(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノアルコール誘導体の製造方法において、一般式（Ｉ）
【化１】
0004711367.tif 000005
（式中、Ｒ１及びＲ２は炭素原子数１〜４の炭化水素基である）で表されるラセミ体アミノアルコール誘導体を、不斉加水分解能力を有する、ピシア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロポリスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ゲオトリカム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ミクロスポリウム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アクチノマドラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）属、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属、アガリカス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属  、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属又はコモモナス（Ｃｏｍｍｏｍｏｎａｓ）属の群から選択される少なくとも１種の微生物菌体培養液又は該処理物に接触させ、未反応の対掌体アミノアルコール誘導体を採取することを特徴とする光学活性アミノアルコール誘導体の製造方法。
【請求項２】
アミノアルコール誘導体が１−アセトキシ−Ｎ−アセチル−４−アミノ−２−メチルブタンである、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬、農薬等の原料又は中間体として有用な光学活性アミノアルコール誘導体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性アミノアルコールの製造方法としては、光学活性２−メチル−４−アミノ酪酸を水素化リチウムアルミニウムで還元して合成する方法（J. Am. Chem. Soc., 81, 4946-4951 (1959)）、あるいは、光学活性２−メチル−４−ニトロ酪酸のメチルエステルを水素化リチウムアルミニウムで還元して合成する方法が報告されている。（J. Plant Growth Regul. 2(1), 47-57(1983)）
しかし、前者の方法は収率が低く、後者の方法では、原料として用いるニトロメタンの安全性に問題がある。さらには、付加反応の収率が低く、工業的な生産法としては成立し難い。
【０００３】
一方、ラセミ体のアミノアルコールの製造法としては、例えば、特開平８−２９１１５７号記載の方法で青酸とメタクリル酸メチルより３−シアノイソ酪酸メチルを得た後、適当な溶媒中でアルカリ金属水素化物を用いて還元すれば得られるが、本化合物の光学分割に関する報告はない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、光学活性医農薬合成中間体として有用なアミノアルコール誘導体の工業的に有利な製造方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ラセミ体アミノアルコール誘導体を光学選択的に加水分解する活性を有する微生物を見い出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、一般式（Ｉ）
【化２】
0004711367.tif 000002
（式中、Ｒ1及びＲ2は置換又は非置換の炭素原子数１〜12の炭化水素基である）で表されるラセミ体アミノアルコール誘導体を、不斉加水分解能力を有する微生物菌体培養液又は該処理物に接触させ、未反応の対掌体アミノアルコール誘導体を採取することを特徴とする光学活性アミノアルコール誘導体の製造方法、である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【化３】
0004711367.tif 000003
一般式(Ｉ) 中において、 Ｒ1及びＲ2は置換又は非置換の炭素原子数１〜12の炭化水素基である。具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、n-ヘキシル基等の炭素原子数１〜12のアルキル基；エテン基、プロペン基、イソプロペン基、ブテン基、イソブテン基、ｎ−ヘキセン基等の炭素原子数２〜12のアルケニル基；エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、等の炭素原子数２〜12のアルキニル基；シクロヘキシル基等の炭素原子数３〜12、好ましくは３〜７のシクロアルキル基；フェニル基、トリル基、ナフチル基等のアリール基；ベンジル基などのアラルキル基等が例示される。
好ましくは、炭素原子数１〜４の炭化水素基である。
また、これらの炭化水素基は、その炭素原子に結合する水素原子がハロゲン等の置換基で置換されていてもよい。
【０００７】
原料となる一般式（Ｉ）に示されるラセミ体アミノアルコール誘導体は、例えば、前記の特開平8-291157号記載の方法で４−アミノ−２−メチルブタン−１−オールを合成後、目的の酸ハライドあるいは酸無水物と公知の方法で反応させれば得られる。
【０００８】
本発明において使用する不斉加水分解酵素は、一般式（Ｉ）に示されるラセミ体アミノアルコール誘導体を不斉加水分解して光学活性アミノアルコール誘導体とその対掌体未反応物を製造する能力を有する酵素であれば酵素種及び酵素源を問わないが、その中でも酵素種としては、リパーゼ類、エステラーゼ類、プロテアーゼ類及びアミダーゼ類と称される酵素が特に有効である。また、一般式（Ｉ）に示されるラセミ体アミノアルコール誘導体を不斉加水分解し、未反応の対掌体アミノアルコール誘導体を製造する能力を有するものであれば何ら制限はなく、その１−エステルあるいは４−アミドのいずれを不斉加水分解したかは問わない。
【０００９】
不斉加水分解酵素としては、例えば、一般式（Ｉ）に示されるラセミ体アミノアルコール誘導体を不斉加水分解して未反応の対掌体アミノアルコール誘導体を製造する能力を有する微生物を使用することができる。
【００１０】
そのような微生物としては、特に制限はないが、代表的なものとしてPichia属、Rhodotorula属、Saccharopolyspora属、Streptomyces属、Actinomucor属、Aspergillus属、Bacillus属、Candida属、Cladosporium属、Fusarium属、Geotrichum属、Acinetobacter属、Gibberella属、Kluyveromyces属、Microsporum属、Brevibacillus属、Mucor属、Actinomadura属、Coprinus属、Agaricus属、Rhodococcus属、Rhizomucor属 、Rhizopus属及びCommomonas属等に属する微生物が挙げられる。
【００１１】
Pichia属に属する微生物としては例えば、Pichia abadieae (ATCC 22263)等が、Rhodotorula属に属する微生物としては例えば、 Rhodotorula mucilaginosa(ATCC 20129)等が、Saccharopolyspora属に属する微生物としては例えば、 Saccharopolyspora hirsuta(ATCC 27875)等が、 Streptomyces属に属する微生物としては例えば、 Streptomyces coelicolor(ATCC 10147)、 Streptomyces rimosus(ATCC 10970)、Streptomyces rochei(ATCC 10739)、Streptomyces albus(ATCC 3004)等が、Actinomucor属に属する微生物としては例えば、Actinomucor elegans(ATCC 6476)等が、Aspergillus属に属する微生物としては例えば、Aspergillus alliaceus(ATCC 1024)、 Aspergillus nidulans(ATCC 11267)、 Aspergillus ochraceus(ATCC 1008)、 Aspergillus foetidus(ATCC 10254)、Aspergillus niger(ATCC 9029)、 Aspergillus oryzae(ATCC 26850)等が、 Bacillus属に属する微生物としては例えば、Bacillus subtlis(ATCC 6051)、 Bacillus cereus(ATCC 11778)、 Bacillus amyloliequifaciens(ATCC 23842)等が、Candida属に属する微生物としては例えば、Candida antarctica(ATCC 28323)、Candida oregonensis(ATCC 42268)、Candida cylindracea(ATCC 14830)、 Candida tropicalis(ATCC 13803)等が、Cladosporium属に属する微生物としては例えば、Cladosporium herbarum(ATCC 28987)等が、Fusarium属に属する微生物としては例えば、 Fusarium oxysporum(IFO 7156)、Fusarium oxysporum(ATCC 7601)等が、Geotrichum属に属する微生物としては例えば、Geotrichum amycelicum(ATCC 24658)等が、Acinetobacter属に属する微生物としては例えば、Acinetobacter calcoaceticus(ATCC 14987)等が、Gibberella属に属する微生物としては例えば、Gibberella fujikuroi(ATCC 14842)等が、Kluyveromyces属に属する微生物としては例えば、 Kluyveromyces lactis(ATCC 2628)等が、Microsporum属に属する微生物としては例えば、Microsporum gypseum(ATCC 14683)等が、Brevibacillus属に属する微生物としては例えば、Brevibacillus parabrevis(ATCC 8185)等が、Mucor属に属する微生物としては例えば、Mucor rouxii(ATCC 24905)等が、Actinomadura属に属する微生物としては例えば、Actinomadura citrea(ATCC 27887)等が、Coprinus属に属する微生物としては例えば、Coprinus sp. (ATCC 16789)等が、Agaricus属に属する微生物としては例えば、Agaricus campestris(ATCC 26815)等が、 Rhodococcus属に属する微生物としては例えば、 Rhodococcus rhodochrous(ATCC 12674)等が、Rhizomucor属に属する微生物としては例えば、Rhizomucor pusillus(ATCC 56683)等が、Rhizopus属に属する微生物としては例えば、Rhizopus oryzae(ATCC 22580)、Rhizopus stolonifer(ATCC 6227b)等が、 Commomonas属に属する微生物としては例えば、Commomonas testosterone(ATCC 11996)等が例示される。
【００１２】
これらの微生物は、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）及びアメリカタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から容易に入手することができる。また、これらの微生物から単離した酵素遺伝子を通常の方法で各種宿主ベクター系に導入した遺伝子操作微生物の利用も可能である。
【００１３】
さらに、不斉加水分解反応の際、上記のような微生物を適当な培地中で培養して得られる微生物培養液又は該処理物を使用することができる。該処理物としては、微生物培養液から遠心分離などの集菌操作によって得られる培養上清、微生物菌体、アセトン又はトルエン等で処理した微生物菌体、微生物菌体の破砕物、該破砕物より得られる無細胞抽出物、固定化菌体、精製された精製酵素、固定化酵素等が例示できる。前記生体触媒の存在下で（Ｉ）に示されるラセミ体アミノアルコール誘導体を不斉加水分解することにより未反応の対掌体アミノアルコール誘導体を製造することもできる。
【００１４】
本発明においては、前記微生物、微生物菌体培養液、微生物菌体処理物等を通常１種類用い不斉加水分解反応を実施するが、同様な能力を有する２種以上のそれを混合して反応を行うことも可能である。
【００１５】
また、本発明の製造方法において、反応終了後の光学活性アミノアルコール誘導体加水分解物及びその未反応対掌体の分離、酵素の分離回収、再利用の点から、微生物菌体、精製された酵素等を適当な担体に固定化して使用することが好ましい。
【００１６】
本発明においてこれらの微生物を培養するための培地としては、通常これらの微生物が生育し得るものであれば何れのものでも使用できる。炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロースやマルトース等の糖類、酢酸、クエン酸やフマル酸等の有機酸あるいはその塩、エタノールやグリセロール等のアルコール類等を使用できる。窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキスやアミノ酸等の一般天然窒素源の他、各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、無機塩、微量金属塩、ビタミン等が必要に応じて適宜添加される。また、高い酵素活性を得るために、一般式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体、エステル結合あるいはアミド結合を持つ化合物等を酵素産生の誘導物質として培地に添加することも有効である。
【００１７】
微生物の培養は常法に従って行えばよく、例えば、ｐＨ４〜１０、温度１５〜４０℃の範囲にて好気的に６〜９６時間培養する。
【００１８】
本発明において、一般式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体の光学選択的加水分解による対掌体アミノアルコール誘導体の製造は、以下の方法で行うことができる。反応溶媒に基質である一般式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体を溶解もしくは懸濁する。また、基質を反応溶媒に添加する前に又は添加した後に触媒となる上記不斉加水分解する能力を有する微生物菌体培養液又は該処理物を添加する。そして、反応温度、必要により反応液のpHを制御しながら、般式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体の半量程度が加水分解されるまで反応を行う。場合によっては反応の初期段階で反応を中断したり、あるいは過剰に反応させてもよい。
【００１９】
反応液の基質濃度は、0.1〜80質量％の間で特に制限はないが、生産性等を考慮すると１〜50質量％の濃度で実施するのが好ましい。
【００２０】
反応液の酵素濃度は、通常、0.01〜10質量％であり、好ましくは 0.05〜５重量％である。
【００２１】
反応液のpHは用いる酵素の至適pHに依存するが、一般的にはpH４〜11の範囲である。化学的加水分解反応による光学純度の低下及び収率の低下を抑えることができるという点でpH５〜９で行うのが好ましい。また、エステル結合部分が不斉加水分解される場合は反応が進行するに従いpHが低下してくるが、この場合は適当な中和剤、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム水溶液等を添加して最適pHに調整することが望ましい。アミド結合分が不斉加水分解される場合にも反応が進行するに従いpHの変化が予想されるが、この場合にも同様に適当な中和剤で最適pHに調整することが望ましい。
【００２２】
反応温度は５〜70℃が好ましく、10〜50℃がより好ましい。
【００２３】
反応溶媒は、通常イオン交換水、緩衝液等の水性媒体を使用するが、有機溶媒を含んだ系でも反応を行うことができる。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、t-ブチルアルコール、t-アミルアルコール等のアルコール系溶媒、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル系溶媒、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒、その他アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド等を適宜使用できる。
【００２４】
また、これらの有機溶媒を水への溶解度以上に加えて２層系で反応を行うことも可能である。有機溶媒を反応系に共存させることで、選択率、変換率、収率などが向上することも多い。反応時間は、通常、１時間〜１週間、好ましくは１〜72時間であり、そのような時間で反応が終了する反応条件を選択することが好ましい。
【００２５】
尚、以上のような基質濃度、酵素濃度、pH、温度、溶媒、反応時間及びその他の反応条件はその条件における反応収率、光学収率等を考慮して目的とする光学活性化合物が最も多く採取できる条件を適宜選択することが望ましい。
【００２６】
上記の反応により、般式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体が不斉加水分解されて、光学活性アミノアルコール誘導体加水分解物及び未反応の対掌体アミノアルコール誘導体が生成する。
生成した光学活性アミノアルコール誘導体加水分解物及び未反応の対掌体アミノアルコール誘導体の反応混合液からの単離は抽出、蒸留、カラム分離など公知の単離法で行うことができる。
【００２７】
生成した光学活性アミノアルコール誘導体加水分解物が４−アミド部分が不斉加水分解されたのもの場合、例えば、ｐＨを中性付近に調整後、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；酢酸エチル等のエステル類；ヘキサン、オクタン、ベンゼン、トルエン等の炭化水素類；塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素等一般的な溶媒により未反応対掌体を抽出分離することができる。
【００２８】
一方、生成した光学活性アミノアルコール誘導体加水分解物が１−エステル部分が不斉加水分解されたのもの場合についても例えば、同様に一般的な低極性有機溶剤で抽出分離することができる。
【００２９】
さらに、光学活性アミノアルコール誘導体加水分解物及び未反応対掌体は、光学活性を維持したまま１−エステル部分及び／又は４−アミド部分を通常の方法で加水分解することができる。また、光学活性アミノアルコール誘導体加水分解物は光学活性を維持したまま通常の方法でエステル化／アミド化することができる。従って、目的に応じて任意の立体配置を取得することができる。
【００３０】
さらに、前記方法でアミド化及びエステル化されたアミノアルコール誘導体は、同酵素の基質として反応を複数回繰り返すことができ、より光学純度の高い目的化合物を得ることも可能である。また、同様に光学選択性の異なる（逆の）酵素を任意に組み合わせて反応を繰り返すことで光学純度が高い目的化合物を得ることも可能である。
【００３１】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定されるものではない。
【００３２】
〔実施例１〜３９〕
グルコース20g、ペプトン5g、酵母エキス 5g、NaCl 5g、K2HPO4 5g、蒸留水１Ｌ（pH7.0）からなる組成の液体培地を調製し、この液体培地を250ml エレンマイヤーフラスコに30mlづつ分注し、120 ℃で15分間蒸気滅菌した後、酢酸ブチルを6μL加え、表１に示す微生物を植菌し、28℃で振盪培養した。次に各フラスコ内の培養液から遠心分離により菌体を回収後、50mMリン酸緩衝液（pH＝7.0) で３回洗浄した（10℃以下）。菌体を50mMリン酸緩衝液（pH＝7.0) 10ml に懸濁した。この菌体懸濁液に 表１に示す量のラセミ体 １-アセトキシ-Ｎ-アセチル-４-アミノ-２-メチルブタンを添加して、28℃にて24時間振盪しながら反応した。
【００３３】
反応液に、15mlの酢酸エチルを加えて攪拌した。酢酸エチル層に含まれる光学活性 １-アセトキシ-Ｎ-アセチル-４-アミノ-２-メチルブタンを光学分割カラム〔キラルセルＯＤカラム（0.46cmID×25cm）；ダイセル株式会社製〕を付けた液体クロマトグラフィーにて、n-ヘキサン：2-プロパノール＝95:5で溶出させ、分析した。
培養時間、基質添加量及び反応液分析結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
0004711367.tif 000004
【００３５】
【発明の効果】
本発明によれば、医薬、農薬等の原料又は合成中間体として有用な光学活性アミノアルコール誘導体類を効率よく工業的に製造することができる。