(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）感光性薬物である2-デビニル-2-(l-ヘキシルオキシエチル)ピロフェオフォルバイドを封入したミセルを調製する工程、
b）前記ミセルにアルコキシ有機シランを添加して、シリカとミセルの複合体を形成する工程、
c）前記シリカとミセルの複合体をアルカリ加水分解し、前記感光性薬物分子を封入したシリカナノ粒子を沈殿する工程、および
d）沈殿したナノ粒子を透析によって単離する工程
とを有する、一以上の感光性薬物を含むセラミックナノ粒子の製造方法。
【請求項２】
前記アルコキシ有機シランがトリエトキシビニルシランである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ミセルが、ビス（２−エチルヘキシル）スルホコハク酸ナトリウムおよび1-ブタノールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アルカリ加水分解がアンモニアによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アルカリ加水分解がアンモニウム化合物によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
a）感光性薬物である2-デビニル-2-(l-ヘキシルオキシエチル)ピロフェオフォルバイドを封入したミセルを調製する工程、
b）前記ミセルにアルコキシ有機シランを添加して、シリカとミセルの複合体を形成する工程、
c）前記シリカとミセルの複合体をアルカリ加水分解し、前記感光性薬物分子を封入したシリカナノ粒子を沈殿する工程、および
d）沈殿したナノ粒子を透析によって単離する工程
とを有する方法によって一以上の感光性薬物を封入した、セラミックナノ粒子
を含む組成物。
【請求項７】
薬学的に許容できるキャリアをさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記アルカリ加水分解が、アンモニアあるいはアンモニウム化合物によって行われる、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記セラミックナノ粒子のサイズが、平均直径30nmの単様式の分布を示す、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
a）請求項１の方法によって、感光性薬物である2-デビニル-2-(l-ヘキシルオキシエチル)ピロフェオフォルバイドを封入したセラミックナノ粒子、を有する組成物を細胞（ヒト細胞を除く）に送達し、前記ナノ粒子を前記細胞に取り込ませる工程、および
b）前記細胞を照射して、活性酸素種を生成させ、該活性酸素種の生成によって前記細胞の成長を阻害する工程
とを有する、細胞（ヒト細胞を除く）の成長を阻害する方法。
【請求項１１】
前記活性酸素種が一重項酸素を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
a）請求項１の方法によって、感光性薬物である2-デビニル-2-(l-ヘキシルオキシエチル)ピロフェオフォルバイドを封入したセラミックナノ粒子、を含む組成物を治療を必要とする個体（ヒトを除く）に投与する工程、
b）前記セラミックナノ粒子を腫瘍細胞に取り込ませる工程、および
c）前記腫瘍が存在する部分を照射することにより、前記感光性薬物によって活性酸素種を生成させ、該活性酸素種によって腫瘍の増殖を低減する工程
とを有する、個体（ヒトを除く）の腫瘍の増殖を低減する方法。
【請求項１３】
前記組成物が薬学的に許容できるキャリアを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物を局所的あるいは全身的に投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記局所投与が腫瘍内注射である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記活性酸素種が一重項酸素を含む、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に光線力学療法の分野に関するものであり、特に光線力学療法のための新規な薬物キャリアシステムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光線力学療法(PDT)は、腫瘍性、心血管系、皮膚科及び眼科系の様々な疾患を治療するための新興モダリティである[1,2]。腫瘍のPDTは、感光性種あるいは光線感作物質(PS)が、全身投与において腫瘍組織中に優先的に局在化するというコンセプトに基づいている[2,3]。このような光線感作物質は、適切な波長の可視あるいは近赤外(NIR)線で照射すると、活性化された分子がそのエネルギーを周囲の酸素分子に転嫁する。この結果、一重項酸素(1O2)あるいはフリー・ラジカルのような活性酸素種(ROS)が形成される。ROSはプラズマ、ミトコンドリア、リソソーム及び核膜等を含む様々な細胞膜を酸化する原因となり、その結果、細胞に非可逆的なダメージを与える[2-6]。適切な条件下で行えば、PDTは隣接する健康な組織にはダメージを与えず、病変組織を効果的且つ選択的に破壊する方法として利点を有する[3]。 
【０００３】
しかしながら、大抵の感光性薬物(PS)は疎水性、すなわち水溶性に乏しく、それゆえ非経口投与用の医薬製剤として調製するのが非常に困難である[2-7]。この困難を克服するために、デリバリー・ビヒクルを用いて、水溶液系中でこれらの薬物を安定に分散させる様々な方法が開発されてきた。全身投与において、このような薬物ドープキャリアは、高められた透過性及び保持(EPR)効果の効力によって優先的に腫瘍組織に取り込まれる[2,8-10]。キャリアには、油-分散(ミセル)、リポソーム、高分子ミセル、親水性薬物-ポリマー複合体等が含まれる。非イオン性ポリオキシエチル化ヒマシ油(例えばTween-80、Cremophor-EL、CRM等)を使用した油性製剤(ミセル系)は、おそらく血液中の血漿リポタンパクとの相互作用が原因で薬物含有量の増加及び腫瘍取込の改善を示す[11-13]。しかしながら、このような乳化剤は、生体内で急性過敏性(アナフィラキシー性)反応を誘発することも報告されている[14,15]。リポソームは、水性区画を被包する同心性のリン脂質二重層であり、水性区画に親水性及び親油性薬物を封じ込めることができる[2]。薬物のリポソーム製剤の腫瘍取込は、単なる水性分散の腫瘍取込よりはよいが、少ない薬物含有量及び封入状態における薬物の自己会合の増強という問題を有する[2,16-18]。リポソームもまた、生体の主要な防御組織(細網内皮系、RES)によるオプソニン作用及びその後の捕獲を受けやすい[18]。最近、pH感受性高分子ミセル内に封入された薬物が、インビトロにおいてCRM製剤と比較して優れた腫瘍光毒性を示すものの、生体内の研究では、腫瘍の退縮が少なく、正常組織内への蓄積が多いことが示された[7, 19, 20]。 
【０００４】
感光性薬物でドープされた、水和したセラミックベースのナノ粒子は、ポリマーで被包された薬物と同様、遊離に関連する問題を解決できる可能性がある。このようなセラミック粒子は、有機重合体粒子を上回るいくつもの利点を有する。まず第一に、必要な調製プロセスは、よく知られているゾル-ゲルプロセスと全く同様であり、簡易且つ室温の状態でよい[21,22]。これらの粒子は、所望のサイズ、形及び気孔率で調製することができるとともに、極めて安定である[22]。それらが極小サイズ(50nm未満)であれば、RESによる捕獲から逃れやすくなる。さらに、pHの変化とともに膨張あるいは気孔率が変化しなければ、これらの粒子は微生物攻撃による損傷を受けにくい[23]。これらの粒子はまた、極端なpH及び温度による変性に対しても、ドープ分子(酵素、薬物等)を効果的に保護する[24]。シリカ、アルミナ、チタニア等のような粒子は、生体系におけるその適合性でも知られている[24, 25, 26]。さらに、それらの表面は、種々の基で容易に官能性を持たせることができ[26,27]、それゆえ、様々なモノクローナル抗体及び他のリガンドに付着させ、生体内の所望の場所でターゲットにすることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
セラミックナノ粒子の合成は、常ではないがたいていシリカをベースとし、文献において広く報告されているが[28-30]、薬物送達への応用はまだ十分に開発されていない。したがって、PDT療法のための新規な薬物送達システムを開発する必要性が現在もなおある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、光線力学療法に有用な組成物及び方法を提供する。本発明の組成物は、一以上の治療薬が封入されたセラミックベースのナノ粒子を含む。
【０００７】
本発明はまた、一以上の治療薬が封入されたセラミックベースのナノ粒子を合成する方法を提供する。本発明の方法で合成すると、粒子は球状になり、高度に単分散する。
【０００８】
ある実施形態では、本発明は、ミセル媒体中でセラミック素材(例えばトリエトキシビニルシラン(VTES)など)を、適切な条件下でアルカリ加水分解することによって、光線感作物質染料／薬物ドープシリカベースナノ粒子(直径30nm以下)を合成する方法を提供する。
【０００９】
ある実施形態では、感光性薬物／染料として、アメリカ合衆国、ニューヨーク、バッファローにあるRoswell Park Cancer Instituteで、フェースI/II臨床試験において効果的な光線感作物質とされた、2-デビニル-2-(l-ヘキシルオキシエチル) ピロフェオフォルバイド(HPPH)を使用した[32,33]。粒子のマトリクスは、封入された感光性薬物の可視吸収スペクトルを妨げないが、薬物の蛍光の消光は、水性媒体中で大部分妨げられることが見出された。一重項酸素検出実験は、封入された光線感作物質が、周囲の酸素分子と相互作用し、生成した一重項酸素が、シリカマトリクスの外に浸透できることを明らかにした。このようなドープ粒子は、腫瘍細胞によって積極的に取り込まれ、適切な波長の光照射により、このような浸透性細胞は非可逆的に破壊された。従って、本発明のセラミックベース粒子は、光線力学療法用薬物のキャリアとして用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、中に一以上の治療薬が封入されたセラミックナノ粒子を提供する。本発明はまた、一以上の治療薬を含むセラミック粒子の合成及び使用方法を提供する。明細書中で使用される「ナノ粒子」という語は、直径が100nm以下の粒子を指す。
【００１１】
本発明のセラミックナノ粒子は、光線力学療法のために、細胞に感光性薬物あるいは染料等の治療薬を送達するために使用することができる。薬物は疎水性であっても親水性であってもよい。
【００１２】
ある実施形態では、本発明に好適なシリカ粒子は、疎水性感光性薬物(本明細書中では光線感作物質とも呼ばれる)を有する有機的に修飾されたケイ酸塩(ORMOSIL)ナノ粒子である。ナノ粒子を調製するために、光線感作物質を、アルコキシ-有機シラン(トリエトキシビニルシラン(VTES)など)中に溶解したビス(2-エチルヘキシル)スルホコハク酸ナトリウム(AOT)/l-ブタノール/水-ミセルの非極性中心に封入し、穏やかな条件の下で(例えば、室温で24時間撹拌)アルカリ加水分解(例えば、アンモニア、アンモニウム化合物あるいは化合物含有アミンによって)することによって沈殿させる。沈殿物質及び界面活性剤は透析によって除去する。透析を長時間(例えば50時間)行うことによって、封入された薬剤は長期間に渡り安定に分散する。
【００１３】
ORMOSILナノ粒子が他のナノ粒子より優れている主な点は、前駆体であるアルコキシ-有機シランの疎水性及び親水性基の両方の存在により、それらが適切な条件下で正常なミセルとしても逆ミセルとしても自己組織化できることである。得られるミセル(及び逆ミセル)の中心は薬物、タンパク質等の生体分子を封入するのに使用できる。このような系は以下のような多くの利点を有する：(a)疎水性染料のみならず親水性染料も封入することができる、(b)シクロヘキサン等の腐食性溶媒、及び、溶媒蒸発、超遠心分離法などの複合精製ステップを用いないで済むように、水中油型マイクロエマルジョン中で沈殿させることができる、(c)それらの有機基は、標的分子と連結するためにさらに修飾されてもよい、及び(d)それらは場合によりSi-C結合の生化学的分解により生物分解されてもよい。有機基の存在もまた、粒子の全体的な剛性及び密度を減少させ、これにより水溶液系におけるこのような粒子の沈殿に対する安定性が増大すると考えられる。
【００１４】
コロイド状シリカの球状・単分散粒子は、テトラアルキルシランの加水分解によって、簡単に調製することができる。この方法は、一般に「ゾル-ゲル法」と言われ、有機的に修飾されたシリカ(ORMOSIL)粒子（前駆体のアルコキシシラン分子も１あるいは２個の有機基を含む）の合成に援用できる。有機基の結合は、例えば、規則的且つ均一の気孔率を有するネットワーク構造をもつ、メソポーラスマトリクスの形成をもたらす等、シリカネットワークの最終構造を修飾する。このような多孔性マトリクスは、生物学的のみならず光学的に活性化された多数の分子（例えば、蛍光染料、プロテイン、抗癌剤、イメージコントラスト剤等）のホストとなることができる。
【００１５】
本発明のセラミック粒子は、薬物を含む粒子を局所的あるいは全身的に投与することによって使用することができる。局所投与は、例えば、標的組織あるいは腫瘍内に近接する部位に、薬剤／染料を含むセラミック粒子を含む組成物を注射することによって、行うことができる。表在性腫瘍の局所投与では、ローション、懸濁液あるいはペースト剤を含む標準的な局所用組成物の中に組み込むことによって、ナノ粒子を局所的に投与することができる。全身投与は、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内あるいは直腸経由で行うことができる。このような投与方法に用いられる製剤は、当該技術分野において周知であり、典型的な製剤は、例えば、「レミングトンの薬学(Remmington's Pharmaceutical Sciences)」(マック出版社、ペンシルバニア州、イーストン)に記載されている。
【００１６】
薬物/染料を封入したナノ粒子は、所望する使用(例えば、経口、非経口、局所投与)に好適な形態に作られた組成物の形式で投与することができる。経口投与に好適な剤形には、錠剤、分散性粉末、顆粒、カプセル、シロップ剤及びエリキシル剤の形態における懸濁液、分散剤、乳剤が含まれる。錠剤用の不活性の希釈剤およびキャリアとしては、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖およびタルク等がある。錠剤はまた、澱粉及びアルギン酸のような造粒剤や崩壊剤、澱粉、ゼラチンおよびアカシアのような結合剤、およびステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、およびタルクのような平滑剤を含んでいてもよい。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、あるいは崩壊および吸収を遅延させるために、既知の技術でコーティングされていてもよい。カプセル剤中で使用できる不活性希釈剤およびキャリアとしては、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、およびカオリン等がある。懸濁液、シロップ剤およびエリキシル剤は、既存の賦形剤（例えば、メチルセルロース、トラガカント、アルギン酸ナトリウム）、湿潤剤（レシチンおよびステアリン酸ポリオキシエチレン等）および防腐剤（例えば、p-ヒドロキシ安息香酸エチル）を含んでいてもよい。非経口投与に好適な剤形としては、セラミックナノ粒子を含む懸濁液、分散剤、乳剤などがある。
【００１７】
一般に、セラミックナノ粒子は高度に安定であり、pHおよび温度条件を非常に厳しくしてさえ、被包した生体分子を全く放出しない可能性がある[24]。従来の薬物送達方法は、適切な生物学的反応を誘発するために、被包薬物を遊離するキャリア媒体を必要とする[3]。しかしながら、これは、高分子のキャリア分子がPDTにおける感光性薬物の送達のために使用される場合には必要とされない[3,31]。本発明において、我々は、PDTで用いる感光性薬物のキャリアとして、セラミックベースのナノ粒子を開発した。前記ナノ粒子の多孔性マトリクスは、活性酸素種(一重項酸素およびフリー・ラジカル)のみならず酸素分子も浸透することができ、ナノ粒子は封入薬物のほとんどを水性環境中へ放出しない。それゆえ、薬物の所望される光破壊効果は、封入された形態においてさえ維持される。
【００１８】
本発明の方法によって、シリカベースナノ粒子は、HPPH等の水不溶性の感光性抗癌剤でドープされ、ミセル状媒体として合成することができる。ドープ粒子は、30nmの単様式の粒度分布を有する、安定な水性分散として調製することができる。薬剤は、粒子のマトリクス内に組み込まれるが、適切な波長の光で照射することによって感光性が付与され、発生した一重項酸素は、粒子のマトリクス外へ拡散できる。このようなドープナノ粒子は、腫瘍細胞に積極的に取り込まれ、このような浸透性細胞を光照射すると、顕著な細胞死が起こる。これらの観測結果は、様々なセラミックベースマトリクスが、光線力学療法のための薬剤キャリアとして使用できることを証明する。本発明の粒子は、インビボにおいて、腫瘍組織へ安全且つ高効率で輸送可能な注射用製剤として使用できる。
【００１９】
ある実施形態では、特異的な腫瘍標的リガンドをセラミックナノ粒子の表面に付着する。最近我々のグループは、磁気コアを被包するシリカベースナノ粒子を合成した[39]。これらの粒子は、ペプチドホルモン標的剤(黄体形成ホルモン放出ホルモン(LH-RH))で官能性をもたせた。その結果生じた「ナノクリニック」は、LH-RH受容体陽性腫瘍細胞を選択的に標的とすることが分かった。その後DC磁場へ曝すことにより、受容体陽性細胞のみに選択的な磁気細胞溶解がおこった(米国特許第6,514,481号、参照によりここに包含される)。したがって、本発明にかかるナノ粒子のセラミック表面を、様々なリガンドを用いて官能性にし、そのようなリガンド-特異的受容体を含む腫瘍細胞を標的とする粒子を形成することができる。
【００２０】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。実施例は、発明を説明する目的で記載され、いかなる限定も意図しない。
【実施例１】
【００２１】
本実施例は、薬物を含むシリカナノ粒子の調製を説明するものである。この実施形態を説明するため、HPPHを含むシリカ粒子を合成した。界面活性剤エアロゾルOT(AOT, 98%)、コ-サーファクタント n-ブタノール(99.8%)およびトリエトキシビニルシラン(VTES, 97%)はAldrich社から購入した。MTTおよびイソプロパノールはSigma社の製品を用いた。重水(99.9 Atom % D)は米国のIsotec社から入手した。染料/薬物HPPH 2-デビニル-2-(l-ヘキシルオキシエチル)ピロフェオフォルバイド[38]は、ニューヨーク、バッファローのRoswell Park Cancer InstituteのDr. Tom Doughertyから寄贈された。染料のアントラセンジプロピオン酸-ジナトリウム塩(ADPA)は米国のMolecular Probes社から購入した。MEM-alpha培地、5%ウシ胎仔血清(FBS)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)等のような細胞培養製品は、米国のGIBCO社から購入した。上記化学薬品は全てさらに精製することなく使用した。
【００２２】
ナノ粒子は、空の粒子も薬物を含む粒子も両方、図２に図式的に示すように、AOT/n-ブタノール/水-ミセルの非極性内で合成した。ミセルは、強力な磁気撹拌によって、20mLの二重蒸留水中に0.44gのAOTおよび800μL(0.56g)のn-ブタノールを溶解することによって調製した。その結果生じた透明な溶液に、DMF中のHPPH 40μL(15mM)および10μLの精製DMFを磁気撹拌によって溶解した(空のormosil粒子の場合、50μLのDMFを加え、HPPHは加えなかった)。その後、ミセル系に、200μLのトリエトキシビニルシラン(VTES)を混合し、約一時間、あるいは溶液が透明になるまで撹拌した。その後、10μLのアンモニア水(10M)溶液を添加し、その系を約20時間撹拌した。全ての反応は室温で行った。工程の最後に、ナノ粒子の形成を示す青白い半透明色が観察された。薬物ドープナノ粒子の形成後、界面活性剤AOTおよびコ-サーファクタントn-ブタノールを、12-14kDカットオフ・セルロース膜(米国のSpectrum Laboratories社)を用いて、水に対して溶液を40時間透析することによって完全に除去した。透析した溶液をその後0.2ミクロン・カットオフ・薄膜フィルター(米国、Nalgene社)でろ過し、その後の実験で使用した。
【００２３】
結果として生じたナノ粒子の水性分散の形態およびサイズを測定するために、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いた。使用した電子顕微鏡はJEOL JEM 2020であり、加速電圧は200kVとした。薬物を含むナノ粒子の透過型電子顕微鏡(TEM)写真の結果を図１に示す。粒子は球状であり、平均サイズ30nmの単様式の粒度分布を示す(調製は上記手順で行った)。
【実施例２】
【００２４】
本実施例は封入薬物の発光特性が、封入されていない薬物の発光特性と同じであることを示すものである。この実施例を説明するために、薬物を封入したシリカ粒子および遊離薬物のUV-可視吸収スペクトルを島津(メリーランド州、コロンビア)製UV-3101PC分光光度計(1cm厚の石英キュベット使用)で記録し、蛍光スペクトルを島津製RF5000U蛍光分光計(1cm厚の石英キュベット使用)で記録した。HPPHのUV-可視吸収スペクトルは、ナノ粒子内に封入されたものも、AOT/BuOH/水-ミセル内のものも、２つの同じピーク位置を示した(図３)。これにより、HPPHのピーク位置は、ナノ粒子内に封入されてもシフトしないことが実証された。空のナノ粒子を使用した対照実験は、光の持つ高い組織透過性のため、PDTで対象となる範囲(治療域)である、可視および近赤外(NIR)の波長域(600-900nm)では実質的に吸収を示さなかった。したがって、このような粒子は、感光性抗癌剤の励起に使用される治療光を妨げず、PDTで効果的に使用できる。
【００２５】
図４は、ナノ粒子内に封入されたHPPHと、AOT/BuOH/水-ミセル内のHPPHの蛍光発光スペクトルを示す。励起波長414nmにおける両サンプルのスペクトルを、蒸留水に対する透析(使用した界面活性剤およびコ-サーファクタント分子を事実上除去する)の前後で記録した。ナノ粒子とミセル内のHPPHの発光は、透析前はほぼ同様であるが、透析後には２つの間に大きな違いが観察された。ナノ粒子ドープHPPHからの発光強度は依然として著しい(透析前の強度の約75%)のに対し、透析後のHPPH/「ミセル」からは実質的に発光が観察されない。これは、HPPHが非極性分子であり、極性溶媒中で凝集し、それによりその蛍光が自己消滅するという事実によって説明できる。HPPH分子がミセルの非極性中心内にある限り、それらは分離しているが、界面活性剤の除去により、分子は次第に水性外界と接触していき、凝集し始める。しかし、ナノ粒子-ドープHPPHの場合は、薬物分子は粒子マトリクス内にばらばらに組み込まれていると考えられるので(図１参照)、水溶液系にさらされても、凝集および発光強度の著しい損失を生じない。水性媒体内において自己消滅へ耐性を示す封入薬物/染料のこの特質は、生体系におけるイメージング用ナノプローブの作製のために有効に利用できる。
【実施例３】
【００２６】
本実施例は、リン光スペクトルによる検出の際の、封入薬物による一重項酸素生成を説明するものである。一重項酸素(1O2)の検出として、1270nmでのリン光発光スペクトルによるものが多数報告されている[34,35]。水中での1O2の寿命は非常に短い(2〜5μS)ので、上記方法による検出は非常に困難である。重水(D2O)を溶媒とした場合、1O2の寿命が増大されるため(50〜60μs)、我々は重水を使用した[36]。代表的な実験は、D2O中に分散させたナノ粒子に封入したHPPH(22.5μM)を3mL用いて行った。D2O中のAOT/BuOH/D2O-ミセルおよび空のナノ粒子内で可溶化したHPPHを、ポジティブおよびネガティブコントロールとして、それぞれ使用した。In-Ga-As光検出器(米国Electro-Optical Systems社)が装備されているSPEX270M分光計(Jobin Yvon)を使用して、一重項酸素のリン光発光スペクトルを記録した。 固体ダイオード励起レーザー(Verdi, Coherent)を励起源として使用した(532nm)。サンプル溶液を乗せた1cm厚の正方形の石英キュベットを分光計の入射スリットの前に直接置き、発光シグナルを、励起レーザー光線に対して90度で、キュベット側面から収集した。さらにNIR長波エッジ・フィルター(米国、Andover 社)も光検出器の前に置いた。
【００２７】
結果から、セラミックマトリクスは一般に多孔性であるため、これらの内部に封入された感光性薬物は、これらの孔を通じた酸素の拡散によって酸素分子と相互作用できることが実証された。励起した光線感作物質と酸素との相互作用の結果生じた活性酸素種(ROS)は、多孔性マトリクスから周辺環境へ拡散するため検出することができる。我々は、1270nmにおけるそのリン光発光スペクトルにより、HPPHから発生するROSである、一重項酸素の生成を研究した。図５は、ナノ粒子内に封入されたHPPH、およびミセル内で可溶化されたHPPHのスペクトルを示す。両方のスペクトルが1270nmでピークを示し、両方のケースで一重項酸素が発生したことが分かる。空のナノ粒子を用いたコントロールスペクトルは、リン光ピークを示さない。これにより、一重項酸素が封入状態における感光性HPPHによって確かに生成され、セラミックマトリクスの孔を通じて外へ拡散し、周辺環境と相互作用することが証明される。
【実施例４】
【００２８】
本実施例は、検出手段としてアントラセンジプロピオン酸(ADPA)ジナトリウム塩を使用する化学的手法によって、封入薬物により生成された一重項酸素を検出できることを説明する。一重項酸素の生成は、リン光スペクトルの他に、一重項酸素センサーとしてADPA(9,10-アントラセンジプロピオン酸)ジナトリウム塩を使用して、化学的にも検出できた[36]。ジナトリウム-ADPA(水溶性アントラセン誘導体)は、一重項酸素との反応において、対応するエンドペルオキシドに退色されるため、400nm(ADPAのλmax)における吸光度の減少を記録することによって分光光度法で追跡した。代表的な実験では、1cm厚の石英キュベット内で、D2O中のジナトリウム-ADPA 150μL(5.5mM)を、15μM HPPH(D2O中でナノ粒子に封入されたもの、およびAOT/D2O-ミセル中のもの)3mLと混合した。D2O中に分散した空のナノ粒子と混合したジナトリウム- ADPA を用いて対照実験を行った。得られた溶液を650nmレーザー光源(固体ダイオード励起レーザー)で照射し、その吸光度を分光光度計で10分ごとに記録した。
【００２９】
図６は、種々のサンプルを用いたインキュべーションおよび光照射において、400nm(ADPAの吸収極大)での吸光度(OD)の減少によって観察される、ADPAの経時的な退色を示す。ナノ粒子内にドープされた場合もミセル内で可溶化された場合も、HPPHのプロットは、光照射の時間とともに、ODのシャープな減少を示し、両方のケースで十分な一重項酸素の発生があることを示唆する。ADPAでインキュベートした空のナノ粒子のプロットは、経時的なODの減少を示さず、ADPAの退色が、発生した一重項酸素の結果であり、照射光によるものではないことが分かる。
【実施例５】
【００３０】
本実施例は、光線感作薬物/染料が封入されたシリカナノ粒子が細胞によって取り込まれることを実証する。ナノ粒子取込の研究のため、KB細胞株(ヒト上皮口腔癌細胞)を使用した。細胞は10%ウシ胎仔血清(FBS)を用いたDMEM培養液で37℃(5%CO2の加湿雰囲気)で維持した。培養液3ml中で、単分子層細胞をHPPH(15μM)ドープナノ粒子の水性分散液100μlとともに、60×15mmの組織培養プレートで一時間インキュベートした。細胞を無菌のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすぎ、共焦点レーザー顕微鏡で直接観察した。
【００３１】
ナノ粒子内にドープされたHPPHにより、細胞傷害性を有する一重項酸素分子の生成が確立されたため、我々は次に、蛍光画像技術を用いて、腫瘍細胞によるこのようなドープナノ粒子の取込を測定した。腫瘍(KB)細胞の二光子蛍光画像(図7A)は、細胞質および膜内における顕著な染色を示し、これらの領域においてナノ粒子の蓄積があることを示唆する。図7Bに示す、細胞質の局在化スペクトルは、このような細胞の自己蛍光とHPPH蛍光とを効果的に分離できる、HPPH特有の発光ピーク(665nm)を示す。このような処置細胞の生存度はその形態によって確認され、その結果、細胞が染色の10時間後でさえ生存していることが分かった。
【実施例６】
【００３２】
本実施例は、本発明のシリカナノ粒子が、光線力学療法のために使用できることを実証するものである。このことを証明するため、薬物を含むシリカナノ粒子を取り込んだ細胞を用いて、光照射した場合としない場合における細胞生存度を研究した。細胞生存度の研究のため、UCI-107(カリフォルニア州、アービン、カリフォルニア大学)腫瘍細胞株を使用した。細胞は37℃(5%CO2加湿雰囲気)で5%FBSを用いたMEMアルファ培地中で維持した。実験の前に、24-ウェルプレートに細胞を接種し(7.5×105cells/well)、一晩インキュベートした。培地を除去し、ウェルを無菌PBSを用いて三回すすいだ。注意深くすすいだ後、2mlの新鮮培地を各ウェル内に置き換えた。所定濃度の薬物を吸光度測定によって測定した。すなわち、(a)120μLの0.25%Tween-80/水-ミセル中の20μM HPPH、(b)120μLの水性ナノ粒子分散中に取り込まれた20μM HPPH、(c)120μLの0.25%Tween-80/水-ミセル、および(d)120μLの空の水性ナノ粒子分散、を指定ウェルに添加し、その後プレートをインキュベータに２時間戻した。ウェルを無菌PBSで３回すすぎ、新鮮な培地と取り替えた(2ml/well)。培地取り替えの直後に、ウェルを10分間ずつ650nm光源(固体ダイオード励起レーザー使用)に曝した。光源への曝露終了後、プレートをインキュベータに一晩戻した。細胞生存度は比色分析MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム ブロミド)アッセイ[37]を用いて評価した。MTTは生存細胞のみを測定し、570nmにおける吸光度はそのような細胞の数と正比例することが認められている。簡潔に、MTTを無菌のPBSに5mg/mlの濃度で溶解し、200μl/wellで各ウェルに添加した。プレートをその後37℃で5%CO2と共に4時間インキュベートした。インキュべーション後、MTT溶液を含む培地を注意深く全てのウェルから吸引した。無水イソプロパノール溶液中の0.1N HCl 2mlを各ウェルに添加し、形成した紫色のMTTホルマザン結晶を全て溶解した。得られた紫色の溶液の吸光度をBausch & Lomb Spectronic 601 分光光度計を用いて570nmで測定した。血清のみを添加した培地でインキュベートしたコントロール細胞の平均吸光度は、100%の細胞生存率を示した。薬物および光線量ごとに4倍複製を行い、各実験を３回繰り返した。
【００３３】
図８は、様々な薬剤でUCI-107腫瘍細胞を処理し、その後光活性化した際の細胞生存率を示す(コントロールは純粋培地)。著しい細胞死が、Tween-80ミセル内HPPH(細胞生存率約7%)およびナノ粒子ドープHPPH(細胞生存率約11%)の両方で観察された。さらに、一般に非毒性の界面活性剤として知られている空のTween-80ミセルでも実質的な細胞毒性が観察された。一方、空のナノ粒子はほとんど毒性をしめさなかった。結果から、HPPHドープナノ粒子は、Tween-80ミセル内で可溶化されたHPPHとほぼ同じくらい、腫瘍細胞を殺す効果的な薬物/キャリアシステムであると結論付けることができる。
【実施例７】
【００３４】
本実施例は、本発明のナノ粒子を動物に使用できることを示すものである。ヒト腫瘍を有する雌のSCIDマウスの腹腔内にHPPHドープナノ粒子を注射する(体重1gあたり1014粒子)。注射後、マウスを完全な暗闇の中、一つのケージ内で24時間飼育する。マウスは体重100g当たり0.9%NaClに溶解した5.5μgフェンタニルおよび5.5mg塩酸メトミデート (metomidat-hydrochloride)(ドイツ、ズルツバッハ、Janssen Cilag)で麻酔し、光照射前にもう一度毛皮を剪毛する。腫瘍に532nmのレーザー光線を電力50mWで2分間照射し、合計30J/cm2 量を照射する(外界温度25℃)。光は光ファイバーによる光送達系を用いて照射する。光照射なしのマウスの腫瘍をコントロールとして用いる。腫瘍反応の評価はサイズおよび組織学的形態の変化によって決定できる。ここに記載した説明に基づき、ナノ粒子を、ヒトを含む他の個体のPDTのために用いることができる。
【００３５】
本発明を明細書記載の実施例を用いて説明したが、様々な実施例に対して通常の変更を加えることができることは当業者に自明であり、それらは明細書および請求の範囲の記載により本発明の範囲内に属する。
【００３６】
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【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、平均直径30ナノメートルの高度に単分散した粒子を示す、HPPHドープシリカ-ベースナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真である。
【図２】図２は、ミセル媒体中におけるHPPHドープシリカ-ベースナノ粒子の合成及び精製の略図である。
【図３】図３は、(a)AOT/BuOH/水-ミセル中のHPPH、(b)シリカナノ粒子中にドープされたHPPH及び(c)多孔性シリカナノ粒子の紫外線-可視吸収スペクトルを示すものである。
【図４】図４は、励起波長414nmにおける(a)透析前：AOT/BuOH/水-ミセル中のHPPH、(b)透析前：シリカナノ粒子中にドープされたHPPH、(c)透析後：AOT/BuOH/水-ミセル中のHPPH、及び(d)透析後：シリカナノ粒子中にドープされたHPPH、の蛍光発光スペクトルを示すものである。
【図５】図５は、(a)AOT/BuOH/D2O-ミセル中のHPPH（実線）、(b)D2O中で分散したシリカナノ粒子中にドープされたHPPH及び(c)D2O中の多孔性シリカナノ粒子、により生成された一重項酸素のリン光発光スペクトルを示すものである(1270nm)。
【図６】図６は、(a)AOT/BuOH/D2O-ミセル中のHPPH、(b)D2O中で分散したシリカナノ粒子中にドープされたHPPH及び、(c)D2O中の多孔性シリカナノ粒子、の光照射によって生成された一重項酸素による染料ADPA(λmax 400nm)の経時的な退色を示すものである。
【図７】図７は、HPPHドープナノ粒子で処理した単一の腫瘍(KB)細胞の二光子共焦点蛍光イメージを表すものである。挿入図は、処理細胞の細胞質からの局在化蛍光スペクトルを示す。
【図８】図８は、MTT法で分析した時のUCI-107細胞の細胞生存率を示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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