(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡサンプルの分析方法において、
ａ) ＲＮＡサンプルから相補性ＤＮＡサンプル（ｃＤＮＡサンプル）の第一鎖を調製するため、第一の蛍光染料で標識された第一のプライマーを使用し、
ｂ) このｃＤＮＡサンプルの第二の鎖を調製するため、第二の蛍光染料で標識された第二のプライマーを使用し、
ｃ) 第一の蛍光染料で標識された第一のプライマーおよび第二の蛍光染料で標識された第二のプライマーをｃＤＮＡサンプルの増幅のために使用し、ついで
ｄ) 増幅された標識ｃＤＮＡサンプルの組成を、スキャナーを用いて分析することからなる方法であって
ここで、第一のプライマーは、配列５′−（Ｔ）xＭＮ−３′（式中、Ｘは１０〜２０であり、ＭはヌクレオチドのＡ、ＣまたはＧであり、ＮはヌクレオチドのＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）を有するオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーは、配列（Ｎ）x（式中、Ｘは１０〜２０であり、ＮはヌクレオチドのＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）を有するオリゴヌクレオチドである、
上記方法。
【請求項２】
ＲＮＡサンプルの分析方法において、
ａ) ＲＮＡサンプルから相補性ＤＮＡサンプル（ｃＤＮＡサンプル）の第一鎖を調製するため、第一のプライマーを使用し、
ｂ) このｃＤＮＡサンプルの第二の鎖を調製するため、第二のプライマーを使用し、
ｃ) 第一の蛍光染料で標識された第一のプライマーおよび第二の蛍光染料で標識された第二のプライマーをｃＤＮＡサンプルの増幅のために使用し、ついで
ｄ) 増幅された標識ｃＤＮＡサンプルの組成を、スキャナーを用いて分析することからなる方法であって
ここで、第一のプライマーは、配列５′−（Ｔ）xＭＮ−３′（式中、Ｘは１０〜２０であり、ＭはヌクレオチドのＡ、ＣまたはＧであり、ＮはヌクレオチドのＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）を有するオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーは、配列（Ｎ）x（式中、Ｘは１０〜２０であり、ＮはヌクレオチドのＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）を有するオリゴヌクレオチドである、
上記方法。
【請求項３】
第一および第二の染料は異なる蛍光物質である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
蛍光物質は、蛍光物質Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＡＭ、６−ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ＨＥＸ、５−ＩＡＦ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＸＲＩＴＣ、ＲＯＸ、Alexa 488、Alexa 532、Ａlexa 546、Alexa 594、テキサスレッドおよびリサミンから選択される請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
第一のＲＮＡサンプルとは別に１種または２種以上の付加的なＲＮＡサンプルを同様に分析的に比較する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ディファレンシャル遺伝子発現を分析するための請求項１〜５のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項７】
医薬的に活性な化合物の同定および／または特性解明のための請求項１〜５のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項８】
標的遺伝子の同定のための請求項１〜５のいずれかに記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、２つの別異に標識されたプライマーを使用するｍＲＮＡサンプルの組成の分析およびディファレンシャル遺伝子発現の分析のための新規な方法ならびにその方法の使用に関する。
【０００２】
【背景技術】
ディファレンシャルＲＮＡディスプレー（ＤＤ）は調節された遺伝子の検出および単離のために最も頻繁に使用される方法の一つである（Liang P. & Pardee A.B., 1992, Science 257: 967-971; Liang & Pardee, 1995, Current Opinion in Immunology 7: 274-280; McClellandら, 1995, Trends in Genetics 11: 242-246）。ＤＤＲＴ（ディファレンシャルディスプレー＋逆転写：ＤＤＲＴ）法は第一工程において、第一の逆プライマーを用いる単離ＲＮＡの逆転写（逆転写：ＲＴ）を包含し、これにより相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の第一鎖を調製し、ついでこのＤＮＡを第二工程において、第一および第二のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、増幅されたｃＤＮＡサンプルの組成をたとえば増幅ｃＤＮＡのゲル中での分画化によって分析する。検出は、たとえば標識プローブとのハイブリダイジングもしくは増幅ｃＤＮＡの標識により行うことができるが、放射性標識ヌクレオチド（通常は放射性標識ｄＡＴＰ）の存在下または、たとえば蛍光物質によって標識された標識プライマーの存在下（「蛍光ＤＤＲＴ」）における増幅によって実施することもできる（Itoら, 1994, FEBS Letters 351:231-236; Ito & Sasaki, Methods in Molecular Biology Vol. 85:Differential Display Methods and Protocols, 1997, p37-44, Liang & Pardeeeds, Human Press Inc. Totowa, NJ; Jonesら, 1997, Biotechniques 22: 536- 543; Smithら,1997, Biotechniques 23: 274-279）。
【０００３】
反応を放射性標識ヌクレオチドの存在下に実施する場合、増幅されたｃＤＮＡのすべてが標識されることになる（放射性ＤＤＲＴ；古典的ＤＤＲＴ）。他方、標識プライマーを使用すれば（たとえば蛍光ＤＤＲＴ）、ＰＣＲ時に第一の標識プライマーと第二の非標識プライマーの可能なプライマーの組み合わせの結果として、増幅されたｃＤＮＡの一部のみが標識され、一方他の部分は標識されないまま残る。
【０００４】
第一の標識プライマー［この場合、プライマー１はさらに２個のヌクレオチド（Ｍ＝Ａ，Ｃ，Ｇ；Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ）をその３′末端に有するオリゴ（ｄＴ）プライマーである（５′−(Ｔ)12−ＭＮ−３′は(Ｔ)12−ＭＮと表記）］はＲＴのために用いられる。以後のＰＣＲにおいては、第二の非標識プライマー［この場合、プライマー２は１０個のランダムな順序のヌクレオチドの配列を有するオリゴヌクレオチド（「１０マー」）である］が、第一のプライマーに加えて用いられる。しかしながら、第一のプライマーは慣用的に２倍過剰に使用される。この方法では一般に、３′末端が第一プライマーの配列を示し、５′末端が第二プライマーの配列を示す増幅されたｃＤＮＡ［たとえば、５′−１０マー---------(Ｔ)12−ＭＮ−３′（式中、---------はプライマー配列間に位置する増幅ｃＤＮＡ配列を表す］が比較的高割合で得られる。これに加えて、１）に比較してプライマーの配列が入れ替わったｃＤＮＡが増幅される（その ５′および３′末端にはそれぞれ (Ｔ)12−ＭＮプライマーおよび１０マープライマーが見いだされる。２参照）。(Ｔ)12−ＭＮプライマーのみを用いて（３参照）または１０マープライマーのみを用いて（４参照）他のｃＤＮＡも増幅される。結局、２つの異なるプライマーを用いた場合、可能なプライマーの組み合わせの結果として、ＤＤＲＴでは以下の反応生成物の増幅が可能である。すなわち、
１) ５′−１０マー---------(Ｔ)12−ＭＮ−３′
２) ５′−(Ｔ)12−ＭＮ---------１０マー−３′
３) ５′−(Ｔ)12−ＭＮ---------(Ｔ)12−ＭＮ−３′
４) ５′−１０マー---------１０マー−３′
【０００５】
この蛍光ＤＤＲＴでは、第一のプライマーのみが標識されているという事実により、標識された第一のプライマーを用いて少なくとも一方向に増幅されたそれらのｃＤＮＡ、すなわち１）、２）および３）に特定されたｃＤＮＡのみが増幅されたｃＤＮＡの以後の分析において検出されるが、第二のプライマーのみを用いて増幅されたｃＤＮＡは標識されていないし検出もされない（４参照）。したがって、検出されるＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ）は放射性ＤＤＲＴの場合より複雑ではない。この理由により、第二のプライマーのみを用いて増幅される慣用の蛍光ＤＤＲＴではそれらの調節されている遺伝子またはそれらに相当するｍＲＮＡは検出されない。したがって、慣用の蛍光ＤＤＲＴによって検出される調節されている遺伝子の数は放射性ＤＤＲＴで検出される数より少なくなる。
【０００６】
さらに、単一のｍＲＮＡを用いた場合、ＰＣＲでは慣用の放射性ＤＤＲＴでもまた慣用の蛍光ＤＤＲＴでも、１）〜４）に示すように、均一なｃＤＮＡ産物は増幅されず、代わりに、長さの異なる数種のｃＤＮＡ（これは、たとえばゲル中での分画化によって明らかである）が、異なるプライマーの組み合わせの結果として増幅される。別異に増幅されたｃＤＮＡが１つの同じ調節される遺伝子のｃＤＮＡ産物であるか否は詳細な分析（たとえば、配列決定分析）によってのみ示される。慣用のＤＤＲＴは、重複して標識された増幅ｃＤＮＡ間の識別の可能性を提供するものではない。放射性ＤＤＲＴでは１）〜４）の間を識別することは不可能である。慣用の蛍光ＤＤＲＴでは１）、２）および３）の間の識別は不可能であるが、３′プライマーは蛍光染料で標識されているので可視的なｃＤＮＡフラグメントが遺伝子の ３′領域から誘導されるより大きい確率がある。
【０００７】
したがって、一方では、重複性は確立できないか、または比較的大量の努力によってのみ確立できる慣用の放射性ＤＤＲＴで増幅されたｃＤＮＡフラグメントの重複性、および他方では、慣用の放射性ＤＤＲＴに比べて慣用の蛍光ＤＤＲＴにおいて増幅されたｃＤＮＡの低い複雑性は、特定の調節された遺伝子の看過の危険を伴い、それぞれ慣用の放射性ＤＤＲＴおよび慣用の蛍光ＤＤＲＴ法の主要な問題になっている。
【０００８】
本出願の基礎となる本発明は、ＲＮＡサンプルの分析とくに別個に調節される遺伝子の分析に使用することができる方法であり、上述の欠点のない方法を提供する。
【０００９】
【発明の開示】
本発明は、ＲＮＡサンプル好ましくはｍＲＮＡサンプルの分析方法において、
ａ) ＲＮＡサンプル、好ましくはｍＲＮＡサンプルから相補性ＤＮＡサンプル（ｃＤＮＡサンプル）の第一鎖を調製するため、適宜、第一の染料で標識された第一のプライマーを使用し、
ｂ) このｃＤＮＡサンプルの第二鎖を調製するために、好ましくは第二の染料で標識された第二のプライマーを使用し、
ｃ) 第一の染料で標識された第一のプライマーおよび第二の染料で標識された第二のプライマーをｃＤＮＡサンプルの増幅のために使用し、ついで
ｄ) 増幅された標識ｃＤＮＡサンプルの組成を分析することからなる方法に関する。
【００１０】
ＲＮＡサンプルは分析すべきｍＲＮＡを含有する。本発明の好ましい実施態様においては、この方法にｍＲＮＡが用いられる。ＲＮＡは、たとえば、ＣｓＣｌ2密度勾配遠心分離またはカラムクロマトグラフィーのような既知の方法によって単離することができる。ＲＮＡは細胞もしくは細胞集団または組織から単離するのが好ましい。必要によっては、ｍＲＮＡは、たとえばオリゴ（ｄＴ）カラムを通すクロマトグラフィーによってＲＮＡから濃縮することができる。
【００１１】
本方法では、第一のプライマーおよび第二のプライマーが採用される。第一のプライマーは逆転写に用いられるプライマーである。第一のプライマーはそれがｍＲＮＡとハイブリダイズし、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の第一鎖の ３′末端を定義するので ３′プライマーと呼ぶこともできる。第二のプライマーはｃＤＮＡの第二鎖を合成するために用いられる。第二のプライマーは、それがｃＤＮＡの第一鎖とハイブリダイズし、ｃＤＮＡの第二鎖の ５′末端を定義するので５′プライマーとも呼ばれる。
【００１２】
適宜、第一のプライマーおよび第二のプライマーは染料で標識される。第一のプライマーは逆転写（処理工程ａ）および以後のｃＤＮＡの増幅（処理工程ｃ）に使用される。ＲＴに用いられる第一のプライマーは染料で標識されてもされていなくてもよい。後者はたとえば、使用した逆転写酵素が標識プライマーを受け入れない場合である。ｃＤＮＡの増幅に用いられるときは、いずれ場合も第一のプライマーは標識される。ＲＴに用いられる第一のプライマーおよび増幅に用いられる第一のプライマーは同一の配列を有することが好ましい。
【００１３】
ｃＤＮＡの第二鎖の合成（処理工程ｂ）およびｃＤＮＡの増幅（処理工程ｃ）の両者に用いられる第二のプライマーは第二鎖の合成時および増幅時ともに標識されていることが好ましい。第二のプライマーはいずれの場合も同じ配列を有することが好ましい。ｃＤＮＡの第二鎖の合成および増幅は、第二のプライマーが同一であるように、一反応の要素であることが好ましい。
【００１４】
本発明の好ましい実施態様では、第一および第二のプライマーは、デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、デオキシイノシン（ｄＩ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、（デオキシ）チミジン（ｄＴ）およびデオキシシチジン（ｄＣ）から構成されるオリゴデオキシヌクレオチドである。
【００１５】
第一および／または第二のプライマーは、１（もしくは２以上）の特定の核酸（単数または複数）の配列（単数または複数）に相補性の塩基配列（アデニン、グアニン、シトシンおよびチミジンからなる配列；以下「配列」という）を有することができる。特定の配列に相補性のプライマーは、この相補性配列またはこの相補性配列から誘導される配列（この相補性配列とある程度のホモロジーを示す）を含有する核酸とハイブリダイズすることができる。たとえば、第一のプライマーは好ましくはｍＲＮＡとハイブリダイズできる。ｃＤＮＡの第一鎖はプライマー伸長によって作られる。プライマーはまた、特定の核酸の配列に同一であるかまたは本質的に同一な配列を有することもできる。それでこのプライマーは特定の核酸の配列に相補性の配列を有する核酸にハイブリダイズすることができる（特定の反応条件下に）。たとえば第二のプライマーの配列は、ｍＲＮＡの配列から誘導され、すなわち、第二のプライマーの配列はｍＲＮＡの配列と同一であるかまたは本質的に同一であることができる。第二のプライマーはしたがって、ｍＲＮＡの配列たとえばｃＤＮＡの第一鎖に相補性である配列を有する核酸と（特定の反応条件下に）ハイブリダイズすることができる。
【００１６】
第一のプライマーおよび第二のプライマーが核酸とハイブリダイズする反応条件は好ましくは温度および／または緩衝条件によって特定される。温度条件は、好ましくはプライマーが相補性核酸配列と特異的にハイブリダイズし、すなわち「正しい」塩基ペアリング（Ａ−Ｔ；Ｇ−Ｃ）が優先的に起こり、正しくない塩基ペアリングは可能な限りない、すなわち可能であれば、「至適」なハイブリダイゼーション温度（アニーリング温度）が選ばれるように選択される（たとえば、Sambrookら, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press）。これに加えて、特異的な塩濃度、とくにＭg2+濃度が選択される。
【００１７】
第一および／または第二のプライマーの配列（単数または複数）からその配列が誘導される核酸［すなわち、この配列（単数または複数）が核酸配列に相補性または同一もしくは本質的に同一である］は、ＤＮＡたとえばｃＤＮＡ、遺伝子もしくはその部分、またはＲＮＡ好ましくはｍＲＮＡとすることができる。
【００１８】
第二のプライマーはランダムな塩基配列をもつことが可能で、これには完全にランダムな配列を有するプライマーと部分的にランダムな（たとえば１または２以上の塩基に関してランダム）配列を有するプライマーの両者が含まれる。配列はランダムであるが、それらは同時に個々の塩基の間で特定の比を表すことができる。たとえばすべての塩基が同じ比で存在するか、または１もしくは２以上の塩基が過剰にもしくは過小に存在する。とくにヒポキサンチンも使用できる。
【００１９】
第二のプライマーは１または２以上の特定の塩基配列を有することもできる。この特定の配列（単数または複数）はランダムに選択され、すなわち、それらは既知の配列に由来しない。この性質のプライマーは以前に同定されたことのない新しい遺伝子またはタンパク質の同定に使用することができる。
【００２０】
第二のプライマーは、既知配列、すなわち全体または部分が既知の配列に相当する配列に由来する塩基配列を有することができる（すなわち、それはこれらの配列と相補性または同一もしくは本質的に同一である）。たとえば、プライマーは特定のコンセンサス配列と多かれ少なかれある程度の同一性を示すか、またはこの配列に相当する配列を有することができる。このアプローチは、たとえば、特定の遺伝子ファミリー／タンパク質ファミリーの既知および／または未知メンバーのディファレンシャル発現の同定に使用することができる。
【００２１】
第二のプライマーは特定のアミノ酸配列（たとえば、アミノ酸レベルにおけるコンセンサス配列）に由来する塩基配列を有することができる。この場合、プライマーには縮重、すなわち特定のアミノ酸配列に関する遺伝子コドンの縮重が許され、したがってプライマーは異なる配列を有するプライマー分子の混合物から構成され、相当するアミノ酸配列をコードするすべてのコード利用可能性が許される（縮重プライマー）。
【００２２】
第二のプライマーの配列は好ましくは制限エンドヌクレアーゼの制限切断部位を有する。
【００２３】
第二のプライマーは、ハイブリダイゼーションが可能な限り特異的であることを保証するために、８〜２０ヌクレオチドの長さであることが好ましい。しかしながら、長さは特定のプライマー配列および／または反応条件に応じて選択されるのが好ましい。第一および第二のプライマーの長さおよび配列は、互いに独立に選択される。
【００２４】
第一および／または第二のプライマー（単数または複数）はまた、ハイブリダイゼーションを要求しない配列（単数または複数）および／またはハイブリダイゼーションに寄与しない配列（単数または複数）を含有することもできる。この性質の他の配列は、たとえば増幅ｃＤＮＡの更なる特性解析または使用を容易にすることができる。これらの他の配列は好ましくはプライマーの５′末端に存在する。たとえばプライマーは、以後の配列決定を容易にする配列、たとえばＭ13配列および／または標識プローブの調製を容易にする配列（たとえば、ノーザンブロットもしくはサザンブロットハイブリダイジングおよび／またはインシトゥハイブリダイジング）、たとえばＴ７プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列もしくはＳＰ６プロモーター配列を含有してもよい。
【００２５】
最初の処理工程においては、ｍＲＮＡが逆転写され、これによってｃＤＮＡの第一鎖が調製される（処理工程ａ）。染料で標識される第一のプライマーは適宜ＲＴのために使用される。第一のプライマーは、好ましくはオリゴ（ｄＴ）配列（「(Ｔ)X」、「Ｘ」はチミジン残基の数を指示する）を有し、これがそれぞれのｍＲＮＡのポリ（Ａ）鎖とハイブリダイズし、この方法でポリメラーゼ反応のための遊離 ３′−ＯＨを提供することができる。オリゴ（ｄＴ）配列は、好ましくは１０〜２０個のチミジン残基（Ｘ＝１０〜２０）からなる配列であり、１２チミジン残基（Ｘ＝１２）または１５チミジン残基（Ｘ＝１５）からなる配列がとくに好ましい。
【００２６】
とくに好ましい実施態様においては、第一のプライマーの配列は、オリゴ（ｄＴ）配列の３′末端に、オリゴ（ｄＴ）配列に属さないさらに少なくとも１個のヌクレオチド、しかしながら好ましくは２個のヌクレオチドを有する。すなわちオリゴ（ｄＴ）配列の３′末端に結合する最初のヌクレオチドはチミジンとは異なることを意味する。第一のプライマーは、オリゴ（ｄＴ）配列に属さないヌクレオチドの配列において異なるプライマー分子の混合物から構成されることが好ましい。たとえば、第一のプライマーは、配列５′−(Ｔ)XＭＮ−３′［式中「Ｍ」はＡ（塩基アデニン）、Ｃ（塩基シトシン）もしくはＧ（塩基グアニン）であり、「Ｎ」はＡ、Ｃ、ＧもしくはＴ（塩基チミジン）である］を有することができる。たとえば、Ｘ＝１２または１５とすることができる：
配列番号１：５′−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＭＮ−３′（５′−(Ｔ)12ＭＮ−３′）、
配列番号２：５′−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＭＮ−３′（５′−(Ｔ)15ＭＮ−３′）
(式中「Ｍ」はＡ、ＣまたはＧであり、「Ｎ」はＡ、Ｃ、ＧまたはＴである)。
【００２７】
第一のプライマーは、オリゴ（ｄＴ）配列に属さない配列において互いに異なる異種プライマーの混合物から構成されるのが好ましい。
５′−(Ｔ)XＭＮ−３′は、配列：
５′−(Ｔ)XＡＮ−３′
５′−(Ｔ)XＣＮ−３′
５′−(Ｔ)XＧＮ−３′
（式中、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を有するプライマー分子の混合物とすることが可能であり、
５′−(Ｔ)XＭＮ−３′は、配列：
５′−(Ｔ)XＭＡ−３′
５′−(Ｔ)XＭＣ−３′
５′−(Ｔ)XＭＧ−３′
５′−(Ｔ)XＭＴ−３′
（式中、Ｍ＝Ａ、Ｃ、Ｇ）を有するプライマー分子の混合物でることが好ましい。この場合、可能な塩基Ａ，ＣおよびＧは混合物中に均一に存在し、たとえば、５′−(Ｔ)XＭＮ−３′は以下の配列：すなわち５′−(Ｔ)XＡＧ、５′−(Ｔ)XＣＧ、５′−(Ｔ)XＧＧまたは５′−(Ｔ)XＡＴ、５′−(Ｔ)XＣＴ、５′−(Ｔ)XＧＴ等有をするプライマー分子の混合物である。この方法で、未知の配列の異なるｍＲＮＡを増幅するためのプライマーを提供することができる。同時に、このアレンジメントは、プライマーが相補性配列の３′末端に（ｍＲＮＡのポリ(Ａ)鎖に）優先的に、ハイブリダイズすることが保証される。
【００２８】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、たとえば逆転写酵素または逆転写酵素活性を有する他のＤＮＡ依存性ポリメラーゼ、たとえばついで以後のｃＤＮＡの増幅（処理工程ｃ）にも使用できる適当な温度安定性ポリメラーゼが、ＲＴにおける使用に好ましい。本発明の特定の実施態様においては、ｃＤＮＡの第二鎖の合成がｃＤＮＡの増幅のための処理工程の要素であり、ｃＤＮＡの増幅のための処理工程はＰＣＲ反応であることが好ましい。
【００２９】
逆転写は、たとえば、３７℃〜５０℃、好ましくは４０℃〜４５℃、とくに好ましくは４２℃で実施することができる。第一のプライマーが特異的に（できるだけ正しくないペアリングが少なく）ハイブリダイズすることが可能なハイブリダイゼーション温度を用いることが好ましく、これはポリメラーゼの活性が十分高いことを保証し、可能な限り完全な転写体を得ることを可能にする。
【００３０】
ｃＤＮＡの第二鎖は、好ましくは標識された第二のプライマーを用いて合成される。第二のプライマーは、好ましくは少なくとも６ヌクレオチドの長さであり（６マー）、とくに好ましくは１０（１０マー）〜２０（２０マー）ヌクレオチド長を有する。本発明の特定の実施態様においては、第二のプライマーは長さ１３ヌクレオチド（１３マー）である。たとえば、第二のプライマーの配列は「(Ｎ)X」（式中、「Ｘ」は６〜２０であり、「Ｎ」は互いに独立に、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴである）とすることができる。
【００３１】
第一および第二のプライマーは好ましくは合成オリゴヌクレオチドであり、たとえば市販品を入手できるかまたは既知の方法（たとえば、Caruthersら, 1983,Tetrahedron Letters 24: 245 に記載されたホスホロアミダイト法）を用いて固相上で合成することができる。プライマーは好ましくは、ヌクレオチドデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシイノシン、デオキシシチジンおよびデオキシチミジンから構成される。
【００３２】
とくに好ましい方法の実施態様においては、ｃＤＮＡの第二鎖の合成はすでにＰＣＲ反応の要素であり、この鎖はＰＣＲが行われる反応条件下に合成される。
【００３３】
第一および第二のプライマーは好ましくは別異に標識をされる。原理的に任意のタイプの標識が使用可能であり、たとえばプライマーはこのプライマーを用いて増幅されたｃＤＮＡ分子をたとえば適当な抗体もしくは酵素で検出できるようなジゴキシゲニンまたはビオチンにカップリングできるか、あるいはプライマーは、基質の添加後それを変換できる化学的化合物たとえば Atto−Phos システム(JBLScientific, San Luis Obispo, CA, USA）もしくはＥＣＦ基質（Amersham−Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany）にカップリングすることができる。
【００３４】
しかしながら、第一および／または第二のプライマーの蛍光物質による標識はとくに優先性が与えられる。優先性は、第一のプライマーは第一の蛍光で、第二のプライマーは第二の蛍光で標識することにより与えられる。第一および第二の蛍光は好ましくは、使用した２つの蛍光が明瞭に識別できるように選択される。これに関して、結果の明瞭性すなわち個々のｃＤＮＡの標識パターンの間の検出可能な差は使用した蛍光および分析方法の感度の両者に依存する。一般に、結果の評価にはコンピューター支援分析方法が用いられる。たとえば蛍光は第一および第二の蛍光の検出可能な励起波長および／または発光波長が２００nmまたはそれ以上たとえば２５０nm、３００nm、３５０nmまたは４００nm異なるようにする。
【００３５】
第一および／または第二のプライマーがカップリングできる蛍光物質の例としてはＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＡＭ、６−ＦＡＭ［６−カルボキシフルオレセイン(青)］、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、フルオレセイン、ＨＥＸ［４,７,２′,４′,５′,７′−ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン(緑)］、５−ＩＡＦ、ＴＡＭＲＡ［６−カルボキシテトラメチレンローダミン(黄)］、ＴＥＴ（４,７,２′,７′−テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン）、ＸＲＩＴＣ（ローダミン−Ｘ−イソチオシアネート）、ＲＯＸ［６−カルボキシローダミン(赤)］、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 594、テキサスレッドおよびリサミンがある。
【００３６】
たとえば以下の組み合わせが可能である。すなわち、Ｃｙ５標識プライマー１およびAlexa 488 標識プライマー２；Ｃｙ５標識プライマー１およびＦＩＴＣ標識プライマー２；Ｃｙ５標識プライマー１およびＦＡＭ標識プライマー２；Ｃｙ５標識プライマー１およびＣｙ２標識プライマー２；Ｃｙ５標識プライマー１およびＣｙ３標識プライマー２；フルオレセイン標識プライマー１およびテキサスレッド標識プライマー２；フルオレセイン標識プライマー１およびリサミン標識プライマー２；フルオレセイン標識プライマー１およびＲＯＸ標識プライマー２；フルオレセイン−Ｃy３ 標識プライマー1；Alexa 594 標識プライマー１および Alexa 488 標識プライマー２；Alexa 568 標識プライマー１およびAlexa 488 標識プライマー２；Alexa 546 標識プライマー１およびAlexa 488 標識プライマー２；Alexa 532 標識プライマー１およびAlexa 448 標識プライマー２；テキサスレッド標識プライマー１およびAlexa 488 標識プライマー２；ＲＯＸ標識プライマー１および Alexa 488 標識プライマー２；Alexa 488 標識プライマー１およびリサミン標識プライマー２；Alexa 488 標識プライマー１およびＣｙ３標識プライマー２；Alexa 488 標識プライマー１およびＲＯＸ標識プライマー２である。標識に用いられる蛍光物質が、上述の例に比べてプライマー１およびプライマー２で入れ替えられた相当するプライマーの組み合わせも当然可能である。
【００３７】
蛍光物質は好ましくはプライマー（オリゴヌクレオチド）の５′末端にカップリングされる。オリゴ（ｄＴ）プライマーの場合には、チミジンとは異なるヌクレオチド、たとえばグアノシンがさらに蛍光物質の前の５′末端に存在してもよい。さらに蛍光物質は塩基によってオリゴヌクレオチドにカップリングすることもできる。蛍光物質は適宜、適当なリンカーによって第一および／または第二のプライマーにカップリングさせることもできる。
【００３８】
第一および／または第二のプライマーとして使用できる標識されたプライマーの例には、５′−ＣＹ５−Ｇ(Ｔ)15ＭＮ−３′、５′−ＣＹ２−Ｇ(Ｔ)15ＭＮ−３′、５′−ＣＹ３−Ｇ(Ｔ)15ＭＮ−３′、５′−ＦＡＭ−Ｇ(Ｔ)15ＭＮ−３′、５′−６−ＦＡＭ−Ｇ(Ｔ)15ＭＮ−３′、５′−ＦＩＴＣ−Ｇ(Ｔ)15ＭＮ−３′、５′−フルオレセイン−Ｇ(Ｔ)15ＭＮ−３′、５′−ＨＥＸ−Ｇ(Ｔ)15ＭＮ−３′、５′−５−ＩＡＦ−Ｇ(Ｔ)15ＭＮ−３′、５′−ＴＡＭＲＡ−Ｇ(Ｔ)15ＭＮ−３′、５′−ＴＥＴ−Ｇ(Ｔ)15ＭＮ−３′、５′−ＸＲＩＴＣ−Ｇ(Ｔ)15ＭＮ−３′、５′−ＲＯＸ−Ｇ(Ｔ)15ＭＮ−３′、５′−Alexa 488−Ｇ(Ｔ)15ＭＮ−３′、５′−Alexa 532−Ｇ(Ｔ)15ＭＮ−３′、５′−Alexa 546−Ｇ(Ｔ)15ＭＮ−３′、５′−Alexa594−Ｇ(Ｔ)15ＭＮ−３′、５′−テキサスレッド−Ｇ(Ｔ)15ＭＮ−３′、５′−リサミン−Ｇ(Ｔ)15ＭＮ−３′（上記プライマーは、好ましくは、第一のプライマーとして使用される）、５′−ＣＹ５−(Ｎ)13−３′、５′−ＣＹ２−(Ｎ)13−３′、５′−ＣＹ３−(Ｎ)13−３′、５′−ＦＡＭ−(Ｎ)13−３′、５′−６−ＦＡＭ−(Ｎ)13−３′、５′−ＦＩＴＣ−(Ｎ)13−３′、５′−フルオレセイン−(Ｎ)13−３′、５′−ＨＥＸ−(Ｎ)13−３′、５′−５−ＩＡＦ−(Ｎ)13−３′、５′−ＴＡＭＲＡ−(Ｎ)13−３′、５′−ＴＥＴ−(Ｎ)13−３′、５′−ＸＲＩＴＣ−(Ｎ)13−３′、５′−ＲＯＸ−(Ｎ)13−３′、５′−Ａlexa 488−(Ｎ)13−３′、５′−Ａlexa532−(Ｎ)13−３′、５′−Ａlexa546−(Ｎ)13−３′、５′−Ａlexa 594−(Ｎ)13−３′、５′−テキサスレッド−(Ｎ)13−３′および ５′−リサミン−(Ｎ)13−３′（これらのプライマーは、好ましくは第二のプライマーとして用いられる）がある（式中、「Ｍ」はＡ、ＣまたはＧであり、「Ｎ」はＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）。
【００３９】
第一および／または第二のプライマーが蛍光物質で標識される場合、励起波長は、励起後、観察される発光が予定される波長に確立できるために十分に離れることを保証する注意が必要である。良好な組み合わせの例は、たとえば第一のプライマーの（たとえばＴＸ−ＭＮプライマー）Ｃy５ 標識（励起波長６５０nm）と第二のプライマーの蛍光に基づく標識（励起波長４９０nm）である。２つの別異に標識をされたプライマーの使用はたとえばゲル中で検出される増幅プライマーのプライマー組成について明瞭な結論を引き出すことを可能にする。
【００４０】
たとえば６５０nmにおける発光のみが観察できる場合、ｃＤＮＡはついでＣｙ５−標識プライマーを用いて増幅され、このｃＤＮＡは少なくとも一端に第一のプライマー（たとえば(Ｔ)X−ＭＮプライマー）を有する。発光が励起波長４９０nmに観察される場合、ｃＤＮＡの少なくとも一端に第二のプライマーが提供される。特定の増幅されたｃＤＮＡ（ゲル中）が１つの励起波長でのみ発光される場合、ｃＤＮＡはついで、１つのプライマー、相当する励起発光で発光する蛍光物質を有するプライマーを用いて増幅された。特定の増幅されたｃＤＮＡ（ゲル中）が２つの励起波長で発光する場合には、このｃＤＮＡはついで第一および／または第二のプライマーを用いて増幅された。
【００４１】
増幅（好ましくはＰＣＲ）は、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施され、特定の優先性はこのＤＮＡポリメラーゼが温度安定性ＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＴａｑポリメラーゼ、ＶＥＮＴポリメラーゼ、ＡmpliＴaq ポリメラーゼまたはとくにＡmpliＴaq Ｇold ポリメラーゼによって与えられる。ＰＣＲは好ましくは、ｃＤＮＡの指数的な増幅を可能にする温度プロファイルを用いて実施される。たとえば、実施例１に引用した温度サイクルはこの目的に使用できる。３０〜４０またはそれ以上のサイクルが好ましい結果を与える。
【００４２】
その後に、標識され増幅されたｃＤＮＡを分析する。たとえば、増幅ｃＤＮＡをゲル中で分画化すると、それらの長さの異なる増幅ｃＤＮＡは異なるバンドに存在する。これらのバンドは、与えられた波長（各場合に用いられた蛍光物質に依存する）において発光するスキャナーおよび／または化学ルミネセンス基質の化学的変換に伴って発光する光を検出できるスキャナーでさらに分析することができる。発光された蛍光はついで、たとえば適当なコンピュータープログラムを用いて評価し、ゲル像を（たとえばオートラジオグラフィーから分かるように）アッセンブルすることができる。使用できるスキャナーの例には、Fluorlmager 575，FluorImager SI, FluorImager（Molecular Dynamics, Krefeld, Germany），Strom（Molecular Dinamics），FLA-2000（Fuji, Tokyo, Japan），FMBioII（Hitachi, Biozym Diagnostic GmbH, Hess, Oldendorf, Germany を通じ），Fluor-S-MultiImager および Molecular Imager FX（BioRad, Munich, Germany）スキャナーがある。
【００４３】
この方法は、とくに、細胞から単離されたｍＲＮＡ（「ＲＮＡサンプル」ともいう）を使用する。一般に、この性質のサンプルは不均一ｍＲＮＡサンプル（すなわち、それはＲＮＡが単離された時点でこの細胞中に存在した遺伝子である）である。一般に、この不均一ｍＲＮＡサンプルは、特定の時点に特定の条件下で特定の細胞によって発現された遺伝子であり、すなわちｍＲＮＡサンプルの組成は、たとえば細胞タイプ、その分化段階、細胞周期および／または細胞の以前の処理等に依存する。
【００４４】
本発明の１つの特定の実施態様は、不均一なｍＲＮＡサンプルの分析において、
ａ) 不均一なｍＲＮＡサンプルからの相補性な不均一ＤＮＡサンプル（不均一なｃＤＮＡサンプル）の第一鎖を調製するため、第一の染料により適宜標識された第一のプライマーを使用し、
ｂ) この不均一なｃＤＮＡサンプルの第二の鎖を調製するために、好ましくは第二の染料で標識された第二のプライマーを使用し、
ｃ) 第一の染料で標識された第一のプライマー（「標識第一プライマー」）および第二の染料で標識された第二のプライマー（「標識第二プライマー」）を不均一なｃＤＮＡサンプルの増幅のために使用し、ついで
ｄ) 不均一な、増幅された標識ｃＤＮＡサンプルの組成を分析することからなる方法に関する。
【００４５】
とくに興味がある特定の細胞により特定の時点で発現される遺伝子は、別異に発現または調節される遺伝子である。この場合とくに興味がもたれるのは別異に発現または調節される遺伝子の分析的な比較である。本発明の特定の一実施態様は２またはそれ以上の不均一なｍＲＮＡサンプルを分析的に比較するための相当する類縁方法に関する。
【００４６】
本発明の特定の一実施態様は、第一の不均一なｍＲＮＡサンプルを１種または２種以上の付加的な不均一ｍＲＮＡサンプルと分析的に比較する方法において、
ａ) これらのｍＲＮＡサンプルから相補性の不均一ＤＮＡサンプル（不均一なｃＤＮＡサンプル）の第一鎖を調製するために、２またはそれ以上の不均一なｍＲＮＡサンプルのそれぞれについて、第一の染料で適宜標識された第一のプライマーを使用し、
ｂ) これらのサンプルそれぞれについて、各場合、不均一なｃＤＮＡサンプルの第二の鎖を調製するために、好ましくは第二の染料で標識された第二のプライマーを使用し、
ｃ) 第一の標識されたプライマーおよび第二の標識されたプライマーをそれぞれの不均一なｃＤＮＡサンプルの増幅のために使用し、ついで
ｄ) 不均一な、増幅された標識ｃＤＮＡサンプルの組成を分析し、サンプルの組成を比較することからなる方法に関する。
【００４７】
本発明の他の特定な実施態様は、
ａ) この場合、これらのｍＲＮＡサンプルから相補性の不均一ＤＮＡサンプル（不均一なｃＤＮＡサンプル）の第一鎖を調製するために、２またはそれ以上の不均一なｍＲＮＡサンプルのそれぞれについて第一の染料で適宜標識された第一のプライマーを使用し、
ｂ) これらのサンプルそれぞれについて、各場合、不均一なｃＤＮＡサンプルの第二の鎖を調製するために、好ましくは第二の染料で標識された第二のプライマーを使用し、
ｃ) 第一の標識されたプライマーおよび第二の標識されたプライマーをそれぞれの不均一なｃＤＮＡサンプルの増幅のために使用し、ついで
ｄ) サンプルのどれが個々のｍＲＮＡ分子を含有するか否かを決定するために分析を行うことからなる方法に関する。
【００４８】
ｃＤＮＡを増幅しｃＤＮＡの組成が適宜分析されたのち、増幅されたｃＤＮＡのどれがどのプライマー組成をもつか、すなわち、どのｃＤＮＡが第一のプライマーのみを用いて増幅され、どれが第二のプライマーのみを用いて増幅され、どれが第一および第二のプライマーを用いて増幅されたかを決定するために検討を行う（別異に増幅されたｃＤＮＡに群１）＋２）、３）および４）への合併）。本発明はまた、特定の増幅されたｃＤＮＡを増幅されたｃＤＮＡのプライマーの組成に基づいて選択し、適宜更なる分析および／または使用に付す追跡方法に関する。これに加えて、本発明は、増幅されたｃＤＮＡの全体のプライマー組成の分布を群１）〜４）について分析する追跡方法に関する。
【００４９】
追跡方法の例は、ＲＮＡサンプル好ましくはｍＲＮＡサンプルを分析する方法において、
ａ) ＲＮＡサンプル好ましくはｍＲＮＡから相補性ＤＮＡサンプル（ｃＤＮＡサンプル）の第一鎖を調製するために、第一の染料で適宜標識された第一のプライマーを使用し、
ｂ) このｃＤＮＡサンプルの第二の鎖を調製するために、好ましくは第二の染料で標識された第二のプライマーを使用し、
ｃ) 第一の染料で標識された第一のプライマーおよび第二の染料で標識された第二のプライマーをｃＤＮＡサンプルの増幅のために使用し、ついで
ｄ) 増幅された標識ｃＤＮＡサンプルの組成を分析し、
ｅ) 増幅されたｃＤＮＡのプライマー組成を決定することからなる方法である。
【００５０】
また、ＲＮＡサンプル好ましくはｍＲＮＡサンプルを分析する方法において、
ａ) ＲＮＡサンプル好ましくはｍＲＮＡから相補性ＤＮＡサンプル（ｃＤＮＡサンプル）の第一鎖を調製するために、第一の染料で適宜標識された第一のプライマーを使用し、
ｂ) このｃＤＮＡサンプルの第二の鎖を調製するために、好ましくは第二の染料で標識された第二のプライマーを使用し、
ｃ) 第一の染料で標識された第一のプライマーおよび第二の染料で標識された第二のプライマーをｃＤＮＡサンプルの増幅のために使用し、ついで
ｄ) 増幅された標識ｃＤＮＡサンプルの組成を分析し、
ｅ) 増幅されたｃＤＮＡのプライマー組成を決定し、ついで
ｆ) 特定のプライマー組成を有するｃＤＮＡ、好ましくは第一および第二のプライマーの両者を含有するｃＤＮＡを選択し、それらを更なる分析に付すことからなる方法がある。
【００５１】
比較分析または方法に用いられるＲＮＡまたはｍＲＮＡサンプルは、その発現パターンを互いに比較すべき異なる細胞から単離することができる。これに関連して、ｍＲＮＡサンプルは、たとえば、互いにそれらの分化段階および／または生育段階または細胞周期の段階が異なる細胞または細胞種、または異なる履歴を有する（たとえば、ｐＨ、温度または組成のような異なる培養条件）、または薬理学的に活性な化合物、疾患促進／疾患阻害または疾患誘発物質（たとえば発癌性または突然変異誘発物質）で処置された、またはそれに（たとえばＵＶ光線）暴露された細胞または細胞種に由来するｍＲＮＡである。このようなＲＮＡまたはｍＲＮＡサンプルは、これらの物質に暴露されていないまたはこの程度までには暴露されていないＲＮＡまたはｍＲＮＡサンプルと比較できる。ＲＮＡまたはｍＲＮＡサンプルは特定の組織から単離することができる。たとえば健康な組織を病的な組織と、若い組織を老齢な組織と、処置組織を非処置組織と、誘導組織を非誘導組織と分析的に比較することができる。また異なる発育および／または細胞周期および／または分化段階からの組織を分析的に比較することができる。組織の語は組織、臓器、細胞種、培養誘導細胞、細胞系の細胞または個体の細胞を意味する。
【００５２】
この方法はディファレンシャル遺伝子発現（組織または細胞中の）の分析に使用することができる。とくに、この方法は、ディファレンシャル遺伝子発現（２またはそれ以上の組織または細胞において）を分析的に比較するために使用することができる。
【００５３】
この方法は、薬理学的に活性な化合物の同定および／または特性の解明に使用することができる。さらにこの方法は、標的遺伝子または標的タンパク質の同定および／または特性の解明に使用することができる。これらの標的遺伝子または標的タンパク質はとくに、疾患の予防、起源および／または進行および／または治癒における機能（可能な限り特異的な）、分化過程たとえば細胞分化（適宜、誘導前または後）および／または疾患の分化過程、細胞周期または細胞周期制御および／または細胞分化たとえば細胞老化過程に機能を有する遺伝子またはタンパク質である。
【００５４】
この方法は、放射性標識ヌクレオチドまたは放射性標識プライマーの使用が蛍光標識プライマーの使用で置換されるので、慣用の放射性ＤＤＲＴに比べて有利であると思われる。本明細書に記載された新規な方法（ＤＤＲＴ変法）は、既知のＤＤＲＴに反して、それぞれの増幅ｃＤＮＡは好ましくは異なる励起スペクトルを有する蛍光物質で別異に標識された２個のプライマーを用いて標識される。この方法により、適当な評価方法を用いて、それぞれの増幅された標識ｃＤＮＡを検出することができる。すなわち、増幅されたｃＤＮＡの複雑性は維持され、検出可能である［産物１）、２）、３）および４）は検出可能であり、ゲル中のバンドの複雑性は維持される］。これに加えて、増幅された標識ｃＤＮＡのプライマー組成について明瞭な結論を引き出すことができる［すなわち、ｃＤＮＡを１）、２）、３）および４）に帰属させることができる］。これは、たとえば、実際に遺伝子配列の ３′領域に由来する増幅されたｃＤＮＡを選択すべきそれらのプライマー組成により、更なる分析に付すｃＤＮＡの選択を可能にする。別異に標識された２個のプライマーの使用に基づくこの方法を用いると、したがって、重複ｃＤＮＡの単離および分析に包含されると考えられる時間および経費を低下させることができる。しかしながら、慣用の放射性ＤＤＲＴと同様、慣用の蛍光ＤＤＲＴでは得られない特徴である、増幅されたすべてのｃＤＮＡを同時に検出し分析することができる。
【００５５】
本発明はまた、この方法の実施に必要な試験キットに関する。
【００５６】
【実施例】
用いられる酵素は Gibco BRL/Life Technologies（Karlsruhe, Germany）（逆転写酵素およびＴaq ポリメラーゼ）ならびに Promega（Heidelberg）（ＲＮＡシン）から入手した。
サーモサイクラー：Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400（Perkin Elmer, Weiterstadt）。
【００５７】
実施例１：逆転写
反応混合物：１μｌのＲＮＡ（１００ng〜１μｇの総ＲＮＡまたは１ng〜１０ngのポリＡ−ＲＮＡ／ｍＲＮＡ）、１μｌのプライマー１（１０μＭプライマー１、たとえば(Ｔ)X−ＭＡ−３′またはＣｙ５−(Ｔ)X−ＭＡ−３′、式中、Ｍ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｘ＝１１〜１５）、および８μｌのＨ2Ｏ（ヌクレアーゼを含まない）。反応混合物は ７０℃で５分間インキュベートしたのち、氷上に置いた。
【００５８】
５×ＲＴ緩衝液（Gibco BRL）４μｌ、２μｌのＤＴＴ（０.１Ｍ）、１μｌのSuperScript 逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）（Gibco BRL）、１μｌのＲＮＡシン（４０Ｕ／μｌ）および２μｌのｄＮＴＰ（２５０μＭ）をついで加えた。
逆転写は３７〜５０℃で６０分間実施され、ついで７０℃で（１０分間）酵素を不活性化する。
【００５９】
実施例２：ＰＣＲ
１０×ＰＣＲ緩衝液（Gibco BRL）２μｌ、０.９μｌのＷ−１洗浄剤（１％）（GibcoBRL）、０.７５μｌのＭｇＣｌ2（５０mM）（Gibco BRL）、１.６μｌのｄＮＴＰ（２５０μＭ）、０.５μｌのＴaq ポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）（Gibco BRL）、各１μｌのプライマー１およびプライマー２［１０μM；たとえば、プライマー１としてＣｙ５−Ｔ７−(Ｔ)X−ＭＡ−３′（Ｔ７はＴ７プロモーターからの配列セグメントである）、およびフルオレセイン−(Ｎ)X（Ｘは１０〜２５，Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔである）］および１０.２６μｌのＨ2Ｏを２μｌの実施例１からのＲＴ混合物に加えた。
【００６０】
ＰＣＲは以下の条件で実施した。
９４℃で５分
４０×：９４℃で１分、  ４０℃〜６０℃で２分、  ７２℃で１分
７２℃で７分
ＰＣＲの完結後、反応混合物を４℃に保存し、ついで配列決定ゲル（５％ポリアクリルアミドゲル；８Ｍ尿素）上で分画化する。
【００６１】
標識された増幅ｃＤＮＡは、たとえば波長４３０±３０nm（フルオレセイン：励起波長４９０nm、発光波長５２０nm）および６３５±５nm（Ｃｙ５：励起波長６５０nm、発光波長６７５nm）において励起するスキャナーを使用して検出することができる。Molecular Dynamics Storm Imager はこのタイプのスキャナーの例である。
【配列表】
0004728480.tif 000002
0004728480.tif 000003