(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１のＧａｇタンパク質の機能性部分と少なくとも１の逆転写酵素および／またはインテグラーゼの機能性部分とを含む少なくとも１つの融合タンパク質をコードする少なくとも１の第１の核酸セグメントであって、前記セグメントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作用で発現することができ、Ｇａｇの前記機能性部分はさらに、前記細胞内で産生されるトランスレンチウイルス粒子内への前記逆転写酵素および／または前記インテグラーゼの取り込みをもたらすことができる、第１の核酸セグメントと、
（ｂ）少なくとも１のＧａｇの機能性部分と少なくとも１のプロテアーゼの機能性部分とをコードする少なくとも１の第２の核酸セグメントであって、前記第２のセグメントが前記第１のセグメントと同じ核酸ストランドまたは前記第１のセグメントとは異なる核酸ストランド上に設けられ、前記第２のセグメントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作用で発現することができ、前記Ｇａｇおよびプロテアーゼの前記機能性部分が、ＲＮＡのパッケージング、粒子形成およびタンパク質分解的切断を行う、第２の核酸セグメントと
を含むトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項２】
少なくとも１つの目的タンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも１の第３の核酸セグメントをさらに含み、前記第３のセグメントが、パッケージング、逆転写および組み込みのためにシス的に作用する核酸配列をさらに含み、前記第３のセグメントは、該セグメントの逆転写されたＤＮＡ産物が宿主ゲノムの核酸配列に組み込まれることを支援し得る十分な長末端反復核酸配列をさらに含む、請求項１に記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項３】
少なくとも１つの目的タンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも１の第４の核酸セグメントをさらに含み、前記第４のセグメントが、パッケージング、逆転写および組み込みのためにシス的に作用する核酸配列をさらに含み、前記第４のセグメントは、該セグメントの逆転写されたＤＮＡ産物が宿主ゲノムの核酸配列に組み込まれることを支援し得る十分な長末端反復核酸配列をさらに含む、請求項２に記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項４】
核酸プロモーター配列と、前記第４のセグメントの細胞内への形質導入を促進する核酸配列とをさらに含む、請求項３に記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項５】
前記形質導入を促進する核酸配列が、ＰＰＴ−ＣＴＳおよびＷＰＲＥからなる群から選択される、請求項４に記載のトランスレンチウイルスベクター。
【請求項６】
前記Ｇａｇタンパク質および／または前記プロテアーゼの前記機能性部分がレトロウイルスのＧａｇ配列およびプロテアーゼ配列に由来する、請求項１〜４のいずれかに記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項７】
前記レトロウイルスが、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＩＡＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶおよびＭＬＶからなる群から選択される請求項６に記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項８】
（ａ）少なくとも１のＧａｇタンパク質の機能性部分と少なくとも１の逆転写酵素および／またはインテグラーゼの機能性部分とを含む少なくとも１つの融合タンパク質をコードする少なくとも１の第１の核酸セグメントであって、前記セグメントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作用で発現することができ、Ｇａｇの前記機能性部分はさらに、前記細胞内で産生されるトランスレンチウイルス粒子内への前記逆転写酵素および／または前記インテグラーゼの取り込みをもたらすことができる、少なくとも１の第１の核酸セグメントと、
（ｂ）少なくとも１のＧａｇの機能性部分と少なくとも１のプロテアーゼの機能性部分とをコードする少なくとも１の第２の核酸セグメントであって、前記第２のセグメントが前記第１のセグメントと同じ核酸ストランドまたは前記第１のセグメントとは異なる核酸ストランド上に設けられ、前記第２のセグメントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作用で発現することができ、前記Ｇａｇおよびプロテアーゼの前記機能性部分が、ＲＮＡのパッケージング、粒子形成およびタンパク質分解的切断を行う、第２の核酸セグメントと
を含むトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項９】
ウイルスのエンベロープ遺伝子をコードする核酸配列を含む少なくとも１の第３の核酸セグメントをさらに含み、前記第３のセグメントが前記第１の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントとは異なる核酸ストランドまたは前記第１の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントと同じ核酸ストランド上に設けられる、請求項８に記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項１０】
少なくとも１つの目的タンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも１の第４の核酸セグメントをさらに含み、前記第４のセグメントは、パッケージング、逆転写および組み込みのためにシス的に作用する核酸配列をさらに含み、前記第４のセグメントは、該セグメントの逆転写されたＤＮＡ産物が宿主ゲノムの核酸配列に組み込まれることを支援し得る十分な長末端反復核酸配列をさらに含む、請求項９に記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項１１】
核酸プロモーター配列と、前記第４のセグメントの細胞内への形質導入を促進する核酸配列とをさらに含む、請求項１０に記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項１２】
前記形質導入を促進する核酸配列が、ＰＰＴ−ＣＴＳおよびＷＰＲＥからなる群から選択される、請求項１１に記載のトランスレンチウイルスベクター。
【請求項１３】
前記Ｇａｇタンパク質および／または前記プロテアーゼの前記機能性部分がレトロウイルスのＧａｇ配列およびプロテアーゼ配列に由来する、請求項８〜１０のいずれかに記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項１４】
前記レトロウイルスが、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＩＡＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶおよびＭＬＶからなる群から選択される、請求項１３に記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項１５】
（ａ）少なくとも１のＧａｇタンパク質の機能性部分と少なくとも１の逆転写酵素および／またはインテグラーゼの機能性部分とを含む少なくとも１つの融合タンパク質をコードする少なくとも第１の核酸セグメントであって、前記セグメントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作用で発現することができ、Ｇａｇの前記機能性部分はさらに、前記細胞内で産生されるトランスレンチウイルス粒子内への前記逆転写酵素および／または前記インテグラーゼの取り込みをもたらすことができる、第１の核酸セグメントと、
（ｂ）少なくとも１のＧａｇの機能性部分と少なくとも１のプロテアーゼの機能性部分とをコードする少なくとも１の第２の核酸セグメントであって、前記第２のセグメントが前記第１のセグメントと同じ核酸ストランドまたは前記第１のセグメントとは異なる核酸ストランド上に設けられ、前記第２のセグメントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作用で発現することができ、前記Ｇａｇおよびプロテアーゼの前記機能性部分が、ＲＮＡのパッケージング、粒子形成およびタンパク質分解的切断を行う、第２の核酸セグメントと、
（ｃ）ウイルスのエンベロープ遺伝子をコードする核酸配列を含む少なくとも１の第３の核酸セグメントであって、前記第３のセグメントが前記第１の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントとは異なる核酸ストランドまたは前記第１の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントと同じ核酸ストランド上に設けられる、少なくとも１の第３の核酸セグメントと
を含むトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項１６】
少なくとも１つの目的タンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも１の第４の核酸セグメントをさらに含み、前記第４のセグメントは、パッケージング、逆転写および組み込みのためにシス的に作用する核酸配列をさらに含み、前記第４のセグメントは、該セグメントの逆転写されたＤＮＡ産物が宿主ゲノムの核酸配列に組み込まれることを支援し得る十分な長末端反復核酸配列をさらに含む、請求項１５に記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項１７】
核酸プロモーター配列と、前記第４のセグメントの細胞内への形質導入を促進する核酸配列とをさらに含む、請求項１６に記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項１８】
前記形質導入を促進する核酸配列が、ＰＰＴ−ＣＴＳおよびＷＰＲＥからなる群から選択される、請求項１７のトランスレンチウイルスベクター。
【請求項１９】
前記Ｇａｇタンパク質および／または前記プロテアーゼの前記機能性部分がレトロウイルスのＧａｇ配列およびプロテアーゼ配列に由来する、請求項１５または１６のいずれかに記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項２０】
前記レトロウイルスが、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＩＡＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶおよびＭＬＶからなる群から選択される、請求項１９に記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項２１】
（ａ）少なくとも１のＧａｇタンパク質の機能性部分と少なくとも１の逆転写酵素および／またはインテグラーゼの機能性部分とを含む少なくとも１つの融合タンパク質をコードする少なくとも１の第１の核酸セグメントであって、前記セグメントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作用で発現することができ、Ｇａｇの前記機能性部分はさらに、前記細胞内で産生されるトランスレンチウイルス粒子内への前記逆転写酵素および／または前記インテグラーゼの取り込みをもたらすことができる、第１の核酸セグメントと、
（ｂ）少なくとも１のＧａｇの機能性部分と少なくとも１のプロテアーゼの機能性部分とをコードする少なくとも１の第２の核酸セグメントであって、前記第２のセグメントが前記第１のセグメントと同じ核酸ストランドまたは前記第１のセグメントとは異なる核酸ストランド上に設けられ、前記第２のセグメントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作用で発現することができ、前記Ｇａｇおよびプロテアーゼの前記機能性部分が、ＲＮＡのパッケージング、粒子形成およびタンパク質分解的切断を行う、第２の核酸セグメントと、
（ｃ）ウイルスのエンベロープ遺伝子をコードする核酸配列を含む少なくとも１の第３の核酸セグメントであって、前記第３のセグメントが前記第１の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントとは異なる核酸ストランドまたは前記第１の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントと同じ核酸ストランド上に設けられる、少なくとも１の第３の核酸セグメントと、
（ｄ）少なくとも１つの目的タンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも１の第４の核酸セグメントであって、前記第４のセグメントは、パッケージング、逆転写および組み込みのためにシス的に作用する核酸配列をさらに含み、前記第４のセグメントは、該セグメントの逆転写されたＤＮＡ産物が宿主ゲノムの核酸配列に組み込まれることを支援し得る十分な長末端反復核酸配列をさらに含む、少なくとも１の第４の核酸セグメントと
を含むトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項２２】
請求項２１に記載の（ｄ）に関して、核酸プロモーター配列と、前記第４のセグメントの細胞内への形質導入を促進する核酸配列とをさらに含む、請求項２１に記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項２３】
前記形質導入を促進する核酸配列が、ＰＰＴ−ＣＴＳおよびＷＰＲＥからなる群から選択される、請求項２２のトランスレンチウイルスベクター。
【請求項２４】
前記Ｇａｇタンパク質および／または前記プロテアーゼの前記機能性部分がレトロウイルスのＧａｇ配列およびプロテアーゼ配列に由来する請求項２１に記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項２５】
前記レトロウイルスが、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＩＡＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶおよびＭＬＶからなる群から選択される、請求項２４に記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項２６】
前記タンパク質が少なくともウイルスアセンブリーおよび核酸パッケージングに関してトランス作用で発現したときに、前記融合タンパク質が、レトロウイルスビリオン、ビリオン様粒子またはトランスレンチベクター粒子に取り込まれ得る、請求項１、８、１５または２１のいずれかに記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項２７】
前記（ａ）の核酸セグメントが、発現可能なｒｅｖタンパク質をコードするｒｅｖ核酸配列をさらに含む請求項１、８、１５または２１のいずれかに記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項２８】
薬学的に受容可能な担体と関連して前記ベクターの効果的な量を含み、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の感染性を低下させることができる、請求項１、８、１５または２１のいずれかに記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項２９】
前記第４のセグメントと同じ核酸ストランドまたは前記第４のセグメントとは異なる核酸ストランド上に設けられる核酸セグメントであって、マーカータンパク質をコードする遺伝子を含む核酸セグメントをさらに含み、前記遺伝子が、β−ｇａｌ、蛍光タンパク質およびルシフェラーゼからなる群から選択される、請求項３、１０、１６または２１のいずれかに記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項３０】
前記目的タンパク質をコードする前記配列が前記第４のセグメント上に設けられ、前記コードされるタンパク質が、ウイルス阻害性タンパク質および治療タンパク質からなる群から選択される、請求項３、１０、１６または２１のいずれかに記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項３１】
（ａ）と同じ核酸ストランドまたは（ａ）とは異なる核酸ストランド上に設けられる核酸セグメントであって、ｇａｇ、エンベロープ、ｎｅｆおよびｖｉｆからなる群から選択されるウイルス遺伝子に由来する抗原タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸セグメントをさらに含む、請求項１、８、１６または２１のいずれかに記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項３２】
前記コードされる目的タンパク質が、ネオマイシン、ヒグロマイシンおよびピューロマイシンからなる群から選択される細菌の耐性タンパク質である、請求項３、１０、１６または２１のいずれかに記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項３３】
前記第１の核酸セグメント、前記第２の核酸セグメント、前記第３の核酸セグメントまたは前記第４の核酸セグメントの少なくとも１つに作動可能に結合されたプロモーターをさらに含み、前記プロモーターが、ＨＩＶプロモーター、非ＨＩＶプロモーター、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターからなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１、３、８、１０、１５、１６または２１のいずれかに記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項３４】
前記第１の核酸セグメント、前記第２の核酸セグメント、前記第３の核酸セグメントまたは前記第４の核酸セグメントの少なくとも１つに作動可能に結合されたポリＡシグナルをさらに含み、前記ポリＡが、非ＨＩＶポリＡ、ＳＶ４０ポリＡおよび非レンチウイルスポリＡからなる群から選択される、請求項３、１０、１６または２１のいずれかに記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
【請求項３５】
トランスレンチウイルスベクターシステムを産生する方法であって、
（ａ）少なくとも１のＧａｇタンパク質の機能性部分と少なくとも１の逆転写酵素および／またはインテグラーゼの機能性部分とを含む少なくとも１つの融合タンパク質をコードする少なくとも１の第１の核酸セグメントであって、前記セグメントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作用で発現することができ、Ｇａｇの前記機能性部分はさらに、前記細胞内で産生されるトランスレンチウイルス粒子内への前記逆転写酵素および／または前記インテグラーゼの取り込みをもたらし得る、第１の核酸セグメントを提供するステップと、
（ｂ）少なくとも１のＧａｇの機能性部分と少なくとも１のプロテアーゼの機能性部分とをコードする少なくとも１の第２の核酸セグメントであって、前記第２のセグメントが前記第１のセグメントと同じ核酸ストランドまたは前記第１のセグメントとは異なる核酸ストランド上に設けられ、前記第２のセグメントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作用で発現することができ、前記Ｇａｇおよびプロテアーゼの前記機能性部分が、ＲＮＡのパッケージング、粒子形成およびタンパク質分解的切断を行う、少なくとも１の第２の核酸セグメントを提供するステップと、
（ｃ）ウイルスのエンベロープ遺伝子をコードする核酸配列を含む第３の核酸セグメントであって、前記第３のセグメントが前記第１の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントとは異なる核酸ストランドまたは前記第１の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントと同じ核酸ストランド上に設けられる、少なくとも１の第３の核酸セグメントを提供するステップと、
（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の前記核酸を哺乳動物細胞と接触させ、前記細胞を前記核酸でトランスフェクションするステップと、
（ｅ）前記融合タンパク質を含有するウイルス粒子を前記細胞から産生させるステップと
を含む方法。
【請求項３６】
少なくとも１つの目的タンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも１の第４の核酸セグメントであって、前記第４のセグメントは、パッケージング、逆転写および組み込みのためにシス的に作用する核酸配列をさらに含み、前記第４のセグメントは、該セグメントの逆転写されたＤＮＡ産物が宿主ゲノムの核酸配列に組み込まれることを支援し得る十分な長末端反復核酸配列をさらに含む、少なくとも１の第４の核酸セグメントを提供するステップを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第４のセグメントが、核酸プロモーター配列と、前記第４のセグメントの細胞内への形質導入を促進する核酸配列とをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記形質導入を促進する核酸配列が、ＰＰＴ−ＣＴＳおよびＷＰＲＥからなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
トランスレンチウイルスベクターシステムを作製する方法であって、
（ａ）少なくとも１のＧａｇタンパク質の機能性部分と少なくとも１の逆転写酵素および／またはインテグラーゼの機能性部分とを含む少なくとも１つの融合タンパク質をコードする少なくとも１の第１の核酸セグメントであって、前記セグメントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作用で発現することができ、Ｇａｇの前記機能性部分はさらに、前記細胞内で産生されるトランスレンチウイルス粒子内への前記逆転写酵素および／または前記インテグラーゼの取り込みをもたらし得る、少なくとも１の第１の核酸セグメントを提供するステップと、
（ｂ）少なくとも１のＧａｇの機能性部分と少なくとも１のプロテアーゼの機能性部分とをコードする少なくとも１の第２の核酸セグメントであって、前記第２のセグメントが前記第１のセグメントと同じ核酸ストランドまたは前記第１のセグメントとは異なる核酸ストランド上に設けられ、前記第２のセグメントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作用で発現することができ、前記Ｇａｇおよびプロテアーゼの前記機能性部分が、ＲＮＡのパッケージング、粒子形成およびタンパク質分解的切断を行う、少なくとも１の第２の核酸セグメントを提供するステップと、
（ｃ）少なくとも１つの目的タンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも１の第３の核酸セグメントであって、前記第３のセグメントは、パッケージング、逆転写および組み込みのためにシス的に作用する核酸配列をさらに含み、前記第３のセグメントは、該セグメントの逆転写されたＤＮＡ産物が宿主ゲノムの核酸配列に組み込まれることを支援し得る十分な長末端反復核酸配列をさらに含む、少なくとも１の第３の核酸セグメントを提供するステップと、
（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の前記核酸を哺乳動物細胞と接触させ、前記細胞を前記核酸でトランスフェクションするステップと、
（ｅ）前記融合タンパク質を含有するウイルス粒子を前記細胞から産生させるステップと
を含む方法。
【請求項４０】
ウイルスのエンベロープ遺伝子をコードする核酸配列を含む少なくとも１の第４の核酸セグメントであって、前記第４のセグメントが前記第１の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントとは異なる核酸ストランドまたは前記第１の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントと同じ核酸ストランド上に設けられる、少なくとも１の第４の核酸セグメントを提供するステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第３のセグメントが、核酸プロモーター配列と、前記第４のセグメントの細胞内への形質導入を促進する核酸配列とをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記形質導入を促進する核酸配列が、ＰＰＴ−ＣＴＳおよびＷＰＲＥからなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
トランスレンチウイルスベクターシステムを作製する方法であって、
（ａ）少なくとも１のＧａｇタンパク質の機能性部分と少なくとも１の逆転写酵素および／またはインテグラーゼの機能性部分とを含む少なくとも１つの融合タンパク質をコードする少なくとも１の第１の核酸セグメントであって、前記セグメントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作用で発現することができ、Ｇａｇの前記機能性部分はさらに、前記細胞内で産生されるトランスレンチウイルス粒子内への前記逆転写酵素および／または前記インテグラーゼの取り込みをもたらし得る、少なくとも１の第１の核酸セグメントを提供するステップと、
（ｂ）少なくとも１のＧａｇの機能性部分と少なくとも１のプロテアーゼの機能性部分とをコードする少なくとも１の第２の核酸セグメントであって、前記第２のセグメントが前記第１のセグメントと同じ核酸ストランドまたは前記第１のセグメントとは異なる核酸ストランド上に設けられ、前記第２のセグメントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作用で発現することができ、前記Ｇａｇおよびプロテアーゼの前記機能性部分が、ＲＮＡのパッケージング、粒子形成およびタンパク質分解的切断を行う、少なくとも１の第２の核酸セグメントを提供するステップと、
（ｃ）ウイルスのエンベロープ遺伝子をコードする核酸配列を含む少なくとも１の第３の核酸セグメントであって、前記第３のセグメントが前記第１の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントとは異なる核酸ストランドまたは前記第１の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントと同じ核酸ストランド上に設けられる、少なくとも１の第３の核酸セグメントを提供するステップと、
（ｄ）少なくとも１つの目的タンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも１の第４の核酸セグメントであって、前記第４のセグメントは、パッケージング、逆転写および組み込みのためにシス的に作用する核酸配列をさらに含み、前記第４のセグメントは、該セグメントの逆転写されたＤＮＡ産物が宿主ゲノムの核酸配列に組み込まれることを支援し得る十分な長末端反復核酸配列をさらに含む、第４の核酸セグメントを提供するステップと、
（ｅ）前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の核酸を哺乳動物細胞と接触させ、前記細胞を前記核酸でトランスフェクションするステップと、
（ｆ）前記融合タンパク質を含有するウイルス粒子を前記細胞から産生させるステップと
を含む方法。
【請求項４４】
前記第４のセグメントが、核酸プロモーター配列と、前記第４のセグメントの細胞内への形質導入を促進する核酸配列とをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記形質導入を促進する核酸配列が、ＰＰＴ−ＣＴＳおよびＷＰＲＥからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記（ａ）の核酸セグメントがｒｅｖタンパク質をさらにコードする、請求項３５または３９に記載の方法。
【請求項４７】
薬学的に受容可能な担体と関連して前記ベクターの効果的な量を含み、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の感染性を低下させることができる、請求項３６、３９または４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記第４のセグメント上に設けられる核酸セグメントであって、マーカータンパク質をコードする核酸配列を含む核酸セグメントをさらに含み、前記マーカータンパク質が、β−ｇａｌ、蛍光タンパク質およびルシフェラーゼからなる群から選択される、請求項３６、４０または４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記第４の核酸セグメントが、ウイルス阻害性タンパク質および治療タンパク質からなる群から選択される目的タンパク質をコードする、請求項３６、４０または４３に記載の方法。
【請求項５０】
前記第４の核酸セグメントが、ネオマイシン、ヒグロマイシンおよびピューロマイシンからなる群から選択される少なくとも１つの薬物耐性タンパク質をコードする、請求項３６、４０または４３に記載の方法。
【請求項５１】
前記第１の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントの少なくとも１つに作動可能に結合されたプロモーターであって、ＨＩＶプロモーター、非ＨＩＶプロモーター、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターからなる群から選択される核酸配列を含むプロモーターを提供するステップをさらに含む、請求項３６、３９または４３に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１の核酸セグメント、前記第２の核酸セグメント、前記第３の核酸セグメントまたは前記第４の核酸セグメントの少なくとも１つに作動可能に結合されたポリＡシグナルであって、非ＨＩＶポリＡ、ＳＶ４０ポリＡおよび非レンチウイルスポリＡからなる群から選択されるポリＡを提供するステップをさらに含む、請求項３６、３９または４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、１９９７年９月２９日に出願された一部継続特許出願番号第０８／９４７，５１６号である１９９８年６月３日に出願された一部継続特許出願番号第０９／０８９，９００号であり、そして特許出願第０８／４２１，９８２号の包袋継続であり、その全ては、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、一般に、分子ウイルス学およびタンパク質化学の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、ヒトおよびシミアン免疫不全ウイルス（ＨＩＶ／ＳＩＶ）Ｇａｇタンパク質の使用、またはタンパク質／ペプチドのビリオンまたはウイルス様粒子への輸送のためのビヒクルとしてそれらのパッケージングを指向するアミノ酸残基およびその使用に関する。
【０００３】
［発明の背景］
単純レトロウイルスと異なり、ヒトおよびシミアン免疫不全ウイルス（ＨＩＶ／ＳＩＶ）は、ウイルス粒子にパッケージ化されるＧａｐ、ＰｏｌおよびＥｎｖに加えてタンパク質をコードする。これらには、全ての霊長類レンチウイルスに存在するＶｐｒタンパク質、およびＨＩＶ−２／ＳＩＶSM／ＳＩＶMAC群のウイルスに特徴的であるＶｐｘタンパク質が挙げられる。ＶｐｒおよびＶｐｘは、感染ビリオンに存在するので、それらは、ウイルスのライフサイクルにおいて、初期に重要な役割を果すと長年考えられた。実際に、ＨＩＶ−１の最近の研究では、Ｖｐｒが、求核特性を示し、マトリックスタンパク質と一緒に、マクロファージのような非分裂細胞におけるウイルス予備組込複合体の核輸送を促進することが示された。同様に、Ｖｐｘを欠損するＨＩＶ−２は、複製カイネティクスが遅延されることを示し、そして末梢血単核細胞での生産感染を生じさせ、維持するのに２〜３桁より多くのウイルスを必要とすることを示した。したがって、両方のアクセサリータンパク質は、一次標的細胞における有効な複製およびＨＩＶ／ＳＩＶの拡大のために重要であると考えられる。
【０００４】
レトロウイルス粒子への外来タンパク質の組込みは、ｇａｇとの融合により先に報告されてきた。酵母レトロトランスポゾンＴｙｌは、ウイルス性の複製に干渉するレトロウイルスアセンブリーモデルとして試験された。（Ｇ．Ｎａｔｓｏｕｌｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２巻：６３２−５頁、１９９１年）。さらに最近、ネズミのレトロウイルスのカプシド−ストレプトコッカスのヌクレアーゼ融合タンパク質の発現は、組織培養細胞でのネズミ白血病ウイルスの複製を阻害することが分かった。Ｇａｐ−ストレプトコッカスのヌクレアーゼの発現は、ウイルス力価を減少させ、そして抗−ＨＩＶ攻略法を推進するウイルス感染性を減少させる。（Ｇ．Ｓｃｈｕｍａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０巻：４３２９３７頁、１９９６年）。
【０００５】
レンチウイルスベクター、特にＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶに基づくものは、非分裂細胞型への安定に組込まれるという魅力的な特性により、遺伝子療法において有用である（Ｎａｌｄｉｎｉ、Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２巻：２６３−２６７頁、１９９６年；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１巻：５５７９−５５９２頁、１９９７年；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９巻：２３４−２３８頁、１９９３年）。ヒト治療法のためのレンチウイルスに基づくベクター使用の利用性は、安全なレンチウイルスに基づくベクターの開発を必要とする。ＨＩＶビリオンに関連したアクセサリータンパク質（ＶｐｒおよびＶｐｘ）は、ウイルスおよび非ウイルスの両方の起源のタンパク質をＨＩＶ粒子に送達するビヒクルとして有用であることが知られている（Ｌｉｕ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９巻：７６３０−７６３８頁、１９９５年；Ｌｉｕ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１巻：７７０４−７７１０頁、１９９７年；Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８巻：６１６１−６１６９頁、１９９４年；Ｗｕ，Ｘ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １６巻：５１１３−５１２２頁、１９９７年；Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０巻：３３７８−３３８４頁、１９９６年）。最近、我々は、トランス−ＲＴおよびＩＮが、シス−ＲＴおよびＩＮ（Ｇａｇ−Ｐｏｌから由来した）を模倣することを示した。トランス−ＲＴおよびＩＮタンパク質は、全てのライフサイクルを通してＲＴ−ＩＮマイナス・プロウイルスに由来するビリオンの感染および複製を有効に救済する（Ｌｉｕ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１巻：７７０４−７７１０頁、１９９７年；Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８巻：６１６１−６１６９頁、１９９４年）。さらに、これらの発見は、切断Ｇａｇ−Ｐｏｌ前駆体ポリタンパク質（Ｇａｇ−Ｐｒｏ）が、ＲＴおよびＩＮの機能がトランスで提供される場合に感染性粒子の形成を支持することを示す。この発見は、全長のＧａｇ−Ｐｏｌ前駆体が、感染性粒子の形成に必要とされないことを、レンチウイルスについて最初に示した。我々のデータは、トランスＶｐｒ−ＲＴ−ＩＮ、またはＶｐｒ−ＩＮと一緒のＶｐｒ−ＲＴが、十分に機能し、そしてウイルス感染性、プロウイルス性ＤＮＡの組込み、およびＲＴ欠損、ＩＮ欠損およびＲＴ−ＩＮ欠損ウイルスの複製（１サイクルの間に）を支持することも示す（Ｌｉｕ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１巻：７７０４−７７１０頁、１９９７年；Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８巻：６１６１−６１６９頁、１９９４年）。我々のデータは、酵素活性のあるＲＴが、ビリオンへの組込みのためにＶｐｒを必要としないことを示すことにも注目すべきである（図１９ＡおよびＢ）。ＲＴは、Ｖｐｒの融合パートナーとして発現することなくとも、トランスで発現される場合にＨＩＶ−１ビリオンに組込まれうる。これらのデータは、これらの重要な酵素の機能が、トランスで供され、発現のためのそれらの正常な機構、およびＧａｇ−Ｐｏｌ前駆体タンパク質の成分としてのビリオン組込みから独立していることを示す。
【０００６】
先行技術は、ビリオンに対して外来のタンパク質、すなわち毒性のタンパク質を送達またはターゲティングする有効な手段が欠如している。本発明は、当分野でのこの長年の必要および所望を満たす。
【０００７】
［発明の要約］
本発明は、Ｇａｇおよび／またはＧａｇ変異体が、ウイルスおよび非ウイルス性起源のタンパク質を、ＨＩＶ／ＳＩＶビリオンに標的化するビヒクルとして使用できる。Ｇａｇ遺伝子融合体は、細菌性ストレプトコッカスのヌクレアーゼ（ＳＮ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、逆転写酵素（ＲＴ）、インテグラーゼ（ＩＮ）およびそれらの組合せで構築された。Ｇａｇ部分を含む融合タンパク質は、トランスでの発現により、生来のウイルス性ゲノムに対するＨＩＶ粒子にパッケージングされる。
【０００８】
Ｇａｇ融合タンパク質が構築され、そしてＨＩＶ粒子に包装するそれらの能力が示された。本発明は、Ｇａｇ融合体タンパク質は、哺乳類細胞で発現され、そして野生型Ｇａｇタンパク質の存在下でさえＨＩＶ粒子に組込まれることを示す。本発明は、さらに、ビリオンに組込まれたＧａｇ融合体は、先行技術と対照的に感染性があるままであることを示す（Ｇ．Ｓｃｈｕｍａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０巻：４３７９−３７頁、１９９６年）。したがって、ビリオンに対する、有害な酵素を含めた異種のＧａｇ融合タンパク質を標的とすることは、抗−ＨＩＶ薬剤の発見および遺伝子療法に向かう新たな道程を表す。
【０００９】
本発明では、Ｇａｇタンパク質およびその変異体は、Ｇａｇ−Ｐｏｌ前駆体タンパク質の成分としてそれらの正常な発現から独立して、トランスで十分に機能性のあるＲＴおよびＩＮをレンチウイルス性およびレトロウイルス粒子に送達するビヒクルとして機能することが示されている。したがって、本発明は、正常なパッケージング成分（Ｇａｐ−Ｐｒｏ）、およびレトロウイルスに基づくベクターのための酵素機能を供する新規のトランス酵素的な要素を発生する。本発明によって、これが、複数の異なるプラスミド、すなわち、ベクタープラスミド、パッケージングプラスミド、トランス酵素発現プラスミドおよびエンベローププラスミドに由来する少なくとも３つの別個のＲＮＡの組換えを必要とし、そしてそれ自体は、起りそうにないので、本発明によって、感染の可能性がある形態／複製中のレトロウイルス形態（ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ＬＴＲ）の発生が、低減される。ビリオンＧａｇタンパク質は、Ｇａｐ−Ｐｏｌとは独立に、ＲＴおよびＩＮタンパク質をレンチウイルスベクターに送達するビヒクルとして本発明で活用される。それ自体、「トランスレンチウイルス」または「トランスレトロウイルス」ベクターは、遺伝子送達、および遺伝子療法のために活用される。
【００１０】
本発明の１つの実施形態では、ウイルス阻害性タンパク質をコードするＤＮＡに融合されたウイルス性Ｇａｇタンパク質をコードするＤＮＡを包含する物質の組成物が提供される。
【００１１】
本発明のさらに別の実施形態では、ウイルス阻害性タンパク質をコードするＤＮＡに融合されたウイルス性Ｇａｇタンパク質断片をコードするＤＮＡを含む物質の組成物が提供される。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態では、動物に有効量の本発明の組成物を投与するステップを含むことを特徴とする、動物において、ウイルス阻害性分子を標的に送達する方法が提供される。
【００１３】
本発明のなお別の実施形態では、本発明の組成物および医薬上許容しうる担体を含むことを特徴とする治療用組成物が提供される。
【００１４】
本発明の他の、そして別の態様、特性および利点は、開示の目的のために付与された本発明の現在のところ好ましい実施形態の以下の説明から明らかになるであろう。
【００１５】
以下に明確される内容と同様に、本発明の上述の特性、利点および目的が達成され、そして詳細に理解され得て、上に簡潔に要約される本発明のさらに特別な説明は、添付される図面で示される特定の実施形態に対する文献によってなされ得る。これらの図面は、明細書の一部を形成する。しかし、添付される図面が、本発明の好ましい実施形態を示し、したがって、それらの範囲に限定すると考えられるべきでないことには注目すべきである。
【００１６】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
ここに使用される場合、語句「融合タンパク質」は、Ｖｐｘ（任意のＨＩＶ−２およびＳＩＶの）またはＶｐｒ（任意のＨＩＶ−１およびＳＩＶの）またはレトロウイルスのＧａｇの全ての生来のタンパク質アミノ酸配列のいずれか、または組換えＤＮＡ技術を通して結合され、そして生来のＨＩＶ／ＳＩＶビリオンまたはレトロウイルス様粒子のいずれかと結合する能力のあるそれらの配列の任意の削除に該当する。
【００１７】
ここに使用される場合、語句「ビリオン」は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶウイルス粒子に該当する。
【００１８】
ここに使用される場合、語句「レトロウイルス様粒子」は、これらのタンパク質を発現する天然のまたは不死化した細胞のいずれかから構築し、そして放出する能力のある自然に感染した宿主で自然に存在するもの以外のＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶまたはレトロウイルスタンパク質の任意の組成に該当する。
【００１９】
ここに使用される場合、語句「変異体」は、「配列比較および分析における最新の方法」、（巨大分子配列決定および合成、選択方法およびアプリケーション（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、１２７−１４９頁）どおり、fastＤＢによって計算されるとおり、その断片を含めた生来の配列と少なくとも３０％の配列同一性を示すポリペプチドまたはヌクレオチド配列をいう。
【００２０】
ここに使用される場合、語句「形質移入」は、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）の真核生物または原核生物の細胞または組織への導入に該当する。
【００２１】
ここに使用される場合、語句「遺伝子形質導入要素」は、細胞に遺伝子を形質導入するための最少限の必要とされる遺伝的情報に該当する。
【００２２】
ここに使用される場合、語句「ウイルス阻害性タンパク質」は、ＶｐｘまたはＶｐｒで融合されたアミノ酸の任意の配列、または、任意の方法で個々の細胞（原核生物および真核生物の）において、または高等生物でのいずれかで多重化され、拡大するレトロウイルスの能力を変える可能性のあるＧａｇ配列に該当する。このような阻害性分子としては、酵素的活性（例としては、ＨＩＶ／ＳＩＶプロテアーゼ、インテグラーゼ、逆転写酵素、ＶｉｆおよびＮｅｆタンパク質が挙げられうる）を保有しうるものを含めたＨＩＶ／ＳＩＶタンパク質または配列、すなわち、任意の方法で、それらの正常な機能または酵素的活性および／または特異性（例としては、ＨＩＶ／ＳＩＶプロテアーゼ、インテグラーゼ、逆転写酵素、ＶｉｆおよびＮｅｆタンパク質の突然変異が挙げられうる）を変えるために、遺伝子操作技術によって改変されたＨＩＶ／ＳＩＶタンパク質またはタンパク質／ペプチド配列、またはＶｐｒまたはＶｐｘまたはＧａｇとの融合タンパク質として発現されるときに、ウイルス多重を変え、そしてインビトロまたはインビボで拡大する任意の他の非ウイルスタンパク質が挙げられうる。
【００２３】
本発明では、ＨＩＶ  ＶｐｒおよびＶｐｘタンパク質を、Ｇａｇポリタンパク質前駆体とのウイルス型特異的相互作用を通してビリオンにパッケージ化させた。ＨＩＶ−１  Ｖｐｒ（Ｖｐｒ１）およびＨＩＶ−２  Ｖｐｘ（Ｖｐｘ２）を、それらのオープンリーディングフレームが、細菌性ストレプトコッカス・ヌクレアーゼ（ＳＮ）、ＳＮの酵素的に不活性な突然変異体（ＳＮ*）、およびクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝子でインフレーム融合されるときに、外来タンパク質を標的化するのに利用する。Ｔ７基本のワクシニアウイルスシステムにおける一過性の発現は、それらの同種ｐ５５Gagタンパク質と同時発現されるときに、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に有効に組込まれ、適切にサイズ決定されたＶｐｒ１ＳＮ／ＳＮ*およびＶｐｘ２ＳＮ／ＳＮ*融合タンパク質の合成を示す。融合タンパク質のパッケージング化は、野生型ＶｐｒおよびＶｐｘタンパク質で先に見られたとおり、ウイルス型特異的決定因子に依存性がある。粒子に結合したＶｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮ融合タンパク質は、ラムダファージＤＮＡのインビトロ消化によって測定される場合に酵素的に活性であった。機能性Ｖｐｒ１およびＶｐｘ２融合タンパク質が、ＨＩＶ粒子に標的化されたことを示すために、遺伝子融合体を、ＨＩＶ−２ＬＴＲ／ＲＲＥで制御した発現ベクターにクローニングさせ、そして野生型ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２プロウイルスで同時形質移入させた。スクロース勾配精製されたビリオンのウエスタンブロット分析は、Ｖｐｒ１およびＶｐｘ２融合タンパク質の両方が、ＳＮ、ＳＮ*またはＣＡＴが、Ｃ末端融合パートナーとして使用されるかどうかにかかわらず有効にパッケージングされることを示した。さらに、融合タンパク質は、酵素的に活性が残り、そして野生型ＶｐｒおよびＶｐｘタンパク質の存在下でパッケージングされた。興味深いことに、ビリオンは、アクセサリータンパク質に特異的な抗体、並びにＳＮおよびＣＡＴ融合パートナーと反応するより小さいタンパク質をも含有した。同様のタンパク質は、Ｇａｇ由来のＶＬＰが不在であり、並びにビリオンでは、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の存在下で伝達されるので、それらは、ウイルス性プロテアーゼによって産生される開裂産物を表すに違いない。一緒にして、これらの結果は、ＶｐｒおよびＶｐｘは、ＨＩＶ／ＳＩＶ粒子に対して、強力に破壊的な酵素を含めた機能性タンパク質を標的化するために使用されうることを示す。これらの特性は、新規な抗ウイルス攻略法の開発のために有用である。
【００２４】
本発明では、遺伝子カセットは、遺伝子の融合タンパク質発現を誘導するトランス酵素プラスミド内のレトロウイルスＧａｇ変異体に結合される。遺伝子の選択およびＧａｇヌクレオチド配列の修飾を通して、本発明のベクターは、パッケージング、ベクターおよびエンベロープポリペプチドをコードする遺伝子またはその変異体と共同して宿主細胞に形質移入されるときに、抗ウイルス療法および／または遺伝子送達ベクターとして作用する。本発明は、各々、様々なベクター機能をコードするプラスミドとともに、ここに詳述されるときに、このような機能は、宿主細胞に同時形質移入される１つ、２つおよび３つのプラスミドを含むより少数のプラスミドと十分に組み合わせることができることが予想される。好ましくは、複数のプラスミド遺伝子送達システムが、本発明によって利用される。
【００２５】
Ｇａｇ基本のトランスレンチウイルスベクターは、２９３Ｔ細胞を、Ｇａｇ、ｐＰＣＭＶ−ｅＧＦＰ（トランスファーベクター）、およびｐＭＤ−Ｇ（エンベローププラスミド）に基づいた様々のトランス酵素プラスミドである、ｐＣＭＶ−ｇａｇ−ｐｒｏ（パッケージングプラスミド）で形質移入させることによって産生される。本発明のＧａｇ基本のトランスレンチウイルスベクターは、Ｇａｇ前駆体タンパク質が、機能性融合タンパク質を宿主細胞に送達する能力があることを示す。融合タンパク質は、実例として、ＲＴ、ＩＮ、ＲＴ−ＩＮ、ＧＦＰ、ＣＡＴ、ＣＦＴＲおよび同等物が挙げられる。対照として、トランスレンチウイルスベクター基本のＶｐｒは、２９３Ｔ細胞を、ｐＣＭＶ−ｇａｇ−ｐｒｏ（パッケージングプラスミド）、ｐＬＲ２Ｐ−Ｖｐｒ−ＲＴＩＮ（トランス酵素プラスミド）、ｐＰＣＭＶ−ｅＧＦＰ（トランスファーベクター）、およびｐＭＤ−Ｇ（エンベローププラスミド）で形質移入させることによって産生された（Ｗｕ，Ｘ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９９７、１６：５１１３−５１２２頁、１９９７年）。ＧＦＰ発現を監視するために蛍光顕微鏡を使用して、トランスレンチウイルスベクター粒子の感染性は、ＨｅＬａ細胞の単層培養物で監視された。表１で示されるとおり、Ｇａｇに基づいたトランスレンチウイルスベクターの力価は、０．４〜４×１０5／ｍｌに及んだ一方で、Ｖｐｒに基づくトランスレンチウイルスベクターのものは、５〜９×１０5／ｍｌに及んだ。本発明によるＧａｇ前駆体タンパク質は、機能性タンパク質をベクター粒子に送達する能力がある。Ｇａｇに基づくトランスレンチウイルスベクターの力価は、ＲＴ−ＩＮに関するトランスレンチウイルスベクターに基づくＶｐｒのものと比較しておよそ２〜５倍少なく、この結果は再現可能であった。
【００２６】
【表１】
0004842482.tif 000002
【００２７】
レンチウイルス群（ＨＩＶ−１のＲＴ−ＩＮマイナス・プロウイルスＤＮＡから由来するビリオン）またはレンチウイルスに基づくベクターのウイルス感染性を支持するトランスＲＴ−ＩＮの能力は、トランス−ＲＴ−ＩＮ融合タンパク質が、シス作用ＲＴ−ＩＮに十分に置換されることを示す。レンチウイルスのような単純レトロウイルスのトランスＲＴ−ＩＮ（Ｇａｇ−ＲＴ−ＩＮ融合タンパク質から由来する）かどうかを測定するために、生来のＧａｇ−Ｐｏｌ構造（ＧＡＧ−ＰＲ−ＲＴ−ＩＮ）に由来するＣｉｓ作用ＲＴ−ＩＮも、Ｇａｇ−ＲＴおよびＧａｇ−ＩＮから由来するトランス−ＲＴ−ＩＮ、またはレンチウイルスのようなレトロウイルス中のＧａｇ−ＲＴ−ＩＮの三重融合に置換される。したがって、トランスレトロウイルスベクターに基づくＧａｇは、５ｕｇのパッケージング構築物（ｐＣＭＶ−ＡＴＧ／ｇａｇ−ｐｒｏ）、２ｕｇのトランス酵素プラスミド（ｐＣＭＶ−ＡＴＧ／ｇａｇ−ＲＴ−ＩＮ）、５ｕｇのトランスファーベクター（ｐＲＴＣＭＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ）およびｐＭＤ−Ｇ（エンベローププラスミド）で、２９３Ｔ細胞を形質移入させることによって産生された。対照として、レトロウイルスベクターは、ｐＣＭＶＡＴＧ／ｇａｇ−ｐｏｌ（パッケージングプラスミド）、５ｕｇのトランスファーベクター（ｐＲＴＣＭＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ）およびｐＭＤ−Ｇ（エンベローププラスミド）で、２９３Ｔ細胞を形質移入させることによって産生された。ＧＦＰ発現を監視するために蛍光顕微鏡を用いて、トランスレンチウイルスベクター粒子の感染性は、ＨｅＬａ細胞の単層培養物で観察された。表２に示されるとおり、トランス−レトロウイルスベクターの力価は、０．６〜１．８×１０7／ｍｌに及んだ。レトロウイルスベクター力価は、０．８〜２．５×１０7／ｍｌに及んだ。この結果は、レトロウイルスの単純ｒｇａｇ前駆体タンパク質も、トランスで機能性タンパク質をベクター粒子に送達できることを示す。したがって、本発明によって、宿主細胞への遺伝子送達は、目的のタンパク質に対する融合パートナーであるＧａｇ前駆体遺伝子で起こり、それにより遺伝子送達ベクターシステムとして作用する多様なレトロウイルスを作り出す。
【００２８】
【表２】
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【００２９】
［方法］
（１）ベクター粒子は、２９３Ｔ細胞へのＤＮＡ形質移入によって産生された。（２）ベクター力価は、ＨｅＬａ細胞を感染させることによって測定された。結果は、形質移入された２９３Ｔ細胞から収集された培養上清の１ｍｌあたりの感染性粒子として表現された。
【００３０】
Ｇａｇ融合は、モロニー白血病ウイルス（ＭＬＶ）、エーベルソンマウス白血病ウイルス、ＡＫＲ（内因性）マウス白血病ウイルス、鳥類の癌腫、ミルヒル・ビニス２、鳥類白血症ウイルス−ＲＳＡ、鳥類骨髄芽球症ウイルス、鳥類骨髄球腫症ウイルス２９、ウシシンシチアルウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ニワトリ・シンシチアルウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ・シンシチアルウイルス、フィンケル−ビスキス−ジュンキンス・マウス肉腫ウイルス、フレンド・マウス白血病ウイルス、フジナミ肉腫ウイルス、ガードナー−アルンステイン・ネコ肉腫、ギボンサル白血病ウイルス、モルモットＣ型腫瘍ウイルス、ハーディー−ザッカーマン・ネコ肉腫ウイルス、ハーベイ・マウス肉腫ウイルス、ヒト泡沫状ウイルス、ヒト・スプマウイルス、ヒトＴ−リンパ向性ウイルス１、ヒトＴ−リンパ向性ウイルス２、ジャグシエケット・ウイルス、キルステン・マウス肉腫ウイルス、ランガーウイルス、マソン−ファイザー・サルウイルス、モロニー・マウス肉腫ウイルス、マウス哺乳類腫瘍ウイルス、ヒツジ肺性アデノ腺癌ウイルス、ブタＣ型腫瘍ウイルス、網内症ウイルス、ロス・肉腫ウイルス、サル泡沫状ウイルス、サル肉腫ウイルス、サルＴリンパ向性ウイルス、サルＤ型ウイルス１、シンダー−セイレン・ネコ肉腫ウイルス、リスザルレトロウイルス、トラガーダック脾臓壊死ウイルス、ＵＲ２肉腫ウイルス、クサリヘビ・レトロウイルス、ビスナ／マエディウイルス、ウッディーモンキー肉腫ウイルス、およびＹ７３肉腫ウイルス  ヒト、サル、ネコ、およびウシ・免疫不全ウイルス（ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ）（Moloney Leukemia Virus (MLV), Abelson murine leukemia virus, AKR (endogenous) murine leukemia virus, Avian carcinoma, Mill Hill vinis 2, Avian leukosis virus - RSA, Avian myeloblastosis virus, Avian myelocytomatosis virus 29, Bovine syncytial virus, Caprine arthritis encephalitis virus, Chick syncytial virus, Equine infectious anemia virus, Feline leukemia virus, Feline syncytial virus, Finkel-Biskis-Jinkins murine sarcoma virus, Friend murine leukemia virus, Fujinami sarcoma virus, Gardner-
Arnstein feline sarcoma virus, Gibbon ape leukemia virus, Guinea pig type C
oncovirus, Hardy-Zuckerman feline sarcoma virus, Harvey murine
sarcoma virus, Human foamy virus, Human spumavirus, Human T-lymphotropic virus
1, Human T-lymphotropic virus 2, Jaagsiekte virus, Kirsten murine sarcoma virus, Langur virus, Mason-Pfizer monkey virus, Moloney murine sarcoma virus, Mouse mammary tumor virus, Ovine pulmonary adenocarcinoma virus, Porcine type C oncovirus, Reticuloendotheliosis virus, Rous sarcoma virus, Simian foamy virus,
Simian sarcoma virus, Simian T-lymphotropic virus, Simian type D virus 1, Snyder-Theilen feline sarcoma virus, Squirrel monkey retrovirus, Trager duck spleen necrosis virus, UR2 sarcoma virus, Viper retrovirus, Visna/maedi virus, Woolly monkey
sarcoma virus, and Y73 sarcoma virus human-, simian-, feline-, and bovine immunodeficiency viruses (HIV, SIV, FIV, BIV)）を含めたレトロウイルスおよびレンチウイルスからここで作用性がある。ＧａｇとのＲＴおよびＴＮ融合が、ここで作用性がある場合、多様な治療性および診断的融合タンパク質は、ここに開示される方法およびベクターによって標的細胞に同様に送達性されると理解される。
【００３１】
Ｇａｇ基本のトランスレンチウイルスベクターは、霊長類レンチウイルス性ＶｐｒまたはＶｐｘタンパク質のものと同種の機能を示すレトロウイルスＧａｇ前駆体タンパク質をコードする非霊長類レンチウイルス生殖能力および単純レトロウイルスに基づいて開示される。先行技術と対照的に、本発明は、非分裂中の霊長類細胞でウイルスの感染性を維持する。本発明のベクター内にコードされるＷＰＲＥ配列は、そのために必要である。本発明のベクターの感受性は、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ）の後期転写性調節要素を含む遺伝子トランスファーベクターの使用を通して増強される。調節中の後期転写の能力のあるＷＰＲＥ遺伝子または遺伝子断片を含めることは、トランスレンチウイルスの力価単独で増加する場合、別のＰＰＴ−ＣＴＳ配列の包含は、ウイルス感染性における累積の増強を作り出す。ＷＰＲＥは、同様のウイルスに基づくベクターにおけるルシフェラーゼまたはＧＦＰ生成を増大することが示された（Ｒ．Ｚｕｆｆｅｒｅｙ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３巻、２８８６−２８９２頁（１９９９年））。代わりに、中央のターミネーター配列（ＣＴＳ）および中央ポリプリン路（ＰＰＴ）は、１９９９年１１月１０日に提出された米国仮出願第６０／１６４，６２６号に詳述されるとおり、力価を独立に増加する遺伝子トランスファーベクター、および新たなウイルス性およびトランスウイルスベクターに導入される。ＰＰＴおよびＣＴＳが、ＨＩＶ−１逆転写に関わってきた。Ｐ．Ｃｈａｍｅａｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４１巻、６５１−６６２頁（１９９４年）。メッセンジャーＲＮＡを安定化させ、そしてそれによりタンパク質発現を促進する能力のある他の対照配列が、本発明内のＷＰＲＥ、ＰＰＴおよびＣＴＳの代わりに作用性があることも予想される。
【００３２】
ＷＰＲＥ配列は、ＰＰＴ−ＣＴＳより異なって機能する。後者が、逆転写および核移入を促進すると考えられるのに対して、前者は、転写物を安定化させ、それにより翻訳および産生シグナルが増加すると考えられる。同じ遺伝子トランスファーベクター内に操作的に配置される場合に、これら２つの配列の累積的効果は、レンチウイルスまたはトランスレンチウイルスシステムのいずれかで使用されるにもかかわらず観察された。これら２つの配列の機能性変動、またはこれらの配列の機能的類似体は、過度の実験なしに存在するか、または製造でき、そして本発明に利益を示すことも予想される。レンチウイルスベクターおよびトランスレンチウイルスベクターシステムにこれらの配列（ｃｔｓ−ｐｐｔおよびＷＰＲＥ）を含むことによって、力価、形質導入効率、したがって形質導入細胞についての利用性が、特に、筋肉、神経単位、幹細胞、非刺激ＣＤ３４＋細胞、気道細胞、肝細胞、眼の細胞、および他の体細胞のような非分裂細胞について増強される。非分裂細胞は、体細胞、限定的寿命を示す細胞、またはゆっくりと分裂する一次細胞と定義されうる。しかし、このような細胞は、刺激されて、例えばＣＤ３４＋骨髄細胞、すなわち、多能性血液生成幹細胞にみられるように、いっそう迅速に分裂しうる。
【００３３】
本発明は、それぞれ、ウイルスタンパク質、または遺伝子送達に対する結合を通して、ウイルスベクターへのトランスタンパク質または遺伝子の送達を供給する。すなわちウイルスタンパク質は、ＶｐｒまたはＶｐｘまたはＧａｇであり、そして遺伝子は、ＶｐｒまたはＶｐｘまたはＧａｇのいずれかをコードする。これらのトランスタンパク質または遺伝子のある種の切断変異体は、完全な配列を有するタンパク質または遺伝子の調節または酵素的機能を行う。例えば、プロテアーゼ、インテグラーゼ、逆転写酵素、Ｖｉｆ、Ｎｅｆ、Ｇａｇ、ＲＴ、ＩＮおよびＣＦＴＲをコードする核酸配列は、置換、付加、欠失または機能的に等価なタンパク質または遺伝子を供給する多重発現によって改変されうる。核酸コード配列の縮重により、天然に生じるタンパク質のものと実質的に同じアミノ酸配列をコードする他の配列は、本発明の実施に使用されうる。これらとしては、それに限定されないが、上記タンパク質をコードする核酸配列の全部または一部を含む核酸配列が挙げられ、そしてそれは、配列内で機能的に等価なアミノ酸残基をコードする様々のコドンの置換によって改変され、それによりサイレント変化（silent change）を生じる。例えば、配列内の１つまたはそれ以上のアミノ酸が、機能的等価物として作用する類似の極性の別のアミノ酸に置換されて、サイレント改変を生じうる。配列内のアミノ酸の置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択されうる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正に荷電された（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられる。負に荷電された（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。さらに、本発明の範囲内に含まれるのは、例えば、グリコシル化（glycosolation）、タンパク質分解開裂、抗体分子または他の細胞リガンドなどに対する連結によって、翻訳の間または後に様々に修飾されるタンパク質または断片またはその誘導体である。さらに、本発明の核酸配列をコードする組換えリガンドは、リガンドのプロセシングまたは発現を修飾するために操作されうる。例えば、シグナル配列は、リガンドの分泌を可能にする配列をコードするリガンドの上流に挿入され、そしてそれによりアポトーシスを促進しうる。
【００３４】
さらに、核酸配列をコードするリガンドは、翻訳、開始、および／または終止配列を作り出し、および／または破壊するため、またはコード領域での変動を作り出し、および／または新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するか、または予め存在するものを破壊するために、インビトロまたはインビボで突然変異させて、さらなるインビトロ修飾を促進しうる。当分野で知られる突然変異誘発のためのあらゆる技術が、使用されうる。インビトロ部位指向性突然変異（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３巻：６５５１頁）、Ｔａｂリンカーの使用（Ｐｈａｒｍａｃｅａ）などが挙げられるが、それに限定されない。
【００３５】
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示する目的のために付与され、そしてあらゆる形態で本発明を制限することが意図されない。
【００３６】
［実施例１−細胞およびウイルス］
ＨｅＬａ、ＨｅＬａ−ｔａｔ（ＨＬｔａｔ）、２９３ＴおよびＣＶ−１細胞を、１０％仔ウシ血清（ＦＢＳ）、１００Ｕペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンで補足したダルベッコの修飾イーグル培地で維持した。ＨＬｔａｔ細胞は、集約的に、ＨＩＶ−１ｔａｔの第一のエキソンを発現するものであり、Ｂ．ＦｅｌｂｅｒおよびＧ．Ｐａｖｌａｋｉｓ博士によって提供された。バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む組換えワクシニアウイルス（ｒＶＴ７）を使用して、Ｔ７プロモーターの制御下に置かれたウイルス遺伝子の発現を促進した。ｒＶＴ７のストックを作製し、そしてＷｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６巻：７１０４−７１１２頁、１９９２年によって先に記述されるとおりに、ＣＶ−１細胞で力価測定した。ＨＩＶ−ＩYU2、ＨＩＶ−ＩｐＮＬ４−３−Ｒ−およびｐＮＬ４−３、ＨＩＶ−Ｉ11XB2D、ＨＩＶ−２ST、およびＨＩＶ−２7312Aプロウイルスクローンを、組換え発現プラスミドの構築および形質移入由来のウイルスの発生のために使用した。
【００３７】
［実施例２−抗体］
ＨＩＶ−１Ｖｐｒ特異的抗体を産生するために、ＨＩＶ−ＩYU2ｖｐｒオープンリーディングフレームを、プライマー（センス：５’ＧＣＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＧＴＴＡＡＡＡＡ
ＡＣＴ−３’（配列番号１）およびアンチセンス：ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む５
’−ＧＴＣＣＴＡＧＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣ−３’）（配列番号２）を用いたポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させ、そして原核生物の発現ベクターｐＧＥＸに連結させ、それによりｐＧＥＸ−ｖｐｒ１を産生した。この構築物は、Ｃ末端融合タンパク質としてＶｐｒ１およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｇｓｔ）の発現を可能にし、したがって、アフィニティー・クロマトグラフィーを用いたタンパク質精製を可能にした。Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５ａ）を、ｐＧＥＸ−ｖｐｒ１で形質転換させ、そしてタンパク質発現を、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。ｇｓｔ−Ｖｐｒ１融合タンパク質の発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認された。溶解性ｇｓｔ−Ｖｐｒ１タンパク質を精製し、そしてＶｐｒ１は、Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅ  ６７巻：３１−４０頁、１９８８年）の先に記述された手段を用いてトロンビン開裂によって放出された。ニュージーランド白色ウサギを、フロイント完全アジュバントで１：１に乳化させた０．４ｍｇの精製Ｖｐｒ１タンパク質で免疫し、フロイント不完全アジュバントで１：１に混合した０．２５ｍｇのＶｐｒを２週間隔で３回追加免疫し、そして第一の免疫化の８および１０週後に血液を採取して、抗血清を収集した。使用された別の抗体としては、ＨＩＶ−１Ｇａｇ（ＡＣＴ１）およびＨＩＶ２Ｇａｇ（６Ｄ２．６）に対するモノクローナル抗体、ＨＩＶ−２Ｖｐｘタンパク質に対して生じたポリクローナルウサギ抗体、および精製された細菌で発現されたＳＮタンパク質に対して生じた抗−ＳＮ抗血清が挙げられる。
【００３８】
［実施例３−Ｔ７に基づく発現プラスミドの構築］
HIV-1ＨＸＢ２Ｄgag（ヌクレオチド３３５−１８３７）を包含するＤＮＡ断片は、プライマー（センス：５’−ＡＡＧＧＡＧＡＧ  ＣＣＡＴＧＧＧＴＧＣＧＡＧＡＧＣＧ−３’（配列番
号３）およびアンチセンス：ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限部位（下線付き）を含む５’ＧＧＧ
ＧＡＴＣＣ  ＣＴＴＴＡＴＴＧ  ＴＧＡＣＧＡＧＧＧＧ−３’（配列番号４））を使用してＰＣ
Ｒによって増幅された。ＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、精製し、そしてｐＴＭ１ベクターのポリリンカーに連結して、そしてｐＴＭ−ｇａｇ１を生じた。同様に、ＨＩＶ−２ST（ヌクレオチド５４７−２１１３）のｇａｇコード領域を含むＤＮＡ断片を、それぞれ、センスおよびアンチセンスプライマー５’−ＡＴＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＡＧＡＡ
ＡＣ−３’（配列番号５）および５’−ＧＧＧＧＧＧ ＣＣＣＣＴＡＣＴＧＧＴＣＴＴＴＴＣＣ
−３’（配列番号６）を用いたＰＣＲによって増幅させた。反応生成物を、ＮｃｏＩおよびＳｍ
ａＩ（下線付き）で切断し、精製し、そしてｐＴＭＩのポリリンカーに連結させて、ｐＴＭ−ｇａｇ２を生成した。
【００３９】
Ｔ７プロモーターの制御下でのＶｐｒ１の発現のために、ＨＩＶ−ＩYU2ｖｐｒコード領域を含むＤＮＡ断片（ヌクレオチド５１０７−５４００）を、それぞれ、ＮｃｏＩおよびＨｐａＩ／ＢａｍＨＩ部位（下線付き）を含むプライマー（センス：５’−ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧ
Ｇ  ＡＡＧＣＣＣＣＡＧＡＡＧＡ−３’（配列番号７）およびアンチセンス：５’−ＣＧＣＧＧ
ＡＴＣＣＧＴＴＡＡＣＡＴＣＴ  ＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＴＴＣＴＴＧＣＴＣ−３’（配列番号
８）を用いたＰＣＲによって増幅させた。反応生成物を、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、そしてｐＴＭ１に連結させて、ｐＴＭ−ｖｐｒ１を生成した（図１２Ａ）。インフレームでＳＮおよびＳＮ*を、ｖｐｒ１と融合させるために、それらのコード領域を、それぞれ、ｐＧＮ１５６１．１およびｐＧＮ１７０９．３から、そして一連のサブクローニング段階を通して切取り、そしてｐＴＭ−ｖｐｒ１のＳｍａＩ／ＸｈｏＩ部位に連結させ、そしてｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮおよびｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ*を生成した。このアプローチは、Ｖｐｒ１の翻訳終止コドンをＴｒｐコドンに、そしてＣ末端Ｓｅｒ残基をＣｙｓに変化させた。ｖｐｒ１およびＳＮ／ＳＮ*の間の生じた結合点は、図１２Ｃに描かれている。
【００４０】
Ｔ７制御下でのＶｐｘ２の発現のために、ＨＩＶ−２STｖｐｘコード配列を含むＤＮＡ断片（ヌクレオチド５３４３−５６９１）を、それぞれ、ＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩ部位（下線付き）を含むプライマー（センス：５’ＧＴＧＣＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＡ−３’
（配列番号９）およびアンチセンス：５’−ＴＧＣＡＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＡＧＡＣ
ＣＴＧＧＡＧＧＧＧＧＡＧ  ＧＡＧＧ−３’（配列番号１０）を用いたＰＣＲによって増幅させ
た。ＢｇｌＩＩおよびクレノウ代用品で開裂させた後に、ＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩで切断し、精製し、そしてｐＴＭ１のＮｃｏＩおよびＳｍａＩ部位に連結させて、それによりｐＴＭ−ｖｐｒ２を生成した（図１２Ｂ）。インフレームで、ｖｐｒ２との融合体を構築させるために、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ、ＳＮおよびＳＮ*含有ＤＮＡ断片を、ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮおよびｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ*から切取り、そしてｐＴＭ−ｖｐｒ２に連結させ、そしてそれにより、それぞれ、ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮおよびｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮ*を生成した。このアプローチは、Ｖｐｘ（ＶａｌからＡｒｇまで）のＣ末端で１つのアミノ酸置換を導入し、ｖｐｘの翻訳終止コドンをＳｅｒに変化させ、そしてｐＴＭ１プラスミドポリリンカーの５つのアミノ酸残基を残した。ｖｐｘ２およびＳＮ／ＳＮ*の間の生じた結合点は、図１Ｄに描かれている。
【００４１】
［実施例４−ＨＩＶ  ＬＴＲに基づくＶｐｒまたはＶｐｘ発現プラスミドの構築］
ＨＩＶの存在下でのＶｐｒおよびＶｐｘ融合タンパク質の有効な発現のために、ＨＩＶ−２ＬＴＲ（ＨＩＶ−２ST、関連（coordinates）−５４４から４６６まで）およびＨＩＶ−２ＲＲＥ（ＨＩＶ−２ROD、関連７３２０から７９７２まで）要素を含む真核生物の発現ベクター（ｐＬＲ２Ｐと称される）を構築した（図７Ａ）。これらのＨＩＶ−２ＬＴＲおよびＲＲＥ要素は、それらがＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ＴａｔおよびＲｅｖタンパク質の療法に応答するので選択された。ｖｐｒ１、ｖｐｒ１ＳＮ、ｖｐｘ２およびｖｐｘ２ＳＮコード領域は、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で、それらの別個のｐＴＭ発現プラスミド（図１参照）から切取られ、そしてｐＬＲ２Ｐに連結されて、それにより、それぞれ、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＳＮ、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２およびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮを生じた（図７Ａ）。ｖｐｒ−およびｖｐｘ−ＣＡＴ遺伝子融合の構築および発現のために、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＳＮおよびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮのＳＮ含有領域（ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片）を除去し、そしてＣＡＴを含む、ＰＣＲで増幅されたＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩＤＮＡ断片で置換して、それにより、それぞれ、ｐＬＲ２ＰＶｐｒ１ＣＡＴおよびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＣＡＴを生成した（図９Ａ）。
【００４２】
［実施例５−レンチウイルス性プラスミドが関与するＧａｇ融合の構築］
ｐＨＲＣＭＶ−ｅＧＦＰプラスミドは、記述された（Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２巻：２６３−２６７頁、１９９６年）ｐＨＲＣＭＶ−Ｌａｃｚを修飾することによって誘導された。ｐＨＲＣＭＶ−ｅＧＦＰプラスミドは、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを用いた消化によりｌａｃｚを除去した後、ｅＧＦＰ（ｐＥＧＦＰ−Ｃｌから誘導された）；（クローンテック・ラボラトリーズ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州パロアルト）を含むＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ  ＤＮＡ断片を、ｐＨＲＣＭＶ−Ｉａｃｚプラスミドに連結させることによって構築された。ｐＰＣＭＶ−ｅＧＦＰを構築するために、（配位４３２７−４４８３を伴う）そして中央ＰＰＴおよび中央終結部位（ＣＴＳ）を含む１５０ｂｐ配列を、ＰＣＲによりＳＧ３分子クローンから増幅させ、そしてＣｌａＩで切断されたｐＨＲＣＭＶ−ｅＧＦＰに連結させた。Ｔｅｔ誘発性発現プラスミドを構築するために、ｐＴＲＥから誘導される４３０ｂｐのＴＲＥ誘導性プロモーター（クローンテック・ラボラトリーズ、カリフォルニア州パロアルト）を、平滑末端に充填されたＸｈｏＩ、およびＢａｍＨＩによって節単した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミド（インビトロゲン、カリフォルニア州）のＣＭＶプロモーターを、ＳｐｅＩ１（平滑末端で充填された）およびＢａｍＨＩを用いて置換させ、それによりｐＴＲＥ−ネオを生成した。ｐＣＭＶｇａｇ−ｐｏｌから誘導されたＨＩＶ−基本のパッケージング成分を含む６．７ｋｂの断片を、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いてｐＴＲＥ−ネオにクローニングさせて、それにより、機能性ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むｐＴＲＥ−ｇａｇ−ｐｏｌを生成した。図２３Ａで示されるＲＴ−ＩＮマイナスプラスミドを構築するために、ｐＴＲＥｇａｇ−ｐｏｌの領域（１９７５から５３３７まで）を、ｐＳＧ３Ｓ−ＲＴのＲＴ−ＩＮ含有ＢｃｌＩ／ＳａｌＩ  ＤＮＡ断片（１９７５から５３３７まで）で置換させ、ｐＴＲＥｇａｇ−ｐｏｌプラスミドのＢｃｌＩおよびＳａｌＩ部位に連結させて、それによりｐＴＲＥｇａｇ−ｐｒｏを生成した。ＲＴ−ＩＮ配列は、ＲＴおよびＩＮコード領域の第一のアミノ酸位置に、翻訳終止コドン（ＴＡＡ）を含有し、そしてＣＭＶプロモーターの制御下にあった。４配列にある３９塩基対の内部欠失が、導入され、エンベロープ遺伝子の内部領域（１３５７ｂｐ）を、５８２７から７１８４までに欠失させ、それによりｐＣＭＶｇａｇ−ｐｏｌを生成した。ＲＴ−ＩＮマイナスプラスミドを構築するために、ｐＣＭＶｇａｇ−ｐｏｌの領域（１９７５から５３３７まで）を、ｐＳＧ３Ｓ−ＲＴのＲＴ−ＩＮ含有ＢｃｌＩ／ＳａｌＩＤＮＡ断片（１９７５から５３３７まで）に置換させ、ｐＣＭＶｇａｇ−ｐｏｌプラスミドのＢｃｌＩおよびＳａｌＩ部位に連結させ、それにより表２に示されるｐＣＭＶｇａｇ−ｐｒｏを生成した。ＲＴ−ＩＮ配列は、ＲＴおよびＩＮコード領域の第一のアミノ酸位置に、翻訳終止コドン（ＴＡＡ）を含有した。図２４Ａ−Ｃおよび表２に示される一連のトランス酵素プラスミドを構築するために、ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子の様々の断片を、ＰＣＲによって増幅させ、そして���ｃｏＩおよびＢｇｌＩＩを用いてｐＬＲ２ＰｖｐｒＲＴＩＮにクローニングさせて、それにより一連のｇａｇ−ＲＴＩＮ融合発現プラスミドを生成した。構築物Ｄとして表１に示されるｐＬＲ２ｇａｇＮＣ−ＲＴＩＮは、欠失したｐ６位置を有するＧａｇ遺伝子を含有した。図２４Ｂで示されるｐＬＲ２ＰｇａｇＮＣ（１ＺＦ）−ＲＴＩＮおよび構築物は、ＮＣの第二の１ＺＦおよび欠失ｐ１−ｐ６断片を示すＧａｇ遺伝子を含有した。図２４Ｃとして、そして構築物として表１で示されるｐＬＲ２ＰｇａｇＣＡ−ＲＴＩＮは、ＮＣ−ｐ１−ｐ６断片を欠失するＧａｇ遺伝子を含有した。ｐＬＲ２ＰＶｐｒＲＴＩＮ構築は、図１２に関して記述される。ｐＭＤ−Ｇは、現存する技術によって構築される（Ｗｕ，Ｘ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９９７、１６：５１１３−５１２２（１９９７年））。
【００４３】
［実施例６−レトロウイルス性プラスミドが関与するＧａｇ融合の構築］
ＲＴ−ＩＮマイナス・パッケージング構築物は、モロニー・マウス白血病ウイルスｐＣＭＶ−ＡＴＧ／ｇａｇ−ｐｏｌに基づいて形成され、ＳａｌＩで切断され、そしてクレノウで充填され、それによりｐＣＭＶ−ＡＴＧ／ｇａｇ−ｐｒｏを生成し、そしてＲＴ遺伝子は、図２１Ａで示されるとおり３６６ａａの位置でのリーディングフレーム移行によって突然変異された。プロテアーゼ領域を含む３１２ｂｐの断片であるトランス酵素プラスミドを、ｐＣＭＶ−ＡＴＧ／ｇａｇ−ｐｏｌのｇａｇ−ｐｏｌから欠失させ、それにより図２１Ｂで示されるとおりｐＣＭＶＡＴＧ／ｇａｇ−ＲＴ−ＩＮを生成した。ＧＦＰトランスファーベクターは、モロニー・マウス白血病ウイルスに基づき、ＧＦＰ−ＷＰＲＥはｐＰＣＭＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥから得られ（Ｍ．Ｈ．Ｆｉｎｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  ８３：４３−５０頁、１９９４年）、そしてＢａｍＨＩおよびＡｐｏｌ１を用いてｐＲＴＣＭＶにクローニングし、それにより図２１Ｃに示されるとおりｐＲＴＣＭＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥを生成した。
【００４４】
［実施例７−ベクター保存液の作製および感染］
トランスレンチウイルスベクター保存液は、リン酸カルシウム沈殿法によって、５ｕｇのパッケージング構築物（ｐＴＲＥｇａｇ−ｐｏｌ）、２ｕｇのＶＳＶ−Ｇ構築物（ＰＭＤ−Ｇ）、および５ｕｇのトランスファーベクター（ｐＰＣＭＶ−ｅＧＦＰ  ＷＰＲＥ）およびＩｕｇのｐＴｅｔ−ｏｆｆ（クローンテック・ラボラトリーズ、カリフォルニア州パロアルト）および様々のトランス酵素プラスミドを、予備融合２９３Ｔ細胞に形質移入させることによって作製された。５ｕｇのパッケージング構築物（ｐＣＭＶ−ＡＴＧ／ｇａｇ−ｐｒｏ）、２ｕｇのＶＳＶ−Ｇ構築物（ｐＭＤ−Ｇ）、および５ｕｇのトランスファーベクター（ｐＲＴＣＭＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ）および２ｕｇのトランス酵素プラスミド（ｐＣＭＶ−ＡＴＧ／ｇａｇ−ＲＴ−ＩＮ）を形質移入させることによって、トランス−レトロウイルスベクター保存液を作製した。およそ１×１０6個の細胞を、形質移入の２４時間前に、６ウエルのプレートに播いた。ベクター保存液を、形質移入の６０時間後に採取した。形質移入された培養物の上清を、低速遠心分離（１０００ｇ、１０分）によって区分けし、そして０．４５ｕｍの穴サイズのフィルターで濾過し、適量を取り、そして続いて−８０℃に凍結した。標的細胞を、３７℃で、４時間、１０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥＴエステロンを含むＤＭＥＭ−Ｉ％ＦＢＳに感染させた。続いて、培地を、新鮮なＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳまたは予備調整培地に交換した。ｅＧＦＰベクターの力価を決定するために、１．０、０．２、０．０４および０．００８ｕｌの上清保存液は、ＨｅＬａ細胞の培養物を感染させるために使用された。２から３日後、正（緑）細胞コロニーは、蛍光顕微鏡を使用して計数された。
【００４５】
［実施例８−形質移入］
プロウイルスクローンの形質移入は、製造業者（ストラテジーン（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）によって記述されるとおり、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿法を用いてＨＬｔａｔ細胞で行われた。Ｔ７−基本（ＰＴＭ１）の発現構築物を、先に記述されるとおり、リポフェクチン（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ））を用いて、ｒＶＴ７感染ＨｅＬａ細胞に形質移入させた；（Ｗｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８巻：６１６１−６１６９頁、１９９４年）。これらの方法は、リポフェクチン試薬の製造業者によって推奨されたものであった。
【００４６】
［実施例９−ウエスタン免疫ブロット分析］
ビリオンおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、２０％スクロースのクッションを通した超遠心分離（１２５，０００×ｇ、２時間、４℃）によって、形質移入または感染された細胞の上清から濃縮させた。ペレットおよび感染／形質移入細胞を、ローディング緩衝液［６２．５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５％の２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール］に可溶化させ、油状化させ、そしてＳＤＳを含む１２．５％ポリアクリルアミドゲルで分離させた。電気泳動に続いて、タンパク質を、電気ブロッティングによってニトロセルロース（０．２ｕｍ；ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ）に移行させ、封鎖緩衝液（リン酸塩緩衝食塩水［ＰＢＳ］中脱脂粉乳５％）中で、室温で、１時間、そしてその後、２時間、封鎖緩衝液中で希釈された適切な抗体を用いてインキュベートさせた。タンパク質結合抗体を、製造業者（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））の指示によって、ＥＣＬ法を用いてＨＲＰで連結された特異的二次抗体で検出した。
【００４７】
［実施例１０−ＳＮヌクレアーゼ活性アッセイ］
細胞およびウイルスペレットを、ヌクレアーゼ溶解緩衝液（４０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１％トリトンＸ−１００）に再浮遊させ、そして、低速遠心分離（１０００×ｇ、１０分）で区分させた。ヌクレアーゼ反応用緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．１％ＮＰ４０）中で１０倍希釈を行い、そして１分間煮沸させた。５ｕｌの各希釈液を、５００ｎｇのラムダファージＤＮＡ（ＨｉｎｄＩＩＩ断片）を含む１４ｕｌの反応用緩衝液に添加し、そして２時間、３７℃でインキュベートさせた。反応生成物を、０．８％アガロースゲルで電気泳動し、そしてＤＮＡを、臭化エチジウム染色によって可視化させた。
【００４８】
［実施例１１−哺乳類細胞におけるＶｐｒ１−およびＶｐｘ２−ＳＮおよびＳＮ*融合タンパク質の発現］
哺乳類細胞におけるＶｐｒ１−およびＶｐｘ２−ＳＮ／ＳＮ*融合タンパク質の発現を、組換えワクシニアウイルス−Ｔ７システム（ｒＶＴ７）を使用して評価した。ＨｅＬａ細胞を、７５−８０％周密まで育成し、そして組換えプラスミドｐＴＭ−ｖｐｒ、ｐＴＭ−ｖｐｘ、ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ／ＳＮ*、およびｐＴＭｖｐｘ２ＳＮ／ＳＮ*で形質移入させた（図１）。形質移入の２４時間後、細胞を、ＰＢＳで二回洗浄し、そして溶解させた。可溶性タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させ、そして免疫ブロット分析にかけた。結果は、図２に示される。ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮおよびｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ*の形質移入は、抗−Ｖｐｒおよび抗−ＳＮ抗体の両方を使用して検出できる３４ｋＤａ融合タンパク質の発現を生じた（Ａ）。同様に、ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮおよびｐＴＭｖｐｘ２ＳＮ*の形質移入は、抗−Ｖｐｘおよび抗−ＳＮ抗体を使用して検出される３５ｋＤａ融合タンパク質の発現を生じた（Ｂ）。両方の融合タンパク質は、それぞれ、Ｖｐｒ１（１４．５ｋＤａ）およびＳＮ（１６ｋＤａ）およびＶｐｘ２（１５ｋＤａ）およびＳＮの合わせた分子量に基づいて、予測されるよりわずかに遅く移動することが分かった。ｐＴＭ−ｖｐｒ１およびｐＴＭ−ｖｐｘ２の形質移入は、単独で、適切なサイズにされた野生型ＶｐｒおよびＶｐｘタンパク質を生じた。抗−Ｖｐｒ、抗−Ｖｐｘおよび抗−ＳＮ抗体は、対照として含まれるｐＴＭ１で形質移入された細胞の溶解液に対し、反応性がなかった。したがって、ＳＮおよびＳＮ*融合タンパク質の両方は、哺乳類細胞で発現されうる。
【００４９】
［実施例１２−ウイルス様粒子へのＶｐｒ１−およびＶｐｘ２−ＳＮおよびＳＮ*融合タンパク質の組込み］
ワクシニアおよびバキュロウイルスシステムでは、ＨＩＶＧａｇの発現は、ＶＬＰの構築および細胞外放出に十分である。Ｖｐｒ１およびＶｐｘ２は、他のウイルス性遺伝子産物の発現なしにＧａｇ粒子に有効に組込まれ得る。Ｖｐｒ１およびＶｐｘ２融合タンパク質が、ＶＬＰにパッケージングされうることを示すために、組換えプラスミドを、ｒＶＴ７システム中でＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２Ｇａｇタンパク質と同時発現させた。ｐＴＭ−ｖｐｒ１、ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮおよびｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ*を、ＨｅＬａ細胞単独、およびＨＩＶ−１Ｇａｇ発現プラスミド、ｐＴＭ−ｇａｇ１と組合せて形質移入させた。形質移入の２４時間後、細胞およびＶＬＰ抽出液を作製し、そして免疫ブロット分析によって分析した（図３Ａ）。抗−Ｖｐｒ抗体は、細胞溶解物（上部パネル）で、そしてｐＴＭ−ｇａｇ１との同時発現によって誘導されたペレット化されたＶＬＰ（中央パネル）で、Ｖｐｒ１、Ｖｐｒ１ＳＮおよびＶｐｒ１ＳＮ*を検出した。ＨＩＶ−１Ｇａｇ発現の不在下で、Ｖｐｒ１およびＶｐｒ１ＳＮは、培養上清のペレット（中央パネル）で検出されなかった。予想されるとおり、ＶＬＰも、ｐ５５Ｇａｇを含有した（下部パネル）。したがって、Ｖｐｒ１ＳＮ／ＳＮ*融合タンパク質は、ＶＬＰに首尾よくパッケージ化された。
【００５０】
Ｖｐｘ２ＳＮが、同様に、ＨＩＶ−２ＶＬＰにパッケージングする能力のあることを示すために、ｐＴＭ−ｖｐｘ２、ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮおよびｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮ*を、ＨｅＬａ細胞単独、およびＨＩＶ−１Ｇａｇ発現プラスミド、ｐＴＭ−ｇａｇ１と組合せて形質移入させた。ウエスタンブロットを、細胞の溶解液および遠心分離による培養上清から濃縮されたＶＬＰで作製した（図３Ｂ）。抗−Ｖｐｘ抗体は、細胞溶解物（上部パネル）で、そしてｐＴＭ−ｇａｇ２との同時発現によって誘導されたＶＬＰ（中央パネル）で、Ｖｐｘ２、Ｖｐｘ２ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮ*を検出した。抗−Ｇａｇ抗体は、ＶＬＰペレット中にｐ５５Ｇａｇを検出した（下部パネル）。関連タンパク質シグナル密度の比較は、Ｖｐｒ１およびＶｐｘ２−ＳＮおよびＳＮ*融合タンパク質が、野生型Ｖｐｒ１およびＶｐｘ２タンパク質と同様の量で、ＶＬＰにパッケージ化されることを示唆した。Ｖｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮを含むＶＬＰのスクロース勾配分析は、ＶＬＰとのこれらの融合タンパク質の同時沈降を示した（データは示されず）。
【００５１】
ＧａｇＣ末端領域は、Ｖｐｒ１およびＶｐｘ２のビリオンへの組込みのために必要とされる。しかし、パッケージングは、ウイルス型に特異的であることが分かり、つまり、トランスで発現される場合、Ｖｐｘ２は、ＨＩＶ−２ビリオンおよびＨＩＶ−２ＶＬＰに有効に組込まれるのみであった。同様に、ＨＩＶ−１Ｖｐｒは、ＨＩＶ−１ＶＬＰへの組込みのために、ＨＩＶ−１Ｇａｇ前駆体との相互作用を必要とした。ＶＬＰとのＶｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮの結合が、ＳＮ部分によって指向されなかったが、しかしＶｐｒおよびＶｐｘに特異的なパッケージングシグナルのためであったことを示すために、ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮおよびｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮを、ｐＴＭ−ｇａｇ１またはｐＴＭ−ｇａｇ２のいずれかと個別に同時形質移入させた。対照として、ｐＴＭ−ｖｐｒ１およびｐＴＭ−ｖｐｘ２も、単独で形質移入させた。２４時間後、細胞の溶解物およびペレット化ＶＬＰを、免疫ブロッティングによって試験した（図４）。Ｖｐｒ１ＳＮが、全ての細胞で発現される場合（図４Ａ、上部パネル）、それは、ｐＴＭ−ｇａｇ１で形質移入された細胞から誘導されたＶＬＰと結合されるのみである。同様に、Ｖｐｘ２ＳＮは、全てのｐＴＭ−ｖｐｘ２で形質移入された細胞で検出された（図４Ｂ、上部パネル）が、しかし、ｐＴＭ−ｇａｇ２と同時形質移入によって誘導されたＶＬＰと結合されるのみであった（図４Ｂ、中央パネル）。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２Ｇａｇモノクローナル抗体は、各ＶＬＰペレット中でＧａｇ前駆体タンパク質の存在を確認した（図４Ｂ、下部パネル）。したがって、Ｖｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮのＶＬＰへの組込みは、ちょうど生来のＶｐｒ１およびＶｐｘ２のような、隣接Ｇａｇ前駆体タンパク質の相互作用を必要とした。
【００５２】
Ｖｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮ融合タンパク質が、ＶＬＰと明らかに結合した（図３）場合、生来のアクセサリータンパク質の存在下でそのようにすることを継続するかどうかという問題が残った。Ｖｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮパッケージングの効率は、競合分析によって比較された（図５）。ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮおよびｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮは、１：４から４：１までに及ぶ比を用いて、それぞれ、ｐＴＭ−ｇａｇ１／ｐＴＭ−ｖｐｒ１およびｐＴＭ−ｇａｇ２／ｐＴＭ−ｖｐｘ２と同時形質移入された（図５Ａおよび図５Ｂ、左パネル）。比較のために、ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮおよびｐＴＭ−ｖｐｒ１は、ｐＴＭ−ｇａｇ１（図５Ａ、それぞれ、中央および右パネル）およびｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮと個別に形質移入され、そしてｐＴＭ−ｖｐｘ２は、ｐＴＭ−ｇａｇ２で形質移入された（図５Ｂ、それぞれ、中央および右パネル）。ＶＬＰを、スクロースクッションを通してペレット化させ、溶解させ、ＰＡＧＥによって分離させ、ニトロセルロースにブロットを取り、そして抗−ＳＮ抗体をプローブとして探索した。結果は、同じ細胞に同時形質移入された場合に、ＶＬＰ中のＶｐｒ１およびＶｐｒ１ＳＮの存在を示した（図５Ａ、左パネル）。同様に、同時発現されたＶｐｘ２およびＶｐｘ２ＳＮも、同時パッケージ化された（図５Ｂ、左パネル）。相対量のＶＬＰ結合ＶＰｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮの比較は、明らかなパッケージング差異がないことを示した。したがって、Ｖｐｒ１／Ｖｐｘ２融合タンパク質は、ビリオン組込みのために野生型タンパク質と効果的に競合しうる。
【００５３】
［実施例１３−Ｖｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮ融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を保持する］
ビリオン結合ＳＮ融合タンパク質が、酵素的に活性であったことを示すために、ｐＴＭ−ｇａｇ１／ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮおよびｐＴＭ−ｇａｇ２／ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮで形質移入されたＨｅＬａ細胞の培養上清からの超遠心分離により濃縮されたＶＬＰは、インビトロＤＮＡ消化アッセイを用いてヌクレアーゼ活性について分析された。この分析の前に、免疫ブロッティングは、ｖｐｒ１ＳＮおよびｖｐｘ２ＳＮのＶＬＰとの結合を確認した（データは示されず）。図６は、Ｖｐｒ１−またはＶｐｘ２−ＳＮ融合タンパク質を含んだＶＬＰ溶解物の希釈物とのインキュベーション後の０．８％アガロースゲル中のラムダファージＤＮＡ断片を示す。Ｖｐｒ１ＳＮ*またはＶｐｘ２−ＳＮ*を含むＶＬＰは、負の対照として含まれ、そして精製されたＳＮの希釈物は、参照標準として役割を果した（図６Ａ）。ビリオンに結合したＶＰｒ１ＳＮ（図６Ｂ）およびＶｐｘ２ＳＮ（図６Ｃ）融合タンパク質の両方は、ラムダファージＤＮＡの分解によって示されるとおり、ヌクレアーゼ活性を示した。細胞結合したＶｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮ融合タンパク質も、このシステムで分析されたときにヌクレアーゼ活性を保有した（データは示されず）。ＳＮ特異性について制御するために、この分析は、Ｃａ＋＋を欠いている緩衝液中でも行われ、そしてこれらの条件下で、ＳＮ活性は検出されなかった（データは示されず）。したがって、ＳＮは、融合タンパク質として発現され、そしてＶＬＰにパッケージングされたときに、酵素的に活性を残す。
【００５４】
［実施例１４−Ｖｐｘ２ＳＮ融合タンパク質のＨＩＶ−２ビリオンへの組込み］
Ｖｐｘは、トランスで発現されたときに、ＨＩＶ−２ビリオンに組込まれる。Ｖｐｘ２融合タンパク質が、同様に、野生型ＨＩＶ−２ビリオンにパッケージングする能力があったことを示すために、ＨＩＶ−２ＬＴＲおよびＲＲＥ要素の制御下にｖｐｘ２ＳＮおよびｖｐｘ２ＳＮ*コード領域を置く発現プラスミド（ｐＬＲ２Ｐ）が構築された。ＨＩＶ−２ＲＲＥは、融合遺伝子の下流に配置されて、ｍＲＮＡ安定性および有効な翻訳を確保した（図７Ａ）。融合タンパク質が、トランスで発現されるときにパッケージ化されうることを示すために、ＨＩＶ−２STプロウイルス性ＤＮＡ（ＰＳＸＢＩ）を、単独で、そしてｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮおよびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮ*と組合せて形質移入させた。４８時間後、細胞外ウイルスは、２０％スクロースのクッションを通した超遠心分離によって培養上清からペレット化され、そして免疫ブロット分析によって試験された（図７Ｂ）。複写ブロットを、抗−Ｖｐｘ（左）、抗−ＳＮ（中央）および抗−Ｇａｇ（右）抗体を用いて釣上げた。抗−Ｖｐｘ抗体は、全ウイルスペレット中に１５ｋＤａ  Ｖｐｘ２タンパク質を検出した。ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮおよびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮ*とのＨＩＶ−２STの同時形質移入によって誘導されたビリオンでは、およそ３５および３２ｋＤａの別のタンパク質が、明らかに見えた。同じ２つのタンパク質は、抗−ＳＮ抗体で釣上げられた複写ブロットでも明らかであり、そしてそれらは、Ｖｐｘ２ＳＮ融合タンパク質を表すことが示された（図７Ｂ，中央パネル）。全長のＶｐｘ２ＳＮ融合タンパク質の推定分子量は、３３ｋＤａである。生来のＶｐｘおよびＳＮは、推定されたものよりわずかにゆっくりと動いたので、３５ｋＤａ種は、全長Ｖｐｘ２ＳＮ融合タンパク質を表すようである。抗−ＳＮ抗体は、およそ２１および１７ｋＤａの別のタンパク質を検出した（これらのタンパク質は、長期間露出された後、いっそう明らかであった）。唯一３５ｋＤａタンパク質が、Ｐｏｌタンパク質（図２）を欠くＧａｇ誘導ＶＬＰで検出されたので、より小さいタンパク質は、ウイルス性プロテアーゼによって生じたｖｐｘ２ＳＮおよびｖｐｘ２ＳＮ*の開裂産物を表した。抗−Ｇａｇ抗体は、各形質移入から得られたおよそ等価な量のビリオンの分析を確認した。
【００５５】
ｖｐｘ２ＳＮのＨＩＶ−２ビリオンへのパッケージングを示すために、スクロース勾配分析が行われた。ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮおよびＨＩＶ−２STとの同時形質移入の４８時間後にＨＬｔａｔ細胞の培養上清から収集された細胞外ウイルスは、２０％スクロースのクッションを通してペレット化された。ペレットを、ＰＢＳ中に再浮遊させ、そしてその後、線形勾配の２０−６０％スクロース上で、１８時間遠心分離にかけた。分画を収集し、そして免疫ブロッティングで分析した（図７Ｃ）。複写ブロットを、抗−ＳＮ（上部）および抗−Ｇａｇ（下部）抗体で別個に釣上げた。Ｖｐｘ２ＳＮおよびＧａｇの両方のピーク濃度は、分画８−１１で検出され、そしてＶｐｘ２ＳＮのＨＩＶ−２ビリオンへの直接結合およびパッケージングを示した。これらの同じスクロース分画（８−１１）は、屈折率測定分析によって測定される場合、１．１６および１．１７ｇ／ｍｌの間の密度を示すことが分かった（データは示されず）。さらに、Ｖｐｘ２ＳＮの３５ｋＤａおよび３２ｋＤａ形態の両方が、検出され、そしてウイルス粒子へのパッケージングに続くプロテアーゼ開裂についての別の証拠を提供した。
【００５６】
ＨＩＶ−２STは、ｖｐｒを欠くので、これは、Ｖｐｘ２ＳＮ融合タンパク質のパッケージングに影響を及ぼしうる。短期ＰＢＭＣ培養物からクローン化されたＨＩＶ−２7312Aと称される第二株のＨＩＶ−２を分析し、そして全遺伝子についてのオープンリーディングフレームを含み、そして無傷のｖｐｒおよびｖｐｘ遺伝子（未公開）を含む。ＨＩＶ−２7312AプロウイルスＤＮＡ（ｐＪＫ）のプラスミドクローンを、単独で、そしてｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮとの組合せで、ＨＬｔａｔ細胞に形質移入させた。比較のために、ＨＩＶ−２STも、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮで同時形質移入された。子孫ウイルスは、スクロースクッションを通した超遠心分離によって濃縮され、そして免疫ブロット分析によって試験した（図７Ｄ）。複写ブロットを、抗−Ｖｐｘ（左）および抗−Ｇａｇ（右）抗体をプローブとして探索した。結果は、ｖｐｒ−欠損ウイルス（ＨＩＶ−２ST）と比較したｖｐｒコンピテントウイルス（ＨＩＶ−２7312A）への相対的レベルのＶｐｘ２ＳＮ組込みを示した。さらに、３５ｋＤａおよび３２ｋＤａタンパク質が、また、ＨＩＶ−２7312Aビリオンで検出された。したがって、Ｖｐｘ２Ｓｎタンパク質の複写コンピテント野生型ＨＩＶ−２の有効な組込みが、生来のＶｐｒおよびＶｐｘタンパク質の存在下でさえ示された。
【００５７】
［実施例１５−Ｖｐｒ１ＳＮのＨＩＶ−１ビリオンへの組込み］
同じＬＴＲ／ＲＲＥ基本の発現プラスミドを用いて、Ｖｐｒ１ＳＮが、ＨＩＶ−１プロウイルスとの同時発現（上で検討されるとおり、ＨＩＶ−２ＬＴＲは、ＨＩＶ−１Ｔａｔによって転写促進され、そしてＨＩＶ−２ＲＲＥは、ＨＩＶ−１Ｒｅｖタンパク質に感受性がありうる）により、ＨＩＶ−１ビリオンにパッケージ化させうることも示された。ｐＮＬ４−３（ＨＩＶ−１）およびｐＮＬ４−３−Ｒ−（ＨＩＶ−１−Ｒ−）単独で、およびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＳＮとの組合せでのＨＬｔａｔ細胞の形質移入の４８時間後に培養培地に放出されたビリオンを、超遠心分離によって濃縮し、そして免疫ブロット分析によって試験した（図８）。ＨＩＶ−２との同時形質移入実験で観察されるとおり、抗−ＳＮ抗体は、およそ３４から３１ｋＤａまでの２つの主要なＶｐｒ１ＳＮ融合タンパク質を同定した。これらのタンパク質は、ｐＮＬ４−３およびｐＮＬ４−ｅ−Ｒ−単独の形質移入によって産生されるビリオンで検出されなかった。ｒＶＴ７システムでの発現から、全長Ｖｐｒ１ＳＮ融合タンパク質は、３４ｋＤａで移行すると予想された。したがって、３１ｋＤａタンパク質は、開裂産物を表しそうである。抗−ＳＮ抗体は、１７ｋＤａで移行するタンパク質をも検出した。抗−Ｖｐｒ抗体は、同時形質移入された細胞から誘導されたビリオンにおける３４および３１ｋＤａタンパク質を検出した。抗−Ｖｐｒおよび抗−ＳＮ抗体の両方が、最も強力に３１ｋＤａタンパク質を検出たこと、そして抗−Ｖｐｒ抗体が、抗−ＳＮ抗体によって認識された１７ｋＤａタンパク質を検出しなかったことは、注目に値する。これらの結果は、生来のＶｐｒタンパク質がパッケージ化されたビリオンでさえ、Ｖｐｒ１ＳＮも、多量に組込まれたことをも示す。Ｇａｇモノクローナル抗体は、全てのウイルスペレットで、同様の量のＧａｇタンパク質を検出し、そしてｐ５５Ｇａｇ前駆体のプロセシングを示した（図８Ｃ）。
【００５８】
Ｖｐｒ１−およびＶｐｘ２−ＳＮ融合タンパク質の開裂が、ＨＩＶプロテアーゼにより指向されたことをより直接的に示すために、ウイルスは、１ｕＭのＨＩＶプロテアーゼ阻害剤Ｌ−６８９，５０２（Ｅ．Ｅｍｉｎｉ博士によって提供された、メルク・アンド・シーオー．インク．）の存在下で培養されたｐＮＬ４−３−Ｒ−／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＳＮおよびｐＳＸＢＩ／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮで形質移入された細胞から濃縮された。予想されるとおり、ビリオンの免疫ブロット分析は、ｐ５５Ｇａｇの実質的に少ないプロセシングを示した（図９Ａ）。同様に、Ｌ−６８９，５０２の存在下で産生されたビリオンも、Ｖｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮ融合タンパク質の多量の無核種を含んだ（図９Ｂ）。総合して、これらの結果は、Ｖｐｒ１−およびＶｐｘ２−ＳＮ融合タンパク質が、ウイルス構築の間、あるいは構築に続いてプロテアーゼ開裂にかけられることを示す。
【００５９】
［実施例１６−ＨＩＶウイルスへのＶｐｒ１−ＣＡＴおよびＶｐｒ−２−ＣＡＴ融合タンパク質組込み］
Ｖｐｘ２およびＶｐｒ１が、ＨＩＶ粒子に対する別のタンパク質を標的化しうることを示すために、全長の７４０ｈｐＣＡＴ遺伝子を、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮおよびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＳＮベクター中でＳＮに置換し、それによりｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＣＡＴおよびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＣＡＴを生成した（図１０Ａ）。ｐＮＬ４−３／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＣＡＴ、ｐｎ１４−３−Ｒ−／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＣＡＴおよびｐＳＸＢＩ／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＣＡＴを、ＨＬｔａｔ細胞に同時形質移入させた。対照として、ｐＮＬ４−３、ｐＮＬ４−３−Ｒ−およびｐＳＸＢＩを、単独で形質移入させた。培養上清から濃縮された子孫ビリオンを、免疫ブロッティングによって分析した（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。抗−Ｖｐｒ抗体を用いて、４０ｋＤａ融合タンパク質を、ｐＮＬ４−３およびｐＮＬ４−３−Ｒ−の両方とのｐＲＬ２Ｐ−ｖｐｒ１ＣＡＴの同時形質移入によって誘導されたウイルスペレット中で検出した（図１０Ｂ）。このサイズは、全長Ｖｐｒ１ＣＡＴ融合タンパク質の推定分子量と一致する。さらに、抗−Ｖｐｒ抗体も、生来のＶｐｒ１タンパク質（ｐＮＬ４−３で形質移入した細胞から誘導されるビリオンでの１４．５ｋＤａ）の分子量に対応しない１７ｋＤａタンパク質を検出した。同じタンパク質は、抗−ＣＡＴ抗体を用いて毎週確認され、そしてそれにより、融合タンパク質産物がほとんどのＶｐｒ配列を含むことが示唆された。非常に似た結果が、ＨＩＶ−２STおよびｐＲＬ２Ｐ−ｖｐｘ２ＣＡＴと同時形質移入されたＨＬｔａｔ細胞から誘導されるビリオンで得られ、そこで、抗−Ｖｐｘ抗体は、４１および１５ｋＤａタンパク質を検出した（図１０Ｃ）。これらの結果は、Ｖｐｒ１ＣＡＴおよびＶｐｘ２ＣＡＴ融合タンパク質が、ビリオンにパッケージ化されることを示す。しかし、ＳＮ融合タンパク質の場合と同様に、ＣＡＴ融合タンパク質も、ＨＩＶプロテアーゼによって開裂された（Ｖｐｘ２ＣＡＴ開裂産物は、生来のＶｐｘタンパク質との同時移行のため見えない）。ＣＡＴ開裂は、免疫ブロットでの全長ＣＡＴ融合タンパク質の密度に基づいて、集約性が低くみえた。
【００６０】
ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ウイルス粒子の溶解物を、２０ｍＭトリス塩基中で１：５０に希釈し、そしてＡｌｌｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２巻：８６４−８６９頁、１９７９年の方法によって、ＣＡＴ活性について分析した。図１０Ｄは、Ｖｐｒ１ＣＡＴおよびＶｐｘ２ＣＡＴタンパク質を含むビリオンがＣＡＴ活性を保有したことを示す。これらの結果は、活性なＶｐｒ１−およびＶｐｘ２−ＣＡＴ融合タンパク質のパッケージングを示す。
【００６１】
［実施例１７−ビリオンに組込まれたＳＮおよびＣＡＴ融合タンパク質は、酵素的に活性である。］
機能的に活性なタンパク質を、ウイルス粒子に送達するＶｐｒ１およびＶｐｘ２の能力は、さらに、スクロース勾配分析によって確認された。ＨＩＶ−２STおよびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２で同時形質移入さらたＨＬｔａｔ細胞から誘導されたビリオンは、上述されるとおり、２０−６０％スクロースの線形勾配で沈降された。分画を収集し、そしてウイルス性Ｇａｇタンパク質（図１１）および対応のＣＡＴ活性（図１１Ｂ）について分析した。ピーク量のＧａｇタンパク質が、分画６および７（それぞれ、密度１．１６および１．１７）で検出された。同様に、ピーク量のアセチル化クロラムフェニコール（Ａｃ−ｃｍ）も、分画６および７で検出された。
【００６２】
ビリオン結合ＳＮ融合タンパク質が、ヌクレアーゼ活性を保持するかどうかも、示された。ＨＩＶ−１SG3ビリオン含有Ｖｐｒ１ＳＮは、スクロースの線形勾配での沈降の後に分析された（図１１）。本発明は、ＳＮ融合タンパク質のプロテアーゼ開裂が（図７、８および９）、Ｖｐｒ１ＳＮヌクレアーゼ活性を際立って減少させたこと（データは示されず）を示したので、これらの実験は、上に記述されるとおり、Ｌ−６８９，５０２の存在下でｐＳＧ３／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＳＮで同時形質移入された細胞を培養することによって行われた。セディニメンテッド（ｓｅｄｉｎｉｅｎｔｅｄ）ビリオンの免疫ブロット分析は、分画６および７でのＧａｇのピーク濃度を示し、そしてｐ５５プロセシングを実質的に減少させた（図１１Ｃ）。ピークＳＮ活性は、最高濃度のウイルスを含有する分画に関連した（図１１Ｄ）。したがって、これらの結果は、ウイルスプロテアーゼによる開裂が、融合パートナーを不活性にしうるが、ビリオン組込みそれ自体が、Ｖｐｒ／Ｖｐｘ融合タンパク質の酵素的活性を終らせないことに証拠を提供する。
【００６３】
［実施例１８−ｇａｇ−ｐｒｏ（ＲＴ−ＩＮマイナス）パッケージングプラスミドの構築および設計］
数種の異なる攻略法が、Ｇａｇ−Ｐｒｏを発現させるために使用された。同じリーディングフレームにＧａｇおよびＰｒｏを置くことで、Ｐｒｏの過剰発現および標識細胞毒性を導く。より小さい欠失した突然変異を含めたＲＴおよびＩＮコード領域内での欠失が、それぞれ、Ｇａｇ−ＰｒｏおよびＧａｇ−Ｐｏｌタンパク質の発現レベルで際立った欠損を起しうることが知られている（Ａｎｓａｒｉ−Ｌａｒｉ，Ｍ．Ａ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１１巻：３３２−３３５頁、１９９５年；Ａｎｓａｒｉ−Ｌａｒｉ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０巻：３８７０−３８７５頁、１９９６年；Ｂｕｋｏｖｓｋｙ，Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０巻：６８２０−６７２５頁、１９９６年；Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９巻：２７２９−２７３６頁、１９９５年；Ｓｃｈｎｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ  ９０巻：８４９−８５７頁、１９９７年）。重要なことだか、これらの環境下で産生されるウイルス粒子は、タンパク質分解プロセシングが欠けており、そしてＲＴおよびＩＮがトランスで供される場合でさえ、感染性がない（Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８巻：６１６１−６１６９頁、１９９４年）。発現およびビリオンに結合したＧａｇ−Ｐｏｌタンパク質のレベルが減ったことは、明らかに、Ｇａｇ−Ｐｒｏフレームシフトの頻度における影響のためである。Ｇａｇ−Ｐｏｌフレームシフトは、ＲＴおよびＩＮの翻訳が終らされるときに際立って影響されはせず、そしてそれは、ウイルス性ＤＮＡ断片の欠失と異なっている。ＲＴおよびＩＮタンパク質合成が、翻訳終止コドンによって終らせられる場合に、Ｇａｇ−Ｐｒｏを構成するビリオンは、成熟し、そしてＲＴおよびＩＮが、トランスで供される場合に、感染性がある（Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８巻：６１６１−６１６９頁、１９９４年）。したがって、本発明のＧａｇ−Ｐｒｏパッケージングプラスミドは、好ましくは、Ｐｒｏの下流の配列の翻訳を終らせる（ＲＴ−ＩＮ）ことによって構築される。ＧａｇおよびＰｏｌでの他の突然変異は、それらが、粒子構築および感染性において、主要な欠損を起さない場合に、トランスレンチウイルスのパッケージングシステムの一部として機能もする。ＲＴの一次アミノ酸残基に翻訳終止コドン（ＴＡＡ）を導入することに加えて、少なくとも１つの別の「致命的」突然変異が、ＲＴおよびＩＮ内に位置決めされる（図１２Ｂ）。この突然変異は、さらに、パッケージング（ｇａｇ−ｐｒｏ）および酵素的（ｖｐｒ−ＲＴ−ＩＮ）プラスミドの間の遺伝子組換えによって、完全なＧａｇ−Ｐｏｌコード領域を再樹立する見込みを減少させる。終止コドンが、タンパク質の一次アミノ酸残基についての第一コドンで以外の位置で、遺伝子配列内に挿入され、そしてなお、感染性を避ける有効な手段でありうることが予想される。終止コドンは、翻訳配列の開始について選択的ではあるが、核酸残基をコードするアミノ酸の前半分で一般に挿入された終止コドン有効である。ここで使用される場合、致命的な突然変異は、コードされたポリペプチド配列を、広範なタンパク質の生物学的役割を行う上で機能的に効果的でなくさせる遺伝子配列内の突然変異に該当する。
【００６４】
Ｇａｇ−Ｐｒｏ発現プラスミド（ｐＣＲ−ｇａｇ−ｐｒｏ）としては、ＣＭＶプロモーターおよびＨＩＶ−２Ｒｅｖ応答性要素（ＲＲＥ）（図１２Ｃ）が挙げられる。ＲＲＥは、ｍＲＮＡ阻害配列を含むＨＩＶタンパク質（Ｇａｇ、ＰＲ、ＲＴ、ＩＮを含めた）の有効な発現に対処する。ＲＴおよびＩＮは、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ−ＲＴ−ＩＮ発現プラスミドとのトランス発現によって供給される（図１２Ｃ）。このベクターは、トランスで、ＨＩＶ−１ビリオン／ベクターに組込まれるＶｐｒ−ＲＴ−ＩＮ融合タンパク質を発現し、そしてウイルス性プロテアーゼによってタンパク質分解的に加工されて、機能的形態のＲＴ（ｐ５１およびｐ６６）およびＩＮを生じる（Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８巻：６１６１−６１６９頁、１９９４年）。これらの初期の研究は、機能的ＲＴおよびＩＮが、別個に供給されうることを示す（Ｖｐｒ−ＲＴおよびＶｐｒ−ＩＮ）（Ｌｉｕ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１巻：７７０４−７７１０頁、１９９７年；Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８巻：６１６１−６１６９頁、１９９４年）。好ましくは、融合タンパク質のＶｐｒ構成要素は、Ｖｐｒ細胞サイクル停止機能をノックアウトするＨｉｓ７１Ａｒｇ置換を含む。
【００６５】
［実施例１９−トランスレンチウイルスベクターの産生］
ｐＣＲ−ｇａｇ−ｐｒｏ、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ−ＲＴ−ＩＮ（酵素的プラスミド）の各々４ｕｇ、ｐＨＲ−ＣＭＶ−β−ｇａｌ（マーカー遺伝子形質移入プラスミド）およびｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ（ｅｎｖプラスミド）を、２９３Ｔセルラインに形質移入させた。２９３Ｔ細胞は、それらが、ＨＩＶ粒子／ベクターの高い力価の保存液を生じ、そして形質移入に鋭敏に感受性があり、そして複数プラスミド形質移入を含むので使用された。対照として、並行した実験では、ｐΔ８．２パッケージングプラスミドも、ｐＨＲ−ＣＭＶ−β−ｇａｌおよびＰＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇで形質移入された（図１２Ｂ）。ｐΔ８．２プラスミドは、Ｄ．Ｔｒｏｎｏ博士から得られたレンチウイルス・パッケージング・ベクターである。ｐΔ８．２は、ｐＨＲ−ＣＭＶ−β−ｇａｌおよびＰＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇとの形質移入により、高い力価のベクター保存液を生じる（Ｎａｌｄｉｎｉ  Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２巻：２６３−２６７頁、１９９６年；Ｓｈａｎｇ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９巻：２３４−２３８頁、１９９３年）、（おそよ１−５×１０5感染性粒子／ｍｌ上清、１５０−８００ｎｇ／ｍｌのｐ２４抗原濃度で）。形質移入のおよそ７２時間後に、培養上清を回収し、低速遠心分離によって区分し、０．４５ミクロンのフィルターで濾過し、そしてＥＬＩＳＡによってｐ２４抗原濃度について分析した。トランスレンチウイルスベクターの力価を測定するために、２５、５、１および０．２ｕｌの上清保存液を、ＨｅＬａ細胞およびＩＢ３細胞の培養物を感染させるために使用した。２日後、細胞を、Ｘ−ｇａｌで染色し、そして正（青色）細胞を、光学顕微鏡を用いて計数した。表３は、トランスレンチウイルスベクターの力価を示す。その力価は、レンチウイルスベクターのものより首尾一貫して低い（２−５倍少ない）が、これらの結果は、トランスレンチウイルスベクターは、２×１０5／ｍｌと同程度に高い力価を達成しえた。生きている細胞での形質導入の直接試験について、形質導入プラスミドは、ＧＦＰ遺伝子／マーカーを含むように構築もされた。（図１２Ｂおよび１２Ｃ）。トランスレンチウイルスおよびレンチウイルスベクターの保存液は、上に記述されるとおり産生され、そしてＨｅＬａ細胞を感染させるために使用された。２日後、細胞を、蛍光顕微鏡によって試験された。図１３および１４は、それぞれ、トランス−レンチおよびレンチウイルスベクターとの正の遺伝子形質導入を示す。
【００６６】
【表３】
0004842482.tif 000004
【００６７】
［実施例２０−超遠心分離によるトランスレンチウイルスベクターの濃度］
トランスレンチウイルスベクターが、超遠心分離による濃縮の間じゅう安定であるかどうかを試験するために、上清−トランスレンチウイルスベクターは、超遠心分離（ＳＷ２８、２３，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）により濃縮された。対照として、上清−レンチウイルスベクターは、同様に濃縮された。両方の力価は、濃縮の前後の両方に測定された。表４は、我々の結果を示し、そしてトランスレンチウイルスベクターが、超遠心分離による濃縮の間安定であることを示す。
【００６８】
【表４】
0004842482.tif 000005
【００６９】
［実施例２１−ＣＦＴＲ遺伝子形質導入のためのトランスレンチウイルスベクター］
レンチウイルスに基づくベクターは、非分裂細胞を形質導入するそれらの能力により肺での用途に魅力的である。この特徴的な特性は、ＣＦの遺伝子療法のためのレンチウイルスベクターの重要な利益を表しうる。トランスレンチウイルスベクターは、ＣＦＴＲ遺伝子を、ＨｅＬａ細胞に送達するために使用された。ＣＦＴＲ遺伝子を、ＳｍａＩおよびＸｈｏＩ部位を用いて、ｐＨＲ形質導入プラスミドにクローニングさせた（図１５）。トランスレンチウイルスおよびレンチウイルス性（対照として）ベクターは、上に記述されるとおり形質移入によって生成され、そしてスライドカバー上で育成されたＨｅＬａ細胞を形質導入するために使用された。２日後、細胞は、ポリクローナル（図１６）およびモノクローナル抗体（図１７）の療法を用いて、免疫蛍光顕微鏡によって試験された。結果は、ＣＦＴＲ発現および細胞表面でのＣＦＴＲの配置を示す。さらに、ＳＰＱ（ハロゲン化物感受性発蛍光団）によって試験された形質導入したＨｅＬａ細胞は、ＣＦＴＲ機能を取り戻したことを示した（図１８）。
【００７０】
本発明は、異種融合分子として発現される場合に、外来タンパク質のＨＩＶビリオンへのパッケージングを指示するＨＩＶ−１ＶｐｒおよびＨＩＶ−２Ｖｐｘの許容性を示した。ＨＩＶプロウイルス性ＤＮＡを用いたトランス相補試験は、Ｖｐｒ１およびＶｐｘ２融合タンパク質も、複製能のあるウイルスに組み込まれたことを示した。さらに、野生型Ｖｐｘおよび／またはＶｐｒタンパク質（図１６および１７）の存在下での融合タンパク質のパッケージングは、それらのパッケージングを指向するウイルス性シグナルが、融合分子の外来構成要素によって妨害されないことを示した。同様に、ビリオンに結合したＳＮおよびＣＡＴ融合タンパク質は、酵素的活性を残した。
【００７１】
ＶＬＰおよびビリオンの免疫ブロット分析に基づいて、本発明は、ビリオン結合ＣＡＴおよびＳＮ／ＳＮ*の両方が、ウイルス性プロテアーゼによって開裂することが疑わしい。ＣＡＴ中に少なくとも１つの開裂部位、ＳＮ／ＳＮ*タンパク質で２つの開裂部位であるようだ。主要なＳＮ／ＳＮ*開裂産物の計算された分子量に基づいて、ＳＮ／ＳＮ*が開裂され、それらのＣ末端に近い１つの部位、および融合タンパク質結合点にかつて近かったようである。Ｖｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮの融合タンパク質結合点は、同一でないので、これらの領域は、ウイルスプロテアーゼに対するそれらの感受性に関して異なる可能性がある。Ｖｐｘ２ＳＮ／ＳＮ*は、Ｖｐｒ１ＳＮより少ない範囲まで加工されたが（図７および８）、主要な開裂部位は保存されるようである。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２プロテアーゼの両方が、融合パートナー中のプロセシング部位を認識すること、および開裂を可能にするのに十分な物理的接触があることには疑問がない。これは、免疫ブロットでの開裂産物強度の減少によって、並びにＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の存在下での酵素的活性が増加されることによって証明される。
【００７２】
Ｖｐｒ１およびＶｐｘ２融合タンパク質が、ＶＬＰおよびビリオンの両方に結合する能力があることの例示は、一般に、これらのアクセサリータンパク質における、そしてＨＩＶ組立での研究を促進する。タンパク質構造／機能関係を研究するために欠失変異体を生じるアプローチは、これが、タンパク質安定性を減少させるか、またはタンパク質の三次元構造を変化させるので、しばしば、限られた価値のものである。Ｖｐｒの場合には、残基７６での単独アミノ酸置換は、感染細胞におけるそれの発現を不安定化させることが示された。研究は、ｖｐｒおよびｖｐｘでの欠失突然変異が、発現に続くタンパク質の時期尚早な分解を起すことを示した。本発明によって示されるとおり、例えばＳＮまたはＣＡＴとのＶｐｒおよびＶｐｘ変異体タンパク質の融合は、安定性を増加させる。
【００７３】
ビリオンへのＶｐｒ１Ｖｐｘ２ＳＮ融合タンパク質の首尾よくいくパッケージングは、アクセサリータンパク質のためのそれらの使用が、ウイルス性不活性化を標的にしたことを示す。本発明は、ＶｐｒおよびＶｐｘが、ＳＮを含めたウイルス阻害分子の特異的ターゲティングのためのビヒクルとして役割を果し得ることを示す。ＨＩＶＧａｇと対照的に、ＶｐｒおよびＶｐｘは、ウイルス複製を変えることなく、比較的容易に操作されうるより小さいタンパク質であり、したがって、このような抗ウイルス攻略法に対する用途のための相当な多才さを示すビヒクルを表しうる。
【００７４】
［実施例２２−ＨＩＶアクセサリータンパク質から独立のレンチウイルスへのトランスでのＲＴの組込み］
ＨＩＶアクセサリータンパク質ＶｐｒおよびＶｐｘは、Ｐｒ５５Gag前駆体タンパク質のｐ６部分との特異的相互作用を通してビリオンに組み込まれる（Ｋａｐｐｅｓら、１９９３年；Ｋｏｎｄｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９巻：２７５９−２７６４頁、１９９５年；Ｌｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９巻：６８７３−６８７９頁、１９９５年；Ｐａｘｔｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７巻：７２２９７２３７、１９９３年；Ｗｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８巻：６１６１−６１６９頁、１９９４年）。同様に、ＶｐｒおよびＶｐｘ融合タンパク質（Ｖｐｒ−およびＶｐｘ−ＳＮおよびＣＡＴ）は、野生型ＶｐｒおよびＶｐｘタンパク質のものに類似して、ｐ６Gagとの特異的相互作用を通してビリオンに組み込まれることが示された（Ｗｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９巻：３３８９−３３９８頁、１９９５年）。ビリオンへのＶｐｒ−ＲＴ融合タンパク質の組込みについてのＶｐｒの寄与を分析するために、ＨＩＶ−１プロウイルス性クローンは、ｐ６Gagで突然変異し、そしてＰＲ（ｐＮＬ４３−Δｐ６Gagと称される、Ｍｉｎｇｊｕｎ  Ｈｕａｎｇによって提供される）は、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒＲＴと、２９３Ｔ細胞に同時形質移入された。この変異体は、ｐ６Gagの第一アミノ酸残基位置に、ＴＡＡ翻訳終止コドンを含む。これは、Ｖｐｒビリオン組込みについて要求されるＧａｇ配列を終らせた。ｐＮＬ４３−Δｐ６Gagクローンも、ＰＲの活性部位中に変異体（Ｄ２５Ｎ）をも含有し、そしてそれは、細胞表面膜からのｐ６Gag変異体ウイルスの放出を促進する（Ｇｏｔｔｌｉｎｇｅｒら、１９９１年；Ｈｕａｎｇら、１９９５年）。対照として、ＨＩＶ−１ＰＲ変異体ＰＭ３（Ｋｏｈｌら、１９８８年）は、同じｐＮＬ４−３親のクローンから誘導され、分析についても含まれた。ｐＮＬ４３−Δｐ６Gagで形質移入された細胞培養物から精製された子孫ビリオンは、ＰＭ３から誘導されるビリオンと比べて、少ない量ではあるが、検出可能な量のＲＴタンパク質（Ｖｐｒ−ｐ６６として標識された）を含んだ（図１９）。細胞溶解液の分析は、配列を確認し、そしてＰＭ３、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒＲＴ／ｐＮＬ４３−Δｐ６GagでのＶｐｒ−ＲＴの蓄積、同時形質移入された細胞と比べた。ＶｐｒS−ＲＴは、追加の対照として含まれ、そしてＶｐｒを、ｐＮＬ４３−Δｐ６Gagとの同時発現によって誘導されるものではなく、ＰＭ３ビリオンに有効に組み込むことが示された。野生型Ｖｐｒタンパク質は、Δｐ６Gagビリオンに不在でもあった。およそ等しい量のＧａｇタンパク質が、様々のウイルスペレットで検出され、それにより類似の量の様々なビリオンが、量的に比較されたことが確認された。これらの結果は、ＲＴタンパク質は、Ｖｐｒ−ｐ６指向性相互作用から独立にビリオンに組込まれうることを示す。これらのデータは、Ｇａｇ−Ｐｏｌから独立に、トランスでのＲＴの発現（および推論によりＩＮ）は、それらの組込みおよび機能に十分であることも示す。
【００７５】
［実施例２３−ＨＩＶアクセサリーから独立のレンチウイルスベクターでのトランスでのＲＴの発現］
機能性のＲＴは、Ｖｐｒに対して融合することなくとも、トランスでのそれの発現により、ＨＩＶ−１ビリオンに組込まれうることが示された（実施例１９）。トランスで発現されたＲＴが、レンチウイルスベクターにパッケージ化でき、そしてマーカー遺伝子の形質導入を支持するかどうかを決定するために、ＲＴを、ＨＩＶ  ＬＴＲおよびＲＲＥの制御下でｐＬＲ２Ｐ発現プラスミドに連結し、それにより、ｐＬＲ２Ｐ−ＲＴ発現プラスミドを生じた。ｐＬＲ２Ｐ−ＲＴ、ｐＨＲ−ＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＨＲＣＭＶ−β−ｇａｌ、およびｐΔ８．２−ＲＴD185Nは、２９３Ｔ細胞と一緒に形質移入された。ｐΔ８．２−ＲＴD185Nプラスミドは、アミノ酸残基位置１８５（Ｄ１８５Ｎ）でＲＴでの点突然変異を含み、そしてそれは、ポリメラーゼ活性を根絶し、そして遺伝子形質導入を支持するそれの能力を破壊する。対照として、Ｖｐｒ−ＲＴ（ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ−ＲＴ）を、並行実験で、ｐＬＲ２Ｐ−ＲＴに置換させた。別の対照として、ＲＴまたはＶｐｒ−ＲＴのいずれも供給されなかった。形質移入によって産生されたビリオンは、ＨｅＬａ細胞を感染させるために使用された。２日後、形質導入された正の細胞を計数した。図２０は、Ｖｐｒ−ＲＴおよびＲＴの両方は、トランスで提供されたときに、ベクター形質導入を支持することを示す。ベクター力価は、ＲＴが、Ｖｐｒとの融合なしに提供される場合に、約１０分の１にまで減少された。これらの結果は、酵素的機能（ＲＴおよびＩＮ）は、Ｇａｇ−Ｐｏｌとは独立に、トランスで提供されうることを示す。
【００７６】
本発明は、ＶｐｒおよびＶｐｘが、機能的に活性な酵素をＨＩＶビリオンに送達するビヒクルとして役割を果しうることを示し、そしてそれは、ＳＮのような抗ウイルス活性を発揮しうるものが含まれる。本発明は、アクセサリータンパク質標的ウイルス不活性化の概念が、実行可能であることを示した。
【００７７】
本明細書で明記される任意の特許および出版物は、本発明が関与する当業者のレベルの例示である。これらの特許および出版物は、各個別の出版物が、参照して組込まれるべきと特に、そして個別に示されるように同じ範囲まで参照してここに組込まれる。
【００７８】
当業者は、本発明が、対象を行い、そして明記された結末および利点、並びにそこに固有のものを得るのに十分に適合されていることを容易に理解する。ここに記述される方法、手段、処理、分子および特定化合物と共に本実施例は、現在、好ましい実施形態の代表であり、例示であり、そして本発明の範囲における制限として意図されない。請求項の範囲によって定義されるとおり本発明の概念の中に含まれるここでの変化および他の用途は、当業者に思い出される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ−Ｄは、ｖｐｒ１、ｖｐｒ１ＳＮ／ＳＮ*、ｖｐｘ２およびｖｐｘ２ＳＮ／ＳＮ*発現プラスミドの構築を示す。図１Ａは、ｐＴＭ−Ｖｐｒ１発現プラスミドの例示を示す。ＨＩＶ−１YU2ｖｐｒコード領域は、ＰＣＲによって増幅され、そしてＮｃｏｌおよびＢａｍＨＩ制限部位でｐＴＭ１に連結された。図１Ｂは、ｐＴＭ−ｖｐｘ２発現プラスミドの例示を示す。ＨＩＶ−２STｖｐｘコード領域は、ＰＣＲにより増幅され、そしてＮｃｏｌおよびＢｇｌＩＩ／ＳｍａＩ部位でｐＴＭ１に連結された。図１Ｃは、ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ／ＳＮ*発現プラスミドの結合点の例示を示す。ＳＮ／ＳＮ*を含むＳｍａＩ／ＸｈｏＩ  ＤＮＡ断片は、ＨｐａＩ／ＸｈｏＩ切断ｐＴＭ−ｖｐｒ１に連結される。ＨｐａＩおよびＳｍａＩ部位での平滑末端ライゲーションは、ｖｐｒ翻訳終止コドン（ＴＡＡ）をＴｒｐに変化させ、そしてＣ末端Ｓｅｒを、Ｃｙｓ残基に置換した。図１Ｄは、ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮ／ＳＮ*発現プラスミドの結合点の例示を示す。ＳＮおよびＳＮ*を含むＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ  ＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ切断ｐＴＭ−ｖｐｘ２に連結させた。これらのプラスミドの構築で、ＶｐｘＣ末端Ａｒｇコドンを、Ｖａｌコドンに変化させ、そしてＳｅｒ残基を、Ｖｐｘ翻訳終止コドン（ＴＡＡ）の代わりに導入させた。ＢａｍＨＩ部位でのｖｐｘとＳＮ／ＳＮ*の融合は、２つのコード領域の間のｐＴＭ１ポリリンカー（二重下線付き）の短いアミノ酸配列を残した。
【図２】  図２ＡおよびＢは、哺乳類細胞でのＶｐｒ１−およびＶＰＸ２−ＳＮ／ＳＮ*融合タンパク質の発現を示す。図２Ａは、ｐＴＭ１、ｐＴＭ−ｖｐｒ１、ｐＴＭｖｐｒ１ＳＮおよびｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ*が、ｒＶＴ７を用いた感染の１時間後にＨｅＬａ細胞に形質移入されたことを示す（ＭＯＩ＝１０）。２４時間後、細胞溶解物を作成し、そして免疫ブロット分析によって試験した。レプリカのブロットを、抗−Ｖｐｒ１（左）および抗−ＳＮ（右）抗体をプローブとして探索した。図２Ｂは、ｐＴＭ１、ｐＴＭ−ｖｐｘ２、ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮおよびｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮ*で形質移入された、ｒＶＴ７に感染したＨｅＬａ細胞から作製されたレプリカのブロットを、抗−Ｖｐｒ２（左）および抗−ＳＮ（右）抗体をプローブとして探索した。結合した抗体は、製造業者によって記述されるとおりＥＣＬ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））法によって検出された。
【図３】  図３ＡおよびＢは、Ｖｐｒ１−およびＶｐｘ２−ＳＮ／ＳＮ*融合タンパク質がウイルス様粒子（ＶＬＰ）に組込まれることを示す。図３Ａ、ｐＴＭ−ｖｐｒ１、ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ、およびｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ*単独を用いたＴ７発現（ｒＶＴ７感染）ＨｅＬａ細胞の形質移入。ｐＴＭ１も、対照のために形質移入された。培養上清を、形質移入の２４時間後に収集し、遠心分離（１０００Ｘｇ、１０分）により清澄にされ、そして２０％スクロースのクッションで超遠心にかけられた（１２５，０００Ｘｇ、２時間）。ペレット（ＶＬＰ、中央および下部パネル）および細胞（上部パネル）を、ローディング緩衝液に溶解させ、そしてプローブとして抗−Ｖｐｒ１（上部および中央）および抗−Ｇａｇ（下部）抗体を用いて、免疫ブロット分析によって試験した。図３Ｂ、ｐＴＭ−ｖｐｘ２、ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮおよびｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮ*単独、ｐＴＭ−ｇａｇ２と一緒に用いたＴ７発現ＨｅＬａ細胞の形質移入。ペレット（ＶＬＰ、中央および下部パネル）および細胞（上部パネル）を、溶解させ、タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させ、そして上に記述されたとおりニトロセルロースに電気ブロットさせた。レプリカブロットを、抗−Ｖｐｘ２（上部および中央パネル）および抗−Ｇａｇ（下部パネル）抗体をプローブとして探索した。結合抗体を、ＥＣＬ法を用いて検出させた。
【図４】  図４ＡおよびＢは、ウイルス特異的シグナルが、Ｖｐｒ−およびＶｐｘ−ＳＮをＶＬＰに組み込むことを指向することを示す。図４Ａは、ＨＩＶ−１Ｇａｇが、Ｖｐｒ１ＳＮのパッケージングを指向することを示す。ｒＶＴ７に感染された（Ｔ７発現）ＨｅＬａ細胞を、ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ単独で、そしてｐＴＭ−ｇａｇ２およびｐＴＭ−ｇａｇ１との組合せで形質移入させた。ペレット（ＶＬＰ、中央および下部パネル）および細胞（上部パネル）を、形質移入の２４時間後に作製し、そしてプローブとして抗−Ｖｐｒ１（上部および中央）および抗−Ｇａｇ（下部）抗体を用いて、免疫ブロット分析によって試験した。（Ｂ）ＨＩＶ−２Ｇａｇは、Ｖｐｘ２ＳＮのパッケージングを指向する。Ｔ７発現ＨｅＬａ細胞を、ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮ単独およびｐＴＭ−ｇａｇ１およびｐＴＭ−ｇａｇ２と組合せて形質移入させた。ペレット（ＶＬＰ、中央および下部パネル）および細胞（上部パネル）を、形質移入の２４時間後に作製し、そしてプローブとして抗−Ｖｐｘ２（上部および中央）および抗−Ｇａｇ（下部）抗体を用いて、免疫ブロット分析によって試験した。
【図５】  図５ＡおよびＢは、ＶＬＰへの組込みについてのＶｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮの拮抗分析を示す。図５Ａは、様々の量のｐＴＭ−ｖｐｒ１（２．５、５および１０ｕｇ）およびｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ（２．５、５および１０ｕｇ）を、個別に、またはｐＴＭｇａｇ１（１０ｕｇ）と組合せて用いるかのいずれかでのＴ７発現ＨｅＬａ細胞の形質移入を示す。図５Ｂは、ＨｅＬａ細胞が、様々な量のｐＴＭ−ｖｐｘ２（２．５、５および１０ｕｇ）およびｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮ（２．５、５および１０ｕｇ）を、個別に、またはｐＴＭ−ｇａｇ２（１０ｕｇ）と組合せて用いるかのいずれかで形質移入されたことを示す。形質移入の２４時間後、粒子を、スクロースクッションを通した超遠心分離によって濃縮させ、そして抗−Ｖｐｒ１（Ａ）または抗−Ｖｐｘ２（Ｂ）抗体を用いた免疫ブロッティングによって分析した。
【図６】  図６Ａ−Ｃは、ＶＬＰに関連したＶｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮタンパク質のヌクレアーゼ活性を示す。ウイルス様粒子は、スクロースの２０％クッションを通した超遠心分離（１２５，０００×ｇ、２時間）によって、ｐＴＭ−ｇａｇ１／ｐＴＭｖｐｒ１ＳＮ、ｐＴＭ−ｇａｇ１／ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ*、ｐＴＭ−ｇａｇ２／ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮおよびｐＴＭｇａｇ２／ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮ*で同時形質移入されたＴ７発現ＨｅＬａ細胞の培養上清から濃縮された。Ｖｐｒ１−ＳＮおよびＳＮ*（Ｂ）およびＶｐｘ２−ＳＮおよびＳＮ*（Ｃ）を含むペレットを、ＰＢＳに再浮遊させた。ヌクレアーゼ反応用緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．１％ＮＰ４０）で、１０倍希釈を行い、そして１分間煮沸した。５ｕｌの各希釈液を、５００ｎｇのラムダ・ファージＤＮＡ（ＨｉｎｄＩＩＩ断片）を含む１４ｕｌの反応用緩衝液に添加し、そして２時間、３７℃でインキュベートした。反応産物を、０．８％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、そしてＤＮＡを、臭化エチジウム染色により可視化させた。標準（Ａ）は、精製ストレプトコッカスのヌクレアーゼ（Ａ．Ｍｉｌｄｖａｎによって提供された）をカクテル緩衝液に希釈することによって作製され、そして分析された。
【図７】  図７Ａ−Ｄは、トランス相補性によるＨＩＶ−２へのＶｐｘ２ＳＮの組込みを示す。図７Ａは、ｐＬＲ２Ｐｖｐｘ２ＳＮ／ＳＮ*発現プラスミドの構築を示す。ＨＩＶ位の有効な発現を促進するために、ＨＩＶ−２ＬＴＲおよびＲＲＥを、ｐＴＺ１９Ｕのポリリンカーに操作して、それによりｐＬＲ２Ｐを生じた。ｐＴＺ１９Ｕポリリンカー内のこれらの構成要素の組織が示される。ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩｖｐｘ２ＳＮおよびｖｐｘ２ＳＮ*（ｖｐｘ２ＳＮ／ＳＮ*）含有ＤＮＡ断片を、ｐＬＲ２Ｐに連結させ、それによりｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮおよびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮ*（ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘＳＮ／ＳＮ*）を生じた。図７Ｂは、ＨＩＶ−２ビリオンとのＶｐｘ２ＳＮの結合を示す。ＨＬｔａｔ細胞の単層培養を、ＨＩＶ−２STプロウイルス性ＤＮＡ（ｐＳＸＢ１）で形質移入させ、そしてｐＳＸＢ１／ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮおよびｐＳＸＢ１／ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮ*で同時形質移入させた。余剰細胞ウイルスを、２０％スクロースのクッションを通した超遠心分離（１２５，０００×ｇ、２時間）による形質移入の４８時間後に培養上清から濃縮させた。ウイルス性ペレットの複写ウエスタンブロットを、作製し、そして抗−Ｖｐｘ２（左）抗−ＳＮ（中央）および抗−Ｇａｇ（右）抗体で独立に釣上げた。図７Ｃは、スクロース勾配分析を示す。ｐＳＸＢ１／ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮで同時形質移入されたＨＬｔａｔ細胞から作製された上清−ウイルスのペレットを、ＰＢＳ中に再浮遊させ、２０−６０％線形勾配のスクロースに積層させ、そして１２５，０００×ｇで、１８時間遠心分離させた。分画（０．５ｍｌ）を、試験管の底から収集し、ＰＢＳ中で１：３に希釈し、再沈殿させ、そして免疫ブロット分析用の電気泳動緩衝液に溶解させた。レプリカブロットを、抗−ＳＮ（上部）および抗−Ｇａｇ（下部）抗体をプローブとして探索した。分画１は、勾配の底からの第一の収集物を表し、そして分画１９は、最後の収集物を表す。タンパク質検定の頂点でを除き、唯一の代替分画が示される。図７Ｄは、ＨＩＶ−２7312AＶｐｒおよびＶｐｘコンピテントウイルスへのＶｐｘ２ＳＮの組込みを示す。ＨＩＶ−２7312Aプロウイルス性ＤＮＡ（ｐＪＫ）で形質移入されるか、またはｐＪＫ／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮまたはｐＪＫ／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮ*で同時形質移入されたＨＬｔａｔ細胞の上清から濃縮されたウイルスを、上に記述されるとおり免疫ブロット分析から作製した。対照として含まれるのは、ｐＳＸＢ１／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮ*同時形質移入によって誘導されるビリオンである。複写ブロットを、抗−Ｖｐｘ（左）および抗−Ｇａｇ（右）抗体をプローブとして探索した。
【図８】  図８Ａ−Ｃは、トランス相補性によるＨＩＶ−１ビリオンへのＶｒ１ＳＮの組込みを示す。ｐＮＬ４−３（ＨＩＶ−１）およびｐＮＬ４−３Ｒ−（ＨＩＶ−１ｖｐｒ突然変異体）で形質移入されるか、またはｐＮＬ４−３／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＳＮおよびｐＮＬ４−３−／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＳＮで同時形質移入されたＨＬｔａｔ細胞から得られる培養上清ウイルスを、上述のとおり免疫ブロット分析のために作製した。ブロットを、抗−ＳＮ（図８Ａ）、抗−Ｖｐｒ１（図８Ｂ）および抗−Ｇａｇ（図８Ｃ）抗体をプローブとして探索した。
【図９】  図９は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤によるＶｐｒ１／Ｖｐｘ２−ＳＮプロセシングの阻害を示す。ＨＩＶ−１（ｐＳＧ３）およびＨＩＶ−２（ｐＳＸＢ１）プロウイルス性ＤＮＡを、それぞれ、ｐＬＲ２Ｐｖｐｒ１ＳＮおよびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮを用いたＨＬｔａｔ細胞のレプリカ培養に別個に同時形質移入させた。各形質移入を含んだ培地の１つの培養物を、１ｕＭのＨＩＶプロテアーゼ阻害剤Ｌ６９９−５０２で補足した。ビリオンを、２０％スクロースのクッションを通した超遠心分離により、培養上清から濃縮させ、そして抗−Ｇａｇ（図９Ａ）および抗−ＳＮ（図９Ｂ）抗体を用いた免疫ブロット分析によって試験した。
【図１０】  図１０Ａ−Ｄは、酵素的に活性なＶｐｒ１−およびＶｐｘ２−ＣＡＴ融合タンパク質のＨＩＶビリオンへの組込みを示す。図１０Ａは、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＣＡＴおよびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＣＡＴ発現プラスミドの結合点の例示を示す。ＰＣＲで増幅された、ＣＡＴを含むＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ  ＤＮＡ断片を、ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ切断ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＳＮおよびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＡＮに連結させ、それによりＳＮを置換した（図１参照）。この構造は、ｖｐｒ１／ｖｐｘ２ＣＡＴコード領域の間の２つの別のアミノ酸残基（ＡｓｐおよびＬｅｕ、上記黒塗り棒線）を誘導した。図１０Ｂは、Ｖｐｒ１ＣＡＴのＨＩＶ−１ビリオンへの組込みを示す。ｐＮＬ４−３（ＨＩＶ−１）およびｐＮＬ４−３Ｒ−（ＨＩＶ−１−Ｒ−）で形質移入されるか、またはｐＮＬ４３／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＣＡＴおよびｐＮＬ４−３Ｒ−／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＣＡＴで同時形質移入されたＨＬｔａｔ細胞から産生されるウイルスを上述のとおり作製し、そして免疫ブロット分析によって試験した。レプリカブロットを、抗−Ｖｐｒ１（左）および抗−Ｇａｇ（右）抗体をプローブとして探索した。図１０Ｃは、Ｖｐｘ２ＣＡＴのＨＩＶ−２ビリオンへの組込みを示す。ｐＳＸＢ１（ＨＩＶ−２）で形質移入されるか、またはｐＳＸＢ１／ｐＬＲ２Ｐｖｐｘ２ＣＡＴで同時形質移入されたＨＬｔａｔ細胞から産生されるウイルスは、上述のとおり作製され、そして免疫ブロット分析によって試験された。レプリカブロットを、抗−Ｖｐｘ２（左）および抗−Ｇａｇ（右）抗体をプローブとして探索した。図１０Ｄは、ビリオンを組込まれたＶｐｒ１−およびＶｐｘ２−ＣＡＴ融合タンパク質は、酵素的活性を保有することを示す。ｐＳＸＢＩ（ＨＩＶ−２）で形質移入されるか、またはｐＳＸＢ１／ｐＬＲ２Ｐｖｐｘ２ＣＡＴおよびｐＮＬ４−３／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＣＡＴで同時形質移入されたＨＬｔａｔ細胞からペレット化されたウイルスを溶解させ、そしてＣＡＴ分析によって試験された。ＨＩＶ−２が、負の対照として含まれた。
【図１１】  図１１Ａ−Ｄは、酵素的に活性なＣＡＴおよびＳＮ融合タンパク質のビリオン結合を示す。図１１Ａは、ｐＳＸＢ１およびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２で同時形質移入されたＨＬｔａｔ細胞の培養上清から収集されるＨＩＶ−２ビリオンが、２０−６０％スクロースの線形勾配で沈殿されたことを示す。０．７ｍｌ分画を収集し、そしてプローブとしてＧａｇモノクローナル抗体を使用した免疫ブロット分析によって分析した。図１１Ｂは、ＣＡＴ酵素活性が、標準法によって各分画で測定されることを示す。非アセチル化［14Ｃ］クロラムフェニコール（Ｃｍ）およびアセチル化クロラムフェニコール（Ａｃ−Ｃｍ）の位置が示される。図１１Ｃは、ｐＳＧ３およびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＳＮで同時形質移入され、そしてＬ６８９，５０２の存在下で培養されたＨＬｔａｔ細胞から由来するＨＩＶ−１ビリオンが、２０−６０％スクロースの線形勾配で沈殿されたことを示す。分画を収集し、そしてＧａｇモノクローナル抗体を使用した免疫ブロット分析によって、ウイルス含有量について分析した。図１１Ｄは、ＳＮ活性が、図６で記述されるとおり各分画で測定されたこをと示す。
【図１２】  図１２Ａ−Ｃは、ＨＩＶ−１ゲノム、ｐΔ８．２、ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＨＲ−ＣＭＶ−β−ｇａｌ、ｐＣＲ−ｇａｇ−ｐｒｏ、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ−ＲＴ−ＩＮ，ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−ＧおよびｐＨＲ−ＣＭＶ−β−ｇａｌプラスミドの構築を示す。図１２Ａは、ＨＩＶ−１ゲノムの例を示す。図１２Ｂは、レンチウイルスベクタープラスミド発現システムを示す。図１２Ｃは、ＲＴおよびＩＮが、Ｖｐｒ融合パートナーとして隣接するトランスレンチウイルスベクター発現システムの例を示す。
【図１３】  図１３は、蛍光顕微鏡によって測定されるとおり本発明のトランスレンチウイルスベクターとの正の遺伝子トランスダクションを示す。
【図１４】  図１４は、蛍光顕微鏡によって測定されるとおり対照としてレンチウイルスベクターとの正の遺伝子トランスダクションを示す。
【図１５】  図１５は、本発明のｐＨＲ−ＣＦＴＲトランスレンチウイルスベクターの構築を示す。
【図１６】  図１６は、トランスレンチウイルスベクターを、および対照としてレンチウイルスベクター用いたＨｅＬａ細胞でのＣＦＴＲの発現を示す。トランスダクトした細胞を、免疫蛍光顕微鏡でポリクローナル抗体を用いて釣上げた。
【図１７】  図１７は、免疫蛍光顕微鏡でのモノクローナル抗体を用いたＨｅＬａ細胞でのＣＦＴＲの発現を示す。
【図１８】  図１８は、ハロゲン化物感受性発蛍光団によって測定されるとおり、トランスレンチウイルスで形質導入されたＨｅＬａ細胞でのＣＦＴＲ機能の保存を示す。
【図１９】  図１９ＡおよびＢは、Ｖｐｒ依存性組込みなしに、トランスでのＲＴの子孫ビリオンにおける存在を示す。
【図２０】  図２０は、Ｖｐｒ−ＲＴおよびＲＴの療法が、トランスで供される場合にベクター形質導入を支持することを示す。
【図２１】  図２１は、本発明によるトランスレンチウイルスベクターの構成要素構築物を示す。図２１Ａは、ｐＣＭＶ、Ｇａｇ−Ｐｒｏパッケージングプラスミドを示す。図２１Ｂは、ｐＣＭＶ、ＧａｇＮＣ−ＲＴ−ＩＮトランス−酵素発現プラスミドを示す。図２１Ｃは、ベクタープラスミドを示す。図２１Ｄは、本発明で操作性のあるエンベローププラスミド構築物を示す。
【図２２】  図２２は、本発明によるレトロウイルスベクターの構成要素構築物を示す。図２２Ａは、ｐＣＭＶ、Ｇａｇ−Ｐｒｏ−ＲＴ−ＩＮレトロウイルス性パッケージングプラスミドを示す。図２２ＢおよびＣは、それぞれ、図２１ＣおよびＤのベクタープラスミドおよびエンベローププラスミドである。
【図２３】  図２３は、本発明によるレンチウイルスベクターの構成要素構築物を示す。図２３Ａは、ｐＴＲＥ、Ｇａｇ−Ｐｒｏ−ＲＴ−ＩＮパッケージングプラスミドを示す。図２３Ｂは、ｐＨＲ−ＣＴＳ、ＣＭＶ、ＧＦＰ、ＷＰＲＥレンチウイルスベクタープラスミドを示す。図２３Ｃは、図２１Ｄでのエンベローププラスミドである。
【図２４】  図２４Ａ−Ｃは、Ｐｒｏ切断部位およびジンクフィンガー位置を示す、本発明による代表的トランスレンチウイルストランス酵素プラスミドを示す。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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