(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１００〜１０９ＥＩＤ５０のニューカッスル病ウイルスのＮＤＷ株由来の変異免疫原を含むニューカッスル病ウイルスに対するワクチンであって、該変異免疫原が配列番号２で示されるアミノ酸配列の１５７番目の位置にアルギニンを含む、ワクチン。
【請求項２】
変異免疫原がｐ.１３と同定され、受入番号＃Ｉ-２９２８でフランス、パリにあるＣＮＣＭに寄託されている、請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
ニューカッスル病から家禽動物を保護する方法であって、配列番号２で示されるアミノ酸配列の１５７番目の位置にアルギニンを含む、１００〜１０９ＥＩＤ５０のニューカッスル病ウイルスのＮＤＷ株由来の変異免疫原を該動物に投与することを含む方法。
【請求項４】
１０４〜１０９ＥＩＤ５０の変異免疫原を投与する請求項３記載の方法。
【請求項５】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する変異免疫原。
【請求項６】
配列番号２で示されるように、アミノ酸配列の１５７番目のアミノ酸セリンがアルギニンに置換されている、ニューカッスル病ウイルスの変異免疫原。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明はニューカッスル病から家禽を保護する、新規ワクチン及び方法に関する。より具体的には、本発明はニューカッスル病に対する安全かつ有効なマーカーワクチンに関し、そしてさらに家禽飼育者が群れの中のワクチン接種したメンバーを、野生型ニューカッスル病ウイルスに感染した可能性のあるメンバーから区別できる、家禽試験用の試薬キット及び検査方法に関する。また、本発明はニューカッスル病に対するワクチンに有用な新規変異免疫原にも関する。
【０００２】
（発明の背景）
ニューカッスル病（ＮＤ）は家禽の重篤な疾患であって、しばしば致命的であり、その結果、甚大な経済的損失をもたらし得る。この病気は、パラミクソウイルス(Paramyxovirdae)科のパラミクソウイルス属に属するウイルスである、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）によって引き起こされる。鳥類のパラミクソウイルスには、ＰＭＶ−１〜ＰＭＶ−９と称される９つの異なる抗原型が認められる；ＮＤＶはＰＭＶ−１または抗原型１である。米国特許第5,149,530（出典明示により本明細書の一部とする）にあるように、現在、ＮＤＶのある株は「ウィルテンベルグ(Wiltenberg)」(また「ウィルテンバーグ(Wiltenburg)」）、あるいはＮＤＷ株と称されている。
【０００３】
ＮＤＶのウイルスエンベロープからは、２種類の表面突起物（スパイク）が突き出している。１つは、ビリオンの血球凝集（Ｈ）およびノイラミニダーゼ（Ｎ）活性の両方を含むグリコシル化されたタンパク（ＨＮ糖タンパク）から構成される。もう１つは、細胞融合、溶血およびウイルス侵入に関与する糖タンパクＦから成る。その膜の内側に組み込まれる炭水化物フリーのマトリックスタンパクＭは、ヌクレオキャプシドの結合部位として働き、そして形質膜からウイルスが出芽する際に、恐らくＨＮおよびＦ糖タンパクの凝集に関与する。
【０００４】
免疫を顕著に媒介する抗体が、３つのタンパク質全てに対して産生されている。ＨＮまたはＦタンパクに対する、これらの抗体は単独で保護的である。
【０００５】
ニューカッスル病は、ニワトリ、七面鳥、キジ、ホロホロ鳥、アヒル、ガチョウおよびハトを含む、多くの商業的な家畜の家禽メンバーに影響を及ぼす。加えて、閉じ込められたトリおよび放し飼いの半家畜のトリ、並びに渡り性水鳥を含む自由に生きるトリなどの広い範囲においても悩みの種となり得る。かごのトリ又は檻のトリにも影響を及ぼし得る。
【０００６】
ニューカッスル病ウイルスは、気道および腸管を介して動物の体に侵入する。５ミクロン未満の空気伝達性の粒子は、気嚢を含む気道全体に分散する。５ミクロンより大きな粒子は、分岐点までに結膜、鼻および気管で捕らえられる。気管において、このウイルスは随伴運動（cillary action）によって、および細胞間感染によって広がる。導入部位での初期増殖の後、毒性ウイルスは、その後脾臓、肝臓、腎臓および肺に運ばれる。このウイルスは最終的に脳を侵すため、多くのトリが死に始める。
【０００７】
ニューカッスル病の症状は主として呼吸性および神経性である。喘ぎ呼吸が共通する。神経症には、翼および/または脚の片側および両側麻痺、円運動（circular movements）、頭や首の上下/波状運動(waving movements)、ならびに翼、首または脚の筋肉の痙攣が含まれる。全身症状には食欲喪失および産卵減少が含まれ、しばしば４０％程度またはそれ以上にまでなる。
【０００８】
死亡率は、関与したウイルスの性質および個々の群れの免疫状態に依存して変化し得る。一般に、迅速に殺傷するウイルス株は、よりゆっくり殺傷する株よりも感染したトリの間で蔓延しにくい。加えて、長期無症候性の保菌状態が、ある種の家禽、例えばニワトリで生じると考えられる。この疾病が大発生期間中に蔓延する最も高いリスクは、人および機器の移動に拠る。養鶏業における多くの工程を集中させたため、ある集団から他の集団に移動する人および装置について膨大な行き来がある。
【０００９】
現在、多くのワクチンが開発され、トリをニューカッスル病の発症から守っている。生抗原ワクチンおよび弱毒抗原ワクチンを、点眼または点鼻によって、あるいは噴霧または飲水により投与することができる。不活化ワクチンもまた、しばしばワクチン接種後の呼吸反応を伴わず、保護を提供できる。これらワクチンの多くは油乳剤ワクチンであり、油性アジュバントがワクチン抗原の免疫原性の特徴を増強するのに利用される。ワクチンは発生中のニワトリ胚にインオボ（in ovo）投与することもできる。このように、時により良い精度が得られる場合がある。
【００１０】
米国特許第5,149,530；5,250,298；6,348,197；5,750,111および5,733,556のいずれもが、ニューカッスル病ウイルスに対するワクチンに関する当分野の現況を扱っている。さらに引用した文献の幾つかは、混合ワクチン、例えばニューカッスル病に加えて、さらなる家禽の病気に対する１つまたはそれ以上の抗原を含有したワクチンを取り扱っている。
【００１１】
残念なことに、現在、ある群れの中のワクチン接種したメンバーを、ニューカッスル病ウイルスの毒性の、「野生型」の種類に罹患している非ワクチン接種メンバーから区別する方法は無いようである。いずれの例においても、抗体が動物の体内で産生されている。しかしながら、現行のＮＤＶに対するワクチン接種免疫原は、毒性の、伝染性ＮＤＶに感染した後に見られる抗体と区別できないことが非常に多い、抗体を誘発する。
【００１２】
従って、当分野で必要とされるものは、ニューカッスル病ウイルスに対する新規ワクチンである。当該ワクチンは、点眼もしくは点鼻によって、または噴霧もしくは飲水により、あるいはインオボで家禽に投与した場合に、安全かつ有効にニューカッスル病を予防すべきである。さらに、家禽業者が、ワクチン接種したメンバーを、ニューカッスル病に罹患している群れの中の非ワクチン接種メンバーから区別できるものであるべきである。新規ワクチンの開発によって、動物が適当にワクチン接種されたか、または毒性のニューカッスル病に感染しているか、あるいは、より従来のＮＤＶワクチンでワクチン接種された可能があるかどうか、を評価する試薬キットの開発も可能となるはずである。
【００１３】
（発明の開示）
本発明の一部として、約１００〜１０９ＥＩＤ５０のニューカッスル病ウイルスのＮＤＷ株由来の変異免疫原を含むニューカッスル病ウイルスに対するワクチンであって、該変異免疫原がｍＡｂ５４と称されるモノクローナル抗体によって認識されるＦ糖タンパク上の抗原結合部位を欠如していることを特徴とするワクチンが提供される。
【００１４】
また、受入番号＃Ｉ−２９２８でＣＮＣＭに寄託されている株と同一のニューカッスル病ウイルスの変異免疫原も提供する。この変異免疫原はＮＤワクチンをさらに開発する際のマスターシードウイルス（master seed virus）として好適である。本発明は、前記寄託株の免疫原性の特徴を有するＮＤウイルスの免疫原についても提供する。
【００１５】
家禽動物をニューカッスル病から保護する方法であって、モノクローナル抗体ｍＡｂ５４により認識されるＦ糖タンパク上の抗原結合部位を欠如する、ニューカッスル病ウイルスのＮＤＷ株由来の変異免疫原を約１００〜１０９ＥＩＤ５０含有するワクチンを該動物に投与することを含む方法もまた提供する。
【００１６】
また、本発明は、標体のＮＤＶ抗原およびイルミネーティング（illuminating）抗体を含む、ニューカッスル病に対する変異免疫原を介した予防接種を検出するための試薬キットにも関するものであり、ここで、前記イルミネーティング抗体は予防接種したトリ由来の血清中では前記抗原と結合するが、予防接種していないトリ由来の血清中では前記抗原とは結合しないことを特徴とする。
【００１７】
さらに、ニューカッスル病に対するワクチンに有用なニューカッスル病ウイルス変異免疫原を生産する方法であって、該変異免疫原がｍＡｂ５４と称されるモノクローナル抗体の存在下で発生かつ成長し、該モノクローナル抗体によって中和されないように、該モノクローナル抗体の存在下でニューカッスル病ウイルスを増殖させることを含む方法を提供する。
【００１８】
また説明すると、変異免疫原は  配列番号１で示されるヌクレオチド配列から派生したものである。このヌクレオチド配列の一部は、モノクローナル抗体ｍＡｂ５４の結合部位を欠如している当該免疫原のＦ糖タンパクをコードしている。その結果、配列番号２に示すアミノ酸配列はニューカッスル病ウイルスのＦ糖タンパクの対応する部分配列を表す。
【００１９】
従って、本発明は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する当該変異免疫原の免疫原性の特徴を持つ、ニューカッスル病ウイルスの免疫原もまた提供する。
【００２０】
本発明はニューカッスル病ウイルスの野生型ＮＤＷ株の１５７番目に通常見られるアミノ酸のセリンがアルギニンに置換されている、該ウイルスの変異免疫原をさらに提供する。
【００２１】
加えて、本発明は家禽動物が本明細書中で後述する本発明に従ってワクチン接種されたか、または他のＮＤＶワクチンを用いて別の方法でワクチン接種されたか、あるいは野生型ＮＤウイルスに感染したかどうか、を評価する試薬キットおよび方法を提供する。
【００２２】
本発明のさらなる目的および特性は、以下に記載する詳細な説明および請求項から明らかとなろう。
【００２３】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
ニューカッスル病ウイルスのウィルテンベルグ株から派生した変異免疫原が、ニューカッスル病に対するマーカーワクチンを生産するのに有効であることが、現在明らかにされている。この派生した免疫原は、当分野で「ｍＡｂ５４」と称されるモノクローナル抗体の結合部位を欠如しているが、既存のＮＤウイルス株はｍＡｂ５４の結合部位を有することが広く知られている。ｍＡｂ５４がＮＤＶのＦ融合タンパクに結合するという特徴は、M.S. Collinsら著の「ハトにおける現行の汎発性家畜流行病（Current Panzootic）に関与する鳥類のパラミクソウイルスＩ型の異型の単離体に対して産生されたマウスモノクローナル抗体の評価（Evaluation of Mouse Monoclonal Antibodies Raised Against an Isolate of the Variant Avian Paramyxovirus Type I Responsible for the Current Panzootic in Pigeons）」Arch. Virol. (1989) 104: 53-61にさらに記載されている。
【００２４】
ｍＡｂ５４の結合部位を欠如する変異免疫原は、モノクローナル抗体ｍＡｂ５４の存在下でニューカッスル病ウイルスの生株を増殖させることによって生成し得る。より好ましく利用されるものに、ウィルテンベルグまたはＮＤＷ株として当分野で利用されるウイルス株がある。好適なＮＤＷ株は、米国特許第5,149,530にて詳述されるように、フランス、パリ（25, Rue de Docteur Roux, F-75724 PARIS CEDEX）にあるパストゥール研究所のＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)から受入番号Ｉ−７８１で入手できる。次いで、変異免疫原を増量させ、かつ選択する技術は、Russell, P.H著, J.Gen. Virol. 65, 795-798 (1984)にて開示されている。簡潔に記載すると、抗体ｍＡｂ５４は、該抗体によって認識されるウイルス上の、すなわちＦ糖タンパク上の結合部位に結合することによって、増殖するニューカッスル病ウイルスを中和するものである。この例外には、該結合部位が欠如して形成された、ある種のエスケープミュータントまたは変異免疫原があるだろう。このように、これらの変異体は中和を回避して、成長し増殖できる。
【００２５】
次いで、これらのエスケープミュータントまたは変異免疫原は、さらにワクチン開発する際の基礎となる。この変異免疫原は、さらに好適な媒体、例えばアフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ）において、さらに増量させることができる。抗体ｍＡｂ５４との反応性について、並びに毒性について免疫選択を行うことで、派生した変異免疫原をさらにスクリーニングすることができる。野生型ウイルスへの復帰変異を、遺伝的方法および抗原的方法によって評価することができる。前述のRussellに記載の技術は、当分野の他の利用できる技術であるため、有益であろう。
【００２６】
好適な変異免疫原、すなわちマスターシードウイルス変異免疫原は、２００２年８月２９日に受入番号I−２９２８で上記住所にあるＣＮＣＭに寄託されている。この特に好ましい変異免疫原または変異原は、現在ではさらにフォートダッジアニマルヘルス（Fort Dodge Animal Health）によってｐ.１３と称されている。このｐ.１３変異免疫原は、以下に記載のように、さらに連続継代することが望ましい。本発明は、本明細書に記載の様式と実質的に同一の様式によって調製され、そして実質的に同一のその免疫原性の特徴を有する、他の変異ＮＤＶ免疫原もまた包含するものである。
【００２７】
本発明のＮＤウイルスの変異免疫原のさらなる特徴は、野生型ＮＤＷウイルスの１５７番目のアミノ酸セリンが突然変種類ではアルギニンに置換されていることである。
【００２８】
当該変異免疫原は、利用可能な技術を用いて、家禽の卵、好ましくは発育家禽卵において、または発育家禽卵由来の胚繊維芽細胞もしくはＶＥＲＯ（アフリカミドリザル）細胞を用いた組織培養中において、連続継代することにより規模を拡大し得る。本発明では約２回の連続継代が考えられ、そして最大約１０回までの継代で有用性が証明されるはずである。約４回〜約８回の継代が当業者に好まれるであろう。発育鶏卵が、この変異免疫原の継代に特に望ましい。
【００２９】
これまでに記載したように、派生した変異免疫原はニューカッスル病に対して免疫学的保護を提供するのに特に有用である。この変異免疫原は、ニューカッスル病に対するワクチンに製剤化できる。好適なワクチンは、１つまたはそれ以上のＮＤＷ免疫原、あるいはその免疫学的活性のある成分を投与当たり約１００〜約１０９ＥＩＤ５０（「５０％卵感染投与」）を含むものである。より好ましい範囲は、特に噴霧によるワクチン接種については、約１０４〜約１０９ＥＩＤ５０の範囲内である。前記範囲は点眼または点鼻による、あるいは飲水による投与の場合に、さらに調整されるだろう。インオボワクチン接種については、投与当たり約１００〜約１０１ＥＩＤ５０の範囲が有用であろう。
【００３０】
投与量は、典型的には、変異免疫原の上記量、並びに後述のアジュバント（群）、賦形剤（群）および担体のいずれかを含むワクチンの約０．０１〜約１０ｍｌ、より好ましくは約０．０１ｍｌ〜１．０ｍｌである（この範囲は当業者によって調整され得る）。
【００３１】
本発明のワクチンには、１つまたはそれ以上の好適なワクチンアジュバントおよび製薬的に許容される担体を含ませることができる。好適なワクチンアジュバントには、当分野で利用される融和性の油剤および油乳剤が含まれ得る。製薬的に許容される担体には、例えば、水または塩水が含まれ得る。また、その他の賦形剤、例えば、製薬分野およびワクチン獣医学分野において利用される安定化剤および防腐剤を、ワクチンに含ませることもできる。変異ＮＤ免疫原（群）と併せて用いるこれらの成分を混合して、最終的なワクチンを製造することができる。
【００３２】
本発明のワクチンは、ニワトリ、七面鳥、キジ、ホロホロ鳥、アヒル、ガチョウ、バンタム、ハトなどを含む家禽群のメンバーに対して安全かつ有用である。
【００３３】
変異ＮＤ免疫原を含有する本発明のワクチンは、その他の家禽の病気に対して免疫学的保護を与える、別のワクチン抗原とともに製剤化することもできる。例えば、Bursal病、マレック病および家禽ヘルペスウイルスによって引き起こされる疾病に対する免疫原を利用することもできる。
【００３４】
本発明に関するワクチンの投与は噴霧によるのが好ましいが、点眼もしくは点鼻または飲水、当業者が利用する全ての方法で投与でき、並びに好適な卵注入装置(egg-injecting equipment)、例えばノースカロライナ州にあるエンブレック(Embrex) から入手できる機械を用いたインオボ注入によっても投与できる。投与は、インキュベートが１日経過した卵から最長約２１日目まで行うことができる。約１０日〜１８日の期間中に一度予防接種することが特に好ましいであろう。このように、ニューカッスル病から家禽を保護する方法には、発生中の家禽に前述のようにインオボでのワクチン投与が含まれよう。
【００３５】
また、本発明の一部として、本発明に関するワクチンで予防接種された家禽メンバーを、予防接種されていないメンバーおよび毒性の、野生型もしくは「フィールド（field）」ニューカッスル病ウイルスに感染したメンバーから、並びにＦ融合糖タンパクを含有する免疫原を利用した従来のＮＤＶワクチンでワクチン接種されたメンバーから、区別する試薬キットおよび検査方法も含まれる。例としては、ＥＬＩＳＡ、免疫ペルオキシダーゼ染色アッセイ、ウェスタンブロット、または当業者が利用するその他の好適な方法が挙げられる。
【００３６】
限定的な例示ではなく、キットには「標体」ＮＤＶ抗原（ｍＡｂ５４によって認識される、Ｆ融合糖タンパク上の結合部位を有する）、並びに標体抗原上の該部位にも結合するイルミネーティング抗体を含ませ得る。この「イルミネーティング」抗体は当分野で利用される方法に基づいて標識化され、そしてその標体抗原と結合することで「発光(light up)」および呈色するものである。このイルミネーティング抗体は抗マウス抗体であって（ｍＡｂ５４がマウスから得られたものだからである）、例えば、当分野で利用されるように、化学反応を起こして発色を触媒できる酵素で標識化されている抗体であっても良い。この抗マウス抗体は（本キットの一部としての）第２の抗体に結合し、次に、その第２の抗体が（標準的なサンドイッチアッセイのように）標体抗原の結合部位に結合し得る。
【００３７】
試験キットおよび検査の更なる実施形態には、イルミネーティング試験キット抗体および第二の試験キット抗体が標体ＮＤ試験キット抗原と結合することになる、競合型アッセイもある。双方の抗体はＦ糖タンパク結合部位について競合し、陽性および陰性と異なる判断を示すであろう。
【００３８】
制限するものではないが、家禽を試験する方法を以下に簡潔に記載する：血液試料を調査する家禽メンバーから採取した後に個別に試験する。野生型、フィールドウイルスに感染した家禽、またはＦ糖タンパク結合部位をなおも有している別のＮＤ株で予防接種された可能性のある家禽は、体内抗体によって認識されるウイルス上の結合部位（Ｆ融合糖タンパク）に対して、体内抗体が産生されることになる。該試料に試験キット「標体」抗原を添加することで、これらの体内抗体もまた標体抗原上の同じ結合部位に結合することになる。これにより、イルミネーティング抗体は標体抗原上の当該部位への結合を妨げられ、または非常に低下させられることで（競合アッセイのように）、呈色が妨げられ、または極めて減少することになる。一方、本発明に従ってワクチン接種された家禽メンバーは、Ｆ糖タンパク上の結合部位を欠如している。従って、この結合部位に対する体内抗体（ｍＡｂ５４）は生成されないだろう。標体抗原を含有する試薬を加えると、イルミネーティング抗体は該標体抗原に結合できるため、呈色して特定の動物が本発明に従ってワクチン接種されたことを示す合図を出す。あるいは、第二の試験キット抗体は標体抗原と結合して、そしてイルミネーティング抗体が該第二の抗体と結合することで（サンドイッチ検査のように）呈色を示し得る。
【００３９】
家禽メンバーを従来のＮＤＶワクチンでワクチン接種したような場合には、該Ｆ糖タンパク部位に対する抗体も産生した可能性があるが、しばしば別個の方法で野生型ウイルスに感染したトリが一方で存在し得た。このような場合には、呈色に差異が認められ、これらの動物を区別できる。
【００４０】
前述した試薬キットおよび検査方法の実施形態における変更もまた本発明の範囲内にある。
【００４１】
以下の実施例は、本発明の好ましい種々の態様を記載するものであるが、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００４２】
（実施例）
（実施例１−プロトコル）
次の４段階のプロトコルは、ニューカッスル病ウイルスに対するマーカーワクチンを作製する有用な手段を簡潔に記述している。
段階１
抗体が、ＰＭＶ１（パラミクソウイルス抗原型１、ＮＤＶと同一）に自然感染した際に抗体ｍＡｂ５４によって認識される抗原性部位に対して、誘導されたかどうかについて決定する。更なる検査のために、ｍＡｂ５４によって認識される融合タンパク上の抗原性部位が欠如したエスケープミュータントを生成する。
段階２
ｍＡｂ５４によって認識される融合タンパク上の抗原性部位を欠如している、エスケープミュータントを遺伝子学的に同定する。
段階３
野生型や毒性への復帰変異を確認するため、エスケープミュータントの安定性試験を実施する。
段階４
野生型およびワクチン株に対する抗体を区別するための、アッセイを開発および検証する。
【００４３】
さらなる詳細：
段階１
・競合結合分析アッセイを用いて、ＰＭＶ１に自然感染したトリ由来の血清を、ｍＡｂ５４によって認識される抗原性部位に対する抗体について検査する。
・ｍＡｂ５４の存在下でニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）培養にてＮＤＶのＮＤＷ株を増殖させる。
・ＣＥＦ中で生成されたウイルスをプラーク精製し、発育家禽卵において制限して継代して、ウイルスストック（マザーウイルスストックと称する）を調製する。
・免疫ペルオキシダーゼ（ＩＰＸ）試験を用いて、エスケープミュータントを、ｍＡｂ５４との反応性についてスクリーニングする。
【００４４】
段階２
・「野生型」およびエスケープミュータントの融合タンパクのヌクレオチド配列を決定する。
・与えられたプロトコル（段階１の完了時の）に従って、一日齢で特定の病原体フリー（「ＳＰＦ」）のヒナにおいて、マザーウイルスストックの効力検討を実施する。
・段階３のために、ｍＡｂ５４によって認識される抗原性部位を欠如または修飾された抗原性部位を有する、エスケープミュータント（群）を選択する。
【００４５】
段階３
・選択されたエスケープミュータントのマザーウイルスストックを発育家禽卵において２×継代し、マスターシードウイルス（第一代（pass））およびワーキングシードウイルス（第二代）を調製する。
・発育家禽卵において、ワーキングシードウイルスを４×継代することにより安定性試験用のワクチンウイルスを調製する。
・ｍＡｂ５４を用いたＩＰＸ試験において、およびヌクレオチド配列決定によって、ワクチンウイルスの特徴を確認する。
・発育家禽卵において「実証された(verified)」ワクチンウイルスを１０×継代し、上記特徴を確認する。
・ＣＥＦにおいて「実証された」ワクチンウイルスを１０×継代し、ＩＰＸ試験によって特徴を確認する。
・合計１０回の継代を行って、一日齢ＳＰＦのヒナにおける毒性および野生型への復帰変異について、インビボ検討を実施する。
・ｍＡｂ５４を用いたＩＰＸ試験およびヌクレオチド配列決定によって、１０回目のインビボ継代から再単離されたウイルス（または１０回よりも少ない場合には、最後の継代から再単離されたウイルス）の特徴を確認する。
・一日齢ＳＰＦのヒナを用いて、マスターシード、ワクチン、インビトロ継代（１０×）されたワクチン、およびインビボ継代（１０回、上記参照）されたワクチンウイルスの大脳内病原性指標（ＩＣＰＩ）を決定する。
【００４６】
段階４
・ＮＤＷの「野生型」およびエスケープミュータントに対する単一特異的な抗血清を、６週齢のニワトリにおいて調製する。後者に対する抗血清は、ワクチンウイルス（上記）を用いて産生されよう。
・ＮＤＶ抗体を検出するためのＥＬＩＳＡを開発して、ＮＤＶの「野生型」およびワクチン株に対する抗体について、家禽の血清をスクリーニングするためのキットアッセイとして使用する。
・既存のＮＤＶ抗体用のＩＰＸ試験を適当な場合には（ＥＬＩＳＡの進歩を受けて）改良して、ＮＤＶの「野生型」およびワクチン株に対する抗体について、家禽の血清をスクリーニングするためのキットアッセイとして使用する。
・陽性および陰性が既知の血清を用いて、ＮＤＶの野生型株に対して選択した試験を検証する。
【００４７】
実施例２−エスケープミュータントの選択のための方法論
Russell, P.H., J.Gen. Virol. (1984) 65, 795-798に記載の方法論を利用することができる。その手順の概要を以下に記載する。
・モノクローナル抗体６１７／５４（ｍＡｂ５４）のバッチを調製するために「テクノマウス（Technomouse）」を用いる。
・９日齢の発育家禽卵において、ＮＤＷ株を培養する。
・ｍＡｂ５４の中和指標を決定する。加熱により不活性化されたｍＡｂを種々希釈してウイルス感染の低下を、微量中和（micro-neutralization）試験により検査する。同量（５０μｌ）のウイルスとｍＡｂを２時間３７℃で反応させた後、ＶＥＲＯ細胞のマイクロウェルに吸着させる。ＩＩＰ試験を実施し、感染細胞を計数する。１０５またはそれ以上にウイルス感染を減少させる。
・種々のプラークを免疫選択する。同量のウイルスと加熱により不活化されたｍＡｂを２時間３７℃でインキュベートする。該混合物をＰＢＳ／溶媒にて１／１０、１／１００および１／１０００に希釈する。希釈していない溶液を含む各々の溶液を、２ウェルの融合性のニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦｓ）に吸着させる（１００ｕｌ／ウェル）。３７℃で１時間経過した後、１／１００−１／５００倍希釈のｍＡｂおよびトリプシン（２−５μｇ／ｍｌ）を含むアガロースオーバーレイを、各ウェルに加える。このプレートを５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートする。
・３−４日後、個々のプラークを、ニュートラルレッド色素を用いて視覚化する。
・パスツールピペットを用いて、前記アガロースをかき分け細胞シートに到達したところで、プラークを「選び取る(Picking)」。変異体を含有するアガロース栓を、ＰＢＳに移し放置する。それぞれの調製物を過剰量のｍＡｂで再度処理し、ＣＥＦｓまたは発育家禽卵で再び継代する。
・それぞれプラーク由来の再継代されたウイルスを、ｍＡｂ６１７／５４の存在および非存在下、ＶＥＲＯ細胞において増殖させる。免疫ペルオキシダーゼ（ＩＰＸ）試験を用いて、エスケープミュータントを、ｍＡｂ６１７／５４およびポリクローナルニワトリ抗血清との反応性についてスクリーニングする。
【００４８】
実施例３
ＮＤＷエスケープミュータントおよび「Poulvac」ワクチンの効力検討
方法
・２つのワクチン接種されたグループ（ある変異体および「Poulvac」ワクチン）をそれぞれ５日齢ヒナから構成した。
・非−ワクチン接種コントロールグループのヒナ１０羽を用意した。
・プラークから選び取ったウイルスを発育家禽卵にて６回継代し、変異体とともに全てのワクチン接種に用いた。
・それぞれのワクチン接種されたヒナは、０．５ｍｌの脱塩水中の１０６．５ＥＩＤ５０を受けた。
・トリに、１羽あたり０．５ｍｌ中１０５．０  ＥＬＤ５０となるよう計算した投与量で筋肉経路により毒性ＮＤＶ（Ｈｅｒｔｓ／３３）を用いてチャレンジした。
【００４９】
始めに、変異体の滴定を行ってウイルス力価を決定した。これを表１に示す。変異体p．１３を１０６．５  ＥＩＤ５０／０．５ｍｌに希釈し、各断路器に入れられた２５羽のヒナに合計１２．５ｍｌを粗く噴霧器で投与した。「Poulvac」ワクチンの力価は、バイアルあたり１０１０．０２  ＥＩＤ５０  （Fort Dodge Animal Health Holland, The Netherlandsにより提供）であり、各ヒナが０．５ｍｌ中１０６．５  ＥＩＤ５０を受けるよう調製した。ヒナのワクチン接種に用いたウイルス調製物の逆滴定を、ワクチン接種直後に、発育家禽卵中で実施した。これらの滴定を用いて、１羽あたりが受ける平均推定ウイルス投与量を計算した（表１）。チャレンジのために、２部屋間でグループを無作為に混合させた。トリはそれぞれ、０．５ｍｌ中１０４．６  ＥＬＤ５０のＨｅｒｔｓ／３３のチャレンジ量を受けた。
【００５０】
実験中、病気のため摂食できなくなったトリは死に絶えた。飲食可能で、かつ実験の１５日目まで生存した病気のトリの記録を表２および表３に詳細に示す。
【００５１】
結果
ＮＤＷウイルスを用いた血球凝集阻害（ＨＩ）による試験を行うために、チャレンジ前および後（１５日）に生存している全てのヒナから血清を採取した。
効力検討の結果を表２および表３にまとめる。
【００５２】
ウイルス群
非−ワクチン接種  
１０羽のワクチン接種していないコントロールヒナは、チャレンジの３日以内に死亡した（死亡率１００％）。
これらのトリ由来の血清は、チャレンジ前のＨＩ試験では全て陰性であった。
【００５３】
「Poulvac」ワクチン
「Poulvac」ワクチンをワクチン接種したヒナの中で、チャレンジの４日後に一羽死亡した（死亡率４％）。毒性ＮＤウイルスを、ホモジナイズした脳組織を発育家禽卵中に接種することで、そのヒナから回収した。
・２羽の別のヒナに臨床的症状が現われ、一羽は１日間、他方は実験の最後まで現れた。
・ＨＩ抗体の力価は、チャレンジ前は２〜１６の範囲にあり、そのうちの２４羽は８またはそれ未満であった。チャレンジ後、全てのトリにおいて抗体力価が増加した（１６−５１２の範囲）。
【００５４】
変異体ｐ．１３
・変異体ｐ．１３をワクチン接種した２５羽のヒナは死亡しなかったが（死亡率０％）、３羽のトリが臨床的サインを出した。
・ＨＩ力価は、チャレンジ前は８またはそれ未満であったが、チャレンジ後にはほとんどの場合において３２〜１０２４と、かなりの増加を示した。
【００５５】
【表１】
0004785531.tif 000002
【００５６】
【表２−１】
0004785531.tif 000003
【００５７】
【表２−２】
0004785531.tif 000004
【００５８】
【表２−３】
0004785531.tif 000005
【００５９】
【表３】
0004785531.tif 000006
表２および表３に適用した記号。
1   ウイルスの４つの血球凝集ユニットを完全にブロックする血清希釈の逆数として表されるチャレンジ前のＨＩ力価。
2    生存したトリのチャレンジ後のＨＩ力価。Ｄ＝死亡。
*   トリは運動失調症、体重減少、平穏が乱された場合のみ移動するが、飲食は可能であった。
【００６０】
実施例４−ＮＤＷエスケープミュータントおよび「Poulvac」ワクチンの融合タンパク（Ｆ0）の遺伝子の配列決定。
発育家禽卵中で６回継代された変異体を、自動シーケンサーABI PrismTM 310 Genetic Analyzerを用いてヌクレオチド配列決定することにより、「野生型」への復帰変異について試験した。（Ｆ遺伝子の一部の配列を配列番号１に示し、加えて、対応するアミノ酸配列を配列番号２に示す）。１５７番目のアミノ酸変化をコードする領域にまたがる、融合タンパクＦ遺伝子の短い配列を、変異体ｐ．１３と決定した。そのアミノ酸配列は変化せずにそのままであった‐ＮＤＷ「野生型」中で観察されるセリンの位置にはアミノ酸のアルギニンがあった。しかしながら、変異体Ｐ．１３中では、アルギニンのコドンがＡＧＡからＣＧＣに変化していた。
【００６１】
この配列決定の結果はＩＰＸ試験により支持された。変異体のいずれともｍＡｂ５４が結合した証拠は見られなかった。しかしながら、ＮＤＷ「野生型」は、このモノクローナル抗体に明らかに結合した。
【００６２】
前駆体Ｆ０ポリペプチドの読み取り枠を含む全遺伝子配列は、「Poulvac」ワクチン中に存在するウイルスと決定された。その配列は、Fort Dodgeにより提供されたＮＤＷ「野生型」ウイルスのマスターシードと同じであった。しかしながら、これらの配列と、発育家禽卵中にてさらに１回継代させたＮＤＷマスターシードの配列から得られた配列との間には１つの相違点があった。それは、この遺伝子の１１９５番目にサイレント変異体があったことである。
【００６３】
実施例５−さらなる効力検討
エスケープミュータントｐ．１３を以下のように用いた：マスターシードウイルス（ＭＳＶ）、ワーキングシードウイルス（ＭＳＶ＋１回継代）および実験ワクチン（ＭＳＶ＋５回継代）。ＭＳＶを、European Pharmacopoeiaに規定のように毒性への復帰変異について試験し、そして卵中およびＶＥＲＯ細胞の組織培養中で継代した後に、遺伝子の安定性を試験した。実験ワクチン（ＭＳＶ＋５回継代）を市販のボイラー中で効力について試験した。すべての試験で、本発明のエスケープミュータント(変異免疫原)およびワクチンとして強い効力を示した。
【００６４】
実施例６−ＮＤマーカー試験
概要
この実施例では、ＮＤマーカー株ｐ．１３でワクチン接種されたニワトリ由来の血清を、ＰＯＵＬＶＡＣ（登録商標）ＮＤＷワクチン（Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IowaおよびWeesp, the Netherlands）に対する抗体を有するニワトリ由来の血清、および毒性ＮＤＶに対する抗体を有するニワトリ由来の血清から区別できる可能性を調査した。前述のように、ＮＤマーカー株ｐ．１３はモノクローナル抗体番号５４（Ｍａｂ＃５４）の結合部位を欠如している。
【００６５】
「ＭＶ」コードされた血清はＮＤマーカー株ｐ．１３でワクチン接種されたニワトリから得られ；「ＦＳ」コードされた血清は急性ＮＤＶ感染したニワトリから得られ；９、１０、１１および１２コードされた血清はＰＯＵＬＶＡＣ（登録商標）ＮＤＷワクチンでワクチン接種されたニワトリから得られた。コントロールとして、この検定に、ＳＰＦニワトリ由来の血清を含め、並びにＮＤＶ  Ｂ１でワクチン接種したニワトリ由来の血清、およびＮＤＶ  Ｈｅｒｔｓ３３でチャレンジしたニワトリ由来の血清を含めた。この検定は免疫ペルオキシダーゼ染色アッセイ（ＩＰＸ）を用いて行った。
【００６６】
ＭＶコード血清はＭａｂ＃５４をいくらかブロッキングを示したが、ＳＰＦ血清は示さなかった。ＭＶコード血清のブロッキング作用を示す理由は明らかではない。特定の理論に拘束されるものではないが、ＮＤＶ抗体がＭａｂ＃５４の結合部位付近に結合することで、立体障害が生じるためかもしれない。また、非特異的な結合活性が原因である可能性もある。ＦＳコード血清は平均的にＭａｂ＃５４の結合をブロックするが、結果にはばらつきが見られた。ＦＳコード血清はＭＶコード血清よりも高いブロッキング活性を示した。９−１２コード血清のブロッキング活性は非常に明白で、明らかにＭＶコード血清より強かった。また、ＭＶコード血清とＮＤＶ抗血清の間には明らかな相違点があった。
【００６７】
結論としては、Ｍａｂ＃５４のＩＰＸブロッキング試験を用いることで、ＮＤマーカー株ｐ１３でワクチン接種したニワトリ由来の血清を：
−実験的にＮＤＶに感染させた
−生ＮＤＷワクチンをワクチン接種させた
ニワトリ由来の血清から区別できる可能がある。
【００６８】
材料および方法
材料
−ＶＥＲＯ細胞の融合性単層を用いる９６ウェル組織培養プレート
−Ｍａｂ＃５４
−ＮＤＶ  Ｕｌｓｔｅｒ株
−１０％緩衝ホルマリン
−リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
−ＳＰＦニワトリ血清
−ＰＯＵＬＶＡＣ（登録商標）ＮＤＷバッチに対する抗血清
−ＮＤＶ陽性血清は、ニワトリを生無毒性Ｂ１に感染させ、続いて毒性ＮＤＶ  Ｈｅｒｔｓ３３でチャレンジして産生された。
−急性ニューカッスル病に罹病したニワトリから得られたフィールド血清
−ＮＤマーカー株ｐ１３のマスターシードウイルスでニワトリを噴霧ワクチン接種した後、筋肉内追加抗原刺激して得られた血清
−ヤギ抗−マウス免疫グロブリンペルオキダーゼ標識抗体 
−基質溶液Ａ：１０ｍｌ滅菌脱塩水中０．２グラムの尿素 Ｈ２Ｏ２
−基質溶液Ｂ：２５ｍｌエタノール中０．１グラムの３−アミノ−９−エチルカルバゾール
【００６９】
方法、免疫ペルオキシダーゼ染色アッセイ（ＩＰＸ）
−ＮＤＶ  Ｕｌｓｔｅｒ−１／１０００をプレートに混入し、一晩放置する
−１０％緩衝ホルマリンをウェルごとに５０μｌを加え、２０分間、細胞を固定する
−ホルマリンを捨て、ウェルを２００μｌの温０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．２で２回洗浄する
−２００μｌのＰＢＳを加えて放置する
−ＰＢＳ中にある範囲の希釈液（Ｐ１３、フィールドおよびＳＰＦ血清の１／２、１／１０、１／２５、１／５０および１／１００）を調製する
−ＰＢＳを捨て、軽くたたいてプレートを乾燥させる
−１０ウェルのウイルスＮＤＷに各血清希釈液を１００μｌ加え、３７℃で４５分間インキュベートする
−血清希釈液をさっと捨て、軽くたたいてプレートを乾燥させ、全てのウェルを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄する。軽くたたいてプレートを乾燥させる。
−ＰＢＳ中のｍＡｂ５４の１／５００から１／１０,０００の範囲の希釈液を調製し、抗原／抗体を含むウェルの１／２に試験血清の各希釈液１００μｌを加える
−プレートを３７℃で４５分間インキュベートする
−ｍＡｂｓをさっと捨て、軽くたたいてプレートを乾燥させる
−ウェルを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄し、軽くたたいて乾燥させる
−各ウェルに１００μｌのヤギ抗−マウス免疫グロブリンペルオキダーゼ標識抗体を加える
−３７℃で５０分間インキュベートする
−標識体をさっと捨て、２００μｌのＰＢＳでウェルを３回洗浄する
−０．１ｍｌの基質溶液Ａと０．１ｍｌの基質溶液Ｂを９．８ｍｌＰＢＳに加えて混合し、最終基質溶液を調製する
−ウェルごとに１００ｍｌの基質を加え、室温で１５分間放置する
−ＰＢＳでウェルを２回洗浄する
−プレートを顕微鏡で観察する
−褐色の細胞の存在により、Ｍａｂ＃５４の結合が示される
【００７０】
結果
Ｍａｂ＃５４の最適な希釈
ＳＰＦ血清およびＮＤＶ抗血清を種々の希釈液中の抗原と反応させた。次に、Ｍａｂ＃５４も種々の希釈液中の抗原と反応させた。この試験を２回実施した。１回目の試験の結果を表４に示す。（２回目試験の結果はほぼ同じであった）。
【００７１】
結果によると、ＳＰＦ抗血清はＮＤＶ抗原とＭａｂ＃５４との結合をブロックしていないが、ＳＰＦ血清の１／２希釈液を用いた場合には低いが幾らか活性がある。ＮＤＶ陽性抗血清の１／２、１／５および１／２５希釈液はＭａｂ＃５４の結合をブロックしている。ブロッキングは血清の１／５０希釈液で低く、１／１００希釈液でブロッキングはほとんど検出されない。
【００７２】
ＳＰＦ血清およびＮＤＶ陽性血清の相違は血清希釈液の１／５および１／２５でもっとも明白であると結論付けることができる。
【００７３】
ＮＤＶ陽性血清の１／５０希釈液および１／１００希釈液において、Ｍａｂ＃５４のより薄い希釈液で反応性の低下があった。Ｍａｂ＃５４の１／２５００希釈液を今後の実験に使用することにした。
【００７４】
【表４】
0004785531.tif 000007
【００７５】
種々の抗血清によるＭＡＢ＃５４の結合のブロッキング
表５にブロッキング検討の結果を示す。ＭＶコード血清は、ＮＤマーカー株Ｐ．１３を用いてワクチン接種したニワトリから得られた。ＦＳコード血清は、急性ＮＤＶ感染したニワトリから得られたフィールド血清であった。９、１０、１１および１２でコード血清は、ＰＯＵＬＶＡＣ（登録商標）ＮＤＷワクチンを用いてワクチン接種されたニワトリから得られた。
【００７６】
結果によると、ＳＰＦ血清はＭａｂ＃５４の結合をブロックしていないが、陽性ＮＤＶ血清はＭａｂ＃５４の結合をブロックしている。ＭＶコード血清はいくらかブロッキング活性を示している。１／２希釈液において、８つ中２つの血清がＭａｂ＃５４の結合をブロックし、１／１０希釈液において明らかなＭａｂ＃５４の結合が検出された。ＦＳコード血清によるブロッキングはばらつきが大きい；ＦＳ１はＭａｂ＃５４の結合を明らかにブロックしているが、ＦＳ６はブロッキング活性をほとんど示していない。
【００７７】
９−１２コード血清は全てＭａｂ＃５４の結合をブロックしているが、１１および１２は特に著しい。
【００７８】
【表５−１】
0004785531.tif 000008
【表５−２】
0004785531.tif 000009
【００７９】
議論
ＭＶ、ＦＳおよび９−１２コード血清の結果は次のように評価した。＋は評価値１、＋＋は評価値２、および＋＋＋は評価値３とし、そして−は評価値０とした。次いで、各血清の平均評価値を算出した。ＳＰＦ血清およびＮＤＶ陽性血清を同様に処理した。
【００８０】
その結果を表６に示す。ＭＶコード血清はＭａｂ＃５４を幾らかブロッキングを示すが、ＳＰＦ血清は示さない。ＭＶコード血清の結合作用の要因は明らかでない。特定の理論に拘束されるものではないが、ＮＤＶ抗体がＭａｂ＃５４の結合部位付近に結合することで、立体障害が生じるためかもしれない。また、血清成分の非特異的な結合によって生じた可能性もある。
【００８１】
ＦＳコード血清のブロッキング活性は、平均してＭＶコード血清よりも強かった。前述のように、ＦＳコード血清を用いて得られた結果にはばらつきが見られる。ＦＳコード血清は、急性ＮＤＶ症状を示したニワトリから得られた。これらの血清の幾つかで、ＮＤＶ抗体が存在しなかったのは、恐らく、感染から血清採取までの期間が短かったためであろう。このことは、個々の血清間のブロッキング活性におけるばらつきに対する説明となるであろう。
【００８２】
９−１２コード血清のブロッキング活性は強かった。これと比較すると、観察されたＭＶコード血清によるブロッキングは比較的弱かった。この差異は１／１０および１／２５の血清希釈液で最も明白であった。ＭＶコード血清とＮＤＶ抗血清との間にも明白な差異があった。
【００８３】
【表６】
0004785531.tif 000010
【００８４】
結論
Ｍａｂ＃５４のＩＰＸブロッキング試験を用いることで、ＮＤマーカー株ｐ．１３でワクチン接種したニワトリ由来の血清を：
−実験的にＮＤＶに感染させた
−生ＮＤＷワクチンをワクチン接種させた
ニワトリ由来の血清から区別することが可能である。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態について特定の引例とともに記載したが、それらに対する変更は、当業者であれば本明細書および添付の請求の範囲に記載する発明の意図および範囲から逸脱することなく行ない得ると考える。
【配列表】
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