(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラスコシド（ｒｕｓｃｏｓｉｄｅ）またはデスグルコラスコシド（ｄｅｓｇｌｕｃｏｒｕｓｃｏｓｉｄｅ）を含む基質を、真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ種を用いる該基質の醗酵によって、一連の酵素的なβ−グルコシダーゼ反応およびα−ラムノシダーゼ反応により加水分解させることを特徴とする、デスグルコデスラムノラシンの製造方法。
【請求項２】
前記基質が培養ブロスである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記醗酵を、２５〜３０℃の温度で、５０％よりも高い、または５０％に等しいｐＯ2に到達するために攪拌および通気下で行う、請求項２記載の方法。
【請求項４】
温度が２７℃である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記ステロイド配糖体の出発濃度が５〜１５％（ｗ／ｖ）である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記濃度が８〜１０％（ｗ／ｖ）である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
培養ブロスのｐＨが４〜６の範囲である、請求項２〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
培養ブロスのｐＨが４．５〜５．５の範囲である、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、Ｒｕｓｃｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓステロイド配糖体（ラスコサポニン）の誘導体の製造方法に関する。
【０００２】
より詳細には、本発明は、醗酵ルートを介したラスコシド（ｒｕｓｃｏｓｉｄｅ）および／またはデスグルコラスコシド（ｄｅｓｇｌｕｃｃｒｕｓｃｏｓｉｄｅ）の加水分解によるデスグルコデスラムノラシン（ｄｅｓｇｌｕｃｏｄｅｓｒｈａｍｎｏｒｕｓｃｉｎ）の製造に関する。
【０００３】
デスグルコデスラムノラシンから酸加水分解によって容易に得ることができる、デスグルコラムノラシン、および対応する遊離アグリコンであるラスコゲニン（ｒｕｓｃｏｇｅｎｉｎ）およびネオラスコゲニン（ｎｅｏｒｕｓｃｏｇｅｎｉｎ）は、抗炎症活性および結合−保護活性を有する価値ある薬学的活性素である。
【０００４】
しかし、ラスコシドまたはデスグルコラスコシドから出発する上記活性素の化学的調製は、強酸による加水分解等の激烈な条件、および中間体と生成物との非常に不均質な混合物を生じる複雑な操作工程を必要とするため、問題が多い。
【０００５】
従って、公知の化学的方法と関連した上述の難点を克服する、デスグルコデスラムノラシンの製造方法を提供することは、極めて望ましいであろう。
【０００６】
本発明は、Ｒｕｓｃｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓステロイド配糖体（ラスコサポニン）を含む基質の、真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ種による醗酵を介した上記配糖体の加水分解を特徴とする、デスグルコデスラムノラシンの製造方法を提供することにより、このような必要性に応えるものである。
【０００７】
培養ブロスは、典型的には、栄養複合基質として使用される。
【０００８】
醗酵は、一般に、２５〜３０℃、好ましくは２７℃の温度で、５０％よりも高い、または５０％に等しいｐＯ2を達成するために攪拌および通気下で、実施される。
【０００９】
出発するステロイド配糖体の濃度は、通常５〜１５％（ｗ／ｖ）、好ましくは８〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲であり、培養ブロスのｐＨは４〜６、好ましくは４．５〜５．５の範囲である。
【００１０】
本発明のバイオテクノロジー的方法を使用すると、適当な微生物学的技法で選択された微生物が、出発する複雑なヘテロ配糖体からモノ配糖体または最終的なアグリコンへの転換逐次反応全てを実行するのに必要な酵素活性を発現することができるため、一連の反応全部を１つの醗酵ステップで実施することが可能である。上記加水分解酵素転換は、事実、工程中に連続的に放出される中間体に対する一連のβ−グルコシダーゼ反応、α−ラムノシダーゼ反応を含む。さらなるα−アラビノシダーゼ反応によって、遊離アグリコン（ラスコゲニン）を得ることが可能である。
【００１１】
上記手順を上記生成物の製造に応用した例を、文献中に見つけることができないため、上記アプローチは全く新規である。
【００１２】
関与する転換を実施するのに適した微生物は、従来の炭素源（グルコ−ス、スクロース等）に加えて、またはその代わりに、転換される基質と同じ基質を加えた合成培地または半合成培地での選択によって得られる。この場合、関心のある基質（ラスコシド、デスグルコラスコシド）を、高濃度、たとえば、９０〜１００g／lでも、加えることができる。寒天化単離用培地は、モルト寒天（Ｍａｌｔ  Ａｇａｒ）およびツァペク寒天（Ｃｚａｐｅｋ  Ａｇａｒ）等の微生物学用の通常の調製物であるが、ここで窒素源はペプトン、尿素、硝酸アンモニウム等で代表され、従来の炭素源（グルコース、スクロース）は、ラスコシドまたはデスグルコラスコシドで置換されているか、ラスコシドまたはデスグルコラスコシドが加えられている類似の調製物を含む。上記培地に、カリウム、マグネシウム、マンガン、亜鉛等の無機塩、たとえば、リン酸塩、硫酸塩および／または塩化物をさらに加えてもよい。単離用培地のｐＨは、４〜６、好ましくは４．５〜５．５の範囲であってもよい。
【００１３】
必要な生物学的変換に適する微生物は、土壌、腐植土、野菜抽出物および他の類似した有機源の試料の水性懸濁液を段階希釈してプレーティングすることにより、回収される。
【００１４】
上記のように選択された微生物培養物を、同じ培地を含む微生物学試験管内に単離し、上述のようにリン酸塩および他の無機塩類を加えて、単離用培地で使用したものと同様の窒素源、たとえば、尿素またはペプトンを含む液体培地に、高濃度で（１００g／lまで）加えられたラスコシドおよびデスグルコラスコシドの生物学的変換に、４〜６、好ましくは４．５〜５．５の範囲のｐＨで使用した。
【００１５】
記載の手順に従って、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒの選択された培養が、一連の酵素的β−グルコシダーゼ反応およびα−ラムノシダーゼ反応により、ラスコシドおよびデスグルコラスコシドを、ラスコゲニンの直接的前駆体であるデスグルコデスラムノラシンに変換できることが確認されている。
【００１６】
その後のα−アラビノシダーゼ反応により、アグリコンの形態（ラスコゲニン−ネオラスコゲニン）のサポニンが得られる。
【００１７】
選択された培養物は、管理された（温度調節された）条件で、２５℃〜３０℃の範囲の最適温度にて、回転攪拌機（２００〜３００rpm）上で攪拌状態で、増殖して上記転換を行うことができる。上記醗酵は、所望のサポニン誘導体の工業生産のための好適なバイオリアクターで、異なる規模で、実施することもできる。
【００１８】
前記生物学的転換に使用される微生物は、反復醗酵サイクルの場合でも、バッチ法または連続法においても、触媒活性を着実に維持することができる。
【００１９】
本方法は、生成物を分離して回収するための複雑でない工程等の、重大な利点を提供し、実施しやすく、且つ費用が節減される。
【００２０】
長期保存のために、選択された微生物を、グリセロール、ペプトン等の凍結保護剤を強化した懸濁液で、−８０℃〜−１９６℃の範囲の温度で（液体窒素中で）凍結してもよく、または凍結乾燥処理に付してもよい。
【００２１】
以下の分析方法を使用して、培養ブロスに対するＴＬＣ分析およびＨＰＬＣ分析により、生物学的変換の進行をモニタリングすることができる。
【００２２】
ＴＬＣ分析
シリカゲルプレート６０  Ｆ２５０  Ｍｅｒｃｋ
溶離剤：
Ａ）酢酸エチル−メタノール  ９：１
Ｂ）酢酸エチル−メタノール−水  １００：１５：１０
検出：１０％硫酸との反応および１２０℃まで５分間加熱、次いで可視およびＵＶ検出。
【００２３】
ＨＰＬＣ分析
カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣ１８、２５０×４．６mm、５μm
溶離剤：アセトニトリル−水  ６０：４０
波長：２００nm
注入量：１０μl
流量：１ml／分
【００２４】
最終生物学的変換生成物、たとえばデスグルコデスラムノラシンを、培養ブロスのｎ−ブタノールによる抽出、その後の塩素化溶剤（たとえば、トリクロロエタン）による精製工程およびシリカゲルクロマトグラフィーによって、回収することができる。最後に、イソプロパノール、酢酸エチル、クロロホルム、アセトン、メタノール等の異なる溶剤から、生成物を結晶化することができる。主生成物に加えて、Ｃ−２′にて、たとえば、２−ヒドロキシ−３−メチルペンタン酸でエステル化されたデスグルコデスラムノラシンが得られる。
【００２５】
上述の醗酵生成物の酸加水分解で、アグリコンの形態のサポニン（ラスコゲニン）が得られる。
【００２６】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に開示する。
【００２７】
実施例１
フラスコ２個の培地（モルトブロス（Ｍａｌｔ  Ｂｒｏｔｈ）、フラスコ当たり２５０ml）に、改良型寒天モルト培地（２％ラスコシドを添加）での選択により得られた、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのモルト寒天（Ｍａｌｔ  Ａｇａｒ）での培養物からの胞子を接種した。このフラスコを、２５０rpmの軌道式攪拌装置上で、＋２７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、以下の組成（数値は脱イオン水１リットルに関する）：ラスコシド乾燥抽出物（９０g）、尿素（１g）、ペプトン（１g）、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（５g）、ＫＣｌ（１．５g）、ＫＨ2ＰＯ4（１g）、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ（０．２g）、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．１g）、消泡剤Ｐ２０００（１．５ml）、約ｐＨ５、を有する、滅菌生産ブロスＲＯ９０約７リットルを含むバイオリアクターに、この前培養物を移した。
【００２８】
醗酵は、溶存酸素パーセンテージ（ｐＯ2）に基づいて実施し、５０％より高いｐＯ2値を得るために、攪拌速度および空気流量を次第に高めた。生物学的変換の進行をＨＰＬＣ分析およびＴＬＣ分析でモニタリングした。２７℃にて５日間インキュベーション後、醗酵が終わった。ブロスのＴＬＣ分析およびＨＰＬＣ分析から、ラスコシドが消失し、主生成物としてのデスグルコデスラムノラシンと、痕跡量のラスコゲニンが存在することが示された。
【００２９】
培養ブロスをｎ−ブタノールで完全に抽出した。ブタノール抽出物を真空下、＋６０℃で濃縮乾固し、７０％メタノールに再溶解し、トリクロロエタンで逆抽出した。塩素化溶液を、真空下、濃縮固化した。この生成物を、クロロホルム−メタノール混合物に再溶解した後、カラムクロマトグラフィー（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ、Ｍｅｒｃｋ）で溶離剤として酢酸エチル−クロロホルム  ９：１を使用して、精製した。分画を、ＴＬＣ分析またはＨＰＬＣ分析で確認した。精製した生成物分画を真空下、濃縮し、次いで、アセトンに再溶解し、結晶化した。さらにメタノールから結晶化した。分光分析でデスグルコデスラムノラシンと同定される生成物約７gを得た。主生成物に加えて、Ｃ−２′にて２−ヒドロキシ−３−メチルペンタン酸でエステル化されたデスグルコデスラムノラシンが少量（約８００mg）得られた。
【００３０】
上述の醗酵生成物の酸加水分解で、アグリコンの形態のサポニン類（ラスコゲニン類）を得た。
【００３１】
実施例２
実施例１に記載のように醗酵槽で操作し、最初の生物学的転換サイクルを実施し、その後、生成物を得るために培養ブロスの９０％を採取して抽出し、残りの醗酵ブロス１０％を新たなＲＯ９０培地と共に醗酵槽に加え、最終容量約７リットルとした。この２回目の醗酵サイクルを、上述のようなパラメーターおよび分析管理で実施した。＋２７℃にて約５日間インキュベーション後、醗酵を完了した。
【００３２】
生成物を抽出および回収するために、２回の醗酵サイクルからの培養ブロスを、実施例１に記載のように処理した。最終工程の終わりに、デスグルコデスラムノラシン約１４gを得た。