(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
翻訳後に修飾されたタンパク質の同定方法であって、
１の翻訳後に修飾されたタンパク質を消化して複数のペプチドを生産する工程、
前記複数のペプチドのうち少なくとも１つをイオン化して１またはそれ以上のペプチドイオンを形成する工程、
１またはそれ以上の前記ペプチドイオンを質量分析し、前記ペプチドまたはペプチドイオンのうち少なくとも１つの質量または質量対電荷比を決定する工程、および、
前記修飾タンパク質を、
(i) １またはそれ以上の重要な修飾を考究し、前記修飾タンパク質を、少なくとも１の前記重要な修飾により修飾されたと考究し、
(ii) １のペプチドまたはペプチドイオンが誘導されたタンパク質が修飾されていなかった場合に前記ペプチドまたはペプチドイオンが有するであろう理論的非修飾質量または質量対電荷比を決定し、
(iii) 前記理論的非修飾質量または質量対電荷比を用いてペプチドのデータバンクを検索し、そして、
(iv) 前記理論的非修飾質量または質量対電荷比に対応する質量または質量対電荷比を有する前記データバンク中のペプチドを決定し、
(v) 前記重要な修飾を支持しないペプチドを、拒否するか、捨てることにより、可能性のあるペプチドのショートリストを形成することにより
同定する工程、
を含む方法。
【請求項２】
前記修飾タンパク質が翻訳後に修飾されたタンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記修飾タンパク質が、メチル化、ヒドロキシ化、酸化、ホルミル化、アセチル化、カルボキシ化、リン酸化、硫酸化、システイニル化、グリコサール化、ファルネシル化、ミリストイル化、ビオチニル化、パルミトイル化、またはステアロイル化により修飾されたタンパク質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
重要な修飾の組合わせを、少なくとも１またはそれ以上列挙することをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
重要な修飾の組合わせを全て列挙することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
修飾の最大数を決定、選択または考究することをさらに含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
重要な修飾の組合わせを列挙する前記工程が、重要な修飾の組合わせを前記修飾の最大数まで列挙することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記理論的非修飾質量または質量対電荷比を決定する前記工程が、重要な修飾の組合わせにおける質量または質量対電荷比を計算または決定することを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記理論的非修飾質量または質量対電荷比を決定する前記工程が、前記ペプチドまたはペプチドイオンの質量または質量対電荷比を、前記重要な修飾の組合わせの観点から、改変、置換、阻止、否定、非修飾化または調整することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記理論的非修飾質量または質量対電荷比を決定する前記工程が、前記重要な修飾の組合わせにおける質量または質量対電荷比を、前記質量分析工程により決定した前記ペプチドまたはペプチドイオンの質量または質量対電荷比から引き算することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記理論的非修飾質量または質量対電荷比を決定する前記工程が、前記重要な修飾の組合わせにおける質量または質量対電荷比を、前記質量分析工程により決定した前記ペプチドまたはペプチドイオンの質量または質量対電荷比に足し算することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドまたはペプチドイオンにおける前記理論的非修飾質量または質量対電荷比と、前記データバンクにリストされたペプチドの質量または質量対電荷比との間で、質量または質量対電荷比について許容された許容誤差を、決定、選択または考究することをさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記質量の許容誤差が：(i) <0.01 Da; (ii) 0.01-0.02 Da; (iii) 0.02-0.03 Da; (iv)0.03-0.04 Da; (v) 0.04-0.05 Da; (vi) 0.05-0.06 Da; (vii) 0.06-0.07 Da; (viii) 0.07-0.08 Da; (ix) 0.08-0.09 Da; (x) 0.09-0.10 Da; および (xi) >0.10 Daからなる群から選択される範囲内に含まれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記質量対電荷比の許容誤差が：(i) ≦ 0.1 質量対電荷比ユニット; (ii) ≦ 0.01質量対電荷比ユニット; (iii) ≦ 0.001質量対電荷比ユニット; (iv) ≦ 0.0001質量対電荷比ユニット; (v) ≦ 0.00001質量対電荷比ユニット; および (vi) ≦ 0.000001質量対電荷比ユニットからなる群から選択される範囲内に含まれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ペプチドのデータバンクを検索する前記工程が、前記データバンク中にリストされたペプチドのうち、前記理論的非修飾質量または質量対電荷比に対し、前記質量または質量対電荷比について許容された許容誤差の範囲内に対応する質量または質量対電荷比を有するものを、決定または選択することを含む、請求項１２、１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ペプチドのデータバンク中におけるペプチドのうち、前記理論的非修飾質量または質量対電荷比に対し、前記質量または質量対電荷比について許容された許容誤差の上限値の範囲内に対応する質量または質量対電荷比を有するものを決定することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチドのデータバンク中におけるペプチドのうち、前記理論的非修飾質量または質量対電荷比に対し、前記質量または質量対電荷比について許容された許容誤差の下限値の範囲内に対応する質量または質量対電荷比を有するものを決定することをさらに含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドのデータバンク中におけるペプチドのうち、前記上限値と前記下限値との間の質量または質量対電荷比を有するものを選択することをさらに含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチドのデータバンク中におけるペプチドのうち、前記上限値と前記下限値との間の質量または質量対電荷比を有するものが、ペプチドの初期リストを形成する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記可能性のあるペプチドのショートリスト中におけるペプチドのうち少なくとも過半数が：(i) 前記ペプチドまたはペプチドイオンの前記理論的非修飾質量または質量対電荷比に対し、前記質量または質量対電荷比について許容された許容誤差の範囲内に対応する質量または質量対電荷比；および(ii) 前記重要な修飾の組合わせのうち少なくとも１つを支持するための、少なくとも同じ数およびタイプの修飾可能部位を有する、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記可能性のあるペプチドのショートリスト中におけるペプチドの前記修飾可能な部位が、重要な修飾の組合わせと正確に符合するかどうかを決定することをさらに含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記可能性のあるペプチドのショートリスト中におけるペプチドの前記修飾可能な部位が、重要な修飾の組合わせと正確にまたは実質的に符合する場合、続いて、前記ショートリスト中における前記ペプチドを、前記ペプチドイオンに対応するフラグメンテーションまたはMS/MSマススペクトルデータに対して評点付ける、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記可能性のあるペプチドのショートリスト中におけるペプチドの前記修飾可能な部位が、重要な修飾の組合わせと正確にまたは実質的に符合しない場合、続いて、前記重要な修飾の組合わせを、それらに当てはまる残基にしたがって分類する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
修飾可能部位の組合わせを列挙することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
重要な修飾を、前記修飾可能部位中において入れ替えることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記重要な修飾を、グループ毎に基いて入れ替える、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
入れ替えた各ペプチドを、前記ペプチドイオンに対応するフラグメンテーションまたはMS/MSマススペクトルデータに対して評点付けることをさらに含む、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記データバンクが、非修飾タンパク質から誘導されたペプチドのデータバンクを含む、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記データバンク中にリストされたペプチドを、質量または質量対電荷比の順に配列する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ペプチドを、単一同位体に基く質量または質量対電荷比の順に配列する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記修飾タンパク質を同定する前記工程が、複数の異なるペプチドまたはペプチドイオンに対し、工程(i), (ii) および (iii)を繰り返すことをさらに含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
(a) １またはそれ以上の重要な修飾を決定、選択または考究すること、
(b) 重要な修飾の組合わせを１またはそれ以上列挙すること、
(c) 前記重要な修飾の組合わせのうち１またはそれ以上における質量または質量対電荷比を計算すること、
(d) 前記重要な修飾の組合わせのうち１つについて計算された質量または質量対電荷比を、実験的に決定したペプチドまたはペプチドイオンの質量または質量対電荷比から引き算し、１のペプチドまたはペプチドイオンが誘導されたタンパク質が修飾されていなかった場合に前記ペプチドまたはペプチドイオンが有するであろう理論的非修飾質量または質量対電荷比を決定すること、
(e) 前記理論的非修飾質量または質量対電荷比を用いてペプチドのデータバンクを検索し、ペプチドの初期リストを生成させること、
(f) 前記ペプチドの初期リストから、前記重要な修飾の組合わせを支持できないペプチドを捨て、それによりペプチドのショートリストを生成させること、および、
(g) 前記ペプチドのショートリスト中におけるペプチドを、フラグメンテーションマススペクトルデータに対して評点付けること、
を含む、修飾タンパク質の同定方法。
【請求項３３】
修飾タンパク質の同定装置であり、前記装置は、使用時において、
(a) １またはそれ以上の重要な修飾を決定、選択または考究し、
(b) 重要な修飾の組合わせを１またはそれ以上列挙し、
(c) 前記重要な修飾の組合わせのうち１またはそれ以上における質量または質量対電荷比を計算し、
(d) 前記重要な修飾の組合わせのうち１つについて計算された質量または質量対電荷比を、実験的に決定したペプチドまたはペプチドイオンの質量または質量対電荷比から引き算し、１のペプチドまたはペプチドイオンが誘導されたタンパク質が修飾されていなかった場合に前記ペプチドまたはペプチドイオンが有するであろう理論的非修飾質量または質量対電荷比を決定し、
(e) 前記理論的非修飾質量または質量対電荷比を用いてペプチドのデータバンクを検索し、ペプチドの初期リストを生成させ、
(f) 前記ペプチドの初期リストから、前記重要な修飾の組合わせを支持できないペプチドを捨て、それによりペプチドのショートリストを生成させ、および、
(g) 前記ペプチドのショートリスト中におけるペプチドを、フラグメンテーションマススペクトルデータに対して評点付ける、
修飾タンパク質同定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾タンパク質の同定方法、修飾タンパク質同定手段を含むマススペクトロメータ、および修飾タンパク質を同定するための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNA中に保存されている遺伝情報は、ポリペプチド（タンパク質）におけるアミノ酸配列（シーケンス）を定義する。その遺伝コードは、DNAのヌクレオチド塩基対配列が対応するアミノ酸配列に翻訳される一揃いの法則を含むと考えることができる。アミノ酸のためのコード言語（コドン）は、３つのヌクレオチド塩基対の配列からなる。DNA中の塩基対配列は、第１に、転写と呼ばれるプロセスにより、情報伝達メッセンジャーRNA(mRNA)分子に変換される。それらは、続いて、翻訳と呼ばれるプロセスにおけるポリペプチド合成のためのテンプレートとして働く。翻訳は、細胞質中のリボソーム内で起こる。そのように形成されたポリペプチド鎖は、「非修飾」形態でリボソームを離れる。しかしながら、前記ポリペプチド鎖は、続いて、種々の方法で修飾されることが可能である。それらのいくつかとして、例えば、システインというアミノ酸を含むポリペプチドは、それら自身を、特定の形状にフォールドし、システイン間でジスルフィド結合を形成できるようにすることで、修飾することができる。これがタンパク質の形状を制御し、そして、タンパク質の機能を決定するのは、しばしばその形状である。他のポリペプチドは、特定のアミノ酸における決まった官能基の化学的誘導により修飾されることができる。例えば、チロシンというアミノ酸における官能基は、リン酸化されることができる。このことは、ポリペプチドの極性および形状を変化させ、そして、それが特定の機能を行なうことを可能にするかまたは不可能にすることができる。上記は、ポリペプチドが合成された後、および、ポリペプチドが他のポリペプチドまたは化学物質と自由に混合された時に起こる翻訳後修飾の例示である。翻訳後修飾形態は多数存在し、そのほとんど全てが、官能基の化学的誘導における何かの形態に関連している。それらは、メチル化、ヒドロキシ化、酸化、ホルミル化、アセチル化、カルボキシ化、リン酸化、硫酸化、システイニル化、グリコサール化、ファルネシル化、ミリストイル化、ビオチニル化、パルミトイル化、およびステアロイル化を含む。これら修飾のうちいくつかは、他よりも一般的である。
【０００３】
タンパク質を同定（一般的には「タンパク質キャラクタリゼーション」と呼ばれている）できる能力は、ライフサイエンス分野において特に重要である。タンパク質同定は、実験データとタンパク質データベース中に保持されているデータとの比較によるタンパク質の認識と関連していても良い。または、タンパク質同定は、前記タンパク質を形成するアミノ酸配列のab-initio計算と関連していても良い。
【０００４】
翻訳後修飾されたタンパク質を同定またはキャラクタリゼーションできる能力は、特に重要である。マススペクトロメトリーは、タンパク質および翻訳後修飾タンパク質を同定するために一般的に用いられている手段である。
【０００５】
ペプチドサンプルの質量分析により得られた実験的マススペクトルデータを、タンパク質の配列（シーケンス）または発現シーケンスタグ(Expressed Sequence Tag (EST))データバンク由来の理論的ペプチドデータと比較することが知られている。理論的ペプチドデータは、タンパク質データバンク中にリストされているタンパク質が消化された時に形成されるであろうペプチドを予想することにより得ることができる。消化ルールは、タンパク質データバンク中にリストされている１またはそれ以上のタンパク質に適用することが可能であり、そして、続いて、得られるペプチド生成物の質量対電荷比を決定することができる。
【０００６】
実験的マススペクトルデータを理論的ペプチドデータに対し比較することに加え、フラグメンテーション（またはMS/MS）データを、ペプチドおよびそれらが誘導されるタンパク質の同定に用いることも知られている。マススペクトロメータの衝突またはフラグメンテーション室内において高エネルギー衝突にかけた時のペプチドイオンは、続いて質量分析できる多数のフラグメントイオンに断片化（フラグメンテーション）されるであろう。ペプチドイオンが断片化（フラグメンテーション）されるプロセスは、タンパク質データバンク中にリストされた１つのタンパク質の消化から理論的に予期されるペプチドから始まってシミュレーションされても良い。どのようにペプチドが断片化され得るかの予想により得られる理論的フラグメンテーションデータは、続いて、実験的に得られたフラグメンテーションマススペクトルデータに対して比較することができる。
【０００７】
フラグメンテーションまたはMS/MSデータの使用は、ペプチドイオンのフラグメンテーションにより形成されるフラグメントイオンが、タンパク質に影響した任意の翻訳後修飾の位置および型の両方に依存するために、タンパク質キャラクタリゼーション（および、特に翻訳後修飾されたタンパク質）において特に強力である。
【０００８】
実験的マススペクトルデータを理論的ペプチドデータに対して比較する近年の技術は、実験的マススペクトルデータを、指標となる、予備消化されたペプチドのデータバンク（予備消化ペプチドデータバンク）中に保持されたペプチドデータと比較することと、直接に関係する。このアプローチは、非修飾タンパク質の同定には好適であったが、前記ペプチドデータバンクが、翻訳後修飾されたタンパク質を支持していなかったために、翻訳後修飾タンパク質の同定はできなかった。
【０００９】
タンパク質キャラクタリゼーションおよび特に翻訳後修飾タンパク質の支持の必要性が増大していることは、翻訳後修飾タンパク質を同定するために、異なるアプローチを採用する必要があることを意味した。従来、消化された翻訳後修飾タンパク質から誘導されたペプチドデータを、伝統的に指標とされてきた予備消化ペプチドデータバンクに対してサーチすることは、実用的であるとは考えられていなかった。なぜならば、前記ペプチドデータバンク中に保存された各非修飾ペプチドの詳細もまた、修飾の全ての潜在的な組合わせおよびそのような修飾における位置の種々の置換に関連する、多数の追加の記載事項により、完成される必要があるであろうと考えられていたからである。可能性のある修飾および修飾可能部位の置換を全て含むあらゆるペプチドデータバンクは、大きすぎるために、そのようなデータバンクを検索するための検索時間が非常に遅く、実用的でないと考えられていた。
【００１０】
タンパク質に対する可能性のある全ての修飾における記載事項を含むペプチドデータバンクの使用の試みが実用的でないという観点から、翻訳後修飾タンパク質を同定しようとする伝統的なアプローチは、第１に、伝統的なタンパク質データバンク（予備消化ペプチドデータバンクに対立する）に代える。前記タンパク質データバンク中にリストされたタンパク質は、続いて、同時進行で理論的に消化される。すなわち、前記タンパク質は、実験的ペプチドデータが分析にかけられるたびに理論的に消化される。
【００１１】
伝統的なアプローチによれば、ユーザが考究したいと欲する任意の特定の修飾は、続いて、完全に、または一部を、前記タンパク質の理論的消化に由来するペプチド生成物に対して適用する。結果として得られる理論的修飾ペプチドデータは、続いて、実際の実験的マススペクトルデータと比較することができる。前記伝統的アプローチは、それゆえに、任意の数の潜在的な（すなわち、可変的またはランダムの）修飾を支持する検索を可能にする。しかしながら、現在のアプローチにおける１つの欠点は、タンパク質データバンク中にリストされたタンパク質を理論的消化するために、比較的長い時間がかかることである。また、タンパク質データバンク中にリストされたタンパク質の前記理論的消化は同時進行で行われるために、そのように生成された各ペプチドは、ユーザが考究したいと欲する全ての修飾の組合わせに対して分析される必要がある。さらに、潜在的に、考究しなくてはならない多数の異なる修飾因子の入れ替えが存在する。例えば、あるペプチドがいくつかの修飾可能部位を有し、ある単一の修飾を考究する場合、各修飾可能部位は、理論的ペプチドデータを生成させる時、および、実験データに最も良く一致するもの（組合わせおよび入れ替え）を探す時に、順番に考究しなければならない。したがって、伝統的なアプローチは、多数の修飾因子を考究しようとする場合には特に、比較的遅い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、翻訳後修飾されたタンパク質を同定またはキャラクタライズするための、より早い方法の提供が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によれば、修飾タンパク質の同定方法であって、
１の修飾タンパク質を消化して複数のペプチドを生産する工程、
前記複数のペプチドのうち少なくとも１つをイオン化して１またはそれ以上のペプチドイオンを形成する工程、
１またはそれ以上の前記ペプチドイオンを質量分析し、前記ペプチドまたはペプチドイオンのうち少なくとも１つの質量または質量対電荷比を決定する工程、および、
前記修飾タンパク質を、
(i)  １のペプチドまたはペプチドイオンが誘導されたタンパク質が修飾されていなかった場合に前記ペプチドまたはペプチドイオンが有するであろう理論的非修飾質量または質量対電荷比を決定し、
(ii)  前記理論的非修飾質量または質量対電荷比を用いてペプチドのデータバンクを検索し、そして、
(iii)  前記理論的非修飾質量または質量対電荷比に対応する質量または質量対電荷比を有する前記データバンク中のペプチドを決定することにより同定する工程、
を含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
前記修飾タンパク質は、翻訳後に、修飾されたタンパク質、例えば、メチル化、ヒドロキシ化、酸化、ホルミル化、アセチル化、カルボキシ化、リン酸化、硫酸化、システイニル化、グリコサール化、ファルネシル化、ミリストイル化、ビオチニル化、パルミトイル化、またはステアロイル化により修飾されたタンパク質であることが好ましい。
【００１５】
１またはそれ以上の重要な修飾は、決定、選択、または、そうでなければ、考究することが好ましい。前記修飾タンパク質は、少なくとも１の前記重要な修飾により修飾されたと決定または考究することが好ましい。重要な修飾の組合わせは、少なくとも１またはそれ以上（好ましくは全て）列挙することが好ましい。修飾の最大数を決定、選択または考究することが好ましい。好ましくは、重要な修飾の組合わせを列挙する前記工程が、重要な修飾の組合わせを前記修飾の最大数まで列挙することを含む。
【００１６】
前記理論的非修飾質量または質量対電荷比を決定する前記工程は、好ましくは、重要な修飾の組合わせにおける質量または質量対電荷比を計算または決定することを含む。前記理論的非修飾質量または質量対電荷比は、好ましくは、実験的に観測されたペプチドまたはペプチドイオンの質量または質量対電荷比を、前記重要な修飾の組合わせの観点から、改変、置換、阻止、否定、非修飾化または調整することにより得る。この工程は、特に、前記重要な修飾の組合わせにおける質量または質量対電荷比を、前記質量分析工程により決定した前記ペプチドまたはペプチドイオンの質量または質量対電荷比から引き算する（または、それよりは好ましくないが、足し算する）ことを含んでいても良い。
【００１７】
前記方法は、好ましくは、前記ペプチドまたはペプチドイオンにおける前記理論的非修飾質量または質量対電荷比と、前記データバンクにリストされたペプチドの質量または質量対電荷比との間で、質量または質量対電荷比について許容された許容誤差を、決定、選択または考究することをさらに含む。前記質量の許容誤差は：(i) < 0.01 Da; (ii) 0.01-0.02 Da; (iii) 0.02-0.03 Da; (iv) 0.03-0.04 Da; (v) 0.04-0.05 Da; (vi) 0.05-0.06 Da; (vii) 0.06-0.07 Da; (viii) 0.07-0.08 Da; (ix) 0.08-0.09 Da; (x) 0.09-0.10 Da; および (xi) > 0.10 Daからなる群から選択される範囲内に含まれていても良い。前記質量対電荷比の許容誤差は：(i) ≦ 0.1 質量対電荷比ユニット; (ii) ≦ 0.01質量対電荷比ユニット; (iii) ≦ 0.001質量対電荷比ユニット; (iv) ≦ 0.0001質量対電荷比ユニット; (v) ≦ 0.00001質量対電荷比ユニット; および (vi) ≦ 0.000001質量対電荷比ユニットからなる群から選択される範囲内に含まれていても良い。
【００１８】
ペプチドのデータバンクを検索する前記工程は、好ましくは、前記データバンク中にリストされたペプチドのうち、前記理論的非修飾質量または質量対電荷比に対し、前記質量または質量対電荷比について許容された許容誤差の範囲内に対応する質量または質量対電荷比を有するものを、決定または選択することを含む。
【００１９】
前記方法は、好ましくは、前記ペプチドのデータバンク中におけるペプチドのうち、前記理論的非修飾質量または質量対電荷比に対し、前記質量または質量対電荷比について許容された許容誤差の上限値の範囲内に対応する質量または質量対電荷比を有するものを決定することをさらに含む。同様に、前記方法は、好ましくは、前記ペプチドのデータバンク中におけるペプチドのうち、前記理論的非修飾質量または質量対電荷比に対し、前記質量または質量対電荷比について許容された許容誤差の下限値の範囲内に対応する質量または質量対電荷比を有するものを決定することをさらに含む。前記ペプチドのデータバンク中におけるペプチドのうち、前記上限値と前記下限値との間の質量または質量対電荷比を有するものは、好ましくは選択され、および、好ましくはペプチドの初期リストを形成する。
【００２０】
前記ペプチドの初期リスト中におけるペプチドのうち、前記重要な修飾の組合わせのうち少なくとも１つを実際に支持しないものは、好ましくは、拒否するか、捨てるか、または、低い優先順位を割り当て、それにより、可能性のあるペプチドのショートリストを形成する。結果として、好ましくは、前記可能性のあるペプチドのショートリスト中におけるペプチドのうち少なくとも過半数が：(i) 前記ペプチドまたはペプチドイオンの前記理論的非修飾質量または質量対電荷比に対し、前記質量または質量対電荷比について許容された許容誤差の範囲内に対応する質量または質量対電荷比；および(ii) 前記重要な修飾の組合わせのうち少なくとも一つを支持するための、少なくとも同じ数およびタイプの修飾可能部位を有する。
【００２１】
好ましい方法においては、前記可能性のあるペプチドのショートリスト中におけるペプチドの前記修飾可能な部位が、重要な修飾の組合わせと正確に符合するかどうかを決定する。前記可能性のあるペプチドのショートリスト中におけるペプチドの前記修飾可能な部位が、重要な修飾の組合わせと正確にまたは実質的に符合する場合、続いて、前記ショートリスト中における前記ペプチドを、前記ペプチドイオンに対応するフラグメンテーションまたはMS/MSマススペクトルデータに対して評点付ける。スコアリング（評点付けること）は、理論的データと実験的データとの間の適合の正確さを、決定、評価または計算することを含む。しかしながら、もし、前記可能性のあるペプチドのショートリスト中におけるペプチドの前記修飾可能な部位が、重要な修飾の組合わせと正確にまたは実質的に符合しない場合、続いて、前記重要な修飾の組合わせを、それらに当てはまる残基にしたがって分類する。修飾可能部位の組合わせは、続いて、好ましくは列挙し、そして、重要な修飾を、前記修飾可能部位中において、好ましくはグループ毎に基いて、入れ替える。入れ替えた各ペプチドは、続いて、好ましくは、前記ペプチドイオンに対応するフラグメンテーションまたはMS/MSマススペクトルデータに対して評点付けるか、または関連付ける。
【００２２】
前記データバンクは、好ましくは、非修飾タンパク質から誘導されたペプチドのデータバンクを含む。前記データバンク中にリストされたペプチドは、好ましくは、質量または質量対電荷比の順に配列する。特に、前記ペプチドは、単一同位体に基く質量または質量対電荷比の順に配列しても良い。
【００２３】
前記修飾タンパク質を同定する前記工程は、好ましくは、複数の異なるペプチドまたはペプチドイオンに対し、工程(i), (ii) および (iii)を繰り返すことをさらに含む。
【００２４】
本発明の他の一側面によれば、マススペクトロメータであって、
１の修飾タンパク質の消化により誘導された複数のペプチドのうち少なくとも１つをイオン化して１またはそれ以上のペプチドイオンを形成させるイオン源、
前記ペプチドイオンのうち１またはそれ以上を質量分析し、前記ペプチドまたはペプチドイオンのうち少なくとも１つの質量または質量対電荷比を決定する質量分析器、
および、
前記修飾タンパク質を同定する同定手段を含み、
前記同定手段は、使用時において、
(i)  １のペプチドまたはペプチドイオンが誘導されたタンパク質が修飾されていなかった場合に前記ペプチドまたはペプチドイオンが有するであろう理論的非修飾質量または質量対電荷比を決定し、
(ii)  前記理論的非修飾質量または質量対電荷比を用いてペプチドのデータバンクを検索し、そして、
(iii)  前記理論的非修飾質量または質量対電荷比に対応する質量または質量対電荷比を有する前記データバンク中のペプチドを決定する、
マススペクトロメータを提供する。
【００２５】
本発明の他の一側面によれば、
(i)  １のペプチドまたはペプチドイオンが誘導されたタンパク質が修飾されていなかった場合に前記ペプチドまたはペプチドイオンが有するであろう理論的非修飾質量または質量対電荷比を決定し、
(ii)  前記理論的非修飾質量または質量対電荷比を用いてペプチドのデータバンクを検索し、そして、
(iii)  前記理論的非修飾質量または質量対電荷比に対応する質量または質量対電荷比を有する前記データバンク中のペプチドを決定することを含む、
修飾タンパク質の同定方法を提供する。
【００２６】
本発明の他の一側面によれば、修飾タンパク質の同定装置であり、前記装置は、使用時において、
(i)  １のペプチドまたはペプチドイオンが誘導されたタンパク質が修飾されていなかった場合に前記ペプチドまたはペプチドイオンが有するであろう理論的非修飾質量または質量対電荷比を決定し、
(ii)  前記理論的非修飾質量または質量対電荷比を用いてペプチドのデータバンクを検索し、そして、
(iii)  前記理論的非修飾質量または質量対電荷比に対応する質量または質量対電荷比を有する前記データバンク中のペプチドを決定する、
修飾タンパク質同定装置を提供する。
【００２７】
本発明の他の一側面によれば、
(a) １またはそれ以上の重要な修飾を決定、選択または考究すること、
(b) 重要な修飾の組合わせを１またはそれ以上列挙すること、
(c) 前記重要な修飾の組合わせのうち１またはそれ以上における質量または質量対電荷比を計算すること、
(d) 前記重要な修飾の組合わせのうち１つについて計算された質量または質量対電荷比を、実験的に決定したペプチドまたはペプチドイオンの質量または質量対電荷比から引き算し、１のペプチドまたはペプチドイオンが誘導されたタンパク質が修飾されていなかった場合に前記ペプチドまたはペプチドイオンが有するであろう理論的非修飾質量または質量対電荷比を決定すること、
(e) 前記理論的非修飾質量または質量対電荷比を用いてペプチドのデータバンクを検索し、ペプチドの初期リストを生成させること、
(f) 前記ペプチドの初期リストから、前記重要な修飾の組合わせを支持できないペプチドを捨て、それによりペプチドのショートリストを生成させること、および、
(g) 前記ペプチドのショートリスト中におけるペプチドを、フラグメンテーションマススペクトルデータに対して評点付けること、
を含む、修飾タンパク質の同定方法を提供する。
【００２８】
本発明の他の一側面によれば、修飾タンパク質の同定装置であり、前記装置は、使用時において、
(a) １またはそれ以上の重要な修飾を決定、選択または考究し、
(b) 重要な修飾の組合わせを１またはそれ以上列挙し、
(c) 前記重要な修飾の組合わせのうち１またはそれ以上における質量または質量対電荷比を計算し、
(d) 前記重要な修飾の組合わせのうち１つについて計算された質量または質量対電荷比を、実験的に決定したペプチドまたはペプチドイオンの質量または質量対電荷比から引き算し、１のペプチドまたはペプチドイオンが誘導されたタンパク質が修飾されていなかった場合に前記ペプチドまたはペプチドイオンが有するであろう理論的非修飾質量または質量対電荷比を決定し、
(e) 前記理論的非修飾質量または質量対電荷比を用いてペプチドのデータバンクを検索し、ペプチドの初期リストを生成させ、
(f) 前記ペプチドの初期リストから、前記重要な修飾の組合わせを支持できないペプチドを捨て、それによりペプチドのショートリストを生成させ、および、
(g) 前記ペプチドのショートリスト中におけるペプチドを、フラグメンテーションマススペクトルデータに対して評点付ける、
修飾タンパク質同定装置を提供する。
【００２９】
修飾タンパク質同定の好ましい方法は、指標となる、予備消化された非修飾ペプチドのデータバンクに対して、直接検索することを含む。伝統的には、翻訳後修飾タンパク質に関係するペプチドデータを、非修飾タンパク質に関係するペプチドデータバンクに対して直接的に検索することは、可能であるとは考えられてこなかった。しかしながら、前記好ましい実施形態は、この仮定が誤りであることを示している。
【００３０】
有利なことには、前記好ましい実施形態は、考究しようとする任意の数の可変的（ランダム）修飾を許容し、そして、それゆえに、伝統的アプローチとちょうど同じ程度に強力である。しかしながら、前記好ましい実施形態は、タンパク質データバンク中にリストされたタンパク質を同時進行で理論的に消化し、そして続いてそれらを指標とすることを含まないために、かなりの程度、さらに速い。
【００３１】
前記好ましい実施形態の重要な側面は、実験的に観測されたペプチドにおける前記質量または質量対電荷比を、改変し、置換し、または、さもなければ「非修飾化」することにより、ある特定の翻訳後修飾が前記ペプチドの質量に対して有していた効果を阻止または否定することである。重要な翻訳後修飾の過半数は、タンパク質の質量または質量対電荷比を増加させる効果を有し、そして、それゆえに、前記タンパク質から誘導される種々のペプチドの質量または質量対電荷比もまた増加するであろう。この例外の１つは、脱水であり、それは、タンパク質の質量または質量対電荷比を減少させる効果を有する。
【００３２】
翻訳後修飾の効果を阻止、否定または置換する工程は、実験的に測定されたペプチドが誘導されたタンパク質が翻訳後修飾を受けていない場合にそのペプチドが有するであろう質量または質量対電荷比を決定することを含む。前記好ましい方法は、それゆえに、可変的またはランダムの修飾がタンパク質に起こった（そしてそれゆえに、結果として生じたペプチドに影響した）と仮定し、そして、非修飾ペプチドについて計算された質量または質量対電荷比すなわち可能性のある修飾の置換の効果を用いて、伝統的に指標とされてきた非修飾ペプチドの予備消化ペプチドデータバンクを検索する。
【００３３】
全体の検索時間を可能な限り減少するために、前記好ましい実施形態は、可能性のあるペプチド（すなわち、前記ペプチドデータバンク中にリストされたペプチドのうち、前記実験的に観測されたペプチドが続いて非修飾化された場合の質量または質量対電荷比に対応する質量または質量対電荷比を有するもの）を高速で選別する。このことは、前記ペプチドデータバンク中にリストされたペプチドのうち、正確な質量または質量対電荷比を有し得るが、実際に重要な修飾を支持できないものを、除外するか、または捨てることを可能にする。このことは、前記選別（フィルタリング）工程を通過することによりショートリストされたそれらのペプチドが、問題に取り組むために重要な修飾のための好適な修飾可能部位を有することを確実にする。このようにして、前記好ましい実施形態は、続いて実験的ペプチドデータとの可能な対の一方として考究されるべきそれらペプチドを、急速に決定することができる。
【００３４】
いったんペプチドが選別され、可能性のあるペプチドのショートリストが生成されると、それら可能性のあるペプチドは、続いて、第２のキャラクタリゼーション段階で分析され、そして、実験データに対して評点付けられる。
【００３５】
伝統的には、分析されるべき全ての実験的に観測されたペプチドのために、タンパク質データバンク中にリストされた１またはそれ以上のタンパク質の理論的消化を行ない、そして指標とする必要がある。タンパク質の消化生成物を決定するための効果的なアルゴリズムが知られているにも関わらず、タンパク質データバンク中にリストされた理論的消化タンパク質にかけられる時間は、全体の検索時間の大部分に寄与することができる。さらに、タンパク質の理論的消化により生成された全てのペプチドは、続いて、ユーザが選択したランダムな修飾因子の組合わせの適用（もし適用できるならば）により、所定のペプチドに加工され、そして次に、問題となるペプチドにおける、可能性のある異なる修飾可能部位の全ての中で、修飾を入れ替える必要がある。このことは、計算時間の消費にもなるし、さらに、翻訳後修飾タンパク質同定における伝統的方法の特徴である、比較的遅い検索時間全体に寄与する。
【００３６】
修飾タンパク質同定の好ましい方法は、伝統的アプローチに対し、２つの重要な利点を有する。第１に、前記好ましい実施形態によれば、タンパク質データバンク中にリストされたタンパク質を理論的に消化するか、または、ペプチドリストを指標とする必要がなく、そして、それゆえに、それらの比較的時間を消費する工程を避けることができる。第２に、キャラクタライズが必要な、可能性のあるペプチドの数を減少させるか、そうでなければ、急速な方法により制限することができる。
【００３７】
本発明に必須ではないが、前記好ましい実施形態は、正確なマススペクトルデータを用いると特に有利である。これは、例えば、ハイブリッド四重極飛行時間（Time of Flight）マススペクトロメータにより達成可能であり、そして、かなりの程度さらに速い全体の検索時間を得ることを可能にする。例えば、前記好ましい実施形態による典型的な検索時間は、正確なマススペクトルデータを用いると、伝統的な検索より少なくとも８倍速くすることも可能である。正確なマススペクトルデータの使用は、続いて考究またはキャラクタリゼーションされる必要がある、可能性のあるペプチドの数を減少させることに対して特に効果的なペプチドの選別を可能にする。
【００３８】
以下に、本発明の種々の実施形態について、添付の図面を参照しながら記述するが、これらは単なる例示に過ぎない。
【００３９】
図１は、タンパク質に影響し得る可能性のある多数の異なる翻訳後修飾、そのような修飾に由来する質量変化、および、そのような修飾が適用されるペプチド部位を示す。
【００４０】
図２は、好ましい実施形態にしたがって行われる工程を示す。第１段階は、実験的に観測されたペプチドの質量または質量対電荷比を非修飾化すること、前記非修飾ペプチドに対し特定の許容誤差範囲内で一致する質量または質量対電荷比を有するペプチドについてペプチドデータバンクを検索すること、および、続いて、可能性のあるペプチドを選別し、重要な修飾を支持できないペプチドを除外し、可能性のあるペプチドのショートリストを生成させることを含む。前記ショートリストは、正確な質量または質量対電荷比の両方を有し、かつ、１または複数の重要な修飾を理論的に支持する。
【００４１】
図３は、好ましい実施形態にしたがって行われる、続いての工程を示す。第２段階では、先立っての選別段階によりショートリストされたペプチドを、実験的フラグメンテーションデータに対して評点付ける。
【００４２】
図４は、168のペプチドを分析し、そして、異なった数の修飾および修飾可能部位を考究したときの、組合わせの数および行なったバイナリサーチ（binary searches）を示す。
【００４３】
図５は、選別され、続いてキャラクタライズされたペプチドの数、および、２の修飾を考究する場合の、実験データに対してのペプチドの選別、入れ替えおよび評点付けにかかった時間の合計を、より詳しく示す。
【００４４】
図６は、選別され、続いてキャラクタライズされたペプチドの数、および、４の修飾を考究する場合の、実験データに対してのペプチドの選別、入れ替えおよび評点付けにかかった時間の合計を、より詳しく示す。
【００４５】
そして、
図７は、伝統的な検索時間に対して、前記好ましい実施形態により達成された検索時間の相対的な結果を示し、そして、前記好ましい実施形態にしたがって達成できる検索時間全体における進歩を示す。
【００４６】
マススペクトルデータおよびタンパク質データバンクを用いたタンパク質の急速な同定は、現在、プロテオームの仕事における標準的な技術である。この分野の研究が発展するとともに、タンパク質をキャラクタライズできる能力、および特に、タンパク質に対する任意の翻訳後修飾の存在および位置を決定できる能力の重要性が増大してきている。前記好ましい実施形態は、翻訳後修飾タンパク質を伝統的な技術よりも速く同定できる方法に関する。
【００４７】
図１は、タンパク質に影響し得る翻訳後修飾およびそのような修飾を適用し得るペプチドの部位または残基のリストを示す。この図は、さらに、前記修飾により引き起こされたタンパク質の質量に結果として起こる変化（標準増加）を示す。
【００４８】
タンパク質消化により誘導されたペプチドを、マススペクトロメータのフラグメンテーション室における衝突でフラグメンテーションにかけることが知られている。結果として得られるフラグメンテーションまたはMS/MSマススペクトルデータは、続いて、データバンク中に保持されたデータに対して、またはデータバンク中に保持されたデータから誘導されたデータに対して、検索することにより、分析することができる。１またはそれ以上の可変的修飾は、そのような検索中に、選択し、および考究することができる。
【００４９】
しかしながら、非修飾ペプチドのみをリストした伝統的な予備消化ペプチドデータバンクを用いて修飾ペプチドを検索することは、実際に可能だとは考えられてこなかった。そのような検索の実行を可能にするためには、前記ペプチドデータバンクが、修飾の潜在的な組合わせのうち可能性のある全てのもの、およびそれらのペプチドを入れ替えたものを許容しなければならないと思われていた。その結果、前記ペプチドデータバンクは、大きく増大する必要があり、結果として、前記データバンクは、大きくなり過ぎ、そして、それを検索するには非実用的すなわち検索時間が極めて遅いと考えられていた。
【００５０】
この理由により、前記伝統的なアプローチにおいて予備消化ペプチドデータバンクを用いることは試みられず、むしろ、タンパク質データバンクの使用から始まり、そして次に、前記タンパク質データバンク中にリストされたタンパク質を同時進行で理論的に消化していた。その後、前記消化工程に由来して決定されたペプチドに対し可変的修飾を適用することができる。結果として生じた理論的修飾ペプチドは、続いて、現実の実験的ペプチドデータに対して比較することができる。特に、選択したペプチドは、マススペクトロメータのフラグメンテーション室内で断片化（フラグメンテーション）することが可能であり、そして、結果として生じたフラグメンテーションマススペクトルデータは、前記タンパク質データバンク中にリストされたタンパク質の理論的消化により得られたペプチドを理論的にフラグメンテーションして得られた理論的フラグメンテーションデータに対して、比較することができる。この伝統的アプローチによれば、前記タンパク質データバンク中の各タンパク質は順番に消化され、そして、その工程は続いて繰り返される。
【００５１】
前記伝統的アプローチとは対照的に、前記好ましい実施形態は、翻訳後修飾されたと信じられているタンパク質から誘導されたペプチドについて検索する時、指標となる予備消化非修飾ペプチドデータバンクを利用する。そのようなアプローチは、したがって、タンパク質データバンク中にリストされたタンパク質を同時進行で消化することの必要を回避している。可変的修飾の検索もまた、比較的速く行なうことができる。前記好ましい実施形態によれば、例えば四重極飛行時間マススペクトロメータにより得られた正確なマススペクトルデータは、高速でのペプチド選別の実行を可能にする。このことは、検索時間をかなりの程度減少させることを可能にし、そして、さらに急速なタンパク質キャラクタリゼーション手段を可能にする。
【００５２】
前記ペプチドデータバンク中にリストされた非修飾ペプチドのうち検索されたものは、データバンク検索を容易にするために、分類し、そして、単一同位体に基く質量の順番に配列することが好ましい。重要なことは、前記好ましい実施形態は、前記ペプチドデータバンク中に保存された非修飾ペプチドに対する直接的な検索を含むということである。したがって、考究される可能性のある多数の異なる修飾をカバーするために、前記ペプチドデータバンク中におけるペプチド毎に複数の記載事項の提供を試みる必要がない。予備消化非修飾ペプチドのデータバンクを使用することは、検索工程を大いに単純化する。
【００５３】
前記非修飾ペプチドデータバンクに対して検索することは、好ましくは、２つの主な一連の段階、すなわち、第１の選別段階および続いての第２のキャラクタリゼーション段階を含む。
【００５４】
前記第１段階においては、可能性のあるペプチドの初期リストが生成される。この初期リスト中における全てのペプチドは、実験的に観測されたペプチド（前記好ましい実施形態にしたがって非修飾化されたと同様）に対し、ユーザ定義による許容誤差の範囲内で一致する質量または質量対電荷比を有する。この初期リストは、続いて、好ましくは、可能性のある候補ペプチドのショートリストを生成させるために選別する。この選別工程は、前記初期リストから、重要な修飾を支持できない全てのペプチドを除くことを含む。結果として得られたショートリスト中における全てのペプチドは、それゆえに、考究される修飾を支持するペプチド部位を有することが好ましい。
【００５５】
前記可能性のあるペプチドのショートリスト中におけるペプチドは、続いて、ペプチドキャラクタリゼーション（同定および修飾位置）に関連する第２段階で加工し、そして、ショートリストされた各ペプチドは、分析されようとしている実験的に観測されたペプチドに関連するフラグメンテーションデータに対して評点付ける。
【００５６】
前記好ましい実施形態にしたがって実行される第１の高速ペプチド選別（フィルタリング）段階は、図２に関して、示し、かつ、より詳細に記述する。
【００５７】
前記好ましい実施形態によれば、ユーザ選択による修飾因子の、異なる組合わせは、順番に取得され、そして、分析されようとしている実験的に観測されたペプチドに対応するデータに対して適用される。前記好ましい実施形態によれば、実験的に観測されたペプチドは、翻訳後修飾タンパク質から誘導されたと仮定する。それゆえに、前記実験的に観測されたペプチドの質量または質量対電荷比を調整し、または「非修飾化」し、１またはそれ以上の仮定された修飾を参酌する。例えば、セリンのリン酸化が重要な修飾因子または修飾の１つである場合、続いて、単一のホスホリル修飾因子(H2PO3)を、異なる組合わせについて列挙したと考える。実験的に観測されたペプチドがリン酸化セリン１つを支持すると仮定される場合、続いて、その質量は、結果として79.9663増加される。それゆえに、予備消化非修飾ペプチドのデータバンクに対して検索するために、前記実験的に観測されたペプチドの質量を、タンパク質のリン酸化を考慮して、実験的に決定した質量から前記数値79.9663を引き算することにより、調整または非修飾化する。
【００５８】
実験的に決定した質量または質量対電荷比を調整または非修飾化し、そして、前記調整または非修飾化したペプチド質量または質量対電荷比を用いて前記ペプチドデータバンクに対して検索する上述のアプローチは、前記好ましい実施形態の重要な側面である。このアプローチは、続いて、伝統的に指標とされる予備消化ペプチドデータバンクに対して行なわれる検索を可能にし、同時に、種々の修飾の考究を可能にする。１またはそれ以上の仮定された修飾を考慮して、前記実験的に観測されたペプチドの質量または質量対電荷比を変更し終わると、前記ペプチドの新しい（非修飾化した）理論的質量を用いて、すぐに前記指標となるペプチドデータバンクを検索することができる。そのようなペプチドデータバンク検索からのアウトプットは、前記実験的に観測されたペプチド（前記好ましい実施形態にしたがって非修飾化された）に対して一定の許容誤差範囲内で一致する質量または質量対電荷比を有する、可能性のあるペプチドの初期リストを含むであろう。このペプチド初期リストは、続いて、好ましくは、候補ペプチドのショートリストを提供するために選別（フィルタリング）する。前記ショートリスト中の全てのペプチドは、修飾因子の望ましい組合わせを支持することが好ましい。言い換えると、可能性のあるペプチドの前記ショートリストは、全てが修飾可能部位の正確な数を少なくとも有し、そして前記修飾可能部位が正確なタイプである、ペプチドのリストを含むであろう。ホスホリル修飾因子１つに関連する上記例を続けると、選別（フィルタリング）工程後、可能性のあるペプチドの前記ショートリスト中におけるペプチドは、全て、少なくとも１つのセリン残基を有し、および、前記観測されたペプチド（前記好ましい実施形態にしたがって非修飾された）と実質的に一致する質量または質量対電荷比を有するであろう。
【００５９】
前記ペプチドデータバンク中のペプチドデータは、好ましくは質量の順番に分類または配列するため、実験的に観測されたペプチド（前記好ましい実施形態にしたがって非修飾化された）の質量または質量対電荷比と同一の質量または質量対電荷比を有する、可能性のある全てのペプチドは、２のバイナリサーチを用いて前記ペプチドデータバンクから得ることができる。前記２のバイナリサーチは、前記非修飾ペプチドの質量または質量対電荷比に対し、ユーザ定義による質量または質量対電荷比許容誤差ユニットをプラスおよびマイナスしたものに対応する。そのようなバイナリサーチは、それゆえに、上方または下方限度のペプチドを生成させ、それらの間では、前記ペプチドデータバンク中にリストされた全てのペプチドが、前記実験的に観測されたペプチド（前記好ましい実施形態にしたがって非修飾化された）に対して一定の許容誤差範囲内で一致する質量または質量対電荷比を有するであろう。
【００６０】
例えば四重極飛行時間マススペクトロメータを用いて、イオンについて質量対電荷比を正確に測定することにより、ユーザ定義による許容誤差を小さく保つことができるゆえに、前記２のバイナリサーチから生じた、可能性のあるペプチドの数は、有利なことに、可能な限り小さくすることができる。この初期リストは、続いて、直ちにショートリストへと縮めることができる。なぜならば、前記実験的に観測されたペプチド（前記好ましい実施形態にしたがって非修飾化された）に対して質量または質量対電荷比が一致する多数のペプチドは、実際には現在の修飾の組合わせを支持しないと思われ、すなわち、前記ペプチドは、適切な１または複数の修飾可能部位を含まないであろうからである。
【００６１】
好ましくはそれに対して検索される、指標となるペプチドデータバンクは、好ましくは、記録の直線配列からなる。各記録は、好ましくは、前記ペプチドにおける単一同位体に基く正確な質量または質量対電荷比の詳細を伴う、タンパク質指標情報（すなわち、タンパク質データベース中においてペプチドを対応するタンパク質に結び付ける情報）を含んでいても良い、多数のフィールドからなる。各ペプチドの記載事項は、好ましくは、特定のタンパク質配列（シーケンス）の範囲内におけるペプチドの長さおよび位置に関係する情報をさらに含む。
【００６２】
前記ペプチドデータバンク中に保存されたペプチドの記録は、好ましくは、質量または質量対電荷比の順番に分類し、および配列する。したがって、ある一定値に対してユーザ定義による許容誤差の範囲内の質量または質量対電荷比を有するペプチドを発見するためには、前記ペプチドデータバンクの範囲内で上方および下方限度を見つけるためにバイナリサーチを行なうことのみが必要である。
【００６３】
多数の消化物を支持することが必要であれば、続いて、追加の整数フィールドを各ペプチド記録中に含ませても良い。前記追加の整数フィールド中における各ビットは、与えられたペプチドが与えられた消化物の生成物であることを示すフラグとして用いても良い。追加のフィールドは、同様に、タンパク質評点（スコアリング）計画に組み込まれる、消化確率を含んでいても良い。
【００６４】
好ましい検索方法は、例えば、C/C++プログラミング言語を用いて書かれ、そして、Microsoft Visual Studio (登録商標)バージョン6.0を用いてMicrosoft Windows (登録商標) XP プラットフォーム上で走らせるためにコンパイルされたソフトウェアコードを用いて実行しても良い。前記好ましい実施形態によれば、タンパク質のトリプシン消化物に基く、指標となるペプチドデータバンクを、生成させ、そして、コンピュータのメインメモリ内にロードしても良い。前記ペプチドデータバンクは、次に、初期選別されそしてショートリストされようとするペプチドである、可能性のあるペプチドに対して検索し、続いて、前記好ましい実施形態にしたがってキャラクタライズしても良い。
【００６５】
他の一実施形態によれば、２の指標ファイル（インデックスファイル）を作成する、やや異なる指標化計画を用いても良い。前記指標ファイルの１つは、ペプチドの、単一同位体に基く正確な質量または質量対電荷比を、対応する第２のファイルを示すペプチドの指標（インデックス）情報とともに、ちょうど含む。前記第２のファイルは、ペプチドに関する情報、すなわち、タンパク質指標情報、ならびに、特定のタンパク質配列（シーケンス）の範囲内におけるペプチドの長さおよび位置に関する情報をさらに含んでいても良い。
【００６６】
前記好ましい実施形態は、複数回（同一のまたは異なるタンパク質記載事項に）出現する個々のトリプシン性ペプチドを扱うので、前記指標となるペプチドデータバンクは、同一のペプチド（特に小さいペプチド）の多数のコピーを含んでいても良い。好ましくは、前記データバンクの単一のコピーのみを処理システムのメモリ中に保持するために、共用メモリモデルを用いても良い。
【００６７】
一実施形態によれば、複数回消化を扱うためのメカニズムを実行しても良い。前記ペプチド記録は、例えば、前記ペプチドに関連する開裂ミスの数を示すフラグを含んでいても良い。
【００６８】
図２に関して、好ましく実行されるペプチド選別工程をより詳細に記述する。第１に、好ましくは、ユーザ選択修飾因子の全ての組合わせを列挙する。Tucker in Applied Combinatorics (John Wiley & Sons Inc. 2001)に記述されているアルゴリズムのような、全ての組合わせを列挙するための標準アルゴリズムを用いても良い。これは、（異なるサイズの）全ての組合わせを繰り返し得る工程である。与えられた修飾因子数ｎおよび修飾可能部位の定数ｋに対して、組合わせの（すなわちサイズｋの）総数は、下記式で与えられる。
【００６９】
【数１】
0004651341.tif 000002
【００７０】
部位の数が未知であるため、修飾可能部位の範囲を、ゼロから、ユーザ指定によるいくらかの修飾可能部位最大数まで考慮することが必要である。そして、実験データに対して検索毎に考究される組合わせの総数は、下記式で与えられる。
【００７１】
【数２】
0004651341.tif 000003
【００７２】
それらの各組合わせに対して、修飾による質量または質量対電荷比の変化を計算し、そして、好ましくは、分析しようとする各ペプチドについて実験的に決定した質量または質量対電荷比から引き算する。指標となるペプチドデータバンクに対する、それゆえに行なう必要があるバイナリサーチBsの数は、下記式で与えられる。
【００７３】
【数３】
0004651341.tif 000004
【００７４】
式中、Tqは、質問の総数である。上限検索および下限検索の両方が要求されるため、ファクター２が含まれている。データバンクの検索は、好ましくは、上方および下方限界のペプチドを得るために、反復のバイナリサーチを用いる。それらの質量限界ペプチドを、次に、選別する。
【００７５】
選別（フィルタリング）段階は、好ましくは、続いてキャラクタライズされる全ての可能性のあるペプチドが、正しい数の残基を少なくとも含み、そしてそれらの残基が正しい種類であることを確実にする。前記選別段階は、それゆえに、前記可能性のあるペプチドの残基を数えること、および、前記可能性のあるペプチドを現在の修飾因子の組合わせと比較することを含む。修飾因子が１つの残基のみに当てはまることは重要である。いくつかの残基に当てはまる可能性のある特定の修飾因子（退化修飾因子）は、いくつかの非退化修飾因子として再考慮する。
【００７６】
それゆえに、データバンク中のペプチドを指標とするとともに前記ペプチドの質量対電荷比を正確に測定することは、処理における前記第１段階が高速フィルターとして働き、続いて、第２段階においてキャラクタライズする必要のあるペプチドの数を減少させることを可能にする。
【００７７】
いったんペプチドのショートリストが形成されると、続いて、第２のキャラクタリゼーション段階が、前記可能性のあるペプチドのショートリストに対して行われる。このキャラクタリゼーション段階を、図３に関連して示し、かつ、より詳細に記述する。前記キャラクタリゼーション段階は、前記ペプチドの修飾可能部位の中で、修飾因子の、可能性のある入れ替えを行ない、そして、各入れ替えを、実験的に観測されたフラグメント(MS/MS)マススペクトルデータに対して評点付ける。
【００７８】
前記キャラクタリゼーション段階は、多数の工程を含む。第１に、ショートリストされまたは選別された各ペプチドについて、問題となっているペプチドの修飾可能部位が、現在の修飾因子の選択と正確に一致するかどうかを決定する。正確に一致する場合、次に、前記ペプチドを、実験的に誘導されたフラグメンテーションまたはMS/MSデータに対して評点付け、そして、続いて、次のショートリストされたペプチドを考究する。
【００７９】
しかしながら、もし、前記ペプチドの修飾可能部位が現在の修飾因子の選択と正確に一致しない場合、次に、選択した修飾の組合わせを、好ましくは、前記修飾因子が当てはまる残基にしたがって分類する。続いて、修飾可能部位の組合わせの全てを列挙する。前記部位中の修飾因子は、続いて、好ましくは、グループ毎に入れ替えられようとする修飾部位と入れ替えられる。これは、前記可能性のあるペプチドには、修飾する必要があるよりも多くの修飾可能部位があっても良いからである。そのように、修飾可能な部位の数が与えられ、そして、修飾因子の数が適用されると、適用された修飾を有し得る部位の組合わせの全てを選択する。
【００８０】
実例として、ペプチドPGPCCKDKCECAEGGCKTを考究しても良い。それは、例えば、CとKが修飾可能であり、そして、４つの修飾可能部位の制限が強制可能であると決定しても良い。したがって、それらが発現する通りに修飾され得る８つの部位は、順番に、CCKKCCCKである。種々の可能性は、したがって、以下の通り列挙することができる。すなわち、(i) CCKK  (ソフトウェアでは、サイズ4のアレイが0123と表される); (ii) CCK C  (ソフトウェアでは、サイズ4のアレイが0124と表される); (iii) CCK C  (ソフトウェアでは、サイズ4のアレイが0125と表される); (iv) CCK C  (ソフトウェアでは、サイズ4のアレイが0126と表される); (v) CCK K (ソフトウェアでは、サイズ4のアレイが0127と表される); (vi) CC KC  (ソフトウェアでは、サイズ4のアレイが0134と表される)... 等である。しかしながら、１つのK修飾および３つのC修飾のみが許容され、そのことは、上で列挙した(i)等のいくつかの可能性が捨てられ得ることを意味する。
【００８１】
有効な各修飾可能部位の組合わせについて、修飾因子は、続いて、好ましくは、前記修飾因子が当てはまる部位内において入れ替える（グループ毎に基いて）。したがって、もし、M1がCに当てはまり、M2がCに当てはまり、M3がCに当てはまり、およびM4がKに当てはまる場合、続いて、M1、M2およびM3は、これら３つの位置の全ての中で当てはめられなければならず、そして、それらの各位置について、M4はKに当てはめられなければならない。それは、続いて、次の列挙のために繰り返される。そのような処理を行なうためのアルゴリズムは、例えば、Knuth の"The Art of Computer Programming" 第４巻, (予備分冊2b: Generating all permutations)等に開示されているような標準辞書式アルゴリズムを用いても良い。
【００８２】
各修飾因子の入れ替えについて、入れ替えたペプチドを、実験的に得られたフラグメンテーションまたはMS/MSデータに対して評点付け、そして、続いて、次の入れ替えを考究する。いったん全ての入れ替えを考究し終えると、次のショートリストされたペプチドを考究する。
【００８３】
前記好ましい実施形態にしたがって達成可能な、検索時間全体の向上を示す実験結果について述べる。結果のセットを２つ示す。１つのセットは、２つの修飾因子のみを考究した場合に選られ、そして、他のセットは、４つの修飾因子を考究した場合に得られる。
【００８４】
ランダムに選択した５つのタンパク質を考究した。これら５つのタンパク質は、TCMO MEDSA, SNC2 YEAST, DAK2 SCHPO, CSPB BACGO および FMT BOVINを含む。前記タンパク質は、トリプシンおよび１のミス開裂を用いて理論的に消化した。結果として得られたペプチドのうち、８残基未満の長さまたは２４残基を越える長さのものは、さらなる考究から捨て、総数168のペプチドを考究すべきものとして残した。それらの残った168のペプチドを、続いて修飾した。
【００８５】
前記５つのランダムに選択したタンパク質の配列（シーケンス）を読み、そして次に、２つまたは４つの修飾を、前記配列中の適切な残基に当てはめた。さらなるランダム効果を導入するために、それらの残基のうち、そのペプチド配列内において偶数位を有していた残基のみを修飾した。許容された、４つの可能性のある修飾は、トレオニンに当てはめられたパルミトイル化、セリンに当てはめられたホスホリル、システインに当てはめられたカルボキシメチル、およびアスパラギン酸に当てはめられたヒドロキシルであった。
【００８６】
図４は、組合わせの総数、ならびに、前記168のペプチドに対して、異なる数の修飾および修飾可能部位について検索するために必要とされるバイナリサーチを示す。図５は、２つの修飾因子についての結果をより詳細に示し、図６は、４つの修飾因子についての結果をより詳細に示す。
【００８７】
図５および６は、可能性のあるペプチドの初期選別（フィルタリング）における第１段階、および、続いてペプチドを入れ替え、そして評点付けする第２段階において、かかった時間を別個に示す。これらの図は、さらに、異なる質量許容誤差および修飾可能部位の最大数を考究した場合の、対応する結果を示す。前記時間は、105224の記載事項を含むスイスプロットデータベースから誘導し、そしてトリプシン消化を用いて指標としたペプチドデータバンクに対して、検索することにより得た。コードは、Compaq Evo W6000 (登録商標)上において、1.7 GHzで、シングルプロセッサオペレーションで走らせた。
【００８８】
図５および６は、ペプチドの選別にかかった時間、ならびに、最終ペプチドすなわち全ての潜在的組合わせを入れ替えおよび評点付けするのにかかった時間を示す。修飾因子および修飾可能部位の数が増加すると、続いて選別しなければならないペプチドが、かなりの程度でより多く初期生成されたことが見て取れる。しかしながら、重要なことは、ペプチドの総数が増加しても、前記選別（フィルタリング）工程を通過するペプチドの数が同じ割合で増加していないことである。考究しようとするペプチドの総数が増加するにつれて、選別時間は、検索時間全体におけるより重大な部分となり始める。このことは、考究しようとする組合わせの数が増加するにつれて、同じペプチドについて、それが現在の組合わせを支持できるか否か決定するために繰り返し評価されるようになるという事実に依存する。同様に、前記同じペプチドは、このテストに繰り返し失敗するであろうし、そしてそれゆえに、評点付け（スコアリング）を必要としないであろう。
【００８９】
質量許容誤差を広げることは、追加のペプチドが考究され、そしてフィルターを通過する結果となる。例えば、質量許容誤差が0.01 Daから0.10 Daに増加すると、続いて、考究されるペプチドの総数は、約１０倍のファクターで増加し、そして、そのことは、選別時間が対応して増加する結果につながる。したがって、分析されるペプチドの質量または質量対電荷比を正確に決定することは、考究する必要があるペプチドの総数を顕著に減少させることができるために、特に有利であることが見て取れる。あるペプチドが有する残基の数および型に関する情報を保存することにより、さらなる向上が得られる。例えば、繰り返しの計算を回避し、そしてそれに伴って、選別時間およびそれゆえに検索時間全体を減少させるために、メモリキャッシュを用いても良い。
【００９０】
図７は、伝統的な検索時間の、前記好ましい実施形態による検索時間に対する比較結果を示す。伝統的検索時間と比較すると、前記好ましい実施形態が、検索時間全体の顕著なスピードアップを可能にしていることが見て取れる。伝統的検索時間は、Proteinlynx (登録商標) Global Server 2.05B19を用いて得た。前記好ましい実施形態による検索時間は、図５および６に強調して示したいくつかの結果から得た。図７にリストされた、前記好ましい実施形態に関する検索時間は、分析されるペプチドのデータを読むのに約２秒を含む。
【００９１】
図７に示す結果から、質量許容誤差が増加すると、続いて、それに対応して、伝統的技術を用いた場合にかかる検索時間と比較しての前記好ましい実施形態による検索時間のスピードアップファクター（または向上）の低下があることが見て取れる。おそらくは、伝統的な同時進行インプリメンテーションもまた、対応して増加した数のペプチドをより広い質量許容誤差で取り扱わなければならないゆえに、この向上の低下の理由は、現在は全てが明らかではない。それにも関わらず、この結果は、前記好ましい実施形態によるペプチドの分析にかかった検索時間全体を、伝統的検索時間と比較すると顕著に減少できることを示す。このことは、ペプチドの質量または質量対電荷比を正確に測定した場合、すなわち、前駆体または親イオンの質量許容誤差が小さく保たれた場合には、特に顕著である。したがって、本発明は、技術の顕著な向上を意味する。
【００９２】
前記好ましい実施形態は、重要な修飾の数がゼロに設定されている場合には、タンパク質同定にも適する。
【００９３】
本発明を、好ましい実施形態に関して記述したが、添付の請求の範囲に述べる本発明の範囲から逸脱しない限り、形態および詳細における種々の変更が可能であることが、技術における熟練者には理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】タンパク質に影響し得る可能性のある多数の異なる翻訳後修飾、そのような修飾に由来する質量変化、および、そのような修飾が適用されるペプチド部位を示す。
【図２】好ましい実施形態にしたがって行われる工程を示す。
【図３】好ましい実施形態にしたがって行われる、続いての工程を示す。
【図４】168のペプチドを分析し、そして、異なった数の修飾および修飾可能部位を考究したときの、組合わせの数および行なったバイナリサーチ（binary searches）を示す。
【図５】選別され、続いてキャラクタライズされたペプチドの数、および、２の修飾を考究する場合の、実験データに対してのペプチドの選別、入れ替えおよび評点付けにかかった時間の合計を、より詳しく示す。
【図６】選別され、続いてキャラクタライズされたペプチドの数、および、４の修飾を考究する場合の、実験データに対してのペプチドの選別、入れ替えおよび評点付けにかかった時間の合計を、より詳しく示す。
【図７】伝統的な検索時間に対して、前記好ましい実施形態により達成された検索時間の相対的な結果を示し、そして、前記好ましい実施形態にしたがって達成できる検索時間全体における進歩を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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