(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミン結合性基を有するポリスルホンを含む支持体にアルキル基の炭素数が４以上、１２以下、アルキル化率が２０％以上、５０％以下であるアルキル化ポリエチレンイミンが前記支持体の成形品にアルキル化ポリアルキレンイミン溶液を接触させる不均一系反応により付与されていることを特徴とする酸化低密度リポ蛋白吸着用吸着材。
【請求項２】
前記アルキル化ポリアルキレンイミンにおいてポリアルキレンイミンの平均重合度が、４０以上２５００以下であることを特徴とする請求項１記載の酸化低密度リポ蛋白吸着用吸着材。
【請求項３】
素材表面積１ｍ2あたりの血漿量が３．３×１０2ｍｌ／ｍ2である条件で素材と血漿を相互作用させたときに、該血漿中に含まれている初期濃度２μｇ／ｍｌの酸化低密度リポ蛋白の吸着除去率が６０％以上であることを特徴とする請求項１または２に記載の酸化低密度リポ蛋白吸着用吸着材。
【請求項４】
請求項３記載の条件で低密度リポ蛋白の吸着除去率が２０％未満であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の酸化低密度リポ蛋白吸着用吸着材。
【請求項５】
請求項３記載の条件で高密度リポ蛋白の吸着除去率が１５％未満であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の酸化低密度リポ蛋白吸着用吸着材。
【請求項６】
前記アミン結合性基がα−クロロアセトアミドメチル基であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の酸化低密度リポ蛋白吸着用吸着材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は酸化低密度リポ蛋白質（酸化ＬＤＬ）の吸着材に関するものである。さらに詳しくは体液中より酸化ＬＤＬを選択的に除去し、動脈硬化症の諸症状の軽減または進展を抑えるための吸着材に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
動脈硬化症とは、動脈壁の肥厚を示し、かつ弾力を失い硬化をきたした病変の総称であり、そのなかでも、頻度がずば抜けて高く、かつ重要な疾患が粥状動脈硬化症であり、一般的にも動脈硬化症といえば粥状動脈硬化症を意味することが多い。粥状動脈硬化巣の形成に重要な役割を果たしているのが、過酸化脂質である。その中でも、特に酸化ＬＤＬは様々な生物作用をもっており、内皮細胞から一酸化窒素（ＮＯ）産生を抑制するなどの作用以外にも、単球を内皮下に遊送、集積させ、そのものをマクロファージとさせ、酸化ＬＤＬそれ自身を取り込み泡沫細胞とさせ、動脈壁のプラーク形成を促進するほか、内皮細胞や平滑筋細胞傷害を促進するなど、動脈硬化の発症、進展に重要な役割を果たしている。従って、血中から過酸化脂質、特に酸化ＬＤＬを除去することが望ましい。
【０００３】
これまで、動脈硬化症を治療する方法としては外科的に狭窄した血管を押し広げたり、薬剤を用いてＬＤＬの代謝を阻害したりするものしかなかった。前者は、侵襲度が高く、また動脈硬化症の進展予防はできない。後者はＬＤＬの代謝異常のない動脈硬化症患者には有効ではないという問題点があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題を解決するために体液中の有効成分をほとんど失うことなく選択的に酸化ＬＤＬを吸着しうる吸着材を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、支持体にアルキル基の炭素数が２以上、１６以下であるアルキル化ポリアルキレンイミンが付与されていることを特徴とする過酸化脂質吸着材によって達成される。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【０００７】
本発明の吸着材は、支持体に酸化ＬＤＬと選択的な親和性をもつアルキル化ポリアルキレンイミンが付与されてなることを特徴とするものである。
【０００８】
高脂血症の患者の場合には血中のＬＤＬ量が多いため、ＬＤＬを除去してやることにより動脈硬化の進展予防などに有効であるが、透析患者や心疾患を有する患者の場合は、血中のＬＤＬ濃度は健常者と同レベルであることが多い。また、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）は動脈硬化防御因子としての機能を有するため、透析患者や心疾患を有する患者の血中のＨＤＬ濃度を下げてはいけない。このように、透析患者や心疾患を有する患者からは、過酸化脂質、特に酸化ＬＤＬを選択的に除去することが望ましい。本発明においては、支持体表面積１ｍ2あたりの血漿量が３．３×１０2ｍｌ／ｍ2である条件で吸着材と血漿を相互作用させたときに、該血漿中に含まれている初期濃度２μｇ／ｍｌの酸化低密度リポ蛋白の吸着除去率が６０％以上、低密度リポ蛋白の吸着除去率が２０％未満、高密度リポ蛋白の吸着除去率が１５％未満であることを、その選択性の指標とすることができる。
【０００９】
本発明でいう支持体とは、アルキル化ポリアルキレンイミンを付与するための水に溶解しない性質をもつ物質をいう。本発明に用いる支持体は有機性、無機性いずれであってもよい。支持体の材料の具体例としては、ポリスチレンで代表される芳香族ポリビニル化合物、ポリスルホン、ポリエーテルイミド、ポリアミド、ポリイミド、ポリエーテル、ポリフェニレンサルファイドなどがあげられるが、目的とする酸化ＬＤＬ以外の体液成分が吸着しにくいポリスルホンが好ましい。ここでいう体液とは、血液、腹水、リンパ液、関節内液、その他の生体由来の液性成分および、これらから得られた分画成分のことを指す。
【００１０】
支持体にアルキル化ポリアルキレンイミンを付与する方法としては、物理吸着による方法、イオン結合による方法、共有結合により固定化する方法などを用いることができる。しかしながら、吸着材の保存性、安定性のためにはアルキル化ポリアルキレンイミンが、支持体から脱離溶出しないことが重要であるので、強固な固定が可能な共有結合法により付与することが望ましい。すなわち、支持体の表面に、アルキル化ポリアルキレンイミンの固定化反応に用いうるアミン結合性基が存在していると好都合である。そのようなアミン結合性基の具体例としては、ハロメチル基、ハロアセチル基、ハロアセトアミドメチル基、ハロゲン化アルキル基、エポキサイド基、カルボキシル基、イソシアン酸基、チオイソシアン酸基、酸無水物基などがあげられる。とりわけ、活性ハロゲン基は、製造が容易な上に反応性が高く、固定化反応を温和な条件で行えることに加え、この際生じる共有結合が化学的に安定なので、本発明では好ましく用いられる。
【００１１】
さらにアミン結合性基を有する支持体の材料の具体例としては、クロロアセトアミドメチルポリスチレン、クロロアセトアミドメチル化ポリスルホン、クロロアセトアミドメチル化したポリエーテルイミドなどがあげられる。さらに、これらは有機溶媒に対して可溶性であると成形しやすいので好ましい。中でも、クロロアセトアミドメチル化ポリスルホンが特に好ましい。
【００１２】
支持体の材料が高分子化合物の場合、その分子量は、通常５０００以上、１００万以下、とりわけ１万以上、２０万以下のものが好ましく用いられる。
【００１３】
本発明でいうアルキル化ポリアルキレンイミンは、ポリアルキレンイミンの窒素原子の一部をアルキル化したものである。アルキル化は、ポリアルキレンイミンを、ブチルブロマイド、オクチルブロマイド、ラウリルブロマイドなどで代表されるハロゲン化炭化水素の単独または混合物でアルキル化することにより行うことができる。アルキル基は直鎖のものでも、分岐したものでもどちらでも良い。また、ポリアルキレンイミンは、入手のしやすさから、ポリエチレンイミンが好まれる。このようなアルキル化ポリアルキレンイミンは、アルキル基の炭素数、アルキル化率に依存して吸着性能が変化する。
【００１４】
本発明のアルキル化ポリアルキレンイミンにおいて、アルキル基の炭素数は、２以上、１６以下である。アルキル基の炭素数が少なくなると酸化ＬＤＬ吸着能が低くなる。また炭素数２０以上のアルキルハロゲン化物は一般的に高価であるうえ、酸化ＬＤＬに対する選択性が低くなる。アルキル基の炭素数は、とりわけ４以上、１２以下が好ましい。
【００１５】
アルキル化ポリアルキレンイミンにおいて、アルキル化率が小さすぎると吸着能が下がり、大きすぎると酸化ＬＤＬに対する選択性が低くなる。したがってアルキル化率は、２０％以上、５０％以下が好ましい。
【００１６】
アルキル化ポリアルキレンイミンにおいて、ポリアルキレンイミンの平均重合度は、小さすぎると吸着能が下がり、大きすぎると酸化ＬＤＬに対する選択性が低くなるため、４０〜２５００が好ましく、とりわけ２００〜７００が好ましい。
【００１７】
本発明で用いられるアルキル化ポリアルキレンイミンの調製は、ポリアルキレンイミンの溶液に、室温ないし１００℃以下の温度で、臭化アルキルのようなハロゲン化炭化水素を混合することにより容易に行うことができる。この反応は、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフランおよびジメチルホルムアミドのような極性溶媒中において、アルキル化率が５０％以下ならば、室温でも仕込み量に対して定量的に進行する。
【００１８】
酸化ＬＤＬの吸着材を製造するには、支持体とアルキル化ポリアルキレンイミンを溶液にして反応させる均一系反応の方法と、支持体の成形品にアルキル化ポリアルキレンイミン溶液を接触させる不均一系反応の方法がある。
【００１９】
均一系反応による方法の一例としては、クロルアセトアミドメチル化ポリスルホンの溶液中にアルキル化ポリアルキレンイミンを適当量加えて、０〜１００℃の温度で反応させることにより、容易に合成することができる。このとき、アルキル化ポリアルキレンイミンのアルキル化率が高いとクロルアセトアミドメチル化ポリスルホンを溶かしている溶媒に溶けにくい。また、アルキル化していないポリアルキレンイミンを、クロルアセトアミドメチル化ポリスルホンと反応させるとゲル化しやすい。したがって、低アルキル化率のアルキル化ポリアルキレンイミンを導入したのち、さらに臭化アルキルを添加し、目標のアルキル化率を得る方法が便利である。また、均一系で反応させる場合の溶媒としては、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドおよびメチルピロリドンなどが好ましく用いられる。
【００２０】
本発明では支持体を不均一系で表面処理する方法も可能で、そのためには支持体を溶かさず、アルキル化ポリアルキレンイミンを溶かす溶媒が好ましく用いられる。
【００２１】
不均一反応の例としては、クロロアセトアミドメチル化ポリスルホンの繊維または中空糸などの成形品を、アルキル化ポリアルキレンイミンのイソプロパノール溶液中に浸し、０〜１００℃の温度で反応させることにより容易に製造することができる。
【００２２】
本発明の吸着材は、体外循環カラム等に充填し、体外循環治療に用いることができる。すなわち、均一反応によって直接、繊維状や膜状などに成形したり、またはコーティングによって成形品に固定化したり、不均一反応によって、繊維や中空糸、ビーズなどに固定化して用いることができる。人工腎臓用の中空糸にアルキル化ポリアルキレンイミンを固定化することで、尿毒素や水分などの除去という従来の機能に加え、体液中の酸化ＬＤＬ除去という新たな機能を付加させることもできるので好ましい。とりわけ、長期に血液透析を行っている患者の中には、血中抗酸化作用の低下や過酸化脂質が高値であることが確認されており、これに起因すると思われる長期透析患者の動脈硬化性疾患等が増加しているため、透析患者の体液中の酸化ＬＤＬを除去する目的で本発明の吸着材を用いることは好ましい。
【００２３】
以下、本発明の膜型吸着器の性能測定条件を記載する。
（１）抗酸化ＬＤＬ抗体の作製
板部らが作製したものを用いた（Ｈ．Ｉｔａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５２７４、１９９４）。すなわち、ヒト粥状硬化病巣ホモジェネートをマウスに注射して免疫、そのマウスの脾臓からハイブリドーマを作製し、硫酸銅処理ＬＤＬと反応するものを選別した。抗体クラスは、マウスＩｇＭで、未処理ＬＤＬ、アセチルＬＤＬ、マロンジアルデヒドＬＤＬとは反応しない。フォスファチジルコリンのアルデヒド誘導体やヒドロペルオキシドを含めていくつかのフォスファチジルコリン過酸化反応生成物と反応する。１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解したものを用いた（蛋白濃度０．６０ｍｇ／ｍｌ）。
（２）酸化ＬＤＬの調製
市販のＬＤＬ（フナコシ製）を脱塩した後、０．２ｍｇ／ｍｌとなるようにリン酸緩衝液（以下ＰＢＳという）で希釈後、０．５ｍＭ硫酸銅水溶液を１ｗｔ％添加し、３７℃で１６時間反応させた。２５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（以下ＥＤＴＡという）を１ｗｔ％、１０ｗｔ％アジ化ナトリウムを０．０２ｗｔ％となるように添加したものを酸化ＬＤＬ標品とした。
（３）吸着実験操作
健常者血漿（日本人、３０歳、ＬＤＬ（βリポ蛋白）濃度２７５ｍｇ／ｄｌ，ＨＤＬ−コレステロール濃度７０ｍｇ／ｄｌ）に上記酸化ＬＤＬを２μｇ／ｍｌとなるように添加した。
【００２４】
表面積９ｃｍ2の支持体を上記血漿０．３ｍｌ中に３７℃、４時間静置した。（支持体表面積１ｍ2あたりの血漿量は３．３×１０2ｍｌ／ｍ2）。
【００２５】
膜と相互作用前後の血漿中の酸化ＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ濃度を定量することにより、それぞれの吸着除去率を下記式により算出した。
【００２６】
それぞれの吸着除去率（％）＝１００×（相互作用前の濃度−相互作用後の濃度）／相互作用前の濃度
（４）酸化ＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ濃度の測定
抗酸化ＬＤＬ抗体をＰＢＳで５μｇ／ｍｌに希釈し、９６穴のプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で２時間震盪した後、４℃にて一晩以上壁に吸着させた。
【００２７】
ウェル中の抗体溶液を捨て、１ｗｔ％Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｍｉｎ（ＢＳＡ、”フラクションＶ”、生化学工業）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を２００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で２時間震盪して壁をブロッキングした後、ウェル中のＢＳＡ溶液を捨て、酸化ＬＤＬを含んだ血漿および検量線作成用のスタンダード（０〜２μｇ／ｍｌの酸化ＬＤＬを含むＰＢＳ緩衝液）を１００μｌ／ウェルずつ分注した。その後、室温で３０分震盪した後、４℃で一晩放置した。
【００２８】
室温に戻し、ウェル中の溶液を捨て、０．０５ｗｔ％”トゥイーン−２０”（片山化学）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でウェルを３回洗浄した。洗浄したウェルにＰＢＳで２０００倍に希釈したヒツジ抗アポＢ抗体（ＴＨＥ  ＢＩＮＤＩＮＧ  ＳＩＴＥ）を１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で２時間震盪した後、ウェル中の抗アポＢ抗体を捨て、０．０５ｗｔ％トゥイーン−２０を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でウェルを３回洗浄した。洗浄したウェルに２ｗｔ％”ブロックエース”（大日本製薬）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２０００倍に希釈したアルカリ性フォスファターゼ標識ロバ抗ヒツジＩｇＧ抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）を１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で２時間震盪した。その後、ウェル中の標識抗体を捨て、０．０５ｗｔ％”トゥイーン−２０”を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でウェルを３回洗浄し、さらにトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。続いて、ｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ）の１ｍｇ／ｍｌ溶液（０．０００５Ｍ  ＭｇＣｌ2、１Ｍジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８）を１００μｌ／ウェルずつ分注し、適当な時間室温で反応させた後、４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。スタンダードの結果から検量線を引き、酸化ＬＤＬ濃度を決定した。
【００２９】
ＬＤＬの定量はβ−リポ測定キット（和光純薬）を用いて行った。
【００３０】
ＨＤＬの定量はＨＤＬ−Ｃ測定キット（和光純薬）を用いて行った。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこのような実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１
（１）支持体の作成
ニトロベンゼンと硫酸の混合溶液を０℃に冷却後、メチロール−α−クロルアセトアミドを加えて溶解し、これを１０℃の”ユーデル”（ポリスルホン）のニトロベンゼン溶液に、よく撹拌しながら加えた。これを室温で３時間撹拌した。その後、反応混合物を大過剰の冷メタノール中に入れ、ポリマーを沈殿させた。沈殿物をメタノールでよく洗った後、乾燥して、α−クロルアセトアミドメチル化ポリスルホンを得た。
【００３３】
次にこのα−クロルアセトアミドメチル化ポリスルホンをＤＭＡｃに室温にて、２０ｗｔ％になるように溶解させた。その後、０．１ｍｍスペーサー付きのガラス板に、溶液を塗布し、ドクターブレードにて平膜に引き延ばしたものを水中（室温）に浸たし、凝固させた。
（２）Ｎ−ブチル化ポリエチレンイミンの支持体への付与
水で十分に洗浄したα−クロルアセトアミドメチル化ポリスルホン平膜を、平均分子量１万（平均重合度２３３）のポリエチレンイミン／イソプロパノール溶液（ポリエチレンイミン濃度５ｗｔ％）に浸し、室温にて２４時間撹拌することで、ポリエチレンイミンを平膜に共有結合により付与した。その後、ブチル化率が３０％になるように臭化Ｎ−ブチルを添加し、室温にて２４時間撹拌することで、ポリエチレンイミンにＮ−ブチル基を導入した。反応終了後、平膜をイソプロパノールで十分に洗浄した後、吸着実験に供した。
【００３４】
実施例２
実施例１と同様にして、ポリエチレンイミンとして平均分子量１万（平均重合度２３３）、ラウリル化率３０％であるラウリル化ポリエチレンイミンが付与された平膜を作成し、吸着実験を行った。
【００３５】
実験結果は表１に示した。
【００３６】
比較例１
アルキル化ポリエチレンイミンを付与しないα−クロルアセトアミドメチル化ポリスルホン平膜について、実施例１と同様にして吸着実験を行った。
【００３７】
比較例２
アルキル化されていない平均分子量１万（平均重合度２３３）のポリエチレンイミンを付与した平膜について、実施例１と同様にして吸着実験を行った。
【００３８】
実施例１、２および比較例１、２における酸化ＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬの吸着除去率の結果を表１に示した。
【００３９】
【表１】
0004783970.tif 000002
【００４０】
【発明の効果】
本発明の吸着材は酸化ＬＤＬを選択的に吸着するため、体液中の他の成分をほとんど損なうことなく、酸化ＬＤＬを取り除くことができる。