(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３７Ｂ１と称する細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢー１２４４１）及び８Ｇ６と称する細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢー１２６５７）から選択されるハイブリドーマ細胞。
【請求項２】
請求項１記載のハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願の全体にわたって、様々な公開が引用される。これらの公開の開示は、本発明が関連する最新技術をさらに十分に記述するために本願に引用することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ある種のCD8特異的抗体を用いてCD8+細胞を単離する陽性選択方法に関する。単離されたCD8+細胞は、ウイルス感染及び腫瘍と闘うための媒体として重要性を有する。
【０００３】
発明の背景
ヒトにおいて、CD8+細胞は、細菌及びウイルスのような潜在的に有害な外来の存在物から防御する免疫系の能力においてきわめて重要な役割を果たす[1]。CD8+細胞は血液中を循環し、そしてそれらの表面上にCD8タンパク質を保有する。必要に応じて、これらの細胞は細胞傷害性細胞（すなわち、細胞を殺す細胞）に転化され、これらは続いて外来の細胞、ウイルス及び被験体に存在する他の有害な病原体を破壊する[2]。宿主防御におけるCD8+細胞の効果的な役割のために、これらはウイルス感染及び悪性腫瘍のような疾患を処置するための治療法として単離された形態において大きな可能性を保有する[3]。
【０００４】
これまで、ヒトCD8+細胞の精製は、陰性選択により行われてきた。詳細には、末梢血単核細胞(「PBMC's」)を非CD8亜集団に特異的なモノクローナル抗体のカクテルとインキュベーションする。これらの亜集団には、例えば、B細胞、CD4+細胞、NK細胞、マクロファージ及び好中球が包含され、そして各々特異的な非CD8「マーカー」を含有する。次に、これらの亜集団は、得られた抗体カクテルから磁気ビーズを用いて除かれる[4]。この技術は、ある重大な不都合を有する。第一に、いくつかのモノクローナル抗体が非CD8+細胞細胞を除くために必要とされることである。第二に、得られたCD8+集団は、比較的低いレベルの非CD8マーカーを保有する非CD8+細胞からの混入の難点があることである。最後に、全ての非CD8+細胞を除くために磁気分離方法を用いる場合、多数の磁気ビーズが必要とされる。
【０００５】
発明の要約
本発明は、
(a) CD8+細胞と一次抗体の間で第一の複合体の形成を可能にする条件下で、単離された末梢単核血液細胞のサンプルをCD8+細胞の表面上に存在するCD8分子上の配列AAEGLDTQRFSGまたはその一部に特異的に結合するが、いったんそれに結合してもそれらのCD8+細胞を活性化しない一次抗体と接触させること；
(b)得られた第一の複合体中に存在しないあらゆる一次抗体をサンプルから分離すること；
(c) 第一の複合体と二次抗体の間で固定された第二の複合体の形成を可能にする条件下で、サンプルを第一の複合体中の一次抗体に特異的に結合する固定された二次抗体と接触させ、それによりサンプル中に存在するCD8+細胞を固定すること；
(d)得られた固定された第二の複合体から工程(c)において固定されなかったサンプル中に存在する細胞を分離すること；
(e) 固定された第二の複合体を、CD8+細胞及び一次抗体-二次抗体の間の固定された第三の複合体への第二の複合体の解離を引き起こす作用因子と適当な条件下で接触させること；及び
(f) 固定された第三の複合体をCD8+細胞から分離し、それによりCD8+細胞を単離すること
の工程を含んでなる、CD8+細胞を単離する方法を提供する。
【０００６】
本発明はまた、CD8+細胞の表面上に存在するCD8分子に特異的に結合するがこれらのCD8+細胞を活性化しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も提供する。本発明はさらに、本発明のハイブリドーマ細胞系の各々により産生されるモノクローナル抗体を提供する。最後に、本発明は、関連するポリペプチド、単離されたCD8+細胞及びキットを提供する。
【０００７】
発明の詳細な記述
37B1及び8G6と称するハイブリドーマ細胞系は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の必要条件に従い且つそれを満たしてAmerican Type Culture Collection(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 2010-2209にそれぞれATCC受託番号HB-12441及びHB-12657で寄託した。
【０００８】
本発明は、ある種の他の試薬と一緒に、抗-CD8抗体を用いることによりCD8+細胞を単離する方法を提供する。詳細には、本発明は、
(a) CD8+細胞と一次抗体の間で第一の複合体の形成を可能にする条件下で、単離された末梢単核血液細胞のサンプルをCD8+細胞の表面上に存在するCD8分子上の配列AAEGLDTQRFSGまたはその一部に特異的に結合するが、いったんそれに結合してもそれらのCD8+細胞を活性化しない一次抗体と接触させること；
(b)得られた第一の複合体中に存在しないあらゆる一次抗体をサンプルから分離すること；
(c) 第一の複合体と二次抗体の間で固定された第二の複合体の形成を可能にする条件下で、サンプルを第一の複合体中の一次抗体に特異的に結合する固定された二次抗体と接触させ、それによりサンプル中に存在するCD8+細胞を固定すること；
(d)得られた固定された第二の複合体から工程(c)において固定されなかったサンプル中に存在する細胞を分離すること；
(e) 固定された第二の複合体を、CD8+細胞及び一次抗体-二次抗体の間の固定された第三の複合体への第二の複合体の解離を引き起こす作用因子と適当な条件下で接触させること；及び
(f) 固定された第三の複合体をCD8+細胞から分離し、それによりCD8+細胞を単離すること
の工程を含んでなる、CD8+細胞を単離する方法を提供する。
【０００９】
本明細書において用いる場合、「CD8+細胞」は、その表面上にCD8タンパク質を有するT細胞を意味する。好ましい態様として、CD8+細胞はヒトCD8+細胞である。CD8+細胞は、あらゆるCD8+細胞を保有する種からであることができる。CD8+細胞を「単離すること」は、CD8+細胞:非CD8+細胞の比率が少なくとも約７：１である末梢単核血液細胞の集団を得ることを意味する。本発明の好ましい態様として、この比率は少なくとも約９：１である。
【００１０】
本発明は、与えられたエピトープに特異的に結合するいくつかのタイプの抗体を用いる。より詳細には、本発明は、CD8+細胞の表面上に存在するCD8分子上の配列AAEGLDTQRFSGまたはその一部に特異的に結合するが、いったんそれに結合してもこれらのCD8+細胞を活性化しない「一次抗体」を使用する。ここで、CD8+細胞「活性化」は、CD8+細胞にγ-インターフェロン(「γ-IFN」)を発現させることを意味する。この活性化は、市販されているキットを用いて実施することができるサンドイッチELISAのような日常的方法を用いて測定することができる。
【００１１】
そのような一次抗体には、ハイブリドーマ細胞系37B1(ATCC受託番号HB-12441)及び8G6(ATCC受託番号HB-12657)により産生されるモノクローナル抗体が包含されるが、これらに限定されるものではない。これらの抗体がCD8+細胞に結合するがこれらを活性化しないことを可能にする条件は、当該技術分野において周知である。これらの条件は記述されており、例えば、１％ヒト血清アルブミン(HSA)及び０.２％クエン酸ナトリウムを含有するCa2+及びMg2+を含まないダルベッコのリン酸緩衝食塩水(DPBS)のような適当なバッファー中で且つ4rpmに設定した回転器で「転倒型」回転により穏やかに混合することである。
【００１２】
本明細書において用いる場合、「抗体」という用語には、天然に存在する抗体及び非天然に存在する抗体の両方が包含されるが、これらに限定されるものではない。詳細には、「抗体」という用語には、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、並びにその結合フラグメントが包含される。さらに、「抗体」という用語には、キメラ抗体及び完全に合成の抗体、並びにそのフラグメントが包含される。一つの態様として、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、ヒト、または例えばマウス及びウサギを包含する別の種のものであることができる。本発明において、一定のエピトープに「特異的に」結合する抗体は、それがあらゆる他のエピトープに結合する解離定数より少なくとも約１０倍小さい解離定数でそのエピトープに結合する。一つの態様として、この解離定数比は少なくとも約100である。好ましい態様として、この解離定数比は少なくとも約103である。
【００１３】
本発明の方法において用いる「二次抗体」は、一次抗体の任意の部分のエピトープを特異的に認識する任意の抗体であることができる。好ましい態様として、二次抗体は、一次抗体の定常(Fc)領域の部分を特異的に認識する。そのような抗-Fc抗体は市販されており、例えば、磁気ビーズ上に固定されたヒツジ抗-マウス抗体[5]を含む。
【００１４】
CD8+細胞及び固定された抗体への固定された第二の複合体の解離を引き起こす作用因子は、一次抗体への特異的結合に関してCD8分子とうまく競合するあらゆる作用因子であることができる。好ましい態様として、この作用因子は、配列AAEGLDTQRFSGを有するCD8-3と呼ばれるポリペプチドである。一つの態様として、固定された二次抗体は、磁気ビーズに操作可能につけられた抗体を含んでなる。
【００１５】
本発明はまた、CD8+細胞の表面上に存在するCD8分子に特異的に結合するが、これらのCD8+細胞を活性化しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も提供する。一つの態様として、ハイブリドーマ細胞系は、37B1(ATCC受託番号HB-12441)及び8G6 (ATCC受託番号HB-12657) と称する細胞系から選択される。本発明はさらに、本発明のハイブリドーマ細胞系の各々により産生されるモノクローナル抗体を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、アミノ酸配列AAEGLDTQRFSGを含んでなる本発明のモノクローナル抗体を作製するために有用なポリペプチドを提供する。好ましい態様として、ポリペプチドは、CD8-3と呼ばれ且つアミノ酸配列AAEGLDTQRFSGを有するポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、場合により、C末端またはN末端の端に１またはそれ以上の追加のアミノ酸残基を含んでなることができる。好ましい態様として、ポリペプチドは配列NKPKAAEGLDTQRFSGKRLGを有する。
【００１７】
本発明はさらに、本発明の方法により単離されるCD8+細胞の集団を提供する。最後に、本発明は、別個の画分に、(a) CD8+細胞の表面上に存在するCD8分子上の配列AAEGLDTQRFSGまたはその一部に特異的に結合するが、いったんそれに結合してもそれらのCD8+細胞を活性化しない抗体；及び(b) CD8+細胞-抗体複合体の解離を引き起こす作用因子を含んでなるCD8+細胞を単離することに使用するキットを提供する。一つの態様として、CD8+細胞-抗体複合体の解離を引き起こす作用因子は、配列AAEGLDTQRFSGを有するポリペプチドを含んでなる。好ましい態様として、作用因子は、配列AAEGLDTQRFSGからなるポリペプチドである。
【００１８】
本発明のキットはさらに、発明の方法の結合及び解離工程を行うために有用な試薬を含んでなることができる。本発明のキットの成分は、市販されているかまたは当該技術分野において周知の方法に従って製造することができる。さらに、本発明のキットの成分は、溶液中であるかまたは適切なように凍結乾燥することができる。好ましい態様として、キットはさらに使用説明書を含んでなる。
【００１９】
本発明に関連する以下の方法は、当該技術分野において慣例的である：CD8+細胞を次に単離する末梢単核血液細胞を単離すること[6]；結合した抗体及び/または細胞を含有するサンプルから結合していない抗体及び細胞を遠心分離またはスピン膜(spinning membrane)により分離すること；並びにポリスチレンフラスコ、カラムまたはビーズにより抗体を固定すること[4,7]。
【００２０】
本発明は、以下の実験の詳細を参照することによりさらによく理解されるが、当業者は、詳述する特定の実験がその後に続く請求項においてさらに十分に記述するような本発明の単なる実例にすぎないことを理解する。
【００２１】
実験の詳細
原理
ヒトCD8+細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)の調製物から陽性または陰性選択のいずれかにより単離することができる。陽性選択は、CD8+細胞の非常に精製された集団をもたらす。陰性選択は、十分な数のCD8+細胞をもたらすが、選択方法の後に残存する低レベルの混入する非CD8集団を有する。
【００２２】
目的は、CD8+細胞に高い親和性を有するが、選択工程の間に細胞を活性化せず、そして細胞から容易に溶離することができる抗体を作製することであった。抗-ペプチド抗体は、これらの規準を満たすと思われた。しかしながら、抗-ペプチド抗体は低い親和性のものであるかもしれず、そして線状のペプチド配列のみを認識する可能性があり、天然の抗原との反応性を妨げることが既知であった。
【００２３】
抗-CD8坑体は、インビトロ刺激プロトコルの間に生来の応答する細胞(responder cells)として効果的に作用するそれらの能力を小さくするので、選択工程の間に細胞を活性化しないことが必要であった。細胞集団を選択的に単離するためのペプチド遊離の使用は、Tseng-Law, et al. [8]によりCD34+細胞について示されている。
【００２４】
方法
CD8α鎖を親水性配列について調べ、４個のペプチドを選択した。全てを担体としてのスカシガイヘモシアニン(KLH)に連結し、マウスを免疫するために用いた。モノクローナル抗体を製造するためにKLHに連結したペプチドの各々にC末端のアミノ酸を付加した。マウスからの抗血清を、ペプチド及びＴ細胞の表面上の天然のCD8の両方を認識する能力に関して評価した。４個のペプチドのうち1個のみが、CD8の両方の抗原性形態を認識することができた。このペプチドに対してモノクローナル抗体を作製し、そして得られた抗体を、PBMC調製物からCD8+細胞を単離するために用いた。この抗体は、非常に精製されたCD8+細胞の集団を単離することに成功し(表１)、それらはこの単離方法により活性化されなかった(表２)。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
【表２】
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【００２７】
【表３】
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