(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を分析するための基板であって、該基板が以下のものを含む：
複数の個々の光ファイバーの融合したバンドルから形成される空洞光ファイバーウェーハであって、各個々の光ファイバーは３から１００μｍの直径を有し、ウェーハは上面と底面を含み、上面は少なくとも１０，０００の部位を含み、ここで、該部位は空洞光ファイバーウェーハの上面内にエッチングされ、そして上面と底面間のウェーハの厚さは０．５ｍｍから５．０ｍｍであり、各部位の深さは、個々の光ファイバーの直径の２分の１から個々の光ファイバーの直径の３倍におよび、そして空洞ウェーハの上面上の複数の部位はその中に核酸を有する、上記空洞光ファイバーウェーハ；および、
空洞ウェーハの上面上の部位内の複数のビーズであって、それらに結合するスルフリラーゼを有する、複数のビーズ。
【請求項２】
核酸が部位上、またはビーズ上に固定化されている、請求項１の基板。
【請求項３】
空洞光ファイバーウェーハ中の各個々の光ファイバーの直径が６−５０μｍである、請求項１の基板。
【請求項４】
空洞光ファイバーウェーハの上面が１０μｍから２００μｍ離れている２つ以上の核酸を含む、請求項１の基板。
【請求項５】
空洞光ファイバーウェーハの上面が５０μｍから１５０μｍ離れている２つ以上の核酸を含む、請求項１の基板。
【請求項６】
空洞光ファイバーウェーハの上面が、分離した領域に１０４以上の核酸配列を含む、請求項１の基板。
【請求項７】
空洞光ファイバーウェーハの上面が、分離した領域に１０５以上の核酸配列を含む、請求項１の基板。
【請求項８】
基板が、空洞光ファイバー面と反対側に磨かれた光ファイバー面を有し、そして磨かれた面が第二の光ファイバーに光学連結を可能にする、請求項１の基板。
【請求項９】
核酸がＤＮＡである、請求項１の基板。
【請求項１０】
ルシフェラーゼが固定化されたビーズをさらに含む、請求項１の基板。
【請求項１１】
複数の核酸を処理する装置であって、該装置は以下のものを含む：
複数の個々の光ファイバーの第一の融合したバンドルから形成される空洞光ファイバーウェーハを中に配置した流れチャンバであって、各個々の光ファイバーは３から１００μｍの直径を有し、ウェーハは上面と底面を含み、底面は光ファイバーの第二の融合したバンドルに光学連結を可能にするように高度に磨かれており、そして上面は少なくとも１０，０００の部位を有し、ここで、該部位は空洞光ファイバーウェーハの上面内にエッチングされ、そして上面と底面間のウェーハの厚さは０．５ｍｍから５．０ｍｍであり、各部位の深さは、個々の光ファイバーの直径の２分の１から個々の光ファイバーの直径の３倍におよび、そして空洞ウェーハの上面上の複数の部位はその中に核酸を有する、上記流れチャンバ；
空洞ウェーハの上面上の部位内の複数のビーズであって、それらに結合するスルフリラーゼを有する、複数のビーズ；
ヌクレオチド３リン酸を連続的に送達することを含む、追加のピロホスフェート配列決定試薬を１つ以上のリザーバーから該流れチャンバへ送達し、それにより光ファイバーウェーハの上面上の部位内の核酸を上記の追加の試薬に曝するための流体手段；および、
各部位からの光学シグナルを検出する検出手段であって、当該検出手段は上記部位と連絡し、各光学シグナルは上記の追加の試薬と上記の部位中の核酸との反応の指標である、上記検出手段。
【請求項１２】
空洞光ファイバーウェーハ内の各個々の光ファイバーの直径が６−５０μｍである、請求項１１の装置。
【請求項１３】
検出手段がＣＣＤカメラである、請求項１２の装置。
【請求項１４】
核酸がＤＮＡである、請求項１１の装置。
【請求項１５】
ルシフェラーゼが結合したビーズをさらに含む、請求項１１の装置。
【請求項１６】
核酸が部位上に、またはビーズ上に固定化されている、請求項１１の装置。
【請求項１７】
空洞光ファイバーウェーハの上面が１０μｍから２００μｍ離れている２つ以上の核酸を含む、請求項１１の装置。
【請求項１８】
空洞光ファイバーウェーハの上面が１０μｍから１５０μｍ離れている２つ以上の核酸を含む、請求項１１の装置。
【請求項１９】
空洞光ファイバーウェーハの上面が、分離した領域に１０４以上の核酸配列を含む、請求項１１の装置。
【請求項２０】
空洞光ファイバーウェーハの上面が、分離した領域に１０５以上の核酸配列を含む、請求項１１の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、核酸配列決定方法および装置に関連する。
【０００２】
（発明の背景）
多くの疾患が特定のＤＮＡ配列と関連性を持っている。多くの場合、疾患状態に関連するＤＮＡ配列が非−患者において対応するＤＮＡ配列と異なることを示すために、そのようなＤＮＡ配列をＤＮＡ配列多型と呼ぶ。ＤＮＡ配列多型には、例えば、第二の配列と比較して、ある配列においてヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。特定のＤＮＡ配列多型の例は、ヒトゲノムのある特定位置にある５’−ＡＴＧＧ−３’配列と比較した場合の、５’−ＡＴＣＧ−３’である。前者配列の第一の「Ｇ」ヌクレオチドが後者配列でヌクレオチド「Ｃ」に置換されている。後者配列は、特定の疾患状態に関係するもので、一方前者は非−疾患状態の個体において見出される。従って、ヌクレオチド配列５’−ＡＴＣＧ−３’の存在は、その個体が特定疾患を持つことを示す。この特定タイプの配列多型は、その配列の相違が１個のヌクレオチドでの変化によるということから、一ヌクレオチド他型、またはＳＮＰとして公知である。
【０００３】
従って、ＤＮＡ一塩基変化のような小さな変化の迅速な検出を可能にする技術は、遺伝的解析を利用するためには重要な方法論である。ヒトゲノムの大きさは３０億塩基対のオーダーというように大きいため、多型を同定する技術は、潜在的に大きい核酸群中で多型を含む配列を特異的に同定するために十分に感度が高くなければならない。
【０００４】
典型的に、個体からＤＮＡを単離し、例えばＤＮＡを制限酵素で消化し、および／または単離ＤＮＡにおいて配列の一部を増幅するなど、単離ＤＮＡを処理することによりＤＮＡ配列多型解析を行う。次に、処理したＤＮＡに対して、特定の配列が存在するか否かを決定するためにさらに解析を行う。
【０００５】
通常使用されるＤＮＡ解析手順には、電気泳動が含まれる。電気泳動を行う際に通常適用するものには、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動が含まれる。ゲルにＤＮＡ配列を挿入またはロードし、電場をかける。ＤＮＡは同一の負電荷を帯びているため、配列の長さ、３次元立体配座および電場をかける際のゲルマトリックス比との相互作用を含む性質に基づいてゲル上を移動する。殆どの適用において、小さなＤＮＡ分子ほど、大きな断片よりも速くゲルを移動する。電気泳動を十分な時間行った後、最初のＤＮＡ配列群中のＤＮＡ分子は、それらの持つ相対的大きさに従って分離される。
【０００６】
次に、様々な検出方法を使用して特定のＤＮＡ分子が検出され得る。ある適用に対して、特定ＤＮＡ分子に結合した放射活性標識など、検出可能なタグの存在により特定のＤＮＡ配列を同定する。
【０００７】
電気泳動を基にした分離解析は、多数の核酸試料に対する特定の配列多型検出を目的とした、迅速で、経済的、および正確な解析が所望される場合に用いる方法としては、あまり望ましいとは言えない。例えば、電気泳動を基にした解析は、多量のインプットＤＮＡが必要とされ得る。さらに、多数の試料を処理する場合、電気泳動を基にした核酸解析は労力を要する。さらに、これらの技術においては、相当の額に上り得るコストで、電気泳動前に調製しなければならない同一のＤＮＡ分子試料が必要とされ得る。
【０００８】
最近、自動化電気泳動システムが利用可能となっている。しかしながら、高いスループットを有する比較的コスト効率のよいユニットを必要とする臨床での配列決定等に適用する場合、電気泳動は不適当であり得る。従って、配列決定のための電気泳動不要である方法の必要性が大きい。多くの適用に関して、ＤＮＡ配列解析と組み合わせて電気泳動が用いられている。
【０００９】
電気泳動を基にした配列決定の代替法のいくつかが記述されている。これらには、走査型トンネル電子顕微鏡、ハイブリダイゼーションによる配列決定および一分子検出法が含まれる。
【００１０】
電気泳動を基にした分離に対する別の代替法は、固体基板解析を基にした核酸解析である。これらの方法は、典型的に、固体支持体の異なる場所に付着させた多数の核酸プローブを用いるものである。これらの固体支持体には、例えば、ガラス面、プラスティックマイクロタイタープレート、プラスティックシート、薄ポリマー、または半導体が含まれ得る。そのプローブは、例えば、吸着または共有結合的に支持体に結合し得る。または、マイクロカプセルに入れて取り込まれるか、あるいは基板膜またはフィルム中に取り込まれ得る。
【００１１】
基板を基にした核酸解析には、固体支持体に結合しているプローブのアレイに対して、特定の配列多型を含むことが分かっているか、または疑いがある試料核酸の適用が含まれ得る。核酸群中のその核酸を、もし存在するならば、基板に結合した相補的配列とハイブリダイゼーションさせることが可能である。次いで、ハイブリダイゼーションしている核酸配列を検出ステップにて検出する。
【００１２】
固体支持体マトリックスを基にしたハイブリダイゼーションおよび配列決定方法は、試料ＤＮＡ濃度が高いことが要求され得、核酸試料の固定化オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション速度論が相対的に遅いことによる妨害が起こり得る。多くの場合、少量の鋳型ＤＮＡのみが利用可能で、標的核酸配列が高濃度であることが望ましくあり得る。従って、基板を基にした検出解析には、多くの場合、標的核酸のコピーまたは標的核酸における配列の一部を増幅するステップが含まれる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を基にした方法は、例えば、溶液中で数オーダーの程度で少量のプローブ標的を増加させ得る。しかしながら、増幅ＤＮＡが固体支持体マトリックスの表面上に固定化されないことから、固相アプローチにＰＣＲを組み入れることは困難であり得る。
【００１３】
固相を基にした配列多型検出が記載されてきた。その例は、固相原理に基づいた「ミニ−配列決定」プロトコールで、Ｈｕｌｔｍａｎら、１９８８．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１７：４９３７−４９４６；Ｓｙｖａｎｅｎら、１９９０．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：６８４−６９２に記載されている。この研究において、放射性標識ヌクレオチド取り込みが測定され、ヒトアポリポタンパク質Ｅ遺伝子の３つの対立遺伝子多型の解析に使用される。しかしながら、そのような放射活性法は、通常の臨床適用にはあまり適切ではなく、そのため、迅速なＤＮＡ配列解析のための単純で、高感度の非放射活性方法の開発がまた、大きな関心である。
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、部分的に、固体基板に結合した核酸の配列を決定するための高感度な方法および核酸配列解析に役立つ新規な基板の発見に基づく。
【００１５】
従って、１つの局面において、本発明は、核酸を解析するための基板を含む。この基板は、一つ以上の核酸配列を結合した光ファイバー面を含む。光ファイバー面は、例えば、光ファイバー開口部の半球状エッチングなどのように空洞化され得る。この基板は、さらに、一つ以上の面にプライマーが結合している束状化した複数の光ファイバー面を含み得る。
【００１６】
別の局面において、本発明は、核酸配列を解析するための装置を含む。この装置は、試薬送達チャンバー（例えば、灌流チャンバー）（ここで、このチャンバーは核酸基板を含む）、灌流チャンバーと連絡するコンジット、灌流チャンバーと連絡するイメージングシステム（例えば光ファイバーシステム）、およびイメージングシステムと連絡するデータ回収システムを含み得る。基板は平坦基板であり得る。他の実施形態において、この基板はその末端に結合された核酸配列を有する前述の光ファイバー面であり得る。
【００１７】
さらなる局面において、本発明は、核酸配列を決定する方法を含む。この方法は、開始アンカープライマー環状鋳型複合体の提供、および複合体のポリメラーゼとの結合、および環状鋳型の連結した直鎖状相補的コピーを生成するために必要なヌクレオチドが含まれる。延長アンカープライマー−環状鋳型複合体は溶液中で生成され得、次いで固体面に連結され得る。あるいは、一つ以上の核酸アンカープライマーは、固体支持体に連結され得、次いで複数の環状核酸鋳型にアニールされ得る。次に、連結された核酸アンカープライマーは、一本鎖環状鋳型とアニールされ、開始プライマー−環状鋳型複合体を生じる。
【００１８】
開始配列決定プライマー−環状核酸鋳型複合体を得るために、配列決定プライマーは環状核酸鋳型とアニールされる。配列決定プライマーのアニールは、延長アンカープライマーの固体基板との結合の前または後に行われ得る。配列決定生成物および配列決定反応副生成物（例えば、無機ピロホスフェート）を生成させるために、この配列プライマーは、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三ホスフェートを用いて伸長される。所定のヌクレオチドがプライマーに取り込まれている場合、その配列決定反応副生成物が生成され、次いで同定され、これによって核酸配列が決定する。所定のヌクレオチドが配列決定プライマーに複数回取り込まれている場合（例えば、連結核酸鋳型が複数の同一ヌクレオチドを有する場合）、取り込まれたヌクレオチド数を決定するために、配列決定反応副生成物の量または濃度が測定される。必要ならば、さらなる所定のヌクレオチド三ホスフェートが添加され得（例えば、連続的に）、そしてそれぞれの反応と関連する配列副生成物の存在または非存在が決定され得る。
【００１９】
なおさらなる局面において、本発明は、光ファイバー面基板（例えば、上記で議論された固体基板）に連結した複数のアンカープライマーに連結した1つ以上の核酸アンカープライマーの提供による核酸配列決定法を含む。
【００２０】
本明細書中で記載される装置および方法の様々な実施形態において、固体基板は、約１０μｍ〜約２００μｍ、５０μｍ〜約１５０μｍ、１００μｍ〜約１５０μｍ、または１５０μｍ離れている２つ以上の固定されているプライマーを含む。固体支持体マトリックスは、固体支持体に共有結合している複数のパッドを含み得る。パッドの表面積は、例えば１０μｍ2であり得、１つ以上のパッドが、互いに約５０μｍ〜約１５０μｍの範囲の距離で離れ得る。
【００２１】
好ましい実施形態において、少なくとも環状核酸鋳型の部分は一本鎖ＤＮＡである。環状核酸鋳型は、例えば、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ、またはそのｃＤＮＡコピーであり得る。環状核酸は、例えば１０〜１０，０００または１０〜１，０００、１０〜２００、１０〜１００、１０〜５０、あるいは２０〜４０ヌクレオチド長であり得る。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応により核酸群における１つ以上の環状核酸の複数のコピーが産生される。他の実施形態において、アニールした環状核酸鋳型の一本鎖コンカテマーを生成するために、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）により開始環状鋳型が伸長される。必要ならば、この鋳型は、ローリングサークル増幅により増幅され、そして開始コンカテマー鋳型を生成させるために一本鎖コンカテマーとリバースプライマーをアニールさせ、そしてコンカテマー鋳型の複数コピーを産生するためにポリメラーゼ酵素と開始コンカテマー鋳型を結合させることによって、さらに増幅される。なおさらなる実施形態において、その鋳型は、ＰＣＲおよびＲＣＡ−増幅の組み合わせによって伸長され得る。
【００２３】
好ましい実施形態において、解析する配列決定副生成物はピロホスフェートである。検出された副生成物としてピロホスフェートが使用される場合、開始配列決定プライマーの伸長においてポリメラーゼによる利用のための好ましいヌクレオチド三ホスフェートは、ｄＡＴＰアナログ（例えば、α−チオＡＴＰ）である。
【００２４】
好ましくは、ＡＴＰを形成するために十分な条件下で配列決定副生成物をＡＴＰスルフリラーゼと接触させることにより、ピロホスフェートが検出される。次に、例えば、ＡＴＰとの反応で検出可能な生成物を生じる酵素を用いて、ＡＴＰが検出され得る。ＡＴＰ検出に好ましい酵素はルシフェラーゼである。必要ならば、本明細書中の様々な反応物の添加の間に洗浄バッファーが使用され得る。好ましくは、例えば配列決定プライマーを伸長するために使用した未反応ｄＮＴＰを除去するために、アピラーゼが使用される。洗浄バッファーは、必要に応じてアピラーゼを含み得る。
【００２５】
本明細書中で使用される反応物および酵素（例えば、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼおよびアピラーゼ）は、固体面に結合され得る。
【００２６】
アンカープライマー配列は、例えば固体支持体に結合したアビジン基を経由して固体支持体とアンカープライマーを連結し得るビオチン基を含み得る。いくつかの実施形態において、アンカープライマーは、ビオチン−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）部分と結合体化する。ビオチン−ＢＳＡ部分は、固体支持体上でアビジン−ビオチン基と連結され得る。必要であれば、アンカープライマー上のビオチン−ＢＳＡ部分は、シラン存在下で固体支持体上のＢＳＡ基と連結され得る。
【００２７】
いくつかの実施形態において、固体支持体は、少なくとも１つの光ファイバーを含むる。
【００２８】
本発明はまた、細胞中に存在するｍＲＮＡ転写物濃度を追跡（ｐｒｏｆｉｌｅ）する方法を提供する。転写物の同一性は、その３’末端の配列（同一の３’配列を持つスプライシング変異体間で区別するために、さらなる断片が使用され得る）によって決定され得る。一回の作動で１０，０００部位を有する配列決定装置が、１：１０，０００以上の濃度で存在するｍＲＮＡ種を決定し得る。複数回の作動または複数のデバイスは、限度を容易に１：１００，０００または１：１，０００，０００にまで拡張し得る。検出限界が１：１０，０００〜１：１００，０００の範囲であるマイクロアレイハイブリダイゼーションなどのような最新の技術よりも、この性能は優れている。
【００２９】
さらなる実施形態において、ＲＮＡ合成副生成物を使用して増幅された核酸の配列が決定され得る。この実施形態において、環状核酸鋳型ライブラリーに存在するプロモーター配列からＲＮＡ転写物が産生される。適切なプロモーター部位およびその同種のＲＮＡポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ3由来のＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ7由来のＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＳＰ６由来のＲＮＡポリメラーゼ、ブロモウイルス、トバモウイルス、トンブスウイルス、レンチウイルス、Ｃ型肝炎様ウイルスおよびピコマウイルスのウイルス属由来のＲＮＡポリメラーゼを含む。ＲＮＡ転写物の配列を決定するために、所定のＮＴＰ、つまりＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰまたはＵＴＰをＲＮＡポリメラーゼ存在下で鋳型とインキュベーションする。本明細書で考察される酵素的検出を用いてＰＰｉの存在についてのアッセイによって、新生ＲＮＡ鎖への試験ＮＴＰの取り込みが決定され得る。
【００３０】
本発明の１つ以上の実施形態の開示は、下記の記述で明らかになる。本発明の実施または試験において、本明細書中で記述されている方法および物質と同様のまたは同等の任意の方法および物質が使用され得るが、好ましい方法および物質を記述する。この記載および特許請求の範囲から、本発明の他の特色、目的および長所が明らかとなる。本明細書および添付の特許請求の範囲において、その状況が明らかに他のように示さない限り、単数形には複数の指示物が含まれる。他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術および科学用語は、この発明が属する分野の当業者に通常理解されているものと同じ意味を有する。他に特別に述べない限り、本明細書中で用いたかまたは考慮された技術は、当業者に既知の標準的方法である。実施形態の例は、例示の目的のみである。この明細書中で引用される全ての特許および刊行物は、参考として援用される。
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、引き続く分析（例えば、配列決定）のための核酸配列を調製する方法、ならびに核酸の配列決定のための方法および装置を提供する。
【００３２】
本明細書中で記載される方法は、標的核酸に相補的な１つ以上のコピーを含む核酸に共有結合する複数のアンカープライマーを含む固体基板アレイを作製する、試料調製プロセスを含む。共有結合したアンカープライマーおよび標的核酸の１つ以上のコピーの形成は、好ましくは、環状核酸の相補的領域へのアンカープライマーのアニール、次いで環状核酸と相補的な配列の１つ以上のコピーを含む核酸形成をもたらすための、ポリメラーゼを用いたアニール済みアンカープライマーの伸長によって生じる。
【００３３】
固体基板へのアンカープライマーの結合は、アニール済みアンカープライマーの伸長前、その間、またはそれに続いて起こり得る。従って、１つの実施形態において、アンカープライマーを標的核酸とアニールさせポリメラーゼ存在下で伸長させた後、１つ以上のアンカープライマーが固体基板に連結される。あるいは、第二の実施形態において、アンカープライマーがまず標的核酸とアニールされ、アニール済みアンカープライマーの３’ＯＨ末端がポリメラーゼで伸長される。次に、伸長されたアンカープライマーが、固体面に連結される。アンカープライマー配列を変化させることにより、核酸群の中に存在する別個の標的核酸を特異的に増幅させることが可能である。
【００３４】
標的核酸における配列は、多くの方法で同定され得る。好ましくは、配列決定プライマーは、増幅された核酸とアニールされ、そして配列決定生成物を生成するために使用される。配列生成物のヌクレオチド配列が次に決定され、それにより核酸の決定が可能となる。
【００３５】
本明細書中で記述している本方法および装置によって、まず核酸をクローニングする必要なく核酸配列情報の決定が可能になる。さらに、本方法は非常に感度が高く、初めの核酸群中に数コピーしか存在しない鋳型核酸のヌクレオチド配列決定に使用し得る。
【００３６】
記述する本方法および装置は、一般的に、任意の特定核酸配列の同定を目的とした任意の適用に対して有用である。例えば、本方法によって、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、ある一つの染色体上で複数のＳＮＰまたは他の多型を持つハプロタイプ、および転写特性の同定が可能となる。他の用途には、その試料からの遺伝子発現特性を決定する目的で任意の発生段階または環境状態の単一の細胞、組織全体、生物からｃＤＮＡ配列を得るためだけでなく、一次配列を確認または引き出すために、または特定の突然変異クローンをランダム突然変異誘発スクリーニングから単離するために、人工ＤＮＡ構成物の配列を決定することが挙げられる。さらに、本方法により、任意の源から単離された任意の大きさのＰＣＲ産物および／またはクローン化ＤＮＡ断片の配列決定が可能になる。
【００３７】
酵素、放射線または化学処理（例えばクロマチンの部分的ＤＮａｓｅ処理）に対するその異なる感受性を利用した高次ＤＮＡ構造を調べる解析技術により生じたＤＮＡ断片の配列決定、または、ポリメラーゼにより認識される有効塩基としてメチル−シトシンをチミン（または他のヌクレオチド）に置換する化学物質による前処理をして、または前処理なしである組織から生じた配列を比較することによりＤＮＡのメチル化状態を決定するためにも本発明の本方法をまた使用し得る。さらに、一次配列レベルにおいて、発生段階または加齢の進行中に起こる細胞の生理的変化をアッセイするために、本発明の方法を使用し得る。
【００３８】
（核酸配列決定法）
（アンカープライマーの構造）
一般的にアンカープライマーには、１つのストーク領域と少なくとも２つの相接するアダプター領域が含まれる。ストーク領域はアンカープライマーの５’末端に存在し、アンカープライマーを固体基板に結合させるヌクレオチド領域が含まれる。
【００３９】
一般的にアンカープライマーには、核酸配列群中の一つ以上のメンバーに存在する相補的配列とハイブリダイズする領域が含まれる。ある実施形態において、アンカープライマーには、標的核酸配列の別々の末端にライゲーションされた相補的領域とハイブリダイズする二つの隣接する領域が含まれる。この実施形態を図１で説明する。より詳細な考察を下記で行う。
【００４０】
ある実施形態において、アンカープライマーのアダプター領域は、第二の核酸配列に存在する配列の非−相接領域と相補的である。それぞれのアダプター領域は、例えば、一つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いた消化により生じた断片のそれぞれの末端と相同的であり得る。その断片には、例えば、配列多型が含まれていることが分かっている、または疑わしい配列が含まれ得る。
【００４１】
別の実施例において、アンカープライマーには、標的核酸配列のギャップ領域、すなわち、一つ以上のヌクレオチドの欠失により非相接的である領域、と相同性のある二つのアダプター領域が含まれ得る。これらの配列を持つアダプター領域を使用する場合、ギャップ配列に相当する一列に並んだオリゴヌクレオチドを、鋳型核酸分子群とともに、アンカープライマーとアニールさせ得る。
【００４２】
アンカープライマーには、必要に応じて、例えば一つ以上の制限酵素認識部位、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（例えばＴ７プロモーター部位）などのさらなるエレメントが含まれ得る。
【００４３】
一つ以上のアダプター領域には、例えば制限酵素認識部位または、例えば既知の遺伝子に存在する配列など、同定されたＤＮＡ配列に存在する配列が含まれ得る。一つ以上のアダプター領域にはまた、フランク配列多型として知られている配列も含まれ得る。配列多型には、二つの、その他の点では同一の核酸配列の間で配列の相違をもたらすヌクレオチド置換、挿入、欠失または他の再編成が含まれる。配列多型の例は、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）である。
【００４４】
（固体支持体に対するアンカープライマーの結合）
一般的に、塩基対合可能な任意の核酸をアンカープライマーとして使用し得る。ある実施形態において、アンカープライマーはオリゴヌクレオチドである。本明細書中で利用する場合に、オリゴヌクレオチドなる用語には、モノマー−モノマー相互作用の通常のパターンで標的ポリヌクレオチドに特異的に結合可能な、天然の線状オリゴマーまたは改変モノマーまたは結合（例えばデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、そのアノマー型、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）など）が含まれる。これらの型の相互作用には、例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｌｉｃｋ型の塩基対合、塩基スタッキング、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆−Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の塩基対合などが含まれ得る。一般的に、大きさの範囲が例えば３〜２００、８〜１５０、１０〜１００、２０〜８０または２５〜５０のモノマー単位のオリゴヌクレオチドを形成するために、ホスフェートジエステル結合、またはそのアナログによりモノマーを結合させる。オリゴヌクレオチドが文字の配列で示されている時はいつでも、本明細書中で他に言及しない限り、ヌクレオチドは、左から右に５’→３’の方向を向いており、“Ａ”なる文字はデオキシアデノシンを示し、“Ｔ”なる文字はチミジン、“Ｃ”なる文字はデオキシシトシン、および“Ｇ”なる文字はデオキシグアノシンを示すと理解される。本発明のオリゴヌクレオチドには、非天然ヌクレオチドアナログが含まれ得る。しかしながら、例えば、酵素によるプロセシングが必要である場合などには、生物学的機能を維持するためには天然に存在するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが一般的に必要とされる。
【００４５】
支持体面がプライマーを安定的に結合可能で核酸配列の検出が可能である限り、固体支持体物質として任意の物質を使用し得る。固体支持体物質は、平坦であるかまたは空洞（例えば、光ファイバーの空洞化末端において）であり得る。ある実施形態において、固体支持体は、例えばガラスなど光学的に透明である。
【００４６】
固体支持体の上または中に存在させるためにアンカープライマーを固体支持体に結合させ得る。ある実施形態において、複数のアンカープライマーを固体支持体に結合させ、それらをアレイ中に一定の間隔で配置する。プライマー間の間隔は好適には、検出前に配列決定反応生成物が拡散する平方自乗平均距離、または検出システムの光学解像度のどちらかより大きい。これら両方については下記で詳述する。固体支持体上のプライマー間の距離は、例えば１０〜４００μｍ、５０〜１５０μｍ、１００−１５０μｍまたは１５０μｍであり得る。
【００４７】
光学的に透明な固体支持体における結合部位のアレイを、例えば、米国特許第５，５１４３，８５４号、第５，４４５，９３４号、第５，７４４，３０５号および第５，８００，９９２号；Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：６１０−６１４（１９９６）；Ｆｏｄｏｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６（１９９３）；Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７３（１９９１）；Ｇｕｓｈｉｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５０：２０３−２１１（１９９７）；Ｋｉｎｏｓｉｔａら、Ｃｅｌｌ  ９３：２１−２４（１９９８）；Ｋａｔｏ−Ｙａｍａｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１９３７５−１９３７７（１９９８）；およびＹａｓｕｄａら、Ｃｅｌｌ  ９３：１１１７−１１２４（１９９８）で記述されている接着技術などで説明されているように、電子集積回路を構築する時に通常使用されているリトグラフィック技術を用いて構築し得る。フォトリトグラフィーおよび電子ビームリトグラフィーにより、改変生体分子（例えば蛋白質または核酸）の結合を可能にする結合基のついた固体支持体または基板を増感する。例えば、Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８３：２７−２８（１９９９）；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ、ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＬＩＴＨＯＧＲＡＰＨＹ，ＭＩＣＲＯＭＡＣＨＩＮＩＮＧ，ＡＮＤ  ＭＩＣＲＯＦＡＢＲＩＣＡＴＩＯＮ（マイクロリトグラフィー、マイクロマシーニング、マイクロファブリケーションハンドブック），ＶＯＬＵＭＥ  Ｉ：ＭＩＣＲＯＬＩＴＨＯＧＲＡＰＨＹ，ＶＯＬＵＭＥ  ＰＭ３９，ＳＰＩＥ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）を参照すること。あるいは、Ｚａｓａｄｚｉｎｓｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６３：１７２６−１７３３（１９９４）で記述しているような薄膜技術を使用して、増感部位のアレイを生成し得る。これらの特許および出版物の全ての内容をそのまま参考として援用する。
【００４８】
増感部位の固体基板にアンカープライマーを結合させる。結合したプライマーを含む固体基板の領域はアンカーパッドである。従って、固体支持体における増感状態を規定することにより、アンカーパッドのアレイまたはマトリックスの形成が可能となる。アンカーパッドは、例えば固体支持体上に均等に一定間隔を保ってエッチングされた小さな直径のスポットであり得る。
【００４９】
共有結合または非共有結合相互作用を経由してアンカープライマーを固体支持体に結合させ得る。一般的に、当該分野で認識される任意の結合を使用し得る。当該分野で一般的なそのような結合の例には、任意の適切な金属（例えば、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋）−ヘキサヒスチジン複合体、例えばＮＥＵＴＲＡＶＩＤＩＮＴＭ改変アビジン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）などのビオチン結合蛋白質、ストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／グルタチオン、モノクローナル抗体／抗原、およびマルトース結合蛋白質／マルトース、およびプルロニックカップリング技術が含まれる。０，１、または複数の分子がそれぞれの増感部位に結合するように、適切なタグを含む試料を増感基板とインキュベーションする。
【００５０】
一つのビオチン−（ストレプト）アビジンを基にしたアンカー法では、固体面で乾燥させた光活性化し得るビオチンアナログの薄層を使用する（ＨｅｎｇｓａｋｕｌおよびＣａｓｓ，１９９６．Ｂｉｏｃｏｎｇｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．７：２４９−２５４）。次に、活性化ビオチンの規定エリアを生成させるために、ビオチンアナログを、マスクを通して白色光に曝露する。次にアビジン（またはストレプトアビジン）を添加し、活性化ビオチンとの結合を行う。アビジンは、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合を通してビオチン化オリゴヌクレオチドを“アンカーする”ために利用可能な遊離ビオチン結合部位を保持している。
【００５１】
あるいは、光−切断性保護基を保持するビオチン誘導体で固体支持体にアンカープライマーを結合させ得る。この部分は共有結合で、例えば、ガラス面などの固体支持体に結合しているウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合している。ＰｉｒｒｕｎｇおよびＨｕａｎｇ，１９９６．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．７：３１７−３２１を参照すること。次いで、規定照射エリア内で活性化ビオチンを生成させるためにマスクを使用する。次に、アビジンを照射エリアに局在させ、続いてビオチン化ＤＮＡをＢＳＡ−ビオチン−アビジン−ビオチン結合で結合させ得る。必要であれば、規定領域に結合しているＢＳＡが局在するようにパターン化され得る二酸化ケイ素シラン面上の自己組織化単層にシランの中間層を置く。例えば、Ｍｏｏｎｅｙら、１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１２２８７−１２２９１を参照すること。
【００５２】
プルロニックに基づいた結合において、最初に、プルロニック化合物としても公知のポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシドトリブロック共重合体の末端にアンカープライマーを結合させる。アンカープライマーを固体基板に結合させるためにプルロニック部分を使用し得る。
【００５３】
疎水性面とポリプロピレンオキシドとの間の反応により、疎水性面に対してプルロニックが結合する。残りのポリエチレンオキシド基は表面に伸長し、それにより親水性環境を生成する。ヘキサヒスチジンタグ付きアンカープライマーの結合を可能にするために、ポリエチレンオキシド鎖の末端にニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）を共役させ得る。その他の実施形態において、ピリジルジスルフィド（ＰＤＳ）をポリエチレン鎖の末端に共役させ、ジスルフィド結合を介したチオール化アンカープライマーの結合を可能にさせ得る。１つの実施形態において、プルロニックＦ１０８（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ．）を結合に使用する。
【００５４】
固体支持体上のそれぞれの増感部位は、潜在的に複数のアンカープライマーと結合可能である。従って、それぞれのアンカーパッドには、一つ以上のアンカープライマーが含まれ得る。一個の生産的反応中心のみを持つパッド数（例えば、伸長反応後に、アンカープライマーから伸長した一つの配列のみを持つパッド数）を最大化することが好適である。このことは、（ｉ）表面全体を洗浄したビオチン化アンカープライマーの希釈率を変化させること；（ｉｉ）ビオチン化プライマーをアビジン面と接触させるインキュベーション時間を変化させること；または、（ｉｉｉ）概して、配列決定鋳型を生成させるためにそれぞれのパッドのただ一つのプライマーのみを伸長させるように、開裂環または閉鎖環状鋳型濃度を変化させること、が含まれるがこれらに限らない技術により行われ得る。
【００５５】
いくつかの実施形態において、それぞれ個々のパッドには、ただ一つの結合アンカープライマーが含まれる。概して、唯一つのアンカープライマーがそれぞれのパッドに置かれるように、固体支持体上で選択したアンカープライマーに対する限界希釈法を行うことにより、唯一つのアンカープライマーを持つパッドを生成し得る。例えば、ポワソン分布モデルを利用してパッドに適用すべきアンカープライマーの濃度を計算し得る。
【００５６】
一つのアンカープライマーを含む反応パッド数を最大化するために、アンカープライマー濃度の範囲または環状鋳型濃度の範囲を変化させるように連続希釈実験を行う。プライマーの高度希釈濃度において、プライマーおよび同じパッドに結合する環状鋳型は互いに独立し、ポワソン分布により任意の一つのパッドで伸長したアンカープライマー数が特徴付けられる。実際に伸長させるプライマー数は多様であるが、最高で３７％のパッドが一個の伸長アンカープライマー（一個のアンカーオリゴヌクレオチドを持つパッド数）を持つ。この数は次のようにして獲得し得る。
【００５７】
Ｎｐをパッド上の平均アンカープライマー数とし、ｆをアンカープライマーが環状鋳型で伸長する確率とする。次に、パッドあたりの平均伸長アンカープライマー数はＮｐｆであり、量ａとして規定する。実際に伸長するプライマー数は多様である。低濃度限界において、プライマーおよび同じパッドに結合する環状鋳型は互いに独立で、ポワソン分布Ｐ（ｎ）は任意のパッドでｎ回伸長するアンカープライマー数を特徴付ける。この分布を、Ｐ（ｎ）＝（ａｎ／ｎ！）ｅｘｐ（−ａ）（ここで、Ｐ（１）＝ａ  ｅｘｐ（−ａ））により数学的に規定し得る。ａ＝１に対して、確率Ｐ（１）が最大値  ｅｘｐ（−１）であるとすると、３７％のパッドが一個の伸長アンカープライマーを持つことになる。
【００５８】
１に最も近似するＮｐｆ値を見出すためにアンカープライマー濃度および環状鋳型濃度の範囲を連続的に調べ得る。この分布を最適にする好適な方法は、複数アンカープライマーをそれぞれの反応パッド上に置くことが可能ではあるが、配列決定鋳型を生成するために、概してそれぞれのパッド上の唯一つのプライマーのみが伸長されるように環状鋳型の限界希釈法を用いる。
【００５９】
あるいは、低濃度アンカープライマーでは、最大一個のアンカープライマーがそれぞれの反応パッドと結合するようである。それぞれのプライマーが伸長され得るように高濃度環状鋳型を使用し得る。
【００６０】
反応パッドを平坦または光ファイバーアレイ（ＦＯＲＡ）上に並べる場合、個々のパッドを一辺１０μｍにし、隣接するパッドとの間を１００μｍ空ける。従って、１ｃｍの面に、合計およそ１０，０００個のマイクロリアクターが置かれ、ポワソン分布によると、およそ３，７００個のマイクロリアクターが一個のアンカープライマーを含むことになる。特定の実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドを固体支持体に結合させた後、表面上に残っている未使用アビジン結合部位に結合させるために例えばビオチン化などの改変を施した酵素を置く。
【００６１】
他の実施形態において、複数のアンカープライマーを任意の一つの個々のパッドにアレイ状に結合させる。限界希釈の複数環状核酸鋳型（詳細については下記）を、概してそれぞれのパッド上の唯一つのプライマーを核酸鋳型とハイブリダイズさせるように固定化したアンカープライマーとハイブリダイズさせ得る。使用すべきライブラリー濃度を、例えば希釈およびポワソン分布モデルを利用して計算し得る。
【００６２】
（一本鎖環状鋳型のライブラリー）
複数の核酸鋳型、例えば核酸ライブラリーは一般に、開裂環状または閉鎖環状核酸分子を含む。「閉鎖環」は、共有結合的に閉鎖した環状核酸分子、例えば環状ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。「開裂環」は、５’ホスフェート基および３’ヒドロキシル基を有する、直鎖状一本鎖核酸分子である。いくつかの実施形態では、開裂環をインサイチュで直鎖状二本鎖核酸分子から形成する。所定の開裂環状核酸分子の末端を、ＤＮＡリガーゼによって連結し得る。開裂環状分子の５’および３’末端の配列は、２番目の核酸分子、例えばアンカープライマーのアダプター領域における隣接するヌクレオチドの２つの領域、または２番目のＤＮＡ分子においてほぼ隣接した２つの領域と相補的である。従って、開裂環状分子の末端を、ＤＮＡリガーゼによって連結し得るか、またはギャップを埋める反応（ｇａｐ−ｆｉｌｌｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）においてＤＮＡポリメラーゼによって伸長し得る。開裂環は、Ｌｉｚａｒｄｉ、米国特許第５，８５４，０３３号において詳しく記載されている。例えば、開裂環をアンカープライマーにアニールした後、開裂環を、ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡのために）またはＲＮＡリガーゼの存在下で閉鎖環へ変換し得る。
【００６３】
もし望ましいなら、核酸鋳型はパッドロックプローブ（ｐａｄｌｏｃｋ  ｐｒｏｂｅ）として提供され得る。パッドロックプローブは、各末端に位置する標的相補的な配列を含み、そしてリンカー配列によって分けられる直鎖状オリゴヌクレオチドである。リンカーを、例えば物理的に剪断された、または制限エンドヌクレアーゼによって消化された、核酸配列ライブラリーのメンバーの末端と連結し得る。標的配列とのハイブリダイゼーション時、プローブの２つの末端が並列になり、次いで、それらを酵素的連結によって結合し得る。リンカーを、物理的に剪断された、または制限エンドヌクレアーゼによって消化された、核酸配列のライブラリーメンバーの末端と連結し得る。
【００６４】
これら直鎖状オリゴヌクレオチドの５’および３’末端領域を、特定の標的配列鎖においてお互いに隣接して塩基対を形成するように設計し、従って直鎖状オリゴヌクレオチドの末端は、標的配列とのハイブリダイゼーションによって並列になる。この並列は、２つのプローブセグメントが（もし適切にハイブリダイズしたなら）酵素的連結（例えばＴ４ＤＮＡリガーゼによって）によって共有結合し、従ってプローブを、特定の標的配列につながれた環状閉鎖分子に変換することを可能にする（例えばＮｉｌｓｓｏｎら、１９９４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：２０８５−２０８８を参照のこと）。得られたプローブは、遺伝子配列改変体に対するその特異性および選択性のために（例えばＬｉｚａｒｄｉら、１９９８．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２；Ｎｉｌｓｓｏｎら、１９９７．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１６：２５２−２５５を参照のこと）、および得られた反応産物が特定の標的配列に局在化したままであるという事実のために、多くの遺伝子配列の同時分析に適切である。さらに、多くの異なるプローブの分子内連結は、複合ＰＣＲ（プライマーの非コグネイト対が不適切な増幅産物を生じさせ得る）に基づく方法論より、非特異的交差反応性の影響を受けにくいと期待される（例えばＬａｎｄｅｇｒｅｎおよびＮｉｌｓｓｏｎ、１９９７．Ａｎｎ．Ｍｅｄ．２９：５８５−５９０を参照のこと）。
【００６５】
開始ライブラリーは、それが、もしライブラリー中に存在するなら、アンカープライマー配列に対するアニールに利用可能な、またはアニールに利用可能にし得る領域を含む限り、一本鎖または二本鎖のいずれでもあり得る。ローリングサークル増幅のための鋳型として使用する場合、アンカープライマーの伸長の鋳型として作用するために、二本鎖鋳型の領域を、少なくとも一時的に一本鎖にする必要がある。
【００６６】
ライブラリー鋳型は、アンカープライマーに相補的な１つ以上の領域を含むがこれに限らない複数の要素を含み得る。例えば、鋳型ライブラリーは、配列決定プライマーに相補的な領域、制御ヌクレオチド領域、および続いて特徴付けされる配列決定鋳型を含む挿入配列を含み得る。下記でより詳しく説明するように、制御ヌクレオチド領域を、副産物の量と組み込まれたヌクレオチド数との間の関係を較正するために使用する。本明細書中で使用する場合、「相補鎖」という用語は、特定のヌクレオチド配列とハイブリダイズして、適合した二本鎖を形成し得るヌクレオチド配列を指す。
【００６７】
１つの実施形態では、ライブラリー鋳型は：（ｉ）アンカープライマーに相補的な２つの別々の領域、（ｉｉ）配列決定プライマーに相同的な１つの領域、（ｉｉｉ）１つの任意のコントロールヌクレオチド領域、（ｉｖ）配列決定される、例えば３０−５００、５０−２００、または６０−１００ヌクレオチドの挿入配列を含む。もちろん、鋳型はこれらの特徴の２、３、または４つ全てを含み得る。
【００６８】
鋳型核酸を、核酸の任意の供給源、例えば任意の細胞、組織、または生物から構築し得、そして任意の当分野で認められた（ａｒｔ−ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ）技術によって産生し得る。適切な方法は、例えばゲノムＤＮＡの超音波処理、および１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）によって消化して、最初の核酸分子の集団から望ましい範囲の長さの断片を産生することを含む。好ましくは、１つ以上の制限酵素は、別々の４塩基認識配列を有する。そのような酵素の例としては、例えばＳａｕ３Ａ１、ＭｓｐＩ、およびＴａｑ１が挙げられる。好ましくは、その酵素を、対応する制限酵素の認識配列を含む領域を有するアンカープライマーと組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、アンカープライマーの１つまたは両方のアダプター領域が、公知の制限酵素認識配列に隣接するさらなる配列を有し、それによって目的の特定の制限断片のアンカープライマーの捕獲またはこのプライマーへのアニールを可能にする。
【００６９】
他の実施形態では、制限酵素をＩＩＳ型制限酵素と共に使用する。
【００７０】
あるいは、鋳型ライブラリーを、ＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を産生することによって作製し得る。もし望ましいなら、ｃＤＮＡライブラリーを、さらに制限エンドヌクレアーゼで処理して、特定のＲＮＡ、内部断片、または単離ＲＮＡの３’末端を含む断片に特徴的な３’末端を得ることができる。アンカープライマーのアダプター領域は、鋳型ライブラリーに存在すると考えられる目的の配列、例えば、エンドヌクレアーゼ消化によって産生された断片中の公知のまたは予測される配列多型に相補的であり得る。
【００７１】
１つの実施形態では、インデックスオリゴヌクレオチドを鋳型ライブラリーメンバーに結合させて、続いて鋳型核酸と、鋳型核酸が得られた核酸集団の相関を示すことを可能にし得る。例えば、開始ＤＮＡ集団の１つ以上の試料を、以前に開示した方法（例えば制限酵素消化、超音波処理）のいずれかを用いて別々に断片化し得る。各試料に特異的なインデックスオリゴヌクレオチド配列を、断片化集団のメンバーの末端に結合、例えば連結させる。インデックスオリゴヌクレオチドは、環化、増幅、および任意で配列決定の領域として作用し得、このインデックスオリゴヌクレオチドは、それが得られた開始試料を同定するために核酸を指標化、またはコードするためにそれを使用することを可能にする。
【００７２】
複数の区別できるインデックスプライマーで作製された別々の鋳型ライブラリーを、続く反応のために共に混合し得る。ライブラリーメンバーの配列の決定は、インデックスオリゴヌクレオチドに対応する配列の同定を可能にする。この情報に基づいて、任意の所定の断片の起源を推測し得る。
【００７３】
（プライマー−鋳型核酸複合体のアニールおよび増幅）
核酸ライブラリーを、認められた技術を用いてアンカープライマー配列にアニールさせる（例えばＨａｔｃｈら、１９９９．Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．１５：３５−４０；Ｋｏｏｌ、米国特許第５，７１４，３２０号およびＬｉｚａｒｄｉ、米国特許第５，８５４，０３３号を参照のこと）。一般的に、アンカープライマー配列のアダプター領域と鋳型ライブラリーに存在する配列との間で、特異的な、すなわち完全なまたはほぼ完全な相補性を形成する限り、アンカープライマーを鋳型核酸配列へアニールさせる任意の手順が適切である。
【００７４】
多くのインビトロ核酸増幅技術を、アンカープライマー配列を伸長するために利用し得る。増幅ＤＮＡの大きさは、好ましくはアンカーパッド（ａｎｃｈｏｒ  ｐａｄ）の大きさより小さく、かつアンカーパッド間の距離よりも小さい。
【００７５】
典型的には、ポリメラーゼ、例えばＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、および１、２、３または４つの型のヌクレオチド３ホスフェート、および任意で補助結合タンパク質の存在下で増幅を行う。一般的に、それが３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠いている限り、プライム化した３’−ＯＨ基を伸長できる任意のポリメラーゼを使用し得る。適切なポリメラーゼとしては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｃｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、バクテリオファージＴ４およびＴ７、ならびにＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片由来のＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。適切なＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば鳥類骨髄芽球症ウイルス由来の逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素、およびヒト免疫不全ウイルス−Ｉの逆転写酵素が挙げられる。
【００７６】
多くのインビトロ核酸増幅技術が記載された。これらの増幅方法論は、以下の方法に区別され得る：（ｉ）温度の循環を必要とするもの−ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えばＳａｉｋｉら、１９９５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０−１３５４を参照のこと）、リガーゼ連鎖反応（例えばＢａｒａｎｙ、１９９１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９−１９３；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら、１９９０．Ｇｅｎｅ  ８９：１１７−１２２を参照のこと）、および転写に基づく増幅（例えばＫｗｏｈら、１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７を参照のこと）、ならびに（ｉｉ）等温増幅システム−自立配列複製（例えばＧｕａｔｅｌｌｉら、１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８を参照のこと）；ＱＢレプリカ−ゼシステム（例えばＬｉｚａｒｄｉら、１９８８．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７−１２０２を参照のこと）；鎖置換増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２年４月１１日；２０（７）：１６９１−６）；およびＰＮＡＳ  １９９２年１月１日；８９（１）：３９２−６；およびＮＡＳＢＡ  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９１年１２月；３５（３）：２７３−８６で記載された方法。
【００７７】
等温増幅はまた、ローリングサークルに基づく増幅（ＲＣＡ）を含む。ＲＣＡは、例えばＫｏｏｌ、米国特許第５，７１４，３２０号およびＬｉｚａｒｄｉ、米国特許第５，８５４，０３３号；Ｈａｔｃｈら、１９９９．Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．１５：３５−４０で議論されている。ＲＣＡの結果は、アンカープライマーの３’末端から伸長した（そして従って固体支持体マトリックスに結合した）一本鎖ＤＮＡであり、そしてプライマー配列にアニールした環状鋳型の複数のコピーを含むコンカテマーを含む。典型的には、それぞれ例えば約３０−５００、５０−２００、または６０−１００ヌクレオチドの大きさの範囲を有する、１，０００から１０，０００以上の環状鋳型のコピーを、ＲＣＡで得ることができる。
【００７８】
環状核酸分子のアンカープライマーへのアニール後の、ＲＣＡ増幅の産物を、図１Ａに図式的に示す。環状鋳型核酸１０２を、表面１０６にその５’末端で結合し、そして伸長に利用可能なフリーの３’ＯＨを有するアンカープライマー１０４にアニールする。環状鋳型核酸１０２は、アンカープライマー１０４における配列の領域に相補的な、２つのアダプター領域１０８および１１０を含む。挿入物１１２および下記で記載される配列決定反応で使用する配列決定プライマーに相同的な領域１１４も、環状鋳型核酸１０２に含まれる。
【００７９】
アニール時に、アンカープライマー１０４のフリーの３’−ＯＨを、鋳型核酸１０２中の配列を用いて伸長し得る。アンカープライマー１０２を、各反復でアンカープライマーから伸長する配列に、環状鋳型核酸に相補的な配列を付加しながら、鋳型にそって複数回伸長し得る。４回の反復、または４周期のローリングサークル複製を、伸長したアンカープライマー増幅産物１１４として図１Ａに示す。アンカープライマーの伸長は、基質１０６に共有結合した、または別の方法で物理的に結合した増幅産物を産生する。
【００８０】
環状鋳型およびアンカープライマーのさらなる実施形態を、図１Ｂ−１Ｆにより詳しく示す。図１Ｂは、連結時に、アンカープライマーの伸長の鋳型として働き得る、アニールした開裂環直鎖状基質を示す。配列５’−ＴＣｇＴｇＴｇＡｇｇＴＣＴＣＡｇＣＡＴＣＴＴＡＴｇＴＡＴＡＴＴＴＡＣＴＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡｇＴＴｇＣＣＴＡＡｇＣＴｇＣＡｇＣＣＡ−３’（配列番号１）を有する鋳型分子を、５’末端にビオチンリンカー、および配列５’−ｇＡＣＣＴＣＡＣＡＣｇＡＴｇｇＣＴｇＣＡｇＣＴＴ−３’（配列番号２）を有するアンカープライマーにアニールさせる。鋳型のアニールは、鋳型分子の５’および３’末端の並置を引き起こす。アンカープライマーの３’ＯＨを、環状鋳型を用いて伸長し得る。
【００８１】
単一ヌクレオチド多型同定のための環状鋳型およびアンカープライマーの使用を、図１Ｃに示す。配列５’−ｇＡＣＣＴＣＡＣＡＣｇＡＴｇｇＣＴｇＣＡｇＣＴＴ−３’（配列番号３）を有する包括的アンカープライマーを示す。アンカープライマーは、配列５’−ＴＴＴＡＴＡＴｇＴＡＴＴＣＴＡＣｇＡＣＴＣＴｇｇＡｇＴｇＴｇＣＴＡＣＣｇＡＣｇＴＣｇＡＡｔＣＣｇＴＴｇＡＣＴＣＴＴＡＴＣＴＴＣＡ−３’（配列番号４）を有するＳＮＰプローブとアニールする。今度はＳＮＰプローブが、配列５’−ＣＴＡｇＣＴＣｇＴＡＣＡＴＡＴＡＡＡＴｇＡＡｇＡＴＡＡｇＡＴＣＣＴｇ−３’（配列番号５）を有する遺伝子のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズする。多型を含む核酸配列のＳＮＰプローブ複合体へのハイブリダイゼーションは、続くＳＮＰプローブの連結および環化を可能にする。図１Ｃに示すように、多型部位の領域で隣接するように５’および３’末端がゲノム領域にアニールするように、ＳＮＰプローブを設計する。環化ＳＮＰプローブを続いて、本明細書中で記載された方法を用いて伸長および配列決定し得る。多型を欠く核酸は、ＳＮＰプローブの５’および３’末端の並列を引き起こすようにハイブリダイズしない。この場合、ＳＮＰプローブは、続く伸長に必要な環状基質を形成するように連結できない。
【００８２】
図１Ｄは、環状鋳型分子を伴ったギャップオリゴヌクレオチドの使用を説明する。配列５’−ｇＡＣＣＴＣＡＣＡＣｇＡｇＴＡｇＣＡＴｇｇＣＴｇＣＡｇＣＴＴ−３’（配列番号６）を有するアンカープライマーを、ビオチンリンカーによって表面に結合させる。配列５’−ＴＣｇＴｇＴｇＡｇｇＴＣＴＣＡｇＣＡＴＣＴＴＡＴｇＴＡＴＡＴＴＴＡＣＴＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡｇＴＴｇＣＣＴＡＡｇＣＴｇＣＡｇＣＣＡ−３’（配列番号７）を有する鋳型分子を、アンカープライマーにアニールさせて、二本鎖領域に隣接した、アンカープライマーの部分的な一本鎖、またはギャップ領域を生じさせる。配列５’−ＴｇＣＴＡＣ−３’を有するギャップ分子を、次いでアンカープライマーにアニールさせる。ギャップオリゴヌクレオチドの両端の、鋳型分子への連結は、ローリングサークル増幅のための鋳型として作用し得る環状核酸分子の形成を引き起こす。
【００８３】
ポリメラーゼによるＤＮＡ複製の間に産生される環状オリゴヌクレオチドは、鋳型と複製開始部位との間の関係に依存する。二本鎖ＤＮＡ鋳型では、決定的な特徴は、鋳型が天然で直鎖状かまたは環状か、および複製開始部位（すなわち複製「フォーク」）が両方のＤＮＡ鎖の合成に参加しているかまたは一方だけかを含む。従来の二本鎖ＤＮＡ複製では、複製フォークは、新しいＤＮＡ鎖が合成される部位として扱われる。しかし、直鎖状分子では（一方向または二方向いずれで複製されるにせよ）、複製フォークの動きは、特定の型の構造モチーフを産生する。鋳型が環状であるなら、複製分子の１つの潜在的な空間的配向は、θ構造の形式をとる。
【００８４】
あるいは、二本鎖分子の複製が起点から開始する場合にＲＣＡが起こり得る。続いて、ニックが鎖の一方を開裂させ、そしてニックによって産生されたフリーの３’末端ヒドロキシル部分が、ＤＮＡポリメラーゼの作用によって伸長される。新しく合成された鎖は、最後にもとの親ＤＮＡ鎖を置換する。複製点が環状鋳型鎖を「回転している」ように見え得ること、そして理論的には永遠にそれが持続し得ることから、この前述の複製の型は、ローリングサークル複製（ＲＣＲ）として公知である。進行するにつれて、複製フォークは前のパートナーに対して外側ＤＮＡ鎖を伸長する。さらに、新しく合成されたＤＮＡ鎖はもとの鋳型に共有結合しているので、置換された鎖はもとのゲノム配列（例えば遺伝子または他の目的の配列）をその５’末端に有する。ローリングサークル複製では、もとのゲノム配列の後に、もとの鋳型配列に相補的な任意の数の「複製ユニット」が続く。ここで各複製ユニットは、上記のもとの鋳型配列の回転を連続することによって合成される。従って、続く各回転は、前の複製サイクルで合成されたＤＮＡを置換する。
【００８５】
インビボで、ローリングサイクル複製は、いくつかの生物学的システムにおいて利用される。例えば、いくつかのバクテリオファージのゲノムは一本鎖環状ＤＮＡである。複製の間、環状ＤＮＡはまず二本鎖形態に変換され、それが次いで前述のローリングサークル複製メカニズムによって複製される。置換された末端は、切断およびファージ粒子に挿入され得る一連のゲノムユニットを産生する。さらに、ローリングサークルの置換された一本鎖は、相補的ＤＮＡ鎖の合成によって二本鎖ＤＮＡに変換され得る。この合成を、特定のファージＤＮＡの成熟に必要なコンカテマー二本鎖分子を産生するために使用し得る。例えば、これは、λバクテリオファージが成熟する主な経路を提供する。ローリングサークル複製はまた、インビボで、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞において増幅ｒＤＮＡを産生するために使用され、そしてこの事実は、なぜ増幅ｒＤＮＡが多数の同一反復ユニットからなるのかを説明するのに役立ち得る。この場合、単一のゲノム反復ユニットが、ローリングサークルに変換される。置換された末端は、次いで二本鎖ＤＮＡに変換され、それは続いて環から切断され、その結果増幅ｒＤＮＡの環を産生するように２つの末端が結合され得る。
【００８６】
ＲＣＡ反応の使用によって、環状化分子に相補的な多くのタンデムコピーを示す鎖を産生し得る。例えば、最近、ヒトゲノムＤＮＡサンプルにおいて単一コピー遺伝子を検出するために、ＲＣＡが利用され、インビトロで環状化パッドロックプローブ（ｐａｄｌｏｃｋ  ｐｒｏｂｅ）の等温カスケード増幅反応を得た（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９９８．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２を参照のこと）。それに加えて、ＲＣＡはまた、固相に基づくアッセイにおいて単一のＤＮＡ分子を検出するために利用されたが、この技術をインサイチュハイブリダイゼーションに適用した時問題が生じた（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９９８．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２を参照のこと）。
【００８７】
所望の場合、上昇した温度で、例えば３７℃、４２℃、４５℃、５０℃、６０℃、または７０℃より高い温度で、ＲＣＡを行い得る。さらに、ＲＣＡを、まずはより低い温度で、例えば室温で行い、そして次いで上昇した温度に移行させ得る。上昇した温度のＲＣＡは、好ましくは熱安定性の核酸ポリメラーゼならびに上昇した温度で安定におよび特異的にアニールし得るプライマーを用いて行う。
【００８８】
ＲＣＡをまた、天然に存在しないヌクレオチド、例えばペプチド核酸を用いて行い得る。さらに、ＲＣＡを、一本鎖結合タンパク質のような補助タンパク質の存在下で行い得る。
【００８９】
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）と呼ばれる、固体支持体に固定化された短いＤＮＡ分子を増幅する方法の開発が、最近文献に記載された（例えば、Ｈａｔｃｈら、１９９９．固体表面上に固定化されたＤＮＡのローリングサークル増幅および複合変異検出に対するその適用。Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．１５：３５−４０；Ｚｈａｎｇら、１９９８．標的特異的、ライゲーション依存性環状プローブの増幅。Ｇｅｎｅ  ２１１：２７７−８５；Ｂａｎｅｒら、１９９８．ローリングサークル複製によるパッドロックプローブのシグナル増幅。Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：５０７３−５０７８；Ｌｉｕら、１９９５．ローリングサークルＤＮＡ合成：ＤＮＡポリメラーゼの効率的な鋳型としての小さな環状オリゴヌクレオチド。Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：１５８７−１５９４；ＦｉｒｅおよびＸｕ、１９９５．短いＤＮＡ環のローリング複製。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４６４１−４６４５；Ｎｉｌｓｓｏｎら、１９９４．パッドロックプローブ：局在化ＤＮＡ検出のためのオリゴヌクレオチドの環状化。Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：２０８５−２０８８を参照のこと）。ＲＣＡは、ハイブリダイゼーションおよびＤＮＡリガーゼ反応によって特定のＤＮＡ配列を標的とする。次いで、環状産物を続いてローリングサークル複製反応での鋳型として使用する。
【００９０】
ＤＮＡポリメラーゼによって進められるローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、等温条件下で、直線的か幾何学的のいずれかの速度論で、環状化オリゴヌクレオチドプローブを複製し得る。２つのプライマーの存在下で（１つはＤＮＡの＋鎖に、そして他方は−鎖にハイブリダイズする）、複雑なパターンのＤＮＡ鎖置換が後に続き、それは短い時間（すなわち９０分未満）に各環の１×１０9またはそれ以上のコピーを産生する能力を有し、ヒトゲノム内の単一点変異を検出することを可能にする。単一のプライマーを使用して、ＲＣＡは、数分で共有結合的に閉鎖した環の、数百のランダムに連結したコピーを産生する。固体支持体マトリックスに結合している場合、ＤＮＡ産物は合成部位に結合したままであり、そこで標識され、濃縮され、そして点光源（ｐｏｉｎｔ  ｌｉｇｈｔ  ｓｏｕｒｃｅ）として画像化され得る。例えば、ＲＣＡシグナルを産生し得る直線状オリゴヌクレオチドプローブを、ガラス表面に共有結合させた。これらのプローブによって産生されるシグナルの色は、特定の標的に向けられた連結反応の結果に依存して、標的の対立遺伝子状態を示す。ＲＣＡは数百万の個々のプローブ分子を計測し、そして分類することが可能であるので、それはまれな体細胞変異の分析に特に敏感に反応し得る。ＲＣＡはまた、細胞学的な調製物中で単一コピー遺伝子に結合したパッドロックプローブの検出に有望である。
【００９１】
さらに、固相ＲＣＡ方法論がまた、溶液中の成分を検出する効果的な方法を提供するために開発された。まず、認識工程を使用して、表面に結合した環状鋳型と二本鎖を形成するＤＮＡプライマーからなる複合体を産生する。次いでポリメラーゼ酵素を使用して、結合した複合体を増幅する。ＲＣＡは、下記でより詳しく記載する方法を含む検出方法を用いて、強いシグナルを提供するために増幅される小さなＤＮＡプローブを使用する。
【００９２】
等温増幅システムの他の例は、例えば（ｉ）自立配列複製（例えばＧｕａｔｅｌｌｉら、１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８を参照のこと）、（ｉｉ）ＱＢレプリカ−ゼシステム（例えばＬｉｚａｒｄｉら、１９８８．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７−１２０２を参照のこと）、および（ｉｉｉ）核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡTM；Ｋｉｅｖｉｔｓら、１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５：２７３−２８６を参照のこと）を含む。
【００９３】
（配列産物のヌクレオチド配列の決定）
上記で記載したような核酸鋳型の増幅は、アンカープライマーに共有結合的に連結された鋳型核酸配列の複数のコピーを生じる。１つの実施形態では、配列産物の領域を、鋳型核酸の領域に配列決定プライマーをアニールさせ次いで配列決定プライマーをＤＮＡポリメラーゼおよび公知のヌクレオチド３ホスフェート、すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはこれらヌクレオチドの１つのアナログと接触させることによって決定する。下記で記載するように、配列反応副産物を検出することによって配列を決定し得る。
【００９４】
配列プライマーは、それが増幅核酸鋳型の領域に特異的にアニールできる限り、あらゆる長さまたは塩基成分であり得る。それが増幅鋳型核酸の領域を特異的にプライム化できる限り、配列決定プライマーに特定の構造は必要でない。好ましくは、配列決定プライマーは、特徴付けされる配列とアンカープライマーにハイブリダイズ可能な配列との間にある鋳型の領域に相補的である。配列決定プライマーをＤＮＡポリメラーゼによって伸長して、配列産物を形成する。１つ以上の型のヌクレオチド３ホスフェート、および所望の場合、補助結合タンパク質の存在下で伸長を行う。
【００９５】
ｄＮＴＰの組み込みを、好ましくは配列決定副産物の存在をアッセイすることによって決定する。好ましい実施形態では、配列決定産物のヌクレオチド配列を、ＮＴＰが伸長配列プライマーに組み込まれる時にヌクレオチド３ホスフェート（ｄＮＴＰ）から放出される無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）を測定することによって決定する。ＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇTM技術（ＰｙｒｏＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）と呼ばれる、この配列決定方法は、溶液中（液相）または固相技術として行い得る。ＰＰｉに基づく配列決定方法は、一般的に、例えばＷＯ９８１３５２３Ａ１、Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９、およびＲｏｎａｇｈｉら、１９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：３６３−３６５（１９９８）に記載されている。ＰＰｉ配列決定のこれらの開示は、本明細書中でその全体を参考文献として組み込まれる。
【００９６】
これらの条件下で放出されるピロホスフェートを、（例えばルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における光の産生によって）酵素的に検出し得る。そのような方法は、電気泳動の必要性および潜在的に危険な放射性標識の使用を避けながら、ヌクレオチドが所定の標的位置で同定されること、およびＤＮＡが簡単にそして迅速に配列決定されることを可能にする。
【００９７】
ＰＰｉを、多くの異なる方法論で検出し得、そして様々な酵素的方法が以前に記載された（例えばＲｅｅｖｅｓら、１９６９．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２８２−２８７；Ｇｕｉｌｌｏｒｙら、１９７１．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１７０−１８０；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９６８．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５：２７３；Ｃｏｏｋら、１９７８．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９１：５５７−５６５；およびＤｒａｋｅら、１９７９．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：１１７−１２０を参照のこと）。
【００９８】
ポリメラーゼによるｄＮＴＰの組み込みの結果として放出されたＰＰｉを、例えばＡＴＰスルフリラーゼを用いてＡＴＰに変換し得る。この酵素は、硫黄代謝に関与していると同定された。硫黄は、還元形態および酸化形態もいずれでも、植物および動物の成長に必須のミネラル栄養素である（例えばＳｃｈｍｉｄｔおよびＪａｇｅｒ、１９９２．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４３：３２５−３４９を参照のこと）。植物および微生物のいずれにおいても、硫酸塩の活発な取り込みの後に硫化物への還元が起こる。硫黄は、利用可能な細胞還元剤に比べて非常に低い酸化／還元ポテンシャルを有するので、同化の最初の工程は、ＡＴＰ依存性反応によるその活性化を必要とする（例えばＬｅｙｈ、１９９３．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８：５１５−５４２を参照のこと）。ＡＴＰスルフリラーゼ（ＡＴＰ：硫酸アデニリルトランスフェラーゼ；ＥＧ２．７．７．４）は、無機硫酸塩（ＳＯ4-2）の代謝において最初の反応を触媒する（例えばＲｏｂｂｉｎｓおよびＬｉｐｍａｎｎ、１９５８．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３３：６８６−６９０；ＨａｗｅｓおよびＮｉｃｈｏｌａｓ、１９７３．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３３：５４１−５５０を参照のこと）。この反応において、ＳＯ4-2は、アデノシン５’−ホスホ硫酸（ＡＰＳ）に活性化される。
【００９９】
ＡＴＰスルフリラーゼは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（例えばＨａｗｅｓおよびＮｉｃｈｏｌａｓ、１９７３．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３３：５４１−５５０を参照のこと）；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（例えばＲｅｎｏｓｔｏら、１９９０．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０３００−１０３０８を参照のこと）；ラット肝臓（例えばＹｕら、１９８９．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６９：１６５−１７４を参照のこと）；および植物（例えばＳｈａｗおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９７２．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１２７：２３７−２４７；Ｏｓｓｌｕｎｄら、１９８２．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．７０：３９−４５を参照のこと）のようないくつかの供給源から高度に精製された。さらに、ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子は、原核生物（例えばＬｅｙｈら、１９９２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０４０５−１０４１０；ＳｃｈｗｅｄｏｃｋおよびＬｏｎｇ、１９８９．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ２：１８１−１９４；ＬａｕｅおよびＮｅｌｓｏｎ、１９９４．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：３７２３−３７２９を参照のこと）；真核生物（例えばＣｈｅｒｅｓｔら、１９８７．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１０：３０７−３１３；ＭｏｕｎｔａｉｎおよびＫｏｒｃｈ、１９９１．Ｙｅａｓｔ  ７：８７３−８８０；Ｆｏｓｔｅｒら、１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９７７７−１９７８６を参照のこと）；植物（例えばＬｅｕｓｔｅｋら、１９９４．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０５：８９７−９０２１６を参照のこと）；および動物（例えばＬｉら、１９９５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９４５３−２９４５９を参照のこと）からクローニングされた。その酵素は、特定の供給源に依存するホモオリゴマーまたはヘテロダイマーである（例えばＬｅｙｈおよびＳｕｏ、１９９２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：５４２−５４５を参照のこと）。
【０１００】
いくつかの実施形態では、熱安定性のスルフリラーゼを使用する。熱安定性のスルフリラーゼは、例えばＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓまたはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐから得ることができる。熱安定性スルフリラーゼの配列は、データベース受託番号０２８６０６、受託番号Ｑ９ＹＣＲ４、および受託番号Ｐ５６８６３で入手可能である。
【０１０１】
ＡＴＰスルフリラーゼは、多くの異なる適用、例えば高濃度のＡＴＰにおけるＡＤＰの生物発光検出（例えばＳｃｈｕｌｔｚら、１９９３．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１５：３０２−３０４を参照のこと）；ＤＮＡポリメラーゼ活性の持続モニタリング（例えばＮｙｒｂｎ、１９８７．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６７：２３５−２３８を参照のこと）；およびＤＮＡ配列決定（例えばＲｏｎａｇｈｉら、１９９６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９；Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：３６３−３６５；Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９８．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：６５−７１を参照のこと）に使用された。
【０１０２】
順方向ＡＴＰスルフリラーゼ反応の検出のために、いくつかのアッセイが開発された。比色定量モリブドリシスアッセイは、ホスフェート検出に基づいており（例えばＷｉｌｓｏｎおよびＢａｎｄｕｒｓｋｉ、１９５８．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３３：９７５−９８１を参照のこと）、一方持続分光測光モリブドリシス（ｍｏｌｙｂｄｏｌｙｓｉｓ）アッセイは、ＮＡＤＨ酸化の検出に基づく（例えばＳｅｕｂｅｒｔら、１９８３．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２２５：６７９−６９１；Ｓｅｕｂｅｒｔら、１９８５．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４０：５０９−５２３を参照のこと）。後者のアッセイは、いくつかの検出酵素の存在を必要とする。さらに、いくつかの放射活性アッセイも文献に記載された（例えばＤａｌｅｙら、１９８６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５７：３８５−３９５を参照のこと）。例えば、１つのアッセイは32Ｐ標識ＡＴＰから放出される32ＰＰｉの検出に基づいており（例えばＳｅｕｂｅｒｔら、１９８５．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４０：５０９−５２３を参照のこと）、および別のものは35Ｓの［35Ｓ］標識ＡＰＳへの組み込みに基づいており（このアッセイはまた、結合酵素として精製ＡＰＳキナーゼを必要とする；例えばＳｅｕｂｅｒｔら、１９８３．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２２５：６７９−６９１を参照のこと）；そして３番目の反応は［35Ｓ］標識ＡＰＳからの35ＳＯ4-2の放出に依存する（例えばＤａｌｅｙら、１９８６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５７：３８５−３９５を参照のこと）。
【０１０３】
逆向きＡＴＰスルフリラーゼ反応の検出のために、持続分光測光アッセイ（例えばＳｅｇｅｌら、１９８７．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４３：３３４−３４９を参照のこと）；生物発光アッセイ（例えばＢａｌｈａｒｒｙおよびＮｉｃｈｏｌａｓ、１９７１．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０：１−１７を参照のこと）；35ＳＯ4-2放出アッセイ（例えばＳｅｕｂｅｒｔら、１９８５．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４０：５０９−５２３を参照のこと）；および32ＰＰｉ組み込みアッセイ（例えばＯｓｓｌｕｎｄら、１９８２．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．７０：３９−４５を参照のこと）が以前に記載された。
【０１０４】
ＡＴＰスルフリラーゼによって産生されたＡＴＰを、酵素反応を用いて加水分解し、光を産生し得る。発光化学反応（すなわち化学発光）および生物学的反応（すなわち生物発光）は、様々な代謝物の高感度測定のために、分析生化学において広く使用されている。生物発光反応において、発光にいたる化学反応は酵素によって触媒される。例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼシステムは、ＡＴＰの特異的アッセイを可能にし、そして細菌ルシフェラーゼ−酸化還元酵素システムを、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈのモニタリングに使用し得る。いずれのシステムも、ＡＴＰまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの産生または利用を含む、組み合わせた反応によって、多くの物質の分析に拡大された（例えばＫｒｉｃｋａ、１９９１．化学発光および生物発光技術。Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１４７２−１２８１を参照のこと）。
【０１０５】
新しい試薬の開発は、ＡＴＰ（例えばＬｕｎｄｉｎ、１９８２．Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ａｓｓａｙｓ（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）中のホタルルシフェラーゼの適用を参照のこと）またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（例えばＬｏｖｇｒｅｎら、細菌発光によるＮＡＤＨ変換反応の持続モニタリング。Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１０３−１１１を参照のこと）の濃度に比例する安定な発光を得ることを可能にした。そのような安定な発光試薬を用いて、終点アッセイを行うこと、および公知の量のＡＴＰまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを加えることによって個々のアッセイそれぞれを較正することが可能である。それに加えて、安定な発光システムはまた、ＡＴＰまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ変換システムの持続モニタリングを可能にする。
【０１０６】
ＡＴＰを光に変換する適当な酵素は、ルシフェラーゼ、例えば昆虫ルシフェラーゼを含む。ルシフェラーゼは、触媒の最終産物として光を産生する。最もよく知られた発光酵素は、ホタル、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）のものである。対応する遺伝子が、細菌（例えばｄｅ  Ｗｅｔら、１９８５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７８７０−７８７３を参照のこと）、および植物（例えばＯｗら、１９８６．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：８５６−８５９を参照のこと）、および昆虫（例えばＪｈａら、１９９０．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２７４：２４−２６を参照のこと）および哺乳動物細胞（例えばｄｅ  Ｗｅｔら、１９８７．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３７３；Ｋｅｌｌｅｒら、１９８７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３２６４−３２６８を参照のこと）でクローニングおよび発現された。それに加えて、ジャマイカコメツキムシＰｙｒｏｐｌｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｉｈａｌａｍｕｓ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）由来の多くのルシフェラーゼ遺伝子が最近クローニングされ、そして一部特徴付けされた（例えばＷｏｏｄら、１９８９．Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．４：２８９−３０１；Ｗｏｏｄら、１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７００−７０２を参照のこと）。別々のルシフェラーゼが、時々異なる波長の光を産生し得、それは異なる波長における発光の同時モニタリングを可能にし得る。よって、これら前述の特徴は独特であり、そして現在のリポーターシステムの利用に関して新しい面を加える。
【０１０７】
ホタルルシフェラーゼは、ルシフェリン、アデノシン５’−３ホスフェート（ＡＴＰ）、マグネシウムイオン、および酸素の存在下で生物発光を触媒し、０．８８の量子収量を生じる（例えばＭｃＥｌｒｏｙおよびＳｅｌｉｎｇｅｒ、１９６０．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８８：１３６−１４５を参照のこと）。ホタルルシフェラーゼ生物発光反応を、約１×１０-13Ｍの検出限界を有するＡＴＰの検出のアッセイとして利用し得る（例えばＬｅａｃｈ、１９８１．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３：４７３−５１７を参照のこと）。それに加えて、ルシフェラーゼ媒介検出システムの全体の感受性および簡便性の程度は、ホタルルシフェラーゼに基づくバイオセンサーの開発にかなりの興味を引いた（例えばＧｒｅｅｎおよびＫｒｉｃｋａ、１９８４．Ｔａｌａｎｔａ  ３１：１７３−１７６；Ｂｌｕｍら、１９８９．Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．４：５４３−５５０を参照のこと）。
【０１０８】
上記で記載した酵素を用いて、配列プライマーをポリメラーゼおよび公知のｄＮＴＰに曝露する。もしｄＮＴＰがプライマー配列の３’末端に組み込まれる場合、ｄＮＴＰは切断され、そしてＰＰｉ分子が放出される。次いでＰＰｉはＡＴＰスルフリラーゼによってＡＴＰに変換される。好ましくは、ＡＴＰスルフリラーゼは、ＰＰｉの変換がＰＰｉに関して一次の速度論で進行するように、十分高い濃度で存在する。ルシフェラーゼの存在下で、ＡＴＰは加水分解されて光子を産生する。好ましくは、ＡＴＰ→ＡＤＰ＋ＰＯ43-＋光子（光）という反応がＡＴＰに関して一次の速度論で進行するように、反応混合物中にルシフェラーゼが十分な濃度で存在する。光子を、下記で記載する方法および装置を用いて測定し得る。
【０１０９】
ほとんどの適用に関して、拡散性の配列決定試薬、例えば組み込まれなかったｄＮＴＰを、洗浄緩衝液で洗浄することが望ましい。ピロホスフェート配列決定で使用されるあらゆる洗浄緩衝液を使用し得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、配列決定反応中の反応物濃度は、０．２ｍｌの緩衝液中、１ｐｍｏｌのＤＮＡ、３ｐｍｏｌのポリメラーゼ、４０ｐｍｏｌのｄＮＴＰを含む。Ｒｏｎａｇｈｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９（１９９６）を参照のこと。
【０１１１】
配列決定反応を、所望する場合４つの前もって決定したヌクレオチドのそれぞれを用いて行い得る。「完全な」サイクルは、一般的に、前もって決定した順序で、連続的にヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ（またはｄＵＴＰ）それぞれの配列決定試薬を投与する工程を含む。組み込まれなかったｄＮＴＰを、各ヌクレオチド追加の間に洗い去る。あるいは、組み込まれなかったｄＮＴＰを、アピラーゼによって分解する（下記を参照のこと）。望ましい量の配列産物の配列が得られるまで、サイクルを望ましいだけ反復する。いくつかの実施形態では、約１０〜１，０００、１０〜１００、１０〜７５、２０〜５０、または約３０ヌクレオチドの配列情報が、１つのアニールした配列決定プライマーの伸長から得られる。
【０１１２】
ルシフェラーゼは、光子の放出を伴ってｄＡＴＰを直接加水分解し得る。加水分解はｄＡＴＰの伸長配列決定プライマーへの組み込みとは独立に起こるので、これは擬陽性シグナルを生じる。この問題を避けるために、ＤＮＡに組み込まれるｄＡＴＰアナログを使用し得る。すなわち、それはＤＮＡポリメラーゼの基質であるが、ルシフェラーゼの基質ではない。そのようなアナログの１つはα−チオ−ｄＡＴＰである。従って、α−チオ−ｄＡＴＰの使用は、ｄＡＴＰが成長している核酸鎖に組み込まれることなく加水分解されたときに起こり得る擬似光子産生を回避する。
【０１１３】
典型的には、ＰＰｉに基づく検出は、コントロールヌクレオチドを、配列決定プライマーの追加直後に配列決定反応混合物に加えた後放出される光を測定することによって較正される。これは、反応条件の標準化を可能にする。２つまたはそれ以上の同じヌクレオチドの連続的な組み込みは、発光量の対応する増加によって明らかとなる。従って、コントロールヌクレオチドに比べて発光が２倍に増加することは、２つの連続したｄＮＴＰの伸長プライマーへの組み込みを明らかにする。
【０１１４】
所望の場合、配列決定反応混合物中に残っている、組み込まれなかったあらゆるｄＮＴＰの分解を促進するために、アピラーゼを固体支持体の表面に「ぬらす」または「流す」ことができる。アピラーゼによる処理時に、あらゆる残留反応物は、続くｄＮＴＰインキュベーションおよび光子検出工程のために、洗浄して除去される。あるいは、アピラーゼを固体支持体に結合し得る。
【０１１５】
支持体が平坦である場合、好ましくは、ピロホスフェート配列決定反応は、１つの光学的に透過性の固体支持体表面および光学的に透過性のカバーを含む、薄い反応チャンバ中で起こる。次いで配列決定試薬を、基質の表面に流すことによって送達し得る。支持体が平坦でない場合、固体支持体をあらゆる所定の試薬の槽に浸すことによって、試薬を送達し得る。
【０１１６】
支持体が空洞のあるアレイの形態、例えば光ファイバー反応アレイ（ＦＯＲＡ）の末端である場合、試薬の適当な送達方法は、例えば流れ、スプレー、エレクトロスプレー、インクジェット送達、スタンプ、超音波噴霧（Ｓｏｎｏｔｅｋ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｔｏｎ、ＮＹ）、およびローリングを含む。好ましくは、全ての試薬溶液は、蒸発を最小限にするために１０−２０％のエチレングリコールを含む。スプレーを使用する場合、工業型スプレーノズル（Ｓｐｒａｙｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｏ．、Ｗｈｅａｔｏｎ、ＩＬ）、またはＣＡＭＡＧ  ＴＬＣ  Ｓｐｒａｙｅｒ（Ｃａｍａｇ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ）のような、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で使用される噴霧器によって産生される均一な薄い層で、試薬をＦＯＲＡ表面に送達する。これらの噴霧器は、０．３から１０μｍのサイズの範囲で、試薬をエアロゾルスプレー粒子に霧状にする。
【０１１７】
タンパク質およびＤＮＡ溶液のエレクトロスプレー沈着（ＥＳＤ）は、現在これらの分子の質量分光分析のためにイオンを産生するために使用されている。静電気力の制御下で、荷電エレクトロスプレー産物のＦＯＲＡ基質の特定の領域への沈着が示唆される。ＥＳ沈着タンパク質およびＤＮＡは、それぞれ特異的に抗体に結合する、およびＤＮＡプローブにマッチする能力を保持することも示され、ＥＳＤで作成したマトリックスのＤｏｔ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｎｄｉｎｇ（ＤＩＢ）およびＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイにおける使用を可能にする。（Ｍｏｒｏｚｏｖ  ＶＮ、Ｍｏｒｏｚｏｖａ  ＴＹ：生物学的および生物学的に活性な物質の、モノ−およびマルチコンポーネントマイクロアレイの大量生産方法としてのエレクトロスプレー沈着。Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９年８月１日；７１（１５）：３１１０−７）
文献に記載されたように、タンパク質溶液および他の生物高分子に対して、インクジェット送達が適用可能である（例えばＲｏｄａ  Ａ、Ｇｕａｒｄｉｇｌｉ  Ｍ、Ｒｕｓｓｏ  Ｃ、Ｐａｓｉｎｉ  Ｐ、Ｂａｒａｌｄｉｎｉ  Ｍ、伝統的なインクジェットプリンターを用いたタンパク質マイクロ沈着。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０００年３月；２８（３）：４９２−６）。それはまた、例えばＭｉｃｒｏＦａｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｌａｎｏ、ＴＸ）から市販される。
【０１１８】
あるいは、試薬溶液を、リトグラフィーに似た方法でＦＯＲＡ表面に送達し得る。ローラー（スタンプ；親水性の材料を使用するべきである）をまず、湿ったスポンジを有するリザーバー中で、試薬の層で覆い、そして次いでＦＯＲＡ表面に転がす（押し付ける）。
【０１１９】
連続的な試薬送達工程は、好ましくは洗浄工程によって分けられる。例えば高流れ噴霧器を含む、またはＦＯＲＡ表面上の液体の流れによる、上記で記載した方法を用いて、これらの洗浄を行い得る。
【０１２０】
様々な実施形態で、反応のいくつかの成分を固定化するが、他の成分を溶液中で提供する。例えば、いくつかの実施形態で、ピロホスフェート配列決定反応で利用する酵素（例えばスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ）を、所望の場合、固体支持体に固定化し得る。同様に、ピロホスフェート配列決定反応で利用する１つ以上の酵素、例えばスルフリラーゼ、ルシフェラーゼを、光ファイバー反応アレイの末端に固定化し得る。反応の他の成分、例えばポリメラーゼ（クレノウ断片のような）、核酸鋳型、およびヌクレオチドを、流れ、スプレー、またはローリングによって加え得る。まださらなる実施形態では、配列決定反応で使用する１つ以上の試薬を、ビーズ上で送達する。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、伸長反応の間に、試薬を分配およびＦＯＲＡ表面上の反応容器を密封する拡張可能で可撓性の膜を用いて試薬を分配する。試薬を、ＦＯＲＡ表面または柔軟な膜のいずれかにスプレーまたはロールし得る。次いで柔軟な膜を、迅速に拡張する、または物理的にＦＯＲＡの近くに移動させるかのいずれかをされ得、それによってＰＰｉがウェルからウェルへ拡散できないようにウェルを密封し得る。好ましくは、最大のシグナルが産生されることを可能にするために、反応開始から適当な時間後にデータ取得を行う。
【０１２２】
伸長アンカープライマー中の配列をまた、配列副産物を検出すること以外の配列決定方法を用いて同定し得る。例えば、標識ヌクレオチドまたは他のヌクレオチドアナログの組み込みを測定することによって配列決定を行い得る。これらの方法を、蛍光または電気化学発光に基づく方法と組み合わせて使用し得る。
【０１２３】
あるいは、３’炭素に標識を有するジデオキシヌクレオチドを用いて、配列副産物を産生し得る。好ましくは、標識は切断されて３’ヒドロキシル基を現す。この方法において、所定のヌクレオチドの追加は陽性または陰性として計測され、そして各試験で１つの塩基が決定される。この実施形態で、固相酵素は必要でなく、そして複数の測定を行い得る。
【０１２４】
別の実施形態では、伸長アンカープライマー産物の正体を、標識デオキシヌクレオチドを用いて決定する。標識デオキシヌクレオチドは、例えば蛍光ヌクレオチドであり得る。好ましくは、蛍光ヌクレオチドを、レーザー照射の後に検出し得る。好ましくは、蛍光標識は、長時間の曝露には安定でない。もし望ましいなら、蛍光シグナルを消光、例えば光退色して、次の塩基を加える前にシグナルをバックグラウンドレベルに戻し得る。好ましい電気化学発光標識は、ルテニウム−ｔｒｉｓ−ｂｉ−ピリジルである。
【０１２５】
ルシフェラーゼを固定化する場合、好ましくは、それはアンカープライマーから５０μｍ未満である。
【０１２６】
ルシフェラーゼによって産生される光子を、様々な検出装置、例えば光電子増倍管、電荷結合ディスプレー（ＣＣＤ）、ＣＭＯＳ、吸光度計、限界計、電荷注入デバイス（ＣＩＤ）、または他の固体状態検出器、および本明細書中で記載した装置を用いて定量し得る。好ましい実施形態では、放出された光子の定量を、融合した光ファイバーのバンドルに取り付けたＣＣＤカメラの使用によって達成する。別の好ましい実施形態では、放出された光子の定量を、マイクロチャネルプレート増強装置に取り付けたＣＣＤカメラの使用によって達成する。ＣＣＤ検出器は、例えばＢｒｏｎｋｓら、１９９５．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６５：２７５０−２７５７で記載されている。
【０１２７】
代表的なＣＣＤシステムは、Ｌｏｃｋｈｅｅｄ−Ｍａｒｔｉｎ  ＬＭ４８５  ＣＣＤチップおよび各ファイバーの直径が６〜８μｍの１−１光ファイバーコネクター（バンドル）を有するＳｐｅｃｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）シリーズ６００  ４−ポートカメラである。このシステムは、４０９６×４０９６、または１６００万より多いピクセル、および１０％〜＞４０％の範囲の量子効率を有する。従って、波長に依存して、ＣＣＤセンサーに画像化された光子の４０％ほどが、検出可能な電子に変換される。
【０１２８】
（核酸を配列決定する装置）
本発明において提供されるものはまた、核酸を配列決定する装置である。いくつかの実施形態において、この装置は、平坦基板に取りつけられたアンカープライマーを含む。核酸配列情報は、平坦基板に取り付けられた従来のオプティクスまたは光ファイバーベースのシステムを使用して検出され得る。他の実施形態において、装置は、光ファイバーアレイの末端に取り付けられたアンカープライマーを含む。これらの実施形態において、配列情報は、この光ファイバーアレイの末端から直接得られ得る。
【０１２９】
（核酸を配列決定する装置）
核酸を配列決定する装置を、図２に例示する。この装置は、取り外し可能な灌流チャンバ２２０と連絡して入口導管２００を含む。この入口導管２００は、複数のチューブ２０２〜２１２を介して配列決定試薬の流入を可能にし、その導管は、複数の配列決定分配試薬容器２１４〜２２４とそれぞれ連絡する。
【０１３０】
試薬は、積極的な流れを導くために加圧システムまたはポンプのいずれかを使用して導管２００を介して灌流チャンバ２２０に導入される。典型的に、試薬の流速は、０．１００ｍｌ〜連続流れ（洗浄のため）の容量で０．０５ｍｌ／分〜５０ｍｌ／分（例えば、１ｍｌ／分〜５０ｍｌ／分）である。バルブは、コンピューター制御下にあって、ヌクレオチド、および試薬のサイクリングを洗浄可能にする。配列決定試薬（例えば、ポリメラーゼ）は、ヌクレオチドと前もって混合されるか、または流れに加えられるかのいずれかであり得る。マニホールドは、灌流チャンバへフィードするため６つのチューブ２０２〜２１２を一緒にして１つにする。従って、いくつかの試薬送達ポートは、灌流チャンバへのアクセスを可能にする。例えば、このポートの１つは、水性の配列決定試薬の投入を可能にするため利用され得るが、一方、別のポートは、これらの試薬（および任意の反応性産物）が灌流チャンバから回収されるのを可能にする。
【０１３１】
灌流チャンバ２００は、複数のアンカープライマーが取り付けられた基板を含む。この基板は、束ねられた光ファイバーアレイの末端に形成されるアンカーパッドにおいて固定された１つ以上のプライマーを含む平坦基板であり得る。後者の基板表面は、以下により詳細に考察される。
【０１３２】
灌流チャンバは、水溶液において増幅された核酸上で必要とされる配列決定試薬の均一線形流れを可能にし、そしてこれらの試薬の迅速なおよび完全な交換を可能にする。従って、この灌流チャンバは、ピロホスフェートベースの配列決定反応を行うのに適切である。この灌流チャンバはまた、アンカープライマーを調製するため、および増幅反応（例えば、本明細書中に記載されるＲＣＡ反応）を行うために使用され得る。
【０１３３】
固体支持体は、従来のオプティカルまたは光ファイバーバンドルにつながったＣＣＤシステムを含む画像化システム２３０に光学的に連結される。１つの実施形態において、灌流チャンバ基板は、水性界面の近くで産生される光が、基板またはチャンバの外側に直接送達されるような光ファイバーアレイウェーハを含む。ＣＣＤシステムが、光ファイバーコネクターを含む場合、画像化は、そのコネクターと直接接触するように灌流チャンバ基板を配置することで達成され得る。あるいは、従来のオプティカルは、（例えば、１−１倍率高開口数レンズシステムを使用することによって）光を光ファイバー基板の外側から直接ＣＣＤセンサーへ画像化するために使用され得る。基板が、光ファイバー連結を備えない場合、レンズシステムはまた、上記に記載されるように使用され得、その場合、基板または灌流チャンバカバーのいずれかは、光学的に透明である。代表的なＣＣＤ画像化システムは、上記に記載されている。
【０１３４】
画像化システム２３０は、基板表面上のリアクターから光を収集するために使用される。例えば、光は、当該分野で公知の高感度低ノイズ装置を使用してＣＣＤ上で画像化され得る。光ファイバーベースの画像化のため、カバースリップ内に直接光ファイバーを組み込むことが好ましい。
【０１３５】
画像化システムは、コンピューター制御およびデータ収集システム２４０に連結される。一般的に、任意の一般的に入手可能なハードウェアおよびソフトウェアパッケージが、使用され得る。コンピューター制御およびデータ収集システムはまた、試薬送達を制御するため導管２００に連結される。
【０１３６】
本発明の灌流チャンバの例を、図３に例示する。灌流チャンバは、統制な上側のスライドおよび下側のスライドを備える密封された区画を含む。基板表面の表面上での溶液の線形流れを可能にするよう、そして試薬の迅速な交換を可能にするように設計される。従って、例えば、この灌流チャンバは、ピロホスフェート配列決定反応を実行するのに適切である。灌流チャンバを横切る層流は、チャンバの幅を減少させそして長さを増大することによって最適化され得る。
【０１３７】
灌流チャンバは、準備されている間は好ましくは画像化システムから取り外され、そして配列決定分析を行う場合にのみ画像化システムに配置される。
【０１３８】
１つの実施形態において、固体支持体（すなわち、ＤＮＡチップまたはガラススライド）は、金属ハウジングまたはプラスチックハウジングによって適所に保持され、この固体支持体の交換を可能にするために組み立てられそして分解され得る。
【０１３９】
灌流チャンバの下側の固体支持体は、反応中心アレイおよび（伝統的な光学ベースの焦点システムについては）高開口数対物レンズを所持し、高開口数対物レンズは、ＣＣＤ画像化システム上に反応中心アレイの画像の焦点をあわせるために使用する。
【０１４０】
ピロホスフェート配列決定反応によって生成された光子は、光子が焦点デバイス（例えば、光学レンズまたは光ファイバー）を通過する場合のみＣＣＤに捕獲され、そしてＣＣＤエレメント上に集束する。しかし、放射された光子は、全ての方向に等しく逃げるはずである。平坦アレイ（例えば、ＤＮＡチップ）を利用する場合、その後の「捕獲」および定量を最大にするために、平坦固体支持体で速やかに光子を収集することが好ましい。これは、以下：（ｉ）カバースリップと伝統的な光学レンズもしくは光ファイバーバンドルとの間で光学液浸オイルを利用する工程または、好ましくは（ｉｉ）カバースリップ自体に光ファイバーを直接組み込む工程のいずれかによって達成される。同様に、薄い、光学的に透明な平坦表面を使用する場合、光ファイバーバンドルはまた、裏表面に対して配置され得、反応／灌流チャンバの全体の深さを介して「画像化する」必要はなくなる。
１つの局面において、本発明は、複数の分析を処理する装置であって、該装置は、以下： 核酸分子をその上に配置した、複数の空洞表面を含む基板を中に配置した流れチャンバ；処理試薬を１つ以上のリザーバーから該流れチャンバへ送達し、それによって複数の微小粒子に固定された分析物が該試薬に曝される流体手段；および該複数の各微小粒子から光学シグナルの配列を検出し、該配列の各光学シグナルが処理試薬とそれに固定される該分析物との間の相互作用の指標である検出手段、ここで該検出手段が該空洞表面と連絡する検出手段を含む前記装置を具体化する。検出手段は、各々のデジタル画像における各々の該微小粒子から前記光学シグナルを相関付けて、配列を形成させるためのシグナル追跡手段をさらに含んでよい。シグナル追跡手段はＣＣＤカメラを含んでよく、そして分析物はＤＮＡを含んでよい。
【０１４１】
（連結されたアンカープライマーを有する光ファイバー基板アレイ）
いくつかの実施形態において、固体支持体は、配列反応副産物を検出および送達するために使用される光ファイバーのバンドルに結合される。バンドル中の光ファイバーの総数は、配列決定反応に利用される個々のアレイの数に合わせるように変えられ得る。バンドルに組み込まれた光ファイバーの数は、１：１の画像化を可能にするようにＣＣＤに合うように（すなわち、約６０ｍｍ×６０ｍｍ）設計される。光ファイバーの所望の数は、最初にバンドルの中に融合され、その末端は切断されており、そして必要とする厚さ（例えば、１．５ｍｍ）の「ウェーハ」を形成するように磨かれている。生じた光ファイバーウェーハは、ガラス表面の取り扱い特性と同様の取り扱い特性を持つ。個々のファイバーは、任意のサイズの直径（例えば、３μｍ〜１００μｍ）であり得る。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、２つの光ファイバーバンドルが、使用される：第１のバンドルは、ＣＣＤセンサー（ファイバーバンドルまたはコネクターまたは固体支持体）に直接取りつけられ、そして第２のバンドルは、灌流チャンバ基板（ウェーハまたは基板）として使用される。この場合、２つは、直接接触するように、必要に応じて光学連結流体を使用して、ＣＣＤセンサー上で反応中心を画像化するために配置される。バンドルの全体のサイズは、灌流チャンバ内で所望の試薬（流れ）特性を維持しながらＣＣＤの有用な面積を最適化するように選択される。従って、１５μｍピクセルで４０９６×４０９６ピクセルのＣＣＤアレイに対しては、ファイバーバンドルは、約６０ｍｍ×６０ｍｍであるように、または約９０ｍｍの直径を有するように選択される。ウェーハは、ＣＣＤ面積の使用を最大にするためにわずかに大きくてもよく、代表的な顕微鏡スライドの様式（２５ｍｍ×７５ｍｍ）に合わせるためにわずかに小さくてもよい。バンドル中の個々のファイバーの直径は、当該分野の技術水準の制約内で、単一の反応が単一のＣＣＤピクセル上で画像化される確率を最大にするように選択される。３〜１００μｍの範囲で任意の直径を使用し得るが、代表的な直径は、ファイバーバンドルについては６〜８μｍ、ウェーハについては６〜５０μｍである。ファイバーバンドルは、ＣＣＤカメラ製造業者から市販される。ウェーハは、Ｉｎｃｏｍ，Ｉｎｃ．（Ｃｈａｒｌｔｏｎ，ＭＡ）から得られ得、そして大きな光ファイバーの融合体から切断され、そして磨かれ、可能であれば０．５ｍｍ〜５ｍｍの厚みであるが、代表的には２ｍｍの厚みである。ウェーハは、窓ガラスまたはガラス顕微鏡スライドと同様の取り扱い特性を有する。
【０１４３】
他の実施形態において、平坦支持体は、省略され、そしてアンカープライマーは、光ファイバーの末端に直接連結される。好ましくは、アンカープライマーは、図４に略図的に示されるように空洞化された末端に取り付けられる。末端は、光ファイバー材料にくぼみを形成するため、例えば、酸で処理される。ここでこのくぼみは、個々の光ファイバーの直径の約２分の１倍〜このファイバーの直径の２〜３倍までの深さの範囲である。
【０１４４】
空洞は、不定量の時間、酸バス内に光ファイバーウェーハの片面を配置することによってこのファイバーの末端に導入され得る。時間の量は、所望される反応空洞全体の深さに依存して変わり得る（例えば、Ｗａｌｔら、１９９６．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：１８８８を参照のこと）。光ファイバーのバンドルの末端にエッチングされた空洞に分子を取りつける（および取りつけられた分子を検出する）いくつかの方法が、当該分野で公知である。例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：１２４２−１２４８（１９９８）；Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：１６８１−１６８４（１９９６）；ＨｅａｌｅｙおよびＷａｌｔ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：２２１３−２２１６（１９９７）を参照のこと。反応性部位のパターンはまた、平坦支持体上の反応性パッドのパターンの産生に使用されたフォトリソグラフィック技術と同様の技術を使用してマイクロウェルに作成され得る。Ｈｅａｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１０７８−１０８０（１９９５）；ＭｕｎｋｈｏｌｍおよびＷａｌｔ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５８：１４２７−１４３０（１９８６）、およびＢｒｏｎｋら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：２７５０−２７５７（１９９５）を参照のこと。
【０１４５】
光ファイバーウェーハの反対側（すなわち、エッチングされていない側）は、第２の光ファイバーバンドルに光学連結（例えば、液浸オイルまたは他の光学結合流体によって）し得るように高度に磨かれている。この第２の光ファイバーバンドルは、反応チャンバを含む光学ウェーハの直径に正確に合い、そして第２の光ファイバーバンドルの取りつけられたＣＣＤ画像化システムまたはカメラへの、ピロホスフェート配列決定反応によって産生された光子の送達のための導管として作用する。
【０１４６】
光ファイバーウェーハの表面は、好ましくは配列決定反応におけるその使用を容易にするようにコートされる。コートされた表面は、好ましくは光学的に透明であり、取りつけられたタンパク質および核酸の簡単な化学的改変を可能にし、そして固定化されたタンパク質の活性に悪影響を及ぼさない。さらに、表面は、好ましくは高分子の非特異的吸収を最小にし、そして連結された高分子（例えば、取りつけられた核酸およびタンパク質）の安定性を増大させる。
【０１４７】
アレイをコートするのに適切な材料は、例えばプラスチック（例えば、ポリスチレン）を含む。プラスチックは、好ましくはスピンコートまたはスパッター（０．１μｍの厚み）され得る。アレイをコートする別の材料は、長鎖チオールアルカンの吸着された自己組み立て単層と共に金層（例えば、２４金、０．１μｍの厚み）を含む。次いで、ビオチンは、表面に共有結合的に連結され、そしてビオチン結合タンパク質（例えば、ストレプトアビジン）で飽和にされる。
【０１４８】
コーティング材料は、さらにアンカープライマーを基板に取りつけるため使用されるシステムを含み得る。有機シラン試薬（アミノ基、スルフヒドリル基またはカルボキシル基を介するタンパク質の直接共有結合連合を可能にする）はまた、アレイをコートするため使用され得る。さらなるコーティング基板は、光反応リンカー（例えば、光ビオチン）を含む（Ａｍｏｓら、「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐａｒｔ  Ａ：Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｗｉｓｅら（編）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ｐｐ．８９５９２６、１９９５）。
【０１４９】
さらなるコーティング材料は、好ましくは表面にまたは重合後共有結合的に取りつけられたポリマー鎖に直接重合する親水性のポリマーゲル（ポリアクリルアミド、ポリサッカライド）（Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｊ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３４７，１９１（１９８５）；Ｎｏｖｏｔｎｙ，Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６２，２４７８（１９９０））、およびポリスチレンまたはシラン化されたガラス表面のいずれかに（Ｈｏら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １４：３８８９−９４，１９９８）、および受動的に吸着されたビオチン結合タンパク質の層に特異的に吸着されるプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリマー（３ブロックコポリマー、例えば、Ｆ−１０８としてまた公知のＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ）を含む。
【０１５０】
さらに、任意の上記材料は、金属キレート化基（例えば、ニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸、五座キレート剤）で誘導体化され得、この金属キレート化基は、６×Ｈｉｓタグ化されたタンパク質および核酸を結合する。
【０１５１】
好ましい実施形態において、融合された光ファイバーバンドル／ウェーハを産生するために利用される個々の光ファイバーは、光画像化システムにおいて利用される光ファイバーの直径（例えば、３μｍ）よりも直径が大きい（例えば、６μｍ〜１２μｍ）。従って、いくつかの光画像化ファイバーは、単一反応部位を画像化するために利用され得る。
【０１５２】
エッチングされた半球状のジオメトリーは、隣接したアンカーパッドから放出されたＰＰｉからのバックグランドシグナルを減少させる。「チップ」ベースのジオメトリーの使用（ここでは、必要とされる配列決定試薬が、固体支持体マトリックス（すなわち、アンカーパッド）の表面上を「流れる」）とは対照的に、酸エッチングされた光ファイバーウェーハの実施形態において種々の配列決定試薬の送達は、酸エッチングされた空洞を、ｄＮＴＰ／ＡＰＳ／スルフリラーゼ試薬へ、次いで引き続き任意の残留ｄＮＴＰの分解を容易にするアピラーゼ試薬へと交互に液浸によって行われる。
【０１５３】
（ピロホスフェート配列決定反応の最適化の基礎をなす数学的解析）
理論による束縛を望まないが、反応条件の最適化は、以下の解析を基礎とする仮定を使用して行われ得ると、考えられる。
【０１５４】
固相ピロホスフェート配列決定は、最初は、固相技術と生物発光を利用する合成による配列決定技術を併用することによって開発された（例えば、Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９６．Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｌｅａｓｅ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９を参照のこと）。固相方法論において、固定化されたプライム化ＤＮＡ鎖は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼと共にインキュベートされる。中間洗浄工程と伴う段階的なヌクレオチド付加によって、連続的な重合化の事象が、引き続いて起こり得る。Ｓ／Ｎ比は、システムにおけるα−チオｄＡＴＰの使用によって増大する。このｄＡＴＰアナログは、ＤＮＡポリメラーゼによって効率的に組み込まれるが、ルシフェラーゼの基質としては働かない。このことは、バックグランドの蛍光を減少させ、そして実時間での配列決定反応の実行を容易にする。これらの初期の研究において、固体支持体としてストレプトアビジンでコートされた磁性ビーズを使用するＰＣＲ産物の配列決定が、提供された。しかし、各ヌクレオチドと酵素の添加との間に実行される洗浄中のビーズの損失が、この技術を短い配列に限定することが、見出された。
【０１５５】
現在、ピロホスフェート配列決定方法論は、単一ＤＮＡ配列決定鋳型の多数の同一コピーからＤＮＡ配列を確かめるために合理的に十分確立された歴史を有する（例えば、Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９６．Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９；Ｎｙｒｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＤＮＡ，特許ＷＯ９８１３５２３Ａ１（１９９８年４月２日発行；１９９７年９月２６日出願）；Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９８．Ａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：３６３−３６５（１９９８）を参照のこと）。ピロホスフェート（ＰＰｉ）生成反応は、生物発光に基づく非常に高感度の技術によってモニターされ得る（例えば、Ｎｙｒｅｎら、１９９６．ｐｐ．４６６−４９６（Ｐｒｏｃ．９ｔｈ  Ｉｎｔｅｒ．Ｓｙｍｐ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．を参照のこと）。これらの生物発光アッセイは、異なる核酸改変反応において放出されるＰＰｉの検出に依存する。これらのアッセイにおいて、産生されたＰＰｉは、続いて、ＡＴＰスルフリラーゼによってＡＴＰへ変換され、そしてＡＴＰ産生は、ルシフェラーゼによって連続的にモニターされる。例えば、ポリメラーゼ媒介反応において、ヌクレオチドが、ポリメラーゼによって合成されている成長中の核酸鎖に組み込まれる場合、ＰＰｉが、産生される。一般的に、ＤＮＡポリメラーゼは、ピロホスフェート配列決定反応中にＰＰｉを産生するため利用されるが（例えば、Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９８．Ｄｏｃｔｏｒａｌ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を参照のこと）、重合現象に続いて逆転写酵素（例えば、Ｋａｒａｍｏｈａｍａｍｅｄら、１９９６．ｐｐ．３１９−３２９（Ｐｒｏｃ．９ｔｈ  Ｉｎｔｅｒ．Ｓｙｍｐ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．）を参照のこと）またはＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｋａｒａｍｏｈａｍａｍｅｄら、１９９８．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：３０２−３０６を参照のこと）を使用することもまた、可能である。
【０１５６】
例えば、生物発光プライマー伸長アッセイは、３’末端での単一ヌクレオチドミスマッチを試験するために利用された（例えば、Ｎｙｒｅｎら、１９９７．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４４：３６７−３７３を参照のこと）。ファージプロモーターは、代表的には、少なくとも１つの任意プライマー上に結合され、そして増幅に続いて、転写ユニットが、得られ得、次いでＲＮＡポリメラーゼによる段階的伸長に供される。次いで、転写媒介ＰＰｉ放出は、生物発光アッセイ（例えば、ＡＴＰスルフリラーゼ−ルシフェラーゼ）によって検出され得る。このストラテジーを使用することによって、追加の特異的な配列決定プライマーを用いることなく２本鎖ＤＮＡを配列決定することが、可能でありそうである。一連の「ラン−オフ」アッセイにおいて、Ｔ7ファージＲＮＡポリメラーゼによる伸長が、試験され、そしてかなり遅いことが見出された（例えば、Ｋｗｏｋら、１９９０．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：９９９−１００５を参照のこと）。３’ミスマッチ末端の後の続く正しい天然のデオキシヌクレオチドに対するα−チオヌクレオチドアナログの置換は、重合化速度を５倍〜１３倍減少させ得る。しかし、２〜３の塩基の組み込み後は、ＤＮＡ合成の速度は、通常の鋳型／プライマーに対して観察される速度に匹敵する。
【０１５７】
この技術による単一塩基検出は、システムへのアピラーゼの組み込みによって改良さた。アピラーゼは、ＮＴＰ加水分解を触媒し、そしてヌクレオチド濃度をＤＮＡポリメラーゼのＫmよりはるかに下に低下させる。アピラーゼの使用は、ミスマッチされた塩基との接触に際してさらなる伸長を最小化し、それによってデータ解析を単純化する。上記技術は、変異検出および単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰ）分析の領域における適用において迅速な実時間分析を提供する。
【０１５８】
ピロホスフェート配列決定システムは、ＤＮＡ合成をモニターするためにいくつかの酵素により順次触媒される反応を使用する。安定性、特異性、感受性、ＫMおよびＫCATなどの酵素特性は、システムの最適実行に重要である。ピロホスフェート配列決定システムにおいて、検出酵素（すなわち、スルフリラーゼおよびルシフェラーゼ）の活性は、一般に、配列決定反応の間一定のままであり、そして高量の産物によって非常にわずかだけ阻害される（例えば、Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９８．Ｄｏｃｔｏｒａｌ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を参照のこと）。スルフリラーゼは、約２．０秒でＰＰｉをＡＴＰへ変換し、そしてルシフェラーゼによる光の生成は、０．２秒未満で起こる。最も重大な反応は、ＤＮＡ重合およびヌクレオチドの分解である。ピロホスフェート配列決定方法論に利用される酵素を特徴付ける定数値を、以下に列挙する：
【０１５９】
【表１】
0004727109.tif 000002
これらの４つの反応に関与する酵素は、同じ基質について競合する。従って、基質濃度の変化は共役する。初期反応は、鎖延長のためのポリメラーゼ／ＤＮＡ複合体へのｄＮＴＰの結合である。この工程を迅速にするため、ヌクレオチド三ホスフェート濃度は、ＤＮＡポリメラーゼのＫMより高くなければならない。しかし、ヌクレオチド三ホスフェートの濃度が、高すぎる場合、より低いポリメラーゼ忠実度が、観察され得る（例えば、Ｃｌｉｎｅら、１９９６，ＰＣＲ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：３５４６−３５５１を参照のこと）。濃度の適切な範囲は、ミス取り込み（ｍｉｓｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＫM（これは通常はるかに高い）によって確立される（例えば、Ｃａｐｓｏｎら、１９９２．Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ４３  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：１０９８４−１０９９４を参照のこと）。非常に高い忠実度は、固有のエキソヌクレアーゼ活性をもつポリメラーゼの使用によって達成され得るが、それらの使用はまた、プライマー分解が起こり得るという不利益を保有する。
【０１６０】
ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（Ｋｌｅｎｏｗ）のエキソヌクレアーゼ活性は、低いが、プライマーの３’末端は、ヌクレオチド三ホスフェートの非存在下でのより長いインキュベーションで分解され得る（例えば、Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９８．Ｄｏｃｔｏｒａｌ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を参照のこと）。忠実度は、エキソヌクレアーゼ活性なしに維持される。なぜなら、重合工程における誘導適合結合メカニズムが、正しいｄＮＴＰに対して非常に効率的な選択性を提供するからである。１×１０5〜１×１０6の忠実度が、報告された（例えば、Ｗｏｎｇら、１９９１．Ａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ−ｆｉｔ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：５２６−５３７を参照のこと）。ピロホスフェート配列決定において、エキソ−Ｋｌｅｎｏｗ  または  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（登録商標）などのエキソヌクレアーゼ−欠損（エキソ−）ポリメラーゼは、高い忠実度を有することが確認された。
【０１６１】
本発明のピロホスフェート配列決定方法論における空間的な制約および時間的な制約のための推定が計算された。ここで、本システムは、総容量５μｌのために約５０μｍの高さで、１ｃｍ2の面積を有する。時間的制約に関して、反応のカスケードに関与する分子種は、最初に規定される。ここで：
Ｎ＝表面に取り付けられたＤＮＡ
ＰＰｉ＝放出されたピロホスフェート分子
ＡＴＰ＝ピロホスフェートから産生されたＡＴＰ
Ｌ＝ルシフェラーゼによって放出された光。
【０１６２】
Ｎ（０）は、ヌクレオチドが付加されていないＤＮＡであり、Ｎ（１）は、１ヌクレオチドが付加されており、Ｎ（２）は、２ヌクレオチドをが付加されているなどとさらに特定される。分子種の濃度に関する擬似一次速度定数は：
Ｎ（ｎ）→Ｎ（ｎ＋１）＋ＰＰｉ                    ｋN
ＰＰｉ→ＡＴＰ                                    ｋP
ＡＴＰ→Ｌ                                        ｋA
である。
【０１６３】
さらに、ＰＰｉに対する拡散定数ＤPおよびＡＴＰに対する拡散定数ＤAもまた、特定されなければならない。これらの値は、希釈水溶液中の生体分子に対する以下の例示的拡散定数から推定され得る（Ｗｅｉｓｉｇｅｒ，１９９７．Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｕｐｔａｋｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ，ｄｉｃｋｗ＠ｉｔｓａ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ，ｈｔｔｐ：／／ｄｉｃｋｗ．ｕｓｃｆ．ｅｄｕ／ｐａｐｅｒｓ／ｇｏｒｅｓｋｙ９７／ｃｈａｐｔｅｒ．ｈｔｍｌを参照のこと）。
【０１６４】
【表２】
0004727109.tif 000003
ここで、オリジナル文献１は：Ｌｏｎｇｓｗｏｒｔｈ，１９５４．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．５８：７７０−７７３；オリジナル文献２は：Ｇａｉｇａｌａｓら、１９９２．Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｖｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９６：２３５５−２３５９；およびオリジナル文献３は：Ｃｈｅｎｇ，１９９３．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−Ｅｎｇｌｉｓｈ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｗａｔｅｒ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｂｙ  ｐｒｏｔｏｎ  ＮＭＲ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｉｍａｇｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｍａｇｎｅｔ．Ｒｅｓｏｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ  １１：５６９−５８３である。
【０１６５】
ＰＰｉの拡散定数を推定するために、次の例示値が、利用され得る（ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，１９８３．（Ｗ．Ｅ．Ｗｅａｓｔ．編）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬを参照のこと）：
【０１６６】
【表３】
0004727109.tif 000004
ＰＰｉの分子量は、１７４ａｍｕである。前述の例示値に基づけば、ＰＰｉに対して約０．７×１０-5ｃｍ2／秒の拡散定数が、予想される。
【０１６７】
３つのピロホスフェート配列決定反応を触媒する酵素は、ほぼＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ速度論に近似していると考えられる（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ，１９８８．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。これは、以下に記述され得る：
ＫM＝［Ｅ］［Ｓ］／［ＥＳ］、
速度＝Ｖmax［Ｓ］／（ＫＭ＋［Ｓ］）、
Ｖmax＝Ｋturnover［ＥT］
ここで［Ｓ］は、基質濃度であり、［Ｅ］は、遊離酵素の濃度であり、［ＥＳ］は、酵素基質複合体の濃度であり、そして［ＥT］は、酵素の総濃度＝［Ｅ］＋［ＥＳ］である。
【０１６８】
反応時間は、論文に記載される溶液相ピロホスフェートベース配列決定と少なくとも同程度に速いことが好ましい。基質が産物に変換される速度は、
−ｄ［Ｓ］／ｄｔ＝Ｋturnover［ＥT］［Ｓ］／（ＫM＋［Ｓ］）である。
【０１６９】
基質の有効な濃度は、複製されたＤＮＡ分子のサイズ（最大（１０μｍ）3）、およびコピーの数（約１０，０００）から推定され得、約１７ｎＭの濃度になる。これは、前述した酵素に対するＫMよりも小さく、それによって速度は、
−ｄ［Ｓ］／ｄｔ＝（Ｋturnover／ＫM）［ＥT］［Ｓ］と推定され得る。
【０１７０】
従って、擬似一次速度論を用いて、基質消失の反応速度定数は、所定の酵素に対する定数ＫturnoverおよびＫMならびに［ＥT］に依存する。従って、論文において報告された同じ酵素濃度を使用することは、同様の速度を生ずる。
【０１７１】
ピロホスフェート配列決定反応における第１の工程（すなわち、新しいヌクレオチドの組み込みとＰＰｉの放出）は、ここで詳細に検討される。好ましい反応条件は：０．２ｍｌの緩衝液中１ｐｍｏｌ  ＤＮＡ、３ｐｍｏｌポリメラーゼ、４０ｐｍｏｌ  ｄＮＴＰである。上記の好ましい反応条件下で、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片に対するヌクレオチド取り込みのためのＫMは、０．２μＭであり、そしてＳｅｑｕｅｎａｓｅ２．０TM（ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）のためのＫMは、０．４μＭであり、そして１塩基の完全な取り込みは、１５ｎＭのポリメラーゼ濃度を用いて０．２秒未満である（例えば、Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９６．Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９を参照のこと）。
【０１７２】
５μｌの反応容量には、それぞれ１０，０００の配列決定プライマー部位を有する合計１０，０００のアンカープライマー、すなわち１×１０8の総伸長部位＝０．１７ｆｍｏｌが存在する。論文において以前に公開された結果は、ポリメラーゼが、反応混合物中に３倍豊富に、すなわち０．５ｆｍｏｌで存在するはずであることを示唆する。従って、ポリメラーゼの最終濃度は、０．１ｎＭである。これらの反応条件は、本発明の実施において容易に得られることに、注意すべきである。
【０１７３】
以前に述べたように、ヌクレオチド付加反応に必要とされる時間は、１ヌクレオチド当たり０．２秒より大きくない。従って、反応を合計Ｔ秒間進行させる場合、ヌクレオチド付加は、（Ｔ／０．２）の同一ヌクレオチドまでの伸長部（ｓｔｒｅｔｃｈ）が、そのポリメラーゼの作用により完全に充填されるに十分に迅速であるはずである。以下に考察されるように、ピロホスフェート配列決定反応の律速段階は、完了するために合計約２秒を必要とするスルフリラーゼ反応である。従って、スルフリラーゼ反応を完了させる総反応時間は、ポリメラーゼが１０の同一ヌクレオチドの伸長部を「充填」し得るに十分であるべきである。ランダムＤＮＡ種において、１０以上の同一ヌクレオチドの領域は、１ヌクレオチド当たり約４-10の確率（約１×１０-6）で起こることが示された。本発明の好ましい実施形態におけるアンカープライマーから伸長された１０，０００配列（それぞれは、少なくとも３０ｎｔ．そして好ましくは１００ｎｔ．伸張されている）中に１０の同一ヌクレオチドの並びがおよそ１つ存在すると予測される。従って、同一ヌクレオチドの並びは、本発明の実施において困難を提起するはずがないと結論し得る。
【０１７４】
生じるＤＮＡ分子の全体サイズは、好ましくは、固定パッドのサイズ（すなわち１０μｍ）より小さく、そして個々の固定パッド間の距離（すなわち１００μｍ）よりも小さくなければならない。合計Ｎヌクレオチドを有する１本鎖ＤＮＡコンカテマーの回転半径は、以下の等式によって数学的に推定され得る：半径＝ｂ（Ｎ／Ｎ0）0.6、ここで、ｂは、持続長さであり、そしてＮ0は、１持続長さあたりのヌクレオチドの数であり；べき指数０．６は、自己回避ウォーク（ｓｅｌｆ−ａｖｏｉｄｉｎｇ  ｗａｌｋ）の特性を示している（例えば、Ｄｏｉ，１９８６．Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ（Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｆｌｏｒｙ，１９５３．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。例として、１本鎖ＤＮＡを使用すると、ｂは、４ｎｍであり、そしてＮ0は、１３．６ｎｔ．である（例えば、Ｇｒｏｓｂｅｒｇ，１９９４．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（ＡＩＰ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。１００マーの１０，０００コピーの使用では、Ｎ＝１×１０6であり、回転半径は３．３μｍである。
【０１７５】
スルフリラーゼ反応は、ここで詳細に考察される。アデノシン５’−ホスホ硫酸（ＡＰＳ）およびＰＰｉからのＡＴＰの生成時間は、２秒未満であると推定された（例えば、ＮｙｒｅｎおよびＬｕｎｄｉｎ，１９８５．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５１：５０４−５０９を参照のこと）。０．２ｍｌ緩衝液における１ｐｍｏｌ  ＰＰｉ（５ｎＭ）について報告された反応条件は、０．３Ｕ／ｍｌＡＴＰスルフリラーゼ（ＡＴＰ：硫酸アデニリルトランスフェラーゼ；Ｐｒｏｄ．Ｎｏ．Ａ８９５７；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および５μＭ  ＡＰＳである（例えば、Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９６．Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９を参照のこと）。スルフリラーゼに対するメーカーの情報（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）は、１ｍｇタンパク質あたり５〜２０単位（すなわち、１単位は、３０℃、ｐＨ８．０で１分当たりにＡＰＳおよびＰＰｉから１．０μｍｏｌｅのＡＴＰを産生する）の活性を報告し、他方で別の文献に、その比活性は、１４０単位／ｍｇとして報告された（Ｋａｒａｍｏｈａｍｅｄら、１９９９．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＥＴ３  Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｓｕｌｆｕｒｙｌａｓｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  １５：３８１−３８８を参照のこと）。本発明の実施において利用される反応条件は、前述の参考文献において報告された反応条件と同様であるという事実から、アッセイ中のスルフリラーゼ濃度は、４．６ｎＭと推定された。従って、半最大速度では、［ＡＰＳ］＝０．５μＭおよび［ＰＰｉ］＝７μＭである。
【０１７６】
本発明で利用される反応条件において、［ＰＰｉ］は、５μｌ中約０．１７ｆｍｏｌ、または０．０３ｎＭである。酵素に結合されたＰＰｉの割合は、［Ｅ］／ＫMであり、ここで［Ｅ］は、遊離酵素の濃度である。この酵素濃度は、ＰＰｉ濃度よりもずっと大きいため、総酵素濃度のみが、この計算に使用され得る。酵素に結合されたＰＰｉの割合は、４．６ｎＭ／７μＭ＝７×１０-4であることが見出された。従って、ＰＰｉは、ＡＴＰへ変換される前にそのほとんどの時間を自由拡散に費やすと結論される。
【０１７７】
各ＰＰｉが反応する平均時間は、１／ｋP＝２秒である。ＰＰｉが各方向に拡散する平均平方距離は、約２ＤP／ｋPまたは２．８×１０3μｍ2である。各方向におけるＲＭＳ距離は、５３μｍである。この値は、個々のアンカープライマーのそれぞれが、５０μｍよりも離れなければならず、または１つのアンカーから放出されるＰＰｉが、次へ拡散し、そして検出され得ることを示している。
【０１７８】
上述の現象を説明するために使用され得る別の方法は、第２のアンカーパッドで産生され、その後第１のアンカーパッドの位置に拡散するＰＰｉの量に対する、第１のアンカーパッドで産生された第１のアンカーパッド上のＰＰｉの量を推定することである。これらの２つの量が大きさにおいてそれぞれに近づく場合、バックグランドのシグナルから「真の」シグナルを識別することが難しくなる。これは、ａをアンカーパッドの半径として、１／ｂ2をアンカーパッドの密度として定義することで数学的に記述され得る。先に公開されたデータに基づいて、ａは、１０μｍにほぼ等しく、そしてｂは、１００μｍにほぼ等しい。第１のアンカーパッド上に存在するＰＰｉの量は、以下：
ｅｘｐ（−ｋPｔ）［１−ｅｘｐ（−ａ2／２ＤPｔ）］によって記述され、そして第２のアンカーパッド上に存在するＰＰｉの量は、以下：
（１／３）ｅｘｐ（−ｋPｔ）［ｐａ2／ｂ2］ｅｘｐ（−ｂ2／２ＤPｔ）によって数学的に近似され得る。前係数１／３は、ＤＮＡ配列の１／４が１ヌクレオチドを取り込み、次いでこれらの１／４が第２のヌクレオチドを取り込むなどを仮定し、従って一連の合計が１／３である。２ＤPｔが、ｂ2とほぼ等しくなる場合、第１のアンカーパッド上および第２のアンカーパッド上のＰＰｉの量は、大きさが似てくる。従って、分子が拡散するＲＭＳ距離が、隣接アンカーパッド間の距離と等いことが示される。従って、本発明の実施において利用されるアッセイ条件に基づけば、アンカーパッドは、約５０μｍよりも近くに配置されてはならず、そして好ましくは、少なくともさらに３倍（すなわち、１５０μｍ）隔てられている。
【０１７９】
前述の知見は、アンカーパッドの表面密度に制限を設けるが、多くの異なるアプローチの使用によって、アンカーパッドの全表面密度を増加させると同時に距離要求を減らすことは可能である。１つのアプローチは、初期光だけを検出することであるが、これは特に多くの連続する同一ヌクレオチドを有するＤＮＡ配列からのシグナルを損失する不利益がある。
【０１８０】
アンカーパッド間の距離を減らすための第２のアプローチは、反応混合物中のスルフリラーゼの濃度を増加させることである。反応速度ｋPは、スルフリラーゼ濃度に正比例し、そして拡散距離は、ｋP-1/2に比例する。従って、スルフリラーゼ酵素濃度が、４倍の係数で増加した場合、同時に個々のアンカーパッド間の距離は、２倍の係数で減少し得る。
【０１８１】
第３のアプローチは、スルフリラーゼをアンカーパッドの表面に結合することによってスルフリラーゼの有効濃度を増加させることである（本明細書中に記載される他の酵素のためまた働く）。アンカーパッドは、配列決定反応の中心を囲む立方体の表面の１つの壁として近似され得る。このパッドについて１０μｍ×１０μｍの表面を仮定すると、１μＭの濃度を生成するためにパッドに結合された分子の数は、約６００，０００分子である。
【０１８２】
アッセイにおけるスルフリラーゼ濃度は、５ｎＭと推定される。この有効濃度に達するために結合された分子の数は、約３，０００分子である。従って、より多くの酵素分子を結合することで、より大きな有効濃度が、達成される。例えば、１０，０００分子が、１アンカーパッド当たり結合され得る。
【０１８３】
前に推定されたように、各スルフリラーゼ分子は、表面上で６５ｎｍ2の総面積を占める。従って、表面に合計１０，０００のスルフリラーゼ酵素分子を固定する（すなわち、その結果放出された１０，０００のＰＰｉに等しくする）ためには、１．７μｍ2を必要とする。この値は、１０μｍ×１０μｍのアンカーパッド上の利用可能な表面積のわずか約２％である。従って、酵素濃度は、より高い値へ容易に増加し得る。
【０１８４】
個々のアンカーパッド間の距離を減少させ得る第４のアプローチは、水ベースのピロホスフェート配列決定試薬（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）の粘性を増加させる１つ以上の薬剤を利用して、ＰＰｉが拡散するためにかかる時間を著しく増加させることである。しかし、これらの薬剤はまた、同時に、配列決定反応中の他の非固定成分の拡散時間を増加させ、従って全体の反応速度論を緩慢にさせる。従って、これらの薬剤の使用はまた、配列決定反応自体を化学的に妨げるように機能し得る。
【０１８５】
個々のアンカーパッド間の距離を減少させ得る第５の好ましい方法論は、放出されたＰＰｉが側方に拡散することを物理的に防ぐ空間的ジオメトリーにおいてピロホスフェート配列決定反応を行うことである。例えば、光ファイバーバンドルの末端を酸エッチィングすることによって作成される均一な空洞は、そのようなＰＰｉの側方拡散を防ぐため利用され得る（Ｍｉｃｈａｅｌら、１９９８．Ｒａｎｄｏｍｌｙ  Ｏｒｄｅｒｅｄ  Ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ａｒｒａｙｓ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：１２４２−１２４８を参照のこと）。この実施形態において、重要な変数は、ＰＰｉが高さｈの空洞を抜け出すための総拡散時間を含み、ここでｈは、エッチングされた空洞の深さである。この拡散時間は、式：２ＤPｔ＝ｈ2を利用して計算され得る。前述した計算における本発明の好ましいピロホスフェート配列決定反応条件の使用によって、配列決定反応が空洞からのＰＰｉの完全な拡散の前に終了するよう進行するためには、深さ５０μｍの空洞が、必要とされることが示され得る。さらに、この型のジオメトリーは、隣接するアンカープライマーから放出されたＰＰｉからバックグランドシグナルを同時に減少させるというさらなる利点を有する。「チップ」ベースジオメトリー（ここでは、必要とされる配列決定試薬は、固体支持体マトリックス（すなわち、アンカーパッド）の表面上を流される）の使用とは対照的に、酸エッチングされた光ファイバーバンドルの実施形態における種々の配列決定試薬の送達は、酸エッチングされた空洞をｄＮＴＰ／ＡＰＳ／スルフリラーゼ試薬へ交互に、次いで、その後に残留ｄＮＴＰの分解を容易にするためアピラーゼ試薬への浸漬することによって実施される。
【０１８６】
その後、一旦ＡＴＰが、本発明の好ましい反応条件の使用によって形成されると、反応時間（１／ｋA）は、０．２秒であることが示された。この反応時間は、ＰＰｉが自由に拡散する時間よりはるかに低いため、本発明において利用されるアッセイジオメトリーおよび条件に関する前述の結論を何も有意には変更しない。
【０１８７】
バックグランドの光の生成を弱めるため、ルシフェラーゼをＤＮＡ配列決定鋳型の領域に（例えば、固定化または結合によって）「局在させる」ことが、好ましい。ＰＰｉ分子がＡＴＰを形成する前に拡散し得る距離によって描かれる領域に、ルシフェラーゼを局在させることが最も好ましい。ルシフェラーゼを固体支持体マトリックスに結合する方法は、文献において周知である（例えば、Ｗａｎｇら、１９９７．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｉｒｅｆｌｙ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃａｒｂｏｘｙｌ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｏｍａｉｎ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４６：１３３−１３９を参照のこと）。従って、２秒間の拡散時間の間、ルシフェラーゼは、ＤＮＡ鎖の５０μｍの距離内に固定される。しかし、拡散時間を減少させ、そしてルシフェラーゼ結合に必要とされる表面積をさらに限定することが好ましいということに注意するべきである。
【０１８８】
結合に必要なルシフェラーゼの濃度を測定するため、ルシフェラーゼが０．１μｍ  ＡＴＰに対して１０ｍＶの応答を与える濃度で使用されるという以前に、公開された条件は、利用された（Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９６．Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９を参照のこと）。より具体的には、０．２ｍｌ反応容量において、２ｎｇのルシフェラーゼが０．１μＭ  ＡＴＰに対して１０ｍＶの応答を与えることは文献から公知である（ＫａｒａｍｏｈａｍｅｄおよびＮｙｒｅｎ，１９９９．Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｓｕｌｆｕｒｙｌａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ａ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１：８１−８５を参照のこと）。従って、０．２ｍｌの総反応容量内の２０ｎｇのルシフェラーゼの濃度が、これらの以前に公開された文献の条件を再現するため必要とされる。本発明の個々のアンカーパッドのそれぞれの周りの１０μｍ立方体の容量において、１×１０-16ｇのルシフェラーゼ濃度を必要とし、そしてルシフェラーゼの７１ｋＤの分子量に基づいて、この濃度は約１，０００ルシフェラーゼ分子と等しい。上述したように、ルシフェラーゼの表面積は、５０ｎｍ2と計算された。従って、ルシフェラーゼ分子が、ビオチン化され、そしてアンカーパッドに結合されると仮定すると、１，０００分子は、０．０５μｍ2の総面積を占める。これらの計算から、各アンカーパッド領域の面積は１００μｍ2であるので、多量のルシフェラーゼ分子が、アンカーパッドに結合され得ることは、容易に明白となる。
【０１８９】
再び、以前に文献に公開された結果に基づいて、配列決定するには、各ヌクレオチドにつき、全部で約３秒かかる（すなわち、ヌクレオチドを付加するために０．５秒；ＡＴＰを作成するために２秒；蛍光を得るために０．２秒）。従って、１ヌクレオチド当たり約６０秒のサイクル時間が、合理的であり、１配列決定鋳型あたり３０ヌクレオチドの情報を産生するためには、１実験あたり約３０分を必要とする。
【０１９０】
前述の配列決定方法論（すなわち、ポリメラーゼ→ＰＰｉ→スルフリラーゼ→ＡＴＰ→ルシフェラーゼ→光カスケード）に対する代替の実施形態において、ヌクレオチドを成長中のＤＮＡ鎖に組み込む場合、光を発生させる能力を有するポリメラーゼが、（例えば、タンパク質融合の使用などにより）開発され得る。さらなる別の代替の実施形態において、配列決定反応においてＰＰｉの生成を直接測定するセンサーが、開発され得る。ＰＰｉの生成が、周囲の緩衝液の電位を変化させるので、生成されたＰＰｉの濃度を測定するためにこの変化が測定され較正され得る。
【０１９１】
前述のように、ピロホスフェート配列決定反応におけるヌクレオチド配列へのｄＮＴＰのポリメラーゼ媒介組み込みは、無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）部分の放出を引き起こし、この無機ピロホスフェート部分は、次いでルシフェラーゼによる触媒作用を介して光子（すなわち、光）の放出を引き起こす。ピロホスフェート配列決定反応によって生成された光子は、その後、種々の方法論（光電子増倍管、ＣＣＤ、吸光光度計、照度計などを含むが、これらに限定されない）によって、「捕獲」および定量され得る。
【０１９２】
ピロホスフェート配列決定反応によって産生された光子は、集束デバイス（例えば、光学レンズまたは光ファイバー）を通過し、そしてＣＣＤエレメント上に集められる場合にだけ、ＣＣＤによって捕獲される。捕獲されたこれらの光子の割合は、次の計算によって推定され得る。第１に、放射された光子を焦点に集めるレンズは、固体表面（すなわち、ＤＮＡチップまたはエッチングされた光ファイバーウェル）の表面から距離ｒ（ここでｒ＝１ｃｍ）にあり、そして光子が、アレイエレメント上に集められるためには直径ｂ（面積＝πｂ2／４）（ここでｂ＝１００μｍ）の領域を通過しなければならないと、仮定する。放射された光子は、全ての方向に等しく逃れるべきであることもまた、注意すべきである。距離ｒで、光子は、４πｒ2と等しい面積上に散らばる。従って、レンズを通過する光子の割合は、以下によって記述される：（１／２）［１−（１＋ｂ2／４ｒ2）1/2］。ｒの値が、ｂの値よりもずっと大きい場合、レンズを通過する割合は、以下によって記述される：ｂ2／１６ｒ2。前述したｒおよびｂの値に対して、光子のこの割合は、６×１０-6である。
【０１９３】
各ヌクレオチド付加に対して、約１０，０００ＰＰｉ分子が、産生されると予想され、そして全てが、スルフリラーゼおよびルシフェラーゼによって変換される場合、これらのＰＰｉは、約１×１０4光子の放射を生じる。平坦アレイ（例えば、ＤＮＡチップ）を利用する場合、続く光子の「捕獲」および定量を最大にするために、平坦固体支持体（例えば、カバースリップ）の直近で光子を収集することが好ましい。これは、以下：（ｉ）カバースリップと伝統的な光学レンズまたは光ファイバーバンドルとの間に光学液浸オイルを使用すること、または好ましくは、（ｉｉ）光ファイバーを直接カバースリップ自体に組み込むことのいずれかによって成し遂げられ得る。前述した計算（この場合、ｂ＝１００μｍおよびｒ＝５０μｍ）を実施して、収集された割合は、０．１５であることが見出された、これは約１×１０3個の光子の捕獲に等しい。この値は、適正シグナルを提供するには十分である。
【０１９４】
次の実施例は、本発明の例示のためであって、本発明を限定することを意味しない。
【０１９５】
（実施例１．空洞化末端光ファイバーアレイに連結されたアンカープライマーの構築）
薄いウェーハ光ファイバーアレイの末端は、Ｈｅａｌｅｙら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：２２１３−２２１６（１９９７）によって記載されるように末端を酸に挿入することによって空洞化した。
【０１９６】
光活性化可能ビオチンアナログの薄層を、ＨｅｎｇｓａｋｕｌおよびＣａｓｓ（Ｂｉｏｃｏｎｇｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．７：２４９−２５４，１９９６）に記載のように空洞化表面上で乾燥させ、そして規定されたパッドまたは活性ビオチンの領域を作成するためにマスクを通して白色光に曝す。次に、アビジンを加え、そしてビオチンに結合させる。次いで、ビオチン化オリゴヌクレオチドを加える。アビジンは、ビオチン−アビジン−ビオチン連結を介してビオチン化オリゴヌクレオチドを固定化し得る遊離ビオチン結合部位を有する。
【０１９７】
パッドは、１００μｍの間隔で片面に約１０μｍである。パッドの約３７％が、１つの固定されたプライマーを含むようにオリゴヌクレオチドを、付加する。１ｃｍ表面上に１０，０００パッドが置かれる。これは、単一アンカープライマーを有する約３７００パッドを生じる。スルフリラーゼ、アピラーゼおよびルシフェラーゼもまた、ビオチン−アビジンを使用して空洞基板に取りつけられる。
【０１９８】
（実施例２．環状核酸ライブラリーのメンバーのアニールおよび増幅）
開環ライブラリー鋳型のライブラリーを、７０ｂｐ  Ｓａｕ３Ａ１−ＭｓｐＩ断片上に単一ヌクレオチド多形性を含むと疑われる核酸の集団から調製する。鋳型は、アンカープライマーに相補的なアダプター、配列決定プライマーに相補的な領域、および特徴付けられるべき挿入配列を含む。ライブラリーを、ゲノムＤＮＡを消化するＳａｕ３Ａ１およびＭｓｐＩを使用して産生する。インサート（約６５〜７５ヌクレオチド）を選択し、そしてアダプターオリゴヌクレオチド（１２ヌクレオチド長）に連結する。アダプターオリゴヌクレオチドは、実施例１に記載の基板表面に連結したアンカープライマーの配列に相補的な配列を有する。
【０１９９】
ライブラリーを、アンカープライマーのアレイにアニールする。ＤＮＡポリメラーゼをｄＮＴＰと共に加え、アンカープライマーを伸張させるためローリングサークル複製を使用する。環状鋳型の多数のコピーの連接である、なお固体支持体に固定化された１本鎖ＤＮＡを生じる。百ヌクレオチドサイズの範囲に１０，０００コピー以上の環状鋳型。
【０２００】
（実施例３．光ファイバー基板の末端に連結された核酸の配列分析）
実施例２に記載するような増幅した核酸を含む光ファイバーアレイウェーハを、灌流チャンバ内に配置し、そして光ファイバーアレイのバンドルに取りつける。そのアレイ自身を、１６，０００，０００ピクセルＣＣＤカメラに連結する。配列決定プライマーを、灌流チャンバへ送達し、そして増幅した配列をアニールさせる。
【０２０１】
配列決定プライマーは、図１に示すように、多形性を有すると疑われるインサート中へ伸長するＤＮＡ合成をプライム化する。まず、灌流チャンバ内へ洗浄溶液、ＤＮＡポリメラーゼ、そしてｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、またはαｄＡＴＰ（ｄＡＴＰアナログ）の１つを順次送達することによって配列決定プライマーを、伸長させる。末端に取りつけたスルフリラーゼ、ルシフェラーゼおよびアピラーゼは、配列決定反応の１部として遊離されたＰＰｉを検出可能な光へ変換する。存在するアピラーゼは、未反応のｄＮＴＰを分解する。光は、代表的には、画像化ファイバーバンドルに連結されたＣＣＤカメラによって３秒間（１〜１００秒ではあるが、例えば、２〜１０秒もまた、適切である）収集され、その後、過剰ヌクレオチドおよび副産物を除去するためにさらなる洗浄溶液を灌流チャンバへ加える。次いで、次のヌクレオチドをポリメラーゼと共に加え、それによってこのサイクルを繰り返す。
【０２０２】
洗浄中、収集した光画像を、ＣＣＤカメラからコンピューターへ移す。光放射を、コンピューターによって分析し、対応するｄＮＴＰが、伸長された配列プライマーへ組み込まれたかどうかを測定するため使用する。ｄＮＴＰおよびピロホスフェート配列決定試薬の添加を、疑われる多形性を含むインサート領域の配列が得られるまで繰り返す。必要に応じて、配列決定プライマーを、ウェーハに結合する前に、増幅された配列にアニールする。
【０２０３】
（実施例４．ローリングサークル増幅を使用して産生された縦列反復鋳型の配列分析）
配列５’−ｇＡＣ  ＣＴＣ  ＡＣＡ  ＣｇＡ  Ｔｇｇ  ＣＴｇ  ＣＡｇ  ＣＴＴ−３’（配列番号２）を有するプライマーを、配列５’−ＴＣｇ  ＴｇＴ  ｇＡｇ  ｇＴＣ  ＴＣＡ  ｇＣＡ  ＴＣＴ  ＴＡＴ  ｇＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＡ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＴＴＣ  ＴＣＡ  ｇＴＴ  ｇＣＣ  ＴＡＡ  ｇＣＴ  ｇＣＡ  ｇＣＣ  Ａ−３’（配列番号８）を有する８８ヌクレオチド鋳型分子へアニールした。鋳型のプライマーへのアニールは、鋳型分子の５’末端および３’末端の並置状態を生じた。アニールした鋳型を、リガーゼに曝した。リガーゼは、鋳型の５’末端および３’末端の連結を生じて環状分子を産生した。
【０２０４】
アニールしたプライマーを、３７℃、１２時間のローリングサークル増幅においてクレノウ断片およびヌクレオチドを使用して伸長させた。産物を、ＳＰＲＩビーズ（Ｓｅｒａｄｙｎｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して精製した。ローリングサークル増幅は、環状鋳型配列に相補的な配列の縦列反復の形成を生じた。
【０２０５】
伸長された配列の縦列反復産物を、配列５’−ＡＡｇＣＴｇＣＡｇＣＣＡＴＣｇＴｇＴｇＡｇｇ−３’（配列番号８）を有する配列決定プライマーをアニールし、そしてアニールしたプライマーを、１Ｍベタインの存在下でＥＴ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して９５℃、１分、２０秒、６０℃のサイクルに交互に４０回供することにより同定した。
【０２０６】
次いで、配列決定産物を、１／５容量に希釈し、Ｇ−５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム上で精製した後、直鎖ポリアクリルアミドと共にＭｅｇａＢＡＣＥ配列決定システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に注入した。
【０２０７】
配列決定分析の通電クロマトグラフィーを、図５に示す。軌跡は、８８塩基対環状鋳型分子の多数コピーが縦列に生じること、およびこれらのコピーがＤＮＡ配列決定反応において検出され得ることを示す。
【０２０８】
（他の実施形態）
本発明は、本発明の詳細な説明と共に記述されているが、その詳細な説明は、本発明の範囲を例示することを意図されるのであって、本発明の範囲を限定することを意図されず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって規定されることを、理解するべきである。他の局面、利点および改変は、本願発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ〜Ｄは、アンカープライマーを用いたローリングサークルを基にした増幅の略図である。
【図２】  図２は、本発明による配列決定装置の図面である。
【図３】  図３は、本発明による灌流チャンバーの図面である。
【図４】  図４は、本発明の空洞化された光ファイバー末端の図面である。
【図５】  図５は、ローリングサークル増幅を用いて生成されたコンカテマー鋳型の配列出力の追跡である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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