(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸。
【請求項２】
配列番号：４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸の相補体の全長に対して高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでなる核酸であって、Mg+2吸収活性を有するポリペプチドをコードするもの。
【請求項３】
配列番号：４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる核酸であって、Mg+2吸収活性を有するポリペプチドをコードするもの。
【請求項４】
前記同一性が少なくとも95％である、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
配列番号：３のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項６】
配列番号：４のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含んでなりそしてMg+2吸収活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなる、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号：４のアミノ酸配列から成る、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項９】
サンプル中のCaALR1核酸の検出方法において、
ａ）前記サンプルを、請求項１に記載の核酸と、ハイブリダイゼーションが生ずる条件下で接触せしめ；そして
ｂ）前記CaALR1核酸に結合した前記核酸分子の存在を検出する；
ことを含んでなる方法。
【請求項１０】
請求項６〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、酵母病原体、カンジダ・アルビカンス（Candida  albicans）において単離された新規な必須真菌特異的遺伝子の同定、およびそれらのサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces  cerevisiae）対応物に対するそれらの構造的および機能的関連性に関する。さらに詳しくは、本発明は、真菌の診断および抗真菌薬剤の発見におけるこれらの新規な必須真菌特異的遺伝子の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
日和見性真菌、例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida  albicans）、アスペルギルス・フミガツス（Aspergillus  fumigatus）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus  neoformans）、およびニューモシティス・カリニ（Pneumocystis  carinii）は、微生物病原体の出現するクラスであり、免疫系が弱化されている患者において全身的真菌感染または「真菌症」を引き起こす。カンジダ（Candida）種は、真菌病原体の主要な属として等級づけられ、今日の病院においてすべての血流のほぼ8％の割合を占める。
【０００３】
驚くべきことには、生命を脅かすカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）の場合または「カンジダ症」の発生率は過去20年間にわたって鋭く上昇し、皮肉には、今日の病院における真菌症の罹患率に対する単一の最大の寄与因子は現代の医療それ自体である。標準的医学的実施、例えば、器官移植、化学療法および放射線療法は、免疫系を抑制し、患者を真菌感染に対して高度に耐性する。現代の疾患、例えば、最も周知的にはAIDSはこの真菌感染発生の増加に寄与する。
【０００４】
事実、ニューモシティス・カリニ（Pneumocystis  carinii）の感染はAIDS被害者の死亡率の第1の原因である。真菌感染の治療は安全性および有効抗真菌薬剤の欠如により妨害される。今日使用されている抗菌化合物、すなわち、ポリエン（アンホテリンB）およびアゾールをベースとする誘導体（フルコナゾール）は、前者の非特異的毒性および後者に対する耐性の発生のために、効能が制限される。フルコナゾールに対する耐性は、特にカンジダ（Candida）およびアスペルギルス（Aspergillus）種において十年を通して劇的に増加した。
【０００５】
明らかなように、真菌の感染および耐性を防除するために新しい抗菌化合物を開発しなくてはならない。解決法の一部分は、新規な抗真菌薬剤のターゲット（すなわち、細胞を死亡させる機能的活性を有する遺伝子産物）の解明に依存する。広いスペクトルの真菌における細胞生活能力に対して必須でありかつヒトにおいて存在しない遺伝子産物の同定は、次いで薬剤の合理的スクリーニングを使用できる、新規な抗真菌薬剤のターゲットとして働くことができるであろう。この出発点から、必須かつ真菌特異的遺伝子を不活性化し、遺伝子崩壊の確認された作用を模擬する特異的抗真菌化合物を同定するために、薬剤スクリーンを開発することができる。
【０００６】
パン・菓子用のイーストのサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces  cerevisiae）について最近完結し、カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）について現在進行中のゲノム配列決定プロジェクトは、抗真菌薬剤の発見に対して特に重要である。サッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）はそれ自体病原性ではないが、それはカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）を包含する、日和見性病原体に分類学的に密接に関係する。
【０００７】
結局、同定され、サッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）において研究される遺伝子の多数のは、スタンフォード（Stanford）カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）のゲノムプロジェクト（http://candida.stanford.edu）により提供される、豊富な配列の情報の中に存在するオーソロガス遺伝子の同定および機能的分析を促進する。このような配列決定の努力は、必須の細胞プロセスに潜在的に参加し、したがって新規な抗真菌薬剤のターゲットとして働くことができる、カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）の遺伝子の同定を促進する。
【０００８】
しかしながら、ゲノム配列の分析による遺伝子の発見単独は、既知の遺伝子または新規な遺伝子を薬剤ターゲットとして確認しない。究極的に、ターゲットの確認は直接的に病原体内の候補の薬剤ターゲット遺伝子の必須性を実験的に証明することを必要とする。なぜなら、異なる生物における特定のオーソログのために必須な遺伝子間に、制限された調和のみが存在するからである。
【０００９】
例えば、遺伝子崩壊により確認された13のカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）の必須遺伝子の文献の検索において、7つの遺伝子（すなわち、CaFKS1、CaHSP90、CaLRE6、CaPRS1、CaRAD6、CaSNF1、およびCaEFT1）はサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）において必須ではない。したがって、1つの生物における遺伝子のヌル表現型は、ある場合において、病原性酵母におけるオーソロガス遺伝子の機能を暗示することがあるが、このような予測は実験後に無効であることが証明できる。
【００１０】
こうして、カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）における新規な必須遺伝子を同定し、それを薬剤ターゲットとして確認することが要求されている。
本発明は、これらおよび他の要求を満足することを探求する。
多数の文献が記載されるが、それらの内容は引用することによって本明細書の一部とされる。
【００１１】
発明の要約
一般に、本発明は、抗真菌療法のターゲットおよびこれらのターゲットを目的とする薬剤に関連する先行技術の欠点を克服することを探求する、必須真菌特異的遺伝子に関する。さらに、本発明は、スクリーニングアッセイ、およびそれにより同定された、真菌、特に病原性真菌、なお特にカンジダ・アルビカンス（Candida  albicans）に対して有意な特異性を表示することができる因子に関する。  本発明は、カンジダ・アルビカンス（Candida  albicans）における必須真菌特異的遺伝子および抗真菌薬剤の発見におけるそれらの使用に関する。
【００１２】
さらに詳しくは、本発明は、サッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）における生活能力のために必須であることが知られている遺伝子の同定、および同一表現型がカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）において観測されるどうかを直接的に評価することに関する。カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）において必須であることが本発明において見出された、このような遺伝子は、確認された抗真菌薬剤のターゲットとして働き、抗真菌薬剤のスクリーニングプログラムにおいて新規な試薬を提供する。
【００１３】
さらに詳しくは、本発明は、カンジダ・アルビカンス（Candida  albicans）のCaKRE5、CaALR1およびCaCDC24のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に関する。さらに、本発明は、必須遺伝子としてCaKRE5、CaALR1およびCaCDC24を同定し、これにより抗真菌薬剤の発見および真菌診断のためのターゲットとしてそれを確認することに関する。
【００１４】
本発明までに、KRE5、ALR1およびCDC24が広範な種類の真菌において必須であるかどうかは未知であった。これらの遺伝子は発芽する酵母（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae））および分裂酵母（例えば、シゾサッカロマイセス・ポンベ（S.  pombe））の1つにおいて必須であることが示されたが、これらの遺伝子の必須性は二形性真菌または病原性真菌（例えば、カンジダ・アルビカンス（C.  albicans））において評価されてきていない。こうして、本発明は、KRE5、ALR1およびCDC24が非常に異なる真菌において必須遺伝子であること教示し、これにより動物感染性真菌および植物感染性真菌を包含する、広範な種類の真菌において、抗真菌薬剤を開発する診断のためのターゲットとして、これらの遺伝子および遺伝子産物を使用する道を開いた。
【００１５】
このような病原性真菌の非限定的例は下記のもを包含する：カンジダ・アルビカンス（Candida  albicans）、アスペルギルス・フミガツス（Aspergillus  fumigatus）、アスペルギルス・フラブス（Aspergillus  flavus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus  niger）、コクシディオイデス・イミチス（Coccidiodes  immitis）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus  neoformans）、エキソフィアラ・デルマチチディス（Exophiala  dermatitidis）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma  capsulatum）、デルムトフィテス（Dermtophytes）種、ミクロスポルム（Microsporum）種、トリコフィトン（Trchophyton）種、フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora  infestans）、およびプッシニア・ソルギ(Puccinia  sorghi)。
【００１６】
さらに詳しくは、本発明は、真菌の界（Mycota）における任意の生物において確認された薬物ターゲットとして、これらの遺伝子および遺伝子産物を同定することに関する。こうして、本発明の説明は主としてカンジダ・アルビカンス（Candida  albicans）に集中されるが、本発明は、また、広範な種類の真菌、さらに詳しくは、病原性真菌における実用性を見出すことができる。
【００１７】
本発明の以前において、これらの遺伝子の必須性は人間ならびに他の哺乳動物の絶対的仲間としてサービスする、不完全、二形性酵母、例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida  albicans）において証明されてきていない。そのうえ、本発明の以前において、カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（S.  pombe）またはサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）間の有意な進化の分岐にかんがみて、こうして、これらの真菌の生物学間の差にかんがみて、カンジダ・アルビカンス（Candida  albicans）におけるこれらの3つの遺伝子の任意の1つにおけるヌル突然変異が必須であるという合理的な予測は存在しなかった。
【００１８】
例えば、KRE5、ALR1およびCDC24が関係づけられる経路の複雑さにかんがみて、CaKRE5、CaALR1またはCaCDC24のノックアウトがそれらの上流または下流における他の因子により補償されないであろうことは、合理的に予測することができなかった。カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）は免疫抑制された個体において日和見性病原体となりうる。その形態は、特定の刺激に依存して、酵母（発芽）形態から偽菌糸、究極的に菌糸（糸状）形態学に転じる。カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）の菌糸形態は病原性／ビルレントであると一般に考えられる。酵母から菌糸形態への変換は、二形性転位と呼ぶ発生プロセスである。
【００１９】
それ以上の一般的面において、本発明は、CaKRE5、CaALR1またはCaCDC24の必須機能をターゲットするための化合物または因子を同定する、スクリーニングアッセイに関する。こうして、関係する面において、本発明は、これらの遺伝子または遺伝子産物をターゲットする化合物、因子または薬物についてスクリーニングするために、CaKRE5、CaALR1またはCaCDC24をコードする配列、それらのフラグメントまたはそれらの誘導体を収容する構築物、またはそれらを発現する細胞の使用に関する。
【００２０】
さらに、本発明は、KRE5、ALR1またはCDC24、特にCaKRE5、CaALR1またはCaCDC24をターゲットする因子を同定する方法およびアッセイに関する。さらに、本発明は、これらのタンパク質が関係する経路をターゲットする因子を同定するアッセイおよび方法に関する。
本発明によれば、1つの態様において、真菌特異的遺伝子CaKRE5、真菌特異的遺伝子CaALR1、真菌特異的遺伝子CaCDC24、それらの一部分、それらに由来するオリゴヌクレオチド、上記のすべてまたは高いストリンジェンシイの条件下に上記に対してハイブリダイゼーションする配列に対して相補的なヌクレオチド配列から成る群より選択される単離されたDNA配列が提供される。
【００２１】
本発明の他の態様によれば、候補の化合物を遺伝子産物とインキュベートし、そして候補の化合物の存在下にこの遺伝子産物の活性を測定することからなり、ここで候補の化合物の存在下に遺伝子産物の活性が候補の化合物の非存在下のそのその活性と測定可能に異なるとき、潜在的薬剤が選択される、CaKRE5またはCaALR1またはCaCDC24によりコードされる産物の活性をモジュレートする化合物を選択する方法が提供される。
【００２２】
本発明の他の態様によれば、CaKRE5、CaALR1、CaCDC24またはそれらの一部分またはそれらの誘導体をコードするRNAまたはcDNAに対して特異的にハイブリダイゼーションする10〜50ヌクレオチドから成り、CaKRE5、CaALR1またはCaCDC24またはそれらの誘導体の核酸配列からの少なくとも10の連続ヌクレオチドから成るヌクレオチド配列であるか、あるいはそれに対して相補的である、単離された核酸分子が提供される。
【００２３】
本発明の他の態様によれば、核酸分子と、CaKRE5、CaALR1またはCaCDC24またはそれらの一部分または誘導体をコードする核酸との間でハイブリダイゼーションを起こさせることができる条件下に、この核酸分子と試料を接触させ、そしてこのハイブリダイゼーションのを検出することからなる、試料中のCaKRE5、CaALR1またはCaCDC24を検出する方法が提供される。
本発明のなお他の態様によれば、精製されたCaKRE5ポリペプチド、精製されたCaALR1ポリペプチドまたは精製されたCaCDC24ポリペプチドまたはそのエピトープを支持する部分が提供される。
【００２４】
本発明のなお追加の態様において、CaKRE5、CaALR1、CaCDC24またはそのエピトープを支持する部分に対する特異的結合アフィニティーを有する抗体が提供される。
さらに詳しくは、それらのサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）の対応物に対して構造的および機能的関連性を示すカンジダ・アルビカンス（Candida  albicans）の真菌特異的遺伝子、CaKRE5、CaALR1およびCaCDC24の同定および崩壊、および真菌の診断および抗真菌薬剤の発見におけるそれらの実用性の確認に関する。
【００２５】
前述したように、KRE5、ALR1またはCDC24の必須性は発芽または分裂する酵母において示されたが、これらの結果は多数の理由でカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）系に翻訳することができない。例えば、米国特許第5,194,600号はサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）のKRE5遺伝子の必須性を教示するが、真菌の生物学からの多数の観測は病原性酵母中のこの遺伝子の存在および／または役割に関してまったく明らかにしない。もちろん、カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）におけるKRE5相同体は必須であること、あるいはそれが抗真菌ターゲットとして実用性を有するかどうかを、米国特許第5,194,600号はまったく教示または示唆していない。このような予測の例を下に記載する：
【００２６】
a）  酵母シゾサッカロマイセス・ポンベ（S.  pombe）中の関係する遺伝子GPT1は必須ではない。そのうえ、タンパク質のフォルディングに関係すると考えられるGPT1は、サッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）のkre5突然変異体を相補することができず、そしてこの酵母中のβ−（1，6）−グルカンポリマーのレベルを減少することができない。
b）  異なる酵母中で異なる方法でβ−（1，6）−グルカンポリマーを作ることができる。
c）  遺伝子は進化の間に喪失され、こうして、カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）がKRE5関係遺伝子を保持かどうかを推測的に決定することができなかった。
【００２７】
そのうえ、CaKRE5はサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）のkre5突然変異体を相補することができず、こうしてこのようなアプローチにより遺伝子を回収することができなかった。同様に、カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）のCaKRE5遺伝子のDNA配列はサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）と十分に異ならないので、プローブとしてサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）のKRE5遺伝子を使用する低いストリンジェンシイのサザンハイブリダイゼーションにより、それを検出することができない。
本発明の目的に対して、下記の略号および用語を定義する。
【００２８】
定義
用語「遺伝子のノックアウト」または「ノックアウト」は、核酸配列によりコードされるポリペプチドの生物学的活性を有意に減少する、好ましくは抑制または破壊する核酸配列の崩壊を意味する。カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）においてCaKRE5、CaALR1またはCaCDC24配列をコードするゲノムDNA配列の少なくとも一部分崩壊する、CaKRE5、CaALR1またはCaCDC24配列の1つのを含んでなる組換え核酸配列を導入することによって、多数のノックアウトがここにおいて例示される。ホモ接合体の崩壊（二倍体生物またはその状態において）が存在する、後者の場合において、突然変異はまた「ヌル」突然変異と命名される。
【００２９】
用語「キレート化合物形成因子」は、確認されたターゲットの生物学的活性を減少または阻害するような方法で、本発明の確認されたターゲットの1つをキレート化する因子を意味する。このようなキレート化合物形成因子の非限定的例は、本発明による確認されたターゲットの1つに対して特異的な抗体を包含する。
【００３０】
用語「フラグメント」は、本明細書においてポリペプチドについて使用するとき、少なくとも7つの隣接アミノ酸、好ましくは約11〜16隣接アミノ酸、より好ましくは40より多い隣接アミノ酸の長さを意味する。このようなペプチドは、当業者によく知られている方法、例えば、タンパク質分解的切断、遺伝子操作または化学合成により製造することができる。本発明による核酸分子の「フラグメント」は、診断プローブおよび／またはプライマーとして実用性を有する，少なくとも12のヌクレオチド、好ましくは少なくとも18のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも24のヌクレオチドを有する、このような分子を意味する。当業者にとって明らかなように、100ヌクレオチド、1000ヌクレオチド、2000ヌクレオチドおよびそれより多いヌクレオチドのより大きいフラグメントはまた本発明による実用性を見出す。
【００３１】
用語「2つの因子のモジュレーション」は、このような2つの因子間のアフィニティー、強度、速度およびその他の変化を意味する。カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）において必須遺伝子および遺伝子産物としてCaKRE5、CaALR1およびCaCDC24が同定されると、この真菌ならびに他の真菌においてそれらのそれぞれの経路に関係する因子を有する、これらの遺伝子産物の相互作用をモジュレートする道が開かれる。
【００３２】
ヌクレオチド配列は、ここにおいて、この分野において普通に使用されているようにかつIUPAC−IUB生化学的命名委員会（Biochemical  Nomenclature  Commission）の推奨に従い、一文字ヌクレオチド記号を使用して、左から右に、5'→3'方向に一本鎖により表示される。
【００３３】
特記しない限り、本明細書において使用する科学的および技術的用語および命名法は、本発明が関係する当業者に普通に理解されているのと同一の意味を有する。一般に、細胞培養、感染、分子生物学の方法およびその他は、この分野において使用されている普通の方法である。このような標準技術は、参考文献のマニュアル、例えば、Sambrook他、1989、Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  LaboratoryおよびAusubel他、1994、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Wiley、に記載されている。
【００３４】
本発明の説明は、多数の日常的に使用されている組換えDNA（rDNA）技術に関する。それにもかかわらず、このようなrDNAの用語の選択された例の定義は、明確さおよび首尾一貫性のために提供される。
本明細書において使用するとき、「核酸分子」はヌクレオチドのポリマーを意味する。その非限定的例は、DNA（例えば、ゲノムDNA、cDNA）およびRNA分子（例えば、mRNA）である。核酸分子は、クローニング技術により得るか、あるいは合成することができる。DNAは二本鎖または一本鎖であることができる（コーディング鎖または非コーディング鎖［アンチセンス］）。
【００３５】
用語「組換えDNA」は、この分野において知られているように、DNAセグメントの結合から生ずるDNA分子を意味する。これはしばしば遺伝子操作と呼ばれる。  用語「DNAセグメント」は、本明細書において、ヌクレオチドの線状ストレッチまたは配列を含んでなるDNA分子を意味する。この配列は、遺伝暗号に従い読むとき、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質フラグメントおよびその他と呼ぶことができる、アミノ酸の線状ストレッチまたは配列をコードすることができる。
【００３６】
用語「増幅対」は、本明細書において、本発明の1対のオリゴヌクレオチド（オリゴ）を意味し、これらは多数のタイプの増幅プロセスの1つ、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応により選択された核酸配列を増幅するとき一緒に使用ように選択される。1つのタイプの増幅プロセスは、リガーゼ連鎖反応、いっそう詳細に後述するように、鎖置換増幅、または核酸配列をベースとする増幅を包含する。この分野において普通に知られているように、オリゴは選択した条件下に相補的配列に結合するように設計される。
本発明を実施するための核酸（例えば、DNAまたはRNA）は、よく知られている方法に従い得ることができる。
【００３７】
本発明による核酸フラグメントは、本発明のポリペプチドのエピトープエンコーディング部分を包含する。このような部分は、よく知られている方法に従い本発明の核酸配列を使用して、当業者により同定することができる。このようなエピトープは、本発明のポリペプチドに対して特異的である抗体を発生させるとき有効である。本発明は、また、ストリンジェンシイの条件下に、本発明のポリヌクレオチド配列またはその一部分に対してハイブリダイゼーションすることができるポリヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子を提供する。
【００３８】
「ポリヌクレオチド配列の一部分」に対してハイブリダイゼーションするという用語は、本発明のポリヌクレオチド配列の少なくとも12ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも18ヌクレオチド、なおより好ましくは少なくとも24ヌクレオチド、特に約50ヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを言及する。
【００３９】
さらに、本発明は、本発明による確認されたターゲットまたはフラグメントおよび／またはそれらの誘導体をコードするポリ核酸配列に対して好ましくは少なくとも90％同一である、より好ましくは96％〜99％同一である、なおより好ましくは95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるポリヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子を提供する。配列およびそれらの相同性／同一性を比較する方法はこの分野においてよく知られている。
【００４０】
本発明のオリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーは、特定のアッセイのフォーマットおよび特定の必要性および使用するターゲッテッドゲノムに依存して、任意の適当な長さを有することができる。一般に、オリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーは少なくとも12ヌクレオチド長さ、好ましくは15〜24ヌクレオチド長さであり、そして選択した核酸増幅系に特に適するように適合させることができる。この分野において普通に知られているように、オリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマーは、そのターゲッテッド配列とのそれらのハイブリダイゼーションの融点を考慮して設計することができる（下記および次の文献を参照のこと：Sambrook他、1989、Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual、第2版、CSH  Laboratories；Ausubel他、1989、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、John  Wiley  &  Sons、N.  Y.）。
【００４１】
用語「オリゴヌクレオチド」または「DNA」分子または配列は、二本鎖の形態の、デオキシリボヌクレオチドのアデニン（A）、グアニン（G）、チミン（T）および／またはシトシン（C）から構成された分子を意味し、そして本発明による「調節因子」を含んでなるか、あるいはそれを包含し、この用語は本明細書において定義される。用語「オリゴヌクレオチド」または「DNA」は、線状DNAの分子またはフラグメント、ウイルス、プラスミド、ベクター、染色体または合成的に誘導されたDNAの中に見出すことができる。
【００４２】
本明細書において使用するとき、特定の二本鎖DNA配列は5'→3'方向においてのみ配列を与える通常のコンベンションに従い記載することができる。「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」は、2またはそれ以上のヌクレオチドを有する分子（リボまたはデオキシリボヌクレオチド）を定義する。オリゴのサイズは、特定の状況、究極的にはその特定の用途により支配され、それに応じて当業者により適合されるであろう。オリゴヌクレオチドは化学的に合成するか、あるいはよく知られている方法に従いクローニングすることによって誘導することができる。
【００４３】
本明細書において使用するとき、「プライマー」は、ターゲット配列にアニーリングし、これにより二本鎖領域をつくることができるオリゴヌクレオチドを定義し、この領域は適当な条件下にDNA合成のための開始点として働くことができる。
【００４４】
用語「相同体」および「相同的」は、核酸配列（例えば、遺伝子配列）に関するとき、有意に関係するヌクレオチド配列、結局有意に関係するコード化遺伝子産物を有し、好ましくは関係する生物学的機能を有する、異なる真菌からの核酸配列に関する。相同的遺伝子配列またはコーディング配列は、48ヌクレオチドの少なくとも1つの配列ウィンドウにわたって少なくとも70％の配列同一性（2またはそれ以上の核酸配列のコンピューター発生整列中の最大の塩基合致により定義する）、より好ましくは少なくとも80または85％、なおより好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有する。
【００４５】
相同的遺伝子のポリペプチド産物は、18アミノ酸残基の少なくとも1つの配列ウィンドウにわたって少なくとも35％の配列同一性、より好ましくは少なくとも40％、なおより好ましくは少なくとも50％または60％、最も好ましくは少なくとも70％、80％または90％の配列同一性を有する。好ましくは、相同的遺伝子産物は機能的相同体でもあり、相同体が比較する産物の1または2以上の生物学的活性を機能的に相補するであろう。相同性が配列同一性の％により規定される、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列について、百分率は非常にこの分野においてよく知られているように既知のプログラムの任意の1つにより決定される。
【００４６】
このようなプログラムの非限定的例はデフォルトパラメーターを有するBLASTプログラムである（Altschu他、1997、″Gapped  BLAST  and  PSI−BLAST：タンパク質データベースの検索プログラムの新しい世代、Nucleic  Acids  Res.  25：3389−3402）。匹敵する結果を提供するこの分野において知られている種々のアルゴリズムの任意のものを、好ましくはデフォルトパラメーターとともに、使用することもできる。3つの異なるアルゴリズムについての性能特性は下記の文献に記載されている：Salamov他、″Combining  sensitive  database  search  with  multiple  intermediates  to  detect  distant  homologues″、Protein  Eng.  12：95−100。他の典型的なプログラムパッケージは、ウィスコンシン大学からのGCGTMパッケージである。
【００４７】
相同体は、さらに、2つの相補的核酸鎖が適当なストリンジェント条件下に互いに対してハイブリダイゼーションする能力により特徴づけられる。ハイブリダイゼーションは典型的にはかつ好ましくはプローブ長さの核酸分子、好ましくは20〜100ヌクレオチド長さの核酸分子を使用して実施される。少なくとも所望のレベルの相補性を有する配列が安定にハイブリダイゼーションするが、より低い相補性を有する配列がハイブリダイゼーションしないような、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシイを推定しかつ調節する方法を、当業者は理解する。ハイブリダイゼーションの条件およびパラメーターの例については、例えば、下記の文献を参照のこと：Sambrook他（1989）前掲；およびAusubel他（1994）前掲。
【００４８】
「核酸のハイブリダイゼーション」は、一般に、相補的塩基配列を有し、適当な条件下に熱力学的に好適な二本鎖構造を形成する、2つの一本鎖核酸分子のハイブリダイゼーションを意味する。ハイブリダイゼーションの例は、前述の2つの実験室のマニュアル（Sambrook他、1989、前掲およびAusubel他、1994、前掲）の中に見出すことができ、そしてこの分野において普通に知られている。例えば、よく知られているサザンブロッティング手順におけるように、ニトロセルロースフィルターに対するハイブリダイゼーションの場合において、50％のホルムアミド、高い塩（5×SSCまたは5×SSPE）、5×デンハルト溶液、1％SDS、および100μg／mlの変性担体DNA（例えば、サケ精子DNA）を含有する溶液中で、ニトロセルロースフィルターを標識化プローブと65℃において一夜インキュベートすることができる。
【００４９】
次いで、所望のストリンジェンシイ：室温（低いストリンジェンシイ）、42℃（中程度のストリンジェンシイ）または65℃（高いストリンジェンシイ）にかんがみて選択した温度において、フィルターを0.2×SSC／0.1％SDS中で数回洗浄することによって、非特異的に結合するプローブを洗浄除去することができる。選択する温度はDNAハイブリッドの溶融温度（Tm）に基づく。もちろん、RNA−DNAをまた形成し、検出することができる。このような場合において、当業者はよく知られている方法に従いハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を適合させることができる。ストリンジェント条件は使用することが好ましいであろう（Sambrook他、1989、前掲）。
【００５０】
天然に存在する糖−リン酸塩のバックボーンならびにホスホロチオエート、ジチオネート、アルキルホスホネートおよびα−ヌクレオチドおよびその他を包含する修飾されたバックボーンとともに、本発明のプローブを利用することができる。修飾された糖−リン酸塩のバックボーンは一般に下記の文献により教示されている：Miller、1988、Ann.  Reports  Med.  Chem.  23：295およびMoran他、1987、Nucleic  acid  molecule  Acids  Res.  14：5019。本発明のプローブは、リボ核酸（RNA）またはデオキシリボ核酸（DNA）、好ましくはDNAから構築することができる。
【００５１】
プローブを使用することができる検出方法のタイプは、サザンブロット（DNA検出）、ドットまたはスロットブロット（DNA、RNA）、およびノザンブロット（RNA検出）を包含する。好ましさに劣るが、標識化タンパク質をまた使用して、それが結合する、特定の核酸配列を検出することができる。他の検出法は、ディップスティックの構成およびその他上にプローブを含有するキットを包含する。
【００５２】
本発明は特定の核酸配列の検出に標識を使用することに特別に依存しないが、このような標識は検出の感度を増加するのでしばしば有益である。さらに、この感度の増加は自動化を可能とする。プローブは多数のよく知られている方法に従い標識化することができる（Sambrook他、1989、前掲）。標識の非限定的例は、3H、14C、32P、および35Sを包含する。検出可能なマーカーの非限定的例は、リガンド、発蛍光団、化学発光因子、酵素、および抗体を包含する。プローブとともに使用し、本発明の方法の感度を増加させる、他の検出可能なマーカーは、ビオチンおよび放射性ヌクレオチドを包含する。当業者にとって明らかになるように、特定の標識の選択はそれをプローブに結合させる方法により支配される。
【００５３】
普通に知られているように、放射性ヌクレオチドをいくつかの方法により本発明のプローブの中に組込むことができる。それらの非限定的例は、ガンマ32P  ATPおよびポリヌクレオチドキナーゼを使用するプローブの5'末端のキナーゼ化、放射性dNTP（例えば、低融点ゲル中のランダムオリゴヌクレオチドプライマーを使用して均一に標識化されたDNAプローブ）の存在下の大腸菌（E.  coli）のPolIのクレノーフラグメントの使用、1または2以上の放射性NTPの存在下にDNAセグメントを転写するためのSP6／T7系の使用およびその他を包含する。
【００５４】
選択したまたはターゲットの核酸配列の増幅は、多数の適当な方法により実施することができる。一般に下記の文献を参照のこと：Kwoh他、1990、Am.  Biotechnol.  Lab.  8：14−25。多数の増幅技術は記載されてきており、当業者の特定の要求に合致するように容易に適合させることができる。増幅技術の非限定的例は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、鎖置換増幅（SDA）、または核酸配列をベースとする増幅、Qβレプリカーゼ系およびNASBAを包含する（Kwoh他、1989、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  86：1173−1177；Lizardi他、1988、Bio  Technology  6：1197−1202；Malek他、1994、Methods  Mol.  Biol.  28：253−260；およびSambrook他、1989、前掲）。好ましくは、増幅はPCRにより実施されるであろう。
【００５５】
既知の技術に従い、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施する：例えば、下記の文献を参照のこと：米国特許第4,683,195号；米国特許第4,683,202号；米国特許第4,800,159号；および米国特許第4,965,188号（すべての3件の米国特許の開示は引用することによって本明細書の一部とされる）。一般に、PCRは、ハイブリダイゼーション条件下に、検出すべき特異的配列の各鎖のためのオリゴヌクレオチドプライマーで核酸試料を処理することを包含する。合成する各プライマーのエクステンション生成物は2つの核酸鎖に対して相補的であり、プライマーはそれとハイブリダイゼーションすべき特異的配列の各鎖に対して十分に相補的である。
【００５６】
各プライマーから合成されたエクステンション生成物は、また、同一プライマーを使用してエクステンション生成物をさらに合成するための鋳型として働く。十分な数のエクステンション生成物合成ラウンドを実施した後、試料を分析して、検出すべき1または2以上の配列が存在するかどうかを評価する。増幅された配列の検出は、遺伝子発現後にDNAをEtBr染色して可視化するか、あるいは既知の技術に従い検出可能な標識を使用するか、あるいは他の技術により実施することができる。PCR技術の概観については、下記の文献を参照のこと：PCR  Protocols、A  Guide  to  Methods  and  Amplifications、Michael他（編者）、Acad.  Press、1990。
【００５７】
リガーゼ連鎖反応（LCR）を既知の技術に従い実施する（Weiss、1991、Science  254：12921）。当業者は所望の必要性を満足するプロトコルを採用することができる。また、鎖置換増幅（SDA）は、既知の技術または特定の必要性を満足する既知の技術の適合に従い実施される（Walker他、1992、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  89：392−396；および前掲、1992、Nucleic  Acids  Res.  20：1691−1696。
【００５８】
本明細書において使用するとき、用語「遺伝子」はこの分野においてよく知られており、そして単一のタンパク質またはポリペプチドを定める核酸配列に関する。「構造遺伝子」は、RNAに転写された、そして特異的アミノ酸配列を有するタンパク質に翻訳され、これにより特異的ポリペプチドまたはタンパク質を発生させるDNA配列を定義する。当業者は容易に認識するように、本発明の核酸配列はこの分野においてよく知られている多数の確立されたキットのフォーマットの中に組込むことができる。
【００５９】
DNA分子の「異種」（例えば、異種遺伝子）領域は、現存してそれとアソシエートして見出されない、より大きいセグメント内のDNAのサブセグメントである。用語「異種」は、事実一緒に結合していない2つのポリペプチドを定義するために同様に使用される。異種遺伝子の非限定的例は、リポーター遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびその他を包含し、これらは異種制御再ターゲッティングまたは異種ポリペプチドに対して並列させるか、あるいは結合することができる。
【００６０】
用語「ベクター」はこの分野において普通に知られており、そしてプラスミドDNA、ファージDNA、ウイルスDNAおよびその他を定義し、これらは本発明のDNAをその中にクローニングすることができるDNAベヒクルとして働くことができる。多数のタイプのベクターが存在し、この分野においてよく知られている。
用語「発現」は、遺伝子がmRNAに転写され（転写）、次いでmRNAが1つまたはそれより多いポリペプチド（またはタンパク質）に翻訳される（翻訳）プロセスを定義する。
【００６１】
用語「発現ベクター」は、前述した通りであるが、宿主の中への形質転換後に挿入された配列の発現を可能とするように設計されたベクターまたはベヒクルを意味する。クローニングされた遺伝子（挿入された配列）は、制御因子の配列、例えば、プロモーター配列の制御下に通常配置される。クローニングされた遺伝子をこのような制御配列下に配置することは、しばしば制御因子または配列に作用可能に連鎖されると呼ばれる。
【００６２】
作用可能に連鎖された配列は、また、同一tRNA転写物上に転写される2つのセグメントを含むことができる。こうして、プロモーターにおいて開始される転写がリポーター配列のRNA転写物を産生する場合、2つの配列、例えば、プロモーターおよび「リポーター配列」は作用可能に連鎖される。「作用可能に連鎖」させるために、2つの配列が互いに密接して隣接することは不必要である。
発現制御配列は、原核細胞または真核細胞または両方（シャトルベクター）において作用可能に連鎖された遺伝子を発現するようにベクターが設計するかどうかに依存して変化し、そして転写因子、例えば、エンハンサー因子、終結配列、組織特異的因子、および／または転写開始および終結部位をさらに含有することができる。
【００６３】
原核生物における発現は、問題のDNA配列によりコードされるタンパク質を大量に製造するために有効である。このタンパク質は、その固有の性質、例えば、サイズおよび電荷を利用する標準的プロトコル（例えば、SDSゲル電気泳動、ゲル濾過、遠心、イオン交換クロマトグラフィーおよびその他）に従い精製することができる。さらに、問題のタンパク質はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。精製されたタンパク質は療法上の応用に使用することができる。
【００６４】
DNA構築物は、本発明のオリゴヌクレオチド配列に作用可能に連鎖され、引き続いてオリゴヌクレオチド配列が異種遺伝子、例えば、ルシフェラーゼリポーター分子の遺伝子に作用可能に連鎖されている、プロモーターを含んでなるベクターであることができる。「プロモーター」は、細胞中でRNAポリメラーゼに直接的または間接的に結合し、下流（3'方向）のコーディング配列の転写を開始することができる、DNA領域を意味する。本発明の目的に対して、プロモーターはその3'末端において転写開始部位により結合され、上流（5'方向）に延びて、バックグラウンドより上において検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基または因子を含む。
【００６５】
プロモーター内に、転写開始部位（S1ヌクレアーゼを使用するマッピングにより好都合に定められる）、ならびにRNAポリメラーゼの結合に関係するタンパク質結合性ドメイン（コンセンサス配列）が存在する。真核生物のプロモーターは、「TATA」ボックスおよび「CCAT」ボックスを常にではなが、しばしば含有する。原核生物のプロモーターは転写を開始する働きをする−10および−35コンセンサス配列を含有し、そして転写産物は翻訳開始の間にリボソーム結合配列として働くシャイン・ダルガルノ配列を含有する。
【００６６】
本明細書において使用するとき、表示「機能的誘導体」は、核酸配列またはアミノ酸配列であるかどうかかかわらず配列の機能的誘導体の関係において、もとの配列のそれに実質的に類似する生物学的活性を保持する分子を意味する。この機能的誘導体または同等物は天然の誘導体であるか、あるいは好ましくは合成的に調製ことができる。このような誘導体は、タンパク質の生物学的活性が保存されるかぎり、1または2以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を包含する。
【００６７】
核酸配列の生物学的活性が一般に維持されるかぎり、1または2以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有する核酸配列に、同一のことが適用される。タンパク質配列に関するとき、置換するアミノ酸は置換されたアミノ酸のそれに類似する化学物理的性質を有する。同様な化学物理的性質は、電荷における類似性、嵩高性、疎水性、親水性およびその他を包含する。用語「機能的誘導体」は、本発明の主題の「フラグメント」、「セグメント」、「変異型」、「アナローグ」または「化学的誘導体」を包含することを意図する。
【００６８】
この分野においてよく知られているように、アミノ酸の保存的突然変異または置換は下記を維持する突然変異または置換を意味する：1）ポリペプチドのバックボーン構造（例えば、ベータシートまたはアルファらせん構造）；2）アミノ酸の電荷または疎水性；または3）側鎖の嵩高性。さらに詳しくは、よく知られている用語「親水性残基」はセリンまたはトレオニンを意味する。「疎水性残基」は、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンまたはアラニンを意味する。「正に帯電した残基」は、リシン、アルギニンまたはヒスチジンを意味する。「負に帯電した残基」は、アスパラギン酸またはグルタミン酸を意味する。「嵩高側鎖」を有する残基は、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンを意味する。
【００６９】
本発明によるペプチド、タンパク質フラグメント、およびその他は、それらの配列に依存的にまたは独立してよく知られている方法により修飾することができる。例えば、ペプチドは、本明細書および図面において例示する野生型配列から、1、2、3またはそれより多い位置における保存的アミノ酸置換を使用して誘導することができる。
【００７０】
用語「保存的アミノ酸置換」はこの分野においてよく知られており、これらは同様な特性を有するアミノ酸により特定のアミノ酸の置換（例えば、グルタミン酸に対するアスパラギン酸、またはロイシンに対するグルタミン酸の置換）に関する。もちろん、これらの修飾がペプチド修飾するかぎり、適当な方法において（例えば、これが修飾により意図される場合、ペプチドの生物学的活性に影響を与えないで）、非保存的アミノ酸置換、ならびに他のタイプの修飾、例えば、欠失または挿入を実施することもできる。典型的な保存的アミノ酸置換のリストを下に記載する。
【００７１】
【表１】
0004842440.tif 000002
【００７２】
この表において見ることができるように、これらの修飾のいくつかを使用してペプチドをタンパク質分解に対していっそう耐性とすることができる。もちろん、この分野においてよく知られているように、酵素的または化学的処理を使用して、その一次配列に影響を与えないで、ペプチドの修飾を実施することもできる。
【００７３】
こうして、用語「変異型」は、本明細書において、構造および生物学的活性が本発明のタンパク質または核酸に実質的に類似するタンパク質または核酸分子を意味する。もちろん、保存的アミノ酸をターゲットし、「非保存的」アミノ酸で置換（または欠失）して、タンパク質の生物学的活性を減少または破壊することができる。このような遺伝的に修飾されたタンパク質の非限定的例は、優性な負の突然変異体を包含する。
【００７４】
本明細書において使用するとき、「化学的誘導体」は、通常本発明の主題の一部分でない、追加の化学的成分を包含することを意味する。このような成分は、誘導体の物理化学的特性（例えば、溶解度、吸収、半減期およびその他、毒性の減少）に影響を与えることがある。このような成分は、Remington's  Pharmaceutical  Sciences（例えば、1980）において例示されている。これらの化学物理的成分をポリペプチドにカップリングさせる方法はこの分野においてよく知られている。理解されるように、化学的修飾およびその他をまた使用して、不活性または低い活性の因子または化合物を産生することができる。これらの因子または化合物は、陰性対照としてまたは免疫学的応答を引き出すために使用することができる。こうして、本発明に従い確認されたターゲットの1つの不活性修飾を使用して免疫学的耐性を引き出すことは、また、本発明の範囲内に入る。
【００７５】
用語「アレレ」は、染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のオールタネイティブ形態を定義する。
多数のタイプの抗真菌ポリペプチド、フラグメント、およびそれらの誘導体をアミノ酸鎖の多数のタイプの修飾に従い産生できることを理解すべきである。このような多数のタイプの修飾は当業者によく知られている。概括的に言えば、これらの修飾は、限定されずに、分子サイズの減少、および／またはそのアミノ酸配列の修飾を包含する。また、本発明に従い、化学的修飾を実施することができる。例えば、ポリペプチド誘導体またはそれらのフラグメントの中に修飾されたまたは非天然のアミノ酸または非アミノ酸成分を組込むことができる。こうして、天然、合成されたまたは修飾されたアミノ酸、またはそれらの混合物を包含する合成ペプチドは本発明の範囲内に入る。
【００７６】
本発明の抗真菌剤、特に本発明の確認されたターゲットの多数のタイプの修飾または誘導体化は、Genaro、1995、Remington's  Pharmaceutical  Sciencesにおいて教示されている。本発明による分子に異なる成分をカップリングさせる方法はこの分野においてよく知られている。それらの非限定的例は、タンパク質、それらのフラグメントまたは誘導体の共有結合的修飾を包含する。さらに詳しくは、本発明によるアミノ酸の修飾は、例えば、システイニル残基、ヒスチジル残基、リシニルおよびアミノ末端の残基、アルギニル残基、チロシニル残基、カルボキシル側鎖、グルタミニルおよびアスパラギニル残基の修飾を包含する。また、アミノ酸の他の修飾は、Creighton、1983、In  Proteins、Freeman  and  Co.、Ed.、79−86に記載されている。
【００７７】
普通に知られているように、「突然変異」は娘細胞に伝達することができる遺伝物質の検出可能な変化である。よく知られているように、突然変異は、例えば、1または2以上のデオキシリボヌクレオチドにおける検出可能な変化であることができる。例えば、ヌクレオチドを新しい位置に対して付加し、欠失し、置換し、逆方向にし、または転移させることができる。自発的突然変異および実験的に誘導された突然変異が存在する。核酸分子の突然変異の結果は突然変異の核酸分子である。突然変異のポリペプチドは、この突然変異の核酸分子からコード化されることができる。
【００７８】
用語「優性の負の突然変異」は、結合相手が細胞において必須機能を実行し、調節しまたはそれに影響を与えるためにもはや有効でないように、結合相手を多少キレート化することができる突然変異を意味する。それゆえ、このキレート化合物形成は結合相手の必須機能に影響を与え、細胞の成長にアッセイ可能な変化を引き起こすことができる。1つの好ましい態様において、この変化は細胞の成長の制限、または細胞の死である。
本明細書において使用するとき、用語「精製された」は細胞成分から分離された分子を意味する。こうして、例えば、「精製されたタンパク質」は自然に見出されないレベルに精製されている。「実質的に純粋な」分子は、大部分の他の細胞成分を欠如する分子である。
【００７９】
本明細書において使用するとき、用語「分子」、「化合物」または「リガンド」は互換的に使用し、広く天然、合成または半合成の分子または化合物を意味する。したがって、用語「分子」は、例えば、化学物質、高分子、細胞または組織の抽出物（植物または動物からの）およびその他を意味する。分子の非限定的例は、核酸分子、ペプチド、抗体、炭水化物および薬学的因子を包含する。これらの因子は、ランダムスクリーニング、合理的選択を包含する種々の手段により、そして例えば、タンパク質またはリガンドモデル化方法、例えば、コンピューターモデル化、組合わせのライブラリースクリーニングおよびその他を使用する合理的設計により、選択し、スクリーニングすることができる。
【００８０】
ある態様下に、2以上の「因子」または「分子」を同時に試験することができることを理解すべきである。事実、分子のプールを試験することができる。本発明による相互作用に対する作用を有するとして分子のプールが同定されると、分子をより小さいプールで試験するか、あるいは個々に試験して、この作用に最初に関係する分子を同定することができる。用語「合理的に選択された」または「合理的に設計された」は、本発明の確認されたターゲットまたはその相互作用ドメインの立体配置に基づいて選択された化合物を定めることを意味する。
【００８１】
当業者は理解するように、天然に存在しない修飾を有する高分子もまた用語「分子」の範囲内である。例えば、ペプチド模倣物は製剤産業においてよく知られており、一般にペプチドアナローグと呼ばれ、前述したようなモデル化により発生させることができる。同様に、好ましい態様において、本発明のポリペプチドを修飾してそれらの安定性を増強する。本発明の教示に従い同定された分子は、真菌感染、特にカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）感染に関連する疾患または症状において療法上の価値を有する。あるいは、本発明の教示に従い同定された分子は、いっそう有効な抗真菌剤の開発において実用性を見出す。
【００８２】
用語「模倣物」は、天然、合成またはキメラであるかどうかにかかわらず参照化合物に構造的にかつ機能的に関係する化合物を意味する。用語「ペプチド模倣物」は、ペプチドまたはポリペプチドの三次元構造の活性に関係する面を模擬する、非ペプチドまたはポリペプチド化合物である。こうして、ペプチド模倣物は真菌ポリペプチドのフラグメントまたは部分の構造を模擬することができる。本発明の1つの態様によれば、本発明の確認されたターゲットの突然変異体のペプチドバックボーンは、その抗真菌活性を保持する炭素をベースとする疎水性構造に変換される。したがって、このペプチド模倣化合物は、それを設計した突然変異体の活性部分の構造に対応する。このようなタイプの誘導体化は、標準的医学化学的方法を使用して実施することができる。
【００８３】
化合物のライブラリー（公衆に入手可能または商業的に入手可能）はこの分野においてよく知られている。また、用語「化合物」はリボザイム（例えば、米国特許第5,712,384号、米国特許第5,879,938号および米国特許第4,987,071号参照）およびアプタマー（例えば、米国特許第5,756,291号および米国特許第5,792,613号参照）を包含することを意味する。
当業者にとって明らかなように、本発明は化合物をスクリーニングするか、あるいは真菌感染を診断するチップ技術に適用可能である。さらに、本発明によるスクリーニングアッセイは、よく知られているアレイまたはミクロアレイ技術を使用して実施することができる。
【００８４】
また、本発明は、例えば、本発明の核酸配列またはタンパク質の発現を減少または阻害するために使用できる、アンチセンス核酸分子を提供する。本発明によるアンチセンス核酸分子は、ターゲッテッド核酸配列（DNAまたはRNA）の一部分と安定な二本鎖または三重らせんを形成することができる分子を意味する。1つの特定の態様において、アンチセンスは4E−BP1に対して特異的である。アンチセンス核酸分子およびこのような分子の修飾の使用は、例えば、下記の文献に記載されているように、この分野においてよく知られている：WO  96／32966、WO  96／11266、WO  94／15646、WO  93／08845および米国特許第5,593,974号。
【００８５】
本発明によるアンチセンス核酸分子は、よく知られている方法に従い、核酸配列から誘導し、修飾することができる。例えば、いくつかのアンチセンス分子は、この分野において普通に知られているように、分解に対していっそう耐性であるようにして、それらのターゲッテッド配列に対するそれらのアフィニティーを増加し、選択した細胞型または細胞区画へのそれらの輸送に影響を与え、および／またはヌクレオチドアナローグを使用してそれらの脂質溶解度を増強しおよび／または選択したそれらの化学的フラグメントを置換するように設計することができる。
【００８６】
また、「in  vivo」実験モデルを使用して、「in vitro」アッセイ実施することができることを理解すべきである。例えば、本発明のin vitro方法またはこの分野において知られているin vitro方法の1つにおいて、本発明のインジケーター細胞からの抽出物を調製し、使用することができる。
【００８７】
本明細書において使用するとき、用語「インジケーター細胞」は、1つの特定の態様において、同定可能または選択可能な表現型または特性が観測可能または検出可能であるのような方法で、CaKRE5、CaALR1およびCaCDC24の1つを発現する細胞を意味する。このようなインジケーター細胞は、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。ある態様において、インジケーター細胞は、これらの相互作用するドメインの選択した誘導体、フラグメント、相同体、または突然変異体を発現するように操作されている。好ましくは、細胞は真菌細胞である。1つの態様において、細胞はサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）細胞、特にカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）細胞である。
【００８８】
1つの特定の態様において、インジケーター細胞はこの分野においてよく知られているように（Ausubel他、1994、前掲）2つのハイブリッド系技術の使用を可能とするベクターを収容する酵母細胞であり、そして化合物またはそのライブラリーを試験するために使用することができる。1つの態様において、選択可能なマーカーまたはアッセイ可能なタンパク質をコードするリポーター遺伝子を制御因子に作用可能に連鎖し、こうして、選択可能なマーカーまたはアッセイ可能なタンパク質の発現が確認されたターゲットの1つの機能に依存するようにする。このようなインジケーター細胞を使用して、高い処理量で被験分子の非常に大きいアレイを急速にスクリーニングすることができる。特定の態様において、リポーター遺伝子はルシフェラーゼまたはβ−Galである。
【００８９】
1つの態様において、本発明の確認されたターゲットを融合タンパク質として提供することができる。そのための構築物の設計および融合タンパク質の発現または産生はこの分野においてよく知られている（Sambrook他、1989、前掲、およびAusubel他、1994、前掲）。特定の態様において、両方の相互作用ドメインは融合タンパク質の一部分である。このような融合タンパク質の非限定的例は、LexA−X融合物（DNA−結合性ドメイン−4E−X；ベイト、ここでXは本発明の確認されたターゲットまたはその一部分または誘導体である）およびB42融合物（トランスアクチベータードメイン−Y；プレイ、ここでYはXに結合する因子またはその一部分である）を包含する。
【００９０】
なお他の特定の態様において、オペレーターおよび／またはLexA応答性因子に作用可能に連鎖されたリポーター遺伝子をまた収容する酵母細胞中で、LexA−XおよびB42−Y融合タンパク質はLexA発現される。もちろん、認識されるように、他の融合タンパク質をこのような2ハイブリッド系において使用することができる。さらに、認識されるように、融合タンパク質は全長の確認されたターゲットまたはその突然変異体またはそれが相互作用するポリペプチドを含有する必要がない。事実、これらのポリペプチドのフラグメントは、それらが相互作用性ドメインを含んでなるかぎり、本発明に従い使用することができる。
【００９１】
このような融合タンパク質の非限定的例は、血球凝集素融合物、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）融合物およびマルトース結合性タンパク質（MBP）融合物を包含する。ある態様において、融合された2つのポリペプチド配列の間にプロテアーゼ切断部位を導入することは有益であろう。2つの異種的に融合されたポリペプチド間のこのようなプロテアーゼ切断部位はこの分野においてよく知られている。
【００９２】
ある態様において、また、宿主細胞からの融合タンパク質の分泌を可能とするシグナルペプチド配列に本発明の相互作用ドメインを融合することは有益であろう。多様な生物からのシグナルペプチドはこの分野においてよく知られている。細菌OmpAおよび酵母Suc2は、シグナル配列を含有するタンパク質の2つの非限定的例である。ある態様において、また、相互作用ドメインと異種ポリペプチド部分との間にリンカー（普通に知られている）を導入することは有益であろう。このようなタンパク質は、本発明のアッセイにおいてならびに精製の目的、検出の目的およびその他のために実用性を見出す。
【００９３】
確かに、本発明の実施に有用な配列およびポリペプチドは、突然変異体、相同体、サブタイプ、アレレおよびその他を包含するが、これらに限定されない。ある態様において、本発明の配列は機能的（にもかかわらず欠陥的）相互作用ドメインをコードすることを理解すべきである。当業者にとって明らかなように、本発明の相互作用ドメイン、その変異型、誘導体、またはフラグメントがその相手に結合する能力を保持するかどうかは、本発明の教示およびアッセイおよびこの分野の一般的教示を使用することによって容易に決定することができる。
【００９４】
もちろん、本発明の相互作用ドメインは、例えば、in vitro突然変異誘発により、修飾して、構造−機能の関係を切り裂きかつモジュレートする化合物のよりすぐれた設計および同定を可能とすることができる。それらのそれぞれの相互作用ドメインと相互作用するそれらの生物学的機能を喪失した誘導体またはアナローグは、抗体の発生において追加の実用性（例えば、優性の負としての機能に加えて）を見出ことができる。このようなアナローグまたは誘導体は、例えば、本発明の相互作用ドメインに対する抗体を発生させるために使用することができる。これらの抗体は検出または精製の目的に使用することができる。さらに、これらの抗体はまた競合または非競合インヒビターとして作用することができ、そして本発明のターゲットの活性のモジュレーターであることが見出された。
【００９５】
宿主細胞またはインジケーター細胞は、外因的または異種DNA（例えば、DNA構築物）がこの細胞の中に導入されたとき、このようなDNAにより「トランスフェクト」されている。トランスフェクトするDNAは、細胞のゲノムを構成する染色体DNAの中に統合（共有結合）するか、あるいはしないことができる。例えば、原核細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞において、トランスフェクトするDNAはエピソーム因子、例えば、プラスミド上に維持されることができる。トランスフェクションおよび形質転換法はこの分野においてよく知られている（Sambrook他、1989、前掲；Ausubel他、1994、前掲；Yeat  Genetic  Course、A  Laboratory  Manual、CSH  Press、1987）。
【００９６】
一般に、抗体（モノクローナル抗体およびハイブリドーマを包含する）製造する技術および抗体を使用して抗原を検出する技術は、この分野においてよく知られている（Campbell、1984、″Monoclonal  Antbody  Technology：Laboratory  Techniques  in  Biochemistry  and  Molecular  Biology″、Elsevier  Science  Publishers、オランダ国アムステルダム、およびHarlow他、1988、Antibody−A  Laboratory  Manual、CSH  Laboratories）。本発明は、また、それらのそれぞれの相互作用ドメインを阻害または中和しおよび／またはそれらに対して特異的である、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、またはそれらのヒト化バージョン、キメラ抗体およびその他を提供する。
【００９７】
明細書および添付された特許請求の範囲から、治療剤という用語は、少なくとも2つのこのような治療剤の組合わせをまた包含するように、広い意味において解釈すべきである。
1つの特定の態様において、本発明は、有効量の本発明の抗真菌剤を投与することを含む、真菌感染を治療する方法を提供する。
ヒトに対する投与のために、処方する医学的プロフェッショナルは所定の患者についての適当な形態および投薬を究極的に決定し、そしてこれは療法上の養生法（例えば、DNA構築物、タンパク質、分子）、患者の応答および症状ならびに疾患の重症度に従い変化することを期待することができる。
【００９８】
本発明の範囲内に入る組成物は、所望の治療効果を達成すると同時に悪い副作用を回避する量で活性因子（例えば、タンパク質、核酸、または分子）を含有するすべきである。典型的には、本発明による核酸は哺乳動物（例えば、ヒト）に治療すべき哺乳動物の体重1kg当たり0.005〜1mg／日の範囲の投与量で投与することができる。活性因子の薬学上許容される調製物は本発明の範囲内であり、この分野においてよく知られている（Remington's  Pharmaceutical  Sciences、第16版、Mack編）。ポリペプチド、アンタゴニスト、アゴニストおよびその他を投与するために、悪い副作用を回避するように、投与量を選択すべきである。投与量は普通の因子、例えば、疾患の程度および患者からの種々のパラメーターに従い臨床医により適合される。典型的には、0.001〜50mg／kg／日を哺乳動物に投与する。
【００９９】
本発明を一般的に記載したが、本発明の好ましい態様を例示する添付図面を次に参照する。
添付図面を参照する下記の好ましい態様の非限定的説明を読むと、本発明の他の目的、利点および特徴はいっそう明らかとなるであろう。これらの説明は例示であり、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【０１００】
好ましい態様の説明
3つのカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）遺伝子が同定され、それらの遺伝子産物はサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）からの必須遺伝子KRE5、CDC24、およびALR1によりコードされるものに対して相同性であった。これらの遺伝子は、これらの遺伝子は、それぞれ、細胞壁の生合成、極性化成長、および2価のカチオン輸送の必須細胞機能に参加する。カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）におけるこれらの遺伝子の崩壊は、この病原性酵母におけるそれらの必須役割を証明する。データベースの検索により、ケノルハブジチス・エレガンス（Caenorhabditis  elegans）、マウスおよびホモ・サピエンス（H.  sapiens）のゲノム中の明瞭な相同的対応物を同定することができず、新規な抗真菌ターゲットとしてのこれらの遺伝子の実用性を支持する。
【０１０１】
カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）の入手可能なフラグメントを使用するCaKRE5、CaCDC24およびCaALR1の全長のクローンを単離し、カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）株SC5314に由来するゲノムDNAをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅した。PCR生成物を放射能標識化し、コロニーハイブリダイゼーションによりカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）ゲノムライブラリーをプロービングするために使用した。DNA配列決定により、CaKRE5、CaCDC24およびCaALR1の完全なオープンリーディングフレームが明らかになった。CaKRE5、CaCDC24およびCaALR1はそれらのサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）対応物、すなわち、KRE5、CDC24、およびALR1に対して統計学的に有意な相同性を共有し、KRE5、CDC24、およびALR1のすべては潜在的抗真菌薬剤ターゲットについて期待される、いくつかの基準を満足した。
【０１０２】
CaKRE5、CaCDC24およびCaALR1の崩壊を実行した。崩壊プラスミドを消化し、カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）株CA14の中に形質転換した。サザンブロット分析により、前述の遺伝子はカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）において必須であることが確証された。
CaKRE5、CaCDC24およびCaALR1を抗真菌アッセイにおいて使用し、このアッセイにより、新規な抗真菌化合物についてスクリーニングする可能性が確証された。
【０１０３】
KRE5
カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）KRE5遺伝子は、潜在的抗真菌薬剤ターゲットについて期待される、いくつかの基準を満足する。サッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）において、KRE5の欠失は致死的表現型（2）を与える。KRE5欠失細胞は1つの特定の株のバックグラウンドにおいて生存可能であることが知られているが、それらは極めてゆっくり成長し、そして実験室条件下にkre5null細胞を増殖させるために自発的遺伝子外サプレッサーを必要とする。遺伝的解析は、KRE5が多数の追加のKRE遺伝子（例えば、KRE9）と一緒に、β−（1，6）−グルカンのin  vivoに参加することを示唆する。
【０１０４】
β−（1，6）−グルカンは他の細胞表面の構成成分、すなわち、β−（1，3）−グルカン、マンナン、およびキチンと共有結合または「接着」して最終の壁構造の中に入り、そしてサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）およびカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）の両方における生活能力のために必須であることが示された（1、2およびその中の参考文献）。重要なことには、β−（1，6）−グルカンは多数の真菌クラス、例えば、他の酵母および糸状子嚢菌網（Ascomycetes）、バシディオミセテス（Basidiomycetes）、接合菌網（Zygomycetes）および卵菌網（Oomycetes）の中に存在することが証明され、β−（1，6）−グルカン生合成経路において機能する遺伝子産物が広いスペクトルの薬物ターゲットとして働く可能性を強調する。
【０１０５】
そのうえ、実験的努力かかわらず高等真核生物においてβ−（1，6）−グルカンを検出することができず、CaKre5pに対して作用することが同定された阻害化合物は哺乳動物、特にヒトに対して最小の毒性を示すようであることを示唆する。今回、CaKRE5はカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）において必須であることが示され、KRE5がまたサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）において必須であることが知られると、進化的に有意に発散した2つの酵母は、KRE5が広範な種類の真菌、例えば、動物および植物を感染する真菌において抗真菌薬剤をスクリーニングしかつ診断するターゲットであることを示唆する。
【０１０６】
β−（1，6）−グルカンのin  vivo生合成における役割と一致して、このポリマーのレベルは同質遺伝子の野生型株に比較してkre5−1において実質的に減少し、いくつかの独立に抑制されたkre5ヌル株においてまったく存在しない（2）。さらに、kre5突然変異体はβ−（1，6）−グルカンアセンブリーに関係する他の遺伝子であるKRE6に対して多数の遺伝的相互作用を示す。
【０１０７】
β−（1，6）−グルカンの合成の生化学的はまだよく理解されていないが、最近の研究において、細胞壁のマンノプロテインはβ−（1，6）結合を通して広範にグルコシル化されること、そしてこの修飾は細胞外マトリックス内のそれらの定着において重要な役割を演ずることが証明された。Kre5pはこのプロセスにおいてCwp1pとしてにおいてきわめて重要な役割を演ずる。Cwp1pは、β−（1，6）−グルカン付加を通して高度にグルコシル化されることが証明され、kre5null細胞の細胞壁画分において検出されず、その代わりに培地の中に分泌される、豊富な細胞壁タンパク質である。
【０１０８】
予測されたKRE5遺伝子産物は、β−（1，6）−グルカン産生に関する可能な生化学的活性について制限された洞察のみを提供する。KRE5は大きい分泌タンパク質をコードし、内形質網状質への局在化のためのN末端のシグナルペプチドおよびC末端のHDEL保持シグナルの両方を含有する。Kre5pはUDP−グルコース：糖タンパク質グルコシルトランスフェラーゼ（UGGT）、すなわち、タンパク質のフォルディングの「品質制御」に参加する酵素クラス、に対して制限されているが、有意な相同性を有する。このようなUGGTは、ミスフォルディングされたタンパク質上に存在するN連鎖GlcNac2Man9コアオリゴ糖構造物の再グルコシル化により、ミスフォルディングされたERタンパク質を「標識（tag）」する機能をする。
【０１０９】
このようにして標識化されたタンパク質は、ミスフォルディングされたタンパク質の再フォルディングを促進するERシャペロニン、カルネキシンの基質である。しかしながら、グルコシル化依存的タンパク質フォルディングおよびβ−（1，6）−グルカン生合成におけるKre5pの相対的掛かり合いを扱う遺伝的分析において、Kre5pの必須機能はタンパク質フォルディングに無関係であり、その代わりにβ−（1，6）−グルカンポリマー生合成におけるその役割に関係することが証明された（2）。生化学的に証明されていないが、グルコシルトランスフェラーゼに対するKre5pの相同性はこのポリマーの初期の生合成におけるその役割を反映しているようである。
【０１１０】
ALR1
カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）遺伝子の産物CaALR1は、また、適当な抗真菌薬剤ターゲットのいくつかの基準の特性を満足する。サッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）において、ALR1は細胞の生活能力のために必須であるが、この必須性は生理学的に無関係のレベルの補助的Mg+2を含有する成長条件下に抑制される。ALR1は922アミノ酸のタンパク質をコードする。このタンパク質は、高度に帯電したN末端ドメインおよび2つの疎水性C末端領域を含有して、原形質膜にタンパク質を定着させる膜スパニングDNA分子として働くことが予測される。
【０１１１】
このような局在化は直接証明されるべきであるが、細胞表面への沈着は生物学的利用能および耐性の両方の問題によりAlr1pを魅力的薬剤ターゲットとする。Alr1pは2つの追加のサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）タンパク質、であるAlr2p（80％の同一性）およびYk1064p（34％の同一性）に対して実質的な相同性を共有する。Alr1pおよびAlr2pの両方はCorAに対して制限された類似性を共有する。ネズミチフス菌（Salmonella  typhimurium）／ペリプラスミック膜は2価のカチオンの輸送に関係した。哺乳網のデータベースにおける広範な相同性の検索にかかわらず、ALR1に対する哺乳動物の相同体は検出されなかった（データは示されていない）。
【０１１２】
過剰発現されたときAl+3に対する増加した耐性を与える遺伝子についてスクリーニングするときALR1は同定されたが、生化学的分析はMg+2および可能ならば他の2価のカチオンについての吸収系におけるALR1の役割を支持する。Mg+2は細菌および酵母の成長のための必須要件である。放射能標識化Co+2、すなわち、吸収アッセイのためのMg+2のアナローグ、の吸収はALR1活性と相関する。
【０１１３】
CDC24
第3の潜在的抗真菌薬剤ターゲットは、カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）遺伝子産物CDC24である。CDC24はサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）およびシゾサッカロマイセス・ポンベ（S.  pombe）の両方における生活能力のために必須である（5）。CDC24は、アクチン細胞骨格の極性化に関係するCdc42p、Rac／Rho−型GTPアーゼに対するGDP−GTPヌクレオチド交換体因子（GEF）をコードすることが生化学的に証明された。非許容性温度にシフトしたCDC24の条件アレレはアクチンの極性化分布を欠如し、結局、細胞壁物質の極性化沈着がその中で崩壊される、大きい、球形、非発芽細胞を形成する。
【０１１４】
究極的に、cdc24突然変異体は制限的温度において溶解する。CDC42のCDC24依存的活性化は、また、交配間のフェロモン応答シグナルトランスダクション経路の活性化に要求され、そして偽菌糸の発生を促進する条件下にこの経路の活性化に参加するようである。なぜなら、CDC42の下流因子STE20が菌糸の形成に要求されるからである。こうして、CDC24は細胞壁アセンブリーおよび酵母−菌糸の二形性トランジション調節し、主要な細胞プロセスおよびターゲットの両方は抗真菌薬剤スクリーンにおいて活性的に遂行される。
【０１１５】
Cdc24pは極性化成長部位において濃縮する細胞皮質に局在化し、そして多数のタンパク質、例えば、Cdc42p、Bem1p、およびそれぞれSTE4およびSTE18によりコードされるヘテロダイマーGタンパク質のβおよびγサブユニットと物理的に相互作用する。Cdc24pはそのシゾサッカロマイセス・ポンベ（S.  pombe）対応物Scd1pに対して24％の全体の同一性を共有する。同様な相同性は哺乳動物のデータベースのタンパク質検索において見出されてきていないが、Cdc24pは事実ヒト交換タンパク質のドメインに対して制限された相同性を有し、そしていくつかの哺乳動物のタンパク質クラスに対して普通の、プレックストリン相同性ドメインを含有する。
【０１１６】
真菌以外において制限された相同性を有するCdc24pと対照的に、Cdc42pは哺乳動物のタンパク質に対して80〜85％の同一性を共有する。CDC24の真菌特異的特性は芽形成、偽菌糸の成長、および交配間の保護の遺伝物質と同様に特徴的な真菌プロセスにおけるその役割のためであることがあるが、これに対してCDC42はすべての真核生物に対して普通の高度に保存された機能（すなわち、アクチンポリマーおよびシグナルトランスダクション）を実行する。
【０１１７】
CaKRE5、CaCDC24およびCaALR1の単離
CaKRE5、CaCDC24およびCaALR1の全長のクローンを単離するために、カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）DNA配列の公衆に入手可能なフラグメントに従いオリゴヌクレオチドを設計した。オリゴヌクレオチドの対CAKRE5.1／CAKRE5.2、CaCDC24.1／CaCDC24.2、およびCaALR1.1／CaALR1.2を使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）SC5314に由来するゲノムDNAを増幅して、それぞれ、574、299、および379bpの生成物を産生した。これらのPCR生成物を32P放射能標識化し、YEp352をベースとするカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）のゲノムライブラリーをコロニーハイブリダイゼーションによりプロービングするために使用した。
【０１１８】
配列の情報
推定上のCaKRE5およびCaALR1クローンを表す2つの独立の単離物のDNA配列決定により、それらのサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）対応物に対して統計的に有意な相同性を共有する、完全なオープンリーディングフレーム（orf）が明らかにされた（第1図および第2図）。CaCDC24の多数の単離物のDNA配列決定により、CDC24に対して強い同一性を含有するが、その3'末端において
トランケートされていることが予測されるorfが明らかにされた。
【０１１９】
このカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）ゲノムライブラリーからCaCDC24のC末端のエンコーディングフラグメントの増幅を可能とする、その大部分の3'配列から設計された1つのオリゴヌクレオチドと、YEp352ポリリンカーにアニールする第2オリゴヌクレオチドを使用してPCR増幅により、CaCDC24の3'末端を単離した。1.0kbのPCR生成物のサブクローニングおよびDNA配列決定はCaCDC24のオープンリーディングフレームを完結し、その遺伝子産物がCdc24pおよびScd1pの両方に対して強い相同性を共有することを明らかにする（第3図）。
【０１２０】
CaKRE5
CaKRE5およびKRE5は、それらの予測されたタンパク質配列を通じて有意な相同性を共有する（22％の同一性、42％の類似性；第1図参照）、同様なサイズのタンパク質（1447vs1365アミノ酸；166vs156kDa）をコードすることが予測されことが、配列の分析により明らかである。そのうえ、KRE5に似て、CaKRE5は分泌経路の中へのトランスロケーションに要求されるアミノ末端のシグナルペプチドと、および小胞体（ER）内の可溶性分泌タンパク質の保持を促進するC末端のHDEL配列とを有することが予測される。
【０１２１】
CaKre5pはKre5pに対してよりもそのC末端のUGGT相同性ドメインを通じてシゾサッカロマイセス・ポンベ（S.  pombe）および後生動物のUGGTタンパク質に対していっそう相同性であるが、CaKre5pおよびKre5pはそれらの残りの配列にわたって互いにいっそう関係する（ほぼ1100アミノ酸）。2つのタンパク質間のこの独特の相同性ならびに同様なヌル表現型（下文参照）は、CaKRE5がカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）において同様にKRE5対応物として働くことを示唆する。
【０１２２】
CaALR1
CaALR1はALR1（1.0e−180）およびALR2（1.0e−179；第2図参照）の両方に対して強い同一性を共有する922アミノ酸残基のタンパク質をコードする。これらのタンパク質と同様に、CaALR1は2つの膜貫通定着ドメインとして同様に機能するC末端の疎水性領域を有する。しかしながら、CaALR1はALR1およびALR2に対して共通の、2つの高度に相同性の領域に対して、制限された相同性のみを共有する；CaALR1のN末端の250アミノ酸およびその最後の50アミノ酸のC末端において、疎水性ドメインはALR1またはALR2に対して強い類似性をもたない。
【０１２３】
さらに、CaALR1はALR1またはALR2のいずれにおいても見出されないCorA相同性領域内に2つの独特の配列エクステンション（一方は38アミノ酸長さ、他方は16アミノ酸長さ）を有する。タンパク質データベースの検索により、CaALR1（2.7e−107）に対して強い相同性を共有するシゾサッカロマイセス・ポンベ（S.  pombe）の仮説のタンパク質は同定されるが、高等真核生物のタンパク質に対する類似性は検出されなかった。
【０１２４】
CaCDC24
CaCDC24遺伝子産物の配列分析により、Cdc24p（1e−93）およびそれぞれサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）およびシゾサッカロマイセス・ポンベ（S.  pombe）からのScd1p（2e−61；第3図参照）両方に対する広範な相同性がそれらの全体のオープンリーディングフレームを通じて明らかにされる。CaCdc24p（およびCdc24pおよびScd1pの両方）と多数の後生動物のタンパク質（5e−18まで）との間に制限された類似性が存在するが、各場合においてその相同性はアミノ酸残基250〜500をスパンすることが予測されるヌクレオチド交換ドメインに制限される。後生動物のデータベースの広範な分析により、CaCdc24pのN末端（アミノ酸1〜250）およびC末端（アミノ酸500〜844）領域に対する有意な相同性を同定することができず、CaCDC24遺伝子ファミリーがもっぱら真菌界内において保存されることを示唆する。
【０１２５】
CaKRE5、CaALR1およびCaCDC24の崩壊
実験の戦略
FonziおよびIrwinにより構築されたhisG−CaURA3−hisG″URA−ブラスター″カセットおよび標準分子生物学的技術を使用して、CaKRE5の崩壊を実行した（1およびその中の参考文献）。ライブラリープラスミド単離物pCaKRE5から780bpのBamHI−BglII  DNAフラグメントを欠失させ、pCUB−6からのhisG−CaURA3−hisGモジュールを含有する4.0kbのBamHI−BglII  DNAフラグメントでそれを置換することによって、cakre5：：hisG−CaURA3−hisG崩壊プラスミドを構築した。UGGT相同性ドメインのほぼ50％を含む、アミノ酸971−1231をコードするDNA配列から、このCaKRE5崩壊プラスミドを欠失させる。次いで、形質転換前に、このCaKRE5崩壊プラスミドをSphIで消化した。
【０１２６】
まずYEp352ライブラリー単離物pCaALR1からの7.0kpのCaALR1  BamHI−SalIフラグメントをPBSKII＋の中にサブクローニングすることによって、CaALR1崩壊アレレを構築した。次いで、841bpのCaALR1  BamHI−SalIフラグメントを、PBSK−hisG−CaURA3−hisGからHindIIおよびBamHIで消化した4.0kbのhisG−CaURA3−hisG  DNAフラグメントで置換した。このCaALR1崩壊アレレはアミノ酸20〜299をコードするDNA配列を欠如し、形質転換前に、このアレレをBamHIおよびSalIで消化した。
【０１２７】
まずYEp352ライブラリー単離物pCaCDC24から0.9kbのKpnIフラグメントを欠失させて、hisG−CaURA3−hisGモジュールの挿入を妨害するBamHIおよびBglII制限部位を含有するCaCDC24の上流配列を除去することによって、CaCDC24挿入アレレを構築した。次いで、pCUB−6からの4.0kbのBamHI−BglII  hisG−CaURA3−hisGフラグメントをBglII部位の中に結合した。形質転換前に、CaCDC24内のアミノ酸位置306に挿入を有する生ずるプラスミドをKpnIおよびSalIで消化した。
【０１２８】
CaKRE5、CaALR1およびCaCDC24を前述したようにで消化しし、酢酸リチウム法を使用してカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）株CAI-4の中に形質転換した。形質転換体をYNB＋Casaプレート上でUra＋プロトトロフとして選択した。ヘテロ接合性崩壊物をPCRにより同定し（データは示されていない）、サザンブロットにより確認し（下文参照）、そして5−FOA耐性について選択することによって第2ラウンドの遺伝子崩壊のために調製した。各遺伝子のヌル表現型を評価するために、ヘテロ接合性CaKRE5／cakre5、CaALR1／caalr1、およびCaCDC24／cacdc24ura3−株を使用して第2ラウンドの形質転換を前述したように実行した。
【０１２９】
下記のプローブを使用するサザンブロット分析により、ヘテロ接合性株からのCaKRE5、CaALR1およびCaCDC24の中へのhisG−CaURA3−hisGモジュールの正しい統合を確認した：
（1a）  CaKRE5のN末端コーディング配列を含有するpCaKRE5から消化した1.25kbのXbaI−KpnIフラグメント；
（1b）  CaALR1のアミノ酸404および3'フランキング配列からのコーディング配列を含有する1.7kbのPCR生成物；
（1c）  アミノ酸154〜430からのCaCDC24コーディング配列を含有する778bpのPCR生成物；
（2）  全CaURA3コーディング領域を含有する783bpのPCR生成物；
（3）  全ネズミチフス菌（Salmonella  typhimurium）hisG遺伝子を含む898bpのPCR生成物。CaKRE5崩壊株からのゲノムDNAをHindIIIで消化し、そしてEcoRIを使用してCaALR1およびCaCDC24崩壊株からゲノムDNAを消化した。
【０１３０】
結果
第1ラウンドの形質転換後、cakre5：：hisG−CaURA3−hisG崩壊フラグメントは野生型遺伝子座（第4B図）の中に正確に統合されることがサザンブロット分析により明らかにされた。5.0kbの野生型バンドおよびCaKRE5崩壊アレレの9.0kbの診断バンドの両方はCaKRE5プローブで検出された（第4B図）。また、9.0kbのバンドはhisGおよびCaURA3プローブの両方で検出され、第1CaKRE5コピーの崩壊が確証された。5−FOA上の成長によるCaURA3遺伝子の切除の成功は下記により確認された：1）CaKRE5またはhisGプローブでプロービングしたとき、9.0kbから6.0kbへのCaKRE5崩壊フラグメントのサイズの予測されたシフト；および2）CaURA3プローブがこのフラグメントを認識することができないこと、そして生ずる株はura3−プロトトロフィーに復帰していること。
【０１３１】
CaKRE5が必須であるかどうかを決定するために、2つの独立に誘導されたCaKRE5／cakre5：：hisG、ura3−／ura3−ヘテロ接合性株において、形質転換を反復した。崩壊した領域を境界づけるBamHIおよびBglII部位をスパンする2.5kbの野生型フラグメントを増幅する、オリゴヌクレオチドを使用するPCRにより、合計36のUra＋コロニー（3日の成長後の24の小さいおよび12大きいコロニー）を分析した。すべてのコロニーはこの2.5kbの野生型フラグメントを含有するが、2.8kbのcakre5：：hisGアレレを欠如し、崩壊した遺伝子座に統合するcakre5：：hisG−CaURA3−hisGモジュールと一致した。
【０１３２】
3つの異なるプローブを使用するサザンブロット分析により、4つのこのようなUra＋形質転換体がボナファイドCaKRE5／cakre5：：hisG−CaURA3−hisGヘテロ接合体として独立に確証された。この遺伝子の両方のコピーの崩壊が必須でなかった場合、回収された崩壊物の50％はCaKRE5遺伝子座の中に統合され、50％の相同性および50％のヘテロ接合性の崩壊物を与えることが期待されであろう。これは、例えば、CaALR1の第2野生型アレレを崩壊させる場合である。事実、CaALR1がこの崩壊方法によりカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）において必須でないことが示された。
【０１３３】
なぜなら、この第2ラウンドの形質転換から、等しい量のヘテロ接合性株およびホモ接合性株が生じたからである（データは示されていない）。しかしながら、この実験において分析した36のUra＋形質転換体の中にホモ接合性CaKRE5崩壊形質転換体が存在しないことが検出され、CaKRE5は必須のカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）遺伝子であることが証明される。さらに、それはCaKRE5およびその遺伝子産物をこの病原体における薬物発見のための療法上のターゲットとして確認する。
【０１３４】
CaALR1
CaALR1の第1形質転換体のサザンブロット分析において、5.7kbの適当なサイズの崩壊バンド、およびCaALR1プローブにより検出された＞9.0kbであると予測される野生型フラグメントにより判定して、caalr1：：hisG−CaURA3−hisG崩壊モジュールの正しい統合が確証された。また、この5.7kbのバンドがhisGおよびCaURA3の両方のプローブで検出され、CaALR1の1つのコピーの崩壊が確証された。サザンブロッティングにおいて、CaALR1プローブはCaURA3の非存在のために期待された5.0kbのフラグメントを検出したので、5−FOA上の成長によりCaURA3遺伝子の切除が機能された。そのうえ、この5kbのcaalr：：hisGバンドがまたhisGプローブで検出されたが、CaURA3プローブで検出されなかった（第4D図）。
【０１３５】
CaKRE5について前述したように、CaALR1ヌル表現型の決定を実行した。しかしながら、サッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）におけるALR1ヌル突然変異の生活不能性が培地にMgCl2を補充させることによって部分的に抑制することができることが報告されているので、500mMのMgCl2を含有する培地上でならびに標準的Casaプレート上でUra＋コロニーを選択することによって、第2形質転換を実施した。種々のサイズの35＋コロニー（それらのうちの22はMgCl2補充プレートから単離された）をPCRにより分析して、caalr1：：hisG−CaURA3−hisGの統合が確証された。
【０１３６】
インサートをスパンしかつcaalr：：hisGアレレのより大きい1.75kbの産物と反対に野生型の1.6kbの産物を産生するオリゴヌクレオチドを使用するPCRにより、これらの35の形質転換体の各々からの第2アレレは野生型であることが決定された。3つの異なるプローブを使用するサザンブロット分析により、4つのこのようなUra＋形質転換体がCaALR1／caalr1：：hisG−CaURA3−hisGヘテロ接合体として独立に確証された。分析した35のUra＋コロニー中でホモ接合性CaALR1崩壊形質転換体を同定することができず、これにより、CaALR1は必須のカンジダ・アルビカンス（C. albicans）遺伝子であることが実験的に証明され、そしてCaALR1およびその遺伝子産物がこの病原体に対する薬物の発見のための療法上のターゲットとして確認される。
【０１３７】
CaCDC24
CaCDC24遺伝子を使用するCaCDC24の第1ラウンドの形質転換体のサザンブロット分析により、挿入アレレを診断する、2.55kbおよび3.7kbの両方のフラグメントが2.2kbの野生型CaCDC24フラグメントに加えて検出されたので、cacdc24：：hisG−CaURA3−hisG挿入フラグメントの正しい統合が確証された（第4F図）。そのうえ、CaURA3およびhisGプローブを使用して、2.55kbおよび3.7kbの両方のフラグメントが検出された。生ずるヘテロ接合体からのCaURA3の切除が下記により確認された：CaCDC24またはhisGプローブを使用して5−FOA耐性コロニーに対してユニークな単一の3.3kbのフラグメントを検出する；そして2）CaURA3プローブを使用してこのバンドを検出することができない（第4F図）。
【０１３８】
前述したように、前述のCaCDC24ヘテロ接合体を使用して第2ラウンドの形質転換を実行した。28＋の種々のサイズのコロニーをPCRにより分析して、cacdc24：：hisG−CaURA3−hisGの統合が確証された。インサートをスパンしかつcaalr：：hisGアレレの1.6kbの産物よりむしろ野生型の0.5kbの産物を産生するオリゴヌクレオチドを使用するPCRにより、これらの28の形質転換体の各々からの第2アレレは野生型であることが決定された。
【０１３９】
3つの異なるプローブを使用するサザンブロット分析により、4つのこのようなUra＋形質転換体がCaCDC24／cacdc24：：hisG−CaURA3−hisGヘテロ接合体として独立に確証された。分析した28のUra＋コロニー中でホモ接合性CaCDC24崩壊形質転換体を同定することず、これにより、CaCDC24は必須のカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）遺伝子り、したがってこの病原体に対する薬物発見に適当な第3の確認された薬物ターゲットであることが再び証明される。
下記の非限定的実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
【０１４０】
実施例１．特異的抗真菌剤をin vivoスクリーニングする方法
今回CaKRE5、CaALR1およびCaCDC24がカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）における薬剤ターゲットとして確認されたので、それぞれサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）kre5、air1およびcdc24突然変異体におけるCaKRE5、CaALR1またはCaCDC24の異種発現は、サッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）遺伝子をカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）対応物の遺伝子との置換を可能とし、こうしてサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）においてこのボナファイド薬剤ターゲットに対する特異的インヒビターについてのスクリーニングを可能とし、ここで生物の追加の実験的取り扱いやすさはスクリーンの開発における追加の複雑化を可能とする。
【０１４１】
例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）におけるCaKre5pをブロックする薬物はK1キラートキシン耐性を与え、そしてこのような化合物についてスクリーニングするために、この表現型を使用することができる。特定の態様において、CaKRE5はそのプロモーター配列を任意の強い構成的サッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）プロモーター（例えば、GAL10、ACT1、ADH1）で置換することによってサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）において機能するように修飾することができる。
【０１４２】
カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）は、標準的ロイシン−CTGコドンをセリンとして翻訳する、変更した遺伝暗号を利用するので、サッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）において発現されるとき、すべての4つのコドン（または任意のそれらの機能的サブセット）は部位特異的突然変異誘発によりセリン残基をコードするように修飾することができる。サッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）におけるCaKre5p活性を障害する化合物は、K1キラートキシンアッセイによりスクリーニングすることができる。同様に、異種的に発現されたCaCDC24を不活性化し、結局2つのハイブリッドアッセイにおいてRsr1pまたはCdc42pとのそのアソシエーションを崩壊する。
【０１４３】
あるいは、CaCDC24依存的方法で偽菌糸の形成を崩壊することができる化合物についてのスクリーンにおいて、CaCDC24の機能をモニターすることができる。CaALR1の機能をベースとする全細胞薬物のスクリーニングアッセイが同様にもくろむことができる。補充のMg+2により抑制されたサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）air1における57CO2＋のCaALR1依存的流入をモニターして、2価のカチオンの輸入を特異的にブロックする化合物を同定することができる。
【０１４４】
実施例２．特異的抗真菌剤をin vitroスクリーニングする方法
1.  β−（1，6）−グルカンを合成するin vitroアッセイの使用
このようなアッセイにおいて、UDP−グルコースから、β−（1，6）−グルカン抗体で免疫沈降または固定化することができる産物の中への標識化グルコースの組込みを測定する。CaKre5pに対するその依存性、およびβ−（1，6）−グルカナーゼによるその消化を示すことによって、この合成の特異性を確立することができる。
このin vitro合成反応をブロックする薬物は、β−（1，6）−グルカン合成をブロックし、そして抗真菌薬剤の候補であり、あるものはKre5pをブロックし、他のものはこのポリマーの合成における他の工程を阻害することができる。
【０１４５】
2.  CaKre5pについての特異的in vitroアッセイの使用
CaKre5pはUDP−グルコース糖タンパク質グルコシルトランスフェラーゼに対してアミノ酸配列の類似性を有する（4）。CaKre5pタンパク質は異種的に発現されたおよび／またはカンジダ・アルビカンス（Candida  albicans）から精製することができ、そして通常KRE5野生型バックグラウンドの中にβ−（1，6）−グルカン連鎖を含有するが、kre5欠失抽出物の中にそれを含有しないことが知られている、精製されたGPI定着細胞壁タンパク質を添加することによって、in vitroアッセイを案出した。
【０１４６】
第2部位の突然変異または条件kre5株抑制される、入手可能なサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）kre5ヌル抽出物から、このようなアクセプター基質を得ることができる（例えば、調節可能なプロモーターまたは温度感受性突然変異の制御下に）。kre5ヌル抽出物から精製されたアクセプター基質の中へのUDP−グルコースの放射能標識化組込みとして、CaKre5p依存的タンパク質グルコシル化を測定する。あるいは、固定化されたCaKre5pに結合する化合物についてスクリーニングすることができる。
【０１４７】
例えば、CaKre5pと放射能標識化UDP−グルコースとの間の結合を崩壊する化合物を検出する、高い処理量のフォーマットで、シンチレーション近接アッセイ（SPA）を開発することができる。あるいは、CaKre5pに対して標識化抗体を使用してSPAをベースとするCaKre5pin vitroスクリーンを用い、CaKre5p：抗CaKre5p抗体依存的蛍光を崩壊することができる化合物についてスクリーニングすることができる。このようなスクリーンにおいて同定された化合物は、新規な抗真菌療法の開発において先導化合物として働く。
【０１４８】
CaCDC24は、Cdc42pをGTP結合状態に変換するために必要なGDP−GTPヌクレオチド交換因子（GEF）をコードすることが実験的証明された。Cdc42pのCdc24p依存的活性化を測定するin vitroアッセイを使用して、Cdc24pのインヒビターをスクリーニングすることができる。Cdc24pにより結合されたGDPに対してGTPの百分率を直接測定することによって、これを達成することができる。あるいは、Ste20pキナーゼ活性のCdc42p−GTP依存的活性化を測定することによって、Cdc24pの機能を間接的に決定することができる。
【０１４９】
実施例３．真菌感染のPCRをベースとする診断におけるCaKRE5、CaALR1およびCaCDC24の使用
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）をベースとするアッセイは、真菌感染の診断において伝統的血清学的方法を越えた多数の利点を提供する。疫学、真菌耐性、信頼性、感度、速度、および株の同定の問題は入手可能なプライマーおよびプローブにより制限される。CaKRE5、CaALR1およびCaCDC24の遺伝配列は潜在的臨床的使用の新規なプライマーの設計を可能とする。さらに、CaAlr1pは原形質膜に局在化し、周辺質空間／細胞壁の中に延びると考えられるので、この細胞外ドメインは血清学的抗原として作用することができ、この抗原に対して抗体を発生させ、血清学的診断アッセイにおいて使用することができる。
【０１５０】
実施例４．Kre5p、Alr1p、またはCdc24p不活性化を測定するプラスミドをベースとするリポーター
サッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）におけるKre5p、Alr1p、およびCdc24p突然変異体の転写的プロファイリングは、KRE5、ALR1またはCDC24の不活性化または過剰産生の条件下に転写的に誘導または特異的に抑制される遺伝子を同定する。KRE5、ALR1またはCDC24の活性の喪失に対して応答性の遺伝子からのプロモーター因子の同定は、これらのターゲットを特異的に不活性化する化合物を同定するスクリーニングアッセイにおいて実際的実用性を提供する。
【０１５１】
例えば、その発現がこのようなプロモーターにより誘導または抑制されるキメラリポーター遺伝子（例えば、lacZ、GFP）はKre5pの活性を反映し、化合物のライブラリーの高い処理量のスクリーニングに使用できるであろう。さらに、このような調節された発現を示すプロモーターのグループは、ALR1、CDC24、またはKRE5遺伝子の阻害または過剰産生のための特異的フィンガープリントまたは転写プロファイルの構築を可能とする。これにより、これらの遺伝子産物を阻害する化合物をスクリーニングする特異的ツールを与える化合物のライブラリーの高い処理量のスクリーニングに使用できるリポーターの組の構築を可能とする。
【０１５２】
結論
本発明の目的は、新しい臨床的に有用な抗真菌化合物の発見に導く、特異的酵素および細胞のアッセイにおいて使用できる、新規な薬剤ターゲットの同定および引き続く確認を提供することである。本発明の以前において、パン酵母、サッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）においてKRE5、ALR1およびCDC24が以前に同定されたが、オーソロガス遺伝子がヒト病原体カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）において同定されるかどうか、またはそれらが存在し、これらの遺伝子が同一または同様な機能を実行するかどうかは未知であった。
【０１５３】
こうしてカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）からのCaKRE5、CaALR1およびCaCDC24遺伝子が同定され、そして直接的に病原体における遺伝子の崩壊によりそれらの必須の特質を実験的に証明することによって、新規な抗真菌薬剤ターゲットとしてそれらの実用性は確認された。これらの遺伝子産物の正確な役割は決定されていないが、それらの細胞の機能の現在の理解はin vitroおよびin  vivoの両方の抗真菌薬剤のスクリーニングアッセイの開発を事実可能とする。
【０１５４】
さらに、臨床的に重要なことには、ゲノムデータベースの検索により、後生動物におけるこれらの遺伝子に対して有意な相同性を検出することができず、これらの真菌特異的薬剤ターゲットを不活性化する化合物についてのスクリーニングは哺乳動物に対して、好ましくはヒトに対して毒性を表示することは少ないことが示唆される。KRE5およびCDC24はサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）においてユニーク遺伝子であり、そしてカンジダ・アルビカンス（C.  albicans）における遺伝子ファミリーに無関係に、それらは必須機能を保持する。
【０１５５】
ALR1p1はサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）における3メンバーの遺伝子ファミリーの一部分であり、そしてALR2pに対する配列の類似性は同定された（Standard  Sequencing  Project）が、カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）におけるCaALR1pの必須の役割およびそれらの予測された細胞外の位置は、細胞の中に入る必要がない新規な抗真菌化合物についてスクリーニングし、化合物デリバリーおよび薬物耐性の問題を回避する可能性を提供する。
【０１５６】
こうして、本発明は、カンジダ・アルビカンス（Candida  albicans）において必須なものとしてかつ真菌特異的な確認された薬物の抗真菌ターゲットとしてのCaKRE5、CaALR1およびCaCDC24の同定を提供する。また、本発明は、一般にミコタ（Mycota）に対する、より特に病原性酵母、例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida  albicans）に対する抗真菌薬剤についてスクリーニングするために、これらの確認されたターゲットを使用する手段を提供する。こうして、本発明は、真菌病原体に対して特異的に向けられた薬物についてスクリーニングするターゲットとして、病原性真菌種におけるこれらの遺伝子の使用を明らかでない方法で拡張する。
本発明を好ましい態様により前述したが、添付された特許請求の範囲に規定された本発明の精神および範囲から逸脱しないで変更が可能である。
【０１５７】
参考文献
１．Lussier他, 1998, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 95: 9825-9830.
２．Meaden他., 1990, Mol.Cell.Biol. 10: 3013-3019.
３．Orlean, P., 1997, Pringle, J.R., Broach, J.R., およびJones, E.W.編、Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY. Vol 3, pp 229-362.
４．Shahinian他., 1998, Genetics 149: 843-856.
５．MacDiarmid他., 1998, J.Biol.Chem. 273: 1727-1732.
６．Pringle他, 1995, Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol. 60: 729-744.
【図面の簡単な説明】
【図１】  第1図は、CaKRE5配列を示し、そしてサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）のKRE5、ドロソフィラ・メラノガステル（Drospphila  melanogaster）のUGGT1、およびシゾサッカロマイセス・ポンベ（S.  pombe）のGPT1に対する比較を示す。（A）はCaKre5pのヌクレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を図解する。CaKre5pシグナルペプチドにはボールドフェースで下線が引かれている。ER保持配列His−Glu−Leu（HDEL）はC末端においてボールドフェースで示されている。Leuの代わりに非規定配列CTGコドンエンコーディングSerはイタリック化されている。（B）はCaKre5p、Kre5p、Gpt1pおよびUggtp間のタンパク質配列の整列を示す。タンパク質は1文字アミノ酸コードで示されており、アミノ酸の同一性は黒色でそして類似性は灰色で陰影がつけられている。整列を改良するために導入されたギャップはダッシュにより示されており、そして位置は左に示されている。
【図２】  第2図は、CaALR1配列を示し、そしてサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）のAlr1pおよびAlr2pに対する比較を示す。（A）はCaALR1のヌクレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を図解する。膜貫通ドメインとして働くことが予測される2つの疎水性アミノ酸ストレッチはボールドフェースで示されている。非規定配列CTGコドンはイタリック化されている。（B）はCaAlr1p、Alr1pそれはAlr2p間のタンパク質配列の整列を示す。タンパク質は1文字アミノ酸コードで示されており、アミノ酸の同一性は黒色でそして類似性は灰色で陰影がつけられている。整列を改良するために導入されたギャップはダッシュにより示されている。
【図３】  第3図は、CaCDC24の配列を示し、そしてサッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）およびシゾサッカロマイセス・ポンベ（S.  pombe）からのCDC24に対する比較を示す。（A）はCaCDC24のヌクレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を図解する。非規定配列CTGコドンはイタリック化されている。（B）はCaAlr1CaCdc24p、サッカロマイセス・セレビシエ（S.  cerevisiae）のCdc24p、およびシゾサッカロマイセス・ポンベ（S.  pombe）の相同体Scd1p間のタンパク質配列の整列を示す。CaCdc24p  dblの相同性ドメインはアミノ酸280〜500から延びる。プレックストリン相同性ドメインは残基500〜700から欠失されている。タンパク質整列は第1図および第2図に記載されているように形成された。
【図４】  第4図は、CaKRE5、CaALR1およびCaCDC24の崩壊を図解する。（A）CaKRE5、（C）CaALR1、および（E）CaCDC24の制限地図は崩壊戦略に関係する制限部位を表示する。CaKRE5、CaALR1およびCaCDC24オープンリーディングフレーム（白抜き矢印で示されている）に関するhisG−URA3−hisG崩壊モジュールの挿入位置、ならびにサザンブロット分析により崩壊を確認するために使用するプローブが示されている。（B、D、F）はCaKRE5、CaALR1およびCaCDC24の中へのhisG−URA3−hisG崩壊モジュールのターゲッテッド統合のサザンブロット確認、および5−FOA処理後のその正確な切除を示す。（B）はカンジダ・アルビカンス（Candida  albicans）野生型株、CA1−4から抽出したゲノムDNA（レーン1）を示し、ヘテロ接合体CaKRE5／cakre5△：：hisG−URA3−hisG（レーン2）、5−FOA処理後のヘテロ接合体CaKRE5／cakre5△：：hisG（レーン3）、およびCaKRE5／cakre5△：：hisGヘテロ接合体の中への第2ラウンドの形質転換から生ずる代表的な形質転換体（レーン4）をHindIIIで消化し、CaKRE5、hisG、およびCaURA3プローブを使用して分析した。星印は3つのプローブに対して非特異的にハイブリダイゼーションする、1.6kbのラダーフラグメントを識別する。（D）はCA1−4から抽出したゲノムDNA（レーン1）を示し、ヘテロ接合体CaALR1／caalr1△：：hisG−URA3−hisG（レーン2）、5−FOA処理後のヘテロ接合体CaALR1／caalr1△：：hisG（レーン3）、およびCaALR1／caalr1△：：hisGヘテロ接合体の中への第2ラウンドの形質転換から生ずる代表的な形質転換体（レーン4）をEcoRIで消化し、CaALR1、hisG、およびCaURA3プローブを使用して分析した。（F）はCA1−4から抽出したゲノムDNA（レーン1）を示し、向き1で崩壊モジュールを含有するヘテロ接合体CaCDC24／cacdc24△：：hisG−URA3−hisG（レーン2）、向き2で崩壊モジュールを含有するヘテロ接合体CaCDC24／cacdc24△：：hisG−URA3−hisG（レーン3）、5−FOA処理後のヘテロ接合体CaCDC24／cacdc24△：：hisG（向き1）（レーン4）、5−FOA処理後のヘテロ接合体CaCDC24／cacdc24△：：hisG（向き2）（レーン5）、およびCaCDC24／cacdc24△：：hisG（向き1）ヘテロ接合体の中への第2ラウンドの形質転換から生ずる代表的な形質転換体（レーン6）をEcoRIで消化し、CaCDC24、hisG、およびCaURA3プローブを使用して分析した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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