(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵法又は酵素的方法により得られた陽イオンを含むコハク酸含有液からコハク酸を精製する方法において前記コハク酸含有液を、同コハク酸含有液に含まれる水素イオン以外の陽イオンに対して当量以上のＨ型強酸性陽イオン交換樹脂と接触させ、得られたイオン交換処理液からコハク酸結晶を析出せしめ、精製されたコハク酸を得ることを特徴とするコハク酸の精製方法。
【請求項２】
前記コハク酸含有液が、コハク酸の塩を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コハク酸の塩が、コハク酸のナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、及びアンモニウム塩より選ばれることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記コハク酸含有液は炭酸塩を含み、かつ、当該コハク酸含有液に酸を添加してｐＨを５．０以下に調整した後、Ｈ型強酸性陽イオン交換樹脂と接触させることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記酸として、前記イオン交換処理液を用いることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記酸として、前記イオン交換処理液から析出したコハク酸を除いた溶液を用いることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
微生物の菌体又はその処理物を水性反応液中で有機原料に作用させることによりコハク酸含有液を取得し、このコハク酸含有液を、同コハク酸含有液に含まれる水素イオン以外の陽イオンに対して当量以上のＨ型強酸性陽イオン交換樹脂と接触させ、得られたイオン交換処理液からコハク酸結晶を析出せしめ、精製されたコハク酸を得ることを特徴とする、コハク酸の製造方法。
【請求項８】
前記水性反応液のｐＨを炭酸マグネシウム又は水酸化マグネシウムで中和することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、コハク酸塩を蓄積させた発酵ブロスからコハク酸を精製する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  コハク酸は、近年、生分解性ポリマーの原料として注目されている。更に、コハク酸は４−炭素中間体として特殊化学品の原料として広く使われている。生分解性ポリマーや特殊化学品の原料となるためには、高純度のコハク酸を安価に製造することが必要である。この理由は、コハク酸から最終生成物への反応が、原料コハク酸に含まれる不純物によって阻害されたり、あるいは最終生成物の品質の劣化原因となるからである。【０００３】  したがって、発酵法や酵素法により、ポリマーや特殊化学品の原料としてのコハク酸を製造するためには、不純物を多く含む発酵ブロスや酵素反応液から効率よく不純物を淘汰し、かつ安価に製造する必要がある。【０００４】  一般的に、コハク酸を発酵法や酵素法で製造するためには、至的なｐＨを保つために培地あるいは酵素反応液に対イオンを添加する。このためコハク酸を蓄積させた培養液あるいは酵素反応液では、多くの場合コハク酸は塩の形で存在する。従って、高純度のコハク酸を製造するためには、発酵培地、あるいは酵素反応液に添加する対イオンを除去する必要がある。さらに、発酵ブロスには他の有機酸やアミノ酸などの多くの不純物が含まれており、これらを効率よく除去する必要がある。【０００５】  従来、高純度のコハク酸を製造する方法としては、イオン交換樹脂を用いる方法、コハク酸の難溶性塩を用いる方法、電気透析を用いる方法等が報告されている。
イオン交換樹脂を用いる方法は、陰イオン交換樹脂を用いる方法と、弱酸性陽イオン交換樹脂を用いる方法に大別される。【０００６】  陰イオン交換樹脂を用いる方法では、まずコハク酸塩を含む原料液に陰イオン交換樹脂を接触させてコハク酸を樹脂に吸着させた後に、有機溶媒、アンモニア水等で溶離する方法（特許文献１、２参照）が報告されている。しかしながら、本法では溶離液中に含まれる有機溶媒やアンモニア等のアルカリを除去・回収する必要があり、工程が複雑となる。【０００７】  一方、陽イオン交換樹脂にコハク酸の対イオンを吸着させ、コハク酸を貫流液として回収する方法（特許文献３参照）が報告されている。しかしながらこの方法では使用するイオン交換樹脂が弱酸性陽イオン交換樹脂であるため、原料液のコハク酸の対イオンがアンモニアに限定されており、他の対イオンとのコハク酸塩には適用出来ないという問題がある。【０００８】  コハク酸の難溶性塩を利用する方法としては、コハク酸塩を含む原料液にカルシウムイオンを添加して、コハク酸カルシウム沈殿として回収する方法（特許文献４）がある。しかし、この方法では、沈殿からカルシウムを除去する際に副生するカルシウム塩の処理が煩雑となるという問題がある。【０００９】  電気透析を利用する方法としては、（特許文献５、６参照）があるが、本法の場合、原料液中に含まれる他の有機酸（酢酸）がコハク酸と同じ挙動を示し、これを除去することが困難であるという問題がある。【００１０】  ところで、コハク酸等の有機酸を含有する水性溶液から有機酸を回収する方法として、水性溶液中の水素イオン濃度を、Ｈ型イオン交換樹脂等を用いて、有機酸の陰イオンと結合するのに必要な量又はそれ以上となるように調整する方法が報告されている（特許文献７）。この方法において、水素イオン濃度を、有機酸の陰イオンと結合するのに必要な量以上に調整する場合、好ましい濃度は当量よりも１〜約１０％高い濃度であると記載されている。しかし、水素イオン濃度をこのような濃度に調整しても、前記方法では、コハク酸の対イオンである発酵液等に含まれる陽イオンをほぼ完全に除くことは困難であるため、コハク酸の純度が低くなるという問題点がある。
【特許文献１】特開昭６２−２３８２３１号公報
【特許文献２】米国特許第５，１３２，４５６号
【特許文献３】特開昭６２−２３８２３２号公報
【特許文献４】特開昭６２−２９４０９０号公報
【特許文献５】特開平２−２８３２８９号公報
【特許文献６】特開平３−１５１８８４号公報
【特許文献７】国際公開第０１／６６５０８号パンフレット（ＷＯ  ０１／６６５０８）
【発明の開示】
【００１１】  本発明が解決しようとする課題は、コハク酸塩を蓄積させた発酵ブロスあるいは酵素反応液から、高純度のコハク酸を高収率で精製する簡便な方法を提供することである。
【００１２】  本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、特定量以上のＨ型強酸性陽イオン交換樹脂を用いたイオン交換と、コハク酸の晶析を組み合わせることで、コハク酸含有液中の不純物を効率よく除去し、高純度のコハク酸を高収率で製造することができることを見出し、発明を完成するに至った。
【００１３】  すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）発酵法又は酵素的方法により得られた陽イオンを含むコハク酸含有液からコハク酸を精製する方法において、前記コハク酸含有液を、同コハク酸含有液に含まれる水素イオン以外の陽イオンに対して当量以上のＨ型強酸性陽イオン交換樹脂と接触させ、得られたイオン交換処理液からコハク酸結晶を析出せしめ、精製されたコハク酸を得ることを特徴とするコハク酸の精製方法。
（２）前記コハク酸含有液が、コハク酸の塩を含むことを特徴とする（１）の方法。
（３）前記コハク酸の塩が、コハク酸のナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、及びアンモニウム塩より選ばれることを特徴とする（２）の方法。
（４）前記コハク酸含有液は炭酸塩を含み、かつ、当該コハク酸含有液に酸を添加してｐＨを５．０以下に調整した後、Ｈ型強酸性陽イオン交換樹脂と接触させることを特徴とする、（３）の方法。
（５）前記酸として、前記イオン交換処理液を用いることを特徴とする（４）の方法。
（６）前記酸として、前記イオン交換処理液から析出したコハク酸を除いた溶液を用いることを特徴とする（４）の方法。
（７）微生物の菌体又はその処理物を水性反応液中で有機原料に作用させることによりコハク酸含有液を取得し、このコハク酸含有液を、同コハク酸含有液に含まれる水素イオン以外の陽イオンに対して当量以上のＨ型強酸性陽イオン交換樹脂と接触させ、得られたイオン交換処理液からコハク酸結晶を析出せしめ、精製されたコハク酸を得ることを特徴とする、コハク酸の製造方法。
（８）前記水性反応液のｐＨを炭酸マグネシウム又は水酸化マグネシウムで中和することを特徴とする（７）の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】  本発明の方法は、発酵法又は酵素的方法により得られた陽イオンを含むコハク酸含有液からコハク酸を精製する方法において、前記コハク酸含有液を、同コハク酸含有液に含まれる水素イオン以外の陽イオンに対して当量以上のＨ型強酸性陽イオン交換樹脂と接触させ、得られたイオン交換処理液からコハク酸結晶を析出せしめ、精製されたコハク酸を得ることを特徴とする。【００１５】  以下、本発明を詳細に説明する。【００１６】＜１＞コハク酸含有液の調製
本発明が適用される発酵法又は酵素的方法により得られた陽イオンを含むコハク酸含有液は、コハク酸、及び水素イオン以外の陽イオンを含むものであれば特に制限されないが、具体的には、コハク酸を含む発酵液、又は炭素源もしくはコハク酸合成の原料又は中間体からコハク酸を生成する反応を触媒する微生物、その処理物又は酵素による反応液等が挙げられる。【００１７】  コハク酸含有液としては、コハク酸塩、好ましくはコハク酸の中性塩を含むことが好ましい。塩として具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。【００１８】  本発明におけるコハク酸含有液の製造法は特に限定されないが、例えば、特開平５−６８５７６号公報、及び特開平１１−１９６８８８号公報に記載の方法を用いることができる。具体的には、ブレビバクテリウム属に属し、コハク酸生成活性を有する微生物菌体又はその処理物を、フマル酸又はその塩等の有機原料を含有する水性反応液に作用させることにより、コハク酸含有液を得ることができる。【００１９】  前記微生物としては、好気性コリネ型細菌、例えば、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３株、及びブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１株等が挙げられる。【００２０】  ＭＪ−２３３株は、１９７５年４月２８日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７が付与されている。また、ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１株は、１９７６年１１月１７日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−３８１２として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８が付与されている。【００２１】  尚、本発明においては、用いる微生物はブレビバクテリウム属細菌に限られず、コハク酸を産生するものであれば特に制限されない。このような微生物としては、例えば、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物（特公昭５６−１７０７７号公報）、アナエロビオスピルリム・サクシニシプロデュセンス（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）等が挙げられる。【００２２】  前記反応液には、還元型及び／又は酸化型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを添加してものよい。その添加濃度は、０．１ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは１ｍＭ〜４０ｍＭである。【００２３】  前記好気的コリネ型細菌等の微生物は、細胞内のピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）活性が増強するように改変されていてもよい。例えば、ＰＣをコードする遺伝子で微生物を形質転換することによって、ＰＣ活性を増強することができる。用いるＰＣ遺伝子としては、微生物または動植物由来の遺伝子、より具体的にはヒト、マウス、ラット、酵母、又はコリネバクテリウム属、バチルス属、リゾビウム属もしくはエシェリヒア属に属する微生物由来の遺伝子が挙げられる。ＰＣ遺伝子の取得、及びＰＣ遺伝子が導入されたコハク酸生産菌については、特開平１１−１９６８８８号公報に記載されている。また、微生物のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を増強することによっても、コハク酸の生産能が向上することが期待される（特公平７−８３７１４号公報、特開平９−１２１８７２号公報参照）。【００２４】  ＰＣ遺伝子及び同遺伝子を含むプラスミドとして具体的には、特開平１１−１９６８８８号公報に記載のｐＰＣ−ＰＹＣ２及び同プラスミドが保持するサッカロマイセス・セレビシエ由来のＰＣ遺伝子（ＰＹＣ２）が挙げられる。また、サッカロマイセス・セレビシエ由来の他のＰＣ遺伝子（ＰＹＣ１）も用いることができる。【００２５】  好気性コリネ型細菌、特にＰＣ遺伝子が導入された同細菌を用いる場合、有機原料を含有する水性反応液に同細菌又はその処理物を作用させる際に、同反応液は炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有することが好ましい。また、この反応は、嫌気的条件下で行うことがより好ましい。【００２６】  好気性コリネ型細菌を本発明の方法に用いるためには、まず菌体を通常の好気的な条件で培養したのち用いることができる。培養に用いる培地は、通常微生物の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。【００２７】  培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収し、菌体をそのまま又は処理物として次に示す反応に用いられる。ここでいう処理物とは、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、またその上清を硫安処理等で部分精製したＰＣ活性を有する画分等を指す。【００２８】  反応液には、水、緩衝液、培地等が用いられるが、適当な無機塩を含有した培地が最も好ましい。【００２９】  本発明に用いる有機原料としては、発酵法においては、コハク酸を生成し得るものであれば特に限定されることなく、一般的な有機原料から選択できる。具体的には、安価であり、コハク酸の生成速度の速いグルコースやエタノールが好適に用いられる。この場合、グルコースの添加濃度は、０．５ｇ／Ｌ〜５００ｇ／Ｌが好ましく、エタノールの添加濃度は、０．５ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌが好ましい。
また、酵素法においては、有機原料としては、フマル酸、又はフマル酸ナトリウム、フマル酸アンモニウム等の塩が挙げられる。【００３０】  尚、コハク酸含有液の製造に微生物の生菌体を用いる場合、コハク酸の生成は、発酵によるものであるか酵素的反応によるものであるかの厳密な区別は困難であるが、結果として陽イオン及びコハク酸を含む溶液が得られる限り、本発明においてはいずれであるかは問わない。【００３１】  反応液には、一般にｐＨを至適に保つため、陽イオンをコハク酸の対イオンとして添加することが望ましいが、必ずしも対イオンを添加しなくても良い。コハク酸の対イオンとしては、発酵または酵素反応を阻害しない陽イオンであれば特に制限は無い。一般にはナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、アンモニウムイオンあるいはこれらの組み合わせが、好ましくはナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、アンモニウムイオンあるいはこれらの組み合わせがコハク酸の対イオンとして用いられる。【００３２】  反応液のｐＨの中和を、炭酸マグネシウム及び／又は水酸化マグネシウムを用いて行うと、コハク酸の生成速度及び収率を向上させることができる点で好ましい。反応液のｐＨは、好ましくはｐＨ５〜１０、より好ましくはｐＨ６〜９．５に保つことが望ましい。【００３３】  コハク酸含有液の調製において、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液を用いる場合、炭酸イオン、重炭酸イオンは、１ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは２〜３００ｍＭ、さらに好ましくは３〜２００ｍＭの濃度で添加する。二酸化炭素ガスを含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５０ｍｇ〜１０ｇの二酸化炭素ガスを含有させる。【００３４】  また、前記嫌気的条件とは、溶液中の溶存酸素濃度を低く抑えて反応させることを指す。この場合、溶存酸素濃度として０〜２ｐｐｍ、好ましくは０〜１ｐｐｍ、さらに好ましくは０〜０．５ｐｐｍで反応させることが望ましい。そのための方法としては、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、二酸化炭素ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法を用いることができる。【００３５】  反応の温度は、通常１５℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３７℃で行う。ｐＨは、５〜９、好ましくは６〜８の範囲で行う。反応は、通常５時間から１２０時間行う。反応に用いる菌体の量は、とくに規定されないが、１ｇ／Ｌ〜７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０ｇ／Ｌ〜５００ｇ／Ｌさらに好ましくは２０ｇ／Ｌ〜４００ｇ／Ｌが用いられる。菌体の調製物を用いる場合は、上記の量の菌体量に相当する量を用いることが好ましい。【００３６】  上記でいう調製物とは、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、またその上清を硫安処理等で部分精製した画分等を指す。【００３７】  上記にようにして得られるコハク酸含有液には、通常、コハク酸の対イオンとしての陽イオン類、コハク酸以外の有機酸類、アミノ酸類、無機塩類、タンパク質、糖類、脂質、菌体等が含まれて��る。【００３８】＜２＞イオン交換
本発明においては、上記のようにして得られるコハク酸含有液を、このコハク酸含有液に含まれる水素イオン以外の陽イオンに対して当量以上のＨ型強酸性陽イオン交換樹脂と接触させ、得られたイオン交換処理液からコハク酸結晶を析出せしめ、精製されたコハク酸を得る。【００３９】  イオン交換又は晶析工程に先だって、発酵液または酵素反応液中の菌体又はその処理物等は除去しておくことが望ましい。一般には、この操作は、イオン交換に先立って行うことが好ましいが、イオン交換後、晶析工程の前に行ってもよい。コハク酸含有液からの菌体又はその処理物の除去方法は特に限定されず、一般に菌体の除去に用いられる、ろ過、遠心分離、又はそれらの組み合わせのいずれの方法も適用可能である。【００４０】  また、コハク酸含有液が炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する場合、コハク酸含有液をＨ型強酸性イオン交換樹脂に接触させると、水素イオンと陽イオンが交換される結果、液のｐＨが低下し、炭酸イオン及び重炭酸イオンは水素イオンを受け取り炭酸ガスとして放出される。このとき激しく発泡し、イオン交換の操作が著しく困難になる場合がある。したがって、イオン交換を行う前に、コハク酸含有液に酸を加え、液を酸性状態に調整することで脱炭酸することが好ましい。【００４１】  前記酸性状態としては、ｐＨ５．０以下、好ましくはｐＨ４．８以下であることが好ましい。添加する酸としては、特に制限は無いが、一般に塩酸や硫酸などの安価な酸が用いられる。更に、添加する酸として、後述するイオン交換操作後のコハク酸含有液（イオン交換処理液）や、イオン交換処理液から析出したコハク酸を除いた溶液（コハク酸の晶析母液）を用いることができる。これらのイオン交換溶液や母液はｐＨが低いため、発酵ブロスのｐＨ低下に有効であるだけでなく、添加された液は本発明の方法の工程を繰り返すことにより循環して使用されるので、収率低下や廃酸処理などのコスト増加原因にはならないというメリットがある。【００４２】  コハク酸含有液、好ましくは除菌操作、必要に応じて脱炭酸処理を行ったコハク酸含有液を、Ｈ型陽イオン交換樹脂に接触させる。このイオン交換操作によって、コハク酸含有液中の陽イオン、及びアミノ酸類がイオン交換樹脂に吸着し、除去される。本発明者らは、この操作によって、塩基性アミノ酸のみならず中性アミノ酸、酸性アミノ酸までもが除去されることを見いだした。通常、発酵液のｐＨは中性付近であり、このｐＨ領域ではアミノ酸類は、塩基性アミノ酸はプラスに帯電し、中性アミノ酸は未解離であり、酸性アミノ酸はマイナスに帯電した状態で存在する。従って、酸性アミノ酸や中性アミノ酸は陽イオン交換樹脂には吸着されない。ところが、Ｈ型の強酸性陽イオン交換樹脂にコハク酸塩を含む原料液を接触させると、原料液からコハク酸の対イオンである陽イオンが除去され、水素イオンと交換される結果、ｐＨが低下する。その結果、中性アミノ酸及び酸性アミノ酸もプラスに帯電し、陽イオン交換樹脂に吸着されると考えられる。
本発明に使用されるＨ型強酸性陽イオン交換樹脂としては、特に制限されず、低架橋度のものでも高架橋度のものでも使用できる。またゲル型、ポーラス型のいずれの形態であっても使用できる。具体的には、市販されているダイヤイオンＳＫ１Ｂ、ＳＫ１０４、ＳＫ１１０、ＰＫ２１２、ＰＫ２１６（三菱化学株式会社製）又はこれらの他グレードの製品等が挙げられるが、これらに限定されない。【００４３】  本発明において、強酸性イオン交換樹脂は、使用する前にＨ型に変換しておく必要がある。Ｈ型に変換する方法としては特に制限されず、一般に用いられている方法が使用でき、回分式、単塔カラム式、多塔カラム式のいずれの操作法も用いることができる（化学工学便覧、改訂四版、化学工学協会編、丸善  参照）。また、Ｈ型にするためには酸を使用するが、この酸としては、強酸性イオン交換樹脂のｐＫよりｐＫａが低い酸を選択する。また、イオン交換樹脂の劣化の原因となる酸化力を有さない酸であることが望ましい。本発明には、この要件を満たしていればいずれの酸も使用することができる。一般には、前記酸としては塩酸や希硫酸が用いられるが、これらに限定されない。【００４４】  コハク酸含有液をＨ型強酸性イオン交換樹脂に接触させる方法は特に制限されず、上記に記載の一般に用いられている方法が使用でき、回分式、単塔カラム式、多塔カラム式のいずれの操作法も用いることができる（化学工学便覧、改訂四版、化学工学協会編、丸善  参照）。通常は、Ｈ型強酸性イオン交換樹脂を充填したカラムにコハク酸含有液を通液させるカラム法が用いられるが、バッチ法も用いることができる。
なお、本発明において、Ｈ型強酸性イオン交換樹脂にコハク酸含有液を接触させて得られた液を貫流液と定義する。【００４５】  本発明においては、Ｈ型強酸性イオン交換樹脂の必要交換容量は、コハク酸含有液に含まれる水素イオン以外の陽イオンに対して当量以上の量であることが必要である。ここで、「水素イオン以外の陽イオン」とは、金属陽イオンに加えて、前述したようにイオン交換処理中にマイナスに帯電するアミノ酸類も含む。これらの陽イオンに対して当量以上の交換容量を持つＨ型強酸性イオン交換樹脂を用いることによって、コハク酸含有液中の不純物を効果的に除去することができる。特に、晶析のみでは完全に除去することが困難なナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン等のイオンや、セリン、グルタミン酸、アラニン、バリン、メチオニン、チロシン等のアミノ酸を効率的に除去することができる。なお、貫流液中の水素イオン以外の陽イオンの濃度は、合計でコハク酸に対し１．０％以下、好ましくは０．５％以下であることが望ましい。【００４６】  コハク酸含有液や貫流液に含まれる水素イオン以外の陽イオンの濃度は、例えば、金属陽イオンはイオン電極法、原子吸光法、イオンクロマトグラフ法等により、アミノ酸の濃度はアミノ酸分析装置（以上分析機器の手引き第９版  平成１３年９月５日  社団法人  日本分析機器工業会発行）等により測定することができる。【００４７】＜３＞晶析
イオン交換を行ったコハク酸含有液から、コハク酸結晶を析出せしめる。結晶を析出させる方法としては、イオン交換処理液の濃縮、冷却、有機溶媒添加、又はこれらの組み合わせによる方法が挙げられる。この操作によって、精製されたコハク酸が得られる。晶析処理によって、特にコハク酸以外の有機酸や、脱炭酸処理又はイオン交換処理によって除去し切れない炭酸イオンやアンモニウムイオン等が効率よく除去される。【００４８】  濃縮の条件としては特に制限はなく、通常は減圧濃縮法が用いられるが、この方法に限らず逆浸透膜濃縮法（化学工学便覧  改訂四版  １９７８丸善）、電気透析を使った濃縮法（食品膜技術，１９９９光琳）等も用いることができる。【００４９】  減圧濃縮の圧力は５０ｋＰａ以下、好ましくは２５ｋＰａ以下、特に好ましくは１５ｋＰａ以下の圧力条件下で行うことが望ましい。
濃縮によりコハク酸結晶を析出せしめるためには、濃縮濃度はコハク酸の溶解度以上となるようにする。コハク酸の溶解度は、例えば化学便覧基礎編ＩＩ改訂２版（日本化学会、１９７５年、丸善）等に記載されている。
冷却によりコハク酸結晶を析出せしめるためには、液のコハク酸濃度がコハク酸の溶解度以下となる温度に冷却することにより行う。
コハク酸の溶解度は、例えば化学便覧基礎編ＩＩ改訂２版（日本化学会、１９７５年、丸善）等に記載されている。
有機溶媒添加によりコハク酸結晶を析出せしめるためには、メタノール、エタノール等の有機溶媒を添加することにより行う。
コハク酸の有機溶媒への溶解度は、例えば化学便覧基礎編ＩＩ改訂２版（日本化学会、１９７５年、丸善）等に記載されている。
コハク酸の結晶化は、濃縮、冷却、有機溶媒添加を単独で行うことの他、これらを組み合わせて行うこともできる。
析出した結晶は、通常の方法で母液と分離される。分離方法は、ろ過、遠心ろ過、遠心沈降等の方法を用いることが出来るが、これらに限定されない。
【実施例】
【００５０】  以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
〔参考例１〕ＰＣ遺伝子増幅株の構築
＜１＞酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来のＰＣ遺伝子（ＰＹＣ２）を含むＤＮＡ断片のクローン化
（Ａ）サッカロマイセス・セレビシエの全ＤＮＡの抽出：
酵母用増殖培地（ＹＰＡＤ）１Ｌ［組成：１０ｇ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ，２０ｇペプトン，２０ｇグルコース，１００ｍｇアデニン及び蒸留水：１０００ｍｌ］にサッカロマイセス・セレビシエＷ３０３−１Ａ株（Ｙｅａｓｔ，Ｖｏｌ．２，１６３−１６７（１９８６））を白金耳を用いて植菌し、対数増殖期後期まで３０℃で培養し、菌体を集めた。【００５１】  得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう、１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａの各成分を含有する溶液１５ｍｌ（各成分の濃度は最終濃度である）に懸濁した。次にプロテナーゼＫを最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ，２０分間，１０〜１２℃）し、上清画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるよう添加した後、２倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後の実験に用いた。【００５２】（Ｂ）サッカロマイセス・セレビシエ由来のＰＣ遺伝子（ＰＹＣ２）を含むＤＮＡ断片のクローン化及び組換え体の創製：
上記（Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。ＰＣＲに際しては、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製「３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）」を用いて合成し、使用した。【００５３】（ａ−１）５’−ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＡＡＡ  ＴＴＧ−３’（配列番号１）
（ｂ−１）５’−ＴＴＴ  ＣＣＴ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＴＡＡ  ＣＧＡ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＴＴ−３’（配列番号２）【００５４】  実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＴａｑＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。【００５５】反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液              １０μｌ
１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液        １６μｌ
鋳型ＤＮＡ                          １０μｌ（ＤＮＡ  含有量  １μＭ以下）
上記記載のａ−１，ｂ−１プライマー    各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ  ０．５μｌ
滅菌蒸留水                                ６１．５μｌ【００５６】  以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃    ６０秒
アニーリング過程      ：５２℃    ６０秒
エクステンション過程  ：７２℃  １２０秒
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。【００５７】  上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約３．５６ｋｐのＤＮＡ断片が検出できた。【００５８】＜２＞ＰＣ遺伝子によるコリネ型細菌組み換え体の作製
（Ａ）シャトルベクターの構築
特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０内に存在する、コリネ型細菌内でのプラスミドの安定化に必要な領域の配列をもとに、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製「３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）」を用いて合成した。【００５９】（ａ−２）５’−ＴＴＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＧＣ  ＡＴＴ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＴＴＧ  ＣＴＡ  ＣＴＧ−３’（配列番号３）
（ｂ−２）５’−ＴＴＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＣＡＴ  ＣＡＡ−３’（配列番号４）【００６０】  上記プラスミドｐＣＲＹ３０は、次のようにして構築されたプラスミドである。ブレビバクテリウム・スタチオニス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）ＩＦＯ１２１４４（１９８８年７月１８日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ  Ｐ−１０１３６の受託番号で寄託され、１９８８年７月１８日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２５１５の受託番号が付与されている）からプラスミドｐＢＹ５０３（このプラスミドの詳細については特開平１−９５７８５号公報参照）ＤＮＡを抽出し、制限酵素ＸｈｏＩで大きさが約４．０ｋｂのプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片（複製領域）を切り出し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで大きさが約２．１ｋｂのプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片（安定化領域）を切り出す。これらの両ＤＮＡ断片をプラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ部位及びＳａｌＩ部位にそれぞれ組み込むことにより、プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調製することができる。【００６１】  実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＴａｑＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。【００６２】反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液              １０μｌ
１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液      １６μｌ
鋳型ＤＮＡ                          １０μｌ（ＤＮＡ  含有量  １μＭ以下）
上記記載のａ−２，ｂ−２プライマー    各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ  ０．５μｌ
滅菌蒸留水                                ６１．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。【００６３】  ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃    ６０秒
アニーリング過程      ：５２℃    ６０秒
エクステンション過程  ：７２℃  １２０秒
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。【００６４】  上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１．１ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。【００６５】  上記で増幅産物を確認できた反応液１０μｌ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋１μｌを各々制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで完全に切断し、７０℃で１０分間処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。【００６６】  得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。【００６７】  この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素（ＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩ）により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋の長さ３．０ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＢＳｐａｒと命名した。【００６８】  米国特許５，１８５，２６２号明細書記載のプラスミドｐＣＲＹ３１内に存在する、コリネ型細菌内でのプラスミドの複製に必要な領域の配列をもとに、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製「３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）」を用いて合成した。【００６９】（ａ−３）５’−ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＧＡＣ  ＴＴＡ  ＧＡＴ  ＡＡＡ  ＧＧＴ  ＣＴＡ−３’（配列番号５）
（ｂ−３）５’−ＴＴＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＧＣ  ＴＧＧ  ＴＡＡ  ＡＡＣ  ＡＡＣ  ＴＴＴ−３’（配列番号６）【００７０】  上記プラスミドｐＣＲＹ３１は、次のようにして構築されたプラスミドである。前記ｐＢＹ５０３由来の複製領域とプラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造製）とを連結したプラスミドｐＣＲＹ３（このプラスミドを保持するブレビバクテリウム・フラバム  ＭＪ２３３  ＧＥ１０２は、１９８８年１月８日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６））にＦＥＲＭ  Ｐ−９８０２の受託番号で寄託され、１９８８年１月８日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２５１３の受託番号が付与されている）をＫｐｎＩで部分分解してＤＮＡ断片を得る。一方、ｐＢＹ５０３をブレビバクテリウム・スタチオニス（ＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２５１５）から調製し、ＫｐｎＩで完全分解し、約７ｋｂのＤＮＡ断片を精製する。これらのＤＮＡ断片を連結し、各種制限酵素で切断したときに下記表に示す切断パターンを示すプラスミドを選択することによって、ｐＣＲＹ３１が得られる。【００７１】
【表１】
0004631706.tif 000002
【００７２】  実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＴａｑＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。【００７３】反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液              １０μｌ
１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液        １６μｌ
鋳型ＤＮＡ                          １０μｌ（ＤＮＡ  含有量  １μＭ以下）
上記記載のａ−３，ｂ−３プライマー    各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ  ０．５μｌ
滅菌蒸留水                                ６１．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。【００７４】ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃    ６０秒
アニーリング過程      ：５２℃    ６０秒
エクステンション過程  ：７２℃  １２０秒
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。【００７５】  上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１．８ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
上記で増幅産物を確認できた反応液１０μｌ、プラスミドｐＢＳｐａｒ  １μｌを各々制限酵素ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩで完全に切断し、７０℃１０分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１０×）緩衝液１μｌ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。【００７６】  得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。【００７７】  この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素（ＸｈｏＩ，ＫｐｎＩ）により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＢＳｐａｒの長さ４．１ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＢＳｐａｒ−ｒｅｐと命名した。【００７８】  上記で作製したプラスミドｐＢＳｐａｒ−ｒｅｐ  １μｌ、ｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製）１μｌを各々制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで完全に切断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。【００７９】  得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。【００８０】  この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８の長さ２．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ２．９ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐと命名した。【００８１】（Ｂ）ｔａｃプロモーターの挿入
ｔａｃプロモーターを含有するプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社製）を鋳型としたＰＣＲ法により、ｔａｃプロモーター断片を増幅させるべく、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製「３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）」を用いて合成した。【００８２】（ａ−４）５’−ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＧＡＴ  ＡＧＣ  ＴＴＡ  ＣＴＣ  ＣＣＣ  ＡＴＣ  ＣＣＣ−３’（配列番号７）
（ｂ−４）５’−ＴＴＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＡＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＴＴＡ  ＴＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＣ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＣＡＴ−３’（配列番号８）【００８３】  実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＴａｑＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。【００８４】反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液              １０μｌ
１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液        １６μｌ
鋳型ＤＮＡ                          １０μｌ（ＤＮＡ  含有量  １μＭ以下）
上記記載のａ−４，ｂ−４プライマー    各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ  ０．５μｌ
滅菌蒸留水                                ６１．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。【００８５】  ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃    ６０秒
アニーリング過程      ：５２℃    ６０秒
エクステンション過程  ：７２℃  １２０秒
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。【００８６】  上記で生成した反応液１０μｌを３％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１００ｂｐのＤＮＡ断片が検出できた。【００８７】  上記で増幅産物を確認できた反応液１０μｌ、上記（Ａ）で作製したプラスミドｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐ  ５μｌを各々制限酵素ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで完全に切断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。【００８８】  得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。【００８９】  この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記（Ａ）作製のプラスミドの長さ５．５ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ０．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。このプラスミドをｐＨＳＧ２９８ｔａｃと命名した。【００９０】（Ｃ）ＰＣ遺伝子のシャトルベクターへの挿入
＜１＞（Ｂ）で増幅産物を確認できた反応液１０μｌ、上記（Ｂ）で作製したプラスミドｐＨＳＧ２９８ｔａｃ  ５μｌを各々制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＳｓｅＩまたはＢａｍＨＩ、ＳｓｅＩで各々切断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。【００９１】  得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。【００９２】  この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素（ＳｓｅＩ，ＮｄｅＩ）により切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記（Ｂ）作製のプラスミドの長さ５．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ３．５６ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。
このプラスミドをｐＰＣ−ＰＹＣ２と命名した。【００９３】（Ｄ）ブレビバクテリウム・フラバム  ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１株の形質転換
本プラスミドを米国特許第５，１８５，２６２号明細書記載の方法に従って、ブレビバクテリウム・フラバム  ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）に導入した。【００９４】〔実施例１〕
コハク酸２アンモニウム塩を蓄積させた発酵液からコハク酸を精製した。【００９５】（Ｈ型強酸性陽イオン交換樹脂の準備）
Ｈ型陽イオン交換樹脂の調整は、以下のように行った。
１．６ＬのＮａ型強酸性陽イオン交換樹脂ＳＫ１ＢＬ（三菱化学株式会社製）をカラムに充填した。当該カラムに１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を１．６Ｌ／ｈｒの流速で５Ｌ通液し、樹脂をＨ型に変換した。引き続き、カラムに純水を２０Ｌ通液して樹脂を洗浄した後、以下の実験に用いた。【００９６】（発酵によるコハク酸の生産）
以下の方法によりコハク酸を発酵法で製造した。【００９７】  グルコース：１００ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、正リン酸：０．６５ｇ、大豆タンパク加水分解液（全窒素含量３５ｇ／Ｌ）：１４．３ｍＬ、硫酸アンモニウム：１．０ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：１ｍｇ、塩酸チアミン：１ｍｇ及び消泡剤（ＧＤ−１１３、日本油脂社製）：０．０５ｍＬを１Ｌ中に含む培地４００ｍｌ作成し、ｐＨを１Ｎ  ＫＯＨで６．５に調整した後、１Ｌのジャーファーメンターに入れ１２０℃、２０分加熱殺菌した。冷却後、プラスミドｐＰＣ−ＰＹＣ２で形質転換したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１菌株を植菌し、３０℃に保温した。通気は毎分３００ｍｌ、攪拌は毎分７００回転で、ｐＨをアンモニアガスにて７．６に調整しながら２０時間培養を行った。得られた培養液の内１００ｍｌを以下のコハク酸発酵に用いた。【００９８】  グルコース：５２０ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：２．６ｇを１Ｌ中に含む糖溶液を７９ｍｌ作成し、１２０℃、２０分加熱滅菌した。また、正リン酸：１．２１ｇ、大豆タンパク加水分解液（全窒素含量３５ｇ／Ｌ）：５．３９ｍＬ、硫酸アンモニウム：１．８６ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：３７．１４ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：３７．１４ｍｇ、Ｄ−ビオチン：１．８６ｍｇ、塩酸チアミン：１．８６ｍｇ及び消泡剤（ＧＤ−１１３）：０．０９ｍＬを１Ｌ中に含む培地を２２１ｍＬ作成し、ｐＨを１Ｎ  ＫＯＨで６．５に調整した後、１２０℃、２０分加熱滅菌した。滅菌した糖溶液と滅菌した培地を１Ｌのジャーファーメンターに入れ、冷却後、前述の培養液を１００ｍＬ加えて全量を４００ｍＬとした後、３０℃に保温した。通気は毎分２０ｍｌ、攪拌は毎分４００回転で、ｐＨをアンモニアガスにて７．６に調整しながら２４時間コハク酸発酵を行った。
上記のコハク酸発酵を９回行い、コハク酸濃度２５ｇ／Ｌの培養液を３．６Ｌ得た。【００９９】（コハク酸塩を蓄積させた発酵液からのコハク酸結晶の精製）
得られた培養液は、１２０℃、２０分間加熱殺菌を行い、引き続き５０００×Ｇ、２０分の遠心分離を行い、上清液３．５Ｌを得た。【０１００】  得られた上清液は、前述のＨ型陽イオン交換樹脂に通液し、貫流液２．２Ｌを得た。得られた貫流液は、ロータリーエバポレーターでコハク酸濃度が１９．２％になるまで濃縮し、コハク酸結晶を析出させて、コハク酸スラリーを得た。得られたコハク酸スラリーは１０℃まで冷却して、コハク酸結晶を析出させた。結晶と母液を分離した。得られたコハク酸結晶は、結晶を洗浄するために結晶重量の１５倍体積のコハク酸の飽和水溶液に再懸濁した後、結晶を分離した。【０１０１】〔比較例１〕
実施例１と同様の方法で、コハク酸を蓄積させた発酵液を殺菌（１２０℃、２０分）、除菌（５０００×Ｇ、２０分）し、これをコハク酸濃度が２３４ｇ／Ｌとなるようにロータリーエバポレーターで濃縮した。得られた濃縮液に硫酸を添加してｐＨを２．２に調整し、１０℃に冷却してコハク酸結晶を析出させた。その後、実施例１と同様にして結晶を分離し、飽和コハク酸水溶液でリスラリー洗浄をし、洗浄結晶を得た。
実施例１および比較例１で得られたコハク酸結晶の分析値を表２に示す。【０１０２】
【表２】
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【０１０３】  表２に示すように、実施例１では洗浄コハク酸結晶には他有機酸やアミノ酸はほとんど検出されなかったのに対し、比較例１では多くの中性アミノ酸および塩基性アミノ酸が検出された。このことは、コハク酸晶析では、中性アミノ酸および塩基性アミノ酸が結晶に取り込まれやすいことを示唆している。
尚、比較例１より得られたコハク酸結晶には有機酸の含量は非常に低くかった。このことは、コハク酸の晶析により有機酸類は比較的よく結晶から除去されることを示唆している。
実施例１においては、中性アミノ酸や塩基性アミノ酸はＨ型強酸性陽イオン交換樹脂により吸着除去されており、このためコハク酸結晶からは全く検出されなかったものと推定される。このことを確認するために、実施例１におけるＨ型強酸性陽イオン交換樹脂カラムへの供給液と貫流液の分析を行った。分析結果を表３に示す。【０１０４】
【表３】
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【０１０５】  表３に示すように、Ｈ型強酸性陽イオン交換樹脂カラムからの貫流液からは、供給液中に含まれる多くのアミノ酸類がほとんど除去されていることが分かる。このことにより、アミノ酸はＨ型強酸性陽イオン交換樹脂に吸着除去され、その結果、目的生産物であるコハク酸結晶にはほとんど検出されなかったものと推定される。【０１０６】〔実施例２〕
コハク酸２ナトリウム塩と炭酸水素ナトリウムを同時に蓄積させた発酵液から、コハク酸結晶を精製した。【０１０７】（Ｈ型強酸性陽イオン交換樹脂の準備）
実施例１と同様の方法でＨ型強酸性陽イオン交換樹脂４．７Ｌを調整した。【０１０８】（発酵によるコハク酸２ナトリウム塩、及び炭酸水素ナトリウムの生産）
実施例１記載の方法に準拠してコハク酸ナトリウムと炭酸ナトリウムを同時に蓄積させた発酵を行った。ただし、ｐＨ調整はアンモニアに替えて２．５ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム水溶液で行った。その結果、コハク酸濃度７０ｇ／Ｌの培養液を３．１Ｌ得た。【０１０９】（発酵液からのコハク酸結晶の精製）
得られた発酵液３．１Ｌを、ＭＦ膜モジュール、（ミリポア社製ＰＥＬＬＩＣＯＮ−２膜モジュール、有効膜面積０．１ｍ２、孔径０．２２μｍ）を使ってクロスフローろ過して除菌を行った。更に、ろ液が２．６Ｌ得られた段階で、膜循環液に純水を１Ｌ添加し、希釈ろ過を行った。その結果、除菌液３．６Ｌを得た。【０１１０】（酸添加による脱炭酸）
得られた除菌液に、実施例１で得られたイオン交換樹脂カラムの貫流液、および晶析母液を添加してｐＨを４．０に調整することによって脱炭酸を行い、脱炭酸液を得た。【０１１１】（Ｈ型強酸性陽イオン交換樹脂への通液）
得られた脱炭酸液を、前述のＨ型強酸性陽イオン交換樹脂を充填したカラムに４．７Ｌ／ｈｒの流速で通液し、貫流液３．５Ｌを得た。通液終了後、更に純水を３．８Ｌ通液し、貫流液を合計で７．３Ｌ得た。【０１１２】（コハク酸の結晶化）
得られた貫流液７．３Ｌを、粒状活性炭カラムに通液して脱色を行った後、この液を実施例１と同様にしてコハク酸濃度３０ｗｔ％の濃度まで濃縮し、得られたスラリーは１０℃で１晩攪拌した。その後、コハク酸結晶は実施例１と同様の方法で分離し、コハク酸の飽和水溶液で洗浄を行い、洗浄コハク酸結晶を得た。
実施例２で得られたコハク酸結晶の分析値を示す。【０１１３】
【表４】
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【０１１４】  表４に示すように、コハク酸ナトリウムを蓄積させた発酵液を原料とした場合でも、非常に高純度のコハク酸を得ることができた。このように、本発明は１価の陽イオンをコハク酸の対イオンとした発酵液にも適用できる。【０１１５】〔比較例２〕
実施例２と同様にしてコハク酸２ナトリウム塩と同時に炭酸水素ナトリウムを蓄積させた発酵液を原料として、コハク酸結晶を精製した。この際、脱炭酸を行わずにＨ型強酸性イオン交換樹脂に通液した。【０１１６】（Ｈ型強酸性陽イオン交換樹脂への通液）
上記発酵液を除菌し、得られた除菌液を、Ｈ型陽イオン交換樹脂カラムに通液した。その結果、陽イオン交換樹脂カラムの上面から発泡し、イオン交換操作は不可能であった。従って、晶析工程に至らなかった。【０１１７】〔実施例３〕コハク酸マグネシウム発酵液からのコハク酸の製造
２価金属塩であるコハク酸マグネシウム発酵液からコハク酸を精製した。【０１１８】（Ｈ型強酸性陽イオン交換樹脂の準備及び発酵法によるコハク酸の製造）
実施例１と同様の方法でＨ型強酸性陽イオン交換樹脂４．７Ｌを調整した。
実施例１と同様の培養方法で、コハク酸マグネシウム発酵を行った。ただし、中和剤としてアンモニアの代わりに水酸化マグネシウムを使用した。具体的には、ｐＨ調整用アンモニアに代えて２．５ｍｏｌ／Ｌの水酸化マグネシウムスラリーを用いた。培地のｐＨは７．５〜７．７に維持した。その結果、コハク酸濃度５０ｇ／Ｌの培養液を１Ｌ得た。【０１１９】  得られた培養液は、１２０℃で２０分間加熱殺菌を行った後、５０００×Ｇ、１５分の遠心分離で菌体を沈殿させ、上清液を得た。得られた上清液は、実施例１と同様にＨ型強酸性陽イオン交換樹脂に通液し、得られた貫流液を減圧濃縮し、コハク酸結晶を得た。
実施例３で得られたコハク酸結晶の分析値を表５に示す。【０１２０】
【表５】
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【０１２１】  表５に示すとおり、２価陽イオンであるマグネシウムのコハク酸塩からも、本発明により高純度のコハク酸を得ることが出来ることが分かった。このように、本発明は、１価陽イオンを対イオンとするコハク酸発酵液のみならず、２価陽イオンを対イオンとするコハク酸発酵液にも適用できる。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】  本発明により、発酵法又は酵素法により得られるコハク酸含有液から高純度のコハク酸を容易に得ることが可能となる。
【配列表】
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