(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動脈の狭窄または再狭窄の処置のための治療上の薬剤の調製のための分子の使用であって、分子は、ＨＭＧＢ１に対する抗体、またはＨＭＧＢ１に対する抗体のフラグメントであって、ＨＭＧＢ１タンパク質の活性をその受容体上でブロックするもの、またはＨＭＧＢ１フラグメントであって、ＨＭＧＢ１と受容体結合において競合し、受容体活性を抑制するもので、ＨＭＧボックスドメインＡのａａ（アミノ酸）の１−９０、ＨＭＧボックスドメインＢのａａの９１−１８０、およびＨＭＧボックスドメインＡまたはＨＭＧボックスドメインＢに対して１５よりも多くの連続的なアミノ酸残基のための配列同一性を有する任意のポリペプチドを備えるＨＭＧＢ１フラグメントからなる群より選ばれる、分子の使用。
【請求項２】
動脈の狭窄または再狭窄は血管形成の後に起こる、請求項１記載の分子の使用。
【請求項３】
分子はカテーテル、外科用器具およびステントからなる群より選ばれる器具から放出される、請求項１記載の分子の使用。
【請求項４】
結合組織の再構築および創傷治癒を増進する治療上の薬剤の調製のための、次の、ＨＭＧＢ１および／またはＨＭＧＢ１フラグメントであって、ＨＭＧＢ１と受容体結合において競合し、受容体活性を抑制するもので、ＨＭＧボックスドメインＡのａａ（アミノ酸）の１−９０、ＨＭＧボックスドメインＢのａａの９１−１８０、およびＨＭＧボックスドメインＡまたはＨＭＧボックスドメインＢに対して１５よりも多くの連続的なアミノ酸残基のための配列同一性を有する任意のポリペプチドを備えるＨＭＧＢ１フラグメントの使用。
【請求項５】
創傷および／または火傷および／または床ずれの治癒を含む結合組織の再構築を減らす治療上の薬剤の調製のための、次の、ＨＭＧＢ１に対する抗体、またはＨＭＧＢ１に対する抗体のフラグメントであって、ＨＭＧＢ１タンパク質の活性をその受容体上でブロックするもの、またはＨＭＧＢ１フラグメントであって、ＨＭＧＢ１と受容体結合において競合し、受容体活性を抑制するもので、ＨＭＧボックスドメインＡのａａ（アミノ酸）の１−９０、ＨＭＧボックスドメインＢのａａの９１−１８０、およびＨＭＧボックスドメインＡまたはＨＭＧボックスドメインＢに対して１５よりも多くの連続的なアミノ酸残基のための配列同一性を有する任意のポリペプチドを備えるＨＭＧＢ１フラグメントの使用。
【請求項６】
結合組織の再構築を増進する治療上の薬剤の調製のための、次の、ＨＭＧＢ１および／またはＨＭＧＢ１フラグメントであって、ＨＭＧＢ１と受容体結合において競合し、受容体活性を抑制するもので、ＨＭＧボックスドメインＡのａａ（アミノ酸）の１−９０、ＨＭＧボックスドメインＢのａａの９１−１８０、およびＨＭＧボックスドメインＡまたはＨＭＧボックスドメインＢに対して１５よりも多くの連続的なアミノ酸残基のための配列同一性を有する任意のポリペプチドを備えるＨＭＧＢ１フラグメントの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野、特に、血管形成を原因とする疾患を含む血管疾患の治療のために使用される、ＨＭＧＢ１蛋白質インヒビタおよびＨＭＧＢ１アンタゴニストに関する。
【０００２】
ＨＭＧＢ１蛋白質（２００１年前はＨＭＣとして知られていた；Ｂｕｓｔｉｎ，２００１、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，２６，１５２−１５３）は、ＨＭＧと呼ばれる、ＤＮＡ結合ドメインの存在により特徴付けられる、ＨＭＧ−ボックスファミリーの典型的な蛋白質である。ＨＭＧ１は、哺乳類の間で高度に保存された配列を具えた、２１５アミノ酸の、小さい２５−ｋＤ蛋白質である。ＨＭＧＢ１分子は３つのドメインに組織化される。すなわち、２つのＤＮＡ結合ドメイン、ＨＭＧボックスＡおよびボックスＢであり、これらは３０のグルタミン酸およびアスパラギン酸残基からなる酸性ＣＯＯＨ末端が続く。２つのＨＭＧボックス、ボックスＡおよびボックスＢは、Ｌ型三次元構造（Ｈａｒｄｍａｎ等、１９９５年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４：１６５９６−１６６０７；Ｒｅａｄ等、１９９３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：３４２７−３４３６；Ｗｅｉｒ等、１９９３年、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１２：１３１１−１３１９）を有する８０のアミノ酸セグメント（２９％の同一性、６５％の類似性）である。
【０００３】
ＨＭＧＢ１は、偏在的に発現された、豊富な核蛋白質として、元々は確認された。これは、単一の核当たり１００万より多いコピーに存在し、配列特異性のない、ダブルストランドＤＮＡに結合する。その代わり、ＨＭＧＢ１は、よじれたかまたは曲がったＤＮＡおよび４方向（four-way）ジャンクションのような、特異的ＤＮＡ構造に高親和性を持って結合する。しかし、ＨＭＧＢ１は、幾つかの異なるＤＮＡ結合蛋白質との相互作用によりダブルストランドＤＮＡに強化される。ダブルストランドＤＮＡに結合する場合、構造歪みをもたらし、核蛋白質複合体を形成させる。この複合体では、幾つかのＤＮＡ結合蛋白質が、それぞれＤＮＡ同族体部位に結合しつつ、互いに接触する（Ｍｕｌｌｅｒ等、２００１年、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１６：４３３７−４３４０および本発明で引用する他の参考文献）。Ｈｍｇｂ１−／−マウスの表現型はこのモデルに一致する（Ｃａｌｏｇｅｒｏ等、１９９９年、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，２２：２７６−２８０）。
【０００４】
最近、細胞核外側のＨＭＧＢ１に対する付加的な役割が焦点となってきた。すなわち、ＨＭＧＢ１はエンドトキシン誘導死亡率の後期媒介物、およびマウスの急性肺炎として作用し、さらに、敗血症患者のＨＭＧＢ１の高血清レベルが予知マーカーである（国際特許出願ＷＯ００／４７１０４パンフレット）。ＨＭＧＢ１はサイトカインおよびバクテリアエンドトキシンに応答して培地中で下垂体細胞およびマクロファージにより分泌され得る（Ａｂｒａｈａｍ等、２０００年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５：２９５０−２９５４；Ｗａｎｇ等、１９９９年、Ｓｕｒｇｅｒｙ（Ｓｔ．Ｌｕｉｓ），１２６：３８９−３９２；Ｗａｎｇ等、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：２４８−２５１）。マウス赤白血病細胞からのＨＭＧＢ１の放出は細胞分化に関連しており、その蛋白質はこれらの細胞における原形質膜結合型に見いだすことができる（Ｐａｓｓａｌａｃｑｕａ等、１９９７年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４００：２７５−２７９；Ｓｐａｒａｔｏｒｅ等、１９９６年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３２０：２５３−２５６）。ＨＭＧＢ１に配列が同一であるアンホテリンという蛋白質は、ニューロン細胞の核および細胞質ならびに細胞外スペースにおいて見いだされる、脳において説明されてきた。外因的に添加された場合には、ＨＭＧＢ１は神経突起の成長を媒介し、神経芽細胞腫およびグリオーム（glioma）細胞のラミニン依存移動はＨＭＧＢ１に対する抗体により阻害される（Ｆａｇｅｓ等、２０００年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１１３：６１１−６２０；Ｍｅｒｅｎｍｉｅｓ等、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：１６７２２−１６７２９；Ｐａｒｋｋｉｎｅｎ等、１９９３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１９７２６：１９７３８；Ｒａｕｖａｌａ等、１９８８年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１０７：２２９３−２３０５）。ＨＭＧＢ１とプラスミノーゲン活性系、特にｔ−ＰＡ（組織型プラスミノーゲンアクチベータ）との間の相互作用によりプラスミン形成を強化する（ＰａｒｋｋｉｎｅｎおよびＲａｕｖａｌａ、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１６７３０−１６７３５）。細胞外マトリクス蛋白質の分解は細胞移動プロセスにおいて重要な段階であり、細胞外プロテアーゼ活性のＨＭＧＢ１促進増加は細胞の移動を可能にする。
【０００５】
ＨＭＧＢ１はＲＡＧＥレセプタ（グリコシル化最終生成物に対するレセプタ）に結合するリガンドの一つとして確認された（Ｈｏｒｉ等、１９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：２５７５２−２５７６１）。ＲＡＧＥはイムノグロブリンスーパーファミリのマルチリガンドレセプタであり、内皮細胞、平滑筋細胞、単核食細胞、およびニューロン等の多くの細胞型において発現される（Ｂｒｅｔｔ等、１９９３年、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈａｔｈｏｌ．，１４３：１６９９−１７１２；Ｎｅｅｐｅｒ等、１９９２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１４９９８−１５００４）。また、これは糖尿病、アミロイド症、アテローム性動脈硬化症等の幾つかの異なる病理学的プロセスに関係する（Ｓｃｈｍｉｄｔ等、１９９９年、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，８４：４８９−４９７）。ＨＭＧＢ１とＲＡＧＥとの相互作用は神経突起成長を誘導し、２つの蛋白質は胎児が発達している間に神経突起を進歩する前縁において共存する（Ｈｕｔｔｕｎｅｎ等、１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１９９１９−１９９２４）。ＨＭＧＢ１およびＲＡＧＥの間の相互作用を防止することにより、腫瘍成長および転移のブロックが観察される。さらに、この相互作用の阻害が、マイトジェン活性化蛋白質（ＭＡＰ）キナーゼの活性化およびマトリックスメタロプロテイキナーゼ、腫瘍増殖および侵入に重大にリンクした分子の発現を抑制する（タグチ等、２０００年、ネイチャー、４０５：３５４−３６０）。
さらに、ＨＭＧＢ１の阻害剤（すなわち、グリチルリジン(Glicyrrhizin)）は抗炎症剤として利用可能であることは既に知られている(サカモト等、２００１年、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２４（８）９０６−９１１；Ｙｏｈ等、２００２年、Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．，４７（８），１７７５−１７８１)。
【０００６】
本発明の発明者は、ＨＭＧＢ１が、ＲＡＧＥが表面で発現される細胞型の一つである平滑筋細胞（ＳＭＣ）における強力な生物学的効果を持つことを証明した。血管ＳＭＣ細胞はより大きい血管の最も優性な細胞である。つまり、細胞外マトリックスに埋設される中膜に位置する。無傷の血管において、ＳＭＣ細胞は収縮状態にあり、血管壁硬度および弾性維持および血圧制御のための細胞分裂および移動がないことにより特徴付けられた表現型を示す。
【０００７】
機械的かまたは炎症性の傷の後に内皮が損傷した場合、ＳＭＣ細胞は合成型に切り替わり、細胞分裂および細胞移動を受ける。中膜から内膜へのＳＭＣ細胞の移動により、内膜が厚くなり、冠動脈血管形成後のアテローム性動脈硬化症および再狭窄等の多くの血管損傷の病理生理学に重要な役割を果たす。前記合成状態では、ＳＭＣ細胞はより多量の細胞外プロテイナーゼ成長因子、およびサイトカインを生成し、繊維性細胞外マトリックスを分泌する。血管壁損傷の後、単球、マクロファージおよび血小板を循環することによりまたは損傷した内皮細胞により、幾つかの成長因子および／または化学誘引物質が放出され、これにより、収縮から合成型へＳＭＣ細胞の切替を誘導でき、ＳＭＣ細胞を血管内膜に向かって移動させることができる。これらの因子の中で、ｂＦＧＦは最も重要なものの一つである。しかし、ＳＭＣ細胞も血管形成の刺激に応答して移動を開始可能である（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，１９９７年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９９：２８１４−２８１６；Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ，１９９６、Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ、１０：５９−７４）。
【０００８】
ＨＭＧＢ１がＲＳＭＣ細胞移動を誘導する作用およびメカニズムを規定する試みにより、発明者はＨＭＧＢ１が強い化学誘引物質であり、細胞型変更、および細胞骨格再組織化を誘導することを示した。これらの事象は、抗ＲＡＧＥ抗体の添加によりおよび百日咳毒素により阻害され、ＲＡＧＥおよびＧｉ／ｏ蛋白質の両方がその経路に含まれるであろうことを強調する。さらに、ＨＭＧＢ１が燐酸化ＥＲＫ１および２蛋白質の核への移行を促進する証拠は、ＭＡＰキナーゼ経路の関連を示す。その後、ＨＭＧＢ１が内皮細胞を含む多くの細胞型の損傷またはネクロシスにより放出されることを示した。
したがって、ＨＭＧＢ１は、血管損傷の後のアテローム性動脈硬化症および再狭窄を促進可能な分子の顕著な特徴を全て有する。
【０００９】
発明者は、ＨＭＣボックスに相当するＨＭＧＢ１フラグメントが、完全な全長さ分子よりもより有効であり、ＨＭＧボックスファミリーの他の蛋白質のＨＭＧボックスドメインでさえも同じ効果を誘導できることを証明した。
結論として、ＨＭＧＢ１およびそのＲＡＧＥレセプタ間の相互作用を遮断できる各種の分子（すなわち、阻害剤クラスに属する全分子：抗体または抗体フラグメント、４方向ＤＮＡ；およびＨＭＧボックスアンタゴニストクラスに属する全分子：ＨＭＧボックスドメインを含むＨＭＧＢ１フラグメント分子）は、血管形成のために血管上皮の損傷後、アテローム性動脈硬化症および再狭窄を回避するか、遅らせるか、または阻害するために、薬理的調薬の製造のために効果的に使用できる。
【００１０】
ＨＭＧＢ１結合分子またはＨＭＧＢ１阻害剤は血管形成手術のために使用される器具により射出または放出可能であり、あるいは前記分子は器具表面に結合可能である。
本発明の目的は、血管疾患治療用の治療薬の調薬のためにＨＭＧＢ１およびＲＡＧＥ間の相互作用を遮断できる分子を使用することである。
【００１１】
本発明の好ましい態様では、前記分子は、前記手術中または手術後、血管形成のための、カテーテル、外科的器具、または血管形成用ステントにより放出される。
本発明のさらなる特徴および利点は、添付図面を参照して、以下の詳細な説明から容易に明らかになるであろう。
【００１２】
ＨＭＧＢ１および誘導体の発現および精製
最初の段階で、ＨＭＧＢ１および誘導体の発現および精製が必要である。
全長ＨＭＧＢ１の発現はｐＴ７−７ｒＨＭＧ１ｃｍプラスミド（ケンブリッジ大学、Ｊ．Ｏ．Ｔｈｏｍａｓ教授から送られた）で形質転換したＥ．ｃｏｌｉにおいて行われ、精製は以下の既知のプロトコル（Ｍｕｌｌｅｒ等、２００１年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０：１０２５４−１０２６１）で実施された。
イーストＰｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉａの全長ＨＭＧＢ１の発現および精製を以下の既知のプロトコル（Ｍｉｓｔｒｙ等、１９９７年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２２：７１８−７２９）で実施した。
【００１３】
周知のプラスミドｐＲＮＨＭＧ１／Ｍ１−Ｖ１７６，ｐＴ７ＨＭＧ１ｂＡ，およびｐＴ７ＨＭＧ１ｂＢを、ボックスＡ＋ボックスＢ、ボックスＡ、およびボックスＢの発現および精製のために使用し、それぞれシングルボックスおよびダブルボックスの、周知の精製手順にしたがった（Ｂｉａｎｃｈｉ等、１９９２年、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１１：１０５５−１０６３）。
【００１４】
ＨＭＧＢ１の効果を実証するために、３つの独立の細胞移動アッセイを実施した：つまり、走化性アッセイ、化学運動性アッセイ、およびインビトロ障害アッセイである。ＨＭＧＢ１誘導細胞移動および非休止細胞の形態学的な変化（すなわち、アクチン繊維再組織化、細胞延長および細胞の形状分極）の間の機能関連を研究した。
【００１５】
走化性アッセイ
走化性アッセイを周知のプロトコル（Ｄｅｇｒｙｓｅ等、１９９９年、Ｂｌｏｏｄ，９４：６４９−６６２）を使用して行った。変法ボイデンチャンバーを０．５μｍポアサイズのフィルタ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ、ＭＡ）と共に使用し、フィブロネクチン（１０μｍ／ｍｌ）のコラーゲンＩ（０．５Ｍの酢酸中１００μｇ／ｍｌ）（Ｒｏｃｈｅ）で処理した。ＲＳＭＣ細胞（ミラン、バイヤーリサーチ研究所、Ｍａｒｃｏ  Ｂｅｒｔｕｌｌｉ博士により送られた）をＤＭＥＭ血清フリー中で培養し、２０．０００−４０．０００細胞のサンプルをボイデンチャンバーの上部ウェルに添加した。試験されるべき分子を同じ血清フリー培地で培養し、下方ウェルに添加した。
【００１６】
異なるＨＭＧＢ１調製物を使用した。つまり、子牛胸腺から精製したＨＭＧＢ１（スペイン、バルセロナ、Ｃ．Ｓ．Ｉ．Ｃ．，Ｊ．Ｂｅｒｎｕｅｓから送られた）、Ｅ．ｃｏｌｉ発現組換えＨＭＧＢ１、およびイーストＰｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｍｉｓｔｒｙ等、１９９７年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２２：７１８−７２９，）にて製造された軽度に改変したＨＭＧＢ１形態（Ｎ−末端に結合したＥＡＥＡＹＶＥＦアミノ酸含有）である。
【００１７】
必要な場合には、ポリクローナルラビット抗ＨＭＧＢ１（ＣＡ、Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＢＤ），百日咳菌（シエナ、Ｉ．Ｒ．Ｉ．Ｓ．、Ｍ．Ｇ．Ｐｉｚｚａ博士から送られた）からの百日咳毒素（ＰＴ）、または前記阻害剤を両ウェルに添加した。
【００１８】
一晩、細胞移動を３７℃で行った。その後、フィルタの上部表面に残った細胞を掻き取り、フィルタをメタノール中に固定し、２０％メタニール中１０％クリスタルバイオレット溶液で染色した。全実験を少なくとも２回三重で行った。
図１−Ａ、１−Ｂ、１−Ｃ、１−Ｄに示すように、結果は、フィルタあたり１０の高倍率フィールドでカウントされ、コントロールを超えたホールドとして発現された、細胞数の平均値±ＳＤである。ランダム細胞移動（すなわち、化学誘引物質が無い状態の移動）は１００％の任意の値を付与した。
統計的分析を、処理したペアでの比較のために、スチューデントのｔテストを使用して、あるいは、試薬の高投与量を用いた処理の評価のために、ＡＮＯＶＡモデルを使用して実施した。
【００１９】
子牛胸腺からのＨＭＧＢ１は、濃度依存性態様でＲＳＭＣの移動を刺激する。０．１ｎｇ／ｍｌ投与量で開始し、１００ｎｇ／ｍｌにおける２．５倍の最大応答を示した（図１−Ａ）。ＨＭＧＢ１の効果を特徴が明確な誘引物質ｆＭＬＰおよびｂＦＧＦの効果と増幅して比較される（図１−Ｂ）。ＨＭＧＢ１に対するポリクローナル抗体は非特異的コントロール抗体ではないが、移動応答を全体的に遮断し（図１−Ｃ）これは特にＨＭＧＢ１が原因であることを示す。これらの抗体は、ポジティブコントロールとして使用した化学誘引物質ペプチドｆＭＬＰの効果を変更しなかった。類似の結果をイーストＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓで生産した組換えＨＭＧＢ１を用いて得た（図１−Ｄ）。
【００２０】
免疫蛍光アッセイ
１５．０００−２０．０００のサンプルを、２０−４０％の密集度で、２ｃｍ２ウェルのガラスカバースリップにまき、ＤＭＥＭプラス１０％ＦＣＳ中で２４時間培養し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＣＳの無いＤＭＥＭ中でさらに２４時間培養した。ＲＳＭＣを、３７℃で５〜１２０分の増加時間間隔で、ＨＭＧＢ１，１００ｎｇ／ｍｌを用いて刺激した。刺激後、ＲＳＭＣを、３％のパラホルムアルデヒド、ＰＢＳ中２％スクロース、ｐＨ７．５の溶液を用いて、室温で２０分間固定し、ＰＢＳ−ＢＳＡ０．２％を用いて３回洗浄した。細胞を２０ｍＭヘペスｐＨ７．４、３００ｍＭサッカロース、５０ｍＭＮａＣｌ，３ｍＭＭｇＣｌ２、０．５％（Ｖ／Ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で４℃、３分間透過させ、再び、３回ＰＢＳ−ＢＳＡ０．２％で洗浄した。その後、ＲＳＭＣをＰＢＳ−ＢＳＡ２％で１５分間３７℃でインキュベートし、プライマリ抗体で３７℃３０分間インキュベートし、３回ＰＢＳ−ＢＳＡ０．２％で洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ２％で１５分間インキュベートした。最後に、細胞をセカンダリ抗体および／または繊維性アクチンの可視化のためのロダミンと結合したファロイジンで染色し、場合によって、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−ヘニリンドロ、ロシュ）を使用して核をラベル化した。
【００２１】
次のインキュベションの後、カバースリップをＰＢＳ−ＢＳＡ０．２％で３回洗浄し、蒸留水で２回洗浄し、ＰＢＳ中２０％Ｍｏｗｉｏｌを入れ、Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）で分析した。蛍光写真をＴ−Ｍａｘ４００かまたはＥＰＨ  Ｐ１６００Ｘフィルム（イーストマンコダック）でＺｅｉｓｓ４００および１００Ｎｅｏｆｌｕａｒレンズを使用して撮影した。
【００２２】
図２−Ａの、低倍率の写真は、ストレス繊維含有量、細胞の形および大きさ、および細胞骨格組織化が３０分以内に変わり、１２０分後に逆になることを示す。より高い倍率の写真（図２−Ｂ）は、刺激前に多くのストレス繊維が充分に可視化され、細胞形が非分極であることを示す。１５〜３０分以内に、形態および細胞骨格組織化の完全な変化が生じる。すなわち、ＲＳＭＣはアクチン細胞骨格の空間的な再配列を反映する、延長した、分極した形態を示す。ＨＭＧＢ１の効果はゆっくり減少する。１〜２時間後、ストレス繊維含量は初期レベルに増加し、細胞形態は未刺激のコントロール細胞の形態に類似して戻る。
【００２３】
実験では、細胞を抗体またはＰＴまたは阻害剤で一晩前処理した。図２−Ｂに示すように、ＨＭＧＢ１に対する抗体は全体的に細胞骨格再組織化およびＨＭＧＢ１により誘導されたＲＳＭＣの形態的変化を阻害する。コントロール抗体はＨＭＧ１効果を阻害することができない。
【００２４】
最後に、ＲＳＭＣにおいて観察したＨＭＧＢ１の効果が実際に休止から活動状態への動的遷移を反映するかどうかを決定するために、異なる各状態において細胞の割合を定量した。低倍率写真と撮影し、細胞を２つの状態に分類した。
−状態１：ここでは、細胞は、多数のストレス繊維および非分極細胞形により特徴付けられた未刺激細胞の典型的な外観を示す。
−状態２：ここでは、ＲＳＭＣが低ストレス繊維含有量、膜波うち、アクチンセミリング、または延長形を示す。
【００２５】
未刺激培地における６０％の細胞が状態１に、そして４０％が状態２にあることが図２−Ｃから明らかである。刺激後、５分以内に状態２の細胞が６０％になり、１５〜３０分で８０％になる。ＨＭＧＢ１での刺激後１時間で、これらの割合は未刺激培地の値と逆になる。つまり、状態１でＲＳＭＣ６０％、状態２で４０％である。これらのデータは、ＨＭＧＢ１効果が一時的であり、休止から移動状態に変化することを表している。これらのデータはＨＭＧＢ１がＲＳＭＣに対する化学誘引物質であるという走化性の結果を確認した。
【００２６】
インビトロ損傷アッセイ
２ｃｍ２ウェルのガラスカバースリップで成長した、ＲＳＭＣの密集培養物をＰＢＳで１回洗浄し、血清フリーＤＭＥＭで２４時間ＦＣＳ飢餓にした。その後、損傷を刺激するために、単層の中央領域にペプチドのチップで単線を形成した。このように処理した単層をＰＢＳで１回洗浄し、ＨＭＧＢ１（１００ｎｇ／ｍｌ）で補助したまたは補助しない血清フリー培地で４８時間再生した。その後、細胞を固定し、ＴＲＩＴＣファロイジンで染色した。移動の定量化を低倍率の写真にとり、細胞の無い空間に移動した細胞数を係数することにより行った。データは平均値±ＳＤを表し、１００％の値は刺激の無い状態で移動した細胞の数（基礎移動）に相当する。
図４に示すように、ＨＭＧＢ１刺激は５−２−倍だけ移動細胞の数を増加する。ボックスＡおよびボックスＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）も試験して、両方共細胞移動を１．８−倍を刺激する。最終的に、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）との比較により、上記分子がより効果的であることを強調される。損傷の治癒が走化性および化学運動性の同じ信号伝達経路に基づくことを仮定可能である。
【００２７】
信号伝達経路
後で、信号伝達経路を検出した。移動信号として作用するために、ＨＭＧＢ１は応答細胞の膜に到達してリセプタに結合する必要がある。ＨＭＧＢ１がＲＳＭＣの表面に結合するかどうかを試験するために、百万の細胞をトリプシン処理し、２０分間４℃で、ボックスＡ＋Ｂペプチド８００ｎｇおよび５μｇＢＳＡ含有ＰＢＳ中でインキュベートした。ボックスＡ＋ボックスＢポリペプチドは内皮全長ＨＭＧＢ１より僅かに小さく、したがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで容易に区別できる。その後、細胞はペレット化され、上澄みは保存された。５００μｌの冷いＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー中に再懸濁し、１００℃で５分間加熱し、１２％のトリシン−ＳＤＳゲルに置いた（ラインＰ）。隣に２０μｌの上澄みを置いた（ラインＳ）。その後、ゲルをイモビロンフィルタにブロットし、インディアインクで染色した。
【００２８】
図５−Ａにおいて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。これから、細胞ペレット中でおよび上澄み中で回復したボックスＡ＋Ｂの量を計算可能である。そして、５０００００より多いボックスＡ＋Ｂ分子がシングルＲＳに結合することを評価できる。この結果は、細胞外ＨＭＧＢ１がＲＳＭＣに結合できるが、実際のレセプタ数を反映しないことを示している。実際、ＨＭＧＢ１はヘパリンおよびプロテオグリカンに結合することが既に示されている（Ｂｉａｎｃｈｉ，１９８８年、ＥＭＢＯ  Ｊ．、７：８４３−８４９；ＮａｉｒおよびＪｕｎｇａｌｗａｌａ、１９９７年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、６８：１２８６−１２９７；Ｓａｌｍｉｖｉｒｔａ等、１９９２年、Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．，２００：４４４−４５１）。ＨｅＬａにおける発明者により既に説明されたように、ＨＭＧＢ１はＲＳＭＣによって生産された細胞外マトリックスにも結合し得る。ここでは、ほんの少量のＨＭＧＢ１が細胞に結合するのみであり、これらの細胞は細胞外マトリックスを殆ど生産しない。
【００２９】
ＨＭＧＢ１は、広い範囲の細胞型によって発現されるＲＡＧＥに結合することが報告された。ＲＡＧＥがＲＳＭＣ膜に存在することを説明するために、百万ＲＳＭＣをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（５０ｍＭトリスｐＨ６．８、２％の２−メルカプトエタノール、４％ＳＤＳ、１２％グリセロール、０．０５％ブルモフェノールブルー）含有プレートに溶解し、１００℃で５分間変性し、そして１２％アクリルアミド上で分離した。分離した蛋白質を、タンクブロットシステム、２５ｍＭトリスｐＨ７．５、０．１９２Ｍグリシン、２０％メタノールを使用して、イモビロン（ミリポアより）でブロットした。このブロットを１時間室温で５％スキムミルク／ＴＢＳＴ（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１３７ｍＭのＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中でブロットし、３回ＴＢＳＴで洗浄し、抗ＨＭＧＢ１抗体と共にＴＢＳＴ−０．０１％ＢＳＡ中でインキュベートした。ＴＢＳＴ−０．０１％ＢＳＡで洗浄した後、セカンダリ抗体と共にインキュベートした。蛋白質をＥＣＬシステム（アメシャム）で検出した。ＲＡＧＥの存在を抗ＲＡＧＥ抗体（ニューヨーク、コロンビア大学、Ａ．Ｍ．シュミット博士から送られた）を使用して検出した。図５−Ｂに示される結果は、ＲＡＧＥがＲＳＭＣに存在することを示している。さらに、ＨＭＧＢ１走化性は、図５−Ｃに示すように、抗ＨＭＧＢ１抗体によって阻害されるのみならず、抗ＲＡＧＥ抗体によっても阻害される。抗ＲＡＧＥ抗体は、ＨＭＧＢ１移動信号に応答して、ＲＳＭＣの細胞骨格再組織化および形態学的変化を遮断する。つまり、無関係な抗体は細胞骨格再組織化を遮断できない。
【００３０】
これらのデータはＲＡＧＥレセプタがＲＳＭＣのＨＭＧＢ１誘導応答に必要であることを示す。
多くの化学誘導物質が、蛋白質（Ｇ蛋白質）に結合するヘテロ三量体のＧＴＰに結合した膜レセプタを介して作用することを知るために、Ｇ蛋白質がＨＭＧＢ１信号伝達に関連するかどうかを試験した。百日咳毒素が特異的サブクラスのＧ蛋白質すなわちＧｉ／ｏ蛋白質を阻害し、信号伝達経路における関与を明らかにするので、百日咳毒素（ＰＴ）を使用した（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ等、１９９４年、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５５：９７−１７９；Ｈａｒｉｂａｂｕ等、１９９９年、．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：３７０８７−３７０９２）。ｍＰＴつまりＰＴの不活性変異体をコントロールとして使用し、ＲＳＭＣをＰＴまたはｍＰＴ（５０ｎｇ／ｍｌ）で６時間前処理し、ＨＭＧＢ１（１００ｎｇ／ｍｌ）、ボックスＡまたはボックスＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）で３０分間刺激した。走化性アッセイを前記のように行った。データは平均値±ＳＤを表し、１００％値は刺激剤の無い状態における基礎移動に相当する。図６−Ａにおいて、ＨＭＧＢ１誘導走化性におけるＰＴの阻害効果を示す。これらのデータは、ＨＭＧＢ１により制御された信号伝達経路におけるＧｉ／ｏ蛋白質の関与を示唆する。図６−Ｂにおいて、細胞骨格再組織化を示す。アクチンフィラメントを前記にように可視化した。その後、ＨＭＧＢ１誘導信号伝達がＭＡＰキナーゼ経路を含むかどうかを研究した。事実、これらの蛋白質はＲＡＧＥにより活性化され、細胞内運動性機構の調製に直接役割を果たすことが知られている。ＲＳＭＣをＰＤ９８０５９（５０ｍＭ）で１時間前処理するかまたは前処理せず、子牛胸腺（１００ｎｇ／ｍｌ）からのＨＭＧＢ１で３０分間刺激し、リン酸化ＥＲＫ１／２（ニューイングランドバイオラボズ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）およびＤＡＰＩに対する特異的抗体で染色した。細胞の別のサンプルをＴＲＩＴＣファロイジンで染色し、細胞骨格の再組織化を可視化した。図７では、３０分間で、いかにしてＨＭＧＢ１刺激がＲＳＭＣにおいてＥＲＫ１／２蛋白質の活性化を誘導するか、および核転移を誘導するか、逆に、リン酸化ＥＲＫ蛋白質が殆ど検出されず、未刺激のＲＳＭＣの細胞質に位置するかを示す。さらに、ＰＤ９８０５９，ＭＥＫの選択的阻害剤、ＥＲＫの上流レギュレータはＨＭＧＢ１誘導ＥＲＫリン酸化および核転移ならびにＲＳＭＣ移動および細胞骨格再組織化を阻害する。したがって、これらのデータはＭＡＰキナーゼ経路がＨＭＧＢ１誘導細胞移動において本質的な役割を果たしていることを示す。
【００３１】
細胞損傷の誘導
技術状態を考慮して、ネクロシスを受ける損傷細胞が細胞外培地中にＨＭＧＢ１を放出できるかどうかを検出した。
５μＭのイオノマイシン（シグマ）および２０μＭのＣＣＣＰ、またはｍＭデオキシグルコースおよび１０ｍＭアジ化ナトリウムで処理することにより、ＨｅＬａ細胞およびＨＵＶＥＣを誘導してネクロシスさせた。３７℃で１６時間後、ネクロシスを受けた細胞の数を形態学的に記録し、５０％に達したとき、上澄みを集めた。
【００３２】
ウェスタンブロット分析のために、処理細胞および未処理細胞からの培地を集め、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣフィルタを使用して５０倍に濃縮し、細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに溶解した。
免疫蛍光分析のため、細胞を４％ＰＦＡで固定し、抗ＨＭＧＢ１抗体でインキュベートし、セカンダリ抗体およびＤＡＰＩで染色した。細胞の透過化処理を、ＰＢＳ中０．１％ＮＰ−４０を使用して行った。
図８−Ａにおいて、上澄み中の蛋白質および細胞ペレットのウェスタンブロット分析を表し、ＨＭＧＢ１をネクロシス細胞および損傷細胞の両方の上澄み中で回収した。図８−Ｂにおいて、シングルリビングおよびネクロシスＨｅＬａにおいて実施された免疫蛍光アッセイを示す。ＨＭＧＢ１はネクロシス細胞の残物に結合しない。
【００３３】
図９では、免疫組織学アッセイの結果を示す。これらのデータはＨＭＧＢ１が、ＲＳＭＣの核ではなくヒト動脈にある内皮細胞の核に含まれることを確認する（図９−Ａでは低い倍率；図９−Ｂでは高い倍率）。実際、平滑筋細胞の殆どの核は非検出量のＨＭＧＢ１を含む（図９−Ｂにおけるフレーム）。図９−Ｃでは、ウェスタンブロット分析はＨｅＬａ細胞に比べたＲＳＭＣにおけるＨＭＧＢ１の発現レベルをしめし、ＲＳＭＣのインビトロ培養物はＨｅＬａ細胞に比べて少量のＨＭＧＢ１を含むことを示す。
【００３４】
結局、これらのデータは、ＨＭＧＢ１分子において、血管平滑筋細胞への信号が単に近傍細胞の機構的損傷またはネクロシスにより起こり得ることを示唆する。
結論として、上記の実験データつまり本発明の基礎は、核ＨＭＧＢ１蛋白質が、機構的損傷および／または炎症後に生じる血管再構築の強い媒介物であることおよび損傷またはネクロシス細胞により受動的に放出されうることを示す。
特に、これらのデータは以下のことを示唆する。
【００３５】
ＨＭＧＢ１は化学誘導物質として作用する
ＨＭＧＢ１は走化性アッセイおよび損傷アッセイにおけるｂＦＧＦまたはｆＭＬＰとして強力な化学誘導物質であり、プロ−ウロキナーゼでの観察に類似した細胞形および細胞骨格組織化の変化を促進する。これらの効果は特にＨＭＧＢ１に起因し、潜在的な汚染物質に起因しない。さらに、ＨＭＧＢ１に対する抗体は、細胞移動における効果を阻害するが、非特異的コントロール抗体はそのようにはできない。
【００３６】
ＲＡＧＥへの結合がＲＳＭＣにおけるＨＭＧＢ１信号伝達経路を開始させる
上記報告の実験は、ＲＡＧＥがＲＳＭＣにおいて発現されること、および抗ＲＡＧＥ抗体がＲＳＭＣにおけるＨＭＧＢ１の効果を阻害することを示す。
ＭＡＰキナーゼがＲＳＭＣのＨＭＧＢ１誘導細胞移動に関与することが確認された。その理由は、ＥＲＫ１／２がリン酸化されＨＭＧＢ１刺激において細胞核に転位され、ＭＥＫ阻害剤ＰＤ９８０５９がＨＭＧＢ１誘導細胞移動を遮断できるからである。さらに、データは、Ｇｉ／ｏ蛋白質がＨＭＧＢ１により活性化される工程に関与することも示す。その理由は、ＨＭＧＢ１誘導細胞移動はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ百日咳毒素により遮断され得るからである。Ｇ蛋白質は通常、７−膜貫通型−エリックスレセプタ（７ＴＭ）に結合するが、現時では、ＲＡＧＥとＧ蛋白質の間の直接の関係は説明されていない。これまで、ＨＭＧＢ１がＲＡＧＥに加えて７ＴＭレセプタ／Ｇ蛋白質レセプタに結合するために必要であるか、Ｇ蛋白質がＲＡＧＥの下流でまたはフィードバック機構で関与するかが知られている。
【００３７】
ＨＭＧＢ１パラクリン機能
細胞が機械的に損傷を受けるかまたはネクロシスを受けるとき、ＨＭＧＢ１は非調整的な態様で放出される。これは、サイトカインまたはリポ多糖体で刺激した際を意味する。こうして、ＨＭＧＢ１はパラクリンの態様で近傍の細胞に個々の細胞の損傷または破壊を信号伝達することができる。細胞外ＨＭＧＢ１に応答する細胞はＨＭＧＢ１を殆ど含まないことが明らかであり、核内には殆どない。ＲＳＭＣはＨｅＬａ細胞または内皮細胞と比較してＨＭＧＢ１を殆ど含まず、殆ど含まれないＨＭＧＢ１は主には細胞質に存在する。移動性ＲＳＭＣは細胞のリーディングエッジにおいて表面上にＨＭＧＢ１を濃縮する傾向がある。移動性細胞のリーディングエッジにおけるＨＭＧＢ１の濃縮により近傍細胞のＨＭＧＢ１誘導応答を呼び起こす。つまり、インテグリン、ウロキナーゼレセプタまたはｃ−Ｓｒｃ等の細胞移動に関与する分子の再配置は、運動性ＲＳＭＣの特徴である。移動は細胞外プロテアーゼの活性化を伴い、ＨＭＧＢ１およびプラスミノーゲン活性化システム間の相互作用は細胞外マトリックス内で細胞移動を促進し得る。
【００３８】
脈管障害におけるＨＭＧＢ１の役割
ＨＭＧＢ１に対する平滑筋細胞の応答性、内皮細胞は多量のＨＭＧＢ１を含むが、血管ＳＭＣは殆ど含まないという観察、および機械的損傷を受ける細胞からのＨＭＧＢ１の放出、上記これらの全結果はアテローム性動脈硬化症および再狭窄において生じる組織再構築の間におけるＨＭＧＢ１の潜在的な役割を示す。
本発明の目的である、ＨＭＧＢ１およびＲＡＧＥレセプタ間の相互作用を阻害できる分子の同定が可能な上記特別な実験結果は、分子の構造的なおよび機能的な特徴を考慮し、以下のとおりである。
１．ＨＭＧＢ１アンタゴニスト：ＨＭＧＢ１フラグメント、ＨＭＧボックス類似体、完全な全長分子よりもより効果的である、およびＨＭＧボックスドメイン含有蛋白質、最後の２つは両方ともＲＡＧＥレセプタに結合可能である。
２．ＨＭＧＢ１阻害剤：分子、抗体または抗体フラグメントおよび４方向ＤＮＡ、ＨＭＧボックスボメインに結合し、かつＨＭＧＢ１がＲＡＧＥに結合するのを回避する。
これらの分子は、脈管形成後に生じる事象を含む、血管上皮損傷後のアテローム性動脈硬化症および／または再狭窄を防止するか、遅らせるか、または最小限にする薬理的調製用に有利に使用される。
【００３９】
さらに、本発明の発明者は、ＨＭＧＢ１はマウス胎児繊維芽細胞における強い生物学的効果を有することを示した。繊維芽細胞は結合組織の主な細胞成分であり、結合性細胞外マトリックスの維持および合成の原因であることが知られている。特に、ＨＭＧＢ１は繊維芽細胞に対する強い化学誘引物質としてインビトロにおいて作用し、抗ＲＡＧＥ抗体はこの効果を遮断する。
【００４０】
したがって、積極的に規制する薬理的薬剤の調製のために、完全な全長蛋白質として、ＨＭＧＢ１とホモロジーを有する各種の分子を使用することができ、したがって、繊維芽細胞の細胞移動を促進および／または誘導することができる。同様に、ＨＭＧＢ１およびそのＲＡＧＥレセプタ間の相互作用を遮断できる各種分子（すなわち、阻害剤グループに属する全分子：抗体または抗体フラグメント、４方向ＤＮＡ；およびＨＭＧボックスアンタゴニストグループに属する全分子）は、結合組織再生成を避けるか、遅らせるか、または減じるために、効果的に薬理的薬剤の製造のために使用できる。
本発明の付加的な目的は、繊維芽細胞移動を促進および／または誘導し、その結果積極的に結合組織再生成を調整する治療的薬剤の調製のために、ＨＭＧＢ１、ＨＭＧボックスに対応するＨＭＧＢ１フラグメント、ＨＭＧボックスファミリーに属する他の蛋白質のＨＭＧボックスドメイン、およびＨＭＧボックスファミリーの他の蛋白質の使用である。
【００４１】
本発明の完全な部分は、以下の実験により明らかにされる、結合組織再生成を減少、遅延、回避する治療的薬剤の調製のために、ＨＭＧＢ１およびＲＡＧＥレセプタ間の相互作用を阻害する、全分子、アンタゴニストおよび／または阻害剤の使用である。
【００４２】
繊維芽細胞の走化性アッセイ
走化性アッセイは周知のプロトコルを使用して実施される（Ｄｅｇｒｙｓｅ等、１９９９年、Ｂｌｏｏｄ、９４：６４９−６６２）。０．５μｍポアサイズ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）を有するフィルタを具えた変法ボイデンチャンバーを使用して、コラーゲンＩ（０．５Ｍの酢酸中の１００μｇ／ｍｌ）およびフィブロネクチン（１０μｇ／ｍｌ）（Ｒｏｃｈｅ）を処理した。マウス胎児繊維芽細胞を周知のプロトコルにしたがって培養した（Ｃａｌｏｇｅｒｏ等、１９９９年、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２２：２７６−２８０）および２４時間の血清飢餓の後、２０．０００−４０．０００細胞のサンプルをボイデンチャンバーの上方ウェルに添加した。Ｅ．ｃｏｌｉ発現組換えＨＭＧＢ１を同じ血清フリー培地に希釈し、下方ウェルに添加した。
【００４３】
抗ＲＡＧＥ抗体（１０００ｎｇ／ｍｌ）（ニューヨーク、コロンビア大学、Ａ．Ｍ．シュミット博士から送られる）を両ウェルに添加した。
３７℃で一晩中細胞移動をさせた。その後、フィルタの上方表面に残る細胞を書き取り、フィルタをメタノール中で固定し、２０％メタノール中１０％のクリスタルバイオレットの溶液中で染色した。全実験を少なくとも２回、三重に行った。
【００４４】
図１０に示すように、結果は、フィルタ当たり１０倍の高倍率で係数した細胞の数の平均値±ＳＤであり、未処理コントロールを超えたホールドとして発現される。ランダム細胞移動（すなわち、化学誘導物質の不存在下の移動）に、１００％の任意値を与える。統計的な分析を、増加する投与量の薬剤での処理の評価に対するＡＮＯＶＡモデルを使用して行った。
【００４５】
Ｅ．ｃｏｌｉ発現組換えＨＭＧＢ１は、濃度依存態様での繊維芽細胞を刺激し、０．１ｎｇ／ｍｌの投与量で、１００ｎｇ／ｍｌにおける最大応答で開始し、より高い投与量（１０００ｎｇ／ｍｌ）で応答はコントロールより低い。抗ＲＡＧＥ抗体（１０００ｎｇ／ｍｌ）は全体的に移動応答（図１０のグラフの右側）を遮断する。これはＨＭＧＢ１に特に起因することを示す。
【００４６】
結合組織再生成の調整におけるＨＭＧＢ１の役割
ＨＭＧＢ１への繊維芽細胞の応答性は、外傷または外科手術に起因する損傷の後生じる結合組織再構築の間、ＨＭＧＢ１の潜在的な役割を指摘する。さらに、抗ＲＡＧＥ抗体が前記応答を遮断する事実は細胞表面上のＲＡＧＥレセプタおよびＨＭＧＢ１間の相互作用がＨＭＧＢ１に対する繊維芽細胞感受性へ至る基本的な事象であることを示す。
【００４７】
結論：
−ＨＭＧＢ１および／またはＨＭＧボックスに対応するＨＭＧＢ１フラグメント、ＨＭＧボックスファミリーにおよびＨＭＧボックスファミリーの他の蛋白質に属する他の蛋白質のＨＭＧボックスドメインは、結合組織再生成を積極的に調節、すなわち促進および／または誘導する薬理的調製のために有利に使用される。
−アンタゴニストグループに属する、（ＲＡＧＥレセプタに結合可能）、阻害剤グループに属する、（すなわち、ＲＡＧＥレセプタにＨＭＧボックスドメインブロッキングＨＭＧＢ１結合を結合可能）ＨＭＧＢ１およびＲＡＧＥ間の相互作用を阻害できる各種類の分子は、結合組織再生成を調製、すなわち遮断、遅延、または減少する薬理的調製のために有利に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、変法ボイデンチャンバーを使用して行われる走化性アッセイにおいてＲＳＭＣにおけるＨＭＧＢ１走化性活性を示す。１００％値は、刺激剤が無い状態における細胞移動（ランダム細胞移動）の数に相当する。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。図１−Ａは、子牛の胸腺からの精製されたＨＭＧＢ１に対するＲＳＭＣの濃度依存移動応答を示す。図１−Ｂは、化学誘引物質ｆＭＬＰおよびｂＦＧＦの効果と、子牛の胸腺から精製したかまたはイーストにおいて発現された、ＨＭＧＢ１蛋白質の走化性効果の比較を示す。図１−Ｃは、ｆＭＬＰ−およびＨＭＧＢ１−誘導移動における抗ＨＭＧＢ１抗体の効果を示す。星印（＊）は、移動性応答が、スチューデント試験においてｐ＝０．０００１限界を超えてコントロールと統計的に異なった処理を示す。図１−Ｄはイースト（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現したＨＭＧＢ１へのＲＳＭＣの濃度依存性移動性応答を示す。
【図２】図２は、ＲＳＭＣの形態学および細胞骨格組織化におけるＨＭＧＢ１の効果を示す。図２−Ａは子牛胸腺から精製された、またはＲＳＭＣのサブコンフルエントな培地におけるイーストまたはＥ．ｃｏｌｉにおいて発現されたＨＭＧＢ１の効果を示す。アクチンフィラメントをＴＲＩＣファロイジンを使用して可視化した。図２−Ｂは、抗ＨＭＧＢ１ラビット抗体がＨＭＧＢ１刺激性細胞骨格再組織化を阻害する様子を示す。休止細胞（状態１）は多くのストレスファイバーを示す。非休止細胞（状態２）はアクチン細胞骨格の再組織化を示す。
【図３】図３はＨＭＧＢ１のＨＭＧボックスドメインへのＲＳＭＣの走化性応答を示す。図３−Ａは共にＥ．ｃｏｌｉで発現された、ボックスＡおよびＢへの濃度依存性応答を示す。ランダム細胞移動は１００％移動として示す。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。結果の統計的有意性は、ボックスＡおよびＢの両方に対して、ＡＮＯＶＡモデルでｐ＜０．０００１である。図３−ＢはＥ．アクチン細胞骨格組織化における、ｃｏｌｉで発現した全長ＨＭＧＢ１、ボックスＡ＋Ｂ、ボックスＡ、またはボックスＢの効果を示す。アクチンフィラメントはＴＲＩＣファロイジンを使用して可視化した。
【図４】図４は、傷へのＲＳＭＣ移動におけるＨＭＧボックスおよびＨＭＧＢ１の効果を示す。１００％値は刺激剤の存在しない状態における細胞移動の数（基礎移動）に相当する。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝５）を表す。統計的有意性は、ｂＦＧＦおよび全長バクテリア作成ＨＭＧＢ１で治療するためには０．０５＜ｐ＜０．０１、ボックスＡおよびボックスＢで治療するためには０．０１＜ｐ＜０．００１、および子牛胸腺ＨＭＧＢ１で治療するためには０．００１＜ｐ＜０．０００１である。
【図５】図５はいかにしてＨＭＧＢ１がＲＳＭＣの表面に結合し、ＲＡＧＥを介して細胞運動性を刺激するかを示す。図５−Ａは多量のＨＭＧＢ１がＲＭＳＣ表面に結合することを示す。図５−Ｂにおいて、ＲＡＧＥを発現するＲＳＭＣが示される。図５−Ｃはいかにして抗ＲＡＧＥ抗体がＨＭＧＢ１誘導ＲＭＳＣ移動を阻害するかを示す。統計的有意性はＨＭＧＢ１およびＨＭＧＢ１プラス非特異的抗体で治療するためには０．００１＜ｐ＜０．０００１である。
【図６】図６はいかにして百日咳毒素（ＰＴ）がＨＭＧＢ１誘導ＲＳＭＣ移動およびアクチン細胞骨格再組織化を阻害するかを示す。図６−Ａに、変法ボイデンチャンバーを使用して実施された走化性アッセイが示される。１００％の値は、刺激剤の無い状態で基礎細胞移動に相当し、データは平均値±ＳＤを表す。図６−Ｂは明らかな細胞骨格再組織化を示し、アクチンフィラメントを結合ＴＲＩＣファロイジンを使用して可視化した。
【図７】図７はＭＡＰキナーゼ経路がＨＭＧＢ１信号伝達に伴われることを示す。細胞はリン酸化ＥＲＫ１／２およびＤＡＰＩに対する特異的抗体で染色され、細胞の別のサンプルはＴＲＩＣファロイジンで染色し細胞骨格の再組織化を可視化する。
【図８】図８はＨＭＧＢ１が壊死および損傷細胞により放出されることを示す。図８−Ａは壊死または透過ＨｅＬａにより放出された蛋白質のウェスタンブロット分析の結果を示す。ＨＭＧＢ１の存在はライン１およびライン３において明らかである。図８−Ｂは壊死および生きているＨｅＬａにおいて実施された免疫蛍光アッセイの結果を示す。
【図９】図９はＨＭＧＢ１が内皮細胞の核に存在するが、血管ＳＭＣの核には存在しないことを示す。図９−Ａおよび９−Ｂでは、ＨＭＧＢ１が内皮細胞の核に存在するが、低倍率（Ａ）および高倍率（Ｂ）にて、抗ＨＭＧＢ１抗体で染色された、およびヘマトキシリンで対比染色されたヒト膵臓動脈の一部の血管平滑筋細胞の核には検出されないことが示される。赤枠は図Ｂにおいて示された領域の位置を示し、矢印はＳＭＣの核を指す。図９−Ｃでは、ウェスタンブロット分析がＨｅＬａ細胞に比較した、ＲＳＭＣにおけるＨＭＧＢ１の発現レベルを示す。
【図１０】図１０は、抗ＲＡＧＥ抗体（１０００ｎｇ／ｍｌ）の存在または非存在下における、変法ボイデンチャンバーを使用して実施された走化性アッセイにおけるマウス胎児繊維芽細胞におけるＨＭＧＢ１の走化性効果を示す。１００％の値は刺激剤の無い状態（ランダム細胞移動）における細胞移動の数に相当する。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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