(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)リンパ球を含む細胞試料をコクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体（CAR）と接触させる工程、及び
(b)工程(a)において、CARと結合した細胞を検出する工程
を含むTh1細胞を検出する方法であって、CARが、配列番号:1または2のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して結合する、以下(1)〜(6)いずれかに記載のアミノ酸配列を含む蛋白質である方法：
(1)天然型CARのアミノ酸配列、
(2)天然型CARをコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列、
(3)天然型CARのアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列、
(4)天然型CARのアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
(5)前記(1)〜(4)のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列、
(6)前記(1)〜(5)に記載の蛋白質とマーカー蛋白質を融合させたアミノ酸配列。
【請求項２】
CARが担体に結合されている、請求項1記載の方法。
【請求項３】
(a)リンパ球を含む細胞試料を抗コクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体リガンド（CARL）抗体と接触させる工程、及び
(b)工程(a)において、抗CARL抗体と結合した細胞を検出する工程
を含むTh1細胞を検出する方法であって、抗CARL抗体は、CARLに特異的に結合する抗体であり、CARLは天然型CARと結合する、以下(1)〜(9)いずれかに記載の蛋白質である方法：
(1)配列番号:1のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(2)配列番号:1のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(3)配列番号:2のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(4)配列番号:2のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(5)前記(1)〜(4)のアミノ酸配列中のIg様ドメイン１を含む蛋白質、
(6)配列番号:3または4のcDNA配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、
(7)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質、
(8)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質、
(9)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含む蛋白質。
【請求項４】
抗CARL抗体が担体に結合されている、請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項1または請求項３に記載の方法を含んで成る、Th1細胞とTh2細胞の比率を検査する方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法に基づいて検査されたTh1細胞とTh2細胞の比率に基づき、細胞試料を採取された被験者がアトピー性疾患であるかどうかを判定する方法。
【請求項７】
抗CARL抗体を検出試薬として含む、Th1細胞を検出するためのキットであって、
該CARLは天然型CARと結合する、以下(1)〜(9)いずれかに記載の蛋白質である、前記キット：
(1)配列番号:1のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(2)配列番号:1のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(3)配列番号:2のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(4)配列番号:2のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(5)前記(1)〜(4)のアミノ酸配列中のIg様ドメイン１を含む蛋白質、
(6)配列番号:3または4のcDNA配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、
(7)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質、
(8)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質、
(9)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含む蛋白質。
【請求項８】
抗CARL抗体が担体に結合されている、請求項７記載のキット。
【請求項９】
細胞試料を採取された被験者がアトピー性疾患であるかどうかを判定する請求項７記載のキット。
【請求項１０】
(a)被験物質存在下でCAR及びCARLを接触させる工程、
(b)工程(a)におけるCAR及びCARLの結合を検出する工程、
(c)工程(b)において検出されたCAR及びCARLの結合レベルを、被験物質不在下の場合と比べる工程、及び
(d)被験物質不在下の場合と比べ、CAR及びCARLの結合を抑制する被験物質を、CARとCARLとの結合の阻害剤として選択する工程
を含む、CARとCARLとの結合の阻害剤をスクリーニングする方法であって；
該CARLは天然型CARと結合する、以下(1)〜(10)いずれかに記載の蛋白質であり、
(1)配列番号:1のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(2)配列番号:1のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(3)配列番号:2のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(4)配列番号:2のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(5)前記(1)〜(4)のアミノ酸配列中のIg様ドメイン１を含む蛋白質、
(6)配列番号:3または4のcDNA配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、
(7)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質、
(8)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含む蛋白質、
(9)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質、
(10)前記(1)〜(8)に記載の蛋白質とマーカー蛋白質を融合させた蛋白質；
該CARは、配列番号:1または2のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して結合する、以下(11)〜(15)いずれかに記載のアミノ酸配列を含む蛋白質である方法。
(11)天然型CARのアミノ酸配列、
(12)天然型CARをコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列、
(13)天然型CARのアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列、
(14)前記(11)〜(13)のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列、
(15)前記(14)に記載の蛋白質とマーカー蛋白質を融合させたアミノ酸配列。
【請求項１１】
CARまたはCARLのどちらか一方が担体に結合されている、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
CAR及び／またはCARLが、宿主細胞において発現ベクターより発現される、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
CAR及びCARLの結合を阻害する抗体であって、該CARLは天然型CARと結合する以下(1)〜(9)いずれかに記載の蛋白質である抗体：
(1)配列番号:1のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(2)配列番号:1のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(3)配列番号:2のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(4)配列番号:2のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(5)前記(1)〜(4)のアミノ酸配列中のIg様ドメイン１を含む蛋白質、
(6)配列番号:3または4のcDNA配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、
(7)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質、
(8)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質、
(9)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含む蛋白質。
【請求項１４】
CAR及びCARLがヒト由来である、請求項13記載の抗体。
【請求項１５】
抗体が抗CAR抗体である、請求項13または14記載の抗体。
【請求項１６】
抗CAR抗体が、受託番号  FERM BP-10317において寄託されたハイブリドーマ@mCAR:5E9-1-1、受託番号  FERM BP-10318において寄託されたハイブリドーマ@mCAR:5G11-1-1-11、または受託番号  FERM BP-10320において寄託されたハイブリドーマ@mCAR:4C9-1-1より産生される、請求項15記載の抗体。
【請求項１７】
抗体が抗CARL抗体である、請求項13または14記載の抗体。
【請求項１８】
抗CARL抗体が、受託番号  FERM BP-10319において寄託されたハイブリドーマ@mCARL:#3.11より産生される、請求項17記載の抗体。
【請求項１９】
請求項13〜18のいずれか一項記載の抗体を含む細胞接着阻害剤。
【請求項２０】
請求項13〜18のいずれか一項記載の抗体を含む接触性皮膚炎治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞性免疫に関与すると考えられているヘルパーT細胞、Th1細胞の検出方法に関する。具体的には、本発明は、コクサッキーウィルス・アデノウィルス受容体(coxsackie and adenovirus receptor;CAR)または、CARと結合するTh1上のリガンドであるCARリガンド(CARL)に対する抗体を用いてTh1細胞を検出する方法に関する。この方法を用いて生体試料中のTh1細胞及びTh2細胞の比率を検査し、生体試料を採取した被験者をアトピー性疾患について診断することができる。本発明はさらに、CARとCARLとの結合の阻害剤をスクリーニングする方法に関する。また、CARとCARLとの結合を阻害する抗体、及び該抗体を含む細胞接着阻害剤、および接触性皮膚炎治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体での免疫反応は局所的に生じ、免疫細胞の浸潤が認められるという共通した特徴がある。すなわち、必要な免疫細胞が適切に局所へ導かれることなくして、効率良い免疫反応は生じない。また、浸潤している免疫細胞は、組織や疾患によって、種類が異なっている。例えば、リウマチの関節にはインターロイキン(IL)-12、インターフェロン(IFN)-γなどを産生するTh1細胞が、喘息の肺にはIL-4、IL-5などを産生するTh2細胞が多く集積している。このような選択的な細胞浸潤を可能にする細胞浸潤機構を解明することで、特定の細胞浸潤を抑制することが可能となり、免疫反応の病態を制御できるものと考えられている。【０００３】
免疫細胞の浸潤は、大きく次の4つのステップに分類される：(1)セレクチンを介した血管内皮細胞との軽い接触、(2)ケモカイン受容体によるインテグリンの活性化、(3)インテグリンを介した血管内皮細胞との強い接着、そして、(4)血管内皮細胞の細胞間隙を通り抜ける血管外遊走である。最初の3つのステップについては、分子機構の解明が進んでいるが、血管外遊走については未だ不明な点が多い。【０００４】
最近では、血管外遊走に関与している分子として、JAM-AやPECAM-1が報告されている。JAM-AとPECAM-1は、イムノグロブリンスーパーファミリー（IgSF）に属する細胞膜蛋白質であり、細胞接着分子として機能する。【０００５】
JAM-A、JAM-B及びJAM-CからなるJAMファミリーは、細胞外に2個のIg様ドメインを持ち、上皮細胞、内皮細胞、白血球、血小板などで発現していることが報告されている。JAM-Aは、ホモフィリックな結合に加えて、インテグリンαLβ2と結合することが報告されている。JAM-Bは、ホモフィリックな結合に加えて、JAM-Cやインテグリンα4β1と結合することが報告されている。また、JAM-Cは、ホモフィリックに結合しないが、JAM-BやインテグリンαMβ2と結合することが報告されている。このように、JAMファミリーの分子は、ホモフィリックあるいはヘテロフィリックな結合を介して、内皮細胞間、白血球と内皮細胞間、血小板と内皮細胞間の接着に関与している。【０００６】
JAMファミリー以外にも、細胞外に2個のIg様ドメインを持つ分子が数多く存在する。それらのうち、JAMファミリーの分子と同様の局在を示すことが報告されているものがある。例えば、CAR (coxsackie and adenovirus receptor)は、コクサッキーウィルスとアデノウィルスの受容体として同定され、上皮細胞や内皮細胞のタイトジャンクションやアドヘレンスジャンクションに局在する(非特許文献1及び2)。また、ESAM (endothelial-selective adheion molecule)は、内皮細胞でのみ選択的に発現する分子として同定されたが、その後血小板での発現が報告されている。【０００７】
このようなIgSFに属する分子が、上皮細胞、内皮細胞、白血球、血小板の接着に関わっているかを調べ、細胞浸潤機構を解明することは、免疫細胞が関わる病態を制御する上で非常に重要である。【０００８】
【非特許文献１】Cohen C.J., Shieh J.T., Pickles R.J., Okegawa T., Hsieh J.T.およびBergelson J.M.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001) 98(26):15191-15196
【非特許文献２】Walters R.W., Freimuth P., Moninger T.O., Ganske I., Zabner J.およびWelsh M.J.、Cell (2002) 110(6):789-799
【非特許文献３】Moog-Lutz C., Cave-Riant F., Guibal F.C., Breau M.A., Di Gioia Y., Couraud P.O., Cayre Y.E., Bourdoulous S.およびLutz P.G.、Blood (2003) 102(9):3371-3378
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特定のリンパ球と接着能を持つ細胞接着分子は、当該リンパ球の選択的な細胞浸潤に寄与しているものと考えられることから、このような細胞接着分子及びそのリガンドを明らかにすることにより、特定のリンパ球の細胞浸潤の抑制、さらには、免疫反応の病態の制御が可能となることが期待される。そこで、本発明の目的は、特定のリンパ球と細胞接着能をもつ細胞接着分子を探索し、その分子のリガンドを同定して、当該接着分子、リガンド及びそれらに対する抗体の用途を見出すことにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、活性化リンパ球と接着能をもつ細胞接着分子を探索するため、IgSFに属する候補分子の細胞外領域と分泌型アルカリフォスファターゼとのキメラ分子を用いて、活性化リンパ球の細胞接着実験を行った。その結果、CARが活性化リンパ球に対する接着分子として機能することが明らかとなった。【００１１】
次に、CARに対するモノクローナル抗体を作製し、CARに特異的な3種類の抗体（4C9、5E9及び5G11）を得た。CARのホモフィリックな結合による細胞接着は、5G11により阻害され、4C9及び5E9により亢進された。また、CARと活性化リンパ球の細胞接着は、4C9及び5G11によって阻害され、5E9では抑制はみられなかった。抗体の細胞接着阻害活性は、抗体の結合部位に依存することが示唆された。
抗CAR抗体を使って活性化リンパ球におけるCARの発現を調べたところ、細胞表面上にはCAR蛋白質の発現は認められず、CARmRNAの発現も認められなかった。したがって、活性化リンパ球はCARのホモフィリックな結合により細胞接着しておらず、活性化リンパ球にはCARに対する未知のリガンドが発現していることが示唆された。そこでまず、CARに対する未知のリガンドがインテグリンである可能性を検討した。CD11a、CD18、CD29、CD49d、CD51、CD61に対する抗体の細胞接着に与える効果を調べた。しかし、CARと活性化リンパ球の接着は、いずれの抗体によっても阻害されなかった。【００１２】
また、CARに対する未知のリガンドを同定するため、CARに接着するリンパ球の状態を調べた。IL-2で刺激した活性化リンパ球はCARに接着するが、IL-15で刺激した活性化リンパ球は接着しないことが明らかになった。T細胞株TK1細胞及び休止期CD4+T細胞もCARに接着しなかった。さらに、CAR細胞外領域とアルカリフォスファターゼ(AP)のキメラ蛋白質（CAR-AP）を用いて、各種リンパ球の細胞表面への結合を調べた。IL-2で刺激した活性化リンパ球にCAR-APは結合したが、IL-15で刺激した活性化リンパ球、T細胞株TK1細胞及び休止期CD4+T細胞へのCAR-APの結合は見られなかった。【００１３】
次に、CARに対する未知のリガンドがIgSFの一員である可能性を検討した。Mouse Ensembleのデータベースを検索してCARおよびJAMファミリー分子の染色体における位置を調べた。これらの分子は、1、9、16番染色体に分かれてクラスターを形成して存在していた。そこで、CARおよびJAMファミリー分子の近傍に存在する50個のIgSFの分子に着目し、各種リンパ球における発現をリアルタイムPCRで調べた。その結果、ENSMUSG0000048534がCARへの接着活性と相関のある発現パターンを示した。そこで、ENSMUSG0000048534がCARに対する未知のリガンドであるかどうかを調べるため、この分子の細胞外領域とアルカリフォスファターゼのキメラ蛋白質を作製し、B300細胞およびCAR発現B300細胞との接着活性を調べた。その結果、CAR発現B300細胞のみが接着し、その接着は5G11によって阻害された。以上の結果より、ENSMUSG0000048534がリンパ球上の新規なCARに対するリガンドであることが明らかとなったので、CARL(CAR Ligand)と命名した。【００１４】
CARLをコードする遺伝子は、マウス9番染色体(46.9Mb)に位置していた。CARLをコードする遺伝子は、similar to AMICA(BC050133)としてGenBankに登録されている機能未知のマウスcDNA配列と一致した。CARLのヒト相同遺伝子は、ヒト染色体上のマウス相同領域11番染色体(117.6Mb)に位置し、アミノ酸配列の相同性の高い、GenBankに登録されている機能未知のヒトcDNA配列AMICA(AY138965)であると考えられる。最近、ヒトAMICAの一部アミノ酸配列を欠失した分子（ヒトJAML(AJ515553)）が、骨髄由来細胞に発現する接着分子として報告された(非特許文献3)。BIAcoreを用いて蛋白質相互作用を解析した結果、CARとCARLの細胞外領域は直接結合し、その結合親和定数は4.8nMであることが明らかとなった。さらに、CARLは、リンパ球においてはTh1細胞で選択的に発現し、CARLの発現に依存してCARがリンパ球においてはTh1細胞と選択的に接着することが示された。【００１５】
さらに、推定される2つのIg様ドメイン（ドメイン1およびドメイン2）を欠損させたCARL発現細胞をそれぞれ作成し、これら細胞のCAR-APキメラ蛋白質に対する接着活性を調べたところ、全長型CARL発現B300細胞とドメイン2欠損型CARL発現B300細胞は、CAR-APキメラ蛋白質に接着したが、ドメイン1欠損型CARL発現B300細胞は接着しなかった。したがって、CARとCARLの結合にはCARLのドメイン1が必要であることが明らかとなった。【００１６】
次に、CARLに特異的な#3モノクローナル抗体を得た。この#3抗体を用いて、Th1およびTh2細胞におけるCARLの発現を調べたところ、Th1細胞で選択的に強く発現していた。また、#3抗体は、CARL-AP蛋白質に対するCAR発現B300細胞の接着を阻害した。さらに、#3抗体は、全長型CARL発現B300細胞とドメイン2欠損型CARL発現B300細胞の膜上のCARLと結合したが、ドメイン1欠損型CARL発現B300細胞では結合しなかった。したがって、結合阻害活性を持つ#3抗体は、CARとCARLの結合に必要なドメイン1を認識していることが明らかとなった。
Th1細胞以外でのCARLの発現を調べたところ、CARLは好中球に強く発現していた。また、作製した#3抗CARL抗体を用いて、マウスの接触性皮膚炎モデルにて治療実験を行ったところ治療効果が認められた。【００１７】
ヒトCAR発現B300細胞とヒト CARL-APキメラ蛋白質との接着活性を調べたところ、ヒトCARとヒトCARLの結合が検出された。同様に、ヒトCARL発現B300細胞とヒト CAR-APキメラ蛋白質およびヒト CARL-APキメラ蛋白質との接着活性を調べたところ、ヒト CARとヒト CARLの結合が検出された。したがって、マウスで得られた現象が、ヒトでも同様に見られることが確認された。さらに、ヒト CARLに対するモノクローナル抗体を作成したところ、CARLのCAR発現細胞への結合を阻害する抗体が見出された。抗ヒト CARL抗体にも、マウス同様、細胞接着阻害活性、および接触性皮膚炎に対する治療活性があることが示された。
【００１８】
以上をまとめると、本発明者により、CARがリンパ球に対して接着分子として機能すること、CARLがCARのリンパ球上の新規リガンドであること、CARLがTh1細胞で選択的に発現すること、CARに対してTh1細胞が選択的に接着すること、CARとCARLの結合にドメイン1が必要であること、ヒトとマウスのCARとCARLは同様の特性を有することが示された。そこで、本発明は、CAR及びCARLの直接的な相互作用を利用したTh1細胞の検出方法、及び検出のためのキットに関する。別の態様として、本発明はTh1細胞上の新規なリガンドとして同定されたCARLに対する抗体を用いてTh1細胞を検出する方法を提供する。このようなTh1細胞の検出により、生体試料中のTh1細胞及びTh2細胞の比率を検査し、生体試料を採取した被験者をアトピー性疾患について診断することができる。よって、本発明はTh1細胞とTh2細胞の比率を検査する方法、及び、その検査された比率に基づきアトピー性疾患について診断する方法に関する。
さらに別の態様として、本発明は、CARとCARLとの結合の阻害剤をスクリーニングする方法に関する。また、CARとCARLとの結合を阻害する抗体、及び該抗体を含む細胞接着を阻害する組成物、例えば、接触性皮膚炎を治療する組成物に関する。【００１９】
即ち本発明は、より具体的には、
[１]  (a)リンパ球を含む細胞試料をCARと接触させる工程、及び
(b)工程(a)において、CARと結合した細胞を検出する工程
を含むTh1細胞を検出する方法であって、CARが、配列番号:1または2のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して結合する、以下(1)〜(6)いずれかに記載のアミノ酸配列を含む蛋白質である方法：
(1)天然型CARのアミノ酸配列、
(2)天然型CARをコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列、
(3)天然型CARのアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列、
(4)天然型CARのアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列、
(5)前記(1)〜(4)のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列、
(6)前記(1)〜(5)に記載の蛋白質とマーカー蛋白質を融合させたアミノ酸配列。
[２]  CARが担体に結合されている、[1]記載の方法。
[３]  CARを検出試薬として含む、Th1細胞を検出するためのキット。
[４]  CARが担体に結合されている、[3]記載のキット。
[５]  (a)リンパ球を含む細胞試料を抗CARL抗体と接触させる工程、及び
(b)工程(a)において、抗CARL抗体と結合した細胞を検出する工程
を含むTh1細胞を検出する方法であって、抗CARL抗体は、CARLに特異的に結合する抗体であり、CARLは天然型CARと結合する、以下(1)〜(9)いずれかに記載の蛋白質である方法：
(1)配列番号:1のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(2)配列番号:1のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(3)配列番号:2のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(4)配列番号:2のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(5)前記(1)〜(4)のアミノ酸配列中のIg様ドメイン１を含む蛋白質、
(6)配列番号:3または4のcDNA配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、
(7)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質、
(8)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質、
(9)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含む蛋白質。
[６]  抗CARL抗体が担体に結合されている、[5]記載の方法。
[７]  [1]または[5]に記載の方法を含んで成る、Th1細胞とTh2細胞の比率を検査する方法。
[８]  [7]に記載の方法に基づいて検査されたTh1細胞とTh2細胞の比率に基づき、細胞試料を採取された被験者がアトピー性疾患であるかどうかを判定する方法。
[９]  抗CARL抗体を検出試薬として含む、Th1細胞を検出するためのキット。
[１０]  抗CARL抗体が担体に結合されている、[9]記載のキット。
[１１]  細胞試料を採取された被験者がアトピー性疾患であるかどうかを判定する[9]記載のキット。
[１２]  (a)被験物質存在下でCAR及びCARLを接触させる工程、
(b)工程(a)におけるCAR及びCARLの結合を検出する工程、
(c)工程(b)において検出されたCAR及びCARLの結合レベルを、被験物質不在下の場合と比べる工程、及び
(d)被験物質不在下の場合と比べ、CAR及びCARLの結合を抑制する被験物質を、CARとCARLとの結合の阻害剤として選択する工程
を含む、CARとCARLとの結合の阻害剤をスクリーニングする方法であって；
該CARLは天然型CARと結合する、以下(1)〜(10)いずれかに記載の蛋白質であり、
(1)配列番号:1のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(2)配列番号:1のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(3)配列番号:2のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(4)配列番号:2のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(5)前記(1)〜(4)のアミノ酸配列中のIg様ドメイン１を含む蛋白質、
(6)配列番号:3または4のcDNA配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、
(7)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質、
(8)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含む蛋白質、
(9)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質、
(10)前記(1)〜(8)に記載の蛋白質とマーカー蛋白質を融合させた蛋白質；
該CARは、配列番号:1または2のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して結合する、以下(11)〜(15)いずれかに記載のアミノ酸配列を含む蛋白質である方法。
(11)天然型CARのアミノ酸配列、
(12)天然型CARをコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列、
(13)天然型CARのアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列、
(14)前記(11)〜(13)のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列、
(15)前記(14)に記載の蛋白質とマーカー蛋白質を融合させたアミノ酸配列。
[１３]  CARまたはCARLのどちらか一方が担体に結合されている、[12]記載の方法。
[１４]  CAR及び／またはCARLが、宿主細胞において発現ベクターより発現される、[12]記載の方法。
[１５]  CAR及びCARLの結合を阻害する抗体であって、CARLが以下(1)〜(9)いずれかに記載の蛋白質である抗体：
(1)配列番号:1のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(2)配列番号:1のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(3)配列番号:2のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(4)配列番号:2のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(5)前記(1)〜(4)のアミノ酸配列中のIg様ドメイン１を含む蛋白質、
(6)配列番号:3または4のcDNA配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、
(7)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質、
(8)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質、
(9)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含む蛋白質。
[１６]  CAR及びCARLがヒト由来である、[15]記載の抗体。
[１７]  抗体が抗CAR抗体である、[15]または[16]記載の抗体。
[１８]  抗CAR抗体が、受託番号  FERM BP-10317において寄託されたハイブリドーマ@mCAR:5E9-1-1、受託番号  FERM BP-10318において寄託されたハイブリドーマ@mCAR:5G11-1-1-11、または受託番号  FERM BP-10320において寄託されたハイブリドーマ@mCAR:4C9-1-1より産生される、[17]記載の抗体。
[１９]  抗体が抗CARL抗体である、[15]または[16]記載の抗体。
[２０]  抗CARL抗体が、受託番号  FERM BP-10319において寄託されたハイブリドーマ@mCARL:#3.11より産生される、[19]記載の抗体。
[２１]  [15]〜[20]のいずれか一項記載の抗体を含む細胞接着阻害剤。
[２２]  [15]〜[20]のいずれか一項記載の抗体を含む接触性皮膚炎治療剤。
を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】CARが活性化T細胞に対する接着分子として機能することを示した図である。
【図２】抗CAR抗体がCARのホモフィリックな結合を介する細胞接着に及ぼす効果を示した図である。
【図３】活性化リンパ球上にはCARが発現していないことを示した図および写真である。
【図４】リンパ球の刺激の状態によって、CARに対する細胞接着活性が異なることを示した図である。
【図５】CAR ligand (CARL)の発現パターンを示した図である。
【図６】CAR ligand (CARL)とCARによる細胞接着と抗CAR抗体による細胞接着阻害を示した図である。
【図７】CARLのアミノ酸配列を示した図である。
【図８】CARとCARLのKd値を求めた図である。
【図９】Th1細胞で選択的に発現しているCARLとの結合を介してCARがTh1と選択的に接着することを示した図である。
【図１０Ａ】抗CAR抗体によるTh1細胞のCARに対する細胞接着阻害を示した図である。
【図１０Ｂ】CD4陽性T細胞以外の細胞におけるCARLの発現を示した図である。
【図１１】CARLのCARとの結合に必要な領域がCARLの1番目のIg様ドメインであることを示した図である。
【図１２】抗CARL抗体による細胞接着阻害を示した図である。
【図１３】ヒト CARとヒト CARLが結合することを示した図である。
【図１４】抗ヒト CARL抗体による細胞接着阻害を示した図である。
【図１５】接触性皮膚炎に対する抗CARL抗体の治療効果を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
CARを用いたTh1細胞検出方法
本発明により、CARが、Th1細胞上に特異的に発現するCARLとの直接的な結合を介してTh1細胞と結合することが示された。そこで、本発明は、CARを用いたTh1細胞を検出する方法に関する。具体的には、本発明により、(a)リンパ球を含む細胞試料をCARと接触させる工程、及び(b)工程(a)においてCARと結合した細胞を検出する工程を含むTh1細胞の検出方法が提供される。【００２２】
本検出方法における「リンパ球を含む細胞試料」は特に限定されず、リンパ球を含むことが期待される骨髄、末梢血等の血液細胞試料が例示される。特に採取の容易性から、末梢血が好ましい。【００２３】
細胞試料とCARとの接触は、通常、細胞を含む反応溶液中にポリペプチドを添加して行う。細胞を含む反応液としては、例えば、実施例4に記載の細胞接着バッファー(RPMI1640、0.5％BSA、20ｍM HEPES(pH7.4))を用いることができる。しかしながら、本発明はこれに限定されず、CAR及びTh1細胞が安定に維持され、これらの結合が阻害されない限りどのような反応溶液中で接触を行ってもよい。【００２４】
本明細書において「CAR」及び「CARポリペプチド」は、NM_001338の番号でGenBankに登録される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列（NP_001329）からなるヒト蛋白質、並びに、そのアレル変異体、スプライシングバリアント、及び、該蛋白質に対応するヒト以外の哺乳動物由来の蛋白質のような、天然型CARを含む。さらに、「CAR」及び「CARポリペプチド」は、上述の天然型CARに加えて、該CARと同等の機能を示す非天然型のポリペプチドを含む。例えば、「CAR」及び「CARポリペプチド」は、天然型CARから改変されたアミノ酸配列を有する蛋白質（改変型CAR）、及び組換え蛋白質として製造されたCAR（組換えCAR）などを含む。より具体的には、「CAR」及び「CARポリペプチド」は、
(1)天然型CARのアミノ酸配列、
(2)天然型CARをコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列、
(3)天然型CARのアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列、
(4)天然型CARのアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列、
(5)前記(1)〜(4)のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列、および
(6)前記(1)〜(5)に記載の蛋白質とマーカー蛋白質を融合させたアミノ酸配列；
を含む。本明細書において、「CAR」及び「CARポリペプチド」は互換的に使用される。【００２５】
天然型CARの由来となるヒト以外の哺乳動物としては、例えば、マウス(GenBank NP_034118)、ラット、ウサギ、イヌ、ウマ、ネコ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、及びサル、ゴリラ、チンパンジー等の霊長類を挙げることができる。アレル変異体、及び、これらの哺乳動物由来の蛋白質は、例えば、上記CARの塩基配列またはアミノ酸配列を元に作製したプローブまたはプライマーを利用してハイブリダイゼーション、PCR等の公知の技術(Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd ed., Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons (1987-1997); DNA Cloning 1:core techniques, a practical approach 2nd ed., Oxford Univ. (1995))を応用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリー等から該アレル変異体または蛋白質をコードするcDNAまたは遺伝子を取得し、該遺伝子を発現させることにより得ることができる。また、公知のアミノ酸配列を元に、慣用の蛋白質合成法によりCARを調製することも可能である。【００２６】
上述したように、「CAR」及び「CARポリペプチド」は、上述の天然型CARの他、該CARと同等の機能を示すポリペプチドを含む。CARの機能は、例えば当該動物のCARL、マウスであれば配列番号:1、ヒトであれば配列番号:2のアミノ酸配列からなる蛋白質との結合により確認できる。一般に、共通の生物活性を示す蛋白質はそのアミノ酸配列においても、また該蛋白質をコードする遺伝子レベルにおいても、進化の過程で保存されていることが知られている。そこで、天然型CARと同等に機能を示すポリペプチドとしては、天然型CARと特にその活性中心において高いアミノ酸配列相同性を示す蛋白質を挙げることができる。CARと結合するマウスCARLに対応するヒトAMICAは、全体のアミノ酸配列では37.4％の相同性があった。そこで、本発明において高いアミノ酸配列相同性とは、例えば、30、35、40、または50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上（例えば、80、90または95％以上）の同一性を意味する。ここで、「％同一性」という用語は、2つのアミノ酸配列の間で最大の数値が得られるよう、必要に応じスペースを含めて該2つの配列を整列させた場合のアミノ酸残基同士が一致する割合（保存的置換は一致に含まれない）として定義される。このようなアミノ酸配列の％同一性は、公知のソフトウェア(BLAST（Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410; http://www.ncbi.nlm.nih.gov.参照）、BLAST-2、Mcgalign等)を用いて計算することができる。当業者であれば、これらの公知のソフトウェアを用いた同一性の計算時に必要とされる各調節可能なパラメーターを、感度等を考慮して適宜決定することができる。【００２７】
天然型CARと同等の活性に対して高いアミノ酸配列相同性を示す蛋白質をコードする遺伝子は、公知の天然型CARのアミノ酸配列若しくは遺伝子配列を元にプローブ、またはプライマーを作製し、ハイブリダイゼーションまたはPCR等の慣用の手法により得ることができ（Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A laboratory manual 2nd ed.,Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press）、該遺伝子を発現させることにより、天然型CARと同等の生物活性を有する蛋白質を得ることができる。そこで、本明細書中に記載の「CAR」及び「CARポリペプチド」には、天然型CARをコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質が含まれる。このような本発明におけるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、例えば、「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」及び「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer(Amersham Life Science)を用いた方法として、68℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して1時間以上68℃に保ってハイブリッド形成させ、その後2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回行い、続いて1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を3回行い、最後に1×SSC、0.1％SDS中、50℃で20分間の洗浄を2回行うことができる。その他、例えばExpresshyb Hybridization Solution(CLONTECH)中、55℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを添加して37〜55℃で1時間以上インキュベートし、2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回、1×SSC,0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を1回行ってもよい。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び2度目の洗浄の際の温度をより高く(例えば、60℃、68℃等)設定することにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。当業者であれば、バッファーの塩濃度、温度に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、プローブの塩基配列構成、反応時間等のその他のハイブリダイゼーション条件を加味し、CARのアイソフォーム、アレリック変異体、及びその他の種由来の対応する遺伝子を得るための条件を設定することができる。ハイブリダイゼーション法については、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed.(Cold Spring Harbor Press(1989))、Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons(1987-1997))、DNA Cloning 1:Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.(Oxford University(1995))等を実験手引きとすることができる。【００２８】
本明細書中の「CAR」及び「CARポリペプチド」には、さらに、上記天然型CARから改変されたアミノ酸配列を有する蛋白質が含まれる。このような「改変されたCAR」及び「改変されたCARポリペプチド」としては、例えば、天然型CARのCARLとの結合に関与しない領域を欠失させた蛋白質が挙げられる。特に好ましい天然型CARの一部を欠失させた蛋白質として、天然型CAR中の細胞外ドメインからなるアミノ酸配列を有するポリペプチドを例示することができる。蛋白質のドメインの予測はドメイン検索サイト、例えばhttp://smart.embl-heidelberg.de/から可能である。その他、天然型CARの1若しくは数個のアミノ酸残基または適当なポリペプチド鎖を天然型CARに付加した蛋白質、天然型CARのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基を置換または挿入した蛋白質も本発明の改変されたCAR及び改変されたCARポリペプチドに含まれる。公知のアミノ酸配列を有する蛋白質において、該配列中の任意のアミノ酸残基を欠失・付加・置換または挿入する方法は周知であり、例えばそれをコードするＤＮＡに例えば、周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Nucleic Acid Research, Vol.10, No.20, p.6487-6500, 1982参照）を施すことにより作成できる。本明細書において「１又は数個のアミノ酸」とは、１回又は数回の部位特異的変異誘発法により付加、欠失または置換できる程度の数のアミノ酸を意味する。部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレートし、ファージを含有する単一細胞からプラークを形成せしめる。そうすると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、元の鎖を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプラークを拾い、培養しＤＮＡを回収する。
尚、酵素などの生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を喪失せしめない１又は複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、付加または置換し、次いで連結する方法もある。【００２９】
本発明で用いるCAR及びCARポリペプチドについても、公知の方法に従って、このような改変を加えることができる。天然型CARのアミノ酸配列中、1以上の任意のアミノ酸配列を別のアミノ酸残基で置換する場合、保存的アミノ酸残基による置換を行うことが望ましい。保存的アミノ酸残基とは、置換前のアミノ酸残基と同様の側鎖を有するアミノ酸を指す。アミノ酸は例えば、その側鎖の化学的性質に従って、次の9群に分類することができる(以下、アミノ酸は一文字表記による)：(1)中性疎水性側鎖(A,F,L,M,P,V,W);(2)中性極性側鎖(C,G,N,Q,S,T,Y);(3)塩基性側鎖(H,K,R);(4)酸性側鎖(D,E);(5)脂肪族側鎖(A,G,I,L,V);(6)脂肪族水酸基側鎖(S,T);(7)アミン含有側鎖(H,K,N,Q,R);(8)芳香族側鎖(F,W,Y);(9)硫黄含有側鎖(C,M)。その他、天然型CAR中の1以上のアミノ酸残基をグリコシル化またはリン酸化等により修飾した蛋白質、及び、化学的または酵素的手法により脱グリコシル化または脱リン酸化により改変した蛋白質も、本発明の改変されたCAR及び改変されたCARポリペプチドに含まれる。このような改変されたCARもまた、本発明においてCAR及びCARポリペプチドとして利用され得る。このような蛋白質の改変及び修飾は、CAR及びCARポリペプチドの安定性及び生物学的活性を上げることを目的として行うことが考えられる。改変または修飾された蛋白質の活性が維持されているかどうかは、例えば、CARLとの結合活性を測定することにより確認することができる。ここで、生物学的活性の維持とは、必ずしも、天然型CARと同等な活性レベルを意味するわけではなく、元の活性より高い活性が得られても、場合によってはより低い活性となってもよい。【００３０】
本発明において用いるCAR及びCARポリペプチドは、天然より上述のようにして単離する他、組換え蛋白質として製造することもできる。「組換えCAR」及び「組換えCARポリペプチド」は、検出を容易にするためのマーカー蛋白質、例えばアルカリフォスファターゼ（SEAP）、β-ガラクトシダーゼ等の酵素、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合蛋白質等の結合蛋白質、抗体のFc領域、緑色蛍光蛋白質等の蛍光蛋白質との融合蛋白質として発現させて製造してもよい。特に好ましい融合蛋白質として、天然型CARの細胞外ドメインにマーカー蛋白質を結合したものを挙げることができる。このような融合蛋白質を含む組換え蛋白質は、例えば、in vitro系及び宿主-ベクター系を含む適当な発現系を利用して産生することができる。【００３１】
一般的には、最初に適当な転写及び翻訳制御領域と、該制御領域に作動可能に連結された目的とする蛋白質をコードする配列とからなるキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築する。転写及び翻訳制御領域は、選択した宿主において認識され、蛋白質コード配列の発現に必要とされるDNA配列を含む。このようなDNA配列には、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、オペレーター配列、リボソーム結合部位、開始シグナル、ターミネーター等が含まれる。真核細胞を宿主とする場合、発現ベクターは、好ましくは、プロモーター/エンハンサーエレメントを含む。「作動可能に」連結または結合とは、制御領域下流に結合された蛋白質コード配列が、読み枠がずれたりすることなく、該制御領域の制御により転写され、宿主中または細胞外へ発現されることを意味する。組換えCARポリペプチドのための、適当な発現ベクターとしては、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞及び細菌細胞における発現用の公知のものを使用できる。市販の発現ベクターを用いてもよい。【００３２】
次の工程では、構築した発現ベクターにより宿主細胞を形質転換する。既に多くの細胞株が宿主細胞株として確立されており、それらの宿主細胞株に適した形質転換法も種々確立されている。組換えCARポリペプチドの製造に当たっては、これら公知のいずれの宿主細胞株を用いてもよく、当業者であれば選択した宿主に適した導入法を適宜採用して効率良く形質転換を行うことができる。例えば、これらの方法に限定されるわけではないが、原核細胞の形質転換はカルシウム処理、エレクトロポーレーション等により行うことができ、植物細胞についてはアグロバクテリウムを用いた方法、リーフディスク法等が知られており、哺乳動物細胞についてはリン酸カルシウム沈降法を例示できる。その他、核マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、DEAE-デキストラン法、細胞融合、電気パルス穿孔法、リポフェクタミン法(GIBCO BRL)、FuGENE6試薬(Boehringer-Mannheim)を使用する方法等も知られている。哺乳動物細胞の形質転換の詳細については、Keown et al.(1990)Methods in Enzymol.185:527-537及びMansour et al. (1988)Nature 336:348-352等の文献を参照することができる。天然型のグリコシル化が必要な場合、哺乳動物細胞を宿主として選択することが好ましい。哺乳動物細胞としては、A431、BHK、CHO、COS、CV-1、Hela、HL-60、Jurkat、205、293細胞を含む多数の細胞が知られており、組換えCARポリペプチドの製造に使用することができる。【００３３】
次の工程では、形質転換された細胞を培養し、目的とする蛋白質を発現させる。宿主細胞の培養は、選択した細胞に適した公知の方法により行う。例えば、哺乳動物細胞を宿主とする場合、Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)(Virology8:396 (1959))、minimal essential medium（MEM）(Science122:501(1952))、RPMI1640(J.Am.Med.Assoc. 199:519(1967))、199(Proc.Soc.Biol.Med.73:1(1950))、Iscove's Modified Dulbecco's Medium （IMDM）等の培地を用い、必要に応じ、ウシ胎児血清(FCS)等の血清を添加し、pH約6〜8、30〜40℃において15〜200時間前後の培養を行う。途中、必要に応じ培地の交換を行ったり、通気及び攪拌を行ったりしてもよい。組換え蛋白質は、選択した宿主細胞において認識される分泌シグナルを蛋白質に付加しておくことにより、細胞外へと分泌させることができる。発現された組換え蛋白質は、宿主細胞、または分泌させた場合には培養液より取得することができる。【００３４】
また、必要に応じ、トランスジェニック動物（Susumu(1985)Nature315:592-594;Lubon (1998)Biotechnol.Annu.Rev.4: 1-54等参照）、トランスジェニック植物等を作成し、それらにより組換えCARポリペプチドを産生させることも可能である。トランスジェニック動物による蛋白質生産を行う場合、組織特異的発現を実現するプロモーターを利用して、蛋白質を組織特異的(例えば、乳汁中)に発現させることが望ましい。【００３５】
本発明において使用するCARポリペプチドは、精製された蛋白質であってもよい。例えば、組換え技術により発現された蛋白質を慣用の蛋白質精製手段に従って精製することができる。アフィニティー、イオン交換、ゲル濾過、逆相、吸着及び疎水性相互作用等のクロマトグラフィー、エタノール沈澱、再結晶、蒸留、電気泳動、透析、免疫沈降、溶媒抽出、及び硫酸アンモニウム沈澱等の手法が蛋白質の精製法として公知であり（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual,MArshak et al. ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)）、CARポリペプチドの精製に利用することができる。本発明において利用されるCARポリペプチドは、このような公知の手段により精製された精製CARポリペプチド、または、場合により、部分的に精製された蛋白質であってもよい。また、例えば、CARポリペプチドをGSTとの融合蛋白質として発現させた場合には、グルタチオンカラムを用いた精製法が有効である。一方、ヒスチジンタグをCARポリペプチドに付加して発現させた場合には、ニッケルカラムを用いた精製法が利用できる。CARポリペプチドをこのような融合蛋白質として製造した場合には、必要に応じて精製後にトロンビンまたはファクターXa等の酵素を使用して、不要な部分を切断することもできる。【００３６】
本発明のTh1細胞の検出において使用されるCARポリペプチドは、担体に結合させた状態で用いることもできる。固定する担体は、CARポリペプチド及び細胞に対して無害なものである必要がある。例えば、合成または天然の有機高分子化合物、ガラス、ポリスチレン等の有機高分子材料、シリカゲル、アルミナ、活性炭等の無機材料、及びこれらの表面に多糖類、合成高分子等をコーティングしたものが考えられる。担体の形状には特に制限はなく、細胞のポリペプチドに対する接触を妨げないものであればよい。例えば、膜状、繊維状、顆粒状、中空糸状、不織布状、多孔形状、ハニカム形状等のものが挙げられる。例えば、プレート、シャーレ、試験管等の反応容器の内壁、ビーズ等にポリペプチドを結合することができる。使用する担体の厚さ、表面積、太さ、長さ、形状、大きさを種々変えることにより、ポリペプチドと細胞試料との接触面積を制御することができる。【００３７】
本発明のTh1細胞の検出は、「リンパ球を含む細胞試料」から公知の方法により、リンパ球、好ましくはT細胞、さらに好ましくはヘルパーT細胞を分離した後に行うか、あるいは「リンパ球を含む細胞試料」から、リンパ球、好ましくはT細胞、さらに好ましくはヘルパーT細胞のマーカー、例えばCD4を共発現する細胞として検出することが好ましい。
本発明のTh1細胞検出方法としては、CARポリペプチドをマーカー蛋白質との融合蛋白質として発現させた場合は、採用したマーカー蛋白質に対応した方法、例えばアルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ等の酵素であれば酵素活性により検出し、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、マルトース結合蛋白質等の結合蛋白質であればそれぞれ結合するグルタチオン、マルトースの結合活性により検出し、抗体のFc領域であればFc結合蛋白との結合により、緑色蛍光蛋白質等の蛍光蛋白質であれば蛍光により検出する。【００３８】
また、マーカー蛋白質との融合蛋白として発現させなかった場合は、Th1細胞と結合したCARポリペプチドを、CARに対する抗体を用いて検出することができる。抗CAR抗体を用いて検出を行う場合、用いる抗体は、Th1細胞上のCARLと結合している以外のCARポリペプチドの部分を認識するものでなければならない。抗CAR抗体は、次の「抗CARL抗体を用いたTh1細胞検出方法」の項における、抗CARL抗体と同様に、一般的な手法により製造することができる。抗体製造の具体例として、実施例5の方法が例示される。その他、適当な抗体により検出可能なように、CARポリペプチドを抗体により認識される別のポリペプチドとの融合蛋白質として設計してもよい（実施例3及び4参照）。市販のエピトープ-抗体系を活用することもできる(Experimental Medicine 13:85-90(1995))。β-ガラクトシダーゼ、マルトース結合蛋白質、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、緑色蛍光蛋白質(GFP)等との融合蛋白質として製造して、二次抗体を用いることなく検出できるようにしてもよい。その他、ポリヒスチジン、インフルエンザ凝集素HA、ヒトc-myc、FLAG、T7等の小さなエピトープ-抗体系も公知であり、これらのタグをCARポリペプチドに付加し、それらに対する市販の抗体を用いてCARポリペプチドを検出することもできる。その他、CARポリペプチドを放射性標識することによりシンチレーションカウンターを用いて検出できるようにすることも可能である。また、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサー(例えば、BIAcore X (BIAcore))を使用して、CARポリペプチドとTh1細胞との相互作用を、ポリペプチドを標識することなく、リアルタイムに観察することもできる。【００３９】
さらに、例えば、担体として磁性粒子を用い、CARポリペプチド及び該ポリペプチドに結合したCARLを発現している細胞を、磁石を利用して検出・回収することもできる。このような回収のための磁石装置も開発されており、利用可能である(例えば、MACS(第一化学))。また、セルソーター(FACS)、及び蛍光(例えば、フルオレシンイソチオシアネート(FITC)、フィコエリスリン)等により標識したCARポリペプチドを使用してフローサイトメトリーによりCARLを発現するTh1細胞を選別することもできる。【００４０】
抗CARL抗体を用いたTh1細胞検出方法
本発明者らにより、CARのTh1上のリガンドとしてCARLが同定された。そこで、本発明は、抗CARL抗体を用いたTh1細胞の検出方法に関する。具体的には、(a)リンパ球を含む細胞試料を抗CARL抗体と接触させる工程、及び(b)工程(a)において抗CARL抗体と結合した細胞を検出する工程により、Th1細胞を検出することができる。【００４１】
本方法おける「リンパ球を含む細胞試料」は、上記「CARを用いたTh1細胞検出方法」の項の場合と同様に、特に限定されず、リンパ球を含むことが期待される骨髄、末梢血等の血液細胞試料を用いることができる。
また、抗体と細胞試料との接触も、上記CARポリペプチドの場合と同様にして適当な反応溶液中で行うことができる。【００４２】
ここで、「CARL」及び「CARLポリペプチド」は、図7に記載のアミノ酸配列(配列番号:1;GenBank Accession No. AAH50133)を有する379残基からなるIgSFに属するマウス蛋白質、並びに、そのアレル変異体、スプライシングバリアント、及び、該蛋白質に対応するマウス以外の哺乳動物由来の蛋白質のような、天然型CARLを含む。さらに、「CARL」及び「CARLポリペプチド」は、上述の天然型CARLに加えて、該CARLと同等の機能を示す非天然型のポリペプチドを含む。例えば、「CARL」及び「CARLポリペプチド」は、天然型CARLから改変されたアミノ酸配列を有する蛋白質（改変型CARL）、及び組換え蛋白質として製造されたCARL（組換えCARL）などを含む。本明細書において、「CARL」及び「CARLポリペプチド」は互換的に使用される。【００４３】
配列番号:1のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするcDNA配列は、GenBank Accession No.BC050133(配列番号:3)として登録されている。また、その変異体として、BC050133の最初の11アミノ酸の代わりに37アミノ酸が挿入され、231番目のアルギニンがグルタミンとなったマウス蛋白質（GenBank Accession No.XM_194453）も公知である。該マウス蛋白質に対応するヒト蛋白質として、GenBank Accession No.AY138965(配列番号:4)のcDNA配列によりコードされるヒトAMICA蛋白質(GenBank Accession No.AAN52117;配列番号:2)を挙げることができる。CARLは、SignalIPプログラムにより推定されたシグナル配列（図7中下線部）及びSMARTプログラムにより推定された膜貫通領域(図7中点下線)を有する。さらに、ScanPrositeプログラムにより、図7中四角で囲われたアスパラギン残基が糖鎖修飾を受けることが推定された。また、図7中アステリスク(*)をつけたシステイン残基はジスルフィド結合を形成すると推定された。CARLは、リンパ球においてはTh1細胞で選択的に発現し、CARLの発現に依存してCARはリンパ球においてはTh1と選択的に結合することが本発明において示された。一般に、共通の生物活性を示す蛋白質はそのアミノ酸配列においても、また該蛋白質をコードする遺伝子レベルにおいても、進化の過程で保存されていることが知られているので、本発明における「天然型CARL」及び「天然型CARLポリペプチド」の由来となるマウス及びヒト以外の哺乳動物としては、例えば、ラット、ウサギ、イヌ、ウマ、ネコ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、及びサル、ゴリラ、チンパンジー等の霊長類を挙げることができる。アレル変異体、及び、これらの哺乳動物由来の蛋白質は、例えば、上記CARLの公知塩基配列またはアミノ酸配列を元に作製したプローブまたはプライマーを利用してハイブリダイゼーション、PCR等の公知の技術を応用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリー等から該アレル変異体または蛋白質をコードするcDNAまたは遺伝子を取得し、該遺伝子を発現させることにより得ることができる。また、公知のアミノ酸配列を元に、慣用の蛋白質合成法（例えば、化学合成法、細胞培養法等）によりCARLを調製することも可能である。【００４４】
本発明における「CARL」及び「CARLポリペプチド」とは、当該動物のCARポリペプチド、マウスであればNP_034118の番号でGenBankに登録される塩基配列によりコードされるペプチドと結合する、ヒトであればNM 001338の番号でGenBankに登録される塩基配列によりコードされるペプチドと結合する、以下の蛋白質を指す。
(1)配列番号:1(マウスCARL)のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(2)上記(1)のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(3)配列番号:2(ヒトCARL)のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(4)上記(2)のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(5)前記(1)〜(4)のアミノ酸配列中のIg様ドメイン１を含む蛋白質、
(6)配列番号:3(マウスcDNA)または配列番号:4(ヒトcDNA)のcDNA配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、
(7)上記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質、
(8)前記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質、および
(9)上記(1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含む蛋白質。
配列番号:1及び2に記載のCARLと同等の生物活性を示すCARLをコードする遺伝子のハイブリダイゼーションによる取得は、上記「CARを用いたTh1細胞検出方法」の項の、CARポリペプチドを取得する際のハイブリダイゼーション条件の説明を参照して行うことができ、配列番号:1及び2に記載のCARLと同等の生物活性を示す1または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列の取得は、上記「CARを用いたTh1細胞検出方法」の項の、CARポリペプチドを取得する際のアミノ酸残基を欠失・付加・置換または挿入する方法の説明を参照して行うことができる。【００４５】
本発明のTh1細胞の検出において用いられる抗CARL抗体は、Th1細胞上のCARLに対して結合できるものであればよく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体(scFV)(Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883;The Pharmacology of Monoclonal Antibody,Vol.113,Rosenburg and Moore ed.,Springer Verlag(1994)p.269-315)、ヒト化抗体、多特異性抗体(LeDoussal et al.(1992)Int.J.Cancer Suppl.7:58-62;Paulus (1985) Behring Inst.Mitt.78:118-132;Millstein and Cuello(1983)Nature305:537-539;Zimmermann(1986)Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.105: 176-260;Van Dijk et al.(1989) Int.J.Cancer43:944-949)、並びに、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv等の抗原結合部位を含む抗体断片が含まれる。さらに、抗CARL抗体は必要に応じ、PEG等により修飾されていてもよい。その他、該抗体は、β-ガラクトシダーゼ、マルトース結合蛋白質、GST、緑色蛍光蛋白質(GFP)等との融合蛋白質として製造して、二次抗体を用いることなく検出できるようにしてもよい。また、ビオチン等により抗体を標識することによりアビジン、ストレプトアビジン等を用いて抗体の回収を行えるようにすることもできる。【００４６】
抗CARL抗体は、CARL若しくはその断片、またはそれらいずれかを発現する細胞を感作抗原として用いることにより製造することができる。CARL断片を抗原として使用する場合には、CARLの細胞外領域を用いることが好ましい。必要に応じ（例えば、使用する抗原断片が短い場合）、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、卵白アルブミン等の担体に結合して免疫原としてもよい。また、抗原に対する免疫応答を強化するため、必要に応じ、アルミニウムアジュバント、完全または不完全フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント等の公知のアジュバントを使用することもできる。【００４７】
CARLに対するポリクローナル抗体は、例えば、CARLまたはその断片を、必要に応じアジュバントと共に哺乳動物に免疫し、該動物より血清として得ることができる。ここで免疫する哺乳動物としては、一般的には、特にこれらに限定されるわけではないが、ゲッ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。例えば、マウス、ラット、ハムスター等のゲッ歯目、ウサギ等のウサギ目、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等のサルを含む霊長目の動物が挙げられる。動物の免疫化は、感作抗原をPBSまたは生理食塩水で適宜希釈及び懸濁し、必要に応じさらにアジュバントを混合して乳化した後、動物の腹腔内、皮下または足蹠に注射することにより行う。その後、好ましくは、フロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を4〜21日毎に数回投与する。抗体の産生は、免疫化した動物の血清中の抗体レベルを測定することにより確認することができる。得られた抗体を含む血清は、さらに必要に応じ精製してもよい。【００４８】
一方、モノクローナル抗体は以下の手順により製造することができる。まず、上述の方法に従って免疫化した動物より脾臓を摘出し、該脾臓より免疫細胞を分離してから適当なミエローマ細胞とポリエチレングリコール等を用いて融合し、ハイブリドーマを作製する。細胞の融合については、Galfre and Milstein(1981)Methods Enzymol.73:3-46等の文献を参照することができる。ここで、特に適当なミエローマ細胞として、融合細胞の薬剤による選択を可能にする細胞が挙げられる。このような薬剤選択を可能にするミエローマを用いた場合、融合細胞以外を死滅させるような培養液(HAT培養液等)中で細胞の培養を行い、融合細胞を選択的に回収する。次に、作成されたハイブリドーマの中から、CARに対して結合する抗体を産生するクローンを選択する。選択したクローンをマウス等の腹腔内に移植し、該動物の腹水を回収することによりモノクローナル抗体を得ることができる。【００４９】
ハイブリドーマはまた、最初にEBウィルスに感染させたヒトリンパ球をin vitroで免疫原を用いて感作し、感作リンパ球をヒト由来のミエローマ細胞(U266等)と融合し、ヒト抗体を産生するハイブリドーマを得る方法(特開昭63-17688号公報)によっても得ることができる。また、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物を感作して製造した抗体産生細胞を用いて、ヒト抗体を得ることもできる（WO92/03918; WO93/02227;WO94/02602;WO94/25585;WO96/33735;WO96/34096;Mendez et al.(1997)Nat. Genet.15:146-156等）。ハイブリドーマを用いない方法としては、抗体を産生するリンパ球等の免疫細胞を癌遺伝子の導入により不死化して抗体を産生させる方法が例示される。【００５０】
本発明は、ヒトモノクローナル抗体も含む。当該モノクローナル抗体は、ヒト抗体産生トランスジェニックマウスのようなヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に、CARL若しくはその断片、またはそれらいずれかを発現する細胞等の免疫原（抗原）を免疫し、モノクローナル抗体の既存の一般的な製造方法に従って製造することができる。
即ち、例えば、該抗原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、該ヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫する。ポリクローナル抗体は、該免疫感作動物から得た血清から取得することができる。またモノクローナル抗体は、該免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）から融合細胞（ハイブリドーマ）を調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。【００５１】
さらに具体的には下記のようにして製造することができる。即ち、所望の免疫原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、該ヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物（特に好ましくは後述の「ヒト抗体産生トランスジェニックマウス」）の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１乃至数回注射するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１乃至１４日毎に１乃至４回免疫を行って、最終免疫より約１乃至５日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。免疫を施す回数及び時間的インターバルは、使用する免疫原の性質などにより、適宜変更することができる。【００５２】
ヒトモノクローナル抗体を分泌する融合細胞（ハイブリドーマ）の調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Nature, Vol.256, p.495-497, 1975）及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作されたヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合させることにより調製される。【００５３】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8.653（ATCC No. CRL-1580）、P3/NSI/1-Ag4-1（NS-1）、P3/X63-Ag8.U1（P3U1）、SP2/0-Ag14（Sp2/O,Sp2）、NS0、PAI、F0あるいはBW5147、ラット由来ミエローマ210RCY3-Ag.2.3.、ヒト由来ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11あるいはCEM-T15を使用することができる。モノクローナル抗体を産生する細胞（例えば、ハイブリドーマ）のスクリーニングは、該細胞を、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の前述の免疫感作で用いた免疫抗原に対する反応性を、例えばRIA（radio immunoassay）やELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、またはマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。
【００５４】
また、本発明のモノクローナル抗体は、下記のような方法により大量に製造することができる。
（1）該ハイブリドーマから該モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードする遺伝子（cDNAなど）クローニングする。
（2）クローニングされた重鎖及び軽鎖の各々をコードする遺伝子を、各々別々または単一のベクターに挿入することにより発現ベクターを調製する。
（3）該ベクターを所望の非ヒト哺乳動物（ヤギなど）の受精卵に導入する。
（4）遺伝子導入した受精卵を仮親（Foster mother）の子宮に移植し、キメラ非ヒト動物を得る。
（5）該キメラヤギを別の非ヒト哺乳動物とさらに交配することにより該重鎖及び軽鎖の各々をコードする遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックな非ヒト哺乳動物（ウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタなど）を作製する。
（6）該トランスジェニック非ヒト哺乳動物のミルク中から当該ヒトモノクローナル抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得する（日経サイエンス、1997年４月号、第７８頁乃至８４頁）。【００５５】
この方法により作製されるヒトモノクローナル抗体も本願発明に包含される。該モノクローナル抗体産生細胞をインビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。【００５６】
基本培地としては、例えば、Ham'F12培地、MCDB153培地あるいは低カルシウムMEM培地等の低カルシウム培地及びMCDB104培地、MEM培地、D-MEM培地、RPMI1640培地、ASF104培地あるいはRD培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／または種々無機あるいは有機物質等を含有することができる。【００５７】
モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（DEAEまたはDE52等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。【００５８】
本発明のヒトモノクローナル抗体には、該抗体を構成する重鎖及び／または軽鎖の各々のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び／または軽鎖からなるヒトモノクローナル抗体も包含される。【００５９】
抗CARL抗体には、さらに上述したように抗体断片が含まれる。抗体断片は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体をパパイン、ペプシン等の酵素で処理することにより製造し得る。または、抗体断片をコードする遺伝子を用いて、遺伝子工学的に製造することも可能である(Co et al.(1994)J.Immunol.152:2968-2976;Better and Horwitz(1989) Methods Enzymol.178:476-496;Pluckthun and Skerra(1989)Methods Enzymol.178: 497-515;Lamoyi(1986)Methods Enzymol.121:652-663;Rousseaux et al.(1986)121: 663-669;Bird and Walker(1991)Trends Biotechnol.9:132-137参照)。【００６０】
抗CARL抗体に含まれる多特異性抗体には、二特異性抗体(BsAb)、ダイアボディ(Db)等が含まれる。多特異性抗体は：(1)異なる特異性の抗体を異種二機能性リンカーにより化学的にカップリングする方法(Paulus(1985)Behring Inst.Mill.78:118-132)；(2)異なるモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを融合して、該ハイブリドーマよりBsAbを産生させる方法(Millstein and Cuello(1983)Nature305:537-539)；(3)異なるモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子(全部で4種類のDNA)によりマウス骨髄腫細胞等の真核細胞発現系をトランスフェクションした後、二特異性の一価部分を単離する方法(Zimmermann(1986)Rev.Physio.Biochem.Pharmacol.105:176-260;Van Dijk et al.(1989) Int.J.Cancer43:944-949)等により作成することができる。一方、Dbは遺伝子融合により構築され得る二価の2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーの抗体断片であり、公知の手法により作製することができる（Holliger et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448;EP404097;WO93/11161参照）。【００６１】
抗体及び抗体断片の回収及び精製は、プロテインAまたはGを用いて行う他、一般的なその他の蛋白質の精製と同様の方法によっても行うことができる(Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow and David Lane ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988))。例えば、本発明の抗体の精製にプロテインAを利用する場合、Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia)等の公知のプロテインAカラムを使用することができる。得られた抗体の濃度は、試料の吸光度、または、試料中の抗体の抗原結合活性を測定することにより決定することができる。【００６２】
抗体の抗原結合活性は、吸光度測定、蛍光抗体法、酵素免疫測定法(EIA)、放射免疫測定法(RIA)、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)等により測定することができる。ELISAによる測定を行う場合、蛋白質(CAR若しくはCARL、またはその一部)を固相化し、目的とする抗体を含む試料を添加する。ここで、抗体を含む試料としては、抗体産生細胞の培養上清、精製抗体等が考えられる。続いて、抗CARL抗体を認識する二次抗体を添加した後、プレートをインキュベートする。その後、プレートを洗浄し、二次抗体に付加された標識を検出する。即ち、二次抗体が、例えばアルカリフォスファターゼで標識されている場合には、p-ニトロフェニルリン酸等の酵素基質を添加して吸光度を測定することで、抗原結合活性を測定することができる。また、抗体の活性評価に、BIAcore(Amersham Pharmacia)等の市販の系を利用することもできる。【００６３】
本発明の抗CARL抗体を用いたTh1細胞の検出は、「リンパ球を含む細胞試料」から公知の方法により、リンパ球、好ましくはT細胞、さらに好ましくはヘルパーT細胞を分離した後に行うか、あるいは「リンパ球を含む細胞試料」から、リンパ球、好ましくはT細胞、さらに好ましくはヘルパーT細胞のマーカー、例えばCD4を共発現する細胞として検出することが好ましい。
また本発明の抗CARL抗体を用いたTh1細胞の検出方法においては、細胞との接触前に、抗体を適当な担体に固定化してもよい。または、CARLを発現する細胞と抗CARL抗体とが結合する条件下で細胞試料と抗体とを接触させた後、抗体のアフィニティーによる精製を行うことにより、抗体に結合した細胞を選択的に検出・回収することもできる。例えば、抗CARL抗体をビオチンと結合しておけば、アビジンまたはストレプトアビジンを結合したプレート、カラム等に対して接触させることで抗体及び細胞の複合体を精製することができる。また、抗CARL抗体は、上述のCARの固定において例示したいずれの担体に固定して用いてもよい。【００６４】
より具体的に抗CARL抗体を用いてTh1細胞を検出する方法として、蛍光抗体法(Monoclonal Antibodies:Principle and Practice, 3rd ed., Academic Press(1996)参照)、ELISA、RIA、免疫組織染色法及び免疫細胞染色法を含む免疫組織化学染色法(例えば、ABC法、CSA法; Monoclonal Antibodies:Principle and Practice, 3rd ed., Academic Press(1996)参照)、ウエスタンブロット、免疫沈降法等がある。ELISAにおいては、抗体を容易に検出することができる物質を基質とするか、または検出可能な生成物を生じる酵素(例えば、ペルオキシダーゼ)により標識し、基質を作用させ、基質または生成物の濃度を吸光度計等により測定する。ELISAの一つとして、サンドイッチELISAも知られている。この方法では、異なる抗原部位に結合する2種類の抗体を使用し、一方の抗体のみを酵素等により標識して分析を行う。RIAでは、抗体に放射線標識を施す。標識した抗体は、シンチレーションカウンター等を用いて検出することができる。免疫組織化学染色法では、抗体を標識し、組織または細胞と反応させた後、顕微鏡を用いて標識を検出する。標識としては蛍光物質、色素を生じる反応を触媒する酵素を用いる。免疫沈降法では、抗体と細胞試料とを反応させた後、免疫グロブリンに特異的に結合する担体(プロテインG-セファロース等)を反応液に添加し、細胞と抗体の複合体を沈降させる。【００６５】
また、CARポリペプチドを用いる場合と同様に、抗CARL抗体の検出を行うことによりTh1細胞を検出することができる。例えば、セルソーター及び蛍光等により標識した抗CARL抗体を使用してフローサイトメトリーにより、または、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いてCARLを発現するTh1細胞を選別することもできる。フローサイトメトリー及び磁石を担体とする方法は、特に簡便な手法であり、本発明のTh1細胞の検出に当たって好ましいものである。【００６６】
Th1細胞検出用キット
上述のCARポリペプチド及び抗CARL抗体は、Th1細胞を検出するためのキットに含ませることもできる。そこで、本発明は、CARポリペプチドまたは抗CARL抗体を含むTh1細胞を検出するためのキットに関連する。CARポリペプチド及び抗CARL抗体は、担体に固定された形でキットに含むようにすることもできる。【００６７】
本発明のキットには、CARポリペプチドまたは抗CARL抗体に加えて、その他Th1細胞の検出に必要とされる材料を組合せることができる。例えば、ポリペプチド及び抗体の検出に必要とされる試薬、容器、装置等を本発明のキットに含めることができる。キット中に含まれるCARポリペプチドまたは抗CARL抗体、及びその他の必要とされる材料は、個別に梱包されても、一つにまとめて梱包されても、または、場合により一部のみを一緒にまとめて梱包してもよく、そのパッケージの形体は何等限定されない。【００６８】
検出に必要とされる材料としては、ポリペプチド、抗体または細胞試料を希釈するための緩衝液等を挙げることができる。その他、ポリペプチドの検出のため、例えば、抗CAR抗体をキット中に含めてもよい。その他、抗体を検出するための2次抗体、抗体が酵素標識されている場合には、該酵素が触媒する反応の基質等を含めることができる。その他、ポリペプチドまたは抗体が磁性粒子に結合されている場合には、磁石等をキット中に入れることもできる。本発明のTh1細胞を検出するためのキットには、好ましくは、キットに含まれるCARポリペプチドまたは抗CARL抗体を用いて検出を行う手順を詳述した説明書が添付される。説明書は、パンフレットの形でキット中に含める他、キットのパッケージ上等に印刷することもできる。【００６９】
Th1細胞とTh2細胞の比率を検査する方法
上記、CARまたは抗CARL抗体を用いたTh1細胞の検出方法、及びTh1細胞検出用のキットは、生体試料中のTh1細胞とTh2細胞の比率の検査に利用することができる。そこで、本発明はまた、Th1細胞とTh2細胞の比率を検査する方法に関する。具体的には、リンパ球を含む細胞試料からヘルパーT細胞を特異的に検出し（例えば、CD4をマーカーとして）、さらに、上述のCARまたは抗CARL抗体を用いたTh1細胞の検出方法により、Th1細胞を検出することができる。このようにして検査された細胞試料におけるTh1細胞とTh2細胞との比率により、Th1またはTh2細胞の選択的不均衡が関与する疾患の診断に利用することができる。例えば、臓器特異的な自己免疫疾患ではTh1が、一方、癌、アレルギー、寄生虫感染等ではTh2応答が支配的であると考えられており、これらの疾患を本発明のTh1細胞とTh2細胞の比率を検査する方法により診断することができる。【００７０】
本発明のTh1細胞とTh2細胞の比率を検査する方法により診断させる特に好ましい疾患としてアトピー性疾患を挙げることができる。そこで、本発明は、本発明のTh1細胞とTh2細胞との比率を検査する方法により決定されたTh1とTh2細胞の比率に基づき、被験者をアトピー性疾患について診断する方法に関する。本方法により診断されるアトピー性疾患には、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎が含まれる。
こららアトピー性疾患ではTh1細胞よりTh2細胞が優位となっていることが知られており（Okazaki H. et al.(2002) Clin Exp Allergy. 32(8):1236-1242；およびKim J.H. et al. (2004) J Asthma. 41(8):869-876）、Th1細胞とTh2細胞の比率を検査することにより、アトピー性皮膚炎を診断することが可能となる。【００７１】
CAR-CARL結合阻害剤スクリーニング方法
本発明によりさらに、CARとCARLとの結合の阻害剤（CAR-CARL結合阻害剤）をスクリーニングする方法が提供される。具体的には、(a)被験物質存在下でCAR及びCARLを接触させる工程；(b)工程(a)におけるCAR及びCARLの結合を検出する工程；(c)検出されたCAR及びCARLの結合程度を、被験物質不在下の場合と比べる工程；並びに、(d)被験物質不在下の場合と比べ、CAR及びCARLの結合を抑制する被験物質を、CARとCARLとの結合の阻害剤として選択する工程により、CAR-CARL結合阻害剤のスクリーニングを行う。【００７２】
CARとCARLとの結合の阻害剤は、特に特定の種類の物質に限定されない。そこで、本発明のスクリーニング方法において使用する被験物質はどのような物質であってもよい。例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、合成ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞(微生物、植物細胞、動物細胞)の抽出液及び培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。本方法によりスクリーニングされた阻害剤は、CARとCARLの間の結合を阻害し、ひいてはCARを発現する上皮細胞及び内皮細胞と、CARLを発現する活性Th1細胞の接着を阻害するものである。従って、このような阻害剤は、リウマチ等のTh1細胞の働きが一因となっている疾患においてTh1細胞の接着を抑制し、病態を緩和するものと期待される。そこで、本スクリーニングにより得られる阻害剤は、Th1細胞が一因となる疾患の治療または予防薬候補となり得る。【００７３】
ここで用いる、CAR及びCARポリペプチドは、上記「CARを用いたTh1細胞検出方法」の項において説明したものを使用する。天然型CARに加え、CARLとの結合能を維持した断片、改変体、修飾体等を用いることができる。CAR及びCARポリペプチドは、検出を容易にするためのマーカー蛋白質、例えばアルカリフォスファターゼ（SEAP）、β-ガラクトシダーゼ等の酵素、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合蛋白質等の結合蛋白質、抗体のFc領域、緑色蛍光蛋白質等の蛍光蛋白質との融合蛋白質として発現させて製造してもよい。
一方、本発明において使用される「CARL」及び「CARLポリペプチド」とは、CAR及びCARポリペプチドと同様に、上記「抗CARL抗体を用いたTh1細胞検出方法」の項において説明したように、天然型CARLに加えて、天然型CARLから改変されたアミノ酸配列を有する蛋白質が含まれる。本方法において用いられるCARLポリペプチドは、CAR-CARL結合阻害剤のスクリーニングに使用することができるよう、CARに対する結合能を保持していればよく、好ましくは、CARLの細胞外ドメインを含む蛋白質である。さらに、CARLと同等に機能を示すポリペプチドとしては、天然型CARLのCARとの結合に必要なドメイン、特にドメイン１を含むポリペプチド、及び天然型CARLと特にその活性中心において高いアミノ酸配列相同性を示す蛋白質を挙げることができる。ここでドメイン１は、Ig様のドメインとの相同性から推察されるドメインで、例えば配列番号:１では30番目から139番目のアミノ酸配列からなる領域であり、配列番号:２では27番目から136番目のアミノ酸配列からなる領域である。蛋白質のドメインの予測はドメイン検索サイト、例えばhttp://smart.embl-heidelberg.de/から可能である。CARと結合するマウスCARLに対応するヒトAMICAは、全体のアミノ酸配列では37.4％の相同性があった。そこで、本発明において高いアミノ酸配列相同性とは、例えば、30、35、40、または50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上（例えば、80、90または95％以上）の同一性を意味する。【００７４】
最初の工程(a)において、互いに結合するCARとCARLとを被験物質存在下で接触させるが、この接触は、通常、CAR及び被験物質を含む反応溶液中にCARLを添加するか、逆に、CARL及び被験物質を含む反応溶液中にCARを添加して行う。この時使用する反応溶液は、CARとCARLの反応を阻害しないものであればよく、特に限定されない。また接触の時間も特に限定されず、CARとCARLが結合するのに十分な時間、例えば、1分、2分、3分または5分以上接触させることができる。CAR及びCARL細胞外領域との親和性を調べた実施例11を参考に、これらの接触条件は適宜決めることができる。【００７５】
ここで、CARまたはCARLのどちらか一方を担体上に結合してスクリーニングを行ってもよい。担体は、上記の「CARを用いたTh1細胞検出方法」において例示される各種担体を使用することができる。ポリペプチドの一方を担体上に固定した場合には、例えば、次のようにして阻害剤のスクリーニングを行う。まず、被験化合物存在下においてCAR及びCARLを接触させる。この際、例示としてCARを固定すると想定する。接触後、担体の洗浄を十分に行い、CARに結合されていないCARLを洗い流す。次に、CARに結合されたCARLの検出を行う。CARLの検出は、CARLに対する抗体を用いて行うことができる。または、標識されたCARLを使用する場合には、該標識を適宜検出してもよい。【００７６】
また、CARまたはCARLの一方を発現している細胞を、それぞれ本発明におけるCARまたはCARLとして用いてもよい。このような細胞は、CARまたはCARLをコードする遺伝子を適当な宿主細胞に導入し、細胞膜上に発現させたものであってもよい。【００７７】
さらに、CAR-CARL結合阻害剤のスクリーニングは、ツーハイブリッド法によって行うこともできる(Dalton and Treisman(1992)Cell68:597-612;Fields and Sternglanz(1994) Trends Genet.10:286-292)。例えば、Clontech社製のMATCHMAKER Two-Hybrid system、Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit及びMATCHMAKER One-Hybrid system、Stratagene社製のHybiZAP Two-Hybrid Vector System等の市販の系を利用したスクリーニングが可能である。ツーハイブリッド法は、サッカロマイセス属酵母の転写アクチベーターGAL4を用いて、2種類の蛋白質間の相互作用をin vivoで検出する方法である。GAL4は、DNA結合ドメイン及び転写活性ドメインを有し、酵母のGAL上流活性化配列UASGに結合し転写を活性化する。そこで、CARまたはCARLの一方をDNA結合ドメイン、そして他方を転写活性ドメインとの融合蛋白質としてコードする発現ベクターを作成する。また、活性化配列UASGを含むプロモーターに作動可能に連結したレポーター遺伝子の発現ベクターを作成し、前記2つの融合蛋白質の発現ベクター共に、宿主細胞に導入する。すると、2つの融合蛋白質中のCARとCARL部分が結合することにより、レポーター遺伝子が発現し、その発現を元にCARとCARLが結合したかどうかを判定することができる。この時、被験物質を系中に加えておくことにより、該被験物質がCARとCARLの結合を阻害するかどうかを判定することができる。被験物質は、遺伝子によりコード可能であれば、該物質をコードする遺伝子を発現するように構築した発現ベクターとして、宿主細胞に導入してもよい。レポーター遺伝子としては、種々のものが公知であり、例えば、Ade2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、HIS3遺伝子、β-ガラクトシダーゼ、β-ラクタマーゼ等が利用できる。【００７８】
CARとCARLとの相互作用は、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサー(例えば、BIAcore(Amersham Pharmacia))を使用してポリペプチドを標識することなく、リアルタイムに観察することもできる。そこで、CARとCARLを接触させる際に被験物質を加えておくことにより、該被験物質がCAR-CARL結合の阻害剤として働くかどうかを、このようなバイオセンサーを用いて検出することもできる。具体的な方法については、例えば、実施例11を参照することができる。【００７９】
CAR-CARL結合阻害抗体
本発明はさらに、CAR及びCARLの結合を阻害する抗体に関する。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体(scFV)(Huston et al. (1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883;The Pharmacology of Monoclonal Antibody, Vol.113,Rosenburg and Moore ed.,Springer Verlag(1994)p.269-315)、ヒト化抗体、多特異性抗体(LeDoussal et al.(1992)Int.J.Cancer Suppl.7:58-62;Paulus (1985) Behring Inst.Mitt.78:118-132;Millstein and Cuello(1983)Nature305:537-539; Zimmermann (1986)Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.105:176-260;Van Dijk et al.(1989) Int.J. Cancer43:944-949)、並びに、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv等の抗原結合部位を含む抗体断片が含まれる。さらに、本発明の抗体は必要に応じ、PEG等により修飾されていてもよい。その他、本発明の抗体は、β-ガラクトシダーゼ、マルトース結合蛋白質、GST、緑色蛍光蛋白質(GFP)等との融合蛋白質として製造して、二次抗体を用いることなく検出できるようにしてもよい。また、ビオチン等により抗体を標識することによりアビジン、ストレプトアビジン等を用いて抗体の回収を行えるようにすることもできる。【００８０】
本発明の抗体は、CAR若しくはその断片、CARL若しくはその断片、またはそれらいずれかを発現する細胞を感作抗原として用いることにより、上記「抗CARL抗体を用いたTh1細胞検出方法」の項において説明した抗CARL抗体と同様に製造することができる。好ましい態様において、本発明の抗体は、抗CAR抗体または抗CARL抗体である。例えば、本発明の抗体は、受託番号FERM BP-10317において国際寄託されたハイブリドーマ@mCAR:5E9-1-1、受託番号FERM BP-10318において国際寄託されたハイブリドーマ@mCAR:5G11-1-1-11、および受託番号FERM BP-10320において国際寄託されたハイブリドーマ@mCAR:4C9-1-1より産生される抗CAR抗体であってもよい。または、本発明の抗体は、受託番号FERM BP-10319において国際寄託されたハイブリドーマ@mCARL:#3.11より産生される抗CARL抗体であってもよい。しかし、本発明の抗体はこれらに限定されることはない。以下の実施例に詳しく開示されるように、例えば、実施例5記載の方法により得られたクローン5G11が産生するモノクローナル抗体は、CARとTh1細胞の結合を阻害するものである。また、実施例14記載の方法により得られた#3抗体は、CARLとCAR発現細胞との接着を阻害するものであり、さらに、接触性皮膚炎の治療に効果を有することが実施例17に示されている。また、ヒトCARLに対するモノクローナル抗体、#5、#49および#77は、ヒトCARLとヒトCAR発現細胞との接着を阻害することが実施例16に示されている。
【００８１】
実施例5において得られたハイブリドーマ5E9、5G11および4C9ならびに実施例14において得られたハイブリドーマ#3を、下記の通り寄託した。本明細書において、5E9とは下記の@mCAR:5E9-1-1と同一であり、5G11は下記の@mCAR:5G11-1-1-11と同一であり、#3は下記の@mCARL:#3.11と同一であり、および4C9は下記の@mCAR:4C9-1-1と同一である。また、該ハイブリドーマが産生する抗体については、該ハイブリドーマと同一の名称を用いるものとする。【００８２】
@mCAR:5E9-1-1
(1)寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1  中央第6（郵便番号305-8566）
(2)国際受託日:  平成17年4月12日（国内寄託日：平成16年4月27日）
(3)国際受託番号：  FERM  BP-10317
（国内受託番号：  P-20031、国内受領番号：  FERM AP-20031）
【００８３】
@mCAR:5G11-1-1-11
(1)寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1  中央第6（郵便番号305-8566）
(2)国際受託日:  平成17年4月12日（国内寄託日：平成16年4月27日）
(3)国際受託番号：  FERM  BP-10318）
（国内受託番号  P-20032、国内受領番号  FERM AP-20032）
【００８４】
@mCARL:#3.11
(1)寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1  中央第6（郵便番号305-8566）
(2)国際受託日:  平成17年4月12日
(3)国際受託番号：  FERM  BP-10319
【００８５】
@mCAR:4C9-1-1
(1)寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1  中央第6（郵便番号305-8566）
(2)国際受託日:  平成17年4月12日
(3)国際受託番号：  FERM  BP-10320
【００８６】
本発明の抗体は、CARとCARLの結合を阻害するものであることから、Th1細胞の接着を抑制し、炎症における細胞接着を抑制し、病態を緩和できるものと期待される。また、CAR及びCARLの結合は、Th1細胞の浸潤に関与すると考えられることから、細胞浸潤機構を解明する上でも役立つものと考えられる。
特に、本発明の抗体のうち、CARまたはその断片を抗原として作製した抗体は、一般的な抗体と同様に、CAR及びその断片の精製に使用することができる。さらに、CARをターゲットとしたドラッグデリバリーシステムにおいても利用可能である。
CARLまたはその断片を抗原として作製した抗体は、CARと同様に、CARL及びその断片の精製、CARLをターゲットとしたドラッグデリバリーシステムにおいて利用することができる。また、上記CAR-CARL結合阻害剤と同様に、リウマチ等のTh1細胞の働きが一因となっている疾患においてTh1細胞の接着を抑制し、病態を緩和するものと期待される。これらの本発明の抗体は、Th1細胞が一因となる疾患の治療または予防薬候補となり得る。実際、本発明において、抗CARL抗体が接触性皮膚炎の治療に効果を有することが示されている（実施例17）。【００８７】
抗CAR抗体含有組成物および抗CARL抗体含有組成物
本発明の抗体は上述のように、CARとCARLの結合を阻害するものであることから、CARを発現する上皮細胞及び内皮細胞等の細胞と、CARLを発現する活性Th1細胞の接着の阻害に利用することができる。そこで、本発明は、本発明の抗体を含む細胞接着の阻害剤に関する。このような組成物は、CAR及びCARLの結合能を調べる際に使用できる。本発明の阻害剤は、例えば、本発明の抗体が適当な緩衝液中等に溶解されたものである。さらに、必要に応じ保存剤、防腐剤、安定化剤等を抗体の活性に影響しない範囲で加えることができる。【００８８】
また、本発明の抗体は、Th1細胞の接着を抑制することから、炎症における細胞浸潤を抑制し、病態を緩和できるものと期待されるので、このような抗体を含む組成物は、Th1細胞の働きが一因となる疾患の治療または予防薬として利用できるものと期待される。例えば、本発明の抗体を含む組成物は、接触性皮膚炎の治療薬または予防薬として利用することができる。このような治療薬または予防薬として抗体を用いる場合には、該治療薬及び予防薬がヒトに対して使用されるのであれば、免疫原性を考慮して、ヒト抗体またはヒト化抗体を使用することが望ましい。【００８９】
抗体の製剤化は、その特性を勘案して公知の抗体製剤の製造方法に基づいて行うことができる。治療薬または予防薬として本発明の組成物を使用する場合には、該組成物は本発明の抗体を有効成分として含み、生理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤等が適宜混合される。投与方法は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤、座剤、経鼻投与剤、経肺投与剤、経皮投与などが挙げられる。注射剤の例としては、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、点滴静注などにより全身または局部的に投与することができる。注射剤として投与することを目的とする場合、本発明の組成物の剤形として、滅菌水や生理食塩水、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ベヒクル、防腐剤などと適宜組み合わせて本発明の抗体の有効量を製剤化することが考えられる。また、経口剤として投与することを目的とする場合、本発明の組成物の剤形として、カプセル剤、顆粒剤、懸濁剤、散剤、錠剤、乳剤、溶剤等を選択することができる。
上記乳化剤または界面活性剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル等を挙げることができ、
上記懸濁剤としては、前記界面活性剤のほか、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子を挙げることができ、
上記安定剤としては、一般に医薬に使用されるものを挙げることができ、
上記ベヒクルとしては、リポソーム、マイクロスフェア、脂質小胞体などの一般に医薬に使用されているものを挙げることができ、
上記防腐剤としては、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等を挙げることができる。【００９０】
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水などの注射用水溶液や注射用の油性液を用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ-５０と併用してもよい。
注射用の油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。
調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。また、本発明の抗体を凍結乾燥させたアンプルに、注射用の水溶液や油性液などの適当なベヒクルを使用時に適量添加するという、用事調製の形態でもよい。
【００９１】
本発明の阻害剤の投与量は、Th1細胞の作用により病態が形成されている病変部において、Th1細胞の接着を抑えるのに十分な量であればよく、患者の年齢、性別、体重、症状等に加え、治療目的、投与方法等により変化するが、当業者であれば、これらの条件及び選択した抗体の活性を考慮し、適当な投与量を決定することができる。例えば、一日につき１〜５回の範囲で、一回につき体重１ｋｇあたり0.0001〜1000 mg、好ましくは0.01〜100 mg、より好ましくは0.1〜10 mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり0.001〜100000 mg/body、好ましくは0.1〜10000 mg/body、より好ましくは1〜100 mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができる。
なお、本明細書中で引用した全ての刊行物は、参照として組み入れられる。
【実施例】
【００９２】
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
[実施例１]  接着分子全長発現細胞の作製
接着分子JAM-A、JAM-B、JAM-C、ESAM、CARの全長cDNAのクローニングは以下のように行った。テンプレートには、JAM-A、JAM-B、JAM-Cについてはmouse heart cDNA library (Clontech Quick Clone 7133-1)を、ESAMについてはマウス小腸cDNA、CARについてはマウス脾臓cDNAを用いた。それぞれのプライマーは、GenBankTMの配列 (JAM-A(U89915)、JAM-B(AF255911)、JAM-C(AJ300304)、ESAM(AF361882)、CAR(NM009988))をもとに設計しPCRで増幅した。例えばCARについては以下のプライマーを使用した。
mCAR F1:GCGGTCGACGCCACCATGGCGCGCCTACTGTGCTTCGTGCT（配列番号：5）
mCAR R2:CGCCGCGGCCGCTTATACCACTGTAATGCCATCGGTCT（配列番号：6）
得られたcDNA断片は、発現ベクターpMXII IRES-EGFP（Oncogene(2000)19(27):3050-3058）に挿入した後、293/EBNA-1細胞株 (Invitrogen)にパッケージングベクター、pCL-Eco (Imgenex, San Diego, CA)とともに導入し、組替えレトロウィルスを作製した。このウィルス液をB300細胞株に感染させ、EGFP陽性細胞をセルソーティングにより分離することで発現細胞を得た。293/EBNA-1細胞株は、10% FCS を含むDulbecco's modified Eagle's培地で、B300細胞株は、10% FCSと55 μM 2-メルカプトエタノールを含むRPMI-1640培地で培養した。【００９３】
[実施例２]  活性化リンパ球の調製
マウス脾臓を100μmのメッシュ上ですり潰し、赤血球を溶血して脾細胞を得た。CD4陽性細胞は、MACS (Miltenyi Biotec)を用いて脾細胞から単離した。1% FCSと2mM EDTAを含むPBS 70μlに4x107個の脾細胞を懸濁し、FcR blocking reagent(Miltenyi Biotec社製)で処理した後、抗CD4抗体固相化磁気ビーズを加え、4℃で20分間反応を行った。洗浄後、AutoMACSを用いてポジティブセレクションを行った。CD4陽性細胞の割合は、90％以上であった。精製したCD4陽性細胞を、抗CD3抗体を1μg/mlで固相化したプレートに加え、抗CD28抗体10μg/ml存在下で培養した。2日後にIL-2 20 ng/mlを加えて培養し、活性化後7から9日目の活性化リンパ球を実験に用いた。【００９４】
[実施例３]  接着分子の細胞外領域とアルカリフォスファターゼのキメラ蛋白質の作製
まず、pcDNA3.1(+)-SEAP(His)10-Neo ベクターを、以下のように作製した。pCDNA3.1 (+) -Neoベクター（CLONTECH 社製）の内在性のSalIサイトは、SalIで消化した後、平滑化を行うことにより欠損させた。SEAP (His)10のcDNA断片は、pDREF-SEAP His6-Hyg (J. Biol. Chem., 1996, 271, 21514-21521) を鋳型として、5'端にHindIIIを3'端にXhoIを付加したプライマーを用いて用いてPCRで増幅した。得られたcDNA断片をHindIIIとXhoIで消化した後、SalIサイトを欠損させたpCDNA3.1 (+) -Neoベクターに挿入した。
次に、接着分子の細胞外領域は、実施例１で得られた全長cDNAを鋳型として、5’端にSalIを3’端にNotIを付加したプライマー（例えばCARについては、以下のプライマー）を用いてPCRで増幅した。
mCAR F1:GCGGTCGACGCCACCATGGCGCGCCTACTGTGCTTCGTGCT（配列番号：5）
mCAR R1:CGCCGCGGCCGCTCGGTTGGAGGGTGGGACAACGTCTA（配列番号：7）
増幅したcDNA断片をSalI とNotIで消化した後、上記pcDNA3.1(+)-SEAP(His)10-Neo ベクターに挿入した。これにより、接着分子の細胞外領域と分泌型ヒト胎盤性アルカリフォスファターゼが3個のアミノ酸リンカー(Ala-Ala-Ala)で結合され、さらにC末端に10個のヒスチジンタグ(His)10のついた分泌キメラ蛋白質（以下APキメラ蛋白質）の発現が可能となる。得られたAPキメラ蛋白質発現ベクターは、TransIT LT1 (TAKARA #V2300)を用いて293/EBNA-1 細胞株へ導入し、4から5日間培養を行った。培養上清中に分泌されたAPキメラ蛋白質は、遠心分離により培養上清を回収し、0.22 μm のフィルターでろ過した後、Hepes (pH 7.4)とアジ化ナトリウムをそれぞれ最終濃度が20mM、0.02％となるように加えて4℃で保存した。APキメラ蛋白質の濃度は、アルカリフォスファターゼ活性をthe Great EscApe detection kit(CLONTECH#K2041-1)を用いて測定し、算出した。【００９５】
[実施例４]  固相化したCARに対する活性化リンパ球の接着
リンパ球に対する接着分子として機能する分子を同定するために、APキメラ蛋白質を用いた細胞接着実験を行った。まず、96ウェルELISAプレート(Nunc)に10μg/mlの抗アルカリフォスファターゼ抗体（Seradyn MIA1802）を50 μlずつ加え、37℃で30分間静置して固相化した。プレートをPBSで洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬）で非特異的結合部位をブロックした。APキメラ蛋白質を最終濃度10 nMになるように希釈してウェルに加え、室温で30分間静置し、固相化した。活性化リンパ球は、細胞接着バッファー（RPMI 1640、0.5% BSA、20 mM HEPES (pH 7.4)）に懸濁して、Calcein-AM（同仁）で蛍光標識した後、1ウェルあたり1 x 105個ずつ加え、37°Cで1時間反応させた。非接着細胞を洗浄して除き、細胞溶解液（10 mM TrisHCl (pH 8.0)、1% TritonX-100）を加えた後、Wallac ARVO SX 1420 MULTILABEL COUNTER (Perkin Elmer)を用いて、励起波長485 nm、検出波長535 nm で測定し、接着細胞を定量した。細胞接着の程度は、添加した細胞に対する接着した細胞の割合をパーセントで表した。JAM-A、JAM-B、JAM-C、CAR、ESAMの細胞外APキメラ蛋白質を固相化した結果、CARが活性化リンパ球に対して接着分子として機能することが明らかとなった（図1）。【００９６】
[実施例５]  CARに対するモノクローナル抗体の作製
免疫用の抗原として用いるために、CAR-APキメラ蛋白質の精製を行った。精製は、APキメラ蛋白質のC末端に存在するヒスチジンタグを利用して、His Trap Kit (Amersham Biosciences #17-1880-01)を用いて行った。CAR-APキメラ蛋白質を含む培養上清を1 ml のHiTrap chelating HPカラム (Amersham #17-0408-01)に添加し、20 mM イミダゾール溶液で洗浄した後、カラムからCAR-APキメラ蛋白質を、500 mMイミダゾール溶液を用いて溶出した。CAR-APキメラ蛋白質の濃度は、the Great EscApe detection kit (CLONTECH #K2041-1)を用いた酵素活性測定とProtein Assay kit II (BIO-RAD 500-0002JA)を用いた蛋白定量により算出した。
得られたCAR-APキメラ蛋白質は、TiterMaxと混合してWKYラットに免疫した。免疫したラットからリンパ球を単離して、P3ミエローマ細胞とリンパ球の比率が1：5となるように混合し、PEG1500溶液（ベーリンガー社783-641）を用いて細胞融合を行った。HAT培地（GIBCO BRL 31062-011）でハイブリドーマを選択し、得られたハイブリドーマの培養上清は、CAR-Fcキメラ蛋白質を用いたサンドイッチELISAによるスクリーニングに付した。陽性ウェルからクローニングを行い、3種類のクローン（4C9、5E9、5G11）を得た。FACSにより特異性を検討した結果、5G11クローンはCAR発現B300細胞に対してのみ反応し、親株のB300細胞及びJAM-A、JAM-B、JAM-C、ESAM発現B300細胞には反応しなかった（図2A）。また同様の結果が、4C9及び5E9クローンでも得られた。【００９７】
[実施例６]  抗CAR抗体の細胞接着阻害活性
CARのホモフィリックな結合を介した細胞接着に及ぼす抗体の効果を調べるため、B300/CAR細胞および固相化したCAR-APキメラ蛋白質に抗CAR抗体10 μg/mlを加え、室温で10分間前処理した後、抗体存在下での細胞接着活性を検討した。その結果、B300/CAR細胞のCAR-APキメラ蛋白質への接着は、5G11抗体によって抑制され、4C9及び5E9抗体によって亢進された。活性化リンパ球のCAR-APキメラ蛋白質への接着は、4C9及び5G11抗体によって抑制されたが、5E9抗体による亢進は観察されなかった（図2B及び図2C）。【００９８】
[実施例７]  活性化リンパ球における未知のCARに対するリガンドの存在
活性化リンパ球がCARを発現し、固相化したCAR-APキメラ蛋白質とのホモフィリックな結合を介して接着しているかどうかを検討した。まず、細胞表面上でのCARの発現を抗CAR抗体とFACSを用いて検討した。活性化リンパ球を5G11抗体と反応させた後、PE標識ヤギ抗ラットIgG抗体と反応させ、FACSCallibur(Becton Dickinson)を用いて測定した。しかしながら、活性化リンパ球表面上でのCARの発現は検出されなかった（図3A）。次にRT-PCRを用いてCARのmRNAの発現を検討したが、mRNAの発現も検出されなかった（図3B）。したがって、活性化リンパ球ではCARは発現しておらず、リンパ球細胞表面上には未知のCARに対するリガンドが存在することが示唆された。
そこでまず、CARに対する未知のリガンドがインテグリンである可能性を検討した。CD11a（M17/4 eBioScience 14-0111）、CD18（GAME-46 BD 555280）、CD29（2C9.G2 BD 553343）、CD49d（R1-2 BD 553153）、CD51（RMV-7 BD 552299）、CD61（GAME-46 BD 555280）に対する抗体の細胞接着に与える効果を調べた。しかし、CARと活性化リンパ球の接着は、いずれの抗体によっても阻害されなかった。【００９９】
[実施例８]  各種リンパ球の固相化CAR-APキメラ蛋白質への細胞接着活性とCAR-APキメラ蛋白質との結合活性
次に、CARに接着するリンパ球の特徴を検討した。MACSで精製した直後のCD4陽性細胞（休止期CD4+細胞）及び、抗CD3抗体で活性化して２日後に20 ng/ml IL-2または25 ng/ml IL-15加えてさらに5日間培養した活性化リンパ球のCAR-APキメラ蛋白質に対する接着活性を調べた。その結果、IL-2で刺激した活性化リンパ球は接着するが、IL-15で刺激した活性化リンパ球及び休止期CD4+細胞は接着しないことが明らかになった。また、TK1細胞株も接着しなかった（図4）。
次に、各種リンパ球のCAR-APキメラ蛋白質の細胞表面上への結合活性を検討した。細胞は、40nM CAR-APキメラ蛋白質と4℃で30分間反応させた後、FMATBlue標識マウス抗アルカリフォスファターゼ抗体と4℃で30分間反応させた。結合は、FACSにより検出した。その結果、IL-2で刺激した活性化リンパ球にCAR-APキメラ蛋白質は結合したが、IL-15で刺激した活性化リンパ球や休止期CD4+細胞、TK1細胞株には結合しないことが明らかとなった（図5）。【０１００】
[実施例９]  CARに対する新規リガンドCARL(CAR ligand)の同定
次に、CARに対する未知のリガンドがIgSFである可能性を検討した。まず、CARおよびJAMファミリー分子のマウス染色体における位置関係を調べた。Mouse Ensembleのデータベースを検索した結果、これらの分子は、1、9、16番染色体に分かれてクラスターを形成して存在していた。そこで、CARおよびJAMファミリー分子の近傍に存在する116個のIgSFに着目し、各種リンパ球における発現をリアルタイムPCRで調べた。全RNAは、RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)を用いて、5x106個のTK1細胞、IL-2刺激活性化リンパ球、およびIL-15刺激活性化リンパ球から単離した。リアルタイムPCRは、SYBR-green 存在下でABI 7700 Sequence Detect ion System (PE Applied-Biosystems)を用いて行った。その結果、ENSMUSG0000048534がCARへの接着活性と相関のある発現パターンを示した。ENSMUSG0000048534がCARに対する未知のリガンドであるかどうかを調べるため、この分子の発現細胞を作製した。テンプレートには、IL-2刺激活性化リンパ球のcDNAを用い、プライマーは、ENSMUSG0000048534の配列をもとに以下の通り設計して、実施例1に記載の方法で発現細胞を得た。
mCARL F1:GCGGTCGACGCCACCATGCTTTGCCTCCTGAAACTGATTGTG（配列番号：8）
mCARL R2:CGCGGCGGCCGCTTACTTGGATCTGACTGAAGAGCGGAC（配列番号：9）
また接着分子（JAM-A、JAM-B、JAM-C、CAR、ESAM）の細胞外領域とAPのキメラタンパク質は、実施例３と同様に作製した。ENSMUSG0000048534にコードされるリガンドのホモフィリックな結合を調べるため、このリガンドについても以下のプライマーを用いて同様にAPのキメラタンパク質を作製した。
mCARL F1:GCGGTCGACGCCACCATGCTTTGCCTCCTGAAACTGATTGTG（配列番号：8）
mCARL R1:[ID:1830]CGCGGCGGCCGCATTTCCATTCAGGATGCCCTGCTGACC（配列番号：10）
この発現細胞を用いて、種々の接着分子の細胞外APキメラ蛋白質に対する接着活性を調べたところ、CARのみに接着した（図6A）。さらに、この細胞外領域のAPキメラ蛋白質に対するCAR発現B300細胞との接着活性を調べたところ、CAR発現B300細胞は接着し、その接着は4C9および5G11によって阻害された（図6B）。以上の結果より、ENSMUSG0000048534がリンパ球上の新規なCAR に対するリガンドであることが明らかとなり、該リガンドをCARL (CAR Ligand)と命名した。【０１０１】
[実施例１０]  CARLの特性
CARLは、379アミノ酸からなるIgSFに属する分子であり、細胞外には２個のIg様ドメインを持っている（図7）。CARLの遺伝子は、マウス9番染色体上に位置し、EPITHELIAL V LIKE ANTIGEN 1 (ENSMUSG0000032092)とSODIUM CAHNNEL BETA-2 SUBUNIT (ENSMUSG0000037714)の遺伝子にはさまれて存在する。CARLは、similar to AMICAとして登録されているBC050133 (gi29477100)と一致した。CARLの塩基配列をNCBI nrでblastnにかけると、BC050133 (gi29477100) 以外に、XM_194453 (gi38089807)が高い類似性を示した。XM_194453 (gi38089807)は、BC050133 (gi29477100)の最初の11アミノ酸の代わりに37アミノ酸が挿入され、231番目のアルギニンがグルタミンとなった変異体である。また、mouse Ensembleのorthologue predictionによると、ヒトにおいてはAMICAとして登録されているENSG00000160593 がCARLのオルソログであると推定されている。ENSG00000160593には、2つの転写産物が存在し、これら (ENST00000292067、ENST00000303475)は5’端のスプライシングバリアントの関係にある。それぞれの推定アミノ酸配列を比較した結果、ENST00000292067の最初の14アミノ酸の代わりに、ENST00000303475では異なる4アミノ酸が挿入されていた。CARL とAMICA(ENST00000292067、ENST00000303475)の相同性は、アミノ酸レベルでそれぞれ38.2％、37.7％であった。ヒトAMICAの遺伝子座は、マウスCARLのヒト染色体上の相同領域11番染色体（11q23.3）に存在していることからヒトAMICAは、マウスCARLのヒト相同遺伝子ヒトCARLであると考えられる。最近、ヒトJAML (AJ515553)が骨髄由来細胞に発現する接着分子として報告された（Blood, 2003 (102),3371-3378）が、この分子は、ヒトCARL (ENST00000292067)の560-596 bpの37塩基が欠損し、その配列が693と694 bpの間に挿入された変異体である。ヒトJAMLは、ヒトCARLと同じく394アミノ酸からなるが、94番目および161番目から205番目のアミノ酸配列は、ヒトCARLとは全く異なる。【０１０２】
[実施例１１] CARとCARLの細胞外領域の蛋白質間相互作用とその解離平衡定数
CARとCARL細胞外領域の蛋白質間相互作用とその親和性を調べるため、BIAcore X  (BIAcore社製)を用いた表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーにより、以下の方法で解離平衡定数Kd値を求めた。まず、アミノカップリング法でセンサーチップCM5 (BIAcore社製)に50 μg/mlの抗アルカリフォスファターゼ抗体（Seradyn社製）を固定した。次にHBS-EP buffer (BIAcore社製)で20 nMに希釈したCAR-APキメラ蛋白質またはコントロールのAPキメラ蛋白質を含む培養上清を添加し、500 RUのAPキメラ蛋白質をセンサーチップ上に固相化した。蛋白質間相互作用は、HBS-EP buffer (BIAcore)でそれぞれ20、6、0.6 nM に希釈したCARL-Fcキメラ蛋白質を含む培養上清を20μl/minで210秒間添加し測定した。BIAevaluation software version 3.2 (BIAcore)を用いて得られた結合速度定数と解離速度定数の値から、CARとCARLの解離平衡定数は、4.8 nMであることが明らかとなった（図8）。【０１０３】
[実施例１２]  CARLのTh1細胞での選択的発現およびCARに対するTh1細胞の選択的接着
Th1およびTh2におけるCARLの発現を調べるため、Th1およびTh2細胞の調製を行った。MACSで精製したCD4陽性細胞は、抗CD3抗体 1μg/mlを固相化したプレートに加え、抗CD28抗体10μg/ml存在下で刺激した。Th1へ分化させる場合は、10 ng/ml IL-12 と 10 μg/ml 抗-IL-4 抗体 (MP4-25D2; PharMingen)存在下で、Th2へ分化させる場合は、15 ng/ml IL-4 と 15 μg/ml抗IL-12抗体(24910.1; R & D Systems) 存在下で抗CD3抗体刺激を行なった。2日後、Th1へ分化させた細胞は20 ng/ml IL-2と10 ng/ml IL-12を加えて培養を行い、Th2へ分化させた細胞は20 ng/ml IL-2と15 ng/ml IL-4を加えて培養を行って、刺激後7から9日の細胞を実験に用いた。Th1 細胞は、IFN-γの産生により、Th2 細胞は、IL-4の産生によりそれぞれ分化していることを確認した。これらの細胞から得られたRNAを用いて、リアルタイムPCRで、CARLのmRNA発現およびHPRTのmRNAの発現（コントロール）を調べたところ、CARLがTh1細胞で選択的に発現していることが明らかとなった（図9A）。また、CAR-APキメラ蛋白質を用いて、細胞表面上への結合活性を調べたところ、同様にTh1細胞に選択的に結合活性が認められた（図9B）。さらに、Th1およびTh2細胞のCAR-APキメラ蛋白質に対する接着活性を調べたところ、CARLの発現と一致してTh1細胞のみが選択的にCARに接着することが明らかとなった（図9C）。また、その接着は4C9および5G11によって阻害された（図10A）。
さらに、CD4陽性T細胞以外の細胞におけるCARLの発現を解析した。C57BL/6雄マウスの脾臓および末梢血から細胞を調整し、5% マウス血清、5% ラット血清を含むFACS緩衝液（PBS /1% FBS/1 mM EDTA）に懸濁し、FcRブロッキング溶液を加えて氷上で10分反応させた。次に、蛍光標識抗mCARL抗体と種々の蛍光標識細胞系列マーカー抗体と氷上で30分反応させた後、FACScaliburを用いて測定した。
その結果、正常マウスの免疫組織では、脾臓から調製したCD3陽性T細胞、CD11b陽性骨髄系細胞、CD11ｃ陽性樹状細胞、B220陽性B細胞で、CARLの発現がみられが、DX5陽性NK細胞、F4/80陽性単球/マクロファージでは、CARLの発現がみられなかった。また、末梢血から調製したSSC high/ Gr1陽性好中球では、CARLの発現がみられたが、SSC high/ F4/80陽性好酸球では、CARLの発現がみられなかった。（図10B）。【０１０４】
[実施例13]  Ig様ドメイン欠損型CARL発現細胞の作製
CARLにおけるmCARの結合領域を決定するため、Ig様ドメイン欠損型mCARL発現細胞を作製した。発現ベクターの改変は、以下のように行った。まず、Oncogene(2000)19(27):3050-3058と同様の手法により、pMX(J. Biol. Chem.,2002, 277, 5583-5587)のBamHIとSalIの間にあらたなマルチクローニングサイト（cgcggatcctaattaattaaggtttaaactgtcgacgaattcgcggccgccacgcgttcgcga）とIRES/Puroを挿入した改変ベクターpMX MCS2.2 IRES Puroを作製した。次に、pMX MCS2.2 IRES PuroのBamHIとSalIの間にシグナル配列とFLAGタグを挿入し、改変ベクターpMX ssFLAG MCS2.2 IRES Puroを作製した。【０１０５】
CARLのシグナル配列は、1番目から20番目のアミノ酸、1番目のIg様ドメイン（ドメイン1）は、30番目から139番目のアミノ酸、2番目のIg様ドメイン（ドメイン2）は、143番目から254番目のアミノ酸であると推定された（SignalP; http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/, SMART ; http://smart.embl-heidelberg.de/ ）。したがって、全長型CARLとは、21番目から379番目のアミノ酸からなる蛋白質を、ドメイン1欠損型CARLとは、21番目から29番目のアミノ酸と140番目から379番目のアミノ酸からなる蛋白質を、ドメイン2欠損型CARLとは、21番目から139番目のアミノ酸と255番目から379番目のアミノ酸からなる蛋白質をそれぞれ示す。【０１０６】
全長型CARL及びドメイン1欠損型CARLのクローニングは、実施例9で得たCARLの全長cDNAを鋳型として用いてPCRで増幅し、得られたcDNA断片を発現ベクターpMX ssFLAG MCS2.2 IRES Puroに挿入した。ドメイン2欠損型CARLのクローニングでは、134番目から139番目のアミノ酸配列と255番目から260番目のアミノ酸配列に相当する塩基配列及びその相補的な配列からなるプライマーを用いた二段階PCRにより、cDNA断片を増幅した。実施例1に記載の方法で作製した組替えレトロウィルスをB300細胞株に感染させ、遺伝子導入細胞を5 μg/ml ピューロマイシンで選択することにより発現細胞を得た。これら細胞表面におけるIg様ドメイン欠損型CARLの発現は、抗FLAG抗体（SIGMA社製）を用いて確認した（図11A）。これら細胞のCAR-APキメラ蛋白質に対する接着活性を実施例4に記載の方法で調べたところ、全長型CARL発現B300細胞とドメイン2欠損型CARL発現B300細胞は、CAR-APキメラ蛋白質に対して接着したが、ドメイン1欠損型CARL発現B300細胞は接着しなかった（図11B）。したがって、CARとCARLの結合にはCARLのドメイン1が必要であることが明らかとなった。【０１０７】
[実施例14]  CARLに対するモノクローナル抗体の作製、抗CARL抗体を用いたTh1細胞における発現および細胞接着阻害活性
実施例9で得たCARL-APキメラ蛋白質を免疫用の抗原として用いて、実施例5に記載の方法で抗CARL抗体#3を得た。FACSにより特異性を検討した結果、#3抗体は、CARL発現B300細胞に対して反応し、親株のB300細胞には反応しなかった（図12A）。#3抗体を用いて、実施例12に記載の方法で調製したTh1およびTh2細胞におけるCARLの発現を調べたところ、Th1細胞で選択的に強く発現していた（図12B）。また、#3抗体は、CARL-AP蛋白質に対するCAR発現B300細胞の接着を阻害した（図12C）。実施例13で得た細胞を用いた免疫染色において、#3抗体は、全長型CARL発現B300細胞とドメイン2欠損型CARL発現B300細胞の膜上のCARLと結合したが、ドメイン1欠損型CARL発現B300細胞では結合しなかった。したがって、結合阻害活性を持つ#3抗体は、CARとCARLの結合に必要なドメイン1を認識していることが明らかとなった。【０１０８】
[実施例15]   ヒト CARとヒト CARLの結合
マウスで得られた現象が、ヒトでも同様にみられることを確認するため、ヒトCARの全長発現細胞およびヒトCARLの全長発現細胞、ならびにヒトCARの細胞外領域のAPキメラ蛋白質およびヒトCARLの細胞外領域のAPキメラ蛋白質を作製した。発現ベクターは、実施例13で得たpMX MCS2.2 IRES Puroを用いた。
ヒトCARおよびCARLの全長cDNAのクローニングは以下のように行った。鋳型には、human whole brain（Clontech社製）から合成したcDNAを用いた。それぞれのプライマーは、GenBankTM の配列（ヒト CAR (NM_001338)、ヒト CARL (AY138965)）をもとに下記の通り設計し、PCRで増幅した。
hCAR F1:CGCGTCGACATGGCGCTCCTGCTGTGCTTCGTG（配列番号：11）
hCAR R2:GCGGGCGGCCGCCTATACTATAGACCCATCCTTGCT（配列番号：12）
hCARL F1:CGCGTCGACATGTTTTGCCCACTGAAACTCATC（配列番号：13）
hCARL R2:GCGGGCGGCCGCTCAAAAGGCTTGCTGTGTTTTTGG（配列番号：14）
得られたcDNA断片はそれぞれ、発現ベクターpMX MCS2.2 IRES Puroに挿入し、実施例1に記載の方法で組換えレトロウィルスをそれぞれ作製した。遺伝子導入B300細胞株を、5 μg/ml ピューロマイシンで選択することにより発現細胞を得た。ヒトCARおよびCARLの細胞外領域のAPキメラ蛋白質は、下記のプライマーを用い実施例3に記載の方法で作製した。
hCAR F1:CGCGTCGACATGGCGCTCCTGCTGTGCTTCGTG（配列番号：11）
hCAR R1:GCGGGCGGCCGCTTTATTTGAAGGAGGGACAACGTT（配列番号：15）
hCARL F1:CGCGTCGACATGTTTTGCCCACTGAAACTCATC（配列番号：13）
hCARL R1:GCGGGCGGCCGCATTACCACCCAAGACCAGAGGCCT（配列番号：16）
ヒトCAR発現B300細胞表面におけるヒトCARの発現は、抗ヒトCAR抗体（upstate biotechnology社製）を用いて、ヒトCARL発現B300細胞表面におけるヒトCARLの発現は、ヒトCAR-APキメラ蛋白質を用いて、それぞれ確認した（図13A）。ヒトCAR発現B300細胞とヒト CARL-APキメラ蛋白質との接着活性を実施例4に記載の方法で調べたところ、ヒトCARとヒトCARLの結合が検出された。同様に、ヒトCARL発現B300細胞とヒト CAR-APキメラ蛋白質との接着活性を調べたところ、ヒト CARとヒト CARLの結合が検出された（図13B）。【０１０９】
[実施例16]   ヒト CARLに対するモノクローナル抗体の作製および抗ヒト CARL抗体の細胞接着阻害活性
実施例15で得たヒトCARL-APキメラ蛋白質を免疫用の抗原として用いて、実施例5に記載の方法で4種類のマウス抗ヒトCARL抗体（#5、#49、#77、#85）を得た。FACSにより特異性を検討した結果、#5の培養上清は、ヒト CARL発現B300細胞に対して反応し、親株のB300細胞には反応しなかった（図14A）。また同様の結果が、#49、#77、#85クローンでも得られた。これら抗体のうち、#5、#49、#77の培養上清は、ヒト CARL-APキメラ蛋白質に対するヒト CAR発現B300細胞の接着を阻害した（図14B）。【０１１０】
[実施例17]  接触性皮膚炎に対する抗CARL抗体の治療効果
接触性過敏反応（CHS）は、6週齢マウスを用い、以下のように誘導した。まず、0.4％ジニトロフルオロベンゼン（WAKO社製）を1匹あたり25μlマウス腹部に塗布し、CHSを惹起する5日及び4日前に感作させた。抗CARL抗体#3は、1匹あたり500μgをCHS惹起の5日前と当日に尾静脈から投与した。そして、1匹あたり20μl の0.4％ジニトロフルオロベンゼンを耳介部に塗布しCHSを惹起した。惹起から24時間後、左右の耳介の厚みを計測したところ、抗体処理により耳介の腫脹が抑制された（図15）。
実施例１２に示す通り、CARLは活性化したTh1細胞及び好中球に発現が認められ、抗CARL抗体はCARLとCARの相互作用を抑制することにより、CHSを抑制していると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明により、Th1細胞を検出する方法が提供される。Th1細胞は、CD4+Tリンパ球であり、活性化されるとIL-2、IL-12、腫瘍壊死因子(TNF)β、リンフォトキシン(LT)、及びIFN-γ等のサイトカインを分泌し、主に細胞性免疫に関与する。リウマチ、クローン病、1型糖尿病、多発性硬化症等を含む臓器特異的な自己免疫疾患の発症には、Th1が主体的な役割を果たしていると考えられている。また、Th1またはTh2細胞の選択的不均衡または偏った活性化は、ある種の慢性炎症性またはアレルギー性の疾患の病因となっていると考えられている。一方、癌、アレルギー（アトピー性疾患等）、寄生虫感染症等の疾病状態では、Th2応答が支配的であるが、Th1応答を誘導することにより、これらの状態が改善される可能性が示唆されている。即ち、Th1表現型へのシフトにより、IFNα、β及びγ、並びにIL-12、IL-18等の分泌が増大し、ウィルス等の細胞内病原体に対する宿主の免疫防御が強化されると報告されている。そこで、本発明のTh1細胞を検出する方法は、例えば、Th1またはTh2細胞の選択的不均衡、偏った活性化等が関与する疾患の診断・病態の解明において利用することができる。また、このような疾患の治療効果の判定においても利用することができる。【０１１２】
さらに、本発明は、CARとCARLとの結合の阻害剤をスクリーニングする方法に関する。CARとCARLとの結合の阻害剤には抗体も含まれるが、このような阻害剤は、CARを発現する上皮細胞及び内皮細胞と、CARLを発現するTh1細胞との細胞接着を阻害するものである。従って、これらの阻害剤、及び該阻害剤を含む組成物は、Th1細胞の接着を抑制するものと期待される。これらの阻害剤、及び該阻害剤を含む組成物により、Th1細胞が関与する自己免疫疾患の治療効果が期待できる。【０１１３】
本発明によりさらに、CAR及びCARLの結合を阻害する抗体が提供される。このような抗体は、上述の物質と同様に、Th1細胞の接着を抑制し、例えば接触性皮膚炎等における細胞接着を抑制し、病態を緩和できるものと期待される。また、CAR及びCARLの結合は、Th1細胞の浸潤に関与すると考えられることから、細胞浸潤機構を解明する上でも役立つものと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図３】
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【配列表】
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