(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象となる生体物質を捕捉するためのプローブが基板表面に固定された基板構造と、
前記基板構造の前記対象となる生体物質を捕捉するためのプローブが設けられた表面に細胞を含む緩衝液を保持する空間構造と、
前記空間構造に保持された緩衝液中の細胞に３２０ｎｍから４００ｎｍの波長範囲の紫外光を照射して該細胞を破壊する機構、
前記破壊する機構により破壊された細胞に対して、前記基板表面に対してほぼ垂直方向に電界を印加するように前記空間構造を挟んで配された２枚の電極と、
前記２枚の電極間に電界を印可することによって前記基板表面に対してほぼ垂直方向に移動した結果、前記基板表面のプローブに捕捉された前記対象となる生体物質を区別して検出する機構とを備える細胞構成物質解析システム。
【請求項２】
前記細胞を破壊する機構がＵＶパルスレーザー照射機構である請求項１記載の生体物質解析システム。
【請求項３】
前記基板表面のプローブに捕捉された生体物質を区別して検出する機構が、前記生体物質にハイブリダイズする標識プローブを標識するナノ粒子とこれを識別する計測手段であり、前記ナノ粒子は、サイズと材料で特定されるものである請求項１または２記載の生体物質解析システム。
【請求項４】
前記生体物質を捕捉するためのプローブを固定する基板表面が、２種類のモノマーを重合させて調製するポリマー層とされ、該ポリマー層が重合用の第１の官能基を２箇所に有する第１のモノマーと重合用の第２の官能基を２箇所に有する第２のモノマーを交互に配するように重合した構造で、前記第１のモノマーおよび前記第２のモノマーの片方には生体物質捕捉用残基を持つ構造である請求項１〜３のいずれか一項記載の生体物質解析システム。
【請求項５】
アガロースゲル膜を一面に配した基板であって、前記アガロースゲル膜内に該アガロースゲルを部分的に除去することによって形成された複数の区画に区分された領域を有する基板と、前記基板の領域表面に設けられたプローブであって、前記基板の領域に収容された細胞の構成物質を捕捉することのできるプローブと、前記基板の領域表面に対してほぼ垂直方向に電界を印加するための２枚の電極とを備える細胞構成物質分取チップを使用して、
前記区画の領域に細胞を含む緩衝液を保持する工程、
前記区画の領域に保持された細胞に３２０ｎｍから４００ｎｍの波長範囲の紫外光を照射して該細胞を破壊する工程、
前記電極間に電界を印可して前記破壊された細胞に含まれる対象となる生体物質をその細胞内での２次元位置情報を保持しながら前記プローブが設けられた前記領域表面に向かってほぼ垂直方向に移動させ前記プローブに捕捉させる工程、
前記捕捉された前記対象となる生体物質に、それぞれ異なるナノ粒子で標識されたプローブを反応させる工程、
前記反応したプローブのナノ粒子の粒子径および元素組成を解析し対象となる生体物質の種類と位置を生体物質の分子毎で同定する工程、
を含む、細胞構成物質解析法。
【請求項６】
アガロースゲル膜を一面に配した基板であって、前記アガロースゲル膜内に該アガロースゲルを部分的に除去することによって形成された、個々の細胞を保持するための複数の区画に区分された領域を有する基板と、該基板の前記区分された領域にスポット状に配列された、前記細胞の構成物質を捕捉することのできる複数種のプローブと、前記基板の領域表面に対してほぼ垂直方向に電界を印加するように前記領域を挟んで配された２枚の電極とを備える細胞構成物質分取チップを使用して、
前記区画の領域に細胞を含む緩衝液を保持する工程、
前記区画の領域に保持された細胞に３２０ｎｍから４００ｎｍの波長範囲の紫外光を照射して該細胞を破壊する工程、
該破壊された細胞に含まれる対象となる生体物質を、前記２枚の電極間に電界を印加することによって前記基板の領域表面に向かってほぼ垂直方向に移動させ、前記基板の領域に存在する前記複数種のプローブに捕捉させる工程、
該捕捉された対象となる生体物質に、それぞれ異なるナノ粒子で標識されたプローブを反応させる工程、
該反応したプローブのナノ粒子の粒子径および元素組成を解析し対象となる生体物質の種類と位置を生体物質の分子毎で同定する工程、
を含む、細胞構成物質解析法。
【請求項７】
複数の区画に区分された領域を有する基板を備える細胞構成物質分取チップを使用して、
前記区画の領域に細胞を含む緩衝液を保持する工程、
前記区画の領域に保持された細胞を乾燥雰囲気に曝して乾燥させる工程、
細胞膜を物質透過性にする溶液を添加する工程、
前記区画の領域に固定された細胞構成物質以外を洗浄する工程、
前記区画の領域に固定された細胞構成物質に、それぞれ異なるナノ粒子で標識されたプローブを反応させる工程、
該反応したプローブのナノ粒子の粒子径および元素組成を解析し対象となる生体物質の種類と位置を生体物質の分子毎で同定する工程、
を含む、細胞構成物質解析法。
【請求項８】
マーカーが付されるとともに、アガロースゲル膜を一面に配した基板であって、前記アガロースゲル膜内に該アガロースゲルを部分的に除去することによって形成された、複数の区画に区分された領域を有する基板と、前記基板の領域表面に設けられた前記基板の領域に収容された細胞の構成物質を捕捉することのできるプローブと、前記基板の領域表面に対してほぼ垂直方向に電界を印加するように前記領域を挟んで配された２枚の電極とを備える細胞構成物質分取チップを使用して、
前記区画の領域に細胞を含む緩衝液を保持する工程、
前記区画の領域に保持された細胞と前記マーカーが一つの画面中に入る第１の画像を得る工程、
前記区画の領域に保持された細胞に３２０ｎｍから４００ｎｍの波長範囲の紫外光を照射して該細胞を破壊する工程、
前記電極間に電界を印可して前記破壊された細胞に含まれる対象となる生体物質をその細胞内での２次元位置情報を保持しながら前記プローブが設けられた前記領域表面に向かってほぼ垂直方向に移動させ、前記プローブに捕捉させる工程、
前記捕捉された対象となる生体物質に、それぞれ異なるナノ粒子で標識されたプローブを反応させる工程、
前記プローブを標識するナノ粒子と前記マーカーが一つの画面中に入る第２の画像を得る工程、
前記反応したプローブのナノ粒子の粒子径および元素組成を解析し対象となる生体物質の種類と位置を生体物質の分子毎で同定する工程、
前記第１の画像と前記第２の画像とをマーカーを一致させて合成する工程、
を含む、細胞構成物質解析法。
【請求項９】
マーカーが付されるとともに複数の区画に区分された領域を有する基板を備える細胞構成物質分取チップを使用して、
前記区画の領域に細胞を含む緩衝液を保持する工程、
前記区画の領域に保持された細胞と前記マーカーが一つの画面中に入る第１の画像を得る工程、
前記区画の領域に保持された細胞を乾燥雰囲気に曝して乾燥させる工程、
ペプシンを含む溶液を添加し、細胞膜を物質透過性にする工程、
前記区画の領域に固定された細胞構成物質を洗浄する工程、
前記区画の領域に固定された細胞構成物質に、それぞれ異なるナノ粒子で標識されたプローブを反応させる工程、
前記プローブを標識するナノ粒子と前記マーカーが一つの画面中に入る第２の画像を得る工程、
該反応したプローブのナノ粒子の粒子径および元素組成を解析し対象となる生体物質の種類と位置を生体物質の分子毎で同定する工程、
前記第１の画像と前記第２の画像とをマーカーを一致させて合成する工程、
を含む、細胞構成物質解析法。
【請求項１０】
対象となる生体物質を捕捉するためのプローブが基板表面に固定された基板構造、前記プローブを固定した基板表面には細胞吸着防止用のアガロース薄膜が塗布された構造、表面が前記基板構造の生体物質を捕捉するためのプローブが設けられた面に細胞を含む緩衝液を保持する空間構造、前記空間構造に保持された緩衝液中の細胞に３２０ｎｍから４００ｎｍの波長範囲の紫外光を照射して該細胞を破壊する機構、該破壊された細胞に含まれる対象となる生体物質を前記基板表面に２次元投影する機構、前記基板表面のプローブに捕捉された生体物質を区別して検出する機構を備える、細胞構成物質解析システム。
【請求項１１】
アガロースゲル膜を一面に配した基板であって、前記アガロースゲル膜内に該アガロースゲルを部分的に除去することによって形成された、複数の区画に区分された領域を有する基板を備える細胞構成物質分取チップを使用して、
前記区画の領域に細胞を含む緩衝液を保持する工程、
前記区画の領域に保持された細胞を乾燥雰囲気に曝して乾燥させる工程、
細胞膜を物質透過性にする溶液を添加する工程、
前記区画の領域に固定された細胞構成物質以外を洗浄する工程、
前記区画の領域に固定された細胞構成物質に、それぞれ異なるナノ粒子で標識されたプローブを反応させる工程、
該反応したプローブのナノ粒子の粒子径および元素組成を解析し対象となる生体物質の種類と位置を生体物質の分子毎で同定する工程、
を含む、細胞構成物質解析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞ないし細胞集合体である組織で発現している遺伝子産物であるｍＲＮＡないしタンパク質を、ｍＲＮＡないしタンパク質の細胞や細胞集合体である組織での空間局在の情報とともに定量的に計測するための細胞構成物質解析チップ、細胞構成物質解析システムおよび方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム計画の進展とともにＤＮＡレベルで生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが有効である。この有力な方法として、固体表面上に数多くのＤＮＡプローブを種類毎に区分けして固定したＤＮＡプローブアレー、あるいはＤＮＡプローブチップ（実際には固定されているのはオリゴヌクレオチドの誘導体であるのでオリゴチップと呼ぶこともある）が用いられている。ＤＮＡプローブのかわりに抗体や抗原を基板上にアレイ状に固定したプロテインチップの概念も実用化されている。たとえば、基板上にアレルギーを起こす数十から数百の抗原（アレルゲン）を固定したデバイスに検体血清を反応させ、各抗原と抗原抗体反応を起こす血清中に存在するＩｇＭを特異的に捕捉し、ＩｇＭに結合する酵素標識２次抗体を反応させ、酵素活性を化学発光と組み合わせることで測定して、アレルゲンを検出するアレルゲン検査用のシステムが医療検査用に実用化されている。
【０００３】
ＤＮＡチップを作るには光化学反応と半導体工業でよく用いられるリソグラフィーを用いて区画された多数のセルに設計された配列のオリゴマーを一塩基ずつ合成して行く方法（非特許文献１：Science 251, 767-773(1991)）、あるいはＤＮＡプローブやタンパク質プローブを各区画に一つ一つ植え込んでいく方法（非特許文献２：Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918 (1996)）などがある。
【０００４】
これらチップは、いずれもスライドガラスなどの平面上に区画を区切り、多数のプローブを、アレイ状に整列させた構造をしている。どのプローブがどの位置にあるかは、プローブが固定されている物理的な位置のみでインデクシングされるのが一般的である。
【０００５】
検出には、ＤＮＡチップの類では標識物に蛍光色素を用いるケースが圧倒的に多い。プロテインチップでは上記したとおり、酵素標識物を用いて化学発光ないし生物発光の系で検出するケースが多いが、蛍光標識検出や、電気化学発光検出を行うケースと多様な方法が実用化されている。
【０００６】
電気化学発光法では、電極表面に抗原捕捉用の抗体が存在する。サンドイッチ用抗体の標識物にはルテニウム錯体を用いる（非特許文献３：Clin. Chem., 37, 1534-1539 (1991)）。電極表面ではルテニウムが酸化され、ＴＰＡのレドックス反応とカップルさせて還元するときに励起状態となったルテニウムの電子が基底状態に落ちる時に光を発する。
【０００７】
【非特許文献１】Science 251, 767-773(1991)
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918(1996)
【非特許文献３】Clin. Chem., 37, 1534-1539 (1991)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記従来技術では、ＤＮＡプローブチップあるいはプロテインチップを用いる遺伝子転写産物であるｍＲＮＡや翻訳産物であるタンパク質の識別や検出法に関してはよく検討されており、何らかの方法で溶液状の試料が準備できていれば測定ができる。上記従来技術で説明した検体血清からのアレルゲン検査では、血清試料を用いる。ｍＲＮＡ検査では予め十分多量な細胞検体からＲＮＡ成分を抽出し、リバーストランスクリプターゼによる逆転写反応でｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅やｃＲＮＡ合成により増幅を行う。また相補鎖合成時に標識ｄＮＴＰを取り込ませて多量の標識ＤＮＡ鎖を得る。最近ではアミノアリルｄＮＴＰを取り込ませて、その後にアミノ基に蛍光色素を反応させて蛍光標識ＤＮＡ鎖を得る方法が主流となっている。このようにして得られた蛍光標識ＤＮＡ鎖を、いわゆる、ＤＮＡチップとハイブリダイズさせて各種発現遺伝子の解析を行う。このように、予め溶液試料が得られる場合のみ解析が可能となる。
【０００９】
検体の内、かなりの部分を占める細胞を扱う場合、測定対象となる細胞構成物資を溶液状態にする操作そのものが問題となるケースがある。多細胞生物においては、細胞は隣接する細胞群との相互インタラクションにより全体の調和を成立させているので、細胞群をすりつぶして均一な状態としてしまうと各細胞の持つ局在的な情報が失われる。さらに、個々の細胞内においても発現遺伝子であるｍＲＮＡは局在化しているし、最終産物であるタンパク質も細胞内でその機能に従い局在している。これら局在ｍＲＮＡやタンパク質は、細胞の活動状態すなわち隣接する細胞群とのコミュニケーションにより変化するし、おかれている環境に対しても変動する。すなわち、生体機能をより正確に記述し、医療向けの検査や創薬に役立つ情報を得ようとすると、細胞間や細胞内で局在化しているｍＲＮＡやタンパク質を、局在空間情報を保持した状態で定量検出する必要がある。
【００１０】
すなわち、本発明の目的は、上記問題点を克服し、細胞間や細胞内で局在化しているｍＲＮＡやタンパク質を、局在空間情報を失わずに定量測定を行うことのできる細胞構成物質解析チップ、細胞構成物質解析システムおよび方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明では、まず、ｍＲＮＡあるいは発現タンパク質の分解を極力少なくし、濃度希釈が不要な方法を実現するために、細胞を２次元投影した形で基板あるいは電極上に、細胞の内容物を捕捉することとする。このためには、電気泳動的な力を利用することができる。すなわち、極薄い間隔からなる２枚の電極で細胞を挟み、電界をかけることで細胞を破壊すると同時に細胞の内容物を電極表面に引き寄せる。あるいは、細胞の破壊にＵＶ光を用いることも効果的である。３５０ｎｍ程度のＵＶ光は溶媒である水では吸収されず、細胞で吸収される。このため、溶媒を沸騰させること無く細胞を可溶化することができる。このときも生体物質の内容物を２次元投影した形で捕捉するには電気泳動力を用いる。
【００１２】
いずれの細胞破壊の方法でも生体物質の内容物を２次元投影した形で捕捉するには、電気力線が電極平面に対してほぼ垂直方向に形成されることが重要である。すなわち、電極面積としては細胞のサイズに比べて十分広いことが必要となる。この条件に加え、電極間の距離が対流の起きにくい数十μｍ程度であれば、細胞内物質は電極平面に対してほぼ垂直方向に移動する。生体物質の内容物を捕捉する基板、あるいは、電極表面にはｍＲＮＡの捕捉用にポリＴのようなｍＲＮＡに結合する物質を固定しておく。タンパク質の場合は、たとえばアミノ基の様なカチオンやカルボキシル基のようなアニオンを表面に緻密に導入したもので静電的にタンパク質を固定する。あるいは電極表面を疎水性残基で覆い、タンパク質の疎水部分同士が水分子の排除エネルギーを利用して結合する力を利用してタンパク質を一網打尽に基板表面に固定することができる。
【００１３】
測定したいものが予測される場合は、それらに対応するＤＮＡプローブを予め基板上に固定して用いることで、より精度のよい測定が可能となる。たとえば、配列番号１の配列をプローブとして固定したものを用いると、Homo sapiens paraoxonase 1 （ＰＯＮ１）由来のｍRNAの細胞内分布を測定することができる。さらに複数のDNAプローブを基板上に固定することで、複数の測定項目のｍＲＮＡ配列を基板上に捕捉することができる。
CGAAGCACCT CTGATGCAGG AGGATTCTCT GAGTCATAGA AGAAGATTTT：（配列番号１）
本発明は細胞が集合した組織様の検体にも適用することができる。ただし、組織様の検体は細胞が一層のものが望ましい。仮に細胞１０個が１列に連なったものを仮想的な組織様の検体としよう。検体を２枚の電極間にはさみＵＶ照射しながら電界をかけると、個々の細胞に対応して個々の細胞由来の生体物質が２次元情報を保持したまま電極表面に固定される。
【００１４】
生体物質の内容物を基板上に捕捉して固定する第２の方法として、電極によらず、細胞の水分を瞬時に蒸発させて固定する方法も有効である。この場合、基板上に細胞を配置した状態で高温にさらして水分を蒸発させることで、ｍＲＮＡやタンパク質を細胞の配置を崩さずに固定することができる。もちろん、細胞内のｍＲＮＡやタンパク質も細胞内の２次元情報を保ったままで固定することができる。あるいは、液体窒素で瞬間的に凍結した後に、乾燥させてもよい。あるいは、ホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドのような試薬を用いて細胞を固定してもよい。ホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドを用いる固定の場合で特にｍＲＮＡの解析には、ホルムアルデヒドによる細胞固定後に、トリプシンなどのタンパク質分解酵素を作用させて、細胞膜表面や構造タンパク質を破壊して、後述するナノ粒子標識プローブを固定されたｍＲＮＡにハイブリダイズできるようにして、反応したナノ粒子を２次元表面的に解析することで達成できる。いずれの方法でもその後のｍＲＮＡやタンパク質の検出が可能である。
【００１５】
第２の固定法では、ｍＲＮＡとタンパク質が同時に基板上に固定される。細胞破壊と固定が短時間で行われるので、ｍＲＮＡを検出するときに問題となるＲＮａｓｅによるｍＲＮＡ分解はあまり気にしなくてもよい。固定後はＲＮａｓｅインヒビターで基板を洗浄し、ＲＮａｓｅ活性をなくす操作を行えばより正確なｍＲＮＡ検出が可能となる。一般のタンパク質は変性した状態で固定されるケースが多いので、プロテアーゼによる分解は気にする必要は無い。
【００１６】
第２の固定方法ではｍＲＮＡとタンパク質に加え、ゲノムも同時に基板上に固定されるので、これらに対応するナノ粒子付きプローブを反応させることで同一基板上で同一細胞のｍＲＮＡとタンパク質発現の空間的情報付きの定量データを得ることができる。核に存在するゲノムの特定遺伝子もｍＲＮＡと区別して同時検出することができる。
【００１７】
本発明では、いずれの方法で固定するにしても、基板あるいは電極上に、細胞内の物質を位置情報を保ったまま２次元平面に固定することになる。このとき１細胞中の細胞内物質を２次元固定する場合では、ＤＮＡチップやプロテインチップのように各区画エレメントに異なるプローブを固定してエレメントの位置で対象となる生体物質を識別することはできない。そこで、２次元平面に固定された細胞内の物質に選択的に結合する標識プローブを利用し、これに適当な識別子を設けて固定された細胞内の物質を識別する。
【００１８】
細胞内物質を２次元固定する場合では、個々の細胞間での差異が測定できる程度の位置情報を得る目的であれば、個別の細胞を細胞のインタラクションを保ったままで各細胞を個別区画に保持し、この個別区画ごとに従来のＤＮＡマイクロアレイやプロテインチップのように複数のプローブをスポット上に配することで、各生体物質の細胞レベルの２次元位置情報と量を測定することができる。このケースでも前記した細胞内物質を２次元投影して測定するケースと同様に、細胞の配置を保持した状態で各細胞固定区画に配した複数プローブに親和的に固定された細胞内物質に選択的に結合する標識プローブを利用し、これに適当な識別子を設けて固定された細胞内の物質を識別する。
【００１９】
適当な識別子とは、たとえば蛍光分子であり、これを１分子検出する。更に容易には、蛍光ナノ粒子を識別子用いて基板上の蛍光点を計数する。測定対象の区別は、対応するプローブを標識する蛍光体の種類や強度の違いを区別することで達成できる。あるいは、ナノ粒子を用いる。ナノ粒子には測定対象に対して異なる粒径や異なる元素組成のナノ粒子を用いる。これにより、細胞の２次元投影面に対して、反応したプローブに付加されたナノ粒子の種類と数を計数することで測定対象を区別しながら細胞内分布を定量的に計測できる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、細胞内発現しているｍＲＮＡやタンパク質および、これらの情報を担うゲノムを、細胞内および細胞間の位置情報と量を分子レベルで検出できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
動物細胞の平均的な大きさはおおよそ１０〜３０μｍである。この中に２万数１０００種の遺伝子が存在し、少ないもので数十分子のｍＲＮＡが数百種以上発現している。中には１０万分子数に及ぶものもあるがわずか数種に過ぎない。多量に発現している遺伝子の多くは、ハウスキーピング遺伝子が多く、細胞内でほぼ一定数、常に発現している。よって本発明で対象とするのはあまり数が多くなく、細胞の置かれている状態で発現ｍＲＮＡ分子数が変動する遺伝子である。
【００２２】
仮に１００分子が発現しているとすると、従来のＤＮＡチップのような方法では増幅なしに検出することは不可能である。細胞を磨り潰し、ｍＲＮＡを抽出する段階で分解したり濃度が薄まったりしてしまい、ハイブリダイゼーションが速度論的に無限に近い時間必要になるからである。
【００２３】
本発明では、細胞を２次元投影した形で基板あるいは電極上に、直接、細胞の内容物を捕捉することとする。以下、具体的な実施例について図面を参照しながら説明する。
【００２４】
（実施例１）
図１（Ａ）は実施例１の細胞構成物質分取チップを示す平面図、（Ｂ）は図１（Ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図である。（Ｃ）は（Ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図の他の例である。１は石英基板であり、この上面に厚さ５μｍのアガロースゲル膜４が形成されており、所定の間隔で細胞保持のための区画５が作成される。区画５の大きさは、例えば、３０μｍ四方とされるが、これは、上記動物細胞の平均的な大きさを１０〜３０μｍφとするとき、この９倍ないし等倍にあたる。図１では細胞７を区画５のいくつかに配した状態を示す。各区画５間は、必要なら、溝６で連結され、区画５に保持された細胞７間の相互インタラクションが可能とされる。また、基板１の上面の各区画５に対応する位置には、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）からなる透明電極２が形成されている。透明電極２は、透過光が３０〜７０％程度になるように金あるいは白金あるいはクロムを蒸着して作成したものでもよい。電極２の大きさは区画５の大きさとほぼ等しいものとされる。前記アガロースゲル膜４の上面にはガラス基板１’が設けられる。基板１と基板１’はスペーサー８で一定間隔が保たれる構造となっている。スペーサー８は基板１’に予め取り付けられており、ガラス基板１に押し付ける形で装着する。この際、スペーサーと接触する基板１の部分のアガロースゲルは予め除去しておくほうが良いが,（Ｃ）のようにアガロースゲル４の厚みが薄い場合はゲルの上からスペーサーを押し付けるだけでよい。ガラス基板１’の、前記区画５の位置には、電極２に対応する対向電極２’を設ける。石英基板１、ガラス基板１’には、それぞれ、電極２、対向電極２’に接続されている引き出し電極３が設けられる。なお、石英基板１のアガロースゲル膜４は、集束光を当てて加熱して容易に加工することができるから、区画５の形成、区画５間の溝の形成は容易である。区画５に入れる細胞を培養中に各区画５を連結する溝を集束光で形成することにより複数の種類の異なる細胞を任意の段階で相互インタラクションするものにできる。
【００２５】
前記対向する電極付の基板１，１’の間隔を０．１ｍｍとすると、両電極付基板ではさまれる区画５の領域は、ほぼ０．０３×０．０３×０．１ｍｍの空間になり、区画５に緩衝液または培養液を入れ、細胞７を１個ずつ挿入すると、この電極に挟まれる空間に細胞１個が存在することになる。図１の第１の例として、浮遊細胞用の細胞構成物質分取チップの例を示す。ここでは浮遊状態にあるニューロン細胞、すなわちニューロン幹細胞を培養液に懸濁した懸濁液からニューロン幹細胞を１個ずつ取り出して、区画５に挿入し２枚の基板１，１’でサンドイッチしている。ニューロン幹細胞は着床しないように区画５の底辺にも０．５μｍ以下の厚みで濃度が０．０５％以下のアガロース膜９を細胞吸着防止用として塗布しておく。このような薄いアガロース膜はｍＲＮＡなどを自由に透過することができる。必要に応じて区画５は溝６’でつながれる。図１（Ｂ）記載の断面図の様に、アガロースゲル膜４を基板１と１’の間を分離するように形成し、区画５を独立した空間とすることで浮遊細胞を空間５に保持する構造としている。２枚の基板１，１’は３５０ｎｍのレーザーを透過することができる構造とする。電極における３５０ｎｍの光吸収が大きい場合には、電極を格子状にしたり、金属薄膜の厚みを５ｎｍ以下としたりすることで部分的に光を透過させることで解決する。
【００２６】
図１の第２の例としては、１０５細胞／ｍｌの濃度のヒトＣＯＳ細胞７をＰＢＳに懸濁した懸濁液から細胞を１個ずつ取り出して、区画５の２箇所に挿入し２枚の基板１，１’でサンドイッチしている。ＣＯＳ細胞７はアガロースゲル膜４の無いところに着床するので、（Ｃ）にその断面図を示すように区画５の基板１上に接着することになる。このために、（Ｃ）に示すようにアガロースゲル膜４’の厚みが薄くて、完全に区画が他とは区切られない状態でも、各細胞が隣接する区画に移動したり、細胞間の相互インタラクションが溝以外で起きたりすることは無い。必要に応じて区画５は溝６’でつながれる。もちろん図１（Ｂ）記載の断面図の様に、アガロースゲル膜４を基板１と１’の間を分離するように形成し、区画５を独立した空間とすることで細胞を空間５に保持する構造としてもよい。この場合、区画間は溝に代えてトンネル６とする。
【００２７】
２枚の基板１，１’は３５０ｎｍのレーザーを透過することができる構造とする。電極における３５０ｎｍの光吸収が大きい場合には、電極を格子状にしたり、金属薄膜の厚みを５ｎｍ以下としたりすることで部分的に光を透過させることで解決する。
【００２８】
なお、図１では、スペーサー８は区画５の設けられる領域の全周を取り囲む形で示したが、図１（Ｂ）の例では、基板１’が、アガロースゲル膜４を強く圧迫することが無いようにし、図１（Ｃ）の例では、基板１と１’との距離を確保するのに十分な程度に断続的に配置するものとして良い。この場合、基板１と１’との距離は小さいので、図１（Ｃ）の例でも、培養液が流失してしまうことはない。
【００２９】
図２（Ａ）は浮遊細胞用の２枚の基板１，１’でサンドイッチされた区画５に細胞が配された状態の断面を示す図である。ここでは、非着床性の細胞を用いるケースについて説明する。細胞２２は基板１と１’とアガロースゲル膜４で区切られた空間に閉じ込められている。この例では、アガロースゲル膜４の厚みは０．１ｍｍで、基板１と１’の間隔も０．１ｍｍである。溝６は各区画５を連結し、細胞間のインタラクションを取るためのもので、培養中に任意に作成する。溝６は細胞が通り抜けられない断面積を有している。２枚の対向する基板の内側には基板１上に電極２、電極２の表面にプローブ２０が固定されている。プローブ２０は実質的にアガロースゲル膜９に埋もれた状態で固定されているが、アガロース濃度が薄いので、ｍＲＮＡやｃＤＮＡなどは自由にプローブにアクセスできる。ここではプローブ２０はポリＴからなるものを使用する。基板１’の表面には電極２’が存在する。区画５はアガロース構造体４で仕切られているが、必要により、トンネル６で連絡される。区画５には緩衝液または培養液が入れられるとともに、細胞２２が挿入される。ガラス基板１’の上面から、３５５ｎｍのパルスレーザ２１を細胞２２の存在する区画５に照射すると、細胞２２が破壊される。なお、電極２，２’は、電界を印加するためのものであるから、基板の裏側にあっても良い。
【００３０】
図２（Ｂ）は区画５内の細胞をパルスレーザ２１によって破壊すると同時に電極２，２’の間に電源６０により、電界（１．２Ｖ）をかけ、ｍＲＮＡやＤＮＡなどの核酸２３をプラスの電極２の方向に引き寄せる過程の様子を模視的に示す図である。タンパク質２５などの細胞の内容物の多くはマイナス極２’に移動するか、移動しないで元の位置に留まっている。電界をかけると電極間にｐＨの勾配ができる。ｐＫが低い核酸類は陽極に移動できるが、ｐＫのあまり低くない他の成分は電荷が中和されるので陽極に達することができない。
【００３１】
図２（Ｃ）は、図２（Ｂ）の状態から時間が経過した状態を模視的に示す図である。時間が経過するのに応じて、ｍＲＮＡやＤＮＡなどの核酸２３は基板上のポリＴプローブ２０にハイブリダイズする。
【００３２】
図３は着床細胞であるヒトＣＯＳ細胞の例である。図３（Ａ）は２枚の基板１，１’でサンドイッチされた区画５に細胞が着床した状態で配された断面を示す図である。細胞２２’は基板１と１’とアガロースゲル膜の壁４−１，４−２で区切られた空間に閉じ込められている。細胞は区画の底面に着床しているので、上部が開いていても隣の区画に入り込むことは無い。実質的にアガロースゲル膜が塗布されている部分に細胞が着床できないので、隣接する区画に移動できないからである。このような細胞の移動を防ぐためのアガロースの厚みは実質０．５μｍあれば十分である。この例では、アガロースゲル膜の厚みは３μｍで、基板１と１’の間隔は０．１ｍｍである。溝６−１は各区画５を連結し、細胞間のインタラクションを取るためのもので、培養中に任意に作成する。溝６−１は細胞が通り抜けられない幅を有している。２枚の対向する基板の内側には基板１上に電極２、電極２の表面にプローブ２０が固定されている。ここではプローブ２０はポリＴからなるものを使用する。基板１’の表面には電極２’が存在する。区画５はアガロース構造体４−１，４−２で仕切られているが、必要により、トンネル６−１で連絡される。区画５には緩衝液または培養液が入れられるとともに、細胞２２が挿入される。ガラス基板１’の上面から、３５５ｎｍのパルスレーザ２１を細胞２２の存在する区画５に照射すると、細胞２２が破壊される。なお、電極２，２’は、電界を印加するためのものであるから、基板の裏側にあっても良い。
【００３３】
図３（Ｂ）は図２の例と同様に区画５内の細胞をパルスレーザ２１によって破壊すると同時に電極２，２’の間に電源６０により、電界（１．２Ｖ）をかけた様子を模視的に示す図である。ｍＲＮＡなどの核酸成分２３は細胞の着床していた基板底面近傍にとどまっているが、タンパク質２５などの細胞の内容物の多くはマイナス極２’に移動する。電界をかけると電極間にｐＨの勾配ができる。ｐＫが低い核酸類はさらに陽極に移動し、基板上のプローブ（ポリＴ）とハイブリダイズできるが、ｐＫのあまり低くない他の成分は電荷が中和されるので陽極に達することができない。
【００３４】
図３（Ｃ）は、図３（Ｂ）の状態から時間が経過した状態を模視的に示す図である。時間が経過するのに応じて、ｍＲＮＡやＤＮＡなどの核酸２３は基板上のポリＴプローブ２０にハイブリダイズする。
【００３５】
プローブ固定法について説明する。ポリＴプローブ２０を固定した電極あるいは通常の電極上に貼り付けて使用する基板は２種類のモノマーを重合させて調製するポリマー層を有するものを作成する。これは、前記ポリマー層が重合用の第１の官能基を２箇所に有する第１のモノマーと重合用の第２の官能基を２箇所に有する第２のモノマーを交互に配するように重合した構造で、前記第１のモノマーおよび前記第２のモノマーの片方に生体物質捕捉用残基を持つ構造をしている。具体的には、基板に第１のモノマーとしてアルキルジイソシアナートと第２のモノマーとしてジアミノフェニル酢酸を等モル比で反応させ重合させる。このケースでは、第１の官能基はイソシアナート基、第２の官能基はアミノ基ということになる。アルキルジイソシアナートとしてはたとえばヘキサメチレンジイソシアナートを用いることができる。また、生体物質捕捉用残基は第２のモノマーであるジアミノフェニル酢酸のカルボキシル基ということになる。重合生成薄膜はポリ尿素ということになる。重合上条件に関しては、上記２種類のモノマーの混合溶液をスピンコーターで塗布した後、所定の温度（１５０℃〜２００℃）でベークすることによりポリマーの薄膜を基板上に形成することができる。あるいは、既存の真空蒸着法（Jpn. J. Appl. Phys. 33, L1721-L1724 (1994) ）を用いることができる。このようにして基板上に形成したポリ尿素薄膜はアルキルジイソシアナートとジアミノフェニル酢酸モノマーが交互に反応して形成する構造のため、側鎖のカルボン酸基が比較的そろった間隔で存在することになる。アルキル基の長さを調製することで導入するカルボキシル基の間隔を調製できる。また、これにより、従来は表面に官能基を導入することが困難であった金や白金などの電極上にも官能基を持つ薄膜を形成することができる。基板上に導入したカルボキシル基をカルボジイミド系の活性化剤を用いて生体物質捕捉用残基としてアミノ基を有するプローブを直接固定してもよい。あるいは、この側鎖カルボキシル基にジシクロヘキシルカルボジイミド系の活性化剤存在下でエチレンジアミンを反応させると、高収率で側鎖カルボキシル基に一級アミン残基を導入することができる。すなわち基板表面には一級アミンがほぼ一定間隔で並んだ状態となる。次にNucleic Acids Research,27,1970-1977(1999)およびCHEMBIOCHEM2, 686- 694(2001)記載の１，４−フェニレンヂイソチオシアナートで一級アミンを修飾し、表面にイソチオシアナート基を導入する。最後に５’末端にアミノ基を有するポリＴ（Ｔ２５）を反応させる。この反応条件は上記文献に詳しい。上記方法でポリＴが約９ｎｍ間隔で固定された電極２（基板）が得られる。
【００３６】
あるいは、２種類のモノマーを第１の官能基としてアルキル基に保護されたＳＨ基を有する残基を側鎖に持つアルキルジイソシアナートと第２の官能基としてカルボキシル基を持つジアミノフェニル酢酸を重合させれば、異なる官能基を交互に持つポリマー薄膜を持つ基板を作成できる。ここで、保護されたＳＨ基とは、たとえば、ペプチド合成のときに使用されるＳＨ機の保護基を導入したものを利用することができる。あるいは、ピリジルジチオ基の形で保護することができる。以下のケースでは、ピリジルジチオ基の形でＳＨ基を保護したモノマーを用いて作成した基板について説明する。基板上にポリマーを形成後に、まず、カルボキシル基に上記方法と同様にジシクロヘキシルカルボジイミド系の活性化剤存在下でエチレンジアミンを反応させ、引き続き１，４−フェニレンヂイソチオシアナートを反応させ、５’末端にアミノ基を有する特定配列の第１のオリゴマーを反応させて、オリゴマーを固定する。次にジチオスレイトールを用いてＳＳ結合を還元し、ＳＨ基を基板上のアルキル基部分に露出させる。マレイイミド基を有する第２のオリゴヌクレオチドをｐＨ６程度の水溶液中で反応させることで、マレイイミドの２重結合部分が基板上のＳＨ基と反応し、チオエーテル結合で第２のオリゴヌクレオチドを固定することができる。この例では、同一基板上に複数のプローブＤＮＡをほぼ一定間隔で導入した基板を得ることができるメリットがある。すなわち、同一面で、２種類の相補配列を持つｍＲＮＡを捕捉することができる。２種類のｍＲＮＡの区別には異なる粒子径の金ナノ粒子を用いればよい。
【００３７】
実施例１では、カルボキシル基をもつポリ尿素を基板上に形成して用いたが、このほかにも、側鎖にプローブとなるポリヌクレオチドやペプチドなどを固定できるような反応基を導入できる残基を周期的に持つポリマーであれば利用することができる。たとえば、２種のモノマーの組み合わせがＲ１−Ｃ＝Ｏ−Ｏ−Ｏ＝Ｃ−Ｒ２−Ｒ３−Ｃ＝Ｏ−Ｏ−Ｏ＝Ｃ−Ｒ４の構造を有する酸無水物（Ｒ１〜Ｒ４は任意の残基）とＮＨ２−Ｒ５−ＮＨ２の構造を有するジアミンモノマー（Ｒ５は任意の残基）で、Ｒ５にカルボキシル基を有するジアミノフェニル酢酸モノマーを用いることができる。酸無水物としては、４，４’−ヘキサフルオロイソプロピリデンビスフタル酸無水物のような構造のものを用いることができる。
【００３８】
このようなポリマーは、すなわちポリイミドである。ポリイミドは一般的にこのようなビス無水フタル酸とビスアミノ化合物を用いる。あるいは、たとえば長カルボキシル基を有するジアミノフェニル酢酸あるいは１，１０−ジアミノデカンのような脂肪族ジアミンの脂肪族位置にカルボン酸残基を有するモノマーとジ酸クロリドモノマーであるテレフタロイルジクロリドを蒸着重合により基板上に膜形成を行うポリアミドを利用することができる。プローブ固定用には長鎖脂肪族ジアミンに各種反応性残基を導入しておけばよい。蒸着重合としては既存の方法、たとえば、Jpn. J. Appl. Phys. 33, L1721-L1724(1994), Thin Solid Films, 215, 94-97 (1992)記載の方法に準じて、使用するモノマーの気化条件を考慮して行えばよい。
【００３９】
図４は、図３（Ｃ）に示したように、電極２の表面上のポリＴプローブ２０に捕捉したｍＲＮＡ群の識別方法を説明する図である。図３（Ｃ）は着床性の細胞を用いる細胞構成物質分取チップの例であるが、先にも述べたように、プローブ２０がアガロース濃度が薄いアガロースゲル膜９に埋もれた状態で固定されている場合は、ｍＲＮＡやｃＤＮＡなどは自由にプローブ２０にアクセスできるので、浮遊性の細胞用の図２（Ｃ）記載の構造の場合でも以下の手順ならびに説明は共通である。
【００４０】
まず、上部ガラス基板１’をはずし、石英基板１の上面のアガロースゲル膜４に形成した区画５の中を洗浄し、電極２上のポリＴプローブ２０にハイブリダイズしなかった物を除去する。次に、ポリＴプローブ２０にハイブリダイズしたｍＲＮＡ２３は、種々の異なったものがあるので、これを識別するための標識プローブの混合溶液を添加する。３時間４５℃でインキュベーションした後、１０ｍＭのＮａＣｌを含むクエン酸緩衝液ｐＨ７で洗浄する。この状態で電極２の上には、ポリＴプローブ２０にハイブリダイズしたｍＲＮＡ群と各ｍＲＮＡにハイブリダイズした標識プローブ３１，３２，３３が３体結合した状態になっている。標識プローブ３１，３２，３３には、容易に識別できる標識物３１’、３２’、３３’をつけておく。したがって、標識物３１’、３２’、３３’をカウントすることで、電極２上のポリＴプローブ２０に固定されたｍＲＮＡの種類と量を測定する。
【００４１】
すなわち、先にも述べたように、基板あるいは電極上に、細胞内の物質を、位置情報を保ったまま２次元平面に固定することになるから、ＤＮＡチップやプロテインチップのように各区画エレメントに異なるプローブを固定してエレメントの位置で対象となる生体物質を識別することはできない。したがって、２次元平面に固定されたｍＲＮＡを、これにハイブリダイズする標識物付きの標識プローブで同定することが必要である。
【００４２】
図５は、本発明によって、電極２上のプローブ２２に固定されたｍＲＮＡの標識物３１’、３２’、３３’が細胞２２の輪郭４１との関係において、２次元平面で認識できることを模式的に示す図である。６１−６３は電極２（または基板１０）に付けられたマーカーである。図５の状態のデータは、以下の手順で得られる。
（１）石英基板１の上面のアガロースゲル膜４に形成した区画５に細胞を配して必要な培養を行う。
（２）培養後、細胞２２を電極２の背面から顕微鏡を通してＣＣＤカメラで撮影する。
（３）３５５ｎｍのパルスレーザ２１を細胞２２の存在する区画５に照射する。
（４）パルスレーザ２１の照射後に、電源６０により電極２，２’間に電界を加える。
（５）図４で説明した洗浄、標識プローブの固着の手順を踏んだ後、再度、電極２の背面から顕微鏡を通してＣＣＤカメラで撮影する。
【００４３】
すなわち、最初の撮影で細胞２２の輪郭４１とマーカー６１−６３を持ったデータが得られるので、これを、画像データとしてコンピュータに保存する。次いで、２度目の撮影でプローブ２２に固定されたｍＲＮＡの標識物３１’、３２’、３３’とマーカー６１−６３を持ったデータが得られるので、これを、画像データとしてコンピュータに保存する。コンピュータで二つのデータをマーカーが一致するようにして重ねる画像処理をすれば、細胞２２の輪郭４１とｍＲＮＡ（標識物３１’，３２’，３３’）の相対的な位置も分かるデータが画像として得られることになる。
【００４４】
上記方法により１個の細胞からのｍＲＮＡを２次元投影する形で基板上に固定し、上皮がん（大腸由来）の細胞で発現するＥｐＣＡＭのｍＲＮＡの最終エクソンと最終エクソンの手前のエクソンにまたがる部分の配列とＥｐＣＡＭ遺伝子ゲノムのイントロン部分に対する配列、同様にＣＤ４４のｍＲＮＡの最終エクソンの手前のエクソンにまたがる部分の配列及びＣＤ４４ゲノムのイントロン部分の配列より標識プローブを設計し、これらの一細胞内での分布と定量的計測を試みる。ＥｐＣＡＭのｍＲＮＡとＥｐＣＡＭ遺伝子ゲノムのイントロン部分のプローブにはそれぞれ１０ｎｍと５０ｎｍの金ナノ粒子、ＣＤ４４のｍＲＮＡ及びＣＤ４４ゲノムのイントロン部分のプローブには２０ｎｍと７０ｎｍの金ナノ粒子がインデクシング用のマーカー（標識物）として結合している。各粒子の粒度分布はＣＶ＝２％以内のものを使用する。
【００４５】
電極２上にｍＲＮＡ捕捉用のポリＴプローブを固定し、区画５の細胞２２に３５５ｎｍのパルスレーザ２１を照射して細胞２２を破壊し、電界を用いてｍＲＮＡをポリＴプローブに捕捉する上記の方法でｍＲＮＡ全体を電極２上に固定する。このとき、細胞内のｍＲＮＡは基板に対して投影される形で固定されるので細胞内位置情報を保つことができる。細胞２２は、上記上皮細胞を区画５に配し、５％二酸化炭素、１１％酸素雰囲気中で１日間区画５に供給した培地中で培養することで電極２上に着床する。固定されている細胞の位置は予め顕微鏡で確認し、電極２の背面から顕微鏡を通してＣＣＤカメラで撮像してデータ化しておく。この状態では、細胞は、電極２に対して着床した面と培地に接する面の物理的な面に接することになる。よって、ｍＲＮＡなどを２次元的に投影する本発明で得られるデータは、細胞が基板上に固定された細胞の着床面に対しての２次元投影ということになる。すなわち、細胞が基板と結合している面と溶液に接している面では、細胞内の機能が異なる。常に着床面を基準面として細胞内の物質分布を測定することができるので、３次元ではなく２次元投影でも有用な情報が得られる。
【００４６】
電極２上のプローブ２０にｍＲＮＡやゲノムＤＮＡなどのポリヌクレオチド２３を捕捉した区画５に金ナノ粒子をインデクシングマーカ３１’、３２’、３３’としたＥｐＣＡＭとＣＤ４４のｍＲＮＡおよびゲノム配列に対する標識プローブ３１、３２、３３の懸濁液を添加し、ｍＲＮＡやゲノムＤＮＡなどのポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーション条件は金ナノ粒子が凝集しないでハイブリダイゼーションが効率よく行われる条件として、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ７．４で行う。その結果、図６の模式図に見られるような結果が得られる。図６では細胞に対する各インデクシングマーカ（金ナノ粒子）の位置関係がわかるようにデフォルメして記載している。
【００４７】
アガロースゲル膜４で基板１上に形成した細胞を保持する区画５に着床した大腸がん由来のがん細胞を予め顕微鏡観察し、ＣＣＤカメラでデータ化したときの細胞の境界を４１、核の境界を４２で表す。細胞は３５５ｎｍのパルスレーザ２１で破砕し、電極２，２’間にかける電圧による電界でポリヌクレオチド成分を電極２上に固定している。一方、ここでは、電極２上を走査型電子顕微鏡で観察し、データ化すると、４種類のサイズの金ナノ粒子４３〜４６の分布が観察される。サイズの違いから判断して、４３はＥｐＣＡＭ遺伝子のイントロンに対応する配列を有するポリヌクレオチド、４４はＣＤ４４遺伝子に対応する配列を有するポリヌクレオチドを検出していると思われる。これらはおもに核内に検出される。核内に検出されるイントロン配列は、ゲノム上の配列とゲノムから転写された未成熟ｍＲＮＡに由来すると考えることができる。少量のイントロン配列を認識する粒子４３’と４４’が細胞室に検出されるが、これらは未成熟ｍＲＮＡから切り取られたイントロンが分解される前に検出されたものと考えることができる。金ナノ粒子４５と４６は核には存在せず、細胞室に存在するので、それぞれＥｐＣＡＭとＣＤ４４の成熟ｍＲＮＡと考えることができる。成熟ｍＲＮＡではイントロンが抜け落ちるからである。
【００４８】
本発明ではこのように各粒子はゲノム上の遺伝子配列や未成熟ｍＲＮＡや成熟ｍＲＮＡを分子別に検出できる。
【００４９】
（実施例２）
実施例２では、細胞の破砕をレーザーによらず、細胞構成物質も電解による移動ではなく、細胞を瞬時に基板上に焼き付ける方法を利用する。図７（Ａ）は実施例２の細胞構成物質分取チップを示す平面図、（Ｂ）は図７（Ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図である。１０は基板である。実施例２では、基板１０は石英に代えて、ｍＲＮＡと発現タンパク質を同時に吸着固定できるように、２種類のモノマーを交互に重合させて、プラスチャージを持つアミノ基や疎水基を交互に有する基板とする。第１のモノマーとしてはたとえば疎水性残基としてベンゼン環を持つメチレンジフェニル４，４’ヂイソシアナートと第２のモノマーとしては実施例１で示したジアミノフェニル酢酸を等モル比で反応させ重合させる。あるいは、前記したジアミノフェニル酢酸モノマーと４,４’−ヘキサフルオロイソプロピリデンビスフタル酸無水物を重合させて親水基と疎水基を交互に導入したものを利用してもよい。
【００５０】
この状態では基板表面には疎水性残基は存在するがプラスにチャージする残基は無いので、ジアミノフェニル酢酸のカルボキシル基をアミノ基に変換する。すなわち、カルボキシル基にジシクロヘキシルカルボジイミド系の活性化剤存在下でエチレンジアミンを反応させ、カルボキシル基を一級アミン残基（アミノ基）に変換する。これにより、疎水性残基とアミノ基を交互に有するポリマー薄膜からなる表面を有する基板を得ることができる。ここではアミノ基と疎水性残基を交互に有するポリマー薄膜を有する基板を用いたが、ポリアミドであるナイロンを基板上に重合させた薄膜やポリスチレン薄膜を有する基板を用いてもよい。
【００５１】
このようにして調整した基板１０上に、実施例１と同様に、厚さ１００μｍのアガロースゲル膜４が形成されており、所定の間隔で細胞保持のための区画５が作成される。区画５の大きさは、例えば、３０μｍ四方とされる。各区画５間は、必要なら、トンネル６で連結され、区画５に保持された細胞間の相互インタラクションが可能とされる。実施例２では電極２と上面ガラス１’は持たない。
【００５２】
実施例１と同様に、区画５に緩衝液または培養液を入れ、細胞を配した後、必要なら、所定の条件で細胞を培養する。細胞が着床した基板１０を軽く水切りした後、１６０℃の乾燥ヘリウム雰囲気に曝す。これにより瞬間的に細胞を乾燥させて基板１０の表面に固着する。あるいは、細胞が着床した基板１０を液体窒素で瞬間的に凍結した後に、乾燥させてもよい。あるいは、ホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドのような試薬を用いて細胞を固定してもよい。これにより、細胞内のｍＲＮＡやタンパク質も細胞内の２次元情報を保ったままで固定することができる。次に、７０％アルコールに浸し、低分子化合物を除去する。
【００５３】
ホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドを使用した場合はポリヌクレオチドのアミン残基やタンパク質のアミノ基が修飾されているので、必要に応じて１００℃の水蒸気にさらし、これらを修復する。
【００５４】
標識プローブを細胞骨格内のｍＲＮＡにハイブリダイズさせるために、細胞膜を処理して標識プローブが反応できるようにする。ここでは一般的に用いられている酵素による処理を用いる。たとえば、ペプシンを含む溶液を添加し、細胞膜表面に穴を開け、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、プローブ標識物がｍＲＮＡに反応できるようにする。
【００５５】
ＥｐＣＡＭのｍＲＮＡ配列に対するプローブに１０ｎｍの金粒子を結合したインデクシングプローブと、タンパク質のＥｐＣＡＭに結合するＲＮＡアプタマーに２０ｎｍの金粒子を結合したインデクシングプローブを用いてＥｐＣＡＭのｍＲＮＡとタンパク質の同時検出を行う。
【００５６】
ＥｐＣＡＭに親和性のあるＲＮＡアプタマー合成は進化工学的な方法を用いて作成する。方法を説明する。ＥｐＣＡＭに結合するＲＮＡアプタマーの調製は、配列番号２に示すように、４０塩基からなるランダムな配列の１本鎖ＤＮＡの５’末端にＴ７プロモーター配列を含む２６塩基長の配列を導入し、３’末端に２４塩基からなるＰＣＲ用のプライミングサイトを導入した全長８９塩基長の配列を合成する。配列は５’側から
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＡＡＮ（４０）ＴＴＣＧＡＣＡＧＧＡＧＧＣＴＣＡＣＡＡＣＡＧＧ：（配列番号２）
である。Ｔ７プロモーター配列を用いてＲＮＡポリメラーゼでＲＮＡに転写する。ＲＮＡへの転写には５００μｌスケールで１００ｐｍｏｌのＤＮＡに１００ｕのＴ７ポリメラーゼを作用させる。基質は各々３ｍＭの２’−Ｆ−ＣＴＰ，２’−Ｆ−ＵＴＰ，各々１ｍＭのＡＴＰとＧＴＰで２５℃で１０時間行う。ＲＮＡ転写後ＤＮａｓｅＩでＤＮＡを分解し電気泳動で転写ＲＮＡ産物を回収する。回収した転写ＲＮＡ産物を熱変性後、２ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でＥｐＣＡＭ固定セファロースＣＬ４Ｂカラムに通す。結合した転写ＲＮＡ成分を７Ｍ尿素を含む溶液で溶出させる。得られる転写ＲＮＡ成分を逆転写し両端の既知配列部分に相補な配列のプライマーペアーでＰＣＲ増幅する。得られるＰＣＲ産物を再度Ｔ７プロモーターで転写し同様にＥｐＣＡＭ固定セファロースＣＬ４Ｂカラムで捕捉し、結合した転写ＲＮＡ成分を回収する。転写−捕捉−回収−ＰＣＲ増幅の工程を１５回繰り返し、ＥｐＣＡＭに特異的に反応するＲＮＡアプタマーを得る。
【００５７】
得られるアプタマーにNucleic Acids Research 26,3915-3924 (1998)記載の論文Staining of cell surface human CD4 with 3'-F-pyrimidine-containing RNA aptamers for flow cytometry記載の方法のインビトロトランスクリプションでアプタマーの５’末端にはチオリン酸基を挿入する。このチオリン酸基にヨードアセチル基を導入したビオチンを反応させ、５’ビオチン化ＲＮＡアプタマーを得る。ストレプトアビジンコンジュゲート金ナノビーズを反応させ、識別物質が金ナノ粒子で、ＥｐＣＡＭに特異的に反応するＲＮＡアプタマーを得る。
【００５８】
ＥｐＣＡＭのｍＲＮＡ配列に対するプローブに１０ｎｍの金粒子を結合したインデクシングプローブと、タンパク質のＥｐＣＡＭに結合するＲＮＡアプタマーに２０ｎｍの金粒子を結合したインデクシングプローブを等モル比で混合し、さらにＲＮａｓｅインヒビターを添加した溶液を、細胞を固定した基板に添加する。２時間４５℃でインキュベーションする。反応終了後、冷水で洗浄し、走査型電子顕微鏡あるいは原子間力顕微鏡で観察する。得られる結果を図８に示す。実施例１で得られた結果を示す図６と同様に、細胞膜５１と核膜５２の位置を細胞固定の前に確認する。粒径から考えてＥｐＣＡＭのｍＲＮＡに結合している金ナノ粒子を５５、ＥｐＣＡＭのタンパク質に結合していると考えられる金ナノ粒子を５６に示す。このケースでは細胞室にｍＲＮＡが存在することがわかる。また、ＥｐＣＡＭタンパク質は全体に検出されるが、５１の境界上に多く集結していることから、このようなケースでは細胞表面に局在していると考えることができる。
【００５９】
なお、実施例２ではｍＲＮＡとタンパク質に加え、ゲノムも同時に基板上に固定されるので、これらに対応するナノ粒子付きプローブを反応させることで、同一基板上で同一細胞のｍＲＮＡとタンパク質発現の空間的情報付きの定量データを得ることができる。核に存在するゲノムの特定遺伝子もｍＲＮＡと区別して同時検出することができる。これを実現するには、ｍＲＮＡとタンパク質とゲノムに対して異なるインデクシングのナノ粒子を用いればよい。たとえば、ｍＲＮＡには金ナノ粒子をベースとして種々元素をドープした粒子径の異なるナノ粒子、タンパク質には銀をベースにした同様な粒子、ゲノムに対してはプラチナをベースとした同様な粒子を用いることができる。あるいは、ゲノムに関しては蛍光ナノ粒子や蛍光付き分岐プローブＤＮＡを用いてもよい。同時に計測するのではなく、ｍＲＮＡとタンパク質とゲノムに対するナノ粒子付きプローブを順次反応させて、時間で区切って検出することも有効である。
【００６０】
（実施例３）
実施例３は細胞が集合した組織様の検体、例えば、組織切片を細胞内の物質の位置情報を保ったまま２次元平面に固定する場合である。図９（Ａ）は実施例３の細胞構成物質分取チップを示す平面図、（Ｂ）は図９（Ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図である。基板１０は予め凍結しておき、その上に組織を乗せて細胞１層分を凍結固定するとともに、剥がして調製する。あるいは、凍結細胞組織を、ミクロトームを用いて２μｍの厚さで切片として基板１０の区画５に配置してもよい。実施例３では、細胞が集合した組織様の検体を対象としているので、実施例１，２のように、細胞単位の区画５を設けるのに代えて、組織様の検体が収納できる区画５とした。その他の点では、実施例１，２のいずれの態様でも良いが、図９では実施例２と同じものとした。すなわち、ＥｐＣＡＭのｍＲＮＡ配列に対するプローブに１０ｎｍの金粒子を結合したインデクシングプローブと、タンパク質のＥｐＣＡＭに結合するＲＮＡアプタマーに２０ｎｍの金粒子を結合したインデクシングプローブを用いてＥｐＣＡＭのｍＲＮＡとタンパク質の同時検出を行う。ＥｐＣＡＭのｍＲＮＡ検出を試みると、組織断片８０の特定細胞層８１にＥｐＣＡＭ由来のｍＲＮＡに結合したと考えられる１０ｎｍの金粒子と、ＥｐＣＡＭタンパク質に結合したと考えられる２０ｎｍの金粒子が検出される。他の部位８２からは検出されないか検出される金ナノ粒子の数が細胞８１の位置に比べ１／１００以下である結果を得る。
【００６１】
本発明では、細胞を２次元面に投影したものとして観察することになるから、細胞が複数連なっていても、一層のものであることが望ましい。仮に、２層以上あれば、それぞれの層の細胞構成物質が重なってしまうから、期待している情報が得られない。
（実施例４）
実施例４は、実施例１と同様、複数の細胞のインタラクションを保ちながら個別区画に保持することのできる図１０に示した細胞構成物質分取チップを用いる。ここでは図１と異なる点を中心に説明する。区画５の領域（ほぼ０．０５ｍｍ×０．０５ｍｍ）には異なるプローブ５−１がスポットされている。ここではプローブを約５μｍのスポットとなるように１０μｍで計１６点作成した系で説明する。インクジェットを用いることでスポット径を１μｍ程度まで小さくすることが可能となるので、スポットを２μｍピッチで作成することで５００項目程度までの同時測定が可能なチップを作成することができる。しかもこのチップは複数の細胞を個別に測定できる。まず、細胞７を各区画５に配し、一定時間培養することで細胞間のネットワークを作成し、チップ上に細胞を配した人工組織を形成させる。各細胞区画を仕切る部材４はアガロースゲルでできており、細胞を配した後で、区画間をレーザー過熱してこの部分のアガロースゲルを除去し、トンネル６を形成することで、任意の細胞間を任意の順序で相互作用させて作成する。もちろん細胞保持区画をＳＵ８のような光硬化性の樹脂で作成しておくことも可能である。この場合は、流路６も予め作製しておく。
【００６２】
後述する工程で、生体内物質が拡散してしまうのを極力防ぐために、図１１に示すようにＳＵ８の部分区画５−２を予め作成したチップで、各区画間はアガロースゲル薄膜４が存在するような構造とすることが最も適している。ＳＵ８の部分区画５−２はスリット５−３が四方に開いており、区画５−２間のアガロースを除去した溝６を作成すると各区画に配した細胞７がスリット５−３と溝６を利用してお互いにジャンクション７−１を作成することができる。
【００６３】
次にＵＶ光を利用して細胞を破壊する。この状態で特に生体物質の固定操作を行わなければ実質的にＳＵ８で仕切られた部分区画５−２内に生体内物質が広がる。ＳＵ８の仕切りがあるので区画外に生体物質が漏れ出ることを最小にすることができる。一定時間インキュベートするか、電極２に実施例1で示したような所定の電圧を印加し、生体物質を区画５の中に配したプローブ５−１に親和的に結合させる。すなわち、１６項目のプローブに対応する物質が基板上のポット位置に捕捉される。捕捉された生体物質はナノ粒子標識プローブで更に分類標識し、操作型電子顕微鏡や原子間力顕微鏡で粒子をカウントする。
【００６４】
たとえば、各スポットに３種類の捕捉用プローブをミクスチャーとして固定し、各々捕捉用プローブに対応する検出用のＤＮＡプローブに１０種類の異なる粒子径と異なる材質組み合わせのナノ粒子を標識したものを用いる。すなわち検出用ＤＮＡプローブの種類は１６×１０種類で、１６種ごとに異なる１０種類の粒子径のナノ粒子で標識したグループの混合液になっている。粒子径として１０、２０、３０、４０、５０ｎｍの各種を利用する。材質としては金、銀を利用すると、合計１0種類の標識物となる。
【００６５】
たとえば、区画５に配した細胞を前記実施例に従いＵＶ光で破壊し、ｍＲＮＡを2時間ハイブリダイズさせた後、ナノ粒子標識ＤＮＡプローブ混合液を添加し、基板表面に細くされているｍＲＮＡ群に対して2時間ハイブリサイズさせる。洗浄乾燥後、各区画５の表面に結合しているナノ粒子を走査型電子顕微鏡で網羅的にスキャンすると、各スポット上の１０種類のナノ粒子の数を計数することができる。その結果、各細胞あたり１６０項目のｍＲＮＡの定量解析が可能となる。
【００６６】
スポットに固定する物質として、細胞内で合成されるタンパク質や糖タンパク質に対するアプタマーを利用する系を説明する。個々の測定項目のタンパク質や糖たんぱく質に対応するアプタマーは本実施例ではＤＮＡアプラマーを用いる。ＤＮＡアプタマーの調製法は、公知例に従いＳＥＬＥＸ法で調整する（J. Clin. Invest. 98, 2688-2692(1996), Nucleic Acids Res. 24, 702-706(1996)）。各アプタマーをＳＵ８構造体５−２で仕切られた全ての区画５にスポットする。各アプタマーには５’末端にアミノ基が導入されているのでこれを実施例１記載の方法を用いて基板上に固定する。基板上にはたとえば、上記J. Clin. Invest. 98, 2688-2692(1996)記載のＣＤ６２Ｌに対するアプタマーやNucleic Acids Res. 24, 702-706(1996)記載のトロンビンに対するアプタマーが固定されることになる。このようにして調整したアプタマースポットアレイ（図１１の５−１）を複数の区画５に全て持つ複数細胞対応のチップ１の各区画５に細胞７を挿入し、お互いにギャップジャンクション５−４を形成させ、細胞ネットワークを形成する。ＵＶレーザーで細胞を破壊し３０分間インキュベートすると、区画５の各スポットにアプタマーに対応するタンパク質や糖タンパク質が捕捉される。次に、未反応の生体物質を０．０５％のＴｗｅｅｎ２０と１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄する。同じ溶液に懸濁した各種粒子径のナノ粒子標識抗体の混合液を基板１表面に添加し、１５分間反応させる。各抗体は種類ごとに異なる粒子径の金ナノ粒子で個別標識されている。ここで、ＣＤ６２Ｌに対応する抗体に結合している粒子は２０ｎｍの金ナノ粒子である。反応後、この粒子径の金ナノ粒子の存在を測定すると、ＣＤ６２Ｌに対するアプタマーをスポットした位置に粒子は２０ｎｍの金ナノ粒子が計測される。他のスポット位置ではバックグランドレベルの数しか計測されない結果を得る。
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<110> Onchip Cellomics Consortium
<120> A preparation chip and a preparation system for materials composed in a cell and analysys methods for materials composed in a cell
<130> NT05P0453
<160> 2
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221>
<223> Synthesized DNA
<400> 1
cgaagcacct ctgatgcagg aggattctct gagtcataga agaagatttt   50
<210> 2
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221>
<223> n stands for random sequence of a c g and t
<400> 2
taatacgact cactataggg agacaannnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn
nnnnnnttcg acaggaggct cacaacagg   89
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】実施例１の細胞構成物質分取チップを示す平面図、（Ｂ）は図１（Ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図である。
【図２】主に浮遊細胞用の細胞構成物質分取チップに関し、（Ａ）は２枚の基板１，１’でサンドイッチされた区画５に細胞が配された状態の断面を示す図、（Ｂ）は区画５内の細胞をパルスレーザ２１によって破壊すると同時に電極２，２’の間に電源６０により、電界（１．２Ｖ）をかけ、ｍＲＮＡやＤＮＡなどの核酸２３をプラスの電極２の方向に引き寄せる過程の様子を模視的に示す図、（Ｃ）は、図２（Ｂ）の状態から時間が経過した状態を模視的に示す図である。
【図３】着床性細胞用の細胞構成物質分取チップに関し、（Ａ）は２枚の基板１，１’でサンドイッチされた区画５に細胞が配された状態の断面を示す図、（Ｂ）は区画５内の細胞をパルスレーザ２１によって破壊すると同時に電極２，２’の間に電源６０により、電界（１．２Ｖ）をかけ、ｍＲＮＡやＤＮＡなどの核酸２３をプラスの電極２の方向に引き寄せ、タンパク質などを基板底面から引き離す過程の様子を模視的に示す図、（Ｃ）は、図２（Ｂ）の状態から時間が経過し、核酸２３がプローブ２０にハイブリダイズした状態を模視的に示す図である。
【図４】電極２の表面上のポリＴプローブ２０に捕捉したｍＲＮＡ群の識別方法を説明する図である。
【図５】電極２上のプローブ２２に固定されたｍＲＮＡの標識物３１’、３２’、３３’が細胞２２の輪郭４１との関係において、２次元平面で認識できることを模式的に示す図である。
【図６】電極２上に固定されたｍＲＮＡの標識物を模式的に示す他の例の図である。
【図７】（Ａ）は実施例２の細胞構成物質分取チップを示す平面図、（Ｂ）は図６（Ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図である。
【図８】基板上に固定されたｍＲＮＡの標識物を模式的に示す他の例の図である。
【図９】（Ａ）は実施例３の細胞構成物質分取チップを示す平面図、（Ｂ）は図８（Ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図である。
【図１０】実施例３の細胞構成物質分取チップを示す平面図である。
【図１１】実施例３の細胞構成物質分取チップの変形例を示す平面図である。
【符号の説明】
【００６８】
１…石英基板、１’…ガラス基板、２…透明電極、２’…対向電極、３…引き出し電極、４，４−１，４−２…アガロースゲル膜、５…区画、６，６’…溝、７…細胞、８…スペーサー、９…細胞吸着防止用アガロース膜、１０…基板、２０…プローブ、２１…パルスレーザ、２２，２２’…細胞、２３…核酸、２５…タンパク質、６０…電源、３１，３２，３３…標識プローブ、３１’，３２’，３３’…標識物、４１…細胞の境界、４２…核の境界、４３，４４，４５，４６…金ナノ粒子、４３’，４４’…少量のイントロン配列を認識する粒子、５１…細胞膜、５２…核膜、５５，５６…金ナノ粒子、６１，６２，６３…マーカー、８０…組織断片、８１…特定細胞層、８２…組織断片のその他の部位。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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