(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（±)−Ｎ−（３−アミノプロピル）−N,N−ジメチル−2,3−ビス（syn−９−テトラデセネイルオキシ)−１−プロパナミニウムの塩（GAP−DMORIE）および一つ以上の共脂質を含むアジュバント組成物。
【請求項２】
前記共脂質が中性脂質である、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項３】
前記共脂質がホスファチジルエタノールアミンである、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項４】
前記ホスファチジルエタノールアミンが、1,2−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（DOPE）、1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（DPyPE）、および1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（DMPE）からなる群から選択される、請求項３に記載のアジュバント組成物。
【請求項５】
前記ホスファチジルエタノールアミンが、1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（DOPE）である、請求項４に記載のアジュバント組成物。
【請求項６】
前記ホスファチジルエタノールアミンが、1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（DPyPE）である、請求項４に記載のアジュバント組成物。
【請求項７】
前記（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−N,N−ジメチル−2,3−ビス（syn−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミニウムの塩（GAP−DMORIE）および前記共脂質が9:1〜1:9のモル比において存在する、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項８】
前記（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−N,N−ジメチル−2,3−ビス（syn−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミニウムの塩（GAP−DMORIE）および前記共脂質が4:1〜1:4のモル比において存在する、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項９】
前記（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−N,N−ジメチル−2,3−ビス（syn−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミニウムの塩（GAP−DMORIE）および前記共脂質が2:1〜1:2のモル比において存在する、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項１０】
前記（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−N,N−ジメチル−2,3−ビス（syn−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミニウムの塩（GAP−DMORIE）および前記共脂質が1:1のモル比において存在する、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項１１】
前記（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−N,N−ジメチル−2,3−ビス（syn−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミニウムの塩（GAP−DMORIE）および1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（DPyPE）が2:1〜1:2のモル比において存在する、請求項６に記載のアジュバント組成物。
【請求項１２】
前記（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−N,N−ジメチル−2,3−ビス（syn−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミニウムの塩（GAP−DMORIE）および1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（DPyPE）が1:1のモル比において存在する、請求項６に記載のアジュバント組成物。
【請求項１３】
免疫原ならびに（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−N,N−ジメチル−2,3−ビス（syn−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミニウムの塩（GAP−DMORIE）および一つ以上の共脂質を含むアジュバント組成物を含む、免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記免疫原が、免疫原コードポリヌクレオチドを含む、請求項13に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記免疫原コードポリヌクレオチドが、DNA、RNA、または核酸オリゴマーである、請求項14に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記免疫原コードポリヌクレオチドが、線状ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドである、請求項14に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記免疫原コードポリヌクレオチドが、プラスミドDNAの全てまたは一部である、請求項１４に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記共脂質が、1,2−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（DOPE）、1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（DPyPE）、および1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（DMPE）からなる群から選択される、請求項14に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記共脂質が、1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（DOPE）である、請求項18に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
前記共脂質が、1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（DPyPE）である、請求項18に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
前記（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−N,N−ジメチル−2,3−ビス（syn−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミニウムの塩（GAP−DMORIE）および前記共脂質が、9:1〜1:9のモル比において存在する、請求項14に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
前記（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−N,N−ジメチル−2,3−ビス（syn−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミニウムの塩（GAP−DMORIE）および前記共脂質が、4:1〜1:4のモル比において存在する、請求項14に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
前記（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−N,N−ジメチル−2,3−ビス（syn−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミニウムの塩（GAP−DMORIE）および前記共脂質が、2:1〜1:2のモル比において存在する、請求項14に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
前記（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−N,N−ジメチル−2,3−ビス（syn−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミニウムの塩（GAP−DMORIE）および前記共脂質が、1:1のモル比において存在する、請求項14に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
前記（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−N,N−ジメチル−2,3−ビス（syn−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミニウムの塩（GAP−DMORIE）および1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（DPyPE）が、2:1〜1:2のモル比において存在する、請求項20に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
前記（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−N,N−ジメチル−2,3−ビス（syn−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミニウムの塩（GAP−DMORIE）および1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（DPyPE）が、1:1のモル比において存在する、請求項20に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
脊椎動物の組織または腔内に投与することにより脊椎動物を免疫化するための、請求項13〜26のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８】
前記脊椎動物が、哺乳動物である、請求項27に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項28に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０】
前記免疫原コードポリヌクレオチドによりコードされる免疫原が、細菌ポリペプチド、真菌ポリペプチド、寄生虫ポリペプチド、アレルゲンポリペプチド、腫瘍特異的ポリペプチド、免疫原性フラグメント、誘導体、またはそのアナログからなる群から選択される、請求項13〜29のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３１】
筋肉、皮膚、脳組織、肺組織、肝臓組織、脾臓組織、骨髄組織、胸腺組織、心臓組織、リンパ組織、血液組織、骨組織、結合組織、粘膜組織、膵臓組織、腎臓組織、胆嚢組織、胃組織、腸組織、精巣組織、卵巣組織、子宮組織、膣組織、直腸組織、神経系組織、眼組織、腺組織および舌からなる群から選択される組織の投与するための、請求項13〜30のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３２】
肺、口、鼻腔、胃、腹膜、腸、心房、静脈、動脈、毛細管、リンパ管、子宮、膣、直腸、および眼腔からなる群から選択される腔に投与するための、請求項13〜30のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３３】
前記腔が、粘膜表面を含む、請求項32に記載の免疫原性組成物。
【請求項３４】
前記組織が、筋肉である、請求項31に記載の免疫原性組成物。
【請求項３５】
前記組織が、骨格筋である、請求項31に記載の免疫原性組成物。
【請求項３６】
静脈内投与のための、請求項13〜30のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３７】
筋肉内投与、気管内投与、鼻腔内投与、経皮性投与、皮膚間投与、皮下投与、眼内投与、膣投与、直腸投与、腹膜内投与、腸管内および吸入投与からなる群から選択される経路により投与するための、請求項13〜30のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３８】
粒子加速器、ポンプ、皮内アプリケータ、微粒子銃注射器、圧気注射器、スポンジデポー、丸剤および錠剤からなる群から選択されるデバイスによって媒介される方法により投与するための、請求項13〜37のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３９】
前記投与が、CO2動力付きジェット注射システムによって媒介される方法により投与するための、請求項13〜37のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４０】
細菌感染と関連する予防処置または治療処置を哺乳動物に提供するための、請求項13〜39のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４１】
ウイルス感染に関連する予防処置または治療処置を哺乳動物に提供するための、請求項13〜39のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
細胞集団の異常増殖に関連する予防処置または治療処置を哺乳動物に提供するための、請求項13〜39のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４３】
前記細胞集団の異常増殖が癌と関連する、請求項42に記載の免疫原性組成物。
【請求項４４】
前記免疫原が、アデノウィルス、アルファウィルス、カリシウィルス、コロナウィルス、ジステンパーウィルス、エボラウィルス、エンテロウィルス、フラビウィルス、肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、免疫不全ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、感染性腹膜炎ウィルス、インフルエンザウィルス、白血病ウィルス、マールブルグウィルス、オルソミクソウィルス、パピローマウィルス、パラインフルエンザウィルス、パラミクソウィルス、パルボウィルス、ペスチウィルス、ピコルナウィルス、ポリオウィルス、ポックスウィルス、ワクシニアウィルス、狂犬病ウィルス、レオウィルス、レトロウィルス、及びロタウィルスから成る群から選択されたウィルスから成る群から選択された病原体からであるか、又は前記免疫原コードポリヌクレオチドが前記病原体からの免疫原をコードする、請求項13〜43のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４５】
前記免疫原がインフルエンザウィルスからであるか、又は前記免疫原コードポリヌクレオチドが前記インフルエンザウィルスからの免疫原をコードする、請求項13〜43のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４６】
前記免疫原がサイトメガロウィルスからであるか、又は前記免疫原コードポリヌクレオチドが前記サイトメガロウィルスからの免疫原をコードする、請求項13〜43のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４７】
前記ウィルス感染が、アデノウィルス、アルファウィルス、カリシウィルス、コロナウィルス、ジステンパーウィルス、エボラウィルス、エンテロウィルス、フラビウィルス、肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、免疫不全ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、感染性腹膜炎ウィルス、インフルエンザウィルス、白血病ウィルス、マールブルグウィルス、オルソミクソウィルス、パピローマウィルス、パラインフルエンザウィルス、パラミクソウィルス、パルボウィルス、ペスチウィルス、ピコルナウィルス、ポリオウィルス、ポックスウィルス、ワクシニアウィルス、狂犬病ウィルス、レオウィルス、レトロウィルス、及びロタウィルスから成る群から選択されたウィルスから発生する、請求項41に記載の免疫原性組成物。
【請求項４８】
薬学的キットであって、該キットは：
（ａ）インビボにおいて脊椎動物細胞内で免疫原を作用可能にコードする、１ng〜30 mgの免疫原コードポリヌクレオチドを保有する容器；ならびに
（ｂ）（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−N,N−ジメチル−2,3−ビス（syn−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミニウムの塩（GAP−DMORIE）および共脂質を含む、アジュバント組成物、を備え、それにより該免疫原が脊椎動物を予防的または治療的に処置するために有効な量で提供される、薬学的キット。
【請求項４９】
前記（ｂ）が（ａ）の容器内にある、請求項48に記載の薬学的キット。
【請求項５０】
前記（ｂ）が（ａ）とは別個の容器内にある、請求項48に記載の薬学的キット。
【請求項５１】
投与手段をさらに含む、請求項48〜50のいずれか１項に記載の薬学的キット。
【請求項５２】
前記共脂質が1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（DPyPE）である、48〜51のいずれか１項に記載の薬学的キット。
【請求項５３】
前記（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−N,N−ジメチル−2,3−ビス（syn−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミニウムの塩（GAP−DMORIE）および1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（DPyPE）が、2:1〜1:2のモル比で存在する、請求項52に記載の薬学的キット。
【請求項５４】
前記（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−N,N−ジメチル−2,3−ビス（syn−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミニウムの塩（GAP−DMORIE）および1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（DPyPE）が、1:1のモル比で存在する、請求項52又は53に記載の薬学的キット。
【請求項５５】
前記免疫原コードポリヌクレオチドが、ウィルス性免疫原である、請求項48〜54のいずれか１項に記載の医薬キット。
【請求項５６】
前記免疫原が、アデノウィルス、アルファウィルス、カリシウィルス、コロナウィルス、ジステンパーウィルス、エボラウィルス、エンテロウィルス、フラビウィルス、肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、免疫不全ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、感染性腹膜炎ウィルス、インフルエンザウィルス、白血病ウィルス、マールブルグウィルス、オルソミクソウィルス、パピローマウィルス、パラインフルエンザウィルス、パラミクソウィルス、パルボウィルス、ペスチウィルス、ピコルナウィルス、ポリオウィルス、ポックスウィルス、ワクシニアウィルス、狂犬病ウィルス、レオウィルス、レトロウィルス、及びロタウィルスから成る群から選択されたウィルスである、請求項55に記載の医薬キット。
【請求項５７】
脊椎動物における疾病状態の処理又は予防のための薬剤の製造への請求項13〜47のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の使用であって、前記組成物が、免疫原に対する免疫応答を生成するのに十分な量で発現する脊椎動物の組織又は腔中に投与される、使用。
【請求項５８】
前記脊椎動物が哺乳類である、請求項57に記載の使用。
【請求項５９】
前記哺乳類がヒトである、請求項58に記載の使用。
【請求項６０】
前記薬剤が筋肉に投与するためのものである、請求項57〜59のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６１】
前記薬剤が骨格筋に投与するためのものである、請求項57〜59のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６２】
前記薬剤が静脈内に投与するためのものである、請求項57〜59のいずれか1項に記載の使用。
【請求項６３】
前記免疫原性組成物が、感染性細菌の１又は複数の抗原性又は免疫原性ポリペプチドをコードする１又は複数の免疫原コードポリヌクレオチドを含んで成り、そして前記薬剤が細菌感染性疾病を処理するか又は予防するためである、請求項57〜62のいずれか1項に記載の使用。
【請求項６４】
前記免疫原性組成物が、感染性ウィルスの１又は複数の抗原性又は免疫原性ポリペプチドをコードする１又は複数の免疫原コードポリヌクレオチドを含んで成り、そして前記薬剤がウィルス感染性疾病を処理するか又は予防するためである、請求項57〜62のいずれか1項に記載の使用。
【請求項６５】
前記免疫原性組成物が、１又は複数の腫瘍関連の抗原性又は免疫原性ポリペプチドをコードする１又は複数の免疫原コードポリヌクレオチドを含んで成り、そして前記薬剤が癌を処理するか又は予防するためである、請求項57〜62のいずれか1項に記載の使用。
【請求項６６】
前記免疫原性組成物が、感染性菌類の１又は複数の抗原性又は免疫原性ポリペプチドをコードする１又は複数の免疫原コードポリヌクレオチドを含んで成り、そして前記薬剤が菌類感染性疾病を処理するか又は予防するためである、請求項57〜62のいずれか1項に記載の使用。
【請求項６７】
前記免疫原性組成物が、感染性寄生虫の１又は複数の抗原性又は免疫原性ポリペプチドをコードする１又は複数の免疫原コードポリヌクレオチドを含んで成り、そして前記薬剤が寄生虫感染性疾病を処理するか又は予防するためである、請求項57〜62のいずれか1項に記載の使用。
【請求項６８】
前記寄生虫感染性疾病が、原虫感染性疾病である、請求項67に記載の使用。
【請求項６９】
前記寄生虫感染性疾病が、蠕虫感染性疾病である、請求項67に記載の使用。
【請求項７０】
前記寄生虫感染性疾病が、外寄生生物感染性疾病である、請求項67に記載の使用。
【請求項７１】
前記免疫原性組成物が、アレルゲンの１又は複数の抗原性又は免疫原性ポリペプチドをコードする１又は複数の免疫原コードポリヌクレオチドを含んで成り、そして前記薬剤がアレルギーを処理するか又は予防するためである、請求項57〜62のいずれか1項に記載の使用。
【請求項７２】
前記ウィルス感染性疾病が、アデノウィルス、アルファウィルス、カリシウィルス、コロナウィルス、ジステンパーウィルス、エボラウィルス、エンテロウィルス、フラビウィルス、肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、免疫不全ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、感染性腹膜炎ウィルス、インフルエンザウィルス、白血病ウィルス、マールブルグウィルス、オルソミクソウィルス、パピローマウィルス、パラインフルエンザウィルス、パラミクソウィルス、パルボウィルス、ペスチウィルス、ピコルナウィルス、ポリオウィルス、ポックスウィルス、ワクシニアウィルス、狂犬病ウィルス、レオウィルス、レトロウィルス、及びロタウィルスから成る群から選択されたウィルスから発生する、請求項64に記載の使用。
【請求項７３】
前記ウィルス感染性疾病が、インフルエンザ感染である、請求項64に記載の使用。
【請求項７４】
前記ウィルス感染性疾病が、サイトメガロウィルス感染である、請求項64に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、補助剤、免疫原性組成物、およびポリヌクレオチドベースのワクチン接種のために有用な方法に関する。本発明は、組成物および免疫応答（特に、脊椎動物のポリヌクレオチドベースワクチンへの体液性免疫応答）を増強するために有用な方法を提供する。特に、本発明は、サイトフェクチン：共脂質（ｃｏ-ｌｉｐｉｄ）の補助剤を提供し、ここで、サイトフェクチンは、（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ｓｙｎ−９−テトラデセネイルデセネイルオキシ）−１−プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ）である。
【０００２】
（発明の背景）
１９８０年代後期、脂質−ＤＮＡ複合体の直接的な筋肉内（ｉ．ｍ．）注射は、測定可能なタンパク質発現を生じ、そして「裸の」プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）が取り込まれ、そして脂質−ＤＮＡ錯合体よりも大きな程度、筋肉において発現することが発見された（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａ、２７６（６），１０２−１０６（１９９７））。
【０００３】
ｐＤＮＡ注入技術の最初の適用の１つは、免疫応答の誘導であった。１９９１年に、マウスが，ｇｐ１２０プラスミドＤＮＡを用いるｉ．ｍ．ワクチン接種のよってＨＩＶ  ｇｐ１２０に対して免疫化され（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ、３４９，３５１−３５２（１９９１））、そしてマウスが、インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）抗原を用いるＤＮＡ免疫化の後に、インフルエンザウイルスの致命的なチャレンジから保護され得ることが最初に報告された。高度に保存されたＮＰ抗原を用いて免疫化された後に得られる保護は、２つの異なるウイルス株を交差して拡大した（ｅｘｔｅｎｄ  ａｃｒｏｓｓ）（Ｕｌｍｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８，５３１−５３６（１９９６））。ポリヌクレオチドベースのワクチン接種の分野における多くの出版物が、その後に続いた（例えば、Ｂｏｙｅｒら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌｏｇｙ，２５（５），２４２−２５０（１９９６）；Ｂｏｙｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３（５），５２６−５３２（１９９７）；Ｄａｖｉｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１５（８），８４９−８５２（１９９７）；Ｗａｎｇら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１５（８），８２１−８２５（１９９７）；Ａｇａｄｊａｎｙａｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２２６，１７５−１９２（１９９８）；Ｈｅｐｐｅｌｌら，Ｆｉｓｈ  ＆  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８（４），２７１−２８６（１９９８）；Ｌｏｄｍｅｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４（８），９４９−９５２（１９９８）；Ｖａｎｄｅｒｚａｎｄｅｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２４６（１）１３４−１４４（１９９８））。
【０００４】
ポリヌクレオチドベースのワクチン接種の過程においてしばしば出会う主要な問題は、不十分または最適以下の体液性応答である。しばしば、ポリヌクレオチドによってコードされる抗原または免疫抗原はインビボで発現されるが、それらは、後のチャレンジに対する保護を提供するのに、および／または長期間にわたる治療的に活性な抗原レベルを発生するための可能性を維持するのに十分なレベルに生物における抗原力価を惹起するために、十分に免疫原性ではない。より強い体液性および／または細胞応答を得るために、補助剤（患者のワクチンに対する免疫応答を増強する物質）を含む免疫原性組成物においてこのようなワクチンを投与することが一般的である。補助剤は、生物の特定の免疫原性に対する免疫応答を改善するために一般的に有用であり、そしてワクチン組成物に通常含まれて、産生される抗体の量を増加させ、そして／または免疫抗原の量および投与の頻度を減少させる。
【０００５】
ポリヌクレオチドベースのワクチン接種に対する免疫応答増強の異なるレベルにするための種々の補助剤が報告されている。このような補助剤物質の例には、半合成細菌細胞壁誘導モノホスホリル脂質Ａ（Ｓａｓａｋｉ，Ｓ．，ら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５（９），３２５０−３２５８（１９９７））、小分子免疫刺激物質（Ｓａｓａｋｉ，Ｓ．，ら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１，３０−３５（１９９８））、およびサポニン（Ｓａｓａｋｉ，Ｓ．，ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２（６），４３９１−４９３９（１９９８））が挙げられる。ｉ．ｍ．ｐＤＮＡワクチン接種からの免疫応答はまた、カチオン性脂質の使用を介して増強されてきている（Ｉｓｈｉｉ，Ｎ，ら，Ａｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １３（１６），１４２１−１４２８（１９９７）、Ｏｋａｄａ，Ｅ．，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５９，３６３８−３６４７（１９９７）；Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｍ．，ら、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４，２２１−２３０（１９９６）；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．，ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ  ４０２，１０７−１１０（１９９７）；Ｇｒａｍｚｉｎｓｋｉ，Ｒ．Ａ．，ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４，１０９−１１８（１９９８）；Ｋｌａｖｉｎｓｋｉｓ，Ｌ．Ｓ．，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６２，２５４−２６２（１９９９）；Ｅｔｃｈａｒｔ，Ｎ．，ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８，１５７７−１５８０（１９９７）；Ｎｏｒｍａｎ，Ｊ．，ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第９巻；ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｄ．Ｂ．Ｌｏｗｒｉｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｗｈａｌｅｎ，編，第１６章，ｐｐ．１８５−１９６（１９９９））。カチオン性脂質は、もともと、インビトロでのｐＤＮＡの細胞への送達を増強するためのサイトフェクチンとして研究されてきた；しかし、さらなる開発が、インビボでのタンパク質送達の成功した特異的な適用に導いた（Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｃ．Ｊ．，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１１４５４−１１４５９（１９９６）；Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｄ．Ｊ．，ら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７，１８０３−１８１２（１９９６）；ＤｅＢｒｕｙｎｅ，Ｌ．Ａ．，ら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５，１０９７−１０８７（１９９８））。従って、このようなサイトフェクチンは、免疫応答の体液性アームの惹起を与える原因であるｐＤＮＡの細胞への送達を増強することによってワクチン適用の有用であり得、それによって抗体力価レベルを増加させる。
【０００６】
通常使用される補助剤は、ワクチン接種に対して低レベルの免疫応答増強を示し（典型的に、３倍未満）、そして、所望ではない毒物学的プロフィールおよび製造プロフィールを有する。さらに、ワクチン接種のために先に使用された低レベルの体液性増強のみを示す。脊椎動物の免疫化に対する（特に、ｐＤＮＡに対する）免疫応答を増強するためにより有用な補助剤組成物に対する必要性が存在する。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、補助剤および免疫原性組成物に関し、そして疾患から脊椎動物を保護する子を助けるために、疾患を有する脊椎動物を処置するために、またはその両方のための、脊椎動物のポリヌクレオチドベースのワクチン接種ための方法を提供する。特定の好ましい実施形態において、本発明は、免疫原をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を脊椎動物に投与することによって、脊椎動物を免疫化する方法に関し、ここで、ポリヌクレオチドは、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥを含む補助組成物と複合体化している。好ましくは、その組成物は、１つ以上の共脂質を含み得る。免疫原コードポリヌクレオチドは、脊椎動物の細胞への組込みの際に、免疫学的に有効量の免疫原（例えば、免疫原性タンパク質）を産生する。本発明の補助組成物は、免疫原に対する脊椎動物の免疫応答を増強する。
【０００８】
本発明の１つの局面は、１つ以上のサイトフェクチンおよび１つ以上の共脂質の混合物を有する補助組成物であり、その補助組成物は、免疫原に対する脊椎動物の体液性免疫応答を増強するために有用である。好ましくは、補助組成物は、サイトフェクチンＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥおよび１つ以上の共脂質を含む。好ましくはまた、共脂質は、例えば、ホスファチジルエタノールアミンのような中性脂質であり得る。より好ましくは、共脂質は、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）、および／または１，２−ジミリストイル−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）である。最も好ましくは、共脂質は、ＤＰｙＰＥである。
【０００９】
本発明の別の局面は、１つ以上の免疫原ならびにサイトフェクチンＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥおよび１つ以上の共脂質を含む（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｉｎｇ）補助組成物を含む免疫原性組成物である。特定の実施形態において、免疫原の供給ゲンは、ｐＤＮＡワクチンの場合には、免疫原コードポリペプチドである。好ましくは、これらの実施形態において、ｐＤＮＡまたはポリヌクレオチドは、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥよおび１つ以上の共脂質を含む補助組成物と複合体化している。
【００１０】
本発明の別の局面は、１つ以上の免疫原コードポリペプチドとＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥとの複合体を含む免疫原性組成物を、コードされた免疫原に対する免疫応答を発生するのに十分な量で脊椎動物に投与することによって、脊椎動物を免疫化するための方法である。好ましくは、免疫原性組成物はさらに、１つ以上の共脂質（例えば、ＤＯＰＥおよび／またはＤＰｙＲＥ）を含む。最も好ましくは、共脂質は、ＤＰｙＰＥである。
【００１１】
先行技術とは対照的に、本発明は、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥの使用を介する、ポリヌクレオチドベースのワクチンに対する脊椎動物の体液性免疫応答を増強するための方法である。抗体レベルの上昇は、免疫原コードポリヌクレオチドのみからの抗体レベルが最適条件に及ばない適用において特に有利である。関連した利点において、所望のレベルの抗体が所定の用量のｐＤＮＡを用いて産生されない場合、所定の抗体力価レベルに達するために必要なｐＤＮＡの量は、より低いｐＤＮＡ用量を使用して達成され得る。ｐＤＮＡワクチン接種適用について、この利点は重要である。なぜなら、受容可能なワクチン接種容積（ｐＤＮＡの濃度に対する機能的な制限と関連している）は、所定のワクチン用量に対する上限を規定している。この利点は、特に、複数のプラスミドを含むワクチンに対して有益であり、プラスミドの各々は、その特定の導入遺伝子に対する免疫応答を誘発するのに十分な量で存在しなければならない。
【００１２】
（発明の好ましい実施形態の詳細な説明）
以下の詳細な説明および本明細書に添付の特許請求の範囲の観点から、種々の置換および改変が、特許請求された発明の範囲から逸脱することなく本発明になされ得ることが、当業者に明らかである。
【００１３】
本発明は、疾患状態からの保護または疾患状態にある脊椎動物を処置するための、脊椎動物のポリヌクレオチドベースの免疫化に関する。本発明は、補助剤ににおけるサイトフェクチン、特にＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥの使用、免疫抗原性組成物、ならびに特にポリヌクレオチドベースの免疫原を用いる脊椎動物を免疫化するための方法を含む。
【００１４】
本発明の補助組成物は、１つ以上のサイトフェクチン、および好ましい実施形態において、１つ以上の共脂質を含む。サイトフェクチンは、カチオン性脂質である。１つの実施形態において、サイトフェクチンはＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥであり、これは、第４級窒素上に２つの直鎖状の１４個の炭素で１つの不飽和を有するアルキル鎖とプロピルアミン置換基との固有の組合せを有する２，３−ジアルコキシ−プロパナミニウム骨格に対応する構造を有する（図２を参照のこと）。
【００１５】
ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥは、１セットの相乗的な構造的特徴を含み、いずれも、骨格中に個々に組み込まれた場合、最適な活性を生じない。従って、図３を参照して、グループＤＭＲＩＥ（（±）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ）−１−プロパナミニウム（ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｉｕｍ）ブロミド）、ＤＬＲＩＥ（（±）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ドデシルオキシ）−１−プロパナミニウムブロミド）およびＤＤＲＩＥ（（±）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（デシルオキシ）−１−プロパナミニウムブロミド）を試験して、そしてグループＧＡＰ−ＤＭＲＩＥ（（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−（ビス−テトラデシルオキシ）−１−プロパナミニウムブロミド）、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ（（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−（ビス−ドデシルオキシ）−１−プロパナミニウムブロミド）、およびＧＡＰ−ＤＰＲＩＥ（（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−（ビス−ヘキサデシルオキシ）−１−プロパナミニウムブロミド）を比較することによって、四級窒素がヒドロキシエチル部分で置換されるか（前者のグループ）、またはプロピルアミノ部分で置換されるか（後者のグループ）に関わらず、１４炭素鎖が、他の鎖長に比べてより活性である（すなわち、より大きいレベルの抗体刺激を誘発する）ことが明らかである。ＤＭＲＩＥをＧＡＰ−ＤＭＲＩＥに対して比較することによって（図３を参照のこと）、ヒドロキシエチル基の代わりにプロピルアミノ基を組み込むことが、明白な利点を全く提供しないことが明らかである。同様に、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＯＲＩＥは、その１４炭素鎖へのオレフィンの組み込みにも関わらず、等しく活性である。しかし、プロピルアミノ置換基およびオレフィン部分の組み合わせを組み込むことによって、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥは、ｐＤＮＡ単独についての相乗平均力価（ＧＭＴ）と比較した相乗平均力価に基づいて、ＤＭＯＲＩＥまたはＧＡＰ−ＤＭＲＩＥのいずれよりも、より活性であるようである（図３）。さらに、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムペンタヒドロクロリド）（これは、その１８炭素アルキル鎖中のオレフィン、およびアミノ含有四級アンモニウム置換基の両方を組み込む）は、ＤＯＲＩＥ（（±）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ｓｙｎ−９−オクタデセネンイルオキシ）−１−プロパナミニウムブロミド）（これは、四級アンモニウム置換を除いて等価である）よりも活性が低いだけでなく、ｐＤＮＡ単独について観察された抗体力価のレベルと比較して、抗体力価のレベルを劇的に減少させる。本発明での使用に好ましいＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥの塩は、臭化物塩であるが；しかし、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥの全ての適切な塩が、用語「ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ」に含まれる。
【００１６】
定義の目的のために、用語「共脂質（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）」とは、サイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ）成分（例えば、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ）と組み合わせられ得る、任意の疎水性物質をいう。本発明の共脂質は、両親媒性脂質および中性脂質であり得る。両親媒性脂質としては、リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリン）が挙げられる。中性脂質としては、コレステロールが挙げられる。１つの好ましい実施形態において、ホスファチジルエタノールアミンとしては、ＤＯＰＥ、ＤＭＰＥおよびＤＰｙＰＥが挙げられる。ＤＯＰＥおよびＤｐｙＰＥが、特に好ましく；最も好ましい共脂質は、ＤｐｙＰＥであり、これは、そのジアシルホスファチジルエタノールアミン骨格に組み込まれた２つのフィタノイル置換基を含む。図３に例示されるように、共脂質ＤＰｙＰＥとのサイトフェクチンＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥの組み合わせは相乗効果を生じて、ｐＤＮＡ免疫由来の抗体力価のレベルによって証明されるように、体液性免疫応答をさらに増強する。
【００１７】
本発明に従って、サイトフェクチンおよび共脂質は、多くの方法で混合されるか、または組み合わされて、非共有結合した巨視的構造（例えば、リポソーム、多重膜小胞、単重膜小胞、ミセルおよび単膜）の種々のアジュバント組成物を産生し得る。サイトフェクチンおよび共脂質は、種々のモル比で混合され得る。好ましくは、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥと共脂質とのモル比は、約９：１〜約１：９であり、より好ましくは、このモル比は、約４：１〜約１：４であり、または約２：１〜約１：２である。最も好ましくは、このモル比は、約１：１である。
【００１８】
サイトフェクチンおよび共脂質を、溶媒中に溶解して、その混合物の均質性を増加し得る。適切な溶媒としては、クロロホルムが挙げられる。例えば、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥは、クロロホルム中で１以上の共脂質と混合され得、続いて、この混合物を、真空下でエバポレートして、ガラス容器（例えば、Ｒｏｔｏｖａｐ丸底フラスコ）の内面上に乾燥された薄い膜の層を形成する。このような乾燥された混合物は、水性溶媒中で懸濁され得、ここで、その両親媒性の脂質成分分子は、均質な脂質小胞に自己アセンブルする。続いて、これらの脂質小胞は、当該分野で使用される任意の方法によって、均一なサイズの選択された平均直径を有するように処理されて、その後、他の実体（例えば、ｐＤＮＡ）と複合体化する。脂質溶液の超音波処理は、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，７４１３−７４１７（１９８７）および米国特許第５，２６４，６１８号（これらの開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００１９】
本発明のアジュバント組成物は、添加剤（例えば、疎水性および両親媒性の添加剤）を含み得る。例えば、このアジュバント組成物は、ステロール、脂肪酸、ガングリオシド、糖脂質、リポペプチド、リポサッカリド、ネオビー（ｎｅｏｂｅｅ）、ニオソーム（ｎｉｏｓｏｍｅ）、プロスタグランジンまたはスフィンゴ脂質を含み得る。このアジュバント中に含まれる添加剤の量は任意であり得、脂質の総量に対して、約０．１モル％〜約９９．９モル％、約１モル％〜約５０モル％、そして約２モル％〜約２５モル％を含む。これらの添加剤はまた、本発明のアジュバント組成物を含む免疫原性組成物中に含まれ得る。
【００２０】
本発明の免疫原性組成物は、上記のようなアジュバント組成物、および免疫原を含む。「免疫原」は、任意の抗原性ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチド（エピトープまたはエピトープの組み合わせを有するポリアミノ酸物質を含む）、および免疫原コードポリヌクレオチドを包含することが意味される。さらに、「免疫原」はまた、免疫応答を生じる際に有用な任意のポリサッカリド物質を包含することが意味される。本明細書中で使用される場合、抗原性ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチドは、脊椎動物中に導入された場合に、その脊椎動物の免疫系分子と反応し（すなわち、抗原性である）、そして／またはその脊椎動物中で免疫応答を誘導する（すなわち、免疫原性である）、ポリペプチドである。ほぼおそらく、免疫原性ポリペプチドはまた、抗原性であるが、抗原性ポリペプチドは、そのサイズまたはコンフォメーションに起因して、必ずしも免疫原性でなくてもよい。抗原性ポリペプチドおよび免疫原性ポリペプチドの例としては、以下由来のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない：感染性因子（例えば、細菌、ウイルス、寄生生物または真菌）、アレルゲン（例えば、ペットの鱗屑、植物、ほこりおよび他の環境供給源由来のアレルゲン）、ならびに特定の自己ポリペプチド（例えば、腫瘍関連抗原）。
【００２１】
本発明の抗原性ポリペプチドおよび免疫原性ポリペプチドを使用して、ウイルス性、細菌性、真菌性および寄生生物性の感染性疾患を予防または処置（すなわち、治癒、回復、重篤度の減少、あるいは感染の予防または減少）し得、ならびにアレルギーを処置し得る。
【００２２】
さらに、本発明の抗原性ポリペプチドおよび免疫原性ポリペプチドを使用して、以下の癌を含むが、これらに限定されない癌を予防または処置（すなわち、治癒、回復、または重篤度の減少）し得る：口腔および咽頭口部（すなわち、舌、口、咽頭）、消化器系（すなわち、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肛門管、肛門直腸、肝臓、胆嚢、膵臓）、呼吸器系（すなわち、喉頭、肺）、骨、関節、軟部組織（心臓を含む）、皮膚、黒色腫、乳房、生殖器官（すなわち、頸部、子宮内膜（ｅｎｄｏｍｅｔｉｒｕｍ）、卵巣、外陰、膣、前立腺、精巣、陰茎）、泌尿器系（すなわち、膀胱、腎臓、尿管および他の泌尿器）、眼、脳、内分泌系（すなわち、甲状腺および他の内分泌系）、リンパ腫（すなわち、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、白血病（すなわち、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病）。
【００２３】
ウイルス性の抗原性ポリペプチドおよび免疫原性ポリペプチドの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アデノウイルスポリペプチド、アルファウイルスポリペプチド、カリチウイルスポリペプチド（例えば、カリチウイルスキャプシド抗原）、コロナウイルスポリペプチド、ジステンパーウイルスポリペプチド、エボラウイルスポリペプチド、エンテロウイルスポリペプチド、フラビウイルスポリペプチド、肝炎ウイルス（ＡＥ）ポリペプチド（例えば、Ｂ型肝炎のコア抗原または表面抗原）、ヘルペスウイルスポリペプチド（例えば、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質または水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質）、免疫不全ウイルスポリペプチド（例えば、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープまたはプロテアーゼ）、感染性腹膜炎ウイルスポリペプチド、インフルエンザウイルスポリペプチド（例えば、インフルエンザＡ型の赤血球凝集素、ノイラミニダーゼまたは核タンパク質）、白血病ウイルスポリペプチド、マルブルクウイルスポリペプチド、オルソミクソウイルスポリペプチド、パピローマウイルスポリペプチド、パラインフルエンザウイルスポリペプチド（例えば、その赤血球凝集素／ノイラミニダーゼ）、パラミクソウイルスポリペプチド、パラボウイルスポリペプチド、ペスチウイルスポリペプチド、ピコルナウイルスポリペプチド（例えば、ポリオウイルスキャプシドポリペプチド）、ポックスウイルスポリペプチド（例えば、ワクシニアウイルスポリペプチド）、狂犬病ウイルスポリペプチド（例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ）、レオウイルスポリペプチド、レトロウイルスポリペプチド、およびロタウイルスポリペプチド。
【００２４】
細菌性の抗原性ポリペプチドおよび免疫原性ポリペプチドの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓポリペプチド、Ｂａｃｉｌｌｕｓポリペプチド、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓポリペプチド、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａポリペプチド、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａポリペプチド、Ｂｏｒｒｅｌｉａポリペプチド（例えば、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ＯｓｐＡ）、Ｂｒｕｃｅｌｌａポリペプチド、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒポリペプチド、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａポリペプチド、Ｃｈｌａｍｙｄｉａポリペプチド、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチド、Ｃｏｘｉｅｌｌａポリペプチド、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓポリペプチド、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓポリペプチド、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａポリペプチド、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａポリペプチド、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａポリペプチド、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチド、Ｈａｅｍｏｂａｒｔｏｎｅｌｌａポリペプチド、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓポリペプチド（例えば、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ型外膜タンパク質）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒポリペプチド、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａポリペプチド、Ｌ−型の細菌ポリペプチド、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａポリペプチド、Ｌｉｓｔｅｒｉａポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａポリペプチド、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａポリペプチド、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａポリペプチド、Ｎｅｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａポリペプチド、Ｎｏｃａｒｄｉａポリペプチド、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａポリペプチド、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓポリペプチド、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓポリペプチド、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓポリペプチド、Ｐｒｏｔｅｕｓポリペプチド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓポリペプチド、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａポリペプチド、Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａポリペプチド、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａポリペプチド、Ｓｈｉｇｅｌｌａポリペプチド、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓポリペプチド、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｍタンパク質）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａポリペプチド、およびＹｅｒｓｉｎｉａポリペプチド（例えば、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ  Ｆ１抗原およびＶ抗原）。
【００２５】
真菌性の免疫原性ポリペプチドおよび抗原性ポリペプチドの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａｂｓｉｄｉａポリペプチド、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍポリペプチド、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａポリペプチド、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓポリペプチド、Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓポリペプチド、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓポリペプチド、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓポリペプチド、Ｃａｎｄｉｄａポリペプチド、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓポリペプチド、Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓポリペプチド、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓポリペプチド、Ｃｕｒｖａｌａｒｉａポリペプチド、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎポリペプチド、Ｅｘｏｐｈｉａｌａポリペプチド、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍポリペプチド、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａポリペプチド、Ｍａｄｕｒｅｌｌａポリペプチド、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａポリペプチド、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍポリペプチド、Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａポリペプチド、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａポリペプチド、Ｍｕｃｏｒポリペプチド、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓポリペプチド、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍポリペプチド、Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍポリペプチド、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａポリペプチド、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａポリペプチド、Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａポリペプチド、Ｐｓｅｕｄｏｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍポリペプチド、Ｐｙｔｈｉｕｍポリペプチド、Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍポリペプチド、Ｒｈｉｚｏｐｕｓポリペプチド、Ｓｃｏｌｅｃｏｂａｓｉｄｉｕｍポリペプチド、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘポリペプチド、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍポリペプチド、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎポリペプチド、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎポリペプチド、およびＸｙｌｏｈｙｐｈａポリペプチド。
【００２６】
原生動物寄生生物の免疫原性ポリペプチドおよび抗原性ポリペプチドの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｂａｂｅｓｉａポリペプチド、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍポリペプチド、Ｂｅｓｎｏｉｔｉａポリペプチド、Ｃｒｙｓｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍポリペプチド、Ｅｉｍｅｒｉａポリペプチド、Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎポリペプチド、Ｅｎｔａｍｏｅｂａポリペプチド、Ｇｉａｒｄｉａポリペプチド、Ｈａｍｍｏｎｄｉａポリペプチド、Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎポリペプチド、Ｉｓｏｓｐｏｒａポリペプチド、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａポリペプチド、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａポリペプチド、Ｎｅｏｓｐｏｒａポリペプチド、Ｎｏｓｅｍａポリペプチド、Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓポリペプチド、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍポリペプチド（例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのサーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）（ＰｆＣＳＰ）、スポロゾイト表面タンパク質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝臓状態抗原１のカルボキシル末端（ＰｆＬＳＡ１  ｃ−末端）、および被輸出タンパク質１（ｅｘｐｏｒｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）（ＰｆＥｘｐ−１））、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓポリペプチド、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓポリペプチド、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａポリペプチド、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａポリペプチド、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａポリペプチド、およびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａポリペプチド。
【００２７】
蠕虫寄生生物の免疫原性ポリペプチドおよび抗原性ポリペプチドの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａｃａｎｔｈｏｃｈｅｉｌｏｎｅｍａポリペプチド、Ａｅｌｕｒｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓポリペプチド、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａポリペプチド、Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓポリペプチド、Ａｓｃａｒｉｓポリペプチド、Ｂｒｕｇｉａポリペプチド、Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍポリペプチド、Ｃａｐｉｌｌａｒｉａポリペプチド、Ｃｈａｂｅｒｔｉａポリペプチド、Ｃｏｏｐｅｒｉａポリペプチド、Ｃｒｅｎｏｓｏｍａポリペプチド、Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓポリペプチド、Ｄｉｏｃｔｏｐｈｙｍｅポリペプチド、Ｄｉｐｅｔａｌｏｎｅｍａポリペプチド、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍポリペプチド、Ｄｉｐｌｙｄｉｕｍポリペプチド、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａポリペプチド、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓポリペプチド、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓポリペプチド、Ｆｉｌａｒｏｉｄｅｓポリペプチド、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓポリペプチド、Ｌａｇｏｃｈｉｌａｓｃａｒｉｓポリペプチド、ＬｏａポリペプチドＭａｎｓｏｎｅｌｌａポリペプチド、Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓポリペプチド、Ｎａｎｏｐｈｙｅｔｕｓポリペプチド、Ｎｅｃａｔｏｒポリペプチド、Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓポリペプチド、Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍポリペプチド、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａポリペプチド、Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓポリペプチド、Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａポリペプチド、Ｐａｒａｆｉｌａｒｉａポリペプチド、Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓポリペプチド、Ｐａｒａｓｃａｒｉｓポリペプチド、Ｐｈｙｓａｌｏｐｔｅｒａポリペプチド、Ｐｒｏｔｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓポリペプチド、Ｓｅｔａｒｉａポリペプチド、Ｓｐｉｒｏｃｅｒｃａポリペプチド、Ｓｐｉｒｏｍｅｔｒａポリペプチド、Ｓｔｅｐｈａｎｏｆｉｌａｒｉａポリペプチド、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓポリペプチド、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓポリペプチド、Ｔｈｅｌａｚｉａポリペプチド、Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓポリペプチド、Ｔｏｘｏｃａｒａポリペプチド、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａポリペプチド、Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓポリペプチド、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓポリペプチド、Ｕｎｃｉｎａｒｉａポリペプチド、およびＷｕｃｈｅｒｅｒｉａポリペプチド。
【００２８】
外寄生生物の免疫原性ポリペプチドおよび抗原性ポリペプチドの例としては、以下由来のポリペプチド（防御抗原およびアレルゲンを含む）が挙げられるが、これらに限定されない：ノミ；ダニ（ダニ（ｈａｒｄ  ｔｉｃｋ）およびヒメダニ（ｓｏｆｔ  ｔｉｃｋ）を含む）；ハエ（例えば、ミジ、カ、スナバエ、ブユ、ウマバエ、サシバエ、アブ（ｄｅｅｒ  ｆｌｙ）、ツェツェバエ、サシバエ（Ｓｔａｂｌｅ  ｆｌｙ）、ハエウジ病発症性ハエ、およびヌカカ（ｂｉｔｉｎｇ  ｇｎａｔ）；アリ；クモ、シラミ；ダニ；ならびに半翅目（例えば、トコジラミおよびサシガメ）。
【００２９】
腫瘍関連性の抗原性ポリペプチドおよび免疫原性ポリペプチドの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：腫瘍特異的免疫グロブリン可変領域、ＧＭ２、Ｔｎ、ｓＴｎ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ）、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、Ｌｅ（ｙ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、癌胎児抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβ鎖（ｈＣＧβ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＫＳＡ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＧＰ１００、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、ＰＡＰ、ＣＥＡ、ＢＡＧＥ、ＭＡＧＥ、ＲＡＧＥ、および関連タンパク質。
【００３０】
本発明のポリペプチドと同様に、前述のポリペプチドのフラグメントまたは改変体、および前述のポリペプチドの任意の組み合わせもまた、包含される。さらなるポリペプチドは、例えば、「Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｔａｌａｒｏら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ（１９９８年１０月）、Ｆｉｅｌｄｓら、「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、第３版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ（１９９６）、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐａｒａｓｉｔｅｓ」、Ｍａｒｒら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）、およびＤｅａｃｏｎ，Ｊ．、「Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ（１９９７）（これらは、本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
【００３１】
免疫原コードポリヌクレオチドは、単数形の「ポリヌクレオチド」および複数形の「ポリヌクレオチド」を包含することが意図され、そして単離された分子または構築物をいう。免疫原コードポリヌクレオチドとしては、ヌクレオチド配列、核酸、核酸オリゴマー、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ（例えば、ｐＤＮＡ、ｐＤＮＡの誘導体、直線状ＤＮＡ）、あるいは任意のそれらのフラグメントが挙げられる。免疫原コードポリヌクレオチドは、直鎖状形態、環状形態（例えば、プラスミド）または分枝状形態、ならびに二本鎖形態または一本鎖形態で、提供され得る。免疫原コードポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または非従来性の結合（例えば、アミド結合（ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見出されるような）を含み得る。
【００３２】
本発明に従って、免疫原コードポリヌクレオチドは、非感染性および非組み込み性のポリヌクレオチドを含む、環状または直鎖状のプラスミドの一部分であり得る。非感染性ポリヌクレオチドは、脊椎動物細胞を感染しないポリヌクレオチドであり、一方、非組み込みポリヌクレオチドは、脊椎動物細胞のゲノムに組み込まれない。直鎖状プラスミドは、その前に環状であったが、例えば、制限エンドヌクレアーゼでの消化によって直鎖化されたプラスミドである。免疫原コードポリヌクレオチドは、ポリペプチドの分泌を指向する配列を含み得る。
【００３３】
免疫原コードポリヌクレオチドの形態は、所望される発現の速度および継続時間に一部依存する。ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の長期送達が所望される場合、好ましい形態は、ＤＮＡである。あるいは、短期の導入遺伝子タンパク質送達が所望される場合、好ましい形態は、ｍＲＮＡである。なぜなら、ｍＲＮＡは、ポリペプチドに迅速に翻訳され得るが、ＲＮＡは、ＤＮＡよりも、より速く分解され得るからである。
【００３４】
１つの実施形態において、免疫原コードポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））である。ＲＮＡ配列を哺乳動物細胞に導入するための方法は、米国特許第５，５８０，８５９号（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載される。ウイルス性αベクター（ＲＮＡの投与に有用な非感染性ベクター）が、ＲＮＡを哺乳動物細胞に導入するために使用され得る。αウイルスベクターの哺乳動物組織へのインビボ導入のための方法は、Ａｌｔｍａｎ−Ｈａｍａｍｄｚｉｃ，Ｓ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４，８１５−８２２（１９９７）（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００３５】
好ましくは、免疫原コードポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合、プロモーターは、好ましくは、この免疫原をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。プロモーターは、予め決定された細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指向する、細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーターに加えて、他の転写制御エレメントが、ＤＮＡの細胞特異的転写を指向するためのポリヌクレオチドと共に含まれ得る。作動可能な連結は、免疫原性分子をコードするポリヌクレオチドが、その免疫原の発現を１以上の調節配列の影響下または制御下に置くような様式で、その調節配列に連結されている、連結である。２つのＤＮＡ配列（例えば、コード配列、およびそのコード配列の５’末端に連結されるプロモーター領域配列）は、プロモーター機能の誘導が、その所望の免疫原をコードするｍＲＮＡの転写を生じる場合、かつその２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入を生じないか、（２）その発現調節配列がその免疫原の発現を指向する能力に干渉しないか、または（３）そのＤＮＡテンプレートが転写される能力に干渉しない場合に、作動可能に連結されている。従って、プロモーター領域は、このプロモーターがＤＮＡ配列の転写をもたらし得た場合に、そのＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。
【００３６】
免疫原コードポリヌクレオチド（例えば、ｐＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリヌクレオチドまたは核酸オリゴマー）は、任意の種々の緩衝液中で可溶化され得、その後、アジュバント成分（例えば、サイトフェクチンおよび共脂質）と共に混合または複合体化される。適切な緩衝液としては、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、通常の生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液、およびリン酸ナトリウムが挙げられる。不溶性ポリヌクレオチドは、弱酸または弱塩基中で可溶化され得、次いで、緩衝液で所望の容量に希釈される。この緩衝液のｐＨは、適切に調節され得る。さらに、薬学的に受容可能な添加剤を使用して、適切な浸透圧モル濃度を提供し得る。このような添加剤は、当業者の範囲内である。
【００３７】
本発明に従って、免疫原コードポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の方法によって（例えば、ｐＤＮＡ溶液とサイトフェクチン／共脂質リポソームの溶液を混合することによって）、本発明のアジュバント組成物と複合体化され得る。１つの実施形態において、各々の成分溶液の濃度を、混合前に調整し、その結果、所望の最終的なｐＤＮＡ／サイトフェクチン：共脂質の比、および所望のｐＤＮＡの最終濃度が、その２つの溶液を混合した際に得られる。例えば、その所望の最終濃度が、生理食塩水（０．９％重量／容量）である場合、ｐＤＮＡおよびサイトフェクチン：共脂質リポソームの両方を、０．９％生理食塩水中で調製し、次いで、単に混合して所望の複合体を生成する。サイトフェクチン：共脂質リポソームは、当該分野で公知の任意の方法によって調製され得る。例えば、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥと共脂質の混合物の薄膜を、適切な容量の水性溶媒中で、周囲温度で約１分間ボルテックス混合することによって水和し得る。サイトフェクチンと共脂質の混合物の薄膜の調製は、当業者に公知であり、そして任意の適切な技術によって調製され得る。例えば、その個々の成分のクロロホルム溶液を混合し、等モル量の溶質比を生成し得、その後、所望の容量の溶液を適切な容器に等分し得る。この容器において、溶媒を、エバポレーション（例えば、最初に、乾燥不活性ガス流（例えば、アルゴン）を用い、次いで、高真空処理によって）除去し得る。
【００３８】
本発明に従って、本発明の免疫原性組成物は、脊椎動物を免疫するために使用され得る。用語「脊椎動物」とは、単数の「脊椎動物」および複数の「脊椎動物」を含むことが意図され、そして哺乳動物および鳥類、ならびに魚類を包含する。脊椎動物を免疫するための方法は、その脊椎動物に、その免疫原に対する免疫応答を生じるのに十分な量の本発明の免疫原性組成物を投与する工程を包含する。
【００３９】
本発明の免疫原性組成物は、当該分野で公知の任意の種々の方法に従って、投与され得る。例えば、米国特許第５，６７６，９５４号は、カチオン性脂質キャリアで複合体化した遺伝物質の、マウスへの注射を報告する。また、米国特許第５，５８９，４６６号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、およびＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０６０６９（ＷＯ９４／２９４６９）（これらの開示は、本明細書中に参考として援用される）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達するための方法を提供する。
【００４０】
詳細には、本発明の免疫原性組成物は、以下を含むがこれらに限定されない、脊椎動物の任意の組織に投与され得る：筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、粘膜組織、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、膣組織、直腸、神経系、眼、腺、舌および結合組織。
【００４１】
好ましくは、この組成物は、骨格筋に投与される。本発明の免疫原性組成物はまた、以下を含むがこれらに限定されない、体腔に投与され得る：肺、口、鼻腔、胃、腹腔、腸、心室（心房）、静脈、動脈、毛細管、リンパ、子宮、膣、直腸および眼の腔。
【００４２】
好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、筋内（ｉ．ｍ．）経路または皮下（ｓ．ｃ．）経路によって投与される。他の適切な投与経路としては、経皮投与、鼻内投与、吸入、気管内投与、経粘膜（すなわち、粘膜を横切る）投与、腔内（例えば、経口、膣または直腸）投与、眼内投与、膣投与、直腸投与、腹腔内投与、腸内投与および静脈内（ｉ．ｖ．）投与が挙げられる。
投与が所望の免疫応答を生じる限り、任意の投与形態が使用され得る。本発明の投与手段としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：針注射、カテーテル注入、微粒子銃注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」または空気式「無針」注射器−−例えば、Ｍｅｄ−Ｅ−Ｊｅｔ（Ｖａｈｌｓｉｎｇ，Ｈ．ら、ｊ。Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７１，１１−２２（１９９４））、Ｐｉｇｊｅｔ（Ｓｃｈｒｉｊｖｅｒ，Ｒ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １５、１９０８−１９１６（１９９７））、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １２、１５０３−１５０９（１９９４）；Ｇｒａｍｚｉｎｓｋｉ，Ｒ．ら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４，１０９−１１８（１９９８））、ＡｄｖａｎｔａＪｅｔ、Ｍｅｄｉｊｅｃｔｏｒ、ゲル形態スポンジデポー、他の市販のデポー材料（例えば、ヒドロゲル）、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経口または坐剤用固体（錠剤または丸剤）薬学的処方物、局所的皮膚クリーム、およびデカンティング（ｄｅｃａｎｔｉｎｇ）、手術中のポリヌクレオチドコート縫合糸（Ｑｉｎら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６５、２１９３−２２０３（１９９９））の使用または局所的適用。好ましい投与様式は、筋内への針による注射および水溶液としての鼻内適用である。
【００４３】
免疫原性組成物の有効量の決定は、例えば、その物質の化学的構造および生物学的活性、被検体の年齢および体重、ならびに投与経路を含む、多くの因子に依存する。正確な量、投薬回数および投薬のタイミングは、当業者に容易に決定され得る。
【００４４】
特定の実施形態において、この免疫学的組成物は、薬学的組成物として投与される。このような薬学的組成物は、公知の方法に従って処方され得、これによって、送達されるべき物質が、薬学的に受容可能なキャリアビヒクルと組み合わせられる。適切なビヒクルおよびそれらの調製は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ａ．Ｏｓｏｌ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８０）、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８５）に記載される。薬学的組成物は、エマルジョン、ゲル、溶液、懸濁液、凍結乾燥形態、または当該分野で公知の任意の他の形態として処方され得る。さらに、薬学的組成物はまた、例えば、希釈剤、結合剤、安定化剤および保存剤を含む、薬学的に受容可能な添加剤を含み得る。本明細書中に記載のポリヌクレオチド構築物の薬学的に受容可能な塩の投与が、好ましい。このような塩は、有機塩基および無機塩基を含む、薬学的に受容可能な非毒性の塩基から調製され得る。無機塩基由来の塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。薬学的に受容可能な有機非毒性塩基由来の塩としては、一級アミン、二級アミンおよび三級アミン、塩基性アミノ酸などの塩が挙げられる。
【００４５】
インビボで使用される水性薬学的組成物のために、滅菌の発熱物質非含有の水の使用が好ましい、このような処方物は、脊椎動物への投与に適切な薬学的に受容可能な組成物を調製するために、有効量の免疫原性組成物を適切な量のビヒクルと共に含む。
【００４６】
本発明はまた、脊椎動物へのポリペプチドの送達における使用のためのキットを提供する。各キットは、１ｎｇ〜３０ｍｇの免疫原コードポリヌクレオチドを有する容器を備え、このポリヌクレオチドは、インビボでの脊椎動物細胞内で免疫原を作動可能にコードする。さらに、各キットは、同じ容器または異なる容器中に、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥおよび共脂質を含むアジュバント組成物を備える。この薬学的キットの任意の成分は、単一の容器または複数の容器中に提供され得る。好ましくは、このキットは、約１ｎｇ〜約３０ｍｇの免疫原コードポリヌクレオチドを備え、より好ましくは、このキットは、約１００ｎｇ〜約１０ｍｇの免疫原コードポリヌクレオチドを備える。
【００４７】
任意の適切な容器が、薬学的キットと共に使用され得る。容器の例としては、ガラス容器、プラスチック容器、またはプラスチック片または紙片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
各々の薬学的キットはさらに、投与手段を備える。投与手段としては、注射筒および針、カテーテル、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｊｅｃｔｏｒ）、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」）、空気式「無針」注射器、ゲル形態スポンジデポー、他の市販のデポー材料（例えば、ヒドロゲル）、浸透圧ポンプ、ならびに手術中のデカンティングまたは局所的適用が挙げられるが、これらに限定されない。この各々の薬学的キットはさらに、例えば、免疫原性組成物でコートされた縫合糸（Ｑｉｎら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６５、２１９３−２２０３（１９９９））を含み得る。
【００４９】
このキットはさらに、脊椎動物への組成物の投与のための説明書を備える。この薬学的組成物のポリヌクレオチド成分は、好ましくは、液体溶液として提供されるか、またはそれらは、凍結乾燥形態で乾燥粉末またはケーキとして提供され得る。ポリヌクレオチドが凍結乾燥形態で提供される場合、この乾燥粉末またはケーキはまた、乾燥形態のこの薬学的組成物の、任意の塩、侵入増強剤、トランスフェクション促進剤、および添加剤を含み得る。このようなキットはさらに、この薬学的組成物の凍結乾燥成分の正確な再構成のために、正確な量の滅菌状態の発熱物質非含有の水を含む容器を備える。
【００５０】
使用の前に薬学的組成物がパッケージングされる容器は、凍結乾燥された処方物またはその薬学的有効用量のために適切な処方物を含有する溶液のある程度の量、あるいは複数の有効容量を同封する、密封してシールされた容器を含み得る。この薬学的組成物は、滅菌容器にパッケージングされ、そして密封してシールされた容器は、薬学的処方物の無菌性を、使用するまで保つために設計される。必要に応じて、この容器は、投与手段および／または使用のための指示に関連し得る。
【００５１】
以下の実施例は、例示のみの目的として含まれ、そして添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するようには意図されない。
【００５２】
（実施例）
以下の実施例は、抗原をコードするｐＤＮＡと複合体化した種々のＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ：共脂質が、マウスまたはウサギの組織に投与される場合、現在公知の核酸免疫法と比較して、後の免疫応答を増大し得るという驚くべき知見を実証する。
【００５３】
（材料および方法）
以下の材料および方法を、本明細書中に開示される全ての実施例において、一般的に適用する。特定の物質および方法は、必要に応じて各実施例において開示する。
【００５４】
（試薬）
滅菌したＵＳＰの水および生理食塩水溶液を、Ｂａｘｔｅｒ（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）から購入した。他の全ての化学物質および溶媒を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏｒｐ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＧａｌｌａｄｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｅｓｃｏｎｄｉｄｏ，ＣＡ）のいずれかから購入した。１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）および１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）の両方を、クロロホルム溶液としてＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ）から購入した。
【００５５】
（アジュバントおよび免疫原性組成物の調製）
（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ｓｙｎ−９−テトラデセンイルオキシ）−１−プロパンアミニウムブロミド（ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ、またＶＣ１０５２ともいわれる）を、アナログサイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ）ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥを調製するための公開手順を用いて合成した（Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３、１１４５４−１１４５９（１９９６））。具体的には、３−ジメチルアミノ−１，２−プロパンジオールの最初のビス−アルキル化において、ドデセニルメタンスルホネートの代わりにｓｙｎ−９−テトラデセニルメタンスルホネートを用いることで、所望のジアルキルアミンを得た。３−ブロモプロピルフタルイミドでの四級化（ｑｕａｔｒａｎｉｚａｔｉｏｎ）、続いてヒドラジンでの保護された一級アミンの脱保護、および抽出精製、ならびにミクロン以下の濾過によって、純粋なＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥを、分析薄層クロマトグラフィーによる判断として得た。生成物の同一性を、高分解能プロトンＮＭＲおよび赤外（ＩＲ）スペクトルを用いて確認した。
【００５６】
サイトフェクチン：共脂質混合物を、再水和薄膜法（ｒｅｈｙｄｒａｔｅｄ  ｔｈｉｎ−ｆｉｌｍ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて調製した。手短に言えば、窒素流下でクロロホルムをエバポレートし、そして微量の溶媒を除去するためにバイアルを真空下に一晩配置することによって、２ｍｌの滅菌ガラスバイアル中に乾燥フィルムを調製した。各バイアルは、サイトフェクチンおよび共脂質の各々１．５μモルを含んだ。バイアル当たり１ｍｌのＳＷＦＩ（注射用滅菌水、ＶＷＲ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）を添加し、続いてＧｅｎｉｅ  Ｖｏｒｔｅｘ  Ｍｉｘｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）の最も高い設定で、連続して５分間ボルテックスすることによって、リポソームを調製した。得られたリポソーム溶液は、１．５ｍＭのサイトフェクチンを含んだ。最後に、処方物を、８：１、４：１および２：１の最終ｐＤＮＡ（ホスフェート）：カチオン性脂質モル比で調製した。ｐＤＮＡ濃度（ｍｇ／ｍｌでの）を３３０（平均ヌクレオチド分子量）で除算することで、ｐＤＮＡホスフェートのモル濃度を計算する。リポソーム（ＳＷＦＩ中の）およびｐＤＮＡ（２ｘビヒクル中の）を、処方物における最終濃度の２倍の濃度で調製した。等しい容量のリポソームを、シリンジおよび２６ゲージまたは２８ゲージの針を使用して、ｐＤＮＡに添加した。定常流でリポソームを添加し、続いて、短時間穏やかにボルテックスして混合した（Ｇｅｎｉｅ  ｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｅｒの設定＃４で数秒間）。
【００５７】
この研究で使用される全てのサイトフェクチン／共脂質処方物は、室温で調製後数時間の間、いずれの明白な凝集もなく、均一に不透明のままであった。処方物を、複合体形成の２０分〜１．５時間後に注射した。代表的な注射において、５μｇのｐＤＮＡが、４：１のｐＤＮＡ：サイトフェクチンのモル比のサイトフェクチンと共に処方される場合、各筋肉は５０μｌのビヒクル中の２．４μｇのサイトフェクチンおよび３．０μｇの中性共脂質を受け取る。マウスモデルにおいて試験された最も高いｐＤＮＡ＋サイトフェクチン：共脂質用量（マウス当たり、１００μｇのＶＲ４７００プラスミド＋４８μｇのＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ＋６０μｇのＤＰｙＰＥに対応する）でさえも、マウスの筋肉に注射した場合、不快感の生成も示さず、いずれの有害な反応も生じなかった。
【００５８】
（ｐＤＮＡの調製）
ＶＲ４７００プラスミドを、当該分野で公知の標準的な技術を用いて調製した。手短に言うと、ＶＲ１２５５（ホタルのルシフェラーゼをコードする最適化されたプラスミド（Ｈａｒｔｉｋｋａ，Ｊ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７、１２０５−１２１７（１９９６）））は、インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）のためのコード配列を有し、これをルシフェラーゼコード配列の代わりに挿入した。このインフルエンザ核タンパク質配列を、ｎＣＭＶｉｎｔｔｐａＰＲＮＰと呼ばれるプラスミドから誘導した（Ｖａｈｌｓｉｎｇ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７４、１１−２２（１９９４））。より具体的には、このＶＲ４７００プラスミドを、以下の手順を介して生成した。ＶＲ１２５５プラスミドをＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｕｓ制限酵素（Ａｃｃ  Ｉ）＋Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＨＩ  制限酵素（Ｂａｍ  ＨＩ）で消化し、次いで、この末端をＫｌｅｎｏｗで平滑末端化し、このようにして所望のベクターフラグメントを得た。この核タンパク質のコード配列を、Ａｃｃ  Ｉ＋Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｉ制限酵素（Ｅｃｏ  ＲＩ）でのｎＣＭＶｉｎｔＴＰＡＰＲＮＰの消化、およびＫｌｅｎｏｗでの末端の平滑末端化によって得た。ベクターフラグメントおよびインサートフラグメントの両方を精製し、次いでＴ４  ＤＮＡリガーゼで結合した。この結合産物を、Ｅ．ｃｏｌｉ中でカナマイシン耐性に形質転換し、この後、適切なプラスミドを保有するクローンを、制限消化プロフィールに基づいて同定した。標準的な細胞培養技術を使用して、適切なクローンを増殖し、このプラスミドを、周知の市販の技術（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してこのクローンから最初に単離および精製した。
【００５９】
ＶＲ１４１２ＬａｃＺプラスミドを、細胞質内の標的化βガラクトシダーゼ遺伝子をＶＲ１０１２ベクターにサブクローニングすることによって構築した（Ｄｏｈ，Ｓ．Ｇ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４（７）、２６８−２６３（１９９７））。ＶＲ１０１２バックボーンベクターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期１プロモーター／エンハンサー、ＣＭＶイントロンＡ、ウシ成長ホルモンターミネーターおよびカナマイシン耐性遺伝子を含む（Ｈａｒｔｉｋｋａ，Ｊ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７（１０）、１０２５−１７（１９９６））。
【００６０】
ＶＲ５９００は、鶏卵リゾチームをコードするｐＤＮＡである。このｐＤＮＡの構築のために、ニワトリ（ｇａｌｌｕｓ）リゾチームｃＤＮＡを、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、重複するオリゴヌクレオチドで合成した。このヌクレオチド配列を、ＧＥＮＢａｎｋの登録Ｖ００４２８から得た。この配列を、ＯＬＩＧＯ  ５．０プログラムおよびＲｅｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した対応するオリゴヌクレオチドでヒト化した。ＰＣＲ産物を、ｐＣＲＩＩ  Ｂｌｕｎｔ  Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングし、その全体において配列決定し、そしてＶＲ１０５５中にサブクローニングした。ＶＲ１０５５は、Ｖｉｃａｌ  ＣＭＶプロモーター／エンハンサーベースの発現ベクターであり、これは、ＶＲ１０５５における最小ウサギβグロビンターミネーターの使用を除いて、ＶＲ１０１２と同一である（Ｈａｒｔｉｋｋａ．Ｊ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７、１２０５−１７（１９９６））。ＨＥＬ発現を、ウサギ抗卵白リゾチーム（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ，ＭＥ）を用いるウエスタンブロットによって確認した。
【００６１】
ＶＲ１９０４は、ヒト第ＩＸ因子をコードするｐＤＮＡである。構築のために、プラスミドＧＴ５０（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｒｏｕｎｄ  Ｌａｋｅ，ＩＬのＳｔｅｖｅｎ  Ｊｏｓｅｐｈｓから親切に提供された）からの第ＩＸ因子ｃＤＮＡインサートを、ＶＲ１０１２ベクターにサブクローニングした。
【００６２】
ＶＲ１６２３は、ヒト定常領域に融合したマウス可変領域を有するキメラ免疫グロブリンを発現する。ヒトκおよびγ（ＩｇＧ１）定常領域を、ヒト末梢血リンパ球からＰＣＲ増幅し、そしてＶＲ１０３１（ＣＩＴＥ配列の挿入によるＶＲ１０１２由来のビシストロンベクター）にクローニングした。この新しい構築物を、ＶＲ１６０５と名付けた。３８ｃ１３（マウスＢ細胞リンパ腫（ＢｅｒｇｍａｎおよびＨａｉｍｏｖｉｃｈ、１９７７））からの可変領域配列を、プラスミドｐＩｄ（ＴａｏおよびＬｅｖｙ、１９９３、Ｄｒ．Ｒｏｎａｌｄ  Ｌｅｖｙ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、ＣＡから親切に提供された）からのＰＣＲによって増幅し、そしてＶＲ１６２３を作製するためにＶＲ１６０５にクローニングした。
【００６３】
（バルクｐＤＮＡ調製および精製）
プラスミドＤＮＡを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０ＢまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αのコンピテント細胞に形質転換し、そして１Ｌの振盪フラスコにおいて、５０ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを補充したＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ，ｐ．Ａ．２（１９８９））内で増殖させた。細胞を、指数関数的増殖期の終わり（約１６時間）に遠心分離することで集め、代表的には１リットル当たり１０グラムの生物量正味重量を得た。共有結合的に閉じられた環状ｐＤＮＡを、改変溶解手順（Ｈｏｒｎ，Ｎ．Ａ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６、５６５−５７３（１９９５））、続いて標準的な二重ＣｓＣｌ−エチジウムブロミド勾配超遠心分離によって単離し、１リットル当たり約５ｍｇの平均収量であった。プラスミドを、エタノール沈殿し、そして４℃で生理食塩水中に再溶解化し、そして生理食塩水に対して透析した。エンドトキシン含有量を、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅアッセイ（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．，Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＭＡ）によって決定した。全てのプラスミド調製物は、検出可能なＲＮＡを有さなかった。エンドトキシンレベルは、プラスミドＤＮＡの７．０エンドトキシンユニット／ｍｇ未満であった。分光光度的なＡ260／Ａ280の比は、１．７５と２．０との間であった。プラスミドをエタノール沈殿し、そして完全に溶解するまで、４℃で注射ビヒクル中に再懸濁させた。ＤＮＡを、使用するまで−２０℃で保存した。
【００６４】
（動物免疫）
拘束した覚醒しているマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮからの雌性８〜１２週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス）大腿四頭筋に、使い捨てのインスリン注射器およびマイクロピペットチップから切断されたプラスチックカラーに取り付けられた２８ゲージ１／２インチの針（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３２９４３０）を使用して、５０μｌのビヒクル中のｐＤＮＡを注射した。そのカラーの長さを、大腿直筋の中心部内に約２ｍｍの距離まで針チップ挿入を制限するように調節した。注射流体および注射器を室温まで平衡化し、そして１回５０μ容量の注射を、１〜２秒において実施した。
【００６５】
塩酸ケタミン／キシラジンで麻酔をかけられた雌Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギ（５〜６月齢、およそ３ｋｇ）の大腿四頭筋に、３００μｌ  ＰＢＳ中１５０μｇのｐＤＮＡを２２ゲージ１インチ針を使用して、注射した。注射の前に、注射部位の毛をそり、アルコールできれいにした。針不要注射デバイス（Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）２０００（Ｂｉｏｊｅｃｔ  Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）をウサギにおいて試験した。このＢｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）２０００は、ＣＯ2により動力提供されるジェット注射システムである。予備実験において、このＢｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）２０００は墨汁溶液を皮膚を通して筋肉組織内に送達し得ることを確認した。
【００６６】
この研究中の動物の世話は、「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９６ならびにＶｉｃａｌ’Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに従った。
【００６７】
（抗ＮＰ  ＥＬＩＳＡ）
９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３６９０，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を、１００μｌＢＢＳ（８９ｍＭホウ酸および９０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２３４ｍＭ  ＮａＯＨ、ｐＨ８．３）中の組換えバキュロウイルス抽出物から精製された７１〜１２５ｎｇ／ウェルのインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４核タンパク質（ＮＰ）で被覆した。そのプレートを一晩＋４℃にて保存し、そしてそのウェルをＢＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充されたＢＢＳ，ｖｏｌ／ｖｏｌ）で２回洗浄した。次いで、そのウェルをＢＢ（５％脱脂乳を補充されたＢＢＳ、ｗｔ／ｖｏｌ）と共に９０分間インキュベートし、そしてＢＢＳＴを用いて再び２回洗浄した。ＢＢ中のマウス血清またはウサギ血清の２倍連続希釈（１：２０にて開始）を連続ウェルにおいて作製し、そしてその溶液を２時間室温にてインキュベートした。次いで、ウェルをＢＢＳＴを用いて４回リンスした。ＶＲ４７００プラスミドＤＮＡを用いて超免疫化したマウス由来の血清を、陽性コントロールとして使用し、そしてマウスおよびウサギ由来のプレ免疫血清を陰性コントロールとして使用した。
【００６８】
ＮＰ特異的抗体を検出するために、ＢＢＳ中１：５０００に希釈されたアルカリホスファターゼ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１１５−０５５−００８，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１１１−０５５−００８，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を５０μｌ／ウェルにて添加し、そしてそのプレートを室温にて２時間インキュベートした。ＢＢＳＴにおいて４回洗浄した後、５０μｌの基質（５０ｍＭ  重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．８および１ｍＭ  ＭｇＣｌ2中１ｍｇ／ｍｌ  ｐ−ニトロフェニルホスフェート、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔ．Ｎｏ．４８７６）を、室温において９０分間インキュベートし、そして４０５ｎｍにおいて吸光度の読み取りを実施した。この血清の力価を相互の最後の希釈物（バックグランドよりも２倍高いシグナルがなおも生じていた）を使用して決定した。バックグランドを、１：２０に希釈されたプレ免疫血清を使用して確立した。
【００６９】
（脾臓細胞51Ｃｒ放出アッセイ）
脾臓細胞の単一細胞懸濁物をペレット化し、そしてＬ−グルタミンおよび２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含み、そしてぺニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、５５μＭ  β−メルカプトエタノールおよび１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地において再懸濁した。他に注釈されない限り、全ての組織培養培地および試薬を、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。次いで、２．５×１０7個の脾臓細胞を、１μｇ／ｍｌにてＮＰ147-155ペプチド（Ｈ−２Ｋd  ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ）またはβ−ｇａｌ876-884ペプチド（Ｈ−２Ｌd  ＴＰＨＰＡＲＩＧＬ）、および０．５Ｕ／ｍｌにて組換えマウスＩＬ−２（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を有する合計１０ｍｌ培地の２５ｃｍ2組織培養フラスコにおいて５日間培養した。
【００７０】
ＣＴＬアッセイのために、Ｐ８１５細胞を、３０μｌ生理食塩液中０．１５ｍＣｉ  Ｎａ251ＣｒＯ4（ＨＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて３７℃にて３５分間標識した。標識された細胞を、１ｍｌ  ＲＰＭＩ  １６４０培地中２０μｇＮＰペプチドまたはβ−ｇａｌペプチド（Ｈ−２Ｌd  ＴＰＨＰＡＲＩＧＬ）を用いて３７℃にて４０分間パルスするか、またはパルスせずに使用した。２重滴定の脾臓細胞を、９６ウェル丸底プレート（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）にて細胞を１：３に連続的に希釈することによって調製した。標的細胞を、設定されたエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）にて２００μｌ／ウェルの最終容量において１×１０4細胞／ウェルに添加した。そのプレートを遠心分離し、そして５％ＣＯ2と共に３７℃にて４時間インキュベートした。１分毎のカウントを、各ウェルに由来する１００μｌの上清について決定した。特定溶解物を、％特定溶解物＝[（ａ−ｂ）／（ｃ−ｂ）]１００として計算した（ここで、ａは、エフェクターの存在下において放出された平均ｃｐｍであり、ｂは、培地のみでインキュベートされた標的細胞から放出された平均ｃｐｍであり、そしてｃは、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の存在下における標的細胞から放出されたｃｐｍである。
【００７１】
（実施例１）
ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ／共脂質は、マウスにおけるｐＤＮＡコードインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）に対する体液性免疫応答を増強させる。
【００７２】
本実施例は、抗ＮＰ抗体応答を提供する際のｐＤＮＡを有する種々のＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ：共脂質複合体対ｐＤＮＡ単独の投与の効果の量的比較を実証する。
【００７３】
ｐＤＮＡコード免疫原を用いる筋肉のトランスフェクションは、体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を誘導する。体液性免疫応答を評価するアッセイにおけるトランスフェクション増大の程度を決定するために、免疫原コードｐＤＮＡ単独および種々のアジュバント組成物と複合体化した同じｐＤＮＡを用いる免疫後の抗ＮＰ抗体レベルにおける変化を定量化した。免疫アッセイの一般的な特徴は、本質的にはＵｌｍｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９，１７４５〜１７４９（１９９３））によって記載されるのもと同様であり、そして抗体力価を定量するために標準的なＥＬＩＳＡ技術を使用する。
【００７４】
マウスを、ｐＤＮＡコードインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）（共脂質との１：１（ｍｏｌ；ｍｏｌ）混合物として処方されるサイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ）と複合体化される）を使用して免疫化した。そのサイトフェクチンを、４：１のｐＤＮＡ／サイトフェクチンモル比にて分析した。試験群における各動物（１群当たり５匹の動物）に、大腿直筋において１足当たり５０μｌ生理的食塩水（水中０．９％ＮａＣｌ重量／容量）中５μｇのｐＤＮＡ単独（１匹動物当たり全部で１０μｇのｐＤＮＡ）またはサイトフェクチン：共脂質複合体として注射した。注射を、「０」日目および３週目に実施した。
【００７５】
サイトフェクチン：共脂質免疫応答増強を、ｐＤＮＡ投与単独に由来するＧＭＴによって分割されるサイトフェクチン増強トランスフェクチン群に由来する相乗平均力価（ＧＭＴ）の比率に基づいて分析した（図３および４を参照のこと）。図３および図４に示されるように、好ましいＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥは、共脂質（特に、ＤＯＰＥまたはＤＰｙＰＥ）と結合された場合、ｐＤＮＡ単独および他のサイトフェクチン：共脂質の組合せと複合体化したｐＤＮＡに両方に渡ってコードされた免疫原に対する抗体応答を顕著に増強させる。最も驚くべきことに、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ：ＤＰｙＰＥと複合体したＶＲ４７００（図４）の筋肉内注射後６週目のマウス抗ＮＰ抗体力価は、抗ＮＰ力価の相乗平均において１０倍増加を生じた。
【００７６】
（実施例２）
ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ／ＤＰｙＰＥは、マウスにおいてｐＤＮＡをコードするインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）に対する体液性の免疫応答を増強する。
【００７７】
本実施例の目的は、ｐＤＮＡをコードするインフルエンザ核ＮＰ抗原に対する体液性の免疫応答増強するための好ましいサイトフェクチン：共脂質すなわちＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ／ＤＰｙＰＥの能力を実証することである。最もより好まれるサイトフェクチン：共脂質の混合物は、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥとＤＰｙＰＥとを１：１のモル比で混ぜたものである。より扱いにくい公式の化学的命名法を用いたり、この混合物の特定のモル比を明記したりする代わりに、この新しい処方物に「Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ」と名付ける。
【００７８】
（β−ガラクトシダーゼアッセイ）
以前に報告されているように（Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ，Ｍら、Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｂｏｓｔｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  ３４３−３６８（１９９８））、筋組織を集め、破砕し、抽出した。筋抽出物におけるβ−ガラクトシダーゼの発現レベルは、製造業者の説明書に従って、化学発光を使用して定量した（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１７５８２４１．Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ．ＩＮ）。何も注入されていない筋肉からのプールされた抽出液において調製された標準曲線は、キットに含まれていたβ−ガラクトシダーゼ酵素標準品を用いた各プレートに対して含まれた。
【００７９】
（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる抗ＮＰ特異的抗体分泌細胞の定量）
抗ＮＰ特異的抗体分泌細胞を、以前に報告されたプロトコールを使用して、ＥＬＩＳＰＯＴ法により定量した（Ｓｌｆｉｋａ，Ｍ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（３），１８９５−１９０２（１９９５））。骨髄（大腿骨、頸骨）から得た細胞を、赤血球を溶かすために０．８３％のＮＨ4Ｃｌで処理した。次いで、５％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）、Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシン（ＬＴＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。底がニトロセルロースである９６ウェルマルチスクリーンフィルトレーションプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を１ウェル当たり１００μｌのＰＢＳ中５μｇ／ｍｌのＮＰ抗原（インフルエンザ核タンパク質株Ａ／ＰＲＪ８／３４）液でコートし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを室温で２時間、５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０でブロッキングした。ブロッキング培地をインフルエンザＮＰ（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎを伴うか、もしくは伴わない）をコードするｐＤＮＡで免疫したマウスから得た骨髄細胞懸濁液を含む１００μｌ／ウェルのブロッキング培地に取り替えた。１０6個の細胞から始め、次いで、３倍希釈になるまで順次希釈してプレートにまいていった。コントロールのウェルには、上記のように希釈されたネイティブのマウスから得られた細胞を含んだ（これより前のコントロールは、不適切な抗原を含んでいた）。プレートを３７℃、７％ＣＯ2湿気のあるインキュベータで５時間インキュベートした。プレートを６回洗い、ＰＢＳ−Ｔ含有１％ＦＢＳ中１ウェル当たり１００μｌのビオチニル化されたウマ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ、１／１０００希釈、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を加え、４℃で一晩インキュベートした。さらにプレートに１００μｌ／ウェルの５μｇ／ｍｌセイヨウワサビペルオキシダーゼを結合したアビジンＤと共に、室温で１時間インキュベートした（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）。抗体分泌細胞を、１ウェルあたり１００μｌの基質（３−アミノ−９−エチルカルバゾールおよびＨ2Ｏ2）を３〜５分プレートに加えることにより検出した。この反応を多量の水道水で洗浄することにより終結させた。スポットを解剖顕微鏡（ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）下で計数した。抗ＮＰ特異的抗体を分泌する細胞は、１０6個の骨髄細胞あたりのスポット数として表した。
【００８０】
（統計的な評価）
全ての統計的な比較を、パラメータのないＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｒａｎｋ  ｓｕｍ試験を使用して行った（ＳｉｇｍａＳｔａｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０３  Ｊａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ．ＣＡ）。Ｐ値が０．０５未満の場合、その違いは統計的に有意とみなした。
【００８１】
（ＤＮＡ／Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ用量応答）
ｐＤＮＡ用量増加の効果およびブースト注射の効果を比較するために、三週間間隔でマウスに、１マウスあたり１μｇ、５μｇ、２５μｇの裸のＶＲ４７００プラスミドを左右の筋肉内注射を与えた（１動物あたり、それぞれ２、１０、５０μｇのｐＤＮＡ用量を与えた）。結果を図５に示す。１筋肉あたり、より多くの裸のｐＤＮＡを注射した場合、抗ＮＰの力価はもっと高くなる。そして、力価は第１ブースト注射および第２ブースト注射の後に高くなる。しかし、９週間後に３回目のブースト注射をした場合、いずれのｐＤＮＡ用量を用いても、抗ＮＰ力価のさらなる増加は見られなかった（データは示さず）。このことは、裸のｐＤＮＡによって抗体の力価レベルはプラトーに達したということを示している。
【００８２】
マウスの第２セットは、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎで処方した同量のｐＤＮＡを受けた。その結果を図５に示す。ここでは３つのｐＤＮＡ用量全てにおいて７〜２０倍の抗体力価の増加が見られた。この実験において、１群あたりの抗ＮＰ力価の最も高い平均は、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎで処方されたｐＤＮＡ用量を２５μｇを用いて９週目に測定された（２０４，８００±５６，０８７、ｎ＝５マウス）。裸のｐＤＮＡ注入時に見られたように９週目に３回目のブースト注射を行った場合、いずれのＶａｘｆｅｃｔｉｎ群においても抗ＮＰ力価の増加は見られなかった（データは示さず）。従って、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎは、ｐＤＮＡ注入量の増加あるいは注射の回数を増やしたりすることのいずれかによって、抗体力価を裸のｐＤＮＡのみでは得られなかったレベルまで増強する。最も著しい発見は、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎで処方した筋肉当たり１μｇのｐＤＮＡを用いるだけで、２５μｇの裸のＶＲ４７００のみを用いた時に得られる値の５倍以上の抗ＮＰ力価が得られるということであった。
【００８３】
体液性の免疫応答においてＶａｘｆｅｃｔｉｎ媒介性増強に、多数の左右対称の注射が必要であるかどうかを調べるための別個の実験を行った。結果を表１に示す。５μｇのＶＲ４７００  ｐＤＮＡをＶａｘｆｅｃｔｉｎと共に処方することで、マウスに１回の片側筋肉内注射後２０日目に、抗ＮＰ力価が６倍もの著しい増加が見せた。このことは、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎは単回用量後の抗体応答を増強し得ることを示している。
【００８４】
【表１】
0004800485.tif 000002
（処方の最適化）
Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ処方を最適化するために、異なるｐＤＮＡ：カチオン性脂質比をマウス免疫モデル系において試験した。その結果（図６に示される）は、ｐＤＮＡ−Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ複合体をもっと大量（従って、プラスミド量およびＶａｘｆｅｃｔｉｎ量の両方を同時に増加する）に注入することにより、用量依存的な様式において抗体の力価が増加することを示す。このような傾向は、ｐＤＮＡ：カチオン性脂質モル比の２：１、４：１の両方についても同様に見られた。増加した量のＶａｘｆｅｃｔｉｎと共に、同じ５μｇのｐＤＮＡを注射した場合（従って、ｐＤＮＡ：カチオン性脂質のモル比が減少する）、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ用量依存的な様式において抗体力価が再び増加した（図６Ｂ）。さらに大量のｐＤＮＡを用いた実験も行ったが、１肢当たりｐＤＮＡ：カチオン性脂質モル比４：１にてＶａｘｆｅｃｔｉｎで処方された５０μｇのｐＤＮＡを注入しても、同じ４：１比にてＶａｘｆｅｃｔｉｎで処方された２５μｇのｐＤＮＡと比べて抗ＮＰ力価のさらなる増加は産生されなかった（データは示さず）。
【００８５】
（増強された体液性応答の持続時間）
Ｖａｘｆｅｃｔｉｎにより促進される体液性応答の持続時間を調べるために、マウスのワクチン接種モデルにはじめに注入した後９ヶ月間、ＮＰ特異的抗体の力価を調べた。結果を図７Ａに示す。２１日目のブースト注射後３週間後、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ群におけるＮＰ力価は裸のｐＤＮＡを注入したコントロールのものに比べて９倍高かった。その後の数週間、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ群における抗体の力価は徐々に減少していったが、一連の実験を通してコントロールのものよりは有意に高い値を示していた。実験を始めてから４０週経っても、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ群における抗ＮＰ力価は裸のｐＤＮＡ群に比べてまだ４倍高かった。
【００８６】
並行実験において、別のセットのマウスは、３週目に一回目のブースト注射、３ヶ月目に二回目の同一のブースト注射を受けた。この結果を図７Ｂに示す。どちらの群においても、２回目のブースト注射によって２〜３倍の抗体力価の増加が見られた。しかし、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ群における抗ＮＰ力価は、数ヶ月の間、このような高い値のままであったが、その一方で裸のｐＤＮＡを用いた群においては、実験終了時に１回のブースト注射後の力価と同じような力価を生じた。その結果として、実験を始めてから、９ヶ月後、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ群における抗ＮＰ力価は、ｐＤＮＡコントロール群における力価に比べて１７倍高い値を示した。
【００８７】
（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎは強いＣＴＬ応答を維持する）
体液性の免疫応答を増強させるようなｐＤＮＡワクチンと組合せて使用されるアジュバントが、同時に、細胞媒介性免疫を減少させないということが非常に所望される。このことを評価するために、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎを伴うか、もしくは伴わずに種々の用量のｐＤＮＡをマウスに注射した後にＣＴＬアッセイを行った。その結果は図８に示される。１回のブースト注射（図８Ｃ）あるいは複数回（図８Ａおよび８Ｂ）のブースト注射後、異なるｐＤＮＡおよびカチオン性脂質比（図８Ａ）にて処方した場合、あるいは、ＰＢＳ（図８Ａ）もしくは１５０ｍＭのＮａＰビヒクル（図８Ｃ）において送達した場合、ＶａｘｆｅｃｔｉｎはＣＴＬ応答に対して有意な効果を有しなかった。筋肉当たり２５μｇの裸のｐＤＮＡを注射することは、１μｇのｐＤＮＡを注射する場合に比べてより強いＣＴＬ応答を生じたように観察された。さらに、ＶａｘｆｅｃｔｉｎはいずれのｐＤＮＡ用量に関するＣＴＬ応答に対しても顕著な影響を与えなかった（図８Ｂ）。ひとまとめにして考えると、これらの結果は、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎを使用してｐＤＮＡワクチンを用いる体液性免疫応答を増強し得るが、ｐＤＮＡ免疫に特徴的な強いＣＴＬ応答を維持することを示す。
【００８８】
（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎは筋肉のトランスフェクションを増加させない）
Ｖａｘｆｅｃｔｉｎが抗体応答を増強させるメカニズムを解明するために、筋肉での発現におけるＶａｘｆｅｃｔｉｎの効果をインビボで調べた。これらの実験において、β−ガラクトシダーゼをコードするｐＤＮＡ（ＶＲ１４１２）を単独で注射したか、あるいはＶａｘｆｅｃｔｉｎで処方し、そして個々の筋肉について、定期的にレポーター遺伝子の発現についてアッセイした。その結果が図９に示されている。注射から１日目、２つの群におけるβ−ガラクトシダーゼの発現は同じであった。このことは、ＶａｘｆｅｃｔｉｎはｐＤＮＡによる筋肉のはじめのトランスフェクションには影響していないということを示していた。１日目から７日目までの間に、裸のｐＤＮＡ群においては、筋肉中での発現が７倍になった。これとは対称的に、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ群における発現は、同じ期間で２５％減少した。７日目から２１日目の間、裸のｐＤＮＡ群におけるレポーター遺伝子の発現レベルは同じままであったが、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ群においては、筋肉中でのβ−ガラクトシダーゼの発現が減り続け、そして２１日目のｐＤＮＡコントロール群の場合に比べて２０倍よりも低い値をとった。従って、注射後時間が経つにつれて、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ群において筋肉中での導入遺伝子の発現は顕著に減少したが、抗体の力価はより高かった。このような、筋肉中での発現と抗体の力価との間に相関関係が見られないことは、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎによる抗体応答の増強（亢進）は、促進された筋原繊維のトランスフェクションおよび／または筋組織において増加した抗原の合成によって説明され得ない、ということを示している。
【００８９】
Ｖａｘｆｅｃｔｉｎが抗原特異的な抗体応答を増強（亢進）するメカニズムはまだ良く分かっていない。Ｖａｘｆｅｃｔｉｎが筋組織中にある、抗原提示細胞を含む複数の細胞型にｐＤＮＡを送達することもあり得るが、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ非存在下でのｐＤＮＡの針注射は、原理的に筋繊維をトランスフェクトし得る。あるいは、ｐＤＮＡ−脂質複合体は筋肉を出て、そして遠位の組織（局所的排出リンパ節における細胞を含む）を形質導入することをより可能にし得る。Ｖａｘｆｅｃｔｉｎはプラスミドをヌクレアーゼに対して保護し得、これによって、ｐＤＮＡ−脂質複合体は注射した部位から遠く離れた組織にまで届くことが可能となる。Ｖａｘｆｅｃｔｉｎはまた、炎症をもたらし得、これは多くの形質導入された筋繊維が損傷を受け、それによって注射後すぐに、より可溶性の抗原を放出する。その後の数日間の抗原産生の減少は、抗原を限定することによって高い親和性をもつ抗原特異的Ｂ細胞を選択し得、その結果、抗体の力価は増加することになる。
【００９０】
（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎは骨髄における抗原特異的形質細胞の数を増加させる）
Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ処置された動物における抗ＮＰ力価の上昇は、ブースト注射後、数ヶ月間維持された（図７）。骨髄において長く生きているプラズマ細胞が、ウイルスのインフェクション後の持続する抗体産生を維持するための主要な機構であることが示されているので（Ｓｌｉｆｋａ，Ｍ．Ｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（３），１８９５−１９０２（１９９５），Ｓｌｉｆｋａ，Ｍ．Ｋ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０（３），２５２−２５８（１９９８））、骨髄由来の抗ＮＰ抗体分泌細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して定量した。その結果、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎは、骨髄中のＮＰ特異的プラズマ細胞の数を統計的有意に３〜５倍の増加を生成したということを示していた。さらに、個々のマウスにおける抗体力価は、裸のｐＤＮＡおよびＶａｘｆｅｃｔｉｎ群のどちらにおいても、骨髄中の抗ＮＰ抗体分泌細胞の数とおおよその相関関係があった（表２）。
【００９１】
【表２】
0004800485.tif 000003
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるデータはＶａｘｆｅｃｔｉｎの使用により、骨髄における抗原特異的プラズマ細胞の数を増加させるということを示している。このようなプラズマ細胞の増加は、ｐＤＮＡ−脂質複合体のアジュバント特性に起因し得る。カチオン性脂質と複合体化したブランクｐＤＮＡを、マウス卵巣腫瘍保有Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスの腹膜に注射することにより、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の産生が誘導される（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６３（１２）６３７８−６３８５（１９９９））。これらのサイトカインはｐＤＮＡまたは脂質のみを処置されたマウスにおいては誘導されなかった。このことは、ｐＤＮＡ−脂質複合体は、インビボで免疫刺激性を持つということを示す。ｐＤＮＡ−脂質複合体の免疫刺激特性はまた、マウスにカチオン性脂質と複合体化したｐＤＮＡを静脈注射により注射する実験により報告された（Ｄｏｗ，Ｓ．Ｗ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６３（３）１５５２−１５６１（１９９９））。ｐＤＮＡ−脂質複合体の腹膜注射による注射および静脈注射による注射に関する限りでは、ｐＤＮＡ−Ｖａｘｆｅｃｔｉｎの筋肉内注射はまた、ＩＬ−６（活性化されたＢ細胞のプラズマ細胞への分化を促進するサイトカイン）を含んだサイトカインの誘導を引き起こし得る。従って、ｐＤＮＡ−Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ複合体は、抗体産生Ｂ細胞の数を増やすことにより間接的に抗体の力価を増強し得る。
【００９２】
また、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎの成分が、Ｂ細胞のポリクローナル増殖を直接刺激し得る、天然に存在するマイトジェンを擬態することも可能である。これは、応答性のＢ細胞数の増加により筋細胞によって発現される導入遺伝子に対する特異的な免疫応答を増強し得る。従って、このように、リンパ節における細胞のトランスフェクションを伴う、ＡＰＣのトランスフェクションまたは排出リンパ節へのｐＤＮＡの送達が増加すると、筋肉損傷が可溶性抗原の有用性の増加を生じ、そしてｐＤＮＡ−Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ複合体の免疫刺激特性が、各々Ｖａｘｆｅｃｔｉｎのアジュバント効果の一因となり得る。
【００９３】
（実施例３）
（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎは、ウサギにおいて抗体力価を増大させる）
本実施例の目的は、ポリヌクレオチドをベースとするワクチン中に処方された場合の、ウサギにおいてＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ：共脂質（例えば、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ）のアジュバント効果を示すことである。
【００９４】
雌性ニュージーランド白色ウサギ（５〜６ヶ月齢）を麻酔した。次いで、１５０μｇのＶＲ４７００プラスミドＤＮＡを含むＰＢＳ溶液、または４モル：１モルのｐＤＮＡ：ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ比で調製された１５０μｇのＶＲ４７００プラスミドとＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ：ＤＰｙＰＥ（１：１）との複合体を含むＰＢＳ溶液のいずれか３００μｌを、後脚に注射した。各ウサギに、滅菌したディスポーザブルのプラスチックのインシュリンシリンジおよび２２ゲージの１インチ針を使用して０日目に一回注射した。そしてこのウサギに、６週目に反対側の後脚に同じ「ブースト」注射を行った。免疫前、および３週間目、６週間目、７週間目、９週間目、および１３週間目に、この動物から耳の静脈より採血した。６週の採血を、同じ日だが、ブースト注射を行う前に実施した。
【００９５】
針およびシリンジを用いて実行した単回の片側筋肉内（ｉ．ｍ．）注射を使用して、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎは、裸のｐＤＮＡの注射と比較して、３週目に抗体力価の旺盛な２０倍の増加を生じた。この結果を図１０に示す。６週目に行ったブースト注射の後、両方の群での抗ＮＰ力価はほぼ一桁増大し、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ群中における抗体力価は、実験の経過を通じて裸のｐＤＮＡ群よりも２０倍〜５０倍高いままであった。ウサギをＢｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）２０００デバイスで免疫した場合、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎは、単回の片側注射の後に抗体応答を増強しないようであった。ブースト注射を６週目に行った後、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ  Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ群での抗ＮＰ力価は、対応する裸のｐＤＮＡ群でのものよりも８倍まで高かった。
【００９６】
（実施例４）
（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎは、種々のプラスミドＤＮＡにコードされた抗原に対する抗体産生を増強し、そしてＴＨ１型免疫応答を促進する）
本実施例の目的は、種々のモデル抗原と処方された場合のＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ：共脂質（例えば、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ）のアジュバント効果を示すこと、そしてＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ：共脂質を含むｐＤＮＡ処方物に対する免疫応答をさらに特徴付けることである。
【００９７】
（免疫および血清収集）
拘束した覚醒しているマウスに、Ａ／ＰＲ／８／３４  ＮＰ（ＶＲ４７００）コードするｐＤＮＡ、鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ、ＶＲ５９００）コードするｐＤＮＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬａｃＺ（β−ｇａｌ、ＶＲ１４１２）コードするｐＤＮＡ、マウスＩｄ／ヒトＦｃ（３８Ｃ１３（ヒトＩｇＧ１定常領域に融合されたマウスリンパ腫細胞株）由来の免疫グロブリン可変領域、ＶＲ１６２３）コードするｐＤＮＡ、またはヒト第ＩＸ因子（ＶＲ１９０４）をコードするｐＤＮＡ  ５μｇを、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（５０μｌ）を含むかまたはＶａｘｆｅｃｔｉｎを含まないＰＢＳ中に調製して与えた。８〜１０週齢の雌性マウスの大腿直筋に注射した。マウスに、同じ用量および処方物を用いて３週目にブーストした。１回目の注射の前、ブーストの１日前、そして１回目の注射後６週目に、静脈叢からマウスから採血した。
【００９８】
（ＩｇＧ抗体ＥＬＩＳＡ）
抗体力価を以下によって決定した：１ウェルあたり５０μｌのＢＢＳ（８９ｍＭのホウ酸、９０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．３））中の、０．０３５μｇインフルエンザ核タンパク質（組換えバキュロウイルス抽出物から精製）、０．２５μｇ鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、０．２５μｇ  Ｅ．Ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、２．２μｇマウスＩｄ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）または０．３μｇヒト第ＩＸ因子（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）で、９６ウェルの１／２領域フラットウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ／Ｃｏｓｔａｒ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）をコートすること。プレートを４℃で一晩インキュベートし、次いでＢＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＢＢＳ）で４回洗浄した。ＮＰでコートしたウェルをＮＰアッセイ緩衝液（ＢＢＳ中５％脱脂乳）１００μｌでブロックし、そして他のすべてのプレートのウェルを、ＢＳＡアッセイ緩衝液（ＢＢＳ中１％ウシ血清アルブミン）１００μｌで室温で１時間ブロックした。アッセイ緩衝液中の血清の２倍系列希釈物（１：２５で始まる）を調製し、そして５０μｌアリコートを各ウェルに添加した。室温で２時間のインキュベーションおよび４回の洗浄の後、アッセイ緩衝液中に１：５０００で希釈したアルカリホスファターゼ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を、５０μｌ／ウェルで添加した。このプレートを室温で２時間インキュベートし、４回洗浄し、そして１ウェルあたり５０μｌのｐ−ＮＰＰ基質（５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）および１ｍＭ  ＭｇＣｌ2中の、１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を添加した。室温で１．５時間後に、４０５ｎｍでの吸光度を読み取った。力価は、最終希釈の逆数であり、シグナルは、採血前のサンプルのシグナルの２倍である。
【００９９】
（抗原特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａのＥＬＩＳＡ）
アルカリホスファターゼに結合体化したマウスサブアイソタイプ特異的モノクローナル抗体をスタンダードを用いて事前に力価決定して、等量のスタンダードについて等しい吸光度値を得る希釈を決定した。力価決定のために、ＢＢＳ中の親和性精製したヤギ抗マウスκ抗血清０．１μｇ／５０μｌ／ウェルで、４℃でプレートを一晩コートした。上記のＮＰ  ＥＬＩＳＡについてと同様に、プレートを洗浄し、そしてブロックした。精製したマウスＩｇＧ１，κまたはＩｇＧ２ａ，κを系列希釈し、そして５０μｌ／ウェルでプレートに添加した。室温で２時間インキュベートした後、アルカリホスファターゼ結合体化ラット抗マウスＩｇＧ１およびアルカリホスファターゼ結合体化ラット抗マウスＩｇＧ２ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を系列希釈し、そして洗浄したプレートに添加した。このアッセイを、ＮＰ抗体ＥＬＩＳＡについてと同様に完了した。抗原特異的サブアイソタイプ血清力価の測定のためのアッセイは、全ＩｇＧレベルについて記載したのと同様であり、以下の改変を伴った：アルカリホスファターゼ結合体化抗マウスＩｇＧ１およびアルカリホスファターゼ結合体化抗マウスＩｇＧ２ａを、それぞれ１：１５００および１：２００で希釈した。
【０１００】
（ＣＴＬの刺激）
１回目の注射の後１１〜１２週目に安楽死させたマウスから脾臓を取り出し、そして２．５×１０7個の脾細胞を、総計５ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培地中で６ウェルプレートにて５日間培養した。この培地（他のように記述しない限り、すべての組織培養試薬は、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手した）には、Ｌ−グルタミンおよび２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含み、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、５．５×１０-5Ｍのβ−メルカプトエタノールおよび１０％  ＦＢＳ（１０％培地）を補充し、１μｇのＮＰ147-155ペプチド（Ｈ−２Ｋd  ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ）またはβ−ｇａｌ876-884ペプチド（Ｈ−２Ｌd  ＴＰＨＡＲＩＧＬ）を補充し、そして０．５Ｕ／ｍｌの組換えマウスＩＬ−２（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を補充した。
【０１０１】
（51Ｃｒ放出アッセイ）
抗原特異的溶解物を検出するために、Ｐ８１５細胞を０．１５ｍＣｉ  Ｎａ251ＣｒＯ4（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で標識し、そして１ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培地中の２０μｇのＮＰ147-155ペプチドまたは５０μｇのβ−ｇａｌ876-884ペプチドのいずれかでパルスするか、パルスしないで使用した。刺激した脾細胞の２連のアリコートを９６ウェル丸底プレート（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ａｕｒｏｒａ、ＯＨ）中で系列希釈し、そして標的細胞を最終容量２００μｌ／ウェルにて、指定のエフェクター：標的比で添加した。プレートを遠心分離し、そして５％  ＣＯ2とともに３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェル由来の１００μｌの上清を分析した。特異的溶解を、特異的溶解％＝［(ａ−ｂ）／（ｃ−ｂ）]１００として計算した。ここで、ａは、エフェクターの存在下で放出された平均ｃｐｍであり、ｂは培地のみにおいてインキュベートした標的細胞から放出された平均ｃｐｍであり、そしてｃは１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ
１００の存在下で標的細胞から放出されたｃｐｍである。
【０１０２】
（サイトカインプロフィール）
インビトロで抗原で再刺激した脾臓細胞のサイトカイン分泌プロフィールを決定するために、精製ＮＰ（組換えバキュロウイルス抽出物から精製）またはβ−ｇａｌタンパク質（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）５μｇ／ｍｌとともに、９６ウェル平底培養プレート中に４×１０5細胞／１００μｌ／ウェルで脾細胞を２連でプレートした。５％  ＣＯ2とともに３７℃で７２時間の後、培養上清を収集した。培養上清中のサイトカインを、マウスＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）およびマウスＩＬ−４  ＥＬＩＳＡミニキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を製造業者の指示に従って用いて定量した。
【０１０３】
（統計学的分析）
統計学的分析を、両側スチューデントｔ検定を用いて実施した。
【０１０４】
（抗原特異的ＩｇＧ力価に対するＶａｘｆｅｃｔｉｎの効果）
３週目のブーストの１日前に収集した血清についての抗原特異的抗体力価および１回目の注射後６週目に収集した血清についての抗原特異的抗体力価を、図１１に示す。ｐＤＮＡ／Ｖａｘｆｅｃｔｉｎでの免疫は、抗ＮＰ抗体および抗第ＩＸ因子抗体の３週の力価に対して中程度の効果を有し、そして抗マウスイディオタイプ抗体力価および抗ＨＥＬ抗体の力価に対しては、もっと大きな効果さえ有した。Ｖａｘｆｅｃｔｉｎは、３週目の抗β−ｇａｌ抗体の血清力価に対して、何の効果も有さなかった。ブースト免疫の３週後、ｐＤＮＡ／Ｖａｘｆｅｃｔｉｎを与えたマウスの力価は、５つの抗原すべてについて裸のｐＤＮＡを与えたマウスの力価に対して増加された。表３は、５つすべての抗原についての６週目の抗原特異的ＩｇＧ応答を要約している。Ｖａｘｆｅｘｔｉｎは、ｐＤＮＡに誘導された抗ＮＰ抗体の力価および抗ＨＥＬ抗体の力価を、裸のｐＤＮＡに対してそれぞれ８倍および１０倍増加させ、そして抗β−ｇａｌ、抗第ＩＸ因子および抗マウスＩｄの力価を、裸のｐＤＮＡに対して３倍増加させた。
【０１０５】
【表３】
0004800485.tif 000004
*マウスには、０週目および３週目に各大腿直筋に、５μｇ  ｐＤＮＡ＋／−Ｖａｘｆｅｃｔｉｎの両側注射を与えた。抗体力価を６週目に決定した（すべての群についてｎ＝２０。ただし、ＮＰについて、裸のＮＰ  ｐＤＮＡについてｎ＝２９、ＮＰ  ｐＤＮＡ／Ｖａｘｆｅｃｔｉｎについてｎ＝３０、そしてマウスイディオタイプについて裸のマウスＩｄ  ｐＤＮＡについてｎ＝１９を除く）。
【０１０６】
（ＣＴＬ応答に対するＶａｘｆｅｃｔｉｎの効果）
筋肉内経路によるプラスミドＤＮＡワクチン接種は、代表的には、コードされた抗原に対する強力なＣＴＬ応答を生じる（Ｕｌｍｅｒら、１９９３；Ｒａｚら、１９９６；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、１９９７）。抗体応答をブーストするためにアジュバントとともにｐＤＮＡを処方する１つの起こりそうな結果は、より弱い細胞媒介性免疫応答を生じ得るＴｈ２型応答の誘導である。ｐＤＮＡ誘導性ＣＴＬ応答に対するＶａｘｆｅｃｔｉｎの効果を決定するために、ＮＰ  ｐＤＮＡまたはβ−ｇａｌ  ｐＤＮＡで免疫したマウス由来の脾臓を、ブースト注射の８〜９週後に収集した。ＮＰペプチドまたはβ−ｇａｌペプチドとともに５〜６日間培養した脾細胞を、ＮＰペプチドまたはβ−ｇａｌペプチドでパルスしたＰ８１５標的細胞のＣＴＬ溶解についてアッセイした。パルスしていないＰ８１５細胞を使用して、非特異的溶解を検出した。ペプチドでパルスした標的細胞の溶解％についての抗原特異的ＣＴＬエフェクター力価測定曲線を、図１２に示す。ＮＰ  ｐＤＮＡおよびβ−ｇａｌ  ｐＤＮＡの両方についての結果は、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎを用いてのｐＤＮＡの処方は、試験したいかなるのエフェクター：標的比でも、ＣＴＬ応答に対して何ら有意な効果を有さない（すべてのＥ：Ｔ比にて、ｐ＞０．０５）。
【０１０７】
（ＩｇＧ１抗体力価およびＩｇＧ２ａ抗体力価に対するＶａｘｆｅｃｔｉｎの効果）
筋肉内ｐＤＮＡ免疫により誘導されるＴヘルパー１（Ｔｈ１）型免疫応答は、ＩｇＧ２ａサブアイソタイプに対して応答性のＢ細胞において、抗体重鎖の変換を促進する（Ｒａｚら、１９９６）。従って、抗原特異的ＩｇＧ２ａの産生は、抗原特異的ＩｇＧ１よりも多い。ｐＤＮＡワクチンにおけるアジュバントの使用は、免疫応答を質的に変化させ得、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａのいずれかのより多い産生をもたらす。種々の抗原プラスミドＤＮＡを用いて処方した場合の抗原特異的血清ＩｇＧ２ａに対する抗原特異的血清ＩｇＧ１の相対的比率に対するＶａｘｆｅｃｔｉｎの効果を決定するために、６週目の血清を、抗原特異的サブアイソタイプ力価について分析した。
【０１０８】
図１３ａに示されるように、異なる抗原をコードする裸のｐＤＮＡでの免疫は、各抗原に対して独特にサブアイソタイププロフィールを生じる。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの相対的比率は異なる抗原について変化したが、ＩｇＧ２ａが産生された優勢なサブアイソタイプであり、これはＴｈ１型免疫応答と一致した。５つすべてのモデル抗原ｐＤＮＡを用いて処方したＶａｘｆｅｃｔｉｎは、抗原特異的抗体サブタイプの両方の増加をもたらす（表４）。抗原特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａにおける増加は、モデル抗原のうちの４つについてＶａｘｆｅｃｔｉｎ処方したｐＤＮＡについてほぼ同じ大きさであった。裸のｐＤＮＡを用いて得た力価と比較した場合、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎを用いてｐＤＮＡを処方することは、抗ＨＥＬ  ＩｇＧ１力価を９倍、そしてＩｇＧ２ａ力価を１１倍増加させた。Ｖａｘｆｅｃｔｉｎは、抗β−ｇａｌ、抗マウスＩｄ／ヒトＦＣおよび抗第ＩＸ因子のＩｇＧ１力価を裸のＤＮＡに対して２〜５倍増加させ、そして抗β−ｇａｌ、抗マウスＩｄ／ヒトＦＣおよび抗第ＩＸ因子のＩｇＧ２ａ力価を裸のｐＤＮＡに対して２〜４倍増加させた。ＮＰ  ｐＤＮＡを用いて処方したＶａｘｆｅｃｔｉｎは、平均抗ＮＰ  ＩｇＧ１抗体力価を裸のｐＤＮＡに対して１５倍増加させた。しかし、平均抗ＮＰ  ＩｇＧ２ａ抗体力価は、３倍しか増加させなかった。従って、ｐＤＮＡ／Ｖａｘｆｅｃｔｉｎの免疫により惹起されるＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの相対的比率は、裸のｐＤＮＡを使用してマウスを免疫する場合に生じる比率と同様のままであり、ただし、ＮＰ  ｐＤＮＡ／Ｖａｘｆｅｃｔｉｎの場合を除く（図１３ｂ）。この場合において、抗ＮＰ  ＩｇＧ２ａの抗体力価の増加よりもかなり大きい抗ＮＰ  ＩｇＧ１の抗体力価の増加が存在する。Ｖａｘｆｅｃｔｉｎを用いて処方したｐＤＮＡのすべてについて、抗原特異的ＩｇＧ２ａの力価は抗原特異的ＩｇＧ１よりも高く、これは、Ｔｈ１型応答を示唆した。
【０１０９】
【表４】
0004800485.tif 000005
*マウスには、０週目および３週目に各大腿直筋に、５μｇ  ｐＤＮＡ＋／−Ｖａｘｆｅｃｔｉｎの両側注射を与えた。抗体力価を６週目に決定した（すべての群についてｎ＝２０。ただし、ＮＰについて、裸のＮＰ  ｐＤＮＡについてｎ＝２９、ＮＰ  ｐＤＮＡ／Ｖａｘｆｅｃｔｉｎについてｎ＝３０、そしてマウスイディオタイプについて裸のマウスＩｄ  ｐＤＮＡについてｎ＝１９を除く）。
【０１１０】
（サイトカインプロフィールに対するＶａｘｆｅｃｔｉｎの効果）
抗原特異的抗体サブアイソタイプ分析は、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ処方したｐＤＮＡを用いて誘導される応答は、裸のｐＤＡＮに関して、Ｔｈ１型応答であることを示唆する。Ｖａｘｆｅｃｔｉｎが抗原特異的インビトロ想起（ｒｅｃａｌｌ）応答におけるＴヘルパー（Ｔｈ）サイトカインプロフィールに対して何の効果も有さないことを確認するために、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎを用いてかまたはＶａｘｆｅｃｔｉｎを用いずに処方した、ＮＰ  ｐＤＮＡまたはβ−ｇａｌ  ｐＤＮＡで免疫したマウスの群由来の脾臓を、ブースト注射の８〜９週間後に収集した。脾細胞を培養し、そしてＮＰタンパク質またはβ−ｇａｌタンパク質で刺激した。培養した細胞から収集した上清を、ＩＮＦ−γおよびインターロイキン−４（ＩＬ−４）の産生についてアッセイした。Ｖａｘｆｅｃｔｉｎを用いてかまたは用いずに処方した、ＮＰプラスミドＤＮＡまたはβ−ｇａｌプラスミドＤＮＡでの免疫によって、すべての群の免疫したマウス由来の脾細胞培養物においてＩＦＮ−γ産生がもたらされた（図１４）。低レベルのＩＬ−４が、すべての群のマウスにて産生されたが、しかしＩＦＮ−γが産生された優勢なサイトカインであり、このことは、Ｔｈ１に偏った応答を示唆した。
【０１１１】
要約すると、上記の実施例は、核酸ワクチンのための独特のカチオン性脂質をベースとする処方物の旺盛なアジュバント効果を示す。体液性応答の刺激は、核酸をベースとするワクチンを代表する強力な細胞溶解性応答を減少させることなく達成され得る。このアジュバント活性は、マウスおよびウサギの両方において観察され、これによって、他の動物における薬学的適用が暗示され、ならびに、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の核酸をベースとする調製における潜在的利益が提供される。抗体応答のＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ／共脂質（例えば、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ）媒介性増強が、単回の片側筋肉内注射の後に容易に観察された。これは、単回注射ワクチンが非常に望ましい農場動物の免疫に重要である。なぜなら、放牧中の動物の駆集めは高価であり、そしてストレスに起因して産生の損失を生じ得るからである（Ｂｅａｒｄ，Ｃ．Ｗ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６（１３）、１３２５〜１３２８（１９９８））。
【０１１２】
（実施例５）
（ヒト投与）
免疫原性組成物（赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするｐＤＮＡを、ＤＰｙＰＥとの１：１（モル：モル）混合物として処方されたＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥを含むアジュバントと混合して含む）を、上記の方法に従って調製する。ｐＤＮＡ／アジュバントモル比は、４：１である。生理学的食塩水中０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１．０ｍｇまたは２．５ｍｇのｐＤＮＡ（アジュバントとの複合体として）の３回の注射を、４週間間隔で交互の三角筋にヒトに注射する。血清をそのヒトから取り出し、そしてＨＡ抗体のレベルを、上記のように標準的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、系列希釈によって決定する。このＨＡ抗体に対するヒト被検体の免疫応答を、ＧＭＴ抗体力価の値により示されるように、誘導する。
【０１１３】
（他の実施形態）
本発明はその詳細な説明と共に記載されてきたが、上記の説明は、本発明の範囲（添付の特許請求の範囲により規定される）を例示するために意図されており、本発明の範囲を限定するためには意図されないことが、理解されるべきである。他の局面、利点、および改変は、上記の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
本発明の先の局面および利点は、以下の図面および上記の詳細な説明を参照して、当業者に容易に明らかである。
【図１】  図１は、プラスミドＤＮＡのダイアグラムを例示する。各ベクターは、複製のｐＵＣ１９起点およびＥ．ｃｏｌｉ細菌におけるプラスミド増殖のためのカナマイシン耐性遺伝子を有する。ＣＭＶ＝ヒトサイトメガロウイルスプロモーターおよびエンハンサー；ＣＭＶ−Ａ＝ヒトサイトメガロウイルスイントロンＡ；ｍＲＧＢ＝改変ウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナル；ＢＧＨ＝ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル。
【図２】  図２は、サイトフェクチンＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥならびに共脂質ＤＯＰＥおよびＤＰｙＰＥについての化学構造を、構造的に関連したサイトフェクチンとともに例示する。
【図３】  図３は、サイトフェクチンの構造要素が、投与の際に抗体刺激のレベルを決定することを示す棒グラフである。マウスをインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）をコードするｐＤＮＡを使用して免疫化し、この核タンパク質は、ＤＯＰＥ共脂質との１：１（ｍｏｌ：ｍｏｌ）として処方される、種々のサイトフェクチン（横軸に示される）と複合体化される。試験群（１つの群当たり５匹の動物）を、「０」日目および３週間目（追加免疫注射）に、大腿直筋において脚当たり５０μｌ  生理学的食塩水中の５μｇのｐＤＮＡを、単独またはサイトフェクチン：共脂質補助剤の複合体として、注射した。６週間後（追加免疫後３週間）、血清を動物から取り出し、ＮＰ抗体力価をＥＬＩＳＡを使用する一連の希釈によって決定した。サイトフェクチン：共脂質増強を、（ｉ）サイトフェクチン−増強トランスフェクション群からの幾何平均力価（ＧＭＴ）の、（ｉｉ）ｐＤＮＡトランスフェクションのみからのＧＭＴ（動物の等価なコントロール群を使用する）に対する比を使用して評価した。
【図４】  図４は、補助組成物においてＤＯＰＥの代わりに共脂質としてＤＰｙＰＥを使用することによるサイトフェクチンに対する抗ＮＰ抗体応答の示差的増強を示す棒グラフである。マウスを、図２に関連して、上記に記載されるように免疫化および分析した。
【図５】  図５は、ｐＤＮＡ−Ｖａｘｆｅｃｔｉｎワクチン接種用量応答および時間経過を示す棒グラフである。ＭＡＬＢ／ｃマウス（８−１０週齢）は、筋肉当たり５０μｌＰＢＳ中の１μｇ、５μｇ、または２５μｇの裸のＶＲ４７００プラスミド（インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）をコードする）の両側での筋肉内注射を受けた（時点当たり、２μｇ、１０μｇ、５０μｇの総ｐＤＮＡ）。第２のセットのマウスは、４：１のモル比の一定のｐＤＮＡ：カチオン性脂質を使用するＶａｘｆｅｃｔｉｎとともに処方された同じｐＤＮＡ用量を受けた。追加免疫注射を２１日目および４２日目（矢印）に与えられた。線は、平均抗ＮＰ抗体力価＋Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す（群当たりｎ＝５匹のマウス）。
【図６】  図６Ａおよび６Ｂは、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ処方の最適化を示す。コントロールマウスは、筋肉当たり５０μｌＰＢＳ中の５μｇの裸のＶＲ４７００プラスミド（インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）をコードする）の両側での筋肉内注射を受けた（白色の棒）。試験群は、示されたｐＤＮＡ：カチオン性脂質モル比でＶａｘｆｅｃｔｉｎとともに処方された当量のｐＤＮＡ用量を受けた。追加免疫注射は初期の注射と同一であり、２１日目に与えた。総ＮＰ−特異性ＩｇＧ抗体力価を、４２日目（追加免疫後３週間）の血清サンプルから決定した。棒は、２つの別個の実験からの平均抗ＮＰ力価を表す（群当たりｎ＝５〜１５マウス）。
【図７】  図７は、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎによって誘導される上昇した抗体力価の持続期間を示す。マウスは、筋肉当たり５０μｌＰＢＳ中の５μｇの裸のＶＲ４７００プラスミド（インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）をコードする）、または４：１のｐＤＮＡ：カチオン性脂質のモル比でＶａｘｆｅｃｔｉｎとともに処方された同じ量のｐＤＮＡのいずれかの両側での筋肉内注射を受けた。同一の追加免疫を２１日目（Ａ）、または２１日目および３ヶ月後（Ｂ）のいずれかで与えた（矢印）。総ＮＰ−特異性ＩｇＧ抗体力価を種々の時点での血清サンプルから決定した。線は、平均抗ＮＰ力価およびＳ．Ｅ．Ｍ．を表す（群当たりｎ＝４〜１０匹のマウス）。
【図８】  図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎとともに処方されたｐＤＮＡが、裸のｐＤＮＡを用いて誘起された応答と同程度に強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘起することを示す。（Ａ）マウスは、０日目、２１日目、４２日目および６３日目に、筋肉当たり５０μｌＰＢＳ中の５μｇのＶＲ４７００プラスミド（インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）をコードする）の両側での筋肉内注射を受けた。第２のセットのマウスは、示されたｐＤＮＡ：カチオン性脂質のモル比においてＶａｘｆｅｃｔｉｎとともに処方された同じｐＤＮＡ用量を受けた。（Ｂ）マウスは、０日目、２１日目、４２日目および６３日目に、筋肉当たり５０μｌＰＢＳ中の１μｇまたは２５μｇのＶＲ４７００プラスミドの両側での筋肉内注射を受けた。第２のセットのマウスは、４：１のｐＤＮＡ：カチオン性脂質のモル比においてＶａｘｆｅｃｔｉｎとともに処方された同じｐＤＮＡ用量を受けた。（Ｃ）マウスは、０日目、および２１日目に、筋肉当たり５０μｌの１５０μＭ  Ｎａｐ中の５μｇの裸のＶＲ４７００プラスミドの両側での筋肉内注射を受けた。第２のセットのマウスは、示されたｐＤＮＡ：カチオン性脂質のモル比においてＶａｘｆｅｃｔｉｎとともに処方された同じｐＤＮＡ用量を受けた。第２のセットのマウスは、４：１のｐＤＮＡ：カチオン性脂質のモル比においてＶａｘｆｅｃｔｉｎとともに処方された同じｐＤＮＡ用量を受けた。全てのＣＴＬアッセイっを、最初の注射後４〜４．５ヵ月で実施した。線は、平均特異的溶解を示す（群当たりｎ＝４〜５匹のマウス）。
【図９】  図９は、筋肉内でのβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）発現に対するＶａｘｆｅｃｔｉｎの効果を示す。マウスは、β−ガラクトシダーゼをコードする５μｇの裸のＶＲ１４１２プラスミドの筋肉内注射を受けた。第２の群のマウスは、４：１のｐＤＮＡ：カチオン性脂質のモル比でＶａｘｆｅｃｔｉｎとともに処方された５μｇのＶＲ１４１２を注射された。示された時点において、四頭筋を収集し、そしてβ−Ｇａｌ活性についてアッセイした。線は、筋肉当たりの平均レポーター遺伝子発現±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す（群当たりｎ＝１０〜２０の筋肉）。
【図１０】  図１０は、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎが、ウサギにおいて体液性免疫応答を増強することを示す。インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）をコードするＶＲ４７００プラスミドＤＮＡのｉ．ｍ．注射後のウサギ血清における総ＩｇＧ抗体力価を示す。ニュージーランド白ウサギ（５〜６月齢）は、１５０μｇのＶＲ４７００プラスミド単独か、または３００μｌ  ＰＢＳ中の（ｐＤＮＡ：カチオン性脂質＝４：１モル比）とともに処方されたＶＲ４７００プラスミドの単一の片側の注射を受けた。動物の１つの群（三角）において、ｐＤＮＡおよびｐＤＮＡ−Ｖａｘｆｅｃｔｉｎの両方を、針およびシリンジを使用して注射した。ウサギの他の群（丸）において、ｐＤＮＡおよびｐＤＮＡ−Ｖａｘｆｅｃｔｉｎを、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ針無し注射デバイスを使用して、注射した。４２日目に（矢印）、ウサギを、対側性四頭筋に同一の追加免疫注射を与えた。抗ＮＰ力価を免疫化の前に、回収された血清サンプルから、３週目、６週目、７週目、９週目および１３週目に決定した。線は、平均抗ＮＰ力価＋Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す（群当たりｎ＝４匹のウサギ）。
【図１１】  図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄおよび１１Ｅは、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎが、５つの異なるｐＤＮＡコードモデル抗原に対して抗原特異性血清抗体応答を増強することを示す。ＢＡＬＡ／ｃマウスを、５μｇのｐＤＮＡ＋／−Ｖａｘｆｅｃｔｉｎの各大腿直筋への、０週間および３週間での注射により免疫化した。示されるデータは、３週目および６週目での追加免疫の前の１日に回収された血清に対する平均抗原特異的ＩｇＧ力価である（全ての群に対してｎ＝２０、裸のＮＰ  ｐＤＮＡに対してｎ＝１９；ＮＰ  ｐＤＮＡ／Ｖａｘｆｅｃｔｉｎに対してｎ＝３０であるＮＰ、および裸のｐＤＮＡに対するｎ＝１９であるマウスＩｄを除く）。Ａ）抗インフルエンザＮＰ  ＩｇＧ力価；Ｂ）抗インフルエンザＨＥＬ  ＩｇＧ力価；Ｃ）抗β−ｇａｌ  ＩｇＧ力価；Ｄ）抗マウスＩｄ  ＩｇＧ力価；Ｅ）抗第ＩＸ因子ＩｇＧ力価。*裸のｐＤＮＡを用いて得られた力価からの統計的に有意な差、ｐ≦０．０５。
【図１２】  図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、および１２Ｄは、サイトフェクチンとともに処方されたｐＤＮＡを用いる免疫化が、抗原誘導ペプチドでコーティングされた標的細胞の抗原特異的ＣＴＬ溶解を誘導することを示す。。ＢＡＬＡ／ｃマウスを、５μｇのｐＤＮＡ＋／−Ｖａｘｆｅｃｔｉｎの各大腿直筋への、０週目および３週目での注射により免疫化した。初期の免疫化に続いて、１１〜１２週目に脾臓を回収し、そして１μＭ  ＮＰ147-155またはβ−ｇａｌ876-884ペプチドおよび０．５Ｕ／ｍｏｌの組換えネズミＩＬ−２を用いて刺激した。示されたデータは、各群における５つの脾臓についての平均５％溶解である。同様な結果が、ＮＰおよびβ−ｇａｌ特異性ＣＴＬの両方についての第２のアッセイにおいて得られた。Ａ）ＮＰ147-155でパルス化されたＰ８１５標的細胞；Ｂ）パルス化されていないＰ８１５標的細胞；Ｃ）β−ｇａｌ876-884でパルス化されたＰ８１５標的細胞；Ｄ）パルス化されていないＰ８１５標的細胞。
【図１３】  図１３Ａおよび１３Ｂは、５つの異なるｐＤＮＡコードモデル抗原を用いて誘導された抗原特異的抗原Ｔｈ１型アイソタイププロフィールを示す。抗原特異的サブアイソタイプ血清力価は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ力価の合計のパーセンテージとして示されている（全ての群に対してｎ＝２０、裸のＮＰ  ｐＤＮＡに対してｎ＝２９；ＮＰ  ｐＤＮＡ／Ｖａｘｆｅｃｔｉｎに対してｎ＝３０であるＮＰ、および裸のｐＤＮＡに対するｎ＝１９であるマウスＩｄを除く）。Ａ）裸のｐＤＮＡ免疫化に続く６週目でのＩｇＧ１よおびＩｇＧ２ａの％；Ｂ）裸のｐＤＮＡ／Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ免疫化に続く６週目でのＩｇＧ１よおびＩｇＧ２ａの％。
【図１４】  図１４Ａおよび１４Ｂは、ｐＤＮＡ／Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ免疫化マウス由来の脾細胞のＹｈ１型サイトカイン分泌プロフィールを示す。脾臓を、最初の免疫化に続いて１１〜１２週目に収集し、５μｇ／ｍｌの精製ＮＰまたはβ−ｇａｌタンパク質で７２時間刺激した。培養上清中のＩＦＮ−γおよびＩＬ−４をＥＬＩＳＡによって決定した。示されたデータは、刺激されていない脾臓細胞（＋／−ＳＥＭ）の培養からのサイトカイン濃度を差し引いた、刺激された脾臓細胞の培養からのサイトカインの平均濃度である。Ａ）裸のｐＤＮＡおよびｐＤＮＡ／サイトカイン免疫化マウス由来の抗原特異的ＩＦＮ−γ応答（各群に対してｎ＝１０）。Ｂ）裸のｐＤＮＡおよびｐＤＮＡ／Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ免疫化マウス由来の抗原特異的ＩＬ−４応答（各群に対してｎ＝１０）。
【図１】
0004800485.tif 000006
【図２】
0004800485.tif 000007
【図３】
0004800485.tif 000008
【図４】
0004800485.tif 000009
【図５】
0004800485.tif 000010
【図６】
0004800485.tif 000011
【図７】
0004800485.tif 000012
【図８】
0004800485.tif 000013
【図９】
0004800485.tif 000014
【図１０】
0004800485.tif 000015
【図１１】
0004800485.tif 000016
【図１２】
0004800485.tif 000017
【図１３】
0004800485.tif 000018
【図１４】
0004800485.tif 000019