(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(1)又は(2)のペプチド。
(1)  配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
(2)  配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として含む細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導剤。
【請求項３】
白血球抗原としてＨＬＡ−Ａ２４０２を有するヒトのための請求項２に記載の細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導剤。
【請求項４】
以下の(3)又は(4)のポリヌクレオチド。
(3)  配列番号１０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(4)  配列番号１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養する工程と、培養物から請求項１に記載のペプチドを回収する工程とを含む請求項１に記載のペプチドの製造方法。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチドがパルスされた抗原提示細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の抗原提示細胞を有効成分として含む細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導剤。
【請求項１０】
請求項１に記載のペプチド又は請求項８に記載の抗原提示細胞上に提示された腫瘍抗原エピトープ・ペプチドと、主要組織適合抗原とが複合した主要組織適合抗原複合体。
【請求項１１】
請求項１に記載のペプチド又は請求項８に記載の抗原提示細胞上に提示された腫瘍抗原エピトープ・ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４０２分子と、β２ミクログロブリンとの複合体である請求項１０に記載の主要組織適合抗原複合体。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の主要組織適合抗原複合体を有効成分として含む細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導剤。
【請求項１３】
請求項１に記載のペプチド又は請求項８に記載の抗原提示細胞上に提示された腫瘍抗原エピトープ・ペプチドと、主要組織適合抗原とが複合した主要組織適合抗原複合体のテトラマー。
【請求項１４】
以下の(a)〜(d)のいずれか１以上を用いて末梢血リンパ球を刺激することにより得られる細胞傷害性Ｔリンパ球。
(a)  請求項１に記載のペプチド
(b)  請求項８に記載の抗原提示細胞
(c)  請求項１０又は１１に記載の主要組織適合抗原複合体
(d)  請求項１３に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマー
【請求項１５】
前記(a)〜(d)のいずれか１以上を用いて末梢血リンパ球を刺激することにより主要組織適合抗原複合体及び／又はそのテトラマーと細胞傷害性Ｔリンパ球との結合体を形成し、この結合体から単離することにより得られるものである請求項１４に記載の細胞傷害性Ｔリンパ球。
【請求項１６】
前記主要組織適合抗原複合体及び／又はそのテトラマーと細胞傷害性Ｔリンパ球との結合体の形成が、下記（１）及び（２）のいずれか１つ：
（１）主要組織適合抗原複合体及び／又はそのテトラマーを固相化させる工程、及び固相化した主要組織適合抗原複合体及び／又はそのテトラマーと末梢血リンパ球とを反応させる工程；ならびに
（２）主要組織適合抗原複合体及び／又はそのテトラマーと磁気ビーズとを結合させる工程、及び主要組織適合抗原複合体及び／又はそのテトラマーと磁気ビーズとの結合体と末梢血リンパ球とを反応させる工程
を含む、請求項１５に記載の細胞傷害性Ｔリンパ球。
【請求項１７】
前記結合体からの細胞傷害性Ｔリンパ球の単離が、細胞傷害性Ｔリンパ球を染色することにより分離する工程を含む、請求項１５に記載の細胞傷害性Ｔリンパ球。
【請求項１８】
採取された末梢血に以下の(a)〜(d)のいずれかを作用させる工程と、
(a)  請求項１に記載のペプチド
(b)  請求項８に記載の抗原提示細胞
(c)  請求項１０又は１１に記載の主要組織適合抗原複合体
(d)  請求項１３に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマー
末梢血中の細胞傷害性Ｔ細胞又はそれが産生するサイトカインを定量する工程とを含む末梢血中のＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球の定量方法。
【請求項１９】
前記末梢血中の細胞傷害性Ｔ細胞又はそれが産生するサイトカインの定量工程が、細胞内ＩＦＮ−γ産生細胞の定量、ＣＤ８陽性細胞の定量、エリスポットアッセイによる定量、及び培養上清上に分泌されたサイトカインの定量のいずれか１つの方法によって行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１に記載のペプチド又は請求項８に記載の抗原提示細胞上に提示された腫瘍抗原エピトープ・ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４０２分子と、β２ミクログロブリンとの複合体のテトラマーである請求項１０に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマー。
【請求項２１】
請求項２０に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマーを有効成分として含む細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性細胞傷害性Tリンパ球が認識するエピトープ・ペプチド、抗原提示細胞及び主要組織適合抗原複合体、これらを有効成分とする癌ワクチン又は細胞傷害性Ｔリンパ球誘導剤、この細胞傷害性Ｔリンパ球誘導剤を有効成分とする上皮性癌に対する受動免疫療法剤、これらを用いた癌の治療又は改善方法、及び、癌に特異的なＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞傷害性Ｔリンパ球（Cytotoxic T Lymphocyte：以下、「ＣＴＬ」と略称する)は癌に対する抵抗における重要な因子の一つと考えられている。【０００３】
癌患者の腫瘍局所には腫瘍細胞に対して傷害活性を示すＣＴＬの浸潤が認められる。この腫瘍特異的なＣＴＬの標的分子である腫瘍抗原は、細胞内で分解されて８〜１１個のアミノ酸からなるペプチド（腫瘍エピトープ・ペプチド）になり、主要組織適合性抗原であるヒト白血球抗原（以下、「ＨＬＡ」という）分子と結合して腫瘍細胞表面上に提示される。ＣＴＬはＨＬＡと腫瘍抗原ペプチドとからなる複合体を認識して腫瘍細胞を傷害する。このように、ＣＴＬはＨＬＡ拘束性に腫瘍細胞を認識する。【０００４】
ＨＬＡは、ほとんど全ての細胞上に発現している細胞膜抗原であり、クラスＩ抗原とクラスＩＩ抗原に大別される。ＣＴＬによりエピトープ・ペプチドと共に認識されるＨＬＡはクラスＩ抗原である。ＨＬＡクラスＩ抗原はさらにＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ等に分類され、それらの遺伝子にはサブタイプがあり、例えば、ＨＬＡ−ＡにはＡ１、Ａ２、Ａ２４、およびＡ２６等の多型が存在している。そのため、それぞれのヒト個人が有するＨＬＡの型は必ずしも同一ではなく、ＣＴＬはＨＬＡクラスＩ抗原と腫瘍エピトープ・ペプチドとの複合体を認識するとき、ＨＬＡの型をも認識する。さらに、ＨＬＡに結合可能なエピトープ・ペプチドには、ＨＬＡの型毎に結合し得るペプチド配列にモチーフ（規則的配列）があることが知られている。従って、ＣＴＬを誘導及び／又は活性化するためには、患者毎に異なる各型のＨＬＡに結合し得るモチーフからなるペプチドを選択する必要がある。【０００５】
Ｅｐ−ＣＡＭは、上皮細胞由来の癌細胞の表面に広く発現している分子であり、カルシウムイオン非依存性の細胞−細胞間接着を媒介する。Ｅｐ−ＣＡＭは、ＥＧＰ−２、１７−１Ａ、ＧＡ７３３−２又はＫＳＡとも称されている。Ｅｐ−ＣＡＭは、大腸、肺、頭頚部、乳腺など、多様な組織学的起源に由来する多くの腫瘍において高発現しており、正常上皮細胞においては発現が限局されている。また、腫瘍進展の程度とＥｐ−ＣＡＭの発現量とが相関していることから、Ｅｐ−ＣＡＭの発現検出は、腫瘍の微小転移の診断又は生存予測のためのマーカーとして有用とされている。【０００６】
Ｅｐ−ＣＡＭは、上皮細胞由来の癌細胞に広く発現しているが正常細胞では発現が限局されているため、モノクローナル抗体を使用する免疫療法や遺伝子治療の主要な標的の一つになっている。【０００７】
例えば外科手術後にＥｐ−ＣＡＭ特異的マウス・モノクローナル抗体(17-1Aと名づけられているもの)を投与することにより、遠隔転移が予防されるとともに、７年間連続投与により延命効果が見られたことが報告されている。また１７−１Ａと名づけられているＥｐ−ＣＡＭに対するモノクローナル抗体を用いて大腸癌患者の治療を行ったところ、死亡率と再発率が低下したことが報告されている。【０００８】
さらに近年、ＨＬＡ拘束性のＥｐ−ＣＡＭを標的とするＣＴＬを用いる癌治療の可能性を示す事実が幾つか報告されてきている。【０００９】
例えば特許文献１には、ＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性Ｅｐ−ＣＡＭに特異的なＣＴＬが上皮腫瘍細胞を破壊するが、正常細胞に影響を与えないことが報告されている。特許文献１は、ＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性ＣＴＬが認識するＥｐ−ＣＡＭ１７４−１８４エピトープ・ペプチドとして、配列番号１２に記載のYQLDPKFITSIの配列からなるペプチドを開示している。【００１０】
またＥｐ−ＣＡＭに対するＴ細胞応答が、免疫治療を受けていない結腸大腸癌患者において観察されている。加えて、Ｅｐ−ＣＡＭを発現する組み換え体カナリヤポックスウイルスで大腸癌患者を免疫したところ、自己免疫応答を起こすことなく抗Ｅｐ−ＣＡＭのＣＴＬ応答が誘導された。【００１１】
ＨＬＡクラスI抗原のＨＬＡ−Ａの中で、日本人に最も多く発現しているのは、ＨＬＡ−Ａ２４である。従って、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＥｐ−ＣＡＭエピトープ・ペプチドは、癌ワクチンとして好適に使用できると考えられる。このようなエピトープペプチドとしては、例えば以下のものが報告されている。【００１２】
特許文献２は、ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＣＴＬエピトープ・ペプチドとしてＳＡＲＴ−２腫瘍抗原蛋白質に対する９個のアミノ酸配列からなる５種のエピトープ・ペプチドを開示している。【００１３】
また特許文献３は、肺腺癌患者から得られたＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＣＴＬエピトープ・ペプチドとしてＡＲＴ−４腫瘍抗原蛋白質に対する８〜１１個のアミノ酸配列からなる６種のエピトープ・ペプチドを開示している。【００１４】
また特許文献４は、食道癌患者から樹立した細胞株から得られたＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＣＴＬエピトープ・ペプチドとして、大腸癌細胞と小細胞性肺癌細胞において異常に発現しているｐ５６luk蛋白質（ｌｕｋ遺伝子がコードする腫瘍抗原蛋白質）の８〜１１個のアミノ酸配列からなる７種のエピトープ・ペプチドを開示している。【００１５】
また特許文献５は、食道癌患者から樹立した細胞株から得られたＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＣＴＬエピトープ・ペプチドとして、ＫＥ４腫瘍細胞株由来のｃＤＮＡライブラリーから得られたＰＩ−９由来ペプチドの９〜１０個のアミノ酸配列からなる４種のペプチドを開示している。【００１６】
また特許文献６は、肺癌患者から樹立した細胞株から得られたＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＣＴＬエピトープ・ペプチドとして、１１−１８肺腺癌細胞株のｃＤＮＡライブラリーから得られたＰＩ−９由来ペプチドの９〜１０個のアミノ酸配列からなる１７種のエピトープ・ペプチドを開示している。【００１７】
また特許文献７は、ＨＬＡ−Ａ２４．１（ＨＬＡ−Ａ２４０２）結合性モチーフを有するエピトープ・ペプチドであって、Ｎ末端部分にＹ、Ｆ、Ｗの第１保存残基を有し、Ｃ末端部分にＦ、Ｉ、Ｗ、Ｍの第２保存残基を有し、第１保存残基と第２保存残基とが６〜７残基隔てられている、９〜１０アミノ酸残基からなるペプチドを開示している。【００１８】
このように、腫瘍関連抗原の種々のＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＣＴＬエピトープが同定されているが、腫瘍抗原の発現は、組織学的な起源間、癌患者間及び個々の病変間で異なるため、さらに新しいエピトープを特定することが求められている。【００１９】
また、ＨＬＡ−Ａ２４０２分子に結合できるＥｐ−ＣＡＭのエピトープ・ペプチドによるＣＴＬ誘導は未だ確認されていないことから、ＨＬＡ−Ａ２４０２分子に結合できる癌細胞に特異的なＥｐ−ＣＡＭエピトープ・ペプチドであってＣＴＬ誘導できるものを新たに開発することが望まれている。
【特許文献１】WO97/15597号国際公報
【特許文献２】特開平11-318455号
【特許文献３】特開2000-116383号
【特許文献４】ＷＯ2000-06595号
【特許文献５】特開2001-245675号
【特許文献６】特開2003-270号
【特許文献７】特表平8-500103号(請求項１１など）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導できるＥｐ−ＣＡＭエピトープ・ペプチド、抗原提示細胞及び主要組織適合抗原複合体、それらを有効成分とする癌ワクチン又は細胞傷害性Ｔリンパ球誘導剤、Ｅｐ−ＣＡＭ特異的なＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球、それを有効成分とする受動免疫療法剤、これらを用いた癌の治療又は改善方法、並びに、上皮性癌に特異的なＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球の定量方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記課題を達成するために本発明者らは、日本人において最も多いＨＬＡ−Ａの型であり(60%以上)、かつヨーロッパ人の約20％にも存在するＨＬＡ−Ａ２４０２分子に結合することができるエピトープ・ペプチド配列を見つけるため、先ずバイオインフォマティク・アプローチによりＥｐ−ＣＡＭ中の７個のペプチド配列を推測し、これらを合成した。【００２２】
バイオインフォマティク・アプローチにより特定ＨＬＡ分子に結合し得るペプチドを予測した場合に、この予測されたペプチドが誘導する細胞傷害性Ｔリンパ球が、実際には、そのペプチドを含む抗原を認識しない場合も多い。【００２３】
このような状況の下で、本発明者は、推測された７個のペプチドのうちの２個のエピトープ・ペプチドに特異的なＣＴＬクローンが、実際にＨＬＡ−Ａ２４０２陽性Ｅｐ−ＣＡＭ発現癌細胞に対して細胞傷害性を示すが、ＨＬＡ−Ａ２４０２陰性癌細胞に対しては細胞傷害性を示さないことを見出した。【００２４】
また、コールドターゲットインヒビションアッセイによれば、これらのエピトープ・ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４０２陽性Ｅｐ−ＣＡＭ陽性癌細胞の表面上において処理され、抗原提示された。【００２５】
これらの結果、この２個のエピトープ・ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４０２を保有する人に対する癌ワクチンとして使用できる。【００２６】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下のエピトープ・ペプチドなどを提供する。
項１．  以下の(1)、(2)、(3)又は(4)のペプチド。
(1)  配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
(2)  配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
(3)  配列番号１において１又は２以上のアミノ酸が付加、欠失又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４０２分子と複合してＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球に認識され得る又はこれを誘導し得る変異体ペプチド
(4)  配列番号２において１又は２以上のアミノ酸が付加、欠失又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４０２分子と複合してＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球に認識され得る又はこれを誘導し得る変異体ペプチド
項２．  以下の(1)又は(2)のペプチド。
(1)  配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
(2)  配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
項３．  項１又は２に記載のペプチドを有効成分として含む癌ワクチン。
項４．  癌が上皮性癌である項３に記載の癌ワクチン。
項５．癌が大腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、口腔癌、膵癌、食道癌、上咽頭癌、子宮癌、前立腺癌、胆嚢癌からなる群より選ばれる癌である項３又は４に記載の癌ワクチン。
項６．  白血球抗原としてＨＬＡ−Ａ２４０２を有するヒトのための項３、４又は５に記載の癌ワクチン。
項７．  項１又は２に記載のペプチドを有効成分として含む細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導剤。
項８．  白血球抗原としてＨＬＡ−Ａ２４０２を有するヒトのための項７に記載の細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導剤。
項９．  以下の(5)、(6)、(7)又は(8)のポリヌクレオチド。
(5)  配列番号１０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(6)  配列番号１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(7)  配列番号１０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＨＬＡ−Ａ２４０２分子と複合してＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球に認識され得る又はこれを誘導し得るペプチドをコードする変異体ポリヌクレオチド
(8)  配列番号１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＨＬＡ−Ａ２４０２分子と複合してＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球に認識され得る又はこれを誘導し得るペプチドをコードする変異体ポリヌクレオチド
項１0．  項９に記載のポリヌクレオチドを有効成分として含む上皮性癌の遺伝子治療剤。
項１１．  項９に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
項１２．  項１１に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
項１３．  項１２に記載の形質転換体を培養する工程と、培養物から項１又は２に記載のペプチドを回収する工程とを含む項１又は２に記載のペプチドの製造方法。
項１４．  項１又は２に記載のペプチドがパルスされた抗原提示細胞。
項１５．  項１４に記載の抗原提示細胞を有効成分として含む癌ワクチン。
項１６．  癌が上皮性癌である項１５に記載の癌ワクチン。
項１７．癌が大腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、口腔癌、膵癌、食道癌、上咽頭癌、子宮癌、前立腺癌、胆嚢癌からなる群より選ばれる癌である項１５又は１６に記載の癌ワクチン。
項１８．  白血球抗原としてＨＬＡ−Ａ２４０２を有するヒトのための項１５、１６又は１７に記載の癌ワクチン。
項１９．  項１４に記載の抗原提示細胞を有効成分として含む細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導剤。
項２０．  白血球抗原としてＨＬＡ−Ａ２４０２を有するヒトの治療のための項１９に記載の細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導剤。
項２１．  項１又は２に記載のペプチド又は項１４に記載の抗原提示細胞上に提示された腫瘍抗原エピトープ・ペプチドと、主要組織適合抗原とが複合した主要組織適合抗原複合体。
項２２．  項１又は２に記載のペプチド又は項１４に記載の抗原提示細胞上に提示された腫瘍抗原エピトープ・ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４０２分子と、β２ミクログロブリンとの複合体である項２１に記載の主要組織適合抗原複合体。
項２３．  項２１又は２２に記載の主要組織適合抗原複合体を有効成分として含む癌ワクチン。
項２４．  癌が上皮性癌である項２３に記載の癌ワクチン。
項２５．癌が大腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、口腔癌、膵癌、食道癌、上咽頭癌、子宮癌、前立腺癌、胆嚢癌からなる群より選ばれる癌である項２３又は２４に記載の癌ワクチン。
項２６．  白血球抗原としてＨＬＡ−Ａ２４０２を有するヒトの治療のための項２３、２４又は２５に記載の癌ワクチン。
項２７．  項２１又は２２に記載の主要組織適合抗原複合体を有効成分として含む細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導剤。
項２８．  白血球抗原としてＨＬＡ−Ａ２４０２を有するヒトの治療のための項２７に記載の細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導剤。
項２９．  項１又は２に記載のペプチド又は項１４に記載の抗原提示細胞上に提示された腫瘍抗原エピトープ・ペプチドと、主要組織適合抗原とが複合した主要組織適合抗原複合体のテトラマー。
項３０．  以下の(a)〜(d)のいずれか１以上を用いて末梢血リンパ球を刺激することにより得られる細胞傷害性Ｔリンパ球。
(a)  項１又は２に記載のペプチド
(b)  項１４に記載の抗原提示細胞
(c)  項２１又は２２に記載の主要組織適合抗原複合体
(d)  項２９に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマー
項３１．  前記(a)〜(d)のいずれか１以上を用いて末梢血リンパ球を刺激することにより主要組織適合抗原複合体又は／及びそのテトラマーと細胞傷害性Ｔリンパ球との結合体を形成し、この結合体から単離することにより得られるものである項３０に記載の細胞傷害性Ｔリンパ球。
項３２．  項３０又は３１に記載の細胞傷害性Ｔリンパ球を有効成分として含む癌の受動免疫療法剤。
項３３．  癌が上皮性癌である項３２に記載の受動免疫療法剤。
項３４．癌が大腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、口腔癌、膵癌、食道癌、上咽頭癌、子宮癌、前立腺癌、胆嚢癌からなる群より選ばれる癌である項３２又は３３に記載の受動免疫療法剤。
項３５  白血球抗原としてＨＬＡ−Ａ２４０２を有するヒトのための項３２、３３又は３４に記載の受動免疫療法剤。
項３６．  末梢血に以下の(a)〜(d)のいずれかを作用させる工程と、
(a)  項１又は２に記載のペプチド
(b)  項１４に記載の抗原提示細胞
(c)  項２１又は２２に記載の主要組織適合抗原複合体
(d)  項２９に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマー
末梢血中の細胞傷害性Ｔ細胞又はそれが産生するサイトカインを定量する工程と
を含む末梢血中のＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球の定量方法。
項３７．  白血球抗原としてＨＬＡ−Ａ２４０２を有するヒトに、以下の(a)〜(d)のいずれか１以上を投与する癌の治療又は改善方法。
(a)  項１又は２に記載のペプチド
(b)  項１４に記載の抗原提示細胞
(c)  項２１又は２２に記載の主要組織適合抗原複合体
(d)  項２９に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマー
項３８．  白血球抗原としてＨＬＡ−Ａ２４０２を有するヒトの末梢血から単核細胞画分を採取する工程と、
単核細胞画分を以下の(a)〜(d)のいずれか１以上と共に培養する工程と、
(a)  項１又は２に記載のペプチド
(b)  項１４に記載の抗原提示細胞
(c)  項２１又は２２に記載の主要組織適合抗原複合体
(d)  項２９に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマー
細胞傷害性Ｔリンパ球が誘導及び／又は活性化された単核細胞画分を患者の血液中に戻す工程と
を含む癌の治療又は改善方法。
項３９．  白血球抗原としてＨＬＡ−Ａ２４０２を有するヒトに、以下の(a)〜(d)のいずれか１以上を投与する細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導方法。
(a)  項１又は２に記載のペプチド
(b)  項１４に記載の抗原提示細胞
(c)  項２１又は２２に記載の主要組織適合抗原複合体
(d)  項２９に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマー
項４０．  白血球抗原としてＨＬＡ−Ａ２４０２を有するヒトに、項３０又は３１に記載の細胞傷害性Ｔリンパ球を投与する癌の治療又は改善方法。
項４１．  項１又は２に記載のペプチド又は項１４に記載の抗原提示細胞上に提示された腫瘍抗原エピトープ・ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４０２分子と、β２ミクログロブリンとの複合体のテトラマーである項２１に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマー。
項４２．  項４１に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマーを有効成分として含む癌ワクチン。
項４３． 癌が上皮性癌である項４２に記載の癌ワクチン。
項４４．癌が大腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、口腔癌、膵癌、食道癌、上咽頭癌、子宮癌、前立腺癌、胆嚢癌からなる群より選ばれる癌である項４２又は４３に記載の癌ワクチン。
項４５．  白血球抗原としてＨＬＡ−Ａ２４０２を有するヒトの治療のための項４２、４３又は４４に記載の癌ワクチン。
項４６．  項４１に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマーを有効成分として含む細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導剤。
項４７．  白血球抗原としてＨＬＡ−Ａ２４０２を有するヒトの治療のための項４６に記載の細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導剤。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、上皮性癌細胞に広く発現しているＥｐ−ＣＡＭ分子のエピトープ・ペプチドであって、日本人の白血球抗原の型として多く見られるＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性の細胞傷害性Ｔリンパ球に認識され得るものが提供された。従って、このエピトープ・ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４０２を有する広範囲のヒトの上皮性癌に対する癌ワクチンとして使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、エリスポット・アッセイによるポリクローナル・ペプチド活性化ＣＴＬ細胞株の評価の結果を示す図である。
【図２】図２は、Ｅｐ−ＣＡＭペプチド特異的ポリクローナル（Ａ）及びクローナル（Ｂ）ＣＴＬのテトラマー染色の結果を示す図である。
【図３】図３は、Ｅｐ173特異的ＣＴＬクローンの特性結果を示す図である。
【００２９】
図Ａは、ペプチドＥｐ173及びコントロール・ペプチドＥＢＶ−ＬＭＰ419のＴ２−Ａ２４細胞に対するＣ２７、Ｅｐ173特異的ＣＴＬクローンの細胞傷害性の結果を示す５１Ｃｒ遊離アッセイの図面である。【００３０】
図Ｂは、ＨＬＡ−Ａ２４０２陽性細胞株、ＰＣ９に対するＥｐ173特異的ＣＴＬクローン、Ｃ２７の細胞傷害性に関する抗ＨＬＡ−Ａ２４モノクローナル抗体の抑制効果を示す図面である。【００３１】
図Ｃは、コールドターゲットインヒビションアッセイにおけるＥｐ173によるＣ２７の細胞傷害性を示す図面である。
【図４】図４は、Ｅｐ−ＣＡＭのＰＣＲ分析の結果を示す図面である。
【図５】図５は、各種癌細胞株に対するＣ２７、Ｅｐ173特異的ＣＴＬクローンの細胞傷害性を示す図面である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）エピトープ・ペプチド
構成
本発明のペプチドは、上皮性細胞由来の癌に広く発現しているＥｐ−ＣＡＭタンパク質のアミノ酸配列について、ＨＬＡ−Ａ２４０２の結合モチーフを有する９〜１０個のアミノ酸からなるエピトープ・ペプチドを検索し得る照合媒体であるワールド・ワイド・ウェブサイト・バイオインフォマティクス&分子分析セクション（BioInformatics & Molecular Analysis Section (BIMAS)のHLA Peptide Binding Predictions （http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html.）によって照合し、エピトープ・ペプチド となり得るペプチドをスクリーニングした結果、細胞傷害性Ｔリンパ球（以下、「ＣＴＬ」と略称する）エピトープ・ペプチドとして確認されたものである。【００３３】
即ち、本発明のペプチドは、以下の(1)、(2)、(3)又は(4)のペプチドである。
(1)  配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
(2)  配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
(3)  配列番号１において１又は２以上のアミノ酸が付加、欠失又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４０２分子と複合してＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球に認識され又はこれを誘導し得る変異体ペプチド
(4)  配列番号２において１又は２以上のアミノ酸が付加、欠失又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４０２分子と複合してＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球に認識され又はこれを誘導し得る変異体ペプチド
本発明において、ペプチドとは、隣接するアミノ酸残基のα−アミノ基とカルボキシル基との間がペプチド結合により相互に結合したアミノ酸分子鎖であって生理活性を有するものを意味する。【００３４】
またペプチドには、当該ペプチドの他にその生理活性を損なわない範囲で、その塩又は誘導体が含まれる。誘導体としては、グリコシル化、アミド化、ホスホリル化、カルボキシル化、リン酸化、ホルミル化、アシル化などされたものが挙げられる。また、塩としては酸付加塩が好ましい。酸付加塩としては、塩酸、リン酸、硫酸等の無機酸との塩、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酒席酸等の有機酸との塩が挙げられる。【００３５】
(1)〜(4)の各ペプチドは、上皮性細胞由来の癌細胞に広く発現しているＥｐ−ＣＡＭのエピトープ・ペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＣＴＬにより認識され若しくはこれを誘導し、又はさらにＣＴＬを活性化できるものである。従って、ＣＴＬを誘導又は活性化する腫瘍抗原、すなわち癌ワクチンとして、ＨＬＡ−Ａ２４０２を有するヒトの癌の治療又は改善に好適に使用できる。またこれらのペプチドは、腫瘍抗原エピトープを特定した各種ペプチドの作製のために使用できる。本発明のペプチドの用途については、後に詳述する。【００３６】
(3)及び(4)の変異体ペプチドのアミノ酸数の下限は、通常５個程度、好ましくは７個程度である。またアミノ酸数の上限は、ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＣＴＬに認識される限り特に限定されないが、通常１２個程度である。中でも、アミノ酸数９〜１１個程度の変異体ペプチドが好ましい。【００３７】
これらの変異体ペプチドは、例えば、上記のHLA Peptide Binding Predictionに照合することによりＨＬＡ−Ａ２４０２結合モチーフに適合するものを設計し、その中から、実際にＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＣＴＬに認識され又はこれを誘導するものを選択することにより得ることができる。【００３８】
HLA−A２４０２陽性Ｅｐ−ＣＡＭエピトープ・ペプチドであるか否かは、例えば以下の方法で判定できる。 【００３９】
１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に２ｘ１０6／ｍｌの細胞濃度でＨＬＡ−Ａ２４０２陽性の成人から分離したリンパ球を浮遊し、これにエピトープ候補ペプチドの中の任意の１種を１μｇ／ｍｌの濃度で加える。これを炭酸ガス恒温槽にて３７℃で７日間培養する。７日目にＩＬ−２を添加する。候補ペプチドによる刺激とＩＬ−２による刺激とからなるサイクルを以後週に1回繰り返すことにより、特異的なＣＴＬを誘導する。【００４０】
このようにして誘導した上皮性癌特異的なＣＴＬをエピトープ候補ペプチドが刺激するか否かをエリスポットアッセイ（Kuzushima K他著、The Journal of Clinical Investigation, 104巻:163-171頁,1999年等）により判定する。【００４１】
上記候補ペプチドは、Ｅｐ−ＣＡＭタンパク質全体を網羅する２０個前後のアミノ酸よりなるペプチドライブラリーを合成し、合成したペプチドに対して上記エリスポットアッセイを行い、ＣＴＬが反応したペプチドについて順次短くし、最終的に９〜１０個程度のアミノ酸からなるペプチドを本発明のエピトープ・ペプチドとすればよい。【００４２】
またアミノ酸の置換の場合には、タンパク質の構造保持の観点から、電荷、可溶性、親水性／疎水性、極性等の点で、置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することにより、同等の活性を有する変異体ペプチドを得易い。【００４３】
欠失、付加（挿入を含む）又は置換の変異を導入する手法は周知であり、例えばウルマーの技術（Science,219,666(1983))を利用できる。【００４４】
本発明のペプチドは、糖類、ポリエチレングリコール、脂質等が付加された複合体、放射性同位元素等による誘導体又は重合体等の形態として用いることができる。
（ＩＩ）ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、上記本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、具体的には、以下の(5)、(6)、(7)又は(8)のポリヌクレオチドである。
(5)  配列番号１０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(6)  配列番号１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(7)  配列番号１０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＨＬＡ−Ａ２４０２分子と複合してＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球に認識され得る又はこれを誘導できるペプチドをコードする変異体ポリヌクレオチド
(8)  配列番号１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＨＬＡ−Ａ２４０２分子と複合してＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球に認識され得る又はこれを誘導できるペプチドをコードする変異体ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドには、特に言及しない限り、DNA及びRNAの双方が含まれる。DNAには、cDNA、ゲノムDNA及び合成DNAが含まれる。RNAには、mRNA、rRNA及び合成RNAが含まれる。また、その塩基配列を有するポリヌクレオチドの他、それに相補的なポリヌクレオチド及び２本鎖ポリヌクレオチドも含まれる。【００４５】
配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの一つである配列番号１０の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び、配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの一つである配列番号１１の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ヒト癌関連抗原ＧＡ７３３−２(Szala, S., et. al.,    Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (9), 3542-3546 (1990))により得られたＥｐ−ＣＡＭ遺伝子の部分配列である。【００４６】
(7)又は(8)の変異体ポリヌクレオチドは、本発明のエピトープ・ペプチドをコードする領域に対応して、通常１５個以上、好ましくは２１個以上、通常４５個以下のヌクレオチドからなるものであればよい。中でも、ヌクレオチド数２７〜３３個程度のポリヌクレオチドであることが好ましい。【００４７】
ポリヌクレオチド分子としてＤＮＡ分子を代表例にとると、「ＤＮＡ分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ分子」は、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, ら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年)等に記載の方法によって得ることができる。本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリタイズする」条件としては、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃で加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃で洗浄した場合に、陽性のハイブリタイズのシグナルが観察される条件が挙げられる。【００４８】
(7)又は(8)の変異体ポリヌクレオチドについては、例えば公知の蛋白質発現系を利用してＨＬＡ−Ａ２４０２を有する細胞で発現させたペプチドについて、後述するようにしてＣＴＬにより認識され得ること又はＣＴＬ誘導能を有することを確認することにより選択すればよい。【００４９】
また変異体ポリヌクレオチドは、その３′末端にポリ（Ａ）構造を有しているが、ポリ（Ａ）の数は腫瘍抗原として作用するアミノ酸のコード部位に影響するものではなく、該ポリヌクレオチドの有するポリ（Ａ）の数は特に限定されるものではない。【００５０】
本発明のポリヌクレオチドは、組み換え技術を利用して本発明のエピトープ・ペプチドを製造する際に有用な遺伝子情報を提供するものである。また核酸試薬又は標準品としても利用できる。
（ＩＩＩ）組み換えベクター
本発明の組み換えベクターは、本発明のポリヌクレオチドを適当なベクターＤＮＡに組み込むことにより得られる組み換えベクターである。【００５１】
ベクターＤＮＡは、宿主の種類及び使用目的により適宜選択すればよい。ベクターＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡであってもよく、天然ＤＮＡから増殖に必要な部分以外のＤＮＡ部分が一部欠落しているものでもよい。ベクターＤＮＡとしては、例えば、染色体、エピソーム又はウイルス等に由来するベクターが挙げられる。具体的には、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウィルス（例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等）等に由来するベクター及びそれらを組み合わせたベクター、プラスミド及びバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター（例えばコスミドおよびファージミド等）が挙げられる。【００５２】
また、本発明のペプチドの生合成のためには、発現ベクター又はクローニングベクター等を用いればよい。【００５３】
組換えベクターは、目的の遺伝子配列と複製及び制御に関する情報を担う遺伝子配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等を構成要素としており、これらを公知の方法により組み合わせることにより作製される。【００５４】
本発明のポリヌクレオチドは、公知の方法によりベクターＤＮＡに挿入すればよい。例えば、適当な制限酵素を用いてＤＮＡ及びベクターＤＮＡを特定部位で切断し、混合してリガーゼにより再結合することができる。また、本発明のポリヌクレオチドに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターＤＮＡのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても組換えベクターを得ることができる。
（ＩＶ）形質転換体
上記ポリヌクレオチドが組み込まれた組み換えベクターを、公知の宿主、例えば大腸菌（例えばK12）、バチルス属細菌（例えばMI114）のような細菌、酵母（例えばAH22）、昆虫細胞（例えばSf細胞）又は動物細胞（例えばCOS-7細胞、Vero細胞、CHO細胞等）等に公知の方法で導入することにより本発明の形質転換体が得られる。【００５５】
遺伝子導入方法としては、遺伝子の安定性を考慮すれば、染色体内へのインテグレート法が好ましく挙げられる。簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を用いることができる。ベクターＤＮＡの宿主細胞への導入は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook,ら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、 １９８９)等に記載されている標準的な方法により行うことができる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（Scrape loading）、バリスティック導入（ballistic introduction）及び感染等を例示できる。
（Ｖ）エピトープ・ペプチドの製造方法
本発明のペプチドは公知のペプチド合成法、例えば固相ペプチド合成等により合成することができる。このようなペプチド合成法としては、例えば「ペプチド合成」（丸善；１９７５年発行）又はPeptide Synthesis, Interscience, New York, （1996）に記載の方法が例示される。また、例えばアプライドバイオシステムズ社のペプチド合成装置のような公知の化学合成装置を用いて製造することもできる。【００５６】
また本発明のペプチドは、上記説明した本発明の形質転換体を培養する工程と、この培養物から本発明のペプチドを回収する工程とを含む方法により製造することもできる。【００５７】
培養は、宿主に適した培地を用いて継代培養又はバッチ培養を行えばよい。培養は、形質転換体の内外に生産されたペプチド量や、形質転換体が生産する本発明のペプチドの作用の一つであるＣＴＬ誘導能を指標にして、本発明のペプチドが適当量得られるまで行えばよい。【００５８】
培養物から本発明のペプチドを回収し、さらにこれを精製することが好ましい。精製は、分子篩クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィーや、硫安又はアルコール等を用いた溶解度差に基づく分画手段等を組み合わせた公知の方法により行えばよい。精製は、このペプチドのＣＴＬによる認識又はＣＴＬの誘導、具体的には例えばＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生量を指標にして行えばよい。【００５９】
また、本発明のペプチドのアミノ酸配列に基づき製造された、このアミノ酸配列に特異的なポリクローナル抗体又はモノクロ−ナル抗体を用いて、培養物中の本発明のペプチドを特異的に吸着回収することもできる。
（ＶＩ）抗原提示細胞
本発明の抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージ又はＢリンパ球のような抗原提示細胞に本発明のペプチドをパスルすることにより得られる細胞である。本発明における抗原提示細胞は、本発明のペプチドを結合するＨＬＡを表面上に発現できる細胞であって、ＣＴＬ刺激能を有する細胞である。【００６０】
「パルス」は、それには限定されないが、例えば、これらの抗原提示細胞を、濃度１〜１０μｇ／ｍl程度の本発明のペプチドを含む培地中、温度２０〜３０℃程度で３０分間〜１時間程度インキュベートすることにより行える。これにより、抗原提示細胞表面に、ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＣＴＬにより認識され得る腫瘍抗原ペプチドが提示される。【００６１】
腫瘍抗原とは腫瘍特異的なＣＴＬに認識され、又はさらにＣＴＬを誘導し又は／及びＣＴＬを活性化し得る蛋白質、ポリペプチド又はペプチドであって腫瘍細胞が有するものを意味する。また腫瘍抗原ペプチドとは、この腫瘍抗原が腫瘍細胞内で分解されて生じるペプチドであり、ＨＬＡ分子と結合して細胞表面上に提示されることによりＣＴＬに認識され、ＣＴＬを誘導し又は／及びＣＴＬを活性化し得るペプチドを意味する。【００６２】
また腫瘍抗原が有するアミノ酸配列部分であって、腫瘍特異的なＣＴＬに認識され、又はさらにＣＴＬを誘導し又はこれを活性化し得るエピトープ配列を腫瘍抗原エピトープ（腫瘍抗原決定基）という。【００６３】
本明細書において、「認識される」とは、認識するものが、認識される対象を他のものと見分けて認知し、例えば認知した対象に結合することを意味する。本明細書において、ＣＴＬが腫瘍細胞又は腫瘍抗原エピトープ・ペプチドを認識するとは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）及び腫瘍抗原ペプチドにＣＴＬがＴ細胞受容体を介して結合することを意味する。【００６４】
また「活性化する」とは、ある活性若しくは作用を有するもの又はその状態を、さらに増強する又は作動させることを意味する。特に、「ＣＴＬが活性化する」とは、ＣＴＬがＨＬＡにより提示されたエピトープ・ペプチドを認識することにより、例えばＩＦＮ−γのようなエフェクターを産生すること、又は、ＣＴＬが認識した標的細胞に対して細胞傷害性を示すことを意味する。【００６５】
また「誘導する」とは、ある活性又は作用を殆ど有さないもの又は状態から、その活性又は作用を発生させることを意味する。特に、「抗原特異的なＣＴＬを誘導する」とは、インビトロ又はインビボにおいて、ある抗原を特異的に認識するＣＴＬを分化及び／又は増殖させることを意味する。【００６６】
本発明のエピトープ・ペプチドがパルスされた抗原提示細胞は、癌ワクチンとして使用できる。また、上皮性癌特異的なＣＴＬの製造、ヒトの末梢血中の上皮性癌特異的なＣＴＬの定量等のために使用できる。
（ＶＩＩ）主要組織適合抗原複合体
本発明の主要組織適合抗原複合体は、本発明のペプチド又は本発明のペプチドがパルスされた抗原提示細胞表面に提示された腫瘍抗原エピトープ・ペプチドと、主要組織適合抗原との複合体である。【００６７】
本発明において、主要組織適合抗原とは、Ｔリンパ球抗原受容体にＴリンパ球が認識するペプチドを提示する分子であって、ＣＴＬによってエピトープ・ペプチドと共に認識されるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）をいう。【００６８】
また本発明の主要組織適合抗原複合体（以下、「ＭＨＣ」と略する）は、詳しくは、エピトープ・ペプチドとともにＣＴＬによって認識される、標的細胞表面に発現しているＭＨＣクラスＩ分子であるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と、ＣＴＬに認識され又はＣＴＬを誘導できるエピトープ・ペプチドとが結合した複合体である。この複合体には、β２ミクログロブリンが結合しているものも含まれる。【００６９】
Ｅｐ−ＣＡＭに特異的なＣＴＬエピトープ・ペプチドとは、Ｅｐ−ＣＡＭタンパク質中の特定部位を占めるペプチドであって、ＣＴＬに認識されて、ＣＴＬの抗原受容体と免疫的に結合する抗原決定基を指す。さらにＣＴＬエピトープ・ペプチドは、Ｅｐ−ＣＡＭ分子を発現する細胞を直接に傷害することにより癌細胞を排除することができる。【００７０】
本発明のＭＨＣは、特に、標的細胞上に発現しているＨＬＡ−Ａ２４０２分子と、ＣＴＬに認識され得るＥｐ−ＣＡＭタンパク質中の特定のエピトープ・ペプチドとが結合した複合体、又はさらにβ２ミクログロブリンが結合した複合体を指す。【００７１】
また、本発明において、ＨＬＡ−Ａ２４０２とは、ヒト白血球抗原のうち、クラスI抗原のサブ・クラスであるＡ２４多型をいい、ＨＬＡ−Ａ２４０２分子とは、ＨＬＡ−Ａ２４０２の遺伝子の抗原提示細胞表面における発現産物をいう。【００７２】
ＨＬＡ−Ａ２４０２分子としては、ＨＬＡ−Ａ２４０２発現用の大腸菌の培養物から精製されたＨＬＡ−Ａ２４０２分子、標的細胞に遺伝子導入することにより強制的に発現させたＨＬＡ−Ａ２４０２分子、標的細胞上に自然に発現しているＨＬＡ−Ａ２４０２分子等のいずれを用いてもよい。また、本発明のＨＬＡ−Ａ２４０２分子には、ＨＬＡ−Ａ２４０２分子の断片やＨＬＡ−Ａ２４０２分子の重鎖も含まれる。【００７３】
本発明のＭＨＣは、その構成要素によって種々の方法で作製できるが、例えば本発明のペプチド、ＨＬＡ−Ａ２４０２分子及びβ２ミクログロブリンを、トリス等のバッファー中に懸濁し、温度４〜１０℃程度で２４〜７２時間程度インキュベートすることにより形成することができる。【００７４】
ＭＨＣは、テトラマーであってもよい。ＭＨＣテトラマーは、ＣＴＬが認識し得るＥｐ−ＣＡＭエピトープ・ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４０２分子（通常はβ２ミクログロブリンが結合したＨＬＡ−Ａ２４０２分子）との複合体が４個会合したものである。【００７５】
ＭＨＣテトラマーは、ＭＨＣをビオチン化し、ストレピプトアビジンとビオチン化複合体とを１：４で混合することにより得られる。また、ＨＬＡ分子のＣ末端に予めビオチン結合部位を付加しておき、ＭＨＣの形成後に、この部位にビオチンを結合させ、さらに、ストレプトアビジンとビオチン化ＭＨＣを１：４で混合することによっても得られる。【００７６】
具体的には、例えば以下のようにしてＭＨＣテトラマーを調製することができる。ＭＨＣを調製するに当たっては、ＭＨＣの調製大腸菌による組換蛋白発現系を用いてＨＬＡ−Ａ２４０２重鎖およびβ２ミクログロブリンを大量に作成、精製する。なお、ＨＬＡ−Ａ２４０２重鎖Ｃ末端には、ビオチンリガーゼが認識するアミノ酸配列を予め付加しておく。精製ＨＬＡ−Ａ２４０２重鎖およびβ２ミクログロブリンをそれぞれ8M尿素に溶解する。200ml のリフォールフィングバッファー (pH8.0 ; 100mM Tris-HCl, 400 mM L-アルギニン-HCl, 2 mM EDTA, 0.5 mM oxidative glutathione, 5 mM reduced glutathione)内に、配列番号１で示されるアミノ酸配列（ＲＹＱＬＤＰＫＦＩ）を有する本発明ペプチド12mg、ＨＬＡ−Ａ２４０２重鎖18.6mg、β２ミクログロブリン13.2mgのそれぞれを27ゲージ針の付いた注射器を用いて加える。 10℃の恒温槽において48〜72時間撹拌し、ＭＨＣの形成を促した後、ＭＨＣを含むリフォールフィングバッファーを1.8Lの蒸留水に対して24時間、4℃の恒温槽において透析し、透析後のリフォールフィングバッファーをセントリプレップ10（MILLIPORE, Bedford, MA）を用いて2mlに濃縮する。 Superdex 200 HR (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーにて分子量45KDあたりに流出するＭＨＣを単離する。かくして所望のＭＨＣテトラマーが製造できる。【００７７】
次いで、ビオチン化ＭＨＣを調製するに当たっては、ビオチンリガーゼ（AVIDITY, Denver, CO）を用いて、ＨＬＡ−Ａ２４０２重鎖C末端の特異的部位にビオチンを結合させる。 Superdex 200 HR カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーにてビオチンを付加したＭＨＣを精製する。【００７８】
さらに、ＰＥ標識ストレプトアビジン (Molecular Probe, Eugene, OR)と精製ビオチン化ＭＨＣをモル比１：４で混合し、 Superdex 200 HR カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーにて分子量480KDあたりに流出する配列番号１で示されるアミノ酸配列（ＲＹＱＬＤＰＫＦＩ）を含むＭＨＣテトラマーを単離する。セントリコン10（MILLIPORE）を用いて約3mg／mlに濃縮し、4℃に保存する。保存剤としては、ナトリウムアジド、ＥＤＴＡ、 ロイペプチン、ペプスタチンを添加すればよい。【００７９】
上記の製造各工程では、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの公知の方法で、使用するタンパク質又はペプチドを精製することが望ましい。【００８０】
本発明のＭＨＣは、癌ワクチンとして使用できる。また上皮性癌特異的なＣＴＬの製造、ヒトの末梢血中の上皮性癌特異的なＣＴＬの定量等のために使用できる。
（ＶＩＩＩ）癌ワクチン・ＣＴＬ誘導剤・遺伝子治療剤
癌ワクチン・ＣＴＬ誘導剤
本発明のペプチドは、能動免疫ワクチン療法に使用する癌ワクチンの有効成分として好適に使用できる。この癌ワクチンは、ＨＬＡ−Ａ２４０２を有するヒトのために使用できる。【００８１】
即ち、白血球抗原としてＨＬＡ−Ａ２４０２を有する癌患者に本発明のペプチドを投与することにより、Ｅｐ−ＣＡＭを特異的に認識するＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＣＴＬを誘導又は活性化することができ、これにより上皮性癌などを治療又は改善することができる。【００８２】
癌患者のＣＴＬは複数の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であるため、１種類のエピトープ・ペプチドを癌ワクチンとして使用するより多種類のエピトープ・ペプチドを組み合わせて癌ワクチンとして使用する方が、より高い効果が得られる場合がある。従って、本発明のペプチドは、１種を単独で又は多種類（複数種類）を組み合わせて使用できる。【００８３】
本発明のペプチドを含むＥｐ−ＣＡＭのｍＲＮＡは、肺癌細胞株（ＱＧ５６、ＬＵ９９、ＬＣ９９Ａ、ＬＣ１−ｓｑ、ＬＣ６５Ａ、及びＰＣ−９）、大腸癌細胞株、胃癌細胞株（ＭＫＮ２８、ＭＫＮ４５）、口腔癌細胞株（ＨＳＣ−２）、乳癌細胞株及び白血病細胞株（Ｋ５６２）等で発現している。また、肺癌、大腸癌、胃癌、乳癌及び口腔癌の各患者由来の種々組織においてもＥｐ−ＣＡＭの発現が認められた。従って、本発明のペプチドはこれらの癌の治療又は改善に有用である。【００８４】
本発明のペプチドは単独で又は各種担体とともに製剤にすることができる。剤形は、経口投与剤又は非経口投与剤のいずれであってもよい。一般的には非経口投与剤が好ましい。非経口投与剤としては、皮下注射剤、筋肉内注射剤、静脈内注射剤、座剤などが挙げられる。【００８５】
経口投与剤とする場合は、薬学的に許容されており、かつ本発明のエピトープ・ペプチドの活性を妨げない賦形剤であるスターチ、マンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、重合アミノ酸、アルブミンなどの賦形剤とともに製剤とすればよい。【００８６】
非経口投与剤とする場合は、薬学的に許容されており、かつ本発明のエピトープ・ペプチドの活性を妨げない担体である、水、食塩、デキストロース、エタノール、グリセロール、ＤＭＳＯなどとともに製剤にすればよい。その他、必要に応じてアルブミン、湿潤剤、乳化剤などを含んでいてもよい。また、細胞性免疫の賦活化のために、エピトープ・ペプチドは適当なアジュバントとともに使用することが望ましい。
本発明のペプチドは、中性又は塩の形態で使用できる。薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸のような無機酸の塩、酢酸、酒石酸のような有機酸の塩が挙げられる。【００８７】
また、本発明のペプチドは、それ自体又はＨＬＡ−Ａ２４０２と相互作用してＣＴＬによるこのペプチドの認識を増強する化合物、又は、このペプチドを免疫学的に認識する抗体などとともに製剤とすることにより、その活性を調節することができる。【００８８】
本発明のペプチドをパルスした抗原提示細胞及び主要組織適合抗原複合体も同様にして癌ワクチンとして好適に使用できる。剤形、投与対象、適用可能な癌の種類、効果などは本発明のペプチドからなる癌ワクチンと同様である。
治療方法
本発明のペプチド、抗原提示細胞及び主要組織適合抗原複合体は、それぞれ、白血球抗原としてＨＬＡ−Ａ２４０２を有するヒトに投与することにより、Ｅｐ−ＣＡＭ特異的なＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＣＴＬの誘導又は活性化を介して、上皮性癌を治療又は改善することができる。【００８９】
本発明のペプチドの投与量は、ＣＴＬによるこのペプチドの認識の程度により変化するが、ヒト成人に対して、活性を有するエピトープ・ペプチド本体を、例えば０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／日程度、好ましくは０．１ｍｇ〜３０ｍｇ／日程度投与すればよい。投与間隔は、患者と投与目的に応じて適宜定めればよい。【００９０】
或いは、患者の末梢血より単核細胞画分を採取し、本発明に係るペプチドと共に培養し、ＣＴＬが誘導及び／又は活性化された単核細胞画分を患者の血液中に戻すことによっても、有効な癌ワクチン効果が得られる。ヒト成人に対して、１０８〜１０１０個／日程度のＣＴＬを投与できるように、培養時の単核細胞濃度、本発明のペプチドの濃度等の培養条件を定めればよい。これらの条件は、簡単な実験により容易に決定できる。さらに、培養時、インターロイキン−２等のリンパ球増殖能を有する物質を添加してもよい。【００９１】
また抗原提示細胞は、ヒト成人に対して、例えば１０６〜１０９個／日程度、好ましくは１０７〜１０８個／日程度投与すればよい。また、患者の末梢血より採取した単核細胞画分と本発明の抗原提示細胞とを共培養し、患者の血液中に戻すことによっても、有効な癌ワクチン効果が得られる。【００９２】
また主要組織適合抗原複合体は、ヒト成人に対して、例えば１〜１００ｍｇ／日程度、好ましくは５〜５０ｍｇ／日程度投与すればよい。また、患者の末梢血より採取した単核細胞画分と本発明の主要組織適合抗原複合体とを共培養し、患者の血液中に戻すことによっても、有効な癌ワクチン効果が得られる。
癌の遺伝子治療剤
また、本発明のポリヌクレオチド（相補鎖を含む）は、例えば肺癌、大腸癌、胃癌、乳癌及び口腔癌等の遺伝子治療剤として有用である。【００９３】
癌の治療に当たっては、本発明のポリヌクレオチドをベクターに担持させ、直接体内に導入してもよく、又ヒトから細胞を採取してベクターを導入した後体内に戻すこともできる。ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス等の遺伝子治療に使用できることが知られているものを制限なく使用できるが、レトロウイルスが推奨される。なお、これらウイルスは複製欠陥性である。【００９４】
また、本発明のポリヌクレオチドをリポソームに封入して送達するマイクロインジェクションなどを使用して細胞に導入することもできる。【００９５】
このように、本発明の癌の遺伝子治療剤は、本発明のポリヌクレオチド単独、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクター、本発明のポリヌクレオチドが封入されたリポソーム等のいずれの形態であってもよい。【００９６】
本発明のポリヌクレオチドの投与量は、ＣＴＬによるこのポリヌクレオチドがコードするペプチドの認識の程度により異なるが、ヒト成人では、本発明のエピトープ・ペプチドをコードするポリヌクレオチド部分の含量として、例えば０．１μｇ〜１００ｍｇ／日間程度、好ましくは１μｇ〜５０ｍｇ／日間程度とすればよい。この量を数日から数ヶ月に１回投与すればよい。
本発明のポリヌクレオチドは、例えばＩＬ−２のようなサイトカイン、又は本発明のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する物質と組み合わせて使用することができる。
（ＩＸ）細胞傷害性Ｔリンパ球
本発明の細胞傷害性Ｔリンパ球は、以下の(a)〜(d)のいずれか１以上を用いて末梢血リンパ球を刺激することにより得られるものである。
(a)本発明のペプチド
(b)本発明の抗原提示細胞
(c)本発明の主要組織適合抗原複合体
(d)本発明の主要組織適合抗原複合体のテトラマー
本発明のＣＴＬは、末梢血リンパ球を上記(a)〜(d)のいずれか１以上とともに、好ましくはヒト血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で温度３７℃程度で７〜１４日間程度培養することにより誘導される。末梢血リンパ球を主要組織適合抗原複合体(以下、「ＭＨＣ」という）又はそのテトラマーを用いて刺激する場合は、ＣＴＬは誘導されてこれらと結合する。従って、ＣＴＬをＭＨＣ又はそのテトラマーから適当な方法で分離すればよい。【００９７】
具体的には、ＣＴＬは、例えば以下の調製方法によって得ることができる。
エピトープ・ペプチド又は抗原提示細胞を用いて刺激する場合
末梢血から分離したリンパ球を、本発明のペプチド又はこのペプチドをパルスした抗原提示細胞とともに、炭酸ガス恒温槽にて３７℃程度で、７〜１０日間程度培養する。次いで、好ましくはＩＬ−２、ＰＨＡ、抗ＣＤ３抗体等を添加して７〜１４日間程度インキュベートすることによりＣＴＬを刺激及び増殖させる。【００９８】
このペプチド又は抗原提示細胞による刺激と、必要に応じてＩＬ−２等による刺激とからなるサイクルを３サイクル程度繰り返すことにより、必要な細胞数のＣＴＬを確保する。【００９９】
このようにして得られる上皮性癌に特異的なＣＴＬは、例えばヒトアルブミン含有ＰＢＳ等に懸濁させて、上皮性癌に対する受動免疫療法剤等として使用できる。受動免疫療法剤の剤形は、通常、筋肉内注射剤、皮下注射剤、静脈内注射剤などの注射剤とすればよい。
ＭＨＣ又はそのテトラマーにより刺激する場合
＜染色により分離する方法＞
リンパ球を末梢血等から分離し、例えばＰＢＳ中で適当な濃度のＭＨＣ又はＭＨＣ−テトラマーと４〜２５℃程度で、３０〜６０分間程度反応させる。反応液にＦＩＴＣ又はＰＥのような標識色素を添加することにより、ＭＨＣ又はＭＨＣ−テトラマーと結合したＣＴＬを染色する。次いで、フローサイトメーター又は顕微鏡などを用いて染色されたＣＴＬを単離する。
＜ＭＨＣを固相化することにより分離する方法＞
表面にＭＨＣ又はＭＨＣ−テトラマーを固相化した無菌プレートを用いて、フラスコ中で末梢血から分離したリンパ球と固相化ＭＨＣ又はそのテトラマーとを４〜２５℃程度で、３０〜６０分間程度反応させる。次いで、結合せずに浮遊している他の細胞を洗い流した後に、プレート上に残った上皮性癌に特異的なＣＴＬを新しい培養液に懸濁する。このようにして単離された上皮性癌に特異的なＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ−２等のＴ細胞刺激薬剤で刺激することにより、受動免疫療法剤として使用するのに必要な細胞数まで増殖させればよい。
＜磁気ビーズを用いる方法＞
前述したようにして調製したビオチン化ＭＨＣをストレプトアビジン標識磁気ビーズと結合させ、結合体（以下、「MHC-磁気ビーズ」と称する）を作製する。次いで、リンパ球を末梢血等から分離し、これに適当な濃度のＭＨＣ−磁気ビーズをリンパ球：ビーズ比が1：５〜２０程度となるように添加して反応させる。【０１００】
ＭＨＣ−磁気ビーズと結合した上皮性癌に特異的なＣＴＬの入った試験管を磁場におくと、ビーズと結合したＣＴＬは磁石側の試験管内壁に寄せられる。【０１０１】
このようにしてビーズと結合したＣＴＬを試験管内壁に付着させた状態でそれ以外の細胞を洗い流した後、試験管を磁場から外して、試験管内に残った抗原特異的ＣＴＬを新しい培養液に懸濁する。
このようにして単離された上皮性癌に特異的なＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ−２等のＴリンパ球刺激薬剤で刺激することにより、受動免疫療法剤として使用するのに必要な細胞数まで増殖させればよい。
＜癌の治療又は改善方法＞
本発明のＣＴＬは、受動免疫療法剤として、上皮性癌の患者に投与することにより、癌を治療又は改善できる。【０１０２】
投与量は、患者及び投与目的により異なるが、ヒト成人に対して、例えば１０７〜１０１１個／日程度、好ましくは１０８〜１０１０個／日程度とすればよい。この量を数日〜数ヶ月に１回の間隔で投与すればよい。
（Ｘ）ＣＴＬの定量方法
上皮性癌に特異的なＣＴＬが、癌のハイリスクの患者（癌細胞又は癌組織に由来する何らかの原因により免疫能が低下した人、合併症を有する患者、高齢者、幼小児、妊婦等）の末梢血に存在するか否かを知ることは、抗癌剤や化学療法剤の適正な使用を含む癌治療管理の上で重要である。上皮性癌に特異的なＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＣＴＬの定量は、以下の方法により行える。【０１０３】
即ち、末梢血に以下の(a)〜(d)のいずれかを作用させる工程と、末梢血中のＣＴＬ又はそれが産生するサイトカインを定量する工程とを含む方法である。
(a)本発明のペプチド
(b)本発明の抗原提示細胞
(c)本発明のＭＨＣ
(d)本発明のＭＨＣのテトラマー
得られた値を、濃度既知のＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＣＴＬ溶液を用いて同様にして求めた定量値と比較することにより、被験抹消血中のＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＣＴＬ濃度を算出すればよい。【０１０４】
上記(a)〜(d)のいずれかにより誘導されたＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＣＴＬ又はそれが産生するサイトカインの定量方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
エピトープ・ペプチドを用いる場合
末梢血から分離されたリンパ球を本発明のペプチドで刺激し、それにより誘導されるＣＴＬ数又はそれが産生するインターフェロン−γ（IFN-γ）、インターロイキン等のサイトカイン（ケモカインを含む）量を定量すればよい。以下にＩＦＮ−γを例にとり具体的に方法を示す。
＜細胞内ＩＦＮ−γ産生細胞の定量＞
末梢血から分離したリンパ球を１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に２ｘ１０6／ｍｌの細胞濃度で浮遊させ、本発明のＣＴＬエピトープ・ペプチドを１μｇ／ｍｌの濃度で加える。さらに細胞内蛋白輸送阻止剤であるBrefeldin A等を加え、炭酸ガス恒温槽にて３７℃で５〜６時間培養する。培養後、細胞を固定、膜透過処理を行い、色素標識抗ＩＦＮ−γ抗体と反応させる。フローサイトメーター等を用いて、ＣＤ８陽性リンパ球中のＩＦＮ−γ陽性細胞を定量する。
＜ＣＤ８陽性細胞の定量＞
上記の細胞内ＩＦＮ−γ産生細胞の定量方法において、色素標識抗ＩＦＮ−γ抗体に代えて抗ＣＤ８抗体を用いることにより、標識されたＣＤ８陽性細胞を定量できる。
＜サイトカインの定量（エリスポットアッセイ）＞
96穴MultiScreen-HAプレート(Mi11ipore)を抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体で一 晩、４℃でコーティングし各ウェルをPBSで洗浄した後、末梢血から分離したリンパ球を各ウェルにまく。エピトープ・ペプチドを各ウェルに入れ３７℃の５%ＣＯ2培養器にて２０時間培養する。翌日、０．０５％ツィーン−２０添加ＰＢＳでプレートを洗浄した後、抗ＩＦＮ−γウサギ血清、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ血清の順で各々９０分ずつ室温で反応させる。さらに３−アミノ９−エチルカルバゾール(3-amino-9-ethylcarbasole ：Sigma社)と０．０１５％の過酸化水素水を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)を各ウェルに入れ、室温で４０分反応させる。ＩＦＮ−γスポットを可視化し、実体顕微鏡でカウントする。
＜培養上清中に分泌されたサイトカインを定量する方法＞
末梢血から分離したリンパ球を１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に２ｘ１０6／ｍｌの細胞濃度で浮遊させ、本発明のＣＴＬエピトープ・ペプチドを１μｇ／mlの濃度で加える。炭酸ガス恒温槽にて３７℃で、２４−４８時間培養する。培養後、上清を回収し、その中に含まれるＩＦＮ−γ濃度を市販のＥＬＩＳＡキット（例えばENDOGEN社のHUMAN IFN gamma ELISA）を使用して定量する。
ＭＨＣテトラマーを用いる場合
末梢血などからリンパ球を分離し、濃度１〜１００μｇ／ｍｌ程度のＭＨＣテトラマー（ストレプトアビジンを蛍光標識したもの）と３７℃で１５分間反応させる。反応液にＭＨＣと結合したＣＴＬに結合する抗体であって別の蛍光で標識したものを添加することにより、ＭＨＣと結合したＣＴＬを染色する。染色したＣＴＬをフローサイトメーター又は顕微鏡等を用いてカウントすればよい。
実施例
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０１０５】
１）ドナー及び細胞株
愛知県がんセンターの倫理委員会によって許可された研究計画と目的は、全ドナーに充分説明された。試験用末梢血のサンプルをインフォームド・コンセントの後に５名のＨＬＡ−Ａ２４０２陽性健康ドナーから得た。即ち、前記各ドナーから採取した末梢血から、遠心分離により形成したフィコール密度勾配法により、末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。【０１０６】
ヒト肺癌細胞株である大細胞癌ＬＵ99(JCRB0080) 細胞；ヒトの扁平上皮癌ＨＳＣ−2(JCRB0622) 細胞；ヒト胃癌細胞株である扁平上皮癌ＭＫＮ28(JCRB0253) 細胞、ＭＫＮ45(JCRB0254) 細胞；及びヒト大腸癌細胞株である扁平上皮癌ＣＯＬＯ320ＤＭ(JCRB0225又はATCC：CCL-220)細胞）は、ＪＣＲＢ細胞バンク(厚生労働省:http//Cellbank.nihs.go.jp/)より購入した。ヒト肺癌細胞株である扁平上皮癌ＬＣ−１／ｓｑ(RCB0455)は、理研細胞バンクより購入した。【０１０７】
ＬＣ／ｓｑ細胞は、１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びカナマイシンを有する栄養補助液を添加した４５％ＲＰＭＩ１６４０培地(シグマ社製)及び、４５％Ｈａｍ‘ｓＦ１２(シグマ社製)中で維持した。ＣＯＬＯ３２０ＤＭ細胞及びＭＫＮ２８はＤＭＥＭ培地(シグマ社製)中で維持した。Ｋ５６２細胞は１０％ＦＣＳ(ウシ胎児血清：ライフテクノロジー社製)、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びカナマイシンを有する栄養補助液を添加したＩＭＤＭ培地(シグマ社製)中で維持した。【０１０８】
その他の癌細胞株は、１０％ＦＣＳ、２ｘ10−３Ｍ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌカナマイシン及び５ｘ10−５Ｍβ−メルカプトエタノール(完全培地として)を含む補助液を添加したＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養した。【０１０９】
ペプチド提示用の細胞として１７４ＣＥＭ．Ｔ２(以下、「T2細胞」と称する)にＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子を導入し、ＨＬＡ−Ａ２４０２結合ペプチドを提示する細胞(以下、「Ｔ２−２４細胞」と称する)を得た。Ｔ２−２４細胞は１０％牛胎児血清、L-グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｇ４１８（ギブコ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Iscove's modified Dulbecco's medium：ギブコ社製）を用いて培養した。【０１１０】
Tissue antigens, 59:502-511,2002に記載された方法により、ＨＬＡ−Ａ２４０２をコードしているレトロウイルスを、それぞれＱＧ５６のＨＬＡ−Ａ２４０２陰性細胞株及びＡ５４９(JCRB0076)のＨＬＡ−Ａ２４０２陰性細胞株に感染させた。感染した細胞を選択するため、感染したＱＧ５６細胞を最終濃度０．６μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む完全培地中に維持し、ＱＧ５６−Ａ２４と命名した。同様に、感染したＡ５４９を最終濃度０．９μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む完全培地中に維持し、Ａ５４９−Ａ２４と命名した。
２）ペプチド合成
Ｅｐ−ＣＡＭ蛋白(アクセッション番号：Ｍ３３０１１)の範囲内の潜在的なＨＬＡ−A２４０２結合ペプチドを同定するために、ワールド・ワイド・ウェブサイト・バイオインフォマティクス＆分子分析セクション(BIMAS:BioInfomatics and molecular analysis section)のＨＬＡペプチド複合体の解離半減時間の評価に基づいた、ＨＬＡペプチド結合予測プログラムを使用するコンピュータ予測を行った（http://bimas.dcrt.gov/molbio/hla_bind/）。【０１１１】
Ｅｐ−ＣＡＭのエピトープ・ペプチド予測結果の中から選択した７つのペプチドをＰｅｐＳｅｔ(Mimotope社製)で合成した。必要に応じて１００μＬのジメチル・スルフォキシドに溶解し、４０％アセトニトリル、０．１Ｍ  (pH7.4)に更に希釈した。【０１１２】
各ペプチドの産生量は１μｍｏｌであると推測された。【０１１３】
合成された７つのペプチドは、Ｅｐ31、Ｅｐ173、Ｅｐ185、Ｅｐ250、Ｅｐ225、Ｅｐ296、及びＥｐ304として命名した。合成されたＥｐ−ＣＡＭのペプチド配列を表１に示す。【０１１４】
【表１】
0004779067.tif 000002
【０１１５】
なお、コントロールとして、ヒト免疫不全ウイルス−１(HIV-1)エンベロープ・ペプチドＲＹＬＲＤＱＱＬＬ(J.Immunol,159:6242-6252,1997：584-592残基、ENV584として命名されている)及びＥＢＶlatent膜蛋白２ペプチド(EBV latent membrane)(J.Immnol,158:3325-3334,1997：419−427残基、ＥＢＶ−ＬＭＰ419として命名されている)を合成した(東レ・リサーチセンター社)。
３）細胞染色及びフローサイトメトリー分析
ＨＬＡ−Ａ２４０２分子の細胞表面発現ＨＬＡ−Ａ２４０２モノクローナル抗体(ワン・ラムダ社製：One Lambda, Inc)とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ(ab’)２断片(イムノテック社製)を用いる間接免疫蛍光抗体法によって試験した。ＭＨＣ／ペプチド・テトラマーは文献記載の方法(Blood,98:1872-1881,2001、Science,274:94-96,1996)に準じて製造した。【０１１６】
ＣＤ８陽性Ｔ細胞株又はクローンをＥｐ−ＣＡＭペプチド、Ｅｐ173(ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｅｐ173テトラマーとして呼んだ)又はＨＩＶ−１ペプチド、ＥＮＶ584(ＨＬＡ−Ａ２４０２／ＥＮＶ584テトラマーとして呼んだ)を取り込んでいるフィコエリスリン(phycoerythrin: ＰＥ)標識されたＨＬＡ−Ａ２４０２テトラマーで染色した。【０１１７】
染色された細胞のフローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ(ベクトン・ディッキンソン社製)を用いて実施し、データはＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア(ベクトン・ディッキンソン社製)を用いて分析した。
MHC安定化アッセイ
合成されたペプチドのＨＬＡ−Ａ２４０２結合効率を試験するため、クズシマ(Kuzushima)らに記載の方法(Blood,98:1872-1881,2001)でＴ２−Ａ２４細胞（T２[174 x CEM.T2：ATCCアクセッション番号：CRL-1992]にＨＬＡ−Ａ２４０２分子を発現するプラスミドをトランスフェクトされた細胞株）を用いるＭＨＣ安定化アッセイを行った。【０１１８】
即ち、Ｔ２−Ａ２４細胞(２ｘ１０５個)を０．１％ＦＣＳ，５ｘ１０−５Ｍβ−メルカプトエタノールを含む２００μＬ  ＲＰＭＩ１６４０培地及び１０μＭの濃度でペプチドの各々を２６℃で１６時間インキュベーションした。さらに３７℃で３時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞表面ＨＬＡ−Ａ２４０２分子を抗ＨＬＡ−Ａ２４０２モノクローナル抗体及び上記（３）のＦＩＴＣ標識抗体で染色した。発現は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒによって測定し、平均蛍光強度（ＭＦＩ：mean fluorescence intensity）を記録した。【０１１９】
％ＭＩＦ上昇は以下の方法で計算した：
％ＭＩＦ上昇＝１００ｘ（ペプチド投与群のＭＩＦ−ペプチド非投与群のＭＩＦ）／(ペプチド非投与群のＭＩＦ）
その結果を表１に％ＭＦＩ上昇として示す。表１に示されるように多くのペプチドは、これらのペプチドが細胞表面上に結合し、ＭＨＣが安定化されることを示している細胞上のＨＬＡ−Ａ２４０２分子発現が上昇した。【０１２０】
中でもペプチドＥｐ173（ＲＹＱＬＤＰＫＦＩ）がＨＬＡ−Ａ２４０２分子に対して最も高い親和性を示した。Ｅｐ304（ＥＭＧＥＭＨＲＥＬ）は最も低い親和性を示したので、以後の実験から排除した。
５）Ｅｐ−ＣＡＭペプチド特異的ＣＴＬ株及びクローンの産生
末梢血単球誘導された樹状細胞（ＤＣｓ）はダゥアー(Dauer)らの方法に準じて産生させた（J.Immnol,170:4069-4076）。【０１２１】
即ち、プラスチックに粘着する細胞をＨＬＡ−Ａ２４０２陽性健康ボランティアの末梢血単球細胞から単離し、５％加熱不活性化ヒト血清、１０μｇ／ｍＬ組換え体ヒト・インターロイキン−４（ｈＩＬ−４：Ｒ＆Ｄシステムズ社製）、及び５０ｎｇ／ｍＬ組換え体ヒト・顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ：Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を共に添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中において培養した。次いで１日インキュベーションの後、５０ｎｇ／ｍＬＩＬ−１β（ペプロ・テック社製）、５０ｎｇ／ｍＬ組換え体ヒト・腫瘍壊死因子−α（ｈＴＮＦ−α：ペプロ・テック社製）及び１μＭプロスタグランディンＥ２（Cayman Chemical Company社製）を細胞の成熟のために添加した。２〜３日経過後、細胞を取得し、抗原提示のために単球誘導樹状細胞として用いた。【０１２２】
産生された細胞は、ＣＤ１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡクラスII分子のような樹状細胞関連抗原を発現しているように思われた。【０１２３】
別途、ＣＤ８マイクロビーズ（Milteny  Biotec社製）の助けを得て同じドナーからＣＤ８陽性Ｔリンパ球を単離した。【０１２４】
次いで自己由来の樹状細胞を室温にて２〜４時間、５ｘ１０−５Ｍβ−メルカプトエタノールを有するＡＩＭ−Ｖ培地(ギブコ社製)中で１０μＭ濃度のＥｐ−ＣＡＭ合成ペプチドの各々でパルスした後、（３３Ｇｙ）で放射線照射した。【０１２５】
その後、樹状細胞（１ｘ１０５個）は、１０％ヒト血清、２５ｎｇ／ｍＬ組換え体ヒトＩＬ−７（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）、５ｎｇ／ｍＬ組換え体ヒトＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中においてＣＤ８陽性Ｔリンパ球（１ｘ１０６個）と共に培養チューブ中において共培養した。【０１２６】
７日間培養後、細胞は前記したように調製された１ｘ１０５個のペプチド・パルスされた自己由来樹状細胞を加えることによって刺激した。更に７日間の間培養した後、細胞を同様な方法で３回刺激した。各再刺激後、ヒト組換え体ＩＬ−２（武田薬品工業社製）を２０単位／ｍｌの最終濃度で加えた。必要であれば、活発に増殖している細胞を２−３のチューブに分けて、２０単位／ｍｌのＩＬ−２を含む新鮮培養培地を与えた。【０１２７】
Ｔ細胞の特異性はエリスポットアッセイで試験した。【０１２８】
Ｔ細胞クローンを確立するために、ポリクローナルＣＴＬの限界希釈を（Blood,98:1872-1881,2001）に沿って実施した。即ち、ポリクローナルＣD８陽性Ｔ細胞を抗ＣＤ３モノクローナル抗体(30ng/ml、オルソ・ダイアグノスティク社製)、ＩＬ−２（50Ｕ／ｍｌ）、γ（３３Ｇｙ）放射された１ｘ１０５個のＰＢＭＣｓ及びγ（５５Ｇｙ）放射された２ｘ１０４個のＥＢＶでトランスフォームされたＢリンパ芽球細胞（ボランティアの末梢血Bリンパ球を95.8細胞(JCRB9123) 上清でトランスフォームすることにより得られた細胞）と共に培養培地(0.2ml)を含んでいる９６穴丸底プレート中に細胞１、３、１０個／ウェルで蒔いた。【０１２９】
２週間培養後、増殖している細胞の特異性をリー(Lee)らが記載した方法(J.Immnol,158:3325-3334,1997)と同様に、ＣＴＬ−ＣＴＬ致死(CTL-CTL killing)アッセイで試験した。【０１３０】
即ち、ＣＴＬクローンを１００μｌの完全培地のみ、或いは最終濃度２μＭでＥｐ−ＣＡＭまたはコントロール・ペプチドＥＮＶ584から誘導された同一起源ペプチドを含んでいる９６穴丸底プレート(細胞300個／ウェル)上において一晩インキュベーションした。【０１３１】
ＣＴＬ細胞の細胞傷害能力は、倒立顕微鏡を用いて翌日測定した。Ｅｐ−ＣＡＭでパルスしたときだけ細胞傷害を示したクローンは、フラスコの中に移し、上記のように増殖させた。
６）ＩＦＮ−γのエリスポットアッセイ
ニトロセルロース膜がある平底９６穴MultiScreen-HAプレート（ミリポア社製）に１０μｇ／ｍＬの抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）をコートし、４℃で一晩イキュベ−トした。ＰＢＳ(リン酸緩衝生理食塩水)で洗浄後、プレートを３７℃で１時間、培養培地でブロッキングした。Ｔ２−Ａ２４細胞（５ｘ１０４個）は、室温で３０分間プレートの各ウェル中に０．１％ＦＣＳ及び５ｘ１０５Ｍのβ−メルカプトエタノールと共に１００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地中においてに各エピトープ候補合成ペプチドをパルスした。２０％の濃度まで付加的ＦＣＳで添加された培養培地中に懸濁した１ｘ１０５個のポリクローナルＣＤ８陽性Ｔ細胞の全量を各ウェル中に蒔いた。【０１３２】
スポットがカウントするにはあまりに多い場合は、１ｘ１０４個のＣＤ８陽性Ｔ細胞を応答細胞として用いた。そして全ての測定操作は2度、実施した。【０１３３】
プレートを３７℃で２０時間、５％炭酸ガス・インキュベータ中で、インキュベートし、そして０．０５％ツィーン２０を含むＰＢＳで広範囲に洗浄した。次いでポリクローナルウサギ抗ＩＦＮ−γ抗体（ジェンザイム社製）を個々のウェルに添加し、室温で９０分間放置し、続いて、さらに９０分間パーオキシダーゼ複合ヒツジ抗ウサギ抗イムノグロブリンＧ（ジェンザイム社製）に曝露させた。ＩＦＮ−γ特異的スポットの可視化のために、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（シグマ社製）及び０．０１５％過酸加水素水を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を各ウェルに加えた。４０分後、反応を水洗によって停止させ、プレートを乾燥させた。そして拡散した大きなスポットを顕微鏡下でカウントした。【０１３４】
その結果を図１及び図２に示す。【０１３５】
図１は、５人のＨＬＡ−Ａ２４０２陽性健康人ドナーのＣＤ８陽性T細胞を６つのペプチドの各々でパルスした自己由来の樹状細胞で刺激させた結果のエリスロット・アッセイによるポリクローナル・ペプチド活性化細胞傷害性リンパ球細胞株の評価を示す。【０１３６】
図１に示されるように５人のＨＬＡ−Ａ２４０２陽性健康人ドナーのＣＤ８陽性T細胞を６つのペプチドの各々でパルスした自己由来の樹状細胞で刺激させた結果、４人のドナーからのＴ細胞株がＥｐ173でパルスしたＴ２−Ａ２４細胞でインキュベートした時にＩＦＮ−γスポットの優位な量を産生した。【０１３７】
また、ドナー番号３からのＥｐ250刺激されたＣＴＬ株が、Ｅｐ250でインキュベートした時に特異的にＩＦＮ−γのスポットを産生した。【０１３８】
図２は、Ｅｐ−ＣＡＭペプチド特異的ポリクローナル及びモノクローナルＣＴＬのテトラマー染色の結果を示す。【０１３９】
図２のＡは、Ｅｐ173で４回刺激したポリクローナルＣＤ８陽性Ｔ細胞がＦＩＴＣ標識された抗ＣＤ８抗体及びＥｐ173が取り込まれているＰＥ標識されたＨＬＡ−Ａ２４テトラマー、又はコントロール・ペプチドＥＮＶ584で染色され、フローサイトメトリーによって分析された。全ＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるテトラマー陽性細胞のパーセントが上段右に示されている。【０１４０】
図２のＡに示されるようにコントロール・ペプチドＥＮＶ584の多くでは、スポットの産生はなかった。４回の刺激の後、４人のドナーから確立したＣＴＬ株がＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｅｐ173テトラマーで特異的に染色したが、ＨＬＡ−Ａ２４０２／ＥＮＶ584テトラマーでは染色しなかった（全CD８陽性Ｔ細胞の37.2% v. 0.06%、図２Ａ）。  【０１４１】
また、図２Ｂは、Ｅｐ173特異的ＣＴＬクローン、Ｃ２７が上記と同様の方法で染色された。全ＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるテトラマー陽性細胞のパーセントが上段右に示されている。  【０１４２】
第２図Ｂに示されるようにテトラマー陽性細胞の強度は、２−３対数までテトラマー陰性細胞のそれより同等で強かった。本発明者らは、ドナー番号４のＥｐ173特異的ポリクローナルＣＴＬ株の限界希釈培地からＴ細胞クローン、Ｃ２７を確立した。【０１４３】
テトラマーでのこの研究は、ポリクローナル及びモノクローナルＥｐ173−特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の両者が、ＨＬＡ−A２４０２／Ｅｐ173複合体に指向する高親和性の細胞レセプターを持っていたことを示した。【０１４４】
かくして、Ｅｐ173−特異的ＣＴＬクローンが、このＣＴＬ細胞株から樹立された。
【実施例２】
【０１４５】
ペプチドＥｐ173−特異的ＣＴＬクローンの特性１
７）ＣＴＬアッセイ（ＣＴＬアッセイ）
本発明者らは、Ｃ２７がＨＬＡ−A２４の前後関係において腫瘍細胞の表面上において自然に生じて、提示されたペプチドを認識するかどうかをさらに試験した。【０１４６】
クロミニウム標識細胞をＣ２７の添加前に総ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ−Ａ２４、或いはＨＬＡ−Ａ２分子に特異的なモノクローナル抗体のいずれかで、インキュベートし、細胞傷害性アッセイを１０のエフェクター−標的比で実施した。【０１４７】
即ち、標的細胞（ＰＣ９細胞）を３７℃で１時間の間１００μｌの培養培地中においてクロミウム（５１Ｃｒ）で標識した。幾つかの実験において、事前に特定した量のブロッキング抗体Ｗ６／３２（抗ＨＬＡクラスＩ）、ＭＡ２．１（抗ＨＬＡ−Ａ２）、及びＡ１１．１（抗ＨＬＡ−Ａ２４）をＨＬＡ拘束の特定のためにエフェクター細胞を加える３０分前にウェルに加えた。【０１４８】
プレートを３７℃で４時間インキュベーションし、そして上澄みをγ―カウンターでカウントした。【０１４９】
特異的５１Ｃｒ遊離パーセントは、１００  ｘ  （実験的な遊離−自然の遊離）／（最大遊離−自然の遊離）で計算した。【０１５０】
その結果を図３及び図５に示す。【０１５１】
図３中Ａは、ペプチドＥｐ173及びコントロール・ペプチドＥＢＶ−ＬＭＰ419の示された濃度におけるＴ２−Ａ２４細胞に対するＣ２７、Ｅｐ173特異的ＣＴＬクローンの細胞傷害性を１のエフェクター−標的比における５１Ｃｒ遊離アッセイによって特定されている。【０１５２】
その結果、Ｅｐ173−特異的ＣＴＬクローン、Ｃ２７は１００ｐＭの低いペプチド濃度のＥｐ173でパルスしたＴ２−Ａ２４細胞に対して細胞傷害性を示したが、コントロール・ペプチドのＥＢＶ−ＬＭＰ419では示さなかった。【０１５３】
また、種々の癌細胞株に対するＣ２７の細胞傷害性の結果を第５図及び表２に示した。【０１５４】
【表２】
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【０１５５】
標的細胞としてＨＬＡ−Ａ２４陽性の８種の癌細胞株及びＨＬＡ−Ａ２４陰性の癌細胞株に対するＣ２７、Ｅｐ173−特異的ＣＴＬクローンの細胞傷害性の結果を表２に示す。【０１５６】
肺腺癌細胞株１１−１８、ＣＯＬＯ３２０ＤＭ及びＡ５４９を除く全ての細胞株は、Ｅｐ−ＣＡＭを発現していた。ＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子は、Ａ５４９及びＱＧ５６の中にレトロウイルス的に形質転換され、Ａ５４９−Ａ２４及びＱＧ５６−Ａ２４として名づけられた形質転換体は、それぞれ標的細胞としても使用された。細胞傷害性は、指摘された各エフェクター−標的比（40:1,20:1,10,1,5:1）で５１Ｃｒ遊離アッセイによって特定した。Ｋ５６２はナチュラルキラー細胞に対して感受性の代表的な細胞株である。【０１５７】
該第５図又は表２に示されるように、Ｃ２７は、肺癌細胞株のＰＣ９、ＬＵ９９、ＬＣ−１／ｓｑ及びＬＣ９９Ａ、或いは口頭扁平上皮細胞腫瘍細胞株ＨＳＣ−２、或いはＨＬＡ−Ａ２４及びＥｐ−ＣＡＭの両者を発現する胃癌細胞株ＭＫＮ４５を効率的に傷害した。しかしながら、ＨＬＡ−Ａ２４陽性Ｅｐ−ＣＡＭ陰性細胞株（Ａ549-Ａ24及びCOLO320DM）、或いはＨＬＡ−Ａ２４陰性及びＥｐ−ＣＡＭ陽性細胞株又はＥｐ−ＣＡＭ陰性細胞株（OG56、A549、MNK28）のいずれかに対する殺傷効果は認められなかった。ＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子をＨＬＡ−Ａ２４陰性ＱＧ５６細胞(QG56-A24)の中に導入したとき、Ｃ２７は標的細胞を殺した。Ｋ５６２細胞に対する傷害性はわずかであった。【０１５８】
これらのデータはＥｐ173−特異的ＣＴＬがＨＬＡ−Ａ２４及びＥｐ−ＣＡＭの両者を発現する腫瘍細胞を殺すことを証明した。【０１５９】
また、第３図中Ｂは、ＨＬＡ−Ａ２４０２陽性細胞株、ＰＣ９に対するＥｐ173−特異的ＣＴＬクローン、Ｃ２７の細胞傷害性に関する抗ＨＬＡ−Ａ２４モノクローナル抗体の抑制効果を示している。【０１６０】
即ち、Ｃ２７は、肺癌細胞株のＰＣ９細胞（ＨＬＡ−Ａ２４陽性Ｅｐ−ＣＡＭ陽性肺癌細胞株）に対するＣ２７の細胞傷害性は、ＨＬＡ−Ａ２４又は汎クラスＩ分子（Ｗ6／32）に対する特異的モノクローナル抗体によってブロックされたが、抗ＨＬＡ−Ａ２モノクローナル抗体によってはブロックされなかった。
８）コールドターゲットインヒビションアッセイ（cold target inhibition assay）
コールドターゲットインヒビションアッセイは、アライ（Arai）ら（Blood,97:2903-2907,2001）に記載のように実施した。【０１６１】
即ち、Ｔ２−Ａ２４細胞を最終濃度１ｘ１０−５Ｍで1時間エピトープペプチドＥｐ173、又はＥＢＶ−ＬＭＰ419でインキュベートした。【０１６２】
数回洗浄した後、ペプチド−パルスされたＴ２−Ａ２４細胞と標的細胞との比が４０：１、２０：１、１０：１、５：１になるように数を合わせて、２ｘ１０４個のエフェクター細胞と１時間の間インキュベーションした。そして２ｘ１０３個の５１Ｃｒ標識されたＰＣ９細胞を各ウェルに加えた。
細胞傷害性は、７）ＣＴＬアッセイの項目に記載したようにして測定した。【０１６３】
第３図中Ｃは、コールドターゲットインヒビションアッセイの結果を示す。図３Ｃ中、Ｅｐ173（●）又はコントロールＥＢＶ−ＬＭＰ419（■）ペプチドをパルスしたＴ２−Ａ２４細胞（コールド）と、クロミニウム標識ＰＣ９細胞（ホット）との数比を横軸に示す。またＣ２７によるＰＣ９細胞の傷害性を％として縦軸に示す。オープン・サークルはコールド標的なしの細胞傷害性を示す。【０１６４】
その結果、ＰＣ９細胞に対するＣ２７介在細胞傷害性が、Ｅｐ173をパルスされたＴ２−Ａ２４細胞の存在によって特異的に抑制されたが、無関係なペプチドでは抑制されなかった。【０１６５】
このように、Ｃ２７介在ＰＣ９細胞傷害性が抗ＨＬＡ−Ａ２４モノクローナル抗体又はＥｐ173−パルスされたコールド標的細胞のいずれかによってブロックされたので、ＣＴＬクローンは、腫瘍細胞の表面上に自然に提示されるＥｐ173に対する卓越した特異性を疑う余地なく証明した。
【実施例３】
【０１６６】
ペプチドＥｐ173−特異的ＣＴＬクローンの特性２
９）ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡはＧｅｎＥｌｕｔｅ  ｍＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット(シグマ社製)を使用し、培養された細胞株から抽出した。遺伝子特異的オリゴヌクレオチド・プライマーはＰｒｏｌｉｇｏ(プロリゴ・ジャパン社製)で合成し、Ｅｐ−ＣＡＭのｍＲＮＡ発現を評価するために使用した。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーを以下の示した：
フォワード・プライマー：ATGGCGCCCCCGCAGGTCCT              （配列番号８）
リバース・プライマー  ：TTATGCATTGAGTTCCCTATGCATCTCACC （配列番号９）
ＲＴ−ＰＣＲはサーマル・サイクラー(パーキン・エルマー社製)を用いて実施し、ＰＣＲ産物は１．５％ゲル電気泳動とエチジウム・ブロマイド視覚化によって分析した。【０１６７】
ＰＣＲは、９４℃で５分間を１サイクル、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間のセットを３０サイクル、７２℃で７分間を１サイクルの条件で行った。
１０）ウェスタン・ブロット分析
ウェスタン・ブロット分析は、シュワルツら(J.Immnol,165:768-778,2000)の方法を少し修飾して実施した。即ち、細胞は、４℃で３０分間溶解緩衝液(50mMトリス／塩酸、ｐＨ７．５、５mM塩化マグネシウム、１mM EDTA、０．５%トリトンＸ−１００、１０μM ロイペプチトン：leupeptin、２．８μMペプスタイン：pepstain、 及び０．８５mMフェニルメタンスルフォニルフロリド：phenylmethanesulfonyl fluoride)において溶解した。溶解された細胞核上清は蛋白濃度を測定するために波長２８０／２６０nmで定量した。そして、さらに１３０μｇの蛋白部分を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。蛋白は、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜(ミリポア・コーポレーション社製)上にブロットされ、４℃で一晩１０0％低脂肪乾燥ミルク及び０．１％ツィーン２０を含むＰＢＳでブロックした。【０１６８】
さらにＥｐ−ＣＡＭに特異的なモノクローナル抗体(LabVision社製)で探して、パーオキシダーゼ複合ヒツジ抗マウスＩｇＧ(Zymed社製)で検出した。【０１６９】
蛋白はＥＣＬウェスタン・ブロット検出システム(アマシャム・バイオサイエンシズ社製)を用いて視覚化した。【０１７０】
癌細胞株のＥｐ−ＣＡＭ発現をＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタン・ブロット分析によって試験した結果を第４図に示す。【０１７１】
１５種の癌細胞株の１２株（80%）がＥｐ−ＣＡＭを発現しているように思われた。ＨＬＡ−Ａ２４の発現は、抗ＨＬＡ−Ａ２４モノクローナル抗体を使用する間接免疫蛍光試験によって試験した。試験した１５の癌細胞株のうち、１０株がＨＬＡ−Ａ２４発現陽性であった。【０１７２】
上記実施例に示されたように、本発明者らは、Ｅｐ−ＣＡＭから誘導された新規なＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性エピトープを得た。少なくとも、エピトープペプチド、Ｅｐ173（ＲＹＱＬＤＰＫＦＩ；配列番号１）はＨＬＡ−Ａ２４０２／ペプチド複合体に指向する高親和性Ｔ細胞レセプターを保有するＣＴＬを誘導する能力を持っており、該ペプチドを用いた免疫療法が期待できる。
【産業上の利用可能性】
【０１７３】
本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４０２を有する広範囲のヒトの上皮性癌に対する癌ワクチンとして好適に使用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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