(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から分離された試料を用いて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるアンギオポエチン−１タンパク質をコードする遺伝子において、上記アンギオポエチン−１タンパク質の第２６９番目のアミノ酸にあたるグリシンをコードする３塩基の挿入の有無を決定する工程を含むことを特徴とするメタボリックシンドロームの発症可能性の判定のためのデータ取得方法。
【請求項２】
生体から分離された試料を用いて、配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有するアンギオポエチン−１遺伝子の上記塩基配列中第８０５〜８０７番目の塩基にあたる「ＧＧＴ」（ＧおよびＴは、それぞれ、グアニンおよびチミンを表す）の３塩基の挿入の有無を決定する工程を含むことを特徴とするメタボリックシンドロームの発症可能性の判定のためのデータ取得方法。
【請求項３】
アンギオポエチン−１タンパク質において、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の第２６９番目のアミノ酸にあたるグリシンの挿入の有無による多型を検出する工程を含むことを特徴とするメタボリックシンドロームの発症可能性の判定のためのデータ取得方法。
【請求項４】
（ａ）配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子の上記塩基配列中第８０５〜８０７番目にあたる塩基を含む領域を増幅するためのプライマー、
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子の上記塩基配列中第８０５〜８０７番目にあたる塩基を含む領域に結合するプローブ、および、
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、当該タンパク質の第２６９番目のアミノ酸にあたるグリシンが欠失したタンパク質のいずれか一方のみを認識する抗体のうち、少なくとも１つを含み、かつ、
請求項１〜３のいずれか１項に記載のメタボリックシンドロームの発症可能性の判定のためのデータ取得のためのデータ取得キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタボリックシンドロームの診断および予防に関するものであって、特に、メタボリックシンドロームの発症に関連する遺伝子またはその翻訳産物たるタンパク質の多型を用いたメタボリックシンドロームの診断および予防に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
メタボリックシンドローム（代謝症候群、metabolic syndrome、以下「ＭＳ」ともいう）は、内臓に脂肪が蓄積することによって、血糖を下げるホルモンであるインスリンの効果が弱くなり（すなわち、インスリン抵抗性が高まり）、糖や脂質の代謝の異常が起こった病態を表すものである。ＭＳでは、動脈硬化の危険因子である「内臓脂肪型肥満」、「高血圧症」、「耐糖能異常（高血糖）」、および「高脂血症」を重複して発症していることが多い。これらの症状は、いずれも動脈硬化を引き起こす要因と考えられているものである。動脈硬化は、現在わが国の死亡原因の第２位、３位で、国民の死因の約３分の１を占める心疾患および脳血管疾患の原因である心脳血管障害を引き起こすと考えられている。したがって、高血圧や糖尿病、脂質代謝異常、肥満といった複数の危険因子が重複する病態であるＭＳは、直接的な死亡要因とはならないが、ＭＳが長期に及ぶと、死亡率の高い疾患を引き起こす疾患といえる。
【０００３】
しかし、ＭＳは、軽症の場合、運動療法および／または食事療法により、症状の改善が期待できる。そのため、ＭＳを早期発見し、早期治療することが、健康寿命をのばすためにも、高齢者の生活の質（ＱＯＬ）を高めるためにもきわめて重要である。
【０００４】
このようなＭＳの診断は、例えば、米国高脂血症治療ガイドラインに基づき行われる。上記米国高脂血症治療ガイドラインでは、（ａ）ウエスト(腹囲)が男性で１０２ｃｍ以上、女性で８８ｃｍ以上、（ｂ）中性脂肪が１５０ｍｇ／ｄｌ以上、（ｃ）ＨＤＬコレステロールが男性で４０ｍｇ／ｄｌ未満、女性で５０ｍｇ／ｄｌ未満、（ｄ）血圧が最大血圧で１３０ｍｍＨｇ以上または最小血圧で８５ｍｍＨｇ以上、（ｅ）空腹時血糖値が１１０ｍｇ／ｄｌ以上、の５つの項目のうち、少なくとも３項目が該当する場合、ＭＳであると診断される。
【０００５】
また、長年、日本では、診断基準が設けられていなかったが、２００５年に、日本内科学会において、ＭＳの診断基準がわが国でも初めて示された。そのＭＳの診断基準によれば、ウエストが規定値（男性で８５センチ、女性で９０センチ）以上であり、かつ、（ａ）最高血圧が１３０以上か、最低血圧が８５以上、（ｂ）空腹時の血糖値が１１０以上、（ｃ）中性脂肪が１５０以上、またはＨＤＬ−コレステロールが４０未満、の３項目のうち、２項目以上当てはまる場合に、ＭＳであると診断される。また、ＭＳの診断基準は、これ以外にも世界保健機構（ＷＨＯ）による診断基準などが存在する。
【０００６】
上記の診断基準は、あくまでも、ＭＳを発症した後に、ＭＳであることを診断するためのものであるが、ＭＳは、生活習慣の改善により、発症を未然に防ぐことが可能な疾患である。つまり、ＭＳを発症する前に、将来的にＭＳとなる可能性を判定することができれば、その判定結果を受けて、生活習慣の改善を図り、ＭＳの発症を未然に防ぐことができる。
【０００７】
そこで、将来、ＭＳになる可能性を判定する方法の開発が求められており、これまでに例えば、クロトー（Kloth、クロソともいう）遺伝子中の多型を検出する方法が提案されている（特許文献１を参照）。具体的には、特許文献１では、クロトー遺伝子の遺伝子型を決定し、当該遺伝子型がリスク遺伝子型を含むかどうかを決定することにより、ＭＳの素因を診断する方法が開示されている。
【特許文献１】特表２００３−５１４５１３号公報（平成１５（２００３）年４月２２日公開）
【非特許文献１】Kuro-o et al. Nature, 390, 45-51 (1997)
【非特許文献２】Christopher D. Kontos et al., Tyrosine 1101 of Tie2 is the major site of association of p85 and is required for activation of phosphatidylinositol 3-kinase and Akt, Molecular and Cellular Biology, 18, 4131-4140 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＭＳの発症、または将来的に発症する可能性を判定する方法として、特許文献１に開示されているような分子生物学的手法を用いれば、迅速に、正確な診断を行うことができる。しかしながら、特許文献１に開示されるクロトー遺伝子は、マウスにおいて、いくつかの加齢表現型の抑制に関与している遺伝子として同定されたものである（非特許文献１を参照）。さらに、ヒトクロトー遺伝子についても、閉経後女性における老人性骨粗鬆症の進行に関わっていることが示唆されている（特許文献１を参照）。つまり、クロトー遺伝子はＭＳとの直接的な因果関係が科学的に証明された遺伝子ではないため、これを指標とするのみでは、ＭＳの発症可能性を診断するのは十分とはいえない。
【０００９】
また、一般的に、疾患は、原因遺伝子が単一であることは少なく、複数の原因遺伝子が複雑に絡み合って発症することが多いため、遺伝子の多型を用いて疾患の発症もしくは発症可能性を判定するには、複数の遺伝子の多型を指標とすることが有効であると考えられている。そこで、ＭＳについても、発症もしくは発症可能性を判定（診断）するための新たな遺伝子の多型を同定することが求められている。
【００１０】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＭＳの発症との関連のある遺伝子の多型を同定し、ＭＳの診断および予防を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、アンギオポエチン−１遺伝子（以下、「Ａｎｇ−１遺伝子」ともいう）の遺伝子型により、ＭＳを発症する頻度が異なることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明にかかるＭＳの発症または発症可能性の判定方法は、生体から分離された試料を用いて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるアンギオポエチン−１タンパク質（以下、「Ａｎｇ−１タンパク質」ともいう）をコードする遺伝子において、上記アンギオポエチン−１の第２６９番目のアミノ酸にあたるグリシンをコードする３塩基の挿入の有無を決定する工程を含むことを特徴としている。
【００１３】
また、本発明にかかるＭＳの発症または発症可能性の判定方法は、生体から分離された試料を用いて、配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（open reading frame；以下、「ＯＲＦ」ともいう）領域として有するＡｎｇ−１遺伝子の上記塩基配列中第８０５〜８０７番目の塩基にあたる「ＧＧＴ」（ＧおよびＴは、それぞれ、グアニンおよびチミンを表す）の３塩基の挿入の有無を決定する工程を含むことを特徴としている。
【００１４】
さらに、本発明にかかるＭＳの発症または発症可能性の判定方法は、Ａｎｇ−１タンパク質の多型を検出する工程を含むことを特徴としている。
【００１５】
本発明にかかるＭＳの発症または発症可能性の判定キットは、（ａ）配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子の上記塩基配列中第８０５〜８０７番目にあたる塩基を含む領域を増幅するためのプライマー、（ｂ）配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子の上記塩基配列中第８０５〜８０７番目にあたる塩基を含む領域に結合するプローブ、および、（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、当該タンパク質の第２６９番目のアミノ酸にあたるグリシンが欠失したタンパク質のいずれか一方のみを認識する抗体のうち、少なくとも１つを含み、かつ、上記メタボリックシンドロームの発症または発症可能性の判定方法のいずれかを利用することを特徴としている。
【００１６】
本発明にかかるＭＳの予防薬剤は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を有する者を投与対象とし、上記タンパク質の第２６９番目のアミノ酸にあたるグリシンが欠失したタンパク質もしくは当該タンパク質をコードするＤＮＡ、当該タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物、またはＡｎｇ−１遺伝子のモジュレーターを含有することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１７】
以上のように、本発明によれば、Ａｎｇ−１遺伝子またはその翻訳産物であるタンパク質の多型と、ＭＳ発症との因果関係を利用して、ＭＳの発症または発症可能性を判定することができる。それゆえ、ＭＳの発症または発症可能性を簡便かつ高精度に判定することができるという効果を奏する。さらに、Ａｎｇ−１遺伝子またはその翻訳産物であるタンパク質の多型のうち、ＭＳ発症のリスクの少ない型のＡｎｇ−１遺伝子またはその翻訳産物であるタンパク質を用いることにより、ＭＳの予防方法や予防薬剤の開発への応用も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の実施形態について、説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１９】
なお、本明細書において、特に断らない限り、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンの各塩基を示す。また、アミノ酸およびアミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。
【００２０】
＜１．アンギオポエチン−１遺伝子およびアンギオポエチン−１タンパク質＞
本明細書において、「Ａｎｇ−１遺伝子」および「Ａｎｇ−１タンパク質」とは、塩基配列データベース上でアンギオポエチン−１遺伝子として公開されている塩基配列を有する遺伝子、および該遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の総称である。また、Ａｎｇ−１タンパク質には、各種データベース上でアンギオポエチン−１タンパク質としてアミノ酸配列が公開されているタンパク質が含まれる。
【００２１】
例えば、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＢ９１３２５およびＮＰ＿００１１３７に登録されるアミノ酸配列からなるタンパク質、並びにこれらのタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００２２】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、その配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシンをもったタンパク質である。一方、ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＢ９１３２５に登録されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、当該グリシンを有さないタンパク質である。
【００２３】
また、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２に示される塩基配列をＯＲＦ領域として有する遺伝子にコードされている。なお、本明細書において、「ＯＲＦ領域」とは、開始コドンから終始コドンまでの領域、またはその一部を指す。上記遺伝子は、配列番号２に示される塩基配列中、第８０５〜８０７番目の塩基として「ＧＧＴ」の３塩基をもっている。この３塩基が、配列番号１に示されるアミノ酸配列中、第２６９番目のアミノ酸であるグリシンをコードする塩基に相当する。配列番号２に示される塩基配列をＯＲＦ領域として有する遺伝子としては、Ａｎｇ−１遺伝子のｃＤＮＡとしてＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（アクセッション番号：Ｕ８３５０８）が該当する。なお、上記配列番号２中の第８０５〜８０７番目の塩基は、上記塩基配列（アクセッション番号：Ｕ８３５０８）の第１１１４〜１１１６番目の塩基に相当する。
【００２４】
ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＢ９１３２５に登録されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（アクセッション番号：ＡＢ０８４４５４）をＯＲＦ領域として有する遺伝子にコードされている。当該遺伝子は、上記配列番号２に示される塩基配列中、第８０５〜８０７番目の塩基にあたる「ＧＧＴ」の３塩基が欠失している。その結果、その翻訳産物であるタンパク質は、上記配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２６９番目のアミノ酸にあたるグリシンが欠失している。
【００２５】
さらに、本発明にかかるＡｎｇ−１遺伝子およびＡｎｇ−１タンパク質として、（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列、もしくはＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＢ９１３２５およびＮＰ＿００１１３７に登録されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡｎｇ−１の機能を有するタンパク質、および該タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００２６】
上記「１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、（１）天然において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたとの意味と、（２）部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたとの意味との両方を表すものである。つまり、上記（ｂ）のタンパク質は、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質と考えることもできるし、また、上記（ａ）のタンパク質の多型と考えることもできる。
【００２７】
また、本発明にかかるＡｎｇ−１遺伝子は、塩基配列（アクセッション番号：ＡＢ０８４４５４）、および上記配列番号２に示される塩基配列の一部に、１個または複数の塩基が挿入、置換、および／または欠失された塩基配列をＯＦＲ領域として有する遺伝子であってもよい。ここにおいても、「１個または複数の塩基が挿入、置換、および／または欠失された塩基配列」は、天然に生じてもよいし、人為的な変異導入により生じてもよい。
【００２８】
さらに、本発明にかかるＡｎｇ−１遺伝子として、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつＡｎｇ−１の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００２９】
上記「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ」するとは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の具体的な例として、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。また、上記ハイブリダイゼーションは、J.Sambrook et al. Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができ、特に限定されるものではない。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる）。
【００３０】
なお、本明細書において、「遺伝子」とは、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用される。「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドの重合体を意味する。したがって、本明細書での用語「遺伝子」には、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）を包含する。アンチセンス鎖は、プローブとしてまたはアンチセンス薬剤として利用できる。「ＤＮＡ」には、例えばクローニングや化学合成技術、またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ等が含まれる。すなわち、ＤＮＡとは、ゲノム中に含まれる形態であるイントロンなどの非コード配列を含む「ゲノム」型ＤＮＡであってもよいし、また逆転写酵素やポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを経て得られるｃＤＮＡ、すなわちイントロンなどの非コード配列を含まない「転写」型ＤＮＡであってもよい。さらに、本発明にかわる遺伝子は、上記（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。また、これらのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの翻訳領域の末端および／または内部に調節配列やポリアデニル配列等の任意のポリヌクレオチドが含まれていてもよい。なお、本明細書において、「核酸」なる語には、任意の単純ヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド、例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、およびｈｎＲＮＡ等が含まれる。「修飾ヌクレオチド」には、イノシン、アセチルシチジン、メチルシチジン、メチルアデノシン、メチルグアノシンを含むリン酸エステルの他、紫外線や化学物質の作用で後天的に発生し得るヌクレオチドも含まれる。
【００３１】
また、本明細書において、「塩基配列」とは、「核酸配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドの配列として示される。また、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの「塩基配列」は、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドに対してのデオキシリボヌクレオチドの配列を意図し、そしてＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドに対してのリボヌクレオチドの対応する配列（ここで特定されるデオキシヌクレオチド配列における各チミジンデオキシヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌクレオチドのウリジン（Ｕ）によって置き換えられる）を意図する。
【００３２】
例えば、デオキシリボヌクレオチドの略語を用いて示される「配列番号２または４の配列を有するＲＮＡ分子」とは、配列番号２または４の各デオキシヌクレオチドＡ、ＧまたはＣが、対応するリボヌクレオチドＡ、ＧまたはＣによって置換され、そしてデオキシヌクレオチドＴが、リボヌクレオチドＵによって置き換えられる配列を有するＲＮＡ分子を示すことを意図する。また、「配列番号２または４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号２または４の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび/またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分を意図する。
【００３３】
＜２．ＭＳの発症または発症可能性の判定方法＞
本発明にかかるＭＳの発症または発症可能性の判定方法（換言すれば、ＭＳの診断方法）は、Ａｎｇ−１タンパク質における特定のアミノ酸の有無、または、Ａｎｇ−１タンパク質をコードする遺伝子もしくはＡｎｇ−１遺伝子における特定の塩基の有無を決定し、当該アミノ酸または塩基の有無に基づき、ＭＳの発症または発症可能性を判定する方法であればよく、その他の具体的な構成については、特に限定されない。例えば、以下に示す方法が挙げられる。
【００３４】
（Ｉ）Ａｎｇ−１タンパク質をコードする遺伝子において、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の第２６９番目のアミノ酸にあたるグリシンをコードする３塩基の挿入の有無を決定する工程を含む方法。
【００３５】
（ＩＩ）Ａｎｇ−１遺伝子において、配列番号２に示される塩基配列をＯＲＦ領域として有する遺伝子の上記塩基配列中第８０５〜８０７番目の塩基にあたる「ＧＧＴ」の３塩基の挿入の有無を決定する工程を含む方法。
【００３６】
（ＩＩＩ）Ａｎｇ−１タンパク質において、配列番号１示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の第２６９番目のアミノ酸にあたるグリシンの挿入の有無を決定する工程を含む方法。
【００３７】
上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の方法は、さらに、Ａｎｇ−１タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子型を決定する工程、Ａｎｇ−１遺伝子の遺伝子型を決定する工程、およびＡｎｇ−１タンパク質の多型を検出する工程をそれぞれ含むことが好ましい。
【００３８】
これらの工程を備えることによって、より精度よく、ＭＳの発症または発症可能性を判定することができる。
【００３９】
なお、本明細書において、「遺伝子の多型」とは、同じ遺伝子の塩基配列にいくつかの型があることを意味する。また、「タンパク質の多型」とは、同じタンパク質のアミノ酸配列にいくつかの型があることを意味する。
【００４０】
以下、上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の方法について、詳細に説明する。なお、上記Ａｎｇ−１タンパク質およびＡｎｇ−１遺伝子については、上記＜１＞項で詳述したので、ここでは、その説明を省略する。
【００４１】
〔方法（Ｉ）〕
Ａｎｇ−１タンパク質をコードする遺伝子において、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の第２６９番目のアミノ酸にあたるグリシンをコードする３塩基の挿入の有無を決定する方法は、特に限定されるものでなく、従来公知の方法を用いることができる。具体的には、（Ａ）ゲノムＤＮＡを用いる方法、（Ｂ）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる方法を用いることができる。
【００４２】
（Ａ）ゲノムＤＮＡを用いる方法
被験者のゲノムは、常法により人体の全ての細胞より得ることが可能であるが、例えば、毛髪、各臓器、末梢リンパ球、滑膜細胞などから得ることができる。また、得られた細胞を培養し、増殖したものから得ることもできる。さらに、末梢血から得ることも可能である。
【００４３】
得られたゲノムは、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法およびＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅して用いることができる。
【００４４】
ゲノムＤＮＡを用いて遺伝子型を決定する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、アリル特異的オリゴヌクレオチドプローブ法、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Oligonucleotide Ligation Assay）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＨＰＦＡ法、インベーダー法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法、プライマーオリゴベースエクステンション（Primer Oligo Base Extension）法、タイリング・アレイ法、および変性勾配ゲル電気泳動法などが挙げられる。
【００４５】
具体的には、ゲノムから、Ａｎｇ−１タンパク質をコードする遺伝子における特定領域（例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の第２６９番目のアミノ酸にあたるグリシンをコードする３塩基を含む領域）を増幅後、得られるＰＣＲ産物をダイレクトシークエンスすることによって、または、サブクローニングしたのち、当該ＰＣＲ産物部分をシークエンスすることによって、当該遺伝子の特定領域の塩基配列を決定することができる。すなわち、本実施形態における配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の第２６９番目のアミノ酸にあたるグリシンをコードする３塩基の有無を決定することができる。
【００４６】
また、上記特定領域をオリゴヌクレオチドプローブに用いることによって、上記特定領域の塩基配列の相違を検出することができる。すなわち、本実施形態における配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の第２６９番目のアミノ酸にあたるグリシンをコードする３塩基の有無を決定することができる。このようにプローブに用いる場合としては、例えば、Ａｎｇ−１遺伝子の特定領域の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをチップ上に固定してＤＮＡチップを構成し、当該ＤＮＡチップを遺伝子型解析用に用いるような場合が挙げられる。この場合、オリゴヌクレオチドプローブの長さとしては、上記Ａｎｇ−１遺伝子の多型領域を含む７〜５０ヌクレオチド、あるいは１０〜３０ヌクレオチドが好ましく、１５〜２５ヌクレオチドがより好ましい。
【００４７】
（Ｂ）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる方法
ｍＲＮＡを利用する場合、例えば、被験者の細胞より抽出したｍＲＮＡから逆転写反応によってｃＤＮＡを作製し、上記遺伝子の領域を増幅後、上記（Ａ）と同様、増幅断片の塩基配列を直接シークエンスすることにより、またはＤＮＡチップを用いることにより、あるいはＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法を用いることにより、遺伝子型を決定できる。
【００４８】
上記遺伝子の特定領域（例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の第２６９番目のアミノ酸にあたるグリシンをコードする３塩基を含む領域）の増幅に用いるプライマーとしては、特に限定されるものではないが、例えば、以下のプライマーの組み合わせによりｃＤＮＡを鋳型とした増幅反応が可能である。
センスプライマー１：5’-CCACCAACAACAGTGTCCTT-3’（配列番号３）
センスプライマー２：5’-CAACCTTGTCAATCTTTGC-3’（配列番号４）
センスプライマー３：5’-GCTGGCAGTACAATGACAG-3’（配列番号５）
アンチセンスプライマー１：5’-TCAAAAATCTAAAGGTCGAAT-3’（配列番号６）
アンチセンスプライマー２：5’-CAGCTTGATATACATCTGCACAG-3’（配列番号７）
なお、本発明において使用されるプライマーおよびプローブは、常法により、ＤＮＡシンセサイザーなどにより作製することができる。
【００４９】
また、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の第２６９番目のアミノ酸にあたるグリシンをコードする３塩基の有無は、上記の増幅断片、またはゲノムＤＮＡを適当な制限酵素を使用し、切断されるゲノム断片のサイズの違いをサザンブロッティングなどで検出することによっても決定することができる。
【００５０】
本発明にかかるＭＳの発症または発症可能性の判定方法においては、決定した上記３塩基の有無によって、当該３塩基を有する遺伝子を有する者では、ＭＳを発症しやすく、逆に、当該３塩基を欠失する遺伝子を有する者では、ＭＳを発症しにくいと判定することができる（後述の実施例を参照）。
【００５１】
また、上記Ａｎｇ−１タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子型を決定する工程では、配列番号１示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の第２６９番目のアミノ酸にあたるグリシンをコードする３塩基が欠失した遺伝子を、ホモで有するか、ヘテロで有するか、それとも有さないかを決定する。なお、Ａｎｇ−１タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子型は、上記３塩基の有無を決定する方法を用いることにより決定することができる。この場合、上記「Ａｎｇ−１タンパク質をコードする遺伝子における特定領域」を「Ａｎｇ−１タンパク質をコードする遺伝子における多型領域」と読み替えればよい。また、本明細書において、上記「多型領域」とは、当該遺伝子の多様性が出現する座または位置を含む領域を意味するものである。
【００５２】
当該工程を備えることにより、ＭＳの発症または発症可能性の判定精度をより高めることができる。具体的には、Ａｎｇ−１遺伝子の遺伝子型が、当該３塩基を欠失するＡｎｇ−１遺伝子（以下、「３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子」ともいう）をホモで有する遺伝子型の場合、ＭＳを発症している可能性または将来発症する可能性は低いと判定することができる。一方、３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する遺伝子型である場合には、ＭＳを発症している可能性または将来発症する可能性が高いと判定することができる。また、当該３塩基を有するＡｎｇ−１遺伝子（以下、「３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子」ともいう）と３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子とをヘテロで有する遺伝子型の場合は、ＭＳを発症している可能性または将来発症する可能性が中程度と判定することができる。
【００５３】
このように、本構成によれば、被験者のＭＳの診断（発症または発症可能性の判定）を正確かつ簡便に行うことができる。
【００５４】
〔方法（ＩＩ）〕
Ａｎｇ−１遺伝子において、配列番号２に示される塩基配列をＯＲＦ領域として有する遺伝子の上記塩基配列中第８０５〜８０７番目の塩基にあたる「ＧＧＴ」の３塩基の挿入の有無を決定する方法は特に限定されるものではない。例えば、上記方法（Ｉ）における３塩基の挿入の有無を決定する方法と同様の方法を用いることができる。上記方法（Ｉ）の説明したところの、「Ａｎｇ−１タンパク質をコードする遺伝子の特定領域」は、本実施形態においては、Ａｎｇ−１遺伝子の特定領域と読み替えばよい。本発明において、Ａｎｇ−１タンパク質をコードする遺伝子の特定領域は、配列番号２に示される塩基配列をＯＲＦ領域として有する遺伝子の上記塩基配列中第８０５〜８０７番目の塩基にあたる「ＧＧＴ」の３塩基を含む領域であることが好ましい。
【００５５】
本発明にかかるＭＳの発症または発症可能性の判定方法においては、決定した上記３塩基の有無によって、当該３塩基を有する遺伝子を有する者では、ＭＳを発症しやすく、逆に、当該３塩基を欠失する遺伝子を有する者では、ＭＳを発症しにくいと判定することができる（後述の実施例を参照）。
【００５６】
また、上記Ａｎｇ−１遺伝子の遺伝子型を決定する工程では、配列番号２に示される塩基配列をＯＲＦ領域として有する遺伝子の上記塩基配列中第８０５〜８０７番目の塩基にあたる「ＧＧＴ」の３塩基を欠失する遺伝子をホモで有するか、ヘテロで有するか、それとも有さないかを決定する。なお、Ａｎｇ−１遺伝子の遺伝子型は、上記３塩基の有無を決定する方法を用いることにより決定することができる。この場合、上記「Ａｎｇ−１タンパク質をコードする遺伝子における特定領域」を「Ａｎｇ−１遺伝子における多型領域」と読み替えればよい。
【００５７】
上記Ａｎｇ−１遺伝子の遺伝子型を決定する工程を備えることにより、ＭＳの発症または発症可能性の判定精度をより高めることができる。具体的には、Ａｎｇ−１遺伝子の遺伝子型が、当該３塩基を欠失するＡｎｇ−１遺伝子（以下、「３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子」ともいう）をホモで有する遺伝子型の場合、ＭＳを発症している可能性または将来発症する可能性は低いと判定することができる。一方、当該３塩基を有するＡｎｇ−１遺伝子（以下、「３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子」ともいう）をホモで有する遺伝子型である場合には、ＭＳを発症している可能性または将来発症する可能性が高いと判定することができる。また、３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子と３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子とをヘテロで有する遺伝子型の場合は、ＭＳを発症している可能性または将来発症する可能性が中程度と判定することができる。なお、上記「中程度」とは、３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する遺伝子型の場合の可能性と３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する遺伝子型の場合の可能性との間との意味である。
【００５８】
このように、本構成によれば、被験者のＭＳの診断（発症または発症可能性の判定）を正確かつ簡便に行うことができる。
【００５９】
〔方法（ＩＩＩ）〕
上記のＡｎｇ−１タンパク質において、配列番号１示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の第２６９番目のアミノ酸にあたるグリシンの挿入の有無を決定する方法についても特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。
【００６０】
例えば、被験者の細胞より調製したタンパク質を利用する場合、一般的なタンパク質のシークエンス方法に準じ、Ａｎｇ−１タンパク質のアミノ酸配列を決定し、そのアミノ酸配列をもとに、上記グリシンの有無を検出することができる。また、上記グリシンを有するＡｎｇ−１タンパク質または上記グリシンを有さないＡｎｇ−１タンパク質のみを認識する抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法やウェスタンブロット法などの免疫化学的手法を用いて検出する方法を用いることができる。さらに、タンパク質を単離し、直接または必要に応じ、酵素等で切断し、プロテインシークエンサーを利用して検出する方法、アミノ酸の等電点を指標に検出する方法および質量分析により測定される質量の差から検出する方法を用いることができる。これら例示した方法のうち、簡便で、精度が高いことから、特定のＡｎｇ−１タンパク質のみを認識する抗体、特に、配列番号１示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の第２６９番目のアミノ酸にあたるグリシンの有無を検出する抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法でＡｎｇ−１タンパク質の当該グリシンの有無を検出する方法が好ましい。
【００６１】
本発明にかかるＭＳの発症または発症可能性の判定方法においては、決定した上記グリシンの有無によって、当該グリシンを有するタンパク質を有する者では、ＭＳを発症しやすく、逆に、当該グリシンを欠失するタンパク質を有する者では、ＭＳを発症しにくいと判定することができる。
【００６２】
また、上記Ａｎｇ−１タンパク質の多型を検出する工程では、被験者が、上記グリシンを有さないＡｎｇ−１タンパク質のみを有するのか、上記グリシンを有するＡｎｇ−１タンパク質のみを有するのか、それとも上記グリシンを有するＡｎｇ−１タンパク質と上記グリシンを有さないＡｎｇ−１タンパク質との両方を有するのかを判別する。
【００６３】
上記Ａｎｇ−１タンパク質の多型を検出する方法は、特に限定されるものではない。例えば、上記グリシンを有するＡｎｇ−１タンパク質のみを認識する抗体と、上記グリシンを有さないＡｎｇ−１タンパク質のみを認識する抗体とを用いて、上記例示したような免疫化学的手法により、上記多型を検出することができる。また、質量分析法により、上記タンパク質の多型を検出することができる。
【００６４】
上記Ａｎｇ−１タンパク質の多型を検出する工程を備えることにより、ＭＳの発症または発症可能性の判定精度をより高めることができる。具体的には、上記グリシンが欠失した型のＡｎｇ−１タンパク質（以下、「グリシン欠失型Ａｎｇ−１タンパク質」ともいう）しか検出されなかった場合は、ＭＳを発症している可能性または将来発症する可能性は低いと判定することができる。一方、上記グリシンが挿入された型のＡｎｇ−１タンパク質（以下、「グリシン挿入型Ａｎｇ−１タンパク質」ともいう）のみが検出された場合は、ＭＳを発症している可能性または将来発症する可能性は高いと判定することができる。また、上記グリシンを挿入された型と欠失した型との両方の型のＡｎｇ−１タンパク質が検出された場合には、ＭＳを発症している可能性または将来発症する可能性が中程度と判定することができる。
【００６５】
このように、上記構成によれば、ＭＳの診断（発症またはその発症可能性の判定）を正確かつ簡便に行うことができる。
【００６６】
なお、上記タンパク質の調製方法は、特に限定されず、被験者のあらゆる組織、細胞などから従来公知の方法で調製することができる。特に、Ａｎｇ−１タンパク質の含有量が多い組織から調製することが好ましい。
【００６７】
また、上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれの方法においても、上記被験者は、特に限定されるものではないが、内臓脂肪型肥満の者、または耐糖能異常、高中性脂肪血症、もしくは高血圧症のいずれかを患っている者、あるいはＭＳを発症している者が好ましい。
【００６８】
さらに、本発明にかかるＭＳの発症またはその発症の可能性の判定方法が適用されるサンプルは、人体等の生体から分離された試料であればよく、上記例示されたものに限定されるものではない。
【００６９】
また、本発明にかかるＭＳの発症または発症可能性の判定方法は、ＭＳの発症または発症可能性を判定する方法としてだけではなく、ＭＳを発症している患者に適用することによって、その予後を判定（予測）する方法として用いることもできる。具体的には、Ａｎｇ−１遺伝子の遺伝子型が、３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する遺伝子型の場合、ＭＳの予後がよいと判定することができる。一方、３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する遺伝子型である場合には、ＭＳの予後が悪いと判定することができる。また、３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子と３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子とをヘテロで有する遺伝子型の場合は、ＭＳの予後は、３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する遺伝子型である場合と３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する遺伝子型の場合との間（中程度）と判定することができる。
【００７０】
一方、タンパク質を用いる方法（上記方法（ＩＩＩ））では、グリシン欠失型Ａｎｇ−１タンパク質しか検出されなかった場合は、ＭＳの予後はよいと判定することができる。一方、グリシン挿入型Ａｎｇ−１タンパク質のみが検出された場合は、ＭＳの予後は悪いと判定することができる。また、上記グリシンを挿入された型と欠失した型との両方の型のＡｎｇ−１タンパク質が検出された場合には、ＭＳの予後は、中程度と判定することができる。
【００７１】
＜３．ＭＳの発症またはその発症可能性の判定キット＞
本発明にかかるＭＳの発症または発症可能性の判定キット（換言すれば、ＭＳの診断キット）は、上記の遺伝子またはタンパク質における特定の塩基またはアミノ酸の有無、より好ましくは上記の遺伝子またはタンパク質の多型、を検出できる試薬を少なくとも含んでいればよく、その他の構成は特に限定されるものではない。そのような試薬としては、例えば、プライマー、プローブ、および抗体などを挙げることができる。これらの試薬は、単独で含まれてもよく、また、複数の組み合わせで含まれていてもよい。さらに、上記判定キットは、上記例示する試薬に加えて、その他の試薬を組み合わせることによっても得ることができる。
【００７２】
具体的には、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いた遺伝子における特定の塩基の有無、好ましくは遺伝子の多型、を検出するキットとしては、当該遺伝子の特定領域、好ましくは多型領域、を増幅できるように設計されたプライマーを含み、さらに、特定の塩基、好ましくは多型、を検出できるように設計されたプローブ、制限酵素、マクサムギルバート法およびサンガー法などの塩基配列決定法に利用される試薬など、特定の塩基、好ましくは多型、を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせたキットが挙げられる。なお、かかる試薬は、採用される検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素、ＲＮＡ合成酵素、プローブなど標識するために使用する試薬（例えば、標識がビオチンの場合には、アビジン酵素結合物および酵素基質および発色団）等を挙げることができる。さらに、多型の検出の妨げとならない適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
【００７３】
プライマーを含むキットの場合、プライマーは、標的遺伝子（例えば、本実施形態におけるＡｎｇ−１遺伝子）の特定の領域、好ましくは多型領域、を増幅できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば上記配列番号３〜７に示されるプライマーから選択して用いることができる。
【００７４】
また、プローブを含むキットの場合、プローブは、標的遺伝子（例えば、本実施形態におけるＡｎｇ−１遺伝子）の特定の領域、好ましくは多型領域、に結合できるものであれば、特に限定されるものではない。
【００７５】
さらに、タンパク質のおける特定のアミノ酸の有無、好ましくはタンパク質の多型、を検出するキットとしては、例えば、本発明にかかるタンパク質のうち、特定の型のみを認識する抗体を含み、さらに、当該抗体を用いて、本発明にかかるタンパク質における特定のアミノ酸の有無、好ましくは当該タンパク質の多型を検出するために用いる試薬や器具、例えば、抗体を標識するために使用する試薬（例えば、標識がビオチンの場合には、アビジン酵素結合物および酵素基質および発色団）、上記抗体を１次抗体として用いる場合、それに対応する２次抗体、ブロッキング試薬、タイタープレート、緩衝液や洗浄液などを含むキットなどが挙げられる。上記抗体としては、上記＜２＞項で例示した抗体を用いることができる。
【００７６】
これらの判定キットを使用することにより、上記＜２＞の項で述べたように、ＭＳの診断（発症またはその発症可能性の判定）を正確かつ簡便に行うことができる
また、本発明にかかるＭＳの発症またはその発症可能性の判定キットが適用される被験者は特に限定されるものではないが、内臓脂肪型肥満の者、または耐糖能異常、高中性脂肪血症、もしくは高血圧症のいずれかを患っている者、あるいはＭＳを発症している者が好ましい。
【００７７】
さらに、本発明にかかるＭＳの発症または発症可能性の判定キットは、上述のＭＳの発症または発症可能性の判定方法のように、ＭＳを発症している患者に適用すれば、ＭＳの予後の判定キット（換言すれば、ＭＳの予後診断キット）として、用いることができる。
【００７８】
＜４．ＭＳの発症の予防方法および予防薬剤＞
後述する実施例に示すように、Ａｎｇ−１タンパク質には、ＭＳを発症しやすい型のＡｎｇ−１タンパク質とＭＳを発症しにくい型のＡｎｇ−１タンパク質とが存在する。そのうち、後述の実施例に示す３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子の翻訳産物であるタンパク質、すなわち、グリシン挿入型Ａｎｇ−１タンパク質は、ＭＳの発症の一要因となるタンパク質である。一方、３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子の翻訳産物であるタンパク質、すなわちグリシン欠失型Ａｎｇ−１タンパク質は、ＭＳの発症を抑制する効果をもつ。したがって、本発明にかかるタンパク質の多型を利用することにより、ＭＳの発症を予防することができる。すなわち、本発明は、（Ａ）ＭＳの予防方法、および（Ｂ）ＭＳの予防薬剤を提供する。
【００７９】
（Ａ）ＭＳの予防方法
本発明にかかるＭＳの予防方法は、ＭＳを発症しやすい型のＡｎｇ−１タンパク質、例えば、グリシン挿入型Ａｎｇ−１タンパク質を有する者に、ＭＳの予防、発症時期の遅延または発症したときの症状の緩和を目的として適用するものである。具体的には、例えば、グリシン欠失型Ａｎｇ−１タンパク質もしくは当該タンパク質をコードするＤＮＡ、または、当該グリシン欠失型Ａｎｇ−１タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を補完する方法が挙げられる。また、本発明にかかる遺伝子のモジュレーターを投与する方法を用いることもできる。
【００８０】
上記本発明にかかる遺伝子のモジュレーターの例には、遺伝子発現ならびに発現遺伝子産物の活性および／または量に影響をおよぼす化合物および物質が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明における使用に適した一般的なモジュレーターには、例えば、本発明にかかる遺伝子またはその遺伝子産物のいずれかのアゴニストおよび／またはアンタゴニスト；本発明にかかる遺伝子の発現もしくは機能に対する高分子または低分子阻害剤；本発明にかかる遺伝子または転写物に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス配列；抗体；オリゴマー形成に関与する本発明にかかる遺伝子産物のドミナント・ネガティブ体を含む本発明にかかる遺伝子産物の結合蛋白質；および本発明にかかる遺伝子産物のキナーゼ、またはそれらの断片、変異体および誘導体が含まれる。
【００８１】
また、本発明にかかるモジュレーターとして、本発明にかかる遺伝子のｍＲＮＡに結合し、その転写を妨げる、または低下させるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることができる。上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞によって産生された本発明にかかる遺伝子のｍＲＮＡと混合して、２重鎖を形成する。これらの２重鎖は、その後、そのｍＲＮＡのそれ以上の転写およびその翻訳のいずれをもブロックできる。それゆえ、本発明にかかるタンパク質の活性および／または量を低下させることができる。
【００８２】
上記のタンパク質、ＤＮＡ、低分子化合物、およびモジュレーターは、予防的、すなわちＭＳと診断される前に投与されてもよいし、ＭＳであると診断された後に投与されてもよい。また、投与経路は、特に限定されるものではないが、一般的な投与経路として、経口、直腸、静脈内、非経口、筋肉内および皮下経路が挙げられる。また、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとして投与される場合、すなわち遺伝子治療の形態で投与される場合、リポゾーム、ウイルスベクターまたは被覆粒子（遺伝子銃）など従来公知の方法を用いて、直接的に細胞中に運搬できる。
【００８３】
（Ｂ）ＭＳの予防薬剤
本発明にかかるＭＳの予防薬剤は、ＭＳを発症しやすい型のＡｎｇ−１タンパク質、例えば、グリシン挿入型Ａｎｇ−１タンパク質を有する者に、ＭＳの予防、発症時期の遅延または発症したときの症状の緩和を目的として用いられる予防薬剤である。例えば、グリシン欠失型Ａｎｇ−１タンパク質または当該グリシン欠失型Ａｎｇ−１タンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、当該グリシン欠失型Ａｎｇ−１タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を含有する薬剤や、上記「（Ａ）ＭＳの予防方法」で例示した本発明にかかる遺伝子のモジュレーターを含有する薬剤が挙げられる。これら薬剤の投与方法は、特に限定されるものではなく、上記「（Ａ）ＭＳの予防方法」で例示した方法を用いることができる。
【００８４】
また、本発明にかかるタンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質としては、例えば、Ｔｉｅ−２受容体が挙げられる。Ａｎｇ−１タンパク質がＴｉｅ−２受容体のリガンドであることは、例えば、非特許文献２などに開示されている。したがって、このＴｉｅ−２受容体のアゴニストとして作用する低分子化合物を経口または静注などによって体内に投与することは、ＭＳの予防方法として有効であると考えられる。なお、ここでいう低分子化合物とは、ペプチドなどのタンパク質をも含むものである。
【００８５】
また、グリシン欠失型Ａｎｇ−１タンパク質または当該グリシン欠失型Ａｎｇ−１タンパク質をコードするＤＮＡと、上記レセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物とは、予防薬剤として択一的に使用されるだけでなく、組み合わせて使用することも可能である。
【００８６】
また、本発明にかかるＭＳの発症に対する予防方法もしくは予防薬剤が適用される被験者は特に限定されるものではないが、ＭＳであると診断された者、ＭＳの可能性があると診断された者、または本発明にかかる判別方法によってＭＳを発症する可能性が高い遺伝子型であると判定された者であることが好ましい。
【００８７】
なお本発明は、以上例示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術範囲に含まれる。
【実施例】
【００８８】
本発明について、実施例および図１〜８に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。なお、以下の実施例におけるＡｎｇ−１遺伝子の遺伝子型は次のようにして評価した。
【００８９】
〔Ａｎｇ−１遺伝子の遺伝子型の評価方法〕
（１）配列分析
被験者の末梢血を、公知の方法によりＥＤＴＡ採血した。採血した上記末梢血からRNA isolation kit （GENTRA SYSTEMS, MN）を用いて、トータルＲＮＡを単離した。単離した上記トータルＲＮＡから公知の方法により、Oligo dTプライマーによる逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。そして、Ａｎｇ−１遺伝子のエクソン４から５にかけて設定したプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法により増幅断片を得た。なお、上記の反応に使用したプライマーは、以下に示すとおりである。
センスプライマーＦ２−２：5’-CCACCAACAACAGTGTCCTT-3’（配列番号３）
センスプライマーＦ２−４：5’-CAACCTTGTCAATCTTTGC-3’（配列番号４）
アンチセンスプライマーＲ１１８６：5’-CAGCTTGATATACATCTGCACAG-3’（配列番号７）
また、上記センスプライマーＦ２−２およびＦ２−４、ならびに上記アンチセンスプライマーＲ１１８６の設定位置については、図１に示すとおりである。
【００９０】
さらに、上記ＲＴ−ＰＣＲにおける増幅条件は以下の通りである。まず、上記合成ｃＤＮＡを鋳型に、上記センスプライマーＦ２−２およびアンチセンスプライマーＲ１１８６をプライマーに用いて、ＲＴ−ＰＣＲによる断片増幅を行った。
【００９１】
上記ＲＴ−ＰＣＲにおける反応液は、ｃＤＮＡ、１×ＰＣＲ−Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（Applied Biosystems）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ、２００ｎＭ のそれぞれのプライマー、２．５ＵのAmpliTaq Gold DNA-Polymerase （Applied Biosystems）を含むように調製した。
【００９２】
さらに、上記ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は、９５℃で１２分の行程を１サイクル、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒および７２℃で１分の行程を３０サイクルとした。
【００９３】
以上の条件によりＲＴ−ＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ産物１μｌを鋳型とし、プライマーに上記センスプライマーＦ２−４およびアンチセンスプライマーＲ１１８６を用いて、上記の反応液組成および反応条件でＰＣＲを行い、増幅断片を得た。
【００９４】
その結果、得られた増幅断片をエタノール沈殿により精製した。次に、上記センスプライマーＦ２−４とBigDye Terminator(Applied Biosystems, CA）とを用いたダイターミネーター法によって、精製した増幅断片から配列分析用の試料を調製した。その後、蛍光ＤＮＡシークエンサー（ABI377、Applied Biosystems）にて、その試料の配列分析を行った。配列解析により決定した上記増幅断片の配列を、配列番号１に示される塩基配列と比較することにより、Ａｎｇ−１遺伝子の遺伝子型を評価することとした（図２右側パネルを参照）。塩基番号８０５からシークエンスフェログラム（波形シグナル）の重複が認められる場合、３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子と３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子とがヘテロで存在すると判定することとした（図２右側パネル下段を参照）。
【００９５】
なお、図２中、「−／−」、「＋／＋」、および「＋／−」は、それぞれ、３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子がホモで検出された場合、３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子がホモで検出された場合、および３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子と３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子とがヘテロで検出された場合を意味する。
【００９６】
（２）鎖長分析
上記の配列分析の場合と同様の方法で増幅断片を得た。ただし、鎖長分析では、上記センスプライマーＦ２−４はＴＥＴ蛍光標識したものを用いた。最終ＰＣＲ反応産物を１０倍に希釈した上記増幅断片を含む溶液を用いて、鎖長分析を行った。鎖長分析は上記の希釈された増幅断片を含む溶液を１μｌ、５ｍｇ／ｍｌ Blue Dextran、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、分子量マーカーＧＳ５００ ＴＡＭＲＡ（Applied Biosystems）０．３μｌを含むホルムアミド液３μｌを試料とし、蛍光ＤＮＡシークエンサーを用いて行った。
【００９７】
鎖長分析では、１０１塩基もしくは９８塩基のピークのいずれが出現するかにより、Ａｎｇ−１遺伝子の遺伝子型を判定することとした（図２左側パネルを参照）。また、１０１塩基と９８塩基との両方のピークが出現する場合には、ヘテロであると判定することとした（図２左側パネル下段を参照）。
【００９８】
〔実施例１〕
ＭＳ患者から上記の方法で採血した末梢血を用いて、上記の配列分析および鎖長分析を行った。図３は、配列分析によるＡｎｇ−１遺伝子の多型解析の結果を示す図である。図３に示すように、Ａｎｇ−１遺伝子においては、３塩基挿入型および３塩基欠失型の２つの多型が存在することが見出された。なお、同図（左）が３塩基挿入型の解析結果であり、同図（右）が３塩基欠失型の解析結果である。つまり、３塩基挿入型では、「ＧＧＴ」の３塩基挿入が生じていることが確認でき（図３（左）を参照）、３塩基欠失型では、この３塩基が欠失していることが確認できた（図３（右）を参照）。
【００９９】
なお、配列番号２には、このうち３塩基挿入型の遺伝子配列が示されている。この３塩基挿入型では、配列番号２に示されるように、その配列中第８０５〜８０７番目の塩基として「ＧＧＴ」の３塩基が挿入されている。
【０１００】
また、上記３塩基挿入型遺伝子の翻訳産物であるタンパク質は、配列番号１に示されるように、そのアミノ酸配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシンが挿入されている。一方、上記３塩基欠失型遺伝子の翻訳産物であるタンパク質においては、この第２６９番目のグリシンが欠落している。
【０１０１】
〔実施例２〕
関節リウマチ（以下、「ＲＡ」ともいう）患者、糖尿病性網膜症（以下、「ＤＲ」ともいう）患者、混合性結合組織病（以下、「ＭＣＴＤ」ともいう）および健常者から採血した末梢血を用いて、上記方法により、Ａｎｇ−１遺伝子の遺伝子型を調べた結果を図４に示す。
【０１０２】
なお、図４において、ｎは各種被験者の全体数を示し、３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する患者群（図中および以下、「−／−」と示す）、３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子と３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子とをヘテロで有する患者群（図中および以下、「＋／−」と示す）、３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する患者群（図中および以下、「＋／＋」と示す）の数をそれぞれの欄に示している。さらに、括弧内には、各種被験者における上記それぞれの者の割合を示す。
【０１０３】
図４に示すように、健常者では、「−／−」は１１．９％、「＋／−」は７８．０％、「＋／＋」は１０．１％であった。ＲＡ患者では、「−／−」は５．１％、「＋／−」は７９．０％、「＋／＋」は２４．５％であった。また、ＤＲ患者では、「−／−」は２５．８％、「＋／−」は３６．５％、「＋／＋」は３７．９％であった。さらに、ＭＣＴＤ患者では、「−／−」は１０．５％、「＋／−」は３４．２％、「＋／＋」は５５．３％であった。さらに、３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する者について、健常者群と、ＲＡ患者群およびＤＲ患者群との間の有意差をカイ２乗検定により解析した。その結果、健常者群とＲＡ患者群との間のＰ値は１０−２、健常者群とＤＲ患者群との間のＰ値は１０−４、健常者群とＭＣＴＤ患者群との間のＰ値は１０−６であった。
【０１０４】
〔実施例３〕
ＤＲ患者について、年齢、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、空腹時血糖（ＦＢＳ）、および羅病期間を調べた。なお、ＨｂＡ１ｃ、ＦＢＳは、空腹時採血サンプルを用いて、定法に従い、測定した。その結果、各測定項目とも、Ａｎｇ−１遺伝子の遺伝子型による相違は見られなかった。
【０１０５】
なお、図５において、３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する患者群（図中および以下、「−／−」と示す）、３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子と３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子とをヘテロで有する患者群（図中および以下、「＋／−」と示す）、３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する患者群（図中および以下、「＋／＋」と示す）における、上記各種測定項目の測定結果をそれぞれの欄に示している。
【０１０６】
〔実施例４〕
ＤＲ患者をさらに、進行度に従い、単純型ＤＲ、前増殖型ＤＲ、および増殖型ＤＲに分類し、それぞれの進行段階にある患者において、Ａｎｇ−１遺伝子の遺伝子型を調べた。また、糖尿病であるとの診断を受けた患者であって、合併症としてＤＲを発症していない患者についても、Ａｎｇ−１遺伝子の遺伝子型を調べた。その結果を、図６に示す。なお、図６において、ＳＤＲは、単純型ＤＲ患者を、ＰＰＤＲは、前増殖型ＤＲ患者を、ＰＤＲは、増殖型ＤＲ患者をそれぞれ表し、さらに、ＤＲ（−）は、糖尿病であるとの診断を受けた患者であって、合併症としてＤＲを発症していない患者を表している。
【０１０７】
〔実施例５〕
ＤＲ患者について、総コレステロール（Ｔ−Ｃｈｏ）、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、トリグリセリド（ＴＧ）、および高血圧症の有無を調べた。なお、総コレステロール（Ｔ−Ｃｈｏ）、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃｈｏ）、およびトリグリセリド（ＴＧ）は、空腹時採血サンプルを用いて、定法に従い、測定した。その結果を図７に示す。なお、図７において、３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する患者群（図中および以下、「−／−」と示す）、３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子と３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子とをヘテロで有する患者群（図中および以下、「＋／−」と示す）、３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する患者群（図中および以下、「＋／＋」と示す）における、上記各種測定項目の測定結果をそれぞれの欄に示している。図７に示すように、ＨＤＬ−Ｃｈｏ値は、「−／−」の患者群では、６７．９±３．９ｍｇ／ｄｌ、「＋／−」の患者群では、５５．１±６．５ｍｇ／ｄｌ、「＋／＋」の患者では、５６．３±１２．７ｍｇ／ｄｌであった。また、ＨＤＬ−Ｃｈｏ値について、「−／−」の患者群と、「＋／−」の患者群および「＋／＋」の患者群との間の有意差をカイ２乗検定により解析した。その結果、「−／−」の患者群と「＋／−」の患者群との間のＰ値は０．０３９、「−／−」の患者群と「＋／＋」の患者群との間のＰ値は０．０２４であった。このことから、「−／−」の患者群では、「＋／−」の患者群および「＋／＋」の患者群に比べて、ＨＤＬ−Ｃｈｏ値が有意に高いことが分かった。
【０１０８】
また、ＴＧ値は、「−／−」の患者群では、１４８．６±４３．１ｍｇ／ｄｌ、「＋／−」の患者群では、１８２．６±８７．４ｍｇ／ｄｌ、「＋／＋」の患者では、１９３．６±６８．２ｍｇ／ｄｌであった。また、ＴＧ値について、「−／−」の患者群と「＋／＋」の患者群との間の有意差をカイ２乗検定により解析した。その結果、「−／−」の患者群と「＋／＋」の患者群との間のＰ値は０．０４７であった。このことから、「−／−」の患者群では、「＋／＋」の患者群に比べて、ＴＧ値が有意に低いことが分かった。
【０１０９】
以上の結果から、３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子を有することが、ＭＳなどに見られるヒト脂質代謝異常を改善することが明らかとなった。
【０１１０】
〔実施例６〕
米国高脂血症治療ガイドラインに基づくＭＳの診断基準のうち、高ＴＧ血症、ＨＤＬコレステロール血症、高血圧症の３項目のうち、２項目以上に該当する者について、Ａｎｇ−１遺伝子の遺伝子型を調べた（図８を参照）。その結果を図８中の表に示す。図８中の表に示されるように、上記３項目のうち、２項目以上に該当する者は、「−／−」では、１５．４％、「＋／−」では、２６．１％、「＋／＋」では、４０．０％であった。このことから、３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子を有する者のほうが３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子を有さない者よりも、ＭＳになりにくいことが明らかとなった。
【０１１１】
なお、本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
以上のように、本発明では、Ａｎｇ−１タンパク質、もしくはＡｎｇ−１遺伝子の多型を利用することにより、ＭＳの発症の可能性を予測することができる。それゆえ、ＭＳの発症または発症可能性の判定方法や判定キットに代表される診断医療の分野だけでなく、保健医学分野に広く利用することができる。さらには、ＭＳを発症しにくい型のＡｎｇ−１タンパク質、もしくはＡｎｇ−１遺伝子を用いることにより、ＭＳの発症の予防方法や予防薬剤に利用することができる。さらに、本発明にかかる遺伝子およびタンパク質は、ＭＳを発症した後の、ＭＳの症状の緩和、すなわち治療にも用いることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】本発明にかかるＡｎｇ−１遺伝子のｃＤＮＡの一部を模式的に示した概略図である。
【図２】本実施例において、Ａｎｇ−１遺伝子の多型解析（配列解析および鎖長解析）を示す図である。
【図３】本実施例において、配列分析によるＡｎｇ−１遺伝子の多型解析の結果を示す図である。
【図４】本実施例において、ＲＡ患者、ＤＲ患者、ＭＣＴＤ患者、および健常者におけるＡｎｇ−１遺伝子の遺伝子型を調べた結果を示す表である。
【図５】本実施例において、ＤＲ患者について、年齢、ＨｂＡ１ｃ、ＦＢＳ、および羅病期間を調べた結果を示す表である。
【図６】本実施例において、ＤＲの進行度とＡｎｇ−１遺伝子の遺伝子型との関係を調べた結果を示す表である。
【図７】本実施例において、ＤＲ患者について、Ｔ−Ｃｈｏ、ＨＤＬ−Ｃｈｏ、ＴＧ、および高血圧症の有無を調べた結果を示す表である。
【図８】本実施例において、米国高脂血症治療ガイドラインに基づくＭＳの診断基準と、当該診断基準においてＭＳと診断された患者について、Ａｎｇ−１遺伝子の遺伝子型を調べた結果とを示す図である。
【図１】
0004657857.tif 000002
【図２】
0004657857.tif 000003
【図３】
0004657857.tif 000004
【図４】
0004657857.tif 000005
【図５】
0004657857.tif 000006
【図６】
0004657857.tif 000007
【図７】
0004657857.tif 000008
【図８】
0004657857.tif 000009
【配列表】
0004657857000001.app