(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ローヤルゼリーに蛋白質分解酵素処理及び糖分解酵素処理を施すことにより、アレルギー性が低減された低アレルゲン化ローヤルゼリーの製造方法であって、
ｐＨが６．５〜８．０に調整されたローヤルゼリー希釈液に蛋白質分解酵素としてエンド型中性プロテアーゼ及び糖分解酵素としてβ−マンノシダーゼを同時に添加して行う第１分解工程と、該第１分解工程後のローヤルゼリー希釈液のｐＨを６．５〜８．０に調整するｐＨ調整工程と、該ｐＨ調整工程後のローヤルゼリー希釈液に両酵素処理を行う第２分解工程とを含むことを特徴とする低アレルゲン化ローヤルゼリーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低アレルゲン化ローヤルゼリーの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、この種の低アレルゲン化ローヤルゼリーとしては、ローヤルゼリーに、糖分解酵素処理及び蛋白質分解酵素処理を施すことにより、実質的に発現されない程度にアレルギー性を低減させた低アレルゲン化ローヤルゼリーが知られている（特許文献１参照）。この低アレルゲン化ローヤルゼリーでは、溶液のｐＨを６．３〜７．３に調整し、等電点沈澱法を用いて主要なアレルゲンである分子量５５ｋＤａ蛋白質を含む画分を沈澱除去した後に酵素分解することによってアレルギー反応が抑えられるようになっている。一方、特許文献２には、ローヤルゼリーのプロテアーゼによる分解物を有効成分とする脂質代謝改善剤が開示されている。この脂質代謝改善剤の分解物では、分子量１００００以上のものがほとんどなくなって、分子量５００〜３０００のペプチドが主成分となっている。
【特許文献１】特開２００２−１１２７１５号公報
【特許文献２】特開２００１−２５７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、本発明者らの鋭意研究の結果、ローヤルゼリー中に含まれるアレルギー性を極めて効果的に消失させることができたという知見に基づいてなされたものである。その目的とするところは、ローヤルゼリーが有する有用な生理活性の低下を抑えつつアレルギー性を低減させることが容易な低アレルゲン化ローヤルゼリーの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明は、ローヤルゼリーに蛋白質分解酵素処理及び糖分解酵素処理を施すことにより、アレルギー性が低減された低アレルゲン化ローヤルゼリーの製造方法であって、ｐＨが６．５〜８．０に調整されたローヤルゼリー希釈液に蛋白質分解酵素としてエンド型中性プロテアーゼ及び糖分解酵素としてβ−マンノシダーゼを同時に添加して行う第１分解工程と、該第１分解工程後のローヤルゼリー希釈液のｐＨを６．５〜８．０に調整するｐＨ調整工程と、該ｐＨ調整工程後のローヤルゼリー希釈液に両酵素処理を行う第２分解工程とを含むことを要旨とする。この構成によれば、基質特異性の高い酵素を用いて製造されることから、ローヤルゼリー由来のペプチド性成分のうち分子量４．５ｋＤａを超える成分が効果的に分解されるとともに、その他の成分に対する影響が少ない。このため、アレルギー性を容易に低減させつつローヤルゼリーの有用な生理活性を低下を抑えることができる。また、ローヤルゼリー由来のペプチド性成分のうちアレルギーを引き起こしやすい成分が効果的に分解されることから、アレルギー性を低減させることが容易となる。さらに、１０−ハイドロキシデセン酸が含有されていることから、健康や美容に高い効果を発揮する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ローヤルゼリーが有する有用な生理活性の低下を抑えつつアレルギー性を低減させることが容易な低アレルゲン化ローヤルゼリーの製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を具体化した実施形態を詳細に説明する。なお、本実施形態では「ローヤルゼリー」を「ＲＪ」と略記する。
ＲＪは、蜜蜂のうち日齢３〜１２日の働き蜂が下咽頭腺及び大腮腺から分泌する分泌物を混合して作る乳白色のゼリー状物質である。このＲＪは、人体に対し好ましい生理活性を持つことが知られている。このＲＪ中の主な生理活性成分としては、例えば、ＲＪに特有な１０−ハイドロキシデセン酸（以下、デセン酸と記載する）等の有機酸類をはじめ、蛋白質、脂質、糖類、ビタミンＢ類や葉酸、ニコチン酸、パントテン酸等のビタミン類、各種ミネラル類等が挙げられる。このＲＪの生理活性や薬理作用としては、抗菌作用、免疫増強作用、功腫瘍作用、抗炎症作用、血流量増加作用等が知られている。また、制癌剤の副作用低減や放射線傷害時の延命効果も報告されている。
【００１１】
本実施形態の低アレルゲン化ＲＪの製造に用いられる原料としては、生ＲＪ又は該生ＲＪを乾燥させて粉末化したＲＪ粉末が使用される。また、ＲＪの産地は、中国、ブラジル、ヨーロッパ諸国、オセアニア諸国、アメリカ等いずれであってもよい。このＲＪ中には、生体にアレルギー反応を引き起こす種々のアレルゲンが含有されている。前記ＲＪ中に含まれるアレルゲンとしては、例えば、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分子量４７〜５５ｋＤａ付近に見られる複数種の蛋白質バンドが挙げられる。このうち、分子量５５ｋＤａの蛋白質は、ＲＪ中の主要なアレルゲンである。また、分子量が４．５ｋＤａを越えるペプチド性成分にもアレルゲンとして作用する成分が含まれている。
【００１２】
実施形態の低アレルゲン化ＲＪは、生ＲＪ由来の有効成分と、生ＲＪ由来のペプチド性成分とを含有しており、経口摂取により体内に吸収されるように構成されている。この低アレルゲン化ＲＪには、前記有効成分及びペプチド性成分以外にも、糖質や脂質等の生ＲＪに由来するその他の成分が含まれていてもよく、その他経口摂取可能な添加物が含まれていても構わない。また、この低アレルゲン化ＲＪには、生ＲＪ由来でない蛋白質が含まれていても構わない。この低アレルゲン化ＲＪの利用形態としては、例えば、液状（ドリンク剤）、凍結乾燥、減圧乾燥又はその他の粉末化手段による粉末状、これに賦形剤を添加した錠剤、カプセル剤、さらに化粧品の基剤を混合したクリームやローション等が挙げられる。
【００１３】
前記有効成分は、経口摂取により主として生命活動を活性化させて健康や美容の増進を図る作用を有し、少なくともデセン酸が含まれており、類パロチンやピオプテリン等のＲＪに特有な成分が含まれているのが好ましい。さらに、この有効成分としては、γ−アミノ酪酸、カルバコール、アセチルコリン等の生理活性物質、ＡＴＰ等のリン酸化合物、ビタミンＢ１，Ｂ２，Ｂ６，Ｂ１２、ナイアシン、パントテン酸、ニコチン酸、葉酸、ビオチン、ピチオシ、イノシトール等のビタミン類、リン、カルシウム、銅、マンガン、鉄、マグネシウム、亜鉛、タウリン、コリン等のミネラル類、リジン、フェニルアラニン、ロイシン、メチオニン、バリン、スレオニン、トリプトファン等の必須アミノ酸を始めとする各種Ｌ−α−アミノ酸が含まれているのが好ましい。なお、この低アレルゲン化ＲＪは、デセン酸を０．１８質量％以上含有する調整ＲＪとして製品化されるのが好ましい。
【００１４】
前記ペプチド性成分は、生ＲＪに由来するものであり、単純蛋白質、複合蛋白質、ポリペプチド又はオリゴペプチドが挙げられる。このペプチド性成分は、分子量が４．５ｋＤａを越える成分を含有していても構わないが、アレルギー性を低減させるために、分子量が４．５ｋＤａ以下の成分のみから構成されているのが好ましい。前記分子量４．５ｋＤａ以下の成分のみから構成される低アレルゲン化ＲＪは、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後の電気泳動ゲルにおいて、クマシー染色、好ましくは銀染色にて分子量４．５ｋＤａを超える蛋白質バンドが検出されないものである。前記検出されないとは、例えば、生ＲＪについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う際にクマシー染色にて前記分子量５５ｋＤａの蛋白質バンドが明確に視認される蛋白質量と等量（乾燥重量換算又は２８０ｎｍの吸光度換算）の低アレルゲン化ＲＪを同条件にて電気泳動したとき、分子量４．５ｋＤａを超える蛋白質バンドが視認されないことを意味する。なお、前記分子量４．５ｋＤａを超える蛋白質バンドは、クマシー染色にて視認されないことを意味するが、銀染色にても視認されないのが特に好ましい。また、前記検出されないとは、ゲル濾過カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析したとき、検出波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムで分子量４．５ｋＤａを越えるピークが検出されないことを意味し、好ましくは分子量４．５ｋＤａを越えるペプチド性成分が検出されないことを意味する。
【００１５】
この低アレルゲン化ＲＪは、ゲル濾過や限外濾過等の分離精製技術、特に分子量に応じて精製する技術を利用して、分子量４．５ｋＤａを越えるペプチド性成分を除去することにより製造されてもよいが、前記有効成分の回収率が高いことからペプチド性成分を酵素分解する処理を行うことにより製造されるのが最も好ましい。前記酵素分解する処理としては、蛋白質分解酵素処理及び／又は糖分解酵素処理が好適に用いられる。この酵素分解する処理は、前記原料（液状）、好ましくは水若しくは緩衝液にて原料を希釈したＲＪ希釈液に、蛋白質分解酵素及び／又は糖分解酵素を添加して実施される。なお、蛋白質分解酵素処理及び糖分解酵素処理を行う場合には、各処理を別々に行っても、同時に行ってもいずれでもよい。
【００１６】
蛋白質分解酵素は、ペプチド性成分（蛋白質）のペプチド結合を加水分解し、高分子のペプチド性成分を急速に低分子化（ペプトン化）する酵素である。この蛋白質分解酵素としては、微生物由来又は植物由来のチオールプロテイナーゼ（パパイン、フィチン、プロメライン等）、アスパルティックプロテイナーゼ、セリンプロテイナーゼ（ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パンクレアチン等）、金属プロテイナーゼが挙げられる。また、蛋白質分解酵素は、その至適ｐＨにより酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ又はアルカリ性プロテアーゼに分類され、基質特異性からエンドプロテアーゼ型（エンド型）又はエクソプロテアーゼ型（エクソ型）に分類される。
【００１７】
これら蛋白質分解酵素のうちＲＪ中の蛋白質を低分子化させる効果が高いことから、中性プロテアーゼ又はアルカリ性プロテアーゼが好適に用いられる。一方、生ＲＪはｐＨ３．５〜４であることから、蛋白質分解酵素処理を高いｐＨで行うと多量の塩が生成されて好ましくないことから、中性プロテアーゼが特に好適に用いられる。また、これら蛋白質分解酵素としては、分子量５５ｋＤａ蛋白質等の高分子を効率よく分解できることから、エンドプロテアーゼ型であるのが好ましい。
【００１８】
このような諸条件を満たす蛋白質分解酵素としては、バチルスサブティリス（Bacillus subtilis）由来のエンド型中性プロテアーゼ又はアスペルギルスオリザエ（Aspergillus oryzae）由来のエンド型中性プロテアーゼが特に好適に用いられる。両エンド型中性プロテアーゼは、金属プロテイナーゼに属しており、至適ｐＨが概ね６．５〜７．５の範囲にある。なお、これらの蛋白質分解酵素としては、単独で使用してもよく、２種以上を適宜組合わせて使用してもよい。また、使用される酵素の純度は、特に規定されることはなく、例えば酵素を産出する微生物生産物、植物又は動物からのホモジネートを用いても構わない。
【００１９】
この蛋白質分解酵素処理は、生ＲＪ中に含まれるアレルゲンの分解を効果的に行うために、蛋白質分解酵素の至適ｐＨにて行われるのが好ましく、蛋白質分解酵素処理中にｐＨが変動する場合には途中でｐＨ調整を行うように構成されるとよい。このとき、蛋白質分解酵素処理は、蛋白質分解酵素の至適ｐＨに調整された原料又はＲＪ希釈液に蛋白質分解酵素処理を行う第１分解工程と、該第１分解工程後の原料又はＲＪ希釈液のｐＨを前記至適ｐＨに再調整するｐＨ調整工程と、該ｐＨ調整工程後の原料又はＲＪ希釈液に蛋白質分解酵素処理を行う第２分解工程とが実施される。
【００２０】
糖分解酵素は、多糖類や糖蛋白質等に作用して糖鎖を切断する酵素である。この糖分解酵素としては、セルラーゼ、アビセラーゼ、ヘミセルラーゼ、グルコシダーゼ、マンナナーゼ、ガラクトシダーゼ、キシラナーゼ等が挙げられる。これら糖分解酵素のうち、ＲＪのアレルギー性を低減させる効果が高いことから、β−マンノシダーゼを使用することが最も好ましい。なお、これらの糖分解酵素としては、単独で使用してもよく、２種以上を適宜組合わせて使用してもよい。また、使用される酵素の純度は、特に規定されることはなく、例えば酵素を産出する微生物生産物、植物又は動物からのホモジネートを用いても構わない。
【００２１】
上記酵素分解する処理は、粘度を低下させて各種酵素反応を円滑に進行させるために、上記原料を所定量の水又は緩衝液で希釈して十分に混合したＲＪ希釈液を用いるのが好ましい。このとき、原料として生ＲＪを使用する場合には、好ましくは０．２〜１倍量、特に好ましくは０．３３倍量の水又は緩衝液で希釈するのが好ましい。希釈するために加えられる水又は緩衝液の量が０．２倍量未満の場合にはＲＪ希釈液の粘度が高いことから各種酵素反応が円滑に進行せず、逆に１倍量を超える場合には製造のための設備を巨大化する必要があること等から不経済である。一方、原料としてＲＪ粉末を使用する場合には、前記生ＲＪの場合と同様の理由で、２〜５倍量の水又は緩衝液で希釈するのが好ましい。さらに、前記ＲＪ希釈液のｐＨを酵素の至適ｐＨ付近に調整するのが好ましく、例えばエンド型中性プロテアーゼを用いる場合にはＲＪ希釈液のｐＨを好ましくは７．０〜８．０、特に好ましくは７．５に調整するのが好ましい。
【００２２】
また、この酵素分解する処理において、添加される酵素量は任意に選択することができる。例えば、反応を５時間程度の短時間で終了させたい場合にはＲＪ固形分１ｇに対して１〜２０ｍｇの酵素を用いればよいが、使用される酵素の純度によっても異なる。一方、例えば酵素反応を一日間かけて行う場合には、酵素量は０．１〜２ｍｇ程度でよい。なお、ＲＪ中には数多くの成分が含有されており、酵素に対して阻害的に働く可能性もあることから、通常の基質に対して酵素処理を行う場合の１０倍以上使用することが好ましい。但し、これも反応時間との兼ね合いで任意に選択することができる。この酵素分解する処理は至適温度（通常は４０〜６０℃）で行われるのが好ましい。また、ＲＪと酵素との反応は、アレルゲンと酵素とを接触させやすくするために攪拌しながら行うのがよい。なお、上記処理において、原料又はＲＪ希釈液中に不溶解物が生成される場合には、適宜遠心又は濾過により不溶解物を除去するのが好ましく、前記不溶解物質中に有用な生理活性成分が含まれている場合には、製品化前に再添加するのが好ましい。さらに、前記酵素分解する処理の終了後、酵素の失活又は除去を行うのが好ましい。
【００２３】
上記実施形態によって発揮される効果について以下に記載する。
・  実施形態の低アレルゲン化ＲＪは、デセン酸を含有していることから、健康や美容に高い効果を発揮する。さらに、この低アレルゲン化ＲＪには、ＲＪ由来のペプチド性成分のうち分子量４．５ｋＤａ以下の成分のみが含有されていることから、アレルギーを引き起こしにくくなっている。即ち、前記ＲＪ由来のペプチド性成分のうち分子量４．５ｋＤａを超える成分は、アレルギーを引き起こす作用があることが本発明者らの鋭意研究によって解明された。
【００２４】
・  実施形態の低アレルゲン化ＲＪは、ＲＪに対し、作用部位の異なる二種類の酵素である糖分解酵素処理及び蛋白質分解酵素処理を施すことにより、ＲＪ中のほとんど全ての高分子のペプチド性成分を低分子化させ、実質的に発現されない程度にアレルギー性を低減させたものである。さらに、この低アレルゲン化ＲＪでは、前記ペプチド性成分が低分子化されたために、アミノ酸吸収性が著しく向上されている。
【００２５】
また、本発明者らによる鋭意研究の結果、前記特許文献１のＲＪに施された処理と同様に、ＲＪに対し、基質に対する作用部位の異なる２種以上の蛋白質分解酵素を作用させた場合でも、酵素の選択によりアレルギー性を確実に低減させることはできなかったことが確認されている。また、ＲＪ中の主要アレルゲンである分子量５５ｋＤａの蛋白質を分画し、糖分解酵素処理及び蛋白質分解酵素処理を施した場合でも、ＲＪ中のアレルギー性を完全に除くことはできないことが確認されている。
【００２６】
一方、例えば加水分解酵素又は酸化還元酵素の作用により、アレルギー性が実質的に発現されない程度に低減されたプロポリス製品が開示されている。これに対し、ＲＪに含まれる主要なアレルゲンは、前記従来のプロポリス製品におけるアレルゲンとは異なり、前記加水分解酵素処理及び／又は酸化還元酵素処理では十分に分解され得ないことが本発明者らの鋭意研究の結果によって確認されている。
【００２７】
・  ＲＪ中に含まれる健康増進活性は、デセン酸を始めとしてペプチド性成分、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸等の様々な成分が関係している。このため、ペプチド性成分を除去すると不測の活性低下が引き起こされる懸念があるうえアミノ酸量が激減するため、生ＲＪが有する健康増進活性を十分に引き起こすことができなくなるおそれが高い。従って、アレルゲンを引き起こす成分のみを特異的に分解し、その他の成分には影響を与えない基質特異性の高い低アレルゲン化方法として酵素分解する処理が最も有効である。
【００２８】
・  糖分解酵素としてβ−マンノシダーゼを使用することによって、ＲＪのアレルギー性を容易かつ確実に低減させることができる。特に、ＲＪ中の主要なアレルゲンである分子量５５ｋＤａの蛋白質は高マンノース型糖鎖を持つことが知られており、それが抗原決定基を構成している可能性が非常に高い。従って、分子量５５ｋＤａの蛋白質のペプチド結合を加水分解するともに、前記高マンノース型糖鎖を分解することによってより一層効果的に抗原決定基を消失させることができる可能性が高い。
【実施例１】
【００２９】
＜＜アレルゲンの分解条件の検討＞＞
ＲＪに含まれる主要なアレルゲンである分子量５５ｋＤａ蛋白質と、アレルゲンであると疑われる分子量４ｋＤａ以上５５ｋＤａ未満の蛋白質とを効率よく分解するための条件を検討した。
【００３０】
＜酵素の選択＞
蛋白質分解酵素のみを用いて予備的に行った。
（試験例１）：中国産生ＲＪ１０００ｇに純水３３０ｍｌを加えて均一に成るまで攪拌してＲＪ希釈液を調製した。このＲＪ希釈液を炭酸水素ナトリウム又は炭酸カルシウムにてｐＨ７．５に調整した後、１００ｍｌずつ９個のビーカーに分取した。各ビーカー内に蛋白質分解酵素１．６７ｇを添加して５０℃で１６時間反応させた。前記ビーカー内には表１に示されるいずれか一種類の蛋白質分解酵素が添加されている。表１に示される蛋白質分解酵素は、バチルスサブティリス由来のエンド型中性プロテアーゼ（天野エンザイム社製プロテアーゼＮ）、アスペルギルスオリザエ由来のエンド型中性プロテアーゼ（大和化成社製プロチンＰ）、アスペルギロペプチダーゼＡ（盛進社製モルシンＦ）、ペプシン（和光純薬工業社製）、パンクレアチン（天野エンザイム社製パンクレアチンＦ）、パパイン（天野エンザイム社製パパインＷ−４０）、プロメライン（天野エンザイム社製プロメラインＦ）、アクチナーゼ（科研製薬社製アクチナーゼＥ）、アルカロフィリックプロテアーゼ（東洋紡社製）である。反応終了後、８０℃で３０分加熱処理して酵素を失活させるとともに殺菌処理をした。
【００３１】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＲＪ由来ペプチド性成分の分解確認１）
試験例１で得られた各サンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。各サンプルは、１／４量の２００ｍＭトリス塩酸（pH6.8）、２５０ｍＭジチオスレイトール、５％ＳＤＳ、２２．５％グリセロール及び適量のブロモフェノールブルーを含む５×ＳＤＳサンプルバッファーを加えて９８℃で２分間加熱した。その後、０．３〜０．５μｌについて、厚さ０．４５ｍｍの８−２５％グラジエントポリアクリルアミドゲルを用い、全自動電気泳動システムPhastSystemTM（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。なお、分子量マーカーとして。ＬＭＷ ｋｉｔ Ｅ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）を用いた。電気泳動後のゲルは、クマシーブリリアントブルーＲ−３５０でクマシー染色し、３０％メタノール及び１０％酢酸を含む溶液で脱色した。染色及び脱色されたゲルについて、分子量５５ｋＤａの蛋白質バンド及び分子量４ｋＤａ以上５５ｋＤａ未満の蛋白質バンド（表中では＞４ｋＤａと記載されている）の分解をそれぞれ目視にて確認した。結果を表１に示す。
【００３２】
【表１】
0004727939.tif 000002
表１より、プロテアーゼＮ、プロチンＰ、モルシンＦ及びペプシンでは分子量５５ｋＤａ蛋白質の分解能が高く、その他のプロテアーゼでは低かった。また、プロテアーゼＮ及びプロチンＰは、モルシンＦ及びペプシンよりも分子量４ｋＤａ以上５５ｋＤａ未満の蛋白質の分解能が高かった。従って、プロテアーゼＮ、プロチンＰ、モルシンＦ及びペプシンがＲＪ由来のペプチド性成分の分解に有効であることが分かった。
【００３３】
＜処理条件の検討＞
ＲＪ由来のペプチド性成分の分解に好適なｐＨ、反応温度等を検討した。なお、本検討では蛋白質分解酵素及び糖分解酵素を用いて行った。
【００３４】
（試験例２）：中国産生ＲＪ１００ｇに純水１００ｍｌを加えてＲＪ希釈液を調製した。このＲＪ希釈液を炭酸水素ナトリウム又は炭酸カルシウムにてｐＨ６．５に調整した後、等電点沈澱法により沈澱画分を分画し、沈澱画分に１．６７ｇのモルシンＦ及び３０ｍｇのβ−マンノシダーゼ（新日本化学工業社製スミチームＡＣＨ）を同時に添加し、５０℃で１６時間反応させた。反応終了後、８０℃で３０分間加熱処理した。
【００３５】
（試験例３）：中国産生ＲＪ１００ｇに純水１００ｍｌを加えてＲＪ希釈液を調製した。このＲＪ希釈液をｐＨ６．５に調整した後、１．６７ｇのモルシンＦ及び３０ｍｇのβ−マンノシダーゼを同時に添加し、５０℃で１６時間反応させた。反応終了後、８０℃で３０分間加熱処理した。
【００３６】
（試験例４）：中国産生ＲＪ１００ｇに純水３３ｍｌを加えてＲＪ希釈液を調製した。このＲＪ希釈液に１．６７ｇのモルシンＦ及び３０ｍｇのβ−マンノシダーゼを同時に添加し、４０℃で１６時間反応させた。反応終了後、８０℃で３０分間加熱処理した。
【００３７】
（試験例５）：中国産生ＲＪ１００ｇに純水３３ｍｌを加えてＲＪ希釈液を調製した。このＲＪ希釈液に１．６７ｇのモルシンＦ及び３０ｍｇのβ−マンノシダーゼを同時に添加し、４５℃で１６時間反応させた後、５５℃まで昇温し２時間反応させた。反応終了後、８０℃で３０分間加熱処理した。
【００３８】
（試験例６）：中国産生ＲＪ１００ｇに純水３３ｍｌを加えてＲＪ希釈液を調製した。このＲＪ希釈液に１．８３ｇのモルシンＦ及び３０ｍｇのβ−マンノシダーゼを同時に添加し、４０℃で１６時間反応させた。反応終了後、８０℃で３０分間加熱処理した。
【００３９】
（試験例７）：中国産生ＲＪ１００ｇに純水３３ｍｌを加えてＲＪ希釈液を調製した。このＲＪ希釈液に１．６７ｇの酸性プロテアーゼ（天野エンザイム社製プロテアーゼＭ）及び３０ｍｇのβ−マンノシダーゼを同時に添加し、４０℃で１６時間反応させた。反応終了後、８０℃で３０分間加熱処理した。
【００４０】
（試験例８）：中国産生ＲＪ１００ｇに純水３３ｍｌを加えてＲＪ希釈液を調製した。このＲＪ希釈液に１．６７ｇのプロテアーゼＭ及び３０ｍｇのβ−マンノシダーゼを同時に添加し、４０℃で１６時間反応させた。反応終了後、８０℃で３０分間加熱処理した。
【００４１】
（試験例９）：中国産生ＲＪ１００ｇに純水３３ｍｌを加えてＲＪ希釈液を調製した。このＲＪ希釈液を炭酸水素ナトリウム又は炭酸カルシウムにてｐＨ６．０に調整し、１．６７ｇのプロテアーゼＮ及び３０ｍｇのβ−マンノシダーゼを同時に添加し、４０℃で１６時間反応させた。反応終了後、８０℃で３０分間加熱処理した。
【００４２】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＲＪ由来ペプチド性成分の分解確認２）
試験例２〜９で得られた各サンプルについて上記試験例１の（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＲＪ由来ペプチド性成分の分解確認１）と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。染色及び脱色されたゲルについて、分子量５５ｋＤａの蛋白質バンド及び分子量４ｋＤａ以上５５ｋＤａ未満の蛋白質バンドの分解をそれぞれ目視にて確認した。結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】
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表２より、プロテアーゼＭは有効でないことが分かった。また、モルシンＦの添加量を増大させてもそれに見合った分解能は発揮されなかった。また、モルシンＦの添加量を増やしても溶液のｐＨが低ければ分解能は低下することが分かり、ｐＨが分解能に最も効いていることが容易に推察される。反応温度はさほど重要でないことも推察される。プロテアーゼＮについても全く同様に、添加量はさほど重要でなかった。従って、プロテアーゼ処理の進行とともに溶液のｐＨが低下し、それに起因して蛋白質の分解能が低下するものと考えられる。
【００４４】
＜ｐＨ調整による分解能の検討１＞
酵素反応の途中で溶液のｐＨ調整を行って分解能に与える影響を検討した。なお、本検討では蛋白質分解酵素のみを用いて予備的に行った。
【００４５】
（試験例１０）：中国産生ＲＪ１０００ｇに純水３３０ｍｌを加えてＲＪ希釈液を調製した。このＲＪ希釈液をｐＨ７．５に調整した後、１００ｍｌずつ９個のビーカーに分取した。各ビーカー内に下記表３に示されるいずれか一種類の蛋白質分解酵素１．６７ｇを添加して５０℃で２時間反応させることにより第１分解工程を行った。続いて、前記第１分解工程後のＲＪ希釈液を炭酸水素ナトリウム又は炭酸カルシウムにてｐＨ７．５に再調整することによりｐＨ調整工程を行った後、さらに５０℃で１４時間反応させることにより第２分解工程を行った。反応終了後、８０℃で３０分加熱処理した。
【００４６】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＲＪ由来ペプチド性成分の分解確認３）
試験例１０で得られた各サンプルについて上記試験例１の（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＲＪ由来ペプチド性成分の分解確認１）と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。染色及び脱色されたゲルについて、分子量５５ｋＤａの蛋白質バンド及び分子量４ｋＤａ以上５５ｋＤａ未満の蛋白質バンドの分解をそれぞれ目視にて確認した。結果を表３に示す。
【００４７】
【表３】
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表３より、ｐＨ調整工程を挟んで第１分解工程と第２分解工程とを行うことにより、少ない酵素添加量であっても全般に良好な分解能が発揮された。但し、蛋白質分解酵素のみでは、分子量４ｋＤａ以上５５ｋＤａ未満の蛋白質の分解は不十分であった。
【００４８】
＜ｐＨ調整による分解能の検討２＞
酵素反応の途中で溶液のｐＨ調整を行って分解能に与える影響を検討した。なお、本検討では蛋白質分解酵素及び糖分解酵素を用いて行った。
【００４９】
（試験例１１）：中国産生ＲＪ１００ｇに純水３３ｍｌを加えてＲＪ希釈液を調製した。このＲＪ希釈液をｐＨ７．５に調整した後、１．６７ｇのプロテアーゼＮ及び３０ｍｇのβ−マンノシダーゼを添加し、５０℃で２時間反応させることにより第１分解工程を行った。続いて、前記第１分解工程後のＲＪ希釈液をｐＨ７．５に再調整することによりｐＨ調整工程を行った後、さらに５０℃で１４時間反応させることにより第２分解工程を行った。反応終了後、８０℃で３０分加熱処理した。
【００５０】
（試験例１２）：中国産生ＲＪ１００ｇに純水３３ｍｌを加えてＲＪ希釈液を調製した。このＲＪ希釈液をｐＨ７．５に調整した後、１．６７ｇのプロチンＰ及び３０ｍｇのβ−マンノシダーゼを添加し、５０℃で２時間反応させることにより第１分解工程を行った。続いて、前記第１分解工程後のＲＪ希釈液をｐＨ７．５に再調整することによりｐＨ調整工程を行った後、さらに５０℃で１４時間反応させることにより第２分解工程を行った。反応終了後、８０℃で３０分加熱処理した。
【００５１】
（試験例１３）：中国産生ＲＪ１００ｇに純水３３ｍｌを加えてＲＪ希釈液を調製した。このＲＪ希釈液をｐＨ７．５に調整した後、１．６７ｇのプロテアーゼＮを添加し、５０℃で２時間反応させることにより第１分解工程を行った。続いて、前記第１分解工程後のＲＪ希釈液をｐＨ７．５に再調整することによりｐＨ調整工程を行った後、β−マンノシダーゼ３０ｍｇを添加し、さらに５０℃で１４時間反応させることにより第２分解工程を行った。反応終了後、８０℃で３０分加熱処理した。
【００５２】
（試験例１４）：中国産生ＲＪ１００ｇに純水３３ｍｌを加えてＲＪ希釈液を調製した。このＲＪ希釈液をｐＨ７．５に調整した後、１．６７ｇのプロチンＰを添加し、５０℃で２時間反応させることにより第１分解工程を行った。続いて、前記第１分解工程後のＲＪ希釈液をｐＨ７．５に再調整することによりｐＨ調整工程を行った後、β−マンノシダーゼ３０ｍｇを添加し、さらに５０℃で１４時間反応させることにより第２分解工程を行った。反応終了後、８０℃で３０分加熱処理した。
【００５３】
（試験例１５）：中国産ＲＪ凍結乾燥粉末１０ｇに純水４０ｍｌを加えて均一に成るまで攪拌してＲＪ希釈液を調製した。このＲＪ希釈液をｐＨ７．５に調整した後、１．６７ｇのプロテアーゼＮ及び３０ｍｇのβ−マンノシダーゼを添加し、５０℃で２時間反応させることにより第１分解工程を行った。前記第１分解工程後のＲＪ希釈液をｐＨ７．５に再調整を行することによりｐＨ調整工程を行った後、さらに５０℃で１４時間反応させることにより第２分解工程を行った。反応終了後、８０℃で３０分加熱処理した。
【００５４】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＲＪ由来ペプチド性成分の分解確認４）
試験例１１〜１５で得られた各サンプルについて上記試験例１の（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＲＪ由来ペプチド性成分の分解確認１）と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。染色及び脱色されたゲルについて、分子量５５ｋＤａの蛋白質バンド及び分子量４ｋＤａ以上５５ｋＤａ未満の蛋白質バンドの分解をそれぞれ目視にて確認した。結果を表４に示す。
【００５５】
【表４】
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表４より、ｐＨ調整工程を挟んで第１分解工程と第２分解工程とを行うことにより、少ない酵素添加量であっても非常に良好な分解能が発揮された。さらに、蛋白質分解酵素及び糖分解酵素の両方を用いることにより、分子量４ｋＤａ以上５５ｋＤａ未満の蛋白質の分解が極めて良好に進行することが確認された。なお、糖分解酵素処理は第１又は第２分解工程のいずれか一方のみで十分であることも分かった。
【実施例２】
【００５６】
＜ＲＪ免疫ラットにおけるＩｇＥ抗体応答の検討＞
４８時間受動皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）反応によるＲＪ特異的ＩｇＥの測定
上記実施例１で分子量４ｋＤａ以上の蛋白質の分解に顕著な効果が認められた試験例１１、１２と、効果が認められなかった試験例２、３について、ラットのＩｇＥ抗体応答の評価を行った。試験に先立ち、以下のとおりＲＪに対する抗血清を得た。まず、６週齢の雌性Ｗｉｓｔａｒラットを日本エスエルシー社から購入し、７〜１０日間検疫飼育を行った。次に、試験例２，３，１１，１２の蛋白質濃度をBradfordの方法（M.Bradford,Anal.Biochm.,72,248-254,1976）に基づき、ウシγグロブリンをスタンダードに用いてそれぞれ定量を行った。試験例２，３，１１，１２又は凍結乾燥ＲＪ粉末３ｍｇをそれぞれ水酸化アルミニウムゲル（アラム・アジュバンド）１０ｍｇと混合し、全量が１ｍｌとなるようにエマルジョンを作製した。対照としての卵白アルブミン（ＯＶＡ）は０．１ｍｇを水酸化アルミニウムゲル１０ｍｇと混合し、全量が１ｍｌとなるようにエマルジョンを作製した。各エマルジョンをラット１匹あたり１ｍｌ腹腔内投与し、２週間間隔で３回の免疫感作を行った。免疫感作開始から３５日後に各群８匹ずつ頚動脈より採血を行った。血液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血餅を取り除き、抗血清を得た。血清は測定まで−４０℃にて保存を行った。なお、ラットは全ての飼育期間を通じて、温度２３±２℃、湿度５５±１５％、オールフレッシュ換気回数１２回／時、午前８時から１２時間照明に条件設定されたセミバリアシステム飼育室内において、ＰＣゲージで５〜６匹ずつ収納し、固形飼料（ＣＥ−２、日本クレア）と濾過水道水とを自由摂取させて飼育した。
【００５７】
次に、６週齢の雌性Ｗｉｓｔａｒラット（１群につき２匹）の背部の毛を刈り、各個体より得られたＲＪ感作抗血清（ラットＮｏ．１〜８）０．１ｍｌをラット背部（８箇所／１匹）に皮内注射した。ＯＶＡ感作抗血清は、各個体の抗血清を０．１ｍｌずつ混合し、生理食塩水にて１／２系列希釈を行い、抗血清及び抗血清希釈液０．１ｍｌをラット背部に皮内注射した。抗血清注射４８時間後に抗原として、生理食塩水１ｍｌ中に凍結乾燥ＲＪ粉末、試験例２，３の等量混合物、試験例１１，１２の等量混合物、又はＯＶＡ１０ｍｇと、エバンスブルー色素５ｍｇとが含まれるようにそれぞれ混合液を作製し、１匹当たり１ｍｌずつ静脈内投与した。３０分後に背部の皮膚を剥離し、抗血清を皮内注射した部位の青染班有無を皮膚内側より観察した。結果を表５に示す。
【００５８】
【表５】
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表５より、ＯＶＡ感作群のＩｇＥ抗体価は予備試験で１６倍と弱かったことから、ＲＪ感作群では抗血清原液を用いてＰＣＡ反応を観察した。生じた青染斑の強さを−（反応なし）、＋（反応あり）、＋＋（直径２０ｍｍ以上の強い反応）の３段階に分けて評価した。その結果、試験例１１，１２では８例中１例のみが陽性を示し、３群中で最も反応が弱かった。また、反応強度においても凍結乾燥ＲＪ＞試験例２，３＞試験例１１，１２の順であり、試験例１１，１２のＩｇＥ抗体産生能は最も弱かった。
【実施例３】
【００５９】
＜ＲＪ免疫ラットにおけるＩｇＧ抗体応答の検討＞
試験に先立ち、以下のとおりＲＪに対する抗血清を得た。まず、６週齢の雌性Ｗｉｓｔａｒラットを日本エスエルシー社から購入し、７〜１０日間検疫飼育を行った。次に、上記実施例２と同様に、試験例１１及び１２の等量混合物、又は凍結乾燥ＲＪ粉末３ｍｇをそれぞれ水酸化アルミニウムゲル１０ｍｇと混合し、全量が１ｍｌとなるようにエマルジョンを作製した。対照としてのＯＶＡも実施例２と同様に０．１ｍｇを水酸化アルミニウムゲル１０ｍｇと混合し、全量が１ｍｌとなるようにエマルジョンを作製した。各エマルジョンをラット１匹あたり１ｍｌ腹腔内投与し、２週間間隔で３回の免疫感作を行った。免疫感作開始から１４日（２回目感作前）、２１日、２８日（３回目感作前）、３５日、４２日後に各群８匹ずつ頚動脈より採血を行った。血液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血餅を取り除き、抗血清を得た。血清は測定まで−４０℃にて保存を行った。
【００６０】
次に、凍結乾燥ＲＪ粉末、試験例１１及び１２の等量混合物、又はＯＶＡをリン酸緩衝液（ＰＢＳ；137mM NaCl, 8.1mM NaHPO4・12H2O, 2.68mM KCl, 1.47mM KH2PO4）で２ｍｇ／ｍｌに調整した抗原液を５０μｌ、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）に添加した。２時間室温にてインキュベートした後、９６ウェルプレート中の抗原液を捨てウェルをＰＢＳにて３回洗浄した。続いて、スキムミルク濃度が５％となるようにＰＢＳ−スキムミルク溶液を作製し、９６ウェルプレートの１ウェルあたり２００μｌずつ加え、１時間室温にてインキュベートした後、ＰＢＳ−スキムミルク溶液を捨て、ＰＢＳでウェル内を３回洗浄した。
【００６１】
次に、前記抗血清をＰＢＳにて１／５に希釈したものを始点として、１／２ずつの系列希釈をしたサンプルをウェルに５０μｌずつ添加した後、２時間室温でインキュベートした後、ウェル内の抗血清を捨て、０．０５％ Tween20−ＰＢＳ溶液でウェルを３回洗浄した。ＨＲＰ標識抗ラットＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ抗体液（ＣＡＰＰＥＬ社＃５５７４.lot＃０１８０９,21mg/ml）をＰＢＳにて２０００倍に希釈したものを５０μｌ添加した。ウェル内の抗体液を捨て、０．０５％ Tween20−ＰＢＳ溶液でウェルを３回洗浄した。最後に、ＴＭＢ液（和光）１００μｌを添加し、３０分発色反応を行いマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。抗体価は、非感作血清の４５０ｎｍにおける吸光度を対照として、抗血清の同波長における吸光度が非感作血清と等価となる最大希釈値とした。結果を表６に示す。
【００６２】
【表６】
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表６より、各ＩｇＧ抗体の抗体価は経時的に増加したが、試験例１１，１２の抗体価は他の２つと比較して著しく低かった。
【実施例４】
【００６３】
＜ヒスタミン放出試験＞
上記実施例２と同様の方法にて、凍結乾燥ＲＪ粉末、試験例２，３，１１，１２及び卵白アルブミン感作抗血清を得た。各抗血清とも等量ずつ混ぜることにより個体間の差を解消した。体重２００〜２５０ｇの雌性Ｗｉｓｔａｒラットを放血死させ腹腔内にタイロード緩衝液（137mM NaCl, 3.7mM KCl, 1.8mM CaCl2, 1.1mM MgCl2, 11.9mM NaHCO3, 0.4mM NaH2PO4, 5.6mM D-Glucose）１０ｍｌを注入し、２分間マッサージ後、ラット腹腔より腹水を回収した。細胞回収液をチューブへ集め、遠心分離（1200rpm,5min）し、ピペットマンにて上清を除いた。さらにチューブへタイロード緩衝液を２０ｍｌ加え、遠心分離（1200rpm,5min）し、ピペットマンにて上清を除いた。この工程を２回行い、細胞を洗浄した。細胞をタイロード緩衝液５ｍｌに懸濁し、血球計算版にて細胞数の測定を行い、最終細胞数が１×１０7cells／ｍｌとなるように細胞浮遊液を調整し、２４ウェルプレートに０．５ｍｌずつ分注した。
【００６４】
細胞浮遊液に非感作血清、ＲＪ感作血清のいずれか、又はタイロード緩衝液０．５ｍｌをそれぞれ添加し、ＣＯ2インキュベータにて３６℃、３時間インキュベートした。２４ウェルプレートより細胞浮遊液を回収し、タイロード緩衝液を２ｍｌ加えて遠心分離（1200rpm,5min）し、ピペットマンにて上清を除いた。この工程を２回行い、細胞を洗浄した。細胞をタイロード緩衝液０．７ｍｌに懸濁し、２４ウェルプレートに移した。細胞浮遊液に凍結乾燥ＲＪ粉末、試験例２，３の等量混合物又は試験例１１，１２の等量混合物をそれぞれ０．２５ｍｇ／ｍｌと、タイロード緩衝液０．２ｍｌと、０．１ｍｇ／ｍｌホスファチジルセリン（ＰＳ溶液）０．１ｍｌとを添加し、ＣＯ2インキュベータにて３６℃、２０分間インキュベートした。氷冷にて反応を停止させた後、２４ウェルプレートより細胞浮遊液を回収し、遠心分離（1200rpm,5min）し、ピペットマンにて上清０．８ｍｌを得、ヒスタミン定量用のサンプルとした。ヒスタミン定量には、ＳＰＩ−ｂｉｏ社のHistamine Enzyme Immunoassay Kitを用い、ＥＬＩＳＡ法にて測定を行った。結果を表７に示す。
【００６５】
【表７】
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表７より、感作抗血清によるヒスタミン遊離量はＯＶＡ＞凍結乾燥ＲＪ＞試験例２，３の等量混合物＞試験例１１，１２の等量混合物の順となり、試験例１１，１２の等量混合物におけるヒスタミン放出量が最も少なかった。
【実施例５】
【００６６】
＜ヒト抗体産生細胞を用いたアレルゲン試験＞
ヒト血液を用いたアレルゲン試験を行った。試験に先立ちＲＪによりアレルギーが起こることが確認されているアレルギー患者ＹＹ、アレルギー患者ＹＭ、及び健常者ＡＯより血液の提供を受けた。これらの血液は３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血餅を取り除き、血清とした。血清は測定まで−４０℃にて保存を行った。
【００６７】
凍結乾燥ＲＪ粉末、試験例２，３の等量混合物、又は試験例１１，１２の等量混合物をそれぞれＰＢＳで固形分１５ｍｇ／ｍｌに調整した抗原液を１００μｌ、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）に添加した。１時間室温にてインキュベートした後、９６ウェルプレート内の抗原液を捨てウェルをＰＢＳにて３回洗浄した。ウシ胎児血清（ＢＳＡ）濃度が１％となるようにＰＢＳ−ＢＳＡ溶液を作製し、９６ウェルプレートの１ウェルあたり２００μｌずつ加え、１時間室温にてインキュベートした後、ＰＢＳ−ＢＳＡ溶液を捨てた。
【００６８】
ヒト血清は、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１／２、１／５、１／１０と段階希釈を行い、ウェルに５０μｌ添加した後、２時間室温でインキュベートした。ウェル内の抗血清を捨て、０．０５％ Tween20−ＰＢＳ溶液でウェルを３回洗浄した。ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＥ（０．５ｍg／ｍｌ）を１％ＢＳＡを含むＰＢＳにて５００倍に希釈したものを５０μｌ添加した。ウェル中の抗体液を捨て、０．０５％ Tween20−ＰＢＳ溶液でウェルを３回洗浄した。検出は、Protein Detector ＥＬＩＳＡ Kitを用い、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、ブランクとしてヒト血清のかわりに１％ＢＳＡを用いた。結果を表８に示す。
【００６９】
【表８】
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表８より、凍結乾燥ＲＪ、試験例２，３の等量混合物に対する反応性は、いずれもＹＭ＞ＹＹ＞ＡＯとなり、健常者であるＡＯは各ＲＪにほとんど反応しなかった。また、試験例１１，１２の等量混合物に対する反応性は被験者全てにおいて全く見られなかった。この結果より、抗原性は未処理の凍結乾燥ＲＪ＞試験例２，３の等量混合物＞試験例１１，１２の等量混合物の順となり、試験例１１，１２の抗原性は限りなく低減されていた。
【実施例６】
【００７０】
＜反転腸管試験によるアミノ酸吸収能比較試験＞
一晩絶食させたモルモットを放血にて屠殺し、腸管を取り出した。この腸管を反転し、腸上部、腸中部、腸下部と三等分に切断した。反転腸管の一端を糸で縛り、その中に０．３％グルコース含有０．９％ＮａＣｌ溶液を２ｍｌ注入し、もう一方の端を縛って反転嚢とした。この反転嚢を５％の凍結乾燥ＲＪ、試験例２，３の等量混合物、又は試験例１１，１２の等量混合物溶液が３０ｍｌ入ったフラスコにそれぞれ入れ、１０分間酸素通気した。その後３７℃、１時間インキュベートして腸管内液を取り出しアミノ酸吸収能試験用のサンプルとした。
【００７１】
これらのサンプルを用いてFolin＆Ciocalteu法によるアミノ酸量の測定を行った。即ち、各サンプル又はＬ−チロシン標準溶液０．５ｍｌをそれぞれ遠心管に入れ、その中に２０％トリクロロ酢酸を０．５ｍｌ加えた。よく混合して遠心した後、上清０．１ｍｌを採取して試験管内に入れた。ここに２％Ｎａ2ＣＯ3／０．１規定ＮａＯＨを５ｍｌ加え、さらにフェノール試薬０．５ｍｌを加えて混合し、３０分間静置した。６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、Ｌ−チロシンにて検量線を作成、各サンプルの吸光度からアミノ酸吸収量（Ｌ−チロシン量として）を算出した。なお、腸管の上部・中部・下部でのアミノ酸の吸収率に差が認められなかったことから、それらの平均値を取り（n=3）Ｌ−チロシン含量を算出した。Ｌ−チロシンについてはあらかじめ検量線を作成し、直線性を確認した。結果を表９に示す。
【００７２】
【表９】
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表９より、試験例２，３の等量混合物は凍結乾燥ＲＪの２．２倍、試験例１１，１２の等量混合物は試験例２，３の等量混合物の２．９倍のアミノ酸吸収量があった。これらの状況から、試験例２，３は凍結乾燥ＲＪの２〜３倍の吸収能、試験例１１，１２は４〜６倍の吸収能があることが認められた。
【実施例７】
【００７３】
＜酵素処理ＲＪの分子量分析＞
試験例２，３の等量混合物、又は試験例１１，１２の等量混合物について、ゲル濾過カラムを用いたＨＰＬＣにて分子量の測定を行った。ＨＰＬＣ条件は、カラム；Superdex-peptide 10/300 GL (1.0cm×30cm)、移動相；３０％ＣＨ3ＣＮ、０．１％ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ、ポンプ；TOYOSODA CCPM、流速；０．３ｍｌ／分、検出波長；２２０ｎｍである。試験例２，３の等量混合物の結果を図１（ｂ）、試験例１１，１２の等量混合物の結果を図１（ｃ）に示す。なお、図１（ａ）は分子量マーカーを示し、左側のピークから順に分子量１２．５ｋＤａ（retention time Y = 26.958）、分子量６．５ｋＤａ（retention time Y = 31.242）、分子量１２７４Ｄａ（retention time Y = 38.993）、分子量３９３Ｄａ（retention time Y = 49.5）、分子量１３２Ｄａ（retention time Y = 56.435）となっている。なお、図１（ａ）に示されるゲル濾過の結果を片対数プロットした検量線より、Ｙ＝８７．４９５−６．４７４４Ｌｎ（Ｘ）、Ｒ2＝０．９９０、Ｙ；retention time、Ｘ；分子量であった。
【００７４】
図１（ｂ）に示されるクロマトグラムでは retention time Y = 33.008のピーク（分子量４５２３Ｄａ）及び retention time Y = 42.09のピーク（分子量１１１１Ｄａ）が確認されており、図１（ｃ）に示されるクロマトグラムでは前記分子量４５２３Ｄａのピーク及びペプチド性成分が消失し、分子量１１１１Ｄａのピークが残っていた。さらに、試験例１１，１２はいずれも、例えば上記表４に示されるような予備的な試験において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシー染色及び銀染色）にて分子量４ｋＤａ以上の蛋白質のバンドを含め、ほとんどの蛋白質バンドが検出されなかったことが確認されている。従って、試験例１１，１２では分子量４．５ｋＤａを超えるペプチド性成分が存在せず、分子量１．２ｋＤａ以上のピークが存在しないことが確認された。
【実施例８】
【００７５】
＜抗疲労効果の検討＞
凍結乾燥ＲＪ粉末及び試験例１１，１２の等量混合物について抗疲労効果を確認するために、マウスに強制水泳運動負荷を与えた状態での水泳運動の持続時間を測定した。５週齢のｄｄｙ系雄性マウス（体重２８ｇ前後）を日本エスエルシー社から購入し、試験時間以外は餌と水を自由に摂取させた。次に、各サンプルを下記表１０に示される用量でマウスに１日１回３日間経口投与し、４日目に水槽（直径１９ｃｍ、深さ２７ｃｍ、水温２５℃）内で５分間強制水泳（第１回目）を試行させた。その直後に各サンプルを下記表１０に示される用量でマウスに経口投与し、６０分経過後に第２回目の強制水泳を５分間試行させた。第２回目の強制水泳時にマウスが水中で不動であった時間を測定し、その累計不動時間を抗疲労効果の指標とした。なお、各サンプルはそれぞれ蒸留水に懸濁し、対照群には蒸留水のみを経口投与させた。結果を表１０に示す。
【００７６】
【表１０】
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表１０より、凍結乾燥ＲＪ及び試験例１１，１２の等量混合物はいずれも、対照に対し抗疲労効果が有意に発揮されるとともに、その強さはほぼ同程度であった。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】（ａ）〜（ｃ）はいずれも、実施例７の結果を示すクロマトグラム。
【図１】
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