(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を生成する方法であって、前記可変ドメインは、選択されたフレームワーク領域（“マスターフレームワーク”）内に位置する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、以下の工程：
（ａ）一以上のＣＤＲをＣＤＲに隣接するフレームワーク領域（“オリジナルフレームワーク”）内でコードする少なくとも一つの核酸分子を準備する工程であって、ここで、オリジナルフレームワークは、マスターフレームワークのフレームワーク領域とは異なる生殖細胞遺伝子ファミリーに由来するフレームワーク領域である、工程；
（ｂ）増幅プライマーとして一以上の対のオリゴヌクレオチドを用いて、工程（ａ）の核酸分子の少なくとも一つのＣＤＲコード部を増幅する工程；および
（ｃ）オーバーラップ伸長ＰＣＲを用いて、工程（ｂ）で生成された、増幅されたＣＤＲコードヌクレオチド配列と、前記マスターフレームワークをコードするヌクレオチド配列とを組み合わせて、抗体可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を組み立てる工程；を含み、
ここで前記工程（ｂ）のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記マスターフレームワークをコードする対応ヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項２】
ポリヌクレオチド配列のライブラリーに共通の選択されたフレームワーク領域（“マスターフレームワーク”）内に位置する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体可変ドメインをそれぞれコードするポリヌクレオチド配列のライブラリーを生成する方法であって、以下の工程：
（ａ）一以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）をＣＤＲに隣接するフレームワーク領域（“オリジナルフレームワーク”）内でコードする核酸分子の集団を準備する工程であって、ここで、オリジナルフレームワークは、マスターフレームワークのフレームワーク領域とは異なる生殖細胞遺伝子ファミリーに由来するフレームワーク領域である、工程；
（ｂ）増幅プライマーとして一以上の対のオリゴヌクレオチドを用いて、工程（ａ）の核酸分子の少なくとも一つのＣＤＲコード部を増幅する工程；および
（ｃ）オーバーラップ伸長ＰＣＲを用いて、工程（ｂ）で生成された、増幅されたＣＤＲコードヌクレオチド配列と、前記マスターフレームワークをコードするヌクレオチド配列とを組み合わせて、抗体可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を組み立てる工程；を含み、
ここで前記工程（ｂ）のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記マスターフレームワークをコードする対応ヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項３】
以下の工程：
(i)少なくとも一対のオリゴヌクレオチドを準備する工程；
(ii)前記各対のオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとして用いて、マスターフレームワーク内のヌクレオチド配列とは異なるＣＤＲコードヌクレオチド配列を増幅する工程；および
(iii)オーバーラップ伸長ＰＣＲを用いて、上記工程(ii)に由来するヌクレオチド配列を、マスターフレームワークをコードするヌクレオチド配列と合わせることにより、抗体可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を組み立てる工程；
を含み、
ここで、工程（i）のオリゴヌクレオチドは、前記マスターフレームワークをコードする対応配列とは異なる配列を有する、
請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）で組み立てられたポリヌクレオチド配列が、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）可変ドメインをコードする、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）で組み立てられたポリヌクレオチド配列が、ＩｇＧ重鎖または軽鎖をコードする、請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）で組み立てられたポリヌクレオチド配列が、天然に存在しない抗体可変ドメインをコードする、請求項１または２記載の方法。
【請求項７】
工程（ｃ）で組み立てられた少なくとも一つのポリヌクレオチド配列が、マスターフレームワークを含む天然に存在する抗体可変ドメインのＣＤＲの非定型性である基準構造を有する少なくとも一つのＣＤＲを含む抗体可変ドメインをコードする、請求項１または２記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）で組み立てられた少なくとも一つのポリヌクレオチド配列が、マスターフレームワークの生殖細胞遺伝子ファミリーとは異なる生殖細胞遺伝子ファミリーに由来する少なくとも一つのＣＤＲを含む抗体可変ドメインをコードする、請求項１または２記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）が、それぞれ抗体可変ドメインをコードする核酸分子の集団を準備することを含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項１０】
核酸分子が、それぞれ、同一の生殖細胞遺伝子ファミリーに由来する抗体可変ドメインをコードする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｂ）のオリゴヌクレオチドプライマー対が、工程（ａ）で準備された核酸分子の集団の一部に選択的にハイブリダイズする、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
核酸分子の集団の一部が、それぞれ、同一の生殖細胞遺伝子ファミリーに由来する抗体可変ドメインをコードする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
核酸分子が、それぞれ、同一の生殖細胞遺伝子に由来する抗体可変ドメインをコードする、請求項１０または１２記載の方法。
【請求項１４】
生殖細胞遺伝子が、ＤＰ-２９およびＤＰ-７３からなる群から選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
マスターフレームワークが、ＤＰ-４７およびＤＰＬ-３からなる群から選択された生殖細胞遺伝子に由来する、請求項１または２記載の方法。
【請求項１６】
増幅されたＣＤＲコード分子のフレームワーク領域をコードする部分が、マスターフレームワークの対応部分とより大きな配列同一性を占めるように、工程（ｂ）の後であって工程（ｃ）の前に、工程（ｂ）の増幅されたＣＤＲコード分子のヌクレオチド配列を変更するさらなる工程を含む、請求項１ないし１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
増幅されたＣＤＲコード分子のフレームワーク領域をコードする部分が、マスターフレームワークの対応部分と１００％の配列同一性を占めるように、工程（ｂ）の増幅されたＣＤＲコード分子のヌクレオチド配列を変更する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記さらなる工程が、オリジナルおよびマスターフレームワークをコードするヌクレオチド配列のキメラであるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いた一回のＰＣＲ増幅を含む、請求項１６または１７記載の方法。
【請求項１９】
前記さらなる工程が、工程（ｂ）で生成されたＣＤＲコード核酸分子のＰＣＲ増幅をさらに一回以上実施することを含み、さらなる回の各増幅が、オリジナルフレームワーク配列に対して増加する数のヌクレオチドミスマッチを有するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施され、係るミスマッチがマスターフレームワークの対応ヌクレオチドと配列同一性を有するものである、請求項１６または１７記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｃ）で組み立てられたポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入するさらなる工程を含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項２１】
発現ベクターがファージディスプレーベクターである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｃ）で組み立てられたポリヌクレオチド配列を発現する工程、および、抗体可変ドメインを含む結果的に得られたポリペプチドを、所望の特性についてスクリーニングする工程をさらに含む、請求項１ないし２１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗体機能のin vitro分子進化の方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＷＯ９８／３２８４５、Soderlindら(1999)、およびJirholtら(1998)は、天然に生じる相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ＶH３ファミリーの生殖細胞遺伝子ＤＰ-４７由来のフレームワーク領域を含む解明および選択された（“マスター”）フレームワークに移植することによる、抗体誘導タンパクのin vitro分子進化について記載している。ＣＤＲに隣接するＤＰ-４７のフレームワーク領域の一部をコードする配列に基づいたオリゴヌクレオチドプライマーが、末梢血液Ｂ細胞から調製したｃＤＮＡライブラリーからＣＤＲをコードする核酸配列を増幅するために用いられる。次いで、増幅領域に由来する一本鎖ＤＮＡを、オーバーラップ伸長ＰＣＲ反応において、マスターフレームワークの残部をコードするオーバーラッピングオリゴヌクレオチドと組合せ、ＤＰ-４７生殖細胞遺伝子のフレームワーク領域と、ＶH３ファミリーの生殖細胞遺伝子由来のＣＤＲとを含むＶH抗体ドメインをコードする全長配列を生成する。
【０００３】
この技術は、抗体ライブラリー（例えば、ファージディスプレーライブラリー）の多様性を増大させる、価値ある手段を提供する。特に、これは、in vivoで通常結合し、かつ、生殖細胞遺伝子再編成の際に組み換えを受けないＣＤＲ１とＣＤＲ２の組み換えを可能にする。
【０００４】
さらに、このＣＤＲは、in vivoで校正(proof-read)されており、免疫原性ではないと考えられ、人工的に変異したＣＤＲ配列を越える利点を与える。また、利用されるマスターフレームワーク（生殖細胞系ＤＰ-４７およびＤＰＬ３由来）は、細菌発現および使用するファージシステムと高度に適合するように選択され、かくして、高度の機能的タンパクディスプレーを確実にする。
【０００５】
ライブラリーの作製における別の重要な側面は、他種類の異なるタイプの抗原に対して、高い親和性で、特異性を保持することができるフレームワークの問題である。このシステムは、多数のＣＤＲ部位に可変性を導入可能なので、達成できる可変性が莫大で、従前に確立された組合せ技術から得られるものをはるかに越えている。最後に、モジュールデザイン(modular design)、すなわち、可変性が共通のフレームワーク構造に導入されることが、選択されたクローンのその後の修飾および研究を簡単かつ効率的にする。
【０００６】
試験的にＣＤＲ移植(CDR-implantation)と呼ばれるこの技術を用いて、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フォーマットに基づいた大きなファージディスプレー抗体ライブラリーが製造された。このライブラリーは、タンパク（ヒトおよびヒト以外に由来する）、ペプチド、炭水化物および低分子量ハプテンを含む多数のリガンドタイプに対する高親和性抗体のパネルを選択するために用いられた。かくして、機能的観点から、単一の、選択された、マスターフレームワークが、極めて異なるタイプの抗原に対して高い親和性を有する抗体特異性を保持できることが明らかであり、表面のトポロジーが抗体間でかなり異なることを示唆している。
【０００７】
しかしながら、依然として、抗体ライブラリーの多様性を増大させることが、当該技術分野において一般的に要求されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
本発明によれば、選択されたマスターフレームワークとは異なる、フレームワーク（“オリジナルフレームワーク”）に通常含まれるＣＤＲをコードする核酸が、イムノグロブリン遺伝子から増幅され、選択されたマスターフレームワークをコードする核酸に挿入される。
【０００９】
増幅は、このＣＤＲに隣接するフレームワーク領域に基づくプライマーを用いたＰＣＲによって、上述したような従来のＣＤＲ移植を用いて達成される。しかしながら、本発明では、オリジナルフレームワークとマスターフレームワークが異なる。それゆえ、上述したＣＤＲ移植方法とは対照的に、ＣＤＲをコードする核酸が、もっぱらマスターフレームワークに基づくプライマーを用いて増幅されない。むしろ、マスターフレームワークをコードする配列とは異なるプライマーが用いられる。このプライマーは、特に、特定の他のフレームワーク、例えば、異なる生殖細胞遺伝子のフレームワークまたは生殖細胞遺伝子ファミリーのコンセンサス配列に基づいてもよく、あるいは、例えば、ある範囲の生殖細胞系ファミリーからＣＤＲを増幅するために縮重されてもよい。
【００１０】
従って、第一の態様では、本発明は、抗体可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を生成する方法を提供する。この可変ドメインは、選択されたフレームワーク（“マスターフレームワーク”）内に位置する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。この方法は、以下の工程：
ａ）一以上のＣＤＲと、関連したフレームワーク領域（“オリジナルフレームワーク”）とをコードする少なくとも一つの核酸分子を準備する工程；
ｂ）増幅プライマーとして一以上の対のオリゴヌクレオチドを用いて、工程（ａ）の核酸分子の少なくとも一つのＣＤＲコード部を増幅する工程；および
ｃ）工程（ｂ）で製造された増幅されたＣＤＲをコードするヌクレオチド配列と、前記マスターフレームワークをコードするヌクレオチド配列とを組み合わせて、抗体可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を組み立てる工程
を含み、
ここで前記工程（ｂ）のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記マスターフレームワークをコードする対応ヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を含む。
【００１１】
本発明の第二の態様は、共通の選択されたフレームワーク（“マスターフレームワーク”）内に位置する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列のライブラリーを製造する方法を提供し、この方法は、以下の工程：
ａ）一以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、関連したフレームワーク領域（“オリジナルフレームワーク”）とをコードする核酸分子の集団を準備する工程；
ｂ）増幅プライマーとして一以上の対のオリゴヌクレオチドを用いて、工程（ａ）の核酸分子の少なくとも一つのＣＤＲコード部を増幅する工程；および
ｃ）工程（ｂ）で製造された増幅されたＣＤＲをコードするヌクレオチド配列と、前記マスターフレームワークをコードするヌクレオチド配列とを組み合わせて、抗体可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を組み立てる工程
を含み、
ここで前記工程（ｂ）のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記マスターフレームワークをコードする対応ヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
工程（ａ）で準備される核酸分子に関して用いられる“関連したフレームワーク領域(associated framework regions)”は、ＣＤＲに隣接するフレームワーク領域のアミノ酸残基を意味する。例えば、工程（ａ）の核酸分子は、ＣＤＲを、ＣＤＲの両側に隣接するフレームワークの５、１０、１５またはそれ以上のアミノ酸残基と共にコードしてもよい。かくして、工程（ａ）の核酸分子は、抗体可変領域または完全な抗体をコードしてもよい。
【００１３】
工程（ｂ）のオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列に関して“異なる”とは、フレームワーク残基をコードする工程（ｂ）のオリゴヌクレオチドプライマーの領域（すなわち、フレームワーク残基をコードする工程（ａ）で準備された核酸分子の領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの領域）が、マスターフレームワークをコードする核酸分子の対応領域と１００％の配列同一性を有しないことを意味する。
【００１４】
本発明の第一及び第二の態様の好ましい実施態様では、当該方法は、以下の工程：
i)少なくとも一対のオリゴヌクレオチドを準備する工程；
ii)前記対のオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとして用いて、種々のＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を増幅する工程；および
iii)上記工程ii)から誘導されたヌクレオチド配列を、選択されたタイプのフレームワーク配列（ＦＲ）をコードするヌクレオチド配列と合わせることにより、抗体可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を組み立てる工程
を含み、
ここで、工程（i）のオリゴヌクレオチドは、前記マスターフレームワークをコードする対応配列とは異なる配列を有する。
【００１５】
疑義を避けるために、ここで用いる可変領域の“フレームワーク”とは、典型的には４つの個々のフレームワーク領域からなり、可変領域の３つのＣＤＲに隣接する：
[---FR1---][CDR1][---FR2---][CDR2][---FR3---][CDR3][---FR4---]
【００１６】
“選択されたタイプのフレームワーク領域（ＦＲ）”は、共に、“マスターフレームワーク”を提供する。
【００１７】
本発明の方法は、種々のタイプの抗体の可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を製造するために用いられることは当業者に理解されるであろう。例えば、可変ドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ可変ドメインであってもよい。
【００１８】
好ましくは、工程（ｃ）で組み立てられたポリヌクレオチド配列は、ＩｇＧ可変ドメインをコードする。有利に、工程（ｃ）で組み立てられたポリヌクレオチド配列は、ＩｇＧ重鎖または軽鎖をコードする。都合よく、工程（ｃ）で組み立てられたポリヌクレオチド配列は、非天然抗体可変ドメインをコードする。
【００１９】
有利に、工程（ｃ）で組み立てられたポリヌクレオチド配列は、マスターフレームワークを含む抗体可変ドメインの非定型である基準構造(canonical structure)を有する少なくとも一つのＣＤＲを含む抗体可変ドメインをコードする。“非定型(atypical)”とは、ＣＤＲが、選択されたマスターフレームワークを含む天然に生じる抗体可変ドメインの１０％未満に見出される基準構造を有することを意味する。好ましくは、ＣＤＲは、選択されたマスターフレームワークを含む天然に生じる抗体可変ドメインの５％、２％または１％未満に見出される基準構造を有する。最も好ましくは、ＣＤＲは、選択されたマスターフレームワークを含む天然に生じる抗体可変ドメインのいずれにも見出されない基準構造を有する。
【００２０】
本発明の方法の好ましい実施態様では、工程（ｃ）で組み立てられた少なくとも一つのポリヌクレオチド配列が、マスターフレームワークとは異なる生殖細胞遺伝子ファミリーから誘導された少なくとも一つのＣＤＲを含む抗体可変ドメインをコードする。例えば、工程（ｃ）で組み立てられたポリヌクレオチド配列は、重鎖フレームワークに軽鎖から誘導された一以上のＣＤＲを含む、あるいはその逆の抗体可変ドメインをコードしてもよい。
【００２１】
有利に、工程（ａ）は、抗体可変ドメインをコードする核酸分子の集団を準備することを含む。都合よく、核酸分子は、同一の生殖細胞遺伝子ファミリーに由来する抗体可変ドメインをコードする。かくして、ＣＤＲがマスターフレームワークに取り込まれる選択性は、少なくとも部分的に、工程（ａ）において核酸分子の選択された集団を準備することによって達成されうる。
【００２２】
あるいは、または加えて、ＣＤＲがマスターフレームワークに取り込まれる選択性は、工程（ｂ）で、工程（ａ）で準備された核酸分子の標的亜集団(target sub-population)に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー対を用いることによって達成されてもよい。“選択的にハイブリダイズ”とは、オリゴヌクレオチドプライマー対が、高いストリンジェンシー条件下で核酸分子の標的亜集団に選択的にハイブリダイズすることを意味する。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション条件は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (third edition), Sambrook and Russell (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
【００２３】
当業者であれば、ターゲット核酸分子と選択的にハイブリダイズするプライマーの能力は、大いに、プライマーとターゲット配列との間の配列相補性の度合いに依存することが理解できるであろう。
【００２４】
好ましくは、工程（ｂ）のオリゴヌクレオチドプライマー対は、同一の生殖細胞遺伝子ファミリーに由来する抗体可変ドメインをコードする、工程（ａ）で準備された核酸分子の標的亜集団に選択的にハイブリダイズする。
【００２５】
かくして、工程（ａ）の核酸分子の選択された集団を準備すること、および／または、工程（ａ）で準備された核酸分子の標的亜集団に選択的にハイブリダイズする工程（ｂ）のオリゴヌクレオチドプライマー対を用いることにより、マスターフレームワークに取り込まれるべきＣＤＲを選択することができる。
【００２６】
好ましい実施態様では、マスターフレームワークに取り込まれるべきＣＤＲは、ＶH３ファミリーのような、同一の生殖細胞遺伝子ファミリーに由来する抗体可変ドメインをコードする核酸分子から誘導される。都合よく、マスターフレームワークに取り込まれるべきＣＤＲは、ＤＰ-２９およびＤＰ-７３のような、同一の生殖細胞遺伝子に由来する抗体可変ドメインをコードする核酸分子から誘導される。
【００２７】
有利には、マスターフレームワークは、ＤＰ-４７およびＤＰＬ-３からなる群から選択される生殖細胞遺伝子から誘導される。
【００２８】
本発明の方法の好ましい実施態様では、工程（ｃ）は、オーバーラップ伸長ＰＣＲの使用を含む（Sambrook & Russell（上掲）参照）。この場合、工程（ｂ）で産生された、増幅されたＣＤＲをコードする核酸分子から一本鎖核酸分子を単離することが必要である。これは、プライマーの一方がビオチニル化されているオリゴヌクレオチドプライマー対を用いて達成され、そうすることによって、ビオチニル化プライマーの伸長により産生された核酸鎖が、ストレプトアビジンに対する親和性に基づいて単離されることを可能にする。ビオチニル化プライマーの使用およびオーバーラップ伸長ＰＣＲについては、Jirholtら,1998（上掲）に記載されている。
【００２９】
フレームワーク残基をコードする増幅プライマーと、マスターフレームワークの対応領域をコードする核酸配列との間にヌクレオチド配列の差異が存在することから、増幅されたＣＤＲは、オーバーラップ伸長ＰＣＲにより、常にマスターフレームワークに直接的に取り込まれるわけではない。これは、増幅されたＣＤＲをコードするヌクレオチドが、マスターフレームワークをコードする核酸と適切にアニールできないかもしれないからである。これは、特に（実施例１Ｂのように）、増幅プライマーの末端（とりわけＣＤＲに近い方の末端）に顕著なミスマッチが存在する場合である。結果的に、ＣＤＲに隣接するフレームワーク領域をコードする増幅されたヌクレオチド配列の領域を変更して、マスターフレームワークの対応領域をコードする核酸分子の領域にそれらの配列をより類似させる必要があるかもしれない。
【００３０】
かくして、本発明の方法の好ましい実施態様では、この方法は、増幅された分子のフレームワーク領域をコードする部分が、マスターフレームワークの対応部分とより大きな配列同一性を占めるように、工程（ｂ）の後であって工程（ｃ）の前に、工程（ｂ）の増幅されたＣＤＲをコードする分子のヌクレオチド配列を変更するさらなる工程を含む。好ましくは、ヌクレオチド配列は、フレームワーク領域をコードする前記増幅された分子の部分が、マスターフレームワークの対応部分と１００％の配列同一性を占めるように変更される。
【００３１】
例えば、これを実施する一つの手段は、先ず、ＣＤＲのオリジナルフレームワークに同一または非常に類似するＰＣＲプライマーを用いて、ＣＤＲと隣接するフレームワーク領域の隣接部分を増幅する。次いで、ＰＣＲ増幅の逐次的ラウンドにおいて、オリジナルフレームワークに対してミスマッチを含むプライマーを用いてフレームワーク領域をコードする増幅された核酸配列の領域を変更することができ、係るミスマッチは、マスターフレームワークの対応部位に存在する残基を提供する。最終的に、このフレームワーク領域は、オーバーラップ伸長ＰＣＲによってそこに取り込まれるに十分に、マスターフレームワークに類似または同一になる。
【００３２】
あるいは、オリジナルおよびマスターフレームワークのキメラを表すプライマーを用いた一回のラウンドのＰＣＲ増幅は、オーバーラップ伸長ＰＣＲプロセスで用いることができるＣＤＲを増幅させるのに十分である。この場合は、前記さらなる工程は必要ない。
【００３３】
第一ラウンドのＰＣＲ（工程“ｂ”）では、それゆえ、前記さらなる工程が行われるか否かによらず、選択されたマスターフレームワークに共通するできるだけ多くの塩基を含むように、オリジナルフレームワークに対してプライマーにミスマッチを含むことが好ましい。含むことができるミスマッチの数は、フレームワーク間で異なる塩基の数、プライマーの長さ、および所望外の配列にアニーリングするリスクを含む一連のファクターに依存する。
【００３４】
オリジナルフレームワークに同一のプライマーにより増幅されたＣＤＲは、オーバーラップ伸長ＰＣＲによって、マスターフレームワークに直接取り込むことができる（すなわち、工程“ｂ”の産物）。あるいは、さらなるＰＣＲ工程（上記）を含むことが、増幅されたＣＤＲをコードする配列に関連するフレームワーク配列を、マスターフレームワークの対応配列に対して、より類似させるのに必要かもしれない。
【００３５】
本発明の第一の態様の好ましい実施態様では、この方法は、工程（ｃ）で組み立てられたポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入するさらなる工程を含む。有利には、発現ベクターは、分泌ベクターである。
【００３６】
かくして、本発明の方法により産生されたポリヌクレオチド配列は、公知技術に従って、適切にここに含まれた技術の観点で変更されて、発現ベクターを構成するために用いることができ、これは次いで、抗体可変ドメインの発現および産生に適した宿主細胞を形質転換するために使用される。かかる技術は、Rutterらの1984年4月3日付けの米国特許第4440859号、Weissmanの1985年7月23日付の第4530901号、Crowlの1986年4月15日付けの第4582800号、Markらの1987年6月30日付の第4677063号、Goeddelの1987年7月7日付けの第4678751号、Itakuraらの1987年11月3日付の第4704362号、Murrayの1987年12月1日付けの第4710463号、Toole, Jrらの1988年7月12日付けの第4757006号、Goeddelらの1988年8月23日付の第4766075号、およびStalkerの1989年3月7日付けの第4810648号に開示されているものを含み、これらの全てを参照としてここに含める。
【００３７】
本発明の方法により生成されたポリヌクレオチド配列は、適切な宿主に導入するための他の多岐にわたるＤＮＡ配列に連結されてもよい。この付随するＤＮＡは、宿主の性質、宿主へのＤＮＡの導入方法、およびエピソームでの維持または組み込みのいずれが所望であるかに依存する。
【００３８】
一般に、ポリヌクレオチド配列は、プラスミドのような発現ベクターに、適切な配向および発現に正しい読み枠で挿入される。必要であれば、ポリヌクレオチド配列は、所望の宿主に認識される適切な転写および翻訳制御コントロールヌクレオチド配列に結合されてもよいが、係るコントロールは、発現ベクターににおいて一般的に利用可能である。かくして、ポリヌクレオチド配列挿入は、適切なプロモーターに機能的に連結されてもよい。細菌性プロモーターは、E.coli lacIおよびlacZプロモーター、T3およびT7プロモーター、gptプロモーター、ファージλPRおよびPLプロモーター、phoAプロモーターおよびtrpプロモーターを含む。真核性プロモーターは、CMV最初期(immediate early)プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期SV40プロモーター、およびレトロウイルスＬＴＲのプロモーターを含む。別の適切なプロモーターが、当業者に公知であろう。この発現構成物が、転写開始および終結の部位、および転写された領域に、翻訳のためのリボソーム結合部位も含むことが望ましい（Hastingsら, 1998年4月23日に公開された国際特許出願WO98/16643）。
【００３９】
ベクターは、標準的な技術を介して宿主に導入される。一般に、宿主の全てが、ベクターによってトランスフォームされるされるわけではなく、それゆえ、トランスフォームされた宿主細胞を選別する必要がある。一つの選択技術は、発現ベクターに、必須のあらゆるコントロールエレメントと共に、形質転換された細胞において選択可能な特性をコードするＤＮＡ配列マーカーを取り込むことを含む。これらのマーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素、G418または真核細胞培養のネオマイシン耐性、およびE.coliおよび他の細菌における培養のためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子を含む。あるいは、係る選択可能な特徴の遺伝子は、所望の宿主細胞を共トランスフォーム(co-transform)するのに用いられる別のベクターにあってもよい。
【００４０】
次に、発現ベクターによってトランスフォームされた宿主細胞を、ここに開示された技術的観点で、当業者に公知の十分な時間および適切な条件下で培養し、コードされた抗体可変ドメインの発現をさせ、次いでこれを回収することができる。
【００４１】
抗体可変ドメインは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む、周知の方法により組み換え細胞培養物から回収および精製することができる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィー（“ＨＰＬＣ”）が精製に用いられる。
【００４２】
多くの発現系が公知であり、例えば組み換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターでトランスフォームされた細菌（例えば、E.coliおよびBacillus subtilis）；例えば、酵母発現ベクターでトランスフォームされた酵母（例えば、Saccaromyces cerevisiae）；例えば、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）でトランスフォームされた昆虫細胞系；例えばウイルス性または細菌性発現ベクターでトランスフェクトされた植物細胞系；例えば、アデノウイルス発現ベクターでトランスフェクトされた動物細胞系を用いる系を含む。
【００４３】
ベクターは、別の非原核細胞タイプにおける発現に用いられる場合であっても、原核生物における増殖のために、例えば、Col E1 oriのような原核性レプリコンを含んでもよい。このベクターは、それで形質転換された、E.coliのような細菌性宿主細胞において、遺伝子の発現（転写および翻訳）を指示することができる原核性プロモーターのような適切なプロモーターを含んでもよい。
【００４４】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合と転写を起こすＤＮＡ配列により形成された発現コントロールエレメントである。模範的な細菌性宿主に適合するプロモーター配列は、本発明のＤＮＡセグメントの挿入に都合のよい制限部位を含むプラスミドベクターに典型的に備えられている。
【００４５】
典型的な原核性ベクタープラスミドは、Biorad Laboratories (Richmond, CA, USA)から入手可能なpUC18、pUC19、pBR322、およびpBR329；Pharmacia(Piscataway, NJ, USA)から入手可能なpTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540およびpRIT5；Stratagene Cloning Systems(La Jolla, CA 92037, USA)から入手可能なpBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46Aである。
【００４６】
典型的な哺乳動物細胞ベクタープラスミドは、Pharmacia(Piscataway, NJ, USA)から入手可能なpSVLである。このベクターは、クローン化遺伝子の発現を誘導するためのＳＶ４０後期プロモーターを用いる。最も高いレベルの発現は、COS-1細胞のようなＴ抗原産生細胞に見出される。誘導性の哺乳動物発現ベクターの例は、pMSGであり、Pharmacia(Piscataway, NJ, USA)から入手できる。このベクターは、クローン化遺伝子の発現を誘導するためのマウス哺乳動物腫瘍ウイルスの長い端末反復のグルココルチコイド誘導性プロモーターを用いる。
【００４７】
有益な酵母プラスミドベクターは、pRS403-406およびpRS413-416であり、一般的に、Stratagene Cloning Systems(La Jolla, CA 92037, USA)から入手可能である。プラスミドpRS403、pRS404、pRS405およびpRS406は、酵母組み込みプラスミド(Yeast Integrating plasmids)(YIps)であり、酵母選択可能マーカーHIS3、TRP1、LEU2およびURA3を含む。プラスミドpRS413-416は、酵母セントロメアプラスミド(Yeast Centromere plasmids)(YCps)である。
【００４８】
当業者に周知の方法を、コード配列と、例えば適切な転写または翻訳コントロールを含む発現ベクターを構築するために用いることができる。係る方法の一つは、ホモポリマーテイルを介したライゲーションを含む。ホモポリマーポリｄＡ（またはポリｄＣ）テイルは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによりクローン化されるべきＤＮＡフラグメントの露呈された３'OH基に付加される。次いで、このフラグメントを、直線化したプラスミドベクターの末端に付加されたポリｄＴ（またはポリｄＧ）テイルにアニーリングすることができる。アニーリング後のギャップは、ＤＮＡポリメラーゼによって満たされ、フリーの末端がＤＮＡリガーゼにより連結される。
【００４９】
別の方法は、付着末端を介したライゲーションを含む。適合する付着末端は、適切な制限酵素の作用によりＤＮＡフラグメントとベクターに生成されうる。これらの末端は、相補的塩基対を介して急速にアニールし、残りのニックはＤＮＡリガーゼの作用によって閉じることができる。
【００５０】
さらなる方法は、リンカーおよびアダプターと称される合成分子を用いる。平滑末端を備えたＤＮＡフラグメントは、突出している３'末端を除いて窪んだ３'末端を埋める、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼまたはE.coli ＤＮＡポリメラーゼＩによって生成される。所定の制限酵素の認識配列を含む合成リンカー、平滑末端化二本鎖ＤＮＡ片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより平滑末端化ＤＮＡフラグメントにライゲートすることができる。これらを、後で、適切な制限酵素で切断して、付着末端を生じ、適切な末端を有する発現ベクターにライゲートする。アダプターは、ライゲーションに使用される１つの平滑末端を有するが、予め形成された一つの付着末端を有する、化学的に合成されたＤＮＡでもよい。
【００５１】
種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USAを含む多くの製造元から商業的に入手できる。
【００５２】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを変性する望ましい方法は、Saikiら(1988), Science 239, 487-491により開示されているようなポリメラーゼ連鎖反応を用いることである。この方法では、酵素的に増幅されるべきＤＮＡは、それ自身が増幅されたＤＮＡに取り込まれる二つの特異的オリゴヌクレオチドプライマーによって隣接される。前記特異的プライマーは、当該技術分野で公知の方法を用いて発現ベクターにクローニングするのに用いられる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでもよい。
【００５３】
かくして、本発明の第三の態様は、本発明の第一または第二の態様の方法によって産生可能なおよび／または産生されたポリヌクレオチド配列を提供する。
【００５４】
本発明の第四の態様は、例えば抗体またはそのフラグメント（例えば、一本鎖ＳｃＦｖ抗体）のような、本発明の第三の態様に係るポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００５５】
本発明はさらに、本発明の第二の態様に係るポリヌクレオチド配列を取り込んだベクター、および係るベクターによりトランスフォームされた宿主細胞を提供する。例示的な宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞のような哺乳動物細胞を含む。
【００５６】
好ましい実施態様では、発現ベクターはファージディスプレーベクターである。
【００５７】
ファージコートタンパクの一つに融合された、バクテリオファージ（ファージ）の表面のタンパクおよびポリペプチドのディスプレーは、特異的リガンドの選択のための強力なツールを提供する。この“ファージディスプレー”技術は、特定の抗原に高い親和性を有する抗体を選択する目的で抗体の大きなライブラリーを作製するために、1985にSmithにより最初に用いられた(Science 228, 1315-7)。最近では、この方法は、所望の特性を有するリガンドを同定するために、ペプチド、タンパクのドメインおよび完全なタンパクを、ファージの表面に提示するために用いられている。
【００５８】
ファージディスプレー技術の原理は以下の通りである：
(i)ディスプレー用のタンパクまたはポリペプチドをコードする核酸をファージにクローン化する；
(ii)外来タンパクまたはポリペプチドがファージ表面に提示されるように、前記クローン化した核酸を、ファージコートタンパク（典型的には、繊維状ファージの場合にはｐ３またはｐ８コートタンパク）の一つのコート-アンカー部に融合させて発現させる；
(iii)所望の特性を有するタンパクまたはポリペプチドを提示するファージを（例えば、アフィニティークロマトグラフィーにより）選択し、それによって、（表現型にリンクした）遺伝子型を得て、これを配列決定し、増殖させ、かつ別の発現系に移すことができる。
【００５９】
あるいは、外来タンパクまたはポリペプチドは、バクテリオファージコートに一本鎖核酸として収容され得るファージミド(phagemid)ベクター（すなわち、ファージおよびプラスミドから誘導される複製起点を含むベクター）を用いて発現されてもよい。ファージミドベクターを用いた場合、“ヘルパーファージ”が、ファージミド核酸の複製およびパッケージングの機能を供給するために用いられる。得られたファージは、野生型コートタンパク（ヘルパーファージによりコードされる）と変性されたコートタンパク（ファージミドによりコードされる）の両方を発現する。一方、ファージベクターが用いられた場合には変性されたコートタンパクのみが発現される。
【００６０】
所望の特異性を備えたタンパクまたはペプチドを発現するファージを選択する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、広く用いられている方法は、“パンニング”であり、この方法では、リガンドを提示しているファージストックが、例えばアフィニティークロマトグラフィーを用いて、固相結合したターゲット分子に曝される。
【００６１】
興味のあるファージを選択するための別法は、ＳＡＰ（Selection and Amplification of Phages(ファージの選択と増幅)；WO95/16027に記載）およびＳＩＰ（Selectively-Infective Phage(選択的感性性ファージ); EP614989A, WO99/07842）を含み、これらは、提示されたリガンドがリガンドバインダーに特異的に結合する、ファージの増幅に基づいた選別を用いる。ＳＡＰ法の一つの実施態様では、非感染性ファージを用いて、興味のあるリガンドバインダーをｐ３のＮ末端部に接続させることによって実施される。かくして、リガンドバインダーが、提示されたリガンドに特異的に結合すれば、当該非感染性のリガンド発現ファージは、感染に必要なｐ３の部分が具備される。この相互作用は可逆的なので、選別は動力学的パラメーターに基づく（Duenasら,1996,Mol.Immunol.33,279-285参照）。
【００６２】
生物学的に関連する分子に結合するリガンドを単離するためのファージディスプレーの使用は、Feliciら(1995) Biotechnol. Annual Rev. 1, 149-183、Katz(1997) Annual Rev. Biophys. Biomol. Struct.26,27-45およびHoogenboomら(1998) Immunotechnology 4(1),1-20に概説されている。いくつかのランダム化コンビナトリアルペプチドライブラリーが、例えば細胞表面レセプターまたはＤＮＡのような種々のターゲットを結合するポリペプチドを選別するために構築された（Kay, 1995, Perspect.Drug Discovery Des.2,251-268; Kay and Paul, 1996, Mol.Divers.1,139-140に概説されている）。タンパクおよび多重結合タンパクが、機能的分子としてファージディスプレー化に成功している（EP0349578A, EP0527839A, EP0589877A；Chiswell and McCafferty, 1992, Trends Biotechnol.10,80-84を参照）。さらに、機能的抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ[ｓｃＦｖ]）が発現され（McCaffertyら,1990,Nature 348,552-554; Barbasら, 1991, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88, 7978-7982; Clacksonら,1991, Nature 352,624-628）、かつ、ヒト高親和性抗体フラグメントが単離されたことから（Marksら, 1991, J.Mol.Biol.222,581-597; Hoogenboom and Winter, 1992, J.Mol.Biol.227,381-388）、ヒトモノクローナル抗体技術の欠点の一部が廃止された。ファージディスプレーの原理と実際に関するさらなる情報は、Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual Ed kay, Winter and McCafferty(1996) Academic Press, Inc ISBN 0-12-402380-0に与えられており、この開示内容を参照としてここに含める。
【００６３】
本発明の第一及び第二の態様の好ましい実施態様では、当該方法は、工程（ｃ）で組み立てたポリヌクレオチド配列を発現させ、かつ、所望の特性に関して、抗体可変ドメインを含む得られたポリペプチドをスクリーニングすることをさらに含む。好ましくは、所望の特性は公知の技術により容易に選択可能である。例えば、抗体は、アフィニティークロマトグラフィー法を用いて所望の親和性に関してスクリーニングすることができる。
【００６４】
本発明のさらなる態様は、本発明の第二の態様に従った方法で生成可能なポリヌクレオチドライブラリーを提供する。すなわち、本発明の第一の態様に係る方法によって生成できるポリヌクレオチドを含む。係るライブラリーは、共通のフレームワーク（“マスターフレームワーク”）を有する抗体可変ドメインの集団をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００６５】
好ましくは、ポリヌクレオチドライブラリーは、発現ベクターライブラリーである。都合よく、ポリヌクレオチドライブラリーはファージディスプレーライブラリーである。
【００６６】
【発明の実施の形態】
本発明は、WO98/32845、Soderlindら(1999) Immunotechnology4,279-285、およびJirholtら(1998) Gene215,471-476に記載された技術の発展にあたるものであって、特に、抗体コード配列を含むｃＤＮＡライブラリーからＣＤＲを増幅するために用いられる方法および条件、およびオーバーラップ伸長ＰＣＲによりマスターフレームワークにかくして増幅されたＣＤＲを再編成するための方法、物質および条件を一般的に記載するために、これらの全てを全体としてここに含む。
【００６７】
この方法は、組み立てられたヌクレオチド配列によりコードされた結果的な抗体を発現する工程および所望の特性についてスクリーニングする工程をさらに含んでもよい。また、これは、上記参考文献に詳細に記載されている。
【００６８】
結果的な発現された抗体は、所望の特徴についてスクリーニングされてもよい。例えば、抗原に特異的に結合できる能力を変更すること、または親抗体と比較して結合特性を改善することが望ましい。これも、上記参考文献に詳細に記載されている。
【００６９】
好ましくは、増幅プライマーに用いられたオリゴヌクレオチドは、マスターフレームワークをコードする核酸配列の対応部分とは異なる核酸残基を少なくとも二つ有する。より好ましくは、少なくとも３、４、５、６、７、８、１０または１２の異なる核酸残基を有する。別の定義では、増幅プライマーは、好ましくは、マスターフレームワークをコードする核酸配列の対応部分と約９５％以下の配列同一性を有し、より好ましくは、約９０％、８５％、８０％、７０％または６０％以下の配列同一性を有する。
【００７０】
従来のＣＤＲ移植では、増幅プライマーは、ＣＤＲの隣接する末端の一以上のアミノ酸残基をコードする少数のヌクレオチドを含んでもよい（例えば、一つのＣＤＲ残基をコードする三つのヌクレオチド）。これは、本発明にも適用され、係る場合においては、プライマーとマスターフレームワークの間のヌクレオチドの差異の数を決定する場合に、ＣＤＲのヌクレオチドを度外視してもよい。
【００７１】
基本的なＣＤＲ移植技術について、ここおよび上記の引用文献に記載された技術を心に留めて、当業者は、ＣＤＲを増幅するため、そして、必要または所望であれば、増幅産物を変性させて、そのフレームワーク領域を選択されたマスターフレームワークに類似させるために、プライマーを設計することができるであろう。
【００７２】
特定の生殖細胞遺伝子がターゲットとされる場合には、例えば、増幅されるＣＤＲに隣接する遺伝子のフレームワーク領域の部分をコードする配列に密接に基づいた、高度に特異的なプライマーが望ましい。種々の生殖細胞遺伝子の配列は、VBASE配列ディレクトリ(URL: http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html)、または、DNAplotディレクトリ(URL: http://www.genetic.uni-koeln.de:80/dnaplot/vsearch human.html)から入手できる。
【００７３】
同様に、特定の生殖細胞遺伝子ファミリーの遺伝子のコンセンサス配列に基づいてプライマーを設計することにより、そのファミリーからＣＤＲを増幅するためのプライマーを設計することができる。例えば、コンセンサス配列は、特定の生殖細胞ファミリーの遺伝子座の＞９０％に見出される塩基の配列として定義することができる。係る配列は、縮重部位を含んでもよく、これは種々の個々の配列がその部位で異なるヌクレオチドを有することを示す。それにも関わらず、係る縮重部位に見られるヌクレオチド残基のある共通の特徴が存在してもよい；係る部位は、Ｒ（プリン；塩基ＧおよびＡ）、Ｙ（ピリミジン；Ｃ、Ｔ）、Ｍ（アミノ；Ａ、Ｃ）、Ｋ（ケト；Ｔ、Ｇ）、Ｓ（強；Ｃ、Ｇ）、Ｗ（弱；Ａ、Ｔ）、Ｂ（Ａ以外）、Ｄ（Ｃ以外）、Ｈ（Ｇ以外）またはＶ（Ｔ以外）と記載される。共通的特徴が明らかでない部位は、Ｎ（全て）と記載される。
【００７４】
かかる記載を含む共通配列に基づくプライマーは、縮重されていてもよい。すなわち、プライマーの集団が、コンセンサス配列と一致する可能な組合せの全てを含むように作製されるか、適切であれば、特定のセットの塩基をまねた人工的塩基が、プライマーの相同的集団に含まれてもよい。
【００７５】
生殖細胞遺伝子ファミリーに生殖細胞遺伝子を帰する情報（例えば、可変重鎖生殖細胞遺伝子ファミリーＶH１、ＶH２、ＶH３、ＶH４、ＶH５、ＶH６およびＶH７）は、上記VBASEディレクトリから入手可能である。
【００７６】
同様に、複数の生殖細胞遺伝子ファミリーから、当該複数のファミリーに由来する生殖細胞遺伝子のコンセンサス配列を用いて、ＣＤＲを増幅するためのプライマーを設計することもできる。しかしながら、特定の生殖細胞遺伝子またはファミリーを標的とすることが一般に好ましい。
【００７７】
このことを心に留めて、当業者は、必要とされる特異性に依存して適切なプライマーを設計することができるであろう。好ましくは、ＣＤＲを最初に増幅するために用いられるペアの少なくとも一つのプライマーは、少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１８、さらに好ましくは少なくとも２１または２４、任意に少なくとも３０、３６または４２ヌクレオチドの長さである。好ましくは、しかしながら、プライマーは、４２ヌクレオチドの長さ以下、より好ましくは３６または３０以下、さらに好ましくは２７以下である。
【００７８】
好ましくは、この方法は、最大の可変性を導き、究極的にはより有益なライブラリーを導くことから、可変ドメインの３つ全ての位置でＣＤＲを移植するために用いられる。しかしながら、この方法はこれに限らず、そして所望であれば（例えば、先に得られた抗体を最適化するために）、この方法は１または２つのＣＤＲのみを移植するために用いることもできる。係る場合には、新たに増幅されたＣＤＲと、選択されたマスターフレームワークをコードする核酸に加えて、不変のＣＤＲ（ｓ）をコードする核酸が、オーバーラップ伸長ＰＣＲ工程で含まれる。
【００７９】
本発明は、本発明の好ましい実施態様ではあるが、マスターフレームワークと同じジェネラルタイプのイムノグロブリン遺伝子由来のＣＤＲを移植すること（例えば、ＶHマスターフレームワークにＶHＣＤＲを移植する）に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、より広い態様の本発明は、上記可変領域を有するあらゆるタイプのイムノグロブリン遺伝子に由来するＣＤＲをコードする核酸を、かかるあらゆるタイプのイムノグロブリンスーパーファミリー遺伝子とは独立のマスターフレームワークに移植することを含む。例えば、Ｖλ ＣＤＲが、ＶＨマスターフレームワークに挿入されてもその逆でもよい。さらに、ＣＤＲとＦＲに類似した構造を有するイムノグロブリンスーパーファミリーのあらゆるメンバが、本発明のＣＤＲおよび／またはマスターＦＲを提供しうる。上記の記載は、必要な変更を加えて適用できる。
【００８０】
用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、フレームワーク領域が隣接するＣＤＲを含む可変ドメインを有する抗体フラグメントも含む。係る可変ドメインを有する抗体フラグメントの例は、ＶL、ＶH、ＣLおよびＣH１ドメインからなるＦａｂフラグメント；ＶHおよびＣH１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体のシングルアームのＶLおよびＶHドメインからなるＦｖフラグメント；ＶHドメインからなるｄＡｂフラグメント；およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された二つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントである。一本鎖Ｆｖフラグメントも含まれる。
【００８１】
所望のあらゆるマスターフレームワーク領域（または“選択されたタイプのフレームワーク領域（ＦＲ）”）を、本発明において利用できる。特に、これらは、用いられる細菌発現系およびファージ系と高度に適合し、かくして、高度の機能的タンパクディスプレーを確実にするように選択される。好ましい例は、（それぞれ、ＶH３およびＶλ生殖細胞遺伝子ファミリーの）ＤＰ-４７およびＤＰＬ-３生殖細胞遺伝子由来のフレームワーク領域である。
【００８２】
抗体結合部位の表面を構成するＣＤＲループが、折り畳み後のそれらのコンホメーションに依存して、限定された数のいわゆる基準構造にグループ化されうることが一般に受け入れられている。この分野の先駆的研究は、CothiaとLesk(1987)により実施され、彼らは、重鎖のＣＤＲ１および２、並びに軽鎖のＣＤＲ１−３を、いくつかの基本的構造に分類した。
【００８３】
基準構造のコンセプトは、経験的に決定および分析された抗体構造の大規模な分析の結果である。基準コンホメーションの決定因子は、ループの長さ、ループのキー残基、および隣接するフレームワーク配列のキー残基である（Chothiaら1992; Tomlinsonら1995; Al-Lazikaniら1997）。例えば、ヒトＶｋ配列はＣＤＲＬ１ループの６つの基準構造、ＣＤＲＬ２ループの１つの基準構造、およびＣＤＲＬ３ループの５つの基準構造にグループ化されうる。同様に、ヒトＶH配列は、ＣＤＲＨ１ループの３つの基準構造およびＣＤＲＨ２ループの４つの基準構造にグループ化されうる。
【００８４】
ＣＤＲＨ３ループは、未だ明瞭な基準クラスに分類されていないが、これはおそらく、柔軟性に関する独特の特性を導く遺伝した長さのバリエーションによる。しかしながら、最近、このＣＤＲも、基本的な胴部を形成し、かつ、フレームワーク領域、並びに場合によってさらなる肩部を含む先端頭部領域をある程度まで含む、構造エレメントからなることが示された（Moreaら1998）。
【００８５】
自然は、免疫系が遭遇するであろう多数の抗原構造を扱うために、種々のタイプの基準構造を発達させてきたと考えられる。自然はまた、種々のフレームワーク構造という状況にこれらの構造を示す。かくして、特定のＣＤＲループは、あるフレームワークと組み合わせて見出される（ＶＢＡＳＥ）。また、種々のタイプの抗原に相補的な適切な表面を生成するために、基準構造が用いられる傾向が存在すると思われる。特に、フラット表面を形成する基準構造を有するループは、大きなタンパク抗原によく結合する表面を生じると考えられる。これらのループは、むしろ短い傾向を有するが、より長いループは、小さい分子、例えばハプテンに特異的な抗体に選択的に見出される（Lara-Ochoaら1996）。全てのループが、表面に可変性を生じるのに同等に重要というわけではないようである。当然、Ｈ３はこれに関して重要であるが、Ｈ２およびＬ１も大いに表面を決定する（Vargas-Madrazoら1995）。
【００８６】
ＣＤＲ移植技術を用いることにより、一部の選択された抗体が、使用したフレームワークに通常見出されない基準構造を有するＣＤＲを含むことが予期せず見出された。これらの抗体は、高い親和性でその抗原に結合することから、機能的である（実施例１）。かくして、シングルフレームワークを用いることにより、一部のフレームワーク内容に非定型の基準ループに基づいた抗体結合部位に機能的可変性を作製することができる。係るコンセプトに基づいたライブラリーは、広範囲のトポロジーを有する抗体を有すると同時に、選択された宿主系（例えば、E.coli）で高度に効率的であることから、より慣例的なライブラリーを越えた利点を有する。
【００８７】
さらに、抗体の結合特性は、最適なＣＤＲをシングル抗体分子に組み込むために、選択されたＣＤＲのシャッフリング(shuffling)を用いて改善することができる。よく理解されているように、ＣＤＲ移植技術は、１から６のＣＤＲを同時にシャッフルすることができ、実施例においてここで示されたライブラリーに基づいて用いられ、選択された抗体の親和性を一回の工程で３０倍より高く改善した。
【００８８】
本発明は、それゆえ、例えば、同一の生殖細胞ファミリーの遺伝子に通常では見出されないクラスの基準構造を組み合わせることにより、基準構造のクラスの新規組合せを導く。例えば、Ｖｋ鎖のＣＤＲＬ２位にＣＤＲＨ２ ＣＤＲを取り込むことにより、４つのクラスの基準構造に由来する可変性がこの位置で利用できるが、天然のＶｋ抗体では、たった一つのクラスの基準構造がＣＤＲＬ２位に用いられているだけである。
【００８９】
好ましくは、増幅プライマーは、マスターフレームワークが属する生殖細胞遺伝子ファミリーに見られる基準構造のクラスの総数より多数のクラスの基準構造のＣＤＲ、またはフレームワークが属する生殖細胞遺伝子ファミリーに見られるものとは異なるクラスの基準構造のＣＤＲを増幅するように設計される。特定のＣＤＲに採用された基準構造の予測は、ＵＲＬ：http://www.biochem.ucl.ac.uk/〜martin/abs/chothia.htmlで入手可能なオンラインツールを用いて決定することができる。
【００９０】
マスターフレームワークは、天然に生じたものである必要はないが、例えば、使用される発現またはファージ系用に、またはin vivoでの抗原性を低減するために最適化されてもよい。
【００９１】
増幅されたＣＤＲは、例えば、エラープローン（誤りを生じやすい）ＰＣＲを用いて、マスターフレームワークに取り込まれる前に、突然変異誘発に処されてもよいが（例えば、WO98/32845に記載されている）、これは、天然に生じるＣＤＲが人工的なものよりも抗原性が低いことから、一般的には好ましくない。
【００９２】
“パーセント（％）核酸配列同一性”は、必要であれば最大パーセント配列同一性を達成するために配列をアライメントしてギャップを導入した後の、比較される配列の核酸残基と同一の、候補配列中の核酸残基のパーセントとして定義され、配列同一性の一部として保存的置換を全く考慮しない。ここで用いたパーセント同一性の値は、WU-BLAST-2のBLASTNモジュールによって得られた（Altschulら(1996); URL:http//blast.wustl/edu/blast/README.htmlから入手）。WU-BLAST-2は、いくつかのサーチパラメーターを用い、その殆どはデフォルト値にセットされている。調節可能なパラメーターは、以下の値にセットされる：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５。核酸配列同一値のパーセントは、マッチングした同一残基の総数を、アライメントした領域の“より長い”配列の残基の総数で割り、１００をかけて決定される。“より長い”配列は、アライメントした領域に最も実際の残基を有するものである（アライメントスコアを最大にするためにWU-BLAST-2によって導入されたギャップは無視される）。
【００９３】
以下の実施例は、本発明をより分かり易くするためのものであり、添付の図面を参照する。
【００９４】
【実施例】
プライマーのデザインと抗体遺伝子の組立
ＤＰ-４７フレームワークの対応配列とは異なるプライマーを、種々の生殖細胞遺伝子のＣＤＲを増幅するために用いた。実施例１Ａでは、マスターフレームワークと、ＣＤＲが増幅された遺伝子のフレームワーク（ＤＰ-２９）とが、十分に類似しており、かくして増幅された配列は、さらに変性すること無くＤＰ-４７フレームワークに取り込むことができる。実施例１Ｂでは、フレームワークは非類似であり、かくして増幅された配列は、取り込み前に、それをＤＰ-４７フレームワークとより類似させるためにさらに変性される。これは、設計および企画された反復的プロセスにおいて、ＣＤＲに隣接するフレームワーク領域を、選択されたフレームワークに逐次的に一致させるプライマーの使用により達成される。このようにして、選択されたＤＰ-４７フレームワークの非定型性の基準構造を有するＣＤＲループをピックアップすることができる。
【００９５】
特定のＣＤＲをマスターフレームワークに取り込むことが望まれる場合には、選択されたフレームワークと、その選択されたフレームワークに取り込まれる非定型ＣＤＲの周りのフレームワークとの間の相同性（すなわち、同一のパーセント）を調べることが有利となりうる。もちろん、ライブラリーのＣＤＲについて“魚(fish)”に公知の配列のプライマーを用いる場合には、プライマーとフレームワーク配列との間の相同性を調べることはより重要である。
【００９６】
相同性の程度は、選択されたフレームワークの非定型ＣＤＲを得るのに必要なＰＣＲ増幅工程の数を決定する。これは、低い程度の相同性は、非定型性のＣＤＲに隣接するオリジナルのＦＲを、選択されたＦＲの配列に変換するために、結果的に、いくつかの連続的なＰＣＲ工程となることを意味する。
【００９７】
実施例１Ａ
図１は、ＤＰ-２９ ＣＤＲＨ２の増幅、並びにＤＰ-４７のフレームワークをコードする核酸へのその取り込みに関与する配列および工程を示す。
【００９８】
パートＡは、ＤＰ-４７およびＤＰ-２９ ＣＤＲＨ２ループに隣接するフレームワーク領域の部分をコードする核酸配列と、推定されるアミノ酸配列を示す。ヌクレオチドの適合は、文字Ｉで示されている。わかるように、いくつかのミスマッチ、すなわち示された二つのフランキング部分のそれぞれに、３６ヌクレオチド中８つ、および２７ヌクレオチド中７つのミスマッチが存在する。
【００９９】
パートＢは、二本鎖ＤＰ-２９コード配列とアライメントされている、ＤＰ-２９ ＣＤＲＨ２ループに隣接するフレームワーク領域の部分をコードする核酸と同一の増幅プライマー（“#1primers”）を示す。
【０１００】
パートＣは、最初のＰＣＲ工程（パートＢに示されているもの）の増幅産物（“#1product”）を示す。増幅条件は、WO98/32845のＣＤＲ増幅と同じである。#1productは、ＤＰ-２９のコード配列に同一である。これと共にアライメントされているのは、第二ＰＣＲ工程用のプライマー（“#2primers”）である。これらは、ＤＰ-４７ ＣＤＲＨ２ループに隣接するフレームワーク領域の対応部分をコードする核酸と同一である。結果的に、パートＡと同じミスマッチが見られる。
【０１０１】
パートＤは、第二のＰＣＲ工程の産物（“#2product”）を示す。これは、ＤＰ-４７のフレームワーク領域（マスターフレームワーク）とＤＰ-２９のＣＤＲＨ２ループとを有する。
【０１０２】
かくして、ＤＰ-４７のフレームワーク領域とＣＤＲＨ２ループに隣接するＤＰ-２９との間には、一回のＰＣＲ工程で、そのループが、あるフレームワークから別のものに交換されるに十分な配列同一性が存在する。
【０１０３】
ＤＰ-２９生殖細胞遺伝子は、基準クラス４（ＶＢＡＳＥ）のＣＤＲＨ２をコードするが、ＤＰ-４７のＣＤＲＨ２は基準クラス３（ＶＢＡＳＥ）のものである。
【０１０４】
第二のＰＣＲ工程は、用いたプライマーが、ＣＤＲが取り込まれることが意図されるマスターフレームワーク配列と同一であることから、例えばWO98/32845に記載されている条件（および他のプライマー）を用いて、オーバーラップ伸長ＰＣＲ工程として行うことができる。
【０１０５】
実施例１Ｂ
連続的ＰＣＲ増幅の反復プロセスは、ＤＰ-４７マスターフレームワークに、ＣＤＲに隣接するフレームワーク領域の部分をコードする顕著に異なる配列を有する生殖細胞遺伝子（ＤＰ-７３）からＣＤＲを挿入するために用いられる。この実施例では、ＣＤＲＨ２に隣接するＤＰ-４７ ＶHフレームワークとＤＰ-７３フレームワークとの間の相同性があまりに低いので、ＤＰ-４７に完全に同一なプライマーを用いて直接増幅（例えば、オーバーラップ伸長ＰＣＲ工程において）することができない。かくして、いくつかの個別のＰＣＲ工程が用いられ、各工程が独特のプライマー対を用いる。プライマーは、ＤＰ-４７プライマーに対してより相同になるように連続的に変性される。
【０１０６】
このプロセスでは、塩基変更の適切な分布を慎重に選択することが重要である。図２は、このプロセスを示す。下線を付した配列は、最も大きな差異がＤＰ-４７とＤＰ-７３との間に生じる場所である。太字は、マスターフレームワークであるＤＰ-４７と同じプライマーの残基を示す。
【０１０７】
パートＡおよびＢは、図１の同じパートに類似する。ＤＰ-４７およびＤＰ-７３ ＣＤＲＨ２ループに隣接するフレームワークの部分をコードする配列の間には、それぞれ二つのフランキング配列に、４２ヌクレオチド中１３、および２７ヌクレオチド中９のミスマッチが存在する。
【０１０８】
パートＣでは、ＤＰ-４７に同一のプライマーを用いる代わりに、増幅されたＤＰ-７３フラグメントのフレームワーク領域に変化を導入し、ＤＰ-４７のそれに部分的に一致させるために、ＤＰ-４７とＤＰ-７３のキメラであるプライマーが用いられる。それゆえ、（実施例１Ａのように）プライマーとＤＰ-４７配列との間にミスマッチがないというよりむしろ、依然としていくつかのミスマッチが、前よりは少ないにしろ、存在する（すなわち、各フランキング配列中に２つ）。
【０１０９】
パートＤは、ＤＰ-４７フレームワークの対応部分に等しいプライマー（“#3primers”）と共にアライメントされている、第二ＰＣＲ工程の増幅産物（“#2product”）を示す。実施例１Ａと同様に、係るプライマーは、オーバーラップ伸長ＰＣＲにおいて用いることができる。第三の増幅工程（実施例１Ａの第二工程に類似）は、ＤＰ-４７のフレームワークにＤＰ-７３のＣＤＲＨ２を取り込んだフラグメントを導く。
【０１１０】
特に、第二のＰＣＲ工程（パートＣに示されている#2primersを用いる）では、第一のＰＣＲ工程で用いた#1primer（パートＢに示されている）に関して、以下の塩基置換が、アッパーＰＣＲプライマーに成された：３５位（プライマーの５’末端から数える）でＧがＣに変化；３７位においてＡがＧに変化、３８位においてＴがＣに変化。これは、ＤＰ-４７に相同なプライマーが第二のＰＣＲ工程で直接用いられる場合よりも、より高い相同性をもたらす。
【０１１１】
それゆえ、この第二のＰＣＲ工程の中間的ＰＣＲ産物は、依然としてＤＰ７３配列に相同な塩基を含む（Ｇ３６およびＧ３９）。これらの塩基は、この工程で用いられたアッパープライマーがＤＰ４７配列に１００％相同なので、第三のＰＣＲ工程でプライムしないであろう。しかしながら、第二増幅工程の増幅産物（“#2product”）の塩基３４、３７および３８は、ＤＰ-４７配列に相同であり、この相同性は、第三のＰＣＲ工程（パートＤに記載）においてアッパープライマーの３’末端（下線部）の８塩基中６塩基のアニーリングを与える。これを、ＤＰ４７とＤＰ７３との間の３’末端の８塩基中３塩基と比較すべきである。相同性の係る増加は、ＤＰ-４７フレームワークにＤＰ-７３ ＣＤＲＨ２を含むＤＮＡ配列の産生の成功をはるかに容易にする。
【０１１２】
この方法の原理を用いて、あらゆるＣＤＲを、あらゆる所定のおよび選択されたフレームワークに移すことができ、天然ＣＤＲループの組合せを有し、かくしておそらくは天然に見られない基準構造を有する混成抗体分子を生成することができる。かくして、非定型ではあるが天然のＣＤＲループの組合せが、抗体結合部位の巨大な可変性の生成の基礎を与え、生成されたバリアントは、例えばファージ（Marksら1991）、リボソーム（Hanes and Pluckthun,1997）または共有（WO98/37186）ディスプレー技術を用いて大きなライブラリーに取り込まれてもよい。
【０１１３】
「参考文献」
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ＡからＤは、生殖細胞遺伝子ＤＰ-２９のＣＤＲＨ２ループの、ＤＰ-４７のフレームワークへの取り込みを示す。
【図２】  ＡからＥは、生殖細胞遺伝子ＤＰ-７３のＣＤＲＨ２ループの、ＤＰ-４７のフレームワークへの取り込みを示す。
【図１】
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【図２】
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