(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム及び機能的外因性キシロースイソメラーゼ遺伝子を有する遺伝子組換え酵母細胞であって、該遺伝子組換え酵母細胞が、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ又はＣａｎｄｉｄａ属であり、該外因性キシロースイソメラーゼ遺伝子は該酵母細胞内で機能的なプロモーター及びターミネーター配列と作動可能に連結し、更に、キシロースからキシリトールへの変換を触媒する酵素を産生する固有の機能的キシロースリダクターゼ遺伝子が欠失又は破壊され、固有のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子が欠失又は破壊され、前記酵母細胞内で機能的なプロモーター及びターミネーター配列と作動可能に連結した機能的外因性キシルロキナーゼ（xylulokinase）遺伝子を有することを特徴とする遺伝子組換え酵母細胞。
【請求項２】
機能的固有のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子が欠失又は破壊された請求項１に記載の遺伝子組換え酵母細胞。
【請求項３】
機能的外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をゲノムに更に組み込んだ請求項１又は２に記載の遺伝子組換え酵母細胞であって、該外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が該酵母細胞内で機能的なプロモーター及びターミネーター配列と作動可能に連結していることを特徴とする遺伝子組換え酵母細胞。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞をペントース糖を含む発酵培地で発酵条件下で培養することから成る発酵方法。
【請求項５】
ゲノムに組み込んだ機能的外因性キシロースイソメラーゼ遺伝子を有する遺伝子組換え酵母細胞であって、該遺伝子組換え酵母細胞が、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ又はＣａｎｄｉｄａ属であり、少なくとも１００ｍＵ／ｍｇのキシルロキナーゼ活性を有し、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を２ｍＵ／ｍｇ以下に減少させ、キシロースリダクターゼ活性を１０ｍＵ／ｍｇ以下に減少させた遺伝子組換え酵母細胞。
【請求項６】
前記酵母細胞内で機能的なプロモーター及びターミネーター配列と作動可能に連結した機能的外因性キシルロキナーゼ（xylulokinase）遺伝子を有する請求項５に記載の遺伝子組換え酵母細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、米国エネルギー省との契約番号DE-FC07-021D14349のもとに完成された。米国政府は本発明に対し一定の権利を有する。本出願は２００３年５月２日に出願された暫定米国出願番号６０／４６７，７２７の優先権を主張する。
この発明は、遺伝子組換え酵母に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界的な石油及び天然ガス供給原料は徐々に枯渇に向かっており、石油輸入国の一部は外国産の石油依存を減少させようと望み、より持続性のある経済の基礎を作り上げようと望むため、代替の供給原料から燃料、有機化学物質、プラスティックを作ろうと多くの労力が注がれてきた。発酵過程は天然に存在する糖源から様々な燃料、化学物質を作り出す可能性を提供する。例えば、エタノールは、かなりの量をグルコースの発酵から作られ、最も典型的には、グルコースはトウモロコシデンプンの加水分解によって得られる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅという酵母種は、発酵によってグルコースをエタノールに変換させる一般的なバイオ触媒である。
【０００３】
これらの糖は相対的に高価な炭素源である。例えば植物体加水分解物のようなバイオマスは、特に安価な炭素源を提供する可能性がある。バイオマスは、主にセルローズとヘミセルローズで構成されている。セルローズは、グルコースのようなヘキソース糖に分解できる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含め多くの酵母はヘキソース糖を効率的に代謝する。他方、ヘミセルローズはキシロースのようなペントース糖に富んでおり、従って、効率良い炭素利用のためにはペントース糖が同様に良く代謝されなければならない。キシロースをエタノール又は他の望まれている発酵産物に効率良く代謝する酵母は殆ど存在しない。そこで、バイオマス炭素源を用いることで充分な経済的な能力を発揮させるためには、効率良くキシロースを所望の発酵産物に変換できるバイオ触媒を提供することが必要である。
【０００４】
キシロースを発酵産物に代謝することができる様々なバクテリアがあるが、これらのバクテリアは、通常望まれるような単一の産生物が主要であるというより、一般的に、様々な産物の混合物を産する。よくある副産物は、バクテリアにとって時に有毒である。ある種のバクテリアは、代謝をコントロールしてホモエタノール（エタノール単独）への発酵を行うが、キシロースに富む基質の共通源である、リグノセルローズ加水分解物の中の過酷な反応条件では、これらバクテリアのエタノール産生の収率は低い。
【０００５】
バクテリアではしばしば混合物の産生が見られるが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母種は、ヘキソース糖を主にエタノールに変換することで知られている。いくつかの酵母種は、低ｐＨ条件に対し耐性があるとか、酢酸、フルフラールの様な発酵副産物に対し耐性があるとか、エタノールに耐性がある等の特性を有し、様々な種類の発酵過程に対する良い候補になりうる。
【０００６】
多くの酵母種はキシロース（仮にそうであれば）を複雑なルートを経て代謝するが、キシロースは、先ずキシロースリダクターゼ（ＸＲ）酵素によりキシリトールに還元される。キシリトールは、キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）酵素によりキシルロースに酸化される。その後、キシルロースは、ＸＫ酵素によりリン酸化される。此の経路は酵母では効率が悪く、その理由は細胞内で酸化還元不均衡が生まれるためである。キシロースからキシリトールへの段階はＮＡＤＨをコファクターとして用い、他方、キシリトールからキシルロースへの段階はＮＡＤＰＨをコファクターとして用いる。細胞内の酸化還元不均衡を回復させるために、他のプロセスが働く。このことは、有機体はキシロース又は他のペントース糖上では、嫌気的に生育できないことを意味している。
【０００７】
しかしながら、キシロースをエタノールに変換するために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母種に外因性のＸＲ及びＸＤＨ遺伝子を導入する試みがなされてきた（特許文献１〜３等）。組換え酵母はエタノールを効率よく産生しなかった。
【０００８】
他の有機体はキシロースをキシルロースに異性化することができ、さらにキシルロースをキシルロース−５−リン酸にリン酸化し、これは更に細胞の中心炭素経路を通り代謝される。この異性化反応は触媒酵素、キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）により促進され、リン酸化は、キシルロキナーゼ（ＸＫ）酵素により触媒される。この経路はバクテリアでは一般的であるが、酵母のような真核生物では比較的希である。この経路はキシロース−キシリトール−キシルロース経路にあるような酸化還元不均衡をもたらさない、従って、原理的には、より効率の良い嫌気的機序である。嫌気菌、ＰｉｒｏｍｙｃｅｓＥ２（ＡＴＣＣ７６７６２）種は、活性のあるＸＩ酵素を発現する遺伝子を有することで知られている。
【０００９】
しかしながら、いかなる野生型、又は組換え酵母種も、キシロース又は他のペントース糖供給原料から、所望の発酵産物を効率よく作り出すことはできなかった。ＰｉｒｏｍｙｃｅｓＥ２種のＸＩ遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入する試みはキシロース上で、発育速度が非常に遅いという結果になり、報告されたようなエタノール産生をもたらさなかった（非特許文献１、特許文献４）。
【００１０】
【特許文献１】ＵＳ特許５，８６６，３８２
【特許文献２】ＷＯ９５／１３３６２
【特許文献３】ＷＯ９７／４２３０７
【特許文献４】ＷＯ０３／０６２４３０Ａ１
【非特許文献１】Ｋｕｙｐｅｒ他、"カビのキシロースイソメラーゼの高水準機能発現：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるキシロースの効率的エタノール発酵への鍵？"ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（酵母研究雑誌）１５７４（２００３）１−１０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、キシロース及び他のペントース糖を所望の発酵産物に効率良く変換できる酵母種が大変望まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第１の側面として、本発明は、機能的外因性キシロースイソメラーゼ遺伝子を有する遺伝子組換え酵母細胞であって、この外因性キシロースイソメラーゼ遺伝子は酵母細胞内で機能を有するプロモーター及びターミネーター配列と作動可能に連結され、また更に、組換え酵母が本来有している、キシロースからキシリトールへの変換を触媒する酵素をコードする遺伝子が欠失又は破壊されている。
【００１３】
第２の側面として、本発明は、ゲノムに機能的外因性キシロースイソメラーゼ遺伝子を組み込んだＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ又はＣａｎｄｉｄａ属の遺伝子組換え酵母細胞であり、ここで外因性キシロースイソメラーゼ遺伝子は酵母細胞内で機能的なプロモーター又はターミネーター配列と作動可能に連結されている。
【００１４】
他の側面として、本発明は、機能的外因性キシロースイソメラーゼ遺伝子を有する遺伝子組換え酵母細胞であり、この外因性キシロースイソメラーゼ遺伝子は酵母細胞内で機能的なプロモーター及びターミネーター配列と作動可能に連結され、またこの酵母細胞は、細胞内で機能的なプロモーター及びターミネーター配列に作動可能に連結した機能的外因性キシルロキナーゼ遺伝子を有する。
【００１５】
更なる他の側面として、本発明は、キシリトールからキシルローゼ、又はキシルローゼからキシリトールへの反応を触媒する酵素を産する、機能的な固有の遺伝子が欠失又は破壊された、遺伝子組換え酵母細胞である。
他の側面として、本発明は、キシロースからキシリトールへの変換を触媒する酵素を産する本来の遺伝子が欠失又は破壊された、遺伝子組換え酵母である。
更に他の側面として、本発明は、ペントース糖を含む発酵培地という発酵条件の下で、前述の側面のいずれかの細胞が培養される発酵方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の遺伝子組換え酵母は、宿主酵母細胞にある遺伝子組換えを行うことで作成された。
【００１７】
適切な宿主酵母細胞は、Ｄ−キシロースからキシリトールへの変換を触媒しうる活性な酵素を産生する、少なくとも１個の固有の遺伝子を有する。この酵素は、キシロース→キシリトール還元に特異的であるか、又は非特異的である（即ち、ある範囲のペントース糖に働く）。この様な遺伝子で産生された酵素は、ＥＣ番号１．１．１．２１とか、また、正式にはアルジトール：ＮＡＤ（Ｐ）１−オキシドリダクターゼ等いろいろに呼称される。この様な遺伝子でコードされる酵素は、一般的に次の活性を有する：Ｄ−キシロース＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＝キシリトール＋ＮＡＤ＋（即ち、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨ又は両者をレドックスコファクターとして用いる）。キシロースリダクターゼ酵素を発現する遺伝子を、本文で"キシロースリダクターゼ遺伝子"又は"ＸＲ遺伝子"と呼称する。本文で、いくつかの例で、特別のＸＲ遺伝子を"ＸＹＬ１"遺伝子と呼称する。
【００１８】
"固有の"という語は、この種の、組換えを行っていない酵母細胞ゲノム内に見られる（機能に影響しない個体から個体への突然変異は別にして）遺伝物質（例えば、遺伝子プロモーター、又はターミネーター）に関して用いられる。
【００１９】
Ｄ−キシロースをキシリトールに変換できる宿主酵母細胞は、一般には、キシリトールを更にＤ−キシルロースに変換する固有の活性を有する。この反応は一般には、本文で"キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子"又は"ＸＤＨ遺伝子"と呼称する遺伝子にコードされている、キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）酵素を発現することによって行われる。この様な遺伝子によりコードされている酵素は、ＥＣ番号１．１．１．９、一般にはキシリトールデヒドロゲナーゼ、体系的にはキシリトール：ＮＡＤ＋２−オキシドリダクターゼ（Ｄ−キシルロース−生成）などいろいろに呼称される。これらの酵素は一般的には次の活性を有する：キシリトール＋ＮＡＤ（Ｐ）＋＝Ｄ−キシルロース＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（ＮＡＤ＋がはるかに好まれるコファクターであるが、いくつかの酵素は、ＮＡＤＰ＋を用いる）。特別のＸＤＨ遺伝子を本文で"ＸＹＬ２"遺伝子と命名する。適切な宿主細胞は、機能的なアルドースリダクターゼ又はキシロースリダクターゼ酵素及び、機能的なＸＤＨ酵素を産生する１又は２以上の固有な遺伝子を有する。本発明の文脈において、ある酵素はその通常の、又は意図された役割を行いうる場合に"機能的"である。本発明の文脈において、ある遺伝子が、機能的な酵素を発現する限り"機能的"である。
他の適切な宿主酵母細胞は、キシロースを細胞壁又は膜を横切って輸送する能力を有する。
【００２０】
他の適切な宿主酵母細胞は、キシロース−５−リン酸からグリセルアルデヒド−３−リン酸への本来の活性な経路を有する酵母のように、自然界でキシロースを用いて生育する酵母である。本発明において、もし野生型の細胞において、ヘキソース１リン酸経路により、少なくとも１０％のグルコースをベースにした糖が代謝されるならば、キシルロース−５−リン酸からグリセルアルデヒド−３−リン酸への経路は活性であると考える。好ましくは、少なくとも２０％、より好ましくは３０％、できうるならば４０％のリブロース−５−リン酸がこの経路で代謝される。
【００２１】
適切な宿主細胞は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ又はＣａｎｄｉｄａ属の酵母細胞である。特に興味のある酵母種としては、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ，Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ、Ｃ．ｄｉｄｄｅｎｓｉａｅ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｎａｅｏｄｅｎｄｒａ、Ｃ．ｂａｌｎｋｉｉ、Ｃ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、Ｃ．ｓｃｅｈａｔａｅ属である。Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ，Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ，Ｃ．ｓｃｅｈａｔａｅ等はキシロース上で生育する酵母細胞の例である。これらの細胞は、固有のキシルロース−５−リン酸からグリセルアルデヒド−３−リン酸への経路、本来の機能的なアルドース及び／又はキシロースリダクターゼ遺伝子、活性なキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、及び、キシロースの細胞壁又は膜を通した本来の輸送能を有する。好ましい宿主細胞としては、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ，Ｋ．ｌａｃｔｉｓ，Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ，Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ及びＣ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａである。
【００２２】
宿主細胞は、ここに特に記載した以外の遺伝子組換えを有してもよい。例えば、宿主細胞は、遺伝子組換えによりキシルロース−５−リン酸及び／又はグリセルアルデヒド−３−リン酸を代謝することで、特定の種類の発酵産物を産生してもよい（又は産生しなくとも良い）。この様な組換えの特別な例としては、本来のピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子の欠失又は破壊、及びＬ−乳酸脱水素酵素（Ｌ−ＬＤＨ）遺伝子又はＤ−乳酸脱水素酵素（Ｄ−ＬＤＨ）遺伝子のような外来遺伝子の挿入がある。この種の組換え方法は例えば、ＷＯ９９／１４３３５，ＷＯ００／７１７３８，ＷＯ０２／４２４７１，ＷＯ０３／１０２２０１，ＷＯ０３／１０２１５２及びＷＯ０３／０４９５２５に記載されている。宿主細胞において、この様な組換えは本文で記載したような、更なる組換えの前に行われても良いし、同時でも良いし、本文で記載したような、更なる組換えの後でも構わない。
【００２３】
本発明のある側面において、遺伝子組換え酵母細胞は、宿主細胞のゲノムに選択的に組み込まれた機能的外因性キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）遺伝子を有する。この文脈において、"外因性"とは（１）ＸＩ遺伝子は宿主細胞にとって固有でない、（２）ＸＩ遺伝子は宿主細胞にとって固有であるが、宿主細胞のゲノムは組換えにより、固有のＸＩ遺伝子が重複し、さらなる機能的複数コピーを有する、又は（３）（１）及び（２）の両方である。適切なＸＩ遺伝子の例としては、嫌気菌以外に（Ｇｅｎｂａｎｋ（寄託番号ＡＪ２４９９０９）に登録されている遺伝子配列をコードするＰｉｒｏｍｙｃｅｓＥ２種ｘｙｌＡのような）ＰｉｒｏｍｙｃｅｓＥ２種及び、Ｃｙｌｌａｍｙｃｅｓ  ａｂｅｒｅｎｓｉｓに固有なＸＩ遺伝子がある。ＰｉｒｏｍｙｃｅｓＥ２種及び、Ｃｙｌｌａｍｙｃｅｓ  ａｂｅｒｅｎｓｉｓＸＩ遺伝子の塩基配列は、それぞれ配列番号５８及び１５１として表わされている。これらのＸＩ遺伝子により産生されるタンパク質の予想アミノ酸配列は、それぞれ配列番号５９及び１５２として表わされる。ある適切なバクテリアＸＩ遺伝子は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎに固有なものである。このＢ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＸＩ遺伝子は配列番号１６２として表わされる。この遺伝子により産生される酵素の予想されるアミノ酸配列は、配列番号１６３として表わされる。適切なＸＩ遺伝子は、配列番号５８又は１５１に少なくとも６０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％相同性のある遺伝子からなる。適切なＸＩ遺伝子は、配列番号５９又は１５２に少なくとも６０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％相同性のある酵素をコードする遺伝子からなる。いくつかの適切なキシロースイソメラーゼ遺伝子は、配列番号５８に９５％以上又は９０％以上相同ではない、又は配列番号５９に９５％以上又は９０％以上相同ではない酵素をコードする。他の適切なキシロースイソメラーゼ遺伝子は、配列番号１６２に少なくとも６０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％相同性のあるバクテリアのキシロースイソメラーゼ遺伝子であるか、又は配列番号１６３に少なくとも６０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％相同性のある酵素を産生する。
【００２４】
アミノ酸配列のパーセント相同性は、デフォルトのパラメーターによるＢＬＡＳＴバージョン２．２．１ソフトウェアーを使い手軽に計算できる。デフォルトのパラメーターによりＢＬＡＳＴバージョン２．２．１ソフトウェアーを用い、少なくともＸＸ％という、Ｉｄｅｎｔｉｔｙ  Ｓｃｏｒｅ（一致の割合の値）及びＰｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｃｏｒｅ（陽性か擬陽性を示す）を有する配列は、少なくともＸＸ％相同であると考えられる。特に適切なキシロースイソメラーゼ遺伝子は、配列番号１６３と比較し少なくとも６０％のｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｓｃｏｒｅを有し、配列番号５９と比較し９５％以下のｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｓｃｏｒｅを有し、また配列番号５９と比較し９７％以下のｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｃｏｒｅを有する酵素をコードする遺伝子からなる。
【００２５】
外因性のＸＩ遺伝子は、組換え酵母細胞内で機能的なプロモーター及びターミネーターの制御下にある。
本文で用いたように、"プロモーター"という術語は、構造遺伝子（一般的には１から１０００ｂｐ、好ましくは１から５００ｂｐ、特に１から１００ｂｐ）の翻訳開始コードンの上流（即ち、５’側）に位置する非転写配列を表し、構造遺伝子の転写開始を制御する。同様に、"ターミネーター"という術語は構造遺伝子（一般的には１から１０００ｂｐ、好ましくは１から５００ｂｐ、特に１から１００ｂｐ）の翻訳終結コードンの下流（即ち、３’側）に位置する非転写配列を表し、構造遺伝子の転写の終結を制御する。もし、ゲノム内での構造遺伝子の位置に対して、プロモーター及びターミネーターが（場合によっては）転写制御を行う位置にあるならば、"プロモーター"及び"ターミネーター"は構造遺伝子に"作用上連結"している。
【００２６】
プロモーター及びターミネーター配列は酵母細胞に固有であるか、又は外因性である。細胞に固有なプロモーター及びターミネーター配列の機能的部分に対して極めて高い相同性（即ち、９０％又はそれ以上、特に９５％又はそれ以上、最も好ましくは９９％又はそれ以上相同）の機能的部分を有するプロモーター及びターミネーター配列は、同様に有用であるが、外来遺伝子の挿入が細胞内ゲノムの特異的な位置を標的とする場合は、特に有用である。
【００２７】
適切なプロモーターは、酵母遺伝子に固有なプロモーターに少なくとも９０％、９５％又は９９％相同性がある。より適切なプロモーターは、宿主細胞に固有な遺伝子のプロモーターに少なくとも９０％、９５％又は９９％相同性がある。特に有用なプロモーターとしては、酵母のピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ），ホスホグリセラートキナーゼ（ＰＧＫ），キシロースリダクターゼ（ＸＲ），キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）及び転写促進因子―１（ＴＥＦ−１）遺伝子に対するプロモーターがあり、特にこの様な遺伝子が宿主細胞に固有な場合は有用である。
【００２８】
適切なターミネーターは、酵母遺伝子に固有なターミネーターに少なくとも９０％、９５％又は９９％相同性がある。より適切なターミネーターは、宿主細胞に固有な遺伝子のターミネーターに少なくとも９０％、９５％又は９９％相同性がある。特に有用なターミネーターとしては、酵母のピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ），キシロースリダクターゼ（ＸＲ），キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ），又はイソ−２−チトクロームＣ（ＣＹＣ）遺伝子のターミネーター、又は酵母のガラクトースファミリー遺伝子のターミネーター、特に所謂ＧＡＬ１０ターミネーターがある。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＧＡＬ１０ターミネーター及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＹＣ１ターミネーターは、酵母における外因性ＸＩ遺伝子の有効なターミネーターであることが示されている。
【００２９】
（宿主細胞に）固有なプロモーター及びターミネーターをこれらの上流、下流隣接領域と共に用いることにより、ＸＩ遺伝子を宿主細胞のゲノムの特異的な位置に組み込むことができ、また、ＸＩ遺伝子の組み込みと同時に例えば、ＸＲ，ＸＤＨ又はＰＤＣ遺伝子のような他の固有な遺伝子を欠失させることができる。
【００３０】
ＸＩ遺伝子の３´末端にはポリ−ｈｉｓ（ヒスチジン）末尾が存在してもよい。これを行う方法を以下実施例３に記載する。しかしながら、ポリ−Ｈｉｓ末尾があると、ＸＩ遺伝子の性能が低下する。ポリ−Ｈｉｓ末尾は本発明において重要ではないので、望むならば、省略できる。
【００３１】
外因性のＸＩ遺伝子は、宿主細胞のゲノムにランダムに組み込まれるか、又は１又は２以上の標的位置に挿入される。標的とされる位置の例としては、ＸＲ，ＸＤＨ又はＰＤＣ遺伝子のような、好ましくは欠失又は破壊される遺伝子座位がある。いくつかの実施例において、固有のＰＤＣ遺伝子部位に隣接してＸＩ遺伝子を組み込むと、組換え酵母細胞が発酵産物を産生する成績の改良に関係するようである。ＰＤＣ遺伝子座位での組み込みは、固有ＰＤＣ遺伝子の欠失又は破壊を伴い、又は、伴わず行われるが、固有ＰＤＣ遺伝子をそのまま機能的に維持することが好ましく、特に、所望の発酵産物がエタノールであるか、又はピルビン酸代謝物である他の産生物である場合には好ましい。
【００３２】
標的遺伝子の上流（５'−）及び下流（３'−）隣接領域に相同性のある領域を有するベクターを設計することで、標的遺伝子への組み込みを行うことができる。２つの領域のどちらか一方は、標的遺伝子の解読領域の部分を用いてもよい。ＸＩカセット（標的遺伝子のプロモーター及びターミネータ領域と異なるならば、繋がっているこれらの領域も含まれる）及び選択マーカー（必要に応じて繋がっているプロモーター及びターミネータと共に）は、ベクター上で、標的遺伝子の隣接した上流及び下流領域に相同性のある領域の間に位置する。
【００３３】
遺伝子組換えした酵母細胞は、外因性のＸＩ遺伝子を１コピー又は複数コピー有することができる。もし外因性の複数コピーのＸＩ遺伝子があるならば、２−８又は２−５コピーのように、２から１０コピー又はそれ以上のコピー数の遺伝子が存在する。外因性の複数コピーのＸＩ遺伝子は宿主細胞ゲノムの単一遺伝子座位（これらの遺伝子はお互いに隣り合う）に組み込まれるか、又はいくつかの遺伝子座位に組み込まれる。特に興味のある実施例に於いては、外因性の複数コピーのＸＩ遺伝子が、固有なＰＤＣ遺伝子が欠失又は破壊された、又はされてない固有なＰＤＣ遺伝子座位、又はそれに隣接して組み込まれる。
異なる外因性のＸＩ遺伝子が、異なったタイプのプロモーター、及び／又はターミネーターの制御下に置かれることは可能である。
【００３４】
特に嫌気的条件において、組換え酵母はそのゲノムに１又は２以上の更なる組換えを行う、及び／又はある種の特徴を有する宿主細胞を選択することで、その性能が向上する。この様な例としては、（１）低いＸＲ（又は他のアルドースリダクターゼ）活性、（２）低いＸＤＨ活性及び（３）ＸＫ過剰発現、の中の１又は２以上が挙げられる。
【００３５】
宿主細胞は、本来、又は組換えにより、低いアルドースリダクターゼ活性を有してもよい。以下実施例４Ｅに記載したように、低いアルドースリダクターゼ活性としては、１０ｍＵ／ｍｇ又は５ｍＵ／ｍｇ以下が適切である。もし宿主細胞が、キシロースからキシリトールへの変換を触媒する酵素を産生する１又は２以上のアルドースリダクターゼ遺伝子を有するならば、１又は２以上のこの遺伝子を欠失又は破壊することが適切である。一般的に、破壊又は欠失するよう選ばれる遺伝子は、個別に又は集合的に（１）宿主細胞のキシロース→キシリトール還元活性の少なくとも４０％、好ましくは５０％以下である、及び／又は（２）キシロース→キシリトール還元に特異的な酵素をコードするＸＲ遺伝子である。一般的には、少なくとも１つのＸＲ遺伝子を欠失又は破壊することが好まれる。欠失又は破壊により、好ましくは酵素活性の５０％低下が望まれるし、より好ましくは、キシロースリダクターゼ活性を１０ｍＵ／ｍｇ又は５ｍＵ／ｍｇ以下が望まれる。
【００３６】
"欠失又は破壊"により、遺伝子の全解読領域が削除（欠失）する、又は遺伝子又はそのプロモーター及び／又はターミネーター領域が組換えられ（欠失、挿入又は突然変異）、その結果遺伝子は最早、活性な酵素を産生できない、又は活性が非常に落ちた酵素を産生することを意味する。欠失又は破壊は、遺伝子組換え法、強制進化、突然変異及び／又は選択、又はスクリーニングにより行われる。ＸＲ又は非特異的アルドースリダクターゼ遺伝子の場合、欠失又は破壊をする適切な方法は、遺伝子に隣接した上流、下流領域（遺伝子の解読領域の一部を含んでも良い）をクローン化し、クローン化した隣接上流、下流領域からなるベクターを作り、このベクターで宿主細胞を形質転換することによって行うことができる。このベクターは、マーカー遺伝子、又は宿主細胞のゲノムの固有なＸＲ、又は（ＸＩ遺伝子、又はＸＫ遺伝子、又は細胞がＬ−又はＤ−ＬＤＨ遺伝子のような所望の発酵産物を産生できる遺伝子のような）非特異的アルドース遺伝子の座位に望み通り組み込まれる他の遺伝子の様な、他の遺伝子素材を保持してもよい。
【００３７】
ＸＲ遺伝子又は非特異的アルドースリダクターゼ遺伝子を欠失させる１つの方法は、宿主細胞を、標的遺伝子の隣接上流（５'−）及び下流（３'−）領域に相同性のある領域からなる、ベクターで形質転換することである。この様な隣接領域の配列は、例えばＰＣＲで、適切に設計したプライマーと、鋳型としてゲノムＤＮＡを用い、適切な領域を増幅することで得ることができる。ベクターは、遺伝子の全機能的部分を含んではならないが、これらの領域のいずれか一方は、標的遺伝子の解読領域の一部分を含んでも構わない。この様な隣接領域の配列は、一般的に少なくとも５０塩基対であり、又は、少なくとも１００塩基対、又は少なくとも５００塩基対である。理論的には隣接配列の長さに上限はないが、好ましくは４０００塩基対まで、より好ましくは１２００塩基対までの長さである。隣接配列は、対応する細胞ゲノムの配列に対し、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは９８％、またさらにより好ましくは９９％相同性を有する。これらの隣接配列には、標的遺伝子の、それぞれ、プロモーター及びターミネーター配列が含まれる。更に、ベクターには、標的遺伝子の隣接上流領域と下流領域に相同性のある領域の間に位置することが有利である、１又は２以上の（必要に応じてプロモーター及びターミネーターと結合した）選択マーカーカセットが含まれる。この様なベクターは、相同的再結合により標的遺伝子を欠失させ、欠失した標的遺伝子の座位に、選択マーカー遺伝子を挿入させる。ベクターには、選択マーカカセットの代わりに、又は加えて、ＸＩ発現カセット、Ｌ−又はＤ−ＬＤＨカセット、又はキシルロキナーゼ発現カセットのような、他の発現カセットからなることもできる、またこれら全てのカセットはプロモーター及びターミネーターと結合していてもよい。ベクターは、ＷＯ０３／１０２１５２に記載されているように、自然発生のループアウト（消失）事象を利用するよう設計できる。
【００３８】
宿主細胞は、本来低いキシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有してもよいし、又は有するよう組換えしてもよい。以下実施例６Ｂで記載する方法で測定する、低いキシリトールデヒドロゲナーゼ酵素活性としては、２ｍＵ／ｍｇ又は１ｍＵ／ｍｇ以下が適切である。もし宿主細胞が、１又は２以上のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有し、その為に高いキシリトールデヒドロゲナーゼ酵素活性を示すならば、１又は２以上のこれらの遺伝子を破壊又は欠失させることが適切である。ＸＤＨ遺伝子を、アルドースリダクターゼ遺伝子の欠失又は破壊に関する前の記載と類似した方法で、欠失又は破壊することができる。ＸＲ又は非特異的アルドースリダクターゼ遺伝子の代わりに、ＸＤＨ遺伝子の隣接上流及び下流領域を形質転換ベクターに取り込むことで、欠失を行うことができる。
【００３９】
前と同様、ベクターは１又は２以上の選択マーカーカセット、及び／又は他の発現カセットを有することができる。欠失又は破壊は、好ましくは酵素活性を少なくとも５０％減少させ、より好ましくはキシリトールデヒドロゲナーゼ活性を２ｍＵ／ｍｇ又は１ｍＵ／ｍｇ以下にさせる。
【００４０】
組換え細胞は、活性を以下の実施例５Ｅに記載した方法で測定し、少なくとも３００ｍＵ／ｍｇ、又は少なくとも５００ｍＵ／ｍｇである、好ましくは少なくとも１００ｍＵ／ｍｇである、活性を有するキシルロキナーゼ酵素を発現する。キシルロキナーゼ酵素は、ＥＣ２．７．１．１７及び、体系的にはＡＴＰ：Ｄ−キシルロース５−ホスホトランスフェラーゼとしていろいろに呼称される。この活性は一般的にＡＴＰ＋Ｄ−キシルロース＝ＡＤＰ＋Ｄ−キシルロース５−リン酸キシルロキナーゼ（ＸＫ）である。過剰発現は、例えば、強制進化（酵素を過剰発現する突然変異体を有利に選択する条件下で）、突然変異誘発、又は宿主細胞ゲノムに１又は２以上の機能的、外因性のキシルロキナーゼ遺伝子を組み込むことにより行うことができる。この文脈において、"外因性"とは（１）ＸＫ遺伝子は宿主細胞に固有でない、（２）ＸＫ遺伝子は宿主細胞に固有であるが、宿主細胞のゲノムは組換えられて固有ＸＫ遺伝子を機能的にさらに複数コピー有する、又は（３）（１）及び（２）の両者であることを意味する。適切なキシルロキナーゼ遺伝子の例としては酵母キシルロキナーゼ遺伝子がある。適切なＸＫ遺伝子の例としては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＸＫ遺伝子（ＳｃＸＫＳ１）がある。ＳｃＸＫＳ１遺伝子の塩基配列は、配列番号８３として表わされている。ＳｃＸＫＳ１遺伝子により産生される酵素の予想アミノ酸配列は、配列番号８４として表わされている。適切なＸＫ遺伝子としては、配列番号８３に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％相同性の遺伝子がある。適切なＸＫ遺伝子としては、配列番号８４に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％相同性の酵素をコードする遺伝子がある。他の適切なＸＫ遺伝子としては、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ又はＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓに固有な遺伝子があり、又はどちらかの遺伝子に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％相同性の遺伝子である。
【００４１】
外因性のＸＫ遺伝子は、組換え酵母細胞内で機能的な、プロモーター及びターミネーターの制御下にある。適切なプロモーター及びターミネーター配列は、宿主細胞に固有であってもよいし、又は固有のプロモーター又はターミネーターに高い相同性（即ち、９０％又はそれ以上、特に９５％又はそれ以上、最も好ましくは９９％又はそれ以上の相同性）を示すものである。この様なプロモーター及びターミネーターは、外因性のＸＫ遺伝子が宿主細胞ゲノムの特異的座位を標的にする場合には、特に有用である。他の適切なプロモーター及びターミネーターは、ＸＫ遺伝子を得た有機体に固有のものであるか、又はこの様な固有のプロモーター及び／又はターミネーターに同様高い相同性を示す。例えば、上記同定されたＳｃＸＫＳ１遺伝子に対する、適切なプロモーター及びターミネーターとしては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対するプロモーター及びターミネーターがある。
プロモーター及び／又はターミネーターは特定のＸＫ遺伝子に固有のものであってもよいし、このようなプロモーター及び／又はターミネーターに高い相同性を示すものでもよい。
【００４２】
ＳｃＸＫＳ１遺伝子に対し特に有用なプロモーターとしては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ），ホスホグリセラートキナーゼ（ＰＧＫ），キシロースリダクターゼ（ＸＲ），キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）及び転写促進因子―１（ＴＥＦ−１）プロモーターがある。ＳｃＸＫＳ１遺伝子に対し、特に有用なターミネーターとしては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ），キシロースリダクターゼ（ＸＲ），キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）又はイソー２−チトクロームｃ（ＣＹＣ）ターミネーター、又は酵母ガラクトースファミリー遺伝子のターミネーター、特に所謂ＧＡＬ１０ターミネーターがある。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＧＡＬ１０ターミネーター及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＹＣ１ターミネーターは、酵母中の外因性ＸＩ遺伝子の有効なターミネーターであることが報告されている。
【００４３】
外因性のＸＫ遺伝子は宿主細胞ゲノムにランダムに組み込まれるか、又は、既に考察したようにＸＲ遺伝子を挿入する際の方法に類似した方法を用い、１又は２以上の標的座位に挿入される。標的位置の例としては、ＸＲ，ＸＤＨ又はＰＤＣ遺伝子のように、欠失又は破壊することが望まれる遺伝子座位がある。前と同様、標的遺伝子の隣接上流（５'−）及び下流（３'−）領域に相同性のある領域を有するベクターをデザインすることで、標的への組み込みを行うことができる。２つの領域のどちらか一方は、標的遺伝子の解読領域の部分であってもよい。ＸＫカセット（標的遺伝子のプロモーター及びターミネーター領域と異なるならば、これらの領域も含めて）及び選択マーカー（必要に応じてプロモーター及びターミネーターと共に）は、ベクター上で、標的遺伝子の隣接した上流及び下流領域に相同性のある領域の間に位置する。
【００４４】
遺伝子組換えした酵母細胞は、外因性のＸＫ遺伝子を１コピー又は複数コピー（２−８又は２−５コピーのように、２から１０コピー又はそれ以上）有することができる。外因性の複数コピーのＸＫ遺伝子は、宿主細胞ゲノムの単一遺伝子座（これらの遺伝子はお互いに隣り合う）に組み込まれるか、又はいくつかの遺伝子座に組み込まれる。異なる外因性のＸＫ遺伝子が、異なったタイプのプロモーター、及び／又はターミネーターの制御下に置かれることは可能である。
【００４５】
本発明によると、キシロースリダクターゼ活性が低く、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性が低く、またキシルロキナーゼ活性を過剰発現する細胞は優れた宿主細胞であり、宿主細胞内で、外因性のキシロースイソメラーゼ遺伝子を活性でスクリーニングできる。
このような遺伝子組換えにより、細胞環境はキシロースイソメラーゼ発現に有利な環境を作り出すので、もしある遺伝子が実際活性を有していたならば、その活性が細胞内の環境で抑制される可能性は低く、従って、細胞内で測定可能となる。
【００４６】
宿主細胞の遺伝子組換えは、適切なベクターを設計、構築し、また宿主細胞をこのベクターで形質転換することで、１又は２以上の段階で遂行できる。電気穿孔法及び／又は（塩化カルシウム又は酢酸リチウムを基礎とした）化学的形質転換法が用いられる。酵母株の形質転換法は、ＷＯ９９／１４３３５，ＷＯ００／７１７３８，ＷＯ０２／４２４７１，ＷＯ０３／１０２２０１，ＷＯ０３／１０２１５２及びＷＯ０３／０４９５２５に記載されている；これらの方法は、本発明に従って宿主細胞を形質転換する際一般的に適用可能である。形質転換に用いるＤＮＡは、特定の制限酵素で切断するか又は環状ＤＮＡが用いられる。
【００４７】
形質転換ベクター設計の一般的な扱い方については、一般的意味では既に論じた。いくつかの特殊な形質転換ベクター設計を以下に示すが、構成要素を読み取り／転写の順に記載した。全ては環状化又は線型化されている。全て、各種の線型化又は断片化のための制限部位を含んでいる。ベクターは更に（商品として酵母又はバクテリアベクターとして容易に入手できる、Ｅ．ｃｏｌｉで増殖させるための）バックボーン部分を有する。
【００４８】
１．宿主細胞ＸＲ遺伝子の上流（５｀−）領域；マーカー発現カセット、宿主ＸＲ遺伝子の宿主下流（３'−）領域。マーカー発現カセットは、必要に応じてプロモーター及びターミネーターを含む、ヒグロマイシン、Ｕｒａ３又はＧ４１８耐性発現カセットであってもよい。Ｕｒａ３カセットは、ＨｉｓＧ−Ｕｒａ３−ＨｉｓＧカセットでもよい。Ｇ４１８カセットには、ＳｃＰＤＣ１プロモーター及び、ＳｃＧＡｌ１０ターミネーターが含まれてもよい。
２．（１）と同様、（遺伝子に作動可能に連結したプロモーター及びターミネーターを含め）ＸＩカセットは宿主細胞ＸＲ遺伝子の５'−及び３'−領域の間に位置する。ＸＩカセットには、宿主細胞に固有なプロモーターがあってもよい。ＸＩカセットには、ＳｃＣＹＣ１又はＳｃＧＡＬ１０ターミネーターがあってもよい。
３．（１）、（２）と同様、（遺伝子に作動可能に連結したプロモーター及びターミネーターを含め）ＸＫカセットは宿主細胞ＸＲ遺伝子の５'−及び３'−領域の間に位置する。ＸＫカセットには、宿主細胞に固有のプロモーター又はＳｃＴＥＦ１プロモーターがあってもよい。ＸＩカセットはＳｃＣＹＣ１又はＳｃＧＡＬ１０ターミネーターがあってもよい。
【００４９】
４．宿主細胞ＸＤＨ遺伝子の上流（５'−）領域、マーカー発現カセット、宿主ＸＤＨ遺伝子の下流（３'−）領域。マーカー発現カセットは、必要に応じてプロモーター及びターミネーターを含むヒグロマイシン、Ｕｒａ３又はＧ４１８耐性発現カセットであってもよい。Ｕｒａ３カセットは、ＨｉｓＧ−Ｕｒａ３−ＨｉｓＧカセットでもよい。Ｇ４１８カセットには、ＳｃＰＤＣ１プロモーター及び、ＳｃＧＡｌ１０ターミネーターがあってもよい。
５．（４）と同様、（遺伝子に作動可能に連結したプロモーター及びターミネーターを含め）ＸＩカセットは宿主ＸＲ遺伝子の５'−及び３'−領域の間に位置する。ＸＩカセットには、宿主細胞に固有のプロモーターがあってもよい。ＸＩカセットには、ＳｃＣＹＣ１又はＳｃＧＡＬ１０ターミネーターがあってもよい。
６．（４）又は（５）と同様、（遺伝子に作動可能に連結したプロモーター及びターミネーターを含め）ＸＫカセットは宿主細胞ＸＲ遺伝子の５'−及び３'−領域の間に位置する。ＸＫカセットには、宿主細胞に固有のプロモーター又はＳｃＴＥＦ１プロモーターがあってもよい。ＸＩカセットには、ＳｃＣＹＣ１又はＳｃＧＡＬ１０ターミネーターがあってもよい。
【００５０】
７．ＨｉｓＧ−Ｕｒａ３−ＨｉｓＧカセットは、ＸＩカセット又はＸＫカセットに先行するか、又は後から続く。
８．あるＸＩカセットには、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓプロモーター又はＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓプロモーターがあり、ＸＩカセットは、マーカー発現カセットに先行するか、後から続く。Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ又はＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓプロモーターは、ＰＤＣ又はＰＧＫプロモーターでもよい。ＸＩカセットのターミネーターはＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ、又はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅターミネーターで良く、特にＳｃＣＹＣ１又はＳｃＧＡＬ１０ターミネーターでもよい。マーカー発現カセットは、必要に応じてプロモーター及びターミネーターを含むヒグロマイシン、Ｕｒａ３又はＧ４１８耐性発現カセットであってもよい。Ｕｒａ３カセットはＨｉｓＧ−Ｕｒａ３−ＨｉｓＧカセットでもよい。Ｇ４１８カセットには、ＳｃＰＤＣ１プロモーター、及びＳｃＧＡｌ１０ターミネーターがあってもよい。ＸＩカセットには、また（以下９で記載するように）ＸＫカセット、ＸＩカセットの上流又は下流、及びマーカー発現カセットの上流又は下流があってもよい。
【００５１】
９．ＸＫカセットは、マーカー発現カセットに先行するか、又は後から続く。ＸＫカセットには、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ、又はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプロモーターがあってもよい。ＸＫカセットプロモーターは特に、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、又はＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓＰＤＣ、又はＰＧＫ；又はＳ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅＰＤＣ，ＰＧＣ、又はＴＥＦ−１プロモーターでもよい。ＸＫカセットのターミネーターはＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ又はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅターミネーターでも良く、また、特にＳｃＣＹＣ１又はＳｃＧＡＬ１ターミネーターであってもよい。
マーカー発現カセットは、必要に応じてプロモーター及びターミネーターを含むヒグロマイシン、Ｕｒａ３又はＧ４１８耐性発現カセットであってもよい。Ｕｒａ３カセットはＨｉｓＧ−Ｕｒａ３−ＨｉｓＧカセットでもよい。Ｇ４１８カセットには、ＳｃＰＤＣ１プロモーター及び、ＳｃＧＡｌ１０ターミネーターがあってよい。
【００５２】
１０．宿主細胞ＸＲ遺伝子の上流（５'−）領域は、ＸＩカセット、ＸＫカセット又は両者に先行し、その後宿主ＸＲ遺伝子の下流（３'−）領域が続く。このベクターは、ＸＲ遺伝子の上流及び下流領域の間に他の構成要素を含んでもよい。
１１．宿主細胞ＸＤＨ遺伝子の上流（５'−）領域は、ＸＩカセット、ＸＫカセット、又は両者に先行し、その後、宿主ＸＤＨ遺伝子の下流（３'−）領域が続く。このベクターには、ＸＤＨ遺伝子の上流及び下流領域の間に他の構成要素があってもよい。
１２．上記全てのプラスミドは、宿主細胞で活性な自己複製部位を有する。
【００５３】
前述のベクターの中で有用な特別のＸＩカセットとには、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓＰＤＣ１（ＫｍＰＤＣ１）プロモーター、ＸＩ遺伝子（上記いずれのでも）、ＳｃＣＹＣ１，ＳｃＧＡＬ１０又はＫｍＰＤＣ１ターミネーター；Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓＰＤＣ１（ＣｓＰＤＣ１）プロモーター、ＸＩ遺伝子及びＳｃＣＹＣ１，ＳｃＧＡＬ１０又はＣｓＰＤＣ１ターミネーター；及びＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓＰＧＫ（ＣｓＰＧＫ）プロモーター、ＸＩ遺伝子及びＳｃＣＹＣ１，ＳｃＧＡＬ１０又はＣｓＰＤＣ１ターミネーターが含まれる。
【００５４】
前述のベクターの中で有用な特別のＸＫカセットとしては、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓＰＤＣ１（ＫｍＰＤＣ１）プロモーター、ＸＫ遺伝子（上記いずれのでも良いが、特にＳｃＸＫＳ１遺伝子）、ＳｃＣＹＣ１，ＳｃＧＡＬ１０又はＫｍＰＤＣ１ターミネーター；Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓＰＤＣ１（ＣｓＰＤＣ１）プロモーター、ＸＫ遺伝子及びＳｃＣＹＣ１，ＳｃＧＡＬ１０又はＣｓＰＤＣ１ターミネーター；及びＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓＰＧＫ（ＣｓＰＧＫ）プロモーター、ＸＫ遺伝子及びＳｃＣＹＣ１，ＳｃＧＡＬ１０又はＣｓＰＤＣ１ターミネーター；及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴＥＦ−１（ＳｃＴＥＦ１）プロモーター、ＸＫ遺伝子及びＳｃＣＹＣ１，ＳｃＧＡＬ１０又はＣｓＰＤＣ１ターミネーターが含まれる。
【００５５】
上記記載の特別の選択マーカー遺伝子に加えて、典型的選択マーカー遺伝子は以下のタンパク質をコードする即ち、（ａ）抗生物質又は他の、ゼオシン（Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン耐性遺伝子）、Ｇ４１８（Ｔｎ９０３のカナマイシン耐性遺伝子）、ヒグロマイシン（Ｅ．ｃｏｌｉのアミノグリコシド抗生物質耐性遺伝子）、アムピシリン、テトラサイクリン、のような毒物、又は宿主細胞に対するカナマイシンに耐性を示す；（ｂ）アミノ酸ロイシン欠乏株（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓＬｅｕ２遺伝子）又はウラシル欠乏株（即ち、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ又はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＵｒａ３遺伝子）のように、細胞の栄養要求性を補足する；（ｃ）単純な培地には欠けている必要な栄養を供給する、又は（ｄ）特定の炭素源を用いる細胞の増殖能を補足するタンパク質である。
キシロース  イソメラーゼ遺伝子は、キシロース上での増殖能をもとにし選択を行うことで、上記のように働く。
【００５６】
成功した形質転換体は、マーカー遺伝子に依存した条件、又は挿入遺伝子の他の特性（例えば、キシロース上での増殖能）を利用して、既知の方法で選択できる。望みの挿入又は欠失が行われたか確認のため、コピー数の確認のため、遺伝子の宿主細胞のゲノムへの組み込み位置の同定のために、ＰＣＲ又はＳｏｕｔｈｅｒｎ分析を用いたスクリーニングを行うことができる。挿入遺伝子にコードされた酵素活性、及び／又は、欠失した遺伝子によりコードされた酵素活性の消失は、既知の検定法で確認できる。
【００５７】
外因性のＸＩ遺伝子を有する、本発明の遺伝子組換え酵母細胞は、ペントース糖を発酵させエタノール及び乳酸のような希望の発酵産物を得るのに用いられる。酵母がある産生物を容認できる収量、タイター、及び／又は、産生力で産生できるようになるためには、ある種の追加的な遺伝子組換えが必要となろう。以前に論じたように、例えば、外因性のＬＤＨ遺伝子の組み込み、及び固有のＰＤＣ遺伝子の欠失が、高収率の乳酸を得るためには必要であろう。
【００５８】
本発明の発酵過程において、本発明の細胞を、ペントース糖を含む発酵培地の中で培養する。ペントース糖は好ましくは、キシロース、キシラン、又は、キシロースの他のオリゴマーである。この様な糖は、ヘミセルロースを含むバイオマスの適切な加水分解産物である。発酵培地には、特に、デキストロース（グルコース）、フラクトース、グルコースのオリゴマーのようなヘキソース糖、及びピラノースのような他の糖が同様に含まれていてもよく、グルコースのオリゴマーとしては、マルトース、マルトトリオース及びイソマルトトリオースがある。オリゴマー糖の場合、発酵培養液に酵素を加え、オリゴマー糖を対応するモノマー糖へ消化することが必要である。
【００５９】
典型的な培地は、窒素源（アミノ酸タンパク質、アンモニア又はアンモニウム塩、その他などの無機窒素源の様な）特定の細胞に必要な栄養素、及び様々なビタミン、無機物その他を含む。
【００６０】
温度、細胞密度、基質の選択、栄養素の選択等の、他の発酵条件は本発明にとって重要とは考えられず、一般的に経済性のために選ばれる。勿論、最適温度は特定の微生物によって決まるであろうが、増殖期及び産生期の温度は培地の凍結温度から約５０℃迄の幅がある。
特に、産生期に好ましい温度は約３０−４５℃である。細胞が組換えＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓの場合、このバクテリアは比較的高温（４０℃以上５０℃まで、特に４５℃まで）を許容する。他の好ましい細胞、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓは約４０℃までを許容する。この温度範囲では、産生力を損失することなく、発酵をこの様な高温（冷却コストを減らすことができる）で行える可能性がある。優れた高温許容の他の利点は、発酵が他の望ましくない微生物のコンタミを受けた場合、多くの場合、発酵培地を４０℃又はそれ以上、特に４５℃又はそれ以上で加熱すると、本発明の望みの細胞を失うことなく、コンタミした微生物を殺すことができる。
【００６１】
産生期の間に、発酵培地中の細胞濃度は、典型的な場合、およそ１−１５０，好ましくは３−１０，より好ましくは３−６ｇ乾燥細胞／Ｌ発酵培地である。
【００６２】
発酵は、好気的に、微好気的に、又は嫌気的に行われる。ＷＯ０３／１０２２００に記載したように、もし望むならば、特定の酸素摂取速度が、プロセス制御のために用いられる。本発明の長所は、典型的場合、遺伝子組換え細胞が、ＸＩ遺伝子発現及び他の組換えにより、嫌気的にキシロースを発酵することができることである。
【００６３】
発酵産物が酸の場合、発酵産生期の間は、培地は、緩衝液により、約ｐＨ５．０から約ｐＨ９．０、好ましくは約ｐＨ５．５から約ｐＨ７．０の範囲に保たれる。適切な緩衝試薬としては、乳酸を生成時に中和する塩基性物質、及び例えば、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、アンモニア、水酸化アンモニウムなどがある。一般的に、通常の発酵過程に用いられるような緩衝試薬はここでも適切である。しかしながら、発酵培地のｐＨを、典型的には６、又は６以上で初め、２から５の範囲、又は２．８から４．５の範囲のように、酸発酵産物のｐＫａ値以下にすることは、本発明の範囲にはいる。
【００６４】
緩衝液を用いた発酵において、乳酸のような発酵産物は、産生時に中和されて乳酸塩が産生される。酸としての回収は自由酸への再生を伴う。この過程は、典型的には細胞を除き、発酵培地を硫酸のような強酸処理して行われる。塩の副産物が作られ（カルシウム塩が中和剤で、硫酸が酸性化試薬の場合には石膏）、酸より分離される。その後、酸は、Ｔ．Ｂ．Ｖｉｃｋｒｏｙ，最近のバイオテクノロジー第３巻第３８章（Ｍ．Ｍｏｏ−Ｙｏｕｎｇ編集）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５；Ｒ．Ｄａｔｔａ他、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．，１９９５；１６：２２１−２３１；Ｕ．Ｓ．特許番号４，２７５，２３４，４，７７１，００１，５，１３２，４５６，５，４２０，３０４，５，５１０，５２６，５，６４１，４０６及び５，８３１，１２２及びＷＯ９３／００４４０に記載されているように、液―液抽出、蒸留、吸着他の技術により回収される。
【００６５】
本発明のプロセスは連続的に、バッチ的に又はいくつかのコンビネーションで行いうる。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例にて本発明を例証するが、発明範囲を制限することを意図しない。特に指示のない限り、全ての割合、パーセンテージは重量で表す。
【００６７】
実施例１Ａ：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＰＧＫ１プロモーター及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＧａｌ１０ターミネーターからなるプラスミドの構築（ｐＮＣ２，図１）；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＰＤＣ１プロモーター及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＧａｌ１０ターミネーターからなるプラスミドの構築（ｐＮＣ４，図２）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＰＧＫ１プロモーター（ＳｃＰＧＫ１）の塩基配列は、配列番号１として表わされている。この配列は、登録プラスミド商標ｐＢＦＹ００４の制限酵素断片として得た。又は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅクロモソームＤＮＡを鋳型とし、配列番号１に基づいて設計したプライマーを用い、ＰＣＲ増幅により得ることができた。
【００６８】
用いられるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＧＡＬ１０ターミネーター（ＳｃＧＡＬ１０）は配列番号２として表わした塩基配列を有する。この配列は、登録プラスミド商標ｐＢＦＹ００４の制限酵素断片として得ることができた。又は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅクロモソームＤＮＡを鋳型として、配列番号２に基づいて設計したプライマーを用いＰＣＲ増幅により得ることができた。
【００６９】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＰＤＣ１プロモーター（ＳｃＰＤＣ１）を、配列番号３及び４に表わしたプライマーとして、またＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＧＹ５０９８（ＡＴＣＣ４００５０９８）のクロモソームＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ増幅した。熱サイクル条件は、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用い、９４℃１分、５６℃１分、７２℃１分を３０サイクル行い、最後に７２℃７分インキュベートした。
ＳｃＰＤＣ１プロモーターの塩基配列は、配列番号５として表わされた。
【００７０】
プラスミドｐＮＣ２（図１）は、ｐＧＥＭ５Ｚ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）骨格ベクター上にＳｃＰＧＫ１とＳｃＧＡＬ１０ターミネーターを結合し作り出す。特に発現される遺伝子を、酵母プロモーターとターミネーター間に挿入するため、制限部位ＸｂａＩ，ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを有するポリリンカーにより、ＳｃＰＧＫ１及びＳｃＧＡＬ１０は、でき上がったベクター上で分離された。〜１．２ｋｂｐＮｏｔＩ制限酵素断片は、ＳｃＰＧＫ１プロモーター、ＳｃＧＡＬ１０ターミネーター及びマルチクローニング部位から成り、配列番号６と表わされた。
【００７１】
発現カセットからなる発現ベクターｐＮＣ４は、ＳｃＰＧＫ１遺伝子の代わりにＳｃＰＤＣ１遺伝子を用いたこと以外は、通常の方法で構築された。でき上がったベクター（ｐＮＣ４）を図２に示す。〜１．３ｋｂｐＮｏｔＩ断片は、ＳｃＰＤＣ１プロモーター、ＳｃＧＡＬ１０ターミネーター及びマルチクローニング部位から成り、配列番号７と表わされた。
【００７２】
実施例１Ｂ：ｐＮＣ２（実施例１Ａ，図１）にＧ４１８耐性マーカー遺伝子を挿入し、Ｇ４１８遺伝子がＳ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅＰＧＫ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターと作動可能に結合したプラスミドの作成（ｐＶＲ２２，図３）
Ｇ４１８耐性遺伝子は、プラスミドｐＰＩＣ９Ｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を鋳型とし、配列番号８及び９と表わされているプライマー、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用い、ＰＣＲ増幅により得ることができた。熱サイクル条件は、最初、反応混合物を９５℃５分インキュベートした後、９５℃３０秒、４９℃３０秒、７２℃２分を３５サイクル行い、最後に７２℃１０分インキュベートした。ＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化し、８２１ｂｐ断片を単離し、ｐＮＣ２（実施例１Ａ，図１）の〜４３０３ｂｐＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片と結合させた。でき上がったプラスミド（ｐＶＲ２２，図３）は、ＳｃＰＧＫ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターと作動可能に連結したＧ４１８耐性遺伝子を有する。
【００７３】
実施例１Ｃ：ｐＮＣ４（実施例１Ａ，図２）にＧ４１８耐性マーカー遺伝子を挿入し、Ｇ４１８遺伝子がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターと作動可能に結合したプラスミドの作成（ｐＶＲ２９，図４）
Ｇ４１８耐性遺伝子は，プラスミドｐＶＲ２２（実施例１Ｂ，図３）を鋳型とし、配列番号８及び９に表わしたプライマー、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用い、ＰＣＲ増幅により得ることができた。
熱サイクル条件は、最初、反応混合物を９５℃５分インキュベートした後、９５℃３０秒、４９℃３０秒、７２℃２分を３５サイクル行い、最後に７２℃１０分インキュベートした。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化し、８２１ｂｐ断片を単離し、ｐＮＣ４（実施例１Ａ，図２）の〜４３０３ｂｐＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片と結合させた。でき上がったプラスミドｐＶＲ２９（図４）は、ＳｃＰＤＣ１プロモーターとＳｃＧＡＬ１０ターミネーターと作動可能に連結したＧ４１８耐性遺伝子を有する。
【００７４】
実施例１Ｄ：Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓＰＤＣ１遺伝子の５’−及び３’−隣接配列及び、ＳｃＰＤＣ１プロモーターとＳｃＧＡＬ１０ターミネーター制御下に置かれたＧ４１８遺伝子からなるベクター（ｐＢＨ５ｂ、図５）の構築
Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓＰＤＣ１（ＫｍＰＤＣ１）遺伝子の上流領域に直接に隣接した１２５４ｂｐＤＮＡ断片を、配列番号１０及び１１に表わしたプライマーと、プラスミドｐＳＯ２１（Ｕ．Ｓ．特許出願２００４／０２９２５６Ａ１）を鋳型として用いてＰＣＲ増幅した。熱サイクル条件は、先ず、反応混合物を９４℃で２分インキュベートし、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１．５分を３５サイクル行い、最後に７２℃７分インキュベートした。ＰＣＲ産物は、０．８％アガロースゲルで分離し、〜１２５４ｂｐ産物を単離した。ＰＣＲ産物とｐＶＲ２９プラスミド（実施例１Ｃ，図４）をＫｐｎＩ及びＳｂｆＩで消化し、連結させｐＢＨ５ａ（図５）と名付けた〜６３１５ｂｐのベクターを作成した。ｐＢＨ５ａプラスミドは、ＳｃＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターと作動可能に連結したＧ４１８耐性遺伝子、及びＫｍＰＤＣ１遺伝子と直接に隣接した上流領域ＤＮＡに相同な〜１２４０ｂｐＤＮＡ断片を含む。
【００７５】
ＫｍＰＤＣ１遺伝子の下流領域に直接に隣接した５３５ｂｐＤＮＡ断片を、配列番号１２及び１３として表わしたプライマーと、プラスミドｐＳＯ２１を鋳型として用いて、ＰＣＲ増幅した。熱サイクル条件は、先ず、反応混合物を９４℃で２分インキュベートし、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃４５秒を３５サイクル行い、最後に７２℃４分インキュベートした。ＰＣＲ産物を，０．８％アガロースゲルで分離し、５３５ｂｐ産物を単離した。ＰＣＲ産物をＳｂｆＩ及びＭｌｕＩで消化し、得られた５２９ｂｐ断片をｐＢＨ５ａのＳｂｆＩ−ＭｌｕＩ断片と結合させ、ｐＢＨ５ｂ（図５）プラスミドを作成した。ｐＢＨ５ｂプラスミドは、単一のＳｂｆＩ部位を内部に有するＫｍＰＤＣ１遺伝子に隣接した配列、即ち〜１．２ｋｂｐ上流隣接配列、及び〜０．５Ｋｂｐ下流隣接配列のＤＮＡを含む。
ｐＢＨ５ｂプラスミドはまた、ＳｃＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターに作動可能に連結したＧ４１８耐性マーカーを含む。
【００７６】
実施例１Ｅ：ポリ−Ｈｉｓ標識、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣＹＣ１ターミネーターを含むベクターの構築（ｐＶＲ７３，図６）；ｐＢＨ５ｂ（実施例１Ｄ，図５）からＧ４１８耐性マーカー遺伝子を除去し、ベクターｐＶＲ７７（図６）を作成
配列番号１４及び１５に表わしたプライマーは、ｐＹＥＳ６ＣＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）をもとに、マルチプルクローニング部位、ポリ−Ｈｉｓ標識及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣＹＣ１ターミネーター（ＳｃＣＹＣ１）を含む塩基配列を増幅するために設計された。プライマーは産物にＳｂｆＩ及びＢｓｍＢＩ部位を導入した。ＰＣＲ条件は、ＰｌａｔｉｎｕｍＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用い、９４℃１分、５５℃１分、６８℃１分を３０サイクル後、６８℃１０分のインキュベーションを行った。ＰＣＲ産物をカラムで精製し、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼで７２℃１０分インキュベートし、ＴＡクローニングの５’末端にアデニンヌクレオチドを付加した。次ぎに、５０７ｂｐ産物をＴＯＰＯＩＩ  ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）中にＴＡクローン化し、ｐＶＲ７３（図６）と命名した。このベクター内にポリＨｉｓ−標識を有するために、ユニークなＳｂｆＩ部位にクローン化された遺伝子では、このＨｉｓ標識が、遺伝子から発現されたタンパク質に融合することになる。ポリＨｉｓ標識によるこのタンパク質の標識化の結果、Ｎｉ−ＮＴＡ（ＨＲＰ）接合体（Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて、タンパク質の比較的迅速なＷｅｓｔｅｒｎブロット検出及び、Ｎｉキレート樹脂とカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用いて、発現した遺伝子産物の迅速な精製が可能となる。
【００７７】
プラスミドｐＢＨ５ｂ（実施例１Ｄ，図５）をＳｐｈＩで消化し、ＫｍＰＤＣ１プロモーター及びターミネーターを含む〜４．７Ｋｂｐ断片は、自己と再環状化してプラスミドｐＶＲ７７（図６）となった。ｐＢＨ５ｂからのＧ４１８抗生物質選択マーカーは、この様にして除去された。
【００７８】
実施例１Ｆ：ＫｍＰＤＣ１隣接上流領域、マルチクローニング部位、ポリ−Ｈｉｓ標識及びＳｃＣＹＣ１ターミネーターを含むベクターｐＶＲ７８（図６）の構築。
プラスミドｐＶＲ７３（実施例１Ｅ，図６）を酵素ＳｂｆＩ及びＢｓｍＢＩで消化し、マルチクローニング部位、ポリ−Ｈｉｓ標識及びＳｃＣＹＣ１ターミネーターを含む５０４ｂｐ断片を切り出した。ベクターｐＶＲ７７を同じ酵素で消化し、ＫｍＰＤＣ１上流、及び下流隣接領域、及びベクター骨格を含む〜４２４９ｂｐ断片を作成した。これら二つの断片を連結させ、ポリＨｉｓ標識から１８４ｂｐ離れた位置にユニークなＳｂｆＩ制限部位を有する〜４７５２ｂｐプラスミド（ｐＶＲ７８，図６）を作成した。
この過程で大部分のＫｍＰＤＣ１下流隣接領域がプラスミドｐＶＲ７８から除去された。
【００７９】
実施例１Ｇ：プラスミドｐＶＲ７８（実施例１Ｆ，図６）を組換え、遺伝子発現向上のためにＳｂｆＩ制限部位からポリＨｉｓ標識迄の距離を短縮させ、プラスミドｐＣＭ３（図７）を作成
配列番号１６及び１７に表わしたプライマーを、プラスミドｐＶＲ７８について、ポリＨｉｓ標識からＳｃＣＹＣ１ターミネーターまで全領域を増幅するために設計した。このプライマーもまた、ポリＨｉｓ標識と３´ＳａｐＩ位置の直接上流領域に１個の５’ＳｂｆＩ部位を有する。ＰＣＲを標準的方法で行った。ＰＣＲ条件は、９４℃２分の最初のインキュベーション後、１０サイクルの９４℃３０秒、６３℃３０秒及び６８℃１分の反応を行った。その後、更に２０サイクルの９４℃３０秒、６８℃１分の反応を行った。最終段階は６８℃８分であった。増幅反応はＰｌａｔｉｎｕｍＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用いて行った。ＰＣＲ産物を、ＳｂｆＩ及びＳａｐＩ制限酵素で消化した。酵素５’ＳｂｆＩ及び３’ＳａｐＩでプラスミドｐＶＲ７８を消化して得た〜３．９ｋｂｐ断片をＰＣＲ産物と結合させた。得られたプラスミドをｐＣＭ３（図７）と命名した。
【００８０】
実施例１Ｈ：ＳｃＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターの転写制御下にあるＥ．ｃｏｌｉヒグロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミド（ｐＰＳ１，図８）の構築
ヒグロマイシンＢに耐性を与えるＥ．ｃｏｌｉ  ｈｐｈ遺伝子を、配列番号１８，１９に表わしたプライマー、鋳型としてプラスミドｐＲＬＭｅｘ３０（Ｍａｃｈ他、１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２５，５６７−５７０）を用いてＰＣＲ増幅した。ｈｐｈ遺伝子は同じプライマーを用い、鋳型としてＥ．ｃｏｌｉクロモソームＤＮＡを用いても得ることができる。熱サイクル条件は、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、３０サイクルの９４℃１分、５６℃１分、７２℃３分の後、最終的に７２℃７分処理した。ＰＣＲ産物を、０．８％アガロースゲル上で電気泳動して分離し、１０２６ｂｐ断片を単離した。１０２６ｂｐ断片をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＳｃＰＤＣ１プロモーターとＳｃＧＡＬ１０ターミネーターを含むｐＮＣ４（実施例１Ａ，図２）のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片に連結し、プラスミドｐＰＳ１（図８）を得た。
【００８１】
実施例１Ｉ：ＫｍＰＤＣ１隣接上流領域、マルチクローニング部位、ポリ−Ｈｉｓ標識及びＳｃＣＹＣ１ターミネーター（全てｐＣＭ３，実施例１Ｇ，図７より）、及びＳｃＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーター（全てｐＰＳ１，実施例１Ｈ，図８より）の転写制御下にあるＥ．ｃｏｌｉヒグロマイシン耐性遺伝子を含むベクター（ｐＣＭ９，図９）の構築
プラスミドｐＰＳ１をＳｐｈＩで消化し、ＳｃＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターの転写制御下にあるｈｐｈ遺伝子を有する〜２．２ｋｂｐ断片をＳｐｈＩで消化したｐＣＭ３と結合した。得られたプラスミド（ｐＣＭ９，図９）は、将来のキシロースイソメラーゼ遺伝子発現のためのＫｍＰＤＣ１プロモーター、ついで単一のＳｂｆＩ部位、及びＳｃＣＹＣ１ターミネーターを含む。更に加えて、この遺伝子発現のためのカセットは、酵母における形質転換の選択のために、ＳｃＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターの転写制御下にあるｈｐｈ遺伝子からなる〜２．２ｋｂｐ断片に直接隣接して位置する。
【００８２】
実施例２Ａ：Ｇｅｎｂａｎｋから得られる配列をもとにしたＰｉｒｏｍｙｃｅｓ  Ｅ２種キシロースイソメラーゼ（ＰＸＹＬＡ）遺伝子の再構成
ＰｉｒｏｍｙｃｅｓＥ２種キシロースイソメラーゼ（ＰＸＹＬＡ）遺伝子の再構成に用いる方法は、Ａｌｂｅｒｔｏ  Ｄｉ  Ｄｏｎａｔｏ他、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２１２，２９１−２９３（１９９３）"ポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子とｃＤＮＡの合成法"より適用した。ＰＡＧＥで精製したプライマーは、再構成が進行するように、遺伝子の中心から出発して順序づけた。プライマーセットは１４−１６ｂｐ重なるよう維持した。各プライマー長は６０−７０ｂｐであった。遺伝子は１７段階で再構成できた。
【００８３】
この方法に従って行うＰＣＲプロトコールとしては、ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、及び業者により指示された緩衝液及びＭｇＳＯ４を用いた。第１段階は、配列番号２０及び２１で表わしたプライマーを用いた。これらのプライマーは遺伝子配列の中心を表わす。プライマーのアニーリングと伸長は、次のＰＣＲ反応が行われる、コア鋳型であるので、第１段階では、鋳型を必要としない。第１段階のサイクルは、２０サイクルの９４℃１分、５４℃１分、６８℃２分（次のサイクルへ進む際更に５秒間追加される）であり、次いで４℃の貯蔵が続く。
【００８４】
第２−１７段階では、ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｌａｔｉｎｕｍＰｆｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、及び業者により指示された緩衝液及びＭｇＳＯ４を用いた。各段階から２，５μＬの混合物を次の段階（５０μＬ反応）の鋳型として用いた。各反応のプライマーセットを表１に示す。各場合の鋳型は、前の反応段階からの５μＬＤＮＡである。
第２−１７段階のサイクリングステップは、２０サイクルの９４℃１分、４６℃１分、６８℃２分（次のサイクルへ進む際更に５秒間追加される）であり、次いで４℃の貯蔵が続く。
【００８５】
【表１】
0004711955.tif 000002
【００８６】
実施例２Ｂ：再構成したＰＸＹＬＡ遺伝子を含むベクターｐＣＭ１７（図１０）の構築；Ｇｅｎｂａｎｋデーターベースにある塩基配列と一致させるように塩基を変える部位特異的な突然変異
再構成したＰＸＹＬＡ遺伝子（実施例２Ａ）を含むプラスミドは、構築の最終段階で作成した〜１．３１４ｋｂｐ断片をＴＯＰＯＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＣＡ）と結合することにより作成した。再構成したＰＸＹＬＡ遺伝子はＧｅｎｂａｎｋ配列と５塩基について異なる。それぞれの差異はマルチ部位特異的突然変異キット（Ｓｔａｒａｔａｇｅｎ，ＣＡ）を用い、このプラスミドを鋳型として用いて修正した。３個のＰＡＧＥ又はＨＰＬＣで精製した、配列番号５４、５５及び５６と表わす５’リン酸化突然変異性プライマーを４種の誤りを修正するために用いた。熱サイクルパラメーターとしては、変性段階１分、アニーリング段階１分、その後伸長段階８分である。ＰＣＲ段階で作られた親鎖を、熱サイクルの終了時に反応混合物に１μＬ  ＤｐｎＩ酵素を加えて消化した。混合物を３７℃１時間保温し、キットと共に提供されたＸＬ１０−ＧｏｌｄＵｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換するのに用いた。混合物をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ＋アンピシリン（ＬＢＡ）を含むプレートに播き、３７℃一晩インキュベートした。
マルチ部位特異的突然変異プロトコールを繰り返し、５番目の誤りを訂正した。ＰＡＧＥ又はＨＰＬＣで精製した、配列番号５７及び５５と表わした２個の５’リン酸化した突然変異性プライマーを用いた。２個の形質転換体は塩基配列決定され、ＰＸＹＬＡ遺伝子のＧｅｎｂａｎｋ配列と１００％相同性を示した。構築物の１つをｐＣＭ１７（図１０）と名付けた。再構成したＰＸＹＬＡ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を、配列番号５８，５９と表わした。  
【００８７】
実施例３Ａ：ＫｍＰＤＣ１プロモーターとＳｃＣＹＣ１ターミネーターの制御下にあるＰＸＹＬＡ遺伝子、及びＳｃＰＤＣ１プロモーターとＳｃＧＡＬ１０ターミネーター制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ  ｈｐｈヒグロマイシン耐性遺伝子を含むベクターｐＣＭ１４（図１１）の構築
ＰＸＹＬＡ遺伝子を、ｐＣＭ１７（実施例２Ｂ，図１０）を鋳型とし、配列番号６０，６１で表わされるプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。熱サイクル条件は、ｐｆｘＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用い３５サイクルの９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１．５分、その後７２℃８分の最終インキュベーションからなる。ＰＣＲ産物をＳｂｆＩで消化し、１．０％アガロースゲル上の電気泳動で分離した。１３１９ｂｐ産物を単離し、ｐＣＭ９をＳｂｆＩで消化して得た〜６８２９ｂｐ断片と連結し、〜８１４８ｂｐプラスミドを構築した。実施例２Ｂに記載したと同じプロトコールに従い、配列番号６２で表わす突然変異性プライマーを用いて、ＳｂｆＩの直接上流に偶然に付加された停止コードンを取り外して、〜８１４８ｂｐプラスミド（ｐＣＭ１４，図１１）を作成した。
【００８８】
プラスミドｐＣＭ１４は、遺伝子の３´末端にポリＨｉｓ末尾を伴うＫｍＰＤＣ１プロモーターとＳｃＣＹＣ１ターミネーターの制御下にあるＰＸＬＹＬＡ遺伝子を含む。このプラスミドはまた、ＳｃＰＤＣ１プロモーターとＳｃＧＡＬ１０ターミネーター制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ  ｈｐｈ遺伝子を含む。
【００８９】
実施例３Ｂ：ｐＣＭ１４プラスミド（実施例３Ａ，図１１）にＵｒａ３選択マーカーを取り込み、ｐＣＭ１４からｈｐｈ発現カセットを欠失させる。
Ａｌａｎｉ等は、"複数箇所破壊された酵母株構築における、繰り返したＵｒａ３選択による遺伝子破壊方法"（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９８７，１１６，５４１−５４５）において、遺伝子組込み方法、又は遺伝子破壊方法を記載している。この方法はウラシル要求性の酵母株、及びＨｉｓＧ−ＳｃＵｒａ３−ＨｉｓＧリピーターカセットを用いる。このカセットは、ＨｉｓＧカセットが次の世代において、自己と再結合するという利点を用いて、遺伝子に導入する、又は遺伝子を破壊する選択マーカーとして用いられる。
このようにして、酵母細胞は、再結合の過程でＳｃＵｒａ３遺伝子を失いＳｃＵｒａ３遺伝子を失うことで、酵母株は同じカセットを用いたその後の形質転換のために、ウラシル要求性が回復する。ＨｉｓＧ−ＳｃＵｒａ３−ＨｉｓＧカセットは、ｐＮＡＤＦ１１（ＮａｎｃｙＤａｓｉｌｖａ，ＵＣＩｒｖｉｎｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と名付けられたプラスミドに取り込まれ、ＮａｎｃｙＤａｓｉｌｖａより得ることができる。ＨｉｓＧ−ＳｃＵｒａ３−ＨｉｓＧカセットは、ｐＮＡＤＦ１１プラスミドをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ酵素で消化し、〜３．８ｋｂｐ断片を、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＰＵＣ１９（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）に連結し、ｐＮＡＤＦ１１から単離することができる。でき上がったプラスミドをｐＶＲ６５（図１９）と名付ける。
【００９０】
プラスミドｐＣＭ１４（実施例３Ａ，図１１）をＡａｔＩＩ／ＳｐｈＩで消化し、１％ゲル状で電気泳動分離する。ＰＸＹＬＡカセットを含む〜５９０７断片が単離された。プラスミドｐＶＲ６５をＡａｔＩＩ／ＳｐｈＩで消化し、１％ゲル上で電気泳動分離した。〜４２９３ｂｐのＨｉｓＧ−ＳｃＵｒａ３−ＨｉｓＧ断片を抽出し、抽出した挿入物とプラスミドｐＣＭ１４から得た〜５９０７ｂｐ断片と連結した。でき上がったベクターをｐＣＭ２８（図１２）と名付けた。このプラスミドは、ＫｍＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＣＹＣ１ターミネーター制御下のＰＸＹＬＡ遺伝子（ポリＨｉｓ標識を伴う）、及びＨｉｓＧ−Ｕｒａ３−ＨｉｓＧカセットを含む。プラスミドｐＣＭ１４に含まれていたＥ．ｃｏｌｉ  ｈｐｈ遺伝子と、その隣接部分はｐＣＭ２８から除去された。
【００９１】
実施例４Ａ：Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓキシロースリダクターゼ（ＫｍＸＹＬ１）遺伝子、及び隣接した上流、下流部分のクローニング
４１０ｂｐ断片のＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓキシロースリダクターゼ（ＫｍＸＹＬ１）の推測解読領域、及び約５００ｂｐのプロモーターは、Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ計画において、同様のＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓの部分ゲノム配列決定された（Ｈｅｍｉａｓｃｏｍｙｃｅｔｏｕｓ酵母のゲノム調査：１２．Ｋｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ  ｖａｒ．  ｍａｒｘｉａｎｕｓ，Ｂｅｒｔｒａｎｄ  Ｌｌｏｒｅｎｔｅ，Ａｌａｉｎ  Ｍａｌｐｅｒｔｕｙ，Ｇａｅｌｌｅ  Ｂｌａｎｄｉｎ，Ｆｒａｎｃｏｉｓ  Ａｒｔｉｇｕｅｎａｖｅ，Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｗｉｎｃｋｅｒ及びＢｅｒｎａｒｄ  Ｄｕｊｏｎ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４８７（１）ｐｐ．７１−７５）。この配列、及び他の酵母キシロースリダクターゼコンセンサス配列から既知のいくつかの配列をもとに、プライマーが設計され、ＫｍＸＹＬ１遺伝子の全配列及びプロモーターが単離された。ゲノムウオーキング法によりＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ野生株よりＫｍＸＹＬ１遺伝子配列の上流及び下流配列を得た。ゲノムウオーカーキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐａｏｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて、隣接上流、下流配列を得た。Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓのゲノムＤＮＡを、ゲノムウオーカーキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）からの制限酵素で消化した。断片で作られたゲノムライブラリーをＰＣＲ反応の鋳型として用いた。
キシロースリダクターゼ及び上流／下流隣接配列を得るために、５’末端及び３’末端ウオークするために、配列番号６３及び６４と表わすＰＣＲプライマーを設計した。これらのプライマーを用いて、ゲノムウオーカーキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）からのプライマーＡＰ１及びＡＰ２にそってウオークを行った。このプライマーセットはこの遺伝子の上流〜２．５ｋｂｐを増幅した。この断片を配列決定すると、ＫｍＸＹＬ１遺伝子の上流領域の最上流末端からのＤＮＡ配列であることが分かった。同様に、配列番号６５及び６６と表わすプライマーを用いて、ゲノムウオーカーキットからのプライマーＡＰ１及びＡＰ２にそってウオークを行った。これにより、ＫｍＸＹＬ１遺伝子の下流の〜１．８ｋｂｐ断片を増幅した。この断片の配列決定により、キシロースリダクターゼ遺伝子の下流領域の最下流末端からのＤＮＡ配列であることが分かった。
【００９２】
ゲノムウオーキングから得た配列情報により、配列番号６７及び６８で表すプライマーが設計できた。このプライマーを用いて、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓのゲノムＤＮＡ５００ｎｇを使う熱サイクル反応を行った。熱反応条件は、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用い、３０サイクルの９４℃１分、５６℃１分、７２℃３分、その後最後に７２℃７分のインキュベーションを行った。ＰＣＲ産物を、０．８％アガロースゲル上で電気泳動分離した。〜３．５ｋｂｐ産物を単離し、ｐＣＲＩＩｔｏｐｏ−クローニングベクターに連結し、プラスミドｐＶＲ９５（図１３）を得た。
【００９３】
実施例４Ｂ：ＫｍＸＹＬ１上流及び下流隣接、及びＳｃＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーター制御下にあるＧ４１８耐性マーカー遺伝子を含むプラスミドｐＣＭ１９（図１４ｂ）の構築
配列番号６９及び７０で表わすプライマーを、プラスミドｐＶＲ９５（実施例４Ａ，図１３）の〜１．３ｋｂｐ断片を増幅するために設計した。この断片には、遺伝子の〜３００ｂｐ解読領域ばかりでなく、ＫｍＸＹＬ１遺伝子のプロモーター領域も含まれる。これらのプライマーとｐＶＲ９５（実施例４Ａ，図１３）の５０ｎｇプラスミドＤＮＡを用いて、熱サイクル反応を行った。熱反応条件は、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用い、３０サイクルの９４℃１分、５３℃１分、６８℃１分、そして最後に６８℃８分のインキュベーションを行った。ＰＣＲ産物を電気泳動分離後ＰｓｔＩ消化し、同じくＰｓｔＩ消化したｐＶＲ２９（実施例１Ｃ，図４）と連結した。この方法で得たプラスミドでは、ｐＶＲ２９ベクター中でＫｍＸＹＬ１遺伝子とプロモーター領域が正しい方向性を有することが証明された。プラスミドはｐＣＭ１８（図１４ａ）と名付けられた。
【００９４】
配列番号７１及び７２で表すプライマーを、ｐＶＲ９５から〜１．１ｋｂｐ断片を増幅するよう設計した。
この断片には、ＫｍＸＹＬ１遺伝子のターミネーターを越えた、下流領域がある。これらのプライマーと５０ｎｇのｐＶＲ９５プラスミドＤＮＡを用い熱サイクル反応を行った。熱反応条件は、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用い、３０サイクルの９４℃１分、５９℃１分、６８℃１分、そして最後に６８℃８分のインキュベーションを行った。配列番号７３及び７４で表わしたプライマーと、上記最初のＰＣＲ産物５０ｎｇを用いて、熱サイクル反応を行った。熱反応条件は、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用い、３０サイクルの９４℃１分、４５℃１分、６８℃１分、そして最後に６８℃８分のインキュベーションを行った。第２の熱サイクル反応後のＰＣＲ産物を、電気泳動分離を行い、ＡｐａＩ消化し、同じくＡｐａＩ消化したプラスミドｐＣＭ１８と連結し、ベクターｐＣＭ１９（図１４ｂ）を作成した。プラスミドｐＣＭ１９は、ＫｍＸＹＬ１遺伝子の下流隣接領域とＫｍＸＹＬ１遺伝子の上流隣接領域を（〜３００ｂｐのこの遺伝子解読領域も共に）含むが、これらはＳｃＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーター制御下のＧ４１８からなるカセットにより分離されている。Ｇ４１８耐性遺伝子に対して、ＫｍＸＹＬ１下流領域が正の方向性を有することは証明された。
【００９５】
実施例４Ｃ：機能性のＵｒａ３遺伝子を非機能性の遺伝子に置き換えることによる、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓウラシル要求性株（ＣＤ６８３）の構築
Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓＵｒａ３（ＫｍＵｒａ３）遺伝子を、ゲノムＤＮＡを鋳型とし、Ｇｅｎｂａｎｋ配列（寄託番号ＡＦ５２８５０８）に基づいて設計したプライマーを使い単離した。８０４ｂｐ断片は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）中にクローニングされ、ｐＢＳＫｕｒａ３Ｍｙｒａ（図１５）と標識した。
【００９６】
このプラスミドをＥｃｏＲＶで消化し、ＫｍＵｒａ３遺伝子を有するが、ＥｃｏＲＶ断片を欠いた〜４ｋｂｐ断片を単離後、再−結合してプラスミドｐＢＳＤｅｌｔａＵｒａ３Ｋｍ（図１５）を作成した。このプラスミドは、非機能性の遺伝子（ＤｅｌｔａＵｒａ３）を有する。このプラスミドを、ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで消化し、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ野生株を形質転換するのに用いた。形質転換体は５−ＦＯＡプレート上で選択した。このプレート上で増殖するコロニーを、ＤｅｌｔａＵｒａ３遺伝子の欠失した領域で設計したプライマーを使いスクリーニングした。また、遺伝子全体を単離するためのプライマーも設計し、これらの断片を配列決定し、形質転換体では、新しい、より短い、非機能的ＤｅｌｔａＵｒａ３遺伝子が、真の固有なＫｍＵｒａ３遺伝子に置き換わったことを示した。成功した形質転換株をＣＤ６８３と命名した。ＣＤ６８３株はＳｃ−Ｕｒａプレートでは増殖せず、実際、ウラシル要求性であることが示された。
【００９７】
実施例４Ｄ：ＣＤ６８３株（実施例４Ｃ）をプラスミドｐＣＭ１９（実施例４Ｂ，図１４ｂ）で形質変換することによる、欠失したキシロースリダクターゼ（ＫｍＸＹＬ１）遺伝子を有するＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ突然変異体（ＣＤ８０４）の誘発
ＫｍＸＹＬ１遺伝子の上流及び下流領域の間にＧ４１８耐性発現カセットを含み、上流、下流領域からなる〜５．２ｋｂｐ断片は、ｐＣＭ１９をＰｖｕＩＩで消化して得た。標準的電気穿孔法を用いて、この断片によりＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓＣＤ６８３株を形質転換した。形質転換細胞を回収し、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌ酵母ペプトン、５０ｇ／Ｌグルコース（ＹＰＤ）＋５０μｇ／ｍＬＧ４１８を含むプレートに播き、３７℃で４８−９６時間インキュベートした。ＹＰＤ＋５０μｇ／ｍＬＧ４１８を含むプレートに増殖した９６形質転換体を、ＹＰＸ［（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌ酵母ペプトン＋キシロース５０ｇ／Ｌ）＋５０μｇ／ｍＬＧ４１８を含むプレート上でレプリカした。９６形質転換体の中７３転換体がＹＰＸ＋５０μｇ／ｍＬＧ４１８を含むプレートでは増殖できず、キシロースを炭素源として用いることができないことを確認した。増殖できないことは、機能的なＫｍＸＹＬ１遺伝子が欠失し、相同的再結合によりＧ４１８カセットに置き換えられたことを示す。キシロースを炭素源として利用できないこれらの形質転換体をＣＤ８０４と命名した。
【００９８】
ＫｍＸＹＬ１遺伝子の中心部分をＰＣＲ増幅するよう設計された、配列番号７５及び７６と表わすＰＣＲプライマーを用いて、機能的なＫｍＸＹＬ１遺伝子を欠くことを証明した。配列番号７７及び７８で表すプライマーを用いたＰＣＲによって、Ｇ４１８遺伝子の存在が証明された。この結果は、Ｇ４１８耐性遺伝子断片が、ＫｍＸＹＬ１遺伝子の座位に組み込まれたことを示す。配列番号７９及び８０で表わすプライマーセットを用いたＰＣＲによって、さらに、Ｇ４１８耐性遺伝子断片が、固有のＫｍＸＹＬ１遺伝子に置き換わったことを確認した。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ解析により更に、キシロースリダクターゼ遺伝子がＣＤ８０４株から除去されたことを確認した。
【００９９】
実施例４Ｅ：ＣＤ６８３（実施例４Ｃ）及びＣＤ８０４（実施例４Ｄ）株のキシロースリダクターゼ酵素活性の検定
分離型のバッフル付き振盪フラスコ（容量２５０ｍｌ）にＣＤ６８３（実施例４Ｃ）株、及びＣＤ８０４（実施例４Ｄ）株を接種した。フラスコを２５０ｒｐｍで振盪させ、３５℃でインキュベートし、一晩増殖させた。培地は２０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌペプトン及び１００ｇ／Ｌデクストローズを含む。１８時間後、細胞を４０００Ｇ５分で遠沈し、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、０．５ｍｌ破砕用緩衝液に懸濁させた。破砕用緩衝液は２００ｍＬ中に、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０），１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ），４０ｍｇフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）（５００μＬＤＭＳＯに溶解）、及び４種のプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ，ＣＡ）を含む。
細胞は機械的にガラスビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＣＡ）を用いて溶菌し、１４，０００Ｇ１５分遠心した。上清を取りだし、キットプロトコール（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従い、ＰＤ−１０脱塩カラムを通した。ＸＲ酵素活性検定テスト溶液は、全量１ｍＬ中、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ，０．５ｍＭＤ−キシロースを含み、ここに様々な量の酵素溶液を加え、３４０ｎｍの吸光度を測定した。使われたＮＡＤＰＨ量がリダクターゼ酵素活性を示す。バックグラウンドとしてのＮＡＤＰＨ消費量を決定するために、キシロースなしのブランク溶液を用いた。
【０１００】
全タンパク質量は、ＢＳＡをスタンダードとして、新タンパク質定量試薬（Ｃｙｓｏｓｋｅｌｅｔｏｎ＃ＡＤＶ０１）を用いて決定した。ＣＤ６８３株のキシロースリダクターゼ酵素活性は、ＮＡＤＰＨ消費量で示すように、１３．７ｍＵ／ｍｇタンパク質であった。ＣＤ８０４株のＮＡＤＰＨ消費量は、予期された０活性ではなく、キシロースリダクターゼ活性４．４ｍＵ／ｍｇタンパク質と一致するものであった。ＣＤ８０４によるＮＡＤＰＨ消費は、キシロースのキシルロースへの転換を行う、非特異的アルドースリダクターゼ酵素に帰因できる。ＣＤ６８３とＣＤ８０４株をＹＰＸプレート上に並べて蒔種した。ＣＤ８０４株は４日後このプレート上でいかなる生育も認められなかったが、ＣＤ６８３株はこれらのプレート上で良く生育した。
【０１０１】
実施例５Ａ：クローン化したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  キシルロキナーゼ（ＳｃＸＫＳ１）遺伝子を有するプラスミドｐＶＲ６７（図１６）の構築
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ寄託番号３８６２６）から得、標準的条件で生育させた。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡは、従来型の方法で単離した。ＰＣＤＲ増幅反応は、Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用いて行った。各反応液は、５００ｎｇ濃度のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡ，各０．２ｍＭ濃度の４ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの各々）及び、１μＭの配列番号８１及び８２で表わす増幅用プライマーからなる。サイクリングは最初のインキュベーション９４℃１０分、その後３５サイクルの９４℃１５秒、５５℃１５秒、６８℃９０秒からなる。〜１．８ｋｂｐ断片を従来型処方でゲルで単離し、ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）にクローン化した。でき上がったプラスミド（ｐＶＲ６７，図１６）を配列決定し、ＳｃＫＸＳ１遺伝子配列が証明された。遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋ（寄託番号Ｘ６１３７７）の既知配列と優れた相同性を示した。
ＳｃＸＫＳ１遺伝子の塩基配列を配列番号８３と表わす。この遺伝子でコードされる酵素のアミノ酸配列を配列番号８４で表わす。
【０１０２】
実施例５Ｂ：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴＥＦ１（ＳｃＴＥＦ１）プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターを有するプラスミドｐＶＲ５２（図１６）の構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴＥＦ１（ＳｃＴＥＦ１）プロモーターは、ｐＴＥＦＺｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）ベクターよりクローン化された。配列番号８５及び８６と表わされたプライマーを用いて、ＳｃＴＥＦ１プロモーターを増幅し、ＸｂａＩ及びＳｓｔＩ制限部位を挿入した。ＰＣＲ産物とｐＮＣ２（実施例１Ａ，図１）プラスミドを、ＸｂａＩ及びＳｓｔＩ酵素で消化し、連結して、プラスミドｐＶＲ５２（図１６）を作成した。
【０１０３】
実施例５Ｃ：ＳｃＴＥＦ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーター制御下にある、ＳｃＸＫＳ１遺伝子を有するプラスミドｐＶＲ１０３（図１８）の構築
プラスミドｐＶＲ６７（実施例５Ａ，図１６）を、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化した。ＳｃＸＫＳ１遺伝子を含む〜１．８ｋｂｐ断片をゲルで精製した。プラスミドｐＶＲ５２（実施例５Ｂ，図１６）もまた、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、得られた断片をｐＶＲ６７の〜１．８ｋｂｐ断片と連結し、プラスミドベクターｐＶＲ９６（図１６）を得た。このプラスミドは、ＳｃＴＥＦ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーター制御下にあるＳｃＸＫＳ１遺伝子を有する。このベクターにおいて、ＳｃＸＫＳ１遺伝子のＡＴＧ開始部位はＳｃＴＥＦ１プロモーター末端より１３０ｂｐ離れている。この距離を約７０−７３ｂｐまで短縮するために、ＳｃＴＥＦ１プロモーターをｐＴＥＦｚｅｏベクターから正しい距離と制限部位を有して増幅するよう、プライマーを設計し、配列番号８７及び８８と表わした。ｐＴＥＦｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を鋳型として用いた。熱サイクルは、Ｆａｉｌｓａｆｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用い、３０サイクルの９４℃３０秒、５７℃３０秒、７２℃３０秒で行い、最後に７２℃４分のインキュベーションを行った。ＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲルで分離し、４６０ｂｐ断片を単離した。第二のＰＣＲにより、配列番号８９及び９０で表わすプライマーを用いてこの断片を増幅した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩ消化のプラスミドｐＶＲ９６（図１６）と連結した。でき上がったプラスミド（ｐＶＲ１０２，図１７）は２個のＳｃＴＥＦ１プロモーターを有し、第２のプロモーターはＳｃＸＫＳ１遺伝子を駆動する。プロモーター末端と遺伝子のＡＴＧ部位間の距離は正確に７３ｂｐであった。プラスミドｐＶＲ１０２をＳｐｈＩで消化し、ＳｐｈＩ消化したｐＰＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）と連結した。でき上がったプラスミド（ｐＶＲ１０３、図１８）は塩基配列決定され、ＳｃＴＥＦＩプロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーター制御下のＳｃＸＫＳＩ遺伝子であることが証明された。
【０１０４】
実施例５Ｄ：ＨｉｓＧ−ＳｃＵｒａ３−ＨｉｓＧカセット（ｐＶＲ６５，実施例３Ｂより）と並んだＳｃＸＫＳＩ発現カセット（ｐＶＲ１０３，実施例５Ｃより）を有する、プラスミドｐＶＲ１０４（図１９）の構築
プラスミドｐＶＲ６５（実施例３Ｂ，図１９）をＳｐｈＩで消化し、線型化したベクターの５’−リン酸末端を、製造会社のプロトコールに従い、エビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＵＳＡ）で脱リン酸化した。
プラスミドｐＶＲ１０３（実施例５Ｃ，図１８）もＳｐｈＩで消化し、ＳｃＴＥＦ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーター制御下にあるＳｃＸＫＳ１遺伝子を有する３．５ｋｂｐ断片を、線型化したｐＶＲ６５断片と連結し、プラスミドｐＶＲ１０４（図１９）を得た。
【０１０５】
実施例５Ｅ：形質転換株ＣＤ８０４（実施例４Ｄ）による、過剰発現したＳｃＸＫＳ１遺伝子活性及び、欠失したキシロースリダクターゼ遺伝子を有する、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ突然変異体（ＣＤ８０５）の誘発
プラスミドｐＶＲ１０４（実施例５Ｄ、図１９）から得た〜６．８ｋｂｐＰｖｕＩＩ断片を使い、通常の電気穿孔法で、ＣＤ８０４株（実施例４Ｄ）を形質転換した。ＹＰＤ培地で回復した形質転換細胞を、４時間後ＳＣＵｒａプレート（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，ＣＡ）を蒔種し、３７℃で４８−７２時間インキュベートした。７２時間後にＳＣＵｒａプレートに増殖した形質転換体を、新ＳＣＵｒａプレート上に再びすじ状に蒔種した。再蒔種した形質転換体はコロニーＰＣＲでスクリーニングされた。
【０１０６】
形質転換株の１個の陽性コロニーを、５０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、３７℃，一晩、２００ｒｐｍ振盪しながらインキュベートした。ここから１０μＬを５−ＦＯＡプレートに蒔種し、３７℃一晩インキュべートした。増殖したコロニーは５−ＦＯＡに耐性であり、ＨｉｓＧ領域の再結合によりＳｃＵｒａ３遺伝子を欠失したと予想される。配列番号９１及び９２で表わすプライマーを用い、７００ｂｐ領域をＰＣＲ増幅し、原型のＳｃＸＫＳ１遺伝子及び〜１ｋｂｐのＨｉｓＧ遺伝子があることを示した。配列番号９３及び９４で表わす、第２のプライマーセットを、ＳｃＸＫＳ１とこの遺伝子の末端部分との間の〜１ｋｂｐ産物を増幅するために設計した。これらの２個のプライマーセットによりＳｃＸＫＳ１遺伝子は、形質転換体のクロモソームに組み込まれ、またＳｃＵｒａ３遺伝子はＨｉｓＧ領域との自然再結合により除去されたことを確認した。この株をＣＤ８０５と名付け、キシルロキナーゼタンパク質活性の増加をさらにテストするのに用いた。
配列番号９１及び９３で表わすプライマーを、ＳｃＴＥＦ１プロモーターとＳｃＸＫＳ１遺伝子末端の間、〜２．６ｋｂｐ産物を増幅するために設計した。配列番号９２及び９５で表わすプライマーは、ＳｃＸＫＳ１遺伝子と断片の開始の間、〜１．７ｋｂｐ産物を増幅するために設計された。これら２つのプライマーセットにより、ＳｃＸＫＳ１遺伝子は、ＣＤ８０５株のクロモソームに組み込まれていることを確認した。
【０１０７】
キシルロキナーゼ活性の検定：
分離型のバッフル付き振盪フラスコ（容量２５０ｍｌ）にＣＤ８０４（実施例４Ｄ）株及びＣＤ８０５（実施例５Ｅ）株を接種した。フラスコを２５０ｒｐｍで振盪させ、３５℃でインキュベートし、一晩増殖させた。培地は２０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌペプトン及び１００ｇ／Ｌデクストローズを含む。１６時間後、細胞を４０００Ｇ５分で遠沈し、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、０．５ｍｌ破砕用緩衝液に再懸濁させた。破砕用緩衝液は、２００ｍＬ中に１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０），１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ），４０ｍｇＰＭＳＦ（５００μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、及び４種のプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を含む。細胞を機械的にガラスビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＣＡ）を用いて溶菌し、１４，０００Ｇ１５分遠心した。上清を取りだし、キットプロトコール（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従い、ＰＤ−１０脱塩カラムを通した。１０μＬの抽出物を、３０℃に保った８０μＬＸｕＫ混合物《全量１００ｍＬに対し、６１ｍｇのＮａ２ＡＴＰ・３Ｈ２Ｏ，１０．０ｍＬの０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５），１．２ｍＬの０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２（１６．０ｍＬに希釈）に加え、さらに１０μＬの２０ｍＭキシルロースを含む》に加えた。ブランクとして水をキシロースに置き換えた。反応は２分間沸騰させて停止し、氷に移した。９００μＬのＨｅｋ２（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２．５ｍＭ  ＰＥＰ及び０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ）を加え、１４，０００Ｇ１０分遠心した。上清をスペクトロフォトメーターキュベットに移し、初期の３４０ｎｍ吸光度ベースラインを確立する。１０μＬのミオキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ及び乳酸塩デヒドロゲナーゼの１：１：１混合物を加え、最終的な吸光度を測定する。全タンパク質量は、ＢＳＡをスタンダードとして、新タンパク質定量試薬（Ｃｙｓｏｓｋｅｌｅｔｏｎ＃ＡＤＶ０１）を用いて決定した。ＣＤ８０４株に対するキシルロキナーゼ活性は、６９．７＋／−８．０ｍＵ／ｍｇであるのに対し、ＣＤ８０５株に対する活性は、４００．８＋／−１０２．７ｍＵ／ｍｇであり、ＣＤ８０５は、ＳｃＸＫＳ１活性を過剰発現したことを示す。
【０１０８】
実施例６Ａ：Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＫｍＸＹＬ２）遺伝子の隣接上流及び下流領域、及びＳｃＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーター制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ  ｈｐｈ遺伝子を有する、プラスミドｐＣＭ２３（図２０）の構築
Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＫｍＸＹＬ２）遺伝子のプロモーター領域を含む９８８ｂｐ断片を、配列番号９６及び９７で表わすプライマーを用い、ゲノムよりＰＣＲ増幅した。熱サイクル条件は、ｐｆｘＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用いて、３５サイクルの９４℃３０秒、５２℃３０秒、６８℃１分後、最終インキュベーション６８℃８分であった。産物をＴＯＰＯＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）中にクローン化した。プラスミドｐＵＣ１９（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）をＥｃｏＲＩで消化し、１．０％ゲルで分離した。２．６８６ｋｂｐバンドをｐＵＣ１９プラスミドより単離し、ＴＯＰＯＩＩプラスミドからＥｃｏＲＩ消化で外れた断片と連結し、〜３．６７４ｋｂｐプラスミドを作成し、ｐＣＭ２０と命名した。    
【０１０９】
ターミネーター配列及びＫｍＸＹＬ２遺伝子の下流領域を含む断片を、三種のプライマーセットを用い、ゲノムよりＰＣＲ増幅した。第１のプライマーセットは、配列番号９８及び９９と表わされ、これは興味の対象となる下流領域を増幅した。熱サイクル条件は、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用いて、３５サイクルの９４℃３０秒、５５℃３０秒、６８℃１分後、最終インキュベーション６８℃８分であった。第２のプライマーセットは、配列番号１００及び１０１と表わされる。これらは、２．５μＬの第１のＰＣＲ産物をＤＮＡ鋳型とし、両末端にＳｐｈＩ部位を導入するのに用いられた。熱サイクル条件は、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼを用いて、３５サイクルの９４℃３０秒、６０℃３０秒、６８℃１分後、最終インキュベーション６８℃８分であった。第３のプライマーセットは配列番号１０２及び１０３と表わされる。これらのプライマーセットは、２．５μＬの第２のＰＣＲ産物を用いて、第２のＰＣＲ産物をＰＣＲ増幅した。熱サイクル条件は、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼを用いて、３５サイクルの９４℃３０秒、４７℃３０秒、６８℃１分後、最終インキュベーション６８℃８分であった。最後の産物をＴＯＰＯＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）にクローン化し、ＳｐｈＩで消化し、１．０％ゲルで分離した。〜１．００８ｋｂｐ断片を単離し、ＳｐｈＩ消化プラスミドｐＣＭ２０（上記）と連結し、ｐＣＭ２１（図２０）と命名する〜４．６８２ｋｂｐプラスミドを作成した。
【０１１０】
プラスミドｐＣＭ２１をＳａｃＩ／ＸｂａＩで消化し、１．０％ゲルで分離した。〜４．６６５ｋｂｐのバンドを単離し、ＳａｃＩ／ＳｐｅＩで消化したプラスミドｐＰＳ１（実施例１Ｈ，図８）から単離した〜２．３６６ｋｂｐバンドと連結した。でき上がった〜７．０３１ｋｂｐプラスミドはｐＣＭ２３（図２０）と名付けた。
このプラスミドは、ＳｃＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーター制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ  ｈｐｈ遺伝子により分離された、ＫｍＸＹＬ１遺伝子の隣接した上流領域と下流領域を有する。
【０１１１】
実施例６Ｂ：キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を欠失させるために、プラスミドｐＣＭ２３（実施例６Ａ，図２０）の断片を用いた、ＣＤ８０５（実施例５Ｅ）株より、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ突然変異体（ＣＤ８０６）の誘発
標準的電気穿孔法を用いて、ＣＤ８０５株の単一コロニーを、プラスミドｐＣＭ２３より得た断片で形質転換させた。ＹＰＤ培地内で回復した形質転換細胞を、４時間後、ＹＰＤ＋１５０μｇ／ｍＬヒグロマイシンを含むプレートに蒔種し、４８時間３７℃でインキュベートした。４８時間後ＹＰＤ＋１５０μｇ／ｍＬヒグロマイシンを含むプレートに増殖した８６形質転換体を、新しいＹＰＤ＋１５０μｇ／ｍＬヒグロマイシンを含むプレートに再蒔種した。配列番号１０４及び１０５と表わされるプライマーを用いて、形質転換体に固有のキシリトールデヒドロゲナーゼが存在するか否かを、ＰＣＲでスクリーニングを行った。熱サイクル条件は、Ｆａｉｌｓａｆｅ酵素（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いて、最初のサイクルは、９４℃１０分ではじまり、次ぎに３５サイクルの９４℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃１分後、最終インキュベーション７２℃８分であった。１０６４ｂｐのＰＣＲ産物は、原型のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子であることを示した。１５個の形質転換体は、期待した産物を作らず、これらの１５個の形質転換体では、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子が首尾良く欠失していることを示した。
【０１１２】
これら１５個の形質転換体について、配列番号１０６及び１０７と命名したプライマーを用いてＰＣＲスクリーニングを行った。このプライマーセットは５’末端をＰＣＲ増幅するよう設計された。陽性という結果（〜１．５ｋｂｐ断片）は、ヒグロマイシン耐性遺伝子断片が、形質転換体クロモソーム中で５’クロスオーバーの際、ＫｍＸＹＬ２遺伝子に置き換わったことを示す。配列番号１０８及び１０９と表わされる第３番目のプライマーセットは３´末端をＰＣＲ増幅するよう設計された。〜１ｋｂｐ産物はヒグロマイシン耐性遺伝子断片が、形質転換体クロモソーム中で３’クロスオーバーの際、ＫｍＸＬ２遺伝子に置き換わったことを示す。１５個の形質転換体の中、２個の転換体は、両方のＰＣＲ産物に対応するバンドを有した。これらの一つは標識株ＣＤ８０６であった。ＣＤ８０６株はＳｃＸＫＳ１遺伝子活性を過剰発現しており、キシロースデヒドロゲナーゼ（ＫｍＸＹＬ２）とキシロースリダクターゼ（ＫｍＸＹＬ１）遺伝子を欠失していた。
【０１１３】
キシリトールデヒドロゲナーゼ活性検定：
分離型のバッフル付き振盪フラスコ（容量２５０ｍｌ）にＣＤ８０５（実施例５Ｅ）株及びＣＤ８０６（実施例６Ｂ）株を接種した。フラスコを２５０ｒｐｍで振盪させ、３３℃でインキュベートし、一晩増殖させた。培地は２０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌペプトン及び１００ｇ／Ｌデクストローズを含む。
１６時間後、細胞を４０００Ｇ５分で遠沈し、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、０．５ｍｌ破砕用緩衝液に懸濁させた。破砕用緩衝液は、２００ｍＬ中に１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０），１ｍＭ  ＤＴＴ，４０ｍｇ  ＰＭＳＦ（５００μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、及び４種のプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を含む。細胞は、機械的にガラスビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＣＡ）を用いて溶菌し、１４，０００Ｇ１５分遠心した。上清を取りだし、キットプロトコール（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従い、ＰＤ−１０脱塩カラムを通した。試料を１００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ及び２０ｍＭキシルロースを含む検定用溶液に加えた。吸収は３４０ｎｍで行った。全タンパク質量は、ＢＳＡをスタンダードとして、新タンパク質定量試薬（Ｃｙｓｏｓｋｅｌｅｔｏｎ＃ＡＤＶ０１）を用いて決定した。ＣＤ８０５（実施例５Ｅ）株の酵素解析によると、酵素活性は１４．５＋／−１．６ｍＵ／ｍｇであるのに対しＣＤ８０６株の活性は０．０＋／−０．１ｍＵ／ｍｇであった。これらの結果はキシリトールデヒドロゲナーゼ酵素活性がＣＤ８０６株では欠失していることを示す。
【０１１４】
実施例７Ａ：ＣＤ８０６（実施例６Ｂ）株をプラスミドｐＣＭ２８（実施例３Ｂ，図１２）で形質転換することにより、外因性のＰＸＹＬＡ遺伝子を有し、ＳｃＸＫＳ１遺伝子活性を過剰発現し、またＫｍＸＹＬ１及びＫｍＸＹＬ２遺伝子を欠失した、Ｋ．ｍｒａｘｉａｎｕｓ突然変異体（ＣＤ８８２）の誘発
標準的電気穿孔法を用い、単一コロニーのＣＤ８０６株を、ＮａｅＩで消化したプラスミドｐＣＭ２８で形質転換した。形質転換体は３７℃で一晩生育させ、スクリーニングのために５枚の等しいＳｃ−Ｕｒａプレート上に蒔種した。ＰＸＹＬＡ遺伝子が在ることは、配列番号１１０及び１１１で表わす、プライマーを用いたＰＣＲで証明した。得られた形質転換体（ＣＤ８８２と表す）には、再構成したＰＸＹＬＡ遺伝子が在り、ＳｃＸＫＳ１遺伝子活性が過剰発現し、またＫｍＸＹＬ１及びＫｍＸＹＬ２遺伝子が欠失していた。
【０１１５】
実施例７Ｂ：ＣＤ８８２株（実施例７Ａ）の酵素的及びＷｅｓｔｅｒｎ解析
ＣＤ８８２からのタンパク質は、６Ｘポリ−Ｈｉｓ標識に結合するＰｒｏｂｏｎｄＮｉ２＋キレート樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、ＵＳＡ）を用いたカラムにより精製した。Ｎｉ−ＮＴＡ−ＨＲＰと結合したプローブ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、標識したタンパク質を直接検出した。精製過程で集めた分画のＷｅｓｔｅｒｎ解析により、ＣＤ８８２株にＸＩタンパク質が在ることが確認できた。酵素活性測定は、"Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓキシロースイソメラーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で発現された場合、誤フォールディングされている"Ｇａｒｄｏｎｙｌ他２００３、に記載されている方法により行われた。検討した結果、６Ｘポリ−Ｈｉｓ標識ＰＸＹＬＡ遺伝子が、ＣＤ８８２株でＷｅｓｔｅｒｎ解析により、検出された同じ分画でキシロースイソメラーゼ活性が在ることが確認できた。
【０１１６】
実施例８Ａ：ポリ−Ｈｉｓ末尾の機能を阻止する停止コードンを有し、再構成したＰＸＹＬＡ遺伝子を有する、プラスミド（ｐＣＭ２９，図２１）の構築
再構成されたＰＸＹＬＡ遺伝子（実施例２Ａ）はｐＣＭ１７（実施例２Ｂ，図１０）を鋳型とし、配列番号１１２及び１１３で表わすプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅した。熱サイクル条件は、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼを用いて、３５サイクルの９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１．５分後、最終インキュベーション７２℃８分であった。ＰＣＲ産物はＳｂｆＩで消化し、１．０％アガロースゲル上の電気泳動で分離した。１３１９ｂｐ産物を単離し、ＳｂｆＩで消化したプラスミドｐＣＭ９（実施例１Ｉ，図９）から得た６８２９ｂｐ断片と連結し、〜８１４８ｂｐプラスミド（ｐＣＭ２９，図２１）を得た。このプラスミドは、ＫｍＰＣＤ１プロモーター及びＳｃＣＹＣ１ターミネーターの制御下で、非機能的なポリ−Ｈｉｓ末尾を伴うＰＸＹＬＡ遺伝子及びＥ，ｃｏｌｉ  ｈｐｈ発現カセットを有する。
【０１１７】
実施例８Ｂ：ＣＤ８０６（実施例６Ｂ）株をプラスミドｐＣＭ２９（実施例８Ａ，図２１）で形質転換することにより、非Ｈｉｓ標識ＰＸＹＬＡ遺伝子を有し、ＳｃＸＫＳ１遺伝子活性を過剰発現し、またキシロースデヒドロゲナーゼ及びキシロースリダクターゼ遺伝子を欠失した、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ突然変異体株（ＣＤ８６１）の誘発
標準的電気穿孔法を使い、ｐＣＭ２９を消化して得た３．１９２ｋｂｐＰｖｕＩＩ／ＳｐｈＩ断片を用いて、ＣＤ８０６株を形質転換した。ＹＰＤ培地で回復した形質転換細胞を、６時間後、ＹＰＸ＋３００μｇ／ｍｌＧ４１８＋１５０μｇ／ｍｌヒグロマイシン（ｐＨ７．０）上に播種した。３０℃で５日後、数百の小さなコロニーと一個の大きなコロニーが生育した。大きなコロニーをＣＤ８６１と命名した。
ＣＤ８６１株上でゲノムウオーキングを行い、ＰＸＹＬＡ遺伝子がどの様に組み込まれているか確認した。ＰＸＹＬＡ遺伝子は、固有ＰＤＣ遺伝子のプロモーターの直接上流領域に、１コピー以上組み込まれていることが分かった。１コピーは、約１４２ｂｐの上流領域遺伝子及びＳｃＣＹＣ１ターミネーターを有する、プラスミドｐＣＭ２９に存在する〜１２３６ｂｐＫｍＰＤＣ１プロモーターの制御下にあった。他のコピーは、このＳｃＣＹＣ１ターミネーターの直接下流領域に在り、固有のＫｍＰＤＣ１プロモーター長とマッチする１０２６ｂｐプロモーターを有していた。このプロモーターは、ｐＣＭ２９及び第一コピーのプロモーターと比較すると、上流領域遺伝子の１４２ｂｐ、及びさらに５’末端の６８ｂｐを欠いている。第２のコピーもまた、ＳｃＣＹＣ１ターミネーターの制御下にあった。
この第２のＳｃＣＹＣ１ターミネーターの直接下流に固有の、１０２６ｂｐＫｍＰＤＣ１プロモーターがあり、固有のＫｍＰＤＣ１遺伝子が続く。
【０１１８】
実施例８Ｃ：ＣＤ８６１（実施例８Ｂ）のキシロースイソメラーゼ、キシロースリダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、及びキシルロキナーゼ酵素解析
分離型のバッフル付き振盪フラスコ（容量２５０ｍｌ）にＣＤ８０６（実施例６Ｂ）及びＣＤ８６１（実施例８Ｂ）を接種した。フラスコは、２５０ｒｐｍで振盪させ、３０℃でインキュベートし、一晩増殖させた。培地は、３００μｇ／ｍＬＧ４１８及び１５０μｇ／ｍＬヒグロマイシンを補強した、２０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌペプトン及び１００ｇ／Ｌデクストローズを含む。細胞はＹ−ＰＥＲ溶液（Ｐｉｅｃｅ−Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で溶菌し、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて脱塩した。検定用溶液は、１、０ｍＬ中に、１００ｍＭ  ＴＥＳ−ＮａＯＨ，  ２５０ｍＭキシロース、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．６ｍＭ  ＮＡＤＨ，１Ｕ  ＳＤＨ（Ｓｉｇｍａ）（ｐＨ７．０）を含み、１００μＬの細胞抽出液を加えた。キシロースイソメラーゼ活性は同じ検定用溶液よりキシロースを除いたブランクを用いて測定した。ＣＤ８０６株のキシロースイソメラーゼ活性は０であったが、ＣＤ８６１株のものは、１．０７＋／−０．２１Ｕ／ｍｇ粗抽出物であった。このことは、ＣＤ８６１株は機能的なキシロースイソメラーゼ遺伝子を有することを証明する。
【０１１９】
キシロースリダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ及びキシルロキナーゼ検定もまた最終株の活性／活性喪失を証明する為に行われた。ＣＤ８６１（実施例８Ｂ）株及びＣＤ６８３（実施例４Ｃ）株は別々に一晩、（ＣＤ８６１株に対しては３００μｇ／ｍＬＧ４１８及び１５０μｇ／ｍＬヒグロマイシンを補強した）２０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌペプトン及び１００ｇ／Ｌデクストローズを含む培地中で増殖させた。細胞は、Ｙ−ＰＥＲ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ−Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で溶菌した。全タンパク質量は、ＢＳＡを標準として、新タンパク質定量試薬（Ｃｙｓｏｓｋｅｌｅｔｏｎ＃ＡＤＶ０１）を用いて決定した。キシロースリダクターゼ酵素活性は、ＣＤ８６１株において２６０＋／−４１．８ｍＵ／ｍＬであるのに対し、ＣＤ６８３株は５１６．５＋／−１０．６ｍＵ／ｍＬであった。〜５０％の活性の低下は、キシロースリダクターゼ遺伝子の欠失を示し、測定された活性は、キシロースをキシルロースにいくらか変換できる非特異的なアルドースリダクターゼ酵素に帰因できる。キシリトールデヒドロゲナーゼ酵素活性はＣＤ８６１株に対して１２．４＋／−４．４ｍＵ／ｍＬであるのに対し、ＣＤ６８３株では１１０．４＋／−７．２ｍＵ／ｍＬであった。キシルロキナーゼ酵素活性は、ＣＤ８６１株に対し、３７０．５＋／−１４７．６ｍＵ／ｍＬであるのに対し，ＣＤ６８３株については４４．８＋／−８．２ｍＵ／ｍＬであった。
【０１２０】
実施例８Ｄ：ＣＤ８６１株（実施例８Ｂ）におけるＰＸＹＬＡ遺伝子の速度論的解析
単一コロニーのＣＤ８６１株を、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン及び１００ｇ／Ｌデキストロースを含む培地中に接種し、一晩増殖した。細胞を遠心で集菌し、１０ｍＬの１００ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（ｐＨ７．０）で一回洗浄し、再び遠心した。
これについて、２ｍＬのＹ−ＰＥＲ溶液を加え、穏やかに懸濁し、細胞溶液を室温で３０分、時々かき回しながらインキュベートした。細胞を遠沈し、上清をＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で脱塩した。酵素検定は実施例８Ｃで記載したように行ったが、ただ一点の違いは基質濃度を０．０５−１０ｍＭキシロースと変えたことである。Ｋｍ及びＶｍａｘはＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎプロットにより得たが、Ｖｍａｘが〜１．８であり、対応するＫｍが２．２ｍＭキシロースであった。Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットにより、対応するＶｍａｘが〜１．０であり、対応するＫｍが１．２ｍＭキシロースであった。
【０１２１】
実施例８Ｅ：ＣＤ８６１株（実施例８Ｂ）のＰＸＹＬＡ活性の、キシリトールによる阻害研究
ＣＤ８６１株は、既知のキシロースイソメラーゼ阻害剤である、様々な濃度のキシリトールを含んだキシロース培地中で増殖した。キシリトールレベルが０から０．２５ｍＭに増加すると、キシロースイソメラーゼ酵素のＫｍ値は２倍になり、キシリトールレベルが０．５０ｍＭに増加すると、更に２倍となった。
【０１２２】
実施例８Ｆ，ＣＤ８６１株（実施例８Ｂ）のＰＸＹＬＡ遺伝子のｐＨ許容度
単一コロニーのＣＤ８６１を１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン及び１００ｇ／Ｌデキストロースを含む培地中に接種し、一晩増殖した。細胞を遠心で集菌し、１０ｍＬの１００ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（ｐＨ７．０）で１度洗浄し、再び遠心した。これに対し、２ｍＬのＹ−ＰＥＲ溶液を加え、穏やかに懸濁し、細胞溶液を室温で３０分、時々かき回しながらインキュベートした。重複した検定溶液には、９００μＬ中、１００ｍＭ  ＴＥＳ−ＮａＯＨ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．６ｍＭ  ＮＡＤＨ，２５０ｍＭキシロース及び１Ｕ  ＳＤＨを加え、それぞれ５Ｍ乳酸（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）でｐＨをｐＨ７．０，６．６，５．９，４．６，３．８に調整した。ここに１００μＬの酵素、又は、その希釈液を加え、最終容量を１ｍＬとした。酵素活性は、実施例８Ｃに従い測定した。最適活性は、ｐＨ６．５であった。ｐＨ５．９において、タンパク質は最大活性の４５％を保持していた。
【０１２３】
実施例９Ａ：ＣＤ８０６（実施例６Ｂ）、ＣＤ８６１（実施例８Ｂ）及びＣＤ８６２（実施例７Ａ）株の微好気的震動フラスコによる特徴付け
単一コロニーのＣＤ８０６，ＣＤ８６１及びＣＤ８８２株を、３００μｇ／ｍＬＧ４１８及び３００μｇ／ｍＬヒグロマイシンを補強した、２０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌペプトン及び１００ｇ／Ｌデキストロースを含む１００ｍＬの培地中に別々に接種し、一晩増殖した。
細胞乾燥重量を測定し、２ｇ細胞乾燥重量（ｇｃｄｗ）当たりの適量の培地を遠心し、２０ｇ／Ｌ酵母ペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５０ｇ／Ｌキシロース及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．０を含む５０ｍＬの培地に懸濁した。細胞は２５０ｍＬのバッフル付き振盪フラスコに入れ、３０℃，７０ｒｐｍで振盪下に置いた。ＣＤ８０６株は唯一の産物として０．７ｇ／Ｌキシリトールを産生した。ＣＤ８８２株は、測定しうる産物としては、０．４ｇ／Ｌ酢酸塩の他に、３．８ｇ／Ｌキシリトールを産生した。ＣＤ８６１株は、１３．５ｇ／Ｌエタノール、０．４ｇ／Ｌキシリトール及び少量のグリセロール、酢酸塩、コハク酸塩（<２ｇ／Ｌ，全）を産生した。
【０１２４】
実施例９Ｂ：ＣＤ８０６（実施例６Ｂ），ＣＤ８６１（実施例８Ｂ），及びＣＤ８８２（実施例７Ａ）のチューブ振盪型フラスコにより特徴付け
ＣＤ８０６，ＣＤ８６１，及びＣＤ８８２の単一コロニーを、３００μｇ／ｍＬＧ４１８及び３００μｇ／ｍＬヒグロマイシンを補強した、２０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌペプトン及び１００ｇ／Ｌデキストロースを含む１００ｍＬの培地中に別々に接種し、一晩増殖した。各株の一晩増殖液の５０ｍＬを遠心し、２０ｇ／Ｌ酵母ペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５０ｇ／Ｌキシロース及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．０を含む２５ｍＬの産生培地に再懸濁した。１ｍＬの細胞再懸濁液を５０ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎチューブ中の４５ｍＬの産生培地に加え、最初のＯＤを記載した（ＯＤ値については別表を参照）。この操作を何回か繰り返し、実験を通して充分な試料を取り込むようにした。チューブは、産生条件３３℃、２００ｒｐｍに保った。ＣＤ８６１株は２１ｇ／Ｌエタノールを産生し、この条件下での容積産生率０．３ｇ／Ｌ−ｈｒを示した。ＣＤ８０６株はキシロースを消費できなかった。ＣＤ８６１株とＣＤ８８２株は、どちらも嫌気的産生を示した。
【０１２５】
実施例１０Ａ：ＳｃＰＧＫプロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターの制御下のＬ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬｈＬＤＨ）遺伝子及び、隣接したＨｉｓ繰り返しなしのＳｃＵｒａ３遺伝子を有する、プラスミドｐＶＲ１１３（図２２）の構築
プラスミドｐＣＭ２８（実施例３Ｂ，図１２）を鋳型として用い、配列番号１１４及び１１５で表わすプライマーを用いて、ＰＣＲによって、隣接したＨｉｓＧリピートを取り外しつつＳｐｈＩ部位を導入した。熱サイクル条件は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素（Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用い、９４℃１０分の最初のサイクル後、３５サイクルの９４℃３０秒、４５℃３０秒、７２℃１．４分後、最終インキュベーション７２℃８分であった。得られたプラスミドをＳｐｈＩで消化し、隣接したＨｉｓＧ繰り返しなしのＳｃＵｒａ３遺伝子を有する〜１．４５ｋｂｐ断片を得た。
ＳｃＰＧＫプロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターの制御下のＬ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬｈＬＤＨ）遺伝子及びＳｃＰＧＫプロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターの制御下にあるＧ４１８耐性マーカー遺伝子、を有するプラスミド（図６のｐＶＲ３９及びＷＯ０３／１０２１５２Ａ１の実施例１Ｅと同一）をＳｐｈＩで消化し、〜５．１６ｋｂｐ断片を作成した。この〜５．１６ｋｂｐ断片を上記の〜１．４５ｋｂｐ断片と連結し、〜６．６１ｋｂｐプラスミド（ｐＶＲ１１３，図２２）を得た。
【０１２６】
実施例１０Ｂ：ＣＤ８６１（実施例８Ｂ）株をプラスミドｐＶＲ１１３（実施例１０Ａ，図２２）で形質転換することにより、外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及び、非Ｈｉｓ標識ＰＸＹＬＡ遺伝子を有し、ＳｃＸＫＳ１遺伝子活性を過剰発現し、またキシロースデヒドロゲナーゼ及びキシロースリダクターゼ遺伝子を欠失した、Ｋ．ｍｒａｘｉａｎｕｓ突然変異体株（ＣＤ８９６）の誘発
標準的電気穿孔法を用い、単一コロニーのＣＤ８６１株をプラスミドｐＶＲ１１３により形質転換した。４時間ＹＰＤ中で回復した形質転換細胞を、ＳｃＵｒａプレートに蒔種した。１個の陽性の形質転換体（ＣＤ８９６株）が、ＬｈＬＤＨ／ＳｃＵｒａ３カセットに対するＰＣＲスクリーニングにより選択された。この形質転換体は、キシロースイソメラーゼ及びキシルロキナーゼプライマーにより陽性のＰＣＲ結果を示し、キシルロリダクターゼ及びキシリトールデヒドロゲナーゼプライマーによりネガティブな結果を示した。
【０１２７】
実施例１０Ｃ：ＣＤ８９６（実施例１０Ｂ）株の振盪フラスコによる特徴付け
単一コロニーのＣＤ８９６株（実施例１０Ｂ）を５０ｍＬのＹＰＤ培地（２５０ｍＬバッフル付きフラスコ中、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン及び１００ｇ／Ｌグルコース）に蒔種し、１６時間、３７℃、２５０ｒｐｍで増殖させた。この培養液より、３ｇｃｄｗを、５０ｇ／Ｌキシロース、２３ｇ／Ｌ  ＣａＣＯ３と共にＹＰ（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物２０ｇ／Ｌペプトン）を入れた振盪フラスコ（微好気的）中に接種し、及び２５０ｍＬガラスボトル（嫌気的）に接種した。フラスコは４２℃でインキュベートし、試料をランダムな間隔でＨＰＬＣのために、取り出した。微好気的条件でＣＤ８９６株の発酵によって、３９ｇ／ＬタイターのＬ−乳酸が得られ、収率はキシロース消費量により７７−７９％であった。Ｌ−乳酸の体積的な産生性は、１ｇ／Ｌ／ｈｒであった、それに対し、初期のキシロース消費速度は１．０と１．４ｇ／Ｌ／ｈｒの間であった。ＣＤ８９６株のＹＰ＋５０ｇ／Ｌキシロース＋２３ｇ／Ｌ炭酸カルシウム上で、嫌気的条件下での発酵により、最初の２４時間に、１０ｇ／ＬＬ−乳酸を産生し、その後キシロース消費は失速した。
【０１２８】
実施例１１Ａ：隣接したＨｉｓリピートのないＳｃＵｒａ３遺伝子と共に、コード化したポリ−Ｈｉｓ標識付き（ｐＣＭ３１，図２３）及び標識なし（ｐＶＲ１１８，図２４）の、再構成したＰＸＹＬＡ遺伝子を有する二重のプラスミドの構築
この実験は再構成されたＰＸＹＬＡ遺伝子の活性に及ぼすポリ−ｈｉｓ標識の効果を調べるために設計された。５μｇのｐＣＭ１４（実施例３Ａ，図１１）をＳｐｈＩで消化し、１．０％アガローズゲル上で電気泳動分離を行った。〜５８８９ｂｐ産物を単離し、プラスミドｐＶＲ１１３（実施例１０Ａ，図２２）をＳｐｈＩで消化して得られた〜１４５０ｂｐ断片と連結して、〜７３３９ｂｐプラスミド（ｐＣＭ３１図２３）を作成した。プラスミドｐＣＭ３１は、ポリ−ｈｉｓ末尾を伴うＫｍＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＣＹＣ１ターミネーターの制御下にあるＰＸＹＬＡ遺伝子及びＳｃＵｒａ３発現カセットを有する。別個に、５μｇのプラスミドｐＣＭ２９（実施例８Ａ，図２１）をＳｐｈＩで消化し、１．０％アガロースゲル上で電気泳動により分離した。〜５８９２ｂｐ産物を単離し、プラスミドｐＶＲ１１３をＳｐｈＩで消化して得た１４５０ｂｐ断片と連結し、〜７３４２ｂｐプラスミド（ｐＶＲ１１８，図２４）を作成した。プラスミドｐＶＲ１１８は、プラスミドｐＣＭ３１と類似しているが、ポリ−ｈｉｓ末端の発現を妨げる終結コードンを有している。
【０１２９】
実施例１１Ｂ：ＣＤ８０９（実施例６Ｂ）株をプラスミドｐＣＭ３１（実施例１１Ａ，図２３）及びｐＶＲ１１８（実施例１１Ａ，図２４）で形質転換することにより、隣接したポリ−Ｈｉｓリピートを伴わないＳｃＵｒａ３遺伝子と共に、Ｈｉｓ標識を有する（ＣＤ９２９）及び有しない（ＣＤ９３１）、再構成したＰＸＹＬＡ遺伝子を有する、Ｋ．ｍａｒａｘｉａｎｕｓ突然変異体株（ＣＤ８９６）の誘発
標準的電気穿孔法を用い、単一コロニーのＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓＣＤ８０６株（実施例６Ｂ）をプラスミドｐＣＭ３１で形質転換した。形質転換体をＹＰＤ培地で回復させ、４時間後Ｓｃ−Ｕｒａプレート上に蒔種した。２個の形質転換体をＰＣＲ増幅し、再構成したＰＸＹＬＡ遺伝子（コード化したポリ−ｈｉｓ標識を伴う）、及び過剰発現したＳｃＸＫＳ１遺伝子を有することが証明され、またＫｍＸＹＬ１及びＫｍＸＹＬ２遺伝子の欠失が確認された。これら形質転換体の１つはＣＤ９２９株と命名された。
標準的電気穿孔法を用い、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓＣＤ８０６株をプラスミドｐＶＲ１１８により形質転換した。形質転換体は、ＰＣＲにより、再構成したＰＸＹＬＡ遺伝子（コード化したポリ−ｈｉｓ標識を伴わず）、及び過剰発現したＳｃＸＫＳ１遺伝子を有することが証明され、またＫｍＸＹＬ１及びＫｍＸＹＬ２遺伝子の欠失が確認され、ＣＤ９３１株と名付けられた。
ＣＤ９３１株のゲノムウオーキングにより、ＣＤ８６１（実施例８Ｂ）株に対して記載されたと同じ方法で、ＰＸＹＬＡ遺伝子が２重に組み込まれていることが証明された。
【０１３０】
実施例１１Ｃ：ＣＤ９２９及びＣＤ９３１（実施例１１Ｂ）株の振盪フラスコによる特徴付け
ＣＤ９２９及びＣＤ９３１（実施例１１Ｂ）の単一コロニーを別々に、２５０ｍＬバッフル付き振盪フラスコに入れた、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、７０ｇ／Ｌグルコース、３００μｇ／ｍＬＧ４１８＋１５０μｇ／ｍｌヒグロマイシンを含む１００ｍＬの培地に蒔種した。培養は一晩３５℃、２５０ｒｐｍでインキュベートして行った。細胞は４５ｍＬ産生培地（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、５０ｇ／Ｌキシロース、１００ｍＭ  Ｔｅｓ−ＮａＯＨ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．０）を入れた５０ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎチューブに、０．２ＯＤまで接種した。チューブは３７℃、２５０ｒｐｍに置かれ、ランダム間隔でサンプリングされ、ＨＰＬＣで分析された。ＣＤ９２９株は１．７ｇ／Ｌ  ＥｔＯＨを産生し、１．１ｇ／Ｌキシルロースを蓄積した。ＣＤ９３１株は１５．２ｇ／Ｌ  ＥｔＯＨを産生し、４．５ｇ／Ｌキシルロースを蓄積した。両ＣＤ株の産生力を比較すると、キシロースイソメラーゼ遺伝子が、ポリ−ｈｉｓ末尾を持たないとＥｔＯＨ産生量はおよそ９倍になることを示す。同様に、ポリ−ｈｉｓ末尾を欠くと、キシルルロース産生は４倍増加する。
【０１３１】
実施例１２Ａ：プラスミドｐＣＭ５２（図２５）による形質導入により、ＫｍＸＹＬ２遺伝子のＣＤ８６１株（実施例８Ｂ）への再組み込み；得られた形質転換体の振盪フラスコによる評価
９８２ｂｐの５’隣接領域及び２００ｂｐの３’隣接領域と共にＫｍＸＹＬ２遺伝子が、配列番号１１６及び１１７と表わされるプライマーを用いて、野生型Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ株のゲノムＤＮＡから増幅された。これらのプライマーはＳａｃＩＩ制限酵素部位を導入する。でき上がったＰＣＲ産物をＳａｃＩＩで消化し、同様に消化した、エビアルカリリン酸−処理プラスミドｐＶＲ１１３（実施例１０Ａ，図２２）と連結した。でき上がったプラスミドをｐＣＭ５２（図２５）と呼称する。配列番号１１８及び１１９で表わすプライマーを用いて、ｐＣＭ５２をスクリーニングした。増幅されたＫｍＸＹＬ２遺伝子は配列決定され、２つのエラー、１つはサイレントであり、他方はアミノ酸変化８５Ｖ→Ｉを有していた。
プラスミドｐＣＭ５２をＰｖｕＩＩで消化し、標準的電気穿孔法を用いて、ＣＤ８６１（実施例８Ｂ）に形質導入した。形質転換体をＳｃ−Ｕｒａプレートに蒔種し、３７℃でインキュベートした。配列番号１０４及び１０５で表わすプライマーを用いて、ＫｍＸＹＬ２遺伝子の解読領域を増幅し、配列番号１２０及び１２１で表わすプライマーを用いて、ＳｃＵｒａ３遺伝子からなる領域から、５’隣接領域を通って、ＫｍＸＹＬ２遺伝子の解読領域まで増幅した。両バンドが陽性で、ＫｍＸＤＨ活性（ＸＤＨ＋形質転換体）を示す５つの形質転換体を振盪フラスコ解析用に取り出した。
ＸＤＨ＋形質転換体のＫｍＸＤＨ活性は、遺伝子に導入された２個のエラーは活性を破壊しないことを示した。５個のＸＤＨ＋形質転換体の各々からの単一コロニーは、これらのコロニーをＹＰＸプレート上の２回の増殖で得た。各コロニーをＹＰＸ培地（ｐＨ６．５）に接種し、３５℃で，一晩インキュベートした。各々２ｇｃｄｗを遠心で集菌し、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、５０ｇ／Ｌキシロース、１０ｍｇ  ＭｇＣｌ２及び７．５ｇ／Ｌ  ＣａＣＯ３を含む５０ｍｌの培地に再懸濁した。フラスコは３５℃，７０ｒｐｍ振盪で産生期に入った。ＣＤ８６１株（実施例８Ｂ）も同様に培養し、ＫｍＸＹＬ２再組み込みの影響を調べた。
【０１３２】
ＣＤ８６１株は、０．４６ｇ／Ｌ−ｈｒ容積当たり産生量、及びキシロース消費量１．４７ｇ／Ｌ―ｈｒを示した。５個のＸＤＨ＋形質転換体は、平均で７０％低い産生性、及び６５％低い消費速度を有していた。〜４８時間後、ＣＤ８６１株は、〜１４ｇ／Ｌエタノール及び〜４．７ｇ／Ｌキシリトールを示したのに対し、５個のＸＤＨ＋形質転換体は、〜２．８−６．３ｇ／Ｌエタノール、及び１．２−２．２ｇ／Ｌキシリトールを産生した。しかしながら１個のＸＤＨ＋形質転換体以外は全て、４０時間を超えてもキシロース消費を時間と共に続けたが、およそ４０時間でエタノール産生を停止した。
【０１３３】
産生開始時及び産生開始６７時間後取りだした細胞を溶菌し、新タンパク質定量試薬（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ−ＵＳＡ）を用いてタンパク質定量を行った。２．３５５ｍＬ  １Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を最終ＮＡＤＨ濃度１．５ｍＭになるように５ｍｇβ−ＮＡＤＨ（Ｓｉｇｍａ）に加え、１０Ｘ溶液を準備した。水は全容量が９５０μＬ（試料体積が９５０μＬより少ない場合）なるよう加えた。次ぎに、無細胞抽出物を加え、３４０ｎｍ吸光度を数分間にわたって測定し、バックグラウンドを定めた。次ぎに、５０μＬの０．４Ｍキシルロースを加え、ＸＤＨ活性を測定するために３４０ｎｍ吸光度を追い続けた。５個のＸＤＨ＋形質転換体のＸＤＨ活性は、産生開始時に２８７−３７４ｍＵ／ｍｇであった。産生開始後６７時間では、ＸＤＨ活性は、６２−８６ｍＵ／ｍｇの範囲であった。ＣＤ８６１株のＸＤＨ活性は、産生開始時１６ｍＵ／ｍｇまた、産生開始後６７時間で３ｍＵ／ｍｇであった。
【０１３４】
実施例１２Ｂ：プラスミドｐＣＭ２８（実施例３Ｂ，図１２）の形質導入によるＣＤ８６１（実施例８Ｂ）株のＳｃＸＫＳ１遺伝子の欠失；得られた形質転換体の振盪フラスコ検定
プラスミドｐＣＭ２８を、別々にＮａｅＩとＰｖｕＩＩにより線型化し、標準的電気穿孔法によりＣＤ８６１株に形質導入した。細胞をＹＰＤ培地で３時間回復後、Ｓｃ−Ｕｒａドロップアウト培地に蒔種した。３２コロニーを２枚づつのプレート上に再蒔種した。
これらに対し、配列番号１２２及び１２３で表わすプライマーを用いたＰＣＲスクリーニングを行い、ＳｃＸＫＳ１遺伝子の解読領域を増幅した。バンドを示さなかった（ＳｃＸＫＳ１遺伝子の欠除を意味する）６個のコロニーをＹＰＤ培地に一晩接種しＳｃＵｒａ３遺伝子をループアウト（消失）させ、ループアウトが実際起こった細胞を選択するために、ＦＯＡプレートに蒔種した。発育したコロニーをＹＰＤ上に再蒔種し、単一の分離したコロニーを選択した。上記プライマーを用いて、各形質転換体から単一コロニーをスクリーニングし、ＰＸＹＬＡ，ＫｍＸＹＬ１及びＫｍＸＹＬ２遺伝子があるかどうか調べた。更に別なＰＣＲスクリーニングを行い、ＳｃＸＫＳ１カセットがプラスミドｐＣＭ２８からのＰＸＹＬＡカセットに置き換えられるという、二重交叉事象をスクリーニングした。分離した６コロニー全て、ＰＸＬＡ遺伝子陽性であり、ＫｍＸＹＬ１，ＫｍＸＹＬ２及びＳｃＸＫＳ１遺伝子ネガティブであった。これらの一つをＣＤ１０６５と名付け、振盪フラスコ検定に回した。
【０１３５】
ＣＤ１０６５及びＣＤ８６１株を別々に５０ｍＬＹＰＤを入れた２５０ｍＬ振盪フラスコに接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。細胞を集菌し、４ｇｃｄｗを５０ｍＬＹＰＸに接種した。フラスコを３５℃、７０ｒｐｍでインキュベートした。試料を定期的に取りだし、発酵能力を監視した。ＣＤ１０６５株は１０−２０時間の遅延時間を示し、その間キシロースを非常にゆっくり消費する。この遅延は固有のキシルロキナーゼ遺伝子のグルコース抑制に帰因する。この遅延時間以降、キシロース消費速度は上昇し、ＣＤ１０６５株は、６５時間後に、約１３ｇ／Ｌエタノールを産生する。ＣＤ８６１株のエタノール産生はより急速であり、２０時間後に、約１８ｇ／Ｌエタノールを産生する。ＣＤ１０６５株は、２０時間後に、およそ３．７ｇ／Ｌキシルロースを産生するが、キシルロース濃度は以後次第に減少する。ＣＤ１０６５株のキシルロキナーゼ活性は、殆ど０であり、ＣＤ８６１株のものは、約４１７ｍＵ／ｍｇである。ＣＤ８６１株のキシロース消費速度はＣＤ１０６５株の速度に比べると約２倍である。キシロースイソメラーゼ活性については、ＣＤ１０６４株が０．９６Ｕ／ｍｇであるのに対し、ＣＤ８６１株は約１．７９Ｕ／ｍｇであった。これらの結果から、キシルロキナーゼの過剰発現によりキシロース活用率及びエタノール産生速度は、これらの条件下で非常に改善されたことを示す。
産生期を追って、ＣＤ８６１及びＣＤ１０６５株からの細胞を取りだし、ＹＰＸプレートに蒔種し、嫌気的ジャーの中に置いた。両者とも同程度増殖した。
【０１３６】
実施例１２Ｃ：プラスミドｐＣＭ５５（図２６）の形質導入による、ＫｍＸＹＬ１遺伝子をＣＤ８６１（実施例８Ｂ）株に再挿入；得られた形質転換体の振盪フラスコ検定
配列番号１２４及び１２５で表わすプライマーを用い、ＫｍＸＹＬ１遺伝子を８９０ｂｐの５’隣接領域及び４１４ｂｐの３’隣接領域と共に野生型Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ株のゲノムＤＮＡから増幅した。これらのプライマーは、ＳａｃＩＩ制限部位を導入した。得られたＰＣＲ産物をＳａｃＩＩで消化し、同様に消化した、エビアルカリリン酸―処理したプラスミドｐＶＲ１１３（実施例１０Ａ，図２２）と連結した。得られたプラスミドを、ｐＣＭ５５（図２６）と名付けた。配列番号１１８及び１２６で表わすプライマーを用いて、プラスミドｐＣＭ５５をスクリーニングし、ＢｓｔＩ及びＳｂｆＩを用いた制限酵素マッピングにより方向性を確認した。増幅したＫｍＸＹＬ１遺伝子を配列決定し、３カ所のエラー、一カ所はサイレントであり、他の箇所は７１Ｖ→Ａ，１１２Ｙ→Ｈ及び３０２Ｉ→Ｖのアミノ酸変化を起こしていた。
【０１３７】
プラスミドｐＣＭ５５をＰｖｕＩＩで消化し、標準的電気穿孔法を用い、ＣＤ８６１（実施例８Ｂ）株に形質導入した。形質転換体をＳｃ−Ｕｒａプレートに蒔種し、３７℃でインキュベートした。配列番号１２７及び１２８で表わすプライマーを用いて、ＫｍＸＹＬ１遺伝子の解読領域を増幅し、配列番号１２１及び１２９で表わすプライマーを用いて、ＳｃＵｒａ３遺伝子のある領域を３｀隣接領域からＫｍＸＹＬ１遺伝子の解読領域まで増幅した。両バンド（ＸＲ＋形質転換体）に陽性な６個の形質転換体を振盪フラスコ分析に回した。
【０１３８】
５個のＸＲ＋形質転換体の各々から分離したコロニーは、最小培地からＹＰＤへ再蒔種することで得られた。分離コロニーはＹＰＸ培地に接種する前に、ＹＰＸ＋３００μｇ／ｍＬＧ４１８＋３００μｇ／ｍｌヒグロマイシン上に再蒔種した。これらの形質転換体は１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、５０ｇ／Ｌキシロース（ｐＨ６．５）を含む培地に接種し、３５℃４８時間インキュベートした。各々の１ｇｃｄｗを遠心で集菌し、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、５０ｇ／Ｌキシロース、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び７．５ｇ／Ｌ  ＣａＣＯ３を含む５０ｍｌの培地に懸濁した。フラスコを、３５℃、７０ｒｐｍ振盪の産生期に置いた。ＣＤ８６１株（実施例８Ｂ）を同様に培養し、２ｇｃｄｗを用いて、ＫｍＸＹＬ１再挿入の効果を比較した。
【０１３９】
ＣＤ８６１株は０．７９ｇ／Ｌ−ｈｒの容量で表した産生率を有し、キシロース消費速度は２．０２ｇ／Ｌ−ｈｒ（２ｇｃｄｗに基づく）であった。５個のＸＲ＋形質転換体は、約２０−５０時間の遅延時間を有し、その後容量で表わした産生率０．０５−０．１３ｇ／Ｌ−ｈｒの範囲を示し、キシロース消費速度は、０．４５−０．６７ｇ／Ｌ−ｈｒであった。
これら５個のＸＲ＋形質転換体のエタノール収量は、１８−３３％で、ＣＤ８６１株の場合は５１％であった。
産生開始時、及び産生開始６７時間後、細胞を取りだし、溶菌し新タンパク質定量試薬（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ−ＵＳＡ）を用いてタンパク質定量を行った。１００μＬの細胞抽出希釈液を、３７℃に保った、１００ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭＤ−キシロース及び０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨを含む９００μＬの溶液に加えた。吸光度を追いかけＫｍＸＹＬ１活性を測定した。５個のＸＲ＋株は３４−８６ｍＵ／ｍｇの範囲のＸＲ活性を有している。これら５個のＸＲ＋形質転換体のＫｍＸＹＬ１活性から、遺伝子に導入されたエラーは活性を破壊しないことを示している。ＣＤ８６１株のＫｍＸＹＬ１活性は、約４ｍＵ／ｍｇである。
【０１４０】
６番目のＸＲ＋形質転換体のＫｍＸＹＬ１活性は１９．５ｍＭ／ｍｇであり、他の形質転換体の活性より高い。従って、此の形質転換体はＣＤ８６１株に他の転換体より似ている。この６番目のＸＲ＋形質転換体について、ＣＤ８６１株と同様、振盪フラスコ培養を行い（最初の遅延時間以後）、５１．５時間後１３．８ｇ／Ｌエタノールを産生した。
これらの結果から、固有のＸＲ活性は、これらの株が、上記の条件で、キシロースを発酵によりエタノールに変換する上で様々な影響を有することが分かる。
【０１４１】
実施例１２Ｄ：プラスミドｐＣＭ５８（図２７）の形質導入によるＣＤ８６１（実施例８Ｂ）株のＫｍＸＹＸＬ１及びＫｍＫＹＬ２遺伝子の再挿入；得られた形質転換体の振盪フラスコ検定
プラスミドｐＣＭ５２（実施例１２Ａ，図２５）で記載した方法と、ＫｍＸＹＬ２遺伝子隣接領域が逆方向であること以外、同じ方法で、あるプラスミドを構築する。このプラスミドをｐＣＭ５３と名付ける。プラスミドｐＣＭ５３のＫｍＸＹＬ２遺伝子を配列決定し、４個のエラーがあることが分かった、即ち、３個はサイレントであり、他のエラーは２６０Ｉ→Ｖアミノ酸突然変異であった。
【０１４２】
ＫｍＸＹＬ１遺伝子を、配列番号１３０及び１３１で表わされたプライマーを用い、野生型のＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ株のゲノムＤＮＡから、５’隣接領域及び３’隣接領域と共に増幅した。これらのプライマーはＳａｃＩ及びＮｏｔＩ制限部位を導入する。得られたＰＣＲ産物をＳａｃＩ及びＮｏｔＩで消化し、同様に消化したプラスミドｐＣＭ５３と連結した。得られたプラスミドをｐＣＭ５８（図２７）と名付けた。配列番号６６及び１１９で表わすプライマーを用いて、プラスミドｐＣＭ５８をスクリーニングし、ＳａｃＩ及びＸｍｎＩ制限酵素マッピングにより方向を確認した。
増幅したＫｍＸＹＬ１遺伝子を配列決定し、２個のエラーを見いだした、即ち１個はサイレントであり、他方は７１Ｖ→Ａへのアミノ酸変化であった。
【０１４３】
プラスミドｐＣＭ５８をＰｖｕＩＩで消化し、標準的電気穿孔法によりＣＤ８６１株（実施例８Ｂ）を形質転換した。形質転換体をＳｃ−Ｕｒａプレートに蒔種し、３７℃でインキュベートした。配列番号１３２及び１３３で表わすプライマーを用いて、ＫｍＸＹＬ１遺伝子の解読領域を増幅し、配列番号１３４及び１０５で表わすプライマーを用いて、ＫｍＸＹＬ２遺伝子及び隣接した領域を増幅した。５個の形質転換体は、両バンドについて陽性であったので、更なる分析に回した。
【０１４４】
５個の選択した形質転換体を、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、５０ｇ／Ｌキシロース（ｐＨ６．５）を含む溶液培地に接種し、３５℃で４８時間インキュベートした。各々の４ｇｃｄｗを遠心で集菌し、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、５０ｇ／Ｌキシロース、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び７．５ｇ／Ｌ  ＣａＣＯ３を含む５０ｍＬの培地に懸濁した。このフラスコは、３５℃、７０ｒｐｍ振盪の産生期に置かれた。ＣＤ８６１株（実施例８Ｂ）も同様に培養し、ＫｍＸＹＬ１及びＫｍＸＹＬ２再挿入物の効果について比較した。
【０１４５】
ＣＤ８６１株は、原則的に３０時間で全てのキシロースを消費し、その間１６．１ｇ／Ｌエタノールを産生した。ＣＤ８６１株のエタノール収量は、６７％であった。５個全てのＸＲ＋、ＸＤＨ＋形質転換体は、キシロースをより遅く消費し、平均的なエタノール収量は、およそ１６％であった。ＣＤ８６１株が産生するキシリトールの収率は、１０％であるが、５個の形質転換体の平均キシリトール収率は、５６％であった。ＣＤ８６１株のキシロースリダクターゼ活性は、約２ｍＵ／ｍｇであるのに対し、形質転換体の場合、７３．５時間培養後、１２６−４２５ｍＵ／ｍｇの範囲であった。ＣＤ８６１株のキシリトールデヒドロゲナーゼ活性は、０であったが、形質転換体の場合７３．５時間培養後２１から９８ｍＵ／ｍｇの範囲であった。これらの酵素の活性が上昇したことは、ＫｍＸＹＬ１及びＫｍＸＹＬ２遺伝子が５個の形質転換体で機能的であることを示す。キシロースイソメラーゼ活性はＣＤ８６１株（〜１３１ｍＵ／ｍｇ）の方が５個の形質転換体（〜２６−４５ｍＵ／ｍｇ）より高かった。しかしながら、キシリトールが存在したので、５個のＸＲ＋，ＸＤＨ＋形質転換体でキシロースイソメラーゼ活性を抑制したかも知れず、そのため人為的に低い値になったかも知れない。
【０１４６】
上記のデータによると、上記の条件下では、アルドースリダクターゼ／キシリトールデヒドロゲナーゼ経路を欠失又は破壊されていることが、外因性のキシロースイソメラーゼ遺伝子を有する株にとって有益であることを示す。
【０１４７】
実施例１３Ａ：Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換のためのＸＤＨ−を標的とするプラスミドｐＭＩ４１０（図２９）の構築
Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ（ＡＴＣＣ寄託番号３２１０９）のゲノムＤＮＡをＷＯ０３／０４９５２５に記載したように得た。ＷＯ０３／０４９５２５に記載したＣａｎｄｉｄａ  ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓラムダライブラリーの一部を、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓＸＹＬ２遺伝子（Ｋｏｔｔｅｒ他、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ，１８：４９３−５００）をプローブとしてスクリーニングを行った。ＸＹＬ２遺伝子はＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｄＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を用い、３２ＰｄＣＴＰで標識した。ハイブリダイゼーションは一晩、５５℃，６ＸＳＳＣ，５ＸＤｅｈａｒｄｔ’ｓ，０．５％ＳＤＳ，１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡの溶液中で行った。ハイブリダイゼーション後フィルターは室温、５分、２ＸＳＳＣ溶液で洗浄し、繰り返し、その後５５℃３０分、２ＸＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中で洗浄した。この結果ハイブリダイゼーションしたクローンはＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＣｓＸＤＨ）を有していることが分かった。
【０１４８】
ＣｓＸＤＨ遺伝子の５’領域を、配列番号１３５及び１３６で表わすプライマーを用い、ＣｓＸＤＨ遺伝子を鋳型として、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＳａｃＩ及びＳａｌＩで切断し、ゲル分離した６４２ｂｐ断片を単離した。
プラスミドｐＭＩ２８１は、プラスミドｐＭＩ２７８（ＷＯ０３／０４９５２５の図１４に記載）をＸｂａＩで切断し、得られた４９７６ｂｐ断片を環状化して得た。上記からの６４２ｂｐ断片を、プラスミドｐＭＩ２８１をＳａｃＩ及びＳａｌＩで消化して得た４９６５ｂｐ断片に連結した。得られたプラスミドをｐＭＩ４０９（図２８）と名付けた。
ＣｓＸＤＨ遺伝子の３´領域を、配列番号１３７及び１３８で表わすプライマー、及び同じラムダライブラリークローンを鋳型として用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＮｏｔＩ及びＡｐａＩで切断した。４５７ｂｐ断片をゲルから単離し、ＮｏｔＩ及びＡｐａＩで消化したプラスミドｐＭＩ４０９から得た５５５１ｂｐ断片と連結した。得られたプラスミドをｐＭＩ４１０（図２９）と名付けた。
【０１４９】
実施例１３Ｂ：Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｉｓ形質転換のためのＸＲを標的とするプラスミドｐＭＩ４１２（図３１）の構築
キシロースリダクターゼ相同塩基配列を、配列番号１３９及び１４０で表わすオリゴヌクレオチド及びＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓのゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ増幅した。オリゴヌクレオチドは既知の菌類キシロースリダクターゼ及びアルドースリダクターゼに見いだされた保存配列をもとに設計した。７００ｂｐのＰＣＲ産物を標識し、ゲノムＣｓＸＲラムダクローンを、ＷＯ／０３０４９５２５の記載したものに類似したゲノムライブラリーより単離する為のプローブとして用いた。
【０１５０】
Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓキシロースリダクターゼ（ＣｓＸＲ）遺伝子の５’領域を、配列番号１４１及び１４２で表わすプライマーを用いてＰＶＲ増幅した。ＷＯ０３／０４９５２５に記載した、ＣｓＸＲ遺伝子が含まれるＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓラムダライブラリークローンの一部を鋳型として用いた。ＰＣＲ産物をＳａｃＩ及びＳａｌＩで切断した。５２６ｂｐ断片をゲルから単離し、ＳａｃＩ及びＳａｌＩで消化したプラスミドから得た４９６５ｂｐ断片と連結した。得られたプラスミドをｐＭＩ４１１（図３０）と名付けた。
【０１５１】
ＣｓＸＲ遺伝子の３´領域を、配列番号１４３及び１４４で表わすプライマー、及び同じラムダライブラリークローンを鋳型として用いて、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＮｏｔＩ及びＡｐａＩで切断し、５９１ｂｐ断片をゲルから単離し、ＮｏｔＩ及びＡｐａＩで消化したプラスミドｐＭＩ４１１から得た５４３５ｂｐ断片と連結した。得られたプラスミドをｐＭＩ４１２（図３１）と名付けた。
【０１５２】
実施例１３Ｃ：Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓで、ＰＸＹＬＡの挿入とＣｓＸＲ欠失を同時に行うための、ＰＸＹＬＡ発現プラスミドｐＭＩ４１７（図３３）の構築
ＰＸＹＬＡ遺伝子を、ＡＴＧより単一のＡｇｅＩ部位まで、配列番号１４５及び１４６で表わすプライマー及びｐＣＭ２９（実施例８Ａ，図２１）を鋳型として、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＡｇｅＩ及びＫｐｎＩで切断し、４５３ｂｐ断片をゲルで単離した。プラスミドｐＣＭ２９をＡｇｅＩで切断した。８１５１ｂｐ断片をゲルにより単離し、ＫｐｎＩで部分消化した。得られた６５０１ｂｐ断片をゲルにより単離し、４５３ｂｐＰＣＲ断片と連結した。プラスミドをｐＭＩ４００と名付けた。
【０１５３】
プラスミドｐＭＩ２７８をＢａｍＨＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で相補末端を埋め、ＸｂａＩで部分消化した。得られた６６７５ｂｐ断片をゲルから単離した。プラスミドｐＭＩ４００をＳｂｆＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端とし、ＸｂａＩで切断した。得られた１３５８ｂｐ断片をゲルより単離し、ｐＭＩ２７８の６６７５ｂｐ断片と連結し、プラスミドｐＭＩ４０３（図３２）を作成した。
【０１５４】
プラスミドｐＭＩ４１２（実施例１３Ｂ，図３１）をＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断した。４０３７ｂｐ断片を単離し、ｐＭＩ４０３をＳａｌＩ及びＮｏｔＩで消化して得た５０４２ｂｐ断片と連結した。得られたプラスミドをｐＭＩ４１７（図３３）と名付ける。プラスミドｐＭＩ４１７は、ＣｓＸＲ遺伝子の上流及び下流領域の間に、ＰＸＹＬＡ遺伝子及びプロモーターとターミネーターと繋がったＧ４１８マーカー遺伝子を有する。
ＰＸＹＬＡ遺伝子は、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓＰＧＫプロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターの制御下にある。
【０１５５】
実施例１３Ｄ：Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換体において、ＳｃＸＫＳ１の挿入とＣｓＸＤＨ欠失を同時に行うための、ＳｃＸＫＳ１発現プラスミドｐＭＩ４２５（図３４）の構築
ＳｃＸＫＳ１遺伝子５’領域を、ＡＴＧより単一のＢｇｌＩＩ部位まで、配列番号１４７及び１４８で表わすプライマー及びｐＶＲ１０３（実施例５Ｃ，図１８）を鋳型として、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、ＮｏｔＩ及びＢｇｌＩＩで切断し、２６７ｂｐ断片をゲルから単離した。プラスミドｐＶＲ１０３（実施例５Ｃ，図１８）をＮｏｔＩ及びＢｇｌＩＩで切断した。４６３３ｂｐ断片を得て、２６７ｂｐＰＣＲ断片と連結した。このプラスミドをｐＭＩ４０６と名付けた。プラスミドｐＭＩ４０３（実施例１３Ｃ，図３２）をＥｃｏＮＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により相補末端を埋め、ＳａｌＩで切断した。６５０５ｂｐ断片をゲルから単離した。プラスミドｐＭＩ２７１（ＷＯ０３／０４９５２５の図７に記載）をＢａｍＨＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素を用いて相補末端を埋め、ＳａｌＩで切断した。得られた１６６６ｂｐ断片をゲルで単離し、６５０５ｂｐ断片と連結した。得られたプラスミドをｐＭＩ４２３と名付けた。
【０１５６】
プラスミドｐＭＩ４１０（実施例１３Ａ，図２９）及びプラスミドｐＭＩ４０６を夫々ＸｂａＩで消化し、仔牛小腸アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化させ、ＢａｍＨＩで切断した。５０３２ｂｐ及び１８１４ｂｐ断片をゲルから単離した。プラスミドｐＭＩ４２３をＸｂａＩで消化し、得られた２８１７ｂｐ断片はゲルから単離した。３個の断片を連結し、得られたプラスミドをｐＭＩ４２５（図３４）と名付けた。プラスミドｐＭＩ４２５には、ＣｓＸＤＨ遺伝子のプロモーター部分の一部、プロモーター及びターミネーター領域と繋がったｈｐｈ遺伝子、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓＰＧＫプロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーター制御下にあるＳｃＸＫＳ１遺伝子、それ等に続いてＣｓＸＤＨ遺伝子ターミネーター領域の一部がある。
【０１５７】
実施例１３Ｅ：再構成したＰＸＹＬＡ遺伝子及びＳｃＸＫＳ１遺伝子を有するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ突然変異株（Ｃｓ／Ｔ−１，Ｃｓ／Ｔ−２５，ＳＣ／Ｔ−３４及びＣｓ／Ｔ−５１）の誘発
ＷＯ０３／０４９５２５に記載した方法に類似した化学的手法により、プラスミドｐＭＩ４１７（実施例１３Ｃ，図３３）、及びｐＭＩ４２５（実施例１３Ｄ，図３４）を用いて、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓコロニーを形質転換した。形質転換細胞は、ＹＰＤ＋２００μｇ／ｍｌＧ４１８，又はＹＰＤ＋２００μｇ／ｍｌヒグロマイシン及び
２００μｇ／ｍｌＧ４１８を含むプレート上に、蒔種した。ＰＸＹＬＡ及びＳｃＸＫＳ１プローブを用いたＰＣＲ解析の結果、各株について次の結果が得られた：
Ｃｓ／Ｔ−１株：１コピーのＰＸＹＬＡ及び１コピーのＳｃＸＫＳ１，
Ｃｓ／Ｔ−２５株：１コピーのＰＸＹＬＡ及び２コピーのＳｃＸＫＳ１，
−ｐ５５−
Ｃｓ／Ｔ−５１株：２コピーのＰＸＹＬＡ及び１コピーのＳｃＸＫＳ１，
Ｃｓ／Ｔ−３４株：２コピーのＰＸＹＬＡ及び２コピーのＳｃＸＫＳ１。
【０１５８】
実施例１３Ｆ：プラスミドｐＭＩ４１７（実施例１３Ｃ，図３３）の形質導入による、ＣｓＸＲ遺伝子が欠失する、又は欠失しない、再構成したＰＸＹＬＡ遺伝子を有するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ突然変異株（Ｃｓ／４１７−２０１，―２０６，―２０８及び−２１４）の誘発
プラスミドｐＭＩ４１７をＳａｃＩ及びＡｐａＩで消化し、ＷＯ０３／０４９５２５に記載した方法と類似した化学的手法により、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓコロニーを形質転換した。形質転換細胞を、ＹＰＤ＋２００μｇ／ｍｌＧ４１８上に蒔種した。ＰＣＲ解析により、ＰＸＹＬＡ遺伝子を有し、ＣｓＸＲを欠失したコロニーを同定した。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ解析により、Ｃｓ／４１７−２０６株は、単一コピーのＰＸＹＬＡ遺伝子を有するのに対し、Ｃｓ／４１７−２１４と表す株は、ＣｓＸＲ欠失に加えて、２コピーのＰＸＹＬＡ遺伝子を有する。Ｃｓ／４１７−２０１株は、２コピーのＰＸＹＬＡ遺伝子を有するがＣｓＸＲ欠失はない。Ｃｓ／４１７−２０８株は、単一コピーのＰＸＹＬＡ遺伝子を有し、ＣｓＸＲ欠失はない。
【０１５９】
実施例１３Ｇ：プラスミドｐＭＩ４２５（実施例１３Ｄ，図３４）をＣｓ／４１７−２１４（実施例１３Ｆ）に形質導入することよる、再構成したＰＸＹＬＡ遺伝子、ＳｃＸＫＳ１遺伝子を有し、ＣｓＸＲを欠失し、またＣｓＸＤＨ遺伝子が欠失した（Ａ）、又は欠失してない（Ｂ）、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ突然変異株（Ｃｓ／４１７−２１４／４２５Ａ，及びＣｓ／４１７−２１４／４２５Ｂ）の誘発
プラスミドｐＭＩ４２５をＰｍｅＩ及びＰｓｐＯＭＩで消化し、ＷＯ０３／０４９５２５に記載した方法と類似した化学的手法により、Ｃｓ４１７−２１４株を形質転換した。形質転換細胞を、ＹＰＤ＋２００μｇ／ｍＬヒグロマイシン、又はＹＰＤ＋２００μｇ／ｍＬヒグロマイシン＋２００μｇ／ｍＬＧ４１８を含むプレート上に蒔種した。ＰＣＲ及びＳｏｕｔｈｅｒｎ解析により、ＳｃＸＫＳ１遺伝子を有するコロニーを同定し、ＣｓＸＤＨ遺伝子の欠失が生じているかどうか確認した。ある株は２コピーの再構成したＰＸＹＬＡ遺伝子と、１コピーのＳｃＸＫＳ１遺伝子を有し、ＣｓＸＲ遺伝子を欠失していた、またＣｓＸＤＨ遺伝子を欠失している株をＣｓ４１７−２１４／４２５Ａと名付けた。ある株は２コピーの再構成したＰＸＹＬＡ遺伝子と、１コピーのＳｃＸＫＳ１遺伝子を有し、ＣｓＸＲ遺伝子を欠失していた、しかしながらＣｓＸＤＨ遺伝子を欠失しおらず、Ｃｓ４１７−２１４／４２５Ｂと名付けた。
【０１６０】
実施例１３Ｈ：プラスミドｐＭＩ４０３（実施例１３Ｃ，図３２）形質導入による、再構成したＰＸＹＬＡ遺伝子、及び機能的な乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子を有する、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ突然変異株（Ｃ２９／４０３−７）の誘発
プラスミドｐＭＩ４０３を用いて、ＷＯ０３／０４９５２５に記載した方法と類似した化学的手法により、そこで２４６−２７株と名付けた株に相当する、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ突然変異株を形質転換した。
２４６−２７株は機能的で、外因性の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子を有する。形質転換細胞はＹＰＤ＋２００μｇ／ｍｌＧ４１８を含むプレート上に蒔種した。７０ｍＵ／ｍｇＸＩ活性を有する株をＣ２９／４０３−７と名付けた。この株はＣｓＰＧＫプロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーター制御下にあるＰＸＹＬＡ遺伝子を、見かけ上複数コピー有している。さらに、Ｃ２９／４０３−７株は機能的乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有する。
【０１６１】
実施例１３Ｉ：プラスミドｐＭＩ４２５（実施例１３Ｄ，図３４）をＣ２９／４０３−７株（実施例１３Ｈ）に形質導入することよる、再構成したＰＸＹＬＡ遺伝子、ＳｃＸＫＳ１遺伝子、及び機能的ＬＤＨ遺伝子を有するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ突然変異株（Ｃ２９／４０３−７／４２５）の誘発
プラスミドｐＭＩ４２５をＳａｌＩ及びＮｏｔＩで消化し、ＷＯ０３／０４９５２５に記載した方法と類似した化学的手法により、Ｃ２９／４０３−７（実施例１３Ｈ）を形質転換するために用いた。形質転換細胞を、ＹＰＤ＋２００μｇ／ｍＬヒグロマイシン又はＹＰＤ＋２００μｇ／ｍＬヒグロマイシン＋２００μｇ／ｍＬＧ４１８を含むプレート上に蒔種した。ＰＣＲ及びＳｏｕｔｈｅｒｎ解析により、ＰＸＹＬＡ及びＳｃＳＫＳ１遺伝子を有する形質転換体を同定し、集合的にＣ２９／４０３−７／４２５と名付けた。
Ｃ２９／４０３−７／４２５株は、機能的な乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有する。
【０１６２】
実施例１３Ｊ：再構成したＰＸＹＬＡ遺伝子を有し、ＣｓＸＲ遺伝子を欠失した、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ突然変異株（Ｃ２９／４１７−４及びＣ２９／４１７−９）の誘発
プラスミドｐＭＩ４１７（実施例１３Ｃ，図３３）をＳａｃＩ及びＡｐａＩで消化し、これを用いて、ＷＯ０３／０４９５２５に記載した方法と類似した化学的手法により、そこで２４６−２７株と名付けた株に相当する、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ突然変異株を形質転換した。形質転換細胞を、ＹＰＤ＋２００μｇ／ｍＬＧ４１８を含むプレートに蒔種した。ＰＣＲ解析により、ＰＸＹＬＡ遺伝子を有し、ＣｓＸＲ欠失のあるコロニーを同定した。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ解析により、Ｃ２９／４１７−４と名付けた突然変異株は、１コピーのＰＸＹＬＡ遺伝子を有し、Ｃ２９／４１７−９と名付けた突然変異株は２コピーのＰＸＹＬＡ遺伝子を有し、更に、ＣｓＸＲを欠失していた。
【０１６３】
実施例１３Ｋ：プラスミドｐＭＩ４２５（実施例１３Ｄ，図３４）をＣ２９／４１７−９株（実施例１３Ｊ）に形質導入することよる、再構成したＰＸＹＬＡ遺伝子、ＳｃＸＫＳ１遺伝子、ＬＤＨ遺伝子を有し、ＣｓＸＲを欠失し、またＣｓＸＤＨ遺伝子を欠失した（Ｃ２９／４１７−９／４２５−１１）、又は欠失しない（Ｃ２９／４１７−９／４２５−９）、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ突然変異株（Ｃｓ／４１７−２１４／４２５Ａ，及びＣｓ／４１７−２１４／４２５Ｂ）の誘発
プラスミドｐＭＩ４２５をＰｍｅＩ及びＡｐａＩで消化し、これを用いて、ＷＯ０３／０４９５２５に記載した方法と類似した化学的手法により、Ｃ２９／４１７−９株（実施例１３Ｊ）を形質転換した。形質転換細胞をＹＰＤ＋２００μｇ／ｍＬヒグロマイシンを含むプレートに蒔種した。
ＰＣＲ解析により、ＳｃＸＫＳ１遺伝子を有し、ＣｓＸＤＨを欠失しているコロニーを同定した。ＣｓＸＤＨを欠失した、及び欠失しない形質転換体を、夫々Ｃ２９／４１７−９／４２５−１１、及びＣ２９／４１７−９／４２５−９と名付ける。
【０１６４】
実施例１４：実施例１３Ｅ−１３ＫのＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ株の振盪フラスコによる特徴付け
次の表に振盪フラスコによる特徴付けに選んだ株を要約し、キシロースイソメラーゼ及びキシルロキナーゼ活性を報告する。
これらの試料のキシルロキナーゼ及びキシロースイソメラーゼ活性を、以下のように測定した：
試料（５−１０ｍＬ）を遠心し、１度１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。洗浄後、試料をプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ，  ＥＤＴＡなし、Ｒｏｃｈｅ）を含む、Ｙ−ＰＥＲ酵母タンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に懸濁した。室温で２０分インキュベーション後、細胞を４oＣ，１０分間，１３，０００ｒｐｍで遠心した。上清試料を活性測定のために集めた。
【０１６５】
キシルロキナーゼ活性は２段階プロトコールにより測定した。第１段階において、反応液は５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨｐＨ７．５，５ｍＭ  ＡＴＰ，６ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び２０ｍＭキシルロースを含む。バックグランド反応は、キシロースの代わりに水を加えることで行われた。酵素試料を加え、反応物を３０℃，０及び２４０秒インキュベートした。インキュベーション後、反応物を９５℃，５分インキュベートすることで停止した。反応停止後、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２．５ｍＭ  ＰＥＰ及び０．２ｍＭ  ＮＡＤＨを反応物に加え、３４０ｎｍの吸光度を測定した。最初の吸光度を測定後、ミオキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ及び乳酸デヒドロゲナーゼの混合物を加えた。この反応物を更に１時間インキュベートし、３４０ｎｍの吸光度を測定した。キシルロキナーゼ活性は、検定の間に産生するＡＤＰ量から計算した。
【０１６６】
キシロースイソメラーゼ活性は、３０℃でＮＡＤＨ酸化を、３４０ｎｍの吸収でモニターすることで測定した。反応物は（試料に加えて）、１００ｍＭ  ＴＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ７．０，２５０ｍＭキシロース、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．６ｍＭ  ＮＡＤＨ及び２．５Ｕソルビトールデヒドロゲナーゼを含む。バックグランドはキシロースなしに活性を測定することで決められた。キシロースイソメラーゼ活性はＣｏｂａｓ  Ｍｉｒａ自動分析装置（Ｒｏｃｈｅ）内で行われた。
タンパク質濃度はＬｏｗｒｙ法（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．、Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ，Ｎ．Ｊ．，Ｆａｒｒ，Ａ．Ｌ．及びＲａｎｄａｌｌ，Ｒ．Ｊ．（１９５１），フォリンフェノール試薬を用いたタンパク質測定、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５−２７５）により決められた。牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）をタンパク質標準として用いた。
【０１６７】
実施例１４Ａ：野生型Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ及びＣｓ／Ｔ−１，−２５，−３４，−５１（実施例１３Ｅ），Ｃｓ／４１７−２０１，−２０６，−２０８，−２１４（実施例１３Ｆ）及びＣｓ／４１７−２１４／４２５Ａ及びーＢ（実施例１３Ｇ）の諸株の微好気性振盪フラスコによる特徴付け
ＹＰＤプレートで生育した細胞を、２５０ｍＬフラスコ中に入れた５０ｍＬのＹＰ（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物及び２０ｇ／Ｌペプトン）＋５％グルコース＋１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２に接種し、一晩、３０℃，２５０ｒｐｍ振盪によりインキュベートした。ＸＩ，ＸＫ及びタンパク質検定のために５ｍＬ部分量取り出した。ＯＤ６００を測定し、ＯＤ６００＝１２相当量（４ｇ／Ｌ細胞乾燥量に相当）（Ｃｓ／４１７−２１４／４２５Ａ及びーＢに対してはＯＤ６００＝４０）の細胞を５０ｍＬから遠心で集め、５０ｍＬのＹＰ＋５％キシロース＋１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２に懸濁した。再懸濁した細胞を１．２ｇＣａＣＯ３が入っている２５０ｍＬフラスコに移した。培養物を３０℃，１００ｒｐｍでインキュベートした。ＨＰＬＣ（キシロース消費、及びエタノール、キシリトール、酢酸塩及びキシルロース産生の測定用）及びＯＤ６００測定の為の試料を毎日集めた。発酵はおよそ１１日間続けられた。
【０１６８】
Ｃｓ／Ｔ−１，−２５，−３４，−５１及びＣｓ／４１７−２１４／４２５Ａ及び−Ｂ株は、これらの株の主要産物として、２−５ｇ／Ｌエタノールと共にキシリトールを産生した。野生型のＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ及びＣｓ／４１７−２０１，２０６，−２０８及び−２１４株は、微好気的条件ではエタノールを産生しなかった。このことは、キシロースイソメラーゼ及びキシルロキナーゼは共に、微好気的条件では、エタノール産生のために必要であることを示す。ＸＲ＋株は全て酢酸塩をも産生した。
【０１６９】
Ｃｓ／４１７−２０１，２０６，−２０８−２１４及びＣｓ／４１７−２１４／４２５Ｂは、この微好気的条件では、キシロースをゆっくり消費し、エタノール、キシリトール及び酢酸塩は産生されない。Ｃｓ／４１７−２０１／４２５Ａもまた、キシロースをゆっくり消費し、幾ばくかのキシリトールを産生する。１１日間で、Ｃｓ／４１７−２０６及びＣｓ／４１７−２１４株は、夫々、０．７及び１．２ｇ／Ｌのキシルロースを産生した。
このことは、これら微好気的条件では、過剰発現したＸＫをもたないＸＩ＋株に、キシルロースが蓄積されること、及び蓄積したキシルロース量は、ＸＩ活性レベルに依存することを示唆する。
【０１７０】
実施例１４Ｂ：野生型Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ及びＣｓ／Ｔ−２５，−３４（実施例１３Ｅ）、Ｃｓ／４１７−２０１，−２１４（実施例１３Ｆ），Ｃｓ／４１７−２１４／４２５Ａ及びＢ（実施例１３Ｇ）の嫌気的振盪フラスコによる特徴付け
ＹＰＤプレート上に増殖した細胞を、２５０ｍｌフラスコに入れた、５０ｍＬのＹＰ＋５％グルコース＋１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２に接種し、一晩、３０℃，２５０ｒｐｍ下でインキュベートした。５ｍＬ部分量を取りだし、ＸＩ，ＸＫ及びタンパク質検定に用いた。ＯＤ６００を測定し、５０ｍＬよりＯＤ６００＝１２（４ｇ／Ｌ細胞乾燥量に相当）（Ｃｓ／４１７−２１４／４２５Ａ及びーＢに対してはＯＤ６００＝４０）相当量を遠心で集め、５０ｍＬのＹＰ＋５％キシロース＋１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋２４ｇ／Ｌ  ＣａＣＯ３に懸濁した。培養物を水ロックでシールした１００ｍＬ振盪フラスコに入れ、３０Ｃ，１００ｒｐｍ振盪でインキュベートした。培養物から試料を取り出した。定期的にＨＰＬＣ（キシロース消費、及びエタノール、キシリトール、酢酸塩及びキシルロース産生の測定用）及びＯＤ６００測定のための試料を集めた。培養を１５日間続けた。
【０１７１】
Ｃｓ／Ｔ−２５及び〜３４株は、最初８日間のインキュベーションの間に２ｇ／Ｌエタノールを産生し、それに対し、野生型Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓは、検出可能なエタノールを産生しなかった。Ｃｓ／４１７−２０１及びー２１４株もまた、これらの条件下では、エタノールを産生せず、このことはこれらの株がキシロースをもとに、嫌気的な発酵能を有するには、キシロースイソメラーゼ及びキシルロキナーゼ遺伝子の両者が必要であることを示す。
【０１７２】
Ｃｓ／４１７−２１４／４２５Ａ株は、４日後〜１３ｇ／Ｌエタノールを産生し、１１日後には〜２５ｇ／Ｌエタノールを産生した。キシロースからエタノールへの収率は、４日後、およそ５５％であり、１１日後５３％であった。キシロース消費は４日後に２２−２３ｇ／Ｌであり、１１日後は４８−４９ｇ／Ｌであった。Ｃｓ／４１７−２１４／４２５Ｂ株は４日間に〜１６ｇ／Ｌのキシロース及び７ｇ／Ｌエタノールを産生した。このことは、これらの株において、外因性ＸＩ遺伝子発現及びＸＫ過剰発現と結びついた固有のＸＲ／ＸＤＨ経路の破壊は、良好なエタノール産生を得る為に重要であることを示す。ＣｓＸＲ及びＣｓＸＤＨ遺伝子の両者を破壊すると、嫌気的条件で、最良のエタノール産生をもたらす。
【０１７３】
実施例１４Ｃ：ＬＤＨを産生するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ突然変異株２４６−２７及びＣ２９／４０３−７（実施例１３Ｈ）及びＣ２９／４０３−７／４２５（実施例１３Ｉ）の微好気的振盪フラスコによる特徴付け
これら３種の株の各々について、乳酸塩産生についてもモニターしたこと以外は、実施例１４Ａに記載した一般的条件で、微好気的振盪フラスコによる培養を行った。
この微好気的条件において、２４６−２７株及びＣ２９／４０３−７株は、キシロースをおよそ０．５ｇ／Ｌ／ｈｒの速度で消費し、乳酸をおよそ０．４ｇ／Ｌ／ｈｒの速度で産生した。Ｃ２９／４０３−７／４２５株は、この条件下で、Ｃ２９／４０３−７株より、およそ１０−１５％多い乳酸、１０−１５％少ないキシリトールを産生した。Ｃ２９／４０３−７株は、他の株よりも多いキシルロースを産生したので、このことはこの株ではキシロースイソメラーゼ活性があるために、キシルロースが蓄積したことを示唆する。
培養の最後に、各フラスコからの細胞は、ＹＰ＋キシロース及び、ＹＰ＋グルコースを含むプレートに蒔種し、９日間、嫌気的ジャーの中でインキュベートした。どの株も嫌気的には増殖しなかったが、全ての株はキシロース；グルコース培地で、好気的に増殖した。
【０１７４】
実施例１４Ｄ：ＬＤＨを産生するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ突然変異株２４６−２７及びＣ２９／４０３―７（実施例１３Ｈ）、Ｃ２９／４０３−７／４２５（実施例１３Ｉ）株及びＣ２９／４１７−９（実施例１３Ｊ）の嫌気的振盪フラスコによる特徴付け
これら３種の株の各々について、乳酸塩産生についてもモニターしたこと以外は、実施例１４Ｂに記載した一般的条件で、嫌気的振盪フラスコによる培養を行った。
全て、キシロースをおよそ０．１ｇ／Ｌ／ｈｒの速度で消費した。２４６−２７，Ｃ２９／４０３−７，Ｃ２９／４０３−７／４２５及びＣ２９／４１７−９株は１４１時間後、夫々、乳酸を４．１，４．８，６．４及び３．０ｇ／Ｌ、キシリトールを０．３，０．４５，０．３及び０．３ｇ／Ｌ及びキシルロースを０．３，１．４５，０．９及び０．８５ｇ／Ｌ産生した。これらの条件下で、キシルロキナーゼ酵素の過剰発現は乳酸産生の改良をもたらした。キシロ−スイソメラーゼを過剰発現するが、キシルロキナーゼを過剰発現しない株は、キシルロースを蓄積し、キシロースイソメラーゼ遺伝子が活性であることを示す。
【０１７５】
実施例１４Ｅ：ＬＤＨを産生するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ突然変異株２４６−２７及びＣ２９／４１７−４及び−９（実施例１３Ｊ）、Ｃ２９／４１７−９／４２５−９、及び−１１株（実施例１３Ｋ）、の微好気的振盪フラスコによる特徴付け
これら３種の株の各々について、実施例１４Ｃに記載した一般的条件で、微好気的振盪フラスコによる培養を行った。培養は７日間連続した。
この微好気的条件下で、２４６−２７株は、キシロースを、他の株より速く消費した。Ｃ２９／４１７−４、−９、Ｃ２０／４１７−４２５−９及び−１１株は、およそ２−５ｇ／Ｌ乳酸を７日後に産生し、その後２５−３５ｇ／Ｌの残余のキシロースが残った。
Ｃ２９／４１７−９／４２５−１１株に乳酸産生能があることは、キシロースイソメラーゼ及びキシルロキナーゼ経路がこれらの株の中で働いていることを確かにした。Ｃ２９／４１７−９−４２５−１１株はキシロースを、Ｃ２９／４１７−９／４２５−９株より僅かに速くキシロースを消費したばかりでなく、１−２ｇ／Ｌキシリトールを蓄積した。
【０１７６】
実施例１４Ｆ：ＬＤＨを産生するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ突然変異株Ｃ２９／４１７―９（実施例１３Ｊ）、Ｃ２９／４１７−９／４２５−９及び−１１（実施例１３Ｋ）の嫌気的振盪フラスコによる特徴付け
これら３種の株の各々について、実施例１４Ｄに記載した一般的条件で、嫌気的振盪フラスコによる培養を行った。
Ｃ２９／４１７−９，Ｃ２９／４１７−９、１４２５−９、及びＣ２９／４１７−９／４２５−１１株は１４６時間後乳酸を４．４，６．２，２４．４ｇ／Ｌ産生した。キシロースに対する乳酸の収率は、これらの株に対し夫々、０．４０，０．７０，及び０．９５ｇ／ｇであった。Ｃ２９／４１７−９／４２５−９又は１１どちらの株についても、キシリトールの産生はなかったが、Ｃ２９／４１７−９株は、２．７ｇ／Ｌキシリトールを産生した。この条件下で、キシルロキナーゼ酵素の過剰発現は、改良された乳酸産生をもたらす。このことは、これらの株において、外因性キシロースイソメラーゼ及びキシルロキナーゼの過剰発現と結びついた、固有のキシロースリダクターゼ／キシリトールデヒドロゲナーゼ経路の破壊により、良好な乳酸産生が行われたことを示す。ＣｓＸＲ及びＣｓＸＤＨ遺伝子の両者の破壊により、嫌気的条件下では、最良の産生が行われた。
【０１７７】
実施例１５Ａ：  Ｃｙｌｌａｍｙｃｅｓ  ａｂｅｒｅｎｓｉｓキシロースイソメラーゼ（ＣａＸＹＬＡ）遺伝子を有するＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ突然変異株（ＣＤ１１０３及びＣＤ１１０６）の誘発
Ｃｙｌｌａｍｙｃｅｓ  ａｂｅｒｅｎｓｉｓＤＮＡ（牛から単離ｆｆｅｗ１、Ｕ．Ｋ．）をＧａｒｅｔｈ  Ｗｙｎ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｌｅｓ，  Ａｂｅｒｙｓｔｗｙｔｈ，ＣｅｒｅｄｉｇｉｏｎＳＹ２３  ３ＤＡ，  Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ．から得た。このＤＮＡを鋳型とし、配列番号１４９で表わす、０．５μＭセンスプライマー及び配列番号１５０で表わす、０．５μＭアンチセンスプライマー、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ緩衝液、及び各々０．２ｍＭのｄＮＴＰを用いて、ＰＣＲ反応を行った。この構築において、遺伝子の５’末端配列に検出された、コード化された第１番目のメチオニンを開始メチオニンとし、フレームの一致した停止コードンを、ＳｂｆＩ制限酵素部位に加えて配置した。３分間の変性前に、２ＵのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  Ｏｙ，Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を加えた。反応は以下の３５サイクルで行った：９８℃１０秒、４５℃３０秒及び、７２℃１分で、サイクル後最後の伸長反応は７２℃８分であった。１３４６ｂｐのＰＣＲ産物を得て、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用い、ＴＯＰＯプラスミドと連結し、その後配列決定を行った。
【０１７８】
Ｃ．ａｂｅｒｅｎｓｉｓキシロースイソメラーゼ（ＣａＸＹＬＡ）遺伝子は、配列番号１５１で表わす塩基配列を有する。この遺伝子でコードされるタンパク質の推量されたアミノ酸配列は、配列番号１５２に表わす。
Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓゲノムＤＮＡは、野生型Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ株から以前記載したと同様の方法で得た。Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ  Ｕｒａ３（ＫｍＵＲＡ３）遺伝子、約７５０ｂｐのＵｒａ３プロモーター領域、及び約２５０ｂｐのＵｒａ３ターミネーター領域を、Ｆａｉｌｓａｆｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ），鋳型としてのゲノムＤＮＡ及び配列番号１５３及び１５４で表わすプライマーを用いた標準的なプロトコールで単離した。ＰＣＲ条件は、９５℃５分、１５サイクルの９５℃３０秒、５５℃３０秒、６８℃２分、その後２５サイクルの９５℃３０秒、６８℃２．５分、最後に平滑末端生成サイクルとして６８℃８分であった。得られた〜１．８ｋｂＰＣＲ産物を、ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、証明のための配列決定を行った。得られたプラスミドを、ｐＳＯ９０と名付けた。クローン化したＫｍＵｒａ３遺伝子の塩基配列は、配列番号１５５に表わされる。プラスミドｐＳＯ９０をＳｐｈＩで消化し、〜１．８ｋｂｐＫｍＵＲＡ３領域をゲルから単離し、同様に消化し、エビアルカリホスファターゼ処理した、プラスミドｐＣＭ９（実施例１Ｉ，図９）の〜４５７０ｂｐ断片と連結した。得られたプラスミド（ｐＳＯ９１，図３５）は、ＫｍＵＲＡ３選択遺伝子、ＫｍＰＤＣ１プロモーター、ＳｂｆＩ部位及びＳｃＣＹＣ１ターミネーターを有する。
【０１７９】
上記のＣａＸＹＬＡを有するプラスミドを消化し、ＣａＸＹＬＡ遺伝子を有する〜１．４ｋｂｐ断片をゲルより単離した。プラスミドｐＳＯ９１を同様に消化し、エビアルカリホスファターゼ処理し、６３７６ｂｐ断片を得た。これらの断片を、ＨＣＴ４リガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて連結し、ＫｍＵＲＡ３選択遺伝子、及びＫｍＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＣＹＣ１ターミネーター制御化にあるＣａＸＹＬＡ遺伝子を有するプラスミド（ｐＳＯ９９，図３６）を得た。
【０１８０】
ＣＤ８０６（実施例６Ｂ）に相当するＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓコロニーを培養した。２０ｍＬの細胞を遠沈し、標準的電気穿孔法を用いて、プラスミドｐＳＯ９９を、ＡａｔＩＩ及びＢａｍＢＩで消化後（クリーンアップなしに）、このプラスミドで形質転換した。１００μＬの細胞をＳＣ−Ｕｒａプレートに蒔種し、３７℃でコロニーが生育するまで増殖させた。コロニーを第２のＳｃ−Ｕｒａプレートに蒔種したが、全てのコロニーが二次的に増殖した。原型の（プラスミドｐＳＯ９９を挿入した）ＫｍＵＲＡ３遺伝子があるかどうか、形質転換体を、配列番号１５６及び１５７で表わすプライマーを用いて、ＰＣＲでスクリーニングし、また、ＣａＸＹＬＡ遺伝子の内部領域があるかどうか、配列番号１５８及び１５９で表わすプライマーを用いて、ＰＣＲスクリーニングした。
ＣＤ１１０３は、ＣａＸＹＬＡ遺伝子、原型のＫｍＵＲＡ３遺伝子、及び破壊したＫｍＵＲＡ３遺伝子を有する。ＣＤ１１０６は、ＣａＸＹＬＡ遺伝子及び破壊したＫｍＵＲＡ３遺伝子を有する。
【０１８１】
実施例１５Ｂ：  ＣＤ１１０３及びＣＤ１１０６株（実施例１５Ａ）の嫌気的発酵
ＣＤ１１０３及びＣＤ１１０６株を各々別に、１００ｍＬ培地（２０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌペプトン、１００ｇ／Ｌグルコース）を入れたバッフル付き振盪フラスコに接種し、３５℃，２５０ｒｐｍで、一晩インキュベートした。〜１４時間後細胞を集菌し、各株４ｇ／Ｌ細胞乾燥重量を別の４５ｍＬ酵母ペプトン、５０ｇ／Ｌ  Ｄ−キシロース、７．５ｇ／Ｌ  ＣａＣＯ３及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０ｍｌＦａｌｃｏｎねじ蓋付きチューブに別々に加えた。チューブを嫌気的に、６５時間、３０℃で，７０ｒｐｍ振盪培養行った。１１０３株は、９ｇ／Ｌ以上のエタノールを産生し、１１０６株は、同時間に７ｇ／Ｌ以上のエタノールを産生した。ＸＩ活性は生育期の細胞を取りだし、溶菌し、決定した。測定したＸＩ活性は、１１０３及び１１０６株各々について、およそ８３ｍＵ／ｍｇであった。
【０１８２】
実施例１６Ａ：Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎキシロースイソメラーゼ［（ＢｔＸＹＬＡ）遺伝子のクローニング（ｐＳＯ８９，図３７）
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎゲノムＤＮＡをＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）分子生物及び薬学教室より得た。ＢｔＸＹＬＡ遺伝子は、ゲノムＤＮＡを鋳型とし、Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），及び配列番号１６０及び１６１で表わすプライマーを用い、標準的プロトコールで単離した。ＰＣＲ条件は、９５℃３分；１５サイクルの９５℃３０秒、６０℃３０秒、６８℃２分、その後２０サイクルの９５℃３０秒、６８℃２．５分、最終的に平滑端末生成サイクルとして６８℃８分で終わった。得られた〜１．４ｋｂＰＣＲ産物を、ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、証明のために配列決定した。得られたプラスミドを、ｐＳＯ８９（図３７）と名付けた。クローン化したＢｔＸＹＬＡ遺伝子の塩基配列及び予想アミノ酸配列は、夫々、配列番号１６２及び１６３に表わす。
【０１８３】
実施例１６Ｂ：ＢｔＸＹＬＡ及びＫｍＵＲＡ３選択遺伝子プラスミドを有するプラスミド（ｐＳＯ９６，図３８）の作成
ｐＳＯ８９プラスミドをＳｂｆＩ消化し、〜１．４ｋｂＢｔＸＹＬＡ遺伝子をゲルより抽出し、同様に消化したプラスミドｐＳＯ９１（実施例１６Ａ，図３５）の６３７６ｂｐ断片と連結した。得られたプラスミド（ｐＳＯ９６，図３８）はＫｍＵＲＡ３選択遺伝子、ＫｍＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＣＹＣ１ターミネーター制御下のＢｔＸＹＬＡ遺伝子を有する。
【０１８４】
実施例１６Ｃ：ＣＤ８０６（実施例６Ｂ）に対応する株をプラスミドｐＳＯ９６（実施例１６Ｂ，図３８）で形質転換し、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ突然変異体（ＣＤ１０８９−１０９６）の作成
ＣＤ８０６（実施例６Ｂ）に対応するＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓコロニーを培養した。２０ｍＬの細胞を遠沈し、標準的電気穿孔法を用いて、プラスミドｐＳＯ９６により形質転換した。プラスミドｐＳＯ９６を、組み込み前に、ＡａｔＩＩ及びＢｓｍＢＩで消化した。１００μＬの細胞をＳｃ−Ｕｒａプレート上に蒔種し、コロニーができるまで３７℃で増殖させた。コロニーを２回目のＳｃ−Ｕｒａプレートに蒔種した。形質転換体について、配列番号１５６及び１５７で表わすプライマーを用いて、原型のＫｍＵＲＡ３遺伝子が在るかＰＣＲスクリーニングを行った。配列番号１６４及び１６５で表わすプライマーを用いて、ＢｔＸＹＬＡ停止コードン上流、及びＳｃＣＹＣ１ターミネーターの直接内側の〜４５０ｂｐ領域が存在するかどうか、ＰＣＲスクリーニングを行った。固有のＫｍＵＲＡ３及びＢｔＸＹＬＡ遺伝子について陽性の形質転換体について、８個を選択し、夫々ＣＤ１０８９−１０９６と命名した。
【０１８５】
キシロースイソメラーゼ活性決定のために、株を３０℃，２５０ｒｐｍ、〜１４時間、ＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、１００ｇ／Ｌデキストロース）中で増殖させた。細胞をＹ−ＰＥＲ（Ｐｉｅｒｃｅ＃７８９９０）のプロトコールに従い溶菌した。新型タンパク質検定試薬（Ｃｙｓｏｓｋｅｌｅｔｏｎ＃ＡＤＶ０１）を用い、ＢＳＡを標準タンパク質として、全タンパク質量を決定した。ＣＤ８０６株及びＣＤ１０８９−１０９６株のキシロースイソメラーゼ活性は次のようである：
【０１８６】
【表２】
0004711955.tif 000003
ＣＤ１０８９及び１０９２の活性が高い理由は、ＢｔＸＹＬＡが複数コピー数あるか、又は組み込みが好ましい座位で行われたからであろう。
【０１８７】
実施例１６Ｄ：ＣＤ１０８９−１０９６株（実施例１６Ｃ）の振盪フラスコによる特徴付け
単一コロニーのＣＤ８０６及びＣＤ１０８９−１０９６株を、別々に１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、及び１００ｇ／Ｌデキストロースを含む１００ｍＬの培地に接種した。細胞を３０℃１４時間増殖させ、その後細胞を集菌し、細胞乾燥重量を測定した。１．４ｇ／Ｌ細胞乾燥重量を、各培養液から別々に、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、５０ｇ／Ｌ  Ｄ−キシロース、７．５ｇ／Ｌ  ＣａＣＯ３及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＬＦａｌｃｏｎチューブに加えた。これらの培養物を３０℃，７０ｒｐｍの振盪でインキュベートした。培地中の試料をおよそ２４時間ごとに、ＨＰＬＣ分析のために、取りだした。７２時間後、この嫌気的発酵による結果は以下の表のようになった。
【０１８８】
【表３】
0004711955.tif 000004
微好気的振盪フラスコ発酵の研究に於いて、ＣＤ１０８９及びＣＤ１０９２株は、３０℃，７０ｒｐｍにおける７時間発酵後、およそ１ｇのエタノールを産生した。
低酸素キシロース培養の終わりに、ＣＤ１０８９−１０９６株を、ＹＰＸプレートに蒔種し、２日間嫌気的チャンバーの中に置いた。ＣＤ１０９５を除いて、全ての株はこの条件下で嫌気的増殖を示し、ＣＤ１０８９及びＣＤ１０９２株は、最大の嫌気的増殖を示した。
【０１８９】
実施例１７：キシロース及び、外部から商品としてあるグルコースイソメラーゼ酵素を加えた培地中で、ＣＤ８０４（実施例４Ｄ），ＣＤ８０５（実施例５Ｅ）及びＣＤ８０６（実施例６Ｂ）株の振盪フラスコ発酵
ＣＤ８０４，ＣＤ８０５及びＣＤ８０６株を別々に、５０μｇ／ｍｌＧ４１８を補強した５０ｍＬのＹＰＤを入れた２５０ｍｌバッフル付き振盪フラスコに、ＹＰＤ寒天プレートより、ＯＤ６００が０．１位になるまで接種し、１６時間、３３℃，２５０ｒｐｍの条件で生育させた。少量のグルコースが各フラスコ残っていること、及び細胞が結果的に対数増殖期に入ったことを判断した後、各株から０．５ｇ／Ｌ細胞乾燥重量相当量を遠心により集菌し、別々に、５０ｇ／Ｌ  Ｄ−キシロースを補強した４７．５ｍＬＹＰが入っている２５０ｍＬバッフル付き振盪フラスコに再懸濁した。２．５ｍＬグルコースイソメラーゼ（ＧｅｎｓｗｅｅｔＳＧＩ；Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｃ．，ＣＡ）（キシロースイソメラーゼとしても知られている）を振盪フラスコに加え、培養を３３℃，７０ｒｐｍで行った。対照として、各ＣＤ８０４，８０５及び８０６株から０．５ｇ／Ｌ細胞乾燥重量相当を別々に、グルコースイソメラーゼは除き、５０ｇ／Ｌ  Ｄ−キシロースを補強した５０ｍＬ  ＹＰを入れた２５０ｍＬバッフル付き振盪フラスコに再懸濁した。これらの振盪フラスコを３３℃，７０ｒｐｍでインキュベートした。試料を様々な時間間隔で取りだし、細胞をフィルターで除いた。培養上清を、キシロース、キシリトール及びエタノールについてＨＰＬＣ法により分析した。
【０１９０】
２５時間後、ＣＤ８０４（実施例４Ｄ）株は、１５ｇ／Ｌ  Ｄ−キシロースを消費し、グルコースイソメラーゼを入れたフラスコから、４．７ｇ／Ｌのキシリトール及び１ｇ／Ｌエタノールを産生した。それに対しＣＤ８０５（実施例、５Ｃ）及びＣＤ８０６（実施例６Ｂ）株は、夫々グルコースイソメラーゼ存在下で、２５ｇ／Ｌ  Ｄ−キシロースを消費した。ＣＤ８０５株は、この時間に、およそ１．９ｇ／Ｌキシリトール及び７．１ｇ／Ｌエタノールを産生した。ＣＤ８０６株は、この時間に、およそ１．８ｇ／Ｌキシリトール及び６．８ｇ／Ｌエタノールを産生した。これらの株において、キシルロースは非常に高速に消費されるようであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは見られなかったことである。非酸化的ペントースリン酸経路は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴＭＢ３００１において、キシルロースの発酵速度を制御するが、キシロースの速度を制御しない（ＦＥＭ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．，２００２Ａｕｇ；２（３）：２７７−８２．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｂ，  Ｈａｈｎ−ＨａｇｅｒｄａｌＢ）。グルコースイソメラーゼを添加しないと、ＣＤ８０４，ＣＤ８０５及びＣＤ８０６各株はキシロースを非常にゆっくり消費する。
【０１９１】
実施例１８：ＣＤ８０６（実施例６Ｂ）に対応する株を自己複製可能なプラスミドｐＣＭ４８（図４０）で形質転換し、ＰＸＹＬＡ遺伝子を導入する；得られた株の培養
ＫｍＰＤＣ１プロモーター、ＰＸＹＬＡ遺伝子及びＳｃＣＹＣ１ターミネーターを含むカセットを、配列番号１６６及び１６７で表わすプライマーを用いて、プラスミドｐＣＭ２９（実施例８Ａ，図２１）を鋳型とし、ＰＣＲ増幅した。これらのプライマーはＰａｃＩ及びＭｌｕＩ制限部位を取り込むように設計された。熱サイクル条件は、９最初に４℃２分のインキュベーション後、３０サイクルの９４℃３０秒、５０℃３０秒、及び７０℃３分であった。その後、最後のインキュベーションは７０℃８分であった。
産物は上記制限酵素で消化し、得られた２，８０４ｋｂｐ断片を、同様に消化したプラスミドｐＳＯ５７（図３９）（ｐＫＤ１自己複製部位を有する）と連結し、プラスミドｐＣＭ４８（図４０）を得た。形質転換体を、ＥｃｏＲＩ及びＳｂｆＩを用いて制限酵素マッピングを行い、夫々を配列決定した。全ＰＸＹＬＡ解読領域は配列決定され、形質転換体と、プラスミドｐＣＭ２９の間で、同一であることを証明した。
【０１９２】
標準的電気穿孔法を用いて、２μｇの非消化プラスミドｐＣＭ４８を、ＣＤ８０６（実施例６Ｂ）に対応する株に形質導入した。細胞を４時間ＹＰＸ中で回復させ、３００μｇ／ｍＬＧ４１８及び１５０μｇ／ｍＬヒグロマイシンを含むＹＰＸプレート上に蒔種し、３７℃、２日間インキュベートした。この結果多数の形質転換体が得られた。いくつかの形質転換体を同一プレートに再蒔種し、数日間３７℃でインキュベートした。４個の形質転換体を選び、２５０ｍＬのバッフル付き振盪フラスコに入れた〜１００ｍＬのＹＰＸに接種し、３７℃，２５０ｒｐｍ振盪を行いインキュべートした。ＣＤ８６１株は含まれ、またバイオマスは同様に作られる。１７時間後、夫々２ｇｃｄｗを別々に、５０ｍＬ培地（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌ酵母ペプトン、５０ｇ／Ｌキシロース、７．５ｇ／Ｌ  ＣａＣＯ３，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，及びｐＨ７．０）を入れた２５０ｍＬ―バッフル付き振盪フラスコに接種した。４個の形質転換体は、４０時間後に、およそ９−１２．３ｇ／Ｌエタノールを産生した。親株はエタノールを産生できなかった。
１０ｍＬの一晩の培養物を遠心で集菌し、酵素活性のために使った。４個の形質転換体のキシロースイソメラーゼ活性は４５６から５３１ｍＵ／ｍｇの範囲であった。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】ｐＮＣ２プラスミドを表現する線図である。
【図２】ｐＮＣ４プラスミドを表現する線図である。
【図３】ｐＶＲ２２プラスミドを表現する線図である。
【図４】ｐＶＲ２９プラスミドを表現する線図である。
【図５】ｐＢＨ５ａ及びｐＢＨ５ｂプラスミドを表現する線図である。
【図６】プラスミドｐＶＲ７３及びｐＶＲ７７から作られたｐＶＲ７８プラスミドアセンブリーを表現する線図である。
【図７】ｐＣＭ３プラスミドを表現する線図である。
【図８】ｐＰＳ１プラスミドを表現する線図である。
【図９】ｐＣＭ９プラスミドを表現する線図である。
【図１０】ｐＣＭ１７プラスミドを表現する線図である。
【図１１】ｐＣＭ１４プラスミドを表現する線図である。
【図１２】ｐＣＭ２８プラスミドを表現する線図である。
【図１３】ｐＶＲ９５プラスミドを表現する線図である。
【図１４】ｐＣＭ１８及びｐＣＭ１９プラスミドを表現する線図である。
【図１５】ｐＢＳＫｕｒａ３Ｋｍ及びｐＢＳＤｅｌｔａＵｒａ３ＫＭプラスミドを表現する線図である。
【図１６】ｐＶＲ５２、ｐＶＲ６７及びｐＶＲ９６プラスミドを表現する線図である。
【図１７】ｐＶＲ１０２プラスミドを表現する線図である。
【図１８】ｐＶＲ１０３プラスミドを表現する線図である。
【図１９】ｐＶＲ６５及びｐＶＲ１０４プラスミドを表現する線図である。
【図２０】ｐＣＭ２１及びｐＣＭ２３プラスミドを表現する線図である。
【図２１】ｐＣＭ２９プラスミドを表現する線図である。
【図２２】ｐＶＲ１１３プラスミドを表現する線図である。
【図２３】ｐＣＭ３１プラスミドを表現する線図である。
【図２４】ｐＶＲ１１８プラスミドを表現する線図である。
【図２５】ｐＣＭ５２プラスミドを表現する線図である。
【図２６】ｐＣＭ５５プラスミドを表現する線図である。
【図２７】ｐＣＭ５８プラスミドを表現する線図である。
【図２８】ｐＭＩ４０９プラスミドを表現する線図である。
【図３０】ｐＭＩ４１０プラスミドを表現する線図である。
【図３１】ｐＭＩ４１２プラスミドを表現する線図である。
【図３２】ｐＭＩ４０３プラスミドを表現する線図である。
【図３３】ｐＭＩ４１７プラスミドを表現する線図である。
【図３４】ｐＭＩ４２５プラスミドを表現する線図である。
【図３５】ｐＳＯ９１プラスミドを表現する線図である。
【図３６】ｐＳＯ９９プラスミドを表現する線図である。
【図３７】ｐＳＯ８９プラスミドを表現する線図である。
【図３８】ｐＳＯ９６プラスミドを表現する線図である。
【図３９】ｐＳＯ５７プラスミドを表現する線図である。
【図４０】ｐＣＭ４８プラスミドを表現する線図である。
【図１】
0004711955.tif 000005
【図２】
0004711955.tif 000006
【図３】
0004711955.tif 000007
【図４】
0004711955.tif 000008
【図５】
0004711955.tif 000009
【図６】
0004711955.tif 000010
【図７】
0004711955.tif 000011
【図８】
0004711955.tif 000012
【図９】
0004711955.tif 000013
【図１０】
0004711955.tif 000014
【図１１】
0004711955.tif 000015
【図１２】
0004711955.tif 000016
【図１３】
0004711955.tif 000017
【図１４ａ】
0004711955.tif 000018
【図１４ｂ】
0004711955.tif 000019
【図１５】
0004711955.tif 000020
【図１６】
0004711955.tif 000021
【図１７】
0004711955.tif 000022
【図１８】
0004711955.tif 000023
【図１９】
0004711955.tif 000024
【図２０】
0004711955.tif 000025
【図２１】
0004711955.tif 000026
【図２２】
0004711955.tif 000027
【図２３】
0004711955.tif 000028
【図２４】
0004711955.tif 000029
【図２５】
0004711955.tif 000030
【図２６】
0004711955.tif 000031
【図２７】
0004711955.tif 000032
【図２８】
0004711955.tif 000033
【図２９】
0004711955.tif 000034
【図３０】
0004711955.tif 000035
【図３１】
0004711955.tif 000036
【図３２】
0004711955.tif 000037
【図３３】
0004711955.tif 000038
【図３４】
0004711955.tif 000039
【図３５】
0004711955.tif 000040
【図３６】
0004711955.tif 000041
【図３７】
0004711955.tif 000042
【図３８】
0004711955.tif 000043
【図３９】
0004711955.tif 000044
【図４０】
0004711955.tif 000045
【配列表】
0004711955000001.xml