(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用を測定する工程と、
被検化合物の存在下におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用が、被検化合物の非存在下におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用よりも強い場合に、当該被検化合物をアポトーシス促進性化合物と判定する工程と、
を備える、アポトーシス促進性化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ５３及びＮＥＤＬ１を発現した細胞を培養する工程と、
培養したそれぞれの細胞における、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用を測定する工程と、
被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用よりも強い場合に、当該被検化合物をアポトーシス促進性化合物と判定する工程と、
を備える、アポトーシス促進性化合物のスクリーニング方法。
【請求項３】
被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用を測定する工程と、
被検化合物の存在下におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用が、被検化合物の非存在下におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用よりも弱い場合に、当該被検化合物を抗アポトーシス性化合物と判定する工程と、
を備える、抗アポトーシス性化合物のスクリーニング方法。
【請求項４】
被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ５３及びＮＥＤＬ１を発現した細胞を培養する工程と、
培養したそれぞれの細胞における、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用を測定する工程と、
被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用よりも弱い場合に、当該被検化合物を抗アポトーシス性化合物と判定する工程と、
を備える、抗アポトーシス性化合物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシス促進性化合物又は抗アポトーシス性化合物をスクリーニングする方法に関する。本発明は、また、神経変性疾患の悪性度の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；Amyotrophic Lateral Sclerosis）は、脊髄、運動皮質、脳幹の運動ニューロンの変性、脱落により筋萎縮を生じる、予後不良の神経変性疾患である。現在、家族性のＡＬＳ（ＦＡＬＳ；Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis）は、ＡＬＳ全体の５〜１０％の頻度で認められる。ＦＡＬＳの一部の家系の原因遺伝子は、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）遺伝子であることが判明しており、ＦＡＬＳの約２０％がＳＯＤ１遺伝子変異を原意としている。
【０００３】
ＳＯＤ１は、好気性代謝の過程で細胞内に生じる活性酸素の一種であるスーパーオキシドを不活性化する。変異型ＳＯＤ１が細胞内で凝集体を形成し、細胞毒性を発揮するという凝集体仮説が、近年、ＦＡＬＳの病因として最も有力なものとされつつある（非特許文献１）。
【０００４】
本発明者らは、ヒト神経芽腫の予後不良群に比べて、自然退縮する予後良好群において高発現する新規遺伝子の一つとして、ＨＥＣＴドメインを持つＥ３ユビキチンリガーゼをコードするＮＥＤＬ１を同定した。ＮＥＤＬ１はＦＡＬＳの原因遺伝子産物の一つである変異型ＳＯＤ１と物理的に結合し、そのユビキチン化を誘導することにより、変異型ＳＯＤ１の分解を促進する機能を持つことが判明している。また、ＮＥＤＬ１と変異型ＳＯＤ１との結合の強度は、由来する病態の重症度に依存しており、野生型ＳＯＤ１との結合は検出されない。さらに、モデルマウス及び実際の症例における免疫染色実験から、ユビキチン化された変異型ＳＯＤ１及びＮＥＤＬ１は凝集体内で蓄積していることが観察された。したがって、ＮＥＤＬ１と変異型ＳＯＤ１との相互作用がＦＡＬＳの発症及び進行に重要な役割を担っていることが強く示唆されるが、ＮＥＤＬ１による神経細胞死（アポトーシス）の詳細な分子機構については不明である（特許文献１、非特許文献２）。
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０３／０１８８４２号パンフレット
【非特許文献１】Rosen DR et al., Nature, 364: 59-62 (1993)
【非特許文献２】Miyazaki K et al., J. Biol. Chem., 279: 11327-11335 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＮＥＤＬ１による神経細胞死の分子機構を解明し、アポトーシスを増強又は抑制する化合物を見出すことは、癌や神経変性疾患の治療・予防薬の開発につながる。したがって、本発明の目的の一つは、ＮＥＤＬ１によるアポトーシスの分子機構を解明することである。本発明の別の目的は、解明された分子機構から導きだされるアポトーシスを促進又は抑制する化合物のスクリーニング方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、解明された分子機構に基づいた、神経変性疾患の悪性度の判定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、シスプラチン処理による細胞死誘導における各種遺伝子の発現解析などの実験結果から、ユビキチン化を介して標的タンパク質の分解を触媒するＮＥＤＬ１は、ｐ５３に対しては分解を促進せずにむしろその活性を昂進することを見出した。このことは、ＮＥＤＬ１によるｐ５３の新たな制御機構の存在を示唆している。また、ＮＥＤＬ１によるｐ５３の活性化は、ＡＬＳのみならずアルツハイマー病やパーキンソン病を含めた神経変性疾患一般における神経細胞死を制御する分子機構の一つである可能性も考えられる。以上の知見から、本発明者らは本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用を測定する工程と、被検化合物の存在下におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用が、被検化合物の非存在下におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用よりも強い場合に、当該被検化合物をアポトーシス促進性化合物と判定する工程と、を備えるアポトーシス促進性化合物のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、ｐ５３とＮＥＤＬ１とが直接相互作用して複合体を形成し、アポトーシスを誘導するという分子機構を応用したものである。かかる分子機構は、本発明者らが新たに見出したものであり、したがって、今までとは作用機序が全く異なるアポトーシス促進性化合物を本スクリーニング方法により得ることが可能である。かかる化合物は、アポトーシス促進剤や抗癌剤に応用することが可能である。
【０００９】
本発明は、また、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ５３及びＮＥＤＬ１を発現した細胞を培養する工程と、培養したそれぞれの細胞における、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用よりも強い場合に、当該被検化合物をアポトーシス促進性化合物と判定する工程と、を備えるアポトーシス促進性化合物のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法により、今までとは作用機序が全く異なるアポトーシス促進性化合物を得ることが可能であり、また、かかる化合物はアポトーシス促進剤や抗癌剤に応用することが可能である。
【００１０】
本発明は、また、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用を測定する工程と、被検化合物の存在下におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用が、被検化合物の非存在下におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用よりも弱い場合に、当該被検化合物を抗アポトーシス性化合物と判定する工程と、を備える抗アポトーシス性化合物のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、ｐ５３とＮＥＤＬ１とが直接相互作用して複合体を形成し、アポトーシスを誘導するという分子機構を応用したものである。かかる分子機構は、本発明者らが新たに見出したものであり、したがって、今までとは作用機序が全く異なる抗アポトーシス性化合物を本スクリーニング方法により得ることが可能である。かかる化合物は、アポトーシス抑制剤や神経変性疾患の治療薬に応用することが可能である。
【００１１】
本発明は、また、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ５３及びＮＥＤＬ１を発現した細胞を培養する工程と、培養したそれぞれの細胞における、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用よりも弱い場合に、当該被検化合物を抗アポトーシス性化合物と判定する工程と、を備える抗アポトーシス性化合物のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法により、今までとは作用機序が全く異なる抗アポトーシス性化合物を得ることが可能であり、また、かかる化合物はアポトーシス抑制剤や神経変性疾患の治療薬に応用することが可能である。
【００１２】
本発明は、さらに、神経変性疾患の患者から採取した神経細胞における、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用を測定する工程と、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用が強いほど神経変性疾患の悪性度が高いと判定する工程と、を備える、神経変性疾患の悪性度の判定方法を提供する。この判定方法は、ｐ５３とＮＥＤＬ１とが直接相互作用して複合体を形成し、アポトーシスを誘導するという分子機構に基づくものである。かかる分子機構は、本発明者らが新たに見出したものであり、したがって、今までとは異なる判定基準により神経変性疾患の悪性度を判定することが可能であり、この判定方法は患者の予後診断等に利用できる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のスクリーニング方法によれば、今までとは作用機序が全く異なるアポトーシス促進性化合物及び抗アポトーシス性化合物を得ることが可能である。このような化合物を見出すことで、癌や神経変性疾患（ＡＬＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病など）の治療・予防に有効な薬を開発することが可能となる。
【００１４】
また、本発明の神経変性疾患の悪性度の判定方法により、今までとは異なる判定基準により神経変性疾患の悪性度を判定することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１６】
（アポトーシス促進性化合物のスクリーニング方法）
本発明のアポトーシス促進性化合物のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用を測定する工程と、被検化合物の存在下におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用が、被検化合物の非存在下におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用よりも強い場合に、当該被検化合物をアポトーシス促進性化合物と判定する工程と、を備える。ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用とは、より具体的には両者の結合、複合体形成を指す。相互作用の測定は、当業者とって公知のタンパク質間相互作用を測定する系が利用可能であり、例えば、酵母ツーハイブリッド法やＰＣＡ法（プロテイン・フラグメント・コンプリメンテーション・アッセイ）が挙げられる。酵母ツーハイブリッド法及びＰＣＡ法の概要を以下に説明する。
【００１７】
まず、酵母ツーハイブリッド法を説明する。酵母Ｇａｌ４は、Ｎ末端側のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）とＣ末端側の転写活性化ドメイン（ＡＤ）とからなる転写制御因子である。両ドメインは基本的には自律的に機能し、ＤＢＤは単独でＤＮＡに結合できるが転写の活性化は起こせない。ＡＤはその反対である。この性質を応用して開発されたのが酵母ツーハイブリッド法である。つまり、Ｇａｌ４のＤＢＤに目的のタンパク質Ｐを融合したタンパク質（ベイト）と、Ｇａｌ４のＡＤに別のタンパク質Ｑを融合したタンパク質（プレイ）を酵母細胞に導入した場合、ＰとＱとが核内で相互作用すれば、酵母細胞内で転写制御複合体が再構成され、Ｇａｌ４結合部位依存的に転写が活性化されることになる。この活性をレポーター遺伝子を用いて検出することにより、タンパク質Ｐ及びＱの間の相互作用が容易に評価できる。レポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３、ｌａｃＺ、ＵＲＡ３などを利用することができる。また、酵母Ｇａｌ４以外にも、ＳＲＦやＬｅｘＡを用いた系も利用することが可能である。
【００１８】
酵母ツーハイブリッド法において、タンパク質Ｐとしてｐ５３を、タンパク質ＱとしてＮＥＤＬ１を用いた系（又はその逆の系でも構わない）によれば、本発明のスクリーニング方法を行うことが可能である。すなわち、ベイトとしてｐ５３又はＮＥＤＬ１の一方を、プレイとしてｐ５３又はＮＥＤＬ１の他方を酵母に発現させ、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で当該酵母を培養し、培養した酵母のレポーター遺伝子の転写活性（ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用の強さを表す）を測定し、被検化合物の存在下の転写活性が被検化合物非存在下の転写活性よりも上昇している場合、被検化合物はアポトーシス促進性化合物であると判定できる。
【００１９】
次に、ＰＣＡ法について説明する。ＰＣＡ法では、一つの機能タンパク質Ａ（酵素、転写因子など）を二つの断片Ａ１及びＡ２に分割し、それぞれを目的タンパク質Ｐ及びＱと融合し、融合タンパク質Ａ１−Ｐ及びＡ２−Ｑを作製する。目的タンパク質Ｐ及びＱが結合すると、機能タンパク質Ａの機能が回復し、その活性を検出することで、Ｐ及びＱの相互作用を判定する、という原理に基づいている。機能タンパク質としては、例えばβ−ラクタマーゼを利用することができる。以下では、β−ラクタマーゼを利用したＰＣＡ法について説明する。
【００２０】
β−ラクタマーゼは細菌由来のβ−ラクタム環切断酵素である。β−ラクタマーゼを、Ｎ末端側のα１９７断片（２５〜１９７残基）とＣ末端側のω１９８断片（１９８〜２８８残基）に分割し、それぞれを目的タンパク質との融合タンパク質として発現させる。両者が結合する場合にのみβ−ラクタマーゼタンパク質の立体構造が回復し、活性を示す。β−ラクタマーゼ活性は細胞透過性の蛍光プローブＣＣＦ２／ＡＭ（ＣＣＦ２アセトキシメチルエステル）により検出される。ＣＣＦ２／ＡＭはセファロスポリン分子の両末端に２種類の異なる蛍光物質クマリン及びフルオレセインが結合した構造を有しており、クマリンをドナー、フルオレセインをアクセプターとする分子内ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）を呈する。すなわち、クマリンを４０９ｎｍの光で励起すると、フルオレセイン由来の５２０ｎｍの蛍光を発することになる。しかし、ＣＣＦ２がβ−ラクタマーゼ活性による分解を受けると、２つの蛍光物質は解離し、ＦＲＥＴは観察されなくなるため、４０９ｎｍの光の励起によってクマリン本来の４４７ｎｍの蛍光を発するようになる。４４７ｎｍの蛍光強度を測定することにより、β−ラクタマーゼの活性、すなわち、目的タンパク質の相互作用の強さを測定することが可能となる。
【００２１】
したがって、ＰＣＡ法を利用して本発明のスクリーニング方法を行うには、以下の方法によればよい。機能タンパク質の二つの断片Ａ１及びＡ２の一方にｐ５３を他方にＮＥＤＬ１を融合させた融合タンパク質を細胞に発現させ、被検化合物の存在下又は非存在下のそれぞれの条件下で当該細胞を培養し、培養した細胞における機能タンパク質の活性を測定し、被検化合物の存在下で培養した細胞における機能タンパク質の活性が、被検化合物非存在下で培養した細胞における機能タンパク質の活性よりも上昇している場合、被検化合物はアポトーシス促進性化合物であると判定できる。
【００２２】
また、本発明のアポトーシス促進性化合物のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ５３及びＮＥＤＬ１を発現した細胞を培養する工程と、培養したそれぞれの細胞における、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用よりも強い場合に、当該被検化合物をアポトーシス促進性化合物と判定する工程と、を備える。相互作用の測定は、当業者にとって公知のタンパク質間相互作用を測定する系が利用可能であり、例えば、免疫沈降法が挙げられる。免疫沈降法を用いたスクリーニング方法を以下に説明する。
【００２３】
まず、ｐ５３及びＮＥＤＬ１を発現した細胞を調製する。かかる細胞は、例えば、ヒト神経芽腫細胞であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞やヒト骨肉種細胞であるＵ２ＯＳ細胞などのｐ５３を発現している細胞にシスプラチンなどの抗癌剤処理で細胞にストレスを与えてＮＥＤＬ１を誘導することにより調製することができる。あるいは、ｐ５３を発現している細胞にＮＥＤＬ１遺伝子を導入することにより、かかる細胞を調製してもよい。そして、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で前記細胞を培養する。
【００２４】
次に、培養したそれぞれの細胞における、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用を測定する。相互作用の測定には、まず、培養した細胞を粉砕して細胞可溶化物を調製する。細胞可溶化物は、細胞全体の細胞可溶化物を用いてもよいが、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用は核内で生じることから、核画分の細胞可溶化物を用いることが好ましい。調製した細胞可溶化物に、ｐ５３又はＮＥＤＬ１のいずれか一方の分子に対する抗体を加えて免疫沈降を行う。得られた沈殿物（ｐ５３及びＮＥＤＬ１の複合体が含まれている）を他方の分子に対する抗体を用いた免疫学的手法（イムノブロット等）により、ｐ５３及びＮＥＤＬ１の複合体を検出、定量することにより、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用を測定できる。
【００２５】
測定の結果、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用よりも強い場合（タンパク質複合体の形成量が多い場合）に、当該化合物をアポトーシス促進性化合物であると判定できる。
【００２６】
（抗アポトーシス性化合物のスクリーニング方法）
本発明の抗アポトーシス性化合物のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用を測定する工程と、被検化合物の存在下におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用が、被検化合物の非存在下におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用よりも弱い場合に、当該被検化合物を抗アポトーシス性化合物と判定する工程と、を備える。相互作用の測定は、当業者とって公知のタンパク質間相互作用を測定する系が利用可能であり、例えば、酵母ツーハイブリッド法やＰＣＡ法が挙げられる。
【００２７】
酵母ツーハイブリッド法を利用した本スクリーニング方法は以下の通りである。ベイトとしてｐ５３又はＮＥＤＬ１の一方を、プレイとしてｐ５３又はＮＥＤＬ１の他方を酵母に発現させ、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で当該酵母を培養し、培養したそれぞれの酵母のレポーター遺伝子の転写活性（ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用の強さを表す）を測定し、被検化合物の存在下の転写活性が被検化合物の非存在下の転写活性よりも低下している場合、被検化合物は抗アポトーシス性化合物であると判定できる。
【００２８】
ＰＣＡ法を利用した本スクリーニング方法は以下の通りである。機能タンパク質の二つの断片Ａ１及びＡ２の一方にｐ５３を他方にＮＥＤＬ１を融合させた融合タンパク質を細胞に発現させ、被検化合物の存在下又は非存在下のそれぞれの条件下で当該細胞を培養し、培養した細胞における機能タンパク質の活性を測定し、被検化合物の存在下で培養した細胞における機能タンパク質の活性が、被検化合物非存在下で培養した細胞における機能タンパク質の活性よりも低下している場合、被検化合物は抗アポトーシス性化合物であると判定できる。
【００２９】
また、本発明の抗アポトーシス性化合物のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ５３及びＮＥＤＬ１を発現した細胞を培養する工程と、培養したそれぞれの細胞における、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用よりも弱い場合に、当該被検化合物を抗アポトーシス性化合物と判定する工程と、を備える。相互作用の測定は、当業者にとって公知のタンパク質間相互作用を測定する系が利用可能であり、例えば、免疫沈降法が挙げられる。
【００３０】
免疫沈降法を利用した本スクリーニング方法は以下の通りである。まず、ｐ５３及びＮＥＤＬ１を発現した細胞を調製する。かかる細胞の調製は前述の通りである。そして、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で前記細胞を培養する。次に、培養したそれぞれの細胞における、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用を測定する。相互作用の測定も前述の通りである。測定の結果、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用よりも弱い場合（タンパク質複合体の形成量が少ない場合）に、当該化合物を抗アポトーシス性化合物であると判定できる。
【００３１】
（神経変性疾患の悪性度の判定方法）
本発明の神経変性疾患の悪性度の判定方法は、神経変性疾患の患者から採取した神経細胞における、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用を測定する工程と、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用が強いほど神経変性疾患の悪性度が高いと判定する工程と、を備える。
【００３２】
対象となる神経変性疾患の具体例としては、ＡＬＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病などが挙げられるが、これらに限定されない。当業者にとって公知の方法に従い、神経変性疾患の患者から神経細胞を採取する。次に、上述のｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用の測定方法（例えば、免疫沈降法）により両者の相互作用（免疫沈降法の場合、タンパク質複合体の形成量に相当する）を測定し、相互作用の強さに応じて神経変性疾患の悪性度を評価する。例えば、健常者から採取した神経細胞におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用を基準とし、基準よりもどのくらい強いかに応じて、神経変性疾患の悪性度の評価を行うことができる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３４】
（実験材料）
ｐ２１ＷＡＦ１及びＢａｘルシフェラーゼレポーターは、Ｊｏｈｎ’ｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ大学のＤｒ．  Ｂ．  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎから入手した。タネル染色システムはＲｏｃｈｅ社から購入した。ｐＣＤＮＡ３はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入した。ルシフェラーゼアッセイシステムはＰｒｏｍｅｇａ社から購入した。シスプラチン（ＣＤＤＰ）及びＧ４１８はＳｉｇｍａ社から購入した。抗ｐ５３抗体、抗アクチン抗体、抗ｐ２１ＷＡＦ１抗体及び抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体は、それぞれ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、Ｓｉｇｍａ社、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入した。正常ウサギ血清はＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社から購入した。
【００３５】
ＰＣＲに用いた各種プライマーは以下の通りである。
ＮＥＤＬ１：5'-CCGATTTGAGATCACTTCCTCC-3'（配列番号１）
5'-CCGCTTTCCATCAGGTTGTT-3'（配列番号２）
ＧＡＰＤＨ：5'-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3'（配列番号３）
5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'（配列番号４）
ｐ５３：5'-ATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAAC-3'（配列番号５）
5'-ACCCTTTTTGGACTTCAGGTGGCTGGAGTG-3'（配列番号６）
ｐ２１：5'-ATGAAATTCACCCCCTTTCC-3'（配列番号７）
5'-CCCTAGGCTGTGCTCACTTC-3'（配列番号８）
ＮＥＤＬ２：5'-ACGTGAGTGGGTACCTCCAG-3'（配列番号９）
5'-CCTCAGAAACTGGCCCATTA-3'（配列番号１０）
ＮＥＤＤ４：5'-TTCCGAAGAAAGTTGAAGAAGC-3'（配列番号１１）
5'-CTCTGGCAACTCCTCCATAATC-3'（配列番号１２）
【００３６】
（実験方法）
ＲＴ−ＰＣＲ法、ウエスタンブロット解析、免疫沈降法、ルシフェラーゼレポーターアッセイ及び細胞分画法は、Ando et al., J.Biol.Chem., 279: 25549-25561, 2004に記載の方法と同様の方法で行った。コロニー形成法は、Ozaki et al., CancerRes., 59: 5902-5907, 1999に記載の方法と同様の方法で行った。
【００３７】
（実施例１：シスプラチン処理によるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞死誘導）
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をシスプラチン（終濃度２０μＭ）の存在下で培養した。培養開始から所定の時間ごとに細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、タネル染色を行い、タネル陽性の細胞数をカウントした。図１にタネル染色陽性細胞の割合を示す。シスプラチンによる細胞死の誘導が検出された。
【００３８】
（実施例２：ＲＴ−ＰＣＲ法による発現解析）
実施例１と同じ条件で、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をシスプラチンで処理し、所定の時間ごとに細胞を回収した後、全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＮＥＤＬ１、ＮＥＤＬ２、ＮＥＤＤ４、ｐ２１ＷＡＦ１及びｐ５３遺伝子の発現解析を行った。発現レベルのコントロールとして、ＧＡＰＤＨを用いた。図２にＲＴ−ＰＣＲ法による解析結果を示す。シスプラチンに応答したＮＥＤＬ１の発現誘導が認められた。
【００３９】
（実施例３：ウエスタンブロット法による発現解析）
実施例１と同じ条件で、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をシスプラチンで処理し、所定の時間ごとに細胞を回収した後、全タンパク質を抽出し、ウエスタンブロット法によりｐ２１ＷＡＦ１、リン酸化ｐ５３（ｐ５３（Ｓｅｒ１５））、ｐ５３及びＮＥＤＬ１の発現解析を行った。発現レベルのコントロールとして、アクチンを用いた。図３にウエスタンブロット法による解析結果を示す。シスプラチンに応答したｐ２１ＷＡＦ１、リン酸化ｐ５３、ｐ５３及びＮＥＤＬ１の発現誘導が認められた。
【００４０】
（実施例４：コロニー形成実験）
ＮＥＤＬ１によって細胞死が誘導されるか否かを検討する目的で、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、Ｕ２ＯＳ及びＨ１２９９細胞にＮＥＤＬ１をコードする発現プラスミドを導入した（コントロールとしてｐＣＤＮＡ３を使用した）。遺伝子導入の４８時間後の時点で、Ｇ４１８を含む培地に細胞を移して１４日間培養し、Ｇ４１８に耐性を示すコロニーの数を数えた。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、Ｕ２ＯＳ及びＨ１２９９細胞の結果を、それぞれ図４、５及び６に示す。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ及びＵ２ＯＳ細胞においては、ＮＥＤＬ１によってＧ４１８耐性コロニー数の減少が観察された。一方、ｐ５３が発現していないＨ１２９９細胞では、ＮＥＤＬ１によるＧ４１８耐性コロニー数の減少は認められなかった。
【００４１】
（実施例５：ルシフェラーゼレポーターアッセイ）
ｐ５３の転写活性化能に対するＮＥＤＬ１の効果を検討する目的で、Ｈ１２９９細胞にｐ５３及びＮＥＤＬ１をコードする発現プラスミド並びにｐ２１ＷＡＦ１又はＢａｘ遺伝子のプロモーター領域を持つルシフェラーゼ発現プラスミドを導入した。遺伝子導入の４８時間後の時点で細胞を回収し、そのルシフェラーゼ活性を測定した。図７に示すように、ＮＥＤＬ１によるｐ５３の転写活性化能の昂進が認められた。
【００４２】
（実施例６：ｐ５３とＮＥＤＬ１との複合体形成の確認）
内在性のｐ５３を発現しているＣＯＳ７細胞にＮＥＤＬ１をコードする発現プラスミドを導入した。遺伝子導入の４８時間後の時点で細胞を回収し、全タンパク質を抽出し、正常ウサギ抗体（ＮＲＳ）又は抗ＮＥＤＬ１抗体で免疫沈降し、免疫沈降産物をウエスタンブロット法で解析した。その結果を図８に示す。ＮＥＤＬ１と内在性のｐ５３との複合体形成が確認された。
【００４３】
（実施例７：細胞核内でのｐ５３とＮＥＤＬ１との複合体形成の確認）
Ｕ２ＯＳ細胞に、Ｘｐｒｅｓｓタグの付いたＮＥＤＬ１をコードする発現プラスミドを導入した。遺伝子導入の２４時間後の時点で、細胞をシスプラチン処理群と無処理群とに分けて、シスプラチンの存在下又は非存在下でさらに２４時間培養した。細胞を回収し、細胞質画分（Ｃ）及び細胞核画分（Ｎ）に分画し、抗ＮＥＤＬ１抗体で免疫沈降し、免疫沈降産物をウエスタンブロット法で解析した。チューブリンαとラミンＢを、細胞の分画マーカーとして使用した。結果を図９に示す。細胞核内でのｐ５３とＮＥＤＬ１との複合体形成が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明のスクリーニング方法は、今までとは作用機序が全く異なるアポトーシス促進性化合物及び抗アポトーシス性化合物を提供する。このような化合物は、癌や神経変性疾患の治療・予防に有効な薬となり得る。
【００４５】
また、本発明の神経変性疾患の悪性度の判定方法は、今までとは異なる判定基準に基づく神経変性疾患の悪性度の判定方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】シスプラチン処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の、タネル染色陽性細胞の割合を表すグラフである。
【図２】シスプラチン処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞からのＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ解析した結果を表す図である。
【図３】シスプラチン処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞からのタンパク質をウエスタンブロット解析した結果を表す図である。
【図４】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対するコロニー形成実験の結果を表す図及びグラフである。（ａ）はコロニーの外観を表し、（ｂ）はＧ４１８耐性コロニーの数を表すグラフである。
【図５】Ｕ２ＯＳ細胞に対するコロニー形成実験の結果を表す図及びグラフである。（ａ）はコロニーの外観を表し、（ｂ）はＧ４１８耐性コロニーの数を表すグラフである。
【図６】Ｈ１２９９細胞に対するコロニー形成実験の結果を表す図及びグラフである。（ａ）はコロニーの外観を表し、（ｂ）はＧ４１８耐性コロニーの数を表すグラフである。
【図７】ｐ５３の転写活性化の倍率を表すグラフである。（ａ）はｐ２１ＷＡＦ１ルシフェラーゼレポーターを、（ｂ）はＢａｘルシフェラーゼレポーターを用いたときの結果を表す。
【図８】ＮＥＤＬ１発現プラスミドを導入したＣＯＳ７細胞を、免疫沈降及びイムノブロットした結果を表す図である。ＩＰは免疫沈降に用いた抗体を、ＩＢはイムノブロットに用いた抗体を、それぞれ表す。
【図９】シスプラチンで処理した又は処理しなかったＵ２ＯＳ細胞の細胞質画分（Ｃ）及び細胞核画分（Ｎ）のイムノブロットの結果を表す図である。
【図１０】ＮＥＤＬ１とｐ５３の関係を表す模式図である。様々なストレスに応答して、ｐ５３は細胞核内でＮＥＤＬ１と物理的に結合することによって活性化され、ｐ５３依存性の細胞死が誘導される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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