(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性かつ増殖性の未分化状態で維持することができる支持細胞非含有のヒト胚性幹細胞株を確立する方法であって、
支持細胞を含まず、マトリックスと、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）および塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が補充された組織培養培地とを含む培養条件のもとでヒト胚性幹細胞を培養し、それにより、支持細胞非含有のヒト胚性幹細胞株を得る工程；
を含む方法。
【請求項２】
前記培養条件のもとでヒト胚性幹細胞株から細胞をクローン化する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
支持細胞を含まない培養条件のもとで、多能性かつ増殖性の未分化状態でヒト胚性幹細胞株を拡大する方法であって、ヒト胚性幹細胞株の細胞を、マトリックスと、ＴＧＦβ１およびｂＦＧＦが補充された組織培養培地とに基づいて培養し、それにより、ヒト胚性幹細胞株の細胞を多能性かつ増殖性の未分化状態で維持する工程を含む方法。
【請求項４】
多能性かつ増殖性の未分化状態で維持することができる特定の種の異種非含有かつ支持細胞非含有の胚性幹細胞株を確立する方法であって、
支持細胞および異種混入物を含まず、特定の種由来のマトリックスと、ＴＧＦβ１およびｂＦＧＦを含む組織培養培地とを含む培養条件のもとで胚性幹細胞を培養し、それにより、異種非含有かつ支持細胞非含有の、特定の種の胚性幹細胞株を得る工程；
を含む方法。
【請求項５】
支持細胞および異種混入物を含まない培養条件のもとで、多能性かつ増殖性の未分化状態で特定の種の胚性幹細胞株を拡大する方法であって、特定の種の胚性幹細胞株の細胞を、特定の種由来のマトリックスと、ＴＧＦβ１およびｂＦＧＦを含む組織培養培地とに基づいて培養し、それにより、特定の種の胚性幹細胞株の細胞を多能性かつ増殖性の未分化状態で維持する工程を含む方法。
【請求項６】
支持細胞を含まない培養条件のもとで、ヒト胚性幹細胞を多能性かつ増殖性の未分化状態で維持する方法であって、マトリックスと、少なくとも２５時間の倍加時間を伴って少なくとも５６回の継代培養にわたって前記幹細胞を維持することができる選択された濃度範囲で提供されるＴＧＦβ１およびｂＦＧＦを含む組織培養培地とを含む培養条件のもとでヒト胚性幹細胞を培養する工程を含む方法。
【請求項７】
前記マトリックスが、ヒト由来フィブロネクチン、ヒト由来ラミニン、包皮繊維芽細胞マトリックス、およびＭＥＦマトリックスからなる群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記マトリックスがフィブロネクチンマトリックスである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記フィブロネクチンが、ウシフィブロネクチン、組換えウシフィブロネクチン、ヒトフィブロネクチン、組換えヒトフィブロネクチン、マウスフィブロネクチン、組換えマウスフィブロネクチン、および合成フィブロネクチンからなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養条件が異種混入物を含まず、前記マトリックスが、ヒト血漿フィブロネクチンマトリックス、組換えヒト血漿フィブロネクチンマトリックス、ヒト細胞フィブロネクチンマトリックス、組換えヒト細胞フィブロネクチンマトリックス、および合成フィブロネクチンからなる群から選択される請求項１，２，３または６に記載の方法。
【請求項１１】
ヒト胚性幹細胞株が少なくとも８５％の未分化ヒト胚性幹細胞を含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ヒト胚性幹細胞株の細胞が少なくとも２５時間の倍加時間を維持する請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項１３】
前記組織培養培地が血清および／または血清代替物をさらに含む請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記血清および／または前記血清代替物が少なくとも１０％の濃度で提供される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＧＦβ１が少なくとも０．０６ｎｇ／ｍｌの濃度で提供される請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｂＦＧＦが少なくとも２ｎｇ／ｍｌの濃度で提供される請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記培地が白血病阻害剤因子（ＬＩＦ）をさらに補充されている請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＬＩＦが少なくとも５００ｕ／ｍｌの濃度で提供される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組織培養培地が特定の種由来の血清および／または血清代替物を含む請求項４または５に記載の方法。
【請求項２０】
未分化で、多能性かつ増殖性のヒト胚性幹細胞を培養培地に含む細胞培養物であって、前記培養培地がＴＧＦβ１およびｂＦＧＦを含み、前記細胞培養物が異種混入物および／または支持細胞の混入物を含まない細胞培養物。
【請求項２１】
培養培地が血清代替物を含む請求項２０に記載の細胞培養物。
【請求項２２】
前記培養培地がＬＩＦをさらに含む請求項２０または２１に記載の細胞培養物。
【請求項２３】
マトリックスおよび組織培養培地を含む異種非含有かつ支持細胞非含有の培養システムであって、前記組織培養培地がＴＧＦβ１およびｂＦＧＦを含み、前記培養システムが、この培養システムで培養されたヒト胚性幹細胞を増殖性かつ多能性の未分化状態で維持することができるように選択される異種非含有かつ支持細胞非含有の培養システム。
【請求項２４】
前記マトリックスがヒト由来のフィブロネクチンである請求項２３に記載の培養システム。
【請求項２５】
前記組織培養培地が血清代替物を含む請求項２３または２４に記載の培養システム。
【請求項２６】
前記培養培地がＬＩＦをさらに含む請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の培養システム。
【請求項２７】
細胞置換および／または組織再生用医薬品の製造のための、異種混入物および支持細胞を含まないヒト胚性幹細胞調製物の使用であって、前記ヒト胚性幹細胞調製物が、支持細胞および異種混入物を含まず、ヒト由来のフィブロネクチンマトリックスと、ＴＧＦβ１およびｂＦＧＦが補充された組織培養培地とを含む培養条件のもとでヒト胚性幹細胞を培養することによって調製される使用。
【請求項２８】
前記培養条件が、１５％の濃度の血清代替物、０．１２ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＧＦβ１、１０００ｕ／ｍｌの濃度のＬＩＦ、および４ｎｇ／ｍｌの濃度のｂＦＧＦを含む請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、支持細胞（例えば、支持細胞層（ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌａｙｅｒ）、支持細胞層（ｆｅｅｄｅｒ  ｌａｙｅｒ）としても知られている）を含まず、異種を含まない培養システムを使用するヒト胚性幹細胞株を調製する方法、および、異種混入物および支持細胞を含まない培養において多能性かつ増殖性の未分化状態で維持することができる幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳＣ）は全能性であるので、任意のタイプの細胞に発達し、また、完全な生物体を含めて任意のタイプの組織または器官または身体部分を生じさせる潜在的能力を有している。そのため、正常なクローン性ヒトＥＳＣを要求に応じて提供することができ、かつ、その分化を操作することができることは、生物医学分野、産業分野および科学分野における根本的な進歩の原動力となり得る強力なツールを提供することが予想される。ＥＳＣの潜在的な用途は広範囲にわたっており、それらには、薬物の発見および試験、移植において使用される細胞、組織および器官の作製、生体分子の製造、化合物の毒性および／または催奇性の試験、ならびに、発達プロセスおよび他の生物学的プロセスの研究の促進が含まれる。例えば、ＥＳＣまたはＥＳＣ由来細胞の治療的移植によって処置可能であることが現在期待される疾患には、パーキンソン病、心筋梗塞、若年性糖尿病および白血病が含まれる（Ｇｅａｒｈａｒｔ，Ｊ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２８２：１０６１；ＲｏｓｓａｎｔおよびＮａｇｙ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９９９、１７：２３）。
【０００３】
しかしながら、ヒトＥＳＣの実用的な利用に重大な障害がある。
【０００４】
ヒトＥＳＣを未分化状態で維持するためには、ＥＳ培養物は、細胞増殖を維持し、ＥＳ細胞の分化を阻害し、多能性を持続させる因子が補充されなければならない。
【０００５】
また、細胞置換治療および組織再生治療の場合、ヒトＥＳＣは、完全な動物非存在の環境で、かつ、ＥＳ培養物の完全な再生産を可能にする十分に規定された培養条件の存在下で培養されなければならない。
【０００６】
現在実用化されているＥＳ培養方法は、主に、幹細胞の増殖のために必要とされる因子を分泌し、一方で同時に、その分化を阻害する支持細胞層の使用に基づいている。支持細胞非含有システムもまた、ＥＳ細胞の培養において使用されており、そのようなシステムでは、支持細胞層の代替物として、血清、サイトカインおよび増殖因子が補充されたマトリックスが利用されている。
【０００７】
支持細胞層に基づく培養
マウス支持細胞層−ＥＳ細胞を培養するための最も一般的な方法は、ＥＳ細胞の増殖および多能性を助ける、血清または白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含有する組織培養培地が補充された支持細胞層としてのマウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）に基づいている［Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ、Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ  Ｊ、Ｓｈａｐｉｒｏ  ＳＳ、Ｗａｋｎｉｔｚ  ＭＡ、Ｓｗｉｅｒｇｉｅｌ  ＪＪ、Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＶＳ、Ｊｏｎｅｓ  ＪＭ（１９９８）、ヒト胚盤胞に由来する胚性幹細胞株、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１１４５〜７；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ＢＥ、Ｐｅｒａ  ＭＦ、Ｆｏｎｇ  Ｃ，Ｔｒｏｕｎｓｏｎ  Ａ、Ｂｏｎｇｓｏ  Ａ（２０００）、ヒト胚盤胞由来の胚性幹細胞株：インビトロでの体細胞分化、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８：３９９〜４０４］。ＭＥＦ細胞は、ウシ胎児血清が補充された培地における１２日齢〜１３日齢のマウス胚から得られる。これらの条件のもとで、マウスＥＳ細胞は、その表現型および機能的特徴を持続させながら、多能性幹細胞として培養状態で維持することができる。しかしながら、マウスＥＳ細胞とは異なり、外部から添加されたＬＩＦの存在下では、ヒトＥＳ細胞の分化は妨げられない（Ｔｈｏｍｓｏｎ他、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１１４５〜７；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ他、２０００、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８：３９９〜４０４）。さらに、支持細胞の使用は製造費用を実質的に増大させ、ヒトＥＳ細胞培養の規模拡大を実施不可能にする。また、支持細胞は、支持細胞が幹細胞を成長させないために代謝的に不活性化されており、従って、ヒトＥＳ培養のそれぞれの分割のために新鮮な支持細胞を有することが必要である。現在、大量培養で調製された胚細胞からの支持細胞成分の分離は効率的に達成することができないので、支持細胞層で調製されたＥＳ培養物はヒト治療には適していない。
【０００８】
ＥＳ細胞はまた、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が補充された血清代替物を使用する血清非含有状態のもとで、ＭＥＦ上で培養することができる［Ａｍｉｔ  Ｍ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ＭＫ、Ｉｎｏｋｕｍａ  ＭＳ、Ｃｈｉｕ  ＣＰ、Ｈａｒｒｉｓ  ＣＰ、Ｗａｋｎｉｔｚ  ＭＡ、Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ  Ｊ、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ（２０００）、クローン的に得られたヒト胚性幹細胞株は多能性および増殖能を長期間の培養にわたって維持する、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２２７：２７１〜８］。これらの条件のもとでは、ＥＳ細胞のクローン化効率は、ウシ胎児血清の場合よりも４倍多い。また、血清代替物のもとでの６ヶ月の培養の後、ＥＳ細胞は、胚の３つの胚葉のすべてを含有する奇形腫を形成するその能力によって示されるように、その多能性を依然として維持している。このシステムでは、より良好に規定された培養条件が使用されるが、培養におけるマウス細胞の存在により、ヒト培養物は、細胞に基づく治療におけるその使用を制限する病原体にさらされる。
【０００９】
支持細胞層としてのヒト胚性繊維芽細胞または成人ファロピウス管上皮細胞−ヒトＥＳ細胞は、ヒト胚性繊維芽細胞または成人ファロピウス管上皮細胞を使用して成長させ、かつ維持することができる。これらのヒト支持細胞上で成長したとき、ヒトＥＳ細胞は正常な核型を示し、アルカリホスファターゼ活性を与え、Ｏｃｔ−４および他の胎児性細胞表面マーカー（これには、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＧＣＴＭ−２が含まれる）を発現し、奇形腫をインビボで形成し、かつ、すべての重要な形態学的特徴を保持する［Ｒｉｃｈａｒｄｓ  Ｍ、Ｆｏｎｇ  ＣＹ、Ｃｈａｎ  ＷＫ、Ｗｏｎｇ  ＰＣ、Ｂｏｎｇｓｏ  Ａ（２００２）、ヒト支持細胞はヒトの内部細胞塊および胚性幹細胞の長期にわたる未分化成長を助ける、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０：９３３〜６］。しかしながら、ヒト胚性繊維芽細胞または成人ファロピウス管上皮細胞を支持細胞として使用することの大きな欠点は、これらの細胞株はともに８回〜１０回にすぎない限定された継代培養能力を有し、それにより、長期にわたるＥＳ成長期間の能力を制限しているということである。長期にわたる培養期間の場合、ＥＳ細胞は、数人に由来するヒト支持細胞において成長させなければならず、このことは、培養条件における変動性の増大をもたらす。
【００１０】
包皮支持細胞層−ヒトＥＳ細胞は、米国特許出願第１０／３６８０４５号に開示されるようにヒト包皮支持細胞層上で培養することができる。包皮由来の支持細胞層は、ヒトＥＳ細胞を培養するために好適な完全な動物非存在の環境からなる。また、包皮細胞は、その誘導以降、４２回の継代培養の長きにわたって培養状態で維持することができ、これにより、ＥＳ細胞には比較的一定の環境が提供される。これらの条件のもとでは、ヒトＥＳ細胞は、代わりのプロトコル（例えば、ＭＥＦ）を用いて成長させた細胞と機能的に異なっていることが見出された。分化後、ＥＳ細胞は、インビトロでは、胚の３つの胚葉のすべてに関連する遺伝子を発現し、インビボでは、３つの胚葉のすべてから生じる組織からなる奇形腫を形成した。また、ヒトファロピウス管上皮細胞またはヒト胚性繊維芽細胞とは異なり、包皮支持細胞層において培養されたヒトＥＳ細胞は、少なくとも８７回の継代培養にわたって多能性の未分化状態で培養において維持された。しかしながら、包皮細胞は長期間（すなわち、４２回の継代培養）にわたって培養状態で維持することができるが、包皮培養システムは、異なるバッチ間での違いのために十分に規定されていない。また、ヒト支持細胞層に基づく培養システムでは、支持細胞層およびｈＥＳ細胞の両方の同時成長が依然として要求される。従って、様々な支持細胞非含有培養システムが開発されている。
【００１１】
支持細胞非含有培養
幹細胞は、培養培地の存在下、細胞外マトリックス（例えば、ＭａｔｒｉｇｅｌＲＴＭまたはラミニン）などの固体表面において成長させることができる。支持細胞および幹細胞の同時成長が要求され、また、混合された細胞集団をもたらし得る支持細胞型培養とは異なり、支持細胞非含有システムで成長した幹細胞は表面から容易に分離される。幹細胞を成長させるために使用される培養培地は、分化を効果的に阻害し、その成長を促進させる因子（例えば、ＭＥＦ馴化培地およびｂＦＧＦなど）を含有する。しかしながら、一般に使用されている支持細胞非含有培養システムでは、マウス血清もしくはウシ血清またはＭＥＦ馴化培地が補充された動物系マトリックス（例えば、ＭａｔｒｉｇｅｌＲＴＭ）が利用されており［Ｘｕ  Ｃ他（２００１）、未分化ヒト胚性幹細胞の支持細胞非含有成長、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９：９７１〜４］、これらは、ヒトＥＳ細胞に対する動物病原体の交差転移の危険性をもたらし、従って、将来の臨床的適用を危うくする。
【００１２】
米国特許出願第１０／３６８０４５号にさらに開示されるように、幹細胞は、包皮由来の馴化培地が補充されたマトリックス表面において培養することができる。しかしながら、この培地は、動物非存在システムを提供しているが、培養組成の点では未だに十分に規定されていない。
【００１３】
より規定された培養組成においてヒト胚性幹細胞を培養する最近の試みでは、Ｍａｔｒｉｇｅｌまたはラミニンの表面および増殖因子の混合物が利用された。しかしながら、米国特許出願第２００３００１７５８９号に開示されるように、これらの条件のもとでは、細胞の５０％〜７０％のみが未分化細胞の形態学を示しただけであった。また、幹細胞はさらに、１９時間の比較的短い倍加時間を示した。このことは、幹細胞が腫瘍形成性になったことを示唆している（Ａｍｉｔ他、２０００、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２２７：２７１〜８を参照のこと）。
【００１４】
従って、ヒトＥＳ細胞を増殖性かつ多能性の未分化状態で維持することができる、上記の制限を有しない支持細胞非含有かつ異種非含有の培養システムが必要であることが広く認識されており、従って、そのような培養システムを有することは非常に好都合である。
【発明の開示】
【００１５】
本発明の１つの態様によれば、多能性かつ増殖性の未分化状態で維持することができる支持細胞非含有のヒト胚性幹細胞株を確立する方法であって、（ａ）ヒト胚性幹細胞を得ること、および（ｂ）支持細胞を含まず、マトリックスと、ＴＧＦβ１、ｂＦＧＦおよび／またはＬＩＦが補充された組織培養培地とを含む培養条件のもとで前記ヒト胚性幹細胞を培養し、それにより、支持細胞非含有のヒト胚性幹細胞株を得ることを含む方法が提供される。
【００１６】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、この方法は、前記培養条件のもとでの工程（ｂ）から得られるヒト胚性幹細胞株から細胞をクローン化することをさらに含む。
【００１７】
本発明の別の態様によれば、支持細胞を含まない培養条件のもとで、多能性かつ増殖性の未分化状態でヒト胚性幹細胞株を拡大する方法であって、ヒト胚性幹細胞株の細胞を、マトリックスと、ＴＧＦβ１、ｂＦＧＦおよび／またはＬＩＦが補充された組織培養培地とに基づいて培養し、それにより、ヒト胚性幹細胞株の細胞を多能性かつ増殖性の未分化状態で維持することを含む方法が提供される。
【００１８】
本発明のさらに別の態様によれば、多能性かつ増殖性の未分化状態で維持することができる支持細胞非含有のヒト胚性幹細胞株を確立する方法であって、（ａ）ヒト胚性幹細胞を得ること、および（ｂ）支持細胞を含まず、フィブロネクチンマトリックスと、ＴＧＦβ１、ｂＦＧＦおよび／またはＬＩＦが補充された組織培養培地とを含む培養条件のもとで前記ヒト胚性幹細胞を培養し、それにより、支持細胞非含有のヒト胚性幹細胞株を得ることを含む方法が提供される。
【００１９】
本発明のなお別の態様によれば、支持細胞を含まない培養条件のもとで、多能性かつ増殖性の未分化状態でヒト胚性幹細胞株を拡大する方法であって、ヒト胚性幹細胞株の細胞を、フィブロネクチンマトリックスと、ＴＧＦβ１、ｂＦＧＦおよび／またはＬＩＦが補充された組織培養培地とに基づいて培養し、それにより、ヒト胚性幹細胞株の細胞を多能性かつ増殖性の未分化状態で維持することを含む方法が提供される。
【００２０】
本発明のさらなる態様によれば、多能性かつ増殖性の未分化状態で維持することができる特定の種の異種非含有かつ支持細胞非含有の胚性幹細胞株を確立する方法であって、（ａ）胚性幹細胞を得ること、および（ｂ）支持細胞および異種混入物を含まず、種由来のマトリックスと、組織培養培地とを含む培養条件のもとで前記胚性幹細胞を培養し、それにより、異種非含有かつ支持細胞非含有の、特定の種の胚性幹細胞株を得ることを含む方法が提供される。
【００２１】
本発明のさらにさらなる態様によれば、支持細胞および異種混入物を含まない培養条件のもとで、多能性かつ増殖性の未分化状態で特定の種の胚性幹細胞株を拡大する方法であって、特定の種の胚性幹細胞株の細胞を、種由来のマトリックスと、組織培養培地とに基づいて培養し、それにより、特定の種の胚性幹細胞株の細胞を多能性かつ増殖性の未分化状態で維持することを含む方法が提供される。
【００２２】
本発明のさらなる態様によれば、未分化で、多能性かつ増殖性のヒト胚性幹細胞を培養培地に含む細胞培養物が提供され、この場合、細胞培養物は異種および／または支持細胞の混入物を実質的に含まない。
【００２３】
本発明のさらなる態様によれば、マトリックスおよび組織培養培地を含む異種非含有かつ支持細胞非含有の培養システムが提供され、この場合、この異種非含有かつ支持細胞非含有の培養システムは、この培養システムで培養されたヒト胚性幹細胞を増殖性かつ多能性の未分化状態で維持することができるように選択される。
【００２４】
本発明のさらにさらなる態様によれば、細胞置換および／または組織再生を必要としている個体を処置する方法であって、異種および支持細胞の混入物を含まないヒト胚性幹細胞調製物を個体に投与することを含む方法が提供される。
【００２５】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、この方法は、ヒト胚性幹細胞調製物を投与前に調製することを含み、この場合、調製は、（ａ）ヒト胚性幹細胞を得ること、および（ｂ）支持細胞および異種混入物を含まず、ヒト由来のフィブロネクチンマトリックスと、ＴＧＦβ１、ｂＦＧＦおよび／またはＬＩＦが補充された組織培養培地とを含む培養条件のもとで前記ヒト胚性幹細胞を培養し、それによりヒト胚性幹細胞調製物を調製することによって達成される。
【００２６】
本発明のなおさらなる態様によれば、支持細胞を含まない培養条件のもとで、ヒト胚性幹細胞を多能性かつ増殖性の未分化状態で維持する方法であって、マトリックスと、少なくとも２５時間の倍加時間を伴って少なくとも５６回の継代培養にわたって幹細胞を維持することができる選択された濃度範囲で提供される少なくとも１つの増殖因子が補充された組織培養培地とを含む培養条件のもとでヒト胚性幹細胞を培養することを含む方法が提供される。
【００２７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、マトリックスはフィブロネクチンマトリックスである。
【００２８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、フィブロネクチンは、ウシフィブロネクチン、組換えウシフィブロネクチン、ヒトフィブロネクチン、組換えヒトフィブロネクチン、マウスフィブロネクチン、組換えマウスフィブロネクチン、および合成フィブロネクチンからなる群から選択される。
【００２９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、培養条件は異種混入物を実質的に含まず、一方、マトリックスは、ヒト血漿フィブロネクチンマトリックス、組換えヒト血漿フィブロネクチンマトリックス、ヒト細胞フィブロネクチンマトリックス、組換えヒト細胞フィブロネクチンマトリックス、および合成フィブロネクチンからなる群から選択される。
【００３０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ヒト胚性幹細胞株は少なくとも８５％の未分化ヒト胚性幹細胞を含む。
【００３１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ヒト胚性幹細胞株の細胞は少なくとも２５時間の倍加時間を維持する。
【００３２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、組織培養培地はさらに血清および／または血清代替物を含む。
【００３３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、血清および／または血清代替物は少なくとも１０％の濃度で提供される。
【００３４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、血清および／または血清代替物は１５％の濃度で提供される。
【００３５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＴＧＦβ１は少なくとも０．０６ｎｇ／ｍｌの濃度で提供される。
【００３６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＴＧＦβ１は０．１２ｎｇ／ｍｌの濃度で提供される。
【００３７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ｂＦＧＦは少なくとも２ｎｇ／ｍｌの濃度で提供される。
【００３８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ｂＦＧＦは４ｎｇ／ｍｌの濃度で提供される。
【００３９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＬＩＦは少なくとも５００ｕ／ｍｌの濃度で提供される。
【００４０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＬＩＦは１０００ｕ／ｍｌの濃度で提供される。
【００４１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、マトリックスは種由来のフィブロネクチンマトリックスである。
【００４２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、支持細胞非含有の培養条件は異種混入物を実質的に含まない。
【００４３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、特定の種の胚性幹細胞株の細胞は少なくとも２０時間の倍加時間を維持する。
【００４４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、組織培養培地は種由来の血清および／または血清代替物を含む。
【００４５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、種由来の血清は少なくとも５％の濃度で提供される。
【００４６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、組織培養培地は少なくとも１つの増殖因子をさらに含む。
【００４７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも１つの増殖因子は、ＴＧＦβ１、ｂＦＧＦ、ＬＩＦからなる群から選択される。
【００４８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、組織培養培地は種由来の馴化培地である。
【００４９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ヒト胚性幹細胞株は、少なくとも３８回目の継代培養について多能性かつ増殖性の未分化状態で維持可能である。
【００５０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＴＧＦβ１は０．０６ｎｇ／ｍｌ〜０．２４ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で提供される。
【００５１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ｂＦＧＦは２ｎｇ／ｍｌ〜８ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で提供される。
【００５２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＬＩＦは５００ｕ／ｍｌ〜２０００ｕ／ｍｌの濃度範囲で提供される。
【００５３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、培養条件は、１５％の濃度での血清代替物、０．１２ｎｇ／ｍｌの濃度でのＴＧＦβ１、１０００ｕ／ｍｌの濃度でのＬＩＦ、および４ｎｇ／ｍｌの濃度でのｂＦＧＦを含む。
【００５４】
本発明は、支持細胞非含有かつ異種非含有の培養システムを使用してヒト胚性幹細胞株を確立および拡大する方法、異種混入物および支持細胞を含まない培養において多能性かつ増殖性の未分化状態で維持することができる幹細胞を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
【００５５】
別途定義されない場合、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と同様または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。また、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定することは意図されない。
【００５６】
図面の簡単な記述
本発明は、例としてだけであるが、添付されている図面を参照して、本明細書中に記載される。次に図面を詳しく具体的に参照して、示されている細目は、例としてであり、また、本発明の好ましい実施形態の例示的な議論のためのものであり、従って、本発明の原理および概念的態様の最も有用かつ容易に理解された記述であると考えられるものを提供するために示されていることが強調される。これに関して、記述を図面と一緒に理解することにより、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具体化され得るかが当業者には明らかになるので、発明の構造的詳細を、発明の基本的な理解のために必要であるよりも詳細に示すことは試みられていない。
図１ａ〜図１ｄは、支持細胞非含有システムでウシ由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したＥＳ細胞コロニーおよび単一ＥＳ細胞を例示する顕微鏡写真である。血清代替物および様々な組合せの増殖因子の存在下でフィブロネクチン上で成長した様々なＥＳ細胞株の明視野像が示される。図１ａ−３１回の継代培養にわたってＴＧＦβ１、ＬＩＦおよびｂＦＧＦ（ＴＬＦ）の存在下で成長したＩ−６ＥＳ細胞株（サイズバーは１００μＭを表す）；図１ｂ−２１回の継代培養にわたってＴＬＦにおいて成長したＩ−３ＥＳ細胞株（サイズバーは５０μＭを表す）；図１ｃ−３１回の継代培養にわたってＴＬＦにおいて成長したＩ−６ＥＳ細胞株（サイズバーは５０μＭを表す）；図１ｄ−２０回の継代培養にわたってＴＧＦβ１およびｂＦＧＦ（ＴＦ）において成長したＩ−３ＥＳ細胞株（サイズバーは３８μＭを表す）。細胞間の間隔（図１ａ〜図１ｃ）およびヒトＥＳ細胞に典型的な大きい核対細胞質比率（図１ｄ）に留意すること。図１ｅ〜図１ｈは、支持細胞非含有システムでウシ由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したヒトＩ−３ＥＳ細胞株およびＩ−６ＥＳ細胞株における未分化細胞に典型的な表面マーカーの発現を例示する免疫組織化学顕微鏡写真である。１７回の継代培養にわたってＴＦの存在下で成長し、抗ＳＳＥＡ４抗体で標識されたヒトＥＳ細胞（系統Ｉ−３）の蛍光像（図１ｅ、サイズバーは５０μＭを表す）；３８回の継代培養にわたってＴＬＦの存在下で成長し、抗ＳＳＥＡ４抗体で標識されたＩ−３ＥＳ細胞の蛍光像（図１ｆ、サイズバーは６μＭを表す）；３０回の継代培養にわたってＴＬＦの存在下で成長し、抗ＴＲＡ−６０抗体で標識されたＩ−６ＥＳ細胞の蛍光像（図１ｇ、サイズバーは６μＭを表す）；２１回の継代培養にわたってＴＦの存在下で成長し、抗ＴＲＡ−８１抗体で標識されたＩ−３ＥＳ細胞の蛍光像（図１ｈ、サイズバーは６μＭを表す）が示される。蛍光像は、倒立型蛍光顕微鏡（図１ｅ）または共焦点顕微鏡（図１ｆ〜図１ｈ）のいずれかを使用して記録された。
図２ａ〜図２ｃは、支持細胞非含有システムでウシ由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したｈＥＳ細胞のインビトロ分化を例示する。支持細胞非含有システムで成長した細胞に由来するＥＢの組織学的断面が示される。図２ａ−ＴＦにおいて２８回の継代培養にわたって成長した後のＩ−３細胞株に由来する２４時間経た純然たるＥＢ（サイズバーは１００μＭを表す）；図２ｂ−ＴＦにおいて２８回の継代培養にわたって成長したＩ−３細胞株に由来する１４日齢のＥＢ（サイズバーは５０μＭを表す）；図２ｃ−ＴＬＦにおいて３０回の継代培養にわたって成長した細胞株Ｉ−３に由来する１４日齢のＥＢ（サイズバーは２５μＭを表す）。ＥＢの外側の保護的上皮（図２ｂ、矢印）、および間葉組織によって取り囲まれる柱状上皮からなるボール様構造（図２ｃ）に留意すること。図２ｄ〜図２ｆは、本発明の支持細胞非含有システムでウシ由来のフィブロネクチンマトリックスにおける様々な培地において成長したＥＳ細胞から形成された１４日齢のＥＢに由来する細胞における中胚葉および外胚葉の代表的なマーカーの発現を例示する。様々なＥＳ細胞株に由来するＥＢ細胞が様々な抗体プローブで蛍光免疫染色された。図２ｄ−２２回の継代培養にわたってＴＬＦにおいて成長し、神経特異的チューブリンに対する抗体を使用して免疫染色されたＩ−６細胞株（サイズバーは６μＭを表す）。図２ｅ−３０回の継代培養にわたってＴＬＦにおいて成長し、平滑筋アクチンに対する抗体を使用して免疫染色されたＩ−３細胞株（サイズバーは６μＭを表す）。図２ｆ−２８回の継代培養にわたってＴＦにおいて成長し、ＣＤ３１に対する抗体を使用して免疫染色されたＩ−３細胞株（サイズバーは６μＭを表す）。
図３は支持細胞非含有システムでウシ由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したＩ−３ＥＳ細胞またはＩ−６ＥＳ細胞の分化段階およびそれらに由来する胚様体（ＥＢ）の分化段階のＲＴ−ＰＣＲ決定を例示する。ＲＴ−ＰＣＲ反応が、Ｉ−３ＥＳ細胞、Ｉ−６ＥＳ細胞、またはそれらに由来するＥＢから抽出されたＲＮＡサンプルに対して行われた。レーン１−１９回の継代培養にわたってＴＦにおいて成長したＩ−３ＥＳ細胞；レーン２−２０回の継代培養にわたってＴＬＦにおいて成長したＩ−３ＥＳ細胞；レーン３−２３回の継代培養にわたってＴＬＦにおいて成長したＩ−３ＥＳ細胞に由来する１４日齢のＥＢ；レーン４−２８回の継代培養にわたってＴＦにおいて成長したＩ−３ＥＳ細胞に由来する１４日齢のＥＢ；レーン５−３０回の継代培養にわたってＴＬＦにおいて成長したＩ−３ＥＳ細胞に由来する１４日齢のＥＢ；レーン６−２９回の継代培養にわたってＴＬＦにおいて成長したＩ−３ＥＳ細胞に由来する１４日齢のＥＢ；レーン７−２２回の継代培養にわたってＴＬＦにおいて成長したＩ−６ＥＳ細胞に由来する１４日齢のＥＢ。反応の特異性がＲＮＡの非存在下で確認された（図３、レーン８）。レーン３〜６のＥＢサンプルは１−３ＥＳ細胞の４つの異なるバッチに由来したことに留意すること。
図４ａ〜図４ｃは、支持細胞非含有システムでウシ由来のフィブロネクチンマトリックスでのＴＬＦにおいてそれぞれ２６回および１９回の継代培養にわたって成長したＩ−３ＥＳ細胞株およびＩ−６ＥＳ細胞株に由来する奇形腫の組織学的断面を例示する。奇形腫の断面には、有髄神経（図４ａ）、ヒアリン軟骨の細部（図４ｂ）、および、杯細胞が多い分泌上皮（図４ｃ）が含まれる。サイズバーは２５μＭを表す。
図５ａ〜図５ｃは、支持細胞非含有システムでヒト由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したＥＳ細胞コロニーを例示する形態学顕微鏡写真である。血清代替物および増殖因子のＴＦ組合せの存在下で２２回の継代培養にわたってヒト細胞フィブロネクチンにおいて成長したＩ−３ＥＳ細胞株の明視野像が示される。図５ｄ〜図５ｆは、支持細胞非含有システムでヒト由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したヒトＩ−３ＥＳ細胞株およびヒトＨ−９ＥＳ細胞株における未分化細胞に典型的な表面マーカーの発現を例示する免疫組織化学顕微鏡写真である。１６回の継代培養にわたってＴＦの存在下でヒト細胞フィブロネクチンにおいて培養され、抗ＴＲＡ−１−６０抗体（図５ｄ）または抗ＴＲＡ−１−８１抗体（図５ｅ）で標識されたヒトＩ−３ＥＳ細胞株の明視野像、ならびに、１０回の継代培養にわたってＴＬＦの存在下でヒト血漿フィブロネクチンにおいて培養され、抗ＳＳＥＡ４抗体で標識されたヒトＨ−９ＥＳ細胞株の明視野像（図５ｆ）が示される。
図６ａ〜図６ｃは、異種非含有かつ支持細胞非含有の状態のもとでヒトフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したｈＥＳ細胞のインビトロ分化を例示する。様々な培養条件のもとで成長したＩ−３ＥＳ細胞に由来する１４日齢のＥＢの像が示される。図６ａ−１７回の継代培養にわたるＴＬＦ増殖因子の存在下におけるヒト細胞フィブロネクチンマトリックス；図６ｂ−１７回の継代培養にわたるＴＦ増殖因子の存在下におけるヒト細胞フィブロネクチンマトリックス；図６ｃ−１６回の継代培養にわたるＴＬＦ増殖因子の存在下におけるヒト血漿フィブロネクチンマトリックス。
図７は支持細胞非含有システムでヒト由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したＩ−３細胞の分化段階およびそれに由来する胚様体（ＥＢ）の分化段階のＲＴ−ＰＣＲ決定を例示する。ＲＴ−ＰＣＲ反応が、Ｉ−３ＥＳ細胞またはそれに由来するＥＢから抽出されたＲＮＡサンプルに対して行われた。レーン１−２２回の継代培養にわたってＴＦにおいて成長したＩ−３ＥＳ細胞；レーン２−１８回の継代培養にわたってＴＬＦにおいて成長したＩ−３ＥＳ細胞；レーン３−１７回の継代培養にわたってＴＬＦにおいて成長したＩ−３ＥＳ細胞；レーン４−１７回の継代培養にわたってＴＦにおいて成長したＩ−３ＥＳ細胞に由来する１４日齢のＥＢ；レーン５−１７回の継代培養にわたってＴＬＦにおいて成長したＩ−３ＥＳ細胞に由来する１４日齢のＥＢ；レーン６−１６回の継代培養にわたってＴＬＦにおいて成長したＩ−３ＥＳ細胞に由来する１４日齢のＥＢ。反応の特異性がＲＮＡの非存在下で確認された（図７、レーン７）。
図８ａ〜図８ｃは、様々な培養条件のもとでのＩ−３ｈＥＳ細胞株の成長速度（図８ａ）、Ｉ−６ｈＥＳ細胞株の成長速度（図８ｂ）およびＨ−９ｈＥＳ細胞株の成長速度（図８ｃ）を例示する。ウシフィブロネクチンマトリックスにおいて、増殖因子のＴＬＦ組合せの存在下で培養されたときの、Ｉ−３ｈＥＳ細胞株、Ｉ−６ｈＥＳ細胞株およびＨ−９ｈＥＳ細胞株の成長速度（ぞれぞれ、図８ａ、図８ｂおよび図８ｃ、ピンク色曲線）、またはＴＦ組合せの存在下で培養されたときのそれらの成長速度（ぞれぞれ、図８ａ、図８ｂおよび図８ｃ、黒色曲線）、あるいは、ヒトフィブロネクチンマトリックスにおいて、増殖因子のＴＦ組合せの存在下で培養されたときのそれらの成長速度（ぞれぞれ、図８ａ、図８ｂおよび図８ｃ、明青色曲線）、またはＭＥＦ支持細胞上で培養されたときのそれらの成長速度（ぞれぞれ、図８ａ、図８ｂおよび図８ｃ、暗青色の曲線）が示される。図８ｄは、未分化ｈＥＳ細胞の成長を助ける様々な培養条件の能力を例示する棒グラフである。ヒトＥＳ細胞が下記の培養条件のもとで培養された：マウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）、ＴＧＦβ、ＬＩＦおよびｂＦＧＦの存在下でのウシフィブロネクチン（ＴＬＦ  ＢＦ）、ＴＧＦβ、ＬＩＦおよびｂＦＧＦの存在下でのヒトフィブロネクチン（ＴＬＦ  ＨＦ）、ＴＧＦβおよびｂＦＧＦの存在下でのウシフィブロネクチン（ＴＦ  ＢＦ）、ＴＧＦβおよびｂＦＧＦの存在下でのヒトフィブロネクチン（ＴＦ  ＨＦ）、ＬＩＦおよびＴＧＦβの存在下でのウシフィブロネクチン（ＬＴ）、ＬＩＦおよびｂＦＧＦの存在下でのウシフィブロネクチン（ＬＦ）、ＴＧＦβだけの存在下でのウシフィブロネクチン（Ｔ）、ならびに、ｂＦＧＦだけの存在下でのウシフィブロネクチン（Ｆ）。未分化細胞の百分率が２日ずつ延ばして測定された。
図９ａ〜図９ｆは、様々な条件のもとでの支持細胞非含有システムで成長したヒトＥＳ細胞およびヒトＥＳ細胞コロニーを例示する。支持細胞非含有システムで成長した様々なＥＳ細胞株の明視野像が示される。図９ａ−５回の継代培養にわたってＴＬＦの存在下で包皮マトリックスにおいて成長したＩ−６細胞株（サイズバーは７５μＭを表す）；図９ｂ−ＭＥＦ馴化培地の存在下で１２回の継代培養にわたってＭａｔｒｉｇｅｌＲＴＭにおいて成長したＩ−３．２細胞株（サイズバーは５０μＭを表す）；図９ｃ−数回の継代培養にわたってＴＬＦの存在下でＭＥＦマトリックスにおいて成長したＩ−６細胞株（サイズバーは７５μＭを表す）；図９ｄ−ＴＦの存在下で２１回の継代培養にわたってフィブロネクチンにおいて成長したＩ−３細胞株（サイズバーは５０μＭを表す）；図９ｅ−ＴＬＦの存在下で１２回の継代培養にわたってＭａｔｒｉｇｅｌＲＴＭにおいて成長したＩ−６細胞株（サイズバーは７５μＭを表す）；図９ｆ−２０回の継代培養にわたってフィブロネクチンにおいて成長したＩ−３細胞株（サイズバーは３８μＭを表す）。
図１０ａ〜図１０ｆは、フィブロネクチン（図１０ａおよび図１０ｂ）、ＭＥＦマトリックス（図１０ｃ、図１０ｅおよび図１０ｆ）またはＭａｔｒｉｇｅｌＲＴＭ（図１０ｄ）において成長したＩ−６ＥＳ細胞株およびＩ−３ＥＳ細胞株に由来するＳＣＩＤベージュマウスにおける奇形腫の組織学的断面を例示する。奇形腫の断面はヘマトキシリン＆エオシンで染色され、断面には、杯細胞を含む腸様上皮（図１０ａ）、成熟した軟骨組織（図１０ｂおよび図１０ｃ）、胚筋管（図１０ｄ）、層状上皮（図１０ｅ）および有髄神経（図１０ｆ）が含まれる。サイズバーは４０μＭを表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
本発明は、支持細胞非含有かつ異種非含有の培養条件を用いてヒト胚性幹細胞株を確立および拡大する方法に関する。本発明はさらに、異種混入物を含まず、また、培養において多能性かつ増殖性の未分化状態で維持することができ、従って、ヒト治療のための非常に好適であるヒト胚性幹細胞株に関する。
【００５８】
本発明に従って、支持細胞および異種の混入物を含まないヒト胚性幹細胞株を調製する方法の原理および操作は、図面および付随する記述を参照してより良く理解することができる。
【００５９】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することが可能であり、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであり、限定であるとして見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００６０】
ヒトＥＳ細胞を未分化状態で維持するために、ＥＳ培養では、細胞増殖を維持し、ＥＳ細胞の分化を阻害し、かつ多能性を持続させる条件を細胞に提供しなければならない。そのような培養条件は、典型的には、幹細胞の増殖のために必要とされる因子を分泌し、一方で同時に、その分化を阻害する支持細胞層を利用することによって達成される。
【００６１】
支持細胞層の使用に関連する制限（例えば、支持細胞の混入および規定されていない培養システムなど）に対抗するために、より規定された支持細胞非含有培養システムが開発されている。支持細胞非含有培養システムでは、ＥＳ細胞が接着するマトリックスと、細胞増殖のために必要とされるサイトカインおよび増殖因子をＥＳ細胞に提供し、一方で同時に、細胞分化を阻害する培養培地とが用いられる。
【００６２】
一般に使用されているマトリックスには、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出された基底膜調製物（例えば、ＭａｔｒｉｇｅｌＲＴＭ）、またはウシのフィブロネクチン／ラミニンが含まれる。そのようなマトリックスは、通常、マウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）馴化培地が補充されるか、または、ウシ血清および増殖因子が補充された合成培地が補充される。
【００６３】
支持細胞非含有培養システムを使用してヒトＥＳ細胞を培養するための以前の試みでは、新鮮な培養培地および増殖因子混合物が補充されたＭａｔｒｉｇｅｌＲＴＭマトリックスまたはラミニンマトリックスが用いられた（米国特許出願第２００３００１７５８９号）。しかしながら、これらの支持細胞非含有マトリックスは動物組織に由来しており、従って、ヒトＥＳ細胞を動物病原体にさらし得る。また、これらの実験では、６つの異なる増殖因子の組合せが、培養された細胞に不可逆的な損傷を与え得る極めて高い濃度で使用された。実際に、米国特許出願第２００３００１７５８９号において明らかにされたように、ＥＳ細胞の倍加時間は約１９時間であった。このことは腫瘍形成性の表現型を示唆している。その上、これらの条件のもとでは、細胞の５０％〜７０％のみが、支持細胞非含有培養システムでの１４回の継代培養の後で未分化細胞の形態学を示しただけであった。
【００６４】
そのような培養条件は研究目的のためには好適であり得るが、ヒトＥＳ細胞は、ヒトにおける細胞置換治療または組織再生のために利用されるときには動物材料を本質的には含まない十分に規定された培養条件のもとで培養されなければならない。
【００６５】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、異種の混入物を含まず、それにもかかわらず、少なくとも３８回の継代培養にわたって培養においてヒト幹細胞を持続させることができる支持細胞非含有の培養条件を考案した。下記の実施例の節において例示されるように、そのような条件のもとで培養された幹細胞は、多能性、不死性、未分化増殖能力および正常な核型を含むＥＳ細胞の特徴をすべて維持した。従って、本発明の支持細胞非含有培養システムは、増殖性状態で少なくとも３８回の継代培養にわたってヒトＥＳ細胞を維持することができ、その一方で、ＥＳの多能性を持続させることができる完全な動物非存在培養環境を初めて提供する。また、そのような条件のもとで培養されたＥＳ細胞の８５％以上が未分化細胞の形態学を３０時間〜３５時間の倍加時間とともに示した。
【００６６】
従って、本発明によれば、多能性かつ増殖性の未分化状態で維持することができ、かつ異種の混入物を実質的に含まないヒト胚性幹細胞株を確立する方法が提供される。
【００６７】
本明細書中で使用される表現「幹細胞株」は、特定の専門化された機能を有する他の細胞タイプ（すなわち、「完全に分化した」細胞）に分化することができる細胞、または、未分化状態で維持することができる細胞（以降、「多能性幹細胞」）を示す。
【００６８】
本発明の幹細胞は、任意の年齢の個体の骨髄組織から、または、新生児個体の臍帯血から得られる造血幹細胞、妊娠後に形成される胚組織（例えば、胚盤胞）から得られる胚性幹（ＥＳ）細胞、あるいは胚性生殖（ＥＧ）細胞であり得る。幹細胞の誘導および調製は本明細書中下記においてさらに記載される。本発明の好ましい幹細胞はヒト胚性幹細胞である。
【００６９】
本発明の１つの態様によれば、本発明の方法は、ヒト胚性幹細胞を得ること、マトリックスと、増殖因子を含む組織培養培地とを含む支持細胞非含有培養条件のもとでヒト胚性幹細胞を培養し、それによりヒト胚性幹細胞株を確立することによって達成される。
【００７０】
本発明のこの態様によれば、培養は、細胞の生存および増殖を促進するが、分化を制限する細胞密度で幹細胞をマトリックスに置床することによって達成される。典型的には、約１５０００細胞／ｃｍ２〜約２０００００細胞／ｃｍ２の置床密度が使用される。
【００７１】
幹細胞の単一細胞懸濁物が通常の場合には播種されるが、小さいクラスターもまた使用され得ることが理解される。この目的のために、クラスター破壊のために利用される酵素消化（下記の実施例の節の実施例１を参照のこと）が、幹細胞が完全に分散される前に停止され、細胞が、塊（すなわち、１０細胞〜２００細胞）が形成されるようにピペットで粉砕される。しかしながら、様々な対策が、細胞の分化を生じさせる大きいクラスターを避けるために取られる。
【００７２】
本発明の幹細胞は、広く知られている細胞培養方法を使用して得ることができる。例えば、ヒト胚性幹細胞をヒト胚盤胞から単離することができる。ヒト胚盤胞は、典型的には、ヒトのインビボでの着床前の胚から、または、体外受精（ＩＶＦ）胚から得られる。あるいは、単一細胞のヒト胚を胚盤胞段階に拡大することができる。ヒトＥＳ細胞を単離するために、透明帯が胚盤胞から除かれ、内側の細胞塊（ＩＣＭ）が、栄養外胚葉細胞が溶解され、穏やかなピペッティングにより無傷のＩＣＭから除かれる免疫手術によって単離される。その後、ＩＣＭは、その成長を可能にする適切な培地を含有する組織培養フラスコに入れられる。９日後〜１５日後に、ＩＣＭ由来の成長物が機械的解離または酵素的分解のいずれかによって塊に解離され、その後、細胞は新鮮な組織培養培地に再び置床される。未分化の形態学を示すコロニーがマイクロピペットによって個々に選択され、塊に機械的に解離され、再び置床される。得られるＥＳ細胞は、その後、１週間〜２週間毎に常法により分割される。ヒトＥＳ細胞の調製方法に関するさらなる詳細については、Ｔｈｏｍｓｏｎ他［米国特許第５８４３７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１１４５、１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、３８：１３３、１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：７８４４、１９９５］；Ｂｏｎｇｓｏ他［Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ、４：７０６、１９８９］；Ｇａｒｄｎｅｒ他［Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．、６９：８４、１９９８］を参照のこと。
【００７３】
市販の幹細胞もまた本発明のこの態様に関して使用できることが理解される。ヒトＥＳ細胞をＮＩＨヒト胚性幹細胞登録部門（ｈｔｔｐ：／／ｅｓｃｒ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から購入することができる。市販の胚性幹細胞株の非限定的な例には、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＣＹ１２、ＣＹ３０、ＣＹ９２、ＣＹ１０、ＴＥ０３およびＴＥ３２がある。
【００７４】
本発明によって使用される幹細胞はまた、ヒトの胚性生殖（ＥＧ）細胞から得ることができる。ヒトＥＧ細胞は、当業者に知られている研究室技術を使用して妊娠の約８週〜１１週のヒト胎児から得られる原始生殖細胞から調製される。生殖隆起部が分離され、小さい塊に切られ、塊は、その後、機械的解離によって細胞に分割される。ＥＧ細胞は、その後、適切な培地を伴う組織培養フラスコにおいて成長させられる。細胞は、ＥＧ細胞と一致する細胞形態学が観測されるまで培地を毎日取り替えながら培養される（典型的には７日〜３０日または１回〜４回の継代培養の後）。ヒトＥＧ細胞の調製方法に関するさらなる詳細については、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ他［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：１３７２６、１９９８］および米国特許第６０９０６２２号を参照のこと。
【００７５】
本明細書中上記で述べられるように、幹細胞は、好ましくは、支持細胞層の代わりにマトリックスを含む支持細胞非含有培養システムにおいて培養される。本明細書中で使用される用語「マトリックス」は、支持細胞の細胞付着機能を代用することができる任意のマトリックスを示す。そのようなマトリックスは、典型的には、幹細胞が付着することができる細胞外成分を含有し、従って、好適な細胞基質を提供する。
【００７６】
本発明との使用のために特に好適なものは、基底膜に由来する細胞外マトリックス成分、または、接着分子受容体−リガンドカップリングの一部を形成する細胞外マトリックス成分である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は、本発明との使用のために好適である市販マトリックスの一例（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国）である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は、室温でゲル化して、再構成された基底膜を形成する、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞から得られる可溶性の調製物である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）はまた、増殖因子低下調製物として得ることができる。本発明との使用のために好適である他の細胞外マトリックス成分および細胞外マトリックス成分混合物には、単独または様々な組合せでのラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫酸などが含まれる。本発明の好ましいマトリックスはフィブロネクチン由来マトリックスである。
【００７７】
完全な動物非存在培養条件が所望される場合、マトリックスは、好ましくは、ヒト起源に由来するか、または組換え技術を使用して合成される。そのようなマトリックスには、例えば、ヒト由来フィブロネクチン、組換えフィブロネクチン、ヒト由来ラミニン、包皮繊維芽細胞マトリックス、または合成フィブロネクチンマトリックスが含まれる。ヒト由来フィブロネクチンは血漿フィブロネクチンまたは細胞フィブロネクチンに由来し得る：これらはともにＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）から得ることができる。ヒト由来ラミニンおよび包皮繊維芽細胞マトリックスをＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）から得ることができる。合成フィブロネクチンマトリックスをＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）から得ることができる。
【００７８】
マトリックスタンパク質の組換え合成を、発現ベクターを使用することによって達成することができる。マトリックスタンパク質（例えば、ヒト血漿フィブロネクチン）をコードするポリヌクレオチドセグメントを、哺乳動物細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞など）を形質転換するために好適であり、かつ、形質転換された細胞におけるこの酵素の発現を行わせるために好適である市販の発現ベクターシステムに連結することができる。そのような市販のベクターシステムは、既存のプロモーター配列またはエンハンサー配列を置換し、または複製し、または変異させるために、および／または任意のさらなるポリヌクレオチド配列（例えば、さらなる選択マーカーをコードする配列、またはレポーターポリペプチドをコードする配列など）を導入するために、一般に使用されている様々な組換え技術によって容易に改変され得ることが理解される。
【００７９】
好適な哺乳動物発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）、ｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａから入手可能である）、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能である）、ｐＴＲＥＳ（これはＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である）、ならびにそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態によれば、培養培地は、細胞増殖のために必要とされるサイトカインおよび増殖因子［例えば、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および白血病阻害剤因子（ＬＩＦ）］、ならびに、幹細胞の分化を阻害する、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）などの因子を含む。
【００８１】
そのような培養培地は、合成された組織培養培地、例えば、血清、血清代替物および／または増殖因子が補充されたＫｏ−ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国））などであり得る。
【００８２】
血清は、ウシ胎児血清、ヤギ血清またはヒト血清を含む任意の供給源のものが可能である。好ましくは、ヒト血清または代替血清ＴＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）が、動物非存在の環境をヒトＥＳ細胞に提供するために利用される。
【００８３】
代替血清ＴＭは、アルブミンまたは代用アルブミン、アミノ酸、ビタミン、トランスフェリンまたは代用トランスフェリン、抗酸化剤、インスリンまたは代用インスリン、コラーゲン前駆体、および微量元素を含む（国際特許出願公開ＷＯ９８／３０６７９（Ｐｒｉｃｅ，Ｐ．Ｊ他））。動物非存在の培養条件を提供するために、アルブミンまたは代用アルブミンは、好ましくはヒト供給源に由来し、および／または組換えタンパク質である。
【００８４】
培養培地、血清および血清代替物を、組織培養製品の任意の市販の供給者から得ることができ、例には、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）およびＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、米国）が含まれる。
【００８５】
本発明によって使用される血清および血清代替物は、１％〜４０％（より好ましくは５％〜３５％、最も好ましくは１０％〜３０％）の濃度範囲で提供される。
【００８６】
現時点で好ましい実施形態によれば、血清代替物は１５％の濃度で提供される（実施例の節の実施例１および実施例４を参照のこと）。
【００８７】
本発明の増殖因子は任意の組合せで使用することができ、ＥＳ細胞の増殖のために、その一方で同時に、ＥＳ細胞の分化を阻害するために好適な任意の濃度で幹細胞に与えることができる。
【００８８】
本発明による好適な増殖因子には、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）およびヒト組換え白血病阻害剤因子（ＬＩＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、組換えヒトオンコスタチンＭ、インターロイキン６（ＩＬ−６）Ｆｌｔ−３リガンドおよび幹細胞因子（ＳＣＦ）などが含まれるが、これらに限定されない。そのような増殖因子は、組織培養試薬の任意の供給者から、例えば、Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（米国）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、米国）およびＣｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、米国）などから得ることができる。
【００８９】
下記の実施例の節の実施例１に示されるように、ＥＳ細胞が、２０％血清代替物が補充された培養培地の存在下においてウシフィブロネクチン上で培養されるとき、増殖因子のＴＧＦβ１およびｂＦＧＦの組合せ（ＴＦ）と、増殖因子のＴＧＦβ１、ＬＩＦおよびｂＦＧＦの組合せ（ＴＬＦ）とはともに、ヒトＥＳ細胞を少なくとも５３回および５６回の継代培養にわたってそれぞれ維持することができる。
【００９０】
従って、本発明の好ましい実施形態によれば、支持細胞非含有システムで培養されるときにＥＳ細胞に補充するために使用される増殖因子には、ＴＧＦβ１、ｂＦＧＦおよび／またはＬＩＦが含まれる。
【００９１】
支持細胞非含有培養システムのもとでは、ＴＧＦβ１は０．０６ｎｇ／ｍｌ〜０．２４ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で提供され、より好ましくは０．１０ｎｇ／ｍｌ〜０．２０ｎｇ／ｍｌで、最も好ましくは０．１２ｎｇ／ｍｌで提供され、ＬＩＦは５００ｕ／ｍｌ〜２０００ｕ／ｍｌの濃度範囲で提供され、より好ましくは７５０ｕ／ｍｌ〜１５００ｕ／ｍｌで、最も好ましくは１０００ｕ／ｍｌで提供され、ｂＦＧＦは２ｎｇ／ｍｌ〜８ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で提供され、より好ましくは３ｎｇ／ｍｌ〜６ｎｇ／ｍｌで、最も好ましくは４ｎｇ／ｍｌで提供される。
【００９２】
あまり好ましくないが、ｈＥＳ細胞の培養は、血清または血清代替物が補充された培地の代わりに馴化培地を使用して代わりに行うことができる。
【００９３】
馴化培地は、特定の培養期間の後に存在する単層細胞培養物（すなわち、支持細胞）の増殖培地である。馴化培地には、培養における単層細胞によって分泌された増殖因子およびサイトカインが含まれる。
【００９４】
馴化培地は、培養において単層を形成する様々な細胞から回収することができる。例には、ＭＥＦ馴化培地、包皮馴化培地、ヒト胚性繊維芽細胞馴化培地、およびヒトファロピウス管上皮細胞馴化培地などが含まれる。
【００９５】
特に好適な馴化培地は、ヒト細胞に由来する馴化培地であり、例えば、馴化培地を製造するために好適な条件のもとでの増殖培地においてヒト包皮細胞を培養することによって製造される包皮馴化培地などである。
【００９６】
そのような増殖培地は、支持細胞を培養するために好適な任意の培地であり得る。増殖培地には、未分化状態における幹細胞の成長に役に立つ様々な栄養性の因子、例えば、アミノ酸（例えば、Ｌ−グルタミン）、抗酸化剤（例えば、β−メルカプトエタノール）および増殖因子などを補充することができる。血清および血清代替物が、他のところ（米国特許出願第１０／３６８０４５号）で記載されるような効果的な濃度範囲で加えられる。
【００９７】
支持細胞は、未分化状態での幹細胞の増殖を助けるための分泌された因子の十分な蓄積を可能にするために十分な期間にわたって増殖培地において培養される。典型的には、培地は、３７℃で４時間〜２４時間培養することによって馴化される。しかしながら、培養期間は、幹細胞の成長および分化に対する馴化培地の影響を評価することによって増減することができる。
【００９８】
培地を馴化するための装置の選択は馴化培地の規模および目的に基づく。大規模な製造では、好ましくは、専用の装置を使用することが伴う。連続細胞培養システムが、Ｆｕｒｅｙ（２０００）、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ、２０：１０に総説される。
【００９９】
十分な因子が培地に蓄積した後、増殖培地（すなわち、馴化培地）は支持細胞から分離され、回収される。支持細胞は、細胞が、培地を馴化するその能力を保持するならば、さらなる培養期間にわたって培地のさらなるバッチを馴化するために繰り返し使用できることが理解される。
【０１００】
好ましくは、馴化培地は使用前に滅菌される（例えば、２０μＭフィルターを使用するろ過）。本発明の馴化培地は、幹細胞に対して直接的に加えることができ、または、塩ろ過などによって効果的な因子を濃縮するために抽出することができる。さらなる使用のために、馴化培地は好ましくは−８０℃で凍結貯蔵される。
【０１０１】
本発明の方法によれば、幹細胞は、ヒト胚性幹細胞株を確立するために、支持細胞非含有培養条件のもとで培養される。
【０１０２】
確立されたヒト胚性幹細胞株は未分化幹細胞によって特徴づけられる。本発明によれば、未分化幹細胞株は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも８５％の未分化幹細胞を含む。
【０１０３】
下記の実施例の節の実施例１および実施例４において記載されるように、未分化幹細胞は、当業者によって胚起源または成体起源の分化した細胞から明瞭に区別可能である異なった形態学を有する。典型的には、未分化幹細胞は、大きい核／細胞質比率、目立った核、および、細胞間結合が十分に識別できない密集したコロニー形成を有する。未分化幹細胞のさらなる特徴が本明細書中下記に記載される。
【０１０４】
本発明の教示に従って培養されたとき、幹細胞の成長は、その分化状態を決定するためにモニターされる。例えば、形態学的な測定を含めて、いくつかの方法を、本明細書中に記載されるように培養された細胞の細胞分化を明らかにするために使用することができる。
【０１０５】
本発明の好ましい実施形態によれば、培養条件は、増殖性で、それにもかかわらず、未分化の状態で幹細胞を無限に維持することができる完全な異種非含有かつ支持細胞非含有の環境を幹細胞に提供する。従って、培養条件には、ヒト由来（または組換え）マトリックスと、ＴＧＦβ１、ＬＩＦおよびｂＦＧＦの増殖因子が補充された細胞培地とが含まれる。
【０１０６】
下記の実施例の節の実施例４および実施例５に示されるように、本発明者らは、ＥＳ細胞を、ヒト血清または血清代替物が補充されたヒト由来フィブロネクチンマトリックスにおいて培養することができ、それにより、動物病原体または何らかの他の混入物を含まない多能性幹細胞培養物が提供されることを例示している。これらの条件のもとでは、本発明の教示を使用して得られたＥＳ細胞株は、増殖性かつ未分化の状態を少なくとも３８回の継代培養にわたって維持した。
【０１０７】
培養工程の期間中、幹細胞はその分化状態についてさらにモニターされる。細胞分化は、分化を示すことが知られている細胞特異的または組織特異的なマーカーを調べたときに決定することができる。例えば、霊長類ＥＳ細胞は、段階特異的な胎児性抗原（ＳＳＥＡ）４、腫瘍拒絶抗原（ＴＲＡ）−１−６０およびＴＲＡ−１−８１を発現し得る。
【０１０８】
下記の実施例の節の実施例２および実施例４に示されるように、異種非含有培養培地および選択された増殖因子が補充された支持細胞非含有培養で成長したＥＳ細胞は、未分化細胞について典型的な細胞表面マーカーのＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１を発現した。
【０１０９】
組織／細胞特異的なマーカーは、この分野で広く知られている免疫学的技術を使用して検出することができる（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ他（１９９８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１１４５〜７）。例には、膜結合マーカーについてのフローサイトメトリー、細胞外マーカーおよび細胞内マーカーについての免疫組織化学、ならびに、分泌された分子マーカーについての酵素免疫アッセイが含まれるが、これに限定されない。
【０１１０】
ＥＳ細胞の分化の決定はまた、アルカリホスファターゼ活性の測定によって行うことができる。未分化のヒトＥＳ細胞は、４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定処理し、製造者の説明書（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）に従ってＶｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄ基質キットを用いて発色させることによって検出され得るアルカリホスファターゼ活性を有する。
【０１１１】
上記で述べられるように、本発明の幹細胞株は多能性を少なくとも３８回の継代培養にわたって維持する。そのような多能性は、胚様体（ＥＢ）の形成によってインビトロでモニターすることができ、また同様に、奇形腫の形成によってインビボでモニターすることができる。
【０１１２】
胚様体は、ＥＳ細胞を支持細胞層または支持細胞非含有培養システムから取り出したときに形成される。ＥＳ細胞の取り出しは、限定された時間のＩＶ型コラゲナーゼ処理を使用して行うことができる。培養表面から解離させた後、細胞は、血清およびアミノ酸が補充された培養培地を含有する組織培養プレートに移される。下記の実施例の節の実施例３および実施例５に示されるように、懸濁培養において１４日後、本発明の教示に従って得られたＥＳ細胞は胚の中胚葉細胞、外胚葉細胞および内胚葉細胞を含有するＥＢに分化した。従って、このことは、本発明のＥＳ細胞株が、本発明によって使用される支持細胞非含有培養条件のもとでは多能性を保持していることを明瞭に明らかにしている。
【０１１３】
ＥＢ細胞の分化レベルは、Ｏｃｔ−４の発現の喪失、および、他のマーカー（例えば、α−フェトプロテイン、ＮＦ−６８ｋＤａ、α−カルジアックおよびアルブミンなど）の増大した発現レベルを追跡することによってモニターすることができる。特異的な遺伝子の発現レベルをモニターするために有用な様々な方法がこの分野では広く知られており、これらには、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡインサイチュウハイブリダイゼーション、ウエスタンブロット分析および免疫組織化学が含まれる。
【０１１４】
ＥＢ細胞株の多能性能力はまた、細胞をＳＣＩＤマウスに注入することによって確認することができる［Ｅｖａｎｓ  ＭＪおよびＫａｕｆｍａｎ  Ｍ（１９８３）、正常なマウス胚から直接的に成長した多能性細胞、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖ．、２：１８５〜２０８］。この場合、ＳＣＩＤマウスは、注入したときに奇形腫を形成する。奇形腫は、４％パラホルムアルデヒドを使用して固定処理され、３つの胚葉（すなわち、内胚葉、中胚葉および外胚葉）について組織学的に調べられる。
【０１１５】
下記の実施例の節の実施例３に示されるように、本発明の選択された増殖因子の組合せ（すなわち、ＴＦ組合せおよびＴＬＦ組合せ）が補充された、フィブロネクチンに基づく支持細胞非含有培養システムで培養されたＥＳ細胞は、機能的な奇形腫を形成した。このことは、インビボで分化するＥＳ細胞の多能性能力を明らかにしている。
【０１１６】
分化状態をモニターすることに加えて、幹細胞は、多くの場合、すべての染色体が存在し、かつ培養期間中に検出可能に変化していない細胞学的な正倍数性を確認するために、核型についてモニターされている。培養された幹細胞は、標準的なギムザ染色を使用して核型を決定することができ、対応する種の発表されている核型と比較することができる。
【０１１７】
本発明の教示に従って培養された幹細胞は、ＴＦ組合せまたはＴＬＦ組合せの増殖因子が補充されたとき、フィブロネクチンマトリックスにおける３０回および３２回の継代培養の後、それぞれ正常な核型を保持している（実施例の節の実施例２を参照のこと）。
【０１１８】
増殖性かつ未分化の状態を少なくとも３８回の継代培養にわたって維持するその多能性および能力は、本発明の教示に従って得られたＥＳ細胞培養物を単一細胞クローニングのための優れた供給源にしている。
【０１１９】
従って、上記の方法はさらに、好ましくは異種を含まず、かつ支持細胞を含まない本発明の培養条件のもとで、上記のヒト胚性幹細胞株に由来する単一細胞を培養し、それにより、単一細胞に由来するＥＳ培養物を確立するというさらなる工程を含むことができる。
【０１２０】
単一細胞クローニングの様々な方法がこの分野では広く知られている（例えば、米国特許第６５４８６５５号、Ａｍｉｔ他、２０００、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２２７：２７１〜８を参照のこと）。そのような方法では、典型的には、細胞群を細胞培養物から選択すること、その細胞群を単一細胞に解離すること、および、細胞増殖を促進させ、その一方で同時に、細胞分化を阻害する条件で単一細胞を別々に成長させることが含まれる。単一細胞クローンが得られると、単一細胞クローンは、好適な培養条件のもとでＥＳ細胞株に拡大することができる。
【０１２１】
本発明のＥＳ細胞株は異種混入物および支持細胞混入物を含まないので、ヒトでの細胞に基づく治療および組織再生のために使用することができる。
【０１２２】
従って、本発明の別の態様によれば、細胞置換および／または組織再生を必要としている個体を処置する方法で、異種混入物および支持細胞混入物を含まないｈＥＳ細胞調製物を個体に投与することを含む方法が提供される。
【０１２３】
好ましくは、この方法はさらに、本明細書中上記に記載される方法論を使用してｈＥＳ細胞調製物を調製する工程を含む。
【０１２４】
本明細書中で使用される「細胞置換および／または組織再生を必要としている個体を処置する」は、障害（例えば、細胞置換および組織再生を必要とする神経学的障害、筋肉障害、心臓血管傷害、血液学的障害、皮膚障害および肝臓障害など）に罹患している個体を処置することを示す。
【０１２５】
表現「処置する」は、疾患、障害または状態に罹患している個体、あるいは、疾患、障害または状態と診断された個体において、疾患、障害または状態の発達を阻害するか、または停止させること、および／あるいは、疾患、障害または状態の軽減、寛解または退行を生じさせることを示す。当業者は、疾患、障害または状態の発達を評価するために使用することができる様々な方法論およびアッセイ、同様に、疾患、障害または状態の軽減、寛解または退行を評価するために使用することができる様々な方法論およびアッセイを承知している。
【０１２６】
本明細書中で使用される「投与する」は、任意の好適な経路を使用して、例えば、経口投与、舌下投与、静脈内投与、皮下投与、経皮投与、筋肉内投与、皮内投与、クモ膜下投与、腹腔内投与、脾臓内投与、肝臓内投与、膵臓内投与、心臓内投与、硬膜外投与、眼内投与、頭蓋内投与、吸入投与、直腸投与、膣投与および同様な投与を使用して、ヒトＥＳ細胞調製物を個体に与えるための手段を示す。
【０１２７】
本明細書中における得られた幹細胞は、そのまま（すなわち、未分化調製物）、あるいは、部分的または完全な分化の後で投与することができる。培養されたヒトＥＳ細胞は、限定された発達系譜の細胞に、または最終分化細胞に分化させることができる。幹細胞の分化は、胚様体を形成させる懸濁培養において未分化のヒトＥＳ細胞を過度に成長させることによって、または、特定の様式で分化を促進させる条件にもとにＥＳ細胞を置くことによって開始させることができる。そのような条件には、栄養物、増殖因子またはサイトカインを除くこと、あるいは、栄養物、増殖因子またはサイトカインを培地に加えること、あるいは、酸素圧力を変化させること、あるいは、培養表面における基質を変更することが含まれ得る。
【０１２８】
未分化幹細胞または分化幹細胞は、様々な障害を処置することにおいて利用することができる。例えば、稀突起神経膠細胞系譜の部分的に分化したＥＳ細胞を、ミエリン障害を処置するために使用することができる（ミエリン疾患の修復：動物モデルにおける方針および進歩、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ、１９９７、５５４頁〜５６１頁）。軟骨細胞または間葉系譜の部分的に分化したＥＳ細胞を骨障害および軟骨障害の処置において使用することができる（米国特許第４６４２１２０号）。また、上皮系譜の部分的に分化したＥＳ細胞を創傷または火傷の皮膚再生において使用することができる（米国特許第５７１６４１１号）。
【０１２９】
細胞置換治療に加えて、本発明のＥＳ細胞株はまた、支持細胞由来のｃＤＮＡで比較的汚染されていないｃＤＮＡラブラリーを調製するために利用することができる。ｍＲＮＡが標準的な技術によってＥＳ細胞から調製され、さらに逆転写されて、ｃＤＮＡが形成される。ｃＤＮＡ調製物は、この分野で知られている技術によって、胚性繊維芽細胞および望ましくない特異性の他の細胞から得られたヌクレオチドを用いてサブトラクションされて、サブトラクションされたｃＤＮＡラブラリーを得ることができる。
【０１３０】
本発明のＥＳ細胞株は、幹細胞の特性に影響を及ぼす因子（例えば、小分子薬物、ペプチドおよびポリヌクレオチドなど）または条件（例えば、培養条件または操作など）についてスクリーニングするために使用することができる。例えば、成長に影響を及ぼす物質、毒素または潜在的な分化因子を、培養培地へのそれらの添加によって調べることができる。
【０１３１】
本発明の追加の目的、利点及び新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０１３２】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０１３３】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学及び組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ    ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号及び５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号及び５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９���６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ＥＪ著「Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７年；Ｎａｇｙ  Ａら「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３年；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｖ．Ｓ．Ｐｒｉｍａｔｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３８，１３３−１６５，１９９８年；Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｖ．Ｓ．，Ｗａｋｎｉｔｚ，Ｍ．Ａ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５８，１１−１８，２００１年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１３４】
（実施例１）
異種非含有培地が補充された支持細胞非含有培養システムはＥＳ細胞株を成長させるために好適である
ヒトＥＳ細胞を、支持細胞非含有の十分に規定された環境をＥＳ細胞培養物に提供するために、血清代替物および選択された増殖因子の存在下でのフィブロネクチンに基づく細胞システムに移した。
【０１３５】
材料および実験方法
ＥＳ細胞培養物：ヒトＥＳ細胞株のＩ−６、Ｉ−３［Ａｍｉｔ，Ｍ．＆Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ，Ｊ．、ヒト胚性幹細胞の誘導および自然分化、Ｊ  Ａｎａｔ．、２００、２２５〜２３２（２００２）］およびＨ−９［Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．他、ヒト胚盤胞に由来する胚性幹細胞株、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２、１１４５〜７（１９９８）］が、１５％の血清代替物（ＳＲ）が補充された８５％のＫｏ−ＤＭＥＭ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック液、および４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦからなる培養培地（これらはすべてが、Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ（米国）から得られる）で、４６回、３９回および２５回の継代培養にわたってそれぞれ、マウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）とともに培養された。ＥＳ細胞は、その後、２０％のＳＲ、８０％の培養培地、および増殖因子の下記組合せの１つの存在下でのウシ由来フィブロネクチン被覆プレート（５０μｇ／１０ｃｍ２、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｔｈ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル））に移された：「Ｔ」−０．１２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、米国））；「ＴＦ」−０．１２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１および４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ（米国））；「ＬＦ」−１０００ｕ／ｍｌの白血病阻害剤因子（ＬＩＦ、ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、米国））および４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ；または「ＴＬＦ」−０．１２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１、１０００ｕ／ｍｌのＬＩＦおよび４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ。付着性細胞が、１ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼ（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ（米国））を３０分間使用して４日毎〜６日毎に分けられ、新鮮な培地を含有するフラスコに再び置床された。凍結プロトコルに従って、細胞を、１０％のＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国））、１０％のヒト血清（ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、米国））または１５％のＳＲ、および８０％のＫｏ−ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ（米国））からなる凍結液を使用して液体窒素で凍結した。
【０１３６】
形態学的評価−ＥＳ細胞を、位相差を使用する倒立型顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＩＸ７０、日本）で調べた（生細胞）。
【０１３７】
実験結果
支持細胞非含有培養システムにおけるｈＥＳ細胞の増殖能力−Ｉ−３、Ｉ−６およびＨ−９の系統に由来するＥＳ細胞を、本明細書中上記の方法に詳しく記載されるように、選択された増殖因子が補充された血清代替物の存在下でのフィブロネクチン被覆プレートに移した。培養培地に、ｂＦＧＦだけが補充されたとき、または、ＬＩＦおよびｂＦＧＦが補充されたとき（ＬＦ）、細胞は数回の継代培養にわたって増殖し続け、その後、分化に変わった。また、ＥＳ培養培地にＴＧＦβだけが補充されたとき、ＥＳ細胞は、１０回を越える継代培養にわたって未分化状態で維持されたが、増殖が悪く、１５回目の継代培養までにゆっくり消失していった。他方で、ＥＳ培養培地に、ＴＧＦβ１およびｂＦＧＦが補充されたとき（ＴＦ）、または、ＴＧＦβ１、ＬＩＦおよびｂＦＧＦが補充されたとき（ＴＬＦ）、細胞は増殖し続け、ＭＥＦにおいて成長したｈＥＳ細胞と同様に、ｈＥＳ細胞の正常な特徴を維持していた。しかしながら、ＴＦの組合せで成長した細胞は、それぞれの継代培養の期間中、１枚のプレートに分けられたが、ＴＬＦの組合せで成長した細胞は、ＭＥＦにおいて成長したＥＳ細胞と同様に、２枚〜３枚のプレートに分けられた。このことは、増殖速度がＴＬＦの組合せの存在下では大きいことを明らかにしている。従って、ＴＬＦ組合せの増殖因子が補充された支持細胞非含有培養システムは、ＭＥＦにおいて成長したＥＳ細胞の倍加時間と同様な少なくとも２５時間の倍加時間を伴ってｈＥＳ細胞の正常な成長を助けることができた。
【０１３８】
支持細胞非含有培養システムにおけるＥＳコロニーおよびＥＳ細胞の形態学的特徴−支持細胞非含有培養システムで成長したＥＳコロニーの形態学的特徴は、ＴＬＦ組合せの増殖因子が補充されたときには（２２４日を越える）５６回を越える継代培養の後でさえ、ＴＦ組合せの増殖因子が補充されたときには（２１２日を越える）５３回を越える継代培養の後でさえ、ＭＥＦにおいて成長したＥＳコロニーの形態学的特徴と区別できなかった（示されず）。また、本発明のフィブロネクチン−支持細胞非含有システムでのそれらの継代培養から４日目において、ｈＥＳ細胞培養物は、３０時間〜３５時間の倍加時間を有する、８５％〜９０％の未分化細胞からなった。この倍加時間は、ＭＥＦにおいて成長したｈＥＳ細胞の倍加時間と一致する。
【０１３９】
より高倍率で見たとき、支持細胞非含有培養システムで成長したｈＥＳ細胞は、大きい核対細胞質比率、１個〜３個の核の特筆すべき存在、および、細胞間の典型的な間隔を伴って、小さく、かつ円形であった（図１ａ〜図１ｄ）。
【０１４０】
支持細胞非含有培養システムで成長したＥＳ細胞は、ＭＥＦにおいて成長したＥＳ細胞の生存率と類似する生存率を有する−ＥＳ貯蔵のために、支持細胞非含有培養システムで成長したＥＳ細胞を１５％のＳＲおよび１０％のＤＭＳＯの存在下で凍結した。凍結ＥＳ細胞がさらに解凍され、再び置床されたとき、凍結ＥＳ細胞は、ＭＥＦにおいて成長したＥＳ細胞の生存率と類似する生存率を示した。
【０１４１】
従って、これらの結果は、ＴＦ組合せおよびＴＬＦ組合せの増殖因子がｈＥＳ培養物のために好適であり、しかし、ＴＦの組合せは、低い増殖能力のためにＴＬＦの組合せよりも劣っていることを明らかにしている。さらに、支持細胞非含有培養システムで成長したＥＳ細胞は、ＭＥＦにおいて成長したＥＳ細胞の形態学的特徴および生存率と同様な形態学的特徴および生存率を示した。
【０１４２】
（実施例２）
異種非含有培地が補充された支持細胞非含有培養システムは、表現型が一致するＥＳ細胞の成長を助ける
異種非含有培地が補充された支持細胞非含有培養システムで成長したｈＥＳ細胞の表現型特徴が、未分化細胞に典型的な細胞表面マーカーを使用して評価された。
【０１４３】
材料および実験方法
核型分析−ＥＳ細胞の有糸分裂中期が、コルセミド（ＫａｒｙｏＭａｘコルセミド溶液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｒａｎｄ  ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国））を使用して阻止され、核膜が、標準的なプロトコル（ヒト細胞遺伝学命名法に関する国際システム、ＩＳＣＮ）による低張溶液において溶解された。染色体のＧバンド形成が、製造者（Ｇｉｅｍｓａ、Ｍｅｒｃｋ）の説明書に従って行われた。サンプルあたり少なくとも２０個の細胞の核型がＩＳＣＮに従って分析および報告された。
【０１４４】
免疫組織化学−細胞が４％パラホルムアルデヒドにおいて２０分間固定処理され、ＰＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｔｈ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル））における２％の正常ヤギ血清において１５分間ブロッキング処理され、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４のマウス抗ヒト抗体（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａバンク（Ｉｏｗａ、米国））、ＴＲＡ−６０、ＴＲＡ−８１のマウス抗ヒト抗体（Ｐ  Ａｎｄｒｅｗｓ（Ｓｈｅｆｉｅｌｄ大学（英国）によって提供）の１：５０希釈物と４℃で一晩インキュベーションされた。その後、細胞はＰＢＳで洗浄され、フルオロクロムＣｙｓ３にコンジュゲート化されたロバ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、米国））の１：１００希釈物とさらにインキュベーションされた。細胞を倒立型蛍光顕微鏡（ＣＡＲＬ  Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）または共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、英国））で可視化した。
【０１４５】
実験結果
異種非含有培地が補充されたフィブロネクチン型支持細胞非含有培養システムは他の支持細胞型プロトコルのような一致した核型を有するＥＳ細胞をもたらす−核型分析が、異種非含有培地が補充されたフィブロネクチン型支持細胞非含有培養システムでの連続培養の後のｈＥＳ細胞に対して行われた。核型分析は、２つの培地条件（ＴＦおよびＴＬＦ）、および、支持細胞非含有培養システムでの６回〜３２回の継代培養の異なる段階における３つのｈＥＳ細胞株（Ｉ−３、Ｉ−６およびＨ−９）を表す９個の別個の培養物に対して行われた。この分析により、正常な核型が、ＴＨ培地で培養されたときの３０回目の継代培養、およびＴＬＦ培地で培養されたときの３２回目の継代培養において調べられた１４０個の細胞のうちの１３６個の細胞において明らかにされた。同じ群の４つの細胞において、４７の異常な核型（すなわち、ＸＸＸ）が見出された。これら４つの細胞は、ほぼ１年間にわたって培養されており、ＴＬＦが補充された支持細胞非含有培養システムにおいてそのうちの２０回の継代培養が行われた誘導後７１回目の継代培養においてであった。以前に報告されているように［Ａｍｉｔ，Ｍ．、クローン誘導されたヒト胚性幹細胞株は多能性および増殖能力を長期間の培養にわたって維持する、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２２７：２７１〜８（２０００）］、染色体の不安定性が、ＭＥＦにおいて８ヶ月間にわたって培養されたとき、ＥＳ細胞において生じ得る。まとめると、これらの結果から、本発明の支持細胞非含有培養システムはｈＥＳ細胞の正常かつ安定な核型を助けていることが示唆される。
【０１４６】
異種非含有培地が補充された支持細胞非含有培養システムで培養されたヒトＥＳ細胞は胎児性表面マーカーを発現する−ヒトＥＳ細胞の正常な成長を維持させるフィブロネクチン型支持細胞非含有培養システムの能力をさらに特徴づけるために、ＩＨＣが、ＴＲＡ−１−６０、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ１を含む胎児性表面マーカー抗体を用いてヒトＥＳ細胞に対して行われた。ＴＦ増殖因子およびＴＬＦ増殖因子が補充された培養における１７回および３８回の継代培養の後、Ｉ−３、Ｉ−６のヒトＥＳ細胞は、段階特異的な胎児性抗原４（ＳＳＥＡ４）、腫瘍拒絶抗原（ＴＲＡ）−１およびＴＲＡ−１−８１の大きい発現レベルが明らかにされた（図１ｅ〜図１ｈ）。これらのマーカーは未分化ＥＳ細胞の典型的な特徴である［Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ他（１９９８）、ヒト胚盤胞に由来する胚性幹細胞株、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１１４５〜７；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ他（１９９６）、コモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）の胚盤胞に由来する多能性細胞株、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ、５５：２５４〜９；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ他（１９９５）、霊長類胚性幹細胞物の単離、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：７８４４〜８］。特筆すべきことに、段階特異的な胎児性抗原３（ＳＳＥＡ３）が適度に発現していただけであり、一方、段階特異的な胎児性抗原１（ＳＳＥＡ１）（マウスＥＳ細胞の特異マーカー）の発現は検出されなかった（データは示されず）。
【０１４７】
これらの結果は、ＴＦまたはＴＬＦの増殖因子が補充された支持細胞非含有培養システムは、長期間の培養期間の後でさえ、ヒトＥＳ細胞を未分化状態で維持することができることを明らかにしている。
【０１４８】
（実施例３）
異種非含有培地が補充された支持細胞非含有培養システムは機能的なＥＳ細胞の成長を助ける
血清代替物および異種非含有増殖因子が補充されたフィブロネクチン型支持細胞非含有の培養システムで成長したヒトＥＳ細胞が、インビトロで胚様体を形成し、かつインビボで奇形腫を形成するその能力について調べられた。
【０１４９】
材料および実験方法
ヒトＥＳ細胞からの胚様体（ＥＢ）の形成−支持細胞非含有培養システムで成長したヒトＥＳ細胞をＩＶ型コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）によって６ウエルプレート（４０ｃｍ２〜６０ｃｍ２）培養物から取り出し、１０００μｌのＧｉｌｓｏｎピペットチップを使用して小さい塊にさらに解離させた。その後、解離した細胞を、２０％の規定されたウシ胎児血清（ＦＢＳｄ、ＨｙＣｌｏｎｅ（Ｕｔａｈ、米国））が補充された８０％のＫｏ−ＤＭＥＭ、１ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、および１％の非必須アミノ酸ストック液からなる培地で５８ｍｍペトリディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）において培養した。別途記されない限り、すべてがＧｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国）から購入された。ＥＢの形成が懸濁状態で１４日後に調べられた。
【０１５０】
奇形腫の形成−ＥＳ細胞を６ウエルプレート（６０ｃｍ２）における６個のコンフルエントなウエルから取り出し、４週齢のオスＳＣＩＤベージュマウス（Ｈａｒｌａｎ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル））の後脚筋肉に注射した。注射後少なくとも１２週目に、得られた奇形腫はホルムアルデヒドにおいて固定処理され、組織学的に調べられた。
【０１５１】
逆転写酵素（ＲＴ）結合ＰＣＲ−総ＲＮＡを、１７回〜２５回の継代培養にわたって支持細胞非含有培養システムで成長した未分化のヒトＥＳ細胞、または、支持細胞非含有条件で成長したＥＳ細胞から得られた１４日齢のＥＢのいずれかから、Ｔｒｉ試薬キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国））を製造者のプロトコルに従って使用して単離した。ｃＤＮＡ合成が、ＭＭＬＶ  ＲＴ−ＲＮａｓｅＨ−マイナス（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国））を製造者の説明書に従って使用して１μｇの総ＲＮＡテンプレートに対して行われた。ＰＣＲプライマーおよび反応条件が本明細書中下記の表１に記載される。すべてのＰＣＲ反応は、９４℃で５分間の最初の鎖の変性を含んだ。ＰＣＲ生成物は、２％アガロースゲル電気泳動を使用してサイズ分画された。
【表１】
0004613069.tif 000002
【０１５２】
実験結果
ＥＳ細胞は、支持細胞非含有培養システムから取り出された後、インビトロで胚の胚葉細胞タイプに自然分化する−フィブロネクチンに基づく支持細胞非含有の培養システムで培養されたヒトＥＳ細胞が、支持細胞に基づくプロトコルによって得られるヒトＥＳ細胞と、表現型だけでなく、機能的に一致することを確認するために、ＥＳ細胞を、ＴＬＦにおける２２回〜３０回の継代培養の後、およびＴＦにおける２８回の継代培養の後の支持細胞非含有培養から取り出して、懸濁状態で成長させた。結果として、ｈＥＳ細胞は、ＭＥＦにおいて成長したＥＳ細胞によって生じた胚様体（ＥＢ）と類似する胚様体を形成した（図２ａ〜図２ｃ）。単離されたＥＢの機能性が、様々な胎児性細胞マーカーを使用するＩＨＣによってさらに調べられた。図２ｄ〜図２ｆにさらに示されるように、ＥＢは、外胚葉起源に由来する神経特異的チューブリン、平滑筋アクチン、および中胚葉起源のＣＤ−３１マーカーを発現した。
【０１５３】
ＥＢ内におけるＥＳ一致の遺伝子発現が、ＲＴ−ＰＣＲを使用してさらに確認された。ＥＢ内において、幹細胞は胚の３つの胚葉（すなわち、中胚葉、内胚葉および外胚葉）の代表的な細胞に分化した。図３に示されるように、ＴＬＦまたはＴＦが補充された支持細胞非含有培養システムで成長した未分化ＥＳ細胞は、高レベルのＯｃｔ４（図３）、すなわち、多能性の胚性幹細胞および胚性生殖細胞についてのマーカー［Ｐｅｓｃｅ  ＭおよびＳｃｈｏｌｅｒ  ＨＲ、Ｏｃｔ−４：哺乳動物発生の開始におけるゲートキーパー、（２００１）、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、１９：２７１〜８］を発現したが、１４日齢のＥＢから集められた細胞は、胚の外胚葉と関連づけられる神経フィラメント（ＮＦ−６８ｋＤ）、胚の中胚葉に関連するα−心臓アクチン、ならびに、ともに胚の内胚葉の指標であるα−フェトプロテインおよびアルブミンを含む、細胞分化に関連する様々な遺伝子を発現した。ＥＢサンプルにおける低下したＯｃｔ４発現は、全能性細胞が体細胞系譜に分化した後における低下したＯｃｔ４発現の以前の報告［Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ他（１９９８）、ヒト胚盤胞に由来する胚性幹細胞株、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１１４５〜７；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ＢＥ他（２０００）、ヒト胚盤胞由来の胚性幹細胞株：インビトロでの体細胞分化、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８：３９９〜４０４］と一致していた。以前に他のところで報告されているように［Ｓｃｕｌｄｉｎｅｒ  Ｍ．他、ヒトＥＳ細胞に由来する細胞の分化に対する８個の増殖因子の影響、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９７：１１３０７〜１２（２０００）；Ａｍｉｔ、Ｍ．他、ヒト胚性幹細胞株のためのヒト支持細胞層、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、６８：２１５０〜２１５６（２００３）；Ｋｅｈａｔ，Ｉ．他、ヒト胚性幹細胞株は心筋細胞の構造的性質および機能的性質を有する筋細胞に分化することができる、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１０８：４０７〜１４（２００１）］、ＥＳ細胞培養物はある程度のバックグラウンド分化を有し得る。実際に、細胞特異的遺伝の一部（アルブミンおよびα−心臓アクチンなど）はまた、本発明の未分化ＥＳ細胞においても発現した（図３）。
【０１５４】
従って、これらの結果は、本発明の支持細胞非含有培養で成長したヒトＥＳ細胞は、様々な体細胞系譜に分化する細胞とともに機能的なＥＢを生じさせることができることを明らかにしている。
【０１５５】
支持細胞非含有培養で成長したヒトＥＳ細胞はインビボで胚の胚葉に分化する−胚の胚葉へのヒトＥＳ細胞の分化を助ける本発明の支持細胞非含有培養システムの能力をさらに立証するために、ＥＳ細胞は、インビボでの奇形腫形成について調べられた。ＳＣＩＤベージュマウスへの注射の後、ＴＬＦにおいて２６回および１９回の継代培養にわたってそれぞれ培養されていたＩ−３細胞およびＩ−６細胞は奇形腫を形成することができた。それぞれの奇形腫は、外胚葉起源の有髄神経（図４ａ）、中胚葉起源であるヒアリン軟骨の詳細（図４ｂ）、および、内胚葉と関連づけられる、杯細胞が多い分泌上皮（図４ｃ）を含む胚の３つの胚葉の代表的な組織を含有していた。
【０１５６】
まとめると、本発明の支持細胞非含有培養システムで成長したヒトＥＳ細胞は、このように、支持細胞に基づく培養で成長した細胞と機能的に異なっていた。分化後、ＥＳ細胞は、胚の３つの胚葉のすべてに関連する遺伝子をインビトロで発現し、同様に、３つの胚葉のすべてから生じる組織からなる奇形腫をインビボで形成した。他の支持細胞非含有プロトコルとは異なり、本発明の培養システムは、ヒトＥＳ細胞を増殖させるために好適な十分に規定された異種非含有の培養培地を含有した。
【０１５７】
（実施例４）
完全な異種非含有かつ支持細胞非含有の培養システムは、表現型が一致するヒトＥＳ細胞を成長させるために好適である
動物非存在の環境はヒトＥＳ細胞の何らかの将来の臨床的使用のためには非常に重要であるので、完全な異種非含有かつ支持細胞非含有の培養システムが、ｈＥＳ細胞を培養するためのマトリックスとしてヒト起源のフィブロネクチン、ならびに、異種非含有の補充された培地、および増殖因子を使用して開発された。
【０１５８】
実験結果
異種非含有かつ支持細胞非含有の培養システムはヒトＥＳ細胞の成長を助ける−ｈＥＳ細胞培養のための完全な動物非存在の十分に規定された環境を得るために、ヒト起源のフィブロネクチンが支持細胞非含有培養システムとして使用された。培養培地には、本明細書中上記の実施例１における材料および実験方法で記載されるように、Ｔ、ＬＦ、ＴＦおよびＴＬＦの増殖因子組合せが補充された血清代替物（１５％）が含まれた。ヒト血漿フィブロネクチン（ヒト血漿から得られるフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国））および細胞フィブロネクチン（ヒト包皮繊維芽細胞から得られる細胞フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国））はともに、ＴＦおよびＴＬＦの両方の増殖因子組合せの存在下で少なくとも３８回の継代培養（約１１０回の倍加）にわたってｈＥＳ細胞の未分化成長を助けることが見出された。また、本発明のフィブロネクチン−支持細胞非含有システムでの継代培養から４日目において、ｈＥＳ細胞培養物は、ＭＥＦにおいて成長したｈＥＳ細胞の倍加時間と一致する３０時間〜３５時間の倍加時間を有する、８５％〜９０％の未分化細胞からなった。このことは、ｈＥＳ細胞の正常な成長を伝えるこれらの異種非含有培養システムの能力を明らかにしている。
【０１５９】
これらの結果は、長く持続する増殖性かつ未分化のヒトＥＳ細胞培養物の成長を助ける、異種非含有培養システムが補充されたヒト起源のフィブロネクチンの能力を明らかにしている。
【０１６０】
異種非含有かつ支持細胞非含有の培養システムで成長したヒトＥＳ細胞は、ウシ由来フィブロネクチンに基づく支持細胞非含有の培養システムで成長したＥＳ細胞と表現型が区別することができない−血清代替物およびＴＦ増殖因子が補充されたヒト細胞フィブロネクチン培養システムで２２回の継代培養にわたって成長した細胞は未分化細胞の形態学を保持していた。ＥＳ細胞は、大きい核対細胞質比率、１個〜３個の核の特筆すべき存在、および、細胞間の典型的な間隔を伴って、小さく、かつ円形であった（図５ａ〜５ｃ）。
【０１６１】
また、異種非含有かつ支持細胞非含有の培養システムで成長したヒトＥＳ細胞は、３２回の継代培養の後で正常な核型を有することが見出された（示されず）。
【０１６２】
その上、ＩＨＣによってさらに解明されたように、完全な異種非含有かつ支持細胞非含有のシステムで１６回の継代培養にわたって培養されたヒトＥＳ細胞は、ＴＲＡ−１−６０、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−８１を含むすべての特徴的な胎児性表面マーカーを発現した（図５ｄ〜図５ｆ）。
【０１６３】
従って、これらの結果は、正常かつ安定な核型を有する非常に増殖性の培養を維持し、かつ、すべての典型的な胎児性表面マーカーを発現する、表現型が一致するヒトＥＳ細胞を助ける完全な異種非含有かつ支持細胞非含有のシステムの能力を明らかにしている。
【０１６４】
従って、これらの結果から、ヒトＥＳ細胞の誘導および培養のための本発明の異種非含有かつ支持細胞非含有の培養システムの使用が示唆される。
【０１６５】
（実施例５）
完全な異種非含有かつ支持細胞非含の培養システムで成長したヒトＥＳ細胞は、他の培養システムで成長したＥＳ細胞と機能的に区別することができない
血清代替物および異種非含有増殖因子が補充されたヒトフィブロネクチン型支持細胞非含有培養システムで成長したヒトＥＳ細胞が、インビボで胚様体を形成するその能力について調べられた。
【０１６６】
ＥＳ細胞は、支持細胞非含有培養システムから取り出された後、インビトロで胚の胚葉細胞タイプに自然分化する−異種非含有かつ支持細胞非含有の培養システムで培養されたヒトＥＳ細胞が、支持細胞に基づくプロトコルによって得られるヒトＥＳ細胞と、表現型だけでなく、機能が一致することを確認するために、ＥＳ細胞を、ヒト細胞フィブロネクチンマトリックスおよびヒト血漿フィブロネクチンマトリックスにおいてそれぞれ、１７回および１６回の継代培養の後の支持細胞非含有培養から取り出した。結果として、ｈＥＳ細胞は、ＭＥＦにおいて成長したＥＳ細胞によって生じた胚様体（ＥＢ）と類似する胚様体を形成した（図６ａ〜図６ｃ）。
【０１６７】
ＥＢ内におけるＥＳ一致の遺伝子発現が、ＲＴ−ＰＣＲを使用してさらに確認された。ＥＢ内において、幹細胞は胚の３つの胚葉（すなわち、中胚葉、内胚葉および外胚葉）の代表的な細胞に分化した。図７に示されるように、ＴＬＦまたはＴＦが補充された異種非含有かつ支持細胞非含有の培養システムで成長した未分化細胞は高レベルのＯｃｔ４およびＬＩＦ受容体を発現した（図７）が、１４日齢のＥＢから集められた細胞は、胚の外胚葉と関連づけられる神経フィラメント（ＮＦ−６８ｋＤ）、胚の中胚葉に関連するα−心臓アクチン、ならびに、ともに胚の内胚葉の指標であるα−フェトプロテインおよびアルブミンを含む、細胞分化に関連する様々な遺伝子を発現した。
【０１６８】
従って、これらの結果は、本発明の完全な異種非含有かつ支持細胞非含有の培養で成長したヒトＥＳ細胞は、様々な体細胞系譜に分化する細胞とともに機能的なＥＢを生じさせることができることを明らかにしている。
【０１６９】
（実施例６）
支持細胞非含有培養システムは未分化のヒト胚性幹細胞の正常な成長速度および大きい割合を支える
ヒト胚性幹細胞を増殖する支持細胞非含有培養システムの能力をさらに特徴づけるために、未分化幹細胞の成長速度および割合が、様々な培養条件のもとでのｈＥＳ細胞において明らかにされた。
【０１７０】
支持細胞非含有培養システムは、支持細胞に基づく培養システムと類似する、未分化ヒトＥＳ細胞の正常な成長速度および大きい割合を維持する−ｈＥＳの成長を助ける本発明の支持細胞非含有培養システムの能力を明らかにするために、未分化幹細胞の成長速度および割合が支持細胞非含有培養システムにおいて測定された。図８ａ〜図８ｃに示されるように、ｈＥＳ細胞がＴＬＦ組合せの増殖因子の存在下でウシ由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて培養されたとき、Ｉ−３ｈＥＳ細胞の成長速度（図８ａ、ピンク色曲線）、Ｉ−６ｈＥＳ細胞の成長速度（図８ｂ、ピンク色曲線）およびＨ−９ｈＥＳ細胞の成長速度（図８ｃ、ピンク色曲線）は、ＭＥＦにおいて培養されたｈＥＳ細胞の成長速度と類似していた。その上、ｈＥＳ細胞がＴＦ組合せの増殖因子のみの存在下でヒト由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて培養されたとき、Ｉ−３ｈＥＳ細胞の成長速度（図８ａ、明青色曲線）、Ｉ−６ｈＥＳ細胞の成長速度（図８ｂ、明青色曲線）およびＨ−９ｈＥＳ細胞の成長速度（図８ｃ、明青色曲線）は、ＭＥＦにおいて培養されたｈＥＳ細胞の成長速度と類似していた。他方で、これらの細胞がＴＦ組合せの増殖因子の存在下でウシ由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて培養されたとき、Ｉ−３ｈＥＳ細胞の成長速度（図８ａ、黒色曲線）、Ｉ−６ｈＥＳ細胞の成長速度（図８ｂ、黒色曲線）およびＨ−９ｈＥＳ細胞の成長速度（図８ｃ、黒色曲線）の成長速度は、ＭＥＦにおいて培養されたｈＥＳ細胞の成長速度と比較して低くなっていた。従って、ＴＬＦ組合せの増殖因子が補充されたウシフィブロネクチンマトリックス、および、ＴＦ組合せの増殖因子のみが補充されたヒトフィブロネクチンマトリックスは、ＭＥＦにおいて達成される成長速度と類似するｈＥＳ細胞の大きい正常な成長速度を助けている。
【０１７１】
支持細胞非含有培養システムで培養されたヒトＥＳ細胞は未分化細胞の大きい割合を維持する−未分化ｈＥＳ細胞株を増殖する本発明の支持細胞非含有システムの能力をさらに特徴づけるために、未分化細胞の割合が、培養での４日後、６日後および１０日後に測定された。図８ｄに示されるように、ｈＥＳ細胞が、ＴＦ組合せまたはＴＬＦ組合せの増殖因子の存在下、ヒト由来のフィブロネクチンマトリックスまたはウシ由来のフィブロネクチンマトリックスのいずれかにおいて培養されたとき、細胞の大きな割合（８５％〜９０％）が、培養での６日後でさえ、未分化のままであった。他方で、ｈＥＳ細胞が、ＬＴ組合せ、ＬＦ組合せ、Ｔ組合せまたはＦ組合せの増殖因子の存在下でウシフィブロネクチンマトリックスにおいて培養されたとき、未分化細胞の割合は、培養での４日後において７７％〜８５％であり、培養での６日後には６０％〜７５％に減少した。従って、これらの結果は、フィブロネクチンおよびＴＦ増殖因子またはＴＬＦ増殖因子を利用する本発明の支持細胞非含有培養システムが、ＭＥＦのもとで達成される割合と同様な未分化細胞の大きな割合を維持することができることを明らかにしている。
【０１７２】
（実施例７）
ＴＬＦ組合せおよびＴＦ組合せの増殖因子は他の支持細胞非含有培養システムでＥＳ細胞を維持するために好適である
他の支持細胞非含有システムを補うＴＬＦ組合せおよびＴＦ組合せの増殖因子の能力をさらに立証するために、さらなるマトリックスが使用されている。
【０１７３】
実験結果
最初にＭＥＦにおいて培養されたヒトＥＳ細胞を下記の支持細胞非含有培養システムに移した：ＭａｔｒｉｇｅｌＲＴＭ、自家製のＭＥＦマトリックス、および自家製の包皮繊維芽細胞マトリックス、これらはすべて、血清代替物および選択された組合せの増殖因子が補充された。ＴＬＦ組合せまたはＴＦ組合せの増殖因子を使用したとき、ｈＥＳ細胞は、ＭａｔｒｉｇｅｌＲＴＭ、ＭＥＦマトリックスおよび包皮繊維芽細胞マトリックスにおいて問題なく成長した（図９ａ〜図９ｆ）。ＭａｔｒｉｇｅｌＲＴＭマトリックスまたはＭＥＦマトリックスのいずれかが利用されたとき、細胞は（１２０日を越える）未分化状態で３０回の継代培養を越え、ＥＢを生じさせ、奇形腫を形成した（図１０ｃ〜図１０ｆ）。しかしながら、これらのマトリックスは動物非存在でもなく、また、十分に規定されたものでもなく、このため、フィブロネクチンには好都合な選択肢が残っている。
【０１７４】
ＥＳ細胞が、ＳＲと、ＴＦ増殖因子およびＴＬＦ増殖因子とが補充された包皮繊維芽細胞マトリックスにおいて成長したとき、細胞は（２０日を越える）未分化状態で５回の継代培養を越え、典型的なＥＳ細胞の形態学的特徴を持続した（図９ａ）。このマトリックスは動物非存在かつ支持細胞非含有の培養システムであるが、包皮繊維芽細胞マトリックスは、フィブロネクチンマトリックスと比較した場合、十分に規定されたシステムではない。
【０１７５】
従って、これらの結果は、血清代替物およびＴＬＦ組合せまたはＴＦ組合せの増殖因子からなる異種非含有の十分に規定された培養培地は、様々な支持細胞非含有培養システムにおいてｈＥＳ細胞を維持および増殖するために好適であることを明らかにしている。
【０１７６】
明確にするために異なる実施形態の状況について記載してきた本発明の一定の特徴は、１つの実施形態において組み合わせて得ることもできることが認識される。逆に、簡潔にするために１つの実施形態の状況について記載した本発明の種々の特徴を、個別または任意の適切な組み合わせで得ることもできる。
【０１７７】
本発明を特定の実施形態と共に記載しているが、多数の変更形態、修正形態、および変形形態が当業者に明らかであることが明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれるこのような全ての変更形態、修正形態、および変形形態が含まれることが意図される。全ての刊行物、本明細書中に記載した特許および特許出願は、その全体が、それぞれの刊行物、本明細書中に記載した特許および特許出願があたかも特別または個別に本明細書中で参考として援用されるように示されるような範囲に本明細書中で参考として援用される。さらに、本出願における任意の引例の引用または識別により、このような引例が先行技術として本発明で利用可能であることを承認すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】図１ａ〜図１ｄは、支持細胞非含有システムでウシ由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したＥＳ細胞コロニーおよび単一ＥＳ細胞を例示する顕微鏡写真である。図１ｅ〜図１ｈは、支持細胞非含有システムでウシ由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したヒトＩ−３ＥＳ細胞株およびＩ−６ＥＳ細胞株における未分化細胞に典型的な表面マーカーの発現を例示する免疫組織化学顕微鏡写真である。
【図２】図２ａ〜図２ｃは、支持細胞非含有システムでウシ由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したｈＥＳ細胞のインビトロ分化を例示する。図２ｄ〜図２ｆは、本発明の支持細胞非含有システムでウシ由来のフィブロネクチンマトリックスにおける様々な培地において成長したＥＳ細胞から形成された１４日齢のＥＢに由来する細胞における中胚葉および外胚葉の代表的なマーカーの発現を例示する。
【図３】支持細胞非含有システムでウシ由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したＩ−３ＥＳ細胞またはＩ−６ＥＳ細胞の分化段階およびそれらに由来する胚様体（ＥＢ）の分化段階のＲＴ−ＰＣＲ決定を例示する。
【図４】図４ａ〜図４ｃは、支持細胞非含有システムでウシ由来のフィブロネクチンマトリックスでのＴＬＦにおいてそれぞれ２６回および１９回の継代培養にわたって成長したＩ−３ＥＳ細胞株およびＩ−６ＥＳ細胞株に由来する奇形腫の組織学的断面を例示する。
【図５ａ−ｃ】支持細胞非含有システムでヒト由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したＥＳ細胞コロニーを例示する形態学顕微鏡写真である。
【図５ｄ−ｆ】支持細胞非含有システムでヒト由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したヒトＩ−３ＥＳ細胞株およびヒトＨ−９ＥＳ細胞株における未分化細胞に典型的な表面マーカーの発現を例示する免疫組織化学顕微鏡写真である。
【図６】図６ａ〜図６ｃは、異種非含有かつ支持細胞非含有の状態のもとでヒトフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したｈＥＳ細胞のインビトロ分化を例示する。
【図７】支持細胞非含有システムでヒト由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したＩ−３細胞の分化段階およびそれに由来する胚様体（ＥＢ）の分化段階のＲＴ−ＰＣＲ決定を例示する。
【図８】図８ａ〜図８ｃは、様々な培養条件のもとでのＩ−３ｈＥＳ細胞株の成長速度（図８ａ）、Ｉ−６ｈＥＳ細胞株の成長速度（図８ｂ）およびＨ−９ｈＥＳ細胞株の成長速度（図８ｃ）を例示する。図８ｄは、未分化ｈＥＳ細胞の成長を助ける様々な培養条件の能力を例示する棒グラフである。
【図９】図９ａ〜図９ｆは、様々な条件のもとでの支持細胞非含有システムで成長したヒトＥＳ細胞およびヒトＥＳ細胞コロニーを例示する。
【図１０】図１０ａ〜図１０ｆは、フィブロネクチン（図１０ａおよび図１０ｂ）、ＭＥＦマトリックス（図１０ｃ、図１０ｅおよび図１０ｆ）またはＭａｔｒｉｇｅｌＲＴＭ（図１０ｄ）において成長したＩ−６ＥＳ細胞株およびＩ−３ＥＳ細胞株に由来するＳＣＩＤベージュマウスにおける奇形腫の組織学的断面を例示する。
【配列表フリーテキスト】
【０１７９】
配列番号１〜１４は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ−ｃ】
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【図５ｄ−ｆ】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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