(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェロシアン化物イオン、フェリシアン化物イオン及びシアン化物イオンに対して分解能を示す微生物であって、フェロシアン化物イオンよりもフェリシアン化物イオンに対して高い分解能を示すアルカリゲネスsp.F4B4m株(受託番号FERMP-18376)。
【請求項２】
請求項１記載の微生物又はその無細胞抽出液を、シアン化合物を含む土壌、排水又は地下水に添加することを特徴とする土壌、排水又は地下水の処理方法。
【請求項３】
請求項１記載の微生物又はその無細胞抽出液を含む、土壌、排水又は地下水用の処理剤。
【請求項４】
請求項１記載の微生物又はその無細胞抽出液と２価の鉄イオン又はコバルトイオンを、シアン化合物を含む土壌、排水又は地下水に添加することを特徴とする土壌、排水又は地下水の処理方法。
【請求項５】
請求項１記載の微生物又はその無細胞抽出液と２価の鉄イオン又はコバルトイオンを含む、土壌、排水又は地下水用の処理剤。
【請求項６】
請求項１記載の微生物をフェロシアン化物イオン又はフェリシアン化物イオンを含む培地中で培養した後、この微生物又はその無細胞抽出液を、シアン化合物を含む土壌、排水又は地下水に添加することを特徴とする土壌、排水又は地下水の処理方法。
【請求項７】
フェロシアン化物イオン又はフェリシアン化物イオンを含む培地中で培養した請求項１記載の微生物又はその無細胞抽出液を含む、土壌、排水又は地下水用の処理剤。
【請求項８】
請求項１記載の微生物をアルミナと混合した後、超音波により破砕し、その破砕物の上清を、シアン化合物を含む土壌、排水又は地下水に添加することを特徴とする土壌、排水又は地下水の処理方法。
【請求項９】
アルミナと共に超音波処理された請求項１記載の微生物の破砕物の上清を含む、土壌、排水又は地下水用の処理剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フェリシアン化物イオンに対して高い分解能を示す微生物、並びにその微生物を用いた土壌、排水又は地下水の処理方法及び処理剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
シアン化合物は、反応性に富み、電気メッキ、写真、医薬、農薬、合成繊維やプラスチックの製造において大量に利用されている。また、製鉄及び石炭のガス化の工程などから排出される処理水中にも含まれている。シアン化合物は生物に対し阻害的に作用することから、環境中に排出されたシアン化合物は微生物等により速やかに分解除去されることが望まれる。シアン化合物は、環境中で遊離体又は金属錯体として存在するが、遊離シアンは、猛毒性を示すものの環境中に存在する微生物によって容易に分解除去される。その一方、金属シアノ錯体は、毒性は弱いものの生物的に分解されにくく、環境中に長期間残存するという問題がある。
【０００３】
微生物を用いて金属シアノ錯体を分解除去することについては既に幾つか報告がある。例えば、ロドコッカス（Rhodococcus）属の微生物（特開2000-270848号公報）、オクロバクトルム属（Ochrobactrum）の微生物（特開2000-270874号公報）、ストレプトマイセス（Streptomyces）属の微生物（特開2000-270853号公報）など用いてフェロシアン化物イオンを分解除去する方法が既に知られている。また、フザリウム・オキシウポルム（Fusarium oxysporum）を用いてニッケルシアノ錯体を分解除去する方法（特開平10-262651号公報）も既に知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
環境中には、上述のフェロシアン化物イオンやニッケルシアノ錯体のほかに、フェリシアン化物イオンなどの金属シアノ錯体も存在している。金属シアノ錯体によって汚染された環境を浄化し、無害化するためには、上述した微生物を利用するだけでは不十分であり、フェリシアン化物イオンを分解する微生物も必要である。しかし、現在までのところ、フェリシアン化物イオンを効率よく分解する微生物は知られていない。
【０００５】
本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、高いフェリシアン化物イオン分解能を示す微生物を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、フェロシアン化物イオン分解能を持つ微生物の中から、フェリシアン化物イオンに対しても高い分解能を示す突然変異体を見出し、この知見に基づき本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明の第一は、フェロシアン化物イオン、フェリシアン化物イオン及びシアン化物イオンに対して分解能を示す微生物であって、フェロシアン化物イオンよりもフェリシアン化物イオンに対して高い分解能を示すアルカリゲネス属に属する微生物である。
【０００８】
本発明の第二は、上記微生物又はその無細胞抽出液を、シアン化合物を含む土壌、排水又は地下水に添加することを特徴とする土壌、排水又は地下水の処理方法である。
【０００９】
本発明の第三は、上記微生物又はその無細胞抽出液を含む、土壌、排水又は地下水用の処理剤である。
【００１０】
本発明の第四は、上記微生物又はその無細胞抽出液と２価の鉄イオン又はコバルトイオンを、シアン化合物を含む土壌、排水又は地下水に添加することを特徴とする土壌、排水又は地下水の処理方法である。
【００１１】
本発明の第五は、上記微生物又はその無細胞抽出液と２価の鉄イオン又はコバルトイオン含む、土壌、排水又は地下水用の処理剤である。
【００１２】
本発明の第六は、上記微生物をフェロシアン化物イオン又はフェリシアン化物イオンを含む培地中で培養した後、この微生物又はその無細胞抽出液を、シアン化合物を含む土壌、排水又は地下水に添加することを特徴とする土壌、排水又は地下水の処理方法である。
【００１３】
本発明の第七は、フェロシアン化物イオン又はフェリシアン化物イオンを含む培地中で培養した上記微生物又はその無細胞抽出液を含む、土壌、排水又は地下水用の処理剤である。
【００１４】
本発明の第八は、上記微生物をアルミナと混合した後、超音波により破砕し、その破砕物の上清を、シアン化合物を含む土壌、排水又は地下水に添加することを特徴とする土壌、排水又は地下水の処理方法である。
【００１５】
本発明の第九は、アルミナと共に超音波処理された上記微生物の破砕物の上清を含む、土壌、排水又は地下水用の処理剤である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明の微生物は、以下の（１）及び（２）の性質を有するアルカリゲネス属に属する微生物である。
（１）フェロシアン化物イオン、フェリシアン化物イオン及びシアン化物イオンに対して分解能を示す。
（２）フェロシアン化物イオンよりもフェリシアン化物イオンに対して高い分解能を示す。
【００１８】
本発明の微生物は、上記（１）及び（２）の性質を有するものであればどのようなものでもよいが、以下の（３）〜（６）の性質の少なくとも一つの性質を有するものが好ましく、少なくとも二つの性質を有するものが更に好ましく、すべての性質を有するものが最も好ましい。
（３）鉄以外の金属シアノ錯体（例えば、ニッケルシアノ錯体）に対して分解能を示す。
（４）有機シアン化合物（例えば、NC(CH2)2CN）に対して分解能を示す。
（５）２価の鉄イオン又はコバルトイオンにより、フェロシアン化物イオンに対する分解能が向上する。
（６）フェロシアン化物イオン又はフェリシアン化物イオンを含む培地中で培養することにより、シアン化物イオンに対する分解能が向上する。
【００１９】
本発明の微生物に含まれる菌株としては、F4B4m株を例示することができる。F4B4m株は、F4B4株の突然変異株であり、この菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P-18376として寄託されている（寄託日：平成13年6月13日）。F4B4m株の親株であるF4B4株は、参考例１に示すように、アルカリゲネス（Alcaligenes）属に属するので、F4B4m株もアルカリゲネス属に属すると考えられる。
【００２０】
本発明の微生物には、F4B4m株の他、この菌株の自然又は人工変異株も含まれる。このような変異株は、（１）フェロシアン化物イオン、フェリシアン化物イオン及びシアン化物イオンに対して分解能を示し、（２）フェロシアン化物イオンよりもフェリシアン化物イオンに対して高い分解能を示すものであれば特に限定されないが、以下の（３）〜（６）の性質の少なくとも一つの性質を有するものが好ましく、少なくとも二つの性質を有するものが更に好ましく、すべての性質を有するものが最も好ましい。
（３）鉄以外の金属シアノ錯体（例えば、ニッケルシアノ錯体）に対して分解能を示す。
（４）有機シアン化合物（例えば、NC(CH2)2CN）に対して分解能を示す。
（５）２価の鉄イオン又はコバルトイオンにより、フェロシアン化物イオンに対する分解能が向上する。
（６）フェロシアン化物イオン又はフェリシアン化物イオンを含む培地中で培養することにより、シアン化物イオンに対する分解能が向上する。
【００２１】
本発明の微生物は、アルカリゲネス属に属する一般的な微生物と同様の方法で増殖させることができる。培養は、好気的条件で行うことが好ましく、無機塩、窒素源、その他栄養源を含む無機栄養培地、有機栄養培地等に本発明の微生物を接種し、例えば、振盪培養法、通気攪拌培養法などにより培養を行う。
【００２２】
上記培養における温度条件は、最適生育温度の範囲（20〜40℃）に設定することができる。培地のpHは6.0〜8.0の範囲に設定すればよい。無機塩として培地に添加する物質としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、アンモニウム塩、その他微量金属塩が挙げられる。また、窒素源としては、例えば、フェロシアン化カリウム３水和物、フェリシアン化カリウムやテトラシアノニッケルカリウム等の金属シアノ錯体をはじめとするシアン化合物が挙げられる。これらの窒素源は１種でもよく、２種以上適宜組み合わせて用いてもよい。さらに、本発明の微生物の増殖を促進するための栄養源として、グルコース、エタノール、グリセロール、酵母エキス、牛肉エキス、ペプトンなどを適量添加することもできる。培養時間は、6〜50日間、好ましくは10日間以上である。
【００２３】
本発明の微生物は、（Ａ）土壌、排水又は地下水の処理方法、（Ｂ）土壌、排水又は地下水の処理剤に利用することができる。以下、これらについて説明する。
（Ａ）土壌、排水又は地下水の処理方法
本発明の微生物をシアン化合物を含む土壌、排水又は地下水（以下、単に「土壌等」という場合がある）に添加することにより、土壌等に含まれるシアン化合物を分解除去することが可能である。
【００２４】
本発明の微生物を添加する土壌等としては、例えば、めっき工場、選鉱精錬所、鉄鋼熱処理工場、コークス製造工場などの周辺土壌、その土壌中に含まれる地下水、これらの工場から排出される排水などを挙げることができるが、シアン化合物を含むものであればどのようなものであってもよい。本発明の微生物はフェリシアン化物イオンに対する分解能が高いので、このイオンを含む土壌等に添加するのがより好ましい。
【００２５】
本発明の微生物の土壌等への添加は、土壌等へ直接散布するか、又は土壌等を回収し、その土壌等に本発明の微生物を混合した後、元に戻すなどの方法によって行うことができる。土壌等への添加量は、含まれるシアン化合物の量や種類等によって異なるが、鉄シアノ錯体の場合は、150〜300mg/Lの鉄シアノ錯体濃度あたり107個以上が好ましく、108〜109個が更に好ましい。なお、排水又は地下水の温度は10〜30℃であることが好ましい。
【００２６】
本発明の微生物を土壌等へ添加する際、微生物のシアン化合物に対する分解能が向上されるような物質を添加してもよい。そのような物質としては、例えば、２価の鉄イオン、コバルトイオンなどを例示することができる。また、本発明の微生物のシアン化合物に対する分解能を向上させるような処理をした後に、微生物を土壌等に添加してもよい。このような処理としては、土壌等に添加する前に、微生物をフェロシアン化物イオン、フェリシアン化物イオンを存在する培地中で培養するといった処理を挙げることができる。
【００２７】
添加する微生物は、通常、菌体自体を使用するが、菌体の代わりに無細胞抽出液を用いてもよい。無細胞抽出液は、通常の方法に従い、菌体を破砕し、その上清を分離することにより調製できる。菌体の破砕手段としては、超音波、フレンチプレス、アルミナによる磨砕を例示することができるが、菌体をアルミナと混合し、超音波処理することが好ましい。
（Ｂ）土壌、排水又は地下水の処理剤
本発明の微生物は、土壌、排水又は地下水の処理剤として使用することができる。本発明の処理剤は、本発明の微生物をそのまま、あるいは適当な液体又は固体の担体と組み合わせて使用することができる。
【００２８】
製剤に使用する液体担体としては、例えば、水が挙げられる。この場合は、純水又は無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム等）、糖（グルコース、ショ糖等）若しくは有機資材（牛肉エキス、酵母エキス等）の水溶液を用いることができる。
【００２９】
また、製剤に使用する固体担体としては、例えば、カオリン、粘土、タルク、チョーク、石英、アタパルジャイト、モンモリロナイト、珪藻土等の天然鉱物粉末、ケイ酸、アルミナ、ケイ酸塩等の合成鉱物粉末、高分子性天然物（結晶性セルロース、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等）、ウレタン等が挙げられ、これらの１種又は２種以上を混合して使用することができる。
【００３０】
本発明の微生物を混合する担体の量は、微生物1,000個あたり粉末で200〜2000mg、水和剤では1〜10g、ゲルビーズでは10〜20gであるが、使用目的によって適宜変更してもよい、
本発明の処理剤には、微生物のシアン化合物に対する分解能が向上されるような物質を混合してもよい。そのような物質としては、例えば、２価の鉄イオン、コバルトイオンなどを例示することができる。また、処理剤中の微生物に適当な処理を施し、シアン化合物に対する分解能を向上させてもよい。このような処理としては、微生物をフェロシアン化物イオン、フェリシアン化物イオンが存在する培地中で培養するといった処理を挙げることができる。
【００３１】
処理剤中の微生物は、通常、菌体自体を使用するが、菌体の代わりに無細胞抽出液を用いてもよい。無細胞抽出液は、通常の方法に従い、菌体を破砕し、その上清を分離することにより調製できる。菌体の破砕手段としては、超音波、フレンチプレス、アルミナによる磨砕を例示することができるが、菌体をアルミナと混合し、超音波処理することが好ましい。
【００３２】
本発明の処理剤は、散布剤、注入剤等を用いて、シアン化合物を含有する土壌等に直接投与することができる。
【００３３】
以上の通り、本発明の微生物は、例えば、鉄シアノ錯体であるフェロシアン化カリウム、フェリシアン化カリウムなどを含んだ培地中で、該シアン化合物を窒素源として生育し、該シアン化合物を迅速に分解する能力を発揮する。従って、安定な化合物である金属シアノ錯体を含んだ排水又は地下水処理にも安価で環境負荷の小さい生物処理を適用できる。また、本発明の微生物は、シアン汚染土壌中に多く含まれる鉄シアノ錯体を分解できる菌であることから、シアン汚染土壌の処理にも対応可能な菌である。
【００３４】
【実施例】
〔実施例１〕
BM液体培地（表１）に、K3[Fe(CN)6]を濃度が0.2%になるように添加し、K3[Fe(CN)6]を唯一の窒素源とする培地を作製した。この培地にF4B4株（FERM P-17742）を植菌して、培養を行い、生育に違いが認められた培養液を、同組成の平板培地に塗布してコロニーを形成させた。形成したコロニーのうちから、大きなコロニーを選び、培養を繰り返すことにより、最終的に、K3[Fe(CN)6]を窒素源として生育する自然突然変異株、F4B4m株を単離した。
【００３５】
【表１】
0004626930.tif 000002
【００３６】
【表２】
0004626930.tif 000003
〔実施例２〕
BM液体培地に、種々の窒素化合物を濃度が0.2％になるように添加し、各培地にF4B4株又はF4B4m株を植菌した。30℃で、１週間振盪培養を行った後、培養液の吸光度（610nm）を測定し、増殖状態を評価した。この結果を表３に示す。
【００３７】
【表３】
0004626930.tif 000004
表に示すように、F4B4株は、K3[Fe(CN)6]よりもK4[Fe(CN)6]を添加した培地で良好に増殖したのに対し、F4B4m株はK4[Fe(CN)6]よりもK3[Fe(CN)6]を添加した培地で良好に増殖した。
〔実施例３〕
BM液体培地に、K4[Fe(CN)6]又はK3[Fe(CN)6]を濃度が1mMになるように添加し、各培地にF4B4株又はF4B4m株を植菌した。30℃で振盪培養を行い、培養開始時、１週間後、及び２週間後の鉄シアノ錯体の濃度を測定した。鉄シアノ錯体濃度の測定は、JIS法に従って行った。即ち、リン酸酸性条件下でサンプルを加熱蒸留した後、鉄シアノ錯体をアルカリ溶液中に回収し、これをピリジン・ピラゾン法で比色定量した。この結果を図１に示す。
【００３８】
図に示すように、F4B4株を植菌した場合は、K4[Fe(CN)6]濃度のみが減少したが、F4B4m株を植菌した場合は、K4[Fe(CN)6]濃度、K3[Fe(CN)6]濃度のいずれも減少した。
〔実施例４〕
BM液体培地に、K4[Fe(CN)6]又はK3[Fe(CN)6]を濃度が1mMになるように添加し、各培地にF4B4株又はF4B4m株を植菌した。30℃で振盪培養を行い、培養液の吸光度（610nm）を測定し、増殖の状態を評価した。この結果を図２に示す。
【００３９】
図に示すように、F4B4株は、K3[Fe(CN)6]よりもK4[Fe(CN)6]を添加した培地で良好に増殖したのに対し、F4B4m株はK4[Fe(CN)6]よりもK3[Fe(CN)6]を添加した培地で良好に増殖した。
〔実施例５〕
以下の（１）〜（６）の培地にF4B4m株を植菌し、30℃で振盪培養を行った。
（１）基本BM液体培地（表４）に、Vitamin solution II（表２）、Metal solution II（表５）、1.0m% MgSO4・7H2O、1.0m% FeCl3・6H2Oを添加した培地（図３及び図４中「All+」と記載）
（２）基本BM液体培地に、Vitamin solution II、Metal solution IIを添加した培地（図３及び図４中「Ms-」と記載）
（３）基本BM液体培地に、Metal solution IIを添加した培地（図３及び図４中「MII+」と記載）
（４）基本BM液体培地に、1.0m% MgSO4・7H2O、1.0m% FeCl3・6H2Oを添加した培地（図３及び図４中「Ms+」と記載）
（５）基本BM液体培地に、Vitamin solution IIを添加した培地（図３及び図４中「V+」と記載）
（６）基本BM液体培地（図３及び図４中「No」と記載）
培養液の吸光度（610nm）及び培地中のK4[Fe(CN)6]濃度を経時的に測定し、増殖状態及びK4[Fe(CN)6]に対する分解能を評価した。
【００４０】
吸光度の測定結果を図３に、K4[Fe(CN)6]濃度の測定結果を図４に、それぞれ示す。
【００４１】
図３及び図４に示すように、培地中に金属塩が含まれない場合（No及びV+）には、F4B4m株は増殖せず、また、K4[Fe(CN)6]もほとんど分解されなかった。従って、F4B4m株の増殖及び金属シアノ錯体の分解には、金属塩が必須であることが明らかになった。
【００４２】
【表４】
0004626930.tif 000005
【００４３】
【表５】
0004626930.tif 000006
〔実施例６〕
以下の（１）〜（３）の培地にF4B4m株を植菌し、30℃で振盪培養を行った。
（１）基本BM液体培地（表４）にFe2+＋Co2+を添加した培地
（２）基本BM液体培地に、Fe2+を添加した培地
（３）基本BM液体培地に、Co2+を添加した培地
培養液の吸光度（610nm）及び培地中のK4[Fe(CN)6]濃度を経時的に測定し、増殖状態及びK4[Fe(CN)6]に対する分解能を評価した。また、対照としてF4B4m株を植菌しない場合の培養液の吸光度も測定した（図５中「N.C.(Fe2+＋Co2+)」、「N.C.(Fe2+のみ)」、「N.C.(Co2+のみ)」と記載）。
【００４４】
吸光度の測定結果を図５に、K4[Fe(CN)6]濃度の測定結果を図６に、それぞれ示す。
【００４５】
これらの図に示すように、Fe2+、又はCo2+のいずれか一方が培地に含まれていれば、F4B4m株は増殖し、K4[Fe(CN)6]を分解できることが明らかになった。
〔実施例７〕
BM液体培地（表1）に、種々の窒素源を濃度が0.2%になるように添加し、各培地にF4B4m株を植菌した。30℃で2週間培養を行った後、遠心分離（6,000 rpm、15分）により菌体を回収した。菌体を50mM KPB(pH 7)で洗浄した後、50mM KPB(pH 7)に懸濁した。この菌体懸濁液を含む菌体反応液（菌体懸濁液 2.0ml、500mM KPB(pH 7.5) 0.8ml、20mM KCN 0.4ml、蒸留水 2.0ml）を調製し、反応液中のKCN濃度を経時的に測定し、菌体のKCNに対する分解能を評価した。また、KCNの代謝産物であるHCOOH及びNH3の濃度も併せて測定した。この結果を図７及び図８に示す。
【００４６】
これらの図に示すように、K4[Fe(CN)6]又はK3[Fe(CN)6]を含む培地で培養した菌体は、高いKCN分解能を示した。一方、NH4Clを含む培地で培養した菌体はほとんどKCNを分解しなかった。
【００４７】
K4[Fe(CN)6]又はK3[Fe(CN)6]によるKCN分解能の誘導を更に詳細に検討するため、K4[Fe(CN)6]、K3[Fe(CN)6]、K2[Ni(CN)6]を用いて上記と同様にKCNに対する分解能を評価した。この結果を図９に示す。
【００４８】
この図に示すように、K3[Fe(CN)6]がKCN分解能誘導効果が最も高かった。
〔実施例８〕
10mMのK4[Fe(CN)6]、10mMのK2[Ni(CN)4]それぞれを唯一の窒素源として含むBM液体培地（表1）にF4B4m株を植菌し、30℃で２週間振盪培養を行った。培養終了後、菌体を超音波により破砕し、その上清を採取した。この上清を無細胞抽出液とし、以下の実験に供した。
【００４９】
無細胞抽出液を含むK4[Fe(CN)6]反応液（無細胞抽出液 0.5ml、500mM KPB(pH 7.0) 0.2ml、20mM K4[Fe(CN)6] 0.1ml、蒸留水 0.2ml）及びK2[Ni(CN)4]反応液（無細胞抽出液 0.5ml、500mM KPB(pH 7.0) 0.2ml、50mM K2[Ni(CN)4] 0.1ml、蒸留水 0.2ml）を調製し、各反応液中のK4[Fe(CN)6]又はK2[Ni(CN)4]濃度及びアンモニア濃度を経時的に測定した。なお、対照として、無細胞抽出液を加えないK4[Fe(CN)6]反応液及びK2[Ni(CN)4]反応液のK4[Fe(CN)6]濃度及びK2[Ni(CN)4]濃度も併せて測定した。この結果を図１０に示す。
【００５０】
この図に示すように、無細胞抽出液は、K4[Fe(CN)6]あるいはK2[Ni(CN)4]を分解し、NH3を遊離した。しかし、その分解速度は休止菌体に比較して明らかに遅かった。
〔実施例９〕
F4B4m株の休止菌体を超音波破砕機で30分間処理し、その破砕物を遠心処理し（5,000rpm、5分、4℃）、上清と沈殿に分離した。ここで得られた沈殿を細胞画分（図１１中「+Cell」と記載）とした。上清については更に遠心処理（10,000rpm、20分、4℃）し、得られた沈殿を細胞膜画分（図１１中「+Membrane fraction」と記載）とし、上清（図１１中「+C.F.E.」と記載）を細胞質画分とした。
【００５１】
細胞画分、細胞膜画分、細胞質画分0.2mlをそれぞれKCNを含む反応液（500mM KPB(pH 7.0) 0.08ml、20mM KCN 0.04ml、蒸留水 0.08ml）に添加し、反応液中のKCN濃度を経時的に測定した。また、細胞質画分については反応液中のNH3濃度も併せて測定した。更に、対照として、いずれの画分も添加しない反応液（図１１中「‐C.F.E.」と記載）、KCNを添加しない反応液（図１１中の「-KCN」と記載）のKCN濃度及びNH3濃度の経時的変化も測定した。以上の結果を図１１に示す。
【００５２】
この図に示すように、細胞質画分を添加した場合のみKCN濃度が減少し、NH3濃度が上昇した。このことから、細胞質画分中にKCN分解に関与する酵素が存在するものと考えられる。
〔実施例１０〕
以下の４通りの方法によって調製した無細胞抽出液0.2mlをそれぞれKCNを含む反応液（500mM KPB(pH 7.0) 0.08ml、20mM KCN 0.04ml、蒸留水 0.08ml）に加え、その後の溶液中のKCN濃度、及びKCNの代謝物（NH3及びHCOOH）濃度を経時的に測定した。
（１）通常の超音波破砕：
K4[Fe(CN)6]生育湿菌体1.07 gを100 mM KPB（pH 7） 10 mlに溶解し、これを氷冷しながら超音波破砕器で30分間破砕し、無細胞抽出液を調製した。蛋白量は、3.21（mg/ml）であった。
（２）アルミナを用いて超音波破砕：
K4[Fe(CN)6]生育湿菌体2.02 gに2 gのアルミナと100 mM KPB（pH 7） 4 mlを加えて、氷冷しながら超音波破砕器で30分間破砕し、無細胞抽出液を調製した。
蛋白量は、10.2（mg/ml）であった。
（３）フレンチプレス：
K4[Fe(CN)6]生育湿菌体1.20 gを100 mM KPB（pH 7） 10 mlに溶解し、手動式油圧フレンチ・プレス（大岳製作所）を用いて、1500 kgf/cm2の圧力一定で破砕した。これを2回行った破砕菌体より、無細胞抽出液を調製した。蛋白量は、0.93（mg/ml）であった。
（４）アルミナ摩砕：
K4[Fe(CN)6]生育湿菌体1.08 gに1 gのアルミナと2 mlの緩衝液を加えて、氷冷した乳鉢中で30分間磨砕し、無細胞抽出液を調製した。蛋白量は、4.47（mg/ml）であった。
【００５３】
以上の結果を図１２及び図１３に示す。この図に示すように、通常の超音波処理により得られた無細胞抽出液は、3時間の反応で0.19 mMのKCNを分解し、アンモニアとギ酸を生成した。アルミナを添加した超音波破砕処理では、3時間後に0.4 mMのKCNを分解した。フレンチプレスでは、0.21 mMのKCNを、また、アルミナ摩砕法では0.26 mMの分解が認められた。以上の結果から、F4B4m株の無細胞抽出液の調製には、超音波破砕にアルミナを補填して処理を行うことにより、高い抽出効率が得られることを明らかとなった。
〔参考例１〕
F4B4株の菌学的性質を調べた。結果を下表に示す。
【００５４】
【表６】
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以上の諸性質をP.R.Murray et al., Mannual of clinical Microbial 6thed., ASM Press, 1995及びE.Yabuuch et al., Microbial. Immunol., 36, 1251-1275, 1992に基づいて検索したところ、分離株F4B4株は鞭毛の着生状況が周毛であることからアルカリゲネス属に属する菌群と考えられ、生理的性状試験からは、アルカリゲネス・フェカーリス(Alcaligenes faecalis)、アルカリゲネス・デニトリフィカンス（Alcaligenes denitrificans）、CDC gr.IV C-2などが示唆されるが、MacConkey寒天での生育陽性、炭水化物の利用性陰性、TSI寒天で硫化水素非産生であることからCDC gr.IV C-2が最も近縁な菌群と考えられる。
【００５５】
【発明の効果】
本発明は、シアン化合物分解微生物、並びにそれを用いた土壌、排水又は地下水の処理方法及び処理剤を提供する。本発明の微生物等を利用することにより、シアン化合物、特にフェリシアン化物イオンを効率的に分解、除去することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  F4B4株及びF4B4m株の鉄シアノ錯体に対する分解能を示す図である。
【図２】  F4B4株及びF4B4m株の鉄シアノ錯体存在下での増殖状態を示す図である。
【図３】培地成分とF4B4m株の増殖との関係を示す図である。
【図４】培地成分とF4B4m株のフェロシアン化カリウムに対する分解能との関係を示す図である。
【図５】金属塩とF4B4m株の増殖との関係を示す図である。
【図６】金属塩とF4B4m株のフェロシアン化カリウムに対する分解能との関係を示す図である。
【図７】前培養時に添加した窒素化合物とF4B4m株のシアン化カリウムに対する分解能との関係を示す図である（１）。
【図８】前培養時に添加した窒素化合物とF4B4m株のシアン化カリウムに対する分解能との関係を示す図である（２）。
【図９】前培養時に添加した金属シアノ錯体とF4B4m株のシアン化カリウムに対する分解能との関係を示す図である。
【図１０】  F4B4m株の無細胞抽出液の金属シアノ錯体に対する分解能を示す図である。
【図１１】  F4B4m株の破砕物の画分とシアン化カリウムに対する分解能との関係を示す図である。
【図１２】  F4B4m株の破砕条件とシアン化カリウムに対する分解能との関係を示す図である（１）。
【図１３】  F4B4m株の破砕条件とシアン化カリウムに対する分解能との関係を示す図である（２）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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