(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェノール酸化酵素系及び次式：
【化１】
0004727818.tif 000031
〔式中、Ａ及びＢは互いに独立して、
【化２】
0004727818.tif 000032
であるか、又はＢはＨもしくはＣ1-16−アルキル（ここで該アルキルは、ヒドロキシ、エステル又はエーテル基を含んでよい）であり、ここでＲ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６は、互いに独立して、Ｈ，ＯＨ，ＮＨ2 ，ＣＯＯＨ，ＳＯ3 Ｈ，Ｃ1-12−アルキル、アシル、ＮＯ2 ，ＣＮ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，ＣＦ3 ，ＮＯＨ−ＣＯ−フェニル、ＣＯ−ＮＯＨ−フェニル、ＣＯＲ１２、ＯＲ７，ＮＲ８Ｒ９，ＣＯＯＲ１０、又はＮＯＨ−ＣＯ−Ｒ１１であり、ここでＲ７，Ｒ８，Ｒ９，Ｒ１０，Ｒ１１及びＲ１２はＣ1-12−アルキル又はアシルである〕
の増強剤を含む酵素的抗微生物組成物であって、前記フェノール酸化酵素系がペルオキシダーゼ及び過酸化水素源である、酵素的抗微生物組成物。
【請求項２】
前記増強剤のＡ及びＢが、互いに独立して、
【化３】
0004727818.tif 000033
であるか、又はＢがＨもしくはＣ1-3 −アルキル（ここで、該アルキルは、ヒドロキシ、エステル又はエーテル基を含んでよい）であり、ここでＲ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６は互いに独立して、Ｈ，ＯＨ，ＮＨ2 ，ＣＯＯＨ，ＳＯ3 Ｈ，Ｃ1-3 −アルキル、アシル、ＮＯ2 ，ＣＮ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，ＣＦ3 ，ＮＯＨ−ＣＯ−フェニル、ＣＯ−ＮＯＨ−フェニル、ＣＯＲ１２，ＯＲ７，ＮＲ８Ｒ９，ＣＯＯＲ１０、又はＮＯＨ−ＣＯ−Ｒ１１であり、ここでＲ７，Ｒ８及びＲ９はＣ1-3 −アルキル又はアシルであり、Ｒ１０，Ｒ１１及びＲ１２はＣ1-3 −アルキルである請求項１に記載の酵素的抗微生物組成物。
【請求項３】
前記増強剤のＡ及びＢが、互いに独立して、
【化４】
0004727818.tif 000034
であるか、又はＢがＨもしくはＣ1-3 −アルキル（ここで、該アルキルは、ヒドロキシ又はエーテル基を含んでよい）であり、ここで、Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６は、互いに独立して、Ｈ，ＯＨ，ＮＨ2 ，ＣＯＯＨ，ＳＯ3 Ｈ，ＣＨ3 、アシル、ＮＯ2 ，ＣＮ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，ＣＦ3 ，ＣＯ−ＮＯＨ−フェニル、ＣＯＣＨ3 ，ＯＲ７，ＮＲ８Ｒ９、又はＣＯＯＣＨ3 であり、ここでＲ７，Ｒ８及びＲ９はＣＨ3 又はＣＯＣＨ3 である請求項１に記載の酵素的抗微生物組成物。
【請求項４】
前記増強剤のＡ及びＢが、互いに独立して、
【化５】
0004727818.tif 000035
であるか、又はＢがＨもしくはＣ1-3 −アルキル（ここで該アルキルは、ヒドロキシ又はエーテル基を含んでもよい）であり、ここでＲ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６は互いに独立して、Ｈ，ＯＨ，ＣＯＯＨ，ＳＯ3 Ｈ，ＣＨ3 、アシル、ＮＯ2 ，ＣＮ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，ＣＯ−ＮＯＨ−フェニル、ＯＣＨ3 ，ＣＯＣＨ3 、又はＣＯＯＣＨ3 である請求項１に記載の酵素的抗微生物組成物。
【請求項５】
前記増強剤のＡ及びＢが、互いに独立して、
【化６】
0004727818.tif 000036
であるか、又はＢがＣ1-3 −アルキル（ここで、該アルキルは、エーテル基を含んでもよい）であり、ここでＲ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６は互いに独立して、Ｈ，ＯＨ，ＣＯＯＨ，ＳＯ3 Ｈ，ＣＨ3 ，ＮＯ2 ，ＣＮ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＣＯ−ＮＯＨ−フェニル、又はＯＣＨ3 である請求項１に記載の酵素的抗微生物組成物。
【請求項６】
前記増強剤が、
４−ニトロ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシアニリド；
４−メトキシ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシアニリド；
Ｎ，Ｎ′−ジヒドロキシ−Ｎ，Ｎ′−ジフェニルテレフタルアミド；
デカン酸−Ｎ−ヒドロキシアニリド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−シアノアセトアニリド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−アセチルアセトアニリド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−ヒドロキシアセトアニリド；
Ｎ−ヒドロキシ−３−（Ｎ′−ヒドロキシアセトアミド）アセトアニリド；
４−シアノ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシアニリド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−ニトロアセトアニリド；
Ｎ−ヒドロキシアセトアニリド；
Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−フェニル−カルバミン酸イソプロピルエステル；
Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−フェニル−カルバミン酸メチルエステル；
Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−フェニル−カルバミン酸フェニルエステル；
Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−フェニル−カルバミン酸エチルエステル；及び
Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−（４−シアノフェニル）−カルバミン酸メチルエステル
からなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ペルオキシダーゼが、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ダイズペルオキシダーゼ又はコプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、もしくはマイキソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）由来のペルオキシダーゼである請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ペルオキシダーゼが、コプリヌス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）又はコプリヌス・マクロリズス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｍａｃｒｏｒｈｉｚｕｓ）由来である請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記過酸化水素源が過酸化水素又は過酸化水素前駆体である請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記フェノール酸化酵素系が、酸素を伴うラッカーゼ又はラッカーゼ関連酵素である請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記ラッカーゼが微生物ラッカーゼである請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ラッカーゼが、コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ポリポルス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）、ピクノポルス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）、シタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）又はリゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）から得られる請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ラッカーゼが、コプリヌス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ポリポルス・ピンシトウス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）、ピクノポルス・シンナバリヌス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）、シタリジウム・サーモフィルム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）又はリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）から得られる請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が水性組成物である請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
前記フェノール酸化酵素の濃度がリッター当り０．００１〜１０mgの酵素タンパク質の範囲内にある請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記増強剤の濃度が１〜１０００μＭに相当する請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が粒状である請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
微生物細胞を殺し又は阻害するための方法であって、前記微生物を請求項１〜１７のいずれかに記載の組成物で処理することを含む方法。
【請求項１９】
界面活性剤と、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物と、を含む洗剤組成物。
【請求項２０】
洗濯場に存在する微生物を阻害する方法であって、該洗濯場を、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物を含む浸漬、洗浄又はゆすぎ液で処理することを含む方法。
【請求項２１】
化粧用品を保護する方法であって、有効量の請求項１〜６のいずれかに記載の組成物を化粧用品に組み込むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記化粧用品が、口内洗浄組成物、化粧用液、ゲルもしくはペースト、点眼液、制汗剤、脱臭剤、鼻噴霧剤、眼軟膏、軟膏もしくはクリーム、又は足浴塩である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
コンタクトレンズの洗浄又は消毒のための請求項１〜６のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項２４】
硬質表面上の微生物増殖を洗浄、消毒又は阻害する方法であって、該表面を請求項１〜６のいずれかに記載の組成物に接触させることを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記硬質表面が、プロセス設備、冷却塔の構成要素、水処理施設、乳製品施設、食品処理プラント、化学又は医薬プロセスプラントである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記硬質表面が、水衛生装置の表面である請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記硬質表面が、製紙用パルププロセッシングのための装置の表面である請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
クリーニング・イン・プレイスシステムにおける請求項１〜６のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項２９】
水システムの消毒のための請求項１〜６のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項３０】
製紙用パルププロセッシングにおける水システムの消毒のための請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
保護用ペイントのための請求項１〜６のいずれかに記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、例えば洗濯場において、硬質表面上に、水システム内に、皮膚上に、歯上に、又は粘膜上に存在する微生物細胞又は微生物を殺し又は阻害することができる酵素組成物に関する。本発明は、食品、化粧品、ペイント、コーティング等を保護するための前記酵素組成物の使用にも関する。
【０００２】
発明の背景
種々の酵素的抗微生物組成物が当業界で知られている。例えば、ＷＯ９４／０４１２７は、抗微生物に有効な濃度のハイポチオシアナイトイオンを生産することができる安定化歯磨剤組成物を開示する。その組成物は、過酸化水素を生産することができるオキシドレダクターゼ及び唾液中に通常、存在するチオシアネートを抗微生物ハイポチオシアナイトイオンに酸化することができるペルオキシダーゼ酵素を含む。
【０００３】
ＥＰ−Ａ−０  ５００  ３８７には、ペルオキシド及びハライドの存在下で標的微生物に選択的に結合しその増殖を阻害する、ハロペルオキシダーゼ、例えばミエローペルオキシダーゼ、好酸球オキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ及びクロロペルオキシダーゼを含む酵素的抗微生物組成物が開示される。
ＷＯ９５／２７０４６は、バナジウムクロロペルオキシダーゼ、ハロゲン化物イオン、及び過酸化水素又は過酸化水素生成剤を含む抗微生物組成物を開示する。
【０００４】
ＷＯ９６／３８５４８は、ハロペルオキシダーゼ、ハロゲン化物イオン、ペルオキシド生成剤及びアミノ酸を含む抗微生物組成物を開示する。
ＷＯ９７／４２８２５は、ペルオキシダーゼ、過酸化水素源及びフェノチアジン型又はアセトシリンゲート型の増強剤を含む抗微生物組成物を開示する。
本発明の目的は、微生物細胞を殺し又は阻害するための組成物を供することである。
【０００５】
発明の概要
本発明によれば、フェノール酸化酵素系及び−ＣＯ−ＮＯＨ−基を含む増強剤を含む抗微生物組成物が微生物細胞を殺し又は阻害するために極めて有効であることが見い出された。
これにより、これらの発見に基づいて、本発明は、第１の態様として、以下のものを供する。
【０００６】
フェノール酸化酵素系及び次式：
【０００７】
【化７】
0004727818.tif 000002
【０００８】
〔式中、Ａ及びＢは互いに独立して、
【０００９】
【化８】
0004727818.tif 000003
【００１０】
であるか、又はＢはＨもしくはＣ1-16−アルキル（ここで該アルキルは、ヒドロキシ、エーテル又はエステル基を含んでよい）であり、ここでＲ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６は、互いに独立して、Ｈ，ＯＨ，ＮＨ2 ，ＣＯＯＨ，ＳＯ3 Ｈ，Ｃ1-12−アルキル、アシル、ＮＯ2 ，ＣＮ，Ｃｌ，ＣＦ3 ，ＮＯＨ−ＣＯ−フェニル、ＣＯ−ＮＯＨ−フェニル、Ｃ1-6 −ＣＯ−ＮＯＨ−Ａ，ＣＯ−ＮＯＨ−Ａ，ＣＯＲ１２、フェニル−ＣＯ−ＮＯＨ−Ａ，ＯＲ７，ＮＲ８Ｒ９，ＣＯＯＲ１０、又はＮＯＨ−ＣＯ−Ｒ１１であり、ここでＲ７，Ｒ８，Ｒ９，Ｒ１０，Ｒ１１及びＲ１２はＣ1-12−アルキル又はアシルである〕
の増強剤を含む酵素的抗微生物組成物。
【００１１】
更なる態様において、本発明は、例えば洗濯場において、化粧品において、又は硬質表面上で微生物細胞を殺し又は阻害するための方法に関する。
なお更なる態様において、本発明は、コンタクトレンズを洗浄するため、水システムを洗浄するため、ペイントを保護するため、及びクリーニング・イン・プレイスシステムにおける酵素的抗微生物組成物の使用に関する。
【００１２】
発明の詳細な記載
本発明の文脈において、用語“抗微生物”は、その中に、殺細菌、静細菌、殺真菌、静真菌、殺ウィルス及び／又は殺胞子効果が存在することを意味することを意図する。
用語“殺細菌”は、細菌細胞を殺すことができることとして理解されるべきである。
【００１３】
殺細菌活性は、生きている細胞の数における対数削減（１０ｇ削減）又はmL当りのコロニー形成単位（ CFU／mL）として測定される。例えば、１１０ｇ削減は、Ｙ×１０xCFU／Ｍ（ CFU：コロニー形成単位；Ｍ：mL又はｇ）からＹ×１０x-1CFU／Ｍ（式中、ｘは１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１であり得、Ｙは０〜１０のいずれかの数であり得る）への大腸菌ＤＳＭ１５７６又はエンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ＤＳＭ２５７０の生きている細胞の数の減少に対応する。生きている細胞の数は、３０℃でＴｒｙｐｔｏｎｅ  Ｓｏｐａ  Ａｇａｒ（＃ＣＭ）２９，Ｏｘｏｉｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）プレート上で増殖することができる大腸菌又はＥ．ファエカリスの数として決定されるべきである。
【００１４】
用語“静細菌”は、細菌増殖を阻害する。即ち増殖細菌細胞を抑制することができるものとして理解されるべきである。
用語“殺真菌”は、真菌細胞を殺すことができるものとして理解されるべきである。
用語“静真菌”は、真菌増殖を阻害する、即ち増殖真菌細胞を抑制することができるものとして理解されるべきである。
【００１５】
用語“殺ウィルス”は、ウィルスを不活性化することができるものとして理解されるべきである。
用語“殺胞子”は、胞子を活性化することができるものとして理解されるべきである。
用語“微生物細胞”とは、細菌又は真菌細胞をいい、用語“微生物”とは、（イーストを含む）真菌又は細菌をいう。
【００１６】
本発明の文脈において、用語“微生物細胞の増殖を阻害”は、細胞が非増殖状態にあること、即ちそれらが繁殖することができないことを意味することを意図する。
“フェノール酸化酵素系”は、過酸化水素源を伴うペルオキシダーゼ活性を有する酵素、又は酸素を伴うラッカーゼもしくはラッカーゼ関連酵素を記述する。
【００１７】
本明細書に用いる用語“硬質表面”は、微生物について本質的に非透過性であるいずれの表面にも関する。硬質表面の例は、例えばペイント、エナメル等で任意にコートされ得る、金属、例えばステンレススチール、プラスチック、ゴム、ボード、ガラス、木、紙、織物、コンクリート、岩、大理石、ギプス及びセラミック材料から作られた表面である。硬質表面は、プロセス装置、例えば冷却塔、浸透膜、水処理プラント、乳製品工場、食品処理プラント、化学又は医薬プロセスプラントであってもよい。従って、本発明による組成物は、慣用的なクリーニング・イン・プレイス（Ｃ−Ｉ−Ｐ）（現場洗浄）システムに役立つ。
【００１８】
増強剤
本発明は、次式：
【００１９】
【化９】
0004727818.tif 000004
【００２０】
〔式中、Ａ及びＢは互いに独立して、
【００２１】
【化１０】
0004727818.tif 000005
【００２２】
であるか、又はＢはＨもしくはＣ1-16−アルキルであり、ここで該アルキルは、ヒドロキシ、エステル又はエーテル基を含んでもよく（例えば、そのエーテル酸素はＡ−Ｎ（ＯＨ）Ｃ＝Ｏ−に直接、結合させて、これによりＮ−ヒドロキシカルバミン酸エステル誘導体を含む）、Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６は、互いに独立して、Ｈ，ＯＨ，ＮＨ2 ，ＣＯＯＨ，ＳＯ3 Ｈ，Ｃ1-12−アルキル、アシル、ＮＯ2 ，ＣＮ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，ＣＦ3 ，ＮＯＨ−ＣＯ−フェニル、ＣＯ−ＮＯＨ−フェニル、Ｃ1-6 −ＣＯ−ＮＯＨ−Ａ，ＣＯ−ＮＯＨ−Ａ，ＣＯＲ１２、フェニル−ＣＯ−ＮＯＨ−Ａ，ＯＲ７，ＮＲ８Ｒ９，ＣＯＯＲ１０、又はＮＯＨ−ＣＯ−Ｒ１１であり、ここでＲ７，Ｒ８，Ｒ９，Ｒ１０，Ｒ１１及びＲ１２はＣ1-12−アルキル又はアシルである〕
の−ＣＯ−ＮＯＨ−基を含む増強剤に関する。
【００２３】
ＡのＲ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６は、好ましくは、Ｈ，ＯＨ，ＮＨ2 ，ＣＯＯＨ，ＳＯ3 Ｈ，Ｃ1-3 −アルキル、アシル、ＮＯ2 ，ＣＮ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，ＣＦ3 ，ＮＯＨ−ＣＯ−フェニル、ＣＯ−ＮＯＨ−フェニル、ＣＯＲ１２，ＯＲ７，ＮＲ８Ｒ９，ＣＯＯＲ１０、又はＮＯＨ−ＣＯ−Ｒ１１であり、ここでＲ７，Ｒ８及びＲ９はＣ1-3 −アルキル又はアシルであり、Ｒ１０，Ｒ１１及びＲ１２はＣ1-3 −アルキルであり；より好ましくはＡのＲ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６はＨ，ＯＨ，ＮＨ2 ，ＣＯＯＨ，ＳＯ3 Ｈ，ＣＨ3 、アシル、ＮＯ2 ，ＣＮ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，ＣＦ3 ，ＣＯ−ＮＯＨ−フェニル、ＣＯＣＨ3 ，ＯＲ７，ＮＲ８Ｒ９、又はＣＯＯＣＨ3 であり、ここでＲ７，Ｒ８及びＲ９はＣＨ3 又はＣＯＣＨ3 であり；更により好ましくはＡのＲ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６はＨ，ＯＨ，ＣＯＯＨ，ＳＯ3 Ｈ，ＣＨ3 、アシル、ＮＯ2 ，ＣＮ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，ＣＯ−ＮＯＨ−フェニル、ＯＣＨ3 ，ＣＯＣＨ3 、又はＣＯＯＣＨ3 であり；そして特にＡのＲ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６はＨ，ＯＨ，ＣＯＯＨ，ＳＯ3 Ｈ，ＣＨ3 ，ＮＯ2 ，ＣＮ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＣＯ−ＮＯＨ−フェニル、又はＯＣＨ3 である。
【００２４】
ＢのＲ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６は、好ましくは、Ｈ，ＯＨ，ＮＨ2 ，ＣＯＯＨ，ＳＯ3 Ｈ，Ｃ1-3 −アルキル、アシル、ＮＯ2 ，ＣＮ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，ＣＦ3 ，ＮＯＨ−ＣＯ−フェニル、ＣＯ−ＮＯＨ−フェニル、ＣＯＲ１２，ＯＲ７，ＮＲ８Ｒ９，ＣＯＯＲ１０、又はＮＯＨ−ＣＯ−Ｒ１１であり、ここで、Ｒ７，Ｒ８及びＲ９はＣ1-3 −アルキル又はアシルであり、Ｒ１０，Ｒ１１及びＲ１２はＣ1-3 −アルキルであり；より好ましくは、ＢのＲ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６はＨ，ＯＨ，ＮＨ2 ，ＣＯＯＨ，ＳＯ3 Ｈ，ＣＨ3 、アシル、ＮＯ2 ，ＣＮ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，ＣＦ3 ，ＣＯ−ＮＯＨ−フェニル、ＣＯＣＨ3 ，ＯＲ７，ＮＲ８Ｒ９、又はＣＯＯＣＨ3 であり、ここでＲ７，Ｒ８及びＲ９はＣＨ3 又はＣＯＣＨ3 であり；更により好ましくはＢのＲ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６はＨ，ＯＨ，ＣＯＯＨ，ＳＯ3 Ｈ，ＣＨ3 、アシル、ＮＯ2 ，ＣＮ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，ＣＯ−ＮＯＨ−フェニル、ＯＣＨ3 ，ＣＯＣＨ3 、又はＣＯＯＣＨ3 であり；そして特にＢのＲ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６はＨ，ＯＨ，ＣＯＯＨ，ＳＯ3 Ｈ，ＣＨ3 ，ＮＯ2 ，ＣＮ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＣＯ−ＮＯＨ−フェニル、又はＯＣＨ3 である。
【００２５】
Ｂは、好ましくは、Ｈ又はＣ1-3 −アルキルであり、ここで該アルキルはヒドロキシ、エステル又はエーテル基を含み得；好ましくはアルキルはエステル又はエーテル基を含み得；より好ましくはアルキルはエーテル基を含み得る。
一実施形態において、Ａ及びＢは、互いに独立して、
【００２６】
【化１１】
0004727818.tif 000006
【００２７】
であるか、又はＢはＨ又はＣ1-3 −アルキルであり、ここで該アルキルは、ヒドロキシ、エステル又はエーテル基を含み得（例えばそのエーテル酸素はＡ−Ｎ（ＯＨ）Ｃ＝Ｏ−に直接、結合させて、これによりＮ−ヒドロキシカルバミン酸エステル誘導体を含む）、Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６は互いに独立して、Ｈ，ＯＨ，ＮＨ2 ，ＣＯＯＨ，ＳＯ3 Ｈ，Ｃ1-3 −アルキル、アシル、ＮＯ2 ，ＣＮ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，ＣＦ3 ，ＮＯＨ−ＣＯ−フェニル、ＣＯ−ＮＯＨ−フェニル、ＣＯＲ１２，ＯＲ７，ＮＲ８Ｒ９，ＣＯＯＲ１０、又はＮＯＨ−ＣＯ−Ｒ１１であり、ここでＲ７，Ｒ８及びＲ９はＣ1-3 −アルキル又はアシルであり、そしてＲ１０，Ｒ１１及びＲ１２はＣ1-3 −アルキルである。
【００２８】
別の実施形態において、Ａ及びＢは、互いに独立して、
【００２９】
【化１２】
0004727818.tif 000007
【００３０】
であるか、又はＢはＨ又はＣ1-3 −アルキルであり、ここで該アルキルは、ヒドロキシ又はエーテル基を含み得（例えばそのエーテル酸素はＡ−Ｎ（ＯＨ）Ｃ＝Ｏ−に直接、結合させて、これによりＮ−ヒドロキシカルバミン酸エステル誘導体を含む）、Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６は互いに独立して、Ｈ，ＯＨ，ＮＨ2 ，ＣＯＯＨ，ＳＯ3 Ｈ，ＣＨ3 、アシル、ＮＯ2 ，ＣＮ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，ＣＦ3 ，ＣＯ−ＮＯＨ−フェニル、ＣＯＣＨ3 ，ＯＲ７，ＮＲ８Ｒ９、又はＣＯＯＣＨ3 であり、ここでＲ７，Ｒ８及びＲ９はＣＨ3 又はＣＯＣＨ3 である。
【００３１】
別の実施形態において、Ａ及びＢは、互いに独立して、
【００３２】
【化１３】
0004727818.tif 000008
【００３３】
であるか、又はＢはＨ又はＣ1-3 −アルキルであり、ここで該アルキルは、ヒドロキシ又はエーテル基を含み得（例えばそのエーテル酸素はＡ−Ｎ（ＯＨ）Ｃ＝Ｏ−に直接、結合させて、これによりＮ−ヒドロキシカルバミン酸エステル誘導体を含む）、Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６は互いに独立して、Ｈ，ＯＨ，ＣＯＯＨ，ＳＯ3 Ｈ，ＣＨ3 、アシル、ＮＯ2 ，ＣＮ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，ＣＯ−ＮＯＨ−フェニル、ＯＣＨ3 ，ＣＯＣＨ3 、又はＣＯＯＣＨ3 である。
【００３４】
別の実施形態において、Ａ及びＢは、互いに独立して、
【００３５】
【化１４】
0004727818.tif 000009
【００３６】
であるか、又はＢはＣ1-3 −アルキルであり、ここで該アルキルは、エーテル基を含み得（例えばそのエーテル酸素はＡ−Ｎ（ＯＨ）Ｃ＝Ｏ−に直接、結合させて、これによりＮ−ヒドロキシカルバミン酸エステル誘導体を含む）、Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６は互いに独立してＨ，ＯＨ，ＣＯＯＨ，ＳＯ3 Ｈ，ＣＨ3 ，ＮＯ2 ，ＣＮ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＣＯ−ＮＯＨ−フェニル、又はＯＣＨ3 である。
【００３７】
本明細書に用いるｎが２〜１６であり得る用語“Ｃ1-n −アルキル”は、１〜特定数の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルキル基を示す。典型的なＣ1-6 −アルキル基は、これらに限らないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、イソヘキシル等を含む。
【００３８】
本明細書に用いる用語“アシル”は、カルボニル基を介して結合したＣ1-6 −アルキル基を含む一価置換基をいい；例えばアセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ピバロイル、バレリル等をいう。
一実施形態において、Ａの置換基Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６のうちの少くとも１つはＨであり、好ましくはＡの置換基Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６のうちの少くとも２つはＨであり、より好ましくはＡの置換基Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６のうちの少くとも３つはＨであり、最も好ましくはＡの置換基Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６はＨであり、特にＡのＲ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６は全てＨである。
【００３９】
別の実施形態において、Ｂの置換基Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６のうちの少くとも１つはＨであり、好ましくはＢの置換基Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６のうちの少くとも２つはＨであり、より好ましくはＢの置換基Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６のうちの少くとも３つはＨであり、最も好ましくはＢの置換基Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６のうちの少くとも４つはＨであり、特にＢのＲ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６は全てＨである。
【００４０】
本発明による特定の実施形態において、増強剤は、
４−ニトロ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシアニリド；
４−メトキシ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシアニリド；
Ｎ，Ｎ′−ジヒドロキシ−Ｎ，Ｎ′−ジフェニルテレフタルアミド；
デカン酸−Ｎ−ヒドロキシアニリド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−シアノアセトアニリド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−アセチルアセトアニリド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−ヒドロキシアセトアニリド；
Ｎ−ヒドロキシ−３−（Ｎ′−ヒドロキシアセトアミド）アセトアニリド；
４−シアノ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシアニリド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−ニトロアセトアニリド；
Ｎ−ヒドロキシアセトアニリド；
Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−フェニル−カルバミン酸イソプロピルエステル；
Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−フェニル−カルバミン酸メチルエステル；
Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−フェニル−カルバミン酸フェニルエステル；
Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−フェニル−カルバミン酸エチルエステル；及び
Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−（４−シアノフェニル）−カルバミン酸メチルエステルからなる群から選択される。
【００４１】
本発明の増強剤は、１〜１０００μＭ、好ましくは５〜５００μＭ、より好ましくは１０〜２００μＭの濃度で存在し得る。
増強剤の調製
本願に記載される増強剤は、当業者に公知の方法を用いて調製することができ；それら増強剤のいくつかは市販もされている。
【００４２】
用いる化合物は、Ｎ−ヒドロキシアセトアニリドについて記載される一般的手順（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  ６７，１９８９，ｐ．１８７〜１９２）次に標準的精製手順に従って調製した。
過酸化水素／酸素
フェノール酸化酵素が過酸化水素のソースを要求する場合、そのソースは、過酸化水素又は過酸化水素のイン・シトウ生産のための過酸化水素前駆体、例えばペルカーボネートもしくはペルボレート、又は過酸化水素生成酵素系（例えばオキシダーゼのための基質を伴うオキシダーゼ、例えば好適なアミノ酸を伴うアミン酸オキシダーゼ）、又はペルオキシカルボン酸又はその塩であり得る。過酸化水素は、その過程の始めに又はその間に加えることができ、典型的には、０．００１〜２５mMのレベル、好ましくは０．００５〜５mMのレベル、特に０．０１〜１mMのレベルに相当する量で加えることができる。
【００４３】
フェノール酸化酵素が酸素分子を要求する場合、その雰囲気からの酸素分子は、通常、十分な量で存在するであろう。より多くのＯ2 が必要とされるなら、更なる酸素を加えることができる。
フェノール酸化酵素
本発明の文脈において、フェノール酸化酵素の酵素は、ペルオキシダーゼ活性を有する酵素又はラッカーゼもしくはラッカーゼ関連酵素であり得る。
【００４４】
本発明の酵素は、典型的には、水溶液１リッター当り１〜１００００μｇの酵素タンパク質、好ましくは水溶液１リッター当り５〜２０００μｇの酵素タンパク質、より好ましくは水溶液１リッター当り５〜１０００μｇの酵素タンパク質、そして最も好ましくは水溶液１リッター当り１〜５００μｇの酵素タンパク質の濃度で存在し得る。
【００４５】
ペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ活性を有する化合物
ペルオキシダーゼ活性を有する化合物は、酵素分類（ＥＣ  １．１１．１．７）に含まれるいずれのペルオキシダーゼ酵素であっても、又はペルオキシダーゼ活性を示すいずれのそれから得られるフラグメントであってもよい。
好ましくは、本発明によるペルオキシダーゼは、植物（例えばセイヨウワサビ又はダイズペルオキシダーゼ）又は微生物、例えば真菌もしくは細菌により生産され得る。
【００４６】
いくつかの好ましい真菌には、亜門Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ、綱Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓに属する株、例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ，Ｈｕｍｉｃｏｌａ，Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ，Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ，Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ，Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ，Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ，Ｅｍｂｅｌｌｉｓｉａ，Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ又はＤｒｅｓｃｈｌｅｒａ、特にＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ（ＤＳＭ  ２６７２），Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｓｉｉ，Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ（ＩＦＯ  ６１１３），Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ  ａｌｂｏａｔｒｕｍ，Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ  ｄａｈｌｉｅ，Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｒａｍｏｓｕｓ（ＦＥＲＭ  Ｐ−７７５４），Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｍａｇｏ，Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ，Ｅｍｂｅｌｌｉｓｉａ  ａｌｌｉ又はＤｒｅｓｃｈｌｅｒａ  ｈａｌｏｄｅｓがある。
【００４７】
他の好ましい真菌には、亜門Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔｉｎａ、綱Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓに属する株、例えば、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ，Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ，Ｃｏｒｉｏｌｕｓ又はＴｒａｍｅｔｅｓ、特にＣｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ  ｆ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ（ＩＦＯ  ８３７１），Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｍａｃｒｏｒｈｉｚｕｓ，Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ（例えば、ＮＡ−１２）又はＴｒａｍｅｔｅｓ（ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｃａｌｌｅｄ  Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）、例えばＴ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（例えば、ＰＲ４  ２８−Ａ）がある。
【００４８】
更に好ましい真菌には、亜門Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔｉｎａ、綱Ｍｙｃｏｒａｃｅａｅに属する株、例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ又はＭｕｃｏｒ、特にＭｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓがある。
いくつかの好ましい細菌には、目Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓの株、例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ（ＡＴＴＣ  ２３９６５），Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ（ＩＦＯ  １２３８２）又はＳｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｓｐ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍがある。
【００４９】
他の好ましい細菌には、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ，Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｒｒｏｃｉｎｉａ（ＡＴＣＣ  １５９５８），Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１）及びＢａｃｉｌｌｕｓ株、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ（ＡＴＣＣ  １２９０５）及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓがある。
【００５０】
更に好ましい細菌には、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓに属する株、例えば、Ｍ．ｖｉｒｅｓｃｅｎｓがある。
ペルオキシダーゼは、更に、ペルオキシダーゼの発現を許容する条件下で培養培地中で、前記ペルオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列、並びにペルオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列の発現を許容する機能をコードするＤＮＡ配列を有する組換えＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、そしてその培養物からペルオキシダーゼを回収することを含む方法により生産することができるものであり得る。
【００５１】
特に、組換え生産されたペルオキシダーゼは、コプリヌス種（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｓｐ）、特にＷＯ９２／１６６３４に従うＣ．マクロリズス（Ｃ．ｍａｃｒｏｒｈｉｚｕｓ）又はＣ．シネレウス（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅｕｓ）から得られるペルオキシダーゼである。
本発明の文脈において、ペルオキシダーゼ活性を有する化合物は、ペルオキシダーゼ酵素、及びシトクロム、ヘモグロビン又はペルオキシダーゼ酵素から得られるペルオキシダーゼ活性フラグメントを含む。
【００５２】
ペルオキシダーゼ活性（ＰＯＸＵ）の測定
１ペルオキシダーゼ単位（ＰＯＸＵ）は、以下の条件下で分当りに１μモルの過酸化水素の変換を触媒する酵素の量である：
０．１Ｍ  リン酸緩衝液pH７．０
０．８８mM  過酸化水素
１．６７mM  ２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホネート）（ＡＢＴＳ）
３０℃
その反応は、４１８nmの吸光度の変化により６０秒（混合後１５秒）、追跡し、それは０．１５〜０．３０の範囲になるべきである。
【００５３】
活性の計算のため、３６mM-1cm-1の酸化ＡＢＴＳの吸光係数及び酸化した２μモルのＡＢＴＳ当りに変換される１μモルのＨ2 Ｏ2 の化学量論を用いる。
ラッカーゼ及びラッカーゼ関連酵素
本発明の文脈において、ラッカーゼ及びラッカーゼ関連酵素は、酵素分類（ＥＣ  １．１０．３．２）に含まれるいずれかのラッカーゼ酵素、酵素分類（ＥＣ  １．１０．３．１）に含まれるいずれかのカテコールオキシダーゼ酵素、酵素分類（ＥＣ  １．３．３．５）に含まれるいずれかのビリルビンオキシダーゼ酵素又は酵素分類（ＥＣ  １．１４．１８．１）に含まれるいずれかのモノフェノールモノオキシゲナーゼ酵素を含む。
【００５４】
上述の酵素は、微生物のものであっても、即ち細菌又は（糸状菌及びイーストを含む）真菌から得られてもよく、又はそれらは植物から得られてもよい。
真菌からの好適な例には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、例えば、Ｎ．ｃｒａｓｓａ，Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ，Ｂｏｔｒｙｔｉｓ，Ｃｏｌｌｙｂｉａ，Ｆｏｍｅｓ，Ｌｅｎｔｉｎｕｓ，Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ，Ｔｒａｍｅｔｅｓ、例えばＴ．ｖｉｌｌｏｓａ及びＴ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ，Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ、例えば、Ｒ．ｓｏｌａｎｉ，Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、例えば、Ｃ．ｃｉｎｅｒｅｕｓ，Ｃ．ｃｏｍａｔｕｓ，Ｃ．ｆｒｉｅｓｉｉ、及びＣ．ｐｌｉｃａｔｉｌｉｓ，Ｐｓａｔｈｙｒｅｌｌａ、例えば、Ｐ．ｃｏｎｄｅｌｌｅａｎａ，Ｐａｎａｅｏｌｕｓ、例えば、Ｐ．ｐａｐｉｌｉｏｎａｃｅｕｓ，Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ、例えば、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ，Ｓｃｈｙｔａｌｉｄｉｕｍ、例えば、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ，Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ、例えば、Ｐ．ｐｉｎｓｉｔｕｓ，Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ、例えば、Ｐ．ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ，Ｐｈｌｅｂｉａ、例えば、Ｐ．ｒａｄｉｔａ（ＷＯ９２／０１０４６）、又はＣｏｒｉｏｌｕｓ、例えば、Ｃ．ｈｉｒｓｕｔｕｓ（ＪＰ  ２−２３８８８５）の株から得ることができるラッカーゼがある。
【００５５】
細菌からの好適な例には、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の株から得ることができるラッカーゼがある。
Ｃｏｐｒｉｎｕｓ，Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ，Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ，Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ，Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ又はＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａから得られるラッカーゼが好ましく；特にＣｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ，Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ，Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ，Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ，Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ又はＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉから得られるラッカーゼが好ましい。
【００５６】
ラッカーゼ又はラッカーゼ関連酵素は、更に、ラッカーゼをコードするＤＮＡ配列及び該ラッカーゼをコードするＤＮＡ配列の発現を許容する機能をコードするＤＮＡ配列を有する組換えＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞を、ラッカーゼ酵素の発現を許容する条件下で培養し、そしてその培養物からラッカーゼを回収することを含む方法によって生産することができるものであり得る。
【００５７】
ラッカーゼ活性（ＬＡＣＵ）の測定
ラッカーゼ活性は、好気性条件下でのシリングアルダジンの酸化から測定される。形成された紫色は５３０nmで光度測定される。分析条件は１９mMシリングアルダジン、２３mMアセテート緩衝液、pH５．５、３０℃、１分の反応時間である。
【００５８】
１ラッカーゼ単位（ＬＡＣＵ）は、これらの条件で分当りに１．０μモルのシリングアルダジンの変換を触媒する酵素の量である。
ラッカーゼ活性（ＬＡＭＵ）の測定
ラッカーゼ活性は、好気性条件下でのシリングアルダジンの酸化から測定される。形成された紫色は５３０nmで光度測定される。分析条件は１９mMシリングアルダジン、２３mM  Ｔｒｉｓ／マレエート緩衝液、pH７．５、３０℃、１分の反応時間である。
【００５９】
１ラッカーゼ単位（ＬＡＭＵ）は、これらの条件で分当りに１．０μモルのシリングアルダジンの変換を触媒する酵素の量である。
組成物
本発明による抗微生物組成物は固体又は液体として調剤することができる。
液体として調剤する場合、組成物は、典型的には、水性組成物である。
【００６０】
固体として調剤する場合、組成物は、典型的には、粉末、顆粒、ペースト又はゲル化製品である。
過酸化水素が必要である場合、２部の調剤システムを用い、それにより過酸化水素を他の成分と別個にしておくのが好ましい。
本発明の組成物は、補助剤、例えば湿潤剤、濃化剤、緩衝液、安定剤、香料、着色料、充填剤等を更に含み得る。
【００６１】
有用な湿潤剤は、界面活性剤、即ち非イオン性、アニオン性、両性又は双性イオン性界面活性剤である。
本発明の組成物は、濃縮製品又は直ちに用いることができる製品であってもよい。使用において、濃縮製品は、典型的には、水で希釈されて、消毒又は保護されるべき対象に適用され、存在する微生物との反応を許容する有効な抗微生物活性を有する媒体を供する。
【００６２】
このような水性組成物の至適pHは、通常、問題の酵素の至適安定性及び至適活性の間の妥協点である。本発明の一態様において、pHはpH３〜１０．５の範囲にあり、本発明の別の態様において、pHはpH５〜９の範囲である。
方法
本発明は、微生物細胞を本発明の組成物で処理することを含む微生物を殺し又は阻害するための方法も供する。その処理は、有効量の前記組成物で行うことができる。
【００６３】
“有効量”は、選択された適用において要求される抗微生物効果を得るために適した量を意味し；例えば生きている細胞の数を１０％、１％又は１％未満に減らし；又は１２時間、１日、５日、３０日又は３０日超の間、生きている細胞の数が倍加するのを防ぐ量である。
使用
本発明の組成物は、更に他の酵素型を典型的に含む洗剤又は洗浄組成物に組み込むことができる（以下を参照のこと）。
【００６４】
本発明の組成物は、有効量の組成物を含む浸漬、洗浄又はゆすぎ液で洗濯場を処理することにより、洗濯場に存在する微生物を阻害するためにも用いることができる。
ペイント、食品、飲料、化粧品、例えばローション（例えば点眼剤）、液体、クリーム、ゲル、ペースト、軟膏（例えば眼軟膏）、セッケン、シャンプー、コンディショナー、制汗剤、脱臭剤、口内洗浄剤、鼻スプレー、コンタクトレンズ製品、酵素製剤、又は食品含有物の保護のために用いる場合、本発明の方法に用いる組成物は、例えば水ベースのペイント、非保護食品、飲料、化粧品、コンタクトレンズ製品、食品含有物又は抗炎症製品に、微生物細胞を殺し又はその増殖を阻害するために有効な量で組み込むことができる。
【００６５】
特に、本発明の組成物は、水ベースのペイントにおいて保護剤又は消毒剤として用いることができる。
更に、本発明による組成物は、例えばアクネ、眼又は口への感染、皮膚感染の治療において；制汗剤又は脱臭剤において；足浴塩において；コンタクトレンズ、硬質表面、歯（オーラルケア）、創傷、挫傷の洗浄及び消毒において、消毒剤として役立ち得る。
【００６６】
一般に、本発明の組成物は、いずれかの硬質表面上の微生物増殖を洗浄、消毒又は阻害するために役立つ。本発明の組成物に有利に接触させることができる表面の例は、例えば乳製品工場、化学又は医薬プロセスプラント、水衛生システム、製紙用パルプ処理プラント、水処理プラント、及び冷却塔に用いられるプロセス装置の表面である。本発明の組成物は、問題の表面上の微生物増殖を洗浄、消毒又は阻害するために有効である量で用いることができる。
【００６７】
特に、本発明の組成物は、紙及びパルプ処理プラントにおいて微生物増殖を消毒し阻害するために用いることができる。
更に、本発明の組成物は、いずれかの種類のプロセス装置の洗浄のための現場洗浄（ｃｌｅａｎｉｎｇ−ｉｎ−ｐｌａｃｅ）（Ｃ．Ｉ．Ｐ．）システムに有利に用いることができる。
【００６８】
本発明の方法は、更に、食品処理プラントにおいて、並びに病院、ナーシングホーム、レストラン、特にファーストフードレストラン、調製食品店等のような食品を調製し又は供給するいずれかの場所において、表面及び料理用品を洗浄するために用いることができる。それは、食品中の抗微生物剤としても用いることができ、チーズ、フルーツ及び野菜のため並びにサラダバーにおける食品のための表面抗微生物剤として特に有用であろう。
【００６９】
本発明の組成物は、水ラインの微生物抑制のため、及び水の消毒のため、特に工業用水の消毒のためにも役立つ。
ペイントの保存／保護
カン内のペイント製品の保存は、当業界において、非酵素的有機殺生物剤をペイントに添加することにより行われている。本発明の文脈において、ペイントは、表面上に広げた時に、乾燥して薄い、着色した、装飾的及び／又は保護的コーティングを残す、液体ビヒクル、例えば水、有機溶媒及び／又は油に溶解分散された固体有色物を含む物質として解釈される。典型的には、イソチアゾリオン類、例えば５−クロロ−２−メチル−４−チアゾリ−３−オンがペイントにおいて微生物増殖を阻害／防止するために殺生物剤としてペイントに添加されている。しかしながら、本発明の方法は、この分野に好適に適用することができ、それによりこれらの毒性殺生物剤を環境的に適合性のある酵素に置換することにより、毒性有機殺生物剤の今まである環境的バイオハザードの問題を解決することができる。これにより、本発明は、ペイントに、フェノール酸化酵素及び本発明による増強剤を接触させることを含むペイントの保存のための方法を供する。更に、本発明は、フェノール酸化酵素及び本発明に記載の増強剤を含むペイント組成物を供する。
【００７０】
ペイントは、好ましくは、水ベースのペイントであり、即ち、ペイントの固体が水溶液に分散されていて、ペイントは、０〜２０％、好ましくは０〜１０％、例えば０〜５％の有機溶媒を含み得る。
酵素は、ペイント１リッター当り０．０００１〜１００mg、好ましくは０．００１〜１０mg／Ｌ、例えば０．０１〜５mg／Ｌの活性酵素タンパク質の量でペイントに加えることができ、増強剤は、ペイント組成物の１０〜５００μＭ、好ましくは２５〜２５０μＭ、例えば１００μＭの量で加えることができる。
【００７１】
洗剤組成物
本発明の抗微生物組成物は、洗剤組成物に加え、これによりその成分となってもよい。
本発明の洗剤組成物は、例えば、染色布帛のプレ処理のために適したランドリー添加組成物及びリンス添加布帛軟化組成物を含む手又は機械洗濯洗剤として調剤することができ、又は一般的な家事用硬質表面洗浄作業に用いるための洗剤組成物として調剤することができ、又は手又は機械式皿洗い作業のために調剤することができる。
【００７２】
特定の態様において、本発明は、本発明の抗微生物組成物を含む洗剤添加物を供する。その洗剤添加物及び洗剤組成物は、１又は複数の他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ及び／又はペルオキシダーゼを含み得る。
【００７３】
一般に、選択された酵素の特性は、選択された洗剤と適合すべきであり（即ちpH至適性、他の酵素及び非酵素成分との適合性等）、その酵素は有効量で存在するべきである。
プロテアーゼ
好適なプロテアーゼには、動物、植物又は微生物源のものがある。微生物源が好ましい。化学的に改変され又はタンパク質操作された変異体が含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼ、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼであり得る。アルカリプロテアーゼの例は、ズブチリシン類、特にバチルス由来のもの、例えばズブチリシンＮｏｖｏ、ズブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、ズブチリシン３０９、ズブチリシン１４７及びズブチリシン１６８（ＷＯ８９／０６２７９に記載）であり得る。トリプシン様プロテアーゼの例は、（例えばブタ又はブタ起源の）トリプシン並びにＷＯ８９／０６２７０及びＷＯ９４／２５５８３に記載のフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼである。
【００７４】
有用なプロテアーゼの例は、ＷＯ９２／１９７２９，ＷＯ９８／２０１１５，ＷＯ９８／２０１１６、及びＷＯ９８／３４９４６に記載される変異体、特に次の位置：２７，３６，５７，７６，８７，９７，１０１，１０４，１２０，１２３，１６７，１７０，１９４，２０６，２１８，２２２，２２４，２３５及び２７４のうちの１つ又は複数に置換がある変異体である。
【００７５】
好ましい市販のプロテアーゼ酵素には、ＡｌｃａｌａｓｅTM，ＳａｖｉｎａｓｅTM，ＰｒｉｍａｓｅTM，ＤｕｒａｌａｓｅTM，ＥｓｐｅｒａｓｅTM、及びＫａｎｎａｓｅTM（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ），ＭａｘａｔａｓｅTM，ＭａｘａｃａｌTM，ＭａｘａｐｅｍTM，ＰｒｏｐｅｒａｓｅTM，ＰｕｒａｆｅｃｔTM，Ｐｕｒａｆｅｃｔ  ＯｘＰTM，ＦＮ２TM、及びＦＮ３TM（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）がある。
【００７６】
リパーゼ
好適なリパーゼには、細菌又は真菌源のものがある。化学的に改変され又はタンパク質操作された変異体が含まれる。有用なリパーゼの例には、Ｈｕｍｉｃｏｌａ（異名Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、例えばＨ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ（Ｔ．  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（ＥＰ  ２５８  ０６８及びＥＰ  ３０５  ２１６）又はＨ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ（ＷＯ９６／１３５８０）からのリパーゼ、ａ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓリパーゼ、例えばＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ又はＰ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（ＥＰ  ２１８  ２７２）、Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ（ＥＰ  ３３１  ３７６）、Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ（ＧＢ  １，３７２，０３４），Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．株ＳＤ  ７０５（ＷＯ９５／０６７２０及びＷＯ９６／２７００２），Ｐ．ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ（ＷＯ９６／１２０１２）からのリパーゼ、ａ  Ｂａｃｉｌｌｕｓリパーゼ、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｄａｒｔｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１３１，２５３−３６０），Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＪＰ  ６４／７４４９９２）又はＢ．ｐｕｍｉｌｕｓ（ＷＯ９１／１６４２２）からのリパーゼがある。
【００７７】
他の例は、リパーゼ変異体、例えばＷＯ９２／０５２４９，ＷＯ９４／０１５４１，ＥＰ  ４０７  ２２５，ＥＰ  ２６０  １０５，ＷＯ９５／３５３８１，ＷＯ９６／００２９２，ＷＯ９５／３０７４４，ＷＯ９４／２５５７８，ＷＯ９５／１４７８３，ＷＯ９５／２２６１５，ＷＯ９７／０４０７９及びＷＯ９７／０７２０２に記載されるものである。
【００７８】
好ましい市販のリパーゼには、ＬｉｐｏｌａｓｅTM  ａｎｄ  Ｌｉｐｏｌａｓｅ  ＵｌｔｒａTM（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）がある。
アミラーゼ：
好適なアミラーゼ（α及び／又はβ）には、細菌又は真菌源のものがある。化学的に改変され又はタンパク質操作された変異体が含まれる。アミラーゼには、例えばＧＢ１，２９６，８３９により詳細に記載される、バチルス、例えばＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓの特定の株から得られるα−アミラーゼがある。
【００７９】
有用なアミラーゼの例は、ＷＯ９４／０２５９７，ＷＯ９４／１８３１４，ＷＯ９６／２３８７３、及びＷＯ９７／４３４２４に記載される変異体、特に次の位置：１５，２３，１０５，１０６，１２４，１２８，１３３，１５４，１５６，１８１，１８８，１９０，１９７，２０２，２０８，２０９，２４３，２６４，３０４，３０５，３９１，４０８、及び４４４のうちの１又は複数が、置換のある変異体である。
【００８０】
市販のアミラーゼには、ＤｕｒａｍｙｌTM，ＴｅｒｍａｍｙｌTM，ＦｕｎｇａｍｙｌTM及びＢＡＮTM（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ），ＲａｐｉｄａｓｅTM及びＰｕｒａｓｔａｒTM（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）がある。
セルラーゼ
好適なセルラーゼには、細菌又は真菌源のものがある。化学的に改変され又はタンパク質操作された変異体が含まれる。好適なセルラーゼには、Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｈｕｍｉｃｏｌａ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ，Ｔｈｉｅｌａｖｉａ，Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍからのセルラーゼ、例えばＨｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ，Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  ａｎｄ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍから生産される真菌セルラーゼ（ＵＳ  ４，４３５，３０７，ＵＳ  ５，６４８，２６３，ＵＳ  ５，６９１，１７８，ＵＳ  ５，７７６，７５７及びＷＯ８９／０９２５９に開示）がある。
【００８１】
特に好適なセルラーゼは、カラー・ケア利益を有するアルカリ又は中性セルラーゼである。このようなセルラーゼの例は、ＥＰ  ０  ４９５  ２５７，ＥＰ  ０  ５３１  ３７２，ＷＯ９６／１１２６２，ＷＯ９６／２９３９７，ＷＯ９８／０８９４０に記載されるセルラーゼである。他の例は、ＷＯ９４／０７９９８，ＥＰ  ０  ５３１  ３１５，ＵＳ  ５，４５７，０４６，ＵＳ  ５，６８６，５９３，ＵＳ  ５，７６３，２５４，ＷＯ９５／２４４７１，ＷＯ９８／１２３０７及びＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９に記載されるもののようなセルラーゼ変異体である。
【００８２】
市販のセルラーゼには、ＣｅｌｌｕｚｙｍｅTM、及びＣａｒｅｚｙｍｅTM（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ），ＣｌａｚｉｎａｓｅTM、及びＰｕｒａｄａｘ  ＨＡTM（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）、及びＫＡＣ−５００（Ｂ）TM（Ｋａｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）がある。
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ
好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼには、植物、細菌又は真菌源のものがある。化学的に改変され又はタンパク質操作された変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例には、ＷＯ９３／２４６１８，ＷＯ９５／１０６０２、及びＷＯ９８／１５２５７に記載されるもののような、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、例えばＣ．ｃｉｎｅｒｅｕｓからのペルオキシダーゼ及びその変異体がある。
【００８３】
市販のペルオキシダーゼには、ＧｕａｒｄｚｙｍｅTM（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）がある。
洗剤酵素は、１又は複数の酵素を含む別個の添加物を加えることにより、又はこれらの酵素全てを含む、組み合わせた添加物を加えることにより洗剤組成物に含めることができる。本発明の洗剤添加物、即ち別個の添加物又は組み合わせ添加物は、例えば、顆粒、液体、スラリー等として調剤することができる。好ましい洗剤添加物製剤は、顆粒、特に非ダスティング粒子、液体、特に安定化液、又はスラリーである。
【００８４】
非ダスティング粒子は、例えばＵＳ  ４，１０６，９９１及び４，６６１，４５２に開示されるように生産することができ、任意に、当業界で知られた方法によってコーティングすることができる。ワキシーコーティング材料の例は、１０００〜２００００の平均分子量を有するポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０のエチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが１２〜２０の炭素原子を含み、１５〜８０のエチレンオキシド単位があるエトキシル化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリグリセリドである。流動床技術による適用のために適したフィルム形成性コーティング材料の例は、ＧＢ１４８３５９１に供される。液体酵素調製物は、例えば、ポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を、確立された方法に従って加えることにより安定化することができる。保護された酵素は、ＥＰ  ２３８，２１６に開示される方法に従って調製することができる。
【００８５】
本発明の洗剤組成物は、いずれの慣用的な形態、例えば棒状、錠剤、粉末、粒子、ペースト又は液体であってよい。液体洗剤は、水性で、典型的には７０％までの水及び０〜３０％の有機溶媒を含むか、又は非水性であり得る。
洗剤組成物は、半極性を含む非イオン性、アニオン性、カチオン性、及び／又は双性イオン性であり得る１又は複数の界面活性剤を含む。界面活性剤は、典型的には、０．１重量％〜６０重量％のレベルで存在する。
【００８６】
その中に含まれる場合、洗剤は、通常、約１％〜約４０％のアニオン界面活性剤、例えば直鎖アルキルベンゼンスルホネート、α−オレフィンスルホネート、アルキルスルフェート（脂肪アルコールスルフェート）、アルコールエトキシスルフェート、２級アルカンスルホネート、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−もしくはアルケニルコハク酸又はセッケンを含むであろう。
【００８７】
その中に含まれる場合、洗剤は、通常、約０．２％〜約４０％の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（“グルカミド”）を含むであろう。
【００８８】
洗剤は、０〜６５％の界面活性剤ビルダー又は錯化剤、例えばゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、カーボネート、シトレート、ニトリロトリ酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、アルキル−もしくはアルケニルコハク酸、可溶性シリケート又は層状シリケート（例えばＨｏｅｃｈｓｔからのＳＫＳ−６）を含み得る。
【００８９】
洗剤は、１又は複数のポリマーを含んでもよい。例は、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルビリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート、例えばポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー及びラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーである。
【００９０】
洗剤は、Ｈ2 Ｏ2 源、例えばテトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホネートのような過酸形成漂白アクティベーターと組み合わせることができるペルボレート又はペルカーボネートを含み得る漂白システムを含み得る、あるいは、漂白システムは、例えばアミド、イミド又はスルホン型のペルオキシ酸を含んでもよい。
【００９１】
本発明の洗剤組成物の酵素は、慣用的な安定化剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又はホウ酸誘導体、例えば芳香族ホウ酸エステル、又はフェニルホウ素酸誘導体、例えば４−ホルミルフェニルホウ素酸を用いて安定化することができ、その組成物は、例えば、ＷＯ９２／１９７０９及びＷＯ９２／１９７０８に記載されるように調剤することができる。
【００９２】
洗剤は、他の慣用的な洗剤成分、例えばファブリックコンディショナー、例えばクレイ、フォームブースター、泡サプレッサー、抗腐食剤、土懸濁剤、抗土再折剤、染料、殺細菌剤、光沢剤、ヒドロトロープ、曇り阻害剤、又は香料も含み得る。
本発明は、以下の例に更に説明されるが、それらは、クレームされる本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００９３】
実施例１
電子供与体としてＮ−ヒドロキシアセトアニリドを伴うコプリヌス・ペルオキシダーゼの抗細菌活性
電子供与体としてＮ−ヒドロキシアセトアニリドを用いることによりpH６及びpH８で、ＷＯ９２／１６６３４に記載される通りに得た組換えコプリヌス・シネレウスペルオキシダーゼ（ｒＣｉＰ）の抗微生物活性をテストした。
【００９４】
抗微生物活性は、０．０５Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ  Ｍ８２５０）（pH６）又は０．０５  ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ  Ｈ３３７５）（pH８）中で評価し；緩衝液はろ過滅菌により滅菌した。
抗微生物活性は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０：３０３−３１６）及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＤＳＭ  ２００４２）に対して測定した。細胞は、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｓｏｙａ  Ｂｒｏｔｈ（Ｏｘｏｉｄ  ＣＭ１２９）中で、３０℃（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）又は２５℃（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）で、２４時間、増殖させ、ＭＥＳ緩衝液中で約１０6cfu／mLの最終細胞濃度に希釈した。その細胞懸濁液をｒＣｉＰ（３POXU／mL）、増強剤（０．２mM）及び過酸化水素（０．５mM）と、２０分、４０℃で混合した。その殺細菌活性は、Ｍａｌｔｈｕｓ中でのインキュベーションにより測定した。Ｍａｌｔｈｕｓ装置により測定した検出時間を較正曲線により cfu／mLに変換した。全生存細胞を計数する時に、直接又は間接Ｍａｌｔｈｕｓ測定を用いた（Ｍａｌｔｈｕｓ  Ｆｌｅｘｉ  Ｍ２０６０，Ｍａｌｔｈｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）。直接測定により、細胞代謝を増殖基質におけるコンダクタンス測定により測定した。間接測定により、３mLの増殖培地を間接Ｍａｌｔｈｕｓセルの外部チャンバーに移し、０．５mLの滅菌ＫＯＨ（０．１Ｍ）を内部チャンバーに移した。その細胞懸濁液を酵素処理後にＭａｌｔｈｕｓセルの外部チャンバーに移した。細胞が外部チャンバー内で増殖するにつれ、それらはＣＯ2 を作り出し、それは内部チャンバー内のＫＯＨ中に溶けて、ＫＯＨのコンダクタンスを変化させる。酵素処理で生きている呼吸する細胞により形成されるＣＯ2 の量を、生存可能細胞の数を評価するために用いた。コンダクタンス変化がＭａｌｔｈｕｓにより測定することができる場合、検出時間を記録した。そのｄｔ’を、 cfu／mLをｄｔに関連づける較正曲線を用いることによりコロニー数に変換した（Ｊｏｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ７８：２９７−３０３，Ｊｏｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６３：３７２４−３７２８）。
【００９５】
観察された過酸化水素と組み合わせたＮ−ヒドロキシアセトアニリド又はＮ−ヒドロキシアセトアニリドの殺細菌活性はなかった。他方、組合わせたシステム：Ｎ−ヒドロキシアセトアニリド、過酸化水素及びｒＣｉＰにより全体の死殺が得られた（図１を参照のこと）。グラム陰性細菌は、全般的に、オキシドレダクターゼ及び増強剤の組合せシステムに対して最も耐性である。しかしながら、グラム陰性細菌Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに対して、pH６及び８の両方で、約１０6CFU／mL（コロニー形成単位）の細胞減少に相当する全体の死殺が得られた。
【００９６】
実施例２
ラッカーゼ及びＮ−ヒドロキシアセトアニリドの殺細菌活性
ＷＯ９６／００２９０に記載の通り得られたポリポルス・ピンシトウス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）ラッカーゼ（ｒＰｐＬ）、及びＷＯ９７／０８３２５に記載の通り得られたコプリヌス・シネレウスラッカーゼ（ｒＣｃＬ）を、増強剤としてＮ−ヒドロキシアセトアニリドを用いて、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ  １０１４５），Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ  １３０４８）及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ（ＤＳＭ  ２５７０）に対して測定した。その殺細菌活性は、実施例１に記載される通り測定し、ｒＰｐＬ（１mg／Ｌ）の抗細菌活性はpH６で評価し、ｒＣｃＬ（１mg／Ｌ）はpH８で評価した。
【００９７】
Ｎ−ヒドロキシアセトアニリドについての投与量応答曲線を、ｒＰｐＬ（図２）又はｒＣｃＬ（図３）と組み合わせた場合について示す。全てのテスト生物に対して有意な殺細菌活性が得られ、グラム陰性株が最も耐性であった。Ｐ．アエルギノサＡＴＣＣ  １０１４５に対する殺細菌活性は、２００μＭ超のＮ−ヒドロキシアセトアニリド濃度で得た。pH６でｒＰｐＬを用いる場合、２つのグラム陰性細菌の全死殺が、高濃度のＮ−ヒドロキシアセトアニリドで得られた。
【００９８】
実施例３
種々のフェノール酸化酵素及び増強剤の殺細菌活性
（ＷＯ９５／０７９８８に記載されるような）Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓペルオキシダーゼ（ｒＣｉＰ）、ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓラッカーゼ（ｒＰｐＬ）、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓラッカーゼ（ｒＣｃＬ）及びＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉラッカーゼ（ｒＲｓＬ）の抗細菌活性を、異なる増強剤で、pH６及び８で測定した（緩衝液；実施例１を参照のこと）。ｒＣｉＰを０．５mMの過酸化水素と組み合わせた。
【００９９】
ｒＣｉＰ及びｒＰｐＬの抗微生物活性を、シュードモナス・フルオレセンス（Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０：３０３〜３１６）に対して測定し、ｒＣｃＬ及びｒＲｓＬの抗微生物活性を、シュードモナス・アエルギノサ（ＡＴＣＣ  １０１４５）に対して測定した。
【０１００】
殺細菌活性は、実施例１に記載される通り測定した。異なる組合せ及び結果を表１に示す。結果は、生きている細胞の数の減少として示す。これにより、４の減少は生きている細胞の４log 削減に相当し、例えば１０6CFU／mLから１０2CFU／mLである。
【０１０１】
【表１】
0004727818.tif 000010
【０１０２】
【表２】
0004727818.tif 000011
【０１０３】
【表３】
0004727818.tif 000012
【０１０４】
【表４】
0004727818.tif 000013
【０１０５】
実施例４
増強剤の例
Ａ）Ｎ１−ヒドロキシ−Ｎ１−フェニル−４−ニトロベンズアミド、４−ニトロ    安息香酸−Ｎ−ヒドロキシアニリド（ＣＡＳ  ２０２９−６１−０）；
【０１０６】
【化１５】
0004727818.tif 000014
【０１０７】
Ｂ）Ｎ１−ヒドロキシ−Ｎ１−フェニル−４−メトキシベンズアミド、４−メト    キシ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシアニリド（ＣＡＳ  １３６６４−４９−８）    ；
【０１０８】
【化１６】
0004727818.tif 000015
【０１０９】
Ｃ）Ｎ，Ｎ′−ジヒドロキシ−Ｎ，Ｎ′−ジフェニルテレフタルアミド（ＣＡＳ      ６１４９４−２６−６）；
【０１１０】
【化１７】
0004727818.tif 000016
【０１１１】
Ｄ）Ｎ１−（４−シアノフェニル）−Ｎ１−ヒドロキシアセトアミド、Ｎ−ヒド    ロキシ−４−シアノアセトアニリド（ＣＡＳ  ８０５８４−６５−２）；
【０１１２】
【化１８】
0004727818.tif 000017
【０１１３】
Ｅ）Ｎ１−ヒドロキシ−Ｎ１−フェニルデカンアミド、デカン酸−Ｎ−ヒドロキ    シアニリド（ＣＡＳ  ２５３１０−１６−１）；
【０１１４】
【化１９】
0004727818.tif 000018
【０１１５】
Ｆ）Ｎ１−ヒドロキシ−Ｎ１−フェニル−４−シアノベンズアミド、４−シアノ    安息香酸−Ｎ−ヒドロキシアニリド；
【０１１６】
【化２０】
0004727818.tif 000019
【０１１７】
Ｇ）Ｎ１−（４−アセチルフェニル）−Ｎ１−ヒドロキシアセトアミド、Ｎ−ヒ    ドロキシ−４−アセチルアセトアニリド（ＣＡＳ  ６７２７４−５１−５）    ；
【０１１８】
【化２１】
0004727818.tif 000020
【０１１９】
Ｈ）Ｎ１−ヒドロキシ−Ｎ１−（３−ニトロフェニル）アセトアミド；
【０１２０】
【化２２】
0004727818.tif 000021
【０１２１】
Ｉ）Ｎ１−（４−ヒドロキシフェニル）−Ｎ１−ヒドロキシアセトアミド、Ｎ−    ヒドロキシ−４−ヒドロキシアセトアニリド（ＣＡＳ  ６３９７５−２１−    ３）；
【０１２２】
【化２３】
0004727818.tif 000022
【０１２３】
Ｋ）Ｎ１−ヒドロキシ−Ｎ１−（４−ニトロフェニル）アセトアミド、Ｎ−ヒド    ロキシ−４−ニトロアセトアニリド（ＣＡＳ  ６７２７４−５２−６）；
【０１２４】
【化２４】
0004727818.tif 000023
【０１２５】
Ｌ）Ｎ−ヒドロキシアセトアニリド（ＣＡＳ  １７９５−８３−１）；
【０１２６】
【化２５】
0004727818.tif 000024
【０１２７】
Ｍ）Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−フェニル−カルバミン酸イソプロピルエステル（ＣＡ    Ｓ  ４２７９−１６−７）；
【０１２８】
【化２６】
0004727818.tif 000025
【０１２９】
Ｎ）Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−フェニル−カルバミン酸メチルエステル（ＣＡＳ  ２    ８０９１−６２−５）；
【０１３０】
【化２７】
0004727818.tif 000026
【０１３１】
Ｏ）Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−フェニル−カルバミン酸フェニルエステル（ＣＡＳ      ４６４５−７２−１）；
【０１３２】
【化２８】
0004727818.tif 000027
【０１３３】
Ｐ）Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−フェニル−カルバミン酸エチルエステル（ＣＡＳ  １    ８６３１−９９−７）；
【０１３４】
【化２９】
0004727818.tif 000028
【０１３５】
Ｑ）Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−（４−シアノフェニル）−カルバミン酸メチルエステ    ル
【０１３６】
【化３０】
0004727818.tif 000029
【０１３７】
全ての化合物は、化合物Ｌ）の合成についてＯｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  １９８９，６７，１８７〜１９２に概説される通り一般的な手順に従って合成した。その手順は、反応混合物の精密検査及び生成物の精製に関して改変した。全ての構造は利用できるなら、文献からのそれらの融点により、及びＶＡＲＩＡＮ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ４００での 1Ｈ−ＮＭＲにより確認した。
【０１３８】
先の化合物は以下に記載される
【０１３９】
【表５】
0004727818.tif 000030
【０１４０】
化合物Ｆ），Ｈ）、及びＱ）の合成を以下に記載する：
Ｎ１−ヒドロキシ−Ｎ１−フェニル−４−シアノベンズアミド（Ｆ）の合成
ＴＨＦ（３０mL）中のＮ−フェニルヒドロキシルアミン（１．７７ｇ、１６．２mmol）の溶液を、Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．１９８９，６７，１８７〜１９２に概説されるように合成した。重炭酸ナトリウムのスラリー（２mLの水中の２ｇ）をその溶液に加えた。その混合物を−２℃に冷やし、４−シアノベンゾイルクロライド（３．２３ｇ、１９．５１mmol）を滴下して加えた。撹拌を一晩、続けた後、水（２００mL）を加えた。その反応混合物をメチレンクロライドで３回、抽出した。その組み合わせた有機相の溶媒を真空下で除去した。その残留物を、溶離剤としてＡｃＯＥｔ／ヘプタン（３：５，ｖ：ｖ）を用いて、４．０×１５．０cmカートリッジを備えたＳＩＭと共にＢｉｏｔａｇｅ  Ｆｌａｓｈ  ４０ｉを用いてクロマトグラフィーで精製し、純粋なｆ）を０．５５ｇ、供した（１４％）：ｍｐ：１４６−１４７℃． 1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）ｄ  １０．９３（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，２Ｈ），７．８０（ｄ，２Ｈ），７．６２（ｄ，２Ｈ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ），７．２４（ｔ，１Ｈ）．13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）ｄ  １６５．９１，１４０．８２，１３９．５９，１３１．４５，１２８．３８，１２８．１１，１２５．４３，１２１．３０，１１７．８５，１１１．９９．分析、計算値（Ｃ14Ｈ10Ｎ2 Ｏ2 ）：Ｃ，７０．５８；Ｈ，４．２３；Ｎ，１１．７６測定値：Ｃ，７０．６２；Ｈ，４．３２；Ｎ，１１．６４。
【０１４１】
Ｎ１−ヒドロキシ−Ｎ１−（３−ニトロフェニル）アセトアミド（Ｈ）の合成
ヒドラジン水和物（３．５６ｇ、７１．１１mmol）を、１５℃未満に温度を維持したテトラヒドロフラン（３０mL）中の１，３−ジニトロベンゼン（６．０ｇ、３５．６９mmol）及び湿潤５％ロジウム炭素（１２０mg）の懸濁液に滴下して加えた。室温で一晩、撹拌した後、その混合物をろ過し、その触媒を少量のテトラヒドロフランで洗った。重炭酸ナトリウムのスラリー（５mLの水中６ｇ）をその溶液に加えた。その混合物を０℃に冷やし、アセチルクロライド（６．１７ｇ、７８．６０mmol）を滴下して加えた。撹拌を一晩、続け、次に水酸化ナトリウムの溶液（１００mL中５ｇ）を加えた。その水性相を分離し、ペトロレウムエーテルを加え、そしてそのテトラヒドロフラン相を再び分離した。その組み合わせ有機相を１０％水酸化ナトリウム水溶液で抽出した。その組み合わせた水性相をＣＨ2 Ｃｌ2 で洗い、次に塩酸で中和した。その混合物をＣＨ2 Ｃｌ2 で抽出し、その抽出物を組み合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、そして減圧下で濃縮した。ペトロレウムエーテルを加えた後、明るいオレンジの結晶が形成され、４．５９ｇの純粋な（ｈ）を供した（６６％）：ｍｐ  ９２−９４℃． 1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）ｄ  ９．４１（１Ｈ），８．３６（１Ｈ），７．９６（１Ｈ），７．９１（１Ｈ），７．４６（１Ｈ），２．２８（３Ｈ）．13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）ｄ  １４９．０１，１３０．５２，１２７．４２，１２１．２５，１１６．４３，２３．４５．計算値（Ｃ8 Ｈ8 Ｎ2 Ｏ4 ）：Ｃ，４８．９８；Ｈ，４．１１；Ｎ，１４．２８測定値：Ｃ，４９．５５；Ｈ，４．１６；Ｎ，１４．２１。
【０１４２】
Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−（４−シアノフェニル）−カルバミン酸メチルエステル（Ｑ）の合成
ＴＨＦ（３０mL）中のＮ−４−（シアノフェニル）ヒドロキシルアミン（３．１３ｇ、２１．１mmol）の溶液を、Ｎ−４−フェニルヒドロキシルアミンの調製についてＯｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．１９８９，６７，１８７〜１９２に記載される手順に従って合成した。重炭酸ナトリウムのスラリー（７mLの水中４．６ｇ）をその溶液に加えた。その混合物を−０℃に冷却し、メチルクロロホルメート（１．４３mL、２１．１mmol）を滴下して加えた。撹拌を一晩、続けた後、ＮａＯＨ（８％、３０mL）を４５分にわたって加えた。その水相を分離した。ペトロレウムエーテル（６０mL）をＴＨＦ相に加え、その水相を再び分離した。その有機相を８％ＮａＯＨ（４０mL）で２回、抽出した。その組み合わせた水相をＣＨ2 Ｃｌ2 で洗い、ＨＣｌで中和した（冷却！）。その酸性化した水相をＣＨ2 Ｃｌ2 （６０mL）で３回、抽出した。その組み合わせた有機相をＭｇＳＯ4 で乾燥させ、ろ過し、そしてその溶媒を真空下で除去して粗（ｇ）を供した。その化合物をトルエン／ヘプタンから再結晶化して２．６９ｇの白色結晶（６６％）を供した：ｍｐ：１１８−１２１℃． 1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）ｄ  ７．７１（ｄ，２Ｈ），７．６３（ｄ，２Ｈ），３．９３（ｓ，３Ｈ）．13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）ｄ  １５４．１６，１４３．８９，１３２．５２，１１９．０１，１１８．５４，１０７．１７，５４．２２．分析、計算値（Ｃ9 Ｈ8 Ｎ2 Ｏ3 ）：Ｃ，５６．２５；Ｈ，４．２０；Ｎ，１４．５８．測定値：Ｃ，５５．５１；Ｈ，４．２４；Ｎ，１４．７３。
【図面の簡単な説明】
本発明は、添付図面を引用することにより更に詳述される。
【図１】  Ｐ．フルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）に対するＣ．シネレウス（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅｕｓ）ペルオキシダーゼの抗微生物活性を示す（ペルオキシダーゼ：３POXU／mL、増強剤：２００μＭ  Ｎ−ヒドロキシアセトアニリド；実施例１を参照のこと）。中黒四角＝pH８；中白四角＝pH６；…＝全体の死殺。
【図２】  pH６、２０分及び４０℃でポリポルス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）ラッカーゼ（ｒＰｐＬ）と組み合わせたＮ−ヒドロキシアセトアニリドについての投与量応答曲線を示す。−□−＝エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）；−−○−−＝シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；…△…＝エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）。
【図３】  pH６、２０分及び４０℃でのコプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）ラッカーゼ（ｒＣｃＬ）と組み合わせたＮ−ヒドロキシアセトアニリドについての投与量応答曲線を示す（実施例２を参照のこと）。−□−＝エンテロコッカス・ファエカリス；−−○−−＝シュードモナス・アエルギノサ；…△…＝エンテロバクター・アエロゲネス。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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