(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
梅肉エキスの中和処理物を有効成分とするオートファジー誘導用医薬品。
【請求項２】
抗炎症性医薬品である請求項１記載の医薬品。
【請求項３】
抗ウィルス性医薬品である請求項１記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高いオートファジー誘導作用を有する飲食品及び医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体にとって、細胞の増殖と細胞死の均衡を保ち恒常性を維持することは重要である。しかし、疾患に陥った場合は、しばしばこの恒常性がバランスを失っている場合がある。例えば、白血球の多くは骨髄での細胞増殖により産生され、適切な細胞死が誘導されている生体では、血液中の白血球数は一定に保たれて恒常性が維持されているが、炎症が起きると末梢血中の白血球数、特に好中球等の顆粒球が増加するため、組織破壊を進行させて炎症病態を悪化させる要因となる。炎症性の刺激は好中球の寿命が延長し細胞死が抑制された状態にある（非特許文献１、２参照）。このように細胞死は、生体の恒常性維持や疾患に深く関わる生体にとって非常に重要な機構である。
【０００３】
近年では、細胞死の種類が分類されるようになり、アポトーシス（apoptosis）や古典的な細胞死を意味するネクローシス（necrosis）以外に、オンコーシス（oncosis）、ピロトーシス（pyroptosis）などの言葉で表現される細胞死が定義されつつある（非特許文献３参照）。また、生理学的な細胞死として生体の恒常性維持や、発生分化などに重要な役割を担っていると考えられているプログラム細胞死（PCD）も幾つかのタイプ別に分類され、TypeI PCDはアポトーシス、TypeII PCDはオートファジー（autophagy）を伴う細胞死とされている（非特許文献４、５参照）。アポトーシスは、もともと形態学的な特徴から定義され、細胞核クロマチンの濃縮と細胞矮小化、細胞膜構造破壊などを伴い、その後には生化学的特長としてDNAの断裂（DNA電気泳動でのラダ−フォーメーション）などの現象がおこる。（非特許文献３−５参照）。一方、TypeIIPCDは、アポトーシスに見られる様な細胞核の形態学的な変化は少なく、細胞にオートファゴソーム（autophagosome,  autophagic vacuole）を伴うことが特徴とされている。すなわち、細胞内に多くの空胞形成を伴う細胞死である。
【０００４】
オートファジーは、オートファゴソーム（リソソームと融合したファゴソーム:自己の細胞成分を取り込んだリソソーム加水分解酵素を含む細胞質内隔離膜構造体）に取り込んだ自己の細胞内成分物をリソソーム酵素で分解する細胞現象である（非特許文献６参照）。この現象は酵母においてよく研究されているが、ほ乳類細胞にも起こる現象である。
オートファジーは、特にアミノ酸の再利用に働く細胞機能として理解されている。培養細胞では、培養液中のアミノ酸が欠如した培養液で培養した場合に、細胞にオートファジーが誘導されることが知られている（非特許文献６参照）。オートファジーは飢餓状態に耐えて、細胞が生き残るのに重要で、酵母などではオートファジーを阻害して飢餓状態にすると細胞がすぐに死亡する。この場合、オートファジーは細胞の延命に作用する機構であるともいえる。
オートファジーの誘導は、古典的には電子顕微鏡によって細胞内オルガネラの分解構造物を空胞内に確認することにより証明されていたが、近年ではオートファジーが起きる過程で必須のフォスファチジルイノシトール3リン酸（PI3）キナーゼ複合体（クラスIIIPI3キナーゼ、ヒトではbeclin-1を含む）を阻害する3-メチルアデニン（非特許文献６−１０参照）やWortmanine（非特許文献６、７、１１−１３参照）などの阻害剤による細胞内空胞形成抑制により証明されている。
【０００５】
前述したように、白血球の細胞死や末梢血細胞数の制御は、炎症や生体防御と深い関わりをもっていることから、細胞死を白血球に誘導することができれば、抗炎症剤としての応用が考えられる。白血球系細胞での細胞死はアポトーシスの研究は盛んであるが、オートファジーを伴う細胞死や細胞減少の研究はあまり研究が進んでいなく、わずかに骨髄性白血病細胞のHL-60や、顆粒球前駆細胞でオートファジーを伴う細胞死や細胞減少が報告されている(非特許文献１４、１５参照)。
【０００６】
さらに、オートファジーは、細胞の飢餓や細胞死以外にも様々な細胞活動に関連していることが知られている。例えば、細胞質内に感染した細菌やウイルスの排除に関連することが報告されている（非特許文献１６−１７参照）。
従って、オートファジーを誘導することができれば、オートファジーを伴う細胞死（TypeII プログラム細胞死）誘導や炎症抑制、病原体による感染防御等ができるものと期待されるが、オートファジー誘導作用を有する飲食品や医薬品については知られていないのが実状である。
【非特許文献１】Walker A, et al., Curr Drug Targets Inflamm Allergy, 2005 Aug., 4(4), 447-54.
【非特許文献２】Mayadas TN et al., Trends Immunol, 2005 Jul., 26(7), 388-95.
【非特許文献３】Fink SL, et al., Infect Immun., 2005 Apr, 73(4), 1907-16.
【非特許文献４】Assuncao Guimaraes C, et al., Eur J Biochem. 2004 May, 271(9), 1638-50.
【非特許文献５】Bras M, et al., Biochemistry (Mosc). 2005 Feb, 70(2), 231-9.
【非特許文献６】Munafo DB, et al., J Cell Sci. 2001 Oct, 114(Pt 20), 3619-29.
【非特許文献７】Petiot A, et al., J Biol Chem. 2000 Jan 14, 275(2), 992-8. Erratum in, J Biol Chem 2000 Apr 21, 275(16), 12360.
【非特許文献８】Paglin S, et al., Cancer Res. 2001 Jan 15, 61(2), 439-44.
【非特許文献９】The role of autophagy. Carcinogenesis. 1996 Aug, 17(8), 1595-607.
【非特許文献１０】Kondo K, et al., Anat Rec. 1997 Apr, 247(4), 449-54.
【非特許文献１１】Blommaart EF, et al., Eur J Biochem. 1997 Jan,243(1-2),240-6.
【非特許文献１２】Kihara A, et al., EMBO Rep. 2001 Apr, 2(4), 330-5.
【非特許文献１３】Munafo DB, et al., J Cell Sci. 2001 Oct, 114(Pt 20), 3619-29.
【非特許文献１４】Saeki K, et al., Cell Death Differ, 2000 Dec., 7(12), 1263-9.
【非特許文献１５】Parmley RT et al.,Am J Pathol, 1984 Aug., 116(2), 279-88.
【非特許文献１６】Jackson WT, et al., PLoS Biol. 2005 May, 3(5), e156. Epub 2005 Apr 26.
【非特許文献１７】Woodfin BM, et al., J Cell Biochem. 1986, 31(4), 271-5.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、斯かる実状に鑑みてなされたもので、高いオートファジー誘導作用を有する飲食品及び医薬品を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく、我が国において古くから健康食品の代表格として食用に供されてきた梅肉に注目し、種々研究を重ねたところ、梅肉に含まれる成分が、細胞内に空胞形成を誘導する作用を有することを見出した。そして、さらに検討したところ、この空胞形成がオートファジーによる現象であり、梅肉に含まれる成分が優れたオートファジー誘導作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物又は梅肉エキスの中和処理物を含有することを特徴とするオートファジー誘導用飲食品により上記課題を解決したものである。
【００１０】
また、本発明は、梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物又は梅肉エキスの中和処理物を有効成分とするオートファジー誘導剤により上記課題を解決したものである。
【００１１】
また、本発明は、梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物又は梅肉エキスの中和処理物を含有することを特徴とする抗ウィルス性飲食品により上記課題を解決したものである。
【００１２】
また、本発明は、梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物又は梅肉エキスの中和処理物を有効成分とする抗ウィルス剤により上記課題を解決したものである。
【００１３】
また、本発明は、梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物又は梅肉エキスの中和処理物を含有することを特徴とする抗炎症性飲食品より上記課題を解決したものである。
【００１４】
また、本発明は、梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物又は梅肉エキスの中和処理物を有効成分とする抗炎症剤より上記課題を解決したものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、高いオートファジー誘導作用を有する飲食品及び医薬品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明において梅肉エキスとしては特に制限されないが、出荷時期の青梅の梅肉から絞りとった梅肉エキスが好ましく、更には当該梅肉エキスを濃縮した濃縮梅肉エキスの状態で使用するのが特に好ましい。より具体的には、当該梅肉エキスは採取直後の青梅をミキサーでくだいて種と果肉（梅肉）とを分離するとともに果肉を抽出しやすく粉砕した後、遠心力を利用した絞り器でこの梅肉を絞り、分離されてくる絞り汁を回収して調製される。この方法によると青梅２０kgから約８kgの梅肉エキスが採取できる。更に当該濃縮梅肉エキスは、この梅肉エキスを加熱沸騰させて約９０時間濃縮して濃縮液とし、更に１００℃にて２４時間加熱処理して調製される。この方法では８kgの梅肉エキスから２kgの濃縮液を得て、最終的には約０．４kg程の濃縮梅肉エキスが得られる。
【００１７】
本発明において、梅肉エキスの抽出に用いる疎水性有機溶媒としては、抽出液から揮発させることが容易であり、水との溶解性が低く、水との混和により分離する溶媒であれば特に制限はなく、単独成分の溶媒でも、適切な有機溶媒（アルコール類、エステル類、アルカン類、ハロゲン化アルカン類、エーテル類など）をまぜあわせることにより作成した混合溶媒でも良い。例えばジエチルエーテル、クロロホルム、ヘキサンなど、変性しにくく、化学的に安定で、水と容易に分離する低沸点である溶媒が好ましいものとして挙げられる。
【００１８】
本発明における梅肉エキスの抽出物は、上記梅肉エキスに上記疎水性有機溶媒を加え、常法により疎水性有機溶媒に溶解親和性を持つ成分を抽出し、該抽出により分取した疎水性有機溶媒層（抽出液）から、常法に従って有機溶媒成分を揮発させることによって得られる。場合によっては分取した抽出液中の不溶性混入物を、通常のろ過精製の手法を使ってろ過して取り除いても良い。また、必要に応じて抽出液に精製した滅菌水を加えて、分液ロートなどの密閉できる容器で分配操作を行い、水溶性の強い物質を水層に溶解させることによって取り除く操作を行い、疎水性有機溶媒中の成分を精製する操作を行っても良い。
【００１９】
また、本発明において梅肉エキスの中和処理物は、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基でｐＨ６〜８程度に中和した中和物の状態で使用するのが製剤加工を容易にする点や、強い酸味を緩和することによる飲食を容易にできる点で好ましい。より具体的には、上記と同様にして得られる梅肉エキスや濃縮梅肉エキスを、等量の水で希釈して懸濁液とし、該懸濁液にアルカリ溶液を適量添加して、懸濁液のｐＨをｐＨ６〜８に中和することにより調製される。場合によっては、中和後、不溶物を遠心操作で沈殿させて取り除いても良い。また、市販の滅菌フィルターを通して無菌化させても良い。
【００２０】
斯くして得られた疎水性有機溶媒抽出物又は中和処理物を含有する飲食品の形態は、特に制限されず、ドリンク剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ペースト剤、練り製品、発酵食品、菓子等が挙げられる。このような飲食品には、保存料、着色料、甘味料、酸化防止剤、増粘安定剤、乳化剤、調味料、防腐剤等の食品添加物、天然物等を適宜配合することができる。
【００２１】
また、当該疎水性有機溶媒抽出物又は中和処理物を有効成分とする医薬品とするには、適宜、薬学的に許容される担体、例えば賦形剤、滑沢剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、乳化剤、安定剤、嬌味嬌臭剤等を使用して錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等の経口的に投与する製剤とするのが好ましい。
【００２２】
本発明において、当該疎水性有機溶媒抽出物の有効投与量は、通常１５ｍｇ〜１５０ｍｇ／日（成人）とするのが好ましい。また、当該中和処理物の有効の投与量は、通常１ｍL〜１５０ｍL/日(成人)とするのが好ましい。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明について実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。
【００２４】
実施例１
採取直後の青梅をミキサーでくだいて種と果肉（梅肉）とを分離するとともに果肉を抽出しやすく粉砕した後、遠心力を利用した絞り器でこの梅肉を絞り、分離されてくる絞り汁を回収して梅肉エキスを得た。この梅肉エキスを加熱沸騰させて約９０時間濃縮して濃縮液とし、更に１００℃にて２４時間加熱処理して濃縮梅肉エキスを得た。得られた濃縮梅肉エキス１０ｇを等量の水で希釈した懸濁液に、疎水性有機溶媒としてジエチルエーテル（和光純薬）を２倍量加えて、密閉容器の中でよく振盪して混和した。この液を室温で１時間静置し、有機溶媒層と梅肉エキスに含まれる水分からなる水層に層分離させた。更に層の分離を明確にし、不溶性沈殿物を除去するため、混合液を容器ごと遠心分離機にかけ（１５００rpm）、遠心力を加えた。有機溶媒層（ジエチルエーテル層：上層）を分取して、ろ紙（東洋濾紙製、Ｎｏ．２）によるろ過操作を行い、そのろ液を抽出液として回収した。回収した抽出液から、ロータリーエバポレーター（東京理科機械製）を使って減圧条件下で溶媒を揮発除去し、乾固した抽出物６０mgを得た。
【００２５】
実施例２
実施例１と同様の方法で得た濃縮梅肉エキス１０ｇを等量の水で希釈して懸濁液とし、この懸濁液に８N NaOH水溶液を加え、ｐＨ７．０に中和した。次いで、不溶物を遠心分離機にかけ（３０００rpm）、沈殿させた。更に滅菌フィルター（0.2μｍポアサイズ,  Sartorius社）を通して、無菌化すると同時に不溶物を取り除き、中和処理物を得た。
【００２６】
試験例１
（１）試料溶液の調製
実施例１で得た抽出物は、黒緑色の乾固した抽出物で疎水性を有するため、培養細胞の培養液に添加する際に溶解性が低く、分散性が悪いので、当該抽出物６０mgにDMSO１mLを加えて再溶解し、さらに細胞培養液（RPMI−1640、SIGMA社）０．５mLに、このDMSO溶液５μLを添加して、６００μg／mLの抽出成分入りの試料溶液Ａとした。
実施例２で得た中和処理物は、細胞培養液（RPMI−1640、SIGMA社）０．５mLに４０μLを添加して、試料溶液Ｂとした。
【００２７】
（２）KatoIII（ヒト胃癌細胞株）を用いたオートファジー誘導作用の検討
試料溶液Ａ及びＢによるオートファジー誘導作用は、KatoIII（ヒト胃癌細胞株）を用いて、その阻害剤である3-メチルアデニン（3-MA）又はWortmanine (WT)による細胞内空胞形成抑制により検討した。KatoIIIは、６５℃で３０分間非働化したFetal Calf Serum(FCS、コスモバイオ社)を10％含むRPMI−1640（SIGMA社）で培養した細胞を使用した。KatoIIIを上記培養液で１×１０5／mLの細胞濃度で懸濁し、この細胞懸濁液を24穴培養プレート（住友ベークライト社製）に０．５mL／mLずつ播種した。なお、3-MA又はWTを添加する  wellには、予め3-MAの最終濃度10mM、WTの最終濃度１００ｎMとなるようにそれぞれ添加した細胞懸濁液を用いた。3-MAは、試料溶液添加の２時間前に細胞懸濁液へ添加し、WTは、１５分間前に添加した。次いで、各プレートへ、試料溶液Ａ、Ｂを、それぞれ１wellあたり０．５mLずつ添加し（総量で１mLとなる）、試料溶液Ａの抽出成分の最終濃度を３００μg／mLとし、試料溶液Ｂの中和処理物の最終濃度を４０μL／mLとした。比較コントロールとしてDMSO、3-MA及びWTをそれぞれ上記の試料溶液と同量加える比較wellを設定した。また、何も添加せずに培養する陰性コントロール（添加量０）も設定した。試料溶液を添加してから、１時間、３時間、６時間、２４時間後にそれぞれの細胞を回収し細胞形態（細胞質の空胞形成）を観察し、添加物のオートファジー誘導作用を評価した。
【００２８】
（３）結果
試料溶液Ａ（抽出物）を添加した細胞では、添加６時間後には明らかな細胞質の空胞形成が確認され、２４時間にはさらに強い空胞形成が見られた（図１）。また、この細胞質の空胞形成は3-MA又はWTの共存によって抑制された（図２-Ａ、Ｂ）。
試料溶液Ｂ（中和処理物）を添加した細胞では、６時間後から空胞形成が観察され始め、２４時間後には、抽出物と同様に空胞形成が確認された。また、この細胞質の空胞も、3-MA又はWTの共存によって抑制された（図３）。
一方、比較コントロール（DMSOコントロール、3-MAコントロール、WTコントロール及び陰性コントロール（添加量０））においては、細胞質の空胞形成は確認されなかった。このことから、濃縮梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物又は濃縮梅肉エキスの中和処理物には、オートファジーを誘導する作用があることが確認された。
【００２９】
試験例２  MCF-7（ヒト乳癌細胞株）を用いたオートファジー誘導作用の検討
細胞として、６５℃で３０分間非働化したFetal Calf Serum(FCS、コスモバイオ社)を１０％含むDMEM培養液（日水）で培養したMCF-7（ヒト乳癌細胞株）を用い、MCF-7播種から1日経過した後に添加物を添加した以外は、試験例１と同様に、添加物のオートファジー誘導作用を評価した。
その結果、試料溶液Ａ（抽出物）を添加した細胞では、６時間後から空胞形成が観察され始め、２４時間後には明らかな空砲形成が確認され、この細胞質の空胞形成は3-MA又はWTの共存によって抑制された（図４）。また、試料溶液Ｂ（中和処理物）を添加した細胞でも、６時間後から空胞形成が観察され始め、２４時間後には、抽出物と同様に空胞形成が確認され、この細胞質の空胞も、3-MA又はWTの共存によって抑制された（図５）。一方、比較コントロール（DMSOコントロール、3-MAコントロール、WTコントロール及び陰性コントロール（添加量０））においては、細胞質の空胞形成は確認されなかった。
【００３０】
試験例３  血液細胞を用いたオートファジー誘導作用の検討
健常者ボランティアから採取したヘパリン添加（４単位／mL）血液を用い、梅肉の抽出物の血液細胞に対するオートファジー誘導作用を検討した。なお、オートファジーの誘導は、3-MAによる細胞内空胞形成抑制により検討した。
１０％のFCS（非働化済）を添加したRPMI-1640培養液で血液を５倍に希釈し、２４穴培養プレート（住友ベークライト社製）に０．５ml／mLずつ添加した。そこへ試験例１と同様に調製した試料溶液Ａ（６００μg/mLの濃度）を０.５mL添加し（血液は最終的に１０倍希釈され、抽出成分の最終濃度が３００μg/mLとなる）、２４時間後の形態を観察した。また、試料溶液Ａ０.５mLに２０mM濃度の３MAを添加し（３MAの最終濃度は１０mMとなる）、オートファジー誘導効果を評価した。比較コントロールとしてDMSOを抽出液と同量加える比較wellを設定した。
その結果、血液細胞のうち主に顆粒球と単球の細胞質に空胞変性を認め、その空胞形成は、3-MAで阻害された（図６）。一方、リンパ球や赤血球には形態学的に明らかな変化は認められなかった。このことから、濃縮梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物には、血液細胞の顆粒球（特に好中球）や単球にオートファジーを誘導する作用があることが確認された。従って、本発明によれば、過剰な顆粒球や単球の活動、増加を抑制することができるため、抗炎症性飲食品又は抗炎症剤として有用である。
【００３１】
また、試料溶液Ａ添加前と添加２４時間後の血液中の白血球の濃度変化を血球自動測定装置（Sysmex社製）により測定したところ、オートファジー誘導作用が確認された顆粒球や単球において、試料溶液Ａとのインキュベーション（３７℃、２４時間）によって細胞が減少した（図７）。このことから、濃縮梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物には、血液細胞を減少させる作用があることが確認された。従って、梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物を血液に添加すれば、白血球中における顆粒球や単球の割合を減少させることができる。なお、血液中の細胞濃度の測定は、血液が１０倍に希釈されているので、血球自動測定装置で測定する前に遠心操作等により１０分１容量にもどし、測定を行った。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物をKatoIII（ヒト胃癌細胞株）に添加した場合の、細胞内空胞形成の状態を示す図である。
【図２】梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物と3-MA、又は梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物とWTをKatoIII（ヒト胃癌細胞株）に添加した場合の、細胞内空胞形成の状態を示す図である。
【図３】梅肉エキスの中和処理物、梅肉エキスの中和処理物と3-MA、又は梅肉エキスの中和処理物とWTをKatoIII（ヒト胃癌細胞株）に添加した場合の、細胞内空胞形成の状態を示す図である。
【図４】梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物、梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物と3-MA、又は梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物とWTをMCF-7（ヒト乳癌細胞株）に添加した場合の、細胞内空胞形成の状態を示す図である。
【図５】梅肉エキスの中和処理物、梅肉エキスの中和処理物と3-MA、又は梅肉エキスの中和処理物とWTをMCF-7（ヒト乳癌細胞株）に添加した場合の、細胞内空胞形成の状態を示す図である。
【図６】梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物、梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物と3-MAを血液細胞に添加した場合の、細胞内空胞形成の状態を示す図である。
【図７】梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物を血液細胞に添加した場合の、血液中の白血球の濃度変化を血球自動測定装置により測定した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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