(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩素数３のＰＣＢに特異的反応性を示し、かつ塩素数が４以上のＰＣＢとの交差反応性が５０％未満である抗ＰＣＢモノクローナル抗体を２種以上用い、
前記２種以上の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を混合し、ＰＣＢを含む試料中に導入した後、該試料を、担体に固定させた抗体検出用物質と接触させ、
前記抗体検出用物質と結合した前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体量を測定し、該抗ＰＣＢモノクローナル抗体量から、前記試料中のＰＣＢの量を求めることを特徴とするＰＣＢの免疫学的定量方法。
【請求項２】
塩素数３のＰＣＢに対する親和性をＡ、塩素数４のＰＣＢに対する親和性をＢ、塩素数５のＰＣＢに対する親和性をＣ、及び塩素数６のＰＣＢに対する親和性をＤとしたとき、Ａ＜Ｂ＜Ｃ＜Ｄの関係を満たす抗ＰＣＢモノクローナル抗体と、Ｄ＜Ｃ＜Ｂ＜Ａの関係を満たす抗ＰＣＢモノクローナル抗体とを用いる請求項１に記載のＰＣＢの免疫学的定量方法。
【請求項３】
抗ＰＣＢモノクローナル抗体が標識物質により標識された抗体であり、抗体検出用物質と結合した前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体量を、前記標識物質に由来する信号の強度から測定する請求項１から２のいずれかに記載のＰＣＢの免疫学的定量方法。
【請求項４】
抗体検出用物質に結合した抗ＰＣＢモノクローナル抗体を無標識の一次抗体とし、前記一次抗体に特異的に結合する標識物質により標識された抗体を二次抗体として用い、前記抗体検出用物質と結合した前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体量を、前記二次抗体の標識物質に由来する信号の強度から測定する請求項１から３のいずれかに記載のＰＣＢの免疫学的定量方法。
【請求項５】
２種以上の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を、標識物質に由来する信号の強度が略同一となる濃度でそれぞれ配合し、試料に導入する請求項３から４のいずれかに記載のＰＣＢの免疫学的定量方法。
【請求項６】
抗体検出用物質を固定した担体を備え、かつ通液可能な検出容器に、抗ＰＣＢモノクローナル抗体を添加した試料を導入し、
前記担体に固定された前記抗体検出用物質と結合した前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体量を測定する請求項１から５のいずれかに記載のＰＣＢの免疫学的定量方法。
【請求項７】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５４７のハイブリドーマ、及び受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７４４のハイブリドーマのいずれかから産生された抗ＰＣＢモノクローナル抗体を少なくとも用いる請求項１から６のいずれかに記載のＰＣＢの免疫学的定量方法。
【請求項８】
塩素数３のＰＣＢに特異的反応性を示し、かつ塩素数が４以上のＰＣＢとの交差反応性が５０％未満である抗ＰＣＢモノクローナル抗体を２種以上含むことを特徴とするＰＣＢの免疫学的定量用抗体。
【請求項９】
塩素数３のＰＣＢに対する親和性をＡ、塩素数４のＰＣＢに対する親和性をＢ、塩素数５のＰＣＢに対する親和性をＣ、及び塩素数６のＰＣＢに対する親和性をＤとしたとき、Ａ＜Ｂ＜Ｃ＜Ｄの関係を満たす抗ＰＣＢモノクローナル抗体と、Ｄ＜Ｃ＜Ｂ＜Ａの関係を満たす抗ＰＣＢモノクローナル抗体とを少なくとも含む請求項８に記載のＰＣＢの免疫学的定量用抗体。
【請求項１０】
請求項８から９のいずれかに記載のＰＣＢの免疫学的定量用抗体と、抗体検出用抗原が固定された担体とを少なくとも含むことを特徴とするＰＣＢの免疫学的定量用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の同族体を含む被検物質の免疫学的定量方法に関し、特に複数の抗ＰＣＢモノクローナル抗体からなる免疫学的定量用抗体を用いたＰＣＢの免疫学的定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＢ（ポリ塩化ビフェニル）は、安定性や絶縁性の高さから、変圧器及びコンデンサー等の電気絶縁材、並びに熱媒体などとして広く使用されてきたが、人体や環境への有害性が確認されたことから製造や使用が禁止された。ＰＣＢは、難分解性で環境中に残留し、食物連鎖を通じて生物に蓄積され、人の健康や生態系に影響を及ぼす性質を有する残留性有機汚染物質の代表的な化学物質として規制されており、ＰＣＢを含む廃棄物は、適正に処理されるまで、生活環境の保全上支障のないように保管することが義務づけられている。
しかし、適正処理が行われずに保管されていたＰＣＢ廃棄物は、保管の長期化により、紛失や漏洩の発生が問題視され、平成１３年に「ポリ塩化ビフェニル廃棄物の適正な処理の推進に関する特別措置法」（ＰＣＢ特措法）が施行された。このＰＣＢ特措法により、１５年以内に全てのＰＣＢ廃棄物の適正処理が義務付けられた。
【０００３】
例えば、絶縁油の場合、保管されている絶縁油以外にも、過去においてＰＣＢを絶縁油として使用していた変圧器において置換された代替絶縁油も、前記変圧器内に微量に残留したＰＣＢに汚染されていることが知られており、このような変圧器中代替絶縁油も含め、大量の廃棄物中のＰＣＢ濃度を検査し、迅速に処理の必要性の有無を明確にする必要がある。また、処理を行ったＰＣＢ廃棄物に対し、処理後のＰＣＢ残留濃度、環境中のＰＣＢ濃度を検査することも極めて重要である。
【０００４】
従来のＰＣＢ分析方法としては、例えば、公定法として、高分解能ガスクロマトグラフ−高分解能質量分析（ＨＲＧＣ−ＨＲＭＳ）や、電子捕獲型検出器付きガスクロマトグラフ法（ＧＣ‐ＥＣＤ法）が用いられている（非特許文献１参照）。これらの方法は分解能が高く、また定量下限も低いが、分析に要する時間が長く、分析の妨害となる夾雑成分を除去する試料の操作が煩雑であり、コスト負担が大きいという問題がある。このため、簡便かつ迅速な分析方法で、測定現場で簡易に測定可能な方法が求められていた。
【０００５】
これに対し、簡便かつ迅速な分析方法として、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法（イムノアッセイ）が提案されている。前記免疫学的測定法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）等が挙げられる。
これらの測定方法においては、測定対象となる物質（抗原）の種類及びその測定範囲は、使用する抗体の該抗原に対する親和性に依存するため、抗体の選択が重要となる。一方、このような免疫学的測定法では、化学構造の類似した抗原（例えば、異性体や同族体）が多数混合されて含まれている試料の測定においては、該試料中の抗原含有量の正確な定量が困難であるという問題がある。
【０００６】
特に、ＰＣＢは、２０９個の異性体と１０個の同族体が存在し、しかも上述の分析対象となっている廃棄物中に含まれるＰＣＢの組成（例えば、工業製品であるカネクロールの含有比率）も一定ではないため、単一のモノクローナル抗体を用いて該抗体にのみ反応性を有する抗原を検出し測定を行う方法では、正確な定量ができない。
【０００７】
このような問題に対し、ＰＣＢと同様に多数の異性体が存在するダイオキシン類の定量方法として、ポリクローナル抗体を用いる方法が提案されている（特許文献１参照）。しかし、遺伝的に均一なポリクローナル抗体を、動物を用いて大量に再現性よく作製することは実質的に困難である。
したがって、多数の異性体や同族体を含む被検物質、特に、未知の組成のＰＣＢを、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法を用い、簡便に、かつ最小限の誤差で高感度に定量可能な方法、該定量方法に用いられる抗体は、未だ満足なものが提供されておらず、改良が求められているのが現状である。
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−０９８１７３号公報
【非特許文献１】「絶縁油中のポリ塩素化ビフェニル（ＰＣＢ）の分析方法規定」（電気技術基準調査委員会編集、社団法人日本電気協会発行、平成３年９月３０日発行）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は従来における前記問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、多数の異性体や同族体を含む被検物質、特に未知の組成のＰＣＢを、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法を用い、簡便に、かつ最小限の誤差で高感度に定量可能な方法、及び該定量方法に用いられる抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するため、本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、ＰＣＢの同族体に対する親和性が、塩素数との関係において反対の傾向を示す抗ＰＣＢモノクローナル抗体、すなわち、塩素数が大きい同族体に高い親和性を示すモノクローナル抗体と、塩素数が小さい同族体に高い親和性を示すモノクローナル抗体とを混合して使用することにより、組成が未知のＰＣＢを、最小の誤差で効率よく定量できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、本発明者による前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  複数の同族体を含む被検物質の一の同族体に対して特異的反応性を示し、かつ他の同族体に対して少なくとも交差反応性を示すモノクローナル抗体を２種以上用い、
該２種以上のモノクローナル抗体を混合して前記被検物質を含む試料中に導入した後、
該試料を、担体に固定させた抗体検出用物質と接触させ、
前記抗体検出用物質と結合した前記モノクローナル抗体量を測定し、該モノクローナル抗体量から、前記試料中の前記被検物質の量を求めることを特徴とする被検物質の免疫学的定量方法である。
＜２＞  モノクローナル抗体が標識物質により標識された抗体であり、抗体検出用物質と結合した前記モノクローナル抗体量を、前記標識物質に由来する信号の強度から測定する前記＜１＞に記載の被検物質の免疫学的定量方法である。
＜３＞  モノクローナル抗体を無標識の一次抗体とし、該モノクローナル抗体に特異的に結合する標識物質により標識された抗体を二次抗体として用い、前記抗体検出用物質と結合した前記モノクローナル抗体量を、前記二次抗体の標識物質に由来する信号の強度から測定する前記＜１＞に記載の被検物質の免疫学的定量方法である。
＜４＞  ２種以上のモノクローナル抗体を、標識物質に由来する信号の強度が略同一となる濃度でそれぞれ配合し、試料に導入する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の免疫学的定量方法である。
【００１２】
＜５＞  前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の免疫学的定量方法により、ＰＣＢの一の同族体に対して特異的反応性を示し、かつ他の同族体に対して少なくとも交差反応性を示す抗ＰＣＢモノクローナル抗体を２種以上用い、
前記２種以上の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を混合し、ＰＣＢを含む試料中に導入した後、該試料を、担体に固定させた抗体検出用物質と接触させ、
前記抗体検出用物質と結合した前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体量を測定し、該抗ＰＣＢモノクローナル抗体量から、前記試料中のＰＣＢの量を求めることを特徴とするＰＣＢの免疫学的定量方法である。
＜６＞  抗ＰＣＢモノクローナル抗体として、塩素数３のＰＣＢに特異的反応性を示し、かつ塩素数が４以上のＰＣＢとの交差反応性が５０％未満である抗ＰＣＢモノクローナル抗体を少なくとも用いる前記＜５＞に記載のＰＣＢの免疫学的定量方法である。
＜７＞  受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５４７のハイブリドーマ、及び受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７４４のハイブリドーマのいずれかから産生された抗ＰＣＢモノクローナル抗体を少なくとも用いる前記＜６＞に記載のＰＣＢの免疫学的定量方法である。
＜８＞  塩素数３のＰＣＢに対する親和性をＡ、塩素数４のＰＣＢに対する親和性をＢ、塩素数５のＰＣＢに対する親和性をＣ、及び塩素数６のＰＣＢに対する親和性をＤとしたとき、Ａ＜Ｂ＜Ｃ＜Ｄの関係を満たす抗ＰＣＢモノクローナル抗体と、Ｄ＜Ｃ＜Ｂ＜Ａの関係を満たす抗ＰＣＢモノクローナル抗体とを用いる前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載のＰＣＢの免疫学的定量方法である。
＜９＞  抗ＰＣＢモノクローナル抗体が標識物質により標識された抗体であり、抗体検出用物質と結合した前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体量を、前記標識物質に由来する信号の強度から測定する前記＜５＞から＜８＞のいずれかに記載のＰＣＢの免疫学的定量方法である。
＜１０＞  抗体検出用物質に結合した抗ＰＣＢモノクローナル抗体を無標識の一次抗体とし、前記一次抗体に特異的に結合する標識物質により標識された抗体を二次抗体として用い、前記抗体検出用物質と結合した前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体量を、前記二次抗体の標識物質に由来する信号の強度から測定する前記＜５＞から＜８＞のいずれかに記載のＰＣＢの免疫学的定量方法である。
＜１１＞  ２種以上の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を、標識物質に由来する信号の強度が略同一となる濃度でそれぞれ配合し、試料に導入する前記＜９＞から＜１０＞のいずれかに記載のＰＣＢの免疫学的定量方法である。
＜１２＞  抗体検出用物質を固定した担体を備え、かつ通液可能な検出容器に、抗ＰＣＢモノクローナル抗体を添加した試料を導入し、
前記担体に固定された前記抗体検出用物質と結合した前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体量を測定する前記＜５＞から＜１１＞のいずれかに記載のＰＣＢの免疫学的定量方法である。
【００１３】
＜１３＞  被検物質の一の同族体に特異的反応性を示し、かつ他の同族体に対して少なくとも交差反応性を示すモノクローナル抗体を２種以上含むことを特徴とする免疫学的定量用抗体である。
＜１４＞  塩素数３のＰＣＢに対する親和性をＡ、塩素数４のＰＣＢに対する親和性をＢ、塩素数５のＰＣＢに対する親和性をＣ、及び塩素数６のＰＣＢに対する親和性をＤとしたとき、Ａ＜Ｂ＜Ｃ＜Ｄの関係を満たす抗ＰＣＢモノクローナル抗体と、Ｄ＜Ｃ＜Ｂ＜Ａの関係を満たす抗ＰＣＢモノクローナル抗体とを少なくとも含む前記＜１３＞に記載の免疫学的定量用抗体である。
【００１４】
＜１５＞  前記＜１３＞から＜１４＞のいずれかに記載の免疫学的定量用抗体と、抗体検出用抗原が固定された担体とを少なくとも含むことを特徴とする免疫学的定量用キットである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によると、多数の異性体や同族体を含む被検物質、特に未知の組成のＰＣＢを、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法を用い、簡便に、かつ最小限の誤差で高感度に定量することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（被検物質の免疫学的定量方法）
本発明の被検物質の免疫学的定量方法は、複数の同族体を含む被検物質の一の同族体に対して特異的反応性を示し、かつ他の同族体に対して少なくとも交差反応性を示すモノクローナル抗体を２種以上用い、該２種以上のモノクローナル抗体を混合して前記被検物質を含む試料中に導入した後、該試料を、担体に固定させた抗体検出用物質と接触させ、前記抗体検出用物質と結合した前記モノクローナル抗体量を測定し、該モノクローナル抗体量から、前記試料中の前記被検物質の量を求める方法である。
【００１７】
本発明の免疫学的定量方法は、抗原抗体反応を利用するものであり、具体的には、被検物質である抗原を含有する試料に、該抗原に親和性を有する抗体を接触させ、抗原抗体反応を起こさせた後、前記抗原に結合しなかった抗体を、前記担体に固定させた前記抗体検出用物質で捕捉し、捕捉された前記抗体の量を蛍光標識によって測定し、前記試料中に被検物質を含まない場合（ブランク）における蛍光強度と、前記捕捉された抗体の蛍光強度との蛍光強度差から、試料中の抗原の存在を検出する方法である。
【００１８】
本発明の免疫学的定量方法において、前記被検物質としては、複数の同族体を含む限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＣＢ、ダイオキシン、ポリ塩化フェノール、類似の構造を持つ農薬（ピレスロイド系殺虫剤、ジチオカーバメイト系殺菌剤など）、ＥＤＴＡ錯体、ＤＴＰＡ錯体等が挙げられる。
【００１９】
本発明の免疫学的定量用抗体は、前記被検物質の一の同族体に特異的反応性を示し、かつ他の同族体に対して少なくとも交差反応性を示すモノクローナル抗体を２種以上含む。
なお、前記免疫学的定量用抗体としては、他の抗体と組み合わされたことによって、その抗体の抗原に対する親和性が変化しないことが必要であり、組合せた２種以上の抗体同士が干渉することなく、独立して同時に反応が起こるものが好ましい。
以下、前記被検物質がＰＣＢである場合、すなわちＰＣＢの免疫学的定量方法の説明を通じ、本発明の免疫学的定量方法、及び本発明の免疫学的定量用抗体を明らかにする。
【００２０】
＜ＰＣＢの免疫学的定量方法＞
前記ＰＣＢの免疫学的定量方法は、ＰＣＢの一の同族体に対して特異的反応性を示し、かつ他の同族体に対して少なくとも交差反応性を示す抗ＰＣＢモノクローナル抗体を２種以上用いる方法であり、前記２種以上の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を混合してなる前記免疫学的定量用抗体を、ＰＣＢを含む試料中に導入した後、該試料を、担体に固定させた抗体検出用物質と接触させ、前記抗体検出用物質と結合した前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体量を測定し、該抗ＰＣＢモノクローナル抗体量から、前記試料中のＰＣＢの量を求める方法である。
【００２１】
＜＜抗ＰＣＢモノクローナル抗体＞＞
前記ＰＣＢの免疫学的定量方法において用いられる前記免疫学的定量用抗体を構成する抗ＰＣＢモノクローナル抗体としては、ＰＣＢの一の同属体に特異的反応性を示し、かつ他の同属体に対して少なくとも交差反応性を示すものであれば、特に制限はなく、適宜作製したものであってもよく、市販品であってもよい。
【００２２】
前記ＰＣＢの免疫学的定量方法において用いられる前記免疫学的定量用抗体を構成する２種以上の抗ＰＣＢモノクローナル抗体のうち、少なくとも１種が、塩素数３のＰＣＢに特異的反応性を示し、かつ塩素数が４以上のＰＣＢとの交差反応性が５０％未満である抗ＰＣＢモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００２３】
また、前記ＰＣＢの免疫学的定量方法において用いられる前記免疫学的定量用抗体を構成する２種以上の抗ＰＣＢモノクローナル抗体として、塩素数３のＰＣＢに対する親和性をＡ、塩素数４のＰＣＢに対する親和性をＢ、塩素数５のＰＣＢに対する親和性をＣ、及び塩素数６のＰＣＢに対する親和性をＤとしたとき、Ａ＜Ｂ＜Ｃ＜Ｄの関係を満たす抗ＰＣＢモノクローナル抗体と、Ｄ＜Ｃ＜Ｂ＜Ａの関係を満たす抗ＰＣＢモノクローナル抗体とを用いることがより好ましい。
【００２４】
ここで、ＰＣＢは、単独では抗原性を持たないため、ＰＣＢを認識する抗体を作製する場合には、例えば、ハプテンとしてのＰＣＢが免疫原性を有するタンパク質に連結されてなる複合体を免疫原として用いることが好ましい。
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、例えば、前記複合体を用いてマウス等の動物を免疫し、免疫した前記動物の脾臓細胞を回収し、該脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合して得たハイブリドーマを培養して作製することができる。
【００２５】
また、樹立された抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを培養して前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を調製してもよい。前記ハイブリドーマとしては、ＰＣＢを認識する本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生する限り、特に限定されないが、例えば、塩素数３のＰＣＢに特異的反応性を示し、かつ塩素数が４以上のＰＣＢとの交差反応性が５０％未満である抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとしては、例えば、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５４７として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されているハイブリドーマＳｚｋ２Ｅ４株、及び下記構造式で表される化合物を用いて調製された、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７４４として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されているハイブリドーマＳｋ３Ａ１１株が好ましく、前記Ｓｋ３Ａ１１株が特に好ましい。
【００２６】
【化１】
0004651558.tif 000002
ただし、前記構造式中、Ｘはタンパク質を表す。
【００２７】
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、それ自体が前記標識物質により標識された抗体であってもよい。
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体の標識物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペルオキシダーゼ、ビオチン、金コロイド、蛍光物質（ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５４７、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６４７等）などが挙げられる。
前記標識物質で前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を標識する方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができる。
【００２８】
また、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体が無標識である場合には、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を一次抗体として、該一次抗体に特異的に結合する前記標識物質により標識された抗体を二次抗体として用いてもよい。該二次抗体は、適宜作製したものであってもよく、市販品であってもよい。
【００２９】
＜＜抗ＰＣＢモノクローナル抗体の親和性及び特異性＞＞
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体のＰＣＢに対する親和性は、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体のＰＣＢとの結合を５０％阻害する抗原濃度（ＩＣ５０値）により評価することができる。
また、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体のＰＣＢに対する特異性（交差反応性）は、塩素数３の同族体に対する特異性を評価する場合、例えば、３塩素化物ＰＣＢに対するＩＣ５０値と、４〜６塩素化物ＰＣＢに対するＩＣ５０値とを比較することにより、具体的にはそれぞれのＩＣ５０値の比を求めることにより評価することができる。
【００３０】
前記ＩＣ５０値の算出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記標識物質に由来する信号強度の測定データを、下記式（１）で表される近似式に当てはめて求めることにより解析することができる。
【００３１】
【数１】
0004651558.tif 000003
前記式（１）中、ｙは、抗原を加えなかったときの信号強度の値を１００％とした時の相対的な信号強度を表し、ｘは、抗原濃度を表し、Ｐ１とＰ２は、近似のパラメータを表す。
【００３２】
測定データは、抗原を加えなかったときの信号強度の値を１００％として相対値に変換した後、最適なＰ１及びＰ２を決定する。Ｐ１及びＰ２は、例えば、グラフ作成ソフトウェアOrigin  version  6.0（OriginLab製）等を用いて決定することができる。
このようにして得られた近似式を、前記抗体と前記抗原との結合曲線とし、ｙ＝５０％となるときのｘの値(＝Ｐ１)をＩＣ５０値とする。
なお、ＩＣ５０値に対して抗体濃度が十分に小さい時（例えば、１０分の１以下の時）、ＩＣ５０値と平衡解離定数（Ｋｄ）がほぼ一致することが知られている。
【００３３】
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体の塩素数の異なるＰＣＢに対する特異性は、例えば、カネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００、ＫＣ−１０００）を標準試料として評価することができる。
前記カネクロールは、それぞれ下記表１に示す比率で異なる塩素数のＰＣＢを含有しているため、例えば、塩素数３の同族体に高い親和性を示す前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体（以下、「３塩素抗体」という）は、カネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００、ＫＣ−１０００）の中でも３塩素化物を最も多く含有するＫＣ−３００に対して最も高い親和性を示す。また、前記３塩素抗体は、ＫＣ−３００以外のカネクロールにも交差反応性を示すが、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００、及びＫＣ−１０００に対する交差反応性は、それぞれ５０％未満である。
【００３４】
【表１】
0004651558.tif 000004
（出典：高菅卓三ら、「各種クリーンアップ法とＨＲＧＣ／ＨＲＭＳを用いたポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢｓ）の全異性体詳細分析方法」，環境化学，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．３，ｐｐ.６４７−６７５，１９９５）
【００３５】
＜＜抗体検出用物質＞＞
前記担体に固定化される前記抗体検出用物質としては、試料中に含まれる被検物質と同種の物質であり、前記免疫学的定量用抗体に対して抗原性を有する物質である限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３６】
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体の抗体検出用物質としては、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を結合可能な物質であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、下記に示すｏ−ジクロロベンゼンをＢＳＡなどのタンパク質にリンカーを介して結合させた物質等が挙げられる。
【００３７】
【化２】
0004651558.tif 000005
【００３８】
前記担体としては、特に制限はなく、種々の形状や材質のものを適宜選択して使用することができ、例えば、綿、麻、ポリエステル、芳香族ポリアミド、ナイロン、及びポリオレフィン等の繊維体からなる膜、ポリメチルメタクリル酸、及びガラス等からなるビーズ、アルギン酸カルシウム粒子等の微細粒子、寒天、ポリアクリルアミド、アガロース等のゲル状物質などが挙げられる。
【００３９】
前記担体への前記抗体検出用物質の固定方法としては、前記抗体検出用物質の抗原性を失わない方法であれば、特に制限はなく、例えば、直接自然吸着法、イオン結合法、共有結合法などを用いて担体に直接結合させる方法、適当な化学物質あるいはタンパク質などのスペーサーを介して間接的に結合させる方法等が挙げられる。
【００４０】
＜＜抗原抗体反応＞＞
前記ＰＣＢの免疫学的定量方法において、試料中に存在すると思われるＰＣＢに対し、ＰＣＢの一の同属体に特異的反応性を示し、かつ他の同属体に対して少なくとも交差反応性を示す抗ＰＣＢモノクローナル抗体を２種以上組み合わせて用い、これら２種以上の抗体を前記試料に同時に導入し、抗原抗体反応を起こさせる。
【００４１】
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体の濃度は、抗原への平衡解離定数に比べて十分に低く、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体自身の抗原結合親和性により抗原との結合が支配されるように添加することが好ましい。このような条件下とすれば、異なる抗原に対する親和性を独立して組み合わせることができ、高感度に検出可能な抗原種を拡大できる。
【００４２】
また、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、標識物質に由来する信号の強度が略同一となる濃度でそれぞれ配合し、試料に導入することが好ましい。例えば、複数の前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体について、前記標識物質に由来する信号強度（又は電圧換算値）と濃度との相関を予め求めておき、同じ信号強度が得られる濃度比で混合して、試料に導入することが好ましい。
【００４３】
＜＜検出＞＞
本発明の免疫学的定量方法は、試料中の抗原と未反応の抗体を、担体に固定された抗体検出用物質で捕捉し、その抗体量を測定することで、間接的に試料中の抗原量を検出する方法であるが、迅速な測定を行うために、前記抗体検出用物質が固定された前記担体を内部に保持してなる検出容器を用いることが好ましい。
具体的には、抗体検出用物質を固定した担体を備え、かつ通液可能な検出容器に、抗ＰＣＢモノクローナル抗体を導入した試料を連続的に供給し、前記担体に固定された前記抗体検出用物質と結合した前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体量を測定することが好ましい。
【００４４】
前記検出容器としては、前記担体を内部に保持し、かつ該担体に固定された前記抗体検出物質と結合した前記標識物質に由来する信号の検出を阻害しないために、透明な材質からなることが好ましく、例えば、ガラス製、プラスチック製であることが好ましい。
前記検出容器は、底部が解放され、導入される試料を通液可能(いわゆるフロー式の検出容器）とすると、前記試料を連続的に導入することができ、検出容器中に検出対象の抗ＰＣＢモノクローナル抗体が蓄積・濃縮され、感度を向上させることができるため好ましい。
また液相と固相の接触時間が極端に短く、液中の数パーセントにあたる抗体をフローにより連続的に捕捉するため、液相中の結合平衡状態を乱すことなく解析が可能であると同時に、連続捕捉が可能なため、液相中の結合が抗体の親和性支配になるまで抗体の結合部位濃度を低下させることができる。
【００４５】
前記標識物質により標識された抗体の前記標識物質に由来する信号強度の測定は、前記抗体検出用物質に捕捉された抗体上の標識に対して光を照射し、例えば、前記標識物質が励起されて発生する蛍光等を検出器により検出する方法、担体の透過光量を測定する方法などにより行われる。
このような測定おいては、まず実際の試料測定に先立ち、ある濃度の抗体を前記抗体検出用物質に結合させた場合の信号強度（ブランク）を測定し、この値を例えば、検出値Ｆ０とする。次に被検物質を含む試料を、ブランク測定時と同濃度の抗体と接触させ、その後、この接触混合物を前記抗体検出用物質に接触させ、該抗体検出用物質に結合した抗体の信号強度を測定し、この値を例えば、検出値Ｆ１とする。
【００４６】
ここで、ＰＣＢの定量においては、前記試料中に被検物質（ＰＣＢ）が存在するならば、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体の一部は前記試料との最初の接触において、試料中のＰＣＢと結合し、この試料中のＰＣＢと結合した抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、続く抗体検出用物質との接触において、該抗体検出用物質と結合できず、反応混合物中に遊離状態で残ることとなるため、その結果が検出値Ｆ１における信号強度の低下となって示される。従って、検出値Ｆ１が検出値Ｆ０に比べ小さい場合(Ｆ１＜Ｆ０)、前記試料中にＰＣＢが存在すると判断でき、さらに、Ｆ１のＦ０に比べた低下の割合が、試料中に含まれるＰＣＢの量と比例することから、既知の濃度のＰＣＢを用いて予め検量線等を作成することにより、Ｆ１の低下の割合に応じて前記試料中に含まれるＰＣＢの定量を行うこともできる。
【００４７】
前記免疫学的定量方法において、信号強度の測定方法としては、上述の方法に限定されるわけではなく、種々の態様を取ることが可能であり、例えば、標識の種類を追加する、検出容器を複数連結するなどして、さらに高度化することができる。
【００４８】
また、前記担体に前記免疫学的定量用抗体を固定し、これを試料と接触させ、試料中のＰＣＢを直接捕捉固定化する態様も、同様に考慮し得るものである。
【００４９】
＜＜試料＞＞
前記試料としては、少なくとも被検物質を含む可能性がある限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、水溶液であることが好ましい。
前記被検物質がＰＣＢであるとき、前記試料としては、例えば、絶縁油、絶縁油以外の油（例えば、植物油、動物油、合成油、鉱物油等）、工場排水、土壌、排ガス、動物の血液や体液、絶縁油の処理作業等において使用した部材等の廃棄物などからＰＣＢを抽出し、転溶してなるものが挙げられる。前記絶縁油としては、脱塩素化処理等のＰＣＢ分解処理を行った後の絶縁油も好適に挙げられる。
【００５０】
（免疫学的定量用キット）
本発明の免疫学的定量用キットとしては、前記免疫学的定量用抗体と、抗体検出用抗原が固定された担体とを少なくとも含み、試料中の被検物質を定量可能である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、標識された二次抗体、緩衝液、検出試薬、及び標準試料（例えば、カネクロール）等を含む。なお、前記免疫学的定量用抗体は、標識されていてもよい。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５２】
（実施例１）
ハイブリドーマＳｚｋ２Ｅ４株（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに平成１７年５月２６日付で、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５４７として寄託されている）を用い、公知の方法により抗ＰＣＢモノクローナル抗体（以下、「Ｓｚｋ２Ｅ４抗体」という）を作製した。
前記Ｓｚｋ２Ｅ４抗体について、ＰＣＢの標準試料として、既知濃度のカネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００）を測定対象として、以下の方法により、ＰＣＢの各同族体に対する親和性及び交差反応性を評価した。結果を図１及び表２に示す。
また、市販の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（ＲＤＩ社製、ＰＣＢ３５、以下「ＲＤＩ抗体」という）についても同様に、ＰＣＢの各同族体に対する親和性及び交差反応性を以下の方法により評価した。結果を図２及び表２に示す。
【００５３】
前記カネクロールはＤＭＳＯを用いて希釈し、２％ＤＭＳＯで測定を行う場合には、前記カネクロールを含むＤＭＳＯ溶液２０μＬと、ＰＢＳ緩衝液４８０μＬとを混合した試料を調製した。前記試料に、前記Ｓｚｋ２Ｅ４抗体溶液５００μＬを加えて１ｍＬとし、これを、アガロースビーズ（ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ；アマシャム  バイオサイエンス社製）に、抗体検出用物質としてｏ−ジクロロベンゼンをタンパク質（ＢＳＡ）にリンカーを介して結合させた物質を固定した担体を備える検出容器に導入し、前記担体上に捕捉された前記Ｓｚｋ２Ｅ４抗体の量を測定した。
【００５４】
前記Ｓｚｋ２Ｅ４抗体の量は、２次抗体（Ｃｙ−５  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｆ（ａｂ’）２  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）で標識された前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体の信号強度を、蛍光光度計（Ｓａｐｉｄｙｎｅ社製、ＫｉｎＥｘＡ  ３０００）を用いて蛍光強度として測定し、前記試料中にＰＣＢを含まない場合（ブランク）における蛍光強度との差を求めた。
【００５５】
上記の蛍光標識以外の標識由来の信号強度を測定することによっても、得られた値から以下の方法により親和性及び交差反応性を求め、定量することができる。
具体的には、前記標識が金コロイドの場合には、前記担体の透過光量を信号強度とし、透過光量測定装置（例えば、柴田科学社製、Ｉｍｎｙ等）を用いて測定することができる。
【００５６】
（ｉ）親和性の測定
得られた前記信号強度の値を下記式（１）で表される近似式に当てはめ、ＩＣ５０値を求めた。
【００５７】
【数１】
0004651558.tif 000006
前記式（１）中、ｙは、試料中に抗原（ＰＣＢ）を加えなかったときの信号強度の値を１００％とした時の相対的な信号強度を表し、ｘは、抗原濃度を表し、Ｐ１とＰ２は、近似のパラメータを表す。
【００５８】
なお、ＩＣ５０値に対して抗体濃度が十分に小さい時（例えば、１０分の１以下の時）、ＩＣ５０値と平衡解離定数（Ｋｄ）とがほぼ一致することが知られているため、親和性の評価として、該平衡解離定数（Ｋｄ）を用いた。前記平衡解離定数（Ｋｄ）の値が小さいほど、親和性が高いことを表す。
【００５９】
（ii）交差反応性
交差反応性は、それぞれ、下記式により算出した。結果を下記表２に示す。
Ｓｋ３Ａ１１の交差反応性（％）＝（ＫＣ３００のＩＣ５０値／試料のＩＣ５０値）
…式（２）
ＲＤＩの交差反応性（％）＝（ＫＣ３００のＩＣ５０値／試料のＩＣ５０値）
…式（３）
【００６０】
【表２】
0004651558.tif 000007
【００６１】
前記Ｓｚｋ２Ｅ４抗体は、塩素数３のＰＣＢに特異的反応性を示し、かつ塩素数が４以上のＰＣＢとの交差反応性が５０％未満であることがわかった。また、前記ＲＤＩ抗体は、塩素数５及び６のＰＣＢに高い特異性を示し、塩素数と親和性との関係において、前記Ｓｚｋ２Ｅ４と反対の傾向を示すことがわかった。
前記Ｓｚｋ２Ｅ４抗体と、前記ＲＤＩ抗体ともに、異なるカネクロールに対する親和性の間に最大で１０倍以上の差があるため、それぞれ単独では、各カネクロールの混合比率が不明である絶縁油にコンタミしたＰＣＢの濃度を正確に測定できないことが分かった。
【００６２】
そこで、前記Ｓｚｋ２Ｅ４抗体と、前記ＲＤＩ抗体とを等モルずつ混合して用い、上記と同様にカネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００）を測定対象として、ＰＣＢの各同族体に対する親和性を評価した。結果を図３に示す。
【００６３】
図３から、ＰＣＢの塩素数の大小に対して、反対の親和性を示す２種の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を混合して試料中のＰＣＢと結合させることにより、単独の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を結合させたときよりも、同族体の組成が異なるＰＣＢ（カネクロール）に対する親和性のばらつきが縮小され、２種の抗ＰＣＢモノクローナル抗体間の親和性の平均値を検量線として、誤差の少ない正確な定量に用いることができることが明らかとなった。
【００６４】
（実施例２）
ハイブリドーマＳｋ３Ａ１１株（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに平成１７年１２月２２日付で、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７４４として寄託されている）を用い、公知の方法により抗ＰＣＢモノクローナル抗体（以下、「Ｓｋ３Ａ１１抗体」という）を作製した。
前記Ｓｋ３Ａ１１抗体について、ＰＣＢの標準試料として、既知濃度のカネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００）を測定対象として、実施例１と同様にしてＰＣＢの各同族体に対する親和性及び交差反応性を評価した。結果を図４及び表３に示す。また、市販の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（ＲＤＩ社製、ＰＣＢ３５、以下「ＲＤＩ抗体」という）についても同様に、ＰＣＢの各同族体に対する親和性及び交差反応性を評価した。結果を図５及び表３に示す。
【００６５】
【表３】
0004651558.tif 000008
【００６６】
図４及び図５、並びに表３の結果から、前記Ｓｋ３Ａ１１抗体は、塩素数３のＰＣＢに特異的反応性を示し、かつ塩素数が４以上のＰＣＢとの交差反応性が５０％未満である抗ＰＣＢモノクローナル抗体であることがわかった。
また、前記塩素数３のＰＣＢに対する親和性をＡ、塩素数４のＰＣＢに対する親和性をＢ、塩素数５のＰＣＢに対する親和性をＣ、及び塩素数６のＰＣＢに対する親和性をＤとしたとき、前記Ａ＜Ｂ＜Ｃ＜Ｄの関係を満たす抗ＰＣＢモノクローナル抗体をＲＤＩ抗体と、Ｄ＜Ｃ＜Ｂ＜Ａの関係を満たす抗ＰＣＢモノクローナル抗体をＳｋ３Ａ１１抗体として、これらを図１０から求められる標識物質に由来する信号の強度が略同一となる濃度で混合してＰＣＢの免疫学的定量方法に用い、試料中のＰＣＢ（カネクロール）の定量を行った。
【００６７】
なお、図１０の信号強度は、前記試料中に、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体に結合する物質が存在しない条件下において略同一となることを表し、混合する濃度は、Ｓｋ３Ａ１１抗体（図１０中「▲」で表す）とＲＤＩ抗体（図１０中「●」で表す）とを、（Ｓｋ３Ａ１１抗体）：（ＲＤＩ抗体）＝２．３：１の比率とすればよいことを表す。図１０中、「◆」は、その比率で混合した抗体の総濃度と信号値の関係を示す。
【００６８】
図６に示す前記Ｓｋ３Ａ１１抗体のシグナル曲線と、図７に示す前記ＲＤＩ抗体のシグナル曲線とから、これらの抗体を混ぜてカネクロールと反応させた時のシグナル曲線を計算した結果を図８に示す。なお、図６は、Ｓｋ３Ａ１１抗体の各カネクロールに対する結合曲線から求めたカネクロール混合液に対するシグナル曲線の計算値であり、図７は、ＲＤＩ抗体の各カネクロールに対する結合曲線から求めたカネクロール混合液に対するシグナル曲線の計算値である。
それぞれの抗体で個別に測定するよりも各カネクロール間の曲線の差が小さくなり、抗体を混合することによって、成分構成が不明であるＰＣＢの測定を少ない誤差で測定できると考えられる。
前記Ｓｋ３Ａ１１抗体と前記ＲＤＩ抗体とを用いた定量結果について、図８に示した計算結果と、実測値とをあわせて、図９に示す。
【００６９】
図９の結果から、実験値と理論値との間に、若干の差は見られるが、前記Ｓｋ３Ａ１１抗体と前記ＲＤＩ抗体との混合比率を、同じ信号値が得られるように調整し、試料中のＰＣＢの定量に用いることによって、試料中のＰＣＢが未知の組成からなる場合でも、極めて少ない誤差で、定量することができることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明の免疫学的定量方法は、多数の異性体や同族体を含む被検物質の定量に好適であり、１０個の同族体からなるＰＣＢの定量方法として特に好適である。本発明のＰＣＢの免疫学的定量方法は、未知の組成のＰＣＢを、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法を用い、簡便に、かつ最小限の誤差で高感度に定量することができるため、廃棄物処理後のＰＣＢ残留濃度、環境中のＰＣＢ濃度等の検査に好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、実施例１で測定した抗ＰＣＢモノクローナル抗体（Ｓｚｋ２Ｅ４抗体）の各カネクロールに対する結合曲線であり、「■」はＫＣ−３００に対する結合曲線、「●」はＫＣ−４００に対する結合曲線、「▲」はＫＣ−５００に対する結合曲線を表し、実線はこれらの平均値を表す。
【図２】図２は、実施例１で測定した抗ＰＣＢモノクローナル抗体（ＲＤＩ抗体）の各カネクロールに対する結合曲線であり、「■」はＫＣ−３００に対する結合曲線、「●」はＫＣ−４００に対する結合曲線、「▲」はＫＣ−５００に対する結合曲線を表し、実線はこれらの平均値を表す。
【図３】図３は、実施例１で測定したＳｚｋ２Ｅ４抗体とＲＤＩ抗体とを等モル混合したときの各カネクロールに対する結合曲線であり、「■」はＫＣ−３００に対する結合曲線、「●」はＫＣ−４００に対する結合曲線、「▲」はＫＣ−５００に対する結合曲線を表し、実線はこれらの平均値を表す。
【図４】図４は、実施例２で測定した抗ＰＣＢモノクローナル抗体（Ｓｋ３Ａ１１抗体）の各カネクロールに対する結合曲線であり、「●」はＫＣ−３００に対する結合曲線、「◆」はＫＣ−４００に対する結合曲線、「▲」はＫＣ−５００に対する結合曲線、「■」はＫＣ−６００に対する結合曲線を表す。
【図５】図５は、実施例２で測定した抗ＰＣＢモノクローナル抗体（ＲＤＩ抗体）の各カネクロールに対する結合曲線であり、「●」はＫＣ−３００に対する結合曲線、「■」はＫＣ−４００に対する結合曲線、「▲」はＫＣ−５００に対する結合曲線、「▼」はＫＣ−６００に対する結合曲線を表す。
【図６】図６は、実施例２で測定した抗ＰＣＢモノクローナル抗体（Ｓｋ３Ａ１１抗体）の各カネクロールに対する結合曲線から求めたカネクロール混合液に対するシグナル曲線の計算値を表すグラフである。
【図７】図７は、実施例２で測定した抗ＰＣＢモノクローナル抗体（ＲＤＩ抗体）の各カネクロールに対する結合曲線から求めたカネクロール混合液に対するシグナル曲線の計算値を表すグラフである。
【図８】図８は、図６のＳｋ３Ａ１１抗体のシグナル曲線と、図７のＲＤＩ抗体のシグナル曲線とから求めた、Ｓｋ３Ａ１１抗体とＲＤＩ抗体とを混合して用いた場合の計算値を示すグラフである。
【図９】図９は、図８の計算値に対する実測値を示すグラフである。
【図１０】図１０は、標識物質に由来する信号の強度が略同一となる濃度を求めるグラフの一例であり、３塩素抗体（Ｓｋ３Ａ１１）「▲」、６塩素抗体（ＲＤＩ）「●」、免疫学的定量用抗体（混合した抗体の合計）「◆」の総濃度と信号値との関係を示すグラフである。
【図１】
0004651558.tif 000009
【図２】
0004651558.tif 000010
【図３】
0004651558.tif 000011
【図４】
0004651558.tif 000012
【図５】
0004651558.tif 000013
【図６】
0004651558.tif 000014
【図７】
0004651558.tif 000015
【図８】
0004651558.tif 000016
【図９】
0004651558.tif 000017
【図１０】
0004651558.tif 000018