(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩類を実質的に含有しない抗体（ヒト型化モノクローナル抗体の断片を除く）含有溶液に0.00025〜0.004重量％の界面活性剤を添加することを特徴とする、限外濾過における抗体含有溶液中の凝集物の生成又は白濁化の抑制方法。
【請求項２】
前記界面活性剤がポリソルベートである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記界面活性剤がポリソルベート20又はポリソルベート80である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体含有溶液に添加する界面活性剤の濃度が前記溶液に対して 0.00025〜0.002 重量％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体がCHO 細胞において産生された抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体がキメラ抗体又はヒト型化抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、抗IL−６レセプター抗体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、抗体含有溶液を圧力ストレス（ｓｈｅａｒ  ｓｔｒｅｓｓ）に対して安定化させる方法に関し、さらに詳しくは抗体含有溶液の限外濾過に際し、抗体含有溶液中の凝集物の生成又は白濁を抑制する方法に関する。本発明はさらに、上記の手段により、圧力ストレスに対して安定化された抗体含有組成物に関する。本発明は、医薬の製造において特に有用である。
背景技術
抗体は疾患の予防又は治療剤の成分として、あるいは診断薬等の成分として重要であり、広く使用されている。抗体の原体の製造及び製剤化に当っては、抗体含有溶液の濃縮等種々の目的で抗体含有液を限外濾過する必要がある場合がある。これらの限外濾過に際して、抗体含有溶液中に凝集物や白濁が生成する場合があり、これは、限外濾過により抗体含有溶液に負荷されるストレスにより溶液中の抗体蛋白質自体又は随伴する他の夾雑物が不溶化、凝集することにより生ずるものと予想される。抗体蛋白質を治療薬あるいは診断薬として使用するには凝集物または白濁が生じることは、特に注射剤としては許容されない。
従って、抗体含有液の限外濾過処理においては、凝集物の生成や白濁化を抑制することが重要であるが、従来この凝集物の生成や白濁化を効果的に防止するための方法は知られていなかった。
発明の開示
従って本発明は、抗体含有溶液の限外濾過に当って、凝集物の生成又は白濁化を効果的に抑制するための新規な方法、及びこの方法によりストレスに対して安定化された抗体含有組成物を提供しようとするものである。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、抗体含有溶液にある種の界面活性剤を添加することにより、限外濾過によるストレスを緩和し、凝集物の生成や白濁化を抑制することができることを見出した。
従って、本発明は、抗体含有溶液に界面活性剤を添加することを特徴とする、限外濾過における抗体溶液中の凝集物の生成又は白濁化の抑制方法を提供する。前記抗体は好ましくはモノクローナル抗体であり、また好ましくは抗ＩＬ−６レセプター抗体である。
本発明はまた、物理的ストレスに対して安定化された抗体含有組成物において、界面活性剤を０．０００２５〜０．５重量％含有する組成物を提供する。この組成物は、好ましくは塩類を実質的に含有しない。前記抗体は好ましくはモノクローナル抗体であり、また好ましくは抗ＩＬ−６レセプター抗体である。
上記の方法及び組成物において使用する界面活性剤としてはポリソルベート、プルロニックが好ましく、特にポリソルベート２０及びポリソルベート８０が好ましい。また、界面活性剤の、抗体含有溶液に対する濃度は０．０００２５〜０．５重量％が好ましい。
発明の実施の形態
本発明はポリクローナル抗体に対しても適用可能であるが、単一分子種から成る抗体に対して適用するのが特に好ましい。単一分子種から成る抗体とは、例えばモノクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体、１本鎖抗体等、あるいはこれらの種々の形態の抗体の断片を包含する。特に、キメラ抗体、ヒト型化抗体、１本鎖抗体は、天然の抗体に比べ、不安定であり、本発明の方法を使用することが好ましい。
モノクローナル抗体は、例えば、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ等の動物を抗原により免疫して得られる抗体産生細胞と、骨髄腫細胞等の永久化された培養細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマにより産生される抗体であり、特定の抗原に対するモノクローナル抗体は周知の方法により製造することができる。
ヒト抗体は、トランスジェニック動物を使用して周知の技術でより製造することができる。
また、キメラ抗体は、ある生物由来のハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体の定常領域（Ｃ−領域）と他の生物由来のハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体の可変領域（Ｖ−領域）とを連結することにより人工的に構成された抗体である。キメラ抗体としては、任意の抗原に対するモノクローナル抗体が入手可能である点で有利な、ヒト以外の動物、例えばマウス等のモノクローナル抗体のＶ−領域をヒトのモノクローナル抗体のＣ−領域により置換したものが重要である。任意のキメラ抗体を周知技術により製造することができる。
ヒト型化抗体は、所望の免疫原に対して生成されたヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体のＶ−領域中の相補性決定領域（ＣＤＲ）により、ヒトの抗体のＣＤＲを置換したものであって、ヒト抗体のＣ−領域、及びＶ−領域中のフレームワーク領域（ＦＲ）と、ヒト以外の動物由来の抗体のＣＤＲとから成り、抗体分子中のヒト以外の動物由来の領域が非常に少いので、ヒトに対する免疫原性が非常に低いという特徴を有する。任意のヒト型化抗体が周知技術により製造され得る。
１本鎖の抗体は、軽鎖（Ｌ−鎖）のＶ−領域と重鎖（Ｈ−鎖）のＶ−領域とを適当なリンカーにより連結して１本鎖にしたものであり、Ｌ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｖ領域は、同一の抗体に由来してもよく、また異る抗体に由来してもよい。１本鎖抗体も周知技術により製造することができる。
本発明はまた、上記種々の形態の抗体の断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２等にも適用可能である。
キメラ抗体、ヒト型化抗体、１本鎖抗体等は、遺伝子組換えにより宿主細胞を用いて産生される。宿主細胞としては微生物あるいは動物の培養細胞が挙げられ、例えば大腸菌、酵母、枯草菌、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ヒト由来の細胞等が使用でき、特にＣＨＯ細胞が好ましい。
本発明においては、本発明を適用する抗体の具体例としてＩＬ−６レセプターに対する抗体であるヒト型化ＰＭ−１抗体を用いるが、本発明を適用できる抗体がこれに限定されるものではないことは言うまでもない。なおヒト型化ＰＭ−１抗体は、ＰＭ−１抗体をヒト型化したものであり、ＰＭ−１抗体は抗原ＩＬ−６レセプターに対するモノクローナル抗体である。
本発明において使用する界面活性剤としても、抗体含有溶液をストレスに対して安定化し、特に限外濾過における凝集物の発生又は白濁化を防止できるものであればよく、ポリソルベート、プルロニック等が挙げられるが、ポリソルベートが好ましく、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０が特に好ましい。その添加濃度は、溶液に対して０．０００２５〜０．５重量％が好ましい。
ポリソルベートは、無水ソルビトールの水酸基の一部を脂肪酸でエステル化したもののポリオキシエチレンエーテルである。ポリソルベート２０はその脂肪酸がラウリン酸であり、ポリソルベート８０は脂肪酸がオレイン酸である。
本発明の抗体含有溶液は、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤等の公知の緩衝剤を含んでいてもよく、このときのｐＨは特に限定すれば、５〜７．５が好ましい。
抗体含有溶液中の凝集物の生成又は白濁化は、これらを測定するための任意の方法により測定することができるが、本発明においては具体例として、ろ過前後の測定対象サンプルを３４０ｎｍにおける吸光度によりそれぞれ測定し、その差を濁度とする。本発明における、ストレスに対する安定化効果、又は凝集物生成もしくは白濁化抑制効果は、例えば下に説明する「濁度の傾き」を指標として表わすことができる。
すなわち、例えば、図１に示すような限外濾過濃縮装置を用いる。まず、図中１で示す容器１に、被験界面活性剤を添加してあるか又は添加してない（対照）抗体含有溶液を入れ、この溶液をポンプ２により限外濾過器３に輸送する。限外濾過器３においては、抗体含有溶液を構成していた溶媒が限外濾過膜を限外濾過して排出路４から排出され、濃縮された抗体含有溶液は管５を通って容器１に返送される。この循環を反復すれば容器中又は管５中の溶液の抗体濃度が上昇する。
今、限外濾過処理によるストレスが抗体含有溶液に全くかからない場合、すなわち限外濾過処理によっても凝集物の生成又は白濁が全く生じない場合には、容器１又は管５中の溶液の抗体濃度は経時的に上昇するが、濁度すなわち３４０ｎｍにおける吸光度は上昇しない。従って、容器１から経時的にサンプルを採取し、その抗体濃度と濁度を測定し、抗体濃度を横軸に、濁度を縦軸に取ってプロットすれば、そのプロットから得られる回帰線は横軸に平行となり、「濁度の傾き」は０となる。
他方、限外濾過により抗体含有溶液にストレスがかかり、凝集物又は白濁が生ずる場合には、経時的に抗体濃度が上昇すると共に、濁度も上昇する。従って、上記のグラフにおいて、得られた回帰線は一定の「傾き」（濁度の傾き）を示す。そして、限外濾過処理により抗体含有溶液中に凝集や白濁が生じやすい程、「濁度の傾き」は大きくなる。従って、被験界面活性剤を添加した抗体含有溶液、及び界面活性剤を添加しない抗体含有溶液について「濁度の傾き」を測定し、比較することにより、被験界面活性剤の抗ストレス効果、すなわち凝集物生成又は白濁化に対する抑制効果を測定することができる。
また、抗体含有溶液に種々の濃度の塩化ナトリウムを添加し、上記の試験において「濁度の傾き」を測定したところ、塩濃度が高くなるに従って濁度の傾きが上昇し、限外濾過におけるストレスに対抗するためには、塩濃度が低い方がよいことが明らかになった。
本発明の方法の実施に当っては、限外濾過に先立って、抗体含有溶液に所定の界面活性剤の所定量を添加すればよい。
本発明はまた、界面活性剤を含有することによって、限外濾過によるストレスに対して安定化された、抗体含有組成物に関する。この組成物は、本発明の方法を実施した結果として得られる。本発明の安定化された組成物はまた、凍結乾燥、真空乾燥等の常用の乾燥手段により固体化された組成物であってもよい。固体化された安定化組成物において、上記の抗体含有量は、固体化する前の液体状態での濃度を意味する。本発明のストレスに対して安定化された抗体含有組成物はまた、所定量の界面活性剤が添加された未限外濾過の抗体含有溶液又はその乾燥生成物であってもよい。これらの組成物は、その後の限外濾過に際して、安定化効果を発揮する。
実施例
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１
図１に模式的に示す装置を具体化したものとして、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＬａｂｓｃａｌｅ  ＴＦＦ  Ｓｙｓｔｅｍを使用し、限外濾過膜としてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＰｅｌｌｉｃｏｎ  Ｂｉｏｍａｘ  ５を使用した。抗体としてヒト型化ＰＭ−１抗体を使用し、抗体溶液の濃度は３４０ｎｍにおいて分光光度計により測定した。またヒト型化ＰＭ−１抗体の濃度はゲルろ過クロマトグラフ法により測定した。
抗体溶液として、ヒト型化ＰＭ−１抗体約１ｍｇ／ｍＬ、リン酸ナトリウム（緩衝液）１５ｍＭ（ｐＨ６．５）及びＮａＣｌ  １２０ｍＭ、並びに実験目的により所定量のポリソルベート８０を含有する溶液を調製し、ヒト型化ＰＭ−１抗体濃度が約３〜４ｍｇ／ｍＬに濃縮されるまで限外濾過処理を続けた。
限外濾過によるストレスは、レオロジー理論から限外濾過速度の関数であると予想される。また、限外濾過速度は限外濾過膜の前後における圧力比の関数であることが確認された。そこで、ポリソルベート８０を０．００５％添加した抗体溶液及びポリソルベート無添加の抗体溶液について、種々の圧力比における「濁度の傾き」を測定した。
なお、「濁度の傾き」は、経時的に採取したサンプル中の濁度とヒト型化ＰＭ−１抗体の濃度を測定し、３４０ｎｍにおいて測定した吸光度の数値を濁度とし、ヒト型化ＰＭ−１抗体の濃度として「ｍｇ／ｍＬ」の数値を用い、横軸にヒト型化ＰＭ−１抗体濃度〔ｍｇ／ｍＬ〕及び縦軸に吸光度を取って、測定値をブロットし、それにより得られた回帰直線の傾斜を算出した数値である。
実験の結果を図２に示す。この図から明らかな通り、限外濾過によるストレス、すなわち凝集物の生成又は白濁化は、圧力比の上昇（すなわち限外濾過速度の上昇）と共に大きくなり、これはポリソルベートの添加により抑制される。
実施例２．ポリソルベート８０の濃度の効果
実施例１に記載した装置及び方法を用い、但し圧力比として３及び１．５を用い、ポリソルベート８０を０％、０．００１％及び０．００５％濃度で添加して、「濁度の傾き」を求めた。結果を図３に示す。
実施例１の場合と同様に、圧力比の大きさに従って、ストレスが上昇した。また、いずれの圧力比においても、ポリソルベート８０を０．００１％以上添加した場合に「濁度の傾き」が低下し、凝集物の生成が抑制された。
実施例３．ポリソルベートの濃度の効果
実施例１に記載したのと同じ装置、及び同様の方法を用いたが、圧力比は３に固定し、ポリソルベート８０の濃度を０％、０．０００２５％、０．０００５％、０．００１０％、０．００２％、及び０．００４％として、「濁度の傾きを」測定した。結果を図４に示す。ポリソルベート８０の濃度が０．０００２５％において十分な抗ストレス効果、すなわち凝集物生成抑制効果が得られることが明らかになった。
実施例４．塩化ナトリウムの効果
実施例１に記載したのと同一の装置及び同様の方法を用いたが、圧力比を約１．５に固定し、ポリソルベートを添加せず、ＮａＣｌ濃度を無添加、１２０ｍＭ及び１０００ｍＭとした。ヒト型化ＰＭ−１抗体濃度約１ｍｇ／ｍＬの初期濃度から約４０ｍｇ／ｍＬに濃縮されるまで限外濾過を行った。結果を図５に示す。ＮａＣｌ無添加において「濁度の傾き」が最低であり、ＮａＣｌは抗体溶液中の凝集物の生成を促進することが明らかになった。
参考例１．ヒトＩＬ−６レセプター抗体ＰＭ−１の調製
Ｈｉｒａｔａらの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４  ３：２９００−２９０６，１９８９）により作成した抗ＩＬ−６Ｒ抗体ＭＴ１８をＣＮＢｒにより活性化させたセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と添付の処方にしたがって結合させ、ＩＬ−６Ｒ（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：８２５−８２８，１９８８）を精製した。
すなわち、ヒトミエローマ細胞株Ｕ２６６を１％ジギトニン（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）、１０ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ７．８）および０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１ｍＭ  ｐ−パラアミノフェニルメタンスルフォニルフルオライドハイドロクロリド（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）（ジギトニン緩衝液）で可溶化し、セファロース４Ｂビーズと結合させたＭＴ１８抗体と混合した。その後、ビーズをジギトニン緩衝液で６回洗浄し、免疫に用いる部分精製ＩＬ−６Ｒとした。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを３×１０９個のＵ２６６細胞から得た上記部分精製ＩＬ−６Ｒで１０日おきに４回免疫し、その後常法によりハイブリドーマを作成した。成長陽性ウェルからのハイブリドーマ培養上清を下記の方法にてＩＬ−６Ｒへの結合活性を調べた。５×１０７個のＵ２６６細胞を３５Ｓ−メチオニン（２．５ｍＣｉ）で標識し、上記ジギトニン緩衝液で可溶化した。
可溶化したＵ２６６細胞を０．０４ｍｌ容量のセファロース４Ｂビーズと結合させたＭＴ１８抗体と混合し、その後、ジギトニン緩衝液で６回洗浄し、０．２５ｍｌのジギトニン緩衝液（ｐＨ３．４）により３５Ｓ−メチオニン標識ＩＬ−６Ｒを流出させ、０．０２５ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）で中和した。０．０５ｍｌのハイブリドーマ培養上清を０．０１ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎＧセファロース（Ｐｈｒａｍａｃｉａ製）と混合した。
洗浄した後、セファロースを上記で調製した０．００５ｍｌの３５Ｓ標識ＩＬ−６Ｒ溶液とともにインキュベートした。免疫沈降物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ＩＬ−６Ｒと反応するハイブリドーマ培養上清を調べた。その結果、反応陽性ハイブリドーマクローンＰＭ−１を樹立した。ハイブリドーマＰＭ−１から産生されるＩＬ−６Ｒ抗体ＰＭ−１は、ＩｇＧ１κ型のサブタイプを有する。
ハイブリドーマＰＭ−１が産生する抗体のヒトＩＬ−６Ｒに対するＩＬ−６Ｒの結合阻害活性をヒトミエローマ細胞株Ｕ２６６を用いて調べた。ヒト組換型ＩＬ−６Ｒを大腸菌より調製し（Ｈｉｒａｎｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７：４１，１９８８）、ボルトン−ハンター試薬（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）により１２５Ｉ標識した（Ｔａｇａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：９６７，１９８７）。
４×１０５個のＵ２６６細胞を、１００倍量の過剰な非標識ＩＬ−６Ｒの存在下で室温にて、１時間、７０％（ｖ／ｖ）のハイブリドーマＰＭ−１の培養上清及び１４０００ＣＰＭの１２５Ｉ標識ＩＬ−６Ｒとともに培養した。７０μｌのサンプルを４００μｌのマイクロフュージポリエチレンチューブに入れた  ３００μｌのＦＣＳ上に重層し、遠心の後、細胞上の放射活性を測定した。その結果、ハイブリドーマＰＭ−１が産生する抗体は、ＩＬ−６ＲのＩＬ−６Ｒに対する結合を阻害することが明らかとなった。
参考例２．ヒト型化ＰＭ−１抗体の作成
ヒト型化ＰＭ−１抗体を国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９に記載の方法により得た。参考例１で作成されたハイブリドーマＰＭ−１から常法で全ＲＮＡを調製し、これより一本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によりマウスＰＭ−１のＶ領域のＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ法に使用するプライマーは、Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１に記載されたものを用いた。
ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を精製し、マウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片、及びマウスガンマ型Ｈ鎖可変領域をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。これらのＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１９に連結し、大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞に導入して大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体から上記プラスミドを得、プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列を、常法にしたがい決定し、さらに各Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を決定した。
キメラＰＭ−１抗体を発現するベクターを作製するため、それぞれマウスＰＭ−１κＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域をコードするｃＤＮＡをＨＣＭＶ発現ベクターに挿入した。ヒト型化ＰＭ−１抗体を作製するために、ＣＤＲ移植法によりマウスＰＭ−１のＶ領域ＣＤＲをヒト抗体へ移植した。ヒト型化抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域のアミノ酸を置換した。
このようにして作成したヒト型化ＰＭ−１抗体のＬ鎖およびＨ鎖の遺伝子を哺乳類細胞中で発現させるために、ヒトエロンゲーションファクターＩα（ＨＥＦ−１α）プロモーターを含有するベクターに各々導入し、ヒト型化ＰＭ−１抗体Ｌ鎖およびＨ鎖を発現するベクターを作成した。これら二つの発現ベクターをＣＨＯ細胞に同時に挿入することにより、ヒト型化ＰＭ−１抗体を産生する細胞株を樹立した。得られたヒト型化抗体のヒトＩＬ−６Ｒへの結合能はＥＬＩＳＡにて確認した。さらに、ｈＰＭ−１はマウス抗体およびキメラ抗体と同様に、ヒトＩＬ−６のヒトＩＬ−６Ｒへの結合を阻害した。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の実験に用いた装置の模式図である。
図２は、図１の装置を用いて実験を行った場合の圧力比の効果およびポリソルベート８０の添加効果を示すグラフである。
図３は、抗体含有溶液中の凝集物の生成の抑制に対するポリソルベート８０の濃度の効果を示すグラフである。
図４は、抗体含有溶液中の凝集物の生成の抑制に対するポリソルベート８０の濃度の効果を示すグラフである。
図５は、抗体含有溶液中での凝集物の生成に対するＮａＣｌの影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
0004812228.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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