(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２及び配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーセット。
【請求項２】
配列番号２及び配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーセット、並びに配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７で示される塩基配列からなる群から選ばれる配列を有するプローブ含むＣＫ１９を検出するための組成物。
【請求項３】
ＣＫ１９を増幅する方法であって、
（ａ）  核酸増幅試薬、請求項１に記載のプライマーセット、及びＣＫ１９を含む疑いのある試験サンプルを含む反応混合物を形成するステップ及び
（ｂ）  混合物を増幅条件に置き、ＣＫ１９に相補的な核酸配列の少なくとも一コピーを生成するステップ
を含んでなる方法。
【請求項４】
試験サンプル中のＣＫ１９を検出する方法であって、
（ａ）  核酸増幅試薬、請求項１に記載のプライマーセット、及びＣＫ１９を含むと疑われる試験サンプルを含む反応混合物を形成するステップ、
（ｂ）  混合物を増幅条件に置き、増幅物を生成するステップ、
（ｃ）  配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７で示される塩基配列からなる群から選ばれるプローブを供給するステップ、
（ｄ）  （ｂ）において得られた増幅物にプローブをハイブリダイズさせてハイブリッドを形成させるステップ；及び
（ｅ）  試験サンプル中のＣＫ１９の存在の指標としてハイブリッドを検出するステップ
を含んでなる前記方法。
【請求項５】
ハイブリッドの検出前にハイブリッドを微粒子に固定するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＣＫ１９を特異的に検出するためのキットであって、
（ａ）配列番号２及び配列番号３で示される塩基配列、並びに
（ｂ）増幅試薬を含有する前記キット。
【請求項７】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７で示される塩基配列からなる群から選ばれるプローブをさらに含む請求項６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、腫瘍学、特に試験サンプル中の癌の検出のためのオリゴヌクレオチドに関する。
【０００２】
（発明の背景）
研究により、造血器官中の上皮細胞の存在が癌の局所から体の他の部位への拡散（転移として知られる）を示すことが示唆されている。
転移は癌のある段階での症状を示すものであり、癌患者の適切な治療に関する決定が、適切な疾病の段階の特徴づけに大きく依存することから、この発見は重要である。特に、局所の癌を有する患者の治療は、転移段階の癌患者の治療と著しく異なるものとなり得る。
【０００３】
免疫細胞学的アッセイの手順を含めた造血器官中の上皮細胞の検出による癌の拡散の発見に対する努力が古くからなされてきた。残念ながら、これらのアッセイに使用され、見かけ上上皮細胞に対して特異的である抗体が、造血器官に通常見られる細胞に交差反応性を示すために、これらの方法は、たいていは不正確である。故に、「正常造血細胞」が転移癌が存在しない状態でときに検出され、それ故にこれらのアッセイの手順により偽の陽性結果が得られ得る。加えて、免疫細胞学的アッセイは感度に欠け、造血器官中に低レベルの上皮細胞が実在するとき、偽の陰性結果を生じる可能性がある。したがって、免疫細胞学的アッセイの使用により早期の転移癌が誤診され得る。
【０００４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような核酸増幅反応の出現によって、造血器官に存在する上皮細胞が、蛋白質レベルに代わって核酸レベルで検出できるようになった。それ故に交差反応性を有する抗体に関連する問題は避けられるようになった。加えて、核酸増幅反応が、従来の抗体に基づくアッセイ法よりも著しく高感度であることはよく知られている。血流中の上皮細胞の検出のための増幅に基づくアッセイは、それ故に、転移癌の初期の発見のための免疫細胞学的アッセイに対し著しい利点をもたらした。
【０００５】
造血器官中の上皮細胞の検出に使用されるＰＣＲに基づくアッセイは文献で報告されてきた。これらのアッセイのほとんどは、上皮細胞の表面にある蛋白質の一種であるサイトケラチン１９（ＣＫ１９）をコードする核酸配列を標的にしている。しかし、偽遺伝子（ＣＫ１９遺伝子を綿密に模倣する核酸配列を含有する）がヒトゲノム中に存在する。従って、ＣＫ１９標的配列の検出のための増幅アッセイを開発する者が直面する一つの課題は、ＣＫ１９由来の配列を増幅し検出するが、密に関連する偽遺伝子を増幅し検出しないアッセイを設計することである。
【０００６】
加えて、増幅プライマー配列を、密に関連する配列とのコンピュータ上での比較に基づいて選択できることがよく知られている。理論上では、この方法で選択された配列を、核酸増幅の原理に従って使用するとき、選択された標的配列のコピーを効果的に生成するはずである。しかし、上記方法で選択された配列の理論上の効力にもかかわらず、多くの場合、このような配列が許容可能な量の増幅物を生成しないことは事実である。残念ながらこの現象は理解されていない。従って、最初はコンピュータープログラムを使ってプライマーをスクリーニングすることができても、このプライマーを実際に試験に使用するまで、効力を的確に決定することができない。
【０００７】
増幅物の検出のための微粒子捕捉に基づく検出法を使用するＰＣＲアッセイの設計者は、さらなる課題に直面している。特に、微粒子の補助によって検出される増幅された標的配列は十分に短いので、微粒子上に捕捉された増幅物は、さらなる増幅物の捕捉を妨げない。従って、微粒子の補助によって増幅物の検出を選択する者は、適当な標的配列の選択に関してさらなる制限に直面する。特に、適当な標的配列は、比較的短い配列とならざるを得ない。
【０００８】
従って、当該技術分野において、核酸増幅の原理に従って、微粒子ベースの検出技術を用いて、ＣＫ１９標的配列を検出するために使用され得る配列と方法が必要とされている。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、ＣＫ１９標的配列を特異的かつ高感度に検出するために使用可能な核酸配列を提供する。特に、本発明で使用されるプライマー配列は、配列番号２及び配列番号３で示される。本明細書において、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４として同定される配列は、配列番号２及び３によって生成された増幅物の検出のためのプローブとして使用される。上記配列の組み合わせは、末梢血中のＣＫ１９標的配列を検出するための増幅反応の実施に用いられる他の試薬と共に、キットとして提供される。
【００１０】
本明細書において配列番号１で示されるＣＫ１９標的配列は、核酸増幅試薬、ＣＫ１９標的配列を含む試験サンプル、及び配列番号２及び３を含むプライマーセットを含む反応混合物の形成によって増幅することができる。増幅後、増幅された標的配列を検出することができる。例えば、配列番号４、５、６及び７で示される任意のプローブ又は任意のプローブの組み合わせを用いて、増幅された標的配列にハイブリダイズさせ、プローブ／増幅物ハイブリッドを形成させ、その後それを微粒子捕捉技術により検出することができる。故に、プライマーもしくはプローブを標識し、増幅された標的配列を捕捉及び検出することができ、よって試験サンプル中の標的配列の存在を示すことができる。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
前に記載されたように、本発明は、試験サンプル中のＣＫ１９標的配列の増幅及び検出のための試薬、方法、キットを提供する。特に、配列番号２及び３を増幅プライマーとして使用して、本明細書において配列番号１と示されるＣＫ１９標的配列を増幅することができる。これらのプライマーが、微粒子捕捉及び検出技術で分析できる増幅物を特異的かつ高感度に生成することが発見された。配列番号４から７を有するプローブ配列を用いて、特異性を確実にして、増幅物を検出するすることができる。
【００１２】
本明細書で開示されたプライマー及びプローブ配列は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）および核酸類似物、例えば、国際特許出願ＷＯ９２／２０７０２に開示されたペプチド核酸（ＰＮＡ）または米国特許第５，１８５，４４４号、第５，０３４，０５６号及び第５，１４２，０４７号（これらは本明細書において引用文献として援用される）に記載されたモルホリノ類似体を含むが、これらに限定されない非荷電核酸類似物を含んでいても良い。このような配列は、現在利用可能な多様な技術を用いて、普通に合成され得る。例えば、ＤＮＡの配列は、従来の核酸ホスホアミダイド化学、及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＤｕＰｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手可能な機器を使用して合成され得る。同様に、所望ならば、配列は、米国特許第５，４６４，７４６号、第５，４２４，４１４号、及び第４，９４８，８８２号（本明細書において引用文献として援用される）に記載されているように、当該技術分野において周知の方法を使用して標識され得る。しかし、プライマーとして使用される配列は、少なくとも配列の３’末端にＤＮＡを含み、好ましくは完全にＤＮＡからなることは理解されよう。
【００１３】
本明細書で使用される「標的配列」は、検出され、増幅され、検出および増幅される核酸配列、あるいは本明細書において提供される配列の一つに相補的な核酸配列を意味する。標的配列という用語はときどき一本鎖と称されるが、当業者は、標的配列が実際は２本鎖であってもよいことを認めるであろう。
【００１４】
本明細書で使用される「試験サンプル」という用語は、標的配列を含有する疑いのある全てのものを意味する。試験サンプルは、任意の生物学的起源のもの、例えば血液、気管支肺胞洗浄液、唾液、咽頭スワブ、眼レンズ液、脳脊髄液、汗、痰、尿、乳、腹水、粘液、滑液、腹膜液、羊水、例えば心臓組織等の組織、または発酵ブロス、細胞培養物、化学反応混合物等に由来し得る。こうした試験サンプルは、（ｉ）そのような起源から得たままの状態で直接、あるいは（ｉｉ）サンプルの特性を変えるための前処理の後で使用することができる。したがって、例えば、血液からの血漿の調製、細胞の破壊、固体物質からの液体の調製、粘性流体の希釈、液体の濾過、液体の蒸留、液体の濃縮、阻害成分の不活性化、試薬の添加、核酸の精製などにより、試験サンプルを使用前に前処理することができる。
【００１５】
配列番号２及び３を、増幅プライマーとして使用し、当技術分野においてよく知られた増幅手順に従って、標的配列を増幅することができる。好ましくは、本明細書で提供される配列は、米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号（これらは本明細書に引用文献として採用される）に記載されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の原理に従って使用される。標的配列がＲＮＡである場合、逆転写段階が標的配列の増幅に含まれるべきであることは、当業者に理解されるであろう。Ｒｔ  ＴＨのような逆転写活性を有する酵素は、ＲＮＡ鋳型からＤＮＡ配列を合成することができる活性があることでよく知られている。逆転写ＰＣＲ（ＲＴ  ＰＣＲ）は、当該技術分野において周知であり、米国特許第５，３１０，６５２号及び第５，３２２，７７０号（これらは本明細書において引用文献として援用される）に記載されている。
【００１６】
従って、本発明における増幅方法は、通常、（ａ）核酸増幅試薬、配列番号２及び３、及び標的配列を含有すると疑われる試験サンプルを含む反応混合物を形成するステップ、及び（ｂ）混合物を増幅条件下に置き、標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも一コピーを生成するためのステップを含む。上記方法のステップ（ｂ）が、当該技術分野において周知なように、反応混合物の温度サイクルによって数回繰り返し得ることは理解されるであろう。
【００１７】
上記の記載のように、反応混合物は、ポリメラーゼ活性（及び必要に応じて逆転写活性）を有する酵素、マグネシウム、又はマンガンのような酵素補因子、塩、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、及び、例えばデオキシアデニン三リン酸、デオキシグアニン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸、及びデオキシチミン三リン酸などのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含むがこれらに限定されない周知の試薬を含む「核酸増幅試薬」を含む。
【００１８】
「増幅条件」とは、通常、プライマー配列の標的配列へのハイブリダイズ又はアニーリング及び、その後のプライマー配列の伸長を促進させる条件として定義される。このようなアニーリングが、いくつかのパラメーター（温度、イオン強度、配列の長さ、相補性、及び配列のＧ：Ｃ含有量など）に相当に予測可能な様態で依存することは、当該技術分野においてよく知られている。例えば、相補的な核酸配列の環境において、温度を低下させるとアニーリングは促進される。任意に与えられた配列のセットにおいて、融解温度、すなわちＴｍは、いくつかの既知の方法のいずれかによって推測することができる。典型的には、診断用途では、融解温度に近似（すなわち１０℃以内）のハイブリダイゼーション温度が使用される。イオン強度すなわち「塩」濃度も、小さい陽イオンがホスホジエステル骨格上の負電荷を打ち消すことによって二本鎖の形成を安定化する傾向があるため、融解温度に影響する。典型的な塩濃度は陽イオンの性質と原子価に依存するが、このことは当業者によってたやすく理解される。同様に、Ａ：Ｔ対が２つの水素結合を有するのに対して、Ｇ：Ｃ対は３つの水素結合を有することから、また、より長鎖の配列は、配列を共に保持する水素結合をより多く有することから、高Ｇ：Ｃ含有量及びより長い配列の長さが、二本鎖の形成を安定化することも良く知られている。従って、高Ｇ：Ｃ含有量およびより長鎖の配列は、融解温度の上昇によって、ハイブリダイゼーション条件に影響する。
【００１９】
ひとたび診断用途に対して配列が選択されれば、Ｇ：Ｃ含有量と長さは明らかにされ、ハイブリダイゼーション条件が包含するものを正確に決定するために利用され得る。イオン強度は一般的に酵素活性のために最適化されるため、変化させる残った唯一のパラメーターは温度である。一般的に、ハイブリダイゼーション温度は、プローブ又はプライマーのＴｍもしくはその近似値で選択される。従って、特定のプライマー、プローブ、もしくはプライマーとプローブのセットに適当なハイブリダイゼーション条件を獲得することは、当該技術分野の研究者が有する通常の技術の範囲内で十分可能である。
【００２０】
上記方法で産出された増幅物は、ＣＫ１９標的配列の増幅中又はその後に検出され得る。増幅中に標的配列の増幅を検出する方法は、米国特許第５，２１０，０１５号（これは本明細書において引用文献として援用される）に記載されている。増幅反応完了後の反応生成物の検出のためにゲル電気泳動が使用され得る。しかし好ましくは、増幅物は他の反応成分から分離され、微粒子および標識プローブを使用し検出される。故に、増幅されたＣＫ１９標的配列の検出方法は、（ａ）標的配列に相補的な核酸配列に、少なくとも一つのハイブリダイゼーションプローブをハイブリダイズし、プローブ及び標的配列と相補的な核酸配列を含むハイブリッドを形成し、（ｂ）ハイブリッドを試験サンプル中の標的配列の存在の指標として検出するステップを含む。
【００２１】
上記方法によって形成されたハイブリッドは、微粒子及びこのようなハイブリッドの分離と検出に使用され得るラベルを使用し検出され得る。好ましくは、検出は、市販のＡｂｂｏｔｔ  ＬＣＸ（登録商標）装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）によって使用されるプロトコルに従って実施される。
【００２２】
本明細書で使用される「ラベル」という用語は、検出可能な特性もしくは特徴を有する分子もしくは部分耕造（ｍｏｉｅｔｙ）を意味する。ラベルは、例えば放射性同位体、蛍光体、化学発光体、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子等を使用して直接的に検出できる。また、例えば特異的結合メンバーを使用して間接的に検出できる。直接的に検出可能なラベルは、さらなる要素、例えば基質、誘発試薬、光線、その他ラベルの検出を可能とするものを必要とする可能性もあることが理解されるであろう。間接的に検出可能なラベルが使用されるときは、一般的に「コンジュゲート」と組み合わせて使用される。コンジュゲートは、一般的に、直接的に検出可能なラベルに接着もしくは結合している特異的結合メンバーである。コンジュゲート合成におけるカップリングケミストリーは、当該技術分野においてよく知られており、例えば、特異的結合メンバーの特異的結合特性もしくはラベルの検出可能特性を破壊しない任意の化学的手法及び／又は物理的手法を含むことができる。本明細書で使用される「特異的結合メンバー」は、結合対、すなわち、一方の分子が例えば化学的もしくは物理的手段により特異的に他方の分子に結合する２つの異なる分子のうちの一つのメンバーを意味する。抗原と抗体の特異的結合体に加え、その他の結合対としてアビジンとビオチン、ハプテンとハプテンに対して特異的な抗体、相補的な核酸配列、酵素補因子もしくは基質と酵素等が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
「微粒子」は、不溶性であるか、もしくは後の反応によって不溶化され、粒子形状を有する任意の材料を示す。従って、微粒子は、ラテックス、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性もしくは非磁性金属、ガラス、シリコン等であってよい。非常に数多くの微粒子形態のものもよく知られており、ビーズ、シェービング、グレインや当業者に知られたその他の粒子を含むがこれらに限定されるものではない。本発明の微粒子は、好ましくは０．１μＭ〜１μＭのサイズであり、より好ましくは０．３μＭ〜０．６μＭのサイズである。
【００２４】
一態様としては、ハイブリッドは、検出を容易にするためにラベルをプライマー及び／またはプローブ配列内に組み込むことによって検出され得る。故に、プライマー及びプローブに接着した第一及び第二の特異的結合メンバーを用いて、ハイブリッドを微粒子に固定し、コンジュゲートの補助により微粒子の存在を検出することができる。
【００２５】
別の態様としては、特異的結合メンバーと直接的に検出可能なラベルの組み合わせは、ハイブリッドの検出のために使用され得る。例えば、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーで標識されたプライマーを使ってハイブリッドに導入され得る。直接的に検出可能なラベルは、直接的に検出可能なラベルで標識されたプローブを使ってハイブリッドに組み込まれ得る。故に、ハイブリッドを、特異的結合メンバーを使って微粒子に固定化し、プローブ上のラベルの効力により直接検出することができる。他の検出形態が当業者にとって適宜選択されるものであることが理解されよう。
【００２６】
好ましい態様としては、米国特許出願番号０８／５１４，０７４（１９９５年８月１４日出願、本明細書において引用文献として援用される）に記載の「オリゴヌクレオチドハイブリゼーションＰＣＲ」（本明細書ではときに「ＯＨ  ＰＣＲ」と示される）増幅反応が、ＣＫ１９標的配列の検出に使用される。すなわち、好ましい方法で使用される試薬は、少なくとも一つの増幅プライマー及び少なくとも一つの内部ハイブリダイゼーションプローブ、さらに増幅反応を実施するための増幅試薬を含む。
【００２７】
プライマー配列は、標的配列（もしくはその相補体）のコピーの伸長を開始するために使用され、捕捉ラベル又は検出ラベルのいずれかによっても標識される。プローブ配列は、プライマー配列によって生成される配列とハイブリダイズするために使用され、一般的にプライマー配列を含まない配列とハイブリダイズする。プライマー配列と同様に、プローブ配列も捕捉ラベル又は検出ラベルのどちらかによって標識されるが、ただし、プライマーが捕捉ラベルにより標識されたときには、プローブは検出ラベルで標識され、プライマーが検出ラベルで標識されたときには、プローブは補足ラベルで標識される。検出ラベルは、前に定義された「ラベル」と同じ定義であり、「捕捉ラベル」は、一般的に、伸長物及びこのような任意の生成物と結合したプローブを他の増幅反応物から分離させるために用いられる。（前に定義された）特異的結合メンバーは、この目的によく通合している。また、この方法によって使用されるプローブは、好ましくは３’末端で阻止されるので、ハイブリダイゼーション条件下で伸長しない。プローブの伸長を妨げる方法は、当業者に良く知られ、適宜選択されるものである。一般的に、プローブの３’末端へのリン酸基の添加は、プローブの伸長を阻止する目的を十分に果たす。
【００２８】
プローブが初期には反応混合物の成分であるという上記の好ましい態様によれば、プライマー、プローブ、および増幅条件を選択して、プローブ配列がプライマー配列より低い融解温度を有するようにし、反応混合物を増幅条件下に置くと、標的配列もしくはその相補体のコピーがプローブのＴｍより高い温度で生成されるようにするのが好ましい。このようなコピーを合成した後、変性し、混合物を冷却して、プローブと標的もしくはその相補体の任意のコピーとの間のハイブリッド形成を可能にする。変性温度からプローブが一本鎖のコピーと結合する温度への温度低下速度は、好ましくはかなり急速であり（例えば８〜１５分間）、特に、ポリメラーゼ活性を有する酵素がプライマーの伸長に対して活性を持つ温度範囲にわたる。このような急速な冷却は、プライマー／コピー配列ハイブリダイゼーションおよび伸長反応よりむしろコピー配列／プローブハイブリダイゼーションに有利に働く。
【００２９】
以下に記載の実施例は、本発明をさらに例示するものであり、本発明を限定するものではない。
【００３０】
（実施例）
以下の実施例は、本明細書で提供されるＤＮＡオリゴマープライマーとプローブを使用した、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）の検出を示す。これらのＤＮＡプライマーおよびプローブは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８として同定され、ＣＫ１９遺伝子内のある領域に特異的である。ＣＫ１９遺伝子標的の部分は、配列番号１と示される。
【００３１】
以下の実施例において、配列番号２、配列番号３、および配列番号８は、ＣＫ１９遺伝子に特異的な増幅プライマーとして使用される。配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７は、ＣＫ１９遺伝子増幅物の内部ハイブリダイゼーションプローブとして使用される。
【００３２】
実施例１．ＣＫ１９プライマーおよびプローブの調製
Ａ．ＣＫ１９プライマー
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションＰＣＲによりＣＫ１９遺伝子標的配列を増幅し検出する標的特異的プライマーおよびプローブを設計した。これらのプライマーは、配列番号２、配列番号３、および配列番号８である。プライマー配列は、標準的なオリゴヌクレオチド合成法により合成され、米国特許第５，４２４，４１４（本明細書において引用文献として援用する）に記載された標準的なシアノエチルホスホルアミダイトカップリング化学により５’末端においてアダマンタンでハプテン化された。
【００３３】
Ｂ．ＣＫ１９プローブ
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによりＣＫ１９標的配列とハイブリダイズする検出プローブを設計した。これらのプローブは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７である。プローブ配列は、標準的なオリゴヌクレオチド合成法により合成され、米国特許第５，４６４，７４６（本明細書において引用文献として援用する）に記載された標準的なシアノエチルホスホルアミダイトカップリング化学により３’末端において２つのカルバゾールでハプテン化された。
【００３４】
実施例２．ＣＫ１９ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡの調製
ＣＫ１９ＲＮＡは、アメリカンタイプカルチャーコレクション、ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１３３、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄから得られるＴ４７Ｄ腺管癌細胞系から抽出された。
【００３５】
ＲＮＡは、Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬を製品の指示書に従い使用して、Ｔ４７Ｄ細胞培養物から抽出、精製された。精製ＲＮＡは、２６０ｎｍの吸光度と、４０の吸光係数を使用し分光光度測定法により定量し、または細胞当たりの量で定量した。
【００３６】
ｃＤＮＡは、（上記方法で調製された）１〜１０×１０５の細胞から精製されたＲＮＡを、２．５ユニットＭｕＬＶ逆転写酵素と共に、いずれも１ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、０．５ユニットのＲＮａｓｅ阻害剤、および２．５μＭオリゴｄ（Ｔ）１６を含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２バッファー中で、４２℃で３０分間インキュベートすることにより調製した。次いで９９℃で５分間加熱し、４℃で５分間冷却し、４℃で保存した。
【００３７】
実施例３．ＣＫ１９の検出
Ａ．ＣＫ１９ｃＤＮＡの検出
（実施例２に記載の方法で調製された）Ｔ４７Ｄ細胞系からのｃＤＮＡを、水１０μｌに対して１細胞に相当するように希釈した。配列番号２および配列番号３をプライマーとし、配列番号４、及び配列番号５を検出プローブとして使用して希釈されたｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し検出した。すべての反応は、５０ｍＭ  Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］グリシン、８１．７ｍＭ  酢酸カリウム、３３．３３ｍＭ  水酸化カリウム、０．０１ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン、０．１ｍＭ  エチレンジアミンテトラ酢酸、０．０２ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム、および８％（ｗ／ｖ）グリセロールを含有する１９０μｌのバッファー中（ｐＨ８．１５）で実施した。反応混合物は、５ユニット／反応の濃度の組換えＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼを、いずれも０．１５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＣＴＰと共に使用した。配列番号２は２５０ｎＭの濃度で使用し、配列番号３は５００ｎＭの濃度で使用し、またどちらのプローブも１０ｎＭで存在した。１０μｌサンプルを添加する直前に、１．６３ｍＭの最終濃度で塩化マンガンを添加した。陰性対照として水およびヒト胎盤ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用い３回繰り返して試験を行った。
【００３８】
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ４８０  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用いて９４℃  ４０秒間と５８℃  ６０秒間を４５サイクルくり返すことにより反応混合物をＰＣＲ増幅した。反応物の温度サイクルをくり返した後、混合物を９７℃で５分間維持し、プローブオリゴハイブリダイゼーションを１２℃で５分間冷却することにより完成させた。プローブのハイブリダイゼーションの後、サンプルを試験されるまで１２℃に保った。
【００３９】
反応生成物を、Ａｂｂｏｔｔ  ＬＣｘ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬより入手可）によって検出した。抗カルバゾール抗体でコートした微粒子および抗アダマンタン抗体／アルカリホスファターゼコンジュゲート（これらはすべてＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬより入手可）の懸濁液を、ＬＣｘ（登録商標）と共に用い、反応生成物の捕捉、検出を行った。この実験で得られる平均値（カウント／秒／秒；c/s/sの単位で算出される）および標準偏差（ＳＤ）は表１に示され、Ｔ４７Ｄ細胞一個の同等物からのＣＫ１９ｃＤＮＡの特異的検出を示している。
【００４０】
【表１】
0004806150.tif 000002
【００４１】
付け加えるならば、上記の温度サイクルステップの直後、少量のサンプルをオリゴハイブリダイゼーション前に取り除き、２％アガロースゲル上でＳＹＢＲ（登録商標）グリーンで染色して目視した。ゲルは予想される１５２塩基対の生成物を示した（データは示さず。）
【００４２】
Ｂ．ＲＮＡまたはｃＤＮＡからのＣＫ１９の検出感度
実施例２に示す方法でＴ４７Ｄ細胞系から精製されたＲＮＡを、反応あたり１×１０４から１×１０−４細胞になるように水で１０倍ごとに希釈し、その後、上記実施例３．Ａに示された反応混合物で６０℃で３０分間初期インキュベートすることにより、逆転写した。次いでサンプルをＰＣＲ増幅し、実施例３．Ａの方法で検出した。試験は水を陰性対照として３回行われた。
【００４３】
Ｔ４７Ｄ細胞系からのｃＤＮＡを開始材料として使用して、上記のものを、実施例２に示す方法で調製し、反応あたり１×１０３から１×１０−４細胞となるよう水で１０倍ごとに希釈したｃＤＮＡと比較した。反応混合物をＰＣＲ増幅し実施例３．Ａの方法で検出した。
【００４４】
この実験で得られる平均値（カウント／秒／秒；c/s/sの単位で算出される）および標準偏差（ＳＤ）は表２に示され、開始サンプルとしてＲＮＡを用いると反応あたり１×１０−４細胞程度の低い濃度でＴ４７Ｄ細胞からのＣＫ１９を検出し、開始サンプルとしてｃＤＮＡを用いると、反応あたり１×１０−３細胞程度の低濃度でＴ４７Ｄ細胞からのＣＫ１９を検出することを示している。従って、これらのプライマーとプローブを使用したこの方法により、ＲＮＡとｃＤＮＡいずれかを開始サンプルとしてもＣＫ１９の検出が可能となる。これはｃＤＮＡが以外に早く効果的に調製され、容易に保存され、より安定であり、分解の危険性が少ないことから、臨床研究室の実験において重要となり得る。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
実施例４．１つおよび２つのプローブによるＣＫ１９の検出の比較
実施例２の方法で調製された精製Ｔ４７ＤｃＤＮＡを、水で反応あたり０．０２５細胞に希釈した。その後、ｎ＝３でＰＣＲ増幅を行い、実施例３Ａに示されたように配列番号４、配列番号５検出プローブの両方を使用し、もしくは配列番号５のみを単一検出プローブとして使用して検出した。水とヒト胎盤ＤＮＡを陰性対照として使用した。
【００４７】
この実験で得られる平均値（カウント／秒／秒；c/s/sの単位で算出される）および標準偏差（ＳＤ）は表３に示され、両方のプローブを使用すると、アッセイのバックグラウンドを増加させずにシグナルを増加させる結果となることを示唆している。従って、ただ一つのプローブを使用する代わりに両方のプローブを使用することが、ＣＫ１９の検出において有利である。
【００４８】
【表３】
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【００４９】
実施例５．プライマーの長さの比較
配列番号３プライマーと、さらに２つのヌクレオチドを含んでいる配列番号８プライマーの使用について比較を行った。実施例２の方法で調製された精製Ｔ４７ＤｃＤＮＡを、水で反応あたり０．０５細胞に希釈した。その後、サイクル条件が９４℃  ４０秒間と５８℃  ８０秒間の４５サイクルに変えたことを除く実施例３．Ａの方法で、ｎ＝６でＰＣＲ増幅した。反応混合物は、実施例３．Ａに示すとおりで、配列番号２プライマーと、配列番号３もしくは配列番号８プライマーのいずれかを使用した。陰性対照として水とヒト胎盤ＤＮＡをｎ＝３で試験した。反応生成物を実施例３．Ａに示す方法で検出した。
【００５０】
この実験で得られるデータは表４に示され、配列番号３プライマーの代わりに配列番号８プライマーを用いると、ヒト胎盤ＤＮＡでのバックグラウンドが上がり、したがって特異性を喪失するため、アッセイに不利益をあたえることを示唆している。
【００５１】
【表４】
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【００５２】
本発明は特定の実施態様に関して詳細に記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、そのような実施態様に種々の変更および修飾を加えうることは、当業者には明らかであろう。
【配列表】
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