(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質と特異的に結合するプローブと粒子を有してなり、該粒子の表面に該プローブが結合しており、かつ該粒子に該プローブに対応する標識が付されている少なくとも３１種のプローブ結合粒子からなり、前記プローブがこれらのプローブ結合粒子間で異なるプローブ結合粒子のセットであって、
少なくとも５種の原子のそれぞれの有無により識別される少なくとも３１種の標識子を、前記プローブ結合粒子ごとに振り分けて前記粒子に標識を付することにより、前記少なくとも３１種のプローブ結合粒子を互いに識別可能とした
ことを特徴とするプローブ結合粒子のセット。
【請求項２】
前記標識子のそれぞれが、前記少なくとも５種の原子のそれぞれの有無を０または１で表す二進法で表記したときに得られるｎ桁（ｎ≧５の整数）の数値情報からなる請求項１に記載されるプローブ結合粒子のセット。
【請求項３】
前記標識子のそれぞれが、前記少なくとも５種の原子のそれぞれの有無を０または１で表す二進法で表記したときに得られるｎ桁（ｎ≧８、１２または１６の整数）の数値情報からなる請求項１に記載されるプローブ結合粒子のセット。
【請求項４】
前記粒子が、磁性粒子である請求項１〜３のいずれか一項に記載のプローブ結合粒子のセット。
【請求項５】
前記粒子のサイズを１ｎｍ〜１０μｍの範囲に選択する請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブ結合粒子のセット。
【請求項６】
前記プローブが、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチド、ポリデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オリゴペプチド核酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗原、抗体、酵素、リガンド、リガンドレセプター、糖、糖鎖、あるいは互いに相手を認識して結合することが可能な一対の物質の一方である請求項１〜５のいずれか一項に記載のプローブ結合粒子のセット。
【請求項７】
前記標識子を構成する原子が、前記粒子を形成する材料中に含まれている請求項１〜６のいずれかに記載のプローブ結合粒子のセット。
【請求項８】
前記少なくとも５種の原子が、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ及びＴｉである請求項１〜７のいずれか一項に記載のプローブ結合粒子のセット。
【請求項９】
前記プローブが核酸鎖からなる請求項１〜８のいずれか一項に記載のプローブ結合粒子のセット。
【請求項１０】
前記プローブとしての核酸鎖が、前記粒子の表面に結合させたプライマーを起点として、該プローブの塩基配列に従って対応するモノマーを逐次的に供給し、該核酸鎖を固相合成法により合成することにより得られたものである請求項９に記載のプローブ結合粒子のセット。
【請求項１１】
前記プローブとしての核酸鎖が、前記粒子の表面に予め合成した該核酸鎖を結合することにより得られたものである請求項９に記載のプローブ結合粒子のセット。
【請求項１２】
前記標識子が、質量分析法、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）またはオージェ電子分光法（ＡＥＳ）を用いて識別可能である請求項１〜１１のいずれか一項に記載のプローブ結合粒子のセット。
【請求項１３】
前記質量分析法が、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）である請求項１２に記載のプローブ結合粒子のセット。
【請求項１４】
プローブ結合粒子のセットを利用した標的核酸の検出または定量方法であって、
（１）請求項９〜１１のいずれか一項に記載のプローブ結合粒子のセットの各プローブ結合粒子と標的核酸とを反応させる工程と、
（２）前記標的核酸と反応させた各プローブ結合粒子でのハイブリッド体の形成の有無または量を検出する工程と、
（３）前記ハイブリッド体の形成が検出されたプローブ結合粒子の有するプローブを、該プローブ結合粒子の粒子に付した標識子を検出することにより特定する工程と、
を
を有することを特徴とする標的核酸の検出または定量方法。
【請求項１５】
前記ハイブリッド体の形成の有無または量の検出を、該ハイブリッド体を形成している標的核酸に含まれ、かつ、該プローブ結合粒子に含まれない標的核酸特定用の原子の存在または量を検出することにより行う請求項１４に記載の標的核酸の検出または定量方法。
【請求項１６】
前記標的核酸特定用の原子がハロゲン原子または金属原子である請求項１５に記載の標的核酸の検出または定量方法。
【請求項１７】
前記ハイブリッド体の形成の有無または量の検出を、質量分析法、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）またはオージェ電子分光法（ＡＥＳ）を用いる請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の標的核酸の検出または定量方法。
【請求項１８】
前記質量分析法は、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）である請求項１７に記載の標的核酸の検出または定量方法。
【請求項１９】
前記標識子の検出を、質量分析法、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）またはオージェ電子分光法（ＡＥＳ）を用いる請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の標的核酸の検出または定量方法。
【請求項２０】
前記質量分析法は、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）である請求項１９に記載の標的核酸の検出または定量方法。
【請求項２１】
前記プローブ結合粒子のセットの各プローブ結合粒子を同じ平面上の異なる領域に配置し、前記ハイブリッド体及び前記標識子の検出結果を二次元イメージングする請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の標的核酸の検出または定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数種のプローブをそれぞれ個別に結合した複数の物体について、該物体個々の種類、すなわち、これらのプローブのそれぞれの種類を判別するために、識別用の標識を付されたプローブ結合物体及びその製造方法に関する。本発明は、更に該物体の有するプローブの判別方法、該物体に結合したプローブの検出、特定、定量方法、ならびに、該プローブに結合した標的物質の検出、特定、定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
複数種の物体を取り扱う際には、多くの場合、該物体個々の種類を正確に判別することが必要とされる。特に、取り扱われる複数種の物体自体が、見掛けの上では、容易に区別できない場合には、物体個々の種類に対応する、識別用の標識を付して、該物体個々の種類の判別に利用している。
【０００３】
識別用の標識には、種々の手法があるが、本質的には、区別すべき種類の数以上の判別可能な符号化された識別子（コード）を個々の種類に割り振るものである。標識を付される対象の物体サイズが大きな場合、利用される判別可能な符号化された識別子（コード）として、多くの場合、文字列型の識別子が利用されている。例えば、バー・コードは、文字列型の識別子に対応させ、所定の規則に従って、バーの線幅、間隔の情報へと変換したものに相当する。なお、文字列型の識別子には、本来、一連のシリアル番号で表記可能な識別子の割り振りをより簡便にするため、例えば、電話番号における、国コード（国番号）、エリア・コード（市外局番）、エリア内の個別番号（エリア内局番＋個別回線番号）のような、階層的な標識部複数を組み合わせ、一体化して、一つの文字列型の識別子とする形態を採用するものが多い。
【０００４】
一方、標識を付される対象の物体サイズが小さな場合、上述するような、視覚的に判別可能な文字列型の識別子を付すことは技術的に困難となる。例えば、ＩＣタグでは、文字列型の識別子として、ＩＣチップ上に電子的に記載される情報を、外部の検出器との間でデジタル化された電磁波を介して識別する方法を採用している。なお、このＩＣタグ自体のサイズは、１００μｍのオーダーであり、十数μｍ以下、場合によっては、数μｍ以下の物体サイズに対して、文字列型の識別子を付すことは技術的により困難な課題となる。
【０００５】
例えば、物体サイズが十数μｍ以下、場合によっては、数μｍ以下となるものの一例としては、生体関連物質の検出に利用される、ミクロな粒子の表面にプローブ分子を固定化したものがある。
【０００６】
例えば、各種微生物の分類に際して、類縁種の微生物に特異的な抗体分子の、対象微生物表面の坑原に対する交叉反応性を評価することで、分類学上の近縁関係を調査する手法が古くから利用されている。その際、プローブとして利用する抗体分子を金微粒子表面に固定化し、微生物の周囲への金微粒子の集積を観察し、交叉反応の有無を判断している。また、各種抗体分子が識別するエピトープ配列の特定法として、大腸菌によってデスプレイされているランダムペプチド・ライブラリーから、例えば、ミクロなフェライト粒子の表面に固定化された抗体分子と抗原・抗体反応するペプチドを表現する大腸菌株を、パニング法を応用して分離する手法も、広く知られている。この方法では、磁気的にミクロなフェライト粒子を回収する際、抗体分子と反応可能なアミノ酸配列を有するペプチドを表現する大腸菌株のみが、フェライト粒子に連結された形態で分離される。
【０００７】
これら生体関連物質の検出に利用される、プローブ分子を固定化するミクロな粒子が有する主要な利点は、固形物であるミクロな粒子を液相から分離する手段を利用することで、プローブ分子によって結合された検出対象物質と、液相中に存在しているそれ以外の夾雑物との分離は容易に行えることにある。すなわち、液相中に存在している検出対象物質をプローブ分子と結合させた後、検出対象物質とプローブ分子の結合体と、未反応のプローブ分子とは、一旦、該プローブ分子を固定化するミクロな粒子を利用することで液相から分離・回収される。その後、回収された検出対象物質とプローブ分子の結合体と未反応のプローブ分子の混合物中に、実際に、検出対象物質とプローブ分子の結合体が存在するか、さらには、その存在量の定量が進められる。
【０００８】
プローブ分子を固相表面に固定化することで、液相との分離が簡便となるという利点は、マクロなサイズを有する固相基板表面にプローブ分子を固定化することでも達成される。例えば、検体試料中に存在する特定のＩｇＧ抗体の有無を検出する際、検出対象のＩｇ抗体に対するエピトープ配列を有する抗原ペプチドを固相基板表面に所定の密度で固定化し、かかる固相基板表面に検体試料を接触させ、この抗原ペプチドとの反応を介して、検出対象のＩｇＧ抗体を固相基板表面に固着させる。その後、固相基板表面に検体試料を除去した後、固相基板表面に固着されているＩｇＧ抗体分子に対して、そのＦｃ領域（定常領域）へ、検出用標識を付した坑ＩｇＧ抗体を定量的に反応させる。未反応の「標識を付した坑ＩｇＧ抗体」を、固相基板表面から洗浄除去した後、固相基板表面に固着されているＩｇＧ抗体分子と定量的に反応している、標識を付した坑ＩｇＧ抗体を、その検出用標識を利用して検出し、また、定量する。
【０００９】
マクロなサイズの固相基板表面にプローブ分子を固定化する手法では、固相基板自体が大きいため、同一基板面上を複数の領域に区分した上で、各領域に別種のプローブ分子を固定化することもできる。具体的には、複数の領域に区分する際、個々の区分をアレイ状、あるいは、マトリックス状に配置した上、各区分を特定するアドレスを付し（番地付けし）、個々の区分に別種のプローブ分子を固定化した、プローブ・アレイの形態とすることができる。例えば、核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応によって、核酸プローブの塩基配列と相補的な塩基配列部分を含む標的核酸分子の固定化に利用される、ＤＮＡ核酸プローブを複数種固定するＤＮＡプローブ・アレイ；抗原・抗体反応によって、抗原ペプチドに対して特異性を有する標的抗体分子の固定化に利用される、既知のアミノ酸配列を有する抗原ペプチドを複数種固定するペプチド抗原・アレイ；逆に、抗原・抗体反応によって、特異的抗体を用いた標的抗原分子の固定化に利用される、既知の特異的抗体分子を複数種固定する抗体アレイ；受容体タンパク質上への基質分子の結合によって、該受容体タンパク質に対する標的基質分子の固定化に利用される、既知の受容体分子を複数種固定する受容体タンパク質アレイなどの形態がある。
【００１０】
プローブ・アレイは、検体試料中に含まれる標的分子複数種を、対応するプローブ分子複数種を利用して、同時に固定化する際に利用される。利用している固相基板自体、マクロなサイズを有するので、液相からの分離、その後の洗浄操作は極めて簡単である。また、プローブ・アレイ上の各プローブ分子と結合体として、基板上に固定される標的物質を検出する際、予め各プローブ分子の固定位置（アドレス）は決められており、アドレスに従って、各標的物質の検出を進める。
【００１１】
マクロなサイズの固相基板表面にプローブ分子を固定化する、プローブ・アレイは、液相からの分離や標的物質の検出を行う際、取り扱いが容易であるという利点があり、様々な分野で利用が進んでいる。但し、マクロなサイズの固相基板表面において、特定領域に固定されているプローブ分子と検体試料中に含まれる標的分子との反応を行わせることに起因して、相対的に反応収率が低い（見掛けの反応速度が遅い）という本質的な欠点を有している。具体的には、プローブ分子は、固相基板表面上の限られた領域に固定化されているが、検体試料中に含まれる標的分子は、液相全体に均一に分布しているため、このプローブ分子と反応可能な標的分子は、限られた領域内で、且つ固相基板表面に近接する範囲に存在するものに限定される。この限られた領域内に存在する標的分子が、固定化されているプローブ分子と結合体を形成すると、この領域内において、液相中に存在する、「自由な標的分子」の濃度は急速に低減する結果、相対的に反応速度の低下が低下する。結果的には、固定化されているプローブ分子の総数当たり、プローブ分子と結合体を形成する標的分子の総数（反応収率）は、限定されたものとなる。この相対的に反応収率が低い（見掛けの反応速度が遅い）という欠点は、固相基板表面上に占める、各プローブ分子の固定領域の占有面積比率が小さくなるとともに、より顕著なものとなる。換言すると、プローブ・アレイを構成するプローブ分子の種類数が増すとともに、この欠点はより顕著なものとなる。
【００１２】
理想的には、反応液を速やかに攪拌して、液相中の濃度分布の均一化を図ることで、この欠点は解消されるが、現実的には、マクロなサイズの固相基板表面を利用する際には、反応液を緩やかに攪拌する、あるいは、ほぼ静置する状況で反応がなされる場合が少なくない。相対的に反応収率が低い（見掛けの反応速度が遅い）場合であっても、固定化されているプローブ分子の総数当たり、プローブ分子と結合体を形成する標的分子の総数（反応収率）は、検体溶液中における、当初の標的分子の濃度を反映したものとなる。但し、各プローブ分子の固定領域の占有面積比率が小さくなるとともに、プローブ分子と結合体を形成する標的分子の総数（反応収率）と、検体溶液中における、当初の標的分子の濃度との間における関係は、高い直線性を示さなくなる。すなわち、マクロなサイズの固相基板表面上に、多種のプローブ分子を高密度のマトリクス状に固定する、高密度プローブ・アレイを利用する場合、各プローブ分子との結合体として固定される標的分子の定量によって、検体溶液中における標的分子濃度の定量を図る際、その定量確度の低下要因の一つとなる。
【００１３】
その他、プローブ・アレイを構成する際、各プローブ分子の固定化領域の周囲に、区画分割用の格子状の枠領域を設けることがある。あるいは、前記格子状の枠領域を設けない場合でも、プローブ分子の固定化領域の周囲にプローブ分子の非固定化領域が存在する場合がある。この格子状の枠領域、もしくは、プローブ分子の非固定化領域には、固相基板表面が露呈しているため、種々の標的分子が非選択的に吸着を起こすことも少なくない。この非選択的に吸着した標的分子は、検出の際、バックグランドの信号レベルを引き上げ、プローブ分子の固定領域において検出される信号レベルと、バックグランドの信号レベルとの差違を、プローブ分子と結合体を形成する標的分子に起因する信号と判定する際、システマティックな誤差要因となる。加えて、相対的に反応収率が低い（見掛けの反応速度が遅い）ため、検体溶液中における標的分子濃度が低い範囲に対して、その定量確度の低下要因の一つとなる。
【００１４】
プローブ・アレイを作製する際、予め別途調製したプローブ分子を、所定の固定化領域に塗布、固定化するスポッティング法が広く利用されている。このスポッティング法は、予め別途調製したプローブ分子を含む液中に、ミクロな粒子を投入し、その表面にプローブ分子を固定する場合と同様に、単位表面積当たりに固定化されるプローブ分子の密度は高い再現性を有するものとなる。一方、固相反応によって、合成可能なＤＮＡプローブ（オリゴヌクレオチド）分子をアレイ状に固定化する際には、フォトリソグラフィー法を利用して、マクロなサイズの固相基板表面上に、各ＤＮＡプローブ（オリゴヌクレオチド）の塩基配列に従って、逐次的に合成されるオリゴヌクレオチドを、固定化プローブ分子として利用する方法もある。この直接、固相基板表面上で合成されるオリゴヌクレオチドに関しては、合成後、その塩基配列の確認を行うことは困難であり、部分的に塩基が欠損したオリゴヌクレオチドが混入する場合がある。あるいは、原理的に1ヌクレオチドずつ短い全ての（オリゴ）ヌクレオチドが、ある割合で全て共存する。このような目的の塩基配列と異なるＤＮＡ分子が混入すると、プローブ・ハイブリダイゼーション反応における反応収率を相対的に低下させる要因となる。場合によっては、目的の塩基配列と異なるＤＮＡ分子が、偶々、他のアドレス上に固定化するＤＮＡプローブ分子と塩基配列が共通するものとなると、本来の標的核酸分子と相違する、別種の核酸分子がかかるアドレス上にも、結合されることになる。従って、上述する所望としないオリゴヌクレオチドの混入は、定量確度の低下要因の一つとなる。
【００１５】
一方、プローブ分子をミクロな粒子の表面に固定化した、プローブ分子固定微粒子は、予め別途調製したプローブ分子を含む液中に、ミクロな粒子を投入し、その表面にプローブ分子を固定する方法で調製されるため、ミクロな粒子の表面へ、種々の標的分子が非選択的に吸着を起こす現象は、実質的に抑制されている。また、固定化されるプローブ分子は、別途調製した後、十分に精製を施したものが利用される。また、後述するように、ミクロな粒子表面での固相逐次合成は、上述のフォトリソグラフィー法の欠点を回避できるので、こちらの手法も好適に用いることが可能である。
【００１６】
プローブ分子固定微粒子は、通常、液相中に均一に分散した状態を維持でき、液相全体に均一に分布している標的分子と、ミクロ的には、固相／液相間での反応はあるが、マクロ的には、液相全体において均一な反応を行うことが可能である。従って、マクロなサイズの固相基板表面上に、多種のプローブ分子を高密度のマトリクス状に固定する、高密度プローブ・アレイを利用する場合に顕著である、相対的に反応収率が低い（見掛けの反応速度が遅い）という欠点は、このプローブ分子固定微粒子を利用する場合には、実質的に解消されたものとなる。従って、プローブ分子固定微粒子を利用すると、プローブ分子との結合体として固定される標的分子の定量によって、検体溶液中における標的分子濃度の定量を図る際、プローブ・アレイにおいて列挙した定量確度の低下要因の大半は回避可能である。
【００１７】
また、プローブ分子固定微粒子は、通常、液相中に均一に分散した状態で反応を終えた後、液相中から簡便に分離することが可能という利点は保持している。例えば、濾過や遠心分離法を適用する固液分離法が利用でき、また、粒子自体が、磁性材料を主成分とする場合、磁力を利用して、液相中から分離することが可能である。
【００１８】
勿論、プローブ分子固定微粒子は、各ミクロな粒子の表面に一つの種類のプローブ分子を固定化するため、多数種のプローブ分子を利用する場合には、対応するプローブ分子固定微粒子を多数種予め準備する必要がある。これらプローブ分子固定微粒子多数種は、個々のプローブ分子固定微粒子を構成するプローブ分子は異なっているが、外見上は、容易に区別することはできない。換言するならば、プローブ分子固定微粒子多数種について、用いているミクロな粒子相互を区別可能なものとし、個々のプローブ分子固定微粒子を特定することが必要となる。すなわち、用いているミクロな粒子に、相互識別用の標識を付すことが必要となる。
【００１９】
プローブ分子固定微粒子を構成する、ミクロな粒子に相互識別用の標識を付す手法に関して、幾つかの提案がなされている。例えば、特許文献１（特開昭６１−２２５６５６号公報）には、用いるミクロな粒子の粒径の差違によって識別する手法；特許文献２（特開昭６２−８１５６６号公報）には、ミクロな粒子の粒径の差違と蛍光標識（合計ｎ種）とを組み合わせて、区別を図る手法；特許文献３（特開昭６２−１９５５５６号公報）には、ミクロな粒子に着色を施すことによって、区別を図る手法；特許文献４（特開平１−９５８００号公報）には、ミクロな粒子を異なる金属元素で形成して、区別を図る手法；特許文献５（特開平２−２９９６９８号公報）では、染色によって、区別を図る手法；特許文献６（特開平７−８３９２７号公報）には、ミクロな粒子を無機蛍光体とし、その蛍光波長によって、区別を図る手法；また、特許文献７（米国特許第６６０２６７１号明細書）には、ミクロな粒子に半導体ナノ結晶を利用して、区別を図る手法；特許文献８（米国特許第６４４０６６７号明細書）には、磁気、色、形状が相違するミクロな粒子を利用して、区別を図る手法；特許文献９（米国特許第６５００６２２号明細書）には、ミクロな粒子に半導体ナノ蛍光粒子を利用して、区別を図る手法が開示されている。これらは、粒子に個別に番地（標識）を与えるための技術に関するものである。
【００２０】
これらの従来技術では、区別可能なミクロな粒子の種類、すなわち、標識の種類は、高々、十数種程度であり、標識の種類を更に増す際、拡張性に乏しい手法である。特に、ミクロな粒子の粒子径、形状、ならびに、主要な構成材料は、共通性を維持した上で、標識の種類を更に増す際、拡張性に乏しい手法である。
【特許文献１】特開昭６１−２２５６５６号公報
【特許文献２】特開昭６２−８１５６６号公報
【特許文献３】特開昭６２−１９５５５６号公報
【特許文献４】特開平１−９５８００号公報
【特許文献５】特開平２−２９９６９８号公報
【特許文献６】特開平７−８３９２７号公報
【特許文献７】米国特許第６６０２６７１号明細書
【特許文献８】米国特許第６４４０６６７号明細書
【特許文献９】米国特許第６５００６２２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
以上に説明するように、液相中に含まれる種々の生体関連物質、例えば、核酸分子、タンパク質、糖鎖分子などについて、その有無の判定、含有濃度を測定する際、検査対象物質（標的物質）に対して特異的に結合する物質（通常、プローブ分子と称される）を作用させて、一旦、結合体として、液相から分離する手法が広く利用されている。具体的には、固相表面にプローブ分子を固定化した上で、液相中に存在する標的物質と結合体を形成し、この固相と液相とを分離する手法が広く利用されている。液相から分離した後、プローブ分子と結合体を構成している標的物質の有無、ならびに、その量を適合する検出手段を用いて行う。
【００２２】
その際、表面積の大きな固相基板上に、複数種のプローブ分子を規則的に固定化する、プローブ・アレイと比較し、各プローブ分子を微細な粒子表面に個別に固定化したプローブ分子固定微粒子は、液相における標的物質との反応性、またその定量性に関しては、有意に優れている。但し、プローブ・アレイでは、各プローブ分子種類の特定は、その固定化位置（アドレス）に基づき、簡単に行うことができるが、プローブ分子固定微粒子では、固定化に利用する微粒子に予め標識を付し、この標識を識別して、プローブ分子種類の特定を行うことが必要となる。
【００２３】
微粒子に標識を施す手段は、上述したように、従来からいくつか提案されているが、対応可能な種類は限られており、利用するプローブ分子種類が多い場合には、それら全てに個別の標識を付す目的を充足可能なものではなかった。特には、プローブ分子の固定化に利用する微粒子のように、サイズ、形状、ならびに、主要な構成材料は、共通性を維持した上で、標識の種類を必要に応じて増すことが可能な、拡張性に富んだ標識方法の開発が待望されている。
【００２４】
本発明は前記の課題を解決するものであり、本発明の目的は、標識を付す対象の物体が、微小サイズであり、形状、ならびに、主要構成材料は共通とした上で、利用可能な標識種類を必要に応じて増すことを可能とする、拡張性に富んだ標識方法、該標識方法によって標識されたプローブ結合物体、該プローブ結合物体、及び該プローブ結合物体に結合したプローブの判別方法、該プローブの検出、特定、定量方法、ならびに、該プローブに結合した標的物質の検出、特定、定量方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明者は、上記の課題を解決すべく、鋭意研究を進めた結果、先ず、以下のことに想到した。例えば、プローブ分子を固定化する際に利用される、ミクロな粒子のサイズは、液相中に均一に分散させるため、粒子径は数μｍ以下、場合によっては、サブミクロンの領域に選択される。その際、ミクロな粒子の表面に固定化されるプローブ分子の量の均一化を図る上では、用いる微粒子の粒子径を一定化し、個々の微粒子が有する表面積の一定化を行う必要がある。勿論、微粒子の外形形状も、例えば、球状に統一することも必要である。さらに、この微粒子表面に、別途調製したプローブ分子を固定化する場合、微粒子表面の材質が全く異なると、それに合わせて、異なる固定化手段を利用する必要がある。具体的には、金属微粒子であっても、それを構成する金属元素が全くことなると、異なる固定化手段を利用する必要がある。逆に、表面に対して、プローブ分子を固定化する手段が異なると、単位面積当たりに固定化されるプローブ分子の密度を同様にすることは困難となる。
【００２６】
従って、ミクロな粒子の粒子径、形状、ならびに、主要な構成材料は、共通性を維持し
た上で、標識の種類を必要に応じて増すことが可能な、拡張性に富んだ標識方法が望まし
い。この粒子径、形状、ならびに、主要な構成材料は、共通性を維持するという要件をも
満足し、且つ、付されている標識の識別に曖昧さが無く、必要に応じて、付与可能な標識
の種類を任意に増減可能な、高い拡張性を有する標識方法の開発を進めた。その結果、例
えば、ミクロな粒子を作製する際に利用する材料として、主要な構成成分に加えて、少量
配合可能な成分として、任意に添加可能な副次的構成成分を有することが可能な材料を選
択し、この任意に添加可能な副次的構成成分の組成を利用して、情報を付加することが可
能であることを見出した。具体的には、かかる任意に添加可能な副次的構成成分の組成と
して、予め複数種の原子を選択し、この種類数（ｎ）の原子に関して、それぞれ含有の有
無を選択すると、各原子について、二水準の状態となり、予め選択される複数種の原子の
種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無とを利用して、二進法ｎ桁の数
値情報に相当する、含有原子の組成条件を設定できることに想到した。更に、この手法を
一般化すると、予め複数種の原子を選択し、この種類数（ｎ）の原子に関して、それぞれ
含有量の水準を複数、例えば、Ｍ個の水準を設定すると、各原子について、Ｍ個の水準の
状態となり、予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の
含有量の水準とを利用して、Ｍ進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を設
定することも可能であることに想到した。これらの着想に加えて、本発明者は、予め選択
される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無、あるい
は、含有量の水準の差違は、例えば、粒子径は数μｍ以下の微粒子であっても、各種の分
析手段を適用すると、予め選択される複数種の原子に関して、その含有量の水準を特定可
能であり、かかる副次的成分の組成として付されている標識情報の判別が十分可能である
点をも確認して、本発明を完成するに至った。
【００２７】
加えて、本発明においては、該標識は、予め選択される複数種の原子から選択された少なくとも２種類の原子を含んでおり、その標識の読み取り手段として、原子の種類、ならびにその存在量の測定に適する手段である、質量分析法、Ｘ線光電子分光法、またはオージェ電子分光法のうちの少なくともいずれかの方法を利用している。
【００２８】
すなわち、本発明にかかるプローブ結合物体は、
プローブを結合した物体であって、
該物体の表面に前記プローブが結合されており、
該物体には標識が付されており、
該標識は、
予め選択される複数種の原子から選択された少なくとも２種類の原子を含み、
前記標識は質量分析法、Ｘ線光電子分光法、またはオージェ電子分光法のうちの少なくともいずれかの方法により識別される
ことを特徴とするプローブ結合物体である。
【００２９】
その際、予め選択される複数種の原子は、プローブを構成する原子ではなく、該プローブが結合される物体、またはその表面を構成する際に利用される種々の原子から選択することが好ましい。すなわち、物体、またはその表面を構成する際に利用可能な種々の原子の群から、プローブを構成する原子の群を除いた、残りの原子群から、質量分析法、Ｘ線光電子分光法、またはオージェ電子分光法のいずれかで検出可能なものが、この予め選択される複数種の原子として、好適に利用可能である。なお、該標識は、「選択された少なくとも２種類の原子」の何れかが検出されない、すなわち、その含有量が零であるという「検出結果」によって、識別されるものであってもよい。換言するならば、本発明においては、「選択された少なくとも２種類の原子を含む」とは、「その原子の含有量に着目することで、標識の識別を行うことが可能な状態である」ということを意味している。
【００３０】
本発明のプローブ結合物体の一態様は、
プローブを結合した物体であって、
該物体の表面に前記プローブが結合されており、
該物体には標識が付されており、
該標識は、標識対象の物体複数、すなわち該物体に結合されているプローブ複数に対して、該物体個々、すなわち該プローブ個々の判別を可能とする離散的な識別情報を付すものであり、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無とを利用して、二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を構成した上で、
前記含有原子の組成条件を満足する組成を有する標識子を用いて、
前記二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報が付されている
ことを特徴とするプローブ結合物体である。
【００３１】
本発明のプローブ結合物体の他の態様は、
プローブを結合した物体であって、
該物体の表面に前記プローブが結合されており、
該物体には標識が付されており、
該標識は、標識対象の物体複数、すなわち該物体に結合されているプローブ複数に対して、該物体個々、すなわち該プローブ個々の判別を可能とする離散的な識別情報を付すものであり、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量水準とを利用して、少なくとも二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を構成した上で、
前記含有原子の組成条件を満足する組成を有する標識子を用いて、
前記少なくとも二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報が付されている
ことを特徴とするプローブ結合物体。
【００３２】
本発明のプローブ結合物体の作成方法の一態様は、
上記各態様のいずれかにかかるプローブ結合物体を作製する方法であって、
前記標識が付された物体表面へのプローブの結合は、
該プローブの結合がなされる物体表面に、当該プローブの塩基配列に従って、対応するモノマーを逐次的に供給し、核酸鎖を固相合成法により合成することにより行う
ことを特徴とするプローブ結合物体の作製方法である。
【００３３】
本発明のプローブ結合物体の作成方法の他の態様は、
上記各態様のいずれかにかかるプローブ結合物体を作製する方法であって、
前記標識が付された物体表面への該プローブの結合は、
当該プローブの塩基配列に従って、予め合成し、精製を行った核酸鎖を、前記物体表面に付与することにより行う
ことを特徴とするプローブ結合物体の作製方法である。
【００３４】
本発明のプローブ結合物体の有するプローブの種類を判別する方法は、
上記各態様のいずれかにかかる標識を付されているプローブ結合物体の種類、すなわち、該物体に結合されているプローブの種類を判別する方法であって、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無、または含有量の水準とを利用して、少なくとも二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を構成した上で、
前記含有原子の組成条件を満足する組成を有する標識子を用いて当該物体個々に付されている標識を、
前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段を用いて、該標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別し、
該標識子の組成において満足される、前記含有原子の組成条件を判別し、対応する少なくとも二進法ｎ桁の数値情報を抽出して、
前記少なくとも二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報に基づき、個々のプローブ結合物体の種類を識別する
ことを特徴とするプローブ結合物体の判別方法である。
【００３５】
本発明のプローブ結合物体の有するプローブの定量方法は、
上記各態様のいずれかにかかるプローブ結合物体に結合されているプローブの特定、検出または定量方法であって、
該物体の種類、すなわち、該物体に結合されているプローブの種類を、
前記標識子を用いて付されている、該物体の標識を、前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段を用いて、該標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別し、
該標識子の組成において満足される、前記含有原子の組成条件を判別し、対応する少なくとも二進法ｎ桁の数値情報を抽出して、
前記少なくとも二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報に基づき識別することにより判別し、
前記種類の判別がなされた、該物体に結合されているプローブを、該プローブには含まれ、該物体には含まれない原子、分子、あるいは物質を、該プローブ由来の指標として用いて、検出または定量する
ことを特徴とする物体に結合したプローブの特定、検出または定量方法である。
【００３６】
本発明の標的核酸の検出、特定、または定量方法は、プローブ結合物体を利用した標的核酸の検出、特定、または定量方法であって、
少なくとも以下の工程（１）及び（２）：
（１）上記各態様のいずれかのプローブ結合物体と、標的物質とを反応させてハイブリッド体を得る工程と、
（２）予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無、または含有量の水準とを利用して、少なくとも二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を構成した上で、
前記含有原子の組成条件を満足する組成を有する標識子を用いて前記ハイブリッド体が形成されている結合物体に付されている標識を、前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段を用いて、該標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別し、
該標識子の組成において満足される、前記含有原子の組成条件を判別し、対応する少なくとも二進法ｎ桁の数値情報を抽出して、
必要に応じて先に記載して方法によって前記ハイブリッド体が形成されている結合物体に結合したプローブを検出、特定、定量し、
同時に、または次いで、前記ハイブリッド体を形成している標的物質を、該標的物質に含まれ、かつ、該プローブ結合物体、及び該プローブに含まれない原子、分子、あるいは物質を指標に検出、特定、定量する工程；
を有することを特徴とする標的物質の検出、特定、定量方法である。
【発明の効果】
【００３７】
本発明にかかる物体の標識方法を利用することで、例えば、生体関連物質の検出に用いるプローブ分子の固定化に利用される微細な粒子状の基体等、微小な物体に対しても、それを構成する材料の一部として、予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無、あるいは、含有量の水準とを利用して、少なくとも二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件に従って調製される標識用材料を用いることで、必要に応じて多数種の標識を付すが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
先に概要を説明したように、本発明において利用されている物体の標識方法では、例えば、ミクロな粒子を作製する際に利用する材料として、主要な構成成分に加えて、少量配合可能な成分として、任意に添加可能な副次的構成成分を有することが可能な材料を選択し、この任意に添加可能な副次的構成成分の組成を利用して、標識情報を付加するものである。具体的には、かかる任意に添加可能な副次的構成成分の組成として、予め複数種の原子を選択し、この種類数（ｎ）の原子に関して、それぞれ含有の有無を選択すると、各原子について、二水準の状態となる。そして、予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無とを利用して、二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を設定でき、この設定される含有原子の組成によって、標識情報を付与する方法である。更に、この手法を一般化すると、予め複数種の原子を選択し、この種類数（ｎ）の原子に関して、それぞれ含有量の水準を複数、例えば、Ｍ個の水準を設定すると、各原子について、Ｍ個の水準の状態となる。これを利用して、予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の水準とを利用して、Ｍ進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を設定することで、標識の種類を必要に応じて増すことが可能な、拡張性を有する方法としている。
【００３９】
すなわち、本発明において利用されている物体の標識方法では、まず、物体を作製する際に、任意に添加可能な副次的構成成分として、予め複数種の原子を選択し、この種類数（ｎ）の原子に関して、選択されている原子個々の含有量（Ｃi；ｉ＝１，・・，ｎ）を用いて、これらｎ種の原子の各含有量（Ｃi）を要素とするベクトル型の情報｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝を設定する。このベクトル型の情報｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝は、対応するｎ次元空間（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）上において、それぞれ離散的に存在する点に相当している。一方、物体は、主要な構成成分と、前記任意に添加可能な副次的構成成分とで構成されており、該主要な構成成分の含有量をＣ0と表現すると、その全体組成は、ベクトル型の情報｛Ｃ0，Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝として表記できる。換言すると、全体組成：｛Ｃ0，Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝を達成するための含有原子の組成条件：ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）は、任意に添加可能な副次的構成成分の組成｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝によって決定されている。物体の組成として、総数ＮTOTAL通りを選択すると、その全体組成：｛Ｃ0，Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝を達成するための含有原子の組成条件：ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）は、総数ＮTOTAL通りとなる。
【００４０】
この総数ＮTOTAL通りの全体組成を示すベクトル型の情報：｛Ｃ0，Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝は、対応する（ｎ＋１）次元空間（Ｃ0，Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）上において、点（Ｃ0，０，・・，０，・・，０）の近傍に存在する、総数ＮTOTALの離散的な点の集合に相当する。含有原子の組成条件：ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）は、全体組成を示すベクトル型の情報：｛Ｃ0，Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝と、任意に添加可能な副次的構成成分の含有量を示すベクトル型の情報｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝とを、それぞれ対応付ける函数（演算子）に相当する。すなわち、ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）⇒｛Ｃ0，Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝と表現できる対応付けを行うことができる。本発明では、任意に添加可能な副次的構成成分の含有量｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝について、総数ＮTOTAL通りの組成条件を予め設定する際、適当な検出手段を選択することで、各組成相互の弁別が可能となるように、利用する検出手段の検出精度を考慮した上で、任意に添加可能な副次的構成成分の含有量｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝を「離散的に」選択している。
【００４１】
各組成相互の弁別が可能な、総数ＮTOTAL通りの全体組成を示す物品に対して、各物品の種類の違い（組成の違い）を示す符号（種番号）として、総数ＮTOTAL通りの離散的な数値情報：ｆ（Ｎ）の集合｛ｆ（Ｎ）｝を別途選定する。そして、「離散的に」選択されている、任意に添加可能な副次的構成成分の含有量｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝によって決定される、総数ＮTOTAL通りの含有原子の組成条件：ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）の集合｛ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）｝の各要素ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）に対して、総数ＮTOTAL通りの離散的な数値情報：ｆ（Ｎ）の集合｛ｆ（Ｎ）｝中の一つの要素ｆ（Ｎ）を、ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）⇔ｆ（Ｎ）で示されるような、「１対１の対応付け」を行っている。すなわち、各物品の種類の違い（組成の違い）を示す符号（種番号）に相当する、前記数値情報ｆ（Ｎ）として表記される、前記「離散的な識別情報」を、「離散的に」設定されている組成：｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝を利用する標識として付している。
【００４２】
本発明にかかる標識されたプローブ結合物体は、この物体の標識方法を利用する際、各組成相互の弁別が可能な、全体組成を示す物品の種類の総数ＮTOTALが、ＮTOTAL≧２n−１を満たすように、「標識」を構成する組成：｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝を「離散的に」設定する手法を新たに見出し、それを応用したものである。
【００４３】
その際、本発明においては、該標識は、予め選択される複数種の原子から選択された少なくとも２種類の原子を含んでおり、その標識の読み取り手段として、原子の種類、ならびにその存在量の測定に適する手段である、質量分析法、Ｘ線光電子分光法、またはオージェ電子分光法のうちの少なくともいずれかの方法を利用する。従って、本発明のプローブ結合物体は、
プローブを結合した物体であって、
該物体の表面に前記プローブが結合されており、
該物体には標識が付されており、
該標識は、
予め選択される複数種の原子から選択された少なくとも２種類の原子を含み、
前記標識は質量分析法、Ｘ線光電子分光法、またはオージェ電子分光法のうちの少なくともいずれかの方法により識別される
ことを特徴とするプローブ結合物体である。
【００４４】
上述する本発明にかかる標識されたプローブ結合物体は、例えば、
プローブを結合した物体であって、
該物体の表面に前記プローブが結合されており、
該物体には標識が付されており、
該標識は、標識対象の物体複数、すなわち該物体に結合されているプローブ複数に対して、該物体個々、すなわち該プローブ個々の判別を可能とする離散的な識別情報を付すものであり、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量（Ｃi；ｉ＝１，・・，ｎ）を利用して、総数ＮTOTAL通りの含有原子の組成条件：ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）の集合｛ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）｝を構成することが可能な組成条件の設定手順に従って、前記総数ＮTOTAL通りの含有原子の組成条件：ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）の集合｛ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）｝に対する部分集合に相当する、要素数ＮLABEL（但し、ＮLABELは、１≦ＮLABEL≦ＮTOTALを満たす整数）の含有原子の組成条件：ｇj（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）の集合｛ｇj（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）：ｊ＝１，・・・，ＮLABEL｝を構成し、
要素数ＮLABEL（但し、ＮLABELは、１≦ＮLABEL≦ＮTOTALを満たす整数）の数値情報：ｆj（Ｎ）の集合｛ｆj（Ｎ）：ｊ＝１，・・・，ＮLABEL｝を構成し、
前記要素数ＮLABELの数値情報：ｆj（Ｎ）の集合｛ｆj（Ｎ）：ｊ＝１，・・・，ＮLABEL｝の各要素ｆj（Ｎ）に対して、１対１に対応する、要素数ＮLABELの含有原子の組成条件：ｇj（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）の集合｛ｇj（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）：ｊ＝１，・・・，ＮLABEL｝の各要素ｇj（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）を選択した上で、
前記含有原子の組成条件：ｇj（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）を満足する組成：｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝を有する標識子を用いて、
該ｇj（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）と、１対１の対応付け（ｇj（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）⇔ｆj（Ｎ））がなされている、前記数値情報ｆj（Ｎ）として表記される、前記離散的な識別情報が付されており、
前記含有原子の組成条件：ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）の集合｛ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）｝の要素数の総和：ＮTOTALは、ＮTOTAL≧２n−１に選択されており、
前記数値情報：ｆj（Ｎ）の集合｛ｆj（Ｎ）：ｊ＝１，・・・，ＮLABEL｝の要素数ＮLABELならびに前記含有原子の組成条件：ｇj（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）の集合｛ｇj（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）：ｊ＝１，・・・，ＮLABEL｝の要素数ＮLABELは、ＮTOTAL≧ＮLABEL≧ｎ・（ｎ−１）＋１に選択されている
ことを特徴とするプローブ結合物体の形態とすることもできる。さらには、
プローブを結合した物体であって、
該物体の表面に前記プローブが結合されており、
該物体には標識が付されており、
該標識は、標識対象の物体複数、すなわち該物体に結合されているプローブ複数に対して、該物体個々、すなわち該プローブ個々の判別を可能とする離散的な識別情報を付すものであり、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量（Ｃi；ｉ＝１，・・，ｎ）を利用して、総数ＮTOTAL通りの数値情報：ｆ（Ｎ）の集合｛ｆ（Ｎ）｝の各要素ｆ（Ｎ）に対して、１対１に対応する、総数ＮTOTAL通りの含有原子の組成条件：ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）の集合｛ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）｝を構成した上で、
前記含有原子の組成条件：ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）を満足する組成：｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝を有する標識子を用いて、
該ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）と、１対１の対応付け（ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）⇔ｆ（Ｎ））がなされている、前記数値情報ｆ（Ｎ）として表記される、前記離散的な識別情報が付されており、
前記数値情報：ｆ（Ｎ）の集合｛ｆ（Ｎ）｝の要素数の総和：ＮTOTALは、ＮTOTAL≧２n−１に選択されている
ことを特徴とするプローブ結合物体とすることも可能である。
【００４５】
その際、数値情報：ｆ（Ｎ）として、組成：｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝に関して、原子個々の含有量（Ｃi；ｉ＝１，・・，ｎ）を、二つの水準、特に、「含有量の有無」という二つの水準の値に変換することで生成される「二進法ｎ桁の数値情報」に相当するものを利用する形態が、本発明の第一の形態である。また、数値情報：ｆ（Ｎ）として、原子個々の含有量（Ｃi；ｉ＝１，・・，ｎ）を、二つの水準以上、例えば、Ｍ個の水準に区分した値に変換することで生成される「Ｍ進法ｎ桁の数値情報」を利用する等、第一の形態の手法をより一般化し、拡張性を付与した形態が、本発明の第二の形態である。
【００４６】
本発明の第一の形態にかかる標識されたプローブ結合物体は
プローブを結合した物体であって、
該物体の表面に前記プローブが結合されており、
該物体には標識が付されており、
該標識は、標識対象の物体複数、すなわち該物体に結合されているプローブ複数に対して、該物体個々、すなわち該プローブ個々の判別を可能とする離散的な識別情報を付すものであり、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無とを利用して、二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を構成した上で、
前記含有原子の組成条件を満足する組成を有する標識子を用いて、
前記二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報が付されている
ことを特徴とするプローブ結合物体である。
【００４７】
また、前記第一の形態に対して、更なる拡張性を持たせている、本発明の第二の形態にかかる標識されたプローブ結合物体は、
プローブを結合した物体であって、
該物体の表面に前記プローブが結合されており、
該物体には標識が付されており、
該標識は、標識対象の物体複数、すなわち該物体に結合されているプローブ複数に対して、該物体個々、すなわち該プローブ個々の判別を可能とする離散的な識別情報を付すものであり、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量水準とを利用して、少なくとも二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を構成した上で、
前記含有原子の組成条件を満足する組成を有する標識子を用いて、
前記少なくとも二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報が付されている
ことを特徴とするプローブ結合物体である。
【００４８】
更に、それらの好ましい形態として、以下に示す各形態を挙げることができる。
【００４９】
例えば、上述する本発明の第一の形態、ならびに、第二の形態にかかる物体では、
前記標識において、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）を５以上とし、
該原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量とで表示される、数値情報の種類Ｎ；Ｎ≧ΣｎＣｍ＝２n−１（１≦ｍ≦ｎ、ｍ、ｎは正の整数）を、３１以上とすることが可能である。
【００５０】
また、前記標識において、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）を８以上とし、
該原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量とで表示される、数値情報の種類Ｎ；Ｎ≧ΣｎＣｍ＝２n−１（１≦ｍ≦ｎ、ｍ、ｎは正の整数）を、２５５以上とすることも可能である。
【００５１】
さらに、高い拡張性を示す態様として、
前記標識において、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）を１２以上とし、
該原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量とで表示される、数値情報の種類Ｎ；Ｎ≧ΣｎＣｍ＝２n−１（１≦ｍ≦ｎ、ｍ、ｎは正の整数）を、４０９５以上とすることも可能である。あるいは、前記標識において、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）を１６以上とし、
該原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量とで表示される、数値情報の種類Ｎ；Ｎ≧ΣｎＣｍ＝２n−１（１≦ｍ≦ｎ、ｍ、ｎは正の整数）を、６５５３５以上とすることも可能である。
【００５２】
以上に示す、本発明の第一の形態、ならびに、第二の形態にかかる標識化されたプローブ結合物体では、物体の形状自体は、標識情報に利用されておらず、任意に選択することが可能である。従って、前記物体の形状は、不定形微粒子、定形微粒子、繊維、またはシートから選択することが可能である。
【００５３】
一方、本発明にかかる標識化されたプローブ結合物体では、標識に、予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無、あるいはその水準とを利用しており、例えば、複数種の原子を構成成分とする磁性体材料に対しても適用できる。従って、前記物体は、磁性体である態様を選択することが可能である。
【００５４】
また、物体の形状の他、物体の大きさも、標識情報に利用されておらず、従って、本発明にかかる標識された物体において、物体の大きさも、その用途に応じて、任意に選択することが可能である。例えば、前記物体の大きさとして、物体が微粒子形状である場合には、その粒径相当サイズを１ｎｍ〜１０μｍの範囲に、物体が繊維または片々の形状である場合には、その縦、横、高さのうち、少なくとも二つのサイズを１ｎｍ〜１０μｍの範囲に選択することも可能である。
【００５５】
本発明にかかるプローブ結合物体に結合したプローブに関しては、いわゆるプローブとしての機能、すなわち、互いに相手を認識して結合することが可能な一対の物質の一方としての機能を有する物質である。さらに、かかる機能を有し、かつ本発明にかかわる物体に結合可能な物質であればどのような物質でもかまわない。そのような物質の例としては、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチド、ポリデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オリゴペプチド核酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗原、抗体、酵素、リガンド、リガンドレセプター、糖、糖鎖を挙げることができる。
【００５６】
本発明にかかる、物体に対するプローブの結合方法は、プローブがプローブとして機能を発揮できる状態で物体に結合した状態を形成できればどのような方法でもかまわず、例えば、共有結合、イオン結合、物理吸着を用いることができる。
【００５７】
プローブが複数のモノマーから構成される、オリゴマー、あるいは、ポリマーの場合、本発明の基本構成はプローブが物体に結合している態様であるので、物体上に、いわゆる固相逐次合成によってプローブを合成結合する方法を採用することができる。固相逐次合成法は、すでに核酸合成、ペプチド核酸合成、ペプチド合成等において、一般的に用いられている方法であって、本発明においても、それらの方法をそのまま採用することができる。いわゆる核酸チップの作製においては、例えば、米国特許第５７４４３０５号明細書にはフォトリソグラフィーと光による脱保護反応を用いて、固相基板上に核酸プローブを合成結合する方法が記載されている。しかしながら、この方法は、光脱保護反応の反応効率、あるいは、全ての反応が基板上での不均一反応であることから、反応収率、反応速度の面、また、基板上に所望としない短鎖核酸が多数形成されるという課題を残している。
【００５８】
一方、本発明において、プローブを結合する物体を、粒子、微粒子等、適宜選択すれば、上記核酸合成、ペプチド核酸合成、ペプチド合成等に用いられる固相自動合成機に適用可能であるとの利便性がある。更に、固相合成、すなわち、不均一系ではあるが、粒子を用いるので、重長な固相基板をもちいるに比較すると、高反応収率、高反応速度を得ることができる。また、合成スキームも、例えば、核酸逐次反応の脱保護も酸を用いる等、一般的なスキームを用いることができるので、基板上で光脱保護を用いる方法に較べて、不必要な短鎖核酸の存在量も少ないことになる等の利点がある。
【００５９】
上記固相合成を用いる際には、例えば、プローブが核酸であれば、プローブを結合すべき物体表面に水酸基を導入した後、自動合成を行なうことが可能であるし、また、プローブがペプチド核酸、ペプチドの場合には、物体表面にアミノ基を導入した後、自動合成を行なうことができる。なお、物体表面へのアミノ基の導入はアミノ基を有するシランカップリング剤を用いてもよい。
【００６０】
他にも、本発明にかかる物体に対するプローブの結合方法としては、あらかじめ合成、精製したプローブを付与する方法も採用可能である。あらかじめ合成、精製したプローブの物体への付与の方法は、従来から用いられている方法を適用することが可能である。例えば、物体を各種官能基（アミノ基、チオール基、水酸基、エポキシ機、スクシンイミドエステル基、マレイミド基、ハライド基等）を有するシランカップリング剤で処理して、所望の官能基を物体表面に導入した後、これら官能基と反応することができる官能基を有するプローブと反応結合する方法を挙げることができる。官能基が整合しない場合には、異なるふたつの官能基を有するリンカー物質、例えば、N−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミド（株式会社同仁化学研究所）を介在させて結合付与しても良い。プローブ側の官能基としては、上述のように物体に導入された官能基と反応する官能基、あるいは、上記リンカー物質を介在して反応する官能基を挙げることができる。例えば、プローブが核酸であれば、アミノ基、チオール基、スクシンイミド基を例として挙げることができる。一方、プローブがペプチド、タンパク質、酵素、抗体の場合には、プローブに合成的にシステイン残基を用いてチオール基を導入するか、既存のシステイン残基のチオール基を用いるかして、基板表面に、例えば、アミノシランかプリング剤、及び上記N−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミドを用いて物体表面にマレイミド基を形成して、上記プローブのチオール基と結合させてもよい。
【００６１】
イオン性結合の例としては、アミノ基とチオール基のイオン結合を挙げることができる。イオン性結合を利用する場合には、結合反応時のｐＨをコントロールして、反応する官能基の電離を制御する必要があることはいうまでもない。
【００６２】
本発明は、さらに、上述する構成を有する、本発明にかかるプローブ結合物体の発明に加えて、標識を付されているプローブ結合物体について、その付されている標識を識別して、物体相互の判別、然して該物体に結合したプローブ相互の判別を行う方法の発明をも提供するものである。
【００６３】
すなわち、本発明にかかる物体、及びプローブの判別方法は、
上述した標識を付されているプローブ結合物体の種類、すなわち、該物体に結合されているプローブの種類を判別する方法であって、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無、または含有量の水準とを利用して、少なくとも二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を構成した上で、
前記含有原子の組成条件を満足する組成を有する標識子を用いて当該物体個々に付されている標識を、
前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段を用いて、該標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別し、
該標識子の組成において満足される、前記含有原子の組成条件を判別し、対応する少なくとも二進法ｎ桁の数値情報を抽出して、
前記少なくとも二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報に基づき、個々のプローブ結合物体の種類を識別する
ことを特徴とするプローブ結合物体の判別方法である。
【００６４】
さらに本発明は、標識を付されているプローブ結合物体について、該プローブを検出、特定、または定量する方法を提供する。
【００６５】
すなわち本発明にかかるプローブの検出、特定、または定量方法は、
該物体の種類、すなわち、該物体に結合されているプローブの種類を、
前記標識子を用いて付されている、該物体の標識を、前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段を用いて、該標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別し、
該標識子の組成において満足される、前記含有原子の組成条件を判別し、対応する少なくとも二進法ｎ桁の数値情報を抽出して、
前記少なくとも二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報に基づき識別することにより判別し、
前記種類の判別がなされた、該物体に結合されているプローブを、該プローブには含まれ、該物体には含まれない原子、分子、あるいは物質を、該プローブ由来の指標として用いて、検出または定量する
ことを特徴とする物体に結合したプローブの特定、検出または定量方法である。
【００６６】
プローブ結合物体の有するプローブには含まれ、該物体には含まれない原子、分子、あるいは物質は、プローブの種類に応じて適宜選択できる。例えば、プローブが核酸であれば、炭素原子、リン原子、窒素原子、核酸塩基、糖、リン酸から選択することができる。また、プローブがペプチド核酸であれば、例えば、炭素原子、窒素原子、核酸塩基から選択することができる。さらに、プローブがペプチド、タンパク質、酵素、抗体であれば、例えば、炭素原子、窒素原子、イオウ原子から選択することができる。
【００６７】
加えて本発明は、標識を付されているプローブ結合物体のプローブと特異的に結合する、いわゆる標的物質の検出、特定、または定量方法をも提供する。
【００６８】
すなわち、本発明にかかる標的物質の検出、特定、または定量方法は、
少なくとも以下の工程（１）及び（２）：
（１）請求項１〜１１のいずれかに記載のプローブ結合物体と、標的物質とを反応させてハイブリッド体を得る工程と、
（２）予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無、または含有量の水準とを利用して、少なくとも二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を構成した上で、
前記含有原子の組成条件を満足する組成を有する標識子を用いて前記ハイブリッド体が形成されている結合物体に付されている標識を、前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段を用いて、該標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別し、
該標識子の組成において満足される、前記含有原子の組成条件を判別し、対応する少なくとも二進法ｎ桁の数値情報を抽出して、
必要に応じて先に記載した方法によって前記ハイブリッド体が形成されている結合物体に結合したプローブを検出、特定、定量し、
同時に、または次いで、前記ハイブリッド体を形成している標的物質を、該標的物質に含まれ、かつ、該プローブ結合物体、及び該プローブに含まれない原子、分子、あるいは物質を指標に検出、特定、定量する工程；
を有することを特徴とする標的物質の検出、特定、定量方法である。
【００６９】
上記各方法において、物体が、平面上に位置する場合、標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別する際、ならびに、前記標識物質を検出する際、少なくとも、平面上における該物体の位置を特定するため、該物体が位置する平面上を、二次元イメージングする工程を更に設けることが好ましい。
【００７０】
例えば、前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段として、質量分析法を用いることができ、特に、好適に利用可能な質量分析法は、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）である。また、前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段として、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）またはオージェ電子分光法（ＡＥＳ）を用いることも可能である。
【００７１】
前記、標的物質に含まれ、かつ、プローブ結合物体、及びプローブに含まれない原子としては、ハロゲン原子、金属原子を好適に用いることが可能である。場合によっては、上記ハロゲン原子、金属原子を、いわゆる標識として標的物質に付してもかまわない。金属原子を標識として導入する際、有機金属錯体、もしくは、有機金属錯体を含んだ物質を用いると導入が容易となる場合がある。
【００７２】
上記、有機金属錯体の例として、下記化合物（シグマアルドリッチ）を用いれば、標的物質のアミノ基を利用して、標的物質にルテニウムを導入することが可能である。
Bis(2,2'-bipyridine)-4'-methyl-4-carboxybipyridine-ruthenium N-succinimidyl ester-bis(hexafluorophosphate
標的物質が核酸の場合には、該核酸を鋳型核酸を元にプライマー伸長反応で酵素的に合成する際に、前期ハロゲン原子、または金属原子が該プライマー、もしくはプライマー伸長反応に用いられる、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ（またはｄＵＴＰ）、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰに結合している様態は、本発明の好適な様態といえる。また、プローブがペプチド核酸であり、標的物質が核酸である場合には、標的物質に特的な原子等として、リン原子、リン酸を挙げることができる。なお、これまで述べてきた、プローブ結合に用いる物質類、プローブそれ自体、あるいは、標的物質は、本発明にかかる物体の標識子と、本発明に用いる検出手段によって、それぞれ区別して検出されうるものである。
【００７３】
次いで、本発明おける標識子の検出方法について更に詳しく述べる。
【００７４】
これまで述べてきた、予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段として、質量分析法を用いる態様とすることが可能である。その際、質量分析法は、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）であるとより好ましい。あるいは、前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段として、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）またはオージェ電子分光法（ＡＥＳ）を用いる態様とすることも可能である。また、前記プローブ結合物体に結合したプローブの検出、特定、定量にも、同様の方法を用いることができる。
【００７５】
なお、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ、ＸＰＳ、またはＡＥＳを利用する場合、これらの分析手法は二次元的な拡がりを有する測定対象の分析にも適用可能であり、例えば、物体が、平面上に位置する場合、前記標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別する際、また、プローブ、もしくは、プローブに結合した標的物質の検出、特定、定量においても、該物体が位置する平面上を、二次元イメージングする工程を更に設ける態様とすることが可能である。これは複数の物体が平面状に配置されている場合にもいえる。
【００７６】
検出装置についてＴＯＦ−ＳＩＭＳを例にして、本発明に必要な検出装置の性能について説明すると、本発明に用いる標識子は原子によって構成されており、その質量は高々１００であり、質量分解能も、基本的には１ｍｓ（マスユニット）あれば十分である。プローブ、及び標的物質の検出、特定、定量についても質量上限は高々数１００であり、分解能も１ｍｓあれば十分である。ＴＯＦ−ＳＩＭＳでは、高質量物質の測定、高分解能測定は、より長いフライトチューブと、高速一次イオン速度、二次イオン引出しのための高電圧等を必要とし、その分、装置は大型で高価で、ランニングコストも高いものとなる。
【００７７】
それに較べると、本発明に必要な装置は小型で安価なものとなり得る。
【００７８】
また、本発明にかかる物体の標識方法では、対象とする物体に付す標識子は、予め複数種の原子を選択し、この種類数（ｎ）の原子に関して、それぞれ含有の有無、あるいは、含有量の水準で示される、組成中に内在する情報を利用している。具体的には、予め選択される複数種（ｎ種）の原子として、例えば、互いに異なるｎ種の元素から、それぞれ一種の原子を選択した上、各原子に関して、含有の有無（二水準）を変えると、少なくとも、予め選択される複数種（ｎ種）の原子の一つは含まれる組成の種類総数ＮTOTALは、ＮTOTAL＝ΣｎＣｍ＝２n−１（１≦ｍ≦ｎ、ｍ、ｎは正の整数）となる。あるいは、各原子に関して、その含有量を、例えば、「微少量、少量」の二段階（二水準）で変えると、少なくとも、予め選択される複数種（ｎ種）の原子は含まれ、その含有量の違いを有する組成の種類総数ＮTOTALは、ＮTOTAL＝２nとなる。
【００７９】
一方、予め選択される複数種（ｎ種）の原子に関して、その含有量を、例えば、「含有無し、微少量、少量」の三段階（三水準）で変えると、少なくとも、予め選択される複数
種（ｎ種）の原子の一つは含まれる組成の種類総数ＮTOTALは、ＮTOTAL＝３n−１となる。
更には、予め選択される複数種（ｎ種）の原子のうち、特定の原子１種に関しては、その含有量を、例えば、「含有無し、微少量、少量」の三段階（三水準）で変え、残る（ｎ−１）種の原子に関しては、含有の有無（二水準）を変えると、少なくとも、予め選択される複数種（ｎ種）の原子の一つは含まれる組成の種類総数ＮTOTALは、ＮTOTAL＝３×（２n−１）−１となる。前記の態様は、形式的には、予め選択される複数種（ｎ種）の原子の全てに関して、例えば、「含有無し、微少量、少量」の三段階（三水準）の指標を設定した上、特定の原子１種に関しては、その含有量を、三段階（三水準）の指標に対応させて、変えるが、残る（ｎ−１）種の原子に関しては、三段階（三水準）の指標中、「含有無し、少量」の二種の指標のみを選択することに対応している。つまり、設定可能な組成の種類総数ＮTOTAL＝３n−１のうち、その部分集合の｛３×（２n−１）−１｝種類を選別して、利用する態様に相当する。このように、予め選択される複数種（ｎ種）の原子に関して、その含有量を三段階（三水準）以上の区分に分け、選択肢の多様化を図ることで、例えば、含有量をＭ段階（Ｍ水準）に区分する際には、｛Ｍn−１｝種類に達するまで、組成の種類総数ＮTOTALの範囲を拡張することも可能である。
【００８０】
以上に説明するように、対象とする物体に付す標識子として、予め複数種の原子を選択し、この種類数（ｎ）の原子に関して、それぞれ含有の有無、あるいは、含有量の水準で示される、組成中に内在する情報を利用することで、少なくとも、予め選択される複数種（ｎ種）の原子に関する、含有量を変化させるのみで、前記のＮTOTAL＝２n−１に達する種類の標識を付与することを可能としている。例えば、前記のＮTOTAL＝２n−１に達する種類の標識は、予め選択される複数種（ｎ種）の原子を各桁に対応させた際、少なくとも二進法ｎ桁の数値に対応したものとなっている。
【００８１】
また、対象とする物体に付す標識子は、組成中に内在する情報を利用するので、予め選択する原子の種類数（ｎ）は、目的とする標識種類の総種類数に応じて、適宜選択することが望ましい。例えば、予め選択する原子の種類数（ｎ）を５以上とすると、含有の有無、あるいは、含有量の水準を指標として、少なくとも、組成の種類総数ＮTOTALは、ＮTOTAL＝｛２5−１｝以上、つまり、目的とする標識種類の総種類数として、３１種類以上に適用が可能となる。例えば、各種細菌の同定に際して、個々の細菌に特有な遺伝子情報、例えば、ｒＲＮＡの塩基配列が利用可能である。このｒＲＮＡの塩基配列に対応する、ゲノム遺伝子上のコード領域の選別には、多種の塩基配列を有するＤＮＡプローブを使用するＤＮＡハイブリダイゼーション・アッセイを実施する必要がある。より具体的には、ＤＮＡハイブリダイゼーション・アッセイを用いた感染症起炎菌の同定では、利用されるＤＮＡプローブの種類は、３１種類を大きく上回ることも少なくない。その場合、各ＤＮＡプローブを固定化する微粒子状の基材に、本発明にかかる標識方法を適用して、予め選択する原子の種類数（ｎ）を８以上とすることによって、２５５以上の種類の標識を付すことが可能である。また、ヒトのゲノム遺伝子中に見出されている１塩基多形（ＳＮＰ）は、２５５種類を大きく超えた種類が報告されており、個々の１塩基多形の検出に利用されるＤＮＡプローブについて、その固定化に利用する微粒子状の基材に付す標識によって、区別を行うことが望ましい。例えば、予め選択する原子の種類数（ｎ）を１２以上とすると、４０９５以上の種類の標識を付すことが可能であり、ヒトのゲノム遺伝子中に見出されている１塩基多形（ＳＮＰ）の相当部分に対応する標識が提供可能である。更には、予め選択する原子の種類数（ｎ）を１６以上とすると、６５５３５以上の種類の標識を付すことが可能であり、例えば、ヒトのゲノム中に存在する全遺伝子に対応する、膨大な数のＤＮＡプローブそれぞれに、独自の標識が提供可能である。このように、本発明にかかる標識方法では、目的とする標識種類の総種類数に対応させて、標識情報の表現に利用される、予め選択する原子の種類数（ｎ）を適正に増減させることができ、各種アッセイに利用される、様々なブローブ分子に対して、その固定化に利用される微粒子状の基材に対して付与される標識子によって、相互の弁別を行うなど、極めて広範なアプリケーションへ対応可能な拡張性を有している。
【００８２】
例えば、特開平１−９５８００号公報に開示する手法では、各ＤＮＡプローブを固定化するマイクロビーズに関して、個別の金属元素一種を利用して、標識された粒子とすることで、蛍光Ｘ線を用いて該金属元素一種を分析し、各ＤＮＡプローブの種類を特定する手法が開示されている。この標識方法は、標識子として、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｂａ、Ｔｉ等の一種類の金属元素を、一文字の標識情報として利用する形態である。従って、本発明にかかる標識方法のように、予め選択される複数種（ｎ種）の原子を利用して、その含有量水準を指標として、例えば、二進法ｎ桁の数値情報に対応する標識情報の表記を行う技術とは、その技術的思想が異なったものである。また、特開平７−８３９２７号公報に開示する手法では、複数種の無機蛍光物質を利用して、プローブ分子を固定化する超微粒子体を作製し、かかる無機蛍光物質個々に特徴的な蛍光を観測して、各プローブ分子の種類を特定する手法が開示されている。この標識方法では、標識子として、複数種の無機蛍光物質個々に特徴的な蛍光を、一文字の標識情報として利用する形態である。従って、本発明にかかる標識方法のように、予め選択される複数種（ｎ種）の原子を利用して、その含有量水準を指標として、例えば、二進法ｎ桁の数値情報に対応する標識情報の表記を行う技術とは、その技術的思想が異なったものである。
【００８３】
より詳細に、技術的思想の特徴を説明するならば、本発明にかかる標識方法においては、見掛け上は、予め５種類の原子を選択して、標識化に利用している形態であっても、その本質は、予め選択される複数種（ｎ種）の原子として、例えば、１６種類を選択した上、各原子をそれぞれ対応する桁に割付を行い、例えば、二進法１６桁の数値情報に対応させた上、その内、５種類の原子のみを任意に選択して、その含有の有無を指標とする部分集合として、｛２5−１｝種類を利用するものである。すなわち、予め十分に広い適用範囲へと拡張可能な形態であるが、その応用範囲に応じて、その一部の部分集合を利用しているものである。
【００８４】
一方、本発明にかかる物体の標識方法では、標識子として、特定の原子に関する含有量の情報を利用可能な限り、物体自体の形状、サイズは任意に選択できる。例えば、各種プローブ分子の固定化に利用される微粒子を対象とする場合、針状、棒状、凹凸がある等の不定形微粒子、また、球状、方形等の定形微粒子とすることが好適である。その他、各種プローブ分子の固定化に利用される基材として、繊維状、シート状の物体とする際にも、本発明にかかる物体の標識方法を好適に適用できる。加えて、各種プローブ分子の固定化に利用される微粒子の材質を、磁性体とすることも可能であり、かかる磁性体微粒子の形態を選択すると、各種プローブ分子を固定化した状態で、液相中から磁力を利用した分離操作を適用可能となる。
【００８５】
なお、各種プローブ分子の固定化に利用される基材は、液相中に均一に分散可能なサイズとすることが望ましい。すなわち、液相中での分散性に利する、微細なサイズが通常選択され、例えば、微粒子においては、その粒径に相当するサイズを、１ｎｍ〜１０μｍの範囲に選択することが望ましい。また、基材が繊維状、または、片々の形態である場合、その縦、横、高さの少なくとも二方向のサイズを、１ｎｍ〜１０μｍの範囲に選択することが望ましい。その他、検出に際して、サイトメトリー法を応用する計数を利用する上では、前記サイズ下限を１００ｎｍ以上に選択することが好ましい。
【００８６】
例えば、本発明にかかる物体の標識方法を、各種プローブ分子の固定化に利用可能な微粒子へ適用する際、この微粒子自体を構成する材質について、その組成を種々に変化させ、予め選択される複数種（ｎ種）の原子について、その含有の有無、あるいは、含有量の水準が異なるものとし、標識を施す形態を採用することができる。所望の組成比に調整した原材料を混合、焼成、粉砕する乾式法、所望の組成比に調整した溶液から、複数種の原子を含む共沈物を得る共沈法、原材料を溶解、噴霧熱分解、解砕する噴霧分解法が利用可能である。例えば、特開昭６４−５１３２２号公報に開示される、酸化物超電導材微粒子の製造方法を利用して、予め選択される複数種（ｎ種）の金属原子について、酸化物の形態で含有される酸化物微粒子として、形成することが可能である。また、特開２００２−１２８５２３号公報に開示される、共沈法を利用するフェライト粒子の製造方法を利用して、予め選択される複数種（ｎ種）の金属原子について、かかる複数の金属元素を含んだフェライト粒子として、形成することが可能である。
【００８７】
更には、種々の材料で形成される核微粒子に対して、被覆層を付加した被覆微粒子を構成し、前記被覆層の材質について、その組成を種々に変化させ、予め選択される複数種（ｎ種）の原子について、その含有の有無、あるいは、含有量の水準が異なるものとし、標識を施す形態を採用することができる。例えば、核微粒子として、ガラス、プラスティック、シリコン、金属等の粒子を用いて、下記する手段によって、所望の組成を有する被覆層形成することができる。例えば、乾式法として、真空蒸着、イオンプレーティング、スパッタリング等のＰＶＤ（物理的気相堆積）法、あるいは、ＣＶＤ（化学的気相堆積）法、特開平０７−０５３２７１号公報に開示される気中分散法を適用した被覆層形成が利用できる。さらには、被覆層に代えて、所望の元素をイオン注入法を用いて、核微粒子の表面から導入し、その表面部の組成を変更して、表面層を形成することもできる。
【００８８】
なお、本発明にかかる物体の標識方法において、標識子を構成する組成成分中に含有させる、予め選択される複数種（ｎ種）の原子は、その種類の特定が高い確度で行え、また、その含有量を再現性良く測定可能である限り、特に制限はない。但し、対象とする物体自体に要求される性能、例えば、磁性体特性を保持する観点では、利用可能な元素に一定の制限がある。加えて、製造方法によっては、原理的に利用できない元素も存在する。従って、対象とする物体自体に要求される性能と、製造方法を考慮した上で、適宜、利用する複数種（ｎ種）の原子を選択するとこが好ましい。その際、例えば、典型金属元素、遷移金属元素のうちから、前記条件を満足するものを選択することが好ましい。
【００８９】
一例として、利用する複数種原子の組み合わせの例として、例えば、８種の場合には、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ、１２種の場合には、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｇ、Ｐｄ、また、１６種の場合には、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｇ、Ｐｄ、Ｖ、Ｃｒ、Ｒｕ、Ｒｈの組み合わせを挙げることができる。
【００９０】
本発明にかかる標識を付された物体を分析、検出する方法としては、本発明による物体の標識方法、すなわち、標識子として利用される、予め選択される複数種の原子について、その含有の有無、あるいは、その含有量の水準を識別可能な手段であれば、いかなる分
析方法も利用可能である。例えば、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）等の質量分析法、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、オージェ電子分光法（ＡＥＳ）を好適に用いることができる。さらに、二次元イメージング可能なこれらの方法を用いれば、複数の異なる粒子が二次元状に存在する場合の検出法として、利用することも可能である。
【実施例】
【００９１】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。なお、これら実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明はかかる実施例に示す形態に限定されるものではない。
【００９２】
（実施例１）
特開２００２−１２８５２３号公報に記載されるフェライト微粒子の製造方法に基づき、２価の鉄イオンを必須成分として含有し、その他、目的とするフェライトを構成する種々の金属元素イオンを添加した溶液を利用し、酸化剤を利用して、２価の鉄イオンを３価の鉄イオンへ酸化して、フェライト微粒子を調製する。調製されるフェライト微粒子は、主要成分の鉄イオン以外に、前記原料溶液中に添加する金属元素イオンの種類、添加濃度を選択することで、主成分金属元素の鉄に加えて、種々の金属元素を所望の含有比率で含むフェライト材質となる。
【００９３】
本実施例では、フェライトを構成する主成分金属元素の鉄に加えて、微量成分金属元素として、少なくとも、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの８種の金属元素から選択される１種以上の金属元素を添加するフェライト微粒子、ならびに、これら８種の金属元素はいずれも添加されていないフェライト微粒子を調製する。すなわち、少なくとも、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの８種の金属元素から選択される１種以上の金属元素を添加するフェライト微粒子は、前記８種の金属元素中、含有される金属元素の種類によって、（２8−１）種＝２５５種に分類される。更に、これら８種の金属元素はいずれも添加されていないフェライト微粒子を加えて、調製されるフェライト微粒子は、その組成中における、該金属元素８種個々の含有の有無に基づき、合計２５６種に分類される。
【００９４】
なお、本実施例においては、フェライト微粒子の作製時に利用する、複数の金属元素イオンを含む溶液中では、微量成分として添加される各金属元素イオンの濃度は同一とした。また、最終的に作製されるフェライト微粒子の粒子径は、おおよそ５００  ｎｍであった。
【００９５】
調製されたフェライト微粒子は、各反応液から分離し、超純水で洗浄する。なお、反応液からの回収分離、洗浄後の回収等、フェライト微粒子の回収・分離操作では、磁石を用いてフェライト粒子を集める手法を利用している。合計２５６種の、洗浄済フェライト微粒子は、それぞれ超純水に懸濁し、分散濃度約５．５ｍｇ／ｍＬ（約５００粒子／μＬ）の懸濁液とする。
【００９６】
得られるフェライト微粒子懸濁液、合計２５６種から、それぞれ約１μｌを採取し、混合した後、一旦含まれるフェライト微粒子集め、１００μＬの純水に再懸濁し、この再懸濁液１μＬをコピー紙上にスポッティングして乾燥する。次いで、前記コピー用紙を適宜切り取り、各スポッティング部分について、存在しているフェライト微粒子中に含有される金属元素組成を測定する。この例では、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置（ＩＯＮ−ＴＯＦ社製：ＴＯＦ−ＳＩＭＳ  IV）、ＸＰＳ装置（日本電子社製：ＪＰＳ−９２００）、ＡＥＳ装置（日本電子社製：ＪＡＭＰ−９５００Ｆ）を利用し、三種の測定手法によって、それぞれ、各スポッティング部分を含む領域を二次元イメージングしながら、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの９種の金属元素に由来するスペクトルの測定を行う。
【００９７】
二次元イメージングの結果、三種の測定手法のいずれにおいて、各スポッティング部位から、主成分金属元素に由来するスペクトルに基づき、各フェライト微粒子存在領域（スポット領域）のイメージが得られる。同時に、それぞれのフェライト微粒子中に含有される、微量成分金属元素に由来するスペクトルに関しても、他の成分金属元素に起因する干渉を受けず、少なくとも微量成分金属元素：Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの個々に特徴的なスペクトルが測定可能であることが確認された。すなわち、フェライト微粒子中に含まれる主成分金属元素Ｆｅに対して、配合可能な微量成分金属元素として、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの８種の金属元素を選択し、該８種金属元素の含有の有無によって、二進法８桁の数値情報に相当する標識を付すことで、合計２５６種（２8種）のフェライト微粒子を判別可能であることが確認された。
【００９８】
次いで、上記２５６種のフェライト微粒子のうち、「Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ」で標識された微粒子及び「Ｃｏ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ」で標識された微粒子の二種について、以下の工程によりオリゴヌクレオチドプローブを結合した。
（１）適当量の微粒子を０．５ｍｌのマイクロチューブに取り、エタノール１００μｌを加えて震盪攪拌後、上述の磁石を利用したセパレーターを用いてエタノールを除き、微粒子を回収した。
（２）アミノ基を結合したシランカップリング剤、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン  ＫＢＭ６０３（信越化学工業）の１ｗｔ％水溶液を室温下で２時間攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。次いでこの溶液１００μｌに上記（１）で得た微粒子を室温で１時間浸漬した後、純水で洗浄し、回収後、乾燥させた。次に１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークして最終的に微粒子表面にアミノ基を導入した。
（３）N−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）２．７ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１混合溶液に濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなる様に溶解した。シランカップリング処理を行った微粒子をこのＥＭＣＳ溶液の１００μｌに室温で２時間浸漬して、シランカップリング処理によって基板表面に担持されているアミノ基とＥＭＣＳ溶液のスクシンイミド基を反応させた。この段階で微粒子表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が存在することになる。ＥＭＣＳ溶液から引き上げた基板はＤＭＳＯ及びエタノールの混合溶媒及びエタノールで順次洗浄した後、減圧下乾燥させた。
（４）DNA合成業者（株式会社ベックス）に依頼して配列番号：１の塩基配列を有する一本鎖核酸と、配列番号：２の塩基配列を有する一本鎖核酸の２種の核酸を合成した。なお、それぞれの一本鎖ＤＮＡの５’末端には合成時にチオールモディファイア（グレンリサーチ社）を用いる事によってチオール（ＳＨ）基を導入した。なお、脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製にはHPLCを用いた。合成から精製までの一連の工程はすべて合成業者に依頼して行った。
配列番号：１
5'  HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA  3'
配列番号：２
5'  HS-(CH2)6-O-PO2-O-CGTACGATCGATGTAGCTAGCATGC  3'
（５）上記一本鎖ＤＮＡを８μＭの濃度で５０ｍMリン酸緩衝液（ｐH７．０）にそれぞれ溶解し、この溶液各１００μｌに（３）で得られた微粒子を室温下１時間浸漬して、微粒子上のマレイミド基と核酸のチオール基を反応させ、プローブとしての核酸を微粒子上の結合した。その後、上記リン酸緩衝液で適宜洗浄して、そのまま、次に使用するまで、緩衝液中で４℃で保存した。
【００９９】
この核酸結合微粒子を純水で適宜洗浄、回収、減圧乾燥した後、上述の方法に基づきＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置によって観察した。その結果、二種にフェライト微粒子について、それぞれ標識子としての原子に加えて、核酸のリン酸部位のフラグメントイオンであるＰＯ-、ＰＯ2-、ＰＯ3-の各イオン、及び塩基のフラグメントイオンが強く観察された。観察された上記イオンのなかでは、ＰＯ2-、ＰＯ3-が特に強く観察された。また、核酸を微粒子に結合する際の核酸濃度を変えて反応させて、同様にＴＯＦ−ＳＩＭＳでＰＯ2-、ＰＯ3-イオンについて観察したところ、核酸濃度の一定の範囲で、核酸濃度に直線的に比例したイオン強度が観察された。
【０１００】
以上より、本発明の、原子による標識子を付与されたプローブ結合微粒子と、該微粒子と結合したプローブの判別、及び該プローブの微粒子上での検出、特定と、相対的ではあるが、定量が可能であることが示された。
【０１０１】
次に、モデル標的核酸として、下記配列番号：３及び配列番号：４として、上記配列番号：１及び配列番号：２の核酸の塩基配列のそれぞれに相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸を合成した。
【０１０２】
なおＡ（Ｂｒ）は臭素原子を結合したアデニル酸を表し、この部分は下図に構造を示した８−ブロモ−３’−デオキシアデノシンフォスフォロアミダイト（グレンリサーチ社）を用いて、自動合成機での合成時に導入した。脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製にはＨＰＬＣを用いた。合成から精製までの一連の工程は同様にすべて合成業者に依頼して行った。
配列番号：３
5'  TGTA（Br）A（Br）A（Br）A（Br）CGA（Br）CGGCCA（Br）GT  3'
配列番号：４
5'  GCA（Br）TGCTA（Br）GCTA（Br）CA（Br）TCGA（Br）TCGTA（Br）CG  3'
【０１０３】
【化１】
0004651094.tif 000002
【０１０４】
これらの核酸を、１MのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐH７．０）に、ぞれぞれ５０ｎＭの濃度で溶解し、その１００μｌに、前記配列番号：１、及び配列番号：２のプローブ核酸を結合した粒子適量を混合して分散し、４０℃で１６時間静置して、微粒子上のプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションを図った。その後、室温下、上記緩衝液、次いで純水で洗浄後、微粒子を回収し、減圧下、乾燥した。
【０１０５】
次に、ハイブリダイゼーションを行なった微粒子を、上述の方法に基づきＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置によって観察した。その結果、当該する相補鎖とハイブリダイゼーションを行なったフェライト微粒子から、該微粒子に付与した標識子としての原子、核酸プローブと標的核酸に由来する前記フラグメントイオン、及び標的核酸由来のＢｒ-イオンが観察された。なお、Ｂｒ-イオンは、天然に存在する同位体イオンとして、79Ｂｒ-、81Ｂｒ-イオン双方が、ほぼ同じイオン強度で観察された。また、非相補的な核酸とハイブリダイゼーションを行なったフェライト粒子からは、標識子としての原子と、核酸プローブ由来のフラグメントイオンは観察されたが、Ｂｒ-イオンは観察されなかった。また、ハイブリダイゼーション時の標的核酸濃度を変えて反応させて、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置で観察したところ、標的核酸濃度の一定の範囲で、標的核酸濃度に直線的に比例したＢｒ-イオン強度が観察された。
【０１０６】
これらにより、本発明の原子による標識子を付与されたプローブ結合微粒子に結合した核酸プローブと特異的に結合（ハイブリダイゼーション）する標的核酸の、該標的核酸には含有し、該微粒子、もしくは、該微粒子に結合したプローブには含有しない原子を用いての検出、特定、相対的ではあるが定量が可能であることが示された。
【０１０７】
なお、本実施例で言及した２５６種のフェライト微粒子には、任意のプローブを結合して、該プローブと特異的に結合する標的物質の検出に用いることができる。
【０１０８】
（実施例２）
本実施例２においては、フェライトを構成する主成分金属元素の鉄に加えて、微量成分金属元素として、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの８種の金属元素に、さらに、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｇ、Ｐｄの４種の金属元素を加えた、合計１２種の金属元素から選択される１種以上の金属元素を添加するフェライト微粒子、ならびに、これら１２種の金属元素はいずれも添加されていないフェライト微粒子を調製する。すなわち、少なくとも、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｇ、Ｐｄの１２種の金属元素から選択される１種以上の金属元素を添加するフェライト微粒子は、前記１２種の金属元素中、含有される金属元素の種類によって、（２12−１）種＝４０９５種に分類される。更に、これら１２種の金属元素はいずれも添加されていないフェライト微粒子を加えて、調製されるフェライト微粒子は、その組成中における、該金属元素１２種個々の含有の有無に基づき、合計４０９６種に分類される。
【０１０９】
なお、本実施例においても、フェライト微粒子の作製時に利用する、複数の金属元素イオンを含む溶液中では、微量成分として添加される各金属元素イオンの濃度は同一とした。但し、主成分金属元素のＦｅ含有量に対する、前記１２種の金属元素個々の含有量は、実施例１における比率の８／１２に低下させている。また、最終的に作製されるフェライト微粒子の粒子径は、おおよそ５００ｎｍであった。
【０１１０】
調製されたフェライト微粒子は、各反応液から分離し、超純水で洗浄する。なお、反応液からの回収分離、洗浄後の回収等、フェライト微粒子の回収・分離操作では、磁石を用いてフェライト粒子を集める手法を利用している。合計４０９６種の、洗浄済フェライト微粒子は、それぞれ超純水に懸濁し、分散濃度約５．５ｍｇ／ｍＬ（約５００粒子／μＬ）の懸濁液とする。
【０１１１】
得られるフェライト微粒子懸濁液、合計４０９６種から、それぞれ約１μｌを採取し、混合した後、一旦含まれるフェライト微粒子集め、１００μＬの純水に再懸濁し、この再懸濁液１μＬをコピー紙上にスポッティングして乾燥する。次いで、実施例１と同様の測定手順・条件において、前記コピー用紙を適宜切り取り、各スポッティング部分について、存在しているフェライト微粒子中に含有される金属元素組成を測定する。
【０１１２】
本実施例２のフェライト微粒子に関しても、二次元イメージングの結果、三種の測定手法のいずれにおいて、各スポッティング部位から、主成分金属元素に由来するスペクトルに基づき、各フェライト微粒子存在領域（スポット領域）のイメージが得られる。同時に、それぞれのフェライト微粒子中に含有される、微量成分金属元素に由来するスペクトルに関しても、他の成分金属元素に起因する干渉を受けず、少なくとも微量成分金属元素：
Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｇ、Ｐｄの個々に特徴的なスペクトルが測定可能であることが確認された。すなわち、フェライト微粒子中に含まれる主成分金属元素Ｆｅに対して、配合可能な微量成分金属元素として、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｇ、Ｐｄの１２種の金属元素を選択し、該１２種金属元素の含有の有無によって、二進法８桁の数値情報に相当する標識を付すことで、合計４０９６種（２12種）のフェライト微粒子を判別可能であることが確認された。
【０１１３】
以上の結果から、フェライトを構成する主成分金属元素の鉄に加えて、微量成分金属元素として、選択可能な金属元素の種類数を更に増した際、この多数種の金属元素の何れについても、各種の検出手段を適用して、金属元素個々に特徴的なスペクトルを測定し、その含有量の評価が可能である限り、フェライト微粒子に付すことが可能な標識の種類を増すことが可能であることが検証される。
【０１１４】
次いで、上記４０９６種のフェライト微粒子のうち、「Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｇ」で標識された微粒子、及び「Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｇ、Ｐｄ」で標識された微粒子の二種について、実施例１と同様な方法によりプローブとしてのオリゴペプチド核酸を結合した。ただし、結合に用いるプローブの微粒子上のマレイミド基と結合に関与するチオール基は、上記オリゴペプチド核酸のアミノ末端（核酸プローブでいう５’末端）に核酸塩基を有しないシステイン残基を結合することによって導入した。塩基配列は配列番号：１、及び配列番号：２と同一である。なお、オリゴペプチド核酸の合成も株式会社ベックスに依頼して行なった。
【０１１５】
上記オリゴペプチド核酸プローブを結合した微粒子をＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置で観察したところ、微粒子の標識子としての原子に加えて、オリゴペプチド核酸プローブ由来の核酸塩基のフラグメントが観察された。オリゴペプチド核酸プローブの他のフラグメントイオンは観察されないか、あるいは、アミノシランカップリング剤、もしくは、ＥＭＣＳ由来のフラグメントイオンと区別できなかった。
【０１１６】
次に、上記オリゴペプチド核酸プローブを結合した二種のフェライト粒子に対し、実施例１と同様な方法でハイブリダイゼーションを行なった。ただし、用意した相補鎖は、塩基配列は配列番号３、及び４と同一であるが、臭素原子は一切結合していない。
【０１１７】
ハイブリダイゼーション後のフェライト微粒子をＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置で観察したところ、当該の相補鎖とハイブリダイゼーションを行なったフェライト微粒子からのみ、微粒子の標識子としての原子に加えて、標的核酸由来で、微粒子自体、及びオリゴペプチド核酸には含有しない、ＰＯ-、ＰＯ2-、ＰＯ3-の各イオンが観察された。
【０１１８】
また、実施例１と同様に、ハイブリダイゼーション時の標的核酸濃度を変えて反応させて、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置で観察したところ、標的核酸濃度の一定の範囲で、標的核酸濃度に直線的に比例したＰＯ2-、ＰＯ3-強度が観察された。
【０１１９】
これらの結果より、オリゴペプチド核酸プローブ、未標識標的核酸の場合においても、実施例１と同様に本発明の有用性が示された。
【０１２０】
なお、本実施例で言及した４０９６種のフェライト微粒子には、任意のプローブを結合して、該プローブと特異的に結合する標的物質の検出に用いることができる。
【０１２１】
（実施例３）
本実施例３においても、フェライトを構成する主成分金属元素の鉄に加えて、微量成分金属元素として、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの８種の金属元素から選択される１種以上の金属元素を添加するフェライト微粒子、ならびに、これら８種の金属元素はいずれも添加されていないフェライト微粒子を調製する。なお、本実施例３においては、フェライト微粒子の作製時に利用する、複数の金属元素イオンを含む溶液中では、微量成分として添加される各金属元素イオンの濃度に関して、ＮｉとＺｎの二種については、実施例１と同一の濃度と、その１／１０濃度の二つの水準を用いた。
【０１２２】
すなわち、少なくとも、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの８種の金属元素から選択される１種以上の金属元素を添加するフェライト微粒子は、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの６種の金属元素中、含有される金属元素の種類（場合の数２6）、ならびに、ＮｉとＺｎの二種に関する含有量の水準（各三水準：０、１／１０、１）の差違（場合の数３2）によって、（２6×３2−１）種＝５７５種に分類される。更に、これら８種の金属元素はいずれも添加されていないフェライト微粒子を加えて、調製されるフェライト微粒子は、その組成中における、該金属元素８種個々の含有量の水準に基づき、合計５７６種（２6×３2種）に分類される。なお、本実施例においても、最終的に作製されるフェライト微粒子の粒子径は、おおよそ５００ｎｍであった。
【０１２３】
得られるフェライト微粒子懸濁液、合計５７５種から、それぞれ約１μｌを採取し、コピー紙上にスポッティングして乾燥する。次いで、実施例１と同様の測定手順・条件において、前記コピー用紙を適宜切り取り、各スポッティング部分について、存在しているフェライト微粒子中に含有される金属元素組成を測定する。
【０１２４】
本実施例３のフェライト微粒子に関しても、二次元イメージングの結果、三種の測定手法のいずれにおいて、各スポッティング部位から、主成分金属元素に由来するスペクトルに基づき、各フェライト微粒子存在領域（スポット領域）のイメージが得られる。同時に、それぞれのフェライト微粒子中に含有される、微量成分金属元素に由来するスペクトルに関しても、他の成分金属元素に起因する干渉を受けず、少なくとも微量成分金属元素：Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｇ、Ｐｄの個々に特徴的なスペクトルが測定可能であること、加えて、ＮｉとＺｎの二種に関する含有量水準の相違も明確に判別可能であることが確認された。すなわち、フェライト微粒子中に含まれる主成分金属元素Ｆｅに対して、配合可能な微量成分金属元素として、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの８種の金属元素を選択し、該８種金属元素の含有量水準の差違によって、二進法８桁の数値情報を超え、例えば、二進法６桁と三進法２桁からなる数値情報に相当する標識を付すことで、合計５７６種（２6×３2種）のフェライト微粒子を判別可能であることが確認された。
【０１２５】
以上の結果から、フェライトを構成する主成分金属元素の鉄に加えて、微量成分金属元素として、選択可能な金属元素の種類数（ｎ）に対して、このｎ種の金属元素の何れについても、各種の検出手段を適用して、金属元素個々に特徴的なスペクトルを測定し、その含有の有無のみでなく、含有量の複数水準（水準数Ｍ）の評価が可能である限り、例えば、Ｍ進法ｎ桁の数値情報に相当する標識をフェライト微粒子に付すことが可能であることが検証される。次いで、上記５７６種のフェライト粒子のうち、「Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ」の８原子のＮｉ原子について、非含有、実施例１と同一の濃度と、その１／１０濃度の二つの水準、計三種の微粒子について、以下の方法により核酸プローブを結合した。
（１）実施例１と全く同様の方法により、アミノシランカップリング剤、及びＥＭＣＳによる処理を行い、微粒子表面にマレイミド基を導入した。
（２）０．５ｍｇ／ｍｌの１−チオグリセロール（シグマ・アルドリッチ）水溶液を作製し、この１００μｌに上記三種のフェライト微粒子の適量を浸漬して、微粒子表面に水酸基を導入した。
（３）上記水酸基を導入した三種のフェライト微粒子に対して、核酸自動合成機により、前記配列番号：１及び配列番号：２に加えて、下記配列番号：５の核酸を、それぞれプローブ核酸として逐次合成した。
配列番号：５
5'  HS-(CH2)6-O-PO2-O-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT   3'
なお、合成は株式会社BEXに依頼して行なった。合成のプロトコールは全て定法により行なった。
【０１２６】
この三種の核酸を結合した微粒子をＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置によって観察した。その結果、三種にフェライト微粒子について、それぞれ標識子としての原子をＮｉ原子の三水準を含めて検出可能であったのに加えて、核酸のリン酸部位のフラグメントイオンであるＰＯ-、ＰＯ2-、ＰＯ3-の各イオン、及び塩基のフラグメントイオンが強く観察された。配列番号５のプローブを結合した微粒子からは塩基由来のフラグメントイオンとして、チミン由来のフラグメントイオンのみが観察された。上記イオンのなかでは、ＰＯ2-、ＰＯ3-が特に強く観察された。
【０１２７】
以上より、本発明の、三水準にわたって存在する原子を含む原子による標識子を付与されたプローブ結合微粒子と、該微粒子と固相逐次合成によって結合したプローブの判別、及び該プローブの微粒子上での検出、及び特定が可能であることが示された。
【０１２８】
次に、上記核酸プローブを結合した三種のフェライト粒子に対し、実施例１と同様な方法でハイブリダイゼーションを行なった。用意した相補鎖は、配列番号：３、及び配列番号：４に加えて、配列番号：５に対して相補的な、下記配列番号：６である。
配列番号：６
5'  A（Br）A（Br）A（Br）A（Br）A（Br）AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA  3'
なお、配列番号：６の５’末端側の５塩基については配列番号：３、及び配列番号：４と同様に臭素原子が結合されている。
【０１２９】
次に、ハイブリダイゼーションを行なった微粒子を、上述の方法に基づきＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置によって観察した。その結果、当該する相補鎖とハイブリダイゼーションを行なったフェライト微粒子から、該微粒子に付与した標識子としての原子原をＮｉ原子の三水準を含めて検出可能であった。その上、核酸プローブと標的核酸に由来する前記フラグメントイオン、及び標的核酸由来の79Ｂｒ-、81Ｂｒ-イオンが観察された。また、非相補的な核酸とハイブリダイゼーションを行なったフェライト粒子からは、標識子としての原子と、核酸プローブ由来のフラグメントイオンは観察されたが、79Ｂｒ-、81Ｂｒ-イオンは観察されなかった。
【０１３０】
また、ハイブリダイゼーション時の標的核酸濃度を変えて反応させて、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置で観察したところ、標的核酸濃度の一定の範囲で、標的核酸濃度に直線的に比例した79Ｂｒ-、81Ｂｒ-イオン強度が観察された。
【０１３１】
これらにより、本発明の原子による標識子を付与されたプローブ結合微粒子に、固相逐次合成により結合した核酸プローブと特異的に結合（ハイブリダイゼーション）する標的核酸の、該標的核酸には含有し、該微粒子、もしくは、該微粒子に結合したプローブには含有しない原子を用いての検出、特定、相対的ではあるが定量が可能であることが示された。
【０１３２】
なお、本実施例で言及した５７５種のフェライト微粒子には、任意のプローブを結合して、該プローブと特異的に結合する標的物質の検出に用いることができる。
【０１３３】
（実施例４）
Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  １８，  ４３８，  ２０００にはヒト口腔扁平上皮癌のふたつのセルライン、ＨＳＣ４とＨＳＣ５のゲノムＤＮＡのエキソン７の変異を検出するためのオリゴヌクレオチドチップの作製と、このチップを用いての、上記エキソンから誘導された蛍光標識核酸の検出に関して記載されている。本実施例では上記方法に準じて、オリゴヌクレオチドプローブを結合したフェライト微粒子を作製し、標識を蛍光から臭素に替えて標的核酸を合成し、さらに、この標的核酸を用いてハイブリダイゼーションを行った。
【０１３４】
以下に具体的な手順について述べる。
配列番号：７
5'  HS-(CH2)6-O-PO2-O-GATGGGCCTCCGGTTCAT  3'
配列番号：８
5'  HS-(CH2)6-O-PO2-O-GATGGGCCACCGGTTCAT  3'
配列番号：９
5'  HS-(CH2)6-O-PO2-O-GATCGGCCACCGGATCAT  3'
上記ＨＳＣ４のエキソン７の塩基配列の一部（コドンＮｏ．２４８を含む部分）に相補的な塩基配列を有し、５’末端に基板への結合のためのチオール基を担持した、配列番号：７の一本鎖核酸をプローブ核酸として、実施例１と同様に合成した。その他に、配列番号：７が完全に相補的であるのに対して、標的塩基配列に対して一塩基、及び三塩基ミスマッチ部位（下線を付したヌクレオチド）を有する一本鎖核酸も合成した（それぞれ配列番号：８、配列番号：９）。
【０１３５】
実施例１のＣｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの原子群で標識を施された２５６種のフェライト微粒子から「Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ」、「Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ」、及び「Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ」で標識された微粒子を選択し、実施例１と同様の方法で、前記、配列番号：７、配列番号：８、及び配列番号：９の一本鎖核酸を、それぞれ結合した。作製されたプローブ結合フェライト微粒子の粒子としての判別と、結合したプローブの確認は、実施例１の手法により行なった。
配列番号：１０
E7S : 5' - ACTGGCCTCATCTTGGGCCT- 3' (exon 7, sense)
配列番号：１１
E7A : 5' - TGTGCAGGGTGGCAAGTGGC- 3' (exon 7, anti-sense)
【０１３６】
【化２】
0004651094.tif 000003
【０１３７】
５−ブロモ−２’−デオキシウリジン三リン酸（Ｂｒ‐ｄＵＴＰ）
次に、上記、配列番号：１０、１１のＰＣＲプライマー（株式会社ベックスに合成依頼）を用いて、ＨＳＣ４のゲノムからエキソン７の部分をＰＣＲ反応で増幅した。すなわち、２０ｎｇのゲノムＤＮＡと各０．４μＭのセンス、アンチセンスプライマーを含む５０μｌのＰＣＲミクスチャーを９４℃（３０ｓｅｃ）、６０℃（４５ｓｅｃ）のサイクルを４０回繰り返してＰＣＲ増幅を行った。得られる鎖長は１７１ヌクレオチドと設計されている。
【０１３８】
次に、上記増幅産物の一部を鋳型として、０．２μＭのセンスプライマー（配列番号：１０）と、上図に構造を示した臭素標識ヌクレオチドの一種である、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン三リン酸（シグマ・アルドリッチ）を、通常の２’−デオキシウリジン三リン酸１０μＭに１／１０の濃度で加えてｓｓＰＣＲ（一本鎖ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲサイクルは９６℃（３０ｓｅｃ）、５０℃（３０ｓｅｃ）、６０℃（４ｍｉｎ）、２５サイクルである。なお、他の三種のデオキシヌクレオチド三リン酸はいずれも１０μＭの濃度で用いた。また、得られた臭素標識一本鎖ＤＮＡはゲルろ過によって精製した。
【０１３９】
上述の三種の核酸プローブ結合フェライト微粒子チップと、上記ｓｓＰＣＲ産物とで、実施例１同様な方法によりハイブリダイゼーションを行なった。ただし、ｓｓＰＣＲ産物の濃度を１０ｎＭとし、緩衝液には２０％ホルムアミドを含む６×ＳＳＰＥ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ、６０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、６ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて、８０℃で１０ｍｉｎ加熱し、ついで、４５℃で１５時間ハイブリダイゼーションを行ない、その後、２×ＳＳＰＥを用いて５５℃で洗いの操作を加えた。つぎに、純水（室温）で適宜洗浄し、フェライト粒子を回収して、減圧乾燥した。
【０１４０】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置で、得られたフェライト微粒子を観測したところ、標的核酸の標的塩基配列部分に完全相補的な核酸プローブを結合した微粒子からは79Ｂｒ-、81Ｂｒ-イオンが強いイオン強度で観察され、次に、一塩基ミスマッチを有する核酸プローブを結合した微粒子から、上記フルマッチに対して１／１０程度の79Ｂｒ-、81Ｂｒ-イオン強度が観察され、三塩基ミスマッチを有する核酸プローブを結合した微粒子からは79Ｂｒ-、81Ｂｒ-イオンは観察されなかた。
【０１４１】
これらより、本発明のプローブ結合微粒子により、実際の細胞ゲノム由来の遺伝子が、ＰＣＲ時の取り込み標識による標的核酸の標識方法との併用により、一塩基ミスマッチを識別して検出可能であることが示された。
【０１４２】
なお、本実施例で言及した２５６種のフェライト微粒子には、任意のプローブを結合して、該プローブと特異的に結合する標的物質の検出に用いることができる。
【０１４３】
（実施例５）
配列番号：１２
E7S : 5' - A（Br）CTGGCCTCA（Br）TCTTGGGCCT- 3' (exon 7, sense)
実施例４の取り込み標識に変えて、ｓｓＰＣＲ時のプライマーとして、実施例１の臭素標識モデル標的核酸と同様の方法によって臭素標識した上記配列番号：１２（塩基配列は配列番号：１０と同一）の一本鎖核酸を用いて標的核酸を標識した。
【０１４４】
他は実施例４と同じ手法でハイブリダイゼーション、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ観察をおき行なった。その結果、全体的に実施例４に較べてイオン強度は弱いものの、傾向としては実施例４と同様の結果が得られた。
【０１４５】
これらより、本発明のプローブ結合微粒子により、実際の細胞ゲノム由来の遺伝子が、ＰＣＲ時のプライマー標識による標的核酸の標識方法との併用により、一塩基ミスマッチを識別して検出可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明にかかる物体の標識方法を利用することで、例えば、バイオアッセイに用いるプローブ分子の固定化に利用される微細な粒子状の基体等、微小な物体に対しても、必要に応じて多数種の標識を付すが可能となる。換言するならば、本発明にかかる物体の標識方法を応用して、予め標識を付されている微細な粒子状の基体を利用し、該標識付きの微粒子表面に所定のプローブ分子を固定化することで、微粒子固定型の多数種のプローブ分子に対して、プローブ分子個々の種類判別に利用可能な標識を簡便に施すことが可能となる。また、上記標識方法によって標識された、例えば、微粒子を用いることにより、上記バイオアッセイが可能となる。
【配列表】
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