(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ波に補助されたＰＣＲによる核酸増幅の方法であって：
少なくとも２０ＰＣＲサイクルを実行し、各サイクルが、
ＤＮＡ試料を変性、アニーリング、及び伸長させ、ここで、少なくとも変性工程及び伸長工程はマイクロ波放射の影響下で実行し；
同時に各ＰＣＲサイクルの間は開始から終了まで該試料の温度が２０℃より大きく変化するのを妨げ；そして
同時に各ＰＣＲサイクルの間及び少なくとも２０ＰＣＲサイクルの全てのサイクル間において開始から終了まで該試料の温度を５０℃以下に維持すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
１時間未満で２０サイクルを実行することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
０．６〜０．９の効率を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
約６０℃より高い温度で変性する複製酵素の存在下で、ＤＮＡ試料に対して十分なマイクロ波放射の第１のパルスを、ＤＮＡとプライマーとからなる組成物に向け；
該プライマーを別個のＤＮＡ鎖上にアニーリングさせ；
一次配列を複製しかつ伸長させるために十分なマイクロ波放射の第２のパルスを該アニーリングしたＤＮＡ鎖に向け；そして
該複製酵素を補充することなく、少なくとも２回、変性、アニーリング、及び伸長サイクルを反復すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
各ＰＣＲサイクルを通して、ＤＮＡと、プライマーと、複製酵素とからなる組成物を約４５℃未満の温度に維持することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
約４５℃より高い温度で変性する複製酵素を含む組成物に、マイクロ波放射の第１のパルスを向けることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
複製酵素を補充することなく、少なくとも２０回、変性、アニーリング、及び伸長サイクルを反復することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
３０分間未満で２０サイクルを実行することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
６０℃より高い温度で変性する複製酵素でＤＮＡを増幅することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
約４５℃より高い温度で変性する複製酵素でＤＮＡを増幅することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
変性工程、アニーリング工程、及び伸長工程の間、ＤＮＡ試料を４５℃より低い温度に維持することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
複数の同一試料に対して、同時に変性工程、アニーリング工程、及び伸長工程を実行することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも２種の異なる試料に対して同時に変性工程、アニーリング工程、及び伸長工程を実行することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
変性工程の温度より低い温度でプライマーをアニーリングさせることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
伸長工程の温度より低い温度でプライマーをアニーリングさせることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
変性工程、アニーリング工程、及び伸長工程の間、所望する温度を維持するために、ＤＮＡ試料を前もって冷却することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
第１のパルス又は第２のパルスを向ける工程が、５０〜２５０ワットのパルスを適用することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡ試料が複製酵素を含み、そして、複製酵素を補充することなく、２０ＰＣＲサイクルを実行することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
背景
本発明は、酵素に触媒される大きな生物学的分子の複製に関し、とりわけマイクロ波に補助されるＤＮＡのＰＣＲ増幅に関する。
【０００２】
当業者によく理解され、そして実際は、門外漢にもある程度は理解されているように、ＤＮＡ分子はヒトの身体的特徴及び機能を含む、生物体のそのような特徴及び機能を決定する遺伝コードを持っている。ＤＮＡ分子はダブルヘリックスと呼ぶことができ、その中ではリン酸基と糖が２種のそれぞれの鎖（“バックボーン”）を形成し、同時に鎖に結合するアミノ基（典型的には“塩基”と呼ばれる）が２つの鎖（“ストランド”）を一緒に連結する水素結合をお互いに形成する。塩基は幾何学的特異性で水素結合を形成するため、塩基はいつも特定のペアでお互いに連結する。結果として、鎖が分離する（又は引き離される）場合、それぞれは、分離した鎖のいずれか、又は両方から全ＤＮＡ分子を再構築するための鋳型を形成する、連続した塩基の型を提供する。この過程は、もちろん、生物体で自然に実行され、“複製”と呼ばれる。
【０００３】
多くの状況では、ＤＮＡはきわめて少量で得られる。そのような量が識別又は分析のために非常に少ない場合、自然のＤＮＡ複製に倣って作られ、“ポリメラーゼ連鎖反応”と呼ばれ、そして典型的には“ＰＣＲ”と省略される実験室業務により、ＤＮＡは増幅することができる。ＰＣＲは一般に３工程で実行され、そのような工程の１セットは“サイクル”と呼ばれる。比較目的の場合、ＰＣＲの結果は少なくとも約３０サイクル後に得ることができる結果に関して通常最もよく理解される。
【０００４】
米国特許第４，６８３，２０２号及び４，６８３，１９５号はしばしばＰＣＲ技術を説明する場合に重要な参照として言及される。第４，６８３，２０２号はそれより後の１４００を超える米国特許で引用され、そして第４，６８３，１９５号はそれより後の１３００を超える米国特許で引用されている。したがって、ＰＣＲ増幅の基本的かつ大いに複雑な特徴は当該技術分野でよく理解されており、本発明を説明するために必要である以外は、本明細書中で詳細には説明しない。
【０００５】
ＤＮＡを増幅する能力は、多数の診断目的のためにＤＮＡを評価するための関連した能力を生み出す。ＰＣＲは、特定の項目（典型的には、ウイルス、細菌、又は遺伝物質の特定の配列までも）の存在又は欠如を検出するために十分なサイズのＤＮＡ試料を産生することができる。ＰＣＲ技術は、このように、感染症、ならびに遺伝的変異及び突然変異を含む遺伝的特徴を検出する能力を提供する。したがって、ＰＣＲは感染症についての多数の臨床診断試験の基礎である。ＰＣＲはきわめて感受性が高いため、ある場合には、ヒトの血液中の特定のウイルスの量も（確認することに加えて）定量し、したがって疾患の進行又は処置に対するその反応のいずれかをモニターする能力を提供することができる。同じ理由から、ＰＣＲは感染性因子の存在を確認するか、又は排除するための血液（すなわち、献血）のスクリーニングに極めて有益である。遺伝的試験の観点から、ＰＣＲは特定の疾患又は状態に対する遺伝的素因を確認することが可能であり、そしてある場合には、特定のヒトが具体的な薬剤的（又は別の医学的）処置にどのように反応することになるかを確認又は予言可能であるか、又はそのように確認又は予言することを期待される。Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＰＣＲ［オンライン］，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒｏｃｈｅ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．ｃｏｍ／ｂａ＿ｒｍｄ＿／ｐｃｒ＿ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ｈｔｍｌ，Ｍａｒｃｈ  ２００６を参照されたい。
【０００６】
また、ＤＮＡ増幅は、バルク物質中に他の状態で存在する特定のＤＮＡ部分を精製する比較的簡単な方法を提供する。増幅が十分な程度に実行される場合、所望するＤＮＡ産物は対応して混合物の圧倒的な成分になり、したがって事実上、他の汚染物質をわずかな量に減少させる。Ｃａｎｔｏｒ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９，９８ページを参照されたい。
【０００７】
更に別の利点としては、ＤＮＡのＰＣＲ増幅を使用して、ＤＮＡライブラリーを生み出し、今度はそれを多様な分析、診断又は合成目的のためのコンビナトリアルケミストリー技術に使用することができる。
【０００８】
各ＰＣＲサイクルには、（ｉ）変性、（ｉｉ）アニーリング、及び（ｉｉｉ）伸長の工程が包含される。変性の前に、増幅されることになるＤＮＡは、プライマー分子及び酵素と合わせて混合する。
【０００９】
“変性”は、少なくとも９９％達成する目標で、ＤＮＡダブルヘリックスを２本の個々の鎖に分ける工程を表す。典型的なＰＣＲ技術では、変性工程は、約９０〜１０５℃の温度で約１〜１０分間、ＤＮＡを加熱することにより行い、その温度で２本鎖が開き、１本鎖ＤＮＡを形成する。この温度はまた、先行するサイクルの反応を停止する結果になる。
【００１０】
“アニーリング”は分離したＤＮＡ鎖に具体的なプライマーを添加する工程を表す。ＤＮＡ酵素はスクラッチからＤＮＡ鎖を開始することができないため、プライマーが必要である。そのかわり、プライマーは特定のＤＮＡ鋳型に沿った位置を決定するために必要であり、その位置で相補鎖の合成が始まることになる。したがって、具体的な所望するＤＮＡ領域は適切なプライマーを使用して選択的に増幅することができる。プライマーは、１本鎖ＤＮＡの短い、合成配列であり、典型的には２０〜３０塩基からなり、識別を容易にするために標識された末端構造を有する。それらは一般に生物のＤＮＡの標的領域に特有である。大部分のＰＣＲ増幅では、変性中に産生された相補的な１本のＤＮＡ鎖それぞれに対して１種ずつ、２種のプライマーが使用される。当該技術分野では、ＤＮＡの具体的な型又は部分を増幅するために開発されている具体的なプライマーの例が充実している。
【００１１】
アニーリング工程は約５０〜６０℃に温度を下げることにより実行され、その時点でプライマーは適切な様式及び量で、前もって分けられた個々のＤＮＡ鎖にそれら自体を付着させる。
【００１２】
いったん、プライマーをＤＮＡ鎖に結合させるほどにアニーリング工程が実行されていれば、温度は典型的には７０℃より高い温度に再び上げられ、そして酵素を使用してＤＮＡ鎖の複製を補助する。酵素は溶液中で相補的ヌクレオチドの結合を促進することにより新規な２本鎖ＤＮＡ分子（すなわち、塩基及びホスフェート基に結合した糖）を合成する。
【００１３】
結果として、１回目のＰＣＲサイクルの終了時には２つの新規ＤＮＡ鎖が存在し、それらは各々変性され、準備された（primed）元の標的ＤＮＡ鎖に同一である。
これまでに示したように、典型的なＤＮＡ増幅は約３０ＰＣＲサイクルを必要とする。時間の観点から、変性工程は典型的には約２分間かかり、別個の鎖にプライマーをアニーリングする冷却工程は同様に約２分間かかり、そして伸長工程は更に約２分間かかる。したがって、各ＰＣＲサイクルは約６分間かかる。同様に、３０サイクルの増幅は全部で約２〜３時間かかることになる。
【００１４】
科学的又は商業的に重要な任意の他の方法におけるように、任意の１以上の工程に必要な時間を減少させることは、同様に１サイクルを実行するために必要な時間を減少させ、したがって全増幅に必要な時間を減少させることになる。更に、ＰＣＲサイクルの各工程は熱的工程であるため、必要な時間は典型的には増加した材料の量に基づいて増大することになる。
【００１５】
したがって、任意の１以上のＰＣＲ工程を実行するために必要な時間は、ＤＮＡ増幅及び複製において、対応する不都合な点を生み出す可能性がある。
別の因子として、典型的なＰＣＲサイクル（たとえば、Ｔａｑポリメラーゼを使用すること；Ｃａｎｔｏｒ，上記）は組成物の温度を上方（９２〜９６℃で３０〜６０秒間の変性）、その後下方（５５〜６０℃で約３０秒間のアニーリング）、そして再び上方（約７２℃で約６０秒間の伸長）に移動させることを包含するため、温度の変動が望ましくない変更を引き起こす可能性があり、それらは急速に拡大される。当該技術分野で一般によく理解されているように、典型的なＰＣＲ装置は複数のチューブホルダー又はマイクロタイタープレートホルダーを使用し、それらは加熱部分と冷却浴により、又は熱電気的加熱及び冷却により、又は強制対流加熱及び冷却により、又は２つ及びそれ以上の水浴間を移動させることにより温度制御されている。Ｃａｎｔｏｒ、上記、１０３ページを参照されたい。
【００１６】
手短に述べると、ＰＣＲ増幅中の温度の周期的変化が望ましくない変更を生み出すか、又は増大させる可能性がある。
さらに別の因子として、変性工程が比較的高温を必要とするため、ＰＣＲ試料中に存在する別の化合物、そして最も典型的には伸長酵素はこれらの高い変性温度で安定を維持しなくてはならない。したがって、これらの温度要求性がＰＣＲに利用可能な酵素の選択を事実上限定する。
【００１７】
とりわけ、ＴａｑポリメラーゼはＤＮＡ変性温度に耐えることができるために使用される。従来のＰＣＲでは、変性温度に耐えることができない酵素を使用することは、サイクル毎に新たな酵素が添加されることを必要とし、したがって工程操作の複雑性及び必要な時間を増加させる。
【００１８】
Ｔａｑのような高温酵素を使用することは、サイクル毎に新たな酵素を添加する必要性を排除するが、Ｔａｑを含むそのような高温酵素は異なる問題を引き起こす。例えば、Ｔａｑ酵素は３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠如する。そのような活性は、非公式には“校正”能力と呼ばれ、それによって（自然の生物と一致した様式で）酵素は間違って配置された塩基を識別し、望ましい位置において正しい塩基とそれらを置き換えることができる。ＰＣＲサイクルが間違って塩基を識別するか、又は間違って配置する場合、もちろん、それは標的配列以外のものを複製することになる。増幅の性質から、そのようなエラーは多くのサイクルの経過中に、著しく拡大されることになる。
【００１９】
第２の問題として、標準ＰＣＲは、典型的には約２０００〜３０００塩基対の標的配列に限定される。より大きな標的（たとえば５０，０００塩基対まで）に対してＰＣＲを行うことは、より遅い加熱サイクルと特有の酵素を必要とする傾向があり、そのような酵素は慣用のＰＣＲサイクルにとって扱い易くない（又は扱い易くないようなものである）かもしれない。
【００２０】
したがって、標的配列における適合度の欠如及びサイズ制限が依然として従来のＰＣＲにおいて不都合である。
要旨
一側面では、本発明は、ＤＮＡのＰＣＲ増幅を実行するための方法であって、ＤＮＡと、プライマー（単数又は複数）と、複製酵素（単数又は複数）とからなる組成物を約６０℃未満の温度に維持し、該ＤＮＡを約６０℃未満の温度に維持しながら、該ＤＮＡを変性させるために十分なマイクロ波放射の第１のパルスを該ＤＮＡに向け、該ＤＮＡを約６０℃未満の温度に維持しながら、該プライマーを別個のＤＮＡ鎖上にアニーリングさせ、そして、該ＤＮＡを約６０℃未満の温度に維持しながら、一次配列を複製しかつ伸長させるために十分なマイクロ波放射の第２のパルスを該アニーリングしたＤＮＡ鎖に向けることを含む、前記方法である。
【００２１】
別の側面では、本発明は、マイクロ波に補助されたＰＣＲによる核酸増幅の方法であって、核酸試料を変性、アニーリング、及び伸長させることを含み、ここで、少なくとも該変性工程及び伸長工程はマイクロ波放射の影響下で実行し、同時に開始から終了まで該試料の温度が４０℃より大きく変化することを妨げ、そして同時に開始から終了まで該試料の温度を６０℃以下に維持する、前記方法である。
【００２２】
別の側面では、本発明は、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅サイクルを実行する方法であって、約６０℃より高い温度で変性する複製酵素の存在下で、ＤＮＡと、プライマーと、複製酵素とからなる組成物に、該ＤＮＡを変性させるために十分なマイクロ波放射の第１のパルスを向け、該プライマーを別個のＤＮＡ鎖上にアニーリングし、一次配列を複製しかつ伸長させるために十分なマイクロ波放射の第２パルスを該アニーリングしたＤＮＡ鎖に向け、そして、該複製酵素を補充することなく、少なくとも２回、変性、アニーリング及び伸長サイクルを反復することを含む、前記方法である。
【００２３】
本発明の上記及び他の目的及び利点ならびに、同じことが成し遂げられる様式は以下の詳細な説明に基づいて更に明らかになるであろう。
具体的な説明
本発明は、ＤＮＡのＰＣＲ増幅を実行する方法である。当該技術分野でよく理解されているように、ＰＣＲ増幅は具体的な核酸配列及びＤＮＡ又はＲＮＡに対して実行することができる。そのもっとも広い意味において、本発明は、核酸、とりわけＤＮＡに見出される任意の１以上の所望する具体的な核酸配列を増幅することができる。したがって、本発明は、この比較的広い意味で理解されることになる。
【００２４】
本明細書の説明から明らかになるように、本発明は、酵素の組み合わせを使用する能力を提供し（したがってより密接に天然の生物に従う）、そして時間超過、もしくは温度、又はそれら両方のいずれかのために酵素が分解する場合に生じる問題を妨げることができ、そして従来の高温ＰＣＲより速いサイクル回数で低温又は中等度の温度のＰＣＲを行う機会を提供する。
【００２５】
ＰＣＲ適用を意図したＤＮＡ試料の性質及び作製は当該技術分野で一般によく理解されている。再生産されることになるＤＮＡ（典型的には“標的”と呼ばれる）は所望するプライマー及び酵素と一緒に選択される。ＰＣＲ増幅に続いて、従来の様式（例えば、ゲル電気泳動、染色、及び紫外線下）でＤＮＡを抽出し、結果を評価する。
【００２６】
本方法は、ＤＮＡと、プライマー（単数又は複数）と、複製酵素（単数又は複数）とからなる組成物を約６０℃未満の温度に維持することを含む。ＤＮＡを約６０℃未満の温度に継続して維持し、ＤＮＡを変性させるために十分なマイクロ波放射の第１のパルスがＤＮＡに向けられる。次に、本方法は、ＤＮＡを約６０℃未満の温度に維持しながら、プライマーを別個のＤＮＡ鎖上にアニーリングし、そして、ＤＮＡを約６０℃未満の温度に維持しながら、一次配列を複製しかつ伸長させるために十分なマイクロ波放射の第２のパルスを、アニーリングしたＤＮＡ鎖に向ける工程を含む。
【００２７】
特定の態様では、本方法は、約６０℃より高い温度で変性する複製酵素によりＤＮＡを増幅することを含む。言い換えると、本方法は、ＤＮＡを変性させるために使用される通常の高温（例えば、約９０℃より高い温度）にて変性することを回避できる能力以外の目的に関して選択されてもよい酵素の使用を可能にする。ある態様では、約４５℃より高い温度で変性する複製酵素が包含されてもよい。そのような場合、方法は、変性、アニーリング、及び伸長工程の間、組成物を約４５℃より低い温度に維持することを含む。
【００２８】
本明細書で言及される温度は、全体又は“バルク（bulk）”試料の温度であると理解されるであろう。マイクロ波の使用は、一時的にはるかに高温を経験する可能性がある試料の小部分を生み出すと理解されている。しかし、現在まで、そのような小部分、又はそれらが到達する具体的な温度を確認するためのいずれか実用的な手段は、依然として入手できないままである。したがって、本明細書で使用するように、試料が特定の温度で維持される場合、これはバルク温度を表し、観察することができない様式で、説明された温度を時折越える可能性がある小部分の存在は、全体的な説明、又は特許請求の範囲から試料を排除しない。
【００２９】
言い換えると、たとえ（測定することができない）小部分が理論的又は事実上、一時的により高い温度に到達しても、本明細書で示された温度及び温度範囲内のままであるバルク試料は本発明及び特許請求の範囲に包含される。
【００３０】
温度に関してさらに深く理解されるように、すべてのＰＣＲ増幅は典型的には周囲温度（通常室温）で、出発物質から開始することになる。したがって、本明細書及び特許請求の範囲が、特定の温度で、又はある温度範囲内に項目を維持することに言及する場合、このことは必ずしも周囲温度から所望する説明された温度まで温度を上げる工程を包含しないことが理解されるであろう。言い換えると、室温で開始し、本明細書に記載の工程中に、本明細書に記載の温度まで試料の温度を上げることは、本発明及び特許請求の範囲内に包含される。
【００３１】
ある態様では、本方法は、ＤＮＡと、プライマー（単数又は複数）と、複製酵素（単数又は複数）とからなる複数の組成物に、同時に変性、アニーリング、及び伸長工程を実行することを含む。本方法は、複数の同一試料、又は少なくとも２種の異なる試料、又はいっそう多数の異なる試料；例えば、典型的にはマイクロタイタープレート上で使用される９６個の試料に対して実行することができる。
【００３２】
本方法は、変性工程の温度より低い温度でプライマーをアニーリングさせるか、もしくは伸長工程の温度より低い温度でプライマーをアニーリングさせる工程、又はそれら両方を含んでいてよい。プライマーは一般に当該技術分野でよく理解され、当業者は過度の負担なく選択することができる。プライマーはそれらの組成及び長さ−すなわち所望する増幅に特有の因子−に基づいて選択されることになり、したがって本明細書においては特定のプライマーを詳細に説明することはない。
【００３３】
ＤＮＡ、プライマー、及び酵素の供与源及び有用性は同様に当該技術分野でよく理解され、当業者が過度の負担なく、そして実際、ある場合には；たとえばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡの注文プライマー対とＡＭＩＬＴＡＱ  ＧＯＬＤ（登録商標）のように、従来の製造業者から得ることができる。
【００３４】
また、プライマーはそれらの“溶解”温度に関して分類される。プライマーに関しては、“溶解”は典型的にはプライマー結合部位の半分が占有される温度として定義される。より長いプライマーはより高い溶解温度を有する。所望より短いプライマーは比較的より長いＤＮＡ鋳型上のいくつかの位置でアニーリングする傾向が見られ、したがって非特異的コピーを生み出す傾向がある。あるいは、より高温で溶解するプライマーはより高温のアニーリング温度を必要とし、今度はそれが酵素の有効性を低下させる可能性がある。したがって、ＰＣＲプライマーは典型的には約１５〜４０ヌクレオチドを含有し、約５５〜６５℃の典型的な溶解温度を有する。したがって、アニーリング工程は典型的には溶解温度近く、すなわち約５０〜６０℃で実行され、溶解温度では実行されない。
【００３５】
本明細書で言及する方法及び装置の冷却能力は、従来のＰＣＲより低い温度で所望する量及び位置にアニーリングさせるのに十分にプライマーを活性化する機会を提供する。言い換えると、従来のＰＣＲはＤＮＡを変性するために約９０℃に温度を上げ、その後プライマーをアニーリングさせるために約５０〜６０℃に明確に温度を下げる。本発明は、はるかに低い温度でＤＮＡを変性し、アニーリング工程中にマイクロ波エネルギーのパルス適用により、又は適用せずに、より低い温度でプライマーをアニーリングさせる能力を提供する。
【００３６】
特定の態様では、方法は、変性、アニーリング、及び伸長工程の間、所望する温度を維持するために、前もってＤＮＡと、プライマーと、複製酵素とからなる組成物を冷却することを含む。
【００３７】
事前の冷却工程は典型的には、不活性ガス又は液体により、試料（そして最も一般的には、順に試料を冷却するために試料容器）を冷却することにより実行される。
マイクロ波放射を適用しながら、前もって化学反応を冷却するための装置及び技術の適切な説明は、本発明の譲受人に譲渡された、米国特許第６，７４４，０２４号及び６，９１７，０２３号に示され、それらのそれぞれの内容は参照によりそのまま本明細書に援用される。試薬を前もって冷却しながら、マイクロ波に補助された化学反応を実行するための市販の装置は本発明の譲受人、ＣＥＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｌｏｌｉｎａ，ＵＳＡから、商品名ＤＩＳＣＯＶＥＲ（登録商標）ＣＯＯＬＭＡＴＥ（登録商標）という名称で入手可能である。
【００３８】
先に援用した特許に述べたように、単一モードマイクロ波空洞（すなわち、マイクロ波源により生成される波長での単一モードを支持する空洞）は、大部分のＰＣＲ反応で使用される試料（たとえば、０．１〜１．０ｍｌ）のような、少ない試料にマイクロ波のエネルギーを正確に適用するための都合のよい能力を提供する。また、ＰＣＲ増幅に関する単一モード空洞の使用が証明されている（たとえば、Ｆｅｍｅｒ，Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｅｄ  ＰＣＲ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８（２００３），１２９〜１３２ページ）。
【００３９】
マイクロ波放射のパルス放出工程は一般に当該技術分野でよく理解され、定義された不連続な期間の定義された出力適用の使用を表す。また、それは米国の標準の６０サイクル周波数（別の国では別の周波数）の交流に従う通常のマイクロ波出力適用の周波数から区別することを意図する。したがって、典型的な態様では、マイクロ波放射適用のパルス放出工程は、１秒間以下の間に約５０〜２５０ワットの非連続パルスを適用することを含む。反応は物質移動が制御されていて、したがってパルスの時間及び出力は増幅される物質の量に依存する。したがって、当業者は過度な負担なしに適切なパルスを選択することができる。
【００４０】
別の側面では、本発明は、マイクロ波に補助されたＰＣＲによる核酸増幅の方法であって、核酸試料を変性、アニーリング、及び伸長する工程を含み、ここで、少なくとも変性工程及び伸長工程はマイクロ波放射の影響下で実行し、同時に開始から終了まで試料の温度が４０℃より大きく変化することを妨げ、そして同時に開始から終了まで試料の温度を６０℃以下に維持する、前記方法である。
【００４１】
ある態様では、本方法は、開始から終了まで試料のバルク温度を２０℃以下、ある態様では開始から終了まで１０℃以下、変化するのを妨げることを含む。
ある態様では、方法は開始から終了まで試料の温度を５０℃以下、そしてある態様では４５℃以下に維持することを含む。
【００４２】
この側面において、方法は少なくとも２サイクルの変性、アニーリング及び伸長、そしてより典型的には３０サイクルの変性、アニーリング及び伸長を含んでいてもよい。
最も一般的な態様では、増幅はＤＮＡ試料に対して実行され、そして単一の試料又は（共存する）複数の試料のいずれかを包含する。複数の試料の場合、本方法は同一ＤＮＡ試料を同時に伸長するか、又は異なるＤＮＡ試料を同時に伸長することを含んでいてもよい。ある態様では、本方法はマイクロタイタープレート使用の場合のように、少なくとも９６個のＤＮＡ試料を伸長することを含んでいてもよい。
【００４３】
先の側面のように、マイクロ波放射の影響下でサイクルを実行する工程はＤＮＡ試料にパルス放射を、そして最も典型的には１秒以下の間に約５０〜２５０ワットのパルスを適用することを含む。最も典型的には、本方法は、変性工程に第１のパルスのマイクロ波放射を適用し、そして伸長工程に第２のパルスのマイクロ波放射を適用することを含む。
【００４４】
マイクロ波適用速度のために、本方法は１時間未満で、そしてある場合には、３０分間未満で少なくとも２０ＰＣＲサイクル、実行することを包含してよい。実際、予言的な例として、マイクロ波パルスが変性及び伸長工程に使用される（したがって、アニーリング工程用に試料を冷却するために必要な時間を排除する）場合、全サイクルは５〜１０秒で（又はおそらくさらに少なく）実行してもよく、それは今度はわずか２〜５分間でおこる３０サイクルの増幅と言い換えられる。
【００４５】
本発明は、各工程の後に新しい試薬を添加することにより順次的な様式で、又は初期の工程で添加されるすべての材料により同時に、又は、一定の数の工程後に添加されている組成物により、部分的に順次及び部分的に同時に実行されてもよい。
【００４６】
ＰＣＲ反応は、典型的には適切なｐＨを維持するバッファーの存在下で実行される。たとえば、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、及び塩化ナトリウムの適切な混合物を使用して、ｐＨを約７．５に維持することができる。塩基性ｐＨがいつも所望されるとは限らないが、別の技術ではｐＨは酸性側、すなわち７．０以下に維持されてもよい。
【００４７】
従来のＰＣＲに予想される結果と一致して、本発明は約０．６〜０．９の範囲で増幅非能率を生じることが予想される。本明細書で使用するように、効率ＥはＣａｎｔｏｒ，上記に定義されるとおりであり；すなわち、
Ｐ／Ｓ＝（１＋Ｅ）ｎであり、
ここで、Ｓは出発物質の量であり、Ｐは産物の量であり、そしてｎはサイクル数である。
【００４８】
本明細書では、本発明の好ましい態様が示され、そして具体的な用語が使用されているが、それらは一般的で、説明的な意味だけに使用され、限定する目的のためではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲において明示される。
以下は本発明の各種の態様である。
１．ＤＮＡのＰＣＲ増幅を実行するための方法であって：
ＤＮＡと、プライマーと、複製酵素とからなる組成物を約６０℃未満の温度に維持し；
該ＤＮＡを約６０℃未満の温度に維持しながら、該ＤＮＡを変性させるために十分なマイクロ波放射の第１パルスを該ＤＮＡに向け；
該ＤＮＡを約６０℃未満の温度に維持しながら、該プライマーを別個のＤＮＡ鎖上にアニーリングさせ；
該ＤＮＡを約６０℃未満の温度に維持しながら、一次配列を複製しかつ伸長させるために十分なマイクロ波放射の第２パルスを該アニーリングしたＤＮＡ鎖に向けること
を含む、前記方法。
２．約６０℃より高い温度で変性する複製酵素でＤＮＡを増幅することを含む、上記１に記載の方法。
３．約４５℃より高い温度で変性する複製酵素でＤＮＡを増幅することを含む、上記１に記載の方法。
４．変性工程、アニーリング工程、及び伸長工程の間、組成物を約４５℃より低い温度に維持することを含む、上記１に記載の方法。
５．ＤＮＡと、プライマーと、複製酵素とからなる複数の組成物に対して、同時に変性工程、アニーリング工程、及び伸長工程を実行することを含む、上記１に記載の方法。
６．複数の同一試料に対して、同時の変性工程、アニーリング工程、及び伸長工程を実行することを含む、上記５に記載の方法。
７．少なくとも２種の異なる試料に対して同時の変性工程、アニーリング工程、及び伸長工程を実行することを含む、上記５に記載の方法。
８．変性工程の温度より低い温度でプライマーをアニーリングさせることを含む、上記１に記載の方法。
９．伸長工程の温度より低い温度でプライマーをアニーリングさせることを含む、上記１に記載の方法。
１０．変性工程、アニーリング工程、及び伸長工程の間、所望する温度を維持するために、ＤＮＡと、プライマーと、複製酵素とからなる組成物を前もって冷却することを含む、上記１に記載の方法。
１１．ＤＮＡのパルス適用工程が、１秒以下の間に約５０〜２５０ワットのパルスを適用することを含む、上記１に記載の方法。
１２．不活性ガスで試料を前もって冷却することにより所望する温度を維持することを含む、上記１に記載の方法。
１３．液体で試料を前もって冷却することにより所望する温度を維持することを含む、上記１に記載の方法。
１４．アニーリング工程の間に組成物にマイクロ波放射のパルスを向けることを更に含む、上記１に記載の方法。
１５．マイクロ波に補助されたＰＣＲによる核酸増幅の方法であって：
核酸試料を変性、アニーリング、及び伸長させ、ここで、少なくとも該変性工程及び伸長工程はマイクロ波放射の影響下で実行し；
同時に開始から終了まで該試料の温度が４０℃より大きく変化することを妨げ；
そして同時に開始から終了まで該試料の温度を６０℃以下に維持すること
を含む、前記方法。
１６．開始から終了まで試料の温度が２０℃より大きく変化するのを妨げることを含む、上記１５に記載の方法。
１７．開始から終了まで試料の温度が１０℃より大きく変化するのを妨げることを含む、上記１５に記載の方法。
１８．開始から終了まで試料の温度を５０℃以下に維持することを含む、上記１５に記載の方法。
１９．開始から終了まで試料の温度を４５℃以下に維持することを含む、上記１５に記載の方法。
２０．少なくとも２サイクルの変性、アニーリング、及び伸長を含む、上記１５に記載の方法。
２１．少なくとも３０サイクルの変性、アニーリング、及び伸長を含む、上記１５に記載の方法。
２２．ＤＮＡ試料の変性、アニーリング、及び伸長を含む、上記１５に記載の方法。
２３．単一のＤＮＡ試料の変性、アニーリング、及び伸長を含む、上記２２に記載の方法。
２４．少なくとも２種のＤＮＡ試料の変性、アニーリング、及び伸長を含む、上記２２に記載の方法。
２５．異なるＤＮＡ試料の変性、アニーリング、及び伸長を含む、上記２４に記載の方法。
２６．少なくとも９６種のＤＮＡ試料の変性、アニーリング、及び伸長を含む、上記２２に記載の方法。
２７．異なるＤＮＡ試料の変性、アニーリング、及び伸長を含む、上記２６に記載の方法。
２８．マイクロ波放射の影響下でサイクルを実行する工程が、ＤＮＡ試料にパルス放射を適用することを含む、上記１５に記載の方法。
２９．変性工程のためにマイクロ波放射の第１のパルスを適用し、そして伸長工程のためにマイクロ波放射の第２のパルスを適用することを含む、上記２８に記載の方法。
３０．マイクロ波に補助されたＰＣＲによる核酸増幅の方法であって：
少なくとも２０ＰＣＲサイクルを含み、各サイクルが、
ＤＮＡ試料を変性、アニーリング、及び伸長させ、ここで、少なくとも変性工程及び伸長工程はマイクロ波放射の影響下で実行し；
同時に開始から終了まで該試料の温度が２０℃より大きく変化するのを妨げ；
そして同時に開始から終了まで該試料の温度を５０℃以下に維持すること
を含む、前記方法。
３１．１時間未満で２０サイクルを実行することを含む、上記３０に記載の方法。
３２．３０分間未満で２０サイクルを実行することを含む、上記３０に記載の方法。
３３．０．６〜０．９の効率を含む、上記３０に記載の方法。
３４．ＰＣＲによるＤＮＡ増幅サイクルを実行する方法であって：
約６０℃より高い温度で変性する複製酵素の存在下で、ＤＮＡを複製させるために十分なマイクロ波放射の第１のパルスを、ＤＮＡと、プライマーと、複製酵素とからなる組成物に向け；
該プライマーを別個のＤＮＡ鎖上にアニーリングさせ；
一次配列を複製しかつ伸長させるために十分なマイクロ波放射の第２のパルスを該アニーリングしたＤＮＡ鎖に向け；そして
該複製酵素を補充することなく、少なくとも２回、変性、アニーリング、及び伸長サイクルを反復すること
を含む、前記方法。
３５．各ＰＣＲサイクルを通して、ＤＮＡと、プライマーと、複製酵素とからなる組成物を約６０℃未満の温度に維持することを含む、上記３４に記載の方法。
３６．各ＰＣＲサイクルを通して、ＤＮＡと、プライマーと、複製酵素とからなる組成物を約４５℃未満の温度に維持することを含む、上記３４に記載の方法。
３７．約４５℃より高い温度で変性する複製酵素を含む組成物に、マイクロ波放射の第１のパルスを向けることを含む、上記３４に記載の方法。
３８．複製酵素を補充することなく、少なくとも２０回、変性、アニーリング、及び伸長サイクルを反復することを含む、上記３４に記載の方法。
３９．複製酵素を補充することなく、少なくとも３０回、変性、アニーリング、及び伸長サイクルを反復することを含む、上記３４に記載の方法。