(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カリウムチャネルＫＣＮＱ４サブユニットをコードする、配列番号１に記載のポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％相同である核酸配列を有する単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
クローン化ポリヌクレオチドである請求項１の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
ポリヌクレオチドがｃＤＮＡライブラリーからクローン化されるか、ｃＤＮＡライブラリーに基づいて製造される請求項２の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
突然変異Ｇ９３５Ａを含む配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含んでなるＫＣＮＱ４カリウムチャネルサブユニットをコードする、請求項１の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
変異体ＫＣＮＱ４／Ｇ２８５Ｓをコードする請求項１の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜７のポリヌクレオチドによってコードされる組換え生産ポリペプチド。
【請求項９】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなるＫＣＮＱ４カリウムチャネルサブユニットである請求項８のポリペプチド。
【請求項１０】
変異体ＫＣＮＱ４／Ｇ２８５Ｓである請求項８のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の異種ポリヌクレオチドの取り込みによって遺伝子操作された細胞。
【請求項１２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなるＫＣＮＱ４チャネルサブユニットの取り込みによって遺伝子操作された請求項１１の細胞。
【請求項１３】
変異体ＫＣＮＱ４／Ｇ２８５Ｓの取り込みによって遺伝子操作された請求項１１の細胞。
【請求項１４】
１または複数のＫＣＮＱチャネルサブユニットを同時発現するように遺伝子操作された請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載のＫＣＮＱ４ポリペプチドおよびＫＣＮＱ１チャネルサブユニット、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のＫＣＮＱ４ポリペプチドおよびＫＣＮＱ２チャネルサブユニット、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のＫＣＮＱ４ポリペプチドおよびＫＣＮＱ３チャネルサブユニット、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のＫＣＮＱ４ポリペプチドおよびＫＣＮＱ１およびＫＣＮＱ２チャネルサブユニット、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のＫＣＮＱ４ポリペプチドおよびＫＣＮＱ１およびＫＣＮＱ３チャネルサブユニット、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のＫＣＮＱ４ポリペプチドおよびＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３チャネルサブユニット、または請求項８〜１０のいずれか一項に記載のＫＣＮＱ４ポリペプチドおよびＫＣＮＱ１およびＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３チャネルサブユニットを同時発現するように遺伝子操作された請求項１４の細胞。
【請求項１６】
ＫＣＮＱ３チャネルサブユニットおよび請求項８〜１０のいずれか一項に記載のＫＣＮＱ４ポリペプチドを同時発現するように遺伝子操作された請求項１４の細胞。
【請求項１７】
真核細胞である請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
哺乳動物細胞、卵母細胞または酵母細胞である請求項１７の細胞。
【請求項１９】
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ２１細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞（ＸＬＯ）細胞またはＫＣＮＱカリウムチャネルを発現できる他の任意の細胞株である請求項１７または１８の細胞。
【請求項２０】
ＫＣＮＱ４サブユニットを含んでなるヒトカリウムチャネルの均一な供給源を得る方法であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが発現可能な形で取り込まれている細胞宿主を培養し、次にその培養細胞を回収する各工程を含む方法。
【請求項２１】
少なくとも１つのＫＣＮＱ４チャネルサブユニットを含んでなるカリウムチャネルに結合する能力に関して化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）請求項１１〜１９のＫＣＮＱ４チャネルサブユニット含有細胞にＫＣＮＱ４結合剤を作用させて、そのＫＣＮＱ４チャネルサブユニット含有細胞との複合体を形成させ、
（ｉｉ）工程（ｉ）の複合体に試験対象化合物を作用させ、
（ｉｉｉ）ＫＣＮＱ４チャネルサブユニット含有細胞との複合体からのＫＣＮＱ４結合剤の置換を検出する、
という各工程を含み、前記ＫＣＮＱ４結合剤が放射標識された１，３−ジヒドロ−１−フェニル−３，３−ビス（４−ピリジルメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン（リノピルジン）または放射標識された１０，１０−ビス（４−ピリジニル−メチル）−９（１０Ｈ）−アントラセノンである、方法。
【請求項２２】
化合物が３Ｈで標識されている請求項２１の方法。
【請求項２３】
ＫＣＮＱ４チャネルサブユニット含有細胞との複合体からのＫＣＮＱ４結合剤の置換が通常の液体シンチレーション計数法で放射活性量を測定することによって検出される請求項２１または２２の方法。
【請求項２４】
少なくとも１つのＫＣＮＱ４サブユニットを含んでなるカリウムチャネルに対する活性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）その化合物を請求項１１〜１９のいずれか一項に記載のＫＣＮＱ４サブユニット含有細胞に作用させ、
（ｉｉ）そのＫＣＮＱ４チャネルサブユニット含有細胞の膜電位、電流、カリウム流束または二次的カルシウム流入を監視する、
という各工程を含む方法。
【請求項２５】
ＫＣＮＱ４チャネルサブユニット含有細胞の膜電位の監視がパッチクランプ法によって行なわれる請求項２４の方法。
【請求項２６】
ＫＣＮＱ４チャネルサブユニット含有細胞の膜電位の監視が蛍光法を使って行なわれる請求項２４の方法。
【請求項２７】
請求項５記載のポリヌクレオチド配列の、この突然変異を有する個体に関する遺伝物質のスクリーニングにおける使用。
【請求項２８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の内因性ＫＣＮＱ４ポリヌクレオチドのノックアウト突然変異または請求項５もしくは７のいずれか一項に記載の突然変異ＫＣＮＱ４ポリヌクレオチドを含むか、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＫＣＮＱ４ポリヌクレオチドを過剰発現させるためもしくは請求項５もしくは７のいずれか一項に記載の突然変異ＫＣＮＱ４ポリヌクレオチドを過剰発現させるために遺伝子操作されたトランスジェニックげっ歯類動物、トランスジェニックブタ、トランスジェニックウシ、トランスジェニックヒツジまたはトランスジェニックヤギから選択されるトランスジェニック動物。
【請求項２９】
上記遺伝子がホモ接合状態で完全に欠失しているノックアウト動物である請求項２８のトランスジェニック動物。
【請求項３０】
突然変異ＫＣＮＱ４遺伝子を含む請求項２８のトランスジェニック動物。
【請求項３１】
ハムスター、モルモット、ウサギまたはラットである請求項２８〜３０のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３２】
治療用化合物のインビボスクリーニングにおける請求項２８〜３１のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物の使用。
【請求項３３】
聴力損失または耳鳴に関連する疾患または状態に作用する薬物のスクリーニングにおける請求項３２の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は新規カリウムチャネルおよび同チャネルをコードする遺伝子に関する。より具体的には、本発明はKCNQ4カリウムチャネルサブユニットをコードする単離されたポリヌクレオチド、同ポリヌクレオチドで形質転換された細胞、遺伝子突然変異を含むトランスジェニック動物ならびにKCNQ4サブユニット含有カリウムチャンネルに作用する化合物のインビトロおよびインビボスクリーニングにおける前記形質転換細胞およびトランスジェニック動物の使用を提供する。
【０００２】
（背景技術）
カリウムチャネルは興奮性細胞における電気的シグナル伝達の調節に関与し、生物学的液体のイオン組成を調節する。遺伝性心不整脈（場合によって難聴を伴なう）と新生児癲癇の根底にはK+チャネル遺伝子ファミリーのKCNQブランチの3つの既知遺伝子中の突然変異がある。
【０００３】
聴力損失はヒトに最もよく見られる感覚欠損である。聴力損失には環境要因によるものと遺伝的要因によるものがあり、高齢者の進行性聴力損失（老人性難聴）はその両者の組み合わせによると思われるものが最も多い。
【０００４】
遺伝性難聴は非症候群性（単独の聴力損失）または症候群性（他の異常を伴なうもの）に分類できる。様々な他の器官系での欠損を伴なう聴力損失から構成される数百の症候群が記載されている。非症候群性難聴はその遺伝様式に従ってDFN、DFNAおよびDFNB（それぞれX連鎖、常染色体優性および常染色体劣性）に分類される。一般に常染色体劣性難聴は早発性で、非常に重症である。これに対し、常染色体優性難聴は数十年かけてゆっくり発症し、成人期に入って初めて出現する。優性難聴を持つ家系で同定される遺伝子も、様々なタイプの突然変異と共に、老人性難聴の一部の型の根底にあるのではないかと期待される。
【０００５】
過去4年間に非症候群性難聴に関して当惑するほど多くの遺伝子座が同定された。少なくとも常染色体優性難聴については19遺伝子座（DFNA1〜DFNA19）、DFNBについては22遺伝子座ある。突然変異に応じて同じ遺伝子が優性難聴または劣性難聴に関与する場合もある。この多数の遺伝子座は内耳の複雑さを反映している。これらの遺伝子を同定しその産物を特徴づけることで、この感覚器の生理学の分子的基礎に関する我々の理解は大いに進歩するだろう。
【０００６】
症候群性難聴と非症候群性難聴に関与するいくつかの遺伝子は既に同定されており、Petit［Petit C「Genes responsible for human hereditary deafness: symphony of a thousand（ヒト遺伝性難聴の原因となる遺伝子："千人の交響曲"）」Nature Gent. 1996 14 385-391］やKalatzisおよびPetit［Kalatzis VおよびPetit C「The fundamental and medical impacts of recent progress in research on hereditary hearing loss（遺伝性聴力障害に関する研究における最近の進歩の基礎と医学への影響）」Hum. Mol. Genet. 1998 7 1589-1597］によって概説されている。それらの遺伝子産物には例えば非従来型のミオシンアイソフォーム、α-テクトリン（細胞外マトリックスタンパク質）、ダイアファナス（diaphanous）（細胞骨格と相互作用するタンパク質）、コネキシン26（ギャップ結合タンパク質）およびカリウムチャネルサブユニットをコードする2種類の遺伝子KCNQ1およびKCNE1などが包含される。
【０００７】
イオンチャネルはシグナル伝達の調節ならびに細胞内液および細胞外液のイオン組成の調節に重要な役割を果たす。いくつかの型の聴力損失の根底にはイオンチャネルの突然変異があるのではないかと古くから考えられていた。蝸牛（聴覚器官）の場合、感覚細胞を通る伝達電流はカリウムイオンによって運搬され、このイオンの濃度が内リンパで高いことに依存している。カリウムチャネルサブユニットをコードする遺伝子のうち症候群性遺伝性難聴で突然変異することが見出されているのは、これまでのところ2種類だけ（KCNQ1とKCNE1）である。両遺伝子の遺伝子産物、それぞれKCNQ1（またはKvLQT1）タンパク質とminK（またはIsK）タンパク質は、ヘテロマー型カリウムチャネルを形成する。
【０００８】
KCNQ1は6つの膜貫通ドメインを持ち第5膜貫通ドメインと第6膜貫通ドメインの間に位置するポア領域を持つ電位開口型カリウムチャネルスーパーファミリーの典型的メンバーである。minKタンパク質は膜貫通区間を一つだけ持ち、単独ではカリウムチャネルを形成できない。しかしこのタンパク質はKCNQ1によって媒介される電流をβ-サブユニットとして増進し調整する。これらのヘテロマー型チャネルは心臓活動電位の再分極に関与する。KCNQ1またはKCNE1の一定の突然変異は常染色体優性QT延長症候群（LQTS）（不整脈と突然死をもたらす心臓活動電位の再分極異常を特徴とする疾患）の一形態を引き起こす。興味深いことにいずれかの遺伝子に別の突然変異があると、LQTSと先天性難聴とを併せ持つ劣性ジャーベル・ランゲニールセン（JLN）症候群が起こる。難聴を引き起こすには、KCNQ1/minK電流を、心不整脈を引き起こすには既に十分に低いレベルまで低下させる必要がある。
【０００９】
（発明の要約）
ここに我々はカリウムチャネルタンパク質のKCNQファミリーの新規メンバーであるKCNQ4をクローン化し、特徴づけた。KCNQ4は常染色体優性聴力損失のDFNA2遺伝子座にマッピングされ、DFNA2家系で難聴を引き起こすドミナントネガティブKCNQ4突然変異が同定された。
【００１０】
KCNQ4は非症候群性難聴の根底にある最初のカリウムチャネル遺伝子である。KCNQ4は他のKCNQチャネルサブユニット（特にKCNQ3）と共にヘテロマー型チャネルを形成する。
【００１１】
本発明はカリウムチャネルスーパーファミリーのこの興味深いブランチの特徴づけと利用ならびに蝸牛生理学の理解およびヒト難聴と進行性聴力損失にとって重要な意味を持っている。
【００１２】
したがって本発明はその第1の態様として配列番号1に記載のポリヌクレオチド配列、その相補鎖またはその部分配列と高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズできる核酸配列を有する単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１３】
もう一つの態様として本発明は本発明のポリヌクレオチドによってコードされる組換え生産ポリペプチドを提供する。
【００１４】
第3の態様として本発明は、本発明異種ポリヌクレオチドの取り込みによって遺伝子操作された細胞を提供する。
【００１５】
第4の態様として本発明は少なくとも1つのKCNQ4チャネルサブユニットを含んでなるカリウムチャネルでの活性を阻害または活性化または他の形で調整するための化合物のスクリーニング方法であって、その化合物をKCNQ4チャネルサブユニット含有細胞に作用させる工程およびそのKCNQ4チャネルサブユニット含有細胞の膜電位、電流、カリウム流束または二次的カルシウム流入を監視する工程を含む方法を提供する。
【００１６】
第5の態様として本発明は聴力損失（例えば優性、劣性、その他の聴力損失）、耳鳴および他の神経学的疾患を患っている人々から得られる遺伝物質をKCNQ4遺伝子中の突然変異に関してスクリーニングするための本発明ポリヌクレオチド配列の使用に関する。
【００１７】
第6の態様として本発明は本発明の方法によって同定される化合物に関し、特に以下の疾患または状態を診断、処置または緩和するための前記化合物の使用に関する：耳鳴に関係する疾患、聴力損失（特に進行性聴力損失）、新生児難聴および老人性難聴（高齢者の難聴）ならびにCNSの疾患または有害状態（情動障害、アルツハイマー病、不安、運動失調、CNS損傷（外傷、脳卒中または神経変性病によって起こるもの）、認知欠損、強迫行動、痴呆、抑うつ、ハンチントン病、躁病、記憶欠陥（memory impairment）、記憶障害、記憶機能異常（memory dysfunctions）、動作障害（motion disorders）、運動障害、神経変性疾患、パーキンソン病およびパーキンソン様運動障害、恐怖症、ピック病、精神病、精神分裂病、脊髄損傷、脳卒中ならびに振せんを含む。
【００１８】
第7の態様として本発明は、内因性KCNQ4遺伝子のノックアウト突然変異、突然変異KCNQ4遺伝子による置換もしくは突然変異KCNQ4遺伝子の追加発現を含むトランスジェニック動物、またはKCNQ4遺伝子を過剰発現させるためもしくは突然変異KCNQ4遺伝子を過剰発現させるために遺伝子操作されたトランスジェニック動物を提供する。
【００１９】
第8の態様として本発明は治療用化合物のインビボスクリーニングにおける上記トランスジェニック動物の使用に関する。
【００２０】
本発明の他の目的は以下の詳細な説明と実施例から当業者には明らかになるだろう。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明は新規電位開口型カリウムチャネルおよび同チャネルをコードする遺伝子を提供する。また本発明はそれらの遺伝子で形質転換された細胞、遺伝子突然変異を含むトランスジェニック動物およびKCNQ4含有カリウムチャネルに作用する薬物のインビトロおよびインビボスクリーニングにおける前記形質転換細胞およびトランスジェニック動物の使用も提供する。
【００２２】
ポリヌクレオチド
本発明はその第1の態様として新規ポリヌクレオチドを提供する。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドは配列番号1(SEQ ID NO:1)に記載のポリヌクレオチド配列、その相補鎖またはその部分配列と高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズできる核酸配列を有するようなポリヌクレオチドである。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチドはDNA、cDNAおよびRNA配列ならびにアンチセンス配列を包含し、天然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチドおよび意図的に操作したポリヌクレオチドを包含する。また本発明のポリヌクレオチドは遺伝コードの結果として縮重している配列も包含する。
【００２５】
本明細書に定義する用語「ポリヌクレオチド」は少なくとも10塩基長、好ましくは少なくとも15塩基長の重合体型ヌクレオチドを指す。「単離されたポリヌクレオチド」とは、そのポリヌクレオチドが由来する生物の天然のゲノムでそのポリヌクレオチドのすぐ隣にあるコード配列の両方（すなわち5'末端に一つ、3'末端に一つ）がすぐ隣にはないポリヌクレオチドをいう。したがってこの用語は発現ベクター、自律的に複製するプラスミドもしくはウイルスまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに取り込まれている組換えDNA、または他のDNA配列からは独立した単独の分子（例えばcDNA）として存在する組換えDNAを包含する。
【００２６】
また本発明のポリヌクレオチドには、配列番号1に記載の配列とは1または複数のヌクレオチド位置で相違するヌクレオチド配列を含む対立遺伝子変異体および「突然変異ポリヌクレオチド」も包含される。突然変異ポリヌクレオチドとしては特に、配列番号1に記載のヌクレオチド配列を含むが変異体ポリペプチドの発現が起こるようにその配列が配列番号1とは異なっている本発明のポリヌクレオチドを挙げることができる。突然変異ポリヌクレオチドとしては、1または複数の位置が改変されたアミノ酸配列を持つカリウムチャネルをコードするヌクレオチド配列を有する本発明のポリヌクレオチドを挙げることができる。突然変異ポリヌクレオチドとしては特に、下記表1に定義する保存領域にある1または複数の位置が改変されたアミノ酸配列を有するカリウムチャネルをコードするヌクレオチド配列を有する本発明のポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００２７】
より具体的な一実施形態として、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1の表示でG285S突然変異をもたらすポリヌクレオチド配列、すなわち935〜937位に配列番号1に記載のコドンGGCではなくコドンAGCを持つDNA配列を有する。
【００２８】
ハイブリダイゼーションプロトコール
本発明のポリヌクレオチドは、以下に詳述するように、配列番号1に記載のポリヌクレオチド配列、その相補鎖またはその部分配列と少なくとも中、中/高または高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズできる核酸配列を有するようなポリヌクレオチドである。
【００２９】
好ましい一実施形態として本ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド（好ましくは配列番号2(SEQ ID NO:2)に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド）をコードするDNAに、以下に詳述する少なくとも中、中/高または高ストリンジェンシー条件で、当該断片をハイブリダイズさせるのに十分な少なくとも15塩基長の断片である。
【００３０】
ヌクレオチドプローブと相同DNAまたはRNA配列の間のハイブリダイゼーションを決定するのに適した実験条件では、ハイブリダイズさせるDNA断片またはRNAを含有するフィルターを5×SSC［塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム、Sambrookら著「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989）参照］に10分間予浸し、そのフィルターを5×SSC、5×デンハルト液［Sambrookら（前掲）参照］、0.5×SDSおよび100μｇ/ml変性超音波処理サケ精子DNA［Sambrookら（前掲）参照］の溶液中でプレハイブリダイズした後、濃度10ng/mlのランダムプライム［Feinberg APおよびVogelstein B，Anal. Biochem. 1983 132 6-13］32P-dCTP標識（比活性＞1×109cpm/μg）プローブを含有する同じ溶液中、約45℃で12時間のハイブリダイゼーションを行なう。次にそのフィルターを2×SSC、0.5％SDS中、少なくとも、少なくとも60℃（中ストリンジェンシー条件）、好ましくは少なくとも65℃（中/高ストリンジェンシー条件）、より好ましくは少なくとも70℃（高ストリンジェンシー条件）、さらに一層好ましくは少なくとも75℃（超高ストリンジェンシー条件）の温度で30分間にわたって2回洗浄する。
【００３１】
これらの条件でオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分子はX線フィルムを使って検出できる。
【００３２】
DNA配列ホモロジー
好ましい一態様として、本発明のポリヌクレオチドは配列番号1に記載のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、さらに一層好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％のホモロジーを示す。
【００３３】
本明細書に定義するDNA配列ホモロジーは、第1配列の第2配列からの派生（derivation）を示す２つのDNA配列間の一致度として決定することができる。ホモロジーはGCGプログラムパッケージに含まれるGAP［Needleman SBおよびWunsch CD，Journal of Molecular Biology 1970 48 443-453］などといった当技術分野で公知のコンピュータープログラムにより、そのデフォルトパラメーターを使って、適宜決定できる。
【００３４】
クローン化ポリヌクレオチド
本発明の単離されたポリヌクレオチドとしては特にクローン化ポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００３５】
本明細書に定義する用語「クローン化ポリヌクレオチド」は、DNAのセグメント（これは特にcDNA、すなわちRNAから酵素的に誘導されたものであってよい）をそれ本来の位置から異なる部位に移転してそこで増殖させるために、現在遺伝子操作に使用されている標準的クローニング法に従ってクローン化されたポリヌクレオチドまたはDNA配列を指す。
【００３６】
クローニングは、所望のDNAセグメントの切り出しと単離、そのDNA片のベクター分子への挿入およびその組換えベクターの細胞（この細胞で当該DNAセグメントの複数コピーまたはクローンが複製される）への取り込みによって、mRNAの逆転写によって（逆転写酵素法）ならびにポリメラーゼ転写反応で配列特異的オリゴヌクレオチドとDNAポリメラーゼを使用することによって（PCR法）達成できる。
【００３７】
本発明のクローン化ポリヌクレオチドは「DNAコンストラクト」または「単離されたDNA配列」と呼ぶこともでき、特に相補DNA（cDNA）を挙げることができる。
【００３８】
カリウムチャネルが異なるサブユニットから構成されるヘテロマー型チャネルを形成できることは十分に立証されている。同様に本発明のカリウムチャネルは他のKCNQ（特にKCNQ3）と同時発現させるとそれら他のサブユニットとヘテロマーを形成できることが見出された。またカリウムチャネルは、それらのチャネルを機能的に調整できるまたは細胞内で特定の局在をもたらす非相同サブユニット、例えばKCNE1（以前はminKと呼ばれていた）サブユニットとも会合できる。
【００３９】
したがって好ましい一態様として本発明のポリヌクレオチドをクローン化し、単独で発現させるか、他のサブユニットをコードするポリヌクレオチド、特にKCNQ3チャネルサブユニットをコードするポリヌクレオチドと同時発現させる。
【００４０】
生物学的起源
本発明の単離されたポリヌクレオチドは任意の適当な供給源から得ることができる。好ましい一態様として本発明のポリヌクレオチドは例えば網膜、脳、骨格筋などのcDNAライブラリーからクローン化されるか、それらcDNAライブラリーに基づいて製造される。市販のcDNAライブラリーは例えばStratageneやClontechなどから入手できる。
【００４１】
本発明の単離されたポリヌクレオチドは例えば下記実施例に記載するような当技術分野公知の方法によって得ることができる。
【００４２】
好ましい態様として本発明のポリヌクレオチドは実施例に記載のPCRプライマー（配列番号（SEQ ID NO:）3〜32）を使って得ることができる。
【００４３】
好ましいポリヌクレオチド
好ましい一態様として本発明のポリヌクレオチドは配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列からなる。
【００４４】
もう一つの好ましい態様として本発明のポリヌクレオチドは１または複数の置換を含むKCNQ4チャネルサブユニットをもたらす配列である。
【００４５】
もう一つの好ましい態様として本発明のポリヌクレオチドは以下により詳しく定義する保存領域中に１または複数の置換を含むKCNQ4チャネルサブユニットをもたらす配列である。
【００４６】
より好ましい一態様として本発明のポリヌクレオチドは配列番号1の表示でG285S突然変異をもたらすポリヌクレオチド配列、例えば935〜937位に配列番号1に記載のコドンGGCではなくコドンAGCを持つDNA配列を有する。
【００４７】
また、増幅後に突然変異に関するスクリーニングの対象とすることができる単一のKCNQ4エキソンを増幅するために下記実施例2で使用されるプライマー配列も、本発明の範囲に包含される。
【００４８】
したがってもう一つの好ましい態様として、本発明のポリヌクレオチドは配列番号3〜32に記載のポリヌクレオチド配列のいずれか一つを含んでなるプライマー配列である。
【００４９】
KCNQチャネルは選択的スプラインシングを示すことが多く、したがって同じ遺伝子に由来するアイソフォームとして存在しうることが実証されている。このようなアイソフォームと、それらの派生源となった様々なcDNA配列も、本発明の範囲に包含される。
【００５０】
最後に、ヒト以外の種でKCNQチャネルサブユニットをコードしている遺伝子はヒト遺伝子とはわずかに異なることが見出されている。しかし他の種（例えばマウス、ラット、サル、ウサギなど）の遺伝子も本発明の範囲に包含される。
【００５１】
組換え生産ポリペプチド
もう一つの態様として本発明は、KCNQ4チャネルまたはKCNQ4チャネルサブユニットの電気生理学的および薬理学的特性を持つ実質的に純粋な機能的ポリペプチドに関する。本発明の新規ポリペプチドは本発明のポリヌクレオチドにより、標準的な組換えDNA技術を使って得ることができる。
【００５２】
好ましい一態様として本発明のポリペプチドは、配列番号2に記載のアミノ酸配列およびその生物学的活性断片を含んでなるKCNQ4カリウムチャネルサブユニットである。
【００５３】
この一次アミノ酸配列の改変は、無改変対応ポリペプチドと比較して実質的に等価な活性を持ち、それゆえに親タンパク質の機能的類似物とみなすことができるタンパク質をもたらしうる。このような改変は、例えば部位特異的突然変異導入などのように作為的な改変であっても、自然に起こる改変であってもよく、スプライス変異体、アイソフォーム、他の種に由来するホモログおよび多型を包含し、以下に詳述する変異体KCNQ4/G285Sを包含する。このような機能的類似物も本発明に包含される。
【００５４】
さらに、この一次アミノ酸配列の改変は、親タンパク質の生物学的活性を保っていないタンパク質、例えばドミナントネガティブ型などをもたらす場合もある。ドミナントネガティブタンパク質は野生型ポリペプチドに結合するか、そうでなければ野生型ポリペプチドと通常機能的に相互作用する調節物質（例えば上流または下流成分など）を封鎖することによって、野生型タンパク質を妨害しうる。このようなドミナントネガティブ型も本発明に包含される。
【００５５】
本発明では「変異体ポリペプチド」という用語は、配列番号2に記載の配列とは1または複数の位置で相違するアミノ酸配列を有するポリペプチド（またはタンパク質）を意味する。このような変異体ポリペプチドには上記の改変ポリペプチドならびに保存的置換、スプライス変異体、アイソフォーム、他の種に由来するホモログおよび多型が包含され、変異体KCNQ4/G285S（すなわちKCNQ1番号系でKCNQ4/G333S）が包含される。
【００５６】
本明細書に定義する用語「保存的置換」は生物学的に類似する別の残基によるアミノ酸残基の置換を表す。保存的置換の例としてはイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの疎水性残基同士の置換または極性残基同士の置換、例えばアルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換もしくはグルタミンによるアスパラギンの置換などがある。保存的置換という用語は、当該置換ポリペプチドに対して産生させた抗体が無置換ポリペプチドとも免疫反応するという条件で、無置換親アミノ酸残基の代わりに置換アミノ酸残基を使用することも包含する。
【００５７】
また、増幅後に突然変異に関するスクリーニングの対象とすることができる単一のKCNQ4エキソンを増幅するために下記実施例2で使用されるプライマー配列によってコードされるオリゴペプチドも、本発明の範囲に包含される。
【００５８】
KCNQ1付番体系
本発明では既成の1文字記号を使ってアミノ酸残基（および核酸塩基）を特定する。
【００５９】
本発明ポリペプチドのアミノ酸配列を既知ポリペプチドのアミノ酸配列と整列させることにより、アミノ酸配列が分かっている任意のKCNQチャネルタンパク質中の任意のアミノ酸に1つのアミノ酸位置番号を明瞭に割り当てることが可能な特有のアミノ酸付番体系を使用することができる。
【００６０】
そのような整列を下記表1に示す。ClustalXコンピュータ整列プログラム［Thompson JD，Gibson TJ，Plewniak F，Jeanmougin FおよびHiggins DG「The ClustalX windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools（ClustalXウィンドウズインターフェース：品質分析ツールを援用した多重配列整列のための自由度の高い戦略）」Nucleic Acids Res. 1997 25（24）4876-82］とそのデフォルトパラメーターとを使って、本発明ポリペプチド（hKCNQ4）のアミノ酸配列および既知ポリペプチドhKCNQ2〜3のアミノ酸配列を、既知ポリペプチドhKCNQ1（以前はKvLQT1と呼ばれていた）のアミノ酸配列と、hKCNQ1のアミノ酸配列を基準として整列させる。本発明ではこの付番体系をKCNQ1付番体系と呼ぶ。
【００６１】
本発明によって製造または企図される様々なタンパク質変異体を記載するにあたって参照が容易なように「元のアミノ酸/位置/置換アミノ酸」という命名法を応用した。
【００６２】
この命名法によれば333位でのセリンによるグリシンの置換は「G333S」と表される。
【００６３】
同じ位置でのグリシンの欠失は「G333★」と表される。
【００６４】
追加のアミノ酸残基（この例ではリジン）の挿入は「G333GK」または「★334K」（この付番体系を確立する際に使用したアミノ酸配列にはこの位置のための位置が存在しないと想定）と表すことができる。
【００６５】
確立された付番体系に存在する位置だが実際にはそこにアミノ酸残基が存在しない位置でのアミノ酸残基（この例ではバリン）の挿入は「-301V」と表すことができる。
【００６６】
表１
CLUSTAL X多重配列整列
KCNQ1番号系
【００６７】
【表１】
0004711512.tif 000002
【００６８】
0004711512.tif 000003
【００６９】
0004711512.tif 000004
【００７０】
hKCNQ1：ヒトKCNQ1［Wang，Qら，Nature Genet. 1996 12 17-23］（SEQ ID No:39）
hKCNQ2：ヒトKCNQ2［Biervertら，Science 1998 279 403-406］（SEQ ID No:40）
hKCNQ3：ヒトKCNQ3［Schroederら，Nature 1998 396 687-690］（SEQ ID No:41）
hKCNQ4：ヒトKCNQ4；本発明のタンパク質（SEQ ID No:2）
-：この位置にはアミノ酸がない
★：単一の完全に保存された残基を持つ位置（保存領域）を示す。
【００７１】
生物学的活性
本発明のポリヌクレオチドはKCNQ4と名付けられたカリウムチャネルサブユニットをコードする。蝸牛ではこれが感覚外有毛細胞で差次的に発現される。常染色体優性聴力損失を持つ家系ではこの遺伝子中の突然変異がKCNQ4ポア領域内の残基を変化させる。これは、それが強いドミナントネガティブ効果を発揮する野生型KCNQ4の外向き整流カリウム電流を消失させる。
【００７２】
イオンチャネルは薬物の優れた標的である。KCNQ4またはKCNQ4を含有するヘテロマーは耳鳴の処置および進行性聴力損失の予防または処置にとってとりわけ興味深い標的になりうる。
【００７３】
遺伝病におけるKCNQチャネル
あらゆる既知KCNQ遺伝子でその突然変異がヒトの疾患につながることは注目に値する。KCNQ1（KvLQT1）中の突然変異は常染色体優性QT延長症候群（LQTS）の原因となり、両対立遺伝子上に存在する場合は心不整脈に加えて難聴もその症状に含まれるジャーベル・ランゲニールセン（JLN）症候群を引き起こす。Ｍチャネルに相当すると思われるヘテロマーを形成するKCNQ2またはKCNQ3中の突然変異は良性家族性新生児痙攣（BFNC）を引き起こす。本発明はこのリストにKCNQ4とそれに関連する常染色体優性難聴とを付け加えるものである。
【００７４】
KCNQ4は、その機能の損失が難聴をもたらすKCNQチャネルとしては、KCNQ1に続いて2番目のチャネルである。
【００７５】
したがって本発明の好ましい一態様として、KCNQ4遺伝子中の上記突然変異に関係する疾患に作用する薬物のスクリーニングに、突然変異ポリヌクレオチドを使用することができる。
【００７６】
KCNQサブユニットによって形成されるヘテロマー
今までに記載されたKCNQチャネルは生理学的にはヘテロマーとして機能する。KCNQ1はKCNE1（以前はminKと呼ばれていた）と会合し、KCNQ2とKCNQ3はいくつかの神経伝達物質によって調節されるニューロン興奮性の重要な決定因子であるＭ電流の基礎をなしている。
【００７７】
他のKCNQチャネルサブユニットと同様にKCNQ4も他のサブユニット、例えばKCNE1または他のKCNQチャネルサブユニット（特にKCNQ3）と相互作用できる。ホモマー型KCNQ3による電流は非常に小さく、アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞バックグラウンド電流と区別できないことが多い。KCNQ3をKCNQ4と同時発現させたところ電流強度が著しく増加した。重要なことに、ヘテロマー型KCNQ3/KCNQ4チャネルはホモマー型KCNQ4チャネルより速く活性化し、電位依存性はより負の電位方向にシフトし、電流は異なる薬物感受性を示した。
【００７８】
抗体
本発明のポリペプチドはこれらのポリペプチドのエピトープに対して免疫反応性を持つまたは結合する抗体を生産するために使用できる。本質的に様々な特異性を持つモノクローナル抗体の集まりから構成される抗体および個別のモノクローナル抗体調製物を提供できる。
【００７９】
ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の製造は当技術分野では周知である。ポリクローナル抗体は特に、Greenら「Production of Polyclonal Antisera（ポリクローナル抗血清の生産）」Immunochemical Protocols（Manson編，Humana Press，1992）の1〜5頁や、Coliganら「Production of Polyclonal Antisera in rabbits, rats, Mice and Hamsters（ウサギ、ラット、マウスおよびハムスターにおけるポリクローナル抗血清の生産）」Current Protocols in Immunology（1992）の2.4.1節などに記載されている方法で得ることができる（これらのプロトコールは参照により本明細書に組み込まれるものとする）。
【００８０】
モノクローナル抗体は特に、KohlerおよびMilstein，Nature 1975 256 495、Coliganら，Current Protocols in Immunology（1992）の2.5.1〜2.6.7節、Harlowら，Antibodies：A Laboratory Manual（コールドスプリングハーバー出版局、1988）の726頁などに記載されている方法で得ることができる（これらのプロトコールは参照により本明細書に組み込まれるものとする）。
【００８１】
簡単に述べるとモノクローナル抗体は例えばマウスに抗原を含む組成物を注射し、抗体産生が起こっていることを血清試料の採取によって確認し、Bリンパ球を得るために脾臓を摘出し、そのBリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを作成し、そのハイブリドーマをクローニングし、前記抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、そのハイブリドーマ培養物から抗体を単離することによって得ることができる。
【００８２】
モノクローナル抗体は例えばプロテインＡセファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどといった様々な確立した技術によってハイブリドーマから単離、精製できる。例えばColiganら，Current Protocols in Immunology（1992）の2.7.1〜2.7.12節と2.9.1〜2.9.3節や、Barnesら「Purification of Immunoglobulin G (IgG)（免疫グロブリンG（IgG）の精製）」Methods in Molecular Biology（Humana Press，1992）第10巻の79〜104頁を参照されたい。
【００８３】
上記ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、要すれば、その抗体を産生させる際に使用したポリペプチドを結合したマトリックスに抗体を結合させ、同マトリックスから抗体を溶出させることなどによって、さらに精製できる。
【００８４】
本発明のポリペプチドに結合する抗体は、完全なポリペプチドまたは免疫抗原として関心がもたれる小ペプチドを含有する断片を使って製造できる。動物の免疫化に使用するポリペプチドは組換えDNA技術または化学合成によって得ることができ、要すれば担体タンパク質に結合してもよい。ペプチドに化学結合される担体タンパク質でよく使用されるものにはキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（BSA）、破傷風トキソイドなどがある。次に結合させたペプチドを使って動物を免疫化する。この動物としては特にマウス、ラット、ハムスターまたはウサギを挙げることができる。
【００８５】
遺伝子操作された細胞
第3の態様として本発明は本発明異種ポリヌクレオチドの取り込みによって遺伝子操作された細胞を提供する。本発明の細胞としては特に、上に定義したKCNQ4チャネルサブユニットを一過性もしくは安定に発現するか、過剰発現するか、同時発現するように遺伝子操作された細胞を挙げることができる。一過性導入と安定導入の方法は当技術分野では知られている。
【００８６】
本発明のポリヌクレオチドは発現ベクター（例えばプラスミド、ウイルスまたは他の発現媒体）に挿入し、発現制御配列に、それら発現制御配列に適合する条件でコード配列の発現が達成されるように、ライゲーションによって機能的に連結することができる。適切な発現制御配列にはプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン、イントロンのためのスプライスシグナルおよび停止コドン（いずれもmRNAの適切な翻訳が可能なように本発明ポリペプチドの正しい読み枠に維持されたもの）が包含される。発現制御配列にはリーダー配列や融合パートナー配列などといった追加成分を含めてもよい。
【００８７】
プロモーターとしては特に構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを挙げることができる。細菌系でのクローニングにはバクテリオファージγのpL、plac、ptrp、ptac（ptrap-lacハイブリッドプロモーター）などといった誘導性プロモーターを使用できる。哺乳類系でのクローニングには哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター、例えばTKプロモーターもしくはメタロチオネインプロモーター、または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター、例えばレトロウイルス末端反復配列、アデノウイルス後期プロモーターもしくはワクシニアウイルス7.5Kプロモーターなどを使用できる。組換えDNA法または合成法によって得られるプロモーターを使って本発明ポリヌクレオチドの転写に備えてもよい。
【００８８】
適切な発現ベクターは通例、発現起点（origin of expression）、プロモーターおよび形質転換細胞の表現型選択を可能にする特有の遺伝子を含み、細菌発現用のT7系発現ベクター［Rosenbergら，Gene 1987 56 125］、哺乳動物細胞発現用のpMSXND発現ベクター［LeeおよびNathans，J. Biol. Chem. 1988 263 3521］、昆虫細胞発現用のバキュロウイルス由来ベクターおよび卵母細胞発現ベクターPTLN［Lorenz C，Pusch MおよびJentsch TJ「Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties（新規な特性を持つヘテロ多量体型CLC塩素チャネル）」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 93 13362-13366］のようなベクターを包含する。
【００８９】
好ましい一態様として本発明の細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞、卵母細胞または酵母細胞である。より好ましい態様として本発明の細胞はヒト胎児腎臓（HEK）細胞、HEK293細胞、BHK21細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）卵母細胞（XLO）、COS細胞またはKCNQカリウムチャネルを発現できる他の任意の細胞株である。
【００９０】
本発明の細胞が真核細胞である場合、本発明の異種ポリヌクレオチドの取り込みは特に感染（ウイルスベクターを使用）、トランスフェクション（プラスミドベクターを使用）またはリン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクションまたは当技術分野公知の他の物理化学的方法によって行なうことができる。
【００９１】
さらにもう一つの好ましい態様では、KCNQ4およびKCNQ1チャネルサブユニット、KCNQ4およびKCNQ2チャネルサブユニット、KCNQ4およびKCNQ3チャネルサブユニット、KCNQ4およびKCNQ1およびKCNQ2チャネルサブユニット、KCNQ4およびKCNQ1およびKCNQ3チャネルサブユニット、KCNQ4およびKCNQ2およびKCNQ3チャネルサブユニットまたはKCNQ4およびKCNQ1およびKCNQ2およびKCNQ3チャネルサブユニットが同時発現するように、本発明の細胞を遺伝子操作する。
【００９２】
KCNQ4活性化合物
もう一つの態様として本発明は1または複数のKCNQ4サブユニットを含有するカリウムチャネルに結合しそこで活性を示すことができる化合物に関する。本発明ではそのような化合物をKCNQ4活性化合物という。本発明のKCNQ4活性化合物は、100μM未満、好ましくは10μM未満、より好ましくは1μm未満の濃度で活性を示す。本発明のKCNQ4活性化合物はその最も好ましい態様として低マイクロモル濃度およびナノモル濃度域で活性を示す。
【００９３】
本発明のKCNQ4活性化合物は治療能力を持ち、医薬組成物の製造に使用できる。
【００９４】
本発明のKCNQ4活性化合物は特に、以下の疾患または状態の診断、処置、予防または緩和に使用できる：耳鳴に関係する疾患、聴力損失（特に進行性聴力損失）、新生児難聴および老人性難聴（高齢者の難聴）ならびにCNSの疾患または有害状態（情動障害、アルツハイマー病、不安、運動失調、CNS損傷（外傷、脳卒中または神経変性病によって起こるもの）、認知欠損、強迫行動、痴呆、抑うつ、ハンチントン病、躁病、記憶欠陥、記憶障害、記憶機能異常、動作障害、運動障害、神経変性疾患、パーキンソン病とパーキンソン様運動障害、恐怖症、ピック病、精神病、精神分裂病、脊髄損傷、脳卒中および振戦を含む）。
【００９５】
現在2つの化合物が同定されている。したがって好ましい態様として本発明は上記の疾患を診断、処置、予防または緩和するための医薬組成物の製造に使用される1,3-ジヒドロ-1-フェニル-3,3-ビス(4-ピリジルメチル)-2H-インドール-2-オン（リノピルジン）および10,10-ビス(4-ピリジニルメチル)-9(10H)-アントラセノン（XE991）を提供する。
【００９６】
薬物のスクリーニング
さらなる態様として本発明はKCNQ4活性化合物、すなわち1または複数のKCNQ4サブユニットを含有するカリウムチャネルに結合しそこで活性を示す能力を持つ化合物に関するスクリーニング法を提供する。決定される活性としては阻害活性、刺激活性または他の調節活性を挙げることができる。特にKCNQ4活性化合物としては、細胞の分子的特徴（例えばイオン流束、酵素活性化ならびにcAMP、cADP、cGMPおよびcGDPなどの環状ヌクレオチドの変化など）の変化を引き起こす二次メッセンジャー応答を誘導するものが挙げられる。
【００９７】
したがって本発明はもう一つの態様として、KCNQ4サブユニットを含んでなるヒトカリウムチャネルの機能的リガンドを同定する方法であって、細胞にKCNQ4チャネルサブユニットをコードする1または複数の本発明ポリペプチドをトランスフェクトし、レセプターへのリガンドの結合によってこれらの細胞で起こるシグナル伝達経路に対する影響を、レポーター系によって検出することからなる方法を提供する。
【００９８】
そのような化合物は下記の方法の一方または両方によって同定できる。
【００９９】
結合試験
結合試験は通常、標的を、標識した選択的アゴニスト（結合剤）と結合させて、標識された複合体を形成させた後、その複合体に試験化合物を添加した時に起こる置換の程度を決定することによって行なわれる。
【０１００】
具体的一態様として本発明は、少なくとも1つのKCNQ4チャネルサブユニットを含んでなるカリウムチャネルに結合する能力に関して化合物をスクリーニングする方法であって、（i）KCNQ4チャネルサブユニット含有細胞にKCNQ4結合剤を作用させて、そのKCNQ4チャネルサブユニット含有細胞との複合体を形成させ、（ii）工程（i）の複合体に試験対象化合物を作用させ、（iii）KCNQ4チャネルサブユニット含有細胞との複合体からのKCNQ4結合剤の置換を検出するという各工程を含む方法を提供する。
【０１０１】
KCNQ4チャネルサブユニット含有細胞は上述した本発明の細胞であることが好ましい。
【０１０２】
KCNQ4結合剤は放射標識された1,3-ジヒドロ-1-フェニル-3,3-ビス(4-ピリジルメチル)-2H-インドール-2-オン（リノピルジン）または10,10-ビス(4-ピリジニル-メチル)-9(10H)-アントラセノンであることが好ましい。
【０１０３】
さらに一層好ましい態様では、結合剤が3Hで標識され、KCNQ4チャネルサブユニット含有細胞との複合体からのKCNQ4結合剤の置換が通常の液体シンチレーション計数法で放射活性量を測定することによって検出される。
【０１０４】
活性試験
KCNQ4チャネルアゴニストは様々な形でカリウムチャネルに作用しうる。アゴニストは特に阻害活性、刺激活性または他の調節活性を示しうる。
【０１０５】
具体的一態様として本発明は1または複数のKCNQ4サブユニットを含有するカリウムチャネルでの活性を決定する方法を提供する。この方法ではKCNQ4チャネルサブユニット含有細胞に試験対象化合物を作用させ、そのKCNQ4チャネルサブユニット含有細胞（好ましくは上述のように遺伝子操作された細胞）の膜電位、電流、カリウム流束または二次的カルシウム流入を監視することによって活性を検出する。
【０１０６】
膜電位と電流は、パッチクランプ法を含む電気生理学的方法、例えば膜電流固定技術や二電極膜電位固定技術などによって、または蛍光法などの分光法によって監視できる。
【０１０７】
好ましい一態様ではKCNQ4チャネルサブユニット含有細胞の膜電位の監視がパッチクランプ法によって行なわれる。
【０１０８】
もう一つの好ましい態様では、KCNQ4チャネルサブユニット含有細胞の膜電位の監視が例えば蛍光法などを用いて分光法によって行なわれる。より具体的な一態様ではKCNQ4チャネルサブユニット含有細胞を、試験化合物の添加によって起こる細胞の膜電位の変化の決定を可能にする膜電位指示薬と混合する。膜電位指示薬としては特に蛍光指示薬、好ましくはDIBAC4（3）、DiOC5(3)およびDiOC2(3)を挙げることができる。
【０１０９】
さらにもう一つの好ましい態様では、KCNQ4チャネルサブユニット含有細胞の膜電位の監視が、例えばFLIPRアッセイ（Fluorescence Image Plate Reader（蛍光画像プレートリーダー）、Molecular Devicesから入手できる）などを使った分光法によって行なわれる。
【０１１０】
遺伝物質のスクリーニング
さらなる態様として本発明は遺伝物質のスクリーニングにおける本発明ポリヌクレオチド配列の使用に関する。この方法により本発明のポリヌクレオチドと同一または相同な遺伝子を保有する個体を同定できる。
【０１１１】
本発明のスクリーニングでは本発明のポリヌクレオチドまたはその任意の断片もしくは部分配列、特に配列番号3〜32に記載のポリヌクレオチド配列のいずれかを使用する。突然変異遺伝子を保有する個体の同定には、配列番号1に記載のポリヌクレオチドの突然変異型、特にKCNQ4/G285S変異体をもたらす突然変異を保持するポリヌクレオチド配列を使用することが好ましい。
【０１１２】
本発明のスクリーニング法では実際に使用する方法に応じて短い配列だけを使用する必要がある。SSCAには数百塩基対が必要であり、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションまたはPCRハイブリダイゼーションに必要な配列は約10〜約50塩基対に過ぎないだろう。
【０１１３】
より具体的な一態様として、下記実施例2で単一のKCNQ4エキソンの増幅に使用されるプライマー配列（配列番号3〜32に記載）を、突然変異のスクリーニングに使用できる。
【０１１４】
スクリーニングはハイブリダイゼーション、SSCA解析、アレイ技術（DNAチップ技術）を含む従来の方法で行なうことができる。上述したハイブリダイゼーションプロトコールは本発明のスクリーニングでの使用に適したプロトコールの代表例である。
【０１１５】
したがって本発明はその一態様として、本発明のポリヌクレオチドを同定、位置特定、単離または増幅する方法であって、本発明のポリヌクレオチドプライマー、特に配列番号3〜32に記載のポリヌクレオチドプライマーのいずれかをプローブとして使用する方法を提供する。この方法は従来の分子生物学的技術、例えば下記実施例で使用し説明する方法などを使って行なうことができる。
【０１１６】
好ましい一態様として本方法は例えば下記実施例に記載するように従来のPCR技術を使って遺伝子増幅を行なうために使用される。
【０１１７】
トランスジェニック動物
トランスジェニック動物モデルはインビボで治療用化合物をスクリーニングする手段になる。トランスジェニック動物の樹立は特にKCNQ4/DFNA2難聴の病態生理を完全に解明するための薬物のスクリーニングに役立ちうる。これらの動物は何十年もかけてゆっくり発症する老人性難聴というよく見られる状態のモデルとしても役立ちうる。KCNQ4は脳でも発現するので、CNS障害（例えば癲癇）に有効な薬物のスクリーニングにも役立ちうる。
【０１１８】
導入遺伝子とは、細胞に人工的に挿入されてその細胞から発生する生物のゲノムの一部になる任意のポリヌクレオチド片をいう。そのような導入遺伝子にはそのトランスジェニック生物にとって部分的にまたは完全に異種（すなわち外来）である遺伝子を含めることができ、またそのような導入遺伝子はその生物の内因性遺伝子に相同な遺伝子に相当してもよい。
【０１１９】
トランスジェニック動物とは、人工的に挿入されたポリヌクレオチド配列を含んでいる細胞であってその細胞がその細胞から発生するトランスジェニック生物の一部になる細胞を保有する任意の生物をいう。そのような導入遺伝子はそのトランスジェニック動物にとって部分的にまたは完全に異種の遺伝子であってよい。トランスジェニックマウスは本発明の好ましい一態様に相当するが、例えばトランスジェニックげっ歯類動物（例えばハムスター、モルモット、ウサギおよびラット）ならびにトランスジェニックブタ、ウシ、ヒツジおよびヤギなどといった（ただしこれらに限らない）他のトランスジェニック動物も標準的技術で作出することができ、本発明に包含される。
【０１２０】
好ましくは、導入遺伝子は核ゲノムに人工的に挿入される。
【０１２１】
ノックアウト動物とノックイン動物
トランスジェニックノックアウト動物モデルは、内因性遺伝子への挿入の結果として当該遺伝子の機能損失を引き起こすKCNQ4遺伝子由来のゲノム配列を含有するコンストラクトを使った胚性幹細胞の相同組換えによって開発できる。
【０１２２】
ノックアウト突然変異とは、ポリヌクレオチド配列の改変であって通常そこにコードされているポリペプチドの生物学的活性を低下させるものをいう。真のノックアウトモデルを作出するには、発現されるポリペプチドの生物学的活性を非突然変異遺伝子に対して少なくとも80％は低下させるべきである。突然変異としては特に置換、欠失、フレームシフト突然変異またはミスセンス突然変異を挙げることができる。突然変異は置換、挿入または欠失であることが好ましい。
【０１２３】
KCNQ4の役割を生物レベルでさらに評価するには、完全なKCNQ4遺伝子を欠く動物または突然変異したKCNQ4遺伝子を保有する動物（好ましくはマウス）の作出が望ましい。
【０１２４】
ノックアウトモデルの作出に使用できる置換型標的ベクターは、例えば129/Svなどのマウス系統由来の同系ゲノムクローン（Stratagene Inc.、カリフォルニア州ラホーヤ）を使って構築することができる。標的ベクターを胚性幹（ES）細胞の適当な派生株にエレクトロポレーションによって導入することで、著しく切断された形のKCNQ4遺伝子を保有するES細胞株を作出することができる。次にその標的細胞株をマウス胞胚期胚に注入してキメラファウンダーマウスを作出することができる。ヘテロ接合型子孫を交配してホモ接合性を得ることができる。
【０１２５】
DFNA2で観察される緩徐進行性聴力損失は一つの対立遺伝子からドミナントネガティブ突然変異体の発現を必要としうるので、野生型KCNQ4遺伝子がこの突然変異遺伝子で置換されているノックイン動物を作出することも望ましいかもしれない。
【０１２６】
過剰発現に関する動物モデルは、標準的技術によってゲノムに1または複数の本発明ポリヌクレオチド配列を組込むことによって作出できる。
【０１２７】
核酸の分子操作を伴なう本明細書に記載の手法は当業者には知られており、例えばFredrick MAら［Fredrick MAら，Short Protocols in Molecular Biology、John Wiley and Sons，1995］やSambrookら［Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版，コールドスプリングハーバー研究所，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，1989］によって、またAlexandra LJ編，Gene Targeting: A practical approach（オックスフォード大学出版局，オックスフォード・ニューヨーク・東京，1993）などに記載されている。
【０１２８】
図面の簡単な説明
本発明を添付の図面を参照して、さらに説明する。
【０１２９】
図１はKCNQ4電流の電気生理学的特性を示す。
【０１３０】
図1A：KCNQ4 cRNAを注入したアフリカツメガエル卵母細胞からの二電極膜電位固定電流トレース。−60mVの保持電位から出発して細胞を−80〜＋60mVの電位に＋10mVステップで4秒間固定した後、−30mVへの定テストパルスを与えた。
【０１３１】
図1B：異なる電位におけるKCNQ4の不活化挙動を示す電流トレース。＋40mVで持続時間3.5秒の活性化電位パルスの後、細胞を＋40〜−120mVの電位に−10mVステップで固定した。
【０１３２】
図1C：（A）に見られるような電流のテール電流解析から決定される電位の関数としての見かけの開口確率（popen）。ボルツマン関数のフィットによれば、半値popenは（−10.0±1.2)mVで記録され、見かけのゲート電荷は1.4±0.1である（2つの卵母細胞バッチからn＝14、±S.E.M.）。
【０１３３】
図1D：ND98を参照溶液とした細胞外K+濃度による逆転電位のシフト。総一価陽イオン濃度を100mMとし、ND100溶液とKD100溶液を混合することによって表記のK+濃度を得た。46.7±0.9mV/decadeの逆転電位シフトはK+に選択的なチャネルを示す（3つの卵母細胞バッチからn＝18、±S.E.M.）。外部K+を他の陽イオンで置換して次の透過性比を得た：PK/PNa＝52.3±4.4、PK/PCs＝7.8±0.7およびPK/PRb＝0.94±0.03（透過性序列Rb+〜K+＞Cs+＞＞Na+、3つの卵母細胞バッチからn＝15、±S.E.M.）。
【０１３４】
図1E：WT KCNQ4（太い実線）、WT KCNQ4とKCNQ4G285S突然変異体の1：1同時注入（細い実線）およびKCNQ4G285S突然変異体（点線）の電流トレース。KCNQ4G285S電流は水注入対照卵母細胞と区別できなかった。細胞を−60mVの保持電位から＋40mVに6秒間電位固定した後、−30mVステップを行なった。
【０１３５】
図1F：（1E）と同様にして卵母細胞を＋40mVに4秒間固定した後に測定し数回の実験から平均した平均電流（4つの卵母細胞バッチからｎ＝20〜35、±S.E.M.）。
【０１３６】
図2AはKCNQ1と同時発現したKCNQ4を表す。
【０１３７】
図2BはKCNQ2と同時発現したKCNQ4を表す。
【０１３８】
図2CはKCNQ3と同時発現したKCNQ4を表す。
【０１３９】
図2Dは誘導ドミナントネガティブ突然変異体（KCNQ1G219S、KCNQ2G279S、KCNQ3G318S）を表す（3つの卵母細胞バッチからn＝10〜31、±S.E.）。KCNQ4をそれぞれKCNQ3またはKCNQ3G318Sと同時注入した場合の変化した活性化動態を示す（C）と同様の実験で得られる代表的電流。−60mVの保持電位から電位を＋40mVに4秒間固定した後、−30mVへのステップを行なった。二指数関数フィット（two-exponential fits）から得られた時定数と振幅はKCNQ4：t1＝360ms、A1＝-4.9μA、t2＝1700ms、A2＝−0.34μA；KCNQ3＋KCNQ4：t1＝120ms、A1＝−6.3μA、t2＝560ms、A2＝−1.3μA。
【０１４０】
図2E：テール電流解析から決定されるKCNQ4およびKCNQ3 cRNAを同時注入した卵母細胞からの電流に関する電位の関数としての見かけのpopen（四角、太い実線）。このデータへのボルツマン関数のフィットによれば、半値popenはV0.5＝（−19.1±2.0）mVで達成され、見かけのゲート電荷は1.5±0.2である（3つの卵母細胞バッチからn＝23、±S.E.M.）。参考にKCNQ4に関するpopen曲線も示してある（丸、細い実線）。
【０１４１】
図2F：典型的M電流電位プロトコールでKCNQ4およびKCNQ4 cRNAを同時注入した卵母細胞から記録された電流トレース。−30mVの保持電位から出発して細胞を−30mV〜−90mVの電位に−10mVステップで1秒間、漸進的に過分極させた。
【０１４２】
図2G：KCNQ4（n＝10、±S.E.M.）とKCNQ3＋KCNQ4（n＝6、±S.E.M.）に対する200μMリノピルジンの弁別的効果。＋40mVで電流を測定し、リノピルジンで残留する電流率（％）を示す。リノピルジンを添加するとKCNQ4電流の場合は約1分後、KCNQ3＋KCNQ4電流の場合は約3分後に定常状態阻害に達した。
（実施例）
下記の実施例を参照して本発明をさらに例証するが、下記の実施例は特許請求の範囲に記載する本発明の範囲をいかなる形でも限定するものではないものとする。
【０１４３】
実施例１
KCNQ4 cDNAのクローニングと特徴づけ
KCNQ3カリウムチャネル部分cDNAをプローブとして、ヒト網膜cDNAλファージライブラリー（Clontech、＃HL1132a）をスクリーニングして、KCNQカリウムチャネルに相同なタンパク質断片をコードする約1kbのcDNAを単離した。これは既知のメンバーKCNQ1（KvLQT1）、KCNQ2およびKCNQ3とは異なっていた。我々はこの新規遺伝子をKCNQ4と名付けた。上記のcDNAライブラリーを再スクリーニングし、Marathonキット（Clontech）とヒト骨格筋cDNAとを使ったRACE（rapid amplification of cDNA ends）実験で5'末端を伸張することにより、全オープンリーディングフレームを包含するオーバーラップしたcDNA群を得た。完全なcDNAを組立て、卵母細胞発現ベクターPTLN［Lorenz C，Pusch MおよびJentsch TJ「Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties（新規な特性を持つヘテロ多量体型CLC塩素チャネル）」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 93 13362-13366］にクローニングした。
【０１４４】
このcDNAは77kDaの予想分子量を持つ695アミノ酸のポリペプチドをコードする（配列番号2）。KCNQ1、KCNQ2およびKCNQ3に対する全体的アミノ酸一致度はそれぞれ38％、44％および37％である。このポリペプチドはこれらのタンパク質と共に全体として電位開口型カリウムチャネルスーパーファミリーの独特なブランチを形成する。この遺伝子ファミリーの典型的メンバーとして、KCNQ4は6つの予想膜貫通ドメインを持ちかつ膜貫通ドメインS5とS6の間にPループを持つ。同一のまたは相同なサブユニットの四量体であるカリウムチャネルでは、これらの高度に保存されたPループ4つが結合してイオン感受性ポアを形成する。他のKCNQチャネルと同様に、KCNQ4は同タンパク質の約半分を占める長い予想細胞質カルボキシ末端を持つ。KCNQ1、2および3のカルボキシ末端に存在する保存領域はKCNQ4にも存在する（ほぼエキソン12に相当する）。
【０１４５】
KCNQ4の配列から、プロテインキナーゼCによるリン酸化を受ける可能性のある部位が数ヶ所予測される。しかしKCNQ1およびKCNQ2とは対照的に、アミノ末端のcAMP依存的リン酸化コンセンサス部位は無い。
【０１４６】
ヒト多組織ノーザンブロット（Multiple Tissue Northern Blot、Clontech、#7760-1）を、KCNQ4の749bp EcoRI/PmlI cDNA断片でプローブした。この断片はRediprime標識キット（Amersham）を使って32Pで標識した。ハイブリダイゼーションはExpressHyb溶液中で、その製造者（Clontech）の使用説明に従って行なった。次にフィルターをKodak BioMaxフィルムに4日間露光した。
【０１４７】
ヒト組織におけるKCNQ4発現のノーザン解析により、心臓、脳および骨格筋に約5kbのかすかなバンドが明らかになった。一部の組織にはこれより大きいバンドもあった。露光時間を長くすると、腎臓と膵臓を含む他の組織にも、さらに弱い約5kbバンドが検出された。
【０１４８】
実施例２
ゲノム構造とDFNA2遺伝子座への染色体マッピング
全KCNQ4コード領域を含有するPACを単離した。KCNQ4のゲノム構造を確定した（配列番号1）。
【０１４９】
ゲノム構造はゲノムDNAからPCR法によって確定した。個々のKCNQ4エキソンと隣接する短いイントロン配列とをヒトゲノムDNAからイントロンオリゴヌクレオチドプライマーを使って標準的PCR技術によって増幅した。
【０１５０】
増幅には以下のイントロンプライマー対を使用した（プライマーは全て5'→3'方向に記載。括弧内はPCR産物のサイズ）。
【０１５１】
【外１】
0004711512.tif 000005
【０１５２】
エキソンと隣接するイントロンの配列はGenBankに登録されている（受け入れ番号AF105203〜AF105216）。
【０１５３】
常染色体優性難聴を持つリンクのない（unlinked）家系をスクリーニングするために、ポアおよび隣接する膜貫通ドメインをコードするエキソン4〜7だけを増幅した。なぜならこれらは突然変異を内包する可能性が最も高いと考えられるからである。増幅とアガロースゲル精製後に、増幅プライマーとABI377自動DNAシーケンサーを使ってPCR産物を直接配列決定した。
【０１５４】
高度に保存された膜貫通ブロックS1〜S6は、KCNQ2およびKCNQ3の場合と同じ境界を持つ6つのエキソン（エキソン2〜7）によってコードされることがわかった。KCNQ1ではさらにもう一つのイントロンがドメインS4をコードする配列を中断している。KCNQ遺伝子のエキソン-イントロン構造は、これらのタンパク質のあまり保存されていないカルボキシ末端で最も多く相違している。
【０１５５】
ヒト染色体へのハイブリダイゼーションによってKCNQ4は1p34にマッピングされた。
【０１５６】
KCNQ4のコード配列を含有するPACをイントロンKCNQ4オリゴヌクレオチドプライマーとPCRを使って単離した。これを使ってFISH（Genome Systems）によりKCNQ4の位置を1p34に特定した。次に上記イントロンプライマーのいくつかと公表されているSTSマーカーとを使って個々のYACクローンからのPCR増幅によりKCNQ4をホワイトヘッドコンティグ（Whitehead Contig）WC1.10にマッピングした。
【０１５７】
この領域にはいくつかの疾患がマッピングされている。これにはDFNA2、優性進行性聴力損失の遺伝子座が含まれる。聴覚メカノトランスダクションにおけるK+ホメオスタシスの重要な役割から、本発明者らはKCNQ4をDFNA2の優れた候補遺伝子とみなした。DFNA2遺伝子座はマーカーD1S255とD1S193の間にマッピングされている。そこで本発明者らはこの領域のYAC（酵母人工染色体）コンティグを使ってKCNQ4の位置付けを、公表された物理的地図および遺伝地図と比較して、さらに精密にした。KCNQ4はCEPH YACクローン914c3に存在した。この結果からこの遺伝子はDFNA2領域内にある。
【０１５８】
実施例３
内耳におけるKCNQ遺伝子の発現
KCNQ4と他のKCNQ遺伝子の発現をマウス蝸牛RNAでの半定量的RT-PCRによって調べた。
マウスKCNQ mRNA発現のRT-PCR解析
約2μgのマウス脳全RNAとマウス蝸牛および前庭RNAをSuperScriptTM II（Gibco BRL）逆転写酵素を使って逆転写した。
【０１５９】
2400 Thermocycler System（Perkin Elmer）を使って1μl（1:10希釈液をそれぞれ1μl）のcDNAを30サイクル（96℃で30秒、61℃で30秒、68℃で45秒）増幅した。2.5Uのポリメラーゼ（Expand（商標）Long Template PCR System、Boehringer Mannheim）と5％DMSOを含む各50μlの反応液を使用した。
【０１６０】
KCNQ1プライマーはマウスcDNA配列（GenBank受け入れ番号U70068）に基づいた。
【０１６１】
(SEQ ID No:33): MK1a 5'-aaggctggatcagtccattgg-3’；および
(SEQ ID No:34): MK1r 5'-aggtgggcaggctgttgctgg-3’ (280 bp)
【０１６２】
マウスKCNQ2配列は入手できなかったので、ヒトKCNQ2（Y15065）とラットKCNQ2（AF087453）の間で保存されている配列を選んだ。
【０１６３】
(SEQ ID No:35): MK2a 5'-gccacggcacctcccccgtgg-3’；および
(SEQ ID No:36): MK2r 5'-ccctctgcaatgtagggcctgac-3’ (331 bp)
【０１６４】
KCNQ3プライマーはマウスEST（AA386747）から得た。
【０１６５】
(SEQ ID No:37): MK3a 5'-ccaaggaatgaaccatatgtagcc-3’；および
(SEQ ID No:38): MK3r 5'-cagaagagtcaagatgggcaggac-3’ (461 bp)
【０１６６】
マウスKCNQ4プライマーは次のとおりとした。
【０１６７】
【外５】
0004711512.tif 000006
【０１６８】
増幅産物を直接シークエンシング法によって確認した。
【０１６９】
これらの結果を前庭および脳RNAで得た結果と比較した。
【０１７０】
KCNQ1、KCNQ3およびKCNQ4メッセージは蝸牛で検出することができ、PCRサイクルを追加すると弱いKCNQ2発現も明らかになった。この高増幅率ではKCNQ1が脳にも検出された。KCNQ1とKCNQ4は蝸牛発現量が最も高いようである。KCNQ1発現量は蝸牛の方が（ノーザン解析で陰性だった）脳より高い。KCNQ2とKCNQ3についてはその逆が当てはまり、これらは共に脳で広く発現する。KCNQ4発現量はこれらの組織のどちらでもかなり大きい。
【０１７１】
インサイチューハイブリダイゼーション
生後P12日齢のマウスから得た蝸牛切片でKCNQ4アンチセンスプローブを使ったインサイチューハイブリダイゼーションを行なった。
【０１７２】
ヒトKCNQ4 ORFのbp618〜1602に相当するマウスKCNQ4 cDNAをpBluescriptにクローニングした。適当に線状化した後、T3およびT7 RNAポリメラーゼを使ってセンスプローブとアンチセンスプローブを転写した。DNAse消化の後、それらのプローブを0.4M LiClで2回エタノール沈殿した。それらを既に記述されているようにジゴキシゲニン-11-UTPで標識した（Schaeren-WiemersおよびGerfin-Moser，1993）。
【０１７３】
マウス内耳を4％パラホルムアルデヒド/PBS中、4℃で1時間固定した。PBS中で3回すすいだ後、それらを20％ショ糖に4℃で終夜浸漬した。クライオスタット切片（10〜14μm）を後固定し、PBS中ですすいだ。室温で少なくとも3時間のプレハイブリダイゼーションの後、湿潤箱中58℃で終夜ハイブリダイズさせた。次に切片を洗浄し、アルカリホスファターゼに結合したヒツジ抗ジゴキシゲニン抗体と共にインキュベートした。NBT/BCIP（Boehringer Mannheim）による染色を37℃で2時間、RTで終夜行った。次に切片をAquatex（Merck，米国）にマウントした。
【０１７４】
感覚外有毛細胞は強く標識された。これに対し内有毛細胞は陰性のようだった。KCNQ1の発現部位である血管条も陰性だった。KCNQ4センスプローブによる対照ハイブリダイゼーションにより、外有毛細胞の染色は特異的であることが明らかになった。
【０１７５】
常染色体優性難聴
これらの結果から、KCNQ4は常染色体優性難聴の優れた候補遺伝子であることが示唆された。本発明者らはDFNA2遺伝子座にリンクされた公開家系にはアクセスできなかったので、過去に連鎖解析が行なわれていない常染色体優性難聴を持つ45家族をスクリーニングした。これらの家族の大半は成人期に入る前に、すなわちDFNA2を含む大半の型のDNFAについて報告されている発症年齢より前に、聴力損失と診断されていた。
【０１７６】
突然変異スクリーニングは、ポア領域と隣接する膜貫通ドメインとをコードするエキソン4〜7に限定した。高度聴力損失を持つフランス人家族にKCNQ4突然変異が見つかった。その臨床像には、より顕著で頻度の高い進行性聴力損失と、患者の一人で耳鳴があり、前庭欠損の徴候と内耳の著しい形態変化はどちらも認められない。一つのミスセンス突然変異（配列番号1参照。ヌクレオチドレベルでの突然変異G935Aが、アミノ酸レベルで変異体G285Sをもたらしている）がヘテロ接合状態でエキソン6に存在した。この突然変異によって導入されるAluI制限部位（AGCT）を利用することにより、この家系ではこれが全ての罹患メンバーと共分離することが明らかになった。この突然変異は150の対照白色人種染色体には認められなかった。
【０１７７】
G285S突然変異はカリウムチャネルのGYGシグネチャー配列の最初のグリシンに影響する。このグリシンはあらゆる種の様々な種類のカリウムチャネルで高度に保存されている。ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）カリウムチャネルの結晶構造から、これら3つのアミノ酸はイオン伝導孔の最も狭い部分を裏打ちすることがわかる。これらのアミノ酸の突然変異はその選択的フィルターを破壊し、ほとんどの場合、チャネル機能の損失につながる。興味深いことに、優性QT延長症候群を持つ一患者のKCNQ1遺伝子で、等価な位置のアミノ酸に同じ変化が見つかった。これはチャネル活性を破壊し、同時発現するWT KCNQ1チャネルに対してドミナントネガティブ効果を発揮した。これらの突然変異はKCNQ2とKCNQ3に挿入した場合にもドミナントネガティブ効果を持つ。これはこの家族における進行性聴力損失がKCNQ4/G285S突然変異によるものだという強い証拠である。
【０１７８】
実施例４
KCNQ4カリウムチャネルサブユニットの機能的発現
アフリカツメガエル卵母細胞中でKCNQ4を発現させ、その活性を二電極膜電位固定法で調べた。
【０１７９】
KCNQ4含有PTLNベクターをHpaIで線状化した後、mMessage mMachine cRNA合成キット（Ambion）を使ってキャップcRNAをインビトロで転写した。通常5〜15ngのcRNAを手作業による濾胞除去と短いコラーゲナーゼ処理によって先に単離したアフリカツメガエル卵母細胞に注入した。同時発現実験ではcRNAを1：1の比で注入した。卵母細胞を改良バース（Modified Barth's）溶液（90mM NaCl、1mM KCl、0.41mM CaCl2、0.33mM Ca(NO3)2、0.82mM MgS04、10mM HEPES、100Uペニシリン-100μgストレプトマイシン/ml、pH7.6）中、17℃に保った。
【０１８０】
標準的二電極電圧固定測定を、Turbotec05増幅器（npi instruments、ドイツ・タム）とpClamp5.5ソフトウェア（Axon Instruments）を使って、注入の2〜4日後に室温で行なった。電流は通常、ND98溶液で記録した（表2参照）。Na+/K+置換実験用の溶液はKD100（100mM KCl）溶液とND100（100mM NaCl）溶液を適当に混合して表記のNa+濃度とK+濃度を得ることによって調製した。リノピルジン（RBI、マサチューセッツ州ネーティック）はDMSO中に100mM原液として調製し、最終濃度が200μMになるようにND98に添加した。
【０１８１】
表２
溶液の内容物（濃度、単位mM）
【０１８２】
【表２】
0004711512.tif 000007
【０１８３】
＋60mVに2秒間の脱分極パルス後のテール電流から逆転電位を決定し、実験的に決定した液間電位差について補正した。透過性比はPK/PX＝exp（−F・Vrev/R・T）に従って計算した。
【０１８４】
見かけの開口確率の電位依存性を決定するために、卵母細胞を−80mVから＋50mVまでの値に10mVステップで4秒間固定した後、一定の−30mVテストパルスを与えた。t＝0に外挿したテール電流を一指数関数フィット（mono-exponential fit）から得て、0mVでの値に規格化し、見かけのpopenの解析に用いた。データ解析にはPClamp6とMicrocal Origin 5.0を使った。
【０１８５】
KCNQ1、KCNQ2およびKCNQ3と同様にKCNQ4も脱分極時に活性化する電流を与える（図1A）。しかしこれら他のKCNQチャネルと比較して、電流活性化は遅く、＋40mVで600ms程度の時定数で起こる（KCNQ2/KCNQ3チャネルの場合、対応する時定数は約300msである）。この時定数は温度の変化に極めて敏感である。生理学的静止電位（約−70mV）での電流の不活化はかなり速い（図1B）。KCNQ2と同様に巨視的な電流は正の電位で多くの場合、多少の内向き整流を示した。卵母細胞を＋60mVに10秒以上脱分極すると、KCNQ3について記載されているものと似た電流の明らかな遅い不活化が観察された。電流は約−40mVで活性化し始め、−10mVで半値活性化を示す（図2C）。イオン置換実験からこのチャネルはカリウムに著しく特異的であることがわかった（図1D）。このチャネルはK+〜Rb+＞Cs+＞Na+という透過性序列を示す。KCNQ4電流は5mM Ba++によって80％以上阻害された。
【０１８６】
次に我々は、罹患家族に見出されたG285S突然変異の効果を調べた（図１Eおよび１F）。突然変異体チャネルはアフリカツメガエル卵母細胞発現系では検出可能な電流を与えなかった。次にヘテロ接合性DFNA2患者での状況を模倣するためにKCNQ4G285SをWT KCNQ4と共に1：1の比で注入した。これは電流を約90％低下させ、この突然変異体の強いドミナントネガティブ効果を示した。この電流低下の程度は、四量体型チャネル複合体の機能を無効にするには1つの突然変異体サブユニットの取り込みで十分であるという見解に合致する。同時注入した卵母細胞中に存在するチャネルはナトリウムまたはカルシウムと比較してカリウムにまだ強い選択性を示した。このことから難聴はナトリウムまたはカルシウムの流入によるのではなくKCNQ4カリウム電流の定量的損失によるものであることが示唆される。
【０１８７】
KCNQ1はminK（IsK）と会合して、より大きい電流を与え、より緩慢に活性化するチャネルを形成する。そこで我々は、minKがKCNQ4にも作用するかどうかを同時発現によって試験した。並行実験でKCNQ1電流に激しい変化をもたらす濃度（1ng minK cRNA／卵母細胞）では、KCNQ4電流に有意な変化はなかった。
【０１８８】
異なるKCNQサブユニットはヘテロマー型チャネルを形成できる。KCNQ2をKCNQ3と同時発現させるとホモマー型チャネルの場合より約10倍大きい電流が得られたが、KCNQ2をKCNQ1と同時発現させた場合はそうならない。KCNQ1とKCNQ3は（また少量ではあるがKCNQ2も）蝸牛で発現されるので、我々はこれらのタンパク質が機能的に相互作用するかどうかを調べた。KCNQ1およびKCNQ4 cRNAを（総cRNA濃度を同じにして）同時注入した卵母細胞は、それぞれのホモマー型チャネルによる電流の線形重ね合わせと相違しないと思われる電流を与え（図2A）、同じことがKCNQ2とKCNQ4を同時発現させる卵母細胞にも当てはまった（図2B）。またドミナントネガティブKCNQ1突然変異体はKCNQ4電流を抑制せず（図2A）、同じことが等価なKCNQ2突然変異体についても言えた（図2B）。
【０１８９】
これに対し、KCNQ3をKCNQ4と同時発現させると、それぞれのホモマー型チャネルによる電流の重ね合わせで説明できるものより有意に大きい電流が得られた（図2Cおよび2D）。さらにKCNQ4電流はドミナントネガティブKCNQ3突然変異体を同時発現させることによって著しく抑制された（図2C）。重要なことに、同時注入卵母細胞で得られる電流はKCNQ4電流よりも速く活性化し（図2D）、開口確率が負の電位側に約10mVシフトした（図2E）。M-電流の基礎をなしていると思われるKCNQ2/KCNQ3チャネルと比較すると、KCNQ3/KCNQ4ヘテロマーは、それよりわずかに正の電位で開口する。KCNQ3/KCNQ4チャネルをM-チャネルと比較するためにこれらのチャネルに使用される典型的電位プロトコールを使用したところ、我々は表面上Ｍ電流に似た電流を認めた（図2F）。M電流の強力でかなり特異的な阻害剤であるリノピルジンは200μMの濃度でKCNQ2/KCNQ3チャネルをほぼ完全に阻害する。このリノピルジン濃度でKCNQ4は約30％阻害されたのに対し、KCNQ3/KCNQ4同時発現ではそれよりかなり高い阻害（約75％）が観察された（図2G）。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図1AはKCNQ4 cRNAを注入したアフリカツメガエル卵母細胞からの二電極膜電位固定電流トレースを表わす。
【図１Ｂ】 図1Bは異なる電位におけるKCNQ4の不活化挙動を示す電流トレースを表わす。
【図１Ｃ】 図1Cは（A）に見られるような電流のテール電流解析から決定される電位の関数としての見かけの開口確率（popen）を表わす。
【図１Ｄ】 図1DはND98を参照溶液とした細胞外K+濃度による逆転電位のシフトを表わす。
【図１Ｅ】 図1EはWT KCNQ4（太い実線）、WT KCNQ4とKCNQ4G285S突然変異体の1：1同時注入（細い実線）およびKCNQ4G285S突然変異体（点線）の電流トレースを表わす。
【図１Ｆ】 図1Fは（1E）と同様にして卵母細胞を＋40mVに4秒間固定した後に測定し数回の実験から平均した平均電流（4つの卵母細胞バッチからｎ＝20〜35、±S.E.M.）を表わす。
【図２Ａ】  図2AはKCNQ1と同時発現したKCNQ4を表す。
【図２Ｂ】  図2BはKCNQ2と同時発現したKCNQ4を表す。
【図２Ｃ】  図2CはKCNQ3と同時発現したKCNQ4を表す。
【図２Ｄ】  図2Dは誘導ドミナントネガティブ突然変異体（KCNQ1G219S、KCNQ2G279S、KCNQ3G318S）を表す。
【図２Ｅ】  図2Eはテール電流解析から決定されるKCNQ4およびKCNQ3 cRNAを同時注入した卵母細胞からの電流に関する電位の関数としての見かけのpopen（四角、太い実線）を表わす。
【図２Ｆ】  図2Fは典型的M電流電位プロトコールでKCNQ4およびKCNQ4 cRNAを同時注入した卵母細胞から記録された電流トレースを表わす。
【図２Ｇ】  図2GはKCNQ4（n＝10、±S.E.M.）とKCNQ3＋KCNQ4（n＝6、±S.E.M.）に対する200μMリノピルジンの弁別的効果を表わす。
【配列表】
0004711512.tif 000008
0004711512.tif 000009
0004711512.tif 000010
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0004711512.tif 000021
0004711512.tif 000022
0004711512.tif 000023
0004711512.tif 000024
【図１Ａ】
0004711512.tif 000025
【図１Ｂ】
0004711512.tif 000026
【図１Ｃ】
0004711512.tif 000027
【図１Ｄ】
0004711512.tif 000028
【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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