(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ１０５の活性を直接的または間接的に変調できる化合物または複数化合物を同定するインビトロの方法であって、 （ａ）Tumor Progression Locus-2（TＰＬ−２）分子を評価すべき化合物または複数化合物と共にインキュベートする工程と；次いで、 （ｂ）ＴＰＬ−２分子の活性に影響する化合物を同定する工程を含む方法。
【請求項２】
化合物または複数化合物がＴＰＬ−２分子に結合する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｃ）細胞ベースのアッセイにおいて、ＴＰＬ−２の活性に影響する化合物をＮＦκＢ活性化を変調する能力につき評価することをさらに含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
炎症応答に関係するまたはそれを用いる病気の治療で有用な医薬のためのリード化合物を同定するインビトロの方法であって、 テストすべき化合物または複数化合物の存在がなければ、Tumor Progression Locus-2（TＰＬ−２）が参照親和性を持ってｐ１０５に会合する条件下にて、テストすべき化合物または複数化合物をＴＰＬ−２分子およびｐ１０５と共にインキュベートすることと；
テストすべき化合物または複数化合物の存在下でｐ１０５に対するＴＰＬ−２の結合親和性を測定することと；
参照結合親和性に関して、ｐ１０５に対するＴＰＬ−２の結合親和性を変調する化合物を選択することを含む方法。
【請求項５】
炎症応答に関係するまたはそれを用いる病気の治療で有用な医薬のためのリード化合物を同定するインビトロの方法であって、 テストすべき化合物または複数化合物の存在がなければ、Tumor Progression Locus-2（TＰＬ−２）が参照親和性を持ってｐ１０５に会合する条件下にて、テストすべき化合物または複数化合物をＴＰＬ−２分子およびｐ１０５と共にインキュベートすることと；
テストすべき化合物または複数化合物の存在下でｐ１０５に対するＴＰＬ−２の結合親和性を測定することと；次いで 参照結合親和性に関して、ＮＦκＢに対するＴＰＬ−２の結合親和性を変調する化合物を選択することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連情報）
本出願は１９９８年８月１８日に出願された仮出願番号：ＧＢ９８１７９３０．２の優先権を主張する１９９８年１２月１６日に出願されたセリアル番号：ＧＢ９８２７７１２．２の一部継続出願である。前記出願および全ての他の特許、特許出願、および本明細書を通じて引用された文献の内容は、ここに、出典明示して本明細書の一部とみなす。
【０００２】
（技術分野）
核因子κＢ（ＭＦκＢ）はまずＢ細胞におけるカッパ軽鎖転写に関与する核因子として１９８６年に発見され（ＳｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，（１９８６）Ｃｅｌｌ４６：７０５−７１６）、それ以来、実質的に全ての真核生物細胞タイプに存在する普遍的転写因子であることが示されている（Ｇｈｏｓｈ等，（１９９８）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６：２２５−２６０）。細胞中では、ＮＦκＢは細胞質に存在し、阻害剤蛋白質ＩκＢに複合体化した不活性形態である。適当なインデューサでの刺激に対して、ＩκＢはＮＦκＢから解離し、その核局所化シグナルをマスク解除し、核への輸送を可能とし、そこで転写因子としてのその生物学的活性が発揮される。このように、その誘導はｄｅ  ｎｏｖｏ蛋白質合成から独立しているからであるので、ＮＦκＢは遺伝子発現の迅速なモジュレータである。
【０００３】
活性なＮＦκＢはＲｅｌファミリーもの蛋白質のダイマーであり、これはＲｅｌ相同性ドメインとして知られている保存された３００アミノ酸Ｎ−末端ドメインを含有する。この領域は、ＤＮＡ結合、他のＲｅｌ蛋白質とのダイマー化、核局所化、およびＩκＢへの結合を担う。各Ｒｅｌ蛋白質は必要なＤＮＡ結合部位の１／２を含有し、このように、適当なＲｅｌ組合せが、コンセンサスＮＦκＢ結合部位、５’−ＧＧＧＧＹＮＮＣＣＹ−３’におけるわずかな改変によって特定されることを可能とする。
【０００４】
前記で示されたごとく、Ｒｅｌ蛋白質はＩκＢ分子によって細胞質中で結合される。ＩκＢはＩκＢ−α、β、γ、εＢｃｌ−３およびＣａｃｔｕｓを含めた、その数が特徴づけられている、アンキリン反復含有分子である。Ｂｃｌ−３は高等脊椎動物のポリペプチドであり、他方、Ｃａｃｔｕｓはショウジョウバエの遺伝子である。アンキリン反復およびＮＦκＢ／Ｒｅｌの間の相互作用は、ＮＦκＢ蛋白質の調節についての進化的に保存されたメカニズムのようである。
【０００５】
蛋白質のＲｅｌファミリーはＲｅｌｉｓｈ、Ｄｉｆ、Ｄｏｒｓａｌ、ＲｅｌＢ、ｃ−Ｒｅｌ、ｖ−Ｒｅｌ（ニワトリ・オンコジーン）、ｐ６５、ｐ１００／ｐ５２およびｐ１０５／ｐ５０を含む。最初の３つのリストはショウジョウバエ蛋白質である。後者の２つのポリペプチドは、より大きい前駆体分子（ｐ１００またはｐ１０５）が共にＲｅｌ蛋白質およびＩκＢをコードする点で異常であり、これはその関連Ｒｅｌ蛋白質と組み合わせてその各局所化をブロックする。モノマーまたはホモダイマーとして、ｐ５０およびｐ５２は転写活性化ドメインを含有しない。よって、遺伝子転写を活性するために、それらはホモダイマーの形態でもう１つのトランス活性化Ｒｅｌ蛋白質と会合する。ｐ５０／ｐ５２のホモダイマーはある種の細胞タイプにおいて遺伝子転写を後退させ得る。
【０００６】
ＮＦκＢ／Ｒｅｌの活性化はＩκＢのリン酸化によってトリガーされる。これはプロテオソームによる分解のためのＩκＢにタグを付すが、ＩκＢリン酸化のメカニズムは今日依然としてかなり不明瞭なままである。ｐ１００／ｐ１０５の場合、ｐ５２／ｐ５０の核局所化シグナルをマスク解除するためには、Ｒｅｌ領域からのＣ−末端アンキリン反復含有領域の蛋白質分解開裂が必要である。
【０００７】
イン・ビボでは、ＮＦκＢは免疫、急性相および炎症応答に関与する遺伝子の調節で重要な役割を演じる。ＮＦκＢ効果はかなり多面的であるが、ｐ１０５の効果はノックアウトマウス（ｐ１０５−／−）で調べられている。これらの動物において、ｐ１０５のＣ−末端領域は欠失され、従って、マウスはｐ５０を発現できたが、ｐ１０５のＩκＢ−様阻害性アンキリン反復と複合体化しない形態である。換言すれば、構成的に活性なｐ５０が生産された（Ｉｓｈｉｋａｗａ等、（１９９８）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ． １８７：９８５−９９６）。これらのマウスは肺および肝臓におけるリンパ球侵潤、感染に対する増大した感受性、複数リンパ節の拡大、巨脾腫およびリンパ様過形成を含む炎症表現型を呈した。マクロファージのサイトカイン生産能力は損なわれ、他方、Ｂ−細胞増殖は増加した。
【０００８】
ＮＦκＢの不適当なまたは正しくない合成は哺乳動物における種々の病気および機能不全に関連する。例えば、Ｓｃｈｉｃｋ等（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２２４７−２２５８によって示されるごとく、ＮＦκＢの核への移動はＨＩＶゲノムの転写およびＨＩＶ感染細胞におけるＨＩＶビリオンの生産、ならびにＨＩＶ遺伝子発現に関連づけられている（Ｓｖｉｎｇｌｅｒ等（１９９２）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（８，４８７−４９３）。また、それはＥＢＶのごとき他のレトロウイルスの複製に関連する（Ｐｏｗｅｌｌら、（１９９３）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９１：４７３−４８１）。
【０００９】
さらに、ＮＦκＢはアポトーシスから細胞を保護し（例えば、Ｓｉｋｏｒａ等（１９９３）ＢＢＲＣ  １９７：７０９−７１５参照）、ＴＮＦの生物学的効果（Ｒｅｎｉｅｒ等（１９９４）Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ３５：２７１−２７８；ＷＯ  ９７／３７０１６）、ストレスに対する応答（Ｔａｃｃｈｉｎｉ等，（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３０９−４５３−４５９）を媒介し、例えば、虚血症から細胞を保護する（Ｍａｔｔｓｏｎ，（１９９７）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｂｅｈａｖ．  Ｒｅｖ．  ２１：１９３−２０６）ことが知られており、種々の癌と関連づけられている（Ｃｈａｎｇ等，（１９９４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：９２８−９３３；  ＥｎｗｏｎｗｕおよびＭｅｅｋｓ，（１９９５）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ６：５−１７；  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，（１９９６）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｇ    ７：２１６−２９１）。
【００１０】
しかしながら、一般に、ＮＦκＢは非常に多様なサイトカインおよびリンホカインの発現の調節に関与している。これは、ストレス、感染または炎症に関連するまたはそれに関与する疾患の治療における、またはイン・ビボでＮＦκＢによって制御される炎症応答のごとき応答を使用することによる疾患の治療におけるＮＦκＢ活性のモジュレータについての役割を示唆する。
【００１１】
ＴＰＬ−２（Tumor Progression Locus-2）は、元来、ラットにおけるモロニーネズミ白血病ウイルス−誘導Ｔ細胞リンパ腫と関連するオンコジーンの産物として、Ｃ−末端欠失形態で同定された（Ｐａｔｒｉｏｔｉｓ等，（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：２２５１−２２５５）。ＴＰＬ−２は、その触媒ドメインにおいてＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（３Ｋ）に相同であり（Ｓａｌｍｅｒｏｎ， Ａ．等，（１９９６）Ｅｍｂｏ Ｊ． １５：８１７−８２６）、ヒトＣＯＴのプロト−オンコジーン産物と＞９０％同一である（Ａｏｋｉ， Ｍ．，（１９９３）等 Ｇ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：２２７２３−２２７３２）蛋白質セリンキナーゼである。ＴＰＬ−２もまた、ＩκＢ−αの誘導分解を調節することが示されているキナーゼＮＩＫと高度に相同である（Ｍａｌｉｎｉｎ等，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５：５４０−５４４；Ｗｏ ９７／３７０１６；ＭａｙおよびＧｈｏｓｈ，（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １９：８０−８８）。しかしながら、ＴＰＬ−２／−ＣＯＴの生物学的機能は従来は知られていない。
【００１２】
（発明の開示）
本発明はＮＦκＢの調節のための新規経路に関する。特に、本発明はＮＦκＢを変調できる剤および、好ましい具体例においては、ＩκＢ  ｐ１０５とＴＰＬ−２の相互作用を変調できる剤の開発のための標的としてのキナーゼＴＰＬ−２／ＣＯＴの使用に関する。明細書を通じて、用語「ＴＰＬ−２」は、特に断りのない限り、ラットＴＰＬ−２およびヒトＴＰＬ−２ホモログＣＯＴを含むことが理解されるであろう。また、いずれかのＴＰＬ−２ホモログ、好ましくは哺乳動物ＴＰＬ−２ホモログは本発明の範囲内に含まれると理解される。用語「ＮＦκＢ」は、他に定義がなければ、当業者に認められたごとくＮＦκＢ−結合活性を有するいずれの蛋白質（またはその断片）、または蛋白質複合体も含むことを意図する。かかる蛋白質または蛋白質複合体は１以上の蛋白質を含むことができ、ホモダイマー、ヘテロダイマーまたはマルチマーの形態を採り得る。典型的には、かかる複合体は、例えば、ｒｅｌ  Ａ、ｒｅｌ  Ｂ、ｐ５０、ｐ５２、ｐ６５、ｃ−Ｒｅｌ、Ｖ−Ｒｅｌおよび／またはｄｏｒｓａｌを含むことができる。
【００１３】
ＴＰＬ−２はｐ１０５の分解およびその結果としてのＲｅｌサブユニットの放出を担うことが以下に示される。従って、本発明はｐ１０５の分解の特異的レギュレータとしての、このように、ｐ５０  Ｒｅｌが関与する炎症応答のモジュレータとしてのＴＰＬ−２を提供する。
【００１４】
従って、本発明の第１の態様において、ＮＦκＢの変調が起こるような、ＮＦκＢ活性の変調におけるＴＰＬ−２の使用が提供される。好ましい具体例において、変調はｐ１０５を介して起こる。
【００１５】
本発明の第２の態様において、（ａ）ＴＰＬ−２分子を評価すべき化合物または複数化合物と共にインキュベートする工程と、
（ｂ）ＴＰＬ−２分子の活性に影響する化合物を同定する工程を含む、ｐ１０５の蛋白質分解およびそれによりその阻害活性を直接または間接に変調することができる化合物または複合化合物を同定する方法が提供される。
【００１６】
下記で示すように、ＴＰＬ−２はホモダイマーとしてまたはさらなるＲｅｌモノマーとのヘテロダイマーとしての、その分解および関連Ｒｅｌサブユニットの核への移動に直接的に導く、ｐ１０５の直接的または間接的リン酸化を担うと判明した。従って、ＴＰＬ−２に結合する、ＴＰＬ−２の活性を変調するまたはＴＰＬ−２とｐ１０５またはｐ１０５のリン酸化に関与する他のポリペプチドとの相互作用に影響することによって、ＴＰＬ−２およびｐ１０５の間の直接的または間接的相互作用を変調することができる化合物は、ＮＦκＢのｐ１０５を介する活性化を変調することができる。
【００１７】
さらに、本発明は、ＴＰＬ−２活性を変調できるポリペプチド（それらをコードする発現核酸配列を含む）、イン・ビボで細胞中でＮＦκＢ活性を変調する方法、およびＮＦκＢに関連する、あるいは炎症を誘導または抑制するのが望ましい疾患の治療方法を提供する。
【００１８】
本発明のさらなる態様において、細胞中または細胞上で腫瘍壊死因子の活性の延長のためのＴＰＬ−２の使用が提供される。後述するように、遺伝子転写のＴＮＦ活性化はＴＰＬ−２アンタゴニスト、ＴＰＬ−２（Ａ２７０）の使用によってブロックされ得る。
【００１９】
ＴＮＦ−αはｐ１０５の分解および遺伝子転写のＮＦκＢ−誘導活性化を刺激することができるのが知られている。従って、本発明は、ｐ１０５のＴＮＦ活性化経路を変調する方法に関する。好ましい具体例において、本発明は、
テストすべき化合物または複数化合物の存在なくしては、ＴＮＦおよびＴＰＬ−２の相互作用が測定可能な化学的または生物学的効果を誘導する条件下でテストすべき化合物または複数化合物をＴＰＬ−２分子および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）と共にインキュベートすることと；
テストすべき化合物または複数化合物の存在下でＴＰＬ−２と直接的または間接的に相互作用して測定可能な化学的または生物学的効果を誘導するＴＮＦの能力を測定することと：
ＴＮＦおよびＴＰＬ−２の相互作用を変調する化合物を選択する医薬のためのリード化合物を同定する方法を提供する。
【００２０】
好ましい具体例において、本発明は、
精製されたＴＰＬ−２分子を提供する工程と；
ＴＰＬ−２分子を、ＴＰＬ−２によってリン酸化されることが知られている基質およびテスト化合物または複数化合物と共にインキュベートする工程と；
基質のリン酸化を変調できるテスト化合物または複数化合物を同定する工程を含む薬剤のためのリード化合物の同定方法を含む。
【００２１】
所望により、次いで、同定された化合物をイン・ビボテストに付して、ＴＮＦ／ｐ１０５に由来するシグナリング経路に対するその効果を測定することができる。
【００２２】
もう１つの態様において、本発明は、ＴＰＬ−２ポリペプチドまたはその断片を含む反応混合物をテスト化合物と接触させ、ＮＦκＢの活性のインジケータに対するテスト化合物の効果を測定して、それにより、ＴＰＬ−２によって媒介されるＮＦκＢ活性を調製する化合物を同定することを含む、ＴＰＬ−２によって媒介される炎症応答を調節する化合物を同定する方法を提供する。
【００２３】
関連する態様において、本発明はＴＰＬ−２−媒介ＮＦκＢ活性を調節する化合物を同定する方法を提供する。
【００２４】
もう１つの態様において、本発明はＴＰＬ−２ポリペプチドまたはその断片を含有する反応混合物をテスト化合物と接触させ、反応混合物中でのＴＰＬ−２ポリペプチドによる情報伝達のインジケータに対するテスト化合物の効果を測定してＴＰＬ−２による情報伝達を調節する化合物を同定することを含む、ＴＰＬ−２による情報伝達を調節する化合物を同定する方法を提供する。
【００２５】
さらにもう１つの態様において、本発明は、テスト化合物の存在なくしては、ＴＰＬ−２ポリペプチドまたはその断片が参照レベルにおいて標的成分と特異的に相互作用する条件下で、ＴＰＬ−２ポリペプチドまたはその断片を含有する反応混合物をＴＰＬ−２変調の標的成分、およびテスト化合物と接触させることを含む、ＴＰＬ−２ポリペプチドとＴＰＬ−２変調の標的成分との相互作用を変調する化合物を同定する方法を提供する。従って、前記方法はテスト化合物の存在下で相互作用のレベルでの変化を測定することを可能とし、ここに、差異は、テスト化合物がＴＰＬ−２ポリペプチドまたはその断片とＴＰＬ−２変調の標的成分との相互作用を変調することを示す。好ましい具体例において、標的成分はｐ１０５、ＩκＢ−α、ＩκＢ−β、ＭＥＫ−１、ＳＥＫ−１またはＮＦκＢ、好ましくは精製されたポリペプチドである。
【００２６】
前記態様の好ましい具体例において、前記方法は、配列番号２または４に供されたアミノ酸配列と少なくとも７５％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＴＰＬ−２ポリペプチド、好ましくは組換えポリペプチドの使用を含む。
【００２７】
前記態様のもう１つの好ましい態様において、前記方法は、配列番号１または配列番号３で供される配列を有する核酸分子と高度にストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるＴＰＬ−２ポリペプチド、好ましくは組換えポリペプチドを含む。
【００２８】
前記態様のもう１つの好ましい具体例において、前記方法は、無細胞混合物または細胞ベースの混合物の使用を含み、かかる混合物は組換え細胞、好ましくはＴＰＬ−２ポリペプチドをコードする異種核酸を有する組換え細胞に由来することができる。好ましい具体例において、無細胞混合物は精製されたＴＰＬ−２ポリペプチドを使用することができる。もう１つの具体例において、前記方法は、ＴＮＦ発現を含むシグナリングの測定を含む。関連する具体例において、組換え細胞は、ＴＰＬ−２またはＮＦκＢによって変換される細胞内シグナルに対して感受性である転写調節配列と作動可能に連結したレポーター遺伝子構築体を含む。好ましい具体例において、転写調節配列はＴＮＦ転写調節配列である。
【００２９】
前記態様のもう１つの好ましい具体例において、前記方法は、キナーゼ活性、結合活性、および／またはシグナリング活性のごときＴＰＬ−２活性の測定を含む。
【００３０】
前記態様のさらにもう１つの具体例において、前記方法は、細胞、細胞増殖、または免疫反応のアポトーシスを測定することを含む測定を含む。
【００３１】
前記態様のさらにもう１つの具体例において、前記方法は、蛋白質ベース、脂質ベース、核酸ベース、天然有機物ベース、合成由来有機物ベース、または抗体ベースであるテスト化合物の使用を含む。
【００３２】
もう１つの好ましい具体例において、本発明は、前記態様の方法に従って同定された化合物を提供し、かかる化合物は、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、インスリン−依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、敗血症、乾癬、移植片拒絶、誤調節ＴＮＦ発現、または好ましくは慢性関節リウマチのごとき疾患を治療するのに適している。
【００３３】
もう１つの態様において、本発明は、患者において免疫系応答を調節するのに十分な量で、ＴＰＬ−２を変調できる医薬組成物を投与することによる、ＴＰＬ−２活性を変調することによってそれを必要とする対象において免疫系疾患を治療する方法を提供する。
【００３４】
関連態様において、本発明は、受容体対象においてＴＰＬ−２−媒介疾患を変調するのに治療上十分な量で、ＴＰＬ−２を変調できる組成物を投与することによる、対象においてＴＰＬ−２−媒介疾患の治療方法を提供する。
【００３５】
もう１つの関連態様において、本発明は、変調が起こるように、治療上有効量の医薬組成物をヒトに投与することによる、それを必要とする対象においてＴＰＬ−２−媒介ＮＦκＢ調節を変調する方法を提供する。
【００３６】
さらにもう１つの関連態様において、本発明は、ＴＰＬ−２−媒介ＮＦκＢ調節が達成されるのに十分な量で、ＴＰＬ−２を変調できる組成物を細胞に投与することを含む、細胞内でＴＰＬ−２−媒介ＮＦκＢ調節を変調する方法を提供する。
【００３７】
前記態様の好ましい具体例において、治療すべき疾患は多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、インスリン−依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、敗血症、乾癬、移植片拒絶、誤調節ＴＮＦ発現、または好ましくは慢性関節リウマチである。
【００３８】
前記態様のもう１つの好ましい具体例において、投与される組成物はＮ１−［４−（４−アミノ−７−シクロペンチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−２−クロロフェニル］−１−ベンゼンスルホンアミド、５−オキソ−４−［４−（フェニルスルファニル）アニリノ］−５，６，７，８−テトラヒドロ−３−キノリンカルボン酸エチル、３−（４−ピリジル）−４，５−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］インダゾールメタンスルホン酸塩および２−クロロベンゾ［１］［１，９］フェナントロリン−７−カルボン酸ナトリウムからなる群から選択される化合物を含有する。
【００３９】
もう１つの態様において、本発明は、治療が起こるように、治療上有効量のＴＰＬ−２モジュレータをＴＮＦ誤調節の危険性がある対象に投与することによるＴＮＦ誤調節の治療方法を提供する。
【００４０】
関連する態様において、本発明は、治療が起こるように、有効量のＴＰＬ−２モジュレータを慢性関節リウマチの危険性がある対象に投与することによる慢性関節リウマチの治療方法を提供する。
【００４１】
２つの前記態様の好ましい具体例において、ＴＰＬ−２モジュレータはＮ１−［４−（４−アミノ−７−シクロペンチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−２−クロロフェニル］−１−ベンゼンスルホンアミド、５−オキソ−４−［４−（フェニルスルファニル）アニリノ］−５，６，７，８−テトラヒドロ−３−キノリンカルボン酸エチル、３−（４−ピリジル）−４，５−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］インダゾールメタンスルホン酸塩および２−クロロベンゾ［１］［１，９］フェナントロリン−７−カルボン酸ナトリウムである。
【００４２】
さらにもう１つの具体例において、治療すべき疾患が関節炎、例えば慢性関節リウマチである場合、３−（４−ピリジル）−４，５−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［Ｇ］インダゾールメタンスルホン酸塩でないＴＰＬ−２モジュレータが使用される。
【００４３】
図面の簡単な説明
図１
ＴＰＬ−２のＣ−末端はイン・ビトロでのＮＦ−κＢ１  ｐ１０５との相互作用に必要である。
Ａ）ＴＰＬ−２欠失突然変異体。ｍｙｃおよびＴＳＰ３エピトープの位置（Ｓａｌｍｅｒｏｎ，  Ａ．等，（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ． １５，  ８１７−８１６）が示される。Ｍ３０はＴＰＬ−２の別の開始部位に対応する（Ａｏｋｉ，  Ｍ．等，（１９９３）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  ｃｈｅｍ．  ２６８，２２７２３−２２７３２）。Ｂ）ＴＰＬ−２ΔＣはｐ１０５とで安定な複合体を形成しない。ｐ１０５（Ｂｌａｎｋら，（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ． １００，  ４１５９４１６７）を合成し、それ自体またはＴＰＬ−２もしくはＴＰＬ−２ΔＣといっしょにイン・ビトロ無細胞翻訳によって［３５Ｓ］−Ｍｅｔで標識する（Ｓａｌｍｅｒｏｎ等，（１９９６））。次いで、適当な翻訳ミックスを抗−ＴＰＬ−２抗体−／＋競合ペプチドと免疫沈殿させる。単離された蛋白質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解像し、フルオログラフィーによって明らかにする（右側パネル）。「溶解物」で表される左側パネルは全ウサギ網状赤血球溶解物翻訳ミックスにおけるＴＰＬ−２およびｐ１０５発現を示す。イン・ビトロで翻訳されたｐ１０５は、フィルムの過剰露出で目に見える（データは示さず）に過ぎない低いレベルのｐ５０を生じた（レーン３）。Ｃ）ＴＰＬ−２のＮ−末端はｐ１０５への結合に必要でない。示されたＴＰＬ−２蛋白質（それらのＮ−末端にタグした全てのｍｙｃエピトープ）をＢにおけるごとくｐ１０５にてイン・ビトロで翻訳し、次いで、抗−ｍｙｃ  ＭＡｂで免疫沈殿させる。［３５Ｓ］−Ｍｅｔ−標識蛋白質は１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にフルオログラフィーによって明らかにされる。下方パネルは溶解物におけるｐ１０５の発現を示す。
【００４４】
図２
ＴＰＬ−２はイン・ビトロにてＮＦ−κＢ１  ｐ１０５のＣ−末端と相互作用する。
Ａ）ｐ１０５欠失突然変異体（Ｆａｎ等，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４，  ３９５−３９８）。Ｒｅｌ相同性ドメイン（ＲＨＤ）（Ｇｈｏｓｈ等，（１９９８）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６，  ２２５−２６０）、グリシンリッチ領域（ＧＲＲ）（Ｉｉｎ等，（１９９６）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １６，  ２２４８−２２５４）および抗体エピトープ、ｍｙｃおよびＮＦ−κＢ１（Ｎ）の位置を示す。開いた矢印の頭はｐ５０のＣ−末端の位置を示す。塗りつぶした矢印の頭は、全て蛋白質のＣ−末端まで続くＮ−κＢ１  ２−ハイブリッドクローンと相互作用する種々のＴＰＬ−２のＮ−末端スタート部位を示す。Ｂ）およびＣ）ＴＰＬ−２はｐ１０５のＣ−末端と相互作用する。ＴＰＬ−２はイン・ビトロで示されたｐ１０５突然変異体といっしょに翻訳される。複合体形成は抗−ＴＰＬ−２免疫沈殿の８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（右側パネル）およびフルオログラフィーによって分析される。左側パネルは溶解物中のＴＰＬ−２およびｐ１０５突然変異体の発現を示す。Ｂ）における矢印の頭はｐ４８の位置を示す。
【００４５】
図３
ＴＰＬ−２はイン・ビボにてＮＦκＢ１  ｐ１０５と会合し、一過性発現の後にＮＦ−κＢ−依存性レポーター遺伝子を活性化する。
Ａ）ＴＰＬ−２はイン・ビボでｐ１０５と会合する。ＨｅＬａ細胞溶解物を示した抗体−／＋競合ペプチドと免疫沈殿させる。単離された蛋白質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解像し、次いで、示された蛋白質につき順次ウエスタンブロットする。Ｂ）ＴＰＬ−２の大部分はｐ１０５とで複合体化する。ＨｅＬａ細胞溶解物を抗−ＮＦ−κＢ１抗体と系列的に３回免疫沈殿させる。細胞溶解物のウエスタンブロッティングはｐ１０５／ｐ５０の枯渇を確認したが、α−チューブリンの枯渇は確認しなかった。ＮＦ−κＢ１−枯渇溶解物のＴＰＬ−２含有量は、溶解物および溶解物からの抗−ＴＰＬ−２免疫沈殿のウエスタンブロットを抗−ＴＰＬ−２抗血清でプロービングすることによって測定される。Ｃ）ＴＰＬ−２発現はＮＦ−κＢ−依存性ルシフェラーゼレポーター遺伝子を活性化する。ジャーカットＴ細胞は０．５μｇの示された発現ベクター＋２μｇのレポーター構築体でトランスフェクトする（全ＤＮＡは空ｐｃＤＮＡ３ベクターで４μｇに調整する。ルシフェラーゼアッセイは二連で行い、空ベクター対照に対する平均刺激指標（＋／−ＳＥ）として表す。ＴＰＬ−２ΔＣデータは、１の任意値を与えられた、ＴＰＬ−２に対するウエスタンブロッティングによって測定されたその発現レベルに基づいて正規化される。ＴＰＬ−２（Ａ２７０）はＴＰＬ−２のキナーゼ−不活性点突然変異体である。Ｄ）Ｃ−末端ｐ１０５断片の共発現はＴＰＬ−２によるＮＦ−κＢ活性化をブロックする。ジャーカットＴ細胞は０．５μｇの示された発現ベクターおよび２μｇの空ベクターもしくは３’ＮＮ構築体＋２μｇのＭＦ−κＢルシフェラーゼレポーター構築体いずれかでトランスフェクトする。二連ルシフェラーゼアッセイは空ベクター対照に対する平均刺激指標として表される（＋／−ＳＥ）。ウエスタンブロッティングにより、３’ＮＮの発現が共トランスフェクトされたＴＰＬ−２の発現に影響しないことが確認された（データは示さず）。
【００４６】
図４
ＴＰＬ−２のｍｙｃ−ｐ１０５との共発現は活性ｍｙｃｐ５０の核転移を誘導する。
Ａ）ＴＰＬ−２は共発現されたＮＦ−κＢ１の核転移を誘導する。３Ｔ３細胞を０．５μｇの示された発現ベクターの各々で一過的にトランスフェクトし、抗−ｍｙｃ  ＭＡｂ（緑色）を用いて間接免疫蛍光につき染色してｍｙｃ−ｐ１０５／ｍｙｃ−ｐ５０および抗−ＴＰＬ−２抗血清（赤色）を位置決定する。示されたイメージは代表的なトランスフェクト細胞を通じての単一共焦点セクションである。相コントラストイメージも示す。
Ｂ）ＴＰＬ−２はｍｙｃ−ｐ５０を誘導して核に転移させる。細胞質および核抽出物を、示されたベクターでトランスフェクトされた細胞から調製する。抗−ｍｙｃ免疫沈殿のウエスタンブロットを抗−ＮＦ−κＢ１（Ｎ）抗血清でプロービングすることによって明らかにする。全細胞溶解物の比較は、ｍｙｃ−ｐ５０が核分から不十分に抽出され、従って過小に表されることを示唆した。
Ｃ）ＴＰＬ−２によって誘導された核ＮＦ−κＢ１は生物学的に活性である。示された発現ベクター（各々０．５μｇ；Ｗａｔａｎａｂｅ等，（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ． １６， ３６０９−３６２０）でトランスフェクトされた３Ｔ３細胞から調製された核抽出物のＮＦ−κＢ  ＤＮＡ−結合活性をＥＭＳＡによって分析する（Ａｌｋａｌａｙ，  Ｉ．等（１９９５）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ． １５， １２９４−１３０１）。塗りつぶした矢印の頭は２つの検出されたＮＦ−κＢ複合体の位置を示す。塗りつぶしていない矢印の頭は抗体−スーパーシフトしたＮＦ−κＢ複合体の位置を示す（レーン６および７）。レーン８において、１００倍の未標識κＢオリゴヌクレオチドとの競合は、検出されたＮＦ−κＢ複合体の特異性を示した。
【００４７】
図５
ＴＰＬ−２はｐ１０５プロセッシングとは独立してｐ５０の核転移を促進する。
３Ｔ３細胞は、ＨＡ−ｐ５０（０．４μｇ）、ＴＰＬ−２（Ａ２７０）またはＴＰＬ（０．２μｇ）いずれかおよびｍｙｃ−ｐ１０５ＡＧＲＲをコードするベクターまたは空ベクター（０．４μｇ）で一過的にトランスフェクトする。培養の２４時間後、ＨＡ−ｐ５０（緑色）を位置決定するための抗−ＨＡ  ＭＡｅおよび抗−ＴＰＬ−２抗血清（赤色）を用いて間接免疫蛍光につき染色する。示されたイメージは代表的なトランスフェクト細胞を通じた単一共焦点セクションである。また、相コントラストイメージも提示する。
【００４８】
図６
ＴＰＬ−２は共発現されたｍｙｃ−ｐ１０５の蛋白質分解を刺激する。
Ａ）ｐ１０５蛋白質分解に対するＴＰＬ−２共発現の効果。３Ｔ３細胞は、ｍｙｃ−ｐ１０５およびＴＰＬ−２をコードする発現ベクター（ＴＰＬ−２）で、またはｍｙｃ−ｐ１０５および空ベクター（対照）で一過的にトランスフェクトする。培養の２４時間後、細胞を［３５Ｓ］−Ｍｅｔ／［３５Ｓ］−Ｃｙｓで３０分間代謝的にパルス標識し、次いで、示された時間チェイスする。標識蛋白質を抗−ｍｙｃ  ＭＡｂを用いて細胞溶解物から免疫沈殿させ、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解像し、フルオログラフィーによって明らかにする。塗りつぶした矢印の頭は共免疫沈殿ＴＰＬ−２の位置を示す。塗りつぶしていない矢印の頭はＴＰＬ−２共発現によって引き起こされたｍｙｃ−ｐ１０５の電気泳動移動度のシフトを示す。Ｂ）およびＣ）パネルＡ中の免疫沈殿したｍｙｃ−ｐ１０５およびｍｙｃ−ｐ５０をレーザーデンシトメトリーによって定量し、データをグラフ表示して、ｍｙｃ−ｐ１０５の代謝回転（Ｂ）およびｍｙｃ−ｐ５０／ｍｙｃ−ｐ１０５の比率（Ｃ）を示す。Ｄ）ｍｙｃ−ｐ１０５ＡＧＲＲおよびＴＰＬ−２（ＴＰＬ−２）またはｍｙｃ−ｐ１０５ＡＧＲＲおよびインサート無し（対照）をコードするベクターで３Ｔ３細胞を一過的にトランスフェクトする。ｍｙｃ−ｐ１０５代謝回転をＢにおけるごとく測定する。Ｅ）ＴＰＬ−２（Ａ２７０）をコードするベクター空または空ベクター（対照）といっしょでｍｙｃ−ｐ１０５をコードするベクターで３Ｔ３細胞をトランスフェクトする。ｍｙｃ−ｐ１０５の代謝回転をＢにおけるごとく測定する。Ｆ）ＴＰＬ−２−誘導ｐ１０５蛋白質分解をプロテアソームのインヒビターによってブロックする。３Ｔ３細胞をＡにおけるごとくトランスフェクトする。ＭＧ１３２プロテアソームインヒビター（２０１１Ｍ）またはＤＭＳＯビヒクル（対照）をパルス標識に先立って添加し、チェイス時間の間維持する。標識ｍｙｃ−ｐ１０５をＡにおけるごとく免疫沈殿によって単離し、レーザーデンシトメトリーによって定量する。データをグラフ表示して、ＴＰＬ−２−誘導ｍｙｃ−ｐ１０５蛋白質分解に対する薬物の効果を示す。ＴＰＬ−２共トランスフェクト細胞におけるチェイスの間に、ＭＧ１３２処理はｍｙｃ−ｐ５０の生産を完全にブロックした（データは示さず）。Ｇ）３Ｔ３細胞を、二連にて、Ａにおけるごとく示したベクターでトランスフェクトする。細胞溶解物のウエスタンブロットを抗−ｍｙｃ抗血清でプロービングすることによって、ｍｙｃ−ｐ５０／ｍｙｃ−ｐ１０５の定常レベルが２４時間後に測定される。ＴＰＬ−２共トランスフェクションは対照と比較してｍｙｃ−ｐ５０の絶対レベルを増加させた。このように、恐らくはその核位置のため、ｍｙｃ−ｐ５０はＴＰＬ−２共発現細胞でより安定であり得る。というのは、ｍｙｃ−ｐ１０５からのｍｙｃ−ｐ５０の生産の全速度は増大されないからである（図６Ａ）。
【００４９】
図７
ＴＰＬ−２活性はｐ１０５のＴＮＦ−α−誘導分解で必要である。
Ａ）キナーゼ−不活性ＴＰＬ−２はＴＮＦ−αによって誘導されたｐ１０５分解をブロックする。ウエスタンブロッティングによって判断されるごとく、ジャーカットＴ細胞はトランスフェクトされてキナーゼ−不活性ＴＰＬ−２（Ａ２７０）を安定に発現する。空ベクターで安定にトランスフェクトされたベクター対照細胞、およびＴＰＬ−２（Ａ２７０）を発現する２つの独立して誘導されたクローンを、［３０Ｓ］−Ｍｅｔ／［３５Ｓ］−Ｃｙｓで代謝的に３０分間パルス標識し、次いで、示すごとく、ＴＮＦ−ａ（２０ｎｇ／ｍｌ）または対照培地の存在下で示された時間チェイスする。標識ｐ１０５を抗−ＮＦ−κＢ１（Ｎ）抗血清を用いて細胞溶解物から免疫沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解像し、フルオログラフィーによって明らかにする。免疫沈殿したｐ１０５をレーザーデンシトメトリーによって定量し、データをグラフ形態で提示する。
Ｂ）ＴＰＬ−２は共発現されたｍｙｃ−ｐ１０５のリン酸化を誘導する。ｍｙｃ−ｐ１０５および示された蛋白質またはインサート対照無し（Ｏ）をコードするベクターで３Ｔ３細胞を一過的にトランスフェクトする。ｍｙｃ−ｐ１０５を抗−ｍｙｃ  ＭＡｂでの免疫沈殿によって単離し、次いで、対照緩衝液（１）、ホスファターゼ（２）またはホスファターゼ＋ホスファターゼインヒビター（３）で処理する。単離された蛋白質を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解像し、抗−ＮＦ−κＢ１（Ｎ）抗血清でウエスタンブロットとする。矢印の頭はＴＰＬ−２共発現によって引き起こされたｍｙｃ−ｐ１０５の電気泳動移動度のシフトを示す。
【００５０】
図８
優性ネガティブＴＰＬ−２はＴＮＦ−誘導レポーター遺伝子の転写を変調する。
ＴＮＦ−誘導性ＮＦκＢ応答性プロモーター系の制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するベクターで、図７Ａの手法に従ってジャーカットＴ細胞を形質転換する。ＴＰＬ−２  ＫＤ（キナーゼデッド）またはＴＰＬ−２  Ｃｔｅｒ（Ｃ−末端切形）の共発現はＴＮＦ−媒介活性化の減少に至る。
【００５１】
図９
ＴＰＬ−２キナーゼ活性を５０μＭのレベルにて５０％だけ阻害することができる化合物Ｎ−（６−フェノキシ−４−キノリル）−Ｎ−［４−（フェニルスルファニル）フェニル］アニンの化学構造を示す。
【００５２】
図１０
１０μＭのレベルにてＴＰＬ−２キナーゼ活性を５０％だけ阻害することができる化合物５−オキソ−４−［４−（フェニルスルファニル）アニリノ］−５，６，７，８−テトラヒドロ−３−キノリンカルボン酸エチルの化学構造を示す。
【００５３】
図１１
１００μＭのレベルにてＴＰＬ−２キナーゼ活性を５０％だけ阻害することができる化合物３−（４−ピリジル）−４，５−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］インダゾール−２−イウムメタンスルフォネートの化学構造を示す。
【００５４】
図１２
１００μＭのレベルにおいてＴＰＬ−２キナーゼ活性を５０％だけ阻害することができる化合物２−クロロベンゾ［ｌ］［１，９］フェナントロリン−７−カルボン酸ナトリウムの化学構造を示す。
【００５５】
図１３
ＴＰＬ−２自動リン酸化（ＦＬＡＧ−ＣＯＴ（３０−３９７）および標的ポリペプチド、すなわち、ＧＳＴ−ＩκＢ−αリン酸化のレベルを減少させるにおけるいくつかの異なる化合物の阻害活性を示すオートラジオグラフィーが示される（レーン１、３−（４−ピリジル）−４，５−ジヒドロ−２−Ｈ−ベンゾ［ｇ］インダゾール；レーン２、５−オキソ−４−（４−（フェニルスルファニル）アニリノ］−５，６，７，８−テトラヒドロ３−キノリンカルボン酸エチル；レーン３、Ｎ−（６−フェノキシ−４−キノリル）−Ｎ−［４−（フェニルスルファニル）フェニル］アミン；レーン４、スタウロスポリン；レーン５、ＳＤ  ２０３５８０；レーン４、ＰＤ  ０９８０５９；レーン７、ＦＬＡＧ−ＣＯＴ（３０−３９７）およびビヒクルのみ（ＤＭＳＯ）；およびレーン８、ＦＬＡＧ−ＣＯＴ（３０−３９７）、ＧＳＴ−ＩκＢ−αおよびビヒクルのみ（ＤＭＳＯ）；さらなる詳細については明細書を参照）。
【００５６】
図１４
キノリニル誘導体のコア構造を示す。
【００５７】
（発明を実施するための最良の形態）
ＴＰＬ−２（腫瘍進行遺伝子座２）は、まず、モロニーネズミ白血病ウイルスとの関連で単離されたＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼである。遺伝子（ｔｐｌ−２）は種々の系において腫瘍進行および腫瘍形成と関連し、Ｃ−末端切形によって腫瘍中で活性化されるように見えるポリペプチドをコードする（Ｍａｋｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６７：１２８６−１２９１；  Ｐａｔｒｏｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９０：２２５１−２２５５；Ｍａｋｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６７：４２８３−４２８９；  Ｐａｔｒｏｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９１：９７５５９７５９；  Ｓａｌｍｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ １５：８１７−８２６；  Ｃｅｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ １１：６８８−７００）。ラットＴＰＬ−２の完全なアミノ酸配列は受託番号Ｍ９４４５４下でＧｅｎｅ  Ｂａｎｋで利用可能である。癌Ｏｓａｋａ  甲状腺ＣＯＴと呼ばれるヒトＴＰＬ−２ホモログの核酸およびアミノ酸配列は受託番号ＮＭ ００５２０４および７２９８８４下でＧｅｎｅ  Ｂａｎｋで利用可能である。
（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ． １１（８），  ４０８８−４０９６（１９９１も参照））。
【００５８】
１．  ＴＰＬ−２はＮＦκＢレギュレータである。
最初の態様において、本発明はＮＦκＢ活性の延長のためのＴＰＬ−２分子の使用に関する。
１ａ．  ＴＰＬ−２分子の使用
本発明は、例えば、イン・ビトロおよび／またはイン・ビボアッセイにおいてＮＦκＢ活性を変調するための、特にかかるアッセイ系においてｐ１０５をリン酸化するためのＴＰＬ−２分子の使用；イン・ビボにて細胞中でＮＦκＢ活性を変調するための、例えば、免疫反応または炎症応答を誘導または防止するためのＴＰＬ−２分子の使用を含む。有利な具体例において、本発明は、脱調節されたＮＦκＢ発現と関連する病気の治療におけるＴＰＬ−２分子の使用に関する。
【００５９】
好ましい具体例において、本発明によるＴＰＬ−２分子は、イン・ビボにおいて、あるいは例えばイン・ビトロまたは細胞培養のごとく細胞中で行われるアッセイ方法において、ＮＦκＢ制御エレメントの下で遺伝子の転写を変調するのに有用である。
【００６０】
前記で定義したアッセイまたは方法で使用されるＴＰＬ−２分子は、ｐ１０５リン酸化および蛋白質分解を誘導または防止すように設計することができる。このように、例えば、野生型ＴＰＬ−２の生物学的活性を有し、ｐ１０５に結合し、それをリン酸化できるＴＰＬ−２分子を用いてｐ１０５分解および／または炎症応答を誘導することができる。さらに、ＴＰＬ−２の構成的に活性な突然変異体を用いることができ、このように、さらなる細胞制御経路からその活性を分離させる。
【００６１】
本発明のさらなる態様において、ＴＰＬ−２の「キナーゼデッド」優性陰性突然変異体を用いて、ｐ１０５についての内因性野生型ＴＰＬ−２と競合させるが標的のリン酸化は調節しないことによって、ｐ１０５リン酸化を下降調節することができる。キナーゼデッド突然変異体は、好ましくは、例えば位置２７０においてキナーゼドメイン中でＴＰＬ−２を突然変異体させることによって調製される。突然変異は、ランダムに行うことができ、人工基質をリン酸化する能力の評価によって選択することができるが、あるいはキナーゼ活性を防止または低下させるための活性部位および部位特異的突然変異誘発のモデリングによって設計することができる。好ましいデッド突然変異体はＴＰＬ−２（Ａ２７０）およびＴＰＬ−２（１６７）。これらの既知の突然変異体は共にＴＰＬ−２の構造における配列相同性から予測された。
【００６２】
１ｂ．  ＴＰＬ−２分子
本明細書中で用いる「ＴＰＬ−２分子」とは、ＴＰＬ−２の少なくとも１つの生物学的活性を有するポリペプチドをいう。このように、前記用語はＴＰＬ−２の少なくとも１つの構造決定基を保持するＴＰＬ−２の断片を含む。
【００６３】
好ましいＴＰＬ−２分子はＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ（受託番号Ｍ９４４５４）に記載された構造を有する。このポリペプチド、ラットＴＰＬ−２はやはり受託番号Ｍ９４４５４下で記載される核酸配列によってコードされる。９４４５４のポリペプチドをコードする別の配列は、遺伝子暗号の縮重に関連して、当業者によって設計され得る。さらに、本発明はＭ９４４５４に記載された核酸配列に対して実質的相同性を有する配列によってコードされるＴＰＬ−２ポリペプチドを含む。相同性が配列同一性を有する場合、「実質的相同性」は、直接的な配列併置および比較によって判断して、４０％を超える配列同一性、好ましくは４５％を超える配列同一性、好ましくは５５％を超える配列同一性、好ましくは６５％を超える配列同一性、最も好ましくは７５％以上の配列同一性を意味する。
【００６４】
例えば、用語「ＴＰＬ−２分子」はＣＯＴ、ＴＰＬ−２のヒト相同体（受託番号ＮＭ００５２０４）をいう。ＣＯＴはＴＰＬ−２と９０％同一である。
【００６５】
さらに、配列相同性（同一性）は、例えば、欠陥パラメータを用いていずれかの適当な相同性アルゴリズムを使用して決定することができる。有利には、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを、欠陥値に設定されたパラメータと共に使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、出典明示して本明細書の一部とみなすｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｈｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌに詳細に記載されている。検索パラメータは以下のごとく定義され、有利には、定義された欠陥パラメータに対して設定される。
【００６６】
有利には、ＢＬＡＳＴによって評価した場合、「実質的相同性」とは、少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９、最も好ましくは１０以上の期待値でマッチする配列と同等である。ＢＬＡＳＴ検索における期待についての欠陥閾値は通常１０である。
【００６７】
ＢＬＡＳＴ（基本的局所併置サーチのツール）は、プログラムｂｌａｓｔｐ，    ｂｌａｓｔｎ．ｂｌａｓｔｘ．ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘによって使用される試行錯誤検索アルゴリズムであり；これらのプログラムは、少数の増強と共にＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｅｕｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｈｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）参照の統計学的方法を用いてそれらの知見に対する優位性を規定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、例えば、クエリー配列に対する相同性を同定するために、配列同様性検索のために作成された。前記プログラムは、一般にはモチーフ−スタイルの検索では有用ではない。配列データベースの同様性検索における基本的論点の議論については、Ａｌｔｓｃｈｅｕｌ等（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：１１９−１２９参照。
【００６８】
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能な５つのＢＬＡＳＴプログラムは以下のタスクを実行する：
ｂｌａｓｔｐはアミノ酸クエリ配列を蛋白質配列データベースに対して比較する；
ｂｌａｓｔｎはヌクレオチドクエリ配列をヌクレオチド配列データベースに対して比較する；
ｂｌａｓｔｘはヌクレオチドクエリ配列（両ストランド）の６フレーム概念翻訳産物を蛋白質配列データベースに対して比較する；
ｔｂｌａｓｔｎは蛋白質クエリ配列をすべての６つのリーディングフレーム（両ストランド）において動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対して比較する；
ｔｂｌａｓｔｘはヌクレオチドクエリ配列をヌクレオチドデータベースの６フレーム翻訳に対して比較する。
【００６９】
ＢＬＡＳＴは以下の検索パラメータを使用する：
ＨＩＳＴＯＧＲＡＭ  各検索のためのスコアのヒストグラムを呈する；欠陥はｙｅｓ（ＢＬＡＳＴマニュアルにおけるパラメータＨ参照）。
【００７０】
ＤＩＳＣＲＩＰＴＩＯＮＳ  報告されたマッチング配列の短いに記載の数を特定の数に制限する；欠陥制限は１００記載である（マニュアルのページ中のパラメータＶ参照）。また、ＥＸＰＥＣＴおよびＣＵＴＯＦＦ参照）。
【００７１】
ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳ  データベースの配列を、それにつき高スコアリングセグメント対（ＡＳＰ）が報告されている特定の数に制限する；欠陥制限は５０である。もしこれよりも多いデータベース配列が、報告する統計学的優位性閾値を偶然に満足するならば（後記ＥＸＰＥＣＴおよびＣＵＴＯＦＦ参照）、最大統計学的優位性に帰するマッチのみが報告される（ＢＬＡＳＴマニュアル中のパラメータＢ参照）。
【００７２】
ＥＸＰＥＣＴ報告のための統計学的優位性閾値はデータベース配列に対してマッチする；ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｅｕｌ（１９９０）の推計モデルに従って、１０のマッチが単に偶然に見出されることが期待されるように欠陥値は１０である。もしマッチに帰せられる統計学的優位性がＥＸＰＥＣＴ閾値より大であるならば、前記マッチは報告されないであろう。より低いＥＸＰＥＣＴ閾値はより厳格であり、報告されるより少ないチャンスのマッチに導く。分率値は許容される（ＢＬＡＳＴマニュアル中のパラメータＥ参照）。
【００７３】
ＣＵＴＯＦＦ高スコアリングセグメント対を報告するためのカットオフスコア。欠陥値はＥＸＰＥＣＴ値から計算される（前記参照）。もし、それらに帰せられる統計学的優位性が、少なくとも、ＣＵＴＯＦＦ値と同等のスコアを有する孤立ＨＳＰに帰せられるであろう程高い場合のみ、データベース配列についてＨＳＰが報告される。より高いＣＵＴＯＦＦ値はより厳格であり、報告されるより少ないチャンスのマッチに導く（ＢＬＡＳＴマニュアル中のパラメータＳ参照）。典型的には、優位性閾値は、ＥＸＰＥＣＴを用いてより直感的に管理することができる。
【００７４】
ＭＡＴＲＩＸ  ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＴＸについての交互スコアリングマトリックスを特定する。欠陥マトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， １９９２）。有効な代替選択はＰＡＭ４０、ＰＡＭ１２０、ＰＡＭ２５０およびＩＤＥＮＴＩＴＹを含む。ＢＬＡＳＴＮでは交互スコアリングマトリックスは利用できず；ＢＬＡＳＴＮ要求におけるＭＡＴＲＩＸ指令を特定するにはエラー応答を復帰させる。
【００７５】
ＳＴＲＡＮＤ  ＴＢＬＡＳＴＮ検索をデータベース配列のちょうど頂部または底部のストランドに制限するか；あるいはＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸまたはＴＢＬＡＳＴＸで検索を、クエリー配列の頂部または底部ストランド上のちょうどリーディングフレームに制限する。
【００７６】
ＦＩＬＴＥＲ  Ｗｏｏｔｔｏｎ  ＆  Ｆｅｄｅｒｈｅｎ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１４９−１６３のＳＥＧプログラムによって決定された低い構成複雑性を有するクエリー配列のセグメント、またはＣｌａｖｅｒｉｅ  ＆  Ｓｔａｔｅｓ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ＆  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１９１−２０１のＸＮＵプログラムによって、またはブラスチンＮについては、ＴａｔｕｓｏｖおよびＬｉｐｍａｎ  のＤＵＳＴプログラムによって（ｈｔｔｐ：／／／ｗｗｗ．ｎｃｈｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）で決定された短い周期性の内部反復からなるセグメントをマスク解除する。フィルタリングはＢＬＡＳＴ出力から統計学的に有意であるが生物学的には興味のない報告を排除でき、（例えば、共通の酸性−、塩基性−またはプロリン−リッチ領域に対するヒット）、データベース配列に対しての特異的マッチングで利用できるクエリー配列のより生物学的に興味のある領域を残す。
【００７７】
ＦＩＬＴＥＲプログラムによって見出された低複雑性配列は、ヌクレオチド配列中の文字「Ｎ」（例えば、「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」）および蛋白質配列における文字「Ｘ」（例えば、「ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ」）を用いて置換される。
【００７８】
フィルタリングはクエリー配列（またはその翻訳産物）にのみ適用され、データベース配列には適用されない。欠陥フィルタリングはＢＬＡＳＴＮについてはＤＵＳＴであり、他のプログラムについてはＳＥＧである。
【００７９】
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴにおける配列に適用する場合、ＳＥＧ、ＸＮＵまたは双方によってマスクされるものが全く何もないということは異常なことではなく、従って、フィルタリングは効果を常に生じると期待されるべきではない。さらに、ある場合には、配列はそのすべてがマスクされ、未濾過クエリ配列に対して報告されたいずれかのマッチの統計学的有意性は疑われることである。
【００８０】
ＮＣＢＩ−ｇｙｉは、受託および／または遺伝子座の名称に加えて、ＮＣＢＩ  ｇｉ  アイデンティファイアーが出力中で示されるようにする。
【００８１】
最も好ましくは、配列の比較は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴに供された単純なＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて行われる。
【００８２】
さらに本発明は低、中程度または高ストリンジェンシーのうちのいずれか１つにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  Ｍ９４４５４に記載された核酸配列にハイブリダイズできる核酸配列によってコードされたポリペプチドを含む。
【００８３】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーはポリ核酸ハイブリッドが安定である条件をいう。かかる条件は当業者に明白である。当業者に知られているごとく、ハイブリッドの安定性は、配列相同性の１％減少ごとにほぼ１から１．５℃減少するハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映されている。一般に、ハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度および温度の関数である。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は高ストリンジェンシーの条件下、続いて種々のストリンジェンシーの洗浄下で行われる。
【００８４】
明細書中で用いるごとく、高ストリンジェンシーは６５から６８℃で１Ｍ  Ｎａ＋中で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能とする条件をいう。高ストリンジェンシー条件は、例えば、６×ＳＳＣ、５×デンハルト、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１  Ｎａ＋ピロフォスフェイトおよび非特異的なコンペティターとしての０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有する水性溶液中でのハイブリダイゼーションによって供することができる。ハイブリダイゼーションに続き、いくつかの工程で高ストリンジェンシー洗浄を行うことができ、０．２から０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中でハイブリダイゼーション温度にて最後の洗浄を行う（約３０分）。
【００８５】
中程度のストリンジェンシーとは、約６０から６２℃におけるのを除き、前記したハイブリダイゼーションと同等の条件をいう。その場合、最後の洗浄は１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中でハイブリダイゼーション温度にて行う。
【００８６】
低ストリンジェンシーとは約５０−５２℃における前記溶液中でのハイブリダイゼーションと同等の条件をいう。その場合、最終洗浄は、２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中でハイブリダイゼーション温度にて行う。
【００８７】
種々の緩衝液、例えば、ホルムアミドベースの緩衝液および温度を用いて、これらの条件を適合させ複製することができるのが理解される。デンハルト溶液およびＳＳＣは、他の適当なハイブリダイゼーション緩衝液と同様に当業者によく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等編（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  または  Ａｕｓｕｂｅｌ等編（１９９０）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，  ｉｎｎｃ．）。最適ハイブリダイゼーション条件は、プローブの長さおよびＧＣ内容もまた役割を演じるので経験的に決定されなければならない。
【００８８】
有利には、本発明は、さらに、ストリンジェント条件下で、Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  Ｍ９４４５４またはＮＭ００５２０４に記載されている核酸配列の断片にハイブリダイズすることができる核酸を提供する（各々、配列番号：１および配列番号：３参照）。好ましくは、断片は長さが１５および５０塩基の間である。有利には、それは長さが約２５塩基である。
【００８９】
本明細書中に提供されるガイダンスがあれば、本発明の核酸は当業者によく知られた方法に従って得ることができる。例えば、本発明のＤＮＡは、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いる化学合成によって、またはゲノムライブラリもしくはＴＰＬ−２を保有し、それを検出可能なレベルで発現すると考えられる源から調製した適当なｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって得ることができる。
【００９０】
注目する核酸の合成のための化学的方法は当業者に知られており、トリエステル、ホスファイト、ホスホルアミダイトおよびＨ−ホスホネイト方法、ＰＣＲおよび他の自動プライマー方法ならびに固体支持体上のオリゴヌクレオチド合成を含む。これらの方法は、もし核酸の全核酸配列が知られていれば、あるいはコーディングストランドに相補的な核酸の配列が利用できれば使用することができる。別法として、もし標的アミノ酸配列が知られていれば、各アミノ酸残基についての既知かつ好ましいコーディング残基を用いて可能な核酸配列を推定することができる。
【００９１】
ＴＰＬ−２をコードする遺伝子を単離するための別の手段は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９のセクション１４に記載されているＰＣＲ技術を用いることである。この方法は、ＴＰＬ−２核酸にハイブリダイズするであろうオリゴヌクレオチドプローブの使用を要する。オリゴヌクレオチドの選択のための戦略は後記する。
【００９２】
注目する遺伝子またはそれによってコードする蛋白質を同定するように設計されたプローブまたは分析ツールでライブラリをスクリーニングする。ｃＤＮＡ発現ライブラリでは、適当な手段はＴＰＬ−２を認識しそれに特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体；同一または異なる種からの既知またはそうであると思われるＴＰＬ−２  ｃＤＮＡをコードする長さが約２０から８０塩基のオリゴヌクレオチド；および／または同一またはハイブリダイズする遺伝子をコードする相補的または相同ｃＤＮＡまたはその断片を含む。ゲノムＤＮＡライブラリをスクリーニングするための適当なプローブは、限定されるものではないが、同一またはハイブリダイズするＤＮＡをコードするオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡまたはその断片；および／または相同ゲノムＤＮＡまたはその断片を含む。
【００９３】
ＴＰＬ−２をコードする核酸は、適当なハイブリダイゼーション条件下で、プローブ、すなわち、Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  受託番号Ｍ９４４５４またはＮＭ００５２０４（各々、配列番号：１、配列番号：３）に記載された配列から得ることができるオリゴヌクレオチドを含めた本明細書中に開示した核酸で適当なｃＤＮＡまたはゲノムライブラリをスクリーニングすることによって単離することができる。適当なライブラリは商業的に利用可能であるか、あるいは細胞系、組織試料等から調製することができる。
【００９４】
本明細書中で用いるごとく、プローブは、Ｍ９４４５４に記載された連続塩基と同等またはそれより大きな数と同一である（またはそれと相補的である）約１０および５０の間、好ましくは１５および３０の間、最も好ましくは少なくとも約２０連続塩基を含むヌクレオチドの配列を有する一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである。プローブとして選択された２０核酸配列は、偽陽性結果が最小化されるように、十分な長さかつ十分に明確であるべきである。ヌクレオチド配列は、通常、ＴＰＬ−２の保存されたまたはコードに相同なヌクレオチド配列もしくは領域に基づく。プローブとして使用される核酸は１以上の位置で縮重する。縮重オリゴヌクレオチドの使用は、その種における優先的コドン用法が知られていない種からライブラリがスクリーニングされる場合に特に重要であり得る。
【００９５】
それからプローブを構築すべき好ましい領域は５’および／または３’コーディング配列、リガンド結合部位をコードするのが予測される配列等を含む。例えば、本明細書中に開示された全長ｃＤＮＡクローンまたはその断片いずれかをプローブとして用いることができる。好ましくは、本発明の核酸プローブを、ハイブリダイゼーションに際して容易な検出のための適当な標識手段で標識する。例えば、適当な標識手段は放射性標識である。ＤＮＡ断片を標識する好ましい方法は、当業者によく知られているごとく、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片でα−３２Ｐ  ｄＡＴＰをランダムプライミング反応で取り込むことによる。オリゴヌクレオチドは、通常、α−３２Ｐ−標識ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼで末端標識する。しかしながら、他の方法（例えば、非放射性）を用いて断片またはオリゴヌクレオチドを標識することもでき、例えば、酵素標識、適当なフルオロフォアでの蛍光標識およびビオチン化を含む。
【００９６】
例えば、実質的に完全なＴＰＬ−２をコードする配列または当該ＤＮＡの一部に基づく適当なオリゴヌクレオチドを含めたＤＮＡの一部を持つライブラリでスクリーニングした後、ハイブリダイゼーションシグナルを検出することによって陽性クローンを同定し；同定されたクローンを制限酵素マッピングおよび／またはＤＮＡ配列分析によって特徴づけ、次いで、例えば、本明細書中に記載する配列との比較によって調べて、それらが完全なＴＰＬ−２をコードするＤＮＡを含むか否か（すなわち、それらが翻訳開始および終止コドンを含むかを）確認する。選択されたクローンが不完全であれば、それらを用いて同一または異なるライブラリを再スクリーニングして重複クローンを得る。ライブラリがゲノムのものである場合、重複クローンはエクソンおよびイントロンを含み得る。もしライブラリがｃＤＮＡライブラリであれば、重複クローンはオープンリーディングフレームを含むであろう。両方の場合において、完全なクローンはＤＮＡおよびここに提供する推定アミノ酸配列との比較によって同定することができる。
【００９７】
「構造決定基」は、問題の誘導体がＴＰＬ−２の少なくとも１つの構造的特徴を保有することを意味する。構造的特徴は天然に生じるＴＰＬ−２ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を複製することができる構造モチーフの保有を含む。このように、本発明によって提供されるＴＰＬ−２は一次転写体、アミノ酸突然変異体、グリコシル化変種およびＴＰＬ−２の少なくとも１つの生理学的および／または物理的特性を保有するＴＰＬ−２の他の共有結合誘導体の別のスプライシングによって生じたｍＲＮＡによってコードされるスプライス変種を含む。誘導体の例は、本発明の蛋白質が天然に生じるアミノ酸以外の部位での置換、化学的、酵素的または他の適当な手段によって共有結合修飾される分子を含む。かかる部位は、酵素またはアイソトープ電池のような検出可能な部位であってよい。さらに、特定の種、好ましくは哺乳動物で見出されるＴＰＬ−２の天然に生じる変種がさらに含まれる。かかる変種は、同一遺伝子ファミリーの関連遺伝子によって、特定の遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードできるか、あるいはＴＰＬ−２の別のスプライシング変種を表すことができる。
【００９８】
ＴＰＬ−２のＣ−末端はｐ１０５との相互作用で必要であることが観察された。このように、本発明によるＴＰＬ−２分子は、好ましくは、天然に生じるＴＰＬ−２のＣ−末端部分を保有する。好ましくは、本発明によるＴＰＬ−２分子は天然に生じるＴＰＬ−２、例えば、Ｍ９４４５４に表されるＴＰＬ−２の少なくともアミノ酸３９８−４６８を保有する。
【００９９】
有利には、本発明によるＴＰＬ−２分子はＴＰＬ−２のアミノ酸３５０−４６８；好ましくは、ＴＰＬ−２のアミノ酸３００−４６８；好ましくは、ＴＰＬ−２のアミノ酸２５０４６８；好ましくは、ＴＰＬ−２のアミノ酸２００−４６８；最も好ましくは、ＴＰＬ−２のアミノ酸３０８−４６８を含む。
【０１００】
別法として、本発明によるＴＰＬ−２分子はＭ９４４５４に示されるＴＰＬ−２の７つのエクソンのうち少なくとも１つを含む。好ましくは、従って、ＴＰＬ−２分子はアミノ酸４２５から４６８（エクソン７）を含み；有利には、それはアミノ酸３２３−４２４（エクソン６）を含み；好ましくは、それはアミノ酸２５６−３４２（エクソン５）を含み；好ましくは、それはアミノ酸１６９から２５５（エクソン４）を含み；好ましくは、それはアミノ酸１１３から１６８（エクソン３）を含み；好ましくは、それはアミノ酸１から１１２（エクソン２）を含み；あるいは前記のいずれかの組合せを含む。
【０１０１】
さらに、本発明は、前記定義の断片の相同体まで拡張される。
【０１０２】
前記で示したごとく、共通の構造決定基を保有する誘導体はＴＰＬ−２の断片であり得る。ＴＰＬ−２の断片はその個々のドメイン、ならびにドメインに由来するより小さなポリペプチドを含む。好ましくは、本発明によるＴＰＬ−２に由来するより小さなポリペプチドは、ＴＰＬ−２に特徴的な単一の基本的ドメインを規定する。断片は、それがＴＰＬ−２の１つの特徴を保有する限り、理論的にはほとんどいずれのサイズであってもよい。好ましくは、断片は長さが４および３００アミノ酸の間である。より長い断片は全長ＴＰＬ−２の切形と見なされ、一般に、用語「ＴＰＬ−２」に含まれる。
【０１０３】
ＴＰＬ−２の誘導体は、ＴＰＬ−２に特徴的な少なくとも１つの特徴を維持する要件を条件として、アミノ酸欠失、付加または置換を含有し得るその突然変異体を含む。このように、保存的アミノ酸置換は、Ｎ末端からの切形がそうであり得るごとく、ＴＰＬ−２の性質を実質的に改変することなく行うことができる。さらに、欠失および置換は本発明に含まれるＴＰＬ−２の断片に対してなすことができる。ＴＰＬ−２突然変異体は、例えば、１以上のアミノ酸の付加、交換および／または欠失の結果となるイン・ビトロ突然変異誘発に付されたＴＰＬ−２をコードするＤＮＡから生産することができる。例えば、ＴＰＬ−２の置換、欠失または挿入変種は組換え方法によって調製することができ、ＴＰＬ−２の天然形態との免疫−交差反応性につきスクリーニングすることができる。
【０１０４】
ＴＰＬ−２の断片、突然変異体および他の誘導体は、好ましくは、ＴＰＬ−２との実質的相同性を保有する。本明細書で用いるごとく、「相同性」とは、２つの存在が、当業者がそれらが期限および機能において同様であると判断するための十分な特徴を有することを意味する。好ましくは、相同性は配列同一性をいうのに用いられ、前記したごとく決定される。
【０１０５】
１つの具体例において、ＴＰＬ−２蛋白質の異なる形態は、例えば、ＣＯＴと呼ばれるヒトＴＰＬ−２ホモログの種々のアミノ酸領域を含み、特に、例えば、アミノ酸残基３０から３９７を表すヒトＴＰＬ−２ポリペプチド（すなわち、ＣＯＴ（３０−３９７））、アミノ酸残基３０から４６７を表すヒトＴＰＬ−２ポリペプチド（すなわち、ＣＯＴ（３０−４６７））、アミノ酸残基１から３９７を表すヒトＴＰＬ−２ポリペプチド（すなわち、ＣＯＴ（１−３９７））およびアミノ酸残基１から４６７を表すヒトＴＰＬ−２ポリペプチド（すなわち、ＣＯＴ（１−４６７））を含む。ＴＰＬ−２ポリペプチドのこれらの異なる形態は当業者に既知の種々のイムノ−またはアフィニティタグに融合して、所与のポリペプチドの精製を助けることができる。タグは、限定されるものではないが、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）およびポリ−ヒスチジン残基、例えば、Ｈｉｓ６を含む。加えて、本発明は、例えば、前記タグに隣接して挿入して、蛋白質精製後のその除去を容易とすることができる望ましいプロテアーゼ切断部位を有するように作成されたポリペプチドを含む。
【０１０６】
従って、本発明のＴＰＬ−２ポリペプチドは、例えば、トランスフェクトされたヒト２９３Ａ細胞からの、または例えば本明細書中に記載するバクロウイルス感染昆虫細胞からの免疫沈殿によって発現され、精製することができる。典型的には、バクロウイルス感染昆虫細胞は、化学ライブラリの質量−スクリーニングに適した大量の組換え発現蛋白質の精製を可能とする。ＴＰＬ−２分子の調製のためのさらなる方法は後記する。
【０１０７】
１ｃ．ＴＰＬ−２分子の調製
本発明は前記したｐ１０５活性の変調で使用されるＴＰＬ−２分子の生産を含む。好ましくは、ＴＰＬ−２分子は組換えＤＮＡ技術によって、ＴＰＬ−２分子をコードする核酸をさらなる操作のためにベクターに取り込むことができる手段によって生産される。本明細書中で用いるごとく、ベクター（またはプラスミド）とは、その発現または複製のために異種ＤＮＡを細胞に導入するのに使用される区別されるエレメントを言う。かかるビイクルの選択および使用は十分に当業者の技量内のものである。多くのベクターが入手可能であり、適当なベクターの選択はベクターの意図した使用、すなわち、それがＤＮＡ増幅またはＤＮＡ発現に使用されるのか、ベクターに挿入すべきＤＮＡのサイズ、およびベクターで形質転換すべき宿主細胞に依存する。各ベクターは、その機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）およびそれが適合する宿主細胞に応じて種々の成分を含有する。ベクター成分は、一般に、限定されるものではないが、以下の：複製起点１以上のマーカー遺伝子エンハンサーエレメント、プロモータ、転写終止配列およびシグナル配列のうちの１以上を含む。
【０１０８】
発現およびクローニング両ベクターは、一般に、１以上の選択された宿主細胞でベクターを複製させることができる核酸配列を含有する。典型的には、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体ＤＮＡとは独立してベクターを複製させることができるものであり、複製起点または自律複製配列を含む。かかる配列は種々の細菌、酵母およびウイルスでよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点はほとんどのグラム陰性菌に適しており、２ｐプラスミド起点は酵母に適しており、種々のウイルス起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス）は哺乳動物細胞においてクローニングベクターで有用である。一般に、複製起点成分は、これらがＣＯＳ細胞のごとき、高レベルのＤＮＡ複製の能力がある哺乳動物細胞で用いられるのでなければ、哺乳動物発現ベクターで必要とされない。
【０１０９】
ほとんどの発現ベクターはシャトルベクターであり、すなわち、それらは少なくとも１つのクラスの生物中で複製することができるが、発現のためにもう１つのクラスの生物にトランスフェクトすることができる。例えば、ベクターをＥ．Ｃｏｌｉにクローン化し、次いで、同ベクターを酵母または哺乳動物細胞にトランスフェクトするが、それは宿主細胞染色体とは独立して複製できない。ＤＮＡは宿主ゲノムへの挿入によって複製することができる。しかしながら、ＴＰＬ−２をコードするゲノムＤＮＡの回復は、外因的に複製されたベクターのそれよりも複雑である。なぜならば、ＴＰＬ−２  ＤＮＡを切り出すのに制限酵素消化が必要だからである。ＤＮＡはＰＣＲによって増幅することができ、いずれの複製成分なくしても宿主細胞に直接トランスフェクトすることができる。
【０１１０】
有利には、発現およびクローニングベクターは選択マーカーとも言われる選択遺伝子を含有することができる。この遺伝子は選択培地中で増殖させた形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要な蛋白質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換してない宿主細胞が培地中で生存しないであろう。典型的選択遺伝子は抗生物質および他のトキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリン、補体要求欠陥に対する抵抗性を付与し、、あるいは複雑な培地から利用できない非常に重要な栄養素を供給する蛋白質をコードする。
【０１１１】
酵母に適した選択的遺伝子マーカーに関しては、マーカー遺伝子の表現型発現のため形質転換についての選択を容易とするいずれの遺伝子も使用することができる。酵母についての適当なマーカーは、例えば、抗生物質Ｇ４１８、ヒグロマイシンまたはブレオマイシンに対する耐性を付与するものであるか、あるいは栄養要求株酵母突然変異体におけるプロトトロピー、例えば、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＴＲＰ１またはＨＩＳ３遺伝子を提供する。
【０１１２】
ベクターの複製は便宜にはＥ．Ｃｏｌｉにおいて行うので、Ｅ．Ｃｏｌｉ遺伝子マーカーおよびＥ．Ｃｏｌｉ複製起点が有利には含まれる。これらはｐＢＲ３２２、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＣベクターまたはｐＵＣプラスミド、例えば、ｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９のごときＥ．Ｃｏｌｉプラスミドから得ることができ、これらはＥ．Ｃｏｌｉ複製起点およびアンピシリンのごとき抗生物質に対する耐性を付与するＥ．Ｃｏｌｉ遺伝子マーカーを共に含有する。
【０１１３】
哺乳動物細胞に対する適当な選択マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ、メトトレキセート耐性）、チミジンキナーゼ、またはＧ４１８またはヒグロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子のごとき、ＴＰＬ−２核酸を摂取する能力のある細胞の同定を可能とするものである。哺乳動物細胞形質転換体は、摂取されて、マーカーを発現している形質転換体のみがユニークに生存するのに適合する選択圧下に置く。ＤＨＦＲまたはグルタミンシンターゼ（ＧＳ）マーカーの場合、選択圧は、圧力が漸次増加する条件下で形質転換体を培養し、それにより、選択遺伝子およびＴＰＬ−２をコードする連結されたＤＮＡ双方の（その染色体組込部位における）増幅に導くことによって課すことができる。増幅は、所望の蛋白質をコードすることができる密接に関連した遺伝子と共に、増殖に非常に重要な蛋白質の生産がかなり必要である場合、遺伝子が組換え細胞の染色体内でタンデムに繰り返すプロセスである。増大した量の所望の蛋白質は、通常、このように増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１１４】
発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、ＴＰＬ−２核酸に作動可能に連結されたプロモータを含有する。かかるプロモータは誘導性または構成的であり得る。前記プロモータは、制限酵素消化により源ＤＮＡからプロモータを除去し、単離されたプロモータ配列をベクターに挿入することによって、ＴＰＬ−２をコードするＤＮＡに作動に可能に連結させる。天然ＴＰＬ−２プロモータ配列および多くの異種プロモータ双方を用いて、ＴＰＬ−２  ＤＮＡの増幅および／または発現を指令することができる。用語「作動可能に連結した」とは、記載された成分がその意図したように機能するようにさせる関係である併置をいう。コーディング配列に「作動可能に連結した」制御配列は、コーディング配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるように連結される。
【０１１５】
原核生物宿主で使用するのに適したプロモータは、例えば、βラクタマーゼおよびラクトースプロモータ系アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系およびｔａｃプロモータのごときハイブリッドプロモータを含む。そのヌクレオチド配列は公表されており、それにより、当業者は、いずれかの必要な制限部位を供するためのリンカーまたはアダプターを用い、それをＴＰＬ−２をコードするＤＮＡに作動可能に連結させることができる。細菌系で用いるプロモータは、一般に、ＴＰＬ−２をコードするＤＮＡに作動可能に連結したシャインダルガノ配列を含有する。
【０１１６】
好ましい発現ベクターは、細菌で機能することができるｐｈａｇｅｘまたはＴ７のごときバクテリオファージのプロモータを含む細菌発現ベクターである。最も広く使用される発現系の１つにおいて、融合蛋白質をコードする核酸を、Ｔ７  ＲＮＡプロメラーゼによってベクターから転写することができる（Ｓｔｕｄｉｅｒ等，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎｎ  Ｅｎｚｙｍｅ． １８５；６０−８９， １９９０）。ｐＥＴベクターと組み合わせて用いられるＥ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主株において、Ｔ７  ＲＮＡプリメラーゼは宿主細菌においてリソーゲンＤＥ３から生産され、その発現はＩＰＴＧ誘導性ｌａｃ  ＵＶ５プロモータの制御下にある。この系は多くの蛋白質の過剰生産で成功して使用されてきた。別法として、商業的に入手可能な（Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，米国）ＣＥ６ファージのごときｉｎｔ−ファージでの感染によってラムダファージに導入することができる。他のベクターはＰＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＮＬ）のごときラムダＰＬプロモータを含有するベクター、ｐＴｒｃＨｉｓＸｐｒｅｓｓＴｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＴｒｃ９９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  ＳＥ）のごときｔｒｃプロモータを含有するベクター、またはｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＰＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  ＭＡ，米国）のごときｔａｃプロモーターを含有するベクターを含む。
【０１１７】
さらに、本発明によるＴＰＬ−２遺伝子は、好ましくは、封入体中におけるよりもむしろ可溶性天然ペプチドとしてそれが生産されるように細菌宿主からポリペプチドの分泌を容易とするための分泌配列を含む。前記ペプチドは、適当には、細菌ペリプラズム空間または培地から回収することができる。
【０１１８】
酵母宿主で使用するのに適した促進配列は調製することができるか、または構成的であり、好ましくは、高度に発現された酵母遺伝子、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子に由来する。このように、ＴＲＰ１遺伝子のプロモーター、ＡＤＨＩまたＡＤＨＩＩ遺伝子、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５遺伝子、ａ−またはａ−因子をコードする酵母接合フェロモン遺伝子のプロモーターまたはエノラーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）、３−ホスフォグレセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスフォフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスフォグリセートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスフォグルコースイソメラーゼまたはグルコキナーゼ遺伝子、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ  ４遺伝子、Ｓ．  ｐｏｍｂｅ  ｎｍｔ１遺伝子のプロモーターのごとき解糖酵素をコードする遺伝子に由来するプロモーターまたはＴＡＴＡ結合蛋白質（ＴＢＰ）遺伝子に由来するプロモーターを用いることができる。さらに、１つの酵母遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）を含むハイブリッドプロモーターおよびもう１つの酵母遺伝子の機能的ＴＡＴＡボックスを含む加硫プロモーターエレメント、例えば、酵母ＰＨ０５遺伝子のＵＡＳ（類）を含むハイブリッドプロモーターおよび酵母ＧＡＰ遺伝子の機能的ＴＡＴＡボックスを含めた加硫プロモーターエレメント（ＰＨ０５−ＧＡＰハイブリッドプロモーター）を使用することができる。適当な構成的５プロモーターは、例えば、ＰＨＯ５遺伝子のヌクレオチド−１７３で開始し、ヌクレオチド−９で終わるＰＨＯ５（−１７３）プロモーターエレメントのごとき上流調節エレメント（ＵＡＳ）に欠く短化酸性ホスファターゼＰＨＯ５プロモーターである。
【０１１９】
哺乳動物宿主におけるベクターからのＴＰＬ−２遺伝子の転写は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルスおよびシニアンウイルス４０（ＳＶ４０）のごときウイルスのゲノムから、アクチンプロモータまたは非常に強力なプロモーター、例えば、リボソーム蛋白質プロモーターのごとき異種哺乳動物プロモーターから、およびＴＰＬ−２配列に通常関連したプロモーターから由来したプロモーターによって制御することができ、但し、かかるプロモーターは宿主細胞系に適合する。
【０１２０】
高等真核生物によるＴＰＬ−２をコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加させることができる。エンハンサーは比較的向きおよび位置独立性である。多くのエンハンサー配列は哺乳動物遺伝子（例えば、エラスターゼおよびグロビン）から知られている。しかしながら、典型的には、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーが使用されるであろう。その例は複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ＢＰ１００−２７０）およびＣＭＶ初期プロモーターエンハンサーを含む。エンハンサーは位置５’または３’からＴＰＬ−２ＤＮＡにおいてベクターにスプライスすることができるが、好ましくはプロモーターから５’側の部位に位置する。
【０１２１】
有利には、ＴＰＬ−２をコードする真核生物発現ベクターは遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）を含むことができる。ＬＣＲは宿主細胞クロマチンに取り込まれたトランスジーンの高レベル取り込み部位独立性発現を指令することができ、これは特に、遺伝子治療適用のために設計したベクターにおいてまたはトランスジェニック動物において、ベクターの染色体取り込みが起こった永久的にトランスフェクトされた真核生物細胞系の意味でＴＰＬ−２遺伝子が発現されるべき場合に重要である。
【０１２２】
真核生物発現ベクターは転写の終止のためにおよびｍＲＮＡを安定化させるために必要な配列をも含有するであろう。かかる配列は真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および３’非翻訳領域から通常は利用可能である。これらの領域はＴＰＬ−２をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含む。
【０１２３】
発現ベクターは、かかるＤＮＡの発現が可能であるプロモーター領域のごとき調節配列と作動可能に連結したＴＰＬ−２核酸を発現することができるいずれのベクターも含むことができる。このように、発現ベクターとは、適当な宿主細胞への導入に際して、クローン化されたＤＮＡの発現がもたらされるプラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターのごとき組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築体をいう。適当な発現ベクターは当業者によく知られており、真核生物および／または原核生物細胞中で複製可能なもの、または宿主細胞ゲノムに組み込まれるものを含む。例えば、ＴＰＬ−２をコードするＤＮＡは、哺乳動物細胞中でのｃＤＮＡの発現に適したベクター、例えば、ｐＥＶＲＦのごときＣＭＶエンハンサーベースのベクターに挿入することができる（Ｍａｔｔｈｉａｓ等（１９８９）ＮＡＲ １７，６４１８）。
【０１２４】
本発明を実施するのに特に有用なものは、哺乳動物細胞においてＴＰＬ−２をコードするＤＮＡの一過性発現を供する発現ベクターである。一過性発現は、通常、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積させ、今度は高レベルのＴＰＬ−２を合成するように、宿主細胞中で効果的に複製できる発現ベクターの使用を含む。本発明の目的では、一過性発現系は、例えば、ＴＰＬ−２突然変異体を同定するには、潜在的リン酸化部位を同定するのに、または蛋白質の機能的ドメインを特徴づけるのに有用である。
【０１２５】
本発明によるベクターの構築は通常の連結技術を使用する。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片を切断し、仕立て、必要なプラスミドを生じさせるのに望まれる形態で再連結する。所望ならば、構築されたプラスミド中の正しい配列を確認するための分析を既知の方法で行う。発現ベクターを構築し、イン・ビトロ転写体を調製し、ＤＮＡを宿主細胞に導入し、およびＴＰＬ−２発現および機能を評価するための分析を行うための適当な方法は当業者に知られている。遺伝子の存在、増幅および／または発現は、例えば、通常のサザーンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を開始させるためのノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）またはイン・サイチュハイブリダイゼーションによって、本明細書中で提供される配列に基づくことができる適当に標識されたプローブを用いて直接的に試料中で測定することができる。当業者にあれば、所望ならば、これらの方法をいかにして修飾することができるかを容易に考えつくであろう。
【０１２６】
このように、本発明は異種ＴＰＬ−２分子をコードするベクターで形質転換した宿主細胞を含む。本明細書中で用いるごとく、異種ＴＰＬ−２分子は内因性ＴＰＬ−２の突然変異した形態、または外因性ＴＰＬ−２の突然変異したまたは野生型形態であり得る。
【０１２７】
ＴＰＬ−２は、有利には、昆虫細胞系で発現させることができる。本発明の方法で使用するのに適した昆虫細胞は、原理的には、発現ベクターで形質転換でき、それによりコードされた異種蛋白質を発現できるいずれの鱗翅類細胞を含む。特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞系ＩＰＢＬ−ＳＦ−２１  ＡＥのごときＳｆ細胞系の使用（Ｖａｕｇｈｎ等、（１９７７）Ｉｎｖｉｔｒｏ， １３，  ２１３−２１７）が好ましい。誘導細胞系Ｓｆ９が特に好ましい。しかしながら、Ｔｒｉｃｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ３６８（ＫｕｒａｓｔａｃｋおよびＭａｒｍｏｒｏｓｃｈ，（１９７６）Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎｎ  Ｍｅｄｉｓｏｎ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，米国）のごとき他の細胞系を使用することができる。これらの細胞系、ならびに本発明で使用するのに適した他の昆虫細胞系は（例えば、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ，米国）から商業的に入手可能である。
【０１２８】
培養中の昆虫細胞における発現と同様に、本発明は全昆虫生物におけるＴＰＬ−２の発現を含む。バクロウイルスのごときウイルスベクターの使用は全昆虫の感染を可能とし、これは、いくつかの方法では、培養した細胞よりも増殖が容易である。というのは、それらは特別の増殖条件に対して有する要件が少ないからである。シルクモス（ｓｉｌｋ  ｍｏｔｈ）のごとき大きな昆虫は高収率の異種蛋白質を供する。前記蛋白質は通常の抽出技術に従って昆虫から抽出することができる。
【０１２９】
本発明で使用するのに適した発現ベクターは、昆虫細胞系において外来性蛋白質を発現することができるすべてのベクターを含む。一般に、哺乳動物および他の真核生物細胞で有用なベクターは昆虫細胞培養に適用することができる。特に昆虫培養細胞を意図したバクロウイルスベクターが特に好ましく、（例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＣｌｏｎｔｅｃｈから）商業的に広く得ることができる。シンドビスウイルス（Ｈａｈｎ等（１９９２）ＰＮＡＳ（米国）８９，  ２６７９−２６８３）のごとき昆虫細胞を感染させることができる他のウイルスベクターが知られている。（Ｍｉｌｌａｒ（１９８８）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２， １７７−１９９によってレビュされている）選択されたバクロウイルスベクターはＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多重核多角体ウイルスＡｃＭＮＰＶである。
【０１３０】
典型的には、ポリヘドリンはウイルス生産に必要でないため、異種遺伝子はＡｃＭＮＰＶのポリヘドリン遺伝子を少なくとも一部分置き換える。異種遺伝子を挿入するには、導入ベクターが有利に用いられる。導入ベクターはＥ．Ｃｏｌｉ宿主で調製され、次いで、相同組換えのプロセスによってＤＮＡインサートがＡｃＭＮＰＢに導入される。
【０１３１】
２．  ＴＰＬ−２は薬物開発のターゲットである。
本発明によると、ＴＰＬ−２分子をターゲットとして用いて、化合物、例えば、ｐ１０５蛋白質分解およびＲｅｌサブユニット放出を介してＮＦκＢの活性を変調することができる医薬のためのリード化合物を同定する。従って、本発明はアッセイに関し、
（ａ）評価すべき化合物または複数化合物と共にＴＰＬ−２分子をインキュベートする工程と；次いで、
（ｂ）１  ＰＬ−２分子の活性に影響する化合物を同定する工程を含む、直接的または間接的にｐ１０５の活性を変調することができる化合物または複数化合物を同定する方法を提供する。
【０１３２】
２ａ．  ＴＰＬ−２結合化合物
この態様の本発明の第１の具体例によると、前記アッセイはＴＰＬ−２分子に直接結合するポリペプチドを検出するように構成される。
従って、本発明は、
（ａ）評価すべき化合物または複合化合物と共にＴＰＬ−２分子をインキュベートする工程と；次いで、
（ｂ）ＴＰＬ−２分子に結合する化合物を同定する工程を含むＮＦκＢ活性のモジュレータを同定する方法を提供する。
好ましくは、前記方法は、
（ｃ）細胞ベースのアッセイにおいて、ＮＦκＢ活性化を変調する能力につきＴＰＬ−２に結合する化合物を評価する工程をさらに含む。
ＴＰＬ−２への結合は当業者に知られたいずれかの技術によって評価することができる。
【０１３３】
適当なアッセイの例は、イン・ビボで相互作用を測定する２ハイブリッドアッセイ系、例えば、カラムに固定化されたポリペプチドへの結合を含むアフィニティクロマトグラフィアッセイ、化合物およびＴＰＬ−２の結合対における一方または双方のパートナーの蛍光の変化に関連する蛍光アッセイを含む。好ましいのは２−ハイブリッドアッセイのごときイン・ビボで細胞中で行われるアッセイである。
【０１３４】
この具体例の好ましい具体例において、本発明は、テストすべき化合物または複数化合物の存在なくしては、ＴＰＬ−２が参照親和性でもってｐ１０５と会合する条件下で、テストすべき化合物または複数化合物をＴＰＬ−２分子およびｐ１０５と共にインキュベートすることと；
テストすべき化合物または複数化合物の存在下でｐ１０５に対するＴＰＬ−２の結合親和性を測定することと；次いで
参照結合親和性に関してｐ１０５に対するＴＰＬ−２の結合親和性を変調する化合物を選択することを含む炎症応答に関するまたはそれを用いる病気の治療で有用な医薬のためのリード化合物を同定する方法を提供する。
【０１３５】
好ましくは、従って、本発明によるアッセイは、テストすべき化合物または化合物類の不存在下において、あるいはそのＴＰＬ−２への結合での活性が知られているかまたはそうでなければ参照値として望ましい参照化合物の存在下でキャリブレートする。例えば、２−ハイブリッド系においては、参照値はいずれかの化合物の存在下で得ることができる。ｐ１０５に対するＴＰＬ−２の結合活性を増加させる化合物または複数化合物の添加は参照レベルを超えてアッセイからの読みを増加させ、他方、この親和性を低下させる化合物または複数化合物の添加の結果、参照レベル未満のアッセイ読みの減少がもたらされる。
【０１３６】
２ｂ．  機能的ｐ１０５／ＴＰＬ−２相互作用を変調する化合物
第２の具体例において、本発明は化合物または複数化合物およびＴＰＬ−２の間の機能的相互作用を検出するように構成することができる。テストすべき化合物または複数化合物に応答して、またはｐ１０５に対するＴＰＬ−２の生物学的効果の変調のレベルでこのキナーゼがそれ自体活性化されまたは不活性化されるように、かかる相互作用はＴＰＬ−２の調節のレベルで起こるであろう。本明細書で用いる「活性化」および「不活性化」は化合物の酵素的または他の活性の変調、ならびに、例えば、細胞中でのポリペプチドの発現の活性化または抑制によるその生産速度の変調を含む。前記用語は遺伝子産物の発現を変調する遺伝子転写に対する直接的作用を含む。
【０１３７】
ＴＰＬ−２およびｐ１０５の間の機能的相互作用の変調を検出するアッセイは好ましくは細胞−ベースのアッセイである。例えば、それらはｐ１０５のリン酸化の程度の評価に基づくことができ、これはＴＰＬ−２−ｐ１０５相互作用に由来するＮＦκＢ活性化の程度の指標である。
【０１３８】
好ましい具体例において、ＴＰＬ−２分子をコードする核酸はベクターに連結され、適当な宿主細胞に導入されて、ＴＰＬ−２分子を発現する形質転換細胞系を得る。従って、得られた細胞系は、ＴＰＬ−２活性に影響する潜在的化合物の再現性ある定性的および／または定量的分析のために生産される。このように、ＴＰＬ−２発現細胞は化合物、特に、ＴＰＬ−２の機能を変調する低分子量化合物の同定で使用することができる。このように、ＴＰＬ−２を発現する宿主細胞は薬物スクリーニングで有用であって、ＴＰＬ−２の活性を変調する化合物を同定する方法を提供するのは本発明のさらなる目的であり、前記方法はＴＰＬ−２をコードする異種ＤＮＡを含有する細胞を、前記ＴＰＬ−２の活性を変調するその能力が測定されることを求められる少なくとも１つの化合物または化合物の混合物またはシグナルに暴露し（ここに、前記細胞は機能的ＴＰＬ−２を生産する）、しかるのち、前記変調によって引き起こされた変化につき前記細胞をモニタリングすることを含む。かかるアッセイはＴＰＬ−２のアゴニスト、アンタゴニストおよびアロステリックモジュレータのごときモジュレータの同定を可能とする。本明細書で用いるごとく、ＴＰＬ−２の活性を変調する化合物またはシグナルとは、（当該化合物またはシグナルの不存在と比較して、化合物またはシグナルの存在下でｐ１０５活性化におけるＴＰＬ−２の活性が異なるように、ＴＰＬ−２の活性を改変する化合物をいう。
【０１３９】
細胞ベースのスクリーニングアッセイは、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）またはルシフェラーゼのごとき、レポーター蛋白質、すなわち容易にアッセイできる蛋白質の発現がＴＰＬ−２によるｐ１０５の活性化に依存する細胞系を構築することによって設計することができる。例えば、前記ポリペプチドの１つをコードするレポーター遺伝子を、特異的に活性化されたｐ５０であるＮＦκＢ−応答エレメントの制御下に置くことができる。前記エレメントがｐ５０ヘテロダイマーによって活性化される場合、予測可能なレベルでの別のＲｅｌモノマーの発現のために準備しなければならない。かかるアッセイは、ＴＰＬ−２によるｐ１０５のリン酸化に拮抗する化合物、またはＴＰＬ−２の活性に必要な他の細胞機能を阻害または増強する化合物のごとき、ＴＰＬ−２機能を直接的に変調する化合物の検出を可能とする。
【０１４０】
別のアッセイ様式は、生物学的系における炎症応答を直接的に評価するアッセイを含む。未調節ｐ５０の構成的発現の結果、動物において炎症表現型がもたらされることは既知である。サイトカイン放出または細胞増殖に依存するもののごとき細胞ベースのシステムを用いてｐ５０の活性を評価することができる。
【０１４１】
本発明のこの具体例の好ましい態様において、
テストすべき化合物または複数化合物の存在なくしては、ＴＰＬ−２が参照リン酸化効率でもってｐ１０５のリン酸化を直接的または間接的に引き起こす条件下で、ＴＰＬ−２分子およびｐ１０５と共にテストすべき化合物または複数化合物をインキュベートすることと；
テストすべき化合物または複数化合物の存在下でｐ１０５のリン酸化を直接的または間接的に引き起こすＴＰＬ−２の能力を測定することと；次いで、
参照リン酸化効率に関してｐ１０５をリン酸化するＴＰＬ−２の能力を変調する化合物を選択することを含む炎症応答に関係するまたはそれを用いる病気の治療で有用な医薬のためのリード化合物を同定する方法が提供される。
【０１４２】
ＴＰＬ−２が標的ポリペプチド、例えば、ｐ１０５を間接的にリン酸化する場合、さらなるキナーゼまたは複数キナーゼを含めることができ、このように、本発明のこの具体例によるアッセイは、有利には、ＴＰＬ−２による間接的標的ポリペプチドまたはｐ１０５のリン酸化を検出するように構成することができる。
【０１４３】
さらなる好ましい態様において、本発明は、
精製されたＴＰＬ−２分子を提供する工程と；
ＴＰＬ−２およびテスト化合物または複数化合物によってリン酸化されることが知られている基質と共にＴＰＬ−２分子をインキュベートする工程と；次いで、
基質のリン酸化を変調できるテスト化合物または複数化合物を同定する工程を含む医薬のためのリード化合物を同定する方法に関する。
【０１４４】
ＴＰＬ−２リン酸化のための基質はＭＥＫ（ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：８１７−８２６， １９９６）。好ましくは、従って、ＭＥＫはＴＰＬ−２キナーゼ活性を変調できる化合物をモニターするための基質として使用される。もう１つの具体例において、テスト基質は、例えば、ＭＥＫ−１、ＳＥＫ−１、ＩκＢα、ＩκＢ−β、ＮＦκＢ  ｐ１０５、ＮＦκＢおよびＴＰＬ−２；ＣＯＴそれ自身のごときいずれの適当なＴＰＬ−２標的ポリペプチドであり得る。特に、本発明は、例えば、便宜なモデル融合蛋白質として、これらの基質を作成するための組換え融合蛋白質構築体を提供する。好ましい具体例において、モデル融合蛋白質は、例えば、ＧＳＴ−ＩκＢα（１−５０）、すなわち、ＧＳＴに融合したＩκＢ−αのアミノ酸残基１から５０、および（ｐ１０５の残基４９８−９６９を含む）ＧＳＴ−ｐ１０５Ｎｄｅｌ．４９８を含む。ＴＰＬ−２／ＣＯＴのための他のペプチド基質はこれらの蛋白質基質から誘導することができ、例えば、ＩκＢ−α−由来ペプチドＮＨ２−ＤＤＲＨＤＳＧＬＤＳＭＫＤＫＫＫ−ＣＯＨ（ここに、太文字のセリン残基はＩκＢ−αのセリン残基３２に対応する）およびＭＥＫ−由来ペプチドＮＨ２−ＱＬＩＤＳＭＡＮＳＦＶＧＴＫＫＫ−ＣＯＨ（ここに、太文字のセリン残基はＮＥＫ−１のセリン残基２１７に対応する）を含む。本明細書中で記載するこれらおよび他のＴＰＬ−２標的ポリペプチドは、当業者がキナーゼモジュレータにつき直接的にスクリーニングするのを可能とする。好ましくは、キナーゼモジュレータはキナーゼ（ＴＰＬ−２）インヒビターである。
【０１４５】
所望により、次いで、同定されたテスト化合物をイン・ビボテストに付して、例えば前記具体例に記載されたＴＮＦ／ｐ１０５由来シグナリング経路に対するその効果を測定することができる。
【０１４６】
２ｃ．  ＴＰＬ−２活性を変調する化合物
本明細書中で用いる「ＴＰＬ−２活性」はその結合活性を含めたＴＰＬ−２のいずれの活性もいうことができるが、特に、ＴＰＬ−２のリン酸化活性をいう。従って、本発明はＴＰＬ−２による標的化合物のリン酸化、および潜在的治療剤によるこの活性の変調を検出するように構成することができる。
【０１４７】
ＴＰＬ−２のリン酸化活性を変調する化合物の例はＴＰＬ−２それ自体の優性陰性突然変異体を含む。かかる化合物はＴＰＬ−２の標的につき競合することができ、このように、生物学的または人工的系においてＴＰＬ−２の活性を減少させる。このように、本発明は、さらに、ＴＰＬ−２のリン酸化活性を変調することができる化合物に関する。
【０１４８】
３．  化合物
なおさらなる態様において、本発明は、本発明の前記態様で規定したアッセイ方法によって同定可能な化合物または複数化合物に関する。従って、ＮＦκＢの活性の変調のための、本明細書中に記載するアッセイによって同定可能な化合物の使用が提供される。
【０１４９】
ＴＰＬ−２／ＮＦκＢ相互作用に影響する化合物はほとんどいずれもの一般的に記載のものであってよく、低分子量化合物を含み、線上、環状、多環状またはその組合せ、抗体または蛋白質を含めたペプチド、ポリペプチドであってよい有機化合物を含む。一般に、本明細書中で用いる「ペプチド」、「ポリペプチド」および「蛋白質」は同等と考えられる。
【０１５０】
３ａ．  抗体
本明細書中で用いる抗体とは選択された標的へ結合できる完全な抗体または抗体断片をいい、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’２）、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラ、ＣＤＲ−グラフト化およびヒト化抗体を含む作成された抗体、およびファージ提示または別の技術を用いて生産された人工的に選択された抗体を含む。ＦｖおよびＳｃＦｖのごとき小さな断片は、その小さなサイズおよび結果としての優れた組織分布のため診断および治療適用のための有利な特性を保有する。
【０１５１】
本発明の抗体は、診断および治療適用で特に示される。従って、それらはトキシンまたは標識のごときエフェクター蛋白質を含む改変された抗体であり得る。特に好ましいものはイン・ビボで抗体の分布のイメージングを可能とする標識である。かかる標識は、患者の身体内で容易に可視化できる金属粒子のごとき放射性標識または放射性不透過性標識であり得る。さらに、それは蛍光標識または患者から取り出された組織試料上で可視化可能な他の標識であり得る。
【０１５２】
組換えＤＮＡ技術を用いて本発明の抗体を改良することができる。このように、キメラ抗体を構築して診断または治療適用においてその免疫原性を減少させることができる。さらに、免疫原性はＣＤＲグラフティング［欧州特許出願０  ２３９  ４００（Ｗｉｎｔｅｒ）参照］および、所望により、フレームワーク修飾（国際出願ＷＯ９０／０７８６１（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ）参照］によって抗体をヒト化することによって最小化することができる。
【０１５３】
本発明による抗体は動物血清から得ることができ、あるいはモノクローナル抗体またはその断片のまわりには、細胞培養から生成させることができる。組換えＤＮＡ技術を用いて、細菌または好ましくは哺乳動物細胞培養において確立された手法に従って抗体を産生させることができる。選択された細胞培養系、好ましくは、抗体産物を分泌する。
【０１５４】
従って、本発明は当該蛋白質をコードする第２のＤＮＡ配列に適当なリーディングフレームにて連結したシグナルペプチドをコードする第１のＤＮＡ配列に作動可能に連結したプロモータを含む発現カセットを含むハイブリッドベクターで形質転換された宿主、例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉまたは哺乳動物細胞を培養し、次いで前記蛋白質を単離することを含む本発明の抗体の製法を提供する。
【０１５５】
イン・ビトロでのハイブリドーマ細胞または哺乳動物宿主細胞の増殖は、慣用的標準培養培地である適当な培養培地、例えば、所望により哺乳動物血清、例えば、胎児ウシ血清、または微量元素および成長維持補足物、例えば、通常のマウス腹腔滲出物細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージ、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポ蛋白質、オレイン酸等のごときフィーダー細胞によって補足されたダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＲＰＭＩ１６４０培地中で行われる。細菌細胞または酵母細胞である宿主細胞の増殖は、同様に、当業者に既知の適当な培地中、例えば、細菌では培地ＬＢ、ＮＺＣＹＭ、ＮＺＴＭ、ＮＺＭ、テリフィックブロス、ＳＯＢ、ＳＯＣ、２×ＹＴ、またはＭＱ最小培地中で、および酵母では培地ＹＰＤ、ＹＥＰＤ、最小培地、または完全な最小ドロップアウト培地中で行われる。
【０１５６】
イン・ビトロ生産は比較的純粋な抗体調製物を提供し、大量の所望の抗体を得るためのスケールアップを可能とする。細菌細胞、酵母または哺乳動物細胞培養のための技術は当業者に知られており、例えば、エアリフトリアクター中または連続的スターラーリアクター中での均一懸濁培養、または例えば中空繊維、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズ上またはセラミックカートリッジ上での固定化または捕獲細胞培養を含む。
【０１５７】
大量の所望の抗体は、イン・ビボで哺乳動物細胞を増殖することによって得ることもできる。この目的では、所望の抗体を生産するハイブリドーマ細胞を組織適合哺乳動物に注射して抗体−生産腫瘍の増殖を引き起こす。所望により、動物を注射に先立って炭化水素、特にプリスタン（テトラメチル−ペンタデカン）のごとき鉱物油で感作させる。１から３週間後、抗体をそれらの哺乳動物の体液から単離する。例えば、適当な骨髄細胞とＢａｌｂ／ｃマウスからの抗体生産脾臓細胞との融合によって得られたハイブリドーマ細胞、または所望の抗体を生産するハイブリドーマ細胞系Ｓｐ２／０に由来するトランスフェクト細胞を、所望によりプリスタンで予備処理したＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射し、１から２週間後に、腹水を前記動物から採取する。
【０１５８】
前記および他の技術は、例えば、出典明示して本明細書の一部とみなすＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７；ＵＳ４，３７６，１１０；  ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒで議論されている。組換え抗体分子の調製のための技術は前記文献および、例えば、出典明示して本明細書の一部とみなすＥＰ  ０６２３６７９；ＥＰ  ０３６８６８４およびＥＰ  ０４３６５９７に記載されている。
【０１５９】
細胞培養上清は、免疫ブロッティングによって酵素免疫アッセイ、例えば、サンドウィッチアッセイもしくはドット−アッセイ、またはラジオイムノアッセイによって、ＴＰＬ−２を発現する細胞の免疫蛍光染色により優先的に所望の抗体につきスクリーニングする。
【０１６０】
抗体の単離には、例えば、硫酸アンモニウムでの沈殿、ポリエチレングリコールのごとき吸湿性物質に対する透析、選択膜を通す濾過によって、培養上清または腹水中の免疫グロブリンを濃縮することができる。必要および／または所望ならば、慣用的クロマトグラフィー方法、例えば、ゲル濾過、イオン−交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロース上のクロマトグラフィーおよび／または（イムノ−）アフィニティクロマトグラフィー、例えば、ＴＰＬ−２分子でのまたはプロテイン−Ａでのアフィニティクロマトグラフィーによって抗体が精製される。
【０１６１】
本発明は、さらに、本発明のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞に関する。本発明の好ましいハイブリドーマ細胞は遺伝的に安定であり、所望の特異性の本発明のモノクローナル抗体を分泌し、解凍および再クローニングによって深−凍結培養から活性化することができる。
【０１６２】
また、本発明は、適当な哺乳動物、例えばＢａｌｂ／ｃマウスが精製されたＴＰＬ−２分子、精製されたＴＰＬ−２分子を含有する抗原性担体またはＴＰＬ−２を担う細胞で免疫化し、免疫化哺乳動物の抗体生産細胞を適当な骨髄細胞系の細胞と融合させ、融合で得られたハイブリッド細胞をクローン化し、所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択する、ＴＰＬ−２分子に向けられたモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系の製法に関する。例えば、ＴＰＬ−２を担う細胞で免疫化したＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞を骨髄腫細胞系ＰＡＩまたは骨髄腫細胞系Ｓｐ２／０−Ａｇ１４の細胞と融合させ、得られたハイブリッド細胞を所望の抗体の分泌につきスクリーニングし、陽性ハイブリドーマ細胞をクローン化する。
【０１６３】
好ましいものは、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、適当なアジュバントを含有するＴＰＬ−２を発現するヒト腫瘍起源の１０７および１０８の間の細胞を数回、例えば、４から６回、数カ月にわたって、例えば、２カ月および４カ月の間、皮下および／または腹腔内注射することによって免疫化し、免疫化マウス４０からの脾臓細胞を最後の注射から２から４日後に採取し、融合プロモーター、好ましくはポリエチレングリコールの存在下で骨髄腫細胞系ＰＡＩの細胞と融合させるハイブリドーマ細胞系の調製方法である。好ましくは、骨髄腫細胞を分子量約４０００の約３０％から約５０％ポリエチレングリコールを含有する溶液中、免疫化マウスからの３から２０倍過剰の脾臓細胞と融合させる。融合の後、選択培地、例えば、ＨＡＴ培地を補足した前記適当な培養培地中で細胞を正規の間隔で増殖させて、正常な骨髄腫細胞が所望のハイブリドーマ細胞を過剰増殖させるのを防止する。
【０１６４】
また、本発明は、前記したＴＰＬ−２分子に向けられた抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡに関する。定義により、かかるＤＮＡはコーディング一本鎖ＤＮＡ、前記コーディングＤＮＡおよびそれに対して相補的なＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ、またはこれらの相補的（一本鎖）ＤＮＡそれ自体を含む。
【０１６５】
さらに、ＴＰＬ−２分子に向けられた抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡは、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメイン、またはその突然変異体をコードする真性ＤＮＡ配列を有する酵素的または化学的に合成されたＤＮＡであり得る。真性ＤＮＡの突然変異体は、１以上のアミノ酸が欠失し、または１以上のアミノ酸と交換された前記抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡである。好ましくは、前記修飾は抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインのＣＤＲの外部にある。かかる突然変異体ＤＮＡは、１以上のヌクレオチドが同一アミノ酸をコードする新しいコドンを持つ他のヌクレオチドによって置き換えられたサイレント突然変異体であることが意図される。かかる突然変異体配列は縮重した配列でもある。縮重配列は、ヌクレオチドの限定されない数が元来コードされたアミノ酸配列の変化をもたらすことなく他のヌクレオチドによって置き換えられたという遺伝子暗号の意味内で縮重している。かかる縮重配列は、重鎖ネズミ可変ドメインおよび／または軽鎖ネズミ可変ドメインの最適発現を得るのに特別の宿主、特にＥ．Ｃｏｌｉによって好まれるその異なる制限部位および／または特定コドンの頻度のため有用であり得る。
【０１６６】
用語「突然変異体」は当業者に既知の方法に従って真性なＤＮＡのイン・ビトロ突然変異誘発によって得られたＤＮＡ突然変異体を含むことを意図する。
【０１６７】
完全なテトラマー免疫グロブリン分子の組み立ておよびキメラ抗体の発現では、重鎖および軽鎖可変ドメインをコードする組換えＤＮＡインサートを、重鎖および軽鎖定常ドメインをコードする対応するＤＮＡと融合させ、次いで、例えばハイブリッドベクターへの取り込み後に適当な宿主細胞に導入する。
【０１６８】
本発明は、従って、ヒト定常ドメインガンマ、例えばγ１、γ２、γ３またはγ４、好ましくは、γ１またはγ４に融合したＴＰＬ−２に向けられた抗体の重鎖ネズミ可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡに関する。同様に、本発明は、ヒト定常ドメインκまたはλ、好ましくはκに融合したＴＰＬ−２に向けられた抗体の軽鎖ネズミ可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡに関する。
【０１６９】
もう１つの具体例において、本発明は、組換えポリペプチドをコードする組換えＤＮＡに関し、ここに、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、所望により、宿主細胞中で抗体のプロセッシングを容易とするシグナル配列および／または抗体の精製を容易とするペプチドをコードするＤＮＡおよび／または切断部位および／またはペプチドスペーサーおよび／またはエフェクター分子を含むスペーサー基によって連結される。
【０１７０】
エフェクター分子をコードするＤＮＡは診断または治療適用で有用なエフェクター分子をコードするＤＮＡであることを意図する。このように、トキシンまたは酵素、特にプロドラッグの活性化を触媒することができる酵素であるエフェクター分子が特に示される。かかるエフェクター分子をコードするＤＮＡは天然に生じる酵素またはトキシンをコードするＤＮＡ、またはその突然変異体の配列を有し、当業者によく知られた方法によって調製することができる。
【０１７１】
本発明による抗体および抗体断片は診断および治療で有用である。従って、本発明は、本発明の抗体を含む治療または診断用の組成物を提供する。
【０１７２】
診断組成物の場合、抗体は好ましくは酵素、蛍光、放射線同位体または他の手段であり得る、抗体を検出する手段と共に供される。抗体および検出手段は、診断を意図した診断キットにおいて、同時に、同時別々にまたは順次に使用するために提供することができる。
【０１７３】
３ｂ．  ペプチド
本発明によるペプチドは有用には機能的ＴＰＬ−２／ｐ１０５相互作用に関与するＴＰＬ−２、ｐ１０５またはもう１つのポリペプチドに由来する。好ましくは、前記ペプチドはｐ１０５／ＴＰＬ−２相互作用を担うＴＰＬ−２またはｐ１０５におけるドメインに由来する。例えばＴｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：３９３４３９４０およびＭｉｌｌｉｇａｎ等，（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ １５：３８５−３９３はＩＣＥプロテアーゼを阻害するための修飾されたテトラペプチドの使用を記載する。同様に、ＴＰＬ−２、ｐ１０５または相互作用蛋白質に由来するペプチドは、例えば、アルデヒド基、クロロメチルケトン、（アシルオキシ）メチルケトンまたはＣＨ２ＯＣ（０）−ＤＣＢ基で修飾してＴＰＬ−２  ｐ１０５相互作用を阻害することができる。
【０１７４】
ペプチド化合物の細胞への送達を容易とするために、ペプチドを修飾して細胞膜を横切るその能力を改良することができる。例えば、米国特許第５，１４９，７８２号は細胞膜を横切っての蛋白質輸送を増大させるための融合誘導ペプチド、イオンチャネル形成ペプチド、膜ペプチド、長鎖脂肪酸および他の膜ブレンディング剤の使用を開示する。これらおよび他の方法は、出典明示して本明細書の一部とみなすＷＯ９７／３７０１６および米国特許第５，１０８，９２１号に記載されている。
【０１７５】
本発明による多くの化合物は薬物開発に有用なリード化合物であり得る。有用なリード化合物は特に抗体および抗原、特に遺伝子治療において細胞内で発現された細胞内抗体であり、これはペプチドまたは低分子量治療剤の開発のためのモデルとして用いることができる。本発明の好ましい態様において、リード化合物およびＴＰＬ−２／ｐ１０５または他の標的ペプチドを共結晶化して、リード化合物で観察された相互作用を模倣する適当な低分子量化合物の設計を容易とすることができる。
【０１７６】
結晶化は、例えば、好ましくは１：１の比率のペプチドもしくはペプチド複合体と「貯蔵器緩衝液」との溶液を、結晶形成に必要な低濃度の沈殿剤と混合することによる結晶化緩衝液の調製を含む。結晶形成には、例えば、沈殿剤の添加によって、例えば、滴定によって、あるいは結晶化緩衝液および貯蔵器緩衝液の間の拡散により沈殿剤の濃度をバランスさせることによって沈殿剤の濃度を増加させる。適当な条件下で、例えば、高濃度の沈殿剤を有する貯蔵器沈殿剤から低濃度の沈殿剤を有する結晶化緩衝液への沈殿剤のグラジエントに沿って沈殿剤のかかる拡散が起こる。拡散は、例えば、共通ガス相中での拡散を可能とする蒸気拡散技術によって達成することができる。既知の技術は、例えば、「ハンギングドロップ」または「シッティングドロップ」方法のごとき蒸気拡散方法である。蒸気拡散方法において、蛋白質を含有する結晶化緩衝液の液滴を貯蔵器緩衝液のかなり大きなプールの上方に垂らすかまたはその横に位置させる。別法として、沈殿剤のバランシングは、貯蔵器緩衝液から結晶化緩衝液を分離し、蛋白質の貯蔵器緩衝液への拡散を防ぐ半透過性膜を通じて達成することができる。
【０１７７】
結晶化緩衝液においては、ペプチドまたはペプチド／結合パートナー複合体は、好ましくは、３０ｍｇ／ｍｌまでの、好ましくは約２ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
【０１７８】
結晶の形成は、以下のパラメーター：ｐＨ、塩および添加剤の存在、沈殿剤、蛋白質濃度および温度によって実質的に決定される種々の条件下で達成することができる。ｐＨは約４．０から９．０の範囲であり得る。緩衝液の濃度およびタイプはむしろ重要ではなく、従って、例えば所望のｐＨとは独立して変更可能である。適当な緩衝液系はホスフェート、アセテート、シトレート、トリス、ＭＥＳおよびＨＰＥＳ緩衝液を含む。有用な塩および添加剤は、例えば、当業者に知られた塩化物、スルフェートおよび他の塩を含む。緩衝液は、水混和性有機溶媒、好ましくは１００および２０００の間、好ましくは４０００および１００００の間の分子量を有するポリエチレングリコール、またはスルフェート、特に硫酸アンモニウム、塩化物、シトレートまたはタルタレートのごとき適当な塩からなる群から選択される沈殿剤を含有する。
【０１７９】
本発明によるペプチドまたはペプチド／結合パートナー複合体の結晶は、例えば、重原子誘導体化によって化学的に修飾することができる。略言すると、かかる誘導体化は、結晶を通じて拡散でき、蛋白質の表面に結合することができる重金属原子塩、または有機金属化合物、例えば、塩化鉛、チオリンゴ酸金、チメロサールまたは酢酸ウラニルを含有する溶液中に結晶を浸漬することによって達成することができる。結合した重金属の位置は浸漬した結合のＸ線の回折分析によって測定することができ、その形成は、例えば、ペプチドの三次元モデルを構築するのに用いることができる。
【０１８０】
三次元モデルは、例えば、結晶の重原子誘導体からおよび／または結晶化によって供された構造データのすべてまたは一部から得ることができる。好ましくはかかるモデルの形成は相同性モデリングおよび／または分子置き換えを含む。
【０１８１】
予備的相同性モデルは、（ＩκＢα，  Ｂａｕｅｒｌｅら、（１９９８）Ｃｅｌｌ  ９５：７２９−７３０を含めた）その構造が知られているいずれかのＭＡＰＫＫキナーゼまたはＮＦκＢとの配列併置、二次構造予測および構造ライブラリのスクリーニングの組合せによって創製することができる。例えば、適当なソフトウェアプログラムを用いてＴＰＬ−２および候補ペプチドの配列を併置することができる。
【０１８２】
また、コンピュータソフトウェアを用いてペプチドまたはペプチド複合体の二次構造を予測することができる。ペプチド配列をＴＰＬ−２構造に取り込むことができる。構造的矛盾、例えば、挿入／欠失のまわりの構造フラグメントは、所望の長さのペプチドのための適当な立体配座を持つ構造ライブラリをスクリーニングすることによってモデリングすることができる。側鎖立体配座の予測では、側鎖ドタマーライブラリを使用することができる。
【０１８３】
最終相同性モデルを用いて、適当なコンピュータソフトウェアを用いる分子置き換えによってペプチドの結晶構造を解明する。相同性モデルは分子置き換えの結果に従って位置させ、分子動力学計算からなるさらなる仕上げおよび電子密度への結晶化で用いるインヒビターのモデリングに位置づけされる。
【０１８４】
３ｃ．    他の化合物
好ましい具体例において、前記アッセイを用いてペプチドを同定し、ＴＰＬ−２活性、例えば、キナーゼ活性、標的ポリペプチド相互作用、またはシグナリング活性を変調することができる非−ペプチドベースのテスト化合物も同定する。本発明のテスト化合物は、：生物学的ライブラリ、空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリ；脱回盤を要する合成ライブラリ方法；「１−ビーズ１−化合物」ライブラリ方法；およびアフィニティクロマトグラフィ選択を用いる合成ライブラリ方法を含めた当業者に既知のコンビナトリアルライブラリ方法を含む多数アプローチのいずれかを用いて得ることができる。これらのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリに適用できる（Ｌａｍ，  Ｋ．  Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ． １２：１４５）。
【０１８５】
分子ライブラリの合成のための方法の例は、例えば：ＤｅＷｉｔｔ等、（１９９３）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０：６９０９；Ｅｒｂ等、（１９９４）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：１１４２２；    Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ等、（１９９４）Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ． ３７：２６７８；  Ｃｈｏ等、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；  Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｒｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ． ３３：２０５９；  Ｃａｒｅｌｌ等、（１９９４）Ａｎｇｒｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；および  ｉｎｎ  Ｇａｌｌｏｐ等、（１９９４）Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ． ３７：１２３３に見出すことができる。
【０１８６】
化合物のライブラリは溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）、ビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  ＵＳＰ  ５，２２３，４０９）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ  ＵＳＰ  ’４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＰ  ８９：１８６５−１８６９）、ファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０）；（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６）；（Ｃｗｉｒｌａら，（１９９０）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８７：６３７８−６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：３０１−３１０）；（Ｌａｄｎｅｒ  前掲）に提示されている。
【０１８７】
所望ならば、本明細書に記載された化合物ライブラリのいずれも、例えば、所与の化学的構造、または所与の活性、例えば、キナーゼ阻害活性を有する化合物を含む予備選択ライブラリに分割することができる化合物ライブラリの予備選択は、さらに、いずれかの当業者に認められた分子モデリングを行って、所与の活性、反応部位、または他の所望の化学的機能性を有するようである特定の化合物または化合物の群もしくは組合せを同定することを含むことができる。１つの具体例において、キナーゼ阻害活性を有する、または有するようである化合物を同定するために設計した分子モデリングを用いてＴＰＬ−２のモジュレータを予備選択する。
【０１８８】
当業者に知られているように、適当な方法を用いて、ＴＰＬ−２の特定のドメインまたは標的成分、例えば、ｐ１０５と相互作用する特定の部位を選択することができる。例えば、特に三次元モデルを利用する肉眼観察を使用できる。好ましくは、コンピュータモデリングプログラムまたはソフトウェアを用いて、特定のドメインと相互作用できる１以上の部位を選択する。適当なコンピュータモデリングプログラムはＱｕａｎｔａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ（１９９２）），  ＳＹＢＹＬ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ（１９９２）），  ＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒ等，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ． １０６：７６５−７８４（１９８４））およびＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ等、Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ｃｈｅｍ．  ４：１８７−２１７（１９８３））を含む。相互作用部位を選択するのに使用することができる他のプログラムはＧＲＩＤ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｕ．  Ｋ．；  Ｇｏｏｄｆｏｒｄ等、Ｊ．  Ｍｏｄ．  Ｃｈｅｍ．２８：８４９−８５７（１９８５））；  ＭＣＳＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ；  Ｍｉｒａｎｋｅｒ，  Ａ．およびＭ．  Ｋａｒｐｌｕｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１：２９−３４（１９９１））；  ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ；  Ｇｏｏｄｓｅｌｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：１９５−２０２（１９９０）；およびＤＯＣＫ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ；  Ｋｕｎｔｚ等、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ． １６１：２６９−２８８（１９８２）を含む。
【０１８９】
潜在的相互作用部位が選択された後、それらを、選択されたドメインとの相互作用に適した方法でそれらを提示することができる足場に付着させることができる。適当な足場およびその上の相互作用部位の空間的分布は、例えば、物理的またはコンピューター創製三次元モデルを用い、またはＣＡＶＥＡＴのごとき適当なコンピュータープログラム（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  Ｂａｒｋｅｌｅｙ，  ＣＡ；  Ｂａｒｔｌｅｔｔ、ｉｎｎ  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ”，  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂ．，  Ｒｏｙａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ７８：１８２−１９６（１９８９））；ＭＡＣＣＳ−３Ｄのごとき三次元データベースシステム（ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，  ＣＡ（Ｍａｒｔｉｎ，  Ｙ．  Ｃ．，  Ｊ．  Ｍｏｄ．  Ｃｈｅｍ． ３５：２１４５−２１５４（１９９２））；および  ＨＯＯＫ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，  Ｉｎｃ．）を用いることによって目で測定することができる。潜在的ＴＰＬ−２阻害剤の設計および／または評価で用いることができる他のコンピュータープログラムはＬＵＤＩ（Ｂｉｏｓｙｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ；  Ｂｏｈｍ，  Ｈ．  Ｊ．，  Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ａｉｄ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｄｅｓｉｇｎ：６１−７８（１９９２）），  ＬＥＧＥＮＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，  Ｉｎｃ．；  Ｎｉｓｈｉｂａｔａ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４７：８９８５−８９９０（１９９１）），およびＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．）を含む。
【０１９０】
加えて、蛋白質−薬物相互作用をモデリングするための種々の技術は当業者に既知であって、この方法で用いることができる（Ｃｏｈｅｎ等、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ． ３３：８８３−８９４（１９９４）；  Ｎａｖｉａ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：  ２０２−２１０（１９９２）；  Ｂａｌｄｗｉｎ等、Ｊ．  Ｍｏｄ．  Ｃｈｅｍ． ３２：２５１０−２５１３（１９８９）；  Ａｐｐｅｌｔ等；  Ｊ．  Ｍｏｄ．  Ｃｈｅｍ． ３４：１９２５−１９３４（１９９１）；  Ｅａｌｉｃｋ等、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＰ  ８８： １１５４０−１１５４４（１９９１））。
【０１９１】
このように、蛋白質ベース、炭水化物ベース、脂質ベース、核酸ベース、天然有機物ベース、合成由来有機物ベース、または抗体ベース化合物のライブラリを組み立て、所望ならば、前記したモデリング技術のいずれかを含むさらなる予備選択工程に付すことができる。次いで、これらのモデリング技術を用いて、ＴＰＬ−２モジュレータであると決定された適当な候補化合物を、当業者に認められた源、例えば、商業的源から選択することができるか、あるいは別法として、分子モデリングにより活性、例えば、ＴＰＬ−２インヒビター活性を有すると予測される所望の部位を含有させる当業者に認められた技術を用いて合成することができる。次いで、これらの化合物を用いて、例えば、本明細書中に記載したアッセイを用いるスクリーニング用の化合物のより小さいまたはより標的化されたテストライブラリを形成することができる。
【０１９２】
従って、ＴＰＬ−２キナーゼ阻害剤の所望のテストライブラリは、例えば、化合物Ｎ−（６−フェノキシ−４−キノリル−Ｎ［４−（フェニルスルファニル）フェニル］アミンを含むことができる。４−（４−フェニルチオアニリノ）キノリニル誘導体の一般的合成は以下のごとく行われる。１，２−ジメトキシエタンおよびジクロロエタンの１：１混合物（Ｖ／Ｖ）中の４−ヒドロキシ−５−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロ−３−キノリンカルボン酸エチルの０．１Ｍ溶液に四塩化炭素（１０モル等量）およびポリマー−結合トリフェニルフォスフィン（３から６等量；Ｆｌｕｋａ）を添加する。次いで、混合物を８０℃の密封バイアル中で震盪しつつ３６時間加熱する。４−（フェニルチオ）アニリン（２−６モル等量；ｔｅｒｔ−ブタノール中０．５Ｍ）を添加し、混合物を密封バイアル中で震盪しつつ２４時間で９０℃まで加熱する。次に、ポリマー樹脂を濾過し、メタノールで洗浄する。プールした濾液および洗液を高真空下で濃縮し、残渣をＲＰ−ＨＰＬＣによるクロマトグラフィーに付した。分析ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＭＳ（ＰＥＲＫＩＮ  Ｅｌｍｍｅｒ  Ｐｅｃｏｓｐｈｅｒｅカラム（４．６ｍｍ×３ｃｍ）で３．５ｍＬ／分にて（０−１００％アセトニトリル／ｐＨ４．５、５０ＭＭ  ＮＨ４ＯＡｃ））によると、５−オキソ−４−［４−（フェニルスルファニル）アニリノ］−５，６，７，８−テトラヒドロ−３−キノリンカルボン酸エチルは３．８５分の保持時間およびｍ／ｚ４１９におけるＭＨ＋を有していた。
【０１９３】
特に、Ｎ−（６−フェノキシ−４−キノリル）−Ｎ−［４−（フェニルスルファニル）フェニル］アミン（分析ＲＰ−ＨＰＬＣ  ＲＴ：４．３２分；ＭＳ：ＭＨ＋４２１）を調製するには、４−ヒドロキシ−６−フェノキシ−キノリンおよび４−（フェニルチオ）アニリンを用いて前記手法を追跡する。
【０１９４】
関連化合物、５−オキソ−４−［４−（フェニルスルファニル）アニリノ］−５，６，７，８−テトラヒドロ−３−キノリンカルボン酸エチルおよび／またはその変異体もまたライブラリのために選択することができ、標準的な技術および以下の方法を用いてこの化合物を生産することができる。略言すれば、１０等量の四塩化炭素および３−６等量のポリマー結合トリフェニルホスフィンを、エチレングリコールジメチルエーテルおよびジクロロエタンの１：１混合物中の４−ヒドロキシ−５−５，６，７，８−テトラヒドロ−３−キノリンカルボン酸エチルの０．１Ｍ溶液に添加する。次いで、混合物を３６時間で８０℃まで加熱する。２５０μｌのｔｅｒｔブタノール中の過剰の４−チオフェニルアニリン（２−６等量）を添加し、混合物を２４時間で９０℃まで加熱する。次いで、ポリマー樹脂を、濾過し、メタノールで洗浄し、残存する溶媒を高真空下で除去して所望のテスト化合物を得る。
【０１９５】
４−（４−フェニルチオアニリノ）キノリニル（およびその誘導体）は、キナーゼ、例えば、ＣＯＴのごときセリン／トレオニンキナーゼを阻害するのに適した化合物を含有する化学クラスを表すと予測される。従って、図１４に示されたコア構造を含むいずれの化合物も本発明に含まれる。１つの具体例において、キノリニル環系は、例えば、ジヒドロキノリニルまたはテトラヒドロキノリニル環系であり得る（図１４、例えば、点線参照）。加えて、ＲおよびＲ’基はヒドロキシ、ハロ、−ＮＨＣ（Ｏ）アルキル−ＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルケニル、Ｃ１−Ｃ６−アルキニル、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、アリールオキシ、置換アリールオキシ、Ｃ１−Ｃ６−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミノ、シアノ、ペルハロメチル、ペルハロメトキシ、アミノ、モノ−もしくはジアルキルアミノ、アリール、置換アリール、ａｒａ−アルキルおよびａｒａ−アルコキシから独立して選択される。加えて、Ｒ’は（Ｒ’）ｎ（ここに、ｎ＝０，１，２等）を表し、従って、例えば、複数のＲ’置換が許容されることが理解される。また、アルキル、アルケニルおよび／またはアルキオニル基は直鎖または分岐鎖であり得ることが理解される。さらに、いずれの塩も、または例えば適当には、図１４に示した上位概念構造を含むまたはそれに由来するアナログ、遊離塩基形態、互変異性体、エナンチオマーラセメート、またはその組合せは本発明に含まれることを意図する。
【０１９６】
テストライブラリーに適したもう１つの適当な化合物は３−（４−ピリジル）−４，５−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］インダゾールメタンスルホネートおよび／またはその変種であり、この化合物はＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．（Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  Ｎｏ．８０９９７−８５−９）から商業的に入手可能である。
【０１９７】
ライブラリーは、また、２−クロロベンゾ［ｌ］［１，９］フェナントロリン−７−カルボン酸ナトリウムおよび／またはその変種を含むことができ、この化合物は標準的な当業者に認められた技術を用い、図１２に示す構造を用いて生産することができる。
【０１９８】
前記化合物の所望の標準的な修飾は種々の当業者に認められた技術を用いてなすことができ、これらの修飾された化合物は本発明に含まれることが認識されよう。
【０１９９】
１つの具体例において、アッセイは細胞ベースアッセイまたは細胞フリーアッセイと呼ばれ、ここに、例えば、ＴＰＬ−２ポリペプチドを発現する細胞、またはＴＰＬ−２を含む細胞溶解物／または精製された蛋白質いずれかをテスト化合物と接触させ、ＴＰＬ−２活性、例えば、キナーゼ活性、標的ポリペプチド相互作用、またはシグナリング活性を改変するテスト化合物の能力を測定する。
【０２００】
細胞ベースアッセイのいずれも、例えば、真核生物または原核生物起源の細胞を使用することができる。ＴＰＬ−２またはＴＰＬ−２標的ポリペプチドに結合するテスト化合物の能力の測定は、例えば、テスト化合物のポリペプチドへの結合が複合体中の標識化合物を検出することによって測定することができるように、テスト化合物を放射性同位体または酵素標識とカップリングさせることによって達成することができる。例えば、テスト化合物を１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３３Ｐ、３２Ｐ、または３Ｈで直接的または間接的に標識することができ、放射性同位体を放射の直接的カウンティングによって、またはシンチレーションカウンティングによって検出することができる。別法として、テスト化合物を、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識することができ、酵素標識を適当に基質の生成物への変換の測定によって直接的に検出することができる。
【０２０１】
また、相互作用物質のいずれ標識もなくして標的ポリペプチドと相互作用するテスト化合物の能力を特定するのは本発明の範囲内のものである。例えば、マイクロフィジオメーターを用いて、テスト化合物、ＴＰＬ−２または標的ポリペプチドの標識なくしてテスト化合物とＴＰＬ−２または標的ポリペプチドとの相互作用を検出することができる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，    Ｈ．Ｍ．等（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１９０６−１９１２）。さらにもう１つの具体例において、本発明のアッセイは細胞フリーアッセイであり、ここに、例えば、ＴＰＬ−２および標的ポリペプチドをテスト化合物と接触させ、相互作用を改変するテスト化合物の能力を測定する。この相互作用はさらにＴＰＬ−２および／またはＴＰＬ−２標的ポリペプチドのリン酸化を含むことができるか、含まなくてもよい。テスト化合物の標的ポリペプチドへの結合は直接的または間接的に測定することができる。いずれかのポリペプチドに結合する候補化合物の能力の測定もまたリアルタイム生物化学相互作用分析（ＢＩＡ）のごとき技術を用いて達成することができる（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，  Ｓ．およびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，  Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６３：２３３８−２３４５およびＳｚａｂｏら（１９９５）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５：６９９−７０５）。本明細書で用いる「ＢＩＡ」はいずれの相互作用物質（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ）も標識することなくリアルタイムで二特異的相互作用を研究するための技術である。光学現象表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の変化は、生物学的分子の間のリアルタイム反応の指標として用いることができる。
【０２０２】
化合物および天然抽出物のライブラリーをテストする多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、所与の時間で観察する化合物の数を最大化するには望ましい。精製されたまたは半精製された蛋白質を用いて行うことができるごとく、細胞フリー系で行われるアッセイは、それがテスト化合物によって媒介される分子標的における改変の迅速な開発および比較的容易な検出を可能する点で、しばしば「一次」スクリーニングとして好まれる。さらに、テスト化合物の細胞毒性および／または生物学的利用性の効果はテン・ビトロ系では一般的に無視され、その代わり、アッセイは、上流または下流エレメントとの結合親和性の改変で発現され得るごとく、分子標的に対する薬物の効果に主として焦点を当ててきた。従って、本発明の例示的スクリーニングアッセイにおいて、ＴＰＬ−２標的ポリペプチド、例えば、ｐ１０５（Ｋｉｅｒａｎ等， １９９０，  Ｃｅｌｌ  ６２：１００７−１０１８、またＡｃｃ．  Ｎｏ．Ｍ３７４９２も参照）またはＩκＢ−α（Ｚａｂｅｌ等 １９９０，  Ｃｅｌｌ  ６１：２５５−２６５）と共にまたはそれなくして注目する化合物をＴＰＬ−２ポリペプチドと接触させ、ＴＰＬ−２および／または標的ポリペプチドのリン酸化の検出および定量は、例えば、放射性同位体を用いリン酸化ＴＰＬ−２および／またはＴＰＬ−２標的ポリペプチドの形成を阻害するときの化合物の効果を評価することによって測定される。テスト化合物の効果は、種々の濃度のテスト化合物を用いて得られたデータからの用量応答曲線を作成することによって評価することができる。さらに、対照アッセイを行って、比較のためのベースラインを供することができる。もう１つの具体例において、種々の候補化合物をテストし、既知の活性、例えば、既知の上位概念活性を有するインヒビター、あるいは特異的活性を持つ対照化合物を、テスト化合物の特異性が測定することができるように比較する。従って、所望ならば、一般的キナーゼインヒビター、例えば、スタウロスポリン（例えば、Ｔａｍａｏｋｉ等， １９８６，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ． １３５：３９７−４０２；Ｍｅｇｇｉｏ等， １９９５，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２３４：３１７−３２２）、または例えば商業的に入手可能なＰＤ９８０５９（ＭＥＫの優れたインヒビター、例えば、Ｄｕｄｌｅｙ等， １９９５，  Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ９２：７６８６−７６８９参照）およびＳＢ２０３５８０（ｐ３８  ＭＡＰキナーゼの優れたインヒビター、例えば、Ｃｕｅｎｄａ等， １９９５，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ． ３６４：２２９−２３３）のごとき特異的キナーゼインヒビターを用いることができる。
【０２０３】
本発明の前記アッセイ方法の１を超える具体例において、標的ポリペプチドを固定化して非複合体化形態から複合体化形態の分離を容易とし、アッセイの自動化を収容するのが望ましいであろう（例えば、実施例４参照）。テスト化合物の存在下または不存在下でのＴＰＬ−２および標的ポリペプチドのリン酸化または結合は、反応体を含有するのに適したいずれかの容器中で達成することができる。かかる容器の例はマイクロタイタープレート、試験管、およびミクロ遠心管を含む。１つの具体例において、蛋白質の一方または双方がマトリックスに結合するのを可能とするドメインを付加する融合蛋白質を供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的ポリペプチド融合蛋白質をグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｓｔ．  Ｌｕｏｉｓｅ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させることができ、次いで、これを（例えば、塩およびｐＨについて生理学的条件で）リン酸化または複合体形成に誘導する条件下でテスト化合物と組合せ、インキュベートする。インキュベーションに続き、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄していずれの未結合成分も、ビーズの場合には固定化されたマトリックスも除去し、複合体を例えは前記してごとく直接的または間接的に測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離され、標的ポリペプチドの結合またはリン酸化活性のレベルを、標準的な技術を用いて測定することができる。マトリックス上への蛋白質を固定化する他の技術もまた本発明のスクリーニングアッセイで用いることができる。
【０２０４】
本発明のさらにもう１つの態様において、ＴＰＬ−２および標的ポリペプチドは、２−ハイブリッドアッセイまたは３−ハイブリッドアッセイにおける「餌蛋白質」として使用して（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；  Ｍａｄｕｒａ等（１９９３）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８：１２０４６−１２０５４；  Ｂａｔｅｌ等（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；  Ｉｗａｂｕｃｈｉ等（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００）、ＴＰＬ−２および／またはＴＰＬ−２標的ポリペプチドに結合またはそれと相互作用する他の蛋白質または化合物を同定することができる。
【０２０５】
本発明は、さらに、前記スクリーニングアッセイによって同定された新規剤、およびこれらのアッッセイの使用によるかかる剤の製法に関する。従って、１つの具体例において、本発明は前記スクリーニングアッセイ（例えば、細胞ベースアッセイまたは細胞フリーアッセイ）のいずれか１つの工程を含む方法によって得ることができる化合物または剤を含む。例えば、１つの具体例において、本発明は本明細書に記載されたもののいずれかによって得ることができる化合物または剤を含む。
【０２０６】
従って、適当な動物モデルにおいて本明細書に記載したごとく同定された剤、例えば、ＴＰＬ−２分子または化合物をさらに使用するのは本発明の範囲内のものである。例えば、本明細書に記載したごとくに同定された剤を動物モデルで使用して、かかる剤での処置の効率、毒性または副作用を測定することができる。別法として、本明細書に記載したごとくに同定された剤は動物モデルで使用してかかる剤の作用メカニズムを測定することができる。加えて、かかる剤は、もし適当とみなされるならば、ヒト対象、好ましくは炎症障害の危険性がある対象に投与することができる。
【０２０７】
また、本発明は、本明細書に記載された障害のいずれかの診断、予後および治療のための前記スクリーニングアッセイによって同定された新規剤の使用に関する。従って、本明細書に記載された障害のいずれかの診断、予後または治療で使用するための薬物または医薬組成物の設計、処方、合成、製造および／または生産においてかかる剤を使用するのは本発明の範囲内のものである。
【０２０８】
４．  医薬組成物
好ましい具体例において、本発明の先の態様で定義されたアッセイ方法によって同定することができる化合物または複数化合物を含む医薬組成物が提供される。
【０２０９】
本発明による医薬組成物は、有効成分としてＴＰＬ−２のｐ１０５−リン酸化活性を変調することができる化合物または複数化合物を含む組成物である。典型的には、前記化合物はいずれかの医薬上許容される塩、例えば、適当であれば、アナログ、遊離塩基形態、互変異性体、エナンチオマーラセメート、またはその組合せの形態である。本発明による有効成分を含む医薬組成物の有効成分は、例えば、特定の場合に応じた量で投与された場合、細胞増殖、感染状態および炎症状態に関連した腫瘍または他の病気の治療において優れた治療活性を呈すると考えられる。例えば、本発明は、ＴＰＬ−２シグナリングを改変することができるいずれの化合物も含む。１つの具体例において、前記化合物は、炎症に関与する遺伝子の誤調節の結果となるＴＰＬ−２活性を阻害することができる。例えば、ＴＰＬ−２活性を阻害し、それにより、ＴＮＦ遺伝子発現を低下させる化合物は、例えば、炎症疾患を治療するための好ましい化合物である。１つの好ましい化合物において、本発明の方法に従って同定された化合物は、例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、インスリン−依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、敗血症、乾癬、ＴＮＦ−媒介病、および移植片拒絶のごとき炎症性疾患を治療するのに使用することができる。もう１つの具体例において、本発明の１以上の化合物は、前記疾患のいずれかを治療するのに特定の兆候を治療するのに適していることが知られているいずれかの当業者に認められている化合物と組み合わせて使用することができる。従って、本発明の１以上の化合物は、便宜な単一組成物を対象に投与することができるように、前記兆候を治療するのに適したことが知られている１以上の当業者に認められた化合物と組み合わせることができる。
【０２１０】
投与法は最適治療応答が供されるように調整することができる。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与することができるか、あるいは用量は治療状況の要件によって示されたごとく比例して減少させることができる。
【０２１１】
有効成分は経口、非経口（水溶性の場合）、筋肉内、皮下、鼻孔内、皮内または坐薬経路または（例えば、徐放性分子を用いる）移植によるごとく便宜に方法で投与することができる。投与経路に応じて、有効成分は、前記成分を酵素、酸および前記成分を不活化し得る他の天然状態から保護するために物質中にコートするのが必要であり得る。
【０２１２】
非経口投与以外によって有効成分を投与するためには、それは、物質でコートするか、またはそれと共に投与してその不活化が防止されるであろう。例えば、有効成分をアジュバント中で投与することができ、酵素インヒビターと共にまたはリポソーム中で共投与することができる。アジュバントはその最も広い意味で使用され、インターフェロンのごときいずれの免疫刺激化合物も含む。ここに考えられるアジュバントはレゾルシノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびヘキサデシルポリオキシエチレンエーテルのごとき非イオン性界面活性剤を含む。酵素インヒビターは膵臓トリプシンを含む。
【０２１３】
リポソームは水中油中水型ＣＧＦエマルジョンならびに通常のリポソームを含む。
【０２１４】
また、有効成分は非経口または腹腔内投与することができる。分散液をグリセロール、液体ポリオキシエチレングリコール、およびその混合物中、および油中で調製することもできる。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの製剤は微生物の増殖を防止するための防腐剤を含有する。
【０２１５】
注射用途に適した医薬形態は滅菌水溶液（水溶性である場合）または分散液および滅菌注射溶液または分散液の処方箋調合製剤のための滅菌粉末を含む。全ての場合において、前記形態は滅菌されていなければならず、容易なシリンジ性が存在する程度に液状でなければならない。それは製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および菌類のごとき微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコール等）、その適当な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。例えば、レシチンのごときコーティングの使用によって、分散液の場合において必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、適当な流動性を維持することができる。
【０２１６】
微生物の作用の防止は種々の抗菌剤および抗菌類剤、例えば、パラペン、クロロブタノール、ソルビン酸、チメサロール等によって達成できる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めるのが好ましいであろう。注射組成物の延長吸収は、吸収を遅延する剤の組成物、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によって達成できる。
【０２１７】
適当な注射溶液は、所要量の有効成分を要すれば種々の前記他の成分と共に適当な溶媒中に配合し、続いて、濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は滅菌有効成分を基本的分散媒体および前記したものからの所要の他の成分を含有する滅菌ビヒクルに配合することによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これは、有効成分＋その前記した滅菌濾過溶液からのいずれかのさらなる所望の成分を生じる。
【０２１８】
有効成分を前記したごとく適当に保護すると、それは例えば不活性希釈剤または許容される可食性担体と共に経口投与することができるか、あるいはそれはハードもしくはソフトゼラチンカプセルに入れることがでるか、あるいはそれはダイエットの食品と共に直接配合することができる。経口治療投与では、結う濃い成分は賦形剤と共に配合することができ、摂取可能な錠剤、口腔錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェハー剤等の形態で使用することができる。かかる適当な剤型のかかる治療上有用な組成物におけるある量の有効成分が得られるであろう。
【０２１９】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤等は以下のものを含有することもでき：トラガカントガム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンのごときバインダー；リン酸二カルシウム；コーンスターチ、ジャガイモスターチ、アルギン酸等のごとき崩壊剤；ステアリン酸のごとき滑沢剤；およびスクロース、ラクトースまたはサッカリンのごとき甘味剤を添加することができるか、あるいはペパーミント、ヒメコウジの油、またはチェリーフレーバーのごときフレーバー剤を添加することができる。投与単位形態がカプセル剤である場合、それは、前記タイプの物質に加えて、液状担体を含有することができる。
【０２２０】
種々の他の物質をコーティングとしてまたは投与単位の物理的形態を修飾するために存在させることができる。例えば、錠剤、丸剤たはカプセル剤をシェラック、糖または双方でコートすることができる。シロップ剤またはエリキシル剤は有効成分、甘味剤としてのスクロース、防腐剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素およびチェリーもしくはオレンジフレーバーのごときフレーバー剤を含有することができる。勿論、いずれの投与単位形態を調製するのに使用されるいずれの物質も医薬上純粋であるべきであり、使用する量で実質的に非特性であるべきである。加えて、有効成分を持続放出製剤および処方に配合することができる。
【０２２１】
本明細書中で用いる「医薬上許容される担体および／または希釈剤」はいずれかのおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗菌類剤、等張剤および吸収遅延剤を含む。医薬上活性な物質のためのかかる媒体および剤の使用は当業者によく知られている。いずれの通常の媒体もしくは剤も有効成分と不適合である限りを除けば、治療組成物におけるその使用が考えられる。補足的有効成分もまた組成物に配合することができる。
【０２２２】
投与の容易性および剤形の均一性のため親組成物を投与単位形態に処方するのが特に有利である。ここに使用される投与単位形態とは、治療すべき哺乳動物対象のための単位剤形として適した物理的に区別される単位をいい；各単位は所要の医薬担体と組み合わせて所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を含有する。本発明の新規な投与単位形態の仕様は（ａ）有効物質のユニークな特徴および達成すべき特定の治療効果、および／（ｂ）身体の健康が損なわれた病気状態を有する生きた対象における病気の治療のための有効物質のごとき調剤分野で固有の制限に指示され、直接それに依存する。
【０２２３】
主要な有効成分は、投与単位形態において適当な医薬上許容される担体と共に有効量にて便宜かつ効果的な投与のために調合される。補足的有効成分を含有する組成物の場合、剤形は通常の用量および前記成分の投与方法を参照することによって決定される。
【０２２４】
さらなる態様において、特定の兆候を治療するのに適することが知られた当業者に認められた化合物と組み合わせてまたは単独で病気の治療で使用される前記定義の本発明の有効成分が提供される。その結果、ＮＦκＢ誘導または抑制に関連した病気の治療のための医薬の製造のための本発明の有効成分の使用が提供される。
【０２２５】
さらに、前記したアッセイ方法を用いて同定可能な化合物または複数化合物の治療上有効量を対象に投与するＮＦκＢ誘導または抑制に関連した疾患の治療方法が提供される。
【０２２６】
以下の実施例において、説明の目的で本発明をさらに記載する。
【０２２７】
（実施例１）
ＴＰＬ−２およびｐ１０５の間の相互作用の同定
ＴＰＬ−２に対する可能な標的を同定するために、改良された接合戦略を用いて酵母２−ハイブリッドスクリーニングを行う（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら， １（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅ １６：２７７−２８２）。ｐＡＳ２ΔΔベクターにサブクローンされたＴＰＬ−２  ｃＤＮＡを餌として用いて、（Ｌｅｇｒａｉｎ，  パスツール研究所、パリによって提供された）ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする。
【０２２８】
平板培養した２２×１０６ジプロイド酵母コロニーから、ＨＩＳ３選択およびＬａｃＺ発現に対して陽性である６８のクローンが得られる。相互作用蛋白質はＤＮＡ配列決定によって同定され、酵母への再形質転換によって確認される。
【０２２９】
得られた６８の陽性クローンのうち３２はＮＦ−κＢ１  ｐ１０５のＩκＢ−様Ｃ−末端をコードする（図２ａ）。無細胞翻訳によって一緒に合成された、ｐ１０５とＴＰＬ−２との共免疫沈殿により、２つの蛋白質が高化学量論的量で相互作用することが確認される（図１ｂ）。ＴＰＬ−２およびｐ１０５は一緒に合成され、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＴＮＴ結合ウサギ網状赤血球系を用いる無細胞翻訳によって、［３５Ｓ］−Ｍｅｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で標識する。翻訳された蛋白質は溶解緩衝液Ａ（Ｓａｌｍｅｒｏｎ，  Ａ．等（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ． １５，  ８１７−８２６）＋０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中に希釈し、前記文献に記載されているごとく免疫沈殿させる。単離された蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解像され、フルオログラフィーによって明らかにされる。
【０２３０】
ｐ１０５が過剰のＴＰＬ−２において翻訳される実験では、抗−ＴＰＬ−２抗体で単離されたＴＰＬ−２／ｐ１０５複合体の化学量論はほぼ１：１であると見積もられる。ＴＰＬ−２のキナーゼ不活性突然変異体は同様の化学量論にてｐ１０５と会合する。
【０２３１】
イン・ビボにてＴＰＬ−２／ｐ１０５相互作用を確認するために、内因性蛋白質をＨｅＬａ細胞から免疫沈殿させる。密集ＨｅＬａ細胞の細胞溶解物からの内因性蛋白質の免疫沈殿およびウエスタンブロッティング（９０ｍｍ皿；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を、緩衝液Ａ中の抽出および１５分間の１００，０００ｇにおける遠心により記載されているごとく行う（Ｋａｂｏｕｒｉｄｉｓ等，（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ． １６：４９８３−４９９８）。抗−ＴＰＬ−２抗体、ＴＳＰ３はすでに記載されている（Ｓａｌｍｅｒｏｎ，Ａ．等（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：８１７−８２６）。ＮＦ−κＢ１（Ｎ）（Ｂｉｏｍｏｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ），  Ｌｅｌ−Ａ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）およびＣ−Ｒｅｌ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に対する抗体は示された商業的供給業者から得られる。抗−ｍｙｃ  ＭＡｂ、９Ｅ１０（Ｇ．  Ｅｖａｌ博士、ＩＣＲＦ  ロンドン）はｍｙｃ−ｐ１０５／ｍｙｃ−ｐ５０の免疫沈殿および免疫蛍光で用いられるが、抗−ｍｙｃ抗血清（Ｓａｎｔ  Ｃｒｕｚ）は免疫ブロッティングで使用される。抗−ＨＡ  ＭＡｂ、１２ＣＡ５はＨＡ−ｐ５０の免疫蛍光染色で使用される。
【０２３２】
ウエスタンブロッティングはｐ１０５とＴＰＬ−２との特異的共免疫沈殿を明瞭い示す（図３ａ）。ｐ５０、ＲｅｌＡおよびｃ−ＲｅｌもまたＴＰＬ−２と特異的に共免疫沈殿する。イン・ビトロ実験はＴＰＬ−２およびｐ５０（ｐ４８突然変異体から生成；図２ｂ、レーン１４）、Ｒｅｌ−ＡまたはｃＲｅｌの間のいずれの直接的会合も検出できなかった。このように、イン・ビボでＴＰＬ−２と会合したｐ１０５は恐らくはｐ１０５のＮ−末端Ｒｅｌ相同性ドメイン（ＲＨＤ）を介してＲｅｌサブユニットと複合体化している（Ｇｈｏｓｈ等，（１９９８）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６，  ２２５−２６０）。
【０２３３】
イン・ビボでのＴＰＬ−２とｐ１０５との相互作用の化学量論はＨｅＬａ細胞溶解物と抗−ＮＦκＢ１（Ｎ）抗血清での免疫枯渇によって調べられる。抗−ＴＰＬ−２免疫沈殿のウエスタンブロッティングは、実質的全ての検出可能なＴＰＬ−２がＮＦ−κＢ１−枯渇細胞溶解物中で除去されることを示す（図３ｂ、底部パネル）。ＴＰＬ−２の免疫枯渇は全細胞ｐ１０５のほぼ５０％を除去する。このように、ＨｅＬａ細胞において、実質的に全てのＴＰＬ−２は全ｐ１０５の大きな割合と複合体化し、これは高化学量論相互作用を示すイン・ビトロデータと合致する（図１、ｂおよびｃ）。
【０２３４】
（実施例２）
ＴＰＬ−２およびｐ１０５突然変異体の分析
Ａ．  欠失突然変異体
ＴＰＬ−２欠失構築体をｐｃＤＮＡ３発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローンする。Ｎ−末端ｍｙｃエピトープ−タグのＴＰＬ−２  ｃＤＮＡへの付加、ＴＰＬ−２欠失突然変異体の創製（図１ａ）およびＴＰＬ−２（Ａ２７０）キナーゼ−不活性突然変異体（未タグ付加）は、適当なオリゴヌクレオチドでのＰＣＲを用いて行い、ＤＮＡ配列決定によって確認する。図の説明で特記しない限り、全長ＴＰＬ−２はｍｙｃ−エピトープタグなくして使用する。ｐｃＤＮＡ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＥＦ−ＢＯＳ発現ベクターいずれかにサブクローンされたｍｙｃ−ｐ１０５欠失突然変異体およびＨＡ−ｐ５０は、ＰＣＲによって創製され、ｐｃＤＮＡ３にサブクローンされたｍｙｃ−ＮΔ−ｐ１０５を例外として、従前に記載されている（Ｗａｔａｎａｂｅ等，（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：３６０９−３６２０；  Ｆａｎ等，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：３９５−３９８）。図１に示された実験において、ｐＲＣ−ＣＭＶ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローンされた未タグドｐ１０５  ｃＤＮＡをｐ１０５の翻訳で用いる（Ｂｌａｎｋ等，（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ． １０：４１５９−４１６７）。
【０２３５】
ＴＰＬ−２およびｐ１０５の欠失突然変異体での実施例１に記載されたごとく行った免疫沈殿実験は、２つの蛋白質がそれらのＣ−末端を通じて相互作用することを明らかにする（図１および２）。特に興味深いのは、Ｃ−末端を欠くＴＰＬ−２、ＴＰＬ−２ＡＣ（Ｓａｌｍｅｒｏｎ，  Ａ．等（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：８１７−８２６）の癌形成性突然変異体は効果的にはｐ１０５と共免疫沈殿しない（図１ｂ，レーン５および６）。加えて、ＴＰＬ−２のちょうどＣ−末端９２アミノ酸のＧＡＬ４融合は酵母２−ハイブリッドアッセイにおいてｐ１０５のＣ−末端（残基４５９から９６９）と相互作用する。イン・ビトロにて、ＴＰＬ−２はｐ１０５のＣ−末端における２つの領域と相互作用するようであり（図２ｂ，右側パネル）、１つは最後の８９アミノ酸におけるものであって、他方は残基５４５および７７７の間である。単離されたｐ１０５  Ｃ−末端はＴＰＬ−２と安定な複合体を形成するのに十分である（図２ｃ）。
【０２３６】
Ｂ．  優性ネガティブＴＰＬ−２
ｐ１０５蛋白質分解に対するＴＰＬ−２発現の効果（後記参照）がその正常な生理学的機能を反映することを確立するのは重要である。この目的で、キナーゼ−不活性ＴＰＬ−２（Ａ２７０）を、アゴニスト−ｐ１０５分解をブロックするその能力につきテストする。１×１０７ジャーカットＴ細胞を、選択ベクターＪ６−Ｈｙｇｒｏ（０．５ｐｇ）と共にＰＭＴ２ベクター（５ｐｇ）にサブクローンしたＴＰＬ−２（Ａ２７０）ｃＤＮＡと共にエレクトロポレーションによって共トランスフェクトする。対照細胞をＰＭＴ２対照ベクターおよびＪ６Ｈｙｇｒｏと共トランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を限定希釈によってクローン化し、ヒグロマイシン耐性（０．５ｍｇ／ｍｌ）につき選択する。生じたクローンにおけるＴＰＬ−２（Ａ２７０）の発現はウエスタンブロックによって測定する。ジャーカットクローンのパルスチェース代謝標識を、点当たり８×１０６細胞を用いて３Ｔ３細胞につき行う。
【０２３７】
対照から空ベクターを安定に発現するジャーカット細胞において、または未トランスフェクト親細胞において、ＴＮＡ−ａはｐ１０５分解を刺激し（図７ａ）、初期の研究と一致する（Ｍｅｌｌｉｔｓ等，（１９９３）Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．  ２１，  ５０５９−５０６６）。しかしながら、ＴＰＬ−２（Ａ２７０）を発現するようにトランスフェクトされたジャーカットＴ細胞のＴＮＡ−ａ刺激はｐ１０５代謝回転に対してほとんど効果を有しない（図７ａ）。このように、ＴＮＡ−ａがｐ１０５分解を誘導するのにＴＰＬ−２に活性が必要であって、ＴＰＬ−２の活性はその優性陰性突然変異体の発現によってブロックされ得る。
【０２３８】
この結果はさらなる実験で確認され、優性ネガティブＴＰＬ−２によるｐ１０５／ＴＮＦの転写−活性化ポテンシャルの阻害を示す。ルシフェラーゼ遺伝子を駆動するＴＮＦ−誘導レポーター構築体を用いてジャーカットＴ細胞を前記したごとくトランスフェクトする。キナーゼドメインを有しないキナーゼ−デッドＴＰＬ−２、またはＴＰＬ−２の切形Ｃ−末端の共発現はルシフェラーゼ遺伝子の発現を顕著に減少させる（図８）。
【０２３９】
（実施例３）
ｐ１０５およびＴＰＬ−２の機能的相互作用
（ａ）ＮＦκＢ活性化
ＴＰＬ−２がｐ１０５を介してＮＦ−κＢを活性するか否かを調べるために、一過的にトランスフェクトされたＴＰＬ−２をまず、ＮＦ−κＢレポーター遺伝子を活性化するその能力につきテストする。ＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイでは、ジャーカットＴ細胞を、適当な発現ベクターの示した量と共にルシフェラーゼ遺伝子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の上流のコンセンサスＮＦ−κＢエンハンサーエレメントの５つのタンデム反復を含有する２μｇのプラスミドで共トランスフェクトする（Ｋａｂｏｕｒｉｄｉｓ等，（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ． １６：４９８３−４９９８）。ＴＰＬ−２およびＮＩＫ  ＣＤＮＡは全てｐｃＤＮＡ３ベクターにサブクローンする（Ｓａｌｍｅｒｏｎ等，（１９９６）；  Ｍａｌｉｎｔｎ等，（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：５４０−５４４）。トランスフェクトされたＤＮＡの量を、空ｐｃＤＮＡベクターの補足によって一定に保つ。ルシフェラーゼ実験（Ｋａｂｏｕｒｉｄｉｓ等，（１９９７））を少なくとも３回行って同様の結果を得る。
【０２４０】
ＴＰＬ−２の発現はレポーター遺伝子を１４０倍高く（図３ｂ）、ＩκＢ−ａの分解を刺激することによってＮＦ−κＢを活性化する関連ＭＡＰ ３Ｋ酵素であるＮＩＫによって誘導されたものと同様のレベルまで活性化する（Ｍａｌｉｎｉｎ等，（１９９７）；  Ｍａｙ，  Ｍ．  Ｊ．＆Ｇｈｏｓｈ，  Ｓ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ １９，  ８０−８８）。キナーゼ不活性点突然変異体ＴＰＬ−２（Ａ２７０）はＮＦ−κＢ誘導に対して効果を有しない。イン・ビトロ（図１ｂ）またはイン・ビボいずれかでｐ１０５とで安定な複合体を形成しないＴＰＬ−２ＡＣの発現の結果、ＮＦ−κＢレポータのまさに中程度の活性化（１２倍）が得られるに過ぎない（図３ｃ）。ＴＰＬ−２がＮＦ−κＢを十分に活性化するにはｐ１０５と複合体化されなければならないことを確認するために、ｐ１０５のＣ−末端断片である３’ＮＮ（図２ａ）をＴＰＬ−２と共発現させる。このＣ−末端断片は共トランスフェクトされたＴＰＬ−２とイン・ビボで相互作用し、内因性ｐ１０５への結合と競合する。３’ＮＮの共発現はＴＰＬ−２によるＮＦ−κＢレポーターの不活化を劇的に阻害するが、ＮＩＫによる不活化は阻害しない（図３ｄ）。まとめると、これらのデータは、トランスフェクトされたＴＰＬ−２がＮＦ−κＢを優れて活性化し、これは内因性ｐ１０５との直接的相互作用を要するように見えることを示す。これは、ＴＰＬ−２がｐ１０５を直接的に活性化するのではないかということを意味する。
【０２４１】
（Ｂ）ＮＦκＢの核転移
もしＴＰＬ−２発現が事実ｐ１０５を活性化すると、ＮＦ−κＢ１の核転移の結果となるはずである。これを調べるために、免疫蛍光を３Ｔ３繊維芽細胞で用い、ここでは、細胞質および核の間の区別は容易である。略言すれば、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を示したベクターで一過的にトランスフェクトし、カバーグラス上で２４時間培養する。次いで、細胞を固定し、透過させ、従前に記載されているように（Ｈｕｂｙ等，（１９９７）Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ． １３７， １６３９−１６４９）示した抗体および適当な蛍光標識第２段階抗体で染色する。Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＮＴ共焦点顕微鏡を用いて、染色されたトランスフェクト細胞の単一光学セクションを可視化する。
【０２４２】
ｍｙｃ−ｐ１０５それ自身でまたはキナーゼ−不活性ＴＰＬ−２（Ａ２７０）と一緒にそれでトランスフェクトした細胞において、抗−ｍｙｃ染色は細胞質に限られ（図４ａ、上方パネル）、これはＩκＢとしてのｐ１０５の機能と合致する。しかしながら、ＴＰＬ−２との共発現は抗−ｍｙｃ染色の核への実質的に定量的なシフトを誘導する（図４ａ、下方パネル）。細胞分別およびウェスタンブロッティングは、ＴＰＬ−２でトランスフェクトされた細胞における核ＮＦ−κＢシグナルが、細胞質に限定されるｍｙｃ−ｐ１０５よりもむしろｍｙｃ−ｐ５０であることを確認する（図４ｂ）。これらのデータは、ＴＰＬ−２発現が、共トランスフェクトされたｍｙｃ−ｐ１０５のｐ５０への増大したプロセッシング、または解離されたｍｙｃ−ｐ５０を放出するその分解のプロセッシングいずれかの結果としての、ｍｙｃ−ｐ５０の核転移を誘導することを示唆する。
【０２４３】
ＴＰＬ−２がｐ１０５蛋白質分解プロセッシングを誘導してｐ５０核転移を促進するにちがいないか否かを調べるために、３Ｔ３細胞を、別のプラスミド上のＨＡ−ｐ５０と共に、ｍｙｃ−ｐ５０にプロセッシングされ得ないｍｙｃ−ｐ１０５ＡＧＲＲをコードするベクターでトランスフェクトする。ＨＡ−ｐ５０はＴＰＬ−２（Ａ２７０）（図５、頂部パネル）または空ベクターと共発現させると核に局所化する。Ｍｙｃ−ｐ１０５ΔＧＲＲはＴＰＬ−２（Ａ２７０）で共トランスフェクトした細胞の細胞質にＨＡ−ｐ５０を保持する（図５、中央パネル）。しかしながら、ＴＰＬ−２のｍｙｃ−ｐ１０５ΔＧＲＲの共発現はＨＡ−ｐ５０染色の核への実質的定量的シフトを誘導する（図５、下方パネル）。このように、ｐ５０核転移のＴＰＬ−２活性化はｐ５０へのｐ１０５プロセッシングの刺激を要しない。これらのデータは、ＴＰＬ−２がｐ１０５の分解を誘導して会合したｐ５０を放出させ、あるいは他の会合Ｒｅｌサブユニットを放出させて、核へ転移させ、それによりＮＦ−κＢを生成させるという立場を支持する。
【０２４４】
（Ｃ）ＮＦκＢの生物学的活性
マウルＩｇκエンハンサー（Ｌｅｎａｒｄｏ，  Ｍ．  Ｇ．＆Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｄ．，（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５８，２２７−２２９）中のＮＦ−κＢ結合部位に対応する放射性標識二本鎖オリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を記載されているごとく（Ａｌｋａｌａｉ，  Ｉ．等（１９９５）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ １５，１２９４−１３０１）行って、ＴＰＬ−２を共発現する細胞においてｍｙｃ−ｐ１０５から生産された核ｍｙｃ−ｐ５０が生物学的活性であることを確認する。
【０２４５】
ＴＰＬ−２の発現の結果、２つのκＢ−結合複合体が明瞭に増加し（図４ｃ、レーン２）これはジャーカットＣ細胞におけるＮＦ−κＢレポータ遺伝子のＴＰＬ−２活性化と合致する（図３ｃ）。Ｍｙｃ−ｐ１０５発現は単独でより低いκＢ複合体の結合活性を中程度に増加させる（図４ｃ、レーン３）。しかしながら、ｍｙｃ−ｐ１０５とＴＰＬ−２との共発現の結果、より低いκＢ複合体の結合活性が相乗的に増加する（図４ｃ、レーン４）。キナーゼ−不活性ＴＰＬ−２（Ａ２７０）はκＢ結合活性に影響を有しない（図４ｃ、レーン５）。また、ｐ１０５のプロセッシング欠陥突然変異体、ｍｙｃ−ｐ１０５ＡＧＲＲ（Ｗａｔａｎａｂｅ等，（１９９７）ＡＥＭＢＯ  Ｊ． １６：３６０９−３６２０）は共発現されたＴＰＬ−２の存在下または不存在下でκＢ結合活性を生じない（図４ｃ、レーン６および７）。
【０２４６】
抗−ｍｙｃ  ＭＡｂは、ＴＰＬ−２＋ｍｙｃ−ｐ１０５共トランスフェクト細胞において誘導されたより低いκＢ複合体と強く反応し、スーパーシフトを引き起こす（図４ｃ、レーン８）。これにより、この複合体におけるプロセッシングされたｍｙｃ−ｐ５０の存在が確認される。この誘導されたより低い複合体はＲｅｌ  Ａ（図４ｃ，レーン９）またはｃ−Ｒｅｌに対する抗体と反応しない。このように、ＴＰＬ−２とｍｙｃ−ｐ１０５との共発現は、ｍｙｃ−ｐ１０５トランスフェクト細胞において過剰発現されるｍｙｃ−ｐ５０のダイマーを主として含む活性ＮＦ−κＢ複合体の生産を刺激する。ＴＰＬ−２単独でトランスフェクトした細胞からの核抽出物スーパーシフト分析（図４ｃ、レーン２）は、主要な誘導された内因性ＮＦ−κＢ複合体がｐ５０／Ｒｅｌ−Ａダイマーからなることを明らかとする（図４ｃ、レーン９）。
【０２４７】
（Ｄ）  ｐ１０５に対するＴＰＬ−２の生物学的効果
パルスチェイス代謝標識を行って、ＴＰＬ−２が３Ｔ３繊維芽細胞におけるｍｙｃ−ｐ１０５の蛋白質分解を調節するか否かを決定する。パルスチェイス代謝標識では、ＮＩＨ−３Ｔ３繊維芽細胞がＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）（Ｈｕｂｙ等，（１９９７）Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ． １３７，１６３９−１６４９）を用いて一過的にトランスフェクトする。細胞質および核画分の調製は記載されているごとく行う（Ｗａｔａｎａｂｅ等、（１９９７）。
【０２４８】
ＥＭＢＯ  Ｊ． １６：３６０９−３６２０）。パルスチェイス代謝標識では、６０ｍｍ当たり２．７×１０５ ３Ｔ３細胞（Ｎｕｎｃ）を示した発現ベクターでトランスフェクトする。２４時間後に、細胞を洗浄し、Ｍｅｔ／Ｃｙｓ−フリー培地中で１時間培養する。次いで、皿当たり１４５  ＭＢｑの［３５Ｓ］−Ｍｅｔ／［３５Ｓ］−Ｃｙｓ（ＰｒｏＭｉｘ，  Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で細胞を３０分間標識し、洗浄の後、示した時間完全培地中でチェイスする。０．１％ＳＤＳおよび０．５％デオキシコレート（ＲＩＰＡ緩衝液）を補足した緩衝液Ｂ（Ｓａｌｍｅｒｏｎ等）に細胞を溶解させ、免疫沈殿した蛋白質をフルオログラフィーによって明らかにするＭＧ１３２プロテオソームインヒビター（Ｂｉｏｍｏｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）を、Ｍｅｔ／Ｃｙｓ飢餓期間の最後の１５分間に２Ｏ’１Ｍで添加し、チェイスの間維持する。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  デンシトメーターを用いるレーザーデンシトメトリーによって標識されたビーズを定量する。全てのパルスチェイス実験は少なくとも２つの場合に行い、同様の結果が得られる。
【０２４９】
ＴＰＬ−２での共発現はｍｙｃ−ｐ１０５の半減期をほぼ５．５時間から１．８時間まで減少させる（図５ａおよびｂ）。ｍｙｃ−ｐ１０５の減少速度のｍｙｃ−ｐ５０生産のそれとの比較は、ｍｙｃ−ｐ１０５の大部分が、すでに提案されているごとく（Ｌｉｎ等， １９９８）Ｃｅｌｌ９２，  ８１９−８２８）ｍｙｃ−ｐ１０５に変換されるよりも（図６ａ）単純に分解されることを示唆する。しかしながら、ＴＰＬ−２共発現は、最近記載されている共翻訳メカニズム（Ｌｉｎ等， １９９８）よりもむしろ、これらの細胞においてｍｙｃ−ｐ１０５から翻訳後に圧倒的に生じる（図６ａ）ｍｙｃ−ｐ５０の生産の全速度を変更しない。ｍｙｃ−ｐ５０は対照細胞におけるごとくＴＰＬ−２共トランスフェクト細胞で同様の速度であるが徐々に減少していく量のｍｙｃ−ｐ１０５から生じるので（図６ｃ）、ＴＰＬ−２ｍｙｃ−ｐ１０５プロセッシングの効率を劇的に増加させることを示唆する。野生型ｐ１０５（図６ｂ）と同様に、ＴＰＬ−２共発現はｍｙｃ−ｐ１０５ＡＧＲＲの分解を促進する（図６ｄ）。しかしながら、キナーゼ−不活性ＴＰＬ−２−（Ａ２７０）は分解（図６ｅ）または共発現されたｍｙｃ−ｐ１０５のプロセッシングいずれかに対して検出可能な効果を有しない。
【０２５０】
ペプチドアルデヒドＭＧ１３２、プロテアソームの優れた阻害剤の効果を測定して、ＴＰＬ−２によって誘導されたｍｙｃ−ｐ１０５蛋白質分解がプロテアソームによって媒介されるか否かを調べる。ＭＧ１３２処理はｍｙｃ−ｐ１０５の増大した代謝回転をブロックし（図６ｆ）、ＴＰＬ−２共発現細胞におけるｍｙｃ−ｐ５０の生産を完全に妨げる。結論として、パルスチェイス代謝標識実験は、ＴＰＬ−２発現の支配的効果がプロテアソームによるｍｙｃ−ｐ１０５分解の速度を増加させることにあるのを示す。しかしながら、同時に、プロテアソームによるｍｙｃ−ｐ１０５からのｍｙｃ−ｐ５０の生産の全速度は変化されない。
【０２５１】
ｍｙｃ−ｐ１０５／ｍｙｃ−ｐ５０の定常状態レベルに対するＴＰＬ−２発現の効果を測定するために、３Ｔ３細胞を示したベクターで一過的に共トランスフェクトし、２４時間後にＲＩＰＡ緩衝液に溶解させる。次いで、細胞溶解物のウェスタンブロットを抗−ｍｙｃ抗血清でプローブする。バンドをレーザーデンシトメトリーによって定量する。一過的にトランスフェクトされた３Ｔ３細胞からの溶解物のウェスタンブロッティングは、ｍｙｃ−ｐ５０／ｍｙｃ−ｐ１０５の定常比率が対照と比較してＴＰＬ−２共発現によって有意に増加することを示す（図６ｇ）。
【０２５２】
このように、ＴＰＬ−２トランスフェクト細胞において、ｍｙｃ−ｐ５０はｍｙｃ−ｐ１０５よりも大モル過剰で発現され（ｍｙｃ−ｐ５０／ｍｙｃ−ｐ１０５）平均値＝１０．３＋／−ＳＥ１．３；ｎ＝２）、他方、対照細胞において、ｍｙｃ−ｐ１０５およびｍｙｃ−ｐ５０はほとんど同等モラーである（ｍｙｃ−ｐ５０／ｍｙｃ−ｐ１０５平均＝０．９３＋／−ＳＥ０．０７；ｎ＝２）。従って、細胞質にそれを維持する不十分なｍｙｃ−ｐ１０５があるので、ｍｙｃ−ｐ５０はＴＰＬ−２共トランスフェクト細胞の核に転移する。
【０２５３】
ＩκＢ−αＮ−末端における調節セリンをリン酸化するＩＫＫ−ａ（ＩＫＫ−ａ）およびＩＫＫ−２）と呼ばれる２つの関連キナーゼをＮＩＫはリン酸化し、それを活性化する。これはＩκＢ−α普遍化およびプロテアソームによる分解をトリガーする。リン酸化がＴＰＬ−２で共発現されたｍｙｃ−ｐ１０５における移動度シフトを引き起こすか否かを調べるために、洗浄した抗−ｍｙｃ免疫沈殿を、５０ｍＭトリス−ｐＨ７．５、０．０３％Ｂｒｉｊ−９６、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有する緩衝液に再懸濁させる。子ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、ホスフェートインヒビターのオルトバナジン酸ナトリウム（１ｍＭ）、フッ化ナトリウム（５ｍＭ）および  Ｏｋａｄａ酸（０．１μｍ）と共にまたはそれなくして４００Ｕ／ｍｌにて適当な試料に添加する。３７℃での１時間のインキュベーション後に、免疫沈殿した蛋白質をウェスタンブロットし、抗−ＮＦ−κＢ１（Ｎ）高血清でプローブする。
【０２５４】
ｍｙｃ−ｐ１０５分解のＴＰＬ−２刺激はそのキナーゼ活性を要し（図６ｂおよびｅ）、これはリン酸化がこの効果で同様に必要であることを示す。ＴＰＬ−２と共発現させたｍｙｃ−１０５はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてよりゆっくりと移動することが常に見出される（図６ａ）。このＴＰＬ−２誘導移動度シフトは、イン・ビトロでのホスファターゼでの処理に対する感受性によって明らかにされるごとく、ｍｙｃ−ｐ１０５リン酸化によるものである。（図７ｂ）。対照的に、キナーゼ−不活性ＴＰＬ−２（Ａ２７０）は共発現されたｍｙｃ−ｐ１０５において移動度シフト誘導しない（図７ｂ）。このように、ｍｙｃ−ｐ１０５蛋白質分解のＴＰＬ−２刺激はその誘導されたリン酸化と相関する。ＩκＢαとの類似性により、ＴＰＬ−２−誘導ｐ１０５リン酸化はその普遍化を促進し、それによりプロテアソームによるｐ１０５蛋白質分解を刺激するようである。
【０２５５】
従って、ＴＰＬ−２は、ＮＦ−κＢ阻害性蛋白質、ｐ１０５のプロテアソーム−媒介蛋白質分解を刺激することによってＮＦ−Ｂを活性化する新規なシグナリング経路の構成要素である。ＴＰＬ−２は、ｐ５０生産の全速度を維持しつつｐ１０５の分解を増大させる（図６ａ）。このように、会合したＲｅｌサブユニットはそれ自身の核まで移動するか（恐らくはダイマーとして）、あるいはｐ５０産物と複合体化する。ＴＰＬ−２はｐ５０、Ｒｅｌ−Ａおよびｃ−Ｒｅｌと特異的に共免疫沈殿するので（図３ａ）、それは細胞に存在する全ての主要なｐ１０５複合体の蛋白質分解を調節できる（Ｒｉｃｅ等，（１９９１）Ｃｅｌｌ７，  ２４３−２５３；  Ｍｅｒｃｕｒｉｏ等，（１９９３）Ｇｅｎｅｓ．  Ｄｅｖｅｌ．    ７，    ７０５−７１８）。興味深いことには、ＴＰＬ−２は、ＩκＢ−αの誘導性分解を調節するＮＩＫに最も密接に相同なキナーゼである（Ｍａｌｉｎｉｎ， １９９７）。従って、ＮＦ−κＢ活性化に至る２つのシグナリング経路は関連するＭＡＰ ３Ｋ−ファミリー酵素によって調節される。
【０２５６】
最後に、これらのデータは、そのＣ−末端の欠失を必要とするＴＰＬ−２の癌形成性活性化についての潜在的メカニズムを提案する（Ｃｅｃｉ等，（１９９７）Ｇｅｎｅ．  Ｄｅｖｅｌ． １１，  ６８８７００）。このように、Ｃ−末端欠失はＴＰＬ−２の発現を増加させると共に、それをｐ１０５との化学量論的相互作用から放出させ（図１Ｂ）、これは一緒になって不適当な標的蛋白質のリン酸化を促進し得る。これらは、突然変異によって活性化された場合、癌形成性であり（Ｃｏｗｅｌｙ等，（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７７，  ８４１−８５２）、ＴＰＬ−２によって強力に活性化される（Ｓａｌｍｅｒｏｎ，  Ａ．等，（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ． １５，  ８１７−８２６）ＭＥＫを含み得る。
【０２５７】
（実施例４）
ＴＰＬ−２／ＣＯＴのモジュレータを同定するためのスクリーニングアッセイ  （Ａ）トランスフェクトされた哺乳動物細胞から免疫沈殿したＣＯＴ蛋白質を用いるＴＰＬ−２／ＣＯＴキナーゼアッセイ
実施例を通じて、特記しない限り、以下の材料および方法を用いる。
【０２５８】
材料および方法
哺乳動物細胞におけるＣＯＴポリペプチドの発現
ＦＬＡＧ−タグドＣＯＴ蛋白質をトランスフェクションによって２９３Ａ細胞で発現させた。典型的には、トランスフェクションの２４時間前に、ヒト２９３Ａ細胞（Ｑｕａｎｔｕｍ）を１０ｃｍのプレート当たり２×１０６細胞で平板培養した。１５ｍｌのチューブ中に６０μｌリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ）および８００μｌのＯｐｔｉｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ）を含むトランスフェクション混合物を調製した。別のチューブ中で、ｐＣＤＮＡベクター中のＦＬＡＧ−タグドＣＯＴ（３０−３９７）遺伝子をコードする８μｇのＤＮＡを８００μｌのＯｐｔｉｍｅｍに添加した。次いで、各チューブの内容物をピペットで温和に混合し、室温にて２５分間インキュベートした。細胞をＯｐｔｉｍｅｍで１回洗浄し、トランスフェクション混合物および６．４ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍとインキュベートし、３５℃および５％ＣＯ２にて５時間インキュベートした。次いで、細胞を第１日に８ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｌ−グルタミンと共に、第２日にＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ＋Ｌ−グルタミンと共にインキュベートし、トランスフェクションから４８時間後に収穫した。
【０２５９】
ＦＬＡＧ−タグドＣＯＴ蛋白質の免疫沈殿
ＦＬＡＧ−ＣＯＴ（３０−３９７）を発現するトランスフェクトされた２９３Ａ細胞を、溶解緩衝液（１％トリトンＸ−１００、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ＮａＦ、１０ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、５０ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４＋完全プロテアーゼ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））中で１５分間、氷上で、溶解させ、上清を遠心し（４℃での１０分間の１４，０００ｒｐｍ）、上清を収集した。混合しつつ、溶解物１ｍＭ当たり５０μｇ  ＡｂにてＦＬＡＧ  Ａｂゲル（Ｓｉｇｍａ）を用いて４℃で３時間免疫沈殿を行った。ゲルビーズを４℃にて溶解緩衝液で２回洗浄し、次いで、洗浄緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍＭ  ＤＴＴ）で２回洗浄した。次いで、ゲルビーズを洗浄緩衝液に再懸濁し、種々のキナーゼ反応のためにチューブに小分けした。
【０２６０】
ＴＰＬ−２／ＣＯＴキナーゼアッセイおよびインヒビタースクリーニング
ＴＰＬ−２／ＣＯＴキナーゼアッセイを用いて種々の候補ＴＰＬ−２／ＣＯＴキナーゼインヒビターをスクリーニングした。キナーゼアッセイは以下のごとく行った。ゲルビーズに結合したＴＰＬ−２キナーゼ（すなわち、ＦＬＡＧ−ＣＯＴ（３０−３９７））を、２５℃にて、適当な放射性標識（３０μｍ  ＡＴＰおよび５μＣｉ  γ−３２Ｐ−ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ））の存在下で、キナーゼ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴおよび０．０１％Ｂｒｉｊ３５）中で２μｇの標的ポリペプチド基質（すなわち、ＧＳＴ  ＩκＢ−α（１−５０）（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）と共に１０分間インキュベートした。１００％ＤＭＳＯ中の１０ｍＭストック溶液として調製した阻害活性のための候補化合物の存在下または不存在下で反応を行った。γ−３２Ｐ−ＡＴＰの添加直前に、テスト化合物をキナーゼ反応混合物に添加した。５×ＳＤＳ試料緩衝液を添加し、１００℃で３分間加熱することによって反応を停止させ、遠心を用いて上清を収集した。ＣＯＴの自動リン酸化および標的ポリペプチド、すなわち、ＧＳＴ−ＩκＢ−αのリン酸化は、ゲル電気泳動（１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、続いてのニトロセルロース膜への移動およびオートラジオグラフィーによって分析した。同等レベルのＦＬＡＧ−ＣＯＴ（３０−３９７）およびＧＳＴ−ＩκＢ−α蛋白質が異なるキナーゼ反応および同等のゲル負荷で用いられたことを確認するための対照として、オートラジオグラフィーで使用した同一膜上で、各々、抗−ＦＬＡＧおよび抗−ＧＳＴ抗体でイムノブロットを行った。ＣＯＴキナーゼ活性、いずれかの自動リン酸化活性の阻害または標的ポリペプチドＧＳＴ−ＩκＢ−αのリン酸化はオートラジオグラフのスキャンニングによって定量した（図１３）。これらの活性のレベルを変更する化合物をさらに後述するように分析した。
【０２６１】
バクロウイルス−発現組換えＣＯＴ蛋白質を用いるＴＰＬ−２／ＣＯＴキナーゼアッセイ
前記と同様に昆虫細胞で発現されたＴＰＬ−２ポリペプチドを、候補モジュレータ化合物の存在下または不存在下で標的ポリペプチドを用いてキナーゼ活性につきテストした。このアッセイにおいて、ＴＰＬ−２キナーゼ、すなわち、ＣＯＴ（３０−３９７）を、標準技術を用いてＣＯＴキナーゼを発現するバクロウイルスで感染した昆虫細胞から調製した。キナーゼアッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％Ｂｒｉｊ３５、５ｍＭ  β−ホスフォグリセロール）中、テスト化合物の存在下または不存在下、放射性標識（［３３Ｐ］−γ−ＡＴＰ ３×ストック：５０μＣｉ／ｍｌ  ［３３Ｐ］−γ−ＡＴＰを含む６０μＭ冷ＡＴＰ）の存在下で、モデルｐ１０５蛋白質を含む標的ポリペプチド（すなわち、ＰＢＳ中の１．４ｍｇ／ｍｌにおける１μｇのＧＳＴ−Ｐ１０５Δ１−４９７）と共にＴＰＬ−２キナーゼ（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中の５μｇ／ｍｌにおける１００ｎｇ）をインキュベートした。加えて、このアッセイを標的ポリペプチド（すなわち、モデルｐ１０５ポリペプチド）の不存在下で行って、テスト化合物のいずれかがＴＰＬ−２自動リン酸化活性を改変したかを測定した。
【０２６２】
９６−ウェルプレート中でアッセイを行って、非常に多数の化合物の効果的なスクリーニングを行った。例えば、典型的には、１０μｌのキナーゼおよび基質を、１０μｌの化合物、１０μｌの［３３Ｐ］−γ−ＡＴＰの存在下で９６ウェルプレート中のウェル当たりでインキュベートした。反応を７５ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４中の１００μｌの５ｍＭ  ＡＴＰで停止させた。次いで、１２０μｌの各反応混合物の９６−ウェルホスフォセルセロール膜フィルタープレートへの移動を行い、２５℃で３０分間インキュベートし、洗浄し（ウェル当たり１００μｌの７５ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４にて６×）、シンチレーションカウンターで測定した回収標識蛋白質の関数としての得られたキナーゼ活性につき（２５μｌのシンチレーションカクテルを用いて）アッセイした。
【０２６３】
前記アツセイを用い、潜在的ＡＴＰ−競合ＴＰＬ−２／キナーゼインヒビターを含有するものとして分子モデリングによって選択された化学ライブラリーから、ＴＰＬ−２キナーゼ活性を変調できるいくつかの化合物を同定した。同定された化合物はＧＳＴ−ＩκＢ−αによって表されるＩκＢ−α標的ポリペプチドのＣＯＴ−媒介リン酸化に対する効果を示した。
【０２６４】
ＴＰＬ−２／ＣＯＴキナーゼモジュレーター
ＴＰＬ−２に対する効果を示す化合物を、二連にて、１００μＭ濃度にてキナーゼ活性の阻害につき、まずスクリーニングした。選択された化合物についてのＴＰＬ−２キナーゼインヒビタースクリーニングデータの例を図１３に示す。テストすべき化合物がＴＰＬ−２の特異的阻害剤であるかまたは一般的キナーゼ阻害剤であるかを決定するために、既知の特異性を持つキナーゼ阻害剤もまた平行してテストした。一般的キナーゼ阻害剤であるスタウロスポリン、ＭＥＫインヒビターＰＤ９８０５９およびｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターＳＢ２０３５８０は、ＣＯＴ自動リン酸化およびＣＯＴ標的（すなわち、ＩκＢ−α）のリン酸化に対してほとんどまたは阻害活性を示さなかった。対照的に、テスト化合物の各々は、変化するレベルの特異的阻害活性を示した（図１３）。ＤＭＳＯビヒクルのみを含有する対照キナーゼ反応（５％の最終濃度）と比較して１００μＭにおいてＴＰＬ−２活性＞５０％阻害した活性化合物を３つの濃度１００μＭ、１０μＭおよび１μＭで再テストして、ＴＰＬ−２阻害に対するＩＣ５０値を測定した。同定されたＴＰＬ−２阻害剤はＩＣ５０＝５０μＭを持つＮ−（６−フェノキシ−４−キノリル）−Ｎ−［４−（フェニルスルファニル）フェニル］アミン］、ＩＣ５０＝１０μＭを持つ５−オキソ−４−［４−（フェニルスルファニル）アニリノ］−５、６，７，８−テトラヒドロ−３−キノリンカルボン酸エチル、ＩＣ５０＝１００μＭを持つ３−（４−ピリジル）−４，５−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］インダゾールメタンスルフォネートおよびＩＣ５０＝１００μＭを持つ２−クロロベンゾ［ｌ］［１，９］フェナントロリン−７−カルボン酸ナトリウムを含む。これらの化合物の各々の化学構造は図９から１２に示される。
【０２６５】
同等物
当業者にあれば、ルーチン的実験を用いるにすぎなくして、本明細書に記載した本発明の具体例の多くの同等物を認識し、あるいは確認できるであろう。かかる同等物は以下の請求の範囲に含まれることを意図する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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