(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の乳汁から分離したラクトフェリン、ラクトフェリン亜鉛、ラクトフェリン鉄、ラクトフェリン銅、及びラクトフェリンマンガンからなる群より選択された化合物、又はこれらの２種以上の混合物を有効成分として含有するＩｇＥ産生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫グロブリン（immunoglobulin）の一種であるＩｇＥの産生抑制剤に関するものである。詳しくは、本発明は、ラクトフェリン類を有効成分として含有するＩｇＥ産生抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ペプチド又は蛋白質を有効成分とするＩｇＥ産生抑制剤としては、トリプスタチン関連化合物である合成ペプチドからなる新規ＩｇＥ産生抑制物質（特開平６−２３９８８７号公報。以下、従来技術１と記載する。）、遺伝子工学的手法により製造される高親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖又はその可溶性断片からなるＩｇＥ産生抑制剤（特開平７−１１８１６８号公報。以下、従来技術２と記載する。）等が知られている。
【０００３】
一方、ラクトフェリンは、乳汁中等に含まれている天然の分子量約８０，０００の鉄結合性糖蛋白質であり、大腸菌、カンジダ菌、クロストリジウム菌、ブドウ球菌等の有害微生物に対して抗菌作用を示すことが知られている［ジャーナル・オブ・ペディアトリクス（Journal of Pediatrics)、第９４巻、第１ページ、１９７９年、及びジャーナル・オブ・デイリー・サイエンス(Journal of Dairy Science)、第６７巻、第６０ページ、１９８４年］。
【０００４】
また、感染モデル動物におけるラクトフェリンの効果も報告されており、ザグルスキ（Zagulski）らは、ラットを用い、致死量の大腸菌を投与する２４時間前にラクトフェリンを静脈内に投与した群及び無投与群について生存率を比較し、ラクトフェリンに感染防御作用があることを立証している［ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・パソロジー（British Journal of Experimental Pathology ）、第７０巻、第６９７ページ、１９８９年］。更に、ウィルス感染実験においてもラクトフェリンに感染防御効果があることは知られている［キャンサー・リサーチ（Cancer Research)、第４７巻、第４１８４ページ、１９８７年］。これらの感染動物で認められた効果は、ラクトフェリンのin vitro（試験管内）で認められた抗菌作用に起因するものではなく、ラクトフェリンが宿主の免疫力を賦活したことに起因するものと考えられている。
【０００５】
即ち、ラクトフェリンには、抗菌作用の他に免疫賦活作用があると理解されている。このラクトフェリンの免疫賦活作用を抗癌に応用した例として、ベザウルト（Bezault)らは、癌モデルマウスにラクトフェリンを腹腔内投与し、ラクトフェリンが癌の成長を抑制する効果を有することを確認しているが、このラクトフェリンの抗癌作用は、その免疫賦活作用の観点からナチュラル・キラー細胞の活性化作用によるものと考えられている［キャンサー・リサーチ（Cancer Research)、第５４巻、第２３１０ページ、１９９４年］。
【０００６】
また、ラクトフェリンには、抗体の産生促進作用があることが知られており［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistry)、第５４巻、第１０８７ページ、１９９０年］、無血清培地における抗体産生促進に関する技術（特開平２−２５７８９２号公報）も開示されている。
【０００７】
更に、ラクトフェリン分解物からなるＩｇＧ及びＩｇＭクラスの抗体産生を促進する免疫賦活剤（特開平７−１７９３５５号公報）、ラクトフェリン由来のペプチドからなる免疫促進剤（特表平７−５０７７６３号公報）等が知られている。
【０００８】
しかしながら、ラクトフェリン類が免疫抑制作用、具体的にはＩｇＥ等の抗体の産生抑制作用を有することは知られておらず、文献にも記載されていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
前記従来技術から明らかなとおり、従来技術１は、合成ペプチドであり、従来技術２は、遺伝子工学的手法により製造されることから、製造工程が繁雑で、天然物に比較して安全性試験を慎重に行う必要がある等の問題点を有していた。
【００１０】
本発明者らは、前記従来技術に鑑みて、従来技術の有する前記問題点を解決し得る天然物を有効成分とするＩｇＥ産生抑制剤を開発することを目的として鋭意研究を行った。その結果、驚くべきことに、免疫賦活作用が知られていたラクトフェリン類に、これとは全く逆の作用である免疫抑制作用の一種であるＩｇＥ産生抑制作用という有益な作用があることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
本発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、安全性の高い天然物からなるＩｇＥ産生抑制剤を提供することを目的としている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決する本発明は、哺乳類の乳汁から分離したラクトフェリン、ラクトフェリン亜鉛、ラクトフェリン鉄、ラクトフェリン銅、及びラクトフェリンマンガンからなる群より選択された化合物、又はこれらの２種以上の混合物を有効成分として含有するＩｇＥ産生抑制剤である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
次に、本発明について詳細に説明する。
【００１４】
本発明のＩｇＥ産生抑制剤の有効成分であるラクトフェリン類は、ヒト、ウシ等の哺乳類の乳汁から分離したラクトフェリン、このラクトフェリンを化学的に処理したラクトフェリン亜鉛、ラクトフェリン鉄、ラクトフェリン銅、ラクトフェリンマンガン、及びアポラクトフェリンからなる群からより選択された化合物、又はこれらの２種以上の混合物であり、公知の方法により調製することができる。
【００１５】
即ち、例えば特公平６−１３５６０号公報記載の方法等により調製されたラクトフェリン、例えば特開昭６２−２４９９３１号公報記載の方法等により調製されたアポラクトフェリン、例えば特許第２５６４１８５号公報記載の方法等により調製されたラクトフェリン亜鉛、ラクトフェリン銅、及びラクトフェリンマンガンを、それぞれ使用することができるが、より簡便には、市販のラクトフェリン（例えば、森永乳業社製等。）を使用することができる。
【００１６】
尚、ラクトフェリンの分離、精製方法の具体的な一例は、次のとおりである。
【００１７】
ＣＭ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製）をカラムに充填し、塩酸を通液し、水洗し、イオン交換体を平衡化し、４℃に冷却したｐＨ６．９の脱脂牛乳をカラムに通液し、透過液を回収し、再度同様にカラムに通液する。次いで、蒸留水をカラムに通液し、次いで食塩水を通液し、イオン交換体に吸着している塩基性蛋白質の溶出液を得る。
【００１８】
この溶液に飽和度８０％で硫酸アンモニウムを添加し、蛋白質を沈殿させ、遠心分離して沈殿を回収し、飽和度８０％の硫酸アンモニウム溶液で洗浄し、脱イオン水を添加して溶解し、得られた溶液を限外濾過膜モジュール（例えば、旭化成社製のＳＬＰ００５３等。）を用いて限外濾過し、のち水を添加し、同装置を用いてダイアフィルトレーションを行い、脱塩し、凍結乾燥し、粉末状ウシ・ラクトフェリンを得る。
【００１９】
以上の方法により得られたラクトフェリンの純度を、電気泳動法により測定した結果、９５％（重量。以下、特に断りのない限り同じ。）以上の純度を有している。尚、凍結乾燥前の各精製工程におけるラクトフェリン含有液を本発明に使用できることは、いうまでもない。
【００２０】
ラクトフェリン類は、乳由来の天然物であって摂取した場合の安全性が高く、牛乳等の食品中に含有され、日常的に摂取されており、毒性を示さず、長期間連続的に摂取しても副作用がほとんど認められない。従って、経口等の投与方法により適宜使用することが可能であり、公知の方法により錠剤、カプセル剤、トロ−チ剤、シロップ剤、顆粒剤、散剤、軟膏等に加工することも可能である。また、ラクトフェリン類を有効成分として食品中に含有させ、ＩｇＥ産生抑制剤の一態様として、ＩｇＥ産生抑制の機能を有する食品として加工することも可能である。
【００２１】
本発明のＩｇＥ産生抑制剤の有効成分であるラクトフェリン類の投与量は、年齢、症状等により異なるが、ＩｇＥ産生抑制の効果を発揮させるためには、少なくとも３０ｍｇ／ｋｇ体重／日の割合で投与することが必要である。
【００２２】
本発明のＩｇＥ産生抑制剤において、ＩｇＥ産生抑制の効果を発揮させるために必要な有効成分であるラクトフェリン類の配合量は、ＩｇＥ産生抑制剤中の配合量として、１ｇ当たり少なくとも１ｍｇ含有されていることが必要である。
【００２３】
次に、試験例を示して本発明を詳細に説明する。
【００２４】
試験例１
この試験は、血清中の総ＩｇＥ量を指標として、ラクトフェリン類の有効投与量を調べるために行った。
【００２５】
（１）試験試料
市販のラクトフェリン（森永乳業社製）を生理食塩水（大塚製薬社製）に３００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液を使用し、空試験には、生理食塩水（大塚製薬社製）を使用した。
【００２６】
（２）試験方法
試験動物として、６週齢ＢＡＬＢ／ｃ系雄性マウス（日本チャールスリバー社から購入）５０匹を、無作為に１試験群１０匹に分けて使用した。
【００２７】
抗原としてオボアルブミン（シグマ社製）２．５μｇを使用し、これをアジュバントである水酸化アルミニウム（和光純薬社製）１ｍｇに吸着させ、前記各試験動物の腹腔内に投与した。投与後３日間放置し、試料を、試料中の有効成分であるラクトフェリンの投与量が、試験群毎に、０ｍｇ／ｋｇ体重／日（空試験）、２０ｍｇ／ｋｇ体重／日、３０ｍｇ／ｋｇ体重／日、１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、又は３００ｍｇ／ｋｇ体重／日の量となるように、１日１回、経口ゾンデを使用して強制的に３日間連続して投与し、４日間放置し、再び試料を３日間連続して投与し、１日間放置し、のちマウスの心臓より採血し、血清サンプルを得た。
【００２８】
各血清サンプル中の総ＩｇＥ量を常法のＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００２９】
即ち、一次抗体である抗マウスＩｇＥモノクローナル抗体Ｒ３５−９２（ファーミンジェン社製）溶液を９６ウェルマイクロプレート（ヌンク社製）に添加して、一晩４℃で吸着させ、次いでウシ血清アルブミン（シグマ社製）を使用してブロッキング処理を行い、血清サンプルを添加して反応させ、二次抗体としてビオチン標識抗マウスＩｇＥモノクローナル抗体Ｒ３５−１１８（ファーミンジェン社製）溶液を添加して反応させ、ペルオキシダーゼ標識アビジンＤ（ベクター・ラボラトリー社製）を添加して反応させ、発色用緩衝液であるパーオキシダーゼ基質溶液（キルケガード・ペリー・ラボラトリー社製）を添加して発色させ、４０５ｎｍの吸光度を測定し、図１に示す検量線に基づいてＩｇＥ量を求め、各試験群１０匹の平均値を算出し、試験群毎の血清中の総ＩｇＥ量を試験した。
【００３０】
尚、図１の検量線は、血清サンプルの変わりに標準ＩｇＥ（ファーミンジェン社製）を使用して前記と同一の方法により予め作成した。
【００３１】
（３）試験結果
この試験の結果は、表１に示すとおりである。表１から明らかなとおり、ラクトフェリンは、少なくとも３０ｍｇ／ｋｇ体重／日の割合で投与することにより顕著なＩｇＥ産生抑制の効果を示した。
【００３２】
尚、ラクトフェリン類の種類を変更して試験を行ったが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００３３】
【表１】
0004767382.tif 000002
【００３４】
試験例２
この試験は、ラクトフェリン類による食物由来の蛋白質抗原によって誘導されるＩｇＥ産生抑制の効果を調べるために行った。
【００３５】
（１）試験試料
市販のラクトフェリン（森永乳業社製）を生理食塩水（大塚製薬社製）に３００ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解したものを使用した。
【００３６】
（２）試験方法
伊藤らの方法［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（European Journal of Immunology）、第２７巻、第３４２７乃至３４３７ページ、１９９７年］により次のとおり試験した。
【００３７】
試験動物として、６週齢ＤＢＡ／２系雌性マウス（日本チャールスリバー社から購入）４０匹を、無作為に１試験群１０匹に分けて使用した。
【００３８】
食物由来の蛋白質抗原であるカゼイン２５％を含む特殊精製飼料（オリエンタル酵母工業社製）を、前記試験動物に給餌した。給餌開始４日目から、試料中の有効成分であるラクトフェリンを３００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量に調整し、１週間当たりの投与回数を試験群毎に、１週間に０回、１回、３回、又は５回（具体的には、週１回は、月曜日のみに投与し、週３回は、月曜日、火曜日、及び水曜日にそれぞれ投与し、週５回は、月曜日、火曜日、水曜日、木曜日、及び金曜日にそれぞれ投与した。）経口ゾンデを使用して強制的に計３週間投与し、４日間放置し、のちマウスの心臓より採血し、血清サンプルを得た。
【００３９】
血清サンプル中のカゼイン特異的ＩｇＥ量は、前記伊藤らの方法により次のとおり測定した。
【００４０】
即ち、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）に１０μｇ／ｍｌの濃度で溶解したウシカゼイン（ナカライテスク社製）溶液を９６ウェルマイクロプレートに５０μｌ添加し、一晩４℃で吸着させた。次いでウシ血清アルブミン（シグマ社製）を使用してブロッキング処理を行い、血清サンプルを添加して反応させ、パーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＥ（Ｆｃ）抗ヤギ抗体（ノルディック・イミュノロジー社製）を添加して反応させ、発色用緩衝液であるパーオキシダーゼ基質溶液（キルケガード・ペリー・ラボラトリー社製）を添加して発色させ、４０５ｎｍの吸光度を測定し、前記図１に示す検量線に基づいてＩｇＥ量を求め、各試験群１０匹の平均値を算出し、試験群毎の血清中のカゼイン特異的ＩｇＥ量を試験した。
【００４１】
（２）試験結果
この試験の結果は、表２に示すとおりである。表２から明らかなとおり、１週間当たりの投与回数に拘らず、ラクトフェリン類投与群において、食物由来の蛋白質抗原により誘導されるＩｇＥ産生を抑制する効果が認められ、特に週３回以上の投与によりその抑制が顕著に認められた。この試験結果から、ラクトフェリン投与により総ＩｇＥ量のみならず、食物由来の蛋白質抗原により発生する特異的なＩｇＥの産生をも抑制し得ることが判明した。
【００４２】
尚、ラクトフェリン類の種類を変更して試験を行ったが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００４３】
【表２】
0004767382.tif 000003
【００４４】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４５】
【実施例】
実施例１
次の組成からなる錠剤のＩｇＥ産生抑制剤を次の方法により製造した。
ラクトフェリン（森永乳業社製）                          ４０．０（％）
ラクチュロース（森永乳業社製）                          ４０．０
エリスリトール（日研化学社製）                            ８．５
マルチトール（東和化成工業社製）                          ８．０
ステビア（日本製紙社製）                                  ０．１
グリセリン脂肪酸エステル（理研ビタミン社製）              ３．０
ヨーグルトフレーバー（長谷川香料社製）                    ０．４
【００４６】
ラクトフェリン、ラクチュロース、エリスリトール、マルチトール、ステビア、グリセリン脂肪酸エステル、及びヨーグルトフレーバーを均一に混合し、常法により打錠機（畑鐵工所社製。型式ＨＴ１２ＳＳ）を使用し、２０，０００Ｐａの圧力で打錠し、錠剤を製造した。
【００４７】
実施例２
常法により次の組成からなるシロップ剤のＩｇＥ産生抑制剤を製造した。
アポラクトフェリン（森永乳業社製）                        １．００（％）
カルボキシメチルセルロ−スカルシウム（第一工業製薬社製）  ０．２０
クエン酸ナトリウム（和光純薬社製）                        ０．１８
クエン酸（和光純薬社製）                                  ０．２２
果糖・ブドウ糖液糖（大塚製薬社製）                        １９．８３
精製水（大塚製薬社製）                                  ７８．５７
【００４８】
実施例３
次の組成からなる散剤のＩｇＥ産生抑制剤を次の方法により製造した。
ラクトフェリン（森永乳業社製）                            ５．０（％）
トウモロコシ澱粉（王子コーンスターチ社製）              ５７．５
結晶セルロース（和光純薬社製）                          ３７．５
【００４９】
前記各材料を均一に混合し、常法により散剤を製造した。
【００５０】
実施例４
次の組成からなるカプセル剤のＩｇＥ産生抑制剤を次の方法により製造した。
ラクトフェリン（ミライ社製）                            ３０．０（％）
乳糖（和光純薬社製）                                    ３０．０
トウモロコシ澱粉（日清製粉社製）                        ２０．０
結晶セルロース（和光純薬社製）                          ２０．０
【００５１】
前記各材料を均一に混合し、常法により全自動カプセル充填機（Cesere Pedini 社製。プレス式）を使用し、カプセル（日本エランコ社製。１号ゼラチンカプセル）に充填し、カプセル剤を製造した。
【００５２】
実施例５
次の組成からなる軟膏状のＩｇＥ産生抑制剤を次の方法により製造した。
ラクトフェリン（森永乳業社製）                            ２．０（％）
カロボキシビニルポリマー
（カーボポール９４０。グッドリッチ社製）                  ０．５
水酸化ナトリウム（和光純薬社製）                          ０．５
注射用蒸留水（和光純薬社製）                            ９７．０
【００５３】
予め２％の濃度で注射用蒸留水に溶解したカロボキシビニルポリマー水溶液２５重量部に対して、予め２％の濃度で注射用蒸留水に溶解した水酸化ナトリウム水溶液２５重量部を撹拌しながら徐々に添加し、ゲルを形成させ、これに注射用蒸留水に溶解したラクトフェリンを添加し、注射用蒸留水を添加し、全量を１００重量部として軟膏剤を製造した。
【００５４】
【発明の効果】
以上詳細に説明したとおり、本発明は、ラクトフェリン類を有効成分として含有するＩｇＥ産生抑制剤に係るものであり、本発明により奏される効果は次のとおりである。
（１）ＩｇＥの産生を抑制することができる。
（２）食物由来の蛋白質抗原によって誘導される特異的なＩｇＥの産生を抑制することができる。
（３）副作用が少ないので、長期間投与することができる。
（４）経口投与が可能であり、従来の注射剤等に比較して、簡便で汎用性が高い。
（５）牛乳等の比較的安価な原料から得られ、大量生産が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、４０５ｎｍの吸光度におけるＩｇＥ濃度の検量線である。
【図１】
0004767382.tif 000004