(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のモチーフ配列：
５’−α１−α２−・・・−αｎ−Ｘ−βｎ−・・・−β２−β１−３’
（式中、α１〜αｎはそれぞれ配列５’−ＣＡＣＡＧＴＧ−３’又は５’−ＣＡＣＴＧＴＧ−３’のうち連続する４〜７塩基からなる配列を表し、Ｘは０〜１０個の塩基からなる任意の配列を表し、β１〜βｎはそれぞれ前記配列α１〜αｎに対して逆方向に相補的な４〜７塩基からなる配列を表し、ｎは１以上の整数を表し、隣接する各α１〜αｎ及びβ１〜βｎの間にはそれぞれ１〜数個の塩基からなる任意の配列が存在してもよい）
と、それぞれ２塩基以上の長さを有する前記モチーフ配列の上流隣接配列及び下流隣接配列とからなる回文配列を有し、レトロウイルス組込み標的活性を有する核酸。
【請求項２】
前記モチーフ配列の上流側隣接配列及び下流側隣接配列が、それぞれ４個以上の塩基からなる、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
前記上流側隣接配列中にＴＣＣ又はＴＴＣが存在し、かつ、前記下流側隣接配列中にＧＧＡ又はＧＡＡが存在する、請求項１又は２記載の核酸。
【請求項４】
前記回文配列が、長さ３６〜１００塩基である、請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸。
【請求項５】
レトロウイルスインテグラーゼと結合しうる、請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸。
【請求項６】
モチーフ配列が、配列番号１、２、及び９のいずれか１に記載の配列又はそれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る配列である、請求項１〜５のいずれか１項記載の核酸。
【請求項７】
回文配列が、配列番号３、５、及び１０のいずれか１に記載の配列又はそれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る配列である、請求項１〜６のいずれか１項記載の核酸。
【請求項８】
ベクター中に担持された形態である、請求項１〜７のいずれか１項記載の核酸。
【請求項９】
以下の工程を含むことを特徴とする、核酸のレトロウイルス組込み標的活性を試験する方法：
（１）レトロウイルスゲノムＬＴＲ配列の５’側末端及び３’側末端にそれぞれ由来する、５’側に２塩基の突出部を有する二本鎖核酸又はそれらを形成し得る一本鎖核酸と、インテグラーゼと、被検対象の標的配列を含む環状核酸とを、共存させ、
（２）前記標的配列中への前記レトロウイルスゲノム由来配列の組込みの有無を検出する工程。
【請求項１０】
前記（１）の工程において、レトロウイルスゲノムＬＴＲ配列の５’側末端由来の核酸と３’側末端由来の核酸とを、同時に、他の反応成分と一緒にする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記（１）の工程において、レトロウイルスゲノムＬＴＲ配列の５’側末端由来の核酸と３’側末端由来の核酸とを、それぞれ個別にインテグラーゼと反応させて予めインテグラーゼ複合体を形成させ、その後、これらの複合体を同時に前記環状核酸と一緒にして反応させる、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
標的配列が、少なくとも１００塩基対以上の長さである、請求項９〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
組込みの有無の検出が、核酸増幅及びその後の配列解析によって行われる、請求項９〜１２のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、宿主ゲノムへのレトロウイルスの組込みの標的となる活性を有する核酸、この核酸を含むベクター、レトロウイルスに起因する疾患の予防又は治療のための抗ウイルス剤、及びレトロウイルス組込みの標的となる活性についての核酸の試験方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レトロウイルスの感染に起因する疾病は、ＡＩＤＳ、ヒト成人Ｔ細胞白血病など、多数存在する。レトロウイルスの感染は、まず第一段階として細胞にウイルスが吸着されることにより始まる。次に、第二段階として細胞内でゲノムＲＮＡから逆転写酵素によりＤＮＡのプロウイルスゲノムが形成される。そして、第三段階としてこのＤＮＡが宿主染色体ＤＮＡに組み込まれ、それによって感染が成立する。こうして感染が成立することを第一歩として、さらにこれらの疾病の発病までの過程が進行する。【０００３】
したがって、レトロウイルスによる疾病の予防又は治療は、ウイルスの細胞への吸着、逆転写、及び組込みのいずれかのプロセスを標的としてそれを阻害することによって行うことができると考えられる。【０００４】
このうち、現在開発されている抗ウイルス剤は、前記の第一又は第二の段階を阻止するものであり、組込み段階を阻止することによるレトロウイルス疾患の予防もしくは治療剤又は方法の開発は遅れている。これは、宿主染色体へのウイルスの組込み機構の解明それ自体が遅れているためである。【０００５】
従来、レトロウイルスの組込みのためのインテグレーションシグナル配列（ＩＳＳ）として、ＬＴＲには、組込み酵素（インテグラーゼ）が認識するＣＡ／ＧＴの２塩基対を含む６塩基対が必須であることは知られていた。しかし、宿主ＤＮＡ側の挿入部位の配列には共通性がないため、宿主ＤＮＡへのウイルス遺伝子の組込みはランダムに起こると想定されていた。【０００６】
たとえば、吉永らは、Ｕ５ＬＴＲの末端を模して合成した２１塩基対のオリゴヌクレオチドを基質（標的に組み込まれるべきＤＮＡ）かつ標的（基質の挿入を受けるべきＤＮＡ）として用いてインテグラーゼと反応させ、インビトロで組込みが起こったかどうかを検定するアッセイ法を開発した（非特許文献（参考文献）１）。しかし、このアッセイの結果によれば、標的ＤＮＡのどこに基質ＤＮＡが入るかは決まっていないとされた。【０００７】
このように、組込みがランダムな部位に起こると考えられていたため、組込み部位の構造的特異性を利用した特異的組込み阻害の機構の研究、及びそれに基づいた阻害試薬の開発はされてこなかった。そのため、組込み阻害剤については、わずかに、少数のインテグラーゼ阻害作用を有する低分子化合物が報告されているにすぎない。【０００８】
したがって、組込み阻害による抗レトロウイルス剤又はレトロウイルスによる疾患を治療するための実用的な組成物又は治療方法は、現在までに実現されていない。【０００９】
一方、レトロウイルスがプロウイルス状態で潜伏する宿主細胞からウイルスが再生され、他の正常な細胞に再感染することを防止（疾病の進展防止）することは、前記第一又は第二の段階を阻止することによる抗ウイルス剤では不可能であり、組込み阻害による第三段階の阻止を可能にする抗ウイルス剤が望まれていた。【００１０】
参考文献１:「エイズ−発見から治療最前線まで」、畑中正一著、共立出版株式会社、１９９９年１月、特に４１〜４７頁
参考文献２:Hacein-Bey-Abina, S. et al., “LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1,” Science 302, 415-419 (2003)
参考文献３:Wu, X., Li, Y., Crise, B., and Burgess, S.M., “Transcriptional start regions in the human genome are favored targets for MLV integration,” Science 300, 1749-1750 (2003)
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、宿主へのレトロウイルスの挿入機構に基づいて、初期感染においてウイルスゲノムが宿主ゲノムに組込まれることを阻害（感染又は疾病の予防）することができ、また、レトロウイルスがプロウイルス状態で潜伏する宿主細胞からウイルスが再生され、他の正常な細胞に再感染することを防止（疾病の進展防止）し得る、レトロウイルスの組込みの標的となりうる活性を有する核酸、この核酸を含む抗ウイルス剤、この核酸を含むベクター、レトロウイルス疾患の治療方法を提供することを目的とする。本発明はさらに、簡便で、再現性がよく、感度の高い、レトロウイルス組込み標的活性についての核酸の試験方法を提供することを目的とする。
【００１２】
本発明者は、マウスリンパ腫ＤＮＡに対するレトロウイルスの組込み部位を多数解析し、さらに公開データベースに収録されているヒト、マウスのレトロウイルス組込み部位の塩基配列を解析することにより、哺乳類におけるレトロウイルス組込み部位の共通性を見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、
（１）  以下のモチーフ配列：
５’−α１−α２−・・・−αｎ−Ｘ−βｎ−・・・−β２−β１−３’
（式中、α１〜αｎはそれぞれ配列５’−ＣＡＣＡＧＴＧ−３’又は５’−ＣＡＣＴＧＴＧ−３’のうち連続する４〜７塩基からなる配列を表し、Ｘは０〜１０個の塩基からなる任意の配列を表し、β１〜βｎはそれぞれ前記配列α１〜αｎに対して逆方向に実質的に相補的な４〜７塩基からなる配列を表し、ｎは１以上の整数を表し、隣接する各α１〜αｎ及びβ１〜βｎの間にはそれぞれ１〜数個の塩基からなる任意の配列が存在してもよい）
と、それぞれ２塩基以上の長さを有する前記モチーフ配列の上流隣接配列及び下流隣接配列とからなる実質的な回文配列を有し、レトロウイルス組込み標的活性を有する核酸；
（２）  前記モチーフ配列の上流側隣接配列及び下流側隣接配列が、それぞれ４個以上の塩基からなる、前記（１）記載の核酸；
（３）  前記上流側隣接配列中にＴＣＣ又はＴＴＣが存在し、かつ、前記下流側隣接配列中にＧＧＡ又はＧＡＡが存在する、前記（１）又は（２）記載の核酸；
（４）  前記回文配列が、長さ３６〜１００塩基である、前記（１）〜（３）のいずれか１項記載の核酸；
（５）  レトロウイルスインテグラーゼと結合しうる、前記（１）〜（４）のいずれか１項記載の核酸；
（６）  モチーフ配列が、配列番号１、２、及び９のいずれか１に記載の配列又はそれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る配列である、前記（１）〜（５）のいずれか１項記載の核酸；
（７）  回文配列が、配列番号３、５、及び１０のいずれか１に記載の配列又はそれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る配列である、前記（１）〜（６）のいずれか１項記載の核酸；
（８）  ベクター中に担持された形態である、前記（１）〜（７）のいずれか１項記載の核酸；
（９）  前記（１）〜（８）のいずれか１項記載の核酸を含有する、抗ウイルス剤；
（１０）  デコイ型医薬、又はアンチセンス医薬である、前記（９）記載の抗ウイルス剤；
（１１）  前記（１）〜（８）のいずれか１項記載のモチーフ配列中の１以上の配列α及び／又はβ中のいずれか１塩基が置換された核酸をデコイとして含有する、抗ウイルス剤；
（１２）  以下の工程を含むことを特徴とする、核酸のレトロウイルス組込み標的活性を試験する方法：
１）レトロウイルスゲノムＬＴＲ配列の５’側末端及び３’側末端にそれぞれ由来する、５’側に２塩基の突出部を有する二本鎖核酸又はそれらを形成し得る一本鎖核酸と、インテグラーゼと、被検対象の標的配列を含む環状核酸とを、共存させ、
２）前記標的配列中への前記レトロウイルスゲノム由来配列の組込みの有無を検出する工程；
（１３）  前記１）の工程において、レトロウイルスゲノムＬＴＲ配列の５’側末端由来の核酸と３’側末端由来の核酸とを、同時に、他の反応成分と一緒にする、前記（１２）記載の方法；
（１４）  前記１）の工程において、レトロウイルスゲノムＬＴＲ配列の５’側末端由来の核酸と３’側末端由来の核酸とを、それぞれ個別にインテグラーゼと反応させて予めインテグラーゼ複合体を形成させ、その後、これらの複合体を同時に前記環状核酸と一緒にして反応させる、前記（１２）記載の方法；
（１５）  標的配列が、少なくとも１００塩基対以上の長さである、前記（１２）〜（１４）のいずれか１項記載の方法；及び
（１６）  組込みの有無の検出が、核酸増幅及びその後の配列解析によって行われる、前記（１２）〜（１５）のいずれか１項記載の方法、
である。
【００１４】
本発明を説明するに際して、本発明の核酸に存在する、式（１）：
５’−α１−α２−・・・−αｎ−Ｘ−βｎ−・・・−β２−β１−３’
（式中、α１〜αｎはそれぞれ配列５’−ＣＡＣＡＧＴＧ−３’又は５’−ＣＡＣＴＧＴＧ−３’のうち連続する４〜７塩基からなる配列を表し、Ｘは０〜１０個の塩基からなる任意の配列を表し、β１〜βｎはそれぞれ前記配列α１〜αｎに対して逆方向に実質的に相補的な４〜７塩基からなる配列を表し、ｎは１以上の整数を表し、隣接する各α１〜αｎ及びβ１〜βｎの間にはそれぞれ１〜数個の塩基からなる任意の配列が存在してもよい）
で示される必須の配列を、「モチーフ配列」と呼ぶことがある。
【００１５】
本発明に関して、「レトロウイルス組込み標的活性」とは、レトロウイルスゲノムの組込みが高頻度で起こり得る、すなわち、レトロウイルスゲノムの組込みの標的となり易い性質を指す。組込み標的活性が高い核酸は、インテグラーゼとの結合に関して他の核酸と競合する場合、他の核酸より有利にインテグラーゼと結合するため、結果として他の核酸とインテグラーゼとの結合を阻害し、さらに他の核酸へのレトロウイルスゲノムの組込みを阻害する能力が高い。
【００１６】
また、本発明に関して使用する場合、各用語は、基本的には、それぞれの属する技術分野において一般に使用されているとおりの通常の意味で使用される。以下に挙げる用語については、特に次のような意義を有する。
【００１７】
「回文配列」（又は「回文構造」）は、「パリンドローム配列」（又は「パリンドローム構造」）とも呼ばれ、一般的な意味で使用される。すなわち、二本鎖核酸の相補鎖をそれぞれ５’末端（又は３’末端）から読むと同じ配列になっている配列（又はそのような構造）をいう。回文配列を有する核酸は、回文配列の中心を境にして鎖内で相補的に結合し、潜在的にヘアピン構造を作ることができる。この場合、回文配列の中心位置に回文形成と関係のないランダムな配列の挿入があると、その部分は塩基対を形成せずにループ構造となる。言い換えれば、回文配列とは、ヘアピン構造又はヘアピンループ構造を潜在的に形成し得る配列である。
【００１８】
回文配列、回文構造、ヘアピン又はヘアピンループ構造、塩基対の形成、配列の相補性等に関して、「実質的に（実質的な）」とは、関与する２つの配列が完全には相補的ではなく、一方又は他方の配列における１個又は数個、例えば２〜４個の塩基の欠失又は挿入によって相補性が不完全になっている部分を有し、あるいはそのために塩基対又は特定の構造の形成が不完全になっている部分を有するものの、全体としては相補的である又は塩基対もしくは特定の構造が形成されていると認められる場合を意味する。たとえば、ｎ個の塩基からなる回文配列を有する核酸の中に、この核酸がヘアピン構造をとった際に塩基対を形成しない１個又は数個、例えば２〜４個の塩基が存在していても、ｎの数がある程度大きければ、その核酸の配列は「実質的に」回文配列であるといえる。
【００１９】
本発明によれば、レトロウイルス組込み標的活性を有する核酸が提供される。本発明の核酸は、各種レトロウイルスに共通する基本的な性質を利用しているため、本質的にあらゆるレトロウイルスに対して有効である。
【００２０】
本発明の核酸は、そのままで又は他の成分と組み合わせて、抗ウイルス剤として使用することができる。また、特に、本発明の核酸は、アンチセンス医薬、デコイ型医薬の形態で使用することができ、それによって、プロウイルス状態で潜伏する宿主細胞からウイルスが再生され、他の正常な細胞に再感染することを防止（疾病の進展防止）することができる。すなわち、本発明の抗ウイルス剤は、生体内細胞へのレトロウイルスの再感染防止を可能にし、他の抗ウイルス剤（感染細胞の殺傷効果を持つ薬剤）との併用により、感染個体からレトロウイルスを完全に排除することを可能とする。
【００２１】
また、本発明の方法によれば、特定の配列の核酸について、レトロウイルス組込み標的活性の有無又はその活性の強弱を、簡便に、再現性よく、しかも高感度で試験することができる。本発明の方法においては、特に、最初から環状形態の標的配列核酸を使用することにより、標的配列の自己環状化が防止され、標的配列とインテグラーゼとの結合の有無・強弱を従来より明確に判定することができる。この効果は、比較的長い標的配列を使用することによって、さらに顕著となる。
【００２２】
さらに、本発明の方法によれば、基質核酸として、レトロウイルスゲノムＬＴＲ配列の５’側末端由来の核酸と３’側末端由来の核酸との両方を使用することによって、基質核酸の２種類の二本鎖に含まれる４本の一本鎖と、インテグラーゼとの間でインテグラーゼの２量体又は４量体が形成され、組込み反応に有利になり、５’側又は３’側のいずれか一方を使用する従来の方法と比較して、組込み反応の検出感度が改善されている。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】は、配列番号３に記載の回文配列が潜在的に形成するヘアピン構造を示す図である。
【図２】は、本発明の方法の一態様を説明する概略図である。
【図３】は、本発明の方法の実施例において得られた結果を、実施例で使用した標的配列と、その各位置への挿入の有無又は頻度とによって示す図である。
【図４】は、実施例において使用された本発明の実施例及び比較例の核酸の配列を示す図である。
【図５】は、図４の配列を有する核酸に対するレトロウイルス核酸の組込み効率を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
核酸
本発明の核酸は、式（１）：
５’−α１−α２−・・・−αｎ−Ｘ−βｎ−・・・−β２−β１−３’
（式中、α１〜αｎはそれぞれ配列５’−ＣＡＣＡＧＴＧ−３’又は５’−ＣＡＣＴＧＴＧ−３’のうち連続する４〜７塩基からなる配列を表し、Ｘは０〜１０個の塩基からなる任意の配列を表し、β１〜βｎはそれぞれ前記配列α１〜αｎに対して逆方向に実質的に相補的な４〜７塩基からなる配列を表し、ｎは１以上の整数を表し、隣接する各α１〜αｎ及びβ１〜βｎの間にはそれぞれ１〜数個の塩基からなる任意の配列が存在してもよい）
で示されるモチーフ配列と、それぞれ２塩基以上の長さを有する前記モチーフ配列の上流隣接配列及び下流隣接配列とからなる実質的な回文配列を有し、かつ、レトロウイルス組込み標的活性を有するものである。【００２５】
すなわち、本発明の核酸は、潜在的にヘアピン構造又はヘアピンループ構造をとり得る実質的な回文配列を有し、そのような構造をとった場合に、配列α及びβによって
５’−ＣＡＣＡＧＴＧ−３’
：：：：：：：
３’−ＧＴＧＴＣＡＣ−５’
のうちの一部の塩基対がステム中に形成されることになる。この７塩基対の配列は、免疫グロブリン遺伝子再構成シグナル配列（recombination signal sequence；ＲＳＳ）と呼ばれる配列と一致する。したがって、以下においてこの配列を「ＲＳＳエレメント」と呼ぶことがある。【００２６】
本発明の核酸における配列α及びβは、逆方向に実質的に相補的であって、潜在的なヘアピン又はヘアピンループ構造において基本的に塩基対を形成し得るが、具体的には、対応する１組の配列α及びβの短い方の塩基数の５０％以上が塩基対を形成すればよい。たとえば、対応する配列α及びβがいずれも４塩基の長さを有する場合、その中で２個以上の塩基対が形成されればよい。また、配列αが５塩基の長さであり、対応する配列βが４塩基の長さの場合も、２個の塩基対が形成されれば、ここでいう「実質的に相補的」である。【００２７】
本発明の核酸において、モチーフ配列中の配列α及びβは、少なくとも１組存在すればよいが、２組以上存在していてもよい。１組が存在する場合は、５’−α１−Ｘ−β１−３’となる。２組以上存在する場合は、たとえば５’−α１−α２−Ｘ−β２−β１−３’（ここで、β１はα１に対して、β２はα２に対して、それぞれ逆方向に実質的に相補的である）、より一般的には式（１）：
５’−α１−α２−・・・−αｎ−Ｘ−βｎ−・・・−β２−β１−３’
のように全体として回文配列になるように配置されていればよい。【００２８】
本発明の核酸の回文配列をこの式で表す場合、ｎは１以上の整数を表すが、ｎは、一般的には１〜１０、有利には１〜６の範囲内である。また、各α及びβはそれぞれ同一の配列でなくてもよく、各々の間にそれぞれ１〜数個の塩基からなる任意の配列が存在していてもよい。この任意の配列は、好ましくは潜在的ヘアピン構造においてそれぞれ対応する位置の同様の配列と塩基対を形成し得る。【００２９】
本発明の核酸において、配列Ｘは、存在してもしなくてもよく、存在する場合、その内部でステムのように塩基対を形成しうるものであってもよく、ループを形成しうるものであってもよく、あるいはその両方を含んでいてもよい。【００３０】
配列Ｘは、好ましくは０〜１０個の塩基であるが、より好ましくは０〜９個の塩基で構成され、たとえば０〜６個の塩基で構成されていてもよい。【００３１】
前記モチーフ配列の上流側隣接配列及び下流側隣接配列は、それぞれ２塩基以上の長さを有し、これらの配列もまた、本発明の核酸の実質的な回文配列の一部を成す。したがって、本発明の核酸がヘアピン又はヘアピンループ構造を形成する場合、前記モチーフ配列によって形成され得る２個以上の塩基対に加えて、上流側隣接配列及び下流側隣接配列によって形成される塩基対が存在することになる。たとえば、天然の配列に基づいて得られる本発明の核酸については、上流側隣接配列中にＴＣＣ又はＴＴＣが存在し、前記下流側隣接配列中にＧＧＡ又はＧＡＡが存在することが多く、これらが存在する場合、さらに３個の塩基対が形成され得る。【００３２】
モチーフ配列の隣接配列は、それぞれ、好ましくは４個以上、さらに好ましくは６個以上、より好ましくは８個以上、最も好ましくは１０個以上の塩基からなる。なかでも特に、モチーフ配列の上流側隣接配列及び下流側隣接配列がそれぞれ１０〜５０個の塩基からなるものが好都合である。【００３３】
上流側の隣接配列と下流側の隣接配列とは、同数の塩基からなりミスマッチのない完全な回文配列又は逆方向相補的配列ではなくてもよく、長さが異なっていてもよいが、本発明の核酸が実質的に回文配列を有するためには、両者を構成する塩基の数の差は少ない方が好ましく、たとえば２０個の塩基からなる配列においては１０個以下、好ましくは８個以下、より好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下であり、最も好ましくは同じ長さである。【００３４】
本核酸のモチーフ配列は、最短で８塩基の長さ（配列α及びβがそれぞれ４塩基であってＸ＝０）である。上流側隣接配列及び下流側隣接配列は、最短でそれぞれ２塩基の長さであるが、好ましくはそれぞれ６塩基以上の長さである。したがって、本発明の核酸の回文配列の全長は、最短で１２塩基の長さであるが、好ましくは２８塩基以上であり、たとえば２８〜１２４塩基の長さであり、さらに好ましくは３６〜１００塩基の長さである。あるいは、本発明の核酸の回文配列に含まれる塩基対の数については、最低３塩基対であるが、好ましくは７塩基対以上であり、たとえば７〜６２塩基対であり、さらに好ましくは１８塩基対以上であり、たとえば１８〜５０塩基対である。あるいは、回文配列中の全塩基数から配列Ｘの塩基数を引いた残りの数の半数のうち、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、それよりさらに好ましくは７０％以上が塩基対を形成する。【００３５】
本発明の核酸は、上記のような配列を有する限りにおいて、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。また、本発明の核酸において、後述するレトロウイルス組込み標的活性が損なわれない限りにおいて、特に示さない限り、各塩基は、塩基類似体であってもよく、塩基の修飾体であってもよく、また、核酸自体が修飾又は改変されていてもよい。これらの塩基又は核酸の類似体、修飾、改変は当該技術分野で公知である。【００３６】
なお、本発明の核酸は、上述のような配列を有することによって、ヘアピン又はヘアピンループ構造をとり得ることが認められればよく、ある特定の条件下で実際にヘアピン又はヘアピンループ構造をとるか否かを問わない。本発明の核酸に関して、計算上、ヘアピン構造を形成する際の自由エネルギー変化は、負値で、絶対値が大きい方が好ましい。本発明の核酸は、ヘアピン構造を形成した場合、計算上、二本鎖についてΔＧ＝−５．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の自由エネルギーを有することが好ましい。この自由エネルギー変化は、より好ましくはΔＧ＝−８．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、さらに好ましくはΔＧ＝−１２．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、最も好ましくはΔＧ＝−１５．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である。なかでも特に、ΔＧ＝−１８．０〜−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌが好都合である。なお、自由エネルギーの計算は、Santa Lucia John Jr.(1998), “A unified view of polymer, dumbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics”(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1460-65)に基づき、Michael Zuker (2003), “Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction”(Nucleic Acids Res. 31(13), 3406-15)にしたがって行うことができる。【００３７】
本発明の核酸のモチーフ配列の具体的な一例は、配列番号１に記載されている配列（５’−ＣＡＣＴＧＡＣＡＴＴＡＴＣＡＣＡ−３’）である。ここで、下線部は配列α及びβに相当する。【００３８】
また、配列α及びβを２組有するモチーフ配列の一例は、配列番号２に記載されている配列（５’−ＣＡＧＴＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＴＡＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡＣＴ−３’）である。下線部は、５’側から順に式（１）のα１、α２、β２、β１にそれぞれ相当する。配列番号２記載の配列においては、塩基番号１１〜１２の「ＴＧ」と塩基番号２０〜２１の「ＣＡ」及び塩基番号２〜５の「ＡＧＴＧ」と塩基番号２７〜３０の「ＣＡＣＴ」が、それぞれ回文配列になっており、潜在的に、塩基対を形成してヘアピン構造のステム部分を形成し得る。【００３９】
また、配列番号２記載のモチーフ配列を含む本発明の核酸の回文配列の一例は、配列番号３に記載されている配列（５’−ＧＣＴＣＡＣＧＣＡＧＴＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＴＡＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡＣＴＣＧＧＡＧＣ−３’）である。この配列を有する核酸が潜在的に形成するヘアピン構造を、図１に示す。【００４０】
配列番号５に記載されている配列（５’−ＣＧＣＡＧＴＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＴＡＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧ−３’）は、式（１）の配列α及びβを２組有するモチーフ配列を含む回文配列の別の例である。下線部は、上記と同様に５’側から順に式（１）のα１、α２、β２、β１にそれぞれ相当する。【００４１】
配列番号７に記載されている配列（５’−ＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＴＡＴＣＡＣＡＣＴ−３’）は、配列番号１記載のα−Ｘ−βモチーフ配列を含むが、上流側隣接配列が１塩基（Ａ）、下流側隣接配列が２塩基（ＣＴ）であり、隣接配列間に形成される塩基対が１対のみとなる例である。【００４２】
これらは、GENBANKの登録番号ＡＦ０４９１０４（Mus musculus signal transducer and transcription activator 5a (Stat5a) gene, partial cds.）の塩基番号４４２０〜４５２０に相当する配列に基づいて設計された配列である。【００４３】
本発明の回文配列を有する核酸の配列は、上記のように天然に存在する配列そのもの又はそれに基づいて改変された人工的な配列のいずれでもよく、さらには完全に人工的に設計された配列であってもよい。たとえば、配列番号９に記載されている配列（５’−ＣＡＣＡＧＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＴＴＡＴＣＡＣＡＧＴＧＣＡＣＡＧＴＧ−３’）は、人工的に作製した、式（１）の配列α及びβを２組有するモチーフ配列の例である。下線部は、ＲＳＳエレメントの７塩基を２回反復した配列であり、５’側から順に式（１）のα１及びα２、β２及びβ１にそれぞれ相当する。【００４４】
配列番号１０に記載されている配列（５’−ＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＴＴＡＴＣＡＣＡＧＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＡＧＣ−３’）は、配列番号９記載のモチーフ配列を含み、それぞれ４塩基からなる上流及び下流隣接配列が４個の塩基対を形成し得る、回文配列のさらに別の例である。【００４５】
これらの人工配列は、天然配列に基づく配列と同等又はそれ以上の効率でレトロウイルス組込み標的活性を有する。【００４６】
なお、配列番号４、配列番号６、配列番号８、及び配列番号１１に記載されている配列は、それぞれ配列番号３、配列番号５、配列番号７及び配列番号１０に記載されている回文配列を含む（実施例において使用した、）インサートの全長の配列である（図４参照）。【００４７】
配列番号１、２、及び９のいずれか１に記載のモチーフ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る配列であって、式（１）の条件を満たすものもまた、本発明の核酸のモチーフ配列の例である。同様に、配列番号３、５、及び１０のいずれか１に記載の回文配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る配列であって、上述の回文配列の条件を満たすものもまた、本発明の核酸の回文配列の例である。ここで、ストリンジェントな条件下とは、５５℃、０．１×ＳＳＣ緩衝液中である。【００４８】
本発明の核酸は、当該技術分野で公知の化学的又は生化学的な方法によって合成することができる。たとえば、ＤＮＡ合成機による直接合成、ＰＣＲ法、及び／又はクローニングベクターを使用する方法等を、適宜単独で又は組み合わせて用いることができる。【００４９】
本発明の核酸は、インテグラーゼと結合してレトロウイルスゲノムの組込みを阻害することができる。インテグラーゼとの結合の有無、組込み標的活性の有無は、後述する方法によって確認することができる。たとえば、配列番号４の配列を有する本発明の核酸は、後述する方法によって試験した場合、約８０％以上の効率で組込みが起こる。また、同じ配列を改変し、モチーフ配列中のＴＧ及び／又はＣＡを取り除いたものを同様にして試験すると、この配列へのウイルス遺伝子組込み効率は１０％以下に低下することがわかっている。【００５０】
本発明の核酸のレトロウイルス組込み標的活性（組込み効率）は、後述の方法によって少なくとも１０個のクローンを調べた場合、好ましくは４０％以上（すなわち４個以上のクローンにおいて組込みが起こる）、さらに好ましくは５０％以上、それよりさらに好ましくは６０％以上であり、最も好ましくは７０％以上である。【００５１】
本発明の核酸は、ベクターに含有されていることができる。ベクターは、たとえば、本発明の核酸を目的（大量発現、医療用等）に応じて選択した市販のクローニングベクターのクローニング部位に組み込むことによって作製することができる。このようなベクターの設計・構築は、当業者には公知である。【００５２】
抗ウイルス剤
本発明の核酸は、レトロウイルスに起因する疾患の予防又は治療のために、それ自体で又は他の成分と一緒にして、抗ウイルス剤、特に、デコイ型医薬又はアンチセンス医薬として使用することができる。【００５３】
ここで、「デコイ」又は「デコイ型医薬」とは、インテグラーゼが結合しうる染色体上の部位と同一又は類似の配列を有する核酸を指す。同一の配列を有するデコイとしては、本発明の核酸からなるものが挙げられる。また、類似の配列を有するデコイとしては、モチーフ配列中の配列α及び／又はβのいずれか１塩基を置換してその置換された塩基がその周辺配列と新たな塩基対を作らないようにしたものが挙げられ、好ましくは、ＴＧ又はＧＴのＧをＡ又はＴに置換したもの及びＣＡ又はＡＣのＣをＡ又はＴに置換したものである。【００５４】
デコイは、投与された場合、インテグラーゼとの結合に関して染色体上の部位と競合して、インテグラーゼと結合し、その結果、染色体上へのインテグラーゼの結合を阻害し、レトロウイルスの組込みを阻害することができる。【００５５】
本発明の抗ウイルス剤は、少なくとも１つの本発明の核酸又は本発明の核酸を含むベクターと、薬学的に許容されうるキャリアとを含む。本発明の核酸がベクターの形態で使用される場合、本発明の核酸が挿入されるクローニング部位の５’側（Ａ）と３’側（Ｂ）とが実質的に逆方向相補的であるもの、たとえばベクターのクローニング部位が５’−ＧＡＡＮＮＮＣＣＴＴＡＡＧＧＮＮＮＴＴＣ−３’のようになっており、ＴＴＡＡのＴとＡとの間に本発明の核酸がクローニングされ、その両側のＮＮＮ同士が相補的であるようなものは、クローニング部位自身が回文配列の一部として潜在的なヘアピン構造のステムを構成するので好ましい。薬学的に許容されうるキャリアとしては、たとえば生理食塩水、水、緩衝液、デキストロース等が挙げられる。【００５６】
本発明の抗ウイルス剤は、さらに、当該技術分野で公知の他の成分、たとえば安定剤、賦形剤、希釈剤、担体等の成分、及び他の抗ウイルス性薬剤をも含むことができる。【００５７】
本発明の抗ウイルス剤は、経口又は非経口経路で投与することができる。具体的には、経口、皮下、筋内、静脈内、腹腔内、経皮、経粘膜等の経路が挙げられるが、これらに限定されない。【００５８】
本発明の抗ウイルス剤は、投与経路に応じて製剤の技術分野で公知の任意の剤型に処方されることができる。たとえば、錠剤、カプセル、顆粒、シロップ、液体、懸濁液、ゲル、リポソーム等の形態が挙げられるが、これらに限定されない。これらの製剤は、当該分野で公知の方法によって製造することができる。【００５９】
本発明の抗ウイルス剤は、本発明の核酸を、その医学的な目的を達成するのに有効な量（薬学的有効量）で含む。一般的には、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ程度であるが、具体的な量は、適当な動物モデル等を使用して公知の方法によって決定される。【００６０】
正確な用量及び投与スケジュールは、投与対象の個体の状況（たとえば、年齢、体重、性別、感染又は疾患の程度等）、組み合わせて投与される他の薬剤又は治療法、特定の製剤の体内持続時間等に応じて、個別に決定される。【００６１】
本発明の核酸は、各種のレトロウイルスの基本的な性格を利用する一般的な作用機序によって作用するため、本質的にあらゆるレトロウイルスに対して同等に作用する。特に、哺乳類、たとえばマウス、ネコ、サル、ヒト、ウシ、ブタ等を宿主とするレトロウイルス、たとえばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）、成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ヘアリー細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−II）、ヒト以外の動物の白血病ウイルス、肉腫ウイルス、乳癌ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ビスナウイルス、ウマ伝染性貧血症ウイルス、フォーミーウイルス等に対して有効である。【００６２】
レトロウイルス組込み標的活性の試験方法
本発明の方法は、少なくとも、（１）レトロウイルスゲノムＬＴＲ配列の５’側末端及び３’側末端にそれぞれ由来する、突出末端を有する二本鎖核酸又はそれらを形成し得る一本鎖核酸と、インテグラーゼと、被検対象の標的配列を含む環状核酸前記標的配列を含む環状核酸とを、共存させ、（２）前記標的配列中への前記レトロウイルスゲノム由来配列の組込みの有無を検出する工程、を含む。【００６３】
本発明の方法において、標的配列は、環状の形態であり、好ましくは適切なベクターに連結されている。また、標的配列は、好ましくは１００塩基対以上の長さを有する。従来の組込みアッセイにおいては通常２０〜３０塩基対の長さの線状オリゴヌクレオチドが標的配列として使用されていたが、本発明の方法においては、予め環状形態の標的配列を使用することにより、しかも比較的長い標的配列を使用することによって、標的配列の自己環状化が防止され、標的配列とインテグラーゼとの結合の有無をより明確に判定することができる。【００６４】
本発明の方法においては、基質核酸として、レトロウイルスゲノムＬＴＲ配列の５’側末端由来の核酸と３’側末端由来の核酸との両方を使用する。従来の方法においては、５’側又は３’側のいずれか一方が使用されていたが、本発明のように両方を使用することによって、基質核酸の２種類の二本鎖に含まれる４本の一本鎖と、インテグラーゼとの間でインテグラーゼの２量体又は４量体が形成され、組込み反応に有利になり、組込み反応の検出感度が向上する。【００６５】
また、前記（１）の工程において、好ましくは、レトロウイルスゲノムＬＴＲ配列の５’側末端由来の核酸と３’側末端由来の核酸とは、同時に他の反応成分と一緒にされる。また、この工程は、さらに、（ａ）レトロウイルスゲノムＬＴＲ配列の５’側末端由来の核酸と３’側末端由来の核酸とをインテグラーゼと一緒にして、予め基質核酸とインテグラーゼとの複合体を形成させる工程、及び（ｂ）前記複合体を、標的配列を含む環状核酸と一緒にする工程、のように二段階で行うことができる。たとえば、前記（１）の工程を、レトロウイルスゲノムＬＴＲ配列の５’側末端由来の核酸と３’側末端由来の核酸とを、それぞれ個別にインテグラーゼと反応させて、予めインテグラーゼ複合体を形成させ、その後、この複合体を同時に前記環状核酸と一緒にして反応させることによって行うことができる。このように先にインテグラーゼ−基質核酸複合体を形成させると、組込みが起こりやすい条件となり、頻度の低い組込みの検出感度が向上する。【００６６】
ＬＴＲ由来の核酸は、好ましくは、それぞれ５０塩基以上、より好ましくはそれぞれ６０塩基以上、たとえば５０〜１００塩基の長さを有する。【００６７】
また、標的配列は、好ましくは、１００塩基対以上の長さを有する。なお、標的配列を含む環状核酸が、標的配列がクローニングベクターのクローニング部位に挿入された形態のものであり、そのクローニング部位がヘアピン構造のステム部分を形成しうる配列を有する場合は、標的配列は、それより１０〜２０塩基対程度短くてもよく、８０塩基対以上であればよい。したがって、標的配列の長さは、一般的には８０塩基対以上が好ましく、より好ましくは１００〜４００塩基対、さらに好ましくは１５０〜４００塩基対、最も好ましくは２００〜４００塩基対である。【００６８】
基質核酸の末端は、好ましくは、（＋）鎖及び／（−）鎖の５’の２塩基が突出している。たとえば、ＭｕＬＶの場合は５’−ＡＡ、ＨＩＶの場合は５’−ＡＣが突出していることが好ましい。さらに好ましくは各一本鎖核酸について、突出している２塩基に続いてＴＧがあり、３’末端がＣＡである。【００６９】
組込みの有無の検出は、当該技術分野で公知のいずれの方法によって行ってもよい。一般的には、ＰＣＲ法等によって核酸を増幅し、続いてその反応産物の配列解析を行って挿入の有無及び挿入部位を特定する。【００７０】
図２に、本発明の方法の一態様の概略を示す。ここでは、３’ＬＴＲ由来及び５’ＬＴＲ由来の各一本鎖核酸４種類をインテグラーゼと一緒にして予め基質核酸とインテグラーゼとの複合体（インテグラーゼコンプレックス中間体）を形成させ、次にこれを標的配列（「ｓｔａｔ５ａ  ＤＮＡ」）を含むベクターと一緒にしている。ここで標的配列のヘアピン形成が起こり、基質核酸が標的配列中に挿入される。その後、標的配列近傍又は基質配列内の配列を有するプライマーを用いて標的配列部分をＰＣＲ増幅することによって挿入の有無を検出する。
【実施例】
【００７１】
以下において、本発明を具体的な特定の実施例によってさらに詳しく説明する。【００７２】
１．ＭｕＬＶ（マウス白血病ウイルス；ＡＫＶ−１）インテグラーゼを用いたレトロウイルス組込み標的活性の試験
１）標的ＤＮＡの調製
GENEBANK登録番号ＡＦ０４９１０４のネズミ転写因子ｓｔａｔ５ａ遺伝子塩基配列の一部（配列番号１２の塩基番号３１〜８２）を、ＴＯＰＯ−ｐＣＲ２．１ベクター（インビトロゲン社、カリフォルニア、製品番号４５−０６４１）にサブクローニングし、Ｓｖｉ１と名付けた。さらに、インサート中のｓｔａｔ５ａ遺伝子の塩基配列を改変（配列番号１２の塩基番号５２に位置するＣをＧに変えたこと以外は同一のものを作製し、ＭｕｔＳｖｉ−１と名付けた。同様に、同じＣをＡに変えたものを作製し、ＭｕｔＳｖｉ−２と名付けた。これらを標的ＤＮＡとして用いた。【００７３】
２）組換え体インテグラーゼの調製
ＭｕＬＶインテグラーゼを発現するベクターは、ＡＫＶ−１のインテグラーゼ遺伝子（配列番号１３；GENBANK, MLOCG [JO1998] AKV murine leukemia virus, complete proviral genome., murine leukemia virusの塩基番号４６２６〜５８４０に相当）を、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ  ベクター（Invitrogen社、Version G、カタログ番号K4400-40）と連結して作製した。【００７４】
得られたベクターを１ｍＭ  ＩＰＴＧの存在下において大腸菌内で３７℃で５時間培養することによって発現させ、培養液中からＭｕＬＶインテグラーゼを回収し、ＰｒｏＢｏｎｄカラム（Invitrogen社）を製品添付のマニュアルにしたがって使用して精製した。【００７５】
３）レトロウイルスゲノム末端とインテグラーゼとの結合
７５ｎｇのＡＫＶ−１のＵ５ＬＴＲ由来ＤＮＡ〔配列番号１４；（＋）ＴＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＡＡＧＧＣＴＴＡＧＣＣＡＧＣＴＡＡＣ  ＴＧＣＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＴＴＴＴＧＣＡＡＧＧＣＡＴＧＧＧＡＡＡＡＴＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧＡ及び配列番号１５；（−）ＡＡＴＣＡＧＣＴＣＴＧＧＴＡＴＴＴＴＣＣＣＡＴＧＣＣＴＴＧＣＡＡＡＡＴＧＧＣＧＴＴＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＣＴＧＧＣＴ  ＡＡＧＣＣＴＴＡＴＧＡＡＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＡ〕を、１０ｍＬの反応緩衝液（２５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、９％（Ｖ／Ｖ）グリセロール、８０ｍＭ  グルタミン酸カリウム・グルタミン酸塩、１０ｍＭ  メルカプトエタノール、１０％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＳＯ、３５ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２））中で５００ｎｇの組換え体ＭｕＬＶ−１インテグラーゼと、３０℃で１時間インキュベートした。上記のＡＫＶ−１のＵ５由来ＤＮＡは、二本鎖の状態で（−）鎖側の５’末端においてＡＡの２塩基が突出する（あるいは（＋）鎖側が２塩基分短い）。【００７６】
同様に、７５ｎｇのＡＫＶ−１のＵ３ＬＴＲ由来ＤＮＡ〔配列番号１６；（＋）ＡＡＡＴＣＧＴＧＧＴＣＴＣＧＣＴＧＡＴＣＣＴＴＧＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＴＧＡＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＡ及び配列番号１７；（−）ＴＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＣＡＡＴＣＡＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＣＣＴＣＣＣＡＡＧＧＡＴＣＡＧＣＧＡＧＡＣＣＡＣＧＡＴ〕を、組換え体ＭｕＬＶ−インテグラーゼと、３０℃で１時間インキュベートした。上記のＡＫＶ−１のＵ３由来ＤＮＡは、二本鎖の状態で（＋）鎖側の５’末端においてＡＡの２塩基が突出する（あるいは（−）鎖側が２塩基分短い）。【００７７】
４）標的ＤＮＡとレトロウイルスゲノム末端／インテグラーゼ複合体との反応
前記３）で用意したＵ５ＬＴＲ／インテグラーゼ複合体及びＵ３ＬＴＲ／インテグラーゼ複合体を、前記１）で用意した２００ｎｇの各標的ＤＮＡと一緒にし、３０℃で１時間、インキュベートした。【００７８】
５）ウイルス−標的ＤＮＡ挿入部位のＰＣＲ増幅
インキュベーション終了後、前記の反応物（５μＬ）のＰＣＲ増幅を、ＡＫＶ−１のＵ３ＬＴＲゲノムプライマー「ＭｕＬＶ  Ｕ３−Ｓｔａｔ５ａ１Ｆ」（フォワード）（配列番号１８；ＴＣＣ  ＴＣＣＧＡＴＡＧＡ  ＣＴＧＡＧＴ  ＣＧ）、「ＭｕＬＶ  Ｕ３−Ｓｔａｔ５ａ２Ｆ」（ネステッドフォワード）（配列番号１９；ＴＴＣＡＴＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡＣＴＣ  ＧＧ）；Ｕ５ＬＴＲプライマー「ＭｕＬＶ  Ｕ５−Ｓｔａｔ５ａ１Ｆ」（フォワード）（配列番号２０；ＴＴＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＣＴＡＧＧ）、「ＭｕＬＶ  Ｕ５−Ｓｔａｔ５ａ２Ｆ」（フォワード）（配列番号２１；ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ）のいずれか１つと、ＴＯＰＯベクタープライマー（リバース）（配列番号２２；ＣＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧ）とを用いて行った。【００７９】
温度サイクルは、９４℃、２分を１回の後、９５℃、４０秒；５８℃、４０秒；７２℃、１分を３５サイクル行い、最後に７２℃、５分のインキュベーションを１回、であった。【００８０】
６）塩基配列解析
前記の工程で得られたＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ−ｐＣＲ２．１ベクターにサブクローニングし、塩基配列分析を行った。【００８１】
結果を図３に示す。上（Ａ）のＤＮＡの配列は、Ｓｖｉ１の組込み部位を含む配列を示し、下（Ｂ）のＤＮＡの配列はＭｕｔＳｖｉ−２の配列を示す。下のＤＮＡの配列の下線部が置換された部分を示す。図３において、各矢印の基部は組込み部位を示す。矢印の向きはウイルスゲノムの転写方向を表し、右向きのときは転写方向が標的配列（Ｓｔａｔ５ａ）のそれと一致し、左向きのときは逆方向である。また、「Ｘ」の後の数字はその位置に組込みが確認されたクローンの数を表す。【００８２】
Ｓｖｉ１を標的として用いた場合（図３、（Ａ）、「ＭｕＬＶ  ＩＮ」）、調べたクローンの９０％以上で挿入が起こっており、その挿入部位はランダムではなく、特定箇所（「４４６８」及び「４４７２」と記した位置）に高頻度に入っていることがわかった。一方、ＭｕｔＳｖｉ−２（図３、（Ｂ）、「ＭｕＬＶ  ＩＮ」）を標的として用いた場合は、変異を導入した部分には挿入がほとんど起こっていなかった。ＭｕｔＳｖｉ−１についても同様の結果が得られた（ＭｕｔＳｖｉ−１のデータは示していない）。
２．ＨＩＶ−１インテグラーゼを用いたレトロウイルス組込み標的活性の試験
１）標的ＤＮＡ及び組換え体インテグラーゼ
標的ＤＮＡとしては、上述のＭｕＬＶインテグラーゼを用いる場合と同じものを用いた。組換え体ＨＩＶ−１インテグラーゼとしては、市販のものを使用した（米国US Biological社、カタログ番号：H6003-15、「HIV-1 pol p31, Met 737-1003, SF-2, Recombinant (Integrase, Human）」）。【００８３】
２）レトロウイルスゲノム末端とインテグラーゼとの結合
７５ｎｇのＨＩＶ−１のＵ５ＬＴＲ由来ＤＮＡ〔配列番号２３；（＋）ＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧＴＡＡＣＴＡＧＡＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＣＣＴＴＴＴＴＧＧＴＡＧＴＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＴＣＴＡＧＣＡＣ、及び配列番号２４；（−）ＡＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＡＣＴＡＣＣＡＡＡＡＡＧＧＧＴＣＴＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＴＡＧＴＴＡＣＣＡＧＡＧＴＣＡＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＧＧＧＣＡＣＡＣ〕を、５００ｎｇの組換え体ＨＩＶ−１インテグラーゼとともに１０ｍＬの反応緩衝液中で３０℃で１時間インキュベートした。【００８４】
同様に、７５ｇのＨＩＶ−１のＵ３ＬＴＲ由来ＤＮＡ〔配列番号２５；（＋）ＡＣＴＧＧＡＡＧＧＧＴＴＡＡＴＴＴＡＣＴＣＣＡＡＧＣＡＡＡＧＧＣＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＴＧＡＴＴＴＧＴＧＧＧＴＣＴＡＴＡＡＣＡＣＡＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＴＣＣＣＡＧ、及び配列番号２６；（−）ＣＴＧＧＧＡＡＧＴＡＧＣＣＴＴＧＴＧＴＧＴＴＡＴＡＧＡＣＣＣＡＣＡＡＡＴＣＡＡＧＧＡＴＡＴＣＴＴＧＣＣＴＴＴＧＣＴＴＧＧＡ  ＧＴＡＡＡＴＴＡＡＣ  ＣＣＴＴＣＣＡ〕を、組換え体ＨＩＶ−１インテグラーゼと、３０℃で１時間インキュベートした。なお、塩基配列は、南アフリカからの９９ＺＡＣＭ９（GENEBANK Accession番号  ＡＦ４１１９６７）による。【００８５】
３）標的ＤＮＡとレトロウイルスゲノム末端／インテグラーゼ複合体との反応
前記２）で用意したＵ５ＬＴＲ／インテグラーゼ複合体及びＵ３ＬＴＲ／インテグラーゼ複合体を、前記１）で用意した２００ｎｇの各標的ＤＮＡと一緒にし、３０℃で１時間、インキュベートした。【００８６】
４）ウイルス−標的ＤＮＡ挿入部位のＰＣＲ増幅
インキュベーション終了後、前記の反応物（５μＬ）を、前記ＭｕＬＶの場合と同様に増幅した。用いたプライマーは、ＨＩＶ−１のＵ５ＬＴＲゲノムプライマー「ＨＩＶ−１  Ｕ５ＬＴＲ」（リバース）（配列番号２７；ＣＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧ）、ＨＩＶ−１のＵ３ＬＴＲゲノムプライマー「ＨＩＶ−１  Ｕ３ＬＴＲ」（リバース）（配列番号２８；ＧＧＧＡＡＧＴＡＧＣＣＴＴＧＴＧＴＧＴＴＡＴＡＧ）、「ＨＩＶ−Ｓｔａｔ５ａ１Ｆ」（フォワード）（配列番号２９；ＴＴＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＣＴＡＧＧ、「ＨＩＶ−Ｓｔａｔ５ａ２Ｆ」（フォワード）（配列番号３０；ＣＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ）のいずれか１つと、ＴＯＰＯベクタープライマーとのプライマーセットであった。【００８７】
６）塩基配列解析
前記の工程で得られたＰＣＲ産物を、前記のＭｕＬＶの場合と同様にＴＯＰＯ−ｐＣＲ２．１ベクターにサブクローニングし、塩基配列分析を行った。【００８８】
結果を図３の「ＨＩＶ−１  ＩＮ」に示す。ＭｕＬＶの場合と同様、ＨＩＶ−１についても特定の位置に高頻度の組込みが起こり、モチーフ配列中の塩基を改変すると組込み頻度が劇的に低下する結果が得られた。【００８９】
３．各種配列のレトロウイルス組込み標的活性の測定
図４に示す（ａ）〜（ｄ）の配列を有するインサートを、上記の試験と同様にＴＯＰＯ−ｐＣＲ２．１ベクターにサブクローニングして得た環状ＤＮＡを標的ＤＮＡとして用いて、上記でＭｕＬＶについて記載したのと同じ方法でＭｕＬＶインテグラーゼ又はＨＩＶインテグラーゼを用いて標的核酸中への組込みの頻度を調べた。それぞれについてランダムに選んだ２０個のクローンの塩基配列を解析した。【００９０】
（ａ）〜（ｄ）の配列は、それぞれ配列番号４、６、８、１１に記載されている。これらの配列は、いずれも本発明の回文配列を含んでいるが、（ｃ）の配列は上流及び下流隣接配列が短く、（ｃ）の配列を有する核酸は、本発明の核酸の条件を満たさない比較例である。【００９１】
結果を図５に示す。（ａ）、（ｂ）又は（ｄ）の配列を有する核酸を標的核酸として用いた場合は、配列を調べたクローンの少なくとも７０％以上において組込みが起こっていた。一方、（ｃ）の配列を有する核酸を標的核酸として用いた場合は組込みが起こったクローンが低頻度でしか見られなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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