(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
0004692958.tif 000048
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立して、水素または直鎖状もしくは分岐したヒドロキシアルキル基である。）
のヒドロキシアルキルデンプンを、反応の前には酸化されていないその還元末端で式（ＩＩ）
Ｒ'−ＮＨ−Ｒ"      （ＩＩ）
（式中、Ｒ'は水素であり、
Ｒ"は、−ＮＨ2、−Ｏ−ＮＨ2、−（Ｃ＝Ｇ）−ＮＨ−ＮＨ2、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｇ）−ＮＨ−ＮＨ2、および−ＳＯ2−ＮＨ−ＮＨ2（式中、Ｇは、ＯまたはＳである。）からなる群から選択される少なくとも１つの官能基Ｘを含み、
化合物（ＩＩ）が、Ｒ'およびＲ"を架橋するＮＨ基を介して式（Ｉ）の酸化されていない還元末端と反応する。）
の化合物と反応させる工程を含み、
上記化合物（ＩＩ）が、
【化２】
0004692958.tif 000049
からなる群から選ばれるヒドロキシアルキルデンプン誘導体を生成する方法。
【請求項２】
前記ヒドロキシアルキルデンプンが、ヒドロキシエチルデンプンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が独立して、水素または２−ヒドロキシエチル基である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
式（ＩＩ）の化合物が、Ｏ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）エチル］ヒドロキシルアミン
【化３】
0004692958.tif 000050
またはカルボヒドラジド
【化４】
0004692958.tif 000051
である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）との反応が、水性溶媒中５〜４５℃の温度で、４．５〜６．５の範囲のｐＨで行われ、化合物（ＩＩ）がヒドロキシルアミンまたはヒドラジドである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）との反応が、水性溶媒中、２５〜９０℃の温度で、８〜１２の範囲のｐＨで行われ、該反応が還元性アミノ化である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
式（Ｉ）：
【化５】
0004692958.tif 000052
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立して、水素または直鎖状もしくは分岐したヒドロキシアルキル基である。）
のヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）を、反応前に酸化されていないその還元末端で式（ＩＩ）：
Ｒ'−ＮＨ−Ｒ"
（式中、Ｒ'は水素であり、
Ｒ"は、−ＮＨ2、−Ｏ−ＮＨ2、−（Ｃ＝Ｇ）−ＮＨ−ＮＨ2、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｇ）−ＮＨ−ＮＨ2、および−ＳＯ2−ＮＨ−ＮＨ2（式中、Ｇは、ＯまたはＳである。）からなる群から選択される少なくとも１つの官能基Ｘを含み、
化合物（ＩＩ）が、Ｒ'およびＲ"を架橋するＮＨ基を介して、化合物（Ｉ）の酸化されていない還元末端と反応する。）
の化合物と反応させる工程を含み、
上記化合物（ＩＩ）が、
【化６】
0004692958.tif 000053
からなる群から選ばれる方法により得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項８】
前記ヒドロキシアルキルデンプンが、ヒドロキシエチルデンプンである請求項７に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項９】
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が独立して、水素または２−ヒドロキシエチル基である請求項７または８に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項１０】
式（ＩＩ）の化合物が、Ｏ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）エチル］ヒドロキシルアミン
【化７】
0004692958.tif 000054
またはカルボヒドラジド
【化８】
0004692958.tif 000055
である請求項７に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項１１】
前記誘導体が式（ＩＩＩａ）：
【化９】
0004692958.tif 000056
の構造を有する請求項７に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項１２】
Ｒ'が水素であり、前記誘導体が式（ＩＩＩａ）の化合物または式（ＩＩＩｂ）の化合物
【化１０】
0004692958.tif 000057
または（ＩＩＩａ）と（ＩＩＩｂ）との化合物の混合物のいずれかである請求項７に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒドロキシアルキルデンプン誘導体、特にヒドロキシアルキルデンプンをリンカー化合物の１級または２級アミノ基と反応させる方法により得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。特に好ましい実施形態によれば、本発明はヒドロキシアルキルデンプンをリンカー化合物の１級または２級アミノ基と反応させ、得られた反応生成物をリンカー化合物の少なくとも１つの別の反応基を介してポリペプチド、好ましくは糖タンパク質と、そして特に好ましくはエリスロポエチンと反応させることによる方法により得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。特に好ましいヒドロキシアルキルデンプンはヒドロキシエチルデンプンである。本発明に従って、ヒドロキシアルキルデンプン、そして好ましくはヒドロキシエチルデンプンを反応の前には酸化されていないその還元末端でリンカー化合物と反応させる。
【０００２】
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は天然発生アミロペクチンの誘導体であり、体内でアルファアミラーゼにより分解される。ＨＥＳは炭水化物ポリマーアミロペクチンの置換誘導体であり、これは９５重量％までの濃度でコーンスターチに存在する。ＨＥＳは有利な生物学的特性を呈し、臨床で血液希釈治療において血漿増量剤として使用されている（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ，８（８）：２７１−２７８；ａｎｄ  Ｗｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．，４１：４９４−４９８）。
【０００３】
アミロペクチンはグルコース部分からなり、その主鎖にはアルファ−１，４−グリコシド結合が存在し、分岐部位にはアルファ−１，６−グリコシド結合が見出される。この分子の物理化学的特性は主にグリコシド結合の型により決定される。割り込んだ（nicked）アルファ−１，４−グリコシド結合のために、らせん１回転あたり約６個のグルコースモノマーを有するらせん構造が生み出される。ポリマーの物理化学的特性および生化学的特性を、置換により改変することができる。アルカリ性ヒドロキシエチル化によりヒドロキシエチル基の導入を達成することができる。ヒドロキシエチル化に関して、反応条件を適合させることにより、置換されていないグルコースモノマーの各々のヒドロキシ基の異なる反応性を利用することが可能である。この事実により、当業者は置換パターンを限定的に操ることができる。
【０００４】
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を生成するいくつかの方法が当分野で報告されている。
【０００５】
ＤＥ  ２６  １６  ０８６は、第１工程で架橋剤、例えばブロモシアンがヒドロキシエチルデンプンに結合し、続いてヘモグロビンが中間生成物に連結される、ヘモグロビンのヒドロキシエチルデンプンへのコンジュゲーションを開示している。
【０００６】
ＨＥＳが使用される１つの重要な分野は、特定の生理学的効果を得るために、例えば循環系に適用されるポリペプチドの安定化である。これらのポリペプチドの１つの具体例はエリスロポエチンであり、これは循環中の赤血球レベルを制御するのに必須であるおよそ３４，０００ｋＤａの酸性糖タンパク質である。
【０００７】
ポリペプチドおよび酵素の適用による周知の問題は、これらのタンパク質がしばしば満足できない安定性を呈するということである。特にエリスロポエチンは相対的に血漿半減期が短い（Ｓｐｉｖａｋ  ａｎｄ  Ｈｏｇａｎｓ，１９８９，Ｂｌｏｏｄ  ７３，９０；ＭｃＭａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｂｌｏｏｄ  ７６，１７１８）。これは、治療用血漿レベルが急速に喪失され、静脈内投与を繰り返し行わなければならないということを意味している。さらに特定に環境では、ペプチドに対する免疫応答が観察される。
【０００８】
ポリペプチドをポリマー分子に結合させると、ポリペプチドの安定性を改善することができ、ポリペプチドに対する免疫応答が低減されることは一般に認められている。国際公開公報第９４／２８０２４号は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾された生理学的に活性なポリペプチドは免疫原性および抗原性の低減を呈し、そしてコンジュゲーションされていないタンパク質よりもかなり長く血流中で循環する、すなわちクリアランス率が延長されることを開示している。しかしながら、ＰＥＧ薬物コンジュゲートはいくつかの不利益を呈し、例えばインビボ分解経路の構成要素により認識され得る天然構造を呈さない。従ってＰＥＧコンジュゲートは別として、その他のコンジュゲートおよびタンパク質重合化物質が生成されている。種々のタンパク質および高分子、例えばポリメラーゼの架橋のための多くの方法が文献に記載されている（例えばＷｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，１９９３，ＣＲＣＳ，Ｉｎｃ．参照）。
【０００９】
当分野で開示されているＨＥＳ薬物コンジュゲートは、ＨＥＳが薬物に位置特異的にコンジュゲーションされないという不利益を被る。結果的に、接合によりコンジュゲーション工程の間に３次元構造の崩壊のために不活性化し得る多くの成分を有する非常に異種性の生成物が生じる。従って、安定性および／または生物活性が改善されている、さらに改善されたＨＥＳポリペプチドコンジュゲートに関する必要性が存在する。
【００１０】
これらのコンジュゲートを生成する１つの方法は、出発材料として、架橋化合物と反応するＨＥＳの酸化形態を用い、ここで得られた生成物をポリペプチドと反応させるか、またはさらに修飾して、続いてポリペプチドと反応させる。第１工程で天然のＨＥＳが概してその還元末端で、末端アルデヒド基および／またはヘミアセタール基のラクトンへの酸化により選択的に酸化されなければならず、従って方法全体がさらに困難で、経費がかかるものになっているのがこの方法の主要な不利な点である。
【００１１】
国際公開公報第０２／０８０７９  Ａ２号は、活性物質およびヒドロキシアルキルデンプンが直接またはリンカー化合物を介してのいずれかで連結されている、活性物質およびヒドロキシアルキルデンプンのコンジュゲートを含む化合物を開示している。直接的な連結に関する限り、活性物質およびヒドロキシアルキルデンプンの反応を、少なくとも１０重量％の水を含む水性溶媒中で実施する。水性溶媒中ヒドロキシアルキルデンプンをその還元末端で構造単位−ＮＨ−を含む架橋化合物と反応させることにより生成されるヒドロキシアルキルデンプン誘導体を志向する実例は示されていない。全ての実例はさらなる反応の前に酸化されているヒドロキシアルキルデンプンを志向し、従って国際公開公報第０２／０８０７９  Ａ２号の具体的な教示は前記の不利益を有している。
【００１２】
従って、本発明の目的は、ヒドロキシアルキルデンプンを、反応の前には酸化されていないその還元末端で適当な化合物と反応させることを可能にするヒドロキシアルキルデンプン誘導体を生成する方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、ヒドロキシアルキルデンプンを、反応の前には酸化されていないその還元末端で適当な化合物と反応させることを可能にするヒドロキシアルキルデンプン誘導体を生成する方法を提供することであり、前記方法は、ヒドロキシアルキルデンプンをその還元末端で適当な化合物との反応の反応生成物をさらに少なくとも１つの別の化合物と反応させることを特徴とする。
【００１４】
本発明のなおさらなる目的は、前記少なくとも１つのさらなる化合物がポリペプチド、好ましくはタンパク質、さらに好ましくはエリスロポエチンである前記方法を提供することである。
【００１５】
さらに別の本発明の目的は、ヒドロキシアルキルデンプンを、反応の前には酸化されていないその還元末端で適当な化合物と反応させることを含む前記方法により得られるヒドロキシアルキルデンプン誘導体を提供することである。
従って、本発明は式（Ｉ）：
【化１】
0004692958.tif 000002
のヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）を、反応の前には酸化されていないその還元末端で式（ＩＩ）：
Ｒ’−ＮＨ−Ｒ”
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立して水素または直鎖状もしくは分岐したヒドロキシアルキル基であり、Ｒ’もしくはＲ”またはＲ’およびＲ”は、（Ｉ）および（ＩＩ）の反応の前または反応の後に少なくとも１つの別の化合物と反応することができる、少なくとも１つの官能基Ｘを含む）
の化合物と反応させることを含むヒドロキシアルキルデンプン誘導体を生成する方法に関する。
【００１６】
本発明の文脈では、「ヒドロキシアルキルデンプン」（ＨＡＳ）は少なくとも１つのヒドロキシアルキル基で置換されているデンプン誘導体を意味する。従って、本発明で用いるヒドロキシアルキルデンプンなる用語は、末端炭水化物部分が簡略にするために式（Ｉ）で表されるようなヒドロキシアルキル基Ｒ1、Ｒ2および／またはＲ3を含む化合物に限定されないだけではなく、末端炭水化物部分か、および／またはデンプン分子ＨＡＳ’の残りの部分のいずれかのどこかに存在する、少なくとも１つのヒドロキシ基がヒドロキシアルキル基Ｒ1、Ｒ2またはＲ3により置換されている化合物をも意味する。
【００１７】
この文脈では、アルキル基は適当に置換されていてよい直鎖状または分岐したアルキル基でよい。好ましくは、ヒドロキシアルキル基は１から１０個の炭素原子、さらに好ましくは１から６個の炭素原子、さらに好ましくは１から４個の炭素原子、そしてなおさらに好ましくは２から４個の炭素原子を含有する。従って、「ヒドロキシアルキルデンプン」は好ましくはヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンおよびヒドロキシブチルデンプンを含み、ここでヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンが特に好ましい。
【００１８】
２つまたはそれ以上の異なるヒドロキシアルキル基を含むヒドロキシアルキルデンプンもまた可能である。
【００１９】
ＨＡＳに含まれる少なくとも１つのヒドロキシアルキル基は、２つまたはそれ以上のヒドロキシ基を含有できる。好ましい実施形態によれば、ＨＡＳに含まれる少なくとも１つのヒドロキシアルキル基は１つのヒドロキシ基を含有する。
【００２０】
「ヒドロキシアルキルデンプン」なる表現はまた、アルキル基がモノ置換またはポリ置換されている誘導体をも含む。この文脈では、アルキル基はＨＡＳが水溶性のままであれば、ハロゲン、特にフッ素で、またはアリール基で置換されているのが好ましい。さらにヒドロキシアルキル基の末端ヒドロキシ基はエステル化またはエーテル化されていてよい。
【００２１】
さらに、アルキルの代わりに、直鎖状または分岐した置換または非置換アルケン基を用いることもできる。
【００２２】
ヒドロキシアルキルデンプンはデンプンのエーテル誘導体である。前記エーテル誘導体に加えて、その他のデンプン誘導体を本発明の文脈で使用することもできる。例えば、エステル化ヒドロキシ基を含む誘導体が有用である。これらの誘導体は、例えば２から１２個の炭素原子を有する非置換モノまたはジカルボン酸の誘導体かまたはその置換誘導体でよい。２から６個の炭素原子を有する非置換モノカルボン酸の誘導体、特に酢酸の誘導体が特に有用である。この文脈では、アセチルデンプン、ブチルデンプンおよびプロピルデンプンが好ましい。
【００２３】
さらに、２から６個の炭素原子を有する非置換ジカルボン酸の誘導体が好ましい。
【００２４】
ジカルボン酸の誘導体の場合、ジカルボン酸の第２のカルボキシ基がエステル化されているのが有用である。さらに、ジカルボン酸のモノアルキルエステルの誘導体もまた本発明の文脈で適している。
【００２５】
置換モノカルボン酸またはジカルボン酸に関しては、好ましくは、置換基は置換アルキル残基に関して前記したものと同一でよい。
【００２６】
デンプンのエステル化の技術は当分野で公知である（例えば、Ｋｌｅｍｍ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．２，１９９８，Ｗｈｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ  ｃｈａｐｔｅｒ４．４，Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＩＳＢＮ  ３−５２７−２９４８９−９）参照）。
【００２７】
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は本発明の全ての実施形態に関して最も好ましい。
【００２８】
従って、本発明はまたヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキシエチルデンプンである前記した方法にも関する。
【００２９】
ＨＥＳは主に分子量分布および置換の程度により特徴付けられる。置換の程度の記載に２つの可能性がある。
１．全てのグルコース部分（ＤＳ）に関して、置換グルコースモノマーの部分に相対的に置換の程度を記載することができる。
２．「モル置換度」（ＭＳ）として置換の程度を記載することができ、その場合グルコース部分あたりのヒドロキシエチル基の数を記載する。
【００３０】
ＨＥＳ溶液は、各分子が重合化の程度、分岐部位の数およびパターン、並びに置換パターンに関して互いに異なっている多分散系組成物として存在する。従って、ＨＥＳは、分子量の異なる化合物の混合物である。結果的に、特定のＨＥＳ溶液は統計学的手段の助けを借りて、平均分子量により決定される。この文脈で、Ｍnは分子の数に依存して算術平均として計算される。また別に、重量平均、ＭwはＨＥＳの質量に依存する単位を表す。
【００３１】
本発明の文脈で、ヒドロキシエチルデンプンの平均分子量（重量平均）は、１〜３００ｋＤａでよく、５〜１００ｋＤａの平均分子量が好ましい。ヒドロキシエチルデンプンはさらに０．１〜０．８のモル置換度、およびヒドロキシエチル基に関して２〜２０の範囲のＣ2：Ｃ6置換間の比率を呈する。
【００３２】
式（Ｉ）による残基Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が関係する限り、化合物（Ｉ）が式（ＩＩ）による化合物と依然反応できれば特別な制限は与えられていない。好ましい実施形態によれば、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立して、水素または１から１０個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基またはヒドロキシアルカリール基である。水素および１から６個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基が好ましい。アルキル、アリール、アラルキルおよび／またはアルカリール基は直鎖状または分岐し、適当に置換されてよい。
【００３３】
従って、本発明はまた、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立して、水素または１から６個の炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐したヒドロキシアルキル基である、前記した方法にも関する。
【００３４】
従って、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3はヒドロキシヘキシル、ヒドロキシペンチル、ヒドロキシブチル、ヒドロキシプロピル、例えば１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシイソプロピル、２−ヒドロキシイソプロピル、ヒドロキシエチル、例えば１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、またはヒドロキシメチルでよい。水素およびヒドロキシエチル基が好ましく、水素および２−ヒドロキシエチル基が特に好ましい。
【００３５】
従って、本発明はまたＲ1、Ｒ2およびＲ3が独立して、水素または２−ヒドロキシエチル基である前記した方法にも関する。
【００３６】
本発明に従って、ヒドロキシアルキルデンプンを式（ＩＩ）の化合物と反応させ、ここで化合物（ＩＩ）を、化合物（Ｉ）との反応の前に別の化合物と反応させてヒドロキシアルキルデンプン誘導体を得ることができる。化合物（ＩＩ）に関して、化合物（ＩＩ）を酸化されていないその還元末端でＲ’およびＲ”を架橋するＮＨ基を介して化合物（Ｉ）と反応させてヒドロキシアルキルデンプン誘導体を得ることができる場合、特別な制限はない。
【００３７】
化合物（ＩＩ）の好ましい残基Ｒ’は、水素およびアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリールまたはシクロアルキルアリール残基であり、ここでシクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリールまたはシクロアルキルアリール残基は化合物（ＩＩ）のＲ’およびＲ”を架橋するＮＨ基に直接連結されているか、または別の実施形態によれば、化合物（ＩＩ）のＲ’およびＲ”を架橋するＮＨ基への酸素橋により連結されていてよい。アルキル、アリール、アラルキルまたはアルカリール残基は適当に置換されていてよい。好ましい置換基として、ハロゲン、例えばＦ、ＣｌまたはＢｒに言及することができる。特に好ましい残基Ｒ’は水素、アルキルおよびアルコキシ基であり、そしてさらに好ましいのは水素および非置換アルキルおよびアルコキシ基である。
【００３８】
従って、本発明はまたＲ’が水素または直鎖状もしくは分岐したアルキルもしくはアルコキシ基である前記した方法にも関する。
【００３９】
アルキルおよびアルコキシ基の中で、１、２、３、４、５、または６個のＣ原子を有する基が好ましい。さらに好ましいのはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、およびイソプロポキシ基である。特に好ましいのはメチル、エチル、メトキシ、エトキシであり、そして特に好ましいのはメチルまたはメトキシである。
【００４０】
従って、本発明はまたＲ’が水素またはメチルもしくはメトキシ基である前記した方法にも関する。
【００４１】
官能基Ｘとは別に、Ｒ”は少なくとも１つのさらなる官能基Ｗを含むことができる。この少なくとも１つのさらなる官能基Ｗは概してＲ”のどこにあってもよい。好ましくは、Ｗは、Ｒ’が連結されるＮＨ基に直接連結される。
【００４２】
概して、化合物（Ｉ）が化合物（ＩＩ）と反応することができるならば、官能基Ｗに関して特別な制限はない。好ましい実施形態では、官能基Ｗは構造単位−ＮＨ−および／または構造単位−（Ｃ＝Ｇ）−（式中、ＧはＯまたはＳである）および／または構造単位−ＳＯ2−を含む。さらに好ましい実施形態によれば、官能基Ｗは；
【化２】
0004692958.tif 000003
および
（式中、Ｇが２つ存在する場合、それは独立して、ＯまたはＳである）
からなる群から選択される。
【００４３】
Ｒ’がＨであり、ＷがＲ’およびＲ”を架橋するＮＨ基に直接連結される本発明の好ましい実施形態によれば、Ｒ’並びにＲ’およびＲ”を架橋するＮＨ基はＷと一緒に以下の基：
【化３】
0004692958.tif 000004
の１つを形成する。
【００４４】
少なくとも１つの官能基Ｘが、Ｒ’および／またはＲ”、好ましくはＲ”に含まれる限り、特別の制限は存在しない。概して、少なくとも１つの別の化合物との反応を可能にする全ての官能基が可能である。
【００４５】
別の化合物とのこの反応に関する限り、少なくとも１つの官能基と少なくとも１つの別の化合物との全ての種類の相互作用が可能である。特に、共有結合、イオン結合および／またはファンデルワース結合を形成するに至る少なくとも１つの官能基Ｘと別の化合物との反応が可能であり、共有結合が特に好ましい。
【００４６】
特に、以下の官能基Ｘについて言及する。
・Ｃ−Ｃ二重結合またはＣ−Ｃ三重結合または芳香族Ｃ−Ｃ結合；
・チオ基またはヒドロキシ基；
・アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド；
・１，２−ジオール；
・１，２−アミノアルコール；
・アミノ基−ＮＨ2または構造単位−ＮＨ−を含むアミノ基の誘導体、例えばアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基；
・ヒドロキシルアミノ基−Ｏ−ＮＨ2、または構造単位−Ｏ−ＮＨ−を含むヒドロキシルアミノ基の誘導体、例えばヒドロキシルアルキルアミノ基、ヒドロキシルアリールアミノ基、ヒドロキシルアラルキルアミノ基、またはヒドロキサルアルカリールアミノ基；
・各々構造単位−ＮＨ−Ｏ−を含むアルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基、またはアルカリールオキシアミノ基；
・カルボニル基、−Ｑ−Ｃ（＝Ｇ）−Ｍを有する残基であって、ここで、ＧはＯまたはＳであり、Ｍは例えば、
・−ＯＨまたは−ＳＨ；
・アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、またはアルカリールオキシ基；
・アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、またはアルカリールチオ基；
・アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカルボニルオキシ基、アルカリールカルボニルオキシ基；
・活性化エステル、例えばイミド構造、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドを有するか、もしくはＮがヘテロアリール化合物の一部である構造単位Ｏ−Ｎを有するヒドロキシルアミンのエステル、またはＧ＝ＯおよびＱは不在である、例えば置換アリール残基、例えばペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニルまたはトロクロロフェニルを有するアリールオキシ化合物；
であり、
ここで、Ｑは不在であるかまたはＮＨもしくはヘテロ原子、例えばＳもしくはＯである；
・−ＮＨ−ＮＨ2、または−ＮＨ−ＮＨ−；
・−ＮＯ2；
・ニトリル基；
・カルボニル基、例えばアルデヒド基またはケト基；
・カルボキシ基；
・−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ基または−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基；
・ハロゲン化ビニル基、例えばヨウ化ビニルもしくは臭化ビニル基またはビニルトリフラート；
・−Ｃ≡Ｃ−Ｈ；
・−（Ｃ＝ＮＨ2Ｃｌ）−Ｏアルキル；
・−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ2−Ｈａｌの基であって、ここでＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである；
・−ＣＨ＝ＣＨ−ＳＯ2−；
・−Ｓ−Ｓ−構造を含むジスルフィド基；
【化４】
0004692958.tif 000005
の基；
【化５】
0004692958.tif 000006
の基。
【００４７】
これらの基の中で、チオ基、アミノ基、ヒドロキシルアミノ基、アルコキシアミノ基および以下の基が特に好ましい：
【化６】
0004692958.tif 000007
【００４８】
従って、本発明は、少なくとも１つの官能基Ｘが、−ＳＨ、−ＮＨ2、−Ｏ−ＮＨ2、−ＮＨ−Ｏ−アルキル、−（Ｃ＝Ｇ）−ＮＨ−ＮＨ2、−Ｇ−（Ｃ＝Ｇ）−ＮＨ−ＮＨ2、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｇ）−ＮＨ−ＮＨ2、および−ＳＯ2−ＮＨ−ＮＨ2からなる群（式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合、これは独立して、ＯまたはＳである）から選択される、前記した方法にも関する。
【００４９】
アルコキシアミノ基に関する限り、プロポキシアミノ基、エトキシアミノ基およびメトキシアミノ基が特に好ましく、特にメトキシアミノ基−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ3が好ましい。
【００５０】
本発明のさらに別の実施形態によれば、少なくとも１つの官能基Ｘは、所与の別の化合物と直接反応できないが、所望の方法で反応できるように化学的に修飾することができる基でよい。化合物（ＩＩ）に含まれる官能基Ｘのこの修飾を化合物（ＩＩ）と化合物（Ｉ）との反応の前か、または化合物（ＩＩ）と化合物（Ｉ）との反応の後のいずれかに実施することができる。化合物（ＩＩ）が少なくとも２つの、任意選択的に化学的に異なる官能基Ｘを含む場合、化合物（ＩＩ）と化合物（Ｉ）との反応の前に少なくとも１つの官能基Ｘを、および化合物（ＩＩ）と化合物（Ｉ）との反応の後に少なくとも１つの官能基Ｘを修飾することが可能である。
【００５１】
別の化合物との反応の前に修飾される官能基Ｘの例として、例えば、酸化により修飾されてアルデヒド基またはケト基を形成する１，２−アミノアルコールまたは１，２−ジオールが挙げられる。
【００５２】
別の化合物との反応の前に修飾される官能基Ｘに関する別の例は、例えば以下の式：
【化７】
0004692958.tif 000008
による化合物との反応により修飾されて、例えば、チオ基と反応する以下の式：
【化８】
0004692958.tif 000009
の構造が得られる−ＮＨ2基である。
【００５３】
別の化合物との反応の前に修飾される官能基Ｘに関する別の例は、例えば以下の式：
【化９】
0004692958.tif 000010
による化合物との反応により修飾されて、例えばチオ基と反応する以下の式：
【化１０】
0004692958.tif 000011
の構造が得られる−ＮＨ2基である。
【００５４】
少なくとも１つの官能基ＸをＲ’およびＲ”を架橋するＮＨ基に直接連結させることができる。従って、本発明の１つの実施形態によれば、官能基ＸはＲ”と同等である。ＸがＲ’およびＲ”を架橋するＮＨ基に直接連結されている化合物の具体例は、特に、
【化１１】
0004692958.tif 000012
である。
【００５５】
これもまた本発明に含まれるこのような化合物の別の具体例はＮＨ3である。
【００５６】
本発明の別の実施形態によれば、直鎖状または分岐したアルキルまたはシクロアルキルまたはアリールまたはアラルキルまたはアリールシクロアルキルまたはアルカリールまたはシクロアルキルアリール基（式中、これらの基は少なくとも１つのヘテロ原子、例えばＮ、Ｏ、Ｓを含むことができ、そしてこれらの基は適当に置換されていてよい）により、Ｒ’およびＲ”を架橋するＮＨ基を少なくとも１つの官能基Ｘから隔離することができる。Ｒ’およびＲ”を架橋するＮＨを隔離する基、および少なくとも１つの官能基Ｘの大きさは特定の必要性に適合させることができる。一般に、隔離基は概して１から６０個、好ましくは１から４０個、さらに好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から６個、そして特に好ましくは１から４個の炭素原子を有する。ヘテロ原子が存在する場合、隔離基は概して１から２０個、好ましくは１から８個、および特に好ましくは１から４個のヘテロ原子を含む。本発明の特に好ましい実施形態によれば、隔離基は１から４個の酸素原子を含む。隔離基は、例えば５から７個の炭素原子を有する、任意に分岐していてもよいアルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基を含むことができるか、またはアルキル部分が直鎖状および／または環状アルキル基でよいアラルキル基、アルカリール基でよい。なおさらに好ましい実施形態によれば、隔離基は１から２０個、好ましくは１から８個、さらに好ましくは１から６個、さらに好ましくは１から４個、そして特に好ましくは２から４個の炭素原子のアルキル鎖である。ヘテロ原子が存在する場合、１から４個の酸素原子を含む鎖が特に好ましい。
【００５７】
ＸがＲ’およびＲ”を架橋するＮＨ基から隔離されている化合物（ＩＩ）の具体例は特に、
【化１２Ａ】
0004692958.tif 000013
【化１２Ｂ】
0004692958.tif 000014
である。
【００５８】
Ｒ’およびＲ”を架橋する、ＮＨを隔離する基、および少なくとも１つの官能基Ｘは適当に置換されていてよい。好ましい置換基は、例えばＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩなどのハロゲン化物である。
【００５９】
Ｒ’およびＲ”を架橋する、ＮＨを隔離する基、および少なくとも１つの官能基Ｘは、予め決定された部位で得られた化合物が容易に切断されることを可能にする１つまたはそれ以上の切断部位、例えば、
【化１３】
0004692958.tif 000015
を含むことができる。
【００６０】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、化合物（ＩＩ）はＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）エチル］ヒドロキシルアミン
【化１４】
0004692958.tif 000016
またはカルボヒドラジド
【化１５】
0004692958.tif 000017
である。
【００６１】
従って、本発明はまた、化合物（ＩＩ）がＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）エチル］ヒドロキシルアミンまたはカルボヒドラジドである、前記した方法にも関する。
【００６２】
化合物（ＩＩ）が１つまたはそれ以上のキラル中心を含む場合、化合物（ＩＩ）は各キラル中心に関してＲ立体配座で、またはＳ立体配座で、またはラセミ化合物として存在することができる。
【００６３】
前記したように、化合物（Ｉ）はこのような化合物（ＩＩ）と、または化合物（Ｉ）との反応の前に少なくとも１つの別の化合物と反応した化合物（ＩＩ）と反応することができる。
【００６４】
化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）との反応を少なくとも１つの適当な溶媒中で実施することができる。各々の溶媒または２つまたはそれ以上の溶媒の混合物を化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応条件および化学的特性の特定の必要性に適合させることができる。本発明の特に好ましい実施形態によれば、溶媒として水を単独、または少なくとも１つのその他の溶媒との組み合わせのいずれかで用いる。少なくとも１つのその他の溶媒として、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノールおよびエタノールが挙げられる。水以外の好ましい溶媒はＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノールおよびエタノールである。
【００６５】
従って、本発明はまた、化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）との反応を水系で実施する前記した方法にも関する。
【００６６】
本発明の文脈で用いる「水系（aqueous system）」なる用語は、関係する溶媒の重量に基づいて、少なくとも１０重量％、好ましくは少なくとも５０重量％、さらに好ましくは少なくとも８０重量％、なおさらに好ましくは少なくとも９０重量％から、または１００重量％までの範囲で水を含む溶媒、または水を含む溶媒の混合物を意味する。好ましい反応溶媒は水である。
【００６７】
反応中に適用される温度に関する限り、反応が所望のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に至るのであれば、特定の制限は存在しない。
【００６８】
化合物（Ｉ）を化合物（ＩＩ）と反応させ、化合物（ＩＩ）がヒドロキシルアミンまたはヒドラジドである場合、温度は好ましくは５から４５℃の範囲、さらに好ましくは１０から３０℃の範囲、そして特に好ましくは１５から２５℃の範囲である。
【００６９】
化合物（Ｉ）を化合物（ＩＩ）と反応させ、前記反応が還元的アミノ化である場合、温度は好ましくは１００℃までの範囲、さらに好ましくは２０から９５℃の範囲、さらに好ましくは２５から９０℃の範囲、さらに好ましくは７０から９０℃の範囲、そして特に好ましくは７５から８５℃の範囲である。
【００７０】
従って、本発明はまた、化合物（ＩＩ）がヒドロキシルアミンまたはヒドラジドであり、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応が５から４５℃の温度で行われる前記した方法にも関する。
【００７１】
従って、本発明はまた、その反応が還元的アミノ化である、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応が２５から９０℃の温度で行われる前記した方法にも関する。
【００７２】
一連の反応中、温度は好ましくは前記した範囲内で変動するか、または本質的に維持されてよい。
【００７３】
化合物（Ｉ）と（ＩＩ）との反応に関する反応時間を特定の必要性に適合させることができ、概して１時間から７日間の範囲である。
【００７４】
化合物（ＩＩ）がヒドロキシルアミンまたはヒドラジドである場合、反応時間は好ましくは１時間から３日間、そしてさらに好ましくは２時間から４８時間の範囲である。
【００７５】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応が還元的アミノ化である場合、反応時間は好ましくは２時間から７日間の範囲である。
【００７６】
化合物（Ｉ）と（ＩＩ）との反応に関するｐＨ値を特定の必要性、例えば反応物質の化学的特性に適合させることができる。
【００７７】
化合物（ＩＩ）がヒドロキシルアミンまたはヒドラジドである場合、ｐＨ値は好ましくは４．５から６．５の範囲である。
【００７８】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応が還元的アミノ化である場合、ｐＨ値は好ましくは８から１２の範囲である。
【００７９】
従って、本発明はまた、化合物（ＩＩ）がヒドロキシルアミンまたはヒドラジドであり、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応が４．５から６．５のｐＨで行われる前記した方法にも関する。
【００８０】
従って、本発明はまた、その反応が還元的アミノ化である、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応が８から１２のｐＨで行われる前記した方法にも関する。
【００８１】
前記した反応条件の具体例は、例えば化合物がヒドロキシルアミンの場合、反応温度約２５℃、およびｐＨ約５．５であり、また化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応が還元的アミノ化である場合、反応温度約８０℃、およびｐＨ約１１である。
【００８２】
少なくとも１つの適当な緩衝液を添加することにより反応混合物の適当なｐＨ値を調整することができる。好ましい緩衝液の中で、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸塩またはホウ酸塩緩衝液が挙げられる。
【００８３】
本発明の好ましい実施形態によれば、化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）との反応から得られた反応生成物を少なくとも１つの官能基Ｘを介して少なくとも１つの別の化合物と反応させる。
【００８４】
必要な場合、化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）との反応の前に、少なくとも１つの官能基Ｘを少なくとも１つの適当な保護基で保護することができる。この点に関して、保護された化合物（ＩＩ）が少なくとも１つの官能基Ｘを介して化合物（Ｉ）と反応することを防ぐ全ての考え得る保護基が可能である。従って、保護基を、保護される官能基Ｘの化学的特性に依存して、例えば反応を行う溶媒または反応混合物のｐＨに依存して選択することができる。好ましい保護基は、特にベンジルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、メトキシフェニル基、２，４−ジメトキシフェニル基、トリアリールメチル基、トリチル、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、モノメチルトリチル基、ジメチルトリチル基、トリフルオロアセチル基、フタルイミン化合物、２−（トリアルキルシリル）エトキシカルボニル化合物、Ｆｍｏｃ、ｔｅｒｔ−ブチル基、またはトリアルキルシリル基である。
【００８５】
２つまたはそれ以上の異なる官能基Ｘが化合物（ＩＩ）に存在する場合、少なくとも１つの基を保護することができるが、一方少なくとも１つの別の基を保護せずにおくことができる。
【００８６】
化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）との反応の後、少なくとも１つの保護基を反応生成物に残すか、または適当な方法、例えば当業者に公知の慣用される方法により除去することができる。２つの異なる官能基Ｘを適当な保護基で保護する場合、少なくとも１つの官能基Ｘを少なくとも１つの別の化合物との別の反応に利用できるようにするために、少なくとも１つの保護基を除去し、そして化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）との反応生成物が別の化合物と反応するまで、少なくとも１つの別の官能基を保護されたままにすることができる。その後、依然保護されている官能基の保護基を除去して、残りの官能基Ｘをさらに別の化合物との反応に利用可能にすることができる。
【００８７】
少なくとも１つの保護基の使用は、反応が２つまたはそれ以上の化合物（Ｉ）と反応した化合物（ＩＩ）、すなわち多ＨＡＳ置換化合物（ＩＩ）からなるヒドロキシアルキルデンプン誘導体に至るのを防御するのに重要である。しかしながら、化合物（Ｉ）を過剰の化合物（ＩＩ）と反応させることにより同一の結果を達成することができる。過剰量の化合物（ＩＩ）を本発明の方法で用いる場合、化合物（ＩＩ）の化合物（Ｉ）に対するモル比は、２から１００の範囲であるのが好ましい。
【００８８】
いったん化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）との反応の反応生成物が形成されると、少なくとも１つの適当な方法により反応混合物からそれを単離することができる。必要に応じて、少なくとも１つの適当な方法による単離の前に、反応生成物を沈殿させることができる。
【００８９】
反応生成物を最初に沈殿させる場合、例えば反応混合物を、適当な温度で反応混合物に存在する溶媒または溶媒混合物以外の少なくとも１つの溶媒または溶媒混合物と接触させることが可能である。溶媒として水を用いる本発明の特に好ましい態様によれば、反応混合物をエタノールおよびアセトンの混合物、好ましくは１：１混合物（これは好ましくは−２０から＋５０℃の範囲、そして特に好ましくは０から２５℃の範囲の温度で前記化合物が等量であることを示している）と接触させる。
【００９０】
１つまたはそれ以上の工程を含むことができる適当な方法により反応生成物の単離を行うことができる。本発明の好ましい態様によれば、適当な方法、例えば遠心または濾過により、反応生成物を最初に反応混合物または反応物混合物と例えばエタノール・アセトン混合物との混合物から分離する。第２の工程では、分離した反応生成物を別の処理、例えば透析、遠心濾過または加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＭＰＬＣ、ゲル濾過および／または凍結乾燥のような後処理に供することができる。なおさらに好ましい態様に従って、分離した反応生成物を最初に好ましくは水に対して透析し、次に、生成物の所望の規格に従って、反応生成物の溶媒含量が十分に低くなるまで凍結乾燥する。２０から３５℃、好ましくは２５から３０℃の温度で凍結乾燥を行うことができる。
【００９１】
このように単離された化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物を、前記反応生成物に含まれる少なくとも１つの官能基Ｘを介してさらに少なくとも１つの別の化合物と反応させることができる。
【００９２】
官能基Ｘの化学的特性に応じて、この基Ｘと化学的結合を形成できる考え得るあらゆる化合物を用いることができる。この反応に関して、１つまたはそれ以上の適当な溶媒を用いることができ、全ての反応パラメーター、例えば反応中の温度、反応時間、反応物質の比率または反応混合物のｐＨ値を特定の必要性に適合させることができる。
【００９３】
本発明の特に好ましい態様に従って、少なくとも１つの官能基Ｘと化学結合を形成することができる少なくとも１つの化合物はポリペプチドまたは少なくとも２つの異なるポリペプチドの混合物である。
【００９４】
従って、本発明はまた、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物を化合物（ＩＩ）に含まれる官能基Ｘを介してポリペプチドと反応させる前記した方法にも関する。
【００９５】
本発明の別の特に好ましい態様に従って、少なくとも１つの官能基Ｘと化学結合を形成することができる少なくとも１つの別の化合物は、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物と少なくとも１つの官能基Ｘとの第１の化学結合、および第２の別の化合物との第２の化学結合を形成できる架橋化合物である。
【００９６】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、第２の別の化合物はポリペプチドまたは少なくとも２つの異なるポリペプチドの混合物である。
【００９７】
本発明のこの実施形態の文脈では、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物、第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を架橋化合物と反応させて第２のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を得ることが可能である。この第２のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を続いて第２の別の化合物、好ましくはポリペプチドと反応させて第３のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を得ることができる。
【００９８】
しかしながら、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物、第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、架橋化合物と第２の別の化合物、好ましくはポリペプチドとの反応生成物と反応させることも可能である。
【００９９】
従って、本発明はまた、架橋化合物に含まれる官能基Ｖ並びに化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物に含まれる官能基Ｘの反応を介して、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物を、架橋化合物である別の化合物と反応させる前記した方法にも関する。
【０１００】
従って、本発明はまた、架橋化合物に含まれる官能基Ｖおよび化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物に含まれる官能基Ｘの反応を介して、化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物を、架橋化合物である別の化合物と反応させ、前記架橋化合物は化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物との反応の前に第２の別の化合物と反応させている、前記した方法にも関する。
【０１０１】
従って、本発明はまた、第２の別の化合物がポリペプチド、好ましくはエリスロポエチンであり、これを架橋化合物に含まれる官能基Ｘの反応を介して架橋化合物と反応させる前記した方法にも関する。
【０１０２】
従って、本発明はまた、化合物（ＩＩ）を第１の別の化合物、好ましくは架橋化合物と反応させて第１の反応生成物が得られ、前記第１の反応生成物を第２の別の化合物と反応させて第２の反応生成物が得られ、そして前記第２の反応生成物を化合物（Ｉ）と反応させる前記した方法にも関する。
【０１０３】
従って、本発明はまた、第１の別の化合物、好ましくは架橋化合物を第２の別の化合物、好ましくはポリペプチドと反応させて第１の反応生成物が得られ、前記第１の反応生成物を化合物（ＩＩ）と反応させて第２の反応生成物が得られ、前記第２の反応生成物を化合物（Ｉ）と反応させてヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られる前記した方法にも関する。
【０１０４】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、架橋化合物を用いて化合物（ＩＩ）または化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物と、第２の別の化合物との間の化学的架橋を形成し、ここで架橋化合物と反応する第２の別の化合物の官能基が−ＳＨ基またはアルデヒド基またはケト基であり、架橋化合物と反応する化合物（ＩＩ）または化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物の官能基は構造ＮＨ−、特に好ましくは−ＮＨ2を含む基である。
【０１０５】
本発明の文脈では、「架橋化合物」なる用語は化合物（ＩＩ）または化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物と、少なくとも１つの所与の第２の別の化合物との間で結合を形成できる化学的化合物に関する。第２の別の化合物の化学的特性に依存して、架橋化合物は化合物（ＩＩ）または化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物に含まれる官能基Ｘと反応することができる少なくとも１つの官能基Ｖ、並びに第２の別の化合物と化学的結合を形成することができる少なくとも１つの別の官能基を含む。架橋化合物に含まれるこの少なくとも１つの別の官能基は官能基Ｘに関して前記で論じた型の官能基でよい。
【０１０６】
架橋化合物を用いて化合物（Ｉ）と第２の別の化合物、好ましくはポリペプチドとの間の全体的な化学的架橋の長さを延長させ、および／または第２の別の化合物を用いて、または用いずに得られた反応生成物の化学的特性に影響を及ぼし、および／またはいくつかの第２の別の化合物と化合物（Ｉ）、（ＩＩ）および架橋化合物の反応生成物との間の結合を形成できる可能性を提供することができ、および／または化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物に含まれる官能基Ｘを化学的に修飾して所与の別の化合物と反応できる前記反応生成物を提供することができる。
【０１０７】
従って、第２の別の化合物、好ましくはポリペプチドに含まれる−ＳＨ基との反応の可能性を提供するために、前記で論じ、そして−ＮＨ2基である官能基Ｘと、別の化合物、例えば、
【化１６】
0004692958.tif 000018
または
【化１７】
0004692958.tif 000019
との化学的修飾に関する本発明の実施形態は、化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物の架橋化合物との反応の具体例である。
【０１０８】
本発明の好ましい実施形態によれば、官能基ＶはＸ基として前記で論じた型の官能基でよい。
【０１０９】
別の好ましい実施形態によれば、官能基Ｘまたは官能基Ｖのいずれかはチオ基であり、官能基Ｖまたは官能基Ｘは好ましくは
【化１８】
0004692958.tif 000020
（式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩ、好ましくはＢｒまたはＩである）からなる群から選択される。
【０１１０】
別の好ましい実施形態によれば、官能基Ｘまたは官能基Ｖのいずれかは前記した活性化エステル、または任意に活性化エステルに変換され得るカルボキシ基からなる群から選択される。この特定の場合では、官能基Ｖまたは官能基Ｘは各々化学構造−ＮＨ−を含む。
【０１１１】
従って、架橋化合物は同一かまたは異なる少なくとも２つの官能基を有する化合物である。２つの官能基の場合、架橋化合物はホモ二官能性かまたはヘテロ二官能性でよい。ホモ二官能性架橋化合物は、例えば化合物（Ｉ）と（ＩＩ）との反応生成物と第２の別の化合物との間で架橋を形成する可能性を提供し、反応生成物および別の化合物は同一の型の官能基を有している。ヘテロ二官能性架橋化合物は、例えば化合物（Ｉ）と（ＩＩ）との反応生成物と第２の別の化合物との間で架橋を形成する可能性を提供し、反応生成物および別の化合物は互いに反応できない官能基を有している。
【０１１２】
架橋化合物の少なくとも２つの官能基は直接一緒に連結されるか、または直鎖状もしくは分岐したアルキルまたはシクロアルキルまたはアリールまたはアラルキルまたはアリールシクロアルキルまたはアルカリールまたはシクロアルキルアリール基により隔離されていてよく、これらの基は少なくとも１つのヘテロ原子、例えばＮ、Ｏ、Ｓを含み、そしてこれらの基は適当に置換されていてよい。架橋化合物の少なくとも２つの官能基を隔離する基の長さを特定の必要性に適合させることができる。一般に、隔離基は１から６０個、好ましくは１から４０個、さらに好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、さらに好ましくは５から１０個の炭素原子を有している。ヘテロ原子が存在する場合、隔離基は概して１から２０個、好ましくは１から８個、そして特に好ましくは１から４個のヘテロ原子を含む。なおさらに好ましい実施形態によれば、隔離基は炭素原子１から２０個のアルキルまたはアラルキル鎖である。さらに、架橋化合物は化合物（ＩＩ）に関して前記で論じた少なくとも１つの切断部位を含むことができる。
【０１１３】
本発明の文脈で言及する架橋化合物の別の例を例えば以下の表に従って分類することができる。
【０１１４】
【表１】
0004692958.tif 000021
【０１１５】
本発明の記載の最後の表１に、架橋化合物の好ましい例をいくつか列挙する。
【０１１６】
少なくとも１つの別の化合物、例えば架橋化合物が１つまたはそれ以上のキラル中心を含む場合、少なくとも１つの別の化合物は各々のキラル中心に関してＲ立体配座で、またはＳ立体配座で、またはラセミ化合物として存在し得る。
【０１１７】
本発明の文脈で用いる「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合、すなわち−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−構造を伴う結合を介して連結される少なくとも２つのアミノ酸を含む化合物を意味する。ポリペプチドは天然発生化合物または天然に発生しないポリペプチドでよく、後者は天然発生アミノ酸および／または少なくとも１つの天然に発生しないアミノ酸を含む。ポリペプチドの骨格、ポリペプチド鎖は少なくとも１つの適当な置換基でさらに置換されてよく、従って少なくとも１つの側鎖を有してよい。少なくとも１つの官能基Ｙはポリペプチド骨格の、または骨格の少なくとも１つの置換基の一部でよく、ここで態様はポリペプチド骨格の一部である少なくとも１つの官能基およびポリペプチド骨格の少なくとも１つの置換基の一部である少なくとも１つの官能基を含むことが可能である。
【０１１８】
ポリペプチドに関する限り、ポリペプチドが少なくとも１つの官能基Ｙを含んでいれば、制限は存在しない。前記官能基Ｙはポリペプチド骨格に直接連結されてもよく、または骨格の側鎖の一部でよい。側鎖もしくは官能基Ｙのいずれか、または双方は、天然発生ポリペプチドの一部であるかまたは、官能基Ｘとの反応の前に、天然発生ポリペプチド、または少なくとも部分的に天然発生でないポリペプチドに導入されてよい。
【０１１９】
さらにポリペプチドは少なくとも部分的に任意のヒトまたは動物供給源のものでよい。好ましい実施形態では、ポリペプチドはヒト供給源のものである。
【０１２０】
ポリペプチドはサイトカイン、特にエリスロポエチン、抗トロンビン（ＡＴ）、例えばＡＴ  ＩＩＩ、インターロイキン、特にインターロイキン−２、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−アルファ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＳＦ、インターロイキン−６および治療用抗体でよい。
【０１２１】
好ましい実施形態によれば、ポリペプチドは抗トロンビン（ＡＴ）、好ましくはＡＴ  ＩＩＩでよい（Ｌｅｖｙ  ＪＨ，Ｗｅｉｓｉｎｇｅｒ  Ａ，Ｚｉｏｍｅｋ  ＣＡ，Ｅｃｈｅｌａｒｄ  Ｙ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ２７，４（２００１）４０５−４１６；Ｅｄｍｕｎｄｓ  Ｔ，Ｖａｎ  Ｐａｔｔｅｎ  ＳＭ，Ｐｏｌｌｏｃｋ  Ｊ，Ｈａｎｓｏｎ  Ｅ，Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ  Ｒ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｅ，Ｍａｎａｖａｌａｎ  Ｐ，Ｚｉｏｍｅｋ  Ｃ，Ｍｅａｄｅ  Ｈ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  Ｊ，Ｃｏｌｅ  ＥＳ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｌｙ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｓｍａ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ，Ｂｌｏｏｄ  ９１，１２（１９９８）４６６１−４６７１；Ｍｉｎｎｅｍａ  ＭＣ，Ｃｈａｎｇ  ＡＣＫ，Ｊａｎｓｅｎ  ＰＭ，Ｌｕｂｂｅｒｓ  ＹＴＰ，Ｐｒａｔｔ  ＢＭ，Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ＢＧ，Ｔａｙｌｏｒ  ＦＢ，Ｈａｃｋ  ＣＥ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ  Ｂ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＩＩＩ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｂａｂｏｏｎｓ  ｌｅｔｈａｌｌｙ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｂｌｏｏｄ  ９５，４（２０００）１１１７−１１２３；Ｖａｎ  Ｐａｔｔｅｎ  ＳＭ，Ｈａｎｓｏｎ  ＥＨ，Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ  Ｒ，Ｚｈａｎｇ  Ｋ，Ｍａｎａｖａｌｎ  Ｐ，Ｃｏｌｅ  ＥＳ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ＪＭ，Ｅｄｍｕｎｄｓ  Ｔ，Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７４，１５（１９９９）１０２６８−１０２７６））。
【０１２２】
別の好ましい実施形態によれば、ポリペプチドはヒトＩＦＮベータ、特にＩＦＮベータ１ａ（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）、ＲＥＢＩＦ（登録商標）参照）およびＩＦＮベータ１ｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標）参照）である。
【０１２３】
別の好ましいポリペプチドは、ヒトＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）である。例えば、Ｎａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｗｏ  ｍＲＮＡｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：５７５−５８１，１９８６；Ｓｏｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２（１９８６）６１−６５；ａｎｄ  Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ），ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，ｉｎ：Ｆｏｒｍｕｌａｌｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｒｕｇｓ，Ｒｏｄｎｅｙ  Ｐｅａｒｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗａｎｇ，ｅｄｓ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６，３０３−３２８。
【０１２４】
少なくとも２つの異なるポリペプチドの混合物を用いる場合、少なくとも２つのポリペプチドは例えば分子量、アミノ酸の数および／または配列、種々の程度のグリコシル化、置換基の数および／または化学的特性または適当な化学結合、例えばジスルフィド架橋により連結されたポリペプチド鎖の数で異なっていてよい。
【０１２５】
本発明の好ましい実施形態によれば、任意にさらに架橋化合物と反応させてもよい、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物を、好ましくは少なくとも１つの前記した方法に従って単離し、次に任意にさらに架橋化合物と反応させてもよい化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物の少なくとも１つの官能基Ｘと反応できる少なくとも１つの官能基Ｙを有するポリペプチドと反応させて、少なくとも１つの化学的結合を形成させる。ポリペプチド、例えばタンパク質の官能基Ｙは、例えば、
【化１９】
0004692958.tif 000022
またはＮ−グリコシル化もしくはＯ−グリコシル化によりポリペプチドに連結できる炭水化物部分である。
【０１２６】
本発明の文脈では、「炭水化物部分」なる用語は、ヒドロキシアルデヒドまたはヒドロキシケトン、およびその化学的修飾を意味する（Ｒｏｍｐｐ  Ｃｈｅｍｉｅｌｅｘｉｋｏｎ，Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，９ｔｈ  ｅｄｄｉｔｉｏｎ  １９９０，Ｖｏｌｕｍｅ  ９、ｐａｇｅｓ  ２２８１−２２８５、およびそこで引用された文献）。さらに、グルコース、ガラクトース、マンノース、シアル酸等の天然発生炭水化物部分の誘導体をも意味する。用語はまた化学的酸化された天然発生炭水化物部分をも含む。酸化された炭水化物部分の構造は環状または直鎖状でよい。
【０１２７】
炭水化物部分はポリペプチド骨格に直接連結されてよい。好ましくは、炭水化物部分は炭水化物側鎖の一部である。さらに好ましくは、炭水化物部分は炭水化物側鎖の末端部分である。
【０１２８】
なおさらに好ましい実施形態では、炭水化物部分は炭水化物側鎖のガラクトース残基、好ましくは炭水化物側鎖の末端ガラクトース残基である。このガラクトース残基を、本明細書に後述するように末端シアル酸の除去、続く酸化による化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物との反応に利用することができる。
【０１２９】
さらに好ましい実施形態では、化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物を炭水化物側鎖のシアル酸残基、好ましくは炭水化物側鎖の末端シアル酸残基に連結させる。
【０１３０】
化学的または酵素的のいずれかで末端炭水化物部分の酸化を行うことができる。
【０１３１】
ポリペプチドの炭水化物部分の化学的酸化のための方法は当分野で公知であり、過ヨウ素酸での処理を含む（Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１５９１６−１５９２２（１９９２））。
【０１３２】
化学的酸化により、原理的には、末端に位置するかまたは位置しないいずれの炭水化物部分も酸化することが可能である。しかしながら、穏やかな条件（厳しい条件である１０ｍＭの過ヨウ素酸塩、室温で１時間とは対照的に、１ｍＭの過ヨウ素酸塩、０℃）を選択することにより、好ましくは炭水化物側鎖の末端シアル酸を酸化することができる。
【０１３３】
代替的に、炭水化物部分を酵素的に酸化することができる。個々の炭水化物部分の酸化のための酵素は当分野で公知であり、例えばガラクトースの場合、酵素はガラクトースオキシダーゼである。末端ガラクトース部分の酸化を意図する場合、シアル酸を炭水化物鎖に付着させることができる細胞、例えば哺乳動物細胞において、または遺伝的に修飾されていて、シアル酸を炭水化物鎖に付着させることができる細胞においてポリペプチドが生成された場合、末端シアル酸を（部分的または完全に）除去することが実際に必要である。シアル酸を除去するための化学的または酵素的方法は当分野で公知である（ＣｈａｐｌｉｎおよびＫｅｎｎｅｄｙ（ｅｄｓ．），１９９６，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ５  Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌｌ，Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｐａｇｅｓ  １７５−１７７；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｓｅｒｉｅｓ（ＩＳＢＮ  ０−９４７９４６−４４−３））。
【０１３４】
従って、本発明はまた化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物をポリペプチドに含まれる酸化された炭水化物部分を介してポリペプチドと反応させる前記した方法にも関する。
【０１３５】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、ポリペプチドの官能基はチオ基である。従って、化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物を、Ｓ原子をポリペプチドに含まれるいずれかのチオ基から誘導できるチオエーテル基を介してポリペプチドに連結することができる。
【０１３６】
チオ基はこのようにポリペプチドに存在し得る。さらに、適当な方法に従ってチオ基をポリペプチドに導入することが可能である。特に化学的方法に言及することができる。ジスルフィド架橋がポリペプチドに存在する場合、−Ｓ−Ｓ−構造を還元してチオ基を得ることが可能である。アミノ基を介するポリペプチドと、その一方はアミノ基と反応することができ、他方はＳＨ基かまたはＳＨ基の前駆体である少なくとも２つの官能基を有する化合物との反応により、ポリペプチドに存在するアミノ基をＳＨ基に転換することも可能である。アミノ基のこの修飾を、タンパク質が、少なくとも２つの異なる官能基を有し、その一方はアミノ基と反応することができ、他方はＳＨ基である化合物（Ｌ）と最初に反応する一例と見なすことができ、得られた反応生成物を次いで例えば、ＨＡＳおよび化合物（Ｄ）を含み、ＳＨ基と反応することができる官能基を含むＨＡＳ誘導体と反応させる。ポリペプチドの変異により、例えばシステインまたは適当なＳＨ官能性アミノ酸をポリペプチドに導入するか、または例えばポリペプチドからシステインを除去してポリペプチドの別のシステインを無効にしてジスルフィド架橋を形成することによりＳＨ基を導入することも可能である。
【０１３７】
この実施形態の文脈で、化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物の架橋化合物との反応の結果である反応生成物とポリペプチドとを反応させるのが特に好ましい。
【０１３８】
従って、本発明はまた化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物を架橋化合物と反応させ、得られた反応生成物をさらに、ポリペプチドに含まれる酸化された炭水化物部分および／またはチオ基を介してポリペプチドと反応させる前記した方法にも関する。
【０１３９】
特に好ましいポリペプチドとしてエリスロポエチン（ＥＰＯ）を用いる。
【０１４０】
従って、本発明はまたポリペプチドがエリスロポエチンである前記した方法にも関する。
【０１４１】
ＥＰＯはいずれかのヒト（例えば、Ｉｎｏｕｅ，Ｗａｄａ，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，１９９４，Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｕｒｉｎｅ  ｏｆ  ａｎｅｍｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１７（２），１８０−４；Ｍｉｙａｋｅ，Ｋｕｎｇ，Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ，１９７７，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２（１５），５５５８−６４参照）または別の哺乳動物供給源のものでよく、ヒト腎臓、胚性ヒト腎臓、胚性ヒト肝臓または動物、好ましくはサル腎臓のような天然発生供給源からの精製により得ることができる。さらに、「エリスロポエチン」または「ＥＰＯ」なる表現はまた、１つまたはそれ以上のアミノ酸（例えば１から２５個、好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、最も好ましくは１または２個）が別のアミノ酸と交換されており、エリスロポエチン活性を呈する（例えば欧州特許第６４０  ６１９  Ｂ１号参照）ＥＰＯ変種をも包含する。エリスロポエチン活性の測定は当分野で報告されている（インビトロ活性の測定に関して、例えばＦｉｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｌｏｏｄ，７７：１２０３  ｆｆ；Ｋｉｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓ．，１４０：３２３−３３４参照；ＥＰＯインビボ活性の測定に関して、Ｐｈ．Ｅｕｒ．２００１，９１１−９１７；Ｐｈ．Ｅｕｒ．２０００，１３１６  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｉ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔａ，７８０−７８５；欧州薬局方（１９９６／２０００）；欧州薬局方、１９９６，Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｔｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｅｕｒｏｐａ．，８，３７１−３７７；Ｆｉｂｉ，Ｈｅｒｍｅｎｔｉｎ，Ｐａｕｌｙ，Ｌａｕｆｆｅｒ，Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ．，１９９５，Ｎ−  ａｎｄ  Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｍｕｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ＢＨＫ−２１  ｃｅｌｌｓ，Ｂｌｏｏｄ，８５（５），１２２９−３６；（ＥＰＯおよび修飾されたＥＰＯ形態を雌ＮＭＲＩマウスに１、２および３日目に注射し（等量のタンパク質５０ｎｇ／マウス）、４日目に血液サンプルを採取し、網状赤血球を測定した））。ＥＰＯの活性の測定に関して試験する別の文献は、Ｂａｒｂｏｎｅ，Ａｐａｒｉｃｉｏ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔａｒａｊａｎ，Ｒｉｔｃｈｉｅ，１９９４，Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｓ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ａｓ  ａ  ｂｉｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，１２（４），５１５−２２；Ｂｏｗｅｎ，Ｃｕｌｌｉｇａｎ，Ｂｅｇｕｉｎ，Ｋｅｎｄａｌｌ，Ｖｉｌｌｉｓ，１９９４，Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｔｏｔａｌ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｒｕｍ  ｔｒａｎｓｆ��ｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，Ｌｅｕｋｅｍｉ，８（１），１５１−５；Ｄｅｌｏｒｍｅ，Ｌｏｒｅｎｚｉｎｉ，Ｇｉｆｆｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ，Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｂｏｏｎｅ，Ｅｌｌｉｏｔｔ，１９９２，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１（４１），９８７１−６；Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｏｈｅｄａ，Ｋｕｂｏｎｉｗａ，Ｔｏｍｏｎｏｈ，Ｓｈｉｍｏｎａｋａ，Ｏｃｈｉ，１９９２；Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｓｕｇａｒ  ｃｈａｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（１１），７７０３−９；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ａｋａｉ，Ｋａｗａｎｉｓｈｉ，Ｕｅｄａ，Ｍａｓｕｄａ，Ｓａｓａｋｉ，１９９１，ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｏｎ  ｉｔｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６（３０），２０４３４−９；Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｉｎｏｕｅ，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ，Ｋｕｂｏｔａ，Ｗａｄａ，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｈｏｓｈｉ，Ｋｏｚｕｔｓｕｍｉ，Ｔａｋａｓａｋｉ，Ｋｏｂａｔａ，１９８９，Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｕｇａｒ  ｃｈａｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５（２０），７８１９−２２；Ｋｕｒｔｚ，Ｅｃｋａｒｄｔ，１９８９，Ａｓｓａｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｎｅｐｈｒｏｎ．，５１（１），１１−４（Ｇｅｒｍａｎ）；Ｚｕｃａｌｉ，Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ，１９８５，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ  ａｎｄ  ｓｉｌｉｃｉｃ  ａｃｉｄ，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１３（３），８３３−７；Ｋｒｙｓｔａｌ，１９８３，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＥＥＦ），ａ  ｌａｔｅ  ａｃｔｉｎｇ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｒｏｍ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１１（１），１８−３１に記載されている。
【０１４２】
好ましくは、ＥＰＯは組換えにより生成される。これには真核または原核細胞、好ましくは哺乳動物、昆虫、酵母、細菌細胞での、またはＥＰＯの組換え生成に好都合であるいずれかその他の細胞型での生成が含まれる。さらに、ＥＰＯをトランスジェニック動物（例えば乳、血液等のような体液において）において、トランスジェニック鳥、特に家禽、好ましくはニワトリにおいて、またはトランスジェニック植物において発現することができる。
【０１４３】
ポリペプチドの組換え生成は当分野で公知である。一般に、これには適当な発現ベクターでの宿主細胞のトランスフェクション、ポリペプチドの生成を可能にする条件下での宿主細胞の培養、および宿主細胞からのポリペプチドの精製が含まれる。詳細な情報に関しては、例えば、Ｋｒｙｓｔａｌ，Ｐａｎｋｒａｔｚ，Ｆａｒｂｅｒ，Ｓｍａｒｔ，１９８６，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｔｏ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｂｙ  ａ  ｒａｐｉｄ  ｆｉｖｅ−ｓｔｅｐ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，Ｂｌｏｏｄ，６７（１），７１−９；Ｑｕｅｌｌｅ，Ｃａｓｌａｋｅ，Ｂｕｒｋｅｒｔ，Ｗｏｊｃｈｏｗｓｋｉ，１９８９，Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｌｏｏｄ，７４（２），６５２−７；欧州特許第６４０  ６１９  Ｂ１号、および欧州特許第６６８  ３５１  Ｂ１号を参照のこと。
【０１４４】
好ましい実施形態では、ＥＰＯはヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有している（欧州特許第１４８  ６０５  Ｂ２号参照）。
【０１４５】
ＥＰＯは、Ｎ−および／またはＯ−で連結されたグリコシル化を介してＥＰＯに付着している、すなわちＥＰＯがグリコシル化されている１つまたはそれ以上の炭水化物側鎖、好ましくは１から１２個、さらに好ましくは１から９個、なおさらに好ましくは１から６個、そして特に１から４個、特に好ましくは４個の炭水化物側鎖を含むことができる。通常、ＥＰＯが真核細胞において生成される場合、ポリペプチドは翻訳後グリコシル化される。結果的に、炭水化物側鎖は哺乳動物、特にヒト、昆虫または酵母細胞における生合成の間、ＥＰＯに付着していてよい。グリコシル化されたＥＰＯの構造および特性は当分野で広く研究されている（欧州特許第４２８  ２６７  Ｂ１号；欧州特許第６４０  ６１９  Ｂ１号；Ｒｕｓｈ，Ｄｅｒｂｙ，Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｒｒｙ，Ｒｏｇｅｒｓ，Ｒｏｈｄｅ，Ｋａｔｔａ，１９９５，Ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．，６７（８），１４４２−５２；Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｋｏｂａｔａ，１９９１，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｇａｒ  ｃｈａｉｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｓ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１（４），３３７−４６（Ｒｅｖｉｅｗ）。
【０１４６】
従って、本発明によるヒドロキシアルキルデンプン誘導体はＥＰＯ分子あたり少なくとも１つ、好ましくは１から１２個、さらに好ましくは１から９個、なおさらに好ましくは１から６個、そして特に好ましくは１から４個のＨＡＳ分子を含むことができる。生成物の加水分解および得られた単糖類の誘導体化の後、ＧＣ−ＭＳを用いる炭水化物組成物の定量的分析によりＥＰＯ分子あたりのＨＡＳ分子の数を決定することができる（Ｃｈａｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｋｅｎｎｅｄｙ（ｅｄｓ．），１９８６，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｓｅｒｉｅｓ（ＩＳＢＮ  ０−９４７９４６−４４−３），ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １，Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ｐａｇｅ  １−３６；Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ｐａｇｅ  ３７−５３，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ｐａｇｅ  ５５−９６参照）。
【０１４７】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、ＥＰＯに連結された炭水化物部分は炭水化物側鎖の一部である。さらに好ましくは、炭水化物部分は炭水化物側鎖の末端部分である。さらに好ましい実施形態によれば、炭水化物部分は炭水化物側鎖のガラクトース残基、好ましくは炭水化物側鎖の末端ガラクトース残基である。本明細書に後述するように、末端シアル酸の除去、続く酸化により、このガラクトース残基を化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物との反応で利用可能にすることができる。さらに好ましい実施形態では、化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物を炭水化物側鎖のシアル酸残基、好ましくは炭水化物側鎖の末端シアル酸残基に連結させる。本明細書に記載するようにシアル酸を酸化する。
【０１４８】
特に好ましくは、このガラクトース残基は末端シアル酸の除去、続く酸化により化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物、または官能基Ｘを介する化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物と架橋化合物との反応の反応生成物との反応で利用可能になる。
【０１４９】
前記したように、任意に架橋化合物と反応させてもよい、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物をＥＰＯに含まれるチオ基と反応させることができる。
【０１５０】
任意に架橋化合物と反応させてもよい、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物を、その各々が少なくとも１つの別の化合物、好ましくはポリペプチド、さらに好ましくはエリスロポエチンに含まれるチオ基および炭水化物部分と反応させることも可能である。
【０１５１】
好ましい実施形態によれば、例えばヒドロキシルアミン誘導体、例えば塩酸２−（アミノオキシ）エチルメルカプタンを用いることにより（Ｂａｕｅｒ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３０：９４９（１９６５））、またはヒドラジド誘導体、例えばチオグリコール酸ヒドラジドを用いることにより（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４２：３３２（１９７７））このＳＨ基を、好ましくは酸化された炭水化物部分に連結させることができる。
【０１５２】
別の好ましい実施形態によれば、チオ基を好ましくはＥＰＯの酸化された炭水化物部分、さらに好ましくはＥＰＯの炭水化物側鎖の一部である酸化された炭水化物部分に導入する。
【０１５３】
好ましくは、チオ基を天然発生システインから、または付加されたシステインから誘導する。さらに好ましくは、ＥＰＯはヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有し、天然発生システインはシステイン２９および／または３３である。さらに好ましい実施形態では、任意に架橋化合物と反応させてもよい、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物をシステイン２９と反応させるが、一方システイン３３を別のアミノ酸と置換する。また別に、任意に架橋化合物と反応させてもよい、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物をシステイン３３と反応させるが、一方システイン２９を別のアミノ酸と置換する。
【０１５４】
本発明の文脈で、「付加されたシステイン」なる用語はポリペプチド、好ましくはＥＰＯが野生型ポリペプチドには存在しないシステイン残基を含むことを示す。
【０１５５】
本発明のこの実施形態の文脈で、システインはＥＰＯのＮ−またはＣ−末端で付加された付加的なアミノ酸でよい。
【０１５６】
さらに、付加されたシステインを、システインまたは適当な置換システインにより天然発生アミノ酸を置換することにより付加することができる。好ましくは、本発明のこの態様の文脈では、ＥＰＯはヒトＥＰＯであり、置換されたアミノ酸残基はセリン１２６である。
【０１５７】
任意選択的に架橋化合物と反応させてもよい、化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物と少なくとも１つの別の化合物との反応の反応条件を、例えば少なくとも１つの別の化合物がポリペプチドである場合、または少なくとも１つの別の化合物が架橋化合物である場合、または少なくとも１つの別の化合物が架橋化合物およびポリペプチドの反応生成物である場合、各々の反応の特定の必要性に適合させることができる。前記した化合物の少なくとも１つを緩衝液化合物として使用できることが好ましい。前記した溶媒の少なくとも１つを溶媒または溶媒の混合物として使用できることが好ましい。単離および／または後処理を実施することができ、その好ましい方法は前記で論じた方法から選択される。
【０１５８】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物を、例えば別の化合物としてポリペプチド、好ましくはＥＰＯとさらに反応させる場合、反応のための溶媒として水を用いるのが好ましい。水に加えて、少なくとも１つの別の溶媒が存在し得る。好ましい可能な別の溶媒として、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノールまたはエタノールが挙げられる。
【０１５９】
従って、本発明はまた化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物とポリペプチド、好ましくはＥＰＯとの反応を水系で実施する前記した方法にも関する。
【０１６０】
この反応中に適用される温度に関する限り、反応が、少なくとも１つの官能基Ｘを介してポリペプチドと反応した化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物を含む所望のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に至るのであれば、特別な制限は存在しない。反応の温度は好ましくは４から３７℃の範囲、さらに好ましくは１０から３０℃の範囲、特に好ましくは１５から２５℃の範囲である。
【０１６１】
従って、本発明はまた化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物とポリペプチドとの反応を４から３７℃の温度で実施する前記した方法にも関する。
【０１６２】
一連の反応中、温度は好ましくは前記した範囲内で変動し得るか、または本質的に一定を保ってよい。
【０１６３】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物とポリペプチドとの反応の反応時間を特定の必要性に適合させることができ、一般に０．５から４８時間の範囲、好ましくは２から２４時間の範囲、そして特に好ましくは１０から２０時間の範囲である。
【０１６４】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物とポリペプチドとの反応のｐＨ値を特定の必要性、例えば反応物質の化学的特性に適合させることができる。
【０１６５】
例えば、化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物を、ヒドロキシルアミノ基−Ｏ−ＮＨ2である官能基Ｘと、ポリペプチドに含まれる少なくとも１つのアルデヒド基との反応を介して別の化合物と反応させる場合、ｐＨ値は好ましくは約４．５から６の範囲、さらに好ましくは約５．５である。
【０１６６】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物を、例えば別の化合物として架橋化合物、好ましくはＥＰＯとさらに反応させる場合、反応のための溶媒として水を用いるのが好ましい。水に加えて、少なくとも１つの別の溶媒が存在し得る。好ましい可能な別の溶媒として、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノールまたはエタノールが挙げられる。
【０１６７】
従って、本発明はまた化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物と架橋化合物との反応を水系で実施する前記した方法にも関する。
【０１６８】
この反応中に適用される温度に関する限り、反応が、少なくとも１つの官能基Ｘを介して架橋化合物と反応した化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物を含む所望のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に至るのであれば、特別な制限は存在しない。反応の温度は好ましくは４から３７℃の範囲、さらに好ましくは１０から３０℃の範囲、特に好ましくは１５から２５℃の範囲である。
【０１６９】
従って、本発明はまた化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物と架橋化合物との反応を４から３７℃の温度で実施する前記した方法にも関する。
【０１７０】
一連の反応中、温度は好ましくは前記した範囲内で変動し得るか、または本質的に一定を保ってよい。
【０１７１】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物と架橋化合物との反応の反応時間を特定の必要性に適合させることができ、そして一般に１０分から１０時間の範囲、好ましくは２０分から５時間の範囲、そしてさらに好ましくは３０分から２時間の範囲である。
【０１７２】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物と架橋化合物との反応のｐＨ値を特定の必要性、例えば反応物質の化学的特性に適合させることができる。
【０１７３】
例えば化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物を、化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物に含まれ、そしてアミノ基ＮＨ2である官能基Ｘを介して架橋化合物である架橋化合物と反応させる場合、ｐＨ値は好ましくは約７から８．５の範囲、さらに好ましくは約７．２である。
【０１７４】
化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物と架橋化合物との反応の反応生成物を、例えばポリペプチド、好ましくはＥＰＯとさらに反応させる場合、反応のための溶媒として水を用いるのが好ましい。水に加えて、少なくとも１つの別の溶媒が存在し得る。好ましい可能な別の溶媒として、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノールまたはエタノールが挙げられる。
【０１７５】
従って、本発明はまた架橋化合物とさらに反応した、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物とポリペプチドとの反応を水系で実施する前記した方法にも関する。
【０１７６】
この反応中に適用される温度に関する限り、反応が、架橋化合物と反応し、架橋化合物に含まれる少なくとも１つの官能基Ｘを介してポリペプチドとさらに反応した、化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物を含む所望のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を生ずるのであれば、特別な制限は存在しない。反応の温度は好ましくは４から３７℃の範囲、さらに好ましくは１０から３０℃の範囲、特に好ましくは１５から２５℃の範囲である。
【０１７７】
従って、本発明はまた、架橋化合物とさらに反応した化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物とポリペプチドとの反応を、４から３７℃の温度で実施する前記した方法にも関する。
【０１７８】
一連の反応中、温度は好ましくは前記した範囲内で変動し得るか、または本質的に一定を保ってよい。
【０１７９】
架橋化合物とさらに反応した化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物とポリペプチドとの反応の反応時間を特定の必要性に適合させることができ、一般に０．５から４８時間の範囲、好ましくは２から２４時間の範囲、そして特に好ましくは１０から２０時間の範囲である。
【０１８０】
架橋化合物とさらに反応した、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物とポリペプチドとの反応のｐＨ値を特定の必要性、例えば反応物質の化学的特性に適合させることができる。
【０１８１】
例えば、架橋化合物とさらに反応した、化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の反応生成物を、架橋化合物に含まれ、そしてアミノ基ＮＨ2である官能基Ｘを介してポリペプチドと反応させる場合、ｐＨ値は好ましくは約７から８．５の範囲、さらに好ましくは約７．２である。
【０１８２】
各々の場合で、反応混合物の適当なｐＨ値を少なくとも１つの適当な緩衝液の添加により調整することができる。好ましい緩衝液の中で、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液またはホウ酸緩衝液が挙げられる。
【０１８３】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物と、ポリペプチドまたは架橋化合物である少なくとも１つの別の化合物との反応から得られた反応生成物、並びに化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、架橋化合物およびポリペプチドの反応から得られた化合物を含む反応生成物を、少なくとも１つの適当な方法により反応混合物から単離し、少なくとも１つの別の処理、例えば少なくとも１つの後処理、例えば透析および／または凍結乾燥に供することができる。
【０１８４】
前記した反応生成物が一度形成されると、少なくとも１つの適当な方法によりこれを反応混合物から単離することができる。
【０１８５】
１つまたはそれ以上の工程を含んでよい適当な方法により反応生成物の単離を実施することができる。
【０１８６】
本発明の好ましい実施形態によれば、反応生成物がポリペプチドを含まない場合、好ましくは遠心により、反応生成物を最初に反応物混合物または反応混合物の混合物から分離する。第２の工程では、分離した反応生成物を別の処理、例えば透析および／または凍結乾燥のような後処理に供することができる。なおさらに好ましい実施形態によれば、分離された反応生成物を最初に好ましくは水に対して透析し、次に生成物の所望の規格に従って、反応生成物の溶媒含量が十分に低くなるまで凍結乾燥する。
【０１８７】
反応生成物がポリペプチドを含む本発明の別の実施形態によれば、実施例７．８に記載するように反応生成物を単離するのが好ましい。
【０１８８】
本発明の別の実施形態によれば、化合物（ＩＩ）を、化合物（Ｉ）との反応の前に別の化合物と反応させる。すなわち化合物（Ｉ）との反応の前に、前記するような少なくとも１つの官能基Ｘを介して化合物（ＩＩ）と少なくとも１つの官能基Ｙを含む少なくとも１つの別の化合物との反応により化合物（ＩＩ）の誘導体を生成する。
【０１８９】
化合物（ＩＩ）が最初に別の化合物、好ましくはポリペプチド、さらに好ましくはＥＰＯと反応する場合、反応のための溶媒として水を用いるのが好ましい。水に加えて、少なくとも１つの別の溶媒が存在し得る。好ましい可能な別の溶媒として、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノールまたはエタノールが挙げられる。
【０１９０】
従って、本発明はまた化合物（Ｉ）との反応の前に化合物（ＩＩ）と別の化合物、好ましくはポリペプチド、なおさらに好ましくはＥＰＯとの反応を水系で実施する前記した方法にも関する。
【０１９１】
その反応中に適用される温度に関する限り、反応が、少なくとも１つの官能基Ｘを介する少なくとも１つの別の化合物、好ましくはポリペプチド、さらに好ましくはＥＰＯと反応した化合物（ＩＩ）の反応生成物を含む所望の化合物（ＩＩ）の誘導体に至るのであれば、特別な制限は存在しない。反応の温度は好ましくは４から３７℃の範囲、さらに好ましくは１０から３０℃の範囲、特に好ましくは１５から２５℃の範囲である。
【０１９２】
従って、本発明はまた化合物（ＩＩ）と少なくとも１つの別の化合物との反応を４から３７℃の温度で実施する前記した方法にも関する。
【０１９３】
一連の反応中、温度は好ましくは前記した範囲内で変動し得るか、または本質的に一定を保ってよい。
【０１９４】
化合物（ＩＩ）と少なくとも１つの別の化合物との反応の反応時間、ｐＨ値を特定の必要性、例えば反応物質の化学的特性に適合させることができる。反応混合物の適当なｐＨ値を少なくとも１つの適当な緩衝液の添加により調整することができる。好ましい緩衝液の中で、酢酸塩、リン酸塩またはホウ酸塩緩衝液、例えば酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液またはホウ酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。
【０１９５】
少なくとも１つの適当な方法により化合物（ＩＩ）と少なくとも１つの別の化合物との反応から得られた反応生成物を反応混合物から単離し、少なくとも１つの別の処理、例えば少なくとも１つの後処理、例えば透析および／または凍結乾燥に供することができる。
【０１９６】
化合物（ＩＩ）と少なくとも１つの別の化合物との反応の反応生成物が一度形成されると、少なくとも１つの適当な方法によりこれを反応混合物から単離することができる。
【０１９７】
既に前記したように１つまたはそれ以上の工程を含んでよい適当な方法により反応生成物の単離を実施することができる。
【０１９８】
所望であれば、および／または必要であれば、化合物（ＩＩ）と少なくとも１つの別の化合物との反応の前に化合物（ＩＩ）のＲ’およびＲ”を架橋するＮＨ基を適当な保護基で保護することができる。保護基として前記した保護基の１つを用いることができる。化合物（ＩＩ）および少なくとも１つの別の化合物、例えばポリペプチド、好ましくはＥＰＯの反応生成物と化合物（Ｉ）との反応の前に、少なくとも１つの適当な方法により保護基を除去する。
【０１９９】
化合物（ＩＩ）を最初に架橋化合物または架橋化合物およびポリペプチドの反応生成物と反応させる場合、全ての反応条件をこれらの反応の特定の必要性に対して調整することができる。特に前記した緩衝液系および／または溶媒を用いることができる。
【０２００】
第２の工程で、化合物（ＩＩ）と少なくとも１つの別の化合物との反応の反応生成物を化合物（Ｉ）と反応させる。
【０２０１】
この反応のために、全ての反応条件をこれらの反応の特定の必要性に対して調整することができる。特に、前記した緩衝液系および／または溶媒を用いることができる。
【０２０２】
少なくとも１つの適当な方法により、化合物（ＩＩ）および少なくとも１つの別の化合物のの反応生成物と化合物（Ｉ）との反応から得られた反応生成物を各々の反応混合物から単離し、少なくとも１つの別の処理、例えば少なくとも１つの後処理、例えば透析および／または凍結乾燥に供することができる。この文脈で、前記した各々の適当な方法を用いることができる。
【０２０３】
一般に、天然および組換えポリペプチドの精製のための公知の手順、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたは少なくとも２つのその方法の組み合わせを用いることにより、架橋化合物を伴うかまたは伴わないいずれかのＨＡＳポリペプチドコンジュゲートの単離を行うことができる。
【０２０４】
ＨＡＳのポリペプチドへの共有結合を修飾されたタンパク質の加水分解の後の炭水化物組成分析により確認することができる。
【０２０５】
ＨＡＳ修飾されたＮグリカンの除去およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ＋／−ウェスタンブロッティング分析での予測された高移動度へのシフト観察により、ポリペプチドのＮ連結されたオリゴ糖でのＨＡＳ修飾を実証することができる。
【０２０６】
ＨＡＳ修飾された生成物のタンパク質溶解性フラグメントにおいて、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳで対応するタンパク質溶解性Ｃｙｓペプチドを検出できないことにより、システイン残基でのポリペプチドのＨＡＳ修飾を実証することができる（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  −  ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ  −  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９（１３），２３４８−５５）。Ｃｙｓ修飾されたポリペプチドのタンパク質溶解性消化の後のＨＡＳ含有分画の単離により、慣用されるアミノ酸組成物分析による対応するペプチドのこの分画の確認が可能になる。
【０２０７】
ポリペプチドまたはＨＡＳの特性に関係する本発明のＨＡＳポリペプチドに関して前記で開示した全ての実施形態を、ＨＡＳポリペプチドコンジュゲートの生成に関する本発明の方法にも適用する。さらに、ＨＡＳ−ＥＰＯまたは一般にペプチドもしくはＨＡＳに関係するその調製に関して前記で開示したすべての実施形態を、ＨＡＳポリペプチドコンジュゲートの生成に関する本発明の方法にも適用する。
【０２０８】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、ヒドロキシエチルデンプンを、好ましくは前記したホモおよびヘテロ二官能性化合物から選択される化合物（ＩＩ）と反応させ、得られた反応生成物を糖タンパク質、好ましくはエリスロポエチンと、好ましくはＥＰＯ炭水化物側鎖の酸化された末端炭水化物部分と反応させる。
【０２０９】
本発明の別の特に好ましい実施形態によれば、ヒドロキシエチルデンプンを、好ましくは前記したホモおよびヘテロ二官能性化合物から選択される化合物（ＩＩ）と反応させ、第１のヒドロキシエチルデンプン誘導体が得られる。この第１のヒドロキシエチルデンプン誘導体を続いて架橋化合物と反応させて、第２のヒドロキシエチルデンプン誘導体が得られる。この第２のヒドロキシエチルデンプン誘導体を、続いて糖タンパク質、好ましくはエリスロポエチンと、好ましくは糖タンパク質に含まれる−ＳＨ基と反応させて、第３のヒドロキシエチルデンプン誘導体が得られる。好ましくは、架橋化合物はヘテロ二官能性化合物である。さらに好ましくは、架橋化合物を第１のヒドロキシエチルデンプン誘導体に含まれる−ＮＨ−構造を含む官能基と反応させる。さらに好ましくは、この官能基は−ＮＨ2である。
【０２１０】
本発明の１つの利点は少なくとも１つの反応工程、好ましくは全ての反応工程、関与する反応工程で毒性学的に限界の溶媒を使用する必要がなく、従って、生成物の溶媒との夾雑を避けるために、生成過程の後にこれらの溶媒を除去する必要がないという点である。さらに残留する毒性学的に限界の溶媒に関して付加的な品質管理を実施する必要がない。好ましくは水に加えて、有機溶媒を用いる場合、毒性学的に限界でない溶媒、例えばエタノールおよび／またはプロピレングリコールを使用するのが好ましい。
【０２１１】
本発明の別の利点は、溶媒として水系を用いる工程で、そうでなければ有機溶媒により誘起される非可逆的または可逆的な構造変化が避けられるという点である。結果的に本発明の方法に従って得られたポリペプチド誘導体は、有機溶媒、例えばＤＭＳＯ中で調製されたものとは異なる。
【０２１２】
さらに驚くべきことに、水溶液中でのＨＡＳのポリペプチド、例えばＥＰＯへのコンジュゲーションにより副反応が最小化されるかまたは回避される。結果的に本発明の方法のこの実施形態により純度の高い改善されたヒドロキシアルキルデンプン生成物に至る。
【０２１３】
別の実施形態によれば、本発明はまた、反応の前に酸化されていないその還元末端で、式（Ｉ）：
【化２０】
0004692958.tif 000023
のヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）を式（ＩＩ）：
Ｒ’−ＮＨ−Ｒ”
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立して、水素または直鎖状もしくは分岐したヒドロキシアルキル基であり、Ｒ’もしくはＲ”またはＲ’およびＲ”のいずれかは、（Ｉ）および（ＩＩ）の反応の前または後で少なくとも１つの別の化合物と反応することができる少なくとも１つの官能基Ｘを含む）の化合物と反応させることを含む方法により得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関する。
【０２１４】
本発明の方法の文脈で既に前記したように、好ましい化合物（ＩＩ）としてＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］ヒドロキシルアミンを用い、好ましいヒドロキシアルキルデンプンとしてヒドロキシエチルデンプンを用いる。
【０２１５】
従って、本発明はまたその還元末端を介してヒドロキシエチルデンプンをＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］ヒドロキシルアミンと反応させる方法により得られるヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関する。
【０２１６】
各々の反応条件、用いた溶媒もしくは溶媒混合物並びに／または残基Ｒ’および／またはＲ”に依存して、前記した方法または複数の方法により得られるヒドロキシアルキルデンプン誘導体は以下の構造（ＩＩＩａ）：
【化２１】
0004692958.tif 000024
を有し得ることが可能である
【０２１７】
従って、本発明はまた式（ＩＩＩａ）による構造を有する前記したヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関する。
【０２１８】
例えばＲ’が水素である場合、前記した方法または複数の方法により得られるヒドロキシアルキルデンプン誘導体は以下の構造（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）を有することができ、ここで（ＩＩＩａ）および（ＩＩＩｂ）が特定の平衡分布を有する反応混合物に双方共に存在し得るということも可能である。
【化２２】
0004692958.tif 000025
【化２３】
0004692958.tif 000026
【０２１９】
従って、本発明はまた式（ＩＩＩｂ）による構造を有する前記したヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関する。
【０２２０】
さらに、本発明はまた式（ＩＩＩａ）および（ＩＩＩｂ）による構造の混合物に存在する前記したヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関する。
【０２２１】
反応条件および／または反応に用いる化合物（ＩＩ）の化学的特性に依存して、式（ＩＩＩａ）による化合物は、双方の形態の混合物もまた特定の平衡分布を有して存在し得るエクアトリアル位またはアキシアル位のＮ原子を伴って存在し得る。
【０２２２】
反応条件および／または反応に用いる化合物（ＩＩ）の化学的特性に依存して、式（ＩＩＩｂ）による化合物は、双方の形態の混合物もまた特定の平衡分布を有して存在し得るＥ立体配座またはＺ立体配座でＣ−Ｎ二重結合を伴って存在し得る。
【０２２３】
式（ＩＩＩａ）による化合物を安定化することが望ましい場合もある。これは特に式（ＩＩＩａ）による化合物が水系で生成され、および／または用いられる場合である。安定化方法としては、特にＲ’が水素である場合、式（ＩＩＩａ）による化合物のアシル化が特に好ましい。アシル化試薬として、式（ＩＶａ）：
【化２４】
0004692958.tif 000027
による所望のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に至る、全ての適当な試薬を用いることができる。
【０２２４】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、アシル化試薬の一部である残基Ｒａはメチルである。アシル化試薬として、無水カルボン酸、ハロゲン化カルボン酸、およびカルボン酸活性エステルを用いるのが好ましい。
【０２２５】
従って本発明は、前記誘導体が式（ＩＶａ）による構造を有する前記した方法により得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関する。
【０２２６】
０から３０℃の範囲、好ましくは２から２０℃の範囲、そして特に好ましくは４から１０℃の範囲の温度でアシル化を実施する。
【０２２７】
また式（ＩＩＩｂ）による化合物を安定化することが望ましい場合もある。これは特に式（ＩＩＩｂ）による化合物が水系で生成され、および／または用いられる場合である。安定化方法としては、特にＲ’が水素である場合、式（ＩＩＩｂ）による化合物の還元が特に好ましい。還元試薬として、式（ＩＶｂ）：
【化２５】
0004692958.tif 000028
による所望のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に至る、全ての適当な試薬を用いることができる。
【０２２８】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、還元試薬をして、水素化ホウ素化合物、例えばＮａＣＮＢＨ3またはＮａＢＨ4を用いることができる。
【０２２９】
従って本発明は、前記誘導体が式（ＩＶｂ）による構造を有する前記した方法により得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関する。
【０２３０】
４から１００℃の範囲、好ましくは１０から９０℃の範囲、そして特に好ましくは２５から８０℃の範囲の温度で還元を実施する。
【０２３１】
本発明はさらに化合物（ＩＩＩａ）および（ＩＩＩｂ）、（ＩＶａ）および（ＩＶｂ）、（ＩＩＩａ）および（ＩＶａ）、（ＩＩＩａ）および（ＩＶｂ）、（ＩＩＩｂ）および（ＩＶａ）、（ＩＩＩｂ）および（ＩＶｂ）、（ＩＩＩａ）および（ＩＩＩｂ）および（ＩＶａ）、（ＩＩＩａ）および（ＩＩＩｂ）および（ＩＶｂ）、（ＩＶａ）および（ＩＶｂ）および（ＩＩＩａ）、並びに（ＩＶａ）および（ＩＶｂ）および（ＩＩＩｂ）の混合物に関し、ここで（ＩＩＩａ）および／または（ＩＶａ）は独立して、Ｎ原子がエクアトリアル位またはアキシアル位である立体配座で存在でき、および／または（ＩＩＩｂ）はＥ立体配座またはＺ立体配座でＣ−Ｎ二重結合を伴って存在できる。
【０２３２】
本発明の１つの態様によれば、化合物（Ｉ）を化合物（ＩＩ）と反応させて第１の反応生成物が得られる。前記第１の反応生成物を、次いで、少なくとも１つの前記の方法により任意選択的に安定化してもよい。第１の、任意選択的に安定化されている反応生成物を、次いで、第１の反応生成物のＲ”に含まれる少なくとも１つの官能基Ｘと、少なくとも１つの別の化合物に含まれる少なくとも１つの官能基Ｙとの反応を介して、少なくとも１つの別の化合物と反応させて、第２の反応生成物を得る。前記第２の反応生成物を次いで、任意選択的に少なくとも１つの前記の方法により安定化してもよい。
【０２３３】
本発明のさらに別の態様によれば、少なくとも１つの別の化合物はポリペプチド、または架橋化合物、または架橋化合物とポリペプチドとの反応生成物である。少なくとも１つの別の化合物がポリペプチドである場合、官能基Ｙはポリペプチドに含まれる。少なくとも１つの別の化合物が架橋化合物である場合、官能基Ｙは架橋化合物に含まれ、任意選択的にポリペプチドにも含まれてもよい。少なくとも１つの別の化合物が架橋化合物とポリペプチドとの反応生成物である場合、官能基Ｙは架橋化合物に含まれる。
【０２３４】
本発明の別の態様によれば、化合物（ＩＩ）を、化合物（ＩＩ）のＲ”に含まれる少なくとも１つの官能基Ｘとの、少なくとも１つの別の化合物に含まれる官能基Ｙとの反応を介して、少なくとも１つの別の化合物と反応させて、第１の反応生成物を得る。少なくとも１つの別の化合物は、前記で論じたようにポリペプチド、または架橋化合物、または架橋化合物とポリペプチドとの反応生成物であることが好ましい。次いで、前記第１の反応生成物を、化合物（Ｉ）の還元末端と化合物（ＩＩ）の天然の残基Ｒ’およびＲ”を架橋する第１の反応生成物のＮＨ基との反応を介して化合物（Ｉ）と反応させて、第２の反応生成物が得られる。次いで前記第２の反応生成物を任意に前記の方法の少なくとも１つに従って安定化してもよい。
【０２３５】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、化合物（Ｉ）としてヒドロキシエチルデンプンを用い、化合物（ＩＩ）としてＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］ヒドロキシルアミンを用い、別の化合物として炭水化物側鎖の酸化された末端炭水化物部分を有するＥＰＯを用いる。さらに好ましくは、ヒドロキシエチルデンプンをＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］ヒドロキシルアミンと反応させて、第１のヒドロキシエチルデンプン誘導体が得られ、その第１の誘導体をさらに炭水化物側鎖の酸化された末端炭水化物部分を有するＥＰＯと反応させて、第２のヒドロキシエチルデンプン誘導体が得られる。この例では、安定化反応を行う必要は全くない。
【０２３６】
従って、本発明はまたヒドロキシエチルデンプンを、その還元末端を介してＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］ヒドロキシルアミンと反応させ、反応生成物をエリスロポエチンの炭水化物側鎖の酸化された末端炭水化物部分を介してエリスロポエチンと反応させる方法により得られるヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関する。
【０２３７】
本発明のさらに別の特に好ましい実施形態によれば、化合物（Ｉ）としてヒドロキシエチルデンプンを用い、化合物（ＩＩ）としてＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］ヒドロキシルアミンを用い、マレイミド基およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基を有するヘテロ二官能性架橋化合物を用い、少なくとも１つの−ＳＨ基を有するＥＰＯ（チオＥＰＯと称する）をポリペプチドとして用いる。さらに好ましくは、ヒドロキシエチルデンプンを、Ｏ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］ヒドロキシルアミンと反応させて、第１のヒドロキシエチルデンプン誘導体が得られ、その第１の誘導体をさらに架橋化合物のＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基と反応させて、第２の誘導体が得られ、その第２の誘導体を、マレイミド基を介してチオＥＰＯと反応させて、第３のヒドロキシエチルデンプン誘導体が得られる。
【０２３８】
以下でＨＡＳ−ＥＰＯコンジュゲートと称する、化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）並びに場合によっては架橋化合物およびエリスロポエチンの反応により形成されるヒドロキシアルキルデンプン誘導体は、コンジュゲーション前のエリスロポエチンと比較した場合、改善された生物学的安定性を呈するという利点を有する。これは主にこのヒドロキシアルキルデンプン誘導体が、肝臓および腎臓の除去系によりあまり認識されないか、または全く認識されず、従ってより長時間循環系で維持されるという事実による。さらに、ＨＡＳは部位特異的に付着するので、ＨＡＳのＥＰＯへのコンジュゲーションによりＥＰＯのインビボ生物学的活性を破壊する危険性が最小化される。
【０２３９】
インビトロ生物学的活性はＥＰＯレセプターへの結合親和性を測定するだけであるため、本発明のＨＡＳ−ＥＰＯコンジュゲートは組換えの天然のＥＰＯと本質的に同一のインビトロ生物学的活性を呈し得る。インビトロ生物学的活性を決定するための方法は当分野で公知である。
【０２４０】
さらに、ＨＡＳ−ＥＰＯはコンジュゲーションのための出発材料として用いるＥＰＯ（コンジュゲートされていないＥＰＯ）よりも大きなインビボ活性を呈する。インビボ生物学的活性を決定するための方法は当分野で公知である。
【０２４１】
コンジュゲートされていないＥＰＯのインビボ活性を１００％と設定すると、ＨＡＳ−ＥＰＯコンジュゲートは１１０％から３００％、好ましくは１１０％から２００％、さらに好ましくは１１０％から１８０％または１１０％から１５０％、最も好ましくは１１０％から１４０％のインビボ活性を呈し得る。
【０２４２】
高度にシアル化されたＡｍｇｅｎのＥＰＯ（欧州特許第４２８  ２６７  Ｂ１号参照）と比較して、高度にシアル化されたＥＰＯのインビボ活性を１００％と設定すると、ＨＡＳ−ＥＰＯは、高度にシアル化されたＥＰＯのインビボ活性の好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、なおさらに好ましくは少なくとも８５％もしくは少なくとも９５％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、または少なくとも３００％の活性を呈する。最も好ましくは、高度にシアル化されたＥＰＯのインビボ活性の少なくとも９５％の活性を呈する。
【０２４３】
本発明のＨＡＳ−ＥＰＯコンジュゲートの高いインビボ生物学的活性は、肝臓の除去系によりあまり認識されないため、および高分子量のために腎クリアランスが低下するために、ＨＡＳ−ＥＰＯコンジュゲートが、コンジュゲートされていないＥＰＯよりも循環中に長く留まるという事実に主に起因する。循環中のＥＰＯのインビボ半減期を決定する方法は当分野で公知である（Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉ，Ｌｕｎｎ，Ｄａｖｉｓ，Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｓｉｅｋｍａｎ，１９９８，Ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｄｉｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｒｋｅｄｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５（３），１１８４−８）。
【０２４４】
結果的に、現在市販により利用可能なＥＰＯよりも低頻度で投与できるＨＡＳ−ＥＰＯコンジュゲートが提供されることが本発明の大きな利点である。標準的なＥＰＯ調製物は少なくとも３日毎に投与しなければならないが、本発明のＨＡＳ−ＥＰＯコンジュゲートは好ましくは週２回、さらに好ましくは週１回投与される。
【０２４５】
さらに、本発明の方法は、低い最終収率をもたらす大規模で時間がかかる精製工程を含まないので、有効なＥＰＯ誘導体を低コストで生成することができる。すなわち、インビボ生物学的活性が低いかまたは全く呈さないことが解っているシアル化が不十分な形態のＥＰＯを精製して除去する必要がないという利点を有している。
【０２４６】
さらに本発明は治療上有効量のＨＡＳポリペプチドコンジュゲート、好ましくはＨＡＳ−ＥＰＯコンジュゲート、さらに好ましくは本発明のＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートを含む医薬組成物に関する。好ましい実施形態では、医薬組成物はさらにエリスロポエチン治療において有用な少なくとも１つの医薬的に許容される希釈剤、補助剤および／または担体を含む。
【０２４７】
従って、本発明は化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）との反応生成物を化合物（ＩＩ）に含まれる少なくとも１つの官能基Ｘを介して少なくとも１つの別の化合物と反応させるか、または化合物（Ｉ）との反応の前に化合物（ＩＩ）を少なくとも１つの官能基Ｘを介して少なくとも１つの別の化合物と反応させ、少なくとも１つの別の化合物がポリペプチドである治療上有効量の前記したヒドロキシアルキルデンプン誘導体を含む医薬組成物にも関する。
【０２４８】
本発明の好ましい実施形態によれば、ポリペプチド、好ましくはエリスロポエチンを、ポリペプチドのチオ基もしくは酸化された炭水化物部分を介して化合物（ＩＩ）と、または化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物と反応させる。
【０２４９】
本発明のなおさらに好ましい実施形態によれば、ポリペプチド、好ましくはエリスロポエチンをポリペプチドに含まれる酸化された炭水化物部分を介して化合物（ＩＩ）と、または化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物と反応させる。
【０２５０】
従って、本発明は、ポリペプチドをポリペプチドに含まれる酸化された炭水化物部分を介して化合物（ＩＩ）と、または化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物と反応させる前記した医薬組成物に関する。
【０２５１】
好ましい実施形態によれば、ポリペプチドはＧＣＳ−Ｆ、ＡＴ  ＩＩＩ、ＩＦＮ−ベータまたはエリスロポエチンであり、さらに好ましくはエリスロポエチンである。
【０２５２】
従って、本発明はまた、ポリペプチドがエリスロポエチンである前記医薬組成物にも関する。
【０２５３】
本発明の特に好ましくは実施形態によれば、水性溶媒中ヒドロキシエチルデンプンを以下の式：
【化２６】
0004692958.tif 000029
による化合物と反応させ、反応生成物をエリスロポエチンと反応させることにより前記した医薬組成物を生成する。
【０２５４】
特に好ましい実施形態によれば、前記の反応の前に過ヨウ素酸ナトリウムでエリスロポエチンを酸化する。
【０２５５】
別の特に好ましい実施形態によれば、反応の前にエリスロポエチンを部分的に脱シアル化し、続いて過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する。
【０２５６】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、実施例５に従って完全に還元されたチオＥＰＯに基づいて生成されたヒドロキシアルキルデンプン誘導体を含む医薬組成物は除外される。
【０２５７】
別の好ましい実施形態によれば、本発明はまた、化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）との反応生成物を化合物（ＩＩ）に含まれる少なくとも１つの官能基Ｘを介して少なくとも１つの別の化合物と反応させるか、または化合物（Ｉ）との反応の前に化合物（ＩＩ）を少なくとも１つの官能基Ｘを介して少なくとも１つの別の化合物と反応させ、そして少なくとも１つの別の化合物が架橋化合物であり、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の反応生成物の架橋化合物との反応生成物をポリペプチドと反応させる治療上有効量の前記したヒドロキシアルキルデンプン誘導体を含む医薬組成物にも関する。
【０２５８】
さらに別の好ましい実施形態によれば、本発明はポリペプチドがエリスロポエチンである前記した医薬組成物に関する。
【０２５９】
前記した医薬組成物は特に貧血性障害または造血機能不全障害またはそれに関連する疾患の処置に適している。
【０２６０】
本明細書で用いる「治療上有効量」とは規定の症状および投与計画に関して治療上の効果を提供する量を意味する。エリスロポエチンイソ型の投与は非経口経路によるのが好ましい。選択される具体的な経路は、処置される症状に依存する。エリスロポエチンイソ型の投与は、適当な担体、例えばヒト血清アルブミン、適当な希釈剤、例えば緩衝生理食塩水、および／または適当な補助剤を含有する処方の一部として行うのが好ましい。必要とされる投与量は患者のヘマトクリットを上昇させるのに十分な量であり、処置される症状の重篤度、用いられる投与方法等に依存して変化する。
【０２６１】
本発明の医薬組成物を用いる処置の目的は、好ましくは血中のヘモグロビン値を６．８ミリモル／ｌ以上に上昇させることである。このために、ヘモグロビン値を週あたり０．６ミリモル／ｌ〜１．６ミリモル／ｌ上昇させるように医薬組成物を投与することができる。ヘモグロビン値が８．７ミリモル／ｌを超える場合、好ましくはヘモグロビン値が８．１ミリモル／ｌ未満になるまで治療を中断すべきである。
【０２６２】
本発明の組成物を、皮下または静脈内または非経口用注射に適した処方で用いることが好ましい。このために、適当な賦形剤および担体は、例えば二水素リン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩素酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ＨＳＡおよび注射用水である。組成物を週３回、好ましくは週２回、さらに好ましくは週１回、そして最も好ましくは隔週で投与することができる。
【０２６３】
好ましくは、患者の体重あたり０．０１から１０μｇ／ｋｇ、さらに好ましくは０．１から５μｇ／ｋｇ、０．１から１μｇ／ｋｇ、または０．２〜０．９μｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．３〜０．７μｇ／ｋｇ、そして最も好ましくは０．４〜０．６μｇ／ｋｇの医薬組成物を投与する。
【０２６４】
一般に、投与あたり、好ましくは１０μｇと２００μｇの間、好ましくは１５μｇと１００μｇの間を投与する。
【０２６５】
本発明はさらにヒトまたは動物体の処置の方法において使用するための本発明によるＨＡＳポリペプチドに関する。
【０２６６】
本発明はさらに貧血性障害または造血機能不全障害またはそれに関連する疾患の処置のための医薬品の調製のための本発明のＨＡＳ−ＥＰＯコンジュゲートの使用に関する。
【０２６７】
以下の実施例、表、および図面により本発明をさらに説明するが、本発明の範囲を制限することを意図するものでは決してない。
【実施例１】
【０２６８】
還元的アミノ化によるヒドロキシエチルデンプン誘導体の形成
［実施例１．１］
ヒドロキシエチルデンプンと１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン：
【化２７】
0004692958.tif 000030
との反応
ａ）ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ１８／０．４（ＭＷ＝１８，０００Ｄ、ＤＳ＝０．４））２００ｍｇの水（５ｍｌ）溶液に、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン０．８３ミリモルおよびシアノボロハイドラートナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）５０ｍｇを加えた。得られた混合物を８０℃で１７時間インキュベートした。アセトンおよびエタノール１：１（容量／容量）冷混合物１６０ｍｌに反応混合物を加えた。遠心により沈殿物を収集し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析用チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥した。
【０２６９】
ｂ）０．８３ミリモルの１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンおよび５０ｍｇのシアノボロハイドラートナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）をヒドロキシエチルデンプン２００ｍｇの溶液へ添加することにより得られた混合物のインキュベーションもまた可能であり、２５℃で３日間行った。
【０２７０】
［実施例１．２］
ヒドロキシエチルデンプンと１，２−ジヒドロキシ−３−アミノプロパン：
【化２８】
0004692958.tif 000031
との反応
ａ）ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ１８／０．４（ＭＷ＝１８，０００Ｄ、ＤＳ＝０．４））２００ｍｇの水（５ｍｌ）溶液に、０．８３ミリモルの１，２−ジヒドロキシ−３−アミノプロパンおよび５０ｍｇのシアノボロハイドラートナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）を加えた。得られた混合物を８０℃で１７時間インキュベートした。アセトンおよびエタノール１：１（容量／容量）冷混合物１６０ｍｌに反応混合物を加えた。遠心により沈殿物を収集し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析用チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥した。
【０２７１】
ｂ）０．８３ミリモルの１，２−ジヒドロキシ−３−アミノプロパンおよび５０ｍｇのシアノボロハイドラートナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）をヒドロキシエチルデンプン２００ｍｇの溶液へ添加することにより得られた混合物のインキュベーションもまた可能であり、２５℃で３日間行った。
【０２７２】
Ｇ．Ａｖｉｇａｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３４（１９８３）：４４９−５０４に記載されるように、過ヨウ素酸による反応生成物中の１，２−ジオールの酸化的切断に起因するホルムアルデヒドの定量により１，２−ジヒドロキシ−３−アミノプロパンとＨＥＳとの反応を間接的に確認した。
【０２７３】
［実施例１．３］
ヒドロキシエチルデンプンと１，４−ジアミノブタン：
【化２９】
0004692958.tif 000032
との反応
ａ）ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ１８／０．４（ＭＷ＝１８，０００Ｄ、ＤＳ＝０．４））２００ｍｇの水（５ｍｌ）溶液に、０．８３ミリモルの１，４−ジアミノブタンおよび５０ｍｇのシアノボロハイドラートナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）を加えた。得られた混合物を８０℃で１７時間インキュベートした。アセトンおよびエタノール１：１（容量／容量）冷混合物１６０ｍｌに反応混合物を加えた。遠心により沈殿物を収集し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析用チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥した。
【０２７４】
ｂ）０．８３ミリモルの１，４−ジアミノブタンおよび５０ｍｇのシアノボロハイドラートナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）をヒドロキシエチルデンプン２００ｍｇの溶液へ添加することにより得られた混合物のインキュベーションもまた可能であり、２５℃で３日間行った。
【０２７５】
［実施例１．４］
ヒドロキシエチルデンプンと１−メルカプト−２−アミノエタン：
【化３０】
0004692958.tif 000033
との反応
ａ）ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ１８／０．４（ＭＷ＝１８，０００Ｄ、ＤＳ＝０．４））２００ｍｇの水（５ｍｌ）溶液に、０．８３ミリモルの１−メルカプト−２−アミノエタンおよび５０ｍｇのシアノボロハイドラートナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）を加えた。得られた混合物を８０℃で１７時間インキュベートした。アセトンおよびエタノール１：１（容量／容量）冷混合物１６０ｍｌに反応混合物を加えた。遠心により沈殿物を収集し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析用チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥した。
【０２７６】
ｂ）０．８３ミリモルの１−メルカプト−２−アミノエタンおよび５０ｍｇのシアノボロハイドラートナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）をヒドロキシエチルデンプン２００ｍｇの溶液へ添加することにより得られた混合物のインキュベーションもまた可能であり、２５℃で３日間行った。
【実施例２】
【０２７７】
コンジュゲーションによるヒドロキシエチルデンプン誘導体の形成
［実施例２．１］
ヒドロキシエチルデンプンとカルボヒドラジド：
【化３１】
0004692958.tif 000034
との反応
０．９６ｇのＨＥＳ１８／０．４（ＭＷ＝１８，０００Ｄ、ＤＳ＝０．４）を０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液水溶液（ｐＨ５．２）８ｍｌに溶解し、８ミリモルのカルボヒドラジド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を加えた。２５℃で１８時間攪拌した後、アセトンおよびエタノール１：１（容量／容量）冷混合物１６０ｍｌに反応混合物を加えた。遠心により沈殿した生成物を収集し、水４０ｍｌに再溶解し、水に対して３日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析用チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥した。
【０２７８】
［実施例２．２］
ヒドロキシエチルデンプンとアジピン酸ジヒドラジド：
【化３２】
0004692958.tif 000035
との反応
０．９６ｇのＨＥＳ１８／０．４（ＭＷ＝１８，０００Ｄ、ＤＳ＝０．４）を０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液水溶液（ｐＨ５．２）８ｍｌに溶解し、８ミリモルのアジピン酸ジヒドラジド（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ／Ｍａｉｎ，Ｄ）を加えた。２５℃で１８時間攪拌した後、アセトンおよびエタノール１：１（容量／容量）冷混合物１６０ｍｌに反応混合物を加えた。遠心により沈殿した生成物を収集し、水４０ｍｌに再溶解し、水に対して３日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析用チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥した。
【０２７９】
［実施例２．３］
ヒドロキシエチルデンプンと１，４−フェニレン−ビス−３−チオセミカルバジド
【化３３】
0004692958.tif 000036
との反応
０．９６ｇのＨＥＳ１８／０．４（ＭＷ＝１８，０００Ｄ、ＤＳ＝０．４）を０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液水溶液（ｐＨ５．２）８ｍｌに溶解し、８ミリモルの１，４−フェニレン−ビス−３−チオセミカルバジド（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ／Ｍａｉｎ，Ｄ）を加えた。２５℃で１８時間攪拌した後、８ｍｌの水を反応混合物に加え、懸濁液を４，５００ｒｐｍで１５分間遠心した。透明な上澄をデカントし、続いてアセトンおよびエタノール１：１（容量／容量）冷混合物１６０ｍｌに加えた。遠心により沈殿した生成物を収集し、水４０ｍｌに再溶解し、４，５００ｒｐｍで１５分間遠心した。透明な上澄を水に対して３日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析用チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥した。
【０２８０】
［実施例２．４］
ヒドロキシエチルデンプンとＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］ヒドロキシルアミン：
【化３４】
0004692958.tif 000037
との反応
Ｂｏｔｕｒｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５３：５４８５−５４９２（１９９７）に記載されるように市販により入手可能な材料から、２工程でＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］ヒドロキシルアミンを合成した。
【０２８１】
０．９６ｇのＨＥＳ１８／０．４（ＭＷ＝１８，０００Ｄ、ＤＳ＝０．４）を０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液水溶液（ｐＨ５．２）８ｍｌに溶解し、８ミリモルのＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］ヒドロキシルアミンを加えた。２５℃で１８時間攪拌した後、アセトンおよびエタノール１：１（容量／容量）冷混合物１６０ｍｌに反応混合物を加えた。遠心により沈殿した生成物を収集し、水４０ｍｌに再溶解し、水に対して３日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析用チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥した。
【実施例３】
【０２８２】
エリスロポエチンの酸化
実施例７に記載するように酸化エリスロポエチンを生成した。酸化されたエリスロポエチンとして実施例７．１１（ｃ）に記載したＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａを用いた（酸加水分解を行わず、穏やかな過ヨウ素酸酸化で処理したＥＰＯ−ＧＴ−１）。
【実施例４】
【０２８３】
ヒドロキシエチルデンプン誘導体と実施例３の酸化されたエリスロポエチンとのコンジュゲーション
［実施例４．１］
酸化されたエリスロポエチンと実施例２．１の反応生成物との反応
２０ｍＭのＰＢＳ緩衝液中で、酸化されたＥＰＯ（１．０５５μｇ／μｌ）を５Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）でｐＨ５．３に調整した。実施例２．１に従って生成された１８μｌのＨＥＳ誘導体の溶液（ＭＷ  １８ｋＤ；０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）中１８．７μｇ／μｌ）を１９μｌのＥＰＯ溶液に加え、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより提供された指示書に記載されるように、ＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、粗生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｒｏｔｉ−ブルークーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）を用いてゲルを一晩染色する。
【０２８４】
実験結果を図１に示す。タンパク質バンドの高分子量への移動によりコンジュゲーションの成功が示される。増加したバンド幅は、用いたＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に連結されたＨＥＳ誘導体の数による。
【０２８５】
［実施例４．２］
酸化エリスロポエチンと実施例２．３の反応生成物との反応
２０ｍＭのＰＢＳ緩衝液中で、酸化されたＥＰＯ（１．０５５μｇ／μｌ）を５Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）でｐＨ５．３に調整した。実施例２．３に従って生成された１８μｌのＨＥＳ誘導体の溶液（ＭＷ  １８ｋＤ；０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）中１８．７μｇ／μｌ）を１９μｌのＥＰＯ溶液に加え、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより提供された指示書に記載されるように、ＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、粗生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０２８６】
［実施例４．３］
酸化されたエリスロポエチンと実施例２．４の反応生成物との反応
２０ｍＭのＰＢＳ緩衝液中で、酸化されたＥＰＯ（１．０５５μｇ／μｌ）を５Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）でｐＨ５．３に調整した。実施例２．４に従って生成された１８μｌのＨＥＳ誘導体の溶液（ＭＷ  １８ｋＤ；０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）中１８．７μｇ／μｌ）を１９μｌのＥＰＯ溶液に加え、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより提供された指示書に記載されるように、ＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、粗生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｒｏｔｉ−ブルークーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）を用いてゲルを一晩染色する。
【０２８７】
実験結果を図２に示す。タンパク質バンドの高分子量への移動によりコンジュゲーションの成功が示されている。増加したバンド幅は、用いたＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に連結されたＨＥＳ誘導体の数による。
【実施例５】
【０２８８】
エリスロポエチンの還元によるチオＥＰＯの形成
２４１．５μｇのエリスロポエチン（ＥＰＯ−ＧＴ−１、実施例７参照）を、０．１Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｍｏｒｃａｍｂｅ，ＵＫ）（ｐＨ８．３）の５００μｌ中で、３７℃で１時間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ０．５ｍｌの濃縮器、１０ＫＤ  ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ）を用いて１３，０００ｒｐｍで遠心濾過によりＤＴＴを除去し、続いてホウ酸塩緩衝液で３回、リン酸塩緩衝液（０．１Ｍ，９．１５Ｍ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２）．で２回洗浄した。
【実施例６】
【０２８９】
架橋化合物を用いるヒドロキシエチルデンプン誘導体とチオエリスロポエチンとのコンジュゲーション
以下の実施例の各々で、Ｎ−（アルファ−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）
【化３５】
0004692958.tif 000038
を架橋化合物として用いた。
【０２９０】
［実施例６．１］
酸化されたエリスロポエチンと実施例２．１の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例２．１に従って生成され、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ，９．１５Ｍ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２）２００μｌに溶解した５０ナノモルのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５マイクロモルのＡＭＡＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）のＤＭＳＯ溶液を加えた。透明な溶液を２５℃で８０分、および４０℃で２０分インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ製の０．５ｍｌ濃縮器、５ＫＤ  ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ）を用いて１３，０００ｒｐｍで遠心濾過により残りのＡＭＡＳを除去し、各々リン酸塩緩衝液を用いて３０分、４回洗浄した。
【０２９１】
残留溶液に実施例５に従って生成された１５μｇのチオＥＰＯ（リン酸緩衝液中１μｇ／μｌ）を加え、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより提供された指示書に記載されるように、ＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、粗生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｒｏｔｉ−ブルークーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）を用いてゲルを一晩染色する。
【０２９２】
実験結果を図３に示す。タンパク質バンドの高分子量への移動によりコンジュゲーションの成功が示される。増加したバンド幅は、用いたＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に連結されたＨＥＳ誘導体の数による。
【０２９３】
［実施例６．２］
酸化されたエリスロポエチンと実施例２．２の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例２．２に従って生成され、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ，９．１５Ｍ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２）２００μｌに溶解した５０ナノモルのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５マイクロモルのＡＭＡＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）ＤＭＳＯ溶液を加えた。透明な溶液を２５℃で８０分、および４０℃で２０分インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ０．５ｍｌ濃縮器、５ＫＤ  ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ）を用いて１３，０００ｒｐｍで遠心濾過により残りのＡＭＡＳを除去し、各々リン酸塩緩衝液を用いて３０分、４回洗浄した。
【０２９４】
残留溶液に実施例５に従って生成された１５μｇのチオＥＰＯ（リン酸緩衝液中１μｇ／μｌ）を加え、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより提供された指示書に記載されるように、ＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，米国）を用いて、粗生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｒｏｔｉ−ブルークーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）を用いてゲルを一晩染色する。
【０２９５】
実験結果を図４に示す。タンパク質バンドの高分子量への移動によりコンジュゲーションの成功が示される。増加したバンド幅は、用いたＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に連結されたＨＥＳ誘導体の数による。
【０２９６】
［実施例６．３］
酸化されたエリスロポエチンと実施例２．３の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例２．３に従って生成され、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ，９．１５Ｍ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２）２００μｌに溶解した５０ナノモルのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５マイクロモルのＡＭＡＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）のＤＭＳＯ溶液を加えた。透明な溶液を２５℃で８０分、および４０℃で２０分インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ０．５ｍｌ濃縮器、５ＫＤ  ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ）を用いて１３，０００ｒｐｍで遠心濾過により残りのＡＭＡＳを除去し、各々リン酸塩緩衝液を用いて３０分、４回洗浄した。
【０２９７】
残留溶液に実施例５に従って生成された１５μｇのチオＥＰＯ（リン酸緩衝液中１μｇ／μｌ）を加え、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより提供された指示書に記載されるように、ＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、粗生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｒｏｔｉ−ブルークーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）を用いてゲルを一晩染色する。
【０２９８】
実験結果を図４に示す。タンパク質バンドの高分子量への移動によりコンジュゲーションの成功が示される。増加したバンド幅は、用いたＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に連結されたＨＥＳ誘導体の数による。
【０２９９】
［実施例６．４］
酸化エリスロポエチンと実施例２．４の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例２．４に従って生成され、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ，９．１５Ｍ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２）２００μｌに溶解した５０ナノモルのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５マイクロモルのＡＭＡＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）のＤＭＳＯ溶液を加えた。透明な溶液を２５℃で８０分、および４０℃で２０分インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ０．５ｍｌ濃縮器、５ＫＤ  ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ）を用いて１３，０００ｒｐｍで遠心濾過により残りのＡＭＡＳを除去し、各々リン酸塩緩衝液を用いて３０分、４回洗浄した。
【０３００】
残留溶液に実施例５に従って生成された１５μｇのチオＥＰＯ（リン酸緩衝液中１μｇ／μｌ）を加え、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより提供された指示書に記載されるように、ＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、粗生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｒｏｔｉ−ブルークーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）を用いてゲルを一晩染色する。
【０３０１】
実験結果を図３に示す。タンパク質バンドの高分子量への移動によりコンジュゲーションの成功が示される。増加したバンド幅は、用いたＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に連結されたＨＥＳ誘導体の数による。
【０３０２】
［実施例６．５］
酸化されたエリスロポエチンと実施例１．１の反応生成物および架橋化合物との反応
８０℃で１７時間（実施例１．１ａ）および２５℃で３日（実施例１．１ｂ）のインキュベーション条件で実施例１．１に従って生成され、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ，９．１５Ｍ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２）２００μｌに溶解した５０ナノモルのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５マイクロモルのＡＭＡＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）のＤＭＳＯ溶液を加えた。透明な溶液を２５℃で８０分、および４０℃で２０分インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ０．５ｍｌ濃縮器、５ＫＤ  ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ）を用いて１３，０００ｒｐｍで遠心濾過により残りのＡＭＡＳを除去し、各々リン酸塩緩衝液を用いて３０分、４回洗浄した。
【０３０３】
残留溶液に実施例５に従って生成された１５μｇのチオＥＰＯ（リン酸緩衝液中１μｇ／μｌ）を加え、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより提供された指示書に記載されるように、ＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、粗生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｒｏｔｉ−ブルークーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）を用いてゲルを一晩染色する。
【０３０４】
実験結果を図４に示す。タンパク質バンドの高分子量への移動によりコンジュゲーションの成功が示される。増加したバンド幅は、用いたＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に連結されたＨＥＳ誘導体の数による。
【０３０５】
［実施例６．６］
酸化されたエリスロポエチンと実施例１．３の反応生成物および架橋化合物との反応
８０℃で１７時間（実施例１．３ａ）および２５℃で３日（実施例１．３ｂ）のインキュベーション条件で実施例１．１に従って生成され、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ，９．１５Ｍ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２）２００μｌに溶解した５０ナノモルのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５マイクロモルのＡＭＡＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）のＤＭＳＯ溶液を加えた。透明な溶液を２５℃で８０分、および４０℃で２０分インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ０．５ｍｌ濃縮器、５ＫＤ  ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ）を用いて１３，０００ｒｐｍで遠心濾過により残りのＡＭＡＳを除去し、各々リン酸塩緩衝液を用いて３０分、４回洗浄した。
【０３０６】
残留溶液に実施例５に従って生成された１５μｇのチオＥＰＯ（リン酸緩衝液中１μｇ／μｌ）を加え、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより提供された指示書に記載されるように、ＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、粗生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｒｏｔｉ−ブルークーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）を用いてゲルを一晩染色する。
【０３０７】
実験結果を図４に示す。タンパク質バンドの高分子量への移動によりコンジュゲーションの成功が示される。増加したバンド幅は、用いたＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に連結されたＨＥＳ誘導体の数による。
【実施例７】
【０３０８】
調製用のＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートの生成
要旨
ＨＥＳ誘導体（平均分子量１８，０００ダルトン；ヒドロキシエチル置換度０．４）の組換えヒトＥＰＯのオリゴ糖鎖の部分的に酸化された（穏やかな過ヨウ素酸）シアル酸残基へのカップリングによりＨＡＳ−ＥＰＯコンジュゲートを合成した。炭水化物構造分析に基づいて、穏やかな酸処理されたＨＥＳ修飾グリカンのＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳは未修飾ＥＰＯ生成物で観察されたものと区別できない無傷の中性のＮ−アセチルラクトースアミン型鎖を示したので、導入された修飾はコアオリゴ糖鎖の構造完全性に影響しなかった。得られた結果により、先に部分的シアル酸除去を行わずに修飾したＥＰＯ調製物の場合、ＥＰＯ分子あたり少なくとも３つの修飾されたＨＥＳ残基が付着することが示される。元のタンパク質の約５０％のシアル酸残基を欠如するＥＰＯ変種は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで類似の見かけの高分子量移動度を示した（ＢＲＰ  ＥＰＯ標準に関して６０〜１１０ｋＤａ対４０ｋＤａ）。ＨＥＳ修飾されたＥＰＯは標準的なイオン交換クロマトグラフィー条件下、室温、ｐＨ３〜１０で安定である。
【０３０９】
ｎｏｒｍｏｃｙｔｈａｅｍｉｃマウス系のＥＰＯバイオアッセイにより、ＨＥＳ修飾されたＥＰＯはこのアッセイで、欧州薬局方およびＢＲＰ  ＥＰＯ標準調製物に対して修正されたＲＰ−ＨＰＬＣ  ＥＰＯタンパク質測定方法のＵＶ吸収値を用いるタンパク質測定に基づく国際ＢＲＰ  ＥＰＯ基準値と比較して２．５〜３．０倍高い特異活性（ＩＵ／ｍｇ）を有することが示される。
【０３１０】
［実施例７．１］
材料および方法
（ａ）Ｎ−グリコシダーゼでの消化によるＮ−連結オリゴ糖の分離
サンプルを２５単位（製造者の規格による、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の組換えＰＮＧアーゼＦと共に３７℃で一晩インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるタンパク質の特定の移動度シフトにより完全な消化をモニター観察した。３容量の冷１００％エタノールの添加、および−２０℃で少なくとも２時間のインキュベーションにより放出されたＮ−グリカンをポリペプチドから分離した（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９））。４℃、１３０００ｒｐｍで１０分間の遠心により沈殿したタンパク質を除去した。次いでペレットを、氷冷７５％エタノール５００μｌを用いてさらに２回洗浄した。プールした上澄中のオリゴ糖を真空遠心で乾燥した（Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ，Ｓａｖａｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）。使用前に以下のようにＨｙｐｅｒｃａｒｂカートリッジ（ＨｙｐｅｒＣａｒｂ２５ｍｇまたは１００ｍｇ）を用いてグリカンサンプルを脱塩した。カラムを０．１％のＴＦＡ中の８０％アセトニトリル（容量／容量）３×５００μｌで洗浄し、続いて水３×５００μｌで洗浄した。サンプルを水で最終容量３００μｌから６００μｌに希釈した後、次いで水で厳密に洗浄したカートリッジに加えた。０．１％のトリフルオロ酢酸（容量／容量）を含有する水中、２５％のアセトニトリル１．２ｍｌ（２５ｍｇカートリッジ；１００ｍｇカートリッジの場合１．８ｍｌ）でオリゴ糖を溶出した。溶出したオリゴ糖を２ＭのＮＨ4ＯＨで中和し、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ濃縮器で乾燥した。Ｎ−グリコシダーゼ放出されたオリゴ糖の脱塩を、全（糖）タンパク質＜１００μｇのサンプルからの消化混合物を１００ｍｇ  Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカートリッジに吸収させることにより実施した場合もあった。
【０３１１】
（ｂ）マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＴＯＦ−ＭＳ）によるオリゴ糖の分析
Ｂｒｕｋｅｒ  ＵＬＴＲＡＦＬＥＸ飛行時間（ＴＯＦ／ＴＯＦ）装置を使用した。双方の場合でリフレクトロンを用いる陽イオンおよび陰イオン様式で、ＵＶ吸収材料として２，５−ジヒドロキシ安息香酸を用いて、天然の脱シアル化オリゴ糖を分析した。ＭＳ−ＭＳ分析のために、選択した親イオンをレーザー誘起解離（ＬＩＤ）に供し、得られたフラグメントイオンを装置の第２のＴＯＦ段階（ＬＩＦＴ）により分離した。およそ１〜１０ピコモル・μｌ-1の濃度のサンプル溶液１μｌを等量の各マトリックスと混合した。この混合物をステレススチール標的にスポットし、分析前に室温で乾燥した。
【０３１２】
［実施例７．２］
組換えヒトＥＰＯ（ＥＰＯ−ＧＴ−１）の調製およびキャラクタリゼーション
Ｍｕｅｌｌｅｒ  ＰＰ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）、Ｄｏｒｎｅｒ  ＡＪ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）に記載されるように、組換えＣＨＯ細胞からＥＰＯを発現させ、そして欧州薬局方に記載される方法（Ｐｈ．Ｅｕｒ．４，Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｙ  ０１／２００２：１３１６：エリスロポエチン濃縮溶液）に従って調製物をキャラクタリゼーションした。最終生成物のシアル酸含量はタンパク質ナノモルあたり１２ナノモル（＋／−１．５ナノモル）であった。Ｎｉｍｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）、Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ（１９９９）に記載されるように、Ｎ連結されたオリゴ糖の構造をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤおよびＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳにより決定した。得られたＥＰＯ調製物は、二、三および四シアル化オリゴ糖を含有した（各々２〜１２％、１５〜２８％、６０〜８０％、硫酸化され、五シアルされた鎖が少量存在した）。ＥＰＯ調製物の全体的なグリコシル化の特徴は、国際ＢＲＰ  ＥＰＯ標準調製物の特徴に類似した。
【０３１３】
組換えＥＰＯの等電点電気泳動のパターンは、対応するイソ型を示す国際ＢＲＰ  ＥＰＯ標準調製物のパターンに匹敵した。ＥＰＯタンパク質の２５％はポリペプチド鎖のＳｅｒ126で、Ｏ−グリコシル化されていなかった。
【０３１４】
［実施例７．３］
部分的に脱シアル化されたＥＰＯ形態の調製
ＥＰＯ  ＧＴ−１タンパク質（２．８４ｍｇ／ｍｌ）を２０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）中８０℃まで加熱し、次にＥＰＯ溶液１ｍｌあたり１ＮのＨ2ＳＯ4１００μｌを加えた。インキュベーションを各々５分、１０分および６０分続け、シアル化の程度が異なるＥＰＯ調製物を生じた。ポリペプチドＮ−グリコシダーゼを用いてオリゴ糖を放出させた後に、０〜４個のシアル酸を伴うオリゴ糖の定量を実施し、Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカートリッジ（２５ｍｇ  ＨｙｐｅｒＳｅｐ  Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ；ＴｈｅｒｍｏＨｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，ＵＫ）を用いる脱塩によりＮ連結された鎖の単離を行った。１ＮのＮａＯＨの添加によりＥＰＯ調製物を中和し、液体Ｎ2中で凍結し、さらに用いる時まで−２０℃で保存した。
【０３１５】
［実施例７．４］
シアル化されたＥＰＯ形態の過ヨウ素酸酸化
２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）３．５ｍｌに溶解した、未処理または穏やかな酸処理を行ったＥＰＯ１０ｍｇに０．１Ｍの酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５）１．５ｍｌを加え、混合物を氷浴中０℃まで冷却し、１０ｍＭの過ヨウ素酸Ｎａ５００μｌを加え、反応混合物を、暗中０℃で６０分間維持した。次いで、１０μｌのグリセロールを加え、暗中でさらに１０分間インキュベーションを続けた。ＶＩＶＡＳＰＩＮ濃縮器（１０，０００  ＭＷＣＯ，ＰＥＳ  Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ  ＡＧ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いる脱塩により、製造者の推奨に従って、固定角ローターを装着した実験用遠心器中３０００ｒｐｍで部分的に酸化されたＥＰＯ形態を試薬から分離した。液体窒素中で凍結した後、ＥＰＯ調製物を最終容量４ｍｌで、−２０℃で保存した。
【０３１６】
部分的に酸化されたＥＰＯ形態の１００μｇアリコートをＮ−グリコシダーゼ処理に供し、記載されるようにＨｙｐｅｒｃａｒｂカートリッジを用いてオリゴ糖を単離した。穏やかな酸処理によりオリゴ糖を脱シアル化し、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより分析し、その保持時間を記載される（Ｎｉｍｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）および（１９９３））真正の標準オリゴ糖の保持時間と比較した。
【０３１７】
［実施例７．５］
ジチオエリスレイトール（dithioerythreitol）によるＥＰＯジスルフィドの還元
ＥＰＯ−ＧＴ−１を３０ｍＭ  ジチオエリスレイトール（ＤＴＴ）の存在下、０．１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．１）５ｍｌ中でインキュベートし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ濃縮器を用いて４℃、４サイクルの緩衝液交換でＤＴＴの除去を達成した。最終還元ＥＰＯ調製物を液体窒素中で凍結し、５０ｍＭの酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５）中、−２０℃で保存した。
【０３１８】
［実施例７．６］
ＥＰＯタンパク質測定
欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  ４，Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｙ  ０１／２００２：１３１６：エリスロポエチン濃縮溶液）に従って、１ｃｍの路長のキュベットで２８０ｎｍのＵＶ吸収を測定することによりＥＰＯタンパク質の定量測定を実施した。加えて、ＲＰ−Ｃ４カラム（Ｖｙｄａｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ４、カタログ番号  ２１４ＴＰ５４１０，Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ，Ｃａ，ＵＳ）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣ方法を適用することによりＥＰＯを定量した。エリスロポエチンＢＲＰ１基準品を用いてＨＰＬＣ法を修正した（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ，Ｃｏｎｓｅｉｌ  ｄｅ  ｌ’Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂ．Ｐ．９０７−Ｆ６７０２９，Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ  Ｃｅｄｅｘ  １）。
【０３１９】
［実施例７．７］
ガラクトースオキシダーゼによる脱シアル化ＥＰＯの酸化
完全に脱シアル化したＥＰＯ４．４８５ｍｇをカタラーゼ（６２１４単位／２００ｍｌ）１６μｌおよびガラクトースオキシダーゼ（Ｄａｃｔｙｌｉｕｍ  ｄｅｎｄｒｏｉｄｅｓ由来、２２５０単位／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ））８０μｌの存在下、２０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．８）中でインキュベートした。３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーションの開始後、４時間および８時間にガラクトースオキシダーゼ２０μｌを２回加えた。
【０３２０】
［実施例７．８］
バイオアッセイのためのＥＰＯサンプルの調製
過ヨウ素酸酸化またはガラクトースオキシダーゼ酸化したＥＰＯタンパク質調製物と活性化ＨＥＳとのインキュベーションからのＥＰＯの精製
室温でＥＰＯサンプルの精製（未反応ＨＥＳ誘導体の除去）を実施した。ＥＰＯインキュベーション混合物（ＥＰＯタンパク質およそ５ｍｇ）を緩衝液Ａ（Ｈ2Ｏ  ｂｉｄｅｓｔ中の、２０ｍＭのＮ−モルホリンプロパンスルホン酸［ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ］、ｐＨ８．０）で１：１０に希釈し、１０カラム容量（ＣＶ）の緩衝液Ａを流速０．５ｍｌ／分で用いることにより平衡にした３ｍｌのＱ−セファロースＨＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  コード番号  １７−１０１４−０３、ロット番号  ２２０２１１）を含有するカラムに適用した。カラムを緩衝液Ａ  ６〜８ＣＶ（流速＝０．８ｍｌ／分）で洗浄し、緩衝液Ｂ（Ｈ2Ｏ  ｂｉｄｅｓｔ中の、２０ｍＭのモルホリンエタンスルホン酸［ＭＥＳ／ＮａＯＨ］、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）を流速０．５ｍｌ／分で用いて溶出を行った。２８０ｎｍでのＵＶ吸収によりＥＰＯを検出し、約６ｍｌで溶出した。緩衝液Ｃ（Ｈ2Ｏ中の、２０ｍＭのＭＥＳ，１．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５に調整）３ＣＶを用いることによりカラムを再生し、緩衝液Ａの１０ＣＶ（流速＝０．７ｍｌ／分）を用いて再度平衡にした。
【０３２１】
Ｖｉｖａｓｐｉｎ濃縮器およびリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いてサンプルあたり各々３回の遠心サイクルでＱ−セファロース工程から得られたＥＰＯ溶出物の緩衝液交換を行い、ＰＢＳでサンプルを２ｍｌに調整し、−２０℃で保存した。
【０３２２】
用いた条件下では塩基性ＥＰＯ形態はＱ−セファロースに結合せず、そして反応しなかったＨＥＳ誘導体と一緒に流出液中に見出されたので、Ｑ−セファロース溶出物からはＨＥＳ修飾に供した、部分的に脱シアル化され、続いて穏やかに過ヨウ素酸酸化されたＥＰＯ形態が、＜２５％しか得られなかった。
【０３２３】
［実施例７．９］
パルスドアンペトメトリー検出器を備えた高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー（High-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection：ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）
パルスドアンペトメトリー検出器（ＰＡＤ）と組み合わせたＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１カラム（０．４×２５ｃｍ）を装着したＤｉｏｎｅｘ  ＢｉｏＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ，米国）を用いる高ｐＨアニオン交換（ＨＰＡＥ）クロマトグラフィーにより精製された天然のオリゴ糖、および脱シアル化されたオリゴ糖を分析した（Ｓｃｈｒｏｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）；Ｎｉｍｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９））。検出器ポテンシャル（Ｅ）およびパルス幅（Ｔ）は：Ｅ１：＋５０ｍＶ，Ｔ１：４８０分；Ｅ２：＋５００ｍＶ，Ｔ２：１２０分；Ｅ３：−５００ｍＶ，Ｔ３：６０分であり、出力範囲は５００〜１５００ｎＡであった。次いでオリゴ糖を１００％の溶媒Ａで平衡にしたＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１カラムに注入した。脱シアル化されたオリゴ糖に関して、溶媒Ｂの直線グラジエント（０〜２０％）を４０分間、続いて２０〜１００％溶媒Ｂの直線的増加を５分間適用することにより溶出（流速：１ｍｌ／分-1）を行った。溶媒Ａは蒸留Ｈ2Ｏ中０．２Ｍ  ＮａＯＨであり、溶媒Ｂは溶媒Ａ中、０．６ＭのＮａＯＡｃからなるものであった。天然のオリゴ糖に関しては、カラムを１００％溶媒Ｃ（蒸留Ｈ2Ｏ中０．１Ｍ  ＮａＯＨ）で平衡にし、溶媒Ｄの直線グラジエント（０〜３５％）を４８分間、続いて３５〜１００％溶媒Ｄの直線的増加を１０分間適用することにより溶出（流速：１ｍｌ／分-1）を行った。溶媒Ｄは溶媒Ｃ中０．６Ｍ  ＮａＡｃから成った。
【０３２４】
［実施例７．１０］
ＧＣ−ＭＳによるＮ−グリカン、ＨＥＳ修飾したＮ−グリカンおよびＥＰＯタンパク質の単糖類組成分析
メタノール分解、Ｎ−再アセチル化および三メチルシリル化の後の対応するメチルグリコシドとして、ＧＣ／ＭＳにより単糖類を分析した［Ｃｈａｐｌｉｎ，Ｍ．Ｆ．（１９８２）Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２３，３３６−３４１」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２３：３３６−３４１（１９８２）］。３０ｍ  ＤＢ５キャピラリーカラムを装着した陽イオンＥＩ様式で作動させるＦｉｎｎｉｇａｎ  ＧＣＱイオントラップ質量分析器（Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ  ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析を実施した。温度プログラム：８０℃で２分間等温、次いで１０℃／分で３００℃まで。
【０３２５】
その保持時間および特徴的な分解パターンにより単糖類を識別した。電子ピーク積分の未修正結果を定量に用いた。アノマー性および／またはフラノイド形態およびピラノイド形態の存在により複数のピークを生じた単糖類を、全ての主要なピークを加算することにより定量した。内部標準化合物として、ミオイノシトール０．５μｇを用いた。
【０３２６】
［実施例７．１１］
結果
［実施例７．１１（ａ）］
穏やかに酸処理した（部分的に脱シアル化された）ＥＰＯ−ＧＴ−１のＮ−グリカンのキャラクタリゼーション
図５に示すように、Ｎ−グリコシダーゼとのインキュベーションによるＮ連結されたオリゴ糖の放出の前および後に、５、１０または６０分間の穏やかに酸処理に供したＥＰＯ−ＧＴ−１調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｎ連結されたオリゴ糖をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤオリゴ糖マッピングに供した（図６）。未処理ＥＰＯ−ＧＴ−１は３個または４個のシアル酸残基を有するＮ連結されたオリゴ糖＞９０％を含有したが、穏やかな酸の存在下での５分間のインキュベーションの後、３個または４個のシアル酸残基を有する炭水化物鎖は＜４０％であった。脱シアル化Ｎ−グリカンのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより未処理ＥＰＯ−ＧＴ−１に関して検出され、５、１０または６０分間の酸処理に供した調製物において安定なままであった中性オリゴ糖の比率が示された。脱シアル化されたグリカンのＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳにより、タンパク質の穏やかな酸処理の後＜９０％の近位フコースが存在したことが示された。
【０３２７】
［実施例７．１１（ｂ）］
過ヨウ素酸処理したＥＰＯ−ＧＴ−１のキャラクタリゼーション
予め５分間および１０分間、酸との処理に供したか、または処理しなかった、穏やかな過ヨウ素酸処理したＥＰＯ形態のＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動度を図８で比較した。シアル酸の過ヨウ素酸酸化に用いた条件はＥＰＯ調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを変化させなかった（図５と比較）。シアル酸の酸化により、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析でオリゴ糖の溶出時間が早まるシフトに至った（図６および図９と比較）。
【０３２８】
［実施例７．１１（ｃ）］
ＨＥＳ修飾されたＥＰＯ誘導体のキャラクタリゼーション
（ａａ）実施例２．４に従って生成されたＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａのヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ誘導体ＸでのＨＥＳ修飾の時間経過
４００μｇのヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ誘導体Ｘを、０．５ＭのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５．５）２０μｌ中の、２０μｇのＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ（穏やかな過ヨウ素酸酸化されたＥＰＯ、穏やかな過ヨウ素酸酸化の前に酸加水分解していない）に加え、３０分、２、４および１７時間後に各々液体窒素中でサンプルを凍結させることにより反応を停止させた。続いてサンプルをさらなる分析まで−２０℃で保存した。
【０３２９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を加え、サンプルを９０℃まで加熱し、ＳＤＳゲルに供した。図１０に示すように、インキュベーション時間を長くすると高分子量のタンパク質向きにシフトが増す結果に至った。ヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ誘導体Ｘの存在下、１７時間のインキュベーションの後、分子量標準の位置に基づいて、６０ｋＤａと１１ｋＤａの間の領域で移動する拡散したクーマシー染色タンパク質バンドが検出された（図１０の左部分）。Ｎ−グリコシダーゼで処理したとき、たいていのタンパク質は脱Ｎ−グリコシル化ＥＰＯの位置に向かってシフトした（図１０参照、右のゲル；矢印ＡはＮ−グリコシダーゼの移動位置を示し、矢印Ｂは脱Ｎ−グリコシル化ＥＰＯの移動位置を示す。２８ｋＤａと３６ｋＤａ分子量標準との間の領域に見える拡散したタンパク質バンドは恐らくＨＥＳおよび分子のＯ−グリコシル化部位により修飾されたＥＰＯ形態を表す）。Ｎ−グリコシダーゼの特異性に鑑みて、この結果から実際にＨＥＳ修飾がＥＰＯタンパク質のグリカンの過ヨウ素酸酸化されたシアル酸残基で起こると結論付けた。
【０３３０】
（ｂｂ）ＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートのキャラクタリゼーション
前記したようにＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートＩ（穏やかな過ヨウ素酸酸化後のＥＰＯ−ＧＴ−１、すなわちＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａに由来する）、ＩＩ（５分間の酸加水分解および穏やかな過ヨウ素酸酸化に供したＥＰＯ−ＧＴ−１から得られた）、ＩＩＩ（１０分間の酸加水分解および穏やかな過ヨウ素酸酸化に供したＥＰＯ−ＧＴ−１から得られた）を合成した。同一緩衝液条件下で、等量の未修飾ＨＥＳを加えた未修飾ＥＰＯ−ＧＴ−１を含有する対照インキュベーション（Ｋ）を含めた。続くＨＥＳ−ＥＰＯ誘導体の生化学的分析のために、インキュベーション混合物をさらなる精製に供した。
【０３３１】
イオン交換カラムの流出液に存在すると予測される過剰の未反応ＨＥＳ試薬を除去するために、「材料および方法」（実施例７．８）に記載するように、インキュベーションＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートＩ、ＩＩおよびＩＩＩ並びに対照インキュベーションＫをＱ−セファロース工程に供した。予め酸処理したサンプルＩＩおよびＩＩＩに含まれる高量の塩基性ＥＰＯ形態のために、流出液中にかなりの量のこれらのインキュベーションに由来する修飾されたＥＰＯ生成物が存在すると予測された。図１１に示すように、サンプルＩに由来するほぼ全てのＥＰＯ材料がＱ−セファロースカラムに保持されたが、高い塩濃度で溶出される分画ではサンプルＩＩＩおよびＩＩはおよそ２０〜３０％しか回収されなかった。ＨＥＳ誘導体Ｘを含むインキュベーションに由来する全てのタンパク質材料は、流出液中、および高塩で溶出される分画中の双方で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは対照ＥＰＯと比較してより高い見かけの分子量を有した。
【０３３２】
さらに詳細にキャラクタリゼーションするために、ＨＥＳ修飾されたＥＰＯサンプルＡおよびＫ（図１１参照）を過ヨウ素酸酸化された形態ＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａと比較した。サンプルをＮ−グリコシダーゼ処理に供し、図１２ａおよび１２ｂに示すように、Ｎ−グリカンの放出の結果、標準ＥＰＯ調製物のＯ−グリコシル化および非グリコシル化ＥＰＯ形態の位置で２つの低分子量バンドに至った。サンプルＡの場合、２８ｋＤａ分子量標準の位置で移動する別のバンドが検出され、これはこのＥＰＯ変種のＯ−グリカンでのＨＥＳ修飾を示唆している（実施例７．１１（ｃ）（ａａ）参照）。このバンド（およびＮ−グリコシル化ＥＰＯの多くＨＥＳ修飾された高分子量形態もまた、図１２ａおよび図１２ｂ参照）はサンプルを穏やかな加水分解に供した後に消失し、これはＨＥＳ修飾がエリスロポエチンの過ヨウ素酸酸化されたシアル酸残基で達成されたとする見解に合致する。
【０３３３】
オリゴ糖からシアル酸残基（およびＨＥＳ誘導体に連結されたシアル酸もまた）の完全な除去を可能にする条件を用いて、Ｎ−グリコシダーゼインキュベーション混合物のアリコートを加水分解し、中和後、次いでその脱塩のために混合物を小型のＨｙｐｅｒｃａｒｂカラムに吸収させた。カラムを水で厳密に洗浄し、続いて０．１％のトリフルオロ酢酸を含有するＨ2Ｏ中の４０％のアセトニトリルを用いて、結合した中性のオリゴ糖を溶出した。得られたオリゴ糖をＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳに供した。サンプルＡ、ＥＰＯ−ＧＴ−１−ＡおよびサンプルＫに由来する脱シアル化されたオリゴ糖分画のスペクトルはｍ／ｚ＝１８１０Ｄａ（２本鎖（diantennary））、２１７５＝３本鎖（triantennary）、２５４０＝４本鎖（tetraantennary）、２９０６＝４本鎖＋１  Ｎ−アセチルラクトースアミン反復、および３２７１＝４本鎖＋２  Ｎ−アセチルラクトースアミン反復で複合型オリゴ糖と同一の質量を示した。フコース（−１４６）およびガラクトース（マイナス１６２）の欠如に相当する小型のシグナルが検出され、これはシアル酸除去のために適用された酸加水分解条件に起因する（ＭＡＬＤＩ−図１５、１６および１７参照）。
【０３３４】
平行実験で、Ｎ−ガラクトシダーゼ消化混合物をＲＰ−Ｃ１８カートリッジ（１ｍｌに吸収させ、予めオリゴ糖を酸加水分解しない）、そして０．１％のＴＦＡを含有する水中５％のアセトニトリルで溶出を行った。これらの条件下でＥＰＯタンパク質は完全にＲＰ材料に保持され、０．１％のＴＦＡを含有するＨ2Ｏ中、５％のアセトニトリルでカラムからオリゴ糖を洗い流した。脱Ｎ−グリコシル化ＥＰＯタンパク質を、０．１％のＴＦＡを含有するＨ2Ｏ中、７０％のアセトニトリルで溶出した。Ｎ−グリコシダーゼ処理したサンプルＡ、ＥＰＯ−ＧＴ−１−ＡおよびサンプルＫのＲＰ−Ｃ１８工程に由来するオリゴ糖分画を中和し、前記したようにＨｙｐｅｒｃａｒｂカートリッジを用いる脱塩に供した。グリカンからのシアル酸の定量的除去を可能にする条件下で穏やかな酸処理の前（図１３参照）および後で単離したオリゴ糖をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤマッピングに供した（図１４参照）。
【０３３５】
ＨＥＳ修飾されたサンプルＡから得られた天然の材料に関するＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロファイルはオリゴ糖に関して無視できるシグナルのみを示したが、ＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ由来のオリゴ糖は図９に示したものと同一のグリカンプロファイルを呈した（穏やかな過ヨウ素酸処理の後ＥＰＯ−ＧＴ−１と命名されたサンプル）。対照ＥＰＯサンプル（Ｋ）から得られたオリゴ糖の溶出プロファイルは予測されたパターンを生じた（図６のプロファイルと比較）。比較するために、国際ＢＲＰ  ＥＰＯ標準の天然のオリゴ糖プロファイルを比較用に、および基準品として含める。
【０３３６】
本研究の出発材料として用いたＥＰＯ調製物に関して方法の項で記載したように、穏やかな酸加水分解の後、全てのオリゴ糖調製物は２本鎖、３本鎖および４本鎖複合型炭水化物鎖の予測される定量的および定性的組成を有する中性のオリゴ糖構造（図１４参照）と同一の溶出プロファイルを示した。この結果は、ＥＰＯサンプルのＨＥＳ修飾は、炭水化物を脱シアル化することが解っている穏やかな酸処理条件を用いてＮ−グリカンから除去されるので、Ｎ−グリコシダーゼによりＥＰＯタンパク質から除去され、そして酸に不安定であるＨＥＳ誘導体の共有結合に至ることを実証している（実施例１２ａ＋ｂ参照）。
【０３３７】
（ｃｃ）ＧＣ−ＭＳによるＨＥＳ−ＥＰＯおよびＨＥＳ−ＥＰＯ  Ｎ−グリカンの単糖類組成分析
さらに分子のＮ−グリカンでのＥＰＯのＨＥＳ修飾を確認するために、ＥＰＯサンプルをＮ−グリコシダーゼで消化し、ＥＰＯタンパク質をＲＰ−Ｃ１８カートリッジに吸収させたが、オリゴ糖材料は前記したように洗い流した。表２に示すように、グルコースおよびヒドロキシエチル化グルコース誘導体はシステイン残基でＨＥＳ修飾に供したＥＰＯタンパク質およびＥＰＯサンプルＡ２のオリゴ糖分画においてのみ検出された。
【０３３８】
［実施例７．１１（ｄ）］
ＨＥＳ修飾されたＥＰＯの生物学的活性のインビボアッセイ
欧州薬局方に記載される手順に従って、ｎｏｒｍｏｃｙｔｈａｅｍｉｃマウス系のＥＰＯバイオアッセイを実施した。ＥＰＯアッセイを実施した研究室は、国際ＢＲＰ  ＥＰＯ標準調製物を使用していた。ＨＥＳ修飾されたＥＰＯ  Ａ２調製物に関して、ＥＰＯタンパク質１ｍｇあたり２９４，６００単位の特異活性に関する平均値を測定し、これは活性アッセイを行うサンプルに含められた国際ＢＲＰ  ＥＰＯ標準調製物に比較した場合、およそ３倍高い特異活性を示した。
【０３３９】
研究結果を表３にまとめる。
【０３４０】
参考文献
【表２】
0004692958.tif 000039
【０３４１】
【表３Ａ】
0004692958.tif 000040
【表３Ｂ】
0004692958.tif 000041
【表３Ｃ】
0004692958.tif 000042
【表３Ｄ】
0004692958.tif 000043
【表３Ｅ】
0004692958.tif 000044
【表３Ｆ】
0004692958.tif 000045
【０３４２】
【表４】
0004692958.tif 000046
【０３４３】
【表５】
0004692958.tif 000047
【図面の簡単な説明】
【０３４４】
【図１】実施例４．１に従って生成されたＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。  レーンＡ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ  ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）；タンパク質マーカーの分子量（ｋＤ）、上から下へ：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４、および１７。  レーンＢ：実施例４．１によるコンジュゲーションの後の粗生成物。  レーンＣ：ＥＰＯ出発材料。
【図２】実施例４．３に従って生成されたＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。  レーンＡ：実施例４．３によるコンジュゲーションの後の粗生成物。  レーンＢ：ＥＰＯ出発材料。  レーンＣ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ  ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）；タンパク質マーカーの分子量（ｋＤ）、上から下へ：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４、および１７。
【図３】実施例６．１および６．４に従って生成されたＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。  レーンＡ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ  ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）；タンパク質マーカーの分子量（ｋＤ）、上から下へ：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４、および１７。  レーンＢ：実施例６．４によるコンジュゲーションの後の粗生成物。  レーンＣ：実施例６．１によるコンジュゲーションの後の粗生成物。  レーンＤ：ＥＰＯ出発材料。
【図４】実施例６．２、６．３、６．５および６．６に従って生成されたＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。  レーンＡ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ  ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）；タンパク質マーカーの分子量（ｋＤ）、上から下へ：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４、および１７。  レーンＢ：実施例１．３ｂ）に基づく、実施例６．６によるコンジュゲーションの後の粗生成物。  レーンＣ：実施例１．１ｂ）に基づく、実施例６．５によるコンジュゲーションの後の粗生成物。  レーンＤ：実施例１．３ａ）に基づく、実施例６．６によるコンジュゲーションの後の粗生成物。  レーンＥ：実施例１．１ａ）に基づく、実施例６．５によるコンジュゲーションの後の粗生成物。  レーンＦ：実施例６．２によるコンジュゲーションの後の粗生成物。  レーンＧ：実施例６．３によるコンジュゲーションの後の粗生成物。  レーンＫ：ＥＰＯ出発材料。
【図５】穏やかな酸処理、５分＝レーン２；１０分＝レーン３；６０分＝レーン４および未処理ＥＰＯ＝レーン１；に供したＥＰＯ−ＧＴ−１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析；Ｎ−グリカンの除去の後のＥＰＯの移動度シフトを示す（＋ＰＮＧＡＳＥ）。
【図６】未処理ＥＰＯから、並びに穏やかな酸加水分解条件下で、５分、１０分および６０分インキュベートしたＥＰＯから単離されたオリゴ糖のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤパターン。ローマ数字Ｉ〜Ｖは、Ｉ＝脱シアル化２本鎖構造、ＩＩ＝三シアル化３本鎖構造（２個の異性体）、ＩＩＩ＝四シアル化４本鎖構造＋２Ｎ−アセチルラクトースアミン反復、ＩＶ＝四シアル化４本鎖構造＋１Ｎ−アセチルラクトースアミン反復；Ｖ＝四シアル化４本鎖構造＋Ｎ−アセチルラクトースアミン反復なし、の溶出位置を示す。１−４シアル酸を伴わないオリゴ糖構造、１−４シアル酸を伴うオリゴ糖構造の溶出エリアを括弧で示す。
【図７】脱シアル化の後のＮ連結されたオリゴ糖のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ；Ｎ−アセチルノイラミン酸の溶出部分を示す；１〜９の数字は標準的なオリゴ糖の溶出位置を示す：１＝２本鎖；２＝３本鎖（２〜４異性体）、３＝３本鎖（２〜６異性体）；４＝４本鎖；５＝３本鎖＋１反復；６＝４本鎖＋１反復；７＝３本鎖＋２反復；８＝４本鎖＋２反復および９＝４本鎖＋３反復。
【図８】シアル酸残基の過ヨウ素酸酸化に供した穏やかに処理された、および未処理ＥＰＯのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。１＝酸処理を行わずに過ヨウ素酸酸化した；２＝５分間酸処理を行って過ヨウ素酸酸化した；３＝過ヨウ素酸酸化および酸処理１０分間；４＝酸処理を行わずに過ヨウ素酸酸化した；５＝過ヨウ素酸酸化を行わず、酸処理を行わないＢＲＰ  ＥＰＯ標準。
【図９】未処理ＥＰＯから、および穏やかな酸加水分解条件下で５分および１０分インキュベートし、続いて過ヨウ素酸処理したＥＰＯから単離した天然のオリゴ糖のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤパターン。１〜４個のシアル酸を伴わないオリゴ糖構造、１〜４個のシアル酸を伴うオリゴ糖構造の溶出エリアを括弧１〜５で示す。
【図１０】ＥＰＯ−ＧＴ−１−ＡのＨＥＳ修飾の経時的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：ＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａの２０μｇのアリコートをヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ誘導体Ｘと３０分、２、４および１７時間反応させた。レーン１＝反応時間３０分；レーン２＝反応時間２時間；レーン３＝反応時間４時間；レーン４＝反応時間１７時間；レーン５＝ＨＥＳ修飾を伴わないＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ。左図はヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ誘導体（流速：１ｍｌ／分）Ｘの存在下、インキュベーション時間を長くしたときのＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａの移動度のシフトを示す：レーン１＝反応時間３０分；レーン２＝反応時間２時間；レーン３＝反応時間４時間；レーン４＝反応時間１７時間；レーン５＝ＨＥＳ修飾を伴うＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ。右図はＮ−グリコシダーゼ処理後の同一サンプルの分析を示す。
【図１１】ＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートのＱ−セファロース分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。各々高塩濃度で溶出する１％流出液および１％分画をＳｐｅｅｄ  Ｖａｃ濃縮器で濃縮し、サンプル緩衝液中ゲルに負荷した。ＥＰＯタンパク質をクーマシーブルーで染色した。Ａ＝サンプルＩ；Ｂ＝サンプルＩＩ；Ｃ＝サンプルＩＩＩ；Ｋ＝対照ＥＰＯ−ＧＴ−１；Ａ１、Ｂ１、Ｃ１およびＫ１は流出液分画を示し；Ａ２、Ｂ２、Ｃ２およびＫ２は高塩濃度で溶出された分画を示す。
【図１２ａ】Ｎ連結されたオリゴ糖を除去するためにＮ−グリコシダーゼの存在下で消化した、ＨＥＳ修飾されたＥＰＯサンプルＡ２（図７参照）、対照ＥＰＯサンプルＫ２およびＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ  ＥＰＯ調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。全てのＥＰＯサンプルはＯ−グリカンを欠如するかまたは含有する低分子量形態への移動度シフトを示した。脱Ｎグリコシル後のＨＥＳ修飾されたＥＰＯサンプルＡ２に関して低比率のＯ−グリコシル化および非グリコシル化タンパク質バンドが観察され、およそ３０ｋＤａで拡散したタンパク質バンドが検出され、恐らくこれはＯ−グリカン残基のシアル酸でのＨＥＳ修飾を示している（アスタリスクにより印した矢印参照）。
【図１２ｂ】未処理またはＮ連結されたオリゴ糖を除去するためにＮ−グリコシダーゼの存在下で消化したＨＥＳ修飾されたＥＰＯサンプルＡ２（図１１参照）、対照ＥＰＯサンプルＫ２、およびＥＰＯ−ＧＴ−１Ａの穏やかな加水分解後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図１２ａ参照）。Ｎ−グリコシダーゼ処理前（Ａ２）および処理後（Ａ）の双方の高分子量形態（矢印を伴う括弧および矢印を伴わない括弧参照）がサンプルの酸処理時に消失した。比較のために流したＢＲＰ  ＥＰＯ標準は穏やかな酸処理に供さなかった。
【図１３】ＨＥＳ修飾されたサンプルＡから、ＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａから、および未修飾ＨＥＳ（Ｋ）と共にインキュベートした対照ＥＰＯサンプルから放出されたＮ連結されたオリゴ糖材料のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析。ローマ数字Ｉ〜Ｖは、Ｉ＝二シアル化２本鎖構造、ＩＩ＝三シアル化３本鎖構造（２個の異性体）、ＩＩＩ＝四シアル化４本鎖構造＋２Ｎ−アセチルラクトースアミン反復、ＩＶ＝四シアル化４本鎖構造＋１Ｎ−アセチルラクトースアミン反復；Ｖ＝四シアル化４本鎖構造＋Ｎ−アセチルラクトースアミン反復なし、の溶出位置を示す。括弧は図６および図９の説明で記載されるように、二、三および四シアル化Ｎ−グリカンの溶出位置を示す。
【図１４】ＨＥＳ修飾されたサンプルＡから、ＥＰＯ−ＧＴ−１Ａから、および未修飾ＨＥＳと共にインキュベートした対照ＥＰＯサンプル（Ｋ）から放出されたＮ連結されたオリゴ糖材料のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析。標準的なオリゴ糖の混合物の保持時間を示す。１〜９の数字は標準的なオリゴ糖の溶出位置を示す。１＝２本鎖；２＝３本鎖（２〜４異性体）、３＝３本鎖（２〜６異性体）；４＝４本鎖；５＝３本鎖＋１反復；６＝４本鎖＋１反復；７＝３本鎖＋２反復；８＝４本鎖＋２反復および９＝４本鎖＋３反復。
【図１５−２１】図１５から図２１は、ＨＥＳ修飾ＥＰＯおよび対照ＥＰＯ調製物から単離された、酵素的に放出された、および化学的に脱シアル化されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトルを示す。ｍ／ｚ  １８０９．７、２１７４．８、２５３９．９、２９０５．０および３２７０．１（［Ｍ＋Ｎａ］+）の主要なシグナルは、ＭＳ分析のためにサンプルの脱シアル化に用いた酸加水分解条件のためであるフコースまたはガラクトースの喪失のための弱いシグナルを付随するＮ−アセチルラクトースアミン反復を伴わない、１つまたは２つ伴う２から４本鎖複合型Ｎ−グリカン構造に相当する。
【図１５】ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトル：ＨＥＳ修飾されたＥＰＯ  Ａ２の脱シアル化オリゴ糖。
【図１６】ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトル：ＥＰＯ  ＧＴ−１−Ａの脱シアル化オリゴ糖。
【図１７】ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトル：ＥＰＯ  Ｋ２の脱シアル化オリゴ糖。
【図１８】ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトル：ＥＰＯ−ＧＴ−１の脱シアル化オリゴ糖。
【図１９】ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトル：酸加水分解に５分間供したＥＰＯ−ＧＴ−１の脱シアル化オリゴ糖。
【図２０】ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトル：酸加水分解に１０分間供したＥＰＯ−ＧＴ−１の脱シアル化オリゴ糖。
【図２１】ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトル：酸加水分解に６０分間供したＥＰＯ−ＧＴ−１の脱シアル化オリゴ糖。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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