(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）〜（Ｆ）工程を含むことを特徴とする架橋ヒアルロン酸スポンジの製造方法。
（Ａ）  ヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩の水溶液を凍結する工程。
（Ｂ）  前記（Ａ）工程後、真空乾燥する工程。
（Ｃ）  前記（Ｂ）工程後、ジ−又はポリ官能基エポキシド架橋剤を含む溶媒に浸漬、加熱処理による架橋化工程。
（Ｄ）  前記（Ｃ）工程後、洗浄する工程。
（Ｅ）  前記（Ｄ）工程後、凍結する工程。
（Ｆ）  前記（Ｅ）工程後、真空乾燥する工程。
【請求項２】
下記（Ａ’）〜（Ｆ’）工程を含むことを特徴とする架橋ヒアルロン酸スポンジの製造方法。
（Ａ’）  ヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩、及びジ−又はポリ官能基エポキシドの架橋剤を含む水溶液を凍結する工程。
（Ｂ’）  前記（Ａ’）工程後、真空乾燥する工程。
（Ｃ’）  前記（Ｂ’）工程後、加熱処理による架橋化工程。
（Ｄ’）  前記（Ｃ’）工程後、洗浄する工程。
（Ｅ’）  前記（Ｄ’）工程後、凍結する工程。
（Ｆ’）  前記（Ｅ’）工程後、真空乾燥する工程。
【請求項３】
請求項１に記載の製造方法において、架橋剤のアルコール溶液の濃度が０．０１〜１Ｍであることを特徴とする架橋ヒアルロン酸スポンジの製造方法。
【請求項４】
請求項２に記載の製造方法において、架橋剤の量がヒアルロン酸の単糖当たり１〜１０mol/％であることを特徴とする架橋ヒアルロン酸スポンジの製造方法。
【請求項５】
請求項１又は３に記載の製造方法において、架橋化工程の反応時間が１〜４８時間であることを特徴とする架橋ヒアルロン酸スポンジの製造方法。
【請求項６】
請求項１、３、又は５のいずれかに記載の製造方法において、ヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩の分子量が１０万〜４００万であることを特徴とする架橋ヒアルロン酸スポンジの製造方法。
【請求項７】
請求項１、３、５、又は６のいずれかに記載の製造方法において、ヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩水溶液の濃度が０．１〜５．０質量％であることを特徴とする架橋ヒアルロン酸スポンジの製造方法。
【請求項８】
請求項２又は４に記載の製造方法において、架橋化工程の反応時間が１〜４８時間であることを特徴とする架橋ヒアルロン酸スポンジの製造方法。
【請求項９】
請求項２、４、又は８のいずれかに記載の製造方法において、ヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩の分子量が１０万〜４００万であることを特徴とする架橋ヒアルロン酸スポンジの製造方法。
【請求項１０】
請求項２、４、８、又は９のいずれかに記載の製造方法において、ヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩水溶液の濃度が０．１〜５．０質量％であることを特徴とする架橋ヒアルロン酸スポンジの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は架橋ヒアルロン酸スポンジの製造方法、特に工程を簡素化した架橋ヒアルロン酸スポンジの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸は、動物組織の細胞間質に多く、具体的には、眼硝子体、臍帯、関節液、皮膚、軟骨、その他の結合組織に存在するムコ多糖の一つであり、ヒアルロン酸及びその誘導体は水溶液やゲルの形態で、眼科手術の補助剤や外科手術後の組織の癒着を防止するための組成物として医療用途で幅広く利用されている
。
【０００３】
しかし、ヒアルロン酸ゲルの成形物は、ピンセットで処理する際や縫合する際に容易に破壊されてしまう、生理食塩水中に膨潤状態で貯蔵しなければならないといった問題を有することから、近年ヒアルロン酸ゲルから水分を除去した架橋ヒアルロン酸スポンジに関する開発がなされるようになった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の架橋ヒアルロン酸スポンジは機械的強度、保水性の面ではある程度好ましいものではあったが、製造工程が煩雑であり、大量生産するためには、より簡素化された製造方法が望まれていた。
本発明は、前記従来の課題に鑑みなされたもので、生成物が機械的強度、保水性に優れ、且つ製造工程が簡素化された架橋ヒアルロン酸スポンジの製造方法を提供することを目的とする。
【０００５】
[課題を解決するための手段]
上記課題に鑑み、本発明者らが鋭意検討した結果、初めにヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩の水溶液を凍結することで、架橋ヒアルロン酸スポンジの製造方法を簡素化できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明の第一の主題は即ち、下記（Ａ）〜（Ｆ）工程を含むことを特徴とする架橋ヒアルロン酸スポンジの製造方法である。
（Ａ）  ヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩の水溶液を凍結する工程。
（Ｂ）  前記（Ａ）工程後、真空乾燥する工程。
（Ｃ）  前記（Ｂ）工程後、ジ−又はポリ官能基エポキシド架橋剤を含む溶媒に浸漬、加熱処理による架橋化工程。
（Ｄ）  前記（Ｃ）工程後、洗浄する工程。
（Ｅ）  前記（Ｄ）工程後、凍結する工程。
（Ｆ）  前記（Ｅ）工程後、真空乾燥する工程。
前記製造方法において、架橋剤のアルコール溶液の濃度が０．０１〜１Ｍであることが好適である。
【０００７】
本発明の第二の主題は即ち、下記（Ａ’）〜（Ｆ’）工程を含むことを特徴とする架橋ヒアルロン酸スポンジの製造方法である。
（Ａ’）  ヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩、及びジ−又はポリ官能基エポキシドの架橋剤の水溶液を凍結する工程。
（Ｂ’）  前記（Ａ’）工程後、真空乾燥する工程。
（Ｃ’）  前記（Ｂ’）工程後、加熱処理による架橋化工程。
（Ｄ’）  前記（Ｃ’）工程後、洗浄する工程。
（Ｅ’）  前記（Ｄ’）工程後、凍結する工程。
（Ｆ’）  前記（Ｅ’）工程後、真空乾燥する工程。
前記製造方法において、加える架橋剤の量がヒアルロン酸の単糖当たり１〜１０mol/％であることが好適である。
【０００８】
前記製造方法において、架橋工程の反応時間が１〜４８時間であることが好適である。
前記製造方法において、ヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩の分子量が１０万〜４００万であることが好適である。
前記製造方法において、ヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩水溶液の濃度が０．１〜５．０質量％であることが好適である。
なお、本明細書において「スポンジ」の用語は、独立気泡あるいは連続気泡を有する多孔質体について用いられる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の好適な実施形態について説明する。
初めに本発明の架橋ヒアルロン酸スポンジの第一製造方法について詳細に説明する。
【００１０】
（Ａ）凍結工程
本発明の架橋ヒアルロン酸スポンジの第一製造方法においては、まずヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩の水溶液を凍結する。
本工程でのヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩の水溶液におけるヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩の濃度は、用いるヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩の種類や分子量等にもよるが、概ね０．１〜５．０重量％、好ましくは１．０〜３．０重量％程度とすることができる。
【００１１】
本工程において凍結温度は、均一な氷の結晶を形成させるために、好ましくは液体窒素温度〜−３０℃、さらに操作性を加味すると、より好ましくは−８５〜−３０℃の温度が用いられ、急速冷凍される。凍結時間は、凍結装置の大きさやヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩の量や形状に依存するので、それらに合わせて適宜選択すればよい。
【００１２】
また、架橋ヒアルロン酸スポンジはシート状に成形される場合において、厚さを概ね２〜２０ｍｍ、好ましくは、３〜５ｍｍ程度にすることにより、十分量の生理活性物質を含有することが可能となる。本工程におけるヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩の水溶液の液層厚が、ほぼそのまま架橋ヒアルロン酸スポンジの厚さとなるため、このような厚さの架橋ヒアルロン酸スポンジを得るためには、本工程において凍結されるヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩の水溶液の液層厚は２〜２０ｍｍであることが好適である。
【００１３】
原料として用いるヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩の分子量は、特に限定されるものではないが、具体的には、平均分子量が好ましくは１０万〜４００万程度のものが、より好ましくは５０万〜３００万程度のものが挙げられる。
【００１４】
また、ヒアルロン酸の金属塩としては、ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアルロン酸カリウム塩等を用いることができる。これらのヒアルロン酸金属塩のうちでも、ヒアルロン酸ナトリウムが好ましく用いられる。
【００１５】
本発明において、ヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩は、市販品を用いることが可能であり、従来公知の方法で製造することも可能であるが、鶏冠、臍帯など動物由来のヒアルロン酸は、プリオン、ウィルス等を含有する可能性も否定できないことから、動物由来原料を使用しない微生物発酵法にて得られるヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩を用いることが好適である。
【００１６】
（Ｂ）真空乾燥工程
上記（Ａ）工程で凍結したヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩の水溶液は、真空乾燥することにより、スポンジ状となる。真空乾燥とは、熱に敏感な湿り材料を凍結した状態で乾燥するために、空気の分圧を低くして乾燥する方法を指し、本発明においては、材料温度が０℃以下で乾燥が行われている。
本工程では、凍結したヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩は減圧下で乾燥することによる気化熱（昇華熱）により、温度が低温に保たれ、解凍することはない。そのため、本工程における工程時の温度は特に限定されず、通常の室温とすることもできる。なお、ここで「室温」とは１０〜２５℃程度を意味する。減圧条件は、３〜５０ｍｍＨｇ程度が好ましく、より好ましくは３〜１０ｍｍＨｇ程度である。
乾燥処理の時間は、凍結乾燥装置の大きさやヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩の量や形状に依存するので、それらに合わせて適宜選択すればよい。
【００１７】
（Ｃ）浸漬、加熱による架橋工程
上記（Ｂ）工程後、架橋剤を含む溶媒に浸漬し、加熱処理を行ってスポンジを架橋化する。本製造方法において用いる架橋剤は、上述のヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩の分子を架橋させる作用を有し、洗浄工程によって十分に除去可能なものであれば特に制限されず、例えば、エーテル、エステルもしくはアミド結合を生じる二官能性又は多官能性の従来公知の架橋剤を用いることが可能である。架橋剤として、本発明において好ましくは、ジ−又はポリ官能基エポキシドが用いられる。
【００１８】
ジ−又はポリ官能基エポキシドとして、具体的には、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、グリセロールトリグリシジルエーテルなどが挙げられ、特に好ましくはエチレングリコールグリシジルエーテルが用いられる。上記溶媒中のジ−又はポリ官能基エポキシドの濃度は、０．０１〜１Ｍであることが好ましく、特に好ましくは０．１Ｍ程度である。０．０１Ｍ未満であると、架橋が充分に行われず、１Ｍを越えると架橋はそれ以上進行しないばかりか、（Ｄ）洗浄工程に手間を要するようになる。
また、リン酸二水素アンモニウム等の四級アンモニウム塩や三級アミン等の触媒を添加することもできる。
【００１９】
架橋剤を含む溶媒に浸漬した未架橋のヒアルロン酸スポンジは、分子間架橋反応を促進するために、混合液を加熱処理することが好ましい。
加熱温度は３０〜７０℃が好ましく、特に好ましい温度は６０℃である。７０℃を越えるような高温で加熱すると、ヒアルロン酸の分解等がおこる場合がある。３０℃より低い温度では、分子間架橋反応速度が小さくなり、所望の濃度の分子間架橋物を得るのに長時間を要することがある。
加熱処理する時間は、１〜４８時間が好ましく、特に好ましくは２４時間程度である。１時間未満であると架橋が十分行われず、４８時間より長く行ってもそれ以上架橋は進まず、製造工程に要する時間が延長されるに過ぎない。
【００２０】
（Ｄ）洗浄工程
上記（Ｃ）工程後、未反応の架橋剤等が洗浄除去される。洗浄方法は上記未反応の架橋剤が除去できる方法であれば特に制限されないが、本発明において好適な洗浄方法の例を挙げる。
洗浄に使用される溶媒は、（Ｃ）工程で用いた溶媒が好ましく、アルコール、特にメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等が好適に用いられる。洗浄方法としては、上記未反応の架橋剤が除去できる方法であれば制限されないが、具体的な洗浄方法として、上記分子間架橋物に対して十分量、具体的には、容量で１０〜５０倍量の溶媒に浸漬し、必要に応じて攪拌や振盪を加えながら適当な時間、例えば、１２〜２４時間放置する方法等が挙げられる。また、この様な洗浄を、必要に応じて、２回以上行ってもよい。
【００２１】
溶媒で洗浄することにより、未反応の架橋剤等を完全に除去することが可能となり、さらに架橋ヒアルロン酸スポンジの最終形態が良好となり得る。
【００２２】
さらに上記溶媒での洗浄後、次いで必要に応じて分子間架橋物中の溶媒を適当な方法で除去した後、水で洗浄することが好ましい。用いる水としては中性のイオン交換水が好ましい。洗浄方法としては、上記溶媒での洗浄と同様にして行うことができる。具体的には、上記分子間架橋物に対して十分量、具体的には、容量で１０〜３０倍量の水に浸漬し、必要に応じて攪拌や振盪を加えながら適当な時間、例えば、１２〜２４時間放置する方法等が挙げられる。また、この様な水による洗浄を、必要に応じて、２回以上行ってもよい。
水で洗浄することにより、水溶性の未反応物の抽出除去と、溶媒の完全除去が可能となり、この後の（Ｅ）工程が円滑に行われるようになる。
なお、前記水洗浄後の生成物は、水分を含んで膨潤した状態のものである。
【００２３】
（Ｅ）凍結工程
本製造方法においては、上記（Ｄ）工程後、再び凍結される。凍結の条件は、上記（Ａ）凍結工程における条件と同様とすることができ、凍結温度は好ましくは液体窒素温度〜−２０℃、より好ましくは−８５〜−３０℃程度である。
（Ｆ）真空乾燥工程
本製造方法においては、上記（Ｅ）工程後、再び真空乾燥される。真空乾燥条件は、上記（Ｂ）真空乾燥工程における条件と同様とすることができる。
【００２４】
次に本発明の架橋ヒアルロン酸スポンジの第二製造方法について説明する。
（Ａ’）凍結工程
本発明の架橋ヒアルロン酸スポンジの第二製造方法においては、まずヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩、及び架橋剤を含む水溶液を凍結する。
本製造方法において用いる架橋剤は、前記第一の製造方法（Ｃ）における架橋剤と同様な物とすることができる。
架橋剤の添加量は、ジ−又はポリ官能基エポキシドを使用する場合、ヒアルロン酸単糖当たり０．１〜２０mol％であることが好ましく、より好ましくは１．０〜１０．０mol％である。０．１mol％未満であると、（Ｃ’）架橋化工程での架橋が充分に行われず、２０mol％を越えて添加しても架橋はそれ以上進行しないばかりか、（Ｄ’）洗浄工程に手間を要するようになる。
上記架橋剤をヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩の水溶液に加え、充分に混合する以外は、本工程（Ａ’）は第一の製造方法の（Ａ）と同様に行うことができ、凍結温度は好ましくは液体窒素温度〜−２０℃、より好ましくは−８５〜−３０℃程度である。
【００２５】
（Ｂ’）真空乾燥工程
本工程（Ｂ’）は上記第一の製造方法の（Ｂ）と同様に行うことができる。
【００２６】
（Ｃ’）加熱工程
上記（Ｂ’）工程で得られた生成物を加熱処理し、架橋化する。
加熱温度は３０〜７０℃が好ましく、特に好ましい温度は６０℃である。７０℃を越えるような高温で加熱すると、ヒアルロン酸の分解等がおこる場合がある。３０℃より低い温度では、分子間架橋反応速度が小さくなり、所望の濃度の分子間架橋物を得るのに長時間を要することがある。
加熱時間は、１〜４８時間が好ましく、特に好ましくは２４時間程度である。１時間未満であると架橋が十分行われず、４８時間より長く行ってもそれ以上架橋は進まず、製造工程に要する時間が延長されるに過ぎない。
【００２７】
（Ｄ’）洗浄工程
本工程（Ｄ’）は、上記第一の製造方法の（Ｄ）と同様に行うことができる。
（Ｅ’）凍結工程
本製造方法においては、上記（Ｄ’）工程後、再び凍結される。凍結の条件は、上記（Ａ’）工程における条件と同様とすることができ、凍結温度は好ましくは液体窒素温度〜−２０℃、より好ましくは−８５〜−３０℃程度である。
（Ｆ’）真空乾燥工程
本製造方法においては、上記（Ｅ’）工程後、再び真空乾燥される。真空乾燥条件は、上記（Ｂ’）工程における条件と同様とすることができる。
【００２８】
（Ａ）〜（Ｆ）工程又は（Ａ’）〜（Ｆ’）工程を含む製造方法により得られる架橋ヒアルロン酸スポンジは、それ自体は非水溶性であるが高空隙率のスポンジ構造を有することから高い吸水性、保水性を有し、生理活性物質の水溶液を多量に保持することが可能となる。また、ピンセットでの処理や縫合、医療用ホッチキスの使用等にも十分耐え得るような機械的強度を有するものである。また、アルコールによる洗浄と水による洗浄によって未反応の原料成分、具体的にはジ−又はポリ官能基エポキシド等の架橋剤等を除去しているので、医療用具としての安全性等に優れるものである。
【００２９】
本発明の２つの製造方法においては、初めに凍結処理を行うので、取り扱いが楽であり、また、ヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩を水溶液の形態で凍結するので、成型が簡単であり、水溶液を入れる容器の形を変えるだけで、所望の大きさの架橋ヒアルロン酸スポンジが得られる。
【００３０】
本発明の製造方法による架橋ヒアルロン酸スポンジは、他の構成要素と組み合わせて使用することもできる。具体的には、架橋ヒアルロン酸スポンジのみ、架橋ヒアルロン酸スポンジと未架橋のヒアルロン酸スポンジ、あるいは架橋ヒアルロン酸スポンジ層と一種または二種以上の他の材料からなる層（ポリウレタンフィルム層、不織布層等）、架橋ヒアルロン酸スポンジ層と未架橋のヒアルロン酸スポンジ層と一種または二種以上の他の材料からなる層（ポリウレタンフィルム層、不織布層等）とから構成されていてもよい。
また、加圧や接着剤を用いる等により各層同士を緩やかにあるいは強固に結合した積層体とすることも可能である。
【００３１】
本発明の製造方法による架橋ヒアルロン酸スポンジに含浸される生理活性物質として、具体的には、アスコルビン酸及びその誘導体、ジブチリルサイクリックＡＭＰ、表皮細胞増殖因子、スルファジアジン銀、ポビドンヨード、銀ゼオライト等を挙げることができる。これら生理活性物質は、公知の方法で製造することが可能であり、あるいは市販品を本発明に用いることも可能である。
【００３２】
さらに、生理活性物質は、一般的に不安定であって、滅菌操作や乾燥状態における長期保存が困難であるので、使用時に含浸されることが好ましい。しかし、生理活性物質が安定性を有する場合にはこの限りではなく、予め含浸しておくことが可能である。生理活性物質の水溶液濃度は、生理活性物質の種類等に応じて、適宜選択されるものである。また、添加に際しては、必要に応じて生理活性物質以外の物質、すなわち、一般に注射液等に使用される薬学的に許容される各種化合物等を適宜配合することが可能である。
【００３３】
本発明の製造方法においては、前述のように所望の大きさの架橋ヒアルロン酸スポンジが簡単に得られるが、製造した架橋ヒアルロン酸スポンジをさらに、包帯状、あるいは数ｃｍ〜数十ｃｍ角のパット状など、創傷の程度や深度、創面の面積等に応じて適当な大きさや形状に加工して使用することもできる。適用される創傷については、特に制限されるものではなく、例えば、擦過傷、皮膚剥脱、外傷性皮膚欠損創、分層採皮創、熱傷、皮膚潰瘍、及び褥瘡などに広く適用可能である。また、適用方法は、従来の被覆材を創傷に適用する方法と同様の方法とすることができる。
【００３４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されることはない。
（１）表面構造
▲１▼ヒアルロン酸（ＨＡ−９TM：（株）資生堂製）２ｇを９８ｍｌの蒸留水に溶解して２質量％ヒアルロン酸水溶液を作製した。この水溶液を９６ウェルマイクロウェルプレートTM（ヌンク社製）３皿にそれぞれ０．２５ｍｌずつ注入し、−３０℃の冷凍庫で一晩凍結させた。
▲２▼次に凍結乾燥機を用い、真空乾燥することにより、未架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。
▲３▼上記未架橋ヒアルロン酸スポンジをプレートから取り出し、０．１Ｍのエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＸ８１０TM：長瀬化成）を含むメタノール１００ｍｌに浸漬させ、メタノールの沸点温度（約６４℃）でそれぞれ４時間、８時間、２４時間加熱還流した。
▲４▼約１Ｌの蒸留水の入ったビーカーに入れ、約１時間攪拌洗浄を行った。この洗浄を５回繰り返した。
▲５▼これをプラスチックシャーレに取り出し、−３０℃の冷凍庫で急速凍結し、真空乾燥し、架橋ヒアルロン酸スポンジを作製した。
【００３５】
得られた架橋ヒアルロン酸スポンジの表面構造を図１に示す。
何れの架橋ヒアルロン酸スポンジも十分な気泡を持っていたが、反応時間が８時間の物（試験例２）は、４時間の物（試験例１）に比べて、気泡のキメが粗く、反応時間２４時間の物（試験例３）は、４時間の物に比べて、気泡のキメが細かくなった。
以上より、反応時間が２４時間である時、特に気泡のキメが細かい架橋ヒアルロン酸スポンジが製造できることが確認された。
【００３６】
（２）保水性
▲１▼ヒアルロン酸（ＨＡ−９TM：（株）資生堂製）３ｇを９７ｍｌの蒸留水に溶解して３質量％ヒアルロン酸水溶液を作製した。この水溶液を３つのビーカーに２０ｇずつ計り取り、０．１Ｍのエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＸ８１０TM：長瀬化成）を１１μｌずつ加え攪拌した。この時の架橋剤は各々溶液中に存在するヒアルロン酸の単糖当たり５mol%となる。このヒアルロン酸水溶液を２４ウェルマイクロウェルプレートTM（ヌンク社製）に１ｇずつ注入し、−３０℃の冷凍庫で一晩凍結させた。
▲２▼次に真空箱型乾燥機を用い、真空乾燥することにより、未架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。
▲３▼上記未架橋ヒアルロン酸スポンジをプレートから取り出し、約６０℃でそれぞれ２時間、６時間、２４時間熱処理した。
▲４▼熱処理後、約１Ｌの蒸留水の入ったビーカーに入れ、約１時間攪拌洗浄を行った。この洗浄を５回繰り返した。
▲５▼これをプラスチックシャーレに取り出し、−３０℃の冷凍庫で急速凍結し、真空乾燥して架橋ヒアルロン酸スポンジを作製した。
【００３７】
得られた架橋ヒアルロン酸スポンジの吸水率を下記数式１により算出し、図２に示す。
【数式１】
吸水率＝（ＷＷ−ＷＯ）／ＷＯ
［式中、ＷＯは吸水前の架橋ヒアルロン酸スポンジの重量、ＷＷは吸水後の架橋ヒアルロン酸スポンジの重量を表す。］
何れの架橋ヒアルロン酸スポンジも十分な吸水率を持っていたが、反応時間が６時間の物（試験例５）は、２時間の物（試験例４）に比べて、吸水率が低く、反応時間２４時間の物（試験例６）は、６時間の物に比べて、吸水率が高くなった。
以上より、反応時間が２４時間である時、特に吸水率が高く、充分な保水性を持つ架橋ヒアルロン酸スポンジが得られることが確認された。
【００３８】
実施例１
▲１▼ヒアルロン酸（ＨＡ−９TM：（株）資生堂製）２ｇを９８ｍｌの蒸留水に溶解して２％ヒアルロン酸水溶液を作製した。この水溶液を９６ウェルマイクロウェルプレートTM（ヌンク社製）に２５０μｌずつ注入し、−３０℃の冷凍庫で一晩凍結させた。
▲２▼次に真空箱型乾燥機を用い、真空乾燥することにより、未架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。
▲３▼上記未架橋ヒアルロン酸スポンジをプレートから取り出し、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＸ８１０TM：長瀬化成）を含むメタノール１００ｍｌに浸漬させ、メタノールの沸点温度（約６４℃）で２４時間加熱還流した。
▲４▼約１Ｌの蒸留水の入ったビーカーに入れ、約１時間攪拌洗浄を行った。この洗浄を５回繰り返した。
▲５▼これをプラスチックシャーレに取り出し、−３０℃の冷凍庫で急速凍結し、真空乾燥して架橋ヒアルロン酸スポンジを作製した。
【００３９】
実施例２
▲１▼ヒアルロン酸（ＨＡ−９TM：（株）資生堂製）３ｇを９７ｍｌの蒸留水に溶解して３％ヒアルロン酸水溶液を作製した。この水溶液をビーカーに２０ｇ計り取り、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＸ８１０TM：長瀬化成）を２３μｌ加え攪拌した。この時の架橋剤は各々溶液中に存在するヒアルロン酸の単糖当たり約１０mol%となる。このヒアルロン酸水溶液を２４ウェルマイクロウェルプレートTM（ヌンク社製）に１ｇ注入し、−３０℃の冷凍庫で一晩凍結させた。
▲２▼次に真空箱型乾燥機を用い、真空乾燥することにより、未架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。
▲３▼上記未架橋ヒアルロン酸スポンジをプレートから取り出し、約６０℃で２４時間熱処理した。
▲４▼熱処理後、約１Ｌの蒸留水の入ったビーカーに入れ、約１時間攪拌洗浄を行った。この洗浄を５回繰り返した。
▲５▼これをプラスチックシャーレに取り出し、−３０℃の冷凍庫で急速凍結し、真空乾燥して架橋ヒアルロン酸スポンジを作製した。
【００４０】
比較例１
▲１▼ヒアルロン酸（ＨＡ−９TM：（株）資生堂製）３ｇを９７ｍｌの蒸留水に溶解して３％ヒアルロン酸水溶液を作製した。この水溶液をビーカーに２０ｇ計り取り、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＸ８１０TM：長瀬化成）をそれぞれ２３μｌ加え攪拌した。このヒアルロン酸水溶液を２４ウェルマイクロウェルプレートTM（ヌンク社製）に１ｇ注入し、６０℃で２４時間熱処理した。
▲２▼反応物を−３０℃の冷凍庫で一晩凍結させた。
▲３▼次に真空箱型乾燥機を用い、真空乾燥した。
▲４▼上記乾燥物をプレートから取り出し、約１Ｌの蒸留水の入ったビーカーに入れ、約１時間攪拌洗浄を行った。この洗浄を５回繰り返した。
▲５▼これをプラスチックシャーレに取り出し、−３０℃の冷凍庫で急速凍結し、真空乾燥して架橋ヒアルロン酸スポンジを作製した。
【００４１】
比較例２
▲１▼ヒアルロン酸（ＨＡ−９TM：（株）資生堂製）３ｇを９７ｍｌの蒸留水に溶解して３％ヒアルロン酸水溶液を作製した。この水溶液をビーカーに２０ｇ計り取り、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＸ８１０TM：長瀬化成）を２３μｌ加え攪拌した。このヒアルロン酸水溶液を２４ウェルマイクロウェルプレートTM（ヌンク社製）に１ｇずつ注入し、−３０℃の冷凍庫で一晩凍結させた。
▲２▼次に乾燥機を用い、高温で乾燥した。
▲３▼上記乾燥物をプレートから取り出し、約６０℃で２４時間熱処理した。
▲４▼熱処理後、約１Ｌの蒸留水の入ったビーカーに入れ、約１時間攪拌洗浄を行った。この洗浄を５回繰り返した。
▲５▼これをプラスチックシャーレに取り出し、−３０℃の冷凍庫で急速凍結し、真空乾燥して架橋ヒアルロン酸スポンジを作製した。
【００４２】
実施例１，２及び比較例１，２の架橋ヒアルロン酸スポンジの物性を比較した。
【表１】

実施例１      実施例２      比較例１      比較例２      
吸水率          ６９          ７０          ――          ――
形態        スポンジ状    スポンジ状    非スポンジ状  非スポンジ状    
表１より、実施例１，２の架橋ヒアルロン酸スポンジは比較例１，２の架橋ヒアルロン酸スポンジに比べて、優れた吸水率を持つことが確認された。
なお、実施例１及び２の架橋ヒアルロン酸スポンジは、ピンセットでの処理や縫合にも十分耐えうるような機械的強度を有していた。
【００４３】
本発明によれば、初めにヒアルロン酸及び／又はヒアルロン酸金属塩の水溶液を凍結することによって、機械的強度、保水性に優れ、且つ製造工程が簡素化された架橋ヒアルロン酸スポンジの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る架橋ヒアルロン酸スポンジの表面構造を示した写真である。
【図２】本発明に係る架橋ヒアルロン酸スポンジの吸水性を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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