(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラビノースによって誘導されるプローモーター（Ｐａｒａ）と、
ラムダ（λ）−レッド（ｒｅｄ）組替えに関与するタンパク質をコーディングする遺伝子と、
ラムノースによって誘導されるプローモーター（Ｐｒｈａ）と、
Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素をコーディングする遺伝子と、を含むことを特徴とする配列番号１と図１の開裂地図とを有する染色体特定部位除去用の組替えベクター。
【請求項２】
請求項１の組替えベクターに形質転換された大腸菌。
【請求項３】
（ａ）微生物への導入時、ラムダ−レッド組替えに関与する相同部位Ａ及び相同部位Ｂと、
選別マーカーと、
選別マーカー除去のための相同組替えに関与するＩ−ＳｃｅＩ制限酵素切断部位と、
選別マーカー除去のための相同組替えに関与する相同部位Ｃと、を含む線形ＤＮＡ断片を製造する段階と、
（ｂ）請求項１の組替えベクターに形質転換された微生物に前記線形ＤＮＡ断片を導入して、前記ＤＮＡ断片上の相同部位とこれらと相同である微生物染色体部位間のラムダ−レッド組替えを用いて、前記線形ＤＮＡ断片を微生物染色体の特定位置に置き換える段階と、
（ｃ）前記特定染色体部分が置き換えられた微生物をラムノースを含有する培地で培養してＩ−ＳｃｅＩ制限酵素を発現させ、前記ＤＮＡ断片上の相同部位Ｃ及びこれと相同である微生物染色体部位間の相同組替えを誘発して選別マーカーを除去する段階と、を含み、
前記相同部位Ａは、微生物染色体の除去しようとする部分の一側末端の５０ないし５００ｂｐと相同である部位であり、相同部位Ｂは、前記微生物染色体の除去しようとする部分の他側末端の５０ないし５００ｂｐと相同である部位であり、
前記相同部位Ｃは、前記相同部位Ａ及び相同部位Ｂと相同である微生物染色体部位のうちいずれか一つと隣接する３００ないし５００ｂｐ部位と相同である部位であることを特徴とする請求項１の組替えベクターを用いて微生物内特定染色体部位を除去する方法。
【請求項４】
前記（ａ）微生物への導入時、ラムダ−レッド組替えに関与する相同部位Ａ及び相同部位Ｂと、
選別マーカーと、
選別マーカー除去のための相同組替えに関与するＩ−ＳｃｅＩ制限酵素切断部位と、
選別マーカー除去のための相同組替えに関与する相同部位Ｃと、を含む線形ＤＮＡ断片を製造する段階と、
（ｂ）請求項１の組替えベクターに形質転換された微生物に前記線形ＤＮＡ断片を導入して、前記ＤＮＡ断片上の相同部位とこれらと相同である微生物染色体部位間のラムダ−レッド組替えを用いて、前記線形ＤＮＡ断片を微生物染色体の特定位置に置き換える段階と、を反復することによって、相異なる複数の線形ＤＮＡ断片を製造して、請求項１の組替えベクターに形質転換された微生物に導入するものであることを特徴とする請求項３に記載の微生物内複数の特定染色体部位を除去する方法。
【請求項５】
前記選別マーカーは、
配列番号１３の塩基配列を有するクロラムフェニコール抵抗遺伝子、配列番号１４の塩基配列を有するカナマイシン抵抗遺伝子及びｓａｃＢで構成された群から選択された一つ以上であるものであることを特徴とする請求項３または４に記載の微生物内特定染色体部位を除去する方法。
【請求項６】
前記選別マーカーを除去する段階後で、前記微生物を蔗糖を含む培地で培養する段階をさらに含むことを特徴とする請求項３または４に記載の微生物内特定染色体部位を除去する方法。
【請求項７】
前記相同部位Ａ、相同部位Ｂ及び相同部位Ｃは、
それぞれ配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７の塩基配列を有することを特徴とする請求項３または４に記載の微生物内特定染色体部位を除去する方法。
【請求項８】
前記相同部位Ａ、相同部位Ｂ及び相同部位Ｃは、
それぞれ配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４の塩基配列を有することを特徴とする請求項３または４に記載の微生物内特定染色体部位を除去する方法。
【請求項９】
前記相同部位Ａ、相同部位Ｂ及び相同部位Ｃは、
それぞれ配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３の塩基配列を有することを特徴とする請求項３または４に記載の微生物内特定染色体部位を除去する方法。
【請求項１０】
前記除去しようとする微生物内特定染色体部位が微生物生存に必須な遺伝子を含み、前記線形ＤＮＡ断片は、前記相同部位Ａと相同部位Ｃとの間に前記微生物生存に必須な遺伝子をさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の微生物内特定染色体部位を除去する方法。
【請求項１１】
前記必須な遺伝子は、
配列番号４３のａｒｇＳであり、
前記相同部位Ａ、相同部位Ｂ及び相同部位Ｃは、
それぞれ配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４２の塩基配列を有することを特徴とする請求項１０に記載の微生物内特定染色体部位を除去する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、より効果的で容易に微生物内の多様な染色体特定部位を同時に除去することができる染色体特定部位除去用の組替えベクター及びそれを利用した微生物内染色体特定部位の除去方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
生物工学の眩しい発展につれて、ポストゲノム時代の到来と共に多くの生命体の遺伝子情報に基づいて生物産業に広く利用されることができる産業用菌株が製造されている。しかし、現在の多くの産業用菌株は、不要な物質を作る遺伝子群によって過度なエネルギー消耗及び副産物の生産のような問題を引き起こして、高純度有用物質の量産には非常に不適合である。したがって、不要な遺伝子群を誘電体から除去して、生産性が画期的に増大した新たな高機能代謝工学用の菌株及び細胞株を人為的に構築するために、微生物誘電体から産業的に不要な遺伝子群を早い時間内により効果的で容易に除去する技術が研究されている。
【０００３】
従来に知られた大腸菌染色体の特定部位を除去する技術は、除去しようとする特定部位の組替え部位と選別マーカーを含んだ線形ＤＮＡ断片と前記線形ＤＮＡ断片の誘電体挿入と除去に必要な機能を有した二つのベクターを利用しなければならない。具体的に、最初の段階で組替え機能を有したベクターを用いて除去しようとする染色体特定部位に選別マーカーを有した線形ＤＮＡ断片を組替えさせて挿入することによって、染色体部位を除去し、前記段階が終わった後で初めて入れたベクターを大腸菌内から除去する。次いで、二番目の段階で染色体特定部位除去時に使った線形ＤＮＡ断片の選別マーカーを除去するためのベクターを再び入れて、選別マーカー遺伝子を除去させる。したがって、従来方法を利用する場合、多くの所の大腸菌染色体特定部位を除去する場合、除去度に毎段階に必要な二つのベクターを順に入れて、除去しなければならないので、方法上煩わしく、時間がかかるなど多くの問題点を有している。
【０００４】
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明の目的は、微生物内特定遺伝子部位を迅速でかつ効果的でありながらも、連続的に除去することができる特定遺伝子部位除去用の組替えベクター及びそれを利用した微生物内染色体特定部位の除去方法を提供することである。
【０００５】
〔課題を解決するための手段〕
前記技術的課題を解決するための本発明は、アラビノースによって誘導されるプローモーター（Ｐａｒａ）と、ラムダ（λ）−レッド（ｒｅｄ）組替えに関与するタンパク質をコーディングする遺伝子と、ラムノースによって誘導されるプローモーター（Ｐｒｈａ）と、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素をコーディングする遺伝子と、を含む配列番号１と図１の開裂地図とを有する染色体特定部位除去用の組替えベクターを提供する。
【０００６】
他の側面において、本発明は、前記組替えベクターに形質転換された大腸菌を提供する。
【０００７】
また他の側面において、本発明は、微生物への導入時、ラムダ−レッド組替えに関与する相同部位Ａ及び相同部位Ｂと、選別マーカーと、選別マーカー除去のための相同組替えに関与するＩ−ＳｃｅＩ制限酵素切断部位と、選別マーカー除去のための相同組替えに関与する相同部位Ｃと、を含む線形ＤＮＡ断片を製造する段階と、前記組替えベクターに形質転換された微生物に前記線形ＤＮＡ断片を導入して、前記ＤＮＡ断片上の相同部位とこれらと相同である微生物染色体部位間のラムダ−レッド組替えを用いて、前記線形ＤＮＡ断片を微生物染色体の特定位置に置き換える段階と、前記特定染色体部分が置き換えられた微生物をラムノースを含有する培地で培養してＩ−ＳｃｅＩ制限酵素を発現させ、前記ＤＮＡ断片上の相同部位Ｃ及びこれと相同である微生物染色体部位間の相同組替え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を誘発して選別マーカーを除去する段階と、を含み、前記相同部位Ａは、微生物染色体の除去しようとする部分の一側末端の５０ないし５００ｂｐと相同である部位であり、相同部位Ｂは、前記微生物染色体の除去しようとする部分の他側末端の５０ないし５００ｂｐと相同である部位であり、前記相同部位Ｃは、前記相同部位Ａ及び相同部位Ｂと相同である微生物染色体部位のうちいずれか一つと隣接する３００ないし５００ｂｐ部位と相同である部位であることを特徴とする前記組替えベクターを用いて微生物内特定染色体部位を除去する方法を提供する。
【０００８】
本発明の一実施例において、前記微生物への導入時、ラムダ−レッド組替えに関与する相同部位Ａ及び相同部位Ｂと、選別マーカーと、選別マーカー除去のための相同組替えに関与するＩ−ＳｃｅＩ制限酵素切断部位と、選別マーカー除去のための相同組替えに関与する相同部位Ｃと、を含む線形ＤＮＡ断片を製造する段階と、前記組替えベクターに形質転換された微生物に前記線形ＤＮＡ断片を導入して、前記ＤＮＡ断片上の相同部位とこれらと相同である微生物染色体部位間のラムダ−レッド組替えを用いて、前記線形ＤＮＡ断片を微生物染色体の特定位置に置き換える段階と、を反復することによって、相異なる複数の線形ＤＮＡ断片を製造して、請求項１の組替えベクターに形質転換された微生物に導入するものである微生物内複数の特定染色体部位を除去する方法であり得る。
【０００９】
本発明の一実施例によれば、前記選別マーカーは、配列番号１３の塩基配列を有するクロラムフェニコール抵抗遺伝子、配列番号１４の塩基配列を有するカナマイシン抵抗遺伝子及びｓａｃＢで構成された群から選択された一つ以上であることであり得る。
本発明の一実施例によれば、前記選別マーカーを除去する段階後で、前記微生物を蔗糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）を含む培地で培養する段階をさらに含みうる。
【００１０】
本発明の一実施例によれば、前記相同部位Ａ、相同部位Ｂ及び相同部位Ｃは、それぞれ配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７の塩基配列を有することができ、本発明の他の実施例によれば、前記相同部位Ａ、相同部位Ｂ及び相同部位Ｃは、それぞれ配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４の塩基配列を有することができ、また他の実施例によれば、前記相同部位Ａ、相同部位Ｂ及び相同部位Ｃは、それぞれ配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３の塩基配列を有しうる。
【００１１】
本発明の一実施例によれば、前記除去しようとする微生物内特定染色体部位が微生物生存に必須な遺伝子を含み、前記線形ＤＮＡ断片は、前記相同部位Ａと相同部位Ｃとの間に前記微生物生存に必須な遺伝子をさらに含みうる。
【００１２】
本発明の一実施例によれば、前記必須な遺伝子は、配列番号４３のａｒｇＳであり、前記相同部位Ａ、相同部位Ｂ及び相同部位Ｃは、それぞれ配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４２の塩基配列を有しうる。
【００１３】
〔発明の効果〕
本発明による染色体特定部位除去用の組替えベクターは、多数のベクターを利用した従来の遺伝子除去方法に比べて、一つのベクターを用いてより簡便で、迅速に、特定遺伝子を連続的に除去することができ、必須遺伝子を含んだ部位も一回の除去作業で迅速かつ効率的に微生物内特定遺伝子部位を除去することができる。
【００１４】
〔発明を実施するための最良の形態〕
本発明は、微生物内染色体特定部位除去に利用されるラムダ−レッド組替え（λ−ｒｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｔｉｏｎ）及びＩ−ＳｃｅＩ制限酵素発現機能のために、二つのベクターを使わなければならない従来の短所を解決するために、前記二つの機能をそれぞれ異なる誘導方法を用いて一つのベクターを通じて発現可能にする組替えベクター（ｐＲＥＤＩ）に関するものであって、微生物内染色体特定部位除去のための組替えベクター（ｐＲＥＤＩ）、前記組替えベクターに形質転換された大腸菌及び前記組替えベクターと選別マーカーを含んだ線形ＤＮＡ断片とを利用した微生物内染色体特定部位の除去方法に関するものである。
【００１５】
より詳細には、本発明は、アラビノースによって誘導されるプローモーター（Ｐａｒａ）と、ラムダ−レッド組替えに関与するタンパク質をコーディングする遺伝子と、ラムノースによって誘導されるプローモーター（Ｐｒｈａ）と、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素をコーディングする遺伝子と、を含む微生物内染色体特定部位除去用の組替えベクターに関するものであって、前記組替えベクターは、配列番号１の塩基配列を有し、図１の開裂地図に表示される。
【００１６】
ここで、ラムダ（λ）−レッド（ｒｅｄ）組替えに関与するタンパク質は、Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．を含んだ従来の文献に記載のように、ガム（Ｇａｍ）、ベット（Ｂｅｔ）及びエキソ（Ｅｘｏ）で構成された複合タンパク質であって、これらはそれぞれγ、β、ｅｘｏ遺伝子によって発現され、ガムは、宿主ＲｅｃＢＣＤエキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）Ｖを抑制して、ベットとエキソとが組替えを促進するＤＮＡ末端に接近させる（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：６６４０，２０００；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋ．Ｃ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０：２０６３，１９９８）。
【００１７】
本発明においては、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）によって誘導されるラムダ−レッド組替えに関与するタンパク質であって、前記組替えベクターは、アラビノースによって誘導されるプローモーター（Ｐａｒａ）（配列番号２）とともにラムダ−レッド組替え関与タンパク質をコーディングする遺伝子であるγ、β、ｅｘｏ遺伝子（配列番号３）を含む。また、前記ラムダ−レッド組替え関与タンパク質（γ、β、ｅｘｏ）は、線形ＤＮＡ断片の相同組替えによる染色体内への挿入時にラムダ−レッド組替えが起きるようにするものであり、前記ガムをコーディングするγ遺伝子、ベットをコーディングするβ遺伝子、エキソをコーディングするｅｘｏ遺伝子は、それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６の塩基配列を有しうる。
【００１８】
また、本発明による組替えベクターは、ラムノース（ｒｈａｍｎｏｓｅ）によって誘導されるＩ−ＳｃｅＩ制限酵素を発現して、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位が特異的に切断させるものであって、誘電体内に挿入された線形ＤＮＡ断片に含まれているＩ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位を切断して線形ＤＮＡに含まれた染色体の一部断片と、これと相同性を有する微生物染色体部位間の相同組替えを促進させるものである。前記ラムノースによって誘導されるＩ−ＳｃｅＩ制限酵素を発現するために、前記ラムノースによって誘導されるプローモーター（Ｐｒｈａ）（配列番号７）及びＩ−ＳｃｅＩ制限酵素をコーディングする遺伝子（配列番号８）をともに含みうる。
【００１９】
また、本発明は、前記組替えベクターに形質転換された大腸菌に関するものである。
【００２０】
また、本発明において、前記組替えベクター（ｐＲＥＤＩ）と選別マーカーを含んだ線形ＤＮＡ断片とを用いて微生物内染色体特定部位の除去方法は、具体的に、下記の段階を含む。
【００２１】
（１）選別マーカー、ｓａｃＢ遺伝子、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素切断部位及び微生物染色体の一部との相同部位（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｒｍｓ）が含まれた線形ＤＮＡ断片を製造する段階と、
（２）前記組替えベクターに形質転換された微生物を前記線形ＤＮＡ断片に形質転換させ、前記組替えベクター内のアラビノースによって誘導されるプローモーター下で発現されるラムダ−レッド組替えタンパク質によって微生物内染色体特定部位に線形ＤＮＡ断片を置き換える段階と、
（３）前記ＤＮＡ断片に形質転換された微生物内の前記組替えベクターのラムノースによって誘導されるプローモーター下で発現されるＩ−ＳｃｅＩ制限酵素を発現して誘電体に残っている選別マーカーを除去する段階と、
また、前記方法は、（４）前記選別マーカーが相異なる二つまたはそれ以上の線形ＤＮＡ断片を挿入して微生物内の二つまたはそれ以上の誘電体部位を同時に除去する段階と、を追加的に含みうる。
【００２２】
また、前記方法は、（５）微生物内に生物生存に必須な遺伝子を含む特定部位の除去において、前記必須遺伝子を含む線形ＤＮＡ断片を用いて前記方法によって必須遺伝子は残っていながらも所望の特定部位のみを早い時間内に効果的に除去することができる。
【００２３】
本発明による染色体特定部位除去用の組替えベクターを用いて、微生物内染色体特定部位の除去方法のうち、前記段階（１）において、前記線形ＤＮＡ断片は選別マーカーと、ラムダ−レッド組替えに関与して微生物染色体の一部と相同である５０ないし５００ｂｐ程度の相同部位Ａ及びＢと、前記選別マーカー除去に必要なＩ−ＳｃｅＩ制限酵素切断部位と、３００ないし５００ｂｐ程度の相同部位Ｃと、選別マーカーの除去有無を確認するためのｓａｃＢ遺伝子と、を含む。
【００２４】
前記選別マーカーとしては、これに制限されるものではないが、主にクロラムフェニコール抵抗遺伝子（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｇｅｎｅ、ＣｍＲ）、カナマイシン抵抗遺伝子（ｋａｎａｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｇｅｎｅ、ＫｍＲ）、テトラサイクリン抵抗遺伝子（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｇｅｎｅ、ＴｃＲ）を使用可能であり、これを含むＤＮＡ断片に組替えされた染色体を有する変異株は、該当する抗生剤に抵抗性を有するので、染色体特定部位が除去された変異株の選別が可能となる。
【００２５】
図２に表われたように、前記相同部位は、染色体が変形される微生物の染色体の一部と相同である部分であって、配列目録及び図面上に相同部位Ａ、Ｂ及びＣに表示されている。これらのうち相同部位Ａ及びＢは、除去される微生物染色体の両末端と連結された約５０ないし５００ｂｐをＰＣＲして得た相同部位であって、線形ＤＮＡ断片の両側末端に位置し、線形ＤＮＡ断片の微生物内導入時のラムダ−レッド組替えに関与する。相同部位Ｃは、相同部位ＡまたはＢと相同である微生物染色体のうち一つと連結された約３００ないし５００ｂｐをＰＣＲして得た相同部位であって、線形ＤＮＡ断片の一側末端の相同部位に連続して位置し、選別マーカー除去時に相同組替えに関与する。ここで、前記相同部位Ａ、Ｂ及びＣは、対象微生物と除去しようとする遺伝子とによって変わる。本発明の一実施例として、これに制限されるものではないが、前記相同部位Ａ、Ｂ及びＣの塩基配列は、それぞれ配列番号１５、１６及び１７であり、配列番号２２、２３及び２４であり、配列番号３１、３２及び３３であり、配列番号４０、４１及び４２であり得る。
【００２６】
また、前記Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素切断部位（配列番号５２）は、１８塩基対になっていて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体にはＩ−ＳｃｅＩ制限酵素切断部位が存在しないために、特定遺伝子の除去のための前記線形ＤＮＡ断片はＩ−ＳｃｅＩ制限酵素切断部位を含まなければならない。
【００２７】
前記段階（２）において、前記組替えベクターで通常的なエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒａｔｉｏｎ）を用いて微生物菌株を形質転換させ、前記線形ＤＮＡ断片を再びエレクトロポレーションを用いて前記微生物菌株に伝達する。図２に表われたように、前記線形ＤＮＡ断片の両末端に位置する微生物染色体との相同部位Ａ及びＢとこれと相同である微生物染色体部位間のラムダ−レッド組替えによって、前記ＤＮＡ断片を微生物菌株染色体の特定位置に置き換えて当該染色体特定位置部分を除去させた後、前記線形ＤＮＡ断片が置き換えられた微生物変異株を選別マーカーの種類によって当該抗生剤を含む培地で培養して選別する。また、前記選別された変異株内のラムダ−レッド組替えによる線形ＤＮＡ断片の置き換えをＰＣＲを通じて確認することができる。
【００２８】
前記段階（３）において、図２に表われたように、線形ＤＮＡ断片が置き換えられた微生物変異株を選別した後、ラムノースによって誘導されるＩ−ＳｃｅＩ制限酵素を発現させて、前記線形ＤＮＡ断片の一側末端に位置する微生物染色体の相同部位Ｃ及びこれと相同性を有する微生物染色体部位間の相同組替えを促進させることによって、微生物変異株内の選別マーカーを除去する。前記組替えベクターに存在するＩ−ＳｃｅＩ制限酵素遺伝子は、ラムノースプローモーターによって転写調節されるので、前記組替えベクターが導入された変異株をラムノースが存在する培地で培養してＩ−ＳｃｅＩ遺伝子を発現させることによって、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位を特異的に切断させる。このように、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位が特異的に切断されることによって、線形ＤＮＡ断片に含まれた微生物染色体一部との相同部位と、これと相同性を有する微生物染色体部位間の相同組替えが促進される。
【００２９】
また、前記微生物変異株を蔗糖が含まれた培地で培養して、微生物変異株に導入された線形ＤＮＡ断片内のｓａｃＢ遺伝子を発現させて毒性を誘発させる。一般的に、ｓａｃＢ遺伝子は、レバンスクラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）を発現させ、これは蔗糖を葡萄糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）及び果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）に分解し、果糖を重合体であるレバン（ｌｅｖａｎ）に合成する。この際、前記レバンが微生物に対して毒性を有しているために、ｓａｃＢ遺伝子（配列番号５３）を有した微生物は、蔗糖が含まれた培地で生存することができない。したがって、相同組替えによって選別マーカーが除去された微生物変異株を蔗糖を含む培地で培養することで選別することができる。
【００３０】
また、追加的に、前記段階（４）において、前記方法を応用して二つの相異なる部位を除去するために、図３（Ａ）に表われたように、相異なる選別マーカー、例えば、クロラムフェニコール抵抗遺伝子（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｇｅｎｅ、ＣｍＲ）及びカナマイシン抵抗遺伝子（ｋａｎａｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｇｅｎｅ、ＫｍＲ）を含む二つの線形ＤＮＡ断片をＰＣＲを通じて製作する。本発明による組替えベクターに形質転換された微生物にエレクトロポレーション方法を用いて最初の線形ＤＮＡ断片を伝達し、前記組替えベクターのラムダ−レッド組替えによって前記線形ＤＮＡ断片を微生物菌株染色体の特定位置に置き換えた後、選別マーカーの種類によって当該抗生剤を含む培地で培養して選別し、ＰＣＲを通じて線形ＤＮＡ置き換えを確認する。次いで、他の選別マーカーを有した二番目の線形ＤＮＡ断片をエレクトロポレーション方法を用いて菌株内に伝達し、ラムダ−レッド組替えによってＤＮＡ断片を染色体の特定位置に置き換えた後、選別マーカーを含む培地で培養して選別し、線形ＤＮＡ置き換えをＰＣＲを通じて確認することができる（図３（Ｂ））。
【００３１】
また、二つの線形ＤＮＡ断片が微生物染色体内に置き換えられた菌株をラムノースが存在する培地で培養してＩ−ＳｃｅＩ遺伝子を発現、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位が特異的に切断されることによって、線形ＤＮＡに含まれた微生物染色体相同部位と、これと相同性を有する微生物染色体部位間の相同組替えがなされ、同時に、微生物変異株内に導入された線形ＤＮＡ断片内のｓａｃＢ遺伝子を発現させて毒性を誘発させることによって、相同組替えによって二つの選別マーカーがいずれも除去された微生物変異株を蔗糖を含む培地で培養することで選別することができる。これにより、２個の他の部位に組替えされて入った選別マーカーを一回の選別マーカー除去作業を通じて除去することによって、時間を減らすことができるという大きな長所を有している。そして、相同組替えによる線形ＤＮＡ断片選別マーカー除去をＰＣＲを通じて確認することができる（図３（Ｂ））。先に、二つの線形ＤＮＡ断片を例示として挙げたが、二つ以上の線形ＤＮＡ断片を用いて追加的に染色体内の多様な特定部位を除去することも可能である。
【００３２】
また、追加的に、前記段階（５）において、既存の誘電体除去方法では、必須遺伝子が存在する誘電体部位は除去することができないので、必須遺伝子が存在する部位の除去のためには、除去しようとする特定部位を必須遺伝子を中心に二つの誘電体部位に分けて二回の除去作業を通じて遺伝子除去を遂行しなければならない短所があった。前記段階（５）は、このような短所を改善することができることであって、必須遺伝子が存在する特定部位を一回に除去するために、特定部位に存在する必須遺伝子を含む線形ＤＮＡ断片を製作し、これを本発明による組替えベクター（ｐＲＥＤＩ）を用いて特定誘電体部位を前記製作した線形ＤＮＡ断片と置き換える。
【００３３】
前記必須遺伝子とは、大腸菌生存に必須に必要な遺伝子を意味するものであって、その例として、ａｒｇＳなどがあり、詳しくは、Ｂａｂａ  Ｔ，Ａｒａ  Ｔ，Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｍ，Ｔａｋａｉ  Ｙ，Ｏｋｕｍｕｒａ  Ｙ，Ｂａｂａ  Ｍ，Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ＫＡ，Ｔｏｍｉｔａ  Ｍ，Ｗａｎｎｅｒ  ＢＬ，Ｍｏｒｉ  Ｈ．；Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｉｎ−ｆｒａｍｅ，ｓｉｎｇｌｅ−ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｕｔａｎｔｓ：ｔｈｅ  Ｋｅｉｏ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．；Ｍｏｌ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ．２００６；２：２００６．０００８．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｆｅｂ  ２１．に開示されたものであって、５ページ９行に補充データ（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｄａｔａ）に３００余個の遺伝子が開示されている。
【００３４】
例えば、図４（Ａ）に表われたように、大腸菌内にａｒｇＳのような必須遺伝子（Ｅ）を相同部位Ａ及びＣの間に位置させて含むように線形ＤＮＡ断片を製作して、特定誘電体部位に置き換えることである。この際、前記段階（３）に表われたように、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素発現による相同組替えさせる過程及び追加的に、蔗糖を含む培地で培養することで選別マーカーが残らずに、微生物内染色体特定部位が除去された菌株を選別する。前記のような方法を通じて、必須遺伝子が存在する部位の除去のために必須遺伝子を含む線形ＤＮＡ断片を使うことによって、除去しようとする目的部位のすべての不要な誘電体部位を除去すると同時に既存の必須遺伝子をそのまま有している菌株を選別可能であり、これはＰＣＲを通じて確認することができる（図４（Ｂ））。
【００３５】
前述したように、前記組替えベクターは菌株内にそのまま保存しながら、特定相同部位を有した線形ＤＮＡ断片のみを製作して菌株内に伝達する過程を反復実施することによって、２ケ所以上の特定部位を除去するか、加えて、必須遺伝子を含む微生物内染色体の特定遺伝子部位を連続的に除去させることができる。
【００３６】
本発明で、前記対象微生物は実施例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使ったが、これに制限されるものではなく、前記線形ＤＮＡの置き換えは、ラムダ−レッド組替え方法に基づく。前記ラムダ−レッド組替え方法を通じて大腸菌染色体の一部をＰＣＲ反応を通じて得た線形ＤＮＡ断片に置き換える過程は、Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ＫＡ  ｅｔ  ａｌに開示されており（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ＫＡ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ，９７：６６４０）、大腸菌染色体の切断によって促進される選別マーカーを除去させる相同組替え過程については、Ｐｏｓｆａｉ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．に記載されており（Ｐｏｓｆａｉ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７：４４０９．１９９９）。また、ｓａｃＢ遺伝子の毒性によって選別マーカーとして活用されるに対して、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．に記載されている（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２０５：１９７，２００１）。
【００３７】
したがって、本発明は、線形ＤＮＡ断片をラムダ−レッド組替え方法を用いて微生物染色体内の特定位置に置き換え、ここにＩ−ＳｃｅＩ制限酵素による染色体切断とともにｓａｃＢ遺伝子の毒性誘発によって選別マーカーを除去し、前記組替えベクター（ｐＲＥＤＩ）内の二つのそれぞれ異なるプローモーターで発現させることによって、迅速で効果的であり、選別マーカーが残らない誘電体特定部位除去方法を提供することであり、これは最小化された誘電体を作るために応用可能である。
【００３８】
以下、本発明を次の実施例によってより詳細に説明するが、本発明が、下記の実施例によって限定されるものではない。
【００３９】
実施例１：本発明による染色体特定部位除去用の組替えベクター（ｐＲＥＤＩ）の製造
本発明による組替えベクターは、制限酵素ＮｃｏＩ認識部位を含むラムノースによって誘導されるＰｒｈａプローモーター下Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素発現する遺伝子である組替えＰＣＲ産物ｒｈａＴＳ−Ｐｒｈａ−Ｉ−ＳｃｅＩ断片を、アラビノースプローモーター下ラムダ−レッド組替え機能を含むｐＫＤ４６（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ＫＡ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９７：６６４０，２０００）ベクターを鋳型としてベクター内のＮｃｏＩ認識部位にクローニングして製作した。前記ｒｈａＴＳ−Ｐｒｈａ−Ｉ−ＳｃｅＩ断片は、２５ｐｍｏｌｅ濃度のプライマーＮｃｏＩ−ｒｈａ（配列番号９）とＰｒｈａ（配列番号１０）とを用いて大腸菌ＭＧ１６５５誘電体から増幅したＰＣＲ産物であるｒｈａＴＳ−Ｐｒｈａ断片とプライマーＩ−ＳｃｅＩ−Ｆ（配列番号１１）及びプライマーＮｃｏＩ−Ｉ−ＳｃｅＩ（配列番号１２）とを用いてｐＳＴ７６−ＡＳｃｅＰ（Ｐｏｓｆａｉ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７：４４０９，１９９９）から増幅したＰＣＲ産物であるＩ−ＳｃｅＩ断片を、プライマーＮｃｏＩ−ｒｈａ及びＮｃｏＩ−Ｉ−ＳｃｅＩを用いて、組替えＰＣＲ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＰＣＲ）を通じて増幅し、これをクローニングして、本発明による組替えベクター（ｐＲＥＤＩ）を製作した。その開裂地図は、図１と同じである。前記プライマーの塩基配列は、下記の通りである。
【００４０】
プライマーＮｃｏＩ−ｒｈａ（配列番号９）：
５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＴＧＧＣＧＡＡＴＴＡＡＴＣＴＴＴＣＴＧ−３’
プライマーＰｒｈａ（配列番号１０）：
５’−ＡＴＧＴＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＴＴＣＡＴＴＡＣＧＡＣＣＡＧＴＣＴ−３’
プライマーＩ−ＳｃｅＩ−Ｆ（配列番号１１）：
５’−ＴＴＡＧＡＣＴＧＧＴＣＧＴＡＡＴＧＡＡＡＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＴＣＡＣＡＴＡＡＴＧＣＡＴ  ＣＡＡＡＡＡＡＡＣ  ＣＡＧＧＴＡＡＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧ−３’
プライマーＮｃｏＩ−Ｉ−ＳｃｅＩ（配列番号１２）：
５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＣＡＧＧＡＡＡＧＴＴＴＣＧＧＡＧＧＡＧ  ＡＴＡＧ−３’
【００４１】
実施例２：ｐＲＥＤＩを用いて微生物内染色体特定部位の除去
（１）線形ＤＮＡ断片の製造
大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５（ソウル大学校微生物学課ノ・ジョンヘ教授）から下記の段階を通じて不要な遺伝子群を誘電体から除去された大腸菌変異株を得た。
【００４２】
まず、ＣｍＲ遺伝子（配列番号１３）を有するｐＳＧ７６（Ｐｏｓｆａｉ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２７：４４０９，１９９９）ベクターを二つの制限酵素ＫｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）及びＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）制限酵素に切断させた後、同一の酵素に切断した線上のＩ−ＳｃｅＩ制限酵素切断部位を有するｐＳＴ７６Ｋ（Ｐｏｓｆａｉ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２７：４４０９，１９９９）ベクターに挿入した。これをＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）制限酵素にもう一回切断した後、ここにｐＤＥＬＴＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ−ＤＥＬＥＴＩＯＮ  ＦＡＣＴＯＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＶＥＲＳＩＯＮ  ２．）ベクターをＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）制限酵素に切断して得たｓａｃＢ遺伝子をリがーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて挿入してベクターを製造した後、これをｐＳＣＩと名付けた。
【００４３】
そして、ｐＤＥＬＴＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ−ＤＥＬＥＴＩＯＮ  ＦＡＣＴＯＲＹ  ＳＹＳＴＥＭ  ＶＥＲＳＩＯＮ  ２．）ベクターをＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）制限酵素に切断して得たｓａｃＢ遺伝子を同一の酵素に切断したＫｍＲ遺伝子（配列番号１４）とＩ−ＳｃｅＩ制限酵素切断部位を有するｐＳＴ７６Ｋ（Ｐｏｓｆａｉ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２７：４４０９，１９９９）ベクターにリがーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて挿入してベクターを製造した後、これをｐＳＫＩと名付けた。
【００４４】
図２に表われたように、三つの相同部位Ａ（配列番号１５）、Ｂ（配列番号１６）、及びＣ（配列番号１７）、選別マーカーであるクロラムフェニコール抵抗遺伝子（ＣｍＲ、配列番号１３）、ｓａｃＢ（配列番号５３）、及びＩ−ＳｃｅＩ制限酵素切断部位（Ｓ、配列番号５２）を含む線形ＤＮＡ断片（〜３．５ｋｂ）は、大腸菌ＭＧ１６５５染色体と前記のように製造されたプラスミドｐＳＣＩまたはｐＳＫＩを鋳型として、組替えＰＣＲ反応させて製造した。一つの短い（５０ｂｐ）末端断片（Ａ：配列番号１５）、一つの相同部位（５００ｂｐ）（Ｃ：配列番号１７）は、大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５染色体を鋳型としてプライマーｂ０００４Ａ−Ｆ（配列番号１８）及びプライマーｂ００２５Ｃ−Ｒ（配列番号１９）を用いて増幅した。ＣｍＲ−ｓａｃＢ−Ｓ断片（ＣＳＩ断片）と異なる短い末端断片（Ｂ：配列番号１６）は、ｐＳＣＩを鋳型とし、プライマーＣＳＩ−ｆ（配列番号２０）及びｂ００２４Ｂ−Ｒ（配列番号２１）を使ってＰＣＲで増幅した。次いで、完全な線形ＤＮＡ断片Ａ−Ｃ−ＣｍＲ−ｓａｃＢ−Ｓ−Ｂ及びＡ−Ｃ−ＫｍＲ−ｓａｃＢ−Ｓ−Ｂは、Ａ−Ｃ断片とＣｍＲ−ｓａｃＢ−Ｓ−Ｂ  ＰＣＲ産物を鋳型としてプライマーｂ０００４Ａ−Ｆ（配列番号１８）、ｂ００２４Ｂ−Ｒ（配列番号２１）を使って組替えＰＣＲを通じて製造し、前記増幅されたＤＮＡは、ヌクレオジェンゲル−抽出キット（Ｎｕｃｌｅｏｇｅｎｅ  Ｇｅｌ−Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ＫＩＴ）を使って分離した。前記収得された線形ＤＮＡ断片は、配列番号５４と同じである。
【００４５】
前記プライマーの塩基配列は、下記の通りである。
【００４６】
プライマーｂ０００４Ａ−Ｆ（配列番号１８）：
５’−ＣＣＧＣＣＧＡＴＴＴ  ＴＧＣＴＧＣＧＴＴＧ  ＣＧＴＡＡＡＴＴＧＡ  ＴＧＡＴＧＡＡＴＣＡ  ＴＣＡＧＴＡＡＡＡＴ  ＣＣＡ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＡＴＡ  ＣＧＣ  ＧＧＣ−３’
プライマーｂ００２５Ｃ−Ｒ（配列番号１９）：
５’−ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＧＴＣ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＴＧＡ  ＧＴＣ  ＧＴＡ  ＣＡＧ  ＡＴＴ  ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＣＴＧ−３’
プライマーＣＳＩ−Ｆ（配列番号２０）：
５’−ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧ−３’
プライマーｂ００２４Ｂ−Ｒ（配列番号２１）：
５’−ＣＣＧ  ＡＧＴ  ＡＴＡ  ＣＣＴ  ＴＧＴ  ＡＣＡ  ＧＣＧ  ＧＴＣ  ＡＡＧ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＣＧＧ  ＣＧＡ  ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＡＣＣ  ＧＡ  ＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＴ−３’
（２）ｐＲＥＤＩベクターに形質転換された大腸菌に線形ＤＮＡ断片を導入して微生物内特定部位の除去
前記のように製作された線形ＤＮＡ断片を標準的なエレクトロポレーション法（Ｂｉｏ−ＲＡＤ，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｌｕｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃａｔ．ＮＯ  １６５−２０９８；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ＪＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｙｅａｓｔ  １４：５６５，１９９８；Ｇｒａｎｔ，ＳＧ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｓ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：４６４５，１９９０）を通じてｐＲＥＤＩベクターを有した大腸菌ＭＧ１６５５菌株内に伝達させた。この際、前記線形ＤＮＡ断片は、前記菌株染色体と二つの相同部位Ａ及びＢを有するので、この二つの部分の間の菌株遺伝子（ｂ０００４−ｂ００２４）が除去され、前記線形ＤＮＡ断片に置き換えられる。前記線形ＤＮＡ断片に置き換えられた大腸菌変異株は、線形ＤＮＡ断片に存在するＣｍＲ遺伝子によってクロラムフェニコール抵抗性を有するので、クロラムフェニコール培地で選別した。
【００４７】
このように、大腸菌内ｂ０００４−ｂ００２４部位の遺伝子群が置き換えられ、選別マーカーを有する大腸菌変異株内ｐＲＥＤＩベクターに存在するＩ−ＳｃｅＩ制限酵素遺伝子はラムノースプローモーターによって転写調節されるので、ラムノースが存在する培地で培養してＩ−ＳｃｅＩ制限酵素を発現させた。この際、前記培地に蔗糖を含ませることによって、前記大腸菌に導入された線形ＤＮＡ断片上に存在するｓａｃＢ遺伝子を利用した選別作業を誘導した。すなわち、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素による微生物染色体の特定部位が切断されて、前記導入された線形ＤＮＡ断片に存在する微生物来由部位と、これと相同性を有する微生物染色体に存在する部位との相同組替えが誘導されて選別マーカー及びｓａｃＢ遺伝子部位が大腸菌染色体から除去されて、レバン毒性を失うので、蔗糖が含まれた培地で培養して選別マーカーが除去された変異株を選別することができた（図２）。選別された変異株をＰＣＲ反応して、ｂ０００４−ｂ００２４部位の遺伝子が除去されたということを確認し、これをΔ（ｂ０００４−ｂ００２４）と名付けた。
【００４８】
実施例３：誘電体特定部位に二つの相異なる選別マーカーを含む線形ＤＮＡ断片を挿入及び除去を利用した二つの特定誘電体部位の除去
前記実施例２で、さらに、二つの相異なる選別マーカーを含む相異なる線形ＤＮＡ断片を製作して、前記と同一の方法で、それぞれ順に染色体内に置き換えた後で、二つの相異なる誘電体部位を一度に除去した。
【００４９】
まず、除去しようとする二つの誘電体部位で、大腸菌誘電体のｂ０９８０−ｂ１０５２及びｂ１１３７−ｂ１１６８部位を選別した。そして、ｂ０９８０−ｂ１０５２部位を除去するために、クロラムフェニコール抵抗遺伝子（ＣｍＲ）を含む一つの線形ＤＮＡ断片を、実施例１と同一の方法で、相同部位Ａは配列番号２２の塩基配列に、相同部位Ｂは配列番号２３の塩基配列に、相同部位Ｃは配列番号２４の塩基配列及びプライマーｂ０９８０Ａ−Ｆ（配列番号２５）、ｂ０９８０Ａ−Ｒ（配列番号２６）、ｂ１０５１Ｂ−Ｆ（配列番号２７）、ｂ１０５１Ｂ−Ｒ（配列番号２８）、ｂ１０５２Ｃ−Ｆ（配列番号２９）、ｂ１０５２Ｃ−Ｒ（配列番号３０）を用いて製作した。前記収得された線形ＤＮＡ断片は、配列番号５５と同じである。
【００５０】
他の一つであるｂ１１３７−ｂ１１６８部位を除去するために、カナマイシン抵抗遺伝子（ＫｍＲ）を含む線形ＤＮＡ断片を相同部位Ａは配列番号３１の塩基配列に、相同部位Ｂは配列番号３２の塩基配列に、相同部位Ｃは配列番号３３の塩基配列及び１１３７Ａ−Ｆ（配列番号３４）、１１３７Ａ−Ｒ（配列番号３５）、１１６７Ｂ−Ｆ（配列番号３６）、１１６７Ｂ−Ｒ（配列番号３７）、１１６８Ｃ−Ｆ（配列番号３８）、１１６８Ｃ−Ｒ（配列番号３９）を用いて製作した。前記収得された線形ＤＮＡ断片は、配列番号５６と同じである。ここで使われたプライマーの塩基配列は、下記の通りである。
【００５１】
プライマーｂ０９８０Ａ−Ｆ（配列番号２５）：
５’−ＡＣＴＧＴＴＧＧＴＧＴＧＡＴＴＣＡＴＣＴＧＣＧ−３’
プライマーｂ０９８０Ａ−Ｒ（配列番号２６）：
５’−ＡＣＣＣＣＡＧＧＴＡＴＣＧＡＡＣＴＧＡＴＴＡＣＣＡＣＡＴＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＣＣＴＴＡＧ−３’
プライマーｂ１０５１Ｂ−Ｆ（配列番号２７）：
５’−ＧＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＴＡＧＣＣＣＡＴＧＧＧＴＡＴＧＡＧＣＡＴＴＡＴＴＡＧＴＣＧＣＡＣＴＡＴＡＣＣＧ−３’
プライマーｂ１０５１Ｂ−Ｒ（配列番号２８）：
５’−ＧＡＴＧＡＣＣＡＴＧＴＡＣＧＣＡＡＣＧＣＴＴＧ−３’
プライマーｂ１０５２Ｃ−Ｆ（配列番号２９）：
５’−ＡＡＴＣＡＧＴＴＣＧＡＴＡＣＣＴＧＧＧＧＴ−３’
プライマーｂ１０５２Ｃ−Ｒ（配列番号３０）：
５’−ＧＣＣＧＡＴＣＡＡＣＧＴＣＴＣＡＴＴＴＴＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴＴＣＴＧＡＣＧＣＴＧＴＡＴＧＴＣＣＧＣＧ−３’
プライマーｂ１１３７Ａ−Ｆ（配列番号３４）：
５’−ＣＴＧＡＴＧＧＡＴＧＧＣＧＣＴＡＡＡＣＴＧＣＴＧ−３’
プライマーｂ１１３７Ａ−Ｒ（配列番号３５）：
５’−ＣＧＣＡＧＧＡＴＣＴＣＴＴＣＡＧＧＣＧＴＴＧＡＡＧＡＴＧＴＡＴＧＴＧＡＡＧＧＧＧＣＣＧＣ−３’
プライマーｂ１１６７Ｂ−Ｆ（配列番号３６）：
５’−ＧＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＴＡＧＣＣＣＡＴＧＧＧＴＡＴＧＡＴＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＴＡＴＴＣＣＧＣＡ−３’
プライマーｂ１１６７Ｂ−Ｒ（配列番号３７）：
５’−ＣＣＡＡＴＡＡＴＧＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＣＧＣＧ−３’
プライマーｂ１１６８Ｃ−Ｆ（配列番号３８）：
５’−ＣＡＡＣＧＣＣＴＧＡＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＧ−３’
プライマーｂ１１６８Ｃ−Ｒ（配列番号３９）：
５’−ＧＣＣＧＡＴＣＡＡＣＧＴＣＴＣＡＴＴＴＴＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴＴＣＧＧＧＴＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＴＧ−３’
【００５２】
図３（Ａ）に表われたように、大腸菌染色体内ｂ０９８０−ｂ１０５２及びｂ１１３７−ｂ１１６８部位が除去された大腸菌変異株を製造するために、選別マーカーとしてはＣｍＲを含む線形ＤＮＡ断片（ｂ０９８０−ｂ１０５２＋ＣｍＲ）を有し、大腸菌内にｂ０９８０−ｂ１０５２部位を前記実施例２と同一の方法で置き換え、次いで、二番目の線形ＤＮＡ断片（ｂ１１３７−ｂ１１６８＋ＫｍＲ）も実施例２と同一の方法で伝達して大腸菌内染色体と置き換えた。前記２個の線形ＤＮＡ断片に置き換えられた大腸菌変異株は、線形ＤＮＡ断片に存在するＣｍＲ遺伝子とＫｍＲ遺伝子のためにクロラムフェニコールとカナマイシン抵抗性を有するので、クロラムフェニコールとカナマイシン培地で選別した。
【００５３】
次いで、前記ｂ０９８０−ｂ１０５２及びｂ１１３７−ｂ１１６８が結実された大腸菌変異株に残っている選別マーカーＣｍＲ遺伝子及びＫｍＲ遺伝子を同時に前記実施例２と同一の方法で除去して、大腸菌ｂ０９８０−ｂ１０５２及びｂ１１３７−ｂ１１６８が除去された変異株を製作し、これをＰＣＲ実験を通じて確認した。図３中、（Ｂ）に表われたように、Ｍはマーカーであり、１ないし３は線形ＤＮＡ断片が入ったことを確認するためのものであって、１は何も入っていないＭＧ１６５５菌株（Ｐｏｓｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、２はｂ０９８０−ｂ１０５２部位を除去するために製作されたＤＮＡ断片Ａ−Ｃ−Ｃｍ  ｓａｃＢ  Ｉ−ＳｅｃＩ−Ｂが菌株に入ったことを確認ＰＣＲしたものであり、３はｂ１１３７−ｂ１１６８部位を除去するために製作されたＤＮＡ断片Ａ−Ｃ−Ｋｍ  ｓａｃＢ  Ｉ−ＳｅｃＩ−Ｂが菌株に入ったことを確認ＰＣＲしたものであり、４はｂ０９８０−ｂ１０５２を除去するために製作されたＤＮＡ断片Ａ−Ｃ−Ｃｍ  ｓａｃＢ  Ｉ−ＳｅｃＩ−Ｂが菌株に入った後、Ｉ−ＳｅｃＩによってＣｍ  ｓａｃＢ  Ｉ−ＳｅｃＩ−Ｂ部分が除去されることを確認ＰＣＲしたものであり、５はｂ１１３７−ｂ１１６８を除去するために製作されたＤＮＡ断片Ａ−Ｃ−Ｋｍ  ｓａｃＢ  Ｉ−ＳｅｃＩ−Ｂが菌株に入った後、Ｉ−ＳｅｃＩによってＫｍ  ｓａｃＢ  Ｉ−ＳｅｃＩ−Ｂ部分が除去されることを確認ＰＣＲしたものであり、６と７はｂ０９８０−ｂ１０５２及びｂ１１３７−ｂ１１６８が菌株から除去されたか否かを確認するためにｂ０９８０−ｂ１０５２及びｂ１１３７−ｂ１１６８のそれぞれの間に該当される部位をＰＣＲした結果である。６はｂ０９８０−ｂ１０５２及びｂ１１３７−ｂ１１６８部分が除去されていない、すなわち、１のようなサンプルでＭＧ１６５５に上部分が除去されなかったので、バンドが表れることであり、７番はｂ０９８０−ｂ１０５２及びｂ１１３７−ｂ１１６８が除去されたので、バンドが表われないことである。前記実験で同時に特定誘電体部位を除去する確率は、９５％であった。
【００５４】
また、図３（Ａ）は、マーカーレス（ｍａｒｋｅｒｌｅｓｓ）除去方法を用いて特定の二つの誘電体部位に他種の選別マーカーを含む二つの線形ＤＮＡ断片を挿入し、同時に特定誘電体部位を除去する過程を表わしたものである。
【００５５】
実施例４：微生物内に必須遺伝子を含んだ染色体特定部位の除去
既存の誘電体除去方法としては、微生物生存に必須な遺伝子が含まれている不要な誘電体群部位は除去することができなかったので、前記必須遺伝子が存在する部位を除去するために、特定部位を必須遺伝子を中心に二つの誘電体部位に分けて二回の除去作業を行った。このような短所を改善するために、実施例から製造された組替えベクターを用いて必須遺伝子が残っていながらも所望の染色体部位のみを除去した。
【００５６】
まず、必須遺伝子であるａｒｇｉｎｙｌ−ｔＲＮＡ合成を暗号化するａｒｇＳ（ｂ１８７６）を含む大腸菌の特定誘電体部位ｙｅｃＤ−ａｒａＦ（ｂ１８６７−ｂ１９０１）を選択した。そして、前記特定誘電体部位ｙｅｃＤ−ａｒａＦ（ｂ１８６７−ｂ１９０１）を除去するために、前記実施例１に記載の方法を用いて、図４（Ａ）に表われた構造のように、［相同部位Ａ（配列番号４０）−Ｅ（ａｒｇＳ）−相同部位Ｃ（配列番号４２）−ＣｍＲ−ｓａｃＢ−Ｉ−ＳｃｅＩ−相同部位Ｂ（配列番号４１）］の構造を有する線形ＤＮＡ断片を製作した。前記収得された線形ＤＮＡ断片は、配列番号５７と同じである。
【００５７】
ｂ１８６７−ｂ１９０１誘電体部位を置き換えるために、大腸菌菌株内に前記製作されたＤＮＡ断片を導入し、ａｒｇＳ（ｂ１８７６）を含むｙｅｃＤ−ａｒａＦ（ｂ１８６７−ｂ１９０１）が除去された菌株をクロラムフェニコールが含まれた培地で培養して選別した。そして、実施例２に開示された方法を通じて線形ＤＮＡに含まれていた選別マーカーを除去しながら相同組替えによって特定染色体部位が跡なしに除去された菌株を選別することができた。図４（Ａ）は、必須遺伝子を含む特定誘電体部位を除去する過程を表わしたものであり、線形ＤＮＡ断片の大腸菌染色体内への置き換え及び除去は、前記除去しようとする特定部位内の遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを遂行して確認した。図４（Ｂ）に表われたように、Ｍはマーカーであり、１は線形ＤＮＡ断片を形質転換していないＭＧ１６５５であり、２は前記製作された線形ＤＮＡ断片を形質転換したＭＧ１６５５に、前記線形ＤＮＡ断片に置き換えられたか否かを確認したものであり、３は相同部位Ａ−Ｅ（ａｒｇＳ）−相同部位Ｃ−ＣｍＲ−ｓａｃＢ−Ｉ−ＳｃｅＩ−相同部位ＢのＤＮＡ断片からＩ−ＳｃｅＩによってＣｍＲ−ｓａｃＢ−Ｉ−ＳｃｅＩ−相同部位Ｂ部分が除去されることを確認ＰＣＲ結果であり、４は前記特定染色体部位が除去されていないＭＧ１６５５である、１番のようなサンプルであって、二つのバンドが浮かんだ理由はｂ１８６７−ｂ１９０１間で２部分を同時にＰＣＲしたために２個のバンドが出され、５は前記染色体特定部位が除去されたＭＧ１６５５に、何のバンドも表われなくて、特定染色体部位が正しく除去されたということが分かった。前記方法は、必須遺伝子を基準に両側の二回の除去作業を行う代りに一回の除去作業で所望の特定部位を迅速かつ効率的に除去することができるという長所を有している。ここに使われるプライマーの塩基配列は、次の通りである。
【００５８】
プライマーｂ１８６７Ａ−Ｆ（配列番号４４）：
５’−ＴＧＣＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＣＧＡＴＴＴＡＣ−３’
プライマーｂ１８６７Ａ−Ｒ（配列番号４５）：
５’−ＴＧＧＣＡＣＡＧＧＧＣＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＡＣＧＣＧＴＴＧＡＧＧＡＴＣＴＣＴＴＣＣＡＣＧ−３’
プライマーａｒｇＳ−Ｆ（配列番号４６）：
５’−ＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＣＣＴＧＴＧＣＣＡ−３’
プライマーａｒｇＳ−Ｒ（配列番号４７）：
５’−ＧＣＧＡＴＧＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＣＴＣＣＴＡＴＧＧＡＧＡＴＣＧＧＣＴＡＡＣＣＣＴＧＡＴＣＡＧＧＣＴＴＣ−３’
プライマーｂ１９０１Ｃ−Ｆ（配列番号４８）：
５’−ＣＴＣＣＡＴＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＣＡＴＣＧＣ−３’
プライマーｂ１９０１Ｃ−Ｒ（配列番号４９）：
５’−ＧＣＣＧＡＴＣＡＡＣＧＴＣＴＣＡＴＴＴＴＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＡＡＴＴＣＴＧＡＣＧ−３’
プライマーｂ１９００Ｂ−Ｆ（配列番号５０）：
５’−ＧＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＴＡＧＣＣＣＡＴＧＧＧＴＡＴＧＡＣＣＡＧＣＡＴＴＧＡＧＴＴＧＧＣＡＧＣＧ−３’
プライマーｂ１９００Ｂ−Ｒ（配列番号５１）：
５’−ＡＴＧＴＣＡＣＡＡＴＣＣＧＣＴＡＴＧＧＣＧＧ−３’
【００５９】
〔産業上の利用可能性〕
染色体特定部位除去用の組替えベクター及びそれを利用した微生物内染色体特定部位の除去方法関連の分野に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明による染色体除去用の組替えベクター（ｐＲＥＤＩ）の構造を表わした開裂地図である。
【図２】本発明による組替えベクター（ｐＲＥＤＩ）を用いて選別マーカーを除去する過程を表わした全体模式図である。
【図３】（Ａ）は、本発明による組替えベクター（ｐＲＥＤＩ）を用いて大腸菌内特定の二つの誘電体部位に他種の選別マーカーを含む二つの線形ＤＮＡ断片を挿入し、該挿入された線形ＤＮＡ断片を同時に除去する過程を表わした絵である。（Ｂ）は、前記大腸菌内特定の二つの誘電体部位に二つの線形ＤＮＡ断片を挿入して除去した結果、二つの線形ＤＮＡ断片の挿入と誘電体の除去程度を確認するためにＰＣＲ増幅結果を電気泳動した写真である（Ｍ：マーカー、１：線形ＤＮＡ断片を形質転換していないＭＧ１６５５菌株、２：ｂ０９８０−ｂ１０５２部位を除去するために製作されたＤＮＡ断片Ａ−Ｃ−Ｃｍ  ｓａｃＢ  Ｉ−ＳｅｃＩ−Ｂが菌株に入ったことを確認ＰＣＲしたもの、３：ｂ１１３７−ｂ１１６８部位を除去するために製作されたＤＮＡ断片Ａ−Ｃ−Ｋｍ  ｓａｃＢ  Ｉ−ＳｅｃＩ−Ｂが菌株に入ったことを確認ＰＣＲしたもの、４：ｂ０９８０−ｂ１０５２を除去するために製作されたＤＮＡ断片Ａ−Ｃ−Ｃｍ  ｓａｃＢ  Ｉ−ＳｅｃＩ−Ｂが菌株に入った後、Ｉ−ＳｅｃＩによってＣｍ  ｓａｃＢ  Ｉ−ＳｅｃＩ−Ｂ部分が除去されることを確認ＰＣＲしたもの、５：ｂ１１３７−ｂ１１６８を除去するために製作されたＤＮＡ断片Ａ−Ｃ−Ｋｍ  ｓａｃＢ  Ｉ−ＳｅｃＩ−Ｂが菌株に入った後、Ｉ−ＳｅｃＩによってＫｍ  ｓａｃＢ  Ｉ−ＳｅｃＩ−Ｂ部分が除去されることを確認ＰＣＲしたもの、６と７はｂ０９８０−ｂ１０５２及びｂ１１３７−ｂ１１６８が菌株から除去されたか否かを確認するためにｂ０９８０−ｂ１０５２及びｂ１１３７−ｂ１１６８のそれぞれの間に該当される部位をＰＣＲした結果）。
【図４】（Ａ）は、本発明による組替えベクター（ｐＲＥＤＩ）を利用した特定誘電体部位除去方法のうちから生存必須遺伝子を含む特定誘電体部位を除去する過程を表わした絵である。（Ｂ）は、前記生存必須遺伝子を含む特定誘電体部位を除去した結果、線形ＤＮＡ断片の挿入と誘電体の除去程度を確認するためにＰＣＲ増幅結果を電気泳動した写真である（１：線形ＤＮＡ断片を形質転換していないＭＧ１６５５菌株、２：線形ＤＮＡ断片を形質転換したＭＧ１６５５菌株、３：線形ＤＮＡ断片を形質転換したＭＧ１６５５菌株、４：染色体が除去されていないＭＧ１６５５菌株、及び５：染色体特定部位が除去されたＭＧ１６５５菌株）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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