(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基部分として次の式Ｉ、式II、式III、式IV又は式Ｖ：
式Ｉ
【化１２】
0004712814.tif 000015
（ただし、式Ｉにおいて、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹの少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基及びシアノ基からなる群より選択された電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残りの基は水素原子を示す）
式II
【化１３】
0004712814.tif 000016
（ただし、式IIにおいて、Ｒ１は、水素原子であり、
Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ２及びＲ３の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す）
式III
【化１４】
0004712814.tif 000017
（ただし、式IIIにおいて、Ｒ４は、水素原子又は低級アルキル基であり、
Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ５及びＲ６の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す）
式IV
【化１５】
0004712814.tif 000018
（ただし、式IVにおいて、Ｒ７は、水素原子又は低級アルキル基であり、
Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ８及びＲ９の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す）
式Ｖ
【化１６】
0004712814.tif 000019
（ただし、式Ｖにおいて、Ｒ１０は、水素原子又は低級アルキル基であり、
Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ１１及びＲ１２の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す）
で表される基を、５’末端又は３’末端に有する核酸からなる光連結性核酸と、
光連結性核酸と光連結可能な塩基部分として炭素−炭素二重結合を有する塩基を、
３’末端又は５’末端に有する、被光連結性核酸と、からなり、
ここで、核酸は核酸又はペプチド核酸であり、
光連結性核酸及び被光連結性核酸のうちのいずれか一方が、標識部分を有し、
光連結性核酸及び被光連結性核酸のうちの標識部分を有さない一方が、あらかじめ基材に固定化されており、
光連結性核酸と被光連結性核酸とが、光連結されることによって、特定の塩基配列を有する標的核酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有する１本の核酸を生成可能であり、
光連結性核酸と被光連結性核酸とが光連結されることによって生成可能な核酸は、相補的二重鎖の解離する洗浄条件で洗浄可能である、特定の塩基配列の標的核酸を検出するための核酸セット、を使用して、核酸混合物中に含まれる、特定の塩基配列を有する標的核酸を検出、同定又は定量する方法、であって、
光連結性核酸及び被光連結性核酸と、核酸混合物中に含まれる、特定の塩基配列を有する標的核酸とを、ハイブリッド形成させる工程と、
特定の塩基配列を有する標的核酸を鋳型とするハイブリッド形成によって、光連結可能に隣接された光連結性核酸と被光連結性核酸に、光照射して光連結させ、標識部分を有する核酸を基材に固定化する工程と、
光連結により基材に固定化された、標識部分を有する核酸を、ハイブリッド形成した相補的二重鎖が解離する洗浄条件で洗浄することによって、光連結により基材に固定化されなかった、標識部分を有する核酸を、除去する工程と、
光連結により基材に固定化された、標識部分を有する核酸を検出するために、標識部分を検出する工程と、
を含み、
洗浄条件が、８０〜１００℃の範囲の洗浄温度での洗浄であり、
ハイブリッド形成させる工程、及び光連結させて標識部分を有する核酸を基材に固定化する工程が、緩衝作用のある塩を含む反応溶液の中で行われ、反応溶液が２０〜６０％（体積比）の水分散性有機溶媒を含み、
緩衝作用のある塩が、カコジル酸塩である、
核酸混合物中に含まれる、特定の塩基配列を有する標的核酸を検出、同定又は定量する方法。
【請求項２】
塩基部分が式Ｉで表される基であり、式Ｉにおいて、ＺがＯで、Ｘが水素原子で、Ｙがカルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基又はシアノ基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
塩基部分が式IIで表される基であり、式IIにおいて、Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方が、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ２及びＲ３の残りの基が水素原子である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
塩基部分が式IIIで表される基であり、式IIIにおいて、Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方が、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ５及びＲ６の残りの基が水素原子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
塩基部分が式IVで表される基であり、式IVにおいて、Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方が、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ８及びＲ９の残りの基が水素原子である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
塩基部分が式Ｖで表される基であり、式Ｖにおいて、Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方が、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ１１及びＲ１２の残りの基が水素原子である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
標識部分の標識として、ビオチン標識、色素標識（蛍光色素標識を含む）、ＲＩ標識からなる群より選択された何れかの標識を有している、請求項１〜６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
光連結性核酸及び被光連結性核酸のうちの、あらかじめ基材に固定化された一方の核酸が、リンカー部分を介して基材に固定化されている、請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
リンカー部分が、ポリエチレングリコール又はアルカン類を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
基材が、ガラスプレート、ＣＰＧ、ポリスチレンビーズからなる群より選択された何れかである、請求項１〜９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
炭素−炭素二重結合を有する塩基が、シトシン、チミン又はウラシルである請求項１〜１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
光連結性核酸が、オリゴヌクレオチドである請求項１〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
光連結性核酸が、ＤＮＡである請求項１〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
光連結性核酸が、ＲＮＡである請求項１〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
光連結性核酸が、ペプチド核酸である請求項１〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
被光連結性核酸が、オリゴヌクレオチドである請求項１〜１５の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
被光連結性核酸が、ＤＮＡである請求項１〜１５の何れかに記載の方法。
【請求項１８】
被光連結性核酸が、ＲＮＡである請求項１〜１５の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
被光連結性核酸が、ペプチド核酸である請求項１〜１５の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
光連結性核酸と被光連結性核酸が、同じ種類の核酸である請求項１〜１９の何れかに記載の方法。
【請求項２１】
光連結性核酸及び被光連結性核酸のうちの、標識部分を有さない一方が、あらかじめ基材に固定化され、ＤＮＡマイクロアレイを形成する、請求項１〜２０の何れかに記載の方法。
【請求項２２】
ハイブリッド形成させる工程、及び光連結させて標識部分を有する核酸を基材に固定化する工程が、２０〜３０℃の温度で行われる、請求項１〜２１の何れかに記載の方法。
【請求項２３】
反応溶液のｐＨが６．５〜８．５の範囲にある、請求項１〜２２の何れかに記載の方法。
【請求項２４】
緩衝作用のある塩の濃度が、５〜２５０ｍＭの範囲にある、請求項１〜２３の何れかに記載の方法。
【請求項２５】
水分散性有機溶媒が、アセトニトリルである、請求項１〜２４の何れかに記載の方法。
【請求項２６】
反応溶液が、アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属の塩を含み、
該塩の濃度が、標的核酸の濃度に対して最適化されている、請求項１〜２５の何れかに記載の方法。
【請求項２７】
アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属の塩として、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
光照射が、３３０ｎｍ以上の波長の光の照射により行われる、請求項１〜２７の何れかに記載の方法。
【請求項２９】
洗浄条件が、９５〜１００℃の範囲の洗浄温度での洗浄である、請求項１〜２８の何れかに記載の方法。
【請求項３０】
洗浄条件が、変性剤を含む洗浄溶液での洗浄である、請求項１〜２９の何れかに記載の方法。
【請求項３１】
洗浄条件が、界面活性剤を含む洗浄溶液での洗浄である、請求項１〜３０の何れかに記載の方法。
【請求項３２】
標識部分の標識が蛍光色素標識であり、
標識部分の検出をする工程において、レーザースキャナを使用した蛍光測定を行う工程が含まれる、請求項１〜３１の何れかに記載の方法。
【請求項３３】
標識部分の標識がビオチン標識であり、
標識部分の検出をする工程において、
蛍光色素標識されたアビジンによって、ビオチン−アビジン結合反応を行う工程と、
レーザースキャナを使用した蛍光測定を行う工程が含まれる、請求項１〜３２の何れかに記載の方法。
【請求項３４】
塩基配列に点変異を有する標的核酸を検出するのに用いられる、請求項１〜３３の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料混合物中に存在する特定の塩基配列の標的核酸類を、光連結を使用して特異的に検出する方法、及び該検出のための核酸類セットに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学において重要な基本的手段の一つとして、試料混合物中に存在する特定の塩基配列の核酸類（核酸類には、核酸、及びペプチド核酸が含まれる）の検出（検出には、同定、及び定量を含む）がある。特定の塩基配列の核酸類あるいは遺伝子の存在を検出することで、着目する遺伝子の発現を解明して新規に創薬することが可能となったり、遺伝子組み換えにおいて目的の遺伝子が導入された細胞や個体を選択することが可能になり、あるいは、遺伝子診断を行って病気の原因となるヒトの遺伝子欠陥や変化を検出することで病気の発症前やその初期段階で診断や予測が可能となったりする。【０００３】
このように、試料混合物中に存在する特定の塩基配列の核酸類の検出は、遺伝子工学において広く使用されている基本的な手段であり、例えば次のような方法が知られている。
最初に、調査したい細胞等から核酸類を抽出して試料混合物溶液を得る。必要があれば、適当な制限酵素で切断した後、電気泳動を行い、得られたゲルからメンブレンへブロッティングを行う。次に、検出の目的とする特定の塩基配列を有する核酸類に対して、特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸プローブを用意する。そして、これとプロットされた核酸類とをハイブリッド形成させる。この核酸プローブは、検出可能となるようにあらかじめ標識をしておく。例えばラジオアイソトープにより標識をしておく。これによって核酸プローブとハイブリッド形成した核酸類のバンドを、オートラジオグラフィーにより検出し、標的とする特定の塩基配列を有する核酸類の存在を確認する。この方法は、ＲＮＡについてはノザンブロッティング、ＤＮＡについてはサザンブロッテイングと呼ばれ、種々の変形をなされつつ、今なお使用されている（例えば、「細胞の分子生物学」第四版、中村桂子・松原謙一監訳、ニュートンプレス刊、２００４年、４９４〜５００頁に記載されている）。
また、特に最近の遺伝子診断技術においては、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）が、特定の塩基配列の核酸類の検出に使用されている。ＤＮＡチップの基板上には、多数の区画のそれぞれに種々の塩基配列のＤＮＡプローブが固定化され、アレイ状に配置されている。そして、被験者由来のＤＮＡの混合物をあらかじめ標識して、例えば蛍光色素による標識をして用意する。この被験者由来のＤＮＡ混合物をＤＮＡチップに滴下して、ハイブリッド形成させる。被験者由来のＤＮＡ混合物中のうち、ＤＮＡプローブと相補性のある塩基配列を含むＤＮＡは、ハイブリッド形成によりＤＮＡチップの基板上に固定される。この固定された被験者由来のＤＮＡを例えば先の蛍光色素による標識で検出する。この方法では、ＤＮＡの調整やＲＮＡの使用、あるいはハイブリッド形成を競合的に行うことで正規化をするなどの種々の変形が行われている（例えば、「細胞の分子生物学」第四版、中村桂子・松原謙一監訳、ニュートンプレス刊、２００４年、５３３〜５３５頁に記載されている）。【０００４】
このように従来の方法から最近の技術に至るまで、特定の塩基配列の核酸類の検出には、相補的な塩基配列を有する核酸プローブとのハイブリッド形成が、相補的な塩基配列の特異的な認識を可能にする基本的原理として永らく利用されてきている。しかしながら、実際のハイブリッド形成の条件下においては、核酸プローブ分子との結合は、完全な相補鎖としてハイブリッド形成する標的塩基配列の核酸類のみで生じることは難しい。すなわち、相補鎖として不完全な非標的塩基配列の核酸類に対しても、一定のミスマッチを含む不完全なハイブリッド形成をしてしまい、核酸プローブ分子との結合が生じることが知られている。このような核酸プローブとの意図しない結合は、検出段階でノイズとして出現する。このようなノイズが出現しないように、検出の特異性を高めようとすれば、不完全なハイブリッド形成を排除することが必要となる。【０００５】
しかし、ハイブリッド形成による識別は熱的安定性の差を利用しているものであって、完全なハイブリッド形成も不完全なハイブリッド形成もその違いは熱的安定性の違いに過ぎない。そのために、両者を区別する適切な条件は目的の塩基配列によって異なり、さらに適切な条件下でもなお、熱的安定性を変化させる条件は両者に均等に作用する。すなわち、ハイブリッド形成の熱的安定性の差のみを、両者の区別の原理として使用する限りは、検出の特異性と感度のバランスで妥協して一定のノイズを甘受せざるを得なかった。
さらに、近年では、新規創薬や遺伝子診断のために、一塩基置換した塩基配列を有する核酸類を、検出することが求められている。特に、ＤＮＡの一塩基多型をタイピングする技術には、医療診断の分野での期待が大きい。このためには、一塩基の置換を検出するほどの特異性と、実用可能な感度（Ｓ／Ｎ比）とを両立させることが特に求められている。【０００６】
【非特許文献１】「細胞の分子生物学」第四版、中村桂子・松原謙一監訳、ニュートンプレス刊、２００４年、４９４〜５００頁
【非特許文献２】「細胞の分子生物学」第四版、中村桂子・松原謙一監訳、ニュートンプレス刊、２００４年、５３３〜５３５頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、試料混合物中に存在する特定の塩基配列の標的核酸類を、相補鎖とのハイブリッド形成を利用しつつ、高い特異性と感度（Ｓ／Ｎ比）を両立させて検出する方法、及び該検出のための核酸類を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的のために、長年にわたって鋭意研究開発を行ってきた光連結を用いた。そして、ハイブリッド形成と光連結を組み合わせることで、上記目的を達成できることを見いだした。すなわち、光連結を利用して、完全なハイブリッド形成を行った場合にのみ特異的に光連結させ、標識部分を有する核酸類の分子を、基材に共有結合的に固定化することができた。そして、検出されるべき標識部分を有する分子が、もはやハイブリッド形成の維持に依存することなく基材に固定化されることによって、相補的二重鎖の解離する条件での徹底的な洗浄が可能となった。これにより、高い特異性と感度（Ｓ／Ｎ比）を両立させることができた。【０００９】
したがって、本発明は、塩基部分として次の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ又は式Ｖ：
式Ｉ
【化１】
0004712814.tif 000002
（ただし、式Ｉにおいて、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹの少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基及びシアノ基からなる群より選択された電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残りの基は水素原子を示す）
式ＩＩ
【化２】
0004712814.tif 000003
（ただし、式ＩＩにおいて、Ｒ１は、水素原子であり、
Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ２及びＲ３の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す）
式ＩＩＩ
【化３】
0004712814.tif 000004
（ただし、式ＩＩＩにおいて、Ｒ４は、水素原子又は低級アルキル基であり、
Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ５及びＲ６の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す）
式ＩＶ
【化４】
0004712814.tif 000005
（ただし、式ＩＶにおいて、Ｒ７は、水素原子又は低級アルキル基であり、
Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ８及びＲ９の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す）
式Ｖ
【化５】
0004712814.tif 000006
（ただし、式Ｖにおいて、Ｒ１０は、水素原子又は低級アルキル基であり、
Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ１１及びＲ１２の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す）
で表される基を、５’末端又は３’末端に有する核酸類（ただし、核酸類には、核酸、ペプチド核酸が含まれる）からなる光連結性核酸類と、
光連結性核酸類と光連結可能な塩基部分として炭素−炭素二重結合を有する塩基を、３’末端又は５’末端に有する、被光連結性核酸類と、からなり、
光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちのいずれか一方が、標識部分を有し、
光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの標識部分を有さない一方が、あらかじめ基材に固定化されており、
光連結性核酸類と被光連結性核酸類とが、光連結されることによって、特定の塩基配列を有する標的核酸類の塩基配列と相補的な塩基配列の核酸類を生成可能であり、
光連結性核酸類と被光連結性核酸類とが光連結されることによって生成可能な核酸類は、相補的二重鎖の解離する洗浄条件で洗浄可能である、特定の塩基配列の標的核酸類を検出するための核酸類セットにある。
好ましい実施の態様において、塩基部分が式Ｉで表される基であり、式Ｉにおいて、ＺがＯで、Ｘが水素原子で、Ｙがカルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基又はシアノ基である。
好ましい実施の別な態様において、塩基部分が式ＩＩで表される基であり、式ＩＩにおいて、Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方が、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ２及びＲ３の残りの基が水素原子である。
好ましい実施の別な態様において、塩基部分が式ＩＩＩで表される基であり、式ＩＩＩにおいて、Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方が、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ５及びＲ６の残りの基が水素原子である。
好ましい実施の別な態様において、塩基部分が式ＩＶで表される基であり、式ＩＶにおいて、Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方が、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ８及びＲ９の残りの基が水素原子である。
好ましい実施の別な態様において、塩基部分が式Ｖで表される基であり、式Ｖにおいて、Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方が、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ１１及びＲ１２の残りの基が水素原子である。
標識部分の標識として、ビオチン標識、色素標識（蛍光色素標識を含む）、ＲＩ標識、酵素標識（発色酵素標識を含む）からなる群より選択された何れかの標識を有していることが好ましい。標識部分の標識として、ビオチン標識を有していることが特に好ましい。
光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの、あらかじめ基材に固定化された一方の核酸類が、リンカー部分を介して基材に固定化されていることが好ましい。
リンカー部分が、ポリエチレングリコール又はアルカン類を含むことが好ましい。リンカー部分が、ポリエチレングリコールを含むことが特に好ましい。
基材が、ガラスプレート、ＣＰＧ、ポリスチレンビーズからなる群より選択された何れかであることが好ましい。基材が、ガラスプレートであることが特に好ましい。
洗浄条件として、８０〜１００℃の範囲の洗浄温度で洗浄可能であることが好ましい。洗浄条件として、９５〜１００℃の範囲の洗浄温度で洗浄可能であることが特に好ましい。  洗浄条件として、変性剤を含む洗浄溶液で洗浄可能であることが好ましい。変性剤として、例えば、尿素を挙げることができる。
洗浄条件として、界面活性剤を含む洗浄溶液で洗浄可能であることが好ましい。界面活性剤として、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムを挙げることができる。
炭素−炭素二重結合を有する塩基が、シトシン、チミン又はウラシルであることが好ましい。
光連結性核酸類が、オリゴヌクレオチドであることが好適である。光連結性核酸類が、ＤＮＡ又はＲＮＡであることが好適である。光連結性核酸類が、ペプチド核酸であることが好適である。
被光連結性核酸類が、オリゴヌクレオチドであることが好適である。被光連結性核酸類が、ＤＮＡ又はＲＮＡであることが好適である。被光連結性核酸類が、ペプチド核酸であることが好適である。
光連結性核酸類と被光連結性核酸類が、同じ種類の核酸類であることが好適である。
標的核酸類が、オリゴヌクレオチドであることが好適である。標的核酸類が、ＤＮＡ又はＲＮＡであることが好適である。標的核酸類が、ペプチド核酸であることが好適である。【００１０】
また、本発明は、上記の光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの、標識部分を有さない一方が、あらかじめ基材に固定化されてなり、
光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの、標識部分を有する一方とともに使用される、ＤＮＡマイクロアレイ（基材上に固定化される分子として、ＤＮＡ以外の核酸、及びペプチド核酸を含む）にもある。【００１１】
また、本発明は、上記の光連結性核酸類及び被光連結性核酸類と、核酸類混合物中に含まれる、特定の塩基配列を有する標的核酸類とを、ハイブリッド形成させる工程と、
特定の塩基配列を有する標的核酸類を鋳型とするハイブリッド形成によって、光連結可能に隣接された光連結性核酸類と被光連結性核酸類に、光照射して光連結させ、標識部分を有する核酸類を基材に固定化する工程と、
光連結により基材に固定化された、標識部分を有する核酸類を、ハイブリッド形成した相補的二重鎖が解離する洗浄条件で洗浄することによって、光連結により基材に固定化されなかった、標識部分を有する核酸類を、除去する工程と、
光連結により基材に固定化された、標識部分を有する核酸類を検出するために、標識部分を検出する工程と、
を含む、核酸類混合物中に含まれる、特定の塩基配列を有する標的核酸類を検出（同定及び定量を含む）する方法にもある。
ハイブリッド形成させる工程、及び光連結させて標識部分を有する核酸類を基材に固定化する工程が、２０〜３０℃の温度で行われることが好ましい。
ハイブリッド形成させる工程、及び光連結させて標識部分を有する核酸類を基材に固定化する工程が、緩衝作用のある塩を含む反応溶液の中で行われることが好ましい。反応溶液のｐＨが６．５〜８．５の範囲にあることが好ましい。緩衝作用のある塩の濃度が、５〜２５０ｍＭの範囲にあることが好ましい。緩衝作用のある塩が、カコジル酸塩であることが好ましい。
また、反応溶液が、水分散性有機溶媒を含むことが好ましい。反応溶液が、２０〜６０％（体積比）の水分散性有機溶媒を含んでいることが好ましい。水分散性有機溶媒が、アセトニトリルであることが好ましい。
また、反応溶液が、アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属の塩を含み、該塩の濃度が、標的核酸類の濃度に対して最適化されていることが好ましい。アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属の塩として、例えば塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含むことが好ましい。
洗浄条件が、８０〜１００℃の範囲の洗浄温度での洗浄であることが好ましい。洗浄条件が、９５〜１００℃の範囲の洗浄温度での洗浄であることが特に好ましい。
洗浄条件が、変性剤を含む洗浄溶液での洗浄であることが好ましい。洗浄条件が、界面活性剤を含む洗浄溶液での洗浄であることが特に好ましい。
光照射が、３３０ｎｍ以上の波長の光の照射により行われることが好ましい。
標的核酸類が、オリゴヌクレオチドであることが好適である。また、標的核酸類が、ＤＮＡであることが好適である。また、標的核酸類が、ＲＮＡであることが好適である。また、標的核酸類が、ペプチド核酸であることが好適である。
また、上記方法において、標識部分の標識が蛍光色素標識であり、
標識部分の検出をする工程において、レーザースキャナを使用した蛍光測定を行う工程が含まれることが好ましい。
さらに、上記方法において、標識部分の標識がビオチン標識であり、
標識部分の検出をする工程において、
蛍光色素標識されたアビジンによって、ビオチン−アビジン結合反応を行う工程と、
レーザースキャナを使用した蛍光測定を行う工程が含まれることが好ましい。【００１２】
さらに、本発明は、上記方法において、特定の塩基配列を有する標的核酸類の塩基配列と相補的な塩基配列から１塩基を置換した配列の核酸類が、光連結性核酸類と被光連結性核酸類とが光連結されることによって生成されるような塩基配列を有する、光連結性核酸類及び被光連結性核酸類を使用することによって、標的核酸類の塩基配列の点変異を検出する方法にもある。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、試料混合物中に存在する特定の塩基配列の標的核酸類を、相補鎖とのハイブリッド形成を検出原理としつつ、高い特異性と感度を両立させて検出できる。すなわち、完全なハイブリッド形成を行った場合にのみ光連結させることを可能としたために、検出される標識部分を有する分子のみが、共有結合的に基材に固定化できる。これによって、相補的二重鎖の解離する条件での徹底的な洗浄が可能となった。このため、未反応物を完全に除去することで、ノイズを極めて低減することができる。これは、共有結合を切断することなく行うために、検出感度を低下させることがない。すなわち、このように不完全なハイブリッド形成を完全に除去することによって、高い特異性と感度とが両立されている。【００１４】
従って、本発明による特定の塩基配列の標的核酸類を検出する方法、及び該検出のための核酸類セットは、相補的塩基配列とハイブリッド形成することを原理としているあらゆる方法において、高い特異性と感度とを両立して提供するものである。
また、本発明において、光連結は光反応であり、酵素反応のような微妙な条件設定を要しない。さらに生成される結合が安定な共有結合である。そのために、反応条件として、極めて広範な範囲の条件から、最適な条件を選択可能であるという実験操作の容易性と効率性を、本発明は実現している。【００１５】
本発明の高い特異性と感度とは、ＤＮＡタイピングに有用であり、医療診断分野への利用が期待される。特に、本発明の高い特異性と感度とは、一塩基置換の検出に有効である。また、本発明をＤＮＡチップへと応用することは、通常のハイブリッド形成による検出法、あるいは酵素を利用するインベーダー法などと比較して、高い特異性と感度という利点に加えて、ハイブリッド形成の条件の選択の自由度が大きく、温度の設定も自由度が大きく、管理等が楽であるという利点を有し、より広範な用途にＤＮＡチップの使用を拓くものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の実施の形態を以下に詳細に説明する。
図１は、本発明の実施の一態様の流れを示した説明図である。
図１の（１−１）では、光連結性核酸類として、ＯＤＮ２（ＣＶＵ）が示されている。このＯＤＮ２（ＣＶＵ）は、光連結性のある式Ｉの塩基部分として、５−カルボキシビニル−２’−デオキシウリジン（ＣＶＵと表記する）を有するオリゴヌクレオチドである。このＯＤＮ２（ＣＶＵ）の一端は、−Ｎ＝ＣＨ−を介して基材の表面上に固定化されている。また、図１の（１−１）では、被光連結性核酸類としてビオチン−ＯＤＮ（Ｔ）が示されている。このビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）−ＯＤＮ（Ｔ）は、光連結性核酸類と光連結可能な塩基部分である炭素−炭素二重結合を有する塩基として、チミン（Ｔと表記する）を有するオリゴヌクレオチドである。このビオチン−ＯＤＮ（Ｔ）はその一端に、標識部分としてビオチンを有している。このビオチンは図１のビオチン−ＯＤＮ（Ｔ）の一端に丸として表されている。また、図１の（１−１）では、特定の塩基配列を有する標的核酸類として、標的（Ｔａｒｇｅｔ）ＲＮＡ（Ａ）が示されている。【００１７】
この標的核酸類である標的ＲＮＡ（Ａ）と、光連結性核酸類であるＯＤＮ２（ＣＶＵ）と被光連結性核酸類であるビオチン−ＯＤＮ（Ｔ）からなる核酸類セットとを、混合してハイブリッド形成をさせる。すると、あらかじめ準備された塩基配列の相補性に従って、標的ＲＮＡ（Ａ）を鋳型として、ビオチン−ＯＤＮ（Ｔ）とＯＤＮ２（ＣＶＵ）とは、ＴとＣＶＵとが光連結可能になるように近接して整列する。この状態で光照射を行うと、光反応により光連結が生じて、図１の（１−２）に示されるように、ビオチン−ＯＤＮ（Ｔ）とＯＤＮ２（ＣＶＵ）とは共有結合で１本に連結された状態となる（光連結された状態は、ＴとＣＶＵを架橋するように＜印を付して示した）。
後述するように、本発明者らの見いだした知見によれば、このように光連結するためには、塩基配列がほぼ完全に相補的にハイブリッド形成することが必要である。この光連結は、わずか一塩基の置換によって生じる不完全なハイブリッド形成によっても妨げられる。すなわち、本発明においては、この光連結による相補鎖の高い識別性が、本発明の高い特異性に寄与している。【００１８】
このように光連結によって標識部分が基材上に固定化された状態（図１の（１−２））となれば、もはや鋳型とされた標的核酸類（図１の標的ＲＮＡ（Ａ）））がハイブリッド形成を維持している必要はない。そこで、次にハイブリッド形成による相補的二重鎖の解離するような条件で、洗浄を行う。特に、本発明では、意図しない不完全なハイブリッド形成による不完全な相補的二重鎖のみならず、目的とする完全なハイブリッド形成による完全な相補的二重鎖をも解離させて、洗浄除去してしまっても、その後の検出には原理的に全く影響がない。すなわち、完全な相補的二重鎖をも解離させる条件での洗浄が可能である。そのため、光連結が生じない程度の不完全なハイブリッド形成によって、標的ＲＮＡ（Ａ）の特定の塩基配列に類似した塩基配列を介して基材上に弱く固定化された標識部分があったとしても、これを完全に除去して、ノイズとして出現することがないようにすることができる。すなわち、本発明においては、ハイブリッド形成による目的の相補的二重鎖をも解離させる洗浄条件での洗浄によるノイズの低減が、本発明の高い感度（Ｓ／Ｎ比）に寄与している。【００１９】
次に、このように光連結によって基材上に固定化された標識部分に対して、検出を行う。図１の（１−３）では、ビオチン−ＯＤＮ（Ｔ）に対して、ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−Ｃｙ３を結合させて検出する様子が示されている。ストレプトアビジンは標識部分であるビオチンと強く結合し、それによって基板上へと固定化される蛍光色素Ｃｙ３の蛍光を、例えばレーザースキャナで読み取ることにより検出を行う。【００２０】
図８は、本発明の異なる実施の一態様を示した説明図である。図８では、説明の便宜のために、図１の（１−２）に相当する図のみを示してある。図８では、光連結性核酸類として、ＯＤＮ  Ｐ１が示されている。このＯＤＮ  Ｐ１は、光連結性のある式Ｉの塩基部分として、５−カルボキシビニル−２’−デオキシウリジン（ＣＶＵと表記する）を有するオリゴヌクレオチドである。このＯＤＮ２（ＣＶＵ）の一端は、ヘキサエチレングリコール（Ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ：Ｓ）を介して基材の表面上に固定化されている。また、図８では、被光連結性核酸類として、ＯＤＮ  Ｓ３５が示されている。このＯＤＮ  Ｓ３５は、光連結性核酸類と光連結可能な塩基部分である炭素−炭素二重結合を有する塩基として、シトシン（Ｃと表記する）を有するオリゴヌクレオチドである。このＯＤＮ  Ｓ３５はその一端に、標識部分としてビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ：Ｂ）を有している。
図８では、既に、このＯＤＮ  Ｐ１とＯＤＮ  Ｓ３５とが、標的となるオリゴヌクレオチド（Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＯＤＮ）を鋳型とするハイブリッド形成によって、光連結可能な状態に隣接して配置された状態である。この状態で光照射を行うことにより、光連結が生じる。【００２１】
本発明においては、このハイブリッド形成させ光照射する条件について詳細に検討を行っている。この条件、すなわち、例えば、温度、溶媒（溶質）、塩などの種類及び濃度について、広範な検討が可能であるのは、本発明においては光連結という光反応によって標識部分の固定化を行っているためである。いわゆるインベーダー法などの酵素を使用する方法においては、その酵素の至適反応条件などの制約があるために、ハイブリッド形成のみに注目した反応条件の検討を行うことがそもそもできない。従って、ハイブリッド形成と光連結の反応条件を高い自由度で選択可能とすることにより、より高い特異性、感度（Ｓ／Ｎ比）による検出を可能としていることは、本発明による利点である。
特に本発明においては、水分散性の有機溶媒、例えばアセトニトリルを使用することにより、極めて迅速にハイブリッド形成と光連結の工程を行うことができることを明らかにしている。また、緩衝液としてカコジル酸緩衝液を使用することで従来の１０倍を越える蛍光強度を安定して得られることを明らかにしている。また、標的核酸類と塩濃度との間に最適条件の相関があり、それぞれ異なった極大値を有することも明らかにしている。すなわち、このように高い自由度で選択された反応条件を組み合わせることにより、従来から考えられるよりも極めて高い特異性と感度（Ｓ／Ｎ比）を実現していることも、本発明によりもたらされた貢献である。【００２２】
このようにハイブリッド形成して光連結した後に、徹底的な洗浄を行って、不完全なハイブリッド形成によって付着している識別部分（未反応の核酸類）を除去する。その後に、例えばビオチン部分に蛍光アビジンを結合させ、スキャナにより検出を行う。このような実施により、１塩基置換、２塩基置換、３塩基置換をした配列に対して、非常に高い特異性と感度（Ｓ／Ｎ比）で、完全な相補配列及びそれぞれの置換配列を識別できることができる。【００２３】
本発明の実施の形態を、さらに詳細に以下に説明する。
好ましい実施の態様において、光連結性核酸類は、塩基部分として次の式Ｉ：
式Ｉ
【化６】
0004712814.tif 000007
（ただし、式Ｉにおいて、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹの少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基及びシアノ基からなる群より選択された電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残りの基は水素原子を示す）
で表される基を有している。アルコキシカルボニル基におけるアルキル基としては、炭素数１から１０、好ましくは１から５の低級アルキル基が挙げられる。置換基Ｘ、Ｙは、両方が同時に同一または異なる電子吸引基であってもよく、また置換基Ｘ、Ｙの一方だけが電子吸引基であり、他方が水素原子であってもよい。式Ｉにおいて、ＺがＯで、Ｘが水素原子で、Ｙがカルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基又はシアノ基であることが好ましい。特に好ましい塩基部分として、５−ビニル−２’−デオキシウリジン、及び５−カルボキシビニル−２’−デオキシウリジンをあげることができる。特に５−カルボキシビニル−２’−デオキシウリジンが好ましい。【００２４】
好ましい実施の別な態様において、光連結性核酸類は、塩基部分として次の式ＩＩ：
式ＩＩ
【化７】
0004712814.tif 000008
（ただし、式ＩＩにおいて、Ｒ１は、水素原子であり、
Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ２及びＲ３の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す）
で表される基を有している。
Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、カルボキシル基は好ましく、カルボキシル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、低級アルコキシカルボニル基は好ましく、低級アルコキシカルボニル基におけるアルキル部分としては、炭素数１〜１０、好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３、さらに好ましくは１〜２、特に好ましくは炭素数１の低級アルキルが挙げられる。すなわち、好ましい低級アルコキシカルボニル基の例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、及びブトキシカルボニル基等を挙げることができ、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基及びプロポキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基及びエトキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基が特に好ましい。低級アルコキシカルボニル基と水素原子の組み合わせ、特にメトキシカルボニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、低級アルケニル基は好ましく、低級アルケニル基としては、炭素数２〜１０、好ましくは炭素数２〜５、さらに好ましくは炭素数２〜３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルケニル基と水素原子の組み合わせ、特にビニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、低級アルキニル基は好ましく、低級アルキニル基としては、炭素数２〜１０，好ましくは炭素数２〜５，さらに好ましくは炭素数２〜３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルキニル基と水素原子の組み合わせ、特にエチニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、置換アミドは好ましく、置換アミドとしては、１置換のＮ−置換アミドを挙げることができ、好ましい例として、Ｎ−アルキルアミド、Ｎ−アミノアルキルアミドを挙げることができる。このようなＮ−アルキルアミド、Ｎ−アミノアルキルアミドとしては、炭素数１〜１０、好ましくは炭素数１〜５、さらに好ましくは炭素数１〜３，特に好ましくは炭素数３のものであり、Ｎ−アミノアルキルアミドが特に好ましい。置換アミドと水素原子の組み合わせ、特にＮ−アミノ（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）アミドと水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、アミド基は好ましく、アミド基と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、シアノ基は好ましく、シアノ基とシアノ基の組み合わせ、及びシアノ基と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、水素原子は好ましく、水素原子を少なくとも１個含む組み合わせ、及び水素原子と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。【００２５】
好ましい実施の別な態様において、光連結性核酸類は、塩基部分として次の式ＩＩＩ：
式ＩＩＩ
【化８】
0004712814.tif 000009
（ただし、式ＩＩＩにおいて、Ｒ４は、水素原子又は低級アルキル基であり、
Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ５及びＲ６の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す）
で表される基を有している。
Ｒ４としては、水素原子は特に好ましい。
Ｒ４としては、低級アルキル基は好ましく、低級アルキル基としては、炭素数１〜５、好ましくは炭素数１〜３、さらに好ましくは炭素数１〜２、特に好ましくは炭素数１のものである。このような低級アルキル基としては、メチル基、エチル基及びプロピル基等を挙げることができ、メチル基及びエチル基は好ましく、特にメチル基が好ましい。
Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、カルボキシル基は好ましく、カルボキシル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、低級アルコキシカルボニル基は好ましく、低級アルコキシカルボニル基におけるアルキル部分としては、炭素数１〜１０、好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３、さらに好ましくは１〜２、特に好ましくは炭素数１の低級アルキルが挙げられる。すなわち、好ましい低級アルコキシカルボニル基の例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、及びブトキシカルボニル基等を挙げることができ、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基及びプロポキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基及びエトキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基が特に好ましい。低級アルコキシカルボニル基と水素原子の組み合わせ、特にメトキシカルボニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、低級アルケニル基は好ましく、低級アルケニル基としては、炭素数２〜１０、好ましくは炭素数２〜５、さらに好ましくは炭素数２〜３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルケニル基と水素原子の組み合わせ、特にビニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、低級アルキニル基は好ましく、低級アルキニル基としては、炭素数２〜１０，好ましくは炭素数２〜５，さらに好ましくは炭素数２〜３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルキニル基と水素原子の組み合わせ、特にエチニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、置換アミドは好ましく、置換アミドとしては、１置換のＮ−置換アミドを挙げることができ、好ましい例として、Ｎ−アルキルアミド、Ｎ−アミノアルキルアミドを挙げることができる。このようなＮ−アルキルアミド、Ｎ−アミノアルキルアミドとしては、炭素数１〜１０、好ましくは炭素数１〜５、さらに好ましくは炭素数１〜３，特に好ましくは炭素数３のものであり、Ｎ−アミノアルキルアミドが特に好ましい。置換アミドと水素原子の組み合わせ、特にＮ−アミノ（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）アミドと水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、アミド基は好ましく、アミド基と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、シアノ基は好ましく、シアノ基とシアノ基の組み合わせ、及びシアノ基と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、水素原子は好ましく、水素原子を少なくとも１個含む組み合わせ、及び水素原子と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。【００２６】
好ましい実施の別な態様において、光連結性核酸類は、塩基部分として次の式ＩＶ：
式ＩＶ
【化９】
0004712814.tif 000010
（ただし、式ＩＶにおいて、Ｒ７は、水素原子又は低級アルキル基であり、
Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ８及びＲ９の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す）
で表される基を有している。
Ｒ７としては、水素原子は特に好ましい。
Ｒ７としては、低級アルキル基は好ましく、低級アルキル基としては、炭素数１〜５、好ましくは炭素数１〜３、さらに好ましくは炭素数１〜２、特に好ましくは炭素数１のものである。このような低級アルキル基としては、メチル基、エチル基及びプロピル基等を挙げることができ、メチル基及びエチル基は好ましく、特にメチル基が好ましい。
Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、カルボキシル基は好ましく、カルボキシル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、低級アルコキシカルボニル基は好ましく、低級アルコキシカルボニル基におけるアルキル部分としては、炭素数１〜１０、好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３、さらに好ましくは１〜２、特に好ましくは炭素数１の低級アルキルが挙げられる。すなわち、好ましい低級アルコキシカルボニル基の例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、及びブトキシカルボニル基等を挙げることができ、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基及びプロポキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基及びエトキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基が特に好ましい。低級アルコキシカルボニル基と水素原子の組み合わせ、特にメトキシカルボニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、低級アルケニル基は好ましく、低級アルケニル基としては、炭素数２〜１０、好ましくは炭素数２〜５、さらに好ましくは炭素数２〜３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルケニル基と水素原子の組み合わせ、特にビニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、低級アルキニル基は好ましく、低級アルキニル基としては、炭素数２〜１０，好ましくは炭素数２〜５，さらに好ましくは炭素数２〜３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルキニル基と水素原子の組み合わせ、特にエチニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、置換アミドは好ましく、置換アミドとしては、１置換のＮ−置換アミドを挙げることができ、好ましい例として、Ｎ−アルキルアミド、Ｎ−アミノアルキルアミドを挙げることができる。このようなＮ−アルキルアミド、Ｎ−アミノアルキルアミドとしては、炭素数１〜１０、好ましくは炭素数１〜５、さらに好ましくは炭素数１〜３，特に好ましくは炭素数３のものであり、Ｎ−アミノアルキルアミドが特に好ましい。置換アミドと水素原子の組み合わせ、特にＮ−アミノ（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）アミドと水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、アミド基は好ましく、アミド基と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、シアノ基は好ましく、シアノ基とシアノ基の組み合わせ、及びシアノ基と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、水素原子は好ましく、水素原子を少なくとも１個含む組み合わせ、及び水素原子と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。【００２７】
好ましい実施の別な態様において、光連結性核酸類は、塩基部分として次の式Ｖ：
式Ｖ
【化１０】
0004712814.tif 000011
（ただし、式Ｖにおいて、Ｒ１０は、水素原子又は低級アルキル基であり、
Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ１１及びＲ１２の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す）
で表される基を有している。
Ｒ１０としては、水素原子は特に好ましい。
Ｒ１０としては、低級アルキル基は好ましく、低級アルキル基としては、炭素数１〜５、好ましくは炭素数１〜３、さらに好ましくは炭素数１〜２、特に好ましくは炭素数１のものである。このような低級アルキル基としては、メチル基、エチル基及びプロピル基等を挙げることができ、メチル基及びエチル基は好ましく、特にメチル基が好ましい。
Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、カルボキシル基は好ましく、カルボキシル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、低級アルコキシカルボニル基は好ましく、低級アルコキシカルボニル基におけるアルキル部分としては、炭素数１〜１０、好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３、さらに好ましくは１〜２、特に好ましくは炭素数１の低級アルキルが挙げられる。すなわち、好ましい低級アルコキシカルボニル基の例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、及びブトキシカルボニル基等を挙げることができ、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基及びプロポキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基及びエトキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基が特に好ましい。低級アルコキシカルボニル基と水素原子の組み合わせ、特にメトキシカルボニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、低級アルケニル基は好ましく、低級アルケニル基としては、炭素数２〜１０、好ましくは炭素数２〜５、さらに好ましくは炭素数２〜３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルケニル基と水素原子の組み合わせ、特にビニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、低級アルキニル基は好ましく、低級アルキニル基としては、炭素数２〜１０，好ましくは炭素数２〜５，さらに好ましくは炭素数２〜３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルキニル基と水素原子の組み合わせ、特にエチニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、置換アミドは好ましく、置換アミドとしては、１置換のＮ−置換アミドを挙げることができ、好ましい例として、Ｎ−アルキルアミド、Ｎ−アミノアルキルアミドを挙げることができる。このようなＮ−アルキルアミド、Ｎ−アミノアルキルアミドとしては、炭素数１〜１０、好ましくは炭素数１〜５、さらに好ましくは炭素数１〜３，特に好ましくは炭素数３のものであり、Ｎ−アミノアルキルアミドが特に好ましい。置換アミドと水素原子の組み合わせ、特にＮ−アミノ（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）アミドと水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、アミド基は好ましく、アミド基と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、シアノ基は好ましく、シアノ基とシアノ基の組み合わせ、及びシアノ基と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、水素原子は好ましく、水素原子を少なくとも１個含む組み合わせ、及び水素原子と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。【００２８】
このような塩基の好適な構造式を以下に例示する。本発明において使用可能な塩基は以下の例示に限定されるものではない。
【化１１】
0004712814.tif 000012
【００２９】
光連結性核酸類は、塩基部分として式Ｉで表される基を、５’末端又は３’末端に有している。この場合に、被光連結性核酸類は、これに対応して光連結性核酸類と光連結可能であるように、３’末端又は５’末端に、光連結可能な塩基部分として炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する。【００３０】
光連結性核酸類の核酸類には、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡが含まれ、これら以外のオリゴヌクレオチドが含まれる。これらは天然又は合成のいずれのものであってもよい。本発明におけるハイブリッド形成による相補的二重鎖を形成可能なものであれば使用することができる。
光連結性核酸類は、通常の核酸の製造方法に準じて製造することができる。例えば、５−置換ビニルウリジンのＤＭＴｒ体にアミダイド化剤を作用させてアミダイド化し、次いで保護基を切断して、これを通常のＤＮＡ合成法によりオリゴヌクレオチドとすることができる。５−置換ビニルシトシン誘導体又は５−置換ビニルウラシル誘導体は、以下に示す具体例の方法によってもよいが、他の通常の有機合成法によっても製造することができる。【００３１】
被光連結性核酸類は、光連結性核酸類と光連結可能な塩基部分として、炭素−炭素二重結合を有する塩基を、３’末端又は５’末端に有している。炭素−炭素二重結合を有する塩基としては、縮合環を形成している炭素−炭素二重結合は好ましくなく、単環式の炭素−炭素二重結合又は環に置換している炭素−炭素二重結合が好ましい。好ましい炭素−炭素二重結合を有する塩基としては、天然のものではシトシン、チミン又はウラシルなどが挙げられる。【００３２】
被光連結性核酸類の核酸類には、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡが含まれ、これら以外のオリゴヌクレオチドが含まれる。これらは天然又は合成のいずれのものであってもよい。本発明におけるハイブリッド形成による相補的二重鎖を形成可能なものであれば使用することができる。【００３３】
被光連結性核酸類の核酸類は、光連結性核酸類と同様に、通常の核酸の製造方法に準じて製造することができる。【００３４】
光連結性核酸類と被光連結性核酸類は、同じ種類の核酸類であってもよく、異なる種類の核酸類であってもよい。【００３５】
光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちのいずれか一方が、標識部分を有し、
光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの標識部分を有さない一方が、あらかじめ基材に固定化されている。【００３６】
標識部分の標識としては、種々の標識を使用することができ、例えば、ビオチン標識、色素標識（蛍光色素標識を含む）、ＲＩ標識、酵素標識（発色酵素標識を含む）を使用することができる。本発明で可能になっている強い洗浄条件での洗浄が可能である標識が好ましい。取り扱いの容易性と強い洗浄条件への耐性から、ビオチン標識又は蛍光色素標識が好ましい。ビオチン標識は、さらにアビジン部分を有する種々の標識を使用して、ビオチン−アビジン結合により検出することができる。これらの標識部分の付加は、通常の製造方法によって行うことができる。光連結性核酸類又は被光連結性核酸類は、通常は光連結しない側の末端付近に、標識部分を有することが好ましいが、光連結とハイブリッド形成に望ましくない影響を与えない範囲で、他のいずれの部位に標識部分を有することもできる。【００３７】
光連結性核酸類又は被光連結性核酸類が固定化される基材としては、ビーズ状、基板状などの種々の形態のものを使用可能であるが、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）などによる好適な使用のために、基板状の基材を使用することが好ましい。
基材の材料としては、生化学分野の固相担体として使用されるような種々の材質の材料を使用することができる。例えば、ガラス、多孔質ガラスなどの無機物質類、ポリスチレン（ＰＳ）などの樹脂類、金などの金属類などが挙げられる。好ましいものとして、アデノシン残基を有する固相担体（オリゴアフィニティーサポート（ＯＡＳ）など）、アルデヒド修飾ガラスなどが挙げられる。ガラスプレート、ＣＰＧ、ポリスチレンビーズなどは好ましい。ＤＮＡチップの基材として使用される通常の材料は、好適に使用可能である。【００３８】
光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの、あらかじめ基材に固定化された一方の核酸類は、基材上に直接に結合して固定化されていてもよいが、良好なハイブリッド形成のためには、リンカー部分を介して基材上に固定化されていることが好ましい。リンカー部分としては、核酸類の化学反応に不活性で、５個以上、好ましくは１０個以上の原子を有する、好ましくは直鎖状の分子種であればよい。リンカー部分としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの核酸や、ポリエチレングリコール、アルカン類などが好ましい。特にポリエチレングリコールが好ましく、ヘキサ（エチレングリコール）を好適に使用できる。基材に固定化された核酸類を製造する方法としては、核酸類の末端のリン酸基をリンカー部分に結合させて製造することができる。リンカー部分と核酸類を結合させて、次いで基材に結合してもよいし、逆に先に基材とリンカー部分を結合させて、次いでリンカー部分と核酸類とを結合させてもよい。核酸類と結合する位置は、通常は末端のリン酸基を用いるのが好ましいが、これに限定させるものではない。例えば、核酸類の途中の塩基部分の官能基と結合させてもよい。【００３９】
光連結性核酸類と被光連結性核酸類とは、光連結されることによって、特定の塩基配列を有する標的核酸類の塩基配列と相補的な塩基配列の核酸類を生成するように作製される。そして、光連結性核酸類と被光連結性核酸類は、標的核酸類を鋳型としてハイブリッド形成することによって、光連結可能に隣接して配置される。【００４０】
このハイブリッド形成は、通常の温度、ｐＨ、塩濃度、緩衝液等の条件下で行うことができるが、ハイブリッド形成と光連結の条件を高い自由度で選択可能とすることにより、より高い特異性、感度（Ｓ／Ｎ比）による検出を可能としていることは、本発明による利点である。この条件としては例えば、温度、溶媒（溶質）、塩などの種類及び濃度を挙げることができる。【００４１】
ハイブリッド形成の条件として、本発明では、温度は、ハイブリッド形成可能な温度であれば使用することができるが、極めて迅速にハイブリッド形成と光連結の工程を行うためには、２０〜３０℃の温度で、特に室温で行われることが好ましいことを見いだした。【００４２】
また、ハイブリッド形成は、緩衝作用のある塩を含む反応溶液の中で行われることが好ましい。反応溶液のｐＨが６．５〜８．５の範囲、特にｐＨ６．７〜７．７の範囲にあることが好ましい。緩衝作用のある塩の濃度が５〜２５０ｍＭの範囲にあることが好ましく、特に１０〜１００ｍＭの範囲に有ることが好ましい。緩衝作用のある塩としては、カコジル酸塩、リン酸塩、トリス塩をあげることができるが、本発明においては、特に、蛍光強度の強度増大の観点から、緩衝作用のある塩が、カコジル酸塩であることが好ましい。上記条件のカコジル酸塩の使用によって、ＰＢＳ緩衝液などと比較して、蛍光強度を１０倍程度にまで高めることができることを見いだしている。また、反応溶液が、水分散性有機溶媒を含むことが好ましく、特に反応の迅速性の観点から、２０〜６０％（体積比）の水分散性有機溶媒を含んでいることが好ましいことがわかった。特に、この水分散性有機溶媒は、アセトニトリルであることが好ましい。また、反応溶液が、アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属の塩を含むことが好ましく、高いＳ／Ｎ比の達成のためには、該塩の濃度は標的核酸類の濃度に対して、それぞれ最適値があることを本発明では見いだした。すなわち、これらは条件検討により、この２条件に対して最適化されていることが好ましい。アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属の塩として、例えば塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含むことが好ましい。【００４３】
光連結性核酸類と被光連結性核酸類との光連結は、光照射による光化学反応により行われる。照射する光としては、反応に必要なエネルギーを有する波長を含むものであればよいが、紫外線が好ましい。波長としては、３３０ｎｍ以上、好ましくは３５０ｎｍ以上、より好ましくは３６０ｎｍ以上の波長を含むものが好ましい。特に好ましい波長としては、３６６ｎｍが挙げられる。【００４４】
なお、この光連結は、その原理において可逆性を有する。従って、比較的短波長側の光を照射して、開裂させることが可能である。開裂させるときの波長としては、３２０ｎｍ以下、好ましくは３１０ｎｍ以下の波長が好ましい。開裂に特に好ましい波長としては、３０２ｎｍが挙げられる。図１には示さないが、光連結した核酸類を開裂する工程をさらに行った後に、基材上から遊離した溶液中の標識部分を検出をすることも可能である。このような工程をさらに行えば、本発明の高い特異性と感度とを生かしつつ、多様な検出方法を使用することができる。本発明者らは、この光連結の原理に関して、すでに出願を行っており、特願２０００−６７５１９、特願２０００−２５６０６８、特願２０００−３８２２８３、特願２００１−７５０に記載の内容は、本願に取り込んで使用することができる。【００４５】
光連結によって標識部分が基材上に固定化された後には、ハイブリッド形成による相補的二重鎖の解離するような洗浄条件で、洗浄を行う。基材上に固定化された標識部分が、途中の共有結合の破壊によって遊離してしまわないような条件であれば、相補的二重鎖の解離作用がどのように強い条件でも使用することができる。不完全な相補性のために光連結しないままに、不完全なハイブリッド形成によって弱く基材上に結合しているような標識部分を、完全に除去するためには、洗浄条件は、相補的二重鎖の解離作用が強いものであったほうがよい。【００４６】
好適な洗浄条件としては、例えば、温度は、８０〜１００℃、好ましくは９０〜１００℃、特に好ましくは９５〜１００℃の範囲の温度を使用することができる。温度は、共有結合を分解しないならば、沸点の値から達成可能な範囲で高いものであるほうがよい。ｐＨは、共有結合を分解しない範囲で特に制限はないが、共有結合の加水分解をもたらしにくいことから中性付近が好ましい。塩の種類及び塩濃度には、操作に不都合な試料の沈殿が生じない範囲で特に制限はなく、一般には適当な濃度の塩（例えば約０．１Ｍ  ＮａＣｌ）の存在は、相補的二重鎖の解離を促すために好都合である。また、相補的二重鎖の解離を促進するために、変性剤として、例えば、尿素を添加することができる。さらに、相補的二重鎖の解離を促進するために、界面活性剤として、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムを添加することができる。その他、相補的二重鎖の解離に寄与するとして知られる条件を使用することができる。【００４７】
洗浄の後に行われる標識部分の検出は、それぞれの標識の原理に応じた通常の方法を使用して行うことができる。例えば、ＲＩ標識に対しては、オートラジオグラフィーを行うことができ、あるいは蛍光色素標識に対しては、レーザースキャナでの読み取りが可能である。また、ビオチン標識に対しては、アビジンを有する別な標識を用意して、アビジン−ビオチン結合により新しい標識を付した後に、その標識の原理に応じた通常の方法を使用することができる。【００４８】
また、光連結を一度だけ使用して標識部分を固定化する態様について説明をしたが、光連結を複数回使用して標識部分を固定化する実施の態様（該態様に使用する核酸類セット、及びそれによる検出の方法）もまた、本発明の範囲に含まれる。例えば、標識部分を有する核酸類から、基材に固定化された核酸類までの間に、１個以上の核酸類の断片がハイブリッド形成と光連結により連結される態様も本発明によって可能である。
本発明の実施を実施例によって以下に詳細に説明する。特に明示的な記載のない実験操作は、当業者の行う通常の条件下（例えば、大気圧下、室温）において行った。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の実施の一態様の流れを示した説明図である。
【図２】ＲＮＡを鋳型とした核酸の光連結の説明図である。
【図３】ＲＮＡを鋳型とした核酸の光連結を示すＨＰＬＣチャートである。
【図４】本発明によるＲＮＡの点変異の検出結果である。
【図５】核酸の光連結の可逆性を示すＨＰＬＣチャートである。
【図６】核酸の光連結の可逆性を示すＨＰＬＣチャートである。
【図７】本発明によるＲＮＡの点変異の検出結果である。
【図８】本発明の別な実施の一態様を示した説明図である。
【図９】本発明によるＳＮＰｓの検出の一態様を示した説明図である。
【図１０】本発明の光連結性核酸類の調整の一例を示した説明図である。
【図１１】本発明によるＳＮＰｓの検出結果である。
【図１２】アセトニトリルの影響を示す実験結果である。
【図１３】ＮａＣｌ濃度の影響を示す実験結果である。
【図１４】標的核酸類の濃度に対する最適ＮａＣｌ濃度を示す実験結果である。
【図１５】ＭｇＣｌ２濃度の影響を示す実験結果である。
【図１６】本発明による各種一塩基多型に対する検出結果である。
【図１７】本発明による各種一塩基多型に対する検出のＳ／Ｎ比である。
【図１８】ウラシル誘導体を使用した可逆的光連結を示す説明図である。
【図１９】塩基部分としてシトシン誘導体を有するＤＮＡの合成経路を例示する説明図である。
【図２０】シトシン誘導体を用いて可逆的な光連結が可能であることを示す実験結果である。
【図２１】塩基部分としてグアニン誘導体を有するＤＮＡの合成経路を例示する説明図である。
【図２２】塩基部分としてグアニン誘導体を有するＤＮＡの合成経路を例示する説明図である。
【図２３】グアニン誘導体を用いて光連結が可能であることを示す実験結果である。
【図２４】グアニン誘導体を用いて光連結した生成物は、光開裂が可能であることを示す実験結果である。
【図２５】塩基部分としてアデニン誘導体を有するＤＮＡの合成経路を例示する説明図である。
【図２６】塩基部分としてアデニン誘導体を有するＤＮＡの合成経路を例示する説明図である。
【図２７】アデニン誘導体を用いて光連結が可能であることを示す実験結果である。
【図２８】アデニン誘導体を用いて光連結が可能であることを示す実験結果である。
【図２９】アデニン誘導体を用いて光連結した生成物は、光開裂が可能であることを示す実験結果である。
【図３０】７−カルボキシビニル−７−デアザ−２’−デオキシアデノシンのＵＶ吸光特性を示す実験結果である。
【実施例１】
【００５０】
ＲＮＡを標的とした実験を以下のように行った。
[光連結性オリゴヌクレオチドの合成]
５−カルボキシビニル−２’−デオキシウリジン（ＣＶＵ）を含むＯＤＮ、ＯＤＮ１（ＣＶＵ）５’−ｄ（ＣＶＵＧＣＧＴＧ）−３’を、ＣＶＵのシアノエチルホスホラミダイトを使用して、通常のＤＮＡ合成によって合成した。ＯＤＮ１（ＣＶＵ）を、ヌクレオシド組成およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ (calcd. 1876.3381 for [M-H]-; found 1876.3477)によって同定した。【００５１】
[ＯＤＮ１（ＣＶＵ）によるＲＮＡ鋳型指向型光連結]
ＯＤＮ１（ＣＶＵ）によるＲＮＡ鋳型指向型光連結の実行可能性を次のように確認した。ＯＤＮ１（ＣＶＵ）およびＯＤＮ（Ｔ）５’−ｄ（ＴＧＴＧＣＴ）−３’に、RNA(A) 5’-r(CACGCAAGCACA)-3’ の存在下、３６６ｎｍで３０分間照射したときに（図２）、９８％の収率でＯＤＮ（ＣＶＵ−Ｔ）のピークが出現することを、ＯＤＮ（ＣＶＵ）およびＯＤＮ（Ｔ）の消失で、ＨＰＬＣによって確認した（図３）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは、ＨＰＬＣ精製から得られた単離ＯＤＮ（ＣＶＵ−Ｔ）がＯＤＮ（ＣＶＵ）およびＯＤＮ（Ｔ）の光連結生成物であることを示している  (calcd. 3677.51 for [M+H]+;found 3677.82)。ＯＤＮ（ＣＶＵ）およびＯＤＮ（Ｔ）に、ODN(A) 5’-d(CACGCAAGCACA)-3’の存在下、３６６ｎｍで３０分間照射したときに、７４％の収率でＯＤＮ（ＣＶＵ−Ｔ）のピークが出現することをＨＰＬＣで確認した。他方で、ＲＮＡ鋳型を光連結に使用したときに、３’末端Ｃが光励起したＣＶＵと反応して、光連結されたＯＤＮ（ＣＶＵ−Ｃ）を３’末端Ｔと同じくらい効率よく生成する。【００５２】
[光可逆性の確認]
連結した生成物の光可逆性を確認するために、光連結ＯＤＮ（ＣＶＵ−Ｔ）に３１２ｎｍで照射を行って試験した。単離したＯＤＮ（ＣＶＵ−Ｔ）に３１２ｎｍで４分間の照射をしたときに、４９％収率でのＯＤＮ１（ＣＶＵ）とＯＤＮ（Ｔ）のピークの出現を、ＯＤＮ（ＣＶＵ−Ｔ）の消失とともにＨＰＬＣによって確認した。従って、ＣＶＵを５’末端に含むＯＤＮは光可逆性を有している。【００５３】
[ＲＮＡ点変異の検出]
ＲＮＡ点変異の検出には、ＤＮＡチップ上に共有結合して配置されたＯＤＮの鋳型指向型光連結を利用した（図１）。ＲＮＡ鋳型指向型光連結は、ＤＮＡチップ技術に適したプラットフォームに組み込んで使用可能であることを実証するために、ＣＶＵを含むアミノ標識ＯＤＮ、ODN2(ＣＶＵ) 5’-d(ＣＶUGCGTG)-SSSS-NH２-3’（ただし、Ｓはヘキサ（エチレングリコール）リンカーフラグメントに対応する）を、アルデヒド修飾ガラス表面上に付加することによって、ＤＮＡチップを構築した。
ＤＮＡチップ上のＯＤＮ２（ＣＶＵ）によってＲＮＡ鋳型指向型光連結の利用可能性を確認した。２μＭ標的ＲＮＡ（Ａ）とビオチン標識ＯＤＮ（Ｔ）、５’−ビオチン−ＴＧＴＧＣＴ−３’をスポットして、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）および１００ｍＭ塩化ナトリウム中で、３６６ｎｍで１０分間照射した。脱イオン水で９８℃５分間洗浄した後に、ストレプトアビジン−Ｃｙ３コンジュゲートのＰＢＳ溶液を表面に加えて、ＰＢＳ緩衝液で二回洗浄した。蛍光シグナルはマイクロアレイスキャナを使用して検出した。図４に示したように、完全に相補鎖形成をした場合に、光連結生成物の強い蛍光シグナルを検出した。配列識別の一般性を確かめるために、種々の位置でミスマッチを持つ５つの標的ＲＮＡを構築した。その結果、ＲＮＡの場合に第９番目の位置でのシングルミスマッチが、ほとんど光連結生成物を生じず、測定された蛍光シグナルは完全な相補性がある場合と比較して３３分の１であった（表１）。次に、第９番目の位置での１個の塩基を変化させた（Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）４つの非常に類似した標的ＲＮＡのセットを構築した。ほとんどのミスマッチは、正しくマッチした場合と比較して、相対的に１０％またはそれより小さい蛍光シグナルを生じた。
以上から、ＣＶＵによるＲＮＡ鋳型指向型光連結を実証した。５’末端にＣＶＵを含むＯＤＮに、鋳型ＲＮＡの存在下で、３’末端にピリミジン塩基を含むＯＤＮとともに光照射すると、全く副生成物形成が見られずに、効率よく光連結が起こった。さらに、種々の位置でのミスマッチは、ＲＮＡ鋳型指向型光連結に基づくＤＮＡチップ分析を使用することによって、良好に区別可能である。従って、この系は、ＲＮＡ配列の特異的な検出に広範に使用可能である。【００５４】
[ＯＤＮの光連結のＨＰＬＣによる検出]
ＯＤＮ１（ＣＶＵ）およびＯＤＮ（Ｔ）（各２０μＭ、鎖濃度(strand concn））を含む反応混合物（全体積６０μＬ）に、５０ｍＭカコジン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）および１００ｍＭ塩化ナトリウム中で鋳型ＲＮＡ（Ａ）（２４μＭ、鎖濃度）の存在下で、０℃で３０分間、２５Ｗトランスイルミネーター（３６６ｎｍ）で照射した。照射の後に、光反応の進行を、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８ＡＲカラム（４．６×１５０ｍｍ、ｐＨ７．０、３０分間で６％〜１０％アセトニトリルの直線勾配、流速０．５ｍＬ／分、５０ｍＭギ酸アンモニウム溶媒混合物での溶出）により、ＨＰＬＣで検出した。【００５５】
[オリゴヌクレオチドの調整]
ＯＤＮは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３４００ＤＮＡ合成装置を使用して、通常のホスホラミダイト法によって合成した。結合効率は、トリチルモニターでモニターした。ＣＶＵのシアノエチルホスホラミダイトの結合効率は、９７％収率であった。ＣＶＵのシアノエチルホスホラミダイトの結合時間は、９９９秒であった。これらを、２８％アンモニアで４時間６５℃で保温することにより脱保護し、逆相ＨＰＬＣによってＣｈｅｍｃｏｂｏｎｄ  ５−ＯＤＳ−Ｈ  カラム（４．６×１５０ｍｍ）で精製した；溶出は、３〜２０％アセトニトリルを含む０．０５Ｍギ酸アンモニウムで、直線勾配（３０分間）、流速１．０ｍＬ／分、３０℃で行った。オリゴヌクレオチドの精製は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析によって確認した。【００５６】
[光連結生成物の光開裂のＨＰＬＣによるモニター]
光連結したＯＤＮ（ＣＶＵ−Ｔ）（２０μＭ、鎖濃度）を含む５０ｍＭカコジン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）および１００ｍＭ塩化ナトリウムの溶液（全体積６０μＬ）に、２５℃で４分間、１５Ｗトランスイルミネーター（３１２ｎｍ）で照射した。照射後に、光反応の進行を、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８ＡＲカラム（４．６×１５０ｍｍ、５０ｍＭギ酸アンモニウム溶媒混合物による溶出、流速０．８ｍＬ／分での３０分間の６％〜１２％アセトニトリル直線勾配）でのＨＰＬＣにより、モニターした（図５）。ＯＤＮ１’（ＣＶＵ）は、ＯＤＮ１（ＣＶＵ）のシス異性体であった。
光連結したＯＤＮ（ＣＶＵ）（２０μＭ、鎖濃度）を含む５０ｍＭカコジン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）および１００ｍＭ塩化ナトリウムの溶液（全体積６０μＬ）に、２５℃で２分間、１５Ｗトランスイルミネーター（３１２ｎｍ）で照射した。照射後に、光反応の進行を、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８ＡＲカラム（４．６×１５０ｍｍ、５０ｍＭギ酸アンモニウム溶媒混合物による溶出、流速０．５ｍＬ／分での３０分間の６％〜１１％アセトニトリル直線勾配）でのＨＰＬＣにより、モニターした（図６）。【００５７】
[ＤＮＡプローブ固定化]
ＣＶＵを含むアミノ標識ＯＤＮプローブを、１００ｍＭカコジン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で２×１０５Ｍの濃度で希釈した。スポッティングを、標準マイクロピペットから５μＬずつ使用して行った。ＣＶＵを含むアミノ標識ＯＤＮプローブを、デシケータ内部で室温下で１２時間かけて表面へ結合させた。プローブの固定化の後に、ガラス表面を０．１％ＳＤＳと脱イオン水で洗浄した。この表面をＮａＢＨ４（３．７５ｍｇ）、ＰＢＳ（１．５ｍＬ）、及びエタノール（３７５μＬ）の溶液で５分間、不活性化した。次にこの表面を脱イオン水で洗浄して乾燥した。【００５８】
[ＤＮＡチップ上でのＲＮＡ鋳型指向型光連結]
５０ｍＭカコジン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と１００ｍＭ塩化ナトリウム中の２μＭ標的ＲＮＡ（Ａ）とビオチン標識ＯＤＮ（Ｔ）の溶液（５μＬ）をスポットしたガラスチップに、３６６ｎｍで１０分間照射した。９８℃の脱イオン水で５分間洗浄した後に、ストレプトアビジン−Ｃｙ３  コンジュゲート（２０μｇ／ｍＬ）のＰＢＳ溶液を、表面に添加して、ＰＢＳ緩衝液で二回洗浄した。蛍光測定は、励起波長５３２ｎｍのレーザーを備えたマイクロアレイスキャナＣＲＢＩＯ  ＩＩｅ（日立）を使用して行った。次に、第６番目の位置で１塩基を変えた（Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）４つの非常に関連した標的ＲＮＡのセットを構築した（表２）。ほとんどのミスマッチでは、正しくマッチした場合と比較して、相対的蛍光シグナルが８％またはそれよりも低くなった（図７）。
【実施例２】
【００５９】
ＤＮＡを標的とした実験を以下のように行った。
[プローブＯＤＮの固定化]
アルデヒド処理されたマイクロアレイスライド（Ｎｕｎｃ社製）に対してアミン末端及び光応答性塩基を有するプローブＯＤＮを次の手順で固定化した。
１．  緩衝液（リン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ８．５、０．０１％ＳＤＳ）にプローブＯＤＮが０．２μｇ／μｌとなるように調整した。
２．  この溶液１０μｌを滴下して、室温で２４時間乾燥させて固定した。
３．  固定後、室温で０．１５％ＳＤＳで２回、超純水で２回洗浄した。
４．  ＮａＢＨ４のＰＢＳ／エタノール溶液を滴下した。
５．  超純水で洗浄した。
この手順によって、１．５〜１．８×１０１１／ｃｍ２の密度で固定することができた。【００６０】
[ＤＮＡチップ上での光連結]
ＤＮＡチップ上での光連結を図８に示すような態様となるように行った。ＯＤＮ  Ｐ１は、ヘキサエチレングリコール（Ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ：Ｓ）を介して基材に固定化されているオリゴヌクレオチドであり、光連結性の塩基部分（ＣＶＵ）を有している。ＯＤＮ  Ｓ３５は、標識部分として末端にビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ：Ｂ）を有するオリゴヌクレオチドであり、被光連結性の塩基部分（図ではＣ）を有している。図８では、このＯＤＮ  Ｐ１とＯＤＮ  Ｓ３５とが、標的となるオリゴヌクレオチド（Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＯＤＮ）を鋳型とするハイブリッド形成によって、光連結可能な状態に隣接して配置されている。実験は、ＯＤＮ  Ｓ３５（２μＭ）、ｔｅｍｐｌａｔｅ−ＯＤＮ（２μＭ）、Ｎａｃａｃｏ．（５０ｍＭ）、ＮａＣｌ（２５ｍＭ）の条件で、室温でハイブリッド形成をすることにより行った。光連結は、３６６ｎｍの波長を１０分間照射することにより行った。
上記の鋳型ＯＤＮのＸＸ〜ＸＸ部分について、ＯＤＮ  Ｐ１に対応する相補的な配列から、１塩基置換、２塩基置換、３塩基置換をした３３個の配列に対してこのような光連結を行って標識部分の検出を行ったところ、非常に高い特異性と感度（Ｓ／Ｎ比）で完全な相補配列を識別できることがわかった。
また、このハイブリッド形成の温度を、０℃、１０℃、室温と変えて最適な温度を探索したところ、室温が最も適していることがわかった。【００６１】
[ＤＮＡチップ上での遺伝子多型（ＳＮＰｓ）検出]
ガン抑制遺伝子ｐ５３の多型部を標的として、ＤＮＡチップ上での遺伝子多型（ＳＮＰｓ）検出を行った。図９はその説明図である。左側に示すプローブＡ、プローブＣ、プローブＧ、プローブＴは、それぞれ一端を基板に固定され、一端に光連結性の塩基部分（ＣＶＵ）を有し、光連結性の塩基部分から３番目の塩基がそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔと異なっている。これらのプローブは、図１０に詳細を示したように調整した。この固定化された各プローブに対して、標的ＤＮＡ（ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ）（１０ｎＭ）、ビオチン−ＤＮＡ（Ｂｉｏｔｉｎ−ＤＮＡ）（１μＭ）を、室温においてアセトニトリルを含む反応溶液中でハイブリッド形成させて、３６６ｎｍの波長で２０分間の照射を行うことにより、光連結を行った。次にビオチン部分に蛍光アビジンを結合させ、スキャナにより検出を行った。
この結果、極めて高いＳ／Ｎ比で、この一塩基置換を検出することができた。この結果を図１１に示す。蛍光強度のグラフからわかるように、プローブＣ、プローブＧ、プローブＴに対するプローブＡの蛍光強度は、１０２〜１０３倍の値となっている。【００６２】
[反応溶媒へのアセトニトリルの添加効果の検討]
ハイブリッド形成の反応溶媒に対して、アセトニトリルを添加することの効果を検討して、図１２に示す結果を得た。時間と蛍光強度のグラフからわかるように、機構の詳細は不明であるが、アセトニトリルの添加が多いほど、反応時間を短縮する効果がある。すなわち、２５〜５０％（体積比）のアセトニトリルの添加は、反応時間を１／２〜１／５程度に短縮しており、アセトニトリル０〜５％では不可能な２０〜３０分程度の所要時間で、十分な蛍光強度での検出を可能としている。【００６３】
[ＮａＣｌ濃度の最適化の検討]
図１３に示すようにＮａＣｌ濃度の最適化の検討を行った。さらに広範囲で同様に検討を行い、また標的核酸類（検出対象ＯＤＮ）の濃度も変化させて、この２条件を組み合わせた変化に対する最適化の検討を行った。この結果を図１４に示す。これによって、ハイブリッド形成での塩濃度には最適な濃度が存在すること、この最適な濃度は標的核酸類（検出対象ＯＤＮ）の濃度に対応して変化すること、標的核酸類（検出対象ＯＤＮ）の濃度が大きいほど最適な塩濃度は減少する傾向にあることがわかった。図１４では、標的核酸類（検出対象ＯＤＮ）濃度１００ｎＭの場合には、最適な塩濃度（極大値）は１００ｍＭを中心とする８０〜１５０ｍＭの範囲の間に存在し、標的核酸類（検出対象ＯＤＮ）濃度１０ｎＭの場合には、最適な塩濃度（極大値）は５００ｍＭを中心とする４００〜７００ｍＭの間に存在している。【００６４】
[ＭｇＣｌ２濃度の最適化の検討]
ＭｇＣｌ２濃度についても最適化の検討を行った。この結果を図１５に示す。グラフは、標的ＯＤＮ濃度１００ｎＭの実験結果を示している。この場合には２〜６ｍＭの間に最適濃度（極大値）が存在している。また、このＭｇＣｌ２濃度についても標的核酸類（検出対象ＯＤＮ）の濃度変化に対する最適化を行った。【００６５】
[最適条件による多型の識別]
最適条件を使用して、全て（４種）の塩基への一塩基多型および欠失に対して、識別する実験を行った。前述のプローブＡ、プローブＣ、プローブＧ、プローブＴ、およびプローブＸ（一塩基部分の欠失したプローブ）を使用し、さらに前述の標的ＯＤＮについても対応する多型を有する相補的塩基配列を使用して、この組み合わせに対して実験を行った。標的ＯＤＮ（Ｔａｒｇｅｔ  ＯＤＮ）（１００ｎＭ）、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（５ｍＭ）の条件を使用した。この結果を図１６に示す。図１６からわかるように、あらゆるタイプの一塩基置換および欠失による多型について、極めて明瞭に多型を識別することができた。図１７に、この結果を改めてＳ／Ｎ比として整理した。どの多型についても、１０２を超えるＳ／Ｎ比で多型が明瞭に識別可能であることが示された。
【実施例３】
【００６６】
本発明で使用される塩基によって、ＤＮＡの可逆的光連結が可能であることを確認するために、以下の実験を行った。
図１８は、ウラシル誘導体を塩基部分として使用することによって可逆的光連結が可能であること（図１８の上段）を示す説明図である。図１８の上段の左側にあるように、鋳型となる１２塩基長のＤＮＡ鎖（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）の存在下で、３’末端にピリミジン塩基を有する６塩基長のＤＮＡ鎖（３’Ｐｙ−ＤＮＡ）と５’末端にウラシル誘導体（ＶｉｎｙｌＵ）を有する６塩基長のＤＮＡ鎖（ＶＵ−ＤＮＡ）とに、３６６ｎｍにて光照射することによって光連結して（右方向への矢印の反応）、図１８の上段の左側にあるように３’Ｐｙ−ＤＮＡのＰｙとＶＵ−ＤＮＡのＶＵとが連結した１２塩基長のＤＮＡ鎖が生じる。この図１８の上段の右側にある１２塩基長のＤＮＡ鎖に３０２ｎｍにて光照射することによって光開裂して（左方向への矢印の反応）、図１８の上段の左側にあるように６塩基長のＤＮＡ鎖が再び生じる。このような可逆的光連結は、図１８の下段の左側の構造式の塩基（ウラシル誘導体）を有するにおいて好適に可能であるが、これを図１８の下段の右側の構造式の塩基（シトシン誘導体）を使用した場合にも好適に可能であることを、以下の実験によって確認した。
この実験に塩基部分として使用するシトシン誘導体は公知の方法によって合成可能であるが、以下の実験では、図１９に示す経路によって塩基部分としてシトシン誘導体を有するＤＮＡを合成して使用した。
図２０に示すように、このようにして得られたシトシン誘導体を用いて、可逆的な光連結が可能である。
図２０の上段の矢印左側にあるように、鋳型となる１２塩基長のＤＮＡ鎖（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）の存在下で、シトシン誘導体（ＶｉｎｙｌＣ）を５’末端に有する６塩基長のＤＮＡ鎖（ＶＣ−ＤＮＡ）と、放射性同位体である３２Ｐを５’末端に有しチミン（Ｔ）を３’末端に有する６塩基長のＤＮＡ鎖（３’Ｔ−ＤＮＡ）とに、３６６ｎｍにて３時間の光照射（ＵＶ照射）をすることによって光連結して（右方向への矢印の反応）、図２０の上段の左側にあるように３’Ｔ−ＤＮＡのＴとＶＣ−ＤＮＡのＶＣとが連結した１２塩基長のＤＮＡ鎖が生じた。この図２０の上段の右側にある１２塩基長のＤＮＡ鎖に３０２ｎｍにて１時間の光照射（ＵＶ照射）をすることによって光開裂して（左方向への矢印の反応）、図２０の上段の左側にあるように６塩基長のＤＮＡ鎖が再び生じた。
このような結果が３’Ｔ−ＤＮＡ、ＶＣ−ＤＮＡ、及びＴｅｍｐｌａｔｅの存在、及び３６６ｎｍ、３０２ｎｍ、及び３６６ｎｍのＵＶ照射操作の存在によって生じたことを明確にするために、それぞれの存在の有無（＋：有及び−：無）の組み合わせを変えて得られた生成物を各レーンに分けて電気泳動しオートラジオグラフィを行った。図２０の中段にはこの組み合わせを示し、図２０の下段にはこのようにして得られたオートラジオグラムを示す。レーン１及び２は、比較のための１２塩基長及び６塩基長のＤＮＡのみをそれぞれ流したレーンである。図２０の下段のレーン番号３〜８は、それぞれ図２０の中段の３〜８の番号を付された組み合わせに対応している。レーン６とレーン３〜５の対比から、光連結生成物（１２塩基長のＤＮＡ鎖：１２ｍｅｒ）が生じるためには、３’Ｔ−ＤＮＡ、ＶＣ−ＤＮＡ、及びＴｅｍｐｌａｔｅと３６６ｎｍの光照射の４要素が必要であることが示されている。またレーン６とレーン７の対比から、いったん生じた光連結生成物（１２塩基長のＤＮＡ鎖：１２ｍｅｒ）は、３０２ｎｍの光照射によって再び６塩基長のＤＮＡ鎖（６ｍｅｒ）に開裂することが示されている。さらにこのように開裂して生じた６塩基長のＤＮＡ鎖（６ｍｅｒ）に３６６ｎｍの光照射を行えば、再び１２塩基長のＤＮＡ鎖（１２ｍｅｒ）が生成することが示されている。
すなわち、塩基部分としてシトシン誘導体を使用して、可逆的な光連結が可能であることが示されている。
【実施例４】
【００６７】
本発明で使用される塩基によって、ＤＮＡの可逆的光連結が可能であることを確認するために、さらに以下の実験を行った。
本発明で使用される塩基部分として、ピリミジン塩基誘導体（すなわち、ウラシル誘導体、チミン誘導体、及びシトシン誘導体）を使用した場合には、複素環構造を改変することなく、光連結性の塩基部分を得ることができた。より自由な可逆的光連結の実現のためには、プリン塩基誘導体を使用して、光連結性の塩基部分を得ることが必要であったが、これは極めて困難であった。本発明者等は、独自の試行錯誤の結果、プリン塩基の複素環構造を改変することによって、本発明における塩基部分として使用可能な、プリン塩基誘導体（すなわち、グアニン誘導体、及びアデニン誘導体）を得ることに成功した。このプリン塩基の複素環構造の改変は、７−デアザ（７−ｄｅａｚａ）を特徴とするものである。
図２１及び図２２に、本発明における塩基部分として使用可能なグアニン誘導体の構造と、塩基部分としてグアニン誘導体を有するＤＮＡの合成経路を例示する。本発明はこれらの例示に限定されるものではない。本発明における塩基部分として使用可能なグアニン誘導体を有するＤＮＡは、公知の方法によっても製造することができる。
図２３には、このようにして得られたグアニン誘導体を５’末端に有する６塩基長のＤＮＡ鎖（ＺＶＣＧ−ＤＮＡ：ＯＤＮ２）と３’末端にＴを有する６塩基長のＤＮＡ鎖（ＯＤＮ１）が、鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）の存在下で、３６６ｎｍで２時間、好ましくは５時間の光照射によって光連結して１２塩基長のＤＮＡ鎖（ＯＤＮ３）を生成することが、クロマトグラフィーの結果によって示されている。
図２４には、図２３のようにして得られた１２塩基長のＤＮＡ鎖（ＯＤＮ３）が、３１２ｎｍで１５分間の光照射によって光開裂して再び６塩基長のＤＮＡ鎖（ＯＤＮ１及びＯＤＮ２）を生成することが示されている。
すなわち、塩基部分としてグアニン誘導体を使用して、可逆的な光連結が可能であることが示されている。
【実施例５】
【００６８】
本発明で使用される塩基によって、ＤＮＡの可逆的光連結が可能であることを確認するために、さらに以下の実験を行った。
本発明者等は、独自の試行錯誤の結果、プリン塩基の複素環構造を改変することによって、本発明における塩基部分として使用可能な、プリン塩基誘導体（すなわち、グアニン誘導体、及びアデニン誘導体）を得ることに成功した。このプリン塩基の複素環構造の改変は、７−デアザ（７−ｄｅａｚａ）を特徴とするものである。
図２５及び図２６に、本発明における塩基部分として使用可能なアデニン誘導体の構造と、塩基部分としてアデニン誘導体を有するＤＮＡの合成経路を例示する。本発明はこれらの例示に限定されるものではない。本発明における塩基部分として使用可能なアデニン誘導体を有するＤＮＡは、公知の方法によっても製造することができる。
図２７には、このようにして得られたアデニン誘導体を５’末端に有する６塩基長のＤＮＡ鎖（ＺＶＡＡ−ＤＮＡ：ＯＤＮ４）と３’末端にＴを有する６塩基長のＤＮＡ鎖（ＯＤＮ１）が、鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）の存在下で、３６６ｎｍで５分間、好ましくは１５分間の光照射によって光連結して１２塩基長のＤＮＡ鎖（ＯＤＮ５）を生成することが、クロマトグラフィーの結果によって示されている。
図２８には、このようにして得られたアデニン誘導体を５’末端に有する６塩基長のＤＮＡ鎖（ＺＶＣＡ−ＤＮＡ：ＯＤＮ６）と３’末端にＴを有する６塩基長のＤＮＡ鎖（ＯＤＮ１）が、鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）の存在下で、３６６ｎｍで１分間、好ましくは５分間の光照射によって光連結して１２塩基長のＤＮＡ鎖（ＯＤＮ７）を生成することが、クロマトグラフィーの結果によって示されている。
図２９には、図２８のようにして得られた１２塩基長のＤＮＡ鎖（ＯＤＮ７）が、３１２ｎｍで１５分間の光照射によって光開裂して再び６塩基長のＤＮＡ鎖（ＯＤＮ１及びＯＤＮ６）を生成することが示されている。
すなわち、塩基部分としてアデニン誘導体を使用して、可逆的な光連結が可能であることが示されている。
図３０には、塩基部分として特に好適なアデニン誘導体を有するデオキシヌクレオシド（ＺＶＣＡ）である、７−カルボキシビニル−７−デアザ−２’−デオキシアデノシンのＵＶ吸光特性を示す。【００６９】
[図表の説明]
図１は、ＤＮＡチップ上でのＲＮＡ点変異の検出の戦略を示している。
図２は、ＣＶＵによるＯＤＮのＲＮＡ鋳型指向型可逆的光連結を示している。
図３は、鋳型ＲＮＡ（Ａ）の存在下で、照射を受けたＯＤＮ１（ＣＶＵ）およびＯＤＮ（Ｔ）のＨＰＬＣ分析を示している。照射前（ａ）；３６６ｎｍでの３０分間照射（ｂ）、収率９８％。
図４は、マッチした及びシングルミスマッチの標的ＲＮＡ上での光連結生成物について、マイクロアレイスキャナで得られた蛍光強度（上）とイメージ（下）を示している。
図５は、照射したＯＤＮ（ＣＶＵ−Ｔ）のＨＰＬＣ分析を示している。照射前（ａ）；  ３１２ｎｍで４分間照射（ｂ）。
図６は、照射したＯＤＮ１（ＣＶU）のＨＰＬＣ分析を示している。照射前（ａ）；  ３１２ｎｍで２分間照射（ｂ）。
図７は、ＯＤＮ２（ＣＶＵ）の光連結生成物に対する蛍光強度（上）及びイメージ（下）を示している。
図８は、ＤＮＡチップ上での光連結を示している。
図９は、ＤＮＡチップ上での遺伝子多型（ＳＮＰｓ）検出を示している。
図１０は、プローブＯＤＮの調整を示している。
図１１は、高いＳ／Ｎ比での一塩基置換の検出を示している。
図１２は、反応溶媒へのアセトニトリルの添加効果を示している。
図１３は、ＮａＣｌ濃度の最適化を示している。
図１４は、標的核酸類（検出対象ＯＤＮ）の濃度と塩濃度の２条件を組み合わせた最適化を示している。
図１５は、ＭｇＣｌ２濃度の最適化を示している。
図１６は、４種の塩基への一塩基多型および欠失に対する識別を示している。
図１７は、４種の塩基への一塩基多型および欠失に対する識別のＳ／Ｎ比を示している。
図１８は、ウラシル誘導体を使用した可逆的光連結を示す説明図である。
図１９は、塩基部分としてシトシン誘導体を有するＤＮＡの合成経路を例示する説明図である。
図２０は、シトシン誘導体を用いて可逆的な光連結が可能であることを示す実験結果である。
図２１は、塩基部分としてグアニン誘導体を有するＤＮＡの合成経路を例示する説明図である。
図２２は、塩基部分としてグアニン誘導体を有するＤＮＡの合成経路を例示する説明図である。
図２３は、グアニン誘導体を用いて光連結が可能であることを示す実験結果である。
図２４は、グアニン誘導体を用いて光連結した生成物は、光開裂が可能であることを示す実験結果である。
図２５は、塩基部分としてアデニン誘導体を有するＤＮＡの合成経路を例示する説明図である。
図２６は、塩基部分としてアデニン誘導体を有するＤＮＡの合成経路を例示する説明図である。
図２７は、アデニン誘導体を用いて光連結が可能であることを示す実験結果である。
図２８は、アデニン誘導体を用いて光連結が可能であることを示す実験結果である。
図２９は、アデニン誘導体を用いて光連結した生成物は、光開裂が可能であることを示す実験結果である。
図３０は、７−カルボキシビニル−７−デアザ−２’−デオキシアデノシンのＵＶ吸光特性を示す実験結果である。【００７０】
表１は、単一のヌクレオチド位置で異なる８つのＲＮＡ標的に対して正しく塩基対形成した、ＯＤＮ２（ＣＶＵ）の光連結生成物に正規化された蛍光強度を示している。[ａ]：下線の付いた文字はミスマッチした塩基を示す。  [ｂ]：各実験は少なくとも４回ずつ行った。【００７１】
表１：点変異させた標的（Ｔａｒｇｅｔ）ＲＮＡの蛍光強度（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の比較
【表１】
0004712814.tif 000013
【００７２】
表２は、ＯＤＮ２（ＣＶＵ）の光連結生成物に対して正規化された蛍光強度を示している。[ａ]  下線付きの文字はミスマッチ塩基を示す。  [ｂ]  各実験は少なくとも４回行った。【００７３】
表２：点変異させた標的（Ｔａｒｇｅｔ）ＲＮＡの蛍光強度（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の比較
【表２】
0004712814.tif 000014
【図１】
0004712814.tif 000020
【図２】
0004712814.tif 000021
【図３】
0004712814.tif 000022
【図５】
0004712814.tif 000023
【図６】
0004712814.tif 000024
【図８】
0004712814.tif 000025
【図９】
0004712814.tif 000026
【図１０】
0004712814.tif 000027
【図１４】
0004712814.tif 000028
【図１７】
0004712814.tif 000029
【図１８】
0004712814.tif 000030
【図１９】
0004712814.tif 000031
【図２０】
0004712814.tif 000032
【図２１】
0004712814.tif 000033
【図２２】
0004712814.tif 000034
【図２３】
0004712814.tif 000035
【図２４】
0004712814.tif 000036
【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
0004712814.tif 000040
【図２９】
0004712814.tif 000041
【図３０】
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【図４】
0004712814.tif 000043
【図７】
0004712814.tif 000044
【図１１】
0004712814.tif 000045
【図１２】
0004712814.tif 000046
【図１３】
0004712814.tif 000047
【図１５】
0004712814.tif 000048
【図１６】
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