(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血に含まれる幼若白血球を分析するための試薬であって、
赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、損傷した血球を収縮させる可溶化剤と、糖と、核酸を染色する色素と、を含有する幼若白血球分析用試薬。
【請求項２】
前記界面活性剤が、以下の構造式
【化１】
0004806342.tif 000010
を有するポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤である、請求項１記載の試薬。
【請求項３】
前記可溶化剤が、サルコシン誘導体、サルコシン誘導体の塩、コール酸誘導体、及びメチルグルカンアミドからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１又は２記載の試薬。
【請求項４】
前記糖が、キシリトール、アラビノース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、リビトールからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１〜３の何れかに記載の試薬。
【請求項５】
前記糖を１０〜７５ｇ／Ｌ含有する請求項１〜４の何れかに記載の試薬。
【請求項６】
塩化ナトリウムを含有しない、請求項１〜５の何れかに記載の試薬。
【請求項７】
ｐＨが５．０〜９．０である、請求項１〜６の何れかに記載の試薬。
【請求項８】
浸透圧が１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇである、請求項１〜７の何れかに記載の試薬。
【請求項９】
末梢血に含まれる幼若白血球を分析するための試薬キットであって、
赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、
損傷した血球を収縮させる可溶化剤と、
浸透圧調整剤とを含有し、
浸透圧が１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、電気伝導度が６ｍＳ／ｃｍ未満である第一試薬、及び
核酸を染色する色素を含有する第二試薬を含む幼若白血球分析用試薬キット。
【請求項１０】
前記第一試薬の電気伝導度が３ｍＳ／ｃｍ以下である請求項９記載の試薬キット。
【請求項１１】
前記浸透圧調整剤が、糖及びアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのである請求項９又は１０記載の試薬キット。
【請求項１２】
前記アミノ酸がグリシン及びアラニンからなる群より選択される少なくとも１つである請求項１１記載の試薬キット。
【請求項１３】
前記アミノ酸を１〜５０ｇ／Ｌ含有する請求項１１又は１２記載の試薬。
【請求項１４】
前記第一試薬の塩化ナトリウムの濃度が３ｇ／Ｌ未満である請求項９〜１３の何れかに記載の試薬。
【請求項１５】
末梢血に含まれる幼若白血球を分析するための試薬キットであって、
赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、損傷した血球を収縮させる可溶化剤と、糖と、を含有する第一試薬、及び
核酸を染色する色素を含有する第二試薬を含む幼若白血球分析用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体から採取された試料に含まれる白血球を分類し、計数するための試薬及び試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血球細胞は骨髄で作られ、未熟な細胞から分化・成熟し、末梢血に移動する。健常人の場合、幼若な白血球（幼若白血球）が末梢血中に出現することはないが、白血病、癌の骨髄転移、重症感染症などの患者の末梢血には、幼若白血球が出現することがある。このため、生体試料中の成熟白血球や幼若白血球を測定することは上述の疾患を診断する上で極めて重要である。
【０００３】
白血球を測定するための試薬として、特許文献１に開示されている試薬が知られている。この試薬と生体試料とを混合した測定用試料をフローサイトメータに導入し、特定の波長の光を照射して得られる光学的情報に基づいて検体中の成熟白血球と幼若白血球とを分類し、それぞれを計数することができる。また、幼若白血球を骨髄芽球や幼若顆粒球などに細分類してそれぞれ計数することも可能である。しかしながら、この試薬を用いて幼若白血球が含まれている試料を処理すると、処理条件によっては骨髄芽球などの幼若白血球の損傷が進行し、分類精度が低下することがあった。従って、この試薬を用いて試料中の幼若白血球の分類や計数を正確に行うためには、反応温度や反応時間などの処理条件の管理を厳格にする必要があった。
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−２０６４２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、骨髄芽球や幼若顆粒球などの幼若白血球や成熟白血球を精度良く分析することができ、且つ試料の処理条件の許容範囲が従来よりも広い幼若白血球分析用試薬及び試薬キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、末梢血中の赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、損傷した血球を収縮させる可溶化剤と、糖と、核酸を染色する色素と、を含有する幼若白血球分析用試薬を提供する。
【０００７】
また、本発明は、赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、損傷した血球を収縮させる可溶化剤と、浸透圧調整剤とを含有し、浸透圧が１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、電気伝導度が６ｍＳ／ｃｍ未満である第一試薬と核酸を染色する色素を含有する第二試薬とを含む、末梢血に含まれる幼若白血球を分析するための幼若白血球分析用試薬キットを提供する。
【０００８】
また、本発明は、赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、損傷した血球を収縮させる可溶化剤と、糖とを含有する第一試薬、及び核酸を染色する色素を含有する第二試薬を含む、末梢血に含まれる幼若白血球を分析するための幼若白血球分析用試薬キットを提供する
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、幼若白血球や成熟白血球を精度良く分析することができ、且つ試料の処理条件の許容範囲が従来よりも広い幼若白血球分析用試薬及び試薬キットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本実施形態の幼若白血球分析用試薬（以下、単に試薬とも言う）を用いると、試料に含まれる白血球を成熟白血球と幼若白血球とに分類し、それぞれを計数することができる。また、成熟白血球をリンパ球、単球及び顆粒球に細分類し、それぞれを計数することができる。特にこの試薬を用いると幼若白血球を幼若顆粒球と骨髄芽球とに細分類し、それぞれを精度良く計数することができる。
【００１１】
本明細書において、幼若白血球とは、健常人においては末梢血には存在せず骨髄に存在する未成熟な白血球のことを指す。例えば、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球等を指す。前骨髄球、骨髄球及び後骨髄球を幼若顆粒球とすることもある。骨髄芽球は、骨髄系幹細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＮ）、好中球・マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、好酸球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＥＯＳ）などの白血球系の造血前駆細胞をも含む。
【００１２】
測定に供される試料は、末梢血である。
【００１３】
本実施形態の試薬は、赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤、損傷した血球を収縮させる可溶化剤及び核酸染色色素を含む。生体試料と試薬とを混合すると、界面活性剤の作用により試料に含まれる血球の細胞膜が損傷を受ける。この界面活性剤は、赤血球や成熟白血球の細胞膜に損傷を与えるが、幼若白血球の細胞膜は実質的に損傷しない。赤血球や成熟白血球などの損傷した血球は可溶化剤の作用により収縮する。幼若白血球の細胞膜は殆ど損傷していないため、赤血球や成熟白血球よりも可溶化剤による細胞の収縮が起こりにくい。損傷を受けた血球の核は、色素の作用により染色されるが、幼若白血球は殆ど染色されない。
【００１４】
界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤を用いることができる。具体的には、以下の構造式を有するものを使用することができる。
【００１５】
【化１】
0004806342.tif 000002
【００１６】
特に、ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテルなどを用いることが好ましい。
【００１７】
試薬に含有させる界面活性剤の好ましい濃度は、界面活性剤の種類によって異なるが、例えばポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテルを用いる場合、１０００〜５００００ｐｐｍが好ましく、１００００〜３５０００ｐｐｍがより好ましい。界面活性剤は、単独で用いてもよいし、二種類以上の界面活性剤を併用してもよい。
【００１８】
可溶化剤としては、例えばサルコシン誘導体又はその塩、コール酸誘導体、メチルグルカンアミドなどを用いることができる。
【００１９】
サルコシン誘導体は下記構造式を有する。
【００２０】
【化２】
0004806342.tif 000003
【００２１】
コール酸誘導体は下記構造式を有する。
【００２２】
【化３】
0004806342.tif 000004
【００２３】
メチルグルカンアミドは下記構造式を有する。
【００２４】
【化４】
0004806342.tif 000005
【００２５】
サルコシン誘導体又はその塩を用いる場合、試薬中の濃度は２００〜３０００ｐｐｍであることが好ましい。コール酸誘導体を用いる場合、１００〜１００００ｐｐｍであることが好ましい。メチルグルカンアミドを用いる場合、１０００〜８０００ｐｐｍであることが好ましい。
【００２６】
サルコシン誘導体又はその塩の具体的な例としては、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ラウロイルメチルβ−アラニンナトリウム、ラウロイルサルコシン等が挙げられる。コール酸誘導体又はその塩の具体的な例としては、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、ＣＨＡＰＳＯ（［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）等が挙げられる。メチルグルカンアミドの具体的な例としては、ＭＥＧＡ８（オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、ＭＥＧＡ９（ノナイノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、ＭＥＧＡ１０（デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド）等が挙げられる。
【００２７】
また、これらの他に可溶化剤としてｎ−オクチルβ−グルコシド、シュークロースモノカプレート、Ｎ−ホルミルメチルロイシルアラニンなどを用いることも可能である。これらを用いる場合、試薬中の濃度は１０〜５００００ｐｐｍであることが好ましい。可溶化剤は、単独で用いてもよいし、二種類以上の可溶化剤を併用してもよい。
【００２８】
色素としては核酸を特異的に染色するものであれば特に限定されないが、蛍光色素であることが好ましい。このような色素を用いることにより、核を持たない赤血球は殆ど染色されず、核を有する白血球は強く染色される。この染色強度の差異に基づいて、赤血球と白血球とを弁別することができる。また、色素が透過できるほどの損傷を受けた細胞膜を有する成熟白血球はこの色素により強く染色されるが、幼若白血球は殆ど染色されない。この染色強度の差異に基づいて、白血球のうち成熟白血球と幼若白血球とを弁別することができる。色素の種類は、照射する光によって適宜選択される。例えば、ヘリウム−ネオンレーザーや赤色半導体レーザを光源として使用する場合、以下のような構造式を有する色素を用いることが好ましい。
【００２９】
【化５】
0004806342.tif 000006
（式中、R1Iは水素原子または低級アルキル基を示し；R2I及びR3Iは、それぞれ同一または異なって、水素原子、低級アルキル基または低級アルコキシ基を示し；R4Iは水素原子、アシル基または低級アルキル基を示し；R5Iは水素原子または置換されてもよい低級アルキル基を示し；Zは硫黄原子、酸素原子、または低級アルキル基で置換された炭素原子を示し；nIは１または２を示し；XI-はアニオンを示す。）
【００３０】
式中R1Iにおける低級アルキル基は、炭素数１〜６の直鎖又は分枝のアルキル基である。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、ter-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられ、これらのうちメチル基及びエチル基が好ましい。
R2I及びR3Iにおける低級アルキル基は上記と同様であり、低級アルコキシ基としては、炭素数１〜６のアルコキシを意味する。例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等が挙げられるが、これらのうちメトキシ基及びエトキシ基が好ましい。なお、R2I及びR3Iは水素原子であることが好ましい。
R4Iにおけるアシル基とは、脂肪族カルボン酸から誘導されたアシル基が好ましい。具体的には、アセチル基、プロピオニル基等が挙げられ、これらのうちアセチル基が好ましい。また、低級アルキル基は上記と同様である。
R5Iにおける低級アルキル基とは上記と同様であり、置換されていてもよい低級アルキル基とは、１〜３個の水酸基、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素）等で置換されていてもよい低級アルキル基を意味する。これらのうち、１個の水酸基で置換されたメチル基及びエチル基が好ましい。
Zにおける低級アルキル基とは上記と同様であり、Zとしては硫黄原子であることが好ましい。
X-におけるアニオンは、ハロゲンイオン（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素イオン）、ハロゲン化ホウ素イオン（BF4-、BCl4-、BBr4-等）、リン化化合物イオン、ハロゲン酸素酸イオン、フルオロ硫酸イオン、メチル硫酸イオン、芳香環ハロゲンあるいはハロゲンをもつアルキル基を置換基として有するテトラフェニルホウ素化合物イオン等が挙げられる。これらのうち臭素イオンまたはBF4-が好ましい。
【００３１】
上記（Ｉ）の色素の具体的な例としては、以下のような色素が好適である。
色素Ａ
【００３２】
【化６】
0004806342.tif 000007
【００３３】
色素Ｂ
【００３４】
【化７】
0004806342.tif 000008
【００３５】
色素Ｃ
【００３６】
【化８】
0004806342.tif 000009
【００３７】
上記の色素の他に、プロピジウムアイオダイド、エチジウムブロマイド、エチジウム−アクリジンへテロダイマー、エチジウムジアジド、エチジウムホモダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、ＴＯＴＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、アイオダイングリーン（Iodine Green）、ＮＫ−３９７５（林原生物学研究所）、ＮＫ−１５７０（林原生物学研究所）、ＮＫ−１０４９（林原生物学研究所）なども好適に使用される。
【００３８】
上記の色素の試薬中の濃度は、０．０１〜５００ｐｐｍであることが好ましく、さらに好ましくは０．１〜２００ｐｐｍである。色素は、単独で用いてもよいし、二種類以上の色素を併用してもよい。
【００３９】
試薬の浸透圧は１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇに調整されることが好ましい。試薬の浸透圧を所望の範囲に調整するために試薬には糖が含有される。糖を用いて試薬の浸透圧を調整することにより、反応時間が延びても或いは反応温度が高くなっても骨髄芽球が損傷しにくく、正確に骨髄芽球と成熟白血球との分類及び計数を行うことができる。
【００４０】
また、浸透圧を調整する物質（浸透圧浸透圧調整剤）として試薬に塩化ナトリウムを含有させることもできる。しかしながら、試薬に塩化ナトリウムが多量に含まれていると、試薬と試料との混合後、反応時間が経過するほど、或いは反応温度が高いほど骨髄芽球の損傷が促進され、骨髄芽球の核が色素で染色される。骨髄芽球が染色されると、検出される蛍光強度が成熟白血球の蛍光強度と同等となってしまい、成熟白血球と骨髄芽球との分類精度が低下する。以上より、試薬中の塩化ナトリウムの含有濃度は、測定に悪影響を及ぼさないよう、０．０１〜３ｇ／Ｌであることが好ましく、０ｇ／Ｌである（含まれない）ことがより好ましい。
【００４１】
試薬に含有させる糖の種類は特に限定されないが、単糖類、多糖類、糖アルコールなどを用いることができる。単糖類としては、グルコース、フルクトースなどが例示され、多糖類としては、アラビノースなどが例示され、糖アルコールとしては、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、リビトールが例示される。試薬中の糖の濃度は、好ましくは１０〜７５ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜５０ｇ／Ｌである。これらの糖のうち一種類を用いてもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００４２】
試薬のｐＨを調整するために試薬に緩衝剤を添加することが好ましい。緩衝剤としては、例えばＨＥＰＥＳなどのグッド緩衝剤、リン酸緩衝剤などと、水酸化ナトリウムなどのｐＨ浸透圧調整剤を用いることができる。試薬のｐＨは、５．０〜９．０に調整されることが好ましい。
【００４３】
上述した各成分は、同一の容器に収容してもよいが、二つ以上の容器に収容して試薬キットとすることが好ましい。この試薬キットは、赤血球及び成熟白血球の細胞膜を損傷する界面活性剤、損傷した血球を収縮させる可溶化剤及び糖を含有する第一試薬と、色素を含有する第二試薬とを含む。この場合、色素の保存安定性を向上させるため、第二試薬の色素は有機溶媒に溶解されていることが好ましい。
【００４４】
また、本発明の別の実施形態の試薬キットは、赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、損傷した血球を収縮させる可溶化剤と、浸透圧調整剤とを含有する第一試薬と、核酸染色色素を含む第二試薬とを含む。
【００４５】
浸透圧調整剤は、第一試薬の浸透圧及び電気伝導度を所望の値に調整する為に添加される。この浸透圧調整剤を用いることにより、第一試薬の浸透圧は１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇに調整される。また、第一試薬の電気伝導度は６ｍＳ／ｃｍ未満に調整され、好ましくは０．０１〜３ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは０．１〜２ｍＳ／ｃｍに調整される。
【００４６】
浸透圧調整剤としては、糖やアミノ酸などを用いることができる。アミノ酸としては、バリン、プロリン、グリシン、アラニンなどを用いることができるが、グリシン及びアラニンの何れか又は両方を用いることが好ましい。アミノ酸の濃度としては、１〜５０ｇ／Ｌが好ましく、１０〜３０ｇ／Ｌがより好ましい。また、浸透圧調整剤としてさらに塩化ナトリウムを試薬に添加する場合は、上述したように、骨髄芽球の測定に影響を与えないよう、試薬中の濃度が０．０１〜３ｇ／Ｌであることが好ましく、０ｇ／Ｌであることがより好ましい。
【００４７】
上述の各成分を含む試薬と、生体試料とを混合して測定用試料を調製し、フローサイトメータを用いて、幼若白血球の分析を行うことができる。
【００４８】
生体試料と試薬（試薬キットの場合は全ての試薬の混合試薬）との混合比は、１：１０〜１：１０００であることが好ましい。生体試料中の血球と試薬との反応は、３〜１５秒間、２０〜４０℃で行うことが好ましい。反応温度が高いときは反応時間を短くし、反応温度が低いときは反応時間を長くすればよい。
【００４９】
試料の測定にフローサイトメータを用いた場合、フローセル中を流れる測定用試料中の血球に光を照射して散乱光や蛍光などの光学的情報を取得し、これに基づいて血球の種類が特定される。
【００５０】
具体的には、図１に示すようなフローサイトメータを用いることができる。以下、図１に基づき、本実施形態の一例として骨髄芽球測定について詳述する。
【００５１】
ノズル６から吐出された測定用試料は、フローセル２３のオリフィス部を流れる。このとき、試料中の血球は一列になってオリフィス部を通過する。光源２１から射出した光は、コリメートレンズ２２を介してフローセル２３を流れる血球に照射される。血球に光を照射することによって側方散乱光、側方蛍光及び前方散乱光が生じる。側方散乱光は、集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とを介して側方散乱光検出器（フォトマルチプライアチューブ）２９に入射する。側方蛍光は、集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とフィルタ２９とピンホール板３０とを介して側方蛍光検出器（フォトマルチプライアチューブ）３１に入射する。前方散乱光は、集光レンズ２４とピンホール板２５とを介して前方散乱光検出器（フォトダイオード）２６に入射する。
【００５２】
前方散乱光検出器２６から出力される前方散乱光信号と、側方散乱光検出器２９から出力される側方散乱光信号と、側方蛍光検出器３１から出力される側方蛍光信号とは、それぞれアンプ３２，アンプ３３及びアンプ３４により増幅され、解析部３５に入力される。
【００５３】
解析部３５は、受信した前方散乱光信号、側方散乱光信号及び側方蛍光信号から、前方散乱光強度、側方散乱光強度及び蛍光強度を算出する。解析部３５は、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第一の二次元分布図を作成し、この二次元分布図上で試料中の全白血球が出現する領域（全白血球領域）を特定する。さらに、全白血球領域に出現する細胞について側方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第二の二次元分布図を作成する。この二次元分布図上で、成熟白血球が出現する領域（成熟白血球領域）、リンパ球が出現する領域（リンパ球領域）、単球が出現する領域（単球領域）及び顆粒球が出現する領域（顆粒球領域）を設定する。さらに、骨髄芽球が出現する領域（骨髄芽球領域）及び幼若顆粒球が出現する領域（幼若顆粒球領域）を特定する。骨髄芽球領域に出現する細胞数を試料に含まれる骨髄芽球数として計数し、幼若顆粒球領域に出現する細胞数を試料に含まれる幼若顆粒球数として計数する。なお、骨髄芽球は細胞サイズが小さく、単核であるため、前方散乱光強度が強く、側方散乱光強度が弱い。また、上述したように殆ど染色されないため蛍光強度は弱い。幼若顆粒球は、細胞サイズが大きく、核が分葉しているため、前方散乱光強度及び側方散乱光強度が弱い。また、上述したように殆ど染色されないため、蛍光強度は弱い。
【００５４】
（実施例１）
以下の組成の第一試薬Ａ及び第二試薬を調整した。
＜第一試薬Ａ＞
ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル（日光ケミカルズ）  ２００００ｐｐｍ
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム  ５００ｐｐｍ
アラビノース  ３９．６ｇ／Ｌ
ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ
精製水  １Ｌ
上記を混合し、さらにＮａＯＨを添加してｐＨを７．０に調整した。第一試薬Ａの浸透圧は２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、電気伝導度は０．５９ｍＳ／ｃｍであった。
＜第二試薬＞
色素Ａ  ２０ｐｐｍ
エチレングリコール１Ｌ
【００５５】
第一試薬９８０μＬと、第二試薬２０μＬと、骨髄芽球を含む血液試料Ａ２０μＬとを混合し、３３℃で７秒間反応させた後、図１に示すフローサイトメータで側方散乱光強度、前方散乱光強度及び蛍光強度を測定した。なお、光源は赤半導体レーザを用いた。
【００５６】
得られた側方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第一の二次元分布図を作成し、全白血球領域を特定した。この図を図２に示す。全白血球領域内に出現する細胞数を全白血球数として計数した。
【００５７】
第一の二次元分布図中の全白血球領域に出現する細胞について、側方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第二の二次元分布図を作成し、側方散乱光強度が小さく蛍光強度が小さい領域を骨髄芽球領域として特定した。この図を図３に示す。骨髄芽球領域内に出現する細胞数を骨髄芽球数として計数した。
【００５８】
本実施例では、全白血球数に対する骨髄芽球の比率（骨髄芽球比率＝骨髄芽球数／全白血球数×１００）を算出した。骨髄芽球比率は４５．８％であった。
【００５９】
（実施例２）
試薬と血液試料Ａとを３５℃で反応させること以外は実施例１と同様にして、骨髄芽球比率を算出した。骨髄芽球比率は４２．６％であった。なお、実施例２で作成された第一の二次元分布図は図４に示され、第二の二次元分布図は図５に示される。
【００６０】
（比較例１）
ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル  ２４．０ｇ／Ｌ、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム  １．５ｇ／Ｌ、ＤＬ−メチオニン  ２０．０ｇ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ  １２．０ｇ／Ｌ、１Ｎ−ＮａＯＨ  ０．３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ４．０ｇ／Ｌ及び色素Ａ  ３．０ｍｇ／Ｌを含む試薬１ｍＬと血液試料Ｂ３３μＬとを混合して反応させること以外は、実施例１と同様にして骨髄芽球比率を算出した。骨髄芽球比率は２５．１％であった。なお、比較例１で作成された第一の二次元分布図は図６に示され、第二の二次元分布図は図７に示される。この試薬の浸透圧は３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、電気伝導度は７．４ｍＳ／ｃｍであった。
【００６１】
（比較例２）
試薬と血液試料Ｂとを３５℃で反応させること以外は比較例１と同様にして、骨髄芽球比率を算出した。骨髄芽球比率は７．２％であった。なお、比較例２で作成された第一の二次元分布図は図８に示され、第二の二次元分布図は図９に示される。
【００６２】
比較例１及び２より、同一の血液試料を用いたにもかかわらず、３３℃で反応させた場合の骨髄芽球比率（比較例１）に比べ、３５℃で反応させた場合の骨髄芽球比率（比較例２）は大変低い値を示した。これは、３５℃で反応させた場合は、骨髄芽球領域内に出現するべき骨髄芽球が領域外に出現したことに起因する。即ち、比較例１及び２で調製した試薬を用いると、反応温度が高いほど骨髄芽球が安定的に存在することができず、７秒間の反応の間に骨髄芽球が損傷してしまったと考えられる。
【００６３】
しかしながら、実施例１及び２より、３３℃で反応させた場合の骨髄芽球比率（実施例１）は、３５℃で反応させた場合の骨髄芽球比率（実施例２）と近似した値を示した。これは、実施例で調製された試薬と骨髄芽球とを高い温度で反応させても、骨髄芽球は実質的に損傷せず正確に計数することができたことを示す。即ち、実施例で調製された試薬を用いると温度に対する骨髄芽球の安定性が向上し損傷しにくくなった。以上より、実施例で調整された試薬を用いることにより正確に試料中の骨髄芽球を測定できることが確認された。
【００６４】
（実施例３）
第一試薬Ｂは、アラビノースではなくキシリトールを３９．５６ｇ／Ｌ、ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテルを２００００ｐｐｍではなく２５０００ｐｐｍ、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウムを５００ｐｐｍではなく７５０ｐｐｍ含有させること以外は第一試薬Ａと同様にして調製された。第一試薬Ｂの浸透圧は２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、電気伝導度は０．５９ｍＳ／ｃｍであった。
【００６５】
第一試薬Ａではなく第一試薬Ｂを用いること、及び血液試料Ａではなく血液試料Ｃを用いること以外は実施例１と同様にして骨髄芽球比率を算出した。また、第一試薬Ａではなく第一試薬Ｂを用いること、血液試料Ａではなく血液試料Ｃを用いること、及び７秒間ではなく１２秒間試薬と血液試料Ｃとを反応させること以外は実施例１と同様にして骨髄芽球比率を算出した。
【００６６】
（実施例４）
第一試薬Ｃは、キシリトールではなく、アラビノースを３９．５２ｇ／Ｌ含有させること以外は第一試薬Ｂと同様にして調製された。第一試薬Ｃの浸透圧は２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、電気伝導度は０．６２ｍＳ／ｃｍであった。
【００６７】
第一試薬Ｂではなく第一試薬Ｃを用いること以外は実施例３と同様にして骨髄芽球比率を算出した。
【００６８】
（実施例５）
第一試薬Ｄは、キシリトールではなく、アラニンを２３．１６ｇ／Ｌ含有させること以外は第一試薬Ｂと同様にして調製された。第一試薬Ｄの浸透圧は２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、電気伝導度は０．６１ｍＳ／ｃｍであった。
【００６９】
第一試薬Ｂではなく第一試薬Ｄを用いること以外は実施例３と同様にして骨髄芽球比率を算出した。
【００７０】
（実施例６）
第一試薬Ｅは、キシリトールではなく、グリシンを１９．５２ｇ／Ｌ含有させること以外は第一試薬Ｂと同様にして調製された。第一試薬Ｅの浸透圧は２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、電気伝導度は０．６３ｍＳ／ｃｍであった。
【００７１】
第一試薬Ｂではなく第一試薬Ｅを用いること以外は実施例３と同様にして骨髄芽球比率を算出した。
【００７２】
（比較例３）
血液試料Ａではなく血液試料Ｃを用いること以外は比較例１と同様にして骨髄芽球比率を算出した。また、血液試料Ａではなく血液試料Ｄをもちいること、及び７秒間ではなく１２秒間試薬と血液試料Ｃとを反応させること以外は比較例１と同様にして骨髄芽球比率を算出した。
【００７３】
実施例３〜６及び比較例３の結果を図１０に示す。図１０は、試料と試薬とを１２秒間反応させたときの骨髄芽球比率が、７秒間反応させたときの骨髄芽球比率に比べてどのくらい低下しているかを示したグラフである。
【００７４】
図１０より、比較例３の試薬を用いると、試薬と試料とを１２秒間反応させた場合、７秒間反応させた場合に比べて骨髄芽球の比率が２０％以上低下した。これは、反応時間が長くなるほど試薬の影響で骨髄芽球が損傷してしまったためであると考えられる。
【００７５】
実施例３〜６の何れかで調製した試薬を用いると、比較例３の試薬を用いた場合に比べて骨髄芽球比率の低下が１０％程度に抑えられた。即ち、実施例３〜６の試薬を用いることにより骨髄芽球の安定性が向上し、測定用試料中で骨髄芽球が損傷しにくくなった。以上のように、実施例３〜６の試薬を用いると骨髄芽球が損傷しにくく、正確に骨髄芽球を測定できることが確認された。
【００７６】
（実施例７）
以下の組成を含む第一試薬Ｆを調整した。
ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル  ２５０００ｐｐｍ
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム  ７５０ｐｐｍ
キシリトール  ３７．０ｇ／Ｌ
ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ
精製水  １Ｌ
上記を混合し、さらにＮａＯＨを添加してｐＨを７．０に調整した。第一試薬Ｆの浸透圧は２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、電気伝導度は０．６４ｍＳ／ｃｍであった。
また、第二試薬は実施例１で調整したものと同様のものを用いた。
【００７７】
第一試薬Ａではなく第一試薬Ｆを用いること、及び血液試料Ａではなく血液試料Ｄを用いること以外は実施例１と同様にして骨髄芽球比率を算出した。骨髄芽球比率は４５％であった。なお、実施例７で作成された第一の二次元分布図は図１１に示され、第二の二次元分布図は図１２に示される。また、図１２の第二の二次元分布図には、成熟白血球が出現する領域（成熟白血球領域）も設定した。
【００７８】
また、血液試料Ｄの骨髄芽球比率を顕微鏡により算出すると、５８．５％であった。実施例７で測定した骨髄芽球比率と顕微鏡により算出した骨髄芽球比率とが近似した値を示したことより、実施例７の試薬を用いると血液試料中の成熟白血球と骨髄芽球とを正確に弁別し、骨髄芽球を正確に計数できることが確認された。
【００７９】
（実施例８）
血液試料Ｄではなく血液試料Ｇを用いること以外は実施例５と同様にして骨髄芽球比率を算出した。骨髄芽球比率は５．５％であった。なお、実施例８で作成された第一の二次元分布図は図１３に示され、第二の二次元分布図は図１４に示される。
【００８０】
また、血液試料Ｅの骨髄芽球比率を顕微鏡により算出すると、骨髄芽球比率は６．３％であった。実施例８で測定した骨髄芽球比率と顕微鏡により算出した骨髄芽球比率とが近似した値を示したことより、実施例８の試薬を用いると血液試料中の成熟白血球と骨髄芽球とを正確に弁別し、骨髄芽球を正確に計数できることが確認された。
【００８１】
さらに、図１３に示される第一の二次元分布図に幼若顆粒球が出現する領域（幼若顆粒球領域）を設定し、この領域内に出現する細胞を幼若顆粒球数として計数した。この値に基づき、全白血球数に対する幼若顆粒球の比率（幼若顆粒球比率）を算出した。幼若顆粒球比率は１０％であった。
【００８２】
また、血液試料Ｅの幼若顆粒球比率を顕微鏡により算出すると、幼若顆粒球比率は１３％であった。実施例８で測定した幼若顆粒球比率と顕微鏡により算出した幼若顆粒球比率とが近似した値を示したことより、実施例８の試薬を用いると血液試料中の成熟白血球と骨髄芽球と幼若顆粒球とを正確に弁別し、骨髄芽球だけでなく幼若顆粒球をも正確に計数できることが確認された。
【００８３】
（実施例９）
血液試料Ｄではなく血液試料Ｆを用いること以外は実施例５と同様にして幼若顆粒球比率を算出した。幼若顆粒球比率は１２．４％であった。なお、実施例９で作成された第一の二次元分布図は図１５に示され、第二の二次元分布図は図１６に示される。
【００８４】
また、血液試料Ｅの骨髄芽球比率及び幼若顆粒球比率を顕微鏡により算出すると、幼若顆粒球比率は１０．８％であった。実施例９で測定した幼若顆粒球比率と顕微鏡により算出した幼若顆粒球比率とが近似した値を示したことより、実施例９の試薬を用いると血液試料中の成熟白血球と幼若顆粒球とを正確に弁別し、幼若顆粒球を正確に計数できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】フローサイトメータである。
【図２】実施例１における第一の二次元分布図である。
【図３】実施例１における第二の二次元分布図である。
【図４】実施例２における第一の二次元分布図である。
【図５】実施例２における第二の二次元分布図である。
【図６】比較例１における第一の二次元分布図である。
【図７】比較例１における第二の二次元分布図である。
【図８】比較例２における第一の二次元分布図である。
【図９】比較例２における第二の二次元分布図である。
【図１０】実施例３〜６及び比較例３の結果を示すグラフである。
【図１１】実施例７における第一の二次元分布図である。
【図１２】実施例７における第二の二次元分布図である。
【図１３】実施例８における第一の二次元分布図である。
【図１４】実施例８における第二の二次元分布図である。
【図１５】実施例９における第一の二次元分布図である。
【図１６】実施例９における第二の二次元分布図である。
【符号の説明】
【００８６】
６：ノズル  ２１：光源  ２２：コリメートレンズ  ２３：フローセル  ２４：集光レンズ  ２５：ピンホール板  ２６：前方散乱光検出器  ２７：集光レンズ  ２８：ダイクロイックミラー  ２９：側方散乱光検出器  ３０：ピンホール板  ３１：側方蛍光検出器  ３２：アンプ  ３３：アンプ  ３４：アンプ  ３５：解析部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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