(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビブリオ培地中にβ−グルコシダーゼの基質である少なくとも１種の色素産生剤およびβ−ガラクトシダーゼの基質である少なくとも１種の色素産生剤を含有することを特徴とする、ビブリオ・コレラエ(V. cholerae、コレラ菌) 、ビブリオ・パラヘモリティカス(V. parahaemolyticus、腸炎ビブリオ菌) およびビブリオ・アルギノリティカス(V. alginolyticus)からなる群より選ばれたビブリオ属細菌の検出、および／またはビブリオ・コレラエ(V. cholerae、コレラ菌) 、ビブリオ・パラヘモリティカス(V. parahaemolyticus、腸炎ビブリオ菌) およびビブリオ・アルギノリティカス(V. alginolyticus)からなる群より選ばれたビブリオ属細菌の少なくとも２種の細菌の間の判別のための培地。
【請求項２】
５ｇ／ｌ以上の濃度のスクロースをさらに含有することを特徴とする、請求項１記載の培地。
【請求項３】
前記色素産生剤が、加水分解により、インドキシル、ハロインドキシル（ブロモインドキシル、クロロインドキシル、フルオロインドキシル、ヨードインドキシル、ジクロロインドキシル、クロロブロモインドキシル、トリクロロインドキシル）、メチルインドキシルまたはヒドロキシキノリン誘導体、特に下記誘導体：６−クロロインドキシル、５−ブロモインドキシル、３−ブロモインドキシル、６−フルオロインドキシル、５−ヨードインドキシル、4,6−ジクロロインドキシル、6,7−ジクロロインドキシル、５−ブロモ−４−クロロインドキシル、５−ブロモ−６−クロロインドキシル、4,6,7−トリクロロインドキシル、Ｎ−メチルインドキシルまたは８−ヒドロキシキノリンから選ばれた発色団を放出するものであることを特徴とする、請求項１または２に記載の培地。
【請求項４】
前記β−グルコシダーゼ基質がインドキシルグルコシドであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の培地。
【請求項５】
β−グルコシダーゼ基質が５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−グルコシドであることを特徴とする、請求項４記載の培地。
【請求項６】
前記β−ガラクトシダーゼ基質がインドキシルガラクトシドであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の培地。
【請求項７】
β−ガラクトシダーゼ基質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−ガラクトシドであることを特徴とする、請求項６に記載の培地。
【請求項８】
ビブリオに対する選択因子をさらに含有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の培地。
【請求項９】
下記成分を含有する (１リットル当たり) ことを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の培地：
・寒天                                                        15ｇ
・ペプトン                                                    15ｇ
・酵母エキス                                                   3ｇ
・ＮａＣｌ                                                    10ｇ
・５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−グルコシド   0.1ｇ
・５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−ガラクトシド 0.1ｇ
・スクロース                                                  20ｇ
・グルコース                                                   1ｇ
・ラクトース                                                 0.1ｇ
・ＩＰＴＧ                                                  0.04ｇ
・トリス塩基                                                   5ｇ
・クエン酸ナトリウム                                          10ｇ
・チオ硫酸ナトリウム                                          10ｇ
・コール酸ナトリウム                                           3ｇ。
【請求項１０】
ビブリオ・コレラエ(V. cholerae、コレラ菌) 、ビブリオ・パラヘモリティカス(V. parahaemolyticus、腸炎ビブリオ菌) およびビブリオ・アルギノリティカス(V. alginolyticus)からなる群より選ばれたビブリオ属細菌の検出および／または判別のための請求項１〜９のいずれかに記載の培地の使用。
【請求項１１】
下記工程を含むことを特徴とする、検体中のビブリオ・コレラエ(V. cholerae、コレラ菌) 、ビブリオ・パラヘモリティカス(V. parahaemolyticus、腸炎ビブリオ菌) およびビブリオ・アルギノリティカス(V. alginolyticus)からなる群より選ばれたビブリオ属細菌の検出および／または判別を行う方法：
ａ. 請求項１〜９のいずれかに記載の培地に前記検体または該検体に由来する接種物を接種し、
ｂ. 前記培地上で前記細菌の存在を検出する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ビブリオ属細菌を目に見えるよう顕示させるための色素産生性培地に関する。
【０００２】
ビブリオ属は、コレラ (ビブリオ・コレラエまたはコレラ菌、V. cholerae)や他のいくつかの臨床症状に関係する。特に、ビブリオ・パラヘモリティカス(V. parahaemolyticus、腸炎ビブリオ菌) は、汚染食物 (一般に海産物、生であるか、少しだけ加熱した魚類、貝類、甲殻類または軟体動物類) を摂取した後に、特に日本で見られる或る種の急性胃腸炎の原因となる。
【０００３】
コレラビブリオ菌の伝播は、一般に人から人へと (吐物、糞便、汗) 、または汚染食物を介して起こる。さらに、ビブリオ菌類は、海岸の海水や河口水の微生物叢中に自然に見られる。それらの自然宿主には、軟体動物、甲殻類、魚類、棘皮動物類およびプランクトンが含まれる。
【０００４】
ビブリオ感染症は公衆衛生の問題を提起するので、これらの細菌による食物汚染を検出する信頼性ある迅速な試験があることは重要である。
今日、検体中のビブリオ菌の存在を検出することができる、ある程度は選択的な培地が存在する。具体的にはＴＣＢＳ寒天（チオ硫酸ナトリウム−クエン酸ナトリウム−ウシ胆汁−スクロース) (Diagnostics Pasteur, ref. 69456; Oxoid, ref. CM 333; Merck, ref. 10263)が使用されている。この培地上では、ビブリオ菌に比べて、大多数の腸内細菌および腸球菌 (エンテロコッカス) はごくわずかしか増殖しない。
【０００５】
ＴＴＧ寒天（タウロコール酸塩−亜テルル酸塩−ゼラチン）も使用されるが、調製が比較的面倒で、亜テルル酸カリウムの規則正しい調節と厳密な添加が必要である。
【０００６】
ＴＣＢＳ培地の欠点の１つは、ビブリオ菌の各種の種の間の判別が一般に可能ではないことである。実際は、分析すべき検体中に存在するビブリオ菌の種を同定できることが得策であろう。特に、コレラ菌と腸炎ビブリオ菌とビブリオ・アルギノリティカスの存在の同定と、それらの判別が可能になると有利であろう。最後の種は、下痢を生ずる症状に関係することはごく稀であるが、温帯諸国では恐らく多様な臨床検体から最も頻繁に単離される菌である。
【０００７】
従って、健康危険性の評価を改善するには、検体（食物検体、糞便等）中に存在しうる各種のビブリオ菌を、 sucrose- 細菌（腸炎ビブリオ菌など）に対して sucrose+ 細菌（ビブリオ・アルギノリティカスまたはコレラ菌など）を判別することしかできなかった従来の培地で得られるのより、より細かく判別することができることが得策である。
【０００８】
本発明は、ビブリオ培地中にβ−グルコシダーゼ基質およびβ−ガラクトシダーゼ基質から選ばれた少なくとも１種の色素産生剤を含有することを特徴とする、ビブリオ属細菌の検出および／または判別用の新規な培地を提案する。
【０００９】
上記酵素の一方の基質である色素産生剤は、その酵素による基質の加水分解によって放出される発色団を含んでいる。従って、細菌コロニーは放出された発色団に応じて着色する。
【００１０】
この発色団は、好ましくは、インドキシル、ハロインドキシル（ブロモインドキシル、クロロインドキシル、フルオロインドキシル、ヨードインドキシル、ジクロロインドキシル、クロロブロモインドキシル、トリクロロインドキシル）、メチルインドキシルまたはヒドロキシキノリン誘導体から選ばれる。この誘導体は、特に下記誘導体から選ばれる：６−クロロインドキシル、５−ブロモインドキシル、３−ブロモインドキシル、６−フルオロインドキシル、５−ヨードインドキシル、4,6−ジクロロインドキシル、6,7−ジクロロインドキシル、５−ブロモ−４−クロロインドキシル、５−ブロモ−６−クロロインドキシル、4,6,7−トリクロロインドキシル、Ｎ−メチルインドキシルまたは８−ヒドロキシキノリン。
【００１１】
従って、好ましくは、β−グルコシダーゼ基質はインドキシルグルコシドであり、および／またはβ−ガラクトシダーゼ基質はインドキシルガラクトシドである。
【００１２】
培地中の各色素産生剤の濃度は約0.02〜0.5 g/l の間である。好ましい濃度は0.1 g/l である。
腸炎ビブリオ菌はβ−グルコシダーゼ特性について陰性であり (フランス、マルシ・レトワールのビオメリウー<BioMerieux>社のRapid 20E 同定ギャラリー) 、β−ガラクトシダーゼ特性については陽性である (上述したビオメリウー社のAPI 20 NE 同定ギャラリー) と説明されている。
【００１３】
意外にも、本発明は、腸炎ビブリオ菌が固体培地上では上記２つの特性に関して逆の表現型を発揮しうることを示す。即ち、β−グルコシダーゼの基質である色素産生剤を使用すると、固体培地上でコロニーを着色することができるのに対し、β−ガラクトシダーゼの基質である色素産生剤を使用した場合には、コロニーが無色のままである。
【００１４】
しかし、海洋起源の同じ検体中にしばしば一緒に見られる、ビブリオ・アルギノリティカスから腸炎ビブリオ菌を識別および判別することは、これら２種が多くの共通の特性を有するため、困難である。即ち、この２種はいずれもβ−グルコシダーゼ特性に関して陽性である。予想外にも、本発明に係る培地にスクロース (蔗糖) を特に高濃度で添加すると、腸炎ビブリオ菌では活性を残したまま、同時にビブリオ・アルギノリティカスのβ−グルコシダーゼ活性を消失させることができる。従って、本発明に係る培地は、単に培地上に存在するコロニーの着色の有無によって、腸炎ビブリオ菌とビブリオ・アルギノリティカスとを容易に識別することができる。
【００１５】
高濃度のスクロースとは、５g/l 以上、好ましくは５g/l 〜35 g/lのスクロース濃度であると考えるべきである。ある有効なスクロース濃度は20 g/lである。
本発明はまたコレラ菌を検出して、それを上述した他の２種のビブリオ菌に対して判別することも可能である。具体的には、コレラ菌は、β−ガラクトシダーゼ活性を示すが、β−グルコシダーゼ活性を示さない。そのため、β−ガラクトシダーゼの基質である色素産生剤をビブリオ培地に添加すると、生成したコロニーの着色によって、コレラ菌を他の２種のビブリオ菌から識別することができる。
【００１６】
従って、１工程で各種細菌の判別を行うのを可能にするには、β−ガラクトシダーゼの基質である色素産生剤とβ−グルコシダーゼの基質である色素産生剤の両方を含有する培地を使用することが有利である。
【００１７】
実際、培地にスクロースを添加してもコレラ菌のβ−ガラクトシダーゼ特性の消失は起こらない。コレラ菌と同じ sucrose+ 特性を示すビブリオ・アルギノリティカスでは阻害が見られることから、この結果はますます予想外である。
【００１８】
このように、β−ガラクトシダーゼの基質である色素産生剤とβ−グルコシダーゼの基質である色素産生剤の両方を含有する培地を使用すると、腸炎ビブリオ菌 (５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−グルコシドを使用した場合、藤紫色) 、コレラ菌 (５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−ガラクトシドを使用した場合、青色) 、およびビブリオ・アルギノリティカス (無色) を判別することができる。従って、本発明に係るこのような培地は、３種類の異なるビブリオ菌の菌株を検出および判別することができるのに対し、従来技術の培地は２つのカテゴリー間の判別 ( sucrose+ と sucrose- ) しか可能ではない。
【００１９】
本発明はまた、下記工程を含むことを特徴とする、検体中のビブリオ属細菌の検出および／または判別を行う方法にも関する：
ａ. 本発明に係る培地に前記検体または該検体に由来する接種物を接種し、
ｂ. 前記培地上でビブリオ属細菌の存在を検出し、
ｃ. 場合により、前記培地上に存在するコレラ菌、腸炎ビブリオ菌およびビブリオ・アルギノリティカスを判別する。
【００２０】
これらの培地を使用する前に、当業者に公知の方法を用いて栄養富化工程を行うのが一般的である。具体的には、１ｇ％のＮａＣｌを含有するアルカリ性ペプトン水 (ｐＨ 8.6) または３ｇ％のＮａＣｌを含有するアルカリ性ペプトン水を使用しうる。
【００２１】
当業者に周知の多様なビブリオの選択因子も本発明の培地に添加しうる。例えば、アルカリ性ｐＨ、チオ硫酸塩、クエン酸塩、胆汁、胆汁塩、マグネシウム、カルシウム、ティーポル(teepol)、ＳＤＳ、ポリキシミン、コリスチン、亜テルル酸塩等の存在により、本発明に係る培地の特性の改善や満足できる方法でのビブリオ菌の単離が可能になる。
【００２２】
【実施例】
実施例１
本発明で使用するための好ましい培地は下記成分を含有する (１リットル当たり) ：
・寒天                                                        15ｇ
・ペプトン                                                    15ｇ
・酵母エキス                                                   3ｇ
・ＮａＣｌ                                                    10ｇ
・５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−グルコシド   0.1ｇ
・５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−ガラクトシド 0.1ｇ
・スクロース                                                  20ｇ
・グルコース                                                   1ｇ
・ラクトース                                                 0.1ｇ
・ＩＰＴＧ                                                  0.04ｇ
・トリス塩基 (Trizma base)                                     5ｇ
・クエン酸ナトリウム                                          10ｇ
・チオ硫酸ナトリウム                                          10ｇ
・コール酸ナトリウム                                           3ｇ。
【００２３】
実施例２
各種培地上での細菌の平板培養により下記の結果が得られた。
【００２４】
【表１】
0004779285.tif 000002
【００２５】
このように、本発明に係る培地の使用により、従来技術の培地とは対照的に、３種のビブリオ菌を判別することが可能となる。