(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体支持体、およびそれに結合しているＡＢＩおよびＡＭＢＩから選択された１つまたは複数のリガンドを含み、該リガンド密度が、約３０μｍｏｌｅ／ｍｌから約８０μｍｏｌｅ／ｍｌおよび約１ｍｍｏｌｅ／ｇ未満である媒体とサンプルとを接触させるステップを含む方法であって、該サンプルからＩｇＧを分離する方法。
【請求項２】
リガンド密度が、約４０μｍｏｌｅ／ｍｌから約７０μｍｏｌｅ／ｍｌ、および約０．５ｍｍｏｌｅ／ｇから約０．８ｍｍｏｌｅ／ｇまでである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リガンド密度が約５０μｍｏｌｅ／ｍｌおよび約０．７ｍｍｏｌｅ／ｇである請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記あるいは各リガンドがＡＢＩである請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記支持体が苛性アルカリ抵抗性の材料を含む請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記支持体が架橋アガロースを含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記支持体が、約４％から約８％のアガロースを含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記支持体が約６％のアガロースを含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記支持体がジルコニアを含む請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記支持体がポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエーテルスルホンおよび／またはポリフッ化ビニリデンを含む請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記支持体が１つまたは複数のビーズ、メンブレン、不織布のシートあるいは単一体構造の形状をしている請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記支持体が１つまたは複数の多孔性のビーズの形状をしている請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は媒体、および分離におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
親和性クロマトグラフィーは、ＩｇＧ等のタンパク質の精製に使用することができる。親和性クロマトグラフィー媒体は通常は固体支持体（たとえば樹脂）、およびそれに結合している選択された親和性リガンドを含む。リガンドの選択性は通常は、たとえばｐＨ、分離を受けるサンプルのイオン強度等の種々の要素に依存する。特定のタンパク質用の選択性を強化するためにイオン強度またはｐＨを変化させることができる。
【０００３】
２−アミノベンズイミダゾール（ＡＢＩ）およびアミノメチルベンズイミダゾール（ＡＭＢＩ）は親和性クロマトグラフィーリガンドの例である。
【０００４】
固体支持体、リガンドおよび分離条件を適切に選択することによって、合理的な度合いの特異性を実現できるようになる。しかしながら、従来の非親和性クロマトグラフィーのプロセスでは、通常は高度な非特異性の結合が付随する。そこで特にＩｇＧのようなタンパク質に対して、より高度の選択性があるクロマトグラフィー媒体が求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＡＢＩおよび／またはＡＭＢＩを、固体の基体に対して約３０から約８０μｍｏｌｅ／ｍｌ、および約１ｍｍｏｌｅ／ｇ（乾重量）未満の密度で使用する場合に最適なリガンド性能が達成されるという発見を基礎としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様は、固体支持体、およびそれに付着している、ＡＢＩおよびＡＭＢＩから選択された１つまたは複数のリガンドを含み、該リガンド密度が、約３０μｍｏｌｅ／ｍｌから約８０μｍｏｌｅ／ｍｌおよび約１ｍｍｏｌｅ／ｇ未満である媒体である。
【０００７】
本発明の第２の態様は、本発明の媒体とサンプルを接触させることを含む、ＡＢＩおよび／またはＡＭＢＩに結合することができる化合物をサンプルから分離する方法である。
【０００８】
本発明の別の態様は、固体支持体にＡＢＩおよびＡＭＢＩから選択される１つまたは複数のリガンドを付着させることを含む本発明の媒体を製造する方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
ここに使用する用語「ＡＢＩ」は２−アミノベンズイミダゾールである。
【００１０】
ここに使用する用語「ＡＭＢＩ」はアミノメチルベンズイミダゾールである。
【００１１】
本発明の媒体は、当該技術で既知の任意の適切な方法によって得られる。たとえば、該媒体は、多孔質支持体の表面を活性化するか誘導体化し、次いでその表面に１つまたは複数のリガンドを付着させることによって得られてもよい（たとえば、ＷＯ−Ａ−９８／０８０６０３、ＷＯ−Ａ−９０／０９２３８およびＷＯ−Ａ−９０／０９２３７を参照。）場合によっては、支持体とリガンドの間にスペーサーを使用してもよい。
【００１２】
通常は、支持体にリガンドを付着させるために、溶媒あるいは湿潤剤（たとえば水）を使用する。硬質な媒体（たとえばシリカ）は、それ自体の気孔内にいかなる湿潤剤をも保持することができる。しかしながら、軟質の媒体（たとえばアガロースゲル）は、湿潤剤に暴露されると膨張もする。この理由で、本発明を示すために２つのリガンド密度計量単位である「μｍｏｌｅ／ｍｌ」および「ｍｍｏｌｅ／ｇ」を使用する。
【００１３】
通常の計量単位は「μｍｏｌｅ／ｍｌ」で表現する。この単位は、膨張した体積の合計当たりのリガンドの量を表わし、「使用中の」支持体のリガンド密度に直接関係する。
【００１４】
硬質、軟質の媒体間の差を説明するために、リガンド密度も「ｍｍｏｌｅ／ｇ」の単位で表現する。この測定単位は、媒体の単位乾重量当たりのリガンドの量に等しく、このようにすれば密度比較から湿潤剤の寄与を除去することができることになる。膨潤しているゲル媒体については、この乾重量は湿潤状態の媒体とは著しく異なる容量を有する。
【００１５】
固体支持体は当該技術で既知の任意の適切な支持体であってよい。この支持体は、１つまたは複数の苛性アルカリ抵抗性の材料を含むことが好ましい。
【００１６】
カセイアルカリは、生物医薬産業で、一般に洗浄剤および／または消毒剤として使用される。このものは、使用と使用の間に媒体を清潔に保つために使用され、これを使用しない場合に残存する可能性のあるあらゆる汚染物質を除去する。カセイアルカリ溶液（代表的な条件は、０．５Ｍで１時間使用）は、残存するかもしれないあらゆる微生物あるいはウイルスをも不活性化するために使用してもよい。最近の親和性リガンドおよびある媒体（多孔質ガラスビーズ上のプロテインＡ等）に関する問題は、支持体と同様に、リガンドもカセイアルカリ安定性を有さないことが多いということである。したがって、カセイアルカリへ暴露されることによって性能の低下が生じることがある。この性能低下を回避するために酸性洗浄が代わりに使用されることがあるが、これらは好ましくない。
【００１７】
この意味で、支持体がカセイアルカリに対して安定性を有することが好ましいと言える。カセイアルカリ抵抗性の材料の例としては、アガロース、セルロース、ジルコニア、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）およびポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）が挙げられる。好ましい実施形態では、支持体は架橋アガロースを含み、アガロースの比率が好ましくは約４から約８％であり、より好ましくは約６％である。
【００１８】
この支持体は任意の適切な形状であってもよく、たとえば１つまたは複数のビーズ、メンブレン、不織布のシートあるいは単一体構造の形状であってもよい。支持体は、１つまたは複数の多孔性のビーズの形態をしていてもよい。
【００１９】
好ましい支持体としては、ＰＶＤＦメンブレン（たとえばＤｕｒａｐｏｒｅ（登録商標））、ＰＥＳメンブレン（たとえばＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標））、アガロースビーズ、フィルターあるいはビーズ製造用のＰＴＦＥ樹脂類、不織布（たとえばＴｙｐａｒあるいはＴｙｖｅｃポリエチレン）、ＰＴＦＥメンブレンが挙げられる。アガロースビーズの例は、米国特許第４，８６１，７０５号、米国特許第５，０５３，３３２号、およびＷＯ−Ａ−９８／５８７３２に記述されている。
【００２０】
ＡＢＩとＡＭＢＩから選択される１つまたは複数のリガンドを、この支持体に付着させる。リガンド類は、約４０から約８０μｍｏｌｅ／ｍｌまで、および約０．５から約０．８ｍｍｏｌｅ／ｇの密度で、より好ましくは、約５０μｍｏｌｅ／ｍｌおよび約０．７ｍｍｏｌｅ／ｇの密度で存在するのが好ましい。
【００２１】
以下の実施例によって本発明を説明する。
【実施例】
【００２２】
ＢＳＡ：ＩｇＧの結合比率に対するリガンド密度の影響をＡＢＩについて決定した。
【００２３】
種々のリガンド密度で様々な吸着体を調製した。これらは、室温でアリル活性化（０．１ｍｌ／ｍｌ）し、臭素化（臭素水使用）し、制御された濃度のリガンドを使用して調製（５０％のカップリング効率の達成を仮定）した。リガンド密度は滴定によって求めた。次いで、デカンテーションで媒体の上澄みを取り、米国特許第５，６５２，３４８号および米国特許第５，９４５，５２０に記載されている試験法を使用してアリコートを取り、リガンド密度を決定した。
【００２４】
キャパシティー測定は１ｍｌの吸着体を使用して行なった。吸着剤は、５カラム体積（ＣＶ）のＰＢＳバッファーを使用して平衡に保った。４０ｍｇ／ｍｌ（２．５ｍｌ）のヒトポリクローナルＩｇＧあるいはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をカラムに入れ、次に５ＣＶのＰＢＳバッファーで洗浄した。５ＣＶの０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２）を使用して溶離を実行した。２８０ｎｍにおける溶離液の吸収を記録してキャパシティーを決定した。
【００２５】
図１に、ＢＳＡ：ＩｇＧの結合比率に対するリガンド密度の影響を示す。ＡＢＩリガンドを、約３０から約８０μｍｏｌｅ／ｍｌまでの密度で使用する場合、最適結合が得られることが明白となった。この場合、最適なリガンド密度はＢＳＡ：ＩｇＧの比率は最低であるがＩｇＧキャパシティーは商業用途には十分に高い密度である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＢＳＡ：ＩｇＧの結合の比率に対するリガンド密度の影響を示す図である。
【図１】
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