(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号FERM BP-7628のCellulomonas属細菌由来であり、下記(1)〜(3)の酵素学的性質を有する新規α-マンノシダーゼ画分であって、比活性が31.9mU/mg以上である、該画分。
（1）作用：α-D-マンノピラノシド（α-Man）のα-マンノシド結合を特異的に分解し、マンノースを遊離する。およびフォスフォジエステル結合しているα-D-マンノピラノシド（α-Man）を特異的に分解し、マンノースを遊離する。
（2）以下の基質特異性のうち少なくとも一つを有する：
（a）β-D-マンノピラノシド（β-Man）の分解活性、およびエンド-α-マンノシダーゼ活性（エンド型分解活性）は検出されない。
（b）下記構造式１で示される糖鎖に作用し、最終的に下記構造式２で示される糖鎖を生成する。
【化１】
0004774496.tif 000009
［式中、Manはマンノース残基を、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン残基を、α1-2はα1-2グリコシド結合を、α1-3はα1-3グリコシド結合を、α1-6はα1-6グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、PAはピリジルアミノ基をそれぞれ示す。］
（c）下記構造式３で示される糖鎖構造を含有する糖蛋白質に作用し、最終的に下記構造式４で示される糖鎖構造を含有する糖蛋白質を生成する。
【化２】
0004774496.tif 000010
［式中、Manはマンノース残基を、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン残基を、α1-2はα1-2グリコシド結合を、α1-3はα1-3グリコシド結合を、α1-6はα1-6グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す。］
（d）下記構造式５〜７で示される糖鎖に作用し、マンノース-6-リン酸（構造式８）を非還元末端に含有する糖鎖を生成する。
【化３】
0004774496.tif 000011
（e）構造式５〜７で示される糖鎖構造を含有する糖蛋白質に作用し、マンノース-6-リン酸（構造式８）を非還元末端に含有する糖鎖構造を含有する糖蛋白質を生成する。
（3）至適ｐＨ：６〜９．５（4-MU-α-Manを基質とした場合）
【請求項２】
更に下記（4）〜（6）の酵素学的性質を有することを特徴とする、請求項１に記載のα-マンノシダーゼ画分。
（4）至適温度：30〜55℃（4-MU-α-Manを基質とした場合）
（5）安定温度：55℃以下（4-MU-α-Manを基質とした場合）
（6）阻害及び活性化：1 mM Ca2+によって僅かに（１０％）活性化される。Hg2+、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）によって活性が100％阻害されるが、Ca2+の添加によって活性が回復する。
【請求項３】
エンド-α-マンノシダーゼ、β-マンノシダーゼ、およびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを実質的に含有しないことを特徴とする、請求項１または２に記載のα-マンノシダーゼ画分。
【請求項４】
受託番号FERM BP-7628のCellulomonas属細菌を培養し、その培養物からα-マンノシダーゼ画分を採取することを特徴とするα-マンノシダーゼ画分の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のα-マンノシダーゼ画分を試薬の調製に用いられる成分と共に含有する組成物。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のα-マンノシダーゼ画分、または請求項５に記載の組成物を用いて、マンノース-6-リン酸（構造式８）を非還元末端に含有する糖鎖構造を含有する糖蛋白質を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はα-マンナンなどのα-マンノシド結合を含有する多糖またはオリゴ糖のα-マンノシド結合に特異的に作用する新規な酵素α-マンノシダーゼ、及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生化学辞典（東京化学同人発行、1990年）には、α-マンノシダーゼは、α-マンノピラノシド結合を加水分解するエキソグリコシダーゼである旨、およびα-マンノシダーゼは動物組織に広く分布し、また高等植物や放線菌にも存在する旨が記載されている。
【０００３】
α-マンノシダーゼは酵母マンナンをはじめ多くのα-マンナンの構造決定のための生化学試薬として、更には酵母表層を覆っているマンナン類を改変してその物性を変化させることで種々の酵母を利用する生産技術の発展を図るためなど多くの用途が考えられる。
【０００４】
また、加水分解の逆反応（脱水縮合反応）を利用してα-マンノシド結合を含む高マンノース型オリゴ糖の合成への利用も考えられている。
また、出芽酵母やメタノール酵母などの主にα-マンノシド結合からなる糖鎖を削ることにより、糖蛋白質の糖鎖部分を除去した構造安定的な蛋白質を回収できる。糖蛋白質糖鎖は蛋白質の結晶化に不都合であることから、糖鎖の除去により結晶構造解析に適した蛋白質の生産が可能である。
【０００５】
α-マンノシダーゼには、その基質特異性からα-１，２-マンノシダーゼ、α-１，６-マンノシダーゼ、α-１，２；１，３-マンノシダーゼ、α-１，３；１，６-マンノシダーゼ、および非特異的に切断するα-マンノシダーゼなどが知られている。α-１，２-マンノシダーゼは非還元末端側からα-１，２-マンノシド結合を切断する酵素で、糸状菌（特開昭５７-５４５８８）や担子菌（Lipari et al., Biochemistry, 38, 1111-1118 (1999) ; Maras et al., J. Biotechnol., 77, 255-63 (2000)）などが知られており、いずれも組み換え体が市販されている。α-１，６-マンノシダーゼとα-１，２；１，３-マンノシダーゼは、Xanthomonas sp. 由来のものが市販されている（Womg-Madden and Landry, Glycobiology, 5, 19-28 (1995); Scaman et al., Glycobiology, 6, 265-270 (1996)）。α-１，３；１，６-マンノシダーゼは、主に動物細胞のゴルジ体で糖蛋白質糖鎖のプロセシングに関わる酵素として知られており、マンノシダーゼIIとも呼ばれる（Moremen and Robbins, J. Cell Biol., 115, 1521-1534 (1991) ; Misago et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 92, 11766-11770 (1995)）。
【０００６】
これらがいずれも結合特異性を有するのに対し、非特異的に切断するα-マンノシダーゼはすべてのα結合のマンノースを切断できる。真核生物で比較的よく保存されているのがリソソーマルマンノシダーゼ（酵母では液胞マンノシダーゼ）と呼ばれるもので、弱酸性領域に至適pHを有し、細胞内で不溶になった糖蛋白質糖鎖部分を分解・再利用するのに利用されている。しかしながら細胞内では膜に結合して存在し、比較的疎水性の高い蛋白質であることが多いため、精製が容易でない。
【０００７】
非特異的に切断するα-マンノシダーゼでもっとも知られているのは、タチナタマメ（Jack Bean）由来のα-マンノシダーゼである。この酵素は1966年に発見され（Li, J. Biol. Chem., 241, 1010-1012 (1966)）、以後数多くの研究が行われてきた（Snaith, Biochem. J., 147, 83-90 (1975) ; Hara et al., Biosci. Biochem. Biotech., 58, 60-63 (1994)など）。この酵素は市販され、構造決定のための生化学試薬として利用されている。他にサザエ由来のα-マンノシダーゼ（生化学工業社製）が市販されているが、いずれも糖蛋白質の糖鎖そのものに対しては比較的酵素活性が弱く長時間の反応が必要であるため、糖蛋白質の糖鎖部分を除去した構造安定的な蛋白質の回収には不適である。また弱酸性側に至適pHを有する（pH=4.5）ため、弱酸性側で不安定な蛋白質は失活する恐れがある。したがって、更に酵素活性が強く、精製も容易であり、かつ蛋白質が安定な中性のpHで作用できる新規のα-マンノシダーゼが求められている。
【０００８】
ところで、酵母の糖鎖中にはα結合のマンノースのほかに、コア糖鎖部分および糖外鎖部分にマンノース-１-リン酸が付加した酸性糖鎖も生成することがわかっている。この修飾は、動物細胞と異なり、酵母では液胞（動物細胞のリソソームに相当するオルガネラ）局在性糖蛋白質のsorting signalとしては機能しないことが報告されている。従って、酵母におけるこのリン酸化糖鎖の生理機能は不明のままである[Kukuruzinska et al, Ann. Rev. Biochem., Vol.56, p915-944 (1987)]。
【０００９】
一方、動物細胞内において、細胞内小器官のひとつであるリソソームでは、数多くの酸性加水分解酵素が存在し、細胞内外からリソソームに取り込まれた物質の分解を担っている。ヒトリソソームに局在する酵素群の多くは、生合成されゴルジ体に輸送されると、そのハイマンノース型糖鎖の非還元末端のマンノース残基の6位にリン酸基が付加し、酸性糖鎖をもつ糖蛋白質に変換され、これがリソソーム酵素特異的な認識マーカーとなる。そしてその高親和性受容体であるマンノース-6-リン酸受容体（MPR）との結合を介して、他の蛋白質から選別され、プレリソソームへ運ばれ、酸性条件下でMPRから解離した後、さらにリソソームへと輸送される（von Figura and Hasilik, Annu. Rev. Biochem., 54, 167-193 (1984)）。マンノース-6-リン酸受容体（M6PR）との結合にはマンノース-6-リン酸を１本の糖鎖内に１分子以上含むことが必要である。このリソソーム酵素特異的なリン酸基の付加反応は、2種の酵素反応により行なわれている。W. Canfieldらはマンノース-６-リン酸合成に関与する２種の酵素（GlcNAc-phosphotransferase、GlcNAc-phosphodiester-GlcNAc'ase）の遺伝子クローニングに成功している（Abstract of the XV International Symposium on Glycoconjugates. Glycoconjugate Journal Vol. 16 No. 4/5 S41 (1999)）。したがって、マンノース-6-リン酸、あるいはそれを含有する糖蛋白質を作製できれば、リソソームやマンノース-6-リン酸受容体（MPR）の機能解明、さらにはリソソーム酵素を欠損したヒトの治療薬への応用が期待できる。
【００１０】
本発明者らは酵母の糖鎖合成変異株（ΔOCH1 mnn1）を用いて糖蛋白質を生産させ、これにMNN6遺伝子産物を生体内または生体外で働かせることにより、マンノース-１-リン酸が付加した酸性糖鎖を得て、これを酸処理することによりリソソーム輸送シグナルとして有効な哺乳類と同様な糖鎖を得る方法を提案している（特開平9-135689）。しかしこの方法では極度の変性条件下（0.01Ｎ塩酸中、100℃、30分間）におくため殆どの糖蛋白質は変性してしまう。よって生理活性を有する糖蛋白質を得る方法としては十分なものではなかった。すなわち、特開平9-135689に記載されているような酵母を利用して、マンノース-6-リン酸を含有した糖蛋白質を得るためには、フォスフォジエステル結合したα-マンノースを温和な条件で切断する酵素が求められていた。
【００１１】
前述のようなフォスフォジエステル結合したα-マンノースを温和な条件で切断するためには、アグリコンとなる部分に特異性が低いことが重要であると考えられる。これまでの実験ではフォスフォジエステル結合したα-マンノースを切断できたのはタチナタマメ由来のα-マンノシダーゼのみである（Herscovics et al., J. Biol. Chem., 250, 8079-8084 (1975)）。このタチナタマメ由来のα-マンノシダーゼは合成基質であるｐ-ニトロフェニル-α-マンノシドや4-メチルウンベリフェリル-α-マンノシドを切断できるが、前述のように至適pHが低いことが問題である。
【００１２】
非特異的に切断するα-マンノシダーゼとしてCellulomonas属のα-マンノシダーゼが考えられた（Takegawa et al., Biochim. Biophys. Acta, 991, 431-437 (1989)；Takegawa, J. Ferm. Bioeng., 69, 129-131 (1990)）。しかしこれらは合成基質であるｐ-ニトロフェニル-α-マンノシドをほとんど切断できない。したがってフォスフォジエステル結合したα-マンノースを切断することは難しいと考えられた。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、従来知られている公知のα-マンノシダーゼより糖蛋白質糖鎖に対する酵素活性が強く、中性付近で作用し、また酵母のマンノース-1-リン酸結合を有する糖蛋白質糖鎖からマンノースを切り出すことが容易である新規α-マンノシダーゼ、および当該α-マンノシダーゼを含有する画分を提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、土壌中より高マンノース型糖鎖を有する糖蛋白質などのα-マンノシド結合に特異的に作用する新規なα-マンノシダーゼを生産するグラム陽性菌を分離した。そのグラム陽性菌の生産する高マンノース型糖鎖を有する糖蛋白質などのα-マンノシド結合を含有する糖鎖に作用する新規なα-マンノシダーゼ（本発明酵素）の分離を試み、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち本発明は、下記の（1）〜（3）の酵素学的性質を有することを特徴とするα-マンノシダーゼ、及び該α-マンノシダーゼを含有し、かつエンド-α-マンノシダーゼ、β-マンノシダーゼ、およびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを実質的に含有しないことを特徴とする、α-マンノシダーゼ画分（以下、「本発明酵素画分」ともいう）を提供するものである。
（1）作用：α-D-マンノピラノシド（α-Man）のα-マンノシド結合を特異的に分解し、マンノースを遊離する。およびフォスフォジエステル結合しているα-D-マンノピラノシド（α-Man）を特異的に分解し、マンノースを遊離する。
（2）以下の基質特異性のうち少なくとも一つを有する：
（a）β-D-マンノピラノシド（β-Man）の分解活性、およびエンド-α-マンノシダーゼ活性（エンド型分解活性）は検出されない。
（b）下記構造式１で示される糖鎖に作用し、最終的に構造式２で示される糖鎖を生成する。
【００１６】
【化４】
0004774496.tif 000002
［式中、Manはマンノース残基を、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン残基を、α1-2はα1-2グリコシド結合を、α1-3はα1-3グリコシド結合を、α1-6はα1-6グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、PAはピリジルアミノ基をそれぞれ示す。］
【００１７】
（c）下記構造式３で示される糖鎖構造を含有する糖蛋白質に作用し、最終的に下記構造式４で示される糖鎖構造を含有する糖蛋白質を生成する。
【００１８】
【化５】
0004774496.tif 000003
［式中、Manはマンノース残基を、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン残基を、α1-2はα1-2グリコシド結合を、α1-3はα1-3グリコシド結合を、α1-6はα1-6グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す。］
【００１９】
（d）下記構造式５〜７で示される糖鎖に作用し、マンノース-6-リン酸（構造式８）を非還元末端に含有する糖鎖を生成する。
【００２０】
【化６】
0004774496.tif 000004
【００２１】
（e）構造式５〜７で示される糖鎖構造を含有する糖蛋白質に作用し、マンノース-6-リン酸（構造式８）を非還元末端に含有する糖鎖構造を含有する糖蛋白質を生成する。
【００２２】
（3）至適ｐＨ：６〜９．５（4-MU-α-Manを基質とした場合）
好ましくは、上記（1）〜（3）の酵素学的な性質に加え、更に下記（4）〜（6)の酵素学的性質を有することを特徴とする、α-マンノシダーゼを提供する。
（4）至適温度：30〜55℃（4-MU-α-Manを基質とした場合）
（5）安定温度：55℃以下（4-MU-α-Manを基質とした場合）
（6）阻害及び活性化：1 mM Ca2+によって僅かに（１０％）活性化される。Hg2+、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）によって活性が100％阻害されるが、Ca2+の添加によって活性が回復する。
（7）ミハエリス定数：0.32 mM-1（4-MU-α-Manを基質とした場合）
エンド-α-マンノシダーゼ、β-マンノシダーゼ、およびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼは、その基質が本発明酵素の基質と共通するグリコシダーゼである。従って、これら類縁のグリコシダーゼを実質的に含有しない本発明画分は、たとえ前記類縁のグリコシダーゼ以外の酵素が混入していても、本発明酵素とほぼ同様に利用することができる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳しく説明する。
本発明酵素画分は、下記の（1）〜（3）の酵素学的性質を有することを特徴とするα-マンノシダーゼ（本発明酵素）を含有し、かつエンド-α-マンノシダーゼ、β-マンノシダーゼ、およびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを実質的に含有しないことを特徴とするものである。
【００２４】
（1）作用：α-D-マンノピラノシド（α-Man）のα-マンノシド結合を特異的に分解し、マンノースを遊離する。およびフォスフォジエステル結合しているα-D-マンノピラノシド（α-Man）を特異的に分解し、マンノースを遊離する。この点で既知のCellulomonas属のα-マンノシダーゼとは区別される。尚、基質としては、天然の基質の他、分解活性の確認のため等に、例えば4-メチルウンベリフェリル-α-D-マンノピラノシド等の合成基質を使用することもできる。
【００２５】
（2）以下の基質特異性のうち少なくとも一つを有する：
β-D-マンノピラノシド（β-Man）の分解活性、およびエンド-α-マンノシダーゼ活性（エンド型分解活性）は検出されない。これらの点で公知のβ-マンノシダーゼ、エンド-α-マンノシダーゼとは区別される。
下記構造式１で示される糖鎖に作用し、最終的に下記構造式２で示される糖鎖を生成する。
【００２６】
【化７】
0004774496.tif 000005
［式中、Manはマンノース残基を、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン残基を、α1-2はα1-2グリコシド結合を、α1-3はα1-3グリコシド結合を、α1-6はα1-6グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、PAはピリジルアミノ基をそれぞれ示す。］
構造式５〜７で示される糖鎖に作用し、マンノース-6-リン酸（構造式８）を非還元末端に含有する糖鎖を生成する。
【００２７】
【化８】
0004774496.tif 000006
なお、上述の基質となる糖鎖はPA誘導体に限定されない。例えば、2-アミノベンズアミドなどの他の標識体でも構わないし、蛋白質に結合した状態でも構わない。
【００２８】
（3）至適ｐＨ：６〜９．５（4-MU-α-Manを基質とした場合）
本発明の酵素：α-マンノシダーゼの至適ｐＨは、より望ましくは７〜８、最も望ましくは７．５である。ここでいう至適ｐＨは、実施例で示された実験によって計測された相対活性が５０％以上の範囲を指す。該酵素の至適温度は、３０〜５５℃、より望ましくは３５〜４５℃、最も望ましくは４０℃である。ここでいう至適温度は、実施例で示された実験によって計測された相対活性が５０％以上の範囲となる温度を指す。該酵素の安定温度は５５℃以下、より望ましくは４０℃以下、最も望ましくは３０℃以下である。ここでいう安定温度は、実施例で示された実験によって計測された相対活性が５０％以上の範囲となる温度を指す。
【００２９】
尚、本発明に係るα-マンノシダーゼ酵素は、糖鎖及び糖鎖構造を含有する蛋白質に対してα-１，２、α-１，３、α-１，６マンノシド結合をいずれも分解することができる。従って、構造式１に示す糖鎖、あるいは構造式３に示す糖鎖構造を含有する糖蛋白質に対して作用した場合、上記のマンノシド結合を、構造式２に示す糖鎖、あるいは構造式４に示す糖鎖構造を含有する糖蛋白質まで順次分解し得る。従って、本明細書において、「最終的に」とは、複数の分解反応を経て生成物が得られることを意味する。
【００３０】
本発明酵素は、該酵素を生産する細菌を適当な培地に接種して培養し、培養後の培養物（液体培養の時は培養液）から菌体を分離除去し（遠心分離、凝集分離、濾過など）、次いで一般的な酵素の分離精製法（例、「入門酵素化学」、昭和４８年７月１日、（株）南江堂発行 参照）を適用することによって必要とされる精製度の酵素標品として採取される。
【００３１】
なお本発明酵素はもともと細菌から得られたものであるが、本発明酵素画分が得られるかぎりにおいてその由来は限定されない。例えば動物由来であってもよく、また遺伝子工学的手法等により製造されたものであってもよい。これらの中でも細菌由来のものが好ましく、グラム陽性菌由来のものがより好ましい。本発明において特に好適に使用できるものは、Cellulomonas属に属する細菌由来のものである。本発明者等は、本発明において特に好適な細菌として、Cellulomonas属に属するSO-5株を、日本国茨城県つくば市東１丁目1番地１  中央第６  独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに2001年６月１２日付けでFERM BP-7628という受託番号で国際寄託されている。
本発明酵素の製造方法も、最終的に本発明酵素画分が取得できる限りにおいて特に限定されない。例えば上述したような細菌等を培養し、その培養物から本発明酵素画分を精製することにより製造することができる。
【００３２】
前記細菌の培養は、該菌が資化可能な窒素源（酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆粕などの有機窒素源；硫安、尿素、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源）、無機塩（鉄、マグネシウム、カルシウム、カリウムなどの硫酸塩、リン酸塩、塩酸塩など）などを含む培地に、酵母マンナンなどの本発明酵素画分が誘導されるような炭素源を加え、好気的な培養法（振盪培養、攪拌培養、通気培養など）によって生育に適した温度で８時間〜数日間培養することによって培地中に酵素を生産させることができる。培養に際し、培地に酵母エキスを添加すると生育が盛んになり、培地単位体積あたりの酵素活性を上昇させることができる。
【００３３】
菌体を分離除去した液体培養後の培養液から、例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析；エタノール、アセトン、イソプロパノール、テトラヒドロフラン等の有機溶媒による沈澱法；ヒドロキシアパタイト（水酸化リン酸カルシウム）等による吸着クロマトグラフ法；ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、トリエチルアミノエチル基等の交換基を有する陰イオン交換体等によるイオン交換クロマトグラフ法；アフィニティークロマトグラフ法；ゲル濾過クロマトグラフ法；分子ふるい膜等による限外濾過法；電気泳動法など公知の酵素精製法によって目的とする精製度の酵素標品を得ることができる。本発明酵素画分に特徴的な活性は、例えば後述の[実施例1]に従って測定することができる。
本発明酵素画分は、少なくとも本発明酵素を含有しており、かつエンド-α-マンノシダーゼ、β-マンノシダーゼ、およびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを実質的に含有しない限りにおいて特に限定されない。
【００３４】
なお本明細書において「実質的に」とは、この言葉のかかる状態が、いわゆる当業者において、その状態であると認識するのに十分な実質を備えている状態を意味する。例えば「実質的に含有しない」とは、全く含有しない、又は含有しているとしてもその含有量がわずかであって、いわゆる当業者において検出できない、もしくは検出できたとしても微量であって、測定誤差範囲内と認識される状態であることを意味するものである。
【００３５】
本発明酵素画分は完全に精製されていなくてもよく、本発明酵素の作用が発揮でき、かつ本発明酵素の利用上好ましくない物質を含まない限りにおいて、部分精製されたものであってもよい。「本発明酵素の利用上好ましくない物質」は、本発明の利用の目的・態様に応じて、当業者が適宜決定でき、除去できる。
部分精製された酵素画分の酵素学的性質を分析し、本発明により開示された本発明酵素画分の酵素学的性質と比較することにより、本発明酵素画分の製造が確認できる。
【００３６】
本発明酵素画分には、エンド-α-マンノシダーゼ、β-マンノシダーゼ、およびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ以外の成分であって、かつ本発明酵素の活性を実質的に害さないかぎり、他の成分を含有していてもよい。例えば通常の試薬の調製に用いられる賦形剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を含有せしめることもできる。
上記本発明のα-マンノシダーゼは、種々の用途に使用することができる。例えば、マンノース-6-リン酸を非還元末端に含有する糖鎖構造を含有する糖蛋白質を製造することができる。
【００３７】
【実施例】
次に実施例により本発明を更に詳しく説明するが、これらの実施例は本発明の一例を示すものであり、これらに限定されるものではない。
【００３８】
[実施例1]  本発明酵素および夾雑酵素の活性測定法
スクリーニングの際のマンナン分解活性の測定は、α-マンナンを基質として反応を行い、遊離した糖の還元力を測定することによって行なった。すなわち、α-マンナン（終濃度0.1％）と酵素液を含む反応液（0.4 M リン酸緩衝液、pH 7.0）中、３７℃で１０分間、反応を行い、反応後マンノースを標準として還元糖をネルソン・ソモジ（Nelson  Somogi）法によって測定した（福井作蔵、生物化学実験法シリーズ１，還元糖の定量法（学会出版センター）、p. 10(1979)）。
【００３９】
精製の各段階の粗酵素および部分精製酵素のα-マンノシダーゼ活性の測定は、4-メチルウンベリフェリル（MU）-α-マンノピラノシドを基質として反応を行い、遊離する4-MUを測定することによって行なった。すなわち、0.5 mM 4-MU-α-マンノピラノシドと酵素液を含む反応液70 μl（0.15 M NaClを含む20 mＭリン酸緩衝液、 pH 7.5）中、37℃で30分間反応後、0.2 M グリシン緩衝液（pH 10.7）を700μl加えて反応を停止した。うち100 μlをとり、遊離した4-MUの蛍光量をマイクロプレートリーダー（Ex:385 nm, Em:450 nm）で測定した。酵素活性の単位は、上記反応において1分間に1 μmoleの4-MUを遊離する酵素量を１ユニット（以下「U」と略す）とした。
【００４０】
共存する夾雑酵素の測定法は以下のように行なった。
エンド-α-マンノシダーゼ活性の測定は、α-1,6-マンナンを基質として反応を行い、遊離した糖の還元力を測定することによって行なった。すなわち、α-1,6-マンナン（終濃度0.1％）と酵素液を含む反応液（0.4 M リン酸緩衝液、pH 7.0）中、３７℃で１０分間、反応を行い、反応後マンノースを標準として還元糖をネルソン・ソモジ（Nelson  Somogi）法によって測定した（福井作蔵、生物化学実験法シリーズ１，還元糖の定量法（学会出版センター）、p. 10(1979)）。
【００４１】
β-マンノシダーゼ活性の測定は、p-ニトロフェニル（pNP）-β-D-マンノピラノシドを基質として反応を行い、遊離するpNPを測定することによって行なった。すなわち、5 mM pNP-β-D-マンノピラノシドと酵素液を含む反応液70 μl（0.15 M NaClを含む20 mＭリン酸緩衝液、 pH 7.5）中、37℃で24時間反応後、0.2 M グリシン緩衝液（pH 10.7）を700μl加えて反応を停止した。うち100 μlをとり、遊離した4-MUの蛍光量をマイクロプレートリーダー（Ex:385 nm, Em:450 nm）で測定した。酵素活性の単位は、上記反応において1分間に1 μmoleの4-MUを遊離する酵素量を１ユニット（以下「U」と略す）とした。
【００４２】
[実施例2]  α-マンノシダーゼ生産菌のスクリーニング
マンノシダーゼを誘導生産するための培地（マンナン液体培地）は以下の通りに作成した。パン酵母マンナン2 g、硫酸アンモニウム［（NH4）2SO4］500 mg、硫酸第二鉄［Fe2SO4］ 20 mg、硫酸マグネシウム［MgSO4・7H2O］ 400 mg、塩化カルシウム［CaCl2・2H2O］ 60 mg、酵母エキス 1 g、第二リン酸カリウム［K2HPO4］ 7.54 g、第一リン酸カリウム［KH2PO4］ 2.32 gに水を加えて１Ｌとした。またマンノシダーゼ生産菌を単離するための平板培地は、上記マンナン液体培地に寒天末を1.5%になるように加えたものを用いた。
【００４３】
試験管に入った2 mlのマンナン液体培地に、土壌懸濁水から植菌耳で植菌し、30℃、2晩振盪培養した。この培養液を植菌耳で新しい2 mlのマンナン液体培地に植え継ぎし、再び30℃、2晩振盪培養した。2晩の振盪培養を計3回行なった後、1晩の振盪培養を2回行なった。培養液を遠心し、培養上清を10 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）に対して透析した粗酵素液を、マンナン分解酵素活性の測定に用いた。活性のあった土壌サンプルについて、さらにα-マンノシダーゼ生産菌のスクリーニングを進めた。
【００４４】
活性のあった培養液を、線引き法、希釈法にて平板プレートに植菌して、30℃で培養した。数日後、現れたコロニーを拾い、マンナン液体培地に植菌して30℃、2晩振盪培養した。培養液を遠心し、培養上清を10 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）に対して透析した粗酵素液について、α-マンナンと合成基質をもちいて酵素活性を測定した。
【００４５】
この操作を数回繰り返し、確実なシングルコロニーを拾って完全なα-マンノシダーゼ生産菌の単離を行なった。この生産菌をSO-5と命名した。なお、このSO-5株は、日本国茨城県つくば市東１丁目1番地１  中央第６  独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに2001年６月１２日付けでFERM BP-7628という受託番号で国際寄託されている。
【００４６】
[実施例3]  新規なα−マンノシダーゼ生産菌SO-5の同定
リボゾームRNA遺伝子の塩基配列の相同性は分子系統、分類上重要であり、遺伝子のコピー数、構成は種によって異なっている。したがってリボゾームRNAの塩基配列により細菌の同定が可能である。
【００４７】
SO-5株よりWizard Genomic DNA Purification Kit（プロメガ社製）を用いてゲノムDNAを単離した。これをテンプレートDNAとし、リボゾームRNA領域をコードする部分の塩基配列をPCRにて増幅した。プライマーはSPF1（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG:配列番号１）とSPR1（GGTTACCTTGTTACGACTT：配列番号２）を用い、得られた約1.5 kbの断片をPGEM-T vector（プロメガ社製）にクローニングした後、ジデオキシ法により部分塩基配列を決定した。その結果を配列番号３に示した。
【００４８】
この配列を日本DNAデータバンクのweb siteから利用できるBLASTシステムを用いて相同性検索を行なったところ、Oerskovia xanthineolyticaならびにCellulomonas属と高い相同性がみられた。Oerskovia属は樹枝状に成長するが、SO-5株は普通の丸いコロニーを形成する。これらの結果から、SO-5株はCellulomonas sp.であることが推定された。
【００４９】
[実施例4]  α-マンノシダーゼの生産と部分精製
α-マンノシダーゼを誘導生産するため、実施例２で得られたSO-5をマンナン液体培地で30℃、一晩培養を行なった。培養後、4℃、15,000 x gで10分遠心し、菌体を除去した。上清を2 mMの塩化カルシウムを含む10 mM HEPES-Na緩衝液（pH 7.0）で透析を行ない、粗酵素液とした。
【００５０】
次にこの粗酵素液に終濃度1.2 Mとなるように硫酸アンモニウムを添加したあと、4℃で一晩混合した。これを遠心し、沈殿を除いた上清に対し、さらに終濃度1.7 Mとなるように硫酸アンモニウムを添加したあと、4℃で一晩混合した。次に4℃、15,000 x gで10分遠心し、沈殿する蛋白質を回収した。得られた沈殿物をH2Oに溶解し、2 mMの塩化カルシウムを含む10 mM HEPES-Na緩衝液（pH 7.0）で透析を行なった。これを2 mMの塩化カルシウムを含む10 mM HEPES-Na緩衝液（pH 7.0）で平衡化したHiTrap Qカラムに供した。NaClの濃度を1 Mまで増加させるグラジエント溶出を行ない、活性画分を得た。これを2 mMの塩化カルシウムを含む10 mM HEPES-Na緩衝液（pH 7.0）で透析を行ない、部分精製標品とした。
【００５１】
部分精製標品は[実施例1]に従い、α-マンノシダーゼ活性、エンド-α-マンノシダーゼ活性、β-マンノシダーゼ活性を測定した。比活性は31.9 mU/mgで、エンド-α-マンノシダーゼ活性（エンド型分解活性）、β-マンノシダーゼ活性は検出されなかった。
【００５２】
[実施例5]  新規なα-マンノシダーゼの酵素学的性質
測定は実施例4で得られた精製酵素を用いて行なった。
（ａ）至適ｐＨ：本酵素について酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.0〜6.5）、リン酸緩衝液（pH 6.0〜8.0）、トリス緩衝液（pH7.5〜10.0）を用いて37℃、30分間の酵素反応を行い、至適ｐＨを調べたところ、図１に示すようにｐＨ６〜９．５、特に7.5付近であった。
（ｂ）至適温度：本酵素について20〜80℃の各温度でリン酸緩衝液（ｐＨ 7.5）中、30分間反応させて至適温度を調べたところ、図２に示すように30〜55℃、特に40℃付近であった。
（ｃ）安定温度：本酵素について0.1 Ｍリン酸緩衝液（pH 7.5）中、0〜80℃の範囲で30分間処理した後、37℃、30分間の酵素反応によって残存活性（相対活性）を調べたところ、図２に示すように55℃まで安定であった。
（ｄ）金属イオンの影響：本酵素について無機イオンおよび阻害剤による影響を、反応系に添加して37℃、30分間の酵素反応によって調べた。Ca2+によって僅かに（１０％）活性化された。またHg2+、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）によって活性が100％阻害されるが、Ca2+の添加によって活性が回復した。
（ｅ）ミハエリス定数：本酵素の4-MU-α-マンノピラノシドに対するミハエリス定数（Km）を、基質濃度の逆数と反応速度の逆数をプロットとして求めたところ、Km=0.32 mM-1であった（図３）。なお、高濃度の基質（1 mM以上）では、基質阻害が見られた。
【００５３】
（ｆ）高マンノース糖鎖に対する作用：本酵素を高マンノース型糖鎖に作用させたときの切断様式を図５に示す。アミノカラムを用いたHPLCでは、蛍光標識された（PA化）オリゴ糖をその鎖長によって分離することが可能である。カラムはSHODEX AsahiPak NH2P-50（4.6 x 250 mm、昭和電工製）を使用し、溶媒は、200 mM酢酸-トリエチルアミン緩衝液（pH 7.0）とアセトニトリルとの30：70の混合液（A液）、200 mM酢酸-トリエチルアミン緩衝液（pH 7.0）とアセトニトリルとの50：50の混合液（B液）を調製した。予め溶媒Aを流速1.0 ml/minで流すことによりカラムを平衡化し、試料注入直後から溶媒Bの割合を50分かけて100％まで直線的に上昇させ、PA化オリゴ糖を溶出した。PA化糖鎖は蛍光検出器（励起波長:320nm, 蛍光波長:400nm）にて検出した。反応は糖鎖100 pmolに対し、本発明酵素画分20 μUを加え、0.1 M リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）中、37℃で10分から2時間反応した。Man8GlcNAc2-PA（構造式1、Ｍ８）を基質とした場合、Man5GlcNAc2-PA（Ｍ５）まで比較的早く分解されたあと、さらにMan4GlcNAc2-PA（Ｍ４）が徐々に生成し、Man2GlcNAc2-PA（Ｍ２）もわずかながら生成している（図４）。２時間反応後では、Man4GlcNAc2-PAの他に、Man3GlcNAc2-PA（Ｍ３）、Man2GlcNAc2-PA（Ｍ２）、Man1GlcNAc2-PA（Ｍ１）の３本のピークが見られた。このことから、本酵素は、α-１，２-マンノシド結合、α-１，３-マンノシド結合、α-１，６-マンノシド結合に関わらず、非還元末端から非特異的にα-マンノシド結合に作用することから、エンド-α-マンノシダーゼ活性（エンド型分解活性）がないことがわかった。またこの結果からエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性は共存しないことが予想された。
【００５４】
（ｇ）β-マンノシド結合を有する糖鎖に対する作用：ｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-マンノシドを基質とした際には活性が見られなかったことから、β-マンノシドには作用しないことが明らかとなった。
（ｈ）酵母リン酸含有酸性糖鎖に対する作用：酵母の生産する糖鎖中にはマンノースリン酸を含有する糖鎖が知られている（Kukuruzinska et al, Ann. Rev. Biochem., 56, 915-944 (1987)）。（構造式７）に示したような構造を有する糖鎖に対する作用を調べた。その結果を図５に示した。なお、分析にはSuperQ 5PW（東ソー製）を使用し、溶媒は、2 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.0）（A液）、0．25 M酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.0）（B液）を調製した。予め溶媒Aを流速1.0 ml/minで流すことによりカラムを平衡化し、試料注入直後から溶媒Bの割合を30分かけて100％まで直線的に上昇させ、PA化オリゴ糖を溶出した。反応は糖鎖100 pmolに対し、本発明酵素画分20μUを加え、0.1 M リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）中、37℃で一晩反応した。リン酸に結合したマンノースが切断された糖鎖はリン酸の負電荷が増えるため、遅い保持時間で溶出されるようになる。コントロール（酵素なし）の糖鎖が10分付近に溶出される（図５Ａ）のに対し、本酵素を作用させたものは12分過ぎに新たなピークが見られた（図５Ｃ）。この溶出位置は（構造式６）の糖鎖を化学的に処理し、リン酸に結合したマンノースを除去した糖鎖の溶出位置と一致した（図５Ｂ）ことから、本酵素はフォスフォジエステル結合のα-マンノースも切断することが可能であることが明らかとなった。
【００５５】
[実施例6]  糖蛋白質に対する作用
リボヌクレアーゼB（RNase B）は高マンノース型糖鎖を有する糖蛋白質として知られている。リボヌクレアーゼB 20 μgに対し、[実施例2]で得られたα-マンノシダーゼ画分を100 μU加え、0.1 M リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）存在下で、37℃、14時間反応させた。なお、コントロールとしてα-マンノシダーゼ画分の代わりに緩衝液のみを等量加えた。それぞれをSDS-PAGEで分析したところ、コントロールに対し、α-マンノシダーゼ画分を加えたものでは見かけの分子量が減少していた（図６）。この分子量はペプチド部分の配列が同じで、糖鎖のみを欠損したリボヌクレアーゼ A（RNase A）のものと近似していた。これらのリボヌクレアーゼ活性を測定したところ、反応前と比べ活性の減少はほとんど見られなかった。従ってこれらのことから、本発明酵素画分を加えたものでは、高マンノース型糖鎖のα-マンノシド結合部分のみが切断され、糖鎖の根元部分に当たるManβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcが残ったものの、蛋白質部分には影響がないことが示唆された。
【００５６】
【発明の効果】
本発明によると、従来知られている公知の酵素に比べて酵素活性が数十倍高く、糖蛋白質糖鎖に対する親和性が高く、中性付近で安定性の優れた新規なα-マンノシダーゼを提供することができる。
また、本酵素は細菌を液体培養することによって培地中に生産できるので、公知の酵素より生産が容易である。
更に本酵素は、α-マンノシド結合を含有する多糖またはオリゴ糖を加水分解する目的だけでなく、フォスフォジエステル結合のα-マンノースをも切断することが可能であり、本酵素を利用することでマンノース-6-リン酸型の糖鎖を出芽酵母から生産するのに利用できる。
【００５７】
【配列表】
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【００５８】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：プライマーSPF1
配列番号２：プライマーSPR1
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明酵素（α-マンノシダーゼ）の至適pHを示す。
【図２】本発明酵素（α-マンノシダーゼ）の至適温度、及び安定温度を示す。
【図３】本発明酵素（α-マンノシダーゼ）のミハエリス定数（Km値）を求めるための、基質・反応速度の二重逆数プロットを示す。
【図４】本発明酵素（α-マンノシダーゼ）をMan8GlcNAc2-PA（構造式１、Ｍ８）に１０分、６０分、及び１２０分作用させたときの分解産物を、HPLCで解析した結果を示す。
【図５】本発明酵素（α-マンノシダーゼ）を(Man-P)2-Man8GlcNAc2-PA（構造式７）に作用させた後の分解産物を、HPLCで解析した結果を示す。
（A）(Man-P)2Man8GlcNAc2-PA糖鎖
（B）(Man-P)2Man8GlcNAc2-PAを0.01 N HCl中で、100℃、30分間処理した糖鎖
（C）(Man-P)2Man8GlcNAc2-PAを本発明酵素（α-マンノシダーゼ）を加え、処理した糖鎖
【図６】本発明酵素（α-マンノシダーゼ）をリボヌクレアーゼBに作用させたときのSDS-PAGEの結果を示す。
レーン1：リボヌクレアーゼB
レーン2：本発明酵素（α-マンノシダーゼ）で処理したリボヌクレアーゼB
レーン3：リボヌクレアーゼA（糖鎖を欠損したリボヌクレアーゼBと同質の酵素）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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