(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程：
（i）シアリダーゼ基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル  α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸又はその塩にヒト由来の生物学的試料を適用する工程；及び
（ii）該シアリダーゼ基質の変化を検出する工程、
を含んでなる、細菌性バギノシスを検出するための方法。
【請求項２】
シアリダーゼ基質が固体支持媒体上に固定されている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
検出される変化が色変化である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
色変化が無色から青への変化である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
色変化が視覚的に検出されるか、又はスティック試験比色計若しくは分光光度計を用いて検出される、請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル  α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の塩が、シクロヘキシルアミン塩である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の細菌性バギノシスを検出するための方法に使用する装置であって、固体媒体上に固定されたシアリダーゼ基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル  α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸又はその塩を含んでなる装置。
【請求項８】
請求項７記載の装置を含んでなる、細菌性バギノシス診断キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、病気を検出するための方法、そのような方法に使用するための装置、及びそのような装置を含んでなるキットに関する。
細菌性バギノシス（bacterial vaginosis）（ＢＶ）は、膣に生息する最も多い微生物（Lactobacilli）がGardnerella vaginalisのような他の微生物に圧倒される状態である。ＢＶは予定日前の分娩（preterm labour）（ＰＴＬ）と関連している。この関連の背景にある機構は、子宮に出入りし、分娩を開始する炎症性メディエイタを放出させるＢＶ関連叢（BV-related flora）によると考えられている。
【０００２】
ＢＶにおいては、細菌感染自体がＰＴＬを生じさせると以前から考えられてきた。ＢＶを治療するため、例えば、ＰＴＬを防ぐために抗生物質が広く使用されるが、そのような治療はめったに成功しない。そのうえ、抗生物質は、Lactobacilliのような有益な種を含む非病原性細菌を殺す可能性がある。
現在では、ＢＶの存在は、臨床検査と病気に特有な細菌についてのグラム染色とを基礎として検出される。グラム染色を用いて結果を得るためには２、３日かかるので、患者は診療所を訪れたときにその結果を知ることができない。
妊娠中は、膣と子宮の間に上行性の細菌感染を防ぐための膜障壁が存在しない。しかし、子宮頸の粘液栓は子宮内感染に対する物理的障壁として機能すると考えられている。
【０００３】
かかる粘液栓は、ムチンと呼ばれる炭水化物に富んだ糖タンパク質の基礎構造に基づいている。ムチンは、中心タンパク質コアにつながったオリゴ糖側鎖から構成される。かかる炭水化物側鎖にはシアル酸残基が存在する。
ＢＶを患う女性の膣分泌物中には、ＢＶを伴わないものとは対照的に高レベルの細菌性シアリダーゼ活性が見られる（MacGregor et al (1994) Am. J. Obstet. Gynaecol. 170 1048-1060; Briselden et al (1992) J. Clin. Microbiol. 30 663-666）。
【０００４】
細菌性シアリダーゼは、糖脂質及び糖タンパク質のシアル酸残基を開裂する酵素である。現在まで、シアリダーゼ活性は種々の基質を用いる手法により分析されてきた。これまでシアリダーゼ活性のアッセイに使用されてきた基質には：ウシ顎下腺ムチン（bovine submandibular gland mucin）及びヒトα−１酸糖タンパク質（human α？1 acid glycoprotein）（Howe et al (1999) in press）；２’−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（Paupermpoonsiri et al (1996) Clin. Inf. Dis. Vol. 23 748-752; Briselden et al (1992) supra）；４−ニトロフェニル−α−シアル酸及び２−（３−メトキシフェニル）−Ｎ−アセチル−Ｄ−ノイラミン酸（MacGregor et al (1994) supra）が含まれる。既知のシアリダーゼ基質の多くは感度が低い。
【０００５】
これまでに説明したシアリダーゼ基質は種々のアッセイに使用される。例えば、合成基質とともに比色定量アッセイ又は蛍光定量アッセイを使用して、かかる基質の非シアル残基（例えば、４−メチルウンベリフェロン又は４−ニトロフェノール）を検出することができる。代わりに、シアログリコ抱合体基質（sialoglycoconjugate substrate）から放出されるシアル酸の量を、ＨＰＬＣ又は比色定量アッセイにより検出することができる。また、放射定量アッセイを使用して、シアロ抱合体に放射性標識を導入し放出されたシアル酸を液体シンチレーション計数により検出することもある。
本発明者らは、ＰＴＬとＢＶとのつながりは細菌感染それ自体よりもむしろ細菌性シアリダーゼ活性によるものであるということを発見した。シアリダーゼ活性は粘液栓の崩壊に関係し、上部の生殖路（upper reproductive tract）内への細菌の接近が高くなると考えられる。
【０００６】
ムチン分子の炭水化物側鎖の末端におけるシアル酸のカルボキシル基は、糖側鎖の硬直性の原因となる負のイオン電荷を与える。シアル酸の開裂は、粘液栓の粘性損失の原因となるムチン分子間の相互反発性電荷（mutual repulsive charge）を消失させる。上部の生殖路内への細菌の接近は、２つの理由に付いてのこの作用の結果として高められる。第一に、ムチンと、その結果粘液マトリックス組織は崩壊後に失われ、粘液マトリックスの機械的及び静菌的特性は障壁機構としての効力が少なくなる。第二に、粘液層の分解によりその下にある皮膚組織への細菌の付着を促進して免疫学的認識応答を変化させ、細菌が膣分泌液の分泌により洗い落とされる可能性を低くする。
【０００７】
この発見から、シアリダーゼ阻害剤は細菌性バギノシスのような状況を治療し防ぐのに有用であり、ＰＴＬを防ぐための治療において有用であろうということになる。また、シアリダーゼ活性についてのアッセイはＢＶのような病気を検出するのに有用であろうということになる。
本発明者らは、また、シアリダーゼ活性の存在を検出する、ＢＶのような病気についての診断試験を開発した。この試験における結果は、慣用的なグラム染色診断を用いるＢＶの発病と有意に相関関係がある事が分かった。かかる試験法は、患者から試料を摂取してその試料をシアリダーゼと接触させることを包含する。インキュベーション後、シアリダーゼ活性が検出されれば、色変化のような検出できる変化が観察される。好ましい態様においては、かかる試験は、スポット試験、すなわち、試料をろ紙のような適する固体媒体によりそれ自体支持されたシリアダーゼ基質に適用する。
【０００８】
かかる試験は、ＢＶの検出において非常に高い感度を有することが分かっている、ＢＶ叢からのシリアダーゼの結合について最適な環境を示す可能性のある基質を使用する。本試験に使用する好ましい基質は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル  α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の塩であり、特に、Rose Scientific Ltd., エドモントン, カナダから入手可能なシクロヘキシルアミン（Ｘ−α−ＮＡＮＡ）である。
【０００９】
シアリダーゼ活性を検出するための本発明の試験方法は、高感度であり、行うのに費用がかからず、短時間かつ簡単に使用することができる。かかる試験は、ＢＶの標識、従って予定日前の出産の可能性を予報するものとしてのシアリダーゼ活性を試験するのに特に有用である。本発明の方法は、普通に入手可能であるもの以外の高価な装置又は材料の品目の使用を必要としないので、かかるアッセイは患者と同じ部屋か又は、診療所若しくはＧＰ手術室内で行うことができる。例えば、慣用的な方法と比較して、グラム染色キット又は光学顕微鏡を必要としない。そのうえ、本発明の方法はグラム染色より労働集約が少ない。
【００１０】
また、かかるシアリダーゼスポット試験は、シアリダーゼ活性はＢＶ又はすべてのＢＶ叢に存在するとは限らないことから、その存在は、状態があるケースの宿主にとって他のケースよりも有害であるという標識であり得るという点において、現在ＢＶを検出するのに使用されている比色、蛍光、放射試験を超える利点を有する。
【００１１】
本発明の第一の側面によれば、次の工程：
（i）ヒト被験者から生物学的試料を得る工程；
（ii）該生物学的試料を固体支持体媒体上に固定されたシアリダーゼ基質に適用する工程；及び
（iii）該固定されたシアリダーゼ基質の変化を検出する工程
を含んでなる、病気（疾病、疾患）を検出するための方法が提供される。
【００１２】
第二の側面によれば、病気の検出に使用するための装置であって、固体媒体に固定されたシアリダーゼ特異性基質を含んでなる装置が提供される。
かかる装置は、次の工程：
i）ヒト被験者から生物学的試料を得る工程；
ii）該生物学的試料をかかる装置に適用する工程；及び
iii）該固定されたシアリダーゼ基質における色変化の有無を検出する工程
を含んでなる、本発明の第一の側面に従った方法に使用されてもよい。
【００１３】
本発明の第三の側面によれば、本発明の第二の側面に従った装置を含んでなる病気の診断キットが提供される。
本発明のこの第三の側面のキットは、例えば、トリス／ＨＣｌバッファーなどの培地（incubation medium）及び／又は試料摂取手段を包含してもよい。
好ましくは、本発明の第二の側面の装置及び本発明の第三の側面のキットは、尿生殖路感染症を診断するために使用される。より好ましくは、かかる病気は細菌性バギノシスである。
かかるシアリダーゼ基質は、シアリダーゼ酵素により特異的に認識される基質である。例えば、かかる基質は、シアリダーゼ基質により開裂される。好ましくは、本基質はシアル酸のグリコシドである。より好ましくは、かかる基質は、５−ブロモ−４−クロロ−インドイル  α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸又はその塩、例えば、そのシクロヘキシルアミン塩である。
【００１４】
かかる固体培地は、例えば、ろ紙であり得る。
好ましくは、哺乳類被験体は、妊娠した女性又は妊娠を計画している女性である。
本発明の第４の側面によれば、試料中のシアリダーゼ活性の検出のための方法であって、次の工程：
（a）前記試料を、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル  α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸又はその塩を含んでなる試験試薬と接触させる工程；及び  （b）試験試薬の変化を検出する工程
を含んでなる方法が提供される。
かかる試験試薬は、例えば、その上又はその中に５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル  α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸又はその塩が支持される、適用される、吸着されるかさもなければ含有される、固体、液体又はゲル相の媒体を含んでもよい。
【００１５】
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル  α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、好ましくは、シクロヘキシルアミン塩の形態である。好ましくは、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル  α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シクロヘキシルアミンは、固体基質、例えば、ろ紙上に支持されるか又は吸着される。このように、反応性化合物を基質上に固定して、診断試験の実施を促進してもよい。反応性化合物が固体媒体上に吸着される診断試験は、かかる診断試験自体が試料（又は試料の抽出物）を固体媒体上の反応性化合物が吸着されている領域に“スポットする”ことにより実施されることから、多くの場合、スポット試験と呼ばれる。
【００１６】
試料は、哺乳類被験体、典型的にはヒト被験者から、例えば、スワブ（swab）、又は適する緩衝液を用いた洗液として直接入手してもよい。試料を摂取した後、試験試薬に適用するか又は直接それに接触させてもよい。代わりとして、例えば、試料がスワブである場合、試料の内容物を液体媒体、例えば、トリス緩衝液のような緩衝液中に抽出してから、試験試薬に適用してもよい。これにより、本試験方法の応用はより便利になる。
かかる試験方法は、特定的には、ＢＶの検出に向いているので、好ましい態様においては、ヒトの女性患者から試料を膣のスワブ又は試料として摂取する。
【００１７】
試料を試験試薬と接触させた後、かかる試験試薬のあらゆる変化を観察する。試験試薬が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル  α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸クロロヘキシルアミンを含んでなる場合には、かかる変化は無色から青への色変化である。この変化は、視覚的に観察することができるか又は、結果を定量するために使用することができる、スティック試験比色計（stick test colorimeter）又は分光比色計のような適する装置を用いて実施することができる。色変化が観察できる場所では、基質の背景部分は、反応性化合物の色変化を曖昧にするか又は隠してしまう色ではないことが好ましい。また、未反応の試験試薬は、基質の背景部分上で目立たない色であることが好ましい。好ましくは、未反応試験試薬のは無色である。
第５の側面によれば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル  α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸又はその塩を含んでなる試験試薬を含んでなる、本発明の第４の側面において使用するためのキットが供給される。
【００１８】
本発明のこの態様においては、かかる試験試薬は、好ましくは、その上に５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル  α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸又はその塩が支持されるか又は吸着される固体媒体の形態の装置（device）である。好ましい試験試薬は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル  α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シクロヘキシルアミン溶液に浸されたろ紙である。好ましくは、ろ紙は、およそ１ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル  α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シクロヘキシルアミンの溶液に浸される。次いで、ろ紙を直接使用するか、又は将来の使用のために乾燥して保管することができる。従って、かかるキットは、使用者がかかる基質を固体媒体に適用することができるように、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル  α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シクロヘキシルアミン（例えば、溶液）及び固体媒体（例えば、ろ紙）を含んでなるか又は、かかるキットは、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル  α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シクロヘキシルアミン溶液を予め適用して乾燥させた固体媒体を含んでなることができる。
【００１９】
また、本発明のこの側面のキットは、培地、例えば、トリス／ＨＣｌ緩衝液及び／又は試料入手手段を含んでもよく、適する使用説明書とともに適する容器に一緒に包装されてもよい。
本発明において使用される試験試薬は、反応性化合物を、適する固体、液体又はゲル相媒体と接触させた結果、反応性化合物がかかる媒体中に含有されるか、その上に支持されるか又は吸着される方法により製造されてもよい。例えば、試験試薬が固体装置である場合、かかる反応性化合物を、次いで固体媒体に適用される適する溶液中に製造してもよい。
本発明の第４及び第５の側面において使用する試験試薬は、それ自体本発明の側面である。かかる試薬の好ましい形態は、その中で試験試薬を固体基質の表面に適用して、診断試験が実施される場所である局部的なパッチ（patch）を形成する、固体装置である。
【００２０】
本発明の第４の側面の方法、本発明の第５の側面のキット、及び本発明の第６の側面の装置は、細菌性シアリダーゼの異常な（例えば、高い）活性を特徴とする病気を検出するために使用することができる。例えば、かかる病気は尿生殖路感染であり得る。好ましくは、本発明の第４の側面の方法、本発明の第５の側面のキット、及び本発明の第６の側面の装置は、細菌性バギノシスを診断するために使用される。
好ましくは、哺乳類被験体は、妊娠した女性であるか又は妊娠を計画している女性である。
本発明の第７の側面によれば、ヒト被験者におけるＰＴＬを診断するための方法であって、患者か又は患者から摂取した試料中の細菌性シアリダーゼ活性をアッセイする工程を含んでなる方法が供給される。
【００２１】
本発明の第８の側面によれば、ＢＶを治療するか又はＰＴＬを防ぐための方法であって、患者にシアリダーゼ阻害剤を投与する工程を含んでなる方法が供給される。
本発明の第９の側面によれば、ＢＶの治療又はＰＴＬの予防のための治療又は予防組成物の製造におけるシアリダーゼ阻害剤の使用が供給される。
本発明をより理解するため、そして同等なものを如何に実施し得るかを示すために、単に例としてのみ以下の実施例が参照される。
【００２２】
【実施例】
ＢＶの診断のための平行グラム染色及びシアリダーゼスポット試験アッセイ
Milen尿生殖診療所、ブリストル王立病院にかかっている１００人の女性を、ＢＶの検出のための慣用的なグラム染色に加えてシアリダーゼ活性について試験した。診察のときに個々のスワブを摂取し、すぐに２５ｍＭトリス／ＨＣｌ／Tween20（ｐＨ７．０）２ｍｌ中に入れた。診療所が終わるまでスワブを４℃の冷蔵所に入れた。
【００２３】
シアル酸基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル  α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シクロヘキシルアミン塩を、２５ｍＭのＣａＣｌ、１５０Ｍの酢酸Ｎａ及び１ｍＭのＮａＣｌの緩衝液（ｐＨ５．５）中に１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように計量した。これをよく混ぜてから、１０ｃｍ径のろ紙片上にろ紙が充分に湿るまでピペットで取った。トリス緩衝液からスワブを取り出し、基質が接種されたろ紙上にすり込んだ。ろ紙をペトリ皿に置き、ふたを閉めその皿を３７℃で１時間インキュベートした。シアリダーゼ活性が存在することを示す青色のスポットが現れた。シアリダーゼ活性が全く無ければ、紙は、ろ紙が乾燥してしまうより前で２時間後でさえ無色のままであった。
【００２４】
ＢＶのグラム染色診断をSpiegelの基準（1980）により評価した。Hay at alにより定義されるグレード２ＢＶは、ＢＶ及び“標準的な”膣の叢両方との関係が更に解明を必要とする問題のある範疇である。この範疇はＢＶの定義を満足せず、グレード２ＢＶがＢＶ微生物コロニー形成が徐々に進行しているという指標であるかどうかは不明瞭である。従って、この研究においては、初期のグラム染色の評価はグレード１（主として、Lactobacillus morphotype）、グレード２（LactobacillusとＢＶに関係する微生物との混合）及びグレード３（殆どか又は全くLactobacillus無し，主として、糸口となる細胞（clue cells）の存在であるＢＶ微生物）にそれらを分けたが、グレード１及び２を、統計分析の目的のため合算した。観察者らはスポット試験の結果に判断を失い、スポット試験の観察者らはグラム染色の結果に判断を失った。
【００２５】
結果
ＢＶについてのグラム染色の結果は、スポット試験の結果と相関があったグレード２がＢＶの決定的な診断としてみなさないように、グレード１とグレード２の結果を統計分析のために合算した。本研究における数は比較的小さかった。
患者の年齢は１６歳から５２歳で平均年齢は２８．３歳であり、メジアンは２６歳、モードは２５歳であった。
シアリダーゼ活性についての明確なスポット試験は、グラム染色診断に関するＢＶグレード３の発病率とｐ＜．０００００１レベルで有意に相関があった。従って、ＢＶの検出におけるスポット試験の感度は、９３．５であり、特異性は９６．３であった。陽性の予測値は９５．６であり、陰性の予測値は９４．５であった。Amsells（1990）の基準は、スポット試験の結果とｐ＝．０４レベルで有意に関係があり、感度は９３．７、特異性は７０．５、陽性予測値は５７．６及び陰性予測値は９６．２であった。