(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８からなる単離されたペプチド組成物。
【請求項２】
医薬上許容される担体中に請求項１に記載のペプチドおよび医薬上許容される賦形剤を含む網膜血管新生を抑制するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般に、哺乳類細胞接着分子のアンタゴニストに関する。より詳しくは、本発明は、哺乳類Ｒ−カドヘリン（カドヘリン‐４）の選択的ペプチドアンタゴニスト、ならびに細胞接着およびそれによる網膜血管新生の抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カドヘリンファミリーの分子は、カルシウム依存的な選択的細胞−細胞相互作用において機能する膜貫通糖タンパク質よりなる。これらの分子は、細胞認識および細胞選別を媒介することにより、胚発生および組織形態形成中に重要な役割を果たす。カドヘリンのサブファミリー（古典的カドヘリン、プロトカドヘリン、デスモコリンおよび他のカドヘリン関連タンパク質）は、種々の数の細胞外カドヘリンドメイン、単一の膜貫通部分および単一の細胞質ドメインにより特徴づけられる。いわゆる古典的カドヘリン（すなわち、Ｅ、Ｐ、ＮおよびＲ−カドヘリン）は、主として同種親和性相互作用に関与する５つの縦列反復細胞外カドヘリンドメイン（ＥＣ１〜ＥＣ５）、および接着特異的細胞内シグナリングを媒介する高度に保存された細胞質尾部を有すると報告されている。
【０００３】
カドヘリンにより媒介される細胞‐細胞接着は、隣接細胞上で発現された複数のカドヘリン分子が相互作用して接着結合の形成を引き起こした場合に生じる。Ｓｈａｐｉｒｏら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９５；３７４（６５２０）：３２７−３７に提示されているカドヘリンジッパーモデルによると、同一細胞の膜内のカドヘリン分子が、密着した平行鎖二量体（すなわち、いわゆるシス二量体）を形成する。図１に示されているとおり、ついでこれらのシス二量体は、隣接細胞上で発現されたカドヘリン二量体に結合する（すなわち、トランス二量体化）。十分な相互作用が維持されたら、より多数のカドヘリン分子がその部位へ呼び寄せられて二細胞表面からの分子のかみ合せを引き起こした際に、カドヘリンの塊化が生じうる。このようにして、比較的弱い相互作用が組合されて、非常に強力な細胞−細胞接着を形成しうる。
【０００４】
初期カドヘリン接着の際に、細胞質カドヘリン尾部とαおよびβカテニン分子との相互作用を介して伝達された細胞内シグナルが細胞骨格の再組織化を引き起こす。アクチンフィラメントとの会合が同種親和性結合に影響を及ぼすとは考えられないが、それらの会合は相互作用部位におけるカドヘリン分子の保持を助ける。共生型の関係においては、カドヘリンの塊化は細胞骨格の再組織化を引き起こし、膜における結合点を与え、これは、接着結合の形成に際して生じる細胞変化に重要である。一方、細胞骨格との会合は相互作用の部位にカドヘリンを保持し、新たなカドヘリン分子の呼び寄せを助けて、カドヘリンの塊化を媒介する。カルシウムはカドヘリンの塊化中に補因子として重要な役割を果たす。不十分な濃度（すなわち、約２ｍＭ未満）のカルシウムイオンを含有する溶液中では、カドヘリンの機能は失われ、分子はプロテアーゼ分解をより受けやすくなる。これは、カドヘリン分子の構造を安定化し隣接カドヘリン境界の適切な配向を得るためにはカルシウムが要求されることによるものである。
【０００５】
５つの細胞外古典的カドヘリンドメインＥＣ１〜ＥＣ５のそれぞれはカドヘリンの二量体化の媒介において重要な役割を果たすと報告されているが、突然変異解析は、二量体化界面を形成している残基の大多数が、最もＮ末端側のカドヘリンドメイン（ＥＣ１）内に見出されることを示唆している（Ｋｉｔａｇａｗａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０００；２７１（２）：３５８−６３）。しかし、カドヘリン分子間の特異的ホモ二量体化に関してはほとんど知られていない。
【０００６】
カドヘリンは中枢神経系の発生および神経誘導中に重要な役割を果たす。脳の種々の細分化はカドヘリン型の差次的発現により特徴づけられると報告されている。カドヘリンは、異なる発生中網膜領域における特異的発現により、神経網膜の発生においても重要な役割を果たす。例えば、胚ニワトリ網膜発生中は、Ｂ−カドヘリンはミュラー膠細胞でしか見出されず、双極細胞の或る集団はＲ−カドヘリン（カドヘリン−４としても公知である）を発現することが報告されている。アマクリン細胞、および神経節細胞のサブセットは、カドヘリン６Ｂおよび７を発現する。網膜の内網状層内では、これらの同じカドヘリンは、シナプシンＩ陽性神経終末に結合した亜板（ｓｕｂｌａｍｉｎａｅ）でしか発現されず、このことは、異なる発現プロフィールが網膜発生中のニューロンの特異的亜集団間のシナプス形成に寄与していることを示唆している。胚視神経においては、神経節細胞軸索成長は、Ｒ−カドヘリンを発現するグリア細胞とのＮ−カドヘリン接着により媒介される。
【０００７】
カドヘリン接着は発生網膜血管新生においても何らかの役割を果たしている（Ｄｏｒｒｅｌｌら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．２００２；４３（１１）：３５００−１０）。表層血管叢の形成中のＲ−カドヘリン接着の破壊は、正常な血管パターン形成中に観察される複雑な血管相互接続の喪失を招く。後続の深部血管層の形成中にＲ−カドヘリン接着が阻止されると、重要な誘発合図が失われて、正常な深部血管叢を越えて光受容体層内に血管が遊走する。
【０００８】
網膜は、ニューロン要素、グリア要素および血管要素の良く特徴づけられた層よりなる。網膜層を少しでも変化させる任意の疾患または状態は神経変性および有意な視力障害を招きうる。網膜変性マウス（ｒｄ／ｒｄマウス）は、光受容体細胞死を招く多数の疾患に関するモデルとして、７０年以上研究されている。ｒｄ／ｒｄマウスにおいては、光受容体変性が生後の最初の３週間のうちに開始し、杆体細胞が、ｃＧＭＰ依存性ホスホジエステラーゼのβサブユニット内の突然変異によると考えられるアポトーシスを受け、ついで錐体光受容体の死が生じる。ｒｄ／ｒｄマウスにおいては、網膜内の血管萎縮も光受容体細胞死に一時的に付随する。最初の３週間以内に３つの機能層が発生しているため、血管系は、正常な典型的様態で形成しているかに思われる。しかし、第２週に深部血管層内の血管が変性し始め、生後４週までに、劇的な血管の減少が観察され、このとき、深部および中間部層はほぼ完全に消失する。
【０００９】
造血幹細胞の集団は、正常な成体の循環および骨髄に存在し、これらから、異なる細胞亜集団が、系統（ｌｉｎｅａｇｅ）陽性（Ｌｉｎ＋ＨＳＣ）または系統陰性（Ｌｉｎ−ＨＳＣ）系統に沿って分化しうる。また、本発明者らは、インビトロおよびインビボで血管を形成しうる内皮前駆細胞（ＥＰＣ）がＬｉｎ−ＨＳＣ亜集団内に存在することを見出した。Ｌｉｎ−ＨＳＣの集団内のＥＰＣは、ｒｄ／ｒｄマウスにおいて、該マウスの眼に硝子体内注射されると、変性しつつある血管に指向し安定化しうる。硝子体内に注射されたＬｉｎ−ＨＳＣは表層血管層内の星状細胞に指向し、生後２日（Ｐ２）に注射された場合には、内因性の発生中の血管網状組織の前に観察される。Ｌｉｎ−ＨＳＣが目指した網膜の周辺部に内因性血管系が到達すると、該細胞が新たな血管内に取り込まれて、注射されたＬｉｎ−ＨＳＣと内因性内皮細胞との混合集団による機能的モザイク血管を形成する。また、Ｌｉｎ−ＨＳＣは網膜の深部および中間部血管層の領域を、内因性内皮細胞によるこれらの層の血管新生が生じる前に、指向する。Ｌｉｎ−ＨＳＣの取り込みは、ｒｄ／ｒｄマウスの深部血管新生を、Ｌｉｎ＋ＨＳＣが注射された正常対照マウスと比べて約２〜約３倍レスキューする。また、深部血管系のレスキューは網膜の外顆粒層内の光受容体の分解を妨げる。しかし、これらの幹細胞が網膜ニューロンまたはグリア細胞への分化を受けうることを示唆する証拠が無いため、ニューロン保護のメカニズムは未知のままである。
【００１０】
自然発生血管新生の前の星状細胞および深部血管領域へのＬｉｎ−ＨＳＣの指向は、発生中の内因性内皮細胞の指向と同様に、指向において機能する細胞表面分子をＬｉｎ−ＨＳＣが発現することを示唆している。Ｒ−カドヘリン接着は、発生網膜血管新生中の星状細胞および血管叢への内皮細胞指向において重要な役割を果たしている。
【００１１】
Ｒ−カドヘリンは多数の哺乳動物において同定されており、配列決定されている。図２は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースにおいてアクセッション番号ＮＰ  ００１７８５，バージョンＮＰ  ００１７８５．２、ＧＩ：１４５８９８９３としてＫｉｔａｇａｗａら（その関連開示を参照により本明細書に組み入れることとする）により報告されているＲ−カドヘリンプレプロタンパク質のヒト変異体のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。配列番号１は２２２−２２８位にアミノ酸配列ＩＤＳＭＳＧＲ（配列番号２）を含む。
【００１２】
図３は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースにおいてアクセッション番号Ｐ５５２８３、バージョンＰ５５２８３、ＧＩ：１７０５５４２としてＴａｎｉｈａｒａら（その関連開示を参照により本明細書に組み入れることとする）により報告されているＲ−カドヘリンプレプロタンパク質のもう１つのヒト変異体のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。配列番号３は２２２−２２８位にアミノ酸配列ＩＮＳＭＳＧＲ（配列番号４）を含む。
【００１３】
図４は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースにおいてアクセッション番号ＮＰ  ０３３９９７、バージョンＮＰ  ０３３９９７．１、ＧＩ：６７５３３７６としてＨｕｔｔｏｎら（その関連開示を参照により本明細書に組み入れることとする）により報告されているＲ−カドヘリンプレプロタンパク質のもう１つのマウス（ムス・ムスキュルス（ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））変異体のアミノ酸配列（配列番号５）を示す。配列番号５は２１９−２２５位にアミノ酸配列ＩＤＳＭＳＧＲ（配列番号２）を含む。
【００１４】
アミノ酸配列Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ（ＨＡＶ）を含むカドヘリンの非選択的ペプチドアンタゴニストがＢｌａｓｃｈｕｋらにより米国特許第６，４６５，４２７、第６，３４５６，５１２号、第６，１６９，０７１号および第６，０３１，０７２号に報告されている。Ｂｌａｓｃｈｕｋらは、カドヘリンの直鎖状および環状の両方のペプチドアンタゴニストを報告しており、それらはすべて、多数のタイプのカドヘリン分子に無差別に拮抗しうる。
【００１５】
アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ（ＩＮＰ）を含むＮ−カドヘリンの選択的ペプチドアンタゴニストがＷｉｌｌｉａｍｓら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０００；１５（５）：４５６−６４に報告されている。ＨＡＶペプチドは非特異的カドヘリンアンタゴニストであるが、Ｗｉｌｌｉａｍｓらにより報告されているＩＮＰペプチドアンタゴニストはＮ−カドヘリンに特異的であり、Ｒ−カドヘリンのような他のカドヘリン分子に対する有意な結合を示さない。
【００１６】
細胞接着分子は体内の種々の組織に差別的に分布しているため、特異的細胞接着分子に対して高選択的であるアンタゴニスト、特に、Ｒ−カドヘリンに対して選択的であるアンタゴニストが、依然として必要とされている。本発明の選択的Ｒ−カドヘリンアンタゴニストペプチドはこの要求を満たすものである。
【発明の開示】
【００１７】
発明の概要
哺乳類Ｒ−カドヘリンの選択的アンタゴニストとして有用な単離されたペプチドは３〜３０アミノ酸残基を含み、該ペプチドの３個の連続した残基は、アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｓｅｒ（ＩＸＳ）を有し、ここで、Ｘａａは、Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎよりなる群から選ばれるアミノ酸残基である。好ましくは、ＸａａはＡｓｐまたはＡｓｎである。１つの好ましい実施形態においては、該ペプチドは少なくとも７個のアミノ酸残基を含み、該ペプチドの７個の連続したアミノ酸残基は、アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号６）を有し、ここで、Ｘａａは前記と同意義を有する。本発明はまた、医薬上許容される担体中にＲ−カドヘリンアンタゴニストペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００１８】
もう１つの好ましい実施形態においては、該ペプチドは、環内に配置された３〜１０アミノ酸残基を有する環状ペプチドであり、該ペプチドの３個の連続した残基は、アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｓｅｒを有し、ここで、Ｘａａは、Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎよりなる群から選ばれるアミノ酸残基である。好ましくは、ＸａａはＡｓｐまたはＡｓｎである。
【００１９】
好ましい環状ペプチドは、式：
【００２０】
【化１】
0004613300.tif 000002
（式中、Ｘ１およびＸ２は、独立して、アミノ酸残基であるか、またはペプチド結合により連結された１０個以下の複数のアミノ酸残基であり、Ｙ１およびＹ２は、独立して、ジスルフィド結合により互いに連結されたアミノ酸残基であり、Ｘａａは、Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎよりなる群から選ばれるアミノ酸残基である。）を有する。
【００２１】
特に好ましい環状ペプチドは、環状アミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（配列番号７）を有し、ここで、Ｘａａは、Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎよりなる群から選ばれるアミノ酸残基であり、該ペプチド環は、これら２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合により形成される。
【００２２】
Ｒ−カドヘリン媒介性細胞接着を抑制するための方法は、Ｒ−カドヘリンを発現する細胞を、本発明の選択的Ｒ−カドヘリンアンタゴニストペプチドの接着抑制量と接触させることを含む。例えば、異常な網膜血管新生に罹患した患者に、本発明のＲ−カドヘリンアンタゴニストペプチドの血管新生抑制量を投与することにより、網膜血管新生が抑制される。同様に、幹細胞を本発明のＲ−カドヘリンアンタゴニストペプチドの血管系指向抑制量と接触させることにより、発生中の血管系への系統（ｌｉｎｅａｇｅ）陰性造血幹細胞への指向が抑制される。発生中の血管系への内皮前駆細胞のようなＬｉｎ−ＨＳＣの指向の抑制は、異常な血管発生に関連した疾患、例えば老人性黄斑変性および糖尿病網膜症の治療に有用である。
【００２３】
好ましい実施形態の詳細な説明
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる「環状ペプチド」なる語は、ペプチド結合により鎖として互いに連結された複数のアミノ酸を含む分子を意味し、該鎖の末端は互いに連結されてアミノ酸残基の環を形成している。環状ペプチドは、ペプチド結合、システイン残基のような２つのアミノ酸残基間のジスルフィド結合、または任意の他の適当な連結基により、互いに連結されうる。非ペプチド性連結基は、該ペプチド鎖の各末端の官能基と反応してそれらの間で連結を形成しうる任意の化学的部分でありうる。例えば、ペプチド鎖の２つの末端は、３−アミノ酪酸のような非タンパク質アミノ酸により、またはアミノ末端におけるチオグリコール酸アミドのような非ペプチド性チオール基から形成されるジスルフィドにより、およびカルボキシ末端において２−アミノエタンチオールから形成されるアミドにより、互いに連結されうる。
【００２４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる、担体および他の賦形剤に関する「医薬上許容される」なる語およびその文法的変形体は、該物質が、望ましくない生理的副作用、例えば網膜または眼刺激、悪心、眩暈、霧視または視覚障害、細胞毒性などの生成を伴うことなくヒト患者に投与されうることを意味する。
【００２５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる「アミノ酸」なる語は、一般には、任意のαアミノ酸を意味する。好ましくは、本発明のペプチドは、遺伝暗号によりコードされる２１アミノ酸を含むが、修飾アミノ酸残基をも含みうる。該アミノ酸はＬ、ＤまたはＤ，Ｌ形でありうる。好ましくは、本発明のペプチドはＬ形アミノ酸を含む。インビボでのプロテイナーゼ分解の可能性を最小にするために、本発明の投与ペプチドは１以上のＤ形アミノ酸残基を含みうる。
【００２６】
哺乳類Ｒ−カドヘリンの選択的アンタゴニストである単離されたペプチドは、３〜３０アミノ酸残基を含み、該ペプチドの３個の連続した残基は、アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｓｅｒを有する。Ｘａａは、Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎよりなる群から選ばれるアミノ酸残基である。好ましくは、ＸａａはＡｓｐまたはＡｓｎである。本発明のＲ−カドヘリンアンタゴニストペプチドは直鎖状または環状でありうる。
【００２７】
本発明の選択的Ｒ−カドヘリンアンタゴニストペプチドは、哺乳類Ｒ−カドヘリンのＥＣ１ドメイン内には見出されるが他のカドヘリン分子には見出されないＩｌｅ−Ａｓｐ−ＳｅｒおよびＩｌｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ配列を模擬している。Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｓｅｒ配列を含むペプチドは哺乳類Ｒ−カドヘリン分子に結合し拮抗しうる。Ｘａａは、哺乳類Ｒ−カドヘリン分子内に天然に存在する配列と合致させるために、好ましくは、アスパラギン酸残基（Ａｓｐ）またはアスパラギン残基（Ａｓｎ）である。グルタミン酸（Ｇｌｕ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）残基はそれぞれＡｓｐおよびＡｓｎと化学的に類似しているため、それらもＸａａに適している。
【００２８】
１つの好ましい実施形態においては、該ペプチドは、少なくとも７個のアミノ酸残基を含み、該ペプチドの７個の連続的アミノ酸残基は、アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号６）を有する。ＸａａはＡｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎよりなる群から選ばれるアミノ酸残基である。
【００２９】
もう１つの好ましい実施形態においては、該ペプチドは、環内に配置された３〜１０アミノ酸残基を有する環状ペプチドであり、該ペプチドの３個の連続した残基は、アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｓｅｒを有し、ここで、Ｘａａは、前記のとおり、Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎよりなる群から選ばれるアミノ酸残基である。好ましくは、ＸａａはＡｓｐまたはＡｓｎである。
【００３０】
環内に配置された５個のアミノ酸を有する好ましい環状ペプチドは、式：
【００３１】
【化１】
0004613300.tif 000003
（式中、Ｘ１およびＸ２は、独立して、アミノ酸残基であるか、またはペプチド結合により連結された１０個以下の複数のアミノ酸残基であり、Ｙ１およびＹ２は、独立して、ジスルフィド結合により互いに連結されたアミノ酸残基であり、Ｘａａは、Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎよりなる群から選ばれるアミノ酸残基である。）を有する。好ましくは、Ｙ１およびＹ２は共に、ジスルフィド結合により互いに連結されたシステイン残基（すなわち、シスチン残基）である。
【００３２】
特に好ましい環状ペプチドは、環状アミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（配列番号７）を有し、ここで、Ｘａａは、Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎよりなる群から選ばれるアミノ酸残基であり、該環は、これら２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合により形成される。好ましくは、ＸａａはＡｓｐまたはＡｓｎである。
【００３３】
Ｒ−カドヘリン媒介性細胞接着を抑制するための方法は、Ｒ−カドヘリンを発現する細胞を、本発明の選択的Ｒ−カドヘリンアンタゴニストペプチドの接着抑制量と接触させることを含む。Ｒ−カドヘリン媒介性細胞接着を抑制することにより治療可能な疾患または状態（例えば、異常な血管増殖により特徴づけられる網膜疾患）に罹患した哺乳動物に該アンタゴニストの細胞接着抑制量を投与することにより、該細胞を該ペプチドアンタゴニストとインビボで接触させることが可能である。例えば、老人性黄斑変性または糖尿病網膜症に罹患したヒト患者を、本発明の選択的Ｒ−カドヘリンアンタゴニストペプチドで有益に治療することが可能である。好ましくは、該アンタゴニストとそのための医薬上許容される担体とを含む医薬組成物として、該アンタゴニストを投与する。
【００３４】
Ｒ−カドヘリンの選択的指向または拮抗のためには、本発明のペプチドおよび組成物を、治療的有効量で、医薬上許容される担体、ビヒクルおよび補助剤と共に単位投与形として、非経口的、経口的、吸入により又は局所的に投与することが可能である。本明細書中で用いる「非経口（的）」なる語は、静脈内、皮下、筋肉内、胸骨内、眼内（例えば、硝子体内）および腹腔内投与、ならびに注入技術による投与を含む。
【００３５】
任意の適当な投与経路を用いることが可能であり、本発明の選択的Ｒ−カドヘリンアンタゴニストペプチドを含む医薬組成物を、意図される治療に有効な用量で投与する。個々の医学的状態の治療またはその進行の抑制に必要な治療的有効量は、医学分野において公知の前臨床および臨床研究により、当業者により容易に決定される。
【００３６】
本明細書中で用いる「治療的有効量」なる語は、臨床家または研究者が求めている組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を惹起する有効成分の量を意味する。
【００３７】
本明細書中で用いる「抑制」なる語は、医学的状態または生化学的相互作用の遅延、遮断または阻止を意味するが、該状態の完全な排除または該相互作用の完全な遮断を必ずしも示すものではない。患者の生存期間の延長または症状の重症度の持続的軽減は、それ自体で及び単独で、該医学的状態が有益に制御（すなわち、抑制）されたことを示す。
【００３８】
本Ｒ−カドヘリンアンタゴニストペプチドおよびそれを含有する組成物の投与計画は、患者の年齢、体重、性別および医学的状態のタイプ、該状態の重症度、投与経路ならびに使用する個々のペプチドアンタゴニストのアンタゴニスト活性のような幾つかの要因に基づく。投与計画は、前記要因に応じて様々となりうる。例えば、網膜血管新生の抑制には、約０．０１ミリグラム〜約１０００ミリグラム／ｋｇ体重のオーダーの用量レベルが有用である。好ましい用量レベルは約０．０１ミリグラム〜約１００ミリグラム／ｋｇ体重の範囲である。
【００３９】
注射による投与には、本発明を例示するペプチド含有組成物を、医薬上許容される担体、例えば水、塩類液またはデキストロース水溶液で製剤化する。注射の場合には、典型的な１日量は、前記要因に応じて１回量または複数回量として毎日注射される約０．０１ミリグラム〜約１００ミリグラム／ｋｇ体重である。
【００４０】
本発明の選択的Ｒ−カドヘリンアンタゴニストペプチドと医薬上許容される担体とを含む本発明の医薬組成物は、医薬上許容される賦形剤をも含みうる。本発明の医薬組成物中に含まれうる医薬上許容される賦形剤には、例えば、当技術分野でよく知られている生理的に許容される界面活性剤、溶媒、緩衝剤、保存剤などが含まれる。
【００４１】
例えば、網膜血管新生を抑制するためには、異常な網膜血管新生に罹患した患者に、治療的有効量の本発明のＲ−カドヘリンアンタゴニストペプチドを投与する。投与されたペプチドは、網膜内のＲ−カドヘリンに選択的に結合して、網膜内の血管新生を妨げ抑制する。好ましくは、該ペプチドアンタゴニストは、硝子体内注射により投与する。
【００４２】
発生中の血管系へのＬｉｎ−ＨＳＣの指向は、幹細胞を血管系指向抑制量の本発明の選択的Ｒ−カドヘリンアンタゴニストペプチドと接触させることにより抑制される。発生中の血管系への内皮前駆細胞のようなＬｉｎ−ＨＳＣの指向の抑制は、異常な血管発生に関連した疾患、例えば老人性黄斑変性および糖尿病網膜症の治療に有用である。好ましくは、血管増殖性疾患または状態に罹患した哺乳動物、例えばヒトに本Ｒ−カドヘリンアンタゴニストペプチドを投与することにより、Ｌｉｎ−ＨＳＣをインビボで接触させる。
【００４３】
以下の非限定的な実施例は、本発明の種々の態様を更に詳しく例示するために記載されている。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に開示されている実施例および例示実施形態の修飾が施されうる、と当業者は認識するであろう。
【実施例１】
【００４４】
ペプチド合成
本発明のペプチドおよび種々の対照ペプチドは、固相合成法を用いてＴｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ中央施設により合成され、ＨＰＬＣ分析による分析において、可能な最高の等級（９５％を超える純度）まで精製された。正しいペプチドの合成を確認するために、該ペプチドの配列をマススペクトロメトリーにより分析した。すべてのペプチドをアミノ末端においてはアミド保護し、カルボキシ末端においてはアシル化した。アミノ末端およびカルボキシ末端にシステイン残基を含有する環状ペプチドを製造して、ジスルフィド結合を形成させ、５アミノ酸残基を含有する環を形成させた。図５（Ｂ）は、製造したペプチドを示す：環状ＣＩＤＳＣ（配列番号８）、環状ＣＩＮＰＣ（配列番号９）、ＩＤＳＭＳＧＲ（配列番号２）、ＩＤＳＡＳＧＲ（配列番号１０）、ＩＮＰＡＳＧＱ（配列番号１１）、環状ＣＳＤＩＣ（配列番号１２）および環状ＣＲＡＤＣ（配列番号１３）。
【実施例２】
【００４５】
Ｌ−細胞トランスフェクション
マウスＲ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリンプラスミドは、Ｍａｓａｔｏｓｈｉ  Ｔａｋｅｉｃｈｉ博士（Ｋｙｏｔｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊａｐａｎ）から快く贈呈されたものである。該カドヘリン分子のＣ末端に結合した赤色蛍光タンパク質（Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＲＦＰ）との融合タンパク質をコードするよう、該プラスミドをｐＤｓＲｅｄ２  Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内にサブクローニングした。Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を該製造業者のプロトコールに従い使用して、Ｌ−細胞（マウス繊維芽細胞Ｌ９２９細胞、ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−２１４８）をＲまたはＮ−カドヘリンｐＤｓＲｅｄ２  Ｎ１で安定にトランスフェクトした。ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（７００ｐｇ／ｍＬ  Ｇ４１８  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で補足された培地内での増殖によるスクリーニングの後、陽性クローンを選択した。細胞をＲＦＰの発現に関して検査し、免疫ブロット法および免疫蛍光染色によりカドヘリンの発現に関して試験した。図６は、ＲおよびＮ−カドヘリンを発現するＬ−細胞の凝集を示す。図６（Ａ）は、凝集しなかったトランスフェクトされていないＬ−細胞と比較した場合の、カルシウム含有培地内での、Ｒ−カドヘリン（左）およびＮ−カドヘリン（中央）を発現するＬ−細胞の凝集の光学顕微鏡写真を示す。図６（Ｂ）は、図６（Ａ）に示す細胞の凝集率（％）を示す棒グラフである。約５ｍＭ  塩化カルシウムを含有するバッファー（ＴＣと表示されている）中でトリプシン処理された、Ｎ−カドヘリンおよびＲ−カドヘリンでトランスフェクトされた細胞は、大きな細胞塊を形成し、一方、内因性Ｌ−細胞はカルシウム含有バッファー中で凝集をほとんど示さなかった。カルシウム非含有バッファー（ＴＥと表示されている）中のＥＤＴＡでトリプシン処理された細胞は、該細胞がカドヘリンでトランスフェクトされたか否かにかかわらず、凝集をほとんど示さなかった。
【実施例３】
【００４６】
細胞培養および免疫蛍光
トランスフェクト化または野生型Ｌ−細胞を、アールの基本塩溶液（Ｅａｒｌ’ｓ  Ｂａｓｉｃ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、２ｍＭ  グルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸および１０％  ウシ胎児血清で補足された変法イーグル培地（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＥＭ）内で増殖させた。トランスフェクト化細胞系を、約７００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８で補足された培地内で増殖させた（すべての培地試薬はＧｉｂｃｏ  ＢＲＬからのものである）。免疫蛍光のために、該細胞をガラスカバー細片上で約７５％のコンフルエンシーまで増殖させた。該細胞を４％  パラホルムアルデヒド中で０．５時間固定し、ついで１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の５％  正常ヤギ血清および５％  ウシ胎児血清でブロッキングした。Ｒ−カドヘリンまたはＮ−カドヘリンに対するヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を１：２００の希釈度で使用し、Ａｌｅｘａ４８８標識抗ヤギＩｇＧ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とのインキュベーションにより蛍光を付与した。Ｒａｄｉａｎｃｅ  ２００蛍光共焦点顕微鏡（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、イメージを作成した。免疫ブロット分析のために、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するバッファー中で細胞を細胞溶解した。約５０μｇの全細胞ライセートを８％  ポリアクリルアミドゲルの各レーンに加え、タンパク質を電気泳動により分離した。Ｎ−カドヘリンまたはＲ−カドヘリンに特異的なモノクローナル抗体（１：１０００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、対応するバンドを可視化した。
【００４７】
図７（Ａ）は、天然Ｌ−細胞ならびにＲ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリンでトランスフェクトされＲ−カドヘリン抗体で染色されたＬ−細胞の免疫ブロットを示す。Ｒ−カドヘリンでトランスフェクトされた細胞のみが、有意なレベルのＲ−カドヘリン発現を示した。図７（Ｂ）は、天然Ｌ−細胞ならびにＲ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリンでトランスフェクトされＮ−カドヘリン抗体で染色されたＬ−細胞の免疫ブロットを示す。Ｎ−カドヘリンでトランスフェクトされた細胞のみが、有意なレベルのＮ−カドヘリン発現を示した。図７（Ｃ）は、蛍光性カドヘリン抗体で標識されたＲ−カドヘリン発現細胞の蛍光光学顕微鏡写真であり、Ｒ−カドヘリン分子のみの細胞表面発現を示している。図７（Ｄ）は、蛍光性カドヘリン抗体で標識されたＮ−カドヘリン発現細胞の蛍光光学顕微鏡写真であり、Ｎ−カドヘリン分子のみの細胞表面発現を示している。図７（Ｅ）は、蛍光性カドヘリン抗体にさらされた天然Ｌ−細胞の蛍光光学顕微鏡写真であるが、いずれのタイプのカドヘリン分子の細胞表面発現も何ら示していない。
【実施例４】
【００４８】
凝集アッセイ
Ｌ−細胞をコンフルエンシー近くまで増殖させ、ついでＥＤＴＡの非存在下の０．０１％  トリプシン＋５ｍＭ  ＣａＣｌ２（ＴＣ）、または０．１ｍｍ  ＥＤＴＡの存在下かつカルシウムの非存在下の０．０１％  トリプシン（ＴＥ）でトリプシン処理した。該細胞を集め、洗浄し、ついで５ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在下（ＴＣ）または非存在下（ＴＥ）のハンクス緩衝溶液（ＨＢＳＳ）＋１％  ＢＳＡに再懸濁させた。約６０〜７０ｒｐｍで振とうさせながら、０．５ｍＬの溶液中、２４ウェルプレートの１プレート当たり２×１０５細胞で、細胞を種々の濃度のペプチドと共に３７℃でインキュベートした。すべてのアッセイは三重に行った。初期粒子数（Ｎ０）に対する、２時間のインキュベーション後の全粒子数（Ｎ２ｈｒ）の比率により、細胞凝集の度合を表した。インキュベーションの前（Ｎ０）および後（Ｎｔ）の、ウェル当たりの８回の独立した２０μＬの計数の和を用いて、血球計数器上で粒子を計数した。結果を図８に示す。
【実施例５】
【００４９】
ペプチドの硝子体内注射によるマウスの処理
ペプチドをＰＢＳ＋１０％  ＤＭＳＯに１０ｍＭの濃度まで溶解した。約０．５μＬまたは１．０μＬの１０ｍＭ  ペプチド溶液をそれぞれ２日齢または７日齢のマウスの硝子体腔内に注射した。Ｐ５またはＰ１１に、網膜を、記載されているとおりに解剖し、血管および星状細胞を免疫組織化学的方法により可視化した。注射された網膜を同じ顕微鏡検査設定でイメージングすることにより、表層血管形成中の末梢血管新生、血管の長さおよび血管面積の定量を行った。ついで、網膜血管新生の度合のベースライン正規化のために使用する、注射されていない対照同腹子で、ＬＡＳＥＲＰＩＸＳ（登録商標）ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用して数値化を行った。焦点顕微鏡検査を用いて深部血管叢の前方に焦点を合わせ、光受容体層内に遊走した血管の数を計数することにより、深部血管形成に対する効果の定量を行った。結果を図９に示す。
【実施例６】
【００５０】
幹細胞の単離および富化
増強されたＧＦＰがβアクチンプロモーターに融合されている（ＡＣＴｂＥＧＦＰ，ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）成体トランスジェニックマウスから、骨髄細胞を単離した。ついで単球を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）を使用する密度勾配分離により集め、Ｌｉｎ−選択のためにビオチン結合系統パネル抗体（ＣＤ４５、ＣＤ３、Ｌｙ−６Ｇ、ＣＤ１１、ＴＥＲ−１１９、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で標識した。Ｌｉｎ＋およびＬｉｎ−細胞を、磁気分離カラム（ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｏｒｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して分離した。血管指向による判定で、ＣＤ３１−細胞は、ＨＣＳの非機能的亜集団の、より良好な対照に相当することが確認されたため、ＣＤ３１−細胞を、ＣＤ３１抗体を使用するＭＡＣＳソーティングにより該単球から単離し、機能的Ｌｉｎ−ＨＳＣの陰性対照として使用した。細胞を抗Ｒ−カドヘリン抗体（ｓｃ−６４５６，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）およびＡｌｅｘａ−４８８標識ロバ抗ヤギ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で標識し、ＦＡＣＳキャリブアー（ｃａｌｉｂｕｒ）（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）フローサイトメーターを使用することにより、Ｒ−カドヘリンの発現に関して、野生型マウスからのＨＳＣを分析した。結果を図１０に示す。
【実施例７】
【００５１】
ＨＳＣ細胞のインキュベーション、注射および定量
Ｌｉｎ−ＨＳＣを、リン酸緩衝食塩水中の１００ｎＭのＲ−カドヘリン阻止抗体（ＳＣ−６４５６，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）または前免疫ヤギＩｇＧと共に、注射前に３７℃で約１時間インキュベートした。０．５μＬのＨＳＣ溶液を使用して、Ｐ６の眼内への硝子体内注射を行った。ついでＰ１２に、ホールマウントまたは切片化により網膜を検査した。網膜ごとに８つの異なる視野（左、右、上および下の四半部（網膜周辺部へ３／４の距離）、２つの中間的な四半部（周辺部へ１／４〜１／２の距離）、注射部位ならびに視神経乳頭領域）を用いて網膜内の幹細胞の総数を計数することにより、Ｌｉｎ−ＨＳＣの指向を定量した。これらの細胞を、表層、中間部もしくは深部層への局在化により、または（光受容体層の背部に位置する細胞に対する）指向の欠如により特徴づけた。光受容体層内の非指向細胞の数が、観察された幹細胞の総数に対する割合（％）として示されている。結果を図１１および図１２に示す。
【００５２】
考察
本発明の選択的Ｒ−カドヘリンアンタゴニストペプチドは、Ｒ−カドヘリンの中心的認識モチーフ（すなわち、哺乳類Ｒ−カドヘリンにおいて見出されるＩＤＳおよびＩＮＳ配列）のペプチド模擬体として作用する。理論により束縛されるものではないが、本アンタゴニストペプチドは、細胞表面上のＲ−カドヘリン分子のＥＣ１ドメインとの競合的相互作用により、Ｒ−カドヘリン分子の接着機能を阻止すると考えられる。本アンタゴニストペプチドは、分子的機能の研究に、および細胞接着関連疾患の治療に有用であり、一般には、インビボ注射に際して、組織内で、抗体に基づくアンタゴニストより拡散性である。
【００５３】
網膜ニューロン組織を含むほとんどの組織の発生中の組織形態形成は、細胞−細胞接着分子の選択的結合を含む。この結合選択性は、同様に分化した細胞が互いに組織化するのを可能にし、不適切な組織構造に細胞型が侵入するのを妨げる。しかし、カドヘリン（特に、Ｎ−およびＥ−カドヘリン）の特性および機能に関する詳細な研究にもかかわらず、カドヘリンの特異性を説明する一般的メカニズムは未だ見出されていない。本Ｒ−カドヘリンアンタゴニストペプチドは哺乳類Ｒ−カドヘリン分子と選択的に相互作用し、他のカドヘリンクラスとの有意な結合を伴わない。これらのペプチドはＩＤＳ配列（またはそのホモログＩＮＳ、ＩＥＳおよびＩＱＳ）を含有し、これは、配列番号１７および１８の残基５３−５５であるカドヘリンドメインＥＣ１内の領域に対応する。構造、突然変異および配列相同性解析に基づけば、この領域において、接着界面内の重要な相互作用が生じると報告されている。
【００５４】
理論により束縛されるものではないが、ＩＤＳモチーフは接着界面において隣接カドヘリン分子からのＶＤＩ配列と直接的に接触すると考えられている。カドヘリンの残基５３−５５はトランス二量体化に必要であるらしいため、また、接着に重要な他の領域とは異なり、この短いアミノ酸配列は古典的カドヘリンファミリーメンバー間で保存されていなかったため、この領域はカドヘリンの特異性の決定因子として作用する。実際、環状ＩＤＳ（ＣＩＤＳＣ、配列番号８）はＲ−カドヘリン媒介性細胞凝集を選択的に抑制し、一方、対応するＮ−カドヘリン対応体である環状ＩＮＰ（ＣＩＮＰＣ、配列番号９）はＮ−カドヘリン媒介性凝集を選択的に抑制する。Ｎ−カドヘリンとＲ−カドヘリンとはカドヘリンファミリーメンバーのなかで最も相同である。実際、ＲおよびＮ−カドヘリンを含むすべてのカドヘリンは同種親和性様態で相互作用する傾向にあるが、ＲおよびＮ−カドヘリンの２つのみが、機能的ヘテロ二量体が観察されている古典的カドヘリンファミリーメンバーである。したがって、環状ＩＤＳおよび環状ＩＮＰが、任意の他のカドヘリンメンバーに対する重複した特性以外に、ＮおよびＲ−カドヘリンに対する異なる機能特性を有する可能性は極めて低い。これらの研究は、ＩＸＳモチーフ（ここで、ＸはＤ、Ｎ、ＥまたはＱである）（すなわち、Ｒ−カドヘリンの残基５３−５５またはそのホモログに対応する）がＲ−カドヘリン分子のホモ会合の媒介において重要な役割を果たすことを示している。Ｒ−カドヘリンに対するＩＸＳの特異性およびＮ−カドヘリンに対するＩＮＰの特異性に基づけば、他のカドヘリンファミリーメンバーにおける、対応して配置された残基（例えば、Ｅ−カドヘリンのＩＥＲモチーフおよびＰ−カドヘリンのＩＥＫモチーフ）も、他の古典的カドヘリンに特異性を付与する可能性もある。
【００５５】
これまでの研究は、Ｒ−カドヘリンに対する抗体が網膜血管新生をインビボで妨げることを示している。表層叢の血管新生は、内皮細胞の前に存在する星状細胞により中継されるＲ−カドヘリン媒介性誘導始動因子の遮断により妨げられた可能性がある。Ｒ−カドヘリンの発現は、血管侵入の直前の、後に深部血管叢が位置する領域においても観察される。これらの領域内のＲ−カドヘリン分子は、適切な血管叢へ内皮細胞を誘導すると考えられる。なぜなら、Ｒ−カドヘリン阻止抗体を注射すると、血管は、正常な血管化層を迂回するからである。
【００５６】
本発明において、表層網膜血管新生中および深部網膜血管新生中の両方における環状ＩＤＳ（ＣＩＤＳＣ、配列番号８）の注射により、類似した血管表現型が得られた。環状ＩＤＳは、Ｒ−カドヘリン媒介性凝集を、有意な度合でインビトロで選択的に妨げる（すなわち、Ｎ−カドヘリン媒介性凝集は有意には妨げられない）ため、環状ＩＤＳとＲ−カドヘリンとの高親和性相互作用により、該インビボ血管表現型も生じたらしい。また、インビトロではＮ−カドヘリン媒介性凝集には有効なインヒビターであったがＲ−カドヘリン凝集には有効でなかった環状ＩＮＰ（ＣＩＮＰＣ、配列番号９）の注射は、有意な網膜血管表現型を与えなかった。総合すると、これらの結果は、血管誘導中のＲ−カドヘリンに関する特異的な役割を証明するものである。
【００５７】
本発明の選択的Ｒ−カドヘリンアンタゴニストペプチドの設計は、古典的カドヘリンファミリーの種々のメンバーの構造的、生化学的および突然変異解析に基づくものであった。トリプトファンー２は、Ｎ−カドヘリンおよびＲ−カドヘリンのアミノ酸残基７９−８１のＨＡＶ配列と共に、カドヘリン機能に重要であることが公知である。実際、ＨＡＶ配列を含有する直鎖状および環状ペプチドは、Ｎ−カドヘリン媒介性神経突起成長をインビトロで阻止することが報告されている。しかし、これらの配列は全てのカドヘリン分子にわたって絶対的に保存されており、したがって、結合の特異性を付与し得ない。他の残基も、カドヘリン認識に重要ないくつかの非保存性残基と、二量体界面内で、重要な接触を行う必要がある。アミノ末端カドヘリン反復（ＥＣ１）内の残基に注目した。接触に重要な残基の大多数は、３つの領域に、すなわち、アミノ酸３５−４５、アミノ酸５３−５９およびアミノ酸７９−８６に局在化していた。残基５３−５９は、二量体界面の形成において潜在的に重要なこれらのカドヘリン特異的残基の大多数を含有していた。これらのうち、残基５３−５５は特に重要である。したがって、Ｒ−カドヘリン特異的ペプチドが産生される可能性を最適化するために、この領域から、ペプチド模擬体を設計した。最も密接に関連したカドヘリンファミリーメンバーであるマウスＮ−カドヘリンからの配列に対する類似したペプチドおよび他の対照ペプチドを設計し、比較分析に使用した。
【００５８】
カドヘリン媒介性凝集
通常Ｌ−細胞と称されるマウス繊維芽細胞（系統Ｌ９２９）を選択した。なぜなら、それは、内因性カドヘリン発現を示さないことが公知だからである。Ｒ−カドヘリン安定トランスフェクタントを作製し、それを使用して、Ｒ−カドヘリン媒介性凝集に対する設計ペプチドの効果を試験した。Ｎ−カドヘリン安定トランスフェクタントも作製し、それを使用して、Ｎ−カドヘリン媒介性凝集に対するその効果に基づき、カドヘリン選択性に関して該ペプチドを評価した。図７に示すとおり、免疫ブロット分析は、Ｒ−カドヘリンクローン８（Ｒ−ｃａｄ８）においては、高レベルのＲ−カドヘリン発現を検出し、Ｎ−カドヘリン発現を全く検出しなかったが、Ｎ−カドヘリンクローン３（Ｎ−ｃａｄ３）においては、高レベルのＮ−カドヘリン発現が見出され、Ｒ−カドヘリン発現は全く見出されなかった。免疫蛍光は、これらの選択されたクローンにおける適当なカドヘリンの発現を証明した。凝集アッセイにおいて試験したところ、カドヘリントランスフェクションの結果として、トランスフェクト化細胞系の形態学的特徴が変化していた。図６（Ａ）に示すとおり、親（すなわち、非トランスフェクト化）Ｌ−細胞は単細胞粒子として解離したままであったが、マウスＲ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリントランスフェクタントは、密着した細胞間会合により、大きなカルシウム依存性（ＴＣバッファー）細胞塊を形成した。図６（Ｂ）に示すとおり、カドヘリン媒介性凝集塊は、ＥＤＴＡ溶液の存在下の細胞の初期トリプシン処理およびカルシウム非含有バッファー（ＴＥバッファー）中の凝集により排除された。
【００５９】
細胞凝集に対するペプチドの効果
ペプチドを種々の濃度で凝集ウェルに加えて、カドヘリン媒介性接着の阻止におけるそれらの有効性を試験した。環状ＩＤＳはＲ−カドヘリン媒介性凝集を約３００μＭのＩＣ５０で抑制した。直鎖状ペプチドＩＤＳＭＳＧＲ（配列番号２）も、Ｒ−カドヘリン媒介性接着を阻止した。しかし、その有効性（ＩＣ５０  〜９００μＭ）は環状ＩＤＳの場合より約３倍低かった。該環状ペプチドは該直鎖状ペプチドより遥かに安定であり扱い易いことが判明したため、以降においては、環状ペプチドのみの分析に重点を置いた（図８（Ａ））。Ｎ−カドヘリン凝集に対する効果はほとんど観察されなかったため、環状ＩＤＳの効果はＲ−カドヘリンに特異的であった。これとは対照的に、対応するＮ−カドヘリン特異的配列である環状ＩＮＰは、Ｒ−カドヘリン凝集に対する環状ＩＤＳの効果と同様に、Ｎ−カドヘリン媒介性凝集を、３００μＭより僅かに低いＩＣ５０で抑制した（図８（Ｂ））。環状ＩＮＰはＲ−カドヘリン媒介性凝集に対する効果をほとんど示さなかった。
【００６０】
その他の対照ペプチドである環状ＲＡＤ（ＣＲＡＤＣ、配列番号１３）および環状ＳＤＩ（ＣＳＤＩＣ、配列番号１２）はＲ−カドヘリン媒介性凝集またはＮ−カドヘリン媒介性凝集のいずれにもほとんど影響を及ぼさなかった。いずれかの古典的カドヘリン分子により媒介される接着の阻止において有効であることが既に知られている環状ＨＡＶペプチド（ＣＨＡＶＣ、配列番号２０）を、比較として試験した。本発明者らのアッセイにおいては、環状ＨＡＶはＲ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリン媒介性凝集を１５０〜２００μＭのＩＣ５０で阻止した。したがって、環状ＩＤＳおよび環状ＩＮＰは、該非特異的一般的カドヘリン阻止ペプチドより僅かに低いだけの親和性で、それぞれＲまたはＮカドヘリン接着を選択的に阻止した。Ｒ−カドヘリンに対する抗体を使用するこれまでの研究は、正常な網膜発生血管新生を妨げることを示している。図８（Ｃ）に示すとおり、これらの抗体はまた、本発明者らのアッセイ系において、約１０ｎＭのＩＣ５０でカドヘリン媒介性凝集を妨げるのに有効であった。
【００６１】
網膜血管新生に対するペプチドの効果
生後マウスの眼の硝子体腔内にペプチドを注射した。環状ＩＤＳまたは環状ＨＡＶペプチドを２日齢のマウスの眼に注射し、生じた血管系を３日後の生後第５日（Ｐ５）に検査したところ、血管形成が妨げられ、抗体注射で観察された結果と同様の結果が得られた。これらの網膜は、注射されていない正常な同腹子対照と比較して、広範でない末梢血管形成、および血管化領域内の、少ない相互連結血管を有するものとして特徴づけられた。全体的には、表層の血管新生はＲ−カドヘリン阻止ペプチドにより半分に切断され、一方、Ｎ−カドヘリン特異的環状ＩＮＰ注射を受けた網膜は比較的正常であった（図９（Ａ〜Ｃ）を参照されたい）。
【００６２】
本発明の選択的Ｒ−カドヘリンアンタゴニストペプチドは深部網膜層の正常な血管新生をも妨げた。表層血管網状構造の血管が潜り込み深部血管叢の形成を開始する直前のＰ７において環状ＩＤＳペプチドを注射し、生じたＰ１１血管系を、正常な深部血管叢を越えて無血管光受容体層内へ遊走した多数の血管出芽により特徴づけした。この場合も、これは、Ｒ−カドヘリン抗体を注射した場合にこれまでに観察された効果に類似していた。これとは対照的に、図９（ＢおよびＤ）に示すとおり、環状ＩＮＰペプチドを注射した眼の深部血管叢は正常に生じた。
【００６３】
Ｒ−カドヘリンはＬｉｎ−ＨＳＣにより発現される
Ｒ−カドヘリン細胞接着分子が機能的指向細胞の細胞表面で発現されるかどうかを判定するために、Ｒ−カドヘリンの造血幹細胞（ＨＳＣ）発現を分析した。フローサイトメトリー分析によれば、Ｒ−カドヘリンはＨＳＣのＬｉｎ−亜集団の約８０％の細胞表面で発現されるが、Ｌｉｎ＋細胞は、その僅か３０％がＲカドヘリンを発現するに過ぎない（図１０）。それらの２つの細胞集団間の相対蛍光強度に基づけば、Ｌｉｎ−細胞はその細胞表面で、Ｒ−カドヘリン陽性Ｌｉｎ＋細胞の場合より高い濃度のＲ−カドヘリンを発現するらしい。したがって、網膜血管系を機能的に指向する亜集団内の細胞の大多数はＲ−カドヘリンを発現し、一方、非指向亜集団からの細胞のほとんどは発現しない。興味深いことに、ＣＤ３１、ＣＤ３４およびＭａｃ１陰性であり指向機能を全く有さないＨＳＣの、異なる亜集団は、遥かに少数のＲ−カドヘリン発現細胞を含有していた。
【００６４】
Ｒ−カドヘリン阻止抗体およびペプチドはＨＳＣ指向を妨げる
異なる網膜血管層へのＨＳＣの指向においてＲ−カドヘリン細胞−細胞接着が機能する度合を調べるために、注射前にＬｉｎ−ＨＳＣをＲ−カドヘリン特異的阻止抗体で阻止した。注射の６日後、正常なＬｉｎ−ＨＳＣは、３つの血管層、すなわち、１）神経節細胞層内に局在化した表層血管層、２）外網状層付近に局在化した深部血管叢、および３）内顆粒層の前端に局在化した中間層にのみ局在化していることが見出される。図１１（Ａ）は、正常なＬｉｎ−ＨＳＣ（左）、接着性阻止Ｒ−カドヘリン抗体と共にインキュベートされたＬｉｎ−ＨＳＣ（中央）、および前免疫ヤギＩｇＧと共にインキュベートされたＬｉｎ−ＨＳＣ（右）の注射後の網膜の横断面を示す。
【００６５】
注射前にＬｉｎ−ＨＳＣを抗Ｒ−カドヘリン抗体と共にプレインキュベートした場合には、これらの細胞の多くが、正しく指向するそれらの能力を喪失し、一方、前免疫ＩｇＧと共にプレインキュベートした細胞は、未阻止ＨＳＣと同様に機能する。深部および中間部血管層への指向はＲ−カドヘリン接着の阻止により特に影響されるらしい。なぜなら、これらの領域内にはＲ−カドヘリン阻止ＨＳＣが比較的にほんの僅かしか局在化していないことが判明したからである。また、表層血管叢に局在化している細胞は、それほど組織化されていないらしく、正常なＬｉｎ−ＨＳＣと同じ、または前免疫ＩｇＧと共にプレインキュベートしたものと同じ度合では、内因性血管系と共局在化していなかった。
【００６６】
Ｒ−カドヘリン抗体と共にプレインキュベートしたＬｉｎ−ＨＳＣの多くは、網膜を介して３つ全ての血管層を越えて遊走し、ＲＰＥ層付近の光受容体の外縁に接着した。Ｒ−カドヘリン阻止ＨＳＣのほぼ半分は光受容体層の外縁に見出された（図１１（Ｂ））。比較として、前免疫ＩｇＧと共にプレインキュベートしたＨＳＣを注射した対照網膜では、該ＨＳＣの１５％がこの領域に誤って指向（誤指向）したに過ぎなかった。該対照網膜からの誤指向細胞の大部分は注射部位付近に見出され、注射針を抜いた際に網膜下に放出された細胞によるものと考えられうる。計算から注射部位を除くと、前免疫ＩｇＧと共にインキュベートされた誤指向ＨＳＣの数は１０％に減少した。この「深部外（ｅｘｔｒａ  ｄｅｅｐ）」層内では、通常、Ｌｉｎ−ＨＳＣはほとんど観察されないため、対照ＩｇＧと共にインキュベートされた誤指向ＨＳＣのこの小さな比率は、前免疫ＩｇＧが該Ｌｉｎ−細胞の約１０％に対する結合能を有していたことによるものであると考えられうる（図１０）。これらの結合ＩｇＧ分子は、単なる立体障害により、正常な接着を非特異的に妨げうる。しかし、特異的Ｒ−カドヘリン阻止による誤指向細胞の数と非特異的ＩｇＧ阻止による誤指向細胞の数との相違は有意である。
【００６７】
図１２（Ａ）は、３つの血管叢と、光受容体層の外縁との、ｚ平面を通る共焦点イメージを示す。正しい血管叢内の及び内因性血管（赤色）に沿った正常な指向が、前免疫ヤギＩｇＧで阻止されたＬｉｎ−ＨＳＣ（緑色）により観察された。Ｒ−カドヘリン接着の阻止により、多数のＬｉｎ−ＨＳＣが光受容体層の外縁に局在化し、正常な血管叢に指向された細胞は互いに塊化する傾向にあり、内因性（赤色）血管に沿っては局在化しなかった。図１２（Ｂ）は、網膜内のＨＳＣの全集団に対する誤指向細胞の比率がＬｉｎ−ＨＳＣのＲ−カドヘリン阻止集団に関しては有意に大きかったことを示す棒グラフである（Ｐ値＜０．０１）。
【００６８】
前記の説明は限定的なものではなく例示的なものであると解釈されるべきである。本発明の精神および範囲内の更に他の変更が当業者に容易に見出されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、カドヘリンの塊化およびカドヘリン調節性細胞接着を図示する。
【図２】図２は、２２２−２２８位に配列ＩＤＳＭＳＧＲ（配列番号２）を含む、Ｒ−カドヘリンプレプロタンパク質のヒト変異体のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図３】図３は、２２２−２２８位に配列ＩＮＳＭＳＧＲ（配列番号４）を含む、Ｒ−カドヘリンプレプロタンパク質のヒト変異体のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図４】図４は、２２９−２２５位に配列ＩＤＳＭＳＧＲ（配列番号２）を含む、Ｒ−カドヘリンプレプロタンパク質のマウス変異体のアミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図５】（Ａ）マウスＮ−カドヘリンおよび種々のＲ−カドヘリンの残基２４−９２における配列相同性（保存された残基（青色）および保存されていない残基（赤色））を示す。ヒト、マウスおよびラットからの哺乳類Ｒ−カドヘリン間の相同性において、それらの全ては残基５３−５５に配列ＩＤＳまたはＩＮＳを含み、一方、ニワトリＲ−カドヘリンおよびマウスＮ−カドヘリンは残基５３−５５にそれぞれ配列ＩＤＰおよびＩＮＰを有することに注目されたい。（Ｂ）マウスおよびヒトＲ−カドヘリンならびにマウスＮ−カドヘリンのこの領域内の残基に対応する環状および直鎖状ペプチドを、対応する対照ペプチドと共に合成した：環状ＣＩＤＳＣ（配列番号８）、環状ＣＩＮＰＣ（配列番号９）、ＩＤＳＭＳＧＲ（配列番号２）、ＩＤＳＡＳＧＲ（配列番号１０）、ＩＮＰＡＳＧＱ（配列番号１１）、環状ＣＳＤＩＣ（配列番号１２）および環状ＣＲＡＤＣ（配列番号１３）；図５（Ａ）に示す部分カドヘリン配列は、上から下へ、マウスＮ−カドヘリン（配列番号１４）、マウスＲ−カドヘリン（配列番号１５）、ラットＲ−カドヘリン（配列番号１６）、ヒトＲ−カドヘリン（配列番号１７）、もう１つのヒトＲ−カドヘリン（配列番号１８）およびニワトリ（ガルス・ガルス（ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ））Ｒ−カドヘリン（配列番号１９）である。
【図６】（Ａ）Ｒ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリンを発現するＬ−細胞の凝集を示す光学顕微鏡写真を示す。（Ｂ）は、カルシウムの存在下および非存在下でＲおよびＮ−カドヘリンにより媒介されるＬ−細胞の凝集率（％）の棒グラフである。
【図７】Ｒ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリンでのＬ−細胞の安定なトランスフェクションを示す。（Ａ）Ｒ−カドヘリン免疫ブロット。（Ｂ）Ｎ−カドヘリン免疫ブロット、（Ｃ〜Ｅ）ＲおよびＮ−カドヘリンのいずれをも発現しない細胞（Ｅ）と比較した場合の、Ｒ−カドヘリン（Ｃ）およびＮ−カドヘリン（Ｄ）の発現を示す染色されたＬ細胞の光学顕微鏡写真。
【図８】Ｎ−カドヘリン発現細胞に結合するＩＮＰ含有ペプチドと比較した場合の、Ｒ−カドヘリン発現細胞に結合するＩＤＳ含有ペプチドによる、Ｌ−細胞を発現するカドヘリンの凝集の選択的抑制をグラフで示す。
【図９】環状ＣＩＮＰＣ（配列番号９）と比較した場合の、環状ＣＩＤＳＣ（配列番号８）の硝子体内注射の後のマウス網膜血管新生の選択的抑制を示す。（Ａ）発生のＰ２期におけるｒｄ／ｒｄマウス網膜の光学顕微鏡写真を示す。（Ｂ）発生のＰ７期におけるｒｄ／ｒｄマウス網膜の光学顕微鏡写真を示す。（Ｃ）は表層血管新生の棒グラフである。（Ｄ）は深部血管新生の棒グラフである。
【図１０】図１０は、造血幹細胞（ＨＳＣ）におけるＲ−カドヘリン発現のフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図１１】図１１は、本発明の種々のペプチドおよび対照ペプチドで処理されたｒｄ／ｒｄマウス網膜の横断面光学顕微鏡写真を示す。
【図１２】図１２は、本発明のＲ−カドヘリンアンタゴニストペプチドによる、発生中の網膜血管系のＬｉｎ−ＨＳＣ指向の阻止を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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