(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
HVEMとp30ポリペプチドとの相互作用によって誘発されるリンパ球細胞応答をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
ａ）化合物をp30ポリペプチドもしくはp30ポリペプチドを発現する細胞、およびHVEMとともに、成分どうしが相互作用し得る条件下でインキュベートし、ここで、該p30ポリペプチドは、還元SDS-PAGEによって決定した場合の分子量が30kDaであり、pIが7〜8.5であり、PMA活性化またはPMAおよびイオノマイシン活性化II.23.D7細胞により発現され、リンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドと結合し、かつLTαと抗原性が異なるものであり；そして
ｂ）HVEMとp30ポリペプチドとの相互作用によって誘発されるリンパ球細胞応答に対する該化合物の作用を判定する、
ことを含む前記方法。
【請求項２】
前記作用がリンパ球細胞応答の抑制である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記作用がリンパ球細胞応答の刺激である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記リンパ球細胞応答が細胞活性化である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記リンパ球細胞応答がHSVインターナリゼーションである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
HVEMを発現する細胞を、HVEMをモジュレートするのに有効な量のp30ポリペプチドに結合する抗体とin vitroで接触させることを含み、ここで、該p30ポリペプチドは、還元SDS-PAGEによって決定した場合の分子量が30kDaであり、pIが7〜8.5であり、PMA活性化またはPMAおよびイオノマイシン活性化II.23.D7細胞により発現され、リンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドと結合し、かつLTαと抗原性が異なるものである、HVEM媒介型リンパ球細胞応答をモジュレートする方法。
【請求項８】
HVEMを発現する細胞を、HVEMをモジュレートするのに有効な量のp30ポリペプチドとin vitroで接触させることを含み、ここで、該p30ポリペプチドは、還元SDS-PAGEによって決定した場合の分子量が30kDaであり、pIが7〜8.5であり、PMA活性化またはPMAおよびイオノマイシン活性化II.23.D7細胞により発現され、リンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドと結合し、かつLTαと抗原性が異なるものである、HVEM媒介型リンパ球細胞応答をモジュレートする方法。
【請求項９】
LTβRを発現する細胞を、LTβRをモジュレートするのに有効な量のp30ポリペプチドに結合する抗体とin vitroで接触させることを含み、ここで、該p30ポリペプチドは、還元SDS-PAGEによって決定した場合の分子量が30kDaであり、pIが7〜8.5であり、PMA活性化またはPMAおよびイオノマイシン活性化II.23.D7細胞により発現され、リンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドと結合し、かつLTαと抗原性が異なるものである、LTβR媒介型リンパ球細胞応答をモジュレートする方法。
【請求項１０】
細胞の単純ヘルペスウイルス感染(HSV)を抑制する方法であって、HSV感染に感受性の細胞を、抑制に有効な量のp30ポリペプチドとin vitroで接触させることにより、HSV感染を抑制することを含み、ここで、該p30ポリペプチドは、還元SDS-PAGEによって決定した場合の分子量が30kDaであり、pIが7〜8.5であり、PMA活性化またはPMAおよびイオノマイシン活性化II.23.D7細胞により発現され、リンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドと結合し、かつLTαと抗原性が異なるものである、前記方法。
【請求項１１】
前記p30ポリペプチドは可溶性p30ポリペプチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
HVEMとp30ポリペプチドとの結合を阻害するp30ポリペプチドに結合する抗体を含む、HVEMを発現する細胞をHVEMをモジュレートするのに有効な量の該p30ポリペプチドに結合する抗体と被験体においてin vivoで接触させることによってHVEM媒介型リンパ球細胞応答をモジュレートするための医薬組成物であって、該p30ポリペプチドは、還元SDS-PAGEによって決定した場合の分子量が30kDaであり、pIが7〜8.5であり、PMA活性化またはPMAおよびイオノマイシン活性化II.23.D7細胞により発現され、リンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドと結合し、かつLTαと抗原性が異なるものである、前記医薬組成物。
【請求項１３】
LTβRとp30ポリペプチドとの結合を阻害するp30ポリペプチドに結合する抗体を含む、LTβRを発現する細胞をLTβRをモジュレートするのに有効な量の該p30ポリペプチドに結合する抗体と被験体においてin vivoで接触させることによりLTβR媒介型リンパ球細胞応答をモジュレートするための医薬組成物であって、該p30ポリペプチドは、還元SDS-PAGEによって決定した場合の分子量が30kDaであり、pIが7〜8.5であり、PMA活性化またはPMAおよびイオノマイシン活性化II.23.D7細胞により発現され、リンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドと結合し、かつLTαと抗原性が異なるものである、前記医薬組成物。
【請求項１４】
前記被験体が哺乳動物である、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記被験体がHVEM関連疾患を有する、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記被験体が自己免疫疾患、白血病およびリンパ腫からなる群から選択されるHVEM関連疾患を有する、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記被験体がLTβR関連疾患を有する、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
LTβR関連疾患が自己免疫疾患、白血病およびリンパ腫からなる群から選択される、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記被験体がHSV感染の危険性があるかまたはHSVに感染している、請求項１２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は一般的には免疫応答およびウイルス感染を調節するために有用な化合物および方法に関し、さらに特定すると、単純ヘルペスウイルスによる感染を抑制するために有用なポリペプチドに関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
単純ヘルペスウイルス(HSV)の１および２型は重症度が良性から重篤までの範囲にわたる再発性感染症の原因となる。HSVはニューロン内での潜伏から出現して、受容能力がある(competent)細胞免疫系の存在下で皮膚またはその他の組織に感染する。HSVのD糖タンパク質(gD)はビリオンエンベロープ中に局在する膜貫通タンパク質であるが、これが細胞受容体に結合することによって感染が開始する［Spearら、(1993) Viral Fusion Mechanisms.Bentz編.CRC発行,Boca Raton］。最近、感染のためにHSVが利用する細胞タンパク質が同定され、HSV侵入メディエーター(HSV entry mediator)(HVEM)と命名された［Montgomeryら、(1996)Cell 87:427］。HVEMは、腫瘍壊死因子(TNF)関連サイトカインのための受容体と有意な相同性を示す、システインに富む細胞外ドメインを有する膜貫通１型タンパク質である［Smithら(1994) Cell 76:959；Wareら(1995) Pathways of Cytolysis.Eds.Griffiths and Tschopp.Springer-Verlag,Basel］。TNFスーパーファミリーメンバーの多くが効果的な炎症応答および免疫応答を起動させるのに必要な各種の細胞応答を開始させる。
【０００３】
TNFは２型膜貫通タンパク質であり［Pennicaら(1984)Nature 312:724］、タンパク質分解されて分泌タンパク質を形成し［Blackら(1997)Nature 385:729］、一方、LTαは膜貫通ドメインを持たず［Grayら(1984)Nature 312:721］、もっぱらホモ三量体として分泌される（この形態はTNFβとしても知られていた）。表面タンパク質として発現される場合、LTαはLTβと命名された［Browningら(1993)Cell 72:847］33kDaのタンパク質と会合しており［Androlewiczら(1992)J.Biol.Chem.267:2542］、またα1β2およびα2β1のサブユニット比率のヘテロ三量体として２型膜貫通糖タンパク質でもある［Androlewiczら、上記引用；Browning ら(1996)J.Biol.Chem.271:8618］。LTαおよびTNFは両者ともに２つの受容体、すなわち55〜60 kDa TNF受容体(TNFR60；CD120aまたは１型)［Schallら(1990)Cell 61:361；Loetscherら(1990)Cell 61:351］および75〜80 kDa TNFR(TNFR80；２型またはCD120b)［Smithら(1990)Science 248:1019］を介して結合し、シグナリングする。これに対して、表面LTα1β2複合体は、LTαにもTNFにも結合しないLTβ受容体(LTβR)によって特異的に認識される［Croweら(1994)Science 264:707］が、他方、両型のTNFRはLTα2β1ヘテロ三量体に結合する［Crowら(1994)Science 264:707；Browningら(1995) J. Immunol. 154:33］。
【０００４】
マウスにおけるLTα遺伝子およびLTβ遺伝子の遺伝子欠失から、リンパ節およびパイエル板の発生におけるこれら２つの遺伝子の役割が明らかになった［De Togniら(1994) Science264:703；Banksら(1995)J.Immunol.155:1685］が、これらはTNFおよびTNFR60とともに、胚中心の形成および成体における免疫応答の間の免疫グロブリンアイソタイプのスイッチング（例えばIgAの生成）を制御する重要なサイトカインでもある［Matsumotoら(1996)Science 271:1289；Mariathasanら(1995)J.Inflammation 45:72］。大部分の研究がこれらの機能を制御する重要なサイトカイン−受容体系としてLTα1β2/LTβRに注目している［Croweら(1994)Science 264:707；Koniら(1997)Immunity 5:491；Ettingerら(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13102；Rennertら(1996)J.Exp.Med.184:1999］。
【０００５】
〔発明の概要〕
本発明は、以前にはHSV gDに結合することのみが知られていた、HVEMのためのリガンドとして機能する内在性ポリペプチドの同定に基づいている。このリガンド（p30と称する）、ならびにp30をコードする核酸配列およびp30に結合する抗体を提供する。本発明はまた、HSV感染をモジュレートする化合物の同定方法、およびリンパ系細胞の応答をモジュレートする方法も包含する。本発明の方法は例えば自己免疫疾患、悪性リンパ腫およびHSV感染患者の治療に有用である。１つの実施形態において、本発明はHVEM結合物質媒介型細胞応答に作用する化合物を同定するためのアッセイを特徴とする。LTbR-p30媒介型細胞応答に作用する化合物を同定するためのアッセイもまた本発明の範囲内である。
【０００６】
特に定義しない限り、本明細書中で使用するすべての技術的および科学的用語は本発明が属する技術分野の通常の技術者が普通に理解している意味と同一の意味を有する。本発明の実施または試験においては、本明細書に記載されているものと同様または等価な方法および物質を使用することができるが、好適な方法および物質を以下に記載する。本明細書中で言及するすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の引用文献はその全文を参照により本明細書に組み入れる。矛盾する場合は、定義を含めて本出願のものが優先する。さらに、本明細書に記載する物質、方法および実施例は単に説明のためのものであって、限定しようとするものではない。
【０００７】
本発明のその他の特徴および利点、例えば各種のヒトの疾病の治療は、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲から明らかになろう。
【０００８】
〔詳細な説明〕
TNF受容体(TNFR)に関連するポリペプチドであるHVEMの細胞外ドメインを含有する融合タンパク質の結合の抑制が関与する実験から、悪性および正常ヒトT細胞の両方がHVEMのための細胞表面リガンドを発現することが示された。競合抑制実験から、このHVEMリガンドはLTαβヘテロ三量体およびLTαに共通する特性を有するが、LTα1β2およびTNFとは異なる特徴も有することが示された。したがって、LTα2β1上のHVEM結合部位はTNFR60と同一でない点に注意は必要であるが、LTα2β1はHVEMによって認識される推定表面リガンドとなり得る。あるいは、HVEMは新規なリガンドを認識するかも知れない。これらの可能性を見極めるために、生化学的手法を使用した。
【０００９】
免疫沈降およびドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)による研究から、LTβおよびLTαの両方と抗原性が異なる、T細胞の表面のHVEMのための新規な30 kDaポリペプチドリガンド(p30)の存在が証明された。アフィニティクロマトグラフィー精製および二次元電気泳動により、分子量が30 kDaでありpIが約7〜8.5である点で、p30がLTβおよびLTαとは物理的にも異なることが示された（図4C）。さらに、これらの研究から、p30もLTβRによって認識されるがTNFRでは認識されないことが示された。
【００１０】
結合抑制実験では、可溶性gD-1（HSV-1由来のgD）およびgD-1の突然変異体であるgD-1(△290-299t)がHVEMには結合するがLTβRまたはTNFR60には結合しないことが証明された。この結果は、HVEMがTNFR60およびLTβRによって認識されるリガンドに結合しても、gD-1はHVEMへの結合について、特異的に同時進化(co-evolved)してきたことを示唆している。さらに、この知見は、gD-1がリンホトキシンの膜固定型ビロカイン(virokine)であり、そしてHSVの侵入または感染細胞からの放出の際にHVEMシグナリング活性をモジュレートするらしいことを意味している。
【００１１】
in vitro細胞培養の研究から、抗HVEM抗体が処女T細胞および記憶T細胞の両方の増殖を増大させることが示された。同様の実験から、HVEMを介するシグナリングはB細胞に活性化刺激を与えること、およびTNFRを介した均衡する負の刺激を伴わない正の刺激はこのp30 HVEMリガンドの独特の特性であるらしいことが示された。これらの結果はHVEMリガンドの生理学的機能はおそらくTNFおよびLTα1β2とは異なるらしいことを意味するものである。HVEMのための新規なp30リガンドの同定から、このリガンドがこれまではLTαまたはLTβによるものとされた生理学的応答の原因であるかも知れないという可能性が出てくる。ここに示したこの発見はLT/TNFサイトカイン系およびヘルペスウイルスのさらに深い理解をもたらし、これによって疾病の経過においてこれらのサイトカインをコントロールするための新しい手法が示唆される。
【００１２】
同時に、これらの結果はHVEMまたはLTβRを含有するFc融合タンパク質がLTαおよび30 kDa HVEMリガンド、p30の作用をモジュレートするであろうことを意味している。同様に、モノクローナル抗体またはペプチドもしくは小さな有機化合物などのリガンド受容体複合体の特異的インヒビターを同定するために、融合タンパク質HVEMを使用することができるであろう。p30もしくはLTαとHVEMとの相互作用、またはp30とLTβRとの相互作用のインヒビターを使用して、TおよびBリンパ腫もしくは白血病を含む、望ましくないリンパ球の増殖が発生する疾病、またはリウマチ様関節炎、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデスもしくは重症筋無力症などの自己免疫疾患をモジュレートすることができるかも知れない。
【００１３】
同様に、LTα、p30およびHVEMシグナリングがエフェクター分子として含まれる免疫反応を抑制するために、ヘルペスウイルス gD-1を使用することができると考えられる。LTαまたは（予測される細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインの欠失によって作製した）可溶性形態の30 kDa HVEMリガンドはヘルペスウイルス感染のインヒビターとして機能し、細胞標的に侵入するヘルペスウイルスの能力をブロックすることによって回復(recrudesce)され得る。
【００１４】
TNFR類と同様に、HVEMはLTαおよびこれと異なる30 kDaの膜結合リガンドであるp30に結合する、という二重のリガンド特異性を有する。LTαのTyr108Phe突然変異はTNFR60およびTNFR80についてと同様に、HVEMとの結合性を破壊する。TNFR60がHVEMの表面30 kDa形態への結合を阻止する能力がないということは、表面LTα2β1がHVEMリガンドではないことを意味する。
【００１５】
さらに、p30はLTαとは異なる。なぜならば、これは免疫原性において異なり、そしてもっぱら分泌されるLTαとは違って、細胞に結合して残留するからである。したがって、HVEM結合性タンパク質(p30)はTNFに関連するその他のタンパク質と同様のII型膜貫通コンフィギュレーションとして配置されている膜貫通ドメインを形成する、一連の疎水性残基を含有すると予測される。このことは、p30がその他の方法（例えば脂質改変）によっても改変(modify)されて細胞表面に付着することができるようにする可能性を排除するものではない。さらに、このタンパク質はLTαおよびLTβならびにこのスーパーファミリーを定義付ける関連サイトカインと配列相同な領域を共有し、そして約150〜160残基のC-末端細胞外ドメインを含有するはずである。
【００１６】
発明者らの知見は、HVEMがLTαに対する特異的受容体であり、TNF結合性受容体であるTNFR60およびTNFR80と明確に識別される特性を有することをも意味している。この特性によって、HVEM融合タンパク質または類似のタンパク質がTNFまたはLTα1β2機能を抑制することなくLTαと特異的に拮抗することが可能になる。
【００１７】
本発明は実質的に純粋なp30ポリペプチドを提供する。p30ポリペプチドは還元SDS-PAGEによって決定した場合の予測分子量が30 kDaであり、pIが約7〜8.5の範囲であるという特徴がある（図4C）。p30は10未満、好ましくは8未満、より好ましくは6未満（例えば3、4または5）の異性体として存在する。このポリペプチドは細胞に結合しており（すなわち分泌されない）、そしてその細胞表面形態でHVEMおよびLTβRに結合する。
【００１８】
本明細書で使用する用語「実質的に純粋」とは、天然状態では会合するその他のタンパク質、脂質、炭水化物またはその他の物質を実質的に含まないp30ポリペプチドをいう。当業者ならばタンパク質精製の標準的技法を使用してp30を精製することができる［Protein Purification,Principles and Practice,第2版(1987)Scopes,Springer Verlag,N.Y.］。実質的に純粋なポリペプチドであれば、還元SDS-PAGEゲル上に約30 kDaの一本の主要バンドを生成する。
【００１９】
本発明には機能性ポリペプチドであるp30、およびその機能性フラグメントが含まれる。本明細書で使用する用語「機能性ポリペプチド」とは、ある定義された機能的アッセイによって同定され、かつ細胞内の特定の生物的、形態的または表現型の改変に関係する、生物学的機能または活性を有するポリペプチドをいう。p30ポリペプチドの「機能性フラグメント」にはp30の活性、例えばHVEMもしくはLTβRに結合することによるかまたはHSVのHVEMへの結合を抑制することによる細胞応答のモジュレート、を保持している、p30のフラグメントが含まれる。p30の生物学的活性を有するさらに小さなペプチドが本発明に含まれる。当業者であれば標準的な方法、例えばウイルスプラーク減少アッセイまたはサイトカイン生成アッセイを含む細胞活性化アッセイによって、p30の機能的活性をアッセイすることができる。
【００２０】
p30の一次アミノ酸配列をわずかに改変することにより、本明細書に記載する天然に存在するp30ポリペプチドと比較して実質的に同等の活性を有するタンパク質が生じ得る。こうした改変は部位特異的突然変異誘発などによる意図的なものであってもよいし、または自然発生的なものであってもよい。p30の生物学的活性、例えばHVEMもしくはLTβRに結合することによるかまたはHSVのHVEMへの結合を抑制することによる細胞応答の改変、が存在するかぎり、これらの改変によって生成するポリペプチドのすべてが本発明に含まれる。さらに、１以上のアミノ酸の欠失によっても、その活性の有意な改変を伴わない、生成分子の構造の改変が生じ得る。これによって、より広い用途を有するより小さな活性分子の開発がもたらされ得る。例えば、p30活性に必要でないアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸を除去することが可能である。
【００２１】
本発明のp30ポリペプチドにはポリペプチド配列の同類変異も含まれる。本明細書で使用する用語「同類変異」とは、アミノ酸残基の１つが生物学的に類似する別のアミノ酸により置換されることを意味する。同類変異の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンなどの疎水性残基の１つの別のものとの置換、あるいはリシンに代えてアルギニン、アスパラギン酸に代えてグルタミン酸、またはアスパラギンに代えてグルタミンへの置換などの極性残基の１つの別のものへの置換が含まれる。用語「同類変異」にはまた、置換されたポリペプチドに対して生起させた抗体が非置換ポリペプチドとも免疫反応する限り、非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することも含まれる。
【００２２】
本発明はさらに、本発明のp30ポリペプチドをコードする単離された核酸配列も提供する。本明細書で使用する用語「単離された」には、天然状態では会合するその他の核酸、タンパク質、脂質、炭水化物またはその他の物質を実質的に含まないポリペプチドが含まれる。本発明のポリヌクレオチド配列にはp30をコードするDNA、cDNAおよびRNA配列が含まれる。p30活性を有するポリペプチドをコードする限り、p30の全体または一部をコードするポリヌクレオチドのすべてが本発明に含まれるものと解釈すべきである。こうしたポリヌクレオチドとしては、天然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチドおよび意図的に操作されたポリヌクレオチドが含まれる。例えば、代替の(alternate)RNAスプライシングパターンによるか、またはRNA転写のための代替のプロモーターの使用によって、mRNA配列の部分を改変してもよい。別の例として、p30ポリヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発させることもできる。p30のためのポリヌクレオチド配列としてはアンチセンス配列も含まれる。本発明のポリヌクレオチドには遺伝コードのために縮重性である配列が含まれる。天然には20種のアミノ酸があるが、その大部分が２以上のコドンによって特定される。したがって、コードされるp30ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化していない限り、すべての縮重ヌクレオチド配列が本発明に含まれる。さらに、本発明には、p30の生物学的活性を有し、p30ポリペプチドと免疫反応性の抗体のための１以上のエピトープを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた含まれる。
【００２３】
本発明のp30核酸には(a)天然に存在するp30をコードする配列、ならびに(b)高ストリンジェント条件、例えば0.5 M NaHPO４、7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1 mM EDTA中、65℃でのフィルターに結合させたDNAとのハイブリダイゼーション、および68℃、0.1X SSC／0.1％ SDSでの洗浄［Ausubel F.M.ら編，(1989)Current Protocols in Molecular Biology,Vol.I,Green Publishing Associates,Inc.,and John Wiley & sons,Inc.,New York］においてその配列の相補体とハイブリダイズし、かつ機能的に等価な遺伝子産物をコードするあらゆるヌクレオチド配列が含まれる。配列(a)および(b)の縮重変異体もまた本発明に含まれる。
【００２４】
前段のヌクレオチド配列(a)および(b)とハイブリダイズし、したがってそれらの相補体である核酸分子、好ましくはDNA分子もまた本発明に含まれる。これらのハイブリダイゼーション条件は上記のような高ストリンジェントであってもよいし、または例えば42℃、0.2X SSC／0.1％SDSでの洗浄［Ausubelら、上記引用］による中程度のストリンジェント条件などのあまり高ストリンジェントでないものでもよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）である例では、高ストリンジェント条件とは、例えば、（14塩基オリゴの場合は）37℃、（17塩基オリゴの場合は）48℃、（20塩基オリゴの場合は）55℃、および（23塩基オリゴの場合は）60℃で、6X SSC／0.05％ピロリン酸ナトリウムでの洗浄をいう。これらの核酸分子は、例えば（p30核酸配列の増幅反応のため、および／またはその際のアンチセンスプライマーとして）p30の調節において有用なp30アンチセンス分子をコードするかまたはそのようなp30アンチセンス分子として作用する。さらに、こうした分子を、例えばp30遺伝子の存在を検出することができるスクリーニング方法の成分として使用することもできる。
【００２５】
上記のヌクレオチド配列の他に、当分野で周知の分子生物学的技法によって、過度の実験をすることなく、全長cDNAまたはゲノム配列を同定して容易に単離することができる。本発明はこれらの核酸分子を包含する。
【００２６】
本発明のDNA配列はいくつかの方法によって取得することができる。例えば、当分野で周知のハイブリダイゼーションまたはコンピュータに基づく技法を使用して、DNAを単離することができる。これらとしては、限定しようとするものではないが、以下のものが含まれる：(a)相同性ヌクレオチド配列の検出のための、ゲノムまたはcDNAライブラリーのプローブとのハイブリダイゼーション；(b)共通した構造的特徴を有するクローン化DNA断片の検出ための、発現ライブラリーの抗体スクリーニング；(c)対象とするDNA配列とアニールできるプライマーを使用するゲノムDNAまたはcDNA上でのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)；(d)類似の配列に関する配列データベースのコンピュータ検索；(e)サブトラクションDNAライブラリー(subtractive DNA library)の分別スクリーニング；および(f)T細胞cDNAライブラリーのエクスプレスド・シーケンス・タグ(EST)による大規模ゲノムシークエンシング。
【００２７】
好ましくは、本発明のp30ポリヌクレオチドは哺乳類生物から誘導される。適切なプローブが入手できるならば、核酸ハイブリダイゼーションに依拠するスクリーニング操作によって、あらゆる生物からどんな遺伝子配列でも単離することが可能になる。問題とするタンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブを化学的に合成することができる。このためには短いオリゴペプチドの一連のアミノ酸配列を知る必要がある。このタンパク質をコードするDNA配列はその遺伝コードから推定することができるが、コードの縮重性を考慮に入れなければならない。配列が縮重している場合は、混合付加反応を実施することが可能である。これには変性二本鎖DNAの異種混合物が含まれる。こうしたスクリーニングの場合、ハイブリダイゼーションは好ましくは一本鎖DNAまたは変性二本鎖DNAのいずれかで実施する。対象のポリペプチドに関連するmRNA配列の存在量が非常に少ない起源から誘導されるcDNAクローンの検出においては、ハイブリダイゼーションが特に有用である。つまり、非特異的結合を回避するようにするストリンジェントハイブリダイゼーション条件を使用することによって、例えば、標的DNAを混合物中のその完全相補体である１個のプローブとハイブリダイズさせて、１個の特異的cDNAクローンをオートラジオグラフィーで可視化することが可能である［Wallaceら(1981)Nucl.Acid Res.,9:879］。あるいは、非特異的cDNAクローンを排除するために、サブトラクションライブラリーが有用である。
【００２８】
所望のポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が未知の場合、DNA配列の直接の合成は不可能であるので、最良の方法はcDNA配列の合成である。対象のcDNA配列を単離するための標準的手法の中に、高レベルの遺伝子発現をするドナー細胞中に豊富なmRNAの逆転写から誘導される、プラスミドまたはファージに保有させたcDNAライブラリーがある。ポリメラーゼ連鎖反応技術と組合せて使用すると、希少な発現産物でもクローン化することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列の有意な部分が既知の場合は、標的cDNA中に存在すると推定される配列の１つと重複する標識一本鎖もしくは二本鎖DNAまたはRNAプローブ配列を作成して、一本鎖形態に変性させたcDNAのクローン化コピー上で実施するDNA/DNAハイブリダイゼーション手法において、利用することができる［Jayら、(1983)Nucl.Acid Res.,11:2325］。N-末端アミノ酸シークエンシングによって取得されるp30ポリペプチドのアミノ酸配列を「逆翻訳(Back-Translate)」することによって、適切なオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを構築することができる。
【００２９】
p30に特異的な抗体を使用して、１以上のエピトープを有するp30ペプチドについて、λgt11などのcDNA発現ライブラリーを間接的にスクリーニングしてもよい。こうした抗体はポリクローナルまたはモノクローナルのいずれとして誘導してもよく、これを使用してp30cDNAの存在を指示する発現産物を検出することができる。
【００３０】
p30核酸の改変としては、遺伝子内突然変異（例えば点突然変異、ナンセンス（停止）、ミスセンス、スプライス部位およびフレームシフト）ならびにヘテロ接合型またはホモ接合型欠失が含まれる。こうした改変の検出は、配列分析、サザンブロット分析、PCRに基づく分析（例えば多重PCR、配列標識部位(STS)）、およびin situハイブリダイゼーションを含む、当業者に既知の標準的方法によって実施することができる。こうしたタンパク質は、例えば、標準的SDS-PAGEおよび／または免疫沈降分析および／またはウエスタンブロット分析によって分析することができる。
【００３１】
本発明は、前記のp30コード配列のいずれかおよび／またはその相補体（すなわちアンチセンス）を含有するDNAベクター、ならびに前記のp30コード配列のいずれかを含有する発現ベクターをも包含する。発現ベクターは、本発明のペプチドもしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列がプロモーターもしくはエンハンサー−プロモーターの組合せに機能し得る形で連結されている核酸配列で構成されるかまたはこれを含有する。プロモーターは、転写開始位置の直前（上流）の典型的には100ヌクレオチド対以内のDNA分子の領域で構成される転写調節エレメントである。もう１つの転写調節エレメントがエンハンサーである。エンハンサーは時間、位置および発現レベルに関する特異性を提供する。プロモーターとは異なり、エンハンサーはプロモーターが存在していれば、転写部位から種々の距離に位置していても機能することができる。エンハンサーは転写開始部位の下流に位置していてもよい。発現ベクターのコード配列を転写終結領域に機能し得るように連結する。コード配列をプロモーターの制御下に置くためには、ペプチドまたはポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位をプロモーターから1〜約50ヌクレオチド下流(3')に位置させる必要がある。こうした調節エレメントとしては、限定しようとするものではないが、サイトメガロウイルスhCMV前初期遺伝子、SV40アデノウイルスの初期または後期プロモーター、lac系、trp系、TAC系、TRC系、ファージAの主要オペレーターおよびプロモーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、3-ホスホグリセリン酸キナーゼのためのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、ならびに酵母α接合因子のプロモーターが含まれる。
【００３２】
発現ベクターおよびその構築方法は当分野に習熟する者には公知である。好適なベクターとしては数ある中でも、プラスミド、ならびにヘルペスウイルス、レトロウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターが含まれる。
【００３３】
記載するp30核酸配列を含有する発現ベクターでトランスフェクトした好適な宿主細胞系が本発明に含まれる。例えば、p30を各種の天然または工学操作された形態で発現させるための、トランスフェクション用に使用する細胞としては、限定しようとするものではないが、例えば哺乳類起源のHEK293細胞またはSf9昆虫細胞が含まれる。当分野で通常使用される各種の方法、例えばエレクトロポレーションまたはリン酸カルシウム沈殿によって、細胞をトランスフェクトする。ウイルスベクター、例えばレトロウイルスでの形質導入によって遺伝子を細胞中に導入することもできる。当分野の普通の技術者によく知られている適切な方法、例えばGeneticinＴＭ(G418)またはピューロマイシンなどの薬剤を補充した組織培養用培地を使用し、関連する発現ベクターにそのための耐性遺伝子を含有させることなどによって、トランスフェクトが成功した細胞系を選択する。各種の可能な方法、例えばフローサイトメトリー分析によって、p30分子の細胞表面発現について、トランスフェクトが成功した細胞系をスクリーニングする。
【００３４】
「宿主細胞」とはその中でベクターが増殖してそのDNAを発現することができる細胞である。この用語には対象宿主細胞の子孫もまた含まれる。複製中に発生する突然変異があるかも知れないので、すべての子孫が親細胞と同一とはかぎらないことが理解される。しかし、用語「宿主細胞」を使用する場合、こうした子孫も含まれる。
【００３５】
p30のアミノ酸配列内の抗原性エピトープを特異的に認識する抗体もまた本発明に包含される。こうした抗体としては、限定しようとするものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab')２フラグメント、および上記のいずれかのエピトープ結合性フラグメントが含まれる。
【００３６】
本発明の抗体は、例えば自己免疫疾患および悪性リンパ腫の治療において使用することができる。これらは細胞上でのp30の発現について試験するために使用することもでき、したがって特定の患者のために適切な治療を選択するためのスクリーニング操作の一部として利用し得る。例えば、リンパ腫または白血病患者の腫瘍細胞がp30を発現する場合、抗p30抗体または抗p30抗体のイムノトキシン複合体をその患者の治療に使用することができる。これらの抗体は本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用することもできる。
【００３７】
本発明の抗体の作製のため、p30ポリペプチドまたはp30ポリペプチドを発現する細胞のいずれかの注射によって宿主動物を免疫する。あるいは、免疫原として、これらのポリペプチドのp30として特異的な領域に相当するペプチドを使用してもよい。こうした宿主動物としては、限定しようとするものではないが、ウサギ、マウスおよびラットが含まれる。宿主の種類に応じて、免疫学的応答を増強するために、各種のアジュバントを使用することができる。これらとしては、限定しようとするものではないが、Freund（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロン酸ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、BCG（Calmette-Guerin細菌）およびCorynebacterium parvumが含まれる。ポリクローナル抗体は免疫動物の血清から誘導された抗体分子の異種集団である。
【００３８】
免疫原性をさらに増強するため、免疫原を担体に結合させることもある。こうした担体の例はキーホールリンペット(keyhole limpet)ヘモシアニン(KLH)およびウシ血清アルブミン(BSA)である。オボアルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンなどのその他のアルブミンも担体として使用することができる。ペプチドを担体に結合させる方法は当分野で周知であり、グルタルアルデヒド、カルボジイミドおよびm-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルの使用が含まれる。
【００３９】
使用すべき抗原の量は、当業者であれば、過度の実験をすることなく容易に決定することができる。抗原を多くの経路によって投与することができる（例えば、皮下、筋内、皮内、静脈内および腹腔内）。免疫した動物の血液を投与後各種の時点でサンプリングして、ポリクローナル抗体の産生をモニターする。所望のレベルの抗体が得られたら、動物から採血し、血清を保存する。
【００４０】
連続的継代培養細胞系によって抗体分子を産生させるための任意の技法によって、特定の抗原に対する抗体の均質集団であるモノクローナル抗体を取得することもできる。これらの技法として、限定するわけではないが、以下のものが挙げられる：ハイブリドーマ技法［Kohler and Milstein(1975)Nature 256:495-497；米国特 許第4,376,110号；Howell and Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.］、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法［Kosborら(1983)Immunology Today 4:72；Coleら(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026］およびEBVハイブリドーマ技法［Coleら(1985),Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.］。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDを含む任意の免疫グロブリンクラスおよびそれらのあらゆるサブクラスのものでよい。
【００４１】
その外、「キメラ抗体」の製造のために開発された技法を使用することができる［Morrisonら(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851；Neubergerら(1984)Nature 312:604；Takedaら(1985)Nature 314:452］。これらの技法には、適切な生物学的活性があるヒト抗体をコードする遺伝子の一部分への、適切な抗原特異性を有するマウス抗体をコードする遺伝子の一部分のスプライシングが関与する。キメラ抗体とは、別々の部分が別々の動物種に由来している分子で、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなどがある。こうしたキメラ抗体は、例えばIgHをコードするヒト遺伝子座ならびにκおよびλＬ鎖遺伝子座を含有するマウスを免疫することによって作製することもできる。
【００４２】
別法として、p30のエピトープに対する一本鎖抗体を製造するために、一本鎖抗体の製造について記載された技法［米国特許第4,946,778号；Bird(1988)Science 242:423；Hustonら(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879；およびWardら(1989)Nature 334:544］を応用することができる。一本鎖抗体はFv領域のＨ鎖およびＬ鎖フラグメントをアミノ酸架橋を介して連結し、その結果一本鎖ポリペプチドとすることによって形成される。それらは組換えDNA技法によって都合よく製造される。
【００４３】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは既知の技法によって作製することができる。例えば、こうしたフラグメントとして、限定するわけではないが、抗体分子のペプシン消化によって作製することができるF(ab')2フラグメント、およびF(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を分解することによって作製することができるFabフラグメントが挙げられる。あるいは、Fab発現ライブラリーを構築する［Huseら(1989)Science 246:1275］ことによって、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速で容易な同定が可能である。
【００４４】
抗体を結合特異性についてスクリーニングする方法は当分野で周知である。このような方法として、限定するわけではないが、以下の試験方法が挙げられる；(a)細胞表面p30を発現する細胞との結合性；(b)p30を発現しない細胞との結合性の欠如；(c)p30ポリペプチドとの結合性；(d)p30以外のポリペプチド（例えば、TNF、LTα、LTβ、Fasリガンド、CD40リガンドまたはアルブミン）との結合性の欠如；ならびに(e)p30内の対象領域、例えばHVEMまたはLTβRとの結合に関与する領域に相当するペプチドによる、p30への結合性の特異的阻害。
【００４５】
本発明は、HVEMまたはLTβR受容体ポリペプチドのいずれかによって媒介される細胞応答をモジュレートすることが可能な化合物を同定するために設計されたin vitroシステムを特徴とする。「細胞応答」とは、本明細書中では、HSVの細胞活性化または細胞インターナリゼーションをいう。これらの細胞応答は、(a)HVEMとp30、gDもしくはLTα；または(b)LTβRとp30の相互作用によって誘発される。
【００４６】
用語「リガンド」は、受容体タンパク質に高アフィニティおよび特異的様式で結合して機能的応答を誘発するポリペプチドまたは化合物をいう。例えば、本発明のリガンドとしてp30、gDまたはLTαが挙げられる。用語「受容体」は、本明細書中では、リガンドが結合したとき、細胞応答を誘導するポリペプチドをいう。本発明の受容体としてHVEMまたはLTβRが挙げられる。用語「結合物質」は、受容体またはリガンドに高アフィニティおよび特異的様式で結合するが、機能的応答を誘発するかまたは誘発しないポリペプチドまたは化合物をいう。試験化合物は、確定され、単離され、そして精製された候補化合物（例えば合成小分子）であるか、コンビナトリアルライブラリーのメンバーであってもよく、または生物学的液体、組織抽出物、細胞画分もしくは細胞溶解物などの生物学的サンプル中に存在してもよい。
【００４７】
１つの実施形態において、本発明はHVEM結合物質媒介型細胞応答に作用する化合物を同定するためのアッセイを特徴とする。このアッセイには、(a)HVEMポリペプチドまたはHVEMポリペプチドを発現する細胞、およびHVEM結合物質とともに、成分どうしが相互作用し得る条件下で、その化合物をインキュベートすること；および(b)HVEM結合物質媒介型細胞応答に対するその化合物の作用を測定することが関与する。LTβR-p30媒介型細胞応答に作用する化合物を同定するためのアッセイもまた本発明の範囲内である。このアッセイには、(a)LTβRポリペプチドまたはLTβRポリペプチドを発現する細胞、およびp30とともに、成分どうしが相互作用し得る条件下で、この化合物をインキュベートすること；および(b)LTβR-p30媒介型細胞応答に対するその化合物の作用を測定することが関与する。本発明のアッセイにおいて、HVEMもしくはLTβRとリガンドとの相互作用によって媒介される細胞の活性化をモジュレートするか、またはHSVによる感受性細胞の感染を抑制する能力について、化合物をスクリーニングする。
【００４８】
本発明は細胞応答アッセイを特徴とする。これらの細胞応答アッセイは、細胞の活性化またはHSVによる細胞の感染のいずれかを測定する。
【００４９】
リガンド（例えば、p30、LTαまたはgD）によって刺激される受容体（例えば、HVEMまたはLTβR）を発現する細胞の応答、およびその細胞にとって適切な刺激の次善の(suboptimal)量をモジュレートする能力について、試験化合物を試験することができる。「応答体」である受容体発現細胞は被験体から新たに取得するか、または培養した細胞系でもよい。該細胞は、内在的にコードされる受容体、またはトランスフェクトされた遺伝子によりコードされる受容体を発現することができる。リガンドは、単離されたポリペプチドの形態で細胞応答培養物に添加するか、またはそのリガンドを発現する細胞の培養物への添加によって、添加することができる。
【００５０】
このリガンドを発現する細胞は、該リガンドをコードする内在性の遺伝子、あるいは該リガンドをコードするトランスフェクトされた遺伝子を発現し得る。さらにこのリガンドは、細胞表面上に発現されてもよいし(p30またはgD)、あるいは分泌されてもよい(p30、gDまたはLTα)。p30またはgDが分泌されるためには、それをコードする遺伝子が、膜貫通ドメインをコードする領域の欠失を有する必要がある。
【００５１】
細胞の活性化は、例えば細胞の増殖、細胞表面活性化マーカーの新たな発現（de novo expression）、または可溶性因子の産生に基づいて測定できる。
【００５２】
好ましい実施形態においては、この細胞はリンパ球である。T細胞の場合、受容体(HVEMまたはLTβR)を発現する応答T細胞を、試験化合物、リガンドおよび最適用量以下（suboptimal dose）のT細胞活性化因子(例えば抗CD3抗体、フィトヘマグルチニン(PHA)のようなレクチン、またはブドウ球菌エンテロトキシンC(SEC)のような超抗原)の存在の下で培養することができる。対照は、(a) T細胞のみを含む培養物、(b) T細胞活性化因子およびリガンドとともにT細胞を含み、試験化合物を含まない培養物、(c) T細胞活性化因子とともにT細胞を含み、リガンドおよび試験化合物を含まない培養物、(d) T細胞活性化因子とともにT細胞を含み、リガンドを含まず、試験化合物を含む培養物、(e) T細胞を含み、T細胞活性化因子を含まず、リガンドを含み、試験化合物を含まない培養物、(f) T細胞を含み、T細胞活性化因子、リガンド、および試験化合物を含まない培養物、および(g) T細胞を含み、T細胞活性化因子およびリガンドを含まず、試験化合物を含む培養物とする。T細胞の活性化は、3H-チミジンの取り込みによるT細胞の増殖(実施例5参照)、CD69またはCD25のような活性化マーカーの誘導、あるいはインターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-4(IL-4)、またはインターフェロン-γ(IFNγ)のようなサイトカインの産生に基づいて測定できる。
【００５３】
Bリンパ球の場合も、同様の応答アッセイを行うことができる。B細胞活性化因子は、アメリカヤマゴボウマイトジェンのようなマイトジェン、ブドウ球菌プロテインＡ、抗免疫グロブリン等とし得る。細胞活性化は、細胞の増殖(この場合も同様に3Hチミジンの組み込みによる)、あるいはIgの分泌に基づいて測定することができる。あるいは、栄養面で最適未満の培地におけるB細胞の生存率を測定してもよい(実施例5参照)。
【００５４】
試験化合物がリンパ球の活性化を抑制する能力を有することは、その化合物が、主としてT細胞が関与する自己免疫疾患(例えば慢性関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、および多発性硬化症)や、T細胞およびB細胞が関与する自己免疫疾患(例えば全身性エリテマトーデスや重症筋無力症)の治療に有用である可能性があることを示すものである。試験化合物がリンパ球の活性化を刺激する能力を有することは、その化合物が、感染症の患者、あるいは例えば化学療法や放射線療法を受けている癌患者やAIDS患者のように免疫抑制状態にある患者において免疫応答を刺激するのに有用である可能性があることを示すものである。
【００５５】
HSV感染症を予防する試験化合物のアッセイでは、試験化合物をHSV感受性細胞およびHSVの培養物に加えればよい。ウイルス感染についての許容細胞系としては、ヒト皮膚線維芽細胞、活性化を引き起こす物質(例えば抗CD3抗体またはフィトヘマグルチニン)で処理した末梢血リンパ球、形質転換された細胞系(例えばヘルト細胞)等が挙げられる。ウイルス産生は、ウイルスプラークアッセイ等の当業者に知られた任意の方法により測定することができ、特定のウイルスタンパク質の産生は、ELISAにより、すなわち比色測定により容易に検出可能な酵素であるβ-ガラクトシダーゼのような指示遺伝子産物を含む組換えウイルスを使用することにより測定できる[Montgomeryら、上記に引用]。
【００５６】
試験化合物が細胞へのHSV感染を抑制する能力を有することは、その化合物がHSV感染症の患者の治療に有用である可能性があることを示すものである。
【００５７】
化合物が関連する受容体-リガンド対の何れかのメンバーに結合することによって細胞応答機能に作用するかどうかを試験するために、その化合物の可溶性形態の受容体またはリガンドに結合する能力を、当分野で周知の方法、例えばELISA、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ等により試験することができる。さらに、試験化合物が受容体かリガンドの何れかに結合することが受容体とリガンドの相互の結合を阻害するかどうかを試験するためには、その試験化合物の可溶性形態の受容体およびリガンドの結合を阻害する能力を調べることができる。このようなアッセイの例としては、競合ELISA、競合ウェスタンブロット、競合ラジオイムノアッセイ等が挙げられる。
【００５８】
本発明のスクリーニングアッセイにおいて用いられるペプチドおよびポリペプチドは、様々な手段によって得ることができる。小さいペプチド(50アミノ酸長未満)は、標準的な化学的方法で合成するのが便利である場合がある。ある種のポリペプチド(例えば抗体)は、市販されているものを購入することができる場合がある。そのように入手できない場合には、前記したように抗体を作製することができる。検出可能なように標識した抗体は、市販されているものを購入するか、あるいは当業者が容易に作製することができる。
【００５９】
HVEM、LTβR、p30、gDまたはLTαのようなポリペプチドは、当業者に周知の方法により生物学的供給源から精製することができる[Protein Purification, Principles and Practice, second edition (1987) Scopes, Springer Verlag, N.Y.]。これらのポリペプチドは、当分野で周知の手法を用いた組換えDNA技術により、それらの天然形態、切断形態、融合タンパク質すなわちキメラタンパク質形態で生成することもできる。このような方法としては、例えばin vitro組換えDNA技術、合成法、in vivo遺伝子組換え等が挙げられる。例えば、Sambrookら、(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.および 上記に引用したAusbelらに記載された技術を参照されたい。あるいは、このようなタンパク質をコードするRNAを化学的に合成することも可能である。例えば、Oligonucleotide Synthesis, (1984) Gait, M.J. ed., IRL Press, Oxfordに記載された技術を参照されたい。この文献は引用によりその全体を本明細書の一部とする。
【００６０】
このようなヌクレオチド配列を発現させるために様々な宿主発現ベクター系を利用することができる。ペプチドまたはポリペプチドが可溶性である場合、(a) そのペプチドまたはポリペプチドが分泌されない場合には、培養物、即ち宿主の細胞から、あるいは(b) そのペプチドまたはポリペプチドが細胞から分泌される場合には培地から、そのペプチドまたはポリペプチドを回収することができる。このような発現系には、in situでポリペプチドを発現する、即ち細胞膜に固着したポリペプチドを発現する人工的な宿主細胞も含まれる。そのような発現系からのポリペプチドの精製または濃縮は、適当な界面活性剤および脂質ミセルと当業者に周知の方法を用いて行うことができる。あるいは、タンパク質の構造的特性および機能的特性をを保持することだけではなく、生物学的活性を評価することも重要である場合には、そのような人工的な宿主細胞そのものを用いてもよい。
【００６１】
本発明の目的に用いることができる発現系としては、限定するものではないが、前記ヌクレオチド配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌（例えば、大腸菌(E. coli)や枯草菌(B. subtilis)）のような微生物、組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母、組換えウイルス発現ベクター(バキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)、タバコモザイクウイルス(TMV)）を感染させた植物細胞系または組換えプラスミド発現ベクターで形質転換された植物細胞系、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含む組換え発現構築物を含む哺乳動物細胞(例えばCOS、CHO、BHK、293、3T3)等が挙げられる。
【００６２】
細菌系においては、発現される遺伝子産物の用途に応じて多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、そのようなタンパク質を大量に製造(例えばそのタンパク質に対する抗体の産生のため)しようとするときは、容易に精製できる大量の融合タンパク質産物を高レベルで発現するベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターとしては、限定するものではないが、コード配列をベクターのフレーム内でLacZコード領域に個々に結合でき、融合タンパク質が産生されるような大腸菌発現ベクターpUR278[Rutherら、(1983) EMBO J. 2:1791]、pINベクター[Inouye & Inouye (1985) Nucleic Acids Res. 13:3101; Van Heeke & Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503]等が挙げられる。またpGEXベクターを用いて、外来ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させることもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性で、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させた後、遊離グルタチオンの存在下で溶出させることによって溶解細胞から容易に精製することができる。このpGEXベクターは、トロンビン、すなわち第Xa因子タンパク質分解酵素切断部位を有するように設計されており、クローン化された標的遺伝子産物をGST部分から切り離すことができる。スクリーニングアッセイで使用されるポリペプチドは、天然形態のポリペプチド、そのようなポリペプチドを含む融合タンパク質のいずれでもよいことは理解されよう。融合タンパク質における無関係な部分としては、例えば免疫グロブリンGのFc部分、ヘキサヒスチジン、GST等がある。
【００６３】
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルス発現系を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合は、対象のヌクレオチド配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターや三分割リーダー配列に結合することができる。次いで、このキメラ遺伝子を、in vitroまたはin vivo組換えによりアデノウイルスのゲノムに挿入する。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば領域E1またはE3)に挿入することにより、感染した宿主において生存可能で、遺伝子産物の発現が可能な組換えウイルスが得られる[例えば、Logan & Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655参照]。挿入されたヌクレオチド配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要なことがある。このシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接する配列が含まれる。遺伝子またはcDNAの全体が、それ自身の開始コドンおよび隣接する配列を含めて適当な発現ベクターに挿入される場合には、追加の翻訳制御シグナル配列は不要なこともある。しかし、コード配列部分のみが挿入される場合は、通常はATG開始コドンを含む外来翻訳制御シグナル配列を与えなければならない。さらに、インサート全体の翻訳を確保するために、開始コドンは所望のコード配列のリーディングフレームと位相が一致していなければならない。これらの外来翻訳制御シグナル配列および開始コドンは、天然および合成いずれかの様々な起源に由来するものであり得る。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を含めることによって増強することができる[Bittnerら、(1987) Methods in Enzymol. 153:516]。
【００６４】
さらに、宿主細胞株として、挿入された配列の発現をモジュレートするものや、あるいは遺伝子産物を所望の特定の形態で修飾およびプロセシングするものを選択することができる。このようなタンパク質産物の修飾(例えばグリコシル化)およびプロセシング(例えば切断)がそのタンパク質の機能に関して重要な場合がある。発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングが確実に行われるように、適当な細胞系または宿主系を選択することができる。哺乳動物の宿主細胞としては、限定するものではないが、CHO、VERO、BHK、Held、COS、MDCK、293、3T3、WI38等が挙げられる。
【００６５】
組換えタンパク質の長期間にわたる高収量の産生のために、安定した発現が好ましい。例えば、上述のような配列を安定して発現する細胞系を製造することができる。ウイルスの複製起点を有する発現ベクターを用いるのではなく、適当な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等)により制御されるDNAと、選択マーカーとを用いて宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAを導入した後、製造した細胞を栄養培地中で1〜2日間増殖させ、次に選択培地に切り換える。組換えプラスミド中の選択マーカーは、その選択に対する耐性を与えるとともに、細胞がそのプラスミドを安定に細胞の染色体に組み込み、増殖して増殖巣を形成できることを可能とする。この増殖巣をクローン化して細胞系に拡張することができる。この方法を用いてその遺伝子産物を発現する細胞系を製造することができ、有利である。このような人工的な細胞系は、その遺伝子産物の内在的活性に作用する化合物のスクリーニングや評価のために特に有用であり得る。
【００６６】
融合タンパク質は、発現されるその融合タンパク質に特異的に結合する抗体または部分を利用することによって容易に精製することができる。例えば、Janknechtら[(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972]により記載された系により、ヒト細胞系において発現された非変性融合タンパク質を容易に精製できる。この系では、対象の遺伝子をワクシニア組換えプラスミドにサブクローニングして、その遺伝子のオープンリーディングフレームが6個のヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳可能な形で融合するようにする。組換えワクシニアウイルスが感染した細胞からの抽出物を、Ni2+ニトリロ酢酸-アガロースカラムにロードし、イミダゾール含有バッファーでヒスチジン標識タンパク質を選択的に溶出させる。必要ならば、適当な酵素でヒスチジンタグを選択的に切断することができる。
【００６７】
キメラタンパク質も当業者に知られた方法で得ることができる。この方法では、所定のタンパク質をコードする遺伝子の部分を、異なる複数のタンパク質をコードする1種以上の遺伝子に由来する1以上の部分にスプライシングする。キメラポリペプチドは、異なる種類のタンパク質に由来する異なる部分を有する分子である。例えば、キメラタンパク質はHVEMのドメインとLTβRの他のドメインとを有し得る。
【００６８】
本発明は、受容体ポリペプチドHVEMを発現する細胞をHVEM結合物質に接触させることによってHVEM媒介型細胞応答をモジュレートする方法を提供する。あるいは、HVEMのリガンドをリガンド結合物質に接触させることによってHVEM媒介型細胞応答をモジュレートする。そのようなリガンドとしては、p30、LTα、gD等が挙げられる。一般にp30は細胞の表面で発現され、LTαは分泌され、gDはHSVビリオン上またはHSVが感染した細胞の表面上に発現される。本明細書中で使用する用語「細胞応答」は同様に、細胞の活性化または細胞によるHSVのインターナリゼーションをいう。本発明は、LTβRを発現する細胞またはLTβRリガンドp30を発現する細胞を、HVEMまたはp30の何れかに結合する結合物質と接触させることによってLTβR媒介型細胞応答をモジュレートする方法も提供する。
【００６９】
本明細書において使用する用語「接触」は、受容体またはリガンドを、受容体をモジュレートするのに有効な量の結合物質に露出することを意味し、これにより結合物質がリガンドと受容体との相互作用により開始される細胞応答を有効にモジュレートし得るものである。モジュレーションにより細胞応答が阻害されるか、活性化される。これらの特定の受容体-リガンドペアに対する特定の結合物質の相反するいずれかの特性は、上述したスクリーニングアッセイを用いて前もって調べておくことができる。
【００７０】
受容体結合物質に関し、HVEM結合物質としては、可溶性gD、可溶性p30、またはLTαのペプチドフラグメント、好ましくは天然のLTαのN末端から108番目の位置に対応する位置にアミノ酸Tyrを有するペプチドフラグメント等が挙げられる。LTβR結合物質としては可溶性p30がある。
【００７１】
リガンド結合物質に関し、p30結合物質としては、可溶性HVEM、可溶性LTβR、p30に特異的に結合する抗体等が挙げられる。LTα結合物質としては、可溶性HVEMがある。
【００７２】
接触はin vitroで行ってもよく、例えばHVEMリガンド(p30、LTαまたはgD)またはLTβRリガンド、p30によって活性化されたHVEMまたはLTβRを発現する細胞(例えばリンパ球)の培養物に結合物質を加えることにより行うことができる。また、結合物質を、例えばHSVビリオンの表面またはHSVが感染した細胞の表面上のgDに曝されたHVEM発現細胞の培養物に加えてもよい。結合物質のこれらの細胞応答をモジュレートする能力を、上述したスクリーニングアッセイを用いて前もって調べておくことができる。この結合物質は、単離したポリペプチドとして、あるいは結合物質をコードする核酸分子を含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞として添加し得る。これらのin vitro法において、結合物質の「受容体をモジュレートするために有効な量」とは、細胞の活性化またはHSV感染を、20%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは80%以上、最も好ましくは95%以上モジュレートするために必要な量である。
【００７３】
接触は被験体中においてin vivoで行ってもよい。被験体は、例えば慢性関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデスや重症筋無力症のような自己免疫疾患、リンパ球(T細胞またはB細胞)の悪性腫瘍、HSV感染症、HSV以外の生物の感染症、または免疫抑制状態を示す哺乳動物、好ましくはヒトとすることができる。自己免疫疾患やリンパ球の悪性腫瘍の患者において、HVEM-p30またはLTβR-p30媒介型細胞応答を阻害することは、(慢性関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、T細胞の悪性腫瘍の場合におけるように)T細胞増殖を防止する点、および(全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、B細胞の悪性腫瘍の場合におけるように)B細胞増殖を防止する点において有益である。HVEM-gD媒介型細胞応答(すなわちHSVインターナリゼーション)を阻害することは、細胞外空間に存在するgD発現HSVビリオンのインターナリゼーションにより媒介されるウイルスの拡散、あるいはその表面上でgDを発現する、HSVが感染した細胞からのウイルスの拡散をそれが防止するという点で、HSV感染症の被験体の治療となる可能性がある。HVEM-p30またはLTβR-p30媒介型細胞応答を刺激することは、T細胞とB細胞の両方の増殖が刺激されるという点で、HSV以外の感染症の被験体の治療、もしくは免疫抑制状態の被験体(例えば、リンパ球悪性腫瘍以外の癌に対する放射線療法および／または化学療法を受けている患者)の治療、またはAIDSの患者の治療に有用である。通常、HSV感染症の被験体に対してHVEM-p30媒介型細胞応答を刺激する結合物質を用いるのは避ける。そのような物質がHVEM-gD細胞応答をも促進してそれによりHSVウイルスの拡散を促進するからである。しかし、関連する結合物質のこの活性は上述したスクリーニングアッセイを用いて前もって調べておくことができる。同様に、これらの刺激性結合物質は、腫瘍細胞の成長を促進し得ることから、リンパ球の悪性腫瘍の場合は用いない。
【００７４】
in vivoでの細胞応答のモジュレーションのために用いられる結合物質としては、天然形態のHVEM、LTβR、p30、gD、LTα等が挙げられる。これらの結合物質は上述の方法によって製造できる。また、p30に対する抗体も含まれる。LTαに由来し、HVEM−LTα相互作用をモジュレートするペプチドも用いられる。これらのペプチドは、205個未満のアミノ酸を含み、好ましくは100個未満、より好ましくは50個未満、最も好ましくは20個未満のアミノ酸を含む。例えば、これらのペプチドは、5個、8個、12個、15個、または18個のアミノ酸を有する。これらのペプチドは、好ましくは、天然のLTαのN末端から108番目のアミノ酸残基に対応する位置にTyr残基、またはその保存的置換を有する。
【００７５】
また、結合物質として、上述のペプチドのペプチド模倣体も挙げられる。ペプチド模倣体化合物は、選択されたペプチドの三次元構造をベースとした三次元構造(即ち「ペプチドモチーフ」)を有する合成化合物である。このペプチドモチーフは、そのペプチド模倣体が由来するペプチドの活性と同程度かそれ以上の細胞応答モジュレーション活性を有するペプチド模倣体化合物を提供するものである。ペプチド模倣体化合物は、例えばより高いアフィニティおよび／またはアビディティや、より長い生物学的半減期のようなその治療上の用途を増強する追加の特性を有し得る。本発明のペプチド模倣体は、通常バックボーンを有し、このバックボーンは部分的にまたは完全に非ペプチドであるが、そのペプチド模倣体がベースとするペプチドに存在するアミノ酸残基の側鎖と同一の側鎖を有する。プロテアーゼ耐性のペプチド模倣体の構築においてペプチド結合の代替として、いくつかのタイプの化学結合、例えば、エステル結合、チオエステル結合、チオアミド結合、レトロアミド結合、還元カルボニル結合、ジメチレン結合、ケトメチレン結合等が一般に有用であることは当分野で知られている。
【００７６】
対象のポリペプチドまたはペプチドのin vivoでの残存性を高めるために、ポリペプチドおよびペプチド結合物質を、そのアミノ末端およびカルボキシ末端の両方あるいは何れか一方にブロッキング物質を付加して修飾することができる。この修飾は、ペプチドの末端がプロテアーゼにより分解される(「削られる」)傾向がある場合に有用であり得る。このようなブロッキング物質としては、限定するものではないが、投与されるポリペプチドまたはペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端残基に結合し得る追加の関連ペプチド配列または関連の無いペプチド配列等が挙げられる。この修飾は、ペプチドまたはポリペプチドの合成の際に化学的に行うこともでき、また組換えDNA技術によって行うこともできる。あるいは、当業者に知られるピログルタミン酸またはその他の分子のようなブロッキング物質を、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の残基、あるいは異なる部分により置換したアミノ末端のアミノ基またはカルボキシ末端のカルボキシル基に付加することができる。同様に、この結合物質を投与の前に医薬上許容される「担体」タンパク質に共有結合または非共有結合によって結合することができる。
【００７７】
in vivo送達では、結合物質自体、結合物質をコードする核酸、結合物質をコードする発現ベクター、またはそのようなベクターによりトランスフェクトもしくは形質導入した細胞の何れかを被験体に投与する。
【００７８】
結合物質は、下記のようなヒト患者への送達と実質的に同一の技術を用いて哺乳動物の細胞に送達することができる。適当な哺乳動物の例としては、限定するものではないが、ヒト、ヒト以外の霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ等が挙げられる。
【００７９】
結合物質は、未修飾の状態で、例えば生理食塩水のような適当な生理学的溶液に溶解して患者の細胞に送達し得る。当然、これらのペプチドが対象の組織および細胞の型を選択的に標的とすることが望ましい。これはそのようなペプチドを、例えば局所注射や移植によって患部の器官または組織に直接接触させることによって達成することができる。従って、慢性関節リウマチやインスリン依存性糖尿病のような自己免疫疾患では、そのようなペプチドをそれぞれの患部の関節や膵臓に、あるいは好ましくは活性自己免疫応答が生じている排出性リンパ系組織に直接導入することができる。
【００８０】
あるいは、結合物質を、対象の細胞(例えばT細胞またはB細胞)上の受容体に対するリガンド、またはこれらの細胞が発現した細胞表面のマーカーに対する抗体を封入したリポソームに入れて送達してもよい。これによりCD4 T細胞表面マーカーに特異的な抗体は、抗CD4抗体および対象の結合物質の両方を含むリポソームをCD4+ T細胞に誘導し得る。この手法は、自己免疫疾患およびHSV感染症のいずれにも用いることができる。優勢な病原性T細胞クローンにより発現されるT細胞受容体(TCR)が特定されている自己免疫疾患では、対象のTCR成分(例えばVβ)に特異的な抗体を用いることができる。後者の方法は、病原性のエフェクター細胞が特異的に阻害の標的となるが、免疫系全体および標的の器官の細胞が損なわれない理想的な免疫療法となる。
【００８１】
リンパ腫や白血病の患者では、抗増殖性の結合物質を癌細胞に誘導するのが好ましい。このようなペプチドは、例えば、腫瘍を切除する外科手術の後に残存した腫瘍細胞の増殖を阻害するために、リンパ腫の腫瘍部位周囲の組織に直接注射することができる。外科手術の代わりに、結合物質を腫瘍にin situで注射することによって腫瘍を治療することができる。上述したリポソームを用いる方法も利用することができる。この場合、腫瘍特異性抗原(TSA)または腫瘍関連抗原(TAA)に特異的な抗体を利用する。
【００８２】
特定の患者に対する投与量は、投与される具体的な化合物、投与の時期および経路、および同時に投与される他の薬物に加えて、多くの要因によって決定されることは医学の分野では周知である。本発明の結合物質の投与量は様々であるが、静脈内投与の場合は血液量に対して約0.01〜10 mg/mlとし得る。投与経路および投与量は、薬理学者および外科医には周知である。投与経路としては、上述したものに加えて、限定するものではないが、腹腔内投与、筋内投与、肺内投与、経粘膜投与、皮下投与、静脈内投与等が挙げられる。
【００８３】
in vivo遺伝子療法では、遺伝子構築物の患者への直接の送達、好ましくは目的の細胞や組織をその遺伝子構築物の標的にすることが必要である。例えば、原発腫瘍の外科手術による除去の後、抗増殖性結合物質をコードするレトロウイルスベクターを含む組成物で腫瘍の周辺を処置することにより、残存細胞を標的とすることができる。あるいは、外科手術の代わりにベクターを直接腫瘍にin situで注射することにより、原発腫瘍を治療することができる。原発腫瘍部位から遠位にある悪性細胞には、ベクターの静脈内送達によって到達させることができる。同様に、ベクターを直接注射することにより、自己免疫の攻撃を受けている組織を標的にすることができる。例えば、増殖当初の細胞を安定にトランスフェクトするレトロウイルスを用いることによって腫瘍細胞または活性化リンパ球を標的にすることができる。
【００８４】
静電的な力または共有結合の力によってポリL-リシンに付着させたプラスミドまたはその他のベクターからなる分子コンジュゲートを用いることにより、組織特異的な標的化を行うこともできる。ポリL-リシンは、腫瘍細胞上の受容体に結合し得るリガンドに結合する[Cristianoら、(1995) J. Mol. Med 73:479]。同様に、上述した種類の腫瘍および細胞に特異的な抗体をベクターに結合させることにより、そのベクターをリンパ系腫瘍やTリンパ球のような細胞に標的化することができる。後者は自己免疫疾患やHSV感染症の場合に有用である。比較的腫瘍特異的な発現を誘導するプロモーターを用いて、さらに高いレベルの標的化を達成することができる。自己免疫疾患の患者または移植患者において使用するための組織特異的プロモーターとしては、例えば、誘導性のIL-2[Thompsonら、(1992) Mol. Cell. Biol. 12: 1043]、IL-4[Toddら、(1993) J. Exp. Med. 177: 1663]、およびγ-インターフェロン[Penixら、(1993) J. Exp. Med. 178: 483]T細胞標的プロモーター等が挙げられる。そのような誘導性プロモーターは、発現が活性化T細胞で選択的に起こる点で極めて有益である。この活性化T細胞の集団にはエフェクター細胞が含まれ、これは自己免疫疾患の患者において選択的に阻害するものであり、理想的な免疫療法の形態である。
【００８５】
ベクターは、上述のように単独で、もしくは細胞特異的抗体とともにリポソームまたは他の送達用ビヒクルに組み入れて送達することもできる。
【００８６】
使用する結合物質が通常は細胞膜に結合する場合は(HVEM、LTβR、p30またはgD)、結合物質の膜貫通ドメインをコードする核酸の領域は、発現ベクターに含める核酸から除去する。
【００８７】
DNAまたはトランスフェクトされた細胞は、医薬上許容される担体に含めて投与することができる。医薬上許容される担体は、例えば生理食塩水のような、ヒトに投与するのに適した生物学的に適合するビヒクルである。治療上有効な量は、処置を受けた動物において所望の医学的な結果が得られるような本発明のDNAの量である。医学の分野で周知のように、特定の患者に対する投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時期および投与経路、全般的な健康状態、同時に投与される他の薬剤等の多くの要因に依存する。投与量は様々であるが、DNAの静脈内投与のための好ましい投与量は、約106〜1012コピーのDNA分子である。この用量を、必要に応じて繰り返し投与することができる。
【００８８】
以下の実施例は、本発明を例示することを意図したものであり、本発明を限定することを意図したものではない。
【００８９】
〔実施例〕
材料
ヒトIgG1のFc領域およびFas:Fcのリガンド結合ドメイン[Brunnerら、(1995) Nature 373:441]、TNFR60[Croweら、(1994) J. Immunol. Methods 168:79]およびヒトLTβR:Fc[Croweら、(1994) Science 264:707]で形成した二価のキメラタンパク質の構築、発現および精製についてはこれまでに記載されている。HVEMの細胞外領域は、1-K184をコードするpBEC 10 DNAからのTaq DNAポリメラーゼ増幅配列を使用するPCR法により、順方向プライマー5'-CGGAGATCTGA GTTCATCCTGCTAGCTGG-3'(配列番号1)および逆方向プライマー5'-ATAGGA TCCCTTGGTCTGGTGCTGACATTCC-3'(配列番号2)を使用して生成した。増幅したHVEM産物を、ヒトFc IgG1を含むバキュロウイルスベクターpVL1392 (Pharmingen)にインフレームで結合した。ウサギIgG1のFc領域を有するHVEM:Fcの同様な構築物をCHO細胞内で作製し、精製し、免疫原として使用してウサギ抗HVEM抗体を生成した。LTβR:Fcは、Taq DNAポリメラーゼを使用するPCR法により、順方向プライマー5'-GACGTCAGATCTTCCCAC CTTTCCTCCTA-3'(配列番号3)および逆方向プライマー5'-GAACAGAGATCTC ATTGCTCCTGGCTCTG-3'(配列番号4)を使用して、前記細胞外ドメインのアミノ酸残基1〜Met221をコードするマウスLTβR(mLTβR)DNA断片[Forceら、(1996) J. Immunol. 1995. 1 155:5280]から構築した。LTαおよびLTαTyr108Pheは、記載されたように組換えバキュロウイルスを用いて昆虫の細胞で作製した[Croweら、(1994) J. Immunol. Methods 168:79]。可溶性の組換えLTα1β2 [Browningら、(1996)、前記に引用]、TNF [BrowningおよびRibolini (1989) J. Immunol. 143:1859]、およびLTα(BF7)に対するモノクローナル抗体、およびLTβ(C37、B9およびB27) [Browningら、(1995)、前記に引用]は、Jeffrey Browning (Biogen, Inc)の好意により譲り受けたものである。免疫沈降性の抗LTα抗体(クローン9B9)は、Boehringer Mannheimから入手した。抗CD3 (OKT3)は、BALB/cマウスの腹水で生成し、1 μg/mlのタンパク質の量で使用した。精製した組換えHSV gD-1タンパク質および変異体は、これまでに詳細に説明されているように[Nicolaら、(1996) J. Virol. 6:3815]、バキュロウイルスで生成した。FITC-抗-CD4およびCD8抗体は、Becton-Dickensonから入手した。
【００９０】
実施例１  T細胞上でのHVEMリガンドの発現
方法
HVEMのII.23.D7細胞への結合
II-23.D7細胞系は、ヒトCD4+ T細胞ハイブリドーマであり[Wareら、(1986) Lymphokine Res. 5:313]、10%ウシ胎児血清(FBS)および抗生物質を含むRPMI1640培地に維持する。II-23.D7細胞は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)(100 ng/ml)、またはPMA(100 ng/ml)およびイオノマイシン(1μg/ml)を用いて37℃で4時間活性化した。この細胞を洗浄し、5 μg/mlのHVEM:Fc、LTβR:FcまたはヒトIgGを含むハンクス液(HBSS)(10%ウシ胎児血清および0.1% NaN3を加えたもの)中で4℃で30分間インキュベートし、次にフィコエリトリンとコンジュゲートしたヤギ抗ヒトIgG(抗huIgG-PE)で染色した。染色された細胞をフローサイトメトリー(FACSCaliber, Becton-Dickenson)で解析した。各ヒストグラムは104個を示す。
【００９１】
HVEMの正常なヒトT細胞への結合
Ficoll Hypaqueにより正常なドナーから得た末梢血の単核細胞をIL-2を含む培地において抗CD3抗体で5日間活性化した。細胞を、PMAまたはPMAおよびイオノマイシンで4時間再刺激し、次にこの細胞をFITC-CD4またはFITC-CD8および上述の抗huIgG-PEで検出されるHVEM:Fcで二重に染色した。補正したFITC蛍光を用いて、CD4およびCD8 T細胞サブ集団を選択した。
【００９２】
受容体への結合
段階的な濃度のHVEM:Fcまたは対照のIgGを上記の活性化されたII-23.D7細胞とインキュベートして受容体への結合を測定した。受容体への結合は、蛍光の強度＝(平均蛍光チャネル)(陽性の蛍光事象数(％))を計算することによって求めた。陽性の事象とは、正常なIgGの値の98%を越える蛍光値を有するものである。比蛍光強度は、対照IgGの値を差し引いた蛍光強度値を示す。
【００９３】
結果
HVEMに対する推定上のリガンドを試験するために、HVEMの細胞外ドメインおよびヒトIgGのFc領域を含む融合タンパク質(HVEM:Fc)を構築した。PMA単独ではなく、カルシウムイオノフォア、イオノマイシン、およびPMAによって活性化した後のヒトCD4+ T細胞ハイブリドーマ、II.23.D7 [Wareら、(1986)、前記に引用]に結合したHVEM:Fcの比結合をフローサイトメトリーで検出した(図1A)。ヒト末梢血由来のTリンパ球についてのHVEM:Fcの比結合も検出した(図1B)。これらの所見は、悪性のヒトT細胞と正常なヒトT細胞の両方がHVEMに対する細胞表面リガンドを発現したことを示す。HVEM:FcのII.23.D7への半値最大結合は、約20 nMで達成された(図1C)。またこのII.23.D7細胞系は、PMAでの誘導によってもLTαおよびβおよびTNFを発現する[Wareら、(1992) J. Immunol. 149:3881]。
【００９４】
実施例２  HVEMリガンドの結合特性
方法
LTβR:Fcによる結合の競合
活性化II-23.D7細胞(実施例1に記載のようにPMAおよびイオノマイシンで活性化)を、LTβR:FcまたはTNFR60:Fc (100 μg/ml)とともに4℃で30分間プレインキュベートした。次にHVEM:Fc-ウサギ (2 μg/ml)を加え、30分間インキュベートし、ヤギ抗ウサギIgG-PEで細胞を染色してHVEM:Fc-ウサギを検出した。ウサギIgGを用いてバックグラウンド染色を測定した。活性化II-23.D7細胞へのHVEM:Fcの結合は、上述のように段階的濃度のLTβR:Fc、TNFR60、Fas:Fc、またはIgGと競合した。
【００９５】
LTαホモ三量体による結合の競合
II-23.D7細胞を活性化し、HVEM:Fcを組換えLTαまたはLTα1β2と4℃で30分間プレインキュベートした。この混合物を活性化II-23.D7細胞に加え、次に抗huIgG-PEで染色した。HVEM:Fc＋LTαによる蛍光染色は、正常なIgGによるバックグラウンドと等しいものであった。
【００９６】
結果
HVEMがTNFまたはLTαβ複合体に結合し得るか否かを判定するために、ウサギIgG Fcを有するHVEM:Fc構築物を使用する、PMAおよびイオノマイシンによって活性化したII-23.D7細胞へのHVEM:Fcの結合に対する競合インヒビターとして、LTβR:FcおよびTNFR:Fcを使用した[Montgomeryら、上記に引用]。LTβR:FcおよびHVEM:Fc(ヒトIgGIのFc)がHVEM:Fc(ウサギ)の結合について競合したが、TNFR60:Fcは競合しなかった(図2A)。さらに、関連する受容体融合タンパク質であるFas:FcおよびTNFR80:FcはいずれもHVEM:Fcの結合に対して競合しなかった。しかし驚くべきことに、LTαホモ三量体がHVEM:Fc結合に対して競合し、TNFまたはLTα1β2はしなかった(図2B)。108番目のチロシン(Tyr)がフェニルアラニン(Phe)で置換された(Tyr108Phe)、LTαのTNFR60結合変異体[Gohら、(1991) Protein Eng. 4:785]は競合しなかった(図3)。これらの結果は、推定HVEMリガンドが、LTαβヘテロ三量体およびLTαと共通する特性を有しているが、LTα1β2およびTNFからは区別される特徴も有することを示している。従ってLTα2β1は、HVEM:Fcにより認識される推定表面リガンドであり得る。但し、LTα2β1上のHVEM結合部位はTNFR60と同一ではないことに注意する必要がある。あるいは、HVEM:Fcは新しいリガンドを認識した可能性がある。これらの可能性を区別するために生化学的方法を用いた。
【００９７】
実施例３  HVEMリガンドの生化学的特性化
方法
SDS-PAGEによる分析
II-23.D7細胞を、(実施例1に記載のように)PMA、またはPMAおよびイオノマイシンで2.5時間活性化し、リン酸緩衝食塩水(PBS)で2回洗浄し、システイン-メチオニンを含まないRPMIで1回洗浄し、次に10%の透析したFBS、それぞれ250μCiの35S-メチオニンおよび35S-システイン、および活性化剤を含む前記培地に1.5時間再懸濁した。培養上清を回収し、細胞を2% NP40、HEPES pH7.0、20 mM EDTA、ロイペプチンおよびアプロチニン(10 μg/ml)を含む150 mM NaCl、PMSF(1 mM)、およびヨードアセトアミド(20mM)を含むバッファー中で溶解した。この抽出物を、ヒトIgG(10 μg)、指示のある場合には抗LT抗体、およびプロテインGビーズを用いて予備清澄化した。次に受容体:Fc融合タンパク質(10 μg/ml)をサンプルに加え、プロテインGビーズで沈殿させた。標識したタンパク質を還元SDS-PAGEおよびホスホイメージ(画素数範囲6〜200)により分析した。
【００９８】
上記段落に記載のように調製した細胞抽出物を、最初に10 μgのマウスIgGまたはLTαまたはLTβに対するモノクローナル抗体で予備清澄化し、次にHVEM:Fcを加えてリガンドを沈殿させた。次にHVEM:Fcに結合したこのタンパク質を、還元SDS-PAGEで分離し、ホスホイメージで検出した。
【００９９】
HVEMリガンドであるp30の精製
II-23.D7細胞を、PMA(100 ng/ml)またはPMAおよびイオノマイシン(1μg/ml)で2.5時間活性化し、次に上記の2つの段落に記載のように35S-メチオニンおよび35S-システインで標識した。細胞抽出物をヒトIgG(5 μg)およびプロテインGビーズで予備清澄化し、非特異的に結合するタンパク質を取り除いた。次にこの抽出物をTNFR60:FcおよびプロテインGビーズで処理することによりLTαを除去した。そしてこの抽出物にHVEM:FcおよびプロテインGビーズを加えてインキュベートした。それぞれの場合につき、このビーズを3回洗浄して非結合分画の汚染タンパク質を取り除いた。このビーズは8 Mの尿素を含むバッファー中で溶出させ、等電点電気泳動(pIが5〜7(50%)、3〜10(40%)、2〜11(10%)の両性混合物で形成した勾配)で第１の次元の分析を行い、還元SDS-PAGE(15%ゲル)で第２の次元の分析を行った。
【０１００】
HVEM:Fcによるp30の精製を、LTβR:FcまたはTNFR60:Fcで精製したサンプルとの比較によりモニターした。LTβR:Fc精製タンパク質、LTα1β2をPMAで刺激したII-23.D7細胞から単離した。これを図4Aに示す。抽出物からLTαを取り除くのに使用したTNFR60:Fcに結合したタンパク質を図4Bに示し、上述のようにHVEM:Fcにより精製したp30を図4Cに示す。
【０１０１】
各ゲルの第1レーンに14C標識した分子量マーカーを示し、第2レーンは第２の次元方向のみに移動する受容体:Fc結合タンパク質を示す。
【０１０２】
結果
LTαは、PMAで活性化された後のII23.D7細胞によって分泌される[Wareら、(1992)、上記に引用; Croweら、(1994) Science 264:707]。HVEM:FcおよびTNFR:Fcは、SDS-PAGEで示されるように、PMAおよびイオノマイシンで刺激されたII-23.D7細胞から分泌されたLTαを沈殿させた。LTαは、グリコシル化の不均一性のために一定の範囲の分子量にわたって移動する[Browningら、(1991)、上記に引用]。TNFR60:FcもTNF(17 kDa)を沈殿させたが、HVEM:Fcは沈殿させず、これにより上述の競合実験の結果が確認された。LTβR:Fcは予想通り分泌されるタンパク質の何れにも結合しなかったが、PMAで活性化したII-23.D7細胞の界面活性剤による抽出物からLTβ(33 kDa)およびLTα(23〜25 kDa)複合体を沈殿させた。しかし、イオノマイシンとPMAで刺激した場合は、LTβR:Fcは、30 kDaの主要なバンドと少量の33 kDaのLTβおよび23〜25 kDaのLTαを沈殿させた。TNFR60:Fcは、LTα前駆物質とサイズが同一の23 kDaのタンパク質を沈殿させた。対照的に、HVEM:Fcは、30 kDaと23 kDaの両タンパク質を沈殿させた。3種の異なる受容体をブロックするLTβに対するモノクローナル抗体では、HVEM:Fcを加える前の抽出物から30 kDaのタンパク質を取り除くことができず、p30タンパク質がLTβと抗原性について関連がないことを示している。しかし、抗LTα抗体は抽出物から23 kDaのバンドを除去し、これはそのLTαとの関連性を示している。LTα抗体が、30 kDaおよび23 kDaの両バンドを予備清澄化できないことは、これらのタンパク質がヘテロ三量体を形成するLTαおよびLTβの場合とは異なり[Androlewiczら、上記に引用]、互いに関連性を有していないことを示すものである。
【０１０３】
p30は、II-23.D7細胞からアフィニティクロマトグラフィによって精製した。連続したTNFR60:Fc工程およびHVEM:Fc工程を用いて、TNFR60により抽出物からLTαを取り除き、LTαがp30のHVEM:Fcへの結合を干渉しないようにした。HVEM:Fc、TNFR60:FcまたはマウスLTβR:Fcに結合するタンパク質の2次元(2D)電気泳動により、p30が、LTαおよびLTβと比較して異なる電荷-質量比を有することがわかった。LTβR:Fcで沈殿させたLTα1β2複合体におけるLTβは酸性で、酸性型のものの質量が検出可能な程度まで増加した、pIが5〜6.5にわたる異なる4種の電荷異性体が認められる(図4A)。LTαは、LTβとの複合体として、あるいはTNFR60に結合したLTαホモ三量体として(図4B)、pIが7〜8.5の範囲の7種の異なる異性体を有し、23 kDaのLTα前駆物質は最も塩基性のpI(≧9)を有する。シグナル配列を有していないLTαのpIは8.9である。これらの結果は、グリコシル化付加物の特徴であり、従前のLTαおよびLTβについての研究結果と完全に一致する[Browningら、(1991)、前記に引用]。対照的にp30は広い範囲のバンド(pI7〜8.5)として移動し、このバンドはより低い強度で3本のバンドに分離する(図4C)。p30が認識可能な質量の変化なしに電荷の不均一性を有することは、例えばリン酸エステルまたはリン脂質の付加のような翻訳後修飾の結果である可能性がある。これらの結果は、LTβとは抗原性の点および物理的に異なる、pI7〜8.5の異性体を有する30 kDaの新規な細胞表面タンパク質(p30またはHVEMリガンドと称する)にHVEMが結合することを明らかに示すものである。HVEMリガンドはLTβR:Fcによっても認識されるが、TNFRによっては認識されない。
【０１０４】
実施例４  HSV gDエンベロープ糖タンパク質は、HVEM:Fcへ結合する内在性HVEMリガンド(p30)と競合する
方法
HVEM:Fc (2 μg/ml)を、gD-1 (250 μg/ml)またはgD-1 (Δ290-299)(100 μg/ml)とともに4℃で30分間プレインキュベートし、次に(実施例1に記載のように)PMAとイオノマイシンで活性化したII-23.D7細胞に加えた。huIgGを用いてバックグラウンド染色を測定したところ、HVEM:Fc＋gD-1(Δ290-299)に等しかった。HVEM:Fcの活性化II-23.D7細胞への結合を、実施例1の場合のように段階的濃度のgD-1またはgD-1(Δ290-299)と競合させた。
【０１０５】
結果
HSV gD-1タンパク質がHVEMに結合することにより、HSV gDがHVEM細胞リガンドのアンタゴニストとして機能する可能性が示唆された。可溶性gD-1、およびHVEMへの結合力が強化されたgDの変異体であるgD-1(Δ290-299t)は、両者共に活性化II-23.D7細胞表面へのHVEMの結合の阻止に関して有効であった(図5A)。gD-1タンパク質の有効な阻害濃度は、そのHVEMへの親和性と相関性を有していた(図5B)。PMAまたはPMA／イオノマイシンで活性化したII-23.D7細胞へのLTβR:FcまたはTNFR60:Fcの結合は、gD-1(Δ290-299t)によっては阻害されなかった。これはHVEM:gD-1相互作用が高度に特異的であることを示している。この結果は、たとえTNFR60およびLTβRにより認識されるリガンドにHVEMが結合するとしても、gD-1がHVEMへの結合について特異的に同時進化してきたことを示唆している。これらの結果は、gD-1がリンホトキシンの膜固着型バイロカインであり、HSVの侵入または感染細胞からの放出の際にHVEMシグナリング活性をモジュレートし得ることを示している。
【０１０６】
実施例５  HVEMの結合はリンパ球の活性化を起こす
方法
T細胞の活性化
新たに単離した末梢血リンパ球を、段階希釈したウサギ抗HVEMまたは予備免疫血清[Montgomeryら、上記に引用]、および有糸分裂促進量未満(1 μg/ml)のPMAを含む培地でインキュベートした。β-シンチレーションのカウントによって評価して3H-チミジンのDNAへの取り込みにより3日後に増殖を測定した。
【０１０７】
新たに単離した末梢血リンパ球を5 μg/mlのフィトヘマグルチニン(PHA)で活性化し、IL-2を含む培地で培養した。17日後、段階希釈した抗HVEM抗血清と有糸裂促進濃度未満(1.5 μg/ml)の抗CD3(OKT3)抗体で再刺激した。上記のように3日後に増殖を測定した。
【０１０８】
B細胞のフローサイトメトリーによる分析
ヒトのリンパ芽球系RAJI細胞を、抗HVEM抗血清(1:100希釈)または対照のウサギIgGとともに4℃でインキュベートし、フィコエリトリンとコンジュゲートしたヤギ抗ウサギIgGで染色することにより、フローサイトメトリーで分析した。各ヒストグラムにつき104個の細胞を分析した。
【０１０９】
B細胞の活性化
RAJIを2%のFBSを含む培地に移して24時間おき、そして示した濃度のウサギ抗HVEM抗体の希釈物の存在下、または培地単体中で3日間インキュベートした。細胞の増殖を上記のように評価した。
【０１１０】
結果
HVEMは休止したCD4+ T細胞上に発現されるが、これはHVEMが免疫応答の初期相において細胞増殖のための同時刺激分子として機能し得るということを示唆している。最適未満のPMA濃度で、抗HVEM抗体は、末梢血リンパ球の増殖の亢進を促進した。これは3日間の培養後に測定した3H-チミジンの取込みの増加によって示された(図6A)。PHAによる活性化後10〜17日経過した連続培養物で生成された記憶リンパ球も、抗CD3抗体の最適未満の濃度において抗HVEM抗体により再活性化された(図6B)。この結果は、免疫応答におけるエフェクター相においてHVEMが機能することを示すものである。抗体はTNF関連リガンドの作用に似た作用をする [Engelmannら、(1990) J. Biol. Chem. 265:14497]ことから、これらの結果は、細胞関連の30 kDaのHVEMリガンドが、T細胞に対する増殖誘導シグナルとして機能し得ることを示すものである。
【０１１１】
LTαは、エプスタイン-バーウイルスで形質転換された細胞系を含むBリンパ球に対する増殖亢進活性を刺激することが以前に示されている[Abkenら、(1992) J. Immunol. 149:2785; Estrovら、(1993) J. Exp. Med. 177:76; Kehrlら、(1987) Science 238:1144; Gibbonら、(1994) Eur. J. Immunol. 24:1879]。HVEMは、リンパ芽球系細胞系においても発現される(図7A)。抗HVEM抗体は、2%の血清を含む培地中のRAJI B細胞系の培養物に加えると、用量依存的に3H-チミジンの取込みを促進した。これはHVEMが低濃度の血清の下でB細胞の生存度を維持するシグナルを与え得ることを示している(図7B)。このアッセイで、LTαは2〜3倍の刺激効果を示した。負の増殖因子としてのTNFR60およびTNFR80が存在すると、LTαに対する応答が低下し得る。抗HVEM抗体の正の効果は、p30 HVEMリガンドに特有の性質であり得る。
【０１１２】
現時点での好ましい態様により本発明を説明したが、本発明の概念を逸脱することなく本発明を種々改変することができることは理解されよう。従って、本発明は特許請求の範囲のみにより限定されるものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図1Aは、PMA（上部ヒストグラム）またはPMAおよびイオノマイシン（下部ヒストグラム）で活性化した後のHVEM:Fc融合タンパク質のII-23.D7細胞への結合を示 す一組のフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図１Ｂ】  図1Bは、HVEM:Fc融合タンパク質の正常ヒトCD4+（上部ヒストグラム）およびCD8+（下部ヒストグラム）T細胞への結合を示す一組のフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図１Ｃ】  図1Cは、HVEM:Fc融合タンパク質の活性化II-23.D7細胞への飽和結合を示す線グ ラフである。
【図２Ａ】  図2Aは、一組の図である。上図はLTβR:Fc融合タンパク質がHVEM:Fc融合タンパク質の活性化II-23.D7細胞への結合に競合することを示すフローサイトメトリーヒストグラムである。下図はLTβR:Fc融合タンパク質によるHVEM:Fc融合タンパ ク質の結合の用量依存的抑制を示す線グラフである。
【図２Ｂ】  図2Bは、一組の図である。上図はLTαホモ三量体がHVEM:Fc融合タンパク質のII-23.D7細胞への結合に競合することを示すフローサイトメトリーヒストグラムである。下図はLTαホモ三量体によるHVEM:Fc融合タンパク質の結合の用量依存的抑制を示す線グラフである。
【図３】  図3は、一組の図である。上図は天然に存在するLTαのTyr108Phe変異体がHVEM:FcのII-23.D7細胞への結合に競合しないことを示すフローサイトメトリーヒストグラムであり、下図はLTαおよびLTα(Tyr108Phe)の競合結合分 析を示す線グラフである。
【図４Ａ】  図4Aは、活性化II-23.D7細胞抽出物をmLTβR:Fc融合タンパク質で処理することによって得た沈殿物の二次元等電点電気泳動／SDS-PAGEゲルから得られたオートラジオグラムである。
【図４Ｂ】  図4Bは、活性化II-23.D7細胞抽出物をTNFR60:Fc融合タンパク質で処理すること によって得た沈殿物の二次元等電点電気泳動／SDS-PAGEゲルから得られたオートラジオグラムである。
【図４Ｃ】  図4Cは、活性化II-23.D7細胞抽出物をHVEM:Fc融合タンパク質で処理することに よって得た沈殿物の二次元等電点電気泳動／SDS-PAGEゲルから得られたオートラジオグラムである。
【図５】  図5は、一組の図である。上図はHSV gD-1糖タンパク質がHVEM:Fc融合タンパク質の結合に競合することを示すフローサイトメトリーヒストグラムである。下図はHSV gD-1糖タンパク質によるHVEM:Fc融合タンパク質の結合の用量依存的抑制を示 す線グラフである。
【図６】  図6は、抗HVEM抗体が新たに単離した末梢血T細胞（上の線グラフ）および記憶T 細胞（下の線グラフ）内で用量依存的増殖を刺激することを示す一組の線グラフである。
【図７】  図7は、一組の図である。上図はRAJIリンパ芽球細胞上でのHVEMの発現を示すフロ ーサイトメトリーヒストグラムである。下図は抗HVEM抗体に応答したRAJI細胞の用量依存的増殖を示す線グラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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