(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または２記載のアミノ酸配列からなる老化を抑制する活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号４または５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡから選ばれるＤＮＡと９５％以上の相同性を有するＤＮＡであり、かつ老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡから選ばれるＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１記載のポリペプチドを認識する抗体。
【請求項７】
請求項６記載の抗体を用いる、請求項１記載のポリペプチドの免疫学的定量法。
【請求項８】
請求項５記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
【請求項９】
請求項５記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該組換え体ＤＮＡがコードするポリペプチドを該培養液中に生成蓄積させ、該培養液より該ポリペプチドを採取することを特徴とする請求項１記載のポリペプチドの製造法。
【請求項１０】
請求項１記載のポリペプチドと被験試料とを接触させ、被験試料より請求項１記載のポリペプチドに対するリガンドを選択することを特徴とする、請求項１記載のポリペプチドに対するリガンドの探索法。
【請求項１１】
請求項１記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、被験試料より請求項１記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を増強させる化合物を選択することを特徴とする、請求項１記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を増強させる化合物の探索法。
【請求項１２】
発現の増強を、請求項７記載の定量法を用いて検出することを特徴とする、請求項１１記載の探索法。
【請求項１３】
発現の増強を、請求項１記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ量を測定することにより検出することを特徴とする、請求項１１記載の探索法。
【請求項１４】
請求項２〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む遺伝子の全部または一部を欠損または置換することにより、老化を抑制する活性を有するポリペプチドの発現の量、時期または組織特異性が変化した遺伝子欠失または置換非ヒト動物。
【請求項１５】
発現量の変化が、発現が低下または発現しない変化である請求項１４記載の遺伝子欠失または置換非ヒト動物。
【請求項１６】
非ヒト動物が非ヒトほ乳類動物であることを特徴とする請求項１４または１５記載の動物。
【請求項１７】
非ヒト動物ほ乳類動物がマウスであることを特徴とする請求項１６記載の動物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、動物の老化を抑制する活性を有する新規ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドを認識する抗体、該ポリペプチドに対するリガンド、該ポリペプチドとリガンドとの特異的な結合を阻害する化合物、該ポリペプチドをコードする老化抑制遺伝子の発現を増加させる化合物、該化合物の探索法および該老化抑制遺伝子を欠損あるいは一部改変された動物の作製法と利用法に関する。
背景技術
老化現象は、通常加齢に伴い進行する個体の機能的、外見的変化における個体の劣化を意味し、老化に伴い種々の成人病の発症頻度が増加することが知られている。従って老化を何等かの形で制御できる薬剤は成人病の治療薬、予防薬、また、機能的、外見的劣化に対する保護薬、予防薬となることが期待される。
個体の老化に関する遣伝子レベルの研究は世界的に見てもまだ開始されたばかりであり、個体の老化に関する分子遺伝学的情報はこれまで皆無であった。しかし、遺伝的早期老化症は数種類知られており、代表的なものにウェルナー症候群、ハッチンソン・ギルフォード症候群（プロゲリア）、ダウン症候群、ターナー症候群、ルイ・バール症候群、ロスモンド・トムソン症候群等々がある（藤本  大三郎編：老化のメカニズムと制御、アイピーシー  １９９３年）。
ウェルナー症候群に関しては原因遺伝子の同定がなされている〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２，２５８（１９９６）〕。ウェルナー症候群の原因遺伝子はヘリカーゼと考えられており、ウェルナー症候群の患者の遺伝子には種々の変異が認められている。該患者においては、該遺伝子変異により正常なヘリカーゼ蛋白質が産生されず、その機能が発現されないことにより早期老化症状を示すものと考えられている。
以上のことから老化に関与する遺伝子が存在し、該遺伝子が変異を受けることにより、老化が促進されるとの考えが示された。他の遺伝的早期老化症にも原因遺伝子が存在するため、老化には複数の遺伝子が関与していると考えられている。
このような考えのもとに、本発明者らは老化に関与する遺伝子の探索を行い、老化の抑制活性を有するポリペプチドをコードするｋｌｏｔｈｏ遺伝子のクローニングに成功している〔Ｎａｔｕｒｅ，３９０，４５（１９９７）、ＷＯ  ９８／２９５４４〕。ｋｌｏｔｈｏ遺伝子の変異により発現が低下したマウスでは以下の観察例に示すような種々の早期老化症状を示す。
［観察例１］外見的観察：老化マウスのホモ体（８から９週齢）は、体長約４ｃｍで、同週齢の野生型マウス（約６ｃｍ）と比較してかなり小さい。また、胴の長さに対し、頭部の比率が大きい。老化マウス（８週齢、雄）では体躯が矮小であるものの、体毛のつや、四肢の爪等に異常は認められない。行動も正常である。
寿命については、１）  生後３週間前後から成長が停止し、徐々に活動性が低下する。
２）  寿命の短縮：平均寿命はオスが８．０±０．９週（ｎ＝１３）、メスが９．３±０．９週（ｎ＝１３）であり、生後１５週までに全例が死亡するという早期老化症状を特徴とする。
以下、８週令前後のホモのオス、メスそれぞれ５匹ずつ、およびそれらの同腹兄弟の野生型マウスのオス、メスそれぞれ４匹ずつを解剖して肉眼的観察の後、常法に従い（渡辺慶一、中根一穂編、酵素抗体法、学際企画、１９９２年  改訂３版）ホルマリン固定、パラフィン包埋、薄切し、ＨＥ染色を施して病理観察を行った（以下、観察例１２まで同一の手法で観察を行った）。
［観察例２］下垂体の病理観察：好酸性細胞の減少が認められた。下垂体の好酸性細胞は成長ホルモン（ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ：ＧＨ）またはプロラクチン（ｐｒｏｌａｃｔｉｎ：ＰＲＬ）を産生する細胞であるが、それらの数が減少している。高齢者ではＧＨ分泌の低下が知られている。
［観察例３］性腺の病理観察：性腺が著明に萎縮しており、不妊であることを見出した。オスでは、精巣が肉眼的に著明に萎縮している。精細管の径は野生型の約１／３程度にまで萎縮し、精子成熟がパキテン期精母細胞までしか進んでおらず、精子が全く認められない。メスでは、卵巣・子宮がやはり肉眼的にも著明に萎縮している。卵子成熟が一次卵胞までしか進んでおらず、二次卵胞や黄体は認められない。
［観察例４］顎下腺の病理観察：正常なオスでは線状部に大量の好酸性顆粒を有しているが、ホモ体では線状部の細胞は丈が低く、好酸性顆粒もほとんど認められない。
［観察例５］腎臓の病理観察：小動脈壁を始め尿細管上皮、ボウマン嚢壁などに石灰沈着が認められる。ボウマン嚢壁は扁平上皮である。
［観察例６］血管系の病理観察：まずホモ個体では動脈硬化が顕著であった。胸部大動脈の径が不整で高度の中膜石灰化が存在し、内膜肥厚も認められた。このような中膜石灰化と内膜肥厚を主体とする動脈硬化は腎動脈などの中血管や実質臓器内の小血管に至るまで認められた。特に腎実質内の血管中膜石灰化は顕著であったが、糸球体・尿細管はほぼ正常であった。沈着物が確かにＣａ２＋であることはＫｏｓｓａ染色で確認した。大動脈中膜石灰化は高齢者によく認められる所見である。
［観察例７］肺組織の病理観察：肺胞壁の破壊をともなう肺胞構造の破壊が顕著であった。肺胞壁に石灰沈着が認められる。
［観察例８］軟部組織・軟骨の観察：気管粘膜固有層、胃粘膜固有層・粘膜筋板、肺胞上皮に石灰沈着が認められた。胃底腺細胞および粘膜下結合組織、筋層に石灰沈着が認められた。胃粘膜の石灰化は長期飼育のラット・マウスで認められる所見と類似している。また、心臓の僧帽弁輪石灰化を認める個体もあった。僧帽弁輪石灰化は高齢者に特徴的な所見である。また、関節軟骨、気管軟骨、肋軟骨にも石灰沈着が認められた。これら硝子軟骨の石灰化は高齢者によく認められる所見である。
［観察例９］骨組織病理観察およびＸ線観察：大腿骨遠位端の骨幹端の骨密度の上昇、骨端軟骨の肥厚が認められる。関節軟骨では軟骨細胞への不正な石灰沈着像が認められる。大腿骨、脛骨のＸ線所見ではＸ線透過度が亢進しており、骨塩密度の低下がうかがわれる。実際骨塩密度を測定すると骨幹部・脛骨遠位端・大腿骨近位端では野生型に比べ最高約半分にまで低下している。組織学的にも皮質骨が著しく低下している。ただし、脛骨近位端と大腿骨遠位端の骨幹端では例外的に一次海綿骨が増生しており、この部分でのみ骨塩密度が逆に上昇している。
［観察例１０］小脳の病理観察：小脳神経細胞層のプルキンエ細胞数の減少および孤在性壊死・軸索の膨化が認められた。小脳においては老化に伴いプルキンエ細胞が減少し、それに伴い軸索突起は膨化することが知られている。
［観察例１１］肝臓の病理観察：好酸性に染色されるグリコーゲン顆粒がほとんど認められない。肝細胞の細胞質は正常と比較するとやや小さい。
［観察例１２］胸腺の病理観察：胸腺が著明に萎縮しており、肉眼的には確認できない個体もあった。
上記の早期老化様症状を示すマウスにおいてｋｌｏｔｈｏ遺伝子を発現させることにより、早期老化症状が抑制されることから、該遺伝子が早期老化マウスでの早期老化症状の抑制遺伝子であることが明らかにされた。またｋｌｏｔｈｏ遺伝子を発現するアデノウィルスを該早期老化症状を示すマウスに接種すると、明らかに体重増加、延命効果が認められ、早期老化症状の解消が認められた〔Ｎａｔｕｒｅ，３９０，４５（１９９７）、ＷＯ  ９８／２９５４４〕。
また、ｋｌｏｔｈｏ遺伝子と相同性の高い、ヒト由来の老化抑制遺伝子もクローニングされている〔Ｎａｔｕｒｅ，３９０，４５（１９９７）、ＷＯ  ９８／２９５４４〕。
以上のことから、老化抑制作用を有するポリペプチドの存在とその有用性が明らかとなったが、上述したように遺伝的早期老化症は複数あることから、その原因遺伝子も複数あり、老化症状には複数の遺伝子が関与していると考えられる。
よってｋｌｏｔｈｏ遺伝子以外の他の老化に関わる遺伝子が存在している可能性が十分考えられるが、ｋｌｏｔｈｏ遺伝子と上述のヒト由来のｋｌｏｔｈｏホモログ遺伝子以外には老化抑制遺伝子は未だ知られていない。
発明の開示
老化に関与する遺伝子の機能が失われることで早期老化症状が発症するなら、該遺伝子機能を補う、即ち、該遺伝子のコードする蛋白質産物を投与する、あるいは遺伝子治療的に発現させるという治療法が有用である。また該遺伝子産物と相互作用する薬剤や、該遺伝子の発現を調節できる薬剤は極めて有用である。更に、遺伝的早期老化症以外の老化においても、老化を制御することができれば、老化と密接に関連して現れる種々の成人病の治療、予防に用いることができる。
同時にこのような薬剤の動物における評価系は薬剤の開発上欠くべからざる要素であり、モデル動物、特に該遺伝子が欠損または一部改変された動物は、このような薬剤開発上非常に有用である。
本発明は上記の早期老化症の治療法、老化に関与する遺伝子の発現を調節する薬剤とその探索法、老化に伴う成人病等の治療、予防、診断に有効な薬剤や方法、該薬剤の開発に必要な老化モデル動物を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ヒト由来であるｋｌｏｔｈｏ遺伝子ホモログと相同性が高い、ｋｌｏｔｈｏ遺伝子とは異なる老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを取得し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の（１）〜（４０）に関する。
（１）配列番号１、２および３記載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有する老化を抑制する活性を有するポリペプチド。
（２）配列番号１、２および３記載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有し、かつ老化を抑制する活性を有するポリペプチド。
（３）（１）または（２）記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（４）配列番号４〜６のいずれか１つに記載の塩基配列で表されるＤＮＡ。
（５）（４）記載のＤＮＡから選ばれるＤＮＡにおいて一個以上の塩基が欠失、置換もしくは付加した塩基配列を有するＤＮＡであり、かつ老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（６）（３）〜（５）のいずれか１項に記載のＤＮＡから選ばれるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（７）（３）〜（６）のいずれか１項に記載のＤＮＡから選ばれるＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（８）（１）または（２）記載のポリペプチドを認識する抗体。
（９）（１）または（２）記載のポリペプチドを含有する早期老化症または成人病治療薬。
（１０）（１）または（２）記載のポリペプチドを含有する老化抑制薬。
（１１）（８）記載の抗体を用いる、（１）または（２）記載のポリペプチドの免疫学的定量法。
（１２）（１１）記載の定量法を用いる老化診断法。
（１３）（３）〜（６）のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有する、早期老化症または成人病治療用の遺伝子治療用ベクター。
（１４）（３）〜（６）のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有する、老化抑制用の遺伝子治療用ベクター。
（１５）（７）記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
（１６）（７）記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該組換え体ＤＮＡがコードするポリペプチドを該培養液中に生成蓄積させ、該培養液より該ポリペプチドを採取することを特徴とする（１）または（２）記載のポリペプチドの製造法。
（１７）（１）または（２）記載のポリペプチドと被験試料とを接触させ、被験試料より（１）または（２）記載のポリペプチドに対するリガンドを選択することを特徴とする、（１）または（２）記載のポリペプチドに対するリガンドの探索法。
（１８）（１７）記載の方法により得られるリガンド。
（１９）〔ａ〕（１）または（２）記載のポリペプチドと（１８）記載のリガンドを接触させた場合と〔ｂ〕（１）または（２）記載のポリペプチドと（１８）記載のリガンドおよび被験化合物とを接触させた場合との比較を行うことを特徴とする、（１）または（２）記載のポリペプチドと（１８）記載のリガンドの特異的な結合を阻害する化合物の探索法。
（２０）（１９）記載の方法により得られる化合物またはその薬理学的に許容される塩。
（２１）（１）または（２）記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、被験試料より（１）または（２）記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を増強させる化合物を選択することを特徴とする、（１）または（２）記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を増強させる化合物の探索法。
（２２）発現の増強を、（１１）記載の定量法を用いて検出することを特徴とする、（２１）記載の探索法。
（２３）発現の増強を、（１）または（２）記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ量を測定することにより検出することを特徴とする、（２１）記載の探索法。
（２４）（２１）、（２２）および（２３）のいずれか１つに記載の探索法により得られる化合物またはその薬理学的に許容される塩。
（２５）（１）または（２）記載のポリペプチドをコードする遺伝子の転写を制御する領域の下流にレポーター遺伝子の連結されたＤＮＡを含むプラスミドで形質転換された形質転換体と被験試料とを接触させ、被験試料より（１）または（２）記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を増強させる化合物を選択することを特徴とする、（１）または（２）記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を増強させる化合物の探索法。
（２６）（２５）記載の転写を制御する領域が、配列番号７記載の塩基配列において塩基番号１〜２１７７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする（２５）記載の探索法。
（２７）（２５）または（２６）記載の探索法により得られる化合物またはその薬理学的に許容される塩。
（２８）（２０）、（２４）および（２７）のいずれか１項に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩を含有する早期老化症または成人病の治療薬。
（２９）（２０）、（２４）および（２７）のいずれか１項に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩を含有する老化抑制薬。
（３０）（３）〜（６）のいずれか１項に記載のＤＮＡを含むＤＮＡを用いる家畜の改良法。
（３１）（３）〜（６）のいずれか１項に記載のＤＮＡを過剰に発現させることを特徴とする（３０）記載の家畜の改良法。
（３２）（３）〜（６）のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む遺伝子の全部または一部を欠損または置換することにより、老化を抑制する活性を有するポリペプチドの発現の量、時期または組織特異性が変化した遺伝子欠失または置換非ヒト動物。
（３３）発現量の変化が、発現が低下または発現しない変化である（３２）記載の遺伝子欠失または置換非ヒト動物。
（３４）非ヒト動物が非ヒトほ乳類動物であることを特徴とする（３２）または
（３３）記載の動物。
（３５）非ヒトほ乳動物がマウスであることを特徴とする（３３）記載の動物。
（３６）（３２）〜（３５）のいずれか１つに記載の動物、あるいは該動物の臓器、組織または細胞と被験化合物とを接触させ、被験化合物より早期老化症または成人病治療薬を選択することを特徴とする早期老化症または成人病治療薬の探索法。
（３７）（３２）〜（３５）のいずれか１つに記載の動物、あるいは該動物の臓器、組織または細胞と被験化合物とを接触させ、被験化合物より老化抑制薬を選択することを特徴とする老化抑制薬の探索法。
（３８）（３６）または（３７）記載の方法により得られる化合物またはその薬理学的に許容される塩。
（３９）（３８）記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩を含有する早期老化症または成人病の治療薬。
（４０）（３９）記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩を含有する老化抑制薬。
本発明のＤＮＡは、老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであり、例えば、
（１）配列番号１、２および３記載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（２）配列番号１、２および３記載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列とは一個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有し、かつ老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（３）配列番号４，５または６記載の塩基配列で表されるＤＮＡ、
（４）配列番号４，５または６記載の塩基配列で表されるＤＮＡの塩基配列において一個以上の塩基が欠失、置換もしくは付加した塩基配列を有し、かつ老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（５）（１）〜（４）のいずれか１つから選ばれるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、をあげることができる。
上記においてストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡとは、老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその染色体遺伝子断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザン・ブロット・ハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、４２〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１倍〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、４２〜６８℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕、ＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号１、２，および３に記載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、更に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明のポリペプチドとして、上述のＤＮＡによりコードされるポリペプチドをあげることができ、具体的には、配列番号１、２および３に記載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは配列番号１、２および３に記載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有し、かつ老化を抑制する活性を有するペプチド等をあげることができる。
上記において１個以上のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により欠失、置換若しくは付加できる程度の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されることを意味し、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をあげることができる。
ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有し、かつ老化を抑制する活性を有するペプチドは、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）、ＷＯ  ８５／００８１７、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて該ポリペプチドをコードするＤＮＡに含まれる塩基を欠失、置換または付加することで得られる変異ＤＮＡを用いて調製することができる。
本発明の老化抑制ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡは、本発明のＤＮＡから選ばれるＤＮＡをモレキュラー・クローニング第２版記載の方法に従ってベクターに連結することで得られる。
本発明のポリペプチドを製造する方法は、上記方法により作製した組換え体ＤＮＡを用いてモレキュラー・クローニング第２版記載の方法に従って形質転換された細胞を、該細胞が生育し得る適当な培養液中で培養し、該培溶液中に配列番号１、２または３記載のポリペプチドを蓄積させ、該培溶液から該ポリペプチドを採取する方法をあげることができる。また該培溶液からポリペプチドを採取するには、ポリペプチドを可溶化後、イオン交換、ゲルろ過あるいは疎水性クロマトグラフィー法等、または該クロマトグラフィー法を組み合わせることにより単離精製する方法があげられる。
本発明の抗体としては、上記発明のポリペプチドを認識する抗体をあげることができる。
上記発明のＤＮＡを連結する遺伝子治療用のベクターＤＮＡとしては、レトロウィルスベクター、アデノウィルスベクターまたは該ウィルスベクターの誘導体など、本発明のＤＮＡから選ばれるＤＮＡを動物細胞内に導入し、発現させることができるベクターをあげることができる。
本発明のリガンドとは、本発明のポリペプチドと特異的に結合する物質のことを意味し、本発明のポリペプチドと特異的に結合する物質であればいずれも本発明のリガンドとして用いることができる。
本発明のポリペプチドから選ばれるポリペプチドの発現を増強させる化合物としては、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写量を特異的に増大させる物質をあげることができる。
本発明の遺伝子改変非ヒト動物としては、ヒト以外の動物であればいかなる動物でもよいが、好ましくはほ乳動物、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、マウス、ラットなどが用いられる。特にゲッ歯類はライフサイクルが比較的短く、また繁殖が容易であることからモデル動物としては好ましく、とりわけラット、マウスが好ましい。該動物を用いて作製される遺伝子改変非ヒト動物は、本発明のＤＮＡ、および該ＤＮＡを含む染色体遺伝子を用いて、本発明の老化を抑制する作用を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子の全部あるいは一部が欠損あるいは置換した遺伝子を有する胚性幹細胞クローンを作成し、キメラ法によって該胚性幹細胞クローンと正常細胞を掛け合わせることでキメラ個体を作成後、該キメラ個体と正常個体を掛け合わせることにより、すべての細胞の該ＤＮＡに変異を有する個体を得たのち、該個体同士の掛け合わせにより相同染色体双方に変異の入ったホモ個体を得る方法により作成できる。本発明のＤＮＡを含む染色体ＤＮＡとしては配列番号７記載の塩基配列で表されるＤＮＡを含む図１に記載された染色体遺伝子を断片をあげることができる。このようにして作製された、老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子に変異を有する遺伝子を保持する個体は、本発明の老化を抑制する活性を有するポリペプチドを発現できず、老化モデル動物として有用である。
本発明の遺伝子改変非ヒト動物を用いた早期老化症治療薬、成人病治療薬、および老化抑制薬の探索法には上述の老化モデル動物を用いる方法があげられる。
具体的には、該動物を被験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較することにより、該化合物の効果を該動物の各器官、組織、細胞等の変化または早期老化症、成人病若しくは老化症状の病態等の変化を観察することにより行うことができる。該動物を被験化合物で処理する方法としては、該動物に経口投与する、または静脈注射等により投与する方法等があげられるが、とくにこれらの方法に限られることはなく、用いられる試験化合物の性質により適宜選択することができる。
１）老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡのクローン化
（１）  老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ断片のクローン化
老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ断片は、ＷＯ  ９８／２９５４４記載のｋｌｏｔｈｏ遺伝子等の塩基配列情報を基に作製されるプライマーを用い、ＰＣＲ法〔ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）〕により以下の方法で取得することができる。プライマーとしては、例えばＷＯ  ９８／２９５４４記載のｐＲＹＨＨ０２にコードされるヒト膵臓由来老化抑制遺伝子の塩基配列を基に作製したプライマーをあげることができ、たとえば配列番号９および配列番号１０に示した塩基配列を有するプライマーのセットをあげることができる。このプライマーセットを用い、染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行い、遺伝子断片を増幅する。染色体ＤＮＡとしては、動物由来の染色体ＤＮＡをあげることができ、例えばマウス由来の染色体ＤＮＡをあげることができる。ＰＣＲ反応の条件は、設計されたプライマーを用いたＰＣＲ法により特異的な増幅断片を与える条件であれば特に制限されない。例えば配列番号９および１０に記載の塩基配列からなるＤＮＡを用い、９７℃で１０分間、［９４℃で１分間、６５℃（１サイクルごとに０．５℃ずつ低下）で１分間、７２℃で１分間］のサイクルを２０回、（９４℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で１分間）のサイクルを２０回、７２℃で５分間、その後４℃で保持という条件をあげることができる。ＰＣＲの条件は、該ＰＣＲに用いられるＴａｑポリメラーゼの性質にあわせて適宜変更することが好ましい。該ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片の塩基配列を、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕あるいは、塩基配列自動分析装置、例えば、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）等を用いて決定する。上記方法で決定された老化を抑制する活性を有するポリペプチドの一部をコードするＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号８に記載された塩基配列をあげることができる。また該染色体遺伝子断片の塩基配列とＷＯ  ９８／２９５４４記載のｐＲＹＨＨ０２にコードされるヒト膵臓由来老化抑制遺伝子の塩基配列と比較することにより、本染色体遺伝子断片は老化抑制遺伝子を含むＤＮＡであることを確認することができる。
（２）  染色体遺伝子コスミドライブラリーからの老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ断片のクローン化
上記（１）で取得した、老化を抑制する活性を有するポリペプチドの一部をコードするＤＮＡを用いて、該ＤＮＡ断片を含む、より長い染色体遺伝子断片を、例えば染色体遺伝子コスミドライブラリーから（１）で取得した該ＤＮＡ断片を含むコスミドクローンを選択することにより取得することができる。
該選択法としては、（１）で取得した染色体ＤＮＡ部分断片をプローブにしたコロニー・ハイブリザイゼーション法、プラーク・ハイブリザイゼーション法（モレキュラー・クローニング第二版記載）等、あるいは（１）で取得した染色体ＤＮＡ部分断片の塩基配列から選ばれる配列を有する合成ＤＮＡをプライマーにしたＰＣＲを利用した方法等があげられる。
ＰＣＲを利用した具体的方法としては以下に示す方法があげられる。
（１）で取得した配列番号８記載の染色体ＤＮＡ断片の塩基配列から選ばれる配列を有するプライマーを合成する。プライマーとしては例えば配列番号１１および配列番号１２記載の塩基配列を有するプライマーのセットをあげることができる。該プライマーセットを用いてＰＣＲ法により染色体遺伝子コスミドライブラリーをスクリーニングする。染色体遺伝子コスミドライブラリーはモレキュラー・クローニング第２版記載の方法により作製することもできるが、市販の染色体遺伝子コスミドライブラリー（例えばＫＵＲＡＢＯ社製）を用いることもできる。取得される染色体ＤＮＡコスミドライブラリーからＰＣＲにより該遺伝子を含むクローンを選択する具体的な方法としては、該プライマーを用いたＰＣＲにより増幅断片を与えるコスミドクローンを選択することにより行われる。ＰＣＲ反応の条件は、該プライマーを用いたＰＣＲ反応により、特異的なＤＮＡ増幅を増幅できる条件であれば特に限定されない。
次に、上記ＰＣＲ反応によって増幅断片を与えるクローンに含まれる染色体ＤＮＡについて制限酵素地図を作成し、（１）で取得した染色体部分断片をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーション法を組み合わせることにより（１）でクローン化した染色体ＤＮＡ部分断片の位置、すなわち該染色体部分断片（エクソン領域）を含んだ制限酵素切断断片を同定できる。マウスの場合には、第１図に示すようなマウス染色体ＤＮＡの制限酵素地図を常法にしたがって作製できる。次に該マウス染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化したＤＮＡ断片に対し、配列番号８記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片をプローブとしたサザン解析を行い、該マウス染色体ＤＮＡ上における配列番号８記載のＤＮＡの位置を特定することで、エクソン部位が決定できる（第１図参照）。該エクソン領域を含む染色体ＤＮＡ断片について、（１）記載の常法により部分塩基配列を決定し、ヒト膵臓由来老化抑制遺伝子と相同性を比較することにより、コスミドライブラリーから選択したコスミドクローンに含まれるマウス染色体ＤＮＡ断片は、マウス老化抑制遺伝子を含む断片であることを確認する。該部分塩基配列の例として配列番号７に示す塩基配列をあげることができる。他の動物についても同様の方法を用いて、老化を抑制する活性を有するポリペプチドの一部をコードするＤＮＡを含む染色体ＤＮＡ断片を取得することができる。
該染色体ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＥＭＲＹＨＨ０２−Ｓ１０を保有する大腸菌ＥＭＲＹＨＨ０２−Ｓ１０はＦＥＲＭ  ＢＰ−６９３５として、平成１１年１１月１０日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）に寄託されている。
（３）  老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローン化
老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡをクローニングする方法としては、上記（２）に記載の方法により同定された、老化を抑制する活性を有するペプチドの一部をコードする、染色体ＤＮＡ上のエクソン部分の塩基配列から選ばれる配列を有するＤＮＡをプローブにしたサザンハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーションによりｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法、該染色体ＤＮＡ上のエクソン部の配列をもとにプライマーを設計し、ＰＣＲによりｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法等があげられる。
ＰＣＲを用いる方法としては、例えば配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡに含まれる老化抑制遺伝子のエクソン部分の塩基配列をもとにプライマーセットを作成し、ｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲ法によりスクリーニングする方法があげられる。プライマーは該老化抑制遺伝子のエクソン中の配列を特異的に増幅できればどのような配列、組み合わせでもよいが、好適には配列番号１３および配列番号１４記載のＤＮＡがあげられる。ｃＤＮＡライブラリーは該プライマーセットで特異的に増幅断片が出現するもの、つまり、該老化抑制遺伝子を発現している組織であれば限定されない。マウスの場合には１９日齢胚を用いて作製されるものがあげられる。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、該胚を用いてモレキュラー・クローニング第２版記載の方法によっても作製可能であるが、市販のものを購入してもよい。市販のｃＤＮＡライブラリーからのＰＣＲによるスクリーニング法の具体的好適な例として、マウスの場合、１９日齢胚ライブラリーをマイクロタイタープレートのウェルに小分割したものを用いた方法をあげることができる〔ＲＡＰＩＤ−ＳＣＲＥＥＮＴＭ  ｃＤＮＡ  ＬＩＢＲＡＲＹ  ＰＡＮＥＬＳ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）〕。
配列番号１３および配列番号１４記載の塩基配列を有するプライマーのセットを用いた該タイタープレートのウェル中の試料に対するＰＣＲにより、増幅断片が認められたウェルに対応するライブラリーのサブプールをさらにＰＣＲによりスクリーニングする。ＰＣＲの条件は、用いたプライマーに特異的な増幅断片を与える条件であれば特に限定されないが、好適には配列番号１３および配列番号１４記載のプライマーセットを用いた場合、９５℃で９分間、（９５℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）の反応サイクルを３３回、７２℃で５分間保温の温度条件をあげることができる。つぎに陽性ウェル、すなわち増幅断片を与えたウェル中のｃＤＮＡを含有する大腸菌のコロニーを寒天培地上に形成させた後、配列番号１３および配列番号１４記載の塩基配列を有するプライマーセットを用いたコロニーＰＣＲ法により、増幅断片が認められるコロニーを選択し、含有するプラスミドを回収し、該プラスミドに含まれるｃＤＮＡ部分の遺伝子配列を（１）記載の常法により決定する。
このようにして決定された老化抑制遺伝子配列として、例えば、配列番号４、５または６に示された配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。配列番号４記載のＤＮＡを有するプラスミドｐＥＭＲＹＨＨ０２−Ｆ１を含有する大腸菌ＥＭＲＹＨＨ０２−Ｆ１は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９３４として、配列番号６記載のＤＮＡを有するプラスミドｐＥＭＲＹＨＨ０２−Ｔ１を含有する大腸菌ＥＭＲＹＨＨ０２−Ｔ１はＦＥＲＭ  ＢＰ−６９３６としてそれぞれ平成１１年１１月１０日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）に寄託されている。
上記老化抑制遣伝子のコードするポリペプチドとしては、例えば、配列番号１、２または３に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをあげることができる。
２）老化抑制ポリペプチドの生産
上記のようにして得られる老化抑制遺伝子を宿主細胞中で発現させ、本発明のポリペプチドを製造するためには、モレキュラー・クローニング第二版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法を用いることができる。
即ち、本発明のＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ＤＮＡを造成し、該ベクターを該ベクターに適合した宿主細胞中に導入することにより、本発明のポリペプチドを発現する形質転換体を取得し、該形質転換体を培養液中で培養し、該培溶液に本発明のポリペプチド蓄積せしめることにより製造できる。
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現できるものは全て用いることができる。例えば、エッシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、ミクロバクテリウム属等に属する原核生物、クルイベロミセス属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母菌株や動物細胞宿主等をあげることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、老化抑制遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、老化抑制遺伝子発現ベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、老化抑制遺伝子、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等を例示することができる。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰｌｅｔＩプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ  １プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クリュイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シュワニオミセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ）等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ナマルバ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入できるいかなる方法も用いることができる。例えば、エレクトロポーレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等を用いることができる。形質転換体の取得および培養は、特開平２−２２７０７５号公報あるいは特開平２−２５７８９１号公報に記載されている方法に準じて行なうことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばバキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ  ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、本発明のポリペプチドを発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、本発明のポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）などを用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
本発明のＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
該ポリペプチド製造用形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら生物を培養する培地は、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
ｐＨ６〜７、培養温度２５〜３０℃がよく、培養時間は、通常１〜５日間である。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明のポリペプチド製造用形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離精製するには、通常の酵素の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該ポリペプチドを回収後、該ポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。該可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチドあるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
また、上記方法により発現させたポリペプチドを、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、桑和貿易（ＡｄｖａｎｃｅｄｃｈｅｍＴｅｃｈ社製）、パーキンエルマージャバン（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）、ファルマシアバイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、アロカ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製）、クラボウ（Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社製）、日本パーセプティブ・リミテッド（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社製）、島津製作所等のペプチド合成機を利用し合成することもできる。
３）老化抑制ポリペプチドを認識する抗体の生産
（１）ポリクローナル抗体の作製
ウサギ、ヤギまたは３〜２０週令のラット、マウスもしくはハムスターに、上述２）で取得される本発明の老化抑制ポリペプチド全長または部分断片精製標品（抗原）を、５０〜１００μｇ／匹程、該動物の皮下、静脈内または腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）または、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに投与する。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊  １９７６年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕などで確認する。
免疫に用いた抗原に対し、該血清が充分な抗体価を示したウサギ、ヤギ、マウス、ラットまたはハムスターより血清を取得し、該血清より、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析法、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはゲルろ過カラム等を用いたクロマト法等の常法を用いて精製抗体を取得する。
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産性細胞の調製
免疫に用いた老化抑制部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。
該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（以下、Ｐ３−Ｕ１と略す）〔Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８）、Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。
添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。
該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−４ｍｏｌ／Ｌ）、チミジン（１．５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）およびアミノプテリン（４×１０−７ｍｏｌ／Ｌ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとりＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ１４（１９８８）等に述べられている酵素免疫測定法により、老化抑制部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体的例として、以下の方法をあげることができる。
免疫の際、抗原に用いた老化抑制部分断片ポリペプチドを適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（ｄ）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行ない、老化抑制ポリペプチドに特異的に反応するものを抗老化抑制ポリペプチドモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを抗老化抑制ポリペプチド抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
（ｄ）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（ｃ）で取得した抗老化抑制ポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５〜２０×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。
得られた上清を、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析法、カプリル酸沈殿法〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）〕、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはセルロファインＧＳＬ２０００（生化学工業社製）を用いたカラムクロマト法等を用いて、ＩｇＧあるいはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体として使用する。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。蛋白質量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
４）モノクローナル抗体を用いた免疫細胞染色
付着細胞を用いて免疫細胞染色を行う場合には、予め下記の処理をすることにより、培養フラスコより剥がした細胞を用いることが好ましい。
即ち、培養付着細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、０．０５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）を含むＰＢＳ緩衝液３ｍｌを加え、余分な溶液を除いた後、３７℃、５分間インキュベートすることによりフラスコより細胞を剥がす（以下、この操作をトリプシン−ＥＤＴＡ処理と呼ぶ）。
浮遊細胞については培養細胞をそのまま用いることができる。
免疫細胞染色を行う細胞を免疫細胞染色用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０２％ＥＤＴＡ、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）等に懸濁し、１〜２０×１０５個ずつ丸底９６穴プレートに分注する。
該プレートに、（ｃ）で取得した抗老化抑制ポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清、（ｄ）で取得した精製モノクローナル抗体、もしくは該モノクローナル抗体を公知の方法（酵素抗体法：学際企画刊１９８５年）でビオチン標識した抗体を０．１〜５０μｇ／ｍｌの濃度になるように免疫細胞染色用緩衝液あるいは１０％動物血清を含む免疫細胞染色用緩衝液を用いて希釈したものを２０〜５００μｌ／穴となるように分注し、氷冷下で３０分間放置する。
上記において、（ｃ）で取得した抗老化抑制ポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清または（ｄ）で取得した精製モノクローナル抗体を用いた場合には、上記プレートに免疫細胞染色用緩衝液を添加し、細胞を洗浄後、ＦＩＴＣあるいはフィコエリスリン等の蛍光色素で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体あるいは抗ラットイムノグロブリン抗体を０．１〜５０μｇ／ｍｌ程度の濃度で含む免疫細胞染色用緩衝液を５０〜５００μｌ／穴ほど分注し、氷冷下で３０分間遮光して放置する。
ビオチン標識した該モノクローナル抗体を用いた場合には、上記プレートにストレプトアビジンを５０〜５００μｌ／穴ほど分注し、氷冷下で３０分間遮光して放置する。
両ケースとも、放置後、プレートに免疫細胞染色用緩衝液を添加し、細胞を良く洗浄し、セルソーターにより解析する。
５）老化抑制ポリペプチドの免疫沈降
本発明の老化抑制ポリペプチドを発現するＣＨＯ細胞あるいは昆虫細胞をシャーレ等の培養容器中で培養する。
該培養容器にＰＢＳを添加し、細胞を洗浄する。
該培養容器に氷冷した１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、２０ｍ  ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍ  ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌからなる緩衝液（以後、緩衝液１と呼ぶ）等の細胞膜を可溶化する緩衝液を１００〜５００μｌ添加し、氷上で３０分間静置した後、５分間隔でゆっくり振動させ、可溶化処理する。
該処理液を１．５ｍｌ用遠心チューブに回収し、１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。
得られた上清に、上記で用いた緩衝液で平衡化させたプロテインＧ−セファロースもしくはプロテインＡ−セファロースを１０〜５０μｌ添加し、４℃で１時間以上振盪した後、５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を回収する。
該上清に、（ｃ）で取得した抗老化抑制ポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清または（ｄ）で取得した精製モノクローナル抗体を０．０１〜５０μｇ／ｍｌとなるように添加し、４℃で１時間以上振盪する。
該振盪液にプロテインＧ−セファロースもしくはブロテインＡ−セファロースを１０〜５０μｌ添加し、４℃で１時間以上振盪後、５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離する。
得られた沈殿画分に２００μｌの上記の細胞膜を可溶化する緩衝液を添加し、沈殿を懸濁させる。同様の操作を３度以上繰り返し、沈殿画分を洗浄する。
該沈殿にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファーを添加し、ヒートブロックを用いて加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、得られたゲル中のポリペプチドをＰＶＤＦ膜等へ転写し、本発明の抗老化抑制部分断片ペプチドポリクローナル抗体等を用いたウエスタンブロッティング法等により老化抑制ポリペプチドを検出する。
６）本発明の老化抑制ポリペプチドと特異的に結合するリガンドの検索および同定
本発明の老化抑制ポリペプチドと被験試料を接触させ、被験試料より本発明のポリペプチドと特異的に結合する物質を選択することによりリガンドを探索、同定することができる。
被験試料として、例えば、哺乳動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒトなど）の尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物などを用いることができる。
例えば、尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物などを適当な希釈、濃縮、分画等を行って、本発明の老化抑制ポリペプチドに接触させ、細胞刺激活性などを指標にさらに分画することにより、最終的に単一のリガンドを単離することができる。
具体的には本来本老化抑制遺伝子を発現していない細胞と、該細胞に本老化抑制遺伝子を導入発現させた細胞の両細胞に被験試料を接触させ、例えば、細胞内カルシウム、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ等の細胞内情報伝達分子濃度の変化、細胞内蛋白質のリン酸化、初期転写因子遺伝子の発現変化、細胞膜電位の変化、細胞内ｐＨの変化、細胞外情報伝達分子の遊離、細胞の形態変化等、種々の細胞刺激活性を両細胞において測定し、両細胞における差異を詳細に比較、解析することにより、リガンドを探索し、同定することができる。
合成化合物、天然に存在するまたは人工的に合成された蛋白質、糖質、脂質およびそれらの修飾体、誘導体を、ラジオアイソトープ等により標識し、該標識化合物の、本発明の老化抑制ポリペプチド発現細胞、該細胞膜画分、もしくはマイクロタイタープレート等へ固層化した本発明の老化抑制ポリペプチドへの、結合量を測定することにより、本発明のリガンドであるか否かの同定が可能である。
また、本発明の老化抑制ポリペプチドまたはその部分改変体や部分ペプチドをＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）のセンサーチップに共有結合させ被験試料を接触させるという公知の方法〔Ｎａｔｕｒｅ，３６８，５５８（１９９４）〕により、リガンドを探索し、同定することができる。
更に、標識した本発明の老化抑制遺伝子ポリペプチドまたは非標識の該ポリペプチドと該ポリペプチドに対する標識抗体を用いて、該ポリペプチドと特異的に会合するリガンドを以下の方法で探索し、同定することが可能である。
即ち、尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物などを適当な分画を行った後、ポリアクリルアミド電気泳動、アガロース電気泳動、二次元電気泳動、などの電気泳動や、ＨＰＬＣ等のカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等の手法によりさらに分画し、本老化抑制遺伝子を発現している個体と発現していない個体、または本老化抑制遺伝子を発現している細胞と発現していない細胞等の間における差異を詳細に比較、解析することにより、本老化抑制遺伝子の発現と特異的に相関して認められる（または消失する）バンドやスポット、ピークを特定する。
該バンド、スポット、ピークより、ブロッティングの手法を用いて、ゲルまたは薄層プレートからニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＤＦ膜等の支持体に写し取った後、標識した本老化抑制遣伝子ポリペプチドまたは非標識の該ポリペプチドと該ポリペプチドに対する標識抗体を用いて、該ポリペプチドと特異的に結合するバンド、スポットを探索し、該バンド、スポットよりリガンドを抽出し、同定することができる。
７）本発明の老化抑制ポリペプチドと本発明のリガンドとの特異的結合を阻害する化合物の探索および同定
本発明の老化抑制ポリペプチドと本発明のリガンドを接触させた場合と、本老化抑制ポリペプチド、本発明のリガンドおよび被験化合物を接触させた場合との比較を行うことにより、被験試料から、本老化抑制ポリペプチドとリガンドとの特異的結合を阻害する化合物（例えば蛋白質、ペプチド、糖質、脂質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、生体成分など）をスクリーニングすることができる。該スクリーニングにより得られる化合物には、リガンドの老化抑制ポリペプチドへの特異的結合を阻害し、老化抑制ポリペプチドの有する活性を阻害する活性を有する化合物（アンタゴニスト）、および、特異的結合を阻害するが、リガンドと同様の機能を有するまたは代替する活性を有する化合物（アゴニスト）が含まれる。
被験試料として、合成化合物、天然に存在するまたは人工的に合成された蛋白質、糖質、脂質およびそれらの修飾体、誘導体などの他に、例えば、哺乳動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒトなど）の尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物、さらに発酵生産物、植物その他の生物の抽出物等をあげることができる。
該化合物のスクリーニング方法として、例えば、以下の方法をあげることができる。
本老化抑制遺伝子を導入発現させた細胞もしくは本来本老化抑制遺伝子を発現している細胞に本発明のリガンド単独、または本発明のリガンドと被験試料を接触させ、例えば、細胞内カルシウム、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ等の細胞内情報伝達分子濃度の変化、細胞内蛋白質のリン酸化、初期転写因子遺伝子の発現変化、細胞膜電位の変化、細胞内ｐＨの変化、細胞外情報伝達分子の遊離、細胞の形態変化等、種々の細胞刺激活性をリガンド単独の場合と、リガンドと被験試料を接触させた場合とで比較することにより、本発明の老化抑制遺伝子ポリペプチドと本発明のリガンドの特異的結合を阻害する化合物を探索し、同定する方法をあげることができる。
また本発明のリガンドをラジオアイソトープ等によって標識し、該標識リガンドの本発明の老化抑制ポリペプチド発現細胞、該細胞膜画分またはマイクロタイタープレート等へ固層化した本発明の老化抑制ポリペプチドへの結合量を該標識を利用して測定し、リガンド単独の場合と、リガンドと被験試料を接触させた場合とで比較することにより、本発明の老化抑制遺伝子ポリペプチドとリガンドとの結合を阻害する化合物を探索し、同定することができる。
８）本発明の老化抑制ポリペプチドと本発明のリガンドが結合した結果誘導される化合物の探索および同定
本発明のポリペプチドを発現させた細胞と、該ポリペプチドを発現しない細胞のそれぞれに本発明のリガンドを接触させた場合と接触させない場合で、その培養上清、細胞、細胞質画分、細胞膜画分等についてポリアクリルアミド電気泳動、アガロース電気泳動、二次元電気泳動、などの電気泳動や、ＨＰＬＣ等のカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等を行い、各成分を分画し、各成分について比較を行うことにより、リガンドを接触させた場合に特異的、また該ポリペプチド発現に相関して特異的に現れる、または消失するバンド、スポット、ピーク等を同定し、該バンド、スポット、ピークより目的とする分子を取得することができる。
また、本発明のポリペプチドを発現している個体では該ポリペプチドとリガンドとの特異的結合が恒常的に生じていると考えられ、発現していない個体（具体的に好適な例としては本特許明細書記載の遺伝子破壊マウス）ではこの相互作用が生じないと考えられる。従って正常のマウスと本特許記載の早期老化マウスの種々の臓器、組織、体液、血液、尿等を適当な分画を行った後、ポリアクリルアミド電気泳動、アガロース電気泳動、二次元電気泳動、などの電気泳動や、ＨＰＬＣ等のカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等の手法により分画し、比較を行うことにより、両者で異なる挙動を示すバンド、スポット、ピーク等を探索し、該バンド、スポット、ピークより分子を回収し、該バンド、スポット、ピークより目的とする化合物を同定することができる。
９）本発明の老化抑制ポリペプチドの発現を増強させる化合物（以下、発現増強化合物と略す）の探索および同定
（１）本発明の老化抑制ポリペプチドを認識する抗体を用いた探索および同定
本発明の老化抑制ポリペプチドを発現する細胞を被験試料と接触させた後、本発明の老化抑制ポリペプチドを認識する抗体を用いて、該ポリペプチドを定量することにより、その細胞中、細胞培養上清中に存在する発現増強化合物を探索、同定することができる。
本発明の老化抑制ポリペプチドを発現する細胞として、例えばマウス膵臓、胎児肝臓、乳腺由来の細胞をあげることができる。例えば胎児肝臓についていえば公知の方法（初代培養肝細胞実験法、学会出版センター刊、１９８７年）を用いて調製したものを用いることができる。
被験試料として、合成化合物、天然に存在するまたは人工的に合成されたタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、糖質、脂質およびそれらの修飾体、誘導体などの他に、例えば、哺乳動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒトなど）の尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物、さらに発酵生産物、植物その他の生物の抽出物等を挙げることができるが、それらに限定されない。
本発明の老化抑制ポリペプチドを発現する細胞を、例えば該細胞の増殖することのできる培地に懸濁し、被験試料を該培地に添加し、該細胞を接触させた後、該細胞の発現した老化抑制ポリペプチド含量を、上記３）のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用い、上記４）の方法に準じて定量する。
被験試料を添加しない系と比較し、老化抑制ポリペプチド含量を増加させることのできた被験試料を探索することにより、発現増強化合物を同定することができる。
（２）本発明の老化抑制遺伝子の転写産物の定量系を利用した探索および同定
本発明の老化抑制ポリペプチドを発現する細胞を被験試料と接触させた後、本発明の老化抑制遺伝子の転写産物を定量することにより発現増強化合物を探索、同定することができる。
本発明の老化抑制ポリペプチドを発現する細胞および被験試料として、上記（１）記載のものを用いることができる。
本発明の老化抑制ポリペプチドを発現する細胞を、例えば該細胞の増殖することのできる培地に懸濁し、被験試料を該培地に添加し、該細胞を接触させた後、該細胞の発現した老化抑制遺伝子の転写産物の量を、通常のノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーション法、ＲＮＡのドット・ブロット・ハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法などを用い定量することができる。
ハイブリダイゼーション法等に用いることのできるプローブおよびＲＴ−ＰＣＲ法等に用いることのできるプライマーとして、本発明の老化抑制遺伝子断片をあげることができ、具体的には配列番号４、５または６記載のＤＮＡ配列から選ばれる配列を有するＤＮＡ断片を好適に用いることができる。
被験試料を添加しない系と比較し、本発明の老化抑制遺伝子の転写産物含量を増加させることのできる被験試料を探索することにより、発現増強化合物を同定することができる。
（３）レポーター遺伝子を利用した探索および同定
本発明の老化抑制ポリペプチドをコードする遺伝子の転写を制御する領域（以下、転写制御領域と略す）の下流にレポーター遣伝子の連結されたＤＮＡを含むプラスミドで形質転換された形質転換体と被験試料とを接触させた後、レポーター遺伝子によりコードされたポリペプチドの発現量を定量することにより発現増強化合物を探索、同定することができる。
転写制御領域としては、配列番号７記載の塩基番号１−２１７７番の領域をあげることができる。また、該領域を適当な制限酵素を用い、適切な長さに切断した断片を転写制御領域として用いることができる。
レポーター遺伝子としては、該遺伝子の翻訳産物が細胞内で安定であり、該翻訳産物の存在量が容易に定量できるものであればいかなるものでも用いることができ、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、グリーンフルオレッセントプロテイン（ＧＦＰ）をコードする遺伝子等をあげることができる。
被験試料として、上記（１）のものを用いることができる。
転写制御領域の下流に常法によりレポーター遺伝子を連結し、作製したプラスミドを用い、常法により宿主細胞を形質転換する。
該形質転換体を、例えば該細胞の増殖することのできる培地に懸濁し、被験試料を該培地に添加し、該細胞を接触させた後、該細胞の発現したレポーター遺伝子の転写産物の量を、該転写産物に適した方法で検出、定量する。
検出、定量法として、ＣＡＴの場合には、例えば、モレキュラー・クローニング第２版，１６章，６０頁に記載の方法を、β−ｇａｌの場合には、例えば、モレキュラー・クローニング第２版，１６章，６６頁に記載の方法を、ｌｕｃの場合には、例えば、実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ４、遺伝子導入と発現・解析法、８１（１９９４）に記載の方法を、ＧＦＰの場合には、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９４，４６５３（１９９７）記載の方法等をあげることができる。
被験試料を添加しない系と比較し、本発明の老化抑制遺伝子の転写産物含量を増加させることのできた被験試料を探索することにより、発現増強化合物を同定することができる。
１０）老化抑制ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ポリペプチドを認識する抗体、本発明のリガンドおよび発現増強化合物の利用
（１）本発明の抗老化抑制ポリペプチド抗体を用いることにより、血液、臓器の一部、細胞等のサンプルでの老化抑制ポリペプチドの検出、定量を行うことができる。
具体的に好適な手法としてはマイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法・蛍光抗体法、ウェスタンブロット法などがあげられ、また病理組織切片を用いた免疫組織染色にも利用できる。従って該抗体は老化抑制ポリペプチド発現の低下に伴う早期老化症や種々の成人病の発生の可能性の診断に有用である。同様に該ペプチドを対象とした研究における研究用試薬としても有用である。
（２）本発明の老化抑制ポリペプチドの全長または部分断片を生体に投与することにより老化の抑制が可能である。従って老化の進行に密接に関連して生ずる種々の成人病、例えば動脈硬化、高血圧、骨粗鬆症等の治療薬、予防薬として有用である。また老化の抑制に基づく寿命の延長の効果にも有用である。
（３）本発明の老化抑制遺伝子をレトロウィルス、アデノウィルス等のウィルスベクターやその他のベクターに組み込み、遺伝子治療の方法により治療に用いることができる。
（４）本発明の老化抑制遺伝子を用いて、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法により、該遺伝子の発現量を測定し、老化、成人病を診断するとともに、該老化抑制遺伝子を老化抑制、成人病発症抑制に利用することができる。また、該老化抑制遺伝子の先天的な欠損により、老化が促進され、成人病を生じやすくなった個体を、該老化抑制遺伝子を用いたサザン・ブロット・ハイブリダイゼーションやＰＣＲ法あるいはＳＳＣＰ法により検出し、該検出された個体の核酸配列情報を基に遺伝子診断を行うことができる。更に該老化抑制遺伝子は遺伝子研究用試薬としても極めて有用である。
（５）更に、本発明により提供される、目的とする家畜動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ニワトリ等、由来の老化抑制遺伝子を相応する動物に投与するか、または該遺伝子を遺伝子治療的に適当なウィルス等のベクターを用いて個体で発現させることにより、さらに該遺伝子を強発現する細胞の核を用いた核移植によるクローン作成法により目的とする家畜の寿命を延長し、また老化を抑制することが可能である。これにより長期に渡り状態の良い飼育と、乳や卵や産子の長期に渡る採取が可能となる。もしくは受精卵に該遺伝子を導入し、体中全ての細胞の染色体に該遺伝子を挿入し、発現させる、いわゆるトランスジェニック動物を作製することにより、同様の効果が期待でき、畜産分野でも育種の面から有用性が高いと考えられる。
（６）本発明の本老化抑制ポリペプチドは、該ポリペプチドに特異的に結合するリガンドを探索し、決定するための試薬として有用である。
（７）本発明の老化抑制ポリペプチドと本発明のリガンドとを用いて、該ポリペプチドとリガンドの特異的結合を阻害する化合物の探索および同定に用いることができる。
（８）本発明の老化抑制ポリペプチドと本発明のリガンドを利用し、該ポリペプチドとリガンドが結合した結果誘導される分子を探索、同定することができる。
（９）本発明のリガンド、本発明の老化抑制ポリペプチドと本発明のリガンドとの特異的結合を阻害する化合物、本発明のポリペプチドとリガンドが結合した結果誘導される分子は、本発明の老化抑制遺伝子ポリペプチドの老化抑制機能を代替もしくは補助すると考えられ、これら分子を含む薬剤は早期老化症治療薬、成人病治療薬、老化抑制薬として有用である。
（１０）早期老化症治療薬、成人病治療薬、老化抑制薬として有用である本発明の老化抑制ポリペプチドをコードする老化抑制遺伝子の発現を増加させる化合物（発現増強化合物）は、老化抑制ポリペプチド同様、老化の抑制、成人病の治療、予防に有用である。
１１）老化抑制遺伝子が欠損または置換した遺伝子改変非ヒト動物の作製法と利用法
（１）老化抑制遺伝子の全部或いはその一部が欠損または置換した、不活性型または置換型老化抑制遺伝子を含むベクターを用い胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）において染色体上の老化抑制遺伝子を公知の相同組換えの手法〔例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，２９５（１９８７）、Ｃｅｌｌ，５１，５０３（１９８７）等〕により不活化または任意の配列と置換した変異クローンを作成することができる〔Ｎａｔｕｒｅ，３５０，２４３（１９９１）〕。
具体的には第１図または配列番号７で示した染色体遺伝子断片を用いることができる。ターゲティングベクターは以下のように造成できるが、これに限定するものではない。
第１図のＳａｃＩ−ＢｇｌＩＩ断片（ｓｈｏｒｔ  ａｒｍ：約２．３ｋｂ）、ＰＧＫｎｅｏｂｐＡカセット〔ＰＧＫプロータ−ネオマイシン耐性遺伝子−ウシ成長ホルモン遺伝子ポリアデニレーションシグナル配列からなるネオマイシン耐性遺伝子発現ユニット、Ｃｅｌｌ，６４，６９３（１９９１）〕、第１図のＳｐｈＩ−ＳｐｈＩ断片（ｌｏｍｇ  ａｒｍ：約４．３ｋｂ）、ＭＣ１／ＤＴ−Ａカセット〔ＭＣ１プロモータとジフテリア毒素Ａ鎖からなるジフテリア毒素Ａ鎖発現ユニット、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１４，７７（１９９３）〕を第１図のＴａｒｇｅｔｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒと示したように連結した断片を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）を造成する。該ベクターをＫｐｎＩなどで切断し線状化した後、ＴＴ２細胞〔Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１４，７０（１９９３）〕などのＥＳ細胞株に導入する。Ｇ４１８耐性を有するクローンよりＰＣＲ法またはサザンハイブリダイゼーション法により、相同組換えを起こして本老化抑制遺伝子のエクソン１部分が破壊されたクローンを選択する。
このようにして作成した胚性幹細胞クローンを用い、動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｃｙｓｔ）への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を作成することができる。このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞の本老化抑制遺伝子に変異を有する個体を得ることができ、さらにその個体の掛け合わせにより相同染色体の双方に変異が入った、ホモ個体を得ることができる。
このようにして動物個体において、老化抑制遺伝子の任意の位置へ変異の導入が可能である。例えば老化抑制遺伝子の翻訳領域中への塩基置換、欠失、挿入等の変異を導入することにより、その産物の活性を変化させることができる。またその発現制御領域への同様な変異の導入により、発現の程度、時期、組織特異性等を改変させることも可能である。さらにＣｒｅ−ｌｏｘＰ系〔Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９８，６００（１９９６）〕との組合せにより、より積極的に発現時期、発現部位、発現量等を制御することも可能である。このような例としては脳のある特定の領域で発現されるプロモータを利用して、その領域でのみ目的遺伝子を欠失させた例〔Ｃｅｌｌ，８７，１３１７（１９９６）〕やＣｒｅを発現するアデノウィルスを用いて、目的の時期に、臓器特異的に目的遺伝子を欠失させた例〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，５３３５（１９９７）〕が知られている。従って本発明の老化抑制遣伝子についてもこのように任意の時期や組織で発現を制御できる、または任意の挿入、欠失、置換をその翻訳領域や、発現制御領域に有する動物個体を作成することが可能である。このような動物は任意の時期、任意の程度または任意の部位で、老化と老化に伴って生ずる成人病等の種々の疾患の症状を誘導することができる。従って老化や成人病等の種々の疾患の治療や予防において極めて有用な動物モデルとなる。特にその治療薬、予防薬、また機能性食品、健康食品等の評価用モデルとして非常に有用である。
発明を実施するための最良の形態
以下実施例を示すが、実施例中、遺伝子操作的手法は特に断らない限り公知のモレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法により行った。
実施例１  老化抑制遺伝子マウスカウンターパート染色体遺伝子のクローン化
（工程１）マウス老化抑制遺伝子染色体断片のクローン化  マウス染色体ＤＮＡ１００ｎｇ、配列番号９に示した塩基配列を有するセンスプライマー１０μｍｏｌ／Ｌを１μｌ、配列番号１０に示した塩基配列を有するアンチセンスプライマー１０μｍｏｌ／Ｌを１μｌと、１０×ＰＣＲ用緩衝液（酵素に添付してあるものを使用）４μｌ、２．５ｍ  ｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ  ３．２μｌを混合し、水を加えて総量を４０μｌとした後、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製、５単位／μｌ）０．５μｌを混合した。９７℃で１０分間、［９４℃で１分間、６５℃（１サイクルごとに０．５℃ずつ低下）で１分間、７２℃で１分間］のサイクルを２０回、（９４℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で１分間）のサイクルを２０回、７２℃で５分間、その後４℃保持という条件でＰＣＲ反応を行った。アガロースゲル電気泳動により解析した結果、約０．３ｋｂの断片が認められたため、増幅断片をアガロースゲルから精製し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＤＮＡライゲーションキット  ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて組み込んだ。方法はキットの説明書の指示に従った。この溶液を用い大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を形質転換し、アンピシリン耐性を有する形質転換体を得た。該形質転換体からプラスミド抽出機ＰＩ−１００（クラボウ社製）を用いてプラスミドを抽出し、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用い、塩基配列をＤＮＡシークエンサー３７７〔Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製〕を用いて決定したところ、ヒト老化抑制遺伝子と相同性を示す配列番号８記載の塩基配列を有するクローンを見出した。
（工程２）マウス老化抑制遺伝子染色体遺伝子のクローン化  工程１で単離したクローンの配列中に特異的かつ完全一致するプライマーとして配列番号１１（配列番号８記載の塩基配列中、塩基番号３１〜５８）および配列番号１２（配列番号８記載の塩基配列中、塩基番号１９８〜２１９の相補鎖）記載のＤＮＡを合成した。配列番号１１および１２記載の塩基配列を有するプライマーセットを用い、１２９Ｓｖｊマウス由来ＥＳ細胞株の染色体遺伝子ＢＡＣライブラリーを検索し、このプライマーセットにより特異的なバンドが増幅される、すなわちマウス老化抑制遺伝子を含むＢＡＣクローン、ｃｌｏｎｅ  １９３４８を単離した。ｃｌｏｎｅ  １９３４８は約１４０ｋｂの挿入断片を有していた。
得られたクローンは、種々の制限酵素消化による解析並びに工程１で得られたクローン断片をプローブとしたサザン・ブロットにより解析した。サザンブロット解析のプローブには、工程（１）で得られたクローン断片をＤＩＧ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）によりジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識したものを用いた。標識法はキット付属の説明書に従った。ＢＡＣクローンは種々の制限酵素で切断し、アガロース電気泳動で分画した後、ナイロンメンブレンフィルターＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）にブロッティングした。ベＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｍａｎｎｈｅｉｍ社のプロトコール（ＤＩＧ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｉｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）に従って、ＤＮＡの変性、固定化、プローブとのハイブリダイズ、フィルターの洗浄を行った。ハイブリダイズ溶液は５×ＳＳＣ、１％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ〔ＤＩＧ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｉｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（ベーリンガー・マンハイム社製）〕、０．１％Ｓａｃｒｃｏｓｙｌ、０．０２％ＳＤＳを含むものを用い、６８℃で一晩行った。また、洗浄は振とうしながら、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中室温で１０分間を２回行った後、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中で６８℃で１５分間を２回行った後、抗ＤＩＧ抗体を用いたＤＩＧ検出キット（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて、ＳａｃＩ消化した場合約１０ｋｂの断片上にプローブとハイブリダイズする領域が存在することが確認された。
そこでｃｌｏｎｅ  １９３４８をＳａｃＩで消化し、生ずる約１０ｋｂの断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）のＳａｃＩ部位にクローン化した。該断片を種々の制限酵素で消化して、第１図に示す制限酵素地図を作製した。種々の制限酵素切断により生ずる断片のサブクローン化により、また同時にＥｘｏ  Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いた逐次消化によるｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｓｅｒｉｅｓを該キット添付の使用説明書に従い作成し、工程１に示した方法で塩基配列を決定した。その結果、第１図の制限酵素地図上左端から約４ｋｂの範囲で塩基配列が決定でき、その中にはヒトＲＹＨＨ０２  ｃＤＮＡと高い相同性を示す領域、すなわちエクソン１と考えられる領域が第１図に示す位置に特定できた。決定された塩基配列を配列番号７に記載した。従ってこの約１０ｋｂ断片上にはマウス老化抑制遺伝子のエクソン１が含まれることが確認された。
実施例２  マウス老化抑制遺伝子ｃＤＮＡのクローン化
マウス老化抑制遺伝子ｃＤＮＡのスクリーニングにはＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ  ｍｏｕｓｅ  １９日齢胚  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙのＲＡＰＩＤ−ＳＣＲＥＥＮＴＭ  ｃＤＮＡ  ＬＩＢＲＡＲＹ  ＰＡＮＥＬＳ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を配列番号１３（配列番号７記載の塩基配列中、塩基番号２３８９〜２４１１）および配列番号１４（配列番号７記載の塩基配列中、塩基番号２９５１〜２９７５の相補鎖）記載のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応により行った。スクリーニング条件等は全てＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のマニュアルに従った。すなわちマスタープレートの各ウェルのプラスミド溶液を用い、２５μｌの反応系で１×ＰＣＲ緩衝液、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ各ｄＮＴＰｓ、配列番号１３記載の塩基配列を有するプライマー１μｍｏｌ／Ｌ、配列番号１４記載の塩基配列を有するプライマー１μｍｏｌ／Ｌ、１．２５Ｕ  Ａｍｐｌｉ  ＴａｑＲ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）の反応溶液組成、９５℃で９分間、（９５℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）の反応を３３サイクル、７２℃で５分間の温度条件でＰＣＲ反応を行った。アガロースゲル電気泳動で解析した結果、６つのウェル由来の反応液に特異的な増幅バンドが検出されたため、該６ウェルに対応する９６ウェルのサブプレートを購入し、同様にＰＣＲ反応を行い、最終的に２ウェルに陽性反応を見出した。該２ウェルに対応する大腸菌グリセロールストックをＬＢ培地で１０００倍に希釈した後、寒天培地上に塗り広げ、コロニーを出現させた。
コロニーＰＣＲ法により、出現したコロニーをランダムに検索し、得られた陽性コロニーからプラスミドを抽出した後、該プラスミドに含有されるｃＤＮＡ部分の全塩基配列を決定した。得られた塩基配列を配列番号４，５および６に、該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１、２および３に示した。
実施例３  老化抑制遺伝子の組織発現分布
ＷＯ  ９８／２９５４４記載のｐＲＹＨＨ０２にコードされるヒト膵臓由来老化抑制ポリペプチドは、ｋｌｏｔｈｏ遺伝子にコードされているポリペプチドとアミノ酸配列で約４５％の相同性を示すことから、ｋｌｏｔｈｏファミリーに属する老化抑制ポリペプチドである。
本発明のＤＮＡにコードされる老化抑制ポリペプチドは、ヒト膵臓由来老化抑制ポリペプチドのマウスカウンターパートであり、ｋｌｏｔｈｏ遺伝子がコードするポリペプチドと約４４％、ヒト膵臓由来老化抑制ポリペプチドと７６％の相同性を有することから、本発明の老化抑制ポリペプチドもまたｋｌｏｔｈｏファミリーに属するポリペプチドであり、ｋｌｏｔｈｏと類似の機能を有すると考えられる。
本発明の老化抑制ポリペプチドの機能を予測する上で、ｋｌｏｔｈｏ遺伝子がコードするポリペプチドとヒト膵臓由来老化抑制ポリペプチドの組織発現分布を比較することは、有効な手段であると考えられる。
ＷＯ  ９８／２９５４４記載のｐＲＹＨＨ０２にコードされるヒト老化抑制遺伝子塩基配列をもとに、配列番号１５記載の塩基配列からなるＤＮＡおよび配列番号１６記載の塩基配列からなるＤＮＡを合成した。
一方、ヒト各種臓器由来のｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）から一本鎖ｃＤＮＡの合成をキット（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＢＲＬ社製）を用いて行った。１μｇのｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成し、水で２４０倍希釈してＰＣＲの鋳型として使用した。プライマーとしては、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いた。ｍＲＮＡとしては、副腎、脳、尾状核、海馬、黒質、視床、腎、膵臓、脳下垂体、小腸、骨髄、扁桃体、小脳、脳梁、胎児脳、胎児腎、胎児肝臓、胎児肺、心臓、肝臓、肺、リンパ節、乳腺、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、子宮の３５種の臓器由来のものを用いた。
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、一本鎖ｃＤＮＡ（０．２ｎｇ／μｌ）５μｌ、１０×Ｅｘ−Ｔａｑ緩衝液２μｌ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰｓ  １．６μｌ、２０μｍｏｌ／Ｌの配列番号１５記載の塩基配列を有するプライマー１μｌ、２０μｍｏｌ／Ｌの配列番号１６記載の塩基配列を有するプライマー１μｌ、ＤＭＳＯ  １μｌ、Ｅｘ−Ｔａｑ（宝酒造社製）０．１μｌ、Ｈ２Ｏ  ８．３μｌからなる溶液を９８℃で５分間、（９４℃で３０秒間、６５℃で１分間、７２℃で２分間）の反応を３０サイクル、７２℃で１０分間という反応を行った。反応産物をアガロースゲル電気泳動にて解析し、生ずるバンドの強度により各組織での発現強度を分析した。
その結果、膵臓、胎児肝臓、乳腺の各組織において強い発現が認められ、尾状核、骨髄、肝臓、精巣で弱い発現が認められたが、その他の組織では調べた範囲で発現は確認されなかった。従ってヒト膵臓由来老化抑制遺伝子の発現は組織特異性が認められ、腎臓で強発現するｋｌｏｔｈｏ遺伝子とは明らかに異なる発現分布を示すことが明らかなことから、両者の生体内で担う機能は明らかに異なると考えられる。
従ってヒト膵臓由来老化抑制ポリペプチドとより高い相同性を有する本発明の老化抑制ポリペプチドもまた、その役割においてｋｌｏｔｈｏとは異なる効果を有すると考えられる。
産業上の利用可能性
本発明は、動物の老化を抑制する新規ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む染色体ＤＮＡ断片、該ポリペプチドを認識する抗体、本発明のポリペプチドに対するリガンド、本発明のポリペプチドとリガンドとの特異的な結合を阻害する化合物、本発明の老化抑制ポリペプチドをコードする老化抑制遺伝子の発現を増加させる化合物、該化合物の探索法および該老化抑制遺伝子を欠損あるいは一部改変された動物の作製法と利用法を提供する。
「配列表フリーテキスト」
配列番号９−配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、老化抑制遺伝子染色体遺伝子クローンの制限酵素地図、および相同組換え法による本老化抑制遺伝子欠失、置換体作成用ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒの構造を示す図である。図中、ｂｐは塩基対（ｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ）、ｋｂはキロ塩基対（ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ）、ＰＧＫｎｅｏｂｐＡはＰＧＫプロータ−ネオマイシン耐性遺伝子−ウシ成長ホルモン遺伝子ポリアデニレーションシグナル配列からなるネオマイシン耐性遺伝子発現ユニットＭＣ１／ＤＴ−Ａ：ＭＣ１プロモータとジフテリア毒素Ａ鎖からなるジフテリア毒素Ａ鎖発現ユニットを表す。
【図１】
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