(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロポリスをアルコールまたは含水アルコールで抽出して得られる抽出液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣにより精製する工程を含む３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸の製造方法であって、前記抽出液に予め水を加えることにより不純物を沈殿物として除き、更に水洗浄することを含む前処理を行い、且つ、前記逆相ＨＰＬＣの固定相がＯＤＳであり、その移動相にギ酸−メタノールを用いることを特徴とする３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロポリスから３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸 ( ３，５−diprenyl−４−hydroxycinnamic acid )を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロポリスは、一般にハチヤニとも呼ばれ、ミツバチが花や樹脂のヤニ状成分をかみ続けることにより、各構成成分とミツバチの唾液中の酵素とが混ぜ合わされて生じる物質である。このプロポリスには、フラボノイド類、桂皮酸類、テルペノイド、ミネラル、ビタミンなどの微量栄養素を含有している為、健康の増進に寄与したり、治療的効果（殺菌、抗炎症など）を有するものと期待されている。
【０００３】
プロポリスの成分は非常に多様であり、また、産地によって由来植物が異なるために成分も産地によりかなり異なってくる。同じブラジル産プロポリスでもその成分は多少異なるが、地域によりある程度の似通った成分のプロポリスが採取される傾向が有るとされている。
【０００４】
近年、プロポリス、特に、ブラジル産プロポリスでの有効成分の一つとして、３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸（図１参照）の有用性が注目され、抗がん剤や殺菌剤等としての研究に関する報告が、例えば、Kimoto TらのAnticancer Research 21:221-228(2001)、Kimoto TらのPathol Int. 2000 Sep;50(9):679-89. 、Kimoto TらのCancer Detect Prev. 1998;22(6):506-15. 、Matsuno TらのAnticancer Res. 1997 Sep-Oct;17(5A):3565-8. 、Kimoto TらのGan To Kagaku Ryoho. 1996 Nov;23(13):1855-9. とAga Hらの(1994) Biotech.Biochem. 58, 945-946.等に見られる。
【０００５】
このような３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸を含有するプロポリス原料の品質を評価し管理するには原料に応じて異なる３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ含有量を分析、定量することが必要であり、そのためには、３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸の標準品が必要である。しかしながら、３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸の標準品は、試薬として市販されていない。その理由の一つは、分析用標準品として好適な高純度の３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸を簡単に得ることができるような製法が確立されていないことによるものと考えられる。例えば、特開昭６０−１６３８４１には、３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸を含むプロペニック酸の合成法が開示されているが、多くの複雑な工程を要し、標準品に用いるような多量の３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸を製造するには適していない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸含有量の分析を行う為に、標準品としての３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸を製造することのできる新しい方法を開発することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、プロポリスそのものから３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸を高純度且つ比較的簡単に抽出、精製し得る方法を確立し、上記の目的を達成したものである。
【０００８】
かくして、本発明に従えば、プロポリスをアルコールまたは含水アルコールで抽出して得られる抽出液をシリカクロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣにより精製する工程を含む３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸の製造方法が提供される。
さらに、本発明は、別の視点として、上記のようにプロポリスから製造され３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸を分析、特にプロポリス中の３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸を分析するための標準品として用いられる３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、多様な構成成分から成るプロポリスから、３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸を効率的に抽出、製製することのできる最適な工程を見出したことに基づくものであり、その基本的な実施工程として、プロポリスをアルコールまたは含水アルコールで抽出する工程、抽出液をシリカゲルを用いるカラムクロマトグラフィーで精製する工程、および逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により精製する工程を含む。
【００１０】
原料となるプロポリスの例としては、３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸を比較的多量に含有する地域由来のブラジル産プロポリス原塊を用いるのが好ましい。
アルコールまたは含水アルコールによる抽出工程に用いられる好ましいアルコールとしては、一般に、メタノールであるが、エタノールを用いることもできる。この工程によってプロポリス原料中の主要な構成成分であるメタノール可溶成分が抽出される。
【００１１】
アルコールによる抽出液（抽出したアルコール溶液）は、シリカゲルを用いるカラムクロマトグラフィー工程に供されて、極性成分（高極性成分および低極性成分）が除去される。この際、カラムクロマトグラフィーへの負荷を軽減するために、抽出したアルコール溶液は、予め、水を加えることにより不純物を沈殿物として除き、更に水洗浄することを含む前処理を行うことが好ましい。
【００１２】
シリカゲルカラムクロマトグラフィー工程は、例えば、クロロホルム／メタノール混合溶媒を溶離液として行うのが好ましい。シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離された画分は、濃縮後、例えばメタノールで希釈し、不溶物を例えば遠心分離により除去して逆相ＨＰＬＣ用サンプルを調製する。
【００１３】
逆相ＨＰＬＣの固定相（カラム）として好ましい例は、ＯＤＳであり、例えば、ギ酸／メタノールを溶離液（移動相）として液体クロマトグラフィー操作を行う。目的の画分はジエチルエーテル可溶分として集め、濃縮した後、残渣を例えばヘキサンで洗浄し、乾燥することにより３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸が得られる。
【００１４】
【実施例】
次に、本発明による製造法の好適な具体例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
ブラジル産プロポリス原塊１５０ｇにメタノール４５０ｍｌを加え、室温で攪拌してメタノール可溶成分を、抽出した。これをろ過することにより抽出液を得た。抽出液には１／１０量の水を加え、沈殿物を遠心分離により残さとして除いた。上清に等量の酢酸エチルを加え、１／２量の水で有機層を洗浄した。
回収した有機層は、濃縮後、メタノール：クロロホルムにて再溶解した（固形分 ２０．９ｇ）。固形分２０．２ｇに相当する溶液をシリカゲルカラム (シリカゲル２００ｇ、５０ｍｍφ)に負荷し、クロロホルム／メタノール（９：１）を溶離液として分離した。黒褐色の部分の画分を集めて濃縮し、黒褐色オイル２２．４ｇを得た。
メタノール希釈し、不溶物を遠沈除去し、ＨＰＬＣ分取サンプルとした。逆相(ＯＤＳ)カラムにて、５％ギ酸−メタノール（３５ｖｏｌ／６５ｖｏｌ）を溶離液として分離・分画し、目的画分を集め濃縮した後、ジエチルエーテル可溶分を集め、再度濃縮し、残さをヘキサンで洗浄し、減圧乾燥することにより黄白色アモルファス状の固体０．１３４ｇを得た（収率０．０９％）。
これは、ＨＰＬＣによる純度分析により３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸を９６．６％含むことが確認された（図２および図３参照）。またその一部を用い、以下のように、1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3／ＴＭＳ）およびＭＳ（質量分析）により３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸であることを確認した。
ＭＳ，ｍ／ｅ；３００[Ｍ]−，２８５[Ｍ−ＣＨ3]＋  （ＥＩＭＳ法、７０ｅＶ）。
1Ｈ−ＮＭＲ(３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3)，内部標準  ＴＭＳ，δ(ｐｐｍ)；７．６７(１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ)、７．１５(２Ｈ，ｂｒｓ)、６．２３(１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ)、５．２８(２Ｈ，ｂｒｔ)、３．３３(４Ｈ，ｍ)、１．７８(１２Ｈ，ｓ)。
【００１５】
【発明の効果】
本発明に従えば、プロポリスを出発原料として比較的簡単な工程により高純度の３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸を製造することができる。本発明によって得られる３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸は、プロポリス原塊やプロポリス製品中の３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸含有量を分析するための標準品として用いられることができ、それらの安定した品質管理および品質向上に資することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸の構造式である。
【図２】３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸純度の確認の為に行った、高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムである。
【図３】図２での高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムにおける３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシ桂皮酸のピーク（図２の保持期間１０．６０分）の紫外吸収スペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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