(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントと、ニューロン限定サイレンサー因子に結合する少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントとを有するサイレンサー誘導領域、および(b)該サイレンサー誘導領域と機能的に連結されていて該サイレンサー誘導領域により調節され、かつ少なくとも１つのヌクレオチド配列の上流にあるプロモーターを含んでなり、前記少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントと前記少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントが互いから500ヌクレオチド以内に配置されている単離された発現ベクターであって、非低酸素細胞に組み込まれたときに前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の発現がサイレンシングされ、該細胞が低酸素にされたときに該サイレンシングされた発現が逆転される、前記単離された発現ベクター。
【請求項２】
(a)少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントと、ヒトシナプシン遺伝子由来の少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントとを有するサイレンサー誘導領域、および(b)該サイレンサー誘導領域と機能的に連結されていて該サイレンサー誘導領域により調節され、かつ少なくとも１つのヌクレオチド配列の上流にあるプロモーターを含んでなり、前記少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントと前記少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントが互いから500ヌクレオチド以内に配置されている単離された発現ベクターであって、非低酸素細胞に組み込まれたときに前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の発現がサイレンシングされ、該細胞が低酸素にされたときに該サイレンシングされた発現が逆転される、前記単離された発現ベクター。
【請求項３】
(a)少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントと、配列番号2の配列を有する少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントとを含むサイレンサー誘導領域、および(b)該サイレンサー誘導領域と機能的に連結されていて該サイレンサー誘導領域により調節され、かつ少なくとも１つのヌクレオチド配列の上流にあるプロモーターを含んでなり、前記少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントと前記少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントが互いから500ヌクレオチド以内に配置されている単離された発現ベクターであって、非低酸素細胞に組み込まれたときに前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の発現がサイレンシングされ、該細胞が低酸素にされたときに該サイレンシングされた発現が逆転される、前記単離された発現ベクター。
【請求項４】
(a)ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子由来の少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントと、ニューロン限定サイレンサー因子に結合する少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントとを有するサイレンサー誘導領域、および(b)該サイレンサー誘導領域と機能的に連結されていて該サイレンサー誘導領域により調節され、かつ少なくとも１つのヌクレオチド配列の上流にあるプロモーターを含んでなり、前記少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントと前記少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントが互いから500ヌクレオチド以内に配置されている単離された発現ベクターであって、非低酸素細胞に組み込まれたときに前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の発現がサイレンシングされ、該細胞が低酸素にされたときに該サイレンシングされた発現が逆転される、前記単離された発現ベクター。
【請求項５】
(a)配列番号1の配列を有する少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントと、ニューロン限定サイレンサー因子に結合する少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントとを有するサイレンサー誘導領域、および(b)該サイレンサー誘導領域と機能的に連結されていて該サイレンサー誘導領域により調節され、かつ少なくとも１つのヌクレオチド配列の上流にあるプロモーターを含んでなり、前記少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントと前記少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントが互いから500ヌクレオチド以内に配置されている単離された発現ベクターであって、非低酸素細胞に組み込まれたときに前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の発現がサイレンシングされ、該細胞が低酸素にされたときに該サイレンシングされた発現が逆転される、前記単離された発現ベクター。
【請求項６】
(a)低酸素誘導因子-1に結合する少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントと、ニューロン限定サイレンサー因子に結合する少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントとを含むサイレンサー誘導領域、および(b)該サイレンサー誘導領域と機能的に連結されていて該サイレンサー誘導領域により調節され、かつ少なくとも１つのヌクレオチド配列の上流にあるプロモーターを含んでなり、前記少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントと前記少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントが互いから500ヌクレオチド以内に配置されている単離された発現ベクターであって、非低酸素細胞に組み込まれたときに前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の発現がサイレンシングされ、該細胞が低酸素にされたときに該サイレンシングされた発現が逆転される、前記単離された発現ベクター。
【請求項７】
(a)少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントと、ニューロン限定サイレンサー因子に結合する少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントとを有するサイレンサー誘導領域、および(b)該サイレンサー誘導領域と機能的に連結されていて該サイレンサー誘導領域により調節され、かつ少なくとも１つのヌクレオチド配列の上流にあるウイルスプロモーターを含んでなり、前記少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントと前記少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントが互いから500ヌクレオチド以内に配置されている単離された発現ベクターであって、非低酸素細胞に組み込まれたときに前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の発現がサイレンシングされ、該細胞が低酸素にされたときに該サイレンシングされた発現が逆転される、前記単離された発現ベクター。
【請求項８】
(a)少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントと、ニューロン限定サイレンサー因子に結合する少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントとを有するサイレンサー誘導領域、および(b)該サイレンサー誘導領域と機能的に連結されていて該サイレンサー誘導領域により調節され、かつ少なくとも１つのヌクレオチド配列の上流にある哺乳動物プロモーターを含んでなり、前記少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントと前記少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントが互いから500ヌクレオチド以内に配置されている単離された発現ベクターであって、非低酸素細胞に組み込まれたときに前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の発現がサイレンシングされ、該細胞が低酸素にされたときに該サイレンシングされた発現が逆転される、前記単離された発現ベクター。
【請求項９】
(a)少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントと、ニューロン限定サイレンサー因子に結合する少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントとを有するサイレンサー誘導領域、および(b)該サイレンサー誘導領域と機能的に連結されていて該サイレンサー誘導領域により調節され、かつ少なくとも１つのヌクレオチド配列の上流にある細胞型特異的プロモーターを含んでなり、前記少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントと前記少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントが互いから500ヌクレオチド以内に配置されている単離された発現ベクターであって、非低酸素細胞に組み込まれたときに前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の発現がサイレンシングされ、該細胞が低酸素にされたときに該サイレンシングされた発現が逆転される、前記単離された発現ベクター。
【請求項１０】
(a)少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントと、ニューロン限定サイレンサー因子に結合する少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントとを有するサイレンサー誘導領域、および(b)該サイレンサー誘導領域と機能的に連結されていて該サイレンサー誘導領域により調節され、かつ少なくとも１つのヌクレオチド配列の上流にあるプロモーターを含んでなり、前記少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントと前記少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントが互いから500ヌクレオチド以内に配置されている単離された発現ベクターであって、前記ベクターは非低酸素細胞に組み込まれたときに前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の発現がサイレンシングされ、該細胞が低酸素にされたときに該サイレンシングされた発現が逆転されるものであり、かつ前記ヌクレオチド配列は、アデノシンデアミナーゼ、アンギオポエチン、アポトーシスインヒビタータンパク質、アンギオスタチン、Ｂ細胞CLL／リンパ腫、カタラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、DT-ジアホラーゼ、エンドスタチン、エリトロポエチン、繊維芽細胞増殖因子、フマジリン、β-グロビン、グルタチオンペルオキシダーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子、熱ショック転写因子、肝細胞増殖因子、インターフェロン、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、一酸化窒素シンターゼ、血小板由来増殖因子、プロリフェリン、ソマトメジンＣ、スーパーオキシドジスムターゼ、サーバイビン(survivin)、チミジンキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、腫瘍タンパク質p53、ウロキナーゼ、および血管内皮増殖因子からなる群より選択される遺伝子の機能性コード領域である、前記単離された発現ベクター。
【請求項１１】
(a)少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントと、ニューロン限定サイレンサー因子に結合する少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントとを有するサイレンサー誘導領域、および(b)該サイレンサー誘導領域と機能的に連結されていて該サイレンサー誘導領域により調節され、かつ少なくとも１つのヌクレオチド配列の上流にあるプロモーターを含んでなり、前記少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントと前記少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントが互いから500ヌクレオチド以内に配置されている単離された発現ベクターであって、前記ベクターは非低酸素細胞に組み込まれたときに前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の発現がサイレンシングされ、該細胞が低酸素にされたときに該サイレンシングされた発現が逆転されるものであり、かつ前記発現ベクターは、Kozak配列、転写終結配列、ポリアデニル化配列およびmRNA分解配列からなる群より選択される配列をさらに１以上有する、前記単離された発現ベクター。
【請求項１２】
(a)少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントと、ニューロン限定サイレンサー因子に結合する少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントとを有するサイレンサー誘導領域、および(b)該サイレンサー誘導領域と機能的に連結されていて該サイレンサー誘導領域により調節され、かつ少なくとも１つのヌクレオチド配列の上流にあるプロモーターを含んでなり、前記少なくとも１つのニューロン限定サイレンサーエレメントと前記少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントが互いから500ヌクレオチド以内に配置されている単離された発現ベクターであって、前記ベクターは非低酸素細胞に組み込まれたときに前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の発現がサイレンシングされ、該細胞が低酸素にされたときに該サイレンシングされた発現が逆転されるものであり、かつ前記発現ベクターはアデノ随伴ウイルス粒子内に封入されている、前記単離された発現ベクター。
【請求項１３】
(a)サイレンサーエレメント、(b)誘導エレメント、および(c)該サイレンサーエレメントと該誘導エレメントに機能的に連結されていて該サイレンサーエレメントと該誘導エレメントにより調節され、かつ少なくとも１つのヌクレオチド配列の上流にあるプロモーターを含んでなる単離された発現ベクターであって、真核細胞に組み込まれたときに前記サイレンサーエレメントは少なくとも１つのヌクレオチド配列の発現を可逆的に抑制する、前記単離された発現ベクター。
【請求項１４】
(a)少なくとも１つの低酸素応答エンハンサーエレメントと、少なくとも１つのサイレンサーエレメントとを有するサイレンサー誘導領域、および(b)該サイレンサー誘導領域と機能的に連結されていて該サイレンサー誘導領域により調節され、かつ少なくとも１つのヌクレオチド配列の上流にあるプロモーターを含んでなる単離された発現ベクターであって、非低酸素細胞に組み込まれたときに前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の発現がサイレンシングされ、該細胞が低酸素にされたときに該サイレンシングされた発現が逆転される、前記単離された発現ベクター。
【請求項１５】
プロモーターがウイルスプロモーターである、請求項１４に記載の単離された発現ベクター。
【請求項１６】
プロモーターが哺乳動物プロモーターである、請求項１４に記載の単離された発現ベクター。
【請求項１７】
プロモーターが細胞型特異的プロモーターである、請求項１４に記載の単離された発現ベクター。
【請求項１８】
前記ヌクレオチド配列が、単球化学誘因タンパク質-1 (MCP-1)、間質細胞誘導因子1 (SDF-1)、エオタキシン、Myo D、アデノシンデアミナーゼ、アンギオポエチン、アポトーシスインヒビタータンパク質、アンギオスタチン、Ｂ細胞CLL／リンパ腫、カタラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、DT-ジアホラーゼ、エンドスタチン、エリトロポエチン、繊維芽細胞増殖因子、フマジリン、β-グロビン、グルタチオンペルオキシダーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子、熱ショック転写因子、肝細胞増殖因子、インターフェロン、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、一酸化窒素シンターゼ、血小板由来増殖因子、プロリフェリン、ソマトメジンＣ、スーパーオキシドジスムターゼ、サーバイビン(survivin)、チミジンキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、腫瘍タンパク質p53、ウロキナーゼ、および血管内皮増殖因子からなる群より選択される遺伝子の機能性コード領域である、請求項１４に記載の単離された発現ベクター。
【請求項１９】
前記発現ベクターが、Kozak配列、転写終結配列、ポリアデニル化配列およびmRNA分解配列からなる群より選択される配列をさらに１以上含む、請求項１４に記載の単離された発現ベクター。
【請求項２０】
前記発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、およびアデノウイルスからなる群より選択される粒子内に封入されている、請求項１４に記載の単離された発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、哺乳動物遺伝子発現を調節することに関するものである。
【０００２】
２．関連技術の説明
遺伝子導入は、外来遺伝物質が発現されるように細胞に外来遺伝物質を導入することを含む。このプロセスは、例えば、遺伝子治療、組換え産物の生産、遺伝子診断、薬物スクリーニングのような用途において利用される。しかし近年、こうした分野の最大の挑戦であるヒト疾患のin vivo遺伝子治療が成功したと報じられている（Kayら, 2000; Cavazzano-Calvoら, 2000）にもかかわらず、新しい発現ベクターの構築は、調節された方法で高レベルの遺伝子発現を達成することに熱心な、多数の研究者の注目を集めている（Agha-MohammadiおよびLotze, 2000に概説）。
【０００３】
たいていの場合、遺伝子導入の最終目標は、治療または予防効果を奏するのに十分な期間にわたり遺伝子産物の産生をもたらす発現ベクターを導入することである。その期間は比較的短いかもしれないし（例えば、数時間ないし数日間）、長期間であるかもしれない（例えば、数週間から１年以上）。遺伝子に基づいた治療の一つの重要な面は、疾病により影響される細胞または組織に遺伝子発現を空間的および時間的に制限するようなやり方で、発現を調節することであろう。そのような調節には、遺伝子が実質的に潜伏した状態で標的細胞または組織に送り込まれ、その結果として疾病の不在下では標的の表現型を変化させたり、表現型に顕著な影響を及ぼしたりしないことが必要である。疾病が進行中である場合は、潜伏遺伝子が病気の症状を消失させるように誘導され（例えば、空間的、時間的、またはその両方）、逆に、症状がおさまっているときには発現を中止することが望ましいと考えられる。単純化するために、それには、内因性の疾病関連刺激に応答することができる厳格なオン／オフスイッチによって遺伝子を調節する必要がある。
【０００４】
そのような調節された遺伝子発現の重要な特性は、サイレンサー-インデューサー比と呼ばれており、すなわち、この比率は誘導条件下で測定した外来遺伝子の発現を、誘導なしの発現（つまり、基礎発現）の量で割った値である。この比率は高くなければならず（例えば、約25〜1000倍以上）、また、誘導条件の適切な制御によって十分に調節可能であるべきである。もう一つの重要な特性は、誘導されない、疾病のない状態で遺伝子発現を実質的に沈黙させる（または抑制する）ことである。
【０００５】
外来遺伝子の発現を調節するうえでの厳格なオン−オフスイッチの必要性は広く認められており、そのような調節が存在しないことは、多くの遺伝子導入用途において重大な制限の一つであると見なされる。調節された外来遺伝子発現は、正の調節および負の調節のいずれも、原核生物（例えば、Lacオペロン）および哺乳動物（例えば、Tetリプレッサーおよびアクチベーター、プロゲステロンまたはエクジソン受容体）においてすでに記載されている（Agha-MohammadiおよびLotze, 2000に概説）。こうした系のそれぞれが、転写に関与するタンパク質への外因性モジュレーターの結合を必要とし、Tet調節系におけるテトラサイクリンまたはドキシサイクリン、プロゲステロン調節系およびFKBP調節系におけるそれぞれRU486またはラパマイシンがそうである。後者の２つの系は、標的遺伝子および異なる調節成分を送達するために複数のベクターを必要とする。これらの系の全てにおいては、アロステリック変化が正および負に作用する転写因子のDNA結合親和力を決定し、それによりオン−オフスイッチを制御している(Freundliebら, 1999)。しかしながら、本発明と相違して、これらの系では、内在性の転写因子（例えば、低酸素誘導因子またはNF-κB転写因子）に作用する内因性の要因（例えば、それぞれ、低酸素またはストレス）による組織内の空間的調節または疾病状態に対する応答性が得られない。調節された発現系は酵母においてすでに作製されており、そこでは正または負に作用する因子のアロステリック活性化（すなわち、リン酸化）が転写を活性化または抑制する(LeeおよびGross, 1993)。こうした系は、アロステリック結合およびプロモーターの活性を制御する外因性モジュレーターを使用することによって、調節された発現に厳格なオン−オフスイッチを提供するという問題を解決している。本明細書に記載する本発明と比較すると、これらの系はすべてが作用機構の点で相違している。なぜならば、本発明は、空間的および時間的な可逆的抑制を媒介するために疾病応答性の内因性要因を使用するもので、アロステリック結合によるものでないからである。したがって、アロステリック調節系は本発明を教示も示唆もしていない。
【０００６】
発明の概要
本発明は、細胞における哺乳動物遺伝子発現を、少なくとも、(a) １以上のサイレンサーエレメント、および(b) 疾病と関連した１以上の内在性転写因子に応答する１以上の条件誘導エレメント、を使用して、サイレンサー誘導領域（この領域は、適切な条件下で、発現領域の上流にあるプロモーターの転写活性を改変する）を形成させることにより調節することに関する。こうして、サイレンサー誘導領域、プロモーター、および少なくとも１つの発現領域を含む発現ベクターは、発現（すなわち、遺伝子の発現領域から転写された産物に対応するRNA、または遺伝子の発現領域によりコードされる産物に対応するポリペプチドの生物学的活性）を条件的サイレンシングにより調節することができ、また、そのような発現を疾病状態により影響される細胞または組織の部分に制限することができる。
【０００７】
本発明の目的は、哺乳動物遺伝子発現（すなわち、遺伝子の発現領域から転写された産物に対応するRNA、または遺伝子の発現領域によりコードされる産物に対応するポリペプチドの生物学的活性）を条件的サイレンシングにより厳格に調節することである。好ましくは、遺伝子発現は疾病に関連した内因性の要因（例えば、虚血や他の低酸素状態、炎症およびその他のストレス状態）により調節される。
【０００８】
１以上のサイレンサーエレメントと、１以上の条件誘導エレメントと（これらはサイレンサー誘導領域へと形成される）、少なくとも１つの発現領域の上流にあって該領域と機能的に連結されたプロモーターと、を含むポリペプチドからなる発現ベクターが開示される。サイレンサーエレメントと条件誘導エレメントの数は独立して選択され、通常はそれぞれ10未満であって、ホモ多量体（すなわち、同一のサイレンサーまたは条件誘導エレメントの反復）またはヘテロ多量体（すなわち、異なるサイレンサーもしくは条件誘導エレメント、またはその変異体の混合物）として形成される。こうして、かかる発現ベクターは１以上の下流領域の転写を条件的サイレンシングにより調節し、そこでは、発現される遺伝子のDNA領域が転写されて、RNA転写物やポリペプチドなどの遺伝子産物を生成する。
【０００９】
発現は、プロモーターによる転写に正の影響を与える条件誘導エレメントへの転写因子の結合、および下流の発現領域を転写させるプロモーターの基礎活性が条件的にサイレンシングされるように該条件誘導エレメントと並列しているサイレンサーエレメントの存在を介して誘導され得る。転写因子は疾病と関連した内因性の要因に対して応答性であることが好ましい。誘導条件下で測定した遺伝子発現を、誘導なしで測定した遺伝子発現で割った比率（すなわち、サイレンサー-インデューサー比）を高くする。好ましくは、サイレンサー-インデューサー比は少なくとも約25または50、より好ましくは少なくとも100または500、より一層好ましくは少なくとも1000である。
【００１０】
遺伝子操作された哺乳動物細胞および非ヒト哺乳動物は、そのような発現ベクターを用いてトランスフェクション、感染、および遺伝子導入技法により作製することができる。
【００１１】
さらに、上記産物の製造方法ならびに使用方法も開示される（例えば、発現ベクターは診断、治療もしくは予防に、またはヒト疾病のモデルを作るために使用される）。
【００１２】
本発明のこれらおよび他の態様は、当業者には以下の説明から明らかになるであろう。
【００１３】
本発明の説明
定義
「組換え」ポリヌクレオチドは異種領域の連結またはその他の結合の結果として生成する。組換えは、少なくとも部分的に精製した酵素によってin vitroで遺伝子操作（例えば増幅、転写もしくは複製）するか、手動もしくは自動化学的手法（例えばホスホジエステルもしくはホスホトリエステル化学）によって合成するか、あるいは酵素により触媒される、部位特異的組換え（例えばインテグラーゼもしくはRAGリコンビナーゼシステム）または相同的組換えによってin vivoで実施することができる。「異種」の意味は、もちろんその背景情況に応じて変わることとなる。例えば、キメラ体を形成するための異種領域の連結とは、それらの領域が同一の生物体内で同一直線上には存在しないことを意味する。少なくとも１つがヒト由来でもう１つが非ヒト種由来の領域同士の連結は、それらが別種に由来するから、異種性である。別の例において、発現ベクターの異種宿主細胞中へのトランスフェクションまたは異種非ヒト生物体のトランスジェネシスは、その発現ベクターが天然ではその細胞もしくは生物体のゲノム中に存在しないことを意味する。
【００１４】
「単離された」産物とは、人工的に合成されたヌクレオチドもしくはアミノ酸のポリマーについては化学反応物から、天然のポリマーもしくは遺伝子工学的に製造したポリマーについては起源（例えばヒト、非ヒト哺乳動物、もしくはその他の真核生物；昆虫もしくはその他の非脊椎動物；植物；酵母、かびもしくはその他の真菌；細菌もしくはその他の原核生物）の細胞から、少なくとも部分的に精製されたものである。例えば、起源細胞の溶解物に比較して、単離された産物はその他の化学的に同類の溶質（例えばポリヌクレオチドの場合は核酸、ポリペプチドの場合はタンパク質）から、少なくとも50％、75％、90％、95％もしくは98％精製される。化学合成されたヌクレオチドもしくはアミノ酸のポリマーについては、純度は早期に停止またはブロックした産物と比較することにより決定され、実際的には、高忠実度の合成により精製なしで単離されたものとみなすことができる。精製は、例えば細胞分画、遠心分離、クロマトグラフィー、および電気泳動などの生化学的技術によって達成することができる。一般的に、溶媒（例えば水）およびバッファーや塩などの化学物質は純度を算出する際には無視される。細胞産物は、ポジティブもしくはネガティブ選択、限界希釈、または発現ベクターが宿主細胞中に導入されたかどうかの選別によって単離することができる。所望の産物を単離するためには、細胞もしくは遺伝子クローニングを使用することが多い。こうして、ポリヌクレオチドは、クローニングによって得られた実質的に均一な集団としてのウイルス粒子もしくはトランスフェクトされた細胞中に含まれる場合に、「単離された」ものとみなすことができる。
【００１５】
「発現ベクター」とは、化学的形態としてはデオキシリボ核酸（DNA）もしくはリボ核酸（RNA）のいずれかの組換えポリヌクレオチドである。発現ベクターの物理的形態も鎖の型（例えば一本鎖もしくは二本鎖）およびトポロジー（例えば直鎖状もしくは環状）において差異がある。しかし、発現ベクターは二本鎖デオキシリボ核酸（dsDNA）であるか、または細胞中に導入された後（例えばプロウイルスとしての宿主ゲノム中へのレトロウイルスの挿入後）dsDNAに変換されるものが好ましいと認識すべきである。発現ベクターはタンパク質もしくはキャリアー（例えばウイルス粒子中にパッケージングされる）中の他の核酸と結合させてもよく、または修飾ヌクレオチド（例えばメチル化ヌクレオチド）を含んでいてもよい。発現ベクターには例えばファージミド、プラスミド、バクテリオファージもしくはウイルス、コスミド、細菌人工染色体（BAC）または酵母人工染色体（YAC）などのシャトルベクターに基づくものがある。本発明の実施形態を限定するものではないが、発現ベクターの長さは、宿主ゲノム中に組み込まれても組み込まれなくても、100〜1,000,000ヌクレオチド長、より好ましくは1000〜100,000ヌクレオチド長、さらに好ましくは5,000〜50,000ヌクレオチド長とするのが好都合である。
【００１６】
本発明にしたがう発現ベクターは、少なくとも１箇所の発現領域の調節を提供するように機能的に連結された、１以上のサイレンサーエレメント、１以上の条件誘導エレメント、および１以上のプロモーターを含んで構成される。好ましくは、１以上のサイレンサーエレメントおよび１以上の条件誘導エレメントは互いに異種性であり；サイレンサーおよび条件誘導エレメントから形成されるサイレンサー誘導領域は、哺乳動物細胞もしくは組織における発現の条件的サイレンシングを行ない、かつこうした発現を空間的および時間的に制限されたパターンで調節するように作用し；また発現を調節するために、アロステリック機構によって作用する外因性の因子（例えば、薬物、組換えポリペプチドなどの組換えトランス作用性因子等）の代わりに、疾病に関連する内因性の要因（例えば虚血およびその他の低酸素状態、炎症ならびにその他のストレス状態）を使用する。
【００１７】
このようにこの発現ベクターは、非アロステリック機構、すなわち、サイレンサーエレメントへのネガティブ作用性転写因子および条件誘導エレメントへのポジティブ作用性転写因子の可逆的で相互に排他的な結合、による「条件的サイレンシング」によって遺伝子発現を調節する。哺乳動物細胞もしくは組織において、目的とする結果は、発現される遺伝子のDNA領域が転写されて単一クラスもしくは複数の異なるクラスのRNA転写物を産生し、その後これが単一クラスもしくは複数の異なるクラスのポリペプチドを産生するように翻訳されてもされなくてもよい、該発現される領域の厳格な調節である。例えば、遺伝子の生物学的活性は転写物それ自体（すなわち誘導可能なRNA活性）および／またはポリペプチド（すなわち誘導可能なタンパク質活性）のレベルで調節される。dsRNAおよびリボザイム分子がRNA活性をもつ転写物の例である。タンパク質活性の例として、アフィニティー結合、酵素活性、受容体とそのコグネイトリガンド間の結合の結果であるシグナル伝達、ならびにその他の生理学的応答が含まれる。
【００１８】
サイレンサーエレメントおよび条件誘導エレメントの数は独立してホモ多量体（すなわち同一のサイレンサーもしくは条件誘導エレメントの反復）またはヘテロ多量体（すなわち異なるサイレンサーもしくは条件誘導エレメント、またはその変異体の混合物）として少なくとも2、3、4、5、6またはそれ以上である。発現ベクター中のサイレンサーエレメントおよび条件誘導エレメントのタイプおよび数は変更され得る。しかし、サイレンサー-インデューサー比は一般的に、すべてではないにしても大部分のタイプのエレメントについて、エレメントの数と直接関係して増加し、最終的には平坦になると予測される。１エレメントの配列が２個組の対称形でない場合、発現ベクターの残りの部分（例えばプロモーター）に対して好ましいエレメントの方向性があるはずであるが、これによって発生するサイレンサー-インデューサー比の差異はおそらく大したことではないと見られる。サイレンサー誘導領域が「エンハンサー」として機能する場合は、そのプロモーターに対するエンハンサーの方向性および距離は本発明の操作上重大な決定因子とはならない。
【００１９】
プロモーターの転写開始部位と最も近傍にあるサイレンサー誘導領域の最も近い配列間の距離は多くとも500、1000、1500、2000もしくは2500ヌクレオチドとする。しかし、上述したように、実施例に示す発現ベクターについてはこの距離は約100から約300ヌクレオチドであるが、これは本発明の有利な効果を得るために決定的に重要であるとは考えられない。ある種のプロモーター、特にTATAおよびCAAT共通配列を欠損しているもの、は完全な転写開始の少なくとも10％に関係する複数の転写部位を持ち得ることに注目されたい。この距離はサイレンサー-インデューサー比を最大にするように変更することができる。ここで、プロモーターとサイレンサー誘導領域の間のスペーサー配列のサイレンサー-インデューサー比に及ぼす影響は通常スペーサー配列内のヌクレオチドの数に依存し、それらのヌクレオチド塩基の正体には依存しないだろう。スペーサー配列の突然変異分析によって、プロモーターとサイレンサー誘導領域の境界が確認されるものと予想される。なぜならば、スペーサー配列の塩基の変更の結果はサイレンサー-インデューサー比について重大な差異とはならないはずだからである。そうでない場合は、（最も近いいずれかの）プロモーターもしくはサイレンサー誘導領域の長さをより長いものと、そしてその分だけスペーサー配列をより短いものとみなさなければならない。
【００２０】
サイレンサーエレメントと条件誘導エレメントを隔てる距離の方が、条件的サイレンシングのためにはより重要である可能性がある。好ましくは、その距離は、サイレンサーエレメントへのネガティブ作用性転写因子の結合と条件誘導エレメントへのポジティブ作用性転写因子の結合間に干渉が存在するように制限される。サイレンサーエレメントと条件誘導エレメント間の500塩基を超える距離は条件的サイレンシングを排除した（実施例１）が、条件的サイレンシングはサイレンサーエレメントに結合するタンパク質の、わずかに約50塩基の距離での条件誘導エレメントに結合する別のタンパク質による置換に直接相関した（実施例3）。より距離が大きいその他の配置でも、サイレンサーおよび条件誘導エレメント中のDNA部位への結合に影響を与えるDNAの屈曲または長距離相互作用がある状況下では、本発明の範囲内となる可能性がある。
【００２１】
サイレンサー誘導領域中のサイレンサーおよび条件誘導エレメントを、発現ベクター中でサイレンサーエレメントと条件誘導エレメントが約50もしくは75塩基またはそれ以下の距離にあるように、配置することができる。また、約100もしくは150塩基から約200もしくは300塩基の距離とし、あるいは約500もしくは1000塩基またはそれ以上の距離としてもよい。上で考察したように、突然変異分析を使用して、サイレンサー誘導領域の長さを確認することができる。例えば、サイレンサーエレメントおよび条件誘導エレメントの転写因子結合部位における少なくともいくつかの突然変異はサイレンサー-インデューサー比を変更させるものと予想されるが、結合部位もしくはエレメントの間に位置する塩基においてはこの比の変化はないものと予想される。
【００２２】
発現はいくつかの条件誘導エレメントへの単一クラスもしくは複数の異なるクラスの転写因子の結合を介して誘導され、こうした結合は１以上のプロモーターによる転写にポジティブな影響を与える。いくつかの条件誘導エレメントに近接して並置されたいくつかのサイレンサーエレメントの存在は、発現ベクター内の少なくとも１つのプロモーターの転写活性を、サイレンサーエレメントが存在しない場合のそのプロモーターの基礎転写活性に比較して、抑制する。これによってその遺伝子の発現される少なくとも１つの下流領域の転写が条件的サイレンシングを受ける。
【００２３】
一般的に、サイレンサーエレメントのタイプおよび数、条件誘導エレメントのタイプおよび数、サイレンサー誘導領域におけるそれらの相対的順序および距離、プロモーターのタイプ、ならびにサイレンサー誘導領域とそれによって条件的サイレンシングを受ける１プロモーターとの最も近い距離を変更することによって、発現ベクターについてサイレンサー-インデューサー比を増加することができる。同一の発現ベクターについてのこの比率は、おそらく誘導条件および連結されるプロモーターに応じて変化するであろう。
【００２４】
組織特異的遺伝子発現の抑制のためのサイレンサーエレメントの役割が概説されている（Ogbourne and Antalis,1998）が、そうしたエレメントに関する条件的機能はこれまで記載されていない。本明細書に開示するように、条件的サイレンシングは本発明にしたがって構築された発現ベクターの１特性であり、機構として新規である。この目的のために、機能的に可逆的なサイレンシングは、サイレンサーエレメント内に位置するそのコグネイト部位の少なくとも１つに結合する少なくとも１つのネガティブ作用性転写因子と、条件誘導エレメント内に位置するそのコグネイト部位の少なくとも１つに結合する少なくとも１つのポジティブ作用性転写因子間の競合の結果として、定義される。こうした競合的結合は共通するハイブリッドDNA結合部位で発生し得る（実施例１〜3）。競合はまた、クロマチン構造などの転写に影響を与える下流部位、または転写開始複合体が結合し、かつポジティブ作用性もしくはネガティブ作用性因子が転写に対してそれぞれが独立して制御作用をするTATAボックスでも作動しうる。
【００２５】
発現ベクターはさらに、発現領域内に１以上のスプライスドナーおよびアクセプター部位；発現領域の上流に翻訳開始のためのKozak共通配列、発現領域の下流に翻訳の停止を確実にするための３つのフォワードリーディングフレーム内の複数の停止コドン、１以上のmRNA分解シグナル、転写停止シグナル、ポリアデニル化シグナル、および3'切断シグナルを含んでいてもよい。イントロンを含まない発現領域（例えばcDNAからのコード領域）については、１対のスプライスドナーおよびアクセプター部位が好ましい場合と好ましくない場合がある。しかし、誘導条件下のみで１以上の下流領域を発現させることを所望するならば、mRNA分解シグナルを含ませるのが有用であろう。宿主ゲノム中に組み込まれる発現ベクターの複製を可能にするため、または自律複製エピソームとして、複製起点を１つ含ませることができる。それぞれ染色体の分離および短縮化からの染色体末端の保護を目的として、セントロメアおよびテロメア配列をも含ませることができる。宿主ゲノム中へのランダムもしくは標的組込みは、発現ベクターの維持をより確実にすると見られるが、エピソームは選択圧によって維持することもでき、あるいはまた、発現ベクターが単に一過性で存在する適用例においては好ましいかもしれない。
【００２６】
発現ベクターは遺伝子操作のために作製することもできる。例えば、抗生物質耐性遺伝子（例えばampr、kanr、tetr）、レポーターもしくは選択マーカー（例えばcat、DHFR、HSV-tk、lacZ、luc）、制限エンドヌクレアーゼのための複数の認識部位を持つポリリンカー（例えばBamHI、EcoRI、HindIII、NotI、SfiI）、in vitro転写のための（例えばSP6、T3もしくはT7バクテリオファージポリメラーゼに関係する）プロモーター、およびin vitro複製のためのプライマーアニーリング部位などの遺伝子操作である。
【００２７】
「サイレンサーエレメント」は、下流の発現領域の転写に負の調節を与える発現ベクターのエレメントである。発現ベクターからのサイレンサーエレメントの除去は下流領域の基礎発現を増加させるものと予想される。上記のように、これはサイレンサー誘導領域中にホモ多量体（すなわち同一のサイレンサーエレメントの反復）またはヘテロ多量体（すなわち異なるサイレンサーエレメントもしくはその変異体の混合物）として、少なくとも１、2、3、4、5、6もしくはそれ以上で存在しうる。サイレンサーエレメント（例えば当分野で知られている共通配列）は通常長さが約8から約200ヌクレオチドの間である。サイレンサーエレメントは大部分の細胞中で働く場合と働かない場合がある（すなわち、サイレンサーは大部分の細胞中、かつ大部分の条件下で、細胞特異的に遺伝子発現を減少させる活性がある）が、好ましくは発現ベクター中に存在する条件誘導エレメントの非誘導条件下でも遺伝子発現を減少させる活性があるものである。
【００２８】
「条件誘導エレメント」は、誘導条件下で下流の発現領域の転写に正の調節を与える発現ベクターのエレメントである。これはやはり条件的に誘導されるエンハンサー領域から得ることができるが、大部分のもしくはあらゆる条件下で基礎転写を増加させる構成的に活性なエンハンサーは条件誘導エレメントのための好ましい起源ではない。発現ベクターからの条件誘導エレメントの除去は誘導条件下で下流領域の発現を減少させるものと予想される。上記のように、これはホモ多量体（すなわち同一の条件誘導エレメントの反復）またはヘテロ多量体（すなわち異なる条件誘導エレメントもしくはその変異体の混合物）として、少なくとも１、2、3、4、5、6もしくはそれ以上で存在しうる。条件誘導エレメント（例えば当分野で知られている共通配列）は通常長さが約4から約100ヌクレオチドの間である。条件誘導エレメントは大部分の細胞中で働く場合と働かない場合があるが、非誘導条件下では後者の場合が好ましい。
【００２９】
「転写因子」はサイレンサーエレメントもしくは条件誘導エレメント中にあるコグネイト配列に特異的に結合するタンパク質である。ポジティブ作用性転写因子の条件誘導エレメント内のコグネイト部位への結合は発現を増加させ、ネガティブ作用性転写因子のサイレンサーエレメント内のコグネイト部位への結合は発現を減少させることとなる。こうした増加もしくは減少は、制御された反応条件下で、発現ベクター中の転写因子の有無、またはエレメントの有無に関して測定することができる。転写因子の存在もしくは活性は、宿主細胞もしくは生物のタイプまたはその宿主を維持する条件に左右される。
【００３０】
「プロモーター」は、発現ベクター中の下流領域の基礎発現に関係する。プロモーターは大部分の細胞中で働く場合と働かない場合がある（例えば遺伝子発現は細胞特異的である）が、発現ベクター内に含まれるサイレンサー誘導領域の誘導条件下では働かなければならない。プロモーターからの転写の開始は（例えばRACEもしくはS1ヌクレアーゼプロテクション法によって）測定することができ、こうした開始またはさらには安定な転写物の定常状態レベルもプロモーター活性の尺度である。突然変異分析からプロモーターの境界および必須のヌクレオチドが確認されるものと予想される（例えば、基礎転写因子もしくはRNAポリメラーゼサブユニットによる結合、ゲル遅延化、またはプロテクションは、プロモーター内の特定のヌクレオチドの存在もしくは正体に依存する）。プロモーターはウイルス（例えば前初期遺伝子もしくは長末端反復）、組織特異的真核生物遺伝子、または非組織特異的真核生物遺伝子（例えばハウスキーピング遺伝子）から取得することができる。プロモーターは１以上のサイレンサーおよび条件誘導エレメントに対して異種であってもなくてもよい。サイレンサー誘導領域の機能に寄与するプロモーターの部分が存在してもよい。
【００３１】
遺伝子発現が特定の発生段階もしくは組織にターゲッティングされるいくつかの適用例においては、それぞれ空間的もしくは時間的に制限された発現が望ましい。例えば、こうしたプロモーターは、血管形成増殖因子を虚血筋肉に、または有害遺伝子を固形腫瘍に送達する発現ベクター中で使用することができる（Prentice and Webster 1995；Webster,1999ab；Alexanderら、1999）。組織特異的プロモーター中の調節エレメントは通常ポジティブ作用性転写因子により結合されるので、発現ベクター内にそれを含めることは標的組織における基礎（すなわち非誘導）遺伝子発現を増加させると予想されていた。この問題はトランスジーンの調節および遺伝子ターゲッティング法における組織特異的調節の使用を妨げる制限要因となっていた。しかし、本発明は、この制限を排除するものである。なんとなれば、発現ベクター内にサイレンサーエレメントを含ませることで、非誘導状態において組織特異的プロモーターエレメントの活性を条件的にサイレンシングし、誘導されたときにそれらを活動させることができるからである。
【００３２】
発現ベクターの成分は哺乳動物遺伝子（例えば、アデニンヌクレオチド輸送体-2、アルブミン、アルデヒドデヒドロゲナーゼ-3、B29/Ig-β、心臓アクチンもしくはミオシン重鎖、CD95/Fas/APO1、クリスタリン、ドーパミンβヒドロキシラーゼ、エラスターゼ、エンドセリン、エノラーゼ、エリトロポエチン、αフェトプロテイン、グロビン、グルココルチコイド受容体、グルタチオンＰトランスフェラーゼ、成長ホルモン、熱ショックタンパク質、ヘムオキシゲナーゼ、ヒストン、インスリン、ソマトメジン、インターフェロン、腸管三葉型因子、メタロチオネイン、核ホルモン受容体、フェニルエタノールアミンN-メチルトランスフェラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、前立腺特異的抗原、プロタミン、ピルビン酸キナーゼ、レニン、SCG10、骨格アクチンもしくはトロポニン、ナトリウムチャネルタイプII、シナプシン、精巣特異的ヒストンH1t、甲状腺受容体-β1、トランスフェリン、チロシンヒドロキシラーゼ、血管細胞接着分子-1、フォンビルブラント因子）；ウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタインバールウイルスおよびその他の単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、モロニー白血病もしくは肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、ポリオーマもしくはSV40ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ワクシニアウイルス）、あまり好ましくはないが、植物、昆虫、かび、真菌および細菌遺伝子から誘導することができる。サイレンサーおよび条件誘導エレメント、プロモーター、転写因子、ならびにそれらの結合部位の詳細については、引用した参考文献を参照されたい。
【００３３】
下流領域の発現は、例えば高温（例えば約39℃よりも高い温度）、低酸素（例えば約10％よりも低い酸素濃度）、炎症（例えばLPSもしくは炎症サイトカインによる処置）、虚血（例えばPrenticeら、1997に示されるような冠動脈結紮；Takeshitaら、1994にあるような大腿動脈結紮）、酸化的ストレス（例えばWebster、1999bに示されるような心筋細胞の低酸素後の再酸素添加）、増殖刺激、収縮機能、抗酸化剤、および筋繊維ストレッチなどの１以上の条件刺激によって誘導することができる。
【００３４】
遺伝子発現のモジュレーションは、転写開始、転写物の安定性、転写物のタンパク質産物への翻訳、タンパク質の安定性、またはそれらの組合せに影響を与えることによって行なわれる。量的な効果は以下のような技法によって測定することができる：in vitro転写、in vitro翻訳、ノーザンハイブリダイゼーション、核酸ハイブリダイゼーション、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）、ランオン（run-on）転写、サザンハイブリダイゼーション、細胞表面タンパク質ラベリング、代謝タンパク質ラベリング、抗体結合、免疫沈降（IP）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光もしくは組織化学的染色、顕微鏡およびデジタル画像解析、ならびに蛍光活性化細胞分析もしくはソーティング（FACS）。
【００３５】
レポーターもしくは選択マーカー遺伝子であってそのタンパク質産物を容易にアッセイすることができるものの使用によって、遺伝子発現をアッセイすることができる。レポーター遺伝子として例えば以下のものが含まれる：アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ（lacZ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、βグルクロニダーゼ（GUS）、細菌／昆虫／海洋性無脊椎動物ルシフェラーゼ（LUC）、グリーンおよびレッド蛍光タンパク質（それぞれGFPおよびRFP）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、βラクタマーゼ、ならびにそれらの誘導体（例えばブルーEBFP、シアンECFP、イエローグリーンEYFP、脱安定化GFP変異体、安定化GFP変異体、またはClontechからLIVING COLORS蛍光タンパク質として販売されている融合変異体）。こうしたレポーター遺伝子は色素原、蛍光もしくはルミネセンスシグナルによって都合よくアッセイされるコグネイト基質を使用することとなる。あるいは、アッセイ産物を異種エピトープであってそのためのコグネイト抗体もしくはアフィニティー樹脂が入手し得るもの（例えば、FLAG、MYC、SV40 T抗原、グルタチオントランスフェラーゼ、ヘキサヒスチジン、マルトース結合タンパク質）でタグ付けすることができる。選択マーカー遺伝子が存在する薬物の例は、アンピシリン、ゲネチシン（G418）／カナマイシン／ネオマイシン、ヒグロマイシン、プロマイシン、およびテトラサイクリンである。感受性宿主細胞もしくは栄養要求体における選択マーカーとして酵素（例えばジフテリアトキシン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、HSV-1チミジンキナーゼ）を使用することができる。例えば、ジフテリアトキシンは系統マッピングにおいて細胞を除去するために使用することができ、段階的に濃度を増大させたメトトレキセートは遺伝子増幅によりDHFR選択マーカーに連結した発現ベクターのコピー数を増加させることができ、ガンシクロビルはウイルスチミジンキナーゼ選択マーカーについてネガティブ選択することができる。
【００３６】
in vivoで転写もしくは翻訳活性を測定する技術は当分野で知られている。例えば、核ランオンアッセイを利用して、レポーター遺伝子の転写を測定することができる。レポーター遺伝子の翻訳は翻訳産物の活性を調べることによって測定することができる。レポーター遺伝子の活性は、ポリヌクレオチド産物の転写（例えば、GFP転写物のRT-PCR）、ポリペプチド産物の翻訳（例えば、GFPタンパク質のイムノアッセイ）、およびレポータータンパク質自体の酵素活性（例えば、GFPの蛍光もしくはそのエネルギー転移）の存在量の１つ以上を調べることによって測定することができる。
【００３７】
「発現される領域」または「発現領域」は、どんな遺伝子に由来するものでもよく、またプロモーターに対してどちらの方向でも設定することができる。cRNA、アンチセンスおよびRNA干渉を作製するためには、アンチセンス方向の発現領域が有用となる。遺伝子は、その宿主細胞もしくは生物、その同一の種から誘導されるか、またはde novo設計することができるが、古細菌、細菌、真菌、植物もしくは動物起源のものが好ましい。遺伝子は限定するわけではないが以下のクラスの１以上の生理学的機能を持つものとする：アルブミン、アミロイド、アポリポタンパク質、グロビン、サルコメア成分およびトランスフェリンなどの構造タンパク質；サイトカイン、ホルモンならびに細胞増殖、有糸分裂、減数分裂、分化および発生を調節するその他の可溶性因子；こうした因子のための可溶性および膜受容体；接着分子；細胞表面受容体およびそのリガンド；クラスター分化（CD）抗原、抗体およびT細胞抗原受容体鎖、組織適合性抗原、ならびにその他の免疫メディエーター；ケモカイン、その受容体、およびその他の炎症に関与する因子；炎症の脂質メディエーターを産生する酵素およびその調節因子；凝固および補体因子；イオンチャネルおよびポンプ；神経伝達物質；好中性(neutrophic)因子およびその受容体；腫瘍遺伝子、腫瘍サプレッサーおよびその他のシグナル伝達物質；プロテアーゼおよびそのインヒビター；異化もしくは代謝酵素、ならびにその調節物質。一部の遺伝子は、選択的転写物を産生するか、ホモポリマーもしくはヘテロポリマーとして組み立てられるサブユニットをコードするか、プロテアーゼ切断によって活性化されるプロペプチドを産生する。
【００３８】
１例として、サイトカインのクラスには以下のものが含まれる：4-1BBリガンド、アンフィレギュリン(amphiregulin)、アンギオポエチン１〜アンギオポエチン4、APO3リガンド、BMP-2〜BMP-15、BDNF、ベータセルリン(betacellulin)、カルジオトロフィン(cardiotrophin)-1、CD27リガンド、CD30リガンド、CD40リガンド、CNTF、EGF、エピレグリン、エリトロポエチン、Fasリガンド、FGF-1〜FGF-19、Flt-3リガンド、G-CSF、GDF-1、GDF-3、GDF-8〜GDF-10、GITRリガンド、GM-CSF、ヘパリン結合EGF、肝細胞増殖因子、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、インヒビンA、インヒビンB、IL-1α、IL-1β、IL-2〜IL-7、IL-9〜IL-11、IL-12 p35、IL-12 p40、IL-13〜IL-19、レプチン、LIF、LIGHT、LT-β、リンホタクチン(lymphotactin)、M-CSF、ミドカイン(midkine)、MIS、マクロファージ刺激性タンパク質、ニューレグリン(neuregulin)、NGF、NT-3、NT-4、NT-6、オンコスタチンM、OX40リガンド、PDGF-A、PDGF-B、胎盤成長因子、プレイオトロフィン(pleiotrophin)、SMDF、SCF、TALL-1、TALL-2、TGF-α、TNF-β1〜β3、チモポエチン、TNF-α、TNF-β、TRAIL、TRANCE、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-DおよびVEGI。これらのサイトカインの大部分は高もしくは低親和性の１種以上の既知の受容体のリガンドである。対照的に、HER2受容体のリガンドはまだ知られていない。これらのサイトカインのさらなる情報は以下の文献に含まれている記事および参照リストから取得することができる：Nicola（Guidebook to Cytokines and Their Receptors, Oxford Press, 1997）；Thomson（The Cytokine Handbook, Academic Press, 1988）；R&D Systems catalogs and its web site；ならびに米国特許第5,773,252号および第5,985,614号。
【００３９】
その他の酵素および細胞タンパク質として以下のものが含まれる：アデノシンデアミナーゼ、アンギオスタチン、アポトーシスインヒビタータンパク質（AIP1もしくはAIP2）、BCL2およびMYCファミリーメンバー、カタラーゼ、シャペロニンおよび熱ショックタンパク質、サイクリン、デオキシリボヌクレアーゼ、DMD2、DT-およびNADPH-ジアホラーゼ、エンドスタチン、エンドセリン、フマジリン、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、成長ホルモン、熱ショック因子、インスリン、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、キナーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP-1、MMP-2、MMP-9、MT-1-MMP）およびそのインヒビター（TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4）、一酸化窒素シンターゼ（iNOSもしくはnNOS）、ホスファターゼ、プロリフェリン、リボヌクレアーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、サーバイビン(survivin)、チミジンキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ならびにウロキナーゼ。
【００４０】
下流の発現領域は翻訳融合物をコードすることもある。ポリペプチドをコードする領域のオープンリーディングフレームと異種ドメイン少なくとも１つを効果的に連結することができる。異種ドメインとしてレポーターもしくは選択マーカーを使用する場合は、融合タンパク質の発現を容易にアッセイまたは所在決定することができる。異種ドメインはアフィニティーもしくはエピトープタグでもよい。
【００４１】
ポリヌクレオチドをリンカーオリゴヌクレオチドに連結するか、特異的結合相手の１メンバーとのコンジュゲートとしてもよい（例えば抗体／ジゴキシゲニン／ハプテン／ペプチドエピトープ、ビオチン-アビジン／ストレプトアビジン、グルタチオントランスフェラーゼもしくはGST-グルタチオン、マルトース結合性タンパク質-マルトース、ポリヒスチジン-ニッケル、タンパク質A／G-イムノグロブリン）。ポリヌクレオチドを、結合するメンバーをコードするヌクレオチド配列の連結によってコンジュゲート化することができる。こうして連結もしくはコンジュゲート化したポリヌクレオチドがコードされた融合体を製造するか、あるいは化学的架橋形成によって結合メンバー上の反応性分子に直接化学的に連結することによって、ポリペプチドを特異的結合相手の１メンバーと結合させることもできる。こうしたポリヌクレオチドおよびポリペプチドをアフィニティー試薬として使用して、発現ベクターの転写物もしくはタンパク質産物を同定し、単離し、またその特異的結合に関与する相互作用を検出することができる。転写物もしくはタンパク質産物のアフィニティー結合の前もしくは後に、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドに結合させたメンバーをそのコグネイト結合メンバーに結合させてもよい。これによって、溶液中または支持体に固定した複合体を作製することができる。（例えば、エンテロキナーゼ、第Ｘa因子、ICE、トロンビンのための）プロテアーゼ認識部位を隣接するドメインの間に含ませることによって、部位特異的タンパク質分解を可能にし、これらのドメインを分離し、かつ／またはタンパク質活性を不活性化することができる。
【００４２】
本発明にしたがってそれぞれトランスフェクションもしくはトランスジェネシス技法によって哺乳動物細胞もしくは非ヒト哺乳動物に適用する発現ベクターの量は、その発現ベクターを宿主細胞もしくは非生殖系組織に一過性もしくは安定的な基準（例えば投与停止後少なくとも１週間はその細胞もしくは組織内に発現ベクターを検出することができる）で導入するのに有効な量である。ベクターをエピソームとして維持するか、または宿主染色体中に組み込むことができる。したがって、用語「有効な量」とは、指示された効果を達成するために必要な組成物の量を意味する。
【００４３】
本発明の方法において有用な医薬組成物を固形剤もしくは液剤（特に保存および輸送用に核酸を安定化させるため）、点眼剤、坐剤、エアロゾル剤、持続性放出剤、またはその他の製剤として投与することができる。発現ベクターの他に、こうした組成物は、薬学上許容される担体およびビヒクル、バッファー、賦形剤、塩、安定化剤、保存剤、ならびに薬物投与を促進および容易にするその他の成分を含んでいてもよい。該組成物には例えば、以下のような成分を含ませることができる：ナノスフェア、ミクロスフェア、リポソーム、複製欠損もしくは複製可能ウイルス粒子、核酸を濃縮する化学的トランスフェクト剤、ならびに抗体／抗原、受容体／リガンド（例えば、トランスフェリン、ガラクトシル化ペプチド）、またはその他の細胞もしくは組織よりも優先的な標的細胞もしくは組織への発現ベクターの導入を指令するその他の特異的な結合相手の１メンバー。
【００４４】
現行の規制にしたがう遺伝子および細胞産物の製造は政府機関（例えば、米国食品医薬品局）によって適正実験室実施規範（GLP）および適正製造規範（GMP）の規制を受けることとなる。これには正確で完全な記録の保存ならびにQA/QCのモニターが要求される。さらに、インフォームドコンセントが得られること；生成物の安全性、生物活性、適切な投与量ならびに有効性がフェーズ毎に研究されること；結果が統計的に有意であること；ならびに倫理上のガイドラインに従うこと、を確認するため、当局および学会審議会による患者のプロトコルの監視が想定される。動物モデルの使用のプロトコル、ならびに毒性化学物質の使用および規制への適合性についての同様の監視が要求される。
【００４５】
本発明の別の態様は、例えば、遺伝子治療（例えば、治療もしくは予防用）、組換え生物学的製剤の製造、遺伝子診断、薬物スクリーニング、ならびに遺伝子研究（例えば、ゲノミクス、プロテオミクス、ヒト疾患のin vivoおよびin vitroモデル）などの用途における発現ベクターの使用である。
【００４６】
本発明を単独で使用してよく、または標準的な医療もしくは手術による治療に加えて使用してもよい。本明細書で使用する「治療」とは以下の意味である：哺乳動物の症状の重篤度を低下もしくは軽減すること；症状の数を減少させること；症状の悪化もしくは進行を防止すること；感染性因子、自己免疫細胞および癌性細胞を抑制もしくは排除すること；罹患していない患者の感染もしくは疾患を予防すること；またはそれらの組合せ。例えば、心臓疾患の治療には、虚血性損傷の低下もしくは予防、再狭窄の抑制、心臓もしくは血管系疾患のその他の病理的影響の緩和、低酸素症の診断、またはそれらの組合せが含まれる。
【００４７】
特に、虚血性心疾患および重篤な四肢虚血がある患者に、プラスミドベクターおよびアデノウイルスベクターによって、VEGFおよびFGF遺伝子を含む血管形成因子を送達する、少なくとも6例の臨床試験を現在実施中である（Genetic Engineering News Vol.18, Number 17, October 1998；Cardiology Today, Vol 3, Number 1, January 2000、参照）。最終目的は、虚血を治療するために血管形成および副行血管成長を刺激することである。しかし、これらの治験では、標的組織内で遺伝子発現を厳密に調節するという問題に対して本発明が提供する解決法が開示されていない（Prentice and Webster, 1995；Webster, 1999ab；Alexanderら、1999）。代わりに、構成的に活性な（CMV）プロモーターを使用したので、別の組織でのこの増殖因子の発現があるため、この操作は十分効果的ではない。しかし、本発明においては、条件によってサイレント化される低酸素誘導性発現ベクターを使用して、VEGFを虚血状態の心筋もしくは四肢筋肉に送達することができる。本発明を使用すると、VEGFが、健全に潅流された組織では低レベルの基底活性で、また低酸素状態である虚血組織では高レベルの誘導された活性で発現することになる（Leeら、2000）ので、血管形成を標的組織に限定し、安全でより効果的な治療法が提供される。
【００４８】
患者に投与される組成物の量は、好ましくはその投与にともなう利点を上回る有害効果を誘発することがない量が好ましい。したがって、治療は訓練された医師の管理、または獣医による注意深い監視のもとで実施するのが好ましい。
【００４９】
本発明の組成物を任意の既知の経路（例えば、経腸、非経口、局所）によって投与することができる。非経口経路として、限定するわけではないが、動脈内、気管支内、筋内、クモ膜下、静脈内、皮下もしくは皮内、経粘膜、およびその他の注射もしくは注入技法が含まれる。例えば、組成物を経口、非経口、局所、部位限定もしくは全身的に投与することができる。
【００５０】
組成物中の活性成分の現実の投与レベルは、特定の１患者において所望の治療もしくは予防効果を達成するのに効果的な発現ベクターの量を投与するように変更することができる。したがって、選択される用量は、サイレンサー-インデューサー比、下流の発現される領域およびその機能、発現ベクターのサイズ、投与経路、治療する症状の重篤度、ならびに治療する患者の容態および既往歴に依存することになる。
【００５１】
しかし、所望の治療もしくは予防効果を達成するのに必要なものよりも低いレベルの用量で開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投与量を増加させることも、当分野の技術範囲である。これらの組成物を本発明の方法にしたがって（例えば、急性疾患の治療のため、または安定トランスフェクションのために）単回用量で、あるいは（例えば、慢性疾患の治療のため、または一過性トランスフェクションのために）異なる時間に投与する複数回用量で投与することができる。１用量の組成物を患者に（例えば、2、3日毎から2、3年毎まで）反復して投与し、これによって初回処置後に遺伝子発現が条件によってサイレント化および誘導され、その後続く処置によって効果を補強する。
【００５２】
しかし、いずれかの特定の患者についての特定の用量は、体重、性別、年令、全身的健康状態、食事、投与の時間および経路、別の薬剤および患者の治療との組合せ、ならびに治療する疾患の重篤度を含む、各種の要因に依存することも同様に理解されるであろう。医薬組成物の大部分の活性成分とは異なって、発現ベクターが残存する場合の発現ベクターの効果的な量の範囲は低いはずである。なぜならば、これは細胞分裂中に複製されるか、または細胞中に維持されるからである。もちろん、投与される発現ベクターの量は組成物のその他の成分ならびに当業者が理解している多数の要因に依存する。
【００５３】
DNAは転写されて、そのDNAに対応するRNA転写物が生成し、そのRNAが翻訳されて新生鎖を産生し、翻訳後プロセス（例えば、アセチル化、アシル化、アミド化、ジスルフィド結合、グリコシル化、リン酸化、γカルボキシグルタミン酸のヒドロキシル化、メチル化、リン酸エステル化、タンパク質分解、スルフェート化）を受け、折り畳まれる。新生鎖、折り畳まれたタンパク質、および翻訳後プロセスを受けたタンパク質のすべてを総括してポリペプチドと称する。
【００５４】
遺伝子の活性化は、遺伝子の活性化の抑制を緩和する（例えば、可溶性サイトカイン受容体などの宿主遺伝子の負の調節因子の発現を少なくとも部分的に抑制する）ように作用する、宿主遺伝子に関連する（例えば、宿主遺伝子の完全コード領域もしくは機能性部分、そのハイパーモルフ突然変異体）か、宿主遺伝子に関連しない下流領域を含有する発現ベクターを誘導することによって、達成することができる。転写もしくは翻訳の過剰発現、ならびにタンパク質機能の過剰発現は遺伝子活性化のためのより直接的な手法である。あるいは、下流の発現される領域がゲノム中の１遺伝子座への直接の相同組換えを導き、それによって宿主遺伝子の内在性転写調節領域を発現ベクターのサイレンサー誘導性領域と置換することができる。
【００５５】
発現ベクターは、例えば化学物質（例えばリン酸カルシウム、DEAEデキストラン、脂質、ポリマー）、エレクトロポレーション、ネイキッド(naked)DNA技法、マイクロインジェクション、またはウイルス感染を使用し、トランスフェクションもしくはトランスジェネシス技法によって、宿主哺乳動物細胞もしくは非ヒト哺乳動物中に導入することができる。好ましくは、導入される発現ベクターを哺乳動物細胞もしくは非ヒト哺乳動物の宿主ゲノム中に組み込む。脂質担体ビヒクルを作製するための多くの中性および荷電脂質、ステロール、およびその他のリン脂質が知られている。例えば、中性脂質はジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）；アニオン性脂質はジオレオイルホスファチジルセリン（DOPS）；ならびにカチオン性脂質はジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（DOTAP）、ジオクタデシルジアミドグリシルスペルミン（DOGS）、ジオレオイルトリメチルアンモニウム（DOTMA）、および1,3-ジオレオイルオキシ-2-(6-カルボキシスペルミル)-プロピルアミドテトラアセテート（DOSPER）である。送達の効力および／または安定性を改善するために、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）を組み込むことができる。FUGENE6、LIPOFECTAMINE、LIPOFECTIN、DMRIE-C、TRANSFECTAM、CELLFECTIN、PFX-1、PFX-2、PFX-3、PFX-4、PFX-5、PFX-6、PFX-7、PFX-8、TRANSFAST、TFX-10、TFX-20、TFX-50およびLIPOTAXI脂質は特許製剤である。ポリマーとしてはポリエチレングリコール（PEG）もしくはポリエチレンイミン（PEI）がある。あるいは、ポリマー材料をナノスフェアもしくはミクロスフェアに成型することができる。ネイキッドDNA技法では、細胞中に導入する前に発現ベクターを濃縮するための化学的トランスフェクト剤（例えば、脂質、ポリマー）を使用することなく、プラスミド形態の発現ベクターを細胞に送達する。ここでプラスミドは宿主ゲノム中に組み込まれる場合と組み込まれない場合がある。
【００５６】
このように、哺乳動物細胞を発現ベクターでトランスフェクトすることができるが、トランスジェニック非ヒト哺乳動物も提供される。前記の変法において、宿主遺伝子からの相同領域を使用して、サイレンサー誘導性領域の宿主ゲノム中の特定の遺伝子座への組み込みを導き、それによってその遺伝子座での宿主遺伝子の発現を調節することができる。トランスフェクトした細胞の培養によってin vitroで；トランスジェネシスによってin vivoで；ならびに発現ベクターの同種異系、オートロガス、組織適合性もしくは異種細胞中への導入、ならびにその後のトランスフェクトした細胞の宿主生物への移植によってex vivoで、ポリペプチドを産生させることができる。トランスフェクションおよびその後の宿主幹細胞の宿主哺乳動物内への移植のためには、特別の回収および培養プロトコルが必要となる。拒絶反応を防止するために、移植後の宿主哺乳動物の免疫抑制および宿主細胞の被包形成が必要となる場合がある。
【００５７】
発現ベクターを使用して、不在もしくは全体として欠陥がある宿主遺伝子の機能に代替させるか、部分的に欠陥がある宿主遺伝子の機能を補充するか、または宿主遺伝子の活性と競合させることができる。したがって、この宿主の内因性の因子遺伝子はネオモルフ、ハイポモルフ、ハイパーモルフもしくは正常な場合がある。機能の代替もしくは補充は上記の方法によって達成することができ、（例えば、転写もしくは翻訳された産物の量、またはいずれかの産物の生理学的機能を評価することによって）下流領域の高度発現性について、トランスフェクトされた哺乳動物細胞もしくはトランスジェニック非ヒト哺乳動物を選択することができる。しかし、発現された下流領域とネオモルフ、ハイポモルフ、ハイパーモルフもしくは正常宿主遺伝子間の競合は、コードされるポリペプチドが複数サブユニットであってこれらがポリマータンパク質複合体を形成するものでないかぎり、成功させるのはさらに難しい。あるいは、ネガティブ調節因子もしくは細胞内で機能を阻害する一本鎖抗体を発現ベクターの下流領域にコードさせてもよい。したがって、それぞれ非改変アンチセンス転写物、dsRNAのいずれか一方もしくは両方の鎖、またはリボザイムに対応する下流領域を発現ベクターが含有している、アンチセンス、RNA干渉技法またはリボザイム技法を使用して、機能性宿主遺伝子の少なくとも部分的な抑制が必要となる。
【００５８】
アンチセンスポリヌクレオチドは当初、mRNA転写物とハイブリダイズすることによって、翻訳を直接妨害すると信じられていたが、現在ではウイルスもしくは細胞遺伝子のmRNA転写物の分解に関与するものと考えられている。アンチセンス分子は、発現ベクター内の下流発現領域とアンチセンス方向にある１遺伝子の少なくとも１機能性部分を使用して、作製することができる。
【００５９】
dsRNAによるRNA干渉には酵素による切断が関与しているものとみられる。なぜならばmRNA転写物はアンチセンス阻害とは異なるプロセス（おそらくリボヌクレアーゼDでの分解による）によって約20〜25リボヌクレオチドの断片に転換されるからである。後者の方が、より大きい効率と設計の容易性のため好ましい（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドはその半減期を増加させるために改変されたヌクレオチドによって化学的に合成する必要があることが多い）。dsRNAは、同一または別種の発現ベクターによって産生されたssRNA鎖2つであって、少なくともその一方がアンチセンス方向の下流領域を含んでいる、少なくとも25ヌクレオチドの細胞もしくはウイルス遺伝子のコード領域の一部から作製することができる。
【００６０】
リボザイムはRNA転写物もしくはゲノムの特異的切断を触媒する。その作用の機序には、相補的な細胞もしくはウイルスRNAへの配列特異的ハイブリダイゼーションとその後のエンドヌクレオチド切断が関与する。リボザイムは目的のRNAに相補的な１以上の配列とともにRNA切断に関係する触媒性配列（例えば、ハンマーヘッド、ヘアピン、アックスヘッドモチーフ）を含んでいる。例えば、以下のトリヌクレオチド配列：GUA、GUUおよびGUC、を含むリボザイム切断部位について、目的のRNAをスキャンすることによって、目的のRNA内の可能なリボザイム切断部位を最初に同定する。同定後、この切断部位を含む目的のRNAの領域に対応する約15〜約20リボヌクレオチド間のオリゴヌクレオチドの１つを、２次構造などの予測される構造特性について評価し、それによって候補オリゴヌクレオチド配列を不適当なものと決定することが可能である。次に候補配列の適合性について、細胞もしくはウイルスRNAとハイブリダイズし、これを切断する能力によって評価することができる。
【００６１】
どんな疾患でも、その疾患に関係する遺伝子根拠およびインデューサーが知られているならば、本発明によって治療することができる（例えば炎症およびその他のストレス症状、虚血およびその他の低酸素症状、グルコース濃度の変動またはその他の代謝性疾患）。
【００６２】
遺伝子接種を使用して、アレルゲン、自己抗原、感染性因子の抗原（例えば、細胞表面もしくはウイルスキャプシド／コート抗原）および腫瘍抗原を発現させるか発現を抑制することによって、ヒト疾患のモデルを提供するか、または罹患した患者を免疫モジュレートすることができる。米国特許第5,580,859号、5,589,466号、5,697,901号、5,804,566号、5,830,877号、5,849,719号、5,985,847号および国際公開公報第98/20734号を参照されたい。抗原に対して特異的な抗体も、診断、治療、もしくは予防用途のために製造することができる。したがって、下流領域に単価もしくは多価エピトープとして１種以上のこうした抗原の免疫原性部分をコードさせることができる。抗原をアジュバントとして作用するサイトカイン（例えば、IFN-γ、GM-CSF）との融合タンパク質として発現させるのが好ましい。
【００６３】
標的とすることができる組織として、以下のものが含まれる：神経系（例えば、脳、眼、グリア、中枢および末梢神経）；網内系（例えば、血液、骨髄、樹状細胞、赤血球細胞、顆粒球、リンパ管内皮、リンパ球、巨核球および血小板、単球およびマクロファージ、骨髄細胞、好中球、脾臓、胸腺）；内分泌、生殖、および泌尿器系（例えば、副腎、乳房、腎臓、卵巣、下垂体、前立腺、精巣、甲状腺、子宮内皮）；心肺系（例えば心臓、肺、動脈および静脈内皮）；消化器系（例えば、結腸、胆嚢、大腸および小腸、肝臓、膵臓、直腸、胃）；骨、軟骨、結合組織、皮膚、平滑筋および横紋筋；外胚葉、内胚葉、もしくは中胚葉組織；間葉および実質組織。
【００６４】
この発現ベクターの各種の正常細胞および組織中への導入能力は、良性および悪性癌（例えば、腹水癌および固形腫瘍、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色種、肉腫）の治療が可能であることを示唆している。興味深いいくつかの腫瘍のタイプは、乳房、結腸直腸(colorectal)、肺、卵巣、膵臓、前立腺、腎臓および精巣癌である。
【００６５】
ここで、適切なコード領域、アンチセンス方向の転写領域、dsRNA、もしくはリボザイムの調節された遺伝子発現によって治療することができると考えられる疾患の例、またはそれらの疾患のモデルを提供し得る例には以下のものがある：後天性もしくは先天性免疫不全、アレルギーおよびその他の免疫過敏症、貧血およびサラセミア、自己免疫疾患、溶血性もしくは敗血症性ショック、血友病、炎症およびその他のストレス症状、虚血およびその他の低酸素症状、癌腫（例えば、基底層細胞、基底扁平細胞、Brown-Pearce、管、Ehrlich腫瘍、発生部内非浸潤性 、Krebs、Merkel細胞、小もしくは非小細胞肺、えんばく細胞、乳頭、細気管支、扁平細胞、移行細胞、Walker）、白血病（例えば、B細胞、T細胞、HTLV、急性および慢性リンパ球、マスト細胞、骨髄）、組織球腫、組織球増加症、Hodgkin病、非Hodgkinリンパ腫、プラスマ細胞腫、網内症、腺腫、腺癌、腺線維腫、腺様リンパ腫、エナメル上皮腫、角化血管腫、好酸球増加を伴う血管リンパ球増加症、硬化性血管腫、血管腫症、APUD細胞腫(apudoma)、えら腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、癌肉腫、セメント腫、胆管腫、コレステリン腫、軟骨肉腫、軟骨芽細胞腫、軟骨肉腫、脊索腫、分離腫、頭蓋咽頭腫、chrondroma、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢腺腫、葉状嚢胞肉腫、未分化胚細胞腫(dysgerminoma)、上衣細胞腫、Ewing肉腫、線維腫、線維肉腫 、巨細胞腫、節神経腫、グリア芽細胞腫、グロムス血管腫、顆粒膜細胞腫、卵巣男性胚細胞腫、過誤腫、血管内皮腫、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、肝癌、膵島細胞腫、Kaposi肉腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、Leydig細胞腫、脂肪腫、脂肪肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、髄芽腫、髄膜腫、間葉腫、中腎腫、中皮腫、筋芽腫、筋腫、筋肉腫、粘液腫、粘液肉腫、神経鞘腫、神経腫、神経芽腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経線維腫症、歯牙腫、骨腫、骨肉腫、乳頭腫、パラガングリオーマ、非クロム親和性パラガングリオーマ、松果体腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、Sertoli細胞腫、奇形腫、卵胞膜細胞腫、および細胞が形成異常、永久増殖もしくはトランスフォームされているその他の疾患。
【００６６】
以下の実施例は本発明を説明することを意図している。しかしこれらによって本発明の実施が何ら限定もしくは制限されるものではない。
【００６７】
実施例
公知の技法が、下記のような文献およびマニュアルに記載されている：Ausubelら（Current Protocls in Molecular Biology, Wiley, 1998）；Birrenら（Genome Analysis Series, CSHL, 1997-1999）；Bonifacinoら（Current Protocols in Cell Biology, Wiley, 1999）；CareyおよびSmale（Transcriptional Regulation in Eukaryotes, CSHL, 2000）；Coliganら（Current Protocols in Immunology, Wiley, 1999）；Coliganら（Current Protocols in Protein Science, Wiley, 1999）；Dracopoliら（Current Protocols in Human Genetics, Wiley, 1999）；HarlowおよびLane（Using Antibodies, CSHL, 1999）；Hoganら（Manipulating the Mouse Embryo, CSHL, 1994）；Marshakら（Strategies for Protein Purification and Characterization, CSHL,1996）；MurphyおよびCarter（Trangenesis Techniques, Humana, 1993）；Murray（Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press, 1991）；Pinkert（Transgenic Animal Technology, Academic, 1994）；Robbins（Gene Therapy Protocols, Humana, 1996）；Sambrookら（Molecular Cloning, CSHL, 1989）；Spectorら（Cell, CSHL, 1998）；Tuan（Recombinant Gene Expression Protocols, Humana, 1997）；ならびに、WaltherおよびStein（Gene Therapy
of Cancer, Humana, 2000）。
【００６８】
発現ベクターの構築、細胞の培養およびトランスフェクション、遺伝子発現の決定、ならびに、結合試験のための試薬供給源、技法については、下記に記載されている：Websterら（1993）、Bodiら（1995）、Wuら（1996）、Prenticeら（1997）、Huら（1998）、Discherら（1998）、Discherら（1999）、Websterら（1999）。
【００６９】
ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の検出により、サイレンサーエレメント、条件誘導エレメント、ならびに、プロモーターの単独の、もしくは組み合わせた転写活性を評価するのに適したプラスミドは、Promegaから入手可能である。このようなベクターとしては、転写休止部位、ルシフェラーゼのコード領域上流のポリリンカー、ルシフェラーゼコード領域が続くSV40からのポリアデニル化シグナル、大腸菌およびf1複製起点、ならびに、選択マーカーamprが挙げられる。pGL3基本ベクター（pGL3BV）には、真核生物プロモーター、サイレンサー、およびエンハンサー配列が欠失している。基本ベクターと比較して、pGL3エンハンサーベクターも真核生物プロモーターが欠失しているが、ルシフェラーゼコード領域下流のSV40エンハンサーと、ポリアデニル化シグナルを含む。また、pGL3プロモーターベクター（pGL3PV）は、ルシフェラーゼコード領域上流にSV40初期プロモーターを含むため、図に示すように、１以上のサイレンサー誘導領域をKpnl制限酵素部位に挿入することができる。pGL3制御ベクターは、コード領域上流のSV40プロモーターと、コード領域下流のSV40エンハンサーを含む。
【００７０】
サイレンサー誘導領域は、pGL3PV、pMHC164（Molkentinら、1996）、pMCH86（Prenticeら、1997）、pMHC1.2、およびpHSA150にクローニングした。図１に示すように、pMHC164は、ラット心臓αミオシン重鎖（αMHC）プロモーター（すなわち、−164〜＋16断片）を、SmaIおよびHindIIIで切断したpGL3BVに結合することにより、作製した。同様に、SmaI-HindIII断片（すなわち、−86〜＋16αMHCプロモーター）をpGL3BVに挿入することにより、pMHC86を作製し、SmaI-HindIII断片（すなわち、−1200〜＋16αMHCプロモーター）をpGL3BVに挿入することにより、pMHC1.2を作製し、SmaI-HindIII断片（すなわち、−150〜＋239ヒト骨格アクチンプロモーター）をpGL3BVに挿入することにより、pHSA150を作製した。
【００７１】
配列の簡単な説明
配列番号１
0004774493.tif 000002
は、センス方向のヒトホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子由来の低酸素応答エンハンサーエレメント（HRE）を含むオリゴヌクレオチドの配列である（HREは、HREpgkとも呼ばれる）。
【００７２】
配列番号２
0004774493.tif 000003
は、センス方向のヒトシナプシン遺伝子由来のサイレンサー（SIL）エレメントを含むオリゴヌクレオチドの配列である。
【００７３】
配列番号３
0004774493.tif 000004
は、センス方向の突然変異HREpgkエレメントを含むオリゴヌクレオチドの配列である。
【００７４】
配列番号４
0004774493.tif 000005
は、センス方向の突然変異SILエレメントを含むオリゴヌクレオチドの配列である。
【００７５】
配列番号５
0004774493.tif 000006
配列番号６
0004774493.tif 000007
配列番号７
0004774493.tif 000008
（連続的だが、重複はない）
配列番号８
0004774493.tif 000009
（５塩基重複を含む）
配列番号９
0004774493.tif 000010
（サイレンサーエレメントがこのオリゴヌクレオチドでは突然変異を起こしている）
配列番号10
0004774493.tif 000011
配列番号11
0004774493.tif 000012
配列番号12
0004774493.tif 000013
配列番号13
0004774493.tif 000014
配列番号15
0004774493.tif 000015
配列番号16
0004774493.tif 000016
は、エンドセリン（ET-1）遺伝子由来の低酸素応答エンハンサー（HRE）エレメントを含むオリゴヌクレオチドの配列である。
【００７６】
上記配列の各々において、第１サイレンサーエレメントを太字で示す。各配列について、センス鎖だけを示すが、アンチセンス鎖も合成されたことを理解すべきである。次に、センスおよびアンチセンス鎖をアニーリングした後、適した付着末端を含む構築物にクローニングした。
【００７７】
実施例１−条件的サイレンシングと位置依存性
ヒトシナプシン遺伝子由来のサイレンサー（SIL）エレメントおよびホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子由来の条件誘導エレメント（HRE）（配列番号５〜７に記載）各々の１、２または３コピーを含むサイレンサー−インデューサー領域を、図２Ａに示すように、pGL3PVのKpnI制限酵素部位にクローニングした。これらの構築物は、pGL3-[SIL/HRE]1、pGL3-[SIL/HRE]2、およびpGL3-[SIL/HRE]3と称する。さらに、図２Ｂに示すように、オリゴヌクレオチド（配列番号８）の３コピーをpGL3PVのKpnI制限酵素部位にクローニングすることにより、pGL3-[SIL/HRE]3（重複を含む）を構築した。pGL3PVのKpnI制限酵素部位にクローニングしたオリゴヌクレオチド（配列番号９）を用いて、pGL3-[SIL0/HRE3]を構築した。その際、上記オリゴヌクレオチドが依然として３つのHREエレメントを含むように、SILエレメントに対する転写因子の結合に不可欠な塩基を突然変異させた。この構築物は、SILエレメントの対照として用いた。
【００７８】
これらプラスミド構築物はすべて、5’から3’（S）および3’から5’（AS）方向の両方に位置する挿入オリゴヌクレオチドを用いて作製した後、配列決定により確認した（Discherら、1999）。以下に示す結果は、（S）配置（配列番号５〜７）における非重複pGL3-[SIL/HRE]シリーズについてのものである。SおよびAS挿入方向の間に相違はなく、また、非重複および重複サイレンサー−インデューサー領域（配列番号８の３コピー）の間にも有意な相違はなかった。
【００７９】
表に示すように、精製発現ベクター（Discherら、1998）は、リン酸カルシウムまたは脂質トランスフェクション（Websterら、1993；Discherら、1998）により、細胞系（例えば、骨格筋C2C12、Hela、および心筋細胞）にトランスフェクションした。全ケースにおいて、内部対照（Promegaから入手したレニラルシフェラーゼ）を用いて、トランスフェクション効率を正規化し、レポーターアッセイには、等量のタンパク質抽出物を用いた。トランスフェクションから３〜４日後、細胞を維持し、好気性条件（21％、O2／５％CO2空気）または低酸素条件（１％、O2／５％CO2／平衡N2）に24時間暴露した。細胞を低酸素に暴露するその他の条件は、すでに記載されている（WebsterおよびBishopric 1992；Websterら、1993；Discherら、1998；Websterら、1999）。簡単に説明すると、細胞を気密環境のチャンバーに入れるが、該チャンバーは、１％O2／５％CO2／平衡N2の標準的気体混合物を充填し、その温度、湿度および気体を制御した環境とする。該装置は、連続記録酸素電極、pHメーター、ならびに、細胞運動および形状の変化を記録するCELL-TRAK運動分析装置を備える。細胞の操作はすべて、再酸素添加を防止するため、チャンバー内で行う。細胞は、処理後、回収して溶解し、レポーター（luc）遺伝子の発現について分析した（Discherら、1998；Websterら、1999）。表１は、それぞれ、低酸素に20時間暴露したC2C12骨格筋細胞を用いて、同じサンプルについて２回行った試験の結果を示す。タンパク質濃度について正規化したルシフェラーゼ活性を示す。
【００８０】
【表１】
0004774493.tif 000017
【００８１】
サイレンサー−インデューサー比（silencer-inducer ratio）は、低酸素条件下で線状に上昇するのがわかり、SILおよびHREエレメントの数は、各々１コピーから３コピーに増加している。この実施例から、配列番号５〜８を用いたインサートシリーズの両方が、低酸素可逆的サイレンシング（hypoxia-reversible silencing）を媒介すると結論付けられる。この作用の大きさは、SIL／HREエレメントの数に直接比例し、個々のSILとHREエレメント間の重複は、条件サイレンシングに必要ではない。
【００８２】
さらに行った試験は、pGL3-[SIL/HRE]3発現ベクターに焦点をあてて行ったが、そのために、C2C12骨格筋細胞（ｎ＝12）、心筋細胞（ｎ＝16）、ならびに、Hela細胞（ｎ＝８）について、ルシフェラーゼレポーターの発現を詳細に試験した。表２にサイレンサー−インデューサー比を示す。サイレンサー−インデューサー比は、C2C12骨格筋細胞で最高であった。
【００８３】
【表２】
0004774493.tif 000018
【００８４】
条件的サイレンシングでは、遺伝子発現の抑制が、非誘導状態（例えば、好気性条件下での基底発現）について選択的であることが必要である。非誘導（好気性）または誘導（低酸素）条件下で培養されたトランスフェクトC2C12細胞中のpGLV-[SIL/HRE]3由来のレポーター遺伝子発現に対するサイレンシングの影響は、pGLPV-[SIL/HRE]3：pGLPV-[SIL0/HRE3]の比として表３に示す。
【００８５】
【表３】
0004774493.tif 000019
【００８６】
3×SILエレメントを用いたサイレンシングにより、好気性条件下の発現が、対応する非サイレンシング構築物と比較して、2.8％に低下したが、低酸素下の発現は、62％にとどまり、低酸素が、このサイレンシングを有意に逆転したことを示している。低酸素下におけるサイレンシングの逆転の範囲は、生成されるHIF-1転写因子の量と、HRE結合部位のアフィニティーに関係する（以下を参照）。
【００８７】
これらの結果から、C2C12細胞中の配列番号５〜８を含むオリゴヌクレオチドインサートを含む構築物の条件的サイレンシングが明らかである。これらの構築物はすべて、互いの50 bp内にSILおよびHREエレメントの対を含む。エレメントの近接性が重要であるか否かを調べるために、HRE（配列番号10）のない３つのSILエレメントを、pGL3PVのマルチクローニング部位の約500 bp上流に位置するDraIII制限酵素部位へとクローニングし、SIL（配列番号９）のない３つのHREエレメントを同じベクターのKpnI制限酵素部位にクローニングした。両方とも、センス5’-3’方向に挿入した。こうして得られた構築物をpGL3PV3XSIL///3XHREと呼ぶ。好気性条件または低酸素条件のいずれかでの発現を測定し、pGLPV[SIL/HRE]3と比較した。得られた結果を表４に示す。
【００８８】
【表４】
0004774493.tif 000020
【００８９】
表４に示した結果から、SILエレメントが誘導HREから非常に離れた位置にある場合には、低酸素によるサイレンシングの逆転が小さくなることがわかる。これによって、サイレンシング−誘導比が有意に低下した（SIL/HRE結合構築物については357、SIL/HRE分離構築物については27.6）。しかし、pGL3PV3XSIL///3XHREでもやはり条件的サイレンシングが明らかであることから、インデューサーの活性化により、該因子が非常に離れた結合部位を有している場合でも、サイレンシングを低下できることに留意すべきである。このことから、１つ以上の条件的サイレンシング機構が明らかであり；第１の機構は、ハイブリッドDNA結合部位への競合的結合と関連し、第２の機構（例えば、より弱い作用）は、SILおよびHREエレメントの相対位置とは独立に作用する。ハイブリッドDNA結合部位への転写因子の競合の関与は、直接結合アッセイにより支持される。
【００９０】
実施例２−組織特異的プロモーターを用いた条件的サイレンシング
表１〜４に示した結果から、SILおよびHREエレメントをpGLPVベクターに組み込むと、条件的サイレンシングが起こることが確認される。このベクターは、組織特異的ではないSV40初期プロモーターを利用するものである。組織特異的プロモーターを用いて同じ作用が認められるか否かを調べるため、図１に記載したような心臓選択的α-MHCプロモーターのプロモーターを含む-164 bp配列で、pGL3PV のSV40プロモーター領域を置換した。SIL0/HRE3、[SIL/HRE]2、および[SIL/HRE]3を含む構築物を作製した。これらを各々心筋細胞にトランスフェクトし、好気性条件下で、かつ、前述の低酸素での処理から24時間後に、ルシフェラーゼの発現を測定した。
【００９１】
C2C12細胞と比べて、心筋細胞の方がサイレンサー−インデューサー比は低いが、α-MHCプロモーターによるSV40初期プロモーターの置換により、増強は変化しなかったため、条件的サイレンシングは、非組織特異的または組織特異的プロモーターのいずれかを用いた場合に有効であることがわかった。表５に示すように、SILエレメントの存在により、サイレンサー−インデューサー比が約10倍増加した。
【００９２】
【表５】
0004774493.tif 000021
【００９３】
実施例３−複数のインデューサーを用いた条件的サイレンシング
これらの実験により、条件的サイレンシングが３つの異なる細胞タイプで起こったが、これは、使用するプロモーターの種類とは関係なく、少なくとも２つの異なる機構が関与することが明らかにされた。その１つは、ハイブリッド／結合DNAの結合部位に対するサイレンサーおよびインデューサーの競合に関与し、もう１つは、エレメントの相対位置とは独立のものである。これら実験のすべてで、内因性の因子に結合する条件誘導エレメントとして、HREエレメントを使用した。上記作用を他の誘導条件の推定に使用できるか否かを調べるため、HREエレメントをNFκBエレメントで置換した類似構築物を作製した。NFκB因子は、リポ多糖（LPS）を含む炎症媒介物質によって誘導される。これらの構築物を作製するため、NFκB-SILエレメント（配列番号11）とNFκB-SIL突然変異体エレメント（配列番号12）を含むオリゴヌクレオチドをpGL3PVのKpnI制限酵素部位にクローニングすることにより、それぞれpGL3-[SIL/NFκB]3およびpGL3-[SIL0/NFκB3]を作製した。条件的サイレンシングを評価するため、これら構築物を、RAW 264.7と呼ばれるマクロファージ細胞系にトランスフェクトした。尚、該細胞系は、American Type Culture Collection（ATCC、メリーランド州ベセスダ）から入手し、ATCCが推奨するように、ウシ胎児血清を含むMEMで培養した。細胞を前記のように、リン酸カルシウムを用いて各ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクション後、集密培養物を３日間血清飢餓状態にした後、処理しないまま１日放置するか、内因性の因子NFκBを活性化することがわかっている３μg／ml（最終濃度）のLPS（Sigma）で処理した。前記とまったく同様に、誘導（LPS処理）および非誘導培養物からの抽出物において、ルシフェラーゼの発現を測定した。サイレンサー−インデューサー比（LPS含有：LPS非含有）を表６に示すが、条件的サイレンシングが明らかである。
【００９４】
【表６】
0004774493.tif 000022
【００９５】
表６から、NFκBエレメントによる発現の誘導が、サイレンサーエレメントの含有により、4.3から24.3に増加しているのがわかる。これは、90％を超える非誘導発現の抑制と、LPS活性によるこの抑制の45％までの逆転によって達成されたものである。この系におけるサイレンシングの逆転は、前記HRE/SIL系における低酸素による処理ほど有効ではなかった。それでも、上記系は、明らかに、類似した条件的サイレンシング作用を示している。
【００９６】
上記結果から、誘導刺激としての低酸素またはLPSと、互いに50 bp以内に位置するHRE/SILおよびNFκB/SILエレメントを用いた条件的サイレンシングが明らかである。立体障害および結合部位競合がこの作用に何らかの役割を果たす可能性を直接調べるために、電気泳動移動度シフトアッセイ（GEMSA）を用いて、SIL/HRE（配列番号５）およびSIL/NFκB（配列番号13）二本鎖オリゴヌクレオチドとタンパク質との結合を測定した。核抽出物の調製、オリゴヌクレオチドの標識、結合条件および電気泳動については、すでに記載されている（Wuら、1998）。これらの条件を、本明細書で実施したすべての結合アッセイで使用した。ただし、結合用カクテルに0.2％ NP40を添加し、電気泳動には４％ポリアクリルアミドゲルを用いた。SIL/HREアッセイにはC2C12細胞を、また、SIL/NFκBアッセイにはRAW 264.7をそれぞれ用いた。
【００９７】
簡単に説明すると、プロトコルは下記の通りである。10％血清を含むMEM中で、C2C12およびRAWマクロファージの培養物を集密的になるまで増殖させた。培養物を２日間血清飢餓状態にし、核抽出物を調製した（非誘導）。低酸素で24時間（C2C12）、または３μg／ml LPSで40分処理した（RAW）類似プレートを作製した。これらのプレートを回収し、核抽出物（誘導）の調製に使用した。等量のタンパク質を等量の32P標識オリゴヌクレオチドプローブと混合し、21℃で40分間かけて結合させた。200V／室温で、４％PAGEにより複合体を分離した。得られた結果を図３Ａおよび３Ｂに示す。図３Ａの矢印は、内因性の因子：サイレンサーおよびHIF-1転写因子の結合の位置を示している。すでに記載されている競合アッセイ（Wuら、1997；Huら、1998；Murphyら、1999）により、これらシフトしたバンドの特異性を確認した。
【００９８】
上記in vitro反応でのHREとサイレンサー結合因子との結合は、最適ではなかった。というのは、効率的結合のために、サイレンサーには0.1％NP40が必要であるが、このNP40濃度では、HIF-1結合が阻害されるからである。従って、妥協して、0.05％ NP40を用いなければならなかった。サイレンサーおよびHRE因子両方の特異的結合が弱くても、HIF-1を含む低酸素活性化細胞からの核抽出物を用いた反応では、サイレンサーエレメントの結合が、低下することは明らかである（レーン２をレーン３と比較）。SIL/NFκBハイブリッドオリゴヌクレオチドおよびRAW±LPS抽出物を用いれば、作用はさらに顕著になった。この場合、未処理細胞からの抽出物を用いると、SIL結合タンパク質の結合が明らかに認められる。しかし、LPSで処理した細胞からの抽出物は、NFκB結合の強力な活性化を示し、SILエレメントの結合がほぼ完全に排除されているのがわかる。これらの結果から、HRE結合因子およびNFκBは、50 bp以内の間隔に位置する結合エレメントを含むオリゴヌクレオチドからSIL結合因子にとってかわることが明らかである。この結果は、本明細書に記載したように、条件的サイレンシング機構の１つとして、立体障害および共通のハイブリッド結合の競合が役割を果たすことを支持している。
【００９９】
実施例４−in vivoでの条件的サイレンシング
in vivoで組織中にこれら構築物のサイレンシングが存在するか否かを調べるため、ラットの心臓に、pGLPV-[SIL/HRE]3またはpGLPV-[SIL0/HRE3]を注射し、５日後発現を測定した。外科手術の手順、左心室へのDNA注射、組織の調製、レポーターアッセイは、以前記載されている通りに実施した（Prenticeら、1997）。表７に示すように、２つの実験結果を非サイレンシング構築物について100に正規化した。
【０１００】
【表７】
0004774493.tif 000023
【０１０１】
これら構築物における唯一の相違は、機能的サイレンサーエレメントが存在するかしないかであり、従って、得られた結果は、in vivoでのサイレンシングの存在を強く支持するものである。現在進行中の実験により、このサイレンシングの虚血可逆性（ischemia-reversibility）を測定中である。
【０１０２】
条件的サイレンシングがin vivoで起こったか否かを調べるため、ラット虚血後肢モデルを用いた（Takeshitaら、1994）。このモデルでは、大腿およびそれに連結する動脈を結紮および除去することにより、ラット後肢筋肉を虚血にした後、ベクターDNAを筋肉に直接注射した。適当な期間の後、筋肉を採取し、レポーター遺伝子発現を前記と同様に測定した。簡単に説明すると、プロトコルは次の通りである。ラットを麻酔し、右肢の皮膚を切開することにより、大腿動脈を露出させた。動脈を静脈から分離した後、大腿の近位端と、伏在動脈の遠位端とを結紮した。結紮間の約２cmの動脈（すべての側枝を含む）を切開し、切除した。レーザードップラー表面分析装置（Lisca）を用いて、ふくらはぎへの血流をモニターした。模擬対照として、左肢に同じ手順を施したが、動脈はインタクトのままとした。結紮間の筋肉領域に、塩化セシウム精製DNA（１μg／μl）を直接注射し、各25μlを4回注射した。同様の注射を模擬操作の肢筋肉にも実施した。筋肉を覆う皮膚を外科ステープラーで吻合し、動物を回復させた。１〜２日後、致死量のナトリウムペントバルビタールで、ラットを死亡させ、注射した筋肉を切開して取り出し、氷冷PBSに移した。１セットの実験（ｎ＝２）の結果を表９に示す。大腿動脈の除去前、足への血流は、77 ml／分（ｎ＝２）であった。除去後、血流は＜５ml／分に低下し、95％を超す低下を示した。
【０１０３】
【表９】
0004774493.tif 000024
【０１０４】
これらの実験で、虚血による対照構築物（非サイレンシング）の誘導は低かった。というのは、ラットの後肢が、副行循環を急速に発達させ、筋肉が再灌流（そして再酸素添加）した状態になるからである。しかし、サイレンサーの存在が、サイレンサー−インデューサー比の20倍増加を媒介することがわかり、これによって、これらの構築物により、条件的サイレンシングがin vivoで起こることが確認される。
【０１０５】
実施例５−低酸素／サイレンサー活性化遺伝子の治療上の影響
心筋細胞を低酸素に24時間、次に再酸素添加に20時間暴露する（心筋の虚血−再灌流をシミュレートする条件）と、心筋の30％を超えるアポトーシスにより死亡に到る（Websterら、1999）。このモデルを用いて、好気性条件下でサイレンシングをうけた低酸素活性化遺伝子（例えば、DT-ジアホラーゼ）が、低酸素−再酸素添加による酸化ストレスから心筋細胞を保護できるかどうかを調べた。DT-ジアホラーゼは、ミトコンドリア電子輸送中のキノン循環により発生する遊離基のクエンチングを媒介する抗酸化剤である。DT-ジアホラーゼをコードするcDNAインサートを、HindIIIで、pcDNAベクターから取り出した。ルシフェラーゼcDNAインサートを取り出した後、pGLPV-[HRE/SIL]3のHindIII-Xbal制限酵素部位に、この約1.3 Kbのインサートをクローニングした。これには、２段階の工程を必要とした。すなわち、第１に、HindIII制限酵素部位で結合させ、第２に、残りの付着末端および平滑末端に充填し、環状にする。配列決定により方向を調べた。こうして得られた構築物をpPV[SIL/HRE]3-DT-dと呼ぶ。２μgのCMV-緑色蛍光タンパク質（GFP、Clontech）および８μｇのpPV[SIL/HRE]3-DT-d、または対照としてエンプティーベクターで心筋細胞をトランスフェクトした。GFPを用いて、トランスフェクト細胞を追跡した。トランスフェクト培養物を低酸素−再酸素添加に暴露することにより、以前の記載（Websterら、1999）と同様に30％細胞アポトーシスを発生させた。類似した培養物を１％H2O2で処理し、低酸素のない酸化ストレスを誘導した。処理後、ヘキスト染色法で培養物を処理することにより、以前の記載（Websterら、1999；Doughertyら、2000）と同様に、アポトーシス細胞を同定し、同じ細胞を蛍光顕微鏡で検査することにより、トランスフェクトGFP陽性細胞を同定した。GFP陽性のアポトーシスおよび非アポトーシス細胞を計数し、pPV[SIL/HRE]3-DT-dの共トランスフェクション（低酸素下で誘導される）が、再酸素添加によって起こるアポトーシスを防御できるかどうかを調べた。これらの実験結果（ｎ＝２）を表10に示す。
【０１０６】
【表１０】
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【０１０７】
pPV[SIL/HRE]3-DT-dでトランスフェクトした細胞は、24時間の低酸素および20時間の再酸素添加によって起こるアポトーシスから強力に保護された。エンプティーベクターでトランスフェクトした対照培養物は、再酸素添加後、GFP陽性細胞の24％アポトーシスを呈示し、以前の結果（Websterら、1999）と類似していた。pPV[SIL/HRE]3-DT-dで共トランスフェクトした培養物は、８％のGFP陽性アポトーシス陽性細胞を呈示したに過ぎず、これは、＞60％の保護を意味する（ｐ＜0.05）。H2O2で処理した細胞は、共トランスフェクトしたプラスミドとは無関係に、同じアポトーシス率（約９％）を示した。従って、DT-ジアホラーゼ発現の活性化、ならびに、低酸素下で条件的サイレンシングを受けたベクターの逆転は、後の再酸素添加中の心臓保護に影響を与えることができる。これにより、条件的サイレンシングを受けた遺伝子は、疾病表現型（低酸素）により活性化することができ、疾病（再灌流傷害）を被った標的宿主細胞に治療効果を及ぼし得ることがわかる。
【０１０８】
配列番号７を用いた条件的サイレンシングにより、他の遺伝子をpGL3PV-[SIL/HRE]3にクローニングして発現させ、その後配列決定した。血球凝集素（HA）エピトープタグを有するβ-gal cDNAを、HindIIIおよびXbaIを用いてpcDNA3.1/HisB/lacZ（Invitrogen）から切り取った。ルシフェラーゼcDNAインサートを除去した後、pGL3PV-[SIL/HRE]3のHindIII-XbaI制限酵素部位に、約４Kbインサートをクローニングした。この構築物は、pβ-gal[SIL/HRE]3と呼ぶ。ヒト平滑筋細胞のcDNAから、ヒトVEGF121 cDNAをPCRによりクローニングした。末端にHindIIIおよびXbaI制限酵素部位を有するプライマーを用いて、精製産物を、以前の記載と同様に、pGL3PV[SIL/HRE]3のHindIII-XbaI制限酵素部位にクローニングした。この構築物をpVEGF121[SIL/HRE]3と呼ぶ。pBluescript（Stratagene）から切り取った全長ヒトHIF-1αcDNAを切断し、pGL3PV-[SIL/HRE]3のXbaI-NcoI制限酵素部位にクローニングした。この構築物をpHIF-1α[SIL/HRE]3と呼ぶ。
【０１０９】
β-gal、IGF-1、VEGF、およびHIF-1αの低酸素活性化発現が証明された。p HIF-1α[SIL/HRE]3の場合には、pGLPV-[SIL/HRE]3を有するこの構築物をC2C12細胞に共トランスフェクトすることにより、低酸素媒介条件的サイレンシングを約10倍増強することが明らかにされた。これは、このベクターを用いることにより、別の状況でも条件的サイレンシングを増強できることを示している。この作用は、HIF-1α生産が低い細胞および組織において、特に有用であると考えられる。
【０１１０】
TRE/SIL（配列番号17）
以下の配列は、チオキシン遺伝子由来の条件誘導エレメントである：
0004774493.tif 000026
【０１１１】
抗酸化剤応答エレメントは、NAD(P)Hキノンレダクターゼ遺伝子に含まれ（Jaiswal, 1994）、コンセンサス配列5’-TGACNNNGC-3’を有する。また、金属応答エレメントは、メタロチオネイン遺伝子に含まれ（Murphyら、1999）、熱応答エレメントは、HSP70およびHSP82のようなヒートショック遺伝子に含まれる。ホルモン応答エレメントは、アンドロゲン応答エレメント（ARE）、グルコ−コルチコイド応答エレメント（GRE）、ならびに、エストロゲン応答エレメント（ERE）などのクラスである。NFκB応答エレメントは、インターフェロンおよびその他のサイトカイン遺伝子に含まれ、配列番号11および13に示すコンセンサス配列を有する。
【０１１２】
参考文献
0004774493.tif 000027
0004774493.tif 000028
0004774493.tif 000029
【０１１３】
本明細書に引用した出版物、特許出願、および特許はすべて、それらが引用される全文を参照として本明細書に組み込まれる。このような参照文献はまた、当該技術の例示としても引用した。
【０１１４】
本発明は、現時点で、実用的かつ好ましい実施形態であると考えられるものについて説明してきたが、本発明は、開示した実施形態に限定または制限されるわけではなく、反対に、特許請求の範囲内にある様々な変更、代替物、および組合せを包含することを理解すべきである。これに関して、特許請求の範囲によってもたらされる保護が、後の技術的進歩を見込んでそれらの発行後に決定され、すべての合法的均等物まで拡大されることにも留意すべきである。
【０１１５】
従って、本明細書に記載されていない本発明の改変は、当業者には明らかであり、従来技術を除き、本発明の新規でかつ自明ではない構成要素から逸脱することなく、実施が可能であることを理解しなければならない。例えば、当業者には公知のサイレンサーエレメント、条件誘導エレメント、プロモーター、発現ベクターにより転写される遺伝子、発現ベクターのその他の成分、内因性の因子、トランスフェクション方法、感染方法、突然変異誘発方法、ならびに、発現ベクターを作製または使用するその他の方法に代わって、本明細書に記載したものを用いることができる。同様に、発現ベクターのヌクレオチド配列、方向および成分の分離、ならびに、該成分の選択を改変してもよく、改変の有用性は、基底発現、サイレンサー−インデューサー比、調節された発現の空間的または時間的パターン、あるいは、それらの組合せに対する影響を比較することにより、決定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  pMHC164の構築を示した図である。
【図２】  サイレンサーエレメントと条件誘導エレメントの間に重複がない（配列番号５〜７）または５塩基の重複がある（配列番号８）発現ベクターのpGL3PV HRE/SILシリーズの構築を示した図である。
【図３】  誘導条件の存在下または不在下でのHIF-1およびNFκB転写因子のコグネイト部位への結合のGEMSA分析を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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