(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン-6（IL-6）受容体に対する抗体を有効成分として含んで成る中皮腫治療剤。
【請求項２】
前記中皮腫が胸膜中皮腫である、請求項１に記載の中皮腫治療剤。
【請求項３】
前記胸膜中皮腫が悪性胸膜中皮腫である、請求項２に記載の中皮腫治療剤。
【請求項４】
前記IL-6受容体に対する抗体がIL-6受容体に対するモノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の中皮腫治療剤。
【請求項５】
前記IL-6受容体に対する抗体がヒトIL-6受容体に対するモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の中皮腫治療剤。
【請求項６】
前記IL-6受容体に対する抗体がマウスIL-6受容体に対するモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の中皮腫治療剤。
【請求項７】
前記IL-6受容体に対する抗体が組換え型抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の中皮腫治療剤。
【請求項８】
前記ヒトIL-6受容体に対するモノクローナル抗体がPM-1抗体である、請求項５又は７に記載の中皮腫療剤。
【請求項９】
前記マウスIL-6受容体に対するモノクローナル抗体がMR16-1抗体である、請求項６又は７に記載の中皮腫治療剤。
【請求項１０】
前記IL-6受容体に対する抗体がIL-6受容体に対するキメラ抗体、ヒト型化抗体またはヒト抗体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の中皮腫治療剤。
【請求項１１】
前記IL-6受容体に対するヒト型化抗体がヒト型化PM-1抗体である、請求項10に記載の中皮腫治療剤。
【請求項１２】
インターロイキン-6（IL-6）受容体に対する抗体を有効成分として含んで成る中皮腫細胞に対する増殖抑制剤。
【請求項１３】
前記中皮腫が胸膜中皮腫である、請求項12に記載の増殖抑制剤。
【請求項１４】
前記胸膜中皮腫が悪性胸膜中皮腫である、請求項13に記載の増殖抑制剤。
【請求項１５】
前記IL-6受容体に対する抗体がIL-6受容体に対するモノクローナル抗体である、請求項12〜14のいずれか1項に記載の増殖抑制剤。
【請求項１６】
前記IL-6受容体に対する抗体がヒトIL-6受容体に対するモノクローナル抗体である、請求項12〜15のいずれか１項に記載の増殖抑制剤。
【請求項１７】
前記IL-6受容体に対する抗体がマウスIL-6受容体に対するモノクローナル抗体である、請求項12〜15のいずれか１項に記載の増殖抑制剤。
【請求項１８】
前記IL-6受容体に対する抗体が組換え型抗体である、請求項12〜17のいずれか１項に記載の増殖抑制剤。
【請求項１９】
前記ヒトIL-6受容体に対するモノクローナル抗体がPM-1抗体である、請求項16又は18に記載の増殖抑制剤。
【請求項２０】
前記マウスIL-6受容体に対するモノクローナル抗体がMR16-1抗体である、請求項17又は18に記載の増殖抑制剤。
【請求項２１】
前記IL-6受容体に対する抗体がIL-6受容体に対するキメラ抗体、ヒト型化抗体またはヒト抗体である、請求項12〜20のいずれか１項に記載の増殖抑制剤。
【請求項２２】
前記IL-6受容体に対するヒト型化抗体がヒト型化PM-1抗体である、請求項21に記載の増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規な中皮腫治療剤及び中皮腫細胞抑制剤に関する。
【背景技術】  中皮腫は、胸部の肺あるいは心臓などの臓器や胃腸・肝臓などの腹部臓器をそれぞれ包む胸膜、腹膜、心膜の表面を覆う中皮に発生する腫瘍である。びまん性胸膜中皮腫では、胸壁胸膜側では肋間神経への浸潤によって胸痛をきたし、臓側胸膜側では腫瘍増生と胸水貯留により呼吸循環障害を生じることになる（高木，医学の歩み（別冊３月）「呼吸器疾患」ｐｐ．４６９−４７２，１９９９）。やがて隣接する縦隔臓器に波及し心臓に直接浸潤したり横隔膜を介して腹腔側へ進展し、またリンパ行性あるいは血行性転移が加わり胸腔外進展していく（同上）。
アメリカでは年間３０００人のびまん性胸膜中皮腫の発症が報告され、１９８０年代からの増加は著しく、６０歳代の男性に多く女性の約５倍の頻度とされている（高木，医学の歩み（別冊３月）「呼吸器疾患」ｐｐ．４６９−４７２，１９９９）。近年の欧米諸国の報告では中皮腫発生頻度は急速な増加傾向を示しており、１９９５年の英国疫学統計では今後２５年間は中皮腫死亡が増え続けることを予想し、最悪の場合、１９４０年代生まれの男性の全死亡の１％が中皮腫によって占められる危険性を指摘している（中野，呼吸、１８巻，９号，ｐｐ．９１６−９２５，１９９９）。
中皮腫については多くの異なった臨床病期分類が用いられており、従来の中皮腫の治療報告は用いられる病期分類法が異なるため治療成績を比較する際の障害になっていた（中野，呼吸  １８巻  ９号  ｐｐ．９１６−９２５，１９９９）。そこで、１９９５年になってＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ（ＩＭＩＧ）により、悪性胸膜中皮腫に対する国際ＴＮＭ分類が提案されている（中野，呼吸  １８巻  ９号  ｐｐ．９１６−９２５，１９９９）。
また、悪性中皮腫は石綿（アスベスト）暴露と因果関係があり、動物実験により証明もなされている（多田，医学のあゆみ（別冊３月）「呼吸器疾患」ｐｐ．４０６−４０８，１９９９）。気道に吸入されたアスベストは胸膜直下に達し、少なくとも約２０年の慢性刺激によって腫瘍が発生し，これが胸膜全面に浅く広がっていく（高木，医学の歩み（別冊３月）「呼吸器疾患」ｐｐ．４６９−４７２，１９９９）。そのため、悪性中皮腫は石綿関連疾患に分類されるが、すべての悪性中皮腫が石綿によるものではなく、約半数の患者で明らかな暴露が認められている（多田，医学のあゆみ（別冊３月）「呼吸器疾患」ｐｐ．４０６−４０８，１９９９）。
悪性胸膜中皮腫は治療に抵抗し予後は極めて不良であり早急に対策を講ずる必要がある（中野，呼吸、１８巻，９号，ｐｐ．９１６−９２５，１９９９）。例えば、中皮腫に対する化学療法では、葉酸拮抗薬であるｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（ＭＴＸ）はｌｅｕｃｏｖｉｎ併用超大量単独療法の奏効率が３７％と良好であったが、大量の胸水貯留をきたす中皮腫への実施は技術的に難しく、普及しなかった（中野，医学のあゆみ（別冊３月）「呼吸器疾患」ｐｐ．５７０−５７３，２００３）。また、びまん性胸膜中皮腫に対しては胸膜肺摘除術や胸膜切除術が行われているが、治療後再発をきたしやすく、ことに述後の局所再発率は３５〜４３％と高い（高木，医学の歩み（別冊３月）「呼吸器疾患」ｐｐ．４６９−４７２，１９９９）。
多くのヒト中皮腫細胞株およびいくつかのマウス中皮腫細胞株がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＬ−６を発現していることは知られており、ＩＬ−６を高発現しているマウス中皮腫細胞株ＡＢ２２を移植したマウスでは、癌細胞増殖や臨床症状、末梢血リンパ球組織の変化に先立って血清でのＩＬ−６検出が見られることが報告されている（Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄｔ−Ｏｈｍａｎｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ４０：２４１−２５０，１９９５）。また、悪性胸膜中皮腫患者の血清中のＩＬ−６レベルは、胸水流出（ｐｌｅｕｒａｌ  ｅｆｆｕｓｉｏｎ）を伴う肺腺癌患者に比べて高く、悪性胸膜中皮腫の臨床症状の一つである血小板増加症に関して、血清中ＩＬ−６レベルと血小板の数に顕著な相関があることが知られている（Ｎａｋａｎｏ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ７７（６）：９０７−９１２，１９９８）。さらに腹膜中皮腫患者の腫瘍細胞はＩＬ−６を高発現しており、死亡前には血清中のＩＬ−６レベルが高くなることが報告されている（Ｈｉｇａｓｈｉｈａｒａ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １５，１９９２，ｖｏｌｕｍｅ  ７０，Ｎｏ．８，ｐｐ．２１０５−２１０８）。
Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄｔ−Ｏｈｍａｎｎらは、ＡＢ２２を移植したマウスに週２回の割合でラット抗マウスＩＬ−６抗体（６Ｂ４）を投与したところ、臨床症状の開始および進行を顕著に弱める効果が認められたことを報告している（Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄｔ−Ｏｈｍａｎｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ４０：２４１−２５０，１９９５）。しかしながら、Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄｔの報告によれば、抗ＩＬ−６抗体はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＢ２２に対して直接の増殖抑制効果は有さず、抗ＩＬ−６抗体で治療したマウスと治療しないマウスの死後の外観に違いはなく、治療したマウスにおいても相当に大きい腫瘍塊が認められた（Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄｔ−Ｏｈｍａｎｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ４０：２４１−２５０，１９９５）。すなわち、抗ＩＬ−６抗体の中皮腫に対する増殖抑制はｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのいずれにおいても知られていなかった。
高木，医学の歩み（別冊３月）「呼吸器疾患」ｐｐ．４６９−４７２，１９９９
中野，呼吸、１８巻，９号，ｐｐ．９１６−９２５，１９９９
多田，医学のあゆみ（別冊３月）「呼吸器疾患」ｐｐ．４０６−４０８，１９９９
中野，医学のあゆみ（別冊３月）「呼吸器疾患」ｐｐ．５７０−５７３，２００３
Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄｔ−Ｏｈｍａｎｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ４０：２４１−２５０，１９９５
Ｈｉｇａｓｈｉｈａｒａ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １５，１９９２，ｖｏｌｕｍｅ  ７０，Ｎｏ．８，ｐｐ．２１０５−２１０８
【発明の開示】
ＩＬ−６アンタゴニストが中皮腫そのものに作用して増殖抑制効果を示すことは知られていなかった。本発明は、ＩＬ−６アンタゴニストを有効成分として含有する新規な中皮腫治療剤（中皮腫細胞の増殖抑制剤）を提供することを目的とする。
本発明者は、中皮腫細胞の増殖を抑制する新規な中皮腫治療剤を開発すべく、種々検討した結果、ＩＬ−６に関連するシグナル伝達を抑制又は遮断することにより、中皮腫細胞の増殖を抑制することが出来るという、新規な知見を得、本発明を完成させた。
従って、本発明は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）アンタゴニストを有効成分として含んで成る中皮腫治療剤を提供する。
本発明はまた、インターロイキン−６（ＩＬ−６）アンタゴニストを有効成分として含んで成る中皮腫細胞に対する増殖抑制剤を提供する。
前記中皮腫は例えば胸膜中皮腫であり、より具体的には、例えば、悪性胸膜中皮腫である。悪性胸膜中皮腫にはびまん性胸膜中皮腫が含まれる。
前記ＩＬ−６アンタゴニストは、例えばＩＬ−６に対する抗体又はＩＬ−６受容体に対する抗体でり、好ましくはＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体である。前記ＩＬ−６受容体に対する抗体は、特に好ましくは、ヒトＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体、例えばＰＭ−１抗体であり、あるいはマウスＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体、例えばＭＲ１６−１抗体である。前記ＩＬ−６受容体に対する抗体は、好ましくは組換え型抗体である。
前記ＩＬ−６受容体に対する抗体は、キメラ抗体、ヒト型化抗体またはヒト抗体であることが出来る。本発明において特に好ましい抗体は、ヒト型化ＰＭ−１抗体である。
本発明はまた、下記の形態をとることが出来る。
（１）中皮腫治療剤の製造のためのインターロイキン−６（ＩＬ−６）アンタゴニストの使用。
（２）前記中皮腫が胸膜中皮腫である、前記（１）に記載の使用。
（３）前記胸膜中皮腫が、悪性胸膜中皮腫である、前記（２）に記載の使用。
（４）前記ＩＬ−６アンタゴニストがＩＬ−６受容体に対する抗体である、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の使用。
（５）前記ＩＬ−６受容体に対する抗体がＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体である、前記（４）に記載の使用。
（６）前記ＩＬ−６受容体に対する抗体がヒトＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体である、前記（４）に記載の使用。
（７）前記ＩＬ−６受容体に対する抗体がマウスＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体である、前記（４）に記載の使用。
（８）前記ＩＬ−６受容体に対する抗体が組換え型抗体である、前記（４）〜（７）のいずれかに記載の使用。
（９）前記ヒトＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体がＰＭ−１抗体である、前記（６）に記載の使用。
（１０）前記マウスＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体がＭＲ１６−１抗体である、前記（７）に記載の使用。
（１１）前記ＩＬ−６受容体に対する抗体がＩＬ−６受容体に対するキメラ抗体、ヒト型化抗体またはヒト抗体である、前記（４）〜（１０）のいずれかに記載の使用。
（１２）前記ＩＬ−６受容体に対するヒト型化抗体がヒト型化ＰＭ−１抗体である、前記（１１）に記載の使用。
（１３）中皮腫細胞に対する増殖抑制剤の製増のためのインターロイキン−６（ＩＬ−６）アンタゴニストの使用。
（１４）前記中皮腫が胸膜中皮腫である、前記（１３）に記載の使用。
（１５）前記胸膜中皮腫が、悪性胸膜中皮腫である、前記（１４）に記載の使用。
（１６）前記ＩＬ−６アンタゴニストがＩＬ−６受容体に対する抗体である、前記（１３）〜（１５）のいずれかに記載の使用。
（１７）前記ＩＬ−６受容体に対する抗体がＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体である、前記（１６）に記載の使用。
（１８）前記ＩＬ−６受容体に対する抗体がヒトＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体である、前記（１６）に記載の使用。
（１９）前記ＩＬ−６受容体に対する抗体がマウスＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体である、前記（１６）に記載の使用。
（２０）前記ＩＬ−６受容体に対する抗体が組換え型抗体である、前記（１６）〜（１９）のいずれかに記載の使用。
（２１）前記ヒトＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体がＰＭ−１抗体である、前記（１８）に記載の使用。
（２２）前記マウスＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体がＭＲ１６−１抗体である、前記（１９）に記載の使用。
（２３）前記ＩＬ−６受容体に対する抗体がＩＬ−６受容体に対するキメラ抗体、ヒト型化抗体またはヒト抗体である、前記（１６）〜（２２）のいずれかに記載の使用。
（２４）前記ＩＬ−６受容体に対するヒト型化抗体がヒト型化ＰＭ−１抗体である、前記（２３）に記載の使用。
本発明はまた、下記の形態を採ることが出来る。
（１）中皮腫の治療方法において、当該治療を必要とする対象にインターロイキン−６（ＩＬ−６）アンタゴニストを投与することを含んで成る方法。
（２）前記中皮腫が胸膜中皮腫である、上記（１）に記載の方法。
（３）前記胸膜中皮腫が、悪性胸膜中皮腫である、上記（２）に記載の方法。
（４）前記ＩＬ−６アンタゴニストがＩＬ−６受容体に対する抗体である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記ＩＬ−６受容体に対する抗体がＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体である、上記（４）に記載の方法。
（６）前記ＩＬ−６受容体に対する抗体がヒトＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体である、上記（４）に記載の方法。
（７）前記ＩＬ−６受容体に対する抗体がマウスＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体である、上記（４）に記載の方法。
（８）前記ＩＬ−６受容体に対する抗体が組換え型抗体である、上記（４）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記ヒトＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体がＰＭ−１抗体である、上記（６）に記載の方法。
（１０）前記マウスＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体がＭＲ１６−１抗体である、上記（７）に記載の方法。
（１１）前記ＩＬ−６受容体に対する抗体がＩＬ−６受容体に対するキメラ抗体、ヒト型化抗体またはヒト抗体である、上記（４）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記ＩＬ−６受容体に対するヒト型化抗体がヒト型化ＰＭ−１抗体である、上記（１１）に記載の方法。
（１３）中皮腫細胞の増殖を抑制する方法において、当該抑制を必要とする対象にインターロイキン−６（ＩＬ−６）アンタゴニストを投与することを含んで成る方法。
（１４）前記中皮腫が胸膜中皮腫である、上記（１３）に記載の方法。
（１５）前記胸膜中皮腫が、悪性胸膜中皮腫である、上記（１４）に記載の方法。
（１６）前記ＩＬ−６アンタゴニストがＩＬ−６受容体に対する抗体である、上記（１３）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）前記ＩＬ−６受容体に対する抗体がＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体である、上記（１６）に記載の方法。
（１８）前記ＩＬ−６受容体に対する抗体がヒトＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体である、上記（１６）に記載の方法。
（１９）前記ＩＬ−６受容体に対する抗体がマウスＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体である、上記（１６）に記載の方法。
（２０）前記ＩＬ−６受容体に対する抗体が組換え型抗体である、上記（１６）〜（１９）のいずれかに記載の方法。
（２１）前記ヒトＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体がＰＭ−１抗体である、上記（１８）に記載の方法。
（２２）前記マウスＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体がＭＲ１６−１抗体である、上記（１９）に記載の方法。
（２３）前記ＩＬ−６受容体に対する抗体がＩＬ−６受容体に対するキメラ抗体、ヒト型化抗体またはヒト抗体である、上記（１６）〜（２２）のいずれかに記載の方法。
（２４）前記ＩＬ−６受容体に対するヒト型化抗体がヒト型化ＰＭ−１抗体である、上記（２３）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例１の結果を示し、種々の悪性中皮腫細胞株のＩＬ−６の生産性を示すグラフである。
図２は、実施例２の結果を示し、種々の悪性中皮腫細胞株のＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）の生産性（生産しないこと）を示すグラフである。なお、ＧＡＰＤＨは、内在性コントロールとして使用したＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）のｍＲＮＡ量を示す。
図３は、実施例３の結果を示し、悪性中皮腫細胞株Ｈ２０５２及びＨ２４５２による血管形成誘導因子（ＶＥＧＦ）の産生が、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとにより誘導されることを示すグラフである。
図４は、実施例４の結果を示し、悪性中皮腫細胞株Ｈ２８について、実施例３と同様な実験を行った結果であり、この細胞株はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒによる誘導を必要としないで血管形成誘導因子（ＶＥＧＦ）を生産することを示すグラフである。
図５は、実施例５の結果を示し、ＩＬ−６によるＶＥＧＦ産生誘導株であるＨ２０２５細胞株においては、ＩＬ−６による刺激によってＳＴＡＴ３のリン酸化が促進されるのに対し、ＩＬ−６によるＶＥＧＦ産生非誘導株であるＨ２８細胞株においては、ＩＬ−６による刺激によってＳＴＡＴ３のリン酸化が促進されないことを示すグラフである。
図６は、実施例６の結果を示し、ＩＬ−６によるＶＥＧＦ産生誘導株であるＨ２０２５細胞株ではＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの刺激によりＳＯＣＳ３の発現が誘導されるのに対し、ＩＬ−６によるＶＥＧＦ産生非誘導株であるＨ２８細胞株では、非誘導的にＳＯＣＳ３が発現されることを示すグラフである。
図７は、実施例７で使用したプラスミドｐＧＬ３−ＶＥＧＦ及びｐＧＬ３−ＶＥＧＦｍｕｔのプロモーター及びその近傍の構造を示す図である。
図８は、実施例７に結果を示し、ＶＥＧＦプロモーターをルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結した系において、ＶＥＧＦプロモーター中のｐ−ＳＴＡＴ３結合部位を変異した場合ＩＬ−６によるＶＥＧＦプロモーターの活性化が生じないことを示すグラフである。
図９は、実施例５〜７の結果から推定される、Ｈ２０５２細胞株における、ＩＬ−６による刺激によるＶＥＧＦプロモーターの誘導（ＶＥＧＦの産生）のメカニズムを示す模式図である。
図１０は、実施例８の結果を示し、Ｈ２０５２細胞株の増殖が、ＩＬ−６Ｒの存在下で、ＩＬ−６濃度依存的に増加することを示すグラフである。
図１１は、実施例９の結果を示し、ＩＬ−６及びＩＬ−６ＲによるＨ２０５２細胞株の増殖の促進が、ＭＲＡにより抑制されることを示すグラフである。
図１２は、実施例１０の結果を示し、Ｈ２２６細胞株の増殖が、ＩＬ−６Ｒの存在かでＩＬ−６濃度依存的に増加すること、及びＭＲＡの抑制効果を示すグラフである。
図１３は、実施例８の結果を示し、Ｈ２２６細胞の増殖が、ＩＬ−６Ｒの存在下で、ＩＬ−６濃度依存的に増加することを示すグラフである。
図１４は、実施例１１の結果を示し、ＩＬ−６及び可溶性ＩＬ−６受容体による悪性中皮腫細胞株Ｈ２０５２細胞及びＨ２２６の増殖促進作用を、ヒト型化ＰＭ−１抗体が抑制することを示すグラフである。
図１５は、実施例１２の結果を示し、悪性中皮腫細胞株ＭＳＴＯ、Ｈ２２６、Ｈ２０５２及びＨ２４５２におけるＩＬ−６の刺激によるＶＥＧＦの生産誘導が、ヒト型化ＰＭ−１抗体により抑制されることを示すグラフである。
図１６は、実施例１３の結果を示し、Ｈ２０５２株及びＨ２４５２細胞株において、ＩＬ−６及び可溶性ＩＬ−６受容体の刺激により誘導されるＳＴＡＴ３のリン酸化がヒト型化ＰＭ−１抗体により抑制されることを示すグラフである。
図１７は、実施例１４の結果を示し、ＩＬ−６及び可溶性ＩＬ−６受容体の刺激によるＨ２０５２細胞株及びＨ２２６細胞株の増殖促進が、抗ＶＥＧＦ抗体により抑制されないことを示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】  ＩＬ−６はＢ細胞刺激因子２（ＢＳＦ２）あるいはインターフェロンβ２とも呼称されたサイトカインである。ＩＬ−６は、Ｂリンパ球系細胞の活性化に関与する分化因子として発見され（Ｈｉｒａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２４，７３−７６）、その後、種々の細胞の機能に影響を及ぼす多機能サイトカインであることが明らかになった（Ａｋｉｒａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９３）５４，１−７８）。ＩＬ−６は、Ｔリンパ球系細胞の成熟化を誘導することが報告されている（Ｌｏｔｚ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８８）１６７，１２５３−１２５８）。
ＩＬ−６は、細胞上で二種の蛋白質を介してその生物学的活性を伝達する。一つは、ＩＬ−６が結合する分子量約８０ｋＤのリガンド結合性蛋白質のＩＬ−６受容体である（Ｔａｇａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８７）１６６，９６７−９８１，Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２４１，８２５−８２８）。ＩＬ−６受容体は、細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結合型の他に、主にその細胞外領域からなる可溶性ＩＬ−６受容体としても存在する。
もう一つは、非リガンド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約１３０ｋＤの膜蛋白質ｇｐ１３０である。ＩＬ−６とＩＬ−６受容体はＩＬ−６／ＩＬ−６受容体複合体を形成し、次いでｇｐ１３０と結合することにより、ＩＬ−６の生物学的活性が細胞内に伝達される（Ｔａｇａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８９）５８，５７３−５８１）。
ＩＬ−６アンタゴニストは、ＩＬ−６の生物学的活性の伝達を阻害する物質である。これまでに、ＩＬ−６に対する抗体（抗ＩＬ−６抗体）、ＩＬ−６受容体に対する抗体（抗ＩＬ−６受容体抗体）、ｇｐ１３０に対する抗体（抗ｇｐ１３０抗体）、ＩＬ−６改変体、ＩＬ−６又はＩＬ−６受容体部分ペプチド等が知られている。
抗ＩＬ−６受容体抗体に関しては、いくつかの報告がある（Ｎｏｖｉｃｋ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（１９９１）１０，１３７−１４６、Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（１９９３）１２，６２１−６３０、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９５−０９８７３、フランス特許出願公開番号ＦＲ  ２６９４７６７、米国特許番号ＵＳ  ５２１６２８）。その一つであるマウス抗体ＰＭ−１（Ｈｉｒａｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１４３，２９００−２９０６）の相捕性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体へ移植することにより得られたヒト型化ＰＭ−１抗体が知られている（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９２−１９７５９）。
前記ＩＬ−６アンタゴニストは、好ましくはＩＬ−６受容体に対する抗体であり、好ましくはヒトＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体又はマウスＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体である。上記ヒトＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体としてはＰＭ−１抗体が例示され、またマウスＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体としてはＭＲ１６−１抗体が挙げられる。前記の抗体は、好ましくは、キメラ抗体、ヒト型化抗体またはヒト抗体であり、例えばヒト型化ＰＭ−１抗体である。
本発明で使用されるＩＬ−６アンタゴニストは、中皮腫細胞の増殖を抑制し、中皮腫治療剤の活性成分として有用なものであれば、その由来、種類および形状を問わない。
ＩＬ−６アンタゴニストは、ＩＬ−６によるシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６の生物学的活性を阻害する物質である。ＩＬ−６アンタゴニストは、好ましくはＩＬ−６、ＩＬ−６受容体及びｇｐ１３０のいずれかの結合に対する阻害作用を有する物質である。ＩＬ−６アンタゴニストとしては、例えば抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−６受容体抗体、抗ｇｐ１３０抗体、ＩＬ−６改変体、可溶性ＩＬ−６受容体改変体あるいはＩＬ−６又はＩＬ−６受容体の部分ペプチドおよび、これらと同様の活性を示す低分子物質が挙げられる。
本発明で使用される抗ＩＬ−６抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＩＬ−６抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体はＩＬ−６と結合することにより、ＩＬ−６のＩＬ−６受容体への結合を阻害してＩＬ−６の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
このような抗体としては、ＭＨ１６６（Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）１８，９５１−９５６）やＳＫ２抗体（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，第２１回  日本免疫学会総会、学術記録（１９９１）２１，１６６）等が挙げられる。
抗ＩＬ−６抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＩＬ−６を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、抗ＩＬ−６抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトＩＬ−６は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８７）１６８，５４３−５５０、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）１４０，１５３４−１５４１、あるいはＡｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）５４，２６８５−２６８８に開示されたＩＬ−６遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。
ＩＬ−６の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のＩＬ−６蛋白質を公知の方法で精製し、この精製ＩＬ−６蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、ＩＬ−６蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
本発明で使用される抗ＩＬ−６受容体抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＩＬ−６受容体抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体はＩＬ−６受容体と結合することにより、ＩＬ−６のＩＬ−６受容体への結合を阻害してＩＬ−６の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
このような抗体としては、ＭＲ１６−１抗体（Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０，１１９２４−１１９２８）、ＰＭ−１抗体（Ｈｉｒａｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１４３，２９００−２９０６）、ＡＵＫ１２−２０抗体、ＡＵＫ６４−７抗体あるいはＡＵＫ１４６−１５抗体（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９２−１９７５９）などが挙げられる。これらのうちで、特に好ましい抗体としてＰＭ−１抗体が挙げられる。
なお、ＰＭ−１抗体産生ハイブリドーマ細胞株は、ＰＭ−１として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、平成元年７月１２日に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２９９８としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。また、ＭＲ１６−１抗体産生ハイブリドーマ細胞株は、Ｒａｔ−ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＭＲ１６−１として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、平成９年３月１３日に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８７５としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
抗ＩＬ−６受容体モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＩＬ−６受容体を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、抗ＩＬ−６受容体抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトＩＬ−６受容体は、欧州特許出願公開番号ＥＰ  ３２５４７４に、マウスＩＬ−６受容体は日本特許出願公開番号特開平３−１５５７９５に開示されたＩＬ−６受容体遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。
ＩＬ−６受容体蛋白質は、細胞膜上に発現しているものと細胞膜より離脱しているもの（可溶性ＩＬ−６受容体）（Ｙａｓｕｋａｗａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１０８，６７３−６７６）との二種類がある。可溶性ＩＬ−６受容体抗体は細胞膜に結合しているＩＬ−６受容体の実質的に細胞外領域から構成されており、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細胞内領域が欠損している点で膜結合型ＩＬ−６受容体と異なっている。ＩＬ−６受容体蛋白質は、本発明で用いられる抗ＩＬ−６受容体抗体の作製の感作抗原として使用されうる限り、いずれのＩＬ−６受容体を使用してもよい。
ＩＬ−６受容体の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のＩＬ−６受容体蛋白質を公知の方法で精製し、この精製ＩＬ−６受容体蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、ＩＬ−６受容体を発現している細胞やＩＬ−６受容体蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
ヒトＩＬ−６受容体をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＩＢＩＢＳＦ２Ｒを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、平成元年（１９８９年）１月９日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、ＨＢ１０１−ｐＩＢＩＢＳＦ２Ｒとして、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３２としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
本発明で使用される抗ｇｐ１３０抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ｇｐ１３０抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体はｇｐ１３０と結合することにより、ＩＬ−６／ＩＬ−６受容体複合体のｇｐ１３０への結合を阻害してＩＬ−６の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
このような抗体としては、ＡＭ６４抗体（特開平３−２１９８９４）、４Ｂ１１抗体および２Ｈ４抗体（ＵＳ  ５５７１５１３）Ｂ−Ｓ１２抗体およびＢ−Ｐ８抗体（特開平８−２９１１９９）などが挙げられる。
抗ｇｐ１３０モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ｇｐ１３０を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるｇｐ１３０は、欧州特許出願公開番号ＥＰ  ４１１９４６に開示されたｇｐ１３０遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。
ｇｐ１３０の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のｇｐ１３０蛋白質を公知の方法で精製し、この精製ｇｐ１３０受容体蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、ｇｐ１３０を発現している細胞やｇｐ１３０蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−２１日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、Ｆ０（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が適宜使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０００〜６０００程度のＰＥＧ溶液を通常、３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原蛋白質又は抗原発現細胞で感作し、感作Ｂリンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原又は抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／１２２２７、ＷＯ  ９２／０３９１８、ＷＯ  ９４／０２６０２、ＷＯ  ９４／２５５８５、ＷＯ  ９６／３４０９６、ＷＯ  ９６／３３７３５参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
例えば、抗ＩＬ−６受容体抗体産生ハイブリドーマの作製は、特開平３−１３９２９３に開示された方法により行うことができる。独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、平成元年７月１２日に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２９９８としてブタペスト条約に基づき国際寄託されたＰＭ−１抗体産生ハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注入して腹水を得、この腹水からＰＭ−１抗体を精製する方法や、本ハイブリドーマを適当な培地、例えば、１０％ウシ胎児血清、５％ＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地、ハイブリドーマＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）、ＰＦＨＭ−ＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）等で培養し、その培養上清からＰＭ−１抗体を精製する方法で行うことができる。
本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｗ．ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。
具体的には、目的とする抗体を産生する細胞、例えばハイブリドーマから、抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用してｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ    Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することができる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ等を用いて行うことができる。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）を使用することができる。得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。
目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト（ｈｕｍａｎ）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９２−１９７５９参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
例えば、キメラＰＭ−１抗体のＬ鎖およびＨ鎖のＶ領域をコードするＤＮＡを含むプラスミドは、各々ｐＰＭ−ｋ３およびｐＰＭ−ｈ１と命名され、このプラスミドを有する大腸菌は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（グレートブリテン及び北部アイルランド連合王国  スコットランド  アバディーン  ＡＢ２  １ＲＹ  マックハードライブ通り  ２３）に、１９９１年２月１２日に、各々ＮＣＩＭＢ４０３６６及びＮＣＩＭＢ４０３６２としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９２−１９７５９参照）。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ；ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９２−１９７５９参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
キメラ抗体、ヒト型化抗体には、ヒト抗体Ｃ領域が使用される。ヒト抗体Ｃ領域としては、Ｃγが挙げられ、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４を使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のＣ領域からなり、ヒト型化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域からなり、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明に使用される抗体として有用である。
本発明に使用されるヒト型化抗体の好ましい具体例としては、ヒト型化ＰＭ−１抗体が挙げられる（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９２−１９７５９参照）。
また、ヒト抗体の取得方法としては先に述べた方法のほか、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングにによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することもできる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列をを適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ  ９２／０１０４７，ＷＯ  ９２／２０７９１，ＷＯ  ９３／０６２１３，ＷＯ  ９３／１１２３６，ＷＯ  ９３／１９１７２，ＷＯ  ９５／０１４３８，ＷＯ  ９５／１５３８８を参考にすることができる。
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させたＤＮＡあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。
例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８−１１４）、また、ＨＥＦ１αロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，Ｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）に従えば容易に実施することができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合、Ｗａｒｄらの方法（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーターを使用する場合、Ｂｅｔｔｅｒらの方法（Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）に従えばよい。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９−４３８３）を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（ｒｅｆｏｌｄ）して使用する（例えば、ＷＯ９６／３０３９４を参照）。
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏなど、（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などが知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。
これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにて抗体を産生してもよい。
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。
哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。
これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、動物又は植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい。（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Ｍａｅｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ５３０に挿入し、このベクターをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍに感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Ｊｕｌｉａｎ，Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
上述のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（Ｈ鎖）又は軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４−１１５２３参照）。
本発明で使用される抗体は、本発明に好適に使用され得るかぎり、抗体の断片やその修飾物であってよい。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域はリンカー、好ましくは、ペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、上記抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２−１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖又は、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖又は、Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを鋳型とし、それらの配列のうちの所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡおよびその両端を各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されれば、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いて常法に従って、ｓｃＦｖを得ることができる。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。
前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。プロテインＡカラムに用いる担体として、例えば、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。
例えば、上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）に適用し得る。また、逆相ＨＰＬＣ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  ＨＰＬＣ）を用いてもよい。
上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又はＥＬＩＳＡ等により行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、ＰＢＳ（−）で適当に希釈した後、２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．３５ＯＤとして算出する。また、ＥＬＩＳＡによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、０．１Ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍｌに希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＴＡＧ製）１００μｌを９６穴プレート（Ｎｕｎｃ製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒトＩｇＧ（ＣＡＰＰＥＬ製）１００μｌを添加し、室温にて１時間インキュベーションする。
洗浄後、５０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ＢＩＯ  ＳＯＵＲＣＥ製）１００μｌを加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用いて４０５ｎｍでの吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。
本発明で使用されるＩＬ−６改変体は、ＩＬ−６受容体との結合活性を有し、且つＩＬ−６の生物学的活性を伝達しない物質である。即ち、ＩＬ−６改変体はＩＬ−６受容体に対しＩＬ−６と競合的に結合するが、ＩＬ−６の生物学的活性を伝達しないため、ＩＬ−６によるシグナル伝達を遮断する。
ＩＬ−６改変体は、ＩＬ−６のアミノ酸配列のアミノ酸残基を置換することにより変異を導入して作製される。ＩＬ−６改変体のもととなるＩＬ−６はその由来を問わないが、抗原性等を考慮すれば、好ましくはヒトＩＬ−６である。
具体的には、ＩＬ−６のアミノ酸配列を公知の分子モデリングプログラム、たとえば、ＷＨＡＴＩＦ（Ｖｒｉｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈｉｃｓ（１９９０）８，５２−５６）を用いてその二次構造を予測し、さらに置換されるアミノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価することにより行われる。適切な置換アミノ酸残基を決定した後、ヒトＩＬ−６遺伝子をコードする塩基配列を含むベクターを鋳型として、通常行われるＰＣＲ法によりアミノ酸が置換されるように変異を導入することにより、ＩＬ−６改変体をコードする遺伝子が得られる。これを必要に応じて適当な発現ベクターに組み込み、前記組換え型抗体の発現、産生及び精製方法に準じてＩＬ−６改変体を得ることができる。
ＩＬ−６改変体の具体例としては、Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９，８６−９３、及びＳａｖｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９４）１３，１３５７−１３６７、ＷＯ  ９６−１８６４８、ＷＯ９６−１７８６９に開示されている。
本発明で使用されるＩＬ−６部分ペプチド又はＩＬ−６受容体部分ペプチドは、各々ＩＬ−６受容体あるいはＩＬ−６との結合活性を有し、且つＩＬ−６の生物学的活性を伝達しない物質である。即ち、ＩＬ−６部分ペプチド又はＩＬ−６受容体部分ペプチドはＩＬ−６受容体又はＩＬ−６に結合し、これらを捕捉することによりＩＬ−６のＩＬ−６受容体への結合を特異的に阻害する。その結果、ＩＬ−６の生物学的活性を伝達しないため、ＩＬ−６によるシグナル伝達を遮断する。
ＩＬ−６部分ペプチド又はＩＬ−６受容体部分ペプチドは、ＩＬ−６又はＩＬ−６受容体のアミノ酸配列においてＩＬ−６とＩＬ−６受容体との結合に係わる領域の一部又は全部のアミノ酸配列からなるペプチドである。このようなペプチドは、通常１０〜８０、好ましくは２０〜５０、より好ましくは２０〜４０個のアミノ酸残基からなる。
ＩＬ−６部分ペプチド又はＩＬ−６受容体部分ペプチドは、ＩＬ−６又はＩＬ−６受容体のアミノ酸配列において、ＩＬ−６とＩＬ−６受容体との結合に係わる領域を特定し、その一部又は全部のアミノ酸配列を通常知られる方法、例えば遺伝子工学的手法又はペプチド合成法により作製することができる。
ＩＬ−６部分ペプチド又はＩＬ−６受容体部分ペプチドを遺伝子工学的手法により作製するには、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、前記組換え型抗体の発現、産生及び精製方法に準じて得ることができる。
ＩＬ−６部分ペプチド又はＩＬ−６受容体部分ペプチドをペプチド合成法により作製するには、ペプチド合成において通常用いられている方法、例えば固相合成法又は液相合成法を用いることができる。
具体的には、続医薬品の開発第１４巻ペプチド合成監修矢島治明廣川書店１９９１年に記載の方法に準じて行えばよい。固相合成法としては、例えば有機溶媒に不溶性である支持体に合成しようとするペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸を結合させ、α−アミノ基及び側鎖官能基を適切な保護基で保護したアミノ酸をＣ末端からＮ末端方向の順番に１アミノ酸ずつ縮合させる反応と樹脂上に結合したアミノ酸又はペプチドのα−アミノ基の該保護基を脱離させる反応を交互に繰り返すことにより、ペプチド鎖を伸長させる方法が用いられる。固相ペプチド合成法は、用いられる保護基の種類によりＢｏｃ法とＦｍｏｃ法に大別される。
このようにして目的とするペプチドを合成した後、脱保護反応及びペプチド鎖の支持体からの切断反応をする。ペプチド鎖との切断反応には、Ｂｏｃ法ではフッ化水素又はトリフルオロメタンスルホン酸を、又Ｆｍｏｃ法ではＴＦＡを通常用いることができる。Ｂｏｃ法では、例えばフッ化水素中で上記保護ペプチド樹脂をアニソール存在下で処理する。次いで、保護基の脱離と支持体からの切断をしペプチドを回収する。これを凍結乾燥することにより、粗ペプチドが得られる。一方、Ｆｍｏｃ法では、例えばＴＦＡ中で上記と同様の操作で脱保護反応及びペプチド鎖の支持体からの切断反応を行うことができる。
得られた粗ペプチドは、ＨＰＬＣに適用することにより分離、精製することができる。その溶出にあたり、蛋白質の精製に通常用いられる水−アセトニトリル系溶媒を使用して最適条件下で行えばよい。得られたクロマトグラフィーのプロファイルのピークに該当する画分を分取し、これを凍結乾燥する。このようにして精製したペプチド画分について、マススペクトル分析による分子量解析、アミノ酸組成分析、又はアミノ酸配列解析等により同定する。
ＩＬ−６部分ペプチド及びＩＬ−６受容体部分ペプチドの具体例は、特開平２−１８８６００、特開平７−３２４０９７、特開平８−３１１０９８及び米国特許公報ＵＳ５２１００７５に開示されている。
本発明で使用されるＩＬ−６アンタゴニストのＩＬ−６シグナル伝達阻害活性は、通常用いられる方法により評価することができる。具体的には、ＩＬ−６依存性ヒト骨髄腫株（Ｓ６Ｂ４５，ＫＰＭＭ２）、ヒトレンネルトＴリンパ腫細胞株ＫＴ３、あるいはＩＬ−６依存性細胞ＭＨ６０．ＢＳＦ２を培養し、これにＩＬ−６を添加し、同時にＩＬ−６アンタゴニストを共存させることによりＩＬ−６依存性細胞の３Ｈ−チミジン取込みを測定すればよい。
また、ＩＬ−６受容体発現細胞であるＵ２６６を培養し、１２５Ｉ標識ＩＬ−６を添加し、同時にＩＬ−６アンタゴニストを加えることにより、ＩＬ−６受容体発現細胞に結合した１２５Ｉ標識ＩＬ−６を測定する。上記アッセイ系において、ＩＬ−６アンタゴニストを存在させる群に加えＩＬ−６アンタゴニストを含まない陰性コントロール群をおき、両者で得られた結果を比較すればＩＬ−６アンタゴニストのＩＬ−６阻害活性を評価することができる。
後述の実施例に示されるように、抗ＩＬ−６受容体抗体により、中皮腫細胞の増殖抑制効果が認められたことから、抗ＩＬ−６受容体抗体等のＩＬ−６アンタゴニストは中皮腫の治療剤として有用であることが示唆された。
本発明における治療対象は哺乳動物である。治療対象の哺乳動物は、好ましくはヒトである。
本発明の中皮腫治療剤又は中皮腫細胞増殖抑制剤は、経口的にまたは非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、胸腔内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齡、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり１〜１０００ｍｇ、好ましくは５〜５０ｍｇの投与量を選ぶことができる。
好ましい投与量、投与方法は、たとえば抗ＩＬ−６レセプター抗体の塲合には、血中にフリーの抗体が存在する程度の量が有効投与量であり、具体的な例としては、体重１ｋｇあたり１ヶ月（４週間）に０．５ｍｇから４０ｍｇ、好ましくは１ｍｇから２０ｍｇを１回から数回に分けて、例えば２回／週、１回／週、１回／２週、１回／４週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射などの方法で、投与する方法などである。投与スケジュールは、病状の観察および血液検査値の動向を観察しながら２回／週あるいは１回／週から１回／２週、１回／３週、１回／４週のように投与間隔を延ばしていくなど調整することも可能である。
本発明の中皮腫治療剤又は中皮腫細胞増殖抑制剤は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】  以下、実施例および参考例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］  悪性中皮腫細胞株によるＩＬ−６の産生
培養液（１０％ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ）中、２４−ウエルプレート中で、細胞濃度５×１０４／ウエルで、悪性中皮腫細胞株、ＭＳＴＯ、Ｈ２０５２、Ｈ２８、Ｈ２２６及びＨ２４５２の培養を開始し、翌日細胞培養液を交換し、その後更に３日間培養し、培養上清中のＩＬ−６の濃度を、全自動化学発光酵素免疫測定システム（富士レビオ、ルミパルス）により測定し、細胞蛋白質の量で補正した。結果を図１に示す。実験は３連で行った。Ｈ２８細胞系はＩＬ−６無産生株であったが、他の４株はＩＬ−６産生株であった。特にＨ２０５２細胞株及びＨ２２６細胞株はＩＬ−６高産生株と考えられた。
［実施例２］  悪性中皮腫細胞株におけるＩＬ−６Ｒの発現
悪性中皮腫５株のＩＬ−６受容体発現量をｍＲＮＡレベルで測定した。陽性対照としてＫＴ−３細胞を用い、陰性対照として潤膜細胞（Ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ）を使用した。これらの細胞を１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ中で４８時間培養し、細胞中のＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）をコードするｍＲＭＡを、検出手段としてＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いるｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ−ＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）法により測定した。結果を図２に示す。なお、図２（下）は、内在性コントロールとして使用したＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）のｍＲＮＡ量を示す。
この結果より、悪性中皮腫細胞はＩＬ−６受容体を殆ど発現していないと考えられる。悪性胸膜中皮腫症例の胸水は血性胸水であるため、可溶性ＩＬ−６受容体が多量に存在し、これがＩＬ−６刺激伝達に関与していると推測される。
［実施例３］  ＩＬ−６刺激によるＶＥＧＦ産生誘導（１）
悪性中皮腫細胞株Ｈ２０５２およびＨ２４５２の腫瘍細胞を、ＲＰＭＩ  １６４０培地中で、初期細胞濃度５×１０４／ウエルとして、２４−ウエルプレート上３連で培養した。翌日、細胞培養液を交換し、（１）組換えＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）、（２）組換えＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）＋組換え可溶性ＩＬ−６Ｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）による刺激、及び（３）抗ＩＬ−６受容体抗体であるヒト型化ＰＭ−１抗体（ＷＯ  ９２／１９７５９参照）（２５μｇ／ｍｌ）による阻害を開始した（ＲＰＭＩは培地対照）。更に３日間培養した後、培養上清中の血管形成誘導因子（ＶＥＧＦ）の濃度を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）により測定し、細胞蛋白質量で補正した。
結果を図３に示す。この図から明らかな通り、Ｈ２０５２細胞株およびＨ２４５２細胞株ではＩＬ−６刺激によりＶＥＧＦ産生が誘導された。
［実施例４］  ＩＬ−６刺激によるＶＥＧＦ産生誘導（２）
悪性中皮腫細胞株Ｈ２８を用いて、実施例３の実験を反復した。結果を図４に示す。この結果から明らかな通り、Ｈ２８細胞株はＶＥＧＦ高産生株であるが、ＩＬ−６刺激に対しては無反応であった。
［実施例５］  ＩＬ−６刺激によるＳＴＡＴ３のリン酸化
ＩＬ−６によるＶＥＧＦ産生誘導株であるＨ２０２５細胞株およびＩＬ−６によるＶＥＧＦ産生非誘導株であるＨ２８細胞株を、組換えＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）及び可溶性組換えＩＬ−６受容体（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ３（ＳＴＡＴ３）と共にインキュベートし、インキュベーションの０時間目、０．５時間目及び１時間目に、ＳＴＡＴ３からｐ−ＳＴＡＴ３へのリン酸化についてウエスタンプロットにより分析した。結果を図５に示す。
図５から明らかな通り、Ｈ２０５２細胞株では、ＩＬ−６刺激後３０分でＳＴＡＴ３の著明なリン酸化が認められた。対照的にＨ２８細胞株ではＩＬ−６刺激に対しては僅かなＳＴＡＴ３のリン酸化しか認められなかった。なお、図５中、ｐ−ＳＴＡＴ３はリン酸化ＳＴＡＴ３を示し、ＳＴＡＴ３はリン酸化と非リン酸化ＳＴＡＴ３の総和を示す。
［実施例６］  ＩＬ−６刺激によるＳＯＣＳ３の誘導
ＩＬ−６によるＶＥＧＦ産生誘導株であるＨ２０２５細胞株およびＩＬ−６によるＶＥＧＦ産生非誘導株であるＨ２８細胞株を、組換えＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）及び可溶性組換えＩＬ−６受容体（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下でインキュベートして刺激を行い、インキュベーションの０時間目、２時間目及び４時間目に、誘導されたＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ３（ＳＯＣＳ３）及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現量を、それらをコードするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる増幅後の測定により、測定した。結果を、図６に示す。
図６から明らかな通り、Ｈ２０５２細胞株では、ＩＬ−６刺激後２時間でＳＯＣＳ３  ｍＲＮＡの誘導が認められた。Ｈ２８細胞株では恒常的なＳＯＣＳ３の高発現が観察された。
［実施例７］  ＶＥＧＦプロモーターアッセイ
ＶＥＧＦプロモーターによりルシフェラーゼ遺伝子の発現をコントロールするプラスミドｐＧＬ３−ＶＥＧＦ、及びリン酸化ＳＴＡＴ３結合部を崩した変異型ＶＥＧＦプロモーターによりルシフェラーゼ遺伝子の発現をコントロールするプラスミドｐＧＬ３−ＶＥＧＦｍｕｔを作成した（図７）。
Ｈ２０５２細胞５０，０００当り１μｇのｐＧＬ３−ＶＥＧＦまたはｐＧＬ３−ＶＥＧＦｍｕｔをトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を組換えＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）および組換え可溶性ＩＬ−６受容体（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。２日間刺激のあと、ＶＥＧＦプロモーターおよび変異型ＶＥＧＦプロモーターから誘導されたルシフェラーゼ活性を検討した。結果を図８に示す。
図８から明らかな通り、ＶＥＧＦプロモーターからリン酸化ＳＴＡＴ３結合部を削除した場合、ＩＬ−６刺激によるＶＥＧＦプロモーターの活性化は見られなくなった。上記実施例５、６及び７の結果から、Ｈ２０５２細胞株におけるＩＬ−６刺激によるＶＥＧＦ産生増強は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ系を介しているものと考えられた。この予想される系を図９に示す。
［実施例８］  ＩＬ−６及び可溶性ＩＬ−６受容体添加によるによるＨ２０５２、Ｈ２２６の増殖促進
Ｈ２０５２細胞株を、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地中、９６−ウエルプレートに５００細胞／ウエルで細胞を播き、組換え可溶性ＩＬ−６受容体の１００ｎｇ／ｍｌでの存在下または非存在下で、且つ種々の濃度（０、１、１０又は１００ｎｇ／ｍｌ）のＩＬ−６の存在下で、５連で、６〜７日間培養した。結果を図１０及び図１３に示す。これらの図から明らかな通り、Ｈ２０５２細胞株及びＨ２２６細胞株は組換え可溶性ＩＬ−６受容体（１００ｎｇ／ｍｌ）存在下で、ＩＬ−６濃度依存的に増殖する。
［実施例９］  ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒの添加によるＨ２０５２細胞の増殖促進のＩＬ−６Ｒに対する抗体（抗ＩＬ−６Ｒ抗体）による抑制
ＩＬ−６及びＩＬ−６受容体によるＨ２０５２細胞株の増殖促進が抗ＩＬ−６Ｒ抗体により抑制されるか否かを見るため、Ｈ２０５２細胞株を、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地中、９６−ウエルプレートに５００細胞／ウエルで細胞を播き、１０ｎｇ／ｍｌの組換え可溶性ＩＬ−６及び１００ｎｇ／ｍｌの組換え可溶性ＩＬ−６受容体の存在下で、且つ種々の濃度（０、１μｇ／ｍｌ又は２５μｇ／ｍｌ）のヒト型化ＰＭ−１抗体の存在下で、３連で、７日間培養した。培養後、ＭＴＳアッセイによりＨ２０５２細胞株の増殖量（ＯＤ  ４５０）を測定した。結果を図１１に示す。その結果、抗ＩＬ−６Ｒ抗体は濃度依存性に増殖を抑制することがわかった。一方、対照として、ＭＲＡの代わりに同じ濃度のヒトＩｇＧ１を加えた場合、抑制効果は見られなかった。
［実施例１０］  ＩＬ−６及び可溶性ＩＬ−６受容体添加によるによるＨ２２６の増殖促進、及び抗ＩＬ−６Ｒ抗体による抑制
Ｈ２２６細胞株を、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地中、９６−ウエルプレートに、５００細胞／ウエルの濃度で細胞濃度で播き、組換え可溶性ＩＬ−６受容体の１００ｎｇ／ｍｌでの存在下で、且つ種々の濃度（０、１、１０又は１００ｎｇ／ｍｌ）のＩＬ−６の存在下で、又は２５μｇ／ｍｌのＭＲＡの存在下で、３連で、７日間培養した。結果を図１２に示す。この図から明らかな通り、ＩＬ−６高生産性のＨ２２６細胞株は、ＩＬ−６高生産性のＨ２０５２細胞株と同様、組換え可溶性ＩＬ−６受容体（１００ｎｇ／ｍｌ）存在下で、ＩＬ−６濃度依存的に増殖し、その増殖は抗ＩＬ−６Ｒ抗体により抑制された。
［実施例１１］  ＩＬ−６及び可溶性ＩＬ−６受容体添加によるＨ２０５２細胞株、Ｈ２２６細胞株の増殖促進の抗ＩＬ−６受容体抗体による抑制
Ｈ２０５２細胞株及びＨ２２６細胞株を、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地中、９６−ウェルプレートに２００細胞／ウェルで細胞を播き、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）及び可溶性ＩＬ−６受容体（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、且つ種々の濃度（０、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ）のヒト型化ＰＭ−１抗体の存在下で、５連で、６日間培養した。培養後、ＭＴＳアッセイによりＨ２０５２細胞株及びＨ２２６細胞株の細胞増殖率を測定した。細胞増殖率は、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ無添加に比べて何倍増殖したかによって示す。結果を図１４に示す。その結果、抗ＩＬ−６受容体抗体は、Ｈ２０５２細胞株及びＨ２２６細胞株のＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ添加による増殖促進作用を完全に抑制した。一方、対照として、抗ＩＬ−６受容体抗体の代わりに同じ濃度のヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）を添加した場合、増殖抑制効果は認められなかった。
［実施例１２］  抗ＩＬ−６受容体抗体による、ＩＬ−６刺激によるＶＥＧＦ産生誘導の抑制
ヒト型化ＰＭ−１抗体の濃度（０．１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ）以外は実施例３と同じ条件で、抗ＩＬ−６受容体抗体による、悪性中皮腫細胞株ＭＳＴＯ、Ｈ２２６、Ｈ２０５２及びＨ２４５２におけるＩＬ−６刺激によるＶＥＧＦ産生誘導の抑制作用を検討した。結果を図１５に示す。その結果、抗ＩＬ−６受容体抗体は、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ刺激によるＶＥＧＦ産生誘導を完全に抑制した。一方、対照として、抗ＩＬ−６受容体抗体の代わりに同じ濃度のヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）を添加した場合、ＶＥＧＦ産生誘導の抑制作用は認められなかった。
［実施例１３］  抗ＩＬ−６受容体抗体によるＳＴＡＴ３リン酸化の抑制
ＶＥＧＦ産生誘導株であるＨ２０５２細胞株及びＨ２４５２細胞株で、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）及び可溶性ＩＬ−６受容体（１００ｎｇ／ｍｌ）刺激により誘導されるＳＴＡＴ３リン酸化が、５μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−６受容体抗体により抑制されるかを検討した。結果を図１６に示す。その結果、抗ＩＬ−６受容体抗体は、悪性中皮腫細胞においてＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ刺激により誘導されるリン酸化ＳＴＡＴ３（ｐ−ＳＴＡＴ３）を顕著に抑制した。一方、対照として、抗ＩＬ−６受容体抗体の代わりに同じ濃度のヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）を添加した場合、ＳＴＡＴ３のリン酸化の抑制はほとんど認められなかった。
［実施例１４］  悪性中皮腫細胞の増殖に対する抗ＶＥＧＦ抗体の効果
Ｈ２０５２細胞株及びＨ２２６細胞株を、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地中、９６−ウェルプレートに５００細胞／ウェルで細胞を播き、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）及び組換え可溶性ＩＬ−６受容体（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、且つ１μｇ／ｍｌの抗ＶＥＧＦ抗体の存在下で、５連で、６〜７日間培養した。培養後、ＭＴＳアッセイにより増殖量を検討した。対照としては、抗ＶＥＧＦ抗体の代わりに同じ濃度のヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）を用いた。結果を図１７に示す。その結果、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ刺激による細胞増殖を抑制しなかった。このことから、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ刺激による悪性中皮腫細胞増殖作用は、ＶＥＧＦを介するものでないことが判明した。
参考例１．ヒト可溶性ＩＬ−６受容体の調製
Ｙａｍａｓａｋｉらの方法（Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１，８２５−８２８）に従い得られたＩＬ−６受容体をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳＦ２Ｒ．２３６を用いて、ＰＣＲ法により可溶性ＩＬ−６受容体を作成した。プラスミドｐＢＳＦ２Ｒ．２３６を制限酵素ＳｐｈＩで消化して、ＩＬ−６受容体ｃＤＮＡを得、これをｍｐ１８（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）に挿入した。ＩＬ−６受容体ｃＤＮＡにストップコドンを導入するようにデザインした合成オリゴプライマーを用いて、インビトロミュータジェネシスシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）により、ＰＣＲ法でＩＬ−６受容体ｃＤＮＡに変異を導入した。この操作によりストップコドンがアミノ酸３４５の位置に導入され、可溶性ＩＬ−６受容体をコードするｃＤＮＡが得られた。
可溶性ＩＬ−６受容体ｃＤＮＡをＣＨＯ細胞で発現するために、プラスミドｐＳＶ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）と連結させ、プラスミドｐＳＶＬ３４４を得た。ｄｈｆｒのｃＤＮＡを含むプラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒにＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｓａｌ  Ｉで切断した可溶性ＩＬ−６受容体ｃＤＮＡを挿入し、ＣＨＯ細胞発現プラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ３４４を得た。
１０μｇのプラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ３４４をｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞株ＤＸＢ−ｌｌ（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）へカルシウムフォスフェイト沈降法（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８７）７，２７４５−２７５１）により、トランスフェクトした。トランスフェクトしたＣＨＯ細胞を１ｍＭグルタミン、１０％透析ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むヌクレオシド不含αＭＥＭ選択培養液で３週間培養した。
選択されたＣＨＯ細胞を限界希釈法でスクリーニングし、単一のＣＨＯ細胞クローンを得た。このＣＨＯ細胞クローンを２０ｎＭ〜２００ｎＭの濃度のメトトレキセートで増幅し、ヒト可溶性ＩＬ−６受容体産生ＣＨＯ細胞株５Ｅ２７を得た。ＣＨＯ細胞株５Ｅ２７を５％ＦＢＳを含むイスコーブ改変ダルベコ培養液（ＩＭＤＭ、Ｇｉｂｃｏ製）で培養した。培養上清を回収し、培養上清中の可溶性ＩＬ−６受容体の濃度をＥＬＩＳＡにて測定した。その結果、培養上清中には可溶性ＩＬ−６受容体が存在することが確認された。
参考例２．抗ヒトＩＬ−６抗体の調製
１０μｇの組換型ＩＬ−６（Ｈｉｒａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９８８）１７，４１）をフロイント完全アジュバントとともにＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、血清中に抗ＩＬ−６抗体が検出できるまで一週間毎にこれを続けた。局部のリンパ節から免疫細胞を摘出し、ポリエチレングリコール１５００を用いてミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と融合させた。ハイブリドーマをＨＡＴ培養液を用いるＯｉらの方法（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，３５１，１９８０）に従って選択し、抗ヒトＩＬ−６抗体を産生するハイブリドーマを樹立した。
抗ヒトＩＬ−６抗体を産生するハイブリドーマは下記のようにしてＩＬ−６結合アッセイをおこなった。すなわち、柔軟なポリビニル製の９６穴マイクロプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製，Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ，ＶＡ）を０．１Ｍのｃａｒｂｏｎａｔｅ−ｈｙｄｒｏｇｅｎ  Ｃａｒｂｏｎａｔｅ緩衝液（ｐＨ９．６）中で１００μｌのヤギ抗マウスＩｇ（１０μｌ／ｍｌ，Ｃｏｏｐｅｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ製Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）により４℃で一晩コートした。次いで、プレートを１００μｌの１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳにより室温で２時間処理した。
これをＰＢＳで洗浄した後、１００μｌのハイブリドーマ培養上清を各穴へ加え、４℃にて一晩インキュベートした。プレートを洗浄して、２０００ｃｐｍ／０．５ｎｇ／ｗｅｌｌとなるように１２５Ｉ標識組換型ＩＬ−６を各穴へ添加し、洗浄した後各穴の放射活性をガンマカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇａｍｍａ  ９０００，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で測定した。２１６ハイブリドーマクローンのうち３２のハイブリドーマクローンがＩＬ−６結合アッセイにより陽性であった。これらのクローンのなかで最終的に安定なＭＨ１６６．ＢＳＦ２が得られた。該ハイブリドーマが産生する抗ＩＬ−６抗体ＭＨ１６６はＩｇＧ１κのサブタイプを有する。
ついで、ＩＬ−６依存性マウスハイブリドーマクローンＭＨ６０．ＢＳＦ２を用いてＭＨ１６６抗体によるハイブリドーマの増殖に関する中和活性を調べた。ＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞を１×１０４／２００μｌ／穴となるように分注し、これにＭＨ１６６抗体を含むサンプルを加え、４８時間培養し、０．５μＣｉ／穴の３Ｈチミジン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を加えた後、更に６時間培養を続けた。細胞をグラスフィルターペーパー上におき、自動ハーベスター（Ｌａｂｏ  Ｍａｓｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で処理した。コントロールとしてウサギ抗ＩＬ−６抗体を用いた。
その結果、ＭＨ１６６抗体はＩＬ−６により誘導されるＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞の３Ｈチミジンの取込みを容量依存的に阻害した。このことより、ＭＨ１６６抗体はＩＬ−６の活性を中和することが明らかとなった。
参考例３．抗ヒトＩＬ−６受容体抗体の調製
Ｈｉｒａｔａらの方法（Ｈｉｒａｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１４３，２９００−２９０６）により作成した抗ＩＬ−６受容体抗体ＭＴ１８をＣＮＢｒにより活性化させたセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と添付の処方にしたがって結合させ、ＩＬ−６受容体（Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１，８２５−８２８）を精製した。ヒトミエローマ細胞株Ｕ２６６を１％ジギトニン（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製），１０ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ７．８）および０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１ｍＭ  ｐ−パラアミノフェニルメタンスルフォニルフルオライドハイドロクロリド（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）（ジギトニン緩衝液）で可溶化し、セファロース４Ｂビーズと結合させたＭＴ１８抗体と混合した。その後、ビーズをジギトニン緩衝液で６回洗浄し、免疫するための部分精製ＩＬ−６受容体とした。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを３×１０９個のＵ２６６細胞から得た上記部分精製ＩＬ−６受容体で１０日おきに４回免疫し、その後常法によりハイブリドーマを作成した。成長陽性穴からのハイブリドーマ培養上清を下記の方法にてＩＬ−６受容体への結合活性を調べた。５ラ１０７個のＵ２６６細胞を３５Ｓ−メチオニン（２．５ｍＣｉ）で標識し、上記ジギトニン緩衝液で可溶化した。可溶化したＵ２６６細胞を０．０４ｍｌ容量のセファロース４Ｂビーズと結合させたＭＴ１８抗体と混合し、その後、ジギトニン緩衝液で６回洗浄し、０．２５ｍｌのジギトニン緩衝液（ｐＨ３．４）により３５Ｓ−メチオニン標識ＩＬ−６受容体を流出させ、０．０２５ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）で中和した。
０．０５ｍｌのハイブリドーマ培養上清を０．０１ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎＧセファロース（Ｐｈｒａｍａｃｉａ製）と混合した。洗浄した後、セファロースを上記で調製した０．００５ｍｌの３５Ｓ標識ＩＬ−６受容体溶液とともにインキュベートした。免疫沈降物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ＩＬ−６受容体と反応するハイブリドーマ培養上清を調べた。その結果、反応陽性ハイブリドーマクローンＰＭ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２９９８）を樹立した。ハイブリドーマＰＭ−１から産生される抗体は、ＩｇＧ１κのサブタイプを有する。
ハイブリドーマＰＭ−１が産生する抗体のヒトＩＬ−６受容体に対するＩＬ−６の結合阻害活性をヒトミエローマ細胞株Ｕ２６６を用いて調べた。ヒト組換型ＩＬ−６を大腸菌より調製し（Ｈｉｒａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９８８）１７，４１−４５）、ボルトン−ハンター試薬（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）により１２５Ｉ標識した（Ｔａｇａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８７）１６６，９６７−９８１）。
４×１０５個のＵ２６６細胞を１時間、７０％（ｖ／ｖ）のハイブリドーマＰＭ−１の培養上清および１４０００ｃｐｍの１２５Ｉ標識ＩＬ−６とともに培養した。７０μｌのサンプルを４００μｌのマイクロフュージポリエチレンチューブに３００μｌのＦＣＳ上に重層し、遠心の後、細胞上の放射活性を測定した。
その結果、ハイブリドーマＰＭ−１が産生する抗体は、ＩＬ−６のＩＬ−６受容体に対する結合を阻害することが明らかとなった。
参考例４．抗マウスＩＬ−６受容体抗体の調製
Ｓａｉｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）１４７，１６８−１７３に記載の方法により、マウスＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体を調製した。
マウス可溶性ＩＬ−６受容体を産生するＣＨＯ細胞を１０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培養液で培養し、その培養上清から抗マウスＩＬ−６受容体抗体ＲＳ１２（上記Ｓａｉｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ参照）をＡｆｆｉｇｅｌ  １０ゲル（Ｂｉｏｒａｄ製）に固定したアフィニティーカラムを用いてマウス可溶性ＩＬ−６受容体を精製した。
得られたマウス可溶性ＩＬ−６受容体５０μｇをフロイント完全アジュバンドと混合し、ウィスターラットの腹部に注射した。２週間後からはフロイント不完全アジュバンドで追加免疫した。４５日目にラット脾臓細胞を採取し、２×１０８個を１×１０７個のマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１と５０％のＰＥＧ１５００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ製）をもちいて常法により細胞融合させた後、ＨＡＴ培地にてハイブリドーマをスクリーニングした。
ウサギ抗ラットＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ製）をコートしたプレートにハイブリドーマ培養上清を加えた後、マウス可溶性ＩＬ−６受容体を反応させた。次いで、ウサギ抗マウスＩＬ−６受容体抗体およびアルカリフォスファターゼ標識ヒツジ抗ウサギＩｇＧによるＥＬＩＳＡ法によりマウス可溶性ＩＬ−６受容体に対する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングした。抗体の産生が確認されたハイブリドーマクローンは２回のサブスクリーニングを行い、単一のハイブリドーマクローンを得た。このクローンをＭＲ１６−１と名付けた。
このハイブリドーマが産生する抗体のマウスＩＬ−６の情報伝達における中和活性をＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞（Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）１８，９５１−９５６）を用いた３Ｈチミジンの取込みで調べた。９６ウェルプレートにＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞を１ラ１０４個／２００μｌ／ウェルとなるように調製した。このプレートに１０ｐｇ／ｍｌのマウスＩＬ−６とＭＲ１６−１抗体又はＲＳ１２抗体を１２．３〜１０００ｎｇ／ｍｌ加えて３７℃、５％ＣＯ２で４４時間培養した後、１μＣｉ／ウェルの３Ｈチミジンを加えた。４時間後に３Ｈチミジンの取込みを測定した。その結果ＭＲ１６−１抗体はＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞の３Ｈチミジン取込みを抑制した。
したがって、ハイブリドーマＭＲ１６−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８７５）が産生する抗体は、ＩＬ−６のＩＬ−６受容体に対する結合を阻害することが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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