルゴリズムを開始させるために信号を送ることを可能にする。かかる制御アルゴリズムでは、少なくとも１つのチャンバと関連する針は、制御パッケージからくる制御流体と掛合させられる。テストされた該制御流体は、プラス制御とすることができるか、または２つのチャンバを使用した場合、プラス制御とマイナス制御とすることができる。アルゴリズムは、(a) 制御結果に鑑みて光中の計算パラメータを調節するために作動する、(b) もし標準からの十分なずれに出くわすならば、計算パラメータのみを調節するよう作動する、(c) モニタリング装置が基準内にあることを確認するか、またはモニタリング装置を変えるかまたは手入れする必要を示すずれを認める、(d) それ以上の制御検定等を成した後にのみ、ずれを調節するかまたは表示するその決定をなす。
【００５６】
ISF回収の強化
１実施例では、近赤外線または可視光放出装置は
ISF-引き抜き装置に合体される。放出された光はISFがそこから引き抜かれる組織を加熱し、その結果ISF回収が増大する。理論の制限なしに増大したISF回収の１形態は加熱された組織へ行くISF流の増大である。好適には、ダイオードまたはソレノイド状レーザの如き光放出装置は1.３乃至1.6ミクロン波長範囲内の光を放出する。
【００５７】
定義
以下の用語は本願の目的のため、以下に述べた夫々の意味をもつ。
・  ジアフォラーゼ。  名称“ジアフォラーゼ”はメチレンブルーまたは2,6-ジクロロフェノール-インドフェノールの如き電子受容体の存在下でベータ-NADHまたはベータ-NADPHの何れかの酸化に触媒作用を及ぼす数個の酵素に適用されている。ジアフォラーゼは典型的には、ベータ-NADHまたはベータ-NADPHの何れかに特定のものである。Straub(Straub, Biochem,J.3:787, 1939)のピッグハート(pig heart)酵素はジアフォラーゼ(ベータ-NADH特性）並びにリポ及びリポアミド脱水素酵素活性をもつ。酵素は単一タンパク質であると報告されているが、Masseyは“ジアフォラーゼ”は変性リポアミド脱水素酵素であるかも知れないと報告している。Cu++を用いたピッグハート製剤のプレインキュベーションはリポアミド脱水素酵素活性を減らし、比例的にベータ-NADHジアフォラーゼ活性を増す。Massay and Veeger, Biochim. Biophys. Acta 48:33, 1961. 出所の例は、Clostridium kluyveri, Torula yeast, Bacillus sterothermophilus 及び当業者に明らかな他の出所を含む。
・  ばね。  ばねは任意の装置である。機械的エネルギーをポテンシャルエネルギーとして機械的に貯蔵する当業者に既知の無数の装置を含む。
【００５８】
本願に引用された特許及び特許出願を含むがこれらに限定されないすべての刊行物及び参考文献は、各個の刊行物または参考文献が特にかつ個別的に完全に説明されている参考文献として合体されるよう表示されているかのように全体的に参考として本願に組み込まれるものである。本願が優先権を請求する何れの特許出願も、刊行物及び参考文献につき上述した仕方で全体的に本願に参考として組み込まれるものである。
【００５９】
本発明は好適実施例につき強調して説明したが、好適装置及び方法の変形例を使用できること及び本発明は本文に特記されたもの以外の手法で実施することができるものであることは当業者には明らかであろう。従って、本発明は本発明の精神と範囲内に包含されるすべての変更例を含むものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の被検成分モニタリング装置を示す図である。
【図２】（Ａ）本発明の１被検成分モニタリング装置の作動を概略示す図である。
（Ｂ）本発明の１被検成分モニタリング装置の後続の作動を概略示す図である。
（Ｃ）本発明の１被検成分モニタリング装置の後続の作動を概略示す図である。
【図３】（Ａ）本発明のもう１つの被検成分モニタリング装置の作動を示す図である。
（Ｂ）本発明のもう１つの被検成分モニタリング装置の後続の作動を示す図である。
（ｃ）本発明のもう１つの被検成分モニタリング装置の後続の作動を示す図である。
【図４】（Ａ）本発明の被検成分モニタリング装置の作動を示す図である。
（Ｂ）本発明の被検成分モニタリング装置の後続の作動を示す図である。
【図５】本発明の追加の被検成分モニタリング装置を示す図である。
【図６】本発明に使用することができる光学的分析装置を示す図である。
【図７】（Ａ）本発明の１被検成分モニタリング装置の１作動を概略示す図である。
（Ｂ）本発明の１被検成分モニタリング装置の他の作動を概略示す図である。
（Ｃ）本発明の１被検成分モニタリング装置の他の作動を概略示す図である。
（Ｄ）本発明の１被検成分モニタリング装置の他の作動を概略示す図である。
（Ｅ）本発明の１被検成分モニタリング装置の他の作動を概略示す図である。
（Ｆ）本発明の１被検成分モニタリング装置の他の作動を概略示す図である。
【図８】（Ａ）本発明のもう１つの被検成分モニタリング装置の作動を示す図である。
（Ｂ）本発明のもう１つの被検成分モニタリング装置の後続の作動を示す図である。
（Ｃ）本発明のもう１つの被検成分モニタリング装置の後続の作動を示す図である。
（Ｄ）本発明のもう１つの被検成分モニタリング装置の後続の作動を示す図である。
【図１】
0004728557.tif 000002
【図２Ａ】
0004728557.tif 000003
【図２Ｂ】
0004728557.tif 000004
【図２Ｃ】
0004728557.tif 000005
【図３Ａ】
0004728557.tif 000006
【図３Ｂ】
0004728557.tif 000007
【図３Ｃ】
0004728557.tif 000008
【図４Ａ】
0004728557.tif 000009
【図４Ｂ】
0004728557.tif 000010
【図５】
0004728557.tif 000011
【図６】
0004728557.tif 000012
【図７Ａ】
0004728557.tif 000013
【図７Ｂ】
0004728557.tif 000014
【図７Ｃ】
0004728557.tif 000015
【図７Ｄ】
0004728557.tif 000016
【図７Ｅ】
0004728557.tif 000017
【図７Ｆ】
0004728557.tif 000018
【図８Ａ】
0004728557.tif 000019
【図８Ｂ】
0004728557.tif 000020
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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