(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）：
【化１】
0004699577.tif 000008
［式中、Ｒは水素原子又は金属イオンを表し、Ｒ’はＧ、Ｍ−Ｇ、Ｇ−Ｇ−Ｇ、Ｇ−Ｇ−Ｍ、Ｇ−Ｍ−Ｇ、Ｇ−Ｍ−Ｍ、Ｍ−Ｇ−Ｇ、Ｍ−Ｍ−Ｇ又はＭ−Ｍ−Ｍ（Ｍは次式（II）：
【化２】
0004699577.tif 000009
（Ｒは前記と同様である。）
で示されるＤ−マンニュロン酸を表し、Ｇは次式(III)：
【化３】
0004699577.tif 000010
（Ｒは前記と同様である。）
で示されるＬ−グルロン酸を表し、各単糖間の結合はα−又はβ−１，４結合である。）を表す。］
で示されるアルギン酸オリゴ糖又はその塩を培地１ml当たり10〜50mg含み、ウシ脳下垂体抽出物及び血清を含まない上皮細胞培養用培地。
【請求項２】
上皮細胞が正常ヒト表皮角化細胞又は毛根細胞である請求項１記載の培地。
【請求項３】
アルギン酸オリゴ糖又はその塩が、アルギン酸又はその塩をアルテロモナス属に属する微生物の培養物、菌体又は菌体処理物で処理したものである請求項１又は２記載の培地。
【請求項４】
アルテロモナス属に属する微生物がアルテロモナス・エスピーNo.1786(FERM BP-5201)である請求項３記載の培地。
【請求項５】
アルギン酸オリゴ糖又はその塩が、単独又は２種以上の混合物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の培地。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の培地で上皮細胞を培養することを特徴とする上皮細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、上皮細胞培養用培地及びそれを用いる上皮細胞の培養方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
正常ヒト表皮角化細胞等の上皮細胞の培養用培地については、血清を含まない培地（以下「無血清培地」という。）が開発され、国内でもキットとして市販されている。しかしながら、成分の不明の蛋白質性の物質を多く含むために本来の正常ヒト表皮角化細胞の増殖因子スクリーニング等を妨げる可能性がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
前述の上皮細胞培養用無血清培地には、さまざまな成分が含まれているが、その中で化学物質として特定されていない唯一の成分がウシ脳下垂体抽出物（以下「ＢＰＥ」という。）である。このＢＰＥの無添加の場合、正常ヒト表皮角化細胞はほとんど増殖しない。また、毛根細胞の増殖にＢＰＥが重要で、ＢＰＥを欠いた培地では毛根細胞は増殖しないという報告がある（日皮会誌，９９（１１），１１４５−１１５２（１９８９））。更に、牛の脳下垂体には、多量の繊維芽細胞成長因子（以下「ＦＧＦ」という。）が含まれているので、ＢＰＥ中の活性がＦＧＦである可能性が考えられているが、現在のところＢＰＥの活性が既知の因子によって置換されたという報告はない。そこで、このＢＰＥの代替物の開発が、成分既知の無血清培地開発につながり、その開発により正確な正常ヒト表皮角化細胞等の上皮細胞の増殖因子スクリーニングが行うことができると考える。なお、正常ヒト表皮角化細胞等の上皮細胞は、増殖速度が遅く、医学の面（ヤケド治療等の皮膚移植等）からも増殖因子の開発が望まれている。
また、このＢＰＥについては、ヨーロッパ諸国では、狂牛病問題で安全性に問題が生じ始め、より安全な増殖因子の開発が望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題に基づいて鋭意研究を行った結果、オリゴ糖がＢＰＥの代替物となることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明の第１は、オリゴ糖を含み、ウシ脳下垂体抽出物を含まない上皮細胞培養用培地であり、本発明の第２は、オリゴ糖を含み、ウシ脳下垂体抽出物を含まない培地で上皮細胞を培養することを特徴とする上皮細胞の培養方法である。
【０００５】
本発明において、オリゴ糖とは、２糖〜１０糖をいい、好ましくは２糖〜４糖が挙げられる。
本発明の培地は、血清を含んでいてもよいが、血清を含まないものが好ましい。
【０００６】
本発明の対象となる上皮細胞としては、動物の上皮細胞であれば、特に制限はないが、好ましくは正常ヒト表皮角化細胞又は毛根細胞が挙げられる。
本発明に用いるオリゴ糖としては、酸性基を有する単糖を構成糖として含むオリゴ糖又はその塩が好ましい。
【０００７】
また、前記酸性基としては、例えばカルボキシル基、硫酸基が挙げられるが、カルボキシル基が好ましい。カルボキシル基を有する単糖としては、例えばマンニュロン酸、グルロン酸、グルクロン酸、ガラクチュロン酸、イズロン酸が挙げられる。酸性基を有する単糖を構成糖として含むオリゴ糖又はその塩としては、好ましくは、アルギン酸オリゴ糖、ペクチンオリゴ糖、ヒアルロン酸オリゴ糖、コンドロイチン硫酸オリゴ糖、ヘパリンオリゴ糖又はこれらの塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、亜鉛塩、鉄（II）塩、鉄(III) 塩が挙げられ、更に好ましくはアルギン酸オリゴ糖又はその塩が挙げられる。
【０００８】
アルギン酸オリゴ糖又はその塩としては、アルギン酸又はその塩をアルテロモナス属に属する微生物の培養物（例えば培養液）、菌体又は菌体処理物（例えば菌体破砕物、菌体抽出物、粗酵素、精製酵素）で処理したものが挙げられる。また、アルギン酸オリゴ糖又はその塩は、単独で又は２種以上を任意に組み合わせて用いることができる。
【０００９】
アルギン酸オリゴ糖又はその塩としては、好ましくは、末端が４，５−不飽和ウロン酸であり、Ｄ−マンニュロン酸及びＬ−グルロン酸を構成糖とするオリゴ糖が挙げられ、更に好ましくは、次式（Ｉ）：
【００１０】
【化４】
0004699577.tif 000002
【００１１】
［式中、Ｒは水素原子又は金属イオンを表し、Ｒ’はＧ、Ｍ−Ｇ、Ｇ−Ｇ−Ｇ、Ｇ−Ｇ−Ｍ、Ｇ−Ｍ−Ｇ、Ｇ−Ｍ−Ｍ、Ｍ−Ｇ−Ｇ、Ｍ−Ｍ−Ｇ又はＭ−Ｍ−Ｍ（Ｍは次式（II）：
【００１２】
【化５】
0004699577.tif 000003
【００１３】
（Ｒは前記と同様である。）
で示されるＤ−マンニュロン酸を表し、Ｇは次式(III) ：
【００１４】
【化６】
0004699577.tif 000004
【００１５】
（Ｒは前記と同様である。）
で示されるＬ−グルロン酸を表し、各単糖間の結合はα−又はβ−１，４結合である。）を表す。］
で示される化合物のうちの少なくとも１つが挙げられる。
【００１６】
前記式（Ｉ）においてＲで表される金属イオンとしては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属イオン、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属イオン、Zn2+、Fe2+、Fe3+が挙げられる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の好ましい実施形態の一例として、オリゴ糖としてアルギン酸オリゴ糖又はその塩を用いた場合について具体的に説明する。
本発明に用いるアルギン酸オリゴ糖又はその塩は、アルギン酸又はその塩に、アルテロモナス属に属する微生物が生産するアルギン酸又はその塩の分解酵素、即ちアルギン酸リアーゼを作用させて得ることができる。アルギン酸とは、Ｄ−マンニュロン酸とＬ−グルロン酸を構成糖とする多糖類の一つであり、その塩としては、例えばアルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム又はその混合物が挙げられる。また、アルギン酸オリゴ糖の塩としては、例えばアルギン酸ナトリウムオリゴ糖、アルギン酸カリウムオリゴ糖、アルギン酸カルシウムオリゴ糖又はその混合物が挙げられる。
【００１８】
前記アルギン酸リアーゼを生産する微生物としては、アルテロモナス属に属する微生物が挙げられ、アルテロモナス・エスピー(Alteromonas sp.) No.1786 を例示することができる。
アルテロモナス・エスピーNo.1786 は、魚介類の腸及びその内容物よりアルギン酸ナトリウムを唯一の炭素源としてスクリーニングを実施した結果、カブトガニの腸より分離されたものであり、その形態学的性質及び生理学的性質は下記の通りである。
【００１９】
（菌株の性質）
・形態学的性質
1)グラム染色性・・・・・・・陰性
2)細胞の形状・・・・・・・・桿菌
3)コロニーの色調・・・・・・乳白色
4)運動性の有無・・・・・・・有り
5)鞭毛の有無・・・・・・・・極鞭毛
・生理学的性質
1)Ｏ−Ｆテスト・・・・・・・酸化
2)オキシダーゼテスト・・・・陽性
3)ゼラチンの分解・・・・・・陽性
4)ＤＮＡの分解・・・・・・・陽性
5)好塩性・・・・・・・・・・陽性
・ＧＣ含量・・・・・・・・・49.1 mol％
【００２０】
前記の菌株の性質に基づいて清水らの方法［海洋微生物研究法、学会出版センター、p.228 〜239(1985) 参照］に従って同定を試みた結果、前記微生物（本菌株）は、アルテロモナス属に属することが判明した。尚、本菌株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、FERM BP-5201（原寄託日：平成２年８月28日）として寄託されている。
前記の性質を有する菌株を培養し、得られた培養物から通常の精製手法によってアルギン酸リアーゼを分離精製する。
【００２１】
本菌株の培養に用いる培地としては、例えば、アルギン酸ナトリウム（1.00％）、硫酸ナトリウム（1.00％）、塩化カリウム（0.08％）、硫酸マグネシウム（７水和物）（1.24％）、リン酸水素二カリウム（３水和物）（0.01％）、塩化アンモニウム（0.10％）、クエン酸アンモニウム鉄(III) （緑色）（0.01％）及び塩化カルシウム（0.15％）を含む培地が挙げられる。
培養は、例えば、凍結乾燥菌体アルテロモナス・エスピーNo.1786 を２回前培養（各々25℃、２日）後、本培養（25℃、１日）することにより行う。
【００２２】
このようにして前記微生物を培養することによって、アルギン酸リアーゼが蓄積された培養上清又は微生物を含む培養物が得られる。次に、該培養物を材料にして、蛋白質の分離、精製に用いられる方法によりアルギン酸リアーゼを得ることができる。例えば、前記培養液から分画分子量500,000 の限外濾過膜（ロミコン社製）により菌体を取り除いて粗アルギン酸リアーゼ溶液とするほか、更に、該アルギン酸リアーゼ溶液について、塩析法、遠心分離法、各種クロマトグラフィー、電気泳動法等を適当に組み合わせて精製を行ってもよい。クロマトグラフィーとしては、疎水、ゲル濾過、イオン交換、逆相、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。また、精製品の純度及びその分子量の確認のため、SDS （ラウリル硫酸ナトリウム）ポリアクリルアミド電気泳動法やゲル濾過法等を用いることもできる。
【００２３】
このようにして得られたアルギン酸リアーゼの酵素的性質は、次の通りである。
▲１▼作用：アルギン酸又はその塩を基質として前記微生物の生産するアルギン酸リアーゼを反応させた時、反応生成物であるアルギン酸オリゴ糖又はその塩の二重結合に特異的な吸収波長である230nm における吸光度の増加、及び生じるオリゴ糖による還元力の増加が確認された。
【００２４】
▲２▼至適pH：前記微生物の生産するアルギン酸リアーゼは、pH7.0 〜7.5 の範囲で相対活性量が高く、相対活性量が最大になるpH7.0 が至適pHである。
▲３▼至適温度及び熱安定性：前記微生物の生産するアルギン酸リアーゼの相対活性量は、45〜55℃の範囲で高く、相対活性量が最大になる50℃が至適温度であった。また、室温での濃縮を行っても失活しなかった。
【００２５】
▲４▼酵素活性：下記組成の反応液を用い、アルギン酸ナトリウムとアルギン酸リアーゼを50℃にて10分間反応させ、生成したオリゴ糖量をネルソン・ソモギー法により測定することにより、アルギン酸リアーゼの酵素活性を測定できる。この酵素活性は、１μmoleのマンニュロン酸に相当するアルギン酸ナトリウムオリゴ糖を生成する酵素量を１単位として示す。酵素活性測定には、アルギン酸カリウムを用いてもよい。
【００２６】
（反応液の組成）
・0.5 ％アルギン酸ナトリウム（和光純薬製）を含む0.05Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0 ） 0.45ml
・酵素液  0.05ml
【００２７】
尚、アルギン酸オリゴ糖又はその塩を製造するためには、前記菌株を通常の変異手段を適用して得られる変異株であってアルギン酸リアーゼ産生能を有する菌株を培養して得られるアルギン酸リアーゼも使用することができる。
次に、原料のアルギン酸又はその塩に、アルギン酸リアーゼを反応させてアルギン酸オリゴ糖又はその塩を得る。
【００２８】
尚、この場合、アルギン酸又はその塩とアルギン酸リアーゼとの反応温度は45〜55℃、反応時のpHが7.0 〜7.5 の条件が好ましく、50℃、pH7.0 の条件で行うのが更に好ましい。
以上のようにして得られるアルギン酸オリゴ糖又はその塩は、そのまま本発明の上皮細胞培養用培地の成分として用いることができ、また凍結乾燥、噴霧乾燥、熱風乾燥等の方法で乾燥しておくことができる。
【００２９】
本発明の上皮細胞培養用培地へのアルギン酸オリゴ糖又はその塩の添加量は培地１ml当たり、通常0.01〜50mg、好ましくは 0.1〜30mgである。
アルギン酸オリゴ糖又はその塩は、それぞれ単独で、あるいは組み合せて合成基礎培地に加え、上皮細胞の培養に用いる。
【００３０】
合成基礎培地としては、ＭＣＤＢ１５３培地、ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＢＭＥ培地(BASAL MEDIUM EAGLE)、及びＤＭＥ培地(DULBECCO'S MODIFIED EAGLE'S MEDIUM)やＩＭＤＭ培地(ISCOVE'S MODIFIED DULBECCO'S MEDIUM) のようなＢＭＥの改変培地等、一般に利用されている多くの動物細胞用培地を挙げることができる。
【００３１】
これらの合成基礎培地は、ＣａＣｌ2 、ＭｇＳＯ4 、ＫＣｌ、ＫＮＯ3 、ＮａＨＣＯ3 、ＮａＣｌ、ＮａＨ2 ＰＯ4 、Ｎａ2 Ｏ3 Ｓｅ等の無機塩類、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等のアミノ酸類、Ｄ−ビオチン、塩化コリン、葉酸、ミオ−イノシトール、ニコチンアミド、Ｄ−パントテン酸カルシウム、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ12等のビタミン類の他、更にＤ−グルコース等の糖類などの炭水化物を含むものであり、その他、必要に応じてＨＥＰＥＳ等の緩衝成分、フェノールレッド、ピルビン酸塩等を含むものである。
【００３２】
また前述した添加物の他に、ヌクレオシド類、２−ケトグルタル酸（２−オキソグルタル酸）、フルクトース、ガラクトース、グリセロリン酸、クエン酸、エタノールアミン、パラアミノ安息香酸、ＦｅＳＯ4 やヘミン等の含鉄化合物、ベンズアミジン、プトレッシン、オレイン酸やリノール酸等の不飽和脂肪酸類等の公知の細胞増殖促進剤を組み合せることができる。更に、細菌やマイコプラズマ汚染を防ぐために、ストレプトマイシン、ナイスタチン、ゲンタマイシン類、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、レボフロキサシン等の抗菌剤を組み合せることもできる。これらの公知の細胞増殖促進物質を適宜組合せることによって、本発明の上皮細胞培養用培地は無血清とすることが可能である。
【００３３】
本発明における上皮細胞の培養においては、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、リポ蛋白質のようなホルモン類や増殖因子を培地に添加してもよい。
培養条件は、対象とする上皮細胞の培養に適する条件であれば、特に制限はないが、例えば正常ヒト表皮角化細胞では、30〜37℃での４〜７日間培養が好ましく、毛根細胞では、30〜37℃での５〜10日間培養が好ましい。
【００３４】
【実施例】
以下、本発明を調製例、参考例、実施例により更に具体的に説明する。但し、本発明は、これらにより限定されるものではない。
【００３５】
（調製例１）アルギン酸塩オリゴ糖の調製
(1)アルギン酸リアーゼの調製
(培地組成)
・アルギン酸ナトリウム・・・・・・・・・・1.00％
・硫酸ナトリウム・・・・・・・・・・・・・1.00％
・塩化カリウム・・・・・・・・・・・・・・0.08％
・硫酸マグネシウム（７水和物）・・・・・・1.24％
・リン酸水素二カリウム（３水和物）・・・・0.01％
・塩化アンモニウム・・・・・・・・・・・・0.10％
・クエン酸アンモニウム鉄(III) （緑色）・・0.01％
・塩化カルシウム・・・・・・・・・・・・・0.15％
【００３６】
前記組成の培地を用い、凍結乾燥菌体アルテロモナス・エスピーNo.1786 を２回前培養 (25℃、２日) 後、本培養 (25℃、１日) を行った。その結果、酵素活性が培養液１ml当たり、0.90単位であるアルギン酸リアーゼ培養液が生産された。
前記培養液から分画分子量500,000 限外濾過膜 (ロミコン社製) により菌体を取り除いて粗アルギン酸リアーゼ溶液とした。
【００３７】
(2) アルギン酸ナトリウムオリゴ糖及びアルギン酸カリウムオリゴ糖の製造
アルギン酸ナトリウム (10.0kg) を90L の脱塩水に溶解後、前記(1) で得られた粗アルギン酸リアーゼ溶液 (50,000U)を加え、40℃で６時間撹拌しながら反応させた。反応液を除蛋白、脱塩後、凍結乾燥してアルギン酸ナトリウムオリゴ糖粉末を4.2kg 得た。
【００３８】
尚、同様にしてアルギン酸カリウム、又はアルギン酸カリウムとアルギン酸ナトリウムとの混合物を用いれば、それぞれアルギン酸カリウムオリゴ糖、又はアルギン酸カリウムオリゴ糖とアルギン酸ナトリウムオリゴ糖との混合物が得られる。
【００３９】
(3) アルギン酸カルシウムオリゴ糖の製造
(2) で得られたアルギン酸ナトリウムオリゴ糖及びアルギン酸カリウムオリゴ糖を、酢酸カルシウムをはじめとする各種の水溶性のカルシウム塩と一緒に電気透析装置 (旭化成工業 (株) 製、商品名、マイクロアシライザー) で処理することによりアルギン酸カルシウムオリゴ糖が得られた。
【００４０】
（参考例１）
本参考例は、本発明に用いるアルギン酸ナトリウムオリゴ糖の重合度の分析例を示すものである。
重合度の決定は、マス分析及びＮＭＲ分析により行った。マス分析には、ジャスコインタナショナル（株）製の液体クロマトグラフ質量分析装置を用い、ＮＭＲ分析には日本電子（株）製を用いた。
【００４１】
次に、調製例１で得たアルギン酸ナトリウムオリゴ糖をDEAE GLASS（ナカライテスク社製）を用いたNaClによる０〜0.25M グラジエント溶出による高速液体クロマトグラフィー（HPLC) に供し、フラクションコレクターで分画した。この溶出パターンを図１に示す。230nm に吸収のある画分１〜８（以下、それぞれ「Ｐ−１」、「Ｐ−２」、・・・「Ｐ−８」とする。）を回収し、それぞれの画分を電気透析装置 (旭化成工業 (株) 製、商品名、マイクロアシライザー) で脱塩した。また、その画分を同じクロマト条件で再びクロマトグラフィーに付すると、表１に示す性質を有するオリゴ糖を得ることができた。そのオリゴ糖をマス分析に供した結果、表１に示すようなｍ／ｚのピークが検出され、そのｍ／ｚ値よりそれぞれ重合度を推定した。更に、ＮＭＲ分析を行ったところ、図２に示すように、当該アルギン酸ナトリウムオリゴ糖の構造が示された。図２中、△は４，５−不飽和ウロン酸を表し、Ｍ及びＧは、それぞれ前記式(II)で示されるＤ−マンニュロン酸、式(III) で示されるＬ−グルロン酸を表す。また、本参考例では、式(I) 、(II)及び(III) 中Ｒがナトリウムである化合物を用いた。なお、アルギン酸カリウムオリゴ糖及びアルギン酸カルシウムオリゴ糖の構造も同一の構造であった。また、各単糖間の結合は、α−又はβ−１，４結合である。
【００４２】
【表１】
0004699577.tif 000005
【００４３】
（実施例１）正常ヒト表皮角化細胞増殖試験（１）
日水製薬（株) 製の正常ヒト表皮角化細胞培養キットを用い、ヒト表皮角化細胞用培地中のＢＰＥの代替の可能性を調べるため、以下の試験を行った。
凍結した正常ヒト表皮角化細胞を融解後、表２に示す組成の表皮角化細胞用無血清培地（日水製薬（株) 製）で培養し、更に２回継代した。
【００４４】
【表２】
表皮角化細胞用無血清培地の組成

▲１▼無血清基礎培地 (mg/ml)
ＭＣＤＢ１５３培地改変処方末        9.770
（亜セレン酸ナトリウム              0.000005188 ）
インスリン                          0.005
トランスフェリン                    0.01
ヒドロコルチゾン                    0.0004
3,3',5-トリヨード-L-チロニン (ナトリウム塩)      0.0000679
エタノールアミン                    0.006108
Ｏ−ホスホエタノールアミン          0.01411
ＨＥＰＥＳ                          6.6724
炭酸ナトリウム                      1.17614
イソブチルメチルキサンチン          0.0067
(+)-イソプロテレノール重酒石酸塩    0.0004
酢酸レチノール                      0.0003285
１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液          0.013ml
プロゲステロン                      0.00000063 
▲２▼上皮増殖因子（ＥＧＦ）(mg/ml)     0.00001
▲３▼ＢＰＥ (mg/ml)                    0.15 
【００４５】
次いで、３回目に継代する細胞をＢＰＥを除いた前記無血清培地で十分洗浄した後、もとの無血清培地（ＢＰＥを含む）と当該無血清培地にＢＰＥの替わりにアルギン酸オリゴ糖（調製例１で得たアルギン酸ナトリウムオリゴ糖を使用）を無菌的に加えた無血清培地（アルギン酸オリゴ糖含量0.1 、1.0 、10mg/ml ）に植菌して、37℃で７日間培養して、細胞数を計測した。細胞数の測定は、3H−チミジンのＤＮＡへの取り込み量で行った。この試験は３回繰り返しその平均値を表３に示した。その結果、アルギン酸オリゴ糖（10mg/ml ）とＢＰＥ (0.15mg/ml)は同程度であり、ＢＰＥの代替としてアルギン酸オリゴ糖を用いることが可能であることが明らかになり、これにより全ての成分が明らかになった完全合成培地を調製できることが明らかになった。
【００４６】
【表３】
0004699577.tif 000006
【００４７】
（実施例２）正常ヒト表皮角化細胞増殖試験（２）
日水製薬（株) 製の正常ヒト表皮角化細胞培養キットを用い、ヒト表皮角化細胞用培地中のＢＰＥの代替の可能性を調べるため、以下の試験を行った。
【００４８】
凍結した正常ヒト表皮角化細胞を融解後、表２に示す組成の表皮角化細胞用無血清培地で培養し、更に２回継代した。そして、３回目に継代する細胞をＢＰＥを除いた前記無血清培地で十分洗浄した後、表２に示す組成の無血清培地においてＢＰＥの替わりにHPLCでピークごとに分画したアルギン酸オリゴ糖（P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8）を無菌的に加えた無血清培地（アルギン酸オリゴ糖含量1.0mg/ml）に植菌して、37℃で７日間培養して、細胞数を計測した。細胞数の測定は、トリパンブルーを用いた色素排除法により行い、この試験は３回繰り返しその平均値を表４に示した。その結果、アルギン酸オリゴ糖のP1、P4、P6、P7に活性が高いことが明らかになった。
【００４９】
【表４】
0004699577.tif 000007
【００５０】
【発明の効果】
本発明により、安全で安定な上皮細胞の培養が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】アルギン酸ナトリウムオリゴ糖のHPLCの結果を示す図である。
【図２】図１に示すHPLCの各ピークより単離されたアルギン酸ナトリウムオリゴ糖の構造を示す図である。
【図１】
0004699577.tif 000011
【図２】
0004699577.tif 000012