(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オトギリソウ科マンゴスチン（Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｍａｎｇｏｓｔａｎａ  Ｌ．）の果皮より得られる抽出物が、
一般式
【化１】
0004630416.tif 000014
（ＲはＣＨ３またはＨである）で表わされる、α（アルファ）−および／またはγ（ガンマ）−マンゴスチンを有効成分とし、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・ソブリヌス、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する抗菌活性用であるとともに、ストレプトコッカス・ソブリヌスが産生するグルコシルトランスフェラーゼに対する阻害活性用であり、且つポルフィロモナス・ジンジバリスの産生するコラゲナーゼに対する阻害活性用であることを特徴とする坑う蝕、歯周病剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オトギリソウ科マンゴスチン（Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｍａｎｇｏｓｔａｎａ  Ｌ．）の果皮より得られる抽出物が、
一般式
【化１】
0004630416.tif 000002
（ＲはＣＨ３またはＨである）で表わされる、α（アルファ）−および／またはγ（ガンマ）−マンゴスチンを有効成分とし、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・ソブリヌス、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する抗菌活性用であるとともに、ストレプトコッカス・ソブリヌスが産生するグルコシルトランスフェラーゼに対する阻害活性用であり、且つポルフィロモナス・ジンジバリスの産生するコラゲナーゼに対する阻害活性用である抗う蝕、歯周病剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
う蝕及び歯周病は、口腔内の二大疾患であり、いずれも特定の細菌による感染症であることが明らかにされている。グラム陽性、通性嫌気性細菌であるStreptococcus mutans（ストレプトコッカス・ミュータンス）及びStreptococcus sobrinus（ストレプトコッカス・ソブリヌス）は、人のう蝕病巣や歯垢の中に見出され、う蝕発生において重要な役割を果たしている。本菌種は、酵素グルコシルトランスフェラーゼを産生し、ショ糖を基質として粘着性の高い高分子多糖体グルカンを生成し、歯のエナメル質表層に強く定着して歯垢を形成する。形成された歯垢には、様々な口腔内細菌が棲息し、その糖代謝に伴い産生した酸により歯のエナメル質が脱灰されてう蝕が誘発されるのである。
【０００３】
一方、歯周病は、作用因子、環境及び宿主からなる多因性疾患であることが知られている。この中で最も病因的な役割を果たすのは細菌であり、近年の研究によりいくつかの病原菌及びその病原性因子等が報告されている。中でもグラム陰性、偏性嫌気性菌であるPorphyromonas gingivalis（ポルフィロモナス・ジンジバリス）は、歯周炎患者の歯周ポケットから高頻度に分離されることや、コラゲナーゼ、免疫グロブリン分解酵素、繊維芽細胞増殖阻害活性、揮発性硫化物の生成等の強い病原性因子を有することから、歯周病の中でも最も多い成人性歯周炎の病原菌として有力視されている。
【０００４】
従って、う蝕及び歯周病の予防や症状を改善するには、病巣においてこれらの細菌類の生育を抑制することや、これらの菌の病原性因子を抑制することが重要であることは明らかである。菌の抑制という観点からは、本菌類に対して有効な抗菌性物質を適用するのが効果的であり、これらの菌に対して有効なものとしてテトラサイクリン、ミノサイクリン等の抗生物質があげられる。しかし、これらは作用が強力である反面、耐性菌の出現、副作用等から日常的な利用に適しているとはいえない。
【０００５】
オトギリソウ科の植物であるマンゴスチン（Garcinia mangostana L.）は、その原産国のタイにおいてマンゴスチンの果皮を健胃生薬、抗炎症薬等として伝承的に用いられている。また、マンゴスチン果皮抽出物及びその主要成分であるα−、γ−マンゴスチンについては、抗アレルギー作用（特開平１０−７２３５７号公報）、美白・抗炎症作用（特開平４−２４４００４号公報）、テストステロン５α−レダクターゼ阻害作用（特開平５−１７３６５号公報）、抗酸化作用（特開平８−２２５７８３号公報）等の生理活性が知られている。さらに、ヘリコバクター・ピロリに対する抗菌活性（特開平８−２３１３９６号公報）、黄色ブドウ球菌やメシチリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対する抗菌活性（特開平８−２５９４９３号公報、特開平９−９５４５３号公報、特開平９−１１０６８８号公報）等の様々な菌に対する抗菌活性が開示されている。しかし、現在までにマンゴスチンが、う蝕原因菌であるＳ・ミュータンス、Ｓ・ソブリヌス、また歯周病原因菌であるＰ・ジンジバリスに対する抗菌活性や、グルコシルトランスフェラーゼ阻害活性、さらにコラゲナーゼ阻害活性を有することについての報告はない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、安全性の高い天然物を原料として、その生産が容易であって、しかもう蝕、歯周病原因菌に対する抗菌活性が高く、う蝕原因菌であるＳ・ソブリヌスが産生するグルコシルトランスフェラーゼに対して阻害活性を有し、さらには歯周病原因菌であるＰ・ジンジバリスの産生するコラゲナーゼに対しても阻害活性を示し、う蝕、歯周病に対して予防効果や症状の軽減効果を有する抗う蝕、歯周病剤を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するため、含そう剤、練り歯磨き等の衛生用品、チューインガム、キャンディ、錠菓等の食品のような口腔用組成物に配合して日常的に利用可能な、抗う蝕、歯周病剤を開発すべく種々の植物抽出物を用いて、う蝕原因菌であるＳ・ミュータンス、Ｓ・ソブリヌス、また歯周病原因菌であるＰ・ジンジバリスに対する抗菌活性、う蝕原因菌Ｓ・ソブリヌスの産生するグルコシルトランスフェラーゼに対する阻害活性、さらには歯周病原因菌Ｐ・ジンジバリスの産生するコラゲナーゼに対する阻害活性を指標としてスクリーニングを行った。その結果、オトギリソウ科の植物であるマンゴスチン（Garcinia mangostana L.）から得られる抽出物、特にその果皮から得られる抽出物、さらにはその成分であるα−マンゴスチン及びγ−マンゴスチンが、それらの強い効果を有することを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、オトギリソウ科マンゴスチン（Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｍａｎｇｏｓｔａｎａ  Ｌ．）の果皮より得られる抽出物が、
一般式
【化１】
0004630416.tif 000003
（ＲはＣＨ３またはＨである）で表わされる、α（アルファ）−および／またはγ（ガンマ）−マンゴスチンを有効成分とし、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・ソブリヌス、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する抗菌活性用であるとともに、ストレプトコッカス・ソブリヌスが産生するグルコシルトランスフェラーゼに対する阻害活性用であり、且つポルフィロモナス・ジンジバリスの産生するコラゲナーゼに対する阻害活性用である抗う蝕、歯周病剤である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明で使用するマンゴスチン（Garcinia mangostana L.）は、オトギリソウ科の植物であり、その果皮、葉、果肉、果実、材、樹皮、根、好ましくはその果皮または葉、特に好ましくはその果皮を乾燥させ、粉砕機等の適当な粉砕手段で粉砕する。この粉砕物に、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、アセトン、酢酸エチル及び水等の溶媒の１種類または2種以上の混合溶媒を加えて、従来一般に行われている抽出方法によって本発明のマンゴスチン抽出物及びマンゴスチン果皮抽出物を得ることができるが、本発明品は口腔に、または飲食品として用いるものであることを考慮すると、抽出溶媒としては安全性の高い水とエタノールとの組合せ、特にエタノール４０％以上の組合せが好ましい。得られた抽出物は、必要により減圧下、濃縮乾燥してもよい。
【００１０】
このようにして得られた抽出物を、さらに吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーのような適当な分離精製手段を用いて分離精製することにより、α−マンゴスチン及びγ−マンゴスチンを得ることができる。
【００１１】
このα−マンゴスチン及びγ−マンゴスチンは、一般式
【化２】
0004630416.tif 000004
（式中、α−マンゴスチンはＲがＣＨ３、γ−マンゴスチンはＲがＨ）で表される黄色の結晶（α−マンゴスチン）及び非結晶性粉末（γ−マンゴスチン）である。
【００１２】
本発明の抗う蝕、歯周病剤として上記マンゴスチン抽出物、マンゴスチン果皮抽出物、α−マンゴスチン、またはγ−マンゴスチンを口腔内に投与する場合におけるその投与量としては、症状または個人差により一概に規定することは困難であるが、好ましくは口中または病巣局所での濃度が約０．００１重量％以上、好ましくは約０．０１重量％以上になるようにするとよい。
【００１３】
また、本発明の口腔用組成物は、上記したマンゴスチン抽出物、特にその果皮抽出物、あるいはα−マンゴスチン、γ−マンゴスチンを含有させることにより調製され、それらが、香り、呈味性に優れ、安全性が高いことから、例えば、含そう剤、練り歯磨等の口腔用組成物、チューインガム、キャンディ、錠菓、ジュース等の飲食品に配合し、日常的に利用することが可能である。添加量としては、口腔用組成物または飲食品に対して乾燥抽出物あるいはα−マンゴスチンもしくはγ−マンゴスチンを約０．００１重量％以上、好ましくは約０．０１重量％以上添加する。さらに飲食品においては、特に嗜好性の面を考慮すると約０．００１〜５重量％、好ましくは約０．０１〜１重量％の割合になるように添加するのが好適である。
【００１４】
マンゴスチン果皮の安全性については、その水溶性（または親水性）有機溶媒抽出物において種々の安全性試験が実施されている。例えば、マウスを用いて経口投与による急性毒性試験が行われ、前記抽出物１０ｇ／ｋｇを投与しても死亡例が認められず（特開平５−１７３６５号公報）、またマンゴスチン果皮抽出物の皮膚塗布による人に対する刺激性試験も行われており、皮膚に紅斑等の反応が全く認められていない（特開平４−２４４００４号公報）等、マンゴスチン果皮抽出物は哺乳動物及び人に対する投与においてその安全性は既に証明されている。従って、本発明品の坑う蝕、歯周病剤を人が口腔用組成物として口腔内で用いたり、飲食品として摂取する場合においても、安全性について問題はない。
【００１５】
以下に実施例、試験例、応用例を挙げて説明するが、これらの例は本発明の範囲を制限するものではない。
【００１６】
【実施例】
実施例１
マンゴスチンの果皮を乾燥後粉砕機で粉末化した。この乾燥粉末１ｋｇを１０リットルの水に浸漬し、４０℃で２４時間攪拌抽出した。抽出液を濾別し、濾液を減圧下、濃縮乾燥することにより、本発明品である赤褐色の抽出物１４０ｇを得た。
【００１７】
実施例２
マンゴスチンの果皮乾燥粉末１ｋｇを１０リットルの４０％エタノール水に浸漬し、４０℃で４時間攪拌抽出した。以下実施例１と同様の操作を行い本発明品である黄褐色の抽出物２０４ｇを得た。
【００１８】
実施例３
マンゴスチンの果皮乾燥粉末１ｋｇを１０リットルの７０％エタノール水に浸漬し、４０℃で４時間攪拌抽出した。以下実施例１と同様の操作を行い本発明品である黄褐色の抽出物２３６ｇを得た。
【００１９】
実施例４
マンゴスチンの果皮乾燥粉末１ｋｇを１０リットルのエタノールに浸漬し、４０℃で４時間攪拌抽出した。以下実施例１と同様の操作を行い本発明品である黄褐色の抽出物９１ｇを得た。
【００２０】
実施例５
マンゴスチンの果皮乾燥粉末１ｋｇを１０リットルのメタノールに浸漬し、４０℃で４時間攪拌抽出した。以下実施例１と同様の操作を行い本発明品である黄褐色の抽出物８８ｇを得た。
【００２１】
実施例６
マンゴスチンの果皮乾燥粉末１ｋｇを１０リットルの酢酸エチルに浸漬し、４０℃で４時間攪拌抽出した。以下実施例１と同様の操作を行い本発明品である黄褐色の抽出物４２ｇを得た。
【００２２】
実施例７
マンゴスチンの葉乾燥粉末１ｋｇを１０リットルのエタノールに浸漬し、４０℃で４時間攪拌抽出した。以下実施例１と同様の操作を行い本発明品である緑褐色の抽出物１９２ｇを得た。
【００２３】
実施例８
実施例４で得られた抽出物８０ｇを水３５０ｍｌに分散させた後、３５０ｍｌの酢酸エチルで分配抽出を２回行い、酢酸エチル画分を得た。酢酸エチル画分を減圧下で溶媒を留去させ、２０ｇの乾燥物を得た。この乾燥物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（８００ｇ）を用いて精製した。溶出はヘキサン−酢酸エチルの系により、徐々に酢酸エチルの構成比を増加させるグラジエント溶出法にて実施した。溶出物を薄層クロマトグラフィー（シリカゲル）分析により３つの画分に分けた。薄層クロマトグラフィーの展開溶媒はヘキサン−酢酸エチル（５０：５０もしくは３０：７０）を用いて実施し、検出にはアニスアルデヒドを用いた。最初の画分（５ｇ）をヘキサンで調製したシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２００ｇ）にのせ、溶出はヘキサン−酢酸エチル（５０：５０→３０：７０→１０：９０）を用いて実施し、黄色針状結晶のα−マンゴスチン（Ｃ24Ｈ26Ｏ6、ｍｐ１８０〜１８１℃）を２ｇ得た。２つ目の画分（２ｇ）も同様に再度シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１００ｇ）により精製した。溶出は、ヘキサン−酢酸エチル（５０：５０→３０：７０）、続いて酢酸エチルのみ、さらには酢酸エチル−メタノール（５０：５０）で実施した。これにより黄色非結晶状のγ−マンゴスチン（Ｃ23Ｈ24Ｏ6、ｍｐ２０６〜２１０℃）５００ｍｇを得た。これらの化合物の同定は、既に報告されている1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、ＭＳ、ＵＶスペクトルデータとの比較により行った。
【００２４】
試験例１
実施例１〜８で調製した本発明品のう蝕及び歯周病原因菌に対する抗菌活性を、以下の方法により試験した。
【００２５】
0004630416.tif 000005
【００２６】
Ｓ・ミュータンス、Ｓ・ソブリヌスの試験培地としてはブレイン・ハート・インフュージョン液体培地を、Ｐ・ジンジバリスの試験培地としてはトリプチケイス・ソイ液体培地にヘミン（５μｇ／ｍｌ）、メナジオン（０．５μｇ／ｍｌ）を添加したものを用いた。
【００２７】
２）抗菌活性試験法及び試験結果
う蝕原因菌２株及び歯周病原因菌1株をそれぞれの培地及び培養条件で２４〜４８時間培養し、菌を充分に生育させた。９６穴平底マイクロプレートを用い、各ウエル中で試料溶液（１００μl）の２倍希釈系列を調製した。試験系にて菌体量が１０５〜１０６個／ｍｌになるように、２倍濃度で調製した培地に各々の菌を接種し、その１００μlを各ウエルに添加した。２４〜４８時間培養した後、マイクロプレートリーダーを用いて各ウエルの濁度（５５０ｎｍ）を測定し、菌の生育を判定し、試料の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を求めた。試験結果を表1に示した。本発明品であるマンゴスチン果皮抽出物及びα−、γ−マンゴスチンは、いずれの菌に対しても抗菌活性を示し、その効果は葉抽出物（実施例７）より強いものであった。特に果皮の７０％以上のエタノール濃度での抽出や、メタノール、酢酸エチル等の抽出により、抗菌活性成分が効率よく抽出される事が分った。またα−、γ−マンゴスチンも非常に強い抗菌活性を有しており、マンゴスチン果皮抽出物中の抗菌活性の本体と考えられた。
【００２８】
【表１】
0004630416.tif 000006
【００２９】
試験例２
実施例１〜８で調製した本発明剤のグルコシルトランスフェラーゼ阻害活性を、以下の方法により試験した。
【００３０】
１）グルコシルトランスフェラーゼ調製法
ストレプトコッカス・ソブリヌス６７１５株を１リットルのブレイン・ハート・インフュージョン液体培地中で３７℃、２４時間培養した。培養液を遠心分離し、上清を４℃下硫酸アンモニウム６０％飽和とし、遠心分離し、上清を除き、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）３０ｍｌで沈殿を回収した。同緩衝液を用いて十分に透析を行い、透析内液を遠心分離し、その上清を試験用グルコシルトランスフェラーゼとした。
【００３１】
２）グルコシルトランスフェラーゼ阻害試験法及び試験結果
６２．５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に蔗糖１．２５％、アジ化ナトリウム０．０２５％を加えたものを基質溶液とした。試験試料規定量を５０％メタノールで溶解したものを試料溶液とした。基質溶液８００μｌ、試料溶液４０μｌ、グルコシルトランスフェラーゼ２０μｌ（試験系のグルコシルトランスフェラーゼ活性が試料無添加時の吸光度Ａ０＝１．５となるように調整したもの）、精製水１４０μｌをグラスチューブ中で混合し、水平面に対して３０度に傾け、３７℃、１６時間静置する。デカンテーションにより反応液を除去し、精製水３ｍｌを穏やかに加え、グルカンを洗浄し、洗浄液を除去する。精製水３ｍｌを加えて超音波処理し、グルカンを分散させた後、さらに精製水３ｍｌを加え、５５０ｎｍの吸光度を測定する。グルコシルトランスフェラーゼ阻害活性は以下の式により求めた。
【００３２】
グルコシルトランスフェラーゼ阻害活性  ＝（（Ａ０−Ａ）／Ａ０）×１００
Ａ：試料添加時の吸光度        Ａ０：試料無添加時の吸光度
【００３３】
試験結果を表２に示した。本発明品であるマンゴスチン果皮、葉抽出物及びα−、γ−マンゴスチンは、いずれも強いグルコシルトランスフェラーゼ阻害活性を有することが分った。
【００３４】
【表２】
0004630416.tif 000007
【００３５】
試験例３
実施例１〜８で調製した本発明品のコラゲナーゼ阻害活性を、以下の方法により試験した。
【００３６】
１）コラゲナーゼ調製法
ポルフィロモナス・ジンジバリスＦＤＣ３８１株をヘミン（５μｇ／ｍｌ）、メナジオン（０．５μｇ／ｍｌ）を添加したトリプチケイス・ソイ液体培地１．５リットルに接種し３７℃で３日間嫌気培養した。培養液を遠心分離し、上清を４℃で硫酸アンモニウム８０％飽和とし、遠心分離し、上清を除き、５ｍＭ塩化カルシウムを含む０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍｌにて沈殿を回収した。同緩衝液を用いて十分に透析を行い、透析内液を遠心分離し、その上清を試験用コラゲナーゼとした。
【００３７】
２）コラゲナーゼ阻害試験法及び試験結果
コラゲナーゼ阻害活性の測定はコラゲノキットＣＬＮ−１００（コラーゲン技術研修会）を用いて行った。試料溶液１００μｌ、ＦＩＴＣ標識コラーゲン溶液２００μｌ、コラゲナーゼ２００μｌ（コラゲナーゼ活性が１ｕｎｉｔ/ｍｌとなるよう希釈したもの、ここで１ｕｎｉｔは１分間にコラーゲン１μｇを分解するコラゲナーゼの活性）をグラスチューブ中で混合し、３５℃で２時間反応を行った。コラゲナーゼにより分解したＦＩＴＣ標識コラーゲンを抽出し、その蛍光強度によりコラゲナーゼ活性の測定を行った。コラゲナーゼ阻害活性は以下の式により求めた。
【００３８】
コラゲナーゼ阻害活性  ＝（（Ｆ０−Ｆ）／Ｆ０）×１００
Ｆ：試料添加時の蛍光強度      Ｆ０：試料無添加時の蛍光強度
【００３９】
【表３】
0004630416.tif 000008
【００４０】
試験結果を表３に示した。本発明品であるマンゴスチン果皮、葉抽出物及びα−、γ−マンゴスチンは、いずれもコラゲナーゼ阻害活性を有することが分った。特に果皮の水抽出物及び含水エタノール抽出物が強い阻害活性を有することが分った。
【００４１】
以上の試験結果より、本発明品であるマンゴスチン抽出物、特にその果皮抽出物及びα−マンゴスチン及びγ−マンゴスチンは、う蝕、歯周病原因菌に対する抗菌活性、う蝕原因菌のグルコシルトランスフェラーゼ及び歯周病原因菌のコラゲナーゼ阻害活性を併せ持つことが今回初めて見出された。
【００４２】
0004630416.tif 000009
【００４３】
0004630416.tif 000010
【００４４】
0004630416.tif 000011
【００４５】
0004630416.tif 000012
【００４６】
0004630416.tif 000013
【００４７】
【発明の効果】
本発明品は安全性の高いマンゴスチン（Garcinia mangostana L.）、特にその果皮から得られる抽出物、その精製物であるα−及び／またはγ−マンゴスチンを有効成分とする抗う蝕、歯周病剤であり、う蝕、歯周病原因菌に対して強い抗菌活性を有し、また、う蝕原因菌ストレプトコッカス・ソブリヌスが産生するグルコシルトランスフェラーゼに対する阻害活性及び歯周病原因菌ポルフィロモナス・ジンジバリスの産生するコラゲナーゼに対する阻害活性を併せ持つものである。