(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記ａ）〜ｃ）の塩基配列のいずれか１つを有することを特徴とする遺伝子。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列。
ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと配列相同性が少なくとも９５％のＤＮＡの塩基配列であって、かつ、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルを不斉還元して（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルを生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
c）配列番号２で示される塩基配列。
【請求項２】
宿主細胞内において機能可能なプロモーターと請求項１記載の遺伝子とが機能可能な形で接続されてなることを特徴とする遺伝子。
【請求項３】
請求項１又は２記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換ベクター。
【請求項４】
請求項２記載の遺伝子又は請求項３記載の組換ベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
【請求項５】
宿主細胞が微生物であることを特徴とする請求項４記載の形質転換体。
【請求項６】
宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項４記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項３記載の組換ベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法。
【請求項８】
下記ａ）〜ｃ）のアミノ酸配列のいずれか１つを有することを特徴とするタンパク質。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列。
ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡと配列相同性が少なくとも９５％のＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルを不斉還元して（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルを生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と配列同一性が少なくとも９５％のアミノ酸配列であって、かつ、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルを不斉還元して（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルを生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
【請求項９】
２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルに請求項８記載のタンパク質、それを産生する形質転換体又はその処理物を作用させることを特徴とする（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法。
【請求項１０】
請求項１記載の遺伝子及び酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含むことを特徴とする組換ベクター。
【請求項１１】
酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素であることを特徴とする請求項１０記載の組換ベクター。
【請求項１２】
請求項１０又は１１記載の組換ベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
【請求項１３】
宿主細胞が微生物であることを特徴とする請求項１２記載の形質転換体。
【請求項１４】
宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項１３記載の形質転換体。
【請求項１５】
請求項１記載の遺伝子及び酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子が宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
【請求項１６】
酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質を反応系内に共存させること特徴とする請求項９記載の（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法。
【請求項１７】
酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素であることを特徴とする請求項１６記載の（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造法。
【請求項１８】
２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルに請求項１２〜１４記載の形質転換体又はその処理物を作用させることを特徴とする（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法。
【請求項１９】
２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルに請求項１５記載の形質転換体又はその処理物を作用させることを特徴とする（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、還元酵素をコードする遺伝子、該酵素及びそれらの利用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルは医農薬中間体等として有用な化合物であり、これまでに種々の製造方法が提案されている（特許文献１）。
【特許文献１】特許公報第２７７４３４１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、従来の（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法は必ずしも工業的に十分なものではなく、新しい（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルを不斉還元して工業的に有利に（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルを生産する能力を有するタンパク質をコードする下記遺伝子、該タンパク質、及びこれを利用した（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法を提供する。
【０００５】
即ち、本発明は、
１．下記の塩基配列のいずれかの特徴を有する遺伝子（以下、本発明遺伝子と記すこともある。）
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと配列相同性が少なくとも７０％のＤＮＡの塩基配列であって、かつ、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルを不斉還元して（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルを生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列、
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、かつ、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルを不斉還元して（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルを生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列、
ｄ）配列番号２で示される塩基配列；
２．宿主細胞内において機能可能なプロモーターと前項１記載の遺伝子とが機能可能な形で接続されてなることを特徴とする遺伝子；
３．前項１又は２記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換ベクター（以下、本発明ベクターと記すこともある。）；
４．前項２記載の遺伝子又は前項３記載の組換ベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体；
５．宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項４記載の形質転換体；
６．宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前項４記載の形質転換体；
７．前項１記載の遺伝子を保有することを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある。）；
８．前項３記載の組換ベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法；
９．下記のアミノ酸配列のいずれかの特徴を有するタンパク質（以下、本発明タンパク質と記載することもある。）
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡと配列相同性が少なくとも７０％のＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルを不斉還元して（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルを生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列、
ｃ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルを不斉還元して（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルを生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列、
ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルを不斉還元して（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルを生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列、
ｅ)配列番号１で示されるアミノ酸配列と配列相同性が少なくとも８０％のアミノ酸配列であって、かつ、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルを不斉還元して（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルを生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列；
１０．２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルに前項９に記載のタンパク質、それを産生する形質転換体又はその処理物を作用させることを特徴とする（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法；
１１．前項１記載の遺伝子及び酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含むことを特徴とする組換ベクター；
１２．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素であることを特徴とする前項１１記載の組換ベクター；
１３．前項１１又は１２記載の組換ベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体；
１４．宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項１３記載の形質転換体；
１５．宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前項１３記載の形質転換体；
１６．前項１記載の遺伝子及び酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を保有することを特徴とする形質転換体；
１７．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質を反応系内に共存させること特徴とする前項１０記載の（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法；
１８．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素であることを特徴とする前項１７記載の（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造法；
１９．２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルに前項１３〜１５記載の形質転換体又はその処理物を作用させることを特徴とする（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法；
２０．２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルに前項１６記載の形質転換体又はその処理物を作用させることを特徴とする（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルを工業的に有利に製造する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、該タンパク質、及びこれを利用した（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法等が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
まず、本発明遺伝子について説明する。
本発明遺伝子は、天然の遺伝子であってもよく、又は天然の遺伝子に変異を導入（部位特異的変異導入法、突然変異処理等）することにより作出された遺伝子であってもよい。天然の遺伝子を検索する場合には、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルを不斉還元して（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルを生産する能力を有する微生物を対象にすればよく、例えばヤマダジーマ・ファリノサ（Yamadazyma farinosa）などのヤマダジーマに属する微生物をその対象として挙げることができる。
【０００８】
本発明遺伝子において「配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９年、農村文化社発行）等に記載されているサザンハイブリダイゼーション法において、（１）高イオン濃度下［例えば、6XSSC（900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム）が挙げられる。］に、65℃でハイブリダイズさせることにより配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下［例えば、0.1 X SSC（15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム）が挙げられる。］に、65℃で30分間保温した後でも該ハイブリッドが維持されうるようなＤＮＡをいう。
【０００９】
具体的には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、その一部の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと、少なくとも７０％の配列相同性、好ましくは少なくとも８０％の配列相同性、より好ましくは少なくとも９０％の配列相同性、さらに好ましくは少なくとも９５％の配列相同性、もっとも好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を有するＤＮＡ等があげられる。
かかるＤＮＡは、自然界に存在するＤＮＡの中からクローニングされたＤＮＡであっても、このクローニングされたＤＮＡの塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換または付加が人為的に導入されてなるＤＮＡであっても、人為的に合成されたＤＮＡであってもよい。配列相同性は、例えば、ＵＷＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅが供給するＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，  ｐ３８７−３９５）や、ＰＩＬＥＵＰやＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０）などの配列分析用ツールを用いて算出し得る。
【００１０】
本発明遺伝子のＤＮＡは、例えば、以下のようにして調製することができる。
ヤマダジーマ・ファリノサ（Yamadazyma farinosa）等のヤマダジーマ属に属する微生物等から通常の遺伝子工学的手法（例えば、「新  細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）に記載された方法）に準じてｃDNAライブラリーを調製し、調製されたｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ及び／又は配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本発明遺伝子のＤＮＡを調製することができる。
【００１１】
また、前記ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ配列番号１０に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡを増幅して本発明遺伝子のＤＮＡを調製することができる。
【００１２】
該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μM、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるｃＤＮＡライブラリーを混合した反応液を97℃（2分間）に加熱した後、97℃(0.25分間)‐50℃(0.5分間)‐72℃（1.5分間）のサイクルを１０回、次いで97℃(0.25分間)‐55℃(0.5分間)‐72℃(2.5分間)のサイクルを２０回行い、さらに72℃で7分間保持する条件が挙げられる。
【００１３】
なお、該ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側、及び／又は３’末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよい。
【００１４】
また、前記ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチド等（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする５’末端側の約１４塩基程度以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）とｃＤＮＡライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍の塩基配列に相補的な塩基配列からなる約１４塩基程度以上のオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによっても、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡや、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本発明遺伝子のＤＮＡを調製することができる。
【００１５】
上記のようにして増幅されたＤＮＡを「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして本発明組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、pUC119（宝酒造社製）、pTV118N（宝酒造社製）、pBluescriptII （東洋紡社製）、pCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）、pTrc99A（Pharmacia社製）、pKK223-3（Pharmacia社製）などが挙げられる。
【００１６】
また、本発明遺伝子のＤＮＡは、例えば、微生物またはファージ由来のベクターに挿入されたｃＤＮＡライブラリーに配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有する約１５塩基程度以上の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして後述する条件にてハイブリダイズさせ、該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出することによっても取得することができる。
【００１７】
染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーにプローブをハイブリダイズさせる方法としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを挙げることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択することができる。
【００１８】
使用されるライブラリーがプラスミドベクターを用いて作製されている場合にはコロニーハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、ライブラリーのＤＮＡを宿主微生物に導入することにより形質転換体を取得し、得られた形質転換体を希釈した後、該希釈物を寒天培地上にまき、コロニーが現われるまで培養する。
【００１９】
使用されるライブラリーがファージベクターを用いて作製されている場合にはプラークハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、宿主微生物とライブラリーのファージとを感染可能な条件下で混合し、さらに軟寒天培地と混合した後、該混合物を寒天培地上にまき、プラークが現われるまで培養する。
【００２０】
次いで、いずれのハイブリダイゼーションの場合にも、前記の培養を行った寒天培地上にメンブレンを置き、形質転換体又はファージを該メンブレンに吸着・転写させる。このメンブレンをアルカリ処理した後、中和処理し、次いでＤＮＡを該メンブレンに固定する処理を行う。より具体的には、例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、前記寒天培地上にニトロセルロースメンブレン又はナイロンメンブレン（例えば、Hybond-N+（アマシャム社登録商標））を置き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンに吸着・転写させる。次に、該メンブレンをアルカリ溶液（例えば１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム）に約３分間浸してファージ粒子を溶解させることによりファージＤＮＡをメンブレン上に溶出させた後、中和溶液（例えば、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス−塩酸緩衝溶液ｐＨ７．５）に約５分間浸す。次いで該メンブレンを洗浄液（例えば、０．３Ｍ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５）で約５分間洗った後、例えば、約８０℃で約９０分間加熱することによりファージＤＮＡをメンブレンに固定する。
【００２１】
このように調製されたメンブレンを用いて、上記ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition（1989）」 Cold Spring Harbor Laboratory Press等の記載に準じて行うことができる。
【００２２】
プローブに用いるＤＮＡは、放射性同位元素により標識されたものや、蛍光色素で標識されたものであってもよい。
プローブに用いるＤＮＡを放射性同位元素により標識する方法としては、例えば、Random Primer Labeling Kit（宝酒造社製）等を利用することにより、ＰＣＲ反応液中のｄＣＴＰを（α−32Ｐ）ｄＣＴＰに替えて、プローブに用いるＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行う方法が挙げられる。
また、プローブに用いるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には、例えば、アマシャム製のECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System等を用いることができる。
【００２３】
ハイブリダイゼーションは、例えば、以下の通りに行うことができる。
４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含みドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｌ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション液（好ましくは９００ｍMの塩化ナトリウム、９０ｍMのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｌ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション液）を上記のようにして作製したメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、該プレハイブリダイゼーション液に前記メンブレンを浸して４２〜６５℃で１〜４時間保温する。
次いで、例えば、４５０〜９００ｍMの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ＳＤＳを０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポロビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液（好ましくは、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液）と前述の方法で調製して得られたプローブ（メンブレン１ｃｍ2当たり１．０×１０4〜２．０×１０6cpm相当量）とを混合した溶液をメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、該ハイブリダイゼーション溶液に浸し４２〜６５℃で１２〜２０時間保温する。
【００２４】
該ハイブリダイゼーション後、メンブレンを取り出し、１５〜３００ｍＭの塩化ナトリウム１．５〜３０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．１〜１．０重量％のＳＤＳ等を含む４２〜６５℃の洗浄液（好ましくは１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム及び１．０重量％のＳＤＳを含む６５℃の洗浄液）等を用いて洗浄する。洗浄したメンブレンを２xSSC（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム）で軽くすすいだ後、乾燥する。このメンブレンを例えばオートラジオグラフィー等に供してメンブレン上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするＤＮＡのメンブレン上の位置に相当するクローンを元の寒天培地上で特定し、これを釣菌することにより、当該ＤＮＡを有するクローンを単離する。
【００２５】
このようにして得られるクローンを培養して得られる培養菌体から本発明遺伝子のＤＮＡを調製することができる。
【００２６】
上記のようにして調製されたＤＮＡを「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして本発明組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、pUC119（宝酒造社製）、pTV118N（宝酒造社製）、pBluescriptII （東洋紡社製）、pCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）、pTrc99A（Pharmacia社製）、pKK223-3（Pharmacia社製）等が挙げられる。
【００２７】
また、前述のＤＮＡの塩基配列は、F.Sanger, S.Nicklen, A.R.Coulson著、Proceeding of Natural Academy of Science U.S.A.(1977) 74: 5463-5467頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等の市販の試薬を用いてもよい。
【００２８】
上述のようにして得られるＤＮＡが、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルを不斉還元して（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルを生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードしていることの確認は、例えば、以下のようにして行うことができる。
【００２９】
まず上述のようにして得られるＤＮＡを後述のように、宿主細胞において機能可能なプロモーターの下流に接続されるようにベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。次いで該形質転換体の培養物を２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルに作用させる。反応生成物中の（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルの量を分析することにより、得られたＤＮＡがかかる能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードすることが確認できる。
【００３０】
本発明遺伝子を宿主細胞で発現させるには、例えば、宿主細胞で機能可能なプロモーターと本発明遺伝子とが機能可能な形で接続されてなる遺伝子を宿主細胞に導入する。
【００３１】
ここで、「機能可能な形で」とは、該遺伝子を宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させた際に、本発明遺伝子が、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。プロモーターとしては、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーター、または、tacプロモーターもしくはtrcプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーター等をあげることができ、ヤマダジーマ・ファリノサにおいて本発明遺伝子の発現を制御しているプロモーターを利用してもよい。
【００３２】
一般的には、宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる遺伝子を前述のようなベクターに組み込んでなる組換ベクターを宿主細胞に導入する。尚、ベクターとしては、選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択することができる。
【００３３】
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明遺伝子又は本発明組換ベクター等を導入する宿主細胞としては、例えば、Escherichia属、Bacillus属、Corynebacterium属、Staphylococcus属、Streptomyces属、Saccharomyces属、Kluyveromyces属、Pichia属、Rhodococcus属及びAspergillus属に属する微生物等があげられる。
【００３４】
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明遺伝子又は本発明組換ベクター等を宿主細胞へ導入する方法は、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載される塩化カルシウム法や、「Methods in Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulser System」 Bio-Rad Laboratories, (1993)等に記載されるエレクトロポレーション法等をあげることができる。
【００３５】
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明遺伝子又は本発明組換ベクター等が導入された形質転換体を選抜するには、例えば、前述のようなベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。
該形質転換体が本発明遺伝子を保有していることは、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
【００３６】
次に本発明タンパク質について説明する。
【００３７】
「配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、活性が性質的に同質なタンパク質をコードしており、配列番号１で示される全アミノ酸配列と、少なくとも８０％の配列相同性、好ましくは少なくとも９０％の配列相同性、より好ましくは少なくとも９５％の配列相同性、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を意味する。
【００３８】
本発明タンパク質は、例えば、本発明遺伝子を保有する形質転換体を培養することにより製造することができる。
該形質転換体を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。
【００３９】
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００４０】
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Corn Steep Liquor）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００４１】
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
【００４２】
さらに、tacプロモーター、trcプロモーター及びlacプロモーター等のアロラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと本発明遺伝子とが機能可能な形で接続されてなる遺伝子が導入されてなる形質転換体の場合には、本発明タンパク質の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、isopropyl thio-β-D-galactoside（IPTG）を培地中に少量加えることもできる。
【００４３】
本発明遺伝子を保有する形質転換体の培養は、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される方法に準じて行うことができ、例えば、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter）培養、タンク培養等の液体培養及び固体培養が挙げられる。
培養温度は、該形質転換体が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１５〜４０℃である。培地のｐHは約６〜８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日〜約５日が好ましい。
【００４４】
本発明遺伝子を保有する形質転換体の培養物から本発明タンパク質を精製する方法としては、通常のタンパク質の精製において使用される方法を適用することができ、例えば、次のような方法を挙げることができる。
【００４５】
まず、形質転換体の培養物から遠心分離等により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルター濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、本発明タンパク質を精製することができる。
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名、いずれもアマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
尚、本発明タンパク質を含む画分を選抜するには、例えば、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルを不斉還元して（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルを優先的に生産する能力を指標にして選抜すればよい。
【００４６】
次に、本発明における（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法について説明する。該製造方法は２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルに本発明タンパク質、それを産生する形質転換体又はその処理物を作用させることを特徴とする。
【００４７】
２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルとしては、下記式（１）で示される化合物が例示される。
0004736654.tif 000002
（式中、Ｒ1は、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルなどのＣ１−Ｃ８アルキル基を表す。）
２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルとしては、具体的には、例えば、２−オキソ−４−フェニル酪酸メチル、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチル、２−オキソ−４−フェニル酪酸プロピル及び２−オキソ−４−フェニル酪酸オクチル等が挙げられる。これらのエステルは、例えば、Tetrahedron(1985) 41(2) 467-72に記載の方法もしくはこれに準じて製造することができる。（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルとしては、例えば、式（１）の化合物の２位のオキソ基が、不斉的に水酸基に還元された（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸のＣ１−Ｃ８アルキルエステル化合物が例示される。
【００４８】
上記方法は、通常、水及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと記す。）、または、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと記す。）の存在下に行われる。この際に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。該緩衝水溶液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩及びこれらの混合物が挙げられる。
【００４９】
上記方法においては、水に加えて有機溶媒を共存させることもできる。共存させることができる有機溶媒としては、例えば、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロプルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、トルエン、ヘキサン、シクロへヘキサン、ヘプタン、イソオクタン等の炭化水素類、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド等の有機硫黄化合物、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類及びこれらの混合物が挙げられる。
【００５０】
上記方法における反応は、例えば、水、２−オキソ−４−フェニル酪酸エステル、及び、ＮＡＤＨ、または、ＮＡＤＰＨを、本発明タンパク質あるいはそれを産生する形質転換体又はその処理物とともに、必要によりさらに有機溶媒等を含有した状態で、攪拌、振盪等により混合することにより行われる。
【００５１】
上記方法における反応時のｐＨは適宜選択することができるが、通常ｐＨ３〜１０の範囲である。また反応温度は適宜選択することができるが、原料及び生成物の安定性、反応速度の点から通常０〜６０℃の範囲である。
【００５２】
反応の終点は、例えば、反応液中の２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルの量を液体クロマトグラフィー等により追跡することにより決めることができる。
反応時間は適宜選択することができるが、通常０．５時間から１０日間の範囲である。
【００５３】
反応液からの（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの回収は、一般に知られている任意の方法で行えばよい。
例えば、反応液の有機溶媒抽出操作、濃縮操作等の後処理を、必要によりカラムクロマトグラフィー、蒸留等を組み合わせて、行うことにより精製する方法が挙げられる。
【００５４】
本発明タンパク質、それを産生する形質転換体又はその処理物は種々の形態で上記方法に用いることができる。
【００５５】
具体的な形態としては、例えば、本発明遺伝子を保有する形質転換体の培養物、かかる形質転換体の処理物、無細胞抽出液、粗精製タンパク質、精製タンパク質等及びこれらの固定化物が挙げられる。ここで、形質転換体の処理物としては、例えば、凍結乾燥形質転換体、有機溶媒処理形質転換体、乾燥形質転換体、形質転換体摩砕物、形質転換体の自己消化物、形質転換体の超音波処理物、形質転換体抽出物、形質転換体のアルカリ処理物が挙げられる。また、固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に本発明タンパク質等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本発明タンパク質等を閉じ込める方法）が挙げられる。
【００５６】
尚、本発明遺伝子を保有する形質転換体を用いた工業的な生産を考慮すれば、生形質転換体を用いるよりも該形質転換体を死滅化させた処理物を用いる方法が製造設備の制限が少ないという点では好ましい。そのための死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、ケトン、シアン及び抗生物質）が挙げられる。一般的には、これらの殺菌法のうちできるだけ本発明タンパク質の酵素活性を失活させず、かつ反応系への残留、汚染などの影響が少ない処理方法を選択することが望ましい。
【００５７】
また、本発明の（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法はＮＡＤＨ、または、ＮＡＤＰＨの存在下に行われ、２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルの不斉還元反応の進行に伴い、当該ＮＡＤＨ、または、ＮＡＤＰＨは酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ+と記す）、または、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ+と記す）に変換される。変換により生じたＮＡＤ+、または、ＮＡＤＰ+は、ＮＡＤ+、または、ＮＡＤＰ+を還元型（ＮＡＤＨ、または、ＮＡＤＰＨ）に変換する能力を有するタンパク質により元のＮＡＤＨ、または、ＮＡＤＰＨに戻すことができるので、上記方法の反応系内には、ＮＡＤ+、または、ＮＡＤＰ+をＮＡＤＨ、または、ＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質を共存させることもできる。
ＮＡＤ+、または、ＮＡＤＰ+をＮＡＤＨ、または、ＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質としては、例えば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等が挙げられる。
また、ＮＡＤ+、または、ＮＡＤＰ+をＮＡＤＨ、または、ＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素である場合には、反応系内にグルコース等を共存させることにより該タンパク質の活性が増強される場合もあり、例えば、反応液にこれらを加えてもよい。
また、当該タンパク質は、酵素そのものであってもよいし、また該酵素をもつ微生物又は該微生物の処理物の形態で反応系内に共存していてもよい。さらにまた、ＮＡＤ+、または、ＮＡＤＰ+をＮＡＤＨ、または、ＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む形質転換体又はその処理物であってもよい。ここで処理物とは、前述にある「形質転換体の処理物」と同等なものを意味する。
【００５８】
さらに、本発明の（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法では、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等のようなＮＡＤ+、または、ＮＡＤＰ+をＮＡＤＨ、または、ＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を同時に保有する形質転換体を用いて行うこともできる。
この形質転換体において、両者遺伝子を宿主細胞へ導入する方法としては、例えば、単一である、両者遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する方法、複製起源の異なる複数のベクターに両者遺伝子を別々に導入した組換ベクターにより宿主細胞を形質転換する方法等があげられる。さらに、一方の遺伝子または両者遺伝子を宿主細胞の染色体中に導入してもよい。
尚、単一である、両者遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する方法としては、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域をそれぞれの両者遺伝子に連結して組換ベクターを構築したり、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させるような組換ベクターを構築してもよい。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
参考例１  （ｃＤＮＡライブラリー（A）の調製）
２本の５００ｍｌフラスコに培地（水１００ｍｌにグルコース２ｇ、ポリペプトン０．５ｇ、酵母エキス０．３ｇ、麦芽エキス０．３ｇ溶解し、２ＮのＨＣｌでｐＨを６に調整したもの）をそれぞれ１００ｍｌずつ入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。ここに同組成の培地中で培養（３０℃、４８時間、振盪培養）したヤマダジーマ・ファリノサ（Yamadazyma farinosa）IFO193株の培養液をそれぞれ０．３ｍｌずつ加え、３０℃で７２時間振盪培養した。その後、得られた培養液を遠心し（８０００rpm、１０分）、生じた沈殿を集めた。この沈殿を０．８５％食塩水５０ｍｌで洗浄して、３．６４ｇの湿菌体を得た。
上記の菌体を用いて、チオシアン酸グアニジンフェノールクロロホルム法で全ＲＮＡを調製した。さらに全ＲＮＡからOligotex-dT30<Super>mRNA purification kit(宝酒造社製)を用いてpoly(A)を有するＲＮＡを得た。
【００６０】
ｃＤＮＡライブラリーの作製はGubler and Hoffman法に基づいて以下のとおり実施した。上記のpoly(A)を有するＲＮＡ（３．０μｇ）とOligo(dT)18-アンカープライマー（（含XhoIサイト）宝酒造社製）、RAV-2  Rtase及びSuperScriptII  Rtaseを用いて一本鎖cDNAを調製し、この反応液（調製された一本鎖ｃＤＮＡを含む）にE. coli DNA polymerase、E. coli Rnase/E. coli DNA Ligase Mixture及びT4 DNA Polymeraseを加え、二本鎖cDNAの合成と平滑末端化を行った。次いで、この二本鎖ｃＤＮＡとEcoRI-NotI-BamHIアダプター（宝酒造社製）とのライゲーションを行った。ライゲーション後のDNAをリン酸化処理、XhoIで切断、スピンカラム(宝酒造社製)で低分子量DNAを除去、λZapII（EcoRI-XhoI切断）とライゲーションを行った後、MaxPlax Lambda Packaging Extracts (EPICENTRE社製)を用いて、パッケージングすることにより、ｃＤＮＡライブラリー（以下、ｃＤＮＡライブラリー（Ａ）と記す。）を得た。
【００６１】
参考例２  （細胞内ＤＮＡ（Ｂ）の調製）
参考例１と同様に、ヤマダジーマ・ファリノサ（Yamadazyma farinosa）IFO193株の湿菌体を１．８ｇ得た。
上記の菌体から、QIAprep Genomic-tip System (Qiagen社製)を用いて細胞内ＤＮＡ（以下、細胞内ＤＮＡ（Ｂ）と記す。）を得た。
【００６２】
実施例１  （本発明遺伝子の取得及びその解析）
（１）本発明タンパク質の調製
参考例と同様の条件で調製したヤマダジーマ・ファリノサ（Yamadazyma farinosa）IFO193株の湿菌体約６２ｇを、２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）１２０ｍｌに懸濁しマルチビーズショッカー（安井器械社製、ガラスビーズ０．５ｍｍΦ、２５００ｒｐｍ、１０分）で破砕した。得られた破砕液を遠心分離（１００００ｘｇ、１０分間）し、上清をさらに超遠心分離（１０００００ｘｇ、６０分間）して、超遠心上清約１５０ｍｌを得た。
得られた超遠心上清約１５０ｍｌをＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて濃縮、および、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．５）に、バッファー交換した。これをイオン交換クロマトグラフィーカラム［ＨｉＴｒａｐ  ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８．５）で平衡化したもの］に展着し、塩化ナトリウムを溶解したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（塩化ナトリウム濃度０→０．５Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出し、還元酵素活性を有する画分として塩化ナトリウム濃度０．０１〜０．１５Ｍの画分１５ｍｌを得た。
【００６３】
この溶出画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて濃縮、脱塩、および、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に、バッファー交換した。これをアフィニティー相互作用クロマトグラフィーカラム［ＨｉＴｒａｐ  ＢｌｕｅＨＰ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、塩化ナトリウムを溶解したリン酸ナトリウム緩衝液（塩化ナトリウム濃度０→１．０Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出し、還元酵素活性を有する画分として塩化ナトリウム濃度０．４８〜０．６７Ｍの画分８ｍｌを得た。
【００６４】
この溶出画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて濃縮、脱塩、および、１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に、バッファー交換した。これを疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム［ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＰＨＥ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、硫酸アンモニウムを溶解したリン酸カリウムバッファー（硫酸アンモニウム濃度１．５Ｍ→０Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出し、還元酵素活性を有する画分として硫酸アンモニウム濃度が１．０Ｍ付近の溶出画分１．５ｍｌを得た。
この溶出画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて濃縮、および、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリムバッファー（ｐＨ７．０）に、バッファー交換した。この濃縮液をゲル濾過カラム［Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００ＧＬ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［移動層：０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリムバッファー（ｐＨ７．０）］し、還元酵素活性を有する画分として分子量約３００００ダルトンの溶出画分１ｍｌ（以下、活性画分（Ａ）と記す。）を得た。
【００６５】
尚、クロマトグラフィー等で得られた画分について、以下の操作により還元酵素活性を測定した。
２−オキソ−４−フェニル酪酸エチル（２．０６ｍｇ／ｍｌ）及びＮＡＤＨ（０．３５５ｍｇ／ｍｌ）を溶解したリン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ７．０）０．１９ｍｌにクロマトグラフィー等により得られた溶出画分０．０１ｍｌを加えて全量を０．２ｍｌとし、３７℃で２０秒間保温した後、３４０ｎｍの吸光度を測定した。３４０ｎｍの吸光度からＮＡＤＨの消費量を計算して画分の還元酵素活性を求めた。
【００６６】
（２）本発明タンパク質由来の部分ペプチドが有するアミノ酸配列の解析
上記操作により得られた活性画分（Ａ）をLaemmli, U. K., Nature, (1970) 227, 680記載の方法に準じてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルーＧ２５０染色液（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で染色し、染色された部分のゲルを切り取った。このゲルを洗浄後、トリプシンを処理し、ゲルからペプチドを抽出した。抽出したペプチドをＨＰＬＣ（カラム：TSK gel ODS-80Ts、2.0mm×250mm（東ソー株式会社）、移動層：Ａ液（０．１％トリフルオロ酢酸水）、Ｂ液（０．０９％トリフルオロ酢酸を含む９０％アセトニトリル水溶液）、Ａ／Ｂ＝１００／０→０／１００の濃度勾配）により分取した。分取した各画分の中から１個の画分につきアミノ酸配列をプロテインシークエンサー（Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９４ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）により決定した。決定したアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００６７】
（３）本発明遺伝子由来の部分塩基配列の解析（その１）
配列番号３で示されるアミノ酸配列を基に、配列番号４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。また、ｃＤＮＡライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍の塩基配列を基に、配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
【００６８】
配列番号４、および、配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記ｃＤＮＡライブラリー（Ａ）を鋳型にして、下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpand High Fidelity PCR Systemを使用した。)
【００６９】
[反応液組成]
cDNAライブラリー原液            1μl
dNTP(各2.5mM-mix)               4μl
プライマー(50pmol/μl)          各0.3μl
10xbuffer(with MgCl)            5μl
enz.expandHiFi (3.5ｘ103U/ml)  0.75μl
超純水                          38.65μl
[反応条件]
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN  ELMER−GeneAmp  PCR  System 9700にセットし、94℃（2分間）に加熱した後、94℃(0.25分間)‐55℃(0.5分間)‐72℃（1.0分間）のサイクルを１０回、次いで94℃(0.25分間)‐55℃(0.5分間)‐72℃(1.0分間＋5秒/サイクル)のサイクルを２０回行い、さらに72℃で7分間保持した。
【００７０】
その後、ＰＣＲ反応液の一部をとり、アガロースゲル電気泳動を行ったところ、約９３０ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
【００７１】
上記の約９３０ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐCR2.1−TOPOベクターの既存「PCR  Product挿入サイト」にライゲーションし（Invitrogen社製ＴＯＰＯＴＭＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇキット使用）、得られたライゲーション液でE．coli TOP10F'を形質転換した。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム）寒天培地に５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（以下、Ｘ−ｇａｌと記す）４％水溶液３０μｌ及び０．１Ｍ  IPTG３０μｌを塗布し、そこに得られた形質転換体を接種し培養した。形成したコロニーのうち白いコロニーを１個とり、このコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３０℃、２４時間）。培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。
【００７２】
得られたプラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、配列番号６に示す塩基配列を決定した。
なお、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析は、Dye Terminator Cycle sequencing FS ready Reaction Kit（パーキンエルマー製）を用いて各プラスミドを鋳型としてシークエンス反応を行い、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマー製）で解析することにより行った。
【００７３】
（４）本発明遺伝子由来の部分塩基配列の解析（その２）  配列番号６で示される塩基配列を基に配列番号７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。また、ｃＤＮＡライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍の塩基配列を基に、配列番号８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
【００７４】
配列番号７、および配列番号８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記ｃＤＮＡライブラリー（Ａ）を鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpand High Fidelity PLUS PCR Systemを使用)
【００７５】
［反応液組成］
cDNAライブラリー原液                     1μl
dNTP(各2.5mM-mix)                         4μl
プライマー(50pmol/μl)                  各0.4μl
5xbuffer(with MgCl)                      10μl
Expand High Fidelity PLUS Taq polymerase  0.5μl (2.5U)
超純水                                   33.7μl
【００７６】
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN  ELMER−GeneAmp  PCR  System9700にセットし、94℃（2分間）に加熱した後、94℃(0.25分間)‐55℃(0.5分間)‐72℃（1.5分間）のサイクルを１０回、次いで94℃(0.25分間)‐55℃(0.5分間)‐72℃(1.0分間＋5秒／サイクル)のサイクルを２０回行い、さらに72℃で7分間保持した。
【００７７】
その後、ＰＣＲ反応液の一部をとり、アガロースゲル電気泳動を行った結果、約４３０ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
【００７８】
上記の約４３０ｂｐのＤＮＡ断片をｐCR2.1−TOPOベクターの既存「PCR  Product挿入サイト」にライゲーションし（Invitrogen社製ＴＯＰＯＴＭＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇキット使用）、そのライゲーション液でE．coli TOP10F'を形質転換した。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地にＸ−ｇａｌ４％水溶液３０μｌ及び０．１Ｍ  IPTG３０μｌを塗布し、そこに得られた形質転換体を接種し培養した。形成したコロニーのうち白いコロニーを１個とり、このコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３０℃、２４時間）。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。
【００７９】
得られたプラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、配列番号９に示す塩基配列を決定した。
なお、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析は、Dye Terminator Cycle sequencing FS ready Reaction Kit（パーキンエルマー製）を用いて各プラスミドを鋳型としてシークエンス反応を行い、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマー製）で解析することにより行った。
【００８０】
配列番号６、９で示される塩基配列を基にＯＲＦ検索を行い、ヤマダジーマ・ファリノサＩＦＯ１９３株が有する２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルを不斉還元して（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルを優先的に生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号２）を決定した。さらに配列番号２をもとに該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を決定した。
なお、配列番号１と配列番号３を比較したところ、配列番号３で示されるアミノ酸配列は配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部分と一致することがわかった。
【００８１】
実施例２  （本発明形質転換体の製造及び還元反応例（その１））
（１）本発明ベクターの調製
配列番号６に示される塩基配列を基に配列番号１０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを、配列番号９で示される塩基配列を基に配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
【００８２】
配列番号１０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１１で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに、前記細胞内ＤＮＡ（Ｂ）を鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpand High Fidelity PLUS PCR Systemを使用)
【００８３】
［反応液組成］
cDNAライブラリー原液                     1μl
dNTP(各2.5mM-mix)                         4μl
プライマー(50pmol/μl)                  各0.4μl
5xbuffer(with MgCl)                      10μl
Expand High Fidelity PLUS Taq polymerase  0.5μl (2.5U)
超純水                                   33.7μl
【００８４】
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN  ELMER−GeneAmp  PCR  System9700にセットし、94℃（2分間）に加熱した後、94℃(0.25分間)‐55℃(0.5分間)‐72℃（1.5分間）のサイクルを１０回、次いで94℃(0.25分間)‐55℃(0.5分間)‐72℃(1.0分間＋5秒／サイクル)のサイクルを２０回行い、さらに72℃で7分間保持した。
【００８５】
その後、ＰＣＲ反応液を一部とりアガロースゲル電気泳動を行ったところ、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に２種類の制限酵素（NcoI及びXbaI）を加え、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia製）を２種類の制限酵素（NcoI及びXbaI）により２重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
【００８６】
これらの酵素消化させたＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から１０コロニーを無作為に選抜した。この選抜したコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出したプラスミドのそれぞれの一部をEcoRIとPstIとの２種類の制限酵素により２重消化した後、電気泳動して、取り出したプラスミドには４つのプラスミドに前記約１０００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。（以下、このプラスミドをプラスミドｐＴｒｃＲＹＦと記す。）
【００８７】
（２）本発明形質転換体の調製及び還元反応例
プラスミドｐＴｒｃＲＹＦを用いてE．coli HB101を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ）に接種し、振盪培養した（３０℃、１７時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体０．５３ｇを得た。得られた湿菌体に１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を５ｍｌ添加し、さらに５ｍｌ分のガラスビーズ（０．１ｍｍ）を添加し、細胞を破砕した。破砕後、遠心上清を約３ｍｌ得た。２−オキソ−４−フェニル酪酸エチル１０ｍｇ、上記破砕後遠心上清２５０μｌ、ＮＡＤＨ５０ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）７５０μｌを混合し、３０℃で１７時間攪拌した。その後、反応液に酢酸エチルを１ｍｌ添加した後、遠心分離し、有機層を得た。この有機層を下記条件でガスクロマトグラフィーによる含量分析を行ったところ、反応に用いた２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルの量に対して２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルは７９．７％生成していることがわかった。また、下記条件で有機層中の２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルの光学純度を測定したところ（Ｒ）体が１００％ｅ．ｅ．であった。
【００８８】
（含量分析条件）
カラム：ＤＢ−１（０．５３ｍｍ×３０ｍ、１．５μｍ）（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
カラム温度：５０℃（０分）→４℃／分→１７０℃（０分）→３０℃／分→２９０℃（４分）
キャリアーガス：ヘリウム（カラム流量：１０ｍｌ／分）
検出器：ＦＩＤ
【００８９】
（光学純度測定条件）
カラム：Ｃｈｉｒａｓｉｌ−Ｄｅｘ−ＣＢ（０．３２ｍｍｘ２５ｍ、０．２５μｍ）（ＣＨＲＯＭＰＡＣＫ社製）
カラム温度：１００℃（０分）→２℃／分→１８０℃（０分）
キャリアーガス：ヘリウム（カラム流量：１．５ｍｌ／分）
検出器：ＦＩＤ
スプリット比：１/５０
尚、生成物の絶対立体配置は（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルの標品と比較することにより決定した。
【００９０】
実施例３  （本発明形質転換体の製造及び還元反応例（その２））
（１）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を調製するための準備
Bacillus megaterium IFO12108株を滅菌したＬＢ培地１００ｍｌ中で培養し、菌体０．４ｇを得た。この菌体からQiagen Genomic Tip (Qiagen社製)を用い、それに付属のマニュアルに記載の方法にしたがって染色体ＤＮＡ（以下、染色体ＤＮＡ（Ｃ）と記す。）を精製した。
（２）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の調製
The Journal of Biological Chemistry Vol.264, No.11, 6381-6385(1989)に記載されたBacillus megaterium IWG3由来のグルコース脱水素酵素の配列をもとに配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとを合成した。
配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに用い、前記染色体ＤＮＡ（Ｃ）を鋳型にして以下の反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpand High Fidelity PCR Systemを使用)
【００９１】
［反応液組成］
染色体DNA原液                     1μl
dNTP(各2.5mM-mix)                  0.4μl
プライマー(20pmol/μl)             各0.75μl
10xbuffer(with MgCl)                5μl
enz.expandHiFi (3.5ｘ103U/ml)      0.375μl
超純水                              41.725μl
【００９２】
［PCR反応条件］
上記組成に反応液が入った容器をPERKIN  ELMER−GeneAmp  PCR  System2400にセットし、97℃（2分間）に加熱した後、97℃(0.25分間)-55℃(0.5分間) -72℃（1.5分間）のサイクルを１０回、次いで97℃(0.25分間)-55℃(0.5分間)-72℃(2.5分間)のサイクルを２０回、さらに72℃で7分間保持した。
【００９３】
その後、ＰＣＲ反応液の一部をとり、アガロースゲル電気泳動を行った結果、約９５０ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
得られたＰＣＲ反応液とInvitrogen社製ＴＯＰＯＴＭＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇキットＶｅｒ．Ｅとを用いて、ＰＣＲによって得られた約９５０ｂｐのＤＮＡ断片をｐCR2.1−TOPOベクターの既存「PCR  Product挿入サイト」にライゲーションし、そのライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地にＸ−ｇａｌ４％水溶液３０μｌ及び０．１Ｍ  IPTG３０μｌを塗布し、そこに得られた形質転換体を接種し培養した。形成したコロニーのうち白いコロニーを１個とり、このコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３０℃、２４時間）。次いで培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出したプラスミドの一部を制限酵素（EcoRI）で消化し、電気泳動することにより、該プラスミドには約９５０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。（以下、このプラスミドをプラスミドｐＳＤＧＤＨ１２と記す。）
【００９４】
次に、プラスミドｐＳＤＧＤＨ１２に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。その結果を配列番号１４に示す。
なお、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析は、Dye Terminator Cycle sequencing FS ready Reaction Kit（パーキンエルマー製）を用いてプラスミドｐＳＤＧＤＨ１２を鋳型としてシークエンス反応を行い、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマー製）で解析することにより行った。
【００９５】
次に、配列番号１４で示される塩基配列を基に配列番号１５および配列番号１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
【００９６】
配列番号１５および配列番号１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記染色体ＤＮＡ（Ｃ）を鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpand High Fidelity PCR Systemを使用)
【００９７】
［反応液組成］
染色体DNA原液                     1μl
dNTP(各2.5mM-mix)                  0.4μl
プライマー(20pmol/μl)             各0.75μl
10xbuffer(with MgCl)                5μl
enz.expandHiFi (3.5ｘ103U/ml)      0.375μl
超純水                              41.725μl
【００９８】
［PCR反応条件］
上記組成に反応液が入った容器をPERKIN  ELMER−GeneAmp  PCR  System2400にセットし、97℃（2分間）に加熱した後、97℃(0.25分間)-55℃(0.5分間) -72℃（1.5分間）のサイクルを１０回、次いで97℃(0.25分間)-55℃(0.5分間)-72℃(2.5分間)のサイクルを２０回、さらに72℃で7分間保持した。
【００９９】
その後、ＰＣＲ反応液を一部とりアガロースゲル電気泳動を行ったところ、約８００ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に２種類の制限酵素（NcoI及びBamHI）を加え、約８００ｂｐのＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia製）を２種類の制限酵素（NcoI及びBamHI）により２重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
【０１００】
これらの酵素消化させたＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から１０コロニーを無作為に選抜した。この選抜したコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出したプラスミドのそれぞれの一部をNcoIとBamHIとの２種類の制限酵素により２重消化した後、電気泳動して、取り出したプラスミドには４つのプラスミドに前記約８００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。（以下、このプラスミドをプラスミドｐＴｒｃＧＤＨと記す。）
【０１０１】
（３）本発明ベクターの調製
配列番号１７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１１で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに、プラスミドｐＴｒｃＲＹＦを鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpand High Fidelity PLUS PCR Systemを使用)
【０１０２】
［反応液組成］
cDNAライブラリー原液                     1μl
dNTP(各2.5mM-mix)                         4μl
プライマー(50pmol/μl)                  各0.4μl
5xbuffer(with MgCl)                      10μl
Expand High Fidelity PLUS Taq polymerase  0.5μl (2.5U)
超純水                                   33.7μl
【０１０３】
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN  ELMER−GeneAmp  PCR  System9700にセットし、94℃（2分間）に加熱した後、94℃(0.25分間)‐55℃(0.5分間)‐72℃（1.5分間）のサイクルを１０回、次いで94℃(0.25分間)‐55℃(0.5分間)‐72℃(1.0分間＋5秒／サイクル)のサイクルを２０回行い、さらに72℃で7分間保持した。
【０１０４】
その後、ＰＣＲ反応液を一部とりアガロースゲル電気泳動を行ったところ、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に２種類の制限酵素（BamHIとXbaI）を加え、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
【０１０５】
一方、プラスミドｐＴｒｃＧＤＨを２種類の制限酵素（BamHIとXbaI）で二重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
それぞれの酵素消化されたＤＮＡ断片をT4 DNAリガーゼでライゲーションし、そのライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーから６コロニーを無作為に選抜した。この選抜したコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３０℃、１７時間）。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出したプラスミドのそれぞれの一部をBamHIとXbaIの2種類の制限酵素で二重消化した後、電気泳動することによって、取り出したプラスミドは全て目的とする約１０００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した（以下、このプラスミドを以下プラスミドｐＴｒｃＧＳＲＹＦと記す）。
【０１０６】
（４）本発明形質転換体の調製及び還元反応例
プラスミドｐＴｒｃＧＳＲＹＦを用いてE．coli HB101を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ）に接種し、振盪培養した（３０℃、１７時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体０．４９ｇを得た。
２−オキソ−４−フェニル酪酸エチル３．０ｇ、上記湿菌体０．４９ｇ、ＮＡＤ+３．０ｍｇ、グルコース４．５ｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３０ｍｌを混合し、３０℃で２７時間攪拌した。なお、攪拌中は反応液のｐＨが７．０となるように２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を徐々に加えた。その後、反応液に酢酸エチルを５０ｍｌ添加した後、遠心分離し、有機層を得た。この有機層を、硫酸マグネシウムにて脱水し、酢酸エチルを留去した結果、２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルを２．４ｇ得た。得られた２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルの光学純度を測定したところ（Ｒ）体が９８．５ ％ｅ．ｅ．であった。
【０１０７】
（含量分析条件）
カラム：ＤＢ−１（０．５３ｍｍ×３０ｍ、１．５μｍ）（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
カラム温度：５０℃（０分）→４℃／分→１７０℃（０分）→３０℃／分→２９０℃（４分）
キャリアーガス：ヘリウム（カラム流量：１０ｍｌ／分）
検出器：ＦＩＤ
【０１０８】
（光学純度測定条件）
カラム：Ｃｈｉｒａｓｉｌ−Ｄｅｘ−ＣＢ（０．３２ｍｍ  ｘ２５ｍ、０．２５μｍ）（ＣＨＲＯＭＰＡＣＫ社製）
カラム温度：１００℃（０分）→２℃／分→１８０℃（０分）
キャリアーガス：ヘリウム（カラム流量：１．５ｍｌ／分）
検出器：ＦＩＤ
スプリット比：１/５０
尚、生成物の絶対立体配置は（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルの標品と比較することにより決定した。
【０１０９】
実施例４  (本発明形質転換体の還元反応例（その２）) 
プラスミドｐＴｒｃＧＳＲＹＦを用いてE．coli HB101を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ）に接種し、振盪培養した（３０℃、１７時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体０．４９ｇを得た。
２−オキソ−４−フェニル酪酸エチル３．０ｇ、上記湿菌体０．４９ｇ、ＮＡＤ+３．０ｍｇ、グルコース４．５ｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３０ｍｌ、酢酸ブチル６ｍｌを混合し、３０℃で９時間攪拌した。なお、攪拌中は反応液のｐＨが７．０となるように２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を徐々に加えた。その後、反応液に酢酸エチルを５０ｍｌ添加した後、遠心分離し、有機層を得た。この有機層を、硫酸マグネシウムにて脱水し、酢酸ブチルおよび酢酸エチルを留去した結果、２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルを３．０ｇ得た。得られた２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルの光学純度を測定したところ（Ｒ）体が１００ ％ｅ．ｅ．であった。
【０１１０】
（含量分析条件）
カラム：ＤＢ−１（０．５３ｍｍ×３０ｍ、１．５μｍ）（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
カラム温度：５０℃（０分）→４℃／分→１７０℃（０分）→３０℃／分→２９０℃（４分）
キャリアーガス：ヘリウム（カラム流量：１０ｍｌ／分）
検出器：ＦＩＤ
【０１１１】
（光学純度測定条件）
カラム：Ｃｈｉｒａｓｉｌ−Ｄｅｘ−ＣＢ（０．３２ｍｍ×２５ｍ、０．２５μｍ）（アステック社製）
カラム温度：１００℃（０分）→２℃／分→１８０℃（０分）
キャリアーガス：ヘリウム（圧力５５Ｋｐａ）
検出器：ＦＩＤ
スプリット比：１/５０
尚、生成物の絶対立体配置は（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルの標品と比較することにより決定した。
【０１１２】
「配列表フリーテキスト」
配列番号４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５
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配列番号７
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配列番号８
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配列番号１０
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配列番号１１
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配列番号１２
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配列番号１３
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配列番号１５
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配列番号１６
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配列番号１７
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