(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−７６８０で寄託されたハイブリドーマ細胞株により生成されたモノクローナル抗体であって、ｃＭｅｔ肝細胞成長因子受容体（Ｍｅｔ）に結合するモノクローナル抗体（Ｍｅｔ−特異的ｍＡｂ）、または該Ｍｅｔ−特異的ｍＡｂの抗原結合フラグメント。
【請求項２】
配列番号：１のアミノ酸２３６−２３９でｃＭｅｔ肝細胞成長因子受容体（Ｍｅｔ）に結合する、単離されたＭｅｔ−特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、または該Ｍｅｔ−特異的ｍＡｂの抗原結合フラグメント。
【請求項３】
（ａ）請求項１または２に記載のＭｅｔ−特異的ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメント、および
（ｂ）診断的に許容される担体または賦形剤
を含む組成物。
【請求項４】
前記Ｍｅｔ−特異的ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメントは、検出可能な部分に連結されている、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
（ａ）請求項１または２に記載のＭｅｔ−特異的ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメントを含む第１容器；（ｂ）該Ｍｅｔ−特異的ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメントのための担体を含む第２容器；および（ｃ）該Ｍｅｔ−特異的ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメントを使用して、試料中のＭｅｔを検出または測定するため、あるいはＭｅｔ−関連疾患を診断するための説明書；を含むキット。
【請求項６】
前記Ｍｅｔ−特異的ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメントが検出可能な部分に連結されている、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記Ｍｅｔ−特異的ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメントに特異的であり、そして該Ｍｅｔ−特異的ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメントに結合する、第２抗体またはその抗原結合フラグメントをさらに含む、請求項５に記載のキット。
【請求項８】
前記第２抗体が検出可能な部分で標識される、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
対象由来の組織試料または別の生物学的試料中のＭｅｔの存在を検出するための方法であって、
（ａ）該試料を請求項３に記載の組成物と接触させる工程；および（ｂ）該試料へのＭｅｔ−特異的ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメントの結合を検出する工程であって、該Ｍｅｔ−特異的ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメントの結合は、該試料中でのＭｅｔの存在を示す、工程
を含む、方法。
【請求項１０】
前記試料が、前記接触させる工程（ａ）の前に、ホルムアルデヒドを用いた処理により固定されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
対象における、増加したＭｅｔ発現を有する癌の診断を補助する方法であって、
（ａ）該対象由来の、Ｍｅｔを発現することが疑われる組織試料または他の生物学的試料を、請求項３に記載の組成物と接触させる工程；
（ｂ）Ｍｅｔ−特異的ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメントの該試料への結合を、検出または測定し、それによって該試料中のＭｅｔの存在またはレベルを判定する工程；ならびに
（ｃ）（ｂ）において判定されたＭｅｔのレベルを、変化したＭｅｔ発現を有する疾患を有さない健常な対象由来の対応する対照試料におけるＭｅｔのレベルと比較する工程；
を含み、ここで
（ｉ）該対照試料におけるＭｅｔの非存在と比較した、工程（ｂ）において判定されたＭｅｔの存在、または
（ｉｉ）該対照試料におけるＭｅｔのレベルと比較した、工程（ｂ）において判定されたＭｅｔの増加したレベル
は、増加したＭｅｔ発現を有する癌の兆候を示す、方法。
【請求項１２】
前記試料が、前記接触させる工程（ａ）の前に、ホルムアルデヒドを用いた処理により固定されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−７６８０で寄託されたハイブリドーマ細胞株。
【請求項１４】
前記Ｍｅｔ−特異的ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメントが検出可能な部分に連結されている、請求項１または２に記載のＭｅｔ−特異的ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
前記Ｍｅｔ−特異的ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメントが検出可能な部分に連結されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料が、前記接触させる工程（ａ）の前に、ホルムアルデヒドを用いた処理により固定されている、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子診断および医薬の分野である。
【背景技術】
【０００２】
ｃ−Ｍｅｔ受容体キナーゼは発達および恒常性維持の間の細胞増殖、遊走、分化および分枝形態形成を調節する１−３。Ｍｅｔはまた種々のヒト原発性固形腫瘍およびその転移物の細胞表面上でも発現される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖａｉ．ｏｒｇ／ｍｅｔ／）。ヒトＭｅｔの細胞外ドメインのアミノ酸配列を配列番号：１、アミノ酸２５−５６７にて提供する。その活性化状態では、Ｍｅｔ受容体が複数のシグナル伝達経路を通して癌細胞の成長、浸潤および転移を制御する４。いくつかの癌細胞系では、サイレンシングによるＭｅｔ発現の喪失がアポトーシスを促進し、Ｍｅｔが生存に必要であることを実証している５−７。Ｍｅｔ活性はキナーゼまたは膜近傍ドメインにおける変異により８−１１、過剰発現により１２，１３、またはそのリガンド、肝細胞成長因子（ＨＧＦ／ＳＦ）への結合により１４、１５増大する。リガンド非依存性Ｍｅｔ活性化を刺激する、生殖系列におけるＭｅｔの活性化変異は遺伝性乳頭状腎細胞癌の発達の原因である１０。癌細胞では、変異Ｍｅｔアレルの選択的な増幅が全体的なＭｅｔキナーゼ活性をさらに増強する１６。Ｍｅｔ発現の大きさにより多くの癌型の侵襲性が予測される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖａｉ．ｏｒｇ／ｍｅｔ／）。Ｍｅｔタンパク質発現の正確な検出および定量が、Ｍｅｔ阻害剤に応答する可能性のある癌を同定するために必要であり、そしてかかる分子診断の開発は薬物開発に大きく遅れを取る。
【０００３】
ｃ−Ｍｅｔの高レベル発現は、乳房、胃、子宮頸部、肝細胞ならびに頭頸部を含む多くの癌型における芳しくない予後に関連している１７−２２。卵巣癌のおよそ２５％および神経膠腫の１１％が高レベルのｃ−Ｍｅｔを発現する。乳癌では、Ｈｅｒ２に非依存性の癌のサブセットにおいてｃ−Ｍｅｔ発現が観察されるが、細胞増殖の増大に関連する２３、２４。乳管癌では、シンデカン−１、Ｅ−カドヘリンおよびｃ−Ｍｅｔの同時発現が血管新生およびリンパ脈管新生を増強する２５。ｃ−Ｍｅｔ発現に関連する任意の疾患を本明細書では「Ｍｅｔ−関連疾患」と称する。しかしながら免疫組織化学研究の信頼性は、たいていの研究で用いられている、ｃ−Ｍｅｔ受容体におけるＣ末端ペプチドに対して上昇させた抗血清のロット間変動性に鑑みて疑問視されている２６。たいていの市販により入手可能なＭｅｔ抗体は信頼できない（またはその信頼性に関して厳密に試験されていない）。ｃ−Ｍｅｔ発現の増大に加えて、腫瘍微小環境におけるＨＧＦ／ＳＦ濃度の上昇もまた悪性の転帰に関連している。例えば膵臓癌における低酸素性腫瘍間質細胞はＨＧＦ分泌を増大させ、そして膵臓癌進行を加速させる２７。
【０００４】
操作されたｃ−ＭｅｔおよびＨＧＦ発現を伴う間葉細胞系は高度に転移性であり、そして細胞系における変異体ｃ−Ｍｅｔ受容体の発現またはｃ−Ｍｅｔ遺伝子座の増幅は癌の増殖性、浸潤性および転移性表現型を増大させる６、２８−３０。野生型ｃ−ＭｅｔはＭｙｃと一緒に乳房の発癌を引き起こす３１。ｃ−Ｍｅｔは進行したヒト癌において最も頻繁に遺伝的に改変されているか、またはそうでなければ調節不全になっている受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の１つであり、そして故に魅力的な処置標的を表す。キナーゼ活性化ｃ−Ｍｅｔ変異は孤発性腎、肺、頭頸部、肝細胞癌腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌およびメラノーマにおいて観察される１３、３２−３５。さらにｃ−Ｍｅｔ遺伝子座の増幅は胃、転移性結腸直腸および食道腺癌１２、１３、さらなるＭｅｔ関連疾患において検出されている。癌細胞におけるｃ−Ｍｅｔの活性化はＶＥＧＦＡおよびＩＬ−８のような血管新生因子の分泌を誘起し、そしてトロンボスポンジン−１、抗血管新生因子の合成を阻害する３６、３７。加えて、内皮細胞におけるｃ−Ｍｅｔ活性化は血管新生を引き起こす。Ｍｅｔ活性阻害の細胞毒性効果は、活性化ｃ−Ｍｅｔを伴う癌においてのみ生じ得るが、抗血管新生効果はさらに頻繁に存在し得る。
【０００５】
経口で生理活性のあるｃ−Ｍｅｔの小型分子阻害剤（「Ｍｅｔ阻害薬」）の開発と共に大きな進歩を生じた。これらの阻害剤のうち、ＰＦ−２３４１０６６はｃ−Ｍｅｔおよび未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）の阻害に関する特異性を実証し、そして５０  ｍｇ／ｋｇ／日の用量でＧＴＬ−１６胃癌異種移植片およびＮＣＩ−Ｈ４４１  ＮＳＣＬＣ異種移植片の退縮に至る３８。この用量で、ｃ−Ｍｅｔは完全に阻害され、そして長期間の最大薬物効果が達成される。単腕抗ｃ−Ｍｅｔ抗体および小型分子キナーゼ阻害剤での前臨床研究７、３９、４０、ならびに患者における初期臨床研究により種々の癌型に対するｃ−Ｍｅｔ阻害剤の有望性、その好ましい薬物動態特性および低い毒性がさらに強調される。故に活性なＭｅｔを枢軸とする癌を処置するために使用する場合、これらの薬物は多くの癌患者にとって実に利益になり得る。しかしながら活性Ｍｅｔ経路を保有する癌を同定するために利用可能な分子診断手段はない。
【０００６】
発現を検出し、そしてキナーゼ阻害剤の処置標的の活性化状態を決定するための分子診断が癌患者の処置を改善するために緊急に必要とされる。細胞表面受容体に結合するか、または細胞に浸透し、そして受容体および非受容体キナーゼを阻害する薬物は臨床において多大な有望性を示すが、ヒト癌における対応する標的の検出は大きな挑戦をもたらす。Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ発現の定量的測定のためのハーセプト（Ｈｅｒｃｅｐｔ）試験は日常的な臨床試料における使用およびＦＤＡ承認のために、長期にわたり、そして厄介な開発を必要とするのに加えて、受容体または非受容体タンパク質キナーゼ発現に関して検証された、利用可能な診断試験はない。これらの診断試薬の開発における困難は、キナーゼの低レベル発現、不安定な活性化状態に起因し、それはタンパク質リン酸化、およびキナーゼ活性を示すたいていのホスホエピトープに対する抗体の芳しくない特異性に依存する。結果的にたいていの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）には、患者の癌から最も一般的に得られる組織調製物であるホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織における発現測定のための検出試薬がない。キナーゼ阻害剤での処置に関する患者の満足は、この群の薬剤の抗新生物活性での成功に極めて重要であることがますます明白になってきている。所定の固形腫瘍型に関して、薬物応答性標的タンパク質を発現する癌の頻度は小さい。故に処置のための患者が注意深く選択されない場合、多くの薬剤がフェーズＩＩおよびフェーズＩＩＩ臨床試験で有効性を実証するのに失敗するであろう。
【０００７】
芳しくない試薬選択、ＦＦＰＥ組織におけるｃ−Ｍｅｔ抗体の性能の不十分な検証およびホルマリン固定に対するｃ−Ｍｅｔの感受性のために、ｃ−Ｍｅｔ受容体はＦＦＰＥ組織において測定することがとりわけ困難である。臨床における新規ｃ−Ｍｅｔ阻害剤が有望であるとすると、これらの薬剤から利益を得る可能性のある患者を同定するためにコンパニオン診断が必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−７６８０で寄託されたハイブリドーマ細胞系により生成されたモノクローナル抗体「Ｍｅｔ４」を含む。本発明はまた該Ｍｅｔ４抗体の抗原結合フラグメントまたは誘導体を含む。また本発明はＭｅｔに対する結合に関してＭｅｔ４と競合する抗Ｍｅｔ抗体または該抗体のフラグメントもしくは誘導体を含む。さらに本発明はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−７６８０で寄託されたハイブリドーマ細胞系により生成されたモノクローナル抗体の同定的な生物学的特徴を全て有するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体；Ｍｅｔに特異的なモノクローナル抗体、ここで該抗体の重鎖および／もしくは軽鎖可変領域または該可変領域の抗原結合部位はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−７６８０で寄託されたハイブリドーマ細胞系により生成されたモノクローナル抗体の対応する領域または部位の同定的な生物学的または構造的特徴を全て有する；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−７６８０で寄託されたハイブリドーマ細胞系により生成されたモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合するＭｅｔに特異的なモノクローナル抗体（または該抗体の抗原結合フラグメントもしくは誘導体）；配列番号：１で２３６−２４２として同定されたアミノ酸を含むポリペプチドに結合するモノクローナル抗体または該抗体の抗原結合フラグメントもしくは誘導体；および配列番号：１で２３６−２３９として同定されたアミノ酸を含むポリペプチドに結合するモノクローナル抗体または該抗体の抗原結合フラグメントもしくは誘導体を含む。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受け入れ番号ＰＴＡ−７６８０で寄託されたハイブリドーマ細胞株により生成されたモノクローナル抗体または該抗体のフラグメントもしくは誘導体。
（項目２）
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受け入れ番号ＰＴＡ−７６８０で寄託されたハイブリドーマ細胞株により生成されたモノクローナル抗体である第２抗体とＭｅｔに対する結合に関して競合する抗体または該抗体のフラグメントもしくは誘導体。
（項目３）
項目１に記載のモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体の同定的な生物学的特徴を全て有するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体。
（項目４）
Ｍｅｔに特異的なモノクローナル抗体であって、該抗体の重鎖および／もしくは軽鎖可変領域または該可変領域の抗原結合部位が項目１に記載のモノクローナル抗体の対応する領域または部位の同定的な生物学的または構造的特徴を全て有する、モノクローナル抗体。
（項目５）
項目１に記載のモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗Ｍｅｔ抗体Ｍｅｔまたは該抗体のフラグメントもしくは誘導体。
（項目６）
配列番号：１でアミノ酸２３６−２４２として同定されたアミノ酸からなるポリペプチドに結合する抗体または該抗体のフラグメントもしくは誘導体。
（項目７）
配列番号：１でアミノ酸２３６−２３９として同定されたアミノ酸からなるポリペプチドに結合する抗体または該抗体のフラグメントもしくは誘導体。
（項目８）
項目１〜７から選択されるモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体を含む組成物。
（項目９）
モノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体が検出可能な部分に連結されている項目８に記載の組成物。
（項目１０）
（ａ）項目８に記載の組成物；および（ｂ）担体；を含む診断的に有用な組成物。
（項目１１）
モノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体が検出可能な部分に連結されている項目１０に記載の組成物。
（項目１２）
（ａ）項目１に記載の抗体、フラグメントまたは誘導体を含む第１容器；（ｂ）担体を含む第２容器；および（ｃ）Ｍｅｔを検出、診断、予後診断またはＭｅｔ阻害薬を評価するために抗体を使用するための説明書；を含むキット。
（項目１３）
前記モノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体が検出可能な部分に連結されている項目１２に記載のキット。
（項目１４）
前記第１容器からのモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体に結合する第２のモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体をさらに含む項目１２に記載のキット。
（項目１５）
前記第２抗体が検出可能な部分に連結されている項目１４に記載のキット。
（項目１６）
さらにＭｅｔ阻害薬を含む項目１２に記載のキット。
（項目１７）
（ａ）Ｍｅｔを発現することが疑われる組織または試料を提供すること；（ｂ）項目８に記載の組成物を提供すること；（ｃ）該組織または試料を項目８に記載の組成物と接触させること；および（ｄ）該組織または試料中のＭｅｔの存在を検出すること；の工程を含むＭｅｔを発現することが疑われる組織または生物学的試料中のＭｅｔの存在を検出するための方法。
（項目１８）
前記組織または生物学的試料がホルムアルデヒドの溶液中で固定されている項目１７に記載の方法。
（項目１９）
（ａ）Ｍｅｔ関連疾患を有するかまたは有することが疑われる患者から組織または生物学的試料を入手すること；（ｂ）項目８に記載の組成物を提供すること；（ｃ）該組織または生物学的試料を項目８に記載の組成物と接触させること；（ｄ）該組織または試料中のＭｅｔの発現レベルを決定すること；および（ｅ）該発現レベルを適当な対照と比較すること；の工程を含む、該患者におけるＭｅｔ関連疾患を診断または予後診断する方法。
（項目２０）
前記組織または生物学的試料がホルムアルデヒドの溶液中で固定されている項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記Ｍｅｔ関連疾患が癌である項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記Ｍｅｔ関連疾患が卵巣癌である項目２１に記載の方法。
（項目２３）
（ａ）Ｍｅｔ関連の癌を有する患者から第１組織試料を入手すること；（ｂ）Ｍｅｔ阻害薬で患者を処置すること；（ｃ）該患者から処置後組織を入手すること；（ｄ）項目８に記載の組成物を提供すること；（ｅ）該第１組織または生物学的試料および該処置後組織または試料の各々を項目８に記載の組成物と接触させること；（ｆ）該第１組織または生物学的試料および該処置後組織または試料の各々におけるＭｅｔの発現レベルを決定すること；ならびに（ｇ）該第１組織または生物学的試料のＭｅｔ発現レベルを該処置後組織または試料のＭｅｔ発現レベルと比較して該Ｍｅｔ阻害薬の有効性を決定すること；の工程を含む、Ｍｅｔ阻害薬の有効性を決定するための方法。
（項目２４）
前記第１組織または生物学的試料および前記処置後組織または試料の各々がホルムアルデヒドの溶液中で固定されている項目２３に記載の方法。
（項目２５）
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受け入れ番号ＰＴＡ−７６８０で寄託されたハイブリドーマ細胞株。
（項目２６）
ホルムアルデヒド溶液で処理されている抗原に結合する抗体を同定する方法であって、抗原を提供すること；該抗原をホルムアルデヒド溶液で処理すること；該処理された抗原を抗体、そのフラグメントまたは誘導体と接触させること；および該抗体を試験して該抗体が該処理された抗原に結合するかどうかを決定すること；の工程を含む、方法。
（項目２７）
前記ホルムアルデヒド溶液がホルマリンである項目２６に記載の方法。
【０００９】
別の発明は先行の段落にて記載されたモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体のいずれかを含んでなる組成物を含む。この組成物のモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体を検出可能な部分に連結させることができる。
【００１０】
さらに本発明は先行の段落の組成物を伴う診断的に有用な組成物；および診断的に許容される担体または賦形剤を含む。またこの組成物と共にモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体を検出可能な部分に連結させることができる。
【００１１】
さらなる発明は：（ａ）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−７６８０で寄託されたハイブリドーマ細胞系により生成されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体を伴う第１容器；（ｂ）診断的に、または医薬的に許容される担体または賦形剤を伴う第２容器；および（ｃ）Ｍｅｔを検出、診断、予後診断またはＭｅｔ阻害薬を評価するために抗体を使用するための説明書；を有するキットを含む。このキットを用いてモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体を検出可能な部分に連結させることができる。またこのキットは第２モノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体を含むことができ；その第２モノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体は第１容器からのモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体に結合し、そして第２抗体を検出可能な部分で標識できる。さらにこれはまたＭｅｔ阻害薬を含むこともできる。
【００１２】
本発明はまたいくつかの方法を含む。第１はＭｅｔを発現することが疑われる組織または生物学的試料中のＭｅｔの存在を検出するための方法であり、（ａ）Ｍｅｔを発現することが疑われる組織または試料を提供すること；（ｂ）本明細書に記載される本発明の組成物を提供すること；（ｃ）組織または試料をこの組成物と接触させること；および（ｄ）組織または試料中のＭｅｔの存在を検出すること；の工程を含んでなる。第２は：（ａ）Ｍｅｔ関連疾患を有するかまたは有することが疑われる患者から組織または生物学的試料を入手すること；（ｂ）本明細書に記載される本発明の組成物を提供すること；（ｃ）組織または生物学的試料をこの組成物と接触させること；（ｄ）組織または試料中のＭｅｔの発現レベルを決定すること；および（ｅ）発現レベルを適当な対照と比較すること；の工程を含んでなる、該患者におけるＭｅｔ関連疾患を診断または予後診断する方法である。Ｍｅｔ関連疾患は癌でよく、そして癌は卵巣癌でよい、最後は：（ａ）Ｍｅｔ関連の癌を有する患者から第１組織試料を入手すること；（ｂ）Ｍｅｔ阻害薬で患者を処置すること；（ｃ）患者から処置後組織を入手すること；（ｄ）本明細書に記載される本発明の組成物を提供すること；（ｅ）第１組織または生物学的試料および処置後組織または試料の各々をこの組成物と接触させること；（ｆ）第１組織または生物学的試料および処置後組織または試料の各々におけるＭｅｔの発現レベルを決定すること；ならびに（ｇ）第１組織または生物学的試料のＭｅｔ発現レベルを処置後組織または試料のＭｅｔ発現レベルと比較して該Ｍｅｔ阻害薬の有効性を決定すること；の工程を含んでなる、Ｍｅｔ阻害薬の有効性を決定するための方法である。これらの方法の各々において、組織または生物学的試料もしくは複数の試料はホルマリン固定されていてよい。
【００１３】
別の発明はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−７６８０で寄託されたハイブリドーマ細胞系を含む。
【００１４】
本発明のこれらのおよびその他の特色、利点および目的は以下の明細書、請求の範囲および添付の図面を参照することにより当業者によりさらに理解され、そして認められよう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｍｅｔ４の特異性を示す。図１Ａおよび１ＢはＭｅｔ４（パネルＡ）またはＣ２８（パネルＢ）で染色されたＦＦＰＥ組織ブロックの切片を示す。Ｍｅｔ発現は基底上皮細胞（長い矢軸で閉じた矢尻）、内皮細胞（閉じた矢尻、矢軸なし）において、および分泌細胞の側底膜（長い矢、および開いた矢尻）において特異的に生じる。図１Ｃから１ＦはＭｅｔ４およびＣ２８での免疫蛍光染色を示す。胃癌ＭＫＮ４５細胞（Ｍｅｔ陽性）およびＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｍｅｔ陰性）を同時培養し、そしてホルマリンで固定した。図１ＣはＭｅｔ４を示し；図１Ｄは明視野（Ｂｒｉｇｈｆｉｅｌｄ）を示し；図１ＥはＭｅｔ  Ｃ２８を示し；そして図１Ｆは図１Ｃおよび１Ｅの重ね合わせである。
【図２】Ｍｅｔ４エピトープを特徴付けするウェスタンブロットである。Ｍｅｔ陽性ＩＧＲＯＶ１またはＭｅｔ陰性Ａ２７８０卵巣癌細胞の細胞ライゼート中のタンパク質をウェスタンブロッティングした。ニトロセルロース膜を１０％ホルマリンで処理するか、抗原回復溶液（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中で煮沸するか、または双方の処理に逐次的に供する。処理した膜をＭｅｔ４でプロービングし、そして化学発光を用いて展開した。ＬＣ：負荷対照。
【図３Ａ】ホルマリン固定卵巣癌細胞系におけるＭｅｔ４およびＭｅｔ  Ｃ−２８反応性を比較する。図３ＡはＭｅｔ  Ｃ−２８でプロービングした卵巣癌細胞系のウェスタンブロットである。ＬＣ：負荷対照。観察されたタンパク質発現に応じたＲＮＡ発現結果を図６に示す。図３Ｂは卵巣癌細胞系からのＦＦＰＥ細胞ペレットのＣ２８およびＭｅｔ４での免疫組織化学染色を示す。茶色は陽性Ｍｅｔ受容体発現を示す。注目すべきことに、全ての細胞系がＭｅｔ  Ｃ−２８で染色される。対照的にＭｅｔ４反応性はウェスタンブロットで測定されたＭｅｔ発現と相関する。図３Ｃはウェスタンブロットのシグナル強度とＩＨＣ測定値との間の相関性を示す。ウェスタンブロットを３Ｄ４モノクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）でプロービングし、そしてＬＩＣＯＲシステムを用いてｃ−Ｍｅｔ発現を定量した。１：５００希釈（４  μｇ／ｍｌ）のＭｅｔ４でＩＨＣを実施した。ピアソン相関係数は０．６０２である。
【図３Ｂ】ホルマリン固定卵巣癌細胞系におけるＭｅｔ４およびＭｅｔ  Ｃ−２８反応性を比較する。図３ＡはＭｅｔ  Ｃ−２８でプロービングした卵巣癌細胞系のウェスタンブロットである。ＬＣ：負荷対照。観察されたタンパク質発現に応じたＲＮＡ発現結果を図６に示す。図３Ｂは卵巣癌細胞系からのＦＦＰＥ細胞ペレットのＣ２８およびＭｅｔ４での免疫組織化学染色を示す。茶色は陽性Ｍｅｔ受容体発現を示す。注目すべきことに、全ての細胞系がＭｅｔ  Ｃ−２８で染色される。対照的にＭｅｔ４反応性はウェスタンブロットで測定されたＭｅｔ発現と相関する。図３Ｃはウェスタンブロットのシグナル強度とＩＨＣ測定値との間の相関性を示す。ウェスタンブロットを３Ｄ４モノクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）でプロービングし、そしてＬＩＣＯＲシステムを用いてｃ−Ｍｅｔ発現を定量した。１：５００希釈（４  μｇ／ｍｌ）のＭｅｔ４でＩＨＣを実施した。ピアソン相関係数は０．６０２である。
【図３Ｃ】ホルマリン固定卵巣癌細胞系におけるＭｅｔ４およびＭｅｔ  Ｃ−２８反応性を比較する。図３ＡはＭｅｔ  Ｃ−２８でプロービングした卵巣癌細胞系のウェスタンブロットである。ＬＣ：負荷対照。観察されたタンパク質発現に応じたＲＮＡ発現結果を図６に示す。図３Ｂは卵巣癌細胞系からのＦＦＰＥ細胞ペレットのＣ２８およびＭｅｔ４での免疫組織化学染色を示す。茶色は陽性Ｍｅｔ受容体発現を示す。注目すべきことに、全ての細胞系がＭｅｔ  Ｃ−２８で染色される。対照的にＭｅｔ４反応性はウェスタンブロットで測定されたＭｅｔ発現と相関する。図３Ｃはウェスタンブロットのシグナル強度とＩＨＣ測定値との間の相関性を示す。ウェスタンブロットを３Ｄ４モノクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）でプロービングし、そしてＬＩＣＯＲシステムを用いてｃ−Ｍｅｔ発現を定量した。１：５００希釈（４  μｇ／ｍｌ）のＭｅｔ４でＩＨＣを実施した。ピアソン相関係数は０．６０２である。
【図４】ホルマリン固定細胞系におけるＭｅｔ４結合の特異性を示す。図４ＡはＭｅｔ  Ｃ−２８でプロービングした卵巣癌細胞系のウェスタンブロットである。β−チューブリンを負荷対照として用いる。図４ＢはＭｅｔ４でのＦＦＰＥ細胞ペレットの免疫組織化学染色を示す。茶色は陽性Ｍｅｔ受容体発現を示す。Ｕ１１８：神経膠芽腫、ＳＷ１７８３：神経膠芽腫、Ｕ３７３：神経膠芽腫、ＮＩＨ３Ｔ３：マウス線維芽細胞、ＤＢＴＲＧ：神経膠芽腫、Ｕ８７：神経膠芽腫、Ｓ１１４：ＨＧＦ／ＳＦおよびＭｅｔ２３に関するヒト遺伝子でトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＭＣＦ７：乳癌。
【図５】卵巣癌および神経膠芽腫におけるＭｅｔ４反応性を示す。卵巣癌の切片（図５Ａ）または神経膠腫組織マイクロアレイ（図５Ｂ）をＭｅｔ４で染色した。４００倍の拡大率で画像を撮影した。前立腺組織の陰性および陽性対照を各染色に含め、そして図３Ｂ（右下パネル）に示す。組織染色の要旨を表２および３に示す。
【図６】卵巣癌細胞系におけるＭｅｔ  ＲＮＡ発現を示すブロットである。卵巣癌細胞系からＲＮＡを単離した。Ｍｅｔキナーゼドメイン内のフラグメントを逆転写されたＲＮＡから増幅し、３２サイクル増幅し、そしてアガロースゲル上で可視化した。
【図７】ファージディスプレイペプチドライブラリーでのパニングを示す。
【図８】Ｍｅｔ４のエピトープをマッピングするための手順のフローダイアグラムである。
【図９】野生型Ｍ１３と比較したファージディスプレイ１２ライブラリーから回収されたＭｅｔ４特異的ファージクローンのＥＬＩＳＡからのＯＤ４５０  ｎｍ値を示す棒グラフである。
【図１０Ａ】ペプチド１および２の存在下のＭｅｔ４およびＲＡ４Ｅの競合ＥＬＩＳＡを示す。図１０Ａは連続希釈されたペプチド１の存在下のＭｅｔ４（１：１００００）ＥＬＩＳＡを示す（モル比Ｍｅｔ４の１０から３２０倍）。
【図１０Ｂ】ペプチド１および２の存在下のＭｅｔ４およびＲＡ４Ｅの競合ＥＬＩＳＡを示す。図１０Ｂはペプチド１および２の存在下のＭｅｔ４  ＥＬＩＳＡを示す。
【図１０Ｃ】ペプチド１および２の存在下のＭｅｔ４およびＲＡ４Ｅの競合ＥＬＩＳＡを示す。図１０Ｃはペプチド１および２の存在下のＲＡ４Ｅ  ＥＬＩＳＡを示す。
【図１１】ＭＫＮ４５およびＮＩＨ３Ｔ３細胞上のＭｅｔ４およびＲＡ４Ｅの免疫蛍光染色を示す。図１１Ａ：赤、Ｍｅｔ４；および緑、Ｃ２８。図１１Ｂ：赤、Ｍｅｔ４；緑、ＲＡ４Ｅ。図１１Ｃ：赤、Ｍｅｔ４＋ペプチド１；緑、ＲＡ４Ｅ＋ペプチド１。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明の好ましい実施態様は以下の具体的な実施態様の詳細な記載ならびに本明細書後記に含まれる実施例および配列表を参照することによりさらに容易に理解され得る。
【００１７】
本出願で参照される全ての参考文献、特許、特許公報、論文およびデータベースは、各々があたかも具体的におよび個々に出典明示により本明細書の一部とされるように、その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とされる。
【００１８】
別に特記されない場合、本明細書にて使用される全ての技術的および科学的用語は本発明が属する分野の当業者により一般的に理解される意味を有する。
【００１９】
任意の適当な方法（例えばＢｅｒｚｏｆｓｋｙら、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ，ＷＥ編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ニューヨーク州（１９８４）、Ｋｕｂｙ、Ｊａｍｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ニューヨーク州（１９９２）およびそこに記載される方法）を用いて抗原に関する抗体の「親和性」または「結合力」を実験的に決定することができる。特定の抗体−抗原相互作用の測定された親和性は、異なる条件下（例えば塩濃度、ｐＨ）で測定された場合に異なり得る。故に親和性およびその他の抗原結合パラメーター（例えばＫ  ｓｕｂ  Ｄ、ＩＣ５０）の測定値は好ましくは抗体および抗原の標準化された溶液および標準化されたバッファーで作成される。
【００２０】
本明細書で使用される際には「生物学的試料」なる用語は、血液、血清、血漿、リンパ、尿、唾液、涙液、脳脊髄液、乳、羊水、胆汁、腹水、膿汁等のような、正常または疾患患者の身体から誘導される器官または組織抽出物および任意の液体またはその他の材料を意味する。
【００２１】
「担体」なる用語はそれと共に化合物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。かかる担体は落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等のような石油、動物、野菜または合成起源のものを含む水および油のような滅菌液体でよい。水または生理食塩水ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液が担体として用いられるのが好ましい。
【００２２】
「細胞」なる用語はその通常の生物学的意味で用いられ、そして多細胞生物全体を指すものではない。例えば細胞はインビトロで例えば細胞培養におけるものでよい。細胞は原核生物性（例えば細菌細胞）または真核生物性（例えば哺乳動物または植物細胞）でよい。
【００２３】
「誘導体」とは、アミノ酸残基置換、欠失または付加の導入により改変されている親タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなるタンパク質またはポリペプチド（例えば抗体）のいずれかを指す。誘導体タンパク質またはポリペプチドは親ポリペプチドと類似のまたは同一の機能を保有する。
【００２４】
「検出可能な部分」なる語句は、本明細書にて使用される際には本明細書に記載されるかまたは当業者に公知の手順またはモダリティによりエキソビボまたはインビトロで撮像および／または検出できる部分を指す。本明細書にて使用される際には検出可能な部分を直接的または間接的に本発明のＭｅｔ４抗体に、抗Ｍｅｔ４抗体、結合フラグメントまたはその誘導体に連結することができる。
【００２５】
「診断用に標識された」なる用語は本発明の抗体、抗Ｍｅｔ４抗体、結合フラグメントまたはその誘導体がそれに付着している診断用に検出可能な標識を有することを意味する。
【００２６】
「ホルムアルデヒド」とは式ＣＨ２Ｏを有する有機化学物質を意味する。ホルムアルデヒドは水溶性である。「ホルマリン」とはホルムアルデヒドの水溶液を意味する。
【００２７】
「フラグメント」とは親タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも４アミノ酸残基（好ましくは少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１５アミノ酸残基、少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも２５アミノ酸残基、少なくとも４０アミノ酸残基、少なくとも５０アミノ酸残基、少なくとも６０アミノ酸残基、少なくとも７０アミノ酸残基、少なくとも８０アミノ酸残基、少なくとも９０アミノ酸残基、少なくとも１００アミノ酸残基、少なくとも１２５アミノ酸残基または少なくとも１５０アミノ酸残基）のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質またはポリペプチドのいずれかを指す。抗体の「抗原結合フラグメント」なる用語に包含される結合フラグメントの実例には、（［ι］）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価フラグメント、（ｎ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含んでなる２価フラグメント、（ｉｎ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（［ι］ｖ）抗体の単腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−４６（１９８９））、ならびに（ｖ［ι］）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）ラクダ抗体が含まれ、そしてラクダ抗体を使用することもできる。かかる抗体は、例えば本明細書に記載されるたった１つの可変ドメインからのＣＤＲを含むことができる。さらにＦｖフラグメント、ＶＬおよびＶＨの２つのドメインは別個の遺伝子によりコードされるが、組換法を用いてＶＬおよびＶＨ領域が組み合わされて１価分子を形成する一本鎖タンパク質として作成することを可能にする合成リンカーによりそれらを結合させることができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知、例えばＢｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−２６（１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−８３（１９８８）参照）。かかる一本鎖抗体はまた抗体の「抗原結合フラグメント」なる用語に包含されるとも意図される。これらの抗体フラグメントは当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、そしてフラグメントをインタクトな抗体と同じ様式で機能に関して評価する。
【００２８】
「検出可能な部分に連結された」タンパク質または抗体は、タンパク質または抗体に結合している標識または検出可能な部分の存在を検出することによりタンパク質または抗体の存在を検出できるように、共有結合で、リンカーにより、またはイオン、ファンデルワールスもしくは水素結合により標識に結合しているものである。
【００２９】
「モノクローナル抗体またはｍＡｂ」は本明細書にて使用される際には、単一のＢリンパ球クローンの生成物である抗体の、全体的でない場合、実質的に均一な集団の一部である抗体を指す。ｍＡｂは当分野において周知であり、そして従来の方法を用いて作成される；例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）；米国特許第４３７６１１０号；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州（１９８８）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ニューヨーク州（１９８０）；Ｈ．Ｚｏｌａら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９８２）参照。ｍＡｂを組換えにより、および例えば米国特許第４８１６５６７号に従って生成できる。
【００３０】
「スクリーニング」または「診断」とは、患者（臨床試験の参加者を含む）を診断、予後診断、モニタリング、特徴付け、選択すること、および特定の障害もしくは臨床事象の危険があるかもしくはそれを有している患者、または特定の治療的処置に応答する可能性が最も高いものを同定すること、または特定の治療的処置に対する患者の応答を評価もしくはモニタリングすることを指す。
【００３１】
「小型分子」とは３キロダルトン（ｋＤａ）未満、および好ましくは１５キロダルトン未満、およびさらに好ましくは約１キロダルトン未満の分子量を有する組成物を指す。小型分子は核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド擬似物質、炭水化物、脂質またはその他の有機（炭素含有）もしくは無機分子でよい。当業者には認められるように、本記載に基づいて、本発明のアッセイのいずれかを用いて化学的および／または生物学的混合物、しばしば真菌、細菌または藻類抽出物の大規模なライブラリーをスクリーニングできる。
【００３２】
「対象」または「患者」とは、症状、障害または疾患のための処置を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトを指す。
【００３３】
「腫瘍細胞」なる用語はインビボ、エキソビボおよび組織培養のいずれかにおける、新しい遺伝材料の取り込みを伴う必要のない自然発生的な、または誘導された表現型変化を有する癌性、前癌性または形質転換された細胞を指す。形質転換ウイルスでの感染および新しいゲノム核酸の組み込み、または外因性核酸の取り込みから形質転換を生じることができるが、自然発生的に、または発癌性物質に暴露し、それにより内因性遺伝子を変異することに続いて生じることもできる。「腫瘍」には少なくとも１つの腫瘍細胞が含まれる。
【００３４】
以下の記載では、免疫学、細胞生物学および分子生物学の分野の当業者に公知の種々の方法論を参照する。参照されるかかる公知の方法論を説明する出版物およびその他の資料を、あたかも全体が説明されるかのように、その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする。免疫学の一般的な原理を説明する標準的な参考研究には、Ａ．Ｋ．Ａｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．、フィラデルフィア（２０００）；Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ（第４版）、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ニューヨーク（１９９９）；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（最新版）、Ｃ．Ｖ．Ｍｏｓｂｙ  Ｃｏ．、セントルイス、ミズーリ州（１９９９）；Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ケンブリッジ、マサチューセッツ州（１９９０）が含まれる。
【００３５】
抗体は免疫グロブリン（Ｉｇ）分子としても公知のポリペプチドであり、それは具体的な抗原またはエピトープに対して結合特異性を呈する。ここでの「抗体」なる用語の使用は広く、従来のインタクトな４鎖Ｉｇ分子（ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体の特徴）を超えて広がる。抗体はポリクローナル抗体（例えば分画または未分画免疫血清）またはｍＡｂ（以下を参照）の形態で生じ得る。１を超える抗原特異性を伴うＩｇ分子（例えば２つの異なる抗体からの抗原結合領域または鎖を結合させることにより形成された二重特異性抗体）もまた含まれる。抗体は典型的には具体的な抗原に対して結合特異性を呈するポリペプチドである。天然のＩｇ分子は典型的にはヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成され、各Ｌ鎖は１つの鎖間ジスルフィド結合によりＨ鎖に連結されている。さらなるジスルフィド連結は２つのＨ鎖を架橋する。各ＨおよびＬ鎖は規則的な間隔の鎖内ジスルフィド結合を有する。各Ｈ鎖および各Ｌ鎖のＮ末端には可変（Ｖ）ドメインまたは領域（ＶＨおよびＶＬ）が含まれる。ＶＨドメインのＣ末端側は多くの定常（Ｃ）ドメイン（ＣＨ）であり；Ｌ鎖はそのＣ末端で単一のＣドメインのみを有する（ＣＬと称される）。特定のアミノ酸残基がＶＨドメインとＶＬドメインの間でインターフェースを形成する。脊椎動物Ｌ鎖はそのＣドメインのアミノ酸配列に基づいて、アイソタイプ、κおよびλとも称される２つの区別される型の１つに割り当てられる。そのＣＨドメインの配列に依存して、Ｉｇは各々γ、μ、α、εおよびδと称されるそのＨ鎖により同定される異なるクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤ；のメンバーである。いくつかのサブクラスまたはアイソタイプもまた公知であり、例えばＩｇＧアイソタイプ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４（各々γ１、γ２、γ３およびγ４として公知のＨ鎖を含んでなる）またはＩｇＡアイソタイプ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２（各々Ｈ鎖ａｌおよびα２を含んでなる）。
【００３６】
抗体分子のドメインまたは領域を記載するために用いられる場合、「可変」なる用語は様々な抗体間で異なり、そして抗体の抗原特異性に寄与するアミノ酸配列を指す。可変性がＶ領域にわたって一様に分布されるが、典型的には３つの特定の領域でより大きい配列は相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と称され、ＶＨおよびＶＬドメインに存在する。Ｖドメインのさらに高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）領域と称される。各ＶＨおよびＶＬドメインは、典型的には主としてβシート立体配置をとる、３つのＣＤＲに結合する４つのＦＲ領域を含んでなり、それはβシート構造を接続し、そして場合によってはβシート構造の一部を形成するループを形成する。各鎖におけるＣＤＲはＦＲ領域により極接近して維持され、そしてその他の鎖からのＣＤＲを伴い、抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州（１９８７））。Ｃドメインは直接抗原結合に関与しないが、オプソニン作用、補体結合および抗体依存性細胞毒性のような種々のエフェクター機能を呈する。
【００３７】
抗体の定義には全て当分野において周知のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖフラグメントを含むＩｇ分子の抗原結合フラグメントもまた含まれる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントはインタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠如し、循環からより迅速に消え、そしてインタクトな抗体よりも非特異的組織結合が低いかもしれない（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。Ｆａｂフラグメントおよび単一の抗原結合部位のみを有する１価抗体のその他の形態は、特にインビボで抗体のＭｅｔ担持細胞への内部移行またはＭｅｔの活性化およびその後のシグナル伝達経路を回避するかまたは制限するのが好ましい場合、その他の公知の利点を有する。
【００３８】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびｓｃＦｖフラグメントまたは本発明において有用な抗体の形態を、インタクトな抗体と同じ様式でＭｅｔタンパク質を検出、定量または単離するために、およびＭｅｔ発現腫瘍の診断または治療のために使用することができる。従来のフラグメントを典型的にはパパイン（Ｆａｂフラグメントのために）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのために）のような酵素を使用してタンパク質分解性切断により生成する。ＦｖフラグメントはＨｏｃｈｍａｎ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：１１３０−１１３５（１９７３）；Ｓｈａｒｏｎ，Ｊ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５：１５９１−１５９４（１９７６）に記載される。ｓｃＦｖポリペプチドは目的のＩｇからの超可変領域を含み、そして天然のＩｇの抗原結合部位を再創成するが、インタクトなＩｇのほんのわずかな大きさである（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４１（１９８８）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７−５１５（１９８９）；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９（１９９１）；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９（１９８８）；米国特許第４７０４６９２号、第４８５３８７１号、第４９４６７７８号、第５２６０２０３号、第５４５５０３０号）。異なる特異性の抗体からの１を超える抗原結合抗体フラグメントを組み合わせることにより形成されたダイアボディーおよび多重特異性抗体もまた抗体として含まれる。
【００３９】
本発明はＭｅｔの細胞外ドメインにおけるエピトープに結合する「Ｍｅｔ４」と称される抗体に関する。以下の実施例７に記載されるように、エピトープはヒトＭｅｔタンパク質のアミノ酸残基２３６−２４２のポリペプチドＤＶＬＰＥＦＲ（配列番号：１、表５参照）であるか、またはさらに具体的にはエピトープは配列番号：１のアミノ酸残基２３６−２３９のポリペプチドＤＶＬＰ（表５）である。
【００４０】
重要なことに、Ｍｅｔ４はホルマリン処理Ｍｅｔに結合し、そしてホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織における変性Ｍｅｔの発現を正確に定量することができる。すなわちＭｅｔ４は診断および予後診断用組織調製物において有用である。１つの実施態様では、Ｍｅｔ４抗体はＭｅｔ組織薬のためのコンパニオン診断用である。さらにＭｅｔ４のＭｅｔ発現細胞の表面との反応性のために、Ｍｅｔ４はまたインビボ分子撮像適用において有用である。
【００４１】
Ｍｅｔ４モノクローナル抗体は、ブダペスト条約に基づく国際寄託として、２００６年６月２９日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−７６８０で寄託されたハイブリドーマ細胞系により生成される。ＡＴＣＣの住所は１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｅ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，２０１１０−２２０９である。ＦＦＰＥ前立腺組織におけるスクリーニングアッセイ、ならびに前立腺上皮および内皮細胞の特定の亜集団におけるｃ−Ｍｅｔの確立された特異的発現に基づいてＭｅｔ４ハイブリドーマを単離した（図１ＡおよびＢ）。このスクリーニング研究法はＦＦＰＥ組織においてｃ−Ｍｅｔと反応性がある抗Ｍｅｔ抗体を入手するための機会を大きく増大させた。
【００４２】
本発明はまたＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−７６８０で寄託されたハイブリドーマ細胞系により生成されたモノクローナル抗体と競合する抗Ｍｅｔ抗体、またはその抗体のフラグメントもしくは誘導体をも含む。本明細書にて使用される際には「Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−７６８０で寄託されたハイブリドーマ細胞系により生成されたモノクローナル抗体と競合する」なる語句はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−７６８０で寄託されたハイブリドーマ細胞系により生成されたモノクローナル抗体と同じエピトープを認識する任意のモノクローナルまたはポリクローナル抗体（例えばマウス、ウサギまたはその他の生物により生成されたかどうか）を意味する。かかる抗Ｍｅｔ抗体、そのフラグメントまたは誘導体がそのように競合するかどうかを、競合ＥＬＩＳＡのような生物学的アッセイ法により実証することができる。例えばＭｅｔタンパク質に結合するＭｅｔ４を間接的ＥＬＩＳＡにより測定することができる。すなわち反応系に添加されたより高濃度のＭｅｔ４は通常、定量的により高いＯＤ（光学密度）値を生じる。ウサギポリクローナル抗Ｍｅｔ抗体を異なるモル比のＭｅｔ４と混合し、そしてＯＤ値が低下する場合、それは、ウサギ抗体がＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−７６８０で寄託されたハイブリドーマ細胞系により生成されたモノクローナル抗体と競合することを意味する（以下の実施例７参照）。
【００４３】
抗体、そのフラグメントおよび誘導体はＦＦＰＥ組織におけるｃ−Ｍｅｔ発現の測定に有用である。Ｍｅｔ４はｃ−Ｍｅｔに関する独特の特異性を実証し、そしてＭｅｔ４  ＩＨＣおよびウェスタンブロッティングシグナルの比較により評価されるように良好な精度でＦＦＰＥにおけるｃ−Ｍｅｔ発現レベルを定量する（σ＝０．６０２）（図３）。同じ日、異なる日およびＭｅｔ４の２つの別個のロットを比較する場合に、Ｍｅｔ４染色は反復染色で再現性があった。
【００４４】
ＦＦＰＥ組織におけるｃ−Ｍｅｔ発現に関するたいていの研究はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚからの抗Ｍｅｔ  Ｃ−２８ポリクローナル抗体の種々のロットを用いる。ＡＱＵＡ（商標）テクノロジーを用いて３つのモノクローナル抗体およびＣ−２８の２つの別個のロットを含む市販のｃ−Ｍｅｔ抗体の系統的な比較により、乳癌組織マイクロアレイ研究において予測された量の変動性よりも大きいことが明確に実証された２６。抗体の１つであるＤＯ−２４（Ｕｐｓｔａｔｅ）はｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメインに結合するが、その他のものは細胞内エピトープを認識する。ウェスタンブロットで全ての抗体がＭｅｔ受容体に結合するという事実にかかわらず、その組織反応性は同じ患者の乳癌試料間で一貫しなかった。ＣｈｅｍｉｃｏｎからのＭＡＢ３７２９およびＣ２８の単一のロットを比較した場合、最も一貫した結果が得られた。ＭＡＢ３７２９は良好な再現性を保有し、そして隣接するＴＭＡスライド上の同じ細胞系からのコアに関して相関係数が０．９４であった。Ｃ２８の２つの異なるロットを比較した場合、かなりのロット間変動性が留意され、それはＣ−２８の臨床利用性および比較によるその他のｃ−Ｍｅｔ抗体を評価するその利用性を危うくする。それ故に現在のところＦＦＰＥ組織調製物における新規ｃ−Ｍｅｔ反応性抗体の試験のための「究極の判断基準」はない。しかしながらウェスタンブロッティングによるｃ−Ｍｅｔの定量をＩＨＣ染色による定量と比較することにより、ＦＦＰＥ細胞ペレットにおいてＭｅｔ４が検証されている（図３Ｃ）。
【００４５】
Ｍｅｔ４はＭｅｔ受容体タンパク質の細胞外２５から５６７アミノ酸におけるエピトープと反応する４１。さらに具体的には、Ｍｅｔ４はＭｅｔの細胞外２３６から２４２アミノ酸におけるエピトープと反応する。なおさらに具体的には、Ｍｅｔ４はＭｅｔの細胞外２３６から２３９アミノ酸におけるエピトープと反応する（実施例６）。Ｍｅｔ４結合部位はＳＤＳ試料バッファー中での煮沸による変性に感受性があるが、熱回復またはホルマリン固定のいずれかにより再確立される（図２）。同じ熱回復がホルマリン固定組織で正常に用いられ、そして抗体反応性を大いに改善する５０。煮沸はホルマリン架橋により作成された結合を加水分解し、そしてまたタンパク質のリフォールディングを引き起こす。ホルマリン固定および熱回復の双方はウェスタンブロッティング後の変性Ｍｅｔ受容体タンパク質内のＭｅｔ４結合部位を再確立するのに有効であった。測定値を患者の処置決定に適用する場合、アッセイの信頼性はとりわけ重要である。それ故に細胞ペレットを使用してＭｅｔ４  ＩＨＣアッセイのアッセイ内およびアッセイ間の変動性を、決定した。恐らく細胞ペレット中の細胞材料は単一の細胞型からなるので、組織切片におけるものよりもさらに均質である。しかしながら同じ組織ブロック内の隣接する切片から得られた細胞ペレットからのスライド間で有意な形態学的差異が観察された。この変動性はアッセイ内およびアッセイ間比較のＣＶ％を増大させた。
【００４６】
ｃ−Ｍｅｔの細胞質ドメインに結合するいくつかのＭｅｔ抗体は核エピトープと反応する。最近の研究により、Ｍｅｔ細胞質ドメインを切断し、そして核に転位置させることができることが実証される５１。しかしながらＭｅｔ核フラグメントの生物学的機能、そのキナーゼ活性および標的、ならびに核Ｍｅｔ発現の広い臨床的関連性は不明確である。乳癌ＴＭＡの切片においてＭＡＢ３７２９抗体を用いて測定されるＭｅｔの核発現は５年生存の７５％から６５％への低下に関連した２６。バイオマーカーとしてのその役割を評価するためにｃ−Ｍｅｔ核発現のさらなる研究が必要とされる。
【００４７】
体細胞遺伝子変異または過剰発現によるｃ−Ｍｅｔ活性化は特定の癌型において明らかに観察されているが、それらは原発性卵巣癌または神経膠腫において稀であるようである。二重微小染色体におけるｃ−Ｍｅｔ遺伝子の重複によるｃ−Ｍｅｔの過剰発現は神経膠腫グレードＩＶで３／１８に、そしてグレードＩＩで１／１８に留意された５２。異なるコホートでは、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子増幅が神経膠腫の３／１１で生じた５３。本明細書の実施例で実証されるように、神経膠腫ＴＭＡの分析でグレードの高い神経膠腫においてｃ−Ｍｅｔ発現の増大が確認された。しかしながら予想外にも、神経膠腫の腫瘍脈管構造における内皮細胞は必ずしもｃ−Ｍｅｔ発現を実証しなかった。神経膠腫とは対照的に、全ての卵巣癌がｃ−Ｍｅｔを発現し、そして７／２８が高いｃ−Ｍｅｔ発現を実証した。この観察は、類内膜性卵巣癌におけるｃ−Ｍｅｔ過剰発現が少なく、そしてその他の組織学的サブタイプわたってｃ−Ｍｅｔ発現が１０％高いことが観察された以前の研究とは異なる５４。高いｃ−Ｍｅｔ発現に寄与するメカニズムおよび卵巣癌におけるｃ−Ｍｅｔの活性化状態は未知である。この研究に関する細胞系パネルにおけるｃ−Ｍｅｔ  ＲＮＡおよびタンパク質発現の比較は芳しくない相関性を示した。卵巣癌細胞系では、ｃ−Ｍｅｔタンパク質の高発現がｃ−Ｍｅｔ遺伝子の増幅、ｃ−Ｍｅｔタンパク質の転写または翻訳後の保持の増大のために生じるかどうかは明らかではない。卵巣癌におけるｃ−Ｍｅｔ過剰発現の関連性およびＭｅｔ阻害薬の治療的有効性に対するその関係性は、処置応答およびｃ−Ｍｅｔ発現レベルを比較する臨床研究においてきっと評価されるであろう。
【００４８】
本発明または生物学的試料中の腫瘍細胞のようなＭｅｔを発現することが疑われる細胞を検出するための方法にも関する。競合結合アッセイ、直接または間接サンドイッチアッセイおよび異種または同種相で行われる免疫沈殿アッセイのような当分野において公知の種々のイムノアッセイ技術を用いることができる。例えばＺｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１４７−１５８頁（１９８７）参照。直接的または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを生成する検出可能な標識で、この様式で用いられる抗体を検出可能に標識できる。当業者はＭｅｔ４抗体のための適当な検出薬または標識を容易に作成することができる。検出可能な部分をＭｅｔ４抗体に（または抗Ｍｅｔ４抗体に）連結させることにより、組織または試料中のＭｅｔ４抗体を検出することができる。組織または試料を、検出可能に標識されたＭｅｔ４抗体と（および、検出可能な部分が代わりに抗Ｍｅｔ４抗体に連結されている場合は抗Ｍｅｔ４抗体と）接触させ、そして組織または試料中の検出可能な部分の存在を検出する。
【００４９】
当業者に公知の多くの様々な標識および標識する方法が存在する。本発明において使用することができる標識の型の実例には、放射性同位元素、常磁性同位元素および陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）により撮像できる化合物が含まれる。本発明において使用される抗体に結合するためのその他の適当な標識は当業者に公知であるか、または日常的な実験により、そのように確認することができるであろう。診断用に標識された（例えば放射標識された）抗体が有効である。
【００５０】
診断のために適当な検出可能な標識には放射活性、蛍光、蛍光発生性、発色性またはその他の化学的標識が含まれる。ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、ＰＥＴスキャニングまたはオートラジオグラフィーにより簡便に検出される有用な放射標識には、３Ｈ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓおよび１４Ｃが含まれる。加えて１３１Ｉは有用な治療用同位元素である（以下を参照）。
【００５１】
一般的な蛍光標識には、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレサミンが含まれる。ダンシル基のようなフルオロフォアは蛍光を発するために特定の波長の光により励起しなければならない。例えばＨａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（第６版）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン州（１９９６）参照。イソチオシアナート、スクシンイミジルエステルまたはジクロロトリアジニル反応基を使用してフルオレセイン、フルオレセイン誘導体およびＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）のようなフルオレセイン様分子、ならびにその誘導体、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ（商標）およびＲｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ（商標）をアミン基に結合させる。同様にマレイミド、ヨードアセトアミドおよびアジリジン反応基を使用してフルオロフォアをチオールに結合させることができる。基本的に窒素上に置換基を有するＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ（商標）誘導体である長波長ローダミン類は中でも最も光安定性のある公知の蛍光標識試薬である。そのスペクトルは４と１０の間のｐＨの変化により影響を受けず、多くの生物学的適用のためにフルオレセイン類に優る重要な利点である。この群には、テトラメチルローダミン類、Ｘ−ローダミン類およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）誘導体が含まれる。本発明によるペプチドを誘導体化するためのその他の好ましいフルオロフォアは紫外光により励起されるものである。実例には、カスケードブルー、クマリン誘導体、ナフタレン類（ダンシルクロリドはそのメンバーである）、ピレン類およびピリジルオキサゾール誘導体が含まれる。最近記載されている２つの関連する無機材料：例えば硫酸カドミウムを含んでなる半導体ナノ結晶（Ｂｒｕｃｈｅｚ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：２０１３−２０１６（１９９８））および量子ドット、例えば硫化亜鉛キャッピングされたセレン化カドミウム（Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｃ．Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：２０１６−２０１８（１９９８））もまた標識として含まれる。
【００５２】
別の研究法では、蛍光生成物、例えばフルオレサミン、ｏ−フタルジアルデヒドのようなジアルデヒド、ナフタレン−２，３−ジカルボキシラートおよびアントラセン−２，３−ジカルボキシラートを生じる試薬と抗体のアミノ基を反応させる。７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）誘導体は、塩化物およびフッ化物の双方共に、アミンを修飾して蛍光生成物を生じるのに有用である。
【００５３】
１５２Ｅｕ＋またはランタニドシリーズのその他のもののような蛍光発光金属を使用して検出のために抗体を標識することもできる。ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレーティング基を使用して、これらの金属をペプチドに付着させることができる。無水物形態のＤＴＰＡはＮＨ２含有抗体を容易に修飾することができる。
【００５４】
抗体をリン光性または化学発光性化合物に結合させることにより、抗体を検出可能にすることもできる。次いで化学反応の経過中に生じる発光の存在を検出することにより、化学発光タグ化ペプチドの存在を決定する。特定の有用な化学発光物質の実例はルミノール、イソルミノール、テロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。同様にペプチドを標識するために生物発光化合物を使用できる。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増大させる生物学的系において見出される化学発光の１つの型である。発光の存在を検出することにより生物発光タンパク質の存在を決定する。標識の目的のために重要な生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【００５５】
さらに別の実施態様では、高い減衰係数を有する発色団を有するかまたはそれをもたらす発色化合物に基づく比色検出を用いる。
【００５６】
対象から組織学的標本を取り出し、そして標識を検出するためにそれを適切な条件下で顕微鏡により試験することにより、標識抗体のインサイチュ検出を達成できる。かかるインサイチュ検出を達成するために多様な組織学的方法（例えば染色手順）のいずれかを修飾できることは当業者に容易に受け入れられよう。
【００５７】
抗体を標識するための１つの方式はそれを酵素に連結させ、そしてそれを酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において使用することによる。かかるアッセイは：Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．、「Ｔｈｅ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｎ
ａ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ」（第１１章）、ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＯＦ  ＡＮＴＩＧＥＮＳ  １巻（Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，Ｍ．、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ボッカラートン（１９９２）、２０９−２５９頁；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．、「ＥＬＩＳＡ」（第２９章）、ｖａｎ  Ｏｓｓ，Ｃ．Ｊ．ら（編）、ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク（１９９４）７５９−８０３頁、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．（編）、ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＳＯＬＩＤ−ＰＨＡＳＥ  ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ボッカラートン（１９９１）；Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．ら、Ｂｕｌｌ．ＷＨＯ  ５３：５５−６５（１９７６）；Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編）、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ボッカラートン（１９８０）、Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．ら（編）、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｋａｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ、東京（１９８１）；においてさらに詳記される。今度は、後にその基質に暴露されるときにこの酵素は例えば分光光度分析、蛍光分析により、または視覚的手段により検出できる化学的部分を生成するためのような様式で基質と反応する。この目的のために一般的に使用される酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、Δ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが含まれる。
【００５８】
抗Ｍｅｔ抗体の共有結合を含む化学的修飾は本発明の範囲内である。ターゲティングされたアミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応することが可能である有機誘導体化剤と反応させることにより、修飾の１つの型を分子に導入する。
【００５９】
二機能性薬剤での誘導体化は、抗体（またはフラグメントもしくは誘導体）を精製法（以下に記載）において使用するための水不溶性支持体マトリックスまたは表面に架橋するのに有用である。一般的に使用される架橋剤には、例えば１，１−ビス（ジアゾ−アセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）のようなジスクシンイミジルエステルおよびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二機能性マレイミドを含むホモ二機能性イミドエステルが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダートのような誘導体化剤は、光を照射された場合に架橋することができる光活性化可能な中間体を創成する。臭化シアン活性化された炭水化物のような反応性水不溶性マトリックスならびに米国特許第３９６９２８７号；第３６９１０１６号；第４１９５１２８号；第４２４７６４２号；第４２２９５３７号；および第４３３０４４０号に記載される反応性基質をタンパク質固定において使用する。
【００６０】
その他の修飾にはグルタミニルおよびアスパラギニル残基の各々対応するグルタミルおよびアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンおよびリジンの水酸化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（例えばＴ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、サンフランシスコ（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。残基の修飾された形態は本発明の範囲内に入る。
【００６１】
ポリペプチドの天然のグリコシル化パターンが改変されている抗体もまた本明細書に含まれる。これは天然のポリペプチド鎖に存在しない１つもしくはそれより多い炭水化物部分の欠失および／または１つもしくはそれより多いグリコシル化部位の付加を意味する。タンパク質グリコシル化は典型的にはＮ連結（Ａｓｐ側鎖に付着）またはＯ連結（ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはＳｅｒまたはＴｈｒに付着；もしかしたら５−ヒドロキシＰｒｏまたは５−ヒドロキシＬｙｓ）されている。トリペプチドＡｓｐ−Ｚ−ＳｅｒおよびＡｓｐ−Ｚ−Ｔｈｒ（ここでＺは任意のアミノ酸であるがＰｒｏではない）はＡｓｐ側鎖に対する炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。これらの配列のいずれかの存在は潜在的なＮ−グリコシル化部位を創成する。Ｏ連結されたグリコシル化は通常Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの結合を伴う。１つまたはそれより多い前記されたトリペプチド配列（Ｎ連結グリコシル化部位のために）を含むように天然のアミノ酸配列を改変すること、または１つもしくはそれより多いセリンもしくはスレオニンの付加もしくはそれによる置換（Ｏ連結グリコシル化部位のために）によりポリペプチドへのグリコシル化部位の付加を達成できる。ＤＮＡレベルでの変化を通して、例えば望ましいアミノ酸をコードするコドンを作成するために予め選択された塩基でＩｇポリペプチド鎖をコードするＤＮＡを変異させることによりアミノ酸配列を改変できる。例えば米国特許第５３６４９３４号参照。
【００６２】
グリコシドのポリペプチドへの化学的または酵素的結合を用いることもできる。用いられる結合に依存して、（複数の）糖を（ａ）アルギニンおよびＨｉｓ；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えばＣｙｓのもの；（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えばセリン、ＴｈｒもしくはヒドロキシＰｒｏのもの；（ｅ）芳香族残基、例えばＰｈｅ、ＴｙｒもしくはＴｒｐのもの；または（ｆ）Ｇｌｎのアミド基；に付着させることができる。これらの方法は第ＷＯ８７／０５３３０号（１９８７年９月１１日）およびＡｐｌｉｎら、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５９−３０６（１９８１）に記載される。
【００６３】
既存の炭水化物部分の除去を化学的もしくは酵素的に、または（前記されたような）コドンの変異置換により達成できる。例えばポリペプチドをトリフルオロメタンスルホン酸、または連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外のたいていのまたは全ての糖を切断する均等な化合物に暴露するが、ポリペプチドはインタクトなままで残すことにより化学的脱グリコシル化を達成する。Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７）；Ｅｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１（１９８１）参照。ポリペプチドからの炭水化物部分の酵素的切断のために多くのエンドおよびエキソグリコシダーゼのいずれかが使用される（Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７））。
【００６４】
潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化をＮ−グリコシド連結の形成を遮断するツニカマイシンの使用により防御できる（Ｄｕｓｋｉｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５７：３１０５（１９８２））。
【００６５】
本抗体の化学的修飾の別の型は、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号；および第４１７９３３７号ならびに第ＷＯ９３／００１０９号に記載される様式の、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンのような多くの様々な非タンパク質性ポリマーのいずれか１つに対する結合を含んでなる。
【００６６】
抗体ならびに担体および／または賦形剤を含む組成物において本発明の抗体を使用することができる。
【００６７】
別の態様では、本発明は癌、例えば卵巣癌のようなＭｅｔ関連疾患を診断または予後診断する方法に関する。方法はＭｅｔ関連疾患を有するかまたは有することが疑われる患者からの組織または生物学的試料と共に、Ｍｅｔ４抗体またはかかる抗体のフラグメントもしくは誘導体を利用する。方法はまたＭｅｔ関連疾患を有するかまたは有することが疑われる患者からの組織または生物学的試料と共に、Ｍｅｔとの結合に関してＭｅｔ４と競合する抗体、またはそのフラグメントもしくは誘導体を使用できる。抗Ｍｅｔ４抗体、競合抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体を検出可能な部分に連結する。患者からの組織または試料中の検出可能な部分の存在を検出し、そして組織または試料中のＭｅｔ発現レベルを決定し、そして適当な対照と比較する。以下の実施例では、Ｍｅｔ４抗体はいくつかの型の腫瘍においてＭｅｔの検出に有用であることが示される。以下の実施例で提示されたデータに基づいて、当業者はＭｅｔの発現に関する比較の参照点として適当な対照を容易に設定することができる。１つの適当な対照は、癌を有していないか、または特定の型の癌を有していない多数の患者の発現レベルの中央値または代表値である。対照としてＭｅｔ発現の中央値または代表値レベルを確立するために、多くの患者を使用するほど、診断決定はより正確になる。好ましくは少なくとも２５人、５０人または１００人の患者を使用して発現の対照レベルを確立する。
【００６８】
本発明はまた、患者の細胞におけるＭｅｔが阻害または根絶されているかどうかを決定することにより、Ｍｅｔ阻害癌処置の有効性をモニタリングまたは評価するための方法を含む。方法は検出可能な部分に連結されたＭｅｔ阻害薬およびＭｅｔ４またはそのフラグメントもしくは誘導体を投与されている患者の組織または生物学的試料と共にＭｅｔ４抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体を利用する。組織または試料中の検出可能な部分の存在を検出し、そして組織または試料中のＭｅｔ発現レベルを決定し、そして患者におけるＭｅｔの前処置または初期処置レベルと比較して、患者の細胞におけるＭｅｔが阻害または根絶されているかどうかを決定する。
【００６９】
ここで本発明を一般的に記載してきたが、例証のために提供され、そして特記しない場合、本発明の限定を意図するものではない以下の実施例を参照することにより、同一物がさらに容易に理解されよう。
【実施例】
【００７０】
ｃ−Ｍｅｔに関するＭｅｔ４の特異性、ｃ−Ｍｅｔ定量の精度およびＭｅｔ４染色アッセイの信頼性をホルマリン固定およびパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）細胞ペレットにおいて評価した。Ｍｅｔ４を使用して卵巣癌および神経膠腫の臨床組織試料のコホートにおけるｃ−Ｍｅｔ発現を測定した。具体的には、２２細胞系においてＦＦＰＥ細胞ペレットの免疫組織化学分析からのＭｅｔ４シグナルはｃ−Ｍｅｔ発現のウェスタンブロット測定値と相関した（σ＝０．６０３）。Ｍｅｔ４とは対照的に、Ｓａｎｔａ  ＣｒｕｚからのＣ−２８抗体はｃ−Ｍｅｔを発現しない細胞系のＦＦＰＥ細胞ペレットと反応した。反復するＭｅｔ４染色アッセイの技術的な信頼性はアッセイ内でＣＶ％＝３７％およびアッセイ間でＣＶ％＝２１％になった。漿液性、類内膜性および明細胞組織学的サブタイプの卵巣癌はＭｅｔ４で陽性染色され、そして２５％でＭｅｔ４シグナルが高かった。神経膠腫の６３％の癌細胞においてＭｅｔ４染色は陽性であったが、神経膠腫腫瘍脈管構造におけるＭｅｔ４染色発現はたいていの症例で陰性であった。これらの結果に基づいて（すなわちＦＦＰＥ組織においてＭｅｔ４抗体は正確におよび再現性よくｃ−Ｍｅｔ発現を測定したため）、Ｍｅｔ４抗体は臨床の局面で組織または生物学的試料中のｃ−Ｍｅｔ発現定量に有用である。
【００７１】
実施例１
実施例１−５に関する材料および方法
モノクローナル抗体作成および検証：
Ｖａｎ  Ａｎｄｅｌ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＤｒ．Ｅｒｉｃ  Ｘｕの研究室で組換えタンパク質Ｍｅｔ２５−５６７Ｈを調製した。Ｍｅｔ２５−５６７Ｈ構築物（配列番号：１、２５−５６７位置のアミノ酸）および精製Ｍｅｔ９２８タンパク質はＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＤｒ．Ｅｒｍａｎｎｏ  Ｇｈｅｒａｄｉの研究室からのものである４１。組換え融合タンパク質Ｍｅｔ−ＩｇＧをＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、ミネソタ州）から購入した。
【００７２】
ＢＡＬＢ／ｃマウスに完全フロイントアジュバント中天然および変性（ＳＤＳ試料バッファー中で煮沸）Ｍｅｔ２５−５６７Ｈを腹腔内注射し、続いて不完全フロイントアジュバントをさらに２回注射することにより、Ｍｅｔに対するマウスモノクローナル抗体を生成した。１か月後、アジュバントを伴わずに腹腔内および静脈内に最終注射を行った。ホルマリン固定ＭＫＮ４５（Ｍｅｔ陽性）およびＮＩＨ３Ｔ３（Ｍｅｔ陰性）細胞での間接的な免疫蛍光により免疫マウスからのポリクローナル抗血清を試験した。標準的な技術を用いて最終注射の後４日に、脾臓細胞をＰ３Ｘ６３ＡＦ８／６５３骨髄腫細胞と融合させた。ＥＬＩＳＡおよび免疫蛍光染色によりハイブリドーマ細胞をＭｅｔに対する反応性に関してスクリーニングした。
【００７３】
１０個の９６ウェルプレートをコーティングバッファー（０．２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６；５０  μｌ／ウェル）中２  μｇ／ｍｌ  Ｍｅｔ２５−５６７Ｈで、４℃で一晩コーティングした。次いでプレートを１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（２００  μｌ／ウェル）で、４℃で一晩遮断した。ハイブリドーマ上澄５０  μｌを室温（ＲＴ）で１．５時間ウェルに添加した。プレートを洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を伴うＰＢＳ）中で２回洗浄し、そしてアルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を１：２０００希釈で、室温で１．５時間添加した（５０  μｌ／ウェル）。洗浄バッファーで４回洗浄した後、ホスファターゼ基質ＣＰ−ニトロフェニルリン酸（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を３０分間添加し、そして４０５ｎｍで吸光度を測定した。Ｍｅｔ２５−５６７Ｈと強い反応性（ＯＤ値は２．０より大きい）を有する全部で３４個のハイブリドーマを選択し、そしてＥＬＩＳＡによりＭｅｔ９２８に関して試験し、そしてそれらのうちの１４個が陽性であった。Ｍｅｔ２５−５６７ＨおよびＭｅｔ９２８の双方と反応する１４個のクローンをＥＬＩＳＡによりＭｅｔ−ＩｇＧに対して試験した。７個のクローンが３つのＭｅｔタンパク質全てに対して陽性であることが見出され、そして免疫蛍光染色により試験された。
【００７４】
ＭＫＮ４５およびＮＩＨ３Ｔ３細胞を混合し、そして１０個の９６ウェルプレートに蒔き、そして３７℃で一晩培養した。細胞を洗浄し、そして翌日１０％ホルマリンで固定した。７個のクローンからのハイブリドーマ上澄５０  μｌを、固定された細胞が入ったウェルに３７℃で１．５時間添加した。プレートを洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を伴うＰＢＳ）中で２回洗浄し、そして１：１００希釈のローダミンレッド抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ）を３７℃
で１．５時間添加した（３０  μｌ／ウェル）。洗浄バッファー中で２回洗浄した後、細胞を蛍光顕微鏡下で試験した。５個のクローンを陽性と見出し、そして取り、そして増殖させた。これらの５個のクローンに以前の融合からの３個のクローンを加えたものの上澄を、ホルマリン固定正常ヒト前立腺組織切片で、免疫組織化学により検証した。クローン８Ｇ６（Ｍｅｔ４と称される）が最も強いシグナルを生じ、２回サブクローニングを行い、そして３つの組換えＭｅｔタンパク質に対するＥＬＩＳＡにより検証された。バイオリアクターを使用してモノクローナル抗体を生成し、そしてプロテインＧアフィニティーカラムを使用してＦＰＬＣにより精製した。
【００７５】
免疫組織化学
細胞ペレット：ＮＩＨ３Ｔ３、Ｓ１１４（ＨＧＦ／ＳＦおよびＭｅｔに関するヒト遺伝子でトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞）２３、ＳＫ−ＬＭＳ−１／ＨＧＦ（ヒトＭｅｔおよびヒトＨＧＦ／ＳＦに関するヒト平滑筋肉腫細胞系オートクリン）２４、ＳＷ−１７８３、Ｕ１１８、Ｕ８７、Ｕ３７３、ＤＢＴＲＧ（ヒト脳神経膠芽腫）、ＭＣＦ−７（乳癌）、ＥＳ−２、ＣａＯＶ３、ＯＶ−９０、ＳＫＯＶ３、ＴＯＶ−１１２ＤおよびＴＯＶ−２１Ｇ（卵巣腺癌）細胞をＡＴＣＣから入手し、そしてその培地規格に従って培養した。１８４７、２７８０、ＯＶＣＡＲ１０、ＯＶＣＡＲ５、ＯＶＣＡＲ３、ＰＥＯ−１細胞系（卵巣腺癌）をＰａｃｉｆｉｃ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（シアトル、ワシントン州）から入手した。２００８をＤｒ．Ｇｅｏｒｇｅ  Ｃｏｕｃｏｓ（ペンシルバニア大学）から入手した。細胞層を１０％中性緩衝ホルマリン中で固定し、削り取り、そしてＨｉｓｔｏＧｅｌ（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に包埋した。ＨｉｓｔｏＧｅｌペレットを大きな患者組織に関するものと同じ設定を用いて加工し、そしてパラフィンに包埋した。
【００７６】
ヒト組織：卵巣癌のホルマリン固定およびパラフィン包埋切片をＰａｃｉｆｉｃ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍからＩＲＢ承認プロトコールの下で入手した。神経膠腫からの組織マイクロアレイをＣｙｂｒｄｉ（フレデリック、メリーランド州）から購入した。Ｂｌａｃｋ  ａｎｄ  Ｄｅｃｋｅｒ野菜用スチーマー中標的回復溶液（ｐＨ９）（ＤＡＫＯ、デンマーク）で２０分間抗原回復を実施した。スライドをＤａｋｏオートステイナーに装着した。以下のインキュベーションを全てオートステイナー上で室温で実施した：内因性ペルオキシダーゼ活性を３％過酸化水素で８分間遮断し；次いでＤａｋｏ血清不含タンパク質遮断を使用するタンパク質遮断工程を１０分間で完了した。モノクローナルマウス抗ヒトＭｅｔ４抗体をＴｒｉｓバッファー／１％ＢＳＡ中、ＴＭＡスライドの染色のために１：１５０で、および細胞ペレットの染色のために１：５００で希釈した。Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ抗Ｍｅｔポリクローナル抗体を１：３００で希釈した。アイソタイプ対照のために精製マウスＩｇＧを希釈してＭｅｔ４濃度に合わせた。ビオチン化抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）二次抗体を１：２００で希釈し、そして３０分間適用した。次いでペルオキシダーゼ抱合ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を１：２０００で３０分間使用した。最後にＤａｋｏ液体ＤＡＢ＋発色基質系を７分間適用した。スライドをＤａｋｏ自動ヘマトキシリンで２分間対比染色し、脱水し、そしてカバーガラスを載せた。
【００７７】
記載されるように免疫組織化学的に染色された切片のスコア化を行った４２。簡単には、陽性細胞のパーセンテージを染色強度で乗じることにより累積スコアを誘導した。累積スコアを０から３のカテゴリーに分けて、そして組織学的サブタイプ（卵巣癌）または腫瘍グレード（神経膠腫）により群分けした。
【００７８】
ウェスタンブロット分析
サブコンフルエントの細胞を記載されるようなプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）バッファーを補充したＲＩＰＡ中で溶解した４３。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して細胞系からのタンパク質ライゼートを測定した。同じ日に０から１２  μｇ／ｍｌの範囲にわたるＢＳＡ標準を使用して試料を測定した。試料１−２  ｍｌが標準曲線の直線範囲内に測定値を提供するように試料を希釈した。試料（５０ｍｇ）を４−１５％グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、そしてＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）−Ｐ  ＰＶＤＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビルリカ、マサチューセッツ州）またはニトロセルロース転写膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）に移した。ホルマリン固定ウェスタンブロットのための膜を２％中性緩衝ホルマリンＺ−ｆｉｘ（Ａｎａｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．、バトルクリーク、ミシガン州）中で２０分間固定し、そしてＰＢＳ中で洗浄した。Ｂｌａｃｋ  ａｎｄ  Ｄｅｃｋｅｒ野菜用スチーマー中標的回復溶液（ｐＨ９）で２０分間抗原回復を実施した。膜を５％乳遮断バッファーで室温で遮断し、そして５％ＢＳＡ中１：２５０希釈でウサギ抗ヒトＭｅｔポリクローナル抗体Ｃ−２８と共に室温で１．５時間、または１：１０００希釈で一晩インキュベートした；これに代えて、Ｍｅｔ４を１：１０００で一晩、およびＺｙｍｅｄマウス抗ｃＭｅｔクローン：３Ｄ４を１：５００で使用した。ロバ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を１：５０００で使用するか、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１：１００００で使用した。化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）またはＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）赤外線撮像システム（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、リンカーン、ネブラスカ州）によりタンパク質バンドを検出した。７００  ｎｍチャンネルを用いて５．０の強度でＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）赤外線撮像システムで画像をスキャンした。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬソフトウェアで１Ｄゲル分析を用いてＭｅｔ特異的バンドのシグナル強度を測定した。「ローリングボール」手段を用いてバックグラウンドを減じた。
【００７９】
ＩＨＣ染色細胞ペレットのデジタル画像分析
ＣＲＩ  Ｎｕａｎｃｅカメラシステム（ｗｗｗ．ｃｒｉ−ｉｎｃ．ｃｏｍ）を使用してＭｅｔ４で染色した細胞ペレットのスライドをスペクトル的に撮像した。各スライドから６−１０個の画像を収集した。４２０ｎｍと７２０ｎｍの間で２０ｎｍ増で発光を測定した。得られた画像キューブを光学密度単位に変換し、そして対照標本から推定されるスペクトルを使用して、数学的に分解された（ｕｎｍｉｘｅｄ）その個々のＤＡＢおよびヘマトキシリン構成要素にし、そしてスペクトルライブラリーに保存した。ＤＡＢ染色は対比を増大させるための擬似カラーの赤であった。ヘマトキシリンは擬似カラーの青であり、そして定量のために画像を擬似蛍光様式に変換した。
【００８０】
次いで平均ＤＡＢ光学密度およびバックグラウンドを超えるピクセル数を同定した（ＲｉｄｌｅｒおよびＣａｌｖａｒｄ４４の自動閾値化アルゴリズムを使用して決定されるように）我々の研究室により開発されたソフトウェアでスペクトル的に分解された（ｕｎｍｉｘｅｄ）画像を定量した。そのヘマトキシリン光学密度がバックグラウンドを超えるピクセルで連結成分アルゴリズム４５を使用して、核を計数することにより細胞数を同定した（ヘマトキシリン対比染色により同定されるように）。自動高域閾値フィルタを使用した後、核の全数を決定した。１７１強度単位の強度閾値フィルタ値を使用して陽性Ｍｅｔ４染色に関する閾値を設定した。陰性対照細胞系（Ａ２７８０、ＯＶＣＡＲ１０およびＴＯＶ−１１２Ｄ）を使用し、そして陽性ピクセル数を０．１％まで制限してこの閾値パラメーターを定義した。これはＰＰＡ統計に類似する４６。次いでこれらの計数を用いて各試料ペレットに関する陽性Ｍｅｔ４細胞のパーセントを決定した。
【００８１】
統計分析
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（著作権）  Ｅｘｃｅｌソフトウェアを使用してピアソンの相関係数を計算した。
【００８２】
実施例２
ホルマリン固定組織におけるｃ−Ｍｅｔの定量のための抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体の開発
たいていのインビトロおよび免疫組織化学研究においてＭｅｔ発現を測定するために使用されている、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚからのポリクローナル抗体であるＣ−２８の制約は、我々がホルマリン固定組織における分子撮像および免疫組織化学を含む臨床適用のための患者の癌におけるｃ−Ｍｅｔタンパク質発現の測定のためのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を開発することの同義付けとなった。Ｍｅｔ受容体の細胞外ドメインと反応するｃ−Ｍｅｔ抗体は細胞表面上のｃ−Ｍｅｔ発現の存在量を評価するための最も直接的な測定を提供するので、これを入手するために免疫原を設計した。得られたｍＡｂはＣ−２８のロット間変動性およびＭｅｔ細胞質ドメインに結合する抗体で観察される核反応性を克服する。
【００８３】
ホルマリン固定およびパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織におけるＭｅｔ受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体を同定するための最終スクリーニングとして、保存（ａｒｃｈｉｖａｌ）前立腺組織の切片をハイブリドーマ上澄で染色した（表１）。
【００８４】
【表１】
0004806469.tif 000002
前立腺におけるＭｅｔ受容体発現の明確な細胞下のパターンに基づいて４７、４８、基底上皮細胞、萎縮管腔上皮細胞４９および内皮細胞と反応し、そして分泌内皮細胞の基底管腔細胞膜を描写するモノクローナル抗体を選択した（図１ＡおよびＢ）。核タンパク質、分泌細胞における細胞質タンパク質に、または前立腺間質におけるタンパク質に散在的に結合する抗体を排除した。最も強力でそして特異的なシグナルを提供する抗体をＭｅｔ４と称した。Ｍｅｔ４は基底上皮細胞の細胞質および管腔上皮細胞の細胞膜と反応する（図１Ａ、挿入）。１０％ホルマリン中で固定されたＭｅｔ反応性ＭＫＮ４５細胞および非反応性ＮＩＨ３Ｔ３細胞の染色同時培養物を染色することによりＭｅｔ４をさらに検証した。免疫蛍光染色はＭＫＮ４５細胞の膜に沿って特異的に観察され、そしてＣ−２８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）の免疫反応性と一致する（図１Ｃ−Ｆ）。
【００８５】
実施例３
ホルマリン固定細胞におけるｃ−Ｍｅｔとの反応性に関するＭｅｔ４の特異性
Ｍｅｔ４のＭｅｔ受容体タンパク質との反応性を確認するために、ウェスタンブロットをＭｅｔ４でプロービングした。組織におけるホルマリン固定の再現条件により、ウェスタンブロット膜を１０％ホルマリンで処理し、そして組織切片に適用していたのと同じ型の抗原回復を行った。多量のｃ−Ｍｅｔを発現するＩＧＲＯＶ１卵巣癌細胞において、Ｍｅｔ４は変性Ｍｅｔ受容体タンパク質と反応しなかった。ホルマリン固定または抗原回復バッファー中の膜の煮沸はｃ−Ｍｅｔに対するＭｅｔ４結合を増大させ、そして１４０  ｋＤａのｃ−Ｍｅｔバンドを表した（図２）。Ｍｅｔ４は低分子量バンドと非特異的に反応し、そのうちのいくつかはＭｅｔ受容体陰性Ａ２７８０細胞系においても現れた。免疫蛍光およびウェスタンブロッティング結果により、Ｍｅｔ４が変性に感受性があり、そしてホルマリン固定または抗原回復により再確立されるＭｅｔ上の特異的エピトープに結合することが実証される。
【００８６】
ホルマリン固定細胞調製物におけるＭｅｔ４の特異性をさらに検証するために、細胞系のパネルを分析した。Ｍｅｔ発現レベルに基づいて細胞系を選択した。第１のパネルは１４個の卵巣癌細胞系からなった。これらの細胞系は不定量のｃ−Ｍｅｔタンパク質を発現する。Ａ２７８０、ＯＶＣＡＲ１０およびＴＯＶ−１１２ＤはＭｅｔ  ＲＮＡまたはタンパク質を発現せず（図３Ａおよび図６）、そしてＩＧＲＯＶ１およびＯＶＣＡＲ５細胞はＭｅｔを高度に発現する。ホルマリン固定調製物におけるＭｅｔ４およびＭｅｔ  Ｃ−２８の特異性を対応するウェスタンブロット結果と比較するために、各細胞系の細胞ペレットをヒト組織と正確に同じ方式で加工した。スライド上の細胞ペレットの平行切片をＭｅｔ４またはＣ−２８  Ｍｅｔ抗体のいずれかで染色した。Ｃ−２８  Ｍｅｔは全ての細胞系と無差別的に反応したが、Ｍｅｔ４はウェスタンブロットおよびＰＣＲ分析でＭｅｔ発現に関して陽性であったこれらの系のみを染色した（図３Ｂ）。ホルマリン固定組織におけるＭｅｔ４の反応性がｃ−Ｍｅｔタンパク質の発現のレベルと比例するかどうかを決定するために、ＩＨＣ染色切片からの染色強度のデジタル測定値をウェスタンブロットにおいて検出されたｃ−Ｍｅｔの量と比較した。細胞ペレット調製物中のＨｉｓｔｏｇｅｌの凝集塊に起因する異常値を除去した後、ＩＨＣとＷＢとの間のピアソン相関係数はｓ＝０．６０２であった（図３Ｃ）。
【００８７】
種々の非卵巣細胞系においてＭｅｔ４の特異性をさらに試験し、そのほとんどが神経膠芽腫細胞系（図４）であり、そしてその結果により、Ｍｅｔ４がｃ−Ｍｅｔ発現ヒト細胞と反応するが、ｃ−Ｍｅｔ陽性マウス細胞またはｃ−Ｍｅｔ陰性ヒト細胞とは反応しないことが確認された。
【００８８】
実施例４
Ｍｅｔ４免疫組織化学測定の再現性
結果により、新規Ｍｅｔ４抗体はＦＦＰＥ細胞調製物においてｃ−Ｍｅｔと特異的に結合することが実証されるので、中間のレベルのｃ−Ｍｅｔを発現するＴＯＶ２１Ｄ細胞における染色の再現性を試験した。アッセイ再現性は臨床試験のための抗体の開発において重要な因子である。同じ日の反復染色（アッセイ内変動性）および異なる３日間に染色したスライド（アッセイ間変動性）の間でＭｅｔ４染色強度の一貫性をＦＦＰＥ細胞ペレットにおいて分析した。加えて、Ｍｅｔ４抗体の２つの別個のロットからの染色結果を比較した。ハイブリドーマ培養培地から別個に調製された精製抗体の２つのロットはｓ＝０．７５の相関係数を表した。アッセイ内およびアッセイ間変動性は生物学的および技術的（アッセイ）変動性の構成要素からなり、それをこの分析において分けることはできなかった。異なる日の細胞ペレットにおいてＴＯＶ２１Ｄ細胞間でＭｅｔ４の染色強度に影響する有意な形態学的差異が観察された。結果的にアッセイ内変動性に関して％ＣＶは３９％であった。別個の３日間に実施したＭｅｔ４アッセイの変動性（アッセイ間変動性）は％ＣＶ＝２１％であった。アッセイ間変動性を日変動性の代表値から計算し、そしてアッセイ内変動性よりも小さかった。
【００８９】
実施例５
卵巣癌および神経膠腫におけるＭｅｔ発現
保存（ａｒｃｈｉｖａｌ）ＦＦＰＥ組織におけるＭｅｔ４の特異性を評価するために、卵巣癌組織の切片および神経膠腫のＴＭＡを分析した。Ｍｅｔ４は卵巣癌細胞、内皮細胞、卵巣間質および形質細胞における細胞の集団に関して高い染色特異性を保有する。核染色は観察されなかった（図５Ａ）。卵巣癌の組織学的サブタイプには、漿液性、類内膜性および明細胞が含まれるが、粘液性癌は含まれず、そして全ての癌はＦＩＧＯステージＩＩＩ−ＩＶであった。２９個全ての卵巣癌がＭｅｔ４反応性を示した（表２）。
【００９０】
【表２】
0004806469.tif 000003
卵巣癌の切片をＭｅｔ４で染色する。全体のスコアはカテゴリースケール０−３の切片の染色強度代表値を表す（Ｓ−漿液性乳頭癌、ＥＭ−類内膜癌、ＣＣ−明細胞癌）。
【００９１】
卵巣癌のサブタイプにわたるＭｅｔ４染色強度において統計的に有意差は観察されなかった。最も侵襲性のサブタイプであると考えられる明細胞癌はその他の組織学的サブタイプよりも大きな反応性を実証しなかった。
【００９２】
脳腫瘍におけるＭｅｔ４の特異性およびｃ−Ｍｅｔの発現を評価するために、神経膠腫の組織アレイを染色した。組織マイクロアレイは３検体ずつのコアで１８個の神経膠腫を表示した。加えて正常な脳組織の３例があった（表３、図５Ｂ）。
【００９３】
【表３】
0004806469.tif 000004
３検体ずつのコアで１８個の神経膠腫の組織マイクロアレイをＭｅｔ４抗体で染色した。相対染色強度を陽性細胞のパーセンテージで乗じることによりＭｅｔ４反応性を評価する。全体のスコアをカテゴリースケール０から３で表現する。
【００９４】
ニューロンおよび反応性アストロサイトはＭｅｔ４で強く染色されたが、オリゴデンドロサイトはＭｅｔ染色を示さなかった。驚くべきことに、腫瘍脈管構造の内皮細胞を含む内皮細胞はＭｅｔ陽性で変動した。１８個の神経膠腫のうちの５個はＭｅｔ陰性であり、そして３／１８個は強く染色された。３個全てが高いグレードの神経膠腫であった。要するに、神経膠腫の７０％がｃ−Ｍｅｔを発現し、そしてｃ−Ｍｅｔ発現レベルは腫瘍グレードと共に増大した。
【００９５】
実施例６
Ｍｅｔ４のエピトープのマッピング
材料および方法
Ｍｅｔ４をＰＢＳ中２．０  ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。Ｐｈ．Ｄ．−１２およびＰｈ．Ｄ．−７ファージディスプレイペプチドライブラリーをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓファージディスプレイペプチドライブラリーキットから入手した。−９６ｇＩＩＩシークエンシングプライマーおよび宿主株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２７３８もまたこのキットから入手した。その他の全ての溶液をＳＩＧＭＡの化学物質を用いて調製した。
【００９６】
図８はＭｅｔ４エピトープをマッピングするために使用した方法を示す。最初に各々異なるペプチド配列を表示するファージのライブラリーを、Ｍｅｔ４抗体でコーティングしたプレートに暴露する。図７はファージディスプレイペプチドライブラリーでのバイオパニングを示す。ファージディスプレイは無作為ペプチド配列とこれらの配列をコードするＤＮＡとの間の連結の存在を可能にする。バイオパニングは、ファージディスプレイされたペプチドを標的分子（酵素、抗体等）でコーティングされた表面に暴露する選択技術である。
【００９７】
Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓファージディスプレイペプチドライブラリーキットに従ってＭ１３ファージディスプレイライブラリーを使用してバイオパニングを実施した。６０×１５  ｍｍペトリ皿を１００  μｇ／ｍｌ  Ｍｅｔ４抗体でコーティングし、そしてプレートをおよそ１×１０  １１  ｐｆｕのＭ１３ペプチドライブラリーに暴露する種々の工程が含まれた。未結合ファージをＴＢＳＴで洗い流し、そして特異的に結合したファージを１０％グリシンＨＣｌおよびＢＳＡで溶出した。以下にさらに詳記されるように溶出されたファージを増幅し；その過程を全部で３−４ラウンド繰り返し；そして最後にＭｅｔ４抗体に関して陽性の個々のクローンを単離し、そしてシークエンシングした。
【００９８】
ファージ増幅および沈殿のために、１：１００希釈のＥＲ２７３８培養物を感染および増幅に使用した。ファージを２０％ポリエチレングリコール、２．５Ｍ  ＮａＣｌで沈殿させた。数回の結合／増幅サイクルを通してＭｅｔ４抗体に特異的なファージを取り出した。表４は、Ｐｈ．Ｄ．−１２ライブラリーからの最初のインプットおよびＭｅｔ４に対するパニングの各ラウンドに続くアウトプットに関するファージ数をｐｆｕで示す。
【００９９】
【表４】
0004806469.tif 000005
最終ファージ単離体の力価決定および増幅を実施して、単一のＤＮＡ配列に相当する各ファージクローンを確実にした。
【０１００】
以下の方法に従ってＭ１３コロニーのＥＬＩＳＡを実施した：Ｍｅｔ４抗体を個々のＭ１３ペプチドディスプレイクローンに暴露した。１％乳バッファー中１：５０００希釈のＨＲＰ抱合抗Ｍ１３抗体を二次抗体として使用した。使用した過酸化物基質をＰｉｅｒｃｅ  ＴＭＢ基質キットから入手した。ＫＣ４  ＰＣプログラムを使用してプレートを４５０  ｎｍで読んだ。図９は野生型Ｍ１３と比較したファージディスプレイ１２ライブラリーから回収されたＭｅｔ４特異的ファージクローンのＥＬＩＳＡからのＯＤ４５０  ｎｍ値を示す棒グラフである。
【０１０１】
以下のようにＭ１３からｓｓＤＮＡを単離した：ＥＬＩＳＡから最高の吸光度の読みを有する８個のＭ１３ファージクローンを選択し、そしてＱＩＡＧＥＮによるＱＩＡｐｒｅｐ  Ｍ１３ハンドブックからのＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍ１３プロトコールを使用してそのｓｓＤＮＡ分子を単離した。
【０１０２】
超特異的ファージクローンのＤＮＡシークエンシングによりエピトープを特徴付けした。ＤＮＡシークエンシング以下のように実施した：各Ｍ１３クローンから単離されたＤＮＡ２．０  μｌをＰＣＲ管中２８  ｇＩＩＩシークエンシングプライマー１．０  μｌと組み合わせた。試料をＰＣＲに提示し、そしてシークエンシングを実施した。Ｓｉｍプログラムを使用して、シークエンシングされたＭｅｔ４特異的Ｍ１３ペプチド（ファージディスプレイ１２ペプチドライブラリーから）をヒトＭｅｔ細胞外ＨＧＦ／ＳＦ結合ドメイン配列と比較した。アミノ酸配列間の類似性を表５にて太字で示す。
【０１０３】
【表５】
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Ｍｅｔ４のエピトープ：
ＤＮＡ配列分析をヒトＭｅｔタンパク質上の（配列番号：１の）アミノ酸残基２３６−２４２のエピトープＤＶＬＰＥＦＲ（表５参照）に、またはさらに具体的にはヒトＭｅｔタンパク質上の（配列番号：１の）アミノ酸残基２３６−２３９のエピトープＤＶＬＰ（表５参照）にマッピングした。
【０１０４】
実施例７
ＲＡ４Ｅウサギ抗Ｍｅｔ抗体はＭｅｔ４のエピトープに結合する
ヒトＭｅｔアミノ酸残基２３３−２４６からのペプチドＳＹＩＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹＰ（ペプチド１）およびＭｅｔアミノ酸４７８−４９１からの別のペプチドＮＦＬＬＤＳＨＰＶＳＰＥＶＩ（ペプチド２）をＧｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．により合成した。ペプチド１をＫＬＨタンパク質に抱合させた。Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ＣｏｒｐによりＳＹＩＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹＰ−ＫＬＨに対してウサギポリ血清（ｐｏｌｙｓｅｒａ）が作成された。ポリクローナル抗体（「ＲＡ４Ｅ」と称される）を、ペプチド１を抱合させたアフィニティーカラムを通して精製した。
【０１０５】
ＲＡ４Ｅ抗Ｍｅｔ抗体はＭｅｔ４と競合する
ウサギ抗Ｍｅｔ抗体ＲＡ４Ｅを競合ＥＬＩＳＡにより特徴付けした。競合ＥＬＩＳＡでは、９６ウェルプレートを１  μｇ／ｍｌのＭｅｔ２５−５６７タンパク質でコーティングした。Ｍｅｔ４およびＲＡ４Ｅを連続希釈のペプチド１およびペプチド２と混合し、そして混合物をＭｅｔコーティングプレート上で室温で１．５時間インキュベートした。洗浄後抗マウスまたは抗ウサギＡＰ抱合体を１：２０００希釈でプレートに添加した。展開させた後、ＥＬＩＳＡリーダーにより４０５ｎｍで光学密度値を測定した。ペプチド１は用量依存的な様式でＭｅｔタンパク質に対するＭｅｔ４およびＲＡ４Ｅ双方の結合を遮断したが（図１０Ａ−Ｃ）が、ペプチド２は結合に影響を及ぼさなかった。
【０１０６】
ＭＫＮ４５およびＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＭｅｔ４およびＲＡ４Ｅの免疫蛍光染色
ウサギ抗Ｍｅｔ抗体ＲＡ４Ｅを免疫蛍光染色によりさらに特徴付けした。ＭＫＮ４５およびＮＩＨ３Ｔ３細胞を８チャンバースライドにおいて３７℃で一晩同時培養した。次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、そして１０％ホルマリンで固定した。固定細胞をＭｅｔ４およびＲＡ４Ｅ（各々８  μｇ／ｍｌ）と共に４℃で一晩インキュベートした。Ｃ２８（２０
μｇ／ｍｌ）を陽性対照として使用した。洗浄後、抗マウスローダミンレッドおよび抗ウサギＦＩＴＣ抱合体を細胞に添加し、そしてスライドを室温（ＲＴ）で１．５時間インキュベートした。核をＤＡＰＩで染色した。Ｍｅｔ４およびＲＡ４ＥはＭｅｔ発現ＭＫＮ４５細胞において共存することが見出されたが、Ｍｅｔ陰性ＮＩＨ３Ｔ３細胞においては見出されなかった（図１１Ａ−Ｃ）。ＲＡ４ＥはＭｅｔ４に類似して１０％ホルマリンで固定されたＭｅｔ陽性ＭＫＮ４５細胞を染色したので、ＲＡ４ＥはＭｅｔ４に類似する特性を有するはずである。すなわちこのデータにより、ＲＡ４ＥはＭｅｔ４同様、免疫組織化学染色によるホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片に関する臨床診断に使用できることが示唆される。
【０１０７】
前記の記載は好ましい（複数の）実施態様の記載にすぎないと考えられる。当業者および本発明を作成または使用するものは本発明の修飾に気づくであろう。それ故に図面にて示された、および前記で記載された（複数の）実施態様は単なる例証目的のためであり、そして均等論を含む特許法の原理に従って解釈されるような請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことは理解される。
（参考文献）
【０１０８】
【化１】
0004806469.tif 000007
【０１０９】
【化２】
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【０１１０】
【化３】
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【０１１１】
【化４】
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【０１１２】
【化５】
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【０１１３】
【化６】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１】
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【図１０Ａ】
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【配列表】
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