(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の(R)-2-オクタノール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドが挿入された組換えベクター。
【請求項４】
更にβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素とする酸化還元反応を触媒することができる脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入された、請求項３に記載の組換えベクター。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチド、または請求項３に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養する工程を含む請求項２に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項７】
請求項２に記載のタンパク質、該酵素または蛋白質を産生する微生物、もしくは該微生物の処理物、をケトンに作用させ、該ケトンを還元してアルコールを製造することを特徴とする、アルコールの製造方法。
【請求項８】
前記微生物が請求項５に記載の形質転換体である請求項７に記載のアルコールの製造方法。
【請求項９】
ケトンが、4-ハロアセト酢酸エステル誘導体であり、アルコールが(S)-4-ハロ-3-ヒドロキシ酪酸エステル誘導体である請求項７に記載のアルコールの製造方法。
【請求項１０】
4-ハロアセト酢酸エステル誘導体が4-クロロアセト酢酸エチルエステルであり、アルコールが(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステルである請求項９に記載のアルコールの製造方法。
【請求項１１】
ケトンが一般式１
一般式１
0004651896.tif 000032
（式中、X1及びX2は、それぞれハロゲン原子を意味する）で表されるアセトニルオキシベンゼン誘導体であり、アルコールが一般式２
一般式２
0004651896.tif 000033
で表される(R)-プロポキシベンゼン誘導体である請求項７に記載のアルコールの製造方法。
【請求項１２】
前記アセトニルオキシベンゼン誘導体が２−アセトニルオキシ−３,４−ジフルオロニトロベンゼンであり、アルコールが、２,３−ジフルオロ−６−ニトロ[[(R)-2-ヒドロキシプロピル]オキシ]ベンゼンである請求項１１に記載のアルコールの製造方法。
【請求項１３】
更に付加的に酸化型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する工程を含むことを特徴とする請求項７に記載のアルコールの製造方法。
【請求項１４】
請求項２に記載のタンパク質、該酵素または該蛋白質を産生する微生物、もしくは該微生物の処理物、をアルコールに作用させ、該アルコールを酸化してケトンを製造することを特徴とする、ケトンの製造方法。
【請求項１５】
請求項２に記載のタンパク質、該酵素または該蛋白質を産生する微生物、もしくは該微生物の処理物、をラセミ体アルコールに作用させ、光学異性体の一方を優先的に酸化し、残存する光学活性アルコールを取得することを特徴とする、光学活性アルコールの製造方法。
【請求項１６】
更に付加的に還元型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを酸化型に変換する工程を含むことを特徴とする請求項１４、または請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、アルコール、ケトン、特に、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル、（Ｒ）−プロポキシベンゼン誘導体を始めとする光学活性アルコールの製造に有用である新規な（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素、該酵素をコードするＤＮＡ、該酵素の製造方法、該酵素を用いたアルコール、ケトン、特に（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは（Ｒ）−プロポキシベンゼン誘導体を始めとする光学活性アルコールを製造する方法に関する。
背景技術
（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤やＤ−カルニチンなどの合成において中間体として利用される化合物である。これらの化合物は、医薬や農薬の合成に有用である。特に、光学的に純粋な（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの対掌体をいかにして入手（合成または分割）するかは、産業上重要な課題となっている。従来、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法として、不斉合成、晶析、パン酵母など微生物を用いた不斉還元法（特開昭６１−１４６１９１、特開平６−２０９７８２等）が知られている。しかし公知の製造方法には、生成物の光学純度が低い、収率が悪いなどの問題点があるため、工業的な利用が困難であった。
また、４−ハロアセト酢酸エステルを（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに還元する酵素が探索されている。例えば、下記に例示するような酵素が知られており、これら酵素による（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの合成方法が報告されている。しかしこれらの酵素は、補酵素として還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨと省略）を利用する還元酵素である。従って、これらの酵素を用いた（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの合成には、高価でかつ化学的に不安定なＮＡＤＰＨの添加と再生が必要であり、工業的に不利である。
・パン酵母由来のいくつかの還元酵素（Ｄ−ｅｎｚｙｍｅ−１，Ｄ−ｅｎｚｙｍｅ−２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７，２９９３−２９９４，１９８５）
・スポロボロマイセス・サルモニカラー由来のアルデヒド還元酵素２（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５，５２０７−５２１１，１９９９）
・キャンディダ・マセドニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ）由来のケトパントテン酸エステル還元酵素（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９４，４６９−４７４，１９９２）
・ゲオトリカム・キャンディダム由来の４−クロロアセト酢酸エチルエステル還元酵素（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  Ｃａｎｄｉｄｕｍ：Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４，７３１−７３８，１９９２）
・キャンディダ・マグノリアエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）由来のカルボニル還元酵素（ＷＯ  ９８３５０２５）
・クライベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）由来のカルボニル還元酵素（特開平１１−１８７８６９）
・ＩＩ型の脂肪酸合成酵素の一つとしてβ−ケトアシル−アシルキャリア−プロテイン還元酵素（特開平２０００−１８９１７０）
補酵素として、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨと省略）を電子供与体として還元反応を行う酵素として、３α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素（特開平１−２７７４９４）、グリセロール脱水素酵素（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２９，２４５３−２４５４，１９８８）、シュードモナス・エスピーＰＥＤ由来のアルコール脱水素酵素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＰＥＤ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７，１５２６−１５３２，１９９２）が知られているが、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの合成反応の活性自体が低いため、工業的には不利である。
以上のように、微生物および酵素を用いた（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの公知の製造方法は、光学純度、収率、あるいは酵素活性等の点において満足のいくものではなかった。これらの問題点が、公知の製造方法の工業的な利用を困難としていた。
一方、（Ｒ）−プロポキシベンゼン誘導体（特開平０２−７３２）は、医薬品、特に、合成抗菌剤であるオフロキサシンの光学活性体（（Ｓ）−（−）−９−フルオロ−３−メチル−１０−（４−メチル−１−ピペラジニル）−７−オキソ−２，３−ジヒドロ−７Ｈ−ピリド［１，２，３−ｄｅ］［１，４］ベンゾオキサジン−６−カルボン酸、特開平６２−２５２７９０）などの合成中間体として有用な化合物である。この化合物の光学的に純粋な対掌体をいかにして入手（合成または分割）するかは、産業上重要な課題となっている。
（Ｒ）−プロポキシベンゼン誘導体を製造する方法としては、ラセミ体プロポキシベンゼン誘導体をリパーゼ、エステラーゼを利用し不斉アシル化することにより合成する方法（特開平０３−１８３４８９）が知られている。しかし公知の方法は、（Ｒ）体を不斉アシル化した後に、残存する原料とアシル化された生成物を分離する工程、アシル化された生成物を脱アシル化する工程が必要であり、工程が複雑で工業的な生産には不向きである。
また、微生物を用いアセトニルオキシベンゼン誘導体を不斉還元する方法も報告されている。しかし公知の方法においては、生成する（Ｒ）−プロポキシベンゼン誘導体の光学純度が８４−９８％（特開平０３−１８３４８９）、あるいは８．８−８８．４％（特開平０５−６８５７７）と低く、基質の濃度も０．１−０．５％程度で工業的な生産には不適である。高い光学純度で不斉還元可能な方法としては、キャンディダ・マグノリアエの生産するカルボニル還元酵素を利用した方法（特開２０００−１７５６９３）において、９９％以上の光学純度で（Ｒ）−プロポキシベンゼン誘導体が合成できることが報告されている。しかし、本カルボニル還元酵素は、補酵素としてＮＡＤＰＨを利用する還元酵素である。従って、本酵素を用いた（Ｒ）−プロポキシベンゼン誘導体の合成には、高価でかつ化学的に不安定なＮＡＤＰＨの添加と再生が必要であり、工業的に不利である。
発明の開示
本発明は、ＮＡＤＨを補酵素として利用し、４−ハロアセト酢酸エステルを還元して、高い光学純度の（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成する酵素活性を有する新規な酵素を提供することを課題とする。さらに、本発明は、該酵素を利用して高い光学純度の（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを製造する方法の提供を課題とする。
また、本発明は、ＮＡＤＨを補酵素として利用し、合成抗菌剤の合成中間体として有用な（Ｒ）−プロポキシベンゼン誘導体を、極めて高い光学純度で生成する酵素活性を有する新規な酵素を提供することを課題とする。さらに、本発明は、該酵素を利用して高い光学純度の（Ｒ）−プロポキシベンゼン誘導体を製造する方法の提供を課題とする。
本発明者らは、電子供与体としてＮＡＤＨを利用しうるアルコール脱水素酵素が、工業的な利用においては有用であると考えた。ＮＡＤＨはＮＡＤＰＨに比較して安価で、かつ化学的にも安定である。また光学活性（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを効率的に生成する酵素を見出すために、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルと立体配置が同じであり、かつ、４−ハロアセト酢酸エステルに近い大きさを有する長鎖のアルコールである（Ｒ）−２−オクタノールに高い活性を有するアルコール脱水素酵素をスクリーニングした。
従来の知見によると、（Ｒ）−２−オクタノールを立体選択的に酸化し、２−オクタノンを生成する活性を有する２級アルコール脱水素酵素としては、コマモナス・テリゲナ、ピキア・エスピーＮＲＲＬ−Ｙ−１１３２８、シュードモナス・エスピーＳＰＤ６由来の酵素が報告されている。しかし、これらの酵素が４−ハロアセト酢酸エステルを還元して、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成するという報告はない。また、これらの酵素の（Ｒ）−２−オクタノールに対する活性は、２−プロパノールのような側鎖の短い２級アルコールとに比較して有意に高い活性を持たないため、カルボニル基にかさ高い側鎖が結合した４−ハロアセト酢酸エステルを還元して、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成する活性は低いと予想された。
そこで、本発明者らは、（Ｒ）−２−オクタノールを優先的に酸化する能力を有する酵素を持つ微生物を広くスクリーニングした。その結果、次の属に属する微生物が、（Ｒ）−２−オクタノールを優先的に酸化する能力を有する酵素を持つことを見出した。
ピキア属
キャンディダ属
オガタエア属
より具体的には、たとえば次のような微生物が、（Ｒ）−２−オクタノールを優先的に酸化する能力を有する酵素を持つことを見出した。
ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）
ピキア・ジャディニー（Ｐｉｃｈｉａ  ｊａｄｉｎｉｉ）
キャンディダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）
オガタエア・ウィッカーハミー（Ｏｇａｔａｅａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）
更に、これらの微生物を培養し、その菌体より（Ｒ）−２−オクタノールを酸化する酵素を精製した。そして、その性質を検討した結果、該酵素が（Ｒ）−２−オクタノールを高い立体選択性を持って酸化すること、更に（Ｒ）−２−オクタノール以外の多くの２級アルコールを立体選択的に酸化することを見出した。また、該酵素は４−クロロアセト酢酸エステルに高い還元活性を有し、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成することを見出すとともに、該酵素は２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼンに高い還元活性を有し、２，３−ジフルオロ−６−ニトロ−［［（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル］オキシ］ベンゼンを生成することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は、以下のアルコール、ケトン、特に、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを始めとする光学活性アルコールの製造に有用である新規な（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素、該酵素をコードするＤＮＡ、該酵素の製造方法、該酵素を用いたアルコール、ケトン、特に（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルや（Ｒ）−プロポキシベンゼン誘導体を始めとする光学活性アルコールを製造する方法に関する。
〔１〕次に示す理化学的性質（１）および（２）を有する（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素。
（１）作用
ｉ）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、アルコールを酸化しケトンを生成する。
ｉｉ）還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、ケトンを還元しアルコールを生成する。
（２）基質特異性
ｉ）２−オクタノールに含まれる２つの光学異性体のうち（Ｒ）−２−オクタノールを優先的に酸化する。
ｉｉ）４−ハロアセト酢酸エステルを還元して（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成する。
〔２〕更に次に示す理化学的性質（３）および（４）を有する〔１〕に記載の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素。
（３）至適ｐＨ
酸化反応の至適ｐＨは８．０〜１１．０である。還元反応の至適ｐＨは５．０〜６．５である。
（４）基質特異性
ｉ）２級アルコールに対して、１級アルコールよりも高い酵素活性を有する。
ｉｉ）（Ｒ）−２−オクタノールに対して、２−プロパノールよりも有意に高い酵素活性を有する。
〔３〕ピキア属、キャンディダ属、およびオガタエア属からなる群から選択されるいずれかの微生物に由来する、〔１〕もしくは２のいずれかに記載の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素。
〔４〕ピキア属に属する微生物が、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）である〔３〕に記載の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素。
〔５〕ピキア属に属する微生物が、ピキア・ジャディニー（Ｐｉｃｈｉａ  ｊａｄｉｎｉｉ）である〔３〕に記載の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素。
〔６〕キャンディダ属に属する微生物が、キャンディダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）である〔３〕に記載の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素。
〔７〕オガタエア属に属する微生物が、オガタエア・ウィッカーハミー（Ｏｇａｔａｅａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）である〔３〕に記載の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素。
〔８〕ピキア属、キャンディダ属、およびオガタエア属からなる群から選択されるいずれかの微生物であって、〔１〕もしくは２に記載の酵素を産生する微生物を培養する工程を含む、〔１〕または２に記載の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の製造方法。
〔９〕下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
〔１０〕〔９〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
〔１１〕〔９〕に記載のポリヌクレオチドが挿入された組換えベクター。
〔１２〕更にβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素とする酸化還元反応を触媒することができる脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入された、〔１１〕に記載の組換えベクター。
〔１３〕〔９〕に記載のポリヌクレオチド、または〔１１〕に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換体。
〔１４〕〔１３〕に記載の形質転換体を培養する工程を含む〔１０〕に記載の蛋白質の製造方法。
〔１５〕〔１〕または２に記載の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素、〔１０〕に記載のタンパク質、該酵素または蛋白質を産生する微生物、もしくは該微生物の処理物、をケトンに作用させ、該ケトンを還元してアルコールを製造することを特徴とする、アルコールの製造方法。
〔１６〕前記微生物が〔１３〕に記載の形質転換体である〔１５〕に記載のアルコールの製造方法。
〔１７〕ケトンが、４−ハロアセト酢酸エステル誘導体であり、アルコールが（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル誘導体である〔１５〕に記載のアルコールの製造方法。
〔１８〕４−ハロアセト酢酸エステル誘導体が４−クロロアセト酢酸エチルエステルであり、アルコールが（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルエステルである〔１７〕に記載のアルコールの製造方法。
〔１９〕ケトンが一般式１
一般式１
0004651896.tif 000002
（式中、Ｘ１及びＸ２は、それぞれハロゲン原子を意味する）で表されるアセトニルオキシベンゼン誘導体であり、アルコールが一般式２
一般式２
0004651896.tif 000003
で表される（Ｒ）−プロポキシベンゼン誘導体である〔１５〕に記載のアルコールの製造方法。
〔２０〕前記アセトニルオキシベンゼン誘導体が２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼンであり、アルコールが、２，３−ジフルオロ−６−ニトロ［［（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル］オキシ］ベンゼンである〔１９〕に記載のアルコールの製造方法。
〔２１〕更に付加的に酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する工程を含むことを特徴とする〔１５〕に記載のアルコールの製造方法。
〔２２〕〔１〕または２に記載の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素、または〔９〕に記載のタンパク質、該酵素または該蛋白質を産生する微生物、もしくは該微生物の処理物、をアルコールに作用させ、該アルコールを酸化してケトンを製造することを特徴とする、ケトンの製造方法。
〔２３〕〔１〕または２に記載の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素、または〔９〕に記載のタンパク質、該酵素または該蛋白質を産生する微生物、もしくは該微生物の処理物、をラセミ体アルコールに作用させ、光学異性体の一方を優先的に酸化し、残存する光学活性アルコールを取得することを特徴とする、光学活性アルコールの製造方法。
〔２４〕更に付加的に還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを酸化型に変換する工程を含むことを特徴とする〔２２〕、または〔２３〕に記載の方法。
本発明は、次の（１）および（２）に示す理化学的性質を有する酵素を提供する。
（１）作用
ｉ）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を補酵素として、アルコールを酸化し、ケトンを生成する。
ｉｉ）還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を補酵素として、ケトンを還元し、アルコールを生成する。
（２）基質特異性
ｉ）２−オクタノールに含まれる２つの光学異性体のうち、（Ｒ）−２−オクタノールを優先的に酸化する。
ｉｉ）４−ハロアセト酢酸エステルを還元して（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成する。
なお、本発明の酵素は、望ましくは更に次の酵素学的性質（３）および（４）を備える。
（３）至適ｐＨ
（Ｒ）−２−オクタノール酸化反応の至適ｐＨは８．０〜１１．０である。４−クロロアセト酢酸エチルの還元反応の至適ｐＨは５．０〜６．５である。
（４）基質特異性
ｉ）２級アルコールに対して、１級アルコールよりも高い活性を有する。
ｉｉ）（Ｒ）−２−オクタノールに対して、２−プロパノールよりも有意に高い活性を有する。
さらに本発明における望ましい（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素は、次の理化学的性質、および酵素学的性質（５）から（８）を有する。
（５）作用適温の範囲
（Ｒ）−２−オクタノール酸化反応の至適温度は４５−５５℃である。４−クロロアセト酢酸エチルの還元反応の至適温度は５５−６０℃である。
（６）安定ｐＨの範囲
ｐＨ８から９の範囲で安定である。
（７）阻害
塩化水銀とキレート剤であるエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム塩（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）によってわずかに阻害される。
（８）安定化
Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ、ｏ−フェナンスロリン、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化マンガンによって安定化される。
（９）精製方法
本発明の酵素は、該酵素を産生する微生物から通常のタンパク質の精製方法により、精製することができる。例えば、菌体を破砕後、プロタミン硫酸沈澱を行い、その遠心分離上清を硫酸アンモニウムを用いて塩析し、更に、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過などを組み合わせることにより、精製することができる。
本発明における「脱水素酵素」とは、脱水素反応、すなわち水素を含む化合物から水素が除去される酸化反応、を触媒する酵素を意味する。さらに該酵素は、ケトンに対する還元活性を有し、還元的条件下においては、酸化反応の逆反応を触媒することができる。従って本発明における「脱水素酵素」は、前記酸化反応の逆反応である水素を付加する還元反応を触媒する作用を有する。一般に「デヒドロゲナーゼ」、「酸化還元酵素」、「オキシダーゼ」または「レダクターゼ」等の名称で呼ばれる酵素も同様の作用を有する場合には本発明による「脱水素酵素」に含まれる。
本発明において、４−クロロアセト酢酸エステルに対する還元活性は、次のようにして測定することができる。リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）−１００ｍＭ、ＮＡＤＨ−０．２０ｍＭ、４−クロロアセト酢酸エチル−２０ｍＭ及び酵素を含む反応液を、３０℃で反応し、ＮＡＤＨの減少にともなう３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより、確認することができる。１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの減少を触媒する酵素量とする。また、タンパク質の定量は、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行うことができる。
一方、（Ｒ）−２−オクタノール酸化活性は、次のようにして測定することができる。すなわち、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５−５０ｍＭ）、ＮＡＤ＋２．５ｍＭ、（Ｒ）−２−オクタノール５ｍＭ及び酵素を含む反応液を３０℃で反応し、ＮＡＤＨの生成に由来する３４０ｎｍの吸光度の増大を測定することによって確認することができる。１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの生成を触媒する酵素量とする。
本発明による（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素は（Ｒ）−２−オクタノールに対して高い酸化活性を有する。また、該酵素の（Ｒ）−２−オクタノールの酸化活性は２−プロパノールの酸化活性に比較して、有意に高い活性を示す。本発明において、基質となる（Ｒ）−２−オクタノールにＮＡＤ＋存在下で接触させたときに、ＮＡＤＨの増減にともなう３４０ｎｍの吸光度の単位時間当たりの変化率が２−プロパノールを１とする相対活性として２倍以上、より好ましくは５倍以上である場合に、脱水素酵素活性が有意に高いと言うことができる。
また、本発明において（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素が（Ｒ）−２−オクタノールを「優先的」に酸化するとは、（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の、２−オクタノールのＲ体に対する酵素活性を１００としたとき、Ｓ体に対する酵素活性が５０以下、好ましくは２０以下、更に好ましくは１０以下である場合を言う。
上記のような理化学的性質を有する（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素は、この酵素を産生する微生物の培養物から得ることができる。例えばピキア属、やキャンディダ属あるいはオガタエア属酵母に、本発明の酵素を産生する菌株を見出すことができる。ピキア属酵母としてはピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・ジャディニー（Ｐｉｃｈｉａ  ｊａｄｉｎｉｉ）、キャンディダ属酵母としてはキャンディダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、オガタエア属酵母としてはオガタエア・ウィッカーハミー（Ｏｇａｔａｅａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）が特に本発明による（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の産生能に優れる。本発明の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素を得るために利用できる菌株として、以下のものを例示することができる。
（ｉ）ピキア・フィンランディカ：  ＤＳＭ  ７０２８０、ＤＳＭ  １３８０
（ｉｉ）ピキア・ジャディニー：  ＤＳＭ  ２３６１、ＤＳＭ  ７０１６７、ＩＦＯ  ０９８７
（ｉｉｉ）キャンディダ・ウチリス：  ＩＦＯ  ０９８８、ＩＦＯ  ０６２６
（ｉｖ）オガタエア・ウィッカーハミー：  ＩＦＯ  １７０６
なお、ピキア・フィンランディカの生産する２級アルコール脱水素酵素に関しては、無細胞抽出液を用いた２−プロパノール脱水素酵素活性を示した報告がある（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、７１６、２９８−３０７，１９８２）。しかし本発明者らの追試によれば、この菌株の無細胞抽出液には、複数の２−プロパノール脱水素酵素が含まれている。一方、本発明の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素は、非常に弱い２−プロパノール脱水素酵素活性しか有しないマイナー成分である。したがって本発明の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素は、この文献記載の酵素とは明確に異なる。
上記微生物は、ＹＭ培地等の真菌の培養に用いられる一般的な培地で培養される。特にピキア・フィンランディカは培地中の炭素源として、グルコース、グリセロールおよびメタノールのいずれを用いても良好に目的の酵素が得られる。キャンディダ・ウチリスは培地中の炭素源として特にメタノールを用いた時に良好に目的の酵素が得られる。十分に増殖させた後に菌体を回収し、２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）等の還元剤や、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＭＦＳ）のようなプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中で、破砕して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液から、タンパク質の溶解度による分画や各種のクロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより精製する事ができる。タンパク質の溶解度による分画方法としては、例えばアセトンやジメチルスルホキシドのような有機溶媒による沈澱や硫安による塩析等を利用することができる。一方クロマトグラフィーには、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いた多くのアフィニティクロマトグラフィーが公知である。より具体的には、例えば、フェニル−トヨパールを用いた疎水クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セファロースを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、ブチル−トヨパールを用いた疎水クロマトグラフィー、ブルー−セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、スーパーデックス２００を用いたゲルろ過等を経て電気泳動的にほぼ単一バンドまで精製することができる。
本発明は、（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそのホモログに関する。本発明において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡやＲＮＡのような天然に存在するポリヌクレオチドであることもできるし、人工的に合成されたヌクレオチド誘導体を含むポリヌクレオチドであっても良い。
本発明の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば配列番号：１に示す塩基配列を含む。配列番号：１に示す塩基配列は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明による（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の好ましい態様を構成する。
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、前記理化学的性質（１）−（２）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。当業者であれば、配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７（１９８２），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８（１９８３），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄＥｄｔ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９），ＰＣＲ  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．２００（１９９１））などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することが可能である。
また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ、前記理化学的性質（１）−（２）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドはとは、配列番号：１に記載された塩基配列中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択したＤＮＡをプローブＤＮＡとし、たとえばＥＣＬ  ｄｉｒｅｃｔｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｉｃａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、マニュアルに記載の条件（ｗａｓｈ：４２℃、０．５ｘ  ＳＳＣを含むｐｒｉｍａｒｙ  ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
ストリンジェントな条件下で配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドには、配列番号：１と類似する塩基配列を含むものが含まれる。このようなポリヌクレオチドは、配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードしている可能性が高い。
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％または９０％、より好ましくは９５％以上のホモロジーを有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質のホモロジー検索は、たとえばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースやＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｎｋ  ｏｆ  ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）、ＥＭＢＬ、Ｇｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡに関するデータベース、ＤＮＡ配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、ＦＡＳＴＡ  ｐｒｏｇｒａｍやＢＬＡＳＴ  ｐｒｏｇｒａｍなどを用いて、たとえば、インターネット上で行うことができる。配列番号：２に記載のアミノ酸配列を用いてＤＤＢＪを対象にＢＬＡＳＴ  ｐｒｏｇｒａｍを用いてホモロジー検索を行った結果、既知のタンパク質の中でもっとも高いホモロジーを示したのは、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの４３％（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、６１％（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）であった。本発明の７０％以上のホモロジーとは、たとえば、ＢＬＡＳＴ  ｐｒｏｇｒａｍを用いたＰｏｓｉｔｉｖｅの相同性の値を示す。
本発明において、前記理化学的性質（１）−（２）を有するタンパク質をコードするこれらのポリヌクレオチドは、特に配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対するホモログと言う。ホモログは、変異の導入の他、配列番号：１に記載された塩基配列に基づいて他の生物からＰＣＲクローニングやハイブリダイズによって単離することもできる。たとえば配列番号：１に記載の塩基配列は、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａより単離された遺伝子のものである。この他、ピキア・ジャディニー（Ｐｉｃｈｉａ  ｊａｄｉｎｉｉ）、キャンディダ属酵母としてキャンディダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、あるいはオガタエア属酵母としてオガタエア・ウィッカーハミー（Ｏｇａｔａｅａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）等の微生物から得ることができる前記理化学的性質（１）−（２）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも本発明に含まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の遺伝子工学的な製造に有用である。あるいは本発明のポリヌクレオチドによって、ケトンやアルコールの製造に有用な（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素活性を有する微生物を遺伝子工学的に作り出すことができる。
本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有し、かつ、前記理化学的性質（１）−（２）を有する（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素、及びそのホモログを含む。配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明による（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の好ましい態様を構成する。
本発明の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素のホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含む。当業者であれば、配列番号：１記載の塩基配列からなるＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７（１９８２），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８（１９８３），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄＥｄｔ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９），ＰＣＲ  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．２００（１９９１））などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素のホモログをコードするＤＮＡを得ることができる。その（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素のホモログをコードするＤＮＡを宿主に導入して発現させることにより、配列番号：２に記載の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素のホモログを得ることが可能である。
さらに、本発明の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素のホモログとは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％または９０％、より好ましくは９５％以上のホモロジーを有するタンパク質をいう。タンパク質のホモロジー検索は、たとえばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースやＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｎｋ  ｏｆ  ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）、ＥＭＢＬ、Ｇｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡに関するデータベース、ＤＮＡ配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、ＦＡＳＴＡ  ｐｒｏｇｒａｍやＢＬＡＳＴ  ｐｒｏｇｒａｍなどを用いて、たとえば、インターネット上で行うことができる。配列番号：２に記載のアミノ酸配列を用いてＤＤＢＪを対象にＢＬＡＳＴ  ｐｒｏｇｒａｍを用いてホモロジー検索を行った結果、既知のタンパク質の中でもっとも高いホモロジーを示したのは、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの４３％（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、６１％（ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）であった。本発明の７０％以上のホモロジーとは、たとえば、ＢＬＡＳＴ  ｐｒｏｇｒａｍを用いたＰｏｓｉｔｉｖｅの相同性の値を示す。
本発明の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素をコードするＤＮＡは、たとえば、以下のような方法によって単離することができる。
本発明の酵素を精製後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析し、さらに、リジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの酵素により切断後、逆相液体クロマトグラフィーなどによりペプチド断片を精製後プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列を解析することにより複数のアミノ酸配列を決めることができる。
部分的なアミノ酸配列が明らかになれば、それをコードする塩基配列を推定することができる。推定された塩基配列、あるいは配列番号：１に示す塩基配列を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲを行うことにより本発明のＤＮＡの一部を得ることができる。
さらに、得られたＤＮＡ断片をプローブとして、酵素生産株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明のＤＮＡを得ることができる。
また、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のＤＮＡの外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応によりＤＮＡを鋳型として逆ＰＣＲを行うことにより（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２０，６２１−６２３（１９８８））、また、ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄ、「ＰＣＲ実験マニュアル」ｐ２５−３３，ＨＢＪ出版局）などにより本発明のＤＮＡを得ることも可能である。
なお本発明のＤＮＡは、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡ、あるいはｃＤＮＡの他、合成によって得ることもできる。
このようにして単離された、本発明による（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素をコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに挿入することにより、（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素発現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素を組み換え体から得ることができる。
本発明においてＮＡＤ＋を補酵素とする（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、ＮＡＤ＋を補酵素とする（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組み換えベクターにより形質転換され、ＮＡＤ＋を補酵素とする（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、たとえば以下のような微生物を示すことができる。
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属
セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属
ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属
コリネバクテリイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属
ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属
ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属
ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属
クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属
シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属
チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属
トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属
ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属
ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属
キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属
セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発されているカビ
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、モレキュラー・クローニング、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。微生物中などにおいて、本発明のＮＡＤ＋を補酵素とする（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターなどに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．４３，７５−１０２（１９９０）、Ｙｅａｓｔ  ８，４２３−４８８（１９９２）、などに詳細に記述されている。
例えばエシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）においては、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドを利用でき、ｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃ、ｔｒｐの融合）、λファージＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが利用できる。また、ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどを用いることができる。
バチルス属においては、ベクターとしてｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとしてａｐｒ（アルカリプロテアーゼ）、ｎｐｒ（中性プロテアーゼ）、ａｍｙ（α−アミラーゼ）などが利用できる。
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｃｅｐａｃｉａ）などで宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ（特開平５−２８４９７３）遺伝子などが利用できる。
ブレビバクテリウム属特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）においては、ｐＡＪ４３（Ｇｅｎｅ  ３９，２８１（１９８５））などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）においては、ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９）、ｐＣＢ１０１（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９６，１７５（１９８４））などのプラスミドベクターが利用可能である。
ストレプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属においては、ｐＨＶ１３０１（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２６，２３９（１９８５）、ｐＧＫ１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５０，９４（１９８５））などがプラスミドベクターとして利用可能である。
ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたｐＡＭβ１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３７，６１４（１９７９））などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属においては、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）から単離されたプラスミドベクターが使用可能である（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８，１００３（１９９２））。
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属においては、ＨｏｐｗｏｏｄらのＧｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（１９８５）に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）においては、ｐＩＪ４８６（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３，４６８−４７８，１９８６）、ｐＫＣ１０６４（Ｇｅｎｅ  １０３，９７−９９（１９９１））、ｐＵＷＬ−ＫＳ（Ｇｅｎｅ  １６５，１４９−１５０（１９９５））が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｅ）においても、同様のプラスミドを使用することができる（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｏｌ．１１，４６−５３（１９９７））。
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームＤＮＡとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（ＥＰ  ５３７４５６など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ＡＤＨ（アルコール脱水素酵素）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）、ＰＨＯ（酸性フォスファターゼ）、ＧＡＬ（β−ガラクトシダーゼ）、ＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）、ＥＮＯ（エノラーゼ）などのプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来２μｍ系プラスミド、ｐＫＤ１系プラスミド（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４５，３８２−３９０（１９８１））、キラー活性に関与するｐＧＫｌ１由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子ＫＡＲＳプラスミド、リボソームＤＮＡなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（ＥＰ  ５３７４５６など）などが利用可能である。また、ＡＤＨ、ＰＧＫなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のＡＲＳ（自律複製に関与する遺伝子）及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６，８０（１９８６））。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のＡＤＨプロモーターなどが利用できる（ＥＭＢＯ  Ｊ．６，７２９（１９８７））。特に、ｐＡＵＲ２２４は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
チゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）由来のｐＳＢ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３，４２６７（１９８５））などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来ＰＨＯ５プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来ＧＡＰ−Ｚｒ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）のプロモーター（Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４，２５２１（１９９０））などが利用可能である。
ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属においては、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子（ＰＡＲＳ１、ＰＡＲＳ２）などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５，３３７６（１９８５））、高濃度培養とメタノールで誘導可能なＡＯＸなど強いプロモーターが利用できる（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５，３８５９（１９８７））。また、ピキア・アンガスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ、旧名ハンゼヌラ・ポリモルファ  Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（ＨＡＲＳ１、ＨＡＲＳ２）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Ｙｅａｓｔ  ７，４３１−４４３（１９９１））。また、メタノールなどで誘導されるＡＯＸ（アルコールオキシダーゼ）、ＦＤＨ（ギ酸脱水素酵素）のプロモーターなどが利用可能である。
キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属においては、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・ウチルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニングされ（Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１，５１，１５８７（１９８７））、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平０８−１７３１７０）。
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリジー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７，２８３−２８７（１９８９））。
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属においては、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７，５９６−６０３（１９８９））。
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Ｎａｔｕｒｅ  ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。
本発明において使用する４−ハロアセト酢酸エステル還元酵素生産能を有する微生物は、ＮＡＤ＋依存性（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素生産能を有するピキア属、キャンディダ属、およびオガタエア属に属するすべての菌株、突然変異株、変種、遺伝子操作技術の利用により作成された本発明の酵素生産能を獲得した形質転換株を含む。
また、上記の方法で得られる本発明の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素を発現する菌株は、本発明の酵素の製造や、以下に述べる２級アルコール、およびケトンの製造に用いることができる。
すなわち本発明は、前記（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素を利用したケトンの還元による２級アルコールの製造方法に関する。本発明の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素は、ＮＡＤＰＨに比べて安価で安定なＮＡＤＨを補酵素として利用しうることから、工業的な利用において有利である。本発明の酵素、酵素を含む培養物、その処理物が反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることができる。
なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されない。反応溶液は、基質や酵素反応に必要な補酵素であるＮＡＤＨを酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。本発明における（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素を含む微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。
本発明による２級アルコールの製造方法におけるケトンとしては、アセトフェノン、２−オクタノン、４−ハロアセト酢酸エステル誘導体、一般式Ｉ
0004651896.tif 000004
（式中、Ｘ１及びＸ２は、それぞれハロゲン原子を意味する）で表されるアセトニルオキシベンゼン誘導体、ブロモメチルシクロプロピルケトン、２−アセチルブチロラクトン、５−クロロ−２−ペンタノン等が好適に用いられる。なお本発明において４−ハロアセト酢酸エステル誘導体とは、アセト酢酸エステルの４位が任意のハロゲン原子で置換された化合物を言う。なお前記アセト酢酸エステルを構成するアルコールは、任意のアルコールであって良い。４−ハロアセト酢酸エステル誘導体のハロゲンとしては、臭素、塩素、ヨウ素が挙げられ、特に塩素が好適に用いられる。エステルとしては、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、オクチルエステル、ベンジルエステルなどの直鎖、分岐鎖、芳香族置換を含むアルコールのエステルが挙げられるが、エチルエステルがもっとも好適に用いられる。４−ハロアセト酢酸エステル誘導体としては、２位に直鎖もしくは分岐鎖を含むアルキル基、塩素、臭素、ヨウ素などのハロゲンを含む誘導体などが挙げられる。アセトニルオキシベンゼン誘導体のハロゲンとしては、臭素、塩素、ヨウ素、フッ素が挙げられ、特にフッ素が好適に用いられる。特に、２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼンは、合成抗菌剤オフロキサシンの合成中間体である２，３−ジフルオロ−６−ニトロ−［［（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル］オキシ］ベンゼンを与える有用な化合物である。
また本発明は、前記（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の２級アルコールの酸化によるケトンの製造方法に関する。本発明の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素、または、該酵素を産生する微生物もしくはその処理物を２級アルコールに作用させ、反応産物であるケトンを製造することができる。本発明において基質とすることができる２級アルコールには、２−プロパノール、２−ブタノール、２−オクタノール、１−フェニルエタノール等、ハロゲン、芳香族置換を有するアルキルアルコール等が利用可能である。
更に、本発明の酵素、または、該酵素を産生する微生物もしくはその処理物は、ラセミ体アルコールを基質として、（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の不斉酸化能を利用した光学活性アルコールの生産にも利用できる。すなわち、本発明の酵素によって、光学異性体の一方を優先的に酸化し、残存する光学活性アルコールを取得することにより、光学活性アルコールが生産される。より具体的には、２−オクタノールまたは１−フェニルエタノールの（Ｓ）体と（Ｒ）体とが混在するラセミ体に、本発明による（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素をＮＡＤ＋共存下で作用させるのである。立体選択性に優れる本発明による（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素は、（Ｒ）体に対して特異的に作用し、これを酸化してケトンとするが、（Ｓ）体のアルコールには作用しないので、やがて（Ｓ）体の割合が大きくなってくる。こうして蓄積する（Ｓ）体を分離すれば、最終的にラセミ体から（Ｓ）体のアルコールを回収することができる。このようにして（ＲＳ）−２−オクタノールから（Ｓ）−２−オクタノール、（ＲＳ）−フェニルエタノールから（Ｓ）−フェニルエタノールなどを得ることができる。
なお本発明における「光学活性アルコール」とは、ある光学異性体が別の光学異性体より多く含まれるアルコール、好ましくは５０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の光学純度（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ  ｅｘｃｅｓｓ；ｅｅ）を有するアルコールを意味する。さらに、本発明の「光学異性体」は、一般的に「光学活性体」および「鏡像異性体」と呼ばれる場合もある。
前記本発明によるケトン製造方法においては、ＮＡＤＨの再生系を組み合わせることができる。（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素による酸化反応に付随して、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨが生成する。ＮＡＤＨからＮＡＤ＋への再生は、微生物の含有するＮＡＤＨからＮＡＤ＋を再生する酵素（系）によって行うことができる。また、ＮＡＤＨからＮＡＤ＋を生成する能力を有する微生物もしくは酵素、例えば、グルタミン酸脱水素酵素、ＮＡＤＨオキシダーゼ、ＮＡＤＨ脱水素酵素等を反応系に添加することにより行うことが可能である。さらには、本発明の酵素の基質特異性を利用して、反応系に２−オクタノン、アセトフェノンなど還元反応の基質を添加し、該酵素自身によりＮＡＤＨからのＮＡＤ＋の再生を同時に行うこともできる。
同様にアルコールの製造方法においては、ＮＡＤ＋の再生系を組み合わせることができる。還元反応に付随して、ＮＡＤＨからＮＡＤ＋が生成する。ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの再生は、微生物の持つＮＡＤ＋還元能（解糖系など）を用いて行うことができる。これらＮＡＤ＋還元能は、反応系にグルコースまたはエタノールを添加することにより、増強することが可能である。また、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、アルコール脱水素酵素などを含む微生物、その処理物、ならびに精製酵素を用いてＮＡＤＨの再生を行うことができる。例えば、上記グルコース脱水素酵素の場合には、グルコースからδ−グルコノラクトンへの変換を利用することにより、ＮＡＤＨの再生が行われる。また、本発明の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の性質を利用して、反応系に２−オクタノールなど本発明の酵素の酸化反応の基質を添加することにより、該酵素自身を用いてＮＡＤＨの再生を行うこともできる。
これらのＮＡＤＨ再生に必要な反応を構成する成分は、本発明によるアルコールの製造のための反応系に添加、もしくは固定化したものを添加することができる。あるいはＮＡＤＨの交換が可能な膜を介して接触させることができる。
また、本発明のＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換した微生物を、生存した状態で前記アルコールの製造方法に利用する場合には、ＮＡＤＨ再生のための付加的な反応系を不要とできる場合がある。すなわち、ＮＡＤＨ再生活性の高い微生物を用いることにより、形質転換体を用いた還元反応において、ＮＡＤＨ再生用の酵素を添加することなく効率的な反応が行える。さらに、ＮＡＤＨ再生に利用可能なグルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などの遺伝子を、本発明のＮＡＤ＋依存性（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素をコードするＤＮＡと同時に宿主に導入することによって、より効率的なＮＡＤＨ再生酵素とＮＡＤ＋依存性（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の発現、還元反応を行うことも可能である。これらの２つもしくはそれ以上の遺伝子の宿主への導入には、不和合性をさけるために複製起源のことなる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組み換えベクターにより宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに両遺伝子を導入する方法、もしくは、両方の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用することができる。
本発明におけるＮＡＤＨ再生に利用可能なグルコース脱水素酵素として、バシラス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来するグルコース脱水素酵素を示すことができる。また、ギ酸脱水素酵素としてはマイコバクテリウム・バッカエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ）に由来するギ酸脱水素酵素を示すことができる。これらの酵素をコードする遺伝子は既に単離されている。あるいは既に明らかにされているその塩基配列に基づいて、ＰＣＲやハイブリダイズスクリーニングによって、当該微生物から取得することもできる。
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
本発明の酵素を用いた酸化反応もしくは還元反応は、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒中、もしくは、エタノールやアセトン等の水性媒体との２相混合系により行うことができる。
本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクター等を利用して行うことも可能である。
本発明の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素による酵素反応は、以下の条件で行うことができる。
・反応温度：４−６０℃、好ましくは１０−３７℃
・ｐＨ：３−１１、好ましくは５−１０、さらに好ましくはｐＨ６．０−９．０
・基質濃度：０．０１−９０％、好ましくは０．１−３０％
反応系には必要に応じて補酵素ＮＡＤ＋またはＮＡＤＨを０．００１ｍＭ−１００ｍＭ、好ましくは、０．０１−１０ｍＭ添加することができる。また、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ましい。
ＮＡＤＨ再生のために反応系に添加される化合物、例えばグルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくは２−プロパノール等は、基質ケトンに対してモル比で０．１−２０、好ましくは０．５−５倍過剰に添加することができる。ＮＡＤＨ再生用の酵素、例えばグルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素等は、本発明のＮＡＤ＋依存性（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素に比較して酵素活性で０．１−１００倍、好ましくは０．５−２０倍程度添加することができる。
本発明のケトンの還元により生成するアルコール、ラセミアルコールの不斉酸化により生成するアルコールの精製は、菌体、タンパク質の遠心分離、膜処理等による分離、溶媒抽出、蒸留等を適宜組み合わせることにより行うことができる。
例えば４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルでは、微生物菌体を含む反応液を遠心分離し、微生物菌体をのぞいた後、その上清に酢酸エチル、トルエンなどの溶媒を添加し、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを溶媒層に抽出する。これを相分離後、蒸留することにより、純度の高い４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを精製することができる。
これら各種合成反応に利用する本発明の酵素は、精製酵素に限定されず、部分精製酵素、本酵素を含む微生物菌体、その処理物も含まれる。なお本発明における処理物とは、菌体、精製酵素、あるいは部分精製酵素などを様々な方法で固定化処理したものを総称して示す用語である。本発明の酵素反応を構成する酵素は、固定化して用いることもできる。酵素を固定化する方法は、特に限定されない。たとえば、グルタルアルデヒド、アクリルアミド、κ−カラギーナン、アルギン酸カルシウム、イオン交換樹脂、セライトなどを用いて酵素を固定化する方法が公知である。本発明の反応は、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。膜リアクターを構成することができる膜としては、限外濾過膜、疎水性膜、カチオン膜、ナノフィルトレーション膜（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．８３，５４−５８（１９９７））等を示すことができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素のスクリーニング
電気泳動と（Ｒ）または（Ｓ）−２−オクタノールの基質と、ＮＡＤ＋、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）を含む反応液を用い酵素の活性染色法により、酵母からの（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素のスクリーニングを行った。反応液の組成は以下の通りである。
・反応液：
（Ｓ）または（Ｒ）−２−オクタノール  ５ｍＭ
ＮＡＤ＋  １．３ｍＭ
ＰＭＳ  ０．１３ｍＭ
ＮＢＴ  ０．４８ｍＭ
その結果、基質が（Ｓ）−２−オクタノールのときにはほとんど染色されず、（Ｒ）−２−オクタノールのときに優先的に染色する酵素が、以下の酵母菌株中に見出された。また、これらの（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素活性を持つ酵素は、４−クロロアセト酢酸エチルを還元して（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを生成する活性を合わせ持っていた。
・ピキア・フィンランディカ：ＤＳＭ  ７０２８０、ＤＳＭ１３８０
・ピキア・ジャディニー：ＤＳＭ  ２３６１、ＤＳＭ７０１６７、ＩＦＯ  ０９８７
・キャンディダ・ウチリス：ＩＦＯ  ０９８８、ＩＦＯ  ０６２６
・オガタエア・ウィッカーハミー：ＩＦＯ  １７０６
［実施例２］（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素を生産する培養条件
実施例１に記載の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素を生産する菌株を、炭素源である２％グルコースを、２％グリセロール、および１％メタノールに変えて培養を行った。その結果、ピキア・フィンランディカに関しては、どの培地においても目的の酵素が誘導された。一方、キャンディダ・ウチリスに関しては、炭素源としてメタノールを用いた時に強く目的の酵素が誘導された。
［実施例３］ピキア・フィンランディカからの（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の精製
ピキア・フィンランディカＤＳＭ  ７０２８０株を４．８Ｌの培地Ａで培養し、遠心分離により菌体を調製した。得られた湿菌体を１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１０％グリセロール、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）、０．０２％  ２−メルカプトエタノール及び２ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）で澱懸し、ビードビーター（Ｂｉｏｓｐｅｃ社製）により破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン硫酸を添加し、遠心分離により除核酸した上清を得た。その上清に硫安を添加して４０％〜７５％飽和において沈殿した画分を得た。その沈殿に３０％飽和硫安を含む標準緩衝液を加え、最終的な濃度で４０％飽和硫安を含む酵素液を得た。その酵素液を遠心分離し上清を得た。上清を３０％飽和硫安を含む標準緩衝液で平衡化したフェニル−トヨパール６５０Ｍ（５．０ｃｍ×２５ｃｍ）に添加し、飽和硫安濃度が３０％−０％の勾配溶出を行った。使用した培地Ａ、標準緩衝液の組成は以下の通りである。
・培地Ａ：
酵母エキス１０ｇ／Ｌ
ペプトン２０ｇ／Ｌ
グルコース２０ｇ／Ｌ
ｐＨ６．０
・標準緩衝液：
トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＭ
２−メルカプトエタノール０．０１％
グリセロール１０％
（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素活性は、勾配溶出部分にみられた。このピーク部分を回収し、限外濾過により濃縮した。
濃縮した酵素液を、標準緩衝液に対して透析した後、その酵素液を遠心分離し上清を得た。上清を同緩衝液で平衡化したブルー−セファロースＣＬ−６Ｂ（５ｃｍ×１０ｃｍ）に添加し、同緩衝液で洗浄後、０−１．５Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配溶出を行った。（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素活性は、勾配溶出部分に溶出したため、この画分を回収し、濃縮した。濃縮した酵素液を標準緩衝液（ｐＨ８．５）に対して透析した後、同緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＦＦ（１．６ｃｍ×１０ｃｍ）に添加し、同緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄後、０−１Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配溶出を行った。（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素活性は、素通り部分と勾配溶出部分に溶出したため、活性画分をそれぞれ回収し濃縮した。素通り部分から得られた酵素液をそれぞれスーパーデックス２００（０．３２ｃｍ×３０ｃｍ、ＳＭＡＲＴシステム、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む標準緩衝液でゲル濾過を行った。ゲル濾過により得られた活性画分を濃縮し精製酵素を得た。
最も高い精製酵素の比活性は（Ｒ）−２−オクタノールの酸化活性で約９１Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであった。精製の要約を表１に示す。
0004651896.tif 000005
［実施例４］（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の分子量測定
実施例３で得られたピキア・フィンランディカ由来の酵素のサブユニットの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより求めた結果、約３．０万であった。また、スーパーデックス２００のゲルろ過カラムを用いて分子量を測定したところ、約８．３万であった。
［実施例５］（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の至適ｐＨ
リン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）、トリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、グリシン緩衝液（Ｇｌｙｃｉｎｅ）を用いてｐＨを変化させて、実施例３で得られた酵素の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素活性を調べた。最大活性を１００とした相対活性で表し、図１に示した。その結果、反応の至適ｐＨは８．０−１１．０であった。
次に、リン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）、酢酸ナトリウム緩衝液（ＮａＯＡｃ）を用いてｐＨを変化させて、実施例３で得られた酵素の４−クロロアセト酢酸エチル還元活性を調べた。最大活性を１００とした相対活性で表し、図２に示した。その結果、反応の至適ｐＨは５．０−６．５であった。
［実施例６］（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の作用至適温度
実施例３で得られた酵素を標準反応条件のうち温度だけを変化させて（Ｒ）−２−オクタノール酸化活性を測定し、最大活性を１００とした相対活性で表し、図３に示した。その結果、至適温度は４５−５５℃であった。
実施例３で得られた酵素を標準反応条件のうち温度だけを変化させて４−クロロアセト酢酸エチル還元活性を測定し、最大活性を１００とした相対活性で表し、図４に示した。その結果、至適温度は５５−６０℃であった。
［実施例７］（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素のｐＨ安定性
実施例３で得られた酵素を、ブリットン・ロビンソンの広域緩衝液ｐＨ３−１２中で、３０℃、３０分間インキュベートし、残存活性を測定した。未処理の活性を１００とした残存活性で表し、図５に示した。その結果、本発明による（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素は、ｐＨ８．０−９．０において最も安定であった。
［実施例８］（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の基質特異性
実施例３で得られた酵素を種々のアルコールと反応させ、その酸化活性を測定した。ＮＡＤ＋を補酵素として、（Ｒ）−オクタノールの酸化活性を１００とした相対活性で表し、表２に示した。
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その結果、アルコール対基質として、（Ｓ）−２−オクタノールに対しては４．７％、２−プロパノールに対しては６．８％、（Ｒ）−１−フェニルエタノールに対しては２５５％の相対活性を示した。
実施例３で得られた酵素を種々のケトンと反応させ、その還元活性を測定した。ＮＡＤＨを補酵素として、４−クロロアセト酢酸エチルの還元活性を１００とした相対活性で表し、表３に示した。
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その結果、ケトン対基質として、２−オクタノンに対しては３１．２％、アセトフェノンに対して４５％の相対活性を示した。
［実施例９］（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の各種試薬に対する挙動
種々の試薬中で３０℃、３０分間処理した後、（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素活性を測定し、試薬を含まない条件で３０℃、３０分間処理した後の活性を１００とした残存活性で表し、表４に示した。本発明による（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素は、塩化水銀、エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム塩（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）によってわずかに阻害された。Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ、ｏ−フェナンスロリン、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化マンガンによって安定化された。
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［実施例１０］（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の各種試薬による活性化
種々の試薬中による（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の活性化効果を測定し、試薬を含まない条件の活性を１００とした相対活性で表し、表５に示した。本発明による（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素は、マグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオンによって活性化された。陰イオンの影響については、硫酸イオンによって活性化されることが分かった。
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［実施例１１］（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の部分アミノ酸配列
実施例３で得られた酵素を用いて、プロテインシーケンサーによりＮ末端アミノ酸配列を解析したが、Ｎ末アミノ酸はブロックされていた。次に、精製酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素を含むゲルを切り出し、トリプシンを含むトリスバッファー（ｐＨ８．０）を加え、３５℃、２０時間の処理を行った。その後試料溶液を逆相ＨＰＬＣに共して、断片ペプチドを分離した。ペプチド断片をプロテインシーケンサーによりアミノ酸配列を解析した結果、３種類のアミノ酸配列が得られた。ベプチドＡ、ペプチドＢ、ペプチドＣのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５に示した。
配列番号：３：ペプチドＡ
Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ
配列番号：４：ペプチドＢ
Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
配列番号：５：ペプチドＣ
Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ
［実施例１２］ピキア・フィンランディカからの染色体ＤＮＡの調製
ピキア・フィンランディカよりＣｒｙｅｒらの方法（Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２，３９−４４（１９７５））により、染色体ＤＮＡの精製を行った。
［実施例１３］（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子のコア領域のＰＣＲによるクローニング
ペプチドＡに対応するセンスプライマーＡ及びペプチドＣに対応したアンチセンスプライマーＣを合成した。それぞれのプライマーの先頭にはＢａｍＨＩの制限酵素サイト（ＧＴＣＧＧＡＴＣＣ）を組み込んだ。それぞれの塩基配列を配列番号：６（プライマーＡ）、７（プライマーＣ）に示した。
配列番号：６：プライマーＡ
ＧＴＣＧＧＡＴＣＣＧＴＢＧＣＨＧＴＢＧＴＢＡＣＨＧＧＨＧＣ
配列番号：７：プライマーＣ
ＧＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＲＴＣＮＧＣＮＡＣＹＴＣＹＴＣＮＧＧ
プライマーＡ、プライマーＣを各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ  １０ｎｍｏｌ、ピキア・フィンランディカ由来染色体ＤＮＡ  １００ｎｇ、ＥｘＴａｑ用緩衝液（宝酒造製）、ＥｘＴａｑ  ２Ｕ（宝酒造製）を含む５０μＬの反応液を、変性（９４℃、３０秒）、アニール（３７℃、３０秒）、伸長（７０℃、１分）を３０サイクル、ＰＣＲを行い、特異的な増幅産物を得た。
［実施例１４］（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子のコア領域のＰＣＲ断片のサブクローニング
ＰＣＲで増幅されたそれぞれのＤＮＡ断片は、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収後、ＢａｍＨＩによる制限酵素消化を行った。後に２％アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドを切り出し、Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（ファルマシア製）により精製、回収した。
得られたそれぞれのＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで制限酵素消化したｐＵＣ１８（宝酒造製）とＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて、ライゲーションし、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅ．ｃｏｌｉと略す）ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換株をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（５０μｇ／ｍＬ）、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと呼ぶ）（２０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム、以下、ＬＢ培地と略す）プレート上で生育させ、いくつかの白色のコロニーをアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養し、Ｆｌｅｘｉ−Ｐｒｅｐ（ファルマシア製）により、目的のＤＮＡ断片を含むプラスミドを精製した。
精製したプラスミドを用い、挿入ＤＮＡの塩基配列を解析した。ＤＮＡ塩基配列の解析には、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ製）を用いてＰＣＲを行い、ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ製）により行った。決定されたコア領域の塩基配列をそれぞれ配列番号：８：ＰＦ−ＣＯＲＥとして示した。
［実施例１５］（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子のコア領域の周辺ＤＮＡのサブクローニング
ピキア・フィンランディカの染色体ＤＮＡを制限酵素ＢｓｔＹＩ，ＮｓｐＩ，ＰｓｔＩでそれぞれ消化し、Ｔ４リガーゼを用いて１６℃で終夜セルフ・ライゲーション反応により、各断片を環化させた。次に、先頭部分にＢａｍＨＩサイト（ＧＴＣＧＧＡＴＣＣ）を組み込んだプライマーＰｆＯＤ−ｃ５ｕ（配列番号：９）、ＰｆＯＤ−ｃ３ｄ（配列番号：１０）を各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ  １０ｎｍｏｌ、セルフ・ライゲーションさせたＤＮＡ  １２５ｎｇ、Ｅｘ−Ｔａｑ用緩衝液（宝酒造製）、Ｅｘ−Ｔａｑ  １Ｕ（宝酒造製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９４℃、３０秒）、アニール（５５℃、３０秒）、伸長（７２℃、７分）を３５サイクル、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００（パーキンエルマー製）を用いて行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、ＢｓｔＹＩ，ＮｓｐＩ，ＰｓｔＩで消化した鋳型ＤＮＡに対応して、約３５００ｂｐ、２０００ｂｐ、４０００ｂｐのＤＮＡ断片が検出できた。
配列番号：９：ＰｆＯＤ−ｃ５ｕ
ＧＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＧＡＴＣＧＴＴＡＣＴＴＴＧＧＣ
配列番号：１０：ＰｆＯＤ−ｃ３ｄ
ＧＴＣＧＧＡＴＣＣＣＧＡＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＡＧＡＴＧＡＧ
ＰＣＲで増幅されたそれぞれのＤＮＡ断片は、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収後、ＢａｍＨＩによる制限酵素消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドを切り出し、Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（ファルマシア製）により精製、回収した。
得られたそれぞれのＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで制限酵素消化したｐＵＣ１８（宝酒造製）とＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換株をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（５０μｇ／ｍＬ）、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと呼ぶ）（２０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地プレート上で生育させ、いくつかの白色のコロニーをアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養し、Ｆｌｅｘｉ−Ｐｒｅｐ（ファルマシア製）によりプラスミドを精製した。得られたプラスミドを、ＰＣＲの鋳型としたＤＮＡの調製に用いた制限酵素ＢｓｔＹＩ，ＮｓｐＩ，ＰｓｔＩに対応して、それぞれｐＰＦ−Ｂｓｔ，ｐＰＦ−Ｎｓｐ，ｐＰＦ−Ｐｓｔ，とした。
精製したプラスミドから挿入ＤＮＡの塩基配列を解析した。ＤＮＡ塩基配列の解析には、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ製）を用いてＰＣＲを行い、ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライトバイオシステムズ製）により行った。ｐＰＦ−Ｂｓｔ，ｐＰＦ−Ｎｓｐ，ｐＰＦ−Ｐｓｔ内の挿入ＤＮＡ断片の解析した塩基配列を、コア領域の５’−上流側（５Ｕ）、３’−下流側（３Ｄ）に分け、それぞれＰＦ−５Ｕ（配列番号：１１）、ＰＦ−３Ｄ（配列番号：１２）として示した。
ＰＦ−５Ｕ，ＰＦ−３Ｄ，ＰＦ−ＣＯＲＥの各塩基配列を合成し、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）検索により（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子の配列を決定した。決定したＤＮＡの塩基配列は配列番号：１に、この塩基配列がコードするアミノ酸の配列は配列番号：２に示す。これらの合成、ＯＲＦ検索は、Ｇｅｎｅｔｙｘ−ＡＴＳＱ／ＷＩＮ、およびＧｅｎｅｔｙｘ−ＷＩＮ（ともにソフトウェア開発株式会社製）ソフトの上で行った。
［実施例１６］（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子のクローニング−１（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の構造遺伝子の塩基配列を元に発現ベクター構築用のプライマーＰＦＯ−ＡＴＧ１（配列番号：１３）、ＰＦＯ−ＴＡＡ１（配列番号：１４）を合成した。プライマーを各１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ  １０ｎｍｏｌ、ピキア・フィンランディカ由来染色体ＤＮＡ  ５０ｎｇ、Ｐｆｕ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ用緩衝液（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）、Ｐｆｕ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１．２５Ｕ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９５℃、３０秒）、アニール（５０℃、１分）、伸長（７５℃、１分３０秒）を３０サイクル、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００（パーキンエルマー製）を用いて行った。
配列番号：１３：ＰＦＯ−ＡＴＧ１
ＴＣＧＡＣＡＴＧＴＣＴＴＡＴＡＡＴＴＴＣＣＡＴＡＡＣＡＡＧ
配列番号：１４：ＰＦＯ−ＴＡＡ１
ＧＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＡＣＣＣ
ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的なバンドが検出できた。
得られたＤＮＡ断片を、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＡｆｌＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで二重消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（ファルマシア製）により精製した。
得られたＤＮＡ断片を、ＮｃｏＩ  ＥｃｏＲＩで二重消化したｐＳＥ４２０Ｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のプラスミドベクターｐＳＥ４２０のマルチクローニングサイトを改変したプラスミド、特開２０００−１８９１７０）とＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
形質転換株をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地プレート上で生育させ、いくつかのコロニーよりプラスミドを精製し、挿入断片の塩基配列を解析した。目的とする（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子を持つプラスミドをｐＳＥ−ＰＦＯ１とし、プラスミド構築の過程を図６に示した。
［実施例１７］（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子のクローニング−２  （Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の構造遺伝子の塩基配列を元に発現ベクター構築用のプライマーＰＦＯ−ＡＴＧ２（配列番号：１５）、ＰＦＯ−ＴＡＡ２（配列番号：１６）を合成した。プライマーを各１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ  １０ｎｍｏｌ、ピキア・フィンランディカ由来染色体ＤＮＡ  ５０ｎｇ、Ｐｆｕ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ用緩衝液（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）、Ｐｆｕ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１．２５Ｕ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９５℃、３０秒）、アニール（５０℃、１分）、伸長（７５℃、１分３０秒）を３０サイクル、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００（パーキンエルマー製）を用いて行った。
配列番号：１５：ＰＦＯ−ＡＴＧ２
ＣＡＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＡＡＴＧＴＣＴＴＡＴＡＡＴＴＴＣＣＡＴＡＡＣＡＡＧ
配列番号：１６：ＰＦＯ−ＴＡＡ２
ＡＧＴＡＣＴＡＧＴＡＴＴＡＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＡＣＣＣ
ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的なバンドが検出できた。
得られたＤＮＡ断片を、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩで二重消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（ファルマシア製）により精製した。
得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩで二重消化したｐＳＥ４２０ＤとＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
形質転換株をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地プレート上で生育させ、いくつかのコロニーよりプラスミドを精製し、挿入断片の塩基配列を解析した。目的とする（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子を持つプラスミドをｐＳＥ−ＰＦＯ２とし、プラスミド構築の過程を図７に示した。
［実施例１８］組換え（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の大腸菌による生産  （Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子の発現プラスミドｐＳＥ−ＰＦＯ１、ｐＳＥ−ＰＦＯ２で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株をアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトピラノシド）を加え、さらに４時間培養を行った。
菌体を遠心分離により集菌後、０．０２％  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  硫酸マグネシウムを含む１００ｍＭ  トリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置ＵＣＤ−２００ＴＭ（コスモバイオ製）を用いて４分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液中として回収した。
［実施例１９］組換え（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の活性
実施例１８で調製した組換え（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素を用いて（Ｒ）−２−オクタノールに対する活性を測定し、プラスミドを含有しない状態で調製した無細胞抽出液の活性と比較した。その結果を表６にまとめる。
0004651896.tif 000010
［実施例２０］組換え（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の各種大腸菌株による生産
ピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素を発現するプラスミドｐＳＥ−ＰＦＯ１により大腸菌ＨＢ１０１株、ＴＧ１株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＳＭ  ６０５６）、ＭＧ１６６５株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ４７０７６）を形質転換した。
それぞれの組換え大腸菌を液体ＬＢ培地に植菌し、３０℃で終夜培養した後、ＩＰＴＧを０．１ｍＭ添加し、さらに４時間培養した。得られた２種類の大腸菌を集菌し、酵素活性の測定をおこなった。
［実施例２１］ｐＳＥ−ＰＦＯ１で形質転換した各種大腸菌株の酵素活性
実施例２０により、形質転換した大腸菌（培養液２ｍＬ相当）を、実施例１８に記載の方法により菌体破砕し、菌体抽出液を調製し、酵素活性の測定に用いた。それぞれの活性の値を表７に示す。
0004651896.tif 000011
［実施例２２］枯草菌からのＤＮＡの精製
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＢＧＳＣ  １Ａ１株）をＬＢ培地上で培養し、菌体を調製した。菌体からの染色体ＤＮＡの精製は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔｉｐ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、付属マニュアルに記載の方法により行った。
［実施例２３］枯草菌からのグルコース脱水素酵素遺伝子のクローニング
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の再生を行わせるために、文献（特開２０００−１８９１７０）記載の枯草菌由来グルコース脱水素酵素遺伝子のクローニングを行った。文献記載の方法により、ｐＳＥ−ＢＳＧ１を得た。プラスミドを新たに構築するために、構造遺伝子の５’−末、３’−末の配列を元にプライマーＢＳＧ−ＡＴＧ３（配列番号：１９）、ＢＳＧ−ＴＡＡ３（配列番号：２０）を合成した。ｐＳＥ−ＢＳＧ１を鋳型として、ＰＣＲ（９５℃，３０秒、５０℃，１分、７５℃，３分１５秒）を３０サイクル行い、特異的な増幅ＤＮＡを得た。
配列番号：１７：ＢＳＧ−ＡＴＧ３
ＡＧＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＴＡＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡＡＡＡＧＧＡＡ配列番号：１８：ＢＳＧ−ＴＡＡ３
ＧＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＣＴＧ
得られたＤＮＡ断片をＮｃｏＩとＸｂａＩの２種類の制限酵素で二重消化した。プラスミドベクターｐＳＥ４２０ＤをＮｃｏＩとＸｂａＩで二重消化し、同酵素で二重消化したＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結し、ｐＳＥ−ＢＳＧ３を得た。プラスミド構築の過程を図８に示した。
［実施例２４］ピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素と枯草菌由来グルコース脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドｐＳＧ−ＰＦＯ１の構築
実施例１５で構築したｐＳＥ−ＰＦＯ１をＭｌｕＩ，ＥｃｏＲＩの２つの制限酵素で二重消化し、ピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。
実施例２３で構築した枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を含むプラスミドｐＳＥ−ＢＳＧ１をＭｌｕＩ，ＥｃｏＲＩの２つの制限酵素で二重消化し、枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製し、ｐＳＥ−ＰＦＯ１より同酵素で切り出したピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片とＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結し、グルコース脱水素酵素と（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素を同時に発現可能なプラスミドｐＳＧ−ＰＦＯ１を得た。プラスミド構築の過程を図９に示した。
［実施例２５］ピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素と枯草菌由来グルコース脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドｐＳＧ−ＰＦＯ２の構築
実施例１６で構築したｐＳＥ−ＰＦＯ２をＥｃｏＲＩ，ＳｐｅＩの２つの制限酵素で二重消化し、ピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。
実施例２３で構築した枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を含むプラスミドｐＳＥ−ＢＳＧ２をＥｃｏＲＩ，ＳｐｅＩの２つの制限酵素で二重消化し、ｐＳＥ−ＰＦＯ２より同酵素で切り出したピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片とＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結し、グルコース脱水素酵素と（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素を同時に発現可能なプラスミドｐＳＧ−ＰＦＯ２を得た。プラスミド構築の過程を図１０に示した。
［実施例２６］枯草菌由来のグルコース脱水素酵素とピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の大腸菌における同時発現
枯草菌由来のグルコース脱水素酵素とピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素を共発現するプラスミドｐＳＧ−ＰＦＯ１、ｐＳＧ−ＰＦＯ２により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
それぞれの組換え大腸菌を液体ＬＢ培地に植菌し、３０℃で終夜培養した後、ＩＰＴＧを０．１ｍＭ添加し、さらに４時間培養した。得られた２種類の大腸菌を集菌し、酵素活性の測定をおこなった。
［実施例２７］ｐＳＧ−ＰＦＯ１、ｐＳＧ−ＰＦＯ２で形質転換した大腸菌の酵素活性
実施例２６により、形質転換した大腸菌（培養液２ｍＬ相当）を、実施例１７に記載の方法により菌体破砕し、菌体抽出液を調製し、酵素活性の測定に用いた。グルコース脱水素酵素活性の測定は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、２．５ｍＭ  ＮＡＤ＋、１００ｍＭ  Ｄ−グルコース及び酵素を含む反応液中で３０℃でおこなった。１Ｕは、上記反応条件において１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの生成を触媒する酵素量とした。それぞれの活性の値を表８に示す。
0004651896.tif 000012
［実施例２８］マイコバクテリウム・バッカエ由来ギ酸脱水素酵素のサブクローニング
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの再生を行なわせるために、文献（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４，４７９−４８３（１９９５））記載のマイコバクテリウム・バッカエ由来のギ酸脱水素酵素遺伝子よりギ酸脱水素酵素のクローニングを行なった。
文献記載の配列を元に、ギ酸脱水素酵素のオープンリーディングフレーム部分のみをクローニングするために、構造遺伝子の５’−末、３’−末配列をもとに、プライマーＭＣＦ−ＡＴＧ２（配列番号：１９）、ＭＣＦ−ＴＡＡ３（配列番号：２０）を合成した。プラスミドｐＳＦＲ４１５（受託番号  生命研条寄第７３９１号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３９１））を鋳型として、ＰＣＲ（９５℃，４５秒、５０℃，１分、７５℃，７分）を３０サイクル行い、特異的な増幅ＤＮＡを得た。得られたＤＮＡ断片をＮｃｏＩとＸｂａＩの２種類の制限酵素で二重消化した。プラスミドベクターｐＳＥ４２０ＤをＮｃｏＩとＸｂａＩで二重消化し、同酵素で二重消化したＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結し、ｐＳＥ−ＭＣＦ１５を得た。プラスミド構築の過程を図１１に示した。
挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の解析を行なった結果、そのコードするタンパク質は文献記載のアミノ酸配列と一致した。
配列番号：１９：ＭＣＦ−ＡＴＧ２
ＣＴＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＡＧＴＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＣ
配列番号：２０：ＭＣＦ−ＴＡＡ３
ＣＡＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＡＣＣＧＣＴＴＴＴＴＴＧＡＡＴＴＴＧＧＣＧ
ｐＳＦＲ４１５で形質転換した大腸菌ＪＭ１０９の国際寄託：
（ａ）寄託機関の名称・あて名
名称：経済産業省  産業技術総合研究所  生命工学工業技術研究所
（旧名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）
（ｂ）寄託日（原寄託日）  平成１２年１１月１０日
（ｃ）受託番号  生命研条寄第７３９１号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３９１）
［実施例２９］ピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子とマイコバクテリウム由来ギ酸脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドｐＳＦ−ＰＦＯ２の構築
実施例１６で構築したｐＳＥ−ＰＦＯ２をＥｃｏＲＩ，ＳｐｅＩの２つの制限酵素で二重消化し、ピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。
実施例２８で構築したプラスミドｐＳＥ−ＭＣＦ１５をＥｃｏＲＩ，ＳｐｅＩの２つの制限酵素で二重消化し、マイコバクテリウム由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製、ｐＳＥ−ＰＦＯ１より同酵素で切り出したピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片とＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結し、ギ酸脱水素酵素と（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素を同時に発現可能なプラスミドｐＳＦ−ＰＦＯ２を得た。プラスミド構築の過程を図１２に示した。
［実施例３０］ピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素とマイコバクテリウム由来ギ酸脱水素酵素の大腸菌における同時発現
マイコバクテリウム由来のギ酸脱水素酵素とピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素を共発現可能なプラスミドｐＳＦ−ＰＦＯ２により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
組換え大腸菌を液体ＬＢ培地に植菌し、３０℃で終夜培養した後、ＩＰＴＧを０．１ｍＭ添加し、さらに４時間培養した。得られた大腸菌を集菌し、酵素活性の測定をおこなった。
［実施例３１］ｐＳＦ−ＰＦＯ２で形質転換した大腸菌の酵素活性
実施例３０により調製したｐＳＦ−ＰＦＯ２で形質転換した大腸菌（培養液２ｍＬ相当）を、実施例１７に記載の方法により菌体破砕し、菌体抽出液を調製し、酵素活性の測定に用いた。ギ酸脱水素酵素活性の測定は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、２．５ｍＭ  ＮＡＤ＋、１００ｍＭギ酸及び酵素を含む反応液中で３０℃でおこなった。１Ｕは、上記反応条件において１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの生成を触媒する酵素量とした。組換え大腸菌から得た粗酵素液の酵素活性は、（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素活性で８．９９Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、ギ酸脱水素酵素活性で０．６５３Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであった。
［実施例３２］ピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素による（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの合成
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、１３９．８ｍｇ  ＮＡＤＨ、実施例３により得られたピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素１．７５Ｕ、０．５％  ４−クロロアセト酢酸エチルを含む反応液中で、３０℃で終夜反応させた。生成した４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの光学純度を次のようにして求めた。反応液から４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを酢酸エチルで抽出し、脱溶媒した後、光学分割カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより分析した。光学分割カラムは、ダイセル化学工業株式会社製キラルセルＯＤ（ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＤ．４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を用い、ｎ−ヘキサン：２−プロパノール＝９３：７の溶離液、流速１ｍＬ／ｍｉｎ、ＲＩ検出により行った。その結果、本発明によって生成した４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルは、９９％ｅｅ以上のＳ体であった。
［実施例３３］ピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素による、２，３−ジフルオロ−６−ニトロ−［［（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル］オキシ］ベンゼンの合成
２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、８６ｍＭグルコース、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、１ｍＭ硫酸マグネシウム、実施例３により得られたピキア・フィンランディカ由来（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素１Ｕ、グルコース脱水素酵素２Ｕを含む１ｍＬの反応液に１％２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼンを含むトルエン１ｍＬを添加し、攪拌下に２５℃、１５時間反応させた。
反応終了液を分析した結果、２，３−ジフルオロ−６−ニトロ−［［（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル］オキシ］ベンゼンが１．０ｇ／Ｌ生成し、その光学純度はほぼ１００％であった。
生成物である２，３−ジフルオロ−６−ニトロ−［［（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル］オキシ］ベンゼンの定量は、水相及び有機相に含まれる生成物を逆相ＨＰＬＣ分析（カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ−ＯＤＳ−２（０．４６ｘ１５ｃｍ，Ｇ−Ｌサイエンス株式会社）；溶離液：水／アセトニトリル＝１／１；流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：室温；検出：２６０ｎｍにおけるＵＶ）により行った。
更に、生成物である２，３−ジフルオロ−６−ニトロ−［［（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル］オキシ］ベンゼンの光学純度の測定は、光学分割カラムを用いたＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤ（０．４６ｘ２５ｃｍ、ダイセル化学工学株式会社）；溶離液：ヘキサン／２−プロパノール＝９／１；カラム温度：４０℃；流速：１ｍｌ／ｍｉｎ；検出：２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収）により行った。
［実施例３４］ｐＳＦ−ＰＦＯ２を用いた２，３−ジフルオロ−６−ニトロ−［［（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル］オキシ］ベンゼンの合成
実施例３０により調製したｐＳＦ−ＰＦＯ２で形質転換した大腸菌（培養液５ｍＬ相当）を集菌し、５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）、８２９ｍＭギ酸ナトリウム、１ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５．２２ｍＬの反応液に２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼン５００ｍｇを添加し攪拌下に３０℃、１８時間反応させた。
反応終了液を分析した結果、２，３−ジフルオロ−６−ニトロ−［［（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル］オキシ］ベンゼンが４８６ｍｇ生成し、その光学純度はほぼ１００％であった。
生成物である２，３−ジフルオロ−６−ニトロ−［［（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル］オキシ］ベンゼンの定量は、反応液にトルエンを加えることによって生成物を抽出し、水相及び有機相に含まれる生成物をガスクロマトグラフィーで定量し、出発原料にたいする収率を求めた。ガスクロマトグラフィーの条件は以下の通りである。すなわち、シリコンＯＶ−２１０  ２０％  クロモソルブＷ（ＡＷ−ＤＭＣＳ）６０／８０メッシュ（Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ＯＶ−２１０  ２０％  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ  Ｗ（ＡＷ−ＤＭＣＳ）６０／８０ｍｅｓｈ、Ｇ−Ｌサイエンス株式会社）、３．２ｍｍ×２００ｃｍとし、カラム温度１７０℃とし、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を利用して検出した。
更に、生成物である２，３−ジフルオロ−６−ニトロ−［［（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル］オキシ］ベンゼンの光学純度の測定は、光学分割カラムを用いたＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤ（０．４６ｘ２５ｃｍ、ダイセル化学工学株式会社）；溶離液：ヘキサン／エタノール＝９／１；カラム温度：４０℃；流速：１ｍＬ／ｍｉｎ；検出：２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収）により行った。
［実施例３５］キャンディダ・ウチリスからの（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の精製
キャンディダ・ウチリスＩＦＯ  ０９８８株を３．６Ｌの培地Ｂで培養し、遠心分離により菌体を調製した。得られた湿菌体を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１０％グリセロール、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）、０．０１％２−メルカプトエタノール及び２ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）で澱懸し、ビードビーター（Ｂｉｏｓｐｅｃ社製）により破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン硫酸を添加し、遠心分離により除核酸した上清を得た。その上清に硫安を添加して３０％飽和において遠心分離により粗酵素液である上清を得た。その酵素液を３０％飽和硫安を含む標準緩衝液に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したフェニル−セファロースＨＰ（２．６ｃｍ×１０ｃｍ）に添加し、硫安濃度を３０％−０％の勾配溶出を行った。溶出した画分のうち、（Ｒ）−２−オクタノールに選択性を有する画分を回収し、限外濾過により濃縮した。使用した培地Ｂの組成は以下の通りである。
・培地Ｂ：
酵母エキス１０ｇ／Ｌ
ペプトン２０ｇ／Ｌ
メタノール１％
ｐＨ６．０
濃縮した酵素液を標準緩衝液に透析した後、同緩衝液で平衡化したブルー−セファロースＨＰ（１．６ｃｍ×２．５ｃｍ）に添加し、同緩衝液で洗浄後、０−１．５Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配溶出を行った。（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素活性は、素通り溶出部分に溶出したため、この画分を回収し、濃縮した。標準緩衝液で平衡化したＭｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  ５／５（０．５ｃｍ×５ｃｍ）に添加し、同緩衝液で洗浄後、０−１Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配溶出を行った。（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素活性は、勾配溶出部分に溶出したため、この画分を回収し、濃縮した。濃縮した酵素液をスーパーデックス２００（０．３２ｃｍ×３０ｃｍ）を用い、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む標準緩衝液でゲル濾過を行った。
ゲル濾過により得られた活性画分をまとめて、精製酵素を得た。
精製酵素の比活性を測定した結果、（Ｒ）−２−オクタノールの酸化活性で約３．３３Ｕ／ｍｇであった。精製の要約を表９に示す。
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［実施例３６］（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の分子量測定
実施例３５で得られたキャンディダ・ウチリス由来の酵素の分子量を、スーパーデックスＧ２００のゲルろ過カラムを用いて測定したところ、約１５万であった。
［実施例３７］（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の至適ｐＨ
トリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、グリシン緩衝液（Ｇｌｙｃｉｎｅ）を用いてｐＨを変化させて、実施例３５で得られた酵素の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素活性を調べ、最大活性を１００とした相対活性で表し、図１３に示した。その結果、反応の至適ｐＨは８．５−１０．０であった。
リン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）、酢酸ナトリウム緩衝液（ＮａＯＡｃ）を用いてｐＨを変化させて、実施例３５で得られた酵素の４−クロロアセト酢酸エチル還元活性を調べ、最大活性を１００とした相対活性で表し、図１４に示した。その結果、反応の至適ｐＨは５．０−６．５であった。
［実施例３８］（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の基質特異性
実施例３５で得られた酵素を種々のアルコールと反応させ、その酸化活性を測定した。結果は、ＮＡＤ＋を補酵素とした（Ｒ）−オクタノールの酸化活性を１００とした相対活性で表し、表１０に示した。その結果、アルコール対基質として、（Ｓ）−２−オクタノールに対しては６．７％、２−プロパノールに対しては８．３％、（Ｒ）−１−フェニルエタノールに対しては８６．７％の相対活性を示した。
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実施例３５で得られた酵素を種々のケトンと反応させ、その還元活性を測定した。結果は、ＮＡＤＨを補酵素とした４−クロロアセト酢酸エチルの還元活性を１００とした相対活性で表し、表１１に示した。その結果、ケトン対基質として、２−オクタノンに対しては２６．６％、アセトフェノンに対して２５．３％の相対活性を示した。
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［実施例３９］キャンディダ・ウチリス由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素による（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの合成
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、１３９．８ｍｇ  ＮＡＤＨ、キャンディダ・ウチリス由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵０．０６Ｕ、０．５％  ４−クロロアセト酢酸エチルを含む反応液中で、３０℃で終夜反応させた。生成した４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの光学純度を実施例３２と同様にして求めた。その結果、本発明によって生成した４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルは、９７％ｅｅ以上のＳ体であった。
産業上の利用の可能性
本発明により、工業的生産に有利なＮＡＤＨ依存性の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素が提供された。本酵素を利用することにより、光学純度の高い（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを始めとした、光学活性アルコールの効率的な生産が可能となった。特に４−ハロアセト酢酸エステルを基質として本発明に基づく酵素反応によって得ることができる（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤やＤ−カルチニン等の医農薬合成の中間体となることから、本発明は産業上、非常に有用である。
中でも、特開平０２−７３２に記載された（Ｒ）−プロポキシベンゼン誘導体は、合成抗菌剤であるオフロキサシンの光学活性体（（Ｓ）−（−）−９−フルオロ−３−メチル−１０−（４−メチル−１−ピペラジニル）−７−オキソ−２，３−ジヒドロ−７Ｈ−ピリド［１，２，３−ｄｅ］［１，４］ベンゾオキサジン−６−カルボン酸、特開平６２−２５２７９０）などの合成中間体として有用な化合物である。オフロキサシンは、特定の光学異性体において高い抗菌活性が確認されている。オフロキサシンの合成中間体を高い光学純度で得ることができる本発明は、オフロキサシンの光学異性体の合成に貢献する。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ピキア・フィンランディカから精製した（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の酵素活性の、ｐＨの変化による影響を示す図。縦軸は、（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の最大活性を１００とした時の相対活性を表す。
図２は、ピキア・フィンランディカから精製した（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の４−クロロアセト酢酸エチル還元活性の、ｐＨの変化による影響を示す図。縦軸は、最大活性を１００とした時の相対活性を表す。
図３は、ピキア・フィンランディカから精製した（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の酵素活性の、酸化活性の温度の変化による影響を示す図。縦軸は、最大活性を１００とした時の相対活性を表す。
図４は、ピキア・フィンランディカから精製した（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の４−クロロアセト酢酸エチル還元活性の、温度変化による影響を示す図。縦軸は、最大活性を１００とした時の相対活性を表す。
図５は、ピキア・フィンランディカから精製した（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の残存活性を示す図。縦軸は、未処理の酵素活性を１００とした時の残存活性を表す。
図６は、ピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子を導入したプラスミド（ｐＳＥ−ＰＦＯ１）の構築図。プラスミドのマップ中で、Ｐ（ｔｒｃ）はｔｒｃプロモーターを、Ｔ（ｒｒｎＢ）はｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターを、Ａｍｐはアンピシリン抵抗性を示すβ−ラクターゼ遺伝子を、ｏｒｉはプラスミドの複製起源を、ｒｏｐはＲＯＰ−ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子を、ｌａｑＩｑはラクトースリプレッサーを表す。ｐＳＥ−ＰＦＯ１中のＰｆＯＤＨはピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子を表す。
図７は、ピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子を導入したプラスミド（ｐＳＥ−ＰＦＯ２）の構築図。プラスミドのマップ中で、Ｐ（ｔｒｃ）はｔｒｃプロモーターを、Ｔ（ｒｒｎＢ）はｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターを、Ａｍｐはアンピシリン抵抗性を示すβ−ラクターゼ遺伝子を、ｏｒｉはプラスミドの複製起源を、ｒｏｐはＲＯＰ−ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子を、ｌａｑＩｑはラクトースリプレッサーを表す。ｐＳＥ−ＰＦＯ２中のＰｆＯＤＨはピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子を表す。
図８は、枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を導入したプラスミド（ｐＳＥ−ＢＳＧ３）の構築図。プラスミドのマップ中で、Ｐ（ｔｒｃ）はｔｒｃプロモーターを、Ｔ（ｒｒｎＢ）はｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターを、Ａｍｐはアンピシリン抵抗性を示すβ−ラクターゼ遺伝子を、ｏｒｉはプラスミドの複製起源を、ｒｏｐはＲＯＰ−ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子を、ｌａｑＩｑはラクトースリプレッサーを、ＢｓＧｌｃＤＨは枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を表す。
図９は、ピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を導入したプラスミド（ｐＳＧ−ＰＦＯ１）の構築図。プラスミドのマップ中で、Ｐ（ｔｒｃ）はｔｒｃプロモーターを、Ｔ（ｒｒｎＢ）はｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターを、Ａｍｐはアンピシリン抵抗性を示すβ−ラクターゼ遺伝子を、ｏｒｉはプラスミドの複製起源を、ｒｏｐはＲＯＰ−ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子を、ｌａｑＩｑはラクトースリプレッサーを、ＢｓＧｌｃＤＨは枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を、ＰｆＯＤＨはピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子を表す。
図１０は、ピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を導入したプラスミド（ｐＳＧ−ＰＦＯ２）の構築図。プラスミドのマップ中で、Ｐ（ｔｒｃ）はｔｒｃプロモーターを、Ｔ（ｒｒｎＢ）はｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターを、Ａｍｐはアンピシリン抵抗性を示すβ−ラクターゼ遺伝子を、ｏｒｉはプラスミドの複製起源を、ｒｏｐはＲＯＰ−ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子を、ｌａｑＩｑはラクトースリプレッサーを、ＢｓＧｌｃＤＨは枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を、ＰｆＯＤＨはピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子を表す。
図１１は、マイコバクテリウム・バッカエ由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を導入したプラスミド（ｐＳＥ−ＭＣＦ１５）の構築図。プラスミドのマップ中で、Ｐ（ｔｒｃ）はｔｒｃプロモーターを、Ｔ（ｒｒｎＢ）はｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターを、Ａｍｐはアンピシリン抵抗性を示すβ−ラクターゼ遺伝子を、ｏｒｉはプラスミドの複製起源を、ｒｏｐはＲＯＰ−ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子を、ｌａｑＩｑはラクトースリプレッサーを、ＭｃＦＤＨはマイコバクテリウム・バッカエ由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を表す。
図１２は、ピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子とマイコバクテリウム・バッカエ由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を導入したプラスミド（ｐＳＦ−ＰＦＯ２）の構築図。プラスミドのマップ中で、Ｐ（ｔｒｃ）はｔｒｃプロモーターを、Ｔ（ｒｒｎＢ）はｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターを、Ａｍｐはアンピシリン抵抗性を示すβ−ラクターゼ遺伝子を、ｏｒｉはプラスミドの複製起源を、ｒｏｐはＲＯＰ−ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子を、ｌａｑＩｑはラクトースリプレッサーを、ＭｃＦＤＨはマイコバクテリウム・バッカエ由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を、ＰｆＯＤＨはピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素遺伝子を表す。
図１３は、キャンディダ・ウチリスから精製した（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の酵素活性の、ｐＨの変化による影響を示す図。縦軸は、最大活性を１００とした時の相対活性を表す。
図１４は、キャンディダ・ウチリスから精製した（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の４−クロロアセト酢酸エチル還元活性の、ｐＨの変化による影響を示す図。縦軸は、最大活性を１００とした時の相対活性を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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