(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビブリオsp.SCRC-37964（FERM-P18219）株。
【請求項２】
シュードアルテロモナスsp.SCRC-38753（FERM-P18220）株。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の微生物の培養液を用いて、大腸菌の細胞融合のためのプロトプラストを調製する方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の微生物が生産する大腸菌の細胞壁分解酵素。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の微生物が生産する細胞壁分解酵素を用いて、大腸菌の細胞融合のためのプロトプラストを調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞壁分解酵素を産生する微生物、その微生物が産生する細胞壁分解酵素及びその酵素を含む培養液、並びにこの酵素或いは培養液を用いたプロトプラスト調製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
代表的な細胞壁分解酵素であるリゾチームは動物組織や卵白などに存在し、外来の細菌感染の防御的な役割を果たしている。動物由来のリゾチーム以外に微生物が産生する細胞壁分解酵素も知られている。これらはいずれも至適反応温度が３０℃以上であり、熱安定性の低い酵素でも５０℃前後までは活性を維持する。
【０００３】
精製されたリゾチームは細胞融合のためのプロトプラスト調製や、菌体からのDNA調製に先立ち、細胞壁の分解に用いられる。分解反応終了後はリゾチーム除去のために、遠心や透析などの洗浄操作が必要であり、目的物の収率の低下に繋がる。特にプロトプラストのように物理的に不安定な目的物は洗浄操作によって収率が著しく低下する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、遠心や透析等による酵素除去操作を行うことなく、反応終了後に活性を除去できる細胞壁分解酵素を見出し、これをプロトプラスト調製に用いることによって、プロトプラスト収率及び総合的にプロトプラスト融合株の収率向上を目指す。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決する手段として、低温で活性を示し目的物の収率を低下させない程度の温度に加温することによって活性を失うような低温活性細胞壁分解酵素の探索を目的として、鋭意検討を重ねた結果、ビブリオ属或いはシュードアルテロモナス属に属し、２０℃以下で活性を示し３０℃以上で活性が著しく低下する細胞壁分解酵素を産生して菌体外に分泌する微生物を分離し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
即ち、本発明はビブリオ属或いはシュードアルテロモナス属に属し、低温で活性を有する細胞壁分解酵素を産生し、菌体外に分泌する微生物を培養することによる細胞壁分解酵素を製造する方法、並びに培養液をそのまま或いは培養液から濃縮した細胞壁分解酵素の応用例として、プロトプラスト融合のためのプロトプラスト調製法を提供することにある。
【発明の実施の形態】
【０００７】
（１）微生物
本発明の微生物は、ビブリオ属或いはシュードアルテロモナス属に属し、低温、例えば２０℃以下で活性を示し、常温以上、例えば３０℃以上で活性が著しく低下する細胞壁分解酵素を産生して菌体外に分泌させることができるものであればいずれでもよく、このような微生物は自然界から新たに分離することもでき、或いはその変異株であってもよい。
【０００８】
本発明のビブリオ属に属する微生物としては新菌株であるビブリオ sp. SCRC-37964、シュードアルテロモナス属に属する微生物としては新菌株であるシュードアルテロモナス sp. SCRC-38753を挙げることができる。これらの菌株は産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所にFERM P-18219、及びFERM P-18220として寄託された。
【０００９】
前記新菌株は次のようにして分離した。まず、表１に示す組成の培地を調製した。
【００１０】
【表１】
表１
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【００１１】
この組成の寒天平板培地に、各地の海洋より採取した海洋性生物体サンプルを滅菌した50％人工海水で適度に希釈して接種し、15℃以下で３〜５日間培養した。出現したコロニーを表１の培地組成から寒天を除いた液体培地に植菌して、15℃以下で静置培養した。低温活性細胞壁分解酵素産生能は後記の方法により検定した。これらのサンプルはいずれもスコットランド沖の北海海域で採取された。ビブリオ sp. SCRC-37964及びシュードアルテロモナス sp.SCRC-38753は次の表２に示す菌学的性質を有する。
【００１２】
【表２】
表２
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【００１３】
上記の菌学的性質からSCRC-37964は運動性を有する好気的なグラム陰性桿菌で、カタラーゼ及びオキシダーゼ共に陽性、ブドウ糖からガスを発生することなく発酵的に分解し、0/129に感受性を示すことからVibrioと推定される。オルニチンデカルボキシラーゼ陰性、b−ガラクトシダーゼ陽性などの性質から最も近いVibrioとして、文献イからV. fluvialis、V. augillarumなどが挙げられるが、アラビノース、ソルビトール陰性の点では一致しない。SCRC-38753は運動性を有するグラム陰性桿菌でカタラーゼ及びオキシダーゼ共に陽性を示し、ゼラチン加水分解とDNase陽性であるので文献ロからAlteromonasと推定される。白糖利用、セロビオース非利用の点では文献イからA. haloplanktisが最も近いと考えられるが、マンノース利用能の点で一致しない。
【００１４】
近年、種の同定に用いられている16S rDNA塩基配列を行った結果、SCRC-37964はV. carchariaeに最も近いが相同率は94％であること、又文献ハからウレアーゼ活性が陰性であることから一致しない。 SCRC-38753はPseudoalteromonas undinaに最も高い相同性を示したが、文献イから菌体の形状が一致しない。
以上の結果からSCRC-37964はVibrio属の新種、SCRC-38753はseudoalteromonas属の新種と考えられる。
【００１５】
文献
イ  N.R. Krieg et al., Berger's Manual of Systemtic Bacteriology, vol. 1, Williams & Wilkins, (1984)
ロ  門田 元、多賀暢夫、海洋微生物研究法、学会出版センター、1985。
ハ  D.J. Grimes et al., System. Appl. Microbiol., 6, 221-226 (1985).
【００１６】
以上、自然界から分離した菌株について詳述したが、これらの菌に変異を生じさせて一層生産性の高い菌株を得ることもできる。本発明の菌株は常法に従って保存することができ、例えば寒天スラント培地上で、又は凍結乾燥法により、又はグリセロール法により保存することができる。寒天スラント培地としては、例えば菌の分離に関して前記した培地を使用することができる。
【００１７】
(2) 細胞壁分解酵素の生産法
前記の微生物を培養して細胞壁分解酵素を製造しようとする場合、基礎栄養培地として本発明の微生物が増殖し得るものであればいずれを使用してもよい。この培地は窒素源として例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキスなどの１種類又は複数種類を含む。又、この培地には必要に応じて炭素源として各種の糖類を加えることができる。この培地には天然海水や人工海水を加えることが好ましい。培養は固体培地又は液体培地のいずれを使用してもよいが、目的とする細胞壁分解酵素を多量にかつ容易に利用或いは精製するには液体培地を用い、静置培養若しくは振盪培養、通気・撹拌培養などにより好気的条件下で培養を行うことが好ましい。培養温度は菌が生育し、細胞壁分解酵素が生産される温度範囲であればいずれの温度でもよく、４〜３０℃である。pHは５〜１０、好ましくは６〜８の範囲である。培養時間は利用し得る量の細胞壁分解酵素が生産される時間を選べばよく、通常は１０〜１２０時間である。
【００１８】
次に得られた培養液から細胞壁分解酵素が採取される。その方法は利用目的によって異なり、培養液をそのまま利用することも可能であり、菌体が不要或いは邪魔になるときは菌体を遠心除去し更に滅菌フィルターで濾過することによって菌体を完全に除去した後利用する。又、細胞壁分解酵素の濃度が低いときは常法に従い、硫安沈殿などの塩析後透析、更にアフニティークロマトやゲルろ過などで濃縮が可能である。
【００１９】
(3) プロトプラスト調製法
プロトプラストを調製する場合、従来法と同様に標的となる微生物を培養して集菌し、浸透圧を調節する物質（ショ糖、ソルビトールなど）を含む高張緩衝液に懸濁し、前記の微生物の培養液或いは前記の方法により濃縮した酵素を添加して、２０℃以下で緩やかに振盪することによって細胞壁を除去する。プロトプラスト化は菌体形状の変化、及び蒸留水で希釈し浸透圧を低下させることによる菌体破砕を光学顕微鏡で観察する。
【００２０】
【実施例】
以下実施例により、本発明を詳細に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２１】
実施例１；.ビブリオ sp. SCRC-37964(FERM P-18219)及びシュードアルテロモナス sp. SCRC-38753(FERM P-18220)からの細胞壁分解酵素の生産
ペプトン1％、酵母エキス0.5％を50％濃度の人工海水に溶解し、pH７に調整した培地100 mlを121℃、20分間加熱滅菌した後、ビブリオ sp. SCRC-37964(FERM P-18219)或いはシュードアルテロモナス sp. SCRC-38753(FERM P-18220)を接種し、15℃で72時間好気的に培養した。培養後、遠心分離機で菌体を除去した培養上清をフィルターでろ過滅菌した。培養上清中の細胞壁分解活性を評価するため、大腸菌から文献（Eur. J. Biochem., 13, 336, (1970)）の方法により細胞壁を調製し、寒天に懸濁したプレートを作製した。そのプレート上に抗菌試験用ディスクを置き、前記のろ過滅菌した培養上清50mlを含浸させて15及び30℃に静置した。約36時間後にディスクの周囲に形成されたハローの面積を測定した。そのハローの面積を表３に示す。コントロールとして、卵白リゾチーム0.1mg/mlの水溶液0.1mlによって形成されたハローの面積を併記する。両株の培養上清の細胞壁分解活性は反応温度15℃の方が30℃よりも高く、卵白リゾチームと逆であった。
【００２２】
【表３】
表３
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【００２３】
実施例２；ビブリオ sp. SCRC-37964(FERM P-18219) からの細胞壁分解酵素の生産
実施例１と同様にビブリオ sp. SCRC-37964(FERM P-18219)を培養し、その培養上清100mlをフィルターでろ過滅菌した。次に硫酸アンモニウムを最終濃度が90％になるように加えて撹拌し、遠心後上清を除いた。残渣に0.1Mリン酸緩衝液(pH6) 5mlを加えて溶解し、同じ組成の緩衝液に対して4℃で２日間透析した。この試料及びこの試料を100℃で5分間加熱処理した場合について、実施例１と同様にして15、30℃及び37℃における細胞壁分解活性を調べた。その結果を表４に示した。
【００２４】
【表４】
表４
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【００２５】
実施例3；ビブリオ sp. SCRC-37964(FERM P-18219) からの細胞壁分解酵素の生産
実施例１と同様にビブリオ sp. SCRC-37964(FERM P-18219)を培養し、5℃から30℃までの各温度における細胞壁分解活性を調べた。その結果を表５に示した。
【００２６】
【表５】
表５
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【００２７】
実施例４；ビブリオ sp. SCRC-37964(FERM P-18219) から調製した細胞壁分解酵素によるグラム陰性細菌のプロトプラスト調製
実施例２と同様にビブリオ sp. SCRC-37964(FERM P-18219)を培養し、その培養上清を硫安沈殿と透析処理により培養上清中のタンパクを濃縮した。BIORADのタンパク測定キットで測定したところ、タンパク濃度は1.3 mg/mlであった。この試料を同量のプロトプラスト緩衝液（ショ糖 40％、 140mM 塩化カリウム、 30mM EDTA、 60mM Bicine）と混合し、細胞壁分解酵素溶液を調整した。Pseudomonas putida ATCC-11172の対数増殖後期の培養液から遠心で菌体を集め、およそ108cells/ml程度の菌体密度になるように上述の細胞壁分解酵素溶液に懸濁し、15℃で緩やかに振盪した。約２時間後に光学顕微鏡で観察したところ約２０％が桿菌から球形に変化した。この反応溶液の一部を蒸留水或いはプロトプラスト緩衝液で３倍に希釈したところ、前者の菌体数は後者の６０％に減少した。これらの結果からP. putida ATCC-11172の一部はプロトプラストになったと判断した。
【００２８】
【発明の効果】
本発明の微生物を使用することにより、20℃以下の低温で細胞壁分解活性を示し、30℃以上ではその活性が著しく低下する酵素を製造することができる。本酵素はその温度特性を利用して、バクテリアのプロトプラスト融合におけるプロトプラスト調製の際、反応終了後に遠心や透析などプロトプラストの収率を著しく低下させる操作を行うことなく、30℃以上に加熱することによって酵素活性を失活させ、次のステップに進むことができる。