(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的不活性前駆体のその天然の切断部位をプロテアーゼにより切断され得る部位に変異させ、その変異された不活性前駆体を切断し生物学的に活性なサイトカインを得ることからなる生物学的に活性なサイトカインの製造方法であって、該プロテアーゼがＸａ因子プロテアーゼおよびカスパーゼ−８から選択され、該サイトカインがＩＬ−１βおよびヒトＩＬ−１８から選択され、かつ該天然の切断部位がカスパーゼ−１切断部位である製造方法。
【請求項２】
切断部位が変異した生物学的に活性なサイトカインの前駆体をコードするｃＤＮＡからなるベクターを宿主にトランスフェクトすること、トランスフェクトされた宿主を培養すること、およびプロテアーゼで処理したのち生物学的に活性なサイトカインを単離することからなる請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｃＤＮＡがフレーム単位でＧＳＴコード配列に融合され、発現された融合分子がプロテアーゼ処理に先立ってグルタチオンアガロースビーズ表面に捕捉される請求項２記載の方法。
【請求項４】
任意にＧＳＴコード配列に融合した、生物学的に活性なサイトカインの変異した生物学的不活性前駆体をコードするｃＤＮＡであって、該サイトカインがＩＬ−１βおよびヒトＩＬ−１８から選択され、かつ該生物学的不活性前駆体の天然のカスパーゼ−１切断部位がＸａ因子プロテアーゼおよびカスパーゼ−８から選択されるプロテアーゼの切断部位に変異されているｃＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は一般的に、不活性前駆体として存在し、プロテアーゼによりイン  ビボにて切断され、完全な（mature）生物学的活性分子になる生物学的活性分子の製造に関する。
【０００２】
さらに詳細には、本発明は、自己切断、そのほかのカスパーゼによる切断、または、たとえば、インターロイキン−１変換酵素（ＩＣＥ）としても知られているプロテアーゼ、カスパーゼ−１による切断により、対応する前駆体からイン  ビボにおいて産生される、カスパーゼおよびサイトカインの製造に関する。このような方式で製造されるサイトカインの例としてはインターロイキン−１βやインターロイキン−１８がある。
【０００３】
［背景技術］
カスパーゼは、標的タンパク質をＡｓｐ残基の後ろで切断するシステインプロテアーゼの１つのファミリーである。公表されている公知の１１種のカスパーゼのうち、カスパーゼ−１、およびおそらく、カスパーゼ−４、−５ならびに−１１は、主に前炎症性サイトカインの処理に関与すると考えられており、一方、その他はアポトーシスまたはプログラムされた細胞死の開始と遂行において非常に重要な役割を果している。カスパーゼは、触媒的に不活性な酵素前駆体として合成され、その酵素前駆体はドメイン間リンカーに存在する特定内部Ａｓｐ残基の後ろで切断されることによって一般的には活性化される、というカスパーゼ間でいくつかの共通の特徴と、Ａｓｐ残基の後ろで、それらの基質を切断する能力とを共有している。結果として、ある完全活性カスパーゼ、とくに長いプロドメインカスパーゼから誘導されたものは、それら自身を、およびそのほかの不活性カスパーゼ酵素原を処理し、活性化することができる。１次構造に基づいて、プロアポトーシス関連カスパーゼは、２つのクラス、すなわち長いアミノ末端プロドメインを含有するカスパーゼ−２、−８、−９および−１０を含むクラスＩと、短いプロドメインを有するあるいはプロドメインが無い、カスパーゼ−３、−６および−７のクラスIIとに分けることができる。イン  ビトロでの切断実験では、クラスIIカスパーゼは、それらのタンパク質分解処理に関して活性化クラスＩカスパーゼを必要とすることが示唆されている（１２）。
【０００４】
カスパーゼのもう１つの分類は、切断部位の特異性によるものである（１３）。ここで、グループＩカスパーゼはコンセンサス配列ＷＥＨＤを有し（カスパーゼ−１、−４、および−５）、グループIIカスパーゼはコンセンサス配列ＤＥｘＤを有し（カスパーゼ−２、−３および−７）、またグループIIIカスパーゼはコンセンサス配列（ＩＶＬ）ＥｘＤを有する（カスパーゼ−６、−８、および−９）。カスパーゼ−８の最適部位はＬＥＴＤである（１４）。
【０００５】
当初は、インターロイキン−γ（ＩＦＮ−γ）誘導因子として説明されたインターロイキン１８（ＩＬ−１８）は、タンパク質のＩＬ−１ファミリーと構造的な特徴を共有している最近特徴付けされたサイトカインである（１〜４）。ＩＬ−１８は、加熱不活性化されたプロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）により処理され続いてリポ多糖（ＬＰＳ）により処理されたマウスの肝臓からまず精製され、ついでクローン化された（２、５）。ヒトＩＬ−１８のクローン化もまた、最近記載されている（３）。
【０００６】
ＩＬ−１２のように、ＩＬ−１８は肝臓クッパー細胞やその他の常在性マクロファージなどの活性化マクロファージにより産生される（３）。ＩＬ−１８はＴｈ１応答の初期誘導物質であり、ＴＮＦ−γ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子およびＩＬ−２だけではなく、ＩＦＮ−γの産生を同時刺激（co-stimulate）する（６）。さらに、それは抗ＣＤ３誘導Ｔ細胞増殖を増強し、またＦａｓリガンドの発現を増加させることによりナチュラルキラー細胞の細胞傷害性を増加させる（６、７）。
【０００７】
４−へリックスバンドル構造を示すたいていの他のサイトカインとは異なり、ＩＬ−１８およびＩＬ−１βは全β−プリーツシート構造を有する（７）。ＩＬ−１βと同様に、ＩＬ−１８は、シグナルペプチドを欠いた生物学的不活性前駆体（プロＩＬ−１８）として合成される（８）。ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８前駆体は、Ｐ１位置にあるアスパラギン酸残基の後ろで切断するカスパーゼ１（ＩＬ−１β変換酵素、すなわちＩＣＥ）により切断される。その結果生じる完全サイトカインは、容易にその細胞から放出される（８、９）。カスパーゼ−１−欠損マウスによる研究では、ＩＦＮ−γおよびＴｈ１応答の誘導物質としての完全ＩＬ−１８の重要な役割が示されている。Ｐ．ａｃｎｅｓとリポ多糖（ＬＰＳ）とをこのマウスに注射した結果、野生型マウスと比較して、血流中ＩＦＮ−γが低レベルとなった（８、９）。ＩＬ−１８の注射により、カスパーゼ−１−欠損マウスにおけるリポ多糖誘導ＩＦＮ−γレベルが回復し（９）、さらに、カスパーゼ−１が活性ＩＬ−１８の産生に関与しているという考え方が支持された。その他のカスパーゼと、とくにこうしたアポトーシスに関連した細胞内タンパク質を切断するものとは、少なくともカスパーゼ−１よりも１００倍活性が低かった（９）。ＩＬ−１８欠損マウスを用いた同様な研究では、ＮＫ細胞活性とサイトカイン誘導におけるその役割が明らかにされた（１０）。
【０００８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現された組換えＩＬ−１βおよびマウスＩＬ−１８は、完全に活性なサイトカインを産生するために、再生（refold）され得る。大腸菌またはその他の宿主においてヒトＩＬ−１８の完全形態を発現させる試みからは、完全に活性なサイトカインがもたらされることはなかった。たとえば悪性疾患における、またはインターフェロン−γ産生の誘導が求められているいずれかの状態におけるその潜在的な治療的用途のため、完全生物学的活性ヒトＩＬ−１８製造のための効率的な発現システムを確立することが望まれている。
【０００９】
［発明の開示］
本発明は、形成のその天然プロセスにおいて、生物学的不活性前駆体型で産生され、その前駆体の切断後活性となる分子の製造を可能にする。これは、イン  ビトロでは容易に達成することはできない。
【００１０】
本発明は、したがって生物学的不活性分子の天然の切断部位を、一般的なプロテアーゼにより、切断されやすい部位に変異させ、生物学的活性分子を得るためにその変異した分子を切断することにより、その生物学的不活性前駆体から生物学的活性分子を製造するための方法を提供する。
【００１１】
好ましくは、その生物学的活性分子はカスパーゼまたはサイトカインであって、さらに好ましくは、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８から選択されるものである。
【００１２】
こうしたサイトカインにおいては、好適な天然の切断部位はカスパーゼ−１切断部位である。
【００１３】
切断に用いられる一般的なプロテアーゼは、トロンビン、エンテロキナーゼ、スブチリシン、Ｇｅｎｅｎａｓｅ（登録商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国マサチューセッツ州ビバリー市）、ヒトライノウイルス３ＣプロテアーゼおよびＸａ因子プロテアーゼから選択されてもよい。カスパーゼが切断に用いられる場合は、カスパーゼ−８が好適である。
【００１４】
本発明の１つの好適な実施態様では、本方法は、その切断部位で変異された生物学的活性分子の前駆体をコードするｃＤＮＡからなるベクターを宿主にトランスフェクトする工程と、そのトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、その前駆体を発現させる工程と、プロテアーゼによる処理後に生物学的活性分子を単離する工程とからなる。
【００１５】
任意には、そのｃＤＮＡがグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）コード配列のあとにフレーム単位で融合され、またその発現融合分子は、プロテアーゼによる処理に先立って、グルタチオンアガロースビーズ上に捕捉されるという点で、これは達成され得る。
【００１６】
本発明はまた、生物学的活性分子の変異された前駆体をコードし、任意にはＧＳＴコード配列に融合されるｃＤＮＡを提供する。
【００１７】
本発明の１つの実施態様では、組換えハイブリッドポリペプチドまたは融合タンパク質を製造および／または精製するプロセスが提供される。さらに詳細には、タンパク質分子をコードするＤＮＡ断片は、カスパーゼにより認識されまた切断されるペプチド配列をコードするＤＮＡをリンキング配列として用い、結合タンパク質をコードするＤＮＡ断片に融合される。その融合ＤＮＡは適当な宿主を形質転換するのに使用されるクローンニングベクター中に挿入される。発現に際しては、そのハイブリッドポリペプチドは、例えばアフィニティークロマトグラフィーにより、結合タンパク質が特異的な親和性を有するリガンドまたは基質と接触させることにより精製される。
【００１８】
本発明の１つの好適な実施態様では、結合タンパク質はＧＳＴであり、またその切断部位はカスパーゼ−８切断部位である。
【００１９】
本発明はまた前記方法により製造される生物学的活性分子に関する。
【００２０】
大腸菌における完全ＩＬ−１８の発現は生物学的活性を欠いたンパク質を生じるという結果になる。大腸菌において発現されるＩＬ−１８のＩＬ−１８ポリペプチド骨格を正確に再生する試みは今までのところ、成功していない。ヒトＩＬ−１８およびヒトＩＬ−１βは、プロＩＬ−１８およびプロＩＬ−１β前駆体としてインビボにて発現される。そのプロＩＬ−１８およびプロＩＬ−１βは生物学的活性完全ＩＬ−１８およびＩＬ−１βをそれぞれ産生するためにカスパーゼ−１により切断される。しかし、カスパーゼ−１は市販されておらず入手不可能である。本発明は、生物学的活性分子、とくにサイトカイン、またさらにとくにヒトＩＬ−１８の大腸菌における産生に関する簡便な手法を提供する。この目的のために、カスパーゼ−１切断部位が、市販されていて入手可能なプロテアーゼ、たとえば、Ｘａ因子の切断部位に変異したヒトプロＩＬ−１８をコードするｃＤＮＡが構築された。容易に操作するために、変異プロＩＬ−１８  ｃＤＮＡはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）コード配列と融合された。Ｘａ因子切断部位を有する結果的に生じたＧＳＴ−プロＩＬ−１８融合タンパク質は、大腸菌中で発現し、グルタチオンアガロースビーズ上に捕捉された。高い生物学的活性を示す完全ヒトＩＬ−１８は、Ｘａ因子による切断によりそのビーズから放出された。
【００２１】
同様に、ヒトＩＬ−１βのカスパーゼ−１切断部位をコードするＤＮＡ配列は、Ｘａ因子の切断部位に変異される。操作を容易にするために、変異プロＩＬ−１β  ｃＤＮＡは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）コード配列と、フレームの単位で融合される。その結果生じる、Ｘａ因子切断部位を有するＧＳＴ−プロＩＬ−１β融合タンパク質は大腸菌中で発現し、グルタチオンアガロースビーズ上で捕捉される。完全ヒトＩＬ−１βは、Ｘａ因子による切断によりビーズから放出される。
【００２２】
カスパーゼ−８が切断のために用いられる場合は、同様の手順が実施されるが、その差違は、ヒトＩＬ−１８またはヒトＩＬ−１βのいずれもカスパーゼ−１切断部位をカスパーゼ−８の切断部位に変異させるという点である。したがって、ＧＳＴコード配列との融合と、さらなる方法の諸ステップは、前述のように実施される。
【００２３】
本発明により、カスパーゼ−１切断部位をＸａ因子部位に変異させたヒトプロＩＬ−１８をコードするｃＤＮＡが作製された。他のプロテアーゼに適している切断部位を生成する他の変異が使用されてもよい。
【００２４】
可能性のある切断部位と適当なプロテアーゼの例には、以下のものが含まれる。すなわち、
Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列識別番号：１）、プロテアーゼ、トロンビンによりアミノ酸ＡｒｇとＧｌｙとの間で切断される配列。
【００２５】
Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列識別番号：２）、プロテアーゼ、Ｘａ因子によりＡｒｇ残基の後ろで切断される配列。
【００２６】
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−（配列識別番号：３）、プロテアーゼ、エンテロキナーゼによりＬｙｓ残基の後ろで切断される配列。
【００２７】
Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−（配列識別番号：４）、プロテアーゼ、スブチリシンまたはその異形Ｇｅｎｅｎａｓｅ（登録商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）によりＴｙｒ残基の後ろで切断される配列。
【００２８】
Ｔｙｒ−Ｈｉｓ（配列識別番号：５）、プロテアーゼ、スブチリシンまたはその異形Ｇｅｎｅｎａｓｅ（登録商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）によりＴｙｒ残基の後ろで切断される配列。
【００２９】
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列識別番号：６）、ヒトライノウイルス３ＣプロテアーゼによりＧｌｎ残基の後ろで切断される配列。
【００３０】
同様に、カスパーゼ−１切断部位をＸａ因子部位に変異させたヒトプロＩＬ−１βをコードするｃＤＮＡが作製された。他のプロテアーゼに適している切断部位を生成する他の変異が使用されてもよい。
【００３１】
可能性のある切断部位と適当なプロテアーゼの例には、以下のものが含まれる。すなわち、
Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列識別番号：２）、プロテアーゼ、Ｘａ因子によりＡｒｇ残基の後ろで切断される配列。
【００３２】
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−（配列識別番号：３）、プロテアーゼ、エンテロキナーゼによりＬｙｓ残基の後ろで切断される配列。
【００３３】
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列識別番号：６）、ヒトライノウイルス３ＣプロテアーゼによりＧｌｎ残基の後ろで切断される配列。
【００３４】
変異の選択は以下のパラメータによる。すなわち、プロＩＬ−１８またはプロＩＬ−１βのポリペプチド骨格内のその他の部位で望ましくない切断を回避するためには、変異により生成される切断部位は非常に特異的でなければならない。プロテアーゼは工学的な切断部位に対する高い特異性を示さなければならない。プロテアーゼはたとえば、市販されていて製造元から都合よく入手できなければならない。そして、変異は好適には、プロＩＬ−１８またはプロＩＬ−１βの２次または３次構造における大きな改変を導入すべきではない。結果として生じるＩＬ−１８またはＩＬ−１βが変異アミノ酸を有さないため、Ｘａ因子またはエンテロキナーゼまたはスブチリシンの使用は、その他のプロテアーゼよりも好適である。Ｘａ因子はもっとも保存的変異を必要とし、それによってプロＩＬ−１８あるいはプロＩＬ−１βの改変された２次あるいは３次構造のリスク、および切断が起こらないというリスクを軽減するので、Ｘａ因子を使用することがもっとも好ましい。Ｘａ因子またはエンテロキナーゼの使用は、結果的に生じるＩＬ−１８またはＩＬ−１βが変異アミノ酸を有さないので、その他のプロテアーゼよりも好適である。
【００３５】
カスパーゼ−１切断部位がＸａ因子切断部位に変異されたヒトプロＩＬ−１８変異体（プロＩＬ−１８IEGR）をコードするｃＤＮＡを構築するために、以下の変異が、ヒトプロＩＬ−１８  ｃＤＮＡに導入された。すなわち、Ｌ３３Ｉ；Ｓ３５ＧおよびＤ３６Ｒである。これらの変異はＸａ因子認識配列ＩＥＧＲを産生した。
【００３６】
ヒトプロＩＬ−１８IEGRを発現するベクターは、以下の方法で構築した。健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を細菌リポ多糖（ＬＰＳ）により刺激した。総ＲＮＡをその細胞から抽出した。ＲＮＡを逆転写し、結果的に生じたｃＤＮＡがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型として役立った。配列中の変異は、ＰＣＲの３つのステップにおいて重複プライマーを用いて導入された（図１）。その結果生じた変異ヒトプロＩＬ−１８をコードする６００ｂｐ  ＰＣＲ産物はＴＡクローンニングベクター（ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）中でクローン化され、そのＤＮＡ配列はＤＮＡ配列分析により実証された。この結果的に生じたｐＧＥＭ−Ｔ−プロＩＬ−１８IEGRプラスミドはＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとにより切断され、ヒトプロＩＬ−１８IEGRをコードする６００ｂｐ断片が、ＧＳＴ遺伝子配列（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を含有する原核発現ベクターｐＧＥＸ−２ＴＫ中でクローン化された。その結果生じた発現ベクターには、ＧＳＴ遺伝子の３'末端と、フレーム単位で融合されたヒトプロＩＬ−１８IEGR遺伝子の配列が含まれていた（図２）。
【００３７】
ＧＳＴ−プロＩＬ−１８IEGRの発現と精製はそののちに実施された。プラスミドｐＧＥＸ−プロＩＬ−１８IEGRにより形質転換された大腸菌ＪＭ１０９の新鮮な単一コロニーを、０．６ＯＤ600の密度に達するまで３７℃にて振とうしながら増殖させた。ついでタンパク質発現は、イソプロピル−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）により誘導され、さらに３時間３７℃にて培養された。総細菌タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＧＳＴ−プロＩＬ−１８IEGRにサイズで対応する４３ｋＤタンパク質の誘導を明らかにした（図３）。ＧＳＴ−プロＩＬ−１８IEGR単離のための下流の全ステップは４℃にて実施された。細菌は遠心分離により集められ、プロテアーゼ阻害剤を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁された。細菌は音波処理により溶菌され、トリトンＸ−１００が、最終濃度１％まで添加され、その清澄ライゼートはグルタチオン−アガロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）と混合された。ビーズは洗浄され、そのビーズのアリコートがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。ＧＳＴ−プロＩＬ−１８IEGR融合タンパク質に対応する単一４３ｋＤバンドがみつかった（図４）。ビーズはその後にＸａ因子により消化され、その上清は採集された。その上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、完全ヒトＩＬ−１８の予想質量と一致しているおよそ１８ｋＤの大きなバンドを示した。１９．５ｋＤというさらに弱いバンドも同様にみられた（図５）。１８ｋＤおよび１９．５ｋＤバンドのタンパク質配列分析は、両方のケースともに、完全ヒトＩＬ−１８の予想されるＮ末端配列を示した。ＧＳＴ−プロＩＬ−１８IEGR融合タンパク質に対応する４３ｋＤバンドは消化後のグルタチオン−アガロースビーズ中にまだ存在しており、不完全な切断を示していた（図示せず）。
【００３８】
組換えヒトＩＬ−１８は、インターフェロン−γの発現を誘導するその能力に基づいてマウス脾臓細胞における生物学的活性について分析された。ヒトＩＬ−１８のみと一緒にマウス非付着脾臓細胞をインキュベートしたところ、ＩＦＮ−γ産生がほとんどないことが示され、同時刺激の必要性が示唆された。０．１２５μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡのみでは、ＩＦＮ−γの有意な値を誘導できなかった。非付着脾臓細胞がコンカナバリンＡと本発明のＩＬ−１８と一緒にインキュベートされたとき、ＩＦＮ−γの投与依存性誘導が得られた（図６）。
【００３９】
カスパーゼ−１切断部位をＸａ因子切断部位に変異した、ヒトプロＩＬ−１β変異体（プロＩＬ−１βIEGR）をコードするｃＤＮＡを構築するために、以下の変異がヒトプロＩＬ−１β  ｃＤＮＡ中に導入された。すなわち、Ｙ１１３Ｉ、Ｖ１１４Ｅ、Ｈ１１５ＧおよびＤ１１６Ｒである。こうした変異はＸａ因子認識配列ＩＥＧＲを産生する。
【００４０】
ヒトプロＩＬ−１βIEGRを発現させるベクターを構築するために、以下のステップが採用される。すなわち、健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を細菌リポ多糖（ＬＰＳ）により刺激する。総ＲＮＡを細胞から抽出する。そのＲＮＡを逆転写し、その結果生じたｃＤＮＡは、ヒトプロＩＬ−１βのコード配列に対応するプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための鋳型として役に立つ。その結果生じたＰＣＲ産物は、ＴＡクローン化ベクター、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社から入手可能なｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ中にクローン化され、その後に、適当なオリゴヌクレオチドにより、位置指定突然変異誘発にかけられる。その結果生じた、変異ヒトプロＩＬ−１βをコードするベクターの配列は、配列分析により実証される。その結果生じたｐＧＥＭ−Ｔ−プロＩＬ−１βIEGRプラスミドは適切な制限酵素により切断され、ヒトプロＩＬ−１βIEGRをコードする〜８２０ｂｐ断片が、原核発現ベクターｐＧＥＸ−２ＴＫ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）中にサブクローン化される。その結果生じた発現ベクターには、ＧＳＴ遺伝子の３'末端とフレーム単位で融合されたヒトプロＩＬ−１βIEGR遺伝子配列が含まれる。
【００４１】
ＧＳＴ−プロＩＬ−１βIEGRの発現と精製が同様に実施される。プラスミドｐＧＥＸ−プロＩＬ−１βIEGRにより形質転換された大腸菌ＪＭ１０９の新鮮な単一コロニーを、０．６ＯＤ600の密度に達するまで３７℃にて振とうして加えて増殖させる。タンパク質発現はその後に、イソプロピル−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）により誘導され、さらに３時間３７℃にて培養される。総細菌タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＧＳＴ−プロＩＬ−１βIEGRにサイズにおいて対応している〜５２ｋＤタンパク質の誘導を明らかにする。ＧＳＴ−プロＩＬ−１βIEGRの単離のための下流の全ステップは４℃にて実施される。細菌は遠心分離により回収され、プロテアーゼ阻害剤を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁される。細菌は音波処理により溶菌され、トリトンＸ−１００が、最終濃度１％まで添加され、その清澄ライゼートはグルタチオン−アガロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）と混合される。ビーズは洗浄され、またそのビーズのアリコートが〜５２ｋＤ  ＧＳＴ−プロＩＬ−１βIEGR融合タンパク質の有無に関してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析される。ビーズはその後にＸａ因子により消化され、また、完全ヒトＩＬ−１βを含有するその上清は採集される。
【００４２】
本発明のもう１つの実施態様では、ポリペプチドの発現と精製が、カスパーゼの切断部位を有する融合タンパク質を産生することにより得られる。カスパーゼ切断部位は、活性ポリペプチドの精製に都合の良い位置に導入されるように、目的のタンパク質と融合した結合ペプチドを発現させるプラスミドを変異させることができる。
【００４３】
カスパーゼ認識部位は、４つのアミノ酸から構成されており、最後のものはアスパラギン酸である。一般的には、カスパーゼは、通常使用されているプロテアーゼよりも、切断部位に対して高く、また異なる特異性を示し、融合ペプチドを切断するのに有用であるとして以前に説明されているプロテアーゼに対して有意な利点を提供している。精製手順は図７に例示される。
【００４４】
各カスパーゼに対する好適な切断部位は文献中に記載されている（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈ，１９９９）。それらのすべてはＰ１位置に共通してＡｓｐ残基を有する。
【００４５】
前記プラスミド、ｐＧＥＸ−プロＩＬ−１８IEGRは、Ｘａ因子切断部位をカスパーゼ−８切断部位に変異された、異なるヒトプロＩＬ−１８変異体（プロＩＬ−１８LETD、図８参照）を得るために修飾された。これは、切断に関してカスパーゼ−８の使用を可能にするものである。
【００４６】
カスパーゼを使用するもう１つの利点は、消化収率および消化時間という観点からみた、その高い効率である。表Ｉに示されているように、ｐＧＥＸ−プロＩＬ−１８IEGRとｐＧＥＸ−プロＩＬ−１８LETDとから得られるＩＬ−１８タンパク質を比較すると、酵素量と１ｍｇのｈＩＬ−１８を得るために必要とされる時間が軽減される。その手順は、その予想されるサイズ（図９）と生物活性とを備えたタンパク質の産生にいたる。
【００４７】
カスパーゼ−８だけが適当なカスパーゼであるのではなく、精製する目的のタンパク質にある特異的なカスパーゼ切断部位の有無により、またはいずれかのほかの基準により、いずれかの他のカスパーゼの切断部位に対応している変異を使用することができる。
【００４８】
カスパーゼは、例えば、ゲルろ過法またはイオン交換クロマトグラフィーなどの標準的な精製方法を用いて目的のタンパク質から取り除くことができる。
【００４９】
結論としては、本明細書に記載された本方法は、大腸菌からＩＬ−１８およびＩＬ−１βなどの精製された、生物学的に活性であるヒトタンパク質を提供する。こうしたサイトカインの正確なフォールディングは、まず前駆体としての発現を必要とし、その後にその完全形態への切断を必要とする。
【００５０】
ヒトＩＬ−１８は、完全な、生物学的に活性なサイトカインとして、宿主細胞中で発現することが可能であるマウスＩＬ−１８とは、この点において異なる。
【００５１】
本発明はここで、以下の非限定的な実施例により説明される。
【００５２】
実施例１：Ｘａ因子部位を備えたヒトプロＩＬ−１８をコードするプラスミドの構築
ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）密度勾配分離法により健康なボランティアの末梢血から得た。ＰＢＭＣは、２％ＦＢＳを含有する氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン（ＲＰＭＩ−１０）で補足された、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に２．５×１０6細胞／ｍｌで再懸濁した。その培養物をＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ、３時間、３７℃）で刺激した。総ＲＮＡをＴｒｉＰｕｒｅ（登録商標）分離試薬（Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）によりその細胞から抽出した。１μｇの総ＲＮＡを、製造業者の指示にしたがってチタン１チューブＲＴ−ＰＣＲキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を用いてＲＴ−ＰＣＲに使用した。
【００５３】
プロＩＬ−１８IEGR  ｃＤＮＡを重複プライマー法を使用して３ステップＰＣＲにより構築した。さまざまなプライマーをヒトプロＩＬ−１８  ｃＤＮＡに基づいて設計した（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｄ４９９５０号、（３））。
【００５４】
最初のＰＣＲに関しては、フォワードプライマーは、
５'−ＡＡＣＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＣ−３'（配列識別番号：７）であり、また、リバースプライマーは、５'−ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧＴ−３'（配列識別番号：８）であった。Ｅｃｏ  ＲＩ部位はリバースプライマー中に含まれる。その鋳型はＬＰＳ刺激ＰＢＭＣから単離された、逆転写全細胞ＲＮＡであった。サーモサイクル条件は、９４℃、３０秒間；５５℃、３０秒間および６８℃、２分間の１０サイクル、続いて９４℃、３０秒間；５５℃、３０秒間と６８℃、１２５秒／サイクルの２５サイクルであった。その結果生じた４９８ｂｐ  ＰＣＲ産物は第２ＰＣＲステップで増幅された。重複フォワードプライマー、
５'−ＴＧＧＣＡＡＴＧＡＡＡＴＴＴＡＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＧＣＴＴＴＡＣＴＴＴＡＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＡＡＣＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＡＣＴＴＴＧ−３'（配列識別番号：９）、および以前のステップのリバースプライマーを使用した。サーモサイクル条件は、９４℃、３０秒間；５６℃、３０秒間および７２℃、１分間の３０サイクルであった。その結果生じた５５１ｂｐ産物は、重複フォワードプライマー：
５'−ＣＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＡＧＴＡＧＡＡＧＡＣＡＡＴＴＧＣＡＴＣＡＡＣＴＴＴＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＡＡＴＴＴＡＴＴＧＡＣ−３'（配列識別番号：１０）、および前回のステップのリバースプライマーを使用して第３ステップにおいて増幅された。ＢａｍＨＩ部位はフォワードプライマー中に含められた。サーモサイクル条件は、前回のステップの条件と同じであった。その結果生じた０．６ｋｂ  ＰＣＲ産物（図１）を、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ（登録商標）ＰＣＲ産物精製キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）で精製し、プラスミドｐＧＥＭ−プロＩＬ−１８IEGRを産生するｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターに連結した。連結産物を入れてＪＭ１０９コンピテント細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を形質転換した。標準的なクローンニングプロトコルが全体を通して使用された（１１）。
【００５５】
単一コロニーから得られたプラスミドｐＧＥＭ−プロＩＬ−１８IEGRは、制限酵素消化とＤＮＡ配列決定とにより、正確な挿入断片の存在について実証された。プラスミドを、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとにより消化した。その結果生じた、ヒトプロＩＬ−１８IEGRをコードするＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡを、１．０％アガロース中で電気泳動により分離し、０．６ｋｂバンドをＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＤＩＡＧＥＮ社、ドイツ）を用いてゲルから単離した。このＤＮＡを、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとにより線状化されたｐＧＥＸ−２ＴＫ発現ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に連結した。その結果生じた組換えプラスミドｐＧＥＸ−プロＩＬ−１８IEGR（図２）を入れて大腸菌ＪＭ１０９菌株を形質転換し、またその結果生じたベクターを、制限酵素消化と核酸配列決定とにより確認した。
【００５６】
実施例２：ＧＳＴ−プロＩＬ−１８IEGR融合タンパク質の発現と精製
プラスミドｐＧＥＸ−プロＩＬ−１８IEGRにより形質転換された大腸菌ＪＭ１０９の新鮮な単一コロニーから得られた５０ｍｌ一晩培養物を１００Ｕ／ｍｌアンピシリンを含有する４５０ｍｌ  ＬＢ培地中に希釈し、０．６ＯＤ600という密度に到達するまで３７℃にて振とうしながら増殖させた。ついで、タンパク質発現を、最終濃度０．１ｍＭまでＩＰＴＧを添加し、さらに３時間３７℃にて培養することにより誘導した。細菌を遠心分離（５，０００×ｇ、５分間、４℃）により集め、プロテアーゼ阻害剤（ロイペプチン１μｇ／ｍｌ、ペプスタチンＡ  １μｇ／ｍｌ、アプロチニン２μｇ／ｍｌ、ＰＭＳＦ  ０．２ｍＭおよびＥＤＴＡ  ５ｍＭ）を含有する氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１６ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、４ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．３）の１：１００開始容量で急速に再懸濁した。細胞を軽度音波処理（４×１５秒間バースト）により氷の上で溶菌した。トリトンＸ−１００を最終濃度１％まで添加し、その混合物を５分間氷の上で保持した。その清澄化ライゼート（１４，０００×ｇ、１５分間、４℃）をグルタチオン−アガロースビーズ（２ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）の５０％懸濁液と混合し、その混合物を４℃で３時間緩やかに振とうしながらインキュベートした。そのビーズを遠心分離（５００×ｇ、５分間）によりペレット化し、溶菌緩衝液（ＰＢＳ中に１％トリトンＸ−１００）の１０容積で２回、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の１０容積で２回、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌの１０容積で２回、また、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．０ｍＭ  ＣａＣｌ2（切断緩衝液）の１０容積で２回、洗浄した。全てのステップは４℃にて実施した。
【００５７】
実施例３：融合タンパク質の切断と完全ヒトＩＬ−１８の精製
結合ＧＳＴ−プロＩＬ−１８IEGR融合タンパク質と一緒にグルタチオン−アガロースビーズを、回転ホイール上で絶え間なく混合しつつ、１：５０（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ：基質比により、１ｍｌ切断緩衝液中に入れたＸａ因子（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）でインキュベートした（６時間、２３℃）。このステップでは完全ヒトＩＬ−１８が放出される。ビーズを５００×ｇで５分間４℃にて遠心分離によりペレット化し、２ｍｌ氷冷ＰＢＳで５回洗浄した。上清およびその洗浄容積すべてを混合し、遠心分離（１４，０００×ｇ、１５分間、４℃）により清澄化し、限外ろ過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０、Ａｍｉｃｏｎ社）により濃縮した。そのタンパク質のアリコートを、消化前と後のビーズとともに、０．１％  ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、続いてクーマシーブルー染色を行なった。完全ヒトＩＬ−１８の予想質量と一致しているおよそ１８ｋＤの大きなバンドがその上清に得られた。１９．５ｋＤの小さなバンドもまたみられた（図５）。その２つのバンドのＮ末端タンパク質配列分析が、完全ヒトＩＬ−１８のそれと一致している配列ＹＦＧＫ‥‥‥を示した。精製されたタンパク質を、０．２μフィルターにより減菌し、−７０℃にて保存した。
【００５８】
実施例４：ヒトＩＬ−１８のバイオアッセイ
ヒトＩＬ−１８活性を説明されているように評価した（２）。簡潔には、正常Ｃ３Ｈ／Ｈｅｊマウスの脾臓を切除し、すりつぶし、また赤血球を破壊するために、Ｇｅｙ緩衝液（０．０１７  Ｍ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．２の中に０．１４４  Ｍ  ＮＨ4Ｃｌ）に曝した。白血球をＲＰＭＩ−５で２回洗浄し、ついでＲＰＭＩ−１０中に再懸濁した。プラスチック非付着細胞作製のため、細胞懸濁液を１００ｍｍプラスチックプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、英国）でインキュベートした（６０分間、３７℃）。非付着細胞を穏やかに集め、遠心分離にかけ、ＲＰＭＩ−１０中に再懸濁した。トリパンブルー染色除外試験により生菌を計測し、またその細胞密度を、５×１０6細胞／ｍｌに調節した。非特異的エステラーゼ陽性細胞の大半はこうした手順により取り除いた。プラスチック非付着細胞（０．１５ｍｌ）の懸濁液を、９６穴平底マイクロタイター培養プレート（ＮＵＮＣＬＯＮ（登録商標）、デンマーク）に置いた。さまざまな濃度のＩＬ−１８、ポリミキシン（１μｇ／ｍｌ）およびコンカナバリンＡ（０．１２５μｇ／ｍｌ）を、５０μｌ  ＲＰＭＩ−１０中の穴に添加した。そのプレートを５％ＣＯ2中で２４時間または４８時間３７℃にてインキュベートした。インキュベーション後、上清を採集し、マウスＩＦＮ−γ力価をＥＬＩＳＡ法により測定した。ヒトＩＬ−１８のみと一緒に行なったマウス非付着脾臓細胞のインキュベーションでは、ＩＦＮ−γ産生がほとんどないことが示され、また同時刺激の必要性が示唆された。０．１２５μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡのみでは、ＩＦＮ−γの有意なレベルを誘導できなかった。非付着脾臓細胞をコンカナバリンＡと本発明のＩＬ−１８と一緒にインキュベートした場合、ＩＦＮ−γの投与依存性誘導が得られた（図６）。
【００５９】
実施例５：Ｘａ因子部位を備えたヒトプロＩＬ−１βをコードするプラスミドの構築
ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）密度勾配分離法により健康なボランティアの末梢血から得た。ＰＢＭＣは、２％ＦＢＳを含有する氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン（ＲＰＭＩ−１０）で補足された、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に２．５×１０6細胞／ｍｌで再懸濁した。その培養物をＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ、３時間、３７℃）で刺激した。総ＲＮＡはＴｒｉＰｕｒｅ（登録商標）分離試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）によりその細胞から抽出した。１μｇの総ＲＮＡを、製造業者の指示にしたがってチタン１チューブＲＴ−ＰＣＲキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を用いてＲＴ−ＰＣＲに使用した。
【００６０】
プロＩＬ−１β  ｃＤＮＡを、ヒトプロＩＬ−１β  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｍ１５３３０号）に基づいて設計されたセンスおよびリバースプライマーを用いてＰＣＲによりクローン化した。そのセンスプライマーは、ＢａｍＨＩ切断部位に先導された、配列Ｍ１５３３０のヌクレオチド８７〜１０７に相当する。そのリバースプライマーはＥｃｏＲＩ部位に先導された、配列Ｍ１５３３０のヌクレオチド８９６〜８７６に相当する。その鋳型はＬＰＳ刺激ＰＢＭＣから単離された、逆転写全細胞ＲＮＡであった。サーモサイクル条件は、９４℃、３０秒間；５５℃、３０秒間および６８℃、２分間の１０サイクル、続いて９４℃、３０秒間；５５℃、３０秒間と６８℃、１２５秒／サイクルの２５サイクルである。その結果生じた８３０ｂｐ  ＰＣＲ産物を、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ（登録商標）ＰＣＲ産物精製キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）で精製し、プラスミドｐＧＥＭ−プロＩＬ−１βを産生するために、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターに連結した。そのプラスミドは、ヒトＩＬ−１β  ｍＲＮＡのヌクレオチド４０５〜４５２に相当するオリゴヌクレオチドＡＣＡＴＧＧＧＡＴＡＡＣＧＡＧＧＣＴＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣＣＴＧＴＡＣＧＡ（配列識別番号：１１）を用いて位置指定突然変異誘発にかけられ、変異Ｙ１１３Ｉ、Ｖ１１４Ｅ、Ｈ１１５ＧおよびＤ１１６Ｒを有する。
【００６１】
単一コロニーから得られたプラスミドｐＧＥＭ−プロＩＬ−１βIEGRは、制限酵素消化とＤＮＡ配列決定とにより、正確な挿入断片の存在が実証される。プラスミドを、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとにより消化する。その結果生じた、ヒトプロＩＬ−１βIEGRをコードするＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡを、１．０％アガロース中で電気泳動により分離し、０．８２ｋｂバンドをＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＤＩＡＧＥＮ社、ドイツ）を用いてゲルから単離する。このＤＮＡを、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとにより線状化された、ｐＧＥＸ−２ＴＫ発現ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に連結する。その結果生じた組換えプラスミドｐＧＥＸ−プロＩＬ−１βIEGRを入れて大腸菌ＪＭ１０９菌株を形質転換し、またその結果生じたベクターを、制限酵素消化と核酸配列決定により確認する。
【００６２】
実施例６：ＧＳＴ−プロＩＬ−１βIEGR融合タンパク質の発現と精製
プラスミドｐＧＥＸ−プロＩＬ−１βIEGRにより形質転換された大腸菌ＪＭ１０９の新鮮な単一コロニーから得られた５０ｍｌ一晩培養物を、１００Ｕ／ｍｌアンピシリンを含有する４５０ｍｌＬＢ培地中に希釈し、０．６ＯＤ600という密度に到達するまで３７℃にて振とうしながら増殖させる。ついで、タンパク質発現が、最終濃度０．１ｍＭまでＩＰＴＧを添加し、さらに３時間３７℃にて培養することにより誘導される。細菌を遠心分離（５，０００×ｇ、５分間、４℃）により集め、プロテアーゼ阻害剤（ロイペプチン  １μｇ／ｍｌ、ペプスタチンＡ  １μｇ／ｍｌ、アプロチニン  ２μｇ／ｍｌ、ＰＭＳＦ  ０．２ｍＭおよびＥＤＴＡ  ５ｍＭ）を含有する氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１６ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、４ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．３）の１：１００開始容積で急速に再懸濁する。細胞を軽度音波処理（４×１５秒間バースト）により氷の上で溶菌する。トリトンＸ−１００を最終濃度１％まで添加し、その混合物を５分間氷の上で保持する。その清澄ライゼート（１４，０００×ｇ、１５分間、４℃）をグルタチオン−アガロースビーズ（２ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）の５０％懸濁液と混合し、その混合物を４℃で３時間、緩やかに振とうしながらインキュベートする。そのビーズを遠心分離（５００×ｇ、５分間）によりペレット化し、溶菌緩衝液（ＰＢＳ中に１％トリトンＸ−１００）の１０容積で２回、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の１０容積で２回、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌの１０容積で２回、また、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．０ｍＭ  ＣａＣｌ2（切断緩衝液）の１０容積で２回、洗浄する。全てのステップは４℃にて実施する。
【００６３】
実施例７：融合タンパク質の切断と完全ヒトＩＬ−１βの精製
結合ＧＳＴ−プロＩＬ−１βIEGR融合タンパク質と一緒にグルタチオン−アガロースビーズを、回転ホイール上で絶え間なく混合しつつ、１：５０（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ：基質比を使用して、１ｍｌ切断緩衝液中でＸａ因子（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）と共にインキュベートする（６時間、２３℃）。このステップでは完全ヒトＩＬ−１βが放出される。ビーズを５００×ｇで５分間４℃にて遠心分離することによりペレット化し、２ｍｌ氷冷ＰＢＳで５回洗浄する。上清およびその洗浄液すべてを混合し、遠心分離（１４，０００×ｇ、１５分間、４℃）により清澄化し、限外ろ過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０、Ａｍｉｃｏｎ社）により濃縮する。そのタンパク質のアリコートを、消化前と消化後のビーズと共に、０．１％ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、続いてクーマシーブルー染色を行なう。完全ヒトＩＬ−１βの予想質量と一致しているおよそ１７ｋＤの大きなバンドがその上清に得られる。精製されたタンパク質を、０．２μフィルターにより減菌し、−７０℃にて保存する。
【００６４】
実施例８：カスパーゼ−８切断部位を備えたヒトプロＩＬ−１８をコードするプラスミドの構築
実施例１の組換えプラスミドｐＧＥＸ−プロＩＬ−１８IEGRを、カスパーゼ−８切断部位（ＬＥＴＤ）を備えたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を挿入することにより修飾した。簡潔には、ｐＧＥＸ−プロＩＬ−１８IEGRを、プロドメインを含有するＤＮＡ部分、Ｘａ因子切断部位（ＩＥＧＲ）およびｈＩＬ−１８のＮ末端から３アミノ酸を切り出す、ｐｏｓ  ９５１における制限酵素ＢＡＭ  ＨＩおよびｐｏｓ  １０７４におけるＨｉｎｄ  IIIにより消化した。
【００６５】
同じプラスミドを、下流プライマー：ａｔｇｃＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＧＴＣ ＧＧＴ ＴＴＣ ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＴＡＴ  ＡＡ（配列識別番号：１２）上に変異部位ＬＥＴＤを導入することにより、ＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。そのＰＣＲ断片を「高純粋産物精製」キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を使用して精製し、そののち同様に１２３ｂｐ挿入断片を生成するＢＡＭ  ＨＩおよびＨｉｎｄ  IIIで切断した。オープンベクターと挿入断片をアガロースゲル上で分離し、市販されているキット“Ｊｅｔ  Ｓｏｒｂ”（Ｇｅｎｏｍｅｄ社）を用いて抽出した。連結はＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社、米国マサチューセッツ州ビバリー市）を用いて一晩行ない、連結産物を入れて大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換した。いくつかのコロニーを単離し、継代培養し、“Ｑｉａｇｅｎ”キットによりミニプレップが作製された。ＰＣＲ増幅（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、遺伝子Ａｍｐ−ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）を、その組換えプラスミドの基本的な部分を配列決定するために、すべてのミニプレップ上で行なった。最終的な形質転換は、ＴＳＳ法（Chung, C.T. et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175）にしたがってコンピテント細菌大腸菌ＪＭ１０９になされた。
【００６６】
実施例９：ＧＳＴ−プロＩＬ−１８LETD融合タンパク質の発現と精製
前記実施例８により構築されたプラスミドを用いて、ＧＳＴ−プロ−LETD−ｈＩＬ１８タンパク質発現を、基本的には前記実施例２に記載されたように、振とうフラスコおよび５リットル培養槽の中で達成した。
【００６７】
実施例１０：カスパーゼ−８を用いた融合タンパク質の切断および完全ヒトＩＬ−１８の精製
結合ＧＳＴ−プロＩＬ−１８LETD融合タンパク質と一緒にグルタチオン−アガロースビーズを、回転ホイールまたはローラー上で絶え間なく混合しつつ、１：１２００（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ：基質比を使用して、切断緩衝液（実施例６で定義）中に入れたカスパーゼ−８（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）によりインキュベートした（４時間、２３℃）。ビーズを５００×ｇで５分間４℃にて遠心分離することによりペレット化し、２ｍｌ氷冷ＰＢＳで５回洗浄した。上清およびその洗浄容積すべてを混合し、遠心分離（１４，０００×ｇ、１５分間、４℃）により清澄化し、遠心分離（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０、Ａｍｉｃｏｎ社）により濃縮した。ついで濃縮消化液を、高分子質量切断産物と残留タンパク質分解酵素（カスパーゼ−８ヘテロダイマー、２９ｋＤａおよびヘテロテトラマー）とからｈＩＬ−１８（１８ｋＤａ）を分離するために、セファデックス−７５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）上で分子サイズ別分類にかけた。
【００６８】
カスパーゼ−８酵素活性を、カスパーゼ−８分析キットおよびＡｃ−ＩＥＴＤ−ＡＭＣ蛍光原性基質（ＢＩＯＭＯＬ）を用いて、様々なセファデックス−７５画分で分析し、５５ｋＤ（カスパーゼ−８ヘテロテトラマーに相当）分子質量に相当する画分において観察され、したがってｈＩＬ−１８（１７ｋＤ）を含有する画分から非常にうまく分離されることを示した。
【００６９】
高度に純粋な１８ｋＤ  ｈＩＬ−１８ゲルろ過画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（Ａｍｉｎｃｏｎ社）上で濃縮し、最終的には０．２２μｍフィルターにより減菌し、−８０℃にて保存した。
【００７０】
そのタンパク質のアリコートを、消化前と消化後のビーズと共に、０．１％  ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、続いてクーマシーブルー染色を行なった（図９）。完全ヒトＩＬ−１８の予想質量と一致している１８ｋＤのバンドが上清画分で観察された。ビーズ画分の分析により、前駆体タンパク質がそのビーズに結合して残っているため、その切断が完全ではないことが示された。さらに、いくつかのＩＬ−１８切断タンパク質がビーズ画分には残っている。
【００７１】
実施例１１：カスパーゼ−８切断により生成されたヒトＩＬ−１８のバイオアッセイ
ヒトＩＬ−１８活性を説明されているように評価した（１０）。簡潔には、ＫＧ−１細胞を２０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中に保持した。ＩＬ−１８分析のため、ＫＧ−１細胞を１．２×１０6細胞／ｍｌ（２５０μｌ／穴、４８穴プレート）で懸濁し、様々な濃度のｈＩＬ−１８（連続希釈法、８０ｎｇ／ｍｌから開始）と一緒にｍＴＮＦα（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ社）で刺激した。そのプレートを５％ＣＯ2で２４時間３７℃にてインキュベートした。インキュベーションののち、上清を採集し、マウスＩＦＮ−γ含量をＥＬＩＳＡ法により測定した（Ｒ＆Ｄシステムから入手したｒｅｃ．ｈＩＦＮ−γおよび抗ｈＩＦＮ−γ）。
【００７２】
ヒトＩＬ−１８は、Ｘａ因子切断部位構築物から得られるｈＩＬ−１８と同じ活性を備えたＩＦＮ−γの投与依存性産生を誘導した。
【００７３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ヒトプロＩＬ−１８変異体（プロＩＬ−１８IEGR）をコードするｃＤＮＡのクローニングを説明している。このｃＤＮＡは、重複プライマー法を用いてＰＣＲの３つのステップによりクローン化された。レーンは以下のようである。すなわち、Ｍは左側に示されているＤＮＡサイズマーカーであり、１は第１ＰＣＲにより産生された４９８ｂｐ  ＤＮＡであり、２は第２ＰＣＲにより産生された５５１ｂｐ  ＤＮＡであり、３はヒトプロＩＬ−１８IEGRをコードする、第３ＰＣＲにより産生された６００ｂｐ  ＤＮＡである。
【図２】  図２は、発現プラスミドｐＧＥＸ−プロＩＬ−１８IEGRの構造を示す。（ａ）はヒトプロＩＬ−１８IEGRをコードする６００ｂｐ  ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ  ｃＤＮＡのフランキング核酸配列である。ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとに対する制限部位およびＸａ因子に対する標的部位が括弧により示されている。白抜き矢印は、Ｘａ因子切断部位を示す。（ｂ）はｐＧＥＸ−２ＴＫの略図である。制限部位もまた示されている。黒塗り矢印は、挿入のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ連結を示している。
【図３】  図３は、ＧＳＴ−プロＩＬ−１８IEGR融合タンパク質を発現する大腸菌の粗タンパク質抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーンは以下のとおりである。すなわち、１．誘導していない親プラスミドｐＧＥＸ−２ＴＫにより形質転換された細胞。２．親プラスミドｐＧＥＸ−２ＴＫにより形質転換され、また０．１ｍＭイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）により誘導された細胞。グルタチオンチオリダクターゼ（ＧＳＴ）の予想２６ｋＤバンドが、左側に矢印により示されている。レーン３〜７は、プラスミドｐＧＥＸ−プロＩＬ−１８IEGRにより形質転換された細胞を、また誘導していない（レーン３）もの、あるいは示されている時間、ＩＰＴＧにより誘導されたものを示している。右側に矢印により示されている４３ｋＤバンドは、ＧＳＴ−プロＩＬ−１８IEGR融合タンパク質にサイズで対応する。
【図４】  図４は、グルタチオンアガロース上での精製に続いて、ＧＳＴ−プロＩＬ−１８IEGR融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）を示す。細菌音波処理の上清（図３のレーン７）はグルタチオンアガロース上でアフィニティー精製された。レーンは以下のとおりである。すなわち、１．は分子質量マーカー（左側にｋＤにより示されている）、２．アフィニティー精製ＧＳＴ−プロＩＬ−１８IEGR。ゲルはクーマシーブルーにより染色された。
【図５】  図５は、精製ＩＬ−１８のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミド）を示す。ＧＳＴ−プロＩＬ−１８IEGR融合タンパク質がグルタチオンアガロースビーズ上で捕捉され、プロテアーゼ：基質比１：５０（ｗ／ｗ）でＸａ因子と一緒にインキュベートされ、その上清が６時間後に分析された。すなわち、レーン１は、左側にｋＤで示されている分子質量マーカー、レーン２はグルタチオン−アガロースビーズの上清中のヒトＩＬ−１８である。ゲルはクーマシーブルーで染色された。
【図６】  図６は、ヒトＩＬ−１８のバイオアッセイを示す。示されている投与量でのヒトＩＬ−１８がコンカナバリンＡ（０．１２５μｇ／ｍｌ）とポリミキシンＢ（１μｇ／ｍｌ）との存在下で、マウスのプラスチック非付着脾臓細胞（５×１０6細胞／穴）の培養培地に加えられた。その上清はマウスのインターフェロン−γに関してＥＬＩＳＡ法により測定された。コンカナバリンＡが存在しない場合にＩＬ−１８（１００ｎｇ／ｍｌ）により誘導されたインターフェロンγのレベルは１６０ｐｇ／ｍｌであった。
【図７】  図７は、略図形でカスパーゼ−８を用いたｈＩＬ−１８の精製のための基本的な手順を示す。
【図８】  図８は、ＧＳＴ−プロ−ｈＩＬ−１８LETDの配列を示す。ボックスはカスパーゼ−８切断部位を示す。下線部の配列は完全ｈＩＬ−１８である。
【図９】  図９は、グルタチオン−アガロース上でのＧＳＴ−プロＩＬ−１８LETD融合タンパク質精製のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミドゲル）を示す。ＧＳＴ−プロＩＬ−１８LETDを発現させる組換え大腸菌ＪＭ１０９の細胞破壊上清が、グルタチオンアガロース上でアフィニティー精製され、固体相上でカスパーゼ−８により消化された。消化後上清は濃縮され、セファデックス−７５上で分子サイズ別分類に適用された。レーンは以下のとおりである。すなわち、１．分子質量マーカー（左側にｋＤにより示される）、２．細胞破壊上清、３．アフィニティー精製ＧＳＴ−プロＩＬ−１８LETD、４．カスパーゼ−８固体相、４時間消化後グルタチオン−アガロース樹脂、５．カスパーゼ−８濃縮４時間消化、６．純粋ｈＩＬ−１８のセファデックス−７５プール。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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