(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍の、パーフォリン非依存治療のための薬学的組成物を調製するための、グランザイムＢの使用であって、前記腫瘍は、その膜表面にＨｓｐ７０を発現する腫瘍細胞を含む、使用。
【請求項２】
グランザイムＢは、前記薬学的組成物中の１つの薬学的に活性な化合物として使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
グランザイムＢを、最終濃度１μｇ/ｍｌ〜５００μｇ/ｍｌで投与する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
グランザイムＢを、最終濃度１ｎｇ/ｍｌ〜１０ｎｇ/ｍｌで投与する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
グランザイムＢを、最終濃度６ｎｇで投与する、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
グランザイムＢをリポソーム中にパッケージする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記腫瘍は、胃、腸、結腸直腸、肺、膵臓、乳房、産婦人科系、頭頚部の腫瘍、皮膚の腫瘍、ニューロン性腫瘍、白血病およびリンパ腫からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞中のグランザイムＢの発現を誘導または促進する方法に関する。本発明はまた、腫瘍、ウイルスもしくは細菌感染または炎症性疾患の治療のための薬学的組成物を調製するための前記ＮＫ細胞の使用に関する。さらに本発明は、腫瘍、ウイルスもしくは細菌感染、または炎症性疾患の治療のためのグランザイムＢの使用であって、腫瘍細胞または感染もしくは炎症にかかった細胞がその細胞表面上にＨｓｐ７０を発現する、使用に関する。
【０００２】
本明細書を通して、種々の文献が引用されている。前記文献の開示内容を引用によって本明細書において援用する。
【０００３】
ヒートショックタンパク質（Ｈｓｐ７０）の細胞質濃度の増加によって、腫瘍がプログラム細胞死から保護されることがわかっている（Nylandstedら、（2000）Ann. N.Y. Acad. Sci. 926、122）。Ｈｓｐ７０は、ヒートショックタンパク質ファミリー（ＨＳＰ）の主要なストレス誘発形態であり、それは主に細胞質ゾルに認められる。近年、細胞外に位置し、かつ原形質膜に結合したＨＳＰが、高度に免疫原性を示し、細胞を免疫攻撃にさらすということが証明されてきた（Schildら、（1999） Current Opinion in Immunology 11、109）。レセプター媒介性の取り込み（Arnold-Schildら、（1999） J. Immunol. 162、3757）および抗原提示細胞（ＡＰＣ）による再提示に続いて、ＨＳＰシャペロンペプチドが細胞毒性、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き出す（Sutoら、（1995） Science 269、1585）。ＣＤ９１およびトール様レセプター２および４（ＴＬＲ２／４）を含むいくつかのレセプターが、ＨＳＰ９０（ｇｐ９６）、ＨＳＰ７０（Ｈｓｐ７０、Ｈｓｃ７０）およびＨＳＰ６０ペプチド複合体とＡＰＣとの相互作用を媒介することが明らかになった（Basuら、（2001）Immunity 14、303; Binderら、（2000） Nat. Immunol. 1、151; Sondermannら、（2000） Biol. Chem. 381、1165.; Ohashiら、（2000） J. Immunol. 164、558）。ペプチド非依存的「シャペロカイン（chaperokine）効果」で、ＨＳＰ７０グループのメンバーの説明がなされてきた。外因性ＨＳＰ７０の、ＣＤ１４依存的経路中、ＴＬＲ２／４を介しての単球への結合が、ＭｙＤ８８／ＩＲＡＫ／ＮＦκ−Ｂ信号導入を介してのレセプタークラスタリングおよび炎症誘発性サイトカイン分泌を誘発する（Pfeifferら、（2001） Eur. J. Immunol. 31、3153; Aseaら、（2000） Nature Medicine、6、435; Aseaら、（2000） Cell Stress & Chaperones、5、425; Aseaら、（2002） J Biol Chem. 277（17）、15028）。
【０００４】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、Ｈｓｐ７０のＣ末端に局在するエピトープと特異的に相互作用することがわかっており（Botzler ら、（1998） Cell Stress & Chaperones、3、6）、それは、腫瘍細胞の細胞膜上に提示される（Multhoffら、（1995） Int. J. Cancer、61、272; Multhoffら、（1997） J. Immunol. 158、4341）。腫瘍細胞上の膜結合Ｈｓｐ７０の量は、ＮＫ細胞が媒介する溶解に対する感受性と正の相関を示す。物理的（熱）ならびに化学的（細胞静止剤）ストレスが、腫瘍細胞上でのＨｓｐ７０細胞表面発現を増加させ、それによってそれらをより良好にＮＫ細胞の標的とすることができる（Multhoff （1997） Int. J. Hyperthermia 13、39; Botzler ら、（1999） Exp. Hematol. 27、470; Rabinovichら、（2000） J. Immunol. 165、2390; Fengら、（2001） Blood 97、3505）。精製ＮＫ細胞を組換えＨｓｐ７０タンパク質とともにインキュベートすることによって、Ｈｓｐ７０膜陽性腫瘍細胞に対するそれらの細胞溶解性活性が増加する（Multhoffら、（1999） Exp. Hematology 27、1627）。ＴＫＤ（TKDNNLLGRFELSG、aa450-463）と称される、Ｈｓｐ７０のＣ末端ドメイン由来の１４アミノ酸ペプチドによっても同様の効果が得られる。この領域は、生存し得る腫瘍細胞の細胞外環境に曝露されたＨｓｐ７０のドメインに対応する（Multhoffら、 （2001） Cell Stress & Chaperones 6、337）。細胞溶解性活性が増加するとともに、Ｈｓｐ７０タンパク質またはＨｓｐ７０ペプチドＴＫＤのいずれかと接触させた後は、Ｃ型レクチンレセプターＣＤ９４の活性化形態の細胞表面発現がＮＫ細胞中で高められた。ＣＤ９４に特異的な阻害抗体を用いたブロッキングアッセイから、ＮＫ細胞とＨｓｐ７０膜陽性腫瘍細胞との相互作用にＣＤ９４が関与していることが明らかになった（Multhoff ら、（1999） Exp. Hematology 27、1627）。これらのデータは、古典的なＨＬＡ−アレルのＨＬＡ−Ｅ提示リーダーペプチドとは別に（Lanierら、（1998） Immunity 8、693; Braudら、（1998）Nature 391、795）、Ｃ末端局在化Ｈｓｐ７０ペプチド配列ＴＫＤが、いまだ明らかでない活性化ＣＤ９４レセプター複合体の潜在的リガンドであると考えられ得ることを示している。これまでの観察から、Ｈｓｐ７０ペプチドがＣＤ９４陽性ＮＫ細胞の腫瘍選択的標的認識構造として機能することが示されている（Multhoffら、（1997） J. Immunol. 158、4341）ものの、ＮＫ細胞がＨｓｐ７０陽性腫瘍標的細胞を溶解するメカニズムはいまだ解明されていない。さらに、ＮＫ細胞の腫瘍細胞に対する溶解活性を、これまで可能であったものより特異的に引き出すことが望ましい。これらすべての具体的目標は、疾患治療および特に腫瘍治療に対する、より有効かつより具体的なアプローチを導く手段を供給することである。
【０００５】
Ｈｓｐ７０を含むヒートショックタンパク質の表面発現は、ウイルス感染後、またはストレスに応答して、起こることも報告されている。特に、膜Ｈｓｐ７０は、ＨＩＶ感染リンパ球系細胞（Di Cesareら、（1992）、Immunology 76、341）およびＨＴＬＶ Ｉ感染ウサギ細胞株（Chouchane ら、（1994）、J. Infect. Dis. 169、253）において発見された。同様に、細菌に感染した細胞または炎症にかかった細胞は、それらの細胞表面上にＨｓｐ７０を発現すると考えられる。したがって、ＮＫ細胞またはグランザイムＢの溶解活性は、ウイルスまたは細菌に感染した細胞ならびに炎症にかかった細胞に対して作用しうる。
【０００６】
したがって、本発明の技術的課題は、疾患および特に、腫瘍、ウイルスおよび細菌感染および炎症性疾患の特異的治療のための手段および方法を提供することである。
【０００７】
前記技術的課題は、請求の範囲において特徴を述べた態様を提供することによって達成される。
【０００８】
したがって、本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞中のグランザイムＢの発現を誘導または促進する方法であって、ＮＫ細胞を、
（ａ）Ｈｓｐ７０タンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列TKDNNLLGRFELSGを含む、（ａ）の（Ｃ末端）フラグメント；
（ｃ）アミノ酸配列TKDNNLLGRFELSGを含む、（ポリ）ペプチド；または、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の組み合わせ
に接触させることを含む、方法に関する。
【０００９】
グランザイムＢは、当該技術分野において公知のセリンプロテアーゼであり、アポトーシス／プログラム細胞死のプロセスに関与することが記載されている（Berke（1995） Cell、81（1）、9-12; Froelichら、（1998） Immunology Today、19（1）、30-26）；Metkar Sら、Cytotoxic cell granule-mediated apopstosis: パーフォリンは、グランザイムＢセルグリシン（serglycin）複合体を、原形質膜の孔の情報なしに、標的細胞内に送達する。Immunity 16（2002）、417-428。
【００１０】
この酵素は、プロパスカーゼを切断（cleavage）して活性型にすることによりＤＮＡフラグメンテーションを促進し、それによって、Ｂｃｌ−２阻害可能経路を介してのプログラム細胞死を誘発する。グランザイムＢは、標的細胞の細胞質ゾルの存在下でアポトーシスのプロセスの誘発を開始する。
【００１１】
「NK細胞」（「ナチュラルキラー細胞」）という用語は、表面にＣＤ４５を発現しており、かつ、前刺激なしでもキラー活性を有する大きな、顆粒リンパ球を含む。それらは、ＣＤ３またはＴ細胞レセプターα／β−もしくはγ／δを発現せず、およびインターロイキン−２により刺激されることにより特に特徴づけられる。
【００１２】
本発明の方法によって刺激されるＮＫ細胞は、更に下記の性質により特徴づけられる：
−それらは、１０〜１０，０００単位の量、例えば、１００ＩＵのＩＬ−２（ＩＬ−２はfirm Chironから購入することが可能である）の添加後、過渡的プラスチック接着性（transient plastic-adherent）を示す；
−この粘着性は、新たに単離されたＰＢＬ（単球により涸渇された末梢血リンパ球）にＩＬ−２を添加後３〜１８時間現われる；
−ＮＫ細胞は、ＣＤ１６ｄｉｍ発現を示している（弱い平均蛍光値）；
−ＮＫ細胞は、典型的なＮＫマーカーとしてＣＤ５６およびＣＤ５７を発現する；
−ＮＫ細胞は、ＣＤ９４（Ｃ型レクチンキラー細胞レセプター）を発現する；
−ＮＫ細胞は、Ｈｓｐ７０およびサイトカインＩＦＮガンマにより活性化された後、分泌する；
−ＮＫ細胞は、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ７０フラグメントまたはＨｓｐ７０ペプチド（精製タンパク質）の添加により刺激され得る（生育および細胞毒素活性）；
−それらは、患者のＭＨＣ型に依存しない。
【００１３】
本発明によれば、他のＮＫ細胞集団を使用することもできる。前記集団を得るための更なる方法は、当該技術分野において公知であり、磁性ビーズを用いた単離や細胞選別があげられる。しかしこの場合、それらは、本発明によって使用されるＨｓｐ７０または上記フラグメントもしくは（ポリ）ペプチドにより活性化することができることが前提である。本発明によれば、単離されたＮＫ細胞を使用することができる。更に、ＮＫ細胞を含有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のような細胞混合物を使用することもできる。
【００１４】
本発明の方法の特に好ましい態様においては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、またはＮＫ細胞を含有するその画分は、生理的細胞懸濁液として使用される。
【００１５】
適切な方法を用いることによって、ＮＫ細胞は、治療対象の患者から、または健康なドナーから採血によって取得することができる。好ましくは、他の手段によって取得された、ＮＫ細胞を含有するバフィーコートまたはリンパ球濃縮物が使用されることになる。
【００１６】
バフィーコートまたはリンパ球濃縮物は、患者の静脈から、例えば、ヘパリンを添加して細胞の凝固を防ぎながら、採取される。ヘパリンが添加されたバフィーコートは、無菌レセプタクル（通常、無菌のプラスチックバッグ）中に採取され、次いで、フィコール密度遠心分離によって遠心分離にかけられ、その結果、血液細胞（＝ＰＢＭＣ、末梢血単核細胞、例えば、リンパ球、単球、顆粒球など）が蓄積する。リンパ球濃縮物は、無菌培養バッグ中では、無菌状態が保たれる。
【００１７】
末梢血単核細胞を含有するバフィーコートは、好ましくは、生理的細胞懸濁液の形状で、ヘパリンが添加された状態で使用される。ヘパリンは細胞の凝固を防ぐ。
【００１８】
Ｃ末端フラグメントのＨｓｐ７０タンパク質とともにインキュベートすることによってＮＫ細胞を刺激する方法は、国際公開公報ＷＯ９９／４９８８１号に記載されている。驚くべきことに、Ｈｓｐ７０タンパク質、アミノ酸配列TKDNNLLGRFELSGを含むそのフラグメント、アミノ酸配列TKDNNLLGRFELSGを含む（ポリ）ペプチド、または、好ましくはＩＬ−２との組み合わせた、前記タンパク質／（ポリ）ペプチドの組み合わせに、細胞を接触させることによって、ＮＫ細胞中でグランザイムＢの発現が、誘導または促進されることがわかった。上記の、および他の（好ましい）態様に関連する本発明のフラグメントは、Ｈｓｐ７０のカルボキシ末端（Ｃ末端）フラグメントであることが好ましい。
【００１９】
本発明によれば、「Ｈｓｐ７０タンパク質」という用語は、真核生物のヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）に関する。該ＨＳＰの発現は、熱だけでなく、更に、多くの他の試薬、例えば、アミノ酸アナログ、重金属、イオノホアまたは細胞毒素により誘導することができ、誘導による発現増加ファクターは、構成性発現と比較した場合少なくとも5である。その完全なアミノ酸配列は、Milnerら、（1990） Immunogenetics 32（4）、242-251において公開されている。
【００２０】
本発明によれば、Ｈｓｐ７０タンパク質の「フラグメント」という用語はまた、ヒトＨｓｐ７０タンパク質のアミノ酸３８４−６４１領域のアミノ酸配列を有する（ポリ）ペプチドを含む。すべてのＣ末端（カルボキシ末端）フラグメントは、アミノ酸配列TKDNNLLGRFELSGを少なくとも含む。対応する（ポリ）ペプチドを単離する方法は、当該技術分野において公知であり、後述の実施例１に詳しく記載されている。したがって当業者は、更に苦労することなく、組換え技術（この技術の標準方法は、 Sambrookら、 「Molecular Cloning、A Laboratory Manual」、2. edition 1989、CSH Press、Cold Spring Harbor、N. Y.に記載されている）により上記フラグメント３８４〜６４１からフラグメントを作製し、かつ、求められる活性化の性質についてそれらを試験することもできる。
【００２１】
（ポリ）ペプチドという用語は、ペプチドならびにポリペプチド（タンパク質）を表す。従来の理解によれば、ペプチドは、最大３０のアミノ酸を含み、一方、ポリペプチドは３０より多くのアミノ酸を含む。この従来の理解を本発明においても採用する。さらに、本発明によれば、明細書を通してアミノ酸を、１つの文字記号(one letter code)で表す。
【００２２】
アミノ酸配列TKDNNLLGRFELSGを含む別の（ポリ）ペプチドは、前記アミノ酸配列および任意に更なるアミノ酸を含む（ポリ）ペプチドであり、Ｈｓｐ７０由来のＮ末端およびＣ末端まで延び、更なるランダムに選択された、または天然に存在するアミノ酸配列に融合する。したがって、本発明の方法は、１４量体Ｈｓｐ７０ペプチドの配列を含む融合タンパク質によるＮＫ細胞の刺激に関する。
【００２３】
本発明の好ましい態様は、Ｈｓｐ７０タンパク質、その（Ｃ末端）フラグメント、アミノ酸配列TKDNNLLGRFELSGを含む（ポリ）ペプチド、またはそれらの組み合わせが複合体形成されてない状態である方法に関する。
【００２４】
ＨＳＰは、当該技術分野において、多くの異なる基質ペプチドとの複合体として発生することが知られている（Tamuraら、（1997） Science、278、117-223）。しかしながら、驚くべきことに、ヒートショックタンパク質、その（Ｃ末端）フラグメントまたはそれに由来する誘導体（上記参照）は、ＮＫ細胞の活性化によって、それらがペプチドとの複合体を形成しないときでさえ、免疫活性を誘導することがわかった。したがって、国際公開公報ＷＯ９９／４９８８１号に記載の方法によれば、当業者は、Ｈｓｐ７０タンパク質、または複合体形成されていない状態のアミノ酸配列TKDNNLLGRFELSGを含む（ポリ）ペプチドを用いて、ＮＫ細胞を刺激することができる。
【００２５】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の方法は、in vivo法である。
【００２６】
予見される処理は、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ７０フラグメント、またはＨｓｐ７０ペプチドを、ＮＫ細胞をin vivo刺激することによってグランザイムを作製するために、患者に注射することを含む。
【００２７】
本発明の別の好ましい態様によれば、本発明の方法は、ex vivo法またはin vitro法である。
【００２８】
この方法は、上記のように、ＮＫ細胞またはＮＫ細胞を含む細胞集団を単離することを含み、ＮＫ細胞を含有する生理学的細胞懸濁液を、Ｈｓｐ７０タンパク質、そのＣ末端フラグメントもしくはその誘導体、またはアミノ酸配列TKDNNLLGRFELSGを含むタンパク質／（ポリ）ペプチドと混合し、インキュベートしてＮＫ細胞中のグランザイムＢの発現を誘導または促進する。
【００２９】
インキュベーションは、例えば、インキュベータ中で、生理学的温度（３７℃）で、攪拌器（穏やかな攪拌）を用いて、５％ＣＯ２および＞８０％湿度雰囲気で、そうでなければＮＫ細胞を生存させ得る生理的条件のままにして行うこともできる。
【００３０】
本発明のさらに好ましい態様は、好ましくは、グランザイムＢ発現を誘導もしくは促進した、自家および/または同種異系ＮＫ細胞を哺乳動物に再注入することをさらに含む方法に関する。
【００３１】
ＮＫ細胞は、グランザイムＢの発現を誘導または促進するためのin vitroまたはex vivo処理が施された後、患者に再注入される。再注入は、標準的な医療機器を用いて行うことができる。例えば、ＮＫ細胞またはＮＫ細胞を含有するＰＢＭＣの再注入は、静脈内（i.v.）、腹腔内（i.p.）、皮下（s.c.）または腫瘍内注入で成される。
【００３２】
本発明の更なる好ましい態様によれば、前記哺乳動物はヒトである。
【００３３】
本発明の方法の別の好ましい態様においては、前記ＮＫ細胞と、Ｈｓｐ７０タンパク質、そのＣ末端フラグメントもしくはその誘導体、またはアミノ酸配列TKDNNLLGRFELSGを含むタンパク質／（ポリ）ペプチドとの接触は、少なくとも１２時間行う。さらに好ましい態様によれば、前記接触は、少なくとも４日間行う。
【００３４】
別の好ましい態様において、本発明は、前記ＮＫ細胞は、前記接触の前に、骨髄細胞を１サイトカインあたり１ｎｇ/ｍｌ〜１０００ｎｇ/ｍｌの濃度のインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）および幹細胞因子（ＳＣＦ）とともに、少なくとも７日間、最大４ヶ月間インキュベートすることによって、骨髄から取得される方法に関する。
【００３５】
この好ましい態様によれば、言及されたサイトカインを用いて骨髄細胞の刺激を行った後、ＮＫ細胞を新鮮に単離することができる。このようにして得られたＮＫ細胞は、上記の典型的なＮＫ細胞マーカーを表示する。サイトカインの好ましい濃度は、各サイトカインにつき１００ｎｇ/ｍｌの範囲である。サイトカインによる刺激、および表面上にＣＤ９４およびＣＤ５６を表示するＮＫ細胞への分化後、これらの細胞の接触は、Ｈｓｐ７０タンパク質または（ポリ）ペプチドの上記フラグメントまたは本明細書において前述した上記組み合わせを用いて行ってもよい。
【００３６】
本発明の別の態様は、
（ａ）Ｈｓｐ７０タンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列TKDNNLLGRFELSGを含む、（ａ）の（Ｃ末端）フラグメント；
（ｃ）アミノ酸配列TKDNNLLGRFELSGを含む、（ポリ）ペプチド；または、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の組み合わせ；
を用いて刺激した後、グランザイムＢを作製する（即ち、発現する）ＮＫ細胞の使用であって、腫瘍、ウイルスもしくは細菌感染、または炎症性疾患の治療のための薬学的組成物を調製するための使用に関する。
【００３７】
本発明によれば、医薬品製剤は、人体上または人体内で使用される場合、病気、慢性的な軽症の病気、身体的障害または病理的不快の治癒、軽減、予防、または認識を目的とする物質および調製物として定義される。
【００３８】
任意に、前記薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤またはアジュバントをさらに含む。
【００３９】
薬剤学的に許容される（認容できる）好適な担体の例は、当業者に公知であり、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、滅菌溶液等を含む。そのような担体を含有する薬剤学的組成物（医薬品製剤）は、一般的な方法により調製することができる。薬剤学的組成物は、各々の個体へ適当な投与量を投与することができる。投与方法としては、例えば、静脈内（i.v.）、腹腔内（i.p.）、腫瘍内、皮下（s.c.）、筋内（i.m.）、局所的または皮内投与がある。投与量は、多くの因子、例えば、患者の大きさ、性別、体重、年齢、ならびに、具体的に投与される組成物の種類、投与の種類等に依存する。該組成物は、局所的に投与することもできるし、全身投与することもできる。一般的に、投与は非経口的に行われる。したがって、本発明のＨｓｐ７０タンパク質、そのＣ末端フラグメントもしくはその誘導体、またはアミノ酸配列TKDNNLLGRFELSGを含むタンパク質／（ポリ）ペプチドによって処理されるＮＫ細胞は、静脈内投与されることが好ましい。注射は、投与されるＮＫ細胞の有効量を用いて腫瘍に対して直接行われることもある。公知の、他の種類の投与ももちろん可能である。投与されるＮＫ細胞の使用可能な数は、リューカフェレセート（leukapheresate）の成分として、５×１０７〜２×１０９の範囲のＮＫ細胞を含む。そのようなリューカフェレセートにおいて、ＮＫ細胞は通常、５％〜２０％の量存在する。
【００４０】
非経口投与のための調製剤としては、無菌水溶液もしくは非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。水性担体としては、水、水溶液、エマルジョン、または０．９％ＮａＣｌ、リン酸緩衝X-vivo 20などの食塩水を含む懸濁液、および緩衝剤が含まれる。非経口賦形剤としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、またはラクトリンゲルが含まれる。静脈内賦形剤としては、流体および栄養補充液、電解質補充液（例えば、リンゲルデキストロースを基剤としたもの）などが含まれる。保存剤、および例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどといった他の添加物を含んでもよい。また、本発明の薬学的組成物は、薬学的組成物の使用目的によってはインターロイキンまたはインターフェロンなどの更なる物質を含むことができる。
【００４１】
本発明の好ましい態様によれば、腫瘍、ウイルスもしくは細菌感染または炎症性疾患の治療のための薬学的組成物の調製に用いられる前記ＮＫ細胞は、本発明の方法によって刺激される。
【００４２】
さらに、本発明の方法によれば、前記薬学的組成物によって治療される腫瘍は、本発明にしたがって、それらの膜上でＨｓｐ７０を発現する腫瘍細胞を含む。また、前記感染または炎症にかかる細胞は、本発明にしたがって、膜上でＨｓｐ７０を発現する腫瘍細胞を含む。
【００４３】
Ｈｓｐ７０の表面発現を検出する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、組織学的方法、フローサイトメトリーなどを含む。
【００４４】
より好ましくは、前記腫瘍は、胃、腸、結腸直腸、膵臓、乳房、肺、産婦人科系、頭頚部の癌、皮膚（例えば、メラノーマ）、ニューロン性腫瘍、白血病、リンパ腫からなる群から選択される。
【００４５】
好ましくは、本発明によるウイルス感染は、ＨＩＶおよび肝炎ウイルスによる感染である。
【００４６】
本発明はまた、腫瘍、ウイルスもしくは細菌感染または炎症性疾患のパーフォリン非依存治療のための薬学的組成物を調製するためのグランザイムＢの使用に関する。
【００４７】
本発明の最も重要な局面は、上記態様に反映される。従来技術の推定とは対照的に、グランザイムＢは、パーフォリン経路とは無関係に腫瘍の治療に有効であることが本発明によって示された。これは、腫瘍の治療方法において、重要な用途を持つ。なぜなら、薬学的に活性な化合物の取り込みを、パーフォリン経路と独立させて考えることができるからである。グランザイムＢは、腫瘍内、iv、皮下投与することができるであろう。
【００４８】
好ましい態様において、本発明の使用は、グランザイムＢは、前記薬学的組成物中の１つの薬学的に活性な化合物として使用される。
【００４９】
また、本発明のこの好ましい態様は、癌治療に用いられる薬学的組成物の必要な成分の設計において重要な示唆をもつ。腫瘍を効果的に治療するため、および/または腫瘍を小さくするため、またはウイルスもしくは細菌感染または炎症性疾患を治療するために、さらなる薬学的に活性な成分を薬学的組成物に含む必要がないことが重要である。
【００５０】
さらに、本発明は、腫瘍、ウイルスもしくは細菌感染、または炎症性疾患を治療する方法であって、
（ａ）ＮＫ細胞を、表面にＨｓｐ７０を持つ腫瘍細胞、または表面にＨｓｐ７０を持つ前記感染もしくは炎症にかかった細胞に接触させること、
（ｂ）腫瘍細胞表面上の前記Ｈｓｐ７０によって形成されたイオンチャネルを介して、グランザイムＢを前記細胞に入れること、および
（ｃ）グランザイムＢの酵素活性の結果、前記細胞にアポトーシスを起こさせること、
を含む方法に関する。
【００５１】
別の方法として、刺激されたＮＫ細胞によって発現させるかわりに、グランザイムを直接的に投与してもよい。したがって、本発明は、腫瘍、ウイルスもしくは細菌感染、または炎症性疾患を治療する方法であって、
（ａ）表面にＨｓｐ７０を持つ腫瘍細胞、または、前記感染もしくは炎症にかかった、表面にＨｓｐ７０を持つ腫瘍細胞に、グランザイムＢを接触させること、
（ｂ）腫瘍細胞表面上の前記Ｈｓｐ７０によって形成されたイオンチャネルを介して、グランザイムＢを前記細胞に入れること、および
（ｃ）グランザイムＢの酵素活性の結果、前記細胞にアポトーシスを起こさせること、
を含む方法に関する。
【００５２】
腫瘍細胞または前記感染もしくは炎症にかかった細胞の範囲およびグランザイムＢの濃度、ならびにグランザイムＢと腫瘍細胞または前記感染もしくは炎症にかかった細胞との接触時間の範囲を、当業者は、本発明の上記教示を研究することによって導き出すことができる。
【００５３】
本発明の態様の好ましい態様において、グランザイムＢは、最終濃度１μｇ/ｍｌ〜５００μｇ/ｍｌで投与される。
【００５４】
本発明の方法の別の好ましい態様において、グランザイムＢは、最終濃度１ｎｇ/ｍｌ〜１０ｎｇ/ｍｌで投与される。グランザイムＢは、最も好ましくは、最終濃度約６ｎｇ/ｍｌで投与される。この点に関しては、投与形態は、これらの濃度のグランザイムＢを腫瘍細胞または感染もしくは炎症にかかった細胞に直接送達することが最も好ましいということが重要である。
【００５５】
本発明の使用または本発明の方法の別の好ましい態様においては、グランザイムＢは、リポソーム中において送達／包装される。
【００５６】
薬学的に活性な化合物のリポソーム中へのカプセル化は、当該技術分野において確立されている。
【実施例】
【００５７】
下記の実施例によって本発明を説明する。これらの実施例は、本発明を限定するものと解釈すべきでなく、本実施例は、例示の目的で含まれており、本発明は請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【００５８】
実施例１：材料と方法
細胞
６ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充した１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Life Technologies、Eggenstein、Germany）および抗生物質（１００ ＩＵ/ｍｌペニシリンおよび１００μｇ/ｍｌストレプトマイシン; Life Technologies）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（Life Technologies、Eggenstein、Germany）１ｍｌあたり０．１〜０．５×１０６個の細胞密度で、ＮＫ細胞株ＹＴを培養した。過渡的プラスチック接着性（transient plastic adherent）ＮＫ細胞は、健康なヒトボランティアのバフィーコートに由来するものである。フィコール分離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をｒＩＬ−２（１００ ＩＵ/ｍｌ、Chiron、Frankfurt、Germany）中で１２時間培養した。修正されたVujanovic（Vujanovic ら、（1993） Cell. Immunol. 151、133）の方法にしたがって、単球が枯渇した末梢血リンパ球の接着選択を行った後、細胞を、Ｈｓｐ７０ペプチドＴＫＤ（２μｇ/ｍｌ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で３日間培養した。
【００５９】
前述したプロトコル（Multhoffら、（1997） J. Immunol. 158、4341）にしたがって、ＣＸ−２結腸（Ｈｓｐ７０陽性：６０％）およびＣｏｌｏ３５７膵臓（Ｈｓｐ７０ 陽性：７０％）カルシノーマ細胞株を、Ｈｓｐ７０特異的モノクローナル抗体Ｃ９２Ｆ３Ｂ１を用いて細胞選別することによって、ヒト腫瘍サブラインＣＸ＋／ＣＸ−およびＣｏｌｏ＋／Ｃｏｌｏ−を得た。したがって、Ｃｏｌｏ＋およびＣｏｌｏ−と同様、ＣＸ＋およびＣＸ−は自家由来である。ＣＸ＋（Ｈｓｐ７０ 陽性：８０％）およびＣｏｌｏ＋（Ｈｓｐ７０ 陽性：８５％）カルシノーマサブラインを安定に高発現するＨｓｐ７０は、ＣＸ−（Ｈｓｐ７０ 陽性：２５％）およびＣｏｌｏ−（Ｈｓｐ７０ 陽性：３５％）カルシノーマ細胞を安定に低発現するＨｓｐ７０と有意に相違する。
【００６０】
Ｈｓｐ７０の膜発現については相違するが、同じＭＨＣクラスＩ発現を示すカルシノーマサブラインＣＸ＋／Ｃｏｌｏ＋およびＣＸ−／Ｃｏｌｏ−、ならびに白血病性非ＮＫ細胞株Ｋ５６２を、５％ＦＣＳ（Life Technologies）、６ｍＭ Ｌ−グルタミンならびに抗生物質を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地において培養した。指数関数的に増加する腫瘍細胞（細胞通過後１日目）を、グランザイムＢ、カンプトテシン治療のために、かつ、細胞毒性アッセイの標的として使用した。
【００６１】
全ての細胞株を定期的にスクリーニングして、マイコプラズマの混入がないかどうかを、酵素免疫検定法によって調べた。M. arginini、M. hyorhinis A. laidlawiiおよびM. orale（Roche、Mannheim、Germany）。マイコプラズマを含まない細胞株のみを用いた。
【００６２】
アフィニティクロマトグラフィーおよび免疫沈降法
ウシ血清アルブミン（BSA、1 mg/ml、Sigma-Aldrich、Steinheim、Germany）、１ｍｇ/ｍｌの凍結乾燥した（lyophylize）組換えヒトＨｓｐ７０タンパク質（Stressgen、British Columbia、Canada）または２ｍｇ/ｍｌのＨｓｐ７０ペプチドＴＫＤ（TKDNNLLGRFELSG、aa450-463、Bachem、Bubendorf、Switzerland）を、均衡化したAminoLinkアガロースビーズ（Pierce、Rockford、USA）（２ｍｌ）、還元剤NaCNBH3とともに６時間インキュベートした。ＢＳＡ、Ｈｓｐ７０タンパク質およびＨｓｐ７０ペプチドＴＫＤの結合能は、９５％であった。未結合の物質をトリス緩衝液で集中的に洗浄することによって除去し、未反応基をクエンチングした後、細胞溶解物をＢＳＡ、Ｈｓｐ７０タンパク質およびＨｓｐ７０ペプチドＴＫＤ結合カラムに１時間適用した。
【００６３】
１０カラム容量の２０ｍＭトリス緩衝液を用いて洗浄後、結合したタンパク質を２０ｍＭトリス緩衝液中、３Ｍ塩化ナトリウムを用いて５画分溶出した。それぞれの画分を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＰＶＤＦ膜にブロットした。
【００６４】
膜透過
膜の精製は、低調の、プロテアーゼインヒビターＰＭＳＦを含有するＥＤＴＡフリーの緩衝液中で、５０×１０６個の細胞のダウンスホモジナイゼーションで行い、続いて１，０００ｇで５分間および１００，０００ｇで４℃で６０分間、連続的に遠心分離を行った。膜を含有するペレットを５０ｍＭトリス緩衝液（０．５％、ＮＰ４０、ｐＨ７．６）中２ｍｌの０．３Ｍ ＮａＣｌに再懸濁した。
【００６５】
ウェスタンブロット分析
脱脂乳（０．１％）中でのブロッキングおよびｍＡｂを用いたグランザイムＢ ２Ｃ５（ＩｇＧ２ａ、Becton Dickinson、Heidelberg、Germany）のインキュベーション（４℃、５時間）の後、ウェスタンブロットを洗浄し、二次マウス抗ＩｇＧ ＨＲＰ Ａｂ（Dianova、Hamburg、Germany）とともに１時間インキュベートした。ＥＣＬキット（Amersham Bioscience）を用いて５秒間タンパク質の検出を行った。
【００６６】
ペプチドマスフィンガープリンティング法によるタンパク質の同定
Ｈｓｐ７０タンパク質およびＨｓｐ７０ペプチドＴＫＤが沈降した３２ｋＤａタンパク質バンドをクーマシーブルー染色ゲルから切り出し、トリプシンで消化し、逆相ＺＩＰチップ（Millipore、Eschborn、Germany）を用いて脱塩した。そのサンプルを４−ヒドロキシ−α―シアノけい皮酸中に包埋し、Perseptive Voyager DePro MALDI-TOF（Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation?Time Of Flight）マススペクトロメーターを用いて、反射モードでペプチド質量を測定した。ピークリスト（peaklist）をm/zソフトウェア（Proteometrics）を用いて編集し、ピーク選択に用いた。得られたペプチドマスフィンガープリントについて、Profound検索エンジン（Proteometrics）を用いて重複していないNCBIタンパク質データペースを検索した。グランザイムＢは、１００％の確率、＞９５％の 信頼度で同定された。
【００６７】
フローサイトメトリー
細胞（０．５×１０６）を１０分間パラホルムアルデヒド中（ＰＢＳ中１％ＰＦＡ）に固定し、ＢＳＡ（０．５％）、ＮａＮ３（０．１％）およびサポニン（０．１％）を含有するＰＢＳ中、透過処理した。次いで、透過処理した細胞を、グランザイムＢ−フィコエリトリン結合モノクローナル抗体ＨＣ２−ＰＥ（ＩｇＧ１；Holzel Diagnostika、Cologne、Germany）、またはアイソタイプが一致するＩｇＧ１対照抗体のいずれかとともに、４℃で１時間、暗所でインキュベートした。細胞を洗浄後、FACSCalibur機器（Becton Dickinson、Heidelberg、Germany）で分析した。
【００６８】
処理
カンプトテシン（４ｍｇ/ｍｌ、Sigma、Munich、Germany）の貯蔵液をＤＭＳＯで希釈し、４℃で暗所にて保存した。グランザイムＢ（６ｎｇ/ｍｌ、Holzel Diagnostics、Cologne、Germany）溶液を使用直前に新鮮に調製した。指数関数的に成長する細胞（０．５〜１．５×１０６/ｍｌ）を最終濃度４μｇ/ｍｌのカンプトテシンで、または、精製された、酵素的に活性なグランザイムＢ（１０ｎｇ/ｍｌ、１μｇ/ｍｌ、２μｇ/ｍｌ、４μｇ/ｍｌ）（Shiら、（2000） Methods in Enzymology 322、125）を用いて、１０分間および３０分間、４℃または３７℃でインキュベートした。ＲＰＭＩ−１６４０培地中で洗浄後、結合と取り込みを、透過していないおよび透過した腫瘍細胞中において、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡検査法を用いて、４０倍対物レンズと標準フィルターの備え付けられているAxioscop 25走査顕微鏡（Zeiss、Jena、Germany）を用いて測定した。画像を、ソフトウェアAxiovison （Zeiss Vison、Jena、Germany）を用いて乗法的シェイディング補正によって処理した。ＨＣ２−ＰＥ抗体を用いることによってグランザイムＢを赤で視覚化した。
【００６９】
腫瘍細胞を６ｎｇ/ｍｌグランザイムＢとともに４時間、１２時間および２４時間、３７℃でインキュベートし、以下に記載するように、異なるアポトーシスアッセイによってＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した後、アポトーシス細胞死を測定した。
アポトーシスアッセイ
アネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色：簡単に、細胞を、５ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するHepes緩衝液で２回洗浄し、アネキシンＶ−ＦｌＴＣ（Roche）を用いて室温で１０分間インキュベートした。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ陽性染色細胞を、FACSCaliburフローサイトメーター（Becton Dickinson、Heidelberg、Germany）で測定した。
【００７０】
ＤＡＰＩ染色：メタノール／アセトン固定化細胞（０．１×１０６個/１００μｌ）を、ＰＢＳ／グリセロール（３：１）中０．５μｇ/μｌの４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）とともに、１５分間暗所でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、その細胞をFluorescent Mounting Medium（Dako、Glostrup、Denmark）に載せ、４０倍対物レンズと標準フィルターの備え付けられているZeiss model Axioscop 2走査顕微鏡（Zeiss Jena、Germany）を用いて蛍光を分析した。５０個ずつの細胞についてＤＡＰＩ染色によってアポトーシスを視覚化した。画像を、ソフトウェアAxiovison（Zeiss Vison、Jena、Germany）を用いて乗法的シェイディング補正によって処理した。
【００７１】
チトクロームc放出：定量イムノアッセイ（DCDCO、R&D Systems、Wiesbaden、Germany）を用いてチトクロームc放出を測定した。簡単に、未処理の、またはカンプトテシン（４μｇ/ｍｌ）もしくはグランザイムＢ（６ｎｇ/ｍｌ）処理したＣＸ＋およびＣＸ−細胞（１．５×１０６/ｍｌ）をＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液で１時間、室温で処理した。１，０００ｇで１５分間遠心分離して上清を除去し、２００μｌの１：１００、１：２５０および１：５００希釈液を用いてサンドイッチELISA法を行った。基質溶液を用いて３０分間暗所でインキュベートした後、反応を止めた。ELISAリーダーで各ウェルの光学的密度を４５０ｎｍで測定した。チトクロームc の量は、検量線を用いて測定した。
【００７２】
グランザイムＢ  ＥＬＩＳＰＯＴ
腫瘍細胞株ＣＸ＋／ＣＸ−およびＣｏｌｏ＋／Ｃｏｌｏ−を用いて、２０：１〜２：１の間の異なるエフェクタ：標的細胞比（Ｅ：Ｔ）で、４時間コインキュベートした後、非刺激ＮＫ細胞（ＮＫ ｄ０）とＴＫＤ刺激ＮＫ細胞（ＮＫ ｄ３）とでグランザイムＢの放出を比較した。検出には、グランザイムＢ ELISPOTキット（#552572、BD、Heidelberg、Germany）を用いた。簡単に、９６ウェルELISPOTプレート（MAIPN45、Millipore）に４℃で一晩、捕捉抗体を塗布し、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培養培地でブロックし、前記のようにして、腫瘍細胞とエフェクタ細胞を用いて３７℃で４時間インキュベートした。脱イオン水および洗浄緩衝液ＡおよびＢで洗浄後、ビオチン化抗グランザイムＢ抗体を２時間添加した（２μｇ/ｍｌ）。別の２つの洗浄ステップ後、新鮮に調製されたアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（２ｈ）および基質溶液（インキュベート時間：２５分）を添加することによって、グランザイムＢを視覚化した。ImmunoSpot Series I Analyzerを用いて、スポットを自動的に計数した。
【００７３】
５１Ｃｒ放出アッセイおよび阻害アッセイ
ＮＫ細胞媒介性細胞毒性を、１２時間の５１Ｃｒ放射性同位体アッセイによって測定した。標的細胞として、結腸カルシノーマサブラインＣＸ＋およびＣＸ−を用いた。ブロッキング研究には、最終濃度５μｇ/１×１０６細胞で、ｍＡｂ Ｃ９２Ｆ３Ｂ１およびアイソタイプが一致する対照抗体（ＩｇＧ１）を用いた。抗体とともに４℃で３０分、ＣＸ＋およびＣＸ−標的細胞をインキュベートした後、細胞を５１Ｃｒで標識し、MacDonald （MacDonaldら、（1974） J. Exp. Med. 140,718）に記載のようにして、細胞毒性アッセイを行った。特異的溶解のパーセンテージは、[（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）]×１００から計算した。
【００７４】
実施例２：グランザイムＢは、全長ヒートショックタンパク質（Ｈｓｐ７０）およびＨｓｐ７０ペプチドＴＫＤの相互作用パートナーである。
パートナータンパク質を、固定化されたヒトＨｓｐ７０タンパク質（１ｍｇ）上で、または、ＮＫ細胞との相互作用を媒介することがわかっているＨｓｐ７０の細胞外エピトープを含有する、１４アミノ酸ペプチド、造られた（coined）ＴＫＤ（TKDNNLLGRFELSG、aa450-463、2 mg）上で、アフィニティクロマトグラフィーによって同定した。このペプチドは、Ｈｓｐ７０特異的抗体（Welch and Suhan （1986） J. Cell. Biol. 103、2035）のエピトープ （Reinekeら、（1996） Immunobiol. 196、96）として予め同定されており、生育可能な腫瘍細胞上の膜結合Ｈｓｐ７０を特異的に検出するものである（Multhoffら、（1995） Int. J. Cancer 61,272; Multhoff ら、（1995） Blood 86, 1374）。ＮＫ細胞株ＹＴの細胞溶解物（Drexlerら、（2000） Leukemia 14,777）を、固定化Ｈｓｐ７０またはＴＫＤペプチドカラム上にて分画した。カラムに結合した材料を、３Ｍ塩化ナトリウムで５つの画分内に溶出した。対照として、ＹＴ細胞溶解物を担体またはＢＳＡ結合カラムに塗布した。さらに、非ＮＫ細胞株（Ｋ５６２）の溶解物をＴＫＤ結合アフィニティカラム上に分画した。溶出した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）によって分離し、銀染色によって視覚化した。見かけの分子量が３２ｋＤａの、強いタンパク質バンドが、Ｈｓｐ７０タンパク質（Ｈｓｐ７０）およびＨｓｐ７０ペプチド（ＴＫＤ）カラム（図１Ａ、ＹＴ）に由来するＹＴ細胞溶出物の画分２（Ｆ２）および３（Ｆ３）に観察された。このバンドは、未結合セファローズカラム（データは示さず）やＢＳＡ結合カラムの溶出物には観察されず、また、Ｋ５６２細胞溶解物が載ったＴＫＤアフィニティカラムからの溶出物にも観察されなかった（図１Ａ）。Ｈｓｐ７０タンパク質カラムによっても同じ結果が得られた（データは示さず）。並行して、画分３（Ｆ３）に由来するＨｓｐ７０ペプチドＴＫＤおよびＨｓｐ７０タンパク質の溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クーマシーブルーで染色した。Ｈｓｐ７０ペプチドカラムのＦ３に由来する３２ｋＤａタンパク質バンドを切り出し、トリプシンで消化した（図１Ｂ）。得られたペプチドをMALDI-TOFペプチドマスフィンガープリンティング法で分析した。トリプシンペプチドの配列は、グランザイムＢと１００％のホモロジーを示し、推定Ｚ値は１．８９であり、グランザイムＢについて９５％を超える確率を示すものであった（図１Ｂ）。グランザイムＢと３２ｋＤａタンパク質バンドとの同一性を、グランザイムＢ特異的抗体２Ｃ５（ＩｇＧ２ａ）を用いたウェスタンブロット分析によってさらに確認した。Ｈｓｐ７０タンパク質（Ｈｓｐ７０）およびＨｓｐ７０ペプチド（ＴＫＤ）カラムから得られたＹＴ細胞溶出物の両方には、強い３２ｋＤａグランザイムＢタンパク質バンドが現れた（図１Ｃ）。グランザイムＢは、Ｈｓｐ７０またはＫ５６２溶解物が載ったＴＫＤアフィニティカラムに溶出した画分には検出されなかった（図１Ｃ）。グランザイムＢに対するフィコエリトリン（ＰＥ）結合グランザイムＢ抗体（ＩｇＧ１）を用いたフローサイトメトリーによって、ＹＴ細胞中においては、細胞質のグランザイムＢの陽性染色が示されたが、Ｋ５６２では示されなかった（図１Ｄ）。これらの所見は、我々のこれまでの結果を裏付けるものである。要約すれ���、これらのデータは、グランザイムＢがＨｓｐ７０の潜在的なパートナータンパク質であることを示している。グランザイムＢは、ＴＫＤと名づけたＨｓｐ７０のＣ末端領域と相互作用する可能性がある。
【００７５】
実施例３：Ｈｓｐ７０膜陽性腫瘍細胞におけるグランザイムＢの特異的結合および相互作用
上記所見は、膜結合Ｈｓｐ７０によってグランザイムＢが細胞質ゾルに特異的に結合し、またそこに入ることを可能とするかどうかという問題を提起している。したがって、パーフォリンを含まない、精製グランザイムＢを、差異的（differential）Ｈｓｐ７０膜発現を示す腫瘍サブラインＣＸ＋／ＣＸ−およびＣｏｌｏ＋／Ｃｏｌｏ−とともにコインキュベートした。未処理のＣＸ＋およびＣｏｌｏ＋細胞（対照）の光学顕微鏡検査法(light microscopy)による分析を４℃と３７℃で行い、各パネルの上の列に示している（図２Ａ）。４℃と３７℃で行った、細胞の対応する免疫蛍光顕微鏡検査法を、下に示している（対照）。最初、どの細胞においても、細胞表面上でも、細胞質内でも、グランザイムＢ染色は認められなかった。しかしながら、該細胞を精製グランザイムＢ（ｇｒＢ）とともに４℃で１５分間インキュベートした後、典型的な膜表面染色を示すリング状の蛍光発光が、ＨｓＰ７０膜陽性ＣＸ＋およびＣｏｌｏ＋腫瘍サブラインにおいて検出された（図２Ａ，左のパネル）。ＣＸ＋およびＣｏｌｏ＋腫瘍サブライン中の細胞質の染色パターンによって測定されるように、３０分間のインキュベート中、４℃から３７℃へ温度シフトを行った結果、グランザイムＢの取り込みが認められた（図２Ａ、右のパネル）。対照的に、Ｈｓｐ７０膜陰性対応物ＣＸ−およびＣｏｌｏ−は、４℃でのグランザイムＢ細胞表面結合も、または３７℃での取り込みも認められなかった（データは示さず）。透過した細胞のフローサイトメトリー分析から、細胞を１μｇ/ｍｌグランザイムＢとともに３７℃で３０分間コインキュベートした場合、Ｈｓｐ７０膜陽性ＣＸ＋およびＣｏｌｏ＋において選択的に、グランザイムＢのピークがかすかに右にシフトするが、ＣＸ−／Ｃｏｌｏ−腫瘍サブラインにおいてはしないことが明らかになった（図２Ｂ、上のグラフ）。２μｇ/ｍｌおよび４μｇ/ｍｌのグランザイムＢを用いたコインキュベーション後、Ｈｓｐ７０の膜陽性腫瘍細胞（ＣＸ＋／Ｃｏｌｏ＋）中において、グランザイムＢ取り込みの用量依存的増加が検出された（図２Ｂ、下のグラフ）。しかしながら、最も高い濃度である４μｇ/ｍｌにおいても、グランザイムＢは、Ｈｓｐ−７０陰性腫瘍細胞（ＣＸ−／Ｃｏｌｏ−）と比較して、Ｈｓｐ７０膜陽性によってより顕著に内面化した。Ｈｓｐ７０によって形成された潜在的イオンチャネルは、Ｈｓｐ７０膜陽性腫瘍細胞における、グランザイムＢの選択的取り込みのメカニズムにおいて役割を果たすかもしれない。実際に、Ｈｓｐ７０膜陽性（ＣＸ＋）腫瘍サブラインの精製リン脂質に由来する小胞の取り込み後、特定のイオン電導経路（ion conductance pathway）が観察された。これは、Ｈｓｐ７０膜陰性（ＣＸ−）腫瘍から得られた細胞小胞においては認められなかった（データは示さず）。これらの結果に基づいて、グランザイムＢのＨｓｐ７０膜陽性腫瘍細胞への選択的取り込みを容易にするイオンチャネル活性について推定することができるかもしれない。
【００７６】
実施例４：in vitroで提供されるグランザイムＢは、Ｈｓｐ７０膜陽性腫瘍細胞において選択的にアポトーシスを誘発する
上記所見は、精製グランザイムＢは、細胞表面にＨｓｐ７０を提示する腫瘍細胞のアポトーシスを誘発することができるかどうかという問題を提起している。同一のＭＨＣクラスＩ発現（Multhoffら、（1997） J. Immunol. 158,4341）を示す、Ｈｓｐ７０膜陽性（ＣＸ＋／Ｃｏｌｏ＋）および膜陰性（ＣＸ−／Ｃｏｌｏ−）結腸カルシノーマ細胞を、単離された、酵素的に活性なグランザイムＢ（６ｎｇ/ｍｌ）とともに４時間、１２時間および２４時間インキュベートした（Shiら、（2000） Methods in Enzymology 322、125）。アポトーシスの陽性対照として、全ての細胞タイプをトポイソメラーゼインヒビターカンプトテシンとともに、４μｇ/ｍｌの濃度でインキュベートした。ＦＡＣＳ（FACSCalibur、Becton Dickinson、Heidelberg、Germany）、ＤＡＰＩ染色およびミトコンドリア性チトクロームｃ放出によって測定される、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色によってアポトーシスを測定した。カンプトテシン（ｃａｍ）またはグランザイムＢ（ｇｒＢ）とともに４時間インキュベートしたＣＸ＋およびＣＸ−細胞においては、アポトーシスは検出されなかった（図３Ａ）。カンプトテシンとともにインキュベートしたＣＸ＋およびＣｏｌｏ＋ならびにＣＸ−およびＣｏｌｏ−を、カンプトテシンとともに１２時間および２４時間インキュベートした後、アポトーシスを起こさせた。結腸カルシノーマサブラインＣＸ＋／ＣＸ−は、膵臓カルシノーマサブラインＣｏｌｏ＋／Ｃｏｌｏ−と比較して、カンプトテシン媒介性の細胞死からより保護さていれた。
【００７７】
図３Ａに示されているように、１２時間後、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ陽性染色ＣＸ＋細胞の量は、１６．６％から２８．０％に増加し（１．７倍）、２４時間後、１８％から３９％に増加した（２．１倍）。ＣＸ−細胞においては、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ陽性染色細胞の量は、同様に１２時間後、１２．１％から１９．８％に増加し（１．６倍）、２４時間後１１．９％から２５．１％に増加した（２．１倍）。対照的に、アポトーシスは、グランザイムＢを用いて１２時間および２４時間インキュベートした、Ｈｓｐ７０膜陽性Ｃｘ＋細胞において選択的に、それぞれ１６．６％から２０．９％（１．３倍）および１８％から３０．２％（１．８倍）の増加が観察された。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ陽性染色Ｃｏｌｏ＋細胞の量については、１２時間後および２４時間後のそれぞれにおいて、１．３倍および２．４倍の増加が認められた。ＣＸ−およびＣｏｌｏ−細胞においては、グランザイムＢを用いた処理の１２時間も２４時間もアポトーシスは誘発されなかった。グランザイムＢで２４時間処理したＣＸ＋およびＣＸ−細胞のアネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色パターンの比較を図３Ｂに示す。未処理の対照細胞（１８％）と比較して、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ陽性染色ＣＸ＋細胞およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性染色ＣＸ＋細胞の量は、グランザイムＢでの処理後、１．７倍（３０％）に増加した。しかしながら、アポトーシスＣＸ−細胞は、グランザイムＢでの同じ処理の前後で変化はなかった。ＣＸ＋細胞に加えて、グランザイムＢは、Ｈｓｐ７０膜陽性白血病細胞株Ｋ５６２においてもアポトーシスを誘発する（データは示さず）。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ陽性染色Ｋ５６２細胞の量は、８．７％から最大１６％まで増加した（１．８倍）。
【００７８】
アノイキスによって開始するアポトーシスを除外するため、未処理（対照）、カンプトテシン（cam）およびグランザイムＢ（ｇｒＢ）処理したＣＸ＋／ＣＸ−およびＣｏｌｏ＋／Ｃｏｌｏ−腫瘍細胞の光顕微鏡分析を行った。図３Ｃに示すように、グランザイムＢでの２４時間の処理で、Ｈｓｐ７０膜陽性腫瘍細胞株も膜陰性腫瘍細胞株も、プラスチック接着(plastic adherence)においていかなる損失の徴候をも示さなかった。これらの所見に関して、我々は、アノイキスがＨｓｐ７０膜陽性腫瘍サブラインにおいて、アポトーシス細胞死の誘発の可能なメカニズムかもしれないという可能性を除外した。全てのアポトーシスアッセイは、接着性細胞集団内において短時間の（１分以内）トリプシン処理の後に測定を行った。
【００７９】
アネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色パターンからの結果と一致して、全ての細胞型、ＣＸ＋／ＣＸ−、Ｃｏｌｏ＋／Ｃｏｌｏ−で、核フラグメンテーションが認めらた（図３Ｄ、ｃａｍ）。これは、カンプトテシン（４μｇ/ｍｌ）での２４時間の処理後の核ＤＮＡのＤＡＰＩ染色によって検出されるように、後の段階での典型的なアポトーシスの徴候である。しかしながら、ＤＮＡフラグメンテーションは、グランザイムＢ（６ｎｇ/ｍｌ）での処理の２４時間後のＨｓｐ７０膜陽性ＣＸ＋およびＣｏｌｏ＋腫瘍細胞においてのみ検出され、Ｈｓｐ７０膜陰性ＣＸ−およびＣｏｌｏ−細胞においては、ＤＮＡフラグメンテーションは観察されなかった（図３Ｄ、ｇｒＢ）。
【００８０】
アポトーシス細胞死についての更なる試験として、ＣＸ＋およびＣＸ−細胞をグランザイムＢとともに２４時間インキュベートした後、チトクロームｃ放出を測定した。表１にまとめたように、グランザイムＢ（６ｎｇ/ｍｌ）での２４時間のインキュベート後、チトクロームｃの濃度は、Ｃｘ＋細胞においては、０．３８２ｍｇ/ｍｌから０．６９０ｍｇ/ｍｌに上昇した（１．８倍）。しかしながら、ＣＸ−細胞においては、グランザイムＢでの処理後、チトクロームｃの増加は認められなかった（０．４５２ｍｇ/ｍｌ対０．４２５ｍｇ/ｍｌ）。対照的に、カンプトテシン（４μｇ/ｍｌ）での２４時間の処理後は、両方の細胞タイプにおいてチトクロームｃ濃度は類似の１．５倍に増加した。これらの結果は、単離されたグランザイムＢは、Ｈｓｐ７０を細胞表面上に提示する腫瘍細胞において選択的にアポトーシス細胞死を誘発することを示している。グランザイムＢによるアポトーシスの誘発は、細胞外に露出されたＨｓｐ７０エピトープＴＫＤに媒介されることが示唆される。
【００８１】
表１
未処理（対照）、またはカンプトテシン（４μｇ/ｍｌ）もしくはグランザイムＢ（６ｎｇ/ｍｌ）で２４時間処理した後のＣＸ＋およびＣＸ−腫瘍細胞中のヒトチトクロームｃの定量的測定。データは、４つの独立した実験における中間値±標準偏差で表している。対照とは有意に異なる値（ｐ＜０．０５）に＊を付している。
【表１】
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【００８２】
実施例５：ＮＫ細胞のＨｓｐ７０ペプチドＴＫＤによる刺激がグランザイムＢの産生を誘発し、Ｈｓｐ７０膜陽性腫瘍標的細胞の殺滅を増加させる。
我々の所見の生理学的役割を、未処置およびＨｓｐ７０で刺激したヒトＮＫ細胞を用いた機能的アッセイにおいて試験した。以前からＮＫ細胞を１０〜５０μｇ/ｍｌの濃度のＨｓｐ７０タンパク質とともに、または等価のＨｓｐ７０ペプチド濃度（０．２〜２．０μｇ/ｍｌ）とともにインキュベートすることによって、ＮＫ細胞のＨｓｐ７０膜陽性腫瘍標的細胞に対する細胞溶解活性が増加することがわかっていた。同時に、Ｃ型レクチンレセプターＣＤ９４を活性化するキラー細胞の発現はアップレギュレートされた（Multhoffら、（1999） Exp. Hematology 27,1627; Grossら、（2002） submitted）。Ｈｓｐ７０は、抗体ブロッキング研究によって結論付けられているように（Multhoffら、（1997） J. Immunol. 158,4341; Multhoffら、（1995） Blood 86,1374）、ＮＫ細胞の腫瘍選択的認識構造として機能するにもかかわらず、ＮＫ細胞毒性のメカニズムは、依然として不明である。可能なメカニズムを解明するために、ＮＫ細胞をＨｓｐ７０ペプチドＴＫＤ（２μｇ/ｍｌ）とともに３日間インキュベートした。３つの独立した実験において証明されたように、有意に上昇した細胞内グランザイムＢ発現が観察された。対照的に、グランザイムＢ発現は、Ｈｓｐ７０ペプチドＴＫＤで処理したＣＤ３陽性Ｔ細胞においては増加しなかった。Ｈｓｐ７０膜陽性ＣＸ＋およびＨｓｐ７０膜陰性ＣＸ−とともにコインキュベートしたＨｓｐ７０ペプチド活性化ＮＫ細胞の光顕微鏡検査による分析を図４Ａに示す。Ｈｓｐ７０膜陽性ＣＸ＋およびＨｓｐ７０膜陰性ＣＸ−腫瘍細胞（０．１×１０６個/ｍｌ）を２４ウェルプレートにて２日間、複製培養した。両腫瘍細胞株の増殖率は、同じ細胞数（０．３×１０６個/ｍｌ）であることが測定されているように類似していた。上のパネルのＣＸ＋およびＣＸ−腫瘍細胞は、ＮＫ細胞不存在下で培養し、下のパネルの腫瘍細胞は、Ｈｓｐ７０ペプチドＴＫＤ（２μｇ/ｍｌ、３日）で刺激されたＮＫ細胞とともに１２時間共培養した。ＣＸ＋細胞コロニーのほぼ１００％がＮＫ細胞を有するクラスター中で認められ、ＣＸ＋腫瘍細胞の生存能力は減少していると思われる。対照的に、ＣＸ−腫瘍細胞およびＮＫ細胞はクラスターには認められなかった。Ｈｓｐ７０膜陰性ＣＸ−腫瘍細胞は、ＮＫ細胞を引き付けなかった。ＮＫ細胞との接触後、ＣＸ−腫瘍細胞の細胞生存能力は、ＣＸ＋腫瘍細胞と比較して、あまり影響を受けなかった。各グラフの右下の角の挿入図は、１つの代表的な細胞コロニーを倍率２.５倍で示した図である。
【００８３】
新鮮に単離された、未刺激（ＮＫ ｄ０）またはＨｓｐ７０ペプチドＴＫＤ刺激されたＮＫ細胞（ＮＫ ｄ３）と接触後のＣＸ＋／ＣＸ−およびＣｏｌｏ＋／Ｃｏｌｏ−腫瘍細胞の細胞殺滅を、１２時間の５１Ｃｒアッセイにおいて定量した（図４Ｂ）。光顕微鏡において観察されたもの（図４Ａ）と一致して、ＣＸ＋標的細胞（左）に対するＴＫＤ刺激ＮＫ細胞（ＮＫ ｄ３）の細胞溶解活性は、ＣＸ−標的細胞（右）と比較して有意に増強した。Ｈｓｐ７０−ペプチドＴＫＤで３日間刺激した後の増加したグランザイムＢ濃度と同時に、Ｈｓｐ７０膜陽性ＣＸ＋およびＣｏｌｏ＋細胞に対する細胞溶解性応答は、有意に上昇した。すなわち、Ｅ：Ｔ比２：１〜２０：１において、１．５倍（ＣＸ＋）および２．０倍（Ｃｏｌｏ＋）であった。Ｈｓｐ７０膜陰性ＣＸ−およびＣｏｌｏ−細胞に対するものは上昇しなかった。ＣＸ＋およびＣＸ−腫瘍細胞は、Ｈｓｐ膜発現についてのみ異なり、ＭＨＣクラスＩ発現パターンは同じであったので、キラー細胞阻害レセプター（ＫＩＲ）に媒介される阻害作用は除外することができるであろう。Ｈｓｐ７０膜陰性ＣＸ−腫瘍細胞（右）に対するものではなく、Ｈｓｐ７０膜陽性ＣＸ＋腫瘍細胞（左）に対する細胞溶解活性の増加は、生存可能な腫瘍細胞上の膜結合Ｈｓｐ７０ペプチドＴＫＤを検出するものとして知られる、Ｈｓｐ７０ペプチド特異的モノクローナル抗体を用いた標的細胞のプレインキュベーションによって完全に阻害され得るだろう（Multhoff ら、（1995） Int. J. Cancer 61、272）。対照的に、Ｈｓｐ７０膜陰性腫瘍細胞のより低い溶解性は、Ｈｓｐ７０抗体を用いたインキュベーション後も影響を受けないままであった。技術的に、ＮＫ細胞から腫瘍細胞へ、細胞間接触によって移動するグランザイムＢの絶対量を定量することはできない。しかしながら、グランザイムＢ放出の相対値は、ELISPOT分析によって測定可能であろう。したがって、ＣＸ＋／ＣＸ−およびＣｏｌｏ＋／Ｃｏｌｏ−腫瘍細胞に対する、新鮮に単離された、未刺激の（ＮＫ ｄ０）およびＴＫＤ刺激されたＮＫ細胞（ＮＫ ｄ３）の細胞応答の比較を、グランザイムＢの放出と同時に行った。腫瘍細胞株およびＥ：Ｔ細胞比とは無関係に、未刺激の腫瘍細胞（ＮＫ ｄ０）を用いてコインキュベートすると、通常非常に低いグランザイムＢ放出が起こり、スポットの数は通常２０未満であった。３日間のＴＫＤでの刺激（ＮＫ ｄ３）後、腫瘍細胞とともに４時間コインキュベートすると、グランザイムＢは有意にアップレギュレートした。Ｅ：Ｔ比が５：１のとき、３つの独立した実験において測定されたように、グランザイムＢスポットの数は、下記のとおりとなった。ＣＸ＋：２６０±２０、ＣＸ−：１６５±６；Ｃｏｌｏ＋：１３７±５５；Ｃｏｌｏ−：６６±８。同時に、Ｈｓｐ７０膜陽性腫瘍標的細胞（ＣＸ＋／Ｃｏｌｏ＋）は、それらの陰性対応物（ＣＸ−／Ｃｏｌｏ−）と比較して、有意に良好に溶解した。これらのデータは、ＴＫＤ活性化ＮＫ細胞によるＨｓｐ７０膜陽性腫瘍細胞の溶解は、グランザイムＢ放出と関連していることを強く示唆する。グランザイムＢと膜結合Ｈｓｐ７０ペプチドＴＫＤとの相互作用は、腫瘍細胞取り込みおよびアポトーシス誘発にとって重要であるとの仮説がたて���れる。ＰＢＳで洗浄することによってＮＫ細胞を除去し、腫瘍細胞をＤＡＰＩで染色した。Ｈｓｐ７０膜陽性ＣＸ＋細胞は、ＤＮＡフラグメンテーションを示したが、ＮＫ細胞でコインキュベーション後、Ｈｓｐ７０膜陰性ＣＸ−細胞はそれを示さなかった。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色によっても同じ結果が得られた（データは示さず）。これらの観察は、ＴＫＤ活性化ＮＫ細胞は、アポトーシスを誘発することによって、Ｈｓｐ７０膜陽性ＣＸ＋細胞を殺滅すること、そしてそれはまたグランザイムＢの濃度を上昇させていたことを強く示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、Ｈｓｐ７０タンパク質およびＨｓｐ７０ペプチドＴＫＤの相互作用のパートナーとしてのグランザイムＢの同定を示す図である。図１Ａ：Ｈｓｐ７０タンパク質（Ｈｓｐ７０）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＨｓｐ７０ペプチド（ＴＫＤ）カラムを、ＮＫ細胞株ＹＴの細胞溶解物または非ＮＫ細胞株Ｋ５６２とともにインキュベートした。結合したタンパク質を５つの画分（Ｆ１〜Ｆ５）のカラムから溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に溶解した。銀染色後、Ｈｓｐ７０およびＴＫＤカラムから得られたＹＴ細胞の溶出物は、画分２（Ｆ２）および３（Ｆ３）に、強い３２ｋＤａのタンパク質バンドが現れた。ＢＳＡカラムから得られたＹＴ溶出物およびＴＫＤカラムから得られたＫ５６２溶出物中には３２ｋＤａタンパク質バンドは検出できなかった。３２ｋＤａバンドの位置を矢印にて示す。  図１Ｂ：ＴＫＤカラムから得られた、クーマシーブルー染色された３２ｋＤａバンドの画分３（Ｆ３）のトリプシンペプチドは、ヒトグランザイムＢに対応する。同一性の確率は１００％であり、推定Ｚスコアは、＞９５％の信頼度に該当する１．８９であった。  図１Ｃ：Ｈｓｐ７０タンパク質（Ｈｓｐ７０）およびＨｓｐ７０ペプチド（ＴＫＤ）カラムを用いたインキュベーション後の、ＹＴおよびＫ５６２細胞溶出物（Ｆ３）の対応するウェスタンブロット分析。該ブロットを、オートラジオグラフ解析し、グランザイムＢの局在性をグランザイムＢ特異的ｍＡｂ ２Ｃ５を用いて免疫染色することによって視覚化した。ＹＴ細胞（左）の溶出物には、３２ｋＤａグランザイムＢタンパク質バンドが明らかに認められたが、Ｋ５６２細胞（右）には認められなかった。  図１Ｄ：アイソタイプが一致する陰性対照抗体（破線）との比較における、フィコエリトリン（ＰＥ）結合グランザイムＢ特異的モノクローナル抗体ＨＣ２−ＰＥ（実線）を用いた、透過ＹＴ細胞（左）およびＫ５６２細胞（右）の細胞内フローサイトメトリー。ＹＴ細胞のみが細胞質グランザイムＢを含有しており、Ｋ５６２細胞は含有していない。
【図２】図２は、Ｈｓｐ７０膜陽性腫瘍細胞による、グランザイムＢ（ｇｒＢ）の特異的細胞表面結合および取り込みを示す図である。図２Ａ：４℃でのグランザイムＢ（２μｇ/ｍｌ）のＣＸ＋／Ｃｘ−およびＣｏｌｏ＋／Ｃｏｌｏ−腫瘍細胞の細胞表面への結合の比較、ならびに３７℃への温度シフト後３０分間の、フィコエリトリン（ＰＥ）結合グランザイムＢ特異的モノクローナル抗体ＨＣ２−ＰＥを用いた、細胞質ゾルへの取り込みの比較示す。第１の列は、光顕微鏡検査、第２の列は、グランザイムＢ無しの細胞の免疫蛍光法（対照）、第３の列は、明記されているように（ｇｒＢ）グランザイムＢの添加後の免疫蛍光法を示す。同じ結果を示した３つのうち、１つの代表的な蛍光顕微鏡検査を示している。倍率４０倍。  図２Ｂ：３７℃で３０分間、１μｇ/ｍｌ、２μｇ/ｍｌ、４μｇ/ｍｌのグランザイムＢを用いた腫瘍細胞のインキュベートを行う前（破線）と後（実線）のグランザイムＢ特異的モノクローナル抗体ＨＣ２−ＰＥを用いた透過ＣＸ＋／ＣＸ−（ｎ＝２）およびＣｏｌｏ＋／Ｃｏｌｏ−（ｎ＝４）腫瘍の細胞内フローサイトメトリーを示す。細胞外のグランザイムＢの取り込みを示すグランザイムＢのピークの用量依存的な右へのシフトがＣＸ＋およびＣｏｌｏ＋細胞のみに示され、ＣＸ−およびＣｏｌｏ−には示されていなかった。
【図３】図３は、Ｈｓｐ７０膜陽性腫瘍細胞中の単離されたグランザイムＢ（ｇｒＢ）によってアポトーシスが選択的に誘導される実験を示す図である。  図３Ａ：未処理（黒いバー）またはカンプトテシン（４μｇ/ｍｌ；明るい灰色のバー）もしくはグランザイムＢ（６ｎｇ/ｍｌ；濃い灰色のバー）で４時間、１２時間および２４時間インキュベートを行った後の、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ陽性ならびにヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性ＣＸ＋／Ｃｏｌｏ＋（左）およびＣＸ−／Ｃｏｌｏ−（右）細胞のパーセンテージ。データは、３〜４の独立した実験における中間値±標準偏差で表している。対照とは有意に異なる値（ｐ＜０．０５）に＊を付している。  図３Ｂ：未処理（対照）またはグランザイムＢ（ｇｒＢ）を用いて２４時間インキュベートを行った後の、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ陽性ならびにヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性ＣＸ＋およびＣＸ−細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ陽性染色細胞のパーセンテージを各グラフの右下の角にパーセンテージで示している。  図３Ｃ：未処理（対照）またはカンプトテシン（cａｍ、４μｇ/ｍｌ）もしくはグランザイムＢ（ｇｒＢ、１０ｎｇ/ｍｌ）で２４時間処理した後の、接着成長（adherent growning）ＣＸ＋／ＣＸ−およびＣｏｌｏ＋／Ｃｏｌｏ−腫瘍細胞クラスターの光顕微鏡分析を示す。スケールバーは１００μｍを示す。  図３Ｄ：並行して、未処理（対照）、またはカンプトテシン（ｃａｍ）もしくはグランザイムＢ（ｇｒＢ）で処理したＣＸ＋／ＣＸ−およびＣｏｌｏ＋／Ｃｏｌｏ−（２４時間）をＤＡＰＩで染色した。かなりの核ＤＮＡフラグメンテーションがカンプトテシン（中間パネル）を用いてインキュベートした後の、すべての腫瘍サブラインにおいて観察された。グランザイムＢを用いてインキュベートした後は、ＣＸ＋およびＣｏｌｏ＋細胞のみに核ＤＮＡフラグメンテーションが認められた（下のパネル、左）。グランザイムＢを用いたインキュベーションの後のＣＸ−およびＣｏｌｏ−細胞においてアポトーシスの徴候は認められなかった（下のパネル、右）。スケールバーは１０μｍを表す。
【図４】図４は、Ｈｓｐ７０膜陽性腫瘍細胞の殺滅を証明する実験を示す図である。グランザイムＢ陽性ＮＫ細胞によって媒介されたアポトーシスは、Ｈｓｐ７０特異的ｍＡｂによって遮断可能である。  図４Ａ：未処理（対照）またはＨｓｐペプチドＴＫＤ刺激ＮＫ細胞（＋ＮＫ）を用いて１２時間コインキュベートした、Ｈｓｐ７０膜陽性ＣＸ＋およびＨｓｐ７０膜陰性ＣＸ−細胞コロニーのの光顕微鏡検査（倍率２０倍）を示す。エフェクタ対標的細胞の比率（Ｅ：Ｔ）は２０：１であった。スケールバーは、２００μｍを示しており、各グラフの右下角の挿入図は、１つの代表的な細胞コロニーの例を示す。倍率２．５倍。  図４Ｂ：未処理（ＮＫ ｄ０）およびＨｓｐ７０ペプチドＴＫＤ刺激ＮＫ細胞（ＮＫ ｄ３）によるＣＸ＋／Ｃｏｌｏ＋（左パネル）およびＣＸ−／Ｃｏｌｏ−（右パネル）腫瘍標的細胞の細胞殺滅を５１Ｃｒ放出アッセイによって定量化した。未処理ＮＫ細胞（ＮＫ ｄ０）対ＴＫＤ刺激ＮＫ細胞（ＮＫ ｄ３）における細胞内グランザイムＢレベルは、１．４倍増加し、同時に、ＣＸ＋細胞の溶解は、１．５倍増加した。Ｃｏｌｏ＋細胞のそれは、異なるエフェクタ対標的比率において２．０倍であった。ＣＸ−およびＣｏｌｏ−腫瘍細胞の溶解は、影響を受けなかった。  また、ＣＸ＋およびＣｏｌｏ＋細胞に対する、ＴＫＤ刺激ＮＫ細胞（ＮＫ ｄ３、Ｈｓｐ７０ ｍＡｂ）の細胞溶解性活性の増加は、Ｈｓｐ７０特異的抗体によって、Ｈｓｐ７０膜陰性腫瘍細胞の溶解のレベル（１．７倍阻害、点線）まで完全に阻害された。２：１〜２０：１の範囲のＥ：Ｔ比率で、細胞毒性を決定した。各標的細胞の自発的放出は、１０％以下であった。データは、３つの独立した実験の中間値±標準偏差で表している。
【図１Ａ−１Ｂ】
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【図１Ｃ−１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ−３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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