(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、又はその一部のアミノ酸が欠失若しくは置換され、及び／又は他のアミノ酸が付加されることにより配列番号２に示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有しているアミノ酸配列からなる、イネの金属−ニコチアナミン錯体トランスポーター。
【請求項２】
前記金属が、鉄及び／又はマンガンである請求項１に記載のトランスポーター。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のイネの金属−ニコチアナミン錯体トランスポーターをコードする塩基配列からなる遺伝子。
【請求項４】
遺伝子が、配列表の配列番号２０に示される塩基配列を含むものである請求項３に記載の遺伝子。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の遺伝子を含有してなるベクター。
【請求項６】
ベクターが、発現ベクターである請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項３又は４に記載の遺伝子を含有する遺伝子により形質転換された形質転換細胞。
【請求項８】
細胞が、植物細胞である請求項７に記載の形質転換細胞。
【請求項９】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、又はその一部のアミノ酸が欠失若しくは置換され、及び／又は他のアミノ酸が付加されることにより配列番号２に示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有しているアミノ酸配列からなり、イネの金属−ニコチアナミン錯体トランスポーターをコードする遺伝子を導入することからなる、植物における鉄錯体及び／又はマンガン錯体の体内輸送を調整する方法。
【請求項１０】
前記遺伝子が、配列表の配列番号２０に示される塩基配列を含む遺伝子である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
植物が、イネ科植物である請求項９又は１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、イネの金属錯体の吸収や輸送に関与しているトランスポーター、及びそれをコードする遺伝子、並びにそれを含有するベクター、及びその遺伝子による形質転換体に関する。イネは土壌中から鉄やマンガンなどの金属元素を吸収し、これを体内に輸送して鉄などの金属元素を補給している。本発明は、イネの生育に必須の成分である鉄などの金属元素の吸収や輸送に関与しているトランスポーターに関するものである。より詳細には、本発明は、イネの鉄やマンガンなどの金属錯体の吸収や輸送に関与しているトランスポーターＯｓＹＳＬ１〜１８、及びそれをコードする遺伝子、並びにそれを含有するベクター、及びその遺伝子による形質転換体に関する。
また、本発明は、ＯｓＹＳＬ２による植物における鉄錯体及び／又はマンガン錯体の体内輸送を調整する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  鉄は地殻上で４番目に存在量が多い元素であり、植物のみならず全ての生物にとって必須な栄養素の一つである。しかし、好気的条件下の土壌では多くの鉄は不溶態の３価鉄Ｆｅ（ＯＨ）３となる。特に塩類集積土壌、土壌がアルカリ性となる母材が石灰岩質の土壌では、土壌中のｐＨが高く、Ｆｅ（ＯＨ）３の溶解度は著しく下がる。植物は不溶態の鉄Ｆｅ（ＯＨ）３を吸収することができないため、このような土壌で生育する植物には深刻な鉄欠乏の症状が顕われる。世界の耕地面積のうち約３分の１は潜在的な鉄欠乏発生土壌といわれている。このため植物の鉄吸収や体内での輸送、分配、代謝のメカニズムを解明し、鉄欠乏に耐性を持つ植物を創り出すことは、昨今問題になっている食料問題の解決にとって非常に重要な課題である。【０００３】  高等植物は不溶態の３価鉄を利用するための機構を進化的に獲得してきた。植物におけるこのような鉄獲得機構は２つに大別でき、ストラテジー−Ｉ（Ｓｔｒａｔｅｇｙ−Ｉ）、及びストラテジー−ＩＩ（Ｓｔｒａｔｅｇｙ−ＩＩ）と呼ばれている。ストラテジー−Ｉはイネ科以外の植物に見られ、次のような特徴を持っている。まず根圏にキレート化合物を分泌し、不溶態の３価鉄を可溶化する。この３価鉄を根の細胞膜上の３価鉄還元酵素（ＦＲＯ２）で２価鉄に還元し、２価鉄トランスポーター（ＩＲＴ１）を介して２価鉄を吸収する。また、３価鉄の溶解度を上げ、３価鉄還元酵素の活性を高めるためにプロトンを放出し根圏のｐＨを下げている。一方、ストラテジー−ＩＩはイネ科植物に見られ、ムギネ酸類という化合物に特徴を持っている。イネ科植物は根からムギネ酸類を分泌し、ムギネ酸類は根圏の不溶態３価鉄をキレートし、可溶化する。植物はこの可溶化した「ムギネ酸類−３価鉄」錯体を根の「ムギネ酸類−３価鉄」トランスポーターを介して吸収することにより鉄を獲得している。【０００４】  このような「ムギネ酸類−３価鉄」トランスポーターのひとつが、キューリーら（非特許文献１参照）によってトウモロコシから初めて単離され、「鉄−ムギネ酸類」錯体のトランスポーターをコードする遺伝子ＹＳ１と命名された。
また、ムギネ酸類を鉄獲得に利用するのはストラテジー−ＩＩに属するイネ科植物のみであるが、ムギネ酸類を体内で合成しないストラテジー−Ｉの植物に属するシロイヌナズナのゲノム上にも、８つものＹＳ１様の遺伝子（ＡｔＹＳＬ）が存在することが報告されてきた。ストラテジー−Ｉの植物は、ムギネ酸類を体内で合成しないのであるから「ムギネ酸類−３価鉄」トランスポーターは必要ないはずである。ストラテジー−Ｉの植物にこのようなトランスポーターが存在することは、ＹＳ１様のトランスポーターが「ムギネ酸類−３価鉄」複合体のみを輸送するものではなく、「鉄−ニコチアナミン」錯体をも輸送するトランスポーターであると推測されている。即ち、ストラテジー−Ｉの植物であるシロイヌナズナのＹＳ１様の遺伝子（ＡｔＹＳＬ）は、植物体内での鉄輸送に関与していると考えられている「鉄−ニコチアナミン」錯体を輸送するトランスポーターをコードしているものと推測されている。【０００５】  本発明者らは、潜在的な鉄欠乏発生土壌においても生育可能な鉄吸収機構が強化された植物、とりわけ穀物植物を創製するために、植物の鉄吸収や体内での輸送、分配、代謝のメカニズムを解明する研究、特に鉄吸収に必要なムギネ酸の合成に関与する酵素群の解明を行ってきた（特許文献１〜４参照）。このような鉄欠乏に耐性を持つ植物、特にイネを創り出すことは、世界の食料問題の解決にとって非常に重要な課題である。
これまでの研究において、ムギネ酸類の合成酵素をコードする各種の遺伝子を本発明者らはクローニングしてきた。このような遺伝子を用いることにより、潜在的な鉄欠乏発生土壌における不溶態の鉄Ｆｅ（ＯＨ）３を植物が吸収可能な「ムギネ酸類−３価鉄」複合体に転換することが可能となった。例えば、最近の研究では、大麦のニコチアナミンアミノ転位酵素（ＮＡＡＴ）の遺伝子を導入した形質転換イネは、低Ｆｅのアルカリ土壌での生育において野生型よりも許容性があることが示されている（非特許文献２参照）。しかしながら、ムギネ酸類の分泌が増強されて土中に可溶化した「ムギネ酸類−３価鉄」複合体が生成しても、当該複合体を植物が吸収するためには、「ムギネ酸類−３価鉄」トランスポーターが必須のものとなる。
このように、鉄欠乏土壌におけるイネの生育を改善するためには、土中におけるムギネ酸類の分泌を改善させるだけでなく、それを吸収し、植物体の必要な箇所に輸送するための吸収輸送機構の改善が同時に必要となる。イネにおける鉄などの金属成分の吸収や輸送のための「ムギネ酸類−３価鉄」トランスポーターは未だ見出されておらず、イネにおける「ムギネ酸類−３価鉄」トランスポーターをコードする遺伝子の解明が求められていた。【０００６】
【特許文献１】ＷＯ９９／５７２４９号
【特許文献２】ＷＯ９９／４８３５６号
【特許文献３】ＷＯ０１／０１７６２号
【特許文献４】ＷＯ０２／０７７７２４０号
【非特許文献１】Ｃｕｒｉｅ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３４６−３４９（２００１）
【非特許文献２】Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４６６−４６９（２００１）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  本発明は、イネにおける鉄などの金属錯体の吸収や輸送に関与するトランスポーター及びその遺伝子を提供するものである。より具体的には、例えば、「ムギネ酸類−３価鉄」トランスポーター及びそれをコードする遺伝子、並びに「鉄−ニコチアナミン」錯体などの「金属−ニコチアナミン」錯体トランスポーター及びそれをコードする遺伝子などの金属錯体の吸収や輸送に関与するトランスポーター及びその遺伝子を提供するものである。また、本発明は、これらの遺伝子を含有するベクター、形質転換体を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明者らは、鉄などの金属元素の吸収や輸送が強化された潜在的な鉄欠乏発生土壌においても生育可能なイネを創出するために、鉄の吸収や輸送に関与している各種の酵素類のクローニングを行ってきた。これまでの研究により、イネが鉄を吸収し輸送するためのメカニズムを解明することができてきたが、イネの細胞が鉄を取り込むためのトランスポーターについては未だ解明されていなかった。トランスポーターは細胞や細胞内オルガネラが各種の栄養分や成分を内部に取り込むために必須のタンパク質であり、鉄吸収や輸送が強化された潜在的な鉄欠乏発生土壌においても生育可能なイネを創出するためには、各種の酵素類と共に必須のタンパク質となる。このために、本発明者らは、イネのトランスポーターのクローニングを試み、イネには鉄などの金属元素の錯体の吸収や輸送に関与する１８種のトランスポーターが存在していることを見出した。
さらに、本発明者らは、この中のＯｓＹＳＬ２が植物における鉄及びマンガンのニコチアナミン錯体の輸送に関与しているトランスポーターであることを見出した。【０００９】  即ち、本発明は、イネの鉄などの金属錯体の吸収や輸送に関与するトランスポーターに関する。より詳細には、本発明は、配列表の配列番号１〜１８のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はその一部のアミノ酸が欠失若しくは置換され、及び／又は他のアミノ酸が付加されることにより配列番号１〜１８のいずれかに示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有しているアミノ酸配列を有し、かつイネの鉄やマンガンなどの金属錯体の吸収や輸送に関与する機能を有するイネのトランスポーターに関する。
また、本発明は、前記した本発明のイネ由来のトランスポーターをコードし得る塩基配列を有する遺伝子、より詳細には、配列表の配列番号１９〜３６のいずれかに示される塩基配列、又はストリンジェントな条件でこれとハイブリダイズ可能な塩基配列を有する遺伝子に関する。
また、本発明は、前記した本発明の遺伝子を含有してなるベクター、及び当該遺伝子を含有する遺伝子により形質転換された形質転換細胞に関する。
さらに、本発明は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、又はその一部のアミノ酸が欠失若しくは置換され、及び／又は他のアミノ酸が付加されることにより配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有しているアミノ酸配列をコードする遺伝子を導入することからなる、植物における鉄錯体及び／又はマンガン錯体の体内輸送を調整する方法に関する。【００１０】  本発明者らは、トウモロコシのＹＳ１遺伝子（非特許文献１参照）との相同性に基づいてイネの遺伝子（ＯｓＹＳＬ）を検索した。このためのイネの遺伝子（ＯｓＹＳＬ）として、ジャポニカ種のイネとしてＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｓｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ（ｃｖ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）（Ｇｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を、またインディカ種のイネとしてＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｓｓｐ．ｉｎｄｉｃａ（ｃｖ．９１−１１）（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）の２つのイネゲノムデータベースを用いて、これらに対してブラスト（Ｂｌａｓｔ）検索（Ａｔｌｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）を行った。以下、ジャポニカ種のデータベースをシンジェンタのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｐｏｒｔａｌ．ｔｍｒｉ．ｏｒｇ／ｒｉｃｅ／）と呼び、インディカ種のデータベースを中国のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｂｔｎ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎ／ｒｉｃｅ／）と呼ぶことにする。
検索では、シンジェンタのデータベースを主に参考にした。しかし、このデータベースはシロイヌナズナのものほど完成されておらず、各コンティグがばらばらの状態での開示されており、そのため検索で得られたＹＳ１に相同性が高いコンティグもＯｓＹＳＬの全長を含んでいない場合が多かった。また、塩基解読の精度もそれほど高くなく、不明の塩基も数多くあった。そこで、中国のデータベースを検索することで得られたインディカ種のＯｓＹＳＬの塩基配列も参考にした。これらの配列を基に、ばらばらになっていたジャポニカ種のＯｓＹＳＬについても断片をつなぎ合わせ、推測される全長を同定した。
その結果、イネのゲノム中に１８個のＹＳ１に相同性の高い遺伝子が存在することを見出した。これらの１８種の遺伝子を、それぞれＯｓＹＳＬ１〜ＯｓＹＳＬ１８と命名した。
そして、これらの遺伝子がイネの鉄輸送にかかわるトランスポーターの遺伝子であるかどうかを検討した。【００１１】  ブラスト（Ｂｌａｓｔ）検索により見いだされた遺伝子はゲノムの配列であり、イントロンを含むために、エキソンを予測し、それらをつなぎ合わせて推測されるタンパク質のアミノ酸配列を決定しなければならない。しかし、キューリーら（非特許文献１参照）はＹＳ１のゲノム配列を明らかにしておらず、ＹＳ１のｃＤＮＡは７つのエキソンから成り立っていることだけが報告されている。したがって、キューリーらのこの報告のみからエキソン領域を予測することはできないので、シロイヌナズナのＹＳＬ遺伝子のひとつであるＡｔＹＳＬ３のゲノム配列とＹＳ１のｃＤＮＡ配列を比べることにより、ＡｔＹＳＬ３のイントロン及びエキソンの位置を決定することにした。シロイヌナズナのゲノム配列は明らかになっているので、このゲノム配列及びＡｔＹＳＬ３の配列に基づいてＡｔＹＳＬ３のイントロンとエキソンの位置を決定した。この結果を図１に示す。図１（Ａ）はＡｔＹＳＬ３のゲノム配列を示している。灰色の部分がエキソン領域を示しており、白色の部分がイントロンを示している。図１の（Ｂ）はＡｔＹＳＬ３の推測されるｍＲＮＡの構造を模式的に示したものである。白三角印はイントロンを示し、その上の数字はその大きさを示している。このシロイヌナズナのＡｔＹＳＬ３のゲノム構造に基づいてＯｓＹＳＬのイントロン及びエキソンを予測した。
ゲノム配列から予測されるＯｓＹＳＬのＯＲＦがコードするタンパク質のアミノ酸配列を、図１に示すトウモロコシのＹＳ１から予測し、ＳＯＳＵＩプログラム（Ｈｉｒｏｋａｗａ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１４，３７８−３７９（１９９８））で各ＯｓＹＳＬタンパク質の膜貫通領域を予測した。この結果、予測される膜貫通領域が７個から１６個存在することが予想され、いずれも膜に存在するタンパク質である可能性が高かいことがわかった。【００１２】  得られた全てのＯｓＹＳＬは、最後のエキソンが８００塩基以上であったので、その一部をノーザン解析のプローブとして用いることとし、その断片を増幅するようなプライマー対を設計した。これらのプライマーの配列を次の表１に示す。【００１３】
0004699211.tif 000002
0004699211.tif 000003
【００１４】  一つのエキソン内でプライマー対を設計したことにより、ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲをしても、ｃＤＮＡを鋳型にした場合と同じ断片を増幅できるようにした。ＯｓＹＳＬ１、ＯｓＹＳＬ８、ＯｓＹＳＬ１６のＰＣＲにはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ）、その他の遺伝子のＰＣＲにはＥｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）をＤＮＡポリメラーゼとして用いた。ＯｓＹＳＬ１の増幅の際、反応液にＤＭＳＯを終り濃度５％（ｖ／ｖ）になるように加えた。ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−で増幅された断片はｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、その他の断片はｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。クローニングの方法はキットに付属のプロトコールに従った。塩基配列を確認し、クローニングされた断片が目的のものであることを確かめた。【００１５】  得られたベクターを鋳型として断片を増幅し、３２Ｐによる標識をしてプローブして用いたノーザン解析を行った。試料として、イネの第五葉目が展開した時に鉄欠乏処理を開始し、１０日間鉄を除いた水耕液で栽培することで行った。コントロール条件のイネはそれまでと同じ濃度の鉄を加えた水耕液で栽培した。処理後１０日目にコントロール区、及び鉄欠乏区ともにサンプリングを行い、鉄欠乏によるＯｓＹＳＬの発現の変化を調べた。
結果を図２に図面に変わる写真で示す。図２の上からＯｓＹＳＬ２、ＯｓＹＳＬ６、ＯｓＹＳＬ１３、ＯｓＹＳＬ１４、ＯｓＹＳＬ１５、及びＯｓＹＳＬ１６をそれぞれ示す。各ＯｓＹＳＬの左側は根からのサンプルによるものであり、右側は葉からのサンプルによるものである。各サンプルの左側はコントロール条件（鉄十分条件）で栽培したものであり、右側は鉄欠乏条件で栽培したものである。【００１６】  イネに鉄を充分与えたコントロール条件（以下、鉄十分条件とも言う。）と、鉄を与えない鉄欠乏条件で水耕栽培し、ＯｓＹＳＬ遺伝子の発現様式をノーザン解析によって明らかにした。ノーザン解析で転写産物が検出できたものについてのみ、図２に示している。ＯｓＹＳＬ１５とＯｓＹＳＬ１６は根特異的に発現していた。ＯｓＹＳＬ１５はコントロール条件では根においてもほとんど発現していなかったが、鉄欠乏処理によって発現が強く誘導された。一方、ＯｓＹＳＬ１６は根においてコントロール条件でも微弱に発現し、鉄欠乏条件で僅かに発現が誘導された。ＯｓＹＳＬ２は鉄欠乏条件の葉でのみ、発現が観察された。ＯｓＹＳＬ６は葉、根のどちらでもコントロール条件で発現していて、鉄欠乏処理により発現が抑制された。ＯｓＹＳＬ１３は葉でも根でもコントロール条件で発現していた。葉における発現は鉄欠乏処理によって抑制されたが、根における発現に変化は無かった。一方、ＯｓＹＳＬ１４は葉、根のどちらでもコントロール条件で発現しており、鉄欠乏処理による発現の変化は観察されなかった。その他の遺伝子に関しては今回の栽培条件では発現は観察されなかった。
一方、オオムギでは根における「鉄−ムギネ酸類」錯体の吸収活性は鉄欠乏誘導的で、オオムギの根の細胞膜には鉄欠乏処理により誘導されるタンパク質がある（Ｍｉｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｍｏｒｉ，１９８９）。イネでも同様の応答が起きていると仮定すれば、「鉄−ムギネ酸類」錯体の吸収トランスポーターは特に根で鉄欠乏によって発現が誘導されると考えられる。
本発明のＯｓＹＳＬ１５とＯｓＹＳＬ１６は、前記したように根特異的に発現し、鉄欠乏条件で発現が誘導されることがノーザン解析によって明らかとなった（図２参照）。【００１７】  ブラスト検索で得られたＯｓＹＳＬ１〜１８の翻訳領域のアミノ酸配列と、トウモロコシのＹＳ１のアミノ酸配列とを比較した。結果を図３〜図５に示す。各行の最上段はＹＳ１のアミノ酸配列を示す。各行の最下段はこれらの相同性を示し、＊印は全てで保存されているアミノ酸であることを示し、・印は高度に保存されているアミノ酸であることを示す。
また、本発明の１８個のＯｓＹＳＬであるＯｓＹＳＬ１〜１８の塩基配列の比較を、図６〜図１４に示す。各行の最下段はこれらの相同性を示し、＊印は全てで保存されている塩基であることを示し、・印は高度に保存されている塩基であることを示す。
これらのＯｓＹＳＬ１〜１８のアミノ酸配列を配列番号１〜１８に示し、その塩基配列を配列表の配列番号１９〜３６にそれぞれ示す。
また、これらのＯｓＹＳＬ１〜１８の遺伝子が存在する染色体の番号（Ｃｈｒ．）、アミノ酸長（Ｌｅｎｇｔｈ）、及びＤＤＢＪにおいてＯｓＹＳＬ１〜１８の遺伝子が存在するＣｏｎｔｉｇをまとめて次の表２に示す。【００１８】
【表２】
0004699211.tif 000004
【００１９】  トウモロコシのＹＳ１、ロイヌナズナのＹＳＬ（ＡｔＹＳＬ）、及び本発明のイネのＯｓＹＳＬのアミノ酸配列に基づいて分子系統樹を作製した。結果を図１５に示す。図１５では、トウモロコシのＹＳ１を赤色、シロイヌナズナのＡｔＹＳＬ１〜８を緑色、そして本発明のイネのＯｓＹＳＬ１〜１８を青色で示している。この系統樹から明らかなようにこれらのトランスポーターは大きく５種類に分類される。ＹＳ１やＡｔＹＳＬ３と同様な位置に分類されるＯｓＹＳＬ２（＊）、１５（＊）、１６（＊）、及び９からなる第１群、ＡｔＹＳＬ４と同様な位置に分類されるＯｓＹＳＬ６（＊）、及び５からなる第２群、ＡｔＹＳＬ７と同様な位置に分類されるＯｓＹＳＬ１０からなる第３群、ＯｓＹＳＬ１３（＊）、１４（＊）、１１、及び１２のイネのトランスポーターのみからなる第４群、同様にＯｓＹＳＬ１、３、４、７、８、１７、及び１８のイネのトランスポーターのみからなる第５群となる。各ＯｓＹＳＬの後に付した（＊）印は前記したノーザン解析により発現が確認されたものを示している。【００２０】  これらのトランスポーターの中では、ＯｓＹＳＬ１５とＯｓＹＳＬ１６がＹＳ１に最も近く位置した（図１５参照）。これらの結果から、ＯｓＹＳＬ１５とＯｓＹＳＬ１６は「鉄−ムギネ酸類」錯体の吸収トランスポーターであると考えられる。これは、酵母を用いたインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）系で、ＯｓＹＳＬ１５およびＯｓＹＳＬ１６が「鉄−ムギネ酸類」錯体のトランスポーターであることを確認することができる。具体的には、本発明者らが開発した酵母の鉄吸収変異株ｆｒｔ１ｆｅｔ３ｆｒｅ１（Ｂｕｇｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２）を用いる。この酵母にＯｓＹＳＬ１５またはＯｓＹＳＬ１６を過剰発現させ、鉄源として「鉄−ムギネ酸類」錯体のみを与えた培地で生育できるかどうかを判定することにより、これらのタンパク質が「鉄−ムギネ酸類」錯体のトランスポーターであることを確認することができる。
さらに、アフリカツメガエル卵母細胞でＯｓＹＳＬ遺伝子を発現させ、「鉄−ムギネ酸類」、「鉄−ニコチアナミン」錯体を輸送するかどうかを確かめることにより、これらのタンパク質が「鉄−ムギネ酸類」、「鉄−ニコチアナミン」錯体のトランスポーターであることを確認することができる。
また、ＯｓＹＳＬ１５とＯｓＹＳＬ１６の各プロモーター領域１．５ｋｂにＧＵＳレポーター遺伝子をつないだ、それぞれのコンストラクトでイネを形質転換して、形質転換植物のＴ１種子を用いてこれらの遺伝子の発現の組織局在を観察することができる。【００２１】  ＯｓＹＳＬ１５とＯｓＹＳＬ１６と同じ第１群に属するＯｓＹＳＬ２は、鉄欠乏条件の葉でのみ発現していた（図２参照）。この結果からだけではＯｓＹＳＬ２が「鉄−ムギネ酸類」錯体または「鉄−ニコチアナミン」錯体のいずれのトランスポーターとして機能しているのかどうかを推測できないが、鉄などの金属のトランスポーターであることは確かであった。
本発明者らは、ＯｓＹＳＬ２の機能についてさらに検証し、そして、ＯｓＹＳＬ２が「鉄−ムギネ酸類」錯体または「鉄−ニコチアナミン」錯体のいずれのトランスポーターとして機能しているのかをさらに検証した。【００２２】  ＯｓＹＳＬ２の発現をＧＦＰ法にてタマネギの表皮細胞で調べた。結果を図１６に図面に代わるカラー写真で示す。図１６ａはＯｓＹＳＬ２とＧＦＰの融合タンパク質の場合の結果を示し、図１６ｂはＧＦＰタンパク質単独の場合の結果を示す。この結果、ＧＦＰ単独では、細胞の原形質と核の両方に局在しているが（図１６ｂ参照）、ＯｓＹＳＬ２とＧＦＰの融合タンパク質の場合には原形質膜に局在して存在することを観察することができた（図１６ａ参照）。このことからＯｓＹＳＬ２は、膜貫通領域を保持するとともに原形質膜に局在するトランスポーターであることが確認された。
ＯｓＹＳＬ２の発現は、先のノーザンブロット解析ではイネに鉄を十分与えたコントロール条件と鉄を与えない鉄欠乏条件の根では共に検出できなかったが、ＧＵＳレポーター遺伝子を結合させた分析では、コントロール条件下のイネの根中心部で検出され、鉄欠乏条件下では発現が増加していることを観察することができた。結果を図１７に図面に代わるカラー写真で示す。図１７ａは鉄十分条件での結果を示し、図１７ｂは鉄欠乏条件での結果を示す。図１７ａ及びｂの右下の写真はそれぞれ中心柱の中の篩部の細胞の倍率を上げて撮影した結果を示している。いずれも青色部分が発現を示している。しかし、鉄欠乏条件下の根の表皮および皮層においてもＯｓＹＳＬ２が検出されていないことは、ＯｓＹＳＬ２が土からの「鉄−ムギネ酸」錯体のトランスポーターではないことを示している。【００２３】  次にイネの葉におけるＯｓＹＳＬ２の発現についてＧＵＳレポーター遺伝子を結合させた分析を行った。結果を図１８及び図１９に図面に代わるカラー写真で示す。図１８ａは、葉鞘の維管束でのＧＵＳ発現を示し、図１８ｂは葉鞘の維管束の部分を拡大して示している。この結果、ＯｓＹＳＬ２の発現は篩部と、伴細胞（図１８ｂの矢印）の中で明瞭に観察された。図１９ａは鉄十分条件での葉におけるＧＵＳに発現（青色）を示し、図１９ｂは鉄欠乏条件でのＧＵＳの発現（青色）を示す。この結果、鉄十分条件の葉では、ＧＵＳ染色は伴細胞を含む篩部での局在が観察されるが、鉄欠乏条件の葉では、すべての組織が伴細胞（図１９の各矢印）と共に明確な強いプロモーター活性を示していることが観察された。このように、鉄を十分与えたコントロール条件下（鉄十分条件）では、イネの葉鞘と葉の維管束の篩部細胞にＯｓＹＳＬ２の発現を観察することができ（図１９ａ参照）、また鉄欠乏条件下では、イネの葉鞘と葉の維管束のすべての細胞でＯｓＹＳＬ２の強い発現を観察することができた（図１９ｂ参照）。【００２４】  さらに、同様にしてイネの生殖成長におけるＯｓＹＳＬ２の発現を調べた。結果を図２０に図面に代わる写真で示す。図２０は、花と種子における維管束でのＧＵＳの発現を調べた結果を示し、図２０ａは開花の前の結果を示し、図２０ｂは受精後の結果を示し、図２０ｃは受精後５日目の結果を示し、図２０ｄは受精後８日目の結果を示し、図２０ｅは受精後２０日目の結果を示し、図２０ｆは受精後の３０日目の結果をそれぞれ示す。この結果、ＧＵＳの発現は、開花前の花粉粒ではまったくなく、雄しべのヤクの中央領域では少し、小穂維管束では活発であることが観察することができた（図２０ａ参照）。花の受精後は、維管束でのＯｓＹＳＬ２発現が強くなり、特にモミの上部では顕著であることが観察できた（図２０ｂ参照）。開花の５日後には、成長している子房にＯｓＹＳＬ２の強い発現が観察でき（図２０ｃ参照）、８日後にはたんぱく質とミネラルの蓄積される胚と胚乳の外皮に強い発現を観察することができた（図２０ｄ参照）。２０日後には、子房は十分成長し、成熟した胚と胚乳の辺縁層にＯｓＹＳＬ２発現を観察でき（図２０ｅ参照）、３０日後にも同じような発現を観察することができた（図２０ｆ参照）。このことは、ＲＴ−ＰＣＲ解析でも種子��成長初期にＯｓＹＳＬ２の転写物が増加し、前述の事象を検証することができた（図２１参照）。【００２５】  アフリカツメガエル卵母細胞にＯｓＹＳ２遺伝子を発現させ、「鉄−ムギネ酸類」、「鉄−ニコチアナミン」などの「金属−ニコチアナミン」錯体を輸送するかどうかを調べた結果、ＯｓＹＳ２タンパク質が「鉄−ムギネ酸類」のトランスポーターではなく、「鉄−ニコチアナミン」、「マンガン−ニコチアナミン」錯体のトランスポーターであることが明らかになった。また、関連する化合物の基質誘導性内向電流を測定すると、ＯｓＹＳＬ２は「鉄−ニコチアナミン」錯体および「マンガン−ニコチアナミン」錯体のトランスポーターとして活性であるが、「鉄−デオキシムギネ酸」錯体および「マンガン−デオキシムギネ酸」錯体のトランスポーターとしてまったく活性がないことが確認できた（図１９ａおよび１９ｂ参照）。しかし、ＯｓＹＳＬ２は「マンガン−ニコチアナミン」錯体のトランスポーターとして活性を持つにもかかわらず、マンガン欠乏条件下でのイネの根および葉ではノーザン解析でＯｓＹＳＬ２発現の増加を確認することができなかった。また、「亜鉛−ニコチアナミン」錯体、「銅−ニコチアナミン」錯体およびの他の金属キレート錯体では、ＯｓＹＳＬ２の輸送活性を確認することができなかった。【００２６】  ＯｓＹＳＬ２の更なる特徴は、染色体２（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ２）の下腕部分に存在していることである。ＺｍＹＳ１とのアミノ酸配列比較にて７つのエキソンがあることと、１４の膜貫通領域（図２２ａおよび図２２ｂ参照）を含む６７４のアミノ酸からなることである。
イネでは、鉄欠乏によりクロロシスを呈した葉でイネのニコチアナミン合成酵素（ＯｓＮＡＳ）の１種であるＯｓＮＡＳ１、及びＯｓＮＡＳ２の発現が強く誘導されており（Ｉｎｏｕｅ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，３６，３６６−３８１）、ＯｓＮＡＳ１、ＯｓＮＡＳ２によって合成されたニコチアナミンが鉄欠乏条件の葉で発現したＯｓＹＳＬ２と何らかの相互作用を持っている可能性も考えられる。また、ショルツ（Ｓｃｈｏｌｚ（１９８９））は、ニコチアナミンが新根や新葉への鉄の再分配に関与し、再分配が篩管を経て行われていることを示唆している。鉄欠乏条件では古い葉から新しい葉へ鉄がＯｓＹＳＬ２を介して再転流しているのかもしれない。【００２７】  第２群に属するＯｓＹＳＬ６と、第４群に属するＯｓＹＳＬ１３はコントロール条件の葉で発現し、鉄欠乏処理によって発現が抑制された（図２参照）。シロイヌナズナのＡｔＹＳＬのうちの一つは同様にコントロール条件の葉で発現し、鉄欠乏処理によって発現が抑制されたことが報告されている（Ｊｅａｎ  ＭＬ．，ｅｔ  ａｌ．，ＵｄｉｎｅＩｔａｌｙ，ｐ１２８（２００２））。さらに、の遺伝子は鉄過剰処理により葉での発現が誘導され、この遺伝子を破壊した変異株は過剰の鉄に感受性を示すことも報告されている（Ｊｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
これらの知見からすれば、本発明のＯｓＹＳＬ６、ＯｓＹＳＬ１３のどちらか、または双方が、過剰の鉄に対する耐性に関与しているのかもしれない。過剰の鉄を何らかの細胞内のオルガネラに隔離するためのトランスポーターとして機能しているのかもしれないことが予想される。このことは鉄過剰処理したイネを栽培し、ノーザン解析により確認することができる。また、ＯｓＹＳＬ６やＯｓＹＳＬ１３が恒常的に土壌からの「鉄−ムギネ酸類」錯体の吸収を行っていることも考えられる。イネマイクロアレイ解析の結果、ＯｓＹＳＬ１３は、亜鉛欠乏により葉で発現が誘導されることが明かになった。このことからＯｓＹＳＬ１３は「亜鉛−ニコチアナミン」トランスポーターとして機能していることも考えられる。いずれにしても、レポーター遺伝子を用いた発現の組織特異性の解析や、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でのトランスポーター活性の確認を行うことにより、機能や組織内の分布などについてのさらなる知見を得ることができる。【００２８】  第４群のＯｓＹＳＬ１４は葉、根のどちらでも発現しており、鉄欠乏処理による発現の変化は見られなかった（図２参照）。このことは、鉄以外の金属元素の輸送に関連している可能性がある。植物体内で合成されるニコチアナミンは、鉄だけでなく、マンガン、亜鉛、コバルト、ニッケル、銅などの遷移金属元素と比較的安定なキレートを形成することがしられており、これらの遷移金属元素が鉄と同様にニコチアナミンと錯体を形成して輸送されるのであれば、本発明のＯｓＹＳＬ１４は鉄以外の金属元素とニコチアナミンとの錯体の輸送に関与している可能性がある。【００２９】  前記したノーザン解析の結果においては、上記以外の１２個のＯｓＹＳＬの発現は観察されなかった。しかし、これらの１２個のＯｓＹＳＬも、発現が確認された６個のＯｓＹＳＬと同様にゲノムデータベースの検索によって見出された遺伝子なので、これらは発現していない擬似遺伝子の可能性もある。また、これらの遺伝子は他の金属元素欠乏ストレスや、過剰ストレス、または生育段階によって発現が制御されていて、今回の栽培条件では発現していなかったのかもしれない。実際、今回発現が確認できなかったＯｓＹＳＬ４、ＯｓＹＳＬ８、ＯｓＹＳＬ１０、及びＯｓＹＳＬ１２は、イネゲノムプロジェクトによる完全長ｃＤＮＡライブラリー中に見出された。これらの４種類のｃＤＮＡクローンは花から抽出したｍＲＮＡをもとに作ったｃＤＮＡライブラリーから見出されるものである。これらの遺伝子は生殖段階において特異的に発現しているのかもしれない。
さらに、農業生物資源研究所遺伝子機能研究チームによって作成されているＴｏｓ１７によるイネの遺伝子破壊系統の中に、ＯｓＹＳＬ１２が破壊された変異株（ＮＥ７０２４）が見出された。この変異株は半分が不稔形質を示していた。したがって、１８個のＯｓＹＳＬのうちのいくつか、特にＯｓＹＳＬ１２が生殖段階で「金属−ニコチアナミン」錯体の輸送に関与している可能性は高い。【００３０】  ＯｓＮＡＳ１と同様にプロモーター領域をβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子につないだコンストラクトを作成し、形質転換イネを作出することにより、さらに詳細な発現の変化を観察したり、発現している組織を特定したりすることが出来る。その形質転換体を用いて様々な金属元素の欠乏、過剰処理を行うことで鉄やその他の金属元素の植物体内での輸送や移行に関する知見が得られる。
例えば、ＯｓＹＳＬ２、ＯｓＹＳＬ６、ＯｓＹＳＬ９、ＯｓＹＳＬ１３、ＯｓＹＳＬ１４、ＯｓＹＳＬ１５、及びＯｓＹＳＬ１６の各プロモーター領域１．５ＫｂにＧＵＳレポーター遺伝子をつないで、それぞれのコンストラクトを用いて、常法によりイネを形質転換対を作製して、様々な金属元素の欠乏、過剰処理を行うことで鉄やその他の金属元素の植物体内での輸送や移行に関する知見をえることができる。【００３１】  今回ノーザン解析で発現が認められたＯｓＹＳＬに関してはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、得られたクローンがコードするＯｓＹＳＬが「鉄−ムギネ酸類」または「鉄−ニコチアナミン」のトランスポート活性を有するかどうか確認しなければならない。
また、井上ら（２００１）が行った鉄欠乏イネへの鉄分の葉面散布の実験では、鉄をニコチアナミンとの錯体として与えた場合にはクロロシスを回復したが、ムギネ酸類の一種であるデオキシムギネ酸との錯体で与えた場合や、塩化第二鉄として与えた場合にはクロロシスの回復は見られなかった。このことは、イネの葉で発現しているＯｓＹＳＬが、葉面から与えられた「鉄−ニコチアナミン」錯体の吸収に関与していることを予測させる。「鉄−デオキシムギネ酸」錯体を与えた場合にクロロシスを回復しなかったことは興味深く、ＯｓＹＳＬは輸送する基質を厳しく選択している可能性がある。酵母の鉄吸収変異株ｆｒｔ１ｆｅｔ３ｆｒｅ１（Ｂｕｇｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を用いて相補実験を行えば、これらのＯｓＹＳＬが「鉄−ニコチアナミン」錯体と「鉄−デオキシムギネ酸」錯体を選択しているのかどうかが明らかになるだろう。
ニコチアナミンは鉄以外の遷移金属元素もキレートし、特に銅はニコチアナミンとの錯体で導管内を輸送されている（Ｐｉｃｈ  ａｎｄ  Ｓｃｈｏｌｚ，１９９６）。また、亜鉛、マンガンなどの金属元素の篩管を通じた輸送にニコチアナミンが関与していると示唆されている（Ｓｔｐｈａｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｏｌｚ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，８８，５２２−５２９（１９９３））。銅や亜鉛、マンガンなどの金属元素を吸収できない酵母の変異株（それぞれｃｔｒ１（Ｄａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、ｚｒｔ１ｚｒｔ２（Ｚａｏ  ａｎｄ  Ｅｉｄｅ，１９９６）、ｓｍｆ１（Ｓｕｐｅｋ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３，５１０５−５１１０（１９９６））を用いて、相補実験を行うことによりＯｓＹＳＬが鉄以外の金属元素の輸送に関与しているかどうかの知見を得ることができる。また、アフリカツメガエル卵母細胞に１８個のＯｓＹＳＬ遺伝子を発現させ、「鉄−ムギネ酸類」、「鉄−ニコチアナミン」、「金属−ニコチアナミン」錯体を輸送するかどうかを確かめることにより、これらのタンパク質が「鉄−ムギネ酸類」、「鉄−ニコチアナミン」、「金属−ニコチアナミン」錯体のどの種類のトランスポーターであるかを確認することができる。【００３２】  このために、本発明者らは、アフリカツメガエル卵母細胞を使用してＯｓＹＳＬ２の輸送活性と基質特異性を調べた。ＯｓＹＳＬ２を卵母細胞で発現させ、各種の基質で誘発される６０ｍＶの電流を測定した。この結果を図２３にグラフで示す。図２３ａは、各種の基質についての電流（μＡ）を測定した結果を示し、図２３ｂは鉄とマンガンのニコチアナミン（ＮＡ）と２’−デオキシムギネ酸（ＤＭＡ）錯体についての基質添加後の電流（μＡ）の変化を示す。この結果、驚いたことに、ＯｓＹＳＬ２はＦｅ（ＩＩ）−ＮＡとＭｎ（ＩＩ）−ＮＡを輸送したが、ＤＭＡ錯体はいずれも輸送しないことがわかった。これによって、ＯｓＹＳＬ２は、イネの金属−ＤＭＡ錯体ではなく、金属−ＮＡ錯体の輸送のための機能を有することが判明した。また、ＯｓＹＳＬ２が鉄の他にＭｎ（ＩＩ）−ＮＡを輸送する機能を有することから、マンガンの欠乏がＯｓＹＳＬ２の発現を引き起こすかどうかをノーザンブロット解析で検討したが、ＯｓＹＳＬ２の転写はＭｎマンガン欠乏イネの根でも葉でも増加しなかった（ここでは、データは示さない。）。
以上のことから、本発明のＯｓＹＳＬ２が、穀物植物におけるミネラル栄養素の篩部の輸送と移動にかかわるＦｅの制御下における金属−ＮＡのトランスポーターであることが確証された。【００３３】  本発明の１８個のＯｓＹＳＬは、全て細胞膜に存在すると予測された。しかし、鉄欠乏処理によって発現が抑制されたＯｓＹＳＬ６やＯｓＹＳＬ１３がイネの鉄過剰に対する耐性に関与しているとすれば、ＯｓＹＳＬ６やＯｓＹＳＬ１３は細胞膜に存在するよりも、液胞膜に存在する可能性が高い。ピッチら（Ｐｉｃｈ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔａ，２１３，９６７−９７６（２００１））は、鉄過剰処理したトマトの液胞中のニコチアナミン濃度が増加したと報告している。液胞は葉緑体におけるフェリチンと共に鉄の貯蔵に関与していると考えられており、ピッチら（Ｐｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００１））は細胞質に存在する過剰な鉄はニコチアナミンとともに液胞に輸送されていることを示唆している。この機構に本発明のＯｓＹＳＬ６やＯｓＹＳＬ１３が関与しているものと考えられる。このような細胞内での局在は、ｓＧＦＰなどとの融合タンパク質を用いて確認することができる。【００３４】  本発明のイネの鉄やマンガンなどの金属錯体の吸収や輸送に関与するトランスポーター（ＯｓＹＳＬ）は、配列表の配列番号１〜１８に示されるアミノ酸配列を有するイネ由来のものに限定されるものではなく、イネにおける鉄やマンガンなどの金属錯体の吸収や輸送に関与するトランスポーターとしての機能を有するものであれば、その一部のアミノ酸が欠失し、若しくはその一部のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され、及び／又は他のアミノ酸のいくつかが付加されたものであってもよいが、配列番号１〜１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上又は９０％以上や９５％以上の相同性を有しているアミノ酸配列を有するタンパク質が包含される。
本発明のイネのトランスポーターにおける金属元素としては、鉄、マンガン、亜鉛、銅、コバルト、ニッケルなどのニコチアナミンと安定な錯体を形成する金属元素であり、好ましい金属元素としては鉄、マンガン、亜鉛、銅などが挙げられ、これらの金属元素の１種又は２種以上の吸収や輸送に関与するものである。本発明のイネのトランスポーターにおける好ましい金属元素としては、例えば、鉄、鉄とマンガン、鉄と亜鉛などが挙げられる。
また、本発明の遺伝子は、前記した本発明のイネの鉄やマンガンなどの金属錯体の吸収や輸送に関与するトランスポーター（ＯｓＹＳＬ）をコードするものである。本発明の遺伝子としては、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。好ましい本発明の遺伝子としては、配列表の配列番号１９〜３６に示される塩基配列を有するものが挙げられるが、これに限定されるものではなく、これとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な配列も包含される。【００３５】  また、本発明は前記した本発明の遺伝子の一部の配列からなるオリゴヌクレオチドを提供するものである。本発明のオリゴヌクレオチドは、前記した本発明の遺伝子の一部の配列からなるものであり、好ましくは１０〜１５０塩基、１０〜１００塩基、１０〜５０塩基、また１５〜１５０塩基、１５〜１００塩基、１５〜５０塩基程度、より好ましくは１５〜３０塩基程度の長さを有するものである。本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明の遺伝子を増幅させる際のプライマーや、本発明の遺伝子を検出や同定する際のプローブなどとして有用なものである。【００３６】  本発明は、前記した本発明の遺伝子を含有してなるベクターを提供するものでもある。本発明のベクターは、前記した本発明の遺伝子をコードする塩基配列を含有するものである。本発明のベクターは、必要により任意のプロモーターを付加してもよいし、既に用意されているプロモーター領域の下流側に本発明の遺伝子を有するものであってもよい。また、本発明のベクターは、本発明の遺伝子を含有しているものであれば、如何なる用途に使用されるものであってもよく、例えば、発現用のベクターであってもよいし、クローニング用のベクターであってもよい。
また、本発明は、本発明の遺伝子、又は本発明の遺伝子を含有する遺伝子が導入された形質転換体を提供する。導入される遺伝子は本発明の遺伝子が単独で導入されてもよいし、本発明の遺伝子に、さらに必要なプロモーター領域やシグナル領域などを付加した遺伝子として、導入することもできる。遺伝子の導入方法としては、プラスミドやファージなどを用いる公知の導入手段を採用できる。
本発明の形質転換体の宿主細胞としては、特に制限は無く動物細胞や植物細胞などを任意に選定することができる。本発明のイネの鉄やマンガンなどの金属錯体の吸収や輸送に関与するトランスポーター（ＯｓＹＳＬ）を製造する場合には、大腸菌などを宿主細胞とすることができるし、また本発明の遺伝子を用いて他の植物を形質転換する場合にはイネやトウモロコシ、トマト、シロイヌナズナなどの植物細胞を宿主細胞とすることができる。【００３７】  また、本発明は、ＯｓＹＳＬ２が、植物体内における鉄錯体及び／又はマンガン錯体、好ましくはニコチアナミン錯体の輸送に関与しているトランスポーターであることを明らかにしたものである。鉄などの金属成分は植物の発育や成長に必要なだけでなく、植物を食糧としている人間の栄養補給の点からも重要である。特に、本発明のＯｓＹＳＬ２は植物の生殖成長における鉄分やマンガン成分の輸送に大きく関与しており、鉄分やマンガン成分の強化された植物体の製造に有用となる。
本発明のＯｓＹＳＬ２は、植物における鉄錯体及び／又はマンガン錯体の体内輸送に関与しており、これを用いて植物の体内における鉄錯体及び／又はマンガン錯体の輸送や蓄積を調節することが可能であり、本発明は当該ＯｓＹＳＬ２を用いた植物における鉄錯体及び／又はマンガン錯体の体内輸送の調整方法を提供するものである。
本発明の調整方法としては、本発明のＯｓＹＳＬ２、例えば、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、又はその一部のアミノ酸が欠失若しくは置換され、及び／又は他のアミノ酸が付加されることにより配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有しているアミノ酸配列をコードする遺伝子、好ましくは配列表の配列番号２０に示される塩基配列を有する遺伝子を植物に導入する方法が挙げられる。植物としては、鉄成分やマンガン成分の輸送が行える植物であれば特に制限はないが、本発明のＯｓＹＳＬ２がイネ由来であることから、イネ科植物が好ましいがこれに限定されるものではない。
本発明のこの方法により、鉄分が強化された植物、例えば、野菜や果実などを製造することも可能となり、本発明のＯｓＹＳＬ２は鉄分などの金属成分の強化された植物の製造に極めて有用である。
【発明の効果】
【００３８】  本発明は、鉄やマンガンなどの金属錯体の吸収や輸送が強化された潜在的に鉄などの金属元素欠乏発生土壌においても生育可能なイネを創出するために必須となるイネの鉄やマンガンなどの金属錯体の吸収や輸送に関与する、「鉄−ムギネ酸類」錯体トランスポーター及びそれをコードする遺伝子、「鉄−ニコチアナミン」錯体トランスポーター及びそれをコードする遺伝子、並びに「マンガンなどの金属−ニコチアナミン」錯体トランスポーター及びそれをコードする遺伝子を提供するものである。本発明のトランスポーターは、イネの細胞又は細胞内のオルガネラが「三価鉄−ムギネ酸類」、「二価鉄−ニコチアナミン」錯体となっている鉄や、「金属−ニコチアナミン」錯体となっている金属錯体を内部に取り込むために必須の膜輸送体であるトランスポーターを提供するものであり、鉄やマンガンなどの金属元素の吸収や輸送が強化された潜在的鉄及び金属元素欠乏発生土壌においても生育可能なイネを創出するために必須となるタンパク質であり遺伝子である。さらにイネ種子に鉄及び金属元素を集積させ栄養価の高い米を作出するためにも必須である。本発明のトランスポーターが有するそれぞれの機能に着目して、イネを生育させる土壌に応じたトランスポーターを有する新規なイネを創出することが可能となり、イネの耕作範囲を拡大することが可能となるため、世界の食糧問題の解決の糸口となる。さらに鉄および金属元素を種子可食部に集積させ、栄養価の高い米を作出することが可能になり、ヒトの鉄欠乏性貧血、金属元素欠乏症の解消に寄与することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、シロイヌナズナのトランスポーターの予想されるゲノム構造を模式的に示したものである。
【図２】図２は、本発明のイネのトランスポーターの発現をノーザン解析によって確認した結果を示す図面に変わるカラー写真である。
【図３】図３は、本発明のイネの１８個のトランスポーターとトウモロコシのＹＳ１とのアミノ酸配列を比較した３枚の図面の１枚目である。
【図４】図４は、本発明のイネの１８個のトランスポーターとトウモロコシのＹＳ１とのアミノ酸配列を比較した３枚の図面の２枚目である。
【図５】図５は、本発明のイネの１８個のトランスポーターとトウモロコシのＹＳ１とのアミノ酸配列を比較した３枚の図面の３枚目である。
【図６】図６は、本発明のイネの１８個のトランスポーターの塩基配列を比較した９枚の図面の１枚目である。
【図７】図７は、本発明のイネの１８個のトランスポーターの塩基配列を比較した９枚の図面の２枚目である。
【図８】図８は、本発明のイネの１８個のトランスポーターの塩基配列を比較した９枚の図面の３枚目である。
【図９】図９は、本発明のイネの１８個のトランスポーターの塩基配列を比較した９枚の図面の４枚目である。
【図１０】図１０は、本発明のイネの１８個のトランスポーターの塩基配列を比較した９枚の図面の５枚目である。
【図１１】図１１は、本発明のイネの１８個のトランスポーターの塩基配列を比較した９枚の図面の６枚目である。
【図１２】図１２は、本発明のイネの１８個のトランスポーターの塩基配列を比較した９枚の図面の７枚目である。
【図１３】図１３は、本発明のイネの１８個のトランスポーターの塩基配列を比較した９枚の図面の８枚目である。
【図１４】図１４は、本発明のイネの１８個のトランスポーターの塩基配列を比較した９枚の図面の９枚目である。
【図１５】図１５は、本発明のイネのトランスポーター（ＯｓＹＳＬ）、トウモロコシのトランスポーター（ＹＳ１）、及びシロイヌナズナのトランスポーター（ＡｔＹＳＬ）のＹＳＬファミリーの分子系統樹を示したものである。
【図１６】図１６は、本発明のＯｓＹＳＬ２とＧＦＰの融合タンパク質をタマネギの表皮細胞で発現させた結果を示す図面に代わるカラー写真である。図１６ａはＯｓＹＳＬ２−ＧＦＰ融合タンパク質の場合を示し、図１６ｂはＧＦＰタンパク質単独の場合を示す。
【図１７】図１７は、イネの根における本発明のＯｓＹＳＬ２のプロモーターの発現をレポーター遺伝子ＧＵＳにより解析した結果を示す図面に代わるカラー写真である。ＧＵＳの発現を青色で示している。図１７ａは鉄十分条件の場合を示し、図１７ｂは鉄欠乏条件の場合を示す。各図の挿入は中心柱の中の篩部細胞の拡大写真である。
【図１８】図１８は、イネの葉鞘の維管束における本発明のＯｓＹＳＬ２のプロモーターの発現をレポーター遺伝子ＧＵＳにより解析した結果を示す図面に代わるカラー写真である。ＧＵＳの発現を青色で示している。図１８ｂはその拡大写真であり、矢印は伴細胞での発現を示している。
【図１９】図１９は、イネの葉における本発明のＯｓＹＳＬ２のプロモーターの発現をレポーター遺伝子ＧＵＳにより解析した結果を示す図面に代わるカラー写真である。ＧＵＳの発現を青色で示している。図１９ａは鉄十分条件の場合を示し、図１９ｂは鉄欠乏条件の場合を示す。各図における矢印は、伴細胞での強い発現を示している。
【図２０】図２０は、イネの花と種子における維管束での本発明のＯｓＹＳＬ２のプロモーターの発現をレポーター遺伝子ＧＵＳにより解析した結果を示す図面に代わるカラー写真である。ＧＵＳの発現を青色で示している。図２０ａは開花の前の場合を示し、図２０ｂは受精後の結果を示し、図２０ｃは受精後５日目の結果を示し、図２０ｄは受精後８日目の結果を示し、図２０ｅは受精後２０日目の結果を示し、図２０ｆは受精後の３０日目の結果をそれぞれ示す。
【図２１】図２１ａは、本発明のイネのトランスポーターＯｓＹＳＬ２のアミノ酸配列をＺｍＹＳ１と比較したものである。図２１ｂは、本発明のイネのトランスポーターＯｓＹＳＬ２のアミノ酸配列を模式的に記載したものである。丸印が個々のアミノ酸を示している。
【図２２】図２２は、本発明のイネのトランスポーターＯｓＹＳＬ２のＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す図面に代わる写真である。
【図２３】図２３は、本発明のイネのトランスポーターＯｓＹＳＬ２による金属キレート錯体の基質による誘発電流を測定した結果を示すグラフである。
【００４０】  以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】イネゲノムデータベースを利用したイネのトランスポーター（ＯｓＹＳＬ）の探索
イネの鉄及び他の金属錯体の吸収や輸送に関与するトランスポーターを見出すために、ジャポニカ種のイネのゲノムデーターベースである、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｓｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ（ｃｖ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）（Ｇｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）（ｈｔｔｐ：／／ｐｏｒｔａｌ．ｔｍｒｉ．ｏｒｇ／ｒｉｃｅ／）を用いて、トウモロコシのトランスポーターであるＹＳ１と高い相同性をもつタンパク質をコードするイネの遺伝子（ＯｓＹＳＬ）をブラスト（Ｂｌａｓｔ）検索（Ａｔｌｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）した。
しかし、このデータベースは完成されたものではなく、各コンティグがばらばらの状態での開示であり、そのため検索で得られたＹＳ１に相同性が高いコンティグもＯｓＹＳＬの全長を含んでいない場合が多かった。また、塩基解読の精度もそれほど高くなく、不明の塩基も数多くあった。
そこで、本発明者らは、インディカ種のイネについてのゲノムデーターベースであるＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｓｓｐ．ｉｎｄｉｃａ（ｃｖ．９１−１１）（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）（ｈｔｔｐ：／／ｂｔｎ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎ／ｒｉｃｅ／）を検索することで得られたインディカ種のＯｓＹＳＬの塩基配列も参考にした。これらの配列を基に、ばらばらになっていたジャポニカ種のＯｓＹＳＬについても断片をつなぎ合わせ、推測される全長を同定した。この結果、合計１８個のＯｓＹＳＬが見出された。これらのトランスポーターをそれぞれＯｓＹＳＬ１〜１８と命名した。
この配列に基づいて、シロイヌナズナのトランスポーターであるＡｔＹＳＬ３のゲノム配列から、イネにおけるこれらの配列を決定した。決定されたそれぞれのアミノ酸配列を配列表の配列番号１〜１８にそれぞれ示す。また、その塩基配列を配列表の配列番号１９〜３６にそれぞれ示す。
決定されたアミノ酸配列とトウモロコシのＹＳ１とのアミノ酸の比較を図３〜５に順次示す。また、これらのＯｓＹＳＬ１〜１８の塩基配列の比較を図６〜１４に順次示す。
このようにして得られたＯｓＹＳＬ１〜１８は、予測されたアミノ酸配列がトウモロコシのＹＳ１と高い相同性を示したこと（図３〜５参照）、そのうちのいくつかはイネゲノムプロジェクトによる完全長ｃＤＮＡライブラリーに一致するｃＤＮＡが発見されたことから、本発明の推測は極めて精度の高いものであると考えられた。これらのタンパク質は全て７個から１６個の膜貫通領域を持つと推測され、ＹＳ１と同様に膜タンパク質である可能性が高いことも明らかとなった。
【実施例２】
【００４２】  試料用のイネの調製
試料用のイネは、次に示す組成を有する水耕液で栽培した。
Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ          ２０００μＭ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                  ５００μＭ
Ｆｅ（ＩＩＩ）・ＥＤＴＡ              １００μＭ
Ｋ２ＳＯ４                            ７００μＭ
ＫＣｌ                                １００μＭ
ＫＨ２ＰＯ４                          １００μＭ
Ｈ３ＢＯ３                              １０μＭ
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                      ０．５μＭ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                      ０．５μＭ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                      ０．２μＭ
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ        ０．０１μＭ
イネの第五葉目が展開した時に鉄欠乏処理を開始し、１０日間鉄を除いた水耕液で栽培することで鉄欠乏処理を行った。コントロール条件のイネはそれまでと同じ濃度の鉄を加えた水耕液で栽培した。処理後１０日目にコントロール区、鉄欠乏区ともにサンプリングを行った。
【実施例３】
【００４３】ノーザン解析用のプローブの調製
前記表１に示すプライマー対を設計し、ゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った。ＯｓＹＳＬ１、ＯｓＹＳＬ８、ＯｓＹＳＬ１６のＰＣＲにはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ）を、その他の遺伝子のＰＣＲにはＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ）をＤＮＡポリメラーゼとして用いた。ＯｓＹＳＬ１の増幅の際、反応液にＤＭＳＯを終濃度５％（ｖ／ｖ）になるように加えた。ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−で増幅された断片はｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、その他の断片はｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。クローニングの方法はキットに付属のプロトコールに従った。塩基配列を確認し、クローニングされた断片が目的のものであることを確認した。
得られた断片を通常の方法により３２Ｐで標識化した。
【実施例４】
【００４４】ノーザン解析
実施例２で栽培したイネをサンプリングして、根と葉の部分について、実施例３で調製したプローブを用いてノーザン解析を行った。
結果を図２に示す。
【実施例５】
【００４５】  ＯｓＹＳＬ２−ｓＧＦＰを含むプラスミドの構築とその発現
カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）−ＮＯＳ３’の構造を有するプラスミドｐＵＣ１８は、丹羽博士（静岡県立大学）から提供された。このプラスミドは、３５Ｓプロモーターの３’側にＳａｌＩとＮｃｏＩサイトを持っている。このＮｃｏＩサイト「ＣＣＡＴＧＧ」は、ｓＧＦＰの開始コドンを含んでいる。そして、このＮｃｏＩとＳａｌＩサイトの間にアニールドオリゴマー（５’ＴＣＧＡＧＡＴＡＴＣＧＧＴＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡと５’ＣＴＡＧＴＣＧＡＣＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＡＴＣ）を挿入し、新しいＥｃｏＲ  Ｖサイト（ＧＡＴＡＴＣ）を導入した。導入されたＥｃｏＲ  Ｖサイトに、５’末端にａｔｔＲ１サイト、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ｃｃｄＢの遺伝子、及びａｔｔＲ２サイトカセットを含む１５７９ｂｐのマルチサイトゲートウェイスリー断片（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を挿入した。そして、この修飾ベクターは、ｐＤＥＳＴ３５Ｓ−ｓＧＦＰと命名され、デェスティネーションベクター（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）として使用された。
一方、ＯｓＹＳＬ２のＯＲＦを、’５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＣＣＧＡＧＡＴＡＧと３’−ＧＣＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＣＡＧの２つのプライマーを用いて増幅した。ＯｓＹＳＬ２のコード配列を含む増幅された断片は、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングされた。ＯｓＹＳＬ２のコード配列を含むこのｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯエントリーベクターは、ｐＥＮＴＲ−ＯｓＹＳＬ２と命名され、前記のデェスティネーションベクター（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）とこのエントリーベクターの間のサブセキュエントＬＲリコンビネーション反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、３５Ｓ−ＯｓＹＳＬ２−ｓＧＦＰをコードする遺伝子を含む発現クローンを得た。【００４６】  たまねぎ表皮細胞に、水野らの方法（Ｍｉｚｕｎｏ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３２，１９８９−１９９７（２００３））パーティクルガン法（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ（ＢｉｏＲａｄ））により前記で製造したベクターを導入した。
また、同様にＧＦＰのみを有するベクターを導入した。
遺伝子が導入され、可視化された結果を図１６に示す。
【実施例６】
【００４７】  ＯｓＹＳＬ２のプロモーターのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）分析
ＯｓＹＳＬ２の推定されるプロモーター領域（翻訳開始コドンからの−１５００〜−１ｂｐ）を含むゲノム配列を、ゲノムＤＮＡからのＰＣＲ法により増幅した。得られたイネのトランスポーターＯｓＹＳＬ２のプロモーター領域１．５ＫｂにＧＵＳレポーター遺伝子を結合させて、これをイネに導入した。イネへの形質転換及びＧＵＳ染色は井上らの方法（Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３６，３６６−３８１（２００３））に準じて行った。
結果を、図１７〜図２０にそれぞれ示す。
【実施例７】
【００４８】  ＲＴ−ＰＣＲ解析
イネの開花前、開花５日後および開花８日後の試料を処理して、ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。その結果を図２２に図面に代わる写真で示す。図２２の左側のレーンは開花前の場合を示し、中央のレーンは開花５日後の場合を示し、右側のレーンは開花８日後の場合を示す。
【実施例８】
【００４９】  アフリカツメガエル卵母細胞におけるＯｓＹＳＬ２の基質輸送能
ＯｓＹＳＬ２をＥｃｏＲＩとＸｂａＩとで消化して、ＯｓＹＳＬ２の２０２２ｂｐの断片を得た。これを、ｐＧＥＭ−３ｚｆ（ｔ）ベクターのＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩサイトに挿入した。得られたプラスミドｐＧＥＭＹＳＬ２ＴをＸｂａＩで消化して鎖状とした。キャップ付きの相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  ＳＰ６キット（ＴＸ、Ａｍｂｉｏｎ、オースチン、米国）を用いてインビトロで合成した。
卵母細胞は、イガラシらの方法（Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｙ．，ＥＴ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４１，７５０−７５６（２０００））により調製した。これに、前記で得たＯｓＹＳＬ２  ｃＲＮＡの１０ｎｇを注入した。注入された卵母細胞は、２日間のＮＤ溶液で培養され、ｐＨ７．５で電気的測定に供せられた。卵母細胞の膜の電流は、ＴＥＶ−２００システム（ＭＮ、Ｄａｇａｎ、ミネアポリス、米国）を有する自動化された日立システムを使用する、２−マイクロボルテージクランプ法により測定した。卵母細胞は、−６０ｍＶに固定され、そして、金属キレートの複合体（１０μＬ、５ｍＭ）の添加に対応した定常電流が得られた。電流は、Ｍａｃ  Ｌａｂシステム（ＮＳＷ、Ａｄｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、シドニーオーストラリア）で絶え間なくモニターして、分析した。ＯｓＹＳＬ２遺伝子が注入された独立している６つの卵母細胞を、電流を測定するのに使用した。また、コントロールとして６つの独立している水注入の卵母細胞を用いた。
この結果を図２３に示す。
【産業上の利用可能性】
【００５０】  本発明のトランスポーター及びその遺伝子は、鉄などの金属錯体の吸収や輸送が強化された潜在的な鉄などの金属元素欠乏発生土壌においても生育可能なイネを創出するために必須となるイネの金属錯体の吸収や輸送に関与するものである。また、地球上には鉄などの金属元素欠乏発生土壌が広大に存在し、このような土壌においても生育できるイネなどの穀物植物を創出することは、世界の食糧問題を解決する上で極めて有効な方法である。また、鉄などの金属元素のミネラル含量の高い米を作出することは、ヒトの鉄欠乏性貧血、金属元素欠乏症を解消するために有効である。
本発明は、イネの「鉄−ムギネ酸類」錯体トランスポーター及びそれをコードする遺伝子、「鉄−ニコチアナミン」錯体トランスポーター及びそれをコードする遺伝子、並びに「金属−ニコチアナミン」錯体トランスポーター及びそれをコードする遺伝子を提供するものであり、潜在的な鉄などの金属元素欠乏発生土壌においても生育可能なイネを創出するため、さらに鉄および金属元素を種子可食部に集積させた栄養価の高い米を作出するために不可欠の、鉄などの金属錯体の吸収や輸送に関与するタンパク質及びその遺伝子を提供するものであり、産業上極めて有用なものである
【配列表フリーテキスト】
【００５１】  配列番号１      ＯｓＹＳＬ１のアミノ酸配列
配列番号２      ＯｓＹＳＬ２のアミノ酸配列
配列番号３      ＯｓＹＳＬ３のアミノ酸配列
配列番号４      ＯｓＹＳＬ４のアミノ酸配列
配列番号５      ＯｓＹＳＬ５のアミノ酸配列
配列番号６      ＯｓＹＳＬ６のアミノ酸配列
配列番号７      ＯｓＹＳＬ７のアミノ酸配列
配列番号８      ＯｓＹＳＬ８のアミノ酸配列
配列番号９      ＯｓＹＳＬ９のアミノ酸配列
配列番号１０    ＯｓＹＳＬ１０のアミノ酸配列
配列番号１１    ＯｓＹＳＬ１１のアミノ酸配列
配列番号１２    ＯｓＹＳＬ１２のアミノ酸配列
配列番号１３    ＯｓＹＳＬ１３のアミノ酸配列
配列番号１４    ＯｓＹＳＬ１４のアミノ酸配列
配列番号１５    ＯｓＹＳＬ１５のアミノ酸配列
配列番号１６    ＯｓＹＳＬ１６のアミノ酸配列
配列番号１７    ＯｓＹＳＬ１７のアミノ酸配列
配列番号１８    ＯｓＹＳＬ１８のアミノ酸配列
配列番号１９    ＯｓＹＳＬ１の塩基配列
配列番号２０    ＯｓＹＳＬ２の塩基配列
配列番号２１    ＯｓＹＳＬ３の塩基配列
配列番号２２    ＯｓＹＳＬ４の塩基配列
配列番号２３    ＯｓＹＳＬ５の塩基配列
配列番号２４    ＯｓＹＳＬ６の塩基配列
配列番号２５    ＯｓＹＳＬ７の塩基配列
配列番号２６    ＯｓＹＳＬ８の塩基配列
配列番号２７    ＯｓＹＳＬ９の塩基配列
配列番号２８    ＯｓＹＳＬ１０の塩基配列
配列番号２９    ＯｓＹＳＬ１１の塩基配列
配列番号３０    ＯｓＹＳＬ１２の塩基配列
配列番号３１    ＯｓＹＳＬ１３の塩基配列
配列番号３２    ＯｓＹＳＬ１４の塩基配列
配列番号３３    ＯｓＹＳＬ１５の塩基配列
配列番号３４    ＯｓＹＳＬ１６の塩基配列
配列番号３５    ＯｓＹＳＬ１７の塩基配列
配列番号３６    ＯｓＹＳＬ１８の塩基配列
【図１】
0004699211.tif 000005
【図２】
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【図３】
0004699211.tif 000007
【図４】
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【図５】
0004699211.tif 000009
【図６】
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【図７】
0004699211.tif 000011
【図８】
0004699211.tif 000012
【図９】
0004699211.tif 000013
【図１０】
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【図１１】
0004699211.tif 000015
【図１２】
0004699211.tif 000016
【図１３】
0004699211.tif 000017
【図１４】
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【図１５】
0004699211.tif 000019
【図１６】
0004699211.tif 000020
【図１７】
0004699211.tif 000021
【図１８】
0004699211.tif 000022
【図１９】
0004699211.tif 000023
【図２０】
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【図２１】
0004699211.tif 000025
【図２２】
0004699211.tif 000026
【図２３】
0004699211.tif 000027
【配列表】
0004699211000001.app