(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）バクテリオファージλリプレッサー蛋白質の二量体化不能な機能性ＤＮＡ結合ドメイン、
ｂ）細菌ＤＮＡジャイレース(gyrase)Ｂサブユニット（ＧｙｒＢ）、および
ｃ）転写活性化ドメイン、
を含む、生物学的活性キメラ型トランス活性化（因子）蛋白質をコードする核酸分子。
【請求項２】
前記転写活性化ドメインが、ＮＦκＢｐ６５、ＶＰ１６、Ｂ４２、およびＧａ１４からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記転写活性化ドメインが、ＮＦκＢの転写活性化ドメインである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記細菌ＤＮＡジャイレースＢサブユニットが、配列番号４のアミノ酸を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項５】
バクテリオファージλリプレッサーが、前記トランス活性化（因子）蛋白質の基礎活性を低減するための変異を有しており、該変異がＶ９２ＣおよびＳ９３Ｗ、Ｖ９２ＬおよびＳ９３Ｅ、Ｖ９２ＬおよびＳ９３Ｌ、およびＳ９３Ｇからなる群から選択される配列番号８の変異である、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項６】
前記変異がＳ９３Ｇである、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされた生物学的活性キメラ型トランス活性化（因子）蛋白質。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子において発現制御配列に作動的に連結した核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項９】
前記発現制御配列が、構成的プロモーターを含む、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記プロモーターが、ＳＶ４０、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ＥＦ１、およびチミンキナーゼ（ＴＫ）の遺伝子に由来するプロモーターからなる群から選択される、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記プロモーターがＳＶ４０である、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記ＳＶ４０プロモーターが、さらにＣＭＶプロモーターＴＡＴＡボックスを含む、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
前記発現制御配列が、前記リプレッサー蛋白質のＤＮＡ結合ドメインによって認識される少なくとも１個のオペレーター配列を含む、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
前記少なくとも１個のオペレーター配列が、バクテリオファージλオペレーター配列である、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
さらに、標的遺伝子を含む、請求項８〜１４のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項１６】
前記標的遺伝子が、治療作用を有する蛋白質をコードする、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
前記標的遺伝子が、リプレッサー蛋白質のＤＮＡ結合ドメインによって認識される少なくとも１個のオペレーター配列に作動的に連結している、請求項１５または１６に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
前記少なくとも１個のオペレーター配列が、バクテリオファージλオペレーター配列である、請求項１７に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
前記ベクターがプラスミドベクターである、請求項８〜１８のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項２０】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項８〜１８のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項２１】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、および単純ヘルペスＩ型ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項２０に記載の発現ベクター。
【請求項２２】
請求項８〜２１のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２３】
請求項８〜１４のいずれか一項に記載の第１の発現ベクターを含み、さらに標的遺伝子を含む第２の発現ベクターをも含む宿主細胞。
【請求項２４】
前記標的遺伝子が、治療作用を有する蛋白質をコードする、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
前記標的遺伝子が、リプレッサー蛋白質のＤＮＡ結合ドメインによって認識される、少なくとも１個のオペレーター配列に作動的に連結している、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記少なくとも１個のオペレーター配列が、バクテリオファージλオペレーター配列である、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記宿主細胞が、内皮細胞、リンパ球、マクロファージ、造血細胞、線維芽細胞、筋細胞、肝臓細胞、腎細胞、消化管上皮細胞、呼吸器系上皮細胞、下部尿路上皮細胞、生殖器上皮細胞、皮膚上皮細胞、グリア細胞、神経系細胞、腫瘍細胞、および白血病細胞からなる群から選択される、請求項２２〜２６のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項２８】
治療用薬剤を調製するための請求項２７に記載の細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの使用。
【請求項２９】
請求項８〜２１のいずれか一項に記載の発現ベクターおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３０】
ｅｘ  ｖｉｖｏにおける宿主細胞中の標的遺伝子の発現を調節する方法であって、前記方法が、
ａ）前記宿主細胞中に請求項８〜２１のいずれか一項に記載の発現ベクターを導入するステップ、
ｂ）前記発現ベクターによってコードされた前記生物学的活性キメラ型トランス活性化（因子）蛋白質を発現させるステップ、
ｃ）前記標的遺伝子の発現を増大させるために、前記細胞に有効量のクメルマイシン(coumermycin)またはその誘導体を導入するステップ、および
ｄ）前記標的遺伝子の発現を低減させるために、前記細胞に有効量のノボビオシン(novobiocin)またはその誘導体を導入するステップを含む方法。
【請求項３１】
疾病を予防しまたは治療するために、外用で、経口で、小胞内的に、経鼻で、気管支内に、または消化管中に投与可能な、あるいは器官内、体腔内、筋系内、皮下、または循環血内に注入可能な、請求項８〜２１のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項３２】
請求項８〜２１のいずれか一項に記載の発現ベクターおよび医薬上適切な担体を含むキットであって、疾病を予防しまたは治療するために、前記発現ベクターを外用で、経口で、小胞内的に、経鼻で、気管支内に、または消化管中に投与可能な、あるいは器官内、体腔内、筋系内、皮下、または循環血内に注入可能な、キット。
【請求項３３】
治療用遺伝子産生物の発現を、当該治療用遺伝子産生物を必要とする非ヒト患者に応じて調節する方法であって、
（ａ）非ヒト患者に請求項８〜２１のいずれか一項に記載の発現ベクターを導入するステップ、
（ｂ）有効量のクメルマイシンまたはその誘導体で非ヒト患者を治療するステップであって、前記クメルマイシンが前記トランス活性化因子に結合し、それによって前記治療遺伝子産生物をコードする遺伝子の発現が活性化するステップ、および
（ｃ）有効量のノボビオシンまたはその誘導体で非ヒト患者を治療するステップであって、前記ノボビオシンが前記トランス活性化因子に結合し、それによって転写が阻止され、前記治療用遺伝子産生物をコードする遺伝子の発現が不活性化するステップ、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現の調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物での遺伝子発現を遺伝子操作することには、特定の遺伝子およびその産生物の機能研究、ならびに創薬および遺伝子治療での応用への大きな可能性がある。遺伝子調節系は、基礎活性は低くても、その発現誘導に対する応答が高度かつ特異的であるのが理想である。さらに、所与の遺伝子の発現は用量応答的であるのが好ましく、そのような系であれば、スイッチの可逆的なオンまたはオフが即座に可能の筈である。これは、遺伝子治療にとって特に有益であり、遺伝子治療では特定の遺伝子発現のタイミングおよびレベルを薬理学的に制御しそれらを治療範囲内に収めることがある種の疾病にとっての必須事項である。
【０００３】
近年、哺乳動物細胞用の誘導系が数種類開発されている。これらの系には変異体が存在し、例えばＦＫ５０６／ラパマイシン、ＲＵ４８８／ミフェプリストン、エクジソン誘導系、およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）誘導系が挙げられる（非特許文献１〜４）。現在、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子発現の調節には、Ｔｅｔ誘導系が最も一般的に使用される。このＴｅｔ系では、ｉｎ  ｖｉｖｏでの発現が著しく改良されており、発現の基礎レベルは低減され、発現の誘導能は高められている（非特許文献５）。
【非特許文献１】Saez, E., No, D., West, A., and Evens, R.M. (1997) Curr. Opin. Biotehcnol. 6, 608-611.
【非特許文献２】Harvey, D., and Caskey, C. (1998) Curr. Opin. Chem. 2, 512-518.
【非特許文献３】Gingrich, J., and Roder, J. (1998) Annu. Rev. Nueurosci. 21, 377-405.
【非特許文献４】DeMayo, F.J., and Tsai, S.Y. (2001) Trends Endocrinol. Metab. 12, 348-353.
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【非特許文献６】Riond, J.L., and Riviere, J.E. (1988) Vet. Human Toxicol. 5, 431-443.
【非特許文献７】Farrar, M.A., Olson, S.H., and Perlmutter, R. M. (2000) Methods Enzymol 327, 421-429.
【非特許文献８】Gilbert, E.J., and Maxwell, A. (1994) Mol microbiol 12, 365-373.
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【非特許文献１４】Kim, Y.I., and Hu, J. C. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92, 7510-7514.
【非特許文献１５】Byrne, B.J., Davis, M.S., Yamaguchi, J., Bergsma, D.J., and Subramanian, K.N. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 721-725.
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【非特許文献１７】Gu, J., Zhang, L., Huang, X., Lin, T., Yin, M., Xu, K., Ji, L., Roth, J.A., and Fang, B. (2002) Oncogene 21, 4757-4764.
【非特許文献１８】Kobayashi, T., Sawa, H., Morikawa, J., Ueno, S., Katayama, N., Zhang, W., and Shiku, H. (2002) Int J Oncol. 20, 723-728.
【非特許文献１９】O=Farrell, A.M., Liu, Y., Moore, K.W., and Mui, A.L. (1998) EMBO J. 17, 1006-1018.
【非特許文献２０】Gormley, N.A., Orphanides, G., Meyer, A., Cullis, P.M., and Maxwell, A. (1996) Biochemistry 35, 5083- 5092.
【非特許文献２１】Godfrey J.C., and Price, K.E. (1972) Adv. Appl. Microbiol. 15, 231-296.
【非特許文献２２】Eder, J.P., Wheeler, C.A. Teicher, B.A., and Schnipper, L.E. (1991) Cancer Res. 52, 510-513.
【非特許文献２３】Chrast-Balz, J., and Van huijsduijnen, R.H. (1996) Nucleic Acids Res., 24, 2900-2904.
【非特許文献２４】Farrar, M.A., Alberola-Lla, J., and Perlmutter, R. M. (1996) Nature, 383, 178-181.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、この系の１つの大きな欠点は、その発現誘導物質に対する有効なアンタゴニストが無いことであり、たとえば、強力な発現誘導物質ドキシサイクリンのｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期はかなり長くなる（約２４時間）（非特許文献６）。迅速かつ効率的なオン／オフスイッチングが例えば遺伝子治療のためや特異遺伝子の発現を罹患中に正確に調節するために不可欠である場合には、この系の使用はこの薬物動態学的特性の理由により忌避される（非特許文献１）。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、転写活性化ドメイン、リプレッサー蛋白質ＤＮＡ結合ドメイン、および細菌ＤＮＡジャイレースＢサブユニット（Ｇｙｒ Ｂ）を含む生物学的活性キメラ型トランス活性化蛋白質をコードする組換え核酸分子を提供する。生物学的活性キメラ型トランス活性化蛋白質は、標的遺伝子の転写を活性化するように設計され、その標的遺伝子にはオペレーターＤＮＡ配列が作動的に連結しており、この配列がリプレッサー蛋白質のＤＮＡ結合ドメインによって認識される。生物学的活性キメラ型トランス活性化（因子）蛋白質は基礎活性が低く、このことは生物学的活性キメラ型トランス活性化（因子）蛋白質を有効にしない限り標的遺伝子の転写はほとんど起こらないことを意味する。
【０００６】
有効量のクメルマイシンを加えた場合には、クメルマイシンによってＧｙｒ Ｂの二量体化がスイッチされ、トランス活性化因子がオペレーターＤＮＡ配列に結合可能となり、その結果標的遺伝子の転写が活性化する。有効量のノボビオシンが加えられた場合には、生物学的活性キメラ型トランス活性化（因子）蛋白質は無能になる、すなわちクメルマイシンによって誘導された生物学的活性キメラ型トランス活性化蛋白質の二量体化がノボビオシンにより無効にされ、その結果標的遺伝子の発現はスイッチングオフになる。
【０００７】
この系は、安定な哺乳動物細胞株における遺伝子発現を緊密に調節するのに有効であり、したがって遺伝子発現の迅速なオン／オフスイッチングが必要な適用例、例えば遺伝子治療に有用である。
【０００８】
したがって、本発明は、リプレッサー蛋白質の二量体化不能な機能性ＤＮＡ結合ドメイン、細菌ＤＮＡジャイレースＢサブユニット（Ｇｙｒ Ｂ）、および転写活性化ドメインを含む生物学的活性キメラ型トランス活性化（因子）蛋白質をコードする核酸分子を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、リプレッサー蛋白質の二量体化不能な機能性ＤＮＡ結合ドメイン、細菌ＤＮＡジャイレースＢサブユニット（Ｇｙｒ Ｂ）、および転写活性化ドメインを含む生物学的活性キメラ型トランス活性化（因子）蛋白質をコードしかつ発現制御配列に作動的に連結した核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、リプレッサー蛋白質の二量体化不能な機能性ＤＮＡ結合ドメイン、細菌ＤＮＡジャイレースＢサブユニット（Ｇｙｒ Ｂ）、および転写活性化ドメインを含む生物学的活性キメラ型トランス活性化（因子）蛋白質をコードしかつ発現制御配列に作動的に連結した核酸分子を含む発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、リプレッサー蛋白質の二量体化不能な機能性ＤＮＡ結合ドメイン、細菌ＤＮＡジャイレースＢサブユニット（Ｇｙｒ Ｂ）、および転写活性化ドメインを含む生物学的活性キメラ型トランス活性化（因子）蛋白質をコードする核酸分子を含む発現ベクターを医薬的に適切な担体中に含むキットを提供し、このキットにおいて発現ベクターは、疾病を予防しまたは治療するために、外用で、経口で、小胞内的に、経鼻で、気管支内に、または消化管中に投与し、あるいは器官内、体腔内、筋系内、皮下、または循環血内に注入される。
【００１２】
さらに、本発明は、リプレッサー蛋白質の二量体化不能な機能性ＤＮＡ結合ドメイン、細菌ＤＮＡジャイレースＢサブユニット（Ｇｙｒ Ｂ）、および転写活性化ドメインを含む生物学的活性キメラ型トランス活性化（因子）蛋白質をコードしかつ発現制御配列に作動的に連結した核酸分子を含む発現ベクターを宿主細胞中に導入するステップ、前記発現ベクターによってコードされた生物学的活性キメラ型トランス活性化（因子）蛋白質を発現させるステップ、前記標的遺伝子の発現を増大させるために、前記細胞に有効量のクメルマイシンまたはその誘導体を導入するステップ、および前記標的遺伝子の発現を低減させるために、前記細胞に有効量のノボビオシンまたはその誘導体を導入するステップを含む、宿主細胞中での標的遺伝子の発現を調節する方法を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、治療用遺伝子産生物の発現を、当該治療用遺伝子産生物を必要とする患者に応じて調節する方法であって、リプレッサー蛋白質の二量体化不能な機能性ＤＮＡ結合ドメイン、細菌ＤＮＡジャイレースＢサブユニット（Ｇｙｒ Ｂ）、および転写活性化ドメインを含む生物学的活性キメラ型トランス活性化（因子）蛋白質をコードしかつ発現制御配列に作動的に連結した核酸分子を含む発現ベクターを患者に導入するステップ、有効量のクメルマイシンまたはその誘導体で患者を治療するにあたり、前記クメルマイシンが前記生物学的活性キメラ型トランス活性化（因子）蛋白質に結合し、それによって前記治療用遺伝子産生物をコードする遺伝子の発現が活性化される治療ステップ、および有効量のノボビオシンまたはその誘導体で患者を治療するにあたり、前記ノボビオシンが前記生物学的活性キメラ型トランス活性化（因子）蛋白質に結合し、それによって転写が阻止され、前記治療用遺伝子産生物をコードする遺伝子の発現が不活性化される治療ステップ、を含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
遺伝子発現の調節のための正確で効率的なオン／オフ交換の要件を充足するために、本発明者らは発現誘導物質および対向誘導物質としてクマリン抗生物質の使用を調査してきた。クメルマイシンは、ストレプトミセスの天然産生物であり、メチルピロールリンカーによって連結し、同様に置換された２個のクマリン環からなる（非特許文献７）。関連抗生物質ノボビオシンは、クメルマイシンのモノマーとみなすことができる。クメルマイシンとノボビオシンは、細菌ＤＮＡジャイレースＢサブユニット（Ｇｙｒ Ｂ）のアミノ末端サブドメイン（２４Ｋ）に結合し、細菌の増殖を阻害する（非特許文献８）。クメルマイシンは、Ｇｙｒ Ｂに化学量論比１：２で結合するが、その単量体であるノボビオシンはＧｙｒ Ｂに１：１割合で結合し、したがってクメルマイシンはＧｙｒ Ｂの天然二量体化物質として作用するが、ノボビオシンがクメルマイシンに対するアンタゴニストとして作用するには二量体化したＧｙｒ Ｂは解離される（非特許文献９）。クメルマイシン誘導体がＧｙｒ Ｂに結合する場合にはこれを二量体化することができ、クメルマイシン誘導体がＧｙｒ Ｂに結合する場合にはその二量体化を阻止することができるのであれば、このこともこの系にとって好都合である。
【００１５】
クメルマイシンを有効な発現誘導物質にするためには、リプレッサー蛋白質ＤＮＡ結合ドメインを使用するのがよい。リプレッサー蛋白質は、その二量体化ドメインを削除された場合も、オペレーターＤＮＡに結合する能力を保持していることが望ましい。λリプレッサー（λＲ）、すなわちバクテリオファージλのｃＩ遺伝子産生物は適切なリプレッサー蛋白質の一つである。そのホモ二量体しかλオペレーター（λＯＰ）ＤＮＡに結合することができないからである（非特許文献１０）。λＲは、Ｎ末端ドメイン（残基１〜９２）およびＣ末端ドメイン（残基１３２〜２３６）から構成される（非特許文献１１）。リプレッサーのＮ末端ドメイン自体もリプレッサーを二量体化する弱い活性を保持しているが、ホモ二量体化はＣ末端ドメインにより促進され、主としてこれによって２個のＮ末端ドメインがオペレーターＤＮＡに結合する（非特許文献１２）。そこで本発明者らは、クマリンによって調節されるキメラトランス活性化因子を構築するにあたり、λＲのＮ末端ドメインをＧｙｒ Ｂに融合した後にそのＣ末端に転写活性化ドメインを融合した。適切な転写活性化ドメインには、転写因子ＮＦκＢｐ６５、ＶＰ１６、Ｂ４２、およびＧａ１４のドメインが挙げられる。ここでは、そのようなクメルマイシン／ノボビオシン調節遺伝子発現系の開発を説明し、基礎活性を減少させるためにλＲに定方向変異を誘発すると共に、キメラλＲ−Ｇｙｒ Ｂトランス活性化因子の二量体化を介してクマリン抗生物質により、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子の発現が効果的かつ可逆的に調節されることを実証する。この新しい誘導可能な遺伝子発現系に従えば、機能ゲノム研究は促進され、またこの調節される遺伝子発現の有用性は、特に迅速かつ徹底的なオン／オフスイッチングを必要とする遺伝子治療ならびに他の適用例に拡大される筈である。
【００１６】
近年、多数のシグナル伝達経路の特徴が、クメルマイシンにより誘導されるＧｙｒ Ｂ融合蛋白質の二量体化によって説明されている（非特許文献７、１９）。こうした報告と同様に、クメルマイシン／ノボビオシンを使用してキメラλＲ−Ｇｙｒ Ｂトランス活性化因子の二量体化をスイッチすることには、いくつかの有利な特性があり、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子の発現においてある種の利点がもたらされる。第一に、クメルマイシンおよびノボビオシンはＧｙｒ Ｂへの結合親和性が高い（Ｋｄ  ３−５×１０−８Ｍ）（非特許文献２０）ので、極めて低濃度であってもこれらクマリンの潜在活性によりＧｙｒ Ｂの二量体化は誘導および抗誘導される。実際、本発明者らは、クメルマイシンが０．５ｎＭ程度の低い濃度であっても、λＲ−Ｇｙｒ Ｂトランス活性化因子の二量体化を介してかなりの遺伝子発現を誘導することができることを見出した。第二に、原核生物の酵素に対するこれらのクマリン抗生物質の特異性は十分に確立されており、これ程高い親和性を持った内在性結合標的は哺乳動物細胞中には存在しないことが知られている。これが、クメルマイシンを哺乳動物細胞での遺伝子発現を調節する誘導物質として非常に好都合なものにしている。第三に、クメルマイシンおよびノボビオシンは、ｉｎ  ｖｉｖｏで優れた薬物動態特性を示し、報告されている血清半減期はクメルマイシンでは５．５時間であり（非特許文献２１）、ノボビオシンは６時間である（非特許文献２２）。さらに、ノボビオシンは抗生物質としての使用が臨床的に認可されている。クメルマイシンに関しては、抗菌活性を効果的に発揮する濃度での詳細な動物試験によって、明白な毒性がないことも判明している。現在の系で、本発明者らは、クメルマイシンが０．５ｎＭ〜５０ｎＭの濃度というｉｎ  ｖｉｖｏ薬物投与ではかなり広い用量範囲で遺伝子の発現を効果的に誘導できることを実証している。この用量範囲でクメルマイシンが発現を誘導する濃度は、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞毒性を引き起こす用量の２０μＭよりはるかに低い。しかし、クメルマイシン用量が高くなる（＞０．５μＭ）に伴い、この系での遺伝子発現の誘導は減少する（図４Ａ）。これは、クメルマイシン濃度が高くなるとその過剰な薬物がＧｙｒ Ｂ二量体を解離するためである。
【００１７】
Ｔｅｔ誘導系に比較して、λＲ−Ｇｙｒ Ｂ系によって得られる一つの利点は、遺伝子発現を制御するオン−オフスイッチングが非常に迅速なことである。この系の２つの特異な性質が、この有益な機能に貢献している。第一に、先に述べたクメルマイシンおよびノボビオシンは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が非常に短く（６時間）、それはＴｅｔ誘導物質ドキシサイクリン（１２〜２４時間）の約１／３である（非特許文献２３）。さらに重要なことには、このλＲ−Ｇｙｒ Ｂ系では、クメルマイシンの単量体形であるノボビオシンはクメルマイシン誘導性遺伝子発現を遮断する抗誘導物質として使用できるので、この研究で実証したように（図５Ｂ）、ノボビオシンはクメルマイシンに対する有益なアンタゴニストとして薬物誘導性遺伝子発現を迅速に停止することができる。Ｇｙｒ Ｂへのノボビオシンの結合親和性はクメルマイシンのそれと匹敵するが、クメルマイシンにより誘導される遺伝子発現を完全に遮断するために必要なノボビオシンの濃度はクメルマイシンの濃度の約１０００倍である。これは、Ｒａｆ−Ｇｙｒ Ｂ二量体の解離についての先の報告に一致する（非特許文献２４）。これに関する一つの説明によれば、クメルマイシンはナノモル濃度（１ｎＭ）であってもＧｙｒ Ｂ分子（約２ｎＭ）を二量体化するのでオペレーター部位に結合して活性化するのに十分であるが、ノボビオシンは細胞中に存在する全てのＧｙｒ Ｂ分子を飽和してそれらの二量体化を阻止し、二量体化したＧｙｒ Ｂ分子はクメルマイシンとの競合を介してそれらを解離しなければならない。細胞中に蓄積するＧｙｒ Ｂ分子の総濃度は、この誘導系で二量体化したＧｙｒ Ｂ分子をはるかに超える可能性がある。
【００１８】
このλＲ−Ｇｙｒ Ｂベースの系の誘導能は、他の調節された遺伝子発現系と同様に、トランス活性化因子（生物学的活性キメラ型トランス活性化蛋白質）の活性化効力および基礎発現の規模に依存しており、後者はクメルマイシン非存在下でのλＲ−Ｇｙｒ Ｂ本来の二量体化能が主として関与する。既に報告されているように（非特許文献１２）、野生型λＲのＮ末端ドメインには、ヘリックス５−ヘリックス５の相互作用を介して本来の二量体化能が相当量保持されているので、この系での基礎発現レベルは高くなる。したがって、本発明者らがこのドメイン中の関連残基にランダムな変異を誘発してみたところ、多数の変異によって基礎レベルがかなり低減することが見出された。変異体２５と特徴づけられた、多くの変異構築体の１つに存在するＳｅｒ９３をＧｌｙへの単一変異によって、クメルマイシン非存在下の基礎発現レベルが著しく低減したように見えたが、野生型に匹敵する活性が維持されていた。したがって、アポトーシスＢａｘ遺伝子の誘導発現にとって安定な細胞系をリード発生することによって実証したように、このＳ９３Ｇ変異体によりこのλＲ−Ｇｙｒ Ｂベース遺伝子調節系は非常に望ましい特性を得る。２９３Ａ細胞中でＣＭＶの強力な最初期プロモーターを使用する方が、比較的に弱いＳＶ４０初期プロモーターに比較して背景が著しく高くなった（データ表示せず）ことは注目に値し、これはおそらくＣＭＶ指導によりトランス活性化因子（生物学的活性キメラ型トランス活性化蛋白質）が高レベルに発現し、細胞中でキメラλＲ−Ｇｙｒ Ｂトランス活性化因子の濃度依存的な自動二量体化が誘発されたためであろう。このような理由で、本発明者らは、キメラλＲ−Ｇｙｒ Ｂトランス活性化因子の構成的な発現にＳＶ４０初期プロモーターを使用している。他の適当なプロモーターには、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ＥＦ１、チミンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子からのプロモーターが挙げられる。比較的弱いＳＶ４０初期プロモーターによって制御されるトランス活性化因子（生物学的活性キメラ型トランス活性化蛋白質）の活性効力を増大するために、基礎ＳＶ４０初期プロモーター配列とＣＭＶ由来ＴＡＴＡボックス配列の間に少なくとも１個の、好ましくは４個のλＯＰ部位を挿入して正の調節フィードバック構築体を設計した。したがって、変異λＲ、例えばＳ９３Ｇを含むクマリンにより調節されるこのλＲ−Ｇｙｒ Ｂ発現系は、非常に高いレベルの誘導能を呈し、遺伝子発現の迅速で可逆的なオン−オフスイッチングを実現する。この系は、使用が報告されている他の調節系を相補することができ、その場合には開発中の特異的遺伝子の正確な発現調節および遺伝子治療に特に有益であることが証明される筈である。
【００１９】
このクメリン(coumerin  or  coumarin)調節遺伝子発現系を作出するためには、キメラトランス活性化遺伝子を含む発現カセットを作出する。発現を調節すべき遺伝子、すなわち導入遺伝子とこの系を含ませる発現カセットは同一であっても、別々であってもよい。
【００２０】
どんな発現ベクターまたは組込み発現ベクターも、このクメリン調節系用の発現カセットを作出するために使用してよい。このカセットは、他の任意の発現用ベクターに移動させることができ、この目的のために特に適当なウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、および単純ヘルペスＩ型ウイルスが挙げられる。
【００２１】
この発現カセットは、ｉｎ  ｖｉｖｏでおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に送達してよく、医薬上適当な担体によってヒトに送達してもよい。当業者は、投与部位や経路などの要因に応じて、様々なベクター、ならびに他の発現および送達成分の中から選択することができる。たとえば、リポソームや非リポソーム脂質試薬など、形質移入試薬と組み合せて、発現プラスミドベクターを直接組織に注入し、または静脈内投与によって導入してよい。しかし、発現カセットはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩ型ウイルスなど、ウイルスベクターを使用して送達するのが好ましい。
【００２２】
発現カセットおよびベクターは、患者を治療処置するために、医薬上適切な担体と共にキットの形で利用してもよい。
【００２３】
（図面の詳細な説明）
図１Ａ。誘導物質クメルマイシンの存在下で構成的に産生したキメラトランス活性化因子（生物学的活性キメラ型トランス活性化蛋白質）を二量体化しλＯＰに結合させて、導入遺伝子をオンにし、活性化ドメイン（ＡＤ）を遂行することによってキメラトランス活性化因子自体の発現を即座に増大させる。細胞にノボビオシンを添加すると二量体化トランス活性化因子の解離が生じて、導入遺伝子のスイッチがオフになり、トランス活性化因子の構成的発現がもたらされる。
図１Ｂ。それぞれ、クメリン調節導入遺伝子（Ｌｕｃ）およびトランス活性化因子λＲ−Ｇｙｒ Ｂ−ＡＤを別々に発現させるために、ｐＬｕｃおよびｐＧｙｒ Ｂと名付けた２個のプラスミドを設計する。
図１Ｃ。クメリン調節導入遺伝子およびトランス活性化因子用の２個の発現カセットを１個のプラスミドｐＬＵＲ（ｐＣＵＲ）の中に構築した。ＴＡＴＡ：ＣＭＶミニプロモーター、ＡＤ：ｐ６５−ＮＦｋＢの転写活性化ドメイン、λｏｐ：λリプレッサー結合部位。
図２Ａ。２個のプラスミドｐＧＦＰおよびｐＧｙｒ Ｂ（二重プラスミド、各０．５μｇ）、あるいはＧＦＰ遺伝子を含む１個のプラスミドｐＣＵＲ（１．０μｇ）（単一プラスミド）のどちらかを２９３Ａ細胞中に一時的に形質移入した。形質移入から３時間後にクメルマイシン（５ｎＭ）を加え、さらに４０時間後に写真を撮った。
図２Ｂ。２個のプラスミドｐＬｕｃおよびｐＧｙｒ Ｂ（ＤＰ、各０．２μｇ）、あるいはＬｕｃ遺伝子を含む１個のプラスミドｐＣＵＲ（０．４μｇ）（ＳＰ）のどちらかを、それぞれ、２９３Ａ細胞に一時的に形質移入した。クメルマイシン（５ｎＭ）による誘導の４０時間後、三通りでルシフェラーゼ活性を測定した。示した結果は、三通りの定量の平均および３個の実験の代表である。ウミシイタケのルシフェラーゼを構成的に産生するｐＲＬ−ＴＫベクターを同時形質移入することによって形質移入効率を規準化した。
図３。レポータープラスミドｐＬｕｃを安定的に形質移入した細胞に、野生型λＲあるいはその変異クローン２５（Ｓ９３Ｇ）、３３（Ｖ９２Ｃ／Ｓ９３Ｗ）、５４（Ｖ９２Ｌ／Ｓ９３Ｅ）、６４（Ｖ９２Ｌ／Ｓ９３Ｌ）、７６（Ｖ９２Ｃ／Ｓ９３Ｆ）、および７７（Ｖ９２Ｔ／Ｓ９３Ｔ）のいずれかを含むプラスミドｐＧｙｒ Ｂ（０．２μｇ）を一時的に形質移入した。ウミシイタケのルシフェラーゼを構成的に産生するｐＲＬ−ＴＫベクターを同時形質移入することによって形質移入効率を規準化した。形質移入から３時間後、形質移入細胞をクメルマイシン（５ｎＭ）で４０時間誘導し、溶解した細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。示した結果は、三通りの定量の平均および３個の実験の代表である。
図４Ａ。変異体Ｓ９３Ｇを安定的に形質移入することによって得られたクローン５の細胞を様々な濃度のクメルマイシンで４０時間誘導した。
図４Ｂ。同じ細胞を５ｎＭのクメルマイシンによって示した通り様々な時間誘導した。結果は、三通り実施した２種の独立した実験を表す。
図５Ａ。安定したクローンＳ９３Ｇ−５の細胞を５ｎＭのクメルマイシンと共に様々な濃度のノボビオシンによって４０時間誘導し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果は、三通り実施した２種の独立した実験を表す。
図５Ｂ。安定したクローンＳ９３Ｇ−５の細胞を最初にクメルマイシンで１１時間誘導し、次いでノボビオシンを加えて終濃度を２．５μＭにした。異なる時点で、細胞を収集してルシフェラーゼ活性をアッセイした。示した結果は、三通りの定量の平均および３個の実験の代表である。
図６Ａ。２個のプラスミドｐＧｙｒ ＢおよびｐＢａｘを安定的に形質移入して得られたクローンＫ５６２−Ｂａｘ  ６５を使用した。細胞を３６時間クメルマイシン（５ｎＭ）で誘導した。細胞のサイトゾル蛋白質画分（３０μｇ）でマウス抗チトクロムＣモノクローナル抗体によって（下枠）、または５×１０５個の細胞全体の細胞抽出物でマウスＢａｘに特異的反応性であるウサギポリクローナル抗マウスＢａｘ抗体によって（上枠）ウエスタンブロット分析を実施した。
図６Ｂ。アポトーシスＫ５６２−Ｂａｘ細胞およびＫ５６２野生型細胞のフローサイトメトリー分析を３６時間のクメルマイシン処理の有無下で実施した。
【実施例】
【００２４】
手順および実施例
細胞培養、培地、および化学薬品
１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ培地でヒト胚腎２９３Ａ細胞（ＡＴＣＣ）を５％ＣＯ２中３７℃で維持した。２．０ｍＭのＬ−グルタミンおよび１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地でヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ）を５％ＣＯ２中３７℃で維持した。安定２９３Ａ細胞系を、それぞれ、２００μｇ／ｍｌもしくは１５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Invitrogen）、およびそれぞれ、１２００μｇ／ｍｌもしくは６００μｇ／ｍｌのＧ４１８（MultiCell）のどちらかで選択しまたは維持した。Ｋ５６２の安定細胞系を４００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢで選択し維持した。
【００２５】
クマリン応答性発現カセットｐＬｕｃ、ｐＧＦＰ、およびｐＢａｘの構築
ＸｂａＩ部位を含むセンスプライマー、および制限部位ＡｓｃＩとＨｐａＩを含むアンチセンスプライマーを用いて、ｐＵＨＤ１０−３ベクター（非特許文献１３）から、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ＊）の最初期遺伝子のミニプロモーター配列をＰＣＲによって増幅した。増幅した配列をＸｂａＩ部位およびＨｐａＩ部位でｐＧ５ＣＡＴ（Clonetech）に挿入しｐＧ５ＣＭＶ＊を産生した。緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子をｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Clonetech）からＰＣＲ増幅しｐＧ５ＣＭＶ＊に挿入してｐＧ５ＣＭＶ＊−ＧＦＰを得た。４個および１２個のλオペレータードメインの複製（４×λＯＰおよび１２×λＯＰ）（１４）は、２個の合成オリゴヌクレオチド：５'−ＴＣＧＡＧＴＴＴＡＣＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＡＴＡＧ−３'（配列番号１）および５'−ＴＣＧＡＣＴＡＴＣＡＣ  ＣＧＣＣＡＧ  ＡＧＧＴＡＡＡＣ−３'（配列番号２）をアニーリングし多重自己連結させることによって得た。４個および１２個のλＯＰの複製に向けて多重自己連結産生物を選択し、ＸｈｏＩおよびＳａｌＩで消化し、ｐＧ５ＣＭＶ＊−ＧＦＰ中の同じ部位にクローン化して４ｘλｏｐＧＦＰおよび１２ｘλｏｐＧＦＰ（ｐＧＦＰ）を産生した。ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）コード配列（受入番号Ｍ１５０７７）をＬｕｃベクター（Promega）からＰＣＲ増幅した。増幅した産生物をＡｓｃＩおよびＨｐａＩでｐ１２ｘλｏｐＧＦＰ中にクローン化しｐＬｕｃを得た。同様に、マウスＢａｘコード配列（受入番号Ｌ２２４７２）をＰＣＲ増幅し、ＡｓｃＩおよびＨｐａＩでｐ１２ｘλｏｐＧＦＰ中にクローン化しｐＢａｘを得た。
【００２６】
キメラλＲ−Ｇｙｒ Ｂトランス活性化因子（生物学的活性キメラ型トランス活性化蛋白質）用発現カセットの構築
選択マーカーとしてネオマイシンまたはハイグロマイシンによりｐｃＤＮＡ３−λＲ−Ｇｙｒ Ｂトランス活性化因子を構築するために、バクテリオファージλリプレッサー（λＲ）（非特許文献１０）のＮ末端ＤＮＡ結合ドメイン（残基１〜１３１個）をＰＣＲ増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩ（クレノー末端平滑化）部位およびＥｃｏＲＶ部位でｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）中にクローン化しｐｃＤＮＡ３λＲ１３１を産生した。アミノ末端２４ｋサブドメイン細菌ＤＮＡジャイレースＢサブユニット（Ｇｙｒ Ｂ）（非特許文献８）を大腸菌ＤＨ５α株のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅してｐＧＥＭＴ−Ｇｙｒ Ｂを産生した。ｐＣＭＶ−ＡＤベクター（Stratagene）のプライマーの適当な制限部位によってｐ６５ＮＦкＢ活性化ドメイン（ＡＤＮＦкＢ）をＰＣＲ増幅した。増幅した産生物をＮｃｏＩおよびＸｂａＩでｐＧＥＭＴ−Ｇｙｒ Ｂ中にクローン化しｐＧＥＭＴ−Ｇｙｒ Ｂ−ＮＦкＢを産生し、これをさらにＥｃｏＲＶ部位およびＸｂａＩ部位でｐｃＤＮＡ３−λＲ１３１中にクローン化した。得られたプラスミドをｐｃＤＮＡ３−λＲ１３１−ＧｒｙＢ−ＮＦкＢと名付けた。ＳＶ４０プロモーターを目標としたクマリン応答性発現カセットを構築するために、ミニＣＭＶ＊プロモーター（非特許文献１３）と共に４ｘλｏｐを適当なプライマーにより４ｘλｏｐＧＦＰからＰＣＲによって増幅した。ＳＶ４０初期プロモーター（非特許文献１５）を含むｐＭベクター（Clonetech）のＮｃｏＩ部位およびＳｍａＩ部位中に増幅した断片をクローン化しｐＭＳＶ４０ｅ−４ｘλｏｐ−ＣＭＶ＊を産生した。λＲ１３１−ＧｒｙＢ−ＮＦкＢカセットをｐｃＤＮＡ３−λＲ１３１−ＧｒｙＢ−ＮＦкＢからＰＣＲ増幅し、ｐＭＳＶ４０ｅ−４ｘλｏｐ−ＣＭＶ＊中にクローン化して、ｐＭＳＶ４０ｅ−４ｘλｏｐ−ＣＭＶ＊−λＲ１３１−ＧｒｙＢ−ＮＦкＢを産生しｐＧｙｒ Ｂと名付けた。
【００２７】
クマリンが調節する２個の遺伝子発現カセットを含むｐＣＵＲの構築
キメラλＲ−Ｇｙｒ Ｂトランス活性化因子（生物学的活性キメラ型トランス活性化蛋白質）の発現カセットおよびクマリン応答性遺伝子の発現カセットを含む１個のプラスミドを構築するために、ＳＶ４０ｅ−４ｘλｏｐ−λＲ１３１断片をＡａｔＩＩ平滑末端およびＥｃｏＲＶで消化した後、ｐＭＳＶ４０ｅ４ｘλｏｐ−λＲ１３１−ＧｒｙＢ−ＮＦкＢから単離し、ＮｒｕＩ部位およびＥｃｏＲＶ部位でｐｃＤＮＡ３−λＲ１３１−ＧｒｙＢ−ＮＦкＢ中にクローン化し、ｐｃＤＮＡ３−ＳＶ４０ｅ−４ｘλｏｐ−λＲ１３１−ＧｒｙＢ−ＮＦкＢを産生した。次に、ＳｍａＩ消化によって１２ｘλｏｐＬｕｃ断片をｐＬｕｃから単離し、ＮｄｅＩ平滑末端でｐｃＤＮＡ３−ＳＶ４０ｅ−４ｘλｏｐ−λＲ１３１−ＧｒｙＢ−ＮＦкＢ中にクローン化し、ｐｃＤＮＡ３−１２ｘλｏｐＬｕｃ−ＳＶ４０ｅ−４ｘλｏｐ−λＲ１３１−ＧｒｙＢ−ＮＦкＢを産生し、これをｐＣＵＲと名付けた。
【００２８】
λリプレッサー１３１ＤＮＡ結合ドメインの変異誘発
QuikChange（登録商標）Site−Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）のメーカーが推奨するように、λ１３１ＤＮＡ結合ドメインの残基８５、９２、および９３でアミノ酸置換を実施した。手短に言えば、残基８５、９２、および９３を包含する２本の４２ｂｐの相補性特異的プライマーを８５、９２、および９３残基のそれぞれにＶＮＮ（Ｖ＝Ａ、Ｃ、ＧおよびＮ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）コドンを含めて合成した。標準的サーマルサイクリング反応は、Pfu Turbo（Stratagene）を使用し鋳型ＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ３−λＲ１３１−Ｇｙｒ Ｂ−ＡＤＮＦкＢを用いて実施した。ＰＣＲ産生物をＤｐｎＩで完全に消化し、XL2-Blue（Stratagene）に形質転換した。単一コロニーを単離し、配列決定してアミノ酸置換を確定した。第一に、ｐＧＦＰを一時的に同時形質移入することによって変異クローンをスクリーニングして、誘導能および背景蛍光強度を評価した。２９３Ａ細胞にｐＬｕｃを一時的にまたは安定して同時形質移入することによって適切な候補をさらに評価し、その誘導能および基礎発現レベルを完全に特徴付けた。
【００２９】
細胞系の安定した産生およびルシフェラーゼアッセイ
形質移入の前日に、指数関数的に増殖する２９３Ａ細胞を６０ｍｍ皿に８×１０５個播種し、SuperFect Kit（Qiagen）を使用し、５μｇのＸｍｎＩ直線化ｐＬｕｃおよび０．２μｇのｐｃＤＮＡ３．１ハイグロマイシンを同時形質移入した。あるいは、細胞にＰｖｕＩ直線化ｐＣＵＲを形質移入した。形質移入から２日後、細胞を１００ｍｍ皿に交換し、適当な抗生物質で２週間選択した。さらにアッセイするために単一クローンを選択した。Ｌｕｃ活性をアッセイするために、１×１０５個の細胞を２４穴プレート（Corning Inc. Costar）に播種し、直ちに５ｎＭのクメルマイシンで誘導した。誘導４０時間後、細胞を１００μｌの溶解緩衝液（Promega）で２０分間溶解した。Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega）を使用し、２０μｌの全細胞ライセートを使用してＬｕｃ活性を定量した。同時形質移入したｐＲＬ−ＴＫから構成的に発現させたウミシイタケのルシフェラーゼの活性により推定した形質移入効率によって、レポーターホタルルシフェラーゼ活性を測定し規準化した。Ｂａｘ遺伝子の誘導性発現には、野生型Ｋ５６２細胞に電気穿孔法を使用し、直線化ｐＢａｘおよびｐＧｙｒ Ｂの５μｇのＤＮＡを形質移入した。細胞系をハイグロマイシンで選択し、抗Ｂａｘ抗体を使用しウエスタンブロットによって可視化して誘導性状態および非誘導性状態の正のクローンをスクリーニングした。
【００３０】
サイトゾル抽出物の調製および免疫ブロット
ｐＢａｘおよびｐＧｙｒ Ｂを安定的に形質移入したＫ５６２（１０６）野生型およびＫ５６２細胞（１０６）を３５ｍｍ皿に播種し５ｎＭのクメルマイシンで誘導した。免疫ブロットには、誘導から３６時間後、細胞を２×添加液で１００℃、５分間溶解した。サイトゾル抽出物には、細胞（１０７）を播種し、誘導から３６時間後、細胞を冷ＰＢＳ（MultiCell）で２度洗浄し、続いて２００×ｇで５分間遠心分離した。２２０ｍＭのマンニトール、６８ｍＭのショ糖、５０ｍＭのパイプ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、５０ｍＭのＫＣＬ、５ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのジチオスレイトール、およびプロテアーゼ阻害剤を含む３００μｌの抽出緩衝液に細胞ペレットを再懸濁した。氷上で３０分間インキュベーション後、ガラス製ダウンスおよびＢペスルを使用し細胞を８０ストローク均質化した。均質化細胞を１４，０００×ｇで１５分間遠心し上清を除去し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うまで−８０℃で貯蔵した。サイトゾル蛋白質抽出物（３０μｇ）を５分間煮沸し、１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。蛋白質をニトロセルロース膜（Hybond ECL）に移し、１０％脱脂乳／ＴＢＳＴ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中、室温で１時間ブロックした。既に報告されているように（非特許文献１６）、マウスＢａｘに特異的に反応するように思われる、ウサギポリクローナル抗マウスＢａｘ抗体（Santa Cruz Biotechnology）、またはマウス抗チトクロムＣモノクローナル抗体（BD pharMingen Technical）のどちらかで膜を検査した。２次抗体を西洋わさびペルオキシダーゼに複合化させた。
【００３１】
フローサイトメトリー
３５ｍｍ皿中の細胞（１０６）を５ｎＭのクメルマイシンで３６時間処理し、次いでアポトーシスを検出するためにAnnexin-V-Flous染色キット（Roche, Mannheim）を使用し染色した。励起源として４８８ｎｍで１５ｍＷのアルゴンイオンレーザーを備えたCoulter EPICS（登録商標）ＸＬ−ＭＣＬフローサイトメーター（Beckman-Coulter, Hieleah， Fl）を使用し１０，０００個の細胞の分析を実施した。４８８ｎｍのダイクロイック・ロング・パス・フィルタを用いて前方散乱および側方散乱パラメーターを使用し全細胞集団を選択した。５５０ｎｍのダイクロイック・ロング・パス・フィルタおよび５２５ｎｍの帯域フィルタセットを使用しＦＩＴＣ緑色蛍光発光を検出した。６４５ｎｍのダイクロイック・ロング・パス・フィルタおよび６２０ｎｍの帯域フィルタセットを使用し、ヨウ化プロピジウム（propidium iodide）染色した細胞から赤色蛍光を検出した。
【００３２】
（実施例１）
キメラλＲ−Ｇｙｒ Ｂトランス活性化因子（生物学的活性キメラ型トランス活性化蛋白質）および標的導入遺伝子を発現させるための構築体
クマリン調節遺伝子発現系を構築するために、細菌ファージλリプレッサー（λＲ）のＮ末端ドメイン（コドン１〜１３１個を）をＧｙｒ Ｂドメイン（細菌ＤＮＡジャイレースのコドン２〜２２０）に融合した。転写活性化ドメインｐ６５ＮＦｋＢをさらにＧｙｒ ＢドメインのＣ末端に融合してキメラトランス活性化因子（生物学的活性キメラ型トランス活性化蛋白質）を作製した。５２個までの基礎ＳＶ４０初期プロモーター配列（非特許文献１５）およびＣＭＶプロモーター（非特許文献１３）のＴＡＴＡボックスからなるハイブリッドプロモーターによってキメラトランス活性化因子の発現を制御する。さらに、λオペレーター（λＯＰ）の４個の結合部位をＳＶ４０とＴＡＴＡボックス配列間に挿入した。導入遺伝子の発現を調節するために、λオペレーター（λＯＰ）部位（非特許文献１４）の１２個の複製をＣＭＶミニ−プロモーター（非特許文献１３）の直接上流に置いて下流の遺伝子の発現を制御した。この調節系では、ハイブリッドＳＶ４０−ＣＭＶプロモーターは、細胞でキメラトランス活性化因子の中程度の発現を構成的に指示する。クメルマイシンを添加するとトランス活性化因子の二量体化が誘導され、λＲがλＯＰ部位へ結合し、それによって正の調節フィードバック方式でトランス活性化因子の産生が増大し、標的導入遺伝子の発現が活性化される。クメルマイシンによって誘導されたトランス活性化因子二量体は、ノボビオシンを添加することによって解離し、それによって直ちに導入遺伝子の発現をオフにすることができる（図１Ａ）。キメラトランス活性化因子の発現カセット、ならびにレポーター遺伝子（ＬｕｃまたはＧＦＰ）を含むクメルマイシン／ノボビオシン応答性導入遺伝子の発現カセットは、同時形質移入するために、または安定した細胞系を２段階で確立するために、２個の別々のプラスミドｐＬｕｃおよびｐＧｙｒ Ｂ中に構築し（図１ＢのＢ）、あるいは好都合な誘導系統を１段階で確立するために１個のプラスミド（ｐＣＵＲ）中に構築する（図１ＢのＣ）。
【００３３】
（実施例２）
キメラλＲ−Ｇｙｒ Ｂトランス活性化因子（生物学的活性キメラ型トランス活性化蛋白質）のクメルマイシン依存性機能特徴付け
キメラトランス活性化因子λＲ−Ｇｙｒ Ｂ−ＮＦｋＢが、遺伝子発現の誘導に関してクメルマイシン応答性であるかどうかを検査するために、本発明者らは２プラスミド誘導性および１プラスミド誘導性発現系の導入遺伝子発現カセット中に、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）および緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をコードする２個のレポーター遺伝子をクローン化した。構築体は、一時的にＨＥＫ２９３Ａ細胞中に形質移入した。形質移入細胞をクメルマイシンの添加によって４０時間誘導した。図２Ａに示す通り、ＧＦＰ発現は２９３Ａ細胞中両方の系で著しく誘導された。同様の結果が、レポータールシフェラーゼで観察された（図２Ｂ）。両カセットのルシフェラーゼ活性の誘導能は発光量比約５０で匹敵する。この調節系のこの中程度の誘導能は、クメルマイシンの非存在下で、低くはあるけれど明白なＧＦＰの発現によって示されるように、比較的高いその基礎活性によって少なくとも部分的に説明がつく（図２Ａ）。
【００３４】
（実施例３）
λリプレッサーＤＮＡ結合ドメインを変異させて内因性二量体化を排除
このλＲ−Ｇｙｒ Ｂベース調節系の誘導効率を改善するために、基礎発現レベルを最小限に抑える努力を行った。主としてλＲのＣ末端ドメイン残基１３２〜２３６が、リプレッサーのホモ二量体化を媒介しているが、Ｎ末端ドメインのへリックス５中の残基Ｉｌｅ−８５、Ｖａｌ−９２、Ｓｅｒ−９３なども、λＲがオペレーター（非特許文献１２）へ結合するための二量体化に関与していることが知られている。２９３Ａ細胞中で観察されたトランス活性化因子λＲ−Ｇｙｒ Ｂ−ＮＦｋＢの基礎活性は、ヘリックス５−ヘリックス５の相互作用に起因するように思われる。この誘導系の基礎活性を低減するために、本発明者らは、λＲのヘリックス５−ヘリックス５の相互作用に潜在的に関与するＩｌｅ−８５、Ｖａｌ−９２、およびＳｅｒ−９３の各残基ついてＰＣＲに基づくランダム変異誘発を実施した。λＲ−Ｇｙｒ Ｂ−ＮＦｋＢトランス活性化因子中に位置するｐＧｙｒ Ｂで１００を超える潜在的変異構築体を発生させ、クマリン応答性ルシフェラーゼレポーター遺伝子（ｐＬｕｃ）を一時的に形質移入し、２９３Ａ細胞中に入れてその基礎発現レベルおよび誘導能を評価した。クメルマイシンに応答して、これらの変異体の活性には劇的な変動が観察された。一般に、同定されたこれらの３個の部位の変異体では、親物質と比較すると低い誘導活性が示された。しかし、ほとんどの変異体の基礎発現レベルは野生型よりも著しく低かった。その誘導能を比較後、７種の変異構築体、すなわち、クローン２５（Ｓ９３Ｇ）、３３（Ｖ９２ＣおよびＳ９３Ｗ）、５４（Ｖ９２ＬおよびＳ９３Ｅ）、６４（Ｖ９２ＬおよびＳ９３Ｌ）、７６（Ｖ９２ＣおよびＳ９３Ｆ）、ならびに７７（Ｖ９２ＴおよびＳ９３Ｔ）（表Ｉを参照）を選択してさらにその誘導能を研究した。そのために、クマリン応答性ルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定的に形質移入した２９３Ａ細胞中にこれらの構築体を一時的に形質移入した。クメルマイシンで処理した形質移入細胞でルシフェレアーゼ活性を測定した。図３に示す通り、ほぼ全てのこれらの変異体は、クメルマイシンに応答して活性に多少の減少を示したが、野生型よりもその基礎発現レベルが減少したために、これらの変異体のほとんどで誘導の規模は著しく増大した。最も特筆すべき変異体Ｓ９３Ｇ（＃２５）は、野生型に匹敵する誘導活性を示し、基礎発現レベルは非常に低く発光量比は１，４６０であった。同様の結果がＨｅＬａ細胞でも観察された（データ表示せず）。この変異体をさらに特徴付けるため、２９３Ａ細胞で誘導系統を１段階で確立する目的で、Ｓ９３Ｇ変異キメラトランス活性化因子をプラスミドｐＣＵＲに組み込んだ。安定したクローンを選択し、そのクメルマイシン応答性を分析した。試験した５０個全ての安定したクローンは、様々な誘導活性でクメルマイシンに応答した。基礎発現レベルが非常に低いために、単離したクメルマイシン応答性クローンの約３０％で誘導の規模が３桁を超えることがルシフェラーゼ活性アッセイによって判明した。特に重要なものは、クローン２３および４４であり、これらはクメルマイシン処理後、発光量比が１０，０００を超えた（表ＩＩ）。
【表１】
0004719147.tif 000002
【００３５】
λリプレッサーの３個の残基、Ｉｌｅ８４、Ｖａｌ９１、およびＳｅｒ９２をランダムに変異させた。列挙した７個のアミノ酸置換変異構築体は、高誘導能を示し、選択して特徴付けを行った。
【００３６】
【表２】
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【００３７】
Ｌｕｃ遺伝子を含むｐＣＵＲを細胞に安定的に形質移入した。試験した５０個のネオマイシン耐性クローンの全てがクメルマイシン応答性であった。高誘導クローンを１０個選択して、クメルマイシン（５ｎＭ）の非存在および存在下、その誘導能をルシフェラーゼ活性アッセイによって特徴付けた。値は、３種の別個の細胞培養から３個の別個のルシフェラーゼ定量の平均である。
【００３８】
（実施例４）
安定な細胞系でのクメルマイシン応答、および誘導した発現のノボビオシンによる即時スイッチオフ
この誘導系の動力学的特性を安定な細胞系でさらに検査した。発現の用量応答性を研究するために、中程度の誘導能を示す安定な細胞クローンＳ９３Ｇ−５において、様々な濃度のクメルマイシンで４０時間処理した細胞のルシフェラーゼ活性をアッセイした。図４Ａに示す通り、ルシフェラーゼの発現をクメルマイシンによって用量依存的に誘導した。０．５ｎＭ（約０．５ｎｇ／ｍｌ）程度の低い濃度の抗生物質でルシフェラーゼの発現が明らかに誘導されたことが観察された。最高の誘導は、濃度２．５〜５ｎＭのクメルマイシンで実現した。クメルマイシンの誘導能は５０ｎＭの濃度で減少し、したがってこの薬物での誘導には（１０倍を超える）相当広い用量範囲を利用することができる。誘導５時間後には、かなりのルシフェラーゼ活性が検出され（データ表示せず）、最高誘導能は誘導２４時間後に観察された（図４Ｂ）。
【００３９】
クメルマイシンのモノマーであるノボビオシンが、ルシフェラーゼのクメルマイシン誘導発現をスイッチオフできるかどうかを研究するために、２９３Ａ細胞で様々な濃度のノボビオシンを５ｎＭのクメルマイシンと共に４０時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性のアッセイによって、ルシフェラーゼのクメルマイシン誘導性発現は、用量依存的に効果的に阻害されることが判明した。しかし、５μＭのノボビオシンの濃度で、９８％を超えるクメルマイシン誘導性ルシフェラーゼ発現が抑制された（図５Ａ）。細胞増殖速度および細胞に形質移入したＣＭＶ−ＧＦＰ構築体（データ表示せず）の一時的発現から判断する限り、１０μＭの濃度のクメルマイシンおよび２５μＭの濃度のノボビオシンが、いかなる検出可能な細胞毒性も及ぼさないことは注目すべきである。この誘導系に対するノボビオシンのスイッチオフ能をさらに実証するために、クローンＳ９３Ｇ−５細胞を５ｎＭのクメルマイシンで１１時間誘導し、その後、ノボビオシンを２．５μＭの濃度になるように培養に加えた。対照培地ではルシフェラーゼ活性は２４時間を超えて継続的に増加したが、２．５μＭの濃度のノボビオシンは、投与後４時間未満でルシフェラーゼのクメルマイシン誘導性発現をほぼ完全にスイッチオフしたことがルシフェラーゼアッセイによって示された（図４Ｂ）。これらの結果から、ノボビオシンが、この誘導系で導入遺伝子の発現を迅速有効に停止するクメルマイシンの適当なアンタゴニストであることが明瞭に実証された。
【００４０】
（実施例５）
変異キメラトランス活性化因子（生物学的活性キメラ型トランス活性化蛋白質）による、ｋ５６２細胞でのアポトーシス遺伝子ＢＡＸの緊密に調節された発現
高レベルのＢａｘ（Ｂｃｌ２関連Ｘ蛋白質）の発現によって、様々なヒト癌細胞でアポトーシスが誘発されることが報告されてきた（非特許文献１７）。悪性造血細胞、例えばｋ５６２では、Ｂａｘが過剰発現すると形質移入細胞はチトクロムＣの放出を経由してアポトーシスに至る（非特許文献１８）。キメラトランス活性化因子（生物学的活性キメラ型トランス活性化蛋白質）が調節する遺伝子発現の緊密性を評価するために、前述の２プラスミド誘導系の導入遺伝子発現カセット中にアポトーシスＢａｘ遺伝子をクローン化した。プラスミドｐＧｙｒ Ｂ中の野生型およびＳ９３Ｇ変異体トランス活性化因子をｐＢａｘプラスミドと共にＫ５６２細胞中に同時形質移入した。両プラスミドを収容する安定なクローンを単離し誘導後に特徴づけをした。ウエスタンブロット分析によって、Ｂａｘの高度誘導性発現を備えたクローンは、野生型トランス活性化因子形質移入細胞ではほとんど同定されないことが判明した。単離したクローンの大部分が、Ｂａｘの更なる誘導性発現も示さず、または誘導性発現も示しても貧弱だったからである（データ表示せず）。しかし、Ｂａｘの誘導性発現が高いクローンは、トランス活性化因子変異体Ｓ９３Ｇを形質移入した細胞から容易に単離された。図６Ａに示す通り、１つの代表的なクローンＳ９３Ｇ−Ｂａｘ  ６５から、３６時間クメルマイシンで処理した細胞でＢａｘの発現が著しく誘導された。同時に、３６時間のクメルマイシン処理に応答して、ミトコンドリアから相当量のチトクロムｃが放出された。蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析によって、薬物は親細胞では細胞死をさらに誘導しないが（図６Ｂ、上枠）クメルマイシンでＳ９３Ｇ−Ｂａｘ６５細胞を処理すると、アポトーシス細胞画分は６．７％から４５．５％に増加する（図６Ｂ、下枠）ことが一貫して裏付けられ、これはＴｅｔ系で観察された結果に匹敵する結果である（非特許文献１８）。変異Ｓ９３Ｇトランス活性化因子を有するこの系は、クメルマイシンによって緊密に調節されて、哺乳動物細胞中でアポトーシス誘導性遺伝子を発現することをこれらの結果は実証している。
【００４１】
略語：ＧＦＰ：緑色蛍光蛋白質、Ｇｙｒ Ｂ：細菌ＤＮＡジャイレースＢサブユニット、ＣＭＶ：ヒトサイトメガロウイルス、λＲ：λリプレッサー、λＯＰ：λオペレーター、ＦＡＣＳ：蛍光標示式細胞分取器
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１Ａ】クマリン調節系の模式図である。
【図１Ｂ】Ｂは発現ベクターの可能な一実施形態を例示するマップである。Ｃは発現ベクターの可能な第２の実施形態を例示するマップである。
【図２Ａ】二重プラスミド発現ベクターおよび単一プラスミド発現ベクターが２９３Ａ細胞でＧＦＰ遺伝子を活性化する能力を試験した結果である。
【図２Ｂ】二重プラスミド発現ベクターおよび単一プラスミド発現ベクターが２９３Ａ細胞でルシフェラーゼ遺伝子を活性化する能力を試験した結果である。
【図３】変異λリプレッサーを含むトランス活性化因子の基礎活性およびクメルマイシンにより誘導された活性を試験したアッセイの結果である。
【図４Ａ】様々な濃度のクメルマイシンでルシフェラーゼ遺伝子の活性化を試験したアッセイの結果である。
【図４Ｂ】７２時間にわたりクメルマイシンによるルシフェラーゼ遺伝子の活性化を試験したアッセイの結果である。
【図５Ａ】様々な濃度のノボビオシンでルシフェラーゼ遺伝子の活性化を試験したアッセイの結果である。
【図５Ｂ】５０時間にわたりクメルマイシン単独の存在下およびクメルマイシンとノボビオシンの存在下でルシフェラーゼ遺伝子の活性化を試験したアッセイの結果である。
【図６Ａ】クメルマイシン処理の有無による、ｋ５６２細胞の細胞溶解液およびサイトゾル蛋白質画分のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図６Ｂ】クメルマイシン処理の有無によるｋ５６２細胞のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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