(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、歯根膜細胞、歯髄細胞、線維芽細胞、上皮細胞および筋芽細胞からなる群から選択される動物細胞を移植するに先立ち、該動物細胞をレクチンを添加した培地中で組織に培養することを特徴とする移植時の定着率の向上した移植組織の製造方法。
【請求項２】
レクチンがコンカナバリンＡである請求項１に記載の移植時の定着率の向上した移植組織の製造方法。
【請求項３】
レクチンがフィトヘマトグルチンＥである請求項１に記載の移植時の定着率の向上した移植組織の製造方法。
【請求項４】
０.０１〜１０００μｇ／ｍＬの濃度になるようにレクチンを添加した培地中で培養する請求項１〜３のいずれかに記載の移植時の定着率の向上した移植組織の製造方法。
【請求項５】
動物細胞がヒト由来である請求項１〜４のいずれかに記載の移植時の定着率の向上した移植組織の製造方法。
【請求項６】
動物細胞が培養細胞である請求項１〜５のいずれかに記載の移植時の定着率の向上した移植組織の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、動物培養細胞および生体中の各種組織に外部刺激に対する抵抗性を付与するための、レクチンを有効成分とする抵抗性付与剤、並びに該抵抗性付与剤を用いた外部刺激に対する抵抗性を付与する方法およびキットに関する。
背景技術
近年、自家および同種間において、間葉系幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、歯根膜細胞および歯髄細胞などの培養細胞の移植が、骨折、変形性関節炎、軟骨損傷、骨髄腫瘍、歯周病、歯髄炎などの軟骨、骨または歯の疾患による軟骨、骨および／または歯根膜や歯髄の欠損を修復するために有効であることが提唱されている。しかし、これらの培養細胞を移植すると、周囲組織または炎症性もしくは免疫系の細胞によって移植細胞が損傷または破壊され、移植組織の脱落、吸収、懐死などが観察される。特に、歯髄細胞は細胞外基質量が少ないために、機械的刺激により容易にはがれ、培養歯髄細胞を移植に供することは困難であった。
移植組織を容易に周囲組織に定着させて組織の修復を促進するためには、移植される組織の細胞が、周囲組織または炎症性もしくは免疫系の細胞による外部刺激、具体的には機械的刺激および／または蛋白質分解反応に対して抵抗性を保持することが重要である。さらに、修復／再生中の間葉系組織、骨組織、軟骨組織、歯根膜組織、歯髄組織における未熟な細胞および／または組織の外部刺激に対する抵抗性を高めることは、種々の骨、軟骨または歯根膜や歯髄の疾患の治療にも有効である。
このため、移植組織をグラスファイバーで包んだり、免疫隔離膜で包むことが行われている。例えば、糖尿病患者に対して、インスリンを産生するマウスのランゲルハンス細胞を免疫隔離膜で包んで移植することが行われている。しかし、人工材料の使用は免疫拒絶を起こしうるとともに、接着強度が弱いという点で問題がある。免疫隔離膜には、免疫系の補体蛋白質は透過させずに細胞が分泌する有益蛋白質は透過させ、さらに酸素と栄養分も十分に透過させる高強度の高分子膜の合成が困難であるという問題がある。（蛋白質  核酸  酵素，Ｖｏ．４５，Ｎｏ．１３（２０００），ｐｐ．２１３９−２１４１，２１７１−２１７８，２３０７−２３１２）。その他には、免疫抑制剤の使用、培養細胞を用いた人工臓器を作製して体外循環により血液を通すことや、免疫応答の高い欠損・障害部位を避けて免疫細胞による拒絶反応の少ない部位に移植することなどが試みられてきたが、免疫抑制剤による副作用、体外循環による患者の負担、欠損・障害部位が残るなどいずれも問題があった。このため、細胞および／または組織自体に抵抗性を付与することが望まれていた。
一方、レクチンは、主に植物や動物に見出されている、結合特異性を有する結合価が２価以上の糖結合性タンパク質であり、種々の動物・植物細胞を凝集させ、多糖類や複合糖質を沈降させる作用を有する。また、一部のレクチン、例えばコンカナバリンＡなどは、Ｔ細胞を幼若化する活性を有することが知られている。さらに種々のレクチンの軟骨細胞の分化、増殖に及ぼす効果が検討され、α−Ｄ−マンノース残基およびα−Ｄ−グルコース残基に親和性を有するレクチン（例えばコンカナバリンＡ）がプロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）の合成を増大させることなどを指標として軟骨細胞の分化を強く促進することが報告されている（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２６５，ｐｐ．１０１２５−１０１３１，１９９０）。しかし、コンカナバリンＡを含むレクチンが、動物細胞、特に培養細胞および／または生体中の各種組織に外部刺激に対する抵抗性を付与しうることは知られていない。
発明の開示
従って、本発明の課題は、動物細胞および／または組織に外部刺激に対する抵抗性を付与する薬剤および外部刺激抵抗性を付与する方法を提供することである。
本発明者は、移植に用いるための間葉系幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、歯根膜細胞、歯髄細胞、線維芽細胞、上皮細胞および筋芽細胞などの培養細胞に外部刺激に対する抵抗性を付与することを目的として鋭意研究した結果、レクチンが該細胞に外部刺激に対する抵抗性を付与しうることを見出した。
従って、本発明は、動物培養細胞に外部刺激に対する抵抗性を付与するための、レクチンを有効成分とする抵抗性付与剤を提供する。
本発明はまた、動物細胞および／または組織をレクチンで処理することからなる、細胞および／または組織に外部刺激に対する抵抗性を付与する方法を提供する。前記方法において、レクチン処理は、該レクチンを細胞および／または組織に直接適用するか、または細胞が培養細胞である場合には培地中に添加して当該細胞を培養することからなる。
本発明において、「外部刺激に対する抵抗性」における外部刺激とは、移植する周囲組織または移植体の炎症性もしくは免疫系の細胞による移植組織への刺激であり、具体的には機械的刺激および／または蛋白質分解反応である。
本発明の抵抗性付与剤で処理すべき動物細胞は、任意の動物細胞であるが、間葉系幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、歯根膜細胞、歯髄細胞、線維芽細胞、上皮細胞および筋芽細胞が好ましい。また該細胞は、哺乳類、例えばげっ歯類（マウス、ラット、ウサギ）、イヌ、サル、ウシ、ヤギおよびヒツジ並びにヒト由来の細胞であるのが好ましく、ヒト由来の細胞であるのが最も好ましい。
本発明において、外部刺激に対する抵抗性付与剤として用いることができるレクチンは、動物細胞に外部刺激抵抗性を付与する作用を有する任意のレクチン、例えば動物由来のレクチンまたは植物由来のレクチンであり、好ましくはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、フィトヘマグルチンＥ（ＰＨＡ−Ｅ）、フィトヘマグルチンＰ（ＰＨＡ−Ｐ）または小麦胚レクチン（ＷＧＡ）、より好ましくはＣｏｎＡまたはＰＨＡ−Ｅである。用いるレクチンの濃度は、レクチンの種類および／または処理すべき細胞により異なるが、培地への添加の場合も一時的処理の場合も共に、０．０１〜１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは０．１〜１００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１〜２０μｇ／ｍＬ、最も好ましくは５〜１０μｇ／ｍＬである。また、該動物細胞をレクチンで処理する時間は、用いるレクチンの種類や濃度、処理すべき細胞により異なるが、１分間〜１０日以上、好ましくは１〜４８時間、例えば２４時間である。ＣｏｎＡまたはＰＨＡ−Ｅを用いる場合には、ＣｏｎＡまたはＰＨＡ−Ｅで細胞を一時的に処理するだけでもよいが、ＣｏｎＡまたはＰＨＡ−Ｅの存在下に数分〜数日インキュベートしてもよい。同時に軟骨の分化を促進する目的がある場合には、低濃度のＣｏｎＡまたはＰＨＡ−Ｅの存在下に細胞を長時間培養する。高濃度のＣｏｎＡまたはＰＨＡ−Ｐを所望する場合には、短時間培養とする。
動物細胞
本発明において外部刺激抵抗性を付与すべき動物細胞の例には、前述したとおり間葉系幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、歯根膜細胞、歯髄細胞、線維芽細胞、上皮細胞および筋芽細胞が包含される。
間葉系幹細胞は、該細胞を有する任意の骨髄または骨膜から採取することができるが、多量の細胞が採取可能であることおよび採取が容易であることから、大腿骨、脛骨および骨盤（腸骨）から採取するのが好ましい。ヒト以外の哺乳動物については、腸骨および脛骨などからも間葉系幹細胞を採取することができる。
骨芽細胞は、該間葉系幹細胞を骨分化誘導に適する培地、例えば前記Ｍ．Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒらに記載の培地にて培養して骨分化を誘導することにより、インビトロで得ることができる。
軟骨細胞は、任意の軟骨組織、例えば耳介軟骨、肋軟骨、関節軟骨、椎間軟骨および気管軟骨の軟骨細胞から採取することができる。関節軟骨には、下顎関節、上腕関節、肘関節、肩関節、手関節、股関節、腰関節および足関節が包含されるが、何れの関節軟骨でもよい。さらに軟骨細胞は、間葉系幹細胞を遠心管培養系、浮遊培養系、アガロース培養系またはアルギン酸培養系に移して、軟骨分化誘導に適する培地、例えばＭ．Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，ｐｐ．１４３−１４７，１９９９年に記載の培地を用いて軟骨細胞を誘導することによりインビトロで得ることができる。
歯根膜細胞は、Ｓｈｉｍａｚｕら（Ｓｈｉｍａｚｕ  Ａ．ら，Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．７８，ｐｐ．１７９１−１７９９，１９９９）の方法に従って抜去歯牙から採取することができる。
歯髄細胞は、Ｙｏｋｏｓｅら（Ｙｏｋｏｓｅ  Ｓ．ら，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．６６，ｐｐ．１３９−１４４（２０００））の方法に従って、歯髄から採取することができる。具体的には、歯から歯髄組織を無菌的に取り出し、これを酵素（例えばコラゲナーゼなど）で処理し、遊離した細胞を遠心分離により回収することにより歯髄細胞を採取する。
骨髄由来の間葉系幹細胞の採取方法としては、公知の方法、例えば医療において用いられている任意の採取方法を用いることができる。ヒト以外の哺乳動物について骨髄から該細胞を採取する際には、実験室的方法として例えば骨（大腿骨、脛骨）の両端を切断し、間葉系幹細胞の培養に適する培地で骨内を洗浄して、洗い出された該培養液から間葉系幹細胞を得ることができる。間葉系幹細胞の採取法を具体的に説明する：
（１）ウサギの大腿骨、脛骨の両端を切断する。次いで（例えばＤＭＥＭ培地）、所望する場合には抗生物質（例えばペニシリン、ストレプトマイシンなど）およびヘパリンをさらに添加した培地で骨髄内を洗浄する。
（２）ヒト腸骨の場合や歯槽骨の場合は、該腸骨または歯槽骨の骨髄から骨髄液を採取する。
（３）洗い出された培地または骨髄液を３００×ｇ、３分程度遠心分離して、凝固塊などを沈澱として除去し、上清中の細胞を組織培養用培養皿に播種する。培養３日後に接着細胞を間葉系幹細胞として計測する。
（４）その後、適当な培地（例えば１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地）で培養する。
骨膜から該幹細胞を採取するには、当該技術分野において公知の方法を用いることができる［Ｍ．Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３２，１６０３−１６０８（１９９３）；Ｊ．Ｆａｎｇ  ＆  Ｂ．Ｋ．Ｈａｌｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌ．１８０，７０１−７１２（１９９６）；Ｓ．Ｂａｈｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  Ｒｅｃｏｒｄ  ２５９，１２４−１３０（２０００）］。
軟骨細胞もまた、種々の動物の軟骨組織から公知の方法により採取することができるが、例えばウサギの肋軟骨成長板から加藤らの方法（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１００，ｐｐ．４７７−４８５，１９８５）に従い、プロテアーゼ及びコラゲナーゼ処理により軟骨細胞を採取することができる。
得られた間葉系幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、歯根膜細胞、歯髄細胞、線維芽細胞、上皮細胞および筋芽細胞は、そのまま播種して培養に供することができるが、通常は適当な培地中にて１０〜２０日程度培養してから使用する。また、該細胞を凍結保存することもできる。
動物細胞に外部刺激抵抗性を付与する方法
上述のようにして得られた細胞は、例えば次のようにして外部刺激抵抗性が付与される：
（１）得られた細胞、例えば３０００個／ｃｍ２にて該細胞の培養に適する任意の培地、例えば１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中に播種して、ほぼ集密的（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）になるまで増殖させる。培養は、動物細胞の培養に適する任意の条件で実施することができるが、哺乳動物の細胞の場合、一般的には３７℃にて５％ＣＯ２存在下で行うのが好ましい。
（２）次いで培地中に種々の濃度、例えば１〜５０μｇ／ｍＬのレクチンを添加し、さらに２４時間培養する。
（３）細胞（細胞層）を適当な溶液、例えばＰＢＳで洗浄した後、培地中に静置する。
このように処理された細胞は、外部刺激（例えば機械的刺激および／または蛋白質分解反応）に対して顕著な抵抗性を示すようになる。また、これ以外に生体中の細胞に対してレクチンを適用することにより、生体中の各組織に外部刺激抵抗性を付与することもできる。
以下実施例により本発明をさらに詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に制限されることはない。
発明を実施するための最良の形態
実施例
実施例１  動物細胞の取得
１）骨髄からの間葉系幹細胞の採取
４週齢ウサギから大腿骨、脛骨を摘出し、筋肉および靱帯などを除去した後、両端を切断する。次いで、ＤＭＥＭ培地（３２単位／ｍＬ  ペニシリン、５０μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン、および６０００単位／ｍＬ  ヘパリンを含有）で骨髄内を洗浄した。洗い出された培地を３００×ｇ、３分遠心分離して、凝固塊などを沈殿として除去した。上清中の細胞を組織培養用の培養皿に播種して３日間培養し、接着細胞を間葉系幹細胞として計測した。
２）腸骨からの間葉系幹細胞の採取
同様に、４週齢ウサギから腸骨を摘出した後、腸骨から骨髄液を採取し、得られた骨髄液を３００×ｇ、３分遠心分離して、凝固塊などを沈殿として除去した。上清中の細胞を組織培養用の培養皿に播種して３日間培養し、接着細胞を間葉系幹細胞として計測した。
３）歯根膜細胞の採取
歯根膜細胞を、Ｓｈｉｍａｚｕらの方法に従って、抜去歯牙から採取した。
４）歯髄細胞の採取
歯髄細胞は、８週齢のＷｉｓｔａｒ系ラットの下顎切歯より歯髄組織を無菌的に取り出し、その歯髄組織に酵素溶液３ｍｌ（０．１％コラゲナーゼ、０．０５％トリプシン、４ｍＭ  ＥＤＴＡ含むＰＢＳ）を添加し、３７℃で２０分間処理し、上清を回収した。この操作を６回繰り返した。回収した細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用い１０ｃｍディッシュに播種して培養した。７０％集密的に達したとき、０．０５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡを含むＰＢＳで３７℃、５分間処理し、単離した細胞を回収してこれを歯髄細胞として計測した。
５）軟骨細胞の採取
軟骨細胞としてはウサギの軟骨細胞を用いた。生後４週令のニュージーランド白色ウサギの肋軟骨成長板を外科的に摘出した。次いで、得られた肋軟骨成長板を加藤らの方法に従ってトリプシンおよびコラゲナーゼ処理することにより軟骨細胞を分離した。この方法によりウサギ一羽当たり約４×１０６個の軟骨細胞が得られた。
６）骨芽細胞の取得
上記１）で得られた間葉系幹細胞を下記の組成の骨分化誘導培地に移した。
骨分化誘導培地
αＭＥＭ培地
１００ｎＭ  デキサメタゾン
１０ｍＭ  βグリセロールリン酸
５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸−２−リン酸
間葉系幹細胞を、上記培地中で３７℃、５％ＣＯ２存在下に培養した。２日毎に培地を交換し、１２日間培養して骨化を誘導し骨芽細胞を得た。
実施例２  外部刺激に対する抵抗性の検討
１）蛋白質分解反応に対する抵抗性（間葉系幹細胞）
実施例１にて得られた間葉系幹細胞を３０００個／ｃｍ２の密度で培養皿（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地）に播種して、３７℃、５％ＣＯ２存在下に集密的になるまで７〜１０日間培養した。これにレクチンとして５μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を添加してさらに２４時間培養した。一方、何も添加せずに２４時間培養したものを対照群とした。培養した細胞層をＰＢＳで洗浄した後、１）０．２５％トリプシン／４ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＤＭＥＭ培地、２）０．１％コラゲナーゼ（シグマ社ｔｙｐｅＩＡ）含有ＤＭＥＭ培地、または３）２ｍｇ／ｍＬプロナーゼ含有ＤＭＥＭ培地を添加して、１〜２４時間インキュベートした。次いで蛋白分解酵素処置により細胞層から遊離して単離した細胞の数をコールターカウンターを用いて測定した。０．１％コラゲナーゼ含有培地におけるＣｏｎＡ添加群、対照群についての結果を図１に示す。５μｇ／ｍＬのＣｏｎＡは０．１％コラゲナーゼによる細胞の分散を著明に抑制した（図１）。同様な結果が、インキュベート２４時間後の０．２５％トリプシン／４ｍＭ  ＥＤＴＡ添加培地および２ｍｇ／ｍＬプロナーゼ添加培地でも観察された。
さらに過酷な条件下でのＣｏｎＡの効果を検討するため、間葉系幹細胞に１０μｇ／ｍＬのＣｏｎＡを添加して２４時間培養し、得られた細胞層を、０．２５％トリプシン＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ＋０．１％コラゲナーゼ含有ＤＭＥＭ培地を添加して、１〜１２時間インキュベートした。次いで遊離した細胞数をコールターカウンターを用いて測定した。その結果、対照群ではほとんどの細胞が遊離したのに対し、ＣｏｎＡ処理群では細胞の遊離が顕著に抑制された（図２）。
次に種々の濃度のＣｏｎＡについて抵抗性付与作用を検討した結果、間葉系幹細胞におけるＣｏｎＡによる抵抗性付与作用は１μｇ／ｍＬから観察され２０μｇ／ｍＬでほぼ最大となった。
２）蛋白質分解反応に対する抵抗性（歯髄細胞）
実施例１にて採取した歯髄細胞を、１０％ＦＢＳおよび５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸含有ＤＭＥＭ培地が入った６穴プレートに２×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種した。細胞が９０％集密的に達したとき、培養液を０．５％ＦＢＳおよび５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸含有ＤＭＥＭ培地に交換して２４時間前培養した。次いで同じ培養液に交換し、これにＣｏｎＡを様々な濃度（１，５，１０μｇ／ｍＬ）で添加し、２４時間処理した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２％コラゲナーゼを含むＤＭＥＭ培地を添加し、各々の時間で浮遊した細胞を回収し、コールターカウンターを用いて細胞数を測定し、細胞層から遊離した割合を算定した。
その結果、ＣｏｎＡ処理していない対照群ではほとんどの細胞が遊離したのに対し、ＣｏｎＡ処理群（１，５，１０μｇ／ｍＬ）ではコラゲナーゼによる細胞の分散が著明に抑制された（図３参照）。
実施例１にて得られた軟骨細胞、歯根膜細胞および間葉系幹細胞から作成した骨芽細胞について同様な実験をした。その結果、５μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬでのＣｏｎＡ処理は、トリプシン、コラゲナーゼおよびプロナーゼの各種蛋白分解酵素による各細胞の細胞層からの遊離を顕著に抑制した。これは、ＣｏｎＡ処理により各細胞に、蛋白質分解反応に対する抵抗性が付与されたことを示すものである。これらの結果を下記の表にまとめる。
0004703943.tif 000002
３）機械的刺激に対する抵抗性の付与
２）の操作に従って歯髄細胞をＣｏｎＡ（１０μｇ／ｍＬ、２４時間）で処理した後、細胞層をＰＢＳで洗浄した。次に該細胞を、ＤＭＥＭ培地中にてシェーカー（Ｗａｔｅｒ  Ｂａｔｈ  Ｓｈａｋｅｒ，Ｐｅｒｓｏｎａｌ−１１，ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて１分間に８０回震盪する条件にて５分間機械的に震盪し、培養皿から剥離した細胞数を計測した。その結果、対照群では細胞が培養皿より剥離したが、ＣｏｎＡ処理群ではほとんど剥離しなかった。この結果を下記の表２に示す。
0004703943.tif 000003
４）細胞外基質プロテオグリカンの分解に対する抵抗性
細胞外基質プロテオグリカンの分解に対する抵抗性を、Ｓｈｉｍａｚｕら（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，Ｖｏｌ．３６，ｐｐ．２４７−２５３）の方法に従って、［３５Ｓ］ラベルしたプロテオグリカンの遊離を測定することにより試験した。実施例２−１）と同様にウサギ肋軟骨由来の軟骨細胞を集密的になるまで培養した。次いで集密的になった細胞を［３５Ｓ］−硫酸とともに２４時間インキュベートし、軟骨細胞外基質の主要成分であるプロテオグリカンを［３５Ｓ］でラベルした。細胞層を血清非含有培地（ＰＢＳ）でよく洗浄して、次いで１０μｇ／ｍＬのＣｏｎＡ在在下（ＣｏｎＡ処理群）またはは非存在下（対照群）にて３７℃でインキュベートして、２、４、６、８、１０日後に培地を一部採取し、分解して培地に遊離した［３５Ｓ］−プロテオグリカンを測定した。その結果、ＣｏｎＡ処理が細胞外基質プロテオグリカンの分解と培地への遊離を抑制することが判明した（図４）。
実施例３  インビボでの抵抗性の検討
実施例１にて得られたウサギ軟骨細胞８×１０４個を１ｍＬの１０％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸含有ＭＥＭ培地に播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて遠心管培養系で３週間培養した。その間、１０μｇ／ｍＬのＣｏｎＡを２回添加した。その際、ＣｏｎＡは細胞増殖を抑制するため、培養による組織量の変化はなかった。次いで培養により得られた軟骨組織を同系統のウサギ皮下へ移植し、３週間後に移植組織を摘出した。その組織切片を作成し、移植された軟骨組織を観察するため、切片をトルイジンブルーにて染色し、その組織を観察した。その結果、対照群では数層の軟骨、骨組織であるのに対して、ＣｏｎＡ添加群では組織の厚さがおよそ２倍に増加していた（図５）。これは、ＣｏｎＡ処理が移植した軟骨細胞／組織に外部刺激に対する抵抗性を付与し、これにより移植体において移植組織の定着が向上することが示された。
実施例４  各種レクチンの検討
他のレクチンについてＣｏｎＡと同様に動物細胞に外部刺激に対する抵抗性を付与し得るかを検討した。なお、本実施例ではＣｏｎＡ以外のレクチンとして、フィトヘマグルチンＥ（ＰＨＡ−Ｅ）、小麦胚レクチン（ＷＧＡ）を用いた。
実施例１−１）に従ってマウス骨髄由来の間葉系細胞を採取した。実施例２と同様に細胞を播種し、１０％ＦＢＳ含有αＭＥＭ培地中で培養した。次いで、得られたマウス間葉系細胞に各種レクチンを５μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬの濃度で添加し、３７℃で３時間インキュベートした。ここでレクチン処理しないものを対照とした。細胞層をＰＢＳで洗浄した後、０．２５％トリプシン＋１ｍＭＥＤＴＡを添加して３７℃で１５分間インキュベートした。次いで実施例２に従って、細胞層中に残存する細胞数をコールターカウンターを用いて測定した。その結果、対照ではほとんどの細胞が遊離したのに対し、ＣｏｎＡ処理群、ＰＨＡ−Ｅ処理群では５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬにて細胞の遊離が顕著に抑制された（図６）。また、ＷＧＡ処理群では５μｇ／ｍＬでは細胞が遊離したものの、１０μｇ／ｍＬでは細胞の遊離が抑制された。これらの結果から、ＰＨＡ−ＥがＣｏｎＡと同様に、顕著に優れた作用を有することが示された。
実施例５  レクチン濃度の検討
ＣｏｎＡおよび実施例４にて効果が示されたＰＨＡ−Ｅについて、種々の濃度における抵抗性の付与の効果を詳細に検討した。
実施例１で得られたウサギ骨髄由来の間葉系細胞を１０％ＦＢＳ含有αＭＥＭ培地中で培養し、集密的になる前に種々の濃度（０．０１，０．１，０．５，１，２，５または１０μｇ／ｍＬ）のＣｏｎＡまたはＰＨＡ−Ｅを添加し、３７℃で３時間インキュベートした。細胞層をＰＢＳで洗浄した後、０．２５％トリプシン＋１ｍＭ  ＥＤＴＡを添加して３７℃で１５分間インキュベートした。次いで実施例２に従って、細胞層中に残存する細胞数をコールターカウンターを用いて測定した。その結果、ＣｏｎＡおよびＰＨＡ−Ｅ共に０．０１〜０．１μｇ／ｍＬという低濃度においても効果があり、特にＰＨＡ−ＥはＣｏｎＡより低濃度で強い効果を有することが示された（図７）。
実施例６  レクチン処理時間の検討
ＣｏｎＡ、ＰＨＡ−Ｅが細胞にプロテアーゼに対する抵抗性を付与する必要な時間（処理時間）について検討した。
実施例４と同様にマウス骨髄由来の間葉系幹細胞を培養した。次に、トリプシン処理（０．２５％トリプシン＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ）の前６０分、２０分、１０分、５分、２分、１分または０分に５μｇ／ｍＬの濃度のＣｏｎＡまたはＰＨＡ−Ｅを添加した。なお、０分ではレクチンとトリプシンを同時に添加した。トリプシン処理後、細胞層中に残存する細胞数をコールターカウンターを用いて測定した。その結果、レクチンで１０〜２０分間処理することによりほぼ最大のプロテアーゼに対する抵抗性が細胞に付与された（図８）。
実施例７  各種プロテアーゼに対する効果の検討
ＣｏｎＡ、ＰＨＡ−Ｅが蛋白質分解反応として各種プロテアーゼに対して効果を有するかを検討した。
実施例４と同様にマウス骨髄由来の間葉系幹細胞を培養した。次いでレクチンとしてＣｏｎＡまたはＰＨＡ−Ｅを５μｇ／ｍＬの濃度で添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。細胞層をＰＢＳで洗浄した後、血清（１０％ＦＢＳ）含有αＭＥＭ培地または血清不含αＭＥＭ培地を添加した。各種プロテアーゼとして、血清不含αＭＥＭ培地には０．２５％トリプシン（ｔｒｉ）＋１ｍＭ  ＥＤＴＡまたは０．５％トリプシン（ｔｒｉ）を添加し、血清含有αＭＥＭ培地には５０Ｕ／ｍＬディスパーゼまたは１ｍｇ／ｍＬプロナーゼを添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで実施例２に従って、細胞層中に残存する細胞数をコールターカウンターを用いて測定した。その結果、レクチン未処理群（−）ではほとんどの細胞が培地中に遊離したのに対し、レクチン処理群（＋）ではＣｏｎＡとＰＨＡ−Ｅともに細胞の遊離が顕著に抑制された（図９）。これは、ＣｏｎＡおよびＰＨＡ−Ｅの効果が、特定のプロテアーゼに対するものではなく、種々のプロテーゼによる蛋白質分解反応に及ぶことを示す。
実施例８  各種動物細胞の検討
線維芽細胞系、上皮細胞系、筋芽細胞系の各種細胞および細胞系に対してレクチンが抵抗性を付与し得るかを検討した。
（１）細胞
組織から採取・培養した細胞（非セルライン）に加えて知られている種々の細胞系（セルライン）についてもレクチンが効果を奏するかを調べた。ここで用いた細胞および細胞系を下記に示す。
細胞（非セルライン）          細胞形態
ウサギ骨髄細胞（ＢＭＣ）    線維芽細胞
ラット歯髄細胞              線維芽細胞
ラット骨膜細胞              線維芽細胞
ラット横隔膜細胞            線維芽細胞
ヒト歯肉細胞                線維芽細胞
細胞系（セルライン）          由来
・線維芽細胞系
１０Ｔ１／２                マウス，Ｃ３Ｈ，胎児
ＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６    マウス，Ｃ５７ＢＬ／６
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１            マウス，Ｃ５７ＢＬ／６
・上皮細胞系
ＢＣＥ                      ウシ，角膜
ＡＴＤＣ５                  マウス，１２９
ＨＢＬ−１００              ヒト，乳腺
ＣＯＳ−７                  サル、腎臓
ＨｅＬａ                    ヒト，子宮
ＨｅｐＧ２                  ヒト，肝臓
・筋芽細胞系
Ｃ２Ｃ１２                  マウス，Ｃ３Ｈ，筋肉
（２）実験
実施例４と同様に各種細胞を播種して培養した。レクチンとしてＣｏｎＡまたはＰＨＡ−Ｅを１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬの濃度で添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。細胞層をＰＢＳで洗浄した後、０．２５％トリプシン（ｔｒｉ）＋１ｍＭ  ＥＤＴＡを添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで実施例２に従って、細胞層中に残存する細胞数をコールターカウンターを用いて測定した。
（３）結果
組織から採取・培養した細胞（非セルライン）では、ＣｏｎＡおよびＰＨＡ−Ｅともに５〜１０μｇ／ｍＬの濃度にて細胞層からの細胞の遊離が抑制された（図１０）。確立された細胞系（セルライン）では、線維芽細胞系（図１１）、上皮細胞系（図１２）および筋芽細胞系（図１３）のいずれの場合おいてもＣｏｎＡおよびＰＨＡ−Ｅともに５〜１０μｇ／ｍＬの濃度にて細胞層からの細胞の遊離が抑制された。これらの結果から、ＣｏｎＡおよびＰＨＡ−Ｅは、線維芽細胞系、上皮細胞系、筋芽細胞系の各種細胞および細胞系に蛋白質分解反応に対する抵抗性しうることが示された。
産業上の利用可能性
本発明によれば、動物細胞、特に哺乳類細胞（例えば間葉系幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、歯根膜細胞、歯髄細胞、線維芽細胞、上皮細胞および筋芽細胞）およびその培養細胞並びに生体中の各種組織に外部刺激に対する抵抗性を付与するための、レクチンを有効成分とする抵抗性付与剤が提供される。本発明の外部刺激抵抗性付与剤を用いることにより、該動物細胞および／または組織に機械的刺激および／または蛋白質分解反応に対して抵抗性が付与され、該細胞および／または組織並びにこれらを培養して得られる移植用組織の移植体中における定着性が向上する。このため、本発明の抵抗性付与剤は、修復／再生中の間葉系組織、骨組織、軟骨組織、歯根膜組織、歯髄組織の移植が必要とされる種々の骨、軟骨または歯の疾患の治療に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＣｏｎＡ処理により間葉系幹細胞に蛋白質分解反応に対する抵抗性が付与されたことを示すグラフである。
図２は、ＣｏｎＡ処理により間葉系幹細胞に蛋白質分解反応に対する抵抗性が付与されたことを示すグラフである。
図３は、ＣｏｎＡ処理により歯髄細胞にコラゲナーゼ処理に対する抵抗性が付与されたことを示すグラフである。
図４は、ＣｏｎＡ処理が軟骨細胞の細胞外基質であるプロテオグリカンの分解と培地中への遊離を抑制したことを示すグラフである。
図５は、ＣｏｎＡ処理より軟骨移植体において移植組織の定着が向上したことを示す顕微鏡写真である。
図６は、種々のレクチンについての蛋白質分解反応に対する抵抗性の付与の効果を示すグラフである。
図７は、種々の濃度におけるのＣｏｎＡおよびＰＨＡ−Ｅの効果を示すグラフである。
図８は、ＣｏｎＡ、ＰＨＡ−Ｅが蛋白質分解反応に対する抵抗性を付与する必要な処理時間を示すグラフである。
図９は、ＣｏｎＡおよびＰＨＡ−Ｅが、種々のプロテーゼによる蛋白質分解反応に対して抵抗性を付与しうることを示すグラフである。
図１０は、ＣｏｎＡ、ＰＨＡ−Ｅにより線維芽細胞（非セルライン）に蛋白質分解反応に対する抵抗性が付与されたことを示すグラフである。
図１１は、ＣｏｎＡ、ＰＨＡ−Ｅにより線維芽細胞系の細胞（セルライン）に蛋白質分解反応に対する抵抗性が付与されたことを示すグラフである。
図１２は、ＣｏｎＡ、ＰＨＡ−Ｅにより上皮細胞系の細胞（セルライン）に蛋白質分解反応に対する抵抗性が付与されたことを示すグラフである。
図１３は、ＣｏｎＡ、ＰＨＡ−Ｅにより筋芽細胞系の細胞（セルライン）に蛋白質分解反応に対する抵抗性が付与されたことを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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