(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
0004843127.tif 000005
で表される側鎖にイソプレニル基を有するソフォラノンを有効成分とするヒ
ト白血病細胞に対する医薬用アポトーシス誘導剤。
【請求項２】
請求項１に記載の側鎖にイソプレニル基を有するソフォラノンを有効成分とするヒト卵巣癌細胞、胃癌細胞、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞及び神経芽種細胞から選択されるヒト固形癌細胞に対する医薬用アポトーシス誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、アポトーシスを誘導し、癌細胞の増殖を阻害する作用を有するアポトーシス誘導剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌は、我が国における死亡原因の第一位を占めている。この癌に対する治療として、外科療法、化学療法、免疫療法等があるが、その治療の効果は、癌の種類、進行度等により異なり、癌に対する効果的な治療法が今なお求められている。
【０００３】
このうち、化学療法による治療法として、多種の化学療法剤が開発されている。例えば、エトポシド、シスプラチンは癌細胞中の核酸に傷害を与えることを特徴とするものである。また、タキソール、ビンクリスチンは細胞骨格のチュブリンの生理機能を阻害して癌細胞に傷害を与えることを特徴とするものである。
【０００４】
しかし、上記従来の化学療法剤は、癌細胞にとどまらず正常細胞にも傷害を与え副作用を引き起こすという欠点を有していた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、１９７０年代に細胞死の新しい概念としてアポトーシスが報告された。アポトーシスが誘導された細胞は、その内容物が流出することなくアポトーシス小体が形成され、このアポトーシス小体はマクロファージ等により貪食されて消滅する。したがって、炎症反応が起きないので副作用を伴わない。
【０００６】
したがって、癌細胞にのみアポトーシスを誘導させることができれば、正常細胞に傷害を与えることなく癌細胞のみを消滅させることができるので、このような性質を有する活性物質は、従来の化学療法剤のような副作用を有さない新たな作用機構を有する化学療法剤となることが期待できる。
【０００７】
この発明は、癌細胞に特異的にアポトーシス誘導能を有する活性物質を見いだすことを目的として、抗癌作用があると民間に言い伝えられている中国の種々の生薬からスクリーニングを行い、豆科のSophora subprostrata Chun et T. Chenの根を乾燥した生薬である山豆根から抽出されるフラボノイド化合物であるソフォラノン（Sophoranone）がアポトーシス誘導能を有することを見いだし、これをアポトーシス誘導剤として提供するものである。
【０００８】
なお、山豆根は、従来から解熱、鎮痛薬として用いられている生薬であり、約４０年前に抗腫瘍効果があることが報告されている。しかし、その活性物質の同定、作用機構の解明は未だされていない。
【０００９】
また、フラボノイド（Flavonoids）は、野菜や果物中に多量に含まれており、抗癌作用があることが知られている。また、抗癌作用の一部は、癌細胞にアポトーシスを誘導するためであることが明らかにされている。現在までにアポトーシス誘導作用があることが知られているフラボノイドには、図６に示すように、baicalein,tangeretin,quercetin,genistein,daidzein,flavopiridol 等が知られている。ソフォラノンは、このようなフラボノイド化合物とは異なり、側鎖にイソプレニル基を有しているのが特徴である。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記スクリーニングの結果、式
【００１１】
【化２】
0004843127.tif 000002
【００１２】
で表される側鎖にイソプレニル基を有するソフォラノンをアポトーシス誘導剤として豆科のSophora subprostrata Chun et T. Chenの根を乾燥した生薬である山豆根から抽出し、この側鎖にイソプレニル基を有するソフォラノンがヒト白血病細胞やヒト固形癌細胞に対し、アポトーシスを誘導し、その増殖を阻害する作用を有することを明らかにした。
【００１３】
【発明の実施の形態】
（ソフォラノンの抽出・単離）
山豆根１ｋｇを粉砕し、メタノールで３回抽出した後、メタノールを留去する。留去後の残さにエーテルを加えた後、１ＭのＮａＯＨ水溶液を加えて振とうし、水層を分取する。水層に塩酸を加えて酸性にし、これにエーテルを加えて振とうした後、エーテル層を濃縮する。残さを酢酸エチルに溶解し、アルミナカラムにのせ、酢酸エチルに溶出する画分を濃縮する。次に、残さをシリカゲルカラムにかけ、ヘキサン：エーテル（２：１）によって精製する。溶媒を留去後、再びシリカゲルクロマトグラフィにより、精製する。その結果、収量９７０ｍｇのソフォラノン（Sophoranone）が得られた。
【００１４】
得られたソフォノランをＪＥＯＬ  ＪＮＭ−ＧＸ  ５００  ＭＨｚ  ＮＭＲスペクトロメータにより1Ｈ−及び13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定しその構造を同定した。ここで、内部標準としてはテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を用いて測定し、得られた化学シフト（δppm）を表１に示した。
【００１５】
【表１】
0004843127.tif 000003
【００１６】
（細胞増殖測定法）（ＸＴＴ法）
後述の各種細胞にSophoranone溶液を加え、４日間培養後、ＸＴＴ（2,3-bis〔2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl〕-2H-tetorazoliumu-5-carboxanilide）を加え、４時間後に５４０ｎｍの吸光度で測定した。
（アポトーシスの分析法）
１．ヘキスト染色法  細胞をヘキスト（Hoechst 33342）で染色し、蛍光顕微鏡で測定した。
２．ＤＮＡ fragmentation の測定  細胞を０．５％ SDS(sodium dodecyl sulfate) で可溶化後、ＤＮＡを１％アガロースゲル中で４０ｍＭ Tris 緩衝液を用い、５０Ｖで１時間電気泳動後、エチジウムブロミドで染色した。ＤＮＡ fragmentation の定量化は、アポトーシスを起こした細胞をTriton X-100 で可溶化して遠心し、上清中の断片化されたＤＮＡ及び沈殿画分に回収される高分子のＤＮＡをＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）で染色し、その蛍光を蛍光光度計で測定する。全ＤＮＡ量に対する上清中のＤＮＡ量の割合から断片化されたＤＮＡ量を算出した。
３．カスペース３活性測定方法  カスペース３により特異的に切断されると蛍光強弩が増加する（7-methoxycoumarin-4-yl-acetyl-DEVDAPK(2,4-dinitrophenyl）-NH2 を用いて測定した。
（ＭＡＰキナーゼ活性の測定）
ＭＡＰキナーゼの活性は、リン酸化ＥＲＫ、リン酸化ＪＮＫ、リン酸化ｐ３８に対する特異抗体を用いたウエスタンブロット法により測定し、各タンパクバンドの濃さから定量した。
【００１７】
【実施例】
（実施例１）
ヒト白血病細胞であるＵ９３７細胞に対するソフォラノンのアポトーシス誘導作用を測定した。すなわち、ヒト白血病Ｕ９３７細胞を種々の濃度のソフォラノンで処理した後、上記ヘキスト染色法により細胞を染色することによりアポトーシスが誘導された細胞の割合を測定した。その結果を図１に示す。
【００１８】
この結果、図１に示すように、ソフォラノンを添加して６時間後に５０％のＵ９３７細胞にアポトーシスを誘導する濃度（ＩＣ50）は、１８μＭであった。
【００１９】
同じ条件では、他のフラボノイド化合物であるケルセチン、ゲニスタイン、ダイゼインでは、アポトーシス誘導効果はほとんど見られなかった。そこで、フラボノイド化合物による処理時間を長くして２日後に測定すると、ソフォラノンでは１８μＭ、ケルセチン及びゲニスタインでは１８０μＭ以上で、ダイゼインではアポトーシスはほとんど誘導されなかった。これは、ソフォラノンが他のフラボノイド化合物であるケルセチン（quercetin）、ゲニスタイン（genistein）よりも１０倍以上強いＩＣ50値をもつことを示している。また、発生起源の異なるヒト白血病ＨＬ−６０細胞にも同様のアポトーシス誘導能を有することが確認できた。
（実施例２）
抗癌剤が一般的に作用しにくいとされるヒト固形癌細胞に対する増殖阻害作用を測定した。すなわち、ヒト卵巣癌細胞ＴＹＫ-ｎｕ細胞を種々の濃度のソフォラノンで４日間処理し、細胞増殖を上記ＸＴＴ法で測定し、未処理の細胞数に対する割合を測定した。その結果を図２に示す。
【００２０】
その結果、卵巣癌細胞ＴＹＫ-ｎｕ細胞に対して濃度依存的に増殖阻害作用を示した。細胞増殖を５０％阻害する濃度（ＩＣ50）は１６μＭであった。
【００２１】
同様に、胃癌細胞AZ-521、大腸癌細胞COLO、膵臓癌細胞MIAPaCa-2、肝癌細胞PLC/PRF/5、子宮癌細胞HeLa、神経芽腫細胞Neuro-2Aに対しても３０μＭ以下の濃度で完全に増殖を阻害した（表２）。
【００２２】
【表２】
0004843127.tif 000004
【００２３】
これらの結果は、ソフォラノンが種々のヒト固形癌細胞に対して非常に強い増殖阻害作用を有することを示している。
【００２４】
強い増殖阻害作用はアポトーシスが誘導された結果であることは、ソフォラノン処理後DNA-fragmentation を定量した結果（図３）から明らかである。すなわち、白血病HL60及びU937細胞だけでなく、胃癌AZ-521細胞及び大腸癌COLO320DM細胞もソフォラノンによる６時間の処理でも強いＤＮＡの断片化が誘導された。
【００２５】
（実施例３）
白血病細胞Ｕ９３７細胞を用いてソフォラノンによるアポトーシス誘導機構の特徴を調べた。すなわち、Ｕ９３７細胞を２５μＭのソフォラノンで処理し、上記ＭＡＰキナーゼ活性の測定法により、ＭＡＰキナーゼの活性変化を測定した。その結果を図４（Ａ）〜（Ｃ）に示す。（Ａ）はＥＲＫ活性、（Ｂ）はＪＮＫ活性、（Ｃ）はｐ３８活性を示している。
【００２６】
その結果、ＥＲＫの中のＥＲＫ１及びＥＲＫ２活性とも、ソフォラノン処理後直ちに阻害され、１時間後には活性がほとんど消失したが、３時間後から再び活性化された。これに対して、ＪＮＫの中のＪＮＫ１及びＪＮＫ２は、ソフォラノン処理後から経時的に増加した。ｐ３８活性は、１時間後に一過性に上昇し、３時間後以降は活性が消失した。このようなＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８の活性変化は、これまでアポトーシス誘導剤による処理では報告されておらず、ソフォラノンがユニークな機構でアポトーシスを誘導していることを示唆している。
【００２７】
他方、Ｕ９３７細胞をソフォラノンで処理した場合に、システインプロテアーゼであるカスパーゼ３が活性化され（図５）、カスパーゼ３の細胞内基質であるpoly(ADP-ribose) polymerase の切断が見られた。これは、多くのアポトーシス誘導剤で、カスパーゼ３が活性化されるのと同様の効果である。
【００２８】
また、ソフォラノンで処理したHL60細胞やU937細胞を可溶化して、ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分析した結果、典型的なアポトーシス誘導の特徴であるＤＮＡラダーが観察された。したがって、ソフォラノンにより誘導されるアポトーシスの最終的な過程は、多くの薬物やストレスによるアポトーシスと共通の機構であることが分かった。
【００２９】
【発明の効果】
以上説明したように、豆科のSophora subprostrata Chun et T. Chenの根を乾燥した生薬である山豆根から、ソフォラノンを単離・同定し、このソフォラノンがヒト白血病U937細胞及びHL-60細胞にアポトーシスを誘導する作用を有し、増殖を阻害すること、及びアポトーシス誘導作用は他のフラボノイド化合物であるケルセチン、ゲニスタイン、ダイゼインよりも１０倍以上強いことをを明らかにした。また、化学合成フラボノイド化合物であるフラボピリドールはサイクリン依存性キナーゼ（CDK1,CDK2,CDK4,CDK7）を阻害し、細胞周期をＧ1期とＧ2期とで阻止することが報告されているが、ソフォラノンは細胞周期に影響を与えないので、フラボピリドールとはアポトーシス誘導機構が異なると考えられる。
【００３０】
また、ヒトの発生組織の異なる７種類の固形癌細胞に対して増殖阻害作用を示すことを明らかとし、その中の胃癌AZ-521細胞及び大腸癌COLO320DM細胞を使って実際にアポトーシスが誘導されることを証明した。このように、ソフォラノンが、抗癌剤が一般的に作用しにくいとされるヒト固形癌細胞に対してもアポトーシスを誘導し、増殖阻害作用を有することを明らかにした。
【００３１】
さらに、ソフォラノンによる処理を行ったときのＭＡＰキナーゼの活性変化を測定し、これまでのアポトーシス誘導剤による処理では報告されていないＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８の活性変化を見いだし、ソフォラノンがユニークな機構でアポトーシスを誘導していることを明らかにした。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト白血病Ｕ９３７細胞に対するアポトーシス誘導作用を示すグラフである。
【図２】ヒト卵巣癌ＴＹＫ-ｎｕ細胞に対する増殖阻害作用を示すグラフである。
【図３】ソフォラノンによるDNA-fragmentation の誘導を示すグラフである。
【図４】ソフォラノン処理のＭＡＰキナーゼファミリーの活性に与える影響を示すグラフであり、（Ａ）はＥＲＫ活性、（Ｂ）はＪＮＫ活性、（Ｃ）はｐ３８活性を示している。
【図５】ソフォラノンによりカスパーゼ３が活性化されることを示すグラフである。
【図６】従来から知られているフラボノイド骨格を有する化合物の例を示している。
【図１】
0004843127.tif 000006
【図２】
0004843127.tif 000007
【図３】
0004843127.tif 000008
【図４】
0004843127.tif 000009
【図５】
0004843127.tif 000010
【図６】
0004843127.tif 000011