(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの重合体であって、該重合体は炭素数1〜12の線状又は分枝状のアルキル基を有するポリ(シアノアクリル酸アルキル)であるものと、少なくとも１つの有効成分と、前記少なくとも１つの重合体と会合した少なくとも１つの環状オリゴ糖とを含んでなるナノ粒子であって、４０〜３００ｎｍの範囲にある粒径を有し、前記環状オリゴ糖は、中性又は荷電の天然の、分枝状、又は重合化された、或いは化学修飾されたシクロデキストリンであり、そして前記有効成分と前記環状オリゴ糖は、複合体を形成していることを特徴とする前記ナノ粒子。
【請求項２】
安定剤をさらに含むことを特徴とする請求項１記載のナノ粒子。
【請求項３】
環状オリゴ糖は、一つ又は複数のヒドロキシプロピル基を、アルキル基、アリール基、アリールアルキル基、グリコシド基による置換、又は脂肪族アルコール又は脂肪族酸によるエーテル化、エステル化によって化学修飾されたシクロデキストリンであることを特徴とする請求項１記載のナノ粒子。
【請求項４】
有効成分は、親水性、疎水性、両親媒性及び／又は不溶性であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
有効成分は、抗癌剤、アンチセンス剤、抗ウィルス剤、抗生剤、蛋白質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、アンチセンス・ヌクレオチド、ワクチン、免疫調整剤、ステロイド剤、鎮痛剤、抗モルヒネ剤、抗真菌剤及び駆虫剤から選択されたものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
有効成分は、タキソールであることを特徴とする請求項５記載のナノ粒子。
【請求項７】
有効成分は、ドキソルビシンであることを特徴とする請求項５記載のナノ粒子。
【請求項８】
有効成分がナノ粒子1gに対して0.01〜300mgの量で含有されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
環状オリゴ糖の割合は、有効成分に対して0.1〜70重量％であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
下記の段階、
a）少なくとも１つの有効成分と、少なくとも１つの環状オリゴ糖から成る複合体を水性又は非水性溶媒の溶液で調製し、ここで、該環状オリゴ糖は、中性又は荷電の天然の、分枝状、又は重合化された、或いは化学修飾されたシクロデキストリンであり、
b）段階a）で得た溶液に、少なくとも１つの重合体の単量体を徐々に添加し、ここで、該単量体は、炭素数1〜12の線状又は分枝状のアルキル基を有するシアノアクリル酸アルキルであり、そして
c）前記単量体を重合して、ナノ粒子を得ること、
から成ることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項１１】
段階c)において重合がアニオン重合であることを特徴とする請求項１０記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項１２】
段階c)において重合が光重合開始剤によって行われることを特徴とする請求項１０記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項１３】
段階c)において重合が１つ又は複数の界面活性剤及び／又は安定剤の存在下、行われることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項１４】
段階a）において環状オリゴ糖の割合は、有効成分に対して０．１〜７０重量％であることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項１５】
下記の段階、
a)少なくとも１つの重合体及び環状オリゴ糖からナノ粒子を調製すること、ここで、前記重合体は、炭素数1〜12の線状又は分枝状のアルキル基を有するポリ(シアノアクリル酸アルキル)であり、前記環状オリゴ糖は、中性又は荷電の天然の、分枝状、又は重合化された、或いは化学修飾されたシクロデキストリンであり、そして
b)前記ナノ粒子に前記有効成分を会合させること、
から成ることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項１６】
段階a）において環状オリゴ糖の割合は、有効成分に対して０．１〜７０重量％であることを特徴とする請求項１５記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項１７】
下記の段階、
a）水性又は非水性溶媒の少なくとも１つの有効成分と少なくとも１つの環状オリゴ糖を含む溶液を調製し、
ここで、該環状オリゴ糖は、中性又は荷電の天然の、分枝状、又は重合化された、或いは化学修飾されたシクロデキストリンであり、
b）段階a）の溶液に、少なくとも１つの重合体の単量体を徐々に添加し、ここで、該単量体は、炭素数1〜12の線状又は分枝状のアルキル基を有するシアノアクリル酸アルキルであり、
c）前記単量体を重合し、そして、
d）段階c）で得たナノ粒子の粒径を調節し、該ナノ粒子を水性又は非水性溶媒の少なくとも１つの有効成分の溶液でインキュベートすること、
から成ることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項１８】
段階c)において重合がアニオン重合であることを特徴とする請求項１７記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項１９】
段階c)において重合が光重合開始剤によって行われることを特徴とする請求項１７記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項２０】
段階c)において重合が１つ又は複数の界面活性剤及び／又は安定剤の存在下、行われることを特徴とする請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項２１】
段階c)において、調節段階の後でインキュベーションの前にナノ粒子を精製することをさらに含むことを特徴とする請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項２２】
段階a）において環状オリゴ糖の割合は、有効成分に対して０．１〜７０重量％であることを特徴とする請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のナノ粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特に予防、治療又は診断を目的とする薬品の分野で使用される有効成分の送達、及び治療係数の改善（利得／危険率の改善）に関する。
【０００２】
本発明は特に、少なくとも一つの有効成分を含有する新しいナノ粒子を得ることを目的とする。
【０００３】
【従来の技術】
有効成分の新しい送達システム又は放出システムの開発は、有効成分を、特に薬理的な有効成分を、治療に最適な速度及び薬量で、その作用部位に制御送達することを第一の目的とする（1）。有効成分の生体内での分布を調節することにより治療係数を改善することが可能である。有効成分を送達システムに会合させることにより、作用部位の標的化後、作用部位への特異的な送達又は制御放出が特に可能となる。有効成分の存在が望ましくない区画内での有効量の低減により、当該有効成分の効果を向上、その有毒な副作用を低減、場合によってはその活性を変更又は復元することも可能である。
【０００４】
有効成分の送達コロイドシステムは、リポソーム、マイクロエマルジョン、ナノカプセル、ナノスフェア、微粒子及びナノ粒子を含む。ナノ粒子は、標的化、分布の調節及び製剤の自由度を利点とし、目的に合わせて構想および実現が可能の重合体構造を有する。ナノ粒子は特に、制御放出、作用部位への特異的な送達（又は標的送達と呼ばれる）ができ、効果の向上と共に、他の臓器での有毒な副作用を低減できるので、上記の改善された治療係数を得ることを図れる。
【０００５】
このような投与方法は、生物分解性重合体の使用を必要とする。その中でも、他の生物分解性重合体と比較して、より急速な、治療又は診断適用に適合した時間で生物分解を示す、ポリ(シアノアクリル酸アルキル)は特に有利である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記の有利な特徴があるとしても、ポリ(シアノアクリル酸アルキル)による有効成分の荷量（重合体1重量単位に会合した有効成分の量で表す）は、多くの場合、特に有効成分の水溶性が低い場合限られるが、これは、ナノ粒子の製造に水相での重合技術を使用するからである。有効成分の荷量に対するこの大きな制限は、特に疎水性、両親媒性及び／又は不溶性有効成分の場合に見られる。
【０００７】
従来のナノ粒子は、投与部位から生体内の標的部位へ、適量の有効成分を輸送する能力が比較的低いことから、多くの場合は、大量な重合体の投与を必要とする恐れがある。有効成分のベクターとしてのナノ粒子の製造に、ポリ(シアノアクリル酸アルキル)が使用されている（3）。しかし、上記理由により、特に疎水性、両親媒性及び／又は不溶性有効成分の場合、得られる荷量が低量であるため、治療上の使用は限られている。
【０００８】
ここで、重合体、特にポリ(シアノアクリル酸アルキル)の使用範囲が広くなることが予想外に発見され、有効成分と複合体を形成できる化合物一つ又は複数を重合体に会合させることにより、特異な性質を有する新規のナノ粒子を得ることが可能である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
従って本発明は少なくとも一つの有効成分を含むナノ粒子を得ることを目的とし、少なくとも一つの、好ましくは、炭素数1〜12の線状又は分枝状のアルキル基を有すポリ(シアノアクリル酸アルキル)の重合体と、当該有効成分と複合体を形成できる少なくとも一つの化合物とを会合させることを特徴とする。
【００１０】
本発明における有効成分と複合体を形成できる化合物は、好ましくは、環状オリゴ糖の中から、特に中性又は荷電の天然（α-、β-、γ-、δ-、ε-シクロデキストリン）、分枝状、又は重合化された、或いは例えば一つ又は複数のヒドロキシプロピル基を、アルキル基、アリール基、アリールアルキル基、グリコシド基等による置換、又は脂肪族アルコール又は脂肪族酸によるエーテル化、エステル化によって化学修飾されたシクロデキストリンの中から選ばれたものである。上記基の中でも特に好ましいのは、ヒドロキシプロピル基、メチル基、スルホブチルエーテル基の中から選ばれたものである。
【００１１】
予想外に、本発明の会合において、有効成分と複合体を形成できる化合物の存在は、有効成分が疎水性、両親媒性及び／又は不溶性であっても、一つ又は複数の重合体と、有効成分と複合体を形成できる一つ又は複数の当該化合物との会合から生じる重合体構造内へ、有効成分が達することを可能とし、この構造内への被包率は従来の技術と比較して有意に増加しており、これは、有効成分と複合体を形成できる化合物の使用による可溶化と、新しい重合体構造に対する有効成分の親和性との平衡に関すると考えられるが、治療や産業において大きな進展を示している。一方、ナノ粒子は固体であるので、一つ又は複数の当該化合物と一つ又は複数の当該重合体との複合体を安定させる。
【００１２】
本発明により、例えばポリ(シアノアクリル酸アルキル)型のナノ粒子に、水溶性の有効成分だけではなく、疎水性、両親媒性及び／又は不溶性の有効成分も、負荷することが可能となった。
【００１３】
重合体と、有効成分と複合体を形成できる化合物との会合は、重合体のみの使用では発生しない有効成分の新しい固定部位を形成する。有効成分と複合体を形成できる化合物によって、これらの新しい部位の発生、特に疎水性空洞の発生は、有効成分の荷量を増加すると同時に、複合体を形成できる化合物のみを使用する際は存在しない制御放出及び遅延放出機能を保持することが可能である。
【００１４】
従来の技術では、調製の過程上シアノアクリル酸アルキルがデキストランと会合する、シアノアクリル酸に基づく重合体の製造方法が記述されている（Egea、M. A. ら、Farmaco、1994年、49号、211〜217頁）。しかしこの製造方法では、デキストランは、安定剤として一般的に使用され、活性分子と複合体を形成することはできない。更に、デキストランは高分子量の線状多糖類分子であり、低分子量で、他の分子と複合体を形成できるシクロデキストリンとは基本的に異なる。
【００１５】
つまり、本発明のナノ粒子は、次の特異な性質を有する：
-粒径の調整、
-活性分子、特に疎水性、両親媒性及び／又は不溶性活性分子の向上した被包化、
-場合により、デキストラン等の安定剤の非存在。
【００１６】
米国特許5641515号では、インシュリンをポリシアノアクリレートの重合体に被包することも提案されている。この被包化は、インシュリンと重合体との間に共有結合が形成することに基づき、本発明のナノ粒子に基づく複合体形成とは異なるものである。即ち、本発明のナノ粒子は、低エネルギー化学結合、つまり、非共有結合の形成により一つ又は複数のシクロデキストリンと会合して包接複合体を形成する有効成分の分子の能力に基づく。この複合体は、遊離型の有効成分及びシクロデキストリンと、包接複合体との平衡が成立することから成る。この複合体は、その安定度定数により定量的に特徴付けられる。本発明における複合体形成とは、後者の現象のみを言う。従って、有効成分の複合体形成は、ナノ粒子の調製時のみならず、調製したナノ粒子内でも実施され、より大量の有効成分を会合できる方法となる。
【００１７】
通常、有効成分とナノ粒子との会合は、単に粒子を構成する重合体内での結晶状有効成分の分散、重合体内での有効成分の可溶性、（低エネルギーの）二次化学結合による吸着、又は粒子を構成する重合体との（高エネルギーの）共有結合から成るものであることを思い出すのは適切である。
【００１８】
これに関して、ナノ粒子の調製が、水相に分散されたシアノアクリル酸アルキル単量体を重合することが必要であることは注目すべきことである。続いて、ポリ(シアノアクリル酸アルキル)の合成により、ナノ粒子を形成できる。この段階は通常、被包するべき有効成分の存在下で行う。その結果、有効成分と形成された重合体との望ましくない共有化学結合が発生する場合がある。この現象は、ペプチド（Grangier、 J. l.、 J. Controlled Rel.、1991年、15号、3-13頁）又は他の分子（ビンブラスチン、V. Guiseら、Pharm. Res.、1990年、7号、736-741頁）について記述されている。
【００１９】
本発明は、本発明のナノ粒子の調製時に有効成分と複合体を形成することが、反応する可能性を有する化学基を遮蔽し、粒子の形成に必要な化学反応に対して、当該有効成分を保護することによって、前記の欠点を解決する。従って、有効成分は、有利に非共有結合的に粒子と会合する。
【００２０】
更に、有効成分とナノ粒子との会合は、通常、酸性水溶液で行われる。しかし、この条件下で不安定である有効成分の場合、化学分解が生じ、望ましくない、かつ高度な有効成分の被包率を得ることを妨げる加水分解物の被包化に達する可能性がある。逆に、本発明では、有効成分をシクロデキストリンと複合体を形成し、外部反応環境に対して有効成分を保護するので、この欠点を解決する。
【００２１】
本発明のナノ粒子の組成に含まれることができる有効成分として、抗癌剤、アンチセンス剤、抗ウィルス剤、抗生剤、蛋白質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、アンチセンス・ヌクレオチド、ワクチン、免疫調整剤、ステロイド剤、鎮痛剤、抗モルヒネ剤、抗真菌剤及び駆虫剤が挙げられる。これらの中でも、本発明は特に、タキソール又はその誘導体、ドキソルビシン又はその誘導体及び白金の誘導体を対象とする。
【００２２】
有効成分の量は通常、ナノ粒子1gに対して0.01〜300mgである。
有効成分と複合体を形成できる化合物の割合は通常、該有効成分に対して0.1〜70重量％である。
有効成分の割合は、有効成分と複合体を形成できる化合物の割合に依存しない。
【００２３】
また、本発明が、本発明のナノ粒子を含む医薬又は診断組成物、及び少なくとも一つの薬学的に受容可能、かつ、適当なビヒクルに関することは言うまでもない。
【００２４】
前記ナノ粒子の調製も本発明の目的である。
【００２５】
上記の如く定義した、重合体に基づく、特にポリ(シアノアクリル酸アルキル)に基づくナノ粒子の第1製造方法は、以下の段階を含むことを特徴とし、
a）少なくとも一つの有効成分と、それと複合体を形成できる少なくとも一つの化合物から成る複合体を水性又は非水性溶媒の溶液で調製し、
b）段階a）で得た溶液に、少なくとも一つの重合体の単量体、特にシアノアクリル酸アルキル単量体を徐々に添加し、そして
c）好ましくはアニオン重合であるが、他の重合開始剤、特に光化学性の重合開始剤も使用可能であり、場合によっては一つ又は複数の界面活性剤及び／又は安定剤の存在下、この単量体を重合する。
【００２６】
上記第1製造方法とは別方法である、本発明のナノ粒子の第2製造方法では、重合体、特にポリ(シアノアクリル酸アルキル)、及び有効成分と複合体を形成できる化合物に基づいた、「空ナノ粒子」（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｕｌｅｓ  ｂｌａｎｃｈｅｓ）とも呼ばれるナノ粒子を先ず調製した後、当該空ナノ粒子に有効成分を会合させる。この製造方法は特に以下の段階を含み、
a）水性又は非水性溶媒の有効成分と複合体を形成できる少なくとも一つの化合物を含む溶液を調製し、
b）段階a）で得た溶液に、重合体の単量体少なくとも一つ、特にシアノアクリル酸アルキル単量体を徐々に添加し、そして
c）好ましくはアニオン重合であるが、他の重合開始剤、特に光化学性の重合開始剤も使用可能であり、場合によっては一つ又は複数の界面活性剤及び／又は安定剤の存在下、この単量体を重合し、
d）段階c）で得たナノ粒子の調節と、場合によっては、精製後、当該ナノ粒子を、水性又は非水性溶媒の有効成分の溶液でインキュベートする。
第1製造方法と同様に、有効成分と空ナノ粒子の会合は、ナノ粒子に会合したシクロデキストリンの量により決定される。この第2製造方法は以下2つの利点を示し、
-有効成分を損失する可能性のある、有効成分で負荷したナノ粒子を精製する段階を避け、
-例えば、有効成分が溶液で極めて不安定な場合、即時に有効成分を負荷できるシステムの作成を可能とする。
【００２７】
従って、本発明は、空ナノ粒子、即ち上記第2製造方法の段階a）〜ｃ）によって得られる無負荷状態のナノ粒子にも関する。更に、これら空ナノ粒子は、特にシクロデキストリンの癌における効果により、治療的な有利性を示す（Grosse、P. Y.ら、British Journal of Cancer、1998年、78：9号、1165-1169頁）。
【００２８】
本発明の第1製造方法の段階a）及びb）では、溶媒は好ましくは重合体の重合化、特にポリ(シアノアクリル酸アルキル)の重合化に対して有利な条件を保持すると共に、その溶媒から成る溶液で、有効成分及び有効成分と複合体を形成できる化合物の溶解度が最も高いものであるように選ばれる。このような溶媒は、好ましくは、水性溶媒又は水性アルコール溶媒の中から選ばれる。本発明の第2製造方法の段階a）、b）及びc）で溶媒はこのように選ばれる。
【００２９】
従来のナノ粒子の調製は、界面活性剤又は安定剤を必要とする。下記の実施例に示すように、本発明では、これら化学剤は不必要となった。つまり、シクロデキストリン等の有効成分と複合体を形成できる化合物は逆説的に、通常使用されている界面活性剤が不必要になる程の安定効果を有す。このことは企業上有意なコストダウンになる。尚、有効成分と、有効成分と複合体を形成できる化合物から成る複合体は、ポリ(シアノアクリル酸アルキル)により安定されることがみられる。
【００３０】
しかし、本発明の製造方法で安定剤及び／又は界面活性剤を使用される場合では、デキストラン、又はポロクサマーが好ましい。
【００３１】
本発明の好ましい実施例の一つでは、有効成分に対するシクロデキストリンの可能性により、粒子に新しい性質の追加が可能である。即ち、シクロデキストリンの粒子での存在は、溶液では不安定である有効成分を安定させることもでき、また、刺激作用等の有効成分の望ましくない性質を遮蔽することができる。
【００３２】
従来のナノ粒子の製造方法では、ナノ粒子の粒径の調節について欠落している。本発明の方法では、予想外に、かつ驚くべきことに、特別な追加過程を一切追加する必要がなく、ナノ粒子の粒径を調製する際、直接調節することができる。
【００３３】
下記の実施例で示すように、本発明におけるナノ粒子の粒径は、主に有効成分と複合体を形成できる化合物の濃度によって決定されるものである。シクロデキストリンの場合、この粒径は、300から50nm以下までの広範囲で調節できる。従って本発明は、単純な準備検討により、目的の特定な効果に準じ、本発明の特に医薬の組成物のナノ粒子の粒径を調節できる。先験的な粒径の選択は、必要に応じて、生体でのナノ粒子の分配に障害になる物理的な問題を克服し、又は細網内皮系による組成物のナノ粒子の捕獲を避けることを可能とする。更に、新しい内臓の標的化も可能とする。
【００３４】
従って、本発明の段階a）では、有効成分と複合体を形成できる化合物の割合は、該有効成分に対して通常0.1〜70重量％である。即ち、上記の如く、有効成分と複合体を形成できる化合物の濃度を選択することは、本発明の方法により得たナノ粒子の粒径の調節を可能とする。以上の如く、粒径が40〜300nmのナノ粒子を得る。
【００３５】
有効成分と複合体を形成できる化合物の放出及び有効成分の放出に関する研究によって、有効成分と複合体を形成できる化合物の放出曲線が極めて急速で、ほぼ100％であるが、有効成分の放出は、急速な第1期と、その後、より低速な生物分解による第2期から成ることが示される。これはポリ(シアノアクリル酸アルキル)の場合について従来から記述されている。
【００３６】
有効成分の放出試験における、ナノ粒子を分解するエステラーゼの使用は、有効成分の大部分がナノ粒子のマトリックス内に含まれていることを示し、これは期待される活性の視点から重要なことである（4）。
【００３７】
最も親水性なもの（ヒドロコルチゾン）から、最も疎水性なもの（プロゲステロン）の範囲のステロイド剤を使用して行った異なる試験は、本発明のナノ粒子が各種の有効成分を特にその疎水性等の理化学的特性によって、高い濃度で含められることを明らかにした。
【００３８】
ここで、下記の実施例で検体として使用されるプロゲステロンは、水溶解度が低く（0.01ml/ml）、従来の水性乳剤で行う重合化の手順では、有効成分の負荷は非常に低くなり、実用性がない。即ち、この負荷は、従来の調製技術を使用する場合では低度なものである。本発明のナノ粒子によれば、有利に、かつ驚くべきことに、この負荷は、50倍以上である。従って、本発明は、疎水性、両親媒性及び／又は不溶性の有効成分の使用を、即ちそれらの治療係数の更新を可能とする。
【００３９】
従って、上記の過程の使用により、標的化かつ治療係数を改善させた医薬品の製造も本発明の目的である。
【００４０】
【発明の実施の形態】
本発明の他の利益や特徴は、付属した図を参照とする下記実施例によって理解を及ぼすものである。
【００４１】
下記の実施例で、シアノアクリル酸イソブチル、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン及びダナゾール、プロゲステロン及びエステラーゼ（19国際単位/ml）はSigma Chemicals（セント・ルイス、ミネソタ州、米国）から、スピロノラクトン、テストステロン、酢酸メゲストロールはそれぞれSophartex、Besin-Iscovesco及びUpjohnから、α-、β-及びγ-シクロデキストリン、平均MS値がそれぞれ0.9、0.6及び0.6である2-ヒドロキシプロピル-α-、2-ヒドロキシプロピル-β-、2-ヒドロキシプロピル-γ-シクロデキストリンはWacker Chemie GmbH（ミュンヘン、ドイツ）から、スルホブチルエーテルβ-シクロデキストリン（以降SBEβCD）はCyDex L. C. （Overland Park、カンサス州、米国）から入手した。ポロクサマー188（Lutrol F68登録商標）はBASF（Ludwigshafen、ドイツ）により贈与されたものである。その他の化学製品及び溶解剤の品質は、分析及びHPLCに適応するものである。
【００４２】
【実施例１】
各種のシクロデキストリン及びポロクサマーの存在下でのナノ粒子の製造方法
【００４３】
ポロクサマー188を1体積％含む0.01 M塩酸（pH 2.0）10 ml内で、α-、β-、γ-、2-ヒドロキシプロピル-α-、2-ヒドロキシプロピル-β-又は2-ヒドロキシプロピル-γ-シクロデキストリン、或いはスルホブチルエーテルβ-シクロデキストリン5 mg/mlの存在下、シアノアクリル酸イソブチル100 μlのアニオン重合によりナノ粒子を調製した（2）。室温で電磁撹拌機を用いてシクロデキストリンの溶液を攪拌し（1000  r.p.m.）、単量体を滴下して添加した。6時間の攪拌後、懸濁液は2.0 μｍの前置ろ過器（Millex AP 500登録商標）でろ過し、更に特徴付けした。
【００４４】
【実施例２】
各種のシクロデキストリンの存在下でのナノ粒子の製造方法
【００４５】
0.01 M塩酸（pH 2.0）10 ml内で、α-、β-、γ-、2-ヒドロキシプロピル-α-、2-ヒドロキシプロピル-β-又は2-ヒドロキシプロピル-γ-シクロデキストリン、或いはβ-シクロデキストリンのスルホブチルエーテル5mg/mlの存在下、シアノアクリル酸イソブチル100μlのアニオン重合によりナノ粒子を調製した（2）。室温で電磁撹拌機を用いてシクロデキストリンの溶液を攪拌し（1000 r.p.m.）、単量体を滴下して添加した。6時間の攪拌後、懸濁液は2.0μmの前置ろ過器（Millex AP 500登録商標）でろ過し、更に特徴付けした。
【００４６】
【実施例３】
プロゲステロン／2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン（HPβCD）複合体の製造方法
【００４７】
水150 mlでHPβCD 3.615gをプロゲステロン3.0gと混合し、室温で電磁撹拌機を用いて24時間の攪拌下、プロゲステロン／HPβCD複合体を調製した。その後、混合液をろ過した（0.45 μm）。ろ過した溶液のHPβCD及びプロゲステロンを検定し、プロゲステロンを負荷したナノ粒子の調製に使用した。
【００４８】
【実施例４】
プロゲステロンを負荷したポリ(シアノアクリル酸イソブチル)／HPβCD（PIBCA／HPβCD）ナノ粒子の製造方法
【００４９】
複合体溶液のHPβCDの濃度が、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0及び20.0 mg/mlになるように実施例3に記述した如く得たプロゲステロン／HPβCD溶液を希釈した。実施例1に準じて、1体積％のポロクサマー188の存在下又は非存在下、ナノ粒子を調製した。
【００５０】
【実施例５】
（対照）：プロゲステロンで負荷したHPβCDを有しないポリ(シアノアクリル酸イソブチル)ナノ粒子の製造方法
【００５１】
対照となるポリ(シアノアクリル酸イソブチル)のナノ粒子をシクロデキストリンなしに重合媒体で調製した。希塩酸（pH 2.0）で、1体積％のポロクサマー188（この媒体で最高の溶解度に相当する、約60 μg/ml）の存在下、有効成分を溶解し、プロゲステロンを負荷したナノ粒子を調製した。重合化の過程は、実施例1に記述の如く行った。
【００５２】
【実施例６】
調製したナノ粒子内でのプロゲステロン及びHPβCDの検定
【００５３】
各種のナノ粒子の懸濁液は、25°Cで30〜40分間、82000ｘgの遠心分離（Beckman、L5-65 超遠心分離機、70.1 Ti型回転子）で処理し、蒸留水5 ml内に再懸濁した。最後に懸濁液は凍結乾燥化した（Christ HED Freeze Drier、ドイツ）。
【００５４】
ナノ粒子内によるプロゲステロンの荷量を検定するために、凍結乾燥化した生成物はHPLC級のアセトニトリルで希釈し、溶液は高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）によって分析した。HPLCシステムは、Waters（Saint-Quentin-en-Yvelines、フランス）の溶媒送達装置510、自動試料採取装置WISP 712、Nova-Pak C18 4 μmカラム（250 x 4.6 mm）及びデータ・モジュール746と接続した245nmで作動する吸光度計486から成る。流速は1.0 ml/minで、溶離液は水とアセトニトリル（40:60）から成り、保持時間は約12分である。結果は検定3回の値を平均して表した。
【００５５】
HPβCDを定量化するために、凍結乾燥化したナノ粒子を0.2 M水酸化ナトリウムによって12時間加水分解し、pHを7.0（±0.5）に調整し、HPβCDの存在下、脱色するフェノールフタレイン溶液を分光測光法により検定し、HPβCDを定量化した。つまり、フェノールフタレインは、シクロデキストリン（CD）と、無色かつ安定した包接複合体を形成する（5）。従って、フェノールフタレインを含むアルカリ性ホウ酸塩緩衝液の溶液の色彩強度は、溶液に含まれるCDの量に応じて減少する。
【００５６】
0.006Mフェノールフタレインのエタノール溶液を2％含むpH 10.0のアルカリ性ホウ酸塩緩衝液で、CDの母液を希釈し、標準液を調製した。標準曲線（λ＝550 nm）は、CDの濃度が1〜100μg/mlの範囲では線状である。検体は、フェノールフタレインを含む緩衝液を4体積単位添加し、直接検討した。
【００５７】
【実施例７】
ナノ粒子の特徴付け
【００５８】
ナノ粒子の粒径分布、平均粒径及び多分散性は、NS Coulter Nanosizer （Coultronics、Margency、フランス）を用いてレーザー散乱法によって推定した。検体はMilliQ水（抵抗力18 MΩ以上、Millipore、Saint-Quentin-en-Yvelines、フランス）に懸濁した。各分析時間は200秒であった。温度は20°Cで、分析角度は90度であった。MilliQ水で懸濁した粒子のゼータ電位は、レーザー・ドップラー速度計（Zetasizer 4、Malvern、英国）を用いて測定した。
【００５９】
実施例1〜7の結果
【００６０】
各種のシクロデキストリン5 mg/ml及び1％のポロクサマー188の存在下調製した粒子の特徴（3回実行した調製の平均値±標準偏差）を以下の表Iに記載した。
【００６１】
【表１】
0004651192.tif 000002
CD＝シクロデキストリン
HP＝ヒドロキシプロピル
SBE＝スルホブチルエーテル
【００６２】
粒径、ゼータ電位、シクロデキストリンの荷量及び安定性（値は表示せず）は、シクロデキストリンの種類により影響される。
【００６３】
粒子に結合した各種のシクロデキストリンの量は、全粒子量の20〜35重量％の範囲である。
【００６４】
HPβCDと共に製剤化されたナノ粒子は、粒径が平均100nm以下で、ゼータ電位が約ゼロmVであるため、最も有利である。HPβCDは更に、重合媒体での高い溶解性及び優れた認容性を示す。尚、各種の物質の被包を可能とする。従って、相補的な検討は、HPβCDを使用して実行した。
【００６５】
重合媒体にHPβCDが存在する場合、界面活性剤であるポロクサマー188の添加はナノ粒子の製造には必要ではない。
【００６６】
一方では、図1に示すように粒子の粒径及びゼータ電位は、ポロクサマー188の存在により変化するものではない。
【００６７】
他方では、HPβCDの濃度は、粒径及びゼータ電位に大きな影響を及ぼす。HPβCDの濃度が0 から12.5mg/mlまで増加すると、粒径が300nmから50nm以下まで縮小する。同じく粒子のゼータ電位は徐々に大きい負値（-40 mV）から約0 mVの表面電位に減少する。
【００６８】
これらの傾向は、図2に示すように、プロゲステロンの存在下、ナノ粒子を調製する場合、一般的に保持される。検討におけるHPβCDの濃度範囲において、プロゲステロンを含まない粒子と比較して、ゼータ電位は微小な陰性を示す。更に、ポロクサマー188の非存在下、ナノ粒子の粒径は450nmまで急速に増加した後、HPβCDの濃度が10mg/ml以上の場合、急速に縮小する。ポロクサマー188の存在下、この現象はなくなる。
【００６９】
図3に示すように、重合媒体にHPβCDを添加することにより、大量のHPβCDがナノ粒子に会合する。粒子に会合するHPβCDの量は継続的に、粒子の重量の60％まで増加することができる。重合媒体でのHPβCD及びシアノアクリル酸イソブチルの初期量が同量である場合、粒子に会合するHPβCDの量は約35％である。
更に、粒子とHPβCDの会合は、ポロクサマー188の存在に影響されない。
【００７０】
図4に示すように、重合媒体にプロゲステロンが存在することは、ナノ粒子のHPβCDの含量に大して影響を及ぼさない。HPβCDの存在下粒子を調製する場合、粒子のプロゲステロン荷量は極めて増加する。図5に示すように、プロゲステロンの荷量は、HPβCDの非存在下、粒子1mg毎0.79 μgであり、50倍まで、即ち粒子1mgに対して45 μgまで、徐々に増加する。ポロクサマー188の存在下、又は非存在下で調製した粒子の間に有意な差は検出されない。
【００７１】
下記の実施例8〜10で使用されるナノ粒子の特徴を、以下の表IIに記述する。
【００７２】
【表２】
0004651192.tif 000003
a＝重合媒体でのHPβCDの初期濃度（mg/ml）
b＝粒子1mgに対してHPβCDのμg量
c＝粒子1mgに対してプロゲステロンのμg量
【００７３】
【実施例８】
インビトロのPIBCA/HPβCDナノ粒子からのプロゲステロンの放出
【００７４】
アルカリ性ホウ酸塩緩衝液（ABB）（pH 8.4）、又はエステラーゼ（25及び100国際単位）を含むABB、又は20及び40％（体積／体積）のABB／ポリエチレン・グリコール400（PEG）を15ml含むフラスコに、一定の計量の凍結乾燥化ナノ粒子（グルコース1％（重量／体積）含む）を添加した。電磁撹拌機を用いて、37°Cで200r.p.m.の条件下、検体を攪拌し、所定の間隔で試料採取した。懸濁液は、30分間20°Cで82000xgの遠心分離で処理し、上清のプロゲステロン含量は全ての溶液で、HPβCD含量はPEG媒体で検定した。ABB媒体でインキュベートした検体の場合は100μl、PEG媒体の場合は20μl注入して、上記の如くHPLCによりプロゲステロン含量を検定した。
【００７５】
試験は全て、放出相の有効成分の濃度が飽和より10％以下に維持できる条件で行った。
【００７６】
【実施例９】
インビトロのPIBCA/HPβCDナノ粒子からのHPβCDの放出
【００７７】
HPβCDの放出の検討は、ABB媒体でのプロゲステロンの放出の検討と同様に行い、超遠心分離後のCD含量を上記の如くフェノールフタレインとの複合体形成により測定した。放出率100％でのCDの濃度は約100 μg/mlであった。
【００７８】
【実施例１０】
示差走査熱量測定法（DSC）
【００７９】
DSCの検討は、Perkin Elmer社のDSC-7示差走査熱量計を用いて行った。インジウムの融解温度の転移点を使用して、温度を較正した。約4mgの検体をアルミニウムのカプセル内に配置し、0°C から250°C までの、10°C/minの走査速度で加熱した。
【００８０】
実施例8〜10の結果
【００８１】
附属した図面の図6は、PIBCA/HPβCDを組み合わせて成るナノ粒子からABB（pH8.4）へのプロゲステロンの放出曲線を示す。この図面では、両試験製剤共、1時間目に急速な（150nm及び70nmのナノ粒子ではそれぞれ10％及び34％の）初期放出（分裂効果）を含む二相性の放出曲線を表わす。前記急速な放出は、重合体ネットワークに組み込まれたプロゲステロン／CD複合体によるものではなく、ナノ粒子の形成によって生じた広い表面に吸着した、又は弱く結合した、一部のプロゲステロンによることと考えられる。第二相は、プロゲステロンの35％及び62％がそれぞれ150nm及び70nmのナノ粒子から放出される、より低速で指数的な放出に相当する。この低速放出相は、単にプロゲステロンがナノ粒子から外部へ拡散すること、又は放出溶液がナノ粒子内に侵入し、プロゲステロンを溶解して、プロゲステロンが外部へ拡散することによることと考えられる。
【００８２】
インビトロの検討は、コロイドシステムからの有効成分の放出が複数の要因により影響されることを立証した。前記要因は、粒子の粒径及び形状、有効成分の荷量及び溶解性を含む（6、7、8）。従来の研究で示されたのと同様、より少量（10.5 μg/mg）のプロゲステロンを負荷された、より大粒径（170 nm）の粒子と比較して、より大量（24 μg/mg）の有効成分を負荷された最小（70 nm）のナノ粒子は、より急速な放出を示す。ナノ粒子の粒径の平均値及び有効成分の荷量は、放出速度の主な要因であり、より大粒径のナノ粒子の場合、急速相は減少する。
【００８３】
図7は、可溶化剤としてのPEG 400（20％及び40％）の存在下、PIBCA/HPβCDナノ粒子からのプロゲステロンの放出曲線を示す。同種類の媒体は、放出媒体の体積を減少させ、その結果、有効成分を濃縮させ、検出の改善を可能とする（9）。同様に、非水性溶媒又は可溶化剤を使用する場合、放出のメカニズムに関する情報を得ることが可能である。図7に示すように、放出曲線は両媒体の場合とも一致せず、放出がPEGの濃度に大きく影響されることを意味する。従って、プロゲステロンの放出は、溶媒が重合体マトリックス内に侵入し、有効成分の溶解及びナノ粒子から外部への拡散によって決定される。これに対して、有効成分の放出が、単なる重合体マトリックスを通っての拡散による場合、放出溶媒の組成は、有効成分の放出に影響しない（10）。
【００８４】
単量体を界面活性剤の水性溶液に添加し、攪拌してミセルを得る（2）ことから成るナノ粒子の製造方法は、重合化の段階で、ミセル内での有効成分の分布を決定できる。
【００８５】
図6及び図7が示す急速な放出は、重合化の段階で粒子の表面がプロゲステロンで富化されていることを示唆する。一方、高度な多孔性内部構造を有す可能性がある重合体ネットワーク内に、有効成分が大量に捕獲された可能性がある（11）。このことが、PEGの濃度を増加した場合、放出速度が上昇する原因である可能性がある（図7）。それは、PEGが放出媒体の組成により異なる速度で構造内に侵入し、有効成分の外部への拡散を変更すると考えられる。
【００８６】
放出媒体にPEGを添加することにより、放出速度が極めて上昇したが、プロゲステロンの放出率は100％以下である（放出率はPEG40％の場合、それぞれ75％及び82％である）。
【００８７】
逆に、エステラーゼ類の酵素が放出媒体に存在する場合、エステラーゼの無い放出溶液の場合よりも急速な放出に達し、放出されるプロゲステロンの量は、試験した両製剤及び酵素の両濃度の場合、ほぼ100％である（図8）。これらは、プロゲステロン分子が、少なくとも一部は、分子の状態で、本発明のナノ粒子の重合体マトリックス内に捕獲され、及び／又は、シアノアクリル酸イソブチルネットワークに結合していると考えられる（12）。放出媒体でのエステラーゼ類の酵素の使用は、ポリ（シアノアクリル酸塩）ナノ粒子の重合体鎖の分解又は溶解をに達する。この場合、マトリックス内に固定された有効成分は、その分解の進行に伴って放出される。
【００８８】
PIBCAの側鎖のエステル結合を分解することから生じる生物分解は、プロゲステロンの放出の有意な加速化を可能とするメカニズムである。このことは他の著者によって報告された結果に相当する（12、13）。エステラーゼを含む媒体での有効成分の放出の研究では、取り込まれた有効成分が100％放出されない場合がある（12、14、15）。そのような場合、PIBCA鎖と有効成分の分子の間に結合が存在すると言われている（12、14）。図９に示すナノ粒子からのシクロデキストリンの放出曲線は、1時間目に極めて急速に100％に近い放出を示す。従って、これらの分子がおそらく化学的に重合体と結合されているのではなく、単に重合体内に吸着又は捕獲されていることを示す。
【００８９】
HPβCDを含む検体のDSC曲線は、30〜90°Cの範囲で再現可能である開始温度が、同範囲の大幅な吸熱的転移を示す（図10a、図10c及び図10ｄ）。この非対称ピークは水の排除によるものであると考えられる。プロゲステロンを含む検体（物理的混合及びプロゲステロンのみ）は、強調された吸熱ピークを約130°Cに示す。これは、結晶状プロゲステロンの融解温度の転移点に相当する（図10b及び図10c）。HPβCD：プロゲステロン複合体は、上記の30〜90°Cの範囲での吸熱転移のみを示し、結晶状プロゲステロンの融解の転移が消え（図10d）、有効成分が分子の状態でシクロデキストリン分子の空洞に分散されていると考えられる。同じ形状で、プロゲステロンを負荷するPIBCA/HPβCDのナノ粒子は、強調された吸熱ピークを表さず、この場合、代わりに130°C〜170°Cの幅広い範囲の吸熱的転移がある（図10e及び図10f）。この現象は、プロゲステロンが分子の状態で、重合体の中に溶解されている、或いは本発明のナノ粒子に会合するシクロデキストリンの中に封入されていることと考えられる。この形状で、シクロデキストリン及びプロゲステロンの各種の媒体での放出に関する総合結果及び各種のDSC曲線は、文献上の情報に加え、ナノ粒子の形態が、分子状の有効成分の一部を含む重合体の核、及びシクロデキストリン：プロゲステロン複合体で富化された表面で表せることを示す。この構造により、プロゲステロンの二相的な放出の説明ができるであろう。即ち、急速な第一相は、シクロデキストリン：プロゲステロン複合体が表面から脱離することによるもので、極めて低速な第二相が、重合体ネットワークを通って、プロゲステロンの外部への拡散を含むものであると考えられる。
【００９０】
【実施例１１】
各種の有効成分を負荷したポリ（シアノアクリル酸イソブチル）のナノ粒子の調製法
【００９１】
HPβCD 300mg及びステロイド剤15mgを15mlの水で混合し、72時間37°Cの電磁攪拌下、プレドニゾロン、スピロノラクトン、テストステロン、プロゲステロン、ダナゾール及び酢酸メゲストロールの複合体を得た。懸濁液はろ過し（0.45mm）、シクロデキストリン及び有効成分の濃度は、以下実施例12と同様に検定した。実施例1と同様に、HPβCD 10mg/mlを含む複合体を形成した溶液を、重量／体積1％のポロクサマー溶液に添加して、ポリ（シアノアクリル酸イソブチル）／HPβCDのナノ粒子を調製した。
【００９２】
【実施例１２】
（対照）：各種の有効成分を負荷したポリ（シアノアクリル酸イソブチル）のナノ粒子の製造方法
【００９３】
ポロクサマー１８８（重量／体積1％）で飽和濃度に相当する濃度のヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、スピロノラクトン、テストステロン、プロゲステロン、ダナゾール及び酢酸メゲストロールを別々に、重合媒体に添加した。HPβCDが無いこと以外は、各種の有効成分を負荷したポリ（シアノアクリル酸イソブチル）のナノ粒子を実施例1と同様に調製した。
【００９４】
【実施例１３】
ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、スピロノラクトン、テストステロン、プロゲステロン、ダナゾール、酢酸メゲストロール及びHPβCDの検定
【００９５】
各種のステロイドは、同じ解析条件でこれら各種の物質の検定できる、実施例6と同様に検定した。HPβCDも同様、実施例6に準じて検定した。
【００９６】
【実施例１４】
ポロクサマー188の存在下又は非存在下、本発明により調製したナノ粒子の粒径及びゼータ電位の特徴
【００９７】
実施例11及び12で調製したナノ粒子は、実施例7に準じて特徴付けた。本発明のナノ粒子が、ポロクサマー188の非存在下、即ちHPβCDのみの存在下調製された場合は、ステロイド剤を負荷した粒子の粒径は一般的に縮小され約100nmであり、粒子の表面に位置するシクロデキストリンにより負荷物が遮蔽されたと考えられる。
【００９８】
ポリ（シアノアクリル酸アルキル）ナノ粒子による薬剤の荷量、又はポリ（シアノアクリル酸アルキル）とヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンから成るナノ粒子による薬剤の荷量と、相当するシクロデキストリンの含有量を以下表IIIに記載する（3値の平均）。
【００９９】
【表３】
0004651192.tif 000004
【０１００】
実施例11〜14の結果：本発明のナノ粒子によるステロイド剤の荷量の増加
【０１０１】
本発明のナノ粒子又は対照粒子によるステロイド剤の荷量の値を表IVに絶対値で表した（調製3回の平均値）。粒子による荷量の増加値の計算は、プレドニゾロンの場合の如く129倍にも成り得ることを示す。
【０１０２】
【表４】
0004651192.tif 000005
【０１０３】
参考文献一覧表
【０１０４】
1) J. Kreuter、Colloidal Drug Delivery Systems、Marcel Decker社、 ニューヨーク、1994年, 219-342頁。
2) 特許EP-B-0007895号 (US-A-4329332号及びUS-A-4489055号)及びEP-B-0064967号 (US-A-4913908号)。
3) C. Cuvierら、 Biochem. Pharmacol.、 44号、509-517頁(1992)。
4) AC de Verdiereら、British  Journal  of  Cancer  76 (2)号、198 - 205頁(1997)。
5) M. Vikmon、Proceed.  First  International  Symposium  on  Cyclodextrins、ブダペスト、1981年、69-74頁。
6) E. Allemannら、Pharm. Res.、10号、1732-1737頁(1993)。
7) J. C. Lerouxら、J. Control. Rel.、39号、339-350頁(1996)。
8) N. Erdenら、International  Journal  of  Pharmaceutics、137号、57 - 66 頁(1996)。
9) J. - P. Benoitら、Microspheres  and  Drug  Therapy.  Pharmaceutical,
Immunological and Medical Aspects、Elsevier社、アムステルダム、1984年、91 - 102頁。
10) C. Washington、Int. J. Pharm.、58号、1-12頁 (1990)。
11) P. Couvreur ら、J. Pharm. Sci.、68号、1521-1524頁 (1979)。
12) F. Fawazら、International  Journal  of  Pharmaceutics、154号、191 - 203頁(1997)。
13) J. L. Grangierら、J. Control. Rel.、15,号、3-13頁(1991)。
14) Ch. Tassetら、J. Control. Rel.、33号、23-30頁(1995)。
15) B. Seijoら、Int. J. Pharm.、62号、1-7頁(1990)。
【図面の簡単な説明】
【図１】  2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン（HPβCD）の存在下調製したポリ(シアノアクリル酸イソブチル)（PIBCA）ナノ粒子の場合、粒子の粒径又は粒径測定及びゼータ電位の変化（3回の検定の平均値±標準偏差）を、HPβCDの初期濃度に対して示す。
【図２】  プロゲステロン：2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン（HPβCD）複合体の存在下調製したPIBCAナノ粒子の粒径測定及びゼータ電位の変化（3回の検定の平均値±標準偏差）を、HPβCDの初期濃度に対して示す。
【図３】  HPβCDの存在下調製したPIBCAナノ粒子のHPβCDの荷量の変化（3回の検定の平均値±標準偏差）を、HPβCDの初期濃度に対して示す。
【図４】  プロゲステロン：HPβCD複合体の存在下調製したPIBCAナノ粒子のHPβCDの荷量の変化（3回の検定の平均値±標準偏差）を、HPβCDの初期濃度に対して示す。
【図５】  PIBCA／HPβCDナノ粒子のプロゲステロンの荷量の変化（3回の検定の平均値±標準偏差）を、HPβCDの初期濃度に対して示す。
【図６】  PIBCA／HPβCDナノ粒子からアルカリ性ホウ酸塩緩衝液（ABB）（pH 8.4）にプロゲステロンを放出する速度に及ぼす、粒径の影響を示す。
【図７Ａ】  PIBCA／HPβCDナノ粒子からABB（pH 8.4）にプロゲステロンを放出する速度に及ぼす、放出溶液の組成による影響を示す。A : ABB:PEG 400 (80:20)
【図７Ｂ】  PIBCA／HPβCDナノ粒子からABB（pH 8.4）にプロゲステロンを放出する速度に及ぼす、放出溶液の組成による影響を示す。B : ABB:PEG 400 (60:40)
【図８Ａ】PIBCA／HPβCDナノ粒子からABB（pH 8.4）にプロゲステロンを放出する速度に及ぼす、エステラーゼ類の酵素の存在による影響を示す。A :エステラーゼ25国際単位を含む放出溶液
【図８Ｂ】PIBCA／HPβCDナノ粒子からABB（pH 8.4）にプロゲステロンを放出する速度に及ぼす、エステラーゼ類の酵素の存在による影響を示す。B :エステラーゼ100国際単位を含む放出溶液
【図９】37°CのABB溶液でHPβCDが放出される速度を示す。
【図１０】  10°C/minの温度上昇速度で得た、示差走査熱量測定法（Differential Scanning Calorimetry、DSC）における曲線を示す。
【図１】
0004651192.tif 000006
【図２】
0004651192.tif 000007
【図３】
0004651192.tif 000008
【図４】
0004651192.tif 000009
【図５】
0004651192.tif 000010
【図６】
0004651192.tif 000011
【図７Ａ】
0004651192.tif 000012
【図７Ｂ】
0004651192.tif 000013
【図８Ａ】
0004651192.tif 000014
【図８Ｂ】
0004651192.tif 000015
【図９】
0004651192.tif 000016
【図１０】
0004651192.tif 000017