(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（％）：２２．０±３．３
Ｃ６位一硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（％）：１０．７±１５．８
Ｃ４位一硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（％）：１２．５±１０．５ 
Ｃ４，Ｃ６位二硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（％）：３１．２±５．３、
Ｃ２位一硫酸化グルクロン酸（％）２３．６±８．７を含んでなるコンドロイチン硫酸。
【請求項２】
バカ貝（アオヤギ）およびその熱抽出物から得られた請求項１に記載のコンドロイチン硫酸。
【請求項３】
バカ貝（アオヤギ）を低温粉砕し、脱脂した後、またはバカ貝（アオヤギ）の熱抽出物を凍結乾燥後、アルカリ及びプロナーゼで処理し、得られた消化液を遠心分離後エタノール沈殿させることを特徴とするコンドロイチン硫酸の製造方法。
【請求項４】
前記コンドロイチン硫酸は、請求項１に記載のものであることを特徴とする請求項３記載のコンドロイチン硫酸の製造方法。
【請求項５】
更に、得られた沈殿を、陽イオン交換樹脂で処理する請求項４に記載のコンドロイチン硫酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品、化粧品、食品添加物等の分野において種々の用途が期待される新規なコンドロイチン硫酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
コンドロイチン硫酸は、動物の結合組織に含まれる酸性ムコ多糖である。これは、硫酸化されたあるいは硫酸化されていないウロン酸（Ｄ−グルクロン酸あるいはＬ−イズロン酸）と、硫酸化されたあるいは硫酸化されていないＮ−アセチルガラクトサミンの二糖繰り返し構造から成り、構成糖の水酸基の硫酸化により多種多様な異性体が存在する。硫酸化されうる部位はグルクロン酸の２位及び３位の水酸基、あるいはイズロン酸の２位の水酸基、及びＮ−アセチルガラクトサミンの４位及び６位の水酸基である。コンドロイチン硫酸鎖は、分子量１０４−１０５の直鎖状の多糖で、コア蛋白質に共有結合したプロテオグリカンとして存在する。
【０００３】
一般に、天然に存在するコンドロイチン硫酸鎖は１種類の硫酸化二糖の繰り返しのみから成るものは少なく、通常、様々な種類の硫酸化、あるいは非硫酸化二糖を異なる割合で含む。コンドロイチン硫酸は、酸性ムコ多糖のうちでは最も早く発見されたものであり、１８８６年、ＦｉｓｃｈｅｒとＢｏｅｄｅｋｅｒによって軟骨から分離され、最初はｃｈｏｎｄｒｏｉｔ
ａｃｉｄと命名された。その後、硫酸エステルを持つことがわかりｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅと呼ばれるようになった。さらに１９５１年、Ｍｅｙｅｒらによって、コンドロイチン硫酸には３種類有り（Ａ，Ｂ，Ｃ）軟骨中にはＡとＣが存在することが明らかにされた。コンドロイチン硫酸鎖を持つプロテオグリカンとしては、アグリカン、バーシカン、デコリンなどがあるが、これらの機能は不明なものも多い。しかし、アグリカンの軟骨組織機能を制御する活性や、バーシカンの抗細胞接着活性は、コンドロイチナーゼ処理により完全に消失するので、コンドロイチン硫酸鎖がそれらの活性を担っていると考えられる。さらに、網膜神経細胞に対する神経栄養因子や、神経突起伸張因子としてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンが単離されたが、これらの活性もコンドロイチナーゼ処理により消失した。最近では、コンドロイチン硫酸由来の二糖がナチュラルキラー細胞の活性化を抑えるという報告もある。また、コンドロイチン硫酸、カラギーナン、硫酸化デキストランなどの硫酸化多糖がインフルエンザウイルスや単純ヘルペスウイルスなど多数のウイルスの細胞への感染を阻害することは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の出現以前から知られていた。このように、コンドロイチン硫酸には多様な生理活性や物性が認められることから、抗炎症剤などの医薬品をはじめ、保湿剤として化粧品あるいは目薬に、ゲル化剤・ゼリー化剤等の食品添加物として、また最近では関節炎に有効な健康食品として利用されており、日常生活において意外に広い範囲で見かけることができる。また、これら通常の用途以外にも、その特性から様々な目的の医薬品などとして潜在的な利用価値が期待されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在医療等に用いられているコンドロイチン硫酸は、鯨軟骨から抽出したコンドロイチン硫酸Ａ（ＣｈＳ−Ａ、コンドロイチン４硫酸）及び鮫の鰭から抽出したコンドロイチン硫酸Ｃ（ＣｈＳ−Ｃ、コンドロイチン６硫酸）である。最近では、捕鯨禁止によってＣｈＳ−ＡからＣｈＳ−Ｃに比重が移りつつあるが、鮫の鰭も中華料理の食材として価格が上昇している。そのため、より安価に、且つ大量にコンドロイチン硫酸を取得できる原材料及び方法が求められている。
【０００５】
従って、本発明の目的は、より安価に、且つ大量に取得でき、尚かつ種々の有用な用途が期待できる新規なコンドロイチン硫酸と、その取得方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、非硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを含む二糖単位（以下、非硫酸化ＧａｌＮＡｃと略す。）：（２２．０±３．３）％、Ｃ６位一硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを含む二糖単位（以下、Ｃ６位一硫酸化ＧａｌＮＡｃと略す。）：（１０．７±１５．８）％、Ｃ４位一硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを含む二糖単位（以下、Ｃ４位一硫酸化ＧａｌＮＡｃと略す。）：（１２．５±１０．５）％、Ｃ４，Ｃ６位二硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを含む二糖単位（以下、Ｃ４，Ｃ６位二硫酸化ＧａｌＮＡｃと略す。）：（３１．２±４．３）％、及びＣ４，Ｃ６位二硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｃ２位グルクロン酸を含む二糖単位（以下、Ｃ４，Ｃ６位二硫酸化ＧａｌＮＡｃＣ２位一硫酸化ＧｌｃＡと略す。）：（２３．６±１．７）％を含んで成るコンドロイチン硫酸、及び、バカ貝（アオヤギ）を低温粉砕し、脱脂した後、あるいはバカ貝（アオヤギ）を熱抽出後凍結乾燥後、アルカリ及びプロナーゼで処理し、得られた消化液を遠心分離後エタノール沈殿させることを特徴とするコンドロイチン硫酸の取得方法、並びに、得られた沈殿を、更に、陽イオン交換樹脂で処理してコンドロイチン硫酸を製造する方法、に関する。また本発明は、当該コンドロイチン硫酸を含んでなる抗炎症剤、保湿剤、および抗血液凝固剤に関する。
【０００７】
本発明のコンドロイチン硫酸は、例えばバカ貝（アオヤギ）から大量に得られる。当該方法の概略は以下の通りである。即ち、先ず、バカ貝（アオヤギ）そのものあるいはバカ貝（アオヤギ）の加工工程中すなわち剥き身あるいは貝柱部を除いた後に出る残渣および粘液を分離して−１２０℃で粉砕したものあるいは熱水抽出物を原料とする。低温粉砕することで、粉砕熱の発生による物質の変性及び酸化を防ぐことができる。また、常温粉砕では不可能なサイズへの微粉砕が可能となり、粒度も揃えられる。この粉体から酸性ムコ多糖を抽出し、これをイオン交換樹脂で処理してコンドロイチン硫酸画分を得る。操作方法等は、鯨及び鮫軟骨からのコンドロイチン硫酸抽出法のそれを参考にすることができる。また、熱水抽出物の場合は脱脂過程を省略することもできる。
【０００８】
粉体から精製コンドロイチン硫酸を製造するまでを更に詳しく記すと大略以下のようになる。即ち、先ず、粉体をアセトン等の有機溶剤により脱脂し、次いで、これを例えば苛性ソーダ水溶液等のアルカリ水溶液で処理し、中和した後、例えばアクチナーゼＥ等のプロナーゼで消化する。次に、この消化液を遠心分離し、酢酸等でｐＨを酸性にした後、エタノールを加えて沈殿を生じさせる。生じた沈殿を遠心分離操作で分取し、エタノールで洗浄した後、これを減圧乾燥する。得られた酸性ムコ多糖を少量の脱イオン水に溶解し、これを、例えばＤＯＷＥＸ５０ＷＸ２等の陽イオン交換樹脂で処理した後、流出液を中和し、これを脱イオン水中で透析する。得られた溶液を濃縮し、メンブランフィルター等で濾過した後凍結乾燥すれば、コンドロイチン硫酸の精製品が得られる。熱水抽出物の場合は、アセトン等の有機溶剤による脱脂工程を省略することができる。
【０００９】
本発明のコンドロイチン硫酸を構成している二糖の存在比は、通常、 非硫酸化ＧａｌＮＡｃ（％）：２２．０±３．３ Ｃ６位一硫酸化ＧａｌＮＡｃ（％）：１０．７±１５．８ Ｃ４位一硫酸化ＧａｌＮＡｃ（％）：１２．５±１０．５ Ｃ４，Ｃ６位二硫酸化ＧａｌＮＡｃ（％）：５４．８±５．３、Ｃ２位一硫酸化ＧｌｃＡ（％）２３．６±８．７であるが、好ましくは、 非硫酸化ＧａｌＮＡｃ（％）：２２．０±２．２
Ｃ６位一硫酸化ＧａｌＮＡｃ（％）：１０．７±１０．６ Ｃ４位一硫酸化ＧａｌＮＡｃ（％）：１２．５±５．７ Ｃ４，Ｃ６位二硫酸化ＧａｌＮＡｃ（％）：５４．８±１．６、Ｃ２位一硫酸化ＧｌｃＡ（％）２３．６±１．７である。
【００１０】
コンドロイチン硫酸を構成している二糖の存在比がこのような割合のものはこれまでに知られていない。因みに、従来から知られている鯨軟骨由来のコンドロイチン硫酸では、Ｃ４位一硫酸化ＧａｌＮＡｃが約７０％と多い反面、Ｃ４，Ｃ６位二硫酸化ＧａｌＮＡｃは１％以下と少なく、同じく従来から知られている鮫軟骨由来のコンドロイチン硫酸ではＣ６位一硫酸化ＧａｌＮＡｃが約７０％と多いが、Ｃ４位一硫酸化ＧａｌＮＡｃは１０数％と少ない。
【００１１】
また、本発明のコンドロイチン硫酸は硫酸基分布が従来のものよりもランダムな構造となっている。即ち、非硫酸化ＧａｌＮＡｃを含む二糖単位、Ｃ６位一硫酸化ＧａｌＮＡｃを含む二糖単位、Ｃ４位一硫酸化ＧａｌＮＡｃを含む二糖単位、Ｃ４，Ｃ６位二硫酸化ＧａｌＮＡｃを含む二糖単位及びＣ４，Ｃ６位二硫酸化ＧａｌＮＡｃ、Ｃ２位一硫酸化ＧｌｃＡを含む二糖単位がランダムに並んだ構造を有する。
【００１２】
本発明のコンドロイチン硫酸は、従来のものと同様、抗炎症剤などの医薬品をはじめ、保湿剤として化粧品あるいは目薬に、また、ゲル化剤・ゼリー化剤等の食品添加物として利用しうる。更に、今後の展開として、当該コンドロイチン硫酸は生理的粘性が従来品より低いため配合薬剤とのブレンドが容易になる効果が考えられる。また角膜コラーゲン繊維の安定化を促進し、目の組織の機能保持に有効であることが報告されていることから、牛皮・豚皮などから抽出されるコラーゲンとのブレンドによって高機能性代用皮膚としての応用も考えられる。さらに生理・薬理活性だけではなく、高分子電解質としての特性を示すことから工業的応用も可能である。本発明のコンドロイチン硫酸は、鯨由来のコンドロイチン硫酸と鮫由来のコンドロイチン硫酸とは全く異なる非常に高い硫酸化度を持った構造を取るため、抗アレルギー活性など新しい範囲に応用できる可能性が期待できる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のコンドロイチン硫酸は、従来から知られている鯨由来のコンドロイチン硫酸や鮫由来のコンドロイチン硫酸とは全く異なる新しい構造を有するため、新しい生理活性が期待でき、幅広い範囲に応用できる可能性が高く、従来のものと同様、抗炎症剤などの医薬品をはじめ、保湿剤として化粧品あるいは目薬に、また、ゲル化剤・ゼリー化剤等の食品添加物として利用しうることはもとより、平均分子量が従来のものよりも小さいことから、従来のものより粘性が低く、配合薬剤とのブレンドが容易となる効果が期待できる。また、コンドロイチン硫酸に関する最近の報告として、角膜コラーゲン繊維の安定化を促進し、目の組織の機能保持に有効である旨の報告もあることから、牛皮・豚皮等から抽出されるコラーゲンとのブレンドによって高機能性代用皮膚としての応用も期待出来る。さらに生理・薬理活性だけではなく、高分子電解質としての特性を示すことから工業的応用も期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００１５】
実施例１
（１）バカ貝（アオヤギ）の加工工程中に排出される残渣部及び粘液、あるいは熱水抽出物のみを分離して、液体窒素下−１２０℃で粉砕・乾燥したものを原料とした。
１）約１００ｍｇの粉体を２０００ｍｌの三角フラスコに入れ、アセトン７００ｍｌを加え、１０分間攪拌した。熱水抽出物の場合はこの工程を省略することができる。
２）５分間放置し上澄み液を除去した。
３）１）−２）の操作をさらに３回繰り返した。
４）残った沈殿を減圧デシケーターで乾燥した。
５）得られた試料は−３０℃で保存した。
【００１６】
（２）アルカリ処理１）脱脂済軟骨粉５ｇを０．２Ｍ ＮａＯＨ８０ｍｌに溶解した。
２）３７℃の湯浴中で、３時間攪拌した。
３）酢酸でｐＨ７．０に中和した。
【００１７】
（３）プロナーゼ消化１）０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）１０ｍｌを加えた。
２）酢酸カルシウムを終濃度０．０２Ｍになるように加えた。
３）防腐のためメタノール５ｍｌを加えた。
４）アクチナーゼＥ５０ｍｇを加えた。
５）３７℃の湯浴中で、４８時間ゆっくりと攪拌した。
【００１８】
（４）エタノール沈殿１）消化液を１０，０００ｒｐｍ×３０分間、４℃にて遠心分離した。
２）上澄を０．４５μｍメンブランフィルターを用いて吸引濾過した。
３）濾過液に５％相当の酢酸カルシウムを加えた。
４）酢酸でｐＨ４．５に調整した。
５）２倍量のエタノールに加えて、４８時間放置した。
【００１９】
（５）沈殿の洗浄・乾燥１）エタノール液を７，０００ｒｐｍ×３０分間、４℃にて遠心分離した。
２）沈殿を回収し８０％エタノール３００ｍｌを加え、１２時間ゆっくり攪拌した。
３）１０，０００ｒｐｍ×３０分間、４℃にて遠心分離した。
４）２）−３）の操作を繰り返した。
５）沈殿に１００％エタノール２００ｍｌを加え、６時間ゆっくり攪拌した。
６）１０，０００ｒｐｍ×３０分間、４℃にて遠心分離した。
７）得られた沈殿（酸性ムコ多糖）を減圧デシケーターで乾燥した。（脱脂済バカ貝（アオヤギ）粉からの見掛歩留：１４．０％）
【００２０】
（６）コンドロイチン硫酸の精製（６−１）前処理１）ＤＯＷＥＸ ５０ＷＸ２陽イオン交換樹脂１００ｍｌを、３Ｍ
ＨＣｌ中で２時間攪拌し、水洗後、２Ｍ ＮａＯＨ中で２時間攪拌した。
２）上記の操作を３回繰り返した後、水洗した。
３）２．５×４０ｃｍのカラムの下に脱脂綿を詰め、空気が入らないように樹脂を詰めた。
（６−２）ＤＯＷＥＸ ５０Ｗ×２陽イオン交換樹脂処理１）上記（５）で得られた酸性ムコ多糖を、ごく少量の脱イオン水に溶解した。
２）カラムに１）を流し、２０分間放置した。
３）カラムに４００ｍｌ（樹脂体積の約４倍）の脱イオン水を流した。
４）流出液をすぐに１Ｍ ＮａＯＨで中和した。
（６−３）精製１）中和液を脱イオン水中で３日間透析した。
２）エバポレーターにて２０ｍｌ程に濃縮した。
３）０．２２ｍメンブランフィルターにより濾過後、凍結乾燥し乾燥標品とした。
【００２１】
［分析結果］上で得られた本発明のコンドロイチン硫酸（以下、ＣｈＳ−Ｓと略記する。）に関する分析結果及び考察を以下に示す。なお、これらの組成分析、構造解析等に当たっては、アミノ糖、ウロン酸の定量はＭｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎ法、Ｂｉｔｔｅｒ−Ｍｕｉｒ法を用いた。また硫酸基の置換度はイオンクロマトグラフィー法、元素分析によって行った。ＣｈＳ−Ｓの分子量、純度検定はＧＰＣ、ＦＴ−ＩＲ、セルロースアセテート膜電気泳動を適宜使用した。構造解析は１３Ｃ−ＮＭＲ
（１５０ＭＨｚ）及び １Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ）を使用した。また硫酸置換位置の決定、その分布はＣｈＳ−ＳのコンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ２による二段階脱離酵素分解によって得られる不飽和二糖のＨＰＬＣ、二次元ＮＭＲ（ＣＯＳＹ１Ｈ−ＮＭＲ水素核シフト相関など）分析により行った。対照サンプルとしては市販のコンドロイチン４−硫酸（ＣｈＳ−Ａ、鯨軟骨由来）及びコンドロイチン６−硫酸（ＣｈＳ−Ｃ、鮫軟骨由来）（何れも生化学工業（株）製）を使用した。
【００２２】
（１）ウロン酸の定量各試料溶液に含まれるウロン酸の割合及びこの値から求めたコンドロイチン硫酸含量（純度）を表１に、また、陽イオン交換樹脂（ＤＯＷＥＸ
５０ＷＸ２）による処理（以下、プロトン交換処理と略す。）が純度及び収率に与える影響を表２にそれぞれ示した。なお、標準コンドロイチン硫酸のウロン酸含量は３７％である。これらの結果から、本法により非常に高純度のコンドロイチン硫酸を得られることがわかった。また、プロトン交換処理前後で純度が大幅に増加している。このことからプロトン交換処理によって、ヒアルロン酸やデルマタン硫酸などの他の酸性ムコ多糖は完全に除去できたものと考えられる。
【００２３】
【表１】
0004719878.tif 000002
【００２４】
【表２】
0004719878.tif 000003
【００２５】
（２）アミノ糖分析各試料溶液のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）含量を表３に示した。また、陽イオン交換処理前の酸性ムコ多糖からはＮ−アセチルグルコサミンが約８％検出されたが、ＣｈＳ−Ｓ、ＣｈＳ−Ａ及びＣｈＳ−Ｃには全く確認されなかった。その他のアミノ糖は何れにも含まれていなかった。このことから、コンドロイチン硫酸を構成するアミノ糖はＮ−アセチルガラクトサミンのみであること、陽イオン交換処理によって他のアミノ糖を完全に除去できたことが確認できた。
【００２６】
【表３】
0004719878.tif 000004
【００２７】
（３）元素分析各サンプルに含まれる炭素、水素、窒素、酸素及び硫黄の重量比と、この結果から得られた硫酸化度をそれぞれ表４、表５に示した。表４からは、バカ貝（アオヤギ）由来コンドロイチン硫酸のＳ含量が高いことがわかる。表５からは、硫酸化度はバカ貝（アオヤギ）由来コンドロイチン硫酸が最も高く、本発明のコンドロイチン硫酸は他に比べると非常に高いという結果が得られた。
【００２８】
【表４】
0004719878.tif 000005
【００２９】
【表５】
0004719878.tif 000006
【００３０】
（４）硫酸基定量各サンプルに含まれる硫酸基及びここから算出した硫黄の比率を表６に示した。この結果から、硫酸基含量はＣｈＳ−Ｓが極めて多く、ＣｈＳ−ＡとＣｈＳ−Ｃは殆ど同じであることがわかった。また、これは上記（３）で述べた元素分析の結果とも一致した。
【００３１】
【表６】
0004719878.tif 000007
【００３２】
（５）分子量測定各サンプルの平均分子量と分子量分布を表７に示した。本発明のコンドロイチン硫酸の平均分子量は７５，０００であった。この値は他に比べるとやや小さいが、分子量分布はほぼ一致している。一般にコンドロイチン硫酸の分子量は、抽出方法により１０，０００−３００，０００の値をとることが知られている。今回得られたコンドロイチン硫酸の分子量分布は、これに一致するものではないがこの範囲にあった。
【００３３】
【表７】
0004719878.tif 000008
【００３４】
（６）ＨＰＬＣ二種類のコンドロイチン分解酵素を併用して酵素分解したコンドロイチン硫酸をＨＰＬＣにより分画し、定量して得られた、各々のコンドロイチン硫酸を構成している二糖の存在比を表８に示す。また、ここから求めたコンドロイチン硫酸の硫酸化度（ＧａｌＮＡｃ一分子あたりの硫酸基の数）を表９に示した。表８から、本発明のコンドロイチン硫酸は、鯨由来のコンドロイチン硫酸と鮫由来のコンドロイチン硫酸とは全く異なる新しい構造を有することが判った。それ故、本発明のコンドロイチン硫酸は、これまで知られているコンドロイチン硫酸の用途以外に、さらに新しい生理的活性を持つことが期待でき、幅広い範囲に応用できるのではないかと考えられる。
【００３５】
【表８】
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【００３６】
【表９】
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