(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１２から２４個のヌクレオチド塩基を含むペプチド核酸（ＰＮＡ）であって、ヒトＮ−ｍｙｃ遺伝子のアンチセンス鎖に相補的であるペプチド核酸であって、前記ペプチド核酸は、ヒトＮ−ｍｙｃ遺伝子のエキソン２の配列に相補的であるセンスアンチジーンＰＮＡ（５’−ＡＴＧＣＣＧＧＧＣＡＴＧＡＴＣＴ−３’）であるペプチド核酸（ＰＮＡ）。
【請求項２】
前記センスアンチジーンＰＮＡが、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子を発現する標的細胞の核膜を通過することができる担体と複合している請求項１に記載のペプチド核酸（ＰＮＡ）。
【請求項３】
前記担体が、３’の位置でＰＮＡ配列に複合している請求項２に記載の複合ペプチド核酸（ＰＮＡ）。
【請求項４】
前記担体が、以下のペプチド配列：
ＰＫＫＫＲＫＶ
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ
ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＡＡＬＡＫＫＩＬ
（Ｄ）−ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲ
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ
ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ
ＭＳＶＬＴＰＬＬＬＲＧＬＴＧＳＡＲＲＬＰＶＰＲＡＫＩＨＳＬ
ＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫ
ＫＫＫＫ
より選択される請求項２もしくは３に記載のペプチド核酸（ＰＮＡ）。
【請求項５】
前記センスアンチジーンＰＮＡが、ＳＶ４０ウイルス由来の核移行シグナル（ＮＬＳ）（ペプチド配列ＰＫＫＫＲＫＶ）に３’で複合している請求項１に記載のペプチド核酸（ＰＮＡ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、センスおよびアンチセンスペプチド核酸（ＰＮＡ）に関する。本発明はさらに、遺伝子疾患治療薬を調製するための前記ＰＮＡの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンチセンス法は、遺伝子疾患やウイルス関連疾患を治療するうえで有効に使用できることが知られている。
【０００３】
アンチセンス法によれば、遺伝子の転写ＲＮＡ領域に相補的なＲＮＡの一部分が、相補ＤＮＡと転写ＲＮＡの間の結合を形成することにより転写ＲＮＡの翻訳を阻止し、転写ＲＮＡが発現されるのをブロックすることができる。
【０００４】
すなわち、１５〜２５塩基長を有する短鎖ＤＮＡを相補的な形態で合成し、ウイルスの特異的ｍＲＮＡや腫瘍細胞にみられる有害源の特異的ｍＲＮＡの一部分と結合させる。
【０００５】
このように作られた相補的な部分は翻訳を直接阻止することができる。
【０００６】
さらに、ヒトの遺伝子治療に用いるアンチセンス薬を調製するためのアンチセンス法の使用が知られている。
【０００７】
例えば、オリゴヌクレオチドのようなアンチセンス構造の使用が知られている。
【０００８】
しかし、近年では、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの新たなアンチセンスおよびアンチジーン構造の使用が開発されている。
【０００９】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、通常のデオキシリボース−リン酸構造の代わりに、擬ペプチド鎖（骨格）を含む中性の電荷を帯びた核酸アナログを含む。
【００１０】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、オリゴヌクレオチドのアンチセンス構造と比較した場合、酵素に対しより安定している。
【００１１】
ペプチド核酸は、ＤＮＡ／ＲＮＡの鎖と相補的に結合するため、ハイブリッド型のＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／ＲＮＡ二重らせん構造をつくることができ、これはホモ２本鎖よりも熱力学的に安定している。
【００１２】
さらに、ペプチド核酸はペプチドの合成に通常用いられる合成技術により合成することができる。
【００１３】
上記に開示した利点に照らして、ペプチド核酸（ＰＮＡ）はアンチセンス遺伝子治療における一つの代替法に当たるものであり、アンチジーン法の最も有益なシステムである。
【００１４】
さらに、ペプチド核酸は標的となる配列に対する特異性が高く、蛋白質の発現を阻害することができることが知られている。
【００１５】
したがって、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は遺伝子疾患またはウイルス関連疾患を治療するための有望な治療アプローチとなっている。
【００１６】
しかし、ペプチド核酸（ＰＮＡ）はオリゴヌクレオチドのアンチセンス構造である点で、細胞膜透過能が低いという短所を有している。こうした短所を克服するため、研究者のなかにはペプチド核酸の細胞膜透過の有効性を増大させるべく、ペプチド核酸を特定の分子と複合させる研究を行っているものもいる。
【００１７】
さらに、未治療の神経芽腫の約２５〜３０％に、進行した病期、急速な進行、不良な予後関連する癌原遺伝子のＮ−ｍｙｃの増幅／過剰発現がみられることが知られている。
【００１８】
神経芽腫は末梢神経系由来の肉腫であり、神経芽（神経細胞になる胚細胞）からなる。
【００１９】
神経芽腫は１０歳以下の小児に発症し、脳転移や肝転移の原因となる。
【００２０】
トランスジェニックマウスでＮ−ｍｙｃを発現させると、神経芽腫を発症する。
【００２１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮ−ｍｙｃ発現をアンチセンスで阻害すると、神経芽腫の増殖が抑制され、神経芽腫の腫瘍細胞の分化が促進される。
【００２２】
今日までの阻害には、ｍＲＮＡのＮ−ｍｙｃに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド構造、およびＮ−ｍｙｃのアンチセンスＲＮＡを作るようにデザインされた担体の発現の双方が付きものであった。
【００２３】
しかし、オリゴヌクレオチドのアンチセンスは、ヌクレアーゼにより急速に分解するという短所を有する。したがって、Ｎ−ＭＹＣ（蛋白質）の選択的阻害剤を特定することは、Ｎ−ｍｙｃ発現神経芽腫の治療に用いる、毒性が低く有効性の高い治療薬を開発するうえできわめて妥当であろう。
【００２４】
その結果、Ｎ−ＭＹＣ蛋白質発現腫瘍で産生される前記Ｎ−ＭＹＣ蛋白質の合成を阻害または排除することができるＰＮＡ配列が必要とされている。
【００２５】
特に、Ｎ−ＭＹＣ蛋白質の合成を阻害または排除するためのアンチセンス法およびアンチジーン法に用いられる、必要に応じて複合が可能なＰＮＡ配列が必要とされている。
【００２６】
特に、遺伝子疾患や病原性ウイルスによる疾患を治療するための、特異性や有効性の高い薬剤（アンチセンス薬およびアンチジーン薬）の調製に用いられるアンチセンスＰＮＡ配列およびアンチジーンＰＮＡ配列が必要とされている。
【００２７】
特に、メッセンジャーｍＲＮＡと結合することができる任意のペプチド核酸が必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
本発明の目的は、細胞膜を通過することができるＰＮＡ配列をデザインし、選択することである。
【００２９】
さらに、本発明の目的は、アンチセンス法で用いるＰＮＡ配列をデザインし、選択することである。
【００３０】
本発明の別の目的は、アンチジーン法で用いるＰＮＡ配列をデザインし、選択することである。
【００３１】
本発明の別の目的は、例えばヒト神経芽腫細胞のＮ−ＭＹＣ蛋白質を選択的に阻害するＰＮＡ配列をデザインし、選択することである。
【００３２】
本発明の別の目的は、遺伝子疾患治療に用いるアンチセンス薬およびアンチジーン薬を調製するため、特性性および有効性の高いＰＮＡ配列をデザインし、選択することである。
【００３３】
これらの目的および他の目的は、以下の詳細な記述から明らかな通り本出願者により達成された。本出願者は、特にヒト神経芽腫細胞において、Ｎ−ＭＹＣ蛋白質を発現する腫瘍での前記蛋白質の合成を阻害する特異なペプチド核酸（ＰＮＡ）を使用することに基づくアンチセンス法およびアンチジーン法を提案するものである。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
したがって、本発明の第１の目的は、添付の独立請求項にあるような特徴を有するＰＮＡ配列にある。
【００３５】
本発明の別の目的は、添付の独立請求項にあるような特徴を有する前記ＰＮＡ配列の調製法にある。
【００３６】
本発明の別の目的は、添付の独立請求項に記載の特徴を有する前記ＰＮＡ配列を遺伝子疾患の治療に使用することにある。
【００３７】
その他の好ましい実施形態を添付の従属請求項に記載しているが、本発明の目的を限定するものではない。
【００３８】
本出願者は好ましい実施形態の中で、ヒト神経芽腫細胞におけるＮ−ＭＹＣ蛋白質を選択的に阻害するためにＰＮＡ配列を使用している。
【００３９】
本出願者が選択したペプチド核酸の有効性を示すために、本出願者は４つの神経芽腫細胞系統、すなわち、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子を増幅および過剰発現しているＧＩ−ＬＩ−Ｎ、ＩＭＲ−３２と、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子を増幅も発現もしていないＧＩ−ＣＡ−Ｎ、ＧＩ−ＭＥ−Ｎとを選択することにより実験を行った。
【００４０】
驚いたことに、本出願者の選択したアンチセンスペプチド核酸は、担体を使わずに細胞膜を通過できることがわかった。
【００４１】
さらに驚いたことに、本出願者は、Ｎ−ＭＹＣ蛋白質の合成に対するアンチセンスおよびアンチジーンＰＮＡによる阻害効果は選択性および特異性が高く、抗増殖効果を有することを発見した。
【００４２】
また、アンチセンスＰＮＡの使用後、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子の増幅したヒト神経芽腫ＧＩ−ＬＩ−Ｎ細胞の増殖が停止すると、それが直接細胞の分化またはアポトーシスにつながる（プログラム細胞死）。
【００４３】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、有利には、１２から２４個のヌクレオチド塩基を含んでいる。前記ペプチド核酸は、ヒトＮ−ｍｙｃ遺伝子のセンスまたはアンチセンス鎖に相補的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下に記載および例示した好ましいＰＮＡは、本発明を限定するものとして考えるべきではない。事実、他のタイプのＰＮＡも、その有効性を高め、さまざまな治療ニーズに対する特異性や適性を増すように、その構造を適宜修正することによって可能である。したがって、これらの変異体もまた、本発明の枠組みや目的の範囲内にある。
【００４５】
第一の実施形態では、ペプチド核酸はヒトＮ−ｍｙｃ遺伝子のセンス鎖に相補的であり、アンチセンスＰＮＡと呼ばれる。
【００４６】
第二の実施形態では、ペプチド核酸はヒトＮ−ｍｙｃ遺伝子のアンチセンス鎖に相補的であり、センスＰＮＡと呼ばれる。
【００４７】
本出願者はリボソームによる攻撃を阻止するために、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子の５’−ＵＴＲ領域の１配列のみに相補的であるアンチセンスペプチド核酸ＰＮＡ（１３５から１５０ｂｐ、５’−ＴＣＣＡＣＣＣＡＧＣＧＣＧＴＣＣ−３’、ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１３２４１）をデザインした。
【００４８】
アンチセンスＰＮＡ活性の特異性を評価するために、３つの塩基の置換を含む変異型ＰＮＡをデザインした（５’−ＣＣＣＡＣＴＣＡＧＣＧＣＧＣＣＣ−３’）。
【００４９】
アンチセンスまたはセンスＰＮＡは、標的細胞、すなわちＮ−ｍｙｃ遺伝子を発現する腫瘍細胞の核膜を通過することができる担体と複合させることができる。
【００５０】
前記担体は、３’の位置でＰＮＡ配列に複合していることが好ましい。
【００５１】
本発明の好ましい特徴として、前記担体は適切な蛋白質に由来する適切なペプチド配列からなる。
【００５２】
前記蛋白質の由来はさまざまであり、例えば異なる種類のウイルスから得ることができる。
【００５３】
前記蛋白質は以下の例の中から選択することが好ましいが、この例に限定されるものでは決してない。
ＳＶ４０ウイルス由来の核移行シグナル（ＮＬＳ）：ペプチド配列ＰＫＫＫＲＫＶからなる担体。
アンテナペディアのペネトラチン：ペプチド配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫからなる担体。
トランスポルタン（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）：ペプチド配列ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＡＡＬＡＫＫＩＬからなる担体。
Ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型ペネトラチン：ペプチド配列（Ｄ）−ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲからなる担体。
ＨＩＶウイルス由来のＴＡＴ蛋白質：ペプチド配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱからなる担体。
ＨＩＶウイルス由来のＴＡＴ蛋白質：ペプチド配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲからなる担体。
【００５４】
担体に用いるその他のペプチド配列は、例えば以下の中から選択することが好ましい。
ＭＳＶＬＴＰＬＬＬＲＧＬＴＧＳＡＲＲＬＰＶＰＲＡＫＩＨＳＬ、
ＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫ、
ＫＫＫＫ。
【００５５】
前記ペプチド配列を構成するアミノ酸は、Ｌ体、ＤＬ体いずれでもよい。
【００５６】
本発明の別の好ましい特徴として、Ｄ体またはＬ体を有するアミノ酸を含むペプチドから選択した担体とＰＮＡが複合することにより、前記ペプチドは、安定した共有結合、または不安定なジスルフィド結合を通じて直接ＰＮＡと結合する。その後これを還元により離すことができる。
【００５７】
Ｄ−アルギニンを含むペプチドは特に好ましい。
【００５８】
本発明の３番目の好ましい特徴として、ＰＮＡがさまざまな構造を有する担体と複合することにより、前記担体は安定した共有結合、または不安定なジスルフィド結合を通じて直接ＰＮＡと結合する。その後これを還元により離すことができる。これらの担体では、レチノイン酸が特に好ましい。
【００５９】
担体と複合したアンチセンスＰＮＡは、アンチジーンＰＮＡ活性を示す。アンチジーンＰＮＡのうち、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子のアンチセンス鎖に結合するものを、センスアンチジーンＰＮＡと呼ぶのに対し、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子のセンス鎖に結合するものを、アンチセンスアンチジーンＰＮＡと呼ぶ。
【００６０】
センスアンチジーンＰＮＡは、特に標的細胞に対して有効であることが証明されている。
【００６１】
また、本出願者はセンスアンチジーンＰＮＡ配列およびアンチセンスアンチジーンＰＮＡ配列もデザインした（センスアンチジーン：１６５０〜１６５５ｂｐ  ５’−ＡＴＧＣＣＧＧＧＣＡＴＧＡＴＣＴ−３’、アンチセンスアンチジーンＰＮＡ：５’−ＡＧＡＴＣＡＴＧＣＣＣＧＧＣＡＴ−３’  ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１３２４１）が、これはＮ−ｍｙｃ遺伝子のエキソン２の配列と相補的である。前記配列は、３’でＳＶ４０ウイルス由来の核移行シグナル（ＮＬＳ）と複合し、これが核膜を通過するのを助ける。この担体はペプチド配列ＰＫＫＫＲＫＶからなる。
【００６２】
好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスＰＮＡとセンスアンチジーンまたはアンチセンスアンチジーンＰＮＡは、薬剤の組成物を調製するために使用される。
【実施例】
【００６３】
本発明によるペプチド核酸（ＰＮＡ）の合成、精製、特性付けの方法を、あくまでも例として以下に記載する（濃度１０マイクロモル）。
【００６４】
メチルベンズヒドリルアミノ基（ＭＢＨＡ−ＰＳ）で官能化したポリスチレン樹脂５０ｍｇをジクロロメタン（ＤＣＭ）で１時間処理し、樹脂を膨張させる。次に、樹脂をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中５％のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）ＤＣＭ、さらに、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中５％のＤＩＰＥＡにて洗浄する。ＮＭＰ１２５マイクロリットルに第１級Ｎ−Ｂｏｃで保護されたＣ末端ＰＮＡモノマー（市販されている）０．０１ミリモルを含む溶液と、ＮＭＰ１２５マイクロリットルにヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾリルウロニウム（ＨＢＴＵ）０．００９５ミリモルを含む溶液を別々に調製し、２つの溶液を混合する。ＤＩＰＥＡ０．０２ミリモルを加え、全体を２分間賦活する。次に、活性化したモノマーを含むこの溶液を樹脂と接触させる。１時間反応させた後、樹脂をＮＭＰにて繰り返し洗浄する。無水酢酸／ピリジン／ＤＭＦの比が１：２：２の溶液で未反応部位をブロックし、１時間樹脂に接触させる。反応部位が存在しないことをカイザーテストにてチェックする。カイザーテストが非陰性の場合は、ブロック処理を繰り返す。次に、ＮＭＰで樹脂を繰り返し洗い流した後、ＤＭＦ中５％のＤＩＰＥＡ、次にＤＭＣにて洗浄する。ここで、樹脂は第１のＣ末端モノマーと０．２ミリモル／グラムの比率で結合する。
【００６５】
この鎖の伸張処理は、導入するモノマーごとに、Ｂｏｃ基の脱保護、前処理活性化、カップリング、未反応部位があればそのブロック（キャッピング）を含むサイクルからなる。こうしたサイクルは通常、自動合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ＡＢＩ  ４３３Ａ）によって行われる。さまざまなステップに用いる溶液を以下に記載する。脱保護：トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／ｍ−クレゾール  ９５：５。前処理活性化およびカップリング：保護されたＮ−ＢｏｃＰＮＡモノマー０．０５ミリモル、およびＨＢＴＵ０．０４８ミリモルをＮＭＰ５００マイクロリットルに溶解させ、ＤＩＰＥＡ０．１ミリモルを添加。キャッピング：無水酢酸：ピリジン：ＮＭＰ（１：２５：２５）。最後から２番目のサイクルでは、ＰＮＡモノマーの代わりにスペーサ分子（Ｂｏｃ−アミノエトキシエトキシ酢酸）を、最後のサイクルではＰＮＡモノマーの代わりにローダミンを使ってローダミン化したＰＮＡを合成した。
【００６６】
こうして合成したＰＮＡを、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）：ＴＦＡ：ｍ−クレソール：チオアニソルの比が２：６：１：１の溶液を使って樹脂から分離し、エチルエーテルをこの分離溶液に加えて沈降させた。
【００６７】
こうして得た未処理のＰＮＡを、ＬＣ−ＭＳ（分析カラムＣ１８  ２５０×４．６ｍｍ、０．２％ギ酸を含む水と、０．２％ギ酸を含む水：アセトニトリルの（６０：４０）溶液とのグラディエント溶離、流速１ｍｌ／分。紫外吸光検出器（波長２６０ｎｍ）およびポジティブイオン化モードの質量検出器、範囲１５０から１５００ｍ／ｚ）により分析した。精製は、セミ分取カラム（２５０×１０ｍｍ）を使用したものの、分析カラムに似たシステムにより行った。純粋化合物の同定は、常に質量検出器により確認した。精製後の標準抽出量は３０％であった。精製後の標準純度は９０から９５％であった。
【００６８】
アンチセンスＰＮＡおよびアンチジーンＰＮＡのヒト神経芽腫細胞への透過能を評価し、その後の細胞内局在性を分析するため、本出願者はＧＩ−ＬＩ−ＮおよびＩＭＲ−３２、ＧＩ−ＣＡ−ＮおよびＧＩ−ＭＥ−Ｎ−の４つの細胞系統を用いて、５’でローダミンに複合したアンチセンスまたはセンスＰＮＡ２０μＭにより３０分から２４時間処理した。さらに、アンチジーンＰＮＡを３’でＮＬＳと複合させた。蛍光顕微鏡像は、ＰＮＡで細胞を処理した３０分後には既に、５’−ＵＴＲのアンチセンスＰＮＡ（ＧＩ−ＬＩ−ＮおよびＧＩ−ＣＡ−Ｎ細胞系統）に対する細胞質内蛍光と、アンチジーンＰＮＡ（ＧＩ−ＬＩ−ＮおよびＧＩ−ＭＥ−Ｎ細胞系統）に対する核内蛍光を測定できることを示している。最大輝度は６時間で得られ、その値は２４時間一定している。
【００６９】
アンチセンスＰＮＡの細胞質内値が高かったのに対し、アンチジーンＰＮＡについては高い核内値が認められた。
【００７０】
未処理の細胞は、６時間後にバックグラウンドの細胞内蛍光のみを示す。
【００７１】
本出願者の選択したペプチド核酸の有効性および特異性を評価するため、本出願者は上記に記載の４つの細胞系統を使用した。
【００７２】
２４ウエルプレートを用いた３重試験（ｔｈｒｅｅ  ｆｏｌｄ  ｔｅｓｔ）で、１０％ＦＢＳおよびＬ−ブタニン２ｍＭを含有する０．５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０にて、１．０×１０５細胞を第１ウエルに導入した。細胞を２４時間培養し、ウエルの底部に付着させた。
【００７３】
次に、細胞増殖阻害の至適濃度を評価するため、５’−ＵＴＲのアンチセンスＰＮＡについては、濃度１０、２０、４０、６０μＭでペプチド核酸をＧＩ−ＬＩ−Ｎ細胞に添加したのに対し、センスおよびアンチセンスのアンチジーンＰＮＡについては、濃度１、２、５、１０、２０μＭでＧＩ−ＬＩ−ＮおよびＩＭＲ−３２細胞に添加した。
【００７４】
ペプチド核酸のＮ−ＭＹＣ蛋白質に対する作用の特異性および選択性を評価するため、ＧＩ−ＬＩ−Ｎ細胞を、３つの変異部位を組み込んだ５’−ＵＴＲのアンチセンスペプチド核酸により２０μＭ濃度（こうしたＰＮＡ用に選ばれた至適濃度）にて処理し、ＧＩ−ＣＡ−Ｎ細胞（Ｎ−ｍｙｃ遺伝子を増幅していない）を、５’−ＵＴＲのアンチセンスＰＮＡにより２０μＭ濃度にて処理した。
【００７５】
センスおよびアンチセンスアンチジーンＰＮＡの特異性を評価するため、ＧＩ−ＭＥ−ＮおよびＧＩ−ＣＡ−Ｎ（Ｎ−ｍｙｃ遺伝子を増幅も過剰発現もしていない）を、センスおよびアンチセンスアンチジーンＰＮＡにより１０μＭ濃度（センスアンチジーンＰＮＡ用に選ばれた至適濃度）にて処理した。
【００７６】
次に、この処理の効果を評価するため、処理の２４、４８、７２時間後に細胞を採集して計測した。
【００７７】
細胞数および細胞生存能は、色素排除法（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）（トリパンブルー染色）により測定した。
【００７８】
Ｎ−ｍｙｃ遺伝子発現が増幅したＧＩ−ＬＩ−Ｎ細胞に対し、２０μＭのアンチセンスＰＮＡで処理した場合には、細胞増殖の高い阻害性が認められる。最大阻害効果は７０％であり、処理後４８時間で得られる（図１）。
【００７９】
反対に、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子発現が増幅しておらず、Ｎ−ｍｙｃを発現していないＧＩ−ＣＡ−Ｎ神経芽腫細胞は、同じ条件化で行った試験でいかなる阻害効果も示していない（図１）。
【００８０】
３つの変異部位を導入した改変配列を含むアンチセンスＰＮＡを用いたＧＩ−ＬＩ−Ｎ細胞の増殖試験では、いかなる阻害効果も示さなかった（図１）。これは、５’−ＵＴＲ配列のＮ−ｍｙｃの転写に対するアンチセンスＰＮＡの選択的、特異的作用を証明するものである。
【００８１】
２０μＭのアンチセンスＰＮＡで処理した２４、４８、７２時間後のＧＩ−ＬＩ−Ｎ細胞系統におけるＮ−ＭＹＣ（蛋白質）の産生量を、ウエスタンブロット法を用いて評価した。２４時間後の蛋白質量は、明らかに減少していることがわかった。前記減少は、７２時間後には低下する。
【００８２】
２０μＭのアンチセンスＰＮＡで処理した３６時間後のＧＩ−ＬＩ−Ｎ細胞に対するフローサイトメトリー分析は、前記ＰＮＡがＧ０／Ｇ１期に３４％から５７％に細胞蓄積を誘発し、Ｇ２期とＳ期にはそれぞれ１３％から６％、５３％から３７％に減少させることを示している。
【００８３】
さらに、ハイポジプロイド（ｈｙｐｏｄｉｐｌｏｉｄ）ＤＮＡ量（２倍体のＤＮＡ、すなわち２ｎより染色体数が少ない）を伴うｓｕｂ−Ｇ１期の細胞数は３から２２％に増加する。
【００８４】
神経細胞におけるＧＩ−ＬＩ−Ｎ細胞の分化を評価するため、前記細胞系統を２０μＭのアンチセンスＰＮＡで処理し、形態変化を顕微分析により検出した。
【００８５】
２０μＭのアンチセンスＰＮＡで処理した場合、処理しない場合のＧＩ−ＬＩ−Ｎ細胞の増殖を３６、４８時間後に顕微鏡で評価した。
【００８６】
３６時間後、処理を行った細胞は対照細胞に比べて分布の均一性が低く、４８時間後には小さな細胞集合体を形成する傾向がみられる。
【００８７】
ＧＩ−ＣＡ−Ｎ細胞に対する増殖阻害効果は認められなかったが、ＧＩ−ＬＩ−Ｎ細胞に対して行った試験では前記効果が認められた。
【００８８】
本発明によるＰＮＡは、Ｎ−ｍｙｃの５’−ＵＴＲ配列にデザインされた標的に対して選択性が高いと有利である。
【００８９】
さらなる確証として、１０μＭの変異型アンチセンスＰＮＡで処理した後も、細胞生存能、細胞周期、Ｎ−ＭＹＣ蛋白質量に対する阻害効果は認められなかった。これはさらに、アンチセンスＰＮＡ効果の特異性を示すものである。
【００９０】
アンチジーンＰＮＡについては、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子発現が増幅しているＧＩ−ＬＩ−ＮおよびＩＭＲ−３２細胞を１０μＭのセンスアンチジーンＰＮＡで処理すると、細胞増殖の高い阻害効果をもたらす。
【００９１】
実際、最大阻害効果はＧＩ−ＬＩ−Ｎ細胞で９０％、ＩＭＲ−３２細胞で８０％であり、処理から４８時間後に得られる（図２、Ｃ（ａ）およびＤ（ｂ））。
【００９２】
反対に、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子を増幅も発現もしていない神経芽腫のＧＩ−ＣＡ−ＮおよびＧＩ−ＭＥ−Ｎ細胞は、同じ条件下で行った試験ではいかなる阻害効果も示さない（図２、（Ｅ（ｃ））。
【００９３】
１０μＭのアンチセンスアンチジーンＰＮＡを用いたＧＩ−ＬＩ−ＮおよびＩＭＲ−３２細胞に対する増殖試験では、いかなる阻害効果も示さなかった（図２、Ｃ（ｘ）およびＤ（ｙ））。これは、センスアンチジーンＰＮＡの作用がＮ−ｍｙｃ遺伝子のアンチセンス鎖に対し選択的かつ特異的であることを証明するものであり、その転写阻害作用は、鋳型として自身のアンチセンス鎖を使用するＲＮＡポリメラーゼを停止させることで起こると考えられる。
【００９４】
ＧＩ−ＬＩ−Ｎ細胞のｍＲＮＡ２５０ｎｇから得たｃＤＮＡをＰＣＲ法で増幅することにより、１０μＭのセンスアンチジーンＰＮＡで４８時間処理する前後のＮ−ｍｙｃの転写産物量を評価した。以下のプライマーを使用した。センスＣＧＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴ（エキソン２、２３６６ｂｐ）、アンチセンスＴＧＡＣＣＡＣＧＴＣＧＡＴＴＴＣＴＴＣＣＴ（エキソン３、５０９５ｂｐ）（ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１３２４１）。ＰＣＲは３０反応サイクル行った。その結果、センスアンチジーンＰＮＡで処理したＧＩ−ＬＩ−Ｎ細胞では、ＰＣＲによるＮ−ｍｙｃ転写産物を検出できないのに対し、未処理の細胞では容易に検出できることが明らかになった。
【００９５】
本発明によるアンチジーンＰＮＡは、Ｎ−ｍｙｃの増幅／過剰発現に対して特異性が高いと有利である。
【００９６】
Ｎ−ｍｙｃ遺伝子の増幅／過剰発現が見られることは、ＧＩ−ＬＩ−Ｎ、ＩＭＲ−３２細胞系統とＧＩ−ＭＥ−ＮおよびＧＩ−ＣＡ−Ｎ細胞系統を区別する主な特徴となっている。
【００９７】
ＧＩ−ＭＥ−ＮおよびＧＩ−ＣＡ−Ｎ細胞に関して、増殖阻害効果は見られなかったが、ＩＭＲ−３２細胞で行った試験では前記効果が認められた。
【００９８】
本発明によるアンチジーンＰＮＡは、Ｎ−ｍｙｃのエキソン２の配列にデザインされた標的に対し高度な選択性を示すと有利である。
【００９９】
実際、アンチジーンＰＮＡはアンチセンス鎖における転写時に、ＰＮＡポリメラーゼを直接干渉するため高い阻害効果を有する。一方、相補的なアンチセンスアンチジーンＰＮＡは効果がはるかに低い。これはひとえに、転写蛋白質複合体を立体構造的に干渉するためと考えられる。
【０１００】
センスアンチジーンＰＮＡに対するさらなる試験では、１０μＭのセンスアンチジーンＰＮＡで３時間処理した後、ＩＭＲ−３２細胞系統におけるＮ−ＭＹＣ蛋白質の産生をウエスタンブロット法により評価した。センスアンチジーンＰＮＡで３時間処理した後、蛋白質濃度の５０％の低下が検出された。
【０１０１】
１０μＭ濃度のセンスアンチジーンＰＮＡで処理した２４、４８時間後に行ったＩＭＲ−３２細胞の細胞蛍光分析では、Ｇ０／Ｇ１期の細胞蓄積が誘発され（２４時間後は３９％から５３％、４８時間後は３１％から５３％）、Ｇ２／Ｍ期（２４時間後は１７％から６％、４８時間後は２５％から９％）、およびＳ期（２４時間後は４５％から４１％、４８時間後は４４％から３９％）では減少していた。
【０１０２】
センスアンチジーンＰＮＡ活性の特異性を評価するため、３塩基の置換を含む変異型ＰＮＡをデザインした（５’−ＧＴＧＣＣＧＡＧＣＡＴＧＧＴＣＴ−３’）。
【０１０３】
センスアンチジーンＰＮＡに用いたのと同じ試験条件下で、１０μＭ濃度の変異型アンチジーンＰＮＡにより処理した後も、細胞生存能、細胞周期、Ｎ−ＭＹＣ蛋白質量に対する阻害効果は認められなかった。これは、センスアンチジーンＰＮＡ効果の特異性を証明するものである。
【０１０４】
１０μＭのセンスアンチジーンＰＮＡによる処理は、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子を発現しているＨＴ２９細胞（結腸癌由来）およびＨｅＬａ細胞（子宮頸癌由来）でも実施した。
【０１０５】
前記処理は、細胞増殖の高い阻害効果をもたらす。
【０１０６】
実際、最大阻害効果は、処理後４８時間のＨＴ２９細胞で７０％、処理後２４時間のＨｅＬａ細胞で７０％である。
【０１０７】
１０μＭの変異型センスアンチジーンＰＮＡを用いたＨＴ２９細胞およびＨｅＬａ細胞の増殖試験では、いかなる阻害効果も認められなかった。これは、Ｎ−ｍｙｃを発現している結腸および子宮頸癌においてもセンスアンチジーンＰＮＡの阻害効果があり、そうした作用がＮ−ｍｙｃ遺伝子のアンチセンスの鎖に対して選択的かつ特異的であることを証明するものである。
【０１０８】
本発明によるＰＮＡは、特異的治療法およびＮ−ＭＹＣ蛋白質発現神経芽腫に対するＰＮＡ薬を開発するうえで興味深い。
【０１０９】
こうしたＰＮＡは、例えば、網膜芽腫、髄芽腫、神経芽腫、膠芽細胞腫、星状細胞腫、または肺小細胞癌、横紋筋肉腫、Ｂ細胞型急性リンパ芽球性白血病などのＮ−ＭＹＣ蛋白質を発現している他の腫瘍に対しても使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】各種細胞系統の細胞増殖を示すことによりアンチセンスアンチジーンＰＮＡの特異性を評価する図である。
【図２】各種細胞系統の細胞増殖を示すことによりセンスおよびアンチセンスアンチジーンＰＮＡの特異性を評価する図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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