(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
上面から下面まで貫通し、且つ集合・分散するマクロ細孔を持つ骨格体のマクロ細孔の表面に、モノマー又はゾル溶液を該マクロ細孔表面に結合しながらゲル化させ、熟成又は焼成により解放構造のミクロ細孔を持つ多孔質体を一体形成させることを特徴とするクロマトグラフィー用多孔質体の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により形成されたことを特徴とするクロマトグラフィー用多孔質体。
【請求項３】
マクロ細孔を持つ骨格体が、多孔質ガラス又は多孔質セラミックであることを特徴とする請求項２に記載のクロマトグラフィー用多孔質体。
【請求項４】
ミクロ多細孔体が多孔質ガラスまたは多孔質ポリマーであることを特徴とする請求項２に記載のクロマトグラフィー用多孔質体。
【請求項５】
シングルポアであり、上面から下面まで貫通し、且つ集合・分散するマクロ細孔を持つ強固な骨格体のマクロ細孔の表面に、開放構造の一体形成したミクロ多孔質体を結合させたことを特徴とするクロマトグラフィー用カラム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クロマトグラフィー用多孔質体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
クロマトグラフィーによる分離技術は、移動相である展開剤により運ばれる試料と充填剤間の何らかの相互作用により保持される力の、各試料間の違いを利用して分離しようとするものである。試料が固定相に捕集される機構は、分配、吸着及びイオン交換や、分子サイズによるものなどに大別される。これらの相互作用のうち、代表的なものは、充填剤の表面の所謂固定相への分配・吸着力を利用し、分別的な捕集及び脱離を連続的に繰返して試料を分離する操作により分離を行う。固定相は、固体吸着媒体の粒子を充填したカラムに保持して形成される。
【０００３】
固定相は、通常充填粒子自体であるか、粒子を担体として分析試料に適した分離剤をコーティング、又は分析試料に適した化学的修飾剤を粒子に化学的に結合させることによって保持されている。従って、充填剤は、充填粒子そのもの、又は固定相を担持する粒子も含む。
【０００４】
クロマトグラフィー分離システムは、試料の分析に広く用いられているが、通常にカラムを使用する場合、実際の使用上の欠点として、再現性の問題が上げられる。即ち、充填カラムは再現性が保証されないために、実験室間或いは同一実験室でも必ずしも同一の結果が得られるとは限らず、保持時間による試料の同定などは相対的な結果に頼らざるを得なかった。
【０００５】
カラムの再現性を阻害する要因としては、充填材粒子内部構造の再現性に問題があると云われている。又、カラムの再現性にとっては、カラム充填剤因子によるものも大きく、充填ロットにより、充填剤が本来持っている分離性能を充分発揮させていない場合がある。
【０００６】
これらの原因としては、充填カラムの内部構造を考えなければならない。例えば、全多孔性のシリカゲル粒子をカラムに充填した場合、カラム全体として見たとき、細孔は粒子間の細孔と粒子内細孔の２つの穴からなり、試料はこの２つの孔間を行き来しながら分離される。この２つの穴のうち、粒子間細孔は充填時に決定されるので、充填時の僅かな違いにより、その構造は変化する。又、その際、粒子同士がぶつかり合うため、充填剤が破壊される現象もしばしば見られ、そのため表面の改質層が剥がれ、異常吸着を発生されることもある。又、充填には非常に手間がかかり、トラブルも多く、均一に充填されないなどの不良品が多発するため、製品歩留まりが悪く、検査の費用を含め、コストの上昇を招いている。
【０００７】
従来知られている充填型のクロマトグラフィー用カラムは構造を大別して次の２種類に分類される。即ち、１）表面多孔性又は全多孔性のシリカゲル又は樹脂製充填剤１をガラス、プラスチック又はステンレス鋼製の円筒状の容器２に充填した構造（図２）、２）無孔性球状のシリカゲル又は樹脂製充填剤３を充填した構造（図３）である。
【０００８】
例えば、表面多孔性又は全多孔性のシリカゲル粒子１でカラム２を充填した場合、粒子間細孔４と粒子内細孔５の二重構造（ダブルポア）をとる（図２，図７）。この場合、充填粒子１の細孔内表面への試料の内流的な吸着及び分配による試料の分離と分子サイズによる分離が同時に起こり、単純な吸着・分配による分離とはならない（ダブルポアによる分離）。又無孔性の充填剤を詰めた場合はシングルポア（図３，図８）であるが、粒子による包囲状態により、図３に示すように形成される空間４の形状の大きさが様々に変化し、相変わらず分離モードが複雑になる。又、無孔性カラムは粒子が小さいため、特に充填は難しい。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
以上のことからこれまで幾つかの充填に頼らないカラムが提唱されてきた。これら充填に頼らないカラムも詳細に検討すると、ダブルポア型とシングルポア型の２つの構造がある。例えば、多孔性の樹脂を容器２内で結合させ、充填剤とした例がある。この構造では、容器内で充填粒子を結合させるため、再現性に問題があること、又、分子サイズによる分離が生じるため、単純な吸着・分配による分離とはならない（ダブルポアによる分離）（図４）。即ち、この場合も充填剤の有する機能が充分発揮されず、分離モードが単純ではない。
【００１０】
又、ゾル・ゲル法多孔質ガラスの製法を用いて、マクロな貫通孔と壁内に微細な拡散孔を持ったロッド状のガラスを用い、カラムとすることが提案されている（特開平６−２６５５３４）。この場合も多孔性の樹脂を容器内で結合させたものと基本的に同様の構造をしており（図４）、従来の充填カラムと同様に貫通孔であるマクロ細孔と壁内細孔の二重構造（ダブルポア）（図７）をとることにより、吸着・分配と分子サイズによる分離が同時に生じるため、単純な分離とはならない。又、ゾル・ゲル法多孔質ガラスの製法を用いて作製したガラスは脆く、周辺シールなどに問題があること、分相構造の再現性の不安定さによる再生産性に問題があるなど、従来の問題を解決するに至っていない。
【００１１】
叉、これらの方法では、骨格としては、単一系になるため、スルーポアと分離に必要なメソポアの割合は、均一系合成条件によりコントロールすることが特徴となっている。従って、広範囲の分析目的に応じたロッドを自由に作成することは困難となる。叉、たとえできたとしても、単一系のため、ロッド構造に無理が生じ、ＨＰＬＣに必要な耐圧性が得られ難い。例えば、従来方法によるアクリルアミド樹脂ロッドでは、膨潤を避けるために、架橋剤であるメチレンビスアクリルアミドやメタクリレートなどを多量に加えて作成する。そのため、合成において、相反応利用が必要となり、他種の溶媒や緩衝溶媒を用いる。使用できる溶媒は限定されるため、ある程度の範囲となってしまう。
【００１２】
又、分相法の多孔質ガラスを用い、骨格６にシングルポア７を持つ多孔質体クロマトグラフィー用カラムが提唱されている（特開平７−１２０４５０）（図５）。これは、実用的且つ生産性に富んだ手法ではあるが、実質的に表面積の小さな保持容量の小さなものしか提供させておらず、より高性能なカラムが望まれており、且つそれに適応した分離システムの確立が必要となる。
【００１３】
一方、分析試料の前処理に使用されることの多い固相抽出法とは、試料を固相に負荷して保持させ、洗浄後に目的成分を溶出させる方法である。そのため、一旦流量を小さくする必要が生じ、低流量での確実な分配が不可欠となる。固相のスルーポアが大きいことは低流量域での分配により効果的であり、又スルーポア表面に形成されるメソポアは、試料成分との接触を大きくすることができ、その分固相の保持によい影響を与えることが期待される。
【００１４】
しかし、実際の固相抽出では、目的成分以外に多量のマトリクス成分が混在することになり、それらの成分の負荷量が問題となり、従来のガラスの単一スルーポアのものは使用できなかった。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は以上の各種の問題点から、シングルポア型の分離の必要性に対応できる多孔質体の強度の大なるものであり、且つ実質的に表面積の大なる保持容量の大なるモノリス型カラム等の多孔質体を提案するもので、マクロ細孔を持つ骨格体のマクロ細孔に、解放構造のミクロ多孔質体を充填形成させたことを特徴とするクロマトグラフィー用多孔質体を提案するものである。
【００１６】
ここでクロマトグラフィーとは、試料を展開剤を介して固定相中で移動させ、固定相に対する吸着、離脱により試料を分離する操作である。従って、広い意味に使用され、具体的にガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーに限定されず、固相抽出法等を含む概念であり、カラムや固相が具体的に使用されるものである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の構成は、骨格体８の上面から下面まで貫通しているマクロ細孔９，９，…の内部に、解放構造のミクロ細孔１０，１０，…を持つ多孔質体３が充填され一体化した構造を持つ多孔質体であり、モノリス型多孔質カラムに形成する。
【００１８】
マクロ細孔９，９，…の軸方向には垂直な断面は、円形又は長径と短径が異なる楕円形など円形に近いものが好ましい。マクロ細孔９，９，…の直径は、０．１〜１０ミクロンであってもよく、より好ましくは、０．５〜５ミクロンである。マクロ細孔９，９，…より小さい解放構造を持つミクロ細孔１０，１０，…は５〜１０００ｎｍであってもよく、好ましくは１０〜５００ｎｍである。マクロ細孔９，９，…より小さいと云うことは、相対的なものであり、例えばマクロ細孔９，９，…が０．１ミクロンの時、ミクロ細孔１０，１０，…は５ｎｍ以上、１００ｎｍ未満であり、マクロ細孔９，９，…が１０ミクロンの時、ミクロ細孔１０，１０，…は５ｎｍ以上、１００００ｎｍ未満であってもよいが、実質的に１０００ｎｍ以下である。と云うことを意味している。
【００１９】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や固相抽出における粒子を詰めた充填剤タイプにおいて、液体抵抗圧力は、その粒子径が小さくなるほど高くなることが知られており、ＨＰＬＣでは、粒子径１〜４０μｍ程度、固相では、２０μｍ〜１００μｍ程度が一般的となっている。
【００２０】
マクロ細孔径を持つモノリスカラムにおいては、マクロ細孔径が、充填剤タイプの粒子径と同様に考えられる。詳細は、文献ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｖｏｌ．２０Ｎｏ．１（１９９９）に示されているように、骨格を形成するマクロ細孔は、液体抵抗と理論段数に影響し、充填タイプに比べて、同一理論段数を得る圧力は、１０分の１になることは知られている。この文献は、同一組成から作成されるマクロ細孔とミクロ細孔からなるモノリスカラムであって、本発明とは異なる。しかし、液抵抗においては、マクロ細孔を持つ骨格の影響が大きく、同じ理論となる。本発明においても、ＨＰＬＣや固相抽出におけるモノリスのマクロ細孔径は、充填タイプ粒子径の１０分の１程度となり、０．１〜１０μｍが実用的となる。
【００２１】
分離に影響を大きく与えるところは、ミクロ細孔となる。本発明のモノリスカラムでは、マクロ細孔径を形成後にミクロ細孔を形成するために、上記報告文献と異なり、より広い範囲のミクロ細孔を作成でき、マクロ細孔とミクロ細孔の比も自由に作成される。
【００２２】
そのため、本発明カラムでは、ミクロ細孔の範囲は、分離目的成分の液体中での分子の大きさによって決定される。化学物質には、多くのものが存在するが、液体中になると、タンパクなどの高次構造を持つものでも、液体親和力により、最大で１０００ｎｍあれば、十分細孔内部に入れることになる。５ｎｍ以下においては、ミクロ細孔容積をいくら大きくしても、マクロ細孔の影響が出てしまい、本発明でのミクロ細孔形成による利点を生かすことが出来ず、コントロールすることは無意味となる。
【００２３】
カラム１２は柱状体に形成するのがよい。柱状体の高さ（長さ）は特に制限はないが、１ｍｍ位から１０ｍであってもよい。柱状体の断面は略円形に近いのが望ましい。柱状体の最大径は特に制限されないが、１ｍｍから５０ｃｍであっても良い。多孔質柱状体は、上記で定義されたマクロ細孔９，９，…が、上面から下面まで貫通しており、屈曲しながら、及び／又は連通していてもよい。即ち、カラムの構造を移動相が通過する細孔の構造から考えた場合、固形多孔質ガラスの場合、滑らかな内面を持つ円筒状の細孔が集合・分散を繰返しながらジャングルジムのように絡み合っていると見なせる。
【００２４】
マクロ細孔９，９，…を持つ多孔質体の材質は、マクロ細孔９，９，…の径を上記の大きさに制御し得る材質であれば、特に制限されないが、多孔質セラミック、多孔質ガラスなどの無機質の多孔体、例えば、多孔質ガラスが望ましい。多孔質ガラスの例としては、組成がＮａＯ―Ｂ２Ｏ３―ＳｉＯ２―ＣａＯ系のものが挙げられ、Ａｌ２Ｏ３，ＺｒＯ２，ＺｎＯ２，ＴｉＯ２，ＳｎＯ２，ＭｇＯ２など種々の酸化物を添加したガラスを用いて製造する場合もある。多孔質ガラスは、例えば、けい砂、硼酸、ソーダ灰及びアルミナを混合し、１２００〜１４００℃に溶融する。
【００２５】
これを８００〜１１００℃にて成形後、未分相硼けいガラスを得、熱処理によりＳｉＯ２相とＢ２Ｏ３―Ｎａ２Ｏ―ＣａＯ相に分相させ、酸処理によって、ＳｉＯ２骨格を残した多孔質体を製造する。細孔径は、用途によって、熱処理時の条件を変化させることにより、０．１〜１０ミクロンの細孔分布の均一なものが用途に応じて製造可能である。
【００２６】
多孔質セラミックの例としては、シリカ、アルミナシリケート質Ａ（硬磁気粒子を燒結したもの）、けい砂質、アルミナ質、アルミナシリト質Ｂ（シャモット粒子を燒結したもの）、多孔質ムライト質、けいそう土質のものなどがある。多孔質セラミックは、例えば、一定範囲の粒子径の陶磁器粒子（硬磁気粉砕物、シリカ、アルミナ、シャモットなど）と気孔形成材、例えば結晶セルロース（旭化成：アビセル）と適当な分散溶媒と混合・成形・燒結して製造する。細孔径５００μ程度から０．１μ程度又はそれを越える範囲のもので、細孔分布の均一なものが用途に応じて製作可能である。
【００２７】
次に、マクロ細孔９，９，…を持つ骨格体８のマクロ細孔９，９，…内にミクロ多孔質体を作成するためのモノマーを含浸させ、予め加えていた触媒等を利用し、マクロ細孔９，９，…内で重合させることにより、マクロ細孔９，９，…より小さく、解放構造を持ち、ミクロ細孔１０，１０，…を持つ多孔質体１１が充填され、一体化した構造を持つ多孔質柱状体を作成する。この場合、ミクロ多孔質体１１を作成するためのモノマーとは、有機、無機のどちらの材料でもよく、無機系であればテトラエトキシランに塩酸などの触媒を加え、調整したゾルを含浸させた後に、熟成させることにより、ミクロ細孔の多孔質シリカガラスを形成させることができる。又、有機系の場合、各種の樹脂が選択でき、例えばアクリルアミドモノマーを含浸させた後、重合させることにより、ポリアクリルアミドゲル多孔質体を得ることができる。
【００２８】
本発明のモノリス型（一体型）クロマトグラフィー用カラムは、液―液分配系、液―固吸着系、気―液分配系及び液―固（液）イオン交換系の全てのカラムクロマトグラフィー系に適用することができる。即ち、大気圧下の液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、超臨界クロマトグラフィーなどに適用し得る。又、前処理などを目的とする固相抽出用固相としても適用し得る。
【００２９】
本発明の多孔質カラムのミクロ細孔１０，１０，…には、従来の充填材に用いられている分離試料に適したコーティング剤及び／又は化学的修飾剤を適用して細孔の表面を修飾・改質し得る。コーティング剤としては、例えばポリエチレングリコール、シリコンオイルなどが挙げられる。又、化学的修飾剤としては、トリメチルクロロシラン（ＴＭＳ）、ジメチル―ｎ―オクチルクロロシラン、ジメチル―ｎ―オクタデシルクロロシラン（ＯＤＳ）などのアルキルクロロシラン、ｒ―アミノプロピルトリエトキシシランなどアミノアルコキシシラン、その他エポキシシランなど各種シラン処理剤が挙げられる。更に、表面修飾剤の修飾基にタンパク質などの高分子化合物又は低分子化合物が結合していてもよい。又、柱状体は変形させてＵ字又はコイル状のカラムとしてもよい。
【００３０】
本発明のモノリス型多孔質カラムは、強固な骨格体８である多孔質ガラスや多孔質セラミックのマクロ細孔９，９，…中に脆いゾル・ゲル法多孔質ガラスもしくは多孔質ポリマーを固定することにより、骨格体全体としては、大変強固な構造を持つことになった。従って、周囲のシールは従来フィルターなどで利用されるような、テフロンもしくはポリプロピレンなどのリングに強固に嵌め込むことで容易に実施できる。
【００３１】
従来タイプの充填材では、水溶離液での必要圧力は数Ｍｐａである。又、ゾルーゲルロッドカラムにおいては、スルーポアとメソポアを同時に作るため、空間を大きくする必要があり、脆くなってしまう。そのため、高圧に適用できないものになる。一方一般的なＨＰＬＣに用いられるインジェクション機能は、切換バルブによるもので、常用圧力が低くても、注入時には圧力変動が生じる。バイパスなどの利用により、解消は可能であるが高価になる。
【００３２】
以下、図に示す本発明カラムを用いた分離装置について説明すれば、溶離液を送液するポンプ１４と試料を注入するインジェクター１５と本発明カラム１２及び検出器１６により構成される。検出器１６も用途に応じ、電気化学検出器、分光光度計、ＲＩ検出器、蛍光検出器等各種選択できること勿論である。
【００３３】
本発明のカラムで構築したＨＰＬＣシステムは、硬い骨格を持つカラム１２のため、圧力変動が大きい安価なインジェクター１５又はインジェクションシステムを用いることができる。又、分析圧力が低いので、ポリプロピレン製などのバルブも使用できる。当然用いるポンプ１４も、安価な低圧ポンプを用いることができる。
【００３４】
従来の高圧システムを用いて、通常使用例の十倍以上の流速を流し高速分析することも可能となる。十倍以上の液を流すことは、カラム両端につけるフィルターの目詰り原因となるが、１つの硬い骨格を持つ本カラムを用いたシステムでは、フィルターを取付ける必要がなく、このような目詰りの心配は要らない。
【００３５】
又、カラム長を通常使用例の十倍にして、流速を通常にすることも可能になる。理論数段は、長さに比例するため、従来の十倍の段数が得られることになる。充填タイプでは、圧力も比例して十倍になり、このようなことは不可能である。ゾル・ゲル利用ロッドでは、カラム内部でゲル化するため、長いものを作成することは不可能に近い。又、出来たとしても、強度不足で折れ易い。
【００３６】
本発明カラムでは、強度の高いスルーポアだけの状態で、機械加工ができ、自由な大きさのものが作成できる。特に、ガラス製のものでは、溶融時に引けば、円形などの自由な形で、自由な長さに引くことが出来る。その後に、２次細孔を形成し、必要に応じて化学処理をすればＨＰＬＣ分離に使えることになる。このように、本発明カラムを用いたＨＰＬＣシステムでは、従来の十倍以上の長さのカラムを用いることも可能となる。
【００３７】
更に、本発明のモノリス型多孔質カラムの場合、背圧が低いこと、叉、低流速領域でも効果的な分離が得られることなどから低圧力、低流量でも流速が安定するポンプとを用いることが望ましく、特に背圧が低くても流速の変化が起こり難い超微量ポンプシステムと組合せることが可能となる。これらポンプシステムと本発明クロマトグラフィー用カラムは、一体のシステムとして機能する。
【００３８】
【実施例】
本発明の多孔質カラムを実施例により具体的に説明するが、以下の記載は本発明を制限するものではない。
〔実施例１〕多孔質ガラスの製造法
ＳｉＯ２  ５９．０、Ｂ２Ｏ３  ２５．０、ＺｒＯ２  ５．０、Ａｌ２Ｏ３  ３．０、ＣａＯ  ３．０、Ｎａ２Ｏ  ５．０各重量％を溶融し、直径約４ｍｍのロッドを５４０℃にて７時間処理し、次いで７５０℃にて約３２時間処理して分相させた。相分離物を９０℃にて１Ｎ硫酸（酸（ｍｌ）／ガラス（ｇ）の比＝１７０）を用いて２日間酸処理し、その後、０．５Ｎ―ＮａＯＨ（酸（ｍｌ）／ガラス（ｇ）の比＝１７０）を用いて６時間アルカリ処理した。得られたガラスロッドを熱蒸留水で洗浄し、乾燥後、デシケーター中で保存した。得られたガラスロッドの細孔容積は、０．６ｍｌ／ｇであり、中心細孔直径２ミクロンであった。細孔径分布の測定は、水銀圧入法により測定した。得られた多孔質ガラス材を機械加工により柱状体に成形した。
【００３９】
上記のようにして得られた直径４ｍｍ×長さ１００ｍｍの２μｍマクロ細孔を持つＳｉＯ２の骨格の骨格体を、５％塩酸水溶液２００ｍＬに全体を浸し、１２０℃で８時間還流し活性化する。活性化後にテフロンチューブに入れ、加熱収縮させ、液体を流せる状態にしておく。テトラエトキシシラン９ｍＬ、水１１ｍＬ、メタノール４ｍＬ、ジメチルホルムアミド４ｍＬ、アンモニア水４ｍＬを０℃で１０分間減圧撹拌し活性化させる。この液を上記骨格体に０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で１０分間流す。空気層が入り込まないように封入する。全体を１分間に２℃の昇温スピードで、６０℃に上げ、６時間ホールドし、マクロ細孔表面に結合しながらゲル化する。室温に戻し、０．０１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１０ｍＬを連続して０．１ｍＬ／ｍｉｎの流速で流し、未反応液を追い出す。封入し、８０℃で６時間熟成させ、ミクロ細孔を持つ多孔質体にする。窒素吸着測定法により、表面積４００ｍ２／ｇ、細孔径２０ｎｍであることを確認した。室温に戻し、水５ｍＬ、アセトン５ｍＬ、ヘキサン２０ｍＬの順に流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで洗浄する。ここで、マクロ細孔とミクロ細孔の比が、０．１〜２００倍であること、マクロ細孔相とミクロ細孔相の容量比が、０．１〜２０００倍であることは推奨される。
【００４０】
このようにして得られた柱状体をＰＥＥＫ樹脂製のホルダー１３に装着して、高速液体クロマトグラフに接続し、溶離液条件９５％ヘキサン／５％イソプロパノール流速１ｍＬ／ｍｉｎで、１．ベンゼン、２．ニトロベンゼン、３．ｏ―ニトロアニゾールを分析した。図９はマクロポアのみの未処理多孔質カラム（表面積４０ｍ２／ｇ以下）によるクロマトグラム、図１０はミクロポアを持つシリカゲルを充填した従来カラムによるクロマトグラム、図１１は処理後のミクロ細孔作成多孔質カラムによるクロマトグラムである。マクロポアだけでは分離が得られないミクロ細孔を形成させることにより、従来のシリカゲル充填カラムと同様なデータが得られた。
【００４１】
〔実施例２〕
直径４ｍｍ×長さ１００ｍｍの２μｍマクロ細孔を持つＳｉＯ２の骨格の骨格体を、柱状体に成形し、実施例１と同様の方法で活性化する。活性化後にテフロンチューブに入れ、加熱収縮させ、液体を流せる状態にしておく。１００ｍＬブタノールと１０ｍＬテトラブトキシチタンの混合液に、１００ｍＬの５％塩酸水溶液を、０℃を保持しながら添加し、３０分間減圧撹拌し、活性化したゾル反応液を得る。この液を上記骨格体に０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で５０分間流す。空気層が入り込まないように封入する。全体を１分間に２℃の昇温スピードで８０℃に上げ６時間ホールドし、マクロ細孔表面に結合しながらゲル化する。ジメチルホルムアミド１０ｍＬ、１０％水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬを連続して０．１ｍＬ／ｍｉｎの流速で流し、未反応液を追い出す。封入し、１２０℃で１２時間熟成させ、ミクロ細孔を持つ多孔質体にする。窒素吸着測定法により、表面積１００ｍ２／ｇ、細孔径２０ｎｍであることを確認した。室温に戻し、水５ｍＬ、アセトン５ｍＬ、ヘキサン２０ｍＬの順に流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで洗浄する。
【００４２】
このようにして得られた柱状体をＰＥＥＫ樹脂製のホルダーに装着して、高速液体クロマトグラフに接続し、溶離液条件ヘキサン／エタノール／メタノール＝90/90/1(w/w)、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで分析したところ、塩基性表面を持つチタニア特有の酸性化合物フェノールが中性ベンジルアルコールより遅れて溶出するという分離が得られた（図１２）。図中数字はサンプル名で、１はベンジルアルコール、２はフェノール、３はアニリンを表す。参考比較として、シリカゲル充填カラムタイプのデータを図１３に示す。分離順だけでなく、全体の保持としてもチタニア２次孔径を持つ本発明カラムのほうが大きくなった。
【００４３】
〔実施例３〕
直径５０ｍｍ×長さ２ｍｍの４μｍマクロ細孔を持つＳｉＯ２の骨格の骨格体を円盤状に成形し、実施例1と同様の方法で活性化させる。液の出入口のある耐圧ステンレス反応槽に入れる。テトラメトキシシラン１００ｍＬ、０．０１Ｍ塩酸水溶液２００ｍＬを４０℃で、１時間撹拌し、ゾル水溶液を得る。この水溶液で上記反応槽を満たす。１２０℃にて１２時間放置する。４０℃に下げ、０．１％アンモニアメタノール液で置換しながら、高圧ポンプで流す。８０℃に保持し、４時間放置する。４０℃に下げ、二酸化炭素超臨界状態でメタノール液を流し出す。メタノール液が完全になくなるまで二酸化炭素で洗浄する。窒素吸着測定法により、表面積２００ｍ２／ｇ、細孔径３０ｎｍであることを確認した。
【００４４】
次に、２０％オクタデシルトリクロロシラントルエン溶液を高圧ポンプで送りこみ、１２０℃で８時間放置する。次に、二酸化炭素超臨界状態で洗浄する。オクタデシル化多孔質固相が得られる。この多孔質固相を濾過器にセットして、分子量４４万の蛋白質フェリチン０．０１％水溶液３０ｍＬを流したところ、目詰りは生じず簡単に流すことが出来た。従来の固相では、このような減圧方法では、目詰りが生じて流れない場合があり、加圧方法が取られるが、この多孔質固相では、簡単に流すことが出来た。次に。１％アンモニア水溶液／１０％ＡＣＮで洗浄した。
【００４５】
２次細孔は、シリカゲルであるが、1次細孔はガラス骨格のため、アルカリ耐久性もあり、ろ液において、シリカゲル固相のようなアルカリ溶融物の溶出が見られなかった。次に、1％アンモニアアセトニトリル溶液で脱着後の蛋白回収率をＵＶ吸収法で測定した結果、８８％以上の回収率が得られた。充填タイプ固相では、充填剤の溶出を防ぐため、樹脂フィルターなどを使用するが、樹脂フィルターは疎水性であり、アルカリ条件下では疎水性の高まる蛋白質の吸着原因となり、回収は難しい。本固相では、フィルター無しで用いることが出来、高い回収率が得られた。
【００４６】
〔実施例４〕
直径４ｍｍ×長さ１００ｍｍの２μｍマクロ細孔を持つＳｉＯ２の骨格の多孔質体を、実施例1と同様の方法で活性化する。活性化後にテフロンチューブに入れ、加熱収縮させ、液体を流せる状態にしておく。減圧蒸留したスチレン０．５ｇ／ブタノール１ｍＬ溶液とスチレンジビニルベンゼン０．３ｇ／ジメチルホメムアミド１ｍＬ溶液とを、０℃で１０分間撹拌混合する。０℃撹拌混合しながら、その溶液に０．１％アゾビスイソブチロニトリル／エタノール溶液１ｍＬを２分間かけて滴下添加した。更に、ビニルトリメトキシシラン１ｍＬ／エタノール３ｍＬ溶液を加えてよく撹拌した。
【００４７】
このモノマー溶液の上澄み均一相（５００回転で遠心分離）を、０℃を保持しながら、上記マクロ多孔質体にシリンジを用いて導入し、空気相が入り込まないように封入した。８０℃で４８時間反応し、シリコン骨格でスルーポア相と結合したスチレン―シリコンポリマー相を作成し、ミクロ細孔を持つ多孔質体を得た。窒素吸着法により、表面積２００ｍ２／ｇ、ミクロ細孔径３０ｎｍであることを確認した。室温に戻し、イソプロパノール１Ｌ、アセトン１Ｌ、水１Ｌの順に、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで洗浄した。高速液体クロマトグラフに接続し、農薬を逆相分配分析した。その結果を図１４のクロマトグラムに示す。そのデータ詳細は次の通りである。
流速        ：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液      ：テトラヒドロフラン／１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）＝３７／６３
オーブン温度：４０℃
検出器      ：２３０ｎｍ
サンプル    ：１．アシュラム  ２．オキシン銅  ３．チウラム  ４．メコプロップ  ５．トリクロピル  ６．イプロジオン  ７．ベンスリド
【００４８】
〔実施例５〕
直径４ｍｍ×長さ１００ｍｍの２μｍマクロ細孔を持つＳｉＯ２の骨格の多孔質体を、実施例1と同様の方法で活性化する。液を廃棄し、アクリロプロピルトリメトキシシラン５ｍＬ、メタノール１００ｍＬを加え、全体を浸し、８０℃で１２時間還流し、ビニル基を結合する。メタノールで数回デカンテーション洗浄後、テフロンチューブに入れ、加熱収縮させ、液体を流せる状態にする。
【００４９】
水洗浄後、減圧蒸留したアクリル酸アミド０．５％／メタノール１０ｍＬ／ジメチルホルムアミド１ｍＬ／０．１ｍｇアゾビスイソブチロニトリルのモノマー溶液を０℃を保持しながら、上記マクロ多孔質体にシリンジを用いて導入し、空気層が入り込まないように封入した。８０℃で４８時間反応し、スルーポア骨格と結合したアクリルアミドポリマー層を作成し、ミクロ細孔を持つ多孔質体を得た。ゲル透過クロマトグラフィーにより、ミクロ細孔径は１００ｎｍであることを確認した。室温に戻し、イソプロパノール１Ｌ、アセトン１Ｌ、水１Ｌの順に、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで洗浄した。高速液体クロマトグラムに接続し、０．１Ｍリン酸アンモニウム水溶液から０．０１Ｍリン酸アンモニウム水溶液まで５分間グラジエントし、蛋白質の分析を行った。その結果を図１５のクロマトグラムに示す。図中数字はサンプル名で、１はシトクロームＣ、２はリボヌクレアーゼ、３はリゾチームを表す。
【００５０】
〔実施例６〕
テトラブトキシシラン１００ｍＬを１Ｍ塩酸水溶液３００ｍＬ、プロパノール溶液４００ｍＬを８０℃で撹拌しながら、プロパノール及び水を除去し、水酸化ゲルを得た。このゲルを粉砕機により粉砕撹拌、１μｍ粒子を得た。この粒子１０ｇと結晶性セルロース０．１ｇ、ラウリル硫酸ナトリウム０．１ｇ、ポリビニルアルコール０．１ｇを濃塩酸１０ｍＬに分散撹拌した溶液を円柱状の型に流し込み、１３００℃で燒結し、直径４ｍｍ×長さ１００ｍｍ、細穴直径２μｍの円柱状の多孔質セラミックを得た。テフロンチューブに押しこみ、液体を流せる状態にしておく。
【００５１】
１００ｍＬエタノールと１０ｍＬテトラエトキシシランの混合液に、１００ｍＬの５％塩酸水溶液を、０℃を保持しながら添加し、３０分間減圧撹拌し、活性化したゾル反応液を得る。この液を上記マクロ多孔質体に０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で１０分間流す。空気層が入り込まないように封入する。全体を１分間に２℃の昇温スピードで８０℃に上げ、６時間ホールドし、マクロ細孔表面に結合しながらゲル化する。室温に戻し、ジメチルホルムアミド１０ｍＬ、１０％水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬを連続して０．１ｍＬ／ｍｉｎの流速で流し、未反応液を追い出す。封入し、１２０℃で１２時間熟成させる。テフロンチューブから出し、４００℃で２０時間焼成し、ミクロ細孔を持つ多孔質体にした。窒素吸着測定法により、表面積２５０ｍ２／ｇ、ミクロ細孔径２０ｎｍであることを確認した。オクタデシルクロロシラン１０ｇ／トルエン１００ｍＬ溶液に、多孔質体を浸し、６０℃で２４時間反応させた。得られたオクタデシル化多孔質体をピークチューブに押しこみ、両端にジョイントを接続しカラムとした。高速液体クロマトグラフに接続し、溶離液条件アセトニトリル／水３０／７０流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで分析したところ、極性の高い順（ニトロアニソール、ニトロベンゼン、ベンゼンの順）に溶出し、逆相分配挙動の多孔質カラムが得られた。その結果を図１６のクロマトグラムに示す。図中数字はサンプル名で、１はＯ―ニトロアニソール、２はニトロベンゼン、３はベンゼンを表す。
【００５２】
【発明の効果】
本発明請求項１及び請求項５によれば、そのモノリス型（一体型）クロマトグラフィー用多孔質体は、従来の充填カラムとは異なり、充填時の影響を受けないばかりではなく、均一な径を有する多孔体、即ち、シングルポアの多孔体の中を移動相が通過する構造中で分離が行われるものであり、これまで実用化されてきた充填構造と同じ二重構造を持たず、従ってシンプルな分離機構であるばかりではなく、潜在的に高理論段数が得られる。
【００５３】
叉、マクロ細孔の内部にマクロ細孔より小さく解放構造を持つミクロ細孔を持つ多孔質体が充填され、一体化した構造を持つため、単純な多孔質体であるクロマトグラフィー用カラムと比べ、高負荷・高段数になる。叉、ベースになるマクロ多孔質体の製法・再現性は実績があり、生産性が高い。叉、低圧力下、低流量でも流速が安定するポンプと組合せ最適化することにより、環境負荷の少ないクロマトグラフィー用カラム分離システムが構築できる。
【００５４】
本方法では、液の流れるスルーポアは既に形成されている状態に、分離を目的とするメソポアを形成するため、架橋剤の有無などの合成への影響はない。スルーポア表面と化学結合していることが望ましいが、従来方法で空間内に別のモノリス構造を物理的に作成しても良いことになる。スルーポアを形成している骨格とメソポアを形成する部分を独立して作成できるため、スルーポアとメソポアの比の範囲は大きくなる。叉、スルーポア骨格とメソポア骨格とを同一成分で作成させ、骨格境界面をなくすこともできる。既にスルーポア骨格が固まっており、メソポア形成条件の検討だけで、自由に多孔質ロッドが作成できる。
【００５５】
分離面において、スルーポア骨格成分とメソポア骨格成分を変えることができるので、両方の特徴を引き出すことができるようになる。例えば、スルーポア骨格は、耐圧の高いセラミックを用いて、メソポア骨格にはポリマーを形成させる。スルーポア骨格としては、耐圧があり、膨潤収縮は起きない。分離に関与するメソポアには、ポリマーを用いるため、ポリマー独自の分離や高い耐薬品性が得られる。両方を混合系で作成したハイブリッドタイプより、元の材質の特徴を大きく出すことができ、より広範囲な分析に用いることができる。叉、当然、メソポアをハイブリッドで形成することもできる。
【００５６】
又、請求項２によれば、請求項１の効果に加えて、マクロ細孔を有する骨格体が始めに多孔質ガラス又は多孔質セラミック、それだけで形成されるため、極めて強固に形成され、全体構造の強度が確保できる。
【００５７】
又、請求項３によれば、請求項１の効果に加えて、ミクロ多孔質体が多孔質ガラス又は多孔質ポリマーであるため、有機系、無機系の選択が自在であり、試料に応じた材質の然もミクロ細孔も選択ができ、材質に応じた分離、耐薬品性が所望に応じて特定提供できる。
【００５８】
又、請求項４によれば、マイクロ細穴の直径０．１〜１０μｍが実用範囲であり、ミクロ細孔の直径５１０００ｎｍが実用範囲である。この範囲であれば、各試料の分離に影響の大なるミクロ細孔を広い範囲で形成でき、且つマクロ細孔とミクロ細穴の比も自由に作成できる。
【００５９】
更に、請求項６によれば、本発明の多孔質体又はカラムを用いることにより、目詰りがなく、フィルターを用いる必要がない。このため、多量の溶液を高速で流し、高速分析が可能となる。又、低圧、低流量でも変化が少ないので、超微量ポンプシステムと組合せることが可能である等その利用範囲は極めて大である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のモノリス型（一体型）多孔質カラムをクロマトグラフィー用カラムとした一例を模式的に示した図のカラムの軸方向の断面図
【図２】  従来の充填カラムの軸方向の断面の一部の模式図
【図３】  従来の充填カラムの軸方向の断面の一部の模式図
【図４】  一体型カラムの軸方向の断面の一部の模式図
【図５】  従来の一体型カラムの軸方向の断面の一部の模式図
【図６】  本発明の構造の断面の一部の模式図
【図７】  従来のカラムの細孔分布のグラフ図（ダブルポア型）
【図８】  本発明カラムの細孔分布のグラフ図（シングルポア型）
【図９】  従来のカラムによる処理例のクロマトグラム
【図１０】  従来のカラムによる処理例のクロマトグラム
【図１１】  本発明カラムによる処理例のクロマトグラム
【図１２】  本発明カラムによる処理例のクロマトグラム
【図１３】  従来のカラムによる処理例の比較クロマトグラム
【図１４】  本発明カラムによる処理例のクロマトグラム
【図１５】  本発明カラムによる処理例のクロマトグラム
【図１６】  本発明カラムによる処理例のクロマトグラム
【図１７】  本発明カラムを使用した分離装置の概略説明図
【符号の説明】
８  骨格体
９  マクロ細孔
１０  多孔質体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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