(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＣＭＶエンハンサーとＣＭＶプロモーターとを含んでなる第一のプロモーターと、テトラサイクリンレセプターにＶＰ１６（単純ヘルペスウィルス転写活性化因子）を連結して成る転写活性化因子とを含む発現ユニット；（ｉｉ）ＣＭＶエンハンサーとアクチンプロモーターとを含んでなる第二のプロモーターと、テトラサイクリンレセプターにｎ１ｓＫＲＡＢ（Ｋｒｕｐｐｅｌａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｏｘ）を連結して成る転写抑制因子とを含む発現ユニット；及び（ｉｉｉ）テトラサイクリンレセプター応答要素（ＴＲＥ）を含む転写調節領域を伴う第三のプロモーターを含む、目的遺伝子を発現させるための発現ユニットを含み、上記（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の発現ユニットが相互にニワトリβ−グロビンインスレーターにより隔離されている、発現ベクター。
【請求項２】
前記第三のプロモーターの下流にｌｏｘｐ配列が挿入されている、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
トランスジェニック細胞又はトランスジェニック動物を作製するための、請求項１又は２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
請求項１から３の何れかに記載の発現ベクターを有するトランスジェニック細胞。
【請求項５】
請求項１から３の何れかに記載の発現ベクターがゲノムに挿入されている、目的遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製するためのトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項６】
マウスである、請求項５に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の動物の生殖細胞に、ｌｏｘＰ配列に連結された目的遺伝子を含む環状ＤＮＡを投与して、前記第三のプロモーターの下流に設けられているｌｏｘＰ配列に前記目的遺伝子を繋ぎこみ、当該生殖細胞から動物を再生することを特徴とする、目的遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法により作製される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物又はその一部。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、外来遺伝子の誘導発現の制御が可能であり、かつ外来遺伝子を内因性野生型遺伝子の発現量と同程度の量で発現させることができる発現ベクター、及びそれを用いて作製したトランスジェニック細胞及び動物に関する。
【背景技術】  従来のトランスジェニック動物の作製においては、前核期の受精卵を採取し、この受精卵に外来遺伝子をＤＮＡインジェクション法により注入することにより当該外来遺伝子を受精卵の染色体に導入し、外来遺伝子を導入した受精卵を代理母動物の卵管に移植して出産させるという方法が用いられている。この方法においては、外来遺伝子が動物の染色体にランダムに挿入されるため、外来遺伝子を動物の染色体の所定の部位に挿入することができない。このため、外来遺伝子は染色体上の元来の遺伝子の発現に影響を及ぼすような位置に挿入される場合が多く、また外来遺伝子が挿入された染色体上の位置により、当該挿入された外来遺伝子の発現量が異なるなどの問題点があった。従って、染色体上の元来の遺伝子の発現に影響を及ぼさずに、且つ外来遺伝子の所望の発現量をもたらすトランスジェニック動物を得るには、多数のトランスジェニック動物の系統を作製し、その中から、目的とする性質を有するトランスジェニックを選択する必要があった。このため、目的とするトランスジェニック動物系を樹立するためには、多くの実験設備と、多くの人手と多くの時間を必要とし、種々の外来遺伝子を導入した広範なトランスジェニック動物を揃えることが不可能であった。
他方、受精卵に外来遺伝子を導入するトランスジェニック動物の作製方法では、導入した外来遺伝子が胚発生の時期から発現されるため、当該外来遺伝子の導入が生体の発生及び維持に必須の遺伝子に変異を加えるようなものである場合、個体が胚致死となり、トランスジェニック動物が得られない場合がある。また、生体の発生・維持の様々な段階で多種多様な機能を有する遺伝子が存在し、外来遺伝子の導入により得ようとする目的の機能を直接解析することができない場合がある。
また、従来のトランスジェニック動物は、外来遺伝子（ここで言う外来遺伝子は、一般的には、野生型動物が本来持っていない遺伝子であるか、又は野生型動物が本来持っている野生型遺伝子に変異を導入した変異遺伝子などである）を過剰発現させることを意図して作製されたものが一般的であった。このようなトランスジェニック動物においては、野生型遺伝子の発現量と同じ量の変異遺伝子を発現させて、それらを競合させることはできなかった。
このような問題点を解決するため、薬剤依存的なリガンド依存性レセプター蛋白質の構造変化を伴う遺伝子発現誘導システムや、ホルモン依存的なリガンド依存性レセプター蛋白質の構造変化を伴う蛋白質の活性調節機構を利用することによって、コンディショナル・トランスジェニック動物（外的な条件の調節により、導入した外来遺伝子の発現を調節することができる）の作成が試みられている。
しかしながら、例えば、前者のトランスジェニック動物を作製するためには、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに転写調節因子を融合させた転写活性化因子を発現する外来遺伝子、レセプターに転写調節因子を融合させた転写抑制化因子を発現する外来遺伝子、及び上記レセプターのための標的配列を転写調節領域に含み目的遺伝子を発現させる外来遺伝子の３種類の遺伝子を１動物に導入したトランスジェニック動物を作製する必要があり、その際に、転写活性化因子と転写抑制因子との発現のバランスとして、転写活性化因子に比べて転写抑制因子の発現を高くする必要がある。
このためには、上記それぞれの外来遺伝子を導入した３種類のトランスジェニック動物を作製し、次にこれらを交配して３種類の外来遺伝子を含むトランスジェニック動物を取得する必要がある。しかしながら、このためには多大の時間と労力を必要とするのみならず、目的とするトランスジェニック動物が得られる成功率は極めて低く、実用性に乏しい。
また、従来の上記したようなテトラサイクリンシステムを利用したトランスジェニック動物においては、外来遺伝子を過剰発現させた場合の結果しか観察することができず、野生型遺伝子の発現量と同じ量の外来遺伝子を発現させて、それらを競合させた結果を観察することはできなかった。さらに、上記のテトラサイクリンシステムを利用したトランスジェニック動物においては、薬剤（ドキシサイクリンなど）の有無によって外来遺伝子の発現をオン又はオフにすることは可能であったが、薬剤の濃度に依存した様式で外来遺伝子の発現量を変化させることはできなかった。
【発明の開示】
従って、本発明の第一の目的は、目的の外来遺伝子を時期特異的に発現することができるトランスジェニック動物を提供することである。本発明の第二の目的は、外来遺伝子の発現がオンになった際にその発現量を制御することができるトランスジェニック動物を提供することである。本発明の第三の目的は、野生型遺伝子の発現量と同程度のレベルで外来遺伝子を発現させることができるトランスジェニック動物を提供することである。本発明の第四の目的は、目的の外来遺伝子が動物のゲノムの所定の部位に導入されており、その発現が元来の遺伝子の発現に影響を及ぼさないようなトランスジェニック動物、およびそのようなトランスジェニック動物を効率よく作製して、多様な目的遺伝子を導入したトランスジェニック動物の品揃えを行うことができる手段を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに転写調節因子を融合させた転写活性化因子を発現する外来遺伝子、レセプターに転写調節因子を融合させた転写抑制化因子を発現する外来遺伝子、及び上記レセプターのための標的配列を転写調節領域に含み目的遺伝子を発現させる外来遺伝子をインスレーターにより相互に分離した状態で１個のベクターに組み込み、このベクターを動物のゲノムに導入し、この際に、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに転写調節因子を融合させた転写活性化因子を発現する外来遺伝子のプロモーターと、レセプターに転写調節因子を融合させた転写抑制化因子を発現する外来遺伝子のプロモーターを適当に選択することにより、上記第一から第三の目的を解決できることを見出した。より具体的には、本発明においては、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに転写調節因子を融合させた転写活性化因子を発現する外来遺伝子のプロモーター中に含まれるエンハンサーと同じエンハンサーを、レセプターに転写調節因子を融合させた転写抑制化因子を発現する外来遺伝子のプロモーター中に含めることによって、上記目的を解決している。
さらに、例えば、上記のベクターにおいて、目的の外来遺伝子の発現のための制御配列の顆粒にｌｏｘＰ配列を挿入しておき、そのベクターを、例えば無作為に動物のゲノムに導入して種々のトランスジェニック動物を作製し、その中から、元来の遺伝子の発現に影響を与えない部位に前記ベクターが挿入されているトランスジェニック動物を選択し、この動物のゲノム中に挿入されている前記ｌｏｘＰ部位に、ｌｏｘＰ配列に連結した任意の目的遺伝子を環状のＤＮＡを導入することにより、上記第四の目的を解決できることを見出した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  （ｉ）第一のプロモーターと、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに正の転写調節因子を連結して成る転写活性化因子とを含む発現ユニット；（ｉｉ）第二のプロモーターと、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに負の転写調節因子を連結して成る転写抑制因子とを含む発現ユニット；及び（ｉｉｉ）前記レセプターのための標的配列を含む転写調節領域を伴う第三のプロモーターを含む、目的遺伝子を発現させるための発現ユニットを含み、上記（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の発現ユニットが相互にインスレーターにより隔離されている、発現ベクター。
（２）  前記の第一のプロモーター、第二のプロモーター及び第三のプロモーターが相互に異なるプロモーターである、（１）に記載の発現ベクター。
（３）  前記第一のプロモーターが組織特異的プロモーターであり、前記第二のプロモーターが組織非特異的プロモーターである、（１）又は（２）に記載の発現ベクター。
（４）  前記第一のプロモーターと前記第二のプロモーターがそれぞれ同一のエンハンサーを含んでいる、（１）から（３）の何れかに記載の発現ベクター。
（５）  前記第一のプロモーターがＣＭＶエンハンサーとＣＭＶプロモーターとを含んでなるプロモーターであり、前記第二のプロモーターがＣＭＶエンハンサーとアクチンプロモーターとを含んでなるプロモーターである、（１）から（４）の何れかに記載の発現ベクター。
（６）  前記正の転写調節因子が、ＶＰ１６（単純ヘルペスウィルス転写活性化因子）である、（１）から（５）の何れかに記載の発現ベクター。
（７）  前記負の転写調節因子が、ｎ１ｓＫＲＡＢ（Ｋｒｕｐｐｅｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｂｏｘ）である、（１）から（６）の何れかに記載の発現ベクター。
（８）  前記インスレーターが、ニワトリβ−グロブリンインスレーターである、（１）から（７）の何れかに記載の発現入ベクター。
（９）  前記第三のプロモーターの下流にｌｏｘｐ配列が挿入されている、（１）から（８）の何れかに記載の発現ベクター。
（１０）  トランスジェニック細胞又はトランスジェニック動物を作製するための、（１）から（９）の何れかに記載の発現ベクター。
（１１）  （１）から（１０）の何れかに記載の発現ベクターを有するトランスジェニック細胞。
（１２）  （１）から（１０）の何れかに記載の発現ベクターがゲノムに挿入されている、目的遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製するためのトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（１３）  マウスである、（１２）に記載の非ヒト哺乳動物。
（１４）  （１２）又は（１３）に記載の動物の生殖細胞に、ｌｏｘＰ配列に連結された目的遺伝子を含む環状ＤＮＡを投与して、前記第三のプロモーターの下流に設けられているｌｏｘＰ配列に前記目的遺伝子を繋ぎこみ、当該生殖細胞から動物を再生することを特徴とする、目的遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（１５）  （１４）に記載の方法により作製される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物又はその一部。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ．Ｔｇ（＋）の作製の概要を示す。
図２は、Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ  Ｔｇ  ＡＤ（＋）の作製の概要（前半）を示す。
図３は、Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ  Ｔｇ  ＡＤ（＋）の作製の概要（後半）を示す。
図４は、Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−ｌｏｘＰ  Ｔｇ  ＡＤ（＋）の作製の概要を示す。
図５は、組換えターゲット配列（ｌｏｘＰ配列）を含有したテトラサイクリンシステム完全長（一本化）プラスミドベクターの作製の概要を示す。
図６は、Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ．Ｔｇ（＋）の概要を示す。
図７は、Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ．Ｔｇ（−）の概要を示す。
図８は、Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ．Ｔｇ  ＡＤ（＋）の概要を示す。
図９は、Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−  ｍｅｖ−１  Ｔｇ  ＡＤ（＋）の概要を示す。
図１０は、Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−ｌｏｘＰ  Ｔｇ  ＡＤの概要を示す。
図１１は、Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｅｔ  ｏｎ−ｏｆｆ  ｓｙｓｔｅｍ）Ｔｒａｎｓｇｅｎｅの概要を示す。
図１２は、ルシフェラーゼアッセイとβ−ガラクトシダーゼアッセイの測定結果を示す。
図１３は、Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｅｔ  ｏｎ−ｏｆｆ  ｓｙｓｔｅｍ）の遺伝子発現制御の様式を示す。
図１４は、Ｃｒｅ−ｌｏｘｐシステムの概要を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施の形態について説明する。
（１）本発明の発現ベクター
本発明の発現ベクターは、（ｉ）第一のプロモーターと、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに正の転写調節因子を連結して成る転写活性化因子とを含む発現ユニット；（ｉｉ）第二のプロモーターと、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに負の転写調節因子を連結して成る転写抑制因子とを含む発現ユニット；及び（ｉｉｉ）前記レセプターのための標的配列を含む転写調節領域を伴う第三のプロモーターを含む、目的遺伝子を発現させるための発現ユニットを含み、上記（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の発現ユニットが相互にインスレーターにより隔離されていることを特徴とするベクターである。
前記の第一のプロモーター、第二のプロモーター及び第三のプロモーターは相互に異なるプロモーターであることが好ましく、前記第一のプロモーターは組織特異的プロモーターであり、前記第二のプロモーターが組織非特異的プロモーターであることが好ましい。プロモーターの具体例としては、例えば、ウイルス（例、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、モロニー白血病ウィルス、ＪＣウィルス、乳癌ウィルスなど）由来遺伝子プロモーター、各種哺乳動物（例、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（例、ニワトリなど）由来のプロモーターなどが挙げられる。
本発明において好ましくは、前記第一のプロモーターと前記第二のプロモーターはそれぞれ同一のエンハンサーを含んでいる。このように第一のプロモーターと第二のプロモーターにおいて同一のエンハンサーを用いることにより、転写因子の競合を起こさせることができ、これにより目的遺伝子の発現の制御が容易になる。前記第一のプロモーターの具体例としては、ＣＭＶエンハンサーとＣＭＶプロモーターとを含んでなるプロモーターが挙げられ、前記第二のプロモーターの具体例としてはＣＭＶエンハンサーとアクチンプロモーターとを含んでなるプロモーターが挙げられる。
本発明では、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに正の転写調節因子を連結して成る転写活性化因子と、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに負の転写調節因子を連結して成る転写抑制因子を使用する。正の転写調節因子の具体例としては、ＶＰ１６（単純ヘルペスウィルス転写活性化因子）（Ｂｅｒｇｅｒ  ＳＬ，他、Ｃｅｌｌ．１９９０  Ｊｕｎ２９；６１（７）：１１９９−２０８；  Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＡＤ，他、Ｎａｔｕｒｅ．１９８８  Ｓｅｐ  ２９；３３５（６１８９）：４５２−４；及び、Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ  ＳＪ，他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１９８８  Ｊｕｎ；２（６）：７１８−２９．）などが挙げられる。
負の転写調節因子としては、Ｚｎフィンガーモチーフを有するタンパク質のうち負の転写調節活性を有するタンパク質を使用することができ、例えば、ｎ１ｓＫＲＡＢ（Ｋｒｕｐｐｅｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｂｏｘ）などが挙げられる（Ｄａｔｅ  Ｓ，他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００４  Ｍａｙ；１３（５）：６３７−４２；Ｓｈｉｍｏｊｏ  Ｍ，他、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００４  Ｍａｒ  １９；７４（１８）：２２１３−２５．Ｒｅｖｉｅｗ；Ｓｅｋｉｍａｔａ  Ｍ，他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４  Ｊａｎ  ２９；３２（２）：５９０−７．Ｐｒｉｎｔ  ２００４；Ｇｏｕ  Ｄ，他、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２００４  Ｊａｎ  ２０；１６７６（２）：２０３−９；Ｌｏｏｍａｎ  Ｃ，他、Ｍａｍｍ  Ｇｅｎｏｍｅ．２００４  Ｊａｎ；１５（１）：３５−４０；Ｓｎｏｗｄｅｎ  ＡＷ，他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３  Ｄｅｃ  １５；６３（２４）：８９６８−７６；Ｈｏｆｍａｎ  Ｋ，他、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００３  Ｄｅｃ；３１（３）：５８３−９６；Ｔａｎ  Ｗ，他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４  Ｆｅｂ  ２０；２７９（８）：６５７６−８７．Ｅｐｕｂ  ２００３  Ｄｅｃ  ０２；Ｓｅｒｔｉｌ  Ｏ，他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３  Ｏｃｔ  １５；３１（２０）：５８３１−７；Ｕｒｒｕｔｉａ  Ｒ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００３；４（１０）：２３１．Ｅｐｕｂ  ２００３  Ｓｅｐ  ２３；Ｙｕｎ  Ｊ，他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００３  Ｏｃｔ；２３（２０）：７３０５−１４；Ｋｉｍ．ＹＳ，他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３  Ｏｃｔ  １；３１（１９）：５５１３−２５；Ｒｕｔｔｅｒ  ＪＬ，他、Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．２００３  Ａｕｇ；２２（２）：１２１−８；Ｗａｃｋｅｒ  Ｉ，他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２００３  Ａｕｇ；１３０（１６）：３７９５−８０５；Ｓｕｎ  Ｙ，他、ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ．２００３  Ｍａｒ；５５（３）：１２７−３１；Ｋａｗａｔａ  Ｈ，他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２００３  Ａｕｇ  １；３７３（Ｐｔ  ３）：７４７−５７；Ｌａｋｏｗｓｋｉ  Ｂ，他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２００３  Ｍａｙ；１３０（１０）：２１１７−２８；Ｙａｍａｄａ  Ｋ，他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２００３  Ｊｕｌ  １；３７３（Ｐｔ  １）：１６７−７８；Ｔｕｒｎｅｒ  Ｊ，他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３  Ａｐｒ  １１；２７８（１５）：１２７８６−９５．Ｅｐｕｂ  ２００３  Ｊａｎ  ２９；Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｌａｍｕｎｏ  Ｄ，他、Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００２  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；２１（６）：５３１−４０；Ｍｅｄｕｇｎｏ  Ｌ，他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００３  Ｊａｎ  １６；５３４（１−３）：９３−１００；Ｌｏｏｍａｎ  Ｃ，他、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ．２００２  Ｄｅｃ；１９（１２）：２１１８−３０；Ｐａｒｋ  Ｈ，他、Ｂｌｏｏｄ．２００３  Ｆｅｂ  １；１０１（３）：８９４−９０２．Ｅｐｕｂ  ２００２  Ｓｅｐ  １９；Ｊｉａｏ  Ｋ，他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００２  Ｎｏｖ；２２（２１）：７６３３−４４；Ｌｅｅ  ＴＨ，他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２  Ｎｏｖ  ２２；２���７（４７）：４４８２６−３７．Ｅｐｕｂ  ２００２  Ｓｅｐ  １７；Ｋｉｍ  ＹＳ，他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２  Ａｕｇ  ２３；２７７（３４）：３０９０１−１３．Ｅｐｕｂ  ２００２  Ｍａｙ  ３１；Ｚｈａｎｇ  ＪＳ，他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００１  Ａｕｇ；２１（１５）：５０４１−９；Ｌｏｒｅｎｚ  Ｐ，他、Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ａｐｒ；３８２（４）：６３７−４４；Ｙｏｃｈｕｍ  ＧＳ，他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００１  Ｊｕｌ；２１（１３）：４１１０−８；Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｔ，他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００１  Ｊｕｎ；２１（１１）：３６０９−１５．Ｙａｎｏ  Ｋ，他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０００  Ａｐｒ  １；６５（１）：７５−８０；Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ  Ｅ，他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０００  Ａｐｒ  ２８；２７５（１７）：１２８７９−８８；Ｔｅｋｋｉ−Ｋｅｓｓａｒｉｓ  Ｎ，他、Ｇｅｎｅ．１９９９  Ｎｏｖ  １５；２４０（１）：１３−２２；Ｓｔｏｎｅ  ＤＭ，他、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１９９９  Ｄｅｃ；１１２（Ｐｔ  ２３）：４４３７−４８；Ｈｕａｎｇ  Ｚ，他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９  Ｍａｒ  １９；２７４（１２）：７６４０−８；Ｄｅｎｇ  Ｚ，他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９８  Ｏｃｔ  １；５３（１）：９７−１０３；Ｅｌｓｅｒ  Ｂ，他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９７  Ｏｃｔ  ３１；２７２（４４）：２７９０８−１２；Ｋｉｍ  ＳＳ，他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９６  Ｄｅｃ  ２４；９３（２６）：１５２９９−３０４；Ｍｏｏｓｍａｎｎ  Ｐ，他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９６  Ｄｅｃ  １５；２４（２４）：４８５９−６７；Ｗｉｔｚｇａｌｌ  Ｒ，他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９４  Ｍａｙ  １０；９１（１０）：４５１４−８；Ｍａｒｇｏｌｉｎ  ＪＦ，他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９４  Ｍａｙ  １０；９１（１０）：４５０９−１３；及びＳａｕｅｒ  Ｆ，他、Ｎａｔｕｒｅ．１９９３  Ｊｕｌ  ２９；３６４（６４３６）：４５４−７）。
本発明で言うテトラサイクリン系薬剤としては、毒性が低い薬剤を使用することが好ましく、例えば、ドキシサイクリンなどが挙げられる。
本発明で用いるインスレーターの具体例としては、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類、又はニワトリ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、サル、ヒト等の動物由来のβ−グロブリンインスレーターを挙げることができ、特に好ましくは、ニワトリβ−グロブリンインスレーター（アクセッション番号Ｕ７８７７５，Ｃｈｕｎｇ，Ｊ．Ｈ．他、Ｃｅｌｌ  ７４（３）５０５−５１４（１９９３））などが挙げられる。
本発明の発現ベクターにおいて、第三のプロモーターの下流には、ｌｏｘｐ配列を挿入することができる。ｌｏｘｐ配列は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識されるＤＮＡ配列である。ここでＣｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘｐ配列に挟まれたＤＮＡ配列を欠失させる組み換え酵素である。本発明の発現ベクター中にｌｏｘｐ配列を挿入することにより、上記第三のプロモーターの下流に、発現させるべき所望の遺伝子を導入することが可能になる。Ｃｒｅ−ｌｏｘｐシステムの概要を図１４に示す。例えば、本発明の発現ベクターを有するトランスジェニック動物（例えば、マウスなど）の子宮、卵巣又は精巣に、Ｃｒｅリコンビナーゼ、及びｌｏｘｐ配列と目的外来遺伝子を連結させた環状ＤＮＡを投与することによって、本発明の発現ベクターの上記第三のプロモーターの下流に、発現させるべき目的外来遺伝子を導入することができる。
上記した各々の配列要素をコードするＤＮＡはＰＣＲ法などを含む当業者に公知の遺伝子クローニング技術により取得することができ、各ＤＮＡ断片を適当なベクター中に順番に挿入することにより、本発明の発現ベクターを構築することができる。本発明の発現ベクターの構築は、ＰＣＲ、制限酵素処理、及びライゲーション等を含む通常の遺伝子組み換え技術により行うことができる。
（２）本発明のトランスジェニック細胞
本発明のトランスジェニック細胞は、上記（１）に記載した本発明の発現ベクターを細胞に導入することによって作製することができる。
細胞は、大腸菌などの細菌細胞、又は動物細胞、植物細胞、昆虫細胞又は酵母などの真核細胞の何れでもよいが、好ましくは動物細胞である。本発明で用いることができる動物細胞の種類は、特に限定されず、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類由来の細胞、又はニワトリ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、サル、ヒト等に由来する細胞を使用することができる。
動物細胞としては、例えば、内皮細胞、上皮細胞、島細胞、ニューロンその他の神経組織由来の細胞、中皮細胞、骨細胞、リンパ球、軟骨細胞、造血細胞、免疫細胞、各種の臓器（例えば、肝臓、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓および皮膚など）の細胞、筋肉細胞（骨格筋、平滑筋および心筋由来の細胞を含む）、外分泌または内分泌細胞、線維芽細胞、ならびに胚その他の分化全能性または多分化能性幹細胞を使用することができ、また樹立されている各種の細胞株（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｈｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター（ＣＨＯ）細胞等）を使用することができる。
本発明の発現ベクターの動物細胞への導入は、当業者に公知の通常の遺伝子導入法により行うことができる。遺伝子導入法の具体例としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法（リポフェクトアミン試薬を使用する方法等を含む）等を挙げることができる。
上記のようにして作製した本発明のトランスジェニック細胞においては、テトラサイクリン系薬剤が存在する場合には目的遺伝子の発現が誘導され、テトラサイクリン系薬剤が存在しない場合には目的遺伝子の発現がゼロになる。
（３）本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物
本発明によれば、上記（１）に記載した発現ベクターがゲノムに挿入されている、目的遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製するためのトランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。
トランスジェニック動物を作製するための方法は当業者に公知である。例えば、Ｈｏｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８６などを参照することができる。外来の発現ベクターを哺乳動物の生殖細胞に導入する技術は最初はマウスにおいて開発された（Ｇｏｒｄｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，７７：７３８０−８４（１９８０）；Ｇｏｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４：１２４４−４６（１９８１）；Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｃｅｌｌ，４１：３４３−４５（１９８５）；Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，８２：４４３８−４２（１９８５）など）。本発明においても、これらの方法に準じて、上記（１）に記載した発現ベクターがゲノムに挿入されているトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製することができる。上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、目的遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製するために有用である。
本発明の発現ベクターがゲノムに挿入されているトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製は、例えば、上記の発現ベクターを受精卵などに導入することにより作製することができる。
本発明の発現ベクターがゲノムに挿入されているトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、例えば、非ヒト哺乳動物の受精卵に上記の発現ベクターを導入し、当該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物に移植し、当該非ヒト哺乳動物から発現ベクターが導入された非ヒト哺乳動物を分娩させることにより作製することができる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類の他、ニワトリ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、サル等を使用することができるが、作製、育成及び使用の簡便さなどの観点から見て、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類が好ましく、そのなかでもマウスが最も好ましい。
本発明で用いるトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、胚芽細胞と、生殖細胞あるいは体細胞とが、非ヒト哺乳動物またはこの動物の先祖に胚発生の段階（好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）において外来性の本発明の発現ベクターを導入することによって作出される。
受精卵細胞段階における発現ベクターの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように維持されるように行う。遺伝子導入後の作出動物の胚芽細胞において、発現ベクターが存在することは、作出動物の後代がすべてその胚芽細胞および体細胞のすべてに発現ベクターが存在することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてのゲノム上に発現ベクターを有する。
本発明のトランスジェニック動物は、交配により遺伝子を安定に保持することを確認して、当該遺伝子保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することができる。導入遺伝子（即ち、本発明の発現ベクター）を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該遺伝子を過剰に有するように繁殖継代することができる。発現ベクターにコードされるタンパク質の発現部位を同定するためには当該発現ベクターの発現を個体、臓器、組織、細胞の各レベルで観察することができる。また、発現ベクターにコードされる各タンパク質の抗体を用いた酵素免疫検定法によりその発現の程度を測定することも可能である。
以下、トランスジェニック非ヒト哺乳動物がトランスジェニックマウスの場合を例に挙げて具体的に説明する。本発明の発現ベクターをマウス受精卵の雄性前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、偽妊娠雌性マウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記発現ベクターを有する仔マウスを選択することによりトランスジェニックマウスを作製することができる。上記マウスの受精卵としては、例えば、１２９／ｓｖ、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ、ＳＪＬ／Ｗｔ等に由来するマウスの交配により得られるものなら任意のものを使用できる。
また、注入する発現ベクターの数は受精卵１個当たり１００〜３０００分子が適当である。そしてまた、発現ベクターを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等よりＤＮＡを抽出し、導入した発現ベクターをプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
さらに本発明においては、上記した本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の生殖細胞（例えば、卵母細胞、精原細胞など）に、ｌｏｘＰ配列に連結された目的遺伝子を含む環状ＤＮＡを投与して、前記第三のプロモーターの下流に設けられているｌｏｘＰ配列に前記目的遺伝子を繋ぎこみ、当該生殖細胞から動物を再生することによって、目的遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製することができる。上記方法によって作製されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物又はその一部も本発明の範囲内である。
上記した本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の一部としては、非ヒト哺乳動物の細胞、細胞内小器官、組織および臓器のほか、頭部、指、手、足、腹部、尾などが挙げられ、これらも全て本発明の範囲内に属する。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】実施例１：遺伝子導入用の発現ベクターの構築
（１）ＰＣＲ法を用いたサイトメガロウィルスプロモーター（ＰｈＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）のＤＮＡ断片の増幅・単離
ＰＣＲ法を用い、ＰｈＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒの両端に新規制限酵素認識サイトを挿入する（これをＧｅｎｅ．１とする）。ＰＣＲで使用した鋳型は、ＰｈＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒを含有するｐｃＤＮＡ３プラスミドベクターである。ＰＣＲで使用したプライマーは、５’ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ  ｇｇｔ  ａｃｃ  ａａｔ  ａｔｔ  ｇｃｔ  ａｇｃ  ｇａｇ  ｃｔｔ  ｇｇｃ  ｃｃａ  ｔｔｇ  ｃａｔ  ａｃｇ  ｔｔｇ（配列番号６）、及び３’ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ  ｃｔｃ  ｇａｇ  ｃａｃ  ｇｔｇ  ａａｇ  ｃｔｔ  ｃｇｇ  ａｔｃ  ｃｇａ  ａｔｔ  ｃｇｃ  ｔａｇ  ｃｇｇ  ｇｇｃ  ｃｇｃ  ｇｇａ  ｇｇｃ  ｔｇｇ  ａｔｃ（配列番号７）である。
ｐｃＤＮＡ３プラスミドベクターをＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素処理および平滑末端処理し、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識サイトを排除した（これをＶｅｃｔｏｒ．１とする）。
Ｖｅｃｔｏｒ．１をＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ制限酵素処理し、同様に処理したＧｅｎｅ．１を挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．２を作製した。
（２）ポリアデニル酸シグナル（ｐｏｌｙＡ）の付加
ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素処理したＳＶ４０  ｐｏｌｙＡを、同様に処理したプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．２へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．３を作製した。
（３）テトラサイクリン依存性転写活性化因子（ｒＴｅｔＲ−ＶＰ１６）の付加
ｐＵＨＤ１７プラスミドベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ制限酵素処理し、ｒＴｅｔＲ−ＶＰ１６を取得し、同様の制限酵素処理したプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．３へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．４を作製した。
（４）ＰＣＲ法を用いたＳＶ４０  ｐｏｌｙＡのＤＮＡ断片の増幅・単離
ＰＣＲ法を用い、ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡの両端に新規制限酵素認識サイトを挿入した（これを、Ｇｅｎｅ．２とする）。ＰＣＲで使用した鋳型は、ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡを含有するｐｃＤＮＡ３又はｐＴＲＥプラスミドベクターである。ＰＣＲで用いたプライマーは、５’ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ａｇａ  ｃａｔ  ｇａｔ  ａａｇ（配列番号８）、及び３’ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ  ｇｇｔ  ａｃｃ  ｇｇｇ  ｃｃｃ  ａｇａ  ｔｃｔ  ｇｇｔ  ｃｇａ  ｇｃｔ  ｇａｔ  ａｃｔ  ｔｃｃ（配列番号９）である。ｐｃＤＮＡ３プラスミドベクターをＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ制限酵素処理し、同様に処理したＧｅｎｅ．２を挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．５を作製した。
（５）テトラサイクリン依存性転写抑制因子発現ベクターの作製
Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １０；Ｋｏｘｌ  ｇｅｎｅ（Ｘ５２３３２）の転写抑制ドメイン（ＫＲＡＢ）をＰＣＲ法により増幅・単離した（これをＧｅｎｅ．３とする）。ＰＣＲで使用した鋳型は、ＨｅＬａ細胞より抽出合成したｃＤＮＡである。ＰＣＲで用いたプライマーは、５’ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ  ｇａａ  ｔｔｃ  ａａｇ  ｃｔｔ  ｇｇｃ  ｇｇｔ  ｇｇｔ  ｇｃｔ  ｔｔｇ  ｔｃｔ（配列番号１０）、及び３’ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ｔｔａ  ａａｃ  ｔｇａ  ｔｇａ  ｔｔｔ  ｇａｔ  ｔｔｃ  ａａａ  ｔｇｃ  ａｇｔ  ｃ（配列番号１１）である。
Ｇｅｎｅ．３をＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素処理し、同様に処理したテトラサイクリン依存性レセプター（ＴｅｔＲ）を含有したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩへ挿入し、ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢを作製した（これをＶｅｃｔｏｒ．６とする）。プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．６をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ制限酵素処理し、同様に処理したＰｈＣＭＶ  ｐｒｏ．を含有したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩへ挿入し、ＰｈＣＭＶ  ｐｒｏ．−ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢを作製した（これをＶｅｃｔｏｒ．７とする）。プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．７をＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ制限酵素処理し、同様に処理したプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．５へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．８を作製した。
（６）テトラサイクリン依存性転写因子（ＰｈＣＭＶ  ｐｒｏ．−ｒＴｅｔＲ−ＶＰ１６，ＰｈＣＭＶ  ｐｒｏ．−ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢ（Ｋｏｘ１））の連結
プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．４及び８をそれぞれＸｈｏＩ−  ＡｐａＩ制限酵素処理し、テトラサイクリン依存性転写活性化因子発現プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．４へ、テトラサイクリン依存性転写抑制因子発現遺伝子を連結して、Ｖｅｃｔｏｒ．９を作製した。
（７）電子伝達阻害型＝活性酸素過剰発生型遺伝子変異を挿入した（ｍｅｖ−１型）ｃｙｔ−１遺伝子の作製（これをＧｅｎｅ．４とする）
ｍｉｃｅ  ＩＣＲ  ｌｉｖｅｒ（ＩＣＲ系統のマウス肝臓由来）ｃＤＮＡを鋳型に、ＰＣＲ法によりチトクロームｂ大サブユニット（ｃｙｔ−１）のクローニングした。ＰＣＲで用いたプライマーは、５’ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ  ｇａａ  ｔｔｃ  ｇｃｃ  ｇｃｃ  ａｃｃ  ａｔｇ  ｇｃｔ  ｇｃｇ  ｔｔｃ  ｔｔｇ  ｃｔｇ  ａｇａ  ｃａｔ  ｇｔｃ  ａｇｃ（配列番号１２）、及び３’ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ  ａａｇ  ｃｔｔ  ｔｃｔ  ａｇａ  ａａａ  ｔｃａ  ｃａｇ  ｇｇｃ  ｇｇｃ  ｃａｇ  ｃｃｃ（配列番号１３）である。上記により得られた、チトクロームｂ大サブユニットの増幅ＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ−ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒのＭＣＳ（ｍｕｌｔｉ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ：制限酵素領域）ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩへ導入した。大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルを作製し、そこへ上記プラスミドベクターの形質導入を行い目的遺伝子のＰＣＲ増幅断片の単離（サブクローニング）を行った。
電子伝達阻害型＝活性酸素過剰発生型遺伝子変異を挿入した（ｍｅｖ−１型）ｃｙｔ−１遺伝子の作製は、プライマーとして、５’ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ  ｇａａ  ｔｔｃ  ｃｔｃ  ｔｔｃ  ｃｃａ  ｔｇｇ  ｃａｃ  ｔｇｔ  ｃｃｇ  ａａｔ  ｇｃｃ（配列番号１４）、及び３’ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ  ａａｇ  ｃｔｔ  ｔｃｔ  ａｇａ  ａａａ  ｔｃａ  ｃａｇ  ｇｇｃ  ｇｇｃ  ｃａｇ  ｃｃｃ（配列番号１５）を使用し、上記と同様にして、ＰＣＲおよび形質導入を行い、ｍｅｖ−１型ｃｙｔ−１遺伝子の３’領域のサブクローニングを行った。
上記で作製した野生型ｃｙｔ−１遺伝子全長サブクローニング用プラスミドベクターへ、ＥａｒＩ−ＸｂａＩ制限酵素を用いて、ｍｅｖ−１型ｃｙｔ−１遺伝子の３’領域を挿入して、ｍｅｖ−１型ｃｙｔ−１遺伝子全長を作製した。
（８）テトラサイクリン系遺伝子発現制御システム（ＴＲＥ）を用いた目的遺伝子（ｍｅｖ−１型ｃｙｔ−１遺伝子）発現用プラスミドベクターの作製
ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ制限酵素処理したｐＴＲＥプラスミドベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）へｍｅｖ−１型ｃｙｔ−１遺伝子：Ｇｅｎｅ．４を挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．１０を作製した。
ｐｃＤＮＡ３プラスミドベクターをＮｒｕＩ−ＥｃｏＲＩ制限酵素処理し、サイトメガロウィルスプロモター（ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を排除したｐｃＤＮＡ３  ΔＣＭＶ  ｐｒｏ．プラスミドベクターを作製（再度生じるＥｃｏＲＩサイトも破壊する）した（これを、Ｖｅｃｔｏｒ．１１とする）。
Ｖｅｃｔｏｒ．１０をＸｈｏＩ−ＸｂａＩ制限酵素処理し、Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＴＲＥ）−ｍｅｖ−１型ｃｙｔ−１遺伝子を取得した。これを、同様にしてＸｈｏＩ−ＸｂａＩ制限酵素処理したＶｅｃｔｏｒ．１１へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．１２を作製した。
（９）プロモーター、転写調節領域内に存在するシスエレメントの効果を外部より絶縁するための働きをする遺伝子（ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｉｎｓｕｌａｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）の挿入（パート１）。
ＰＣＲ法によるｉｎｓｕｌａｔｏｒＤＮＡ断片の増幅・単離した（これをＧｅｎｅ．５とする）。ＰＣＲで使用した鋳型は、ニワトリｃＤＮＡライブラリーである。ＰＣＲで使用したプライマーは、５’ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ  ｇａｔ  ａｔｃ  ｇｇｇ  ａｃａ  ｇｃｃ  ｃｃｃ  ｃｃｃ  ｃａａ  ａｇ（配列番号１６）、及び、３’ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ  ｇａｔ  ａｔｃ  ｃｔｃ  ａｃｔ  ｇａｃ  ｔｃｃ  ｇｔｃ  ｃｔｇ  ｇ（配列番号１７）である。
上記で増幅したＤＮＡ断片：Ｇｅｎｅ．５をＥｃｏＲＶ制限酵素処理し、同様にＥｃｏＲＶ制限酵素処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ−プラスミドベクターへ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．１３を作製した。上記プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１３をＥｃｏＲＶ制限酵素処理し取得したｉｎｓｕｌａｔｏｒを、ＰｖｕＩＩ制限酵素処理したプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１２へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．１４を作製した。
（１０）Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＴＲＥ）を利用したテトラサイクリン遺伝子発現制御システム全長の作製
テトラサイクリン依存性転写因子（活性化因子、抑制因子）発現プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．９、およびテトラサイクリン系遺伝子発現制御システム（ＴＲＥ）を用いた目的遺伝子（ｍｅｖ−１型ｃｙｔ−１遺伝子）発現用プラスミドベクターをそれぞれＳｓｐＩ−ＢｇｌＩＩ制限酵素処理し、連結して、Ｖｅｃｔｏｒ．１５を作製した。
（１１）プロモーター、転写調節領域内に存在するシスエレメントの効果を外部より絶縁するための働きをする遺伝子（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）の挿入（パート２）
ｉｎｓｕｌａｔｏｒ含有ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ−プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１３をＥｃｏＲＶ制限酵素処理し取得したｉｎｓｕｌａｔｏｒを、ＳｓｐＩ制限酵素処理したプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１５へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．１６を作製した。
（１２）プロモーター、転写調節領域内に存在するシスエレメントの効果を外部より絶縁するための働きをする遺伝子（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）の挿入（パート３）
ｉｎｓｕｌａｔｏｒ含有ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ−プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１３をＥｃｏＲＶ制限酵素処理し取得したｉｎｓｕｌａｔｏｒを、ＰｍｌＩ制限酵素処理したプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１６へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．１７を作製した。
（１３）プロモーター、転写調節領域内に存在するシスエレメントの効果を外部より絶縁するための働きをする遺伝子（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）の挿入（パート４）
ｉｎｓｕｌａｔｏｒ含有ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ−プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１３をＥｃｏＲＶ制限酵素処理し取得したｉｎｓｕｌａｔｏｒを、ＥｃｏＲＶ制限酵素処理したプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１７へ挿入して、テトラサイクリンシステム完全長（一本化）プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１８を作製した。このＶｅｃｔｏｒ．１８が、電子伝達阻害型＝活性酸素過剰発生型；ｍｅｖ−１動物作製のための導入遺伝子である。
（１４）レポーター蛋白質（核移行緑色蛍光蛋白質：ｎ１ｓＧＦＰ）遺伝子の挿入
ＰＣＲ法によりｎ１ｓＧＦＰ  ＤＮＡ断片を増幅・単離した（これをＧｅｎｅ．６とする）。ＰＣＲで使用した鋳型は、ＧＦＰを含有するｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドベクターである。ＰＣＲで使用したプライマーは、５’ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：  ｇｇｇ  ｔｃｔ  ａｇａ  ａａｔ  ａｔｔ  ａａｇ  ｃｔｔ  ｔｇｃ  ｇｇｃ  ｃｇｃ  ａｔｇ  ｃｃｃ  ａａｇ  ａａｇ  ａａｇ  ｃｇｃ  ａａｇ  ｇｔｇ  ｇａｇ  ｇａｃ  ｇｃｃ  ａｔｇ  ｇｔｇ  ａｇｃ  ａａｇ  ｇｇｃ  ｇａｇ（配列番号１８）、及び３’ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ  ｇｇｔ  ａｃｃ  ｇｇｇ  ｃｃｃ  ｃｇｇ  ａｔｃ  ｃｃｔ  ｔｇｔ  ａｃａ  ｇｃｔ  ｃｇｔ  ｃｃａ  ｔｇｃ（配列番号１９）である。上記で増幅・単離したｎ１ｓＧＦＰ遺伝子：Ｇｅｎｅ．６をＡｐａＩ−ＸｂａＩ制限酵素処理し、同様に制限酵素処理したテトラサイクリンシステム完全長（一本化）プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１８へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．１９を作製した。
（１５）レポーター蛋白質（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子の挿入
ＰＣＲ法によりＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ＤＮＡ断片を増幅・単離した（これを、Ｇｅｎｅ．７とする）。ＰＣＲで使用した鋳型は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを含有したｐＣＨ１１０あるいはｐＭＣ１８７１プラスミドベクターである。ＰＣＲで使用したプライマーは、５’ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ａｔｇ  ｇａａ  ｇａｃ  ｇｃｃ  ａａａ  ａａｃ（配列番号２０）、及び３’ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ  ｇｇｔ  ａｃｃ  ｇｇｇ  ｃｃｃ  ｔｔａ  ｃａａ  ｔｔｔ  ｇｇａ  ｃｔｔ  ｔｃｃ  ｇｃ（配列番号２１）である。上記で増幅・単離したＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子：Ｇｅｎｅ．７をＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ制限酵素処理し、同様に制限酵素処理したテトラサイクリンシステム完全長（一本化）プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１９へ挿入してＶｅｃｔｏｒ．２０を作製した。
（１６）一種類のプロモーターより二種類のｍＲＮＡを発現することを可能にする遺伝子配列（ＩＲＥＳ）の挿入する
ＩＲＥＳ含有のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ−プラスミドベクターをＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ制限酵素処理し、ＩＲＥＳを取得した。これを、同様にしてＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ制限酵素処理したテトラサイクリンシステム完全長（一本化）プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．２０へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．２１を作製した。Ｖｅｃｔｏｒ．２１は、テトラサイクリンシステムがｉｎｓｕｌａｔｏｒの効果により目的遺伝子の誘導発現が厳密に行えることを証明するための導入遺伝子（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ（Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ（＋））：Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ．Ｔｇ（＋））（構造を図６に示す。塩基配列を配列番号１に示す）である。Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ．Ｔｇ（＋）の作製の概要を図１に示す。また、Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ（Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ（−））：Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ．Ｔｇ（−））（構造を図７に示す。塩基配列を配列番号２に示す）となるプラスミドベクターは、（９）、（１１）〜（１３）の工程を除いたものである。
（１７）テトラサイクリン依存性転写活性化因子（ｒＴｅｔＲ−ＶＰ１６）の発現がＰｈＣＭＶプロモーターによって制御されるプラスミドベクターの作製
ＰＣＲ法を用いて、ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ遺伝子イントロン２、エキソン３領域（ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｓｐｌｉｃｅ  Ａ／Ｄ）遺伝子を増幅・単離した（これをＧｅｎｅ．８とする）。ＰＣＲで使用した鋳型は、マウスｃＤＮＡライブラリーである。ＰＣＲで使用したプライマーは、５’ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ  ｔｃｔ  ａｇａ  ｇｃｃ  ｔｃｔ  ｇｃｔ  ａａｃ  ｃａｔ  ｇｔｔ  ｃａｔ  ｇ（配列番号２２）、及び３’ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ  ｇａａ  ｔｃｃ  ｇａａ  ｔｔｃ  ｔｔｔ  ｇｃｃ  ａａａ  ａｔｇ  ａｔｇ  ａｇａ  ｃａｇ  ｃａｃ（配列番号２３）である。上記で増幅・単離したｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｓｐｌｉｃｅ  Ａ／Ｄ遺伝子：Ｇｅｎｅ．８をＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ制限酵素処理し、またＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩ制限酵素処理したテトラサイクリン依存性転写活性化因子発現プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．４へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．２２を作製した。
（１８）テトラサイクリン依存性転写抑制因子（ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢ）の発現がＰｈＣＭＶエンハンサー  −アクチンプロモーターによって制御されるプラスミドベクターの作製
ＰＣＲ法を用いたｂｅｔａ−ａｃｔｉｎプロモーター領域（ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ  ｐｒｏ．）遺伝子を増幅、単離した（これをＧｅｎｅ．９とする）。ＰＣＲで使用した鋳型は、マウスｃＤＮＡライブラリーである。ＰＣＲで使用したプライマーは、５’ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ｔａｃ  ｇｔａ  ｔｃｇ  ａｇｇ  ｔｇａ  ｇｃｃ  ｃｃａ  ｃｇｔ  ｔｃ（配列番号２４）、及び３’ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ  ｇａａ  ｔｔｃ  ｔｃｔ  ａｇａ  ｇｃｃ  ｇｃｃ  ｇｇｔ  ｃａｃ  ｇｃｃ  ａｇａ  ａｇ（配列番号２５）である。上記で増幅・単離したｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ  ｐｒｏ．遺伝子：Ｇｅｎｅ．９をＳｎａＢＩ−ＸｂａＩ制限酵素処理し、同様に制限酵素処理したｐｃＤＮＡ３プラスミドベクターへ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．２３を作製した。
ＣＭＶ  ｅｎｈａｎｃｅｒにｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ  ｐｒｏ．を連結した（ＣＭＶ  ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｐｒｏ．）。即ち、ｐｃＤＮＡ３プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．２３、およびｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ遺伝子イントロン２、エキソン３領域（ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｓｐｌｉｃｅ  Ａ／Ｄ）遺伝子断片：Ｇｅｎｅ．８をＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ制限酵素処理し、Ｖｅｃｔｏｒ．２３へｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｓｐｌｉｃｅ  Ａ／Ｄを挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．２４を作製した。
テトラサイクリン依存性転写抑制因子プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．８をＮｒｕＩ−ＫｐｎＩ制限酵素処理し、Ｖｅｃｔｏｒ．８内に存在するｐｃＤＮＡ３プラスミドベクターのＣＭＶ  ｐｒｏ．を排除した（これをＶｅｃｔｏｒ．２５とする）。ＣＭＶ  ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｐｒｏ．にｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｓｐｌｉｃｅ  Ａ／Ｄを連結した（ＣＭＶ  ｅｎｈａｎｃｅｒ−  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｐｒｏ．−ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｓｐｌｉｃｅ  Ａ／Ｄ）ｐｃＤＮＡ３プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．２４をＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ制限酵素処理し、同様に制限酵素処理した上記Ｖｅｃｔｏｒ．２５へＣＭＶ  ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｐｒｏ．−ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｓｐｌｉｃｅ  Ａ／Ｄを挿入した（これをＶｅｃｔｏｒ．２６とする）。
（１９）テトラサイクリン系薬剤による遺伝子誘導発現制御を厳密に行うテトラサイクリンシステム完全長（一本化）プラスミドベクターの作製
テトラサイクリン依存性転写活性化因子（ｒＴｅｔＲ−ＶＰ１６）の発現がＰｈＣＭＶプロモーターによって制御されるプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．２２、およびテトラサイクリン依存性転写抑制因子（ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢ）の発現がＰｈＣＭＶ  ｅｎｈａｎｃｅｒ−ａｃｔｉｎプロモーターによって制御されるプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．２６をＡｐａＩ−ＸｈｏＩ制限酵素処理しＶｅｃｔｏｒ．２２へＶｅｃｔｏｒ．２６を連結して、Ｖｅｃｔｏｒ．２７を作製した。
上記プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．２７のＰｍｌＩ制限酵素サイトへ、平滑末端（ＥｃｏＲＶ制限酵素処理された）のｉｎｓｕｌａｔｏｒを挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．２８を作製した。上記プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．２８をＮｈｅＩ−ＮｒｕＩ制限酵素処理し、同様にして制限酵素処理されたテトラサイクリンシステム完全長（一本化）プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．２１へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．２９を作製した。Ｖｅｃｔｏｒ．２９は、２段階での転写調節因子の競合（ＣＭＶ  ｅｎｈａｎｃｅｒへの転写因子の結合競合およびＴＲＥへのテトラサイクリン依存性転写調節因子の結合競合）によりテトラサイクリン系遺伝子誘導発現を厳密に制御することを可能とした本発明の導入遺伝子（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ：Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ  Ｔｇ  ＡＤ（＋））である（構造を図８に示す）。Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ  Ｔｇ  ＡＤ（＋）の作製の概要を図２および図３に示す。Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ  Ｔｇ  ＡＤ（＋）の塩基配列を配列番号３に示す。
また、ｍｅｖ−１マウス作製には、このＴｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅへｍｅｖ−１型ｃｙｔ−１遺伝子を導入したもの（Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−ｍｅｖ−１  Ｔｇ  ＡＤ（＋））（構造を図９に示す。塩基配列を配列番号４に示す）を使用できる。Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−  ｍｅｖ−１  Ｔｇ  ＡＤ（＋）の作製の概要を図４に示す。
実施例２：遺伝子導入用の発現ベクターの構築
（１）Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ合成法を用いた、ｌｏｘＰ配列２本鎖ＤＮＡ断片の合成
下記に部分例を示すｌｏｘＰ配列のＯｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを合成した。
５’Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇａ  ｔａａ  ｃｔｔ  ｃｇｔ  ａｔａ  ｇｔａ  ｔａｃ  ａｔｔ  ａｔａ  ｃｇａ  ａｃｇ  ｇｔａ  ｇ（配列番号２６）
３’Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇａｔ  ｃｃｔ  ａｃｃ  ｇｔｔ  ｃｇｔ  ａｔａ  ａｔｇ  ｔａｔ  ａｃｔ  ａｔａ  ｃｇａ  ａｇｔ  ｔａｔ  ｃｃｇ  ｃ（配列番号２７）
５’Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇａ  ｔａａ  ｃｔｔ  ｃｇｔ  ａｔａ  ｇｔａ  ｔａｃ  ａｔｔ  ａｔａ  ｇｃａ  ａｔｇ  ｇｔａ  ｇ（配列番号２８）
３’Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇａｔ  ｃｃｔ  ａｃｃ  ａｔｔ  ｇｃｔ  ａｔａ  ａｔｇ  ｔａｔ  ａｃｔ  ａｔａ  ｃｇａ  ａｇｔ  ｔａｔ  ｃｃｇ  ｃ（配列番号２９）
５’Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇａ  ｔａａ  ｃｔｔ  ｃｇｔ  ａｔａ  ｇｇａ  ｔａｃ  ｔｔｔ  ａｔａ  ｃｇａ  ａｃｇ  ｇｔａ  ｇ（配列番号３０）
３’Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇａｔ  ｃｃｔ  ａｃｃ  ｇｔｔ  ｃｇｔ  ａｔａ  ａａｇ  ｔａｔ  ｃｃｔ  ａｔａ  ｃｇａ  ａｇｔ  ｔａｔ  ｃｃｇ  ｃ（配列番号３１）
５’Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇａ  ｔａａ  ｃｔｔ  ｃｇｔ  ａｔａ  ｇｇａ  ｔａｃ  ｔｔｔ  ａｔａ  ｇｃａ  ａｔｇ  ｇｔａ  ｇ（配列番号３２）
３’Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇａｔ  ｃｃｔ  ａｃｃ  ａｔｔ  ｇｃｔ  ａｔａ  ａａｇ  ｔａｔ  ｃｃｔ  ａｔａ  ｃｇａ  ａｇｔ  ｔａｔ  ｃｃｇ  ｃ（配列番号３３）
５’Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇａ  ｔａａ  ｃｔｔ  ｃｇｔ  ａｔａ  ｇｔａ  ｔａｃ  ａｔｔ  ａｔａ  ｃｇａ  ａｇｔ  ｔａｔ  ｇ（配列番号３４）
３’Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇａｔ  ｃｃａ  ｔａａ  ｃｔｔ  ｃｇｔ  ａｔａ  ａｔｇ  ｔａｔ  ａｃｔ  ａｔａ  ｃｇａ  ａｇｔ  ｔａｔ  ｃｃｇ  ｃ（配列番号３５）
５’Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｔ  ａｃｃ  ｇｔｔ  ｃｇｔ  ａｔａ  ｇｔａ  ｔａｃ  ａｔｔ  ａｔａ  ｇｃａ  ａｇｔ  ｔａｔ  ｇ（配列番号３６）
３’Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇａｔ  ｃｃａ  ｔａａ  ｃｔｔ  ｃｇｔ  ａｔａ  ａｔｇ  ｔａｔ  ａｃｔ  ａｔａ  ｃｇａ  ａｃｇ  ｇｔａ  ｃｃｇ  ｃ（配列番号３７）
５’Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇａ  ａｔｔ  ａｔｔ  ｃｇｔ  ａｔａ  ｇｔａ  ｔａｃ  ａｔｔ  ａｔａ  ｃｇａ  ａｇｔ  ｔａｔ  ｇ（配列番号３８）
３’Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇａｔ  ｃｃａ  ｔａａ  ｃｔｔ  ｃｇｔ  ａｔａ  ａｔｇ  ｔａｔ  ａｃｔ  ａｔａ  ｃｇａ  ａｔａ  ａｔｔ  ｃｃｇ  ｃ（配列番号３９）
５’Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇａ  ａｔｔ  ａｔｔ  ｃｇｔ  ａｔａ  ｇｇａ  ｔａｃ  ｔｔｔ  ａｔａ  ｃｇａ  ａｇｔ  ｔａｔ  ｇ（配列番号４０）
３’Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇａｔ  ｃｃａ  ｔａａ  ｃｔｔ  ｃｇｔ  ａｔａ  ａａｇ  ｔａｔ  ｃｃｔ  ａｔａ  ｃｇａ  ａｔａ  ａｔｔ  ｃｃｇ  ｃ（配列番号４１）
上記５’及び３’のＯｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅそれぞれの組み合わせをＰｏｌｙ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（ＰＮＫ）処理後、２本鎖ＤＮＡ断片とし、ｌｏｘＰ  ＤＮＡ配列断片を合成した（これをＧｅｎｅ．１とする）。
（２）ｌｏｘＰ配列２本鎖ＤＮＡ断片と赤色蛍光蛋白質（ＤｓＲｅｄ）発現遺伝子の連結
上記で作製したｌｏｘＰ配列２本鎖ＤＮＡ断片を、ＳａｃＩＩ−ＢａｍＨＩ制限酵素処理したｐＤｓＲｅｄ１−Ｎ１プラスミドベクターへ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．１を作製した。
（３）テトラサイクリン系遺伝子発現制御システム（ＴＲＥ）を用いた目的遺伝子（ｌｏｘＰ−ＤｓＲｅｄ）発現用プラスミドベクターの作製
ｌｏｘＰ配列２本鎖ＤＮＡ断片とＤｓＲｅｄが連結されたプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１をＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩ制限酵素処理し、  同様に制限酵素処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ−プラスミドベクターへ挿入してＶｅｃｔｏｒ．２を作製した。上記プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．２をＳａｃＩＩ−ＸｂａＩ制限酵素処理し、同様に制限酵素処理したｐＴＲＥプラスミドベクターへ挿入してＶｅｃｔｏｒ．３を作製した。
（４）組換えターゲット配列（ｌｏｘＰ配列）を含有したテトラサイクリンシステム完全長（一本化）プラスミドベクターの作製
上記、ｐＴＲＥ−ｌｏｘＰ−ＤｓＲｅｄプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．３をＸｂａＩ−ＸｈｏＩ制限酵素処理し、同様に制限酵素処理したｐｃＤＮＡ３プラスミドベクターへ挿入してＶｅｃｔｏｒ．４を作製した。上記、プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．４をＡｐａＩ−ＥｃｏＲＶ制限酵素処理し、同様に制限酵素処理したテトラサイクリンシステム完全長（一本化）プラスミドベクターへ：Ｖｅｃｔｏｒ．２９へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．５を作製した。Ｖｅｃｔｏｒ．５が、本発明の最終目的であるＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムとテトラサイクリン系遺伝子誘導発現システムを併用するための導入遺伝子（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ−ｌｏｘＰ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）である。
組換えターゲット配列（ｌｏｘＰ配列）を含有したテトラサイクリンシステム完全長（一本化）プラスミドベクターの作製の概要を図５に示す。作製したＴｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−ｌｏｘＰ  Ｔｇ  ＡＤ（＋）の構造を図１０に示し、その塩基配列を配列番号５に示す。
実施例３：遺伝子導入と発現アッセイ
ＮＩＨ３Ｔ３細胞株を６ｗｅｌｌプレートに（１×１０５〜ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）培養した。１２時間の培養後、無血清培地へ培地交換を行い、遺伝子導入を行った。遺伝子導入はリポフェクトアミン試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ｐｌｕｓ  ｒｅｇｅｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｉｎｃ．）を用いて行った。ＤＮＡ濃度は以下の通りである。
（１）（図１１）
Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｒＴｅｔＲ−ＶＰ１６：Ｖｅｃｔｏｒ．５）…５００ｎｇ／ｗｅｌｌ
Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ（ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢ：Ｖｅｃｔｏｒ．７）…５００ｎｇ／ｗｅｌｌ
ｐＴＲＥ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ…５００ｎｇ／ｗｅｌｌ
ｐＣＭＶ−Ｂ−ｇａｌ…５０ｎｇ／ｗｅｌｌ
（２）（図７）
Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ．Ｔｇ（−）…１５００ｎｇ／ｗｅｌｌ
ｐＣＭＶ−Ｂ−ｇａｌ…５０ｎｇ／ｗｅｌｌ
（３）（図６）
Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ．Ｔｇ（＋）（Ｖｅｃｔｏｒ．２１）…２０００ｎｇ／ｗｅｌｌ
ｐＣＭＶ−Ｂ−ｇａｌ…５０ｎｇ／ｗｅｌｌ
（４）（図８）
Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ．Ｔｇ  ＡＤ（＋）（Ｖｅｃｔｏｒ．２９）…２０００ｎｇ／ｗｅｌｌ
ｐＣＭＶ−Ｂ−ｇａｌ…５０ｎｇ／ｗｅｌｌ
遺伝子導入後、５時間培養し、１０％ＦＢＳ培地を加え、培地中の最終血清（ＦＢＳ）濃度が５％になるようにした。遺伝子導入から２４時間した後、５％ＦＢＳ培地へ培地交換し、さらに４８時間培養した。この際、テトラサイクリン系薬剤であるドキシサイクリン（Ｄｏｘｃｙｃｌｉｎ）添加培地には、Ｄｏｘｃｙｃｌｉｎを最終濃度１μｇ／ｍｌ培地となるように添加した。
上記の通り遺伝子導入を行った６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１００〜１５０μｌのｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（組成は下記に示す）を加え、３０分間反応後、細胞溶出液を回収し、ルシフェラーゼアッセイとβ−ガラクトシダーゼアッセイを下記の通り行った。
ルシフェラーゼアッセイでは、細胞溶出液２０ｍｉｃｒｏ１を用い、１００μｌのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（組成は下記に示す）を加え、ルシフェラーゼによる発光強度をＡＢ−２２００  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ（ＡＴＴＯ  Ｉｎｃ．）で測定した。β−ガラクトシダーゼアッセイでは、細胞溶出液５０μｌを用い、１００μｌのβ−Ｇａｌ  ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（組成は下記に示す）を加え比色定量法によるβ−ガラクトシダーゼ活性を４２０ｎｍ波長でＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により測定した。遺伝子導入効率の補正として、β−ガラクトシダーゼ活性を測定しており、ルシフェラーゼ活性の数値をβ−ガラクトシダーゼ活性の数値で割った値が、実際の遺伝子発現産物量となる。測定結果を図１２に示す。本発明の遺伝子導入用の発現ベクターを用いた場合、ドキシサイクリンの有無により目的遺伝子の発現を制御できることが分かる。また、本発明による遺伝子発現制御の様式を図１３に示す。
試薬組成
0004811765.tif 000002
0004811765.tif 000003
【産業上の利用可能性】  本発明による発現ベクターにおいては、（ｉ）第一のプロモーターと、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに正の転写調節因子を連結して成る転写活性化因子とを含む発現ユニット；（ｉｉ）第二のプロモーターと、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに負の転写調節因子を連結して成る転写抑制因子とを含む発現ユニット；及び（ｉｉｉ）前記レセプターのための標的配列を含む転写調節領域を伴う第三のプロモーターを含む、目的遺伝子を発現させるための発現ユニットが一つのベクターに組み込まれているので、このベクターを使用することにより、上記３種類の発現ベクター系を含むトランスジェニック動物を極めて効率的に作製することができる。
また、上記３種類の発現系のために相互に異なるプロモーターが使用され、且つそれらの発現系がインスレーターにより相互に分離されているので、隣り合った発現系のエンハンサーの効力が相互に絶縁され、転写活性化因子と転写抑制因子の発現量を相互に独立に容易に制御することができる。更に、転写活性化因子の発現のためのプロモーターに比べて転写抑制因子の発現のために強力なプロモーターを使用することにより、転写活性化因子に比べて転写抑制因子を多く発現させて、リガンドであるテトラサイクリン系薬物による目的外来遺伝子の発現のレベルを、本来の野生型遺伝子の発現レベルにおいて容易に制御することができる。また、本発明の好ましい態様によれば、前記第一のプロモーターと前記第二のプロモーターには、それぞれ同一のエンハンサーを含めることができる。
また、本発明においては、上記した発現ベクターにおいて、目的の外来遺伝子を発現させるための制御領域の下流にｌｏｘＰ配列を挿入しておき（目的の外来遺伝子自体は挿入されていない）、この発現ベクターを動物のゲノム上にランダムに導入することができる。これにより、動物のゲノムの種々の部位に外来遺伝子系が挿入された種々のトランスジェニック動物がえられ、それらのトランスジェニック動物には、元来の遺伝子の発現が悪影響を受けるものや、導入した外来遺伝子の発現制御が容易でないものも含まれるが、元来の遺伝子の発現が影響を受けず、且つ導入した外来遺伝子の発現のオンとオフの制御を厳密に行うと同時にその発現量を容易にコントロールすることができるトランスジェニック動物を得ることができる。
そして、このようなトランスジェニック動物を一旦得ることができれば、目的とする外来遺伝子をｌｏｘＰ配列に連結した環状の遺伝子構成物を別途用意し、この目的外来遺伝子を、目的遺伝子の発現のための制御領域の下流に、ｌｏｘＰ配列の組み換えを介して導入することができる。この場合、上記のトランスジェニック動物においては、外来遺伝子が、元来の遺伝子の発現が影響を受けない位置に導入されており、しかもｌｏｘＰの組み換えによる目的外来遺伝子の導入は、例えば、個体の子宮、卵巣又は精巣レベルにおいて容易に行うことができるので、元来の遺伝子の発現に影響することなく、且つ導入した目的外来遺伝子の発現を容易に制御することができ、かつ広範な種類の目的外来遺伝子のいずれかを導入したトランスジェニック動物の品揃えを容易に行うことができる。上記の通り、本発明においては、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて目的外来遺伝子を含む環状ＤＮＡを個体に導入した場合、目的外来遺伝子は本発明の発現ベクターの配列中の目的遺伝子の発現のための制御領域の下流に、ｌｏｘＰ配列の組み換えを介して挿入されるので、元来の染色体上の遺伝子には影響を及ぼすことがないという利点を有している。また、このように目的外来遺伝子を導入した動物個体に、Ｃｒｅリコンビナーゼのみを導入すると、導入した目的外来遺伝子を除去することも可能である。そして、このように目的外来遺伝子を除去した動物個体には再度、別の目的外来遺伝子を上記と同様に導入することが可能であり、遺伝子導入を繰り返し行うことができるという利点を有している。さらに、本発明においては、マイクロインジェクションを行うことなく目的の外来遺伝子を導入したトランスジェニック動物を作製することができるという利点がある。
上記の通り、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いた環状ＤＮＡ導入の利点としては以下のものが挙げられる。
（１）染色体上への環状ＤＮＡの導入効率は、直鎖状ＤＮＡの導入効率に比べはるかに低いことから、無作為な染色体上への導入を防ぐ効果が期待される。これにより、ｌｏｘＰ配列を有する環状ＤＮＡの導入は、無作為な染色体上への導入を防ぎ、染色体上の所定の位置（ｌｏｘＰ配列）への導入が期待できる。
（２）Ｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ−ｌｏｘＰ  Ｔｇ  ＡＤトランスジェニックマウスへの目的遺伝子の導入は、テトラサイクリン系薬剤の投与によりその遺伝子発現量を抑制することが可能となる。即ち、ｌｏｘＰ配列への導入が可能なことで、無作為導入による新たな遺伝子欠損を招く危険性を回避し、さらに導入した遺伝子の発現はテトラサイクリン系薬剤に依存的で、目的に応じた発現量を制御することが可能である。
【図１】
0004811765.tif 000004
【図２】
0004811765.tif 000005
【図３】
0004811765.tif 000006
【図４】
0004811765.tif 000007
【図５】
0004811765.tif 000008
【図６】
0004811765.tif 000009
【図７】
0004811765.tif 000010
【図８】
0004811765.tif 000011
【図９】
0004811765.tif 000012
【図１０】
0004811765.tif 000013
【図１１】
0004811765.tif 000014
【図１２】
0004811765.tif 000015
【図１３】
0004811765.tif 000016
【図１４】
0004811765.tif 000017
【配列表】
0004811765000001.xml