(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から前記ＧＬＰ−１ペプチドを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程：
前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤及び水から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分による溶離及び／あるいは線形もしくは階段式ｐＨ勾配又は一定のｐＨ値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該ｐＨ勾配又はｐＨ値は、前記ＧＬＰ−１ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる局部又は総合的な正の正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるｐＨ範囲内にあり；
前記有機改質剤がＣ１−６−アルカノール及びＣ２−６グリコールから選ばれる、
方法。
【請求項２】
溶離が、有機改質剤、水及び塩成分から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分によるもの及び／あるいは線形もしくは階段式ｐＨ勾配又は一定のｐＨ値によるものであり、ここで当該ｐＨ勾配又はｐＨ値は、前記ＧＬＰ−１ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる局部又は総合的な正の正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるｐＨ範囲内にあり；
前記有機改質剤がＣ１−６−アルカノール及びＣ２−６グリコールから選ばれる、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
溶離が、有機改質剤、水及び緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分によるもの及び／あるいは線形もしくは階段式ｐＨ勾配又は一定のｐＨ値によるものであり、ここで当該ｐＨ勾配又はｐＨ値は、前記ＧＬＰ−１ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる局部又は総合的な正の正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるｐＨ範囲内にあり；
前記有機改質剤がＣ１−６−アルカノール及びＣ２−６グリコールから選ばれる、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
溶離が、有機改質剤、水、塩成分及び緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分によるもの及び／あるいは線形もしくは階段式ｐＨ勾配又は一定のｐＨ値によるものであり、ここで当該ｐＨ勾配又はｐＨ値は、前記ＧＬＰ−１ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる局部又は総合的な正の正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるｐＨ範囲内にあり；
前記有機改質剤がＣ１−６−アルカノール及びＣ２−６グリコールから選ばれる、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から前記ＧＬＰ−１ペプチドを精製するための陰イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程：
前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤及び水から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分による溶離及び／あるいは線形もしくは階段式ｐＨ勾配又は一定のｐＨ値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該ｐＨ勾配又はｐＨ値は、前記ＧＬＰ−１ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる局部又は総合的な負の正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるｐＨ範囲内にあり；
前記有機改質剤がＣ１−６−アルカノール及びＣ２−６グリコールから選ばれる、
方法。
【請求項６】
溶離が、有機改質剤、水及び塩成分から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分によるもの及び／あるいは線形もしくは階段式ｐＨ勾配又は一定のｐＨ値によるものであり、ここで当該ｐＨ勾配又はｐＨ値は、前記ＧＬＰ−１ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる局部又は総合的な負の正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるｐＨ範囲内にあり；
前記有機改質剤がＣ１−６−アルカノール及びＣ２−６グリコールから選ばれる、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
溶離が、有機改質剤、水及び緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分によるもの及び／あるいは線形もしくは階段式ｐＨ勾配又は一定のｐＨ値によるものであり、ここで当該ｐＨ勾配又はｐＨ値は、前記ＧＬＰ−１ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる局部又は総合的な負の正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるｐＨ範囲内にあり；
前記有機改質剤がＣ１−６−アルカノール及びＣ２−６グリコールから選ばれる、
請求項５に記載の方法。
【請求項８】
溶離が、有機改質剤、水、塩成分及び緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分によるもの及び／あるいは線形もしくは階段式ｐＨ勾配又は一定のｐＨ値によるものであり、ここで当該ｐＨ勾配又はｐＨ値は、前記ＧＬＰ−１ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる局部又は総合的な負の正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるｐＨ範囲内にあり；
前記有機改質剤がＣ１−６−アルカノール及びＣ２−６グリコールから選ばれる、
請求項５に記載の方法。
【請求項９】
近縁の不純物が、ＧＬＰ−１ペプチドとは異なる局部又は総合的な正味の電荷を有する不純物であり、切頭型、伸長型、追加のアミノ酸を伴う型、脱アミド型、不適切に折りたたまれた型、所望されないグリコシル化を有する型及びシアル化を有する型からなる群から選ばれる請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
精製すべき前記ＧＬＰ−１ペプチドがＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド並びにその類似体及び誘導体から選ばれる、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
精製すべき前記ＧＬＰ−１ペプチドがＡｒｇ３４ＧＬＰ−１（７−３７）；Ａｒｇ２６ＧＬＰ−１（７−３７）；Ａｒｇ３４Ｌｙｓ２６（Ｎε−（γ−Ｇｌｕ−（Ｎα−テトラデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３７）；Ａｒｇ３４Ｌｙｓ２６（Ｎε−（γ−Ｇｌｕ−（Ｎα−ヘキサデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３７）；Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３４（Ｎα−（γ−Ｇｌｕ−（Ｎα−テトラデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３７）；Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３４（Ｎε−（γ−Ｇｌｕ−（Ｎα−ヘキサデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｖａｌ8ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｔｈｒ8ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｍｅｔ8ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｇｌｙ8ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｖａｌ8ＧＬＰ−１（７−３６）アミド；Ｔｈｒ8ＧＬＰ−１（７−３６）アミド；Ｍｅｔ8ＧＬＰ−１（７−３６）アミド；Ｇｌｙ8ＧＬＰ−１（７−３６）アミドから選ばれる、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
精製すべき前記ＧＬＰ−１ペプチドが、ＧＬＰ−１（７−３７）；ＧＬＰ−１（７−３６）アミド；Ａｒｇ３４ＧＬＰ−１（７−３７）；Ａｒｇ２６ＧＬＰ−１（７−３７）；Ａｒｇ３４Ｌｙｓ２６（Ｎε−（γ−Ｇｌｕ−（Ｎα−テトラデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３７）；Ａｒｇ３４Ｌｙｓ２６（Ｎε−（γ−Ｇｌｕ−（Ｎα−ヘキサデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３７）；Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３４（Ｎα−（γ−Ｇｌｕ−（Ｎα−テトラデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３７）；Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３４（Ｎε−（γ−Ｇｌｕ−（Ｎα−ヘキサデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｖａｌ8ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｔｈｒ8ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｍｅｔ8ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｇｌｙ8ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｖａｌ8ＧＬＰ−１（７−３６）アミド；Ｔｈｒ8ＧＬＰ−１（７−３６）アミド；Ｍｅｔ8ＧＬＰ−１（７−３６）アミド；Ｇｌｙ8ＧＬＰ−１（７−３６）アミドから選ばれる、請求項１又は５に記載の方法。
【請求項１３】
前記有機改質剤、対、水の比が重量パーセント基準で１：９９〜９９：１である、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記有機改質剤、対、水の比が重量パーセント基準で３０：７０〜７０：３０である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記有機改質剤、対、水の比が重量パーセント基準で３５：５０〜５０：３５である、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記有機改質剤、対、水の比が重量パーセント基準で４０：５０〜５０：４０である、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
前記有機改質剤がＣ１−６−アルカノール、及びヘキシレングリコールから選ばれる、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
有機改質剤がＣ１−６−アルカノールである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記有機改質剤がエタノール、２−プロパノール及び２−メチル−２，４−ペンタンジオールからなる群から選ばれる請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記有機改質剤がＣ２−６−グリコールである、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
有機改質剤がヘキシレングリコールである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ＧＬＰ−２ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から前記ＧＬＰ−２ペプチドを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程：
前記混合物の前記ＧＬＰ−２ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤及び水から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分による溶離及び／あるいは線形もしくは階段式ｐＨ勾配又は一定のｐＨ値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該ｐＨ勾配又はｐＨ値は、前記ＧＬＰ−２ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる局部又は総合的な正の正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるｐＨ範囲内にあり；
前記有機改質剤がＣ１−６−アルカノール及びＣ２−６グリコールから選ばれる、
方法。
【請求項２３】
溶離が、有機改質剤、水及び塩成分から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分によるもの及び／あるいは線形もしくは階段式ｐＨ勾配又は一定のｐＨ値によるものであり、ここで当該ｐＨ勾配又はｐＨ値は、前記ＧＬＰ−１ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる局部又は総合的な正の正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるｐＨ範囲内にあり；
前記有機改質剤がＣ１−６−アルカノール及びＣ２−６グリコールから選ばれる、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
溶離が、有機改質剤、水及び緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分によるもの及び／あるいは線形もしくは階段式ｐＨ勾配又は一定のｐＨ値によるものであり、ここで当該ｐＨ勾配又はｐＨ値は、前記ＧＬＰ−１ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる局部又は総合的な正の正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるｐＨ範囲内にあり；
前記有機改質剤がＣ１−６−アルカノール及びＣ２−６グリコールから選ばれる、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
溶離が、有機改質剤、水、塩成分及び緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分によるもの及び／あるいは線形もしくは階段式ｐＨ勾配又は一定のｐＨ値によるものであり、ここで当該ｐＨ勾配又はｐＨ値は、前記ＧＬＰ−１ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる局部又は総合的な正の正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるｐＨ範囲内にあり；
前記有機改質剤がＣ１−６−アルカノール及びＣ２−６グリコールから選ばれる、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ＧＬＰ−２ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から前記ＧＬＰ−２ペプチドを精製するための陰イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程：
前記混合物の前記ＧＬＰ−２ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤及び水から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分による溶離及び／あるいは線形もしくは階段式ｐＨ勾配又は一定のｐＨ値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該ｐＨ勾配又はｐＨ値は、前記ＧＬＰ−２ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる局部又は総合的な負の正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるｐＨ範囲内にあり；
前記有機改質剤がＣ１−６−アルカノール及びＣ２−６グリコールから選ばれる、
方法。
【請求項２７】
溶離が、有機改質剤、水及び塩成分から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分によるもの及び／あるいは線形もしくは階段式ｐＨ勾配又は一定のｐＨ値によるものであり、ここで当該ｐＨ勾配又はｐＨ値は、前記ＧＬＰ−１ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる局部又は総合的な負の正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるｐＨ範囲内にあり；
前記有機改質剤がＣ１−６−アルカノール及びＣ２−６グリコールから選ばれる、
請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
溶離が、有機改質剤、水及び緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分によるもの及び／あるいは線形もしくは階段式ｐＨ勾配又は一定のｐＨ値によるものであり、ここで当該ｐＨ勾配又はｐＨ値は、前記ＧＬＰ−１ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる局部又は総合的な負の正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるｐＨ範囲内にあり；
前記有機改質剤がＣ１−６−アルカノール及びＣ２−６グリコールから選ばれる、
請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
溶離が、有機改質剤、水、塩成分及び緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分によるもの及び／あるいは線形もしくは階段式ｐＨ勾配又は一定のｐＨ値によるものであり、ここで当該ｐＨ勾配又はｐＨ値は、前記ＧＬＰ−１ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる局部又は総合的な負の正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるｐＨ範囲内にあり；
前記有機改質剤がＣ１−６−アルカノール及びＣ２−６グリコールから選ばれる、
請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
近縁の不純物が、ＧＬＰ−１ペプチドとは異なる局部又は総合的な正味の電荷を有する不純物であり、切頭型、伸長型、追加のアミノ酸を伴う型、脱アミド型、不適切に折りたたまれた型、所望されないグリコシル化を有する型及びシアル化を有する型からなる群から選ばれる請求項２２〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
精製すべき前記ＧＬＰ−２ペプチドがＧＬＰ−２（１−３３）及びＧＬＰ−２（１−３４）並びにその類似体及び誘導体から選ばれる、請求項２２〜３０のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
精製すべき前記ＧＬＰ−２ペプチドが、ｈＧＬＰ−２、ＧＬＰ−２（１−３０）；ＧＬＰ−２（１−３１）；ＧＬＰ−２（１−３２）；ＧＬＰ−２（１−３３）；ＧＬＰ−２（１−３４）；ＧＬＰ−２（１−３５）；Ｌｙｓ２０ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ２０Ａｒｇ３０ＧＬＰ−２（１−３３）；Ａｒｇ３０Ｌｙｓ３４ＧＬＰ−２（１−３４）；Ａｒｇ３０Ｌｙｓ３５ＧＬＰ−２（１−３５）；Ａｒｇ３０，３５Ｌｙｓ２０ＧＬＰ−２（１−３５）；Ａｒｇ３５ＧＬＰ−２（１−３５）；Ｌｙｓ２０（Ｎε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ２０，３０ｂｉｓ（Ｎε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ２０（Ｎε−テトラデカノイル）Ａｒｇ３０ＧＬＰ−２（１−３３）；Ａｒｇ３０Ｌｙｓ３５（Ｎε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３５）；Ａｒｇ３０，３５Ｌｙｓ２０（Ｎε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３５）；Ａｒｇ３５Ｌｙｓ３０（Ｎε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３５）；Ａｒｇ３０Ｌｙｓ３４（Ｎε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３４）；Ｌｙｓ２０（Ｎε−（ω―カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ２０、３０−ｂｉｓ（Ｎε−（ω―カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ２０（Ｎε−（ω―カルボキシノナデカノイル））Ａｒｇ３０ＧＬＰ−２（１−３３）；Ａｒｇ３０Ｌｙｓ３５−（Ｎε−（ω―カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３５）；Ｌｙｓ３０（Ｎε−（γ―グルタミル（Ｎα−テトラデカノイル）））ｈＧＬＰ−２；Ａｒｇ３０，３５Ｌｙｓ２０（Ｎε−（ω―カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３５）；Ａｒｇ３５Ｌｙｓ３０（Ｎε−（ω―カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３５）；及びＡｒｇ３０Ｌｙｓ３４（Ｎε−（ω―カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３４）から選ばれる、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記有機改質剤、対、水の比が重量パーセント基準で１：９９〜９９：１である、請求項２２〜３２のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
前記有機改質剤、対、水の比が重量パーセント基準で３０：７０〜７０：３０である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記有機改質剤、対、水の比が重量パーセント基準で３５：５０〜５０：３５である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記有機改質剤、対、水の比が重量パーセント基準で４０：５０〜５０：４０である、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記有機改質剤がＣ１−６−アルカノール、及びヘキシレングリコールから選ばれる、請求項２２〜３６のいずれか１項記載の方法。
【請求項３８】
有機改質剤がＣ１−６−アルカノールである、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
有機改質剤がエタノール、２−プロパノール及び２−メチル−２，４−ペンタンジオールからなる群から選ばれる請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
有機改質剤がＣ２−６−グリコールである、請求項２２〜３６のいずれか１項記載の方法。
【請求項４１】
有機改質剤がヘキシレングリコールである、請求項４０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明はＧＬＰ−１及び近縁の不純物を含む混合物からＧＬＰ−１又はその類似体もしくは誘導体を精製するためのイオン交換クロマトグラフィー方法、並びにかかるイオン交換クロマトグラフィー方法を含む工業的方法に関連する。
【０００２】
背景
タンパク質及びペプチドの精製及び分析のためにクロマトグラフィーはよく知られ且つ幅広く利用されている方法である。多種多様なクロマトグラフィー原理、とりわけイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）の原理が応用されている。ＩＥＣ原理には、イオン交換樹脂上のリガンドの電荷に従って陰イオン交換と陽イオン交換といった二通りのアプローチが含まれる。慣用のＩＥＣ精製工程は通常１又は複数回の平衡化段階、適用又は装填段階、洗浄段階、溶出段階及び再生段階から成る（Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990又はRemington : The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition (1995) 参照のこと）。
【０００３】
工業的精製方法におけるＩＥＣの溶離の主たる原理は一定のpHでの水性緩衝溶液内での階段又は線形勾配のいずれかでの塩成分勾配である（S. Bjorn and L. Thim, Activation of Coagulation Factor VII to VIIa, Res. Discl. No. 269, 564-565, 1986参照のこと）。イソクラティック溶離も考えられているが、めったに利用されていない。有機溶媒又は改質剤がタンパク質又はペプチドを所望の形態又は単に溶液状に保つために溶液によく添加されている（K.H. Jorgensen, Process for Purifying Insulin, US Patent No. 3,907,676, Sept. 23, 1975 ; 及びJ. Brange, O. Hallund and E. Sorensen, Chemical Stability of Insulin 5. Isolation, Characterisation and Identification of Insulin Transformation Products, Acta Pharm. Nord. 4 (4), 223-232, 1992参照）。
【０００４】
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）（Schmidtら、Diabetologia 28 704-707, 1985）並びにその類似体及び誘導体はＷＯ９８／０８８７１に開示のように糖尿病の処置に利用されうる。ＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の類似体は水性溶媒の中に容易に溶解し、そして単量体で保たれる。しかしながら、水性溶媒中での塩勾配によるＧＬＰ−１の伝統的なＩＥＣ精製は、ＧＬＰ−１標的成分と近縁の不純物との間での選択性の欠如を理由に困難な場合がある。
【０００５】
ＷＯ８７／０６９４１号（The General Hospital Corporation）はＧＬＰ−１（７−３７）及びその機能性誘導体を含むペプチドフラグメント、並びに向インスリン薬としてのその利用を開示する。
【０００６】
ＷＯ９０／１１２９６号（The General Hospital Corporation）は、ＧＬＰ−１（７−３６）及びその機能性誘導体を含んで成り、且つＧＬＰ−１（１−３６）又はＧＬＰ−１（１−３７）の向インスリン活性を超える向インスリン活性を有するペプチドフラグメント、並びに向インスリン薬としてのその利用を開示する。
【０００７】
ＷＯ９１／１１４５７号（Buckleyら）は活性ＧＬＰ−１ペプチド７−３４、７−３５、７−３６及び７−３７の類似体を開示する。
【０００８】
ＷＯ９８／０８８７１号は少なくとも１個のアミノ酸残基に親油性置換基の結合してＧＬＰ−１誘導体を開示する。その親油性置換基は詳しくは、例えば１２〜２４個の炭素原子を含む長鎖基である。
【０００９】
ＷＯ９８／０８８７２号は少なくとも１個のアミノ酸残基に親油性置換基の結合したＧＬＰ−２誘導体を開示する。この親油性置換基は詳しくは、例えば１２〜２４個の炭素原子を含む長鎖基である。
【００１０】
ＷＯ９６／３２４１４号はＧＬＰ−２類似体を開示する。
【００１１】
ＥＰ  ０６９９６８６−Ａ２（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏ．）は生物学的に活性であると報告されているＧＬＰ−１の所定のＮ末端切頭型フラグメントを開示する。
【００１２】
ＥＰ  ０７０８１７９−Ａ２（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏ．）はＮ末端イミダゾール基及び任意的に３４位のリジン残基に結合した枝分れしていないＣ6 −Ｃ10アシル基を含むＧＬＰ−１類似体及び誘導体を開示する。
【００１３】
発明の説明
１又は複数回の平衡化段階、適用又は装填段階、洗浄段階、溶離段階及び再生段階から成る任意のタンパク質又はペプチドの精製のための上記のＩＥＣ技術とは対照的に、本発明はＩＥＣによるＧＬＰ−１ペプチド及び全ての近縁の類似体の精製のための有機改質剤の利用に関連する。ＩＥＣ精製工程の溶離段階への有機改質剤の添加により、陰イオン及び陽イオン交換クロマトグラフィーの双方で、水性緩衝剤で行った場合と比べ、選択性及び効率性の上昇が図られる。平衡用の溶液及び適用サンプルは有機改質剤を含んでも含まなくてもよい。有機改質剤の利用には、水性クロマトグラフィーシステムと比べ、特に陽イオン交換クロマトグラフィーに関し、溶離のために塩が必要でない又は極めて低い濃度で十分といった更なる利点がある。
【００１４】
広い観点において、本発明はペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から前記ペプチドを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程：
前記混合物の前記ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる正の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法に関連する。
【００１５】
別の広い観点において、本発明はペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から前記ペプチドを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程：
前記混合物の前記ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる正の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法に関連する。
【００１６】
別の広い観点において、本発明はペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から前記ペプチドを精製するための陰イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程：
前記混合物の前記ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる負の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法に関連する。
【００１７】
別の広い観点において、本発明はペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から前記ペプチドを精製するための陰イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程：
前記混合物の前記ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる負の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法に関連する。
【００１８】
本発明の態様において、精製すべきペプチドはポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、レセプター、ビラ（ｖｉｒａ）、並びにその相同体、類似体及び誘導体、好ましくはグルカゴン、ｈＧＨ、インスリン、アプロチニン、第VII 因子、ＴＰＡ、第VIIａ 因子（Novo Seven（登録商標）、Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmarkより入手可能）、第VIIａｉ 因子、ＦＦＲ−第VIIａ 因子、ヘパリナーゼ、ＡＣＴＨ、ヘパリン結合性タンパク質、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、アンギオテンシン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、インスリン様成長因子−１、インスリン様成長因子−２、線維芽細胞成長因子、ガストリックインヒビターペプチド、成長ホルモン放出因子、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化性ペプチド、セクレチニン、エンテロガストリン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、トロンボポイエチン、エリトロポイエチン、視床下部ホルモン放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、バソプレシン、オキシトシン、オピオド、ＤＰＰＩＶ、インターロイキン、イムノグロブリン、補因子インヒビター、セルピンプロテアーゼインヒビター、サイトカイン、サイトカインレセプター、ＰＤＧＦ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子レセプター、成長因子並びにそれらの類似体及び誘導体、より好ましくはグルカゴン、ｈＧＨ、インスリン、アプロチニン、第VII 因子、第VIIａ 因子、ＦＦＲ−第VIIａ 因子、ヘパリナーゼ、グルカゴン様ペプチド−１、グルカゴン様ペプチド−２並びにその類似体及び誘導体、例えばＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37) 、ヒトインスリン及びＢ２８ＩｓｏＡｓｐインスリンから選ばれる。各ペプチドは本発明の択一的な態様を構成する。
【００１９】
従って、本発明の一の観点はＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から前記ペプチドを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程：
前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる正の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法に関連する。
【００２０】
本発明の別の観点は、ＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から前記ペプチドを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程：
前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる正の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法に関連する。
【００２１】
本発明の別の観点はＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から前記ペプチドを精製するための陰イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程：
前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる負の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法に関連する。
【００２２】
本発明の別の観点はＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から前記ペプチドを精製するための陰イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程：
前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる負の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法に関連する。
【００２３】
上記の観点における溶離は、溶離段階での有機改質剤の含有量を改変することにより可能でもあり、それは本発明の一の態様として考慮される。
【００２４】
塩成分の線形又は階段式勾配は、双方のＩＥＣモードにおいて、低濃度から高濃度に至るものであろう。
【００２５】
本方法の上記の観点において、溶離は近縁の不純物の洗浄段階と考えてもよい。
【００２６】
本発明の一の態様において、有機改質剤、対、水の重量％基準での比は、１：９９〜９９：１、例えば１：９９〜８０：２０、２０：８０〜８０：２０、３０：７０〜７０：３０、３５：５０〜５０：３５、又は４０：５０〜５０：４０とする。これらの比各々は本発明の択一的な態様を構成する。
【００２７】
本発明の別の態様において、有機改質剤はＣ1-6 アルカノール、Ｃ1-6 アルケノール又はＣ1-6 アルキノール、尿素、グアニジン、又はＣ1-6 アルカン酸、例えば酢酸、Ｃ2-6 グリコール、Ｃ3-7 ポリアルコール、例えば糖、好ましくはＣ1-6 アルカノール及びＣ2-6 グリコール、より好ましくはメタノール、エタノール、プロパノール及びブタノール及びヘキシルグリコール、最も好ましくはエタノール及び２−プロパノールから選ばれる。これらの有機改質剤各々は本発明の択一的な態様を構成する。
【００２８】
本発明の更なる態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー方法のための階段又は線形pH勾配は高いpHから出発して低いpHに至る。
【００２９】
本発明の更なる態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー方法のための階段又は線形pH勾配は低いpHから出発して高いpHに至る。
【００３０】
本発明の更なる態様において、塩成分は任意の有機又は無機塩及びその混合物、好ましくはＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮＨ4 Ｃｌ、ＣａＣｌ2 、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸カルシウム又はその混合物、最も好ましくは酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、ＮａＣｌ、ＮＨ4 Ｃｌ、ＫＣｌから選ばれる。これらの塩成分各々は本発明の択一的な態様を構成する。
【００３１】
本発明の更なる態様において、塩成分の勾配は塩成分の階段式勾配である。
【００３２】
本発明の更なる態様において、塩成分は０．１mmol／kg〜３０００mmol／kg、好ましくは１mmol／kg〜１０００mmol／kg、より好ましくは５mmol／kg〜５００mmol／kg、最も好ましくは２０mmol／kg〜３００mmol／kgの範囲から選ばれる階段式濃度で存在する。これらの範囲各々は本発明の択一的な態様を構成する。
【００３３】
本発明の更なる態様において、塩成分の勾配は塩成分の線形勾配である。
【００３４】
本発明の更なる態様において、塩成分は０．１mmol／kgから３０００mmol／kgに至る、好ましくは１mmol／kgから１０００mmol／kgに至る、より好ましくは５mmol／kgから５００mmol／kgに至る、最も好ましくは２０mmol／kgから３００mmol／kgに至るといった範囲から選ばれる線形濃度で存在する。これらの範囲各々は本発明の択一的な態様を構成する。
【００３５】
本発明の更なる態様において、塩成分は存在しない。
【００３６】
本発明の更なる態様において、緩衝剤はクエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、硼酸緩衝剤、乳酸緩衝剤、グリシルグリシン緩衝剤、アルギニン緩衝剤、炭酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、グルタミン酸緩衝剤、アンモニウム緩衝剤、グリシン緩衝剤、アルキルアミン緩衝剤、アミノエチルアルコール緩衝剤、エチレンジアミン緩衝剤、トリエタノールアミン、イミダゾール緩衝剤、ピリジン緩衝剤及びバルビツール酸緩衝剤及びこれらの混合物、好ましくはクエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸、グルタミン酸、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、グリシン、炭酸ナトリウム、トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン及び硼酸、並びにこれらの混合物から選ばれる。これらの緩衝剤各々は本発明の択一的な態様を構成する。
【００３７】
本発明の更なる態様において、緩衝剤は０．１mmol／kg〜５００mmol／kg、好ましくは１mmol／kg〜２００mmol／kg、より好ましくは５mmol／kg〜１００mmol／kg、最も好ましくは１０mmol／kg〜５０mmol／kgの範囲から選ばれる濃度で存在する。これらの範囲各々は本発明の択一的な態様を構成する。
【００３８】
本発明の更なる態様において、緩衝剤は入っていない。
【００３９】
本発明の更なる態様において、精製すべきＧＬＰ−１ペプチドはＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、並びにその類似体及び誘導体、特に限定することなく、下記のヒトグルカゴン様ペプチド−１から選ばれる：
【化１】
0004732590.tif 000002
【化２】
0004732590.tif 000003
【化３】
0004732590.tif 000004
【化４】
0004732590.tif 000005
【化５】
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【化６】
0004732590.tif 000007
【化７】
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【化８】
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【化９】
0004732590.tif 000010
【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
0004732590.tif 000014
【化１４】
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【化１５】
0004732590.tif 000016
【化１６】
0004732590.tif 000017
【化１７】
0004732590.tif 000018
【化１８】
0004732590.tif 000019
【化１９】
0004732590.tif 000020
これらのＧＬＰ−１ペプチド各々は本発明の択一的な態様を構成する。
【００４０】
本発明の更なる態様において、除去すべきＧＬＰ−１近縁不純物は限定することなく、切頭型、あらゆる種類の伸長型（追加のアミノ酸、エステル等の様々な誘導体）、脱アミド型、不適切に折りたたまれた型、シアル化等の所望されないグリコシル化を有する型から選ばれる。本発明の例示として、ヒスチジンはpH約６．５未満の主たる正の正味の電荷を有し、それ故陽イオン交換のため、有機溶媒又は改質剤を含んで成る溶媒によるpH溶離勾配は、ヒスチジンを欠く切頭型を除くためpH６．５を下まわるpHから始め、そして勾配をpH６．５を上まわるpHで終らさせ、かくして後に標的ＧＬＰ−１成分が溶離される。他に、有機溶媒を採用して標的ＧＬＰ−１成分から切頭型を分割する溶離は単に溶離条件での塩成分（勾配又はイソクラティック式）によりpH６．５を下まわるpHで実施してよい。更に他に、有機溶媒を採用して標的ＧＬＰ−１成分から切頭型を分割する溶離は低から高含有量に至る有機改質剤の勾配によりpH６．５を下まわるpHで実施してよい。第二の例として、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基はpH約３．１上まわる主たる負の正味の電荷を有し、それ故陰イオン交換のため、有機改質剤を含んで成る溶媒によるpH溶離勾配はアミドにまで伸長した型を除去するためにpH３．１を上まわるpHで始まり、そして勾配をpH３．１を下まわるpHで終わらさせ、かくして後に標的ＧＬＰ−１成分が溶離する。他に、有機改質剤を採用して標的ＧＬＰ−１成分からアミド型を分割する溶離は単に溶離条件での塩成分（勾配又はイソクラティック式）を介してpH３．１を上まわるpHで実施してよい。第三の例として、アスパラギン酸はpH約４．４を上まわる主たる負の正味の電荷を有し、それ故陰イオン交換のため、有機改質剤を含んで成る溶媒によるpH溶離勾配は、アスパラギン酸を欠く切頭型を除去するためpH４．４を上まわるpHで始め、そして勾配をpH４．４を下まわるpHで終わらさせ、かくして後に標的ＧＬＰ−１成分が溶離する。他に、有機改質剤を採用して標的ＧＬＰ−１成分から切頭型を分割する溶離は、単に溶離条件での塩成分（勾配又はイソクラティック式）を介してpH４．４を上まわるpHで実施してよい。第四の例として、グルタミン酸はpH約４．４を上まわる主たる負の正味の電荷を有し、それ故陰イオン交換のため、有機改質剤を含んで成る溶媒によるpH溶離勾配は、標的ＧＬＰ−１成分を溶離するためpH４．４を上まわるpHで始め、そして勾配をpH４．４を下まわるpHで終わらさせ、かくして後に追加のグルタミン酸残基を含んで成る伸長型が除去できる。他に、有機改質剤を採用して標的ＧＬＰ−１成分から伸長型を分割する溶離は、単に溶離条件での塩成分（勾配又はイソクラティック式）を介してpH４．４を上まわるpHで実施してよい。第五の例として、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基はpH約８．０を下まわる主たる正の正味の電荷を有し、それ故陽イオン交換のため、有機改質剤を含んで成る溶媒によるpH溶離勾配は、所望されないアシル基で伸長した型を除去するためpH８．０を下まわるpHで始め、そして勾配をpH８．０を上まわるpHで終わらさせ、かくして後に標的ＧＬＰ−１成分が溶離する。他に、有機改質剤を採用して標的ＧＬＰ−１成分からアシル化型を分割する溶離は、単に溶離条件での塩成分（勾配又はイ���クラティック式）を介してpH８．０を下まわるpHで実施してよい。第六の例として、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基はpH約８．０を下まわる主たる正の正味の電荷を有し、それ故陽イオン交換のため、有機改質剤を含んで成る溶媒によるpH溶離勾配は、所望のアシル基で伸長した標的ＧＬＰ−１成分を溶離するためpH８．０を下まわるpHで始め、そして勾配をpH８．０を上まわるpHで終わらさせ、かくして後に所望されない非伸長型が除去される。他に、有機改質剤を採用して非アシル化型からアシル化標的ＧＬＰ−１成分を分割する溶離は、単に溶離条件での塩成分（勾配又はイソクラティック式）を介してpH８．０を下まわるpHで実施してよい。第七の例として、チロシンはpH約１０．０を上まわる主たる負の正味の電荷を有し、それ故陰イオン交換のため、有機改質剤を含んで成る溶媒によるpH溶離勾配は、チロシン残基を欠く切頭型を除去するためpH１０．０を上まわるpHで始め、そして勾配をpH１０．０を下まわるpHで終わらさせ、かくして後に標的ＧＬＰ−１成分が溶離する。他に、有機改質剤を採用して標的ＧＬＰ−１成分から切頭型を分割する溶離は、単に溶離条件での塩成分（勾配又はイソクラティック式）を介してpH１０．０を上まわるpHで実施してよい。第八の例として、リジン酸はpH約１０．０を下まわる主たる正の正味の電荷を有し、それ故陽イオン交換のため、有機改質剤を含んで成る溶媒によるpH溶離勾配は、リジン残基の側鎖がアシル化された標的ＧＬＰ−１成分を溶離するためpH１０．０を下まわるpHで始め、そして勾配をpH１０．０を上まわるpHで終わらさせ、かくして後に所望されない非アシル化型が除去される。他に、有機改質剤を採用して非アシル化型からアシル化標的ＧＬＰ−１成分を分割する溶離は、単に溶離条件での塩成分（勾配又はイソクラティック式）を介してpH１０．０を下まわるpHで実施してよい。第九の例として、アルギニンはpH約１２．０を下まわる主たる正の正味の電荷を有し、それ故陰イオン交換のため、有機改質剤を含んで成る溶媒によるpH溶離勾配は、標的ＧＬＰ−１成分を溶離するためpH１２．０を下まわるpHで始め、そして勾配をpH１２．０を上まわるpHで終わらさせ、かくして後に追加のアルギニン残基を含んで成る所望されない型が除去される。他に、有機改質剤を採用して追加のアルギニン残基を含んで成る型から標的ＧＬＰ−１成分を分割する溶離は、単に溶離条件での塩成分（勾配又はイソクラティック式）を介してpH１２．０を下まわるpHで実施してよい。（これらの例において利用するpKA 値はL. Stryer. Biochemistry, 第３版、W.H. Freeman and Company, New York, Table 2-1, 第21頁を参照のこと）。
【００４１】
本発明の更なる態様において、除去すべき不純物はＧＬＰ−１に近縁でないものである。
【００４２】
上記の方法の特異的なＧＬＰ−１ペプチドの例は、塩及び／又はpH勾配を採用しての、陽イオン交換クロマトグラフィーによるＡｒｇ34ＧＬＰ−１（７−３７）及びＡｒｇ34ＧＬＰ−１（９−３７）、陰イオン交換クロマトグラフィーによるＧＬＰ−１（７−３７）及びＧＬＰ−１（７−３６）アミド、陰イオン交換クロマトグラフィーによるＧＬＰ−１（１５−３７）及びＧＬＰ−１（１６−３７）、陰イオン交換クロマトグラフィーによるＡｒｇ34ＧＬＰ−１（７−３７）及びＡｒｇ34Ｌｙｓ26（Ｎε−Ｇｌｕ）ＧＬＰ−１（７−３７）、陽イオン交換クロマトグラフィーによるＡｒｇ34Ｌｙｓ26（Ｎε−（γ−Ｇｌｕ−（Ｎα−テトラデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３７）及びＡｒｇ34Ｌｙｓ26（Ｎε−（γ−Ｇｌｕ−（Ｎα−テトラデカノイル）））Ｇｌｙ37（Ｎα−（γ−Ｇｌｕ−（Ｎα−テトラデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３７）、陽イオン交換クロマトグラフィーによるＧｌｙ37（Ｎα−（γ−Ｇｌｕ−（Ｎα−テトラデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３７）及びＧＬＰ−１（７−３７）、陰イオン交換クロマトグラフィーによるＧＬＰ−１（１９−３７）及びＧＬＰ−１（２０−３７）、陽イオン交換クロマトグラフィーによるＡｒｇ34Ｌｙｓ26（Ｎε−（γ−Ｇｌｕ−（Ｎα−テトラデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３７）及びＡｒｇ34ＧＬＰ−１（７−３７）、並びに陽イオン交換クロマトグラフィーによるＧＬＰ−１（７−３７）及びＡｒｇ34ＧＬＰ−１（７−３７）の分割である。
【００４３】
本発明の更なる態様において、精製すべきペプチドはＧＬＰ−２ペプチドである。
【００４４】
本発明の更なる態様において、精製すべきペプチドは以下から選ばれる：
ＧＬＰ−２（１−３４）、ＧＬＰ−２（１−３３）並びにその類似体及び誘導体、特に限定することなく、ヒトグルカゴン様ペプチド−２（ｈＧＬＰ−２）、ＧＬＰ−２（１−３０）；ＧＬＰ−２（１−３１）；ＧＬＰ−２（１−３２）；ＧＬＰ−２（１−３３）；ＧＬＰ−２（１−３４）；ＧＬＰ−２（１−３５）、Ｌｙｓ20ＧＬＰ−２（１−３３）、Ｌｙｓ20Ａｒｇ30ＧＬＰ−２（１−３３）、Ａｒｇ30Ｌｙｓ34ＧＬＰ−２（１−３４）、Ａｒｇ30Ｌｙｓ35ＧＬＰ−２（１−３５）、Ａｒｇ30,35 Ｌｙｓ20ＧＬＰ−２（１−３５）、Ａｒｇ35ＧＬＰ−２（１−３５）、Ｌｙｓ20（Ｎε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ20,30 −ビス（Ｎε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ20（Ｎε−テトラデカノイル）Ａｒｇ30ＧＬＰ−２（１−３３）；Ａｒｇ30Ｌｙｓ35（Ｎε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３５）；Ａｒｇ30,35 Ｌｙｓ20（Ｎε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３５）；Ａｒｇ35Ｌｙｓ30（Ｎε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３５）；Ａｒｇ30Ｌｙｓ34（Ｎε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３４）；Ｌｙｓ20（Ｎε−（ω−カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ20,30 −ビス（Ｎε−（ω−カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ20（Ｎε−（ω−カルボキシノナデカノイル））Ａｒｇ30ＧＬＰ−２（１−３３）；Ａｒｇ30Ｌｙｓ35（Ｎε−（ω−カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３５）；Ｌｙｓ30（Ｎε−（γ−グルタミル（Ｎα−テトラデカノイル）））ｈＧＬＰ−２、Ａｒｇ30,35 Ｌｙｓ20（Ｎε−（ω−カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３５）；Ａｒｇ35Ｌｙｓ30（Ｎε−（ω−カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３５）；及びＡｒｇ30Ｌｙｓ34（Ｎε−（ω−カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３４）。
【００４５】
当該ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドは、当該ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、且つ当該ペプチドを発現できる宿主細胞を適当な栄養培地の中で当該ペプチドが発現される条件下で培養又は発酵させ、しかる後に得られるペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドを培養又は発酵ブロスから回収することを含んで成る方法により生産できる。以降、培養なる語は、培養、発酵等の双方を包括して使用する。
【００４６】
前記細胞を培養する培地は、宿主細胞の増殖に適する従来の任意の慣用の培地、例えば、最小培地又は適当な補充物を含有する複合培地でよい。適当な培地を、市販品から入手するか、又は公開された配合表(American Type Culture Collection のカタログなど）に従って調製することもできる。細胞によって生産されたペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドを、従来の手順によって培地から回収することができる。その手順には、例えば、任意的な細胞の溶解、遠心又は濾過による培地からの細胞の分離、塩、例えば硫酸アンモニウムによる上清又は濾液のタンパク質成分の沈殿、慣用の精製技術、例えばクロマトグラフィー技術による精製、必要なら、本発明に従うイオン交換クロマトグラフィーによる精製、しかる後、分析検査、例えばＰＡＧＥ、ＩＥＦにかけ、必要なら、更なる精製にかけ、必要なら、更に純粋なペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドを単離することが含まれる。
【００４７】
培養培地から得られるペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドの回収の間、しかしながら本発明に従うイオン交換クロマトグラフィーによる精製の前に、ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドと近縁の不純物とを含んで成る混合物は任意的に慣用の技術、例えばアルキル化、アシル化、エステル形成又はアミド形成等により化学修飾してよい。
【００４８】
元になるペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ゲノム又はｃＤＮＡ由来が適当であり、例えば、標準的な方法によって、ゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを調製後に、合成オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、当該ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドの全部又は部分をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングして、これを得る（Sambrook, J., Fritsch. E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989）。当該ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、確立した標準的な方法、例えばBeaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869に記載されたホスホアミダイト法、又はMatthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801-805に記載された方法によって、合成的に調製することもできる。このＤＮＡ配列を、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法によって、例えば、ＵＳ４６８３２０２又はSaiki et al., Science 239 (1988), 487-491 の記載通りに、調製することもできる。
【００４９】
本ＤＮＡ配列を、組換えＤＮＡ技法で簡便に扱える任意のベクターに挿入することができる。このベクターの選択は、しばしば、導入される宿主細胞に依存する。従って、このベクターは、自律複製性のベクター、すなわち染色体外体として存在して、その複製が染色体複製から独立しているベクター、例えばプラスミドであってもよい。あるいは、このベクターは、宿主細胞に導入された場合、その宿主細胞ゲノムに組み込まれ、そして組み込まれた染色体と共に複製するものであってもよい。
【００５０】
本ベクターとしては、当該ペプチド又はＧＬＰ−１をコードするＤＮＡ配列が、このＤＮＡの転写調節に必要な追加領域、例えばプロモーターに作用可能に連結されている発現ベクターが好ましい。このプロモーターは、選択した宿主細胞において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり、そして宿主細胞に固有の、又は異種性のタンパク質をコードする遺伝子から、これを得ることができる。種々の宿主細胞において、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を指令するために適したプロモーターの例は、当技術分野で良く知られている（前出のSambrook et al.）。
【００５１】
必要がある場合、当該ペプチド又はＧＬＰ−１をコードするＤＮＡ配列を、適当なターミネーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー配列、及び翻訳エンハンサー配列に作用可能に連結することもできる。さらに本発明の組換えベクターは、問題の宿主細胞において、本ベクターの複製を可能にするＤＮＡ配列を含んでもよい。
【００５２】
また、本ベクターは、選択性マーカー、例えば、宿主細胞の欠陥を補完する産物の遺伝子、あるいは、薬物、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレキセートに対する耐性を付与する遺伝子を含んでもよい。
【００５３】
ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドが宿主細胞の分泌経路に入る様に指示するために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、この組換えベクターに含まれてもよい。この分泌シグナル配列を、当該ペプチド又はＧＬＰ−１をコードするＤＮＡ配列に、適切な読み枠で連結する。分泌シグナル配列は、一般に、当該ペプチド又はＧＬＰ−１をコードするＤＮＡ配列の５’側に位置する。
【００５４】
この分泌シグナル配列は、当該ペプチド又はＧＬＰ−１に常態で連結しているものでもよいし、又は他の分泌タンパク質をコードする遺伝子から得てもよい。当該ペプチド又はＧＬＰ−１をコードするＤＮＡ配列、プロモーター、並びに任意にはターミネーター及び／又は分泌シグナル配列を各々連結するための手順、並びに、複製に必要な情報を有する適当なベクターに、それらを挿入するための手順は、当業者に良く知られている（Sambrook et al. 前出）。
【００５５】
本ＤＮＡ配列又は組換えベクターを導入する宿主細胞は、当該ペプチド又はＧＬＰ−１を生産することができる任意の細胞でよく、そしてこれには細菌、ウィルス、例えばバキュロウィルス、酵母、真菌、昆虫及びより高等な真核細胞が含まれる。当技術分野で良く知られ、そして使われている適当な宿主細胞の例は、大腸菌、サッカロミセス・セレビシエ、あるいは哺乳類のＢＨＫ細胞又はＣＨＯ細胞株であるが、これらに限定されない。
【００５６】
当該ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドの一部は慣用の有機ペプチド合成化学に従って生産できる。得られる合成混合物は、例えばアルキル化、アシル化、エステル形成又はアミド形成等により化学修飾し、そして精製するか、又はそのまま精製し、次いで上記の通りに化学修飾してよい。
【００５７】
第VIIａ 因子の調製
本発明において使用するのに適当なヒト精製第VIIａ 因子は好ましくは例えばHagen ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 2412-2416, 1986 又はヨーロッパ特許第２００．４２１（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ）に記載のＤＮＡ組換技術により作られる。組換技術により生産された第VIIａ 因子は真正第VIIａ 因子であるか、又は真正第VIIａ 因子と同程度の血液凝固生物活性を実質的に有することを前提に多かれ少なかれ修飾された第VIIａ 因子であってよい。かかる第VIIａ 因子は第VII 因子をコードする核酸配列を、公知の手段、例えば部位特異的突然変異誘発を介し、天然ＦVII をコードする核酸内のアミノ酸コドンを改変又はアミノ酸コドンの一部を除去することにより修飾することによって生産できうる。
【００５８】
第VII 因子はBroze and Majerus, J. Biol. Chem. 255 (4) : 1242-1247, 1980 及びHedner and Kisiel, J. Clin. Invest. 71 : 1836-1841, 1983に記載の方法によっても生産できうる。これらの方法は検出できる量のその他の凝血因子を伴わずに第VII 因子をもたらす。更に一層精製された第VII 因子調製物は最終精製段階として追加のゲル濾過等によって得られうる。次に第VII 因子は公知の手段、例えばいくつかの異なる血漿タンパク質、例えば第XIIａ ，IXａ又はＸａ因子を介して活性化第VIIａ 因子へと変換される。他方、Bjoernら（Research Disclousure, 269 1986年９月、第564-565頁）によると、第VII 因子はイオン交換クロマトグラフィー、例えばＭｏｎｏ  Ｑ（登録商標）（Pharmacia fine Chemicals）等に通すことによって活性化させることができうる。
【００５９】
修飾又は不活性化第VIIａ（VIIａｉ）因子は下記の方法により生産されうる：
国際特許出願ＷＯ９２／１５６８６号は修飾第VIIａ 因子、修飾第VIIａ 因子の生産のためのポリ核酸及び哺乳動物細胞系、並びに凝血を阻害するための修飾第VIIａ 因子を含んで成る組成物に関連する。
【００６０】
修飾された第VII 因子は、それぞれビタミンＫ−依存性血漿タンパク質のプレ−プロペプチド及びｇｌａドメイン、並びにｇｌａドメインを欠く第VII 因子タンパク質をコードする２種の作用可能に連結された配列コード領域を含んで成るポリヌクレオチド分子によりコードされ得、ここで、発現に際し、前記ポリヌクレオチドは、血漿第Ｘ又はIX因子を有意に活性化しないが、しかし組織因子を結合することができる修飾された第VII 因子分子をコードする。
【００６１】
第VIIａ 因子の触媒活性は、触媒中心又はトリアド（ｔｒｉａｄ）の化学的誘導体化により阻害され得る。誘導体化は、第VII 因子と不可逆的インヒビター、例えば有機リン化合物、弗化スルホニル、ペプチドハロメチルケトンもしくはアザペプチドとの反応により、又はアシル化により達成され得る。好ましいペプチドハロメチルケトンは、ＰＰＡＣＫ（Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチル−ケトン；米国特許第４，３１８，９０４号を参照のこと；引用により本明細書に組込まれる）、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ及びＰｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン（ＦＦＲ−ｃｍｋ）；並びにＤＥＧＲｃＫ（ダンシル−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン）を包含する。
【００６２】
第VIIａ 因子の触媒活性はまた、アミノ酸を置換し、挿入し、又は欠失することによっても阻害され得る。好ましい態様においては、アミノ酸置換は、第VIIａ 因子触媒部位に寄与するアミノ酸を含む領域として本明細書において定義される、第VII 因子触媒トリアドのアミノ酸配列において行なわれる。触媒トリアドにおける置換、挿入又は欠失は一般的に、触媒部位を形成するアミノ酸で又はそのアミノ酸に隣接して存在する。ヒト及びウシ第VII 因子タンパク質においては、触媒“トリアド”を形成するアミノ酸は、Ｓｅｒ344 ，Ａｓｐ242 及びＨｉｓ193 （下付きの数字は、配列における位置を示す）である。他の哺乳類種からの第VII 因子における触媒部位は、現在入手できる技法、例えば中でも、タンパク質単離及びアミノ酸配列分析の技法を用いて決定され得る。触媒部位はまた、他のセリンプロテアーゼ、特にキモトリプシン（その活性部位はこれまで決定されている）の配列と並べ（Siglerなど., J. Mol. Biol., 35 : 143-164 (1968)；引用により本明細書に組込まれる）、そして次に、前記の配列の並びから類似する活性部位残基を決定することによっても決定され得る。
【００６３】
ヒト及びウシ第VII 因子のための好ましい態様においては、活性部位残基Ｓｅｒ344 がＧｌｙ，Ｍｅｔ，Ｔｈｒ又はより好ましくはＡｌａにより置換されて修飾される。かかる置換は単独でも、Ｈｉｓ193 及びＡｓｐ242 等の触媒トリアド内のその他の部位での置換と組合わせて行ってもよい。
【００６４】
第VII 因子において触媒部位を形成するアミノ酸、例えばヒト及びウシ第VII 因子におけるＳｅｒ344 ，Ａｓｐ242 及びＨｉｓ193 が、置換され、又は欠失され得る。本発明においては、単一のアミノ酸のみを変更することが好ましく、従って、分子の抗原性を高め、又は組織因子と結合する能力を阻害する可能性を最少にすることが好ましいが、しかしながら、複数のアミノ酸変更（置換、付加又は欠失）が行なわれ得、そして置換、付加及び欠失の組合せもまた行なわれ得る。ヒト及びウシ第VII 因子のための好ましい態様においては、Ｓｅｒ344 は好ましくは、Ａｌａにより置換されるが、しかしＧｌｙ，Ｍｅｔ，Ｔｈｒ又は他のアミノ酸によっても置換され得る。ＧｌｕによりＡｓｐを置換し、そしてＬｙｓ又はＡｒｇによりＨｉｓを置換することが好ましい。一般的に、置換は、できるだけタンパク質の三次構造を破壊しないように選択される。引用により本明細書に組込まれるDayhoffなど.（Atlas of Protein Structure 1978, Nat'l Biomed. Res. Found., Washington, D.C.）のモデルは、他のアミノ酸置換の選択のガイドとして使用され得る。ヒト、ウシ又は他の種の適切な第VII 因子配列の触媒部位に上記のような残基変更を導入することができ、そして上記のような触媒活性の阻害及び得られる抗凝固活性の所望レベルについて得られるタンパク質を試験することができる。修飾された第VII 因子に関しては、触媒活性は、実質的に、その対応する種の野生型第VII 因子の触媒活性の約５％以下、より好ましくは約１％以下に阻害されるであろう。
【００６５】
修飾された第VII 因子は、組換えＤＮＡ技法の使用を通して生成され得る。
【００６６】
アミノ酸配列の変更は、種々の技法により達成され得る。ＤＮＡ配列の修飾は、部位特異的突然変異誘発により行なわれ得る。部位特異的突然変異誘発についての技法は、当業界において良く知られており、そして例えば、Zoller and Smith(DNA 3 : 479-488, 1984) により記載されている。従って、第VII 因子のヌクレオチド及びアミノ酸配列を用いて、選択した変更を導入することができる。修飾第VIIａ 因子は化学的方法によっても生産できる。
【００６７】
ＦＦＲ−ＦVIIａ （即ち、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＦVIIａ ）
例ＦＦＲクロロメチルケトン
ＦＦＲクロロメチルケトンによる第VIIａ 活性部位のブロッケージ。
クロロメチルケトンによる活性部位セリン及びヒスチジンのブロッケージはセリンプロテアーゼの不可逆的不活性化のために周知の方法である。所定のプロテアーゼのブロッケージの最適化を図るため、この活性部位と特異的に且つすばやく反応するクロロメチルケトン誘導体を選択することは重要である。かかる誘導体は、注目の特定のセリンプロテアーゼの基質結合ポケットと相互作用するオリゴペプチドのクロロメチルケトン基への結合によって発色しうる。
【００６８】
グルタミル−グリシル−アルギニンクロロメチルケトン（ＥＧＲ−ｃｋ又はそのダンシル誘導体、ＤＥＧＲ−ｃｋ）(S. Higashi, H. Nishimura, S. Fujii, K. Takeda, S. Iwanaga, (1992) J. Biol. Chem. 267, 17990）又はプロリル−フェニル−アルギニンクロロメチルケトン（ＰＦＲ−ｃｋ）（J.H. Lawson, S. Butenas, K. Mann, (1992) J. Biol. Chem. 267, 4834 ; J. Contrino, G.A. Hair, M.A. Schmeizi, F.R. Rickles, D.L. Kreutzer (1994) Am. J. Pathol. 145, 1315）がＦVIIａ の活性部位阻害剤として利用されている。これらのクロロメチルケトンと比較して、ＦＦＲｃｋの利用は１０〜７０倍の速度の上昇を示す。
【００６９】
ＦVIIａ のＦＦＲ−クロロメチルケトン誘導体との反応の特異性をＨＰＬＣ及びペプチドマッピングにより検定し、ＦVIIａ がＦＦＲ−クロロメチルケトンと１：１の比で反応することを示し、かくして＞９８％がヒスチジンで誘導された期待の生成物として回収できた。
【００７０】
様々なクロロメチルケトンによるＦVIIａ の不活性化
３μＭのＦVIIａ を５０mMのＴｒｉｓ  ＨＣｌ，１００mMのＮａＣｌ，５mMのＣａＣｌ2 ，０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０，pH７．４の中で１２μＭのクロロメチルケトン誘導体とインキュベーションした。サンプルを表示の様々な時間間隔で抜き取り、そして１mMのＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡを含む５０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１００mMのＮａＣｌ，５mMのＣａＣｌ2 ，０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０，pH７．４の中で活性測定用に２０倍希釈した。残留ＦVIIａ 活性を４５０nmでの吸収の上昇により測定した。
【００７１】
通常、当該ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る本発明に従うイオン交換クロマトグラフィーにより精製すべき混合物は、組換ＤＮＡ技術及び／又は化学修飾技術を使用しようと、又は有機ペプチド合成化学を使用しようと、アミノ酸、小ペプチド、大ペプチド、無縁のタンパク質、反応体、細胞塊、ＨＣＰ、内毒素及び／又はウィルス（ｖｉｒａ）をも含むであろう。
【００７２】
かくして、本発明に係るＩＥＣ方法を含む純粋なペプチド又はＧＬＰ−ペプチドを生産するための任意の方法、例えば工業的方法も本発明の一の観点である。
【００７３】
従って、本発明は更なる観点において、純粋なペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドを生産するための、
前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から前記ペプチドを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程：
前記混合物の前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる正の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法を含む、を含む工業的方法に関連する。
【００７４】
本発明は更なる観点において、ＧＬＰ−１ペプチドを単離するための方法であって、陽イオン交換クロマトグラフィーを介して前記ＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から当該プチドを精製し、ここで当該陽イオン交換クロマトグラフィー方法は下記の工程：
前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる正の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきであり；
しかる後、適宜、分析検査及び／又は更なる精製に委ね、次いで前記ペプチドを慣用の方法で単離することを含む、方法に関連する。
【００７５】
本発明は更なる観点において、ＧＬＰ−１ペプチドを単離するための方法であって、陽イオン交換クロマトグラフィーを介して前記ＧＬＰ−１ペプチド及び近縁又は無縁の不純物を含んで成る混合物から当該プチドを精製し、ここで当該陽イオン交換クロマトグラフィー方法は下記の工程：
前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる正の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきであり；
しかる後、適宜、分析検査及び／又は更なる精製に委ね、次いで前記ペプチドを慣用の方法で単離することを含む、方法に関連する。
【００７６】
本発明は更なる観点において、純粋なペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドを生産するための、
前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から前記ペプチドを精製するための陰イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程：
前記混合物の前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる負の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法を含む、工業的方法に関連する。
【００７７】
本発明は別の観点において、ＧＬＰ−１ペプチドを単離するための方法であって、陰イオン交換クロマトグラフィーを介して前記ＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から当該ペプチドを精製し、ここで当該陰イオン交換クロマトグラフィー方法は下記の工程：
前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる負の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきであり；
しかる後、適宜、分析検査及び／又は更なる精製に委ね、次いで前記ペプチドを慣用の方法で単離することを含む、方法に関連する。
【００７８】
本発明は更なる別の観点において、ＧＬＰ−１ペプチドを単離するための方法であって、陰イオン交換クロマトグラフィーを介してＧＬＰ−１ペプチド及び近縁又は無縁の不純物を含んで成る混合物から当該ペプチドを精製し、ここで当該陰イオン交換クロマトグラフィー方法は下記の工程：
前記混合物の前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる負の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきであり；
しかる後、適宜、分析検査及び／又は更なる精製に委ね、次いで前記ペプチドを慣用の方法で単離することを含む、方法に関連する。
【００７９】
本明細書に記載の２以上の態様の任意の可能な組合せは本発明の範囲の一部である。
【００８０】
本明細書において使用する「有機改質剤」とは、有機溶媒もしくは水溶性有機化合物、又はそれらの組合せを含むことを意図しており、かかる改質剤は不要の近縁不純物及びＧＬＰ−１ペプチドとイオン交換体との間の好適且つ改変された選択性を誘導する。選定の改質剤がかかる選択性を誘導するか否かは通常近縁不純物に依存し、そして試行錯誤で試験されうる。かかる有機改質剤には、限定することなく、Ｃ1-6 アルカノール、Ｃ1-6 アルケノール又はＣ1-6 −アルキノール、尿素、グアニジン−ＨＣｌ又はＣ1-6 アルカン酸、例えば酢酸、Ｃ2-6 グリコール、Ｃ3-7 ポリアルコール、例えば糖、又はそれらの混合物が挙げられる。
【００８１】
本明細書において使用する「Ｃ1-6−アルカノール」、「Ｃ1-6 アルケノール」又は「Ｃ1-6 アルキノール」は、単独で、又は組合さって、表示の長さのＣ1-6 アルカン、Ｃ1-6 アルケン又はＣ1-6 アルキン基を含むことを意図し、線形、枝分れ、環状形態のいずれでもよく、それに対してヒドロキシル（−ＯＨ）が結合している(Morrison & Boyd, Organic Chemistry 第４版参照）。線形アルコールの例はメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、アリルアルコール、ｎ−ブタノール、ｎ−ペンタノール及びｎ−ヘキサノールである。枝分れアルコールの例は２−プロパノール及びｔｅｒｔ−ブチルアルコールである。環状アルコールの例はシクロプロピルアルコール及び２−シクロヘキセン−１−オールである。
【００８２】
本明細書において使用する「Ｃ1-6 アルカン酸」とは、式Ｒ’ＣＯＯＨ（式中、Ｒ’はＨ又はＣ1-5 アルキルである）の基、例えば酢酸、プロピオン酸、酪酸、メチル酪酸又は吉草酸を含むことを意図する（Morrison & Boyd, Organic Chemistry、第４版参照）。
【００８３】
本明細書において使用する「Ｃ1-5 アルキル」とは、１〜５個の炭素原子を有する枝分れした又は線形のアルキル基を含むことを意図する。典型的なＣ1-5 アルキル基には、限定することなく、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソ−ペンチル等が挙げられる（Morrison & Boyd, Organic Chemistry、第４版参照）。
【００８４】
本明細書において使用する「Ｃ2-6 グリコール」とは、隣接していてもしていなくてもよい別々の炭素原子上に２個のヒドロキシル基を含むＣ2-6 アルカンを含むことを意図とする。典型的なＣ2-6 グリコールには、限定することなく、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール又は２−メチル−２，４−ペンタンジオールが挙げられる（Morrison & Boyd, Organic Chemistry、第４版参照）。
【００８５】
本明細書において使用する「Ｃ2-6 アルカン」とは、２〜６個の炭素原子を有する枝分れした又は線形のアルカン基を含むことを意図する。典型的なＣ2-6 アルカンには、限定することなく、エタン、プロパン、イソ−プロパン、ブタン、イソ−ブタン、ペンタン、ヘキサン等が挙げられる（Morrison & Boyd, Organic Chemistry、第４版参照）。
【００８６】
本明細書において使用する「Ｃ3-7 ポリアルコール、例えば糖」とは、式ＨＯＣＨ2（ＣＨＯＨ）n ＣＨ2ＯＨ（式中、ｎは１〜５の整数である）の基、並びに単糖類、例えばマンノース及びグルコースを含むことを意図する（Morrison & Boyd, Organic Chemistry、第４版参照）。
【００８７】
本明細書において使用する「ＧＬＰ−１ペプチド」とは、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、並びにその類似体及び誘導体を意味することを意図し、それらは慣用の組換ＤＮＡ技術及び慣用の合成方法により生産できる。かかるＧＬＰ−１ペプチドには、限定することなく、天然グルカゴン様ペプチド−１、例えばＷＯ８７／０６９４１に開示のＧＬＰ−１（７−３７）及びその機能性誘導体を含んで成るペプチドフラグメント；ＷＯ９０／１１２９６に開示のＧＬＰ−１（７−３６）及びその機能性誘導体を含んで成るペプチドフラグメント；ＷＯ９１／１１４５７に開示の活性ＧＬＰ−１ペプチド７−３４、７−３５、７−３６及び７−３７の類似体；ＷＯ９８／０８８７１に開示の親油性置換基が少なくとも１個のアミノ酸残基に結合したＧＬＰ−１誘導体；ＥＰ  ０６９９６８６−Ａ２に開示のＧＬＰ−１のＮ末端切頭型フラグメント；並びにＥＰ  ０７０８１７９−Ａ２に開示のＮ−末端イミダゾール基を含むＧＬＰ−１類似体及び誘導体が挙げられる。
【００８８】
本明細書において使用する「ＧＬＰ−２ペプチド」とは、ＧＬＰ−２（１−３５）、ＧＬＰ−２（１−３４）、ＧＬＰ−２（１−３３）、並びにその類似体及び誘導体を意味することを意図し、それらは慣用の組換ＤＮＡ技術及び慣用の合成方法により生産できる。かかるＧＬＰ−２ペプチドには、限定することなく、天然グルカゴン様ペプチド−２、ＷＯ９８／０８８７２に開示の親油性置換基が少なくとも１個のアミノ酸残基に結合したＧＬＰ−２誘導体；ヒトグルカゴン様ペプチド−２（ｈＧＬＰ−２）、ＧＬＰ−２（１−３０）；ＧＬＰ−２（１−３１）；ＧＬＰ−２（１−３２）；ＧＬＰ−２（１−３３）；ＧＬＰ−２（１−３４）；ＧＬＰ−２（１−３５）；Ｌｙｓ20ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ20Ａｒｇ30ＧＬＰ−２（１−３３）、Ａｒｇ30Ｌｙｓ34ＧＬＰ−２（１−３４）、Ａｒｇ30Ｌｙｓ35ＧＬＰ−２（１−３５）、Ａｒｇ30,35 Ｌｙｓ20ＧＬＰ−２（１−３５）、Ａｒｇ35ＧＬＰ−２（１−３５）、Ｌｙｓ20（Ｎε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ20,30 −ビス（Ｎε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ20（Ｎε−テトラデカノイル）Ａｒｇ30ＧＬＰ−２（１−３３）；Ａｒｇ30Ｌｙｓ35（Ｎε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３５）；Ａｒｇ30,35 Ｌｙｓ20（Ｎε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３５）；Ａｒｇ35Ｌｙｓ30（Ｎε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３５）；Ａｒｇ30Ｌｙｓ34（Ｎε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３４）；Ｌｙｓ20（Ｎε−（ω−カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ20,30 −ビス（Ｎε−（ω−カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ20（Ｎε−（ω−カルボキシノナデカノイル））Ａｒｇ30ＧＬＰ−２（１−３３）；Ａｒｇ30Ｌｙｓ35（Ｎε−（ω−カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３５）；Ｌｙｓ30（Ｎε−（γ−グルタミル（Ｎα−テトラデカノイル）））ｈＧＬＰ−２、Ｌｙｓ30（Ｎε−（γ−グルタミル（Ｎα−テトラデカノイル）））ｈＧＬＰ−２、Ａｒｇ30,35 Ｌｙｓ20（Ｎε−（ω−カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３５）；Ａｒｇ35Ｌｙｓ30（Ｎε−（ω−カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３５）；及びＡｒｇ30Ｌｙｓ34（Ｎε−（ω−カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３４）が挙げられる。
【００８９】
本明細書において使用する「類似体」とは、元のペプチドの１又は複数個のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基により置換されているペプチド、及び／又は元のペプチドに１又は複数個のアミノ酸残基が追加されているペプチドを意味することを意図する。かかる追加は元のペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれか、又は双方に施されていてよい。
【００９０】
本明細書において使用する「誘導体」とは、元のペプチドの１又は複数個のアミノ酸残基が例えばアルキル化、アシル化、エステル形成又はアミド形成等により化学修飾されているペプチドを意味することを意図している。
【００９１】
本明細書において使用する「塩成分」とは、任意の有機又は無機塩、例えば限定することなく、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮＨ4 Ｃｌ、ＣａＣｌ2 、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸カルシウム又はそれらの混合物を含むことを意図とする（Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, or Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition (1995), 又はAmersham-Pharmacia Biotechからのハンドブック参照）。
【００９２】
本明細書において使用する「緩衝剤」とは、任意の緩衝剤、例えば、限定することなく、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、硼酸緩衝剤、乳酸緩衝剤、グリシルグリシン緩衝剤、アルギニン緩衝剤、炭酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、グルタミン酸緩衝剤、アンモニウム緩衝剤、グリシン緩衝剤、アルキルアミン緩衝剤、アミノエチルアルコール緩衝剤、エチレンジアミン緩衝剤、トリエタノールアミン、イミダゾール緩衝剤、ピリジン緩衝剤及びバルビツール酸緩衝剤、並びにそれらの混合物を含むことを意図とする（Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, or Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition (1995), 又はAmersham-Pharmacia Biotechからのハンドブック参照）。
【００９３】
出発pH、緩衝剤及びイオン強度の選定は周知の技術、例えば慣用の試験管法に従って行われる（Amersham Pharmacia Biotechからのハンドブック参照）。クロマトグラフィーイオン交換樹脂は精製すべき特定のＧＬＰ−１ペプチド、並びに採用する条件、例えば当業者に周知のpH、緩衝剤、イオン強度等（即ち、典型的には、陽イオン交換樹脂の場合、ＧＬＰ−１ペプチドの等電点より低いpH、そして陰イオン交換樹脂の場合、ＧＬＰ−１ペプチドのpIより高いpH、所望のpHを維持するのに十分に強い緩衝剤、及び塩濃度により誘導される可能性のある十分に低いイオン強度）に応じて選定されるものであり、そして例えばＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ由来のＳｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ樹脂及びＳｏｕｒｃｅ樹脂、ＢｉｏＳｅｐｒａ由来のＨｙｐｅｒＤ樹脂、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ樹脂及びＳｐｈｅｒｏｓｉｌ樹脂、ＴｏｓｏＨａａｓ由来のＴＳＫｇｅｌ樹脂及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂、Ｍｅｒｃｋ由来のＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ樹脂、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ由来のＰｏｒｏｓ樹脂、ＢｉｏＲＡＤ由来のＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ樹脂、Ｗｈａｔｍａｎ由来のＥｘｐｒｅｓｓ−ｉｏｎ樹脂、等が挙げられる。
【００９４】
本明細書で使用する「有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液」とは、１又は複数種の有機改質剤、水、１又は複数種の塩成分（又は塩成分抜き）、１又は複数種の緩衝剤（又は緩衝剤抜き）、並びに慣用のイオン交換クロマトグラフィー方法に従い当業者が添加を考慮する任意の１又は複数種の更なる慣用の成分を含む溶液を意味することを意図とする。
【００９５】
本明細書で使用する「近縁の不純物」とは、ＧＬＰ−１ペプチドとは異なる局部又は総合的な正味の電荷を有する１又は複数種の不純物、例えば切頭型、あらゆる種類の伸長型（追加のアミノ酸、エステル等の様々な誘導体）、脱アミド型、不適切に折りたたまれた型、シアル化等の所望されないグリコシル化を有する型、他を意味することを意図する。本明細書で使用する「無縁の不純物」とは、近縁の不純物とは異なる不純物を包括することを意図する。
【００９６】
本明細書で使用する「一定のpH値」とは、例えば緩衝剤の存在下といったpH値が一定でありうること、又は緩衝剤が存在しないなら一般に３pH単位内で変動しうることを意味することを意図とする。
【００９７】
本明細書で使用する「線形又は階段式pH勾配」とは、pH値が溶離の最中に低pHから高pHへと変化すると、又は高pHから低pHへと変化することを意味することを意図する。かかるpHの変化は通常緩衝剤により、及び／又は無機もしくは有機系の酸もしくは塩基、例えばＨＣｌ、ＮａＯＨ、Ｈ2 Ｏ、酢酸、ＮＨ3 、ＫＯＨ、Ｈ2 ＳＯ4 、クエン酸の添加により生ずる。陽イオン交換のためのpH勾配は通常低pHから高pHであり、陰イオン交換の場合高pHから低pHである。
【００９８】
本明細書で使用する「線形又は階段式勾配の塩成分又はイソクラティック式塩成分」とは、塩濃度が溶離の最中に低濃度から高濃度へと変化するか、又は一定であることを意味することを意図する。
【００９９】
本発明は更に下記の観点に関連する。
【０１００】
観点１．ＧＬＰ−１ペプチド及び近縁又は無縁の不純物を含んで成る混合物から前記ペプチドを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程：
前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁又は無縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁又は無縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる正の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁又は無縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法。
【０１０１】
観点２．ＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から前記ペプチドを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程：
前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる正の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法。
【０１０２】
観点３．ＧＬＰ−１ペプチド及び近縁又は無縁の不純物を含んで成る混合物から前記ペプチドを精製するための陰イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程：
前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁又は無縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁又は無縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる負の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁又は無縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法。
【０１０３】
観点４．ＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から前記ペプチドを精製するための陰イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程：
前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる負の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法。
【０１０４】
観点５．前記有機改質剤、対、水の比が重量パーセント基準で１：９９〜９９：１である、観点１〜４のいずれかに記載の方法。
【０１０５】
観点６．前記有機改質剤がＣ1-6 −アルカノール、Ｃ1-6 アルケノール又はＣ1-6 アルキノール、尿素、グアニジン又はＣ1-6 アルカン酸、Ｃ2-6 グリコール又はＣ3-7 ポリアルコール、例えば糖から選ばれる、観点１〜５のいずれかに記載の方法。
【０１０６】
観点７．前記塩成分が任意の有機塩又は無機塩、好ましくはＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮＨ4 Ｃｌ、ＣａＣｌ2 、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸カルシウム又はそれらの混合物から選ばれる、観点１〜６のいずれかに記載の方法。
【０１０７】
観点８．塩成分の存在しない、観点１〜６のいずれかに記載の方法。
【０１０８】
観点９．塩成分の勾配が塩成分の階段又は線形勾配である、観点１〜７のいずれかに記載の方法。
【０１０９】
観点１０．塩成分が０．１mmol／kg〜３０００mmol／kgの範囲から選ばれる濃度で存在する、観点９に記載の方法。
【０１１０】
観点１１．前記緩衝剤がクエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、硼酸緩衝剤、乳酸緩衝剤、グリシルグリシン緩衝剤、アルギニン緩衝剤、炭酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、グルタミン酸緩衝剤、アンモニウム緩衝剤、グリシン緩衝剤、アルキルアミン緩衝剤、アミノエチルアルコール緩衝剤、エチレンジアミン緩衝剤、トリエタノールアミン、イミダゾール緩衝剤、ピリジン緩衝剤及びバルビツール酸緩衝剤、並びにそれらの混合物から選ばれる、観点１〜１０のいずれかに記載の方法。
【０１１１】
観点１２．緩衝剤が０．１mmol／kg〜５００mmol／kgの範囲から選ばれる濃度で存在する、観点１〜１１のいずれかに記載の方法。
【０１１２】
観点１３．緩衝剤が存在していない、観点１〜１０のいずれかに記載の方法。
【０１１３】
観点１４．ペプチドを単離するための方法であって、陽イオン交換クロマトグラフィーを介してＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から当該ＧＬＰ−ペプチドを精製し、ここで当該陽イオン交換クロマトグラフィー方法は下記の工程：
前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる正の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきであり；
しかる後、適宜、分析検査及び／又は更なる精製に委ね、次いで前記ペプチドを慣用の方法で単離することを含む、方法。
【０１１４】
観点１５．ペプチドを単離するための方法であって、陰イオン交換クロマトグラフィーを介してＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から当該ペプチドを精製し、ここで当該陰イオン交換クロマトグラフィー方法は下記の工程：
前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる負の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきであり；
しかる後、適宜、分析検査及び／又は更なる精製に委ね、次いで前記ペプチドを慣用の方法で単離することを含む、方法。
【０１１５】
観点１６．精製すべきペプチドがＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、並びにその類似体及び誘導体から選ばれる、観点１〜１５のいずれかに記載の方法。
【０１１６】
実施例
本発明を下記の実施例により更に説明するが、それらは本発明の範囲を限定するものではない。以上の説明及び下記の実施例に開示の特徴は、単独でも組合さっても、本発明を様々な形態で具現化するための資料となる。
【０１１７】
実施例１：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を例えばＷＯ９８／０８８７１に記載の慣用の組換ＤＮＡ技術により酵母（Ｓａｃｃｈ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の中で発現させた、Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)発酵ブロスを慣用の陽イオン交換クロマトグラフィー捕獲工程により精製した。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び不純物としてその切頭型Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含むプールをpH３．１に調整し、そして得られる溶液１mlを３２．５mlの１．５４％（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．６％（ｗ／ｗ）のコハク酸、１．０９％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物、pH約３．２で平衡にした６．５mlのＣｅｒａｍｉｃ  Ｓ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｆ（ＢｉｏＳｅｐｒａ  Ｓ．Ａ）カラムに載せた。このカラムを６．５mlの平衡溶液で洗い、そして溶離を３．２から８．０に至る線形pH勾配（１．５４％（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．６％（ｗ／ｗ）のコハク酸、１．０９％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物、pH８．０）、次いでpH８．０での１３mlのイソクラティック溶離で実施した。切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク又は分割は得られなかった。
【０１１８】
実施例２：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させ、陽イオン交換により捕獲した。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び不純物としてその切頭型Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含むプールをpH３．１に調整し、そして得られる溶液１mlを１００mlの１．５４％（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．６％（ｗ／ｗ）のコハク酸、１．０９％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物、pH約３．２で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。このカラムを２０mlの平衡溶液で洗い、そして溶離を３．２から８．０に至る線形pH勾配（１．５４％（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．６％（ｗ／ｗ）のコハク酸、１．０９％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物、pH８．０）、次いでpH８．０での４０mlのイソクラティック溶離により行った。切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク又は分割は得られなかった。
【０１１９】
実施例３：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させ、陽イオン交換により捕獲した。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び不純物としてその切頭型Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含むプールをpH３．１に調整し、そして得られる溶液１mlを１００mlの０．７７％（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．３％（ｗ／ｗ）のコハク酸、０．５５％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物、pH約３．２で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。このカラムを２０mlの平衡溶液で洗った。溶離を３．２から８．０に至る線形pH勾配（０．７７％（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．３％（ｗ／ｗ）のコハク酸、０．５５％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物）、次いでpH８．０での４０mlのイソクラティック溶離により行った。pH８．０での後半の溶離は０．０から１．０ＭのＮａＣｌに至る線形塩勾配（０．７７％（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．３％（ｗ／ｗ）のコハク酸、０．５５％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物、pH８．０）、次いで１．０ＭのＮａＣｌでの４０mlのイソクラティック溶離で行った。切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク又は分割は得られなかった。
【０１２０】
実施例４：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させ、陽イオン交換により捕獲した。２容量の水をＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び不純物としてその切頭型Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含むプールに加え、次いでその溶液をpH３．５に調整した。得られる溶液２５．５mlを１００mlの０．２１％（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．０８％（ｗ／ｗ）のコハク酸、０．１５％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH約３．２で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。このカラムを２０mlの平衡溶液で洗い、そして溶離を３．２から８．０に至る線形pH勾配（０．２１％（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．０８％（ｗ／ｗ）のコハク酸、０．１５％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物、４５％のエタノール、pH８．０）、次いでpH８．０での４０mlのイソクラティック溶離により行った。クロマトグラフ図を図２に示す。クロマトグラフィー溶液へのエタノールの添加によっては切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク又は分割は得られなかった。本例と実施例２との設定の間での有意義でない相違点はバッチが異なる、pH、適用のためのサンプルの水希釈率、装填量の多さ、及び低い緩衝剤濃度にある。
【０１２１】
実施例５：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させ、陽イオン交換により捕獲した。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び不純物としてその切頭型Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含むプールをpH３．１に調整し、そして得られる溶液５mlを１００mlの０．８５％（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．３３％（ｗ／ｗ）のコハク酸、０．６％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH約３．２で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。このカラムを２０mlの平衡溶液で洗い、そして溶離を約３．２から約５．０に至る線形pH勾配（０．８５％（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．３３％（ｗ／ｗ）のコハク酸、０．６％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール）、次いでpH８．０での４０mlのイソクラティック溶離（８５％（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．３３％（ｗ／ｗ）のコハク酸、０．６％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH８．０）により行った。クロマトグラフ図を図３に示す。クロマトグラフィー溶液へのエタノールの添加によって切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク及び分割が得られた。
【０１２２】
集めたピークの同定／確認のためのＲＰ−ＨＰＬＣ分析を５μｍの粒子の入ったＣ18置換化１２０Åシリカ（ＹＭＣ）４．０×２５０mMカラムで実施した。緩衝液Ａは７．８％（ｗ／ｗ）のアセトニトリルpH２．５中の０．１５Ｍの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 から成り、そして緩衝液Ｂは６３．４％（ｗ／ｗ）のアセトニトリルを含んだ。１２分間での３７〜４１％のＢ、しかる後の１５分間での４１〜１００％のＢの線形勾配を１ml／min の流速で流した。クロマトグラフィー温度は６０℃に保ち、そしてＵＶ検出は２１４nmで行った。分析結果は以下の通りである：
【０１２３】
0004732590.tif 000021
【０１２４】
適用サンプル及び溶離液のクロマトグラフ図を図４及び５にそれぞれ示す。分析結果は、有機改質剤を採用する陽イオン交換クロマトグラフィーによる切頭型の選択的な分割及び標的ＧＬＰ−１成分を含むメインピーク内での切頭型の激減を示す。
【０１２５】
実施例６：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させ、陽イオン交換により捕獲した。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び不純物としてのその切頭型Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含むプールをpH３．１に調整し、そして得られる溶液１０mlを１００mlの２０mmol／kgのクエン酸、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．０で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。そのカラムを２０mlの平衡溶液で洗い、そして溶離を０から２５０mmol／kgのＫＣｌに至る線形塩勾配（２０mmol／kgのクエン酸、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．０）、次いで２５０mmol／kgのＫＣｌでの６０mlのイソクラティック溶離により行った。クロマトグラフ図を図６に示す。クロマトグラフィー溶液へのエタノールの添加により切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク及び分割が得られた。
【０１２６】
実施例７：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させ、陽イオン交換により捕獲した。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び不純物としてのその切頭型Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含むプールをpH３．５に調整し、そして得られる溶液１０mlを１００mlの２０mmol／kgのクエン酸、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。そのカラムを２０mlの平衡溶液で洗い、そして溶離を０から２５０mmol／kgのＫＣｌに至る線形塩勾配（２０mmol／kgのクエン酸、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５）、次いで２５０mmol／kgのＫＣｌでの４０mlのイソクラティック溶離により行った。実施例６で得られたとの似たように、切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク及び分割が得られた。
【０１２７】
実施例８：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)発酵ブロスを慣用の陽イオン交換クロマトグラフィー捕獲工程、しかる後の慣用のＲＰ−ＨＰＬＣ精製工程により精製した。６容量の水をＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び不純物としてのその切頭型Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含むプールに添加し、そしてその溶液をpH３．５に調整し、そして得られる溶液１７０mlを１００mlの２０mmol／kgのクエン酸、３７．５mmol／kgのＫＣｌ、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。そのカラムを２０mlの平衡溶液で洗い、そして溶離を３７．５から１６２．５mmol／kgのＫＣｌに至る線形塩勾配（２０mmol／kgのクエン酸、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５）、次いで２５０mmol／kgのＫＣｌでの２０mlのイソクラティック溶離（２０mmol／kgのクエン酸、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５）により行った。クロマトグラフィー溶液へのエタノールの添加により切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク及び分割が得られた。
【０１２８】
実施例９：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させ、そして陽イオン交換により捕獲した。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び様々な不純物を含むプール１０mlを１００mlの２０mMのリン酸水素二ナトリウム・二水和物、pH７．５で平衡にした２０mlのＤＥＡＥ  ＨｙｐｅｒＤ  ２０（ＢｉｏＳｅｐｒａ  Ｓ．Ａ．）カラムに載せた。そのカラムを２０mlの平衡溶液で洗い、そして溶離を０から２５０mMのＮａＣｌに至る線形塩勾配（２０mMのリン酸水素二ナトリウム・二水和物、pH７．５）、次いで１mMのＮａＣｌでの４０mlのイソクラティック溶離（２０mMのリン酸水素二ナトリウム、pH７．５）により行った。全ピーク領域の間で標的ＧＬＰ−１成分が溶離する際に異なるピーク又は分割は得られなかった。
【０１２９】
実施例１０：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させ、そして陽イオン交換により捕獲した。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び様々な不純物を含むプールを３容量の水で希釈し、そして得られる溶液４０mlを１００mlの２０mMのトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン、pH８．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ  １５Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。そのカラムを２０mlの平衡溶液で洗い、そして溶離を０から２５０mMのＮａＣｌに至る線形塩勾配（２０mMのトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン、pH８．５）、次いで２５０mMのＮａＣｌでの４０mlのイソクラティック溶離により行った。クロマトグラフ図を図７に示す。全ピーク領域の間で標的ＧＬＰ−１成分が溶離する際に異なるピーク又は分割は得られなかった。
【０１３０】
実施例１１：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させ、そして陽イオン交換により捕獲した。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び様々な不純物を含むプールを３容量の水で希釈し、そして得られる溶液２０mlを１００mlの２０mmol／kgのトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH８．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ  １５Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。そのカラムを２０mlの平衡溶液で洗い、そして溶離を０から２５０mmol／kgのＮａＣｌに至る線形塩勾配（２０mmol／kgのトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH８．５）、次いで２５０mmol／kgのＮａＣｌでの４０mlのイソクラティック溶離により行った。クロマトグラフ図を図８に示す。クロマトグラフィー溶液へのエタノールの添加により、様々な不純物と標的ＧＬＰ−１成分との間で有意なピーク又は分割は得られた。本例と実施例１０との設定における有意義でない相違点は、異なる装填量及び緩衝液濃度にある。
【０１３１】
実施例１２：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させ、そして陽イオン交換により捕獲した。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び様々な不純物を含むプールを１容量の水で希釈し、そして得られる溶液２０mlを１００mlの２０mmol／kgのトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH８．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ  １５Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。そのカラムを２０mlの平衡溶液で洗い、そして溶離を０から１００mmol／kgのＮａＣｌに至る線形塩勾配（２０mmol／kgのトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH８．５）、次いで１００mMのＮａＣｌでの４０mlのイソクラティック溶離により行った。クロマトグラフィー溶液へのエタノールの添加により様々な不純物と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク又は分割は得られた。
【０１３２】
実施例１３：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させた。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィー捕獲工程により発酵ブロスから単離し、次いでＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)のpI（等電点）にて沈殿させた。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び複数種の不純物としてその切頭型Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含む沈殿物１０ｇを５００mlの水に懸濁し、そして８．３のpHに調整することにより溶解してＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)濃度約１．６mg／mlにした。得られる溶液５mlをpH３．５に調整し、そして６０mlの０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、pH３．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に載せた。切頭型は０から２ＭのＮａＣｌに至る線形勾配では溶離／洗浄除去されなかった。標的ペプチドＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び不純物Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)は４％（ｗ／ｗ）のＮａＯＨの再生溶媒４０mlにより単一のピークとして溶離した。クロマトグラフ図を図９に示す。有機改質剤抜きでは慣用の高塩溶液による低pHでの洗浄段階による切頭型不純物の除去は達成されなかった。
【０１３３】
実施例１４：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロスから単離し、そして実施例１３に記載の通りにして沈殿させた。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び複数の不純物の一つとしてのその切頭型Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含む沈殿物１０ｇを５００mlの水に懸濁し、そしてpHを８．３に調整することにより溶解させてＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)濃度約１．６mg／mlにした。得られる溶液５mlをpH３．５に調整し、そして６０mlの０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、３４％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。溶離は０から２．２３％（ｗ／ｗ）のＫＣｌに至る線形塩勾配（０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、３４％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５）で実施した。実施例６と似たように、切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク及び分割が得られた。
【０１３４】
実施例１５：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロスから単離し、そして実施例１３に記載の通りにして沈殿させた。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び複数の不純物の一つとしてのその切頭型Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含む沈殿物１０ｇを５００mlの水に懸濁し、そしてpHを８．３に調整することにより溶解させてＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)濃度約１．６mg／mlにした。得られる溶液５mlをpH３．５に調整し、そして６０mlの０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、２９％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。溶離は０から２．２３％（ｗ／ｗ）のＫＣｌに至る線形塩勾配（０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、２９％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５）で実施した。切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で分割が得られた。
【０１３５】
実施例１６：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロスから単離し、そして実施例１３に記載の通りにして沈殿させた。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び複数の不純物の一つとしてのその切頭型Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含む沈殿物１０ｇを５００mlの水に懸濁し、そしてpHを８．３に調整することにより溶解させてＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)濃度約１．６mg／mlにした。得られる溶液５mlをpH３．５に調整し、そして６０mlの０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、５１％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。溶離は０から２．２３％（ｗ／ｗ）のＫＣｌに至る線形塩勾配（０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、５１％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５）で実施した。実施例６と似たように、切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク及び分割が得られた。
【０１３６】
実施例１７：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロスから単離し、そして実施例１３に記載の通りにして沈殿させた。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び複数の不純物の一つとしてのその切頭型Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含む沈殿物１０ｇを５００mlの水に懸濁し、そしてpHを８．３に調整することにより溶解させてＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)濃度約１．６mg／mlにした。得られる溶液５mlをpH３．５に調整し、そして６０mlの０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、７１％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。溶離は０から１．１２％（ｗ／ｗ）のＫＣｌに至る線形塩勾配（０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、７１％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５）で実施した。クロマトグラフ図を図１０に示す。実施例６と似たように、切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク及び分割が得られた。
【０１３７】
実施例１８：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロスから単離し、そして実施例１３に記載の通りにして沈殿させた。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び複数の不純物の一つとしてのその切頭型Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含む沈殿物１０ｇを５００mlの水に懸濁し、そしてpHを８．３に調整することにより溶解させてＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)濃度約１．６mg／mlにした。得られる溶液５mlをpH３．５に調整し、そして６０mlの０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、４０％（ｗ／ｗ）の２−プロパノール、pH３．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。溶離は０から２．２３％（ｗ／ｗ）のＫＣｌに至る線形塩勾配（０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、４０％（ｗ／ｗ）の２−プロパノール、pH３．５）で実施した。クロマトグラフ図を図１１に示す。切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク及び分割が得られた。
【０１３８】
実施例１９：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロスから単離し、そして実施例１３に記載の通りにして沈殿させた。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び複数の不純物の一つとしてのその切頭型Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含む沈殿物１０ｇを５００mlの水に懸濁し、そしてpHを８．３に調整することにより溶解させてＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)濃度約１．６mg／mlにした。得られる溶液５mlをpH３．５に調整し、そして２４mlの０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、５１％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５で平衡にした８mlのＰｏｒｏｓ  ５０ＨＳ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）カラムに載せた。溶離は０から２．２３％（ｗ／ｗ）のＫＣｌに至る線形塩勾配（０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、５１％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５）で実施した。クロマトグラフ図を図１２に示す。切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク及び分割が得られた。
【０１３９】
実施例２０：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロスから単離し、そして実施例１３に記載の通りにして沈殿させた。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び複数の不純物の一つとしてのその切頭型Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含む沈殿物１０ｇを５００mlの水に懸濁し、そしてpHを８．３に調整することにより溶解させてＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)濃度約１．６mg／mlにした。得られる溶液５mlをpH３．５に調整し、そして２４mlの０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、４０％（ｗ／ｗ）の２−プロパノール、pH３．５で平衡にした８mlのＰｏｒｏｓ  ５０ＨＳ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）カラムに載せた。溶離は０から２．２３％（ｗ／ｗ）のＫＣｌに至る線形塩勾配（０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、４０％（ｗ／ｗ）の２−プロパノール、pH３．５）で実施した。切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク及び分割が得られた。
【０１４０】
実施例２１：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロスから単離し、そして実施例１３に記載の通りにして沈殿させた。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び複数の不純物の一つとしてのその切頭型Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含む沈殿物１０ｇを５００mlの水に懸濁し、そしてpHを８．３に調整することにより溶解させてＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)濃度約１．６mg／mlにした。得られる溶液５mlをpH３．５に調整し、そして６０mlの０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、４０％（ｗ／ｗ）の２−メチル−２，４−ペンタンジオール、pH３．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。溶離は０から２．２３％（ｗ／ｗ）のＫＣｌに至る線形塩勾配（０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、４０％（ｗ／ｗ）の２−メチル−２，４−ペンタンジオール、pH３．５）で実施した。クロマトグラフ図を図１３に示す。切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク及び分割が得られた。
【０１４１】
実施例２２：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロスから単離し、そして実施例１３に記載の通りにして沈殿させた。その沈殿物を水に溶解し、そして有機改質剤を利用する陽イオン交換クロマトグラフィー、しかる後のエタノールでの慣用の逆相クロマトグラフィーにより精製した。逆相溶離液から精製Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)をＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)のpIで沈殿させた。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)をＷＯ  ９８０８８７１に記載の通りにしてアシル化した。
２mg／mlの濃度でモノアシル化Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、そして不純物としてＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及びジアシル化Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を含む得られる溶液を３容量の水で希釈した。pH６．９の５mlの希釈溶液を６０mlの０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、６４．５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。溶離は、０から１．３０％（ｗ／ｗ）のＫＣｌに至る線形塩勾配（０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、６４．５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５）で行った。クロマトグラフ図４を図１４に示す。３つのＧＬＰ−１成分間で異なるピーク及び分割として溶離したＧＬＰ−１成分が得られた。
【０１４２】
集めたピークの同定／確認のためのＲＰ−ＨＰＬＣ分析を５μｍの粒子の入ったジメチル−ブチル−ジメチル−シリル置換化１００Åシリカ（Ｆｕｊｉ−Ｄａｖｉｓｏｎ）４．０×２５０mmカラムで実施した。緩衝液Ａは７．８％（ｗ／ｗ）のアセトニトリル、pH２．５中の０．１５Ｍの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 から成り、そして緩衝液Ｂは６３．４％（ｗ／ｗ）のアセトニトリルを含んだ。１ml／min の流速での勾配プログラムは下記の通りである：１０分間での３５〜５７．５％のＢの線形勾配；２２分間での５７．５〜６７．５％のＢの線形勾配；３分間での６７．５〜９０％のＢの線形勾配；５分間での９０％のＢのイソクラティック；２分間での９０〜３５％のＢの線形勾配；及び５分間での３５％のＢのイソクラティック。クロマトグラフィー温度は６０℃に保ち、そしてＵＶ検出は２１４nmで実施した。分析クロマトグラフ図は３つのＧＬＰ−１成分間の分割を確認した。
【０１４３】
実施例２３：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロスから単離し、そして実施例１３に記載の通りにして沈殿させた。その沈殿物を水に溶解し、そして有機改質剤を利用する陽イオン交換クロマトグラフィー、しかる後のエタノールでの慣用の逆相クロマトグラフィーにより精製した。逆相溶離液から精製Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)をＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)のpIで沈殿させた。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)をＷＯ  ９８０８８７１に記載の通りにしてアシル化した。
２mg／mlの濃度でモノアシル化Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、そして不純物としてＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及びジアシル化Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を含む得られる溶液を３容量の水で希釈した。pH６．９の５mlの希釈溶液を６０mlの０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、４０％（ｗ／ｗ）の２−プロパノール、pH３．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。溶離は、０から２．２３％（ｗ／ｗ）のＫＣｌに至る線形塩勾配（０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、４０％（ｗ／ｗ）の２−プロパノール、pH３．５）で行った。３つのＧＬＰ−１成分間で異なるピーク及び分割として溶離したＧＬＰ−１成分が得られた。実施例２２のＲＰ−ＨＰＬＣ分析方法を集めたピークの同定／確認のために使用した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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