(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の完全な細胞からの核酸の精製方法であって、
サンプル流入口およびサンプル流出口を有し、その内部に、少なくとも１つの多孔質膜を含み、前記流入口から前記流出口までのサンプルの通路が１つまたは複数の多孔質膜で部分的に閉塞され、それにより前記多孔質膜の周囲にサンプルの流れが供給されるようになっている濾過装置に、
完全な細胞を含むサンプルを流入口から入れて、前記少なくとも１つの多孔質膜の表面を、膜面に０．２５ｂａｒ〜１．２５ｂａｒの圧力を加えつつ通過させて、
それにより、前記多孔質膜の中に核酸を分離し保持する、核酸の精製方法。
【請求項２】
前記多孔質膜が中空糸膜である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
濾過装置内に配置された前記中空糸膜は、その一方の末端が塞がれており、他方の末端が装置外に通じる内腔絞り弁に連結している請求項２に記載の核酸の精製方法。
【請求項４】
前記核酸にはＤＮＡ及び／またはＲＮＡが含まれる請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸の精製方法。
【請求項５】
前記多孔質膜が、流入口と流出口の間の濾過装置の断面積の少なくとも５０％を占める請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸の精製方法。
【請求項６】
前記多孔質膜が、流入口と流出口の間の濾過装置の断面積の少なくとも９０％を占める請求項５に記載の核酸の精製方法。
【請求項７】
前記サンプルを導入する前に、緩衝液またはサンプルを充填する工程をさらに包含する請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸の精製方法。
【請求項８】
サンプルが濾過装置に導入され、処理された工程の後に、濾過装置を洗浄する工程をさらに含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸の精製方法。
【請求項９】
前記多孔質膜が１０５〜１０７ダルトンの分画分子量の孔を有する請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸の精製方法。
【請求項１０】
前記多孔質膜が１０６ダルトンの分画分子量の孔を有する請求項９に記載の核酸の精製方法。
【請求項１１】
前記核酸が、一度精製された前記多孔質膜から溶出される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸の精製方法。
【請求項１２】
サンプル中の完全な細胞から核酸を精製するための装置であって、濾過装置を含み、
前記濾過装置は、サンプル流入口およびサンプル流出口を有し、その内部に、少なくとも１つの多孔質膜を含み、前記流入口から前記流出口までのサンプルの通路が１つまたは複数の多孔質膜で部分的に閉塞され、それにより前記多孔質膜の周囲にサンプルの流れが供給されるようになっている濾過装置であり、
完全な細胞を含むサンプルを流入口から入れて通路を通過するときに、前記少なくとも１つの多孔質膜の膜面に、０．２５〜１．２５ｂａｒの圧力を加える手段を含む、
前記多孔質膜の中に核酸を分離し保持するようにしている、核酸の精製装置。
【請求項１３】
前記核酸が一度精製された前記多孔質膜から溶出される手段を含む請求項１２に記載の核酸の精製装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、サンプル中の全細胞からの核酸の分離に関する。特に、患者の血液サンプルの細胞からゲノムＤＮＡを回収することに関する。
【０００２】
（従来技術）
細胞溶解、核溶解、タンパク質沈殿、ＤＮＡ再水和、およびＲＮＡ消化の分離工程を含む、サンプルから核酸を分離する現在の技術は、時間および費用がかかることがある。例えば、全血サンプルからのゲノムＤＮＡ精製に利用可能な多くのキットのうちの１つに、ＰｒｏｍｅｇａのＷｉｚａｒｄ（ＲＴＭ）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔがある。５０×３ｍｌのサンプルを精製するのに十分なキットは、非常に高価で、プロトコルを行うのに約４５分かかり得る。他の技術が利用可能であるが、一般的にはより長い時間がかかり、タンパク質分解酵素または有機溶媒の使用、またはサンプルの分画を精製するためのカラムもしくは樹脂の使用が必要である。
【０００３】
本発明は、先行技術を改良し、サンプル中の完全な細胞から核酸を精製する新規の方法を提供する。本発明によれば、サンプル流入口およびサンプル流出口を有する濾過装置中に含まれる少なくとも１つの多孔質膜の表面をサンプルが通過する工程を包含し、流入口から流出口までの通路が１つまたは複数の膜で部分的に閉塞されて膜間圧力を生じる、サンプル中の全細胞からの核酸の精製方法を提供する。
【０００４】
膜表面の流れを濾過する技術は、「クロスフロー濾過」として広く一般に知られている（例えば、Ｈｏｏｄ，Ｒ．、１９９８、Ｎｅｗ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ、７７〜８６、ＷＯ  ９６／０４０６７、ＷＯ  ９６／０４０６８、ＷＯ  ９６／１７６７３、ＷＯ  ９６／２０４０２を参照のこと）。その他の膜装置には米国特許第５４３８１２８号のものがある。しかし、それらのいずれも膜をめぐるサンプル流入口とサンプル流出口との間の通路を部分的に閉塞するだけで流れを通るまたは横切るとは反対に流れを生じない。  驚いたことに、本発明者は、本発明を使用して細胞膜および核膜を破壊し、核酸を精製することができることを見出した。流入口と流出口との間の通路を部分的に閉塞することによってのみ、すなわち１つまたは複数の膜の周囲に流動を起こすことにより、より大きな細胞片が詰まらずに膜周辺を通過することができる。細胞が破壊するだけでなく、細胞中に含まれる核酸もまた膜表面および膜内部に蓄積する。実験（以下）により、非常に多くの割合の細胞性核酸が膜に蓄積されることが示された。さらに、比較用の標準として分子量マーカーを用いた試験（以下を参照のこと）によっても、回収されたＤＮＡの平均分子量は非常に高いことが示されたが、これは、細胞の剪断力が細胞膜または核膜を破壊するのに十分であるが、核酸の広範な剪断を引き起こすほどではないことを示す。
【０００５】
これは、損傷を受けた鎖は、適切な結合部位（例えば、エピトープ）を示すことがないか、または正確なＰＣＲプライマー結合に十分な配列および有効な増幅のための伸長を得ることができないので、回収した核酸のその後の試験に特に重要である。
【０００６】
有効な細胞破壊には０．２５ｂａｒの最小膜間圧力が必要である。膜間圧力が増加するにつれて、破壊がより有効になり、核酸の剪断がわずかに増加し、高圧では膜の変形が起こる。膜間圧力が増加するにつれて、より多くの核酸が濾過膜の孔／隙間に蓄積し、高膜間圧力では、核酸、特により短い核酸は完全に膜を通過して、膜上に残存しないこともまた見出された。これらすべてが原因で、最大膜間圧力は約１．２５ｂａｒが適切であるようであるが、もちろん、特定の装置用の最大膜間圧力を簡単な実験を用いて用意に同定することができる。
【０００７】
膜の光学顕微鏡試験によって、膜表面は核酸で覆われているが他の細胞成分は認められないことが示された。
【０００８】
他の細胞成分の除去を、内腔を有する膜（例えば、中空糸膜）を用いて濾過液を内腔を介して排出させることによって、さらに改良することができる。例えば、中空糸膜の一方の末端（または一連の中空糸膜）を塞ぎ、他方の末端を内腔絞り弁に連結して、絞り弁が開口するのに十分な高さの圧力になったときに、濾過物を開放させることができる。例えば、０．５ｂａｒの流出口絞り弁を有する装置は、０．２５ｂａｒの絞り弁を有する内腔流出口を使用することができる。あるいは、内腔絞り弁を開口するために必要な圧力は、流出口の弁の圧力より高くてもよく、この場合、核酸は孔／隙間よりも膜の外側に優先的に蓄積する。内腔絞り弁の開口に必要な圧力を非常に低くすると、非常に高い膜間圧力を生じて核酸剪断が増加し、内腔流出口を通過する核酸が損失する。当業者は、流出口および内腔絞り弁用の適切な弁を、簡単な実験を用いて容易に同定することができる。
【０００９】
実験（以下）によってもまた、結合した核酸を保有する膜上で直接ＰＣＲ増幅を首尾よく行うことができる、つまり、逆転写の最初のステップを用いてＲＮＡを増幅することができることを示した。ＰＣＲ技術は周知であり（ＰＣＲ（Ｖｏｌｕｍｅ  １）、Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅｄｓ．、Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｐ．Ｑｕｉｒｋｅ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９１）、容易に使用することができる。
【００１０】
本発明の方法が簡単であるということは、使用した装置が比較的安価であり得ることを意味する。重要なのは、核酸、特にゲノムＤＮＡを、全血サンプルなどのサンプルから非常に短時間で回収することができることである。実験（以下）により、５×１ｍｌのサンプルを、全体で約２分間で分離することができることが示される。
【００１１】
サンプルから可能な限り大量の核酸を回収することが当然所望されるので、１つまたは複数の膜は流入口と流出口との間の通路のほとんどを塞いでもよい。例えば、膜は、流入口と流出口との間の濾過装置の断面積の少なくとも９０％を占めることができる。また、膜は、流入口と流出口の間の濾過装置の断面積の少なくとも５０％を占めることができる。このようにして、膜との最大細胞接触（およびそれによる細胞破壊および核酸回収）が達成されるが、膜周囲の細胞片が流動し、それにより最終的な膜結合核酸が実質的に不純物を有さないことが確実となる。サンプルが流入口から流出口まで通過したときサンプル全体に圧力がかかるように、濾過装置にサンプルを導入する前に、例えば、適切な緩衝液で濾過装置を前充填することもまた所望され得る。同様に、サンプルすべて（膜によって保持されたものを除く）の流出口への通過を確実にするために、サンプルを濾過装置に導入した後にフラッシングする工程を使用することができる。
【００１２】
膜の孔は、膜間圧力差を生じて核酸を捕獲するように作用する。孔はまた、小さな細胞片を容易に流出口に通過させる。孔は、１０５〜１０７ダルトン、例えば、１０６ダルトンの分画分子量（ＭＷＣＯ）を有し得る。
【００１３】
例として、使用することができる膜は、０．２μｍの孔径を有するポリプロピレン膜（例えば、ＡＫＺＯ  ＮＯＢＥＬより販売されている）およびＡ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．ＵＳＡから販売されているポリスルホン膜モデルＵＬＦ  １ミリオンおよびＵＦＬ  ７５０ならびにＦｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ａ．Ｇ．（Ｓｔ．Ｗｅｎｄｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から販売されているモデル９００２および９００５である。膜は、核酸に反発すべきではないので、膜が親水性であり、および／または正電荷を確実に有するように膜を前処理する必要があり得る。ポリプロピレン膜の場合、膜を、２０％Ｔｗｅｅｎ溶液中に予浸することができる。細胞膜および核膜の破壊を増大させるために、表面が粗い膜を使用することができる。必要であれば、この処理を膜の前処理で行うことができる。
【００１４】
種々の型の膜、例えば、平らな（シート状）の膜および中空糸膜を使用することができる。
【００１５】
膜を、特に核酸または核酸配列を検出する薬剤で処理することができる。例えば、膜はＲＮＡ配列に特異的な抗体で前処理することができる。次いで、抗体へのＲＮＡの結合を、抗体による吸光／蛍光の変化で検出することができる。抗体、その製造および使用は周知である（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８）。あるいは、ＥＬＩＳＡスタイルの試験を行うことができる。あるいは、第１の抗体を膜上で精製された核酸に適用することができる。非特異的に結合した抗体を洗浄して除去した後、第１の抗体に対して特異的な第２の抗体を適用することができ、その第２の抗体はルシフェラーゼなどのシグナル分子と結合しているので、増幅検出シグナルが提供される。膜表面に固定したＤＮＡに対する装置内の標的ＤＮＡ配列または相補ＤＮＡ配列の捕獲プローブとして作用するポリメラーゼＤＮＡを有する捕獲プローブを使用することができる。（例えば、Ｍｏｓａｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．のＡｃｒｙｄｉｔｅＤＮＡゲル）
中空糸膜の場合、繊維の体積によって１つの試薬または一連の薬剤を通過させることが可能である。これらの試薬は、例えば、特異的なＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を検出することができる。試薬が膜を通過して排出しないように試薬を膜と組み合わせて選択することにより、膜に結合した物質（すなわち、核酸）のみを確実に試薬に接触させることができる。
【００１６】
本発明によれば、サンプル流入口およびサンプル流出口を有し、流入口から流出口までの経路が少なくとも１つの多孔質膜によって閉塞され、使用時に装置が少なくとも０．２５ｂａｒの膜間圧力を生じる濾過装置もまた提供される。濾過装置は、核酸の精製方法に使用することができる。濾過装置は、本発明の核酸の精製方法に使用することができる。
【００１７】
本発明で使用される典型的な濾過装置は、流出口に０．５ｂａｒの絞り弁が嵌合された内径１．２５ｍｍの流入口および流出口（ＰＶＣ製）を具備する。流入口および流出口は、濾過装置の本体に対して垂直で、本体の両側に配置される。本体の全長（内径３．２５ｍｍ）は、６０ｍｍであり、流入口と流出口は３０ｍｍ離れている。１４本のポリスルホン膜（ＵＬＦ  ７５０または１ミリオン）または９００２（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ａ．Ｇ．、Ｓｔ．Ｗｅｎｄｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が本体に沿って位置し、その全表面積は６．２８ｃｍ２である。
【００１８】
別の装置は、上記と同一の物理的寸法であるが、６本のポリスルホン膜タイプＵＬＦ  ７５０または１ミリオン、または９００５（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ａ．Ｇ．）が本体の長さに沿って位置し、その全表面積は６．２８ｃｍ２である。
【００１９】
別の装置は、上記と同一の物理的寸法であるが、孔径が０．２μｍの４本のポリプロピレンファイバーが本体の長さに沿って位置し、その全表面積は６．２８ｃｍ２である。
【００２０】
小さな孔径を有する膜（例えば、ＵＬＦ  ７５０）と比較した場合、より大きな孔径を有する膜（例えば、ＵＦＬ  １ミリオン）がより長い平均長を有する核酸を精製するのに有用である。これは、サンプルの濁度によるようである。つまり、濁ったサンプル（例えば、部分的に凝固した血液）は、より濁度の低いサンプル（例えば、鮮血）よりも本発明の装置を通過するのにより大きな力が必要である。より大きな力が必要であるほど、精製された核酸により機械的な損傷を与えるので、精製核酸の平均長が短くなる。同様に、小さな孔径の膜を提供することは、膜から精製サンプルの非核酸部分を取り除くのにより大きな力が必要であることを意味し、従ってより大きな機械的損傷を与え、より短い核酸フラグメントが精製される。
【００２１】
上記のように、中空糸膜を用いた場合、濾過膜の内腔に回収された濾過物を取り除くためにさらに内腔流出口が必要であり得る。
【００２２】
本発明によれば、本発明の核酸の精製方法における本発明の濾過装置の使用もまた提供される。
【００２３】
本発明を使用して一旦核酸が膜に捕獲されると、核酸を上記のように分析、例えば、配列決定することができるだけでなく、膜から溶出させることもできる。これを達成するために、膜周辺の溶液に電流を印加することができる。例えば、１０００ボルトで０．２アンペアの直流を印加すると、膜に捕獲された核酸の膜からの分離が起こる。溶液中の核酸をさらに処理することができる。もちろん、捕獲された核酸に印加された電流の正確な性質は、上記の例により変化し得るが、適切な条件は当業者には明らかである。例えば、溶出された核酸分子の平均サイズと核酸を溶出するために必要な電位との間には反比例の関係がある、つまり、より短い核酸分子には、より長い核酸分子より高い電位の印加が必要であることが見出されている。このことについて特定の理由付けに拘束されることを望まないが、より長い核酸分子はより短い核酸分子よりも単位長さあたりの膜との接触点が少なく、従って、膜から分離するためにより小さな電流を必要とするようである。
【００２４】
核酸がサンプル中の完全な細胞から分離されて膜から核酸を溶出することができるということは、例えば大量の全血から核酸が精製されて比較的少量の流体に溶出され、その後の分析がより簡潔で容易になることを意味する。
【００２５】
核酸が異なればその物理的特徴も異なるので、核酸を溶出する場合、異なる核酸（例えば、細菌性ＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ）を適切な電流（例えば、必要に応じて周波数を変化させた交流を使用する）を用いる（すなわち、電気泳動を行う）ことによってそれぞれを分離することができる（「Ｓｈｏｃｋ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」、Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、６  Ｊｕｎｅ  １９９８、「Ｄｅｖｉｌｉｓｈ  ｔｒｉｃｋｓ  ｗｉｔｈ  ｔｉｎｙ  ｃｈｉｐｓ」、Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、１  Ｍａｒｃｈ  １９９７、ｐ．２２、および本明細書中の引例を参照のこと）。
【００２６】
交流は、１００Ｈｚと１０ＭＨｚとの間の周波数を有しうる。例えば、膜の長さ方向への１００ｋＨｚの電流の印加により、細菌性ＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡを相対的な位置に移動させる。
【００２７】
本発明の方法および装置は、遺伝子チップ技術と組み合わせて使用することができる。つまり、一旦核酸を膜表面上で回収することによって精製し、遺伝子チップと接触させることができる。その後、遺伝子チップを分析して、精製された核酸中の特定の核酸の有無を同定することができる。
【００２８】
あるいは、遺伝子チップを、多孔質膜の表面上に提供することもできる。精製後、非ハイブリッド形成核酸を取り除いて遺伝子チップを分析することができる。
【００２９】
この遺伝子チップ技術の使用は、細胞由来の核酸の回収、精製、および分析を１つの装置を用いて非常に短時間で行うことが可能な、完全な細胞を含むサンプルの非常に迅速な分析を提供することができる。
【００３０】
多孔質膜上の核酸の回収を改良するために、精製を行っている間膜を回転させ、それによって精製された核酸の分布を一様にし、任意の点で核酸の過剰な集結を防止（およびこのような集結を生じ得る効率を低減）することができる。
【００３１】
本発明は、添付の図面のいくつかの図を参照して以下の説明によってさらに明白になるが、これは核酸精製の１つの形態の例示に過ぎない。
【００３２】
（実施例）
以下の試験は、全精製時間が約２分間であるヒツジの全血サンプルからのＤＮＡの精製を詳述する。ゲル電気泳動により、回収されたＤＮＡはあまり剪断されておらず、ほとんどのＤＮＡが少なくとも２３ｋｂの長さであることが示された。吸収スペクトルは、サンプル中少なくとも６０％の利用可能なＤＮＡが回収されたことを示す。ＰＣＲ試験により、溶出されたＤＮＡは機能的で、ＰＣＲで増幅可能であることが示された。光学顕微鏡により、膜によって精製されたＤＮＡは細胞片などの汚染物を実質的に有さないことが示された。
【００３３】
従って、以下に例示の技術を使用して、サンプル中に含まれる完全な細胞から核酸を迅速かつ安価に精製することができる。
【００３４】
濾過装置
使用した濾過装置（図１）は、本体１００、流入口１１０、少なくとも０．５ｂａｒの圧力がかかった時のみ開口する０．５ｂａｒ絞り弁１２１を有する流出口１２０を具備する。濾過膜１３０は、孔径が０．２μｍで全表面積が６．２８ｃｍ２の４本の中空糸膜を具備する。濾過物が濾過流出口１２０を通過して回収チャンバー１４０に集められる。
【００３５】
別の濾過装置（図２）は、本体１００、流入口１１０、０．５ｂａｒの絞り弁１２１を有する流出口１２０、孔径０．２μｍの４本のポリプロピレン中空糸膜１３０を具備し、一方の末端１３１が塞がれており、他方の末端が０．２５ｂａｒの絞り弁１５１を有する内腔流出口１５０に連結されている。膜１３０の内腔へ通過する小さな粒子は、内腔流出口１５０を介して排出し、例えば、その後の回収および試験に使用される。
【００３６】
核酸精製
５×１ｍｌのヒツジ全血を、濾過装置（上記）に通過させた。５ｍｌのサンプルを装置でに通過させるのに要した全時間は、２分間であった。
【００３７】
ゲル電気泳動
０．８％アガロースおよび１×ＴＢＥ緩衝液（０．８ｇアガロース／１００ｍｌ緩衝液）を用いて０．８％アガロースゲルを調製した。精製工程からの濾過膜を細かく切断し、ゲルの上部に置き、１つのレーンには分子量マーカーをのせた。ゲルに１２５Ｖで３０分間通電した。ＤＮＡの染色により、膜の切片を置いたゲルの上部の７００ｂｐのバンドに強い染色が認められることが示された。これにより、膜によって高分子量のＤＮＡ鎖を回収することができることが示された。
【００３８】
実験を繰り返したが、ゲルを１２５Ｖで１．５日間泳動したが、やはり膜切片を置いたゲルの上部でＤＮＡの強い染色が認められ、これは非常に高分子量のＤＮＡ鎖の存在をさらに示唆するものである。
【００３９】
膜（精製ＤＮＡを保有する）を、３００μｌの水を含むエッペンドルフに入れ、３７℃の水浴で３０分間置いて核酸を溶出させた。次いで、溶液を取り出して３０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）および９００μｌのエタノールを添加し、−８０℃に５分間静置してＤＮＡを沈殿させた。次いで、沈殿したＤＮＡを、１３，０００ｒｐｍで５分間スピンしてペレット化した。次いで、上清を除去し、ペレットを懸濁し、懸濁物を分子量マーカーと共に０．８％アガロースゲルで１２５Ｖで１時間泳動した。ＤＮＡの視覚化により２３ｋｂを超えるサイズの尾を引いたバンドが認められた。
【００４０】
ＤＮＡの回収
ＤＮＡを上記のように膜から溶出し、ＤＮＡの回収量を吸収スペクトルを用いて計算した。これにより、血液１ｍｌあたりで利用可能な全ＤＮＡの６０％を超える量が、膜から回収されたことが示された。
【００４１】
ＰＣＲ試験
５ｍｌのヒツジ血液から回収された固定および溶出ゲノムＤＮＡの両方についてＰＣＲを行った。ＤＮＡを、上記のようにヒツジ全血から精製し、上記のように水または塩溶液を用いて溶出させた。ＰＣＲの条件を以下に示す：１×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、１００ｐｍｏｌｅ  ＣＲＥｂ（環状アデノシン一リン酸塩応答エレメント結合タンパク質）、０．６２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、２．５Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ、およびゲノムＤＮＡ鋳型。反応混合物を、９４℃で5分間静置してＤＮＡを変性し、９４℃２分、５０℃２分、および７２℃２分を２０サイクル行った。ＣＲＥＢの推定産物サイズは４９０ｂｐである。ＰＣＲ反応を完了したサンプルを、１．２％アガロースゲルで分析した場合、固定および溶出ゲノムＤＮＡのＰＣＲ反応産物は共に４９０ｂｐのフラグメントが認められた。上記と同一の反応条件に供したが、鋳型ＤＮＡを添加していないネガティブコントロールでは、ＰＣＲ産物は認められず、これは、プライマーの特異性およびゲノムＤＮＡの機能性を証明している。
【００４２】
光学顕微鏡
上記のように核酸精製後の濾過装置から膜を取り出し、細かく切断して光学顕微鏡に設置した。切片を、図３および図４に示し、各図は、膜２００の約５ｍｍを示し、これから長い鎖のＤＮＡ２１０を観察することができる。
【００４３】
図６は、本体１００、流入口１１０、膜１３０および回収チャンバー１４０に連結した絞り弁１２１を有する流出口１２０を具備する濾過装置を示す。濾過膜１３０は、回転マウンティング１８０、１８１と連結し、これらは電動機１７０によって回転する。回転マウンティングにより、防水シールで維持しながら膜１３０が回転し、信号発生器１６０によって得られる電流の通過が可能になり、それにより膜１３０上の核酸の操作が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明で使用した装置を示す。
【図２】  本発明で使用した装置を示す。
【図３】  図１のＩ−Ｉ断面の平面図を示す。
【図４】  膜（２０）の表面上で回収された核酸（１０）を示す。
【図５】  膜（２０）の表面上で回収された核酸（１０）を示す。
【図６】  膜を回転させる手段およびそれらの長さに沿って電流を印加する手段を有する、本発明で使用された装置を示す。
【図１】
0004703849.tif 000002
【図２】
0004703849.tif 000003
【図３】
0004703849.tif 000004
【図４】
0004703849.tif 000005
【図５】
0004703849.tif 000006
【図６】
0004703849.tif 000007