(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
0004658281.tif 000013
［上記式において、Ｚ1はＯＲ3及びＳＲ3から選択される基であり、
Ｒ3はアルキル基、塩素で置換されたかまたは無置換のアリール基、及び、アラルキル基から選択され、
Ｒ1及びＲ2は、別個に、アルキル基（一緒になってシクロアルキル基を形成してもよい）、アリール基、及び、アラルキル基から選択され、そして、
Ｍは水素原子、並びに、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、アンモニウムイオン、第４級アンモニウムイオン、第４級ホスホニウムイオン、及び、ジカチオン性のアンモニウム又はホスホニウム化合物から選択されるカチオンから選択される］を有する化合物。
【請求項２】
Ｒ1及びＲ2の各々がアルキル基である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｚ1がＯ−Ａｒ及びＳ−Ａｒ基［Ａｒは塩素で置換されたかまたは無置換のアリール基］から選択される、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
Ａｒがフェニル、塩素で置換されたフェニル及びナフチルから選択される請求項３記載の化合物。
【請求項５】
Ｚ1がＳ−Ａｒ基であり、Ｒ1及びＲ2の各々がメチル基であり、そして、Ｍが水素原子及びアルカリ金属イオンから選択される、請求項２記載の化合物。
【請求項６】
下記式：
【化２】
0004658281.tif 000014
を有する請求項５記載の化合物。
【請求項７】
下記式：
【化３】
0004658281.tif 000015
を有する請求項５記載の化合物。
【請求項８】
下記式：
【化４】
0004658281.tif 000016
を有する請求項５記載の化合物。
【請求項９】
水性溶液中に
ａ）少なくとも１つの
【化５】
0004658281.tif 000017
［上記式において、Ｚ1はＯＲ3及びＳＲ3から選択される基であり、
Ｒ3はアルキル基、塩素で置換されたかまたは無置換のアリール基、及び、アラルキル基から選択され、
Ｒ1及びＲ2は、別個に、アルキル基（一緒になってシクロアルキル基を形成してもよい）、アリール基、及び、アラルキル基から選択され、そして、
Ｍは水素原子、並びに、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、アンモニウムイオン、第４級アンモニウムイオン、第４級ホスホニウムイオン、及び、ジカチオン性のアンモニウム又はホスホニウム化合物から選択されるカチオンから選択される］、及び、
ｂ）ルシゲニン、ベーシックブルー４１、ベーシックブルー６６及びメチレンブルーから選択されるカチオン性芳香族化合物を含む試薬組成物。
【請求項１０】
非イオン性界面活性剤を更に含む請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン化アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化エーテル及びポリオキシエチレン化ソルビトールエステルから選択される請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
Ｒ1及びＲ2が各々アルキル基である請求項９記載の組成物。
【請求項１３】
Ｚ1がＯ−Ａｒ及びＳ−Ａｒ基［Ａｒは塩素で置換されたかまたは無置換のアリール基］から選択される、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
Ａｒがフェニル、塩素で置換されたフェニル及びナフチルから選択される請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
Ｚ1がＳ−Ａｒ基であり、Ｒ1及びＲ2の各々がメチル基であり、そして、Ｍが水素原子及びアルカリ金属イオンから選択される、請求項１２記載の組成物。
【請求項１６】
式Ｉの化合物が式
【化６】
0004658281.tif 000018
を有する請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
式Ｉの化合物が式
【化７】
0004658281.tif 000019
を有する請求項１５記載の組成物。
【請求項１８】
式Ｉの化合物が式
【化８】
0004658281.tif 000020
を有する請求項１５記載の組成物。
【請求項１９】
ホスファターゼ酵素と下記式：
【化９】
0004658281.tif 000021
［上記式において、Ｚ1はＯＲ3及びＳＲ3から選択される基であり、
Ｒ3はアルキル基、塩素で置換されたかまたは無置換のアリール基、及び、アラルキル基から選択され、
Ｒ1及びＲ2は、別個に、アルキル基（一緒になってシクロアルキル基を形成してもよい）、アリール基、及び、アラルキル基から選択され、
Ｍは水素原子、並びに、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、アンモニウムイオン、第４級アンモニウムイオン、第４級ホスホニウムイオン、及び、ジカチオン性のアンモニウム又はホスホニウム化合物から選択されるカチオンから選択される］を有する化合物とを反応させることを含む化学発光生成方法。
【請求項２０】
前記フォスファターゼ酵素がバクテリアアルカリフォスファターゼ、動物アルカリフォスファターゼ、植物酸フォスファターゼ、動物酸フォスファターゼ及びアルカリフォスファターゼ複合体（conjugates）からなる群から選択される請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記フォスファターゼ酵素がアルカリフォスファターゼである請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記アルカリフォスファターゼ複合体が、ハプテン、抗体、蛋白、核酸及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択された生物学的分子に結合したアルカリフォスファターゼを含む請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
化学発光アッセイ法によって試料中の分析物を検出する方法であって、（ａ）少なくとも１つの式Ｉ：
【化１０】
0004658281.tif 000022
［上記式において、Ｚ1はＯＲ3及びＳＲ3から選択される基であり、
Ｒ3はアルキル基、塩素で置換されたかまたは無置換のアリール基、及び、アラルキル基から選択され、
Ｒ1及びＲ2は、別個に、アルキル基（この場合は一緒になってシクロアルキル基を形成してもよい）、アリール基、及び、アラルキル基から選択され、
Ｍは水素原子、並びに、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、アンモニウムイオン、第４級アンモニウムイオン、第４級ホスホニウムイオン、及び、ジカチオン性のアンモニウム又はホスホニウム化合物から選択されるカチオンから選択される］の化合物を、もし前記試料中に存在しない場合は化学発光を生成させるためのフォスファターゼ酵素と共に、前記試料に接触させ、（ｂ）化学発光を検出し；そして（ｃ）化学発光量を前記試料中の前記分析物の量に関連づけることを含む方法。
【請求項２４】
検出されるべき前記分析物がフォスファターゼ酵素である請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
検出されるべき前記分析物が前記酵素の阻害剤である請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
前記試料中の前記分析物を、当該分析物と特異的に結合する分析物結合化合物と反応させることを更に含み、しかも、当該分析物結合化合物がアルカリフォスファターゼと結合している、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
前記分析物結合化合物がハプテン、抗体、蛋白、核酸及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択される請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記フォスファターゼ酵素が前記分析物に標識として直接取り付けられている請求項２３記載の方法。
【請求項２９】
前記試料中の前記分析物を、分析物結合化合物、並びに、フォスファターゼが結合されており当該分析物結合化合物に特異的に結合する物質と反応させることを更に含む請求項２３記載の方法。
【請求項３０】
前記試料中の前記分析物を（ａ）前記分析物及び少なくとも１つの第２の特異結合物質と特異的に結合する分析物結合化合物を含む標識された分析物結合化合物；及び（ｂ）フォスファターゼ標識された、前記第２の特異結合物質の結合パートナー；と反応させることを更に含む請求項２３記載の方法。
【請求項３１】
前記検出が膜上で行われる請求項２３記載の方法。
【請求項３２】
式Ｉの化合物を、水性溶液中に式Ｉの化合物及びカチオン性芳香族化合物を含む試薬組成物で提供することを更に含み、
前記カチオン性芳香族化合物が、ルシゲニン、ベーシックブルー４１、ベーシックブルー６６及びメチレンブルーから選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項３３】
前記化学発光が電荷対デバイス（charge-coupled device）又は赤色感受性フォトダイオードによって検出される請求項２３記載の方法。
【請求項３４】
下記式：
【化１１】
0004658281.tif 000023
［上記式において、Ｚ1はＯＲ3及びＳＲ3から選択される基であり、
Ｒ3はアルキル基、塩素で置換されたかまたは無置換のアリール基、及び、アラルキル基から選択され、Ｒ1及びＲ2は、別個に、アルキル基、アリール基、及び、アラルキル基から選択され、また、Ｒ1及びＲ2は一緒になってのシクロアルキル基を形成してもよく、
Ｒ4はトリアルキルシリル基、アルキルジアリールシリル基、アルキルカルボニル基及びアリールカルボニル基から選択される基であり、
Ｒ5基の一つは、アルキル、トリアルキルシリル、アルキルジアリールシリル及びアラルキル基から選択される保護基であり、Ｒ5基の他方は、アルキル、トリアルキルシリル、アルキルジアリールシリル及びアラルキル基又はアルカリ金属イオンから選択される］を有する化合物。
【請求項３５】
両方のＲ5基が２−シアノエチル基である請求項３４記載の化合物。
【請求項３６】
Ｒ4がピバロイル基及びｔ−ブチルジフェニルシリル基から選択される請求項３４記載の化合物。
【請求項３７】
Ｚ1がＳ−Ａｒ基であり、Ｒ1及びＲ2の各々がメチル基であり、そして、Ａｒがフェニル、４−クロロフェニル及び２−ナフチルから選択される、請求項３４記載の化合物。
【請求項３８】
Ｚ1がＳ−Ａｒ基であり、Ｒ1及びＲ2の各々がメチル基であり、そして、Ａｒがフェニル、４−クロロフェニル及び２−ナフチルから選択される、請求項３６記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フォスファターゼ酵素と反応して化学発光を生じさせる化学発光化合物及び組成物に関する。本発明はさらに赤色の化学発光を生成させる方法に関する。また、本発明はイムノアッセイ、核酸プローブアッセイ等の分析（assay）において上記酵素或いは酵素標識した特異結合パートナーを検出するためのこれらの方法の使用にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
化学発光を検出する様々な手段が公知であり、また、商業的に使用されている。最も簡便な手段は、通常、カメラ(CCDカメラ）に組み込まれている電荷対デバイス（charge-coupled device：CCD）である。このタイプのデバイスは事実上どのような形状の対象物であろうと定量的なイメージングを可能とし、また、コンピュータを用いたデータ保存及び操作が簡単であるので急速に多くの研究所に導入されている。ＣＣＤの特徴は赤色光に対する優れた感受性にある。残念なことに、酵素の定性的及び定量的な検出に現在利用可能な化学発光化合物は青又は緑に発光する。ＣＣＤの検出感度はその波長では著しく悪化する。したがって、ＣＣＤ検出技術の利点を十分引き出すためにスペクトル中で赤色の領域の光を生成する化学発光化合物が求められていた。
【０００３】
アルカリフォスファターゼ（AP）は生物学的分子、並びに、薬物、ホルモン、ステロイド及び癌マーカーのような他の興味ある分析物の酵素結合アッセイにおけるマーカー又はラベルとして頻繁に使用されている。この酵素の化学発光検出は、試料中の酵素の量、或いは、酵素標識された分析物又は分析物と特異的に結合する標識されたパートナーの量の定量的な測定を可能とする、安全、簡便かつ高感度の手段を提供する。商業的に使用されている化学発光酵素基質は赤色の化学発光を生成しない。赤色の化学発光を生じさせることの可能な基質はＣＣＤ検出と連係して使用されると有利であると思われる。そのような基質は高い効率で、しかも、長い間持続して赤色の化学発光を生成することが好ましいと考えられる。これらの要求の双方とも本発明の化合物及び組成物によって満たされる。
【０００４】
本出願人の公開された国際特許出願WO97/26245はフォスファターゼとの反応によって光を発生させる化学発光複素環式化合物を開示している。そして、ありうる複素環断片は２−（４−ヒドロキシ−２−ベンゾチアゾリル）−２−チアゾリル基（ルシフェリン基）を含んでいる。
【０００５】
ルシフェリンと命名された、様々な種類の甲虫が有している発光化合物は、ルシフェラーゼによって酸化されて緑色からオレンジ色の範囲で生体内生物発光を生じさせる。赤色の化学発光は、試験管内で天然のルシフェリンとルシフェラーゼをｐＨ＜７で使用して、DMSO又は水性ベース中でルシフェリンを自動酸化させることによって得ることができる（W. D. McElroy, H. H. Seliger, E. H. White, Photochem. Photobiol., 10, 153-170 (1969)）。４，６−ジヒドロキシルシフェリン及び６−アミノルシフェリンのようなルシフェリンの合成類似体はルシフェラーゼと反応して赤色の生物発光を生じさせることが報告されている（E. H. White, H. Worther, J. Org. Chem. 31, 1484-1488(1966); E. H. White, H. Worther, H. H. Seliger, W. D. McElroy, J. Am. Chem. Soc., 88, 2015-2019(1966)）。別の類似体である５，５−ジメチルルシフェリンは酸化DMSO又は水性アルカリ溶液中で赤色の化学発光を行うが、ルシフェラーゼと一緒に生物発光を生じさせることはない（T. A. Hopkins, H. H. Seliger, E. H. White, M. W. Cass, J. Am. Chem. Soc., 89, 7148(1967)）。上記した赤色放射生物又は化学発光反応のいずれもイムノアッセイやDNAプローブアッセイのような酵素標識アッセイにおいて商業的に有用であるとされなかったことは重要であり、特記すべきである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、フォスファターゼ酵素と反応して赤色の化学発光を生成する化合物及び組成物を提供することである。
本発明は、フォスファターゼ酵素と反応して、酵素複合体の検出用の赤色の化学発光を生成する化合物及び組成物を提供することをも目的とする。
本発明の目的は、フォスファターゼ酵素と反応して、長時間持続する赤色の化学発光を生成する化合物及び組成物を提供することである。
本発明は、CCDカメラ及び光度計を含む電荷対デバイス（CCD）での検出のために、フォスファターゼ酵素と反応して赤色の化学発光を生成する化合物及び組成物を提供することをも目的とする。
そして、本発明の目的は、化学発光化合物の合成に中間体として有用な化合物を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】
定義：
「アルキル」−１〜２０の炭素を含む分岐状、直鎖状又は環状の炭化水素基。
ここで使用される低級アルキルは炭素を８まで含むアルキル基である。
【０００８】
「アルケニル」−少なくとも１つのＣ−Ｃ二重結合と２〜２０の炭素を含む分岐状、直鎖状又は環状の炭化水素基。ここで使用される低級アルケニルは炭素を８まで含むアルケニル基である。
【０００９】
「アルキニル」−少なくとも１つのＣ−Ｃ三重結合と２〜２０の炭素を含む分岐状又は直鎖状の炭化水素基。ここで使用される低級アルキニルは炭素を８まで含むアルキニル基である。
【００１０】
「分析物」−試料中の存在又はその量がアッセイ（分析）によって測定されるべき物質。特異的な結合親和性を有する特異結合パートナーが存在する有機及び生物学的分子が分析物に含まれる。典型的な分析物には、制限はないが、一本鎖又は二本鎖DNA、RNA、DNA-RNA複合体、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、抗体−DNAキメラ、抗原、ハプテン、蛋白、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン及びビオチンが含まれる。他の典型的な分析物としては加水分解酵素、加水分解酵素の阻害剤及びジヒドロキシ芳香族化合物も含まれる。
【００１１】
「アリール」−１〜５の炭素環又は複素環式芳香族環を含む芳香族環含有基であり、それらの環は水素原子以外の１又はそれ以上の置換基によって置換されてもよい。典型的なアリール基には、フェニル、ナフチル、ピリジル、キノリル、フリル、チオフェニル及びピロリルが含まれる。
【００１２】
「カチオン中心」−カチオン中心とは、正に荷電した原子又は原子団、或いは、１つ又はそれ以上の正電荷のサイトを有する分子の一部を意味する。典型的なカチオン中心は、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、アンモニウム、第４級アンモニウム及び第４級ホスホニウムイオン、ジカチオン性アンモニウム又はホスホニウム化合物、及び、複数のカチオン性基を有する重合体化合物が含まれる。カチオン中心はそれらの「価（valence）」に応じた数で存在する。
【００１３】
「ハロゲン」−フッ素、塩素、臭素又はヨウ素原子である。
【００１４】
「発光」−電子的な励起状態に励起されたときに光を放射すること。光は、一重項励起状態から減衰するときには蛍光として、或いは、三重項励起状態から減衰するときには燐光として放射される。
【００１５】
「試料」−分析されるべき１つ又はそれ以上の分析物を含む、或いは、含んでいると思われる流体。化学発光反応法によって分析される典型的な試料は血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、細胞分離物（cell lysates）、組織抽出物等の体液を含む生物学的試料である。他のタイプの試料は土壌又は水等の環境的試料及び食品試料を含む。
【００１６】
「特異結合対」−相互結合親和性を示す二つの物質。例としては、抗原−抗体、ハプテン−抗体又は抗体−抗体対、相補的なオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン−受容体、レクチン−炭水化物、IgG−プロテインＡ、核酸−核酸結合蛋白及び核酸−抗核酸抗体が含まれる。
【００１７】
「置換（され）」−ある基上の少なくとも１つの水素原子が非水素原子基によって置き換えられることをさす。置換された基に関して注意すべきことは、明示がなければ、複数の置換部位が存在することができるというつもりであるということである。
【００１８】
下記式Ｉの化合物がフォスファターゼ酵素と反応すると高い強度の赤色の化学発光を生成することが見い出された。更に、式Ｉの化合物は予期しないほど長時間にわたって化学発光を行うことも発見された。式Ｉ：
【化１２】
0004658281.tif 000002
において、Ｚ1及びＺ2の一つは式ＯＰＯ（ＯＭ）2を有する基であり、他方はＯＲ3及びＳＲ3から選択される基である。Ｒ3は置換又は無置換アルキル基、置換又は無置換アリール基、及び、置換又は無置換アラルキル基から選択される。Ｒ1及びＲ2は、別個に、水素原子、置換又は無置換アルキル基、置換又は無置換アリール基、置換又は無置換アラルキル基から選択され、また、Ｒ1及びＲ2は一緒になって置換又は無置換のシクロアルキル基を形成してもよい。Ｍは水素原子及びカチオン中心から選択される。
【００１９】
式Ｉの化合物の好ましいクラスは下記の構造ＩＩを有しており、ここで、Ｒ1及びＲ2はアルキル基である。
【化１３】
0004658281.tif 000003
【００２０】
式Ｉの他の好ましい化合物は下記の構造ＩＩＩ及びＩＶを有しており、Ｒ1及びＲ2はアルキル基であり、Ｚ1はＯ−Ａｒ及びＳ−Ａｒ基から選択される。ここで、Ａｒは置換又は無置換アリール基である。
【化１４】
0004658281.tif 000004
【００２１】
好ましいＲ1及びＲ2は、それぞれ、１〜８の炭素原子を有する低級アルキル基であり、より好ましくは１〜４の炭素原子を有する低級アルキル基であり、さらに好ましくは、メチル基である。Ｍは好ましくはアルカリ金属カチオンであり、より好ましくはリチウム、ナトリウム又はカリウムイオンである。アリール基Ａｒは好ましくは置換又は無置換フェニル或いは置換又は無置換ナフチル基である。
【００２２】
Ｍが水素又はアルカリ金属イオンである化合物はその高い水溶性のために、中性からアルカリ性のｐＨの水性溶液中での使用に好適である。そのような化合物は溶液中でイオン化するようなイオン性基を有しており、それ自体が溶液中でイオン化し、そして、緩衝塩を含む利用可能な反対の電荷のイオンと可逆的にイオン対をつくることがわかる。
【００２３】
式Ｉの化合物とフォスファターゼ酵素との反応によって赤色の化学発光が開始されるということは、二重結合異性体のいずれも、また、その二つの異性体のどのような割合の混合物も使用することができるということを意味する。ここで二重結合異性体とは環外の二重結合の一方の末端での置換基の交換によって形成される二つの幾何異性体をさす。
【化１５】
0004658281.tif 000005
【００２４】
式Ｉ〜ＩＶのいずれの化合物もフォスファターゼ酵素との反応によって赤色の化学発光を生成するのに有用である。式Ｉの化合物と酵素との反応は簡単に検出できる赤色の化学発光を生成する。反応がアルカリのｐＨで行われると光強度は室温で数分以内に最大レベルに到達する。反応は任意にエンハンサー（enhancer）の存在下で行われる。
【００２５】
本発明の方法で放射される光は適当な公知の手段によって検出することができるが、最も有利なのはＣＣＤ又は赤色感受性フォトダイオードによる検出である。検出装置の選択はその応用及び費用を考慮して行われるであろうし、利便性及び永久的な記録の作成が求められるかどうかにも支配されるであろう。ＣＣＤに基づく検出器の赤色感受性は本発明の方法に従って生成される赤色の化学発光に最も有利である。ＣＣＤ画像化と酵素的な赤色化学発光の生成の組み合わせは、サザン、ノザン及びウェスタンブロッティングのようなブロッティング技術を使用するときに、核酸及び蛋白分析物の検出用の予期せぬ強力な道具となる。ＣＣＤカメラ画像システムによって画像化したときの検出感受性、信号強度及び持続性は他の商業的に使用されている化学発光フォスファターゼ基質の性能を越えることができる。
【００２６】
本発明の方法では、化合物Ｉが化学発光を生じさせるためにフォスファターゼ酵素と反応する。好ましい方法では、化合物Ｉはリン酸塩基を有しており、赤色の化学発光を生成させるための反応はｐＨ８〜１０のアルカリ性緩衝液中で行われる。分析感度は以下に詳細に記載されるような様々な補助試薬を加えることで増大させることができる。酵素反応は５〜５０℃、好ましくは２０℃〜４０℃で、ｐＨ７〜１０．５、好ましくは８．５〜１０の水性緩衝溶液中で行われる。化合物Ｉは、１μＭ〜２０ｍＭの間、好ましくは１０μＭ〜１ｍＭの間の濃度で使用される。
【００２７】
本発明の化学発光反応で有用なフォスファターゼ酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ等の微生物源からのアルカリフォスファターゼ、動物アルカリフォスファターゼ、植物又は動物源からの酸フォスファターゼ、及び、そのような酵素の複合体を含む。
【００２８】
フォスファターゼ酵素と化学発光物質の反応混合物へのあるカチオン性芳香族化合物の導入は化学発光量を著しく増大させる。有効なカチオン性芳香族化合物のリストは公開された本出願人のＰＣＴ出願WO97/26245に記載されている。好ましい化合物には、ルシゲニン、ベーシックブルー４１、ベーシックブルー６６及びメチレンブルーが含まれる。非イオン性界面活性剤は分析感度を改善するために本願の化学発光反応に添加剤として添加することができる。本発明のプラクティスにおいて有用な非イオン性界面活性剤には、例えば、ポリオキシエチレン化アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化エーテル、ポリオキシエチレン化ソルビトールエステル及びポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体が含まれる。
【００２９】
米国特許第５，３９３，４６９号に開示されている重合体化合物を含む、第４級アンモニウム及びホスホニウム塩化合物のようなカチオン性界面活性剤はこの化学発光反応に関して使用することができる。例えば、ポリ（ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）ポリマー等のポリ（ビニルベンジルトリアルキルホスホニウム）ポリマーがあげられる。
【００３０】
本発明での反応は、便利には、酵素で被覆されたビーズ、チューブ、膜又はマイクロウェルプレート等の固体支持部材の表面に接触しうる水性緩衝液等の溶液中で行われる。好適な緩衝液はｐＨを約６〜約１０の間に維持できる、広く使用されている緩衝剤のいずれをも含み、例えば、フォスフェート、ボーレート、カーボネート、トリス（ヒドロキシメチルアミノ）メタン、グリシン、グルカミン（glucamine）、トリシン（tricine）、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（「２２１」）、ジエタノールアミン等がある。緩衝溶液は１つ以上の緩衝化合物の混合物を含むことができる。この点で、本発明の実施の好適な方法は特に意図された使用の要求によって決定される。
【００３１】
この反応はフォスファターゼ酵素によって触媒されるために、検知可能な光を生成させるためには非常に少量の酵素で十分である。０．０１アットモル（１×１０-20モル）での感度が達成されている。そのような少量の酵素の検知能力はこの化学発光技術を酵素結合アッセイを使用する多くのタイプの分析物の高感度分析に好適なものとする。
【００３２】
本発明の化学発光方法の重要な用途は化学発光反応によるアッセイ手法における分析物の存在又はその量の検知である。その方法は分析物を含んでいると思われる試料を、試料中にフォスファターゼ酵素が存在しないならばそれと共に、本発明の化学発光化合物と接触させる工程を含み、定性的な方法では生成した光を検出し、もし定量が求められるなら、生成した光を分析物の量と関連づける工程が含まれる。光強度と分析物量の関係は既知の量の分析物を用いたカリブレーション曲線を構築することによって簡単に見いだすことができる。化学発光化合物は典型的には約１０-5Ｍ〜約１０-2Ｍ、好ましくは、約１０-4Ｍ〜約１０-3Ｍの濃度で使用される。酵素は、溶液中で検出されるときには、好ましくは約１０-9Ｍ以下である。化学発光反応方法によって分析される典型的な試料は血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、ＣＳＦ等の体液や食品及び環境的な試料である。
【００３３】
本発明の方法によって分析可能な分析物は、フォスファターゼ酵素（その場合は付加的な酵素を添加する必要はない）、フォスファターゼ阻害剤、及びフォスファターゼ酵素で直接又は間接に標識可能な様々な種類の有機及び生物学的分子を含む。酵素標識アッセイ及び酵素標識特異結合アッセイの技術及び形式は当該分野で広く知られている。本発明に従ってアッセイ（分析）を行う方法を例証するためにいくつかの例が以下に存在する。
【００３４】
第１の典型的な方法では、フォスファターゼ酵素が分析物に標識として直接取り付けられる。第２の典型的な方法では、フォスファターゼ酵素が分析物に特異的に結合する親和性を有する化合物に取り付けられる。この化合物の例は分析物の酵素標識抗体である。第３の典型的な方法では、分析物に結合する化合物が、当該化合物に特異的に結合する少なくとも１つの酵素標識された物質に結合する。この方法での例には、分析物の標識されていない一次抗体に結合する酵素標識された二次抗体、又は、核酸分析物と相補的な標識されていない第１のオリゴヌクレオチドと１つ又はそれ以上の標識されたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが含まれる。第４の典型的な方法では、分析物に結合する化合物が少なくとも１つの第２の特異結合物質によって標識されうるが、それは当該第２の特異結合物質の酵素標識された結合パートナーと結合する。第４の方法の例は、アビジン標識された抗分析物抗体とビオチン−酵素複合体との反応である。
【００３５】
上記したように、分析物自体が化学発光反応を触媒するために使用されるフォスファターゼ酵素であってもよい。そのようなアッセイ方法は本発明の化学発光反応によってもたされる速度及び感度のために、臨床上の検体の酵素レベルの検知に有用である。酵素アッセイを実施するための技術は周知である。ここに教示される例によって得られる指針によって、試料の調製、試薬の適当な量と比率の決定、反応時間、カリブレーション曲線の構築等の工程を変動させることは当業者の日常的な実験事項的な工夫としての能力の範囲内である。
【００３６】
他の態様では、分析物は酵素阻害剤でありうる。試料中の酵素阻害剤を検知する方法は、その試料を適当な酵素と式Ｉの化合物とを接触させ、化学発光の特性を検知することを含む。阻害定数Ｋｉや阻害の半減期ｔ1/2等の阻害剤の特徴や阻害剤の量の測定は、式Ｉの化合物への酵素の作用によって生成される光を、阻害剤の存在下で、並びに、阻害剤の不存在下で測定し、その結果を比較することによってなされる。阻害剤の存在は、光強度の低下、光強度の低い上昇率又は光放射開始までの時間の遅延、といった作用によって測定することができる。フォスファターゼの阻害剤には、無機フォスフェート及びレバミゾールが含まれる。
【００３７】
別のタイプのアッセイでは、フォスファターゼ酵素が特異結合対の一つのメンバーに結合される。その例は、いわゆる酵素結合イムノソルベントアッセイ或いはＥＬＩＳＡ等の化学発光酵素結合イムノアッセイである。そのようなアッセイは、通常、自動化マルチテストイムノアッセイシステムと同じ様に、マニュアルフォーマットで使用される。典型的なイムノアッセイでは、分析物であるハプテン、抗原又は抗体が、その分析物の酵素標識された特異結合パートナー又は分析物の酵素標識された類似体の存在又は量を検出することによって検定される。イムノアッセイの工程を実施するための様々なアッセイフォーマットは当業者に周知である。これらのアッセイは２つのカテゴリーに広く分類される。競合的アッセイは、分析物及び分析物類似体（例えば、検出可能に標識された分析物分子）と特定の抗体との免疫結合を特徴とする。サンドイッチアッセイは、分析物と、一方が検出可能に標識された二つの抗体の逐次又は同時の結合に帰着する。そこで形成された検出可能に標識された結合対は本発明の化合物及び方法によって検定される。検出可能な標識が酵素である場合、それは直接検出される。検出可能な標識が他の特異結合対のメンバー、例えば、ハプテン、の場合は、その結合パートナーと酵素の複合体がまず反応し、次に、その酵素が本発明の方法によって検出される。測定は、当該分野で広く使用されているビーズ、チューブ、マイクロウェル、磁気粒子、テストストリップ、膜及びフィルター等を含む固体の表面又は支持体に付着した酵素標識種を用いて行うことができる。酵素標識された検出可能な種は溶液中に存在してもよく、また、リポゾームのような有機的なアセンブリ中に含まれていてもよい（この場合は、リポゾームを溶解して酵素を検出可能とする溶解剤が使用される）。
【００３８】
他の典型的な用途はウェスタンブロッティング技術による蛋白の検出である。
蛋白分析物を含む試料が電気泳動的に分離される。分離された蛋白は膜状にブロットされ、特異一次抗体及び当該一次抗体に親和性を有する酵素標識された二次抗体によってプローブされる。標識となる酵素は化学発光反応の触媒によって検出される（化学発光の発生は分析物である蛋白の存在を反映している）。酵素標識された一次抗体、ビオチニル化抗体及びアビジン−ＡＰ等の使用といったこの技術についてのバリエーションは本発明の方法を使用して行うことができるアッセイの範囲に含まれる。
【００３９】
本発明の検出方法の他の応用分野は酵素標識された核酸プローブを用いた核酸の検知である。酵素標識を使用した核酸の分析及び化学発光検出方法はよく確立された技術であり、溶液ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンブロッティングによるＤＮＡ検出、ノザンブロッティングによるＲＮＡ検出、ＤＮＡシークエンス法、ＤＮＡフィンガープリント法、コロニーハイブリダイゼーション及びプラークリフトを含む。酵素標識はプローブオリゴヌクレオチド又は捕捉オリゴヌクレオチドとの直接複合体として存在することができ、又は、公知の技術手法を用いて間接結合手段を介して組み込むことができる。間接結合手段の例はハプテン標識されたオリゴヌクレオチド及び抗ハプテン−酵素複合体、或いは、ビオチン化されたオリゴヌクレオチド及びアビジン−酵素複合体を含む。このような核酸アッセイはブロッティング膜上又は当該分野で公知のビーズ、チューブ、マイクロウェル、磁気粒子又はテストストリップを含む固体表面に付着したオリゴヌクレオチドを使用して溶液中で行うことができる。
【００４０】
本発明に従って行われるアッセイ方法において有用な他の特異結合対は相補的なオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン−受容体、レクチン−炭水化物、ＩｇＧ−プロテインＡ、核酸−核酸結合蛋白、及び、核酸−抗核酸抗体を含む。
【００４１】
他の側面からみれば、本発明は酵素との反応によって化学発光を生成する試薬組成物に関する。フォスファターゼとの反応によって化学発光を生成するために好ましい試薬組成物は約８〜１０の範囲のｐＨを有する水性緩衝液、０．００１−１０ｍＭ、好ましくは０．０１−１ｍＭの範囲の濃度の式Ｉの化合物であって、Ｚ1又はＺ2基の一つとしてリン酸塩基を含む化合物、そして、０．００１−１０ｍＭ、好ましくは０．０１−１ｍＭの範囲の濃度のカチオン性芳香族化合物を含む。
【００４２】
本発明の他の側面は、式Ｉの化合物の調製における合成中間体として有用な式Ｖの化合物を提供することである。
【化１６】
0004658281.tif 000006
式Ｖの化合物において、Ｚ1はＯＲ3及びＳＲ3から選択される基であり、Ｒ3は置換又は無置換アルキル基、置換又は無置換アリール基、及び、置換又は無置換アラルキル基から選択され、Ｒ1及びＲ2は、別個に、水素原子、置換又は無置換アルキル基（この場合は一緒になって置換又は無置換シクロアルキル基を形成してもよい）、置換又は無置換アリール基、及び、置換又は無置換アラルキル基から選択され、そして、Ｒ4はトリアルキルシリル基、アルキルジアリールシリル基、アルキルカルボニル（例えばアセチル及びピバロイル）基及びアリールカルボニル（例えばベンゾイル）基から選択される保護基であり、Ｒ5の一つは置換アルキル、トリアルキルシリル、アルキルジアリールシリル及びアラルキル基から選択される保護基であり、他方のＲ5は置換アルキル、トリアルキルシリル、アルキルジアリールシリル及びアラルキル基又はアルカリ金属イオンから選択される基であり、Ｒ5基として使用可能な典型的な置換アルキル基は２−シアノエチル及び２−トリメチルシリルエチル基を含む。
【００４３】
本発明の様々な側面をより十分に記述するために、下記に実施例が存在するが、これは本発明の範囲をどのように制限するものでもない。
【００４４】
【実施例】
実施例１．合成
下記の化合物が以下のように調製された。
【化１７】
0004658281.tif 000007
【化１８】
0004658281.tif 000008
ｐＨ＝フェニル、４−ＣｌＣ6Ｈ4−Ｓ＝ｐ−クロロフェニルチオ、Ｎｐ＝２−ナフチル、Ｐｉｖ＝ピバロイル（トリメチルアセチル）、ＴＢＤＰＳ＝ｔ−ブチルジフェニルシリルである。
【００４５】
化合物１−１３の合成では、二つの異性体が生成しうる。二つの異性体が分離されたとき、それらは、シリカゲルクロマトグラフィにおいて溶出する順序に基づいて異性体１及び異性体２と称された。仮の立体化学アサイメントが実施例２０に記載されている。
【００４６】
実施例２．化合物５及び１１の合成
２−シアノ−６−ピバロイルオキシベンゾチアゾール：
２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（２．１g、１２．５mmol）の乾燥ＴＨＦの３０ml溶液が不活性雰囲気下でピリジン（２．０g、２５mmol）で処理され、次に、塩化ピバロイル（１．９５g、１６．２mmol）で処理された。この反応系は室温で１５時間撹拌された。次に反応混合物は１００mlの蒸留水で希釈され、この溶液は酢酸エチル（４×５０ml）で抽出された。抽出された有機物は炭酸水素ナトリウム水溶液（２×１００ml）及び蒸留水（１×１００ml）で洗浄され、次いで、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥され、減圧下で濃縮されて３．０gの粘稠なオイルとされた。この物質はシリカゲルでクロマトグラフされ、１０％の酢酸エチル／ヘキサンによって１．８ｇの生成物が溶出した。
1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．３９（ｓ、９Ｈ）；７．３４−７．３８（ｍ、１Ｈ）；７．７４−７．７５（ｄ、１Ｈ）；８．２０−８．２３（ｄ、１Ｈ）。
【００４７】
２−（６−ピバロイルオキシ−２−ベンゾチアゾリル）−５，５−ジメチル−Δ2−チアゾリン−４−カルボン酸：
２−シアノ−６−ピバロイルオキシベンゾチアゾール（１．２５g、４．８mmol）がＭｅＯＨ（３０ml、無酸素）に溶解され、その溶液中にアルゴンを通じた。ＤＬ−ペニシラミン（０．７８９g、５mmol）の１５ml水溶液と５０mgの炭酸ナトリウムにもアルゴンが５〜１０分通じられ、次に、それらは上記ＭｅＯＨ溶液に滴下された。滴下中、白色沈殿が反応混合物中に生成したが、さらに５mlのＭｅＯＨを添加すると再溶解した。この薄い黄色の溶液には室温で４５分間アルゴンが導入された。反応体積は半分に濃縮され、１：１の濃塩酸：タイプＩ水（２ml）によって酸性化された。白色沈殿物が生成し、酢酸エチル中に吸収された。この有機層は水で洗浄され、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥され、濃縮されて１．８６ｇの白色固体が生成した。1ＨＮＭＲ（ＣＤ3ＣＯＣＤ3）：δ１．３７（ｓ、９Ｈ）；１．５５（ｓ、３Ｈ）；１．８２（ｓ、３Ｈ）；５．０１（ｓ、１Ｈ）；７．３４−７．３７（ｄｄ、１Ｈ）；７．９２（ｄ、１Ｈ）；８．０９−８．１３（ｄ、１Ｈ）。
【００４８】
ｐ−クロロフェニル  ２−（６−ピバロイルオキシ−２−ベンゾチアゾリル）−５，５−ジメチル−Δ2−チアゾリン−４−チオカルボキシレート：
ＤＣＣ（０．６８４g、３．３mmol）が２−（６−ピバロイルオキシ−２−ベンゾチアゾリル）−５，５−ジメチル−Δ2−チアゾリン−４−チオカルボキシレート（１．０ｇ、２．５５mmol）の乾燥ＴＨＦ３０ｍｌ溶液に添加され、暗赤色の溶液が生成した。２〜３分後、ｐ−クロロチオフェノール（０．５３３g、３．８mmol）が添加され、淡黄色溶液とされて２時間撹拌された。反応物は−２０℃で１時間放置され、生成した白色沈殿物は濾過された。濾液は乾燥状態になるまで濃縮され、粗生成物はシリカゲルにて３０％のＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサンを用いてクロマトグラフされ、３６０mgの生成物を得た。1ＨＮＭＲ（ＣＤ3ＣＯＣＤ3）：δ１．３７（ｓ、９Ｈ）；１．５４（ｓ、３Ｈ）；１．８３（ｓ、３Ｈ）；５．１５（ｓ、１Ｈ）；７．３７−７．５５（ｍ、５Ｈ）；７．９６−７．９７（ｄ、１Ｈ）；８．１４−８．１７（ｄ、１Ｈ）。
【００４９】
化合物１１：
ジイソプロピルアミン０．１３６ml（０．９７mmol）及び１０mlの乾燥ＴＨＦがシリンジを介して、不活性雰囲気下にある、漏斗を備えた１００mlの三つ首丸底フラスコ中に添加された。溶液は−７８℃に冷却され、その温度でｎ−ブチルリチウム（０．３９ml、０．９７mmol）がシリンジを介して添加され、反応物は１５分間撹拌された。前工程からのチオエステル（０．３６g、０．６９mmol）の１２mlＴＨＦ溶液が反応混合物に１０分にわたって添加され、反応物である暗赤色溶液は−７８℃で１時間撹拌された。乾燥ＴＨＦ０．５ml、ピリジン（０．８ml）及びＰＯＣｌ3（０．１１３ml、１mmol）の溶液が冷却された前記溶液に滴下され、混合物は−７８℃で３０分間撹拌された。反応混合物は室温へ戻された。室温で１時間撹拌した後、２−ヒドロキシプロピオニトリル（０．３３１ml、４．８mmol）が添加され、反応物は２．５時間撹拌された。反応溶液は−２０℃で一晩保管された。沈殿は濾過によって収集され、ＴＨＦによって洗浄されて廃棄された。濾液は濃縮されて得られた物質は酢酸エチルに吸収させて水で洗浄された。この有機層は乾燥及び濃縮され、粗生成物はシリカゲルのカラムでクロマトグラフされた。異性体１は５０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出し、収量は６５．３mgであった。異性体２は７０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出し、収量は５１mgであった。
【００５０】
異性体１：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．３９（ｓ、９Ｈ）；１．９９（ｓ、６Ｈ）；２．７４−２．７８（ｔ、４Ｈ）；４．３０−４．３６（ｍ、４Ｈ）；７．２５−８．１４（ｍ、７Ｈ）。31ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ−９．８２〜−９．５５。
異性体２：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．３９（ｓ、９Ｈ）；１．９５（ｓ、６Ｈ）；２．７４−２．７８（ｍ、４Ｈ）；４．２６−４．４７（ｍ、４Ｈ）；７．２１５−８．１０（ｍ、７Ｈ）。31ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ−９．４４〜−９．１７。
【００５１】
化合物５（異性体１）：
６mlのアセトン中の化合物１１の異性体１の６５．３mg（９３μmol）が氷浴中で０℃に冷却され、アルゴンが導入された。この溶液に１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液２９６μｌ（０．２９mmol）と２９６μｌの水が添加された。前記塩基を添加すると反応混合物の色は暗赤色に変化し、更に、１時間の撹拌によって徐々にオレンジに変化した。１時間後、溶液中に沈殿が生成した。反応混合物は室温で１８時間撹拌に供された。次に、反応混合物は遠心分離され、アセトンで洗浄され、再度遠心分離され、乾燥されて４９mgのオレンジ色の固体を得た（９６％）。1ＨＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：δ１．８６（ｓ、６Ｈ）；６．８５−６．８９（ｄｄ、１Ｈ）；７．０６−７．０７（ｄ、１Ｈ）；７．３４（ｓ、４Ｈ）；７．７２−７．７５（ｄ、１Ｈ）。31ＰＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：０．４０４。
【００５２】
化合物５（異性体２）：
５mlのアセトン中の化合物１１の異性体２の５１mg（９２μmol）が１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液２３２μｌ（０．２３mmol）と２５０μｌの水と同様に反応させられ、３４mgのオレンジ色の固体を得た（８１％）。1ＨＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：δ１．８９（ｓ、６Ｈ）；６．８２−６．８６（ｄｄ、１Ｈ）；７．００（ｄ、１Ｈ）；７．２６−７．４５（ｄｄ、４Ｈ）；７．６４−７．６７（ｄ、１Ｈ）。31ＰＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：０．１０７。
【００５３】
実施例３．化合物２及び８の合成
２−（６−ピバロイルオキシ−２−ベンゾチアゾリル）−Δ2−チアゾリン−４−カルボン酸：
２−シアノ−６−ピバロイルオキシベンゾチアゾール（１．３５g、５mmol）が３０mlのＭｅＯＨに溶解され、溶液にはアルゴンが通じられた。システイン（０．６２９g、５．７mmol）が７mlの水に溶解され、炭酸ナトリウムによって溶液のｐＨは８に調整された。この水溶液はアルゴンで飽和され、上記ＭｅＯＨ溶液に滴下されて添加された。得られた薄い黄色の溶液には室温で３０分間、アルゴンが通じられた。反応物は０℃に冷却され、１：１の濃塩酸：タイプＩ水（１ml）によって酸性化された。溶液は酢酸エチルで希釈され、２０mlの体積まで濃縮され、酢酸エチルで抽出（３×５０ml）された。得られた有機物は水で洗浄され、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥され、濃縮されて１．９６ｇの白色固体を得た。
1ＨＮＭＲ（ＣＤ3ＣＯＣＤ3）：δ１．３７（ｓ、９Ｈ）；３．８２−３．８６（ｄｄ、２Ｈ）；５．４９（ｔ、１Ｈ）；７．３５−７．３８（ｄｄ、１Ｈ）；７．９２−７．９３（ｄ、１Ｈ）；８．１１−８．１４（ｄ、１Ｈ）。
【００５４】
フェニル  ２−（６−ピバロイルオキシ−２−ベンゾチアゾリル）−Δ2−チアゾリン−４−チオカルボキシレート：
ＤＣＣ（０．７３６g、３．５mmol）が、先程のカルボン酸（１．０g、２．７mmol）の乾燥ＴＨＦ溶液２０mlに添加され、暗赤色の溶液を得た。チオフェノール（０．４２３ml、４mmol）が添加されて淡黄色溶液が生成し、２時間撹拌された。副成生物である白色尿素を濾過で収集し、ＴＨＦで洗浄して廃棄した。濾液は減圧下で１０mlの体積へ濃縮された。粗生成物は４mlのヘキサンで希釈されて−２０℃で１８時間保管した。さらなる尿素副成生物は除去されて濾液はヘキサンで数回洗浄された。ヘキサン洗浄物は濃縮され、生成物はシリカゲル上でクロマトグラフされ、３０％ＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサン、その次に、２０％酢酸エチル（ヘキサン中）によって溶出されて１２４mgの生成物を得た。残存する濾液層もシリカゲル上で同様にクロマトグラフされて、生成物がプール（６６０mg）された。1ＨＮＭＲ（ＣＤ3ＣＯＣＤ3）：δ１．３８（ｓ、９Ｈ）；３．８２−３．９７（ｍ、２Ｈ）；５．７７−５．８３（ｍ、１Ｈ）；７．３８−７．４６（ｍ、６Ｈ）；７．９７−７．９８（ｄ、１Ｈ）；８．１５−８．１８（ｄ、１Ｈ）。
【００５５】
化合物８：
不活性雰囲気下にあるジイソプロピルアミン（１３２μｌ、０．９４mmol）の乾燥ＴＨＦ５ｍｌ溶液が−７８℃に冷却され、ｎ−ブチルリチウム（３７６μｌ、０．９４mmol）がシリンジを介して添加された。反応物が１５分間冷却された後、チオエステル（３３０mg、０．７２mmol）のＴＨＦ溶液１０mlが反応混合物に滴下されて添加された。生成した暗赤色の溶液は−７８℃で５０分間撹拌された。ピリジン（０．５８ml、７．２mol）の溶液と、乾燥ＴＨＦ２ml中のＰＯＣｌ3（１１８μｌ、１．２mmol）が冷却された上記溶液に滴下され、混合物は−７８℃で更に４５分間撹拌された。そして、冷却浴は除去されて反応混合物は室温へ戻されたが、その間に、反応混合物は暗赤色からオレンジ色へ変化した。反応物は氷浴中で短時間冷却され、２−ヒドロキシプロピオニトリル（３６０mg、５mmol）が反応物に注入され、次いで、３００μｌのピリジンが注入された。反応物は室温で１８時間撹拌された。沈殿物は濾過によって収集され、ＴＨＦで洗浄されて廃棄された。濾液は減圧下で濃縮し、残渣は酢酸エチルに吸収させて水で洗浄された（２×５０ml）。有機層は乾燥及び濃縮されて、粗生成物はシリカゲルのカラムに担持された。カラムからは７５〜８０％の酢酸エチル／ヘキサンによって二つの異性体が溶出した。異性体１及び２は分取（prep.）ＴＬＣによってそれぞれ純化され、異性体１は６０％の酢酸エチル／ヘキサンで溶出し、５mgが得られた。異性体２は７５％の酢酸エチル／ヘキサンで溶出し、９mgが得られた。
【００５６】
異性体１：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．３９（ｓ、９Ｈ）；２．７７（ｔ、４Ｈ）；４．３３−４．４５（ｍ、６Ｈ）；７．２６−７．４８（ｍ、６Ｈ）；７．６９−７．７０（ｄ、１Ｈ）；８．１３−８．１６（ｄ、１Ｈ）。31ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：−９．６７〜（−９．３９）。
異性体２：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．３９（ｓ、９Ｈ）；２．６７−２．７６（ｍ、４Ｈ）；４．２０−４．３０（ｍ、４Ｈ）；４．５５−４．５７（ｄ、２Ｈ）；７．３２−７．４９（ｍ、６Ｈ）；７．６６−７．６７（ｄ、１Ｈ）；８．１１−８．１５（ｄ、１Ｈ）。31ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：−９．５６〜（−９．３２）。
【００５７】
化合物２（異性体１）：
５mlのアセトン中の４．５mgの化合物８（異性体１、７．０μmol）が氷浴中で０℃に冷却され、アルゴンが通じられた。この溶液に、０．２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液１１２μl（２２μmol）及び１１２μlの水が添加された。反応混合物の色は塩基の添加によって暗赤色に変化し、撹拌によって徐々にオレンジ色となった。反応混合物は室温でアルゴン下、１８時間撹拌された。反応混合物中に沈殿が見られたので、沈殿を動かさずに溶液を移し、残った固体物質はアセトンで洗浄され、遠心分離され、乾燥されて２．５mgの固体とされた。1ＨＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：δ４．２５（ｄ、２Ｈ）；６．８５−７．７５（ｍ、８Ｈ）。
【００５８】
化合物２（異性体２）：
５mlのアセトン中の９mgの化合物８（異性体２、１４μmol）が０．２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液２２４μl（４５μmol）及び２２５μlの水と同様に反応させられ、６．４mgの固体を得た。1ＨＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：δ４．５０−４．５２（ｄ、２Ｈ）；６．８２−７．７２（ｍ、８Ｈ）。
【００５９】
実施例４．化合物４及び１３の合成
２−シアノ−６−ｔ−ブチルジフェニルシロキシ−ベンゾチアゾール：
２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（５．０g、２８mmol）の１００mlの無水ＤＭＦ溶液が不活性雰囲気下で２．９gのイミダゾール（４．２mmol）、続いて、ｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（９．３４g、３４mmol）によって処理された。反応物は室温で３時間撹拌されて、次に２００mlの酢酸エチルで希釈され、水で洗浄された（４×４００ml）。有機層は硫酸ナトリウム上で乾燥され、減圧下で濃縮された。粗生成物はカラムクロマトグラフィによって純化され、５−１０％の酢酸エチル／ヘキサンで溶出されて、収量で１０％以下のシリル不純物を含む目的物を１３．０g得た。目的物は更なる純化を必要としなかった。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．１２（ｓ、９Ｈ）；７．１３−７．４６（ｍ、８Ｈ）；７．７０−７．７２（ｍ、４Ｈ）；７．９２−７．９５（ｄ、１Ｈ）。
【００６０】
２−（６−ｔ−ブチルジフェニルシロキシ−２−ベンゾチアゾリル）−５，５−ジメチル−Δ2−チアゾリン−４−カルボン酸：
２−シアノ−６−ｔ−ブチルジフェニルシロキシベンゾチアゾール（１３．０g、３１mmol）が三つ首丸底フラスコ中のＭｅＯＨ（５００ml、酸素なし）に溶解され、この溶液にアルゴンが通じられた。ＤＬ−ペニシラミン（４．９g、３３mmol）が９０mlの水に溶解され、炭酸ナトリウムによってこの溶液のｐＨは８に調整された。この水性溶液はアルゴンで飽和させられ、上記ＭｅＯＨ溶液に滴下されて添加された。反応物には室温で１．５時間にわたってアルゴンが導入された。反応中に生成した粘性沈殿物はＭｅＯＨを１５ml加えて再溶解させられた。反応物は濃縮されてＭｅＯＨの大部分が除去され、残った水性溶液は濃塩酸：タイプＩの水＝１：１（６ml）によって酸性化された。生成した白色沈殿は３５０mlの酢酸エチル中に抽出された。有機層は水で洗浄され（４×２００ml）、硫酸ナトリウム上で乾燥され、濃縮されて、１０％のシリル不純物を含む目的物を１６．０g得た（９４％）。目的物は更なる純化を要することなく採用された。
【００６１】
フェニル  ２−（６−ｔ−ブチルジフェニルシロキシ−２−ベンゾチアゾリル）−５，５−ジメチル−Δ2−チアゾリン−４−チオカルボキシレート：
ＤＣＣ（０．６３５g、３mmol）が上記カルボン酸（１．３g、２．４mmol）の乾燥ＴＨＦ３０ml溶液に添加された。チオフェノール（０．４６８g、４．３mmol）が添加され、反応物は２時間撹拌された。副生成物である白色尿素は収集され、濾過され、そして廃棄された。濾液は減圧下で濃縮されて粘性液体とされ、シリカゲル上でクロマトグラフされ、そこでは過剰のチオフェノールを除去するために５％酢酸エチル／ヘキサンで溶出を行い、次に、１０−１５％の酢酸エチル／ヘキサンで溶出を行って、０．３８gの目的物を得た（２４％）。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．１３（ｓ、９Ｈ）；１．５３（ｓ、３Ｈ）；１．７９（ｓ、３Ｈ）；４．８７（ｓ、１Ｈ）；６．９９−７．０４（ｍ、１Ｈ）；７．２２−７．２３（ｄ、１Ｈ）；７．３２−７．４３（ｍ、１１Ｈ）；７．７０−７．７４（ｍ、４Ｈ）；７．８５−７．８８（ｄ、１Ｈ）。
【００６２】
上記チオエステルの別の合成法：
カルボニルジイミダゾール（１．９２g、１２mmol）が上記カルボン酸（５．０g、９．１mmol）の乾燥ＣＨ3ＣＮ溶液に不活性雰囲気下で添加された。２分の撹拌後、チオフェノール（１．２g、０．０１mol）が添加され、反応物は１時間撹拌された。減圧下で溶媒が除去され、粗固体はシリカゲル上でクロマトグラフされ、そこでは過剰のチオフェノールを除去するために５％酢酸エチル／ヘキサンで溶出が行われ、次いで、１２％酢酸エチル／ヘキサンで溶出が行われ、１．９ｇの目的物を得た（３２％）。
【００６３】
化合物１３：
ジイソプロピルアミン０．７３ml（５mmol）がシリンジを介して５０mlの乾燥ＴＨＦにアルゴン雰囲気下で添加された。溶液は−７８℃に冷却され、ｎ−ブチルリチウム（２．０２ml、５mmol）がシリンジを介して添加された。反応物は２０分間冷却された後、前記チオエステル（２．５g、３．９mmol）の乾燥ＴＨＦ５０ml溶液が、当該反応物に滴下漏斗を介して添加された。溶液は−７８℃で１時間撹拌された。ピリジン（３．０g、３８mmol）とＰＯＣｌ3（０．６ml、６．２mmol）が滴下漏斗に装填され、その混合物は冷却された前記溶液に滴下された。溶液は−７８℃で１５分間撹拌され、その後、氷浴は外され、反応混合物は室温に戻されて１時間撹拌された。ヒドロキシプロピオニトリル（２．８g、３９mmol）が反応物に注入され、当該反応物は室温で４時間撹拌されて４℃で１５時間保管された。反応混合物は減圧下で濃縮され、残存物は１００mlの酢酸エチルに抽出され、水で洗浄された。有機層は乾燥され、減圧下で濃縮され、粗生成物（３g）はカラムクロマトグラフィで１０−８５％酢酸エチル／ヘキサンで溶出されて純化され、０．３８ｇの異性体１と０．９２ｇの異性体２を得た。
【００６４】
異性体１：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．１２（ｓ、９Ｈ）；１．９８（ｓ、６Ｈ）；２．６５−２．６９（ｔ、４Ｈ）；４．１９−４．３８（ｍ、４Ｈ）；６．９８−７．０２（ｍ、１Ｈ）；７．２４−７．４３（ｍ、１２Ｈ）；７．７１−７．７４（ｍ、４Ｈ）；７．８３−７．８６（ｄ、１Ｈ）。31ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：−１０．１３〜（−９．８５）。
異性体２：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．１２（ｓ、９Ｈ）；１．９５（ｓ、６Ｈ）；２．６４−２．６９（ｍ、４Ｈ）；４．１９−４．３５（ｍ、４Ｈ）；６．９７−７．００（ｍ、１Ｈ）；７．１５−７．４３（ｍ、１２Ｈ）；７．６９−７．７２（ｍ、４Ｈ）；７．８０−７．８３（ｄ、１Ｈ）。31ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：−９．７１〜（−９．４５）。
【００６５】
化合物４（異性体１）：
化合物１３（異性体１；０．１５g、０．１８mmol）の８mlアセトン溶液にアルゴンが通じられた。この溶液に、０．６７５Ｎ水酸化ナトリウムの水溶液８００μl（０．５４mmol）が添加された。反応混合物はアルゴン下で１８時間、室温で撹拌された。反応混合物中に沈殿がみられたので、沈殿を動かさないように溶媒が移され、残った固体物質は５mlのアセトンで摩砕された（triturated）。この固体は濾過によって収集され、更にアセトンで洗浄され、乾燥されて１００mgの固体を得た。1ＨＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：δ１．８８（ｓ、６Ｈ）；６．８５−６．８９（ｍ、１Ｈ）；７．０６−７．０７（ｄ、１Ｈ）；７．２２−７．２４（ｔ、１Ｈ）；７．３３−７．３８（ｍ、４Ｈ）；７．７２−７．７５（ｄ、１Ｈ）。31ＰＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：０．３８。
【００６６】
化合物４（異性体２）：
化合物１３（異性体２；０．２１g、０．２６mmol）の８mlアセトン溶液が０．７５Ｎ水酸化ナトリウムの水溶液１．０ml（０．７６mmol）と同様に反応させられ、１２０mgの目的物を得た。1ＨＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：δ１．９０（ｓ、６Ｈ）；６．８０−６．８３（ｄ、１Ｈ）；６．９７（ｓ、１Ｈ）；７．１４−７．１７（ｔ、１Ｈ）；７．２６−７．３１（ｔ、２Ｈ）；７．４６−７．４８（ｄ、２Ｈ）；７．６３−７．６６（ｄ、１Ｈ）。31ＰＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：０．０７。
【００６７】
実施例５．化合物６及び１２の合成
カルボニルジイミダゾール（０．５３７g、３．３mmol）が２−（６−ピバロイルオキシ−２−ベンゾチアゾリル）−５，５−ジメチル−Δ2−チアゾリン−４−カルボン酸（１．０g、２．６mmol）のＣＨ3ＣＮ３０ml溶液に添加され、暗赤色の溶液とされた。チオナフトール（０．６５４g、４mmol）が添加され、薄いオレンジ色の溶液が形成された。溶液は沈殿と粘性を有していたので、ＣＨ3ＣＮが３０ml更に反応物に添加された。２０分後、反応混合物は濾過されて０．８gの白色粉体（1ＨＮＭＲによって純粋な目的物であると分かった）を得た。濾液は濃縮されてシリカゲル上でクロマトグラフされ、そこでは１５％酢酸エチル／ヘキサンを使用した溶出によって更に０．５３gのチオエステルを得た（全量１．３３g、９８％）。1ＨＮＭＲ（ＣＤ3ＣＯＣＤ3）：δ１．３８（ｓ、９Ｈ）；１．５９（ｓ、３Ｈ）；１．８４（ｓ、３Ｈ）；５．１８（ｓ、１Ｈ）；７．３８−７．６２（ｍ、４Ｈ）；７．９７−８．１８（ｍ、６Ｈ）。
【００６８】
化合物１２：
ジイソプロピルアミン１６９μl（１．２mmol）がシリンジを介して不活性雰囲気下で１０mlの乾燥ＴＨＦに添加された。この溶液は−７８℃に冷却され、ｎ−ブチルリチウム（４８２μl、１．２×１０-3mol）がシリンジを介して添加された。反応物を１５分間冷却した後、上記チオエステル（４６０mg、０．８６mmol）の１４mlのＴＨＦ溶液が当該反応混合物にシリンジを介して滴下されて添加された。暗赤色の溶液は−７８℃で１時間撹拌された。ピリジン（１．０ml、１２．９mmol）とＰＯＣｌ3（１４０μl、１．４６mmol）の乾燥ＴＨＦ０．７ml溶液がシリンジを介して滴下されて添加され、混合物は−７８℃で３５分間撹拌された。反応混合物は１時間かけて室温へ戻され、その間に反応混合物は暗赤色から黄色へ変色した。反応物は氷浴中で短時間冷却され、２−ヒドロキシプロピオニトリル（５５０μl、８mmol）が反応物に注入され、氷上で２０分間撹拌され、そして、室温で一晩撹拌された。沈殿物は濾過によって収集され、ＴＨＦで洗浄され、廃棄された。濾液は濃縮されて最終生成物は酢酸エチルに抽出され、水で洗浄された（３×３０ml）。有機層は乾燥・濃縮され粗生成物はシリカゲル上でクロマトグラフされた。異性体１（１０６mg）は５０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出された。異性体２（１００mg）は７０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出され、次いで、分取ＴＬＣによって純化された。
【００６９】
異性体１：1ＨＮＭＲ（ＣＤ3ＣＯＣＤ3）：δ１．３７（ｓ、９Ｈ）；２．０７（ｓ、６Ｈ）；２．８６−２．９０（ｔ、４Ｈ）；４．２８−４．４８（ｍ、４Ｈ）；７．３７−８．１７（ｍ、１０Ｈ）。31ＰＮＭＲ（ＣＤ3ＣＯＣＤ3）：−３．８７〜（−３．６１）。
異性体２：1ＨＮＭＲ（ＣＤ3ＣＯＣＤ3）：δ１．３６（ｓ、９Ｈ）；２．０７（ｓ、６Ｈ）；２．８９−２．９４（ｔ、４Ｈ）；４．３７−４．４８（ｍ、４Ｈ）；７．３２−８．１０（ｍ、１０Ｈ）。31ＰＮＭＲ（ＣＤ3ＣＯＣＤ3）：−３．８７〜（−３．６２）。
【００７０】
化合物６（異性体１）：
化合物１２（異性体１；１０５mg、０．１４mmol）の６mlアセトン溶液にアルゴンが通じられた。この溶液に２Ｎ水酸化ナトリウム２２８μl（０．４５mmol）及び水２５０μlが添加された。反応混合物の色は塩基の添加によって暗赤色に変化した。反応混合物はアルゴン下、室温で１６時間撹拌された。反応混合物中に沈殿がみられたので、沈殿が動かないように溶媒が移され、残った固形物はアセトンで洗浄（２×１．５ml）され、遠心分離され、乾燥されて８６mgの固体を得た。1ＨＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：δ１．８７（ｓ、６Ｈ）；６．８５−７．８７（ｍ、１０Ｈ）。31ＰＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：０．４２５。
【００７１】
化合物６（異性体２）：
化合物１２（異性体２；９６mg、０．１３mmol）の６mlアセトン溶液が異性体１の場合と同様に２ＮＮａＯＨ水溶液２１３μl及び水２５０μlと反応させられ、化合物６の異性体２を７０mg得た。1ＨＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：δ１．９１（ｓ、６Ｈ）；６．７５−６．８２（ｍ、２Ｈ）；７．３２−７．８４（ｍ、７Ｈ）；７．９６（ｓ、１Ｈ）。31ＰＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：０．１５６。
【００７２】
実施例６．化合物１及び７の合成
ＤＣＣ（０．７３６g、３．５mmol）が２−（６−ピバロイルオキシ−２−ベンゾチアゾリル）−Δ2−チアゾリン−４−カルボン酸（１．０g、２．７mmol）の乾燥ＴＨＦ３０ml溶液に添加され、暗赤色の溶液とされた。フェノール（０．３３５mg、３．５mmol）が添加され、反応混合物は１時間撹拌された。副生成物である白色尿素が濾過によって収集され、ＴＨＦで洗浄され、廃棄された。濾液は４℃で一晩保存された。更なる副生成物の尿素が濾過によって除去された。濾液は濃縮され、３０％ＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサン中のシリカゲルのカラム上でクロマトグラフされた。そこでは、３０−７５％ＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサンで溶出が行われ、過剰のフェノールを除去するために最終的にはほぼＣＨ2Ｃｌ2だけで溶出が行われ、そして、次に５％酢酸エチル／ＣＨ2Ｃｌ2で溶出が行われて生成混合物を得た。これらは分取ＴＬＣプレートで更に純化されて、２０％の酢酸エチル／ヘキサンで溶出されて１４０mgの目的物を得た。1ＨＮＭＲ（ＣＤ3ＣＯＣＤ3）：δ１．３７（ｓ、９Ｈ）；３．９９−４．０２（ｄ、２Ｈ）；５．７９（ｔ、１Ｈ）；７．２２−７．４８（ｍ、６Ｈ）；７．９４（ｄ、１Ｈ）；８．１４−８．１６（ｄ、１Ｈ）。
【００７３】
化合物７：
アルゴン下のジイソプロピルアミン６５．４μl（０．４６mmol）の乾燥ＴＨＦ５ml溶液が−７８℃に冷却されてｎ−ブチルリチウム（１８７μl、０．４６mmol）がシリンジを介して添加された。１５分後、上記フェニルエステル（１４０mg、０．３３mmol）のＴＨＦ１０ml溶液がシリンジを介して滴下されて添加された。暗赤色の溶液は−７８℃で１時間撹拌された。ピリジン（５００μl、６．１mmol）及びＰＯＣｌ3（５４．２μl、０．５mmol）の乾燥ＴＨＦ１ml溶液がシリンジを介して滴下されて添加され、混合物は−７８℃で４５分撹拌された。反応混合物は４５分かけて室温に戻された。反応物は短時間氷浴で冷却され、２−ヒドロキシプロピオニトリル（１６６mg、２３mmol）が反応物に注入され、当該反応物は室温で１８時間撹拌された。反応混合物は減圧下で濃縮され、残渣はシリカゲル上で５０％酢酸エチル／ヘキサンを用いてクロマトグラフされ、２つの異性体に分離された。異性体１を含むフラグションは酢酸エチルに抽出され、水で洗浄され乾燥・濃縮された。異性体１は分取ＴＬＣで、６０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出されて１mgに純化された。異性体２は異性体１との混合物としてフラクション中に得られた。
異性体１：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．３９（ｓ、９Ｈ）；２．７５（ｍ、４Ｈ）；４．２５−４．２７（ｄ、２Ｈ）；４．３３−４．３８（ｍ、４Ｈ）；７．１８−８．１５（ｍ、８Ｈ）。
【００７４】
化合物１：
化合物７が、実施例３の手法を用いて、ピバレート（pivalate）基及びシアノエチル保護基のアルカリ加水分解によって化合物１に変換される。
【００７５】
実施例７．化合物３及び９の合成
２−（６−ピバロイルオキシ−２−ベンゾチアゾリル）−Δ2−チアゾリン−４−カルボン酸：
ＤＬ−システイン（０．８４g、６．９mmol）がｐＨ８の酸素なし炭酸ナトリウム溶液３０mlに溶解された。システインが完全に溶解すると、ｐＨは炭酸ナトリウムを添加して再度８に調整された。アルゴンが溶液に５〜１０分通され、その後、２−シアノ−６−ピバロイルオキシベンゾチアゾール（１．８g、６．９mmol）のＭｅＯＨ（１００ml、酸素なし）溶液が当該溶液に添加された。反応物には室温で３５〜４０分アルゴンが通され、時々、振り動かした。そして、反応混合物は０．５mlの濃塩酸と０．５mlの水の溶液で酸性化された。溶液は酢酸エチルですぐに抽出（３×５０ml）され、有機物は水で洗浄され、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥され濃縮されて粘性の赤色液体となった。この液体を４℃で一晩放置させて固化を行い、２．０ｇのオレンジ−ピンク色の固体を得た。1ＨＮＭＲ（ＣＤ3ＣＯＣＤ3）：δ１．３７（ｓ、９Ｈ）；３．８３−３．８６（ｄ、２Ｈ）；５．４７−５．５３（ｔ、１Ｈ）；７．３５−７．３９（ｍ、１Ｈ）；７．９２−７．９３（ｄ、１Ｈ）；８．１２−８．１５（ｄ、１Ｈ）。
【００７６】
ｐ−クロロフェニル  ２−（６−ピバロイルオキシ−２−ベンゾチアゾリル）−Δ2−チアゾリン−４−チオカルボキシレート：
ＤＣＣ（１．４４g、７mmol）が２−（６−ピバロイルオキシ−２−ベンゾチアゾリル）−Δ2−チアゾリン−４−カルボン酸（２．０g、５．４mmol）の無水ＴＨＦ３５ml溶液に添加され、暗赤色の溶液とされた。２〜３分後、ｐ−クロロチオフェノール（１．５８g、１０mmol）が添加されて淡黄色の溶液とされて２時間撹拌された。反応物は−４℃で１時間放置され、生成した白色沈殿（副生成物である尿素）は収集され、ＴＨＦで洗浄（２×１０ml）されて廃棄された。濾液は減圧下で濃縮・乾燥され、粗固体はｐ−クロロチオフェノールを除去するためにヘキサンで洗浄（３×５０ml）された。残った固体は真空下で乾燥されて１．４gの純粋な目的物を得た。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．３９（ｓ、９Ｈ）；３．７９−３．８４（ｍ、２Ｈ）；５．５５−５．６０（ｍ、１Ｈ）；７．２５−７．２８（ｍ、１Ｈ）；７．３４−７．３９（ｍ、４Ｈ）；７．７１−７．７２（ｄ、１Ｈ）；８．１５−８．１８（ｄ、１Ｈ）。
【００７７】
化合物９：
ジイソプロピルアミン（０．２６６ml、１．８mmol）及び２５mlの無水ＴＨＦが不活性雰囲気下におかれた。この溶液は−７０℃に冷却され、ｎ−ブチルリチウム（０．７２ml、１．８mmol）がシリンジを介して添加され、反応物は１５分撹拌された。上記チオエステル（０．７g、１．４mmol）の１０mlＴＨＦ溶液が反応混合物に１０分かけて添加され、生成した暗赤色溶液が−７０℃で１時間撹拌された。無水ＴＨＦ（２ml）がこの冷却された溶液に添加漏斗を介して添加され、次いで、ピリジン（１．１ml、１４mmol）及びＰＯＣｌ3（０．２１６ml、２．２mmol）が同様に添加されて、混合物は−７０℃で２０分撹拌された。氷浴が除去され反応混合物は室温へ戻された。室温で４０分撹拌後、２−ヒドロキシプロピオニトリル（１．０g、１４mmol）が反応物に注入され、反応物は３時間撹拌された。反応物は１００mlの酢酸エチルで希釈され、タイプＩの水で洗浄（３×８０ml）された。有機層はＮａ2ＳＯ4上で乾燥され、濃縮されて７００mgの粘性液体とされた。分取ＴＬＣ（７０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出）による７０mgの粗生成物の純化により、１５mgの純粋な目的物を得た。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．３９（ｓ、９Ｈ）；２．７４−２．７８（ｔ、４Ｈ）；４．２８−４．３６（ｍ、４Ｈ）；４．５３−４．５５（ｄ、２Ｈ）；７．２３−７．２４（ｄ、１Ｈ）；７．３２−７．３５（ｄ、２Ｈ）；７．４３−７．４６（ｄ、２Ｈ）；７．６７−７．６８（ｄ、１Ｈ）；８．１２−８．１５（ｄ、１Ｈ）。
【００７８】
化合物３：
実施例３の手法を用いて、ピバレート基及びシアノエチル保護基のアルカリ加水分解によって化合物９は化合物３へ転換される。
【００７９】
実施例８．化合物１０の合成
カルボニルジイミダゾール（２．１g、１３mmol）が２−（６−ピバロイルオキシ−２−ベンゾチアゾリル）−５，５−ジメチル−Δ2−チアゾリン−４−カルボン酸（５．０g、１３mmol）と１００mlのＣＨ3ＣＮの混合物に添加された。チオフェノール（１．５４g、１４mmol）が添加され、溶液は１時間撹拌された。反応混合物は濾過され、濾液は４℃に冷却されてチオエステル生成物を結晶化させた。生成物はヘキサンで洗浄され、乾燥されて３．８gの目的物を得た。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．４０（ｓ、９Ｈ）；１．５８（ｓ、３Ｈ）；１．８５（ｓ、３Ｈ）；４．９４（ｓ、１Ｈ）；７．２４−７．２８（ｍ、１Ｈ）；７．４５（ｍ、５Ｈ）；７．７０−７．７１（ｄ、１Ｈ）；８．１３−８．１６（ｄ、１Ｈ）。
【００８０】
化合物１０：
ジイソプロピルアミン１．３５ml（９．４mmol）の乾燥ＴＨＦ５０ml溶液が不活性雰囲気下におかれた。この溶液は−７８℃に冷却され、ｎ−ブチルリチウム（３．７６ml、９．４mmol）がシリンジを介して添加された。２０分後、上記チオエステル（３．５g、７．２mmol）の５０mlＴＨＦ溶液が反応混合物に滴下されて添加された。暗赤色の溶液は−７８℃で１時間撹拌された。ピリジン（５．６g、７２mmol）及びＰＯＣｌ3（１．１ml、１１mmol）の乾燥ＴＨＦ溶液が滴下され、混合物は−７８℃で１５分、そして、室温で１時間撹拌された。２−ヒドロキシプロピオニトリル（５．１g、７２mmol）が反応物に注入され、室温で一晩撹拌が継続された。混合物は減圧下で濃縮され、残渣は２００mlの酢酸エチルに抽出され、水で洗浄（３×３０ml）された。有機層は乾燥・濃縮されて、粗生成物はシリカゲルカラム上でクロマトグラフされた。異性体１（９００mg）と異性体２（１．１g）が単離された。
【００８１】
異性体１：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．３８（ｓ、９Ｈ）；２．０２（ｓ、６Ｈ）；２．６８−２．７２（ｔ、４Ｈ）；４．２５−４．３５（ｍ、４Ｈ）；７．２５−７．４７（ｍ、６Ｈ）；７．６９−７．７０（ｄ、１Ｈ）；８．１１−８．１４（ｄ、１Ｈ）。31ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：−１０．２１〜−９．９４（ｍ）。
異性体２：1ＨＮＭＲ（ＣＤ3ＣＯＣＤ3）：δ１．３８（ｓ、９Ｈ）；１．９８（ｓ、６Ｈ）；２．６６−２．７２（ｍ、４Ｈ）；４．２０−４．４０（ｍ、４Ｈ）；７．２０−７．４７（ｍ、６Ｈ）；７．６３−７．６４（ｄ、１Ｈ）；８．０７−８．１０（ｄ、１Ｈ）。31ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：−９．７６〜−９．４９（ｍ）。
【００８２】
化合物１０は、実施例４の手法を用いて、ピバレート（pivalate）基及びシアノエチル保護基のアルカリ加水分解によって化合物４に変換される。
【００８３】
実施例９
０．１Ｍの２２１バッファー（２２１＝２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール）、０．３３ｍＭのルシゲニン、０．１％トウィーン（Tween）２０及び０．６６ｍＭの化合物４（異性体２）を含む試薬組成物が、表１に示されるｐＨで、化学発光の生成についてテストされた。テストでは、室温で０．８fmolの酵素を含むＡＰ水溶液１０μlと１００μｌの試薬との反応を３回行った。混合によって光が発生し、その光は２６分後に測定された。
【表１】
0004658281.tif 000009
【００８４】
実施例１０
９．６のｐＨをそれぞれ有するが２２１バッファーの濃度が異なる複数の試薬組成物を前述の実施例に従って調製した。光の生成が同様にテストされた。化学発光は、２２１バッファーが０．０５Ｍ〜０．７５Ｍの範囲にある全てのバッファー系で簡単に検出された。光強度は０．０５〜０．２Ｍの範囲のバッファー濃度で最大であった。
【００８５】
実施例１１
９．６のｐＨ、０．１Ｍの２２１バッファーをそれぞれ有するが化合物４（異性体２）の濃度が異なる複数の試薬組成物を実施例９に従って調製した。光の生成が同様にテストされた。化合物４を０．０６６ｍＭ〜０．６６ｍＭの範囲の濃度で含む全てのサンプルで高いレベルの化学発光が生成した。
【００８６】
実施例１２
９．６のｐＨ、０．１Ｍの２２１バッファー、０．３３ｍＭの化合物４（異性体２）をそれぞれ有するがルシゲニンの濃度が異なる複数の試薬組成物を実施例９に従って調製した。光の生成が同様にテストされた。ルシゲニンを０．０３３ｍＭ〜０．６６ｍＭの範囲の濃度で含む全てのサンプルで高いレベルの化学発光が生成した。
【００８７】
実施例１３
９．６のｐＨ、０．１Ｍの２２１バッファー、０．３３ｍＭの化合物４（異性体２）及び０．１ｍＭのルシゲニンをそれぞれ有する複数の試薬組成物を実施例９に従って調製した。様々な界面活性剤がこのテスト組成物に添加され、８fmolのＡＰとの反応によって生成する化学発光のピークが決定された。トウィーン２０，トウィーン４０、トウィーン８０、ブリジ（Brij）３５及びポリ（ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）クロライドを使用したときに光強度の有用な増大がみられた。
【００８８】
実施例１４
９．６のｐＨ、０．１Ｍの２２１バッファー、０．３３ｍＭの化合物４（異性体２）及び０．１ｍＭのルシゲニンをそれぞれ有するがトウィーン２０の濃度が異なる複数の試薬組成物を実施例９に従って調製した。テストされた組成物の中で、シグナル／背景の比が最も高かったのはトウィーンの濃度が０．０３〜０．１％の範囲のときであった。
【００８９】
実施例１５
９．６のｐＨ、０．１Ｍの２２１バッファー、０．３３ｍＭの化合物４（異性体２）及び０．１％のトウィーン２０をそれぞれ有する複数の試薬組成物を実施例９に従って調製した。ルシゲニンの代わりにメチレンブルー又はベーシックブルー６６が添加された。メチレンブルー又はベーシックブルー６６を使用したときに、光強度とシグナル／背景の有用な増大がみられた。
【００９０】
実施例１６
９．６のｐＨ、０．１Ｍの２２１バッファー、０．１ｍＭのルシゲニン、０．１％のトウィーン２０及び０．３３ｍＭの化合物６（異性体１又は２）を含む試薬組成物が化学発光の生成についてテストされた。そこでは、試薬の１００μlの部分が、２５℃で８fmolの酵素を含むＡＰ水溶液１０μlと反応させられた。ピークの光強度／背景の比は、異性体１：９４３、異性体２：１８００であった。
【００９１】
実施例１７
０．１Ｍの２２１バッファー、９．６のｐＨ、０．３３ｍＭの化合物４（異性体２）、０．１％のトウィーン２０及び０．１ｍＭのルシゲニンを含む試薬組成物の１００μl部分と８×１０-16〜８×１０-22モルの酵素を含む１０μlのＡＰ溶液とを３回反応させて、アルカリフォスファターゼ検出感度が分析された。光生成は室温で１０分測定された。化学発光強度と酵素量の関係が図１に示されている。
【００９２】
実施例１８
０．１Ｍの２２１バッファー、９．６のｐＨ、０．３３ｍＭの化合物４（異性体２）、０．１％のトウィーン２０及び０．０６４ｍＭのベーシックブルー６６を含む試薬組成物の１００μl部分と８×１０-16〜８×１０-22モルの酵素を含む１０μlのＡＰ溶液とを３回反応させて、ＡＰ検出感度が分析された。光生成は室温で１０分測定された。化学発光強度と酵素量の関係が図２に示されている。
【００９３】
実施例１９
ＡＰと反応した化合物４（異性体２）の化学発光プロファイルが図３に描かれている。実施例１７の試薬組成物１００μlとＡＰの４×１０-17モルとの２５℃での反応は、光放射における即座の上昇をもたらし、光放射は５分で最大強度に到達する。
【００９４】
実施例２０
化合物４及び５の二重結合異性体の間の化学発光強度の比較を行った。複数の試薬組成物が、０．１Ｍのトリスバッファー、８．８のｐＨ及び０．６６ｍＭの化合物４又は５の一つの異性体を含む第１の溶液と、０．２Ｍの２２１バッファー、９．６のｐＨ、０．６６ｍＭのルシゲニン及び０．５％のトウィーン２０を含む第２の溶液とを等体積量づつ組み合わせることによって調製された。このように調製された各試薬の１００μlの部分が、室温でＡＰを０．８fmol含む溶液１μlと反応させられた。任意のユニットにおけるピーク光強度が以下に示されている。
【表２】
0004658281.tif 000010
【００９５】
化合物１３の二つの異性体（化合物４の異性体の合成前駆体）についてのＮＯＥ  ＮＭＲ実験に基づいて、化合物４の異性体１はＥ体であり、異性体２はＺ体であると思われる。同じ立体化学アサイメントが化合物５についても成り立つと思われる。化合物４の二つの異性体はＡＰとの反応による光放射に対して同じキネティックプロファイルを示した。同様に、化合物５の二つの異性体もＡＰとの反応による光放射に対して同じキネティックプロファイルを示した。
【００９６】
実施例３０．ＴＳＨの化学発光イムノアッセイ
化学発光イムノアッセイによるＴＳＨの検出方法がダイアグノスティックプロダクツ社の「イムライト（ＩＭＭＵＬＩＴＥ）  ＴＳＨ  第３世代ＴＳＨアッセイ」キットを使用してイムライト自動分析機で、製造者のプロトコルに従って行われた。実施例１７の試薬がキット中の検出試薬の代わりとされた。
【表３】
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図４と表３に示されるアッセイ結果は本発明の組成物が高感度アッセイを提供するのに有用であることを示している。
【００９７】
実施例３３．ウェスタンブロットアッセイ
本発明の組成物が、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）及びニトロセルロース膜上でのＡＰ標識された抗体を用いたウェスタンブロットにおいて、蛋白（β−ガラクトシダーゼ）を検出し、定量するために使用された。５０００、１０００、１８０、３０及び５ｐｇのβ−ガラクトシダーゼをそれぞれ含む複数の希釈液が１３０Ｖで電気泳動にかけられ、ＰＶＤＦ（マサチューセッツのベッドフォードのミリポアー（Millipore）社製）及びニトロセルロース（アメルシャム（Amersham）社製）の膜に２３分かけて１００Ｖで転写された。膜は１％の脱脂乳でブロックされ、マウス  抗−β−ガラクトシダーゼ及び羊  抗−マウス−ＡＰ複合体と順々に反応させられた。膜は、９．６のｐＨで０．５％のトウィーン２０、０．６６ｍＭのルシゲニンを含む０．２Ｍの２２１バッファーと、８．８のｐＨで０．６６ｍＭの化合物４（異性体２）を含む０．１Ｍトリスバッファーとの等体積量を組み合わせることによって調製された本発明の試薬Ａ（最終ｐＨ＝９．３５）に短時間浸漬された。膜は透明なプラスティックシートの間に挟まれ、ＣＣＤカメラシステムによって様々な長さの時間にわたってイメージ化された。比較のために、以下の構造を有する化合物、９−［（４−クロロ−フェニルチオ）ホスホリルオキシメチレン］−１０−メチル−アクリダン、二ナトリウム塩（参照化合物１）
【化１９】
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を含む試薬「ルミゲン（Lumigen;商標、ミシガン、サウスフィールドのルミゲン社製）APS-5」を試薬Ｂとして使用して同様にブロットが作製され、イメージ化された。
【００９８】
本発明の試薬を使用すると、ＰＶＤＦとニトロセルロース膜の両方を試薬Ａで濡らした後、１分間露光すると、図５に示されるように、β−ガラクトシダーゼのバンドは直ちに検出された。試薬Ｂを用いて得られた同じ露光では両方の膜について試薬Ａより弱い強度のイメージを生成した。
【００９９】
実施例３４．
ジゴキシゲニンで標識されたＤＮＡ（pBR328）のドットブロットアッセイが本発明に従って調製された検知試薬（試薬Ａ及びＣ）を用いて行われた。試薬Ａは前の実施例に記載されたものである。試薬Ｃは化合物４の異性体２の代わりに異性体１が含まれている以外は試薬Ａと同一とされて調製された。
【０１００】
正に荷電されたナイロン膜、抗体−ＡＰ複合体、標識されたＤＮＡ及びブロッキング試薬はボーリンガー−マンハイム（Boehringer-Mannheim）社から得られた。洗浄バッファーはｐＨ７．５の０．１Ｍマレイン酸、０．１５ＭＮａＣｌであった。
【０１０１】
ＤＮＡ希釈液（１０、３、１、０．３、０．１、０．０３、０．０１pg）はナイロン膜上にドットブロットされた。ブロットはマレイン酸洗浄バッファーに３分間浸漬され、２％ブロッキングバッファーによってブロックされた。ブロットは抗ジゴキシゲニン−ＡＰ複合体に浸され、０．３％のトウィーン２０を含むマレイン酸バッファーで洗浄され、次いで、０．１ＭＮａＣｌを含むｐＨ９．５の０．１Ｍトリス（tris）に３分間浸漬された。過剰のバッファーは吸引除去され、ブロットは検出試薬Ａ又はＣに浸漬された。過剰の試薬は吸引除去され、ブロットは透明シートの間に挟まれ、様々な長さの時間にわたってＣＣＤカメラシステムによってイメージ化された。１分間の露光（exposure）で直ちに１０pg−０．０３pgのスポットが両方の試薬で検出された。３０分後、１分の露光で全ての７個のスポットが検出された（図６）。少なくとも１日に数回の露光を行うことができた。
【０１０２】
実施例３５．
試薬Ｃ、及び、前述の実施例に記載される試薬Ｂを用いてドットブロットアッセイが実施例３４に記載されるようにして行われた。試薬Ｃは、試薬Ｂより有意に高い光強度（ＣＣＤカメラで測定される）を生成した。試薬Ｃで現像されたブロットからの光放射は試薬Ｂで現像されたブロットからの放射が減衰した後も、何時間にもわたって持続した。
【０１０３】
既述した実施例は例証のためのものであり、なんらかの制限としてみなされるべきではない。ここに特に開示されなかった特定の化合物や方法の修正は本発明の範囲及び精神から外れることなく行えることが認識されよう。本発明の範囲は特許請求の範囲のみによって制限されるのである。
【図面の簡単な説明】
【図１】APの量を化合物４を含む本発明の試薬によって発生した化学発光の強度に関連させたグラフ。アルカリフォスファターゼ検出感度は、０．１Ｍの２２１バッファー、ｐＨ９．６、０．３３ｍＭの化合物４、０．１％のトウィーン（Tween）２０及び０．１ｍＭのルシゲニンを含む１００μＬの試薬組成物と８×１０-16〜８×１０-22モルの酵素を含む１０μＬのAP溶液とを組み合わせることによって決定された。生成した光は２５℃で１０分測定された。点で示されるデータは３回の分析の平均である。
【図２】APの量を化合物４を含む本発明の試薬によって発生した化学発光の強度に関連させたグラフ。アルカリフォスファターゼ検出感度は、０．１Ｍの２２１バッファー、ｐＨ９．６、０．３３ｍＭの化合物４、０．１％のトウィーン２０及び０．６４ｍＭのベーシックブルー６６を含む１００μＬの試薬組成物と８×１０-16〜８×１０-22モルの酵素を含む１０μＬのAP溶液とを組み合わせることによって決定された。生成した光は２５℃で２５分測定された。点で示されるデータは３回の分析の平均である。
【図３】２５℃において、１．４ｆモルのAPと、化合物４（実施例１９に記載される異性体２）を含む１００μＬの試薬組成物とを反応させて得られた化学発光の時間プロファイルを示すグラフ。
【図４】本発明の検出試薬を使用した甲状腺刺激ホルモン（thyroid stimulating hormone）の化学発光イムノアッセイの結果を示すグラフ。
【図５】PVDF及びニトロセルロース膜上のAP標識された抗体を化学発光試薬組成物と共に使用したβ−ガラクトシダーゼのウェスタンブロットアッセイからのCCDカメラ像のセット。５０００、１０００、１８０、３０及び５ｐｇの蛋白を含むβ−ガラクトシダーゼの希釈液が本発明の試薬及びアクリダンフォスフェートを含む試薬によって検出された。
【図６】AP標識された抗体を使用した、ジゴキシゲニンで標識されたpBR328DNAのドットブロットアッセイからのCCDカメラ像のセット。
【図７】AP標識された抗体を使用した、ジゴキシゲニンで標識されたpBR328DNAのドットブロットアッセイからのCCDカメラ像のセット。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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