(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
椿花を水性アルコール又は水性アルコール水溶液で抽出して得られる抽出物であって、該抽出物が少なくとも以下の式（１）又は式（２）
【化１】
0004806135.tif 000011
で表される化合物を含有することを特徴とする椿花抽出物。
【請求項２】
請求項１の抽出物が、さらにブタノールで抽出して得られる抽出物であって、該抽出物が少なくとも式（１）又は式（２）で表される化合物を含有する椿花抽出物。
【請求項３】
以下の式（１）〜式（６）のいずれか
【化２】
0004806135.tif 000012
で表される化合物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の椿花抽出物を含有する胃粘膜保護剤。
【請求項５】
請求項３に記載のいずれか１つの化合物を含有する胃粘膜保護剤。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の椿花抽出物を含有するアルコール吸収抑制剤。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の椿花抽出物を含有する糖吸収抑制剤。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の椿花抽出物を含有する健康食品。
【請求項９】
請求項３に記載の化合物の少なくとも一つ以上を含有する健康食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規化合物、それを含有する椿花抽出物及びそれらの用途に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
従来から、椿花は民間薬として、吐血や腸風下血（腸出血）の治療に用いられており、滋養強壮効果を有することも知られている。
また、近年においては、椿花に含有される成分によるコンディショニングやライトニング等の美肌用化粧品としての研究が進められている。
椿花の含有成分としては，ロイコアントシアニン、アントシアニン及びトリテルペンサポニン等が一般に知られているが、椿花の他の含有成分やそれらの薬効等については未解明の部分が多く、さらなる研究が求められている。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、椿花を水性アルコール又は水性アルコール水溶液で抽出して得られる抽出物であって、該抽出物が少なくとも以下の式（１）又は式（２）
【化３】
0004806135.tif 000002
で表される化合物を含有する椿花抽出物が提供される。
また、本発明によれば、以下の式（１）〜式（６）のいずれか
【化４】
0004806135.tif 000003
で表される化合物が提供される。
さらに、本発明によれば、上記椿花抽出物又は式（１）〜式（６）の少なくとも１つの化合物を有効成分として含有する胃粘膜保護剤、アルコール吸収抑制剤及び糖吸収抑制剤が提供される。
【０００４】
【発明の実施の形態】
本発明の椿花抽出物を得るために用いることができる植物の花は、ツバキ科（Theaceae）に属する植物の花であれば特に限定されるものではなく、例えば、ヤブツバキ、ユキツバキ、ホンコンツバキ、サルウィンツバキ、ヤクシマツバキ、トウツバキ、ウラクツバキ、ワビスケ、カンツバキ、ナツツバキ、岩根絞、春曙光、太郎冠者等の種々の品種の花が挙げられる。なかでも、ヤブツバキ（Camellia Japonica L.)の花が好ましい。これらの植物は、日本、中国等に広く生育しているものであり、どこに生育しているものでも使用することができる。しかし、ツバキ科植物の花中に含有される成分は、原料とするツバキ科植物の種類及び産地等により、量や種類等に若干の差があると考えられるため、本発明の椿花抽出物を得るためには、日本国内で栽培されたものを用いることが好ましい。なお、ツバキ科植物の花としては、単種又は複数種のツバキ科植物の花のいずれを使用してもよい。ツバキ科植物の花は、通常、ガク片、花弁、心皮、雄ずい、雌ずい等を含むもので、かつ新鮮なものであることが好ましい。
【０００５】
本発明で使用される水性アルコールとしては、炭素数１〜３の脂肪族アルコールが挙げられ、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール等が挙げられる。なかでも、メタノールが好ましい。また、水性アルコール水溶液としては、１〜５０重量％程度の水性アルコールを含有する水溶液が挙げられる。
【０００６】
本発明によれば、ツバキ科植物の花を水性アルコール又は水性アルコール水溶液により抽出し、椿花抽出物を得る。この際、水性アルコール等は、ツバキ科植物の花の１〜１０倍（重量）程度、好ましくは１〜５倍程度使用することが適当である。
【０００７】
また、抽出は、冷浸又は温浸のいずれで行ってもよいが、５０〜８５℃程度の温度で、振盪下又は非振盪下に、上述したツバキ科植物の花を上述した溶剤に浸漬することによって行うことが適当である。振盪下に浸漬する場合には、３０分間〜５時間程度行うことが適当であり、非振盪下に浸漬する場合は、１時間〜１０日間程度行うことが適当である。なお、抽出処理は、同一椿花材料について１回のみ行ってもよいが、２回以上繰り返して行うことが好ましい。
【０００８】
上記で得られる抽出物は、さらにｎ−ブタノールで抽出することが好ましい。この際、例えば、水、酢酸エチル等をｎ−ブタノールとともに加えて、分配抽出してもよい。分配抽出は、上記の水性アルコールでの抽出と同様に行うことができる。特に、分配抽出は、室温下、振盪下又は非振盪下に、水性アルコール又は水性アルコール水溶液により得られた抽出物又は後述するように濃縮した抽出物に対して、ｎ−ブタノールを１〜３０（重量）倍程度加えて行うことが適当である。
なお、ツバキ科植物の花を水性アルコール又は水性アルコール水溶液により抽出した後又はさらにｎ−ブタノールで抽出した後、抽出物を濃縮することが好ましい。この際の濃縮は低温又は加温、かつ減圧下で行うことが好ましい。また、この濃縮は乾固するまで行ってもよいし、濃縮する前にろ過し、ろ液を濃縮して抽出物としてもよい。
【０００９】
得られた抽出物は、精製処理に付してもよい。精製処理は、クロマトグラフ法、イオン交換樹脂を使用する溶離法等を単独又は組み合わせて採用することができる。例えば、クロマトグラフ法としては、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、遠心液体クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等のいずれか又はそれらを組み合わせて行う方法が挙げられる。この際の担体、溶出溶媒等の精製条件は、各種クロマトグラフィーに対応して適宜選択することができる。例えば、薄層クロマトグラフィーの場合には、水―メタノール系の溶媒、高速液体クロマトグラフィーの場合にはメタノール−酢酸系の溶媒等を使用することができる。
【００１０】
上記で得られた水性アルコール（特に、メタノール）抽出物又はｎ−ブタノール抽出物を順相及び逆相薄層クロマトグラフィーに付し、さらに高速液体クロマトグラフィーに付した場合、上記に示す式（１）〜式（６）の６種の新規化合物に対応するスポット及びピークを得ることができる。
このように、本発明の椿花抽出物は、最終的に得られたピークを示す成分を精製することにより、式（１）〜式（６）の化合物を単離することができる。
【００１１】
本発明の方法によって得られる抽出物は、後述するように、活性酸素の消去作用、塩酸エタノール誘発胃粘膜損傷に対する保護作用、血小板凝集作用、ブドウ糖負荷による血糖値上昇抑制作用、アルコール吸収抑制作用、糖吸収抑制作用等の種々の作用が認められ、特に、胃粘膜保護剤、アルコール吸収抑制剤又は糖吸収抑制剤等として、そのままの状態であるいは適当な媒体で希釈して使用することができる。また、本発明の抽出物は、そのままの状態又は適当な媒体で希釈して、医薬的な治療効果を現さない量、つまり健康維持のための量で健康食品として用いてもよい。これらの場合の抽出物の形態は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又は液剤等の製剤のいずれであってもよい。
【００１２】
適当な媒体としては、例えば、乳糖、澱粉、デキストリン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、合成及び天然の珪酸アルミニウム、酸化マグネシウム、乾燥水酸化アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、重炭酸ナトリウム、乾燥酵母、酸化亜鉛、タルク、カオリン、硼酸末、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、沈降炭酸カルシウム、次没子酸ビスマス、硫酸アルミニウムカリウム末、グリセリン、プロピレングリコール、脂肪油、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、界面活性剤等が挙げられる。
なお、上記の各種製剤は、医薬又は健康食品等の分野で広く採用されている公知の方法により製造することができる。
【００１３】
本発明の抽出物又は化合物の使用量は、濃縮、精製等の程度、使用目的、治療又は予防等の対象疾患、その疾患の程度、体重等により適宜調節することができるが、例えば、抽出物として、あるいは上記化合物を有効成分として、成人1日あたり、１μｇ〜１００００ｍｇ程度を２〜３回に分けて与えることが適当である。
【００１４】
【実施例】
以下、本発明の椿花抽出物、それに含有される新規化合物及びそれらの作用についての実施例を、具体的に説明する。
【００１５】
（１）椿花の抽出及び椿花抽出物中に含有される新規化合物
椿花の抽出方法の概要を図１に示す。
伊豆大島で採取した新鮮な椿花（Camellia Japonica L.）６．０ｋｇをメタノール（９９．９％）６リットルに浸漬し、８０℃の加温下、３時間抽出した。これを３回繰り返し、得られたメタノールを合液し、メタノールを蒸発させることにより、メタノール抽出物を得た（４８０ｇ）。
次いで、得られたメタノール抽出物４８０ｇに、室温下、酢酸エチル及び水（１：１）を１リットルずつ加えて振り混ぜ、得られた酢酸エチル層及び水層をそれぞれ分液採取した。この操作を３回繰り返した。さらに、得られた水層に、室温下、ｎ−ブタノール（９９．８％）を３リットル加えて振り混ぜ、得られたｎ−ブタノール層及び水層をそれぞれ分液採取した。この操作を３回繰り返した。ｎ−ブタノール層及び水層から溶媒を蒸発させることにより、ｎ−ブタノール抽出物及び水抽出物を、それぞれ得た（１２１ｇ及び３３２ｇ）。メタノール抽出物、酢酸エチル抽出物、ｎ−ブタノール抽出物及び水抽出物の順相及び逆相薄層クロマトグラムを図２（ａ）及び（ｂ）にそれぞれ示す。
【００１６】
続いて、得られたｎ−ブタノール抽出物を、ＳｉＯ2カラムを用いた薄層クロマトグラフィーにより、分離状態を確認しながら、移動相としてＣＨＣｌ3−メタノール−水を７：３：０．５→６：４：１→５：５：５（ｖ／ｖ）と、組成比を順次切り替えて分離し、１３のフラクションを得た（図３（ａ）：順相、（ｂ）：逆相）。
得られた１３のフラクションのうち、フラクション５として得られた分画を、さらにＯＤＳカラムを用いた薄層クロマトグラフィーにより、分離状態を確認しながら、移動相としてメタノール（１０、３０、５０、６０、７０、１００％）→ＣＨＣｌ3−メタノール−水（６：４：１（ｖ／ｖ））→メタノールと、組成比を順次切り替えて分離し、１２のフラクションを得た（図４（ａ）：順相、（ｂ）：逆相）。
得られた１２のフラクションのうち、フラクション１０として得られた分画を、液体クロマトグラフ装置（島津製作所製：ＨＰＬＣ装置、送液ポンプ：ＬＣ−１０ＡＳ、示差屈折計：ＲＩＤ−６Ａ、ＹＭＣ−ＰＡＣ  ＯＤＳカラム：４Ａ１２Ｓ０５−２５２０ＷＴ  ＳＨ−３４３−５、流速：０．９ｍｌ／分、圧力：１７０〜１８０ｋｇｆ／ｃｍ2）と、移動相としてメタノール１％水溶液−酢酸とを用いて、２つのフラクションに分離し、上記式（１）及び式（２）の化合物をそれぞれ得た（式（１）の化合物：２６４ｍｇ及び式（２）の化合物：１７５ｍｇ）。
【００１７】
また、得られた１２のフラクションのうち、フラクション１１として得られた分画を、上記と同様に３つのフラクションに分離し、上記式（３）、式（４）及び式（５）の化合物をそれぞれ得た（式（３）の化合物：１５．４ｍｇ、式（４）の化合物：３４．１ｍｇ、及び式（５）の化合物：１３．６ｍｇ）。
さらに、得られた１２のフラクションのうち、フラクション１２として得られた分画から、移動相としてメタノール１％水溶液−酢酸、ＣＨ3ＣＮ１％水溶液−酢酸を用いる以外、上記と同様に１つのフラクションを分離し、上記（６）の化合物を得た（式（６）の化合物：９．９ｍｇ）。
これらのクロマトグラムを図５（（ａ）：順相、（ｂ）：逆相）に示す。
式（１）〜式（４）の化合物の物性を図６〜図９に示す。なお、式（１）〜式（４）の各化合物の構造式の決定は、ＮＭＲ法により行った。また、式（１）及び（２）、式（３）、式（４）、式（５）、式（６）の各化合物のＨＰＬＣのチャートをそれぞれ図１０〜図１４に示す。
【００１８】
（２）活性酸素の消去活性
老化や炎症などの様々な病態に関与する活性酸素の消去活性として、インビトロの系において、キサンチンオキシダーゼ法によりＳＯＤ様活性及びＤＰＰＨラジカル消去活性を検討した。
【００１９】
（ｉ）ＳＯＤ様活性の実験方法
キサンチン３ｍＭ、ＥＤＴＡ３ｍＭ、０.１５％ウシ血清アルブミン (ＢＳＡ)、ニトロブルーテトラゾリウム (ＮＢＴ)０.７５ｍＭをそれぞれ０．１ｍｌずつ加えて混合した。これに、各濃度の被験物質２.５ｍｌを加え、２５℃で１０分間予備加温した後、キサンチンオキシダーゼ溶液０．１ｍｌを加え、２５℃で２０分間インキュベートした。６ｍＭのＣｕＣｌ2 を０．１ｍｌ加えて反応を停止させ、５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、被験物質はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した後、蒸留水で順次希釈したものを用いた。また、被験物質２.５ｍｌの代わりに水を添加したものを対照として測定した。
【００２０】
（ii）ＤＰＰＨラジカル消去活性の実験方法
０．１Ｍ酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ５.５）１．０ｍｌ、２．０×１０-4Ｍの１,１-ジフェニル-２-ピクリルヒドラジル (ＤＰＰＨ) ラジカル０．５ｍｌ、エタノール０．５ｍｌ及び各濃度の被験物質１．０ｍｌを混合し、室温にて３０分間放置した後、５１７ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、ＤＰＰＨはエタノールに溶解し、被験物質はＤＭＳＯに溶解した後、エタノールで順次希釈したものを用いた。
【００２１】
(iii）結果
表１に示したように、公知の抗酸化剤と同様に、椿花メタノール抽出物、酢酸エチルおよびｎ−ブタノール分画に活性酸素消去作用及びラジカル消去活性が認められた 。
【００２２】
【表１】
0004806135.tif 000004
【００２３】
（３）胃粘膜保護作用
椿花抽出物及びその中に含まれる化合物の急性胃粘膜損傷ラットに対する影響を検討するとともに、胃腸出血に対する治療・予防効果を実証するために止血に関与する血小板凝集活性をあわせて検討した。
（ｉ）塩酸エタノール誘発胃粘膜損傷に対する保護作用の実験方法
ＳＤ系雄性ラット (８〜９週令、２５０ｇ前後) を２４時間絶食させた後、椿花メタノール抽出物 (１２５、２５０ ｍｇ／ｋｇ) 又はｎ−ブタノール分画(２５、５０ ｍｇ／ｋｇ) を経口投与し、１時間後に９９．５％エタノールを１．５ｍｌ経口投与した。１時間後に胃を摘出し、１．５％ホルマリンで組織を固定した後に、胃粘膜に生じた損傷の長さ (ｍｍ)を測定し、その合計値を損傷係数とした。
また、式（１）及び式（２）の化合物についても、上記と同様に胃粘膜に生じた損傷の長さ（ｍｍ）を測定し、損傷係数とした。
【００２４】
（ii）血小板凝集活性
日本白色種雄性ウサギの耳介動脈より全血を採取し、洗浄血小板 (５×１０6cells／μｌ、２２５μｌ／アッセイ) を調製し、1ｍＭのＣａＣｌ2存在下に、種々濃度の椿花抽出物 (分画を含む) を添加し、血小板凝集活性を凝集計 (Hematracer) にて、光の透過率によって測定した。なお、１Ｕ／ｍｌトロンビンの凝集活性を凝集率１００％とした。
また、式（１）及び式（２）の化合物についても、上記と同様に血小板凝集活性を測定した。なお、この場合は、０．５U／ｍｌトロンビンの凝集活性を凝集率１００％とした。
【００２５】
（iii）結果
表２に示すように、エタノール誘発急性胃粘膜損傷モデルに対して、椿花メタノール抽出物（２５０ｍｇ／ｋｇ）及びｎ−ブタノール分画 （５０ｍｇ／ｋｇ）は、胃粘膜損傷を有意に抑制した。
また、表３に示すように、エタノール誘発急性胃粘膜損傷モデルに対して、式（１）の化合物（２０ｍｇ／ｋｇ）及び式（２）の化合物（１０、２０ｍｇ／ｋｇ）は、胃粘膜損傷を有意に抑制した。
【００２６】
【表２】
0004806135.tif 000005
【００２７】
【表３】
0004806135.tif 000006
さらに、表４に示すように、メタノール抽出物、ｎ−ブタノール分画及び酢酸エチル分画に、強い血小板凝集活性が認められ、臨床で出血を伴う胃腸損傷や外傷の止血に使用されているトロンビンの血小板凝集効果 (０．５〜１Ｕ／ｍｌの濃度で完全凝集を惹起する) と同様に強い凝集活性が認められた。
また、表５に示すように、式（１）及び式（２）の化合物にも、血小板凝集活性が認められた。
【００２８】
【表４】
0004806135.tif 000007
【００２９】
【表５】
0004806135.tif 000008
【００３０】
このことから、椿花のメタノール抽出物、ｎ−ブタノール分画、式（１）及び式（２）の化合物は強い胃粘膜保護作用を有し、過度の飲酒による胃炎などの胃腸障害に対して適用できることが示唆された。また、強い血小板凝集活性を有していることより、出血を伴う胃腸障害 (急性胃炎、急性大腸炎) に対しても有用であることが示された。
【００３１】
（４）アルコール吸収抑制作用
（ｉ）実験方法
ウィスター系雄性ラット（５〜６週齢、体重：１３０ｇ）を２０〜２４時間絶食させた後にメタノール抽出物、ｎ−ブタノール分画及び酢酸エチル分画を、それぞれ経口投与し、３０分後に２０％エタノール５ｍｌ／ｋｇを経口投与した。経時的（０.５、１、２時間)に採血を行い、血中アルコール濃度をアルコールデヒドロゲナーゼ−アルデヒドデヒドロゲナーゼ法により測定した。
【００３２】
（ii）結果
表６に示したように、椿花メタノール抽出物（５００ｍｇ／ｋｇ）及びｎ−ブタノール分画 （１２５ｍｇ／ｋｇ）は、有意に血中エタノール濃度を低下させた。
【００３３】
【表６】
0004806135.tif 000009
【００３４】
（５）糖吸収阻害活性
（ｉ）アルドース還元酵素阻害作用の実験方法
０．１Ｍ硫酸リチウム、１ｍＭのＤＬ-グリセルアルデヒド、酵素分画 (ラットレンズ由来)、各濃度の被験物質、０．０３ｍＭのニコチン酸アミドアデニンジムクレオチドリン酸の還元型（ＮＡＤＰＨ）を含む１３５ｍＭリン酸緩衝液 (ｐＨ７．０) を３０℃で３０分間インキュベートした後、塩酸を添加して反応を停止させた。これを強アルカリで処理し、６０℃で２０分間加熱した後、室温に戻してから生成したＮＡＤＰを蛍光法により定量した (励起波長：３６０ｎｍ、測定波長：４６０ｎｍ)。なお、被験物質はＤＭＳＯに溶解したものを用いた。
【００３５】
（ii）ブドウ糖吸収抑制作用の実験方法
ウィスター系雄性ラット（５〜６週令、１２０〜１５０ｇ）を２０時間絶食した後に、メタノール抽出エキス (500、1000 mg/kg) 又はｎ−ブタノール分画 (250、500 mg/kg) を経口投与した。３０分後にブドウ糖 (0.5 g/kg) を経口投与し、経時的に眼窩静脈より採血し、グルコースオキシダーゼ法により、血中グルコース濃度を測定した。
【００３６】
（iii）結果
アルドース還元酵素に対しては、IC50＝２３．８μｇ／ｍｌと、阻害作用が認められた。
また、グルコース負荷ラットにおける血糖値上昇に対しては、表７に示したように、メタノール抽出物は有意ではないものの血糖値上昇に対して抑制傾向を示した。ｎ−ブタノール分画は、500mg/kg の用量で、ブドウ糖負荷後３０分後の血糖値上昇に対して有意に抑制効果を示した。
【００３７】
【表７】
0004806135.tif 000010
以上の結果から、椿花のメタノール抽出物及びｎ−ブタノール分画は、食後の過血糖を予防できるとともに、糖尿病の予防・改善に有用であることが認められた。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、椿花を水性アルコール又は水性アルコール水溶液で抽出して得られる抽出物には、式（１）及び／又は式（２）の新規化合物が含有されていることが確認された。また、これらの成分に基づいて、ＳＯＤ様活性及びＤＰＰＨラジカル消去活性；塩酸エタノール誘発胃粘膜損傷に対する保護作用及び血小板凝集活性；アルコール吸収抑制作用；ブドウ糖吸収抑制作用及びアルドース還元酵素阻害作用等を有していることが確認され、老化や動脈硬化など、フリーラジカルが関与する病態、出血を伴う胃腸障害 (急性胃炎、急性大腸炎) 、糖尿病の予防・改善等に有用であることが認められた。
【００３９】
また、本発明によれば、式（１）〜式（６）で表される新規化合物は、上記の椿花抽出物の各種作用・効果の源であり、医薬及び健康食品等への用途開発が期待される。
さらに、本発明によれば、椿花抽出物が、ＳＯＤ様活性及びＤＰＰＨラジカル消去活性のような活性酸素の消去活性を有していることから、老化や動脈硬化など、フリーラジカルが関与する病態等に対して有効であり、また、塩酸エタノール誘発胃粘膜損傷に対する保護作用及び血小板凝集活性による出血を伴う胃腸障害 (急性胃炎、急性大腸炎) に対する予防及び治療に有用であり、さらに、アルコール吸収抑制作用を有しており、ブドウ糖吸収抑制作用及びアルドース還元酵素阻害作用等の糖尿病の予防・改善に有用であることが認められた。よって、医薬及び健康食品等への用途開発を可能にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の椿花の抽出方法を説明するための概略図である。
【図２】本発明の椿花の各抽出物の薄層クロマトグラムである。
【図３】本発明の椿花のブタノール抽出物の薄層クロマトグラムである。
【図４】本発明の椿花のブタノール抽出物のフラクション５の薄層クロマトグラムである。
【図５】本発明の椿花抽出物中に含有される新規化合物を示す薄層クロマトグラムである。
【図６】本発明の式（１）の化合物の物性を示す図である。
【図７】本発明の式（２）の化合物の物性を示す図である。
【図８】本発明の式（３）の化合物の物性を示す図である。
【図９】本発明の式（４）の化合物の物性を示す図である。ＨＰＬＣのチャートである。
【図１０】本発明の式（１）及び（２）の化合物のＨＰＬＣのチャートである。
【図１１】本発明の式（３）の化合物のＨＰＬＣのチャートである。
【図１２】本発明の式（４）の化合物のＨＰＬＣのチャートである。
【図１３】本発明の式（５）の化合物のＨＰＬＣのチャートである。
【図１４】本発明の式（６）の化合物のＨＰＬＣのチャートである。
【図１】
0004806135.tif 000013
【図２】
0004806135.tif 000014
【図３】
0004806135.tif 000015
【図４】
0004806135.tif 000016
【図５】
0004806135.tif 000017
【図６】
0004806135.tif 000018
【図７】
0004806135.tif 000019
【図８】
0004806135.tif 000020
【図９】
0004806135.tif 000021
【図１０】
0004806135.tif 000022
【図１１】
0004806135.tif 000023
【図１２】
0004806135.tif 000024
【図１３】
0004806135.tif 000025
【図１４】
0004806135.tif 000026