(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に親和性を有するGSL-IIおよびPHAからなる群から選ばれるGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種、および、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するBLLおよびABAからなる群から選ばれるGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を組み合わせて用いることを特徴とする、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖の検出方法。
【請求項２】
前記GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖が、転移性癌に特徴的な糖鎖であることを特徴とする、請求項１に記載のGnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖の検出方法。
【請求項３】
GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に親和性を有するGSL-IIおよびPHAからなる群から選ばれるGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種、および、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するBLLおよびABAからなる群から選ばれるGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を組み合わせて用いることを特徴とする、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖の精製方法。
【請求項４】
GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に親和性を有するGSL-IIおよびPHAからなる群から選ばれるGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種、および、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するBLLおよびABAからなる群から選ばれるGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を組み合わせて用いることを特徴とする、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖のスクリーニング方法。
【請求項５】
GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に親和性を有するGSL-IIおよびPHAからなる群から選ばれるGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種、および、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するBLLおよびABAからなる群から選ばれるGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を含む、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖を検出するための検出試薬キット。
【請求項６】
GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に親和性を有するGSL-IIおよびPHAからなる群から選ばれるGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種、および、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するBLLおよびABAからなる群から選ばれるGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を含む、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に由来する疾患または該糖鎖をマーカーとする疾患の診断薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、N-アセチルグルコサミン転移酵素-V（GnT-Vという）により合成される糖鎖の検出方法に関し、より詳細には転移性癌に特徴的な糖鎖を精度高く検出する等に有用な前記検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質のN結合型糖鎖の分岐鎖構造を決定する糖転移酵素に、N-アセチルグルコサミン転移酵素-III（GnT-III）、-IV（GnT-IV）、-V（GnT-V）、-VI（GnT-VI）等があり、これらは、図５に示すように、それぞれ特定の分岐鎖に非還元末端N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）を転移付加する働きを有する。付加された糖鎖は、さまざまな生体機能に関与している。【０００３】
例えばGnT-IIIは、混成型や複合型のN型糖鎖上に、バイセクティングGlcNAc結合を合成する。狂牛病のプリオンタンパク質では、GnT-IIIによって付加されるはずの糖鎖が正常なプリオンタンパク質よりも少ないことを、英国のDwek博士等が発見した。GnT-III遺伝子の発現低下は、疾病型プリオンタンパク質の増加につながる可能性がある。また、GnT-IIIには、メラノーマの肺転移等の癌転移を抑制する作用、B型肝炎ウイルス（HBV）の増殖を抑制する作用、HBV関連タンパクの分泌を抑制する作用、IgGの活性を高める作用を有することも示唆されている。【０００４】
GnT-Vは、N型糖鎖にGlcNAcβ1-6Manα1-6Manβ1-4の分岐を合成する。N型糖鎖における分岐側鎖の数は、通常、３〜４個であるが、組織の癌化やTリンパ球の活性化に伴って数が増加する。側鎖の数が増えることは、癌で増加することが知られているポリ-N-アセチルラクトサミンの量が増えることにつながる。N-アセチルグルコサミン転移酵素GnT-Vの遺伝子が破壊されたマウスでは、癌の転移が抑制されること、また転移性の高い癌ではGnT-Vの活性が高まっていることが知られている。GnT-Vは、癌の転移だけでなく、肝発癌過程で癌化の初期にも発現が上昇するために、発癌にも深く関与することも指摘されている。
【発明の開示】
【０００５】
N-アセチルグルコサミン転移酵素の中でもGnT-Vにより合成される糖鎖は、癌転移に関わる生命情報物質として生命機構や疾患治療に特に有用なため、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖を正確に識別したいという要望がある。
【０００６】
レクチンは、細胞膜表面の糖タンパク質や糖脂質に含まれる糖鎖と特異的に結合するタンパク質である。レクチンは、糖タンパク質の糖鎖を認識して結合すると、細胞が血球の場合には血球凝集を引き起こし、細菌の場合には細胞凝集を引き起こす等の作用も有する。レクチンの特異的な認識作用や凝集作用を利用して、臨床診断薬、試薬、治療薬等が開発されている。
【０００７】
N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）の付加した糖鎖を特異的に認識するレクチンとして、コムギ胚芽レクチン、インゲンマメレクチン等が知られている。レクチンは一般に特定の糖鎖に特異的に結合するといわれているが、現在知られているGlcNAc特異的レクチンは、GnT-Vによって転移される糖鎖を認識する他に、GnT-ＩＩＩやGnT-VＩにより合成される糖鎖も認識する点で、GnT-Vにより合成される糖鎖を正確に識別したいという上記の要望を完全に満たすものとはいえない。したがって、現状では、一のレクチンを使用して、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖を正確に識別することは困難である。
【０００８】
本発明は、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖を確実にまたは高い精度をもって検出し、精製し、そしてスクリーニングする方法を提供することにある。
【０００９】
本発明者等は、上記課題を鋭意検討した結果、GlcNAc特異的レクチンにはGnT-Vにより転移付加されるGlcNAcを持つ糖鎖を認識するものと認識しないものとの二種類が存在し、これらの二種類のレクチンを組み合わせて用いれば上記課題を解決できること見出した。すなわち、本発明のGnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖の検出方法は、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種、および、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を組み合わせて用いることを特徴とする。本発明の検出方法は、二種類の異なるGlcNAc特異的レクチンを用いることが重要であり、これらのレクチンを同時に用いても、あるいは時系列、すなわち二段階の検出操作に用いてもよい。二段階操作を行う場合は、二種類のレクチンのいずれを優先させてもよい。
【００１０】
本明細書において、「糖鎖」は、N型結合型糖鎖であれば、遊離のオリゴ糖鎖、Cy3やアミノピリジン等で蛍光標識された糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、細胞等のすべてを含有する意味で使用する。糖タンパク質は、高マンノース型、複合型、混成型等を含む。さらに、シリアリダーゼ、ガラクシトシターゼ、N-アセチルヘキソサミニダーゼ、フコシダーゼのいずれかを単独もしくは混用して、あるいは段階的に使用して、前記糖鎖を部分的に分解したものであってもよい。
【００１１】
前記GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するGlcNAc特異的レクチンは、GnT-Iおよび／またはGnT-IIにより転移されたGlcNAｃを持つ糖鎖に親和性を有することが好ましい。前記GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に親和性を有するGlcNAc特異的レクチンは、例えばGSL-II、DSA、EVA、ECA、LEA、PWM、STA、WGA、PVL、PHAおよびCEL-Iからなる群の少なくとも一種であり、かつ前記GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するGlcNAc特異的レクチンがBLLおよびABAの少なくとも一種である。
【００１２】
前記GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖は、例えば転移性癌に特徴的な糖鎖である。
【００１３】
本発明はまた、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種、および、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を組み合わせて用いることを特徴とする、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖の精製方法を提供する。本発明は、さらに前記精製方法により精製されたGnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖を提供する。
【００１４】
本発明はまた、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種、および、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を組み合わせて用いることを特徴とする、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖のスクリーニング方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種、および、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を含む、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖を検出するための検出試薬キットを提供する。
【００１６】
本発明はまた、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種、および、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を含む、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に由来する疾患または該糖鎖をマーカーとする疾患を診断するためのキットを提供する。
【００１７】
本発明はまた、上記方法により検出されたGnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖を用いて、GlcNAc特異的レクチンのGnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に対する親和性を判別する方法を提供する。この方法は、GlcNAc特異的レクチンといわれるものから、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に対する非親和性を有するレクチンを選別するのに有用である。
【００１８】
本発明によれば、GlcNAc特異性の詳細が異なる二種類のレクチンを併用することによって、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖の正確な検出、スクリーニングおよび精製が可能になる。
【００１９】
前記GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖は、転移性の高い癌に特徴的でもあるため、本発明は、癌転移性の簡易かつ正確な診断や診断率向上を可能にする。癌治療の効果判定や予後判定にも使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の検出方法に従う行程（I）および（II）のフローシートである。
【図２Ａ】本発明の検出方法に使用するPA-オリゴ糖の構造表示を示す。還元末端は、ピリジルアミノ化されている。
【図２Ｂ】本発明の検出方法に使用するPA-オリゴ糖の構造表示（図２Aの続き）を示す。還元末端は、ピリジルアミノ化されている。単糖のピラノース環を表示するのに使用する記号および、結合の種類がαかβかを表す記号を、図下の枠内に示す。
【図３】GSL-II（左側）およびBLL（右側）について、（A）pNP-糖および（B）PA-糖の結合定数（Ka）を示す棒グラフである。
【図４】一部および完全アガラクトN結合型糖鎖に対する（A）GSL-IIおよび（B）BLLの結合定数（Ka）を示す棒グラフである。図は糖鎖を結合定数の大きい順に配列している。
【図５】各種N-アセチルグルコサミン転移酵素によってGlcNAcが転移される場所を模式化した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態を添付の図面を用いて説明する。本発明の検出方法で検出しようとするGnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖とは、例えば下記の化学式：
【化１】
0004822455.tif 000002
〔式中、R’は、OHまたはα-L-Fucose (α-L-フコース)であり、R1、R2、R3、R4、およびR6は、独立に、OH、または糖鎖、例えばGlcNAcβ1、Galβ1-3GlcNAcβ1、Galβ1-4GlcNAcβ1、Siaα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1、Siaα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1、Siaα2-6Galβ1-3GlcNAcβ1、Siaα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1やその部分的繰り返し、Fucoseがついたもの、例えばSiaα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-6Galβ1、Fucα1-2Galβ1等の糖鎖であり、R5は、OHまたはGalβ1、Siaα2-3Galβ1、Siaα2-6Galβ1などが一般的であるが、Galの先にラクトサミン構造が繰り返しになっていたり、部分的にα-L-Fucoseがついていたりするもの、例えばSiaα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1等の糖鎖である。〕
に示されるものである。また、GnT-Vにより転移されたGlcNAｃを持つ糖鎖には、GnT-Vにより転移されたGlcNAcの2,3,4,6位水酸基のいづれか一箇所にα-L-Fucoseがついた糖鎖も含まれる。【００２２】
本発明の検出方法は、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種、および、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を組み合わせて用いることを必須とする。その材料を以下に説明する。【００２３】
まず、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に親和性を有するGlcNAc特異的レクチンは、その特異的親和性を有するものであれば、動物、植物、真菌、細菌、ウイルス等の由来を問わない。さらに、上記特性を保持する限り、天然のレクチンと実質的に相同のポリペプチドであって一以上の欠失、挿入または置換によって天然レクチンと異なるアミノ酸配列をもつ変異体や、人工物であってもよい。【００２４】
天然原料由来のレクチンの具体例には、グリフォニアマメレクチン(GSL-II、Griffonia simplicifolia lectin II)、ヨウシュチョウセンアサガオレクチン(DSA、Datura stramonium lectin)、デイゴマメレクチン(EVA、Erythrina variegate lectin およびECA、Erythrina cristagalli lectin)、トマトレクチン(LEA、Lycopersicon esculentum lectin)、アメリカヤマゴボウレクチン(PWM、pokeweed mitogen lectin)、ジャガイモレクチン(STA、Solanum tuberosum lectin)、コムギ胚レクチン(WGA、wheat germ agglutinin)、ムジナタケレクチン (PVL、Psathyrella velutina lectin)、インゲンマメレクチン（PHA、Phaseolus vulgaris lectin）、およびグミレクチン（CEL-I、Cucumaria echinata lectin）が挙げられる。【００２５】
レクチンの、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に対する親和性に関して、その結合定数（Ka）は、通常、1.0×103M-1以上であり、好ましくは1.0×104M-1以上であり、特に好ましくは1.0×105M-1以上である。【００２６】
次に、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するGlcNAc特異的レクチンは、動物、植物、真菌、細菌、ウイルス等の由来を問わない。さらに、上記特性を保持する限り、天然のレクチンと実質的に相同のポリペプチドであって一以上の欠失、挿入または置換によって天然レクチンと異なるアミノ酸配列をもつ変異体や、人工物であってもよい。【００２７】
該レクチンは、例えばGlcNAc特異的レクチンからGnT-Iおよび／またはGnT-IIにより転移されたGlcNAｃを持つ糖鎖に親和性を有するものを探索することにより得られる。天然由来のレクチンの例として、クロカワレクチン(BLL、Boletopsis leucomelas lectin)およびマッシュルームレクチン（ABA、Agaricus bisporus lectin）が挙げられる。【００２８】
レクチンの、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性に関して、その結合定数（Ka）は、通常、1.0×103M-1未満であり、好ましくは1.0×10２M-1以下であり、特に好ましくは1.0×10１M-1以下である。【００２９】
本発明の検出方法を、図１（I）で説明すると、糖鎖試料を、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖を認識するレクチンを用いて吸着させ、次いで、吸着された糖鎖試料を、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖を認識しないレクチンを用いて再スクリーニングする。二回目の非吸着画分からGnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖が正確に検出される。【００３０】
前記検出方法は、図１（II）のように、糖鎖試料を、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を固定化したカラムに通し、その非吸着画分を、親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を固定化したカラムに通すようにしてもよい。その場合、一回目のカラムの非吸着画分を二回目のカラムに通し、その吸着画分からGnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖が正確に検出される。【００３１】
上記各段階の検出操作には、レクチンクロマトグラフィーを使用することができる。レクチンクロマトグラフィーは、レクチンが糖鎖と特異的に結合する性質を利用したアフィニティクロマトグラフィーである。HPLCと組み合わせる（HPLAC）と、ハイスループットを期待できる。その担体としては、アガロース、デキストラン、セルロース、スターチ、ポリアクリルアミド等のゲル材が一般的である。これらには、市販のものを特に制限なく使用でき、例えば、セファロース４Bやセファロース６B（ともにGEヘルスケアバイオサイエンス社製）が挙げられる。また、レクチンクロマトグラフィーに用いるカラムとしては、マイクロプレートやナノウエルにレクチンを固定化したものも含まれる。【００３２】
固定化するレクチンの濃度は、通常、0.001〜20mg/ml、好ましくは0.01〜10mg/mlである。担体がアガロースゲルの場合、それをCNBr等で活性化してから、レクチンとカップリングする。活性化スペーサーを導入したゲルにレクチンを固定化してもよい。さらには、ホルミル基を導入したゲルにレクチンを固定化してからNaCNBH3で還元してもよい。また、NHS-セファロース（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）のような市販の活性化ゲルを使用してもよい。【００３３】
糖鎖試料をカラムにかけた後、洗浄と平衡化の目的で緩衝液を流す。緩衝液の一例は、モル濃度が５〜500mM、好ましくは10〜100mM、pHが4.0〜10.0、好ましくは6.0〜9.0、NaCl含量が0〜0.5M、好ましくは0.1〜0.2M、CaCl2、MgCl2またはMnCl2含量が０〜10mM、好ましくは1.0〜５mMの緩衝液である。【００３４】
アフィニティカラムの洗浄後、糖鎖の溶出は、糖鎖を有効に溶出できる中性の非変性緩衝液中で、脱着剤を用いて行われる。この緩衝液は、上記と同様であってもよい。脱着剤は、Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）や（GlcNAc）nであってもよい。好ましくは、１〜500mM、特に好ましくは10〜200ｍM濃度のGlcNAcである。【００３５】
本発明の検出方法の別法として、二種類のレクチンを同時に用いる場合、一方のレクチンをCy3（緑）標識し、他方のレクチンをCy5（赤）標識する。チップ（マイクロアレイ）上でどちらに呈色するか、あるいはどちらの方が濃色かを調べることで、癌の悪性度等を判断することが可能である。【００３６】
レクチンと糖鎖との結合定数を測定するには、フロンタルアフィニティクロマトグラフィー（ＦＡＣ法）を用いるとよい。この方法は、レクチンを固定化したカラムに、蛍光標識した一定濃度の糖鎖希釈液を流した際、レクチンと糖鎖とが相互作用がなければ糖鎖は短時間でカラムから流れ出てしまい、溶出前端（フロント）が即座に観察され、一方、レクチンとの親和性がある場合、糖鎖の溶出が遅れるという原理に基づく。【００３７】
該装置に使用するレクチンカラムの調製は、以下のようにして行われる。
１．精製レクチンを0.1〜0.2M NaHCO3緩衝液(pH8.3〜8.5)に溶解する。
２．レクチンをタンパク質中の一級アミノ基を介してNHS活性化セファロース等の担体に固定化する。
３．0.8％ NaClを含む10mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.4、TBS)中にレクチン-セファロースを懸濁させ、レクチン固定化濃度が２〜９mg／mlになるように樹脂を調製する。
４．レクチン固定化樹脂を、ミニチュアカラム(φ2mm x 10mm, 31.4μl)に充填する。
５．カプセルの前後にフィルターを挟む。
６．２種類の固定化樹脂を充填したカプセルをホルダーで保護し、レクチンカラムをFAC-1装置に接続する。【００３８】
緩衝化した２本のレクチンカラムに対し、分析用緩衝液（0.8％NaClを含む10mMTris-HCl緩衝液（ｐH7.4））でレクチンが持つ解離定数（Kd）よりも充分低い濃度（2.5nM）に希釈したピリジルアミノ化糖鎖（PA化糖鎖）を、流速0.125ml／minで300μｌづつ連続注入する。カラムからのPA化糖鎖の溶出を、蛍光検出器（励起波長／蛍光波長：310nm／380nm）を用いて検出する。【００３９】
検出データから、レクチンと相互作用しない糖鎖（PA化ラムノース）の溶出前端（V0）を基準とし、相互作用する糖鎖の溶出前端（V）の遅れ（V-V0）を算出する。次いで、FACの基準式に基づいてV-V0およびBｔから糖鎖とレクチンとの結合定数（Ka）を求める。【００４０】
糖鎖の検出には、上記以外のクロマトグラフィー、レクチンチップ、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法、凝集法、ＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）システム等もまた、当業者に周知の方法で使用することができる。【００４１】
本発明はまた、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種、および、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を組み合わせて用いることを特徴とする、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖の精製方法を提供する。【００４２】
レクチンカラムを用いて糖タンパク質の精製を行なう場合、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種をアガロースやセルロースからなるカラム担体に官能基を介して共有結合させて親和性カラムを調製し、糖鎖試料を通す。糖鎖試料に、GlcNAc特異的レクチンと相互作用を有するものが存在すれば、目的とする糖タンパク質の粗分離をすることができる。次いで、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種をアガロースやセルロースからなるカラム担体に官能基を介して共有結合させて親和性カラムを調製し、前記溶出液をカラムに通すことでGnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖を精製することができる。【００４３】
前記精製方法は、糖鎖を、まず、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を固定化したカラムに通し、その非吸着画分を、さらに親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を固定化したカラムに通すようにしてもよい。【００４４】
本発明はまた、上記精製方法により得られたGnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖を提供する。該糖鎖の純度（全てのGnTにより合成されるGlcNAcを持つ糖鎖に対するGnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖の割合）は、通常、70％以上であり、好ましくは80％以上であり、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上である。【００４５】
本発明はまた、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種、および、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を組み合わせて用いることを特徴とする、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖のスクリーニング方法を提供する。【００４６】
前記方法は、検体を、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を固定化したカラムに通し、その溶出液をさらに非親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を固定化したカラムに通すことを含む。【００４７】
前記方法は、検体を、まず、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を固定化したカラムに通し、その非吸着画分を、さらに親和性を有するGlcNAc特異的レクチンの少なくとも一種を固定化したカラムに通すようにしてもよい。【００４８】
（診断薬）
本発明はまた、GnT-V転移酵素により合成される糖鎖を検出することによって、該糖鎖に由来する疾患を診断するための診断薬キットを提供する。GnT-V転移酵素により合成される糖鎖に由来する疾患には、例えば、発癌、癌の転移、浸潤や悪性化を含む。癌の具体例としては、前立腺癌、乳癌、胃癌、小腸癌、大腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、膵癌、小細胞肺癌、非小細胞癌、子宮がん、卵巣癌、甲状腺癌、軟部肉腫、骨肉腫、メラノーマ、膠芽腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、急性リンパ腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病等を含む。特に、これらの低分化型癌に有用である。【００４９】
診断薬キットの使用方法を、以下に述べる。まず、患者から、癌組織、あるいは血液、血清、血漿、尿、唾液等の体液を採取する。採取した癌組織は常法により破砕する。各サンプルに有機溶媒を添加して、脂質等を除去した後、界面活性剤を用いて膜タンパク質や糖タンパク質を可溶化して、糖タンパク質を抽出する。前記有機溶媒には、例えばクロロホルム−メタノール、ヘキサン−イソプロパン等が用いられる。前記界面活性剤には、例えばオクチルβ-グリコシド、オクチルチオβ-グリコシド、n-オクチル-β-D-グルコピラノシド、n-ヘプチル-β-D-チオグルコピラノシド、3-〔（3-クロラミドプロピル）−ジメチル-アンモニオ〕-１-プロパンスルホネート、3-〔（3-クロラミドプロピル）−ジメチル-アンモニオ〕-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホネート、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、コール酸ナトリウム等が用いられる。【００５０】
前記可溶化した糖タンパク質に、アセトンまたは硫安を適当量加えて、遠心分離後、沈殿物中の糖タンパク質を回収してもよい。得られた糖タンパク質を含む抽出液を、本発明の診断薬キットを用いて、二段階操作のアフィニティカラムクロマトグラフィー等にかける。本キットによるGlcNAcを持つ糖鎖の検出は、GnT-VによりGlcNAcの転移付加された糖鎖の存在を意味するので、癌組織は転移性である可能性が高い。【００５１】
該診断薬キットによれば、癌治療予後を定性的または定量的に診断することも可能である。また、GnT-V遺伝子発現抑制物質の探索にも応用可能である。【００５２】
上記クロマトグラフィーで濃縮精製された糖タンパク質を、哺乳動物等に免疫すると、GnT-Vにより合成されるGlcNAcを持つ糖鎖を認識する抗体が得られる。適宜、モノクロナール抗体を取得してもよい。該抗体を用いて、患者の血清等に存在する転移性癌を高感度で検出することも可能になる。その結果、癌の転移等の診断に役立つことになる。抗体は、癌治療のための抗体医薬としても利用可能である。【００５３】
（GlcNAc特異的レクチンの判別方法）
本発明はまた、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖を用いて、レクチンのGnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に対する親和性を判別する方法もまた提供する。この方法は、GlcNAc特異的レクチンといわれるものから、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に対する非親和性を有するレクチンを選別するのに有用である。【００５４】
具体的には、予めGlcNAc特異的であることが知られているがその詳細が未知の被検レクチンを用意する。後述する実施例１で使用した分岐Ｖを有するN結合型糖鎖（107、315、411、414、108、205、318、320、316、413等）や、GnT-Vにより合成される糖鎖を有することが確認された糖タンパク質をリガンドとして担体に固定化したアフィニティカラムを調製する。このカラムに前記被検レクチンを通塔し、GlcNAc等のハプテン糖を脱着剤として用いて吸着成分を溶出させる。【００５５】
クロマトグラフィーの非吸着画分やリガンドと弱い相互作用を示す溶出画分は、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に非親和性を有するレクチンである。一方、強い相互作用を有する画分は、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖に親和性を有するレクチンであると評価される。【００５６】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
〔オリゴ糖の準備〕
Gal-β、GalNAc-β-、Man-α-、GlcNAc-α、Fuc-α-およびGalβ1-4Glc-β-のp-ニトロフェニル(pNP)グリコシドを、シグマ社（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入し、Galα-、GalNAc-α-、Man-β、Galβ1-4GlcNAc-β、Galβ1-3GalNAc-α(Core1)、Galβ1-3(GlcNAcβ1-6)GalNAc-α(Core2)、GlcNAcβ1-3GalNAc-α(Core3)およびGlcNAcβ1-6GalNAc-α(Core6)を、トロント・リサーチ・ケミカルズ社(ノースヨーク、カナダ)から購入し、Glc-αをガルバイオケム社（サンジェゴ、カリフォルニア州、米国）から購入した。他のpNPグリコシド（Glc-β、GlcNAc-β-および (GlcNAcβ1-4)2-5-α-pNP)は、生化学工業株式会社から購入した。【００５７】
実施例に使用したピリジルアミノ化（PA-）オリゴ糖を、図２Aおよび２Bにリストする。番号001〜014、103、105、107、108、307、313、314、323、405、410、418〜420、および503のN結合型糖鎖は、タカラバイオ社から購入し、それ以外は、生化学工業株式会社から購入した。未標識のオリゴ糖906および907は、生化学工業株式会社から取得して、GlycoTAG（登録商標、タカラバイオ社）を用いてピリジルアミノ化した。【００５８】
〔レクチンの調製〕
GSL-II（Griffnia simplicifolia lectin II、グリフォニア・シンプリシフォリアレクチンII）-アガロースを、ベクター・ラボラトリーズ社（バーリンガム、カリフォルニア、米国）から取得した。BLL (Boletopsis leucomelaslectin、クロカワレクチン)は、食用マッシュルームであるクロカワの子実体を「Apoptosis induction by lectin isolated from the mushroom Boletopsis leucomelas in U937 cells」Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 784-789に記載の方法によって精製した。【００５９】
〔レクチンカラムの調製〕
0.5M NaClを含む0.2M NaHCO3緩衝液（pH8.3）中にBLLを溶解し、NHS-活性化セファロース（GEヘルスケアバイオサイエンス社、ウプサラ、スェーデン）へその製造者マニュアルに従って結合させた。0.8% NaClを含む10mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.4、TBS緩衝液)中にレクチン-セファロースを懸濁させ、ミニチュアカラム(φ2mm x 10mm, 31.4μl)に充填した。同様にして、GSL-IIレクチンカラムを調製した。【００６０】
〔フロンタルアフィニティクロマトグラフィー（FAC）〕
FAC自動分析装置（FAC-1、（株）島津製作所製）を用いてフロンタルアフィニティクロマトグラフィーを行った。詳細には、上記で調製したレクチンカラムを、ステンレスホルダーに差し込み、FAC-1装置に接続した。【００６１】
流速およびカラム温度を、それぞれ0.125 ml/minおよび25℃に保った。前記TBS緩衝液でミニチュアカラムを平衡後、過剰容積(0.5〜0.8 ml)のpNP-糖鎖(5μM)およびPA-糖鎖(2.5または5.0 nM)を、自動サンプリング装置を用いてカラム中へ連続注入した。【００６２】
pNP-糖鎖およびPA-糖鎖の溶出液を、UV(280 nm)ならびに蛍光(励起波長310 nmおよび蛍光波長380 nm)を測定することによりモニターした。標準オリゴ糖（PA-ラクトース）に対する前端溶出液（すなわちV-V0）を測定した。また、解離定数（Kd）をFACの基準式に基づいてV-V0およびBｔから求めた。なお、結合定数Kaは、Ka＝１／Kdにより求まる。【００６３】
〔濃度依存性分析〕
有効リガンド濃度Bｔを測定するため、濃度依存性の分析を行った。GSL-IIに対して、初期濃度([A]０)のGlcNAc-α-pNP、そしてBLLに対して初期濃度([A]０)のGalβ1-3GalNAc-α-pNPを、カラム注入し、荒田等が開発した方法（Application of reinforced frontal affinity chromatography and advanced processing procedure to the study of the binding property of a Caenorhabditis elegans galectin, J Chromatogr A. 905, 337-43）に従ってV-V0 (溶出前端の遅れ)を計算した。Hofstee型プロット（(V-V0)対（V-V0）[A]0）を作り、近似曲線の切片および傾きからそれぞれBtならびにKd決定した。【００６４】
〔pNP-オリゴ糖を用いたレクチンカラムの評価〕
BLL-アガロースおよびGSL-IIアガロースを、それぞれ、0.1mgタンパク/mlゲルおよび3mgタンパク/mlゲルの濃度で調製した。次いで、カラムの評価のために、濃度依存性分析を行った。【００６５】
GSL-IIについては、各種濃度（2.5〜70μM）のGlcNAc-α-pNPを調製し、カラムへ注入した。前記FACを行った結果、BtおよびKaは、それぞれ、0.86 nmolおよび1.4×105M-1であった（図３（A）左側）。【００６６】
BLLについては、GlcNAc-アガロースで精製しているにもかかわらず、試験したGlcNAc関連pNP誘導体、すなわち、GlcNAc-α-pNP、GlcNAc-β-pNPおよび(GlcNAcβ1-4)2-5-α-pNPのいずれにも、顕著な親和性を示さなかった（図３（A）右）。Galβ1-3GalNAc-α-pNPには、顕著な親和性を示し、BtおよびKaは、それぞれ、0.56nmolおよび9.09×104M-1であった（図３（A）右側）。【００６７】
〔pNP-誘導体を用いたレクチンの評価〕
GSL-IIは、試験したpNPグリコシドのうち、GlcNAc-α-pNPに最も強い親和性を示し、それにキトオリゴ糖の(GlcNAcβ1-4)2-α-pNP、(GlcNAcβ1-4)3-α-pNP、(GlcNAcβ1-4)4-α-pNPおよび(GlcNAcβ1-4)5-α-pNPが続いた（図３（A）左側）。GSL-IIでは、GlcNAc-β-pNPに対しても顕著な親和性を有したが、その結合は、α-アノマーの1/7であった。【００６８】
BLLは、GlcNAc-α／β-pNPやキトオリゴ糖に対して検知しうる親和性を有さなかった（すなわち、Ka＜3.4×１０３M-1）。BLLは、Galβ1-3GalNAc-α／β-pNP (Core1)に対しては顕著な親和性を示した（Ka＝0.9×105M-1)。【００６９】
〔PA-オリゴ糖を用いたレクチンの評価〕
GSL-IIは、ガラクトースがひとつもないアガラクトN結合型糖鎖101〜205のうち、105〜108および203〜205に対して顕著な親和性を示したが、101〜104、201および202に対しては明確な親和性を示さなかった（図３（Ｂ）左）。ガラクトースが全部あるいは部分的に付いた複合型N結合型糖鎖301〜420に関しては、312、315〜320、407〜409、411〜416で強い親和性を示した。【００７０】
GSL-IIによって特異的に認識される構造要素を明らかにするため、FACにより測定したKa値を棒グラフに加工して示す（図３（B）左）。図から、GSL-IIは、三本鎖および四本鎖糖鎖に強く結合し、一本鎖および二本鎖糖鎖には結合しないか、結合してもわずかであることがわかる。【００７１】
それに対して、BLLは、アガラクトN結合型糖鎖101-205のうち、101-106および201-204に比較的高い親和性をもって認識したが、107、108および205はまったく認識しなかった（図３（B）右）。このような選択性は、GSL-IIの場合と逆である。ガラクトースが全部あるいは部分的に付いた複合型N結合型糖鎖301〜420のうち、301〜306、309〜312、403、404および407〜409で強い親和性が観測された。これも、GSL-IIとほとんど逆である。【００７２】
BLLは、図３（B）右から明らかなように、二本鎖アガラクトN結合型糖鎖103および202に対して最も強い親和性を有する。三本鎖アガラクト糖鎖105および204もまた、よいリガンドであるが、その親和性は一本鎖糖鎖101および201とほぼ同様である。分岐V（GlcNAcβ1-6Manα1-6Manβ、図３（B）右）を有する糖鎖のいずれも、BLLに対して親和性を有さない。本発明は、以下の内容に拘束されるものではないが、分岐Vがあると複合型N結合型糖鎖内に大きな変化が生じるので、BLLの認識には二本鎖アガラクトN結合型糖鎖の分岐Vがつく前の立体配置が必要なのかもしれない。【００７３】
以上の内容を図４の棒グラフの下に示した分岐鎖マップを用いて説明する。このマップは、各N結合型糖鎖が有するGlcNAc分岐鎖をヒトGlcNAc転移酵素に適用される命名法に基づいて類別したものである。例えば、ある糖鎖のVのマス目が埋まっていれば、その糖鎖はGnT-V酵素により合成されるGlcNAcを有することを意味している。【００７４】
図４の分岐鎖マップを見ると、GSL-IIは、分岐V、すなわち、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖を有するN結合型糖鎖107、315、411、414、108、205等を正しく認識する。しかし、GSL-IIは、そのような糖鎖をもたないN結合型糖鎖105、106、204、408等もまた認識する。したがって、GSL-IIのようなGnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖を認識するとされるレクチン単独に用いただけでは、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖のみを検出したり、精製したりすることはできない。【００７５】
BLLは、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖を含むN結合型糖鎖107、315、411等を認識しないが、該GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖をもたないN結合型糖鎖105、106、204、408等は認識する。両結果から、GSL-IIとBLLとを併用することで、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖を正確に検出できることがわかる。以上の内容を、表１に整理する。
【表１】
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表１中、糖鎖番号に下線のついたものが、GnT-Vにより転移されたGlcNAcを持つ糖鎖である。グループB（GSL-IIには結合するが、BLLには結合しない糖鎖のグループ）には、それらの糖鎖がすべて入っており、またそれら以外の糖鎖がひとつも入って来ていないことがわかる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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