(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質アレイを製造する方法であって、
(a)無細胞系によって転写及び翻訳できる配列と、コードされたタンパク質、ドメイン又はペプチドを表面又はビーズに共有又は非共有結合で付着できる配列とを含むDNA構造物を調製し、
(b)前記DNA構造物を、前記タンパク質を固定化するためのリガンド又は試薬を担持するウエル中に、表面上に、又はビーズの存在下で、グリッドの形に分布させ、
(c)前記DNAを、無細胞系を使用して、グリッドの形で転写及び翻訳し、及び
(d)前記タンパク質、ドメイン又はペプチドが生成するに従って、生成されたタンパク質、ドメイン又はペプチドが、前記ウエル、表面又はビーズに付着して、タンパク質アレイを作る、
ことを特徴とする、方法。
【請求項２】
タンパク質アレイを製造する方法であって、
(a)無細胞系によって転写及び翻訳できる配列と、コードされたタンパク質、ドメイン又はペプチドを、表面又はビーズに共有又は非共有結合で付着できる配列とを含むDNA構造物を調製し、
(b)前記DNAを、グリッドの形に配置し、かつタンパク質を固定化するためのリガンド又は試薬を担持するウエル中に、表面又はビーズ上に共有又は非共有結合のいずれかで固定化し、
(c)前記DNAを、無細胞系を使用して、グリッドの形で転写又は翻訳し、及び
(d)前記タンパク質、ドメイン又はペプチドが生成するに従って、生成されたタンパク質、ドメイン又はペプチドが、前記ウエル、表面又はビーズに付着して、タンパク質アレイを作る、
ことを特徴とする、方法。
【請求項３】
前記DNAを、まず、mRNAに転写し、次に、該mRNAを、別の反応で翻訳する、請求項１又は２記載のタンパク質アレイを製造する方法。
【請求項４】
前記無細胞系が、DNAの連結した転写及び翻訳を実施でき、又は別々のDNAの転写及びmRNAの翻訳ができ、かつ、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽、酵母、細菌又は他の真核若しくは原核細胞起源である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質、ドメイン又はペプチドが、ニッケルなどの金属イオンとの相互作用によって固定化されるための一対のヘキサヒスチジンを含み、かつ該一対のヘキサヒスチジンの２つのヘキサヒスチジン配列が、アミノ酸スペーサー配列によって分けられている請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記アミノ酸スペーサー配列が、１１アミノ酸の長さである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記アミノ酸スペーサー配列によって分けられた一対のヘキサヒスチジン配列が、アミノ酸配列(his)6-SRAWRHPQFGG-(his)6［配列ID番号２］を有する、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
前記DNA又はmRNA分子が、表面又はビーズに共有又は非共有結合され、前記個々のタンパク質が生成されるに従って前記表面又はビーズに付着するように、前記表面又はビーズが、前記タンパク質の固定化のためのリガンド又は試薬を担持する、請求項５〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
適切なプライマー配列を含有する結果、原核及び真核無細胞系のいずれか又は両方で発現され得るDNA構造物から作られた、請求項５〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質アレイが、DNAの連結した転写及び翻訳を実施でき、又は別々のDNAの転写及びmRNAの翻訳ができ、かつウサギ網状赤血球、コムギ胚芽、酵母、細菌又は他の真核若しくは原核細胞起源である無細胞系を使用して形成される、請求項５〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
DNAの連結された転写／翻訳、又は別個のmRNAの翻訳が、マイクロウエル内で、又はガラス、ニトロセルロース若しくは他の膜の表面上で、又は他の支持媒体で、又はビーズ存在下で行われる、請求項５〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記配列されたタンパク質が、一本鎖抗体フラグメントである、請求項５〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記配列されたタンパク質が、タンパク質の天然の機能を保持し、かつ示す、請求項５〜１２のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【背景】
アレイは、成分の正確な規則正しい配置であり、成分をディスプレイし、同時に試験することを可能にする(1)。アレイは、通常、一般のグリッドの形態に配置された一連の個々の種の分子又は粒子を含む。アレイは、認識と選択に基づいて、アレイに適用される第二の一連の分子又は粒子を用いて、相互作用を検出するのに使用できる。アレイは、複数のサンプルの取り扱いと研究に利点を有する。アレイは、各成分に固定した位置を提供し、例えば、アッセイでのスコア陽性が直ちに特定される。アレイは、広範囲でかつ高密度の容量を有する。アレイは少量の試薬を使う高速処理の自動装置手順によりアレイが作られ、選別される。また、アレイは、多くの同じアッセイの結果を用いて各アッセイ値の比較をすることができる。アレイの形は、核酸の全体的な分析で十分に確立されており、オリゴヌクレオチド及びｃDNAアレイ（DNAチップ）が、遺伝子発現分析に使用される。よく知られている形では、大きな数（例えば数千）のDNAハイブリダイゼーションプローブが、ナイロン、ガラス又はシリコン等の表面に規則正しいパターンで付着され、蛍光性標識された全体細胞のmRNA又はcDNAにハイブリダイズされる。各アレイ成分の定量的なシグナルが読み取り装置によって同時に測定される。
【０００２】
また、アレイのアプローチによって、ペプチド及びタンパク質のディスプレイを適合させることができる。ディスプレイされる成分は、一連の関連するタンパク質又はペプチド、又は生物の全タンパク質補体であってもよい。タンパク質アレイの技術は、遺伝子発現及び分子相互作用の高速処理スクリーニングを可能にする。タンパク質のＤＮＡ配列によってのみ既に公知である数千のタンパク質の機能を同時に試験するのに、タンパク質アレイを使用することができる。機能情報を得るためには、配列したタンパク質は天然の形でなければならない。しかしながら、幾つかの調製方法は、タンパク質変性を起こし、細菌からのリコンビナントタンパク質の抽出又は放出中に起こることがあり、従って、例えば出発材料からのアレイの使用は、三次構造よりも一次配列のタンパク質によってのみ決定される適用に制限される。機能情報を得られる全体的なタンパク質分析に対する高速処理アプローチを開発するために、タンパク質がその機能を保持したアレイを製造する方法が要求される。固定化されたタンパク質アレイを、結合反応を示すのに使用でき、アレイが直接又は間接的に標識された抗体又はリガンドのような存在に暴露され、アレイの特定のセグメントにラベルが局在することによって結合が示される。また、アレイの結合の相互作用を同定するのに、質量分析法を使用することができる。それとは別に、配列されるタンパク質が溶液中に存在してもよく、生物化学的機能を研究するのに使用することができる。文献（１〜１２）で議論されているタンパク質アレイの潜在的な使用には、抗体の同定及び抗体特異性の分析、全体的なタンパク質発現の測定、リガンド受容体相互作用及びタンパク質―タンパク質の相互作用の同定、及びライブラリーからのタンパク質又はリガンドのスクリーニング及び選択が挙げられる。（ｉ）発現プロファイリング。提案されているタンパク質アレイの１つのタイプは、表面での抗体の固定化に基づく（抗体アレイ）。原則として、抗体アレイと細胞タンパク質との反応によって、特定の時間で発現するタンパク質をすべて全体的に定量的に読み出しする装置を提供できる（プロテオーム分析）。あるバージョンでは、ディファレンシャルディスプレイのために、２つの異なる細胞状態から蛍光性に標識したタンパク質で、アレイを調べた。細胞ライセートを異なる蛍光物で標識して、色が変化の読み出しとして働くように多量に混ぜる。(ii)抗体検出。第二の適用は、細胞タンパク質に対する抗体の検出であり、パートナーのいずれか又は両方が知られていない。従って、細胞タンパク質のアレイは、可溶性抗体のライブラリー、又はファージディスプレイ又はリボソームディスプレイライブラリーから抗体を選択するのに使用できる。また、抗原アレイは、感染中又は自己免疫状態である、患者血清の少量中の抗体の分析に使用できる。(iii)リガンドスクリーニング。レセプターのような潜在的ターゲットタンパク質アレイは、小さい分子、ペプチド、アプタマー、核酸又は合成骨格等の、可能性のある薬物候補かもしれないリガンドの選択のためのふるいとして使用できる。(iv)タンパク質―タンパク質相互作用の検出。タンパク質アレイにおける更なる使用は、タンパク質―タン��ク質相互作用の検出である。ゲノムの各タンパク質は、多くのパートナーと相互作用することができ、そのためヒトゲノムでコードされるおおよそ100,000のタンパク質において、数百万の相互作用が存在するであろう。このような相互作用は、しばしば、酵母two-hybrid（細胞ベース）法で測定されるが、隠れたタンパク質、ジスルフィド架橋を持つタンパク質及びレセプターのような膜結合タンパク質を含む相互作用を測定することができないであろう。アレイ法は、このような場合に高く望まれ、細胞の方法では検出されない相互作用を示すであろう。
【０００３】
タンパク質アレイの調製の文献説明
現在までに述べられているアレイは、精製タンパク質又は生きている細胞又はウイルスで発現されるタンパク質のどちらかで構成される。最初の例は、ペプチドのアレイであり、ペプチドは、固体担体上で化学的に合成され、抗体（２）によって認識されるエピトープを同定するのに使用された。ペプチドアレイは、約３０のアミノ酸の長さまで化学的に合成され得るが、完全長の折りたたまれたタンパク質を生成することはできない。
明らかに、処理したガラススライドや、ニトロセルロース又はPVDFのような吸収性膜等の好適な表面上に予備形成したタンパク質を化学的又は非共有付着することによって、タンパク質アレイを作ることができる。プロテオミクスやライブラリースクリーニングのような高速処理の研究では、多数のタンパク質を同時に調製し、精製し、固定化する方法が要求される。配列された形でアッセイするための、細菌からリコンビナントタンパク質を生産する方法が開示された（３，６−１０）。タンパク質を、アフィニティータグ（例えばヘキサヒスチジン）又はグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST)と融合した構造物として発現し、細胞溶解によって回収して、粗ライセートとして使用するか、又はアフィニティー精製（例えばNi-NTA金属アフィニティーカラム）後使用する。しかしながら、細菌系のリコンビナントタンパク質の生成は、凝集、不溶性封入体及び/又は生成物の分解により、問題があることがあり、一方、真核細胞系では、無菌で又は時間がかかるクローニング手順（例えばバキュロウイルス）で、低い収率及び高い需要を欠点として持つ。変性剤を抽出で使用する場合、タンパク質がしばしば機能しなくなる。タンパク質が一度単離されると、様々な技術フォーマット、基質、精製方法及び検出系が有用になる（８を参照のこと）。
【０００４】
Martzenら(3)は、GSTと融合した異なる酵母ORF（オープンリーディングフレーム）を有するプラスミドをそれぞれ含む６１４４酵母系からのグルタチオンアガロースアフィニティークロマトグラフィーによって、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces  cerevisiae）から可溶性タンパク質の殆どを精製した。タンパク質は、溶解状態で特定の酵素活性をアッセイされた。タンパク質は自然の形で精製されたので、これによって機能的タンパク質アレイを構成したが、タンパク質は表面で固定化されなかった。「生きている」組換えタンパク質アレイをつくるのに酵母細胞が使用され、異なるORF  Gal4-融合タンパク質をそれぞれが発現する約6000コロニーを含んだ(4)。これは、本質的には、９６ウエルプレートフォーマットで行われる細胞の、酵母two-hybridスクリーニングである。
【０００５】
適切なベクター系とタンパク質生成物の高スピード配列で、多数のcDNAクローンの同時発現を誘発することによって、アレイを調製できる。Bussowら(6)は、エシェリチア・コリ（Escherichia coli)でクローニングされたヒト胎児脳cDNA発現ライブラリーhEx1のcDNAクローンから発現されたタンパク質を配列した。his6（ヘキサヒスチジン）−タグタンパク質を、３８４ウエルマイクロタイタープレートで育てた個々のコロニーから誘発して、IPTGで発現誘発する前に、高密度PVDFフィルター膜の上にグリッドした。細菌細胞質からのタンパク質の放出によって、フィルターに固定化されたタンパク質アレイを作った。２例のタンパク質を、抗体を使用してフィルターの上で同定した。この方法は、発現ライブラリーのふるいわけを技術者に可能にしたが、抽出手順は0.5M  NaOHを使用し、その工程中、タンパク質が変性して機能しなくなる。他の報告では（以下に示す）、タンパク質を、変性剤でもある６MグアニジウムHCl（guanidinium  HCl）を使用して抽出及び可溶化した。アレイを作る手段としてのこの手順の他の欠点は、クローンを、フレーム発現において広範囲にふるいわけしなければならないことと、cDNAライブラリーが５’末端（N-末端）を欠く、多くのクローンを含むことであり、一部の遺伝子の複数のコピーと他の遺伝子の劣等表現を有するかもしれない。
【０００６】
Luekingら(9)は、古典的なドットブロッティング方法論を拡大して、hEx1ライブラリーから精製されたタンパク質溶液をPVDFフィルターの上にグリッドにした。高速処理、即ちスモールスケールのタンパク質発現のため、hEx1ライブラリーのクローンを９６ウエルマイクロタイタープレートで育成し、IPTGで誘発した。細胞を、６MグアニジウムHClで溶解し、上清をPBDF膜の上に９６ウエルフィルターを通して濾過した。精製したタンパク質のラージスケール製造のため、ペプチド−及びhis6−タグタンパク質をE.coliから発現し、Ni-NTAアガロースで単離した。高速処理スクリーニングの結果、かなり多くの偽陽性、即ち実際にタグをつけたフレームがない抗タグによって検出されたタンパク質が見られ、抗体特異性スクリーニングは、たいていリボソームタンパク質との、見かけ上の理由によらない、予想外の交差反応をしばしば示した。グアニジウムHClの使用は、タンパク質を変性し、異常な結果を生じさせるかもしれない。
【０００７】
Holtら(7)は、特異性があらかじめ知られていない１２種のウエル発現した抗体フラグメントを使用して、変性タンパク質と反応性の特異的な抗体を同定するのに、hEx1ライブラリーをスクリーニングした。４つの特異的相互作用が確認された。
ドットブロッティングの他の例で、Geは、他のタンパク質、DNA、RNA及び小さいリガンドとのたんぱく質の相互作用を検出するためのアレイシステムを述べた（12)。この場合、４８の高精製で天然のタンパク質を、９６ウエルドットブロット装置を使用するスポッティングによって、ニトロセルロース膜に配列した。タンパク質を細菌又はバキュロウイルスで過剰発現させ、均一に精製した。ドットブロットアレイを、多くの異なる放射標識プローブ（タンパク質、DNA、RNA、リガンド）と反応させ、その後オートラジオグラフィー及び濃度測定することによって、機能的態様、即ちプローブが予想された特異性を持つパートナー分子と相互作用することを示した。
Afanassievら(5)は、顕微鏡スライド上のアガロースフィルムへのタンパク質の化学的カップリングを使用する、タンパク質アレイの製造方法を述べる。アガロースは過ヨウ素酸ナトリウムによって活性化され、タンパク質のアミノ基と結合するアルデヒド基を発生する。様々な量の抗原（BAD)及び抗BAD抗体(6A11)を固定化し、パートナー分子と結合して蛍光第二試薬で検出される。
【０００８】
文献
1. Emili A.Q. 及び Cagney G.(2000) ペプチド又はタンパク質アレイを使ったラージスケール機能分析（Large-scale functional analysis using peptide or protein arrays） Nature Biotechnology 18:393-397.
2. Geysen H.M., Meloen, R.H. 及び Barteling S.J.(1984) 単一アミノ酸の分解に対するエピトープのためにウイルス抗原を試験するペプチド合成の使用（Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid） Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:3998-4002.
3. Martzen M.R., McCraith S.M., Spinelli S.L., Torres F.M., Fields S., Grayhack E.J. 及び Phizicky E.M.(1992) 遺伝子生産物の活性によって遺伝子を同定するための生物化学的ゲノム的アプローチ（A biochemical genomics approach for identifying genes by the activity of their products） Science Nov 5;286(5442):1153-5.
4. Uetz P. ら (2000) サッカロマイセス・セレビシエのタンパク質−タンパク質相互作用の総合的分析（A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae） Nature 403, 623-627.
5. Afanassiev V., Hanemann V. 及び Wolfl, S.(2000) アガロースフィルムでコートしたガラススライドのDNA及びタンパク質マイクロアレイの調製（Preparation of DNA and protein microarrays on glass slides coated with an agarose film） Nucleic Acids Research 28:E66.
6. Bussow K., Cahill D.ら (1998) 全体的なタンパク質発現及び配列したcDNAライブラリーの高密度フィルターでの抗体スクリーニングの方法（A method for global protein expression and antibody screening on high-density filters of an arrayed cDNA library） Nucleic Acids Res. 26:5007-5008.
7. Holt L.J., Bussow K., Walter G 及び Tomlinson I.M.(2000)  追い越す選択：タンパク質アレイを使用する抗体−抗原相互作用のための直接スクリーニング（By-passing selection: direct screening for antibody-antigen interactions using protein arrays. Nucleic Acids Research 28:e72.
8. Walter G., Bussow K., Cahill D., Lueking A. 及び Lehrach H. (2000) 遺伝子発現及び分子相互作用スクリーニングのためのタンパク質アレイ（Protein arrays for gene expression and molecular interaction screening） Current Opinion in Microbiology 3:298-302.
9. Lueking A., Horn, M., Eickhoff, H., Bussow, K., Lehrach H. 及び Walter G. (1999) 遺伝子発現及び抗体スクリーニング分析のためのタンパク質マイクロアレイ（Protetin Microarrays for gene Expression and Antibody Screening） Anal. Biochem. 270:103-111.
10. Bussow K., Nordhoff E., Lubbert C., Lehrach H 及び Walter G. (2000) 高速処理タンパク質発現スクリーニングのためのヒトcDNAライブラリー（A human cDNA library for high-throughput protein expression screening）Genomics 65:1-8.
11. Pandey A. 及び Mann M. (2000) 遺伝子及びゲノムを研究するためのプロテオミクス（Proteomics to study genes and genomes） Nature 405:837-846.
12. Ge H. (2000) UPA、即ちタンパク質−タンパク質、タンパク質−DNA、タンパク質−RNA及びタンパク質−リガンド相互作用の定量的検出のための一般的なタンパク質アレイ系（UPA, a universal protein array system for quantitative detection of protein-protein, protein-DNA, protein-RNA and protein-ligand interactions） Nucleic Acids Research 28, e3.
【０００９】
【発明の開示】
DNAから始まるタンパク質アレイを生成する方法が開示され、この方法では、多数の天然の機能的なタンパク質又はドメインを、転写及び翻訳するための無細胞系を使用するインビトロ合成によって並行して生成し、タンパク質の中に組み込まれた単離配列タグを使用して、続いて表面にグリッドの形で生成物を固定する。１つの態様において、タンパク質の発現を、金属イオン又は抗体等の固定化分子（アフィニティーリガンド）でコートしたウエル、表面又はビーズの存在下で行うことにより、アレイを単一の工程でインサイツ（in  situ）で形成できる。
出発材料には、ゲノムDNA、ｍRNA、クローンDNAフラグメント、又はｃDNAライブラリーなどが挙げられる。インビトロの転写／翻訳のためのインプットDNA構造物は、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）又はRT（逆転写）−PCR増幅によって得られ、データベースやゲノムプロジェクトからの配列のような、公知のDNA配列に設計されたプライマーを使用する。タンパク質合成のための無細胞系とは、例えばウサギ網状赤血球、コムギ胚芽、酵母又は細菌の抽出物等である。多数の個々の天然タンパク質又はドメインを、PCR  DNA構造物からじかに同時に生成することができる。一つの態様において、反応を、マルチウエルプレートのウエルで行う。別の態様において、例えば、マイクロ液滴で反応を行うことにより、ガラス、膜又はビーズ等の表面の上でじかにタンパク質を合成することができる。構造物DNAを、反応量又は液滴に添加するか、又は表面に前固定することができる。後者の場合、まずDNAアレイを効率的に作り、次にタンパク質アレイを作るのに使用する。タンパク質を、例えばヘキサヒスチジンや他のペプチドタグ等の配列を封入することによって、迅速な単離、固定化及び同定に適合させることができる。タンパク質が作られるウエルの中又は他の表面の上を、ニッケルイオンや抗タグ抗体のような固定化試薬でプレコートする場合、タンパク質をインサイツで製造するとアレイを形成するであろうし、試薬分子を洗浄によって除去できる。代わりに、反応を固定化試薬でコートされたビーズの存在下で行うことができ、続いて、ビーズをグリッドのアレイの形に配置する。それとは別に、タンパク質を、プラスチック、ガラス、アガロースビーズ、ニトロセルロースや他の膜等の第二の表面に（例えばグリッド自動装置で）移すことができる。
次に、標識リガンド、タンパク質又は核酸等のターゲット分子をアレイに暴露し、酵素連結反応、蛍光、オートラジオグラフィー又は質量分析で検出される個々のアレイの位置に、ターゲット分子が結合する。それによって、アレイを、抗体、リガンド、タンパク質相互作用等をスクリーニングするのに使用できる。幾つかの場合では、生物化学的研究を行うために、配列されるタンパク質を溶解状態で使用してもよい。グリッドの形を保持し、溶液を、抗原等のターゲット分子でプレコートしたフィルターやプレートに移すこともでき、結合を標識された第二の試薬によって検出する。
【００１０】
また、アレイを、ライブラリーディスプレイシステムに連結することができる。従って、ターゲット分子は、ファージやリボソームディスプレイライブラリー等のディスプレイライブラリーのターゲット分子でもよく、その個々のタンパク質を、コードするDNA又はｍRNAに連結する。アレイに結合した後、相互作用分子を、連結されたDNA又はｍRNAの増幅及び同定によって、例えば繁殖するファージ、又はPCR、RT-PCR、ハイブリダイゼーション又は他の方法によって、確認する。インビトロの合成を利用することにより、前記方法論は、DNAから直ちに機能的タンパク質アレイを得る迅速な方法を提供し、DNA配列からのみ知られるタンパク質又はドメインを含む。この方法論は、クローニング、インビボの発現システム及び精製手順に取って代わることができる。この方法論は、しばしば細菌の発現で起こる、封入抗体、凝集及び分解の問題を回避する。PCR及びインビトロの翻訳を、多くのサンプルを使用して同時に並行して行うことができるので、このようなアレイは、タンパク質の発現、機能的活性及び相互作用の分析に高速処理容量を提供するであろうし、特に、ゲノムプロジェクトからの遺伝情報に使用されるであろう。
【００１１】
方法の詳細
DNA構造物
インビトロの転写／翻訳のための構造物（図１）には、以下を含む。真核細胞系（図２ａ)、又は原核細胞及び真核細胞系（図２ｂ）の両方のいずれかで遺伝子が発現するように設計された、上流T7プロモーター及びタンパク質発現シグナル；フレキシブルリンカー（１９残基）と、金属アフィニティー結合によってタンパクを固定化するための(his)６［配列ID番号１］又は(his)６-SRAWRHPQFGG-(his)６［配列ID番号２］のようなタグ配列（図３）及び/又は抗体又はリガンドによって確認するための更なるペプチドタグ配列とをコードする、上流又は下流配列；及び下流翻訳停止コドン。このような構造物を作るため、興味ある遺伝子を、公知のDNA配列由来の特定のプライマーを使用するPCR又はRT-PCRで、単独で増幅して、上流及び下流成分を、PCRアセンブリで構造物に組み込む。
構造物を表面又はビーズに共有結合で固定化するため、転写終結領域をコードするDNAフラグメントも、その構造物（図４）に含まれる。加えて、末端アミノ基のような共有結合の化学基を、PCRで使用される３’プライマーの修飾を経由して導入することができる。表面又はビーズを、DNA固定化装置TMアントラキノンフォトカップリング（Exiqon)のような適切な化学反応によって、付着用に調製する。
【００１２】
タグを付けた一本鎖抗体のインビトロでの発現のためのPCR構造物の設計
図１０は、例として一本鎖抗体VH/Kフラグメントを使用する、PISA用のインビトロタンパク質合成に好適なDNAの構造物のための一般的なPCR方法の概略を説明する。構造物には、T7  RNAポリメラーゼによる転写のためのT7プロモーター及び無細胞の真核細胞系で翻訳を開始するためのKozak配列が含まれる。Ni-NTAコート表面にタンパク質を固定化する効率を上げ、かつタンパク質アレイの再使用を可能にするため、一対の(His)6−タグドメインを設計した。付着タンパク質の折りたたみでタグ配列の起こりうる障害を減少させるため、フレキシブルな１９残基のリンカー（Robinson及びSauer, 1998, Proc. Natl Acad. Sci. USA 95:5929-5934)を、配列されるタンパク質とHis-タグドメインとの間に配置する。ポリ（A)28テイル及び転写ターミネーターをDNAの３’末端に組み込んで、転写効率を上げる。翻訳終止及びリボソーム複合体からの新生ポリペプチドの放出を確実にするため、２つの停止コドン（TAATAA［配列ID番号３］）を、一対の（His)6-タグ配列に続いて含める。
VH/Kフラグメントが一対の（His)6-タグドメイン（VH/K-His）に結合する構造物を、以下のプライマーでPCRによって生成した。
【００１３】
VH/K-リンカーフラグメントのPCR生成のためのプライマー
【００１４】
【化１】
0004719403.tif 000002
【００１５】
このプライマーは、T7プロモーター及びKozakシグナル（下線部）及び抗体重鎖の５’領域に相補的な変性配列（イタリック体）を提供する。開始コドンを太字で示す。
Ab-リンカー/フォア:  5'-GCC ACC GCC TCT AGA GCG GCT CAG CGT CAG GGT GCT GCT-3' [配列ID番号５]。これは、ヒトκ定常ドメイン（Cκ）の３’領域に相補的な配列及び一対の(His)6−タグドメインの生成のために使用されるリンカー−タグ／バックプライマー（以下を参照）と部分的に一致する配列（下線部）を提供する。
【００１６】
His-タグドメインのPCR生成のためのプライマー
リンカー-タグ/バック: 5'-GC TCT AGA GGC GGT GGC TCT GGT GGC GGT TCT GGC GGT GGC ACC GGT GGC GGT TCT GGC GGT GGC AAA CGG GCT GAT GCT GCA [配列ID番号６]。これは、VH/K-リンカー構成に使用されるAb−リンカー／フォアプライマー （前述）と一対の(His)6−タグドメインのPCR生成のためのリンカー配列（後述）と部分的に一致する配列（下線）を提供する。
His-タグ/フォア : 5'-TCC GGA TAT AGT TCC TCC-3' [配列ID 番号７]。
【００１７】
一対の（His)6−タグドメインをコードするプラスミドPTA−His
プラスミドPTA-Hisは、フレキシブルリンカーと一対の(His)6−タグを（順番に）コードするフラグメントを含み、２つの停止コドンに続いて、ポリAテイル及び転写終結領域を含む。このフラグメントの配列は、以下のとおりである。
【００１８】
【化２】
0004719403.tif 000003
【００１９】
小文字配列は、１９アミノ酸配列をコードするリンカー、下線配列は、一対の(His)6タグ、太字は、停止コドン、（A)28は、２８×Ａを含むポリＡ領域である。イタリック体、下線配列は、転写ターミネーターである。
【００２０】
ＰＣＲフラグメントの構造物
一般的に、製造メーカーの指示に従って、VH/K-リンカーフラグメント及び一対の(His)6−タグドメインを得るため、Taqポリメラーゼ（キアゲン社、イギリス)を使用する別々の反応で、標準ＰＣＲを３０サイクル行った。生成したフラグメントを分析して、ゲル抽出キット（キアゲン社、イギリス）を使用して１％アガロースゲルから溶出した。アセンブリ用に、同量のVH/K−リンカー及び一対の(His)6−タグドメイン（全部で１０〜５０ng）を混合して、２．５μｌの10×PCRバッファー（TaqDNAポリメラーゼと一緒に供給）、１μｌの２．５ｍＭ  dNTP、１U  TaqDNAポリメラーゼ及び最終量で２５μｌにするH2Oを含むPCR混合物に添加した。８回の熱サイクル（９４℃で３０秒、５４℃で１分及び７２℃で１分）後、２μｌの混合物を、プライマーT7Ab／バック及びHis-タグ/フォアを使用して、５０μｌで３０サイクルの第二PCRにかけ、VH/K-Hisを生成した(図１０参照）。
【００２１】
一つの態様において、転写及び翻訳のためのグリッドの形には、好適なプレート（例えば、９６、３８４又は１５３６ウエルポリスチレンプレート）のマイクロウエルが含まれる。個々のDNA構造物（１μｇ）をウエルに分注し、それぞれには、PCR  DNA系用ウサギ網状赤血球TNT  T7  Quick（プロメガ社)、TNT連結コムギ胚芽抽出系（プロメガ社)又は大腸菌（E.coli）S30抽出系等の無細胞の連結転写／翻訳系の少量（例えば１〜５０μｌ）が、メチオニン（０．０２ｍＭ)と一緒に含まれる。タンパク質を標識するため、35Ｓメチオニン又は他の標識アミノ酸を含めてもよい。プレートを３０℃で１時間インキュベートする。タンパク質が、単一又は一対のヘキサヒスチジンタグ又は特定のペプチドタグ配列等の固定化配列を含む場合、タンパク質を、ニッケルでコートした表面又はビーズに金属アフィニティーで、又はタグ配列に対する抗体のいずれかによって結合できる。従って、翻訳反応が起きるウエルを、HisSorbプレート及びストリップ（キアゲン社）等のＮｉ−ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）又は抗タグ抗体でプレコートすると、タンパク質は生成後直ちに表面に結合して、インサイツでアレイを生成するであろう。同様に、Ni-NTAでコートしたビーズの存在下では、タンパク質がビーズの表面に結合するようになるであろう。また、コートされていないウエルでTNT反応を行ってもよく、手動又は自動化手順で、翻訳混合物を、Ni-NTAでコートしたガラス、Ni-NTAでコートしたビーズ、ニトロセルロースやPVDFフィルター膜等の、別の固定化表面に移すことができる。非結合材料は、結合タンパク質を残したまま、洗い流される。
【００２２】
別の態様において、転写／翻訳反応を、他の表面、例えばガラス、膜又はアガロースの表面に分配した液滴で、行うことができる。蒸発を防ぐために液滴を油でカバーしてもよい。
タンパク質合成を固定化DNAで行う態様において、まず、DNA構造物を表面に共有又は非共有で付着し、表面は、ポリスチレンマイクロウエル、変更を加えたガラス、膜、ビーズ、アガロース又は他の表面でよく、このようにして、タンパク質合成が起こり得る固定化DNAアレイを形成する。また、タンパク質を固定化するため、表面をNi-NTA又は抗タグ抗体のような固定化する試薬と連結して、表面を作る。次に、タンパク質合成反応をインサイツ、例えばマイクロウエルや、ガラス上のDNA位置の上に配置した無細胞系のマイクロ液滴等で行う。従って、この態様では、固定化DNA配列が、インビトロの転写／翻訳を経由してタンパク質アレイに加工される。
【００２３】
アレイの品質の調整
翻訳されたタンパク質の存在を、組み込まれた放射標識を使用するか、又は全ての構造物に共有される確定したタグ配列に対する抗体によって示すことができる。この方法において、異なるウエル又はアレイ部位の内容物を、基準化することができる。タンパク質に好適な、特異的なリガンド結合又は酵素活性によって相関関係を示すことができる。
【００２４】
【実施例】
例１  インサイツでの抗体フラグメントの同時発現及び固定化による、機能的タンパク質アレイ成分の製造
インサイツでの機能的タンパク質アレイ成分の製造を証明するため、一本鎖ヒト抗プロゲステロン抗体VH/Kフラグメント（P5-17)をコードする構造物を使用した（Heら、1999、J.  Immunol.  Methods,  231：105）。タンパク質アレイの構造物を調製するため、T7プロモーター、発現シグナル及び一対のヘキサヒスチジンタグをPCRアセンブリによってこのフラグメントに組み込んだ。PCRフラグメント（0.5μｇ）を、２０μｌの連結した転写／翻訳「PCR  DNAシステム用TNT」（プロメガ（Promega）社)と混合して全体量を２５μｌにし、混合物を、８ウエルHisSorbストリップ（キアゲン（Qiagen）社)のNi-NTAコートウエルで３０℃で１時間インキュベートした。コントロールとして、非抗体PCRフラグメントを、
同じ転写／翻訳及びインキュベーション条件で使用した。インキュベーション後、ストリップをPBS（リン酸緩衝食塩水）、0.05％ツイーンで３回洗浄した。抗体フラグメントが発現してウエルの表面に固定化されたのを証明するため、HRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）−抗−ヒトκ抗体を使用した。固定化されたP5-17の結合活性をテストするため、ウエルをビオチン標識プロゲステロン−BSA（P-BSA)で１時間インキュベートし、続いてHRP-ストレプトアビジンで、さらに１時間で検出した。HRP活性を発色させ、その色をELISAリーダーで450nmで測定した。
この２つの成分アレイの実験の結果、抗体フラグメントは、インビトロでうまく発現し、ウエルの表面にインサイツで結合し（抗体κ結合陽性）、特定の抗原結合の判定基準によって機能的であったことが示された（図５）。この結果は、PCR  DNAのインビトロの転写及び翻訳と、ウエル表面に生成物が同時に固定化されることによって、タンパク質の機能を保持しつつ、個々のタンパク質アレイ位置をマイクロウエルに作成できることを示す。
【００２５】
例２  インビトロでの発現、続いて別の表面への抗体フラグメントの固定化による、機能的タンパク質アレイ成分の製造
P5-17構造物を、固定化リガンドでコートされていないマイクロウエルで、前述の条件を使用して、転写及び翻訳した。１時間後、ウエル内容物を（翻訳混合物）をPBSで４倍希釈し、５０μｌをHisSorbストリップのNi-NTAウエルに移した。１時間後、ウエルを洗浄し、ビオチン標識プロゲステロン−BSA、BSA又はCEAに暴露し、続いて１時間後HRP-ストレプトアビジンで検出した。図６は、P5-17タンパク質がうまく製造でき、個別ウエルで固定化されたことを、抗κ結合陽性によって示し、かつプロゲステロン−BSAに特異的であることを示す。従って、PCR−生成DNAのインビトロの転写及び翻訳によって、タンパク質アレイ成分を生成でき、またタンパク質の機能を保持しつつ、固定化ウエルの表面に生成物を移すことができる。
【００２６】
例３  固定化がヘキサヒスチジンタグを要求する証明
非特異的タンパク質の局在を不可能にするため、抗プロゲステロンDB3のマウス抗体VH/Kフラグメントを、前述の２つの異なる構造物を使用して生成した。一つは、単一のヘキサヒスチジンタグ配列を含めたのに対し、もう一つは、その配列を除いた。タンパク質合成をHisSorbウエルで行った。 (His)6-含有構造物だけが、HRP-結合抗マウスκによって翻訳後に検出され、インサイツでの固定化はヘキサヒスチジン配列を要求することを示した。
【００２７】
例４  インサイツでのタンパク質アレイによるヒト一本鎖抗プロゲステロンVH/K（P5-17)の機能分析
フラグメントP5-17をコードするDNA構造物をPCRで生成した。構造物は、インビトロでのタンパク質合成のためのT7プロモーターとKozak配列、タンパク質固定化のための一対のHis-タグ、及び有効なタンパク質生成のためのポリA及び転写終結領域を含む。タンパク質発現を、プロメガ社「PCR’キット用TNT  Quick」にPCR構造物を添加することにより行った。混合物を、Ni+-NTAコートプレート（キアゲン社)のそれぞれのウエルでインキュベートし、その結果タンパク質生成及びインサイツでの固定化が同時に行われた。各ウエルは２５μｌのTNT翻訳混合物を含み、この混合物を、３０℃で２〜３時間シェーキングしながらインキュベートした。PBS-ツイーンで洗浄（３回）後、ウエルをビオチン標識プロゲステロン−BSA(P-BSA)又はHRP-結合ヒツジ抗ヒトκのいずれかで処理した。ビオチン標識された抗原の検出には、HRP結合ストレプトアビジンを使用した。コントロールとして、ビオチン標識BSA（BSA)及び抗マウスκ（マウス）を使用した。図６は、ビオチン標識BSAが結合しなかったのに対し、ビオチン標識プロゲステロンBSAを強く結合した（黄色）ことを示す。同様に、P5-17の存在は、抗マウスκではなく抗ヒトκ（青）によってのみ検出された。従って、この実験は、「タンパク質インサイツアレイ」の形（PISA)で、P5-17フラグメントの機能的発現及び固定化を証明する。
【００２８】
例５  発現の定量的評価及びウエスタンブロッティングによる抗体のインサイツでの固定化
前述のようにして生成された抗体VH/Kフラグメントを、マイクロウエルプレートに固定化する前又は後のいずれかで、SDS−PAGEで分析した。作られたフラグメントの量を評価するため、大腸菌から生成したVH/Kの標準量をゲルに並行して流した。図７は、約１５０ｎｇのVH/Kが、２５μｌのTNT混合物に産生され得たことを示す。インサイツでの固定化後、全VH/Kの約５０％が上清に残り、この場合、３０％がプレートから溶出し、約５０ngの結合を示した。
【００２９】
例６  機能的タンパク質インサイツアレイ（PISA)による、ライブラリーからクローニングした抗体VH/Kフラグメントのスクリーニング
ヒト抗プロゲステロンVH/KフラグメントをコードするDNAを有する、個々の大腸菌クローンからのPCR生成物を使用して、タンパク質インサイツアレイ手順によってアレイを確立した。クローンを、プロゲステロン−BSA選択の前又は後のいずれかで、トランスジェニックマウスVH/Kライブラリによる大腸菌形質転換によって得た（Heら、1999、J. Immunological Methods 231:105)。図８において、１−５の番号をつけた選択前クローン（上）及びP5-8、10、16、17の標識された選択後クローンで、アレイ成分をデュプリケートで並べた。アレイを、ビオチン標識プロゲステロン−BSAに続いてHRP結合ストレプトアビジン（左）、又はHRP結合ヒツジ抗ヒトκ（右）のいずれかで発色させた。アレイは、抗原選択後の４つのクローンが抗原結合後陽性であったのに対し、選択前のクローンは陰性であり、結果は、大腸菌の発現によって独立して確認された。抗κ検出によって、VH/Kフラグメントが発現されて、全てのクローンにおいて固定化されたことが示された。
【００３０】
例７  連結した発現及びマグネチックビーズでのルシフェラーゼの固定化
PISA手順を使用してマグネチックビーズの固体表面に固定化した機能的酵素を生成するのに、ルシフェラーゼを選択した。C末端一対His-タグ（Luci-His)を有するルシフェラーゼをコードする構造物を、VH/Kで述べたPCRで生成した。また、コントロールとして、His-タグドメインを欠くルシフェラーゼDNA（Luci)をPCR生成した。ルシフェラーゼDNAのPCR生成用プライマーは、以下の通りであった。
【００３１】
【化３】
0004719403.tif 000004
【００３２】
T7プロモーター及びKozakシグナルは、下線部である。イタリック体は、ルシフェラーゼの５’領域に相補的な配列を示す。ATGは、開始コドンである。
Luci-リンカー/フォア: GCC ACC GCC TCT AGA GCG CAA TTT GGA CTT TCC GCC [配列ID番号１０]。下線部の配列は、一対の（His)6-タグドメインの生成に使用されるリンカー−タグ/バックプライマー（前記参照）と部分的に一致する。
Ni-NTAコートマグネチックビーズの存在下で無細胞発現後、後者を翻訳混合物から分離し、洗浄した。翻訳混合物上清中のフリーのルシフェラーゼ活性、ビーズに固定化されたルシフェラーゼ活性を、照度計を使用して測定した（図１１）。His-タグドメインを欠くルシフェラーゼ構造物は、翻訳混合物中でのみ活性を生じたが、Luci-Hisは混合物又はビーズの両方で活性を起こし、一対のHisタグドメインを通して機能的ルシフェラーゼの成功した固定化が示された。
【００３３】
例８  固定化DNAからのタンパク質インサイツアレイ（PISA)成分の生成
この例では、PCR  DNAをマグネチックビーズに固定化し、テンプレートとして使用して、Ni-NTA連結したウエル又はマグネチックアガロースビーズの表面にインサイツで固定化される、His−タグ付着したタンパク質を生成した。ヒト抗プロゲステロンVH/KフラグメントP5-17又はルシフェラーゼをコードするPCR  DNAフラグメントをビオチンで標識した３’プライマーを使用してビオチン標識した。ビオチン標識PCRフラグメントをストレプトアビジン結合マグネチックビーズ（プロメガ社)と混合して、３０分間室温で穏やかに回転しながらインキュベートして、ビーズへの連結を行った。DNA連結ビースを集めて0.5mlリン酸バッファー食塩水（PBS)で３回洗浄した。
Ni-NTAコートウエル表面に、PISAでP5-17VH/Kのアレイ成分を作るため、0.02ｍＭメチオニン及び0.5ｍＭ  Ｍｇアセテートを含むTNT混合物２５μｌをP5-17DNA連結ビーズ（前述）と混合し、その混合物をNi-NTAコートプレート（Ni-NTA  HisSorbストリップ、キアゲン社)のウエルに添加した。シェーキングしながら２時間インキュベーション後、プレートを100μｌ洗浄バッファー（50ｍＭNaH2PO4、300ｍＭNaCl、20ｍＭイミダゾール、pH8.0）で洗浄し、続いて100μｌのリン酸緩衝食塩水（PBS)で最終洗浄した。ウエルを、ビオチン標識プロゲステロンBSA又はHRP結合抗ヒトκ鎖のいずれかで探索した。PCRコートビーズ無しのTNT混合物をコントロールとして使用した。図１２（ａ）は、陰性コントロール（ＤＮＡ連結ビーズ無のTNT混合物）には結合活性が検出されなかったが、P5-17DNA連結ビーズでインキュベートしたウエルは、抗原、ビオチン標識プロゲステロンBSA、及びHRP連結ストレプトアビジン、又はHRP結合抗ヒトκ鎖のいずれかを使用して陽性シグナルを発生した。
【００３４】
Ni-NTAコートアガロースビーズの表面に、PISAでルシフェラーゼのアレイ成分を作るため、0.02ｍＭメチオニン及び0.5ｍＭ  Ｍｇアセテートを含むTNT混合物25μｌを、ルシフェラーゼDNA連結ビーズ及びNi-NTAコートビーズ（キアゲン社)の混合物に添加した。この混合物を穏やかにシェーキングしながら２時間、３０℃でインキュベートした。ビーズを前述のように洗浄し、照度計でルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼDNAコートビーズを含むが、Ni-NTAコートビーズを含まないTNT混合物を、コントロールとして使用した。図１２（ｂ)は、DNA連結及びNi-NTAコートビーズを含むTNT反応混合物からの上清及びビーズは、ルシフェラーゼ活性を生じたが、Ni-NTAビーズを欠くコントロール混合物では、酵素活性が上清のみで検出されたことを示す。
これらの実験は、インビトロでの合成によって、固定化DNAから固定化されたタンパク質を生成する可能性を示す（PISA方法）。これは、DNAアレイをタンパク質アレイに変えるのに使用できよう。
【００３５】
例９  Ni-NTAウエル及びマグネチックビーズにタンパク質インサイツアレイ（PISA)を製造するためのタイムコース
Ni-NTAコートウエルの上にインビトロで合成されたタンパク質を固定化するための適切な時間を測定するため、P5-17VH/K  DNAを含むNTN混合物100μｌを25μｌのアリコートに細分し、４つのNi-NTAコートウエルに添加した。混合物を３０℃で、それぞれ１、２、４及び７時間インキュベートした。洗浄後、HRP結合抗ヒトκを固定化P5-17抗体フラグメントを検出するのに使用した（図１３ａ）。２時間のインキュベーションが最も高いVH/K固定化レベルを示した。
Ni-NTA連結マグネチックビーズの上にインビトロ合成タンパク質を固定化するための適切な時間を測定するため、ルシフェラーゼDNAを含むTNT混合物100μｌを２５μｌのアリコートに細分し、Ni-NTAコートビーズに添加した。混合物を、３０℃で１、２、４及び７時間インキュベートした。洗浄後、ルシフェラーゼ活性を照度計で測定した（図１３ｂ）。これは、フリーと固定化されたルシフェラーゼ活性の両方が２時間で活性でピークに達し、フリーのルシフェラーゼは２時間後有意に減少したことを示した。
【００３６】
例１０  無細胞合成後のHis−タグ付着したP5-17VH/Kの固定化及び連続希釈でのNi−NTAコートウエルへの移転
His−タグ標識したP5-17VH/Kフラグメントを、５０μｌのウサギ網状赤血球ライセートで発現した。連続２倍希釈後、２５μｌを個々のNi-NTAコートウエルにデュプリケートで添加した。３０℃で２時間インキュベーション後、ウエルを洗浄し、P5-17の固定化をHRP連結抗ヒトκ鎖を使用して検出した（図１４）。結果は、４倍希釈までウエル表面でVH/Kが検出できたことを示す。
【００３７】
例１１  ウエスタンブロッティングによるNi-NTAコートビーズ上へのタンパク質固定化の分析
Ni-NTAコートビーズの上へのタンパク質固定化の効率を評価するため、ウエスタンブロッティングを適用した。P5-17ヒト抗プロゲステロンVH/K及びルシフェラーゼの両方を、PISA手順を使用してNi-NTAコートビーズの上に固定化した。次に、PAGEに流す前に、ビーズをSDSサンプルバッファー中で沸騰させ、ビーズ除去後、TNT混合物に残っている上清タンパク質と共に並行して流した。ウエスタンブロッティング後、移転したタンパク質をHRP結合抗(His)6抗体で検出し、デンシトメトリーで定量した。結果は、翻訳されたタンパク質の４０〜５０％がNi-NTAコートビーズから溶出されたことを示す（図１５、矢印）（Ni-NTAコートウエルを使用した同様の結果を参照、例５）。
【００３８】
例１２  貯蔵後のルシフェラーゼ固定化ビーズの再使用
PISA手順によって固定化された配列したタンパク質を再アッセイできるかどうかをテストするため、ルシフェラーゼ固定化ビーズを例７と同様にして生成し、上清中のフリー及びビーズに固定化したルシフェラーゼ活性を同時に分析した。第一測定後、ビーズを洗浄バッファーで３回、PBSで２回洗浄した。ビーズを５０μｌPBSで再懸濁し、１週間、−２０℃で貯蔵した。また、上清を同じ期間、−２０℃で貯蔵した。洗浄液及びサンプルの貯蔵を含むルシフェラーゼ活性の第二及び第三測定を第一測定と同様に行った。図１６は、PISA固定化ルシフェラーゼを２回再アッセイでき、陽性の結果であったことを示す。
【００３９】
例１３  原核細胞及び真核細胞発現の両方における共通配列の有効性
設計されたPISA構造物には、原核細胞及び真核細胞系の両方でタンパク質翻訳開始のための新規な共通配列が含まれる（図２）。その有効性を確認するため、共通開始配列を含むルシフェラーゼ構造物を連結したウサギ網状赤血球ライセート及び連結した大腸菌S30系の両方でタンパク質発現をテストした。図１７は、この配列が両方の系で機能的ルシフェラーゼの製造が可能であることを示す。また、比較によって、真核細胞系における定型的な配列と同等の有効性でルシフェラーゼを生成したことが示された（図１７ａ）。
Ｅ：真核細胞開始配列単独。
ＰＥ：原核細胞及び真核細胞開始配列との組み合わせ（新規）。
【００４０】
例１４  リボソームディスプレイ及びPISAの組み合わせによるタンパク質―タンパク質相互反応の証明：Grb2のVav/N-SH3との相互作用
シグナル伝達タンパク質Vav及びGrb2の相互作用（Ye及びBaltimore（1994）PNAS  91：12629-12633）をモデルとして選択し、リボゾームディスプレイ及びPISAタンパク質アレイの組み合わせを通してタンパク質−タンパク質相互作用を証明した。未処理の哺乳類の造血細胞において、Vavはアダプター分子Grb2に結合し、Rasアクチベーションを経由してシグナル伝達を開始する。Vavは、Src相同性２及び３ドメイン（SH2、SH3）を(N-SH3)-SH2-(C-SH3)の順で含む。まず、Grb2との相互作用を酵母two-hybridスクリーニングによって同定し、引き続いてフィルター結合アッセイによってVavのN-SH3ドメインとGrb2のC-SH3ドメインの間に高い特異性結合を伴うことが示された（Ye及びBaltimore、1994）。Grb2  C-SH3ドメインは、VavのN-SH3のドメインと結合するが、Vav/SH2-(C-SH3)ドメインとは結合しない。また、Ye及びBaltimoreは、Vavとの相互作用を検出するため、グルタチオン複合アガロースビーズに連結したGST-Grb2を調製し、ビーズの完全長Grb2が細胞ライセートから完全長Vavを沈澱させたことを示した。
我々は、Martin  Turner博士（Babraham  Institute)によって提供されたプラスミドから、Vav/N-SH3フラグメント（N末端SH3ドメインを含む）、Vav/SH2-C-SH3（SH2ドメイン及び結合C末端SH3ドメインを含む）及びPCRによる完全長Grb2に対するDNAを、これらに対応するDNA配列に基づくプライマーを用いて生成した。リボソームディスプレイのための構造物に、ヒトCκドメインを、タンパク質のC末端で組み入れ、一方タンパク質アレイ（PISA)フォーマットのための構造物に、一対の（His)6ドメインをC末端（Cκドメインなし）に加えた。
【００４１】
Vav/N-SH3リボソームディスプレイのPISA産生Grb2との相互作用
Vav/N-SH3及びVav/SH2-C-SH3タンパク質のリボソームディスプレイは、真核細胞の方法によった（He及びTaussing(1997）Nucl.  Acids  Res.  25：5132）。PISA-固定化完全長Grb2を、ここで述べた無細胞合成によってNi-NTAコートビーズに生成した。Grb2ビーズを、Vav/N-SH3、Vav/SH2-C-SH3又はVav/N-SH3：Vav/SH2-C-SH3の１：１の混合物を示すリボソームとそれぞれ混合した。相互作用を２時間氷上で行い、Grb2ビーズと相互作用するリボソーム複合体を磁力選鉱機（magnetic  concentrator）で単離した。ビーズを５０μｌ洗浄バッファー（PBS、0.1％BSA、0.05％ツイーン、５ｍＭ  Ｍｇアセテート）で３回洗浄後、続いて水で２回洗浄し、ビーズを、Vav/N-SH3及びVav/SH2-C-SH3構造物の両方の一般的なプライマー（T7A1及びevol４）を使用してRT-PCRにかけた。図１８は、Vav/SH2-C-SH3をコードするDNAは検出されなかったが、Vav/N-SH3は、Vav/N-SH3及び１：１の混合物の両方から効率的に回収され、結果はGrb2及びVav/N-SH3間の報告された相互作用と一致する。
【００４２】
Grb2リボソームディスプレイ複合体とPISA産生Vav/N-SH3との相互作用
前記で認められた相互作用を確認するため、タンパク質のディスプレイされたフォーマットを逆転し、即ち、Vav/N-SH3及びVav/SH2-C-SH3をPISA固定化タンパク質としてマグネチックビーズに発現させ、Grb2をリボソームディスプレイ複合体の形にした。相互作用の条件と洗浄は前述の通りであった。図１９は、Grb2  DNAのRT-PCR回収率が、Vav/SH2-C-SH3ビーズからよりもVav/N-SH3ビーズからの方がずっと強かったことを示す。これによって、Grb2及びVav/N-SH3間の特異的な相互作用が再び確認された。
【００４３】
リボソームディスプレイライブラリーからの相互作用分子の選択
相互作用分子がリボソームディスプレイライブラリーから選択できるかをテストするため、Vav/N-SH3及びVav/SH2-C-SH3を１：１、１：２及び１：５の比で含むリボソーム複合体の混合物を生成して、PISA産生Grb2ビーズと反応させた。相互作用の条件とそれに続く洗浄は、前述の(a)のとおりであった。選択された相互作用分子をコードするDNAをRT-PCRによって再生した。また、比較として、未選択のリボソームディスプレイライブラリーをDNA再生と同じプライマーを使用してRT-PCRにかけた。図２０は、Vav/N-SH3とVav/SH2-C-SH3の両方とも、もとのライブラリーからのRT-PCRによって比例的に増幅されたのに対し、Vav/N-SH3のみは、異なる比のライブラリー混合物とGrb2結合ビーズとの相互作用の後で、明らかに再生されたことを示し、相互作用分子Vav/N-SH3の選択を示した。
これらの実験は、リボソームディスプレイ及びPISAを組み合わせた使用によって、タンパク質−タンパク質相互作用を検出でき、相互作用するパートナーにおけるDNAの再生と同定を可能にすることを示す。それによって、新規の相互作用の発見において、PISAタンパク質アレイに対するリボソームディスプレイライブラリーのスクリーニングが可能になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  インビトロの発現とタンパク質固定化のためのDNA構造物の図である。
【図２（ａ）】  真核細胞発現のための上流配列成分［配列ID番号１１］であり、T7プロモーター（イタリック体）及びKozak（イタリック体）配列を示す。
【図２（ｂ）】  原核細胞及び真核細胞発現の両方における上流配列成分［配列ID番号１２］であり、T7プロモーター（イタリック体）、シャイン・ダルガルノ（S/D)配列（下線部）及びKozak（イタリック体）配列を示す。
【図３】  ヘキサヒスチジン及びフレキシブルリンカーのDNA及びタンパク質配列である。
［配列ID番号：
図３ａは、配列ID番号１３(DNA)及び１４（タンパク質）である。
図３ｂは、配列ID番号１５(DNA)及び１６（タンパク質）である。
図３ｃは、配列ID番号１７(DNA)及び１８（タンパク質）である。
図３ｄは、配列ID番号１９(DNA)及び２０（タンパク質）である。］
【図４】  インビトロの発現の前に固定化するためのDNA構造物の図である。
【図５】インビトロでのDNAの転写及び翻訳後のインサイツでの機能的タンパク質アレイ成分の構造物である。
P5-17タンパク質又はコントロールタンパク質を、インビトロでそれぞれ３デュプリケートウエルでPCR  DNAから合成し、一対のヘキサヒスチジンタグを介してHisSorbウエルのNi-NTA表面にインサイツで固定化した。
１：ビオチン標識プロゲステロンBSAの結合、その後HPRストレプトアビジン検出。
２：HRP抗ヒトκ抗体の結合。
３：HRPストレプトアビジンの結合。
【図６】インビトロでのDNAの転写および翻訳後、第二表面へのタンパク質の移転による機能的タンパク質アレイ成分の構築
一対のヘキサヒスチジンタグを有するP5-17タンパク質又はコントロールタンパク質を、コートしていないポリスチレンウエルで、インビトロでPCR  DNAから合成して、Ni-NTAでコートしたHisSorbウエルに移した。特異的結合を、ビオチン標識プロゲステロンウシ血清アルブミン（*P-BSA)、ビオチン標識BSA（*BSA)、又はビオチン標識癌胎児性抗原（*CEA)で、続いてHRPストレプトアビジン検出で、検出した。タンパク質の発現を、HRP抗ヒトκ抗体で検出した。
【図７】  ヒト一本鎖抗プロゲステロンVH/K（P5-17)のタンパク質インサイツアレイ（PISA)である。（説明については例４、結果を参照されたい。）ｙは黄色、ｂは青である。
【図８】  タンパク質インサイツアレイ（PISA)：ヒトVH/K抗体フラグメントの発現及び固定化のウエスタンブロット定量である。Cは、TNTコントロール、Tは、全部、Uは、非結合フラクション、Pは、PISA結合フラクション（溶出）を示す。
【図９】  ARMディスプレイの選択前後のトランスジェニックライブラリーからの複製ヒトVH/Kフラグメントのタンパク質インサイツアレイ（PISA)アッセイである。
【図１０】  例として一本鎖抗体VH/Kフラグメントを使用した、PISAのためのインビトロタンパク質合成に好適なDNAの組み立ての説明図である。
【図１１】照度計によるフリー及びPISA固定化されたルシフェラーゼの機能的アッセイである。上清：NiNTAマグネチックアガロースビーズとのインキュベーション後のTNT混合物である。NC:PCR  DNAを欠くTNT混合物コントロールである。Luci：一対のHisタグドメインなしのルシフェラーゼをコードするPCR構造物を含むTNT混合物である。Luci-His：一対のHisタグドメインと融着したルシフェラーゼをコードするPCR構造物を含むTNT混合物である。
【図１２】  固定化PCR  DNAを使用したタンパク質アレイ成分の産生である。
P5-17ヒト抗体プロゲステロンVH/Kフラグメントを、P5-17  DNA連結ビーズからのTNT無細胞合成後、Ni-NTAコートウエルに固定化した（immP5-17)。コントロール：DNA連結ビーズを省略した。
ルシフェラーゼを、ルシフェラーゼDNA連結ビーズからTNT無細胞合成した後、Ni-NTAビーズに固定化した（TNT+DNA-ビーズ+Ni-ビーズ)。コントロール：Ni-NTAビーズ単独；TNT+DNA連結ビーズのみ。
【図１３】  TNTによる無細胞タンパク質合成と、Ni-NTAコートウエル及びマグネチックビーズにインサイツで固定化するタイムコースである。
【図１４】  無細胞合成、連続希釈、及びNi-NTAコートウエルへの移動後のP5-17VH/K固定化である。VH/Kを、HRP結合抗κ抗体で検出した。
【図１５】  無細胞転写／翻訳（PISA法）後、Ni-NTAコートビーズ上へインサイツで固定化されたタンパク質のウエスタンブロッティング分析である。
S:ビーズ除去後の上清中のフリータンパク質、B:ビーズから溶出されたタンパク質である。(a)P5-17VH/K、(b)ルシフェラーゼである。
【図１６】  ビーズのPISA固定化ルシフェラーゼの繰り返しアッセイである。
Ni-NTAコートマグネチックビーズのPISA固定化ルシフェラーゼを照度計でアッセイした。ビーズを、各使用後洗浄して、第一及び第二アッセイの間に、−２０℃で１週間貯蔵し、第二及び第三のアッセイを行った。上清を同様に貯蔵した。
【図１７】  原核細胞及び真核細胞発現の両方での共通翻訳開始配列の有効性である。
(a)連結されたウサギ網状赤血球系での発現
(b)連結された大腸菌S30系での発現
ルシフェラーゼ発現を、照度計でアッセイした。
NC：DNAなしの無細胞TNT混合物
E:原核細胞配列単独を含むDNA構造物
PE:共通配列を含むDNA構造物
【図１８】  Vav/N-SH3リボソームディスプレイ複合体のPISA固定化Grb2との相互作用。
印のついたレーンは、
NC:RT-PCR用溶液コントロール、
１．Grb2ビーズと相互作用したVav/N-SH3リボソーム複合体、
２．Grb2ビーズと相互作用したVav/SH2-C-SH3リボソーム複合体、
３．Grb2ビーズと相互作用した、Vav/N-SH3及びVav/SH2-C-SH3  DNAの１：１混合物から発現したリボソーム複合体、
である。
【図１９】  リボソームディスプレイ複合体Grb2のPISA固定化Vav/N-SH3との相互作用。
印のついたレーンは、
１．Vav/SH2-C-SH3ビーズと相互作用したGrb2リボソーム複合体。
２．Vav/N-SH3ビーズと相互作用したGrb2リボソーム複合体。
【図２０】  ライブラリー混合物からのタンパク質―タンパク質相互作用の選択。
リボソーム複合体ライブラリーは、印がつけられたように、Vav/N-SH3及びVav/SH2-C-SH3の比が１：１、１：２及び１：５の混合物であった。
ゲル(A)：Grb2ビーズとの混合物の相互作用後のRT-PCRの結果
ゲル(B)：出発混合物のRT-PCR
【配列表】
0004719403.tif 000005
0004719403.tif 000006
0004719403.tif 000007
0004719403.tif 000008
0004719403.tif 000009
【図１】
0004719403.tif 000010
【図２（ａ）】
0004719403.tif 000011
【図２（ｂ）】
0004719403.tif 000012
【図３】
0004719403.tif 000013
【図４】
0004719403.tif 000014
【図５】
0004719403.tif 000015
【図６】
0004719403.tif 000016
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
0004719403.tif 000030