(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香族アミンの代謝活性を有するバチルス・セレウス（Bacillus cereus）PDa-1株（受託番号FERM BP-10292）またはバチルス・セレウス（Bacillus cereus）10-L-2株（受託番号FERM BP-10291）、または前記菌株に由来し後記の条件のゲル濾過法によって決定される分子量が３１，０００もしくは３５，４００であるアミノアセチルトランスフェラーゼを使用して、２−フェニレンジアミン、３−フェニレンジアミン、４−フェニレンジアミン、２−アミノフルオレン、１−ナフチルアミン、及び１−アミノ−２−ナフトールからなる群から選ばれる、１又は複数の芳香族アミンのアミノ基をアセチル化する方法。
［条件］０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて流速２０ｍｌ／ｈでタンパク質を溶出させる。マーカーとして、チトクロームｃ（１２，５００）、キモトリプシノゲン（２５，０００）、オルアルブミン（４５，０００）、ウシ血清アルブミン（６８，０００）、アルドラーゼ（１５８，０００）を使用し、分子量算出のための検量線を作成する。
【請求項２】
休止菌体を使用することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
バチルス・セレウス（Bacillus cereus）PDa-1株（受託番号FERM BP-10292）。
【請求項４】
バチルス・セレウス（Bacillus cereus）10-L-2株（受託番号FERM BP-10291）。
【請求項５】
請求項１又は２記載の方法に使用される請求項３又は４に記載のバチルス属菌由来であって、請求項１に記載の条件のゲル濾過法によって決定される分子量が３１，０００もしくは３５，４００であるアミノアセチルトランスフェラーゼ。
【請求項６】
請求項１又は２記載の方法に使用される請求項３又は４に記載のバチルス属菌由来であって、請求項１に記載の条件のゲル濾過法によって決定される分子量が３１，０００もしくは３５，４００であるアセチルCoA依存型アミノアセチルトランスフェラーゼ。
【請求項７】
請求項１又は２記載の方法によって、２−フェニレンジアミン、３−フェニレンジアミン、４−フェニレンジアミン、２−アミノフルオレン、１−ナフチルアミン、及び１−アミノ−２−ナフトールからなる群から選ばれる、１又は複数の芳香族アミンのアミノ基をアセチル化する工程を含む、化合物の製造方法であって、製造される化合物が、２−アミノアセトアニリド、３−アミノアセトアニリド、４−アミノアセトアニリド、２−アセトアミドフルオレン、１−ナフチルアセトアミド、及びＮ−（２−ヒドロキシ−１−ナフチル）アセトアミドのいずれかである、化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アニリン誘導体を代謝する微生物、及びその微生物が産生する酵素を利用してアニリン誘導体のアミノ基をアセチル化する技術に関するものである。なお、本明細書において「アニリン誘導体」の語は、特に断りのない限り、アミノ基を有する芳香族化合物（芳香族アミン、又はアリルアミン（arylamine））という広義の意味で使用しており、単環式のアニリン類のみならずアミノナフタレン類などの多環式芳香族化合物も含む意味である。
【背景技術】
【０００２】
アニリン誘導体（芳香族アミン）のアセチル化体は、様々な産業分野で利用されている。例えば、アミノ基を２つ有するフェニレンジアミンの一方のアミノ基がアセチル化されたアミノアセトアニリドは、アゾ染料の中間体である。アミノフェノールのアセチル化体であるヒドロキシアセトアニリド（アセトアミドフェノール［ＡＡＰ］）は、医薬品名をアセトアミノフェンと称し鎮痛剤として広く利用されている。クロロアセトアニリド、メチルアセトアニリドは、それぞれクロロアニリン、トルイジンのアセチル化体であるが、除草剤の原料等として使用されている。アミノ安息香酸のアセチル化体であるアセトアミド安息香酸は、顔料等の中間体であり、また、特表2002-541139号公報（国際公開番号WO00/59875）には、後期糖化最終生成物（ＡＧＥ）形成の新規阻害剤として有効である旨開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上述のように、アミノアセトアニリドなどの上記アセチル化体（アセトアニリド類）は産業上非常に有用であるが、その製造において、従来の有機化学的な合成法は複雑な製造工程を要し、高コストなものとなっていた。例えば、２−アミノアセトアニリドを製造する場合、従来法では安価な２−フェニレンジアミンから直接２−アミノアセトアニリドを合成することは困難であり、アミノ基両方がアセチル化されてしまうため、図１１に示すようにまず、出発基質としてアセトアニリドやニトロアニリン等を調製する。アセトアニリドを出発基質とした場合、ニトロ化の後o-（2-）体とm-（3-）体が生じ、これらを分別する必要がある。また、ニトロアニリンを出発基質とした場合、アセチル化とニトロ基の還元ステップが必要となる。しかも、有機反応では反応条件により生成した２−アミノアセトアニリドから分子内脱水により２−メチルベンズイミダゾールが生じることがある。【０００４】
このような従来の有機化学的な合成法の問題を解決するため、アニリン誘導体を代謝する微生物、及びその代謝に関わる酵素を利用した、まったく新しいアセトアニリド類の製造方法の開発が期待される。即ち、微生物やその酵素を用いて、アニリン誘導体のアミノ基をアセチル化することによって、１段階の反応で簡便にしかも低コストで目的とするアセトアニリド類を製造する新たな製造方法の開発が強く望まれる。【０００５】
現在、微生物由来の酵素としていくつかのアセチルトランスフェラーゼが同定、報告されている（例えば、DDBJ / GenBank / EMBLデータベースにアクセッション番号：AE017004、locus_tag：BC2140として登録されているN-hydroxyarylamine O-acetyltransferaseなど）。しかし、これらの酵素活性および基質特異性は不明であり、現状では利用困難である。また、フェニレンジアミンのようなアミノ基を２つ有する芳香族化合物に作用し、その一方のアミノ基のみアセチル化するという特徴をもった酵素は従来まったく知られていなかった。【０００６】
本発明は、このような状況に鑑みなされたものであり、その目的は、微生物及び微生物由来酵素を用いてアニリン誘導体のアミノ基をアセチル化する新規方法を提供すること、並びに当該方法を用いてアセトアニリド類の新規製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、各地から採取した土壌試料の中から、アニリン誘導体の代謝能を有する微生物を探索した結果、フェニレンジアミンの一方のアミノ基をアセチル化してアミノアセトアニリドを生成する性質をもった２種類の菌株（後述のPDa-1株および10-L-2株）を分離・同定すると共に、これらの菌株が産生する酵素がフェニレンジアミンのみならず多数のアニリン誘導体を基質とする広い基質特異性を有すること、さらに単環式のアニリン類のみならず多環式のアミノナフタレン類にも作用し、そのアミノ基をアセチル化すること等を見出し、本発明を完成させるに至った。【０００８】
即ち、本発明は、産業上有用な発明として、以下の（１）〜（１３）の発明を包含するものである。
（１） アニリン誘導体（芳香族アミン）の代謝活性を有する微生物または同微生物由来の酵素を使用して、アニリン誘導体のアミノ基をアセチル化する方法。
（２） 上記（１）の方法であって、２−フェニレンジアミン、３−フェニレンジアミン、４−フェニレンジアミン、２−トルイジン、３−トルイジン、４−トルイジン、２−クロロアニリン、３−クロロアニリン、４−クロロアニリン、２−アミノフェノール、３−アミノフェノール、４−アミノフェノール、２−アミノ安息香酸、３−アミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸、２−ニトロアニリン、３−ニトロアニリン、４−ニトロアニリン、アニリン、４−アミノサリチル酸、５−アミノサリチル酸、２−アミノフルオレン、１−ナフチルアミン、及び１−アミノ−２−ナフトールからなる群から選ばれる、１又は複数のアニリン誘導体のアミノ基をアセチル化する方法。
（３） 休止菌体を使用することを特徴とする上記（１）又は（２）の方法。
（４） 上記（１）〜（３）のいずれかの方法に使用される微生物。
（５） 上記（１）〜（３）のいずれかの方法に使用されるバチルス属菌。
（６） バチルス・セレウス菌（Bacillus cereus）PDa-1株（受託番号FERM BP-10292）。
（７） バチルス・セレウス菌（Bacillus cereus）10-L-2株（受託番号FERM BP-10291）。
（８） 上記（１）又は（２）の方法に使用される微生物由来の酵素。
（９） 上記（１）又は（２）の方法に使用される微生物由来アミノアセチルトランスフェラーゼ。
（１０） 上記（１）又は（２）の方法に使用される微生物由来アセチルCoA依存型アミノアセチルトランスフェラーゼ。
（１１） 上記（１）又は（２）の方法に使用される微生物由来の酵素であって、アミノナフタレン類のアミノ基をアセチル化する酵素活性を有する酵素。
（１２） 上記（１）〜（３）のいずれかの方法によって、アニリン誘導体のアミノ基をアセチル化する工程を含む、化合物の製造方法。
（１３） 化合物が、２−アミノアセトアニリド、３−アミノアセトアニリド、４−アミノアセトアニリド、２−メチルアセトアニリド、３−メチルアセトアニリド、４−メチルアセトアニリド、２−クロロアセトアニリド、３−クロロアセトアニリド、４−クロロアセトアニリド、２−ヒドロキシアセトアニリド、３−ヒドロキシアセトアニリド、４−ヒドロキシアセトアニリド、２−アセトアミド安息香酸、３−アセトアミド安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、２−ニトロアセトアニリド、３−ニトロアセトアニリド、４−ニトロアセトアニリド、アセトアニリド、２−ヒドロキシ−４−アセチルアミノ安息香酸、２−ヒドロキシ−５−アセチルアミノ安息香酸、２−アセトアミドフルオレン、１−ナフチルアセトアミド、及びＮ−（２−ヒドロキシ−１−ナフチル）アセトアミドのいずれかである、上記（１２）の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来の化学合成では複雑な製造工程を要し、高コストとなっていたアミノアセトアニリドなどの化学物質を１段階の反応で簡易かつ低コストで製造することができる。
本発明の更なる特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で一層明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明による、１９種の各アニリン誘導体からアセトアニリド誘導体への変換を説明する図である。
【図２】本発明による、更に他の５種の各アニリン誘導体からアセトアニリド誘導体への変換を説明する図である。
【図３】PDa-1株および10-L-2株由来のアリルアミン N-アセチルトランスフェラーゼによる、アニリン誘導体のアセチル化を説明する図である。
【図４】アニリン誘導体をアセトアニリド誘導体へ変換する合成系と、アセチルCoAの再生系とを組み合わせた反応システムを説明する図である。
【図５】PDa-1株による２−フェニレンジアミンの代謝産物の質量分析結果を示すグラフである。
【図６】PDa-1株による２−フェニレンジアミンの代謝産物のＮＭＲ解析結果を示す図である。
【図７】PDa-1株による２−フェニレンジアミンのアセチル化を経時的に示すグラフである。黒丸印は生成された２−アミノアセトアニリド（ｍＭ）、白丸印は２−フェニレンジアミンの残存濃度（ｍＭ）、白四角印はコントロール（対照）の２−フェニレンジアミンの残存濃度（ｍＭ）、黒三角印は波長６６０ｎｍにおける濁度であり、反応に使用したPDa-1株の休止菌体の量を示す。
【図８】10-L-2株による４−フェニレンジアミンのアセチル化を経時的に示すグラフである。黒丸印は生成された４−アミノアセトアニリド（ｍＭ）、白丸印は４−フェニレンジアミンの残存濃度（ｍＭ）、白四角印はコントロール（対照）の４−フェニレンジアミンの残存濃度（ｍＭ）、黒三角印は波長６６０ｎｍにおける濁度であり、反応に使用した10-L-2株の成長期菌体の量を示す。
【図９】DE52カラムクロマトグラフィーによるPDa-1株由来の酵素精製結果を示すグラフである。各フラクション（3 ml/tube）の酵素活性（U/ml）およびタンパク質量（mg/ml）をそれぞれ、黒丸印、白丸印で示す。
【図１０】DE52カラムクロマトグラフィーによる10-L-2株由来の酵素精製結果を示すグラフである。各フラクション（4 ml/tube）の酵素活性（U/ml）およびタンパク質量（mg/ml）をそれぞれ、黒丸印、白丸印で示す。
【図１１】従来の有機化学的な合成法による、２−アミノアセトアニリドの製造工程を説明する図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の一形態について説明する。
［１］アニリン誘導体を代謝する微生物の分離・同定
本発明者は後述するように、採取した土壌試料の中から、２−フェニレンジアミンを代謝する菌株Bacillus cereus PDa-1および４−フェニレンジアミンを代謝する菌株Bacillus cereus 10-L-2を分離すると共に、これらの菌株によって２−フェニレンジアミンおよび４−フェニレンジアミンはそれぞれ２−アミノアセトアニリドおよび４−アミノアセトアニリドへと変換されること、即ち両菌株によってフェニレンジアミンの一方のアミノ基のみアセチル化できることを明らかにした（実施例１・２）。なお、両菌株PDa-1および10-L-2は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566））にそれぞれ受領番号FERM ABP-10292（受領日：2005年3月7日）、FERM ABP-10291（受領日：2005年3月7日）として寄託されている。【００１２】
両菌株はバチルス・セレウス菌（Bacillus cereus）に属し、アニリン誘導体を代謝する酵素としてアリルアミン N-アセチルトランスフェラーゼ（図３）を生産する点において共通している。他方、両菌株は、フェニレンジアミンからアミノアセトアニリドへの変換に対する各種環境因子の影響試験の結果や、各菌体を用いた基質特異性試験の結果、さらに各菌体中に含まれる酵素の種類やその緩衝液中での安定性において相違がみられた。各菌体における酵素精製の結果から、PDa-1株由来のアリルアミン N-アセチルトランスフェラーゼは１種類であるのに対して、10-L-2株は２種類のアイソザイム（アリルアミン N-アセチルトランスフェラーゼＩおよびII）を生産することがわかった（図９および図１０）。【００１３】
両菌株由来の酵素の基質特性を休止菌体（resting cell）および成長期菌体（growing cell）を用いて試験したところ、以下の表１に示すように、いずれもその基質特異性は大変広いものであった。なお、表１中、「Decreasing (％)」は各菌株培養液における基質の減少率、「DI-MS analysis」は各基質より生成した代謝産物のDI-MS分析結果を示す。【００１４】
【表１】
0004812619.tif 000002
［注］
a)  PDa-1の休止菌体を用いた反応系はpHが6.8のため、反応中に基質が重合及び変性してしまい、定量できなかった。
b)  基質は100％分解されたが、代謝中間体を分離・同定できなかった。
c)  ND：変換量が微量であったため、DI-MS分析の際に明瞭なイオンピークを検出できなかった。
d)  ND：PDa-1株の休止菌体を用いた変換反応では基質の分解量が微量であったため生成物も少なく、DI-MS分析の際に明瞭なイオンピークを検出できなかった。一方、10-L-2株のgrowing cellを用いた変換反応では基質の分解は良好であった。
e)  10-L-2株では未決定。【００１５】
図１および図２には、MS分析の結果から予測される両菌株由来の酵素による各アニリン誘導体からアセトアニリド誘導体へのアセチル化の反応機構が示される。表１に示すように、PDa-1株の休止菌体を用いた反応系では、１−ナフチルアミン、１−アミノ−２−ナフトールなどのアミノナフタレン類も基質に含まれることが確認された（図２）。【００１６】
両菌株由来の酵素はフェニレンジアミンに対して高い活性を示し、いずれもフェニレンジアミンの２つのアミノ基のうち一方のみをアセチル化するという既報の酵素にはない特徴を有することから、その特徴を表す表現としてこれらの酵素を「フェニレンジアミン  モノアセチルトランスフェラーゼ」と呼ぶことができる。【００１７】
このように、上記菌株PDa-1および10-L-2、あるいはこれらの菌株が産生する酵素を利用して各アニリン誘導体のアミノ基をアセチル化することが可能であり、この方法によってアミノアセトアニリドなどの有用化合物を従来法に比し１段階の反応で簡易かつ低コストで生産することが可能である。また、本発明は上記２種の菌株を用いた方法に限定されるものではなく、後述の実施例に示すような方法で土壌中、水中などから微生物のスクリーニングを行い、上記２種の菌株以外にアニリン誘導体を代謝する微生物を分離・同定し、得られた微生物又はその酵素を利用してアニリン誘導体のアセチル化を行ってもよい。今回得られた２種の菌株はいずれもバチルス・セレウス菌であったため、バチルス属菌とりわけバチルス・セレウス菌に着目してスクリーニングを行うことは好ましい方法である。また、遺伝情報を利用して上記２種の菌株とｒＲＮＡの相同性が高い近縁株をスクリーニングすることとしてもよい。（PDa-1株と10-L-2株の16S rRNAの相同性（％）は、99.5％であった。）【００１８】
微生物を用いてアニリン誘導体のアセチル化を行う場合、休止菌体（resting cell）の方が一般に酵素活性が高く、分解率も良く、変換反応後の目的とする反応生産物の回収・精製もより容易と考えられることから、休止菌体を用いる方法が好ましいが、これに限定されず、成長期菌体（growing cell）を使用してもよい。表１に示す試験ではPDa-1株は休止菌体を使用し、10-L-2株は成長期菌体を使用した。【００１９】
本発明において微生物を使用する際の使用条件（基質濃度、炭素源、ｐＨ、温度、培地組成、培養方法（振盪あるいは攪拌による培養等）、その他の培養条件など）は特に限定されるものではなく、使用する微生物の性質・特徴に応じてアセチル化に最適な使用条件を選択すればよい。例えば、エネルギー源（アセチルCoA供給源）としてグルコース、フルクトース、スクロースなどの安価な糖類を反応溶液中に添加すると、反応を継続して行うことができ、基質（アリルアミン類）の初発濃度を高くできると考えられる。また、酵素反応時に基質濃度が高いと基質阻害が生じることがあるので、低濃度で反応を開始して基質が減ったことを確認しながら、反応系に基質を再添加する方法は最終的な収率を向上することができ、好ましい方法と考えられる。【００２０】
PDa-1株および10-L-2株由来の酵素は、いずれもアセチルCoA依存型アリルアミン N-アセチルトランスフェラーゼであったため（実施例４、図３）、微生物を用いずにその精製酵素を用いた反応系では反応の進行に伴いアセチルCoAを追加することが好ましい。あるいは、アセチルCoAを追加することなしに変換反応を継続する方法として、アリルアミン類をアセトアニリド類へ変換する合成系と、この反応により生じたCoASHを再びアセチルCoAへ変換する再生系とを組み合わせた反応システムを構築することは好ましい方法である。例えば、図４に示すように、CoASH、アセチルリン酸およびホスホトランスアセチラーゼによる再生系と組み合わせて、アセチルCoAをリユースする方法が挙げられる。その他に、（１）CoASH、NAD+およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（E.C. 1.2.1.10）による再生系と組み合わせてアセチルCoAをリユースする方法、（２）CoASH、ATPおよびアセチルCoAシンテターゼ（E.C. 6.2.1.1）による再生系と組み合わせてアセチルCoAをリユースする方法、が考えられる。【００２１】
本発明によるアリルアミン類からアセトアニリド類への変換反応は、従来の有機化学的合成法（図１１）と比較して次のような利点が挙げられる。（１）反応に触媒として重金属等を必要とせず、しかも常温で反応が進行する。（２）基質特異性が広いため、種々の基質から有用な化学物質を製造できる。（３）アミノ基以外にアセチル化される置換基（アミノ基および水酸基など）や反応性の高い置換基（アルデヒド基など）を有する化合物の場合、有機化学的手法では副産物が生じる。一方、本発明による合成法では１段階で反応が進行し、目的とする化合物が得られる。例えば、フェニレンジアミンからアミノアセトアニリドへの変換反応のように従来の有機化学的手法では数ステップ必要な反応経路を１段階で済ませることができるので、安価な２−フェニレンジアミンから高価な２−アミノアセトアニリドへの生産等に利用できる。【００２２】
［２］酵素の精製方法
以下では、PDa-1株および10-L-2株からの酵素の精製方法の一例について説明するが、勿論これとは異なる方法で酵素の精製を行ってもよい。【００２３】
［a］PDa-1株由来酵素の精製と特性解析
［a-1］酵素の精製
＜方法＞
酵素精製におけるすべての操作は4℃以下で行った。遠心分離は全て、20,000×g，10分間の条件で行った。精製には1 mM DTTおよび1 m EDTAを含む20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）（以下buffer A）を用いた。本酵素1 unitは30℃で1時間に1μmolの2-アミノアセトアニリドを生成する酵素量と定義した。タンパク質の定量はLowry法によった。また、比活性はタンパク質1 mgあたりのunit数で示した。【００２４】
(1)  無細胞抽出液の調製
培養液4.4ＬからPDa-1株の菌体を23.8 g（湿菌体）得た。湿菌体1 gあたり10 mlのbuffer Aを加え、菌体懸濁液（240 ml）を調製した。懸濁液25 mlずつKUBOTA model 201 M Isonatorを用いて180 W，15分間超音波処理することで破砕した。破砕液を遠心分離して上清（無細胞抽出液）を回収した。（Fraction 1，218 ml）【００２５】
(2)  除核酸操作
無細胞抽出液に、20％（w/v）硫酸ストレプトマイシン溶液を終濃度が1％（w/v）となるように攪拌しながら添加した。30分間攪拌した後、遠心分離により沈殿した核酸類を除いた。（Fraction 2，220 ml）【００２６】
(3)  硫安分画
Fraction 2に、粉末状に砕いた硫安を50％飽和になるように攪拌しながら加えた。30分間攪拌後、遠心分離により沈殿を除去した。得られた上清に硫安を80％飽和となるように加え、30分間攪拌後、遠心分離により沈殿を回収した。沈殿をbuffer A 11 mlに溶解した後、1Ｌのbuffer Aに対して透析した。3時間おきに透析外液を交換し、合計９時間透析した。（Fraction 3，20 ml）【００２７】
(4)  DE-52 カラムクロマトグラフィー
Fraction 3を、buffer Aで平衡化したDEAE-Cellulose（DE52）（Whatman International Ltd，Maidstone，England）を充填したカラム（1.5×17.5 cm）にアプライした。90 mlのbuffer Aでカラムを洗浄した後、0〜0.4 M NaClを含む360 mlのbuffer Aを用いてリニアグラジエント法により、流速40 ml/hで酵素を溶出した。各フラクション（3.0 ml/tube）の酵素活性およびタンパク質を測定した。高活性画分を集め buffer A 1Ｌに対して3時間おきに透析外液を交換し、合計6時間透析を行った。（Fraction 4，27 ml）【００２８】
(5)  POROS 50HQカラムクロマトグラフィー
BioCAD Workstation system（PerSeptove Biosystems，Cambridge，MA）およびPOROS 50HQカラム（PerSeptove Biosystems）によるperfusion chromatography workstationにより活性画分を分画した。Fraction 4をbuffer Aで平衡化したPOROS 50HQカラム（0.46×10.0 cm）にアプライした。buffer Aでカラムを洗浄した後、0〜0.5 M NaClを含むbuffer Aを用いてリニアグラジエント法により、流速15 ml/minで酵素を溶出した。各フラクション（6 ml/tube）の酵素活性およびタンパク質量を測定した。（Fraction 5，30 ml）【００２９】
(6)  POROS 20PEカラムクロマトグラフィー
Fraction 5を2 M硫酸アンモニウムを含むbuffer Aで平衡化したPOROS 20PE（PerSeptove Biosystems）を充填したカラム（0.46×10.0 cm）にアプライした。2 M硫酸アンモニウムを含むbuffer Aでカラムを洗浄した後、2.0〜0 M硫酸アンモニウムを含むbuffer Aを用いてBioCAD Workstation systemを用いてリニアグラジエント法により、流速15 ml/minで酵素を溶出した。各フラクション（2 ml/tube）の酵素活性およびタンパク質量を測定した。（Fraction 6，36 ml）【００３０】
(7)  ゲル濾過クロマトグラフィー
Fraction 6をApollo 20 ml high-performance centrifugal concentrators（Orbital Biosciences，MA，USA）により1 mlまで濃縮した。濃縮液を0.2 M NaClを含むbuffer Aで平衡化したTOYOPEARL HW-55F （東ソー，東京）を充填したカラム（2.0×97 cm）にアプライした。同bufferを用いて流速20 ml/hで酵素を溶出した。各フラクション（2 ml/tube）の酵素活性およびタンパク質を測定し、高活性画分を集めた。（Fraction 7，8 ml）【００３１】
＜結果＞
硫安分画に続いて、DE52カラムクロマトグラフィー、POROS 50HQカラムクロマトグラフィー、POROS 20PEカラムクロマトグラフィーに供した後、ゲル濾過クロマトグラフィーに供することによって本酵素を精製した。各精製段階における酵素活性およびタンパク質量を表２に示す。最終調製酵素は4％の収率で94倍に精製され、比活性は3 U/mgであった。同調製酵素についてNativeなポリアクリルアミド電気泳動およびSDS-PAGE電気泳動による純度の検討を行ったが、単一ではなかった。【００３２】
【表２】
0004812619.tif 000003
【００３３】
［a-2］酵素の特性解析：ゲル濾過法による分子量の測定
＜方法＞
分子量は、ゲル濾過法により決定した。マーカー（各4 mg）を用いて、上記(7)で述べた方法に従いTOYOPEARL HW-55F（2.0×97 cm）上で行った。マーカーとして、チトクロームc（12,500）、キモトリプシノゲン（25,000）、オルアルブミン（45,000）、ウシ血清アルブミン（68,000）、アルドラーゼ（158,000）を使用した。【００３４】
＜結果＞
ゲル濾過法による本酵素の分子量は31,000であった。【００３５】
［b］10-L-2株由来酵素の精製と特性解析
［b-1］酵素の精製
＜方法＞
酵素精製におけるすべての操作は4℃以下で行った。遠心分離は全て、20,000×g，10分間の条件で行った。精製には20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）（以下buffer B）を用いた。本酵素1 unitは30℃で1時間に1μmolの4-アミノアセトアニリドを生成する酵素量と定義した。タンパク質の定量はLowry法によった。また、比活性はタンパク質1 mgあたりのunit数で示した。【００３６】
(1)  無細胞抽出液の調製
培養液２．４Ｌから10-L-2株の菌体を19 g（湿菌体）得た。湿菌体1 gあたり10 mlのbuffer Bを加え、菌体懸濁液（190 ml）を調製した。懸濁液25 mlずつKUBOTA model 201 M Isonatorを用いて180 W，15分間超音波処理することで破砕した。破砕液を遠心分離して上清（無細胞抽出液）を回収した。（Fraction 1，190 ml）【００３７】
(2)  除核酸操作
無細胞抽出液に、20％（w/v）硫酸ストレプトマイシン溶液を終濃度が1％（w/v）となるように攪拌しながら添加した。30分間攪拌した後、遠心分離により沈殿した核酸類を除いた。（Fraction 2，190 ml）【００３８】
(3)  硫安分画
Fraction 2に、粉末状に砕いた硫安を50％飽和になるように攪拌しながら加えた。30分間攪拌後、遠心分離により沈殿を除去した。得られた上清に硫安を85％飽和となるように加え、一晩攪拌後、遠心分離により沈殿を回収した。沈殿をbuffer B 20 mlに溶解した後、1Ｌのbuffer Bに対して透析した。3時間おきに透析外液を交換し、合計９時間透析した。（Fraction 3，33 ml）【００３９】
(4)  DE-52 カラムクロマトグラフィー
Fraction 3を、buffer Bで平衡化したDEAE-Cellulose（DE52）（Whatman International Ltd，Maidstone，England）を充填したカラム（2.2×11 cm）にアプライした。200 mlのbuffer Bでカラムを洗浄した後、0〜0.3 M NaClを含む600 mlのbuffer Bを用いてリニアグラジエント法により、流速40 ml/hで酵素を溶出した。各フラクション（4 ml/tube）の酵素活性およびタンパク質を測定した。高活性画分（NAT IおよびNAT II画分）を集め buffer B 1Ｌに対して3時間おきに透析外液を交換し、合計6時間透析を行った。（Fraction 4， NAT I fraction 32 mlおよびNAT II fraction 36 ml。ここで、「NAT I」「NAT II」は、10-L-2株由来の２種類のアリルアミン N-アセチルトランスフェラーゼを意味する。）【００４０】
(5)  DEAE-Toyopearlカラムクロマトグラフィー
Fraction 4（NAT I fractionおよびNAT II fraction）をそれぞれ、buffer Bで平衡化したDEAE-Toyopearl（東ソー、東京）を充填したカラム（2.2×11 cm）にアプライした。200 mlのbuffer Bでカラムを洗浄した後、0〜0.3 M NaClを含む120 mlのbuffer Bを用いてリニアグラジエント法により、流速40 ml/hで酵素を溶出した。各フラクション（3 ml/tube）の酵素活性およびタンパク質を測定した。高活性画分を集め buffer B 1Ｌに対して3時間おきに透析外液を交換し、合計6時間透析を行った。（Fraction 5，NAT I fraction 19 mlおよびNAT II fraction 21 ml）【００４１】
(6)  POROS 20PEカラムクロマトグラフィー
Fraction 5（NAT I fraction 19 mlおよびNAT II fraction 21 ml）をそれぞれ2 M硫酸アンモニウムを含むbuffer Bで平衡化したPOROS 20PE（PerSeptove Biosystems）を充填したカラム（0.46×10.0 cm）にアプライした。2 M硫酸アンモニウムを含むbuffer Bでカラムを洗浄した後、2.0〜0 M硫酸アンモニウムを含むbuffer Bを用いてBioCAD Workstation systemを用いてリニアグラジエント法により、流速15 ml/minで酵素を溶出した。各フラクション（2 ml/tube）の酵素活性およびタンパク質量を測定した。（Fraction 6，36 ml）【００４２】
(7)  ゲル濾過クロマトグラフィー
Fraction 6をApollo 20 ml high-performance centrifugal concentrators（Orbital Biosciences，MA，USA）により1 mlまで濃縮した。濃縮液を0.2 M NaClを含むbuffer Bで平衡化したTOYOPEARL HW-55F （東ソー，東京）を充填したカラム（2.0×97 cm）にアプライした。同bufferを用いて流速20 ml/hで酵素を溶出した。各フラクション（2 ml/tube）の酵素活性およびタンパク質を測定し、高活性画分を集めた。（Fraction 7）【００４３】
＜結果＞
硫安分画に続いて、DE52カラムクロマトグラフィーに供したところ、アリルアミン N-アセチルトランスフェラーゼ活性のピークが2ピーク見られた（図１０）。そこで、各ピークをNAT IおよびNAT IIとし、精製を進めた。各精製段階における酵素活性およびタンパク質量を表３に示す。最終調製酵素は4％の収率で94倍に精製され、比活性は3 U/mgであった。同調製酵素についてNativeなポリアクリルアミド電気泳動およびSDS-PAGE電気泳動による純度の検討を行ったが、単一ではなかった。【００４４】
【表３】
0004812619.tif 000004
【００４５】
［b-2］酵素の特性解析：ゲル濾過法による分子量の測定
＜方法＞
分子量は、ゲル濾過法により決定した。マーカー（各4 mg）を用いて、上記(7)で述べた方法に従いTOYOPEARL HW-55F（2.0×97 cm）上で行った。マーカーとして、チトクロームc（12,500）、キモトリプシノゲン（25,000）、オルアルブミン（45,000）、ウシ血清アルブミン（68,000）、アルドラーゼ（158,000）を使用した。【００４６】
＜結果＞
ゲル濾過法によるNAT IおよびNAT IIの分子量はともに35,400であった。
以上の方法により精製したPDa-1株および10-L-2株由来のアリルアミン N-アセチルトランスフェラーゼについて、各酵素の特徴を比較してまとめた表を以下に示す。【００４７】
【表４】
0004812619.tif 000005
【００４８】
上記のように、10-L-2株由来の酵素は、3位に置換基を有する誘導体（3-トルイジン、3-クロロアニリン、3-アミノフェノール、3-アミノ安息香酸、3-ニトロアニリン）に対して比較的高い活性を示した。
PDa-1株および10-L-2株以外の菌株を使用する場合も、同様の方法により菌株からの酵素精製が可能である。
【実施例】
【００４９】
以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。【００５０】
［実施例１：フェニレンジアミンを代謝する微生物の分離・同定］
［1-1］フェニレンジアミンを代謝する微生物の分離
＜方法＞
１．分離源
各地から採取した土壌試料350を分離源として用いた。【００５１】
２．分離培地の調製
o-、m-、p-体のフェニレンジアミン・二塩酸塩を基質として用いた。下記の表５に分離用培地組成を示す。培地のpHが5.5および6.8になるようにKH2PO4およびNa2HPO4・12H2Oの添加量を調整した。同培地はフェニレンジアミンとは別に炭素源としてショ糖、窒素源として硝酸アンモニウムを含む。Ａ液およびＢ液はオートクレーブにて別々に殺菌し、フェニレンジアミン・二塩酸塩を含むＣ液は濾過除菌装置を用いて除菌した。冷却後これらを混合した。また、固体培地は1.5％（w/v）寒天を加えて調製した。【００５２】
【表５】
0004812619.tif 000006
【００５３】
３．分離方法
１ｇの土壌を0.8％（w/v）NaCl 溶液9 mlに懸濁後2〜3分間静置し、上清1 mlを表５に示した0.12％（w/v）フェニレンジアミン培地6.7 mlに添加した。これを30℃で1〜2週間振盪培養した後、生育の見られた培養液をフェニレンジアミン固体培地上に塗抹した。さらに、単一コロニーをフェニレンジアミン固体培地に移し、同培地にて良好な生育を示した菌株をフェニレンジアミン分解菌として保存した。【００５４】
４．培地中のフェニレンジアミンの定量
芳香族アミン類の定量法であるジアゾカップリング法によった。【００５５】
＜結果＞
１．フェニレンジアミンを代謝する菌株の分離
フェニレンジアミンは、2-、3-、4-体3種類とも水溶液中では不安定で、菌が摂取しないコントロール培地では集積培養7日間のうちに培養液は褐色〜黒色に変わる。まず、菌の生育が良好かつ培養液の色が変色しない集積培養サンプルを選抜した。350の土壌試料から目的にかなう菌株を2-フェニレンジアミン分離培地（pH 6.8）および4-フェニレンジアミン分離培地（pH 5.5）よりそれぞれ17株、44株分離した。【００５６】
２．フェニレンジアミンを代謝する菌株の選択
2-フェニレンジアミンを代謝する菌株17株について肉汁平板培地および2-フェニレンジアミン平板培地上にて純粋分離を行い、生育の良好な株を4株（PDa-1、PDa-2、PDa-3、PDa-4）選択した。さらに、液体培地にて基質の分解を確認し、以後の実験にはこれら4株のうち最も生育の良好なPDa-1株を用いることにした。【００５７】
4-フェニレンジアミンを代謝する菌株44株から純粋分離を行い、生育の良好な株を3株（10-L-1、10-L-2、10-L-3）選択した。以後の実験には生育の最も良好な10-L-2株を用いることにした。【００５８】
［1-2］分離菌PDa-1および10-L-2株の同定
＜方法＞
分離菌の同定は形態的性質、生化学的試験および16S rRNA遺伝子の解析によった。【００５９】
＜結果＞
同定試験に用いたPDa-1および10-L-2株の菌学的性質を下記の表６に示す。グラム陽性で周鞭毛を有し、オキシダーゼは陰性、カタラーゼ活性は陽性であった。また、試験に用いた糖（D-アラビノース、D-フルクトース、ショ糖、D-グルコース）から発酵により嫌気的にも酸の生成が見られた。さらに、胞子形成能も見られた。以上の結果は、Bacillus属の特徴を示すものであった。そこで、16S rRNA遺伝子の解析を行った。PDa-1株（1544 bp）および10-L-2株（1540 bp）の16S rRNA遺伝子の塩基配列をそれぞれ決定した。DDBJデータバンクのデータベースを用いてシークエンス解析したところ、既報のBacillus cereusと高い類似性を示した。以上より、両株をBacillus cereusと同定した。また、PDa-1株と10-L-2株由来の16S rRNA遺伝子の相同性を調べたところ、99.5％であった。【００６０】
【表６】
0004812619.tif 000007
【００６１】
［1-3］本実施例の結果と考察
フェニレンジアミンを含む三種類（2-、3-、4-）の分離培地（pH 6.8およびpH 5.5）を用いてスクリーニングを行った結果、2-フェニレンジアミンを代謝するBacillus cereus PDa-1および4-フェニレンジアミンを代謝するBacillus cereus 10-L-2を分離することができた。アミノフェノール（水酸基置換体）やフェニレンジアミン（アミノ基置換体）等のアニリン誘導体は、水溶液中での安定性はpHに依存する。2-フェニレンジアミンは中性付近で安定であるのに対して、4-フェニレンジアミンは弱酸性において安定で、基質が安定なpH条件において基質を代謝する菌株を分離できる傾向がみられた。PDa-1株と10-L-2株由来の16S rRNA遺伝子の相同性は、99.5％であったが、実施例３で述べる基質特異性の相違（前記表１）から、同種に属するが異なる菌であると結論した。（また、10-L-2株は2種類のアリルアミン N-アセチルトランスフェラーゼを生産する（前記表４）。）【００６２】
［実施例２：Bacillus cereus PDa-1およびBacillus cereus 10-L-2株の生育とフェニレンジアミンの代謝］
［2-1］B. cereus PDa-1およびB. cereus 10-L-2株の生育とフェニレンジアミンの代謝に与える各種環境因子の影響
＜方法＞
１．B. cereus PDa-1およびB. cereus 10-L-2株の生育とフェニレンジアミンの代謝に与える基質濃度の影響
a. 前培養
1％（w/v）ポリペプトンを含む0.1％（w/v）フェニレンジアミン培地（7 ml/tube）にて12時間前培養した。【００６３】
b. 本培養
PDa-1株の本培養：前培養液1 mlを1％（w/v）ショ糖、0.15％（w/v）NH4NO3を含む培地（pH 6.8、70 ml/500 mlコルベン）に2-フェニレンジアミン・二塩酸塩（0.10％〜0.20％（w/v））を添加し培養した。【００６４】
10-L-2株の本培養：前培養液1 mlを1％（w/v）ポリペプトンを含む0.07％フェニレンジアミン培地（pH 5.5、70 ml/500 mlコルベン）に4-フェニレンジアミン・二塩酸塩（0.035％〜0.21％（w/v））を添加し培養した。【００６５】
c. フェニレンジアミンおよび代謝産物の定量  HPLCによった。
分析条件
カラム：Inertsil ODS-2（4.6×150 mm）
溶離液：20 mM H3PO4-NaH2PO4緩衝液（pH 3.0）-MeOH（98：2）
流速：0.7 ml/min
検出波長：274 nm【００６６】
２．B. cereus PDa-1およびB. cereus 10-L-2株の生育とフェニレンジアミンの代謝に与える炭素源の影響
前培養は上記１．a.で述べた条件とし、本培養においてショ糖（0.1％（w/v）2-フェニレンジアミン培地、PDa-1株）またはポリペプトン（0.07％（w/v）4-フェニレンジアミン培地、10-L-2株）のかわりに培地に添加する炭素源としてポリペプトン、D-グルコース、ショ糖、コハク酸2ナトリウム、酢酸ナトリウム、グリセロールを終濃度１％（w/v）となるように加えた。【００６７】
３．B. cereus PDa-1およびB. cereus 10-L-2株の生育とフェニレンジアミンの代謝に与えるpHの影響
前培養培地は上記１．a.で述べた条件とし、本培養において培地のpHが3.5〜8.5となるようにKH2PO4およびNa2HPO4・12H2Oの添加量を調整した。本培地でのフェニレンジアミン濃度は0.1％（w/v）2-フェニレンジアミン・二塩酸塩および0.07％（w/v）4-フェニレンジアミン・二塩酸塩とした。【００６８】
＜結果＞
１．B. cereus PDa-1およびB. cereus 10-L-2株の生育とフェニレンジアミンの代謝に与える基質濃度の影響
B. cereus PDa-1株：2-フェニレンジアミン・二塩酸塩濃度が0.125％（w/v）まではPDa-1株は良好な生育とともに基質を100％分解したが、0.15％（w/v）濃度の培地では、生育は不良で残存基質量（％）は40％であった。【００６９】
B. cereus 10-L-2株：0.035％〜0.105％（w/v）までは生育とともに基質を100％分解した。しかし、0.035％（w/v）フェニレンジアミン培地と比較して基質濃度が増加するにつれて生育も不良となり、0.14％（w/v）培地での残存基質量（％）は50％であった。一方、0.20％（w/v）培地においても本菌は生育を示したが、4-フェニレンジアミンの分解はまったく見られなかった。【００７０】
２．B. cereus PDa-1およびB. cereus 10-L-2株の生育とフェニレンジアミンの代謝に与える炭素源の影響
B. cereus PDa-1株：試験した中で、1.0％（w/v）ショ糖を含む2-フェニレンジアミン培地において良好な生育を示し、基質も完全に分解された。しかし、1.0％（w/v）コハク酸2ナトリウムを含む同培地では生育は不良で、基質の減少も全く見られなかった。【００７１】
B. cereus 10-L-2株：試験した中で、1.0％（w/v）ポリペプトンを含む4-フェニレンジアミン培地において非常に良好な生育を示し、基質も完全に分解された。一方、PDa-1株が良好な生育を示した1.0％（w/v）ショ糖添加培地では、生育は不良で残存基質量（％）は50％であった。【００７２】
３．B. cereus PDa-1およびB. cereus 10-L-2株の生育とフェニレンジアミンの代謝に与えるpHの影響
B. cereus PDa-1株：試験した中で、pH 7.5の2-フェニレンジアミン培地において良好な生育とともに基質が80％分解された。【００７３】
B. cereus 10-L-2株：試験した中で、pH 4.5および5.5の4-フェニレンジアミン培地において良好な生育を示すとともに基質がほぼ完全に分解された。【００７４】
［2-2］代謝産物の分離・同定
１．B. cereus PDa-1の培養と休止菌体の調製
1％（w/v）ポリペプトンを含む0.1％（w/v）2-フェニレンジアミン培地（7 ml/tube）にてPDa-1株を前培養後、1％（w/v）ショ糖、0.15％（w/v）NH4NO3を含む培地（70 ml/500 mlコルベン）に前培養液1 mlを添加し、24時間培養した。集菌した菌体を反応溶液（組成を下記表７に示す）に濁度（OD660）が30となるように懸濁し、30℃で振とうした。各時間ごとに反応溶液をサンプリングし、PDa-1株の生育と2-フェニレンジアミンの減少をHPLCにて定量した。【００７５】
【表７】
0004812619.tif 000008
【００７６】
２．B. cereus 10-L-2株の培養
1％（w/v）ポリペプトンを含む0.07％4-フェニレンジアミン培地（7 ml/tube）にて10-L-2株を前培養後、同じ組成の培地（70 ml/500 mlコルベン）に前培養液1 mlを添加し、24時間培養した。各時間ごとに反応溶液をサンプリングし、10-L-2株の生育と4-フェニレンジアミンの減少をHPLCにて定量した。【００７７】
３．代謝産物の分離・同定
遠心分離し、菌体と上清を分別した。上清を濃縮後、3N NaOHにてpH 11とし、酢酸エチルにて蓄積した代謝産物を反応溶液より抽出した。抽出後のサンプルをDI-MS分析およびNMR分析した。【００７８】
＜結果＞
DI-MS分析および１H-NMRおよび13C-NMR分析より得られたスペクトルを解析し、代謝産物はアミノアセトアニリドであると同定した。2-フェニレンジアミンおよび4-フェニレンジアミンはそれぞれ2-アミノアセトアニリドおよび4-アミノアセトアニリドに変換されたと結論した。図５および図６に2-フェニレンジアミンより生成した代謝産物の各スペクトルを示す。【００７９】
［2-3］B. cereus PDa-1およびB. cereus 10-L-2株によるフェニレンジアミンからアミノアセトアニリドの生産
＜方法＞
PDa-1の培養および本菌の休止菌体を用いた反応は前記［2-1］に述べた方法に従った。反応溶液中の本菌由来の濁度（OD660）および反応溶液中の2-フェニレンジアミン（初濃度：5.5 mM）と代謝産物2-アミノアセトアニリドの量をHPLCにて定量した。【００８０】
10-L-2のgrowing cellを用いた反応は前記［2-2］に述べた方法に従った。反応溶液中の本菌由来の濁度（OD660）および反応溶液中の4-フェニレンジアミン（初濃度：3.9 mM）と代謝産物4-アミノアセトアニリドの量をHPLCにて定量した。【００８１】
＜結果＞
PDa-1の休止菌体を用いた反応において反応30時間の時点で2-フェニレンジアミンの残存量は0.14 mM、2-アミノアセトアニリドの生産量は3.80 mMであり、モル変換率は71％であった（図７）。【００８２】
10-L-2のgrowing cellを用いた反応において培養時間30時間の時点で4-フェニレンジアミンの残存量は0％であり、4-アミノアセトアニリドの生産量は3.5 mMであり、モル変換率は90％であった（図８）。【００８３】
［2-4］本実施例の結果と考察
フェニレンジアミンの代謝に与える基質濃度の影響を調べたところ、反応溶液（または培地）中の基質濃度の増加に伴い、基質の分解率および分解速度は減少した。フェニレンジアミン類は変異原性を示すことが報告されており、その毒性から菌の増殖および代謝酵素の生合成系が抑制されたと思われる。PDa-1株および10-L-2株の生育とフェニレンジアミンの分解に与えるpHの影響を調べたところ、PDa-1株は中性付近で生育および基質の分解が良好であった。一方、10-L-2株は弱酸性側で生育および基質の分解が良好であった。この結果は、スクリーニング時のpH領域と類似している。フェニレンジアミンの分解に与える炭素源の影響およびpHの影響試験結果は両菌において相違が見られた。【００８４】
フェニレンジアミンからの代謝産物を分離し、アミノアセトアニリドであると同定した。両菌はフェニレンジアミンの有する2つのアミノ基のうち、片方のみをアセチル化した。しかも、そのモル変換効率は高く、PDa-1株は71％（2-フェニレンジアミン→2-アミノアセトアニリド）であり、10-L-2株は90％（4-フェニレンジアミン→4-アミノアセトアニリド）であった。【００８５】
［実施例３：アニリン誘導体に対する基質特性］
＜方法＞
PDa-1株の休止菌体調製法および反応は、実施例２の［2-1］で述べた方法によった。10-L-2株の培養方法は、実施例２の［2-2］で述べた方法によった。【００８６】
用いた基質は、アニリンおよびその誘導体である2-, 3-, 4-フェニレンジアミン、2-, 3-, 4-トルイジン、2-, 3-, 4-クロロアニリン、2-, 3-, 4-アミノフェノール、2-, 3-, 4-アミノ安息香酸、2-, 3-, 4-ニトロアニリン、4-, 5-アミノサリチル酸、2-アミノフルオレン、スルファメタジン、1-ナフチルアミン、1-アミノ-2-ナフトールである。前記表７に組成を示した5 mM基質を含む反応溶液を調製した（ただし、2-アミノフルオレン、スルファメタジン、1-ナフチルアミン、1-アミノ-2-ナフトールの4種類は水に難溶のため終濃度1 mMとした）。【００８７】
各時間サンプリングを行い、基質の減少量を分光光学的またはHPLCにて定量した。フェニレンジアミン以外のアニリン誘導体の定量はジアゾカップリング反応によった。さらに、蓄積した代謝産物（アセトアニリド誘導体）の同定はHPLCおよびDI-MS分析によった。【００８８】
＜結果＞
PDa-1株のresting cellおよび10-L-2株のgrowing cellを用いたアニリン誘導体に対する基質特異性試験結果を前記表１に示した。さらにMS分析の結果から推定した反応機構を図１に示した。【００８９】
＜本実施例の結果と考察＞
PDa-1株および10-L-2株由来のアセチルトランスフェラーゼは幅広い基質に対して活性を示した。PDa-1株由来の同酵素は10-L-2株由来の同酵素と比較してより幅広い基質に対して活性を示すと言える。10-L-2株由来の同酵素はクロロアニリン類にはまったく作用しないが、PDa-1株由来の同酵素よりもトルイジン、ニトロアニリンやアミノ安息香酸分解率が高かった。【００９０】
［実施例４：フェニレンジアミン代謝に関与する酵素系の解析］
［4-1］フェニレンジアミン代謝に関与する酵素系の検索
＜方法＞
PDa-1株および10-L-2株をそれぞれ培養し、得られた菌体から無細胞抽出液を調製した。表８に示す反応組成にて酵素反応（30℃、１時間）を行い、HPLCにてフェニレンジアミンから生成したアミノアセトアニリドを分析した。【００９１】
【表８】
0004812619.tif 000009
【００９２】
＜結果＞
アセチルCoA添加時のみフェニレンジアミンからアミノアセトアニリドへの変換が見られた。アセチル化を触媒する酵素はアリルアミン N-アセチルトランスフェラーゼであるといえる。酵素反応機構を図３に示す。【００９３】
［4-2］PDa-1株および10-L-2株由来アリルアミン N-アセチルトランスフェラーゼの特性解析
＜方法＞
１．酵素の安定化
無細胞抽出液を調製し、硫酸ストレプトマイシンにより除核酸後、硫安分画により活性画分を分画した。活性画分を種々の有機酸、糖類等を含む20 mM Tris-HCl (pH 8.0)にて透析し、経時的に酵素活性を測定した。【００９４】
２．酵素の精製
前述した方法により菌体破砕後、除核酸、硫安分画を行い、各種クロマトグラフィーにより分画した。【００９５】
＜結果＞
１．酵素の安定化
PDa-1株由来の同酵素は20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）では、菌体破砕後2日で活性を失ったが、1.0 mM EDTAおよび1.0 mM DTTを含む20 mM Tris-HCl（pH 8.0）緩衝液中では安定であることを見いだした。一方、10-L-2株由来の同酵素は20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）において1週間以上安定であった。【００９６】
２．酵素の精製
各精製段階における酵素活性およびタンパク質量は、前記の表２（PDa-1株由来アリルアミン N-アセチルトランスフェラーゼ）および表３（10-L-2株由来アリルアミン N-アセチルトランスフェラーゼ）に示したとおりである。精製酵素は単一でなかった。DE52クロトグラムよりPDa-1株由来の粗酵素液には一種類の同酵素が含まれているのに対して、10-L-2株由来の粗酵素液には電気化学的性質が異なる2種類の同酵素が含まれていることがわかった（図９および図１０）。【００９７】
３．酵素の特性
分子量は、ゲル濾過法により決定した。マーカー（各4 mg）を用いて、Toyopearl HW-55F （東ソー，東京）を充填したカラム（2.0×97 cm）および0.2 M NaClを含む20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）を用いて行った．同緩衝液を用いて流速20 ml/hでタンパク質を溶出した。マーカーとして、チトクロームｃ（12,500）、キモトリプシノゲン（25,000）、オルアルブミン（45,000）、ウシ血清アルブミン（68,000）、アルドラーゼ（158,000）を使用し、分子量算出のための検量線を作成した。PDa-1株由来の同酵素の分子量は、31,000であった。また、10-L-2株由来の2種類の同酵素はともに分子量35,400であった。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明は以上のように、微生物及びその微生物が産生する酵素を利用してアニリン誘導体（芳香族アミン）のアミノ基をアセチル化する方法であり、多数のアニリン誘導体を基質として、それらのアミノ基を１段階の反応で簡易にアセチル化することができるため、アミノアセトアニリドをはじめとする種々の有用なアセトアニリド類の生産に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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