(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドトキシンの除去、分離、単離、精製、特徴付け、同定または定量のための一般式（Ｉ）：
【化１】
0004712978.tif 000030
〔上式中、一方のＸがＮであり、そして他方のＸがＮ，ＣＣｌまたはＣＣＮであり；
Ａ1およびＡ2は各々独立にＯ，ＳまたはＮ−Ｒ1であり、そしてＲ1はＨ，Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6ヒドロキシアルキル、ベンジルまたはβ−フェニルエチルであり；
Ｂ1およびＢ2は各々独立に炭素原子数１〜10の置換されることがある炭化水素結合であり；
Ｄ1はＨであるかまたは第一アミノ、第二アミノ、第三アミノ、第四級アンモニウム、イミダゾール、グアニジノもしくはアミジノ基であり；そして
Ｄ2は第二アミノ、第三アミノ、第四級アンモニウム、イミダゾール、グアニジノまたはアミジノ基であり；あるいは
Ｂ2-Ｄ2 が−ＣＨＣＯＯＨ−(ＣＨ2)3-4−ＮＨ2であり；
ｐは０または１であり；そして
Ｚが固体母材と反応することができる官能基である〕
で表されるリガンドまたはアフィニティーリガンド結合体およびＺ基によりリガンドに結合した母材の生体外における使用。
【請求項２】
前記エンドトキシンがグラム陰性菌に由来する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
水もしくは水溶液、体液、血液、血漿、薬品、タンパク質または他の生物起源の化合物の溶液からのエンドトキシンの除去のための、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
ドナーまたは別の受容者への再輸液前に、全血または血漿からエンドトキシンを体外除去するために前記結合体を使用することを含んでなる、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
エンドトキシン含有溶液または液体が1.0〜13.0のｐＨにおいて前記結合体に適用される、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
Ｚが
−Ｔ−〔Ｌ−Ｖ〕m−        (II）
（上式中、ＴはＯ，ＳまたはＮＲ2であり、そしてＲ2はＨまたはＣ1-6アルキルであり；
ＶはＯ，Ｓ，−ＣＯＯ−，ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ，−ＰＯ3Ｈ−，ＮＨ−アリーレン−ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−またはＮ−Ｒ3であり、そしてＲ3はＨまたはＣ1-6アルキルであり；
Ｌは炭素原子数２〜20の置換されることがある炭化水素結合であり；そして
ｍは０または１である）
である、請求項１〜５のいずれかに記載の結合体の使用。
【請求項７】
Ｒ2およびＲ3が各々Ｈである、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
ＴがＯまたはＮＨである、請求項６または７に記載の使用。
【請求項９】
ＴがＮＨである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ｍが１でありそしてＬが二価のブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルまたはドデシル基である、請求項６〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
ｍが１でありそしてＶがＯ，−ＣＯＮＨ−，−ＮＨＣＯ−またはＮ−Ｒ3である、請求項６〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
ＶがＯまたはＮＨである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
ＶがＮＨである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
Ｚ−Ｍ（Ｍは母材である）が−ＮＨ−（ＣＨ2）4-10−ＮＨ−Ｍである、請求項１２または１３に記載の使用。
【請求項１５】
ＺがＦ，Ｃｌ，ＢｒまたはＩである、請求項１〜３のいずれかに記載のリガンドの使用。
【請求項１６】
Ｚが−ＮＨ−（ＣＨ2）2-20−ＮＨ2である、請求項１〜３のいずれかに記載のリガンドの使用。
【請求項１７】
Ｚが−ＮＨ−（ＣＨ2）2-20−（ＣＯ）0-1−ＯＨである、請求項１〜３のいずれかに記載のリガンドの使用。
【請求項１８】
Ｚが
−Ｔ−〔Ｌ−Ｖ〕m−Ｒ10−ＣＲ11＝ＣＨ2
（上式中、Ｔ，Ｌ，Ｖおよびｍは請求項６〜１３のいずれかに定義した通りであり；Ｒ10はＣＯ，ＣＨ2，ＮＨ−ＣＨ2−または−Ｓ−ＣＨ2−であり；そしてＲ11はＨまたはＣ1-6アルキルである）
である、請求項１〜３のいずれかに記載のリガンドの使用。
【請求項１９】
ＺがＣｌでありそして各ＸがＮである、請求項１５に記載の使用。
【請求項２０】
各ＸがＮである、請求項１５に記載の使用。
【請求項２１】
各ＸがＮである、請求項１〜１４いずれかに記載の結合体の使用。
【請求項２２】
Ａ1およびＡ2が各々独立にＮ−Ｒ1であり、ここでＲ1は請求項１に定義した通りである、請求項１〜２１のいずれかに記載の使用。
【請求項２３】
Ａ1およびＡ2が各々ＮＨである、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
Ｂ1およびＢ2が各々独立に−ＣＨＣＯＯＨ−(ＣＨ2）1-4−であるか、または二価のエチル、プロピル、２−ヒドロキシプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、フェニル、ナフチルもしくはシクロヘキシル基である、請求項１〜２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
Ｂ1およびＢ2が各々独立に−ＣＨＣＯＯＨ−(ＣＨ2）3-4−であるか、または二価のブチル、ペンチルもしくはフェニル基である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
Ｄ1がＨ、アミノ、イミダゾリル、グアニジノ、アミニジノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルアミノまたはエチルアミノである、請求項１〜２５のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
Ｄ2がイミダゾリル、グアニジノ、アミニジノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルアミノまたはエチルアミノである、請求項１〜２６のいずれかに記載の使用。
【請求項２８】
ｐが１である、請求項１〜２７のいずれかに記載の使用。
【請求項２９】
Ｂ1およびＢ2が各々独立に−ＣＨＣＯＯＨ−(ＣＨ2）3-4−である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
ｐが１である、請求項１に定義した通りである結合体。
【請求項３１】
Ｂ1およびＢ2が各々独立に−ＣＨＣＯＯＨ−(ＣＨ2）3-4−である、請求項３０に記載の結合体。
【請求項３２】
ｐが１である、請求項１に定義した通りであるリガンド。
【請求項３３】
Ｂ1およびＢ2が各々独立に−ＣＨＣＯＯＨ−(ＣＨ2）3-4−である、請求項３２に記載のリガンド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規アフィニティーリガンド、それらの調製および母材への結合に関する。前記母材は固体状、半固体状、粒状もしくはコロイド状物質または可溶性ポリマーから成ることができる。本発明はさらに、それらの新規アフィニティーリガンド−母材結合体、それらの調製、並びに水もしくは水溶液、体液、血液、血漿、薬品、タンパク質または他の生物起源の化合物の溶液といった様々な液体からのエンドトキシンの結合と除去のためのそれらの結合体の使用にも関する。
【０００２】
発明の背景
エンドトキシン（内毒素）はグラム陰性菌、特に腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、ナイセリア科（Neisseriaceae）およびクラミジア科（Chlamydiaceae）の病原菌の最も外側の膜に見つかるリポ多糖である。エンドトキシンはその生物起源に応じて可変的な構造を有する多糖にリピドＡが結合したものを含む。腸内細菌科エンドトキシンの多糖成分はＯ特異的鎖領域とコア領域により特徴付けられる。Ｏ特異的領域は、８種類ほどの糖残基を含む50以下のオリゴ糖反復単位を含んでなる。Ｏ特異的鎖は種によって大きな構造多様性を示すが、一方で外側コア領域と内側コア領域に分けられるコア領域は多様性が小さい。内側コア領域は、しはしばリン酸またはリン酸誘導体により置換されているヘプトースや２−ケト−３−デオキシオクトン酸（ＫＤＯ）といった珍しい糖残基の存在により特徴付けられる。内側コア領域に同じく付着しているリピドＡは、保存されたビホスホリル化グルコサミン二糖であり、これは４つの飽和第一級アシル基によりアシル化されており、そのうちの２つが第二級飽和アシル基を担持している。疎水性のリピドＡテールと親水性でアニオン性の多糖単位との組合せにより、両親媒性の性質を有するエンドトキシンが提供される。
【０００３】
グラム陰性菌の細胞壁より遊離されたエンドトキシンは、グラム陰性敗血症を伴う多くの病理生理学的現象の主原因であると考えられている。血中pg/ml濃度のエンドトキシンが、インターロイキンやＴＮＦをはじめとする様々なサイトカインの放出を触発する。エンドトキシンによる免疫系の過剰刺激は、サイトカインの大量放出を引き起こし、ひいては代謝の損傷および敗血症ショックを引き起こす。敗血症ショックの間、補体および凝固カスケードが活性化状態になり、血管浸透性が増大する。これは、散在した血管内凝固や多臓器不全を引き起こし、しばしば致命的続発症を伴うことがある。敗血症ショックは、しばしば血液由来エンドトキシンのレベルを危険（臨界）レベルに到達させる感染初期応答の欠如のために起こる。
【０００４】
非経口用医薬品中の生存グラム陰性菌または細胞壁破片の存在により与えられる明らかな危険性に加えて、医薬製剤中の遊離型エンドトキシンの存在も大きな懸念である。エンドトキシンは上述したように有力な免疫刺激剤であるため、非常に低濃度でも発熱作用などの毒性反応を引き起こし得る。エンドトキシンは比較的安定な分子であり、通常の加熱殺菌処理や有機溶剤処理により不活性化されない。濃水酸化ナトリウムへの暴露または長時間の高温（250℃）処理はエンドトキシンを不活性化させるだろうが、そのような方法は大部分の生物学的製品には不適当である。更に、バイオ治療薬の製造において終止完全無菌状態を維持することは問題がある。結果、非経口用医薬品からのエンドトキシンの効率的捕集と除去が非常に望ましく、特にエンドトキシンが治療用製剤の成分と結び付くことが知られている場合には非常に望ましい。
【０００５】
水溶液からエンドトキシンを除去するのに様々な技術が用いられている。そのような技術としては、限外濾過、活性炭吸着、カチオン交換クロマトグラフィー、ポリミキシンＢやエンドトキシン結合タンパク質をはじめとする様々な固定化アフィニティーリガンドの使用が挙げられる。特に治療用タンパク質のような高分子量化合物からのエンドトキシンの除去の場合、これらの技術はすべて有意な欠点を示す。限外濾過は低分子量化合物からエンドトキシンを除去するためにしか使用できず、一方で活性炭吸着は大部分の有機化合物の結合を促進する傾向がある。カチオン交換クロマトグラフィーは水からのエンドトキシンの除去には効果的であるが、タンパク質含有溶液、特に酸性の等電点を有するタンパク質にはあまり効果がない。環状ポリペプチド系抗生物質であるポリミキシンＢは医薬品の精製にそれを使用するには毒性が大きすぎ、一方エンドトキシン結合タンパク質は商業用途にするには高価すぎる。
【０００６】
固定化されたカチオン性アミノ酸（ヒスチジン、リジンおよびアルギニン）もエンドトキシン除去に使用されている（Tosa, T.他、Molecular Interactions in Bioseparations, Ngo, T.T.編，Plenum Press, New York, pp. 323-332, 1993; Lawden, K.H.他、Bacterial Endotoxins: Lipopolysaccharides from Genes to Therapy, Wiley-Liss Inc., pp. 443-452, 1995）。そのような材料は、エポキシ活性化クロマトグラフィー用母材へのアミノ酸の直接結合により調製されている。田辺製薬（日本、大阪）製のPyrosep（商標）の場合、単一のヒスチジン基がヘキサンジアミンスペーサーアームにより支持母材に固定化されている。そのような材料は水または低分子量化合物の溶液からのエンドトキシンの除去に適するけれども、それらの性能は塩（＞50 mM）またはエンドトキシンに対して親和性を有するタンパク質の存在下では劣化する。従って、現存するエンドトキシン除去方法のうち、非経口投与用のバイオ治療用化合物からのエンドトキシンの除去に適しているものは１つもない。これは、単独効果的で且つ安全なエンドトキシン除去方法が１つもないタンパク質治療薬について特に言えることである。
【０００７】
血液または血漿からのエンドトキシンの除去は、敗血症ショックを伴う危険性が大きい状況（例えば大腸または肝臓手術）において、感染の初期段階にまたは予防的に適用すれば、敗血症ショックのマネージメントへの効果的アプローチを提供することができる。ショック反応の初期段階に放出されるサイトカインまたはエンドトキシンに対して向けられたモノクローナル抗体の使用に関して幾つかの研究が報告されている。しかしながら、それらのアプローチの大部分は効果がないことがわかった（Siegen, J.P., Drug Information Journal, 30, pp. 567-572, 1996）。対照的に、繊維に固定したポリミキシンＢの使用により、全血からのエンドトキシンの体外抽出が行われている（Aoki, H.他、日本外科学会雑誌、94, pp. 775-780, 1993）が、ポリミキシンＢの潜在的毒性に関する懸念は残っている。従って、エンドトキシンに対する親和性が高く且つ毒性が小さいエンドトキシン結合リガンドを含んでなるアフィニティ吸着材は敗血症のマネージメントに有益であろう。
【０００８】
固定化アミノ酸も有力なエンドトキシン除去剤として研究されているが、そのような材料はエンドトキシンを弱く且つ非特異的に結合するので、生物学的液体および生物学的化合物の溶液からのエンドトキシンの抽出には限定された有用性しかもたない。タンパク質に選択的に結合するトリアジン系化合物が報告されているが、そのようなリガンドはエンドトキシンの単離には適用できない。
【０００９】
発明の要約
本発明は、エンドトキシンに選択的に結合する合成アフィニティーリガンド構造の発見に関する。エンドトキシンに対して高い親和性を示し且つ様々な起源由来のエンドトキシンの単離に一般的に適用できる、包括的な新規アフィニティーリガンド群が発見された。
【００１０】
本発明の特徴は、生物学的材料からのエンドトキシン汚染物質の除去のための一般的手段を提供することである。エンドトキシンは、本発明のアフィニティーリガンド−母材結合体に非常に強固に結合する。この特徴により、水および水溶液からのエンドトキシンの高効率的抽出が可能になり、発熱物質不含有の水または発熱物質不含有の溶液を調製する手段を提供する。本発明のアフィニティーリガンド−母材結合体は、特に医療用もしくは薬用用途のタンパク質、薬物または他の生物学的化合物に結合するかまたはそれと会合するエンドトキシンを除去するために特に有用である。ある種の生物学的化合物、特にタンパク質は、しばしばエンドトキシンと強固に結合するので、現存の手法では、その後の除去が不可能でないにしても非常に困難である。本発明のアフィニティーリガンド−母材結合体は血液または血漿からのエンドトキシンの除去に適用することができ、それ故にエンドトキシンの試験管内または生体内除去のための特に有用な手段を提供する。後者は、例えば、体外エンドトキシン抽出装置を使って達成される。そのような装置は、細菌感染の間に血流中に放出されるエンドトキシンの除去に特に有効であり、そのような感染はしばしば敗血症や髄膜炎といった生命を脅かす病気を引き起こす。血液由来のエンドトキシンを除去することは、それらの病気の治療においておよび敗血症ショックの予防とマネージメントにおいて特に有益である。
【００１１】
本発明により提供される新規アフィニティーリガンド−母材結合体は、別のエンドトキシン結合材料の代わりに使用することができ、そしてそれらの使用に一層融通性があり、より一層強固であり、製造が安価であり、しばしばより大きなエンドトキシン結合効率を有する。
【００１２】
本発明は、一般式（Ｉ）：
【化２】
0004712978.tif 000002
〔上式中、記号Ｘの一方が窒素原子であり、そして他方の記号Ｘが窒素原子であるかまたは塩素原子もしくはシアノ基を担持している炭素原子であり；
Ａ1およびＡ2は各々独立に酸素原子、硫黄原子またはＮ−Ｒ1基であり；
Ｒ1は水素原子、炭素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数１〜６のヒドロキシアルキル基、ベンジル基またはβ−フェニルエチル基であり；
Ｂ1およびＢ2は各々独立に、炭素原子数１〜10の置換されることがある炭化水素結合（どの置換基も有用性に関して実質上重要ではない）であり、その例としてアルキル、フェニル、ナフチルおよびシクロヘキシル基が挙げられ；
Ｄ1は水素原子、第一アミノ基、第二アミノ基、第三アミノ基、第四級アンモニウム基、イミダゾール基、グアニジノ基またはアミジノ基であり；そして
Ｄ2は第一アミノ基（例えばリジンまたはオルニチンから誘導されるような）、第二アミノ基、第三アミノ基、第四級アンモニウム基、イミダゾール基、グアニジノ基またはアミジノ基であり；そして
ｐは０または１である〕
を有するリガンドを含んでなる、アフィニティーリガンド−母材結合体に関する。
【００１３】
このリガンドは、場合によりリガンドと母材の間に挿入されたスペーサーアームを介して、位置Ｚで支持母材に結合している。あるいは、本発明の新規リガンド中、Ｚは固体母材と反応することができるタイプの官能基を表し、ここで前記母材は活性化（必要もしくは所望により）または不活性化されていてもよい。
【００１４】
発明の説明
母材に結合されるとき、任意のスペーサーアームは好ましくは下記一般式（II）により表される：
−Ｔ−〔Ｌ−Ｖ〕m−              (II）
【００１５】
（上式中、Ｔは酸素原子、硫黄原子または基Ｎ−Ｒ2を表し；Ｒ2は水素原子または炭素原子数１〜６のアルキル基を表し；
Ｖは酸素原子、硫黄原子、−ＣＯＯ−基、ＣＯＮＨ基、ＮＨＣＯ基、−ＰＯ3Ｈ基、ＮＨ−アリーレン−ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−基またはＮ−Ｒ3基を表し、ここでＲ3は水素原子または炭素原子数１〜６のアルキル基を表し；
Ｌは炭素原子数２〜20の置換されることがある炭化水素結合であり；そして
ｍは０または１である）。
【００１６】
支持母材は、アフィニティーリガンドと共にアフィニティーリガンド−母材結合体の形成に使用することができ且つ接触溶液中の溶質からアフィニティーリガンドを分離する便利な手段を提供する、粒状もしくは非粒状、可溶性もしくは不溶性、多孔質もしくは非孔質の任意の化合物または材料であることができる。
【００１７】
本発明は新規アフィニティーリガンド−母材結合体を提供し、このアフィニティーリガンド−母材結合体は、水、水溶液、体液、血液、血漿、薬品、タンパク質および生物起源の他の化合物の溶液からのエンドトキシンの単離または除去に利用することができる。
【００１８】
好ましい態様では、本発明は、下記一般式（III）により表される新規アフィニティーリガンド−母材結合体を提供する：
【化３】
0004712978.tif 000003
（上式中、Ａ1，Ａ2，Ｂ1，Ｂ2，Ｄ1，Ｄ2，ｐ，Ｘ，Ｔ，Ｌ，Ｖ，ｍ，Ｒ1，Ｒ2およびＲ3は上記に特定した意味を有し；そしてＭは、アフィニティーリガンドと共にアフィニティーリガンド−母材結合体の形成に使用することができ且つ接触溶液中の溶質からアフィニティーリガンドを分離する便利な手段を提供する、粒状もしくは非粒状、可溶性もしくは不溶性、多孔質もしくは非孔質の任意の化合物または材料であることができる支持母材の残基を表す）。
【００１９】
本発明は特に、−Ｔ−〔Ｌ−Ｖ〕0-1−Ｍ置換基もしくはその前駆体、およびヘテロ原子を介して環に連結される他の置換基を担持しているピリミジン、ジアジンまたはトリアジン類である化合物の使用に関すると期待される。そのような置換基は、炭素原子数２〜20の障害のない基（non-interfering group）を含んでもよい。
【００２０】
本明細書中、エンドトキシンという用語は、複数のまたは一般的意味で用いられる場合は常に、任意の微生物源に由来するエンドトキシンを意味するものである。よって、エンドトキシンなる用語は、腸内細菌科、ナイセリア科およびクラミジア科をはじめとする任意の種からのリポ多糖も意味する。エンドトキシンは不均一であることが知られているので、本明細書中で使用する「エンドトキシン」という語は、多糖に共有結合で連結したリピドＡを含んでなるあらゆる天然に存在する形態を包含し、その類似体、誘導体、断片および前駆体を包含する。
【００２１】
本明細書中で単独でまたは組み合わせて用いられる「第一アミノ基」という語は−ＮＨ2基を意味する。
本明細書中で単独でまたは組み合わせて用いられる「第ニアミノ基」という語は−ＮＨＲ4基を意味し、ここでＲ4は炭素原子数１〜６の直鎖または分岐鎖アルキル基を表す。
【００２２】
本明細書中で単独でまたは組み合わせて用いられる「第三アミノ基」という語は−ＮＲ5Ｒ6基を意味し、ここでＲ5とＲ6は各々炭素原子数１〜６の直鎖または分岐鎖アルキル基を表す。
本明細書中で単独でまたは組み合わせて用いられる「第四級アンモニウム基」という語は−ＮＲ7Ｒ8Ｒ9 +基を指し、ここでＲ7，Ｒ8およびＲ9は各々炭素原子数１〜６の直鎖または分岐鎖アルキル基を表す。
【００２３】
本明細書中で単独でまたは組み合わせて用いられる「炭素原子数１〜６のアルキル基」という語は、１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖状の飽和炭化水素鎖を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、４−メチルペンチル、ネオペンチルおよび２，２−ジメチルプロピルを意味する。
【００２４】
本明細書中で単独でまたは組み合わせて用いられる「炭素原子数１〜６のヒドロキシアルキル基」という語は、１個もしくは複数個のヒドロキシ基、好ましくは１個のヒドロキシ基で置換された、１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖状の飽和炭化水素鎖を意味し、例えば、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、４−ヒドロキシブチル、５−ヒドロキシペンチルおよび６−ヒドロキシヘキシルを意味する。
【００２５】
本明細書中で単独でまたは組み合わせて用いられる「炭素原子数１〜６のアルコキシ基」という語は、エーテル酸素からの自由原子価結合を有するエーテル酸素を介して連結した１〜６個の炭素原子を有するアルキル基を含む直鎖または分岐鎖状の炭素原子数１〜６の一価置換基を意味し、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシおよびペントキシを意味する。
【００２６】
「ハロゲン」という語はフッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。
【００２７】
本明細書中で用いられる「炭素原子数１〜６のアシルオキシまたはアシルアミノ」という語は、カルボニルオキシまたはオキシカルボニル基を介して連結した１〜５個の炭素原子を含むアルキル基を含んでなる一価置換基を指し、例えば、メチルカルボニルオキシ、エチルカルボニルオキシ、メチルオキシカルボニルまたはエチルオキシカルボニル基を指し、あるいはカルボニルアミノまたはアミノカルボニル基を介して連結したもの、例えば、メチルカルボニルアミノ、エチルカルボニルアミノ、メチルアミノカルボニルまたはエチルアミノカルボニル基を指す。
【００２８】
本明細書中で用いられる「炭素原子数１〜６のアルキルスルホニル」という語は、スルホニル基を介して連結した炭素原子数１〜６のアルキル基を含んでなる一価置換基を指し、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、ｎ−プロピルスルホニル、イソプロピルスルホニル、ｎ−ブチルスルホニル、sec−ブチルスルホニル、イソブチルスルホニル、tert−ブチルスルホニル、ｎ−ペンチルスルホニル、２−メチルブチルスルホニル、３−メチルブチルスルホニル、ｎ−ヘキシルスルホニル、４−メチルペンチルスルホニル、ネオペンチルスルホニルおよび２，２−ジメチルプロピルスルホニルを意味する。
【００２９】
「〜より独立に選ばれる１または複数の置換基」という語は、より好ましくは１〜３個の置換基を指すだろう。この用語は更に好ましくは１〜２個の置換基を指し、そして最も好ましくは１個の置換基を指すだろう。
【００３０】
本明細書中で用いられる「炭素原子数２〜20の置換されることがある炭化水素結合」という語は、所望により例えばヒドロキシもしくは炭素原子数１〜６のアルコキシ基により置換されることがあり、そして所望によりアミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アミドもしくはスルホンアミド結合によって一緒に連結されて炭素原子数２〜20の鎖を提供する、１個または複数の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル鎖を意味する。この構造は好ましくはフレキシブルである。そのような置換されることがある炭化水素結合の構造は、例えば、Lowe, C.R. & Dean, P.D.G., 1974, Affinity Chromatography, John Wiley & Sons, London中に記載されており、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【００３１】
本明細書中で単独でまたは組み合わせて用いられる「炭素原子数１〜10の置換されることがある炭化水素結合」という語は、１もしくは複数の官能基（非限定的にカルボキシル基、好ましくは１個のカルボキシル基、およびヒドロキシル基が挙げられる）により置換されることがある炭素原子数１〜10の直鎖状または分岐鎖状の炭化水素鎖を指して言う。
【００３２】
本発明の好ましい態様では、Ｒ1が水素原子を表す。
本発明の別の好ましい態様では、Ｒ2が水素原子を表す。
本発明の別の好ましい態様では、Ｒ3が水素原子を表す。
本発明の別の好ましい態様では、Ｒ4がメチル基、エチル基またはプロピル基を表す。
【００３３】
本発明の別の好ましい態様では、Ｒ5がメチル基、エチル基またはプロピル基を表す。
本発明の別の好ましい態様では、Ｒ6がメチル基、エチル基またはプロピル基を表す。
本発明の別の好ましい態様では、Ｒ7がメチル基、エチル基またはプロピル基を表す。
【００３４】
本発明の別の好ましい態様では、Ｒ8がメチル基、エチル基またはプロピル基を表す。
本発明の別の好ましい態様では、Ｒ9がメチル基、エチル基またはプロピル基を表す。
【００３５】
本発明の別の好ましい態様では、Ａ1がＮ−Ｒ1を表し、ここでＲ1は前に定義した通りである。
本発明の別の好ましい態様では、Ａ2がＮ−Ｒ1を表し、ここでＲ1は前に定義した通りである。
【００３６】
本発明の別の好ましい態様では、Ｂ1が−ＣＨＣＯＯＨ−ＣＨ2−基、−ＣＨＣＯＯＨ−(ＣＨ2）2−基、−ＣＨＣＯＯＨ−(ＣＨ2）3−基、−ＣＨＣＯＯＨ−(ＣＨ2）4−基、エチル基、プロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基またはフェニル基を表す。
【００３７】
本発明の別の好ましい態様では、Ｂ2が−ＣＨＣＯＯＨ−ＣＨ2−基、−ＣＨＣＯＯＨ−(ＣＨ2）2−基、−ＣＨＣＯＯＨ−(ＣＨ2）3−基、−ＣＨＣＯＯＨ−(ＣＨ2）4−基、エチル基、プロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基またはフェニル基を表す。
【００３８】
本発明の別の好ましい態様では、Ｄ1が水素、アミノ基、イミダゾール基、グアニジノ基、アミニジノ基、トリメチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、メチルアミノ基またはエチルアミノ基を表す。
【００３９】
本発明の別の好ましい態様では、Ｄ2がアミノ基、イミダゾール基、グアニジノ基、アミニジノ基、トリメチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、メチルアミノ基またはエチルアミノ基を表す。Ｄ2は（しばしばＤ1も)好ましくは強力に荷電した種である。
【００４０】
本発明の別の好ましい態様では、ｐが０または１を表す。
本発明の別の好ましい態様では、２つのＸとも窒素原子を表す。
本発明の別の好ましい態様では、Ｔが酸素原子、またはより好ましくはＮＨ基を表す。
【００４１】
本発明の別の好ましい態様では、Ｌがブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルまたはドデシル基を表し、そしてＶとｍが前に定義した通りである。
【００４２】
本発明の別の好ましい態様では、Ｖが酸素原子、−ＣＯＯ−基、ＰＯ3Ｈ−基またはＮ−Ｒ3基を表し、そしてより好ましくは酸素原子またはＮＨ基を表し；そしてＬおよびｍは前に定義した通りである。
【００４３】
本発明の別の好ましい態様では、ｍが１を表しそしてＬとＶが前に定義した通りである。
「ｘ〜ｙの整数」という語は、ｘ（０を含む）とｙの値を包含することができる。
【００４４】
本発明はまた、本発明の新規アフィニティーリガンド−母材結合体の製造方法であって、任意の順序において、
(i) 一般式（IV）のハロゲノ複素環式化合物：
【化４】
0004712978.tif 000004
（上式中、記号Ｘは上記に示した意味を有し、そしてＷはハロゲン原子を表す）を、
(ii)一般式（Ｖ）の化合物：
【化５】
0004712978.tif 000005
（上式中、記号Ｄ1，Ｂ1，Ａ1およびｐは上記に示した意味を有し、そしてＨは水素である）、
(iii)一般式（VI）の化合物：
【化６】
0004712978.tif 000006
（上式中、記号Ｄ2，Ｂ2およびＡ2は上記に示した意味を有し、そしてＨは水素である）、および
(iv)所望により誘導体化された一般式（VII）の支持母材：
【化７】
0004712978.tif 000007
（上式中、記号Ｔ，Ｌ，Ｖ，ｍおよびＭは上記に示した意味を有し、そしてＨは水素である）と、または
一般式（VIII）の連結単位：
Ｈ−Ｔ−Ｌ−Ｖ−Ｈ        （VIII）
（上式中、記号Ｔ，Ｌ，Ｖは上記に示した意味を有する）
と反応させることにより、一般式（IX）の化合物：
【化８】
0004712978.tif 000008
（上式中、Ａ1，Ａ2，Ｂ1，Ｂ2，Ｄ1，Ｄ2，ｐ，Ｘ，Ｔ，Ｌ，Ｖ，ｍ，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7，Ｒ8およびＲ9は上記に示した意味を有する）を提供することを含んでなる。次いで、一般式（IX）の化合物を、当業者に周知である活性化およびカップリング法を使って、支持母材（残基はＭにより表される）と更に反応させる。
【００４５】
一般式（IV）のハロゲノ複素環式化合物の例として、５−クロロ−２，４，６−トリフルオロピリミジン、５−シアノ−２，４，６−トリクロロピリミジン、シアヌル酸フルオリド（フッ化シアヌル）、シアヌル酸ブロミド（臭化シアヌル）、および特にシアヌル酸クロリド（塩化シアヌル）を挙げることができる。
【００４６】
一般式（Ｖ）の化合物の例として、アンモニア、水、アルギニン、リジン、ヒスチジン、α，γ−ジアミノ酪酸、ｍ−アミノベンズアミジン、ｐ−アミノベンズアミジン、ｍ−アミノベンゼントリメチルアンモニウムブロミド、ｐ−アミノベンゼントリメチルアンモニウムブロミド、２−（ジエチルアミノ）エチルアミン、（２−アミノエチル）トリメチルアンモニウムクロリド、ヒスタミン、アグマチン、エチレンジアミン、１，３−ジアミノプロパン、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタンおよび１，６−ジアミノヘキサンを挙げることができる。
【００４７】
一般式（VI）の化合物の例としては、アルギニン、リジン、ヒスチジン、α，γ−ジアミノ酪酸、ｍ−アミノベンズアミジン、ｐ−アミノベンズアミジン、ｍ−アミノベンゼントリメチルアンモニウムブロミド、ｐ−アミノベンゼントリメチルアンモニウムブロミド、２−（ジエチルアミノ）エチルアミン、（２−アミノエチル）トリメチルアンモニウムクロリド、ヒスタミン、アグマチン、エチレンジアミン、１，３−ジアミノプロパン、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタンおよび１，６−ジアミノヘキサンを挙げることができる。
【００４８】
残基がＭにより表される支持母材の例としては、不溶性支持母材、例えば天然ポリマー、例えばポリペプチドもしくはタンパク質、例えば架橋アルブミン、または多糖、例えばアガロース、アルギネート、カラギーナン、キチン、セルロース、デキストランもしくはデンプン；合成ポリマー、例えばポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリアクロレイン、ポリビニルアルコール、ポリメチルアクリレートまたはペルフルオロカーボン；無機化合物、例えばシリカ、ガラス、珪藻土（kieselguhr）、アルミナ、酸化鉄もしくは他の酸化金属；あるいは天然ポリマー、合成ポリマーまたは無機化合物のうちの２以上の任意組合せからなるコポリマーを挙げることができる。デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたは水解デンプンのようなポリマーを含んでなる可溶性支持母材（これらは液相分配用のアフィニティーリガンド−母材結合体を提供する）；またはペルフルオロデカリンのような化合物を含んでなる支持母材（これらはアフィニティーエマルションの調製用のアフィニティーリガンド−母材結合体を提供する）もまた、残基がＭにより表される支持母材の定義の中に含まれる。虚偽を回避するため、本明細書中、支持母材は、粒状または非粒状、可溶性または不溶性、多孔質または非孔質であるにかかわらず、本発明の新規アフィニティーリガンド−母材結合体を形成するのに用いることができ且つ接触溶液中の溶質からアフィニティーリガンドを分離する便利な手段を提供することができる任意の化合物または材料として定義される。
【００４９】
リガンドの付着前にまたは最中に活性化剤での処理により改質されているかまたは改質される、アガロース、セルロース、デキストラン、デンプン、アルギネート、カラギーナン、合成ポリマー、シリカ、ガラスおよび金属酸化物のような支持母材も、残基がＭにより表される支持母材の定義の中に含まれる。
【００５０】
本発明の好ましい態様では、Ｍは活性化されることがあるアガロース、シリカ、セルロース、デキストラン、ガラス、トヨパール、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリルアミド、スチレンジビニルベンゼン、ハイパーＤ、ペルフルオロカーボン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、フッ化ポリビニリデン、ナイロン、およびポリ塩化ビニルを表す。好ましくは、Ｍはトレシル活性化、スルホニルクロリド活性化、トシル活性化、ビニルスルホン活性化またはエポキシ活性化されることがあるアガロースを表す。
【００５１】
支持母材へのリガンドの付着という一般目的での用途が見出されている活性化剤は相当の数存在する。それらの化合物およびそれらの使用方法は当業者に周知であり、本発明の核心は母材に取り付けられるリガンドの性質にあるのであって、付着の形態にあるのではないので、それらの活性化剤のいずれでも本発明の新規母材−リガンド結合体の調製に役立つだろう。そのような活性化剤の非限定例としては、臭化シアン、シアヌル酸クロリド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、ｐ−トルエンスルホニルクロリド、１，１′−カルボニルジイミダゾール、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン−４−スルホン酸、グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、および２，２，２−トリフルオロエタンスルホニルクロリドのような多様な化合物が挙げられる。上述した通り、そのような活性化段階を実施する方法は当業者に周知である。
【００５２】
同様に、一般式（VIII）および（IX）の化合物をアガロース、セルロース、デキストラン、デンプン、アルギネート、カラギーナン、シリカまたはガラスのような支持母材に取り付けるのに、多種多様な縮合剤を使うことができる。それらの化合物およびそれらの使用方法も当業者に周知であり、同様に、本発明の核心はリガンドの性質にあるのであって付着の形態にあるのではないので、それらの縮合剤のいずれでも本発明の新規母材−リガンド結合体の調製に役立つだろう。そのような縮合剤の非限定例としては、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドが挙げられる。
【００５３】
式（IX）の化合物の製造に用いることができる一般式（VIII）の連結単位の例としては、ジアミン類、例えばエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ′−ジメチルエチレンジアミン、Ｎ−エチルエチレンジアミン、Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン、プロピレンジアミン、Ｎ−メチルプロピレンジアミン、Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）プロピレンジアミン、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，７−ジアミノヘプタン、１，８−ジアミノオクタン、１，９−ジアミノノナン、１，10−ジアミノデカン、１，12−ジアミノドデカン、ピペラジン、３−ヒドロキシ−１，５−ジアミノペンタン、ｍ−およびｐ−フェニレンジアミン、ｍ−およびｐ−アミノベンジルアミン；アミノアルコール類、例えばエタノールアミン、Ｎ−メチルエタノールアミン、Ｎ−プロピルエタノールアミン、ジエタノールアミン、３−ヒドロキシプロピルアミン、２，３−ジヒドロキシプロピルアミン、イソプロパノールアミン、５−アミノペンタン−１−オールおよび６−アミノヘキサン−１−オール；アミノフェノール類、例えばｏ−，ｍ−およびｐ−アミノフェノール；アミノカルボン酸類、例えばグリシン、Ｎ−メチルグリシン、３−および４−アミノ酪酸、３−アミノイソ酪酸、５−アミノ吉草酸、６−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、ｍ−およびｐ−アミノ安息香酸；アミノホスホン酸類、例えばｍ−アミノベンゼンホスホン酸並びにｐ−アミノベンジルホスホン酸；並びにアミノアリーレンビニルスルホン前駆体、例えばアニリン−３−β−スルファトエチルスルホンおよびアニリン−４−β−スルファトエチルスルホンが挙げられる。
【００５４】
一般式（IV）のハロゲノ複素環式化合物と一般式（Ｖ），（VI）および（VII）または（VIII）の化合物との反応は、水と混和性でない有機溶媒中で、または水と混和性である有機溶媒中で、または水と水混和性有機溶媒との混合物中で実施することができる。水と混和性でない適当な有機溶媒の例はトルエン、キシレンまたはクロロベンゼンであり；水と混和性である適当な有機溶媒の例はアセトン、メチルエチルケトンまたはジオキサンである。ハロゲノ複素環式化合物の最初の反応は、０℃〜25℃の温度で、理想的には０℃〜５℃の温度で実施され；２番目の反応は20℃〜50℃の温度で、理想的には30℃〜45℃の温度で実施され；そして３番目の反応は20℃〜100℃の温度で実施される。そのような反応の間、生成される塩酸またはフッ化水素酸のような無機酸は酸結合剤、例えば水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カルシウムまたは炭酸カルシウムを使って中和される。
【００５５】
更に、一般式（IX）の化合物を反応性重合性モノマーと反応させて、一般式（Ｘ）の重合性化合物を形成させることができる：
【化９】
0004712978.tif 000009
（上式中、Ａ1，Ａ2，Ｂ1，Ｂ2，Ｄ1，Ｄ2，ｐ，Ｘ，Ｔ，Ｌ，Ｖ，ｍ，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7，Ｒ8およびＲ9は上記に示した意味を有し；Ｒ11は水素原子または炭素原子数１〜６のアルキル基を表し；Ｒ10はカルボニル基、メチレン基、−ＮＨ−ＣＨ2−基または−Ｓ−ＣＨ2−基を表す）。反応性重合性モノマーの例としては、アクリロイルクロリド、メタクリロイルクロリド、アリルブロミド、アリルアミンまたは３，４−エポキシブテンが挙げられる。一般式（Ｘ）の重合性化合物は、所望により別の重合性モノマーの存在下で重合させることにより、一般式（III）のアフィニティーリガンド−母材結合体を形成せしめることができる。そのような重合方法は当業者に周知である。
【００５６】
本発明は、別の態様において、一般式（XI）の新規アフィニティーリガンド−母材結合体に関する：
【化１０】
0004712978.tif 000010
（上式中、Ａ1，Ａ2，Ｂ1，Ｂ2，Ｄ1，Ｄ2，ｐ，Ｘ，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7，Ｒ8およびＲ9は上記に示した意味を有し；Halogenはフッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子を表す）。
【００５７】
更に、本発明は、上記一般式（VII）の母材への上記一般式（XI）の新規アフィニティーリガンドの結合方法であって、新規アフィニティーリガンドを０℃〜100℃の温度で所望により酸結合剤の存在下で母材と反応させることによる方法にも関する。
【００５８】
本発明は、別の態様によれば、一般式（XII）の新規アフィニティーリガンドにも関する：
【化１１】
0004712978.tif 000011
（上式中、Ａ1，Ａ2，Ｂ1，Ｂ2，Ｄ1，Ｄ2，ｐ，Ｘ，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7，Ｒ8およびＲ9は上記に示した意味を有し；そしてｊは２〜20の整数である）。
【００５９】
更に、本発明は、上記新規アフィニティーリガンドの調製方法であって、上記一般式（IX）の化合物を、所望により酸結合剤の存在下で、０℃〜100℃の温度で一般式Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）j−ＮＨ2のアルキレンジアミンと反応させることによる方法にも関する。
【００６０】
本発明は、別の態様では、一般式（XIII）の新規アフィニティーリガンドにも関する：
【化１２】
0004712978.tif 000012
（上式中、Ａ1，Ａ2，Ｂ1，Ｂ2，Ｄ1，Ｄ2，ｐ，Ｘ，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7，Ｒ8およびＲ9は上記に示した意味を有し；ｊは２〜20の整数であり；そしてｑは０または１である）。
更に、本発明は、上記一般式（XIII）の新規アフィニティーリガンドを上記一般式（VII）の母材に結合させる方法であって、前記新規アフィニティーリガンドを縮合剤の存在下で０℃〜100℃の温度で前記母材と反応させることによる方法にも関する。そのような縮合剤の非限定例としては、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドが挙げられる。
【００６１】
更に、本発明は、上記一般式（XIII）の新規アフィニティーリガンドの調製方法であって、上記一般式の化合物を０℃〜100℃の温度で所望により酸結合剤の存在下でＨ2Ｎ−（ＣＨ2）j−（ＣＯ）q−ＯＨと反応させることによる方法にも関する。
【００６２】
別の態様によれば、本発明は、Ａ1，Ａ2，Ｂ1，Ｂ2，Ｄ1，Ｄ2，ｐ，Ｘ，Ｔ，Ｌ，Ｖ，ｍ，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7，Ｒ8およびＲ9が上記に示した意味を有し；Ｒ10が水素原子または炭素原子数１〜６のアルキル基を表し；Ｒ11がカルボニル基、メチレン基、−ＮＨ−ＣＨ2−基または−Ｓ−ＣＨ2−基を表し；好ましくはＬが炭素原子数４〜10のアルキル基であり、好ましくはＴが−ＮＨ−基を表し、好ましくはＶが−ＮＨ−基を表し、そしてｍが好ましくは１である、上記一般式（Ｘ）の新規アフィニティーリガンドに関する。
【００６３】
好ましい態様では、本発明は一般式（XIV）の新規アフィニティーリガンドに関する：
【化１３】
0004712978.tif 000013
（上式中、Ａ1，Ａ2，Ｂ1，Ｂ2，Ｄ1，Ｄ2，ｐおよびＲ1は上記に示した意味を有する）。
【００６４】
別の好ましい態様では、本発明は一般式（XV）の新規アフィニティーリガンドに関する：
【化１４】
0004712978.tif 000014
（上式中、Ａ1，Ａ2，Ｂ1，Ｂ2，Ｄ1，Ｄ2，ｐおよびＲ1は上記に示した意味を有し；そしてｊは２〜20の整数である）。
【００６５】
別の好ましい態様では、本発明は、Ｄ1およびＤ2が各々独立にグアニジノ基、イミダゾール基、第一アミノ基、ジエチルアミノ基、トリメチルアンモニウム基またはトリエチルアンモニウム基を表す、一般式(Ｘ), (XI), (XII), (XIII), (XIV)および(XV)のアフィニティーリガンドに関する。
【００６６】
別の好ましい態様では、本発明は、ｐが１である一般式(IX), (Ｘ), (XI), (XII), (XIII), (XIV)および(XV)のアフィニティーリガンドに関する。
【００６７】
別の好ましい態様では、本発明は、Ｂ1およびＢ2が各々独立に−ＣＨＣＯＯＨ−（ＣＨ2）3−基、−ＣＨＣＯＯＨ−（ＣＨ2）4−基、ブチル基、ペンチル基またはフェニル基を表す、一般式(IX), (Ｘ), (XI), (XII), (XIII), (XIV)および(XV)のアフィニティーリガンドに関する。
【００６８】
別の好ましい態様では、本発明は、Ａ1およびＡ2が各々独立に−ＮＨ−基を表す、一般式(IX), (Ｘ), (XI), (XII), (XIII), (XIV)および(XV)のアフィニティーリガンドに関する。
【００６９】
別の好ましい態様では、本発明は、Ｘが窒素原子を表す一般式(IX), (Ｘ), (XI), (XII)および(XIII)のアフィニティーリガンドに関する。
別の好ましい態様では、本発明は、ｊが１〜10である一般式(XII), (XIII)および(XV)のアフィニティーリガンドに関する。
【００７０】
本発明の好ましいアフィニティーリガンドは下記のものである：
【化１５】
0004712978.tif 000015
【化１６】
0004712978.tif 000016
【化１７】
0004712978.tif 000017
【化１８】
0004712978.tif 000018
【００７１】
アフィニティーリガンド−母材結合体の有益な群は次の一般式（XXVII）により表される：
【化１９】
0004712978.tif 000019
（上式中、Ｂ1，Ｂ2，Ｄ1，Ｄ2，ｐ，Ｍ，Ｒ1，Ｒ2およびＲ3は上記に示した意味を有し；そしてｊは４〜10の整数である）。
【００７２】
アフィニティーリガンド−支持母材の特に有益な群は次の一般式（XXVIII）により表される：
【化２０】
0004712978.tif 000020
（上式中、Ｂ1，Ｂ2，Ｄ1，Ｄ2，ｐ，Ｘ，Ｍ，Ｒ1，Ｒ2およびＲ3は上記に示した意味を有する）。
【００７３】
典型的には、一般式（XXIX）の化合物：
【化２１】
0004712978.tif 000021
を、酸結合剤の存在下で10℃〜30℃の温度で３−プロポキシ−（１，２−エポキシ）誘導体化母材と反応させることにより、水、水溶液、タンパク質、薬物、血液および血漿からのエンドトキシンの結合に特に有効である新規アフィニティーリガンド−母材結合体が製造される。
【００７４】
本発明に係る好ましいアフィニティーリガンド母材結合体は、下記のものである：
【化２２】
0004712978.tif 000022
【化２３】
0004712978.tif 000023
【化２４】
0004712978.tif 000024
【化２５】
0004712978.tif 000025
（上式中、Ｍは前に定義した通りである）。
【００７５】
本発明は更に、エンドトキシンまたはそれの類似体、断片、誘導体および前駆体の分離、単離、精製、定量、同定および特徴付けにおける、そのような全てのアフィニティーリガンド−支持母材の使用を包含する。
【００７６】
エンドトキシンは、共通の構造を共有するリポ多糖（しばしばＬＰＳと略される）類である。エンドトキシンは多数の形態で存在し、例えば最も重要なエンドトキシン種は、コア多糖成分（これはＯ−特異的鎖多糖に結合してもよい）にリピドＡが付着した形である。コア多糖成分は内側コア、外側のオリゴ糖に付着した内側コア、または外側コアに付着した内側コアから成る。エンドトキシンは非常に不均一であることが知られており、特にＯ特異的鎖多糖と外側コア多糖に関して不均一である。エンドトキシンは不均一であることが知られているため、本明細書中で用いる「エンドトキシン」という語は、多糖に共有結合で結合したリピドＡを含んでなる全ての天然形態（それの類似体、誘導体、断片および前駆体を含む）を包含するものであり、そして全てのそのような形態は、それらの起源に関係なく、本発明の特許請求の対象である。
【００７７】
更に、本発明は、上記一般式（IX）、上記一般式（Ｘ）、上記一般式（XII）、上記一般式（XV）および上記一般式（XXIX）の新規アフィニティーリガンドを炭水化物または有機ポリマー母材に取り付ける方法であって、前記炭水化物または有機ポリマー母材を活性化剤と反応させ、次いで所望により酸結合剤の存在下で、活性化された母材を前記新規アフィニティーリガンドと反応させることによる方法にも関する。本発明は、上記一般式（XIII）の新規アフィニティーリガンドを炭水化物または有機ポリマー母材に取り付ける方法であって、前記母材との縮合による方法にも関する。本発明は更に、上記一般式（IX）、上記一般式（Ｘ）、上記一般式（XII）、上記一般式（XV）および上記一般式（XXIX）の新規アフィニティーリガンドを金属酸化物、ガラスまたはシリカ母材に付着させる方法であって、所望により有機ポリマーでコーティングされた金属酸化物、ガラスまたはシリカ母材を活性化剤と反応させ、続いて所望により酸結合剤の存在下で、前記活性化された母材を新規アフィニティーリガンドと反応させることによる方法にも関する。本発明の別の態様は、上記一般式（XIII）の新規アフィニティーリガンドを、所望により有機ポリマーでコーティングされた金属酸化物、ガラスまたはシリカ母材に付着させる方法であって、前記母材との縮合により行う方法にも関する。別の態様では、本発明は、上記一般式（XI）、上記一般式（XIV）および上記一般式（XVI〜XXVI）の新規アフィニティーリガンドを上記一般式（VII）の母材に付着させる方法であって、前記新規アフィニティーリガンドを−０℃〜100℃の温度において、所望により酸結合剤の存在下で、前記母材と反応させることによる方法にも関する。本発明は、上記方法において記載の通りに調製された全てのアフィニティーリガンド−母材結合体にも関する。
【００７８】
別の態様では、本発明は、エンドトキシンの分離、単離、精製、特徴付け、同定または定量のための、本発明のアフィニティーリガンドおよび本発明のアフィニティーリガンド−母材結合体の使用に関する。別の態様では、本発明は、エンドトキシン含有溶液または液体を1.0〜13.0の範囲内のｐＨにおいて本発明のアフィニティーリガンド−母材結合体に適用することによる任意方法に関する。本発明はまた、水、水溶液、体液、血液、血漿、薬品の溶液、タンパク質および生物学的起源の別の化合物の溶液からのエンドトキシンの単離方法であって、生物特異的リガンドとして上記一般式（Ｉ）のリガンドを使ってアフィニティークロマトグラフィーを実施することによる方法にも関する。
【００７９】
本発明の別の態様は、ドナーから採取されそして処理後に同じドナーまたは別の受容者に再輸液される全血または血漿からのエンドトキシンの体外除去のための、本発明のアフィニティーリガンドおよびそのようなリガンドを含んでなるアフィニティーリガンド−母材結合体の使用に関する。
【００８０】
本発明を下記実施例に関連して更に詳細に説明する。これらの実施例は例示目的のために提供されるのであり、決して本発明の範囲を限定するものであると解釈してはならない。
【００８１】
実施例１
本実施例は、一般式（IV）のハロゲノ複素環式化合物と一般式（Ｖ）および（VI）の化合物との反応により限定される一般式（XIV）の典型的アフィニティーリガンドの合成を示す。
【００８２】
アセトン10部中のシアヌル酸クロリド１部の溶液を、水100部中にＬ−アルギニン２部を含む攪拌溶液に滴下添加した。この混合物を０〜５℃で２時間攪拌し、次いで溶液を30℃に温め、更に16時間混合を続けた。１Ｍ水酸化ナトリウム溶液での滴定により全体を通してｐＨを5.0〜7.0の範囲内に維持した。固形塩化ナトリウムを20％（w/v）の最終濃度になるように添加することにより、反応生成物を沈澱させ、濾過し、真空乾燥した。ＴＬＣ分析（ＴＨＦ／プロパン−２−オール／水（容量で1:2:1）溶媒）は、単一の反応生成物（Ｒf 0.42）の存在を示した。単離された化合物の分子量を質量分析により測定すると、２分子のアルギニンにより誘導体化されたシアヌル酸クロリドを含んでなる化合物と一致することがわかった〔計算Ｍr＝459.5；分子イオン（+ve FAB）＝460.3、（-ve FAB）＝458.4〕。1H-NMRスペクトルはアルギニン含有化合物と一致した。
【００８３】
実施例２
本実施例は、一般式（VII）の随意に誘導体化される支持母材の合成を例証する。
【００８４】
水12部中に１，６−ジアミノヘキサン１部を含む溶液を、水48部中にエポキシ活性化アガロースビーズ（アガロースゲル１ｇあたり30μモルのエポキシド基）29部を含む攪拌懸濁液に添加し、30℃で24時間攪拌した。アミノ−ヘキシルアガロースゲルを濾過し、12×29部の水で連続的に洗浄し、そして最終洗浄の終了時に重力の下で排水した。第一アミン（ＴＮＢＳアッサイ）とエポキシド基（チオスルフェート／水酸化ナトリウム滴定）の存在についての生成アミノ−ヘキシルアガロースの分析は、１，６−ジアミノヘキサンとエポキシド基との完全な反応を示した。
【００８５】
実施例３
１，６−ジアミノヘキサンを１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン、１，７−ジアミノヘプタン、１，８−ジアミノオクタン、１，９−ジアミノノナンおよび１，10−ジアミノデカンに置き換えることにより実施例２を繰り返した。どの場合も、アミノ−アルキル誘導体化アガロース母材が得られた。
【００８６】
実施例４
本実施例は、一般式（VII）の随意に誘導体化された支持母材と一般式（IV）のハロゲノ複素環式化合物との反応を例証する。
【００８７】
アセトン10部中にシアヌル酸クロリド１部を含む溶液を、0.5Ｍリン酸カリウム緩衝液, pH 7.0  40部中に実施例２に従って調製したアミノ−ヘキシルアガロース母材40部を含む予冷（０〜４℃）懸濁液に添加した。混合物を０〜４℃で１時間攪拌し、濾過し、そしてアセトン１部と水１部を含む溶液５×40部、水５×40部、アセトン１部と水１部を含む溶液５×40部、および水10×40部で連続的に洗浄した。アミンの存在（ＴＮＢＳアッセイ）についての生成ジクロロトリアジン活性化アガロース母材の分析、および１Ｍ水酸化ナトリウムでの処理後のクロリドイオンの放出についての分析は、アミノヘキシルアガロース母材上の第一アミノ基とシアヌル酸クロリドとの完全な反応を示した。
【００８８】
実施例５
実施例２に従って調製した生成物を実施例３に従って調製した生成物に置き換えることにより実施例４を繰り返した。アミンの存在についての生成ジクロロトリアジン活性化アガロース母材の分析（ＴＮＢＳアッセイ）、および１Ｍ水酸化ナトリウムでの処理後のクロリドイオンの放出についての分析は、全ての場合においてアミノアルキルアガロース母材上の第一アミノ基とシアヌル酸クロリドとの完全な反応を示した。
【００８９】
実施例６
本実施例は、一般式（III）のアフィニティーリガンド−母材結合体を製造するための、実施例４に従って調製した生成物と一般式（VI）の化合物および一般式（Ｖ）の化合物との反応を示す。全ての溶液は発熱物質不含有の水を使って調製した。
【００９０】
0.1Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液, pH 10.25  105部中に実施例４に従って調製した生成物35部を含有する懸濁液にアルギニン１部を添加した。この混合物を30℃で24時間攪拌し、12×35部の0.1Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液, pH 10.25で連続洗浄し、重力の下で排水せしめた。この材料を105部の0.1Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液, pH 10.25中に再スラリー化した。
【００９１】
上記アガローススラリーにＮ−ε−t-BOC−Ｌ−リジン１部を添加し、混合物を85℃で72時間攪拌した。懸濁液を濾過し、12×35部の水で連続洗浄し、重力の下で排水せしめた。混合物を35部の0.1Ｍトリフルオロ酢酸中に再懸濁し、20℃で１時間攪拌し、濾過し、３×35部のメタノール、12×35部の水で連続洗浄し、そして重力の下で排水せしめた。この手順はt-BOC保護基を除去するために必要である。
【００９２】
実施例７〜14
表１は、本発明の新規アフィニティーリガンド−母材結合体の合成の更なる例を提供する。これらは、上記方法により調製したが、アルギニンを表１のカラムIIに記載のアミン化合物により置換し、そしてＮ−ε−t-BOC−Ｌ−リジンを表１のカラムIIIに記載のアミン化合物により置換して調製した。実施例の番号は表１のカラムＩに与えられる。
【００９３】
【表１】
0004712978.tif 000026
【００９４】
実施例15
本実施例は、一般式（III）のアフィニティーリガンド−母材結合体の、水からのエンドトキシン結合能力を例証する。
【００９５】
実施例６に従って調製したアフィニティーリガンド−母材結合体（150μL）を、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）#055:B5エンドトキシン（1.5×104 EU）を含有する水（1.5 ml）に添加し、20℃で１時間攪拌した。試料を遠心分離し、Limulus Amoebocyte Lysate Chromogenic Testにより、上清をエンドトキシンの存在についてアッセイした。上清中にわずか0.1 EU/ml（10 pg/mlと同等）しか検出されなかったことは、水からエンドトキシンが99.99％以上されたことを示す。
【００９６】
実施例16〜23
表２は、本発明の新規アフィニティーリガンド−母材結合体のエンドトキシン結合能力の更なる例を提供する。アフィニティーリガンド−母材結合体を表２のカラムIIに与える実施例番号に従って合成したことを除いて上記手順を実施した。上清中に残存するエンドトキシンの量（EU/ml）が表２のカラムIIIに与えられ、そしてアフィニティーリガンド−母材結合体により吸着されたエンドトキシンの量（％）が表２のカラムIVに与えられる。実施例の番号は表２のカラムＩに与えられる。
【００９７】
【表２】
0004712978.tif 000027
【００９８】
実施例24
本実施例は、エンドトキシンで汚染されたタンパク質含有溶液からエンドトキシンを分離する一般式（III）のアフィニティーリガンド−母材結合体の能力を例証する。
【００９９】
実施例６に従って調製したアフィニティーリガンド−母材結合体（150μl）を、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）#055:B5エンドトキシン（1.5×104 EU）とヒト血清アルブミン（15 mg）を含有する水（1.5 ml）に添加し、20℃で１時間攪拌した。試料を遠心分離し、そして10 mg/mlのヒト血清アルブミンの存在下でエンドトキシンを検出するために較正されているLimulus Amoebocyte Lysate Chromogenic Testにより、上清をエンドトキシンの存在についてアッセイした。上清中に50 EU/mlの濃度のエンドトキシンが検出され、これは10 mg/mlのヒト血清アルブミンを含む溶液からエンドトキシンが99.5％除去されたことを示す。
【０１００】
実施例25〜32
本実施例は、エンドトキシンで汚染されたタンパク質含有溶液からエンドトキシンを分離する本発明の新規アフィニティーリガンド−母材結合体の能力を証明する。アフィニティーリガンド−母材結合体を表３のカラムIIに与える実施例番号に従って合成したことを除いて上記手順を実施した。上清中に残存するエンドトキシンの量（EU/ml）が表３のカラムIIIに与えられ、そしてアフィニティーリガンド−母材結合体により吸着されたエンドトキシンの量（％）が表３のカラムIVに与えられる。実施例の番号は表３のカラムＩに与えられる。
【０１０１】
【表３】
0004712978.tif 000028
【０１０２】
実施例33
本実施例は、タンパク質の存在下でエンドトキシンを結合する一般式（III）の新規アフィニティーリガンド−母材結合体の能力を例証する。実施例６に従って調製したアフィニティーリガンド−母材結合体（150μl）を、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）#055:B5エンドトキシン（7.5×103 EU〜1.5×105 EU）とヒト血清アルブミン（15 mg）を含有する水（1.5 ml）に添加し、20℃で１時間攪拌した。試料を遠心分離し、そして10 mg/mlのヒト血清アルブミンの存在下でエンドトキシンを検出するために較正されているLimulus Amoebocyte Lysate Chromogenic Testにより、上清をエンドトキシンの存在についてアッセイした。投入混合物中に存在するエンドトキシンの全量および吸着されたエンドトキシンの量が表４に与えられる。
【０１０３】
【表４】
0004712978.tif 000029
【０１０４】
これらの結果は、１ｇの一般式（III）の新規アフィニティーリガンド−母材結合体が、10 mg/mlのヒト血清アルブミンの存在下で99％より高い抽出効率で１×106 EU（100μgのエンドトキシン）を結合できることを証明する。
【０１０５】
実施例34
本実施例は、タンパク質および様々なイオン強度の緩衝剤の存在下でエンドトキシンを結合する一般式（III）の新規アフィニティーリガンド−母材結合体の能力を例証する。実施例６に従って調製したアフィニティーリガンド−母材結合体（150μl）を、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）#055:B5エンドトキシン（7.5×104 EU）、ヒト血清アルブミン（15 mg）およびＰＢＳ緩衝剤（０〜200 mM）を含有する水（1.5 ml）に添加し、20℃で１時間攪拌した。試料を遠心分離し、そして10 mg/mlのヒト血清アルブミンの存在下でエンドトキシンを検出するために較正されているLimulus Amoebocyte Lysate Chromogenic Testにより、上清をエンドトキシンの存在についてアッセイした。試験した全濃度のＰＢＳ緩衝剤について存在するエンドトキシンの99％以上が吸着された。これらの結果は、一般式（III）の新規アフィニティーリガンド−母材結合体が高い効率で且つイオン強度やタンパク質の存在に関係なくエンドトキシンを結合できることを証明する。