(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定微生物数の検出可能限界値が、少なくとも食品の試料１ｇ中１０個相当（１０ＣＦＵ／ｇ）以下となるように培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法により検査する食品の微生物検査方法であって、
前記培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法が（１）食品の試料０．１ｇ以上の試料を含む液体を、有効濾過面積が直径２４ｍｍの円の面積と同等又はそれ以上の面積を有するメンブレンフィルターを用いて濾過し、（２）マイクロコロニーの大きさを２０μｍ乃至１５０μｍとなるように培養することを含み、
前記検査が、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法により増殖された特定微生物を、同軸落射による照射ではなく、観察光軸外から蛍光励起照明光を照射し、メンブレンフィルターの蛍光シグナルを、作動距離１０ｍｍ以上の低倍率光学系で観察することによりなされることを特徴とする食品の微生物検査方法。
【請求項２】
前記低倍率系が光学倍率３倍乃至６倍である請求項１に記載の食品の微生物検査方法。
【請求項３】
前記培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法において、低倍率光学系と固体撮像素子を組み合わせ、メンブレンフィルター全範囲に渡って自動的に走査し、メンブレンフィルターの蛍光シグナルを観察することを特徴とする請求項１又は２に記載の食品の微生物検査方法。
【請求項４】
メンブレンフィルターの蛍光シグナルの観察結果を利用し、観察領域に含まれる特定微生物の計数を自動化することを特徴とする請求項１から３いずれか１項に記載の食品の微生物検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品製造業、食品加工業などの産業分野で、インサイチューハイブリダイゼーション法を用いて、検査対象微生物を特異的に検出および計数するための方法に関する。          
【背景技術】
【０００２】
大腸菌、サルモネラ、リステリア、腸炎ビブリオ、腸内細菌など特定微生物の検出あるいは計数をする微生物検査は、食品や環境中の衛生評価のために必須のものである。一般に、これらの検査は培養法により行われ、試料を寒天培地に接種して培養し、疑わしいコロニーについて推定試験及び確認試験を行い、陽性確定に至るまで１日〜８日間の日数を要する。
【０００３】
近年、検出対象微生物のｒRNAの標的塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに蛍光物質を標識したプローブを用いる蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法により、試料中の検出対象微生物を迅速に検出あるいは計数する方法が開発された（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。この方法は、次のように行う。
【０００４】
試料懸濁液にパラホルムアルデヒド溶液等を添加して、固定化処理を行い（約２時間）、これをスライドガラス上に約５μｌ載せ、乾燥させる。これに、ハイブリダイゼーション溶液及びプローブを加え、特定温度に保温後（約３時間）、洗浄して乾燥させ、封入剤を加え、カバーガラスを被せて標本とする。この標本を蛍光顕微鏡で観察し、検出対象微生物をプローブ由来の蛍光シグナルにより検出し、計数する。
【０００５】
蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法は、特定したい微生物の種類に応じて使用するプローブの種類を変えれば、様々な微生物に対して、それぞれ微生物を特定して検出および計数が可能で、培養が不要なので迅速（約５時間）に結果を得られ、主に微生物生態学の研究分野で用いられている。
【０００６】
しかし、この方法では、検出可能限界値が１０５ＣＦＵ／ｇ程度であり（例えば、非特許文献２参照）、検出された微生物の生死を区別できない（例えば、非特許文献３参照）、という欠点がある。また、試料が採取されるまでに置かれた環境条件により、検出対象微生物細胞内のｒRNAコピー数が少なくなった場合、検出対象微生物を検出できないなどの問題もあり（例えば、非特許文献２参照）、食品製造業、食品加工業などの産業分野での微生物検査への応用は困難であった。
【０００７】
本発明者らは、これらの産業分野における微生物検査に、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法を適用するために、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法を開発し、上記の問題を解決した（例えば、特許文献２、非特許文献４参照）。この方法は、次の（１）〜（７）の工程により行う。
【０００８】
（１）微生物懸濁液試料のろ過
試料懸濁液をメンブレンフィルター（ポアサイズ０．４５μｍ以下）で濾過し、対象細菌をフィルター上に捕集する。
（２）固形培地上での培養
同フィルターを固形培地（例えば寒天培地）に置き、所定時間（例えば約６時間）保温する。
（３）固定処理
このフィルターを、エタノールを含む濾紙に５分程度置き、固定処理する。
（４）ハイブリダイゼーション
これにハイブリダイゼーション溶液とプローブを添加し、所定温度で保温する。
（５）洗浄
所定温度の洗浄液に、同フィルターを１５分間浸し洗浄後、さらに蒸留水ですすぐ。
（６）標本作成
同フィルターをスライドガラス上に置き、その上に封入剤を加え、カバーガラスを被せ、これを標本とする。
（７）観察
蛍光顕微鏡で標本を観察する。
【０００９】
培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法には、従来の蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法にはない三つの利点がある。一つ目は、培養によりメンブレンフィルター上に微生物のマイクロコロニーが形成され、微生物が生きていることの証となること。二つ目は、試料中の微生物細胞内ｒRNAコピー数が少なくなった場合でも、培養により、微生物細胞内ｒRNAコピー数が増加し、検出対象微生物の強い蛍光シグナルが得られ、検出および計数が可能となること。そして三つ目は、微生物よりは大きいマイクロコロニーを観察すればよいので、通常は４０倍以上が必要な蛍光顕微鏡の対物レンズ倍率を１０倍まで下げることが可能となり、直径１３ｍｍのメンブレンフィルターを用いた場合には、約５分間で２７視野の検鏡でフィルター全域を観察できることである。このとき、多くの固形食品ではメンブレンフィルターの濾過量は０．０１ｇなので、検出可能限界値は１００ＣＦＵ／ｇであり、上述の従来型の蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法の１０００倍の検出感度を実現できることになる。
【００１０】
【特許文献１】特表２００４−５２３２２３
【特許文献２】特開２００４−１６０１４
【非特許文献１】Amann, R., Snaidr, J., Wagner, M., Ludwig, W. and Schleifer, K.-H. (1996) In situ visualization of high genetic diversity in a natural microbial community. Journal of Bacteriology 178, 3496-3500.
【非特許文献２】Amann, R. I., Ludwig, W. and Schleifer, K.-H. (1995) Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169.
【非特許文献３】Tolker-Nielsen, T., Larsen, M. H., Kyed, H. and Molin, S. (1997) Effect of stress treatments on the detection of Salmonella typhimurium by in situ hybridization. International Journal of Food Microbiology, 35, 251-258．
【非特許文献４】Ootsubo etal. Journal of Applied Microbiology 2003, 95, 1182-1190．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上のように、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法は、従来の蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法の持つ欠点を克服し、食品製造業、食品加工業などの産業分野での微生物検査への応用の道を拓いたが、実際に産業の現場で食品の微生物検査に応用しようとした場合には、さらに以下の技術課題を克服しなければならない。
【００１２】
食品製造業等の産業分野で、従来から広く行われている培養法による微生物の検査では、一定量の食品試料中に含まれる生きた特定微生物の検出あるいは計数を行っている。従って、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法を適用するためには、特定微生物判定の迅速さのみならず、特定微生物数の検出可能限界値が、少なくとも従来から行われている培養法と同等である必要がある。広く行われている混釈平板培養法においては、通常、食品試料０．１ｇ当たり１個単位、即ち、１ｇ当たりでは１０個相当（１０ＣＦＵ／ｇ）の微生物数の検出が可能であることが必要とされており、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法を適用するに際しても、これと同等の検出可能限界値を実現する必要がある。
【００１３】
このためには、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法を適用する場合にも、１枚のメンブレンフィルター（ポアサイズ０．４５μｍ以下）を用いて、食品試料を少なくとも０．１ｇ以上含んだ懸濁液の濾過を行い、対象微生物をフィルター上にもれなく捕集し、フィルター上の対象微生物を１個単位で正確に計数し、検出可能限界値が１０ＣＦＵ／ｇ以下になるようにする必要がある。しかしながら、食品によってはメンブレンフィルターが目詰まりを起こし、食品試料を０．１ｇ含んだ懸濁液を濾過できない場合が多い。このような場合、メンブレンフィルターのサイズを大きくして、濾過面積を増やすことで目詰まりを防ぐのが妥当である。しかしながら、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法では、メンブレンフィルター上の検出対象微生物の蛍光シグナルを蛍光顕微鏡により観察することが必須であるため、濾過面積の拡大は、直ちに観察視野数の二乗比例的な増加に結びつく。
【００１４】
例えば、直径１３ｍｍのメンブレンフィルターを用いた場合に、１０倍の対物レンズを使用してこの全領域を観察するとすれば、検出対象微生物の蛍光シグナルを１個たりとも見逃さないように細心の注意をはらいながら、１検体当たり２７視野観察する必要があり、これに必要となる時間と検査員の疲労を考えれば、これだけでも産業現場での食品微生物検査に応用するのは困難といえる。これをほぼ倍の直径２５ｍｍのメンブレンフィルターにすれば、約２０分間の時間を要して１１０視野以上観察しなければならなくなり、到底現実的な方法とはいえないものとなる。
【００１５】
このため、従来は懸濁液の濾過量は少なくなるがメンブレンフィルターの面積を小さくするか、面積の大きなメンブレンフィルターを使用して規定量を濾過し、そのメンブレンフィルターの一部分について観察せざるを得なかった。しかしこうした方法では、従来から行われている培養法と同等の検出可能限界値を実現していることにはならず、食品製造業、食品加工業などの産業分野での微生物検査への応用は難しかった。
【００１６】
本発明は、このように十分な検出可能限界値を実現しようとすれば、メンブレンフィルター面積の増大に伴い膨大な観察時間と労力が必要となり、この労力を軽減しようとすれば十分な検出可能限界値を確保できなくなるというジレンマを解消し、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法の特長を十分生かし、食品製造業、食品加工業などの産業分野で利用可能な、生きている特定微生物について迅速な検出・計数が可能で、検出感度の高い微生物検査を実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明者らは、非常な多数の試行錯誤の後、有効濾過面積が、少なくとも直径２４ｍｍ以上の円の面積と同等か、それ以上の面積を有するメンブレンフィルターを用いることにより、１枚のメンブレンフィルターで食品試料を少なくとも０．１ｇ以上含んだ懸濁液を濾過することができることを見出した。更に、培養時間を適切に調整することで、フィルター上のマイクロコロニーの大きさが２０μｍ乃至１５０μｍになるように設定することにより、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション操作を行い、上記メンブレンフィルター上の検出対象微生物のマイクロコロニーが発する蛍光シグナルを、低倍率の対物レンズを使用する蛍光検出光学系で観察できることを見出した。更に、蛍光シグナル像を固体撮像素子の撮像面上に結像し、蛍光画像化するとともに、上記メンブレンフィルターを搭載したステージを、メンブレンフィルター全域をカバー可能な作動範囲で、二次元的に高速走査可能なように構成し、メンブレンフィルター全域に渡って取得した蛍光画像を画像処理手段により画像処理して、メンブレンフィルター上の検出対象微生物の個数を数分で自動的に計数するように構成した。
【００１８】
従来の培養法である混釈平板法で使用する食品試料の１０倍希釈懸濁液の液量は１ｍｌで、この中に含まれている食品試料の重量は０．１ｇ相当となる。従って、この０．１ｇの食品試料中に含まれている１個の検出対象微生物を計数するのが、この方法での検出可能限界であり、食品試料１ｇ当たりの単位量に換算すると、１０個相当（１０ＣＦＵ／ｇ）の微生物数の検出が可能ということになる。従って、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法においても、少なくとも０．１ｇの食品試料を含んだ懸濁液を、先ずは濾過する必要がある。本発明者らが様々な食品試料で実験を繰り返したところ、これを濾過するには、有効濾過面積が少なくとも直径２４ｍｍ以上の円の面積と同等以上の大きさのメンブレンフィルターが必要であることがわかった。また、より確実に、多くの食品試料において、少なくても０．１ｇの試料を含んだ懸濁液を濾過するには、直径４７ｍｍのメンブレンフィルターを用いる必要があることもわかった（表１を参照。表１の実験においては、メンブレンの直径が２５ｍｍ、ポアサイズが０．４μmであるメンブレンフィルターを有するトランスウェルインサート、又は直径が４７ｍｍ、ポアサイズが０．４μmであるメンブレンフィルターで吸引濾過した。）。
【００１９】
【表１】
0004785449.tif 000002
【００２０】
直径４７ｍｍのメンブレンフィルターを用いた場合の有効濾過面積は、減圧濾過用フィルターホルダー（アドバンテック社製）を用いた場合、ほぼ直径４０ｍｍの円の面積となるが、この全域を仮に１０倍の対物レンズを使用して検査しようとすると、顕微鏡視野の関係から単純に計算しても２５０視野以上の検鏡が必要となる。そこで発明者らは、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法の特徴である、培養時間を制御することで、メンブレンフィルター上に形成されるマイクロコロニーの大きさを制御することが可能という特徴を利用し、検出対象細菌の至適温度下にて、培養時間を５時間から６時間の間で調整することで、マイクロコロニーの大きさを２０μｍ乃至１５０μｍの間に調整した。これにより蛍光シグナルの強度と発光面積が非常に大きくなり、通常、蛍光顕微鏡光学系を使用しなければ観察不能な蛍光シグナルを、簡易な低倍率蛍光検出光学系と安価な固体撮像素子の組み合わせで観察可能とした。なお、上記の光学倍率としては、３倍乃至６倍程度を使用すれば十分なことを見出したため、メンブレンフィルター全域の自動検査に適した広視野で、かつ検鏡途中の焦点調節が不要な程度に焦点深度の大きな光学系が利用可能となった。
【００２１】
こうして低倍率蛍光検出光学系で固体撮像素子の撮像面上に蛍光シグナル像を結像し、蛍光画像化するとともに、上記メンブレンフィルターを搭載したステージを、メンブレンフィルター全域をカバー可能な作動範囲で二次元的に高速走査可能なように構成し、メンブレンフィルター全域に渡って蛍光画像を取得可能なように構成したことで、検査員は蛍光画像を表示する画像モニター上でマイクロコロニーの蛍光像を確認可能となり、通常の検鏡作業よりは大幅に疲労を軽減することが可能となった。単に特定の検出対象微生物の有無を確認するのみなら、こうした構成でも食品製造業、食品加工業などの産業分野で、微生物検査方法として利用可能である。
【００２２】
しかしながら、数多くの画像を観察して検出対象微生物の正確な計数を行うには、検査員の労力に頼るのでは限界があり、検査試料数が多い食品製造業、食品加工業などの産業分野では、この部分の自動化も必要になる。そこで発明者らは、メンブレンフィルター全域に渡って取得した蛍光画像を画像処理手段に入力して画像処理し、メンブレンフィルター上の検出対象微生物の個数を自動的に計数可能なように構成した。画像処理方法は、多くの生鮮食品の場合には、マイクロコロニーの蛍光像がノイズとなる介在物等の蛍光像よりも光量や発光面積の点で大きく勝り、簡単に弁別可能なため、安価な画像処理機器でもリアルタイムに実現可能な一般的な粒子計数プロセスで計数可能である。
【００２３】
また本発明では、蛍光強度が十分強いため、メンブレンフィルター面までの作動距離を長く取れる低倍率蛍光検出光学系を適用したことで、通常の蛍光顕微鏡光学系で必要とされる高価な同軸落射蛍光照明は不要となった。同軸落射蛍光照明を不要にしたことで、蛍光励起用照明光学系は蛍光観察光学系とは完全に独立させた自由な構成とすることが可能になり、通常の蛍光顕微鏡光学系で必要なダイクロイックミラーが不要となるとともに、発熱処理が問題となる蛍光励起用照明ランプの自由な配置が可能となった。さらに、マイクロコロニーの蛍光強度が十分強いので、蛍光励起用照明光源としては、通常使用されるキセノンランプや水銀ランプを必ずしも必要とせず、メタルハライドランプやハロゲンランプ、高輝度ＬＥＤでも十分観察可能となった。このとき蛍光励起用照明光学系は自由な配置が可能なので、必要に応じて多方向から蛍光励起用照明を照射することも可能である。
【発明の効果】
【００２４】
上述したように本発明の微生物検査方法は、生きている特定微生物について、従来の培養法と同等の高い検出感度で、従来にはない迅速な定性・定量を可能とし、検査の自動化を実現したので、食品製造業、食品加工業などの産業分野での、製造工程中での検査への利用や、製品出荷前の検査など、正確性と迅速性を要求される産業上の多くの工程で利用可能で、産業上きわめて有益なものである。また、本発明は、高価な蛍光顕微鏡を使用せずに、自動測定を可能としたので、企業規模を問わずに利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
１．本願発明の概要
本願発明には、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法を用いる食品等の微生物検査方法において、有効濾過面積が直径２４ｍｍの円の面積と同等又は、それ以上の面積を有するメンブレンフィルター、例えば、メンブレンの直径が２５ｍｍ、ポアサイズが０．４μmであるメンブレンフィルターを有するトランスウェルインサート、好適には、直径４７ｍｍ、ポアサイズが０．４μmであるのメンブレンフィルターにより濾過する工程を含むことを特徴とする、食品等の微生物検査方法を包含する。
【００２６】
更に本願発明には、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法を用いる食品等の微生物検査方法において、有効濾過面積が直径２４ｍｍの円の面積と同等又はそれ以上の面積を有するメンブレンフィルターを用いることにより、低倍率蛍光検出光学系を用いて蛍光シグナルを観察することを特徴とする、食品等の微生物検査方法を包含する。
【００２７】
更に、本願発明には、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法を用いる食品等の微生物検査方法において、有効濾過面積が直径２４ｍｍの円の面積と同等又はそれ以上の面積を有するメンブレンフィルターを用いることにより、低倍率蛍光検出光学系を用いて、メンブレンフィルターの蛍光シグナルを固体撮像素子により観察し、好適には更に観察部位をメンブレンフィルター全範囲に渡って自動的に走査可能とし、更に好適には、観察領域に含まれる特定微生物の計数を自動化することを特徴とする、食品等の微生物検査方法を包含する。
【００２８】
（１）培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法
本願発明において、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法には、微生物を含有する試料を培地で培養して増殖させた後に、微生物検出用の蛍光プローブを用いて検出する方法を包含する。
【００２９】
培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーションは、例えば、次のようにして行うことができる。
（イ）試料の濾過  
メンブレンフィルターを吸引濾過フィルターユニットに組み込み、試料液を濾過する。高さのある外枠つきメンブレンフィルターを用いる場合は、吸引濾過用フィルターベースに置き、試料液を濾過する。
（ロ）培養
ベース上のメンブレンフィルターを固形の培地（ゲル状培地、あるいは液体培地を含む繊維状パット）の上に置き、フィルターの他方の面（裏側面）と培地を接触させる。所定条件で培養し、マイクロコロニーをフィルターの表側の面上に形成させる。例えば、高さのある外枠つきメンブレンフィルターを寒天培地上に置く、検出対象細菌の至適温度下にて、約5〜６時間程度培養することにより、マイクロコロニーをメンブレンフィルターの表側に形成させることができる。
（ハ）固定
メンブレンフィルターを適切な固定液（エタノールなど）に浸し、その後乾燥させる。高さのある外枠つきフィルターを用いる場合は、例えば、メンブレンフィルターをエタノールを含んだろ紙の上におくことにより固定することもできる。
（ニ）ハイブリダイゼーション
例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液と特定細菌検出用蛍光標識プローブを入れた専用の容器に、フィルターを移しハイブリダイゼーションさせることができる。高さのある外枠つきフィルターを用いる場合は、フィルター上に特定細菌検出用蛍光標識プローブとハイブリダイゼーション緩衝液を添加し、所定の温度で反応させる。
（ホ）洗浄
例えば、メンブレンフィルターを、ピンセットを用いて、専用の容器に移し、その中でフィルターを洗浄液に浸して洗浄できる。また、高さのある外枠つきメンブレンフィルターを用いる場合は、フィルター上に洗浄液を添加し、所定の温度で反応させることもできる。
（ヘ）標本作成
例えば、メンブレンフィルターをスライドガラス上に置き、その上に封入剤を加え、次いでカバーガラスを被せこれを標本とする。しかし、高さのある外枠つきメンブレンフィルターを用いる場合は、その作業は不要となる。
（ト）蛍光顕微鏡による観察
作成した標本もしくは外枠付きメンブレンフィルターを取り出し、これを蛍光観察装置（蛍光顕微鏡など）に供し特定細菌の検出・計数をする。
【００３０】
なお、この際、蛍光顕微鏡観察に低倍率の対物レンズを使用でき、広い観察視野が得られ観察時間の短縮がはかられる他、低倍率レンズの使用により標本とレンズとの距離が大きくなるので、対物レンズにぶつからない高さの外枠つきメンブレンフィルターが観察に用いることができるようになる。これにより、外枠付きメンブレンフィルターに接触せずにフィルターの全面積にわたりスポットを計測できる。
【００３１】
（２）高感度培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法の実施条件
本願発明では、特定微生物数の検出可能限界値が、少なくとも食品等の試料１ｇ中１０個相当（１０ＣＦＵ／ｇ）以下となるように、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法の実施条件を調整する。
【００３２】
[メンブレンフィルター]
具体的には、食品等の試料0.1ｇを一時に検査できるようにすればよく、そのためには、例えば、メンブレンフィルターとして、有効濾過面積が直径２４ｍｍの円の面積と同等又はそれ以上の面積を有するメンブレンフィルター、例えば、直径４７ｍｍのメンブレンフィルターを用いることができる。
【００３３】
メンブレンフィルターの素材は、通常市販されているいずれのものでよく、例えば、ポリカーボネート又はセルロースアセテートを用いることができる。平均ポアサイズは、細菌を捕集できるように、０．２μｍ〜０．５μｍが望ましい。またメンブレンフィルターの底面は、吸引濾過フィルターベースに設置でき、固体培養時に固体培地に密接でき、顕微鏡の操作台に設置できる形状であればよい。
【００３４】
必要に応じて、メンブレンフィルターの表側の面に、その外部に高さのある外枠（以下外枠と言う。）を設けることもできる。
【００３５】
外枠をメンブレンフィルターに付けることにより、一定量の液体をメンブレン上に収容可能となり、メンブレンフィルター上にハイブリダイゼーション用及び洗浄用の溶液が保持できるようになる。また、この外枠により、メンブレンフィルターはたるみのない状態で保持できる。外枠は、例えば、メンブレンフィルターに隙間なく直接に接着することもできるが、メンブレンフィルターの周囲にメンブレンフィルターをたるまないように保持する保持枠を設けその上に高さを持った外枠を設けることもできる。外枠の素材は、プラスチック、金属、セルロースなど、一定の硬さとフィルターをたるみなく張らせるための一定のテンションに耐えられる素材で液体が透過しない素材であればよい。外枠の高さは、対物レンズ（２倍〜１０倍）を用いて外枠付フィルター面に焦点を合わせたとき、対物レンズが該外枠に接触しない高さで、通常の蛍光顕微鏡用であれば、例えば、３ｍｍ〜３０ｍｍとすることができる。外枠の形状は、例えば、円柱状、四角などに形成でき任意であるが、円柱状の外枠とすることが望ましい。円柱状の外枠は、メンブレンフィルターの面積よりも開口部の面積が大きくなるように、例えば、ファンネル状、漏斗状に形成することもできる。外枠付きメンブレンフィルターとしては、メンブレンフィルターに外壁を設けた市販品、例えば、パーミアブルサポートトランスウェルを用いることもできる。
【００３６】
また、場合によってはメンブレンフィルターの裏面にも、培地を含む容器を装着できる高さのある外枠を設けてもよい。
【００３７】
[蛍光プローブ]
蛍光プローブとしては、種々の蛍光プローブを用いることができるが、好適には、オリゴヌクレオチドを蛍光標識したプローブを用いることができる。具体的には、蛍光標識したｒＲＮＡに対するオリゴヌクレオチドプローブが挙げられ、蛍光標識としては、TAMRA(N,N,N',N'-Tetramethyl-6-6carboxyrhodamine）、フローレッセン、ローダミンなどが挙げられる。更に具体的には、TAMRA(N,N,N',N'-Tetramethyl-6-6carboxyrhodamine）で蛍光標識をしたオリゴDNAヌクレオチドからなる腸内細菌科細菌検出用プローブ[5'-TGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTT-3']（特開2001−136969））やTAMRA(N,N,N',N'-Tetramethyl-6-6carboxyrhodamine）で蛍光標識をしたCl. perfringens検出用プローブCLP-180[5'-AATGATGATGCCATCTTTCAACA-3']（特願2004−336584）などを用いることができる。
【００３８】
（２）  蛍光顕微鏡、低倍率蛍光検出光学系
本願発明では、試料中の検出目的とする微生物(特定微生物とも言う)を培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法により増殖させるため、上述したように通常の蛍光顕微鏡を用いることもできるが、蛍光顕微鏡と機能的には同等で簡便な低倍率蛍光検出光学系によることもできる。
【００３９】
具体的には、倍率が、２〜１０倍、好適には、３〜６倍の倍率の低倍率蛍光検出光学系を用いることができる。また、照明方法を簡易化するために、作動距離が１０ｍｍ以上の対物レンズを用いることが好ましい。このように対物レンズの作動距離を大きくすることで、照明光が対物レンズ枠体に遮られず、同軸落射照明を用いることなくとも、斜め上方から照明する、単なる落射照明が可能になり、低倍率蛍光検出光学系を単純化することができ、コストを下げることができる。
【００４０】
本発明で蛍光観察に用いる簡便な低倍率蛍光検出光学系の蛍光励起用照明光源としては、通常使用されるキセノンランプ、水銀ランプに加え、メタルハライドランプやハロゲンランプ、高輝度ＬＥＤを用いることが可能であり、このとき蛍光励起用照明光学系は対物レンズの作動距離が大きいので、空間的に自由な配置が可能で、観察光軸外から蛍光励起照明光を照射することが好ましく、必要に応じて多方向から蛍光励起用照明を照射することも可能である。
【００４１】
（３）  計測手段  自動化手段
本願発明では、低倍率蛍光検出光学系で固体撮像素子の撮像面上に蛍光シグナル像を結像し、蛍光画像として画像モニター等で観察することもできる。更に上記のメンブレンフィルターを搭載したステージを、メンブレンフィルター全域に渡って二次元的に高速走査可能なように構成して、メンブレンフィルター全体の蛍光画像を観察することもできる。
【００４２】
また、この蛍光画像信号を画像処理装置に入力し、簡単にメンブレンフィルター全体の特定微生物数を計数することもできる。
【００４３】
２．本発明の具体的態様
以下、本発明の実施の形態を、図に基づいて説明する。
図１において、１はトランスウェルインサート(直径２５mm)、１ａはトランスウェルインサートに固着されたメンブレンフィルター、２は試料台、３は紙面に垂直な方向（５を付した）に駆動可能な直進ステージ、４は５に直交する矢印６方向に駆動可能な直進ステージで、７は対物レンズ、８は蛍光検出用フィルター、９は結像レンズ、１０は撮像面１１を内蔵する固体撮像カメラ、１２は蛍光励起用光源、１３はライトガイド、１４はコリメータレンズ、１５は蛍光励起用フィルター、１６は照明光収束用レンズ、１７は画像モニターである。
【００４４】
試料台２に搭載されたトランスウェルインサート１のメンブレンフィルター１ａには、蛍光励起用光源１２からライトガイド１３により導光され、コリメータレンズ１４、蛍光励起用フィルター１５を経て、照明光収束用レンズ１６で集光された蛍光励起用照明光が斜め上方より照射される。標識蛍光色素としてTAMRAを用いる場合には、蛍光励起用フィルター１５としては、５５０ｎｍ近傍の透過特性を持つ干渉フィルターを使用するのが一般的である。また、蛍光励起用光源１２としては、通常蛍光励起用に使用されるキセノンランプや高圧水銀ランプの使用を妨げるものではないが、安価なメタルハライドランプやハロゲンランプを使用した方が、光源の寿命も長く経済的にも効果が大きい。標識蛍光色素の種類によっては、蛍光励起用光源として高輝度発光ダイオードを使用して高効率に蛍光を励起可能な場合があり、その場合には図２のように、発光ダイオードランプ１８の出力光を、蛍光励起用フィルター１５を経ずに、照明光収束用レンズ１６で蛍光励起用照明光として直接メンブレンフィルター１ａに照射してもよい。また、この例ではライトガイド１３により導光する場合を記載しているが、ライトガイドを使用せずにコリメータレンズ１４に直接蛍光励起用光源１２からの照明光を入射しても何ら効果は変わらない。
【００４５】
メンブレンフィルター１ａ上の蛍光励起用照明光照射部分１ｂの像は、対物レンズ７及び、結像レンズ９の作用により、固体撮像カメラ１０内の撮像面１１に結像される。このとき該光路中に、例えば、標識蛍光色素TAMRAの発光波長に対応した干渉フィルター等の蛍光検出用フィルター８を挿入すれば、固体撮像カメラ１０により得られる画像は、このプローブ特有の赤色蛍光に由来するマイクロコロニーの画像となり、必要に応じて画像モニター１７に表示される。
【００４６】
このとき対物レンズ７及び結像レンズ９により撮像面１１上に結像される蛍光励起用照明光照射部分１ｂの像の光学倍率は、マイクロコロニーの大きさが２０μｍ乃至１５０μｍに調整されているので、３倍乃至６倍の低倍率で十分であり、作動距離を１０ｍｍ以上確保しても十分観察可能である。また低倍率であるため、広い観察視野の確保も可能で、通常の蛍光顕微鏡を使用した場合に比べて、直径比で１０倍、面積比で１００倍以上の広視野を得られ、検鏡回数の大幅な低減にも寄与する。
【００４７】
ここで、３及び４の直進ステージを観察視野に相当するステップずつ自動的に順次駆動して、メンブレンフィルター１ａの全面を走査すれば、画像モニター１７上にはメンブレンフィルター１ａ全面のマイクロコロニーの画像が表示され、検査員は蛍光顕微鏡による検鏡をすることなく、該当マイクロコロニーの有無を観察可能である。このとき、対物レンズ７及び結像レンズ９による光学倍率が低いので、焦点調節操作を一度行えば、メンブレンフィルター１ａ全面に渡って、良好な結像が得られ、高価な自動焦点装置は必要ない。なお、この例では光学系を固定してトランスウェルインサート１側を移動しているが、相対的に両者が移動してメンブレンフィルター１ａの全面を観察できればよいので、トランスウェルインサート１を固定して、光学系を移動しても上述の例と同じ効果が得られるのは言うまでもなく、光学系を移動する場合においても、本発明の光学系は小型軽量化が容易なため、安価に実現可能である。
【００４８】
次に、図３に基づき、自動的にメンブレンフィルター全面に渡って計数する例を示す。図３において、１９は画像処理手段、２０は直進ステージ制御手段であり、図１と同一の要素に関しては、図１と同じ番号を付してある。固体撮像カメラ１０により得られる画像は、図１において画像モニター１７に表示される他、画像処理手段１９へも入力される。多くの生鮮食品の場合には、マイクロコロニーの蛍光像がノイズとなる原料由来の自家蛍光物質等の蛍光像よりも光量や発光面積の点で大きく勝り、簡単に弁別可能なため、画像処理手段１９では、一般的な画像処理手順である画像補正、ノイズ除去、二値化、ラベリング、計数という安価な画像処理機器でもリアルタイムに実現可能な一般的な粒子計数手順に従うことで、容易に計数可能である。画像処理手段１９での計数処理は、直進ステージ３及び４を統括的に制御する直進ステージ制御手段２０との通信により、メンブレンフィルター１ａの全面に渡って１観察視野ごとに順次行われるので、最終的には、メンブレンフィルター１ａの全面でのマイクロコロニー数を計数可能である。
【００４９】
次に、図１と同一の要素に関しては、図１と同じ番号を付して、図４に基づき、蛍光励起用照明光を照射する別の例を示す。蛍光励起用光源１２から２分岐したライトガイド１３ａ、１３ｂにより導光され、それぞれコリメータレンズ１４ａ、１４ｂ、蛍光励起用フィルター１５ａ、１５ｂを経て、照明光収束用レンズ１６ａ、１６ｂで集光された蛍光励起用照明光は、試料台２に搭載されたトランスウェルインサート１のメンブレンフィルター１ａに、異なる斜め上方２方向より照射される。蛍光励起用光源１２の出力光は、通常その一部分のみがライトガイドに入射され利用されるだけなので、このように２分岐することで蛍光励起用光源１２の出力光の有効利用が図られるとともに、同時に複数の蛍光励起用照明光を照射することで、マイクロコロニーの蛍光強度をより高くすることが可能である。さらにトランスウェルインサート１のように、メンブレンフィルター外周部に光を遮蔽する可能性がある部材が固着されている場合においても、蛍光励起用照明光を確実にメンブレンフィルター１ａに照射可能という効果が得られる。図４においては、ライトガイドを２分岐した場合のみを記載したが、必要に応じて３分岐、４分岐と分岐数を増やしてもむろん構わない。
【００５０】
また複数の蛍光励起用照明光を同時に照射可能なので、検出したい特定微生物の種類ごとに、吸収波長帯域は異なるが、蛍光発光波長帯域が近傍にあるような標識蛍光色素を選択し、蛍光励起用フィルター１５ａ、１５ｂをそれらの標識蛍光色素の吸収波長に対応した狭帯域の透過特性を持たせることで、異なる種類のプローブにより複数種類の特定微生物を同時に検出することも可能である。また２１ａ、２１ｂで示したような光路中に挿抜可能なシャッターを設けることにより、交互に蛍光励起用照明光を照射するように構成することも容易に可能となり、蛍光励起用フィルター１５ａ、１５ｂと蛍光検出用フィルター８の組み合わせを適切に調整することで、きわめて簡単な構成で多波長励起によるマルチバンドの蛍光画像の観察が可能となる利点もある。
【００５１】
以上の例はメンブレンフィルター１ａの直径が２５ｍｍの場合を記したが、４７ｍｍの場合も走査面積は拡大するものの基本的動作は同様である。
【実施例１】
【００５２】
まず、以下の（１）から（３）の手順で、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法を適用する。
（１）供試菌株  腸内細菌科細菌としてEscherichia coli ATCC11775を用いる。
（２）供試食品試料として、野菜（キャベツ、レタス）、飲料水（ビール、オレンジジュース、サイダー）を用いる。飲料水を除く各食品試料の場合、試料１０ｇに滅菌生理食塩水９０ｍｌ加え（１０倍希釈）、ストマッカーで懸濁後、これに供試菌株Escherichia coli ATCC11775を添加し、食品試料調製液として調製する。飲料水の場合は、試料を希釈せず、供試菌株Escherichia coli ATCC11775を直接添加して食品試料調製液として調製する。
【００５３】
（３）メンブレンフィルターとして、トランスウェル（corning社）を用いた。食品試料調製液は、野菜、オレンジジュースの場合は試料の０．１ｇ相当（検出限界１０CFU/ｇ）用い、炭酸飲料およびビールの場合は試料の１ｇ相当（検出限界１CFU/ｇ）を、メンブレンの直径が２５ｍｍ、ポアサイズが０．４μmであるメンブレンフィルターを有するトランスウェルインサートで吸引濾過後、トランスウェルインサートをトリプトソーヤ寒天培地（日水製薬社）上に置き、３７℃，６時間、培養し、フィルター表面上にコロニーを形成させた。培養後、トランスウェルインサートを１００％エタノールを含む濾紙上に置き、室温で細胞固定を５分間行う。次にトランスウェルインサートをマルチプルウェルに装着し，トランスウェルインサート内にハイブリダイゼーションバッファー（0.9M NaCl、20% formamide、200mM Tris-HCl (pH7.4)、0.01% SDS）９００μｌを静かに注入し、６０℃でプレハイブリダイゼーションを１０分間行う。
【００５４】
その後さらにTAMRA(N,N,N',N'-Tetramethyl-6-6carboxyrhodamine）で標識したオリゴDNAヌクレオチドからなる腸内細菌科細菌検出用プローブ（特開２００１−１３６９６９）を５０ｐｍｏｌ添加し，６０℃でハイブリダイゼーションを４５分間行う。トランスウェルインサートに洗浄用バッファー（（20mM Tris HCl (pH7.4)、180mM NaCl、0.01% SDS））５ｍｌを加え６０℃、１５分間静置する。トランスウェルインサートを傾け洗浄用バッファーを除き、蒸留水５ｍｌを添加後、直ちに除去して洗浄後、トランスウェルインサートを図１の検査装置の試料台に載せ、プローブ特有の赤色蛍光を発するコロニーを自動的に計数する蛍光シグナルの観察をおこなった。
【００５５】
（４）培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法による計数結果の比較対照として、前記の食品試料調製液について培養法による大腸菌の計測を行った。すなわち、食品試料調製液を滅菌生理食塩水で適宜希釈後、クロモカルトコリフォーム寒天培地（メルク社）を用い、３７℃２４時間、混釈平板培養を行った。培養後、大腸菌を計数した。
【００５６】
結果１
上記の試験を５回繰り返して実施した結果を表２に示した。直径２５ｍｍのメンブレンフィルターを用いた培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法は、いずれの試料においても、培養法と有意な差はなく（P>0.05）、ほぼ正確に特定細菌を計数した。結果を表２に示す。
【００５７】
【表２】
0004785449.tif 000003
【実施例２】
【００５８】
上記実施例１の試験のうち、トランスウェルインサートを、直径４７ｍｍ、ポアサイズ0.4μmのセルロース製メンブレンフィルター（アドバンテック社）に変え、また、食品試料として、豚肉、いか、サバ、チキンカツ、豆腐をそれぞれ0.1g相当量について、後の工程を上記同様に５回繰り返して行った（検出限界１０CFU/ｇ）。結果を表３に示した。培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法は、直径４７ｍｍのメンブレンフィルターを用いた場合でも、いずれの試料においても、培養法と有意な差はなく（P>0.05）、ほぼ正確に特定細菌を計数した。
【００５９】
【表３】
0004785449.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００６０】
こうして高価な蛍光顕微鏡装置を使用しないきわめて簡単な構成で、生きている特定微生物について、従来の培養法と同等の高い検出感度で、微生物検査の自動化を実現できるので、食品製造業、食品加工業などの産業分野で利用可能な自動微生物検査装置をきわめて安価に提供可能となり、食品の安全・安心な供給にも大きな貢献が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】メンブレンフィルター上のマイクロコロニー観察方法
【図２】蛍光励起用照明の別の構成
【図３】自動的に微生物数を計数する構成
【図４】多分岐型の蛍光励起用照明方法
【符号の説明】
【００６２】
１トランスウェルインサート
１ａメンブレンフィルター
２試料台
３、４直進ステージ
７対物レンズ
８蛍光検出用フィルター
９結像レンズ
１０固体撮像カメラ
１１撮像面
１２蛍光励起用光源
１３ライトガイド
１４コリメータレンズ
１５蛍光励起用フィルター
１６照明光収束用レンズ
１７画像モニター
１８発光ダイオードランプ
１９画像処理手段
２０直進ステージ制御手段
【図１】
0004785449.tif 000005
【図２】
0004785449.tif 000006
【図３】
0004785449.tif 000007
【図４】
0004785449.tif 000008
【配列表】
0004785449000001.app