(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の性質：
（１）作用：Ｌ−グルタミンに作用してＬ−グルタミン酸を生成する；
（２）至適pH：至適pHが約8.5である；
（３）安定pH範囲：４℃にて24時間インキュベートした場合、安定pH範囲はおよそ５〜10である；
（４）至適作用温度：pH8.0において測定した場合、至適作用温度は約45℃である；
（５）温度安定性：pH8.0にて30分間インキュベートした場合、40℃以下の温度で安定である；
（６）分子量：ゲル濾過により測定した場合、分子量は約71,000である；
を有するグルタミナーゼ。
【請求項２】
配列番号：14に示すアミノ酸配列において、アミノ酸１〜584のアミノ酸配列を有するグルタミナーゼ。
【請求項３】
配列番号：14に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜584のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つグルタミナーゼ活性を有する修飾されたグルタミナーゼ。
【請求項４】
配列番号：５に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸とストリンジエント条件下でハイブリダイズすることができる核酸によりコードされているグルタミナーゼ。
【請求項５】
配列番号：14に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜584のアミノ酸配列に対して90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するグルタミナーゼ。
【請求項６】
配列番号：16に示すアミノ酸配列において、アミノ酸１〜584のアミノ酸配列を有するグルタミナーゼ。
【請求項７】
配列番号：16に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜584のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つグルタミナーゼ活性を有する修飾されたグルタミナーゼ。
【請求項８】
配列番号：７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸とストリンジエント条件下でハイブリダイズすることができる核酸によりコードされているグルタミナーゼ。
【請求項９】
配列番号：16に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜５８４のアミノ酸配列に対して90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するグルタミナーゼ。
【請求項１０】
配列番号：17に示すアミノ酸配列において、アミノ酸１〜584のアミノ酸配列を有するグルタミナーゼ。
【請求項１１】
配列番号：17に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜584のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つグルタミナーゼ活性を有する修飾されたグルタミナーゼ。
【請求項１２】
配列番号：８に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸とストリンジエント条件下でハイブリダイズすることができる核酸によりコードされているグルタミナーゼ。
【請求項１３】
配列番号：17に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜584のアミノ酸配列に対して90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するグルタミナーゼ。
【請求項１４】
配列番号：18に示すアミノ酸配列において、アミノ酸１〜584のアミノ酸配列を有するグルタミナーゼ。
【請求項１５】
配列番号：18に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜584のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つグルタミナーゼ活性を有する修飾されたグルタミナーゼ。
【請求項１６】
配列番号：９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸とストリンジエント条件下でハイブリダイズすることができる核酸によりコードされているグルタミナーゼ。
【請求項１７】
配列番号：18に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜584のアミノ酸配列に対して90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するグルタミナーゼ。
【請求項１８】
請求項２〜17のいずれか１項に記載のグルタミナーゼをコードするDNA。
【請求項１９】
イントロンを含んで成る請求項18に記載のDNA。
【請求項２０】
ゲノムDNAである請求項19に記載のDNA。
【請求項２１】
cDNAである請求項18に記載のグルタミナーゼをコードするDNA。
【請求項２２】
請求項18〜21のいずれか１項に記載のDNAを含んで成るベクター。
【請求項２３】
請求項22に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１に記載のグルタミナーゼの製造方法において、アスペルギルス（Aspergillus ）属に属し、該グルタミナーゼを生産することができる微生物を培養し、培養物からグルタミナーゼを採取することを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記微生物が、アスペルギルス・ソヤー（Aspergillus sojae）又はアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２〜17のいずれか１項に記載のグルタミナーゼの製造方法において、該グルタミナーゼをコードするDNAを含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、該培養物から、該グルタミナーゼを採取することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なグルタミナーゼ、該グルタミナーゼをコードする遺伝子系、及び該グルタミナーゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルタミナーゼ(Glutaminase）〔EC3. 5. 1. 2〕はグルタミンからグルタミン酸を生成する酵素であり、特に、麹菌が生成するグルタミナーゼは醤油や味噌などの醸造中に旨味を高めるなどの重要な役割を果たしている。（板倉辰六郎  編著、醤油の化学と技術、ｐ．181 、日本醸造協会（1988））また、麹菌のグルタミナーゼについては精製され、その性質が検討されている。（T. Yano, M. Ito, K. Tomita, H. Kumagai, and T. Tochikura, J. Ferment. Technol., 66, 137-143 (1988)）しかし、分子生物学的手法を用いたアプローチは未だされていない。また、このグルタミナーゼは、生産性が低い、等のため、工業的利用の面で限界があった。
【０００３】
また、アスペルギルス・ソヤー（Aspergillus sojae)由来のグルタミナーゼ及びそれをコードする遺伝子が特開2000-166547 公報に記載されている。しかしながらそのアミノ酸配列は本発明のグルタミナーゼのそれと全く異る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、新規なグルタミナーゼを提供しようとするものである。本発明はさらに、上記のグルタミナーゼの製造方法を提供し、またその手段として、該グルタミナーゼをコードする遺伝子系を提供するものである。
【０００５】
従って本発明は、（Ａ）次の性質：
（１）作用：Ｌ−グルタミンに作用してＬ−グルタミン酸を生成する；
（２）至適pH：至適pHが約８．５である；
（３）安定pH範囲：４℃にて２４時間インキュベートした場合、安定pH範囲はおよそ５〜１０である；
（４）至適作用温度：pH８．０において測定した場合、至適作用温度は約４５℃である；
（５）温度安定性：pH８．０にて３０分間インキュベートした場合、４０℃以下の温度で安定である；
（６）分子量：ゲル濾過により測定した場合、分子量は約７１，０００である；
を有するグルタミナーゼを提供する。
【０００６】
本発明はまた、（Ｂ）配列番号：１４に示すアミノ酸配列において、アミノ酸１〜５８４のアミノ酸配列を有するグルタミナーゼ；配列番号：１４に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜５８４のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つグルタミナーゼ活性を有する修飾されたグルタミナーゼ；配列番号：５に示す塩基配列を有する核酸のエクソン領域とストリンジエント条件下でハイブリダイズすることができる核酸によりコードされているグルタミナーゼ；並びに配列番号：１４に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号３４〜７０３のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するグルタミナーゼを提供する。
【０００７】
本発明はさらに、（Ｃ）配列番号：１６に示すアミノ酸配列において、アミノ酸１〜５８４のアミノ酸配列を有するグルタミナーゼ；配列番号：１６に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜５８４のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つグルタミナーゼ活性を有する修飾されたグルタミナーゼ；配列番号：７に示す塩基配列を有する核酸とストリンジエント条件下でハイブリダイズすることができる核酸によりコードされているグルタミナーゼ；並びに配列番号：１６に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号３４〜７０３のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するグルタミナーゼを提供する。
【０００８】
本発明はまた、（Ｄ）配列番号：１７に示すアミノ酸配列において、アミノ酸１〜５８４のアミノ酸配列を有するグルタミナーゼ；配列番号：１７に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜５８４のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つグルタミナーゼ活性を有する修飾されたグルタミナーゼ；配列番号：８に示す塩基配列を有する核酸のエクソン領域とストリンジエント条件下でハイブリダイズすることができる核酸によりコードされているグルタミナーゼ；並びに配列番号：１７に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜５８４のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するグルタミナーゼを提供する。
【０００９】
本発明はさらに、（Ｅ）配列番号：１８に示すアミノ酸配列において、アミノ酸１〜５８４のアミノ酸配列を有するグルタミナーゼ；配列番号：１８に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜５８４のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つグルタミナーゼ活性を有する修飾されたグルタミナーゼ；配列番号：９に示す塩基配列を有する核酸のエクソン領域とストリンジエント条件下でハイブリダイズすることができる核酸によりコードされているグルタミナーゼ；並びに配列番号：１８に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜５８４のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するグルタミナーゼを提供する。
【００１０】
本発明はまた、前記（Ｂ）〜（Ｅ）に記載のグルタミナーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成るベクター、及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、前記Ａに記載のグルタミナーゼの製造方法において、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属し、該グルタミナーゼを生産することができる微生物を培養し、培養物からグルタミナーゼを採取することを特徴とする方法を提供する。
【００１１】
前記微生物は、例えば、アスペルギルス・ソヤー(Aspergillus sojae）又はアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）である。
本発明はまた、前記（Ｂ）〜（Ｅ）に記載のグルタミナーゼの製造方法において、該グルタミナーゼをコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、該培養物から、該グルタミナーゼを採取することを特徴とする方法を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
（１）微生物
本発明の微生物、すなわち、本発明のグルタミナーゼの発酵生産に利用する微生物、及び本発明のグルタミナーゼをコードする遺伝子の分離源としての微生物としては、本発明のグルタミナーゼを生産することができる微生物であればよいが、好ましくはアスペルギルス(Aspergillus）属の微生物であり、さらに好ましくは、アスペルギルス・ソヤー(Aspergillus sojae）又はアスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)である。
【００１３】
これらの種の具体的な菌株としては、アスペルギルス・ソヤー(Aspergillus sojae) BA-104、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae) KBN616 を挙げることができる。なお、アスペルギルス・ソヤー株もしくは、アスペルギルス・オリゼー株は、醤油や味噌の製造のために広く使用されまた市販されている麹菌を単胞子分離等の常法に従って純化することにより容易に得られる。また、アスペルギルス・オリゼー株は、清酒用として広く使用されまた市販されている麹菌を単胞子分離等の常法に従って純化することによっても容易に得られる。
【００１４】
（２）グルタミナーゼの精製
本発明のグルタミナーゼは、該グルタミナーゼを生産することができる微生物、好ましくは上に記載した微生物を常法に従って培養し、そして酵素の精製に用いられる常法に従って培養物から回収（採取）することができる。培養は液体培地でも固体培地でもよく、例えばフスマの固体培地において培養するのが好ましい。本発明のグルタミナーゼの発酵生産方法の一例を、アスペルギルス・ソヤーＢＡ−１０４株を使用した場合について、実施例１に具体的に記載する。
【００１５】
（３）グルタミナーゼの性質
（ａ）活性測定法及びユニットの定義
本発明のグルタミナーゼは、Ｌ−γ−グルタミニル−ｐ−ニトロアニリドを基質として使用し、グルタミナーゼの作用により遊離するｐ−ニトロアニリンを比色定量することにより活性測定することができる。
【００１６】
具体的には、８００μｌの５０mM  Tris-HCl緩衝液（pH８．０）と、該緩衝液中１mM  Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド溶液２００μｌとを試験管に入れ、これを３０℃にて３分間予熱した後、これに２００μｌの被験酵素液を加えて６０分間反応せしめ、４００μｌの１Ｍ酢酸を添加して反応を停止せしめ、４０５nmの吸光度を測定する。盲検として、酵素液を加えずに同様の操作を行い、反応停止後に酵素液を加えて、４０５nmの吸光度を測定する。上記の条件下で１分間に１μmol のｐ−ニトロアニリンを生じさせる酵素量を１ユニットと定義する。
【００１７】
次に、本発明の酵素の１例として、実施例１において得られた。アスペルギルス・ソヤーBA-104から得られたグルタミナーゼの性質を次に示す。
（ｂ）至適pH
緩衝液９００μｌ（pH5.0 〜8.0 : 25mM Na2HPO4-KH2PO4 ; pH8.0 〜 9.0 :25mM Tris-HCl)に酵素液１００μｌを加え、３０℃にて６０分間反応せしめ、最高活性を１００として、各pHにおける相対活性を求める。結果を図１に示す。この結果から明らかな通り、至適pHは約８．５である。
【００１８】
（ｃ）pH安定性
２５０μｌの緩衝液（pH3.0 〜5.0 : 25mM HCl-CH3COONa ; pH5.0 〜8.0 : 25mM Na2HPO4-KH2PO4 ; pH8.0 〜9.0 : 25mM Tris-HCl;pH9.2 〜11.0 : 25mM Na2B4P7-NaOH）に２５０μｌの酵素液を加え、４℃にて２４時間インキュベートし、50mM Tris-HCl （pH８．０）緩衝液中で（ａ）に記載したようにして活性を測定し、最高活性を１００として各インキュベーションpHにおける活性の相対値を求める。結果を図２に示す。この結果から明らかな通り、上記の条件下でおよそpH５．０〜１０．０において安定である。
【００１９】
（ｄ）至適温度
５０mM  Tris-HCl（pH８．０）緩衝液中で２０℃〜５０℃にて活性を測定し、最高値を１００として各温度における相対活性値を求める。結果を図３に示す。この結果から明らかな通り、至適温度は約４５℃であり、４０℃〜４５℃において高い活性を示す。
【００２０】
（ｅ）温度安定性
酵素を５０mM  Tris-HCl（pH８．０）緩衝液中で２０℃〜６０℃にて３０分間インキュベートした後、５０mM  Tris-HCl（pH８．０）緩衝液中３０℃にて活性を測定し、３０分間のインキュベートなしのサンプルを１００として各インキュベーション温度における相対活性値を求める。結果を図４に示す。この結果から、本発明の酵素は、上記の条件において、約４０℃以下において安定である。
【００２１】
（ｆ）基質特異性
前記活性測定法（ａ）に記載した条件下で、反応液に基質として各種試薬を添加して酵素活性を測定し、Ｌ−グルタミンに対する活性を１００として相対活性を求めた結果は次の表１に示す通りである。
【００２２】
【表１】
0004651203.tif 000002
【００２３】
本酵素はＬ−グルタミン及びＬ−γ−グルタミニル−ｐ−ニトロアニリドに対して高い反応性を示し、Ｌ−テアニン及びグルタチオンに対してはＬ−グルタミンに比べてそれぞれ約６４％及び６８％の反応性を示すが、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン、Glu-Glu,Glu-Asr 等に対しては実質的に反応性を示さない。
【００２４】
（ｈ）分子量
HPLCによるゲル濾過法（カラム：YMC-Pack Diol-200G６mm×３００mm；移動相：５０mM  Tris-HCl（pH７．０）中０．１Ｍ  NaCl；流速：０．５ml／分；温度：室温（２３℃）；注入量：２０μｌ；標準蛋白質：ウシ血清アルブミン（M.W.66,000）、オバルブミン（M.W.42,000）、大豆トリプシンインヒビター（M.W.20,000））において、約71,000の分子量を示す。
【００２５】
上記の本発明の酵素（アスペルギルス・ソヤーBA-104）とT.Yanoら、J. Ferment. Technol. Vol. 66, p.138 (1988)に記載されているアスペルギルス・オリゼーMA-27 由来のグルタミナーゼ（細胞内酵素及び細胞外酵素）及び特開2000-166547 公報に記載されているグルタミナーゼとを比較すれば次の表２に示す通りである。
【００２６】
【表２】
0004651203.tif 000003
【００２７】
この表から明らかな通り、本発明のグルタミナーゼは、公知のグルタミナーゼと比べて、分子量、至適pH、pH安定性、至適温度、温度安定性等の点で明らかに異り、本発明の酵素は新規な酵素である。
アスペルギルス・オリゼーMA-27 由来のグルタミナーゼのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は不明であるが、該グルタミナーゼの性質は本発明のアスペルギルス・ソヤーBA-104由来のグルタミナーゼの性質と全く異り、特に本発明の酵素は温度安定性及びpH安定性の点で優れている。他方、特開2000-166547 公報に記載されているアスペルギルス・ソヤー及びBA-104由来のグルタミナーゼ及びそれをコードする塩基配列は、本発明の酵素のそれと全く異り、化学物質として全く異るものである。
【００２８】
他方配列番号：１４，１６，１７及び１８に示す本発明の酵素のアミノ酸配列は非常に高い相同性を有する。従って、本発明は配列番号：１４，１６，１７又は１８に示すアミノ酸配列を有するグルタミナーゼを提供する。
【００２９】
しかしながら、ある酵素がその酵素活性を発揮するには、生来のアミノ酸配列のすべてがそのまま必要なわけではなく、活性の発現に必須の領域以外の領域においては、アミノ酸の欠失、付加、置換等によりアミノ酸配列が修飾されていても本来の酵素活性を発揮することが知られている。従って本発明は、配列番号：１４，１６，１７又は１８に記載のアミノ酸配列における第１位のＭｅｔから第５８４位のＶａｌまでのアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されているアミノ酸配列を有し、且つグルタミナーゼ活性を維持している修飾型グルタミナーゼを提供する。
【００３０】
上記の修飾の程度は、ＰＣＲ、部位特定変異誘発等、周知技術により修飾できる程度であり、且つグルタミナーゼ活性を喪失しない範囲である。例えば、配列番号：１４，１６，１７又は１８に記載の第１位のＭｅｔから第５８４位のＶａｌまでのアミノ酸配列に対して、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の相同性を有するものである。
従って本発明はまた、配列番号：１４，１６，１７又は１８に記載の第１位のＭｅｔから第５８４位のＶａｌまでのアミノ酸配列に対して、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、且つグルタミナーゼ活性を維持している修飾型グルタミナーゼを含む。
【００３１】
一旦、酵素をコードする生来の生来のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡがクローニングされれば、該ゲノムＤＮＡ特にそのエクソン部分もしくはｃＤＮＡ、又はそれらの一部分をプローブとして用いることにより、同じ酵素活性を有する他の蛋白質をコードするＤＮＡを選択することができる。従って、本発明は、配列番号：５，７，８又は９に示す塩基配列を有する核酸、例えばＤＮＡ、特にエクソン部分の配列を有する核酸、例えばＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ、あるいはそれらの断片、例えば好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは２０塩基以上、例えば３０塩基以上の長さの断片とハイブリダイズすることができる核酸によりコードされており、且つグルタミナーゼ活性を有する蛋白質をも提供する。
【００３２】
上記の場合のハイブリダイゼーション条件は、例えば、野村慎太郎、稲澤譲治著「脱アイソトープ実験プロトコール」ｐ．４０（秀潤社、１９９４）に記載の条件の条件（５００mM  ＮａＰｉ緩衝液（pH７．２），７％ＳＤＳ，１mM  ＥＤＴＡ）である。上記ハイブリダイゼーションによるスクリーニングの対象となる核酸は特に限定される。
【００３３】
例えば合成ＤＮＡや、生来のＤＮＡを前記のごとく修飾したものでもよいが、天然のＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡやｃＤＮＡのライブラリーが好ましい。この様なＤＮＡライブラリーは、例えば真菌類、例えばアスペルギルス属の微生物、例えばアスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ソヤー、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）等から、常法に従って調製することができる。あるいは、そのようなライブラリーは、他の微生物、例えば細菌、動物細胞、植物細胞等からも調製することができる。
【００３４】
本発明はまた、前記の生来のグルタミナーゼ、又はグルタミナーゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸、特にＤＮＡに関する。典型的には、配列番号：５，７，８又は９に示す塩基配列を有するゲノムＤＮＡ又はそのエクソン部分のみから成るｃＤＮＡである。ゲノムＤＮＡのクローニング方法の１例は、実施例３において具体的に記載する。
【００３５】
一旦、ゲノムＤＮＡがクローニングされれば、該ゲノムＤＮＡ、又はその１部分、特にエクソン部分のＤＮＡをプローブとして、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明のグルタミナーゼをコードするｃＤＮＡを得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーの調製及びプローブハイブリダイゼーションによるそのスクリーニングは常法に従って行うことができる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えば前記の出発材料、例えばアスペルギルス属微生物、例えばアスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ソヤー、アスペルギルス・ニガー、等から調製することができる。
【００３６】
また、修飾されたグルタミナーゼをコードするＤＮＡは、生来のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを基礎とし、部位特定変異誘発、ＰＣＲ、ランダム変異、ジーンシャッフリング等の常法に従って行うことができる。また、１又は複数個のアミノ酸が欠失した短縮型酵素をコードするＤＮＡは、生来のＤＮＡに開始コドン及び／又は終止コドンを導入することによっても得られる。さらに、適当な制限酵素により、生来のＤＮＡを切断することによっても得られる。
【００３７】
本発明はまた、上記のＤＮＡを含んで成るベクター、特に発現ベクター、及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞に関する。グルタミナーゼを生産するための宿主細胞としては、グルタミナーゼをコードするＤＮＡがゲノムＤＮＡである場合にはスプライシング活性を有する宿主細胞である必要があり、真核性細胞、例えば真菌類、例えば酵母又は糸状真菌類、又は動物細胞、さらには植物細胞が使用される。
【００３８】
酵母としては例えばサッカロミセス（Saccharomyces ）属酵母、例えばサッカロミセス・セービシエー（Saccharomyces cerevisiae）等が挙げられ、糸状真菌類としては、例えばアスペルギルス属微生物、例えばアスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー、等が挙げられる。動物細胞としては、昆虫細胞、例えばカイコの細胞、哺乳類培養細胞、例えばＣＯＳ細胞等が挙げられる。さらに植物細胞を用いることもできる。
【００３９】
さらに、グルタミナーゼをコードするＤＮＡがｃＤＮＡである場合、上記の宿主の他に、原核性宿主、例えば細菌宿主を用いることができる。細菌宿主としては、例えば大腸菌（Escherichia coli）、バシルス（Bacillus）属細菌、例えばバシルス・ズブチリス(Bacillus subtilis) 等の常用の宿主が用いられる。
【００４０】
発現ベクターは、宿主に応じて発現制御配列、例えばプロモーター、ターミネーター等を含有する必要がある。例えば、酵母用のプロモーターとしては解糖系酵素、遺伝子のプロモーター、Ｇａｌプロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしてはＡｍｙＡプロモーター等が挙げられ、動物細胞用プロモーターとしてはウイルスプロモーター等が用いられる。また、細菌用プロモーターとしては、ウイルスベクター用プロモーター等が用いられる。宿主としての細胞とそれに適合するベクター系の使用はすでに常用技術となっており、本発明においては、それらの既知の発現系を適宜選択して使用することができる。
【００４１】
本発明はまた、本発明のグルタミナーゼの製造方法を提供する。第１の態様によれば、本発明のグルタミナーゼを生産することができるアスペルギルス属微生物を培養し、該培養物から、グルタミナーゼを採取すればよい。このための生産菌としては、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ソヤー等が挙げられ、具体例としてアスペルギルス・オリゼーKBN616株及びアスペルギルス・ソヤーBA-104株が挙げられる。
【００４２】
グルタミナーゼの製造のための培養は、固体培地及び液体培地のいずれでもよい。固体培地に培養する場合には、例えばフスマ等の通気性のよい材料、好ましくは植物材料に、必要に応じて、リン酸塩等の無機物、又は米糖等の有機窒素源などを添加し、２０℃〜３５℃、好ましくは約３０℃の温度で好気的に培養すればよい。
また、液体培地に培養する場合には、アスペルギルス属微生物が増殖することができる任意の液体培地を使用することができる。
【００４３】
液体培地には、アスペルギルス属微生物が資化し得る炭素源、例えば澱粉、マルトース、グルコース等を０．１〜１０％、好ましくは１〜５％含有せしめ、またアスペルギルス属微生物が資化し得る窒素源、例えば酵母エキス、マルトエキス（炭素源としても役立つ）等を、例えば０．１〜５％の濃度で含有せしめることができる。さらに無機窒素源として、硝酸塩、アンモニウム塩等を例えば０．０１％〜２％の濃度で含有せしめることもできる。無機塩類として、リン酸塩、硫酸塩、塩化物等の陰イオンと、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン等の陽イオンとを添加することもできる。
【００４４】
液体培養は、通気、撹拌及び／又は振とう等の手段により好気的条件下で行う。培養温度は約２０〜３５℃、好ましくは２８℃〜３０℃である。
本発明の第二の態様によれば、本発明のグルタミナーゼをコードするＤＮＡを含んで成る発現プラスミドにより形質転換された宿主を培養する。宿主としては詳細に前記したものを使用し、常法に従って培養、好ましくは液体培養すればよい。
【００４５】
本発明の酵素は菌体外に分泌される。従って、固体培養した場合には、培養物を水又は水性緩衝液、例えばリン酸緩衝液等により抽出することにより酵素含有水溶液が得られる。また、液体培養した場合には、濾過、遠心分離等の常法に従って菌体を除去することにより、酵素含有液が得られる。酵素含有液から酵素を採取、精製するには、酵素の精製のための常法を用いればよい。例えば、塩析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）等を組合せて使用することができる。
【００４６】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１．アスペルギルス・ソヤーBA-104からのグルタミナーゼの製造
１０本の２Ｌ容三角フラスコに５００mlのＧＰ培地（N.Kitamoto, J.Matsui, Y.Kawai, A.Kato, S.Yoshino, K.Ohmiya, and N.Tsukagoshi, Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 85-92 (1998)）を入れ、殺菌後、アスペルギルス・ソヤー（Aspergillus sojae)BA-104を植菌し、３０℃、９日間培養した。
【００４７】
その培養液をろ過し、４０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、遠心分離した上清を４０％飽和硫酸アンモニウムを加えた２０mM  Tris-HCl緩衝液（pH７．０）で平衡化したButyl Toyopearl 650M（50φ×150mm 、東ソー製）のカラムに供与し、同緩衝液で洗浄を行い、２０％飽和硫酸アンモニウムを加えた２０mM  Tris-HCl緩衝液（pH７．０）で溶出した。溶出した活性画分を２０mM  Tris-HCl緩衝液（pH７．０）に対し、透析し、２０mM  Tris-HCl緩衝液（pH７．０）で平衡化したDEAE-Sepharose FF （３０φ×１３０mm、アマシャム  ファルマシア製）のカラムに供与し、同緩衝液で洗浄を行い、０．２Ｍ  NaClを加えた同緩衝液で溶出した。
【００４８】
その溶出液の活性画分に４０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、４０％飽和硫酸アンモニウムを加えた１０mM酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液（pH５．０）で平衡化したPhenyl-5PW（８．０φ×７．５mm、東ソー製）のＨＰＬＣカラムに供与し、４０％から０％までの飽和硫酸アンモニウムのリニアグラジエントで溶出した。
その活性画分を２０mM  Tris-HCl緩衝液（pH７．０）で透析した後、同緩衝液で平衡化したPoros HQ/H（4.6 φ×50mm、ピーイーバイオシステムズ製）のカラムに供与し、０Ｍから０．３ＭまでのNaClのリニアグラジエントで溶出した。
【００４９】
その活性画分をウルトラセント−１０（東ソー製）で濃縮後、０．２Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０mM  Tris-HCl緩衝液（pH７）で平衡化したYMC Dio1200G（8.0 φ×300mm 、YMC 製）のカラムに供与し、その活性画分を得た。
その活性画分を１０mM酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液（pH５．０）で透析後、Poros HQ/Hを用いたＨＰＬＣを用い、同緩衝液中で０Ｍから０．２ＭまでのNaClのリニアグラジエントで溶出した。
【００５０】
その活性画分を１０mM酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液（pH４．２５）で透析後、Poros HQ/Hを用いたＨＰＬＣを使い、同緩衝液中で０Ｍから０．２ＭまでのNaClのリニアグラジエントで溶出した。
この活性画分を蒸留水に対して透析後、精製酵素とした。全精製工程での活性の回収率０．８９％、２８００倍に精製した。精製過程を表３に示す。
【００５１】
【表３】
0004651203.tif 000004
この酵素は、前記の性質を有し、そして具体的には図１〜図４に示す性質を有する。
【００５２】
実施例２．アスペルギルス・オリゼーKBN616株からの、グルタミナーゼをコードするゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡのクローニング
（１）グルタミナーゼの部分アミノ酸配列の決定
実施例１で得た精製酵素の凍結乾燥品３０μｇを用い、常法（マイクロシークエンスのための微量タンパク質精製法、p.48-52 、羊土社、1992年）に準じて、酵素の断片を得て、その配列を決定した。
【００５３】
即ち、２５μｌの８Ｍ尿素・０．４Ｍ重炭酸ナトリウム溶液を加え、２．５μｌの４５mMジチオスレイトールを加え、５０℃、１５分間処理を行い、２．５μｌの１００mMヨードアセトアミドを加え、１５分間放置した。７０μｌの蒸留水を加え、３０μｌの１０μｇ／mlエンドプロテイナーゼLys-C （ロッシュ・ダイアグノスティックス製）を添加後、３７℃、２４時間インキュベートした。その断片化した酵素をＨＰＬＣにより分離し、各酵素断片を取得した。その各断片をＮ末端配列シークエンサー（島津製作所製PPSQ-21 ）を用いて解析した。得られた配列は次のようになった。
【００５４】
0004651203.tif 000005
【００５５】
（２）ＤＮＡのクローニング全ＲＮＡの調製
アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae) ＫＢＮ６１６株をツァペック培地で３０℃、３日間振とう培養後の菌糸からライフテックオリエンタル製TRIZOL Reagentを用い、そのプロトコールに従って抽出し、全ＲＮＡを得た。
【００５６】
グルタミナーゼ遺伝子ｃＤＮＡ断片の増幅
プライマーの設計
断片（３）からＰ１プライマー（配列番号：２３）を設計した。
【化１】
0004651203.tif 000006
【００５７】
断片（４）のPro Thr Ile Val Thr His Gln の配列からアンチセンスでＰ２プライマー（配列番号：２４）を設計した。
Ｐ２  TG(A/G)TG(A/G)GT(A/G)AC(A/G)AT(A/G)GT(A/G)GG
断片（３）からＰ３プライマー（配列番号：２５）を設計した。
【化２】
0004651203.tif 000007
【００５８】
ｃＤＮＡ部分配列の取得
約１μｇの全ＲＮＡから3'-Full RACE Core Set （宝酒造製）用いて、プロトコールに準じた条件でｃＤＮＡの合成を行った。そのｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてプライマーに3site Adaptor Primer（宝酒造製）（配列番号：２６）及びＰ１プライマーを用い、ＰＣＲ反応を３０サイクル行った。次に、１００倍希釈したＰＣＲ反応液を鋳型ＤＮＡとしてプライマーにＰ１プライマー及びＰ２プライマーをそれぞれ使用して、ＰＣＲ反応を３０サイクル行った。更に、１００倍希釈したＰＣＲ反応液を鋳型ＤＮＡとしてプライマーにＰ２プライマー及びＰ３プライマーをそれぞれ使用して、ＰＣＲ反応をさらに３０サイクル行った。その結果、１３４bpのＤＮＡ断片が特異的に増幅された。
【００５９】
１３４bpのＤＮＡ断片をｐＵＣ１８にサブクローニングし、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。そして、サブクローニングされたＤＮＡ断片の塩基配列をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｎａｓｅ蛍光シークエンサー用サイクルシーケンシングキット（アマシャム  ファルマシア  バイオテク製）及びＤＮＡシーケンサーModel 4000LS（LI-COR製）を使用して決定した。この配列を配列番号：１に示す。なお、この配列は配列番号：７に示す塩基配列の第1288〜第1420塩基配列に相当する。配列番号：１に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号：１０に示す。なお、以下の配列決定は上記の同様の方法によった。
【００６０】
配列番号：１からＰ４プライマー（配列番号：２７）を設計した。
Ｐ４  CCAACGCATTTGGATACGTCCC
再度、ｃＤＮＡを用いて、プライマーに3site Adaptor Primer（配列番号：２６）及びＰ４プライマーをそれぞれ使用して、ＰＣＲ反応を４０サイクル行った。その結果、ポリＡ配列を除いて６００bpのＤＮＡ断片が特異的に増幅された。
増幅されたＤＮＡ断片を同様にpUC18 にサブクローニングした後、その塩基配列を決定した。この配列を配列番号：２に示す。これは、配列番号：７の第1328〜第1927の塩基配列に相当する。なお、配列番号：２の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号：１１に示す。
【００６１】
グルタミナーゼ遺伝子の塩基配列決定
配列番号：２からＰ５プライマー（配列番号：２８）を設計した。
Ｐ５  TGATCGTGAAGACGTGGTCTAG
配列番号：２からＰ６プライマー（配列番号：２９）を設計した。
Ｐ６  TCTGATGCGTCACAATGGTTGG
【００６２】
５’上流域のＤＮＡ断片の増幅は、次のようにして行った。Ｒａｅｄｅｒらの方法（U. Raeder and P. Broda, Lett. Appl. Microb., 1, 17-20(1985))にしたがって調製したA.oryzae KBN616 株の染色体ＤＮＡを制限酵素Bgl IIで消化した後、宝酒造製LA-PCR in vitro Cloning Kit を用いて、cassette-ligation-mediated PCRを行った。即ち、制限酵素処理断片にＳａｕ３ＡＩカセット（宝酒造製）を結合させ、このＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＣ１プライマー（宝酒造製）（配列番号：３０）及びＰ５プライマーをそれぞれ使用して、ＰＣＲ反応を３０サイクル行った。
【００６３】
１００倍希釈した反応液を鋳型ＤＮＡとしてＣ２プライマー（宝酒造製）（配列番号：３１）及びＰ６プライマーを使用して、ＰＣＲ反応をさらに３０サイクル行った。その結果、2233bpのＤＮＡ断片が特異的に増幅された。増幅されたＤＮＡ断片を同様に、pUC18 にサブクローニングした後、その塩基配列を決定した。その塩基配列を配列番号：３に示す。この配列は配列番号：５の第１〜第２２３３の塩基配列に相当する。なお、配列番号：３に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号：１２に示す。
【００６４】
３’下流域のＤＮＡ断片の増幅は、次のようにして行った。Raederらの方法にしたがって調製したA.oryzae KBN616 株の染色体ＤＮＡを制限酵素Hind IIIで消化した後、宝酒造製LA-PCR in vitro Cloning Kit を用いて、cassette-ligation-mediated PCRを行った。即ち、制限酵素処理断片にHind IIIカセット（宝酒造製）を結合させた。このＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＣ１プライマー及びＰ４プライマーを使用して、ＰＣＲ反応を３０サイクル行った。
【００６５】
１００倍希釈した反応液を鋳型ＤＮＡとしてＣ２プライマー及びＰ４プライマーを使用して、ＰＣＲ反応をさらに３０サイクル行った。その結果、６５７bpのＤＮＡ断片が特異的に増幅された。増幅されたＤＮＡ断片を同様に、ｐＵＣ１８にサブクローニングした後、その塩基配列を決定した。この配列を配列番号：４に示す。この配列は配列番号：５の第２１３位〜第２７９４位の塩基配列に相当する。なお配列番号：４に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号：１３に示す。
【００６６】
前記配列番号：３の配列と配列番号：４の配列をつなぎ合わせて、グルタミナーゼをコードするゲノムＤＮＡの塩基配列を決定した。この配列を配列番号：５に示す。また、この塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号：１４に示す。
配列番号：３からＰ７プライマー（配列番号：３３）を設計した。
Ｐ７  CCATGTATCGTTTTTTAAGGAATACG
【００６７】
ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、プライマーとしてＰ６プライマー及びＰ７プライマーを使用して、ＰＣＲ反応を３０サイクル行った。その結果、1423bpのＤＮＡ断片が特異的に増幅された。増幅されたＤＮＡ断片を同様に、pUC18 にクローニングした後、その塩基配列を決定した。この塩基配列を配列番号：６に示す。
この配列は、配列番号：７の第１位〜第１４２３位の塩基配列に相当する。なお、この配列番号：６に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号：１５に示す。
【００６８】
配列番号：２の配列と配列番号：６の配列をつなぎ合わせて、グルタミナーゼをコードするｃＤＮＡを塩基配列を決定した。この塩基配列を配列番号：７に示す。この配列番号：７に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号：１６に示す。
【００６９】
実施例３．アスペルギルス・ソヤーBA-104のグルタミナーゼ遺伝子のクローニング
Ｐ７プライマーを１塩基変更し、Ｐ８（配列番号：３３）を設計した。
Ｐ８  CCATGCATCGTTTTTTAAGGAATACG
配列番号：５からＰ９プライマー（配列番号：３４）を設計した。
Ｐ９  CCTCTAGAGCATATCCACAAGATTTCTCTT
【００７０】
実施例１で使用したアスペルギルス・ソヤー（A.sojae ）BA-104株からＲａｅｄｅｒらの方法（U. Raeder and P. Broda, Lett. Appl. Microb., 1, 17-20 (1985)) にしたがって染色体ＤＮＡを単離精製し、そのＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰ８プライマー及びＰ９プライマーを用いてＰＣＲ反応を３０サイクル行った。
その結果、約２．３kbp のＤＮＡ断片が得られた。
【００７１】
得られたＤＮＡ断片をT4 DNAポリメラーゼで処理した後、制限酵素Xbalで消化し、その断片を制限酵素EcoT22I で消化後、T4 DNAポリメラーゼで処理し、その後、制限酵素Xbalで消化したベクターｐＴＦ１００（N. Kitamoto, J. Matsui, Y. Kawai, Y. Kato, S. Yoshino, K. Ohmiya, and N. Tsukagoshi, Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 85-92 (1998))に組み込みグルタミナーゼ遺伝子を含むベクターを作製した。そのベクターを大腸菌DH５αへ形質転換後、得られたベクター中には２種類のグルタミナーゼ遺伝子が存在していることが、制限酵素Hind IIIによる消化により判明した。その２種類のベクター（pGT200及びpGT300）からグルタミナーゼ遺伝子の配列を解析し、各グルタミナーゼの塩基配列を決定した。
【００７２】
その結果、配列番号：８及び配列番号：９に示す塩基配列が得られた。これらの塩基配列によりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１７及び配列番号：１８に示す。両アミノ酸配列（配列番号：１７、１８）には、実施例１で精製した酵素の部分アミノ酸配列（配列番号：１９、２０、２１、２２）が完全に含まれており、その酵素の遺伝子であることが確認できた。
【００７３】
実施例４．グルタミナーゼ遺伝子の麹菌での高発現
Raederらの方法にしたがって調製したアスペルギルス・オリゼー（A.oryzae）KBN616株の染色体ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰ８プライマー及びＰ９プライマーを使用して、ＰＣＲ反応を３０サイクル行った。増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素EcoT22I 及びXbalで消化した断片と、制限酵素Sall及びEcoT22I で消化したpTF100（N. Kitamoto, J. Matsui, Y. Kawai, Y. Kato, S. Yoshino, K. Ohmiya, and N. Tsukagoshi, Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 85-92 (1998))の断片を、制限酵素Sall及びXbalで消化したpND300（N. Kitamoto, T. Kimura, Y. Kito, K. Ohmiya, and N. Tsukagoshi, Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1795-1797 (1995)) に組み込みグルタミナーゼ遺伝子高発現ベクターpTFGT100を作製した。
【００７４】
pTFGT100でアスペルギルス・オリゼー（A.oryzae）KBN616-39 niaD- 株（N. Kitamoto, T. Kimura, Y. Kito, K. Ohmiya, and N. Tsukagoshi, Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1795-1797 (1995)) を形質転換したところ、グルタミナーゼ高生産アスペルギルス・オリゼーGT7 株を得ることができた。
【００７５】
また、同様にアスペルギルス・ソヤー由来のグルタミナーゼ遺伝子を含む上記のpGT200及びpGT300をそれぞれ制限酵素Sall及びXbalで消化した断片を制限酵素Sall及びXbalで消化したpND300に組み込みグルタミナーゼ遺伝子高発現ベクターpTFGT200及びpTFGT300を作製した。アスペルギルス・オリゼーKBN616-39 niaD- 株に形質転換したところ、アスペルギルス・ソヤー由来グルタミナーゼ高生産アスペルギルス・オリゼーGT26株、及びアスペルギルス・オリゼーGT33株を得ることができた。
【００７６】
A.oryzae GT7株を用いてＧＰ培地（N. Kitamoto, J. Matsui, Y. Kawai, Y. Kato, s. Yoshino, K. Ohmiya, and N. Tsukagoshi, Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 85-92 (1998))１００mlを用い、３０℃、１０日間静置培養を行ったところ、３１２ユニット／ｌのグルタミナーゼ活性を得た。また、アスペルギルス・オリゼー（A.oryzae）GT26株及びアスペルギルス・オリゼー（A.oryzae）GT33株を用いて同様に培養後、活性測定を行ったところ、培養液当り、２００ユニット／ｌ及び３４０ユニット／ｌのグルタミナーゼ活性を得た。
【００７７】
【配列表】
0004651203.tif 000008
【００７８】
0004651203.tif 000009
【００７９】
0004651203.tif 000010
0004651203.tif 000011
【００８０】
0004651203.tif 000012
0004651203.tif 000013
0004651203.tif 000014
0004651203.tif 000015
0004651203.tif 000016
【００８１】
0004651203.tif 000017
0004651203.tif 000018
【００８２】
0004651203.tif 000019
0004651203.tif 000020
0004651203.tif 000021
0004651203.tif 000022
0004651203.tif 000023
【００８３】
0004651203.tif 000024
0004651203.tif 000025
0004651203.tif 000026
0004651203.tif 000027
【００８４】
0004651203.tif 000028
0004651203.tif 000029
0004651203.tif 000030
0004651203.tif 000031
0004651203.tif 000032
【００８５】
0004651203.tif 000033
0004651203.tif 000034
0004651203.tif 000035
0004651203.tif 000036
0004651203.tif 000037
【００８６】
0004651203.tif 000038
0004651203.tif 000039
0004651203.tif 000040
0004651203.tif 000041
0004651203.tif 000042
【００８７】
0004651203.tif 000043
【００８８】
0004651203.tif 000044
【００８９】
0004651203.tif 000045
0004651203.tif 000046
0004651203.tif 000047
【００９０】
0004651203.tif 000048
【００９１】
0004651203.tif 000049
0004651203.tif 000050
0004651203.tif 000051
【００９２】
0004651203.tif 000052
0004651203.tif 000053
0004651203.tif 000054
【００９３】
0004651203.tif 000055
0004651203.tif 000056
0004651203.tif 000057
【００９４】
0004651203.tif 000058
0004651203.tif 000059
0004651203.tif 000060
【００９５】
0004651203.tif 000061
0004651203.tif 000062
0004651203.tif 000063
【００９６】
0004651203.tif 000064
【００９７】
0004651203.tif 000065
【００９８】
0004651203.tif 000066
【００９９】
0004651203.tif 000067
【０１００】
0004651203.tif 000068
【０１０１】
0004651203.tif 000069
【０１０２】
0004651203.tif 000070
【０１０３】
0004651203.tif 000071
【０１０４】
0004651203.tif 000072
【０１０５】
0004651203.tif 000073
【０１０６】
0004651203.tif 000074
【０１０７】
0004651203.tif 000075
【０１０８】
0004651203.tif 000076
【０１０９】
0004651203.tif 000077
【０１１０】
0004651203.tif 000078
【０１１１】
0004651203.tif 000079
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明のグルタミナーゼの至適pHを示すグラフである。
【図２】図２は本発明のグルタミナーゼのpH安定性を示すグラフである。
【図３】図３は本発明のグルタミナーゼの至適温度を示すグラフである。
【図４】図４は本発明のグルタミナーゼの温度安定性を示すグラフである。
【図１】
0004651203.tif 000080
【図２】
0004651203.tif 000081
【図３】
0004651203.tif 000082
【図４】
0004651203.tif 000083