(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンドロゲン非依存性状態への前立腺腫瘍細胞の進行を遅らせるための組成物であって、配列番号４または１２の配列を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する組成物。
【請求項２】
同じ型の正常組織とは異なる量でＴＲＰＭ−２を発現する癌に罹っている個体における癌細胞の化学療法または放射線感受性を増強するための組成物であって、配列番号４または１２の配列を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する組成物。
【請求項３】
化学療法の感受性を増強するための、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
放射線感受性を増強するための、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４により表される配列からなる、請求項１−４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１２により表される配列からなる、請求項１−４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
ＴＲＰＭ−２以外の抗アポトーシスタンパク質の発現を阻害する第２のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
第２のアンチセンスデオキシオリゴヌクレオチドは、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘｌおよびｃ−ｍｙｃから選ばれる配列に特異的に結合する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
配列番号４に記載された配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号１２に記載された配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがin vivoでの安定性を増加させるための修飾を受けている請求項１−８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
アンドロゲン非依存性状態への前立腺腫瘍細胞の進行を遅らせるため、または癌細胞の化学療法または放射線感受性を増強するための医薬組成物を製造するための請求項１―１１のいずれか一項に記載の組成物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用であって；該腫瘍細胞及び該癌細胞が同じ型の正常組織とは異なる量でＴＲＰＭ−２を発現している；上記使用。
【請求項１３】
ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡに相補的であって、配列番号４または１２に記載された配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、および、哺乳類対象に該アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供してＴＲＰＭ−２の発現を減少させるための薬学的に許容し得る担体を含む、同じ型の正常組織とは異なる量でＴＲＰＭ−２を発現している癌においてＴＲＰＭ−２の発現を減らすための医薬組成物。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号４の配列からなる、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドがin vivoでの安定性を増加させるための修飾を受けている請求項１３または１４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記同じ型の正常組織とは異なる量でＴＲＰＭ−２を発現している癌が前立腺癌である請求項１３−１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記同じ型の正常組織とは異なる量でＴＲＰＭ−２を発現している癌が腎細胞癌である請求項１３−１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、１９９９年２月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／１２１，７２６号（これは、参照することにより本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
本出願は、テストステロン抑制前立腺メッセージ−２（testosterone-repressed prostate message-2）（ＴＲＰＭ−２）に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用する、癌のアンチセンス治療法に関する。
【０００３】
前立腺癌は、男性が罹患する最も一般的な癌であり、西洋世界の男性の癌の死亡原因の第２である。前立腺癌はアンドロゲン感受性腫瘍であるため、進行前立腺癌患者の治療法の１つとして例えば精巣除去によるアンドロゲン離脱が使用されている。アンドロゲン離脱は、前立腺腫瘍で広範なアポトーシスを引き起こし、従って疾患が退縮する。しかし精巣除去に誘導されたアポトーシスは完全ではなく、最終的に、生存している腫瘍細胞のアンドロゲン非依存性への進行が起きる。この進行は、生存とクオリティオブライフの改善に対する大きな障害であり、従ってアンドロゲン非依存性細胞を標的とする試みが行われている。これらの試みは、アンドロゲン非依存性腫瘍細胞を標的とする非ホルモン治療法に集中している（ヤゴダ（Yagoda）ら、Ｃａｎｃｅｒ  ７１（捕冊３）：１０９８−１１０９（１９９３）；オー（Oh）ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．６０：１２２０−１２２９（１９９８））が、これまでのところ、生存率を改善する非ホルモン性物質はまだ見つかっていない。従って別のアプローチが必要である。
【０００４】
アンドロゲン離脱後の前立腺腫瘍細胞により、無数のタンパク質の発現量が増加することが観察されている。これらのタンパク質の少なくとも一部は、アンドロゲン離脱で観察されるアポトーシス性細胞死に関連すると推測されている（ラッフォ（Raffo）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．：４４４８−４４４５（１９９５）；クラジェウスカ（Krajewska）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４８：１５６７−１５７６（１９９６）；マクドネル（McDonnell）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：６９４０−６９４４（１９９２））。しかしこれらのタンパク質の多くの機能は、明確には理解されていない。ＴＲＰＭ−２（硫化グリコプロテイン−２（ＳＧＰ−２）またはクラステリン（clusterin）としても知られている）は、この後者の分類に入る。
【０００５】
ＴＲＰＭ−２は遍在するタンパク質であり、広範な活性を有する。前立腺上皮細胞では、精巣除去後直ちにＴＲＰＭ−２の発現が上昇し、ラットの前立腺細胞では精巣除去後３〜４日でピークレベルに達し、多量の細胞死滅の開始と一致する。これらの結果から一部の研究者は、ＴＲＰＭ−２が細胞死滅のマーカーおよびアポトーシスのプロモーターであると結論している。一方、セルトリ細胞と一部の上皮細胞は、細胞死滅レベルを上昇させることなく高レベルのＴＲＰＭ−２を発現するという観察結果は、この結論が正しいかどうかについて疑問を投げかけている。
【０００６】
センシバー（Sensibar）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５：２４３１−２４３７（１９９５）は、前立腺細胞の死滅におけるＴＲＰＭ−２の役割をより明確に解明するために行ったインビトロの実験を報告した。彼らは、ＴＲＰＭ−２をコードする遺伝子でトランスフェクションしたＬＮＣａＰ細胞を使用して、このタンパク質の発現が、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）（ＬＮＣａＰ細胞は、これに対して非常に感受性であり、通常約１２時間以内で細胞の死滅が起きる）の作用を改変するかどうかを観察した。トランスフェクションしたＬＮＣａＰ細胞をＴＮＦαで処理すると、数時間の間一時的にＴＲＰＭ−２レベルが上昇するが、細胞死滅に先行するＤＮＡ断片化が観察されるまでに、これらのレベルは消滅することが証明された。ＴＲＰＭ−２配列の塩基１〜２１に対応するアンチセンス分子（しかし、他のＴＲＰＭ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドではない）を使用すると、ＴＲＰＭ−２の発現が大幅に低下し、ＴＮＦαに暴露されたＬＮＣａＰ細胞のアポトーシス性細胞死が増加した。このためセンシバー（Sensibar）らは、ＴＲＰＭ−２の過剰発現はＴＮＦの細胞障害作用から細胞を防御し、ＴＲＰＭ−２の枯渇が、細胞死滅の開始の原因であるという仮説をたてた（ただし、この作用機序は不明のままである）。
【０００７】
センシバー（Sensibar）らは、ＴＲＰＭ−２の可能な役割に関する情報を提供しているが、これは、ＴＲＰＭ−２の発現がトランスフェクションされた遺伝子に基づくというモデル系からのみの結果を開示するものである。さらに、他の研究室で増殖させたＬＮＣａＰ細胞中では、ＴＲＰＭ−２の発現レベルは非常に低いかまたは発現が無い。前立腺腫瘍細胞をアンドロゲン離脱に付した時インビボで起きる状況ははるかに複雑であり、その結果多くのタンパク質では発現レベルが変化する。すなわち、センシバー（Sensibar）らのデータから、ＴＲＰＭ−２が他のタンパク質と一緒に存在する時に同じ機能を果たすかどうか、またはインビボでアンドロゲン離脱後のＴＲＰＭ−２のレベルの変化が、治療的利点が有るかどうかについて予測することは不可能である。確かに、ＴＲＰＭ−２は、アンドロゲン離脱後に種々の段階（有意なアポトーシス性細胞死が起きている段階を含む）で前立腺腫瘍細胞中で多量に発現されるという事実は、インビボでのＴＲＰＭ−２の役割はもっと複雑かも知れないことを示唆する。すなわち、この分野では、前立腺腫瘍細胞中のアポトーシス性細胞死のある面に関するデータを提供するが、アンドロゲン非依存性の発症の遅延を提供する方法を教示も示唆もしない。
【０００８】
本発明の目的は、そのような方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前立腺腫瘍細胞中のアンドロゲン非依存性の発症を遅らせるための、治療的アンチセンス分子を提供することである。
本発明のさらなる目的は、ＴＲＰＭ−２を発現する癌からの癌細胞の化学療法または放射線に対する感受性を増強する方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、ＴＲＰＭ−２の発現を阻害するアンチセンス分子を提供することである。
【０００９】
（発明の要約）
本発明において、ＴＲＰＭ−２の発現を低減させるアンチセンス療法は、癌の治療において治療的利点を提供することが確定された。特にそのようなアンチセンス療法は、前立腺癌および腎細胞癌の治療に応用することができる。
インビボで前立腺腫瘍細胞へのアンチセンスＴＲＰＭ−２オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の添加は、アンドロゲン非依存性の発症を遅らせるのに有効である。すなわちある実施態様において本発明は、前立腺癌に罹っている個体の前立腺癌の治療法であって、アンドロゲン離脱を開始して個体の前立腺腫瘍細胞のアポトーシス性細胞死を誘導する工程と、腫瘍細胞によるＴＲＰＭ−２の発現を阻害するのに有効な組成物を個体に投与する工程とを含んでなり、こうして個体のアンドロゲン非依存性状態への前立腺腫瘍細胞の進行を遅らせる上記方法を提供する。さらに、アンチセンスＴＲＰＭ−２と細胞障害性化学療法（例えば、タキサン）を組合せて使用すると、ホルモン不応性の前立腺癌での化学療法感受性を、相乗的に増強させる。本発明の別の実施態様において、ＴＲＰＭ−２以外の抗アポトーシスタンパク質の発現を阻害する第２のアンチセンスＯＤＮが、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮとともに投与される。
アンチセンスＴＲＰＭ−２は、他のタイプの癌にも有効作用を有することがわかっている。具体的には、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮは、ヒト腎細胞癌（客観的応答率が１０％を超える活性な化学療法剤がない通常の化学療法耐性疾患）の化学療法感受性を増強させる。ＴＲＰＭ−２を発現する細胞をアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮで処理すると、放射線感受性もまた増強される。すなわち、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮは、ＴＲＰＭ−２の発現が観察されている種々のタイプの癌の治療に使用することができる。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ、および癌の治療におけるこれらの組成物の使用に関する。本発明は、癌細胞がＴＲＰＭ−２を発現する癌の治療に応用することができる。ＴＲＰＭ−２を発現する３つの大きなクラスの癌細胞は、前立腺癌細胞、ヒト腎細胞癌（ＲＣＣ）細胞、および一部の乳癌細胞である。
【００１１】
ある実施態様において本発明は、精巣除去誘導性の腫瘍細胞死滅の増強方法、およびアンドロゲン非依存性への前立腺腫瘍細胞の進行を遅らせる方法；前立腺癌に罹っている個体（ヒトを含む）の治療のための治療法；およびそのような方法での使用に有効な治療薬を提供する。本発明の治療法は、最も一般的には進行性前立腺癌を有する個体の治療で使用される。
【００１２】
精巣除去誘導性の腫瘍細胞死滅の増強およびアンドロゲン非依存性へのアンドロゲン感受性前立腺癌細胞の進行の遅延は、細胞によるＴＲＰＭ−２の発現を阻害することにより達成される。３つのモデル系（インビボのシオノギ（Shionogi）腫瘍モデル、ヒトＴＲＰＭ−２でトランスフェクションしたＬＮＣａＰモデル、およびヒトＰＣ−３モデル）で実験を行い、これらはともに、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）でアンドロゲン感受性前立腺腫瘍細胞を処理することにより、そのような阻害がアンドロゲン非依存性を遅延させることを証明した。
【００１３】
最初の実験で、シオノギ（Shionogi）腫瘍モデルでアンドロゲン非依存性の発症を遅らせる、マウスＴＲＰＭ−２アンチセンス分子（配列番号１）の能力を評価した。シオノギ（Shionogi）腫瘍モデルは、同系の雄の宿主の皮下で増殖するアンドロゲン依存性マウス乳腺癌の異種移植片である。シオノギ（Shionogi）腫瘍細胞は、腫瘍原性が高くかつ局所侵襲性である。この細胞は、前立腺腫瘍細胞の観察された挙動を模倣するようにアンドロゲン離脱に応答することが証明されており、ヒトの前立腺癌の有効なモデルであるとして受け入れられている。（ブルチョフスキー（Bruchovsky）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：２２７５−２２８２（１９９０）；レニー（Rennie）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：６３０９−６３１２（１９８８）；ブルチョフスキー（Bruchovsky）ら、Ｃｅｌｌ  １３：２７２−２８０（１９７８）；グリーブ（Gleave）ら、Ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎａｒｙ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｐｐ．３６７−３７８、ランゲ（Lange）ら編、リッペンコット（Lippencott）（１９９７）；グリーブ（Gleave）ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５７：１７２７−１７３０（１９９７）；ブルチョフスキー（Bruchovsky）ら、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６：１３−２１（１９９６））。すなわちアンドロゲン離脱は、アポトーシスと腫瘍退縮を再現性高く促進する。さらに、精巣除去後とアンドロゲン非依存性への進行中のヒト前立腺癌におけるＴＲＰＭ−２とＢｃｌ−２の発現の変化は、シオノギ（Shionogi）腫瘍細胞で観察されたものに似ている。すなわち、シオノギ（Shionogi）腫瘍モデルは、前立腺癌細胞の特徴の多くを模倣している。さらにシオノギ（Shionogi）腫瘍モデルは、アンドロゲン非依存性の発症を遅らせる化合物の能力を評価するための、非常に有用なモデルを提供する。精巣除去後の完全な腫瘍退縮にもかかわらず、急速に増殖するアンドロゲン非依存性シオノギ（Shionogi）腫瘍は、１ヶ月後に必ず再発し、これは、アンドロゲン非依存性への進行を遅らせることができる物質を評価するための信頼できる終点を提供する。１ヶ月以内にシオノギ（Shionogi）腫瘍モデル中で起きる事象は、一般に約２年以内にヒト患者で起きる。
【００１４】
ＴＲＰＭ−２の発現を阻害してアンドロゲン非依存性の発症を遅らせるアンチセンスＯＤＮの能力を、シオノギ（Shionogi）腫瘍モデルで精巣除去後の腫瘍容量を測定することにより評価した。試験動物（ｎ＝７）を、緩衝化食塩水中のアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ（配列番号１）の１２．５mg/kgの繰り返し用量で、１日１回腹腔内処理した。対照として、動物（ｎ＝７）をミスマッチＯＤＮ（配列番号２）で処理した。図１に示すように、試験群および対照群の両方とも、精巣除去直後に腫瘍容量の予測された減少を示したが、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ処理したマウスでは対照より速く腫瘍が退縮した。対照群はまた、アンドロゲン非依存性の進展に関連する腫瘍容量の予測された増加を示した。これに対して、精巣除去の４９日後には、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮを使用して処理したマウスでは、腫瘍の再増殖はほとんど起きなかった。アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ処理したマウスでは腫瘍は結局再発したが、再発までの中央時間は、対照群の約２倍であった。すなわちＴＲＰＭ−２の阻害は、アンドロゲン離脱直後に起きる細胞死滅の量を上昇させるだけでなく、アンドロゲン非依存性の発症を遅らせるのにも有効である。アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮで処理したマウス中の腫瘍容量のより急速な減少は、早期の発症とより広範な精巣除去誘導性のアポトーシスが原因であった。これは、シオノギ（Shionogi）腫瘍検体中のポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）切断断片を検出して確認した（ミヤケ（Miyake）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：１７０−１７６（２０００））。
【００１５】
ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡ配列に相補的などのヒトアンチセンスＯＤＮが本目的に最も有効であるかを評価するために、図２に示す種々のｍＲＮＡ領域をつないで一連の１０個のアンチセンスホスホロチオエートＯＤＮを調製した。これらの１０個のＯＤＮの配列を、添付の配列リストに配列３〜１２として示す。この１０個のヒトアンチセンスＯＤＮを、ＴＲＰＭ−２トランスフェクションＬＮＣａＰ細胞とヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞を使用して、ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡの発現を阻害する能力について評価した。図３に示すように、試験したアンチセンスＯＤＮは、種々のレベルのＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡ発現の阻害を示し、配列番号４、５、および１２で最適な結果が得られた。配列番号５は、センシバー（Sensibar）らが使用した、ＬＮＣａＰ細胞中のＴＲＰＭ−２発現を阻害した配列に対応し、ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡの最初の２１塩基に相補的である。最も有効なダウンレギュレーションは、配列番号４で起きた。ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡの開始または停止部位のいずれかとの重複は、有効な配列のすべてに共通であった。すなわち一般的な意味で、本発明の方法は、翻訳開始部位または停止部位に広がるＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡの領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。
【００１６】
本発明のさらなる実施態様において、前立腺癌に罹っている個体（ヒト個体を含む）の治療は、アンドロゲン離脱を開始して、その個体中の前立腺腫瘍細胞のアポトーシス性細胞死を誘導し、かつ腫瘍細胞によるＴＲＰＭ−２の発現を阻害するのに有効な組成物を個体に投与し、こうして個体中の前立腺腫瘍細胞のアンドロゲン非依存性状態への進行を遅らせることにより行われる。
【００１７】
アンドロゲン離脱の開始は、外科的（両方の睾丸の摘出）または内科的（テストステロンの薬物誘導性抑制）精巣除去（これは、現在前立腺癌の治療に望ましいとされている）により行われる。内科的精巣除去は、ＬＨＲＨ剤または抗アンドロゲン剤（クリーブ（Gleave）ら、ＣＭＡＪ  １６０：２２５−２３２（１９９９））を含む種々の処方で行うことができる。可逆的アンドロゲン離脱を行う間欠性治療法は、クリーブ（Gleave）ら、Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ．３４（補冊３）：３７−４１（１９９８）に記載されている。
【００１８】
ＴＲＰＭ−２発現の阻害は一過性であり、理想的には、アンドロゲン離脱と同時に起きる。ヒトではこれは、発現の阻害はアンドロゲン離脱の１日または２日以内に開始し、約３〜６ヶ月続くことが有効であることを意味する。これを行うには、複数回投与することが必要かも知れない。しかしこの期間はより長期でもよく、精巣除去後に開始し、本発明の範囲を逸脱することなく、以後充分な期間続けても良い。
【００１９】
アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮはまた、ヒト腎細胞癌（ＲＣＣ）での化学療法感受性を増強させることが測定されている。ＲＣＣは、客観的応答率が１０％を超える活性な化学療法剤がない化学療法耐性疾患である。アポトーシスを受けている腎近位曲尿細管細胞中のＴＲＰＭ−２発現の上昇は、尿道閉塞やアミノ配糖体を含む種々の刺激後に観察されている。しかしＲＣＣにおけるＴＲＰＭ−２発現の機能的意義は、充分に解明されていない。しかし試験結果は、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮが、ヒトＲＣＣ  ＣａＫｉ−２細胞（例６を参照、後述）の化学療法感受性を増強させることを示している。
【００２０】
アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮはまた、放射線に対する感受性を上昇させることがわかった（例７と図８を参照）。
【００２１】
ＴＲＰＭ−２の発現の阻害は、アンチセンスＯＤＮ、特に翻訳開始部位または停止部位に広がるＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡの領域に相補的なアンチセンスＯＤＮの投与により行われる。ヒトでの前立腺癌の治療のために、具体的な有用な配列は、配列番号４、５、および１２に示すものである。
【００２２】
使用されるＯＤＮは、インビボでのＯＤＮの安定性を上昇させるために修飾してもよい。例えばＯＤＮは、ヌクレアーゼ消化に対する耐性が上昇したホスホロチオエート誘導体（非架橋性ホスホリル酸素原子をイオウ原子で置換）として使用される。ＭＯＥ修飾（ＩＳＩＳ骨格）もまた有効である。
【００２３】
アンチセンスＯＤＮの投与は、当該分野で公知の種々の機序（そのまま投与、および薬剤学的に許容される脂質担体中での投与を含む）を使用して投与することができる。例えば、アンチセンス送達のための脂質担体は、米国特許第５，８５５，９１１号と第５，４１７，９７８号（これらは、参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示されている。一般にアンチセンスは、静脈内、腹腔内、皮下、もしくは経口経路、または局所的に腫瘍に直接注射して投与される。シオノギ（Shionogi）マウスモデルを使用して行われた実験から、アンチセンスＯＤＮは腫瘍細胞中で選択的に活性なようである。確かに、非腫瘍組織中でのＴＲＰＭ−２発現は実質的に影響を受けなく、アンチセンスＯＤＮ投与の副作用も観察されなかった。
【００２４】
投与されるアンチセンスＯＤＮの量は、前立腺細胞中でＴＲＰＭ−２の発現を阻害するのに有効な量である。この量は、使用されるアンチセンスＯＤＮの有効性、および使用される担体の性質の両方で変化することは理解されるであろう。特定の組成物についての適当な量の決定は、適当な治療レベルを評価するのに計画される標準的な一連の試験により、当該分野で公知である。
【００２５】
本発明に従う前立腺癌の治療法は、異なる標的に対する化学療法剤および／または追加のアンチセンスＯＤＮの投与をさらに含んでも良い。例えばシオノギ（Shionogi）腫瘍モデルを使用して、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮは、タキサン（パクリタキセルとドセタキセル）およびミトキサントロンのような従来の化学療法剤に対する感受性を上昇させることがわかっている（図１２Ａと１２Ｂ）。図１２Ａと１２Ｂに示すように、タキソールまたはミトキサントロンの存在下でアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮで治療すると、タキソールまたはミトキサントロンとミスマッチ（ＭＭ）ＯＤＮとの組合せと比較して、腫瘍容量が減少した。相乗作用を示す可能性のある他の物質には、他の細胞障害性物質（例えば、シクロホスファミド、トポイソメラーゼインヒビター）、血管形成インヒビター、分化物質および神経伝達インヒビターがある。同様に、ＴＲＰＭ−２アンチセンスと他のアンチセンス種（例えば、アンチセンスＢｃｌ−２ＯＤＮ）との組合せは、ＯＤＮ単独よりインビトロでシオノギ（Shionogi）細胞を死滅させるのに優れていた。すなわちＴＲＰＭ−２は、他のアンチセンス分子（例えば、アンチセンスＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘｌおよびｃ−ｍｙｃ  ＯＤＮ）と共同して作用して、より大きな効果を示すことができる。
【００２６】
本発明を、以下の非限定例を参照して説明する。
【００２７】
例１
シオノギ（Shionogi）腫瘍モデル実験は、移植可能なＳＣ−１１５  ＡＤマウス乳腺癌のトロント亜株からの細胞を使用して行った。インビボ試験のために、シオノギ（Shionogi）癌の約５×１０6細胞を、ＤＤ／Ｓ株の雌の成体マウスに皮下注射した。シオノギ（Shionogi）腫瘍が直径１〜２cmになった時（注射後、通常２〜３週間目）、メトキシフルラン麻酔下で腹腔切開により精巣除去を行った。マウスの位置、腫瘍のストック、および手術操作の詳細は、既に記載されている。ブルチョフスキー（Bruchovsky）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：２２７５−２２８２（１９９０）；レニー（Rennie）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：６３０９−６３１２（１９８８）；ブルチョフスキー（Bruchovsky）ら、Ｃｅｌｌ  １３：２７２−２８０（１９７８）；グリーブ（Gleave）ら、Ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎａｒｙ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｐｐ．３６７−３７８、ランゲ（Lange）ら編、リッペンコット（Lippencott）（１９９７）；グリーブ（Gleave）ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５７：１７２７−１７３０（１９９７）；ブルチョフスキー（Bruchovsky）ら、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６：１３−２１（１９９６））。
【００２８】
マスホスホロチオエートアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ（配列番号１）またはミスマッチ対照（配列番号２）（これは、配列中でアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮから２塩基異なる）を用いる処理についてランダムに選択した。各実験群は、７匹のマウスから構成された。精巣除去の１日後、リン酸緩衝化生理食塩水に溶解した１２．５mg/kgのアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮまたはミスマッチ対照ＯＤＮを、１日１回で４０日間各マウスの腹腔内に投与した。腫瘍容量を週に２回測定し、式（長さ×幅×奥行き×０．５２３６）を使用して計算した。グリーブ（Gleave）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１５９８−１６０５（１９９２）。データ点は、平均腫瘍容量±標準偏差として報告した。
【００２９】
この試験の結果を図１に示す。図示したように、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮで処理したマウス中で、シオノギ（Shionogi）腫瘍はより速く退縮し、完全な退縮が早期に起きた。さらに、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮで処理すると、実質的にアンドロゲン非依存性の発症を遅らせ、これは、対照動物での２１日後の腫瘍容量の増加に反映される。アンチセンスＴＲＰＭ−２またはミスマッチ対照に関連する副作用は観察されなかった。
【００３０】
ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡのレベルに及ぼすインビボでのＯＤＮ処理の作用を調べるために、マウスのシオノギ（Shionogi）腫瘍組織にノーザンブロット解析を行った。マウスを１２．５mg/kgのアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ（ｎ＝６）またはミスマッチ対照（ｎ＝６）で、精巣除去後１日目に開始して腹腔内注射して処理した。精巣除去後４日目に、腫瘍組織を採取し、ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡについてノーザンブロットで解析した。アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮは、ミスマッチ対照ＯＤＮ処理腫瘍と比較して、シオノギ（Shionogi）腫瘍中のＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡレベルを７５％低下させた（図３）。
【００３１】
正常なマウス臓器について比較分析を行った。同じ処理スケジュール下でアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮとミスマッチ対照で処理したシオノギ（Shionogi）腫瘍マウスから、腎臓、前立腺、および能の試料を採取し、ノーザンブロットで解析した。ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡレベルは、腫瘍組織で有意に低かったが、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮは、正常臓器中のＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡに対して何の作用もなかった。
【００３２】
例２
種々のレベルのアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮまたはミスマッチ対照（配列番号２）で処理後、インビトロで維持したシオノギ（Shionogi）腫瘍細胞中のＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡの発現レベルを比較することにより、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ（配列番号１）の配列選択性を確認した。細胞内へのＯＤＮの取り込みを促進するために、ＯＤＮを陽イオン性脂質担体（リポフェクチン（Lipofectin）（登録商標）（ライフテクノロジーズ（Life Technologies, INc.））中で調製した。以下のプロトコールを使用して、細胞を２日間にわたって２回処理した。無血清ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）（ライフテクノロジーズ（Life Technologies, INc.））中の４μg/mlのリポフェクチンで細胞を２０分間プレインキュベートし、次にＯＤＮの選択濃度とリポフェクチンを含有する培地中で４時間インキュベートした。次に、標準的培養培地で培地を交換した。
【００３３】
細胞中のＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡの量を、ノーザンブロット解析を使用して評価した。図４に示すように、シオノギ（Shionogi）細胞をアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮで処理すると、用量依存性にＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡレベルが低下した。これに対して、ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡレベルは、使用したどの濃度でもミスマッチＯＤＮ（配列番号２）により影響を受けなかった。すなわちアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮの作用は、明らかに配列特異的なようである。
【００３４】
例３
インビトロで維持したシオノギ（Shionogi）細胞を、異なる量のタキソール単独、または５００nMのアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ（配列番号１）もしくはミスマッチ対照（配列番号２）と組合せて処理した。例２に示すように細胞を２回処理し、残存する生存細胞のパーセントを測定した。結果を図５に要約する。図示したように、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮを含有させると、用量依存性曲線が左にシフトし、ＩＣ50が５〜１０倍低下した。パクリタキセルの代わりにミトキサントロンを使用して同様の結果が得られた（図１２Ａと図１２Ｂ）。
【００３５】
例４
アンチセンス／ミスマッチＴＲＰＭ−２  ＯＤＮとタキソールの種々の組合せ中で、アンチセンスＢｃｌ−２ＯＤＮ（配列番号１３）またはミスマッチＢｃｌ−２ＯＤＮ（配列番号１４）を添加して、例３の実験を繰り返した。結果を図６に示す。アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮとアンチセンスＢｃｌ−２ＯＤＮおよびタキソールとの組合せは、タキソールの細胞障害性作用をさらに増強した。すなわち、追加の抗アポトーシス物質のターゲティングは治療的利点を有するようである。
【００３６】
例５
ヒトの治療法で使用するための適当なアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ配列を同定するために、ヒトＴＲＰＭ−２遺伝子の１０個の異なる部位に対するアンチセンスＯＤＮ配列（図２、配列番号３〜１２）を合成し、ヒト前立腺癌ＰＣ−３とトランスフェクションＬＮＣａＰ細胞（ＴＲＰＭ−２を過剰発現する）中のＴＲＰＭ−２遺伝子発現を低下させる能力を、例２と同じ処理プロトコールを使用して試験した。結果を図３に要約する。図示したように、配列番号４、５および１２は、ＴＲＰＭ−２発現の低下について活性である。これらの３つの配列は重複するか、または翻訳開始または停止部位にすぐ隣接している。
【００３７】
例６
免疫組織化学染色を使用して、根治的腎摘出試料から得られた１７個のＲＣＣと正常腎臓組織中のクラステリン（clusterin）発現を解析した。ヒト腎細胞癌株ＡＣＨＮ、ＣａＫｉ−１、およびＣａＫｉ−２中のＴＲＰＭ−２発現を、ノーザンブロットおよびウェスタンブロット解析により評価した。ノーザンブロット解析は、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ処理後のＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡ発現の変化を評価するために行った。アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮとタキソールの組合せがＣａＫｉ−２細胞増殖に及ぼす作用を、ＭＴＴ測定法を使用して調べた。
【００３８】
免疫染色は、隣接する正常な腎組織と比較して１１個のＲＣＣ試料でクラステリン発現の上昇を示した。残りの６例では、悪性組織と正常組織との間に差は見られなかった。ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡとタンパク質発現の両方とも、すべての３つのヒトＲＣＣ細胞株で検出され、ＣａＫｉ−２について最も高いレベルであった。アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ（配列番号４）は、用量依存性かつ配列特異的にＣａＫｉ−２細胞でのＴＲＰＭ−２発現を阻害したが、ミスマッチ対照ＯＤＮは阻害しなかった（図７Ａ）。さらにアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮはタキソールの化学療法感受性を実質的に上昇させ、タキソールのＩＣ５０をミスマッチ対照ＯＤＮと比較して１  ｌｏｇ（５００ｎＭ対５０ｎＭ）低下させた（図７Ｂ）。これらのデータは、ＴＲＰＭ−２とそのタンパク質（クラステリン）は、正常な腎組織と比較してＲＣＣでより高レベルで発現されることを示し、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮは、進行性ＲＣＣの従来の化学療法の細胞障害性を増強するのに有用かも知れないことを示している。
【００３９】
例７
アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮは、ＴＲＰＭ−２を発現する癌細胞の放射線感受性を増強させる。ノーザン解析を使用して我々は、放射線療法が、ヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞中のＴＲＰＭ−２遺伝子発現を用量依存性および時間依存性に上昇させることを見いだした（図８）。ＴＲＰＭ−２の過剰発現は、放射線誘導性の細胞死滅に対する耐性を上昇させる。ＴＲＰＭ−２を過剰発現するヒト前立腺ＬＮＣａＰ細胞（ＬＮＣａＰ／Ｔ１）は、放射線療法に対してより耐性である（図９ＡとＢ）。ヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞を１００と５００ｎＭアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ（配列番号１）で処理すると、ミスマッチＯＤＮ（配列番号２）処理と比較して、４Ｇｙ放射線療法による単回処理後に細胞生存率が有意に低下する（図１０）。図１１ＡとＢは、インビトロで１０、５０、１００ｎＭのアンチセンスＴＲＰＭ−２オリゴで処理後に、ヒト前立腺癌ＰＣ−３の用量依存性放射線増感を示す。
【００４０】
例８
ヒトアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮによる処理が、ＰＣ３ヒト前立腺腫瘍細胞株中の化学療法感受性を増強させるかどうかを調べるために、ＰＣ３腫瘍担持マウスを、アンチセンスヒトＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ＋ミセル状パクリタキセルまたはミトキサントロン、およびミスマッチ対照ＯＤＮ＋でミセル状パクリタキセルもしくはミトキサントロンで処理した（図１２Ａと１２Ｂ）。ＯＤＮを２８日間投与し、０．５ｍｇのミセル状タキソールまたは０．３ｍｇのミトキサントロンを２回投与（１０日から１４日、および２４から２８日）した。ミスマッチ対照ＯＤＮで処理したものと比較して、アンチセンスＯＤＮ処理動物では、腫瘍サイズの有意な低下が観察された。この作用は、ミセル状パクリタキセルまたはミトキサントロンの２回目の投与後に、より顕著であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮを使用して得られる、アンドロゲン非依存性の発症の遅延を示す。
【図２】  図２は、ＴＲＰＭ−２発現を阻害する能力とアンドロゲン非依存性の発症を遅らせる能力とについて評価した、１０個のアンチセンスオリゴヌクレオチドの位置を示す。
【図３】  図３は、種々のアンチセンスＯＤＮの存在下のＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡの発現レベルを示す。
【図４】  図４は、種々の量のアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮまたはミスマッチ対照で、インビトロで処理したシオノギ（Shionogi）細胞中のＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡのレベルを示す。
【図５】  図５は、タキソールとアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮの組合せについての用量応答曲線を示す。
【図６】  図６は、タキソール、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ、およびアンチセンスＢｃｌ−２  ＯＤＮの組合せの用量応答曲線を示す。
【図７】  図７Ａは、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮで処理後のヒト腎細胞癌中のＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡレベルの低下を示す。
図７Ｂは、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮで処理後の、タキソールに対するヒト腎細胞癌の化学療法感受性の上昇を示す。
【図８】  図８は、種々の線量の放射線照射後のＰＣ−３前立腺癌細胞中のＴＲＰＭ−２発現を示す。
【図９】  図９Ａと９Ｂは、ＴＲＰＭ−２を過剰（ＬＮＣａＰ／Ｔ）および正常（ＬＮＣａＰ／Ｐ）に発現するヒト前立腺細胞株の放射線耐性の比較を示す。
【図１０】  図１０は、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮで処理後の、放射線に対するＰＣ−３細胞の感受性の上昇を示す。
【図１１】  図１１Ａと１１Ｂは、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮで処理後の、放射線に対するＰＣ−３細胞の感受性の上昇を示す。
【図１２】  図１２Ａと１２Ｂは、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮを投与した時、化学療法剤パクリタキセルとミトキサントロンに対するシオノギ（Shionogi）腫瘍細胞の感受性の上昇を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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