(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造タンパク質がウイルスの抗原性を低減させる修飾を少なくとも１つ含み、該修飾が、ＡＡＶ２の、ＹＫＱＩＳ  ＳＱＳＧＡ、ＹＬＴＬＮ  ＮＧＳＱＡ、ＹＹＬＳＲ  ＴＮＴＰＳ、ＥＥＫＦＦ  ＰＱＳＧＶ、ＮＰＶＡＴ  ＥＱＹＧＳ、ＬＱＲＧＮ  ＲＱＡＡＴ、ＮＶＤＦＴ  ＶＤＴＮＧから選択された配列における少なくとも１つのアミノ酸の前及び／又は後に位置することを特徴とする、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の構造タンパク質。
【請求項２】
修飾ＶＰ１、修飾ＶＰ２及び／又は修飾ＶＰ３から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の構造タンパク質。
【請求項３】
修飾が、１つ以上のアミノ酸又はアミノ酸配列に対する１つ以上の高分子量又は低分子量化合物の共有結合又は非共有結合に基づくものであることを特徴とする、請求項１または２に記載の構造タンパク質。
【請求項４】
修飾が、突然変異であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の構造タンパク質。
【請求項５】
タンパク質若しくはペプチドが挿入されることを特徴とする、請求項４記載の構造タンパク質。
【請求項６】
該挿入が、インテグリン、サイトカイン、又はサイトカイン、インテグリン若しくは成長因子の受容体結合ドメイン、細胞表面受容体に結合する一本鎖抗体、細胞表面構造に対する抗体、抗体結合構造又はエピトープから選択されることを特徴とする、請求項５に記載の構造タンパク質。
【請求項７】
ＡＡＶ粒子の形態である、請求項１〜６のいずれかに記載の構造タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の構造タンパク質をコードする核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸を含む細胞。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載の構造タンパク質の製造方法であって、請求項８記載の細胞を培養し、適当である場合には、発現された構造タンパク質を単離することを特徴とする前記方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれかに記載の構造タンパク質、請求項８記載の核酸及び／又は請求項９記載の細胞及び／又は、適当である場合には、賦形剤及び／又は添加剤を含む薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、抗原性の低減をもたらす少なくとも１つの修飾を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の構造タンパク質と、その製造及び使用とに関する。
【０００２】
ＡＡＶウイルスは、パルボウイルスのファミリーに属する。これらは、１８〜３０ｎｍの直径を有し、約５ｋｂの線状一本鎖ＤＮＡを含有する、二十面体の無外被カプシドによって識別される。ＡＡＶの効果的な複製は、ヘルパーウイルス、例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニアウイルスとの宿主細胞の同時感染を必要とする。ヘルパーウイルスが存在しない場合には、ＡＡＶは潜伏状態に入り、ウイルスゲノムは宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれることができる。宿主ゲノムに組み込まれるというＡＡＶの性質は、哺乳動物細胞のための形質導入ベクター(transduction vector)としてＡＡＶを特に重要にしている。一般に、約１４５ｂｐ長さである２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）はベクター機能に関して充分である。これらは、宿主細胞ゲノム中への複製、パッケージング及び組み込みのために必要な“シス”シグナルを有する。組換えベクター粒子中へのパッケージングのためには、非構造タンパク質（Ｒｅｐタンパク質）の遺伝子と構造タンパク質（Ｃａｐタンパク質）の遺伝子とを有するヘルパープラスミドが、パッケージングに適した細胞、例えばＨｅＬａ又は２９３細胞中へトランスフェクトされ、これらの細胞は次に例えばアデノウイルスによって感染する。数日後に、組換えＡＡＶ粒子を含有する溶解物(lysate)が得られる。適当なヘルパープラスミドは、例えばChiorini et al., (1995) Hum. Gene Ther. 6, 1531-1541又は Girod et al. (1999), Nat. Med.によって述べられている。
【０００３】
ＡＡＶカプシドは３つの異なるタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３から成り、これらの相対的割合は５％  ＶＰ１、５％  ＶＰ２及び９０％  ＶＰ３である。ＡＡＶカプシド遺伝子はＡＡＶゲノムの右手端部に位置され、異なる開始コドンと、転写物(transcript)の２つの異なってスプライスされた変異体(variant)とを用いて、同じオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列をオーバーラップさせることによって、コードされる。ＶＰ１遺伝子はＶＰ２遺伝子配列全体を含有し、このＶＰ２遺伝子配列は、特異的なＮ末端領域を有するＶＰ３遺伝子配列全体を含有する。オーバーラッピングリーディングフレームが３種類のＡＡＶカプシドタンパク質の全てをコードするという事実が、全てのカプシドタンパク質の、程度の差こそあれ、必須の発現を生じることになる。
【０００４】
カプシドタンパク質の分子質量は、ＶＰ１が８７ｋＤ、ＶＰ２が７３ｋＤ及びＶＰ３が６２ｋＤである。カプシド遺伝子の配列は、例えば、Srivastava, A. et al. (1983), J. Virol., 45, 555-564; Muzyczka, N. (1992), Curr. Top. Micro. Immunol., 158, 97-129, Ruffing, N. et al. (1992), J. Virol., 66, 69226930 又は Rutledge, E. A. et al. (1998) J. Virol. 72, 309-319に述べられている。 ＡＡＶゲノムの物理的及び遺伝的マップは、例えば、Kotin, R.M. (1994), Human Gene Therapy, 5, 793-801に述べられている。
【０００５】
種々なＡＡＶ血清型も知られており、これらのうちでヒトＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）が最も徹底的に研究されている。これらの分析は、ＡＡＶウイルスが身体的遺伝子療法のためにウイルスベクターとして有利な性質を有することを示している。本質的な利点は、ヒトに対する病原性が無いこと、細胞ゲノム中へのウイルスＤＮＡの安定な組み込み、非分割細胞(non-dividing cells)を感染させる能力、高タイター（１０13〜１０14粒子／ｍｌ）までの精製を可能にするビリオンの安定性、比較的低い免疫原性、及び組換えＡＡＶベクター中にウイルス遺伝子と遺伝子産物とが存在しないこと（これは遺伝子療法に用いるために安全性の見地から有利である）である。ＡＡＶベクター中への遺伝子のクローニングは現在、例えば WO95/23867、Chiorini J.A. et al. (1995),Human Gene Therapy,6,1531-1541又はKotin,R.M.(1994),上記文献に述べられているような、当業者に一般に知られた方法によって行なわれる。
【０００６】
遺伝子療法へのまさにウイルスベクターの使用は、この療法の成果を妨害する恐れがある免疫応答の強化に高い抗原性が関連するので、用いる系の抗原性に非常に依存する。それ故、ＡＡＶウイルスの抗原性は療法へのその使用可能性のためにも決定的に重要である。抗原なる用語は、ヒト又は動物体内への導入後に、特定の免疫応答を誘発する物質を意味する。これは、抗体の産生（体液性免疫応答）と細胞仲介免疫性（細胞免疫応答）の発生とによって、又は特異的な免疫寛容によって明示される。免疫応答のため（抗原の免疫原性のため）の一般的前提条件は、抗原が身体によって異物として認識されること、抗原が＞１ＫＤａのＭＷを有し、タンパク質若しくは多糖類、稀にはデオキシリボ核酸又は脂質のクラスに属することである。例えば、細菌、ウイルス又は赤血球（粒状抗原）のような複雑な構造は、一般に、さらに効果的な抗原である、即ち、高い抗原性を有する。それ故、本発明のために、抗原性とは結合によって免疫系（体液性と細胞性）と相互作用する（免疫系によって認識される）能力を意味する。さらに、この用語は免疫原性、即ち、免疫応答を誘発する能力をも包含する。この場合、まさにウイルスでは、抗体結合のための根本的な抗原構造がカプシドタンパク質又はカプシドの一次構造によってのみでなく、二次、三次又は四次構造によっても決定される可能性がある。
【０００７】
Chapman M.S.とRossmann M.G. (1993), Virology, 194, 491508は、種々なパルボウイルスとの配列比較によってＣＰＶカプシドの主要な抗原決定基を同定することができ、これからカプシドタンパク質間の抗原差異を予測した。この研究によると、ＣＰＶカプシドタンパク質の抗原性は、高度な配列可変性を有する外側に暴露されたループに主として関連する。他方では、このような研究はＡＡＶウイルスカプシドに関してはまだ行なわれていない。ＷＯ９６／００５８７のみが、例えば、臨床的に有意味な抗原をコードするＤＮＡがカプシドタンパク質をコードするＤＮＡ中にカプシド形成を妨害せずに挿入され、この構築体がＡＡＶカプシド融合タンパク質として発現される、ＡＡＶカプシド融合タンパク質を述べている。
臨床的に有意味な抗原は、例えば細菌（例えば、サルモネラ）、ウイルス（例えば、ｅｎｖ−ＨＩＶ）又は腫瘍細胞に由来するエピトープである。得られるＡＡＶカプシド融合タンパク質は免疫応答を惹起し、さらにＡＡＶウイルスの抗原性を増強させることになる。
【０００８】
先行技術には、ＡＡＶ抗原性の低減は示唆されていない。しかし、ＡＡＶベクターの−特に遺伝子療法における−実際の使用のために、野性型に比べて又は野性型に由来するＡＡＶベクターに比べて低減した抗原性は有利である。この理由は、野性型ＡＡＶも確実に抗原決定基を有するからである。したがって、野生型抗原性のＡＡＶベクターによる治療が不可避に困難であるか又は不可能である抗ＡＡＶ２  Ｉｇ陽性の個人が存在する。同様に、ＡＡＶベクターによる反復治療時に、患者が用いられるＡＡＶベクターに対して体液性及び／又は細胞性免疫応答をますます発生させる可能性がある。このような免疫化は治療をあまり成功的ではなく又は不成功にすると考えられる。したがって、組換えＡＡＶウイルスの抗原性が低ければ低いほど、又はその抗原性が野性型ウイルス若しくは以前に用いられた組換えＡＡＶウイルスから大きく異なれば異なるほど、その治療的使用はますます有望であると思われることを意味する。
【０００９】
それ故、本発明の課題は、ＡＡＶウイルスの抗原性、特に構造タンパク質の抗原性を野性型に比べて低減することであった。特異的で、効果的な遺伝子転移を可能にするが、免疫応答をより良く又は完全に回避するＡＡＶベクターを修飾によって開発することが、特に意図された。それ故、この修飾は好ましくは、同時にウイルスの感染性を無視できるほどに低減する又は少なくとも保持するような修飾であるべきである。
【００１０】
今回、抗原性が低減され、その際に感染性も無視できるほどに低減されるが、感染性が少なくとも保持されるようなやり方でＡＡＶの構造タンパク質又はカプシドタンパク質が修飾されうることが意外にも発見された。
【００１１】
それ故、本発明の１態様は、抗原性を低減させる修飾を少なくとも１つ含むＡＡＶの構造タンパク質である。
【００１２】
本発明の意図及び上記定義において、抗原性の低減とは特定の配列若しくはエピトープの、特に野性型に存在する特定のエピトープ及び配列の修飾、欠失若しくは付加、又はこれらの手段の組み合わせによる抗体産生及び／又は抗体結合の低減を意味する。低減した抗原性は、例えば、ＡＡＶベクターによる療法による生物の低減した免疫化を意味する。これに関連して、絶対的表現において、即ち、免疫応答の平均強度において単に変化した抗原性も、本発明の構造タンパク質が野性型によっては誘発されたであろう抗体（免疫）応答を誘発しないならば、本発明の意図では低減したと見なされるべきである。絶対的表現で単に変化している、このような抗原性は、抗原性の異なる本発明のＡＡＶベクターを連続的治療に用いるならば、低減した免疫化を生じる可能性がある。さらに、この場合、変化した抗原性とは体液性及び細胞性免疫応答の両方に関係しうる。
【００１３】
体液性免疫応答に関して、低減した抗原性は、例えば、本発明の修飾されたＡＡＶカプシドタンパク質又はＡＡＶカプシドをもはや認識しないか又はあまり充分に認識しない、非修飾（野性型）ＡＡＶカプシドタンパク質又はＡＡＶカプシドに結合することができる抗体によって検出されることができる。このような検出は、例えばエンザイム−リンクト  イムノアブソルベント  アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような標準方法によって行なうことができる。適当な抗体は、例えば、Ａ２０モノクローナル抗体である（Wistuba,A.et al. (1997) J.Virol.,71, 1341-52参照）、この抗体は野性型の完全にアセンブルされたＡＡＶ２カプシドのみを特異的に認識するが、遊離のカプシドタンパク質を認識しない。
【００１４】
細胞性免疫応答に関して、修飾された抗原性は、修飾構造タンパク質の粒子によって感染している抗原提示細胞によって、オリジナルの構造タンパク質の粒子によって感染している抗原提示細胞によるほど強く刺激されないＡＡＶ特異性免疫細胞によって検出されることができる。この方法は、ワクシニアウイルス及びアデノウイルスに関する方法に類似する（Tarpey, I. et al., (1994), Immunology, 81, 222-7; Nimako, M. et al., (1997), Cancer Res. 57, 4855-61)。免疫細胞の刺激は、例えば、サイトカインアッセイによって定量的に測定することができる（Current Protocols in Immunology (1999),  Coligan J.E. et al.編集, John Wiley & Sons,Chapter 6.2 - 6.24)。
【００１５】
本発明の構造タンパク質の修飾がウイルスの感染性の無視できるほどの低減を生じるか、又は感染性が少なくとも保持されることが、特に好ましい。本発明の意図において、感染性とは、細胞に形質導入する能力を意味する。
【００１６】
さらに、本発明の構造タンパク質がそのうえ、粒子形成する、即ち、特にＡＡＶカプシドとして二十面体カプシドを形成する能力を有することが好ましい、この理由は粒子及びカプシドが選択された化合物、例えばｒＡＡＶ形質導入ベクターのキャリヤーとして特に適しているからである。粒子の形成は、例えば、電子顕微鏡によって検出することができる。他の検出方法は、塩化セシウム密度勾配遠心分離中の沈降挙動と、続いての粒子中に存在するウイルスＤＮＡの任意の検出である。
【００１７】
一般に、修飾はＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶ３構造タンパク質、好ましくはＶＰ１及び／又はＶＰ３構造タンパク質中に存在しうる。さらに、構造タンパク質は全てのＡＡＶ血清型に、特にヒト血清型に、好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５及び／又はＡＡＶ６に、特にＡＡＶ２、ＡＡＶ３及び／又はＡＡＶ６に由来することができる。
【００１８】
修飾（単数又は複数）は好ましくはウイルス表面に位置する。構造タンパク質の表面に位置している領域の決定に関して、本発明によって、ＣＰＶ（イヌパルボウイルス）とＡＡＶ２の配列及び構造が匹敵することが意外にも発見された。それ故、好ましくは、例えばパルボウイルスＢ１９又はＣＰＶのようなパルボウイルスの既知結晶構造に頼って、ホモロジー比較によって、ウイルス表面に位置するタンパク質ドメインを同定することが可能である。それ故、本発明によると、例えば、ＣＰＶとＡＡＶ２とのコンピューター補助比較、及びパルボウイルスＢ１９とＡＡＶ２とのコンピューター補助比較が、配列が変化して、即ち、低いホモロジーを有して、ウイルス表面に位置すると期待される、ＶＰ３中のループの同定を意外にも再現可能に生じた。体液性免疫応答に対する抗原は抗体に、したがってウイルス表面にアクセス可能でなければならないので、これらのループは修飾のための好ましい候補である。このように、ＣＰＶ  ＶＰ２カプシドタンパク質の既知結晶構造（例えば、Luo M. (1988), J. Mol. Biol., 200, 209-211; Wu and Rossmann (1993), J. Mol. Biol., 233, 231-244; Tsao J. et al. (1991) Science, 251, 1456-1464）は、ウイルスカプシド表面上に暴露され、局部的アミノ酸配列に基づいてペプチド配列の挿入を克服するために充分にフレキシブルである領域を見出すために、タンパク質の二次構造におけるＡＡＶ２  ＶＰ３との大きな類似性に基づいてパターンと見なされた。この場合に、カプシドを不安定化すると考えられるＡＡＶ２カプシドタンパク質の二次構造要素を選択しないように注意した。
【００１９】
好ましい実施態様では、修飾（単数又は複数）は構造タンパク質のＮ末端に位置する、この理由は、例えばパルボウイルスＢ１９の場合にはＮ末端が細胞表面に位置することが発見されているからである。
【００２０】
構造タンパク質の表面に位置する領域を決定するための他の可能性は、異なるＡＡＶ血清型からのカプシドをコードする核酸配列を比較することである。このために、例えばＡＡＶ２の可能なカプシド形態の構造分析のために、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５又はＡＡＶ６のような、異なるＡＡＶ血清型からの既知ＤＮＡ配列を用いることが可能であり、この場合に、最初から、可能な三次構造を算出して、一般に知られたアミノ酸性質に基づいて配列領域を内側又は外側カプシド領域に割り当てることが可能である。したがって、本発明によると、例えば、ＡＡＶ２カプシドのＶＰ３領域における可能な挿入部位を確定することが可能であり、これらの部位は、例えばペプチドを挿入して、それらをウイルス表面上に発現させることを可能にした（以下参照）。
【００２１】
修飾は、例えば、１つ以上のアミノ酸又はアミノ酸配列への分子の共有結合又は非共有結合によって得られるカプシドタンパク質の変化を意味する。したがって、例えば、１つ以上のアミノ酸への単糖若しくはオリゴ糖、ビオチン又は他の高分子量化合物の共有結合によってカプシドタンパク質を修飾することができる。しかし、１つ以上のアミノ酸への例えばヒドロキシル基のような低分子量化合物の共有結合によって、修飾を達成することもできる。さらなる可能性は、分子又は分子複合体を非共有結合によってカプシドタンパク質に付着させることによって、抗原領域をシールドすることである。これは、例えば、免疫グロブリンの抗原結合部位であることができ、抗原領域又は隣接領域に対して高いアフィニティを有する、例えばＦabフラグメント又は他の分子でありうる。このような分子を分子ライブラリーから例えばそれらのアフィニティに関してスクリーニングすることができる。抗原領域又はカプシドタンパク質の三次元構造が既知である場合には、一連の可能な結合する分子を設計して、合成し、次にこれらの分子をそれらのアフィニティに関して試験することができる。
【００２２】
しかし、修飾はさらに、例えば１つ以上の突然変異、即ち、アミノ酸の配列における変化を意味する。突然変異なる用語は、例えば、点突然変異、複数のアミノ酸の突然変異、１つ以上の欠失、１つ以上の挿入又はこれらの突然変異の組み合わせを包含する。さらに、点突然変異又は複数のアミノ酸の突然変異がＴ又はＢ細胞エピトープ中に存在することが可能であり、修飾が同時に点突然変異、複数のアミノ酸の突然変異、挿入及び／又は欠失から成ることが可能である。
【００２３】
好ましい実施態様では、タンパク質又はペプチドの挿入、好ましくは免疫抑制性タンパク質又はペプチドの挿入が存在する。この場合のペプチドは例えば５〜３０アミノ酸、好ましくは８〜２０アミノ酸、特に１０〜１８アミノ酸から成ることができる。これらのペプチドは例えば配列QAGTFALRGDNPQG又はこれと高度にホモロジーである配列を有する。
【００２４】
特に好ましい、本発明の構造タンパク質は少なくとも１つの他の修飾を含む。このことは、構造タンパク質が、ウイルスの抗原性を低減させる修飾の他に、ウイルスの抗原性を必ずしも低減させない他の修飾をも含むことを意味する。これに関連して、ウイルスの感染性を変化させる、好ましくは増強させる他の変化が特に好ましい。
【００２５】
他の好ましい実施態様では、該他の修飾は構造タンパク質における１つ以上の欠失及び／又は１つ以上の挿入又はこれらの修飾の組み合わせを表す。これに関連して、挿入は好ましくは、細胞膜受容体リガンドの挿入、例えばＲｅｐドメインとしてのＲｅｐタンパク質若しくはペプチドの挿入、免疫抑制性タンパク質若しくはペプチドの挿入及び／又は、導入遺伝子(transgene)若しくは異種遺伝子(foreign gene)の二本鎖合成のためのシグナルを有するタンパク質若しくはペプチドの挿入である。
【００２６】
他の挿入の例は、特に、インテグリン、サイトカイン、又はサイトカイン、インテグリン若しくは成長因子の受容体結合ドメイン、例えばGMCSF, IL-2, IL-12, CD40L, TNF, NGF, PDGF若しくは EGF、細胞表面受容体に結合する一本鎖抗体、いわゆる一本鎖抗体(scFv)、例えば表面受容体CD40, CD40L, B7, CD28 若しくはCD34に結合する一本鎖抗体、又は例えば抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体のような特定の抗体によって若しくは化学物質若しくは例えばカテコールアミンのようなホルモンによって認識されるエピトープ若しくは受容体結合部位である。
【００２７】
他の修飾の好ましい実施態様では、例えばプロテインＡ、プロテインＧ又は抗Ｆｃ抗体又はこれらの部分のような抗体結合構造が挿入される。これらに、再び、特定の細胞表面構造に対して（例えば、リンパ細胞の場合にはＣＤ４０に対して又は造血細胞の場合にはＣＤ３４に対して）特異的な抗体が結合する。
【００２８】
好ましい実施態様では、ＶＰ１コーディング核酸のＸｈｏＩ切断部位における１つ以上の挿入によって、他の好ましい実施態様では、ＶＰ１コーディング核酸のＢｓｒＢＩ切断部位における１つ以上の挿入によって修飾が行なわれる。本発明の構造タンパク質の他の好ましい実施態様は、ＶＰ１コーディング核酸のＢｓｒＢＩ／ＨｉｎｄＩＩ切断部位間の欠失と、好ましくは該欠失部位における１つ以上の挿入とによって行なわれる。
【００２９】
本発明の他の好ましい実施態様では、６２アミノ酸を含むＶＰ１コーディング核酸のＸｈｏＩ／ＸｈｏＩ切断部位間の１つ以上の欠失によって、修飾（単数又は複数）が行なわれる（Hermonat, P.L. et al. (1984), J. Virol., 51, 329-339）。他の好ましい、対応する実施態様では、上記欠失内に位置され、２９アミノ酸を含むＶＰ１コーディング核酸のＢｓｒＢＩ／ＨｉｎｄＩＩ切断部位間に、欠失（単数又は複数）が位置される。この欠失はＲｅｐ遺伝子とのオーバーラップを有さないので、パッケージング機構に本質的に影響を及ぼさないという利点を有する。
【００３０】
他の好ましい実施態様では、ＶＰ３構造タンパク質(Rutledge, E.A. et al. (1998) 上記文献) 中の、YKQIS SQSGA, YLTLN NGSQA, YYLSR TNTPS, EEKFF PQSGV, NPVAT, EQYGS, LQRGN RQAAT, NVDFT VDTNGから選択された配列における少なくとも１つのアミノ酸の前及び／又は後に１つ以上の挿入が存在する、この理由はこれらの部位がループの暴露部位に位置され、この場合にはＶＰ３構造が変化する危険性が低いからである。
【００３１】
点突然変異（単数又は複数）、幾つかのアミノ酸の突然変異（単数又は複数）、欠失（単数又は複数）又は挿入（単数又は複数）は、一般に知られた方法に従って、構造タンパク質をコードする遺伝子中の欠失及び挿入によって行なわれる。欠失は例えばＰＣＲ補助突然変異誘発によって個々の構造タンパク質遺伝子中に導入することができる。挿入は一般に知られた方法に従って、例えば、適当な構造タンパク質遺伝子の制限エンドヌクレアーゼによる加水分解とそれに続くリガーゼ反応とによって導入することができる。その後の突然変異遺伝子の発現が本発明の構造タンパク質を生じる。
【００３２】
本発明の他の態様もまた、ＡＡＶ粒子としての、特にＡＡＶカプシドとしての本発明の構造タンパク質である、この理由は、粒子及びカプシドが選択された化合物、例えばｒＡＡＶ形質導入ベクターのキャリヤーとして特に適しているからである。
【００３３】
本発明の他の態様は、本発明の構造タンパク質をコードする核酸、好ましくはＲＮＡ又はＤＮＡ、特に二本鎖ＤＮＡである。
【００３４】
本発明はまた、本発明の核酸を含む細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞又は２９３細胞に関する。このような細胞は、組換えＡＡＶ粒子を製造するために適している。
【００３５】
それ故、本発明の他の態様は、本発明の構造タンパク質の製造方法、特にＡＡＶ粒子としての本発明による構造タンパク質の製造方法であって、本発明による構造タンパク質をコードする核酸を含む適当な細胞を培養して、適当である場合には、発現された構造タンパク質を単離する前記方法でもある。例えば、本発明の構造タンパク質は、例えばChiorini,J.A.et al.(1995),上記文献に述べられている塩化セシウム勾配上で単離することができる。
【００３６】
本発明の他の態様はまた、本発明の構造タンパク質又は本発明の核酸又は本発明の細胞と、適当である場合には、例えば生理食塩溶液、安定剤、プロテイナーゼ阻害剤、ＤＮＡｓｅ阻害剤等のような、適当な賦形剤及び添加剤とを含む薬剤にも関する。
【００３７】
本発明の他の態様は、各々が異なる修飾を有する、少なくとも２種類の異なる、本発明の構造タンパク質を含む薬剤である。これに関連して、これらの構造タンパク質が抗原性において異なることが特に好ましい。
【００３８】
他の好ましい態様は、少なくとも２種類の異なる、本発明の構造タンパク質を含むキットであって、各構造タンパク質がキット内で他の構造タンパク質（単数又は複数）から分離して存在する前記キットである。
【００３９】
少なくとも２種類の異なる、本発明の構造タンパク質を有するキット又は薬剤の、例えば療法の一部としての使用に関して、最初に１つの構造タンパク質を用いる。その後の１回以上の使用のために、抗原性の異なる構造タンパク質が用いられる。したがって、薬剤又はキットを用いる療法は、本発明の構造タンパク質の連続的投与を含む。したがって、薬剤及びキットは、（１）同じ構造タンパク質の反復使用時に誘発される免疫応答の可能性を回避することができる及び（２）最初の使用中に免疫応答が誘発される場合には、抗原性の異なる構造タンパク質の使用によって、この第２使用に対する防御応答は第１構造タンパク質による使用に対するよりも効果的でないことが実証されるという利点を有する。このようにして低減される患者の免疫化は、効力を高める。したがって、連続使用のためには、患者の免疫化をできるだけ低く維持するように、種々な構造タンパク質の間で多重に交換することが可能である。抗原性の異なる感染性粒子としての一組の幾つかの構造タンパク質が好ましく、これらは例えば同じ治療用遺伝子(therapeutic gene)の多数回転移のためのベクターとして用いられる。他の薬剤は、異なる治療のためにベクターとして用いられる感染性粒子としての一組の構造タンパク質を含む。
【００４０】
本発明の他の態様は、ＡＡＶの抗原性を変えるため、細胞を形質転換するため及び／又は−適当なｒＡＡＶベクターとして−遺伝子療法のための本発明の構造タンパク質の使用に関する。遺伝子療法は、細胞中への核酸の導入によって、エフェクター遺伝子、したがって通常はタンパク質が発現される療法のタイプを意味する。原則として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法とｉｎ  ｖｉｖｏ方法とが区別される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法では、細胞が生物から取り出され、続いて、同じ生物又は他の生物中に再び導入されるために、ベクターによってｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入される。ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子療法では、例えば腫瘍を制圧するためのベクターが全身的に（例えば、血流によって）又は局部に（例えば、腫瘍中に）投与される。
【００４１】
本発明の本質的な利点は、組換えＡＡＶベクターのパッケージング効率を実際に損失させずに、−したがって、感染性のための基本的な前提条件を実際に損失させずに−ＡＡＶ構造タンパク質の本発明による突然変異誘発によってウイルスのカプシド内で抗原性を変化させることができることである。それ故、本発明は、患者の免疫化低減が望ましい場合に、例えば身体の遺伝子療法のための細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ形質導入に特に適している。
【００４２】
下記実施例は、本発明を限定せずに、本発明を詳細に例示するように意図される。
【００４３】
実施例１
ＶＰ３におけるＰ１突然変異：
出発点は、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．）のＢａｍＨＩ切断部位中にｐＡＶ２（ＡＴＣＣ３７２６１，ｒｅｆ．５３）の４．８ｋｂ  ＢｇｌＩＩフラグメントをサブクローニングすることによって製造されたプラスミドｐＵＣ−ＡＶ２であった。該プラスミド中の一定の部位において当業者に知られたＰＣＲ補助突然変異誘発によって突然変異を生じさせた。これはＰ１、ラミニンフラグメントのＲＧＤ結合モチーフ(Aumailly et al. (1990) FEBS Lett. 262, 82-86)を含有するＡＡ配列 QAGTFALRGDNPQGを含む１４ＡＡ ペプチドをコードする配列をヌクレオチド２９８５、３３４５及び３９６３の後に挿入することを包含する。これは、ＡＡＶ２カプシドタンパク質におけるアミノ酸２６１、３８１及び５８７（ＡＡＶ２のＶＰ−１におけるＮ末端の始点からのアミノ酸（ＡＡ）後に数えられるＡＡ数に応じて名付けられる）後の挿入に相当する。その後のＰＣＲでは、各場合に２つの突然変異特異性プライマーが用いられ、キャップ遺伝子のみを含有し、ｐＵＣ−ＡＶ２から２．２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｐＭＩフラグメントを切り取って、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ切断部位にそれを挿入することによって形成されるプラスミド、ｐＣａｐが鋳型として用いられる。続いて、ＰＣＲ産物を細菌中で増幅し、配列決定して、Ｐ１を含有する１．４ｋｂのＥｃｏＮＩ−ＸｃｍＩフラグメントを、対応する野性型キャップ配列が切り取られているｐＵＣ−ＡＶ２中にサブクローニングする。その結果として、ＡＡ挿入後に部位ｐＩ−２６１、ｐＩ−３８１及びｐＩ−５８７と名付けられるプラスミド（変異体）は完全なＡＡＶ２ゲノムを含有した。対応する突然変異タンパク質はＩ−２６１、Ｉ−３８１及びＩ−５８７と呼ばれる。
【００４４】
実施例２
ＡＡＶ２粒子の産生
ＨｅＬａ細胞（ヒト頚部上皮細胞系）を実施例１のプラスミドによってトランスフェクトし、約２０時間インキュベートしてから、アデノウイルス型５によって感染させた。感染後７２時間に、細胞を破壊して、ＡＡＶ２粒子をＣｓＣｌ勾配で精製した。
【００４５】
実施例３
実施例１のカプシド変異体の特徴付け
これらの実験の意図は、カプシド変異体がウイルスゲノムをパッケージして、完全なカプシドを形成することができるかどうかを確認することであった。実施例２による変異体のＡＡＶ２粒子がウイルスゲノムを有するかどうか、もし有するならば、如何に多くの粒子がウイルスゲノムを有するのか、及び如何に多くのＤＮＡがカプシド変異体中にパッケージされているかを知るために、実施例２による変異体のＡＡＶ２粒子を試験した。このために、実施例２で精製したウイルス粒子（変異体と野性型）をＤＮＡｓｅで処理し、ブロッティングして、Ｒｅｐプローブとハイブリダイズさせた。
【００４６】
これから生ずるタイターは野性型との量的又は質的な差異を示さなかった（表１参照）。ウイルスはゲノムをパッケージする能力を保持した。
さらに、カプシドも形成されることを電子顕微鏡分析によって確認することができた。
【００４７】
それ故、正確なフォールディング、カプシド構築又はゲノムのパッケージングのために重要である領域では、突然変異は行なわれなかった。本発明のＡＡＶ粒子の機能は損なわれない。
【００４８】
実施例４
実施例１のカプシド変異体の抗原性
突然変異カプシドの抗原性を察知することができるために、さらなる実験においてＥＬＩＳＡにＡ２０モノクローナル抗体（Ａ２０ＭＡｂ）を用いた。Ａ２０ＭＡｂは野性型の完全に構築されたＡＡＶ２カプシドと特異的に反応する（Wistuba et al., (1997), J.Virol. 71, 13411352)。この場合にも、結果を表１に示す。これから、Ａ２０モノクローナル抗体は、変異体Ｉ−２６１及びＩ−３８１中への挿入によって、野性型及びＩ−５８７とは対照的にもはや結合することができないことが分かる。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
ゲノムウイルスタイター（ドット−ブロット）とＡ２０カプシドＥＬＩＳＡによるタイターとを示す。濃度は粒子数／ｍｌで記載する。“ｎ．ｍ．”は“測定不能”を意味する。
【００５１】
実施例５
実施例１のカプシド変異体による感染試験
カプシド変異体Ｉ−２６１、Ｉ−３８１及びＩ−５８７のトロピズム(tropism)を試験するために、細胞系Ｃｏ−１１５の細胞を突然変異ウイルスによって感染させた。Ｃｏ−１１５細胞を用いて、ビリオンの野性型受容体トロピズムを試験した、この理由は野性型ＡＡＶ２によって後者に形質導入することができるからである。感染後３日目に、ウイルスＲｅｐタンパク質が発現したかどうかを知るために、細胞を抗Ｒｅｐ抗体を用いて免疫蛍光測定によって調べた（Wistuba et al. (1997) J. Virol. 71, 1341-1352; Wistuba et al. (1995) J. Virol. 69, 5311-5319)。細胞を顕微鏡スライド上で７０％集密度まで増殖させ、無血清培地中でアデノウイルス５と一緒に、種々な濃度の本発明のウイルス製剤と共にインキュベートした。３日間後に、免疫蛍光アッセイにおいてＲｅｐタンパク質合成のｉｎ  ｓｉｔｕ検出によって、ウイルス製剤のタイターを測定した（Ｒｅｐタイター）。この場合に、Ｗｉｓｔｕｂａ等の方法(Wistuba et al. (1997) J. Virol. 71, 1341-1352; Wistuba et al. (1995) J. Virol. 69, 5311-5319)によって、ＡＡＶ２感染細胞に関して免疫蛍光染色を行なった。顕微鏡スライドをＰＢＳによって１回洗浄し、メタノール中で固定し（５分間、４℃）、次に、アセトンによって処理した（５分間、４℃）。次に、ＡＡＶ２のＲｅｐタンパク質と反応するモノクローナル抗体７６−３と共に、これらの細胞を室温において１時間インキュベートした。これに続いて、洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１：５０に希釈して、ローダミン結合抗マウス二次抗体と共に１時間インキュベートした。蛍光陽性細胞に達したウイルスストック溶液の最後に限定した希釈度からタイターを算出した。
【００５２】
Ｒｅｐ陽性ＣＯ１１５細胞は、野性型ＡＡＶ２及び変異体Ｉ−２６１とＩ−５８７による感染後に、検出可能であり、この場合に変異体の感染性は野性型の感染性よりも２〜３桁低かった、又は１つの変異体は感染性ではなかった（Ｉ−３８１）（表２）。しかし、変異体Ｉ−２６１に関しては、低減した抗原性にも拘わらず（実施例４参照）感染性が保持された。
【００５３】
【表２】
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【００５４】
野性型感受性ＣＯ１１５細胞のタイターを示す。これらのタイターは野性型に関してと同様にＩ−２６１、Ｉ−３８１及びＩ−５８７に関してＲｅｐ  ＥＦＵ／ｍｌで表される。この場合に、ＥＦＵは発現形成単位（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）を意味する。さらに、“ｎ．ｍ．”は“測定不能”を意味する。
【配列表】
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