(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子発現の少なくとも１種類の阻害剤またはサプレッサーと、前記遺伝子の発現産物の機能活性を抑制する少なくとも１種類の分子と、を含有する薬剤組成物であって、
前記少なくとも１種類の阻害剤またはサプレッサーがアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
遺伝子の発現産物の機能活性を抑制する前記少なくとも１種類の分子が抗体であり、
前記遺伝子が、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２及びｃ−ｅｒｂＢ−２からなる群から選択され、かつ
該薬剤組成物は、腫瘍若しくは免疫不全の治療、或いは臓器若しくは細胞移植又は細胞増殖の改善に用いるための薬剤組成物である、上記薬剤組成物。
【請求項２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、アニオン脂質、カチオン脂質、非カチオン脂質およびそれらの混合物の群から選択される脂質と共にウイルスベクターおよび／または非ウイルスベクターを含むＤＮＡデリバリーシステムに組み込まれる、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、糖部位、塩基および／またはヌクレオチド間結合のうちの１つまたは複数において、かつ／あるいは取り込み活性および／または阻害活性のエンハンサーにアンチセンスオリゴヌクレオチドを結合させることによって修飾される、請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１〜６のヌクレオチド配列のいずれか１つを有する、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
前記抗体が、抗体ライブラリーをスクリーニングし、かつ遺伝子発現産物への結合について発現産物を試験することによって得られる、請求項１から４のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載の薬剤組成物を製造するための、遺伝子発現の少なくとも１種類の阻害剤またはサプレッサーと、前記遺伝子の発現産物の機能活性を抑制する少なくとも１種類の分子と、を含有する混合物の使用であって、
前記少なくとも１種類の阻害剤またはサプレッサーがアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
遺伝子の発現産物の機能活性を抑制する前記少なくとも１種類の分子が抗体であり、かつ
前記遺伝子が、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２及びｃ−ｅｒｂＢ−２からなる群から選択される、上記使用。
【請求項７】
遺伝子発現の少なくとも１種類の阻害剤またはサプレッサーと、前記遺伝子の発現産物の機能活性を抑制する少なくとも１種類の分子とを用いて、生物学的システムを同時にまたは連続的に処置することを含む、生物学的システムにおいて遺伝子産物の機能活性を低減する方法であって、
前記少なくとも１種類の阻害剤またはサプレッサーがアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
遺伝子の発現産物の機能活性を抑制する前記少なくとも１種類の分子が抗体であり、
前記遺伝子が、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２及びｃ−ｅｒｂＢ−２からなる群から選択され、かつ
前記生物学的システムが細胞培養物、ヒトにおける細胞を除く細胞、ヒトにおける臓器を除く臓器、又はヒトを除く生物体である、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
古典的に、遺伝子産物およびそれらの誘導体‐例えばグリコシル化、リン酸化遺伝子産物もしくは他の修飾遺伝子産物の生物学的機能を調節するために使用される薬物を含む分子は、遺伝子産物および／またはそれらの誘導体を刺激するか、または抑制している。刺激または抑制は、例えば、低分子量分子、ペプチド、抗体等を含むアゴニストまたはアンタゴニストを使用することによって達成された。よく知られる例としては、Ｈ２拮抗薬およびβ遮断薬、またはＨＥＲ２タンパク質にもしくは免疫調節受容体に結合する抗体、ならびにホルモン受容体結合分子が挙げられる。
【０００２】
結合は、アプタマーおよびスピーゲルマー(Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ)などの核酸誘導体によって達成することもできる。
【０００３】
さらに最近では、アンチセンス、リボザイム、三重らせんバインダー等の発現を抑制することによる、遺伝子産物の抑制も用いられた。その例は、脳における神経伝達物質受容体の発現の抑制、または細胞成長調節タンパク質、サイトカインおよび成長因子の抑制である。
【０００４】
多種多様な遺伝子産物およびそれらの誘導体に対して、両方のアプローチ、遺伝子産物およびそれらの誘導体への分子の結合による遺伝子産物の抑制、またはその代わりに発現の抑制のいずれかが用いられてきた。
【０００５】
本発明は、遺伝子発現の少なくとも１種類の阻害剤またはサプレッサー、および前記遺伝子の発現産物に結合する少なくとも１種類の分子に関する。その少なくとも１種類の分子は、発現産物の機能活性を抑制することが好ましい。
【０００６】
驚くべきことに、この組み合わせは相乗作用を示す。「相乗」とは、混合物の単一化合物の作用合計を少なくとも２０％を超える、好ましくは５０％を超える、さらに好ましくは１００％を超える、混合物の有効性として定義される。これは、ａ）それぞれの遺伝子を発現し、ｂ）その遺伝子の発現がその系で測定可能な作用を有する、生体外(in vitro)系または生体内(in vivo)系のいずれでも試験することが可能である。
【０００７】
この利点は、個々のアプローチと比較して用量が低く、かつ／または効率が高いことである。
【０００８】
米国特許第５，８９１，８５８号（ルーベンステイン(Rubenstein)）には、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ‐α）およびヒト上皮成長因子（γＥＧＦ）の受容体に対するアンチセンスポリヌクレオチドが開示されている。それには、γＥＧＦに対するアンチセンスポリヌクレオチドと、γＥＧＦに対する抗体（抗γＥＧＦ）との組み合わせが開示されているが、抗γＥＧＦは、ＥＧＦ受容体の活性を抑制することができない。対照的に、抗γＥＧＦは、その受容体の刺激物質である。
【０００９】
その少なくとも１種類の阻害剤またはサプレッサーは、核酸分子またはその誘導体であることが好ましい。その少なくとも１種類の核酸分子は、病態生理学的現象において役割を果たす、遺伝子発現を抑制するかまたは遺伝子発現を妨げるオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはリボザイムであることが好ましい。
【００１０】
遺伝子産物の誘導体は、例えば転写後もしくは翻訳後に修飾された遺伝子産物、例えばメチル化、リン酸化、グリコシル化等により受けたエディティングまたは化学修飾を有するＲＮＡまたはタンパク質である。
【００１１】
本発明によれば、アンチセンスおよび／またはリボザイム分子をＤＡＮデリバリーシステムに組み込むことは有用である可能性がある。ＤＮＡデリバリーシステムは、ウイルスもしくは非ウイルスベクターまたはその両方、さらにアニオン脂質、カチオン脂質、非カチオン脂質またはそれらの混合物を含む。
【００１２】
アンチセンスおよび／またはリボザイム分子は、糖部位、塩基および／ヌクレオチド間の結合、例えばリン酸エステル結合のうちの１つまたは複数にて修飾されることが好ましい。例えば、オリゴヌクレオチド、リボザイムおよび／または核酸の修飾は、ホスホロチオエート（Ｓ‐ＯＤＮ）ヌクレオチド間結合、メチルホスホネートヌクレオチド間結合、ホスホラミデイト（phosphoramidate）結合、ペプチド結合の修飾、糖の２’‐Ｏ‐アルキル修飾、特にメチル、エチル、プロピル、ブチル等、糖の２’‐メトキシエトキシ修飾および／または塩基の修飾などの修飾を含む。様々な修飾をオリゴもしくはポリヌクレオチドにおいて組み合わせることができる。
【００１３】
アンチセンスおよび／またはリボザイム分子を、取り込み活性および／または阻害活性のエンハンサーにそれを結合させることによって修飾することもできる。
【００１４】
本発明のさらに好ましい実施形態では、葉酸、ホルモン、ステロイドホルモン、例えばエストロゲン、プロゲステロン、コルチコステロイド、鉱質コルチコイド、ペプチド、プロテオグリカン、糖脂質、リン脂質およびそれらの誘導体に、核酸分子を結合させるか、またはそれらと混合する。
【００１５】
非常に好ましい実施形態において、核酸分子は、以下のヌクレオチド配列の１通りまたは複数通りを含む核酸分子から選択する：
GTA GTA CAC GAT GG                (配列番号1)
CTG ATG TGT TGA AGA ACA           (配列番号2)
CTC TGA TGT GTT GAA G             (配列番号3)
CGG CAT GTC TAT TTT GTA           (配列番号4)
GCT TTC ACC AAA TTG GAA GC        (配列番号5)
CTG GCT TTT GGG TT                (配列番号6)
GCT GTT GAC TGC CC                (配列番号7)
CCC AGT ATT ACT GC                (配列番号8)
GGT TGA AGC CAT TG                (配列番号9)
GCC GCT CAA TCT TCA TC            (配列番号10)
GAA CAG TTC GTC CAT G             (配列番号11)
CCA GAG TTT CGG TTC               (配列番号12)
CTA GGA CTG GGA CAG               (配列番号13)
CAT CTT CTG CCA TTC               (配列番号14)
CGT AGG TGG TGC TG                (配列番号15)
GTG TTT TCC CAC CAG               (配列番号16)
GGT TTT GGT TCA CTA G             (配列番号17)
【００１６】
さらに適切な核酸配列は、当業者には公知である。さらなる配列およびかかる配列を選択する方法は、例えばＷＯ９４／２５５８８またはＷＯ９８／３３９０４に記載されている。
【００１７】
他の実施形態では、阻害剤またはサプレッサーは、遺伝子をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡに結合することが可能であり、したがって遺伝子の発現を阻害または抑制する、ペプチド、タンパク質および／または低分子量物質である。適切なタンパク質は、抗体および抗体フラグメントもまた含む。
【００１８】
本発明の混合物は、遺伝子の発現産物に結合する少なくとも１つの分子として、Ｆabフラグメント、一本鎖抗体などの抗体、抗体フラグメント、またはそれらの組み合わせを含むことが好ましい。Ｆabフラグメント、一本鎖抗体などの抗体、抗体フラグメント、またはそれらの組み合わせは、例えば、抗体ライブラリーをスクリーニングし、かつ遺伝子の発現産物への結合について発現産物を試験することによって、得ることが可能である。
【００１９】
他の実施形態では、遺伝子の発現産物に結合する少なくとも１種類の分子が、ペプチドおよび／またはタンパク質であることが好ましい。そのペプチドおよび／またはタンパク質は、例えば、発現ライブラリーをスクリーニングし、かつ遺伝子の発現産物への結合について発現産物を試験することによって、得ることが可能である。
【００２０】
合成ペプチドおよび／タンパク質は、ランダムに合成したペプチドおよび／ポリペプチドを遺伝子の発現産物への結合についてスクリーニングすることによってもまた得ることが可能である。発現産物に結合するペプチドは、例えばEMBO J. 20(2001) 340-349に開示されている。そのペプチドは、ＭＩＡ（黒色腫阻害活性）に結合し、したがってＭＩＡの機能活性を抑制する。適切なペプチド（配列番号１８〜４１）は例えば、
ＶＰＨＩＰＰＮ
ＭＰＰＴＱＶＳ
ＱＭＨＰＷＰＰ
ＱＰＰＦＷＱＦ
ＴＰＰＱＧＬＡ
ＩＰＰＹＮＴＬ
ＡＶＲＰＡＰＬ
ＧＡＫＰＨＰＱ
ＱＱＬＳＰＬＰ
ＧＰＰＰＳＰＶ
ＬＰＬＴＰＬＰ
ＱＬＮＶＮＨＱＡＲＡＤＱ
ＴＳＡＳＴＲＰＥＬＨＹＰ
ＴＦＬＰＨＱＭＨＰＷＰＰ
ＶＰＨＩＰＰＮＳＭＡＬＴ
ＲＬＴＬＬＶＬＩＭＰＡＰ
ＲＫＬＰＰＲＰＲＲ
ＶＬＡＳＱＩＡＴＴＰＳＰ
ＴＰＬＴＫＬＰＳＶＮＨＰ
ＰＰＮＳＦＳＳＡＧＧＱＲＴ
ＥＱＤＳＲＱＧＱＥＬＴＫＫＧＬ
ＥＴＴＩＶＩＴＷＴＰＡＰＲ
ＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴ
ＮＳＬＬＶＳＷＱＰＰＲＡＲ
である。
【００２１】
他の実施形態において、本発明の混合物は、遺伝子発現産物に結合する低分子量分子を含有する。特に、その低分子量分子は、コンビナトリアル・ケミストリーを用い、かつ遺伝子発現産物への結合について産物を試験することによって得ることができる。
【００２２】
本明細書において使用する低分子量分子（小分子）は、Ｎ、Ｓ、Ｏ、Ｐ等の他の原子と組み合わせて１００個までの炭素原子を有する分子である。発現産物に結合する適切な化合物が、図２に記載されており、すべてがＭＩＡに結合する。
【００２３】
遺伝子発現産物に結合する分子または因子は、遺伝子発現産物に結合する、ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子、またはアプタマーおよび／もしくはＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒを含むそれらの誘導体であることも可能である。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、その遺伝子は、ＴＧＦ‐β、ｅｒｂＢ‐２、ＭＩＡ、ｃ‐ｊｕｎ、ｊｕｎＢ、ｃ‐ｆｏｓ、ＶＣＡＭ、ＮＦ‐カッパーＢｐ６５、ＮＦ‐カッパーＢｐ５０、ＩＣＡＭ、ＶＥＧＦおよびＮＦ‐ｋＢ２からなる群から選択される。
【００２５】
本発明は、配列番号１〜１７の配列を有するオリゴヌクレオチドにもまた関する。
【００２６】
本発明の混合物を含有する薬物もまた、本発明の主題である。
【００２７】
本発明はさらに、遺伝子発現の少なくとも１種類のサプレッサーまたは阻害剤と、腫瘍、免疫不全を治療するための、または造血幹細胞、および赤血球、白血球、血小板、栓球およびそれらの前駆細胞を含むそれらの誘導体の移植が含まれる臓器もしく細胞移植を改善するための、前記遺伝子の発現産物に結合する少なくとも１種類の分子または因子と、を含む混合物を使用する方法に関する。臓器移植には、肝臓、腎臓、心臓、肺、胃腸器官、骨、すい臓、軟骨、神経細胞、島細胞、およびこれらの臓器をそれから誘導または再構成することができる幹細胞の移植が含まれる。
【００２８】
本発明はさらに、腫瘍、免疫不全を治療する方法、または遺伝子の発現を抑制もしくは阻害する少なくとも１種類の分子または因子と、前記遺伝子の発現産物に結合する少なくとも１種類の因子との組み合わせを有効量投与することによって臓器もしくは細胞移植を改善する方法に関するものであり、それによって、造血幹細胞、および赤血球、白血球、血小板、栓球およびそれらの前駆細胞を含むそれらの誘導体の移植を含む、腫瘍増殖抑制、臓器もしくは細胞移植の改善、免疫応答の増強もしくは抑制が、相乗作用的手法で高められる。臓器移植には、肝臓、腎臓、心臓、肺、胃腸器官、骨、すい臓、軟骨、神経細胞、島細胞、およびこれらの臓器をそれから誘導または再構成することができる幹細胞の移植が含まれる。
【００２９】
本発明の混合物は、薬物標的のバリデーションにおいて、つまり細胞系および生体に対する本発明の混合物の効果を試験することによって、特定の病理学的状態に関連する遺伝子を同定するのにもまた有用である。
【００３０】
他の実施形態では、本発明は、遺伝子の発現の少なくとも１種類の阻害剤またはサプレッサーと、前記遺伝子の発現産物の機能活性を抑制する少なくとも１種類の分子とを用いて、生物学的システムを同時にもしくは連続的に処置することを含む、生物学的システムにおいて遺伝子の機能活性を低減する方法に関する。生物学的システムは、細胞、細胞培養、臓器または生物体であることが可能である。
【００３１】
実施例
実施例１
腫瘍細胞上の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびリンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）の免疫応答活性に対する、遺伝子産物の阻害剤としてのＴＧＦ‐β２に対する中和抗体、遺伝子発現の阻害剤としてのＴＧＦ‐β２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびその２つの組み合わせの効果を研究するために、ＣＡＲＥ‐ＬＡＳＳアッセイが用いられている（ヒテンフェルルス(Lichtenfels), R., ビディソン(Biddison), W.E.1 シュルツ(Schulz), H.1 ボイト(Voyt), A.B. およびマーティン(Martin). CARE-LASS (calcein-release assay), an improved fluorescence based test system to measure cytotoxic lymphocyte activity. J. Immunol. Meth., 172: 227-239,1994)。
【００３２】
ＬＡＫ細胞およびＣＴＬの産生
先に記述されているように、標準フィコール-ハイパック比重遠心法によって、健常ドナーの静脈血から、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。簡単に説明すると、等量の完全培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清および１ｍＭ  Ｌ‐グルタミンで懸濁したＲＭＰＩ  １６４０培地）とヘパリン血を混合し、フィコール-ハイパック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、スウェーデン、ウプサラ）勾配上に層状に重ねた。４００ｇで室温にて３０分間遠心分離した後、プラズマ‐フィコール界面でバンド形成したＰＢＭＣを除去し、３回洗浄し、完全培地中に再懸濁した。トリパンブルー排除によって決定した細胞生死判別は、＞９７％であった。１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−１α、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２で処理することによって、リンパ球を活性化した。
【００３３】
アッセイ当日に、神経膠腫細胞を収集し、５％ＦＣＳ／ＰＢＳ溶液中で２回洗浄し、５％ＦＣＳ／ＰＢＳ中で１０Ｍｉｏ細胞／ｍｌにて懸濁した。Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、米国）を最終濃度２５μＭに添加した。その細胞を３７℃で３０分間標識し、次いで５％ＦＣＳ／ＰＢＳ中で２回洗浄し、１Ｍｉｏ細胞／ｍｌに調節し、最終濃度０．１Ｍｉｏ／１００μＬ／１ウェルで９６ウェルＵ字型マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社、デンマーク）に添加した。
【００３４】
−アンチセンスホスホロチオネートＴＧＦ‐β２オリゴヌクレオチド（ｆ.ｃ.２〜５μＭ）、または
−ＴＧＦ‐β２に対する中和抗体（ｆ.ｃ.１００ｍｇ／ｍｌ）、または
−その２つの組み合わせ
のいずれかを図に示すように添加するか、あるいは
−その２つのどちらも添加しなかった。
【００３５】
標的細胞（Ｔ）に対する効果細胞（Ｅ）の細胞障害活性の測定：
効果細胞の細胞障害活性を測定するために、ＣＴＬおよびＬＡＫ細胞（Ｅ）１００μＭをウェルに添加して、所望のＥ：Ｔ比１：２０とした。
【００３６】
カルセインの自発的放出
カルセインの自発的放出および全放出を測定するために、５％ＦＣＳ／ＰＢＳ１００μｌまたは溶解バッファー１００μＬ（５０ｎＭホウ酸ナトリウム、０．１％トリトン×１００、ｐＨ９．０）それぞれを、ウェルに予め添加した。そのプレートを３７℃で４時間インキュベートした後、上清（５０μＬ）を新しいウェルに移し、自動蛍光スキャナー（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ  Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  ＩＩ、ドイツ）を用いて測定した。その細胞毒性を以下の等式から決定した：
【数１】
Ｆ／ＣＴＬアッセイ−Ｆ自発的放出
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−×１００＝細胞毒性％
Ｆ全溶解−Ｆ自発的放出
【００３７】
実施例２
一日量１０μｇ／ｋｇ／日でｒｈＧ‐ＣＳＦを５日間投与して骨髄から、または臍帯血（臍帯血幹細胞）から動員し、免疫精製で得たＣＤ３４＋細胞を濃縮した後に、造血幹細胞をアフェレーシスにより回収した。
【００３８】
骨髄由来幹細胞および臍帯血由来幹細胞のどちらの多分化能前駆体画分も、臨床用途に重大な関連性がある。現在の幹細胞移植の問題は、最適化されたサイトカインカクテルによって産生された幹細胞数が少ないことである。さらに、長期的な成功に対する重要な問題は、サイトカインカクテルでの現在の処置による多分化能前駆体画分の休止および成熟である。
【００３９】
ＴＧＦ‐β１不活化抗体またはＴＧＦ‐β１アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理することによって、細胞の数および骨髄幹細胞の増殖能力のどちらも改善することができる。
【００４０】
驚くべきことに、ＴＧＦ‐β１不活化抗体およびＴＧＦ‐β１アンチセンスオリゴヌクレオチド、両方の組み合わせが、強い相乗作用を有した。
【００４１】
−アンチセンスＴＧＦ‐β１オリゴヌクレオチド、または
−ＴＧＦ‐β１に対する中和抗体、または
−その２つの組み合わせ
のいずれかで骨髄由来幹細胞および臍帯血由来幹細胞を処理したか、あるいは
−その２つのどちらでも処理しなかった（対照）。
【００４２】
ＴＧＦ‐β１アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理することによって、多分化能増殖性前駆細胞の数は、対照と比較して８５％増大した。
【００４３】
ＴＧＦ‐β１中和抗体で処理することによって、多分化能増殖性前駆細胞の数は、対照と比較して６３％増大した。
【００４４】
ＴＧＦ‐β１不活化抗体およびＴＧＦ‐β１アンチセンスオリゴヌクレオチド両方の組み合わせで処理することによって、多分化能増殖性前駆細胞の数は、対照と比較して３５０％を超えて増大した。
【００４５】
実施例３
ＴＧＦ‐β１結合ペプチドおよびＴＧＦ‐β１アンチセンスオリゴヌクレオチドの両方の組み合わせは、多分化能増殖性造血前駆細胞の増殖に対して同様の強い相乗作用を有した。
【００４６】
多分化能増殖性前駆細胞の数は、ＴＧＦ‐β１アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理することによって、対照と比較して８５％増大した。
【００４７】
多分化能増殖性前駆細胞の数は、ＴＧＦ‐β１結合ペプチドで処理することによって、対照と比較して５７％増大した。
【００４８】
多分化能増殖性前駆細胞の数は、ＴＧＦ‐β１結合ペプチドおよびＴＧＦ‐β１アンチセンスオリゴヌクレオチド両方の組み合わせで処理することによって、対照と比較して３倍超えて増大した。
【００４９】
実施例４
ｃ‐ｅｒｂＢ‐２遺伝子（ｐ１８５、ＨＥＲ‐２またはｎｅｕとも呼ばれる）は、ヒト乳癌の３０〜４５％において、膵臓癌、卵巣癌、胃癌、非小細胞肺癌、口腔扁平上皮癌の５０％までにおいて、増幅および／または過剰発現する。
【００５０】
商品名ハーセプチンを有する、ｃｅｒｂＢ‐２またはＨＥＲ２に対する不活性化抗体が、乳癌患者の治療に使用されている。臨床研究では当初、優れた治療可能性が示されたが、現在の臨床研究では議論の余地のある結果が示されている。本発明者らは、ｃｅｒｂＢ‐２遺伝子発現の阻害剤と、ｃｅｒｂＢ‐２遺伝子産物に結合する分子との組み合わせによって、各分子単の効果が単独で強く増強されることを見出した。
【００５１】
−アンチセンスｃ‐ｅｒｂＢ‐２オリゴヌクレオチド、または
−ｃ‐ｅｒｂＢ‐２に対する中和抗体、または
−  その２つの組み合わせ
のいずれかで、卵巣癌細胞および膵臓癌細胞を処理するか、あるいは
その２つのいずれでも処理しなかった。
【００５２】
腫瘍細胞増殖の抑制は、アンチセンスｃ‐ｅｒｂＢ‐２オリゴヌクレオチドでは１８％〜３１％であり、抗体では１３〜３４％であったが、その２つの組み合わせでは８５％を超えた。
【００５３】
実施例５
ヒトＭＩＡ分泌黒色腫ならびに乳癌細胞株において、以下のアンチセンス配列：
ＧＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＧＧＴＡＧＧＣＴＧＡＧＣＴＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＡＧＡＡＡＴＣＣＣＡＴＴＴＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＧＣＣＡＧＧＴＴＴＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＣＴＣＧＧＡＣＡＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＧＧＡＡＡＴＡＧＣＣＣＡＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＡＧＴＡＡＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＣＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＧＣＣＣＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＴＡＣＡＣＣＡＣＴＴＧＧＣＣＣＣＧＧＴＧＡＡＴＧＧＴＣＡＧＧＡＡＴＣＧＧＣＡＧＴＣＧＧＧＧＧＣＣＡＴＧＴＡＧＴＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＧＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＣＡＣＡＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＴＣＡＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＴＡＧＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＡＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＧＧＡＧＡＡＧＧＣＡＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＣＡＣＣＡＧＧＧＡＣＣＧＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＴＧＴＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＧＧＴＧＣＴＧＧ
または、この配列の一部を発現する移入ベクターによる、内因性ＭＩＡ合成の抑制は、それらの移動活性を低減しただけではなく、基質に対するそれらの接着を増大した。この両方により、ＭＩＡ阻害剤および腫瘍浸潤および転移の強い抑制作用が示唆されている。
【００５４】
移動活性の低減、ならびに基質に対する接着の増大での相乗作用は、ＭＩＡ結合ペプチドと、上記のアンチセンス配列を発現する移入ベクターとの組み合わせによって達成された。
【００５５】
実施例６
相乗的な抑制は、受容体、酵素、転写因子、細胞接着分子、サイトカイン、または成長因子、例えばＴＧＦ‐β、ＭＩＡ、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ｃ‐ｊｕｎ、ｊｕｎＢ、ＮＦ‐カッパーＢ、ＶＥＧＦもしくはインテグリン遺伝子の制御配列に結合する転写因子またはその結合ドメインを、受容体、酵素、転写因子、細胞接着分子、サイトカインまたは成長因子、例えばＴＧＦ‐β、ＭＩＡ、ＶＣＡＭ、ＩＡＣＭ、ｃ‐ｊｕｎ、ｊｕｎＢ、ＮＦ‐カッパーＢ、ＶＥＧＦもしくはインテグリンに結合する、例えばコンビナトリアル・ケミストリーによって得られる低分子量分子と組み合わせることによってもまた達成することができる。
【００５６】
実施例７
相乗的な抑制は、受容体、酵素、転写因子、細胞接着分子、サイトカイン、または成長因子、例えばＴＧＦ‐β、ＭＩＡ、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ｃ‐ｊｕｎ、ｊｕｎＢ、ＮＦ‐カッパーＢ、ＶＥＧＦもしくはインテグリン遺伝子から転写されたｍＲＮＡに結合する、ペプチドまたはタンパク質を、受容体、酵素、転写因子、細胞接着分子、サイトカインまたは成長因子、例えばＴＧＦ‐β、ＭＩＡ、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ｃ‐ｊｕｎ、ｊｕｎＢ、ＮＦ‐カッパーＢ、ＶＥＧＦもしくはインテグリンに結合する小分子と組み合わせることによってもまた達成することができる。
【００５７】
実施例８
相乗的な抑制は、受容体、酵素、転写因子、細胞接着分子、サイトカイン成長因子、例えばＴＧＦ‐β、ＭＩＡ、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ｃ‐ｊｕｎ、ｊｕｎＢ、ＮＦ‐カッパーＢ、ＶＥＧＦもしくはインテグリン遺伝子の制御配列に結合する、ペプチド、タンパク質、例えば転写因子またはその結合ドメインを、受容体、酵素、転写因子、細胞接着分子、サイトカインまたは成長因子、例えばＴＧＦ‐β、ＭＩＡ、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ｃ‐ｊｕｎ、ｊｕｎＢ、ＮＦ‐カッパーＢ、ＶＥＧＦもしくはインテグリンに結合するＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒと組み合わせることによってもまた達成することができる。
【００５８】
実施例９
相乗的な抑制は、受容体、酵素、転写因子、細胞接着分子、サイトカインまたは成長因子、例えばＴＧＦ‐β、ＭＩＡ、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ｃ‐ｊｕｎ、ｊｕｎＢ、ＮＦ‐カッパーＢ、ＶＥＧＦもしくはインテグリン遺伝子の制御配列に結合する、転写因子またはその結合ドメインを、受容体、酵素、転写因子、細胞接着分子、サイトカインまたは成長因子、例えばＴＧＦ‐β、ＭＩＡ、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ｃ‐ｊｕｎ、ｊｕｎＢ、ＮＦ‐カッパーＢ、ＶＥＧＦもしくはインテグリンに結合するペプチドと組み合わせることによってもまた達成することができる。
【００５９】
実施例６〜９の混合物は、神経細胞の幹細胞増殖に特に有用である。
【００６０】
実施例１０
ｃ‐ｊｕｎ発現の阻害剤を、ｃ‐ｊｕｎ遺伝子産物またはその誘導体に結合する分子と組み合わせることによって、相乗作用を達成することもできる。かかる混合物は、虚血、低酸素、変性または過剰刺激に対して神経細胞を保護するのに有用である。
【００６１】
実施例１１
ＨＰＰ‐Ｑ‐アッセイ
ヒト造血幹細胞に対する、アンチセンスＴＧＦ‐β１オリゴヌクレオチドおよび抗ＴＧＦ‐β１抗体の組み合わせの効果を調べた。この理由で、末梢血から精製したヒトＣＤ３４陽性細胞を最初に、オリゴヌクレオチドなしで、またはアンチセンスＴＧＦ‐β１オリゴヌクレオチドもしくはミスセンス対照の存在下にて、サイトカイン（ＩＬ‐３、ＩＬ‐６、ＧＭ‐ＣＳＦ、Ｇ‐ＣＳＦ、ＳＣＦ）を含有する培地中で７２時間培養した。続いて、ＨＰＰ‐Ｑ‐アッセイ（高増殖可能性の休止細胞アッセイ）において、抗ＴＧＦ‐β１抗体と共に、または抗ＴＧＦ‐β１抗体を用いることなく、細胞をさらに培養した。
【００６２】
そのＨＰＰ‐Ｑ‐アッセイによって、サイトカイン（ＩＬ‐３、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１１、Ｇ‐ＣＳＦ、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＳＣＦおよびＥｐｏ）を含有する対照培地中で培養した細胞を、抗ＴＧＦ‐β１阻止抗体の存在下にて、同一のサイトカインを含有する培地中で培養した細胞と比較する。その対照は、サイトカイン応答性前駆体を示し、阻止ＴＧＦ‐β抗体を添加することによって、休止前駆体が誘導される。
【００６３】
製造元（ＳｔｅｍＢｉｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、フランス、ヴィルジュイフ）により説明されているように、ＨＰＰ‐Ｑ‐アッセイを行った。簡単に説明すると、１．６×１０4培養細胞を、３５ｍｍ組織シャーレ中にアリコート１ｍｌで各培地に対して３通りにプレーティングした。１８日後、コロニー数（ＣＦＵ＝得られた最も未成熟な細胞）をカウントした。
【００６４】
表１に、アンチセンスＴＧＦ‐β１によって、リンパ腫患者由来のＣＤ３４陽性細胞に対する抗ＴＧＦ‐β１抗体（ＴＧＦ‐β１ＡＢ）の効果が２倍超えて増大することが示されている。つまり、アンチセンスＴＧＦ‐β１の存在下では、細胞数が、抗体のみと比較して２倍を超える数となる。
【００６５】
【表１】
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【００６６】
表２には、リンパ腫患者２名および骨髄腫患者１名からのＣＤ３４陽性細胞に対するアンチセンスＴＧＦ‐β１の効果が、抗体よって増幅することもまた示されている：ＴＧＦ‐β１抗体もまた添加した場合、アンチセンスＴＧＦ‐β１のみで得られた細胞数は、ほぼ３倍増大する。
【００６７】
【表２】
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【００６８】
このように、アンチセンスＴＧＦ‐β１および抗ＴＧＦ‐β１抗体の組み合わせは、アンチセンスまたは抗体のみと比較して、細胞数の増大が２倍を超える結果となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  中和抗体と組み合わせたアンチセンス分子を用いた、遺伝子の遮断両方の組み合わせの強い相乗作用を示す図である。
【図２】  遺伝子産物ＭＩＡを抑制することが可能な小分子を開示する図である。
【図１】
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【図２】
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