(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１５に示されるアミノ酸配列よりなるペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドの薬剤的有効量を含んでなる胃腸炎症の処置用製薬学的組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドの薬剤的有効量を含んでなる炎症性腸疾患の処置用製薬学的組成物。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドの薬剤的有効量を含んでなる腹腔疾患の処置用製薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の進展は、メリーランド州ボルチモアのメリーランド大学(Universityof Maryland, Baltimore, Maryland) により支援された。本明細書に記載する本発明は、国立衛生研究所(National Institute of Health)からの資金により支援された（ＮＩＨ、ＤＫ−４８３７３）。政府は一定の権利を保有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ゾヌリン(zonulin) のペプチドアンタゴニスト、ならびにその使用方法に関する。該ペプチドアンタゴニストは、閉鎖帯受容体に結合するが、しかしヒト密着結合の開放(open)を生理学的に調整はしない。
【０００３】
発明の背景
１．腸密着結合の機能および調節
密着結合（”ｔｊ”）または閉鎖帯（以後「ＺＯ」と呼ぶ）は、吸収および分泌上皮の顕著な特徴の一つである〔マダラ(Madara, J. Clin. Invest., 83:1089-1094 (1989));およびマダラ「分泌性下痢の教科書」レベンタールら編集、第１１章(Madara, Textbook of Secretory Diarrhea, Eds. Lebenthal et al., Chapter 11, p125-138 (1990))〕。頂端部と側底部との間のバリアーとして、これらはイオンおよび水溶性溶質の細胞外(paracellular)経路を通じる受動拡散を選択的に調節する〔グンビナー(Gumbiner, Am. J. Physiol. 253(Cell Physiol. 22): C749-C758 (1987)) 〕。このバリアーは、細胞通過経路に関連する経路の活動により発生するあらゆる勾配を維持する〔ダイアモンド(Diamond, Physiologist, 20: 10-18 (1977)) 〕。
【０００４】
腸細胞原形質膜の抵抗が比較的高いので、上皮通過コンダクタンスの変動は、通常、細胞外経路の透過性の変化に帰せられる（マダラ、上記）。閉鎖帯は、この細胞外経路内の主要なバリヤーであり、上皮組織の電気抵抗は、閉鎖帯中の膜通過タンパク質ひも状体(strand)の数およびその複雑度に依存するように見え、これは冷凍割断電子顕微鏡により観察される〔マダラら(Madara et al., J. Cell. Biol., 101:2124-2133 (1985)) 〕。
【０００５】
閉鎖帯は、以前は静的構造と考えられていたが、実際には動的であり、各種の発生的〔マグヌソンら(Magnuson et al., Dev. Biol., 67:214-224 (1978)); レヴェルら(Revel et al.,Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 40:443-455(1976));およびシュネーバーガーら(Schneeberger et al., J. Cell Sci., 32:307-324 (1978))〕、生理学的〔ジルラら(Gilula et al., Dev. Biol. 50:142-168 (1976));マダラら(Madara et al., J. Membr. Biol., 100:149-164 (1987));マザリエゴスら(Mazariegos et al., J. Cell. Biol., 98:1865-1877 (1984));およびサルデットら(Sardet et al., J. Cell. Biol., 80:96-117 (1979)) 〕、および病理学的〔ミルクスら(Milks et al., J. Cell. Biol., 103:2729-2738 (1986)); ナッシュら(Nash et al., Lab. Invest., 59:531-537 (1988)); およびシャズビーら(Shasby et al., Am. J. Physiol., 255(Cell Physiol., 24):C781-C788 (1988)) 〕環境に直ちに適応するという多くの証拠が存在する。この適応の基礎となる調節機構はまだ完全には理解されていない。しかし、Ｃａ2+が存在すると、生化学的事象の複雑なカスケードを開始させ、それは最終的には、その組成はまだ部分的にしか特性解明されていない閉鎖帯要素の組織化されたネットワークの形成および調整に導く閉鎖帯のアセンブリーは細胞相互作用の結果であることは明らかである〔ダイアモンド(Diamond, Physiologist, 20:10-18 (1977))〕。膜浸透タンパク質ひも状体の候補であるオクルディンが最近同定された〔フルセら(Furuse et al., J. Membr. Biol., 87:141-150 (1985)) 〕。
【０００６】
６種のタンパク質が、膜接触部の下にある細胞質亞膜性プラーク内で同定されたが、しかしこれらの機能はまだ確立されていない（ダイアモンド、上記）。ＺＯ−１およびＺＯ−２は、特性不明の１３０ｋＤタンパク質（ＺＯ−３）との界面活性剤安定性複合体内でヘテロダイマーとして存在する〔ガンビナーら(Gumbiner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:3460-3464 (1991)) 〕。大部分の免疫電子顕微鏡研究では、ＺＯ−１を膜接触部の直下に位置づけている〔スチーブンソンら(Stevenson et al., Molec. Cell. Biochem., 83:129-145 (1988))〕。２種の他のタンパク質、シングリン(cingulin)〔シティら(Citi et al., Nature (London), 333:272-275 (1988))〕および７Ｈ６抗原〔ツォングら(Zhong et al., J. Cell Biol., 120:477-483 (1993)) 〕は、膜からさらに離れて位置づけられ、まだクローニングされていない。小さいＧＴＰ結合タンパク質であるＲａｂ１３も、最近接合領域に位置づけられた〔ザラウイら(Zahraoui et al,, J. Cell Biol., 124:101-115 (1994))〕。その他の小さいＧＴＰ結合タンパク質は、皮質細胞骨格を調節することが知られており、すなわちｒｈｏはフォーカルコンタクト内のアクチン膜付着を調節し〔リドレーら(Ridley et al, Cell, 70:389-399 (1992)) 〕、またｒａｃは成長因子誘導の膜の波うち運動を調節する〔リドレーら(Ridley et al, Cell, 70:401-410 (1992)) 〕。より良く特徴が解明されている細胞接合部のフォーカルコンタクト〔グアンら(Guan et al., Nature,358:690-692 (1992)) 〕、および接着結合部〔ツキタら(Tsukita et al., J. Cell Biol., 123:1049-1053 (1993)) 〕中のプラークタンパク質の既知の機能との類推に基づいて、ｔｊ−関連プラークタンパク質は、細胞膜を貫通する両方向へのシグナルの伝達、および皮質アクチン細胞骨格への連結の調節に関与しているとの仮説が立てられている。
【０００７】
上皮がさらされる多数の生理学的および病理学的な誘導に対処するために、閉鎖帯は、複雑な調節系の存在を必要とする迅速で協調的な応答が可能でなければならない。閉鎖帯の構築および調節に関与する機構の正確な特徴解明は、最近の活発な研究の領域である。
【０００８】
現在、ｔｊの構造的および機能的連結が、吸収細胞のアクチン細胞骨格とｔｊ複合体間に存在するという一連の証拠がある〔ガンビナーら、上記; マダラら、上記; およびドレンチャーンら(Drenchahn et al., J. Cell Biol., 107:1037-1048 (1988)) 〕。アクチン細胞骨格は、微細フィラメントの複雑な網目から構成されており、その正確な構成はアクチン結合タンパク質の大きい構造により調節されている。アクチン結合タンパク質のリン酸化の状態が、細胞形質膜への細胞骨格の連結をどのようにして調節するかの一例は、ミリストイル化されたアラニンリッチなＣキナーゼ基質である（以後「ＭＡＲＣＫＳ」と呼ぶ）。ＭＡＲＣＫＳは、形質膜の細胞質面と連合される特異性タンパク質キナーゼＣ（以後「ＰＫＣ〕と呼ぶ）基質である〔アデレム(Aderem, Elsevier Sci. Pub. (UK), 438-443 (1992))〕。その非リン酸化形で、ＭＡＲＣＫＳは膜アクチンに架橋する。従って、ＭＡＲＣＫＳを介して膜と連合するアクチン網目は、比較的剛直であるらしい〔ハートヴィッグら(Hartwig et al., Nature, 356:618-622 (1992))〕。活性化したＰＫＣはＭＡＲＣＫＳをリン酸化し、これは膜から解放される〔ローゼンら(Rosen et al., J. Exp. Med., 172:1211-1215 (1990)); およびテレンら(Thelen et al., Nature, 351:320-322 (1991)) 〕。ＭＡＲＣＫＳに連結されたアクチンは、膜から空間的に分離され、より可塑性であるらしい。ＭＡＲＣＫＳが脱リン酸化された場合に、これは膜に戻り、そこで再びアクチンと架橋する〔ハートヴィッグら、上記；およびテレンら、上記〕。これらのデータは、Ｆ−アクチンのネットワークが、アクチン結合タンパク質（ＭＡＲＣＫＳはその一つである）を含むＰＫＣ依存リン酸化プロセスにより再配列され得ることを示唆している。
【０００９】
種々の細胞内媒介体が、ｔｊの機能および／または構造を改変することが証明されている。両生類胆のう〔デュフェイら(Duffey et al., Nature, 204:451-452 (1981)) 〕、および金魚〔バッカーら(Bakker et al., Am. J. Physiol., 246:G213-G217 (1984))〕およびカレイ〔クラスネイら(Krasney et al., Fed. Proc., 42:1100 (1983))〕の両者の腸の密着結合は、細胞内ｃＡＭＰが上昇すると、受動イオン流への抵抗増大を示す。また、Ｃａ2+イオノホアへの両生類胆のうの暴露は、ｔｊ抵抗を増大させ、そしてｔｊ構造中の改変を誘導するように見える〔パラントら(Palant et al., Am. J. Physiol., 245:C203-C212 (1983))〕。さらに、フォルボールエステルによるＰＫＣの活性化は、腎臓〔エリスら(Ellis et al., C. Am. J. Physiol., 263 (Renal Fluid Electrolyte Physiol. 32):F293-F300 (1992))〕および腸〔ステンソンら(Stenson et al., C. Am. J. Physiol., 265 (Gastrointest. Liver Physiol., 28):G955-G962 (1993)) 〕の両者の上皮細胞株内において、細胞外透過性を上昇させる。
ＩＩ．血液脳関門
血液脳関門（ＢＢＢ）は、溶質自由拡散(Solute free diffusion) に対して高く抵抗する極めて薄い膜性関門であり、血液と脳とを分離している。分子的尺度において、この膜を通る薬剤または溶質の動きは、ＢＢＢ膜内に埋め込まれている特殊化した酵素様の数個の輸送機構の一つに化合物が接近しない限り、本質的にゼロである。ＢＢＢは、上皮細胞の単層ではなくて複層の細胞から成っている。ＢＢＢを構成する細胞の４種の異なる形（上皮細胞、周細胞、星状細胞、および神経細胞）の中で、毛細血管の上皮細胞成分は、ＢＢＢの透過性の限定因子となっている。脊椎動物の脳および脊髄中の毛細血管内皮は、正常では末梢組織中の微小血管内皮関門内に存在する内皮間細孔を閉止するｔｊを備えている。最終的に、内皮ｔｊは、ＢＢＢの限定された浸透性をもたらす。
ＩＩＩ．閉鎖帯毒素
コレラ毒素（ＣＴ）をコードするｃｔｘＡ遺伝子を欠失させて構築された大部分のコレラ菌(Vibrio cholerae) ワクチン候補は、高い抗体反応を導出することができるが、しかしワクチンの半数を越えるものはまだ軽度の下痢を発症させる〔レヴィンら(Levin et al., Infect. Immun., 56(1):161-167 (1988))〕。ＣＴが存在しないで誘発された下痢の程度を考えると、コレラ菌は、ｃｔｘＡ配列の欠如した株内にまだ存在する他の腸毒素源性因子を産生すると仮定された（レヴィンら、上記）。その結果、コレラ菌により産生され、残留下痢に関与する第二の毒素である閉鎖帯毒素（以後「ＺＯＴ」と呼ぶ）が発見された〔ファサノら(Fasano et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 8:5242-5246 (1991))〕。ｚｏｔ遺伝子は、ｃｔｘ遺伝子に直ちに隣接して位置している。コレラ菌株の間でｃｔｘ遺伝子を有するｚｏｔ遺伝子の高率の同時産生〔ジョンソンら(Johnson et al., J. Clin. Microb., 31/3:732-733 (1993));およびカラサワら(Karasawa et al., FEBS Microbiology Letters, 106:143-146 (1993))〕は、コレラの典型である急性脱水性下痢の因果関係における可能なＺＯＴの共同的役割の可能性を示唆する。最近、ｚｏｔ遺伝子は、また他の腸内病原体内で同定されている〔チャペ(Tschape, 2nd. Asian-Pacific Symposium on Typhoid fever and other Salomellosis, 47(Abstr.)(1994)) 〕。
【００１０】
ラビット回腸粘膜上で試験した場合に、ＺＯＴは、細胞間ｔｊの構造を調整して腸透過性を上昇させることが以前に発見されている（ファサノら、上記）。細胞外経路の改変の結果、腸内粘膜はさらに透過性が上昇することが発見されている。ＺＯＴは、Ｎａ+ −グルコース共役能動輸送に影響を及ぼさず、細胞毒性ではなく、また内皮通過抵抗を完全に消失させないことも発見された（ファサノら、上記）。
【００１１】
さらに最近では、ＺＯＴが腸内粘膜内のｔｊの可逆的開放が可能であり、従って、ＺＯＴは、治療医薬と同時投与された場合には、腸内ドラッグデリバリーのための経口投与組成物内に使用された場合に、治療薬剤の腸内デリバリーを行うことが可能であることが発見された〔ＷＯ９６／３７１９６；米国特許（ＵＳ）出願番号０８／４４３，８６４、出願１９９５年５月２４日；および米国特許（ＵＳ）第５，６６５，３８９号；およびファサノら(Fasano et al., J. Clin. Invest., 99:1158-1164 (1997))、いずれもその全体をここに引用文献として編入する〕。ＺＯＴは、鼻粘膜中のｔｊを可逆的に開放することが可能で、従って、ＺＯＴは、治療薬剤と同時投与された場合に、治療薬剤の鼻吸収を増大させることが可能なことが発見された〔米国特許（ＵＳ）出願番号０８／７８１，０５７、出願１９９７年１月９日、いずれもその全体をここに引用文献として編入する〕。
【００１２】
全体をここに引用文献として編入する米国特許（ＵＳ）出願番号０８／８０３，３６４、出願１９９７年２月２０日、の中で、腸内細胞株、すなわちＣａＣｏ２細胞から、ＺＯＴ受容体が同定および精製されている。さらに、全体をここに引用文献として編入する米国特許（ＵＳ）出願番号０９／０２４，１９８、出願１９９８年２月１７日の中で、ヒト腸、心臓および脳組織からのＺＯＴ受容体が同定および精製されている。ＺＯＴ受容体は、腸および鼻透過性の制御に関与する細胞外経路の第一段階である。
ＩＶ．ゾヌリン
全体をここに引用文献として編入する未決定の米国特許（ＵＳ）出願番号０９８／８５９，９３１、出願１９９７年５月２１日の中で、ＺＯＴと免疫学的および機能的に関連し、またヒト密着結合の生理学的モジュレーターとして機能するヒトタンパク質が、同定および精製されている。「ゾヌリン」と呼ぶこれらのヒトタンパク質は、腸および鼻粘膜のｔｊを貫通して、ならびに血液脳関門のｔｊを貫通して治療薬剤の吸収を増大させるために役立つ。
【００１３】
本発明において、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストが初めて同定された。上記のペプチドアンタゴニストは、ＺＯＴ受容体に結合するが、ヒト密着結合の開放を生理学的に調整するために機能はしない。ペプチドアンタゴニストは、ＺＯＴおよびゾヌリンのＺＯＴ受容体への結合を競合的に抑制し、これにより、ヒト密着結合の開放を生理学的に調整するためのＺＯＴおよびゾヌリンの能力を抑制する。
【００１４】
発明の要約
本発明の目的はゾヌリンのペプチドアンタゴニストを同定することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、該ペプチドアンタゴニストを合成および精製することである。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、上記のペプチドアンタゴニストを胃腸炎症の処置における抗炎症剤として使用することである。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は、血液脳関門の損傷を抑制するための上記のペプチドアンタゴニストの使用である。
【００１８】
以下の本明細書に記載する本発明の詳細な説明から明らかになるこれらおよびその他の本発明の目的は、一つの態様において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号３５からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含んでなり、該ペプチドアンタゴニストが、ＺＯＴ受容体に結合するが、しかしヒト密着結合の開放を生理学的に調整はしないペプチドアンタゴニストにより達成される。
【００１９】
発明の詳細な説明
以上に考察したように、一つの態様では、本発明の上記の目的は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号３５からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含んでなり、該ペプチドアンタゴニストが、ＺＯＴ受容体に結合するが、しかしヒト密着結合の開放を生理学的に調整はしないペプチドアンタゴニストにより達成される。
【００２０】
ペプチドアンタゴニストの大きさは、本発明に重要ではない。一般に、ペプチドアンタゴニストの大きさは、アミノ酸８〜１１０個、好ましくはアミノ酸８〜４０個の範囲内、さらに好ましくはアミノ酸８個である。
【００２１】
ペプチドアンタゴニストは、周知の技術、例えば「ペプチドおよびタンパク質の高速液体クロマトグラフィー：分離、分析およびコンフォーメーション」マントら編集[High Performance Liquid Chromatography of Peptides and Proteins:Separation Analysis and Conformation, Eds. Mant et al., C.R.C. Press (1991)] に記載の技術、およびペプチド合成装置、例えばシンフォニー〔Symphony (プロテイン・テクノロジー社(Protein Technologies, Inc.)〕を用いて；または組み替えＤＮＡ技術、すなわちペプチドをコードするヌクレオチド配列を適合する発現ベクター、例えば大腸菌(E. coli) または酵母発現ベクター中に挿入し、それぞれの宿主細胞中に発現させ、そしてこれから周知の技術を用いて精製する技術を用いて化学的に合成および精製できる。
【００２２】
ペプチドアンタゴニストは、増大した腸透過性を起こさせる胃腸炎症の処置のための抗炎症剤として使用できる。従って、本発明のペプチドアンタゴニストは、例えばタンパク質損失腸症を起こす腸内状態の処置に有用である。タンパク質損失腸症は、
感染、例えばＣ．ディフィシレ(C. difficile)感染、全腸炎、細菌性赤痢、ウイルス性胃腸炎、寄生虫発生、細菌異常増殖、ホイップル病、
粘液腐食または潰瘍を伴う疾患、例えば胃炎、胃ガン、膠原性大腸炎、炎症性腸疾患、
リンパ管閉塞を特徴とする疾患、例えば先天性腸リンパ管拡張症、リンパサルコイドーシス、腸間結核、およびフォンタン手術を用いた先天性心臓疾患の外科矯正後、
潰瘍を伴わない粘膜疾患、例えばメネトリエ病、腹腔疾患、好酸性胃腸炎、および
免疫疾患、例えば前進紅斑性エリテマトーデスまたは食品、主として牛乳アレルギー〔また「小児科胃腸疾患病態生理学診断マネージメント」ワイリーら編集(Pediatric Gastrointestinal Disease Pathophysiology Diagnosis Management, Eds. Wyllie et al., Saunders Co. (1993) 536-543,  表40-2)これは引用することによってその全体が本明細書に編入される〕
から起きる。
【００２３】
従って、別の態様では、本発明は、胃腸炎症の処置の方法であって、このような処置を必要とする患者に対する薬剤的有効量のゾヌリンのペプチドアンタゴニストを投与することを含んでなり、該ペプチドアンタゴニストが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４からなる群から選ばれるアミノ酸配列番号を含んでなり、該ペプチドアンタゴニストが、該患者の腸内の閉鎖帯毒素受容体に結合するが、しかし該腸内の密着結合の開放を生理学的に調整はしない方法に関する。
【００２４】
この目的には、ペプチドアンタゴニストは、小腸デリバリーのための経口投与組成物として投与できる。このような小腸デリバリーのための経口投与組成物は、当該技術分野では周知であり、一般に耐胃酸性錠剤またはカプセルを含んでなる〔レミントンの薬剤科学、第１６版、オソル編集(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th. Ed. Eds. Osol, Mack Publishing Co., Chapter 89 (1980)); ディジェニスら(Digenis et al., J. Pharm. Sci., 83:915-921 (1994));ヴァンティニら(Vantini et al., Clinica Terapeutica, 145:445-451 (1993));ヨシトミら(Yoshitomi et al., Chem. Pharm. Bull., 40:1902-1905 (1992));トーマら(Thoma et al., Pharmazie, 46:331-336 (1991)); モリシタら(Morishita etal., Drug Design and Delivery, 7:309-319 (1991)); およびリンら(Lin et al., Pharmaceutical Res., 8:919-924 (1991)),いずれも引用することにより、それらの全体が本明細書に編入される〕。
【００２５】
錠剤は、例えば酢酸フタル酸セルロースまたは酢酸テレフタル酸セルロースのいずれかの添加により耐胃液性としている。
【００２６】
カプセルは、ペプチドアンタゴニストをゼラチンの硬質または軟質のいずれかの可溶性容器または殻内に包み込んだ固体投与剤型である。カプセル製造に用いられるゼラチンは、コラーゲン様物質から加水分解により得られる。ゼラチンには２種類ある。酸処理によりブタ皮膚から得られるタイプＡ、およびアルカリ処理により骨および動物皮膚から得られるタイプＢである。硬質ゼラチンカプセルの使用は、個別の患者に対して最善と考えられる正確な投与レベルにおける単回のペプチドアンタゴニストまたはその組合せの処方の選択を可能とする。硬質ゼラチンカプセルは、一方が他方の上に滑ってはめ込む２部分からなり、これにより完全にペプチドアンタゴニストを包み込んでいる。これらのカプセルには、ペプチドアンタゴニスト、またはペプチドアンタゴニストを含む体胃液性ビーズをカプセルの長い方の端部に入れ、次いでキャップを被せて充填する。硬質ゼラチンカプセルは、主としてゼラチン、ＦＤ＆Ｃ（食品、医薬品および化粧品用）着色料、および場合により不透明剤、例えば二酸化チタンからなっている。ＵＳＰ（アメリカ薬局方）は、この目的のゼラチンが、製造の間の分解を防止するために二酸化硫黄０．１５％（ｗ／ｖ）を含むことを認めている。
【００２７】
本発明の範囲内で、小腸デリバリーのための経口投与組成物は、またペプチドアンタゴニストが胃内で胃液により著しく不活性化されることを防ぎ、これによりペプチドアンタゴニストを小腸内に活性形で到達させるための水性緩衝剤を含む液状組成物も含む。本発明で使用できるこのような水性緩衝液の例には、炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ５．５〜８．７、好ましくは約７．４）が含まれる。
【００２８】
経口投与組成物が液状組成物である場合には、組成物を投与の直前に調製して、安定性の問題を最小化することが好ましい。この場合に、液状組成物は、凍結乾燥したペプチドアンタゴニストを水性緩衝液中に溶解させて調製できる。
【００２９】
ペプチドアンタゴニストは、血液脳関門の損傷を抑制するために使用できる。従って、本発明のペプチドアンタゴニストは、例えば血液脳関門の損傷に関連する状態の処置に有用である。このような状態の例には、浸透性損傷、例えば脳虚血、卒中または脳水腫、高血圧、二酸化炭素、けいれん発作、化学毒素、尿毒症（腎不全）、髄膜炎、脳炎、脳脊髄炎、例えば感染性（ウイルス性（ＳＲＶ、ＨＩＶ、など）、または細菌性（ＴＢ、インフルエンザ菌(H. influenzae) 、髄膜炎菌、など）またはアレルギー性、腫瘍、外傷性脳損傷、放射線脳損傷、未熟症および核黄疸、脱髄疾患、例えば多発性硬化症またはギラン・バレー症候群が含まれる。
【００３０】
従って、別の態様では、本発明は、血液脳関門の損傷に関連する状態の処置であって、このような処置を必要とする患者に対して、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストの薬剤的に有効量を投与することを含んでなり、該ペプチドアンタゴニストが、アミノ酸配列番号３５を含んでなり、該ペプチドアンタゴニストが、該患者の脳内の閉鎖帯毒素受容体に結合するが、しかし該脳内の密着結合の開放を生理学的に調整はしない方法に関する。
【００３１】
この目的には、ペプチドアンタゴニストは、脳へのデリバリーのために、静脈内投与組成物として投与できる。このような組成物は、当該技術分野では周知であり、組成物は、一般に生理学的希釈剤、例えば蒸留水または０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを含んでなる。
【００３２】
使用されるペプチドアンタゴニストの薬剤的有効量は、本発明には重要ではなく、処置される疾患または状態、ならびに処置される患者の年齢、体重および性別に応じて変化する。一般に、胃腸炎症の抑制または血液脳関門の損傷の抑制、例えばゾヌリン生理学活性の抑制のために本発明に使用されるペプチドアンタゴニストの量は、約７．５ｘ１０-6Ｍ〜７．５ｘ１０-3Ｍ、好ましくは約７．５ｘ１０-6Ｍ〜７．５ｘ１０-4Ｍの範囲内である。例えば腸内または血液内でこの最終濃度に達するために、本発明の単回経口投与組成物中のペプチドアンタゴニストの量は、一般に約１．０μｇ〜１０００μｇ、好ましくは約１．０μｇ〜１００μｇである。
【００３３】
ペプチドアンタゴニストは、また当該技術分野で周知の技術を用いてゾヌリンに対して特異的に結合したポリクローナルまたはモノクローナル抗体のアンタゴニストを得るための免疫源としても使用できる〔アブラムズ(Abrams, Methods Enzymol., 121:107-119 (1986))〕。これらの抗体は、他方では体組織または液内のゾヌリンのアッセイ、またはゾヌリンのアフィニティー精製、あるいは、ゾヌリンを結合するために、そしてこれによりゾヌリン活性を抑制、例えば胃腸炎症の抑制のためまたは血管脳関門の損傷を抑制するために使用できる。
【００３４】
下記の実施例は、説明の目的のためのみに提供するものであり、いかなる意味でも本発明の範囲の限定を意図するものではない。
【００３５】
実施例１
ＺＯＴの精製
プラスミドｐＺ１４を用いて形質転換したコレラ菌株ＣＶ１１０〔ミハルスキーら(Michalski et al., Infect. Immun., G1:4462-4468 (1993)) 〕を培養して得られた上清画分５０００ｍｌを、１０ｋＤａの分子量カットオフを有する層流(Lamina flow) フィルターを用いて１０００倍濃縮した。コレラ菌ｚｏｔ遺伝子を含むｐＺ１４の構造は、なかでもＷＯ９６／３７１９６中に詳細に記載されている。得られた上清を次いで８．０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理する。タンパク質バンドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシーブルー染色により検出された。プラスミドｐＴＴＱ181 を用いて形質転換した株ＳＶＤ１１０〔アマーシャム(Amersham, Arlington Hights, IL)〕からの対照上清を同様の処理したものと比較すると、ＺＯＴに相当するタンパク質バンドは検出できなかった。従って、ｚｏｔ遺伝子がｐＺ１４内で高度に誘導可能で強力なｔａｃプロモーターの後に位置していたとしても、１０００倍濃縮したｐＺ１４上清中のタンパク質のレベルは、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによってはまだ検出できなかった。
【００３６】
Ａ．ＭＢＰ−ＺＯＴ
産生されるＺＯＴの量を増加させるために、ｚｏｔ遺伝子をマルトース結合タンパク質（以後「ＭＢＰ」と呼ぶ）遺伝子を有するフレーム内に融合させて、ＭＢＰ−ＺＯＴタンパク質を創成した。
【００３７】
ｚｏｔ遺伝子を大腸菌のｍａｌＥ遺伝子に融合させてＺＯＴを発現および精製するために、ＭＢＰベクターｐＭＡＬ−ｃ２〔バイオラブ(Biolab)〕を使用した。この構築物は、強力で誘導可能なｔａｃプロモーター、およびｍａｌＥ翻訳開始シグナルを用いてクローニングされたｚｏｔ遺伝子の高レベル発現をもたらした。ベクターｐＭＡＬ−ｃ２は、ｍａｌＥシグナル配列の正確な欠失を有し、これは融合タンパク質の細胞質発現に導く。融合タンパク質の単離を容易にするために、ＭＢＰに対するアフィニティクロマトグラフィー精製を用いた（バイオラブ）。
【００３８】
さらに具体的には、ベクターｐＭＡＬ−ｃ２を、（ｍａｌＥ遺伝子の３’末端で切断する）ＥｃｏＲＩを用いて線状化し、クレノウ断片を用いて充填(fill in) し、（ｐＭＡＬ−ｃ２ポリリンカー中に単一部位を有する）ＸｂａＩを用いて消化した。ＺＯＴをコードするｏｒｆを、プラスミドｐＢＢ２４１〔ボードリーら(Baudry et al., Infect. Immun., 60:428-434 (1992))〕からサブクローニングした。プラスミドｐＢＢ２４１をＢｓｓＨＩＩを用いて消化し、クレノウ断片を用いて充填し、そしてＸｂａＩを用いて消化した。次いで、平滑ＸｂａＩ断片をｐＭＡＬ−ｃ２内にサブクローニングしてプラスミドｐＬＣ１０−ｃが得られた。両方の挿入物、およびベクターは平滑で粘着性の末端を有しているので、正しい配向が、挿入物の５’末端と融合させたｍａｌＥの３’末端を伴って得られた。次いでｐＬＣ１０−ｃを大腸菌株ＤＨ５α内にエレクトロポレーションした。ｐＢＢ２４１内で、ＢｓｓＨＩＩ制限部位はｚｏｔ  ｏｒｆ内にある。従って、ＺＯＴのアミノ酸１−８は、ＭＢＰ−ＺＯＴ融合タンパク質中では欠失している。
【００３９】
ＭＢＰ−ＺＯＴ融合タンパク質を精製するために、グルコース０．２％（ｗ／ｖ）およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むルリア・ベルタニ(Luria Bertani) ブロス１０ｍｌに、ｐＣＬ１０−ｃを含む単一コロニーを接種し、そして３７℃で振とうしながら一晩インキュベーションした。カルチャーを同じ新しい培地１．０ｍｌ中で１：１００に薄め、そして３７℃で振とうしながら、約１．０ｘ１０8 個（細胞）／ｍｌまで増殖させた。次いで、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧを加えてＭＢＰ−ＺＯＴ発現を誘導させ、そしてカルチャーを３７℃でさらに３時間インキュベーションした。次いで細菌をペレット化し、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ２−ＭＥ、１．０ｍＭ  ＮａＮ3 を含んでなる氷冷「カラム緩衝液」２０ｍｌ中に再懸濁させた。細菌懸濁液をフレンチ・プレス処理により溶菌させ、３０分間、１３，０００ｇで４℃において回転させた。上清を集め、カラム緩衝液を用いて１：５に薄め、カラム緩衝液を用いてあらかじめ平衡化してあったアミロース樹脂（バイオラブズ、ＭＢＰ融合精製系）の１ｘ１０カラム内に負荷した。カラム緩衝液５容積を用いてカラムを洗浄した後に、カラム緩衝液中の１０ｍＭマルトース１０ｍｌを負荷して、ＭＢＰ−ＺＯＴ融合タンパク質を溶出させた。カルチャー１．０ｍｌからの代表的な収率は、タンパク質２〜３ｍｇであった。
【００４０】
次いで、精製したＭＢＰ−ＺＯＴ融合タンパク質のＭＢＰ融合相手を、ＭＢＰ−ＺＯＴ２０μｇあたりにＸａ因子プロテアーゼ（バイオラブズ）１．０μｇを用いて切断した。Ｘａ因子プロテアーゼは、ＺＯＴのアミノ末端の直前で切断する。このようにして得られたＺＯＴタンパク質を８．０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に通し、電気分離室〔シュライヒャー・アンド・シュル(Schleicher & Schuell, Keene, NH) 〕を用いてゲルから電気溶出させた。
【００４１】
ユシング室を用いて試験すると、得られた精製ＺＯＴはＲｔの投与量依存性低下を誘導し、そのＥＤ50は７．５ｘ１０-8Ｍであった。
【００４２】
Ｂ．６ｘＨｉｓ−ＺＯＴ
ディープ・ヴェント・ポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）(Deep Vent Polymerase(New England Biolabs)) を用いて、ｐＢＢ２４１プラスミド（ボードリーら、上記）ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによりｚｏｔ遺伝子を増幅した。使用した正方向および逆方向プライマーは、それぞれ５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＴＡＴＧＡＧＴＡＴＣＴＴＴ−３’（配列番号３９）および５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＣＡＡＡＡＴＡＴＡＣＴ−３’（配列番号４０）であった。これらのオリゴヌクレオチドの５’テイルは、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位をそれぞれ含んでいた。得られたアンプリコン（１．２ｋｂ）を８．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動により分析し、エキストリーム・スピン・カラム（ピアス）(Xtreme spin column (Pierce)) を用いて塩および遊離ヌクレオチドから精製した。次いで、上記の２個の制限酵素を、精製アンプリコンを消化するために使用し、次いで、得られた消化アンプリコンを、あらかじめＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化したベクターｐＱＥ３０〔キアゲン(Quiagen) 〕中に挿入してプラスミドｐＳＵ１１３が得られた。ｐＱＥ３０は、６個のポリ−ヒスチジン・タグ（６ｘＨｉｓ）を有する組み替えタンパク質の高レベル発現を与える発現ベクターである。従って、プラスミドｐＳＵ１１３の発現産生物は、６ｘＨｉｓ−ＺＯＴ融合タンパク質である。次いで、ｐＳＵ１１３を大腸菌ＤＨ５αに入れて形質転換した。
【００４３】
６ｘＨｉｓ−ＺＯＴ融合タンパク質を精製するために、得られた形質転換大腸菌を一晩、３７℃で、グルコース２．０％（ｗ／ｖ）、カナマイシン２５μｇ／ｍｌおよびアンピシリン２００μｇ／ｍｌを含むルリア・ベルタニ・ブロス１５０ｍｌ中で、Ａ600 が約１．１０となるまで増殖させた。次いで、一晩経過した培地を、グルコース２．０％（ｗ／ｖ）、カナマイシン２５μｇ／ｍｌおよびアンピシリン２００μｇ／ｍｌを含むルリア・ベルタニ・ブロス１０００ｍｌ中に加え、約３時間、３７℃で強く攪拌して、Ａ600 が約０．７〜０．９となるまでインキュベーションした。次いで、ＩＰＴＧを最終濃度２．０ｍＭとなるように加え、５時間、３７で増殖を続けさせた。次いで、４０００ｘｇで２０分間遠心分離して細胞を収穫し、細胞を６．０Ｍ  ＧｕＨＣｌ、０．１Ｍリン酸ナトリウム、および０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む緩衝液Ａの５．０ｍｌ／ｇ（湿潤重量）中に再懸濁し、そして１時間、室温で攪拌した。次いで、混合物を１０，０００ｘｇで３０分間、４℃で遠心分離し、そして得られた上清にスーパーフロー(SUPERFLOW) 樹脂（キアゲン）の５０％スラリー４．０〜５．０ｍｌ／ｇ（湿潤重量）を加え、攪拌を１時間、室温で続けた。得られた樹脂を１．６ｘ８．０カラム内に負荷し、次いでこれを順番に緩衝液Ａ、８．０Ｍ尿素、０．１Ｍリン酸ナトリウム、および０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む緩衝液Ｂおよび８．０Ｍ尿素、０．１Ｍリン酸ナトリウム、およびおよび０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．３）を含む緩衝液Ｃを用いて洗浄した。それぞれの洗浄は、流出物のＡ600 が０．０１未満となるまで行った。６ｘＨｉｓ−ＺＯＴ融合タンパク質を、２５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液Ｃ  ２０ｍｌを用いてカラムから溶出させた。次いで、６ｘＨｉｓ−ＺＯＴ融合タンパク質を含む画分を、デーヴィス(Davis, Ann, N.Y. Acad. Sci., 121:404 (1964)) により記載された方法を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検査し、クーマシーブルーを用いてゲルを染色した。６ｘＨｉｓ−ＺＯＴ融合タンパク質を含む画分を８．０ｍ尿素に対して透析し、一緒にし、次いでＰＢＳ中で１００倍に薄めた。次いで、スーパーフロー樹脂の５０％スラリー４．０ｍｌを加え、２時間、室温で攪拌し、得られた樹脂を１．６ｘ８．０カラム内に負荷し、これを次いでＰＢＳ５０ｍｌを用いて洗浄した。６ｘＨｉｓ−ＺＯＴ融合タンパク質をカラムから２５０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ１０ｍｌを用いて溶出させた。得られた溶出物をＰＢＳに対して透析し、そして６ｘＨｉｓ−ＺＯＴ融合タンパク質を上記のようにしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検査した。
【００４４】
実施例２
アフィニティー精製した抗ＺＯＴ抗体の産生
特異性抗血清を得るために、キメラ性グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＺＯＴタンパク質を発現させ、精製した。
【００４５】
さらに具体的には、プラスミドｐＢＢ２４１（ボーンドリー、上記）を鋳型ＤＮＡとして用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｚｏｔ  ｏｒｆを増幅するために、オリゴヌクレオチドプライマーを使用した。正方向プライマー（ＴＣＡＴＣＡＣＧＧＣ  ＧＣＧＣＣＡＧＧ、配列番号２５）はｚｏｔ  ｏｒｆのヌクレオチド１５−３２に相当しており、そして逆方向プライマー（ＧＧＡＧＧＴＣＴＡＧ  ＡＡＴＣＴＧＣＣＣＧ  ＡＴ、配列番号２６）はｃｔｘＡ  ｏｒｆの５’末端に相当していた。従って、ＺＯＴのアミノ酸１−５は、得られた融合タンパク質中に欠失していた。増幅産生物を、ｐＧＥＸ−２Ｔ〔ファルマシア(Pharmacia, Milwaukee, WI)〕中のＧＳＴ遺伝子の末端に位置するポリリンカー（ＳｍａＩ部位）内に挿入した。ｐＧＥＸ−２Ｔは、ニホンジュウケツキュウチュウ(Schistosoma japonicum) のＧＳＴとの融合タンパク質としてクローニングした遺伝子を発現する融合タンパク質発現ベクターである。融合遺伝子は、ｔａｃプロモーターの制御下にある。ＩＰＴＧにより誘導されると、脱抑制が起き、そしてＧＳＴタンパク質が発現される。
【００４６】
ｐＬＣ１１と名付けられた得られた組み替えプラスミドを大腸菌ＤＨ５α中でエレクトロポレーションした。ＧＳＴ−ＺＯＴ融合タンパク質を精製するために、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むルリア・ベルタニ・ブロス１０ｍｌにｐＬＣ１１を含む単一コロニーを接種し、一晩、３７℃で振とうしながらインキュベーションした。カルチャーを同じ新しい培地を用いて１：１００に薄め、３７℃で振とうしながら約１．０ｘ１０8 個（細胞）／ｍｌまで増殖させた。次いで、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧを加えてＧＳＴ−ＺＯＴ発現を誘導させ、そしてカルチャーを３７℃でさらに３時間インキュベーションした。次いで細菌をペレット化し、氷冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２０モル中に再懸濁し、フレンチプレス法を用いて溶菌させた。ＧＳＴ−ＺＯＴ融合タンパク質は、細菌ペレット画分と一緒に沈降したので、これらの条件下で可溶性ではない。従って、ペレットを、０．００６２５トリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．２Ｍ  ２−ＭＥ、２．０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．０２５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノール・ブルーおよび１０％（ｗ／ｖ）グリセロールを含むラエムリ(Laemli)溶菌緩衝液中に再懸濁し、そして８．０％（ｗ／ｖ）ＰＡＧＥ−ＳＤＳゲル上で電気泳動を行い、クーマシー・ブリリアント・ブルーを用いて染色した。融合タンパク質に相当する約７０ｋＤａ（ＧＳＴの２６ｋＤａ＋ＺＯＴの４４ｋＤａ）のバンドが、電気分離室（シュライヒャー・アンド・シュル(Keene, NH) ）を用いてゲルから電気溶出された。
【００４７】
得られた溶出タンパク質（１０〜２０μｇ）の１０μｇを等容積のフロイント完全アジュバント(Freund's complete adjuvant)と混合させてラビットに注射した。４および８週間後に、２回のブースター投与をフロイント完全アジュバントを用いて投与した。１カ月後に、ラビットを放血した。
【００４８】
特異性抗体の産生を測定するために、ＺＯＴ１０-10Ｍを、２種の融合タンパク質ＮＢＰ−ＺＯＴおよびＧＳＴ−ＺＯＴと一緒に、ナイロン膜上に転移させ、ラビット抗血清の１：５０００希釈液と一緒にして、一晩、４℃で、温和に振とうしてインキュベーションした。次いでフィルターを１５分間、４回、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン(Tween) ２０を含むＰＢＳ（以後「ＰＢＳ−Ｔ」と呼ぶ）を用いて洗浄し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたヤギ抗ラビットＩｇＧの１：３０，０００希釈液と一緒に、２時間、室温でインキュベーションした。フィルターを再び１５分間、４回、０．１％（ｖ／ｖ）ツイーンを含むＰＢＳを用いて洗浄し、免疫反応姓バンドを強化化学蛍光（enhanced chemiluminescence）〔アマーシャム(Amersham)〕を用いて検出した。
【００４９】
免疫ブロット上で、ラビット抗血清は、ＺＯＴ、ならびにＭＢＰ−ＺＯＴおよびＧＳＴ−ＺＯＴ融合タンパク質を認識するが、しかしＭＢＰ陰性対照体は認識しないことが見いだされた。
【００５０】
さらに、適合する抗ＺＯＴ抗体の産生を確認するために、ユシング室内で中和実験を行った。ｐＺ１４上清を用いて３７℃で６０分間プレインキュベーションをすると、ＺＯＴ特異性抗血清（１：１００希釈）は、ユシング室内に取り付けられたラビット回腸に対してＺＯＴにより誘導されたＲｔの低下を完全に中和できた。
【００５１】
次いで、抗ＺＯＴ抗体を、ＭＢＰ−ＺＯＴアフィニティーカラムを用いてアフィニティー精製した。さらに具体的には、ＭＢＰ−ＺＯＴアフィニティーカラムは、一晩、室温で上記の実施例１に記載のようにして得られた精製ＭＢＰ−ＺＯＴ１．０ｍｇを前活性化したゲル（pre-activated gel）〔アミノリンク(Aminolink) 、ピアス〕に不動体化して調製された。カラムをＰＢＳを用いて洗浄し、次いで抗ＺＯＴラビット抗血清２．０ｍｌを負荷した。９０分間、室温で９０分間インキュベーションした後に、カラムをＰＢＳ１４ｍｌを用いて洗浄し、そして特異性抗ＺＯＴ抗体を５０ｍＭグリシン（ｐＨ２．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００を含む溶液４．０ｍｌを用いてカラムから溶出させた。溶出画分１．０ｍｌのｐＨを１．０Ｎ  ＮａＯＨを用いて直ちに中和した。
【００５２】
実施例３
ゾヌリンの精製
ＺＯＴは、特異性外皮表面受容体と相互作用し、引き続いて、ｔｊ透過性を調節する事象の複雑な細胞内カスケードの活性化を起こすという、米国特許（ＵＳ）出願番号０８／８０３，３６４、出願１９９７年２月２０日における観察に基づいて、本発明では、ＺＯＴがヒトｔｊの生理学的モジュレーターの効果を模倣することを前提とした。米国特許（ＵＳ）出願番号０８／８５９，９３１、出願１９９７年５月２１日では、ＺＯＴおよびその生理学的類似体（ゾヌリン）は、機能的および免疫学的に関連することを前提とした。従って、本明細書中に記載のように、アフィニティー精製抗ＺＯＴ抗体およびユシング室アッセーを組み合わせて、種々のラビットおよびヒト組織中のゾヌリンの探索に使用した。
【００５３】
Ｂ．ラビット組織
最初に、ラビット腸からゾヌリンを精製した。組織をＰＢＳ中のホモジナイゼーションにより分断した。次いで、得られた細胞調製物を４０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を集めて冷凍乾燥した。得られた冷凍乾燥産物を引き続いてＰＢＳ（１０：１（ｖ／ｖ））中で再構築し、０．４５ｍｍ膜フィルターを通して濾過し、セファデックス(Sephadex)Ｇ−５０クロマトグラフィーカラム上に負荷し、ＰＢＳを用いて溶出させた。次いで、カラムから得られた画分２．０ｍｌを、上記の実施例２に記載のようにして得られたアフィニティー精製抗ＺＯＴ抗体を用いて標準ウエスタン免疫ブロット試験を行った。
【００５４】
陽性画分、すなわち、抗ＺＯＴ抗体が結合した画分を一緒にし、冷凍乾燥し、ＢＳ（１：１（ｖ／ｖ））中で再構築し、Ｑ−セファロースカラムを通す塩勾配クロマトグラフィーを行った。塩勾配は、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中の０〜１００％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌであった。２０ｍｌ画分５個を採取し、上記の実施例２に記載のようにして得られたアフィニティー精製抗ＺＯＴ抗体を用いて標準ウエスタン免疫ブロット試験を行った。画分１（２０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）が、ウエスタン免疫ブロット試験で陽性と認められた唯一の画分であった。
【００５５】
Ｑ−セファロースカラムから得られた画分を、次いで、ＣａＣｏ２単層、およびラビット小腸上におけるこれらの組織抵抗効果についてユシング室内で試験した。
【００５６】
さらに具体的には、ＣａＣｏ２細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン４０μｇ／ｌおよびストレプトマイシン９０μｇ／ｌを含むダルベッコ(Dulbecco)の変性イーグル培地(modified Eagle's medium) 中、３７℃で９５％Ｏ2 ／５％ＣＯ2 の加湿雰囲気下、細胞培養フラスコ（ファルコン(Falcon)）内で増殖させた。細胞は、集密度７０〜８０％に達すると、５日毎にトリプシン処置の後、１：５の表面比で継代培養した。この試験に使用した細胞の継代数は、１５から３０の間に変動した。
【００５７】
ＣａＣｏ２単層は、ポリスチレン環（直径６．４ｍｍ、トランスウエル・コスター(Transwell Coster)）にしっかりと固定してある組織−カルチャー−処理ポリカーボネート・フィルター上に集密化するまで（表面比１：１２．５でプレート適用後１２〜１４日）増殖させた。フィルターは、改造ユシング室のしょう膜および粘膜コンパートメントを分離しているしっかり固定した挿入物中に設置され、そして実験は、ユシング室中のラビット腸に対するファサノらの記載(Fasano et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 8:5242-5246 (1991) のようにして行った。結果を図１に示す。
【００５８】
図１に記載のように、ゾヌリン陰性画分と比較して、ゾヌリン含有画分は、ＣａＣｏ２単層抵抗の著しい減少を誘導した。
【００５９】
次いで、頸部脱臼により屠殺した２〜３ｋｇの成体雄ニュージーランド白色ラビットからの回腸を用いて、ユシング室アッセーを行った。回腸の２０ｃｍ断片を取り出し、腸内容物がなくなるまでリンスし、腸間膜境界に沿って開き、筋肉およびしょう膜層を外した。このようにして調製した粘膜シート８枚をルーサイト(lucite)ユシング室（開口１．１２ｃｍ2 ）内に取り付け、電圧クランプ装置（ＥＶＣ  ４０００ＷＰＩ、サラトサ(Saratosa, FL)）に接続し、５３ｍＭ  ＮａＣｌ、５．０ｍＭ  ＫＣｌ、３０．５ｍＭマンニトール、１．６９ｍＭ  Ｎａ2 ＨＰＯ4 、０．３ｍＭ  ＮａＨ2 ＰＯ4 、１．２５ｍＭ  ＣａＣｌ2 、１．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、および２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ3 を含む新しく調製したリンゲル液に浸漬した。定温循環ポンプに接続した水ジャケット容器を用いて浸漬溶液を３７℃に保持し、９５％Ｏ2 ／５％ＣＯ2 を通気した。
【００６０】
ラビット腸から精製したゾヌリン１００μｌを粘膜側に加えた。電圧差（ＰＤ）を１０分毎に測定し、短絡電流（Ｉｓｃ）および組織抵抗（Ｒｔ）をファサノら（上記）の記載のようにして算出した。組織の変動性のために、データは、ΔＲｔ＝（時間ｘにおけるＲｔ）−（時間０におけるＲｔ）として算出した。その結果を図２に示す。
【００６１】
図２に記載のように、ゾヌリン陰性画分と比較して、ゾヌリン含有画分は、ラビット小腸抵抗の著しい減少を誘導した。この効果は、ゾヌリンが容器から取り出されると完全に逆転できる。
【００６２】
ゾヌリン陽性画分も８．０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理し、次いで抗ＺＯＴ抗体を用いてウエスタン免疫ブロット試験を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離されたタンパク質バンドを、次いで、（３−〔シクロヘキシルアミノ〕−１−プロパンスルホン酸）１０ｘの１００ｍｌ、メタノール１００ｍｌ、蒸留水８００ｍｌを含むＣＡＰＳ緩衝液を用いてＰＶＤＦフィルター（ミリポア(Millipore) ）上に移行させた。ウエスタン免疫ブロット試験により検出された単一バンドに配置したタンパク質は、約４７ｋＤａのみかけ分子量を有する。このバンドをＰＶＤＦフィルターから切り取り、フンカピラー：「タンパク質ミクロ特性試験方法」(Hunkapiller, in: Methods of Protein Microcharacterization,Ed. Shibley, Chapters 11-12, Humana Press, 315-334 (1985))に記載のようにして、パーキン−エルマーの応用生物システム装置(Perkin-Elmer Applied Biosystems Apparatus) モデル４９４を用いてＮ末端配列決定した。ラビット腸から精製したゾヌリンのＮ末端配列を配列番号２７に記載してある。
【００６３】
ラビットゾヌリンＮ末端配列を他のタンパク質配列とＬＡＳＴサーチ分析により比較した。この分析の結果は、ラビットゾヌリンのＮ末端配列が、ヒト(Homosapiens)からのｔａｕタンパク質のＮ末端配列に対して、８５％が一致、また１００％が類似であることを明らかにした。
【００６４】
その結果、ラビットゾヌリンおよびｔａｕが同じ部分であるか否かを決定するために、ユシング室で交差中和(cross neutralization)実験を行った。さらに具体的には、非処理または抗ｔａｕ抗体（希釈１：１０）（シグマ(Sigma) ）と一緒に３７℃で６０分間プレインキュベーションしたいずれかのラビットゾヌリン１０μｌ／ｍｌをラビット回腸の粘膜側に、加えた。抗ＺＯＴ抗体（希釈１：１０）（実施例２）と一緒にプレインキュベーションしたラビットゾヌリン１０μｌ／ｍｌおよび精製ｔａｕ（シグマ）０．４μｌ／ｍｌの両方を対照として使用した。結果を図３に示す。
【００６５】
図３に記載のように、ラビットゾヌリンは組織抵抗の典型的な低下を誘導し、これはタンパク質をユシング室から取り出すと直ちに回復できる。この活性  は、抗ＺＯＴ抗体を用いて前処理すると完全に中和されるが、抗ｔａｕ抗体を用いて前処理すると中和されない。一方、ｔａｕタンパク質に暴露された組織中では組織抵抗に対して著しい効果はない。
【００６６】
ラビットゾヌリンはまた、種々のその他のラビット組織、すなわちラビットの心臓、脳、筋肉、胃、脾臓、肺、腎臓、ならびに種々のラビットの腸の部分、例えば遠位空腸(distal jejunum)、近位空腸(Proximal jejunum)、回腸、盲腸および結腸内でも検出された。すなわち、これらのラビット組織を上記のようにラビット腸と同様の方法で処理し、８．０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理し、次いで上記の実施例２に記載のよにして得られたアフィニティー精製抗ＺＯＴ抗体を用いるウエスタンブロット試験により、大きさが約４７ｋＤａの単一バンドが、試験したこれらのすべての組織中で検出された。
【００６７】
Ｂ．ヒト組織
ゾヌリンはまた、腸、心臓、および脳を含む数種のヒト組織からも精製された。胎児および成人の組織の両方を使用した。組織をＰＢＳ中でホモジナイズして分断した。得られた細胞調製物を次いで４０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を集めて冷凍乾燥した。得られた冷凍乾燥産物を引き続いてＰＢＳ（１０：１（ｖ／ｖ））中で再構築し、０．４５ｍｍ膜フィルターを通して濾過し、セファデックスＧ−５０クロマトグラフィーカラム上に負荷し、そしてＰＢＳを用いて溶出させた。次いで、カラムから得られた２．０ｍｌ画分を、上記の実施例２に記載のようにして得られたアフィニティー精製抗ＺＯＴ抗体を用いて標準ウエスタン−ブロット試験を行った。
【００６８】
陽性画分、すなわち抗ＺＯＴ抗体が結合しているものを一緒にし、冷凍乾燥し、ＰＢＳ（１：１（ｖ／ｖ））中で再構築し、Ｑ−セファロースカラムを通す塩勾配クロマトグラフィーで分析した。塩勾配は、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）中で０〜１００％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌであった。２０ｍｌ画分５個を採取し、上記の実施例２に記載のようにして得られたアフィニティー精製抗ＺＯＴ抗体を用いて標準ウエスタン−ブロット試験を行った。画分１（２０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）は、大きさ４７ｋＤａの単一バンドをウエスタン−ブロット試験で示した。画分２（４０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）は、追加して大きさ３５ｋＤａおよび１５ｋＤａの２バンドをウエスタン−ブロット試験で示した。画分３（６０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）および画分４（８０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）は、３５ｋＤａおよび１５ｋＤａのバンドのみを示した。これらの結果は、ゾヌリンが、多分使用したヒト組織中に存在するプロテアーゼにより分解を受け、また分解生成物は、完全タンパク質(holoprotein) と比較して、より高い塩濃度においてカラムから溶出することを示唆している。
【００６９】
Ｑ−セファロースカラムから得られた画分１（ヒト心臓、腸および脳組織から）および画分４（心臓組織から）を、次いでユシング室中におけるラビット腸およびアカゲザル腸の両方に対するこれらの組織抵抗効果について試験した。
【００７０】
ユシング室試験は、ニュージーランド白色ラビットの２〜３ｋｇ成体雄、またはアカゲザルの５〜６ｋｇ成体雄のいずれかからの空腸、回腸または結腸を含む種々の腸管を用いて行った。動物を屠殺した後、空腸、回腸、および結腸を含む腸の種々の断片を取り出し、腸内容物がなくなるようにリンスし、腸間膜境界に沿って開き、そして筋肉およびしょう膜層を除いた。このように調製した粘膜シート８枚（空腸３枚、回腸３枚、および結腸２枚）を次いでルーサイトユシング室（開口１．１２ｃｍ2 ）内に取り付け、電圧クランプ装置（ＥＶＣ４０００ＷＰＩ、サラトサ、ＦＬ）に接続し、５３ｍＭ  ＮａＣｌ、５．０ｍＭ  ＫＣｌ、３０．５ｍＭマンニトール、１．６９ｍＭ  Ｎａ2 ＨＰＯ4 、０．３ｍＭ  ＮａＨ2 ＰＯ4 、１．２５ｍＭ  ＣａＣｌ2 、１．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、および２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ3 を含む新しく調製したリンゲル液に浸漬した。定温循環ポンプに接続した水ジャケット容器を用いて、浸漬溶液を３７℃に保持し、９５％Ｏ2 ／５％ＣＯ2 を通気した。
【００７１】
ヒト心臓から精製したゾヌリンの画分１またはヒト脳から精製したゾヌリンの画分１、またはヒト腸から精製したゾヌリンの画分１またはヒト心臓から精製したゾヌリンの画分４の１００μｌを粘膜側に加えた。電圧差（ＰＤ）を１０分ごとに測定し、そして短絡電流（ＳＣ）および組織抵抗（Ｒｔ）をファサノら（上記）の記載のようにして算出した。データは、図４Ａおよび４Ｂに対してＲｔとして算出したが、しかし組織の変動性のために、データは、図５Ａおよび５Ｂに対してはΔＲｔ＝（時間ｘにおけるＲｔ）−（時間０におけるＲｔ）として算出した。結果を図４Ａおよび４Ｂ（サル腸）および図５Ａおよび５Ｂ（ラビット腸）に示す。
【００７２】
図４Ａおよび４Ｂに示すように、ヒト心臓および腸から精製したゾヌリン（画分１）は、ＰＢＳ陰性対照と比較して、サル腸抵抗内に著しい低下を誘導した（空腸（図４Ａ）および回腸（図４Ｂ）の両方）。ヒト心臓またはヒト腸から精製されたゾヌリンを結腸内で試験すると、著しい変化は観察されなかった。図４Ａおよび４Ｂは、またヒト脳から精製されたゾヌリン（画分１）を試験すると、サル空腸（図４Ａ）および回腸（図４Ｂ）の両方に対して著しい効果は観察されなかったことを示している。ヒト心臓から精製されたゾヌリンの画分４も、サル小腸組織抵抗に著しい低下を誘導した。
【００７３】
図５Ａおよび５Ｂに示すように、ラビット腸を用いると、同様の結果が得られた。すなわち、ヒト心臓から精製したゾヌリン（画分１）は、ラビット空腸（図５Ａ）およびラビット回腸（図５Ｂ）の両方の組織抵抗に著しい効果を示したが、結腸に対しては示さなかった。図５Ａおよび５Ｂは、またヒト脳から精製されたゾヌリン（画分１）を試験すると、ラビット空腸（図５Ａ）およびラビット回腸（図５Ｂ）の両方に対して、著しい効果は観察されなかったことを示している。
【００７４】
ゾヌリンがインスリンの経口デリバリーを増加させるか否かを確定するために、ラビット腸を用いるインビトロモデル試験を行った。要約すると、成体雄ニュージーランド白色ラビット（２〜３ｋｇ）を頸部脱臼により屠殺した。ラビット小腸（空腸または回腸のいずれか）の断片を取り出し、腸内容物がなくなるまでリンスし、腸間膜境界に沿って開き、そして筋肉およびしょう膜層を外した。このように調製した粘膜のシート８枚を次いでルーサイトユシング室（開口１．１２ｃｍ2 ）内に取り付け、電圧クランプ装置（ＥＶＣ４０００ＷＰＩ、サラトサ、ＦＬ）に接続し、５３ｍＭ  ＮａＣｌ、５．０ｍＭ  ＫＣｌ、３０．５ｍＭマンニトール、１．６９ｍＭ  Ｎａ2 ＨＰＯ4 、０．３ｍＭ  ＮａＨ2 ＰＯ4 、１．２５ｍＭ  ＣａＣｌ2 、１．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、および２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ3 を含む、新しく調製したリンゲル液に浸漬した。定温循環ポンプに接続した水ジャケット容器を用いて、浸漬溶液を３７℃に保持し、９５％Ｏ2 ／５％ＣＯ2 を通気した。電圧差（ＰＤ）を測定し、短絡電流（Ｉｓｃ）および組織抵抗（Ｒｔ）を算出した。一旦組織が定常状態に達すると、その抵抗に基づいて組み合わせた対となった組織を１０-11 Ｍ 125Ｉ−インスリン（アマーシャム(Amersham, Arlington Hights, IL); 2.0 μCi＝１０-12 Ｍ）を単独または画分１からの心臓ゾヌリン１００μｌの存在下で管腔に(luminally) 暴露した。基線値を確定するために、しょう膜側から１．０ｍｌ試料、粘膜側から５０μｌ試料が直ちに得られた。しょう膜側からの試料を、次いで２０分間隔で以後１００分間にわたって採取した。
【００７５】
心臓ゾヌリンが、空腸内（０．０５８±０．００３ｆｍｏｌ／ｃｍ2 ・分  対  ０．１２±０．００５ｆｍｏｌ／ｃｍ2 ・分、それぞれ非処理  対  ゾヌリン処理組織、ｐ＝０．００１）および回腸内（０．００６±０．０００２ｆｍｏｌ／ｃｍ2 ・分  対  ０．０１８±０．００５ｆｍｏｌ／ｃｍ2 ・分、それぞれ非処理  対  ゾヌリン処理組織、ｐ＝０．０５）の両者で、時間依存的にインスリンの腸吸収を増加させることが見いだされた。
【００７６】
ヒト心臓から精製されたゾヌリンの画分１、ヒト腸から精製されたゾヌリンの画分１およびヒト脳から精製されたゾヌリンの画分１も、８．０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理を行い、次いで上記の実施例２に記載ようにして抗ＺＯＴ抗体を用いてウエスタン免疫ブロット試験を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離されたタンパク質バンドを、次いで、（３−〔シクロヘキシルアミノ〕−１−プロパンスルホン酸）１０ｘの１００ｍｌ、メタノール１００ｍｌ、蒸留水８００ｍｌを含むＣＡＰＳ緩衝液を用いてＰＶＤＦフィルター上に移行させた。ウエスタン免疫ブロット試験により検出された単一バンドに配列するタンパク質は、約４７ｋＤａのみかけ分子量を有していた。このバンドをＰＶＤＦフィルターから切り取り、フンカピラー：「タンパク質ミクロ特性試験」中(Hunkapiller, in:Methods of Protein Microcharacterization, Ed. Shibley, Chapters 11-12, Humana Press, 315-334 (1985))に記載のようにして、パーキン−エルマーの応用生物系装置モデル４９４を用いてＮ末端配列決定した。成人心臓から精製したゾヌリンのＮ末端配列を配列番号２８に記載してあり、成人脳から精製したゾヌリンのＮ末端配列を配列番号２９に記載してあり、成人胎児脳から精製したゾヌリンのＮ末端配列を配列番号３６に記載してある。
【００７７】
成人腸から精製したゾヌリンのＮ末端配列からの最初の９個のアミノ酸も配列決定し（配列番号３１）、そして配列番号２８に記載した成人心臓から精製したゾヌリンの最初の９個のアミノ酸と一致することを見いだした（図６参照）。ヒト胎児腸から精製したゾヌリンのＮ末端配列の最初の２０個のアミノ酸も配列決定し：Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号３０）であり、配列番号２８に示したヒト心臓から精製したゾヌリンのアミノ酸配列とほとんど等しいことを見いだした（図６参照）。
【００７８】
成人脳から精製したゾヌリンのＮ末端配列（配列番号２９）およびヒト胎児脳からのもの（配列番号３６）は、心臓（配列番号２８）、胎児腸（配列番号３０）および成人腸（配列番号３１）のいずれから精製したゾヌリンのＮ末端とも完全に異なっていた（図６、７参照）。この差異は、上記のように、組織、例えば腸の透過性を決定する際のゾヌリンの組織特異性を説明すると考えられる。
【００７９】
心臓、腸、および脳から精製したヒトゾヌリンのＮ末端配列は、すべてラビット腸から精製したゾヌリンのＮ末端配列と異なっている（図６）。これらのタンパク質が、タンパク質のｔａｕ関連ファミリーの異なるイソ形を表しているか否かを確定するために、ラビットおよびヒトの両者からの組織を８．０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで抗ＺＯＴまたは抗ＺＯＴ抗体を用いるウエスタン免疫ブロット試験を行った。抗ＺＯＴ抗体により認識されることを見いだされたラビットおよびヒトの両者の組織（脳、腸、および心臓を含む）から精製された４７ｋＤａゾヌリンバンドも、抗ｔａｕ抗体と交差反応することが見いだされた。塩クロマトグラフィーにより得られたヒト脳から精製したゾヌリンの種々の画分も、抗ＺＯＴ抗体または抗ｔａｕ抗体のいずれかを用いてウエスタン免疫ブロット試験を行った。抗ＺＯＴ抗体は不変４６ｋＤａタンパク質および３５ｋＤａおよび１５ｋＤａ断片タンパク質の両者を認識したけれども、抗ｔａｕ抗体は不変４６ｋＤａタンパク質および３５ｋＤａ断片のみを認識し、抗ｔａｕ抗体は１５ｋＤａ断片を認識しなかった。３５ｋＤａ断片がゾヌリンのＮ末端またはＣ末端を含んでいるか否かを確定するために、３５ｋＤａバンドのＮ末端配列を決定し、以下のように見いだした：Ｘａａ  Ｘａａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ（配列番号３２）。この配列は、不変のヒト脳ゾヌリンのＮ末端配列（配列番号２９）とは異なる。これらの結果は、１５ｋＤａ断片がゾヌリンのＮ末端部分であり、一方３５ｋＤａ断片はゾヌリンのＣ末端部分であることを示唆している。
【００８０】
これらを総合すると、これらの結果は、抗ｔａｕ抗体により認識されるゾヌリンドメインは、タンパク質のＣ末端に向かっており、ヒトまたはラビットのいずれかの組織からのゾヌリンの種々のイソ形に共通しており（一方、Ｎ末端部分は変動することがある）、またタンパク質の透過化作用に多分関係している（ｔａｕが引き続く細胞骨格の再配列を伴ってβ−チューブリンに結合するという観察、およびサル小腸組織抵抗に対する画分４の影響に基づいて）ことを示唆している。
【００８１】
心臓と腸の両方から精製したヒトゾヌリンのＮ末端配列を、他のタンパク質配列とＢＬＡＳＴサーチ分析により比較した。この分析の結果は、ヒトゾヌリンのＮ末端配列が、ヒトからのＩｇＭの変動重鎖(Heavy variable chain)のＮ末端配列（配列番号３７）に９５％が一致することを明らかにした。
【００８２】
その結果、心臓から精製したヒトゾヌリンおよびヒトＩｇＭが、同じ部分であることを決定するために、ヒトゾヌリンの部分消化を行って内部断片を入手し、これを次いで配列決定した。
【００８３】
さらに具体的には、ヒト心臓から精製したゾヌリンを含むＰＶＤＦフィルター１．０ｍｍを、あらかじめ０．１％（ｗ／ｖ）トルフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて洗浄し、メタノールを用いてリンスしたプラスチック管内に配置した。１００ｍＭトリス（ｐＨ８．２）、１０％（ｖ／ｖ）ＣＨ3 ＣＮ、および１．０％（ｖ／ｖ）脱水素トリトンＸ−１００を含む緩衝溶液７５μｌを加え、そして膜と一緒に３７℃で６０分間インキュベーションした。次いでトリプシン１５０ｎｇを加え、さらに２４時間のインキュベーション期間を３７℃において行った。得られた溶液を１０分間音波処理し、上清をデカンテーションした。次いで０．１％（ｗ／ｖ）ＴＦＡ７５μｌを加え、溶液をさらに１０分間音波処理し、上清をデカンテーションした。両方の試料を０．５ｍｍ  ｘ  ２５０ｍｍＣ18カラム、粒径５．０μｍ、孔サイズ３００Å上に負荷した。０．１％（ｗ／ｖ）ＴＦＡから４５％ＣＨ3 ＣＮ水＋０．１％（ｗ／ｖ）ＴＦＡの勾配を２時間１５分間展開した。ピークを最後に集め、配列決定した。
【００８４】
成人心臓から精製したヒトゾヌリンの内部配列は下記であった：Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（配列番号３３）。
【００８５】
ヒトゾヌリン内部配列を他のタンパク質配列とＢＬＡＳＴサーチ分析により比較した。この分析の結果は、ヒトゾヌリンの内部配列は、ヒトからのＩｇＭの変動重鎖のいずれの内部配列とも０％の一致であることが明らかになった。
【００８６】
上記の実施例３の結果は、（１）ゾヌリンが細胞外経路の生理学的モジュレーターであり、（２）ラビットゾヌリンのＮ末端配列は、ｔａｕタンパク質のＮ末端配列に高度に相同であり、（３）ゾヌリンおよびｔａｕは、免疫学的に関連するが機能的には異なる２種の明確な部分であり、（４）心臓および腸から得られたヒトゾヌリンのＮ末端配列は、ＩｇＭの変動領域の重鎖のＮ末端配列に高度に相同性であり、（５）ヒトゾヌリンおよびＩｇＭは、構造的に関連しているがしかし機能的には異なる２種の明確な部分であり、そして（６）ゾヌリンは、共通の活性Ｃ末端配列、および変動するＮ末端配列を有するｔａｕ関連タンパク質のファミリーであることを証明している。
【００８７】
実施例４
ゾヌリンのペプチドアンタゴニスト
ＺＯＴ、ヒト腸ゾヌリン（ゾヌリンi ）およびヒト心臓ゾヌリン（ゾヌリンh ）がすべて腸〔ファサノら(Fasano et al., Gastroenterology, 112:839 (1997));ファサノら(Fasano et al., J. Clin. Invest., 96:710 (1995))；および図１〜５〕および内皮ｔｊ上に作用し、またこれらすべての３種が、腸内のＺＯＴ受容体分布と一致する〔ファサノら(1995)上記；およびファサノら(1997)上記〕同じ領域効果〔ファサノら(1997)上記；および図１〜５〕を有する場合には、本発明において、これらの３分子が同じ受容体結合部位と相互作用することを前提とした。従って、ＺＯＴおよびヒトゾヌリンの一次アミノ酸構造の比較を、腸ｔｊの調節に関与する受容体−リガンド相互作用の絶対的な構造要件に関する洞察を得るために実施した。これらの分子のＮ末端の分析は、以下の共通モチーフ（図７中で囲んだアミノ酸残基８〜１５）：非極性（腸に対してはＧｌｙ、脳に対してはＶａｌ）、変動、非極性、変動、非極性、極性、変動、極性（Ｇｌｙ）を明らかにした。８位のＧｌｙ、１２位のＶａｌ、１３位のＧｌｎのすべては、ＺＯＴ、ゾヌリンi 、ゾヌリンh 中で高度に保存され（図７参照）、これは腸内の受容体結合機能に対して重要と考えられる。これを確認するために、合成オクタペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ（配列番号１５）（ＦＺＩ／０と呼ばれ、またヒト胎児ゾヌリンi のアミノ酸残基８〜１５に相当）を化学的に合成した。
【００８８】
次いで、上記のようにしてユシング室内に取り付けたラビット回腸を、ＦＺＩ／０（配列番号１５）１００μｇ、ＦＺＩ／１（配列番号３４）１００μｇ、６ｘＨｉｓ−ＺＯＴ（実施例１に記載のようにして得られたもの）１．０μｇ、ゾヌリンi （実施例３に記載のようにして得られたもの）１．０μｇまたはゾヌリンh （実施例３に記載のようにして得られたもの）１．０μｇの単独に暴露；またはＦＺＩ／０またはＦＺＩ／１の１００μｇに２０分間事前暴露し、その時点で６ｘＨｉｓ−ＺＯＴ１．０μｇ、ゾヌリンi １．０μｇ、またはゾヌリンh １．０μｇを加えた。ΔＲｔは上記の用にして算出した。その結果を図８に示す。
【００８９】
図８に示すように、ＦＺＩ／０は、Ｒｔにいかなる著しい変化も誘導しなかった（陰性対照と比較して０．５％）（黒棒参照）。反対に、ＦＺＩ／０を用いる２０分間の前処理は、ＺＯＴ、ゾヌリンi 、ゾヌリンh のＲｔへの効果をそれぞれ７５％、９７％および１００％低下させた（白棒参照）。また、図８に示すように、第二の合成ペプチド（ＦＺＩ／１）を、８位のＧｌｙ、１２位のＶａｌ、および１３位のＧｌｎに相当（ゾヌリンi と呼ぶ）をゾヌリンb の相応するアミノ酸残基（それぞれＶａｌ、ＧｌｙおよびＡｒｇ）に変化させて化学合成して使用すると、この抑制効果は完全に除去される（斜線棒参照）。
【００９０】
上記の結果は、標的受容体に結合するために重要であり、そして、位置８、１２、および１３のアミノ酸残基がこの結合の組織特異性を決定するようなＺＯＴおよびゾヌリンファミリーのＮ末端の残基８と１５との間にある領域が存在することを証明している。
【００９１】
本発明は以上に詳細に、また特定の態様を引用して記載されているけれども、種々の変更および改質を本発明の精神および目的から逸脱することなく行うことができることは、当該業界の通常の熟練者には明らかである。
【００９２】
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＣａＣｏ２細胞単層の組織抵抗（Ｒｔ）に対するラビット腸（■）から精製されたゾヌリンの効果を、各種の陰性対照〔Ｑ−セファロース・カラムからの画分２（◇）；画分３（●）；画分４（▲）；および画分５（□）〕と比較して示す。
【図２】  ユシング室内に取り付けられたラビット回腸の組織抵抗（Ｒｔ）に対するラビット腸（■）から精製されたゾヌリンの効果を、各種の陰性対照（□）と比較して示す。
【図３】  ユシング室内に取り付けられたラビット回腸の組織抵抗（Ｒｔ）に対するラビット腸（■）から精製されたゾヌリンの効果を、陰性対照〔ゾヌリン＋抗ＺＯＴ抗体（□）；ゾヌリン＋抗ｔａｕ抗体（△）；およびｔａｕ（▲）〕と比較して示す。
【図４】  図４Ａおよび４Ｂは、ユシング室内に取り付けられたアカゲザル空腸（図４Ａ）およびアカゲザル回腸（図４Ｂ）の組織抵抗（Ｒｔ）に対する、ヒト脳（▲）、ヒト腸（●）、または心臓（○）のいずれかからから精製されたゾヌリンの効果を、陰性対照（□）と比較して示す。
【図５】  図５Ａおよび５Ｂは、ユシング室内に取り付けられたラビット空腸（図５Ａ）およびラビット回腸（図５Ｂ）の組織抵抗（Ｒｔ）に対する、ヒト心臓（▲）またはヒト脳（□）のいずれかからから精製されたゾヌリンの効果を、陰性対照（■）と比較して示す。
【図６】  ラビットおよび各種のヒト組織から精製されたゾヌリンのＮ末端配列の比較を示す。
【図７】  各種のヒト組織およびＩｇＭ重鎖から精製されたゾヌリンのＮ末端配列とＺＯＴの生物学的に活性の断片（アミノ酸２８８−３９９）のＮ末端配列との比較を示す。
【図８】  ユシング室内に取り付けられたラビット回腸の組織抵抗（Ｒｔ）に対する、ＺＯＴ、ゾヌリンi 、ゾヌリンh を単独（黒棒）、またはペプチドアンタゴニストＦＺＩ／０と組合せ（白棒）またはＦＺＩ／１と組合せ（斜線棒）た場合の効果を陰性対照と比較して示す。Ｎは３〜５に等しく、＊はｐ＜０．０１に等しい。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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