(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポタンパク質を含有する被検試料に、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する過酸化水素又は還元型補酵素を測定することによりリポタンパク質中のコレステロールを測定する方法において、リポタンパク質リパーゼとコレステロールエステラーゼの活性比率（リポタンパク質リパーゼ活性／コレステロールエステラーゼ活性）が２８〜８００であるコレステロールエステラーゼを用いることを特徴とするレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方法。
【請求項２】
被検試料を抗アポＢ−１００抗体、抗アポＡ−Ｉ抗体にて前処理するものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
リポタンパク質リパーゼとコレステロールエステラーゼの活性比率（リポタンパク質リパーゼ活性／コレステロールエステラーゼ活性）が２８〜８００であるコレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを含有するレムナント様リポタンパク質中のコレステロール測定試薬。
【請求項４】
抗アポＢ−１００抗体、抗アポＡ−Ｉ抗体を含む第１試薬と、請求項３記載の測定試薬を含む第２試薬からなるレムナント様リポタンパク質中のコレステロール測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レムナント様リポタンパク質中のコレステロールの測定方法及び測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高齢化に伴い、成人病の罹患率が急激に上昇している。この中で、特に循環器系疾患、例えば心疾患、脳血管系疾患（脳梗塞など）の発症には、動脈硬化症が重要な位置を占めていることは周知のところである。【０００３】
一方、動脈硬化症の成立には血管壁へのコレステロールの蓄積が重要な役割を演じており、これには、血液中に存在する種々のリポタンパク質が関与する。リポタンパク質は、コレステロール、コレステロールエステル、中性脂肪、リン脂質及びアポタンパク質を構成成分としているが、これらリポタンパク質の中で、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）中のコレステロールは動脈硬化症の危険因子として負の因子、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）中のコレステロールは動脈硬化症の危険因子として正の因子とされており、臨床検査の分野で頻繁に測定されてきた。【０００４】
しかしながら、近年ＬＤＬ中のコレステロールよりも、レムナント様リポタンパク質の如く、脂質の代謝等に起因して生成するリポ蛋白質中のコレステロールが、動脈硬化症の危険因子として、より密接な指標となることが示されており、この観点で生体試料におけるリポタンパク質中のコレステロールを効率よく、より簡便に測定することが課題となっている。【０００５】
従来、レムナント様リポタンパク質中のコレステロールの酵素測定方法に関しては、リポタンパク質中の構成アポタンパク質に対する抗体の固定化ゲルや、リン脂質分解酵素又は界面活性剤等を用いて、測定の選択性を上げ、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを作用させることにより、コレステロールエステルをコレステロールに変換した後、生じる過酸化水素又は還元型補酵素を測定する方法が報告されている（特許文献１及び２、非特許文献１参照）。【０００６】
しかしながら、斯かる方法においても、レムナント様リポタンパク質に対する選択性や操作上の簡便性・測定時間の長さなどの点で一長一短があり、必ずしも十分であるとは言えない。
【特許文献１】特開平２００１−２３１５９７号公報
【特許文献２】特許第２９４９３５４号公報
【非特許文献１】動脈硬化，２５（９，１０），３７１（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、レムナント様タンパク質中のコレステロールをより簡便に且つ精度よく測定する方法及び当該方法を行うための試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、斯かる実情に鑑み、コレステロールエステラーゼの多くが少なからずエステラーゼ活性の他にリポタンパク質リパーゼ活性があることに注目し、リポタンパク質中のコレステロールを測定する際の条件を種々検討したところ、コレステロールエステラーゼ活性に比べてリポタンパク質リパーゼ活性の比率が高いコレステロールエステラーゼを選択し、これとコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを用いてリポタンパク質中のコレステロールを測定した場合に、レムナント様リポタンパク質に対する選択性が高く、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、カイロミクロン（ＣＭ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、ＣＭレムナント、ＶＬＤＬレムナント、中密度リポタンパク質（ＩＤＬ）レムナント等のリポタンパク質を含有する生体試料の中からレムナント様リポタンパク質中のコレステロールを選択的に測定できることを見出した。【０００９】
すなわち、本発明は、リポタンパク質を含有する被検試料に、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する過酸化水素又は還元型補酵素を測定することによりリポタンパク質中のコレステロールを測定する方法において、リポタンパク質リパーゼとコレステロールエステラーゼの活性比率（リポタンパク質リパーゼ活性／コレステロールエステラーゼ活性）が１２〜７０００であるコレステロールエステラーゼを用いることを特徴とするレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方法に係るものである。【００１０】
また本発明は、リポタンパク質リパーゼとコレステロールエステラーゼの活性比率（リポタンパク質リパーゼ活性／コレステロールエステラーゼ活性）が１２〜７０００であるコレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを含有するレムナント様リポタンパク質中のコレステロール測定試薬に係るものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の測定方法及び測定試薬を用いることにより、レムナント様リポタンパク質中のコレステロールを極めて簡便に且つ感度良く、しかも短時間で測定できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＬＰ酵素を用いた場合のＬＤＬの反応特異性を示した図である。
【図２】ＬＰ酵素を用いた場合のＨＤＬの反応特異性を示した図である。
【図３】本発明方法におけるｕｎｂｏｕｎｄ−ＶＬＤＬ、ｂｏｕｎｄ−ＶＬＤＬに対する反応特異性を示した図である。
【図４】抗体添加におけるｕｎｂｏｕｎｄ−ＶＬＤＬ及びｂｏｕｎｄ−ＶＬＤＬに対する反応性を示した図である。
【図５】本発明測定方法及び既存の測定方法（ＲＬＰ−ＩＩ）における、血液中のレムナント様リポタンパク質を測定した時の相関を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方法は、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する過酸化水素又は還元型補酵素を測定するものであって、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）とコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）の活性比率（リポタンパク質リパーゼ活性／コレステロールエステラーゼ活性）が１２〜７０００であるコレステロールエステラーゼを用いるものである。【００１４】
コレステロールエステラーゼは、リポタンパク質中に含まれるコレステロールエステルを加水分解し、コレステロールを生成する酵素であるが、この酵素の多くは少なからず該エステラーゼ活性の他にリポタンパク質リパーゼ活性、即ち中性脂肪を加水分解するリパーゼ活性も併せ持つことが知られている。本発明においては、コレステロールエステラーゼ活性に比しリポタンパク質リパーゼ活性の強いもの、具体的にはリポタンパク質リパーゼとコレステロールエステラーゼの活性比率（リポタンパク質リパーゼ活性／コレステロールエステラーゼ活性）が１２〜７０００であるコレステロールエステラーゼを用いることが必要であり、これにより、レムナント様リポタンパク質に対して当該酵素が選択的に作用し、該タンパク質中のコレステロールエステルが選択的に加水分解され、その結果、目的のレムナント様リポタンパク質中のコレステロールのみが選択的に測定できる。【００１５】
ここで、リポタンパク質リパーゼ活性とは、オリーブ油エマルジョンを用いたリポタンパク質リパーゼ活性分析法により算出した時の活性単位を示し（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９７６；８０：３６７−３７０．）、コレステロールエステラーゼ活性とは、仔牛血清を用いたＣＥＮ活性分析法により算出した活性単位を示す（Ｋａｍｅｎｏ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｊａｐ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈ  １９７６；２４：６５０．）。【００１６】
リポタンパク質リパーゼとコレステロールエステラーゼの活性比率（リポタンパク質リパーゼ活性／コレステロールエステラーゼ活性（以下、これを単に「活性比率」ともいう））は、１２〜７０００であるが、好ましくは２０〜１０００、より好ましくは２８〜８００である。
斯かる活性比率を有するコレステロールエステラーゼとしては、例えばＬＰ（旭化成ファーマ社製、活性比率４６０〜８００）、ＬＰＢＰ（旭化成ファーマ社製、活性比率５６００〜６９００）、ＣＥＮ（旭化成ファーマ社製、活性比率１３．０〜１６．０）、ＣＥ（天野エンザイム社製、活性比率１３．０〜１６．０）、ＣＯＥ３１１（東洋紡社製、活性比率２８．０〜３５．０）又はこれらと同等の活性比率を有する酵素が挙げられる。【００１７】
当該コレステロールエステラーゼは、該条件を満たす酵素であれば微生物又は動物由来のいずれでもよい。
また、コレステロールエステラーゼの使用量としては、被検試料中のレムナント様リポタンパク質の含有量或いは物理的性状に依存するが、通常０．１〜２００単位／ｍＬを使用すればよく、好適には１〜１００単位／ｍＬの範囲で使用することができる。通常、健常人においては、１〜５単位／ｍＬ程度で良好な測定結果を得ることができる。
尚、高脂血症患者の中でも特に従来から簡便な測定方法が望まれていたＩＩＩ型家族性高脂血症患者では、５０単位／ｍＬ以上を使用することが望ましい。また、健常妊婦では、一般に血中コレステロール値の上昇が認められるが、本発明のコレステロールエステラーゼを用いれば２０単位／ｍＬで良好な測定値を得ることができる。【００１８】
本発明のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方法においては、被検試料を抗アポＢ−１００抗体、抗アポＡ−Ｉ抗体にて前処理を施してもよい。斯かる抗体を添加することにより、アポＢ−１００を構成成分に持つＬＤＬ，ＶＬＤＬ及びアポＡ−Ｉを構成成分に持つＨＤＬ、ＣＭに対するコレステロールエステラーゼの選択性を上げることができる。【００１９】
斯かる抗体処理技術は、特許第２９４９３５４号公報において開示されているが、操作方法としては抗体結合ゲルを被検試料に添加し、数時間放置することによりレムナント様リポタンパク質と他のリポタンパク質（ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ）を分離し、二次的にコレステロールエステラーゼの選択性を上げることを目的としている。しかし、本発明のコレステロールエステラーゼを用いれば、抗体をゲルで固定化する必要はなく、単に該抗体を添加するだけで、当該酵素のレムナント様リポタンパク質以外のリポタンパク質への作用を抑制することができ、結果的にレムナント様リポタンパク質への選択性を上げることができる。従って、上記方法においては、ゲル固定化抗体を添加後長時間静置することが必要であったが、本発明の方法によれば、抗体とリポタンパク質の結合により目的が達せられるため、添加後数分で次の操作に進むことができ、よって、操作方法の簡便さ・測定精度・時間的短縮の面で飛躍的に改善できる。【００２０】
使用抗体としては、アポＢ−１００或いはアポＡ−Ｉに対する抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体或いはそれらの組み合わせのいずれも使用することができるが、一例としてアポＢ−１００認識抗体としてＪＩ−Ｈ（日本抗体研究所製）、アポＡ−Ｉ認識抗体としてＨ−１２（日本抗体研究所製）を挙げることができる。さらに、抗体添加量としては、被検試料中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ或いはＣＭ量に依存することから、当該リポタンパク質に結合し得る量を添加すれば足りる。【００２１】
コレステロールオキシダーゼとしては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に限定されず、例えば微生物又は動物由来のコレステロールオキシダーゼが挙げられる。【００２２】
コレステロールデヒドロゲナーゼとしては、コレステロールを酸化し酸化型補酵素を還元する能力を有する酵素であれば特に限定されず、例えば微生物又は動物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼが挙げられる。【００２３】
上記コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼの使用量は、反応液中、それぞれ０．０１〜２００Ｕ／ｍＬが好ましく、０．１〜１００Ｕ／ｍＬがより好ましい。【００２４】
本発明の測定方法においては、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼの他に、当該酵素の特異性、安定性を向上させるために、種々の金属イオン、特にＣａイオンを添加して使用できる。【００２５】
また、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼは、同等の活性を有する限り、ポリエチレングリコールを主成分とする基、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで化学的に修飾されたものであってもよく、遺伝子操作により得られる同等の活性を有する改良酵素であってもよい。【００２６】
本発明の酵素反応は、水性媒体中で行なわれるが、特に緩衝液中で行なうのが好ましい。
緩衝液としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤及びグッドの緩衝液等が上げられる。グッドの緩衝剤としては、Ｎ−（２−アセタミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−（２−アセタミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドキシルエチル）アミノ］−２−ヒドキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、２−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モノホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳ）などが挙げられる。
また、緩衝液のｐＨは４〜１０、好ましくは５〜９である。緩衝液の使用濃度は、５〜５００ｍＭが好ましく、１０〜２００ｍＭがより好ましく、２０〜１００ｍＭが特に好ましい。【００２７】
本発明の測定方法において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを用いる場合は、コレステロールの反応により酸素から過酸化水素が発生する。発生した過酸化水素は、例えばパーオキシダーゼの存在下、４−アミノアンチピリンとフェノール類、４−アミノアンチピリンとトリンダー試薬又は高感度の色素源を用いて定量することができる。
フェノール類としては、例えばフェノール、４−クロロフェノール、ｍ−クレゾール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。【００２８】
トリンダー試薬（同人化学研究所第１９版総合カタログ、２００２年）としては、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジスルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−ジスルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−ｍ−３−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（ＡＰＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−３−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−２−ヒドロキシ−３−スルフプロキシル−３−メトキシアニリン等のアニリン類あるいはＮ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン等が挙げられる。【００２９】
高感度の色素源としては、特公昭６０−３３４７９号公報で示される１０−（Ｎ−メチルカルバモイル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、特公平４−２７８３９で示されるビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミノ（ＢＣＭＡ）、特開昭６２−２９６号公報で示される化合物等が挙げられる。これら色素源の濃度としては、０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましい。【００３０】
また、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼを用いる場合は、コレステロールの反応により酸化型補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）から還元型補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈが発生する。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、約３００〜５００ｎｍ、好ましくは３３０〜４００ｎｍ、特に好ましくは約３４０ｎｍでの反応液の吸光度を測定することにより定量することができる。尚、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの定量は、ジアホラーゼ、テトラゾリウム塩を添加してホルマザン色素を生成させ、ホルマザン色素を比色して行なうこともできる。
反応は、１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃、通常３７℃で、１〜３０分間、好ましくは２〜１０分間行なえばよい。【００３１】
本発明の試薬は、コレステロールエステラーゼ活性に比しリポタンパク質リパーゼ活性の強いコレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを含有するものである。
また、例えばレムナント様リポタンパク質以外のリポタンパク質が被検試料中に多く存在している場合など、これらリポタンパク質の影響を低減したい際、前述抗アポＢ−１００抗体及び抗アポＡ−Ｉ抗体による前処理を行なう場合には、当該抗体を含有する第１試薬、上記の酵素溶液を含有する第２試薬からなる試薬として構成するのが好ましい。この場合、被検試料に第１試薬を添加し、２５〜４０℃で、１〜１０分反応させた後、第２試薬を添加し２５〜４０℃で、２〜２０分間作用させるのが望ましい。【００３２】
また、当該測定試薬には、必要により生体試料中のグロブリンなどのタンパク質を可溶化するための種々の塩類、リポタンパク質凝集剤、他の酵素等を含有させることができる。
斯かる塩類としては、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化リチウム、硫酸リチウム、硫酸アンモニウム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウムなどが挙げられ、０〜１００ｍＭで使用される。リポタンパク質凝集剤としてはリンタングステン酸塩、デキストラン硫酸塩、ヘパリンなどのポリアニオンが、マグネシウム、カルシウム、コバルト等の２価の金属塩が挙げられる。また、他の酵素としてはアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。【００３３】
尚、本発明に適用する被検試料は、特に限定されるものではなく、具体的には生体試料においては血液自体又は血漿、血清等の血液画分を使用することができる。
【実施例】
【００３４】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
実施例１
（１）試料の調製
血清成分をＬＤＬ画分及びＨＤＬ画分に分画し、各リポタンパク質の測定を行なった。該タンパク質の分画方法を下記に示す。
抗アポＢ−１００抗体結合アフィニテイカラム、抗アポＡ−Ｉ抗体結合アフィニテイカラムを各々作製し、血清を添加して結合画分を回収し、それぞれＬＤＬ、ＨＤＬとした。
また、ＶＬＤＬの分画は超遠心分離法（Ｈａｖｅｌ  Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９５５；３４：１３４５．、１２０，０００ｒｐｍ，１．５ｈｒ，４℃）で分離した（Ｔｏｔａｌ−ＶＬＤＬ）後、免疫吸着法（抗アポＢ−１００抗体結合アフィニティーカラム）に結合した画分を、Ｂｏｕｎｄ−ＶＬＤＬ、素通り画分をＵｎｂｏｕｎｄ−ＶＬＤＬ（レムナント様リポタンパク質画分）とした。実施例２及び３の測定に際しては、いずれもコレステロール濃度として４０ｍｇ／ｄＬに調製したものを使用した。【００３５】
（２）測定試薬の調製
下記に示されるレムナント様リポタンパク質中のコレステロール測定試薬を作製した。【００３６】
【表１】
0004842838.tif 000002
【００３７】
【表２】
0004842838.tif 000003
【００３８】
（３）測定方法・結果
抗体前処理を行なう場合は、２１０μＬの試薬１を分光光度計のセルに入れ、血清２０μＬを添加して攪拌した後、３７℃にて加温した。次いで、５分後（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｏｉｎｔ  １７）に予め３７℃に加温しておいた試薬２を７０μＬ添加し、その後５分（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｏｉｎｔ  ３３）まで測定した。測定波長は、主波長５７２ｎｍ及び副波長７４８ｎｍにて測定した。
評価の基準はｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｏｉｎｔ  １７−３３までの吸光度変化率で評価した。【００３９】
実施例２
（１）コレステロールエステラーゼのＬＤＬ及びＨＤＬに対する反応特異性
ＬＤＬ及びＨＤＬを０．１％の界面活性剤（エマルゲン、花王社製）にて処理を行なったものと、未処理溶液を被検試料として、コレステロールの測定を行なった。但し、コレステロールエステラーゼとして、ＬＰ酵素（旭化成ファーマ社製、活性比率５１２）又はＣＥ酵素（天野エンザイム社製、活性比率１４．３）を用いた。ＬＤＬを図１に、ＨＤＬを図２に示す。測定方法は、実施例１に従った。いずれもコレステロール総反応量（界面活性剤処理）に比べＬＰ酵素を使用した場合、著しく反応性が低減されていた。また、ＣＥ酵素を用いた場合は、ＬＰ酵素に比べ高い吸収を示した。【００４０】
実施例３
（２）Ｕｎｂｏｕｎｄ−ＶＬＤＬ（レムナント様リポタンパク質画分）、ｂｏｕｎｄ−ＶＬＤＬの反応特異性
本発明測定方法におけるＶＬＤＬ画分の反応特異性をＬＰ酵素を用いて検討した。尚、測定方法は、実施例１に従った。図３は、抗アポＢ−１００抗体（ＪＩ−Ｈ）及び抗アポＡ−Ｉ抗体（Ｈ−１２）未添加、図４は、抗体添加における反応性を示す。抗体は、ＪＩ−Ｈ及びＨ−１２共に終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように第１液に対して抗体を添加した。図３、図４共にｕｎｂｏｕｎｄ−ＶＬＤＬ及びｂｏｕｎｄ−ＶＬＤＬ共にほぼ同様の反応曲線を示し、レムナント様リポタンパク質中のコレステロールが選択的に測定されることが確認された。さらに、抗体の添加した場合は、ｂｏｕｎｄ−ＶＬＤＬ反応性はさらに約１／３まで低下し、酵素反応が抑制された。
従って、抗体添加によりレムナント様リポタンパク質がより精度良く測定されることが判明した。【００４１】
実施例４  市販レムナント様リポタンパク質中コレステロール測定キットとの比較
（１）ＶＬＤＬ画分中のレムナント様リポタンパク質中のコレステロールを従来のレムナント様タンパク質測定キット（ＲＬＰ−Ｃ  ＩＩ、日本抗体研究所社製）と、各種コレステロールエステラーゼ（ＬＰ：活性比率５１２（旭化成ファーマ社製）、ＬＰＢＰ：活性比率６２９６（旭化成ファーマ社製）、ＣＥＢＰＭ：活性比率１１．２（東洋紡社製）、ＣＥＮ：活性比率１４．３（旭化成ファーマ社製）、ＣＯＥ３１１：活性比率３１．８（東洋紡社製））を使用して実施例３と同様の条件で測定し、その相関を求めた。結果を表１に示す。
その結果、ＣＥＢＰＭを除く４酵素を使用した場合には、既存の市販キットとの測定値の間に相関が認められた。【００４２】
【表３】
0004842838.tif 000004
【００４３】
（２）臨床検体のレムナント様リポタンパク質中のコレステロールを、従来のレムナント様タンパク質測定キット（ＲＬＰ−Ｃ  ＩＩ、日本抗体研究所社製）と、本発明の測定方法（コレステロールエステラーゼとして、ＬＰ（旭化成ファーマ社製、活性比率５１２）を使用）を用いて測定し、その相関を求めた。
健常人１４例、ＩＩＩ型高脂血症２例を含む高脂血症者２０例、冠動脈疾患患者６５例、以上９９例を対象としてＲＬＰ−Ｃ  ＩＩ法とＤｉｒｅｃｔ  ＲＬＰ−Ｃ法で同時に測定し、その相関を比較検討した。その結果、回帰曲線ｙ＝０．９８７ｘ＋０．３２６、相関係数ｒ＝０．９６２と良好な相関が得られた（図５）。
【図１】
0004842838.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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