(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰの改変蛍光タンパク質であって、
該ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列（配列番号：１）中、
0004719226.tif 000043
その５２番目のアミノ酸Ｈｉｓを、
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐからなる芳香族アミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、レッド・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である；
該ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５２番目のアミノ酸Ｈｉｓを、
Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である；あるいは、
該ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５２番目のアミノ酸Ｈｉｓを、
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である
のいずれかの改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする改変蛍光タンパク質。
【請求項２】
前記ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列（配列番号：１）中、５２番目のアミノ酸Ｈｉｓを、Ｐｈｅで置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、レッド・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ−Ｈ５２Ｆである
ことを特徴とする請求項１に記載の改変蛍光タンパク質。
【請求項３】
前記ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列（配列番号：１）中、５２番目のアミノ酸Ｈｉｓを、Ｔｈｒで置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ−Ｈ５２Ｔである
ことを特徴とする請求項１に記載の改変蛍光タンパク質。
【請求項４】
前記ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列（配列番号：１）中、５２番目のアミノ酸Ｈｉｓを、Ａｓｐで置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ−Ｈ５２Ｄである
ことを特徴とする請求項１に記載の改変蛍光タンパク質。
【請求項５】
Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰと高い相同性を有するＰｏｎｔｅｌｌｉｎａ  ｐｌｕｍａｔａ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ｐｐｌｕＧＦＰ２の改変蛍光タンパク質であって、
前記ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５２番目のアミノ酸Ｈｉｓに対応する、該ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列（配列番号：４）中、
0004719226.tif 000044
その５４番目のアミノ酸Ｈｉｓを、
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐからなる芳香族アミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ｐｐｌｕＧＦＰ２が発する蛍光のピーク波長と比較し、レッド・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である；
該ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列中、５４番目のアミノ酸Ｈｉｓを、
Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ｐｐｌｕＧＦＰ２が発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である；あるいは、
該ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列中、５４番目のアミノ酸Ｈｉｓを、
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ｐｐｌｕＧＦＰ２が発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である
のいずれかである
ことを特徴とする改変蛍光タンパク質。
【請求項６】
前記ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列（配列番号：４）中、５４番目のアミノ酸Ｈｉｓを、Ｐｈｅで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする請求項５に記載の改変蛍光タンパク質。
【請求項７】
前記ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列（配列番号：４）中、５４番目のアミノ酸Ｈｉｓを、Ｔｈｒで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする請求項５に記載の改変蛍光タンパク質。
【請求項８】
前記ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列（配列番号：４）中、５４番目のアミノ酸Ｈｉｓを、Ａｓｐで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする請求項５に記載の改変蛍光タンパク質。
【請求項９】
Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰの改変蛍光タンパク質であって、
該ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列（配列番号：１）中、
0004719226.tif 000045
0004719226.tif 000046
その５６番目のアミノ酸Ｔｙｒを、
Ｔｒｐで置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした、４６０ｎｍ以下の蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗである；
該ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５６番目のアミノ酸Ｔｙｒを、Ｔｒｐで置換し、
さらに、１９４番目のアミノ酸Ｖａｌを、Ｓｅｒで置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした、４６０ｎｍ以下の蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓである；あるいは、
該ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５６番目のアミノ酸Ｔｙｒを、Ｔｒｐで置換し、
さらに、１９４番目のアミノ酸Ｖａｌを、Ｓｅｒで、１３６番目のアミノ酸Ｔｈｒを、Ａｌａで置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした、４６０ｎｍ以下の蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ，Ｔ１３６Ａである
のいずれかの改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする改変蛍光タンパク質。
【請求項１０】
Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰと高い相同性を有するＰｏｎｔｅｌｌｉｎａ  ｐｌｕｍａｔａ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ｐｐｌｕＧＦＰ２の改変蛍光タンパク質であって、
前記ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５６番目のアミノ酸Ｔｙｒに対応する、該ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列（配列番号：４）中、
0004719226.tif 000047
その５８番目のアミノ酸Ｔｙｒを、Ｔｒｐで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質；
該ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列中、５８番目のアミノ酸Ｔｙｒを、Ｔｒｐで置換し、
さらに、１９７番目のアミノ酸Ｖａｌを、Ｓｅｒで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質；あるいは
該ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列中、５８番目のアミノ酸Ｔｙｒを、Ｔｒｐで置換し、
さらに、１９７番目のアミノ酸Ｖａｌを、Ｓｅｒで、１３８番目のアミノ酸Ｔｈｒを、Ａｌａで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質
のいずれかの改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする改変蛍光タンパク質。
【請求項１１】
Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰの蛍光のピーク波長を長波長側あるいは短波長側にシフトさせるための、該蛍光タンパク質の改変方法であって、
該蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰに対する改変によって作製される改変蛍光タンパク質は、
該ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列（配列番号：１）中、
0004719226.tif 000048
その５２番目のアミノ酸Ｈｉｓを、
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐからなる芳香族アミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、レッド・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質；
該ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５２番目のアミノ酸Ｈｉｓを、
Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質；あるいは、
該ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５２番目のアミノ酸Ｈｉｓを、
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質
のいずれかである
ことを特徴とする蛍光タンパク質の改変方法。
【請求項１２】
該蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰに対する改変によって作製される改変蛍光タンパク質は、
前記ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５２番目のアミノ酸Ｈｉｓを、ｐｈｅで置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、レッド・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ−Ｈ５２Ｆである
ことを特徴とする請求項１１に記載の蛍光タンパク質の改変方法。
【請求項１３】
該蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰに対する改変によって作製される改変蛍光タンパク質は、
前記ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５２番目のアミノ酸Ｈｉｓを、Ｔｈｒで置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ−Ｈ５２Ｔである
ことを特徴とする請求項１１に記載の蛍光タンパク質の改変方法。
【請求項１４】
該蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰに対する改変によって作製される改変蛍光タンパク質は、
前記ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５２番目のアミノ酸Ｈｉｓを、Ａｓｐで置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ−Ｈ５２Ｄである
ことを特徴とする請求項１１に記載の蛍光タンパク質の改変方法。
【請求項１５】
Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰの蛍光のピーク波長を４６０ｎｍ以下の短波長側にシフトさせるための、該蛍光タンパク質の改変方法であって、
該蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰに対する改変によって作製される改変蛍光タンパク質は、
該ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列（配列番号：１）中、
0004719226.tif 000049
その５６番目のアミノ酸Ｔｙｒを、
Ｔｒｐで置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした、４６０ｎｍに蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗ；
該ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５６番目のアミノ酸Ｔｙｒを、Ｔｒｐで置換し、
さらに、１９４番目のアミノ酸Ｖａｌを、Ｓｅｒで置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした、４６０ｎｍに蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ；あるいは、
該ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５６番目のアミノ酸Ｔｙｒを、Ｔｒｐで置換し、
さらに、１９４番目のアミノ酸Ｖａｌを、Ｓｅｒで、１３６番目のアミノ酸Ｔｈｒを、Ａｌａで置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした、４５９ｎｍに蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ，Ｔ１３６Ａ
のいずれかである
ことを特徴とする蛍光タンパク質の改変方法。
【請求項１６】
Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰと高い相同性を有するＰｏｎｔｅｌｌｉｎａ  ｐｌｕｍａｔａ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ｐｐｌｕＧＦＰ２の蛍光のピーク波長を長波長側あるいは短波長側にシフトさせるための、該蛍光タンパク質の改変方法であって、
該蛍光タンパク質ｐｐｌｕＧＦＰ２に対する改変によって作製される改変蛍光タンパク質は、
前記ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５２番目のアミノ酸Ｈｉｓに対応する、該ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列（配列番号：４）中、
0004719226.tif 000050
その５４番目のアミノ酸Ｈｉｓを、
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐからなる芳香族アミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ｐｐｌｕＧＦＰ２が発する蛍光のピーク波長と比較し、レッド・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質；
該ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列中、５４番目のアミノ酸Ｈｉｓを、
Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ｐｐｌｕＧＦＰ２が発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質；あるいは、
該ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列中、５４番目のアミノ酸Ｈｉｓを、
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ｐｐｌｕＧＦＰ２が発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質
のいずれかである
ことを特徴とする蛍光タンパク質の改変方法。
【請求項１７】
該蛍光タンパク質ｐｐｌｕＧＦＰ２に対する改変によって作製される改変蛍光タンパク質は、
前記ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列（配列番号：４）中、５４番目のアミノ酸Ｈｉｓを、Ｐｈｅで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする請求項１６に記載の蛍光タンパク質の改変方法。
【請求項１８】
該蛍光タンパク質ｐｐｌｕＧＦＰ２に対する改変によって作製される改変蛍光タンパク質は、
前記ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列（配列番号：４）中、５４番目のアミノ酸Ｈｉｓを、Ｔｈｒで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする請求項１６に記載の蛍光タンパク質の改変方法。
【請求項１９】
該蛍光タンパク質ｐｐｌｕＧＦＰ２に対する改変によって作製される改変蛍光タンパク質は、
前記ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列（配列番号：４）中、５４番目のアミノ酸Ｈｉｓを、Ａｓｐで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする請求項１６に記載の蛍光タンパク質の改変方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＦＰ様の蛍光タンパク質の蛍光波長を変える方法、ならびに、該方法を適用して得られる、改変蛍光タンパク質に関する。特には、Ａｅｔｉｄｅｉｄａｅ  科に属するＣｏｐｅｐｏｄａ、Ｐｏｎｔｅｌｌｉｎａ  ｐｌｕｍａｔａ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質：ｐｐｌｕＧＦＰ２、あるいは、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰを対象として、該蛍光タンパク質の蛍光波長を変える方法、ならびに、該方法を適用して得られる、改変蛍光タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
クラゲのアエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ：Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｒｏｅｓｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、あるいは、その改変体タンパク質は、異種細胞内、特には、各種の哺乳動物細胞内において、組換え発現可能であり、また、得られる組換えタンパク質は、宿主細胞内において、蛍光特性を示す。この特徴を利用して、生化学、細胞生理学、医学分野において、動物細胞内で発現可能な、ｉｎ  ｖｉｖｏ  蛍光性マーカー・タンパク質として、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰならびにその相同体は、種々の対象、用途へ利用が図られている（文献１：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，  Ｊ．  Ｇ．Ｈ．  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．３００，  ８７−９１  （２００３）；  文献２：Ｔｓｉｅｎ，  Ｒ．Ｙ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．６７，  ５０９−５４４  （１９９８）を参照）。【０００３】
Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰに関しては、その蛍光特性の発揮に必要な機構の研究が進んでいる。まず、翻訳されたＧＦＰポリペプチドは、天然の立体構造へとフォールディングされる際、その蛍光団を形成する内部トリペプチド部位の環化と、その後の酸化を経て、蛍光特性を有する成熟型ＧＦＰとなることが解明された。更には、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の野生型ＧＦＰの推定アミノ酸配列（ｄｅｄｕｃｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）中、６５番〜６７番目のＳＹＧが、蛍光団を形成する内部トリペプチド部位であることも確認されている。このＡ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の野生型ＧＦＰに関して、Ｘ線結晶構造解析結果が公表されている。その三次元構造は、１１個のβ鎖がバレル形状を構成し、そのバレル形状中心部を上下に貫くように、αヘリックスが配置され、その全体形状は、“βｃａｎ”と称されている。６５番〜６７番目のＳＹＧは、このαヘリックス中に存在しており、形成された蛍光団は、“βｃａｎ”のほぼ中央に位置し、周囲の溶媒分子（水分子）から隔離された疎水的環境下に保持されている（文献３：Ｏｒｍｏ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２７３，  １３９２−１３９５  （１９９６）；  文献４：Ｙａｎｇ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  Ｖｏｌ．１４，  １２４６−１２５１  （１９９６）を参照）。【０００４】
翻訳後、成熟型ＧＦＰへと変換されるメカニズム、すなわち、αヘリックス中に存在している、ＳＹＧから、蛍光団：ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造の形成は、下記の機構によると推定されている。【０００５】
・翻訳後、フォールディング；（歪んだ配置への移行）【０００６】
【化１】
0004719226.tif 000002
・環化、脱水過程【０００７】
【化２】
0004719226.tif 000003
・酸化過程：p-hydroxybenzylideneimidazolinone構造の完成【０００８】
【化３】
0004719226.tif 000004
最終的に、蛍光団：ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造は、下記の非イオン化型とイオン化型の間で平衡状態となっている。【０００９】
・p-hydroxybenzylideneimidazolinone構造におけるイオン化型と、非イオン化型の平衡【００１０】
【化４】
0004719226.tif 000005
従って、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の野生型ＧＦＰは、励起スペクトル上において、非イオン化型における吸収に相当する、極大吸収波長３９５〜３９７ｎｍのピークと、イオン化型における吸収に相当する、極大吸収波長４７０〜４７５ｎｍのピークとが観測される。一方、蛍光スペクトルにおいては、イオン化型における蛍光に相当する、極大蛍光波長５０４ｎｍのピークが測定される。発色団に含まれる、“ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌ”の六員環と、“ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ”の五員環とが、“ｉｄｅｎｅ”構造で連結されており、全体が平面的な配置を有すると、π電子の共役系が拡がり、最低の電子的励起状態と基底状態間のエネルギー差は、低下する。具体的には、イオン化型構造では、上記の互変異性型の超共役が存在するため、全体が平面的な配置を有している。一方、非イオン化型構造では、“ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌ”の六員環は、“ｉｄｅｎｅ”構造と“ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ”の五員環の存在する平面から、僅かに傾くと、両者のπ電子の共役系は、分断されており、主に、“ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌ”の六員環に局在した基底状態からの光吸収が観測される。【００１１】
また、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の野生型ＧＦＰに対して、そのアミノ酸配列を改変して、蛍光波長を変える試みが多数報告されている。具体的には、蛍光団となるπ電子の共役系に影響を及ぼす変異を導入し、得られる蛍光を、本来の緑色から、ブルー・シフトさせ、青色、青緑色とする、レッド・シフトさせ、黄色とする手法が報告されている。【００１２】
蛍光団を構成する６５番〜６７番目のＳＹＧ中、６５番目のＳｅｒをＴｈｒへと変異を施した、Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰでは、ＴＹＧが同様に発色団を形成した際、非イオン化型とイオン化型の間での平衡は、イオン化型へ傾く。その結果、Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰでは、励起スペクトル上において、主に、イオン化型における吸収に相当する、極大吸収波長４８９〜４９０ｎｍのピークが観測される。また、蛍光スペクトルにおいては、イオン化型における蛍光に相当する、極大蛍光波長５１０〜５１１ｎｍのピークが測定され、野生型ＧＦＰの蛍光よりも、若干レッド・シフトを示す。【００１３】
蛍光団を構成する６５番〜６７番目のＳＹＧに変異を施さなくとも、Ｔｙｒのフェノール性ヒドロキシル基のイオン化を促進する手段として、天然の立体構造へとフォールディングした際、発光団のｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造の近傍に存在する、Ｃ末端側の２本のβ鎖（β１０、β１１）中に存在する、例えば、２２２番目のＧｌｕをＧｌｙへ置換する変異を施す方法も報告されている。すなわち、プロトン供与体として機能する、２２２番目のＧｌｕの側鎖上のカルボキシル基を除くと、それをＴｙｒのフェノール性ヒドロキシル基が補うため、結果的に、Ｔｙｒのフェノール性ヒドロキシル基のイオン化が促進される。【００１４】
上記のＧＦＰの発光団を構成する、ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造中、“ｉｄｅｎｅ”構造と“ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ”の五員環部分は、基本的に同じであるが、６６番目のＴｙｒの側鎖に由来するｐ−ヒドロキシファニル基（フェノール環）に代えて、Ｈｉｓ由来のイミダゾール環、あるいは、Ｔｒｐ由来のインドール環に置き換え、野生型ＧＦＰの蛍光波長を変える試みもなされている。【００１５】
例えば、６６番目のＴｙｒをＨｉｓへと変異を施した、Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰでは、その蛍光は、野生型ＧＦＰの緑色蛍光に対して、ブルー・シフトを起こし、極大波長４４７ｎｍの青色蛍光を示すことが報告されている。このＳＨＧから形成される蛍光団を有するＹ６６Ｈ−ＧＦＰは、ＢＦＰ（Ｂｌｅｕ  Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）とも称されている。このＢＦＰ中の発光団は、Ｔｙｒ由来のｐ−ヒドロキシファニル基（フェノール環）が、Ｈｉｓ由来のイミダゾール環へと変換され、１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−４−ｙｌ−ｍｅｔｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造を有している。なお、１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−４−ｙｌ−ｍｅｔｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造は、下記のようなイオン化型と非イオン化型の間で平衡状態となっていると可能もある。【００１６】
・1H-imidazol-4-yl-metylideneimidazolinone構造におけるイオン化型と、非イオン化型の平衡【００１７】
【化５】
0004719226.tif 000006
何れにしても、π電子の共役系の差違に起因して、励起スペクトル上においては、極大吸収波長３８３ｎｍのピーク、一方、蛍光スペクトルにおいては、極大蛍光波長４４７ｎｍのピークが測定され、それぞれブルー・シフトを示している。【００１８】
一方、６６番目のＴｙｒをＴｒｐへと変異を施した、Ｙ６６Ｗ−ＧＦＰでは、その蛍光は、野生型ＧＦＰの緑色蛍光に対して、ブルー・シフトを起こし、極大波長４８５ｎｍの青緑色蛍光を示すことが報告されている。このＳＷＧから形成される蛍光団を有するＹ６６Ｗ−ＧＦＰは、ＣＦＰ（Ｃｙａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）とも称されている。このＣＦＰ中の発光団は、Ｔｙｒ由来のｐ−ヒドロキシファニル基（フェノール環）が、Ｔｒｐ由来のインドール環へと変換され、ｉｎｄｏｌｅ−３−ｙｌ−ｍｅｔｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造を有している。【００１９】
・indole-3-yl-metylideneimidazolinone構造【００２０】
【化６】
0004719226.tif 000007
なお、前記ＣＦＰの蛍光スペクトルは、エネルギー差が小さな、二つの蛍光ピークが重ね合わせた形態を示し、対応する励起スペクトル上にも、エネルギー差が小さな、二つのピークが重ね合わせた形態を示している。この二種のピークを与える要因として、二つの蛍光状態（光励起状態）が共存しており、この二つの蛍光状態（光励起状態）の間で、何らかの平衡関係が存在している可能性が示唆されている。【００２１】
これらＢＦＰ、ＣＦＰにおいては、蛍光団を形成する６６番目のＴｙｒを、他の芳香族アミノ酸残で置換することにより、π電子の共役系自体を構成する芳香環基を変更する手法に加えて、複数の芳香環基を、その重ね合わせ、両者のπ電子の重なりを介した、相互作用（π−π−スタッキング）により、蛍光波長をレッド・シフトさせる手法も報告されている。具体的には、天然の立体構造へとフォールディングした際、発光団のｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造の近傍に存在する、Ｃ末端側のβ鎖（β１０）中に存在する、２０３番目のＴｈｒを、芳香族アミノ酸残基へ置換すると、ｉｎｄｏｌｅ−３−ｙｌ−ｍｅｔｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造のπ電子の共役系、特に、Ｔｙｒ由来のｐ−ヒドロキシファニル基（フェノール環）部分に対して、該芳香族アミノ酸残基に由来する芳香環基が、重なりを生じる状態となる。例えば、２０３番目のＴｈｒをＴｙｒへと変異を施した、改変体は、励起スペクトル上においては、極大吸収波長５１６ｎｍ付近のピーク、一方、蛍光スペクトルにおいては、極大蛍光波長５２９ｎｍ付近のピークが測定され、それぞれレッド・シフトを示している。この種のπ−π−スタッキングに起因して、黄色蛍光を示す改変体タンパク質は、ＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）と命名されている（文献５：Ｃｕｂｉｔｔ，  Ａ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  Ｖｏｌ．２０、  ４４８−４５５  （１９９５）を参照）。【００２２】
上述するＡ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰと、その改変体タンパク質とは別に、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｔｒｉａｔａ由来の蛍光タンパク質が、知られており、この蛍光タンパク質は、励起スペクトル上においては、極大吸収波長５５８ｎｍ付近のピーク、一方、蛍光スペクトルにおいては、極大蛍光波長５８３ｎｍ付近のピークが測定される。すなわち、赤色蛍光を示す蛍光タンパク質であり、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｔｒｉａｔａ由来の赤色蛍光タンパク質（Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）の意味で、ＤｓＲＦＰと称されている。このＤｓＲＦＰの蛍光団は、ＱＹＧで形成されている。このＤｓＲＦＰにおいては、ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造に加えて、６５番目のＧｌｕのＮ末側のアミド結合を含めた領域が蛍光団として機能する結果、上記の大きなレッド・シフトが達成されている（文献６：Ｍａｔｚ，  Ｍ．Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  Ｖｏｌ．１７，  ９６９−９７３  （１９９９）；文献７：Ｖｅｒｋｈｕｓｈａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  Ｖｏｌ．２２，  ２８９−２９６  （２００４）を参照）。
【非特許文献１】Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，  Ｊ．  Ｇ．Ｈ．  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．３００，  ８７−９１  （２００３）
【非特許文献２】Ｔｓｉｅｎ，  Ｒ．Ｙ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．６７，  ５０９−５４４  （１９９８）を参照
【非特許文献３】Ｏｒｍｏ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２７３，  １３９２−１３９５  （１９９６）
【非特許文献４】Ｙａｎｇ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  Ｖｏｌ．１４，  １２４６−１２５１  （１９９６）
【非特許文献５】Ｃｕｂｉｔｔ，  Ａ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  Ｖｏｌ．２０、  ４４８−４５５  （１９９５）
【非特許文献６】Ｍａｔｚ，  Ｍ．Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  Ｖｏｌ．１７，  ９６９−９７３  （１９９９）
【非特許文献７】Ｖｅｒｋｈｕｓｈａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  Ｖｏｌ．２２，  ２８９−２９６  （２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
更には、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰ以外にも、刺胞動物門（Ｃｎｉｄａｒｉａ）のヒドロ虫類（ｃｌａｓｓ  Ｈｙｄｒｏｚｏａ）からＧＦＰ様タンパク質のクローニングされており、更には、刺胞動物門（Ｃｎｉｄａｒｉａ）の花虫類（ｃｌａｓｓ  Ａｎｔｈｏｚｏａ）からも、ＧＦＰ様タンパク質のクローニングされている。これら刺胞動物門（Ｃｎiｄａｒｉａ）の花虫類（ｃｌａｓｓ  Ａｎｔｈｏｚｏａ）で発見されているＧＦＰ様タンパク質に関して、生物進化的には、共通する起源を有する、蛍光性タンパク質ファミリーを構成するであろうことが報告されている（文献８：Ｙ．Ａ．  Ｌａｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ｖｏｌ．９９，  ４２５６−４２６１  （２００２）を参照）。【００２４】
加えて、刺胞動物門（Ｃｎｉｄａｒｉａ）以外に、節足動物門（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ  ｐｈｙｌｕｍ）、大顎類（Ｍａｎｄｉｂｕｌａｔａ  ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ）、甲殻類（Ｃｒｕｓｔａｃｅａ  ｃｌａｓｓ）、橈脚類（カイアシ類：Ｃｏｐｅｐｏｄａ  ｓｕｂｃｌａｓｓ）に属する、橈脚類の数種が緑色蛍光を発する蛍光タンパク質を産出することが報告されている。例えば、橈脚類（カイアシ類：Ｃｏｐｒｐｏｄａ  ｓｕｂｃｌａｓｓ）中、カラヌス類（Ｃａｌａｎｏｉｄａ  ｏｒｄｅｒ）に分類されるＰｏｎｔｅｌｌｉｄａｅ科（Ｐｏｎｔｅｌｌｉｄａｅ  ｆａｍｉｌｙ）に属する、Ｐｏｎｔｅｌｌｉｎａ  ｐｌｕｔｅｌｌｉｎａ、Ｌａｂｉｄｏｃｅｒａ  ａｅｓｔｉｖａ、Ｐｏｎｔｅｌｌａ  ｍｅａｄｉ、ならびに、未同定の一種、合計４種は、ＧＦＰ様の蛍光タンパク質を保持することが報告されている（文献９：ＳＨＡＧＩＮ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．，  （２００４），  Ｖｏｌ．２１，  Ｎｏ．５，  ｐｐ．  ８４１−８５０を参照）。また、本発明者らも、橈脚類（カイアシ類：Ｃｏｐｅｐｏｄａ  ｓｕｂｃｌａｓｓ）中、カラヌス類（Ｃａｌａｎｏｉｄａ  ｏｒｄｅｒ）に分類されるＡｅｔｉｄｅｉｄａｅ科（Ａｅｔｉｄｅｉｄａｅ  ｆａｍｉｌｙ）に属する、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉに由来するＧＦＰ様の蛍光タンパク質（ＣｐＹＧＦＰ）を見出している（文献１０：国際公開第２００５／０９５５９９号パンフレット、または米国特許出願公開２００５／０２２１３３８号明細書）。【００２５】
これらの橈脚類（ｃｏｐｅｐｏｄ）由来のＧＦＰ様の蛍光タンパク質は、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰとは、アミノ酸配列の相同性は乏しく、進化の過程で、アミノ酸配列の変異が多数集積されていると推定されている。しかしながら、二次構造の推定から、これら橈脚類（ｃｏｐｅｐｏｄ）由来のＧＦＰ様の蛍光タンパク質は、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰ、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｔｒｉａｔａ由来のＤｓＲＦＰと同様に、１１個のβ鎖と、蛍光団の構成に関与するＧＹＧを内在するαヘリックス一本の存在が予測される。また、その三次構造も、全体形状は、“βｃａｎ”と称されているバレル形状を共通に有していると予測される。【００２６】
しかしながら、これらの橈脚類（ｃｏｐｅｐｏｄ）由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質の有する三次元構造、特には、成熟型蛍光タンパク質中において形成されている蛍光団とその周囲の詳細な構造は解明されてなく、アミノ酸配列を改変して、その蛍光波長を変化させる手段として、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰに対して適用された手法が同様に適用可能か、否かを判断する根拠がなかった。更には、アミノ酸配列を改変して、その蛍光波長を変化させる手段として、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰに対して適用された手法以外に、橈脚類（ｃｏｐｅｐｏｄ）由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質の発する蛍光波長を変化する際、有効な新たな手法が存在するか否かを判断する根拠がなかった。【００２７】
本発明は、前記の課題を解決するもので、本発明の目的は、橈脚類（ｃｏｐｅｐｏｄ）由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質の有する三次元構造を新たに解析し、解明された三次元構造に基づき、橈脚類（ｃｏｐｅｐｏｄ）由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質が発する蛍光波長を決定する構造的な要因を特定し、この構造的な要因に関与するアミノ酸残基を改変し、野生型蛍光タンパク質と遜色の組換え発現効率を保持しつつ、一方、蛍光波長を変化させる方法、ならびに、かかる方法を適用して得られる改変蛍光タンパク質を提供することにある。特には、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉに由来するＧＦＰ様蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ、あるいは、Ｐｏｎｔｅｌｌｉｎａ  ｐｌｕｔｅｌｌｉｎａ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質：ｐｐｌｕＧＦＰ２（あるいは、商品名“Ｃｏｐ−Ｇｒｅｅｎ”）を基礎に、その野生型タンパク質の有するアミノ酸配列を改変して、野生型蛍光タンパク質と遜色の組換え発現効率を保持し、一方、蛍光波長を変化させる方法、ならびに、かかる方法を適用して得られる改変体タンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
発明者らは、前記の課題を解決すべく、先ず、橈脚類（ｃｏｐｅｐｏｄ）由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質の有する三次元構造を新たに解析し、解明された三次元構造に基づき、橈脚類（ｃｏｐｅｐｏｄ）由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質が発する蛍光波長を決定する構造的な要因の特定を進めた。特に、本発明者らにより見出されたＣｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰについて、野生型アミノ酸配列を有し、蛍光団を形成する内部トリペプチド部位「ＧＹＧ」の環化と、その後の酸化を経て、蛍光特性を有する成熟型蛍光タンパク質を宿主大腸菌中で組換え発現し、精製済みＣｐＹＧＦＰ評品を調製した。この精製済みＣｐＹＧＦＰ評品を用いて、結晶化を行い、得られた結晶について、Ｘ線結晶構造解析を行って、該結晶中におけるＣｐＹＧＦＰの三次元構造を決定した。決定されたＣｐＹＧＦＰの三次元構造は、図３に示すように、１１個のβ鎖と、蛍光団の構成に関与するＧＹＧを内在するαヘリックス（α１−ヘリックス）と他の一本の短いαヘリックス（α２−ヘリックス）が、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰ、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｔｒｉａｔａ由来のＤｓＲＦＰが共通に示す全体形状、すなわち、“βｃａｎ”と称されているバレル形状を構成している。また、バレルの内部に位置するαヘリックス中に内在するＧＹＧは、環化と、その後の酸化を経て、実際に、下記のようなｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造の蛍光団を形成している。【００２９】
・p-hydroxybenzylideneimidazolinone構造におけるイオン化型と、非イオン化型の平衡【００３０】
【化７】
0004719226.tif 000008
この蛍光団の近傍に存在するアミノ酸残基を含む、局所的な立体配置は、図４に示すものとなっていることが判明した。野生型のＣｐＹＧＦＰにおいても、蛍光に関与する形状は、上述するイオン化型形状であり、このイオン化型の安定化には、β鎖（β６）中に存在する、１３６番目のＴｈｒが何らかの寄与を有することが予測される。加えて、野生型のＣｐＹＧＦＰにおいては、ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造の蛍光団中、Ｔｙｒ由来のｐ−ヒドロキシファニル基（フェノール環）部分に対して、５２番目のＨｉｓ側鎖のイミダゾール環が、重ね合わせた位置に存在し、両者のπ電子の重なりを介した、相互作用（π−π−スタッキング）により、蛍光波長をレッド・シフトさせる機能を有すると予測される。【００３１】
以上の二点は、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰの三次元構造と比較した際、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＣｐＹＧＦＰの三次元構造に特徴的な、蛍光団近傍の構造上の相違点であるという知見に基づき、実際に、５２番目のＨｉｓ側鎖のイミダゾール環に代えて、種々のアミノ酸残基に置換した改変体タンパク質を創製し、その蛍光特性を対比した。その対比結果から、下記のような効果を示すと考察される。【００３２】
すなわち、５２番目のアミノ酸残基として、Ｈｉｓ側鎖のイミダゾール環、Ｐｈｅ側鎖のベンゼン環、Ｔｙｒ側鎖のｐ−ヒドロキシファニル基（フェノール環）、Ｔｒｐ側鎖のインドール環は、いずれも、ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造の蛍光団中、Ｔｙｒ由来のｐ−ヒドロキシファニル基（フェノール環）部分に対して、π−π−スタッキングの効果をもたらし、蛍光波長をレッド・シフトさせる機能を有する。一方、π電子共役系を有していない、Ａｌａ（側鎖：ＣＨ３−）、Ｖａｌ（側鎖：ＣＨ３−ＣＨ（ＣＨ３）−）、Ｉｌｅ（側鎖：Ｃ２Ｈ５−ＣＨ（ＣＨ３）−）、Ｌｅｕ（側鎖：ＣＨ３−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−）、Ｇｌｙ（側鎖無し）、Ｃｙｓ（側鎖：ＨＳ−ＣＨ２−）、Ｍｅｔ（ＣＨ３−Ｓ−Ｃ２Ｈ４−）、Ｓｅｒ（側鎖：ＨＯ−ＣＨ２−）、Ｔｈｒ（側鎖：ＣＨ３−ＣＨ（ＯＨ）−）で置換した際には、対応する相互作用は無く、Ｈｉｓ側鎖のイミダゾール環に起因するレッド・シフトの効果が失われる。その他、プロトン供与能を有する、Ａｓｐ（側鎖：ＨＯＯＣ−ＣＨ２−）、Ｇｌｕ（側鎖：ＨＯＯＣ−Ｃ２Ｈ４−）で置換した際には、Ｔｙｒ側鎖のｐ−ヒドロキシファニル基のイオン化比率を低下させる効果を示し、結果的に非イオン化型の比率が増し、例えば、励起スペクトル上に、非イオン化型に由来する、４００ｎｍ近傍のピークが付加され、一方、見掛けの蛍光強度の低下が引き起こされる。【００３３】
一方、上記のＡ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰと同様に、野生型のＣｐＹＧＦＰにおいても、その蛍光団を形成する「ＧＹＧ」のうち、Ｔｙｒを、Ｈｉｓ、Ｔｒｐにより置換すると、形成される蛍光団自体のπ電子共役系の差違に起因する蛍光波長のシフトが生じると予想される。その際、Ｔｙｒを、Ｔｒｐへ置換する際、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰに対する、ＣＦＰで見出されるブルー・シフトと比較して、ＣｐＹＧＦＰにおける改変体で見出されるブルー・シフトは、顕著に大きく、その蛍光は、青緑色の波長域を超え、青色の波長域に達することを見出した。【００３４】
以上の知見に基づく、本発明者らは、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＣｐＹＧＦＰの三次元構造に基づき、該ＣｐＹＧＦＰのアミノ酸配列に変異を施し、得られる改変体タンパク質の発する蛍光の極大蛍光波長を変化させる手法を見出し、本発明を完成するに至った。加えて、図１に示すように、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＣｐＹＧＦＰと、Ｐｏｎｔｅｌｌｉｎａ  ｐｌｕｔｅｌｌｉｎａ由来のｐｐｌｕＧＦＰ２（あるいは、商品名“Ｃｏｐ−Ｇｒｅｅｎ”）とは、そのアミノ酸配列は高い相同性を示す。従って、その三次元構造中、この蛍光団の近傍に存在するアミノ酸残基を含む、局所的な立体配置、特に、５２番目のＨｉｓと蛍光団との相対的配置は、極めて高い類似性を示すと判断でき、本発明の手段は、Ｐｏｎｔｅｌｌｉｎａ  ｐｌｕｔｅｌｌｉｎａ由来のｐｐｌｕＧＦＰ２（あるいは、商品名“Ｃｏｐ−Ｇｒｅｅｎ”）に対しても、有効であることに想到した。【００３５】
すなわち、本発明の第一の形態にかかる改変蛍光タンパク質の一つは、
Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰの改変蛍光タンパク質であって、
該ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列（配列番号：１）中、
0004719226.tif 000009
その５２番目のアミノ酸Ｈｉｓを、
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐからなる芳香族アミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、レッド・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である；
該ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５２番目のアミノ酸Ｈｉｓを、
Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である；あるいは、
該ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５２番目のアミノ酸Ｈｉｓを、
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である
のいずれかの改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする改変蛍光タンパク質である。【００３６】
前記一群のＣｐＹＧＦＰの改変蛍光タンパク質中、好ましい一例は、
前記ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５２番目のアミノ酸Ｈｉｓを、Ｐｈｅで置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、レッド・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ−Ｈ５２Ｆである。【００３７】
前記一群のＣｐＹＧＦＰの改変蛍光タンパク質中、好ましい一例は、
前記ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５２番目のアミノ酸Ｈｉｓを、Ｔｈｒで置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ−Ｈ５２Ｔである。【００３８】
前記一群のＣｐＹＧＦＰの改変蛍光タンパク質中、好ましい一例は、
前記ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５２番目のアミノ酸Ｈｉｓを、Ａｓｐで置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ−Ｈ５２Ｄである。【００３９】
本発明の第一の形態にかかる改変蛍光タンパク質の他一つは、
Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰと高い相同性を有するＰｏｎｔｅｌｌｉｎａ  ｐｌｕｔｅｌｌｉｎａ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ｐｐｌｕＧＦＰ２の改変蛍光タンパク質であって、
前記ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５２番目のアミノ酸Ｈｉｓに対応する、該ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列（配列番号：４）中、
0004719226.tif 000010
その５４番目のアミノ酸Ｈｉｓを、
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐからなる芳香族アミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ｐｐｌｕＧＦＰ２が発する蛍光のピーク波長と比較し、レッド・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である；
該ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列中、５４番目のアミノ酸Ｈｉｓを、
Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ｐｐｌｕＧＦＰ２が発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である；あるいは、
該ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列中、５４番目のアミノ酸Ｈｉｓを、
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ｐｐｌｕＧＦＰ２が発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である
のいずれかであることを特徴とする改変蛍光タンパク質である。【００４０】
前記一群のｐｐｌｕＧＦＰ２の改変蛍光タンパク質中、好ましい一例は、
前記ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列中、５４番目のアミノ酸Ｈｉｓを、Ｐｈｅで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質である。【００４１】
前記一群のｐｐｌｕＧＦＰ２の改変蛍光タンパク質中、好ましい一例は、
前記ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列中、５４番目のアミノ酸Ｈｉｓを、Ｔｈｒで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質である。【００４２】
前記一群のｐｐｌｕＧＦＰ２の改変蛍光タンパク質中、好ましい一例は、
前記ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列中、５４番目のアミノ酸Ｈｉｓを、Ａｓｐで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質である。【００４３】
一方、本発明の第二の形態にかかる改変蛍光タンパク質の一つは、
Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰの改変蛍光タンパク質であって、
該ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列（配列番号：１）中、
0004719226.tif 000011
その５６番目のアミノ酸Ｔｙｒを、
Ｔｒｐで置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗである；
該ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５６番目のアミノ酸Ｔｙｒを、Ｔｒｐで置換し、
さらに、１９４番目のアミノ酸Ｖａｌを、Ｓｅｒで置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓである；あるいは、
該ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５６番目のアミノ酸Ｔｙｒを、Ｔｒｐで置換し、
さらに、１９４番目のアミノ酸Ｖａｌを、Ｓｅｒで、１３６番目のアミノ酸Ｔｈｒを、Ａｌａで置換されているアミノ酸配列を有し、該ＣｐＹＧＦＰが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ，Ｔ１３６Ａである
のいずれかの改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする改変蛍光タンパク質である。【００４４】
本発明の第二の形態にかかる改変蛍光タンパク質の他の一つは、
Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰと高い相同性を有するＰｏｎｔｅｌｌｉｎａ  ｐｌｕｔｅｌｌｉｎａ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ｐｐｌｕＧＦＰ２の改変蛍光タンパク質であって、
前記ＣｐＹＧＦＰが有する完全長アミノ酸配列中、５６番目のアミノ酸Ｔｙｒに対応する、該ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列（配列番号：４）中、
0004719226.tif 000012
その５８番目のアミノ酸Ｔｙｒを、Ｔｒｐで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質；
該ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列中、５８番目のアミノ酸Ｔｙｒを、Ｔｒｐで置換し、
さらに、１９７番目のアミノ酸Ｖａｌを、Ｓｅｒで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質；あるいは
該ｐｐｌｕＧＦＰ２が有する完全長アミノ酸配列中、５８番目のアミノ酸Ｔｙｒを、Ｔｒｐで置換し、
さらに、１９７番目のアミノ酸Ｖａｌを、Ｓｅｒで、１３８番目のアミノ酸Ｔｈｒを、Ａｌａで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質
のいずれかの改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする改変蛍光タンパク質である。
【発明の効果】
【００４５】
本発明の第一の形態にかかる蛍光タンパク質の蛍光波長を変える方法を適用して得られる改変蛍光タンパク質は、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰ、Ｐｏｎｔｅｌｌｉｎａ  ｐｌｕｔｅｌｌｉｎａ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ｐｐｌｕＧＦＰ２で代表される、Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の野生型ＧＦＰ様蛍光タンパク質の蛍光団を構成する“ＸＹＧ”中のＴｙｒを、他の芳香性環基を有するアミノ酸残基、ＨｉｓまたはＴｒｐへ置換する手段に代えて、該Ｔｙｒの位置をｎ番目とするとき、（ｎ−４）番目に位置するアミノ酸残基を、芳香性環基を有するアミノ酸残基とすることで、該Ｔｙｒ側鎖上のｐ−ヒドロキシフェニル基（フェノール環）と、前記（ｎ−４）番目に位置するアミノ酸残基側鎖上の芳香性環基とを“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”させることで、改変蛍光タンパク質が発する蛍光波長を、野生型蛍光タンパク質の発する蛍光波長と比較して、長波長側へシフトさせることができる。逆に、該Ｔｙｒの位置をｎ番目とするとき、（ｎ−４）番目に位置するアミノ酸残基を、芳香性環基を持たないアミノ酸残基とすることで、前記“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”に起因する効果を排除することで、改変蛍光タンパク質が発する蛍光波長を、野生型蛍光タンパク質の発する蛍光波長と比較して、短波長側へシフトさせることもできる。この本発明にかかる手法を用いると、野生型蛍光タンパク質の蛍光団を構成する“ＸＹＧ”への変異はなされないため、環化、その後の酸化を経由する蛍光団の形成過程は、かかる改変蛍光タンパク質においても、実質的に同等のものとなる。【００４６】
また、本発明の第二の形態にかかる蛍光タンパク質の蛍光波長を変える方法を適用して得られる改変蛍光タンパク質は、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰ、Ｐｏｎｔｅｌｌｉｎａ  ｐｌｕｔｅｌｌｉｎａ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ｐｐｌｕＧＦＰ２で代表される、Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の野生型ＧＦＰ様蛍光タンパク質の蛍光団を構成する“ＸＹＧ”中のＴｙｒを、Ｔｒｐで置き換えることにより、改変蛍光タンパク質が発する蛍光波長を、野生型蛍光タンパク質の発する蛍光波長と比較して、短波長側へシフトさせることができる。特に、本発明の第二の形態にかかる蛍光タンパク質の蛍光波長を変える方法を、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰ、Ｐｏｎｔｅｌｌｉｎａ  ｐｌｕｔｅｌｌｉｎａ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ｐｐｌｕＧＦＰ２の改変に適用すると、実質的に単一のピーク波長を示す蛍光スペクトルを示す、青色の色調を示す改変蛍光タンパク質を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰと、Ｐｏｎｔｅｌｌｉｎａ  ｐｌｕｔｅｌｌｉｎａ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ｐｐｌｕＧＦＰ２（商品名“Ｃｏｐ−Ｇｒｅｅｎ”）のアミノ酸配列をアラインした結果を示す。該アミノ酸配列のアラインメントは、両者間の相同性を示す。
【図２】図２は、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰの蛍光スペクトルと、励起スペクトルを示す図である。
【図３】図３は、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰの結晶構造を示す図であり、結晶の単位格子中に二量体として存在するＣｐＹＧＦＰの全体構造をリボンモデル表示したステレオ図である。
【図４】図４は、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰの「ＧＹＧ」から形成されるｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造の蛍光団と、その近傍に位置するアミノ酸残基；Ｈｉｓ５２、Ｔｙｒ５９、Ａｒｇ８５、Ｔｈｒ１３６、Ａｓｎ１７０、Ｇｌｕ２０７の側鎖の配置、ならびに、推定される水素結合、水素結合を介して、固定されている水分子の酸素原子の位置を示す部分構造図である。
【図５】図５は、解析されたＣｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰの結晶構造と、既に報告されているＤｓＲｅｄの結晶構造、ａｑＧＦＰの結晶構造との比較に基づき、対応する二次構造を構成するアミノ酸配列のアライメントを行った結果を示す。該アミノ酸配列のアライメント中、ＣｐＹＧＦＰの結晶構造において特定された、各二次構造の部分配列を、配列下に付記する。
【図６】図６は、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰの蛍光団を形成する「ＧＹＧ」を、「ＧＷＧ」で置換した改変蛍光タンパク質；ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ（ＣｐＹＧＦＰ  ｍｕｔａｎａｔ１）、ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ，Ｔ１３６Ａ（ＣｐＹＧＦＰ  ｍｕｔａｎａｔ２）のアミノ酸配列を示す図である。
【図７−１】図７−１は、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰと、改変蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰ−Ｈ５２Ｔの蛍光スペクトル、ならびに励起スペクトルの形状を対比して示す図である。
【図７−２】図７−２は、改変蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰ−Ｈ５２Ｄと、ＣｐＹＧＦＰ−Ｈ５２Ｆの蛍光スペクトル、ならびに励起スペクトルの形状を対比して示す図である。
【図８】図８は、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰの蛍光団を構成する「ＧＹＧ」を、「ＧＷＧ」へと変換した改変蛍光タンパク質；ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓの蛍光スペクトル、ならびに励起スペクトルの形状を示す図である。
【図９】図９は、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰの蛍光団を構成する「ＧＹＧ」を、「ＧＷＧ」へと変換した改変蛍光タンパク質；ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ，Ｔ１３６Ａの蛍光スペクトル、ならびに励起スペクトルの形状を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
以下に、本発明をより詳しく説明する。【００４９】
本発明の第一の形態にかかるＧＦＰ様の蛍光タンパク質の蛍光波長を変える方法は、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉに由来するＧＦＰ様蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ、あるいは、Ｐｏｎｔｅｌｌｉｎａ  ｐｌｕｔｅｌｌｉｎａ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質：ｐｐｌｕＧＦＰ２を基礎に、これらの野生型ＧＦＰ様蛍光タンパク質が発する蛍光の色調、すなわち、蛍光スペクトル上において観測される極大蛍光波長（蛍光ピーク波長）を、長波長側へシフト（レッド・シフト）、あるいは、短波長側へシフト（ブルー・シフト）させる改変蛍光タンパク質を創製する方法の一つである。【００５０】
具体的には、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉに由来するＧＦＰ様蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰの結晶構造を新たに解析した結果、該ＧＦＰ様蛍光タンパク質中に存在する蛍光団は、“ＧＹＧ”の環化、脱水過程を介して形成されるｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造であることが確認された。また、該蛍光団：ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造に含まれる、Ｔｙｒ５６に由来するｐ−ヒドロキシフェニル基（フェノール環）に対して、Ｈｉｓ５２の側鎖上のイミダゾール環が、“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”が可能な配置を有していることを見出した。【００５１】
本発明の第一の形態においては、この構造上の特徴を利用し、Ｈｉｓ５２に由来するイミダゾール環を、対応する配置を採ることが可能な芳香族アミノ酸；Ｐｈｅに由来するベンゼン環、Ｔｙｒに由来するフェノール環（ｐ−ヒドロキシフェニル基）、Ｔｒｐに由来するインドール環で置き換え、“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”に起因する、π電子共役系の相互作用を増すことで、蛍光状態の励起エネルギーをより低下させることで、かかる改変蛍光タンパク質の極大蛍光波長（蛍光ピーク波長）は、野生型ＣｐＹＧＦＰの極大蛍光波長（蛍光ピーク波長）より、長波長側へシフト（レッド・シフト）されている。【００５２】
あるいは、イミダゾール環を有するＨｉｓ５２を、対応する配置を採ることが可能な、π電子共役系を有していない鎖式構造アミノ酸；Ａｌａ（側鎖：ＣＨ３−）、Ｖａｌ（側鎖：ＣＨ３−ＣＨ（ＣＨ３）−）、Ｉｌｅ（側鎖：Ｃ２Ｈ５−ＣＨ（ＣＨ３）−）、Ｌｅｕ（側鎖：ＣＨ３−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−）、Ｇｌｙ（側鎖無し）、Ｃｙｓ（側鎖：ＨＳ−ＣＨ２−）、Ｍｅｔ（ＣＨ３−Ｓ−Ｃ２Ｈ４−）、Ｓｅｒ（側鎖：ＨＯ−ＣＨ２−）、Ｔｈｒ（側鎖：ＣＨ３−ＣＨ（ＯＨ）−）で置き換え、“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”に起因する相互作用を除くことで、結果的に、かかる改変蛍光タンパク質の極大蛍光波長（蛍光ピーク波長）は、野生型ＣｐＹＧＦＰの極大蛍光波長（蛍光ピーク波長）より、短波長側へシフト（レッド・シフト）されている。【００５３】
加えて、イミダゾール環を有するＨｉｓ５２を、対応する配置を採ることが可能な、π電子共役系を有していないアミノ酸；Ａｓｐ（側鎖：−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）、Ｇｌｕ（側鎖：−Ｃ２Ｈ４−ＣＯＯＨ）、Ａｓｎ（側鎖：−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２）、Ｇｌｎ（側鎖：−Ｃ２Ｈ４−ＣＯＮＨ２）ことで、結果的に、かかる改変蛍光タンパク質の極大蛍光波長（蛍光ピーク波長）は、野生型ＣｐＹＧＦＰの極大蛍光波長（蛍光ピーク波長）より、短波長側へシフト（ブルー・シフト）されている。【００５４】
その際、Ｈｉｓ５２を置き換えた際、その側鎖がイミダゾール環と同等のサイズを有するものは、“ＧＹＧ”の環化過程における構造変化に際して、立体障害を引き起こすことが無く、より好適なものとなる。例えば、Ｈｉｓ５２を置き換えた際、芳香族アミノ酸のうち、Ｐｈｅのベンゼン環は、Ｈｉｓのイミダゾール環と同等のサイズであり、より好適なものとなる。【００５５】
また、図５に示す、結晶構造に基づき、二次構造を構成する部分アミノ酸配列をアライメントした結果から、かかる蛍光団を構成する「ＸＹＧ」は、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰ、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｔｒｉａｔａ由来のＤｓＲＦＰ、ならびに、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＣｐＹＧＦＰのいずれでも、対応する長さのαヘリックス様の二次構造（α１−ヘリックス）含まれている。その際、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＣｐＹＧＦＰにおける、Ｈｉｓ５２に対応するアミノ酸位置には、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰ：ａｑＧＦＰでは、Ｔｈｒが存在している。この点をも考慮すると、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＣｐＹＧＦＰにおける、Ｈｉｓ５２をπ電子共役系を有していない鎖式構造アミノ酸で置換し、改変蛍光タンパク質の極大蛍光波長（蛍光ピーク波長）を、野生型ＣｐＹＧＦＰの極大蛍光波長（蛍光ピーク波長）より、短波長側へシフト（ブルー・シフト）させる際、Ｔｈｒへの置換はより好ましいものと一つと判断される。【００５６】
一方、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＣｐＹＧＦＰにおける、Ｈｉｓ５２を、プロトン供与能を有する、Ａｓｐ（側鎖：−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）、Ｇｌｕ（側鎖：−Ｃ２Ｈ４−ＣＯＯＨ）へと置換すると、蛍光団のｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造において、イオン化型と、非イオン化型との平衡は、非イオン化型へ傾くため、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＣｐＹＧＦＰと比較して、ｐＨの低下に付随する、蛍光強度の低下傾向は、より抑制されると考えられる。この観点では、Ｈｉｓ５２を、プロトン供与能を有する、Ａｓｐ（側鎖：−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）、Ｇｌｕ（側鎖：−Ｃ２Ｈ４−ＣＯＯＨ）へと置換した改変蛍光タンパク質は、極大蛍光波長（蛍光ピーク波長）より、短波長側へシフト（ブルー・シフト）させると同時に、ｐＨの低下に付随する、蛍光強度の低下傾向を更に抑制する効果を併せ持ち、好適なものの一つとなる。【００５７】
図１に示すように、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＣｐＹＧＦＰと、Ｐｏｎｔｅｌｌｉｎａ  ｐｌｕｔｅｌｌｉｎａ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質：ｐｐｌｕＧＦＰ２とは、一次元構造（アミノ酸配列）を比較すると、相当に高い類似性を有している。加えて、今回、新たに解析された野生型ＣｐＹＧＦＰの結晶構造により、特定された二次構造を形成する部分アミノ酸配列に着目すると、両者は、ほぼ等しい三次構造を構成すると推断される。特に、蛍光団を構成する「ＧＹＧ」を含むαヘリックス様の二次構造（α１−ヘリックス）の部分アミノ酸配列は、高い同一性を示しており、ｐｐｌｕＧＦＰ２においても、形成された蛍光団：ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造に含まれる、Ｔｙｒ５６に由来するｐ−ヒドロキシフェニル基（フェノール環）に対して、Ｈｉｓ５２の側鎖上のイミダゾール環が、“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”が可能な配置を有していることを推断される。従って、ＣｐＹＧＦＰにおける、Ｈｉｓ５２に対する他のアミノ酸への置換で得られる効果は、このｐｐｌｕＧＦＰ２においても、本質的に同等なものとなる。【００５８】
野生型ｐｐｌｕＧＦＰ２が示す蛍光特性は、蛍光ピーク波長は、５０２ｎｍ、励起スペクトルにおけるピーク波長は、４８２ｎｍと報告されており、図２に示す、野生型ＣｐＹＧＦＰの蛍光ピーク波長、５１７ｎｍ、励起スペクトルにおけるピーク波長、５０９ｎｍと比較して、いずれも、短波長側にシフトしている。両者とも、蛍光団：ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造に対して、Ｈｉｓ５２の側鎖上のイミダゾール環は、“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”が可能な配置を有していると推定されるが、見掛け上、野生型ｐｐｌｕＧＦＰ２においては、前記“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”に起因する、蛍光ピーク波長、および励起スペクトルにおけるピーク波長の長波長側へのシフト（レッド・シフト）の効果が乏しいという測定結果となっている。【００５９】
例えば、ａｑＧＦＰが示す、蛍光ピーク波長は５０４ｎｍ、励起スペクトルにおけるピーク波長は４７０〜４７５ｎｍであり、蛍光団がイオン化型に変換されているＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＧＦＰ）が示す、蛍光ピーク波長は５０７〜５０９ｎｍ、励起スペクトルにおけるピーク波長は４８５ｎｍであり、蛍光ピーク波長、および励起スペクトルにおけるピーク波長は、非イオン化型の寄与を有するａｑＧＦＰが、ＥＧＦＰより、短波長側にシフトしている。すなわち、蛍光団の形状において、非イオン化型の寄与がより高いと、観測される蛍光ピーク波長、および励起スペクトルにおけるピーク波長は、短波長側にシフトすることが示されている。【００６０】
この蛍光団の形状における、非イオン化型とイオン型との寄与の差違を反映する、蛍光ピーク波長、および励起スペクトルにおけるピーク波長のシフトのメカニズムを考慮すると、野生型ｐｐｌｕＧＦＰ２においては、非イオン化型の寄与がより高く、そのため、見掛け上、前記“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”に起因する、蛍光ピーク波長、および励起スペクトルにおけるピーク波長の長波長側へのシフト（レッド・シフト）の効果がスペクトル上に反映されていないと判断される。換言するならば、野生型ｐｐｌｕＧＦＰ２においても、形成された蛍光団：ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造に含まれる、Ｔｙｒ５６に由来するｐ−ヒドロキシフェニル基（フェノール環）に対して、Ｈｉｓ５２の側鎖上のイミダゾール環が、“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”が可能な配置を有しているとの推断と、その蛍光スペクトル、励起スペクトル上では、長波長側へのシフト（レッド・シフト）の効果が見出されないこととは、矛盾するものでないと判断される。【００６１】
従って、ｐｐｌｕＧＦＰ２に対して、上述するＨｉｓ５２を他のアミノ酸により置換する改変に伴う効果は、このＣｐＹＧＦＰにおける効果と、本質的に同等なものとなる。なお、ｐｐｌｕＧＦＰ２に対して、Ｈｉｓ５２を、π電子共役系を有していない鎖式構造アミノ酸；Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒで置き換え、“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”に起因する相互作用を除いた場合、得られる改変蛍光タンパク質が示す、蛍光スペクトル、励起スペクトル上のピーク波長は、野生型ｐｐｌｕＧＦＰ２の蛍光ピーク波長と見掛け上、差違が無いものとなる。但し、蛍光スペクトルの全体的な形状は変化し、それらを積分したものに相当する色調は、前記置換に伴い、ブルー・シフトに相当する変化を示すものとなる。同じく、ｐｐｌｕＧＦＰ２に対して、Ｈｉｓ５２を、π電子共役系を有していないアミノ酸；Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎで置き換え、“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”に起因する相互作用を除いた場合、得られる改変蛍光タンパク質が示す、蛍光スペクトル、励起スペクトル上のピーク波長は、野生型ｐｐｌｕＧＦＰ２の蛍光ピーク波長と見掛け上、差違が無いものとなる。但し、蛍光スペクトルの全体的な形状は変化し、それらを積分したものに相当する色調は、前記置換に伴い、ブルー・シフトに相当する変化を示すものとなる。【００６２】
一方、ｐｐｌｕＧＦＰ２に対して、Ｈｉｓ５２を、より大きなπ電子共役系を有している、芳香族アミノ酸；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐで置き換え、“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”に起因する相互作用を増した場合には、得られる改変蛍光タンパク質が示す、蛍光スペクトル、励起スペクトル上のピーク波長は、野生型ｐｐｌｕＧＦＰ２の蛍光ピーク波長と見掛けでも、長波長側へのシフト（レッド・シフト）を示すものとなる。【００６３】
“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”に起因する相互作用を利用して、蛍光ピーク波長、ならびに励起スペクトル上のピーク波長を長波長側へシフト（レッド・シフト）する手法は、ａｑＧＦＰに基づく、改変蛍光タンパク質：ＹＦＰにおいても、利用されている。このＹＦＰ型の改変蛍光タンパク質では、ａｑＧＦＰの有する蛍光団を構成する「ＳＹＧ」のＴｙｒ６６に由来するｐ−ヒドロキシフェニル基（フェノール環）に対して、β１０鎖中に存在するＴｈｒ２０３を、π電子共役系を有しているアミノ酸残基；Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒで置き換えることで、“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”を誘起させている。ａｑＧＦＰに基づく、ＹＦＰの三次構造において、β１０鎖と、蛍光団とが近接しており、偶々、前記の“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”の誘起が可能な状態となっている。そのため、ＹＦＰでは、所望の蛍光ピーク波長を示す蛍光団の形成効率は、環化、脱水過程が進行する際の環境により影響を受ける点が、実用上の問題となっている。【００６４】
それに対して、例えば、ＣｐＹＧＦＰの三次構造においては、「ＧＹＧ」を含むαヘリックス様の二次構造（α１−ヘリックス）に含まれているＨｉｓ５２の側鎖の配向は、「ＧＹＧ」に環化、脱水が起こる過程において、一義的に決定される。そのため、Ｈｉｓ５２を、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐで置き換えた際、これらのアミノ酸残基の側鎖に存在する芳香環基は、Ｈｉｓ５２の側鎖に存在するイミダゾール環と本質的に同じ配向を有する。すなわち、「ＧＹＧ」から蛍光団が形成されるとともに、自動的に、これらのアミノ酸残基の側鎖に存在する芳香環基は、“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”が可能な配向に位置する。【００６５】
その結果、本発明の第一の形態に基づく、Ｈｉｓ５２を、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐで置き換えた改変蛍光タンパク質においては、所望の長波長側へのシフトを示す蛍光団の形成効率は、環化、脱水過程が進行する際の環境に起因する影響は、実用上の問題とならない程度に抑制可能となっている。【００６６】
ｐｐｌｕＧＦＰ２においても、「ＧＹＧ」を含むαヘリックス様の二次構造（α１−ヘリックス）の部分アミノ酸配列（アミノ酸番号４９〜６３）は、ＣｐＹＧＦＰのα１−ヘリックス（アミノ酸番号４７〜６１）と極めて高い同一性を有しており、Ｈｉｓ５４を、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐで置き換えた改変蛍光タンパク質においては、所望の長波長側へのシフトを示す蛍光団の形成効率は、環化、脱水過程が進行する際の環境に起因する影響は、実用上の問題とならない程度に抑制可能となっている。【００６７】
本発明の第二の形態にかかるＧＦＰ様の蛍光タンパク質の蛍光波長を変える方法は、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉに由来するＣｐＹＧＦＰ、あるいは、Ｐｏｎｔｅｌｌｉｎａ  ｐｌｕｔｅｌｌｉｎａ由来のｐｐｌｕＧＦＰ２を基礎に、これらの野生型ＧＦＰ様蛍光タンパク質が発する蛍光の色調、すなわち、蛍光スペクトル上において観測される極大蛍光波長（蛍光ピーク波長）を、短波長側へシフト（ブルー・シフト）させる改変蛍光タンパク質を創製する方法の一つである。【００６８】
本発明の第二の形態では、ＣｐＹＧＦＰ、ｐｐｌｕＧＦＰ２の蛍光団を構成する「ＧＹＧ」を、「ＧＷＧ」へと変更することで、形成される蛍光団を、ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造から、ｉｎｄｏｌｅ−３−ｙｌ−ｍｅｔｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造へと変更することにより、得られる改変蛍光タンパク質の蛍光のピーク波長を、野生型蛍光タンパク質よりも、短波長側へシフト（ブルー・シフト）させている。【００６９】
ａｑＧＦＰに基づき、その蛍光団を構成する「ＳＹＧ」を、「ＳＷＧ」に置き換えたＣＦＰ、「ＳＨＧ」に置き換えたＢＦＰでも、蛍光団自体を変更することにより、得られる改変蛍光タンパク質の蛍光のピーク波長を、野生型蛍光タンパク質よりも、短波長側へシフト（ブルー・シフト）させている。但し、これらＣＦＰ、ＢＦＰの蛍光スペクトル、励起スペクトルは、少なくとも、二つ以上のピークが近接して、一つのブロードな多峰性ピークを構成している。この二つ以上のピークは、それぞれ異なる状態に起因しており、その二つの状態間で何らかの平衡関係が存在すると想定される。一般に、この種の二つ以上の状態に、同程度の存在比率で分布する場合、その存在比率が外因的な要因で変化することに由来する、全体的なスペクトル形状の変化がしばしば生じる。【００７０】
それに対して、本発明の第二の形態による、改変蛍光タンパク質は、下記の実施例に示すように、その蛍光スペクトル、励起スペクトルは、実質的に単一の状態に由来すると見なせる程度の単峰型のピークを示している。すなわち、本発明の第二の形態による、改変蛍光タンパク質は、実質的に単一の状態に対する光吸収と、蛍光を示すものとなっており、外的な要因によって、そのスペクトル形状の変化が引き起こされることは回避されている。【００７１】
加えて、本発明の第二の形態による、改変蛍光タンパク質では、蛍光団は、「ＧＷＧ」から形成されるｉｎｄｏｌｅ−３−ｙｌ−ｍｅｔｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造と推定されるが、その蛍光ピーク波長は、４６０ｎｍであり、同様に、ｉｎｄｏｌｅ−３−ｙｌ−ｍｅｔｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造の蛍光団を有するＣＦＰ型の蛍光タンパク質の蛍光ピーク波長４７６ｎｍ〜４８５ｎｍと比較し、有意に短波長側へのシフト量（ブルー・シフト）が優っている。蛍光団として、１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−４−ｙｌ−ｍｅｔｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造を有するＢＦＰの蛍光ピーク波長、４４０〜４４８ｎｍと比較しても、遜色の無い短波長側へのシフト量（ブルー・シフト）が得られている。【００７２】
本発明の第一の形態、第二の形態にかかる方法を適用して、作製される改変蛍光タンパク質は、野生型蛍光タンパク質をコードする遺伝子に対して、部位特異的な変異導入した遺伝子を利用して、組換え発現型タンパク質として製造される。その際、野生型蛍光タンパク質をコードする遺伝子、例えば、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉに由来するＣｐＹＧＦＰをコードする遺伝子としては、該ＣｐＹＧＦＰをコードするｍＲＮＡから調製されるｃＤＮＡに相当する、下記の塩基配列を有するＤＮＡが利用できる。
0004719226.tif 000013
0004719226.tif 000014
この塩基配列（配列番号：３）は、国際公開第２００５／０９５５９９号パンフレットに開示されており、該ＣｐＹＧＦＰをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を、クローニング・ベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫのマルチ・クローニング・サイト中に挿入したベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＳＫ−ＮＦＰは、ブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６８１として、国際寄託（平成１６年３月３１日付け）がなされている。【００７３】
一方、Ｐｏｎｔｅｌｌｉｎａ  ｐｌｕｔｅｌｌｉｎａ由来のｐｐｌｕＧＦＰ２をコードする遺伝子の塩基配列は、公表されており（文献９：ＳＨＡＧＩＮ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．，  （２００４），  Ｖｏｌ．２１，  Ｎｏ．５，  ｐｐ．  ８４１−８５０）、具体的には、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＹ２６８０７２として、収録されている。また、該ｐｐｌｕＧＦＰ２をコードする遺伝子として、ＥＶＲΩＧＥＮ社から、商品名：Ｃｏｐ−ＧｒｅｅｎＴＭとして、一連のプラスミド中に該コード遺伝子を組換え発現可能な形態で挿入した発現ベクターが市販されている。この市販される発現ベクター中には、該ｐｐｌｕＧＦＰ２をコードする遺伝子として、下記のヒト化コドンに変換した塩基配列を含むＤＮＡが挿入されている。
Sequence of
the humanized version of the CopGFP's open reading frame
0004719226.tif 000015
0004719226.tif 000016
本発明の第一の形態、第二の形態にかかる方法を適用して、作製される改変蛍光タンパク質は、上述する野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列中、１〜数個の離散的なアミノ酸を、他のアミノ酸へ置換したものであり、入手可能な、塩基配列が既知の遺伝子ＤＮＡを鋳型として、下記の実施例に記載する手法に準じて、部位特異的な変異を導入し、組換え発現タンパク質として生産できる。特に、野生型蛍光タンパク質は、何れも組換え発現が可能であり、また、改変部位は、そのタンパク質フォールディングに影響を及ぼすものでなく、野生型蛍光タンパク質が組換え発現可能な宿主において、同様の効率で実際に蛍光を発する成熟型蛍光タンパク質として、生産可能である。【００７４】
例えば、本発明の第一の形態、第二の形態にかかる方法を、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉに由来するＣｐＹＧＦＰに適用して、作製される改変蛍光タンパク質は、国際公開第２００５／０９５５９９号パンフレットに開示される手法に準じて、ヒト細胞内において、蛍光を発する成熟型蛍光タンパク質として、組換え発現が可能である。また、これら成熟型蛍光タンパク質は、蛍光性マーカー・タンパク質として、他のタンパク質と融合した融合タンパク質として、宿主細胞内で組換え発現可能である。その際に利用する手法は、国際公開第２００５／０９５５９９号パンフレットに開示される手法に準じたものである。
【実施例】
【００７５】
以下に、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。ここに示す具体例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、これら具体例に限定されるものではない。【００７６】
Ｉ．Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰの三次元構造の決定
Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰの三次元構造を決定するため、組換え発現ＣｐＹＧＦＰの精製済標品を用いて、結晶化を行い、得られた結晶を利用し、Ｘ線結晶構造解析を行った。【００７７】
（Ｉ−１）組換え発現ＣｐＹＧＦＰの精製済標品の調製
国際公開第２００５／０９５５９９号パンフレットに開示する手法に従って、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＣｐＹＧＦＰをコードする遺伝子を、市販のプラスミドｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  製）中に挿入し、該ＣｐＹＧＦＰを大腸菌内で組換え発現用に利用可能な発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰを作製する。【００７８】
その際、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＣｐＹＧＦＰをコードする遺伝子は、既に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＳＫ−ＮＦＰ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６８１）中にクローニングされているものを鋳型として、ＰＣＲ法により調製する。なお、ＣｐＹＧＦＰをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を、クローニング・ベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫのマルチ・クローニング・サイト中に挿入したベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＳＫ−ＮＦＰは、ブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６８１として、国際寄託（平成１６年３月３１日付け）がなされている。
先ず、図７に示す、該ＣｐＹＧＰの組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰを用いて、大腸菌を形質転換する。得られた形質転換大腸菌に関して、選択マーカーのＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎ耐性遺伝子を用いて、クローン選別を行う。【００７９】
選別されたクローンについて、ベクターｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ由来のプロモーターから、ＩＰＴＧを用いて、挿入された遺伝子の発現を誘導し、誘導後２時間、４時間経過後、蛍光性タンパク質の組換え発現の有無を確認する。また、ＩＰＴＧ発現誘導後、組換え発現されている蛍光性タンパク質が成熟型タンパク質となっていることは、形質転換株のコロニーを紫外線照射下、蛍光を示すことによって確認される。【００８０】
国際公開第２００５／０９５５９９号パンフレットに開示する手順、条件に従って、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＣｐＹＧＦＰの組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰを保持する形質転換大腸菌を大量培養し、ＩＰＴＧ発現誘導によって産生された蛍光性タンパク質組換え体の分離精製を行う。この工程に従って、精製された、組換え発現ＣｐＹＧＦＰは、回収後、精製済標品タンパク質として、結晶化に用いる。【００８１】
次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでシングルバンドと認められる程度に精製された組換え発現ＣｐＹＧＦＰを含む溶液は、タンパク質濃度  ２３ｍｇ／ｍｌまで遠心濃縮する。【００８２】
（Ｉ−２）結晶化
結晶化は、シッティング・ドロップ蒸気拡散法を用いて行う。リザーバー溶液量１００μｌ、ドロップとして、タンパク質溶液１μｌとリザーバー溶液と同じ組成の沈澱剤溶液１μｌの混合物をセットする。１８℃において、約１週間保持して、ドロップ中の溶媒（水）を減少させ、タンパク質の濃縮を行って、結晶の析出を起こさせる。【００８３】
結晶化条件の最適化のため、リザーバー溶液の組成を種々に変えて、上記条件で結晶析出が起こるリザーバー溶液組成を選別する。このスクリーニングにより、リザーバー溶液／沈澱剤溶液の組成として、０．１Ｍ  ＣＡＰＳ  （ｐＨ  １０．５），  ０．２Ｍ  Ｌｉ２ＳＯ４，  ２．２Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４を用いる際、０．１−０．２ｍｍの柱状もしくはブロック状の結晶が析出した。前記結晶サイズは、後述するＸ線光源として、放射光を用いるＸ線回折装置に利用可能なサイズである。【００８４】
（Ｉ−３）Ｘ線結晶構造解析
組換え発現ＣｐＹＧＦＰの結晶について、その対称性と格子定数を確認したところ、空間群  Ｃ２２２１、格子定数  ａ＝１１３．５Å，ｂ＝１３３．５Å，ｃ＝１０８．７Åであった。【００８５】
Ｘ線回折強度の測定は、大学共同利用機関法人  高エネルギー加速器研究機構にある、Ｐｈｏｔｏｎ  ＦａｃｔｏｒｙのビームラインＢＬ−６Ａに設置されるＸ線回折装置を用いて行った。用いたＸ線光源（放射光）は、波長λ＝０．９７９９Å、回折パターン・強度測定は、二次元マトリックス配置のＣＣＤ検出器を採用している。【００８６】
Ｘ線回折の測定は、結晶を１００Ｋに冷却した状態で行う。結晶の冷却時に使用する、クライオプロテクタントとして、グリセロールと、結晶化に使用したリザーバー溶液とを、３：７（容積比）で混合した液を用いた。先ず、タンパク質結晶を、該クライオプロテクタント中に１０秒程度浸して、結晶表面に該クライオプロテクタントの被覆層を形成する。次いで、温度１００Ｋに調整した、乾燥窒素気流の中に、前記処理を施したタンパク質結晶を曝し、急速冷凍する。冷凍された結晶は、１００Ｋの乾燥窒素により冷却した状態に保ち、Ｘ線回折の測定を行う。【００８７】
検出された回折パターン・強度データのデータ処理には、プログラムＭＯＳＦＬＭとＳＣＡＬＡ（ＣＣＰ４）を使用した。表１に、回折強度データの統計値を示す。該結晶は、空間群  Ｃ２２２１、格子定数  ａ＝１１３．５Å，ｂ＝１３３．５Å，ｃ＝１０８．７Åであり、分解能１．９Åのデータが収集できていた。【００８８】
【表１】
0004719226.tif 000017
得られた回折強度データに基づく、該組換え発現ＣｐＹＧＦＰの結晶構造解析では、類似の構造を有すると想定されるＤｓＲｅｄの座標データを利用し、分子置換法を用いて、初期位相の決定を進めた。なお、モデルに用いたＤｓＲｅｄの座標データは、Ｐｒｏｔａｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ中に、ＩＤ  １ＧＧＸとして、公開されている。また、分子置換法によるタンパク質分子位置の決定には、プログラムＣＮＸを用いた。決定された位相データから、三次元電子密度マップを作成し、引き続き、プログラムＣＮＸと、三次元グラフィクス・ソフトＸｔａｌＶｉｅｗを使用して、構造モデルの精密化を行った。【００８９】
空間群  Ｃ２２２１の結晶において、各非対称単位中には、二つのタンパク質分子が存在しており、それぞれ、結晶学的２回軸対する回転対称性を有する、ダイマー形状を形成していることが確認された。前記精密化を行った構造モデルの原子座標に関して、その統計値を表２に示す。【００９０】
【表２】
0004719226.tif 000018
図３に、上述の精密化を終えた構造モデルにおけるペプチド主鎖の三次元的配置をリボンモデルにより示す。なお、蛍光団のｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造は、詳細に表示されている。特に、図４に、蛍光団のｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造と、その周囲に位置するアミノ酸残基の配置を含め、局所的な構造を示す。なお、組換え発現ＣｐＹＧＦＰの蛍光団、すなわち、図３に示す結晶構造の詳細な座標データは、Ｐｒｏｔａｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ中に、ＩＤ  ｃｏｄｅ：２ＤＤ７として、登録されており、かかる座標データに基づき、三次元的グラフィック化することで、図３に示す全体像のみでなく、図４に示す部分構造も更に詳細に参照可能な状態とされている。【００９１】
加えて、後述する改変体タンパク質Ｈ５２Ｄに関しても、同等の精度の結晶構造の詳細な座標データは、Ｐｒｏｔａｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ中に、ＩＤ  ｃｏｄｅ：２ＤＤ９として、登録されている。【００９２】
図４に示されるように、ＧＹＧから形成される蛍光団のｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造中、Ｔｙｒ５６の側鎖に由来する、ｐ−ヒドロキシフェニル基（フェノール環）に対して、Ｈｉｓ５２の側鎖のイミダゾール環は、重なる配置を採っている。すなわち、ｐ−ヒドロキシフェニル基（フェノール環）とイミダゾール環とは、両者のπ電子の重なりを介した、相互作用（π−π−スタッキング）が可能な相対配置を採っている。【００９３】
加えて、ｐ−ヒドロキシフェニル基（フェノール環）のヒドロキシル基（−ＯＨ；フェノール性水酸基）と、Ｔｈｒ１３６の側鎖上のヒドロキシル基（−ＯＨ；アルコール性水酸基）とは、近接しており、水素結合形成か可能な距離となっている。また、ｐ−ヒドロキシフェニル基（フェノール環）のヒドロキシル基に対して、水素結合形成か可能な距離に水分子が存在している。【００９４】
一方、イミダゾリノン環のオキソ酸素（＝Ｏ）と、Ａｒｇ８５の側鎖上のグアニジル基のアミノ窒素原子とは、近接しており、水素結合形成か可能な距離となっている。また、イミダゾリノン環のオキソ酸素（＝Ｏ）に対して、水素結合形成か可能な距離に水分子が存在している。【００９５】
上述する相互作用（水素結合）の可能性は、蛍光団のｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造が、下記するイオン化型と非イオン化型の平衡において、イオン化型を安定化する上で、Ｔｈｒ１３６の側鎖上のヒドロキシル基と、Ａｒｇ８５の側鎖上のグアニジル基のアミノ窒素原子が重要な役割を果たしていることを示唆している。【００９６】
・p-hydroxybenzylideneimidazolinone構造におけるイオン化型と、非イオン化型の平衡【００９７】
【化８】
0004719226.tif 000019
解析された組換え発現ＣｐＹＧＦＰの結晶構造は、分子置換法のモデルとして利用したＤｓＲｅｄ、ならびに、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰ(以下ａｑＧＦＰと略す)において、共通に見出される、１１個のβ鎖がバレル形状を構成し、そのバレル形状中心部を上下に貫くように、αヘリックスが配置されている、“βｃａｎ”構造を採っている。また、蛍光団は、“ＸＹＧ”として、“ＧＹＧ”が利用され、実際に、自己触媒的に、ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造が生成されている。ａｑＧＦＰにおいては、この“Ｘ６５Ｙ６６Ｇ６７”は、当初、αヘリックスに相当する二次構造を形成し、タンパク質フォールディング後、環化の過程には、β４鎖中に含まれるＡｒｇ９６、ならびに、β１１鎖中に含まれるＧｌｕ２２２が関与すると推定されている。組換え発現ＣｐＹＧＦＰにおいても、対応して、β４鎖中に含まれるＡｒｇ８５、ならびに、β１１鎖中に含まれるＧｌｕ２０７が、蛍光団の近傍に位置している。【００９８】
上述する環化過程が進行すると、当初のαヘリックスに相当する二次構造中に存在している、ｎ番目のアミノ酸残基のα位の−ＮＨ−と、（ｎ−４）番目のアミノ酸残基のＣ末の＞Ｃ＝Ｏとの間の水素結合のうち、Ｇ５５Ｙ５６Ｇ５７の部位が関与する鎖内の水素結合は失われる。【００９９】
タンパク質中で見出される一般的な二次構造のαヘリックスは、１巻きは、３．６アミノ酸残基を要し、その間にらせんは５．６Å進む。また、ｎ番目のアミノ酸残基のα位の−ＮＨ−と、（ｎ−４）番目のアミノ酸残基のＣ末の＞Ｃ＝Ｏとの間で水素結合が形成されているため、ｎ番目のアミノ酸残基の側鎖と（ｎ−４）番目のアミノ酸残基の側鎖とが互いに重なり合う配置を占めることは無い。一方、“ＸＹＧ”由来の蛍光団領域においては、Ｘ（Ｇｌｙ５５）のＣ末の＞Ｃ＝ＯとＧｌｙ５７のＮ末の−ＮＨ−との間で環化、脱水による環状構造を形成するため、この領域のペプチド主鎖の面間角（φ，ψ）は、αヘリックスにおける面間角（φ，ψ）とは異なったものとなっている。すなわち、Ｇ５５Ｙ５６Ｇ５７の部位は、下記のように、Ｇｌｙ５５のＣ末の＞Ｃ＝Ｏが、Ｇｌｙ５７のα位の−ＮＨ−と近接する「歪んだ配置」へと移行する。【０１００】
・翻訳後、フォールディング；（歪んだ配置への移行）【０１０１】
【化９】
0004719226.tif 000020
この構造変化に付随して、Ｈｉｓ５２の側鎖上のイミダゾール環と、Ｔｙｒ５６の側鎖上のｐ−ヒドロキシフェニル基（フェノール環）とが、互いに重なり合う配置を占めること可能となっていると推定される。最終的に、環化、脱水反応が完了すると、Ｈｉｓ５２のＣ末の＞Ｃ＝Ｏと、Ｔｙｒ５６のＣ末の＞Ｃ＝Ｏは、β４鎖中に含まれるＡｒｇ８５の側鎖のグアニジノ基と近接し、一方、Ｔｙｒ５６のＮ末の−ＮＨ−は、β１１鎖中に含まれるＧｌｕ２０７の側鎖のカルボキシル基と近接する配置となっている。この配置においては、Ｈｉｓ５２の側鎖上のイミダゾール環と、Ｔｙｒ５６の側鎖上のｐ−ヒドロキシフェニル基（フェノール環）とが、環相互の間隔  ３Å程度で重なり合うことができる。この種の芳香環が平行に積み重なった配置をとると、“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”と称される構造的に安定な状態となり、その際、二つのπ電子共役系の相互作用が生じる。【０１０２】
II．改変体タンパク質の作製
上記の“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”が達成されると、二つのπ電子共役系の相互作用が生じ、結果的に、蛍光団のｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造による蛍光のピーク波長（蛍光波長）、ならびに、励起スペクトル上で観測されるピーク波長は、“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”が達成されない場合と比較して、ともに、長波長側にシフトすると予測される。実際に、５２番目のアミノ酸残基を、ＨｉｓからＴｈｒに置換した改変体（Ｈ５３Ｔ）、ＨｉｓからＰｈｅに置換した改変体（Ｈ５２Ｆ）、ＨｉｓからＡｓｐに置換した改変体（Ｈ５２Ｄ）の三種の改変体タンパク質を組換え発現により作製し、その蛍光特性の比較を行った。【０１０３】
（II−１）改変体タンパク質の組換え発現用ベクターの構築
国際公開第２００５／０９５５９９号パンフレットに開示する、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＣｐＹＧＦＰの組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰ中に挿入されている、野生型ＣｐＹＧＦＰをコードする遺伝子を鋳型として、部位特異的変異導入により、Ｈ５３Ｔ、Ｈ５２Ｆ、Ｈ５２Ｄ改変体タンパク質三種をコードする遺伝子を調製する。【０１０４】
Ｈｉｓ５２をコードするコドンＣＡＣを、ＡｓｐをコードするコドンＧＡＴ、ＴｈｒをコードするコドンＡＣＣ、ＰｈｅをコードするコドンＴＴＣにそれぞれ置換するため、下記のプライマーを利用して、ＰＣＲ法により、ＤＮＡ断片を作製する。すなわち、ＰＣＲ用ファワード・プライマーとして、その５’末端に上記のコドン変換を施した、下記の三種のプライマーを使用する。一方、リバース・プライマーとして、Ｈｉｓ５２をコードするコドンＣＡＣより上流側の部分的塩基配列（塩基番号１２５−１５３；下記部分配列）に対して、相補的な塩基配列を有するプライマーを利用する。
0004719226.tif 000021
具体的には、ＰＣＲ用ファワード・プライマーは、
Ｈ５２Ｄのポイント・ミューテーション用には、
ＣｐＹＧＦＰ/Ｈ５２Ｄ  ＵＰ（３０ｍｅｒ）
0004719226.tif 000022
Ｈ５２Ｔのポイント・ミューテーション用には、
ＣｐＹＧＦＰ/Ｈ５２Ｔ  ＵＰ（３０ｍｅｒ）
0004719226.tif 000023
Ｈ５２Ｆのポイント・ミューテーション用には、
ＣｐＹＧＦＰ/Ｈ５２Ｆ  ＵＰ（３０ｍｅｒ）
0004719226.tif 000024
の三種を用い、一方、共通のリバース・プライマーとして、
リバース・プライマー：ＣｐＹＧＦＰ/ＬＰ１５３（２８ｍｅｒ）
0004719226.tif 000025
を用いた。【０１０５】
ＣｐＹＧＦＰの組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰを鋳型として、下記する条件で、該プラスミドの全長に相当する、約６．４ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物を調製した。表３に、用いたＰＣＲ反応の温度条件、表４に、反応液の組成を示す。なお、ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ時間は、伸長すべき塩基長が約６．４ｋｂｐと長い点を考慮して、十分に長い時間を選択している。【０１０６】
【表３】
0004719226.tif 000026
【０１０７】
【表４】
0004719226.tif 000027
調製されたＰＣＲ増幅産物の精製は、以下の手順で行った。【０１０８】
各２５μＬの反応液量でＰＣＲ反応を実施した後、合計３回の反応液を合わせ、５μＬの反応液を採取し、０．７％アガロース・ゲル上で泳動し、目的分子量、約６．４ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物を確認した。【０１０９】
次いで、反応液から、産物ＤＮＡを、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）で濃縮した。反応液１容（７０μＬ）当たり、ＰＢ  ｂｕｆｆｅｒ  ５容（３５０μＬ）を加え、ヴォルテックスにかけた後、ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに移した。３０秒間遠心し、析出するＤＮＡを沈積させ、上清を除去した。析出したＤＮＡを、ＰＥ  ｂｕｆｆｅｒ  ０．７ｍＬで洗浄し、１分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）した。さらに、ＥＢ  ｂｕｆｆｅｒ  ２０μＬを加えて、室温で、１分間静置する。その後、１分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）し、上清を回収した。【０１１０】
回収されたＤＮＡ溶液に、３μＬ  １０×Ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ９．５，１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ  ＤＴＴ）、３μＬ  ５０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、３μＬ  ７５ｍＭ  ＡＴＰを加え、ヴォルテックスにかけた後、１μＬ  Ｔ４  ＰＮＫ（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ）を加え、３７℃で約３０分インキュベートした。【０１１１】
１０×ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅ  液  ３μＬを添加した後、０．７％  ＴＡＥ  アガロース・ゲル上、各レーン  ＤＮＡ溶液  ３３μＬを泳動した。目的の約６．４ｋｂｐのバンドをゲルから切り出した。切り出したゲル切片は、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＤＡ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）を使用し、１０分間、遠心（７０００ｒｐｍ）し、ゲル切片から１．５ｍＬ容ｅｐｐｅｎチューブ中にＤＮＡ溶液を抽出した。その抽出液から、産物ＤＮＡを、ＭｉｎＥｌｕｔｅ    ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）で濃縮した。反応液１容当たり、ＰＢ  ｂｕｆｆｅｒ  ５容を加え、ヴォルテックスにかけた後、ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに移した。３０秒間遠心し、析出するＤＮＡを沈積させ、上清を除去した。析出したＤＮＡを、ＰＥ  ｂｕｆｆｅｒ  ０．７ｍＬで洗浄し、１分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）した。さらに、ＥＢ  ｂｕｆｆｅｒ  １０μＬを加えて、室温で、１分間静置する。その後、１分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）し、上清を回収した。回収された上清を、精製済み二本鎖ＤＮＡの溶液として使用した。【０１１２】
精製済み二本鎖ＤＮＡの溶液１μＬを１μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ製）とミックスし、１６℃で一晩、ライゲーション反応を行った。このライゲーション反応により、二本鎖ＤＮＡは、両端の連結され、環状プラスミドが構築される。各プラスミドは、導入されたポイント・ミューテーションを除き、それ以外は、鋳型のＣｐＹＧＦＰの組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰと同じ構成となっており、各改変体タンパク質の組換え発現ベクターとなっている。【０１１３】
ライゲーション後、ＴＯＰ１０ ｃｅｌｌにライゲーション液全量（２μＬ）をトランスフォームし、Ｃａａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎを含むＬＢプレートに蒔種した。翌朝、プラスミド・ベクター中に存在する、前記薬剤に対する耐性遺伝子を保持するコロニーを数個採取する。採取したコロニーを、Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎを含むＬＢ培地に植菌し、形質転換大腸菌を増殖させ、プラスミド・ベクターの増殖を行った。集菌した形質転換大腸菌を破砕し、ＤＮＡを回収し、目的の分子量約約６．４ｋｂｐを有する環状ＤＮＡ分子（プラスミド・ベクター）を単離、精製した。【０１１４】
精製した各プラスミド・ベクター中に含まれる、各改変体タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を確認するため、該各プラスミド・ベクター中に含まれる改変体タンパク質をコードする領域を鋳型として、ＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅し、シークエンス解析用試料を作製した。【０１１５】
その際、用いたＰＣＲ用プライマーは、国際公開第２００５／０９５５９９号パンフレットに開示する、フォワード・プライマー：ｐＥＴ−ＵＰ１（２８ｍｅｒ）：
0004719226.tif 000028
リバース・プライマー：ＳａｌＩ−ＬＰ１（３５ｍｅｒ）：
0004719226.tif 000029
を用いて、塩基長６７３ｂｐの増幅産物を調製した。【０１１６】
該６７３ｂｐのＤＡＮ断片から調製した、シークエンス解析用試料は、市販のシークエンス装置：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒにかけ、５’末端側からの配列解析、ならびに、３’末端側からの配列解析をそれぞれ行った。【０１１７】
５’末端側からの配列解析結果と、３’末端側からの配列解析結果とを総合し、改変体タンパク質をコードする領域の塩基配列が、目的の部位特異的変異が導入されていること、また、ＰＣＲ増幅時の誤りを含まないことを確認した。【０１１８】
（II−２）改変体タンパク質の組換え発現
上述の手順で調製、精製した、Ｈ５３Ｔ改変体タンパク質の組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＣｐＹＧＦＰ−Ｈ５３Ｔ、Ｈ５２Ｆ改変体タンパク質の組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＣｐＹＧＦＰ−Ｈ５２Ｆ、Ｈ５２Ｄ改変体タンパク質の組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＣｐＹＧＦＰ−Ｈ５２Ｄを利用して、下記の手順に従って、各改変体タンパク質を調製した。【０１１９】
先ず、各改変体タンパク質の組換え発現ベクターを用いて、大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓＴＭ（ＤＥ３）−ＲＩＬ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を形質転換する。目的の発現ベクターの導入された形質転換大腸菌を、ベクターｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯに由来する薬剤耐性遺伝子を利用し、選別する。【０１２０】
選別された形質転換大腸菌を、薬剤Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ添加液体培地において、３７℃で、培地中の菌体密度を示すＯＤ６００が０．６に達するまで、前培養を行う。ＯＤ６００が０．６に達した時点で、培地にＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなる量添加し、培養温度を下げ、培養を継続する。すなわち、ベクターｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ由来のプロモーターから、ＩＰＴＧを用いて、各改変体タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導する。該ＩＰＴＧ発現誘導後、それぞれ、Ｈ５２Ｔ改変体タンパク質の場合、２５℃で２０時間、Ｈ５２Ｄ改変体タンパク質の場合、３０℃で１６時間、Ｈ５２Ｆ改変体タンパク質の場合、３０℃で１６時間培養した時点で、培養を停止し、遠心により集菌する。集菌した菌体は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５で洗浄した後、−８０℃で冷凍し、保存した。【０１２１】
冷凍した各形質転換大腸菌を解凍後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）に懸濁し、超音波破砕する。菌体破砕後、１００００ｘｇで遠心分離して、可溶性画分を含む上清を分取する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った結果、該上清中に、目的の改変体タンパク質の分子量に相当する、２５ｋＤａの新たなバンドが見出された。【０１２２】
該上清中に含まれる各改変体タンパク質は、国際公開第２００５／０９５５９９号パンフレットに開示する、組換え発現ＣｐＹＧＦＰの精製手順に準じて、ＨｉＴｒａｐ−ＤＥＡＥカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＨｉＴｒａｐ−ｐｈｅｎｙｌカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ゲルろ過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用する、下記の三段階の精製工程によって精製する。【０１２３】
工程１：
各改変体タンパク質を含む上清を、アニオン交換カラム：ＨｉＴｒａｐ  ＤＥＡＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）にかけ、溶出条件：Ａ  ｂｕｆｆｅｒ  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、  Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ  １Ｍ  ＮａＣｌ  ｉｎ  Ａ  ｂｕｆｆｅｒ、  直線勾配  ０−１５％  Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ（０−１５０ｍＭ  ＮａＣｌ濃度）において、１−５％  Ｂ  ｂｕｆｆｅｒの画分に該改変体タンパク質を回収した。【０１２４】
工程２：
次いで、該回収画分を、アフィニフィカラム：ＨｉＴｒａｐ−ｐｈｅｎｙｌカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にかけ、溶出条件：Ａ  ｂｕｆｆｅｒ  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、  Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ  ０．７Ｍ  Ｎａ２ＳＯ４  ｉｎ  Ａ  ｂｕｆｆｅｒ、  直線勾配  １００−０％  Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ（０．７Ｍ−０Ｍ  Ｎａ２ＳＯ４濃度）において、それぞれ、６５％Ｂ−３８％Ｂ（Ｈ５２Ｔ）、６２％Ｂ−０％Ｂ（Ｈ５２Ｆ）、４６％Ｂ―０％Ｂ（Ｈ５２Ｄ）の画分に、該改変体タンパク質三種を回収した。【０１２５】
工程３：
さらに、該回収画分を、予め、ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０  ＭＷ１０，０００ｃｕｔの条件で、遠心濃縮した。この濃縮サンプルを、ゲル濾過：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）にかけ、溶出条件：ｂｕｆｆｅｒ  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０  ０．２Ｍ  ＮａＣｌを用いて、波長４９０ｎｍに吸収を示す画分として、該改変体タンパク質を精製、回収した。なお、回収された画分に含まれるタンパク質のＳＤＳ分析を行ったところ、ＳＤＳ電気泳動上で、分子量２４−２５ｋＤａ程度のバンドを示すタンパク質のみを含むことが確認される。【０１２６】
この精製済みの改変体タンパク質の溶液サンプルは、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ光（波長範囲４２０ｎｍ〜５００ｎｍ）照射下では、いずれも、黄緑色の蛍光を発していることが確認される。【０１２７】
（II−３）組換え発現改変体タンパク質の蛍光特性
精製済改変体タンパク質について、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ中に溶解した溶液サンプルを用いて、蛍光スペクトルと、励起スペクトルの測定を行った。対比のため、野生型ＣｐＹＧＦＰについても、前記バッファ溶液中に溶解した溶液サンプルを用いて、蛍光スペクトルと、励起スペクトルの測定を行った。蛍光スペクトルの測定は、室温（２５℃）において、日立製蛍光測定装置Ｆ−４５００を使用して行った。一方、励起スペクトルの測定は、蛍光スペクトル中の極大ピーク波長において、蛍光強度もモニターして行った。【０１２８】
図７−１、図７−２に、野生型ＣｐＹＧＦＰ、Ｈ５２Ｔ改変体タンパク質、Ｈ５２Ｄ改変体タンパク質、Ｈ５２Ｆ改変体タンパク質について、測定された蛍光スペクトルと励起スペクトルを併せて示す。表５に、蛍光スペクトル上の極大ピーク波長（λｅｍ．ＭＡＸ）と、励起スペクトル上に存在するピークの波長（λｅｘ．ｐｅａｋ）を併せて示す。【０１２９】
【表５】
0004719226.tif 000030
Ｈｉｓ５２をＴｈｒで置き換えたＨ５２Ｔ改変体タンパク質の蛍光スペクトルは、野生型ＣｐＹＧＦＰの蛍光スペクトルと比較して、ブルー・シフトを示しており、対応して、励起スペクトル上のピークも、ブルー・シフトを示している。この結果は、野生型ＣｐＹＧＦＰの蛍光団では、ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造中、Ｔｙｒ５６の側鎖に由来する、ｐ−ヒドロキシフェニル基（フェノール環）に対して、Ｈｉｓ５２の側鎖のイミダゾール環は、重なり合う配置を採っているため、実際に“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”が達成され、二つのπ電子共役系の相互作用が生じていることを査証している。【０１３０】
同じく、Ｈｉｓ５２をＡｓｐで置き換えたＨ５２Ｄ改変体タンパク質の蛍光スペクトルも、“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”の寄与がなく、野生型ＣｐＹＧＦＰの蛍光スペクトルと比較して、ブルー・シフトを示している。加えて、Ｈ５２Ｄ改変体タンパク質の励起スペクトル上には、二つのピークが観測されている。波長４９９．２ｎｍのピークは、イオン化型の形状を示す蛍光団に起因する吸収に相当すると考えられる。一方、波長４０８．２のピークは、非イオン化型の形状を示す蛍光団に起因する吸収に相当すると考えられる。すなわち、プロトン供与能を有するＡｓｐが、Ｔｙｒ５６の側鎖に由来する、ｐ−ヒドロキシフェニル基（フェノール環）に近接して存在するため、該ｐ−ヒドロキシフェニル基（フェノール環）のフェノール性水酸基のイオン化比率が低下しており、結果として、非イオン化型の形状を示す蛍光団に起因する吸収に対応するピークが、励起スペクトル上において、観測されていると考えられる。【０１３１】
一方、Ｈｉｓ５２をＰｈｅで置き換えたＨ５２Ｆ改変体タンパク質の蛍光スペクトルは、野生型ＣｐＹＧＦＰの蛍光スペクトルと比較して、レッド・シフトを示しており、対応して、励起スペクトル上のピークも、レッド・シフトを示している。この結果は、野生型ＣｐＹＧＦＰの蛍光団では、ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造中、Ｔｙｒ５６の側鎖に由来する、ｐ−ヒドロキシフェニル基（フェノール環）に対して、実際に、Ｐｈｅ５２の側鎖のベンゼン環は、重なり合う配置を採っているため、“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”が達成され、二つのπ電子共役系の相互作用が生じていることを示唆している。【０１３２】
以上の結果から、Ｈｉｓ５２に代えて、“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”が可能であり、また、Ｈｉｓ５２の側鎖のイミダゾール環と比較して、そのπ電子共役系がより広い、ベンゼン環、ｐ−ヒドロキシフェニル基（フェノール環）、インドール環を有する、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐへと置き換えると、得られる改変体、すなわち、Ｈ５２Ｆ、Ｈ５２Ｙ、Ｈ５２Ｗ改変体が示す蛍光は、野生型ＣｐＹＧＦＰの蛍光と比較して、同等のピーク波長を示す、あるいは、レッド・シフトを示すと予測される。【０１３３】
一方、Ｈｉｓ５２に代えて、“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”を起こす可能性が無い、Ａｌａ（側鎖：ＣＨ３−）、Ｖａｌ（側鎖：ＣＨ３−ＣＨ（ＣＨ３）−）、Ｉｌｅ（側鎖：Ｃ２Ｈ５−ＣＨ（ＣＨ３）−）、Ｌｅｕ（側鎖：ＣＨ３−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−）、Ｇｌｙ（側鎖無し）、システイン（側鎖：ＨＳ−ＣＨ２−）、メチオニン（ＣＨ３−Ｓ−Ｃ２Ｈ４−）、セリン（側鎖：ＨＯ−ＣＨ２−）、トレオニン（側鎖：ＣＨ３−ＣＨ（ＯＨ）−）で置換した際には、かかる改変体の蛍光は、野生型ＣｐＹＧＦＰの蛍光と比較して、ブルー・シフトを示すと予測される。【０１３４】
さらに、Ｈｉｓ５２に代えて、“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”を起こす可能性が無く、また、プロトン供与能を有するカルボキシル基を側鎖上に有する、Ａｓｐ（側鎖：−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）、Ｇｌｕ（側鎖：−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）で置換した際には、かかる改変体の蛍光は、野生型ＣｐＹＧＦＰの蛍光と比較して、ブルー・シフトを示すと予測される。また、Ｈｉｓ５２に代えて、“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”を起こす可能性が無い、Ａｓｎ（側鎖：−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ２）、Ｇｌｎ（側鎖：−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ２）で置換した際にも、かかる改変体の蛍光は、野生型ＣｐＹＧＦＰの蛍光と比較して、ブルー・シフトを示すと予測される。【０１３５】
III．蛍光団に変異を導入した改変体タンパク質の作製
上記の蛍光団に対して、“π−π  ｓｔａｃｋｉｎｇ”を起こすＨｉｓ５２を他のアミノ酸残基で置き換える改変以外に、蛍光団を形成する“ＧＹＧ”中のＴｙｒ５６を、Ｔｒｐで置き換える改変体タンパク質を作製し、極めて興味ある結果を得た。【０１３６】
具体的には、野生型ＣｐＹＧＦＰの蛍光団を形成する“ＧＹＧ”中のＴｙｒ５６を、Ｔｒｐで置き換える改変体タンパク質は、上記のａｑＧＦＰの蛍光団を形成する“ＳＹＧ”中のＴｙｒ６６を、Ｔｒｐで置き換えたＣＦＰに相当しており、蛍光スペクトルは、エネルギー差が小さな、二つの蛍光ピークが重ね合わせた形態を示し、対応する励起スペクトル上にも、エネルギー差が小さな、二つのピークが重ね合わせた形態を示すであろうと予測される。しかし、実際に、野生型ＣｐＹＧＦＰの蛍光団を形成する“ＧＹＧ”を、“ＧＷＧ”に置き換えた改変体タンパク質を作製して、その蛍光スペクトル、励起スペクトルを測定したところ、予想に反して、いずれも、単一のピークを示すことを見出した。【０１３７】
（III−１）蛍光団に変異を導入した改変体タンパク質の組換え発現用ベクターの構築
国際公開第２００５／０９５５９９号パンフレットに開示する、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来のＣｐＹＧＦＰの組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰ中に挿入されている、野生型ＣｐＹＧＦＰをコードする遺伝子を鋳型として、部位特異的変異導入により、蛍光団を形成する“ＧＹＧ”を“ＧＷＧ”に置き換えた改変体タンパク質をコードする遺伝子を調製する。【０１３８】
具体的には、Ｔｙｒ５６をＴｒｐに置き換えたＹ５６Ｗ改変体タンパク質、さらに、Ｖａｌ１９４をＳｅｒに置換する変異を施した、Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ改変体タンパク質、加えて、Ｔｈｒ１３６をＡｌａに置換する変異をも施した、Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ，Ｔ１３６Ａ改変体タンパク質の計三種の改変体タンパク質をコードする遺伝子を、順次調製する。【０１３９】
（ａ）Ｙ５６Ｗ改変体タンパク質の組換え発現用ベクターの構築
Ｔｙｒ５６をコードするコドンＴＡＣを、ＴｒｐをコードするコドンＴＧＧに置換するため、下記のプライマーを利用して、ＰＣＲ法により、ＤＮＡ断片を作製する。すなわち、ＰＣＲ用ファワード・プライマーとして、その５’末端に上記のコドン変換を施した、下記のプライマーを使用する。
ＰＣＲ用ファワード・プライマーは、
Ｙ５６Ｗのポイント・ミューテーション用には、
ＣｐＹＧＦＰ/Ｙ５６Ｗ  ＵＰ（２７ｍｅｒ）
0004719226.tif 000031
一方、リバース・プライマーとして、Ｔｙｒ５６をコードするコドンＴＡＣより上流側の部分的塩基配列（塩基番号１３５−１６５；下記部分配列）に対して、相補的な塩基配列を有するプライマーを利用する。
0004719226.tif 000032
すなわち、ＰＣＲ用リバース・プライマーには、下記の塩基配列を有するＣｐＹＧＦＰ  ＬＰ１６５（３１ｍｅｒ）を用いる。
0004719226.tif 000033
ＣｐＹＧＦＰの組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰを鋳型として、上記（II−１）に記載する条件で、該プラスミドの全長に相当する、約６．４ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物を調製した。また、ＰＣＲ増幅後に行う、
調製されたＰＣＲ増幅産物の精製；
精製済み約６．４ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物からライゲーション反応による環状プラスミドの作製；
ＴＯＰ１０ ｃｅｌｌの形質転換と、培養によるプラスミドの増幅；
増幅したプラスミドの回収、ならびに、タンパク質コード領域の塩基配列の解析；
以上の各工程も、上記（II−１）に記載する条件、手順に従って実施する。【０１４０】
上述の手順で、Ｙ５６Ｗ改変体タンパク質の組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗを調製、精製した。【０１４１】
（ｂ）Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ改変体タンパク質の組換え発現用ベクターの構築
Ｔｙｒ５６のＴｒｐへの置換に加え、Ｖａｌ１９４をコードするコドンＧＴＣを、ＳｅｒをコードするコドンＡＧＣに置換するため、下記のプライマーを利用して、ＰＣＲ法により、ＤＮＡ断片を作製する。すなわち、ＰＣＲ用リバース・プライマーとして、その相補的塩基配列は上記のコドン変換を施したものとなる、下記のプライマーを使用する。
Ｖ１９４Ｓのポイント・ミューテーション用には、
リバース・プライマーは、
ＣｐＹＧＦＰ  Ｖ１９４Ｓ  ＬＰ（２５ｍｅｒ）
0004719226.tif 000034
を用いて、その相補鎖を用いて翻訳される際に、下記のようなアミノ酸残基の変換がなされる。
0004719226.tif 000035
一方、ファワード・プライマーは、
ＣｐＹＧＦＰ  ＵＰ５８７（２８ｍｅｒ）
0004719226.tif 000036
を用いて、Ｖａｌ１９４をコードするコドンＧＴＣの直ぐ下流側の部分的塩基配列（塩基番号５８７−６１４部分）に相当する塩基配列を有するプライマーを利用する。【０１４２】
Ｙ５６Ｗ改変体タンパク質の組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗを鋳型として、上記（II−１）に記載する条件で、該プラスミドの全長に相当する、約６．４ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物を調製した。また、ＰＣＲ増幅後に行う、
調製されたＰＣＲ増幅産物の精製；
精製済み約６．４ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物からライゲーション反応による環状プラスミドの作製；
ＴＯＰ１０ ｃｅｌｌの形質転換と、培養によるプラスミドの増幅；
増幅したプラスミドの回収、ならびに、タンパク質コード領域の塩基配列の解析；
以上の各工程も、上記（II−１）に記載する条件、手順に従って実施する。【０１４３】
上述の手順で、Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ改変体タンパク質の組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓを調製、精製した。【０１４４】
（ｃ）Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ，Ｔ１３６Ａ改変体タンパク質の組換え発現用ベクターの構築
Ｔｙｒ５６のＴｒｐへの置換、Ｖａｌ１９４のＳｅｒへの置換に加え、Ｔｈｒ１３６をコードするコドンＡＣＧを、ＡｌａをコードするコドンＧＣＣに置換するため、下記のプライマーを利用して、ＰＣＲ法により、ＤＮＡ断片を作製する。すなわち、ＰＣＲ用リバース・プライマーとして、その相補的塩基配列は上記のコドン変換を施したものとなる、下記のプライマーを使用する。
Ｔ１３６Ａのポイント・ミューテーション用には、
リバース・プライマーは、
ＣｐＹＧＦＰ  Ｔ１３６Ａ  ＬＰ（２２ｍｅｒ）
0004719226.tif 000037
を用いて、その相補鎖を用いて翻訳される際に、下記のようなアミノ酸残基の変換がなされる。
0004719226.tif 000038
一方、ファワード・プライマーは、
ＣｐＹＧＦＰ  ＵＰ４１２（２１ｍｅｒ）
0004719226.tif 000039
を用いて、Ａｓｐ１３８をコードするコドンＧＴＣを５’末端とする部分的塩基配列（塩基番号４１２−４３２部分）に相当する塩基配列を有するプライマーを利用する。【０１４５】
Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ改変体タンパク質の組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓを鋳型として、上記（II−１）に記載する条件で、該プラスミドの全長に相当する、約６．４ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物を調製した。また、ＰＣＲ増幅後に行う、
調製されたＰＣＲ増幅産物の精製；
精製済み約６．４ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物からライゲーション反応による環状プラスミドの作製；
ＴＯＰ１０ ｃｅｌｌの形質転換と、培養によるプラスミドの増幅；
増幅したプラスミドの回収、ならびに、タンパク質コード領域の塩基配列の解析；
以上の各工程も、上記（II−１）に記載する条件、手順に従って実施する。【０１４６】
上述の手順で、Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ，Ｔ１３６Ａ改変体タンパク質の組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ，Ｔ１３６Ａを調製、精製した。【０１４７】
Ｙ５６Ｗ改変体タンパク質の組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗ、Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ改変体タンパク質の組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ、Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ，Ｔ１３６Ａ改変体タンパク質の組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ，Ｔ１３６Ａは、調製、精製後、導入された変異部位の塩基配列を下記の手順で確認した。【０１４８】
精製した各プラスミド・ベクター中に含まれる、各改変体タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を確認するため、該各プラスミド・ベクター中に含まれる改変体タンパク質をコードする領域を鋳型として、ＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅し、シークエンス解析用試料を作製した。【０１４９】
その際、用いたＰＣＲ用プライマーは、国際公開第２００５／０９５５９９号パンフレットに開示する、フォワード・プライマー：ｐＥＴ−ＵＰ１（２８ｍｅｒ）：
0004719226.tif 000040
リバース・プライマー：ＳａｌＩ−ＬＰ１（３５ｍｅｒ）：
0004719226.tif 000041
を用いて、塩基長６７３ｂｐの増幅産物を調製した。【０１５０】
該６７３ｂｐのＤＡＮ断片から調製した、シークエンス解析用試料は、市販のシークエンス装置：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒにかけ、５’末端側からの配列解析、ならびに、３’末端側からの配列解析をそれぞれ行った。【０１５１】
５’末端側からの配列解析結果と、３’末端側からの配列解析結果とを総合し、改変体タンパク質をコードする領域の塩基配列が、目的の部位特異的変異が導入されていること、また、ＰＣＲ増幅時の誤りを含まないことを確認した。【０１５２】
（III−２）改変体タンパク質の組換え発現
上述の手順で調製、精製した、Ｙ５６Ｗ改変体タンパク質の組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗ；Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ改変体タンパク質の組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ；Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ，Ｔ１３６Ａ改変体タンパク質の組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＣｐＹＧＦＰ−Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ，Ｔ１３６Ａを利用して、下記の手順に従って、各改変体タンパク質を調製した。【０１５３】
先ず、各改変体タンパク質の組換え発現ベクターを用いて、大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓＴＭ（ＤＥ３）−ＲＩＬ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を形質転換する。目的の発現ベクターの導入された形質転換大腸菌を、ベクターｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯに由来する薬剤耐性遺伝子を利用し、選別する。【０１５４】
選別された形質転換大腸菌を、薬剤Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ添加液体培地において、３７℃で、培地中の菌体密度を示すＯＤ６００が０．６に達するまで、前培養を行う。ＯＤ６００が０．６に達した時点で、培地にＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなる量添加し、培養温度を下げ、培養を継続する。すなわち、ベクターｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ由来のプロモーターから、ＩＰＴＧを用いて、各改変体タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導する。該ＩＰＴＧ発現誘導後、それぞれ、Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ改変体タンパク質の場合、２５℃で５時間、Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ，Ｔ１３６Ａ改変体タンパク質の場合、２５℃で５時間培養した時点で、培養を停止し、遠心により集菌する。集菌した菌体は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５で洗浄した後、−８０℃で冷凍し、保存した。【０１５５】
冷凍した各形質転換大腸菌を解凍後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）に懸濁し、超音波破砕する。菌体破砕後、１００００ｘｇで遠心分離して、可溶性画分を含む上清を分取する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った結果、該上清中に、目的の改変体タンパク質の分子量に相当する、２５ｋＤａの新たなバンドが確認された。【０１５６】
該上清中に含まれる各改変体タンパク質は、国際公開第２００５／０９５５９９号パンフレットに開示する、組換え発現ＣｐＹＧＦＰの精製手順に準じて、ＨｉＴｒａｐ−ＤＥＡＥカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用して、宿主大腸菌由来の可溶性タンパク質と、組換え発現されたタンパク質とを分離し、精製する。【０１５７】
ＨｉＴｒａｐ−ＤＥＡＥカラム精製工程：
各改変体タンパク質を含む上清を、アニオン交換カラム：ＨｉＴｒａｐ  ＤＥＡＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）にかけ、溶出条件：Ａ  ｂｕｆｆｅｒ  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、  Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ  １Ｍ  ＮａＣｌ  ｉｎ  Ａ  ｂｕｆｆｅｒ、  直線勾配  ０−２０％  Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ（０−２００ｍＭ  ＮａＣｌ濃度）にかけた。【０１５８】
Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ改変体タンパク質、Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ，Ｔ１３６Ａ改変体タンパク質のいずれの場合も、可溶性画分を含む上清を、該カラムにインジェクション後、前記の溶出条件で溶出液を流通し、Ｗａｓｈ画分を含め、所定の液量毎に分画し、各画分について、蛍光性タンパク質の有無を確認した。その際、波長３６５ｎｍの励起光を照射したところ、Ｗａｓｈ画分中に、青色の蛍光を発する蛍光性タンパク質が存在することが確認された。【０１５９】
宿主大腸菌由来の可溶性タンパク質中、Ｗａｓｈ画分に回収される可能性のあるものは、蛍光性を示さない点は、別途確認されており、確認された蛍光性タンパク質は、組換え発現された、各改変体タンパク質である。すなわち、＜１％  Ｂ  ｂｕｆｆｅｒの画分（Ｗａｓｈ画分）に、該改変体タンパク質が回収されていた。【０１６０】
（III−３）組換え発現改変体タンパク質の蛍光特性
前記のカラム精製済改変体タンパク質について、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５中に希釈した溶液サンプルを用いて、蛍光スペクトルと、励起スペクトルの測定を行った。蛍光スペクトルの測定は、室温（２５℃）において、日立製蛍光測定装置Ｆ−４５００を使用して行った。一方、励起スペクトルの測定は、蛍光スペクトル中の極大ピーク波長において、蛍光強度をモニターして行った。【０１６１】
図８、図９に、Ｙ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ改変体タンパク質、ならびにＹ５６Ｗ，Ｖ１９４Ｓ，Ｔ１３６Ａ改変体タンパク質について、測定された蛍光スペクトルと励起スペクトルをそれぞれ示す。表６に、蛍光スペクトル上の極大ピーク波長（λｅｍ．ＭＡＸ）と、励起スペクトル上に存在するピークの波長（λｅｘ．ｐｅａｋ）を併せて示す。【０１６２】
【表６】
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Ｔｙｒ５６をＴｒｐで置き換えた上記の三種の改変体タンパク質の蛍光スペクトルは、野生型ＣｐＹＧＦＰの蛍光スペクトルと比較して、ブルー・シフトを示しており、対応して、励起スペクトル上のピークも、ブルー・シフトを示している。この結果は、野生型ＣｐＹＧＦＰの蛍光団は、ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造であるが、Ｔｙｒ５６をＴｒｐで置き換えた結果、上記三種の改変体タンパク質の蛍光団は、ｉｎｄｏｌｅ−３−ｙｌ−ｍｅｔｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造となっており、「ブルー・シフト」の傾向は、ａｑＧＦＰに対する、ＣＦＰと類似するものとなっている。【０１６３】
なお、ＣＦＰは、蛍光スペクトル、励起スペクトルともに、エネルギー差が小さな、二つのピークが重ね合わせた形態を示し、該二種のピークを与える要因として、二つの蛍光状態（光励起状態）が共存しており、この二つの蛍光状態（光励起状態）の間で、何らかの平衡関係が存在している可能性が示唆されている。一方、上記三種の改変体タンパク質では、蛍光スペクトル、励起スペクトルともに、外見的には、単一のピークの形状を示しており、すなわち、それぞれ、一つの蛍光状態（光励起状態）が関与すると推定される。具体的には、上記三種の改変体タンパク質において、蛍光スペクトル、励起スペクトルに関与する蛍光状態（光励起状態）は、ＣＦＰにおいて、観測される二つの蛍光状態（光励起状態）のうち、高いエネルギー側のピークを与える蛍光状態（光励起状態）に相当するものと考えられる。【０１６４】
ＣＦＰにおいて、観測される二つの蛍光状態（光励起状態）のうち、低いエネルギー側のピークを与える蛍光状態（光励起状態）は、蛍光団であるｉｎｄｏｌｅ−３−ｙｌ−ｍｅｔｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造において、インドール環のπ電子共役系と、イミダゾリノン環のπ電子共役系とが、イデン型の連結部を介して、繋がり、励起状態ではより大きな非局在化が生じていると推定される。一方、ＣＦＰにおいて、観測される二つの蛍光状態（光励起状態）のうち、高いエネルギー側のピークを与える蛍光状態（光励起状態）は、前記の二つのπ電子共役系における非局在化の寄与は乏しいと推定される。【０１６５】
上記三種の改変体タンパク質の蛍光スペクトル、励起スペクトルに関与する蛍光状態（光励起状態）は、ＣＦＰにおいて、観測される二つの蛍光状態（光励起状態）のうち、高いエネルギー側のピークを与える蛍光状態（光励起状態）と比較しても、さらに、高いエネルギー側にピークを与えており、インドール環のπ電子共役系と、イミダゾリノン環のπ電子共役系との間で、イデン型の連結部を介した非局在化の寄与は、更に少ない、あるいは、インドール環とイミダゾリノン環とは、同一平面上に存在してなく、イデン型の連結部を介した非局在化が困難な状態となっていると推察される。【０１６６】
このＣｐＹＧＦＰに基づき、その蛍光団を形成する“ＧＹＧ”を“ＧＷＧ”に置き換えた改変体タンパク質は、ａｑＧＦＰに基づき、その蛍光団を形成する“ＳＹＧ”を“ＳＷＧ”に置き換えた改変体タンパク質ＣＦＰよりも、蛍光のピーク波長はブルー・シフトしており、その青色蛍光は、ＢＦＰの青色蛍光と比較しても、遜色の無い色調（青色）を示す。
【産業上の利用可能性】
【０１６７】
本発明の改変を施し、蛍光波長を変化させた蛍光性タンパク質は、野生型ＣｐＹＧＦＰと同様に、哺乳動物細胞を利用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系において、該宿主細胞内で発現可能なｉｎ  ｖｉｖｏ  蛍光性マーカー・タンパク質として利用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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