(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱処理された食品のアクリルアミド含有率を、相当する遺伝子的に改変されていない植物の植物材料から生成した相当する熱処理された食品と比較して減少させる方法であって、
ａ）遺伝子的な改変が、野生型植物からの相当する遺伝子的に改変されていない植物材料と比較して還元糖の含有率の減少をもたらし、そして遺伝子的な改変が、遺伝子的に改変されていない野生型植物の相当する植物細胞と比較して、植物細胞中に存在する１種又はそれより多くの内因性Ｒ１タンパク質の活性の減少をもたらす、遺伝子的に改変された植物材料を選択すること、
ｂ）該植物材料を加工して食品を得ること、そして
ｃ）加工工程ｂ）において生成した食品をディープファットフライング、フライング又はパーフライングにより熱処理すること、
を含む方法。
【請求項２】
該アクリルアミド含有率を、相当する遺伝子的に改変されていない植物の植物材料から生成した相当する熱処理された食品のアクリルアミド含有率と比較して少なくとも１５％減少させる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該アクリルアミド含有率を、相当する遺伝子的に改変されていない植物の植物材料から生成した相当する熱処理された食品のアクリルアミド含有率と比較して少なくとも３０％減少させる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該熱処理が少なくとも１００℃の温度で行われる、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
該遺伝子的な改変が、１種又はそれより多くの外来核酸分子の導入であり、該外来核酸分子の存在及び／又は発現が遺伝子的に改変されていない野生型植物の相当する植物細胞と比較して植物細胞中に存在する１種又はそれより多くの内因性Ｒ１タンパク質の活性の減少をもたらす、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
該外来核酸分子が、
（ａ）Ｒ１タンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の減少を引き起こす少なくとも１種のアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ分子、
（ｂ）コサプレッション効果により、Ｒ１タンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の減少をもたらすＤＮＡ分子、
（ｃ）Ｒ１タンパク質をコードする内因性遺伝子の転写物を特異的方法で開裂する少なくとも１種のリボザイムをコードするＤＮＡ分子、
（ｄ）ｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発により導入されそして内因性Ｒ１タンパク質をコードする遺伝子における突然変異又は異種配列の挿入をもたらす核酸分子であって、該突然変異又は挿入が該遺伝子の発現の減少又は不活性Ｒ１タンパク質の合成を引き起こす、核酸分子、
（ｅ）少なくとも１種のアンチセンスＲＮＡと少なくとも１種のセンスＲＮＡを同時にコードするＤＮＡ分子であって、該アンチセンスＲＮＡと該センスＲＮＡがＲ１タンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の減少を引き起こす二本鎖ＲＮＡ分子を形成する、ＤＮＡ分子、
（ｆ）トランスポゾンを含有するＤＮＡ分子であって、該トランスポゾン配列の組込みがＲ１タンパク質をコードする内因性遺伝子における突然変異または挿入をもたらし、該突然変異又は挿入が該遺伝子の発現の減少又は不活性Ｒ１タンパク質の合成を引き起こす、ＤＮＡ分子、及び
（ｇ）Ｒ１タンパク質をコードする内因性遺伝子における挿入により、Ｒ１タンパク質をコードする遺伝子の発現の減少又は不活性Ｒ１タンパク質の合成を引き起こすＴ−ＤＮＡ分子、
よりなる群から選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
該植物材料がジャガイモ植物を起源とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
該熱処理された食品が、ポテトクリスプ、（ポテト）チップ、パーフライドポテトチップ、マッシュドポテト、コロッケ、ウエッジ及びポテトスティックよりなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
相当する遺伝子的に改変されていない植物の植物材料から生成した相当する熱処理された食品と比較して減少したアクリルアミド含有率を有する、熱処理された食品を製造するための、遺伝子的に改変された植物材料の使用であって、
ここで遺伝子的な改変が、野生型植物からの相当する遺伝子的に改変されていない植物材料と比較して還元糖の含有率の減少をもたらし、そして遺伝子的な改変が、遺伝子的に改変されていない野生型植物の相当する植物細胞と比較して、植物細胞中に存在する１種又はそれより多くの内因性Ｒ１タンパク質の活性の減少をもたらし、該熱処理が、ディープファットフライング、フライング又はパーフライングである、使用。
【請求項１０】
該アクリルアミド含有率が、相当する遺伝子的に改変されていない植物の植物材料から生成した相当する熱処理された食品のアクリルアミド含有率と比較して少なくとも１５％減少している、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
該熱処理された食品が、ポテトクリスプ、（ポテト）チップ、パーフライドポテトチップ、マッシュドポテト、コロッケ、ウエッジ及びポテトスティックよりなる群から選択される、請求項９又は１０記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慣用の熱処理された食品と比較して、熱処理された食品のアクリルアミド含有率を減少させる方法に関する。
【０００２】
最近、スエーデン国家食品行政機関（Swedish National Food Administration）（ＮＦＡ）及びストックホルム大学からの科学者は新しい研究結果を公表したが、それによれば、製造時に高い熱処理を受ける種々の食品において、毒性でありそして多分発癌性物質であるアクリルアミドが形成される。ＮＦＡは国際的協力及び研究を刺激するために、他の国家及び国際機関及び機構に知らせた。その理由は、食品を加熱する際のアクリルアミドの形成は明らかに広く行きわたった現象であるからである。次いで２００２年夏に、ジュネーブで、国連の食料農業機構（ＦＡＯ）及び世界保健機関（ＷＨＯ）により協同で開催された専門家協議会（食品中のアクリルアミドの健康への関係に関するＷＨＯ、ＦＡＯ／ＷＨＯ協議会）（WHO、FAO/WHO Consultation on the Health Implications of Acrylamide in Foods）（ジュネーブ、２００２年６月２５〜２７日）が行われた。
【０００３】
専門家協議会はアクリルアミドの毒物学的作用の本質的な最終点として下記のこと：神経毒性、生殖毒性、突然変異誘発性（mutagenicity）及び発癌性を論議した。
【０００４】
特に、専門家協議会は、アクリルアミド及びその代謝産物グリシドアミドの遺伝毒性潜在力は重要な役割を演じるという見解から出発した。ｉｎ  ｖｉｖｏで、アクリルアミドは体細胞及び生殖細胞において遺伝毒性である。ゆえに、アクリルアミドは遺伝子及び染色体のレベルで遺伝される損傷を引き起こすことがありうる。知られているとおり、その代謝産物の１つは化学的に反応性のエポキシドであるグリシドアミドであり、これはＤＮＡと直接反応しそしてアダクトを形成することができる。遺伝毒性機構はアクリルアミドの発癌性において重要な役割を演じることが強調された。
【０００５】
専門家協議会は、実験室動物に関する研究からの入手可能なデータを評価した。協議会は、特に発癌性の遺伝毒性機構の重要性を強調しそして、今日まで、追加の別の機構について、例えばホルモン的な性質のいかなる証拠もほとんど与えられていないという意見であった。
【０００６】
国際専門家協議会は、部分的に製造に依存して、ある種の食品中に存在する他の発癌性物質、例えば、ベンゾピレン、の発癌性影響力に匹敵しうるラットにおけるアクリルアミドの発癌性影響力を述べている。しかしながら、アクリルアミドは食品中の今日まで見出されたすべての他の発癌性物質よりも高い含有率で存在すると言われている。ヒトについては、食品中の発癌性物質の相対的影響力は未知である。働いているときにさらされる労働者の疫学的研究からのデータはあまり重要ではない。何故ならば、それらは癌の危険のわずかな変化を決定するのにまったく適当ではないからである。総体的に、専門家協議会は、食品中のアクリルアミドの存在を懸念を引き起こすものとして評価した。
【０００７】
入手可能なデータに基づいて、ＷＨＯ／ＦＡＯ専門家協議会は、食品は消費者がさらされることに重要な寄与をするという結論に至った。
【０００８】
アクリルアミドは、ある種の食品が相対的に高い温度で製造されるときに形成される。高い温度に加えて、高い温度にさらされる期間が重要な役割を果たす。国際専門家協議会は機構の形成のためのいかなる他の信頼性のある証拠も見出さなかった。専門家協議会によれば、アクリルアミド形成の機構はまだ理解さていない。
【０００９】
ある実験条件下に、アクリルアミドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、アミノ酸、特にアスパラギン（Mottram et al.,Nature 419,(2002),448;Stadler et al.,Nature 419,(2002),449）と糖、例えばフルクトース、ガラクトース、ラクトース又はスクロース（Stadler et al.,Nature 419,(2002),449）との反応において形成されるようである。
【００１０】
熱処理された食品中のアクリルアミド含有率の変動性の原因はまだ十分には理解されていない（食品中のアクリルアミドの健康への関係に関するＷＨＯ、ＦＡＯ／ＷＨＯ協議会）（ジュネーブ、２００２年６月２５〜２７日）。
【００１１】
ＥＡＯ及びＷＨＯにより開催された国際専門家協議会は、食品の加工条件とアクリルアミドの形成との関係及びアクリルアミド含有率を最小化するための加工条件の最適化の研究を推奨した。
【００１２】
熱処理された食品のアクリルアミド含有率を最小にする方法は先行技術では今日までまだ記載されておらずそして緊急に必要とされる。ゆえに、本発明の基礎をなす目的は、慣用の熱処理された食品と比べて減少したアクリルアミド含有率を有する熱処理された食品の製造を可能とする方法を提供することである。
【００１３】
この目的は、特許請求の範囲に記載された態様の提供により達成される。
【００１４】
ゆえに、本発明は、熱処理された食品のアクリルアミド含有率を、相当する慣用の熱処理された食品と比較して減少させる方法であって、
ａ）相当する慣用の植物材料と比較して可溶性糖及び／又はアミノ酸の減少した含有率を有する植物材料を提供するか又は選択すること、
ｂ）該植物材料を加工して食品を得ること、そして
ｃ）加工工程ｂ）において生成した食品を熱処理する、
ことを含む方法に関する。
【００１５】
２−プロペンアミド、ビニルアミド又はエチレンカルボキサミドとも呼ばれるアクリルアミド（ＣＡＳ番号７９−０６−１）は、水にきわめて可溶性であるがヘプタンには不溶性である室温で無色の固体である。本発明に関して、「アクリルアミド含有率の減少」という用語は、相当する慣用の熱処理された食品のアクリルアミド含有率と比較して、少なくとも１５％、特に少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、７５％、特に好ましくは少なくとも９０％のアクリルアミド含有率の減少を意味すると理解されるべきである。
【００１６】
食品のアクリルアミド含有率を決定する方法は、例えば、Tareke et al.（J.Agric.Food Chem.50,(2002),4998-5006）に記載されている。アクリルアミドは、誘導体化（例えばジブロモ化合物を形成するための）の後ＧＣ／ＭＳにより、又はＬＣ／ＭＳ−ＭＳにより、好ましくはTareke et al.（J.Agric.Food Chem.50,(2002),4998-5006）により記載されたＬＣ／ＭＳ−ＭＳにより定量的に決定された。ジブロモ生成物を形成するための誘導体化は、例えば、US Environmental Protection Agency（＝ＥＰＡ）のＥＰＡ法８０３２Ａ（http://www.epa.gov/epaoswer/hazwaste/test/pdfs/8032a.pdf,December 1996 version, “Acrylamide by gas chromatography”）におけると同じように行うことができる。本発明に関して、誘導体化は、好ましくは、ＥＰＡ法８０３２Ａに従って行われる。
【００１７】
本発明に関して、「食品」という用語は、植物材料を含有するいかなる食品も意味するものと理解されるべきである。この用語は、特に、予備工程、例えば、「熱処理された食品」を製造するための適当な、パン生地混合物（dough mixtures）、ポテトスライス、ポテトストリップ、顆粒（granules）及びトウモロコシ粒（maize grains）を含む。予備工程、特に熱処理された食品を製造するためのポテトスライスは、予備加熱調理された（precooked）もしくはブランチングされた（blanched）形態又は冷凍された形態で存在することもできる。
【００１８】
本発明に関して、「熱処理された食品」という用語は、＞１００℃、好ましくは１１０℃〜２３０℃、特に１２０℃〜２００℃、好ましくは１５０℃〜１７０℃、特に好ましくは１５０℃〜１８０℃の温度にさらされたいかなる食品も意味するものと理解されるべきである。本発明に関して、「熱処理」という用語は、標準圧力条件下に１００℃より高い温度に導くいかなる処理も意味すると理解されるべきであり、特に、それはディープファットフライング（deep-fat frying）、グリル（grilling）、フライング（frying）、ロースティング（roasting）、押出し、バッキング（backing）もしくはマイクロ波加熱、オートクレーブ処理又はパーフライング（parfrying）を意味すると理解されるべきである。
【００１９】
熱処理時間は、食品に依存して異なることができる。絶対アクリルアミド含有率は常に熱処理時間と共に増加する。本発明の助けにより、慣用の熱処理された食品と比較して、定められた方法により定められた時間定められた温度で熱処理された食品のアクリルアミド含有率を低くすることが今や可能である。
【００２０】
本発明に関して、特にポテトチップ（potato chips）及びポテトクリスプ（potato crisps）に関しては、熱処理は、これがディープファットフライングプロセスであるとき、１０秒〜８分間、好ましくは２〜５分間、特に好ましくは２〜３分間行われる。熱処理がベーキングプロセスであるならば、熱処理は、本発明に関しては、１〜１２０分、好ましくは５〜３０分間行われる。
【００２１】
本発明に関しては、特に部分的にフライングされた（パーフライド（parfried））ポテトチップに関しては、ポテトストリップの熱処理は、３０秒〜６００秒、好ましくは６０秒〜３６０秒間行うことができる油中でのディープファットパーフライングプロセス（deep-fat parfrying process）であり、及び／又はパーフライング温度は１２０℃〜２００℃、好ましくは１３０℃〜１７０℃の範囲にあることができる。一般に、パーフライング時間はポテトスライスの水分を７５重量％より少ない水分含有率に減少させるのに十分であるべきである。フライングによる仕上げ調整（finish preparation）を意図したパーフライングされそして冷凍されたポテトストリップは、典型的には６０〜７０重量％の水分含有率となるようにパーフライングされる。オーブン加熱による仕上げ調整を意図した冷凍されたポテトストリップは一般に６０重量％未満、好ましくは４０〜５５重量％、更に好ましくは４４〜５０重量％のより低い水分含有率となるようにパーフライングされる。
【００２２】
パーフライング工程に必要な実際の時間は、特定の油の温度、ポテトスライスの寸法及び温度、バッチサイズ、フライング鍋の容積及びポテトスライスの最初の水分含有率を含むいくつかのファクターにより決定される。
【００２３】
好ましくは、水分含有率は国際特許出願ＷＯ９７／４０７０７Ａ１の１４頁に記載のようにして決定される。
【００２４】
このような「熱処理された食品」の例は、ポテトクリスプ（この英国用語に対する同義語は米国用語「ポテトチップ」である）、（ポテト）チップ（この英国用語に対する同義語は米国用語「フレンチフライ」である）、パーフライドポテトチップ（場合により熱処理の後冷凍されてもよい）、マッシュドポテト、ビスケット、クラッカー、クリスプブレッド（crisp bread）、ブレックファーストシリアル、メイズクリスプ（maize crisps)（タコス）、ポップコーン、ブレッドクリスプ（bread crisps）、ウエイハー、サルトスティック（salt sticks）、コーヒー、パン、ロール、ケーキ、ライスクリスプ（rice crisps）、ピザ及びトースト、更にトルティーヤ、コロッケ、ウエッジ（wedges）、ポテトスティック（potato sticks）、ツイストパン、肉、魚及び野菜のためのパンコーティング、ナッツのためのパンコーティング、トルティーヤチップ、パン及び種々の焼成製品（baked goods）及びシリアル配合物（cereal formulations）、並びに予備加熱調理されたミール（pre-cooked meals）、特にベビーフードである。
【００２５】
本発明に関して、英国用語「ポテトクリスプ」及び「ポテトチップ」は、同義の米国用語「ポテトチップ」及び「フレンチフライ」の代わりに使用される。
【００２６】
本発明に関して、「慣用の熱処理された食品」という用語は、慣用の植物材料から製造された食品を意味すると理解されるべきである。本発明に関して、「相当する慣用の熱処理された食品」という用語は、好ましくは、相当する慣用の植物材料と比較して遺伝子改変により可溶性糖及び／又はアミノ酸の減少した含有率を有する本発明に従って使用されるべき植物材料と同じ方法で加工及び熱処理された、慣用の植物材料から製造された熱処理された食品に関する。
【００２７】
本発明に関して、「植物材料」という用語は、植物からなるか又は植物の一部を含むいかなる材料も意味するものと理解されるべきである。好ましくは、該植物の一部は植物の収穫された産物、例えば、塊茎、果実、種子、タマネギ、葉及び根である。植物材料は、いかなる所望の植物種から生じるものであってもよく、即ち、単子葉植物及び双子葉植物の両方から生じるものであることができる。好ましくは、これは農業による農場植物（agricultural farmed plants）、即ち、栄養補給の目的又は技術的、特に工業的な目的でヒトにより栽培される植物からの植物材料である。デンプン質植物（例えば、コムギ、オオムギ、オーツムギ、ライムギ、ジャガイモ、トウモロコシ、イネ、エンドウ豆、キャッサバ）、特にジャガイモ植物からの植物材料が特に好ましい。
【００２８】
本発明に関して、「慣用の植物材料」という用語は、特に、相当する遺伝子改変されていない植物、即ち、相当する野生型植物と比較して、可溶性糖、特にグルコース及び／又はフルクトースの含有率の減少及び／又はアミノ酸、特にアスパラギンの含有率の減少をもたらす遺伝子改変を持たない植物の植物材料を意味するものと理解されるべきである。しかしながら、本発明に関して、慣用の植物材料は、他の面で遺伝子改変されている遺伝子改変された植物から生じるものであることもできるが、この遺伝子改変は、相当する野生型植物と比較して、可溶性糖、特にグルコース、及び／又はフルクトースの含有率の減少及び／又はアミノ酸、特にアスパラギンの含有率の減少をもたらさない。
【００２９】
「遺伝子改変」という用語は後に定義される。
【００３０】
本発明に関して、「可溶性糖」という用語は植物材料中に存在するいかなる水溶性糖も意味するものと理解されるべきであり、好ましくは、可溶性糖はヘキソース、好ましくは還元糖、特にフルクトース及び／又はグルコースである。
【００３１】
本発明に関して、「可溶性糖の含有率を減少させる」又は「可溶性糖の減少した含有率」という用語は、相当する慣用の熱処理された食品又は相当する慣用の植物材料の可溶性糖、特にフルクトース及び／又はグルコースの含有率と比較して、可溶性糖の含有率を減少させること、好ましくは、植物材料の可溶性糖、特にフルクトース及び／又はグルコースの含有率を少なくとも１０％、特に少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、特に好ましくは少なくとも４０％、特に５０〜９５％、好ましくは、６０％〜９０％減少させることを意味すると理解されるべきである。
【００３２】
本発明に関して、「アミノ酸」という用語は、植物材料中に存在するいかなるアミノ酸も意味し、好ましくは、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、メチオニン、トレオニン及びバリン、更に好ましくは、アスパラギンを意味するものと理解されるべきである。
【００３３】
本発明に関して、「アミノ酸の含有率を減少させる」又は「アミノ酸の減少した含有率」という用語は、相当する慣用の熱処理された食品又は相当する慣用の植物材料のアミノ酸、特にアスパラギンの含有率と比較して、植物材料のアミノ酸の含有率を減少さること、好ましくは、植物鎖料のアミノ酸、特に、アスパラギンの含有率を少なくとも１０％、特に少なくとも１５％、好ましくは、少なくとも２０％、特に好ましくは少なくとも４０％減少させることを意味するものと理解されるべきである。
【００３４】
熱処理された食品中のアクリルアミド含有率の変動性の原因は、まだ十分に理解されておらず（食品中のアクリルアミドの健康との関係に関するＷＨＯ、ＦＡＯ／ＷＨＯ協議会）（ジュネーブ、２００２年６月２５〜２７日）、それゆえ今日まで熱処理された食品のアクリルアミド含有率を最小にする方法は記載されていない。特に、それらの基礎として特定の植物材料の選択を伴う方法は記載されていない。
【００３５】
驚くべきことに、熱処理された食品を製造するために使用される出発植物材料の選択はこのような食品のアクリルアミド含有率に対する決定的に重要な効果を有することが今や見出された。本発明は、相当する慣用の植物材料と比較して可溶性糖及び／又はアミノ酸の減少した含有率を有する植物材料の使用により、熱処理後、可溶性糖及び／又はアミノ酸の慣用の含有率を有する植物材料を使用する場合よりも低いアクリルアミド含有率を有する食品の製造が可能となることを始めて教示する。ゆえに、本発明は、熱処理された食品におけるアクリルアミドの形成を回避するために、可溶性糖及び／又はアミノ酸の相対的に低い含有率を有する植物材料を使用することを教示する。
【００３６】
植物材料中の糖、特に、フルクトース及びグルコースの含有率を決定する方法は当業者に知られておりそして例えば、Miuller-Roeber et al.（Mol.Gen.Genet.224,(1990),136-146）及び下記するテキストにも記載されている。本発明に関して、グルコース、フルクトース及び／又はスクロースの含有率の決定は好ましくは下記の如くして行われる（「グルコース、フルクトース及びスクロースの決定」）。
【００３７】
植物材料中のアミノ酸、特にアスパラギンの含有率を決定する方法は当業者に知られておりそして、例えば、Cohen,Meys,Tarvin(1988),The pico-tag method: A Manual of advanced techniques for amino acid analysis,Millipore Corporation,Milford,Mass.,USAに記載されている。Roessner et al（Plant Physiology 127,(2001),749-764）により記載された方法が好ましい。
【００３８】
本発明の方法の更なる態様では、使用される植物材料は、それが遺伝子改変されており、この遺伝子改変は、野生型植物の相当する慣用の植物材料と比較して、可溶性糖、特にグルコース及び／又はフルクトースの含有率の減少をもたらすことを特徴とする。
【００３９】
本発明に関して、「遺伝子改変」は、野生型植物の相当する慣用の植物材料と比較して可溶性糖の含有率の減少をもたらすいかなる遺伝子改変であってもよい。
【００４０】
本発明に関して、遺伝子改変は、１つ又はそれより多くの遺伝子の突然変異誘発により引き起こされることができる。突然変異のタイプは、それが野生型植物の相当する慣用の植物材料と比較して可溶性糖の含有率の減少をもたらすとの条件下に、遺伝子改変にとって決定的に重要ではない。
【００４１】
本発明に関して、「突然変異誘発」という用語は、いかなるタイプの突然変異も意味し、例えば、欠失、点突然変異（ヌクレオチド置き換え）、挿入、逆位、遺伝子変換又は染色体転座を意味すると理解されるべきである。
【００４２】
突然変異は化学的作用物質又は高エネルギー放射（例えば、Ｘ線、中性子、ガンマ線又は紫外線）の使用により引き起こすことができる。化学的に誘発される突然変異を引き起こすために使用することができる作用物質及び相当する突然変異源の反応によりそれによって生じる突然変異は、例えば、Ehrenberg and Husain,1981,(Mutation Research 86,1-113),Miuller,1972(Biologisches Zentralblatt 91(1),31-48)に記載されている。ガンマ線、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ尿素又はナトリウムアジド（ＮａＮ３）を使用するイネ突然変異体の発生は、例えば、Jauhar and Siddiq(1999,Indian Journal of Genetics,59(1),23-28),Rao(1977,Cytologica 42,443-450),Gupta and Sharma(1990, Oryza 27,217-219)及び Satoh and Omura(1981, Japanese Journal of Breeding 31(3),316-326)に記載されている）。ＮａＮ３及びマレイン酸ヒドラジド（１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオン）を使用するコムギ突然変異体の発生は、例えば、Arora et al.(1992,Annals of Biology 8(1),65-69)に記載されている。種々のタイプの高エネルギー放射及び化学的作用物質を使用するコムギ突然変異体の産生の概説は、Scarascia-Mugnozza et al.(1993,Mutation Breeding Review 10,1-28)に与えられている。Svec et al.(1998,Cereal Research Communication 26(4),391-396)は、トリチカレにおける突然変異体を発生させるためのＮ−エチル−Ｎ−ニトロ尿素の使用を記載している。アワ突然変異体を発生させるためのＭＭＳ及びガンマ線の使用は、Shashidhara et al.(1990,Journalof Maharashtra Agricultural Universities 15(1),20-23)に記載されている。
【００４３】
主として栄養生殖する植物種における突然変異体の産生は、例えば、改変されたデンプンを産生するジャガイモについて(Hovenkamp-Hermelink et al.(1987,Theoretical and Applied Genetics 75,217-221)、並びに増加した油収率及び改変された油品質を有するハッカについて(Dwivedi et al.,2000,Journal of Medicinal and Aromatic Plant Sciences 22,460-463)記載されている。
【００４４】
これらの方法のすべては、一般に、遺伝子改変により野生型植物の相当する慣用の植物材料と比較して可溶性糖の減少した含有率を有する植物材料を提供するのに適当であり、ゆえに本発明の方法で使用するために適当である。
【００４５】
適当な遺伝子における突然変異は、当業者に知られている方法を使用して発見されうる。特に、この目的に使用することができる方法は、プローブとのハイブリダイゼーション（Southern blot）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅、該当するゲノム配列の配列決定及び個々のヌクレオチド置換を調査することに基づく分析である。ハイブリダイゼーションパターンに基づいて突然変異を同定するための方法は、例えば、制限断片長多形（restriction fragment length polymorphism)（ＲＦＬＰ）についての調査（Nam et al.,1989,The Plant Cell 1,699-705;Leister and Dean,1993,The Plant Journal 4(4),745-750）である。ＰＣＲに基づく方法は、例えば、増幅断片長多形（amplified fragment length polymorphism）（ＡＦＬＰ）の分析（Castiglioni et al.,1998,Genetics 149,2039-2056; Meksem et al.,2001,Molecular Genetics and Genomics 265,207-214; Meyer et al.,1998,Molecular and General Genetics 259,150-160）である。突然変異を同定するために制限エンドヌクレアーゼにより開裂された増幅した断片の使用（Cleaved Amplified Polymorphic Sequences,CAPS）も使用することができる（Konieczny and Ausubel,1993,The Plant Journal 4,403-410; Jarvis et al.,1994,Plant Molecular Biology 24,685-687;Bachem et al.,1996,The Plant Journal9(5),745-753）。ＳＮＰｓ（一塩基多形）を決定するための方法は、中でも、Qi et al.(2001,Nucleic Acids Research 29(22),e116)Drenkard et al.(2000,Plant Physiology 124,1483-1492)及びCho et al.(1999,Nature Genetics 23,203-207）により記載されている。特に或る遺伝子の突然変異について短時間内に多くの植物を調べることを可能とする方法が適当である。ＴＩＬＬＩＮＧ（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）と呼ばれるこのような方法は、例として、McCallum et al.(2000,Plant Physiology 123,439-442)により記載されている。
【００４６】
これらの方法のすべての使用は、一般に本発明の方法で使用するのに適当な遺伝子改変された植物材料を同定するために適当である。
【００４７】
更に、本発明に関して、使用することができる遺伝子改変された植物材料は、遺伝子工学的方法（アンチセンス、コサプレッション技術、リボザイム、ｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発、ＲＮＡｉ技術等）により産生させることができる。
【００４８】
特に好ましい本発明の方法の更なる態様では、遺伝子改変は、遺伝子改変されていない野生型植物の相当する植物細胞と比較して、植物細胞中に存在する１種又はそれより多くの内因性Ｒ１タンパク質の活性の減少をもたらす。
【００４９】
本発明に関して、「Ｒ１タンパク質」という用語は、例えば、Lorberth et al.(Nature Biotech.16,(1998),473-477),Ritte et al.,(PNAS 99,(2002),7166-7171)及び国際特許出願ＷＯ９８／２７２１２、ＷＯ００／７７２２９、ＷＯ００／２８０５２に記載されておりそして下記の特徴を有するタンパク質を意味するものと理解されるべきである。Ｒ１タンパク質の重要な特徴は、ｉ）それらのアミノ酸配列（例えば、GenBank Acc.No.A61831,Y09533参照）；ｉｉ）植物細胞のプラスチドにおけるそれらの局在化；ｉｉｉ）植物中のデンプンのリン酸化の程度に影響を与えるそれらの能力である。更に、「Ｒ１タンパク質」という用語は、３つの基質、α−ポリグルカン、ＡＴＰ及びＨ２Ｏが３つの生成物、α−ポリグルカン−Ｐ、ＡＭＰ及びオルトホスフェートに転化されるジキナーゼ型反応におけるデンプンのリン酸化を触媒するタンパク質を表す（Ritte et al., PNAS Vol.99No.10,(2002),7166-7171）。「Ｒ１タンパク質」という用語に対してより最近の文献で使用される同義語は、「アルファグルカン  水  ジキナーゼ」に対する略号である「ＧＷＤタンパク質」という用語である（Blennow et al.,Trends in Plant Sciences Vol.7 No.10(2002),445-450）。ゆえに、本発明に関して、「Ｒ１タンパク質」という用語は「ＧＷＤタンパク質」も含む。
【００５０】
例えば、ジャガイモからのＲ１タンパク質をコードするＲ１遺伝子を抑制することは、トランスジェニックジャガイモ植物において、ジャガイモ塊茎から単離されうるデンプンのホスフェート含有率の減少をもたらす。更に、Ｌｏｒｂｅｒｔｈ等は、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍからのＲ１タンパク質は、相当するＲ１ｃＤＮＡがＥ．ｃｏｌｉ中で発現されるときバクテリアグリコーゲンをリン酸化することができることを示す（Lorberth et al.,Nature Biotech.16,(1998),473-477）。
【００５１】
Ritte et al.(Plant J.21,(2000),387-391)は、ジャガイモ植物におけるＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍからのＲ１タンパク質はデンプン粒（starch granules）に可逆的に結合し、デンプン粒への結合の強度は植物の代謝状態に依存していることを示した。デンプン粒に結合した形態では、ジャガイモ植物中のタンパク質は暗所で成長させた葉の中に主として存在する。対照的に、葉を照射した後、タンパク質はデンプン粒に結合されていない可溶性形態で主として存在する。
【００５２】
本発明に関して、トランスジェニックジャガイモ植物又はそれらの塊茎におけるジャガイモＲ１遺伝子の発現を抑制することは低温誘発された甘味料（cold-induced sweetenings）と呼ばれるものの減少をもたらす（Lorberth et al.,Nature Biotech.16,(1998),473-477）、即ち、低温貯蔵された（cold-stored）ジャガイモ塊茎が、遺伝子改変されていない相当する野生型植物の塊茎と比較して、可溶性糖、特にフルクトース及びグルコースの減少した含有率を有するということは特に重要である。
【００５３】
更に、減少したＲ１遺伝子発現を有するこれらのトランスジェニック植物のジャガイモ塊茎は、収穫の直後ですら又は室温での貯蔵の後、遺伝子改変されていない相当する野生型植物の塊茎と比較して、可溶性糖、特にフルクトース及びグルコースの減少した含有率を有する。
【００５４】
減少したＲ１遺伝子発現を有する植物から生じる(低温貯蔵された）ジャガイモ塊茎（Lorberth et al.,Nature Biotech.16,(1998),473-477）のディープファットフライング又はパーフライングは、遺伝子改変されていない相当するジャガイモ塊茎がディープファットフライングされるときよりもディープファットフライングされた製品における顕著に減少したアクリルアミド形成をもたらすことが、本発明によって始めて証明された。アクリルアミド形成の減少は驚くほど高い。
【００５５】
本発明の方法の更なる態様では、遺伝子改変は、遺伝子改変されていない野生型植物の相当する植物細胞と比較して、植物細胞中に存在する１種又はそれより多くの内因性インベルターゼタンパク質の活性の減少をもたらす。
【００５６】
本発明に関して、「インベルターゼタンパク質」という用語は、インベルターゼの酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解されるべきである。インベルターゼは、スクロースのグルコース及びフルクトースへの開裂を触媒する。好ましくは、本発明に関して、これらは酸インベルターゼであり、これらは液胞インベルターゼとも呼ばれ、そして、例えば、Zrenner et al.(Planta 198,(1996),246-252)に記載されている。
【００５７】
減少したインベルターゼ活性を有するジャガイモ植物は、例えば、Zrenner et al.(Planta 198,(1996),246-252)及びGreiner et al.(Nature Biotechnology 17,(1999),708-711)に記載されている。
【００５８】
本発明に関して、トランスジェニックジャガイモ植物、特にタバコからの液胞インベルターゼ阻害剤を発現するトランスジェニックジャガイモ植物（Greiner et al,Nature Biotechnology 17,(1999),708-711）におけるインベルターゼ活性の減少は、遺伝子改変されていない相当する野生型植物の塊茎と比較して、可溶性糖、特に、フルクトース及びグルコースの減少した含有率を有するこれらのトランスジェニック植物の低温貯蔵されたジャガイモ塊茎をもたらすことは特に重要である。
【００５９】
本発明に関して、「活性の減少」という用語は、Ｒ１又はインベルターゼタンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の相当する遺伝子改変されていない細胞と比べた減少、及び／又は植物材料の細胞中のＲ１又はインベルターゼタンパク質の量の減少、及び／又は植物材料の細胞中のＲ１又はインベルターゼタンパク質の酵素活性の減少を意味する。
【００６０】
本発明に関して、「植物細胞中に存在する１種又はそれより多くの内因性Ｒ１タンパク質の活性の減少」という用語は、相当する遺伝子改変されていない野生型植物の細胞と比べた、Ｒ１タンパク質をコードする１種又はそれより多くの内因性遺伝子の発現の減少、及び／又は植物材料の細胞中のＲ１タンパク質の量の減少、及び／又は植物材料の細胞中のＲ１タンパク質の酵素活性の減少を意味するものと理解されるべきである。
【００６１】
本発明に関して、「植物細胞中に存在する１種又はそれより多くの内因性インベルターゼタンパク質の活性の減少」という用語は、相当する遺伝子改変されていない細胞と比べた、インベルターゼタンパク質をコードする１種又はそれより多くの内因性遺伝子の発現の減少、及び／又は植物材料の細胞中のインベルターゼタンパク質の量の減少、及び／又は植物材料の細胞中のインベルターゼタンパク質の酵素活性の減少を意味するものと理解されるべきである。
【００６２】
発現の減少は、例えば、ノーザンブロット分析又はＲＴ−ＰＣＲによりＲ１又はインベルターゼタンパク質をコードする転写物（transcripts）の量を測定することにより決定することができる。減少は、好ましくは、相当する遺伝子改変されていない細胞と比較して転写物の量において、少なくとも５０％、特に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、特に好ましくは少なくとも９５％の減少を意味する。
【００６３】
問題の植物細胞中のこれらのタンパク質の減少した活性をもたらすＲ１又はインベルターゼタンパク質の量の減少は、例えば、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）又はＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）の如き免疫学的方法により決定することができる。減少は、好ましくは、相当する遺伝子改変されていない細胞と比較してＲ１又はインベルターゼの量において、少なくとも５０％、特に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、特に好ましくは少なくとも９５％の減少を意味する。
【００６４】
Ｒ１タンパク質の酵素活性の減少は、Ritte et al.(PNAS 99,(2002),7166-7171)により記載された酵素アッセイに基づいて決定することができる。
【００６５】
インベルターゼタンパク質の酵素活性の減少は、Greiner et al.(Nature Biotechnology 17,(1999),708)により記載された方法により決定することができる。
【００６６】
Ｒ１又はインベルターゼタンパク質の酵素活性の減少は、好ましくは、相当する遺伝子改変されていない細胞と比較して活性において少なくとも５０％、特に少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％の減少を意味する。
【００６７】
Ｒ１タンパク質の酵素活性の減少は、好ましくは、相当する遺伝子改変されていない細胞のＲ１活性と比較してＲ１の活性において少なくとも５０％、特に少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％の減少を意味する。
【００６８】
インベルターゼタンパク質の酵素活性の減少は、好ましくは、相当する遺伝子改変されていない細胞のインベルターゼ活性と比較してインベルターゼタンパク質の活性において少なくとも５０％、特に少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％の減少を意味する。
【００６９】
本発明の方法の更なる態様では、遺伝子改変は、１種又はそれより多くの外来核酸分子の導入であって、該核酸分子の存在及び／又は発現は、遺伝子改変されていない野生型植物の相当する植物細胞と比較して植物細胞中に存在する１種又はそれより多くの内因性Ｒ１タンパク質の活性の減少をもたらす、外来核酸分子の導入である。
【００７０】
本発明の方法の更なる態様においては、遺伝子改変は、１種又はそれより多くの外来核酸分子の導入であって、該核酸分子の存在及び／又は発現は、遺伝子改変されていない野生型植物の相当する植物細胞と比較して植物細胞中に存在する１種又はそれより多くの内因性インベルターゼタンパク質の活性の減少をもたらす、外来核酸分子の導入である。
【００７１】
本発明に関して、「外来核酸分子（単数）」又は「外来核酸分子（複数）」という用語は、相当する植物細胞中に天然には存在しない分子又は特定の空間的配置（spatial arrangement）において植物細胞中に天然には存在しない分子、又は植物細胞のゲノムにおける部位に局在化されている分子であって、この部位にはそれは天然には存在しない、分子を意味すると理解されるべきである。好ましくは、外来核酸分子は、種々のエレメントからなる組換え分子であって、該エレメントの組み合わせ又はその特定の空間的配置は植物細胞中に天然には存在しない、組換え分子である。
【００７２】
本発明の方法の更なる好ましい態様では、外来核酸分子は、
（ａ）Ｒ１タンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の減少を引き起こす少なくとも１種のアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ分子、
（ｂ）コサプレッション効果により、Ｒ１タンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の減少をもたらすＤＮＡ分子、
（ｃ）Ｒ１タンパク質をコードする内因性遺伝子の転写物を特異的方法で開裂する少なくとも１種のリボザイムをコードするＤＮＡ分子、
（ｄ）ｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発により導入されそして、内因性Ｒ１タンパク質をコードする遺伝子における突然変異または異種配列の挿入をもたらす核酸分子であって、該突然変異又は挿入は該遺伝子の発現の減少又は不活性Ｒ１タンパク質の合成を引き起こす、核酸分子、
（ｅ）少なくとも１種のアンチセンスＲＮＡと少なくとも１種のセンスＲＮＡを同時にコードするＤＮＡ分子であって、該アンチセンスＲＮＡと該センスＲＮＡは、Ｒ１タンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の減少を引き起こす二本鎖ＲＮＡ分子を形成する、ＤＮＡ分子、
（ｆ）トランスポゾンを含有するＤＮＡ分子であって、該トランスポゾン配列の組込みはＲ１タンパク質をコードする内因性遺伝子における突然変異又は挿入をもたらし、該突然変異又は挿入は該遺伝子の発現の減少又は不活性Ｒ１タンパク質の合成を引き起こす、ＤＮＡ分子、及び
（ｇ）Ｒ１タンパク質をコードする内因性遺伝子における挿入により、Ｒ１タンパク質をコードする遺伝子の発現の減少又は不活性Ｒ１タンパク質の合成を引き起こすＴ−ＤＮＡ分子、
よりなる群から選ばれる。
【００７３】
本発明の方法の更なる好ましい態様では、外来核酸分子は、
（ａ）インベルターゼ阻害剤をコードするＤＮＡ分子、
（ｂ）インベルターゼタンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の減少を引き起こす少なくとも１種のアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ分子、
（ｃ）コサプレッション効果により、インベルターゼタンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の減少をもたらすＤＮＡ分子、
（ｄ）インベルターゼタンパク質をコードする内因性遺伝子の転写物を特異的方法で開裂する少なくとも１種のリボザイムをコードするＤＮＡ分子、
（ｅ）ｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発により導入されそしてインベルターゼタンパク質をコードする内因性遺伝子における突然変異又は異種配列の挿入をもたらす核酸分子であって、該突然変異又は挿入は該遺伝子の発現の減少又は不活性インベルターゼタンパク質の合成を引き起こす、核酸分子、
（ｆ）少なくとも１種のアンチセンスＲＮＡと少なくとも１種のセンスＲＮＡを同時にコードするＤＮＡ分子であって、該アンチセンスＲＮＡと該センスＲＮＡはインベルターゼタンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の減少を引き起こす二本鎖ＲＮＡ分子を形成する、ＤＮＡ分子、
（ｇ）トランスポゾンを含有するＤＮＡ分子であって、該トランスポゾン配列の組込みはインベルターゼタンパク質をコードする内因性遺伝子における突然変異又は挿入をもたらし、該突然変異又は挿入は該遺伝子の発現の減少又は不活性インベルターゼタンパク質の合成を引き起こす、ＤＮＡ分子、
（ｈ）インベルターゼタンパク質をコードする内因性遺伝子における挿入により、インベルターゼタンパク質をコードする遺伝子の発現の減少又は不活性インベルターゼタンパク質の合成を引き起こすＴ−ＤＮＡ分子、
よりなる群から選ばれる。
【００７４】
アンチセンス又はコサプレッション技術により遺伝子発現を抑制するために、例えば、Ｒ１タンパク質又はインベルターゼタンパク質及び場合により存在する隣接配列（flanking sequences）をコードする全体配列（entire sequence）を含むＤＮＡ分子を使用することができ、そしてコード配列の一部のみを含むＤＮＡ分子であって、これらの部分は細胞におけるアンチセンス効果又はコサプレッション効果を引き起こすのに十分に長いことが必要である、ＤＮＡ分子も使用することができる。適当な配列は、一般に、１５ｂｐの最小長さ、好ましくは２１ｂｐの最小長さ、好ましくは１００〜５００ｂｐの長さまでの配列であり、そして効果的なアンチセンス又はコサプレッション抑制のために、５００ｂｐを超える長さを有する配列が特に好ましい。これらの記述はＢＥＩ遺伝子発現の抑制に対応して当てはまる。
【００７５】
アンチセンス又はコサプレッションアプローチのために、Ｒ１タンパク質又はインベルターゼタンパク質をコードする植物細胞における内因性配列に対する高度の相同性を有するＤＮＡ配列を使用することも適当である。最小相同性は約６５％より大きくあるべきである。少なくとも９０％、特に９５〜１００％の相同性を有する配列の使用は好ましいはずである。これらの記述はＢＥＩ遺伝子発現の抑制に対応して当てはまる。
【００７６】
更に、アンチセンス又はコサプレッション効果を達成するために、イントロン、即ち、Ｒ１タンパク質又はインベルターゼタンパク質をコードする遺伝子の非コード領域、の使用も考えられる。
【００７７】
デンプン生合成のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子発現を抑制するためのイントロン配列の使用は、例えば、国際特許出願ＷＯ９７／０４１１２、ＷＯ９７／０４１１３、ＷＯ９８／３７２１３、ＷＯ９８／３７２１４に記載されている。これらの記述はＢＥＩ遺伝子発現の抑制に対応して当てはまる。
【００７８】
当業者は、アンチセンス及びコサプレッション効果をいかにして達成するかについては精通している。コサプレッション抑制の方法は、例えば、Jorgensen(Trends Biotechnol.8(1990),340-344),Niebel et al.,(Curr.Top.Microbial.Immunol.197(1995),91-103),Flavell et al.(Curr.Top.Microbial.Immunol.197(1995),43-46),Palaqui and Vaucheret(Plant.Mol.Biol.29(1995),149-159),Vaucheret et al.,(Mol.Gen.Genet.248(1995),311-317)、de Borne et al.(Mol.Gen.Genet.243(1994),613-621)に記載されている。
【００７９】
細胞中のある酵素の活性を減少させるためのリボザイムの発現も当業者に知られておりそして、例えば、ＥＰ−Ｂ１  ０３２１２０１に記載されている。植物細胞中のリボザイムの発現は、例えば、Feyter et al.(Mol.Gen.Genet.250(1996),329-338)に記載されている。
【００８０】
更に、植物材料の植物細胞におけるＲ１又はインベルターゼ活性の減少は、細胞の形質転換により、ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド（「キメロプラス（chimeroplas）」を細胞に導入する「ｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発」により達成することもできる（Kipp,P.B.et al.,Poster Session at the 5th International Congress of Plant Molecular Biology,21-27.September 1997,Singapore;R.A.Dixon and C.J.Arntzen,Meeting report on "Metabolic Engineering in Transgenic Plants",Keystone Symposia,Copper Mountain,CO,USA,TIBTECH 15,(1997),441-447;国際特許出願WO9515972;Kren et al.,Hepatology 25,(1997),1462-1468;Cole-Strauss et al.,Science 273,(1996),1386-1389;Beetham et al.,(1999),PNAS 96,8774-8778）。
【００８１】
ＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドのＤＮＡ成分の一部は、内因性Ｒ１又はインベルターゼ遺伝子の核酸配列に対して相同性であるが、それと比べて、突然変異を有するか又は相同性領域により囲まれている（enclosed）異種領域を含有する。
【００８２】
ＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド及び内因性核酸分子の相同性領域を塩基対化し、次いで相同性組換えにより、ＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドのＤＮＡ成分中に存在する突然変異又は異種領域は植物細胞のゲノム中に移すことができる。これは、１種又はそれより多くのＲ１又はインベルターゼタンパク質の活性の減少をもたらす。これらの記述はＢＥＩ遺伝子発現の抑制に対応して当てはまる。
【００８３】
更に、Ｒ１又はインベルターゼ活性は、抑制されるべきそれぞれの標的遺伝子、好ましくはＲ１又はインベルターゼ遺伝子のセンス及びアンチセンスＲＮＡ分子の同時発現により植物細胞において減少させることもできる。
【００８４】
これは、例えば、それぞれの標的遺伝子又は標的遺伝子の一部の逆方向反復（inverted repeats）含有するキメラ構築物を使用することにより達成することができる。この場合に、キメラ構築物はそれぞれの標的遺伝子のセンス及びアンチセンスＲＮＡ分子をコードする。センス及びアンチセンスＲＮＡは１つのＲＮＡ分子として同時にｉｎ  ｐｌａｎｔａで合成され、センス及びアンチセンスＲＮＡはスペーサーにより互いに分離されておりそして二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。この技術は「ＲＮＡｉ技術」とも呼ばれる。
【００８５】
植物のゲノム中に逆方向反復ＤＮＡ構築物を導入することは、逆方向反復ＤＮＡ構築物に相当する遺伝子を抑制するための高度に有効な方法であることが示された（Waterhouse et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,(1998),13959-13964; Wang and Waterhouse,Plant.Mol.Biol.43,(2000),67-82; Singh et al.,Biochemical Society Transactions Vol.28 Part6(2000),925-927;Liu et al.,Biochemical Society Transactions Vol.28 Part6(2000),927-929);Smith et al.,(Nature 407,(2000),319-320；国際特許出願ＷＯ９９／５３０５０  Ａ１）。標的遺伝子（単数）又は標的遺伝子（複数）のセンス及びアンチセンス配列は、同じ又は異なるプロモーターによって互いに別々に発現させることもできる（Nap,J-P et al,6th Intenational Congress of Plant Molecular Biology,Quebec,18-24 June,2000;Poster S7-27,Presentation Session S7）。これらの記述はＢＥＩ遺伝子発現の抑制に対応して当てはまる。
【００８６】
ゆえに、植物材料の植物細胞におけるＲ１又はインベルターゼ活性の減少は、Ｒ１又はインベルターゼ遺伝子の二本鎖ＲＮＡ分子を生成させることにより達成することもできる。好ましくは、この目的で、Ｒ１又はインベルターゼ遺伝子のＤＮＡ分子又はｃＤＮＡの逆方向反復が植物のゲノムに導入され、転写されるべきＤＮＡ分子（Ｒ１又はインベルターゼ遺伝子又はｃＤＮＡあるいはこれらの遺伝子又はｃＤＮＡの断片）は該ＤＮＡ分子の発現を制御するプロモーターの制御下にある。これらの記述はＢＥＩ遺伝子発現の抑制に対応して当てはまる。
【００８７】
更に、ｉｎ  ｔｒａｎｓでの植物におけるプロモーターＤＮＡ分子の二本鎖ＲＮＡ分子の形成は、以後標的プロモーターと呼ばれることになるこれらのプロモーターの相同性コピーのメチル化及び転写不活性化をもたらすことができることは知られている（Mette et al., EMBO J.19,(2000),5194-5201）。
【００８８】
かくして、標的プロモーターの不活性化により、この標的プロモーターの制御下に天然に存在する或る標的遺伝子（例えば、Ｒ１又はインベルターゼ遺伝子）の遺伝子発現を減少させることが可能である。
【００８９】
即ち、抑制されるべき遺伝子（標的遺伝子）の標的プロモーターを含むＤＮＡ分子は、この場合に、植物中のプロモーターの元の機能とは対照的に、遺伝子又ｃＤＮＡｓの発現のための制御エレメントとして使用されるのではなくて、それら自身転写可能なＤＮＡ分子として使用される。
【００９０】
ＲＮＡヘアピン分子として存在することができる二本鎖標的プロモーターＲＮＡ分子をｉｎ  ｐｌａｎｔａで生成させるために、好ましくは、標的プロモーターＤＮＡ分子の逆方向反復を含有する構築物が使用され、この標的プロモーターＤＮＡ分子は該標的プロモーターＤＮＡ分子の遺伝子発現を制御するプロモーターの制御下にある。次いでこれらの構築物を植物のゲノムに導入する。該標的プロモーターＤＮＡ分子の「逆方向反復」の発現はｉｎ  ｐｌａｎｔａで二本鎖標的プロモーターＲＮＡ分子の形成をもたらす（Mette et al., EMBO J.19,(2000),5194-5201）。この手段によって、標的プロモーターを不活性化させることができる。かくして、植物細胞におけるＲ１又はインベルターゼ活性の減少は、Ｒ１又はインベルターゼ遺伝子のプロモーター配列の二本鎖ＲＮＡ分子を生成させることにより達成することもできる。好ましくは、この目的で、Ｒ１又はインベルターゼプロモーターのプロモーターＤＮＡ分子の逆方向反復が植物のゲノムに導入され、転写されるべき標的プロモーターＤＮＡ分子（Ｒ１又はインベルターゼプロモーター）は該標的プロモーターＤＮＡ分子の発現を制御するプロモーターの制御下にある。これらの記述はＢＥＩ遺伝子発現の抑制に対応して当てはまる。
【００９１】
本発明の更なる態様では、外来核酸分子は、Ｒ１又はインベルターゼタンパク質をコードする遺伝子に挿入されたトランスポゾン又はトランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）と呼ばれるものであり、該タンパク質の活性は植物材料の当該細胞において結果として減少させられる。これらの記述はＢＥＩ遺伝子発現の抑制に対応して当てはまる。
【００９２】
一般に、本発明の方法に適当な植物材料は相同性トランスポゾンを使用するのみならず異種トランスポゾンも使用して産生させることができ、相同性トランスポゾンの使用は植物ゲノム中にすでに天然に存在するトランスポゾンを意味するものとも理解される。これらの記述はＢＥＩ遺伝子発現の抑制に対応して当てはまる。
【００９３】
トランスポゾンにより遺伝子発現を改変することは当業者に知られている。植物バイオテクノロジーにおけるツールとして内因性及び異種トランスポゾンの使用の概説は、Ramachandran and Sundareson(2001,Plant Physiology and Biochemistry 39,234-252)に示される。特定の遺伝子がトランスポゾン挿入突然変異誘発により不活性化されている突然変異体を同定する可能性はMaes et al.(1999,Trends in Plant Science 4(3),90-96)による概説に記載されている。内因性トランスポゾンの助けによりイネ突然変異体を産生させることは、Hirochika(2001,Current Opinion in Plant Biology 4,118-122)により記載されている。内因性レトロトランスポゾンを使用するトウモロコシ遺伝子の同定は、例えば、Hanley et al.(2000,The Plant Journal 22(4),557-566)により報告されている。レトロトランスポゾンを使用して突然変異体を産生する可能性及び突然変異体を同定する方法は、Kumar and Hirochika(2001,Trends in Plant Science 6(3),127-134)により記載されている。異なる種における異種トランスポゾンの活性は、双子葉植物のみならず単子葉植物についても記載されている：例えば、イネについては（Greco et al.,2001,Plant Physiology 125,1175-1177;Liu et al.,1999,Molecular and General Genetics 262,413-420;Hiroyuki et al.,1999,The Plant Journal 19(5),605-613;Jeon and Gynheung,2001,Plant Science 161,211-219）、オオムギ（2000,Koprek et al.,The Plant Journal 24(2),253-263）、アラビアドプシス．タリアナ（Arabiadopsis Thaliana)(Aarts et al.,1993,Nature 363,715-717,Schmidt and Willmitzer,1989,Molecular and General Genetics 220,17-24;Altmann et al.,1992,Theoretical and Applied Genetics 84,371-383; Tissier et al.,1999,The Plant Cell 11,1841-1852),トマト(Belzile and Yoder,1992,The Plant Journal 2(2),173-179）及びジャガイモ（Frey et al.,1989,Molecular and General Genetics 217,172-177;Knap et al.,1988, Molecular and General Genetics 213,285-290）。
【００９４】
Ｔ−ＤＮＡ挿入突然変異誘発は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）からのＴｉ−プラスミドの或る区域（Ｔ−ＤＮＡ）を植物細胞のゲノムに組み込むことができるということに基づいている。植物染色体における組込みの部位はここでは固定されておらず、それはいかなる所望の位置にあってもよい。もしＴ−ＤＮＡが遺伝子機能を表す染色体の区域に組み込まれるならば、これは遺伝子発現の改変をもたらすことができ、したがって問題の遺伝子によりコードされたタンパク質の活性の変化ももたらすことができる。特に、タンパク質のコード領域へのＴ−ＤＮＡの組込みは、しばしば、問題の細胞によりもはや合成されえない相当するタンパク質又は活性な形態にはない相当するタンパク質をもたらす。突然変異体を産生するためのＴ−ＤＮＡ挿入の使用は、例えば、アラビドプシス．タリアナ（Krysan et al.,1999,The Plant Cell 11,2283-2290;Atipiroz-Leehan and Feldmann,1997,Trends in gnetics 13(4),152-156;Parinov and Sundaresan,2000,Current Opinion in Biotechnology 11,157-161）そしてイネ（Jeon and An,2001,Plant Science 161,211-219;Jeon et al.,2000,The Plant Journal 22(6),561-570）について記載されている。Ｔ−ＤＮＡ挿入突然変異誘発を使用して産生された突然変異体を同定する方法は、中でも、Young et al.,(2001,Plant Physiology 125,513-518),Parinov et al.(1999,The Plant cell 11,2263-2270);Thorneycroft et al.,(2001,Journal of Experimental Botany 52,1593-1601)及びMcKinney et al.,(1995,The Plant Journal 8(4),613-622)により記載されている。
【００９５】
Ｔ−ＤＮＡ突然変異誘発は、一般に、本発明の方法において使用することができる植物材料を産生するのに適当である。
【００９６】
本発明の方法の更なる態様では、遺伝子改変は、野生型植物の相当する遺伝子改変されていない植物細胞と比較して植物細胞中に存在する１種又はそれより多くのＲ１タンパク質の活性の減少をもたらすのみならず、同時に植物細胞中に存在するアイソフォームＩの１種又はそれより多くの内因性分枝酵素（分枝酵素Ｉ＝ＢＥＩタンパク質）の活性の減少ももたらす。
【００９７】
本発明に関しては、「ＢＥＩタンパク質」という用語は、アイソフォームＩの分枝酵素（＝ＢＥ）を意味するものと理解されるべきである。好ましくはＢＥＩタンパク質はジャガイモ植物から生じる。
【００９８】
アイソフォームの命名は、ここではＳｍｉｔｈ−Ｗｈｉｔｅ及びＰｒｅｉｓｓにより提唱された命名法に基づいている（Smith-White and Preis,plant Mol Biol.Rep.12,(1994),67-71,Larsson et al.,Plant Mol Biol.37,(1998),505-511）。この命名法は、トウモロコシからのＢＥＩＩタンパク質（Genbank Acc.NoAF072725,U65948）に対する相同性よりもトウモロコシからのＢＥＩタンパク質（GenBank Acc.No.D11081;Baba et al., Biochem.Biophys.Res.Commun.181(1),(1991),87-94;Kim et al.,Gene 216,(1998),233-243）に対するアミノ酸レベルでのより高い相同性（同一性）を有するすべての酵素は、アイソフォームＩの分枝酵素と呼ばれるか又は略してＢＥＩタンパク質と呼ばれるという立場から出発する。
【００９９】
「ＢＥＩタンパク質」をコードする核酸分子は、多数の植物、例えば、トウモロコシ（Genbank Acc. No.D11081,AF072724）、イネ（Genbank Acc. No.D11082）、エンドウ豆（Genbank Acc. No X80010）及びジャガイモについて記載されている。ジャガイモからのＢＥＩ遺伝子及びＢＥＩタンパク質の種々の形態は、例えば、Khoshnoodi et al.,Eur.J.Biochem.242(1),148-155(1996),Genbank Acc. No.Y08786及びKossmann et al.,Mol.Gen.Genet.230,(1991),39-44)に記載されている。ジャガイモ植物において、ＢＥＩ遺伝子は主として塊茎において発現されそして葉においてはほとんど発現されない（Larsson et al.,Plant Mol.Biol,(1998),505-511）。
【０１００】
Ｒ１活性の減少をもたらす遺伝子改変に関して、上記した記述は当てはまる。ＢＥＩタンパク質Ｉ（分枝酵素Ｉ）の活性の減少をもたらす遺伝子改変は、１種又はそれより多くの外来核酸分子の導入であって、該核酸分子の存在及び／又は発現は、野生型植物の相当する遺伝子改変されていない植物細胞と比較して、植物細胞中に存在するアイソフォームＩの１種又はそれより多くの内因性ＢＥＩタンパク質の活性の減少をもたらす、外来核酸分子の導入であることができる。
【０１０１】
本発明に関して、「植物細胞中に存在するアイソフォームＩの１種又はそれより多くの内因性分枝酵素の活性の減少」という用語は、ＢＥＩタンパク質をコードする１種又はそれより多くの内因性遺伝子の発現における相当する遺伝子改変されていない細胞と比較した減少、及び／又は植物材料の細胞におけるＢＥＩタンパク質の量の減少及び／又は植物材料の細胞中のＢＥＩタンパク質の酵素活性の減少を意味すると理解されるべきである。
【０１０２】
発現の減少は、例えば、ノーザンブロット分析又はＲＴ−ＰＣＲによりＢＥＩタンパク質をコードする転写物の量を測定することにより決定することができる。減少は、好ましくは、相当する遺伝子改変されていない細胞と比較して転写物の量において、少なくとも５０％、特に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、特に好ましくは少なくとも９５％の減少を意味する。
【０１０３】
問題の植物細胞中のＢＥＩタンパク質の減少した活性をもたらすＢＥＩタンパク質の量の減少は、例えば、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）又はＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）の如き免疫学的方法により決定することができる。減少は、好ましくは、相当する遺伝子改変されていない細胞と比較してＢＥＩタンパク質の量において、少なくとも５０％、特に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、特に好ましくは少なくとも９５％の減少を意味する。
【０１０４】
本発明の方法の更なる好ましい態様では、植物細胞中に存在するアイソフォームＩの１種又はそれより多くの内因性ＢＥＩタンパク質の活性の減少をもたらす外来核酸分子は、
（ａ）ＢＥＩタンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の減少を引き起こす少なくとも１種のアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ分子、
（ｂ）コサプレッション効果により、ＢＥＩタンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の減少をもたらすＤＮＡ分子、
（ｃ）ＢＥＩタンパク質をコードする内因性遺伝子の転写物を特異的方法で開裂する少なくとも１種のリボザイムをコードするＤＮＡ分子、
（ｄ）ｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発により導入されそして、内因性ＢＥＩタンパク質をコードする遺伝子における突然変異又は異種配列の挿入をもたらす核酸分子であって、該突然変異又は挿入は該遺伝子の発現の減少又は不活性ＢＥＩタンパク質の合成を引き起こす、核酸分子、
（ｅ）少なくとも１種のアンチセンスＲＮＡと少なくとも１種のセンスＲＮＡを同時にコードするＤＮＡ分子であって、該アンチセンスＲＮＡと該センスＲＮＡはＢＥＩタンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の減少を引き起こす二本鎖ＲＮＡ分子を形成する、ＤＮＡ分子、
（ｆ）トランスポゾンを含有するＤＮＡ分子であって、該トランスポゾン配列の組込みはＢＥＩタンパク質をコードする内因性遺伝子における突然変異又は挿入をもたらし、該突然変異又は挿入は該遺伝子の発現の減少又は不活性ＢＥＩタンパク質の合成を引き起こす、ＤＮＡ分子、
（ｇ）ＢＥＩタンパク質をコードする内因性遺伝子における挿入により、ＢＥＩタンパク質をコードする遺伝子の発現の減少又は不活性ＢＥＩタンパク質の合成を引き起こすＴ−ＤＮＡ分子、
よりなる群から選ばれる。
【０１０５】
本発明の方法の更なる態様では、使用される植物材料は、それが遺伝子改変されており、該遺伝子改変は、野生型植物からの相当する慣用の植物材料と比較して、アミノ酸、特にアスパラギンの含有率の減少をもたらすことを特徴とする。
【０１０６】
本発明に関して、「遺伝子改変」は、野生型植物からの相当する慣用の植物材料と比較して、アミノ酸、特にアスパラギンの含有率の減少をもたらすいかなる遺伝子改変であってもよい。
【０１０７】
アミノ酸含有率、特にアスパラギンの減少をもたらす遺伝子改変を生じさせるための種々の異なる考えられうる方法に関して、一般に上記した記述は糖の含有率の減少をもたらす遺伝子改変に関して当てはまる。
【０１０８】
本発明の方法の更なる態様では、遺伝子改変は、遺伝子改変されていない野生型植物の相当する植物細胞と比較して植物細胞中に存在する１種又はそれより多くの内因性アスパラギンシンテターゼタンパク質の活性の減少をもたらす。
【０１０９】
本発明に関して、「アスパラギンシンテターゼタンパク質」は、ＡＴＰのＡＭＰ及びピロホスフェートへの転化及びグルタミンのグルタメートへの転化を伴うアスパルテートのアスパラギンへの転化を触媒するタンパク質を意味すると理解されるべきである。アスパラギンシンテターゼ（ａｓｎ１）についての配列情報は、例えば、Lam et al.(Plant Physiol.106(4),(1994),1347-1357)。
【０１１０】
減少したアスパラギンシンテターゼ活性を有する植物は、相当する野生型植物と比較して、アスパラギンの減少した含有率を有する（Annual Meeting of the American Society of Plant Biologists in Madison,WI,USA,(1998),Molecular and transgenic studies of asparagine synthetase genes in Arabidopsis Thaliana,Abstract Number 535）。
【０１１１】
したがって、「活性の減少」という用語の定義に関して、Ｒ１又はインベルターゼタンパク質に関して上になされた記述は当てはまる。アスパラギンシンテターゼの活性は、例えば、Romagni及びDayan(Journal of Agricultural & Food Chemistry 48(5),(2000),1692-1696)により記載された方法により決定することができる。
【０１１２】
本発明の方法の更なる態様では、遺伝子改変は、１種又はそれより多くの外来核酸分子の導入であって、該核酸分子の存在及び／又は発現は遺伝子改変されていない野生型植物からの相当する植物細胞と比較して植物細胞中に存在する１種又はそれより多くの内因性アスパラギンシンテターゼタンパク質の活性の減少をもたらす、核酸分子の導入である。
【０１１３】
「外来核酸分子」という用語はすでに前記した意味を有する。
【０１１４】
本発明の方法の更なる態様では、外来核酸分子は
（ａ）アスパラギンシンテターゼタンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の減少を引き起こす少なくとも１種のアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ分子、
（ｂ）コサプレッション効果により、アスパラギンシンテターゼタンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の減少をもたらすＤＮＡ分子、
（ｃ）アスパラギンシンテターゼタンパク質をコードする内因性遺伝子の転写物を特異的方法で開裂する少なくとも１種のリボザイムをコードするＤＮＡ分子、
（ｄ）、内因性アスパラギンシンテターゼタンパク質をコードする遺伝子への突然変異又は異種配列の挿入をもたらすｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発により導入される核酸分子であって、該突然変異又は挿入は該遺伝子の発現の減少又は不活性アスパラギンシンテターゼタンパク質の合成を引き起こす、核酸分子、
（ｅ）少なくとも１種のアンチセンスＲＮＡと少なくとも１種のセンスＲＮＡを同時にコードするＤＮＡ分子であって、該アンチセンスＲＮＡと該センスＲＮＡは、アスパラギンシンテターゼタンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の減少を引き起こす二本鎖ＲＮＡ分子を形成する、ＤＮＡ分子、
（ｆ）トランスポゾンを含有するＤＮＡ分子であって、該トランスポゾン配列の組込みは内因性アスパラギンシンテターゼタンパク質をコードする遺伝子における突然変異又は挿入をもたらし、該突然変異又は挿入は該遺伝子の発現の減少又は不活性アスパラギンシンテターゼタンパク質の合成を引き起こす、ＤＮＡ分子、
（ｇ）内因性アスパラギンシンテターゼタンパク質をコードする遺伝子における挿入により、アスパラギンシンテターゼタンパク質をコードする遺伝子の発現の減少又は不活性アスパラギンシンテターゼタンパク質の合成を引き起こすＴ−ＤＮＡ分子、
よりなる群から選ばれる。
【０１１５】
したがって、これに関して、遺伝子工学的アプローチ（アンチセンス、コサプレッション及びリボザイム技術、ｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発、トランスポゾン、Ｔ−ＤＮＡ挿入）を行う際の種々の異なる状況において既に一般的に上でなされた記述はアスパラギンシンテターゼ活性の遺伝子改変に当てはまる。
【０１１６】
本発明の方法の更なる態様では、遺伝子改変は、遺伝子改変されていない野生型植物の相当する植物細胞と比較して、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼタンパク質の活性の増加をもたらす。
【０１１７】
ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ活性は、例えば、Miuller-Roeber et al.(EMBO J.11,(1992),1229-1238)に記載の如くして決定することができる。
【０１１８】
本発明に関して、「ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼタンパク質」は、グルコース−１−ホスフェート及びＡＴＰのＡＤＰ−グルコース及びピロホスフェートへの転化を触媒するタンパク質を意味するものと理解されるべきである。
【０１１９】
本発明の方法の更なる態様では、遺伝子改変は１種又はそれより多くの外来核酸分子の導入であって、該核酸分子の存在及び／又は発現は遺伝子改変されていない野生型植物の相当する植物細胞と比較して、植物細胞中に存在する１種又はそれより多くのＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼタンパク質の活性の増加をもたらす、外来核酸分子の導入である。
【０１２０】
ここで「外来核酸分子」はすでに上に定義した意味を有する。
【０１２１】
好ましくは、外来核酸分子は、脱調節された（deregulated）ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、特に好ましくは、ｇｌｇＣ１６と呼ばれそしてトランスジェニックジャガイモ植物における発現において、増加したデンプン合成速度をもたらすＥ．ｃｏｌｉからのＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼをコードする。これらの植物の低温貯蔵されたジャガイモ塊茎は有意に減少したヘキソースの蓄積を示す（Stark et al.,Science 258,(1992),287-292;Stark et al.,Ann.NY Acad.Sci.792,(1996),26-37）。
【０１２２】
更なる態様では、本発明は、相当する慣用の熱処理された食品と比較して減少したアクリルアミド含有率を有する熱処理された食品を製造する本発明の方法において使用することができる、上記した植物材料の使用に関する
【０１２３】
更なる態様では、本発明は、相当する慣用の植物材料と比較して、減少したアクリルアミド含有率を有する熱処理された食品を製造するための可溶性糖及び／又はアミノ酸の減少した含有率を有する植物材料の使用に関する。
【０１２４】
更なる態様では、本発明は、熱処理された食品のアクリルアミド含有率を減少させるための本発明の方法で使用することができる上記した植物材料の使用に関する。
【０１２５】
更なる態様では、本発明は、減少したアクリルアミド含有率を有する熱処理された食品を製造するのに適当な植物材料を同定する方法であって、
ａ）熱処理された食品を製造するのに適当な植物材料中の可溶性糖及び／又はアミノ酸の含有率を決定し、そして
ｂ）相当する慣用の植物材料と比較して、可溶性糖及び／又はアミノ酸の減少した含有率を有する製造工程ａ）に従うこのような植物材料を選ぶ、
ことを含む方法に関する。
本明細書において参照された刊行物及び特許のすべては、参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。
【０１２６】
方法
グルコース、フルクトース及びスクロースの決定
ジャガイモ塊茎中のグルコース、フルクトース及びスクロースの含有率を決定するために、ジャガイモ塊茎の小片（直径約１０mm）を液体窒素中で冷凍し、次いで８０％（容積／容積）エタノール０．５ml中で８０℃で１時間抽出する。遠心（３分、３０００rpm）の後、上澄液を取り出しそして沈殿物（deposit）を再び８０％（容積／容積）エタノール０．５ml中に抽出する。この方法を繰り返す。一緒にした上澄液を使用して可溶性糖の量を決定する。
【０１２７】
可溶性グルコース、フルクトース及びスクロースを下記の組成のアッセイ溶液において定量的に決定する。
１００mMイミダゾール／ＨＣｌ（ｐＨ６．９）
５mMＭｇＣｌ２
２mMＮＡＤ＋
１mMＡＴＰ
サンプル２００μl
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Leuconostoc mesenteroidesからの）２単位
【０１２８】
アッセイ溶液を室温で５分間インキュベーションする。次いで２００μlの反応容積に酵母ヘキソキナーゼ１５００単位（グルコースを決定するために）、酵母ホスホグルコイソメラーゼ２．５単位（フルクトースを決定するために）、酵母β−フルクトシダーゼ３５０単位（スクロースを決定するために）を順次加えた後３４０nmでの吸収を測定することより慣用の測光法を使用して糖を決定した。
【０１２９】
下記の実施例により本発明を説明する。
実施例１
ジャガイモ塊茎からのポテトクリスプ及びポテトチップの製造
ポテトクリスプ及びポテトチップを製造するために、Ｒ１遺伝子の減少した発現を有するトランスジェニックジャガイモ植物の熟したジャガイモ塊茎（Lorbeth et al.,Nature Biotechnology 16,(1998),473-477）及び減少したＲ１遺伝子発現及び更に分枝酵素Ｉ遺伝子の減少した発現（ＷＯ９７／１１１８８）を有するジャガイモ植物のジャガイモ塊茎を使用した。
【０１３０】
クリスプ及びチップを更に収穫の直後及び種々の異なる時間４℃で貯蔵の後加工した。
【０１３１】
塊茎を手で皮をむき、次いでスライサー（モデル  Chef200,Saro Emmerich,Germanyからの）でスライスしてクリスプの製造用スライスとするか又はパンチ（Weisser,Germany）を使用して切断してチップを形成した。
【０１３２】
サンプルを１８０℃の温度で植物脂肪（Palmaja,Meylip mbH&Co.KG,Germanny）を使用して種々の異なる時間ディープファットフライヤー（Frita4,Franke,Frifri aro GmbH,Germany）においてディープファットフライングした。
【０１３３】
ディープファットフライングした生成物を次いで微粉砕しそしてそれらのアクリルアミド含有率を分析した。これは誘導体化の後ＧＣ／ＭＳ又はＬＤ／ＭＳ−ＭＳを使用して検出された（Epa method 8032a,U.S Environmental Protection Agency）これは、低く限定された測定に加えて、検出の高い選択性を確実にする。
【０１３４】
ディープファットフライングされたサンプルの場合に、トランスジェニックジャガイモ塊茎におけるアクリルアミド含有率は相当する野生型植物の塊茎のアクリルアミド含有率と比較して少なくとも１５％減少していることが見いだされた。
【０１３５】
実施例２
減少したＲ１−及び分枝酵素Ｉ−遺伝子発現を有するジャガイモ塊茎から製造されたポテトクリスプ及びポテトチップのアクリルアミド含有率の決定
実施例１に従って製造されたポテトクリスプ及びポテトチップをそれらのアクリルアミド含有率について分析した。
【０１３６】
遺伝子改変されていない植物は以後野生型植物と呼ぶ。減少したＲ１遺伝子発現（Lorbeth et al.,Nature Biotechnology 16,(1998),473-477）及び更に減少した分枝酵素Ｉ遺伝子発現（international patent application WO97/11188）を有するトランスジェニックジャガイモ植物は以後０１５ＶＬ００１と呼ばれる。
【０１３７】
ジャガイモ植物の収穫したばかりの塊茎が１８０℃で３分及び６分間のディープファットフライングのために使用されるならば、ポテトクリスプは下記のアクリルアミド含有率を有する：
【０１３８】
【表１】
0004699898.tif 000002
【０１３９】
表１：クリスプ（収穫直後ジャガイモ塊茎から製造された）の百分率アクリルアミド含有率。野生型は１００％に設定された。
【０１４０】
絶対アクリルアミド含有率は増加するディープファットフライング時間と共に大きく増加する。これは野生型塊茎からのクリスプについてのみならずトランスジェニック塊茎からのクリスプについてもそうである。しかしながら、両ディープファットフライング時間について、トランスジェニックジャガイモ塊茎から製造されたクリスプにおけるアクリルアミド含有率の増加は、野生型植物のクリスプと比較して有意に減少している。３分のディープファットフライング時間では、トランスジェニッククリスプのアクリルアミド含有率は野生型クリスプと比較して約７０％減少している。６分のディープファットフライング時間では、野生型と比較して約５０％のトランスジェニッククリスプにおけるアクリルアミド形成の減少がある。
【０１４１】
更なる実験においては、４℃で貯蔵されたジャガイモ塊茎を使用してポテトクリスプを製造した。収穫後、トランスジェニック塊茎尾及び関連した野生型塊茎を４℃で５６日間貯蔵した。ポテトクリスプ及びポテトチップを製造しそして上記した条件下に種々の異なる時間１８０℃でディープファットフライングした。
【０１４２】
【表２】
0004699898.tif 000003
【０１４３】
表２：クリスプ（４℃で貯蔵した塊茎から製造された）の百分率アクリルアミド含有率。野生型は１００％に設定された。
【０１４４】
絶対アクリルアミド含有率は４℃で貯蔵したジャガイモからの製品においては常に大きく増加する。しかしながら、トランスジェニックジャガイモ塊茎から製造されたクリスプにおけるアクリルアミド含有率は、相当する野生型植物から製造されたクリスプと比較して、３分のディープファットフライング時間及び６分のディープファットフライング時間の両方について、約７０％少なく増加していることが示される。
【０１４５】
更なる実験において、ポテトチップを実施例１に記載のようにして低温貯蔵されたジャガイモ塊茎（４℃で５６日間貯蔵された）から製造しそしてディープファットフライングした。ポテトクリスプとは対照的に、ポテトチップは１８０℃て３０秒間プレフライングし、キッチンペーパー上に置き、そして室温に冷却し、次いで特定された時間ディープファットフライングした。
【０１４６】
【表３】
0004699898.tif 000004
【０１４７】
表３：ポテトチップ（低温貯蔵した塊茎から製造された）の百分率アクリルアミド含有率。野生型は１００％に設定された。
【０１４８】
絶対アクリルアミド含有率はポテトクリスプと比較してポテトチップではより低い。これは、多分主としてジャガイモｋｇ当りポテトクリスプと比較してポテトチップのより小さい表面積による。この製品においても、百分率アクリルアミド含有率は、野生型塊茎から製造されたポテトチップと比較して、両ディープファットフライング時間についてトランスジェニックジャガイモ植物から製造されたポテトチップにおいて約５０％の減少を示す。
【０１４９】
クリスプ又はポテトチップの工業的製造に関して、スライスされたジャガイモはディープファットフライングの前にブランチングされる。ブランチングは水又はスチームブランチャーで行うことができる。ブランチング条件は固定された値ではなくて、使用されるジャガイモの品質に依存して極めて大きく変わる。ブランチングの間、可溶性糖は部分的に洗い流される。これはディープファットフライングにおけるジャガイモ製品のより均一な、褐色着色（browning）を引き起こす。
【０１５０】
本発明の方法が相当する野生型塊茎からの製品と比較して変化したプロセス条件下にトランスジェニックジャガイモ植物から製造されたジャガイモ製品におけるアクリルアミド形成の減少ももたらすことを証明するために、スライスされたジャガイモを熱本管水（hot mains water）で洗浄することにより、ブランチングを実験室規模で行った。
【０１５１】
この目的で、ジャガイモ（収穫後４℃で５６日間貯蔵された）約２００ｇを、各回４５℃の本管水５リットルを使用して各回１．５分間で３回洗浄した。次いでスライスされたジャガイモを家庭用ペーパー上で乾燥しそして上記の如く１８０℃で３分間ディープファットフライングした。
【０１５２】
【表４】
0004699898.tif 000005
【０１５３】
表４：洗浄されたクリスプ（ジャガイモ塊茎から製造された）の百分率アクリルアミド含有率。野生型は１００％に設定された。
【０１５４】
洗浄は洗浄されていないポテトクリスプと比較して野生型植物のジャガイモ塊茎から製造されたクリスプにおけるアクリルアミド形成を約１６％減少させる。
【０１５５】
野生型植物のジャガイモ塊茎から製造された「洗浄された」クリスプと比較して、トランスジェニックジャガイモ植物のジャガイモ塊茎から製造された「洗浄された」クリスプは約８０％アクリルアミド形成が減少している。
【０１５６】
更なる分析において、可溶性糖、特に、グルコース及び／又はフルクトースの含有率は、野生型植物の慣用の植物材料と比較して決定された。
【０１５７】
この目的で、ジャガイモ塊茎の皮をむきそして約０．５cmのサンプル直径を有するサンプルをコルクボーラー（Ｒｏｔｈからの）を使用して切り取った。このサンプルから、各場合に５つの異なる塊茎から、各回最初、４分の１及び２分の１からの約２mm厚さのスライスを反応容器中で一緒にしそして可溶性糖を測定するのに使用した。
【０１５８】
植物材料の糖、特にフルクトース及びグルコースの含有率の決定は当業者に知られておりそして上記のように行われた。
【０１５９】
【表５】
0004699898.tif 000006
【０１６０】
表６：相当する野生型（１００％）の塊茎に基づく収穫されたばかりの塊茎サンプル及び貯蔵された塊茎サンプルの百分率可溶性糖含有率の比較
【０１６１】
貯蔵は、野生型植物中の可溶性糖の含有率の鋭い上昇を引き起こす。系統０１５ＶＬの塊茎は、収穫の直後、野生型植物と比較して約３０％〜４０％減少したグルコース又はフルクトースの含有率を示す。上記した低温貯蔵の後、相当する野生型植物と比較してトランスジェニック植物における約５０％のグルコース又はフルクトースの減少がある。
【０１６２】
グルコース又はフルクトースの含有率がクリスプ中のアクリルアミド含有率と相関するならば、ジャガイモ塊茎中のグルコース又はフルクトースの含有率とディープファットフライングされた製品クリスプ中のアクリルアミドの形成との間に線形相関があることが分かる。
【０１６３】
かくして、熱処理された食品中のアクリルアミドの形成と熱処理された食品を製造するのに使用される植物材料の可溶性糖の含有率との間に相関があることが初めて示された。アクリルアミド形成の減少に対する効果は予想されたよりもはるかに顕著である。
【０１６４】
実施例３
減少したＲ１遺伝子発現を有するジャガイモ塊茎から製造されたポテトクリスプ及びポテトチップのアクリルアミド含有率の測定
減少したＲ１遺伝子発現を有するジャガイモ塊茎から製造された実施例１に従って製造されたポテトクリスプ及びポテトチップをそれらのアクリルアミド含有率について分析した。
【０１６５】
この場合に、実施例2に既に述べたように、最初に異なるディープファットフライング時間について試験を行いそして異なる貯蔵又は洗浄をされたサンプルも調べた。
【０１６６】
実施例２に記載された結果が確認された、即ち、減少したＲ１遺伝子発現を有するジャガイモ塊茎から製造されたポテトクリスプ及びポテトチップは、実施例２で更に詳細に記載された条件下に、相当する遺伝子改変されていない野生型植物からのジャガイモ塊茎から製造された相当する製品と比較してより少ないアクリルアミドを同様に示す。
【０１６７】
実施例４
減少したＲ１遺伝子発現を有する種々の種類のトランスジェニックジャガイモ植物の産生
減少したＲ１遺伝子発現を有するトランスジェニックジャガイモ植物を産生させるために、Rocha-Sosa et al.(EMBO J.(1989),23-29)に記載のように、アグロバクテリアを使用して、栽培品種Ｔｏｍｅｎｓａ、Ｓｏｌａｒａ及びＢｉｎｔｊｅのジャガイモ植物にプラスミドＩＲ５／２９のＴ−ＤＮＡを移入した。
ベクターＩＲ５／２９に関する注
ＩＲ５／２９は、なかでも、Solanum tuberosumからのパタチン遺伝子Ｂ３３のプロモーターの配列（Rocha-Sosa et al.,(1989),上記参照）及び該プロモーターへの「センス」方位（“sense”orientation）における完全なＲ１−ｃＤＮＡ（Lorberth et al.Nature Biotechnology 16,(1998),473-477）を含有するプラスミドｐＧＳＶ７１の誘導体である。
【０１６８】
ｐＧＳＶ７１は、中間体ベクターｐＧＳＶ１から誘導されるプラスミドｐＧＳＶ７の誘導体である。ｐＧＳＶ１はｐＧＳＣ１７００の誘導体であり、ｐＧＳＣ１７００の構築は、Ｃｐｒｎｅｌｉｓｓｅｎ及びＶａｎｄｅｒｗｉｅｌｅにより記載されている（(1989)、Nuclear transcriptional activity of the tobacco plastid psbA promotor.Nucleic Acids Research 17:19-29）。ｐＧＳＶ１は、ｐＧＳＣ１７００からカルベニシリン耐性遺伝子の欠失及びプラスミドｐＴｉＢ６Ｓ３のＴＬ−ＤＮＡ領域のＴ−ＤＮＡ配列の欠失により得られた。
【０１６９】
ｐＧＳＶ７はプラスミドｐＢＲ３２２の複製起点（Bolivar et al.,(1977),Construction and characterization of new cloning vehicles.II.A multipurpose cloning system.Gene,2:95-113）及びプソイドモナスプラスミドｐＶＳ１の複製起点（Itoh et al.,(1984),Genetic and molecular characterization of the Pseudomonas plasmid pVS1.PlasmidII:206-220）を含有する。
【０１７０】
ｐＧＳＶ７は抗生物質スペクチノマイシン及びストレプトマイシンに対する耐性を与えるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのトランスポゾンＴｎ１３３１からの選択性マーカー遺伝子ａａｄＡ（Tolmasky,(1990),Sequencing and expression of aadA,bla,and tnpR from the multiresistance transposon Tn1331.Plasmid.24(3):218-226; Tolmasky and Crosa,(1993),Genetic organization of antibiotic resistance genes(aac(6')-lb,aadA,and oxa9) in the multiresistance transposon Tn1331.Plasmid.29(1):31-40）も含有する。
【０１７１】
プラスミドｐＧＳＶ７１は、ｐＧＳＶ７のボーダー領域（border regions）間のキメラバー遺伝子（chimeric bar gene）をクローニングすることにより得られた。キメラバー遺伝子は、転写を開始するためのカリフラワーモザイクウイルスのプロモーター配列（Odell et al.,(1985),Identification of DNA sequences required for activity of the Caouliflower Mosaic Virus 35S promotor.Nature 313:810-812),Streptomyces hygroscopicusからのバー遺伝子(Thompson et al.,(1987); Characterization of the herbicide resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus.The EMBO Journal,6:2519-2523）及び転写の終結及びポリアデニル化のためのｐＴｉＴ３７のＴ−ＤＮＡのノパリンシンターゼ遺伝子の非翻訳３’領域を含有する。バー遺伝子は除草剤グルホシネートアンモニウムに対する耐性を与える。
【０１７２】
Ｔ−ＤＮＡは列挙された順番に下記のエレメント：
−ｐＴｉＢ６Ｓ３からのＴＬ−ＤＮＡの左ボーダー配列（left border sequence)(Gielen et al.,(1984),The complete nucleotide sequence of the TL-DNA of the Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiAch5.The EMBO J.3:835-846）、
−ＴＬ−ＤＮＡの左ボーダー配列に基づくセンス方位におけるSolanum tuberosumからのパタチン遺伝子Ｂ３３のプロモーター（Rocha-Sosa et al.,1989,上記参照）、
−パタチンプロモーターに基づくセンス方位における完全なＲ１−ｃＤＮＡ（Lorberth et al.,(1998),上記参照）、
−ＴＬ−ＤＮＡの左ボーダー配列に基づくセンス方位におけるＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５のＴ−ＤＮＡのオクトピンシンターゼ遺伝子（遺伝子３）のポリアデニル化シグナル（３’端部）（Gielen et al.,(1984)、上記参照）、
−ＴＬ−ＤＮＡの左ボーダー配列に基づくアンチセンス方位におけるプラスミドｐＴｉＴ３７のＴ−ＤＮＡからのノパリンシンターゼ遺伝子（３’ｎｏｓ）の非翻訳３’端部のＴａｑｌ断片（Depicker et al.,(1982),Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence.Journal of molecular and applied Genetics 1:561-573）、
−ＴＬ−ＤＮＡの左ボーダー配列に基づくアンチセンス方位におけるStreptomyces hygroscopicus）からのホスフィノトリシン耐性遺伝子（バー）のコード配列（Thompson et al.(1987),上記参照）。バー野生型遺伝子の５'端部の２つの末端コドンはコドンＡＴＧ及びＧＡＣにより置き換えられた。
−ＴＬ−ＤＮＡの左ボーダー配列に基づくアンチセンス方位におけるカリフラワーモザイクウイルスのＰ３５Ｓ３プロモーター領域（Odell et al.,(1985),上記参照）、
−プラスミドｐＴｉＢ６Ｓ３からのＴＬ−ＤＮＡの右ボーダー配列（Gielen et al.,(1984),上記参照）、
を含有する。
【０１７３】
種々のジャガイモ栽培品種が形質転換された後、ウエスタンブロット分析（Lorberth et al., Nature Biotechnology 16,(1998),473-477）を使用して栽培品種の各々について、その塊茎がコサプレッション効果により顕著に減少した量のＲ１タンパク質を有する種々の系統を同定した。
【０１７４】
プラスミドＩＲ５／２９を使用する形質転換により得られる栽培品種Ｔｏｍｅｎｓａの植物は０９３１Ｒ植物と呼ばれ、栽培品種Ｓｏｌａｒａの植物は０９５１Ｒ植物と呼ばれそして栽培品種Ｂｉｎｔｊｅの植物は０９２１Ｒ植物と呼ばれた。
【０１７５】
系統０９３１Ｒ３６０、０９５１Ｒ０４９及び０９２１Ｒ００２からのジャガイモ塊茎を使用してポテトチップを製造した（実施例５）。
【０１７６】
実施例５
減少したＲ１遺伝子発現を有する異なる種々のジャガイモ塊茎から製造されたポテトチップのアクリルアミド含有率の決定
実施例４に従って産生された植物の収穫されたばかりのジャガイモ塊茎を実施例１に従って加工してポテトチップを製造しそして実施例２に従って１８０℃で３０秒間プレディープファットフライングし、キッチンペーパー上に置きそして室温に冷却し、次いで１８０℃で３分間ディープファットフライングした。
【０１７７】
製造されたポテトチップは下記のアクリルアミド含有率を有していた：
【０１７８】
【表６】
0004699898.tif 000007
【０１７９】
表１：ポテトチップ（収穫の直後にジャガイモ塊茎から製造された）の百分率アクリルアミド含有率。各相当する野生型は１００％に設定された。
【０１８０】
部分的に製造されたポテトチップの絶対アクリルアミド含有率は、使用される栽培品種
間で相当変わる。これは主として可溶性糖の異なる絶対値による。例えば、栽培品種Ｓｏｌａｒａからのポテトチップは、例えば、最も高いアクリルアミド含有率のみならず最も高い可溶性糖含有率も示した。
【０１８１】
しかしながら、ポテトチップの相対的アクリルアミド含有率は、使用されるすべてのトランスジェニック栽培品種について、野生型塊茎から製造されたポテトチップと比較して約４５−５０％のアクリルアミドの量の相当な減少を示した。
【０１８２】
更なる分析において、可溶性糖、特に、グルコース、フルクトース及びスクロースの含有率を種々の栽培品種からのジャガイモ塊茎において決定した。
【０１８３】
この目的で、実施例２に従ってジャガイモ塊茎の皮をむきそしてコルクボーラー（Rothからの）を使用して、直径約０．５mmのサンプルを切り取った。このコルクボーラーサンプルから、５つの異なる塊茎の各々から、各場合に、最初、４分の１及び中点（half way）から約２mm厚さのスライスを採取しそして反応容器中で一緒にしそして可溶性糖を決定するために使用した。
【０１８４】
植物材料の糖、特に、フルクトース及びグルコースの含有率を上記のように決定した。
【０１８５】
上記したとおり、可溶性糖の絶対値は調べた栽培品種間で大きく変わる。
【０１８６】
栽培品種Ｓｏｌａｒａは、最も高いグルコース、フルクトース及びスクロース含有率を示す。Ｔｏｍｅｎｓａは最も低いグルコース、及びフルクトース含有率を示し、そしてＢｉｎｔｊｅは最も低いスクロース含有率を示す。系統０９３１Ｒ３６０からの塊茎は、収穫の直後、相当する野生型植物と比較して約３０〜４０％減少したグルコース及びスクロース含有率を示す。系統０９５１Ｒ０４９の塊茎は、収穫の直後、野生型植物と比較して約１０〜３０％減少したグルコース及びフルクトース含有率を示す。
【０１８７】
総グルコース及び／又はフルクトース含有率がポテトチップにおけるアクリルアミド含有率と相関しているならば、グルコース及び／又はフルクトース含有率とポテトチップにおけるアクリルアミドの形成との間には線形相関があることが分かり得る。
【０１８８】
かくして、減少したＲ１遺伝子発現を有するジャガイモ植物の使用は、相当する遺伝子改変されていない野生型植物から製造される相当する熱処理された食品と比較して顕著に減少したアクリルアミド含有率により区別される熱処理された食品、特にポテトチップの製造を可能とすることが種々の栽培品種について確認された。
【０１８９】
実施例６
減少したＲ１遺伝子発現の種々の異なる種類の貯蔵されたジャガイモ塊茎から製造されたポテトチップのアクリルアミド含有率の決定
実施例４に従って製造された植物からの４℃で７３日間貯蔵されたジャガイモ塊茎を実施例１に従ってポテトチップに加工しそして実施例2に従って１８０℃で３０秒間ディープファットプレフライングし、キッチンペーパー上に置きそして室温に冷却し、次いで１８０℃で３分間ディープファットフライングした。
【０１９０】
製造されたポテトチップは下記のアクリルアミド含有率を有していた：
【０１９１】
【表７】
0004699898.tif 000008
【０１９２】
表１：ポテトチップ（４℃で貯蔵したジャガイモ塊茎から製造された）百分率アクリルアミド含有率。相当するそれぞれの野生型は１００％に設定された。
【０１９３】
４℃で貯蔵されたジャガイモからの製品における絶対アクリルアミド含有率は常に顕著に増加する。しかしながら、トランスジェニックジャガイモ塊茎からのポテトチップのアクリルアミド含有率は相当する野生型植物からのポテトチップと比較して約３０〜４５％少なく増加することも列挙された変種について見出される。
【０１９４】
更なる実験において、減少したＲ１遺伝子発現を有する栽培品種Ｄｅｓｉｒｅｅのジャガイモ塊茎（Loberth et al.,Nature Biotechnology 16,(1998),473-477）を４℃で７３日間貯蔵した。ポテトチップ及びクリスプを実施例１に記載のようにして製造した。クリスプを実施例２に記載の如くして１８０℃で３分間ディープファットフライングした。ポテトクリスプと対照的に、ポテトチップを１８０℃で３０秒間ディープファットプレフライングし、キッチンペーパー上に置き、そして室温に冷却し、次いで３分間ディープファットフライングした。
【０１９５】
製造されたポテトチップ及びクリスプは下記のアクリルアミド含有率を有していた：
【０１９６】
【表８】
0004699898.tif 000009
【０１９７】
表２：ポテトチップ及びクリスプ（４℃で貯蔵した塊茎から製造された）の百分率アクリルアミド含有率。野生型は１００％に設定された。
４℃で貯蔵したジャガイモからの製品の絶対アクリルアミド含有率は常に顕著に増加する。しかしながら、この実験においては、アクリルアミド含有率は、相当する野生型植物から製造されたクリスプと比較してトランスジェニックジャガイモ塊茎から製造されたクリスプにおいて約７０％少なく増加することも見出される。
【０１９８】
更なる実験においては、減少したＲ１遺伝子発現の栽培品種Ｄｅｓｉｒｅｅのジャガイモ塊茎（Loberth et al.,Nature Biotechnology 16,(1998),473-477）を８℃で７３日間貯蔵した。これらの貯蔵されたジャガイモ塊茎を実施例１に従ってポテトチップに加工しそして実施と例２に従って１８０℃で３０秒間ディープファットプレフライングし、キッチンペーパー上に置き、そして室温に冷却し、次いで１８０℃で３分間ディープファットフライングした。
【０１９９】
製造されたポテトチップは下記のアクリルアミド含有率を有していた：
【０２００】
【表９】
0004699898.tif 000010
【０２０１】
表３：ポテトチップ（８℃で貯蔵した塊茎から製造された）の百分率アクリルアミド含有率。野生型は１００％に設定された。
【０２０２】
８℃で貯蔵したジャガイモ塊茎からの製品における絶対アクリルアミド含有率は、４℃で貯蔵したジャガイモ塊茎の場合におけると同じく大きくは増加しない。しかしながら、この実験においても、トランスジェニックジャガイモ塊茎からのポテトチップのアクリルアミド含有率は相当する野生型植物から製造されたポテトチップと比較して、約４８％少なく増加することが見出される。