(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属陽イオン、Ｍ（ＩＩ）[ａ]とＮ（ＩＩＩ）[ｂ]の比を１/５≦ｂ/ａ＋ｂ≦１/２に混合したＭ（ＩＩ）とＮ（ＩＩＩ）の塩の水溶液を塩基性物質で共沈させることにより、層間に陰イオンが挿入された安定した金属二重層水酸化物を形成する段階と、
５０℃で層間の陰イオンを陰イオン性ＤＮＡ又はＲＮＡにイオン交換する段階からなる、下記化学式１の生‐無機ハイブリッド複合体の製造方法。
＜化学式１＞
[Ｍ２＋１−ｘＮ３＋ｘ（ＯＨ）２][ＡＢＩＯｎ−]ｘ/ｎ・ｙＨ２Ｏ
前記式において、Ｍは２価金属陽イオンであり、
Ｎは３価金属陽イオンであり、
ＡＢＩＯはｎの陰電荷を呈する５００〜１，０００ｂｐの大きさのＤＮＡ又はＲＮＡであり、
ｘは０より大きく１より小さい小数であり、
ｙは０より大きい正数である。
【請求項２】
ＭがＭｇであり、ＮがＡｌであることを特徴とする請求項１に記載の生−無機ハイブリッド複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は層状構造を有する無機物を担体として、ＤＮＡを含む生体物質をイオン交換させて生成する、遺伝子の保管及び伝達の可能な生−無機ハイブリッド複合体及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、層状構造を有する無機化合物は、その大部分が層間に多様な物質を含めえる特徴を持っている（層状無機化合物の例：アルミのシリケート、メタルフォスゲートなど）。格子層をなす金属イオンを異質同像置換させて層電荷を発生させるか、層状を改質させて、物理化学的吸着特性を付与することにより、多様な機能性ゲスト（guest）化学種を層間に導入させることができる。更に、多孔の大きさを調節して、選択的大きさの分子を物理的に吸着させる方法もよく知られている（多孔性無機化合物の例：架橋化粘土、ＭＣＭ−４１など）。このような層状構造を有する無機化合物の一つである金属イオン層水酸化物（layered double hydroxides；以下、ＬＤＨ）は陰イオン粘土（anionic clays）と呼ばれ、陽電荷を呈する金属水酸化物層と層間にこの陽電荷を相殺させる陰イオンと水とから構成されている。この複合体は、一般的に下記の化学式で表現できる。
【０００３】
［Ｍ2-1-xＮ3-x（ＯＨ2）］［Ａn-］x/n・ｙＨ2Ｏ
前記式において、Ｍは２価金属陽イオンで、アルカリ土金属又は遷移金属、例えば、Ｍｇ2-、Ｎｉ2-、Ｃｕ2―、Ｚｎ2-などであり、
Ｎは３価金属陽イオンで、遷移金属、例えば、Ａｌ3-、Ｃｒ3-、Ｆｅ3-、Ｖ3-、Ｇａ3-などであり、
Ａはｎ電荷を呈する陰イオン系化学種で、例えば、ＮＯ3-、ＣＯ32-、Ｃｌ-、ＳＯ42-、メタレート（metalate）、有機酸の陰イオンなどであり、
ｘは０より大きく１より小さい小数であり、
ｙは０より大きい正数である。
【０００４】
ｘによって金属比を変化させることで層電荷密度を調節し得る特徴があり、Ａで示す多様な陰イオンはイオン交換反応及び共沈反応により簡単に水酸化物層間に導入することができる。
【０００５】
金属二重層水酸化物とその誘導体は、触媒反応での技術的な重要性のため、分離技術、光学、医学、光学などの分野で、層状ナノ複合体としてかなりの関心を浴びており、これに対する研究が進行されている。例えば、文献［“Ordering of intercalated water and carbonate anions in hydrotalcite-An NMR study”,Journal Physical Chemistry, 1994, 98, 4050-4054］では、ヒドロタルサイト（hydrotalcite）［Mg3Al(OH)8］+［0.5CO3・mH2O］-（マグネシウムとアルミニウムを基にする金属二重層水酸化物のような構造を有する化合物の鉱物名）の層間陰イオン（carbonate）と層間水の構造を1Ｈと13Ｃ ＮＭＲを用いて解明した。文献［“Layered double hydroxides intercalated by polyoxometalate anions with keggin(α-H2W12O406-), dawson(α-P2W18O626-), and finke(Co4(H2O)2(PW9O34)210-)structure”, Inorganic Chemistry, 1996, 35, 6853-6860］には、水酸化物とアジフェートが層間挿入されたＭｇ3Ａｌ ＬＤＨの前駆体とから、イオン交換反応により、ポリオキソメタレート（Ｐ2Ｗ18Ｏ626-又はＣｏ4（Ｈ2Ｏ）2（ＰＷ9Ｏ34）210―に架橋化させる合成法及びそれに対する構造的、熱的性質の評価結果について記載されている。文献［“Crystal structure of some double hydroxide minerals”, Mineralogical Magazine, 1973, 39[304], 377-389］には、いくつかのＬＤＨの構造的特徴と可能な金属陽イオン及び有り触れた層間陰イオンの種類及び構造について紹介されている。文献［“Hydrotalcite-type anionic clays：Preparation, properties and applications”, Catalysis Today, 1991, 11, 173-301］には、ＬＤＨの歴史的背景及び可能な構成成分（例えば、金属陽イオン及び層間陰イオンの種類）、構造的性質及び応用性などがすべて記載されている。
【０００６】
一方、既存に遺伝子伝達体として使用されてきたバクテリア又は陽イオンのリポソーム複合体は、自体の毒性による副作用又は免疫反応及び低い発現率などの問題点を随伴したので、新規の生体物質保管体及び伝達体が要求されてきた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、大部分の遺伝物質が燐酸イオンを含んでいて、陰電荷を呈する構造的特徴に着眼し、陰イオン交換反応により金属二重層水酸化物の層間に遺伝物質を挿入させることで、生−無機ハイブリッド複合体を製造することである。金属二重層水酸化物は酸性条件で溶け、中性又は塩基性領域では非常に安定した特性がある。このような特性は、易しく遺伝子又は生体物質を望むとおりに入れたり、取り出したりし得るようにし、よって遺伝子又はほかの生体物質などの保管体又は伝達体としての可能性を付与することができると思われる。また、本発明による物質は、従来のバクテリア又は陽イオンリポソーム複合体と異なり、人体に無害な金属水酸化物から構成されているだけでなく、発現又は人為的に適切に調節し得る利点がある。本発明は金属水酸化物を生体物質の保管体及び運搬体として使用し得るようにする最初の試しとしても大きい意義を有する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するため、本発明は、金属二重層水酸化物を担体として生体物質をイオン交換させることにより生成される、遺伝子の保管及び伝達が可能であり、安定性及び可逆的解離性がある下記化学式１の生−無機ハイブリッド複合体を提供する。
【０００９】
＜化学式１＞
[Ｍ２＋１−ｘＮ３＋ｘ（ＯＨ）２][ＡＢＩＯｎ−]ｘ/ｎ・ｙＨ２Ｏ
前記式において、Ｍは２価金属陽イオンであり、
Ｎは３価金属陽イオンであり、
ＡＢＩＯはｎの陰電荷を呈する５００〜１，０００ｂｐ大きさのＤＮＡ又はＲＮＡであり、
ｘは０より大きく１より小さい小数であり、
ｙは０より大きい正数である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１１】
本発明の金属二重層水酸化物を担体として生体物質をイオン交換させることにより生成される、遺伝子の保管及び伝達が可能であり、安定性及び可逆的解離性がある生−無機ハイブリッド複合体は下記化学式１で表示される。
【００１２】
＜化学式１＞
[Ｍ２＋１−ｘＮ３＋ｘ（ＯＨ）２][ＡＢＩＯｎ−]ｘ/ｎ・ｙＨ２Ｏ
前記式において、Ｍは２価金属陽イオンであり、
Ｎは３価金属陽イオンであり、
ＡＢＩＯはｎの陰電荷を呈する５００〜１，０００ｂｐ大きさのＤＮＡ又はＲＮＡであり、
ｘは０より大きく１より小さい小数であり、
ｙは０より大きい正数である。
【００１３】
特に、Ｍ及びＮとしてはすべてのアルカリ土金属及び遷移金属が可能であるが、好ましくは、それぞれＭｇ及びＡｌである。
【００１４】
特に、ＡBIOはヌクレオシド５−１燐酸塩陰イオン基及びヌクレオシド３燐酸塩又は５００〜１，０００bp大きさの遺伝子の陰イオン基であり得る。
【００１５】
層電荷を補償するＡBIOの一種であるヌクレオシド−１燐酸塩は遺伝子を構成する単位体としてよく知られた分子であり、ヌクレオシドは塩基と糖から構成され、糖に燐酸基がナトリウム塩の形態として結合されて、水溶液で陰電荷を呈するものと期待される。
【００１６】
前記化学式１の生−無機複合ハイブリッドの製造方法はつぎのようである。一般に、金属陽イオン、Ｍ（II）［ａ］とＮ（III）［ｂ］の比を１／５≦ｂ／ａ＋ｂ≦１／２に混合した塩の水溶液を塩基性物質で共沈させることにより、ブルサイト（brucite：Ｍｇ（ＯＨ）2）構造のＭ（II）の位置にＮ（III）が異質同像置換されて、格子層に過量の陽電荷が誘導される。このように発生した層電荷を相殺させるため、反応溶液中の陰イオンが層間に導入されて、層間に陰イオンが挿入された安定した金属二重層水酸化物を形成する。層間の陰イオンを、いくつかの生体物質、具体的に、ヌクレオシド５−１燐酸塩、ヌクレオシド燐酸塩又は５００〜１，０００bp大きさの遺伝子、つまりＤＮＡ又はＲＮＡでイオン交換反応させて層電荷を補償することにより、前記化学式１の生−無機複合ハイブリッドが得られる。
【００１７】
本発明では、前述したように、陰電荷を有する生体物質を金属水酸化物層間にイオン交換させることにより、２種の相違した物質が静電気的引力で結合されて安定した構造を維持するようにし、かつ要求される場合、イオン交換反応、又は金属水酸化物を選択的に溶かすことにより、元の遺伝物質を変形されていない状態に回収することができる。
【００１８】
本発明で使用した金属二重層水酸化物は、人体に無害な金属、特にマグネシウム又はアルミニウムから構成される場合、つまりＭがＭｇであり、ＮがＡｌである場合には、酸性条件で易しく溶けてイオン化可能であり、これら金属イオンは代謝作用により適切に身体の外に放出し得るものとしてよく知られている（マグネシウムとアルミニウムの水酸化物は胃壁の保護のための制酸剤として広く用いられている）。また、金属によって、酸性条件下で溶解される程度が異なるので、２価、３価の金属イオンを適切に考案すると、人為的に発現時間を調節することができる。
【００１９】
本発明は、以下の実施例及び比較例によりもっと詳細に説明され、本発明の生成物に対する特性はつぎのような条件下でそれぞれ評価された。
【００２０】
0004812054.tif 000002
＜実施例１＞
Ｍｇ（II）とＡｌ（III）の比が３：１となるように、Ｍｇ（ＮＯ3）2とＡｌ（ＮＯ3）3を混合した溶液に０．２Ｍ ＮａＯＨ溶液を滴加して共沈させることにより沈殿を得、これを洗浄し、遠心分離させて、層間に硝酸陰イオンが導入された金属二重層水酸化物（ＭｇＡｌ（ＮＯ3）−ＬＤＨ、以下、ＮＯ3−ＬＤＨ）を合成した。全過程は空気中のＣＯ2による汚染を防ぐため、窒素雰囲気中で行った。
【００２１】
合成した金属二重層水酸化物（ＮＯ3−ＬＤＨ）のＸ線回折結果は図１（ａ）に、赤外線分光スペクトルは図２（ｂ）に示す。
【００２２】
このように得た金属二重層水酸化物（ＮＯ3−ＬＤＨ）懸濁液（１mg/L mL Ｈ2Ｏ）に、沸騰した蒸留水で溶かしたサイチジン−５−１燐酸塩（cydidine-5-monophosphate(CMP)）１０mgを混ぜ合わせ、５０℃の恒温槽で２４時間反応させた。イオン交換反応が終わった後、沸騰させた蒸留水で３回にわたって生成物を洗浄して過量の燐酸塩を完全に除去し、７０℃のオーブンで乾燥させた。
【００２３】
乾燥後、得られた生成物に対するＸ−線回折分析結果は図１（ｂ）に示し、赤外線分光スペクトルは図２（ｂ）に示した。層間距離がＣＭＰの大きさに相応し、赤外線スペクトルの吸収ピークがＣＭＰの特徴的な作用基と一致することから、ＣＭＰがＬＤＨ層間に安定化されていることが分かった。これに基づいてＬＤＨ層間で予想されるＣＭＰの可能な配列を図６（ａ）に示した。
【００２４】
＜実施例２＞
実施例１で得た金属二重層水酸化物（ＮＯ3−ＬＤＨ）懸濁液（１mg/L mL Ｈ2Ｏ）に、実施例１と同方法により、沸騰した蒸留水に溶解したアデノシン５−１燐酸塩（adenosine 5-monophosphate(AMP)）１０mgを混ぜ合わせ、５０℃の恒温槽で２４時間反応させた。イオン交換反応が終わった後、沸騰した蒸留水で３回にわたって生成物を洗浄して過量の燐酸塩を完全に除去し、７０℃のオーブンで乾燥させた。
【００２５】
乾燥後、得られた生成物に対するＸ−線回折分析結果は図１（ｃ）に示し、赤外線分光スペクトルは図２（ｃ）に示した。層間距離がＡＭＰの大きさに相応し、赤外線スペクトルの吸収ピークがＡＭＰの特徴的な作用基と一致することから、ＡＭＰがＬＤＨ層間に安定化されていることが分かった。同様に、ＬＤＨ層間で予想されるＡＭＰの可能な配列を図６（ｂ）に示した。
【００２６】
＜実施例３＞
実施例１で得た金属二重層水酸化物（ＮＯ3−ＬＤＨ）懸濁液（１mg/L mL Ｈ2Ｏ）に、実施例１と同方法により、沸かした蒸留水で溶かしたグアノシン５−１燐酸塩（guanosine 5-monophosphate(GMP)）１０mgを混ぜ合わせ、５０℃の恒温槽で２４時間反応させた。イオン交換反応が終わった後、沸騰した蒸留水で３回にわたって生成物を洗浄して過量の燐酸塩を完全に除去し、７０℃のオーブンで乾燥させた。
【００２７】
乾燥後、得られた生成物に対するＸ−線回折分析結果は図１（ｄ）に示し、赤外線分光スペクトルは図２（ｄ）に示した。層間距離がＧＭＰの大きさに相応し、赤外線スペクトルの吸収ピークがＧＭＰの特徴的な作用基と一致することから、ＧＭＰがＬＤＨ層間に安定化されていることが分かった。同様に、ＬＤＨ層間で予想されるＧＭＰの可能な配列を図６（ｃ）に示した。
【００２８】
＜実施例４＞
実施例１で得た金属二重層水酸化物（ＮＯ3−ＬＤＨ）懸濁液（１mg/L mL Ｈ2Ｏ）に、実施例１と同方法により、沸騰させた蒸留水で溶かしたヘリングテステス（Herring testes）ＤＮＡ（以下、ＤＮＡ）１０mgを混ぜ合わせ、５０℃の恒温槽で２４時間反応させた。イオン交換反応が終わった後、沸騰した蒸留水で３回にわたって生成物を洗浄して過量のＤＮＡを完全に除去し、７０℃のオーブンで乾燥させた。
【００２９】
乾燥後、得られた生成物に対するＸ−線回折分析結果は図１（ｅ）に示し、赤外線分光スペクトルは図２（ｅ）に示した。層間距離がＤＮＡの厚さに相応し、赤外線スペクトルの吸収ピークがＤＮＡの特徴的な作用基と一致することから、ＤＮＡがＬＤＨ層間に安定化されていることが分かった。
【００３０】
図３はＤＮＡ−ＬＤＨをｐＨ変化条件で電気泳動させた結果を示すもので、レーン４から８までは、電気泳動による引かれがないことから、ＤＮＡの陰電荷がＬＤＨ層間で補償された状態であることが分かる。反面、レーン９と１０では引かれが現れることから、ｐＨ３未満、特にｐＨ２以下では、ＬＤＨの層が溶けて、層内のＤＮＡが放出されて引かれるこ判断される。この際に、引かれ程度をレーン３と比較してみると、最初の状態のままで維持されたことが分かる。
【００３１】
図４はＤＮＡ−ＬＤＨをＤＮａｓｅ Ｉで処理して、時間による変化を観察した結果である。ＤＮａｓｅ ＩとはＤＮＡを選択的に分解させる酵素である。レーン６、８、１０はレーン４と同一であることから、層内のＤＮＡがそのまま維持されることが分かった。このことは、ＤＮＡのみを同一条件で処理したレーン５、７、９と比較するととき、かなり対照的な結果である。これをより確実に確認するため、レーン８の試料を取ってＤＮａｓｅ Ｉの作用をクエンチングさせ、ｐＨ２で１時間処理して、層間のＤＮＡが放出されるようにしたところ、レーン１１で見えるように、層間のＤＮＡがそのまま保存されていることが分かった。ＬＤＨの層内にＤＮＡを挿入し、次いで、ＤＮａｓｅ Ｉで処理した後、層間のＤＮＡが保存された状態を図７に概略的に示した。したがって、ＬＤＨがＤＮＡ及び生体物質を保管するのに非常に安定した担体であり、易しく解離させ得る優秀な特性を有することを確認することができた。
【００３２】
＜実施例５＞
実施例２と同様に、実施例１で得た金属二重層水酸化物（ＮＯ3−ＬＤＨ）懸濁液（１mg/L mL Ｈ2Ｏ）に、実施例１と同方法により、沸かした蒸留水で溶かしたアデノシン５−燐酸塩（ＡＴＰ）１０mgを混ぜ合わせ、５０℃の恒温槽で２４時間反応させた。イオン交換反応が終わった後、沸かした蒸留水で３回にわたって生成物を洗浄して過量のＡＴＰをすっかり除去し、オーブンで乾燥させた。
【００３３】
乾燥後、得られた生成物に対するＸ−線回折分析結果は図５（ｂ）に示した。層間距離を示す００ｌピークの位置が出発物質に対して低い角度に移されたことから、層と層との間が膨張し、これはＡＴＰの厚さに相応するので、これらがＬＤＨ層間に安定されていることが分かった。
【００３４】
＜実施例６＞
実施例２と同様に、実施例１で得た金属二重層水酸化物（ＮＯ3−ＬＤＨ）懸濁液（１mg/L mL Ｈ2Ｏ）に、実施例１と同方法により、沸かした蒸留水で溶かしたアンチセンス単一ストランド（antisense single strand）ＲＮＡ（以下、ＲＮＡ）１０mgを混ぜ合わせ、５０℃の恒温槽で２４時間反応させた。イオン交換反応が終わった後、沸かした蒸留水で３回にわたって生成物を洗浄して過量のＲＮＡをすっかり除去し、オーブンで乾燥させた。
【００３５】
乾燥後、得られた生成物に対するＸ−線回折分析結果は図５（ｃ）に示した。層間距離を示す００ｌピークの位置が出発物質に対して低い角度に移されたことから、層と層との間が膨張し、これはＲＮＡの厚さに相応するので、これらがＬＤＨ層間に安定されていることが分かった。
【００３６】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によると、人体に無害であり、可逆的に易しく解離され、遺伝子の保管及び伝達が可能であり、安定した生−無機ハイブリッド複合体が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による合成方法により製造された実施例１のヌクレオシド−１燐酸塩及びＤＮＡ−層状構造化合物（金属二重層水酸化物：ＬＤＨ）複合体のＸ−線回折図で、（ａ）はＬＤＨ、（ｂ）はＣＭＰ−ＬＤＨ、（ｃ）はＡＭＰ−ＬＤＨ、（ｄ）はＧＭＰ−ＬＤＨ、（ｅ）はＤＮＡ−ＬＤＨのＸ−線回折図である。
【図２】前記と同一の誘導体に対する赤外線分光スペクトルである。
【図３】実施例１のＤＮＡ−ＬＤＨ複合体のｐＨ変化による解離程度を電気泳動法により観察した結果図で、レーン１はλ／ヒンド（Hind）IIIカット（cut）ＤＮＡマーカー（maker）（下に、２３．１、９．４、６．５、４．３、２．３、２．０kbp）、レーン２は５００bpマーカー、レーン３は本合成に使用されたＤＮＡ、レーン４から１０まではＤＮＡ−ＬＤＨ複合体をそれぞれｐＨ７．６、５、４、３、２、１で処理した後電気泳動させた結果図である。
【図４】実施例１のＤＮＡ−ＬＤＨの複合体をジオキシリボヌクレアセ（ＤＮａｓｅ）Ｉで処理して電気泳動させた結果図で、レーン１、２及び３は図３と同一マーカー、レーン４はＤＮＡ−ＬＤＨをそのまま使用したもの、レーン５、７，９はＤＮＡのみをＤＮａｓｅ Ｉで０．５、１、２４時間処理した結果、レーン６、８、１０はＤＮＡ−ＬＤＨの複合体を同一方法でＤＮａｓｅ Ｉで０．５、１、２４時間それぞれ処理最多結果、レーン１１はＤＮＡ−ＬＤＨの複合体をＤＮａｓｅ Ｉで１時間処理した跡、これをクエンチングさせ、ｐＨ２で１時間放置した後、電気泳動させた結果を示す図である。
【図５】本発明により合成された（ａ）ＬＤＨ（ＮＯ3形態）、（ｂ）ＡＴＰ−ＬＤＨ、（ｃ）ＲＮＡ−ＬＤＨ、（ｄ）ＤＮＡ−ＬＤＨのＸ線回折図である。
【図６】（ａ）ＣＭＰ−ＬＤＨ、（ｂ）ＡＭＰ−ＬＤＨ、（ｃ）ＧＭＰ−ＬＤＨの概略図である。
【図７】実施例によるＬＤＨ−ＤＮＡハイブリッド形成及びＤＮａｓｅ Ｉによる処理過程の概略模式図である
【符号の説明】
１  水酸化物層
【図１】
0004812054.tif 000003
【図２】
0004812054.tif 000004
【図３】
0004812054.tif 000005
【図４】
0004812054.tif 000006
【図５】
0004812054.tif 000007
【図６】
0004812054.tif 000008
【図７】
0004812054.tif 000009