(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式（ＩＡ）
【化２】
0004727814.tif 000020
Ｙは６−クロロであり、Ｒ３はＨまたは（Ｃ１−Ｃ４）であり、Ｒ４は（Ｃ１−Ｃ４）である式（１Ａ）の化合物。
【請求項２】
放射性標識されている、請求項１の化合物。
【請求項３】
少なくとも１種の薬学認容性のキャリア、希釈剤、賦形剤、又は補助剤と、請求項１の化合物を含む医薬組成物。
【請求項４】
少なくとも１種の薬学認容性のキャリア、希釈剤、賦形剤、又は補助剤と、請求項２の化合物を含む医薬組成物。
【請求項５】
神経変性疾患、腫瘍、神経毒性障害または認知障害である疾患の診断用組成物を製造するための請求項２の化合物の利用。
【請求項６】
神経変性疾患、腫瘍、神経毒性障害または認知障害の治療に用いる薬剤を製造するための請求項１に記載の化合物の利用。
【請求項７】
神経変性疾患、腫瘍、神経毒性障害または認知障害の放射線治療に用いる薬剤を製造するための請求項２に記載の化合物の利用。
【請求項８】
神経変性疾患、腫瘍、神経毒性障害または認知障害の治療に用いるための請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項９】
神経変性疾患、腫瘍、神経毒性障害または認知障害の放射線治療に用いるための請求項４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
この発明は、末梢性ベンゾジアゼピン受容体に結合し、そのような受容体を画像化するのに有用で且つ放射線療法を含む治療法を提供するのに有用な放射性標識イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン及び関連化合物に関するものである。
【従来の技術とその課題】
末梢性ベンゾジアゼピン受容体は、一般にミトコンドリアのベンゾジアゼピン受容体又はω−３−受容体とも言われ、薬理作用、細胞下の部位、および構造上の必要条件が中枢性のベンゾジアゼピン受容体とは異なっている。末梢性ベンゾジアゼピン受容体は、主として腎臓、心臓、副腎皮質、卵巣、血漿（血小板）、及び脳内のグリア細胞や嗅球に認められる。また、末梢性ベンゾジアゼピン受容体の密度は、神経膠腫、卵巣癌、結腸癌などの腫瘍において、その正常組織よりも高いことが報告されている。最近では、ダニング系ラットの前立腺腫瘍における末梢性ベンゾジアゼピン受容体の濃度が正常の腹側又は背横側の前立腺に比べて高いことが報告されている。
末梢性ベンゾジアゼピン受容体は、（限定的ではないが）多くの組織のミトコンドリア外膜に会合し、そこでホルモンや薬剤に調節されたり、感情的ストレスや高血圧の影響を反映したりすると考えられている。また、脳における末梢性ベンゾジアゼピン受容体を、ハンチントン病、アルツハイマー病、不安症、ストレス、情動障害、認知障害、脳卒中、及び脳虚血を含む神経変性症のマーカーとして使用するための研究がなされてきた。数種類のリガンドが末梢性ベンゾジアゼピン受容体に対して高い親和性を示すことが明らかにされているが、最も広く研究されているのは、ベンゾジアゼピンＲｏ５−４８６４（７−クロロ−５−（４−クロロフェニル）−１，３−ジヒドロ−１−メチル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン）及びイソキノリンＰＫ１１１９５（１−（２−クロロフェニル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−メチルプロピル）−３−イソキノリンカルボキシアミド）である。これらのリガンドは、11Ｃ、18Ｆ及び123Ｉで標識され、ヒトの心臓や脳における末梢性ベンゾジアゼピン受容体の位置を決定するために使用されてきた。乳癌、卵巣癌、前立腺癌、副腎腫瘍、脳腫瘍及び結腸癌を含む種々の腫瘍細胞で［3Ｈ］ＰＫ−１１１９５の取り込み量が上昇することが報告されている。これらの腫瘍を診断するためには、まず、適当なレベルの放射性ヨウ素で放射性標識し（123Ｉや131Ｉなどの放射性標識を用いて）、続いて（例えば123Ｉ、125Ｉ又は131Ｉを用いて）治療量でそれらを治療してもよい。さらに、最近の研究によって、異なる臓器や種には、イソキノリン及びベンソジアゼピンリガンドに対して異なる親和性を有する数種の結合ドメインが存在することが明らかにされている。
抗不安作用、催眠作用、抗痙攣作用、鎮痛作用及びその他の特性を有する種々の２−アリール置換イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンが報告されている（Almirante L. et al., J.Med.Chem.12 122-126 (1969); Langer S.Z. et al., Pharmacol.Biochem. Behav. 29 763-766 (1988); Langer S.Z. et al., Pharmacopsychiatry 23 103-107 (1990); Bourguignon, J-J., "Endogenous and Synthetic Ligands of Mitochondrial Benzodiazepine Receptors: Structure Affinity Relationships" in Giesen-Grouse, E. ed. Peripheral Benzodiazapine Receptors, Academic Press, London (1993)）。例えば、ＳＰＥＣＴを用いた末梢性ベンゾジアゼピン受容体の研究におけるトレーサー候補として、123Ｉ標識した６−メチル−（４’−ヨードフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アセトアミドが報告されている（Katsifis A. et al., J.Lab.Comp.Radiopharm. 40 620-622 (1997)）。
しかしながら、上述の化合物はいずれも、末梢性ベンゾジアゼピン受容体に結合するものの、一般的に中枢性ベンゾジアゼピン受容体にも強い結合を示すものなのである（例えば、Anzini M. et al., J.Med.Chem. 39 4275-4284 (1996)及びTrapani G. et al., J.Med.Chem. 40 3109-3118 (1997)参照）。そのため、先行技術の化合物の末梢性ベンゾジアゼピン受容体に対する選択性は、高受容体密度が関連する状態を診断又は治療するために有用となりうるのに十分ではないのである。従って、中枢性ベンゾジアゼピン受容体には強く結合せず、末梢性ペンゾジアゼピン受容体には強く結合する物質が必要とされている。
驚くべきことに、本発明者らは、ピリジン核に負に荷電した置換基、特にハロゲン基を有するある種の２−（ヨードフェニル）−イミダゾ［１，２−a］ピリジンが、末梢性ベンゾジアゼピン受容体に強く結合し、中枢性ベンゾジアゼピン受容体には極めて弱くしか結合しないことを見い出した。つまり、本発明の化合物は、末梢性ベンゾジアゼピン受容体のＰＥＴおよびＳＰＥＣＴ画像処理においては、これまでに報告されている関連物質に比べて優れた特性を有するのである。
本発明の化合物は、適切に標識すれば、例えば、高密度の末梢性ベンゾジアゼピン受容体を表わす癌の検出、及び／又は神経変性疾患の検出、又は非侵襲的診断などのＳＰＥＣＴ及びＰＥＴ走査において臨床的に有用である。本発明の化合物はまた、神経変性疾患や腫瘍のような末梢性ベンゾジアゼピン受容体の密度異常を特徴とする疾患の治療に有用である。
【課題を解決するための手段】
この発明は、第1の実施態様として、次の式（Ｉ）
【化３】
0004727814.tif 000002
式中、
ＹはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ2、ＣＮ、及びＣＯＯＨからなる群より選択され、
Ｚは、Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4及びＣ（Ｏ）ＮＲ3Ｒ4からなる群より選択され、
Ｒ1及びＲ2は、独立してハロゲン、ＯＨ、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ2、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシカルボニル、（Ｃ2〜Ｃ4）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮ、及びＮＨＯＨから成る群から選択される１〜３の置換基で置換されてもされなくてもよい（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ2〜Ｃ6）アルケニル、（Ｃ2〜Ｃ6）アルキニル、（Ｃ3〜Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ12）アリール、（Ｃ6〜Ｃ12）アリルオキシ、（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、複素環、（Ｃ2〜Ｃ6）アルカノイル、及び（Ｃ2〜Ｃ7）アシルからなる群より選択される置換基であり、
Ｒ3及びＲ4は、独立して水素原子、又はハロゲン、ＯＨ、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ2、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシカルボニル、（Ｃ1〜Ｃ4）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮ、及びＮＨＯＨから成る群から選択される１〜３の置換基で置換されてもされなくてもよい（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル、（Ｃ2〜Ｃ4）アルケニル、（Ｃ2〜Ｃ4）アルキニル、（Ｃ3〜Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ12）アリール、（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル、複素環、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシカルボニル、及び（Ｃ2〜Ｃ5）アシルからなる群より選択される置換基、
又はＲ3及びＲ4は結合して、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ2、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシカルボニル、（Ｃ1〜Ｃ4）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮ、及びＮＨＯＨから成る群から選択される１〜３の置換基で置換されてもされなくてもよい（Ｃ2〜Ｃ7）アルキリデンであってもよく、
ｍ及びｎは独立して０、１又は２であり、
ｐは１である
で表わされる化合物を提供する。
この発明は、第２の実施態様として、放射性標識した第１の実施態様の化合物を提供する。
この発明はさらに、少なくとも１つの薬学認容性のキャリア、希釈剤、賦形剤又は補助剤と共に第１の、又は第２の実施態様の化合物を包含する医薬組成物を提供する。
さらに、第３の実施態様では、この発明は、末梢性ベンゾジアゼピン受容体の密度異常を伴うことを特徴とする哺乳類の疾患を診断する方法であって、
該哺乳類の体内における放射性標識物質の位置を画像で検出するのに十分な量の放射性標識した第２の実施態様の化合物を哺乳類に投与すること；
哺乳類の体内の少なくとも一部における放射性物質の分布の画像を記録すること；及び
画像から疾患の有無を診断すること
をステップとして包含する方法を提供する。
第４の実施態様では、この発明は、治療を必要とする哺乳類において、末梢性ベンゾジアゼピン受容体の密度異常を伴うことを特徴とする疾患を治療する方法であって、有効な量の第１の実施態様の化合物、又はその医薬組成物を哺乳類に投与することを包含する方法を提供する。
第５の実施態様では、この発明は、放射線治療を必要とする哺乳類において、末梢性ベンゾジアゼピン受容体の密度異常を伴うことを特徴とする疾患を放射線治療する方法であって、有効な量の第２の実施態様の化合物、又はその医薬組成物を哺乳類に投与することを包含する方法を提供する。
第６の実施態様では、この発明は、末梢性ベンゾジアゼピン受容体の密度異常を伴うことを特徴とする哺乳類における疾患を診断するための診断組成物を製造するための第２の実施態様の化合物の利用を提供する。
第７の実施態様では、この発明は、治療が必要な哺乳類において、末梢性ベンゾジアゼピン受容体の密度異常を伴うことを特徴とする疾患を治療するための薬剤を製造するための第１の実施態様の化合物の利用を提供する。
第８の実施態様では、この発明は、放射性治療が必要な哺乳類において、末梢性ベンゾジアゼピン受容体の密度異常を伴うことを特徴とする疾患を放射性治療するための薬剤を製造するための第２の実施態様の化合物の利用を提供する。
第９の実施態様では、この発明は、第３の実施態様の方法で使用される第２の実施態様の化合物を提供する。
第１０の実施態様では、この発明は、第４の実施態様の方法で使用される第１の実施態様の化合物を提供する。
第１１の実施態様では、この発明は、第５の実施態様の方法で使用される第２の実施態様の化合物を提供する。
【発明の実施の形態】
本明細書において使用されるとき、用語「アルキル」は、その意味の範囲に、直鎖及び分枝鎖アルキル基を包含する。そのような置換基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、アミル、イソアミル、ｓｅｃ−アミル、１，２−ジメチルプロピル、１，１−ジメチルプロピル、ヘキシル、４−メチルペンチル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、１，２，２−トリメチルプロピル及び１，1，２−トリメチルプロピルが挙げられる。
本明細書において使用されるとき、用語「シクロアルキル」は、環状アルキル基、又はアルキル基で置換された環状アルキル基をいう。そのような置換基の例としては、シクロプロピル、メチルシクロプロピル、シクロブチル、メチルシクロブチル、シクロペンチル、メチルシクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられる。
本明細書において使用されるとき、用語「アルコキシ」とは、式  アルキル−Ｏ−  で表わされる基をいい、式中アルキル基は上で説明されるとおりのものである。
本明細書において使用されるとき、用語「アルケニル」は、その意味の範囲に、エチレン的にモノ又はジ−不飽和となっているアルキル基、又はシクロアルキル基を包含し、アルキル基およびシクロアルキル基は、前記のとおりのものである。そのようなアルケニル基の例としては、ビニル、アリル、１−メチルビニル、ブテニル、イソブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ペンテニル、シクロペンテニル、１−メチル−シクロペンテニル、１−ヘキセニル、３−ヘキセニル、シクロヘキセニル、1，３−ブタジエニル、1，４−ペンタジエニル、１，３−シクロペンタジエニル、１，３−ヘキサジエニル、１，４−ヘキサジエニル、１，３−シクロヘキサジエニル及び１，４−シクロヘキサジエニルが挙げられる。
本明細書において使用されるとき、用語「アルキニル」は、その意味の範囲に、アセチレン的不飽和なアルキル基を包含し、アルキル基は、前記のとおりのものである。そのようなアルキニル基の例としては、エチニル、プロピニル、ｎ−ブチニル、ｎ−ペンチニル、３−メチル−１−ブチニル、ｎ−ヘキシニル及びメチルペンチニルが挙げられる。
本明細書において使用されるとき、用語「アルキリデン」とは、任意の不飽和二価アルキル基を言う。そのような基の例としては、−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ−、−（ＣＨ2）4−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2−、及び−（ＣＨ2）r−  でｒが５〜７であるものが挙げられる。この用語はまた、任意の不飽和二価アルキルラジカルで、１つ以上の基の結合が環構造を形成するものをも意味する。
本明細書において使用されるとき、用語「アリール」とは、芳香族炭化水素の単核、多核、共役、及び融合残基をいう。そのような基の例としては、フェニル、ビフェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インデニル及びアズレニルが挙げられる。また、芳香族残基のいかなる利用可能な部位も式（Ｉ）の分子の他の部位との結合に利用できる。
本明細書において使用されるとき、用語「アリールオキシ」とは、式  アリール−Ｏ−  で表わされる基をいい、アリール基は上述のとおりのものをいう。
本明細書において使用されるとき、用語「ヘテロアリール」とは、芳香族複素環系の単核、多核、共役、及び融合残基をいう。そのような基の例としては、ピリジル、４−フェニルピリジル、３−フェニルピリジル、チエニル、フリル、ピリル、インドリル、ピリダジニル、ピラゾリル、ピラジニル、チアゾリル、ピリミジニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、プリニル、キナゾリニル、フェナジニル、アクリジニル、ベンゾキサゾリル、ベンゾチアゾリルなどが挙げられる。また、複素環式芳香族残基のいかなる利用可能な部位も一般式式（Ｉ）分子の残りの部位との結合に使用できる。
本明細書において使用されるとき、用語「複素環式」は、３及び４員環については１つのヘテロ原子、５員環については１つ又は２つのヘテロ原子、６及び７員環については１〜３個のヘテロ原子、８及び９員環については１〜４個のヘテロ原子、１０及び１１員環については１〜５個のヘテロ原子、１２員環については１〜６個のヘテロ原子を含有し、ヘテロ原子は独立に酸素、窒素及びイオウから選択される３〜１２員環の単環、二環、及び多環を表わす。また、用語「複素環式」は、複素環がベンゼン環に融合されたいかなる基をも包含する。複素環の例としては、ピリル、ピリミジニル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ピペリジニル、ピリジニル、フリル、チオフェニル、テトラヒドロフリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピレニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、イソキサゾリジニル、イミダゾリジニル、モルホリニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、フルフリル、チエニル、ベンゾチエニル、ベンゾキサゾリル、ベンジソキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、テトラゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ベンジミダゾリル、ピロリニル、キヌクリジニル、アザノルボルニル、イソキヌクリジニルなどが挙げられる。窒素含有複素環は窒素部位が酸素と置換されていてもよい。イオウ含有複素環は、イオウ部位で１つ又は２つの酸素原子と置換されていてもよい。不安定な複素環を生じるヘテロ原子の立体は位置は、「複素環式」の定義の範囲内に包含しない。
本明細書で使用されるとき、用語「アルカノイル」とは、式  アルキル基−Ｃ（Ｏ）Ｏ−  で表わされる基をいい、アルキル基は上述のようなものをいう。
本明細書において使用されるとき、用語「アシル」は、Ｑがアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル及び複素環基で、それぞれ、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシ基、ＳＨ、ＮＨ2、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルアミノ基、ジ（（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル）アミノ基、カルボキシ基、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシカルボニル基、（Ｃ2〜Ｃ4）アルカノイル基、オキソ基、アミド基、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮ、及びＮＨＯＨから成る群から選択される１〜３の置換基で置換されてもされなくてもよい、一般式  ＱＣ（Ｏ）−  で表わされるあらゆる基をいう。
第２の実施態様の化合物は、いかなる好適な放射性核種で放射性標識されてもよい。一般的には放射性核種は、そのエネルギーが発光の画像化、又は放射線療法に好適である粒子の放射体であることが好ましい。例えば放射性核種は、11Ｃ、18Ｆ、76Ｂｒ及び123Ｉであってもよい。通常、放射性核種は、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ又は131Ｉのようなヨウ素の放射性核種である。放射線療法では、放射性核種は一般的には123Ｉ、125Ｉ又は131Ｉである。
この発明に基づく化合物は、当該技術分野において一般的に知られている方法によって合成できる。本発明に基づくイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの１つの合成例をスキーム１に説明する。
スキーム１に示すように、エタノール又は類似の溶媒中でのα−ブロモアセトフェノン（IIｂ）と２−アミノピリジン（IIａ）との反応により、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン（III）が生成する。また、例えば、水性媒質におけるジメチルアミンやホルムアルデヒドを用いて、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを処理することによって３−位にアミノメチル部分を導入することができる。得られたアミノメチル置換基を既知の方法により脱メチル化およびアシル化して本発明の化合物を得てもよく、又はスキーム１に示されるように、アミドメチル置換基としてもよい。アミノメチル基のメチル化に続いてシアン化カリウムで処理することにより、３−シアノメチルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン（VI）が得られ、これを常法により種々のアミドメチル類縁体（VIII）に変換してもよい。
スキーム２は、カルボキシメチル誘導体（VII）から化合物（VIII）のＮ−アルキニル（IX）化物、及びＮ−（ヨードアルケニル）（X）化物を調製する方法の例を示したものである。
【化４】
0004727814.tif 000003
【化５】
0004727814.tif 000004
発明の第２の実施態様の化合物における放射性核種がヨウ素の核種のとき、ヨウ素各種は、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの２−フェニル置換基上でヨウ素置換基として、又は式（Ｉ）の化合物における置換基Ｙとして、都合良く導入してもよい。スキーム３に123Ｉ（又はその他のヨウ素放射性同位体、*Ｉ）を導入する図式を示す。
スキーム３に示すように、２−（ブロモフェニル）又は２−（ヨードフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン（VIII）（２−（ブロモフェニル）化合物が示されている）を出発物質として、ビストリブチルチン及びパラジウムテトラキストリフェニルホスフィン存在下、トルエン、ジオキサン、又はトルエン／ＤＭＦ還流中で６〜２４時間処理することにより相当するトリブチルスタンナンを調製される。得られたスタンナンは、カラムクロマトグラフィ及び／又は酢酸エチル／ヘキサンからの再結晶によって精製できる。放射性標識ヨウ素類縁体は、トリブチルチン誘導体を、エタノール／メタノール又は酢酸などの適当な溶媒中、過酢酸、クロラミンＴ、ヨードゲン又はその他の酸化剤の存在下、室温でＮａ*Ｉを用いて求電子性ヨード脱スタンナンして調製される。
【化６】
0004727814.tif 000005
発明に基づく化合物の合成のための出発物質は、市販されているもの、公知の化合物、又はその合成が当業者にとっては困難ではない化合物のいずれかである。スキーム１〜３に示されるいずれかのステップのように、分子の置換基における官能基の存在によって所望の合成ステップが妨げられることがあるような場合には、官能基を適切に保護する必要がある。好適な保護基は当該技術分野において一般的に知られており、例えば、T.W.Greene, P.G.M.Wux "Protective Groups in Organic Synthesis", 2nd edition, John Wiley & Sons Inc., New York (1991)に記載されている。（これは、参考文献として記載して本明細書にて開示する）。
発明に基づく医薬組成物は、経口的に、局所的に、非経口的に（例えば、注射、動脈内注入による）、直腸から、又は吸入スプレーによって投与できる。
経口投与については、医薬組成物は、錠剤、トローチ、カプセル、霊薬、粉末、顆粒、懸濁液、乳液、シロップ及びチンキの形態であってよい。被覆粒子、多層錠剤又は微小顆粒の形態で緩慢放出又は遅延放出の形態を調製してもよい。
経口投与のための固体形態は、薬学認容性の結合剤、甘味料、崩壊剤、希釈剤、人工香味料、被覆剤、保存剤、潤滑剤及び／又は効果遅延剤を含有していてもよい。好適な結合剤には、アラビアゴム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、又はポリエチレングリコールが挙げられる。好適な甘味料には、スクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテーム又はサッカリンが挙げられる。好適な崩壊剤としては、コーンスターチ、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、キサンタンゴム、ベントナイト、アルギン酸又は寒天が挙げられる。好適な希釈剤としては、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、デキストロース、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、珪酸カルシウム又はリン酸二カルシウムが挙げられる。好適な人工香味料としては、ペパーミント油、ウィンターグリーン油、チェリー、オレンジ又はラズベリーの香料が挙げられる。好適な被覆剤としては、アクリル酸及び／又はメタクリル酸及び／又はそれらのエステルのポリマー又はコポリマー、ワックス、脂肪アルコール、ゼイン、セラック又はグルテンが挙げられる。好適な保存剤としては、安息香酸ナトリウム、ビタミンＥ、α−トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベン、又は亜硫酸水素ナトリウムが挙げられる。好適な潤滑剤としては、スレアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウム又はタルクが挙げられる。好適な効果遅延剤には、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルが挙げられる。
経口投与のための液体形態は、上記の物質等に加えて液体キャリアを含有していてもよい。好適な液体キャリアとしては、水、例えばオリーブ油、ピーナツ油、ゴマ油、ヒマワリ油、ベニバナ油、落花生油、ココナッツ油等の油、流動パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール、トリグリセリド又はそれらの混合物が挙げられる。
経口投与のための懸濁液は、さらに分散剤及び／又は懸濁剤を含んでもよい。そのような懸濁剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム又はセチルアルコールが挙げられる。好適な分散剤には、レシチン、例えばステアリン酸のような脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビトールモノ又はジオレイン酸、ステアリン酸又はラウリン酸、ポリオキシエチレンソルビタンモノ又はジオレイン酸、ステアリン酸又はラウリン酸などが挙げられる。
経口投与の乳状液は、さらに１つ又は複数の乳化剤を含んでいてもよい。好適な乳化剤には、上で例示されるような分散剤又はアラビアゴムやトラガカントゴムのような天然ゴムが挙げられる。
局所塗布は、医薬組成物はクリーム、軟膏、ジェル、ゼリー、チンキ、懸濁液又は乳状液の形態であってもよい。医薬組成物は上に例示されるような薬学認容性の結合剤、希釈剤、崩壊剤、保存剤、潤滑剤、分散剤、懸濁剤及び／又は乳化剤を含有してもよい。
非経口投与では、式（Ｉ）の化合物又はその塩は、無菌の水溶液、又は油性溶液、あるいは懸濁液中で調製してもよい。好適な、無毒の非経口的に認容される希釈剤又は溶媒としては、水、リンガー溶液、等浸透圧の塩溶液、水と混合した１，３−ブタンジオール、エタノール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールが挙げられる。水溶液又は懸濁液はさらに１種以上の緩衝剤を含んでいてもよい。好適な緩衝剤には、例えば酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム又は酒石酸ナトリウムが挙げられる。
直腸投与については、式（Ｉ）の化合物は、浣腸又は座薬の形態で好適に投与される。好適な座薬は、活性物質を常温では固体で直腸では融解する非刺激性の賦形剤と混合することによって調製してもよい。そのような物質で好適なものは、ココアバター及びポリエチレングリコールである。好適な浣腸は、局所塗布の形態に関連して上で例示されるような物質を含んでもよい。
好適には、式（Ｉ）の化合物を含む吸入スプレーは、上で例示されるような溶液、懸濁液又は乳状液の形態とする。吸入スプレー組成物は、さらに低毒性の吸入可能な噴霧剤を含んでもよい。好適な噴霧剤は二酸化炭素及び一酸化二窒素である。
第１又は第２の実施態様の化合物を包含する医薬組成物、診断用組成物及び薬物は、当該技術分野において一般的に知られる方法によって製造されてもよい。一般的には、そのような組成物又は薬剤は、第１又は第２の実施態様の化合物を１種以上の好適なキャリア、補助剤、希釈剤又は賦形剤と共にすりつぶす、粉砕する、ブレンドする、分散する、溶解する、懸濁する、混合する、混和する、組合せる、乳化する、又はホモジネートすることによって調製される。１以上の上記ステップを組合せて用いてもよい。
式（Ｉ）の化合物の剤形は、０．０１〜９９重量％の活性物質を包含するものとする。通常、この発明に基づく剤形は０．１〜約１０重量％の活性物質を含む。
この発明の第３の実施態様に基づく診断法では、一般的には約３〜約２５ｍＣｉの投薬量の第２の実施態様の化合物を哺乳類、通常は、末梢性ベンゾジアゼピン受容体の密度異常を伴うことを特徴とする疾患の有無を診断することが所望されるヒトに一般的に投与する。第２の実施態様の化合物の投与から０．５〜６０時間後、より一般的には１〜４０時間後、哺乳類の体内、又は体内の一部における放射能の分布の画像を得る。小児への投与量はさらに低くすることが適当であり、物質の投与から２４時間以上後に画像解析を行う腫瘍の診断のためには、投与用量はさらに高くすることがより適当であることが好ましい。疾患に苦しむ哺乳類において末梢性ベンゾジアゼピン受容体の密度異常が生じている部位に放射能の集中が存在することは陽性の診断を表している。
第４の実施態様に基づく方法は、哺乳類、一般的にはヒトに、第１の実施態様の化合物を投与することを包含する。式（Ｉ）の化合物の投与用量は、患者の状態などのいくつかの要因によって変化することができる。投薬量は１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ〜２００ｍｇの範囲とする。通常、活性物質の用量は体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ〜１０ｍｇとする。
第２の実施態様の放射性標識化合物、又はその医薬組成物あるいは診断用組成物の投与を含むこの発明の第５の実施態様に基づく方法では、投与される用量は一般的に、哺乳類の体重１ｋｇ当たり１〜３ｍＣｉ、又は１０〜３００ｍＣｉであり、より一般的には用量当たり５０〜３００ｍＣｉである。哺乳類は一般的にはヒトである。
この発明の第１又は第２の実施態様の化合物の治療用量又は放射性治療用量は、いかなる一定の状況であれ、患者の治療されるべき状態及びその重症度などの事項に応じて主治医が決定する。
この発明に基づく化合物が有用となるような治療法を要する症状は、ハンチントン病、アルツハイマー病、不安症、ストレス、情動障害、認知障害、脳卒中及び脳虚血を含む神経変性疾患；神経膠腫のような腫瘍、及び卵巣、結腸、乳腺、前立腺、脳及び副腎の悪性腫瘍；卒中や心臓発作のため生じる酸素欠乏や虚血に関連したものを含む神経毒性傷害；認知障害、及び認知亢進などの末梢性ベンゾジアゼピン受容体の密度異常に関連した状態である。
この発明に基づく化合物は、疾患、疾患の段階、治療への反応、及び明らかになるであろう望ましくない影響に応じて、単一用量、二用量又は複数用量で投与してもよい。
本発明の１つの形態では、式（Ｉ）の化合物は：
式中、ＹがＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ及びＯＨから選択され；
ＺがＺは、Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4及びＣ（Ｏ）ＮＲ3Ｒ4から選択され；
Ｒ1及びＲ2は独立して（Ｃ1〜Ｃ3）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ3）アルコキシ、（Ｃ2〜Ｃ3）アルケニル、（Ｃ5〜Ｃ6）シクロアルキル、フェニル、ナフチル、フェノキシ、ナフチルオキシ、ベンジル、ピリジル、フラニル、チエニル、ピペリジニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニル、ジオキサニル、（Ｃ2〜Ｃ4）アルカノイル及び（Ｃ2〜Ｃ4）アシルから選択され、それらはそれぞれハロゲン、ＯＨ、（Ｃ2〜Ｃ4）アルコキシ、ＮＨ2、（Ｃ1〜Ｃ3）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ1〜Ｃ3）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ1〜Ｃ3）アルコキシカルボニル、（Ｃ2〜Ｃ4）アルカノイル基、オキソ基及びアミド基からなる群から選択される置換基で置換されていても、されていなくてもよく；
Ｒ3及びＲ4は独立に、水素原子、又は（Ｃ1〜Ｃ3）アルキル、（Ｃ2〜Ｃ3）アルケニル、（Ｃ5〜Ｃ6）シクロアルキル、フェニル、ナフチル、ベンジル及び（Ｃ2〜Ｃ4）アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ1〜Ｃ3）アルコキシ、ＮＨ2、（Ｃ1〜Ｃ3）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ1〜Ｃ3）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ1〜Ｃ3）アルコキシカルボニル、（Ｃ2〜Ｃ4）アルカノイル、オキソ及びアミドからなる群より選択される置換基で置換されていてもされていなくてもよく；
又はＲ3及びＲ4は結合して、任意に、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ1〜Ｃ3）アルコキシ、ＮＨ2、（Ｃ1〜Ｃ3）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ1〜Ｃ3）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ1〜Ｃ3）アルコキシカルボニル、（Ｃ2〜Ｃ4）アルカノイル、オキソ及びアミドからなる群から選択される置換基で置換されていてもよい（Ｃ2〜Ｃ3）アルキリデン基であってもよく；
ｍ及びｎは独立して０又は１であり；及び
Ｐが１
である化合物である。
本発明のさらにもう１つの形態では、式（Ｉ）の化合物はｎが０である化合物である。
本発明のその上もう１つの形態では、式（Ｉ）の化合物はｐが１、且つｎ及びｍがそれぞれ０である化合物である。
本発明のさらにもう１つの形態では、式（Ｉ）の化合物はｐが１、且つｎ及びｍがそれぞれ０であり、且つＹがＦ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択される化合物である。
本発明のさらにもう１つの形態では、式（Ｉ）の化合物はｐが１、且つｎ及びｍがそれぞれ０であり、且つＹがＣｌ及びＢｒから選択される化合物である。
本発明のさらにもう１つの形態では、式（Ｉ）の化合物はｐが１、且つｎ及びｍがそれぞれ０であり、且つＹがＣｌ及びＢｒから選択され、且つＺがＣ（Ｏ）ＮＲ13Ｒ14であり、Ｒ13及びＲ14は独立して、それぞれ水素原子、またはヨウ素で置換されてもよい（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル基及び（Ｃ2〜Ｃ4）アルケニル基から選択される化合物である。
本発明のさらなる形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＡ）の２−（４’−ヨードフェニル）−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−アセトアミド誘導体であり、
【化７】
0004727814.tif 000006
式中、Ｙはハロゲンであり、Ｒ3及びＲ4は、独立に、水素原子、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル基及び（Ｃ2〜Ｃ4）アルケニル基から選択されるか、又はＲ3及びＲ4は、結合して（Ｃ2〜Ｃ3）アルキリジン基である。
本発明のさらなる形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＡ）の２−（４’−ヨードフェニル）−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−アセトアミド誘導体であり、式中、Ｙは６−位にあり、Ｒ3及びＲ4は、独立して、水素原子及び（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル基から選択される。
ＳＰＥＣＴを利用する第３の実施態様の診断における好ましい１つの方法では、この発明に基づく化合物は123Ｉで放射性標識される。
ＰＥＴを利用する第３の実施態様の診断における好ましいもう１つの方法では、発明に基づく化合物は124Ｉで放射性標識される。
第５の実施態様に基づく治療における好ましい１つの方法では、発明に基づく化合物は125Ｉ又は131Ｉで放射性標識される。
【実施例】
この発明に基づく式（Ｉ）の具体的な化合物の例、及び代表的な比較例は、以下のような式（XI）の化合物である
【化８】
0004727814.tif 000007
【表１】
0004727814.tif 000008
発明に基づくイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを調製するための一般的合成手順
以下に説明するステップＡ〜Ｆにより、発明に基づく化合物を得るための一般的な合成手順を提供する。（III）のような識別番号は上のスキーム１及びスキーム２における識別番号を表わす。
Ａ．  ２−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン（III）
等モルのαーブロモ−アセトフェノンと２−アミノ−ピリジンの混合物をエタノール中で２時間加熱還流する。冷却後、混合物を５％ＮａＨＣＯ3で処理し、さらにエタノール中で５時間加熱還流する。混合物を室温まで冷却し、得られたイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの懸濁を濾過して除く。残留物を濃縮又は酢酸エチルで抽出して反応生成物の二次産物を得ることができる。酢酸エチル抽出物を少量の冷エタノールと水で洗浄し、乾燥（Ｎａ2ＳＯ4上）して、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除く。
Ｂ．  ２−フェニル−３−ジメチルアミノメチルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン（IV）
ステップＡの生成物の混合物の酢酸溶液に、６当量の３７％ホルムアルデヒド水溶液と１．２当量の４０％ジメチルアミン水溶液を加える。混合物を５５℃にて２４時間撹拌し、次いで乾燥するまで蒸発させる。残余オイルを常温まで冷却し、クロロホルムに溶解する。２ＭのＨＣｌにてクロロホルム層を洗浄し、水層はｐＨ１２のアルカリにする。生じた沈殿物を濾過し、水で洗浄し、乾燥して白色の固体を得る。
Ｃ．  ３−ジメチルアミノメチル−２−フェニル−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニルメチオジド（V）
ステップＢの生成物とベンゼン中の約２．７５当量のヨウ化メチルの混合物を室温にて遮光して７２時間撹拌する。生じた白色の懸濁物を濾過し、エーテルにて洗浄し、乾燥してメチオジド塩を得る。これは精製せずに直接次のステップで用いられる。
Ｄ．  ２−フェニル−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−アセトニトリル（VI）
ステップＣで得たメチオジド塩と４当量のシアン化カリウムをエタノールと水１：１の混合溶液中で２４時間加熱還流する。緩やかな流量の窒素を反応混合物の上に流し、溶媒の一部と残ったＨＣＮを除く。生じた懸濁物を濾過して分離し、灰色がかった白色の固体を得る。
Ｅ．  ２−フェニル−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−酢酸（VII）
濃塩酸と酢酸（１：１）の混合物をステップＤで得たニトリルに加え、混合物を加熱して１５〜１８時間還流する。混合物を室温に冷却した後、溶媒を蒸発させ、残留物をＮａＯＨ水溶液でアルカリ性にし、得られた溶液を濾過する。濾液を氷酢酸で酸性化し、生成物を濾過して回収して、水で洗浄し、乾燥して白色の固体を得る。
Ｆ．  ２−フェニル−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−アセトアミド（VIII）
１．２当量の１’１−カルボニルジイミダゾールを無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中でステップＥの酸性産物の懸濁液に加え、出来た混合物を室温にて１時間及び５０℃にて１時間撹拌する。混合物を室温まで冷却した後、ＴＨＦ中、所望のアミンでそれを処理する。混合物を１時間撹拌し、溶媒を蒸発させる。残留物をジクロロメタンに溶解し、１０％重炭酸ナトリウムで洗浄する。ジクロロメタンで水層を３回抽出する。有機層を合わせ、乾燥し、蒸発させて粗生成物を得る。生成物は、ジクロロメタン、酢酸エチル、エーテル、エタノール及びそれらの混合物のような好適な溶媒からの再結晶により精製する。
Ｇ．  ２−フェニル−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−（Ｎ−（トリブチルスタニル）プロペニル）アセトアミド
アセトアミド部分にＮ−プロピニル置換基を有するステップＦの反応生成物、約１．２当量のヘキブチルジチン及びＡＩＢＮの混合物を無水トルエン中、窒素下で４〜５時間加熱還流する。生じた反応混合物を水上に展開し、酢酸エチルで抽出する。溶媒抽出物を乾燥し、真空下で濃縮する。フラッシュクロマトグラフィ（酢酸エチル：軽油  ４０：６０）により残留物を精製してトリ−ｎ−ブチルスズ酸を固体として得る。
Ｈ．  ２−フェニル−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−（Ｎ−ヨードプロペニル）アセトアミド（X）
ステップＧで得たスタンナンをメタノールに溶解し、等モル量のヨウ素を加え、混合物を２時間撹拌する。得られた反応混合物を蒸発させ、ジクロロメタンに溶解する。この溶液を亜硫酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、乾燥して蒸発させる。  上記のステップＡ〜Ｆの一般的手順によって、以下の化合物が調製された。
【実施例１】
６−クロロ−２−（４’−ヨードフェニル）−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−（Ｎ−メチル）アセトアミド
ジクロロメタン／エタノールから再結晶（収率６０〜７０％）融点３０８−３１０℃
【表２】
0004727814.tif 000009
【実施例２】
６−クロロ−２−（４’−ヨードフェニル）−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−（Ｎ、Ｎ−ジメチル）アセトアミド
ジクロロメタンから再結晶（収率６０〜７０％）融点２１６−２１８℃
【表３】
0004727814.tif 000010
【実施例３】
６−クロロ−２−（４’−ヨードフェニル）−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−（Ｎ、Ｎ−ジエチル）アセトアミド
ジクロロメタン／エタノールから再結晶（収率８０〜９０％）融点１７８−１８０℃
【表４】
0004727814.tif 000011
【実施例４】
６−クロロ−２−（４’−ヨードフェニル）−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−（Ｎ−メチル，Ｎ−プロピル）アセトアミド
ジクロロメタンから再結晶（収率５０〜６０％）融点１７０−１７２℃
【表５】
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【実施例５】
６−クロロ−２−（４’−ヨードフェニル）−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−（Ｎ、Ｎ−ジプロピル）アセトアミド
ジクロロメタンから再結晶（収率８０〜９０％）融点１５２−１５３℃
【表６】
0004727814.tif 000013
【実施例６】
６−クロロ−２−（４’−ヨードフェニル）−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−（Ｎ−メチル，Ｎ−ブチル）アセトアミド
ジクロロメタンから再結晶（収率５０〜６０％）融点２４６−２４８℃
【表７】
0004727814.tif 000014
【実施例７】
６−クロロ−２−（４’−ヨードフェニル）−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−（Ｎ，Ｎ−ジブチル）アセトアミド
ジクロロメタン／エーテルから再結晶（収率６０〜７０％）融点２５０−２５２℃
【表８】
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放射性標識した誘導体
４’−位にヨウ素の放射性核種を有する放射性標識誘導体は、スキーム３に一般的に示される方法で合成される。
トリブチルチン前駆体の放射性標識４’−ヨードフェニル−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−アセトアミドへの変換
酢酸（２００〜５００μＬ）中のブチルチン前駆体（０．１〜０．５ｍｇ）は、Ｎａ123Ｉ（又は124/125/131Ｉ）で処理した後、過酢酸（１００μＬ）で処理する。過酢酸は酢酸（５００μＬ）に過酸化水素（１００μＬ）を加えることによって調製してもよいし、酢酸に市販の過酢酸（０．３〜３３％）を入れて用いてもよい。１〜１０分後、反応混合物はＮａ2Ｓ2Ｏ5（５０ｍｇ／ｍＬを２００μＬ）でクェンチされ、ＮａＨＣＯ3（５０ｍｇ／ｍＬを２００μＬ）で中和する。精製と精製物の単離のために、半調製されたＣ−１８逆相ＨＰＬＣカラム（エコノルシル、アルテック・アソシエーツ）に反応混合物を注入する。移動相溶出液は一般的にはエタノール／水又はアセトニトリル／０．１Ｍ酢酸アンモニウムであり、一般的な流速は２．５〜４ｍＬ／分の範囲である。放射性ヨウ化産物の放射性化合物の収率は、６５〜６８％で、その化学的および放射能純度は９７％を超える値であった。すべての場合で比活性は２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌを超えていた。溶媒は、す減圧下で蒸発させ、静脈内注射に好適な認容性の媒質で生成物を再構築する。この媒質は０．９％の無菌生理食塩水でもよく、生成物は、０．２２μの無菌フィルターを通して無菌化する。
in vitro結合試験
副腎及び腎臓におけるミトコンドリア細胞膜へのin vitro結合によって、本発明の化合物は単一集団の結合部位に結合することが示された。それに対して、ラットの脳ホモジネートを用いた中枢性ベンゾジアゼピン受容体へのin vitro結合は１００ｎＭよりも大きかった。
方法
末梢性ベンゾジアゼピン受容体へのin vitro結合アッセイ
膜の調製
オスのＳＤ系ラットをＣＯ2投与後の頚椎脱臼により屠殺する。腎臓を取り出し、２０容量の氷冷緩衝液（５０ｎＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に入れ、ハサミで細かく刻む。これをポリトロン（PCU Kinematica, Bioblock, Switzerland）で設定１０で１回１０秒間のバーストを行い、ホモジェナイズした後、懸濁液を４℃にて４９，０００ｇで１５分間遠心分離する。ペレットを上記緩衝液中にダウンス（手動ホモジナイザー）によって再浮遊させ、適当なタンパク質濃度を得る。タンパク質測定は、ウシ血清アルブミンを標準として用いローリー法により行う。
in vitro結合アッセイ
試験化合物の阻害定数（ＩＣ50）は、３連試験として、腎臓の膜調製物の希釈溶液の部分（０．１ｍＬ）を、７種類の濃度の試験化合物（１０-6〜１０-10Ｍ）と、微量（２ｎＭ）の［3Ｈ］−ＰＫ１１１９５と共に最終容量０．５ｍＬとして、４℃で１時間インキュベートすることによって測定する。非特異的な結合は、ＰＫ１１１９５（１０μＭ）で阻害し、測定する。インキュベートは、ワットマンＧＦ／Ｂグラスフィルターで素早く濾過することにより終了する。各試料チューブとフィルターは直ちに５ｍｌの氷冷５０ｎＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で３回洗浄する。結合した放射能を測定するために、β−シンチレーションカウンタ（Packard）でフィルターを計測する。ＥＢＤＡ／リガンド、反復非線形最小２乗曲線適合プログラムによってＫｉ及びＩＣ50を算出する（G.A.McPherson, J.Pharmacol. Methods, 14, 213-228 (1985)）。
中枢性ベンゾジアゼピン受容体へのin vitroの結合アッセイ
膜の調製
オスのＳＤ系ラットをＣＯ2投与後の頚椎脱臼により屠殺する。皮質を取り出し、２０容量の氷冷緩衝液（５０ｎＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に入れ、ハサミで細かく刻む。これをポリトロン（PCU Kinematica, Bioblock, Switzerland）で設定１０で１回１０秒間のバーストを行い、ホモジェナイズした後、懸濁液を４℃にて２０，０００ｇで２０分間遠心分離する。ペレットを上記緩衝液中にダウンス（手動ホモジナイザー）によって再浮遊させる。２回目の遠心分離後、ペレットを最終緩衝液（５０ｎｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３２Ｍスクロース、ｐＨ７．４）に再浮遊させて適当なタンパク質濃度を得る。タンパク質測定は、ウシ血清アルブミンを標準としたローリー法により行う。
In vitro結合アッセイ
試験化合物の阻害定数（ＩＣ50）は、希釈した皮質の膜調製物溶液（０．１ｍＬ）に７種類の濃度の試験化合物（１０-6〜１０-10Ｍ）と微量（２ｎＭ）の［3Ｈ］−Ｒｏ１５−１７８８を添加して最終容量０．５ｍＬとして、２５℃で４５分間インキュベートする３連試験によって測定する。非特異的な結合は標識していないフルマゼニル（２０μＭ）による阻害によって測定する。インキュベートは、ワットマンＧＦ／Ｂグラスフィルターで素早く濾過することにより終了する。各試料チューブとフィルターは直ちに５ｍｌの氷冷５０ｎＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で３回洗浄する。結合した放射能を測定するために、β−シンチレーションカウンタ（パッカード）でフィルターを計測する。ＥＢＤＡ／リガンド、反復非線形最小２乗曲線適合プログラムによってＫｉ及びＩＣ50を算出する（G.A.McPherson, J.Pharmacol. Methods, 14, 213-228 (1985)）。
表１は、本発明の化合物及び先行技術の化合物を含めた代表的な比較化合物に関するin vitro結合のＩＣ50の比較値を提供する。
【表９】
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in vivo生体分布試験
この発明の放射性標識化合物のin vivo生体分布は、ＰＢＲ部位が知られている組織において高い取り込みを示した。表２〜４は、ヨウ素が放射性標識されている例１〜３の化合物をラットに投与した場合の生体分布を示す。
ＰＫ１１１９５のような既知の標準物質及び放射性標識していない例１〜７の化合物（１ｍｇ／ｋｇ）でラットを前処理すると、当該組織における活性の取り込みが顕著に低下した。ジアゼパン及びフルマゼニル及びその他の中枢作用性ベンゾジアゼピンによる前処理では発明の放射性標識化合物の取り込み活性をわずかにしか低下させなかったことから、発明の化合物のin vivoでの結合が末梢性ベンゾジアゼピン受容体に特異的、且つ選択的であることを示している。
【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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