(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製された熱不安定性のアンタークティックホスファターゼ（ＴＡＰ）を得る方法であって、
（ａ）ヒスチジンタグを有する親水性オリゴペプチドを発現するための配列に融合させた切り詰め型ＴＡＰ遺伝子を、Ｔ７プロモータに操作可能に連結すること；
（ｂ）宿主細胞を、（ａ）の生成物で形質転換すること；
（ｃ）ＴＡＰを過剰発現させること；
（ｄ）該宿主細胞を破砕して可溶性画分を得ること；及び
（ｅ）ニッケルカラムの不在下で、ヒスチジンタグを有するＴＡＰを、可溶性画分から精製することを含む方法。
【請求項２】
ＴＡＰ遺伝子がＮ末端及びＣ末端先端を有するＴＡＰタンパク質をコードし、ＴＡＰタンパク質がＮ末端先端で切り詰められ、切り詰め部がシグナル配列に相当し、Ｎ末端先端が該親水性オリゴペプチドを有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＴＡＰを精製する工程がさらに、所望のカラムで可溶性画分を分離することを含み、ＴＡＰが該所望のカラムに結合し、それから溶出されることにより分画を達成する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
熱不安定性のアンタークティックホスファターゼ（ＴＡＰ）の活性をアッセイする方法であって、
（ａ）亜鉛イオンを含むｐＨ５．５〜７．０の緩衝液中の基質に、請求項１に記載の方法により得られた精製ＴＡＰを加えること、並びに
（ｂ）基質から外されるホスフェートの量を測定してＴＡＰ活性を決定することを含む方法。
【請求項５】
緩衝液が、ＺｎＣｌ２塩を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
基質が、核酸である請求項４に記載の方法。
【請求項７】
基質が、核酸における末端ヌクレオチドである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
基質が、糖リン酸である請求項４に記載の方法。
【請求項９】
基質が、リン酸化されたペプチド又はタンパク質である請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
切り詰め部が配列番号１０により表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のシグナル配列の欠失に相当し、ホスファターゼがＣ末端及びＮ末端先端を有し、該Ｎ末端先端が親水性のリーダー配列と共有結合している、配列番号１０により表されるアミノ酸配列からなるタンパク質から誘導された、切り詰め型の、酵素活性のある熱不安定性のアンタークティックホスファターゼ（ＴＡＰ）を含み、
亜鉛イオンをさらに含む、調製物。
【請求項１１】
親水性のリーダー配列がオリゴペプチドである請求項１０に記載の調製物。
【請求項１２】
オリゴペプチドが正に荷電したオリゴペプチドである請求項１１に記載の調製物。
【請求項１３】
正に荷電したオリゴペプチドがヒスチジンタグである請求項１２に記載の調製物。
【請求項１４】
６５℃にて３０分未満でＴＡＰが不活化される請求項１０に記載の調製物。
【請求項１５】
ｐＨ６より高いｐＨのトリス塩酸でＴＡＰ活性が安定である請求項１０に記載の調製物。
【請求項１６】
ｐＨ７．４のトリス塩酸緩衝液でＴＡＰ活性が安定である請求項１０に記載の調製物。
【請求項１７】
リン酸化された基質を脱リン酸化する方法であって、
（ａ）亜鉛イオンを含むｐＨ５．５〜７．０の緩衝液中の基質に熱不安定性のアンタークティックホスファターゼ（ＴＡＰ）を加えること；並びに
（ｂ）ホスフェートを基質から外すことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
精製ホスファターゼは、試験管内で線状化したＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド及びタンパク質からリン酸基を外すのに分子生物学者らによって使用される。ＤＮＡリガーゼは、一方のヌクレオチドが５’−ホスフェートを含有し、他方が３’水酸基を含有する場合のみ隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合の形成を触媒するので、線状化したＤＮＡベクターから双方の５’−末端リン酸残基を外すとライゲーション反応におけるベクターＤＮＡの再環化が妨げられる。しかしながら、５’末端のホスフェートを持つ外来のＤＮＡ断片を脱リン酸化したベクターに効率よく連結し、コンピテント細胞を容易に形質転換することができる２つのニックを含有する開環分子を生じることができる。
【０００２】
生体分子からリン酸基を外すために幾つかの異なったホスファターゼが開発されており、それぞれ、それ自体の長所及び短所を有する。この目的で使用されるべき最初のホスファターゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製された細菌性アルカリホスファターゼ(ＢＡＰ)であった。ＢＡＰは、あらゆる種類のＤＮＡ末端に対して良好な活性を有するという長所を有する。しかしながら、それは熱及び界面活性剤への耐性がきわめて強いので反応物から除くのが困難である（Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual Sections 1.53-1.72 (1989)）。伝えられるところによれば、熱安定性を高めた変異体ＢＡＰが調製されている（米国特許第５，８９１，６９９号、欧州特許第０４４１２５２号）。仔ウシ腸管アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ又はＣＩＡＰ）は別のホスファターゼであり、分子生物学の技術で広範に使用されている（米国特許第５，７７３，２２６号及び同第５，７０７，８５３号）。ＣＩＡＰは、ＢＡＰほどＤＮＡに対して活性は高くないが、プロテイナーゼＫ処理その後のフェノール：クロロホルム抽出又はＥＤＴＡの存在下での加熱工程その後のフェノール：クロロホルム抽出のいずれかの使用を必要とする反応物から除くのがやや容易である（Sambrook et al., 1989, 同上）。さらに最近、北極のエビ、Pandalus borealis (SAP)から単離されたホスファターゼ（米国特許第６，３８７，６３４号及び同第６，３７９，９４０号）は、使用するのがさらに容易であることが判っている。それは、ＢＡＰのようにあらゆる種類のＤＮＡ末端に良好な活性を有するが、６５℃にて１５分間熱不活性化することによって容易に反応物から除かれるという長所を有することが報告されている（Amersham Bioscience, Piscataway, NJ）。
【０００３】
文献には、そのほかの熱不安定性ホスファターゼに関するそのほかの報告もあり、熱不安定性のアンタークティックホスファターゼ(ＴＡＰ)と呼ばれる南極大陸で単離された好冷性の株ＴＡＢ５から精製されたものが含まれる（Rina, et al., Eur. J. Biochem. 267:1230-1238 (2000)）。他のホスファターゼを超えるＴＡＰの長所には、高温不安定性及び高い比活性が挙げられる。Rinaらは、このホスファターゼがｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）基質に対しタンパク質のｍｇ当たり１６５０単位の比活性を有し、それは、そのほかのいかなる既知のホスファターゼの活性よりも有意に高いことを報告した。しかしながら、Rinaらが報告したクローン（上記、２０００年）により産生されるタンパク質は、過剰発現及び精製に関連する多数の問題があった。たとえば、Rinaらにより記載された精製プロトコール（上記、２０００年）は、ＴＡＰが明らかに会合する細胞膜からＴＡＰを抽出するのに複数の超遠心工程を必要とする。このプロトコールは、大規模な製造（たとえば、３００ｇ以上の細胞ベーストの生産に関与する製造プロトコール）には向いていない。さらに、Rinaらにより記載されたプロトコールを用いたＴＡＰ遺伝子の過剰発現は、結果として、きわめて低い且つそのために大規模製造では費用有効性がない酵素の収量を生じた。
【発明の開示】
【０００４】
本発明の本実施態様は、中性ｐＨで高められた高温不安定性を有し、高い活性があり、タンパク質のＮ末端に親水性リーダー配列を持つアルカリホスファターゼを提供する。親水性のリーダー配列は、オリゴペプチド、たとえば、Ｈｉｓタグのような正味の正の電荷を持つオリゴペプチドであってもよい。このホスファターゼの長所には、ほかの反応物や生成物が影響を受けずにいられるレベルに温度を上げることによって活性を消去する能力が挙げられる。これらの特性を有するホスファターゼの例が、実施例で詳細に記載されるＴＡＰである。本明細書で記載する方法は、タンパク質のＮ末端に融合したＨｉｓタグのような親水性リーダー配列の存在に頼るが、ニッケルカラムの緩衝液は、活性に悪影響を与えるので、ニッケルカラムを用いたタンパク質の精製は行わないことが好ましい。それにもかかわらず、驚くべきことに、親水性リーダー配列の存在は、他のカラム組成を用いたカラム精製で収量を高めた。
【０００５】
本発明の実施態様では、切り詰め部がシグナル配列の欠失に相当し、ホスファターゼがＣ末端及びＮ末端先端を有し、該Ｎ末端先端がたとえば、Ｈｉｓタグのような正に荷電するオリゴペプチドのような親水性のリーダー配列に共有結合する、切り詰められた、酵素活性のあるＴＡＰが提供される。切り詰められたＴＡＰは、約６５℃にて１５分未満で実質的に不活化することができる。特に、切り詰められたＴＡＰの活性は、ｐＨ６より高い、さらに特にｐＨ約７．４でのトリス塩酸中にて実質的に安定である。
【０００６】
さらに、ＴＡＰ（ジェンバンク（GenBank）Ｙ１８０１６にも記載されている）をコードするが、天然に存在するＴＡＰ遺伝子に関連するシグナル配列の一部又は全部を欠くＤＮＡを記載する。該ＤＮＡは、好ましくは、発現されるＴＡＰ遺伝子のＮ末端で複数のＨｉｓアミノ酸をコードする配列をさらに含んでもよい。このＤＮＡは、強力なプロモータ、たとえば、Ｔ７プロモータの制御下でベクターにおいて発現させてもよい。
【０００７】
好ましい実施態様では、上述のＤＮＡを含有するベクターが提供される。これらベクターの一例は、ｐＥＧＴＡＰ７．４．１．である。本発明の追加の実施態様では、少なくとも１種のベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。他の種類の宿主細胞の使用を除外しないが、実施例では、宿主細胞は大腸菌である。
【０００８】
本発明の追加の実施態様では、トリス塩酸、ＭｇＣｌ2、ＤＴＴ及びグリセロールを含み、さらに特には、ｐＨが約７．４である緩衝液中で３７℃にて実質的に安定であるＴＡＰの組成物が提供される。
【０００９】
本発明の実施態様では、（ａ）たとえば、Ｈｉｓタグのような親水性オリゴペプチドを発現するための配列に融合した切り詰め型ＴＡＰ遺伝子をＴ７プロモータに操作可能に連結すること、（ｂ）宿主細胞を形質転換すること、及び（ｃ）ＴＡＰを過剰発現することを含むＴＡＰを過剰発現するための方法が提供される。さらなる実施態様では、ＴＡＰ遺伝子は、Ｎ末端及びＣ末端先端を有し、Ｎ末端先端で切り詰められ、切り詰め部がシグナル配列に相当し、該Ｎ末端先端がそこに結合された親水性オリゴペプチドを有するＴＡＰタンパク質をコードする。
【００１０】
本発明の追加の実施態様では、（ａ）上述のような形質転換された宿主細胞を得ること；（ｂ）該宿主細胞を破砕して可溶性分画を得ること；及び（ｃ）該可溶性分画からＴＡＰを精製することを含む、精製したＴＡＰを得る方法が提供される。さらに、該方法は、ＴＡＰがカラムから溶出されるカラム分離を追加的に含んでもよい。このような状況で、精製は、破砕した細胞混合物における全タンパク質に対するＴＡＰタンパク質の比率の増加を言う。たとえば、ＴＡＰタンパク質の比率が混合物における全タンパク質の５％を超えた場合、精製が達成することができる。好ましくは、ＴＡＰタンパク質の比率は、全タンパク質の５０％、８０％又は９０％を超えてもよい。特定の実施態様では、ＴＡＰタンパク質の比率は、全タンパク質の約９５％まで精製される。
【００１１】
本発明の追加の実施態様では、（ａ）約ｐＨ５．５〜７．０の緩衝液中の基質にＴＡＰを加えること；並びに（ｂ）規定された時間及び規定された温度で基質から外れるホスフェートの量を測定してＴＡＰの活性を決定することを含む、ＴＡＰの活性をアッセイする方法が提供される。好ましい実施態様では、緩衝液はＺｎＣｌ2塩及びＭｇＣｌ2塩を含む。さらに好ましくは、緩衝液は、ビス−トリスプロパンである。
【００１２】
追加の実施態様では、ｐＨ５．５〜７．０の緩衝液中の基質にＴＡＰを加えること；並びに規定された時間及び規定された温度で基質から外されるべきホスフェートの量をもたらすことを含むリン酸化された基質を脱リン酸化する方法が提供される。
【００１３】
基質は、核酸又は核酸の末端ヌクレオチド、糖リン酸、或いはリン酸化されたペプチド又はタンパク質であってもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
ＴＡＰ遺伝子は、Rinaらにより単離され、クローニングされ（ｐＮ１）、ＤＮＡ配列は公表されている。しかしながら、公表されたプロトコールを用いてこのクローンからＴＡＰを過剰発現させ、精製することを試みた場合、試薬目的には不十分な量の精製酵素しか得られないこと、及び酵素が会合する膜断片から酵素を分離するのに複数の超遠心工程を必要とすることを含む多数の課題に遭遇した。本明細書では、ＴＡＰ遺伝子を確実に過剰発現させて、大規模製造で費用有効性の高い酵素の収量を提供するプロトコールを提供する。さらに、複数の超遠心工程の必要性を回避し、大規模製造に適した精製プロトコールを開発した。核酸、ペプチド及び糖からホスフェートを外すＴＡＰの用途が確立している。ＴＡＰの基質として作用してもよいそのほかの基質は、「The Enzymes（酵素）」, Vol. IV (1971) ch17, p373でReid & Wilsonにより記載されたものである。
【００１５】
好ましい実施態様では、本明細書では「糖類」は、単糖類、オリゴ糖類又は多糖類を言う。糖類は、任意のペントース、ヘキソース又はヘプツロースの化合物を含む。ホスフェートがα異性体であろうとβ異性体であろうとそれには関係なく、ホスフェート（単数）又はホスフェート（複数）がどこに位置しようと、ＴＡＰを用いて、糖における任意の炭素からホスフェートを切断してもよい。一部の糖リン酸の例は、ウエブサイト、http://www.arabidopsis.org.で提供されている。糖リン酸の例には、マンノース、グルコース、フコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、キシロース及びラムノースのホスフェートが挙げられる。
【００１６】
精製の収量及び容易さを改善するように公表されたプロトコールを改変して用い、ｐＮ１プラスミドを含有するＥＲ２５７５（ＥＲ２５６６ｐＬｙｓＳ）からのＴＡＰの精製を試みた。形質転換した大腸菌株を増殖させ、誘導し、以下の例外と共に、Rinaら（上記）に記載されるようにホスファターゼを精製した。超遠心により可溶性膜分画を単離した後、タンパク質を緩衝液Ａ（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．６、１０ｍＭのＭａＣｌ2、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２％のトリトンＸ−１００）で透析し、次いで、緩衝液Ａで平衡化したＤＥＡＥカラムに装填した。ｐＮＰＰアッセイで測定したときホスファターゼ活性を有する通過物をRinaらが記載したようなＱ−セファロースカラムに装填した。Ｑ−セファロースカラムからの分画をプールして緩衝液Ｂ（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．６、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2）で透析し、緩衝液Ｂで平衡化したハイトラップＳＰカラムに装填した。ホスファターゼ活性を有する通過物を緩衝液Ｃ（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2）で透析し、緩衝液Ｃで平衡化したハイドロキシアパタイトカラムに装填した。ホスファターゼ活性は通過した。各工程からの試料を１０〜２０％のトリストリシンＰＡＧ（カリフォルニア州、Carlsbad、Invitrogen Corp.)で泳動し、クマシーブリリアントブルーで染色した。図１に見ることができるように、レーン１〜６におけるホスファターゼの収量は、期待はずれだった。
【００１７】
上記プロトコールを用いて得られた期待はずれの結果のために、図２に記載したようなＴＡＰ遺伝子のクローニングを含む別のアプローチを検討した。
【００１８】
具体的には、強力なプロモータ（Ｔ７プロモータ）の直後にＴＡＰ遺伝子を直接クローニングし、精製を円滑にするためにＨｉｓタグ（親和性タグ）を取り付けた。図１３及び１４に示すＨｉｓタグの配列は、タンパク質のＮ末端先端（遺伝子の５’末端）に融合した６個のヒスチジンを有する。しかしながら、ヒスチジンのこの数は重要ではない。本明細書で記載された目的を達成するには、タグにおけるヒスチジンの数は３個ほどで少なくても、６個を超えて所望のとおり多くてもよい。幾つかの異なった構築物を作成した。２種の構築物では、メチオニン開始コドンに隣接する、タンパク質のＮ末端の２２アミノ酸から成る推定上のシグナル配列を取り除くことによってＴＡＰ遺伝子を切り詰めた。一方のクローンでは、Ｃ末端のＨｉｓタグを加えて切り詰め型ホスファターゼとの融合タンパク質を形成したが、他方ではそうはしなかった。たとえば、ｐＥＧＴＡＰ１．４．１は、Ｈｉｓタグを有したが、ｐＥＧＴＡＰ１．２．１は有さなかった。２種のほかの構築物では、遺伝子は推定上のシグナル配列を保持し、いずれかがさらにＣ末端Ｈｉｓタグを含有し（ｐＥＧＴＡＰ１．３．１）、又は含有しなかった（ｐＥＧＴＡＰ１．１．１）（図２）。
【００１９】
ｐＥＴ２１ａにＰＣＲ産物を挿入することによって（実施例Ｉ、図２、１１及び１２）創った５種の異なるプラスミドを図２に示す。ｐＥＧＴＡＰ１．１．１はＨｉｓタグのない無傷のＴＡＰをコードする。ｐＥＧＴＡＰ１．２．１は、Ｈｉｓタグのない、切り詰め型ＴＡＰをコードする。ｐＥＧＴＡＰ１．３．１はＣ末端Ｈｉｓタグを持つ、無傷のＴＡＰをコードする。ｐＥＧＴＡＰ１．４．１はＣ末端Ｈｉｓタグを持つ、切り詰め型ＴＡＰをコードする。ｐＥＧＴＡＰ７．４．１は、Ｎ末端Ｈｉｓタグを持つ、切り詰め型ＴＡＰをコードする。
【００２０】
Ｃ末端でＨｉｓタグを持つ又は持たない、推定上のシグナル配列を持つ無傷のＴＡＰ遺伝子を含有するプラスミドは、誘導後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、いかなる明瞭な可溶性ホスファターゼも産生することができなかった（図３、レーン１、３及び４）。しかしながら、Ｈｉｓタグを持つ又は持たない、推定上のシグナル配列なしで構築されたプラスミドはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて正しいサイズのきわめて強いバンドを生じた（図３、レーン２、５及び６）。しかしながら、タンパク質の精製中、問題が生じた。ｐＥＧＴＡＰ１．４．１（切り詰め型ＴＡＰ及びＣ末端Ｈｉｓ）を含有する、形質転換した宿主細胞ＥＲ２５６６は、非変性条件で主に不溶性ＴＡＰを産生した（図４）。変性条件下で精製を試み、その後、変性させたホスファターゼを折り畳んだ状態に戻した。しかしながら、このアプローチでは、活性のある酵素は、相対的に少ない量しか得られなかった。ｐＥＧＴＡＰ１．２．１（Ｈｉｓタグを持たない切り詰め型ＴＡＰ）を含有する大腸菌ＥＲ２５６６は可溶性のＴＡＰを産生したが、タンパク質はほとんどのカラムに結合できなかった。
【００２１】
上記の問題を克服するために、Ｈｉｓタグをコードする配列をＴＡＰ遺伝子のＣ末端に代えてＮ末端に配置した第５のクローン（ｐＥＧＴＡＰ７．４．１）を構築した（図２）。この構築物は、可溶性分画で良好な収量のＴＡＰを産生し（図５）、複数の超遠心工程なしで容易にそれを精製することができた（実施例ＩＩ）。具体的には、ホスファターゼのＮ末端におけるＨｉｓタグの存在によって、ニッケルカラムを含まないたった２又は３回のカラムでほぼ均質までの精製が可能になった。理論によって限定されることを望まないで、Ｈｉｓタグの最初の効用は、親和性タグとしてではなく、可溶性ホスファターゼの産生を促進することだったと思われる。
【００２２】
ＤＮＡ及びタンパク質基質を用いたアッセイ（実施例ＶＩＩ）によって上記方法（実施例Ｉ及びＩＩ）により調製したＴＡＰホスファターゼの活性を、ＳＡＰ及びＣＩＡＰのホスファターゼ活性と比較し、ＴＡＰが向上した活性を有することが判明した。たとえば、実施例ＶＩＩに記載したホスフェート放出アッセイを用いて、ＤＮＡの５’末端突出、３’末端突出及び平滑末端について、ＴＡＰ及びＳＡＰの線状ＤＮＡの脱リン酸化活性を測定した。これらの異なった構造の脱リン酸化を、同一のｐＮＰＰ単位量を用いて比較すると、ＴＡＰは一貫してＳＡＰよりも効率が良いことが分かった（図１０）。
【００２３】
ＴＡＰはまた、ＣＩＡＰと同じくらい効率的に、リン酸化されたタンパク質におけるセリン／スレオニン残基及びチロシン残基からリン酸基を取り外すことができる（実施例ＶＩＩ、図１３）。
【００２４】
他のホスファターゼと比べたＴＡＰの高い活性に加えて、ＴＡＰは、高い熱不安定性を有することが判明した（実施例ＩＶ、図８）。ＣＩＡＰ、ＳＡＰ及びＴＡＰの高温不安定性を比較すると、ＴＡＰが６５℃で５分後に９８％の活性を失ったのに比べて、ＳＡＰはこの温度で７０％の活性を失い、ＣＩＡＰはたった１０％の活性しか失わなかったことが判明した。
【００２５】
本発明のほかの実施態様では、ＺｎＣｌ2及びＭｇＣｌ2が、ホスファターゼの活性を上げることが判明した（実施例ＩＩＩ）。ＴＡＰの活性は、たとえば、ビス−トリスプロパン緩衝液を用いてｐＨ約５．５〜７．０で最適化された（実施例ＩＩＩ）。
【００２６】
以下の実施例によって本発明をさらに説明する。これら実施例は本発明の理解を助けるために提供されるのであって、その限定として解釈されるものではない。
【００２７】
上記及び以下に引用した参考文献は、参考により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００２８】
実施例Ｉ：ＴＡＰ−Ｈｉｓタグ融合遺伝子の構築及び発現
分類されていない南極の株ＴＡＢ５に由来する切り詰め型ホスファターゼ遺伝子をＮ末端の６ヒスチジン残基のタグと共にクローニングした。簡単に言えば、ＰＣＲにより、組換えプラスミドｐＮ１（Rina, et al., Eur. J. Biochem., 267:1230-1238, 2000）から１．１ｋｂの断片を増幅した。正方向のプライマー（図２、プライマーＣ）は、推定上のシグナル配列（６３塩基）（図１６及び１７）を持たない遺伝子の５’末端に相同の配列を含有することに加えて、ＡＴＧ開始コドンの一部としてのＮｄｅＩ制限部位及びＡＴＧ開始コドンと切り詰め型ホスファターゼ遺伝子の最初のコドンとの間に位置する６個のヒスチジン残基をコードする６個のコドンを含有した（図１６及び１７）。逆方向のプライマー（図２、プライマーＤ）は、遺伝子の３’末端に逆相補的な配列を含有することに加えて、ＴＡＡ停止コドンのすぐ下流にＸｈｏＩ制限部位を含有した（図１６及び１７）。いったん増幅し、１．１ｋｂの断片をＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化して、同様にＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化したＴ７発現ベクターｐＥＴ２１ａ（ウィスコンシン州、マジソン、Novagen）に連結した（Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sections 1.53-1.72 (1989)）。得られたライゲーションで大腸菌株ＥＲ２６８８（マサチューセッツ州、バーバリ、ニューイングランドバイオラブズ）を形質転換した。形質転換のプラスミドを単離し、制限マッピング及びＤＮＡの配列決定により特性分析し、特性分析した際、正しいサイズ及び配列の挿入物を含有することが判った。Ｔ７プロモータでホスファターゼ遺伝子を発現させるために、プラスミド構築物で大腸菌株ＥＲ２５６６（マサチューセッツ州、バーバリ、ニューイングランドバイオラブズ）を形質転換した。ｐＥＧＴＡＰ７．４．１が、最良の収量及び精製特性を提供することが判明した（図３〜５）。
【００２９】
実施例ＩＩ：ＴＡＰ−Ｈｉｓタグ融合タンパク質の製造及び精製
（ａ）ＴＡＰの小規模の精製
１００ｍｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む５ｍＬのリッチブロス（１リットル当たり１０ｇのトリプトン（ミシガン州、リボニア、ディフコラボラトリーズ）、５ｇの酵母抽出物（ミシガン州、リボニア、ディフコラボラトリーズ）、５ｇのＮａＣｌ、ＮａＯＨでｐＨ７．２）中にて単離したコロニーからＥＲ２５６６（ｐＥＧＴＡＰ７．４．１）を３０℃で一晩増殖させた。３ｍＬの一晩培養物を用いて、１００ｍｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む３００ｍＬのリッチブロスに植菌した。３０℃にて対数増殖期の中間（クレット７０）まで培養物を増殖させ、氷上で冷却し、０．４ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、１５℃にて２０時間増殖させた。４℃にて８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより３５ｍＬの細胞を回収した。上清を除き、細胞ペレットを秤量し、−２０℃に２時間置いた。ペレットを氷上で融解し、１ｍＬの細胞溶解緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）に細胞を再懸濁した。リゾチームを１ｍＬ／ｍＬまで加え、試料を氷上で３０分間インキュベートした。インキュベートに続いて、細胞を、氷上で６回それぞれ１０秒間、途中で１分間停止しての超音波処理により破壊した。４℃にて１４，０００ｒｐｍで２０分間、粗抽出物を遠心し、未破砕の細胞及びそのほかの不溶性物質を除いて清澄な粗抽出物を生成した。０．６ｍＬの細胞溶解緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡスピンカラムに０．６ｍＬの清澄な粗抽出物を装填した。７００ｘｇにて２分間、試料を遠心した。通過物を除き、０．６ｍＬの洗浄緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）で２回カラムを洗浄した。０．２ｍＬの溶出緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）でタンパク質を２回溶出した。各工程における１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。ｐＥＧＴＡＰ７．４．１の結果を図５に示す。
【００３０】
（ｂ）ＥＲ２５６６におけるｐＥＧＴＡＰ７．４．１からのＴＡＰの大規模な精製
２５℃にて発酵用のリッチブロス（１００リットル当たり、５００ｇのAmberexの酵母抽出物（ウィスコンシン州、ミルウォーキーのSensient Technologies）、１ｋｇのＣＥ９０ＭＳトリプトン（ニュージャージー州、Carlstadt、Marcor Development Corp.）、２７ｇのＮａＯＨ，１０ｇのアンピシリン、５．５ｇのポリプロピレングリコール消泡剤（ウエストバージニア州、サウスチャールストン、Arco Chemical Co.））２０００ｍＬ中で２５℃にてｐＥＧＴＡＰ７．４．１プラスミドを収容する大腸菌株ＥＲ２５６６を増殖させた。この培養物を用いて１００リットルの発酵用リッチブロスに植菌した。７０のクレット（Klett）に達するまで２５℃にて５時間、細胞を好気的に増殖させた。次いで発酵槽を１５℃に冷却し、クレットが９０に達したとき、最終濃度０．３ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えた。次いで１５℃にて細胞を好気的にさらに１７時間増殖させ、細胞は最終クレット３０５を持つ定常期に達した。３２１グラム湿重量の細胞ペレットを回収するのに１００リットルの発酵を要した。３２１グラムの細胞ペレットを９６３ｍＬの緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４、５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール）に懸濁し、約１２，０００ｐｓｉｇでゴーリンのホモゲナイザーを通過させた。細胞溶解物を約１３，０００Ｇにて４０分間遠心し、上清を回収した（１１５０ｍＬ）。
【００３１】
緩衝液Ａで平衡化した５００ｍＬのヘパリンハイパー−Ｄカラム（カリフォルニア州、フレモントのCiphergen Biosystems, Inc.）に上清溶液をかけた。１Ｌの緩衝液Ａで洗浄し、次いで、緩衝液Ａ中０．０５Ｍ〜１ＭのＮａＣｌの勾配２Ｌを流し、５０ｍＬの分画を回収した。１０ｍＭのＭｇＣｌ2を含有する１Ｍのジエタノールアミン／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）中の０．１ＭのｐＮＰＰと共に試料をインキュベートすることにより、ホスファターゼ活性について各分画を測定した。３７℃にて１〜５分間反応を行い、活性は、黄色の生成として、４０５ｎｍにて分光光度計で測定した。０．０５〜０．３５ＭのＮａＣｌでホスファターゼ活性は溶出された。
【００３２】
ヘパリンハイパー−Ｄカラムのホスファターゼ活性を含有する分画をプールし、次いで、緩衝液Ａに対して一晩透析した。この８００ｍＬのプールの１００ｍＬを１０５ｍＬのソースＱカラム（ニューヨーク州、ニューヨークのファイザー社）にかけた。２１０ｍＬの緩衝液Ａで洗浄した後、緩衝液Ａ中０．０５Ｍ〜１ＭのＮａＣｌの勾配１Ｌを流し、１５ｍＬの分画を回収した。上で記載したｐＮＰＰアッセイを用いて分画を測定し、ホスファターゼ活性は、０．１５〜０．１８ＭのＮａＣｌで溶出された。ヘパリンハイパー−Ｄでプールした残りの７００ｍＬも同様にカラムにかけ、溶出し；次いでホスファターゼ活性を含有する勾配分画をプールした。
【００３３】
集め合わせたソースＱのプールを緩衝液Ａに対して透析し、５０％グリセロールを補った。この１２０ｍＬのプールの４０ｍＬを５００ｍＬの緩衝液Ａで希釈し、次いで、緩衝液Ａで平衡化した４００ｍＬのＰＥＩカラム（英国、ケントのワットマン）にかけた。４００ｍＬの緩衝液Ａで洗浄した後、緩衝液Ａ中０．０５Ｍ〜１ＭのＮａＣｌの線形勾配を流し、１５ｍＬの分画を回収した。上で記載したｐＮＰＰアッセイを用いて分画を測定した。ホスファターゼ活性は０．１４〜０．２ＭのＮａＣｌの間で溶出された。ソースＱでプールした残りの８０ｍＬも同様にカラムにかけ、溶出し；次いでホスファターゼ活性を含有する勾配分画をプールした。１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＭｇＣｌ2，１ｍＭのＤＴＴ、５０％のグリセロールを含有する保存緩衝液に対してこのプールを透析した。
【００３４】
実施例ＩＩＩ：ＴＡＰによるリン酸基取り外しのための至適ｐＨ及び塩条件の決定
実施例ＩＩで記載されたように精製したＴＡＰを用いて、ＤＮＡからリン酸基を外すための最適条件を決定した。以下のようなホスフェート放出アッセイによって脱リン酸化を測定した。５０μＬの反応物中で、２種の相補的な４０量体のオリゴヌクレオチド
5'-ACGTATGTTAGGTTAGGTTAGGTTAGGTTAGGTTAGGCTC-3' （配列番号１）
3'-TGCATACAATCCAATCCAATCCAATCCAATCCAATCCGAG-5' （配列番号２）
をアニーリングし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（マサチューセッツ州、バーバリ、ニューイングランドバイオラボ社）及びγ32Ｐ−ＡＴＰを用いて製造元により推奨されるように末端標識した。この放射活性のある二量体を用いて、ホスファターゼ基質（最終２０μｇ／ｍＬ）として作用するラムダＨｉｎｄＩＩＩ断片の混合物１ｍｇを「スパイク」した。３７℃にて５分間の、基質混合物（１ｍＭのＭｇＣｌ2及び０．１ｍＭのＺｎＣｌ2を含有する緩衝液中で反応物当たり０．０１単位のｐＮＰＰ）とホスファターゼとのインキュベートに続く放射活性の放出によってＴＡＰ活性を測定した。ＴＣＡによるＤＮＡ基質の沈殿及び沈殿しなかった放射活性のシンチレーションカウントにより放出を測定した。ＴＣＡ沈殿は、１００μＬのニシン精子ＤＮＡ（２ｍｇ／ｍＬ）をキャリアとして各反応物に加えることから成った。次いで、１５０μＬの２０％冷却ＴＣＡを加えた。試料をボルテックスし、５分間氷上で冷却した。微量遠心機にて１４，０００ｘｇで５分間、各反応物を遠心した。各上清(５０％)１５０μＬを２ｍＬのシンチラントに加え、０．５分間カウントした。ｐＮＰＰ比色アッセイにより測定された０．００１〜０．０１単位の範囲にわたってＴＡＰ活性は線形であることが判明した。
【００３５】
３種の異なった緩衝液：ｐＨ範囲が６〜９．５のトリス−塩酸、ｐＨ範囲が６〜７のビストリスプロパン緩衝液及びｐＨ範囲が５．５〜７のビス−トリスプロパン緩衝液を用いてｐＨ範囲が５．５〜９．５の反応緩衝液を調べた。ビス−トリスプロパン緩衝液にてＤＮＡ基質に対して最適の活性を与えたｐＨ範囲は、５．５〜６．０の間であることが判った（図６）。
【００３６】
カチオンの必要性を調べた。ｐＮＰＰでのアッセイにおいてＺｎ2+イオンが阻害活性を示すと報告したRinaら（上記、２０００年）とは対照的に、上述のアッセイは、ＺｎＣｌ2の存在が１０倍多いホスフェートの放出を与えることを示していることを確定した。その後、ＴＡＰ活性のアッセイに１ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１ｍＭのＺｎＣｌ2を含めた。１００ｍＭの濃度でのＫＣｌ、ＮａＣｌ、酢酸カリウム及び酢酸ナトリウムを含むそのほかの塩の添加は、ＴＡＰ活性に影響を有さないことが認められた（図７）。
【００３７】
実施例ＩＶ：ＴＡＰの熱不安定性の確定
ｐＮＰＰ活性の１単位は、室温にて１分間に１ｍＬの反応容積において１μモルのｐＮＰＰをｐ−ニトロフェノールに加水分解するのに必要とされる酵素の量に相当する。各酵素について推奨された反応緩衝液にて、ＴＡＰ、ＣＩＡＰ及びＳＡＰそれぞれの１０ｐＮＰＰ単位を１μｇのラムダＨｉｎｄＩＩＩ断片と混合した。混合物を３７℃にて１０分間インキュベートし、次いで氷上に置いた。次いで反応物を６５℃の温水浴に入れ、５分、１０分、２０分及び３０分後に試料を取り出し、氷上に置いた。熱処理に続いて、ｐＮＰＰ活性について試料を測定した。０時点の比率として残っている活性を計算した。５分後、ＴＡＰは９８％を超えるその活性を喪失した。同時間では、ＳＡＰは依然として３０％の活性が残っており、ＣＩＡＰは、ほぼ９０％の活性を残していた。３０分後、ＳＡＰが依然として２０％の活性を残し、ＣＩＰが４０％の活性を残していたということは、ＴＡＰは、ＳＡＰ又はＣＩＡＰのいずれかよりはるかに高温不安定性であることを示している（図８）。
【００３８】
実施例Ｖ：３７℃及び２５℃におけるＴＡＰの安定性
比色アッセイにおけるｐＮＰＰからの遊離のホスフェートの放出によって３７℃及び２５℃でのＴＡＰ活性の安定性を測定した。このアッセイでの活性は、ｐＮＰＰがｐ−ニトロフェノール（ｐＮＰ）に変換される際に生じる色の生成によって決定された。１Ｍのジエタノールアミン（ｐＨ８．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのｐＮＰＰ及び１ｍＬ当たり１０単位のＴＡＰを含有するホスフェート反応混合物を調製した。この混合物を３ｍＬの試験管に、試験管当たり０．１ｍＬずつ分注し、２５℃又は３７℃に試験管を置くことにより反応を開始させた。０〜３０分の間５分間隔で１０ＮのＮａＯＨを０．１ｍＬ添加することにより反応を終了させた。各反応物を１ｍＬの反応混合物（ｐＮＰＰ又はＴＡＰなしの）で希釈して４０５ｎｍの分光光度測定に好適な容積にした。蓄積させたｐＮＰを測定し、既知のｐＮＰ標準と比較することにより放出されたホスフェートを決定した。結果は、３０分の時間経過にわたる２５℃又は３７℃で放出されたホスフェートのナノモルとして表した（図９）。これらの結果は、ＴＡＰ活性は、２５℃よりも３７℃の方が約２倍高く、いずれの温度でもＴＡＰ活性は少なくとも３０分間安定であることを実証した。
【００３９】
実施例ＶＩ：ＴＡＰの保存のための最適な条件
保存のための最適な条件を決定するためにＴＡＰを７５℃にて５分間インキュベートした。３種の異なった緩衝液、ビス−トリスプロパン緩衝液（ｐＨ６．０）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及びトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を調べ、後者がＴＡＰを安定化するのに最良であることが判った。様々な濃度のＮａＣｌを調べ、酵素の活性を維持するには、５０ｍＭ，１００ｍＭ又は２００ｍＭに比べて、ＮａＣｌを含まないほうが良いことが判った。ＥＤＴＡがＴＡＰの酵素活性に阻害活性を示す場合、１ｍＭのＤＴＴ及び２００μｇ／ｍＬのＢＳＡの双方がＴＡＰ活性を安定化した。トリス塩酸（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ、２００μｇ／ｍＬのＢＳＡ及び５０％グリセロールを含有する緩衝液において、ＴＡＰは活性を低下させることなく、１２ヵ月にわたって安定であることが判明した。
【００４０】
実施例ＶＩＩ：ホスファターゼ活性
（ａ）ｐＮＰＰ活性について標準化したＤＮＡライゲーションアッセイにおけるＳＡＰとＴＡＰの酵素活性の比較：５’末端、３’末端及び平滑末端における脱リン酸化
【００４１】
効率は、１μｇのＤＮＡを脱リン酸化できる希釈に基づいた１ｐＮＰＰ単位の酵素により脱リン酸化することができるＤＮＡの量として定義される。
【００４２】
ｐＮＰＰアッセイを用いてμＬ当たり１単位にＳＡＰ及びＴＡＰの双方を調整した。リトマス２８ＤＮＡ（マサチューセッツ州、バーバリ、ニューイングランドバイオラブズ社）をＨｉｎｄＩＩＩ（５’末端突出）、ＥｃｏＲＶ（平滑末端）又はＰｓｔＩ（３’末端突出）のいずれかで消化した。各切断ベクターＤＮＡの部分試料（１ｍｇ／５０μＬ）を、推奨される緩衝液中で３７℃にて３０分間、数種に希釈した各ホスファターゼで処理した。６５℃にて５分間で、ＴＡＰを熱で失活させた。６５℃にて１５分間で、ＳＡＰを熱で失活させた。クイックリガーゼキット（マサチューセッツ州、バーバリ、ニューイングランドバイオラブズ社）を用い、指示書に従って、切断し、脱リン酸化したＤＮＡを再環化した。次いで、連結したベクターで大腸菌を形質転換し、アンピシリン入りプレートに一晩置いた。コロニーの数が対照（ベクターを切断したが、脱リン酸化しなかった）の５％未満であれば、ホスファターゼ活性は完全であるとみなした。１ｐＮＰＰ単位のＳＡＰが、５μｇの５’末端突出ＤＮＡを脱リン酸化することができたのに対して、同一単位のＴＡＰは、同一ＤＮＡ５０μｇを脱リン酸化することができた（図１０）。従って、ＴＡＰは、ＤＮＡにおける５’末端突出からリン酸基を外すとき、１０倍多く効率的であることが示された。平滑末端では、ＴＡＰは、ＳＡＰよりも５０倍高く効率的であり、３’末端突出では、ＴＡＰは８倍高く効率的だった。
【００４３】
（ｂ）ＴＡＰはデオキシヌクレオチドからリン酸基を外すことができる
Heinonen及びLahti（上記）により記載されたように本質的な比色アッセイにおける遊離のホスフェートの放出により、デオキシヌクレオチダーゼとしてのＴＡＰの活性を測定した。このアッセイの活性は、既知のホスフェート標準に比べて決定された。５０ｍＭのビストリス−プロパン（ｐＨ６．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１ｍＭのＺｎＣｌ2及び１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ又はＴＴＰのナトリウム塩を含有する４種の異なったデオキシヌクレオチド反応混合物を４本の別個の１．５ｍＬの試験管に入れた。各試験管に２．５単位のＴＡＰを加えた。試験管を３７℃に置くことにより反応を開始させ、１５分後、試験管を６５℃に５分間置くことにより反応を停止させた。各反応混合物の試験管の内容物すべて（０．１ｍＬ）を、１．２５ＮのＨ2ＳＯ4、４ｍＭのモリブデン酸アンモニウム及び５０％のアセトンを含有する測定溶液２．４ｍＬを含有するガラス管に加えた。ガラス管を手短にボルテックスし、室温にて１５分間インキュベートした。最終濃度０．３３Ｍとなるようにクエン酸を加えることにより測定反応を停止させ、各管のＯＤ390を記録した。０〜３０ｍＭのホスフェート標準それぞれ１０μＬを、処理し、ＴＡＰ反応の試験管と同様に測定される模擬反応試験管に加えることにより標準曲線を生成した。ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰはＴＡＰに対するほぼ同等の基質であり、これらの条件下で単位当たり１分当たり１〜２ナノモルのホスフェートを生成することを割り出した。
【００４４】
ＳＡＰ及びＴＡＰのデオキシヌクレオチダーゼ活性を比較した。ｄＡＴＰを試験基質として用いたが、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ又はｄＴＴＰを用いて同様の結果が得られると結論付けられた。５０ｍＭのビストリス−プロパン（ｐＨ６．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１ｍＭのＺｎＣｌ2及び０．８ｍＭのｄＡＴＰを含有するデオキシヌクレオチダーゼ反応混合物を調製した。この混合物０．１ｍＬを１．５ｍＬの反応管７本に分注し、５単位のＴＡＰ又はＳＡＰを各管に加えた。試験管を３７℃に置くことにより反応を開始させた。試験開始から０〜３０分間後、５分間隔で各試験管を６５℃に５分間置くことにより反応を停止させた。ｄＡＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＡＭＰ及びデオキシアデノシンについて標準を含有するプロファイルと比較するために、反応生成物をキャピラリ高速液体クロマトグラフィ（Ｃａｐ−ＨＰＬＣ）の対象とした。自動試料注入器、カラムヒーター及びダイオードアレイ検出器を備えたアジレント（Agilent） １１００シリーズＣａｐ−ＨＰＬＣを用いて、すべての解析を行った。標準のｄＡＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＡＭＰ及びｄＡは、シグマケミカルから購入した。３μｍの１５０ｘ１ｍｍのＣ１８逆相Ｃａｐ−ＨＰＬＣデベロシル（Develosil）カラム（日本、愛知、野村化学株式会社）を用いて４つの種を分離した。１００μＬのフローセンサーを用いた、３０℃、流速２０μＬ／分での９５％の０．１ＭのＫ2ＨＰＯ4（ＫＯＨでｐＨ６．０に調整）及び５％のアセトニトリルを用いたイソクラティック分離は、４種すべての良好な分離を生じることが判明した。ｄＡＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＡＭＰ及びｄＡの典型的な保持時間はそれぞれ、４．７分、５．２分、７．０分及び２１．６分であった。ＴＡＰ及びＳＡＰで処理した試料を上記緩衝液で０．２ｍＬに希釈し、１回当たり４μＬを注入した。データは、２５４ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸収について、アジレント（Agilent）ケムステーション（ChemStation）ソフトウエア（カリフォルニア州、パロアルト、アジレントテクノロジーズ）を用いて回収し、ソフトウエアによってピークサイズを定量した。結果は、各反応成分について、存在する全ヌクレオチドの比率として表した（図１１）。これらの結果は、ＴＡＰがデオキシヌクレオチダーゼとして機能することができ、ｄＮＴＰ、ｄＮＤＰ又はｄＮＭＰ（Ｎは、アデノシン、シトシン、グアノシン又はチミジンを表す）からリン酸基を外すことができ、且つ、ＴＡＰは、デオキシヌクレオチダーゼとしてＳＡＰ（Heinonen及びLahti、上記）よりも高い活性を有することを実証した。
【００４５】
（ｃ）ＴＡＰはピロホスフェートから無機ホスフェートを放出することができる
Heinonen及びLahti（上記）により記載されたように本質的な比色アッセイにおける遊離のホスフェートの放出により、ピロホスファターゼとしてのＴＡＰの活性を測定した。このアッセイにおける活性は、既知のピロホスファターゼを対照として用い、既知のホスフェート標準に比べて決定された。５０ｍＭのビストリス−プロパン（ｐＨ６．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１ｍＭのＺｎＣｌ2及び０．３２ｍＭのピロリン酸ナトリウムを含有するピロホスファターゼ反応混合物を調製した。この混合物を１．５ｍＬの反応試験管に分注し、試験管当たり０．５ｍＬで、最初の試験管が１０単位で始まるＴＡＰの２倍段階希釈を行った。試験管を３７℃に置くことにより反応を開始させ、１０分後、試験管を６５℃に５分間置くことにより反応を停止させた。１．２５ＮのＨ2ＳＯ4、４ｍＭのモリブデン酸アンモニウム及び５０％のアセトンを含有するホスフェート測定溶液を調製した。各反応混合物の試験管の内容物すべて（０．５ｍＬ）を、測定溶液２ｍＬを含有するガラス管に加え、手短にボルテックスし、室温にて１５分間インキュベートした。最終濃度０．３３Ｍとなるようにクエン酸を加えることにより測定反応を停止させ、各試験管のＯＤ390を記録した。０〜３０ｍＭのホスフェート標準それぞれ１０μＬを、ＴＡＰ反応の試験管と同様に処理し測定される模擬反応試験管に加えることにより標準曲線を生成した。ＴＩＰＰを含有する反応を並行して行った。ＴＩＰＰ反応混合物は、２単位のＴＩＰＰ、５０ｍＭのトリシン（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ2及び０．３２ｍＭのピロリン酸ナトリウムを含有し、７５℃でそれをインキュベートした。１０分後、ＴＩＰＰが不活性である室温に試験管を置くことにより反応を停止させた。ＴＡＰと同様に放出されたホスフェートの測定を行った。この実験は、１０単位のＴＡＰが２単位のＴＩＰＰとほぼ同じ量の無機ホスフェートを放出することを示した（図１２）。これらの結果は、ＴＡＰがピロホスファターゼとして機能することができ、ピロホスフェート(ＰＰｉ)を無機ホスフェート(Ｐｉ)に切断することができることを実証した。
【００４６】
（ｄ）ＴＡＰは、リン酸化されたペプチドからリン酸基を外すことができる
33Ｐ標識したミエリン塩基性タンパク質基質(ＭｙＢＰ)の調製
【００４７】
マサチューセッツ州、バーバリのニューイングランドバイオラブズのタンパク質セリン／スレオニンホスファターゼ（ＰＳＰ）アッセイシステムキット（カタログ番号＃Ｐ０７８０Ｓ）を用いて、セリン／スレオニン（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）がリン酸化されたＭｙＢＰ基質を調製した。取り込まれた33Ｐを考慮して５０μＭ（５ｘ濃縮された）の濃度にＳｅｒ／Ｔｈｒ標識したＭｙＢＰ基質を希釈した。
【００４８】
マサチューセッツ州、バーバリのニューイングランドバイオラブズのタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）アッセイシステムキット（カタログ番号＃Ｐ０７８５Ｓ）を用いて、チロシン（Ｔｙｒ）がリン酸化されたＭｙＢＰ基質を調製した。取り込まれた33Ｐを考慮して２５μＭ（５ｘ濃縮された）の濃度にＴｙｒ標識したＭｙＢＰ基質を希釈した。
【００４９】
推奨された緩衝液中において、段階希釈したＴＡＰホスファターゼ、１０ｐＮＰＰ単位のＣＩＡＰホスファターゼと共に、又は酵素なしで３７℃にて１時間、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（５０μＭ）又はＴｙｒ（２５μＭ）標識したＭｙＢＰタンパク質基質１０μＬをインキュベートした。２００μＬの冷却ＴＣＡを加え、氷上で５〜１０分間インキュベートすることにより反応を停止させた。次いで、試料を１２，０００ｘｇにて５分間遠心した。上清１５０μＬを慎重に取り出し、２ｍＬのシンチレーション液を加え、シンチレーションカウンタで計数した。結果を図１３に示す。
【００５０】
リン酸化されたＳｅｒ／Ｔｈｒ残基に対するＴＡＰの比活性は、１９１０ナノモル／分／ｍｇであり、同一基質に対するＣＩＡＰの比活性よりもやや高い。リン酸化されたＴｙｒ残基に対するＴＡＰの比活性もＣＩＡＰの比活性より高い（図１３）。
【００５１】
ＴＡＰの活性に関する上記実験の結果は、それぞれ単一のホスホ−アミノ酸残基を含有する３種のペプチド基質を用いて確認されたものである。標準のＦＭＯＣ化学反応を用いてこれらのペプチドを調製した。ペプチド１はホスホセリン残基を含有し、ペプチド２はホスホスレオニン残基を含有し、ペプチド３はホスホチロシンを含有し、それぞれ、ｐＳｅｒ、ｐＴｈｒ及びｐＴｙｒで示した。以下に列記するのは各ペプチドの配列である。
【００５２】
１．H-Val-Pro-Ile-Pro-Gly-Arg-Phe-Asp-Arg-Arg-Val-pSer-Val-Ala-Ala-Glu-NH2 （配列番号３）
【００５３】
２．H-Thr-Ala-Asp-Ser-Gln-His-Ser-pThr-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Glu-OH(配列番号４）
【００５４】
３．H-Glu-Trp-Met-Arg-Glu-Asn-Ala-Glu-pTyr-Leu-Arg-Val-Ala-OH（配列番号５）
【００５５】
各ペプチドについて、同一配列を有するがホスフェートを欠いた対照ペプチドも合成した。
【００５６】
１ｘＴＡＰ緩衝液（実施例ＶＩＩＩを参照のこと）中で各ホスホ−ペプチド５μｇを含有する反応物５０μＬを３７℃にて１０分間、段階希釈したＴＡＰと共にインキュベートした。インキュベートの後、Ｃａｐ−ＨＰＬＣを用いて試料を解析した。バイダック（Vydac）５μｍ、Ｃ１８の１ｘ２５０ｍｍカラムを流速２５μＬ／分で用いて、３種のペプチドの脱リン酸化反応すべてを分析した。しかしながら、各ペプチドセットについて、リン酸化されたペプチドと脱リン酸化されたペプチドを分離するには最適化された勾配を必要とした。０．１％ＴＦＡ水溶液（ｖ／ｖ）に対してアセトニトリルの比率（％Ｂ）を高めることによるＣａｐ−ＨＰＬＣの勾配をプログラムした時間割は以下のとおりである。
【００５７】
【表１】
0004812617.tif 000002
【００５８】
ペプチド１、ペプチド２及びペプチド３のカラムを平衡化するのにそれぞれ、８０％のＡと２０％のＢ、９１．５％のＡと８．５％のＢ，及び９５％のＡと５％のＢの比率を用いた。２１４ｎｍ、２５４ｎｍ及び２８０ｎｍおける吸収についてアジレント（Agilent）ケムステーション（ChemStation）ソフトウエア（カリフォルニア州、パロアルト、アジレントテクノロジーズ）を用いてデータを回収し、ソフトウエアによってピークサイズを計算した。反応に存在する種の同一性を検証するために、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）においても反応を調べた。α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリクスとして、加速電圧２０ｋＶ及び陽イオンモードにて約１５０η秒の遅延時間で、ＡＢＩボイジャー（Voyager）ＤＥ質量分析計を用いた。図１４は、ＴＡＰの量が増えるにつれて、量が減るホスホペプチド及び量が増える脱リン酸化されたペプチドを示すデータをまとめた３つのグラフから成る。このデータは、ＴＡＰがホスホ−チロシンペプチドに対して最も活性が高く、１０分間で５μｇのペプチドからホスフェートをすべて外すのに必要とした酵素はたった０．０２単位であることを示している。ホスホ−セリン及びホスホ−スレオニンペプチドからホスフェートを完全に外すにはそれぞれ、２．５単位及び１０単位のＴＡＰを必要とした。このデータは、ペプチドからリン酸基を外すのにＴＡＰを使用できることを示している。
【００５９】
実施例ＶＩＩＩ：ＴＡＰは、糖におけるホスフェートの位置にかかわりなく糖リン酸を脱リン酸化することができる
ＴＡＰが位置にかかわりなく、糖リン酸からリン酸残基を切断できるかどうかを調べるために、３種の糖リン酸、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸及びマンノース−６−リン酸に対するその活性を測定した。各糖リン酸について反応混合物の段階希釈物を調製したが、各反応混合物は、５ｍｇ／ｍＬの１種の糖リン酸の溶液１００μＬ、１０ｘＴＡＰ緩衝液（５００ｍＭのビストリス−プロパン、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＺｎＣｌ2、ｐＨ６．０）を３０μＬ及びＨ2Ｏを２１０μＬ含有した。５０μＬの反応混合物を最初の試験管に入れ、それに続く５本の試験管に２５μＬ入れた。３種の調べるべき糖リン酸それぞれについてこれを繰り返した。これらの試験管を氷上に置いて冷却した。５０μＬの反応混合物を含有する最初の試験管に５μＬの冷却ＴＡＰ（５Ｕ／μＬ）をいったん加えた。混合した後、この試験管から２５μＬを取り出し、２５μＬの反応混合物を含有する次の試験管に入れた。混合した後、この第２の試験管から２５μＬを取り出し、次の試験管に入れた。この１：１の段階希釈を６本の試験管すべてについて行った。各糖リン酸についてＴＡＰの段階希釈を行った後、試験管を氷から取り出し、３７℃に１５分間置いた。インキュベートした後、シリカゲルガラス上の薄層クロマトグラフィ(ＴＬＣ)プレート上の密着したバンドに各試料３μＬでスポットを作った。酵素なしでインキュベートした混合物のみを含有する陰性対照及び１ｍｇ／ｍＬのグルコース又はマンノースを含有する陽性対照でもＴＬＣ上にスポットを作った。ホットエアガン（７０℃を超えない温度）でスポットを完全に乾燥した。イソプロパノール、エタノール及び水（２．５：１：０．５、ｖ：ｖ：ｖ）の中で溶媒の先頭が９ｃｍ移動するまでプレートを展開した。クロマトグラフィに続いて、プレートを乾燥させ、１０％の過塩素酸を噴霧した。ヒートガンでプレートを焦がすことにより糖を視覚化した。３６６ｎｍでのＵＶのもとで生成物を視覚化することにより感度を高めた。４２μｇのグルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸及びマンノース−６−リン酸の完全な消化は、６ＵのＴＡＰを用いて３７℃にて１５分で達成された（図１５）。
【００６０】
糖におけるホスフェートの連結（すなわち、１又は６）は、酵素の活性に明瞭な影響を有さなかった。さらに、マンノース糖リン酸におけるＴＡＰの活性は、グルコース糖リン酸におけるものと同様だった。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ｐＮ１を含有する大腸菌株からのＴＡＰ精製の結果を示す図である。レーン１〜６は、精製における連続工程である。レーン１は、誘導した後の全粗抽出物である。レーン２は、可溶化した膜分画である。レーン３は、ＤＥＡＥカラムからの通過物である。レーン４は、Ｑセファロースカラムからのプールした分画である。レーン５は、ハイトラップＳカラムからの通過物である。レーン６は、ヒドロキシアパタイトカラムからの通過物である。レーン７は、ｐＮＩクローンから得た精製したＴＡＰである。分子量標準（Ｓ）は、ｋＤで示す。レーン７の４７．５ｋＤに相当するバンドが実質的に精製されたＴＡＰを表す。
【図２】ＴＡＰ遺伝子を過剰発現させるベクターを構築するのに使用した工程を示す説明図である。図の上側の細長い四角は、遺伝子のそれに相当する発現生成物のＮ末端部分及びＣ末端部分を含むＴＡＰ遺伝子の模式図である。Ｎ末端では、メチオニン開始コドン及び仮定されたシグナル配列をコードするプロセッシング部位周辺の領域の位置を示す。Ｃ末端では、星印で示した停止コドンと共に、遺伝子産物のアミノ酸を示す。ＴＡＰ遺伝子のＰＣＲ増幅に使用したプライマーを、各プライマーがＴＡＰ遺伝子にハイブリッド形成する部位で、細長い四角の上（実際のサイズではない）（正方向プライマーＡ、Ｂ及びＣについて）及び下（逆方向プライマーＤ及びＥ）に示す。プライマー上のＮ及びＸは、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ又はＸｈｏＩについて操作した切断部位を示す。プライマーＣは、ＮｄｅＩに続く６個のＨを示す。これらは、プライマーのメチオニン開始コドンの下流に挿入され、それに隣接するヒスチジンをコードする６個のコドンに相当し、ＴＡＰと融合したＮ末端Ｈｉｓタグを創る。「ＰＣＲ」に続く次の一連の線は、指示したプライマー対を用いることによって生じる結果の産物を示す。上記のように、星印は停止コドンを示し、６個のＨは、ヒスチジンタグをいう。ＰＣＲ産物をｐＥＴ２１ａに挿入することによって創った５種の異なるプラスミドを示す。ｐＥＧＴＡＰ１．１．１はＨｉｓタグのない無傷のＴＡＰをコードする。ｐＥＧＴＡＰ１．２．１は、Ｈｉｓタグのない切り詰め型ＴＡＰをコードする。ｐＥＧＴＡＰ１．３．１はＣ末端Ｈｉｓタグを持つ無傷のＴＡＰをコードする。ｐＥＧＴＡＰ１．４．１はＣ末端Ｈｉｓタグを持つ切り詰め型ＴＡＰをコードする。後の実験では、Ｎ末端Ｈｉｓタグを持つ切り詰め型ＴＡＰをコードするようにｐＥＧＴＡＰ７．４．１を構築した。
【図３】Ｈｉｓタグの存在下又は非存在下、ＴＡＰ遺伝子が切り詰められたか又は切り詰められていない様々なクローンから生じるＴＡＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。「試験的」精製は、１ｍＬ未満の試料サイズを言う。レーン１は、Ｈｉｓタグなしの無傷のＴＡＰ遺伝子を持つクローンｐＥＧＴＡＰ１．１．１からの可溶性粗抽出物である。レーン２は、Ｈｉｓタグなしの切り詰め型ＴＡＰ遺伝子を持つクローンｐＥＧＴＡＰ１．２．１からの可溶性粗抽出物である。レーン３及びレーン４は、Ｈｉｓタグに融合した無傷のＴＡＰ遺伝子を持つクローンｐＥＧＴＡＰ１．３．１からの２種の異なった単離物から得た可溶性粗抽出物である。レーン５及びレーン６は、Ｈｉｓタグに融合した切り詰め型ＴＡＰ遺伝子を持つクローンｐＥＧＴＡＰ１．４．１からの２種の異なった単離物から得た可溶性粗抽出物である。分子量標準（Ｓ）は、ｋＤで示す。切り詰め型ＴＡＰ遺伝子を有するそれらのクローン（レーン２、５及び６）はＴＡＰに相当する最強のバンドを提供した。
【図４】Ｃ末端のＨｉｓタグと共に切り詰め型の遺伝子を含有する（ｐＥＧＴＡＰ１．４．１）大腸菌（ＥＲ２５６６）クローンから非変性条件下で精製した可溶性ＴＡＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。全粗抽出物（Ｔ）、清澄化した粗抽出物（装填）（Ｌ）、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラム（カリフォルニア州、Studio City、キアゲン）からの通過物（ＦＴ）、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラムの洗浄物（Ｗ）並びに溶出緩衝液でＮｉ−ＮＴＡスピンカラムから溶出された第１の試料及び第２の試料（Ｅ１及びＥ２）の試料１０μＬを、１０〜２０％のトリストリシンＰＡＧ（カリフォルニア州、Carlsbad、Invitrogen Corp.)で泳動し、クマシーブリリアントブルーで染色した。分子量標準（Ｓ）は、ｋＤで示す。
【図５】解析したクローンがＥＲ２５６６（ｐＥＧＴＡＰ７．４．１）であったことを除いて図４で使用したのと同様の精製プロトコールの結果を示す図である。また、細胞抽出物全体をゲル上で泳動するのに代えて、粗抽出物を遠心して得られたペレットを再懸濁させて、不溶性ペレット（Ｐ）として泳動した。ペレット、可溶性装填試料（Ｌ）、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラムの通過物（ＦＴ）、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラムの洗浄物（Ｗ）、イミダゾールによるＮｉ−ＮＴＡスピンカラムからの溶出物（Ｅ）及びｋＤで示す分子量標準（Ｓ）各１０μＬを、１０〜２０％のトリストリシンＰＡＧで泳動し、クマシーブリリアントブルーで染色した。
【図６】様々なｐＨ及び様々な緩衝液におけるＴＡＰ活性の比較を示す図である。ホスフェート放出アッセイを用いてｐＨの最適性を決定した。32Ｐ標識した二本鎖ＤＮＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ2及び０．１ｍＭのＺｎＣｌ2を含有する反応混合物中で５０ｍＭの各緩衝液をインキュベートした。反応物を３７℃にて５分間インキュベートし、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）可溶性のカウントの量を測定した。
【図７】ホスフェート放出アッセイを用いた、ＴＡＰ活性に対する様々な塩の影響を示す図である。１００ｍＭの各塩、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、酢酸カリウム又は酢酸ナトリウムを調べた。
【図８】ＣＩＡＰ、ＳＡＰ及びＴＡＰの温度不安定性の比較を示す図である。ＤＮＡの存在下、６５℃にて各酵素を３０分までインキュベートした。インキュベート中、様々な時点で試料を取り出し、ｐＮＰＰで活性を測定した。
【図９】ＴＡＰによるｐＮＰＰからの経時的なホスフェートの放出を測定することにより、３７℃及び２５℃における安定性を示す図である。１単位のＴＡＰ及び未反応のｐＮＰＰを含有する試験管を２５℃又は３５℃のいずれかでインキュベートした。最終濃度５ＮとなるようにＮａＯＨを添加することにより０〜３０分について５分間隔で反応を止めた。ホスフェートの放出（ｐＮＰの蓄積）を４０５ｎｍ（黄色）にて分光光度計で測定し、反応時間に対してグラフを作った。
【図１０】様々な種類のＤＮＡ末端からのリン酸基の取り外しにおけるＴＡＰの効率のＳＡＰに対する比較を示す図である：５’末端突出、平滑末端及び３’末端突出を調べた。これらの末端は、ベクターをそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＶ及びＰｓｔＩで消化することにより作製した。
【図１１】ＴＡＰ及びＳＡＰについてデオキシヌクレオチダーゼ活性の反応時間経過を示す図である。ｄＡＴＰアーゼ反応混合物の組成は、５分間隔でＣａｐ−ＨＰＬＣにより測定した。結果は、存在するヌクレオチド全体の比率として各成分を表す。
【図１２】ＴＡＰによるピロリン酸からの無機ホスフェートの放出を示す図である。０．３２ｍＭのピロリン酸ナトリウムを含有する各反応混合物に量を増やしながらＴＡＰを加えた。無機ホスフェートは、Heinonen及びLahtiの方法（Heinonen J. K. & Lahti R. J., 「無機オルトホスフェートの新しい且つ好都合な比色分析測定及び無機ピロホスファターゼの測定へのその応用」Anal. Biochem., 113(2):313-7, 1981）により既知のホスフェート標準と比較することによって本質的に測定した。並行する反応で熱安定性の無機ピロホスフェート（ＴＩＰＰ）を用いて、同等性を実証した。ＴＡＰについては３７℃で、ＴＩＰＰについては７５℃で１０分間のアッセイについて結果を示す。
【図１３】リン酸化されたミエリン塩基性タンパク質におけるＣＩＡＰと比べたＴＡＰの比活性を示す表である。
【図１４】Ｃａｐ−ＨＰＬＣで測定した場合の、３種のホスホペプチド：ホスホセリン（グラフＡ）、ホスホスレオニン（グラフＢ）及びホスホチロシン（グラフＣ）に対するＴＡＰの活性を示す図である。ホスホペプチド及びペプチドについての吸収ピークの面積が測定され、合計面積の比率としてＴＡＰの単位数に対してグラフ上にプロットされた。
【図１５】３種の異なった糖−リン酸、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸及びマンノース−６リン酸に対する１力価のＴＡＰのＴＬＣ解析を示す図である。陽性対照として、３μｇのグルコース（Ｇ）及びマンノース（Ｍ）のスポットを置いた。陰性対照（−）は、酵素なしでインキュベートした緩衝液と糖リン酸基質を含有する反応混合物だけを含有する。１〜６と付けたレーンは、１２．５単位のＴＡＰを含有する反応１で開始し、０．４単位のＴＡＰを含有する反応６まで落とす、反応混合物における酵素の段階希釈（１：１）である。矢印は、糖及び糖−リン酸がＴＬＣ上を移動する距離を示す。
【図１６】ｐＮ１プラスミドからの１．１ｋｂの断片をＰＣＲするのに使用したプライマーの配列（配列番号６及び７）である。クローニングしたＰＣＲ断片からの発現の結果、予想されるタンパク質のＮ末端配列（配列番号８）を正方向プライマーの配列の下に示す。プライマー内に含有されるＮｄｅＩ及びＸｈｏＩのクローニング部位も示す。
【図１７】無傷のＴＡＰ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号９）及びアミノ酸配列（配列番号１０）を示す図である。四角で示すのは、Ｎ末端配列解析（Rina et al., 上記）により決定されるときのタンパク質の開始点である。矢印は、切り詰め型遺伝子をクローニングするのに使用したＰＣＲプライマーがアニーリングする位置を示す。
【図１】
0004812617.tif 000003
【図２】
0004812617.tif 000004
【図３】
0004812617.tif 000005
【図４】
0004812617.tif 000006
【図５】
0004812617.tif 000007
【図６】
0004812617.tif 000008
【図７】
0004812617.tif 000009
【図８】
0004812617.tif 000010
【図９】
0004812617.tif 000011
【図１０】
0004812617.tif 000012
【図１１】
0004812617.tif 000013
【図１２】
0004812617.tif 000014
【図１３】
0004812617.tif 000015
【図１４】
0004812617.tif 000016
【図１５】
0004812617.tif 000017
【図１６】
0004812617.tif 000018
【図１７】
0004812617.tif 000019
【配列表】
0004812617000001.app