(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内グルタチオン量を増加させる物質をスクリーニングする方法であって、GTRAP3-18蛋白質を発現する培養細胞に被験物質を接触させ、GTRAP3-18蛋白質の発現量を減少させるか、またはGTRAP3-18蛋白質の機能を抑制する物質を、目的物質として特定することを特徴とする方法。
【請求項２】
細胞内グルタチオン量を増加させる物質をスクリーニングする方法であって、非ヒト動物個体内のGTRAP3-18蛋白質を発現する細胞に被験物質を接触させ、GTRAP3-18蛋白質の発現量を減少させるか、またはGTRAP3-18蛋白質の機能を抑制する物質を、目的物質として特定することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、神経変性疾患、悪性腫瘍、感染症など多数の疾患治療薬の有効成分となりうる細胞内グルタチオン量増加物質をスクリーニングする方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞内グルタチオンは生体が有する主要な抗酸化物質であり、生体防御にきわめて重要な分子である（非特許文献１）。グルタチオンは３個のアミノ酸（グリシン、システイン、グルタミン酸）からなり、２段階の酵素反応によって合成される。しかし、グルタチオンの原料である３種類のアミノ酸を単に投与しただけでは細胞内のグルタチオンは増加しないことから、複雑な調節機構が予想される。【０００３】
実験的に神経細胞内のグルタチオンを減少させると神経変性が起こることが知られている（非特許文献２）。実際の疾患においても、神経変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病など）、悪性腫瘍、感染症など多数の疾患でグルタチオンが減少していることが知られており、グルタチオンを増加させる治療薬があればきわめて有用であると予想され、望まれている（非特許文献３−６）。しかし、そのような治療薬は現存しない。【０００４】
細胞膜に発現するEAAC1（excitory amino acid carrier-1）はグルタミン酸を細胞内に取り込む蛋白質（グルタミン酸輸送蛋白質）として発見されたが、グルタミン酸輸送蛋白としては能力が低く、他の蛋白質（GLT-1、GLAST）の方がグルタミン酸輸送蛋白としてははるかに重要であることが知られている（非特許文献７−８）。その後、EAAC1はグルタミン酸のみならずシステインを含む他のアミノ酸を輸送する能力があることが見出された（非特許文献９−１１）。【０００５】
さらに最近になって、EAAC1は細胞内グルタチオン量を維持するために必要な蛋白質であることが発見された（非特許文献１２）。これはEAAC1にはグルタチオンの構成アミノ酸であるグルタミン酸およびシステインを輸送する能力があることが貢献していると推定された。【０００６】
従って、EAAC１を活性化する手段があれば、理論的には細胞内グルタチオン量を増加させることが可能かもしれない。しかしながら、現在のところ、EAAC1に結合して活性化する分子や化合物は発見されていない。また、EAAC1を標的とする薬物の開発上懸念される点は、細胞膜に発現する輸送蛋白質に結合する分子や化合物はいずれも阻害薬となっているという事実である。たとえば、セロトニン輸送蛋白に対する抗うつ薬のSSRI、ノルアドレナリン輸送蛋白に対する抗うつ薬のデシプラミン、神経終末顆粒ものアミン輸送蛋白に対する降圧薬のレセルピンなどの例がある。したがって、EAAC1を標的とする分子や化合物はむしろ、グルタチオン量を減少させてしまう可能性が大きいと考えられ、実際にその例がある（非特許文献１３）
一方、EAAC1と結合する生体内分子としては、GTRAP3-18（glutamate -transporter-associated protein 3-18）という蛋白質が存在する。このGTRAP3-18は脳、脊髄、腎臓、心臓、骨格筋に多く発現し、EAAC１と結合してグルタミン酸の輸送能力を低下させることが知られている（非特許文献１４）。ただし、EAAC１の各アミノ酸の輸送機構が異なっているため（非特許文献１５，１６）、GTRAP3-18がEAAC1と結合した場合にシステインの輸送能力がどのように変化するかは不明であり、さらにGTRAP3-18の増減が細胞内グルタチオン量にどのように影響するかは全く不明であった。なお、GTRAP3-18のアミノ酸配列や、GTRAP3-18をコードするcDNA配列は特許文献１に記載されている。
【特許文献１】米国特許第6,808,893号
【非特許文献１】Dringen, Prog Neurobiol 62: 649-671, 2000.
【非特許文献２】Jain et al., Proc Natl Acad Sci 88: 1913-1917, 1991.
【非特許文献３】Exner et al., Wien Klin Wochenschr 112: 610-616, 2000.
【非特許文献４】Lomaestro et al., Ann Pharmacother 29: 1263-1273, 1995.
【非特許文献５】Reid and Johoor , Curr Opin Clin Nutr Metab Care 4: 65-71, 2001.
【非特許文献６】Townsend and Tew, Oncogene 22: 7369-7375, 2003.
【非特許文献７】Kanai et al. Neuroreport 6: 2357-2362, 1995.
【非特許文献８】Robinson and Dowd Adv Pharmacol 37: 69-115, 1997.
【非特許文献９】King, et al. Cardiovasc Res 52: 84-94, 2001.
【非特許文献１０】Chen and Swanson J Neurochem 84: 1332-1339, 2003.
【非特許文献１１】Himi et al. J Neural Transm 110: 1337-1348, 2003.
【非特許文献１２】Aoyama et al., Nature Neuroscience 9:119-126, 2006.
【非特許文献１３】Esslinger et al., Neuropharmacology 49: 850-861, 2005.
【非特許文献１４】Lin et al. Nature 410: 84-88, 2001.
【非特許文献１５】Bendahan, A.et al., J Biol Chem 275: 37436-37442, 2000.
【非特許文献１６】Borre and Kahner, J Biol Chem 279: 2513-2519, 2004.
【発明の開示】
【０００７】
前記のとおり、神経変性疾患、悪性腫瘍、感染症など多数の疾患手段として、グルタチオンを増加させる治療薬の開発が望まれている。
【０００８】
本願発明は、そのようなグルタチオンを増加させる治療薬の有効成分となる物質をスクリーニングするための手段を提供することを課題としている。
本願発明者らは、グルタチオンとの関係が知られていなかったGTRAP3-18蛋白質に着目し、鋭意研究の結果、GTRAP3-18蛋白質の発現を人為的に減少させるとグルタチオン量が増加し、逆にGTRAP3-18蛋白質の発現を増加させるとグルタチオン量が減少することを見出した。
【０００９】
本願発明は、このような発明者らの新規な知見に基づくものである。
すなわち、本願発明は、細胞内グルタチオン量を増加させる物質をスクリーニングする方法であって、GTRAP3-18蛋白質を発現する細胞に被験物質を接触させ、GTRAP3-18蛋白質の発現量を減少させるか、またはGTRAP3-18蛋白質の機能を抑制する物質を、目的物質として特定することを特徴とする方法である。
また本願発明の方法は、動物個体内の細胞を対象として行うこともできる。
本願発明によれば、従来全く存在していなかった、細胞内グルタチオン量を増加させることのできる物質を特定することが可能となる。このような物質は、神経変性疾患、悪性腫瘍、感染症などの疾患に対する新しい治療薬の開発を大きく促進する。
本願発明において、「GTRAP3-18蛋白質の発現量の減少」とは、細胞内におけるGTRAP3-18蛋白質それ自体の減少、あるいはGTRAP3-18蛋白質をコードする遺伝子の転写量の減少、遺伝子転写産物からのGTRAP3-18蛋白質への翻訳量の減少等を意味する。また、「GTRAP3-18蛋白質の機能抑制」とは、GTRAP3-18蛋白質の機能（例えばEAAC1活性を抑制する機能、さらにはEAAC1活性の抑制によってグルタチオン量を減少させる機能）が抑制されることを意味する。さらに、「細胞に被験物質を接触させる」とは、被験物質が細胞内でGTRAP3-18蛋白質発現に作用するように、細胞に被験物質を接触させることを意味する。
【００１０】
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等、あるいはこれらに引用されている文献に基づいて行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】HEK293細胞のGTRAP3-18蛋白発現に及ぼすGTRAP3-18アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびメチル−β−シクロデキストリン（MeβCD）の影響を調べた結果である。HEK293細胞にGTRAP3-18センスオリゴヌクレオチド(GTRAP3-18(S))もしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド(GTRAP3-18(As))を導入するか、または250μMメチル−β−シクロデキストリン（MeβCD）を作用させた。A)細胞を破砕後、抗EAAC1抗体、抗GTRAP3-18抗体、抗Actin抗体を用いてウェスタンブロットを行った。B)ウェスタンブロットの結果をデジタル化し、Actinに対する比で表した。GTRAP3-18アンチセンスオリゴヌクレオチドの導入によりGTRAP3-18は減少し、MeβCDによりGTRAP3-18は増加した。EAAC1量は変化しなかった。
【図２】図１の条件下で、細胞内グルタチオン量(GSH)を定量した。GTRAP3-18アンチセンスオリゴヌクレオチドの導入によりグルタチオンは増加し、MeβCDによりグルタチオンは減少した。
【図３】マウス海馬細胞のGTRAP3-18蛋白発現に及ぼすGTRAP3-18 siRNAの影響を調べた結果である。A)細胞を破砕後、抗GTRAP3-18抗体を用いてウェスタンブロットを行った。B)ウェスタンブロットの結果をデジタル化し、Buffer投与に対する比で表した。GTRAP3-18 siRNAの導入によりGTRAP3-18量は減少した。
【図４】マウス海馬細胞のEAAC1蛋白発現に及ぼすEAAC1 siRNAの影響を調べた結果である。A)細胞を破砕後、抗EAAC1抗体を用いてウェスタンブロットを行った。B)ウェスタンブロットの結果をデジタル化し、Buffer投与に対する比で表した。EAAC1 siRNAの導入によりEAAC1量は減少した。
【図５】図３および図４の条件下で海馬細胞内グルタチオン量を定量した結果である。EAAC1 siRNAの脳室内投与によって海馬細胞のグルタチオン量は減少したが、GTRAP3-18量 siRNAによってグルタチオン量は増加した。
【図６】マウス海馬細胞のGTRAP3-18蛋白発現に及ぼすメチル−β−シクロデキストリン（MeβCD）の影響を調べた結果である。A)細胞を破砕後、抗EAAC1抗体、抗GTRAP3-18抗体、抗Actin抗体を用いてウェスタンブロットを行った。B)ウェスタンブロットの結果をデジタル化し、Actinに対する比で表した。MeβCDによりGTRAP3-18は増加した。EAAC1量は変化しなかった。
【図７】図6の条件下で、細胞内グルタチオン量(GSH)を定量した。MeβCDによりグルタチオンは減少した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本願発明方法において使用する「GTRAP3-18蛋白質を発現する細胞」は、GTRAP3-18蛋白質を発現している細胞を動物体内から単離し、培養した細胞、あるいは動物体内の細胞である。培養細胞を対象とする場合はin vitroスクリーニングであり、動物個体内の細胞を対象とする場合はin vivoスクリーニングである。また対象となる細胞は、特に、GTRAP3-18蛋白質を多く発現している脳、脊髄、腎臓、心臓、骨格筋等に由来する細胞が好ましい。【００１３】
あるいはまた、特にin vitroスクリーニングの場合は、GTRAP3-18蛋白質をコードするポリヌクレオチド（cDNA）によって形質転換させた細胞を使用することもできる。GTRAP3-18蛋白質をコードするcDNAは、公知のヌクレオチド配列またはその一部配列からなるDNA断片をプローブとしてゲノムDNAライブラリーやcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。得られたcDNAは、例えば、PCR（Polymerase Chain Reaction）法、NASBN（Nucleic acid sequence based amplification）法、TMA（Transcription-mediated amplification）法、SDA（Strand Displacement Amplification）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。また、公知配列に基づいて合成したプライマーを用いて、細胞から単離したmRNAを鋳型とするRT-PCR法によっても目的cDNAを得ることもできる。なお、ヒトGTRAP3-18のcDNA配列は、特許文献１（米国特許第6,808,893号）に開示されている。また、形質転換する細胞は、ヒト等に由来する哺乳動物細胞が好ましいが、GTRAP3-18の発現量に対する被験物質の効果を確認する目的であれば、他の動植物細胞や大腸菌等の原核細胞であってもよい。【００１４】
in vitroスクリーニングの場合には、培養細胞の培地に被験物質を添加することによって細胞に被験物質を接触させる。またin vivoスクリーニングの場合には、動物個体に被験物質を投与（例えば、経口投与、静脈注射、腹腔注射、皮下注射、脳内注射など）し、GTRAP3-18蛋白質を多く発現している脳、脊髄、腎臓、心臓、骨格筋等の細胞に被験物質を接触させる。【００１５】
スクリーニングの対象となる被験物質には、例えば、有機または無機の化合物（特に低分子量の化合物）、タンパク質、ペプチド等が含まれる。これらの物質は、機能や構造が既知のものであって未知のものであってもよい。【００１６】
また、「コンビナトリアルケミカルライブラリー」は、目的物質を効率的に特定するための被験物質群として有効な手段である。コンビナトリアルケミカルライブラリーは、化学合成または生物学的合成により、試薬などの多くの化学的「ビルディングブロック」を結びつけることにより生成される種々の化学組成物のコレクションである。例えば、ペプチドライブラリーなどの直線的なコンビナトリアルケミカルライブラリーは、ビルディングブロック（アミノ酸）のセットを、所与の化合物の長さ（すなわちペプチドのサイズ）について可能なすべての方法で結びつけることにより形成される。化学的なビルディングブロックについてのこのようなコンビナトリアルミキシングを通して、多数の化学組成物を合成することが可能である。例えば、100の可換的な化学的ビルディングブロックについての系統的なコンビナトリアルミキシングは、結果として１億個の4量体化合物または100億個の5量体化合物を生じる（例えば、Gallop et al.,（1994）37（9）:1233-1250参照）。コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第6,004,617号；5,985,365号を参照）。このようなコンビナトリアルケミカルライブラリーは、例えばペプチドライブラリー（例えば米国特許第5,010,175号；Furka（1991）Int. J. Pept. Prot. Res., 37:487-493、Houghton et al.,（1991）Nature, 354:84-88参照）、ペプトイド(peptoids)（例えば、WO91/19735参照）、コード化ペプチド（例えば、WO93/20242参照）、ランダムなバイオオリゴマー（例えば、WO92/00091参照）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第5,288,514号参照）、ヒダントイン、ベンゾアゼピン、およびジペプチド（例えば、Hobbs（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-6913参照）などのダイバーソマー（diversomer）、ビニログ性ポリペプチド（例えば、Hagihara（1992）J. Amer. Chem. Soc. 114:6568参照）、β-D-グルコース骨格をもつ非ペプチド性ペプチド模倣物（例えばHirschmann（1992）J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218参照）、低分子化合物ライブラリーの類似有機合成（例えば、Chen（1994）J. Amer. Chem. Soc. 116:2661参照）、オリゴカルバメート（例えば、Cho（1993）Science 261:1303）、および/またはペプチジルホスホネート（例えば、Campbell（1994）J. Org. Chem. 59:658参照）等である。また核酸ライブラリー（例えばGordon（1994）J. Med. Chem. 37:1385参照）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば米国特許第5,539,083号参照）、抗体ライブラリー（例えばVaughn（1996）Nature biotechnology 14:309-314参照）、炭水化物ライブラリー（例えばLiang et al.,（1996）Science 274:1520-1522、米国特許第5,593,853号参照）、有機低分子ライブラリーとしてイソプレノイドライブラリー（例えば米国特許第5,569,588号参照）；チアゾリジノンおよびメタチアゾノンライブラリー（米国特許第5,549,974号参照）；ピロリジンライブラリー（米国特許第5,525,735号および5,519,134号参照）；モルフォリノ化合物ライブラリー（米国特許第5,506,337号参照）、ベンゾジアゼピンライブラリー（米国特許第5,288,514号参照）等も使用することができる。さらには、市販のライブラリー（例えば、米国ComGenex社製、ロシアAsinex社製、米国Tripos, Inc.社製、ロシアChemStar, Ltd社製、米国3D Pharmaceuticals社製、Martek Biosciences社製などのライブラリー）を使用することもできる。【００１７】
GTRAP3-18の発現は、例えば、GTRAP3-18遺伝子の転写産物（mRNA）を測定することによって定量することができる。例えば、公知の遺伝子工学および分子生物学的技術に従い、当該分野で特定の遺伝子の発現を検知測定するために知られた手法、例えばin situ ハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、ドットブロット、RNaseプロテクションアッセイ、RT-PCR、Real-Time PCR（Journal of Molecular Endocrinology, 25, 169-193(2000)およびそこで引用されている文献）、DNAアレイ解析法（Mark Shena編、"Microarray Biochip Technology", Eaton Publishing, 2000）などによってGTRAP3-18 mRNA発現量を検知・測定して実施することができる。【００１８】
例えば、オリゴヌクレオチドプローブを用いてGTRAP3-18 mRNA量を検出する方法（ノーザンブロット分析法の場合には、少なくとも以下の工程：
(a)被験物質を接触させた細胞からRNAを調製する工程；
(b)工程(a)で調製されたRNAを電気泳動分離する工程；
(c)工程(b)で分離されたRNAをオリゴヌクレオチドプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする工程；
(d)工程(e)でRNAにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの標識量をGTRAP3-18 mRNA発現量の指標とし、対照細胞の結果と比較する工程
を含む。【００１９】
対照細胞の結果と比較して、有意に低いGTRAP3-18 mRNA発現量を生じさせた被験物質を、目的物質（細胞内グルタチオン量を増加させる物質）として特定する。【００２０】
オリゴヌクレオチドプローブは、GTRAP3-18 mRNAとストリンジェントな条件（例えば特表平10-508186号公報、特表平9-511236号公報に記載された条件）でハイブリダイズするため、mRNAの任意領域と正確に相補的な配列からなるDNA配列を用いる。このようなDNA配列は、例えばGTRAP3-18 cDNAを適当な制限酵素で切断することによっても得ることができる。あるいは、Carruthers（1982）Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams（1983）J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov（1997）Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel（1995）Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers（1994）Biochemistry 33:7886-7896; Narang（1979）Meth. Enzymol. 68:90; Brown（1979）Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage（1981）Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することができる。【００２１】
また、オリゴヌクレオチドプローブはラジオアイソトープ（RI）法または非RI法によって標識するが、非RI法を用いることが好ましい。非RI法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シアニン色素（例えば、Cy Dye TMシリーズのCy3、Cy5等）、ローダミン6G試薬、N-アセトキシ-N2-アセチルアミノフルオレン（AAF）、AAIF（AAFのヨウ素誘導体）などを使用することができる。また標識法としては、当該分野で知られた方法（例えばランダムプライム法、ニック・トランスレーション法、PCRによるDNAの増幅、ラベリング／テイリング法、in vitro transcription法等）を適宜選択して使用できる。例えば、HRFオリゴヌクレオチドに官能基（例えば、第一級脂肪族アミノ基、SH基など）を導入し、こうした官能基に前記の標識を結合して標識化オリゴヌクレオチドプローブを作成することができる。【００２２】
また、DNAマイクロアレイを使用することによってもGTRAP3-18 mRNA量を測定することができる。この方法は、少なくとも以下の工程：
(a)被験物質を接触させた細胞からRNAを調製する工程；
(b)工程(a)で調製したRNAから、標識cDNAを調製する工程、
(c)工程(b)で調製した標識cDNAをDNAマイクロアレイに接触させる工程；
(d)工程(c)でDNAマイクロアレイのキャプチャープローブにハイブリダイズした標識cDNAの標識量をGTRAP3-18 mRNA量の指標とし、対照細胞の結果と比較する工程
を含む。【００２３】
対照細胞の結果と比較して、有意に低いGTRAP3-18 mRNA発現量を生じさせた被験物質を、目的物質（細胞内グルタチオン量を増加させる物質）として特定する。【００２４】
またさらに、GTRAP3-18 mRNA量はRT-PCT法によっても測定することができる。この方法は、少なくとも以下の工程：
(a)被験物質を接触させた細胞からRNAを調製する工程；
(b)工程(a)で調製したRNAを鋳型とし、プライマーセットを用いてcDNAを合成する工程；
(c)工程(b)で合成されたcDNA量をGTRAP3-18 mRNA量の指標とし、対照細胞の結果と比較する工程
を含む。【００２５】
対照細胞の結果と比較して、有意に低いGTRAP3-18 mRNA発現量を生じさせた被験物質を、目的物質（細胞内グルタチオン量を増加させる物質）として特定する。【００２６】
使用するプライマーセットは、公知のGTRAP3-18 cDNA配列に基づき、市販のソフトウェア、例えばOligoTM［National Bioscience Inc.（米国）製］、GENETYX［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いて設計し、合成・精製の各工程を経て調製することができる。【００２７】
GTRAP3-18遺伝子の発現を測定する別の方法は、GTRAP3-18遺伝子の発現産物であるGTRAP3-18蛋白質量を定量することである。このような蛋白質の定量は、公知の遺伝子工学および分子生物学的技術に従い、当該分野で特定の蛋白質量を検知測定するために知られた手法、例えばin situ ハイブリダイゼーション、ウェスタンブロッティング、各種の免疫組織学的方法などによって行うことができる。【００２８】
具体的には、GTRAP3-18蛋白質を特異的に認識する抗体を用いて実施することができる。抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、それぞれGTRAP3-18蛋白質のエピトープに結合することができる全体分子、およびFab、F(ab')2、Fv断片等が全て含まれる。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、GTRAP3-18蛋白質やその一部断片を免疫原として動物を免役した後、血清から得ることができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。【００２９】
また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996）に従い作製することができる。【００３０】
また抗体の標識物質は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、turnover numberが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のEIAに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3',5,5'−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、125Ｉや3Ｈ等の通常のRIAで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。【００３１】
このような抗体を使用する方法は、例えば免疫染色、例えば組織あるいは細胞染色、免疫電子顕微鏡、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで行うことができ、放射免疫測定法（RIA）、蛍光免疫測定法（FIA）、ルミネッセント免疫測定法（LIA）、酵素免疫測定法（EIA）、ELISAなどを用いることができ、B-F分離を行ってもよいし、あるいは行わないでその測定を行うことができる。好ましくはRIA、EIA、FIA、LIAであり、さらにサンドイッチ型アッセイが挙げられる。サンドイッチ型アッセイには、同時サンドイッチ型アッセイ、フォワード（forward）サンドイッチ型アッセイあるいは逆サンドイッチ型アッセイなどであってもよい。【００３２】
以上に例示したような方法によって、GTRAP3-18遺伝子の発現を指標として、細胞内におけるGTRAP3-18蛋白質量を減少させる物質（すなわち、細胞内グルタチオン量を増加させる物質）を特定することができる。【００３３】
また、細胞内グルタチオン量を増加させる物質は、GTRAP3-18蛋白質の機能を抑制する物質を探索することによっても特定することができる。GTRAP3-18蛋白質の機能は、例えばEAAC1活性の抑制である。従って、GTRAP3-18とEAAC1が共存する細胞において、EAAC1活性（グルタミン酸輸送）が促進すれば、その原因として被験物質がGTRAP3-18の機能を抑制したと判定することができる。また、EAAC1活性の促進（GTRAP3-18機能の抑制）は、細胞内グルタチオン量の増加を引き起こすから、グルタチオン量を測定することによってGTRAP3-18機能の抑制を判定することもできる。【００３４】
以下、実施例として、本願発明の基礎となった実験結果を示す
【実施例１】
【００３５】
HEK293細胞にGTRAP3-18のアンチセンスオリゴヌクレオチドを一過性に導入することにより細胞内のGTRAP3-18量を減少させた（図１）。次いで、細胞内グルタチオン量をThioGlo-1（Calbiochem社）により測定した。GTRAP3-18量の増加はウェスタンブロット法によって確認した。対照群にはセンスオリゴヌクレオチドを導入した細胞を用いた。【００３６】
その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドの導入によってGTRAP3-18量を減少させた細胞におけるグルタチオン量は、対象群に比較して有意に増加した（図２）。【００３７】
この結果は、GTRAP3-18量を減少させることにより、細胞内グルタチオン量を増加させることが可能であることを示している。【００３８】
一方、メチル−β−シクロデキストリン（MeβCD）をHEK293細胞に作用させるとGTRAP3−18量が対照群に比べて増加することをウェスタンブロット法によって確認した（図１）。このとき、細胞内グルタチオン量は対照群に比べて有意に減少していた（図２）。【００３９】
この結果は、GTRAP3-18量を増大させることにより、細胞内グルタチオン量が減少することを示している。【００４０】
以上の結果から、細胞内のGTRAP3-18量の変化（あるいはGTRAP3-18の機能変化）を指標として、細胞内グルタチオン量を増加させることのできる物質の探索が可能であることが確認された。
【実施例２】
【００４１】
マウスの脳室内に、GTRAP3-18に対するsiRNAを投与（10μg/h）した。1週間後、海馬細胞におけるGTRAP3-18量はコントロール（Buffer）を投与した場合と比較して優位に減少した（図３）。同様に、EAAC1に対するsiRNAをマウス脳室内に投与した場合の海馬細胞におけるEAAC1量を測定し、このsiRNAによってEAAC1量が有意に減少することを確認した（図４）。【００４２】
次に、このようにしてGTRAP3-18量およびEAAC1量を減少させた海馬細胞におけるグルタチオン量を測定した。すなわち、海馬組織からの抽出液をEDTA（ethylenediaminetetraacetic acid）、GSH reductase、DTNB（5,5’-ditiobis-nitrobenzoic acid）、NADPHを含む反応溶液と混合した後、412 nmの吸光度を測定した。GSH標準溶液の吸光度を用いて濃度を求めた後、組織重量にて補正した。【００４３】
その結果、図５に示したとおり、EAAC1量を減少させたマウス海馬細胞ではグルタチオン量もコントロールよりも減少したが、GTRAP3-18量を減少させたマウス海馬細胞ではグルタチオン量はコントロールよりも有意に増加した。【００４４】
一方、メチル−β−シクロデキストリン（MeβCD）をマウス脳室内に投与すると、海馬細胞におけるGTRAP3−18量が対照群に比べて増加するが（図６）、このとき、海馬細胞内グルタチオン量は対照群に比べて有意に減少した（図７）。【００４５】
以上の結果から、動物個体内の細胞を対象としても、GTRAP3-18の発現に対する効果を指標とすることで、グルタチオン量を増加させる物質のスクリーニングが可能であることが確認された。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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