(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン分子または胆汁糖タンパク質に結合するその断片に融合されている、胆汁糖タンパク質ポリペプチドまたは胆汁糖タンパク質に結合するその断片を含む、単離融合タンパク質。
【請求項２】
胆汁糖タンパク質または胆汁糖タンパク質に結合するその断片が、34B1、5F4および26H7からなる群より選択されるモノクローナル抗体に選択的に結合する、請求項1の単離融合タンパク質。
【請求項３】
胆汁糖タンパク質に結合する胆汁糖タンパク質の断片が、CD66aのN−ドメイン、CD66aのNA1B1ドメイン、CD66aのNA1B1A2ドメインからなる群より選択される、請求項2の単離融合タンパク質。
【請求項４】
胆汁糖タンパク質に結合する免疫グロブリン分子の断片が、免疫グロブリン分子のFc部分である、請求項1の単離融合タンパク質。
【請求項５】
胆汁糖タンパク質に結合する、2つまたはそれ以上の胆汁糖タンパク質ポリペプチドまたは胆汁糖タンパク質に結合するその断片を含む、単離融合タンパク質。
【請求項６】
キラーT細胞活性を亢進させるかまたは抑制する被検化合物を同定するための方法であって、
（a）胆汁糖タンパク質を発現するキラーT細胞集団を、胆汁糖タンパク質と結合する被検化合物と接触させ、そして
（b）細胞傷害性または増殖を増加させる被検化合物は、キラーT細胞活性を亢進させる被検化合物であり、そして細胞傷害性または増殖を減少させる被検化合物は、キラーT細胞活性を抑制する被検化合物であることに基づいて、コントロールに比較した、キラーT細胞集団の細胞傷害性または増殖を測定する、
ことを含む、前記方法。
【請求項７】
さらに
（i）請求項6の工程（a）の前に、胆汁糖タンパク質ポリペプチドまたは胆汁糖タンパク質に結合するその断片を提供し、
（ii）該胆汁糖タンパク質ポリペプチドまたは胆汁糖タンパク質に結合するその断片を、被検化合物と接触させ、
（iii）該胆汁糖タンパク質ポリペプチドまたは胆汁糖タンパク質に結合するその断片に対する、請求項6の段階（a）に用いられている該被検化合物の結合を測定する、
段階を含む、請求項6の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Ｔ細胞阻害性受容体分子に結合し、そしてＴ細胞活性を調節する組成物に関する。
発明の背景
ヒト腸上皮内リンパ球（ｉＩＥＬ）の生物学的役割およびそれらの腸上皮細胞（ＩＥＣ）との機能的な関連の性質決定は不完全なままである。ヒトｉＩＥＬは、多様なサイトカイン類の分泌を通じ、細胞溶解機能およびおそらく免疫制御機能を示すことが、多様に示されてきている（Ｅｂｅｒｔ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ８２：８１−８５，  １９９０；  Ｌｕｎｄｑｖｉｓｔら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５７：１９２６−１９３４，  １９９６；  Ｂａｌｋら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５３：１４１１−１４１５，  １９９１）。しかし、これらの機能的活性が、腸に関連するリンパ組織に特有である可能性がある過程、例えばＩＥＣ損傷および悪性トランスフォーメーションに対する口部耐性および局所免疫監視に関連しているのかは、明らかでない。さらに、ｉＩＥＬの機能的活性化を制御し、そしてこの特別な微小環境で利用されている可能性があるｉＩＥＬの細胞表面上の分子およびそのＩＥＣ対受容体の解明は始まったばかりである。
【０００２】
小腸および大腸両方のヒトｉＩＥＬのかなりの分画は、制限されたアレーのαβおよび、より少ない量で、γδ−Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＣＤ８−αβ+およびＣＤ４５ＲＯ+  Ｔ細胞である（Ｂａｌｋら，  １９９１；  Ｊａｒｒｙら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０：１０９７−１１０３，  １９９０；  Ｂｌｕｍｂｅｒｇら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５０：５１４４−５１５３，  １９９３；  Ｖａｎ  Ｋｅｒｃｋｈｏｖｅら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １７５：５７−６３，  １９９２；  Ｃｈｏｗｅｒｓら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １８０：１８３−１９０，  １９９４）。これらの表現型特性は、ｉＩＥＬがＩＥＣの基底外側表面に局在する、該ＩＥＣ上の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはクラスＩ様分子の背景における限定された数の抗原を認識するための、記憶細胞であることを示す。しかし、マウスおよびヒトにおいて、ｉＩＥＬの大部分は、ＣＤ２８-であり、ｉＩＥＬ活性化のため、必要な二次シグナルを提供するのに、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体仲介活性化のための他の補助的刺激分子が重要である可能性があることが示唆される（Ｇｅｌｆａｎｏｖら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １５５：７６−８２，  １９９５；  Ｇｒａｍｚｉｎｓｋｉら，  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５：１４５−１５３，  １９９３；  Ｒｕｓｓｅｌｌら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５７：３３６６−３３７４，  １９９６）。ヒトｉＩＥＬの補助的刺激分子の候補には、大部分のｉＩＥＬにより発現される、ＣＤ２（Ｅｂｅｒｔ，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，  ９７：１３７２−１３８１，  １９８９）、ＣＤ１０１（Ｒｕｓｓｅｌｌら，  １９９６）、ＢＹ−５５（Ａｎｕｍａｎｔｈａｎら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６１：２７８０−２７９０，  １９９８）およびαEβ7（Ｐａｒｋｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８９：１９２４−１９２８，  １９９２）が含まれる。
【０００３】
補助的刺激分子を活性化するのに加え、Ｔ細胞は、Ｔ細胞の最初の活性化が妨げられるかまたは活性化状態が下方制御されるように、阻害性のシグナルを運ぶ、多様な分子を発現する可能性があることもまた、次第に明らかになってきている。前者には、Ｔ細胞サブセット上に発現され、そして標的細胞上の特定の種類の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子に結合する、キラー阻害性受容体（ＫＩＲ）が含まれる（Ｌａｎｉｅｒら，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ７：７５−８２，  １９９５）。後者には、Ｔ細胞活性化後に発現されると、抗原提示細胞上のＣＤ８０（Ｂ７．１）またはＣＤ８６（Ｂ７．２）のいずれかに結合する、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）が含まれる（Ｗａｌｕｎａｓら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １８３：２５４１−２５５０，  １９９６；  Ｋｒｕｍｍｅｌら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８３：２５３３−２５４０，  １９９６）。これらの阻害性受容体は、特徴的に、細胞外に免疫グロブリン様ドメインを、そして細胞質テールに、コンセンサス配列Ｉ／Ｌ／ＶｘＹｘｘＬ／Ｖからなる、１つまたはそれ以上の免疫受容体のチロシンに基づく阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｖｅｌｙら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５９：２０７５−２０７７，  １９９７）。ＣＴＬＡ−４の場合、ＩＴＩＭは、ＧｘＹｘｘＭにわずかに修飾されている（Ｃａｍｂｉｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９４：５９９３−５９９５，  １９９７）。ＩＴＩＭ含有受容体は、Ｓｒｃ相同ドメイン含有プロテインチロシンホスファターゼ、ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２、またはＳＨ２ドメイン含有イノシトールポリリン酸５−ホスファターゼ、ＳＨＩＰのいずれかの補充（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）に役割を果たす（Ｉｓａｋｏｖ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．，  １６：８５−１００，  １９９７）。これらのホスファターゼは、ＴＣＲと会合するＣＤ３−γ、δ、εおよびζ鎖に含まれるものと似た、免疫受容体のチロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を持つ受容体により補充されるシグナル分子の脱リン酸化に役割を果たす。こうしたものとして、Ｔ細胞上のＩＴＩＭを持つ受容体は、どちらも互いに近接して連結されていれば、ＩＴＡＭを持つ受容体により引き出される活性化事象を下方制御すると予測される。重要なことに、ＣＴＬＡ−４またはＣＤ８０／ＣＤ８６のどちらも、それぞれヒト小腸のｉＩＥＬまたはＩＥＣ上に観察されてきていない。
発明の概要
癌胎児抗原ファミリー（ＣＥＡ）のメンバーである、胆汁糖タンパク質（ＢＧＰ；ＣＤ６６ａおよびＣ−ＣＡＭとしても知られる）は、ヒト腸上皮内に含まれる活性化Ｔ細胞に対する阻害性受容体であることが、現在、発見されてきている。これらの研究により、主にＣＤ２８／ＣＴＬＡ４−ＣＤ８０／ＣＤ８６陰性である局部的な微小環境において、他の受容体・リガンド相互作用が、Ｔ細胞活性化および免疫病理を限定するのに必要な下方制御シグナルを提供する可能性があることが示唆されている。
【０００４】
本発明の１つの側面にしたがい、患者において、キラーＴ細胞の細胞傷害性または増殖を、特異的に亢進させるための方法が提供される。該方法は、こうした治療が必要な患者に、胆汁糖タンパク質ポリペプチドの架橋を選択的に減少させる剤を、該患者におけるキラーＴ細胞の細胞傷害性または増殖を亢進させるのに有効な量で、投与することを含む。特定の態様において、該剤は、単一の胆汁糖タンパク質ポリペプチドにのみ結合する、抗体または抗体断片である。好ましい抗体断片にはＦａｂ断片が含まれる。他の態様において、該剤は、胆汁糖タンパク質ポリペプチドに対するリガンドを含み、該リガンドは、単一の胆汁糖タンパク質ポリペプチドにのみ結合する。好ましい態様において、該リガンドは、免疫グロブリン分子またはその断片に融合しているか、あるいは、可溶性胆汁糖タンパク質分子またはその断片である。
【０００５】
本発明の別の側面にしたがい、患者において、キラーＴ細胞の細胞傷害性または増殖を、特異的に抑制するための方法が提供される。該方法は、こうした治療が必要な患者に、胆汁糖タンパク質ポリペプチドの架橋を選択的に増加させる剤を、該患者におけるキラーＴ細胞の活性を抑制するのに有効な量で、投与することを含む。特定の態様において、該剤は抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。他の態様において、該剤は、胆汁糖タンパク質ポリペプチドに対するリガンドを含み、該リガンドは、２つまたはそれ以上の胆汁糖タンパク質ポリペプチドに結合する。好ましい態様において、該リガンドは、免疫グロブリン分子またはその断片に融合しているか、あるいは、胆汁糖タンパク質ポリペプチドまたはその断片を含む。
【０００６】
本発明の別の側面にしたがい、組成物が提供される。該組成物は、患者におけるキラーＴ細胞の細胞傷害性または増殖を亢進させるのに有効な量の、胆汁糖タンパク質ポリペプチドの架橋を選択的に減少させる剤、および薬学的に許容しうるキャリアーを含む。特定の態様において、該剤は、単一の胆汁糖タンパク質分子にのみ結合する、抗体または抗体断片である。好ましい抗体断片は、Ｆａｂ断片を含む。好ましい態様において、該剤は、胆汁糖タンパク質ポリペプチドに対するリガンドを含み、該リガンドは、単一の胆汁糖タンパク質ポリペプチドにのみ結合する。好ましくは、こうしたリガンドは、免疫グロブリン分子またはその断片に融合している。特定の態様において、該リガンドは、胆汁糖タンパク質またはその断片である。好ましくは、該組成物は薬剤組成物である。
【０００７】
本発明のさらに別の側面にしたがい、患者におけるキラーＴ細胞の細胞傷害性または増殖を抑制するのに有効な量の、胆汁糖タンパク質ポリペプチドの架橋を選択的に増加させる剤を含む組成物が提供される。該組成物はまた、薬学的に許容しうるキャリアーも含む。いくつかの態様において、該剤は抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。別の態様において、該剤は、胆汁糖タンパク質ポリペプチドに対するリガンドを含み、該リガンドは、２つまたはそれ以上の胆汁糖タンパク質ポリペプチドに結合する。好ましくは、該リガンドは、免疫グロブリン分子またはその断片に融合している。他の好ましい態様において、該リガンドは、胆汁糖タンパク質またはその断片である。好ましくは、該組成物は薬剤組成物である。
【０００８】
本発明のさらに別の側面にしたがい、キラーＴ細胞の細胞傷害性または増殖を、特異的に亢進させるための方法もまた、提供される。該方法は、キラーＴ細胞集団の細胞傷害性または増殖を亢進させるのに有効な量の、胆汁糖タンパク質ポリペプチドの架橋を選択的に減少させる剤と、キラーＴ細胞集団を接触させることを含む。胆汁糖タンパク質結合剤は、患者におけるキラーＴ細胞活性を亢進させるための方法において、上述されたとおりである。
【０００９】
本発明の別の側面において、キラーＴ細胞の細胞傷害性または増殖を、特異的に抑制するための方法が提供される。該方法は、キラーＴ細胞集団の細胞傷害性または増殖を抑制するのに有効な量の、胆汁糖タンパク質ポリペプチドの架橋を選択的に増加させる剤と、キラーＴ細胞集団を接触させることを含む。胆汁糖タンパク質結合剤は、患者におけるキラーＴ細胞活性を抑制するための方法において、上述されたとおりである。
【００１０】
本発明の別の側面にしたがい、単離融合タンパク質が提供される。該単離融合タンパク質は、免疫グロブリン分子またはその断片に融合している、胆汁糖タンパク質ポリペプチドまたはその断片を含む。該融合タンパク質の構成要素は、直接融合していてもよいし、あるいは、胆汁糖タンパク質構成要素および免疫グロブリン構成要素の間に、ペプチドなどのリンカー分子を介在させてもよい。一般の当業者に明らかであろうように、他のポリペプチドを免疫グロブリン構成要素に置換させてもよい。特定の態様において、融合タンパク質の胆汁糖タンパク質（またはその断片）構成要素は、３４Ｂ１、５Ｆ４および２６Ｈ７からなる群より選択されるモノクローナル抗体に選択的に結合する。好ましくは、胆汁糖タンパク質の断片は、ＣＤ６６ａのＮ−ドメイン、ＣＤ６６ａのＮＡ１Ｂ１ドメイン、ＣＤ６６ａのＮＡ１Ｂ１Ａ２ドメインからなる群より選択される。免疫グロブリン分子の断片は、好ましくは、免疫グロブリン分子のＦｃ部分である。
【００１１】
本発明の別の側面にしたがい、胆汁糖タンパク質に結合する、２つまたはそれ以上の胆汁糖タンパク質ポリペプチドまたはその断片を含む、単離融合タンパク質が提供される。該融合タンパク質は、２つ（またはそれ以上）の胆汁糖タンパク質分子に結合する胆汁糖タンパク質結合剤、特に胆汁糖タンパク質分子を架橋する剤を選択するのに有用である。
【００１２】
本発明のさらに別の側面にしたがい、キラーＴ細胞活性を亢進させるまたは抑制する化合物を同定するための方法が提供される。該方法は、胆汁糖タンパク質を発現するキラーＴ細胞集団を、胆汁糖タンパク質と結合する化合物と接触させ、そしてコントロールに比較した、キラーＴ細胞集団の細胞傷害性または増殖を測定することを含む。細胞傷害性または増殖を増加させる化合物は、キラーＴ細胞活性を亢進させる化合物であり、そして細胞傷害性または増殖を減少させる化合物は、キラーＴ細胞活性を抑制する化合物である。特定の態様において、該方法は、胆汁糖タンパク質ポリペプチドまたはその断片を提供し、該胆汁糖タンパク質ポリペプチドまたはその断片を、化合物と接触させ、そして該胆汁糖タンパク質ポリペプチドまたはその断片に対する、該化合物の結合を測定する段階を含む。該化合物は、前述の、キラーＴ細胞細胞傷害性または増殖の増加または減少を試験するための方法に用いられている。
【００１３】
本発明の別の側面において、異常なキラーＴ細胞活性により特徴付けられる異常を有する患者を選択的に治療するための方法が提供される。該方法は、こうした治療が必要な患者に、胆汁糖タンパク質に対し選択的である薬理学的剤を、異常なキラーＴ細胞活性を正常にするのに有効な量で、投与することを含む。
【００１４】
前述の、本発明の側面および態様において、好ましいキラーＴ細胞には、ＣＤ４+  Ｔ細胞、ＣＤ８+  Ｔ細胞、ＮＫ細胞、腸上皮内リンパ球および末梢血Ｔ細胞が含まれる。特に好ましいキラーＴ細胞は、ＣＤ８+  Ｔ細胞である。
【００１５】
前述の組成物の、医薬の調製における使用もまた、提供される。好ましい態様において、該医薬は、自己免疫疾患、癌および移植を含む、免疫系機能に関連する異常の治療に有用である。
【００１６】
本発明のこれらのおよび他の目的は、本発明の詳細な説明と関連し、さらに詳細に記載されるであろう。
発明の詳細な説明
ヒト胆汁糖タンパク質（ＢＧＰ、ＣＤ６６ａ）の、活性化ｉＩＥＬ上の阻害性分子としての役割に関する証拠は、活性化ｉＩＥＬ細胞株に対し作成された３つのモノクローナル抗体の性質決定を通じ、提供されてきている。これらのデータは、ＣＴＬＡ−４の非存在下で、他の分子、例えば胆汁糖タンパク質が、Ｔ細胞活性化の下方制御に貢献している可能性があることを示唆するため、ｉＩＥＬに特に関係がある。これらの研究はまた、胆汁糖タンパク質がまた、活性化ヒト末梢血Ｔ細胞によっても発現されるという観察を考慮すると、胆汁糖タンパク質の機能を、一般的にＴリンパ球の免疫制御における重要な役割に拡張するのに関係がある。
【００１７】
ヒト胆汁糖タンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーの一部である、糖タンパク質のＣＥＡファミリーのメンバーであり、そして染色体１９上の巨大クラスターにコードされる（Ｗａｔｔら，  Ｂｌｏｏｄ，  ８４：２００−２１０，  １９９４；  Ｄａｎｉｅｌら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ５５：３０３−３１０，  １９９３；  Ｔｅｉｘｅｉｒａら，  Ｂｌｏｏｄ，  ８４：２１１−２１９，  １９９４；  Ｔｅｉｘｅｉｒａ，  １９９６；  Ｂａｒｎｅｔｔら，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １３：１２７３−１２８２，  １９９３）。ＣＥＡクラスターは、遺伝的に連鎖している、妊娠特異的遺伝子クラスターに非常に関連している（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂ  Ａｎａｌ．，  ５：３４４−３６６，  １９９１；  Ｏｂｒｉｎｋ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ９：６１６−６２６，  １９９７）。本ファミリーのＣＥＡサブグループは、血清学的にＣＤ６６ａ（ＢＧＰまたはＣ−ＣＡＭ）、ＣＤ６６ｂ（ＣＧＭ６）、ＣＤ６６ｃ（ＮＣＡ）、ＣＤ６６ｄ（ＣＧＭ１）およびＣＤ６６ｅ（ＣＥＡ）として同定されている。これらの構造的に関連する糖タンパク質は、ＢＧＰ、ＮＣＡ、ＣＧＭ６およびＣＥＡの場合、非常に相同な膜遠位アミノ末端ＩｇＶ様Ｎ−ドメインおよび多様な数の膜遠位ＩｇＣ２様ドメインからなる。グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーにより、膜に連結しているヒトＣＥＡ、ＣＧＭ６およびＮＣＡと対照的に、ＣＧＭ１およびＢＧＰは、１型膜貫通糖タンパク質である。後者は共に、短いまたは長い細胞質テールを含むアイソフォームとして存在する。
【００１８】
胆汁糖タンパク質、並びにそのマウスおよびラット相同体Ｃ−ＣＡＭ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５３：４８３８−４９４５，  １９９３；  Ｌｉｎら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６４：１４４０８−１４４１４，  １９８９；  Ｏｂｒｉｎｋ，  ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，  １３：２２７−２３４，  １９９１）は主に、胃腸管および胆管系の上皮細胞、好中球並びに、より最近はＢ細胞により主に発現される、細胞・細胞接着において機能する分子と見なされてきている。胆汁糖タンパク質はまた、マウス肝炎ウイルス（Ｗｉｌｌｉａｍｓら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８８：５５３３−５５３６，  １９９１）および細菌のナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種のＯｐａタンパク質（Ｖｉｒｊｉら，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ５：９４１−９５０，  １９９６）の受容体としても働く。上皮細胞上の胆汁糖タンパク質の連結が、胆汁糖タンパク質の発現が減少することにより、腫瘍形成中に減少する可能性がある、陰性の増殖シグナルを運ぶ可能性があることが重要である（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，  １９９３；  Ｋｕｎａｔｈら，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １１：２３７５−２３８２，  １９９５；  Ｂｒｕｍｍｅｒら，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １１：１６４９−１６６５，  １９９５）。胆汁糖タンパク質はまた、高い度合いの代替転写プロセシングを示し、その結果、少なくとも８つの潜在的な代替膜貫通転写物を生じる。これらの転写物の２つ、ＢＧＰａおよびＢＧＰｂは、２つのＩＴＩＭモチーフを含む６７アミノ酸の長い細胞質テールをコードし、阻害性受容体としての役割が示唆される（Ｏｂｒｉｎｋ，  １９９７）実際、この細胞質テールは、チロシンリン酸化されると、マウス結腸癌腫細胞株においてＳＨＰ−１に結合することが可能である（Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎら，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  ７８３−７９０，  １９９６）。こうした相互作用は、上皮細胞上の本分子の阻害性増殖効果を説明する可能性がある。
【００１９】
本明細書に含まれる研究は、胆汁糖タンパク質は、ＩＥＣにより恒常的に発現されるが、該タンパク質は、上皮細胞に隣接するＴ細胞上の活性化分子であるという、予期しなかった知見を記載する。他方、末梢血Ｔ細胞の研究は、胆汁糖タンパク質は、低いレベルで恒常的に発現され、そしてＴ細胞活性化により上方制御されるという、予期しなかった結果を示す。ｉＩＥＬおよびＰＢＴの間のこの相違は、胆汁糖タンパク質発現が、通常の条件下では、上皮において能動的に抑制されている可能性があることを示唆する。胆汁糖タンパク質と活性化状態の関係はまた、ＣＴＬＡ−４発現とも似ている。
【００２０】
ｉＩＥＬの主な機能である細胞傷害性を尺度として用いると、活性化ｉＩＥＬ上の胆汁糖タンパク質は、ＣＤ３が指示する細胞傷害活性の阻害性分子として機能するようである。この意味で、胆汁糖タンパク質は、キラー阻害性受容体として見なされるべきである。ＩＥＣ上の胆汁糖タンパク質に対するリガンドは未知であるが、ＣＤ６６群メンバーの間の既知の同種親和性および異種親和性相互作用を考慮すると、候補リガンドは、胆汁糖タンパク質自体または別のＣＤ６６ファミリーメンバーである（Ｗａｔｔら，  １９９４；  Ｏｉｋａｗａら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．，  １８６：８８１−８８７，  １９９２；  Ｔｅｉｘｅｉｒａら，  １９９４；  Ｏｂｒｉｎｋ，  １９９７）。したがって、活性化ｉＩＥＬによる、ＩＥＣ上の胆汁糖タンパク質の連結は、ＩＥＣ増殖の阻害において機能するよう働くことが可能であると仮定することが可能である。結果として、ＩＥＣ上のＢＧＰによる、活性化ｉＩＥＬ上の胆汁糖タンパク質の結合は、Ｔ細胞の活性化を制限することが可能である。胆汁糖タンパク質発現が減少していることが観察されている上皮の腫瘍において、ＩＥＣに対するｉＩＥＬの増殖阻害効果が失われている可能性がある（Ｂｒｕｍｍｅｒ，  １９９５）。
【００２１】
したがって、本発明は、キラーＴ細胞上の胆汁糖タンパク質に結合する分子（すなわち「胆汁糖タンパク質結合剤」）、例えば抗体が、キラーＴ細胞の活性、例えば細胞傷害性および／または増殖を阻害するまたは亢進させる可能性があるという知見に関する。本明細書において、「キラーＴ細胞」には、ＣＤ４+  Ｔ細胞、ＣＤ８+  Ｔ細胞およびＮＫ細胞が含まれる。胆汁糖タンパク質ポリペプチドの架橋を増加させる胆汁糖タンパク質結合剤は、胆汁糖タンパク質の阻害性シグナルを増加させ、それによりキラーＴ細胞の活性を抑制する。胆汁糖タンパク質ポリペプチドの架橋を減少させる胆汁糖タンパク質結合剤は、胆汁糖タンパク質の阻害性シグナルを減少させ、それによりキラーＴ細胞の活性を亢進させる。本発明はまた、キラーＴ細胞活性を亢進させるまたは抑制するが、上述の架橋特性にしたがって機能しない分子も含む。例えば、キラーＴ細胞の活性を抑制する特定の胆汁糖タンパク質結合剤は、胆汁糖タンパク質に結合し、そして架橋を増加させることなく、胆汁糖タンパク質の阻害性シグナルを増加させる可能性がある（例えば、胆汁糖タンパク質のコンホメーション変化を誘導することによる）。
【００２２】
キラーＴ細胞表面上に発現される胆汁糖タンパク質に結合する分子によるキラーＴ細胞活性の調節は、ｉｎ  ｖｉｖｏで免疫反応を特異的に亢進させるまたは抑制するのに有用であり、該調節は自己免疫疾患、癌および移植（例えば骨髄または器官）を含む免疫機能に関連する異常の治療に有用である可能性がある。キラーＴ細胞活性の調節はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／または非療法的適用にも有用であり、該適用には、癌、自己免疫疾患、および移植の実験モデルにおいて、患者のＴ細胞が機能するかどうか決定し（例えば増殖および／または細胞傷害機能）、治療がキラーＴ細胞を機能しなくしているか決定し、例えば特定の器官または生理学的過程に対するキラーＴ細胞機能の増加または減少の影響を決定し、そしてキラーＴ細胞活性を増加させるまたは減少させる剤に関し試験する適用が含まれる。他の使用は、一般の当業者に明らかになるであろう。
【００２３】
胆汁糖タンパク質に結合し、そしてキラーＴ細胞活性を調節する分子（胆汁糖タンパク質結合剤）には、抗体およびその断片、胆汁糖タンパク質に対するリガンド、その断片並びにリガンドまたは他の胆汁糖タンパク質結合分子を含む融合タンパク質が含まれる。さらに別の胆汁糖タンパク質結合剤は、本明細書に記載されるアッセイおよび当業で標準的なＴ細胞活性のアッセイを用い、キラーＴ細胞活性を亢進させるまたは抑制する能力に関し化合物をスクリーニングすることにより、同定することが可能である。本発明にしたがい、キラーＴ細胞活性を調節するのに有用な融合タンパク質を調製するための典型的な方法が本明細書に記載され；こうした融合タンパク質を調製するためのさらなる典型的な方法は、米国特許第５，４３４，１３１号に記載される。胆汁糖タンパク質に結合する分子は、一次療法として単独で用いてもよく、またはコンビネーション療法として他の治療法と組み合わせ、他の医学的処置の療法的利点を亢進させてもよい。
【００２４】
本発明はまた、胆汁糖タンパク質および／または胆汁糖タンパク質の断片に結合し、そしてキラーＴ細胞活性を誘導するまたは抑制する剤を含む。本明細書に記載される使用に加え、こうした結合剤は、胆汁糖タンパク質ポリペプチドの存在または非存在、ｉＩＥＬの存在または位置を検出するスクリーニングアッセイに、そしてｉＩＥＬおよび胆汁糖タンパク質を発現する他のキラーＴ細胞を単離する精製プロトコルに用いてもよい。同様に、こうした結合剤を用い、薬剤、毒素または他の分子を、胆汁糖タンパク質を発現するキラーＴ細胞に選択的に標的化してもよい。この方式で、胆汁糖タンパク質を発現するキラーＴ細胞を細胞傷害性化合物で処理し、それにより望ましくない免疫反応を減少させてもよい。
【００２５】
本発明にしたがい有用な胆汁糖タンパク質結合剤は、抗体および他のポリペプチドを含み、単離剤である。本明細書において、胆汁糖タンパク質結合剤に関し、「単離」という用語は、剤が実質的に純粋であり、そして天然またはｉｎ  ｖｉｖｏ系で該剤と共に見られる可能性がある他の物質を、事実上そして意図される使用に適した度合いで、本質的に含まないことを意味する。特に、該剤は、例えば、薬剤調製を産生するのに有用であるように、十分に純粋であり、そして宿主細胞の他の生物学的構成要素を十分に含まない。薬剤調製において、単離胆汁糖タンパク質結合剤を薬学的に許容しうるキャリアーと混合してもよいため、胆汁糖タンパク質結合剤は、該調製の重量にしてわずかな割合のみを含む可能性がある。胆汁糖タンパク質結合剤は、それにもかかわらず、生体系で関連している可能性がある物質から実質的に分離されている点で、純粋である。
【００２６】
１つの態様にしたがい、本発明に用いられる胆汁糖タンパク質結合剤は、単離された型の、好ましくは可溶性型の、あるいは薬剤調製における、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗胆汁糖タンパク質モノクローナル抗体である。損なわれていないモノクローナル抗体は、当業に周知であるように、ジスルフィド架橋により連結されるポリペプチド鎖の集合である。２つの主な（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）ポリペプチド鎖は、軽鎖および重鎖と称され、抗体のすべての主要な構造種（アイソタイプ）を構成する。重鎖および軽鎖はともに、さらに可変部および定常部と称される下位領域に分割される。本明細書において、「モノクローナル抗体」という用語は、ヒト胆汁糖タンパク質のエピトープ（すなわち抗原性決定基）に特異的に結合する免疫グロブリンの均一な集団を指す。
【００２７】
本発明は、したがって、胆汁糖タンパク質、特にキラーＴ細胞、例えば腸上皮内リンパ球および活性化末梢血リンパ球の細胞表面に結合されるような該胆汁糖タンパク質に選択的に結合する能力を有する抗体または抗体断片の使用を含む。抗体には、慣用的な方法論にしたがい調製されたポリクローナルおよびモノクローナル抗体が含まれる。例には、実施例に記載されるモノクローナル抗体３４Ｂ１、５Ｆ４および２６Ｈ７が含まれる。胆汁糖タンパク質と反応性であるさらなる抗体、特にキラーＴ細胞上に発現される胆汁糖タンパク質に対して作成された抗体を、標準的方法にしたがい、調製してもよい。
【００２８】
抗体は、いかなる多様な方法により調製してもよく、該方法は、タンパク質、タンパク質の断片、タンパク質またはその断片を発現している細胞およびそれらに匹敵するものを動物に投与し、ポリクローナル抗体を誘導することを含む。モノクローナル抗体の産生は、当業に周知の技術にしたがう。本明細書に詳細に記載されるように、こうした抗体は、例えば、タンパク質を発現している組織を同定するのにまたはタンパク質を精製するのに用いてもよい。抗体はまた、限定されるわけではないが、メトトレキセート、放射性ヨウ素化化合物、リシン（ｒｉｃｉｎ）などの毒素、他の細胞分裂停止または細胞溶解性薬剤などを含む、画像化のための特定の標識剤または細胞傷害性剤にカップリングさせてもよい。
【００２９】
重要なことに、当業に周知であるように、抗体分子のわずかな一部、パラトープのみが、そのエピトープに対する抗体の結合に関与する（一般的には、Ｃｌａｒｋ，  Ｗ．Ｒ．（１９８６）  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，ニューヨーク；  Ｒｏｉｔｔ，  Ｉ．（１９９１）  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第７版，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，オックスフォードを参照されたい）。例えば、ｐＦｃ’およびＦｃ領域は、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合には関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断されている、またはｐＦｃ’領域なしに産生されている抗体は、Ｆ（ａｂ’）2断片と称され、損なわれていない抗体の抗原結合部位を両方とも保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断されている、またはＦｃ領域なしに産生されている抗体は、Ｆａｂ断片と称され、損なわれていない抗体分子の抗原結合部位の１つを保持する。さらに続けると、Ｆａｂ断片は、共有結合した抗体軽鎖およびＦｄと呼ばれる抗体重鎖の一部からなる。Ｆｄ断片は、抗体特異性の主要な決定基であり（単一のＦｄ断片は、抗体特異性を改変することなく、最大１０の異なる軽鎖と会合することが可能である）、そしてＦｄ断片は、単離された際、エピトープ結合能を保持する。
【００３０】
抗体の抗原結合部分内には、当業に周知であるように、抗原のエピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびパラトープの三次構造を維持する枠組み（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）領域（ＦＲ）がある（一般的には、Ｃｌａｒｋ，  １９８６；  Ｒｏｉｔｔ，  １９９１を参照されたい）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄ断片および軽鎖には共に、それぞれ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）により分離されている４つの枠組み領域（ＦＲ１からＦＲ４）がある。ＣＤＲ、そして特にＣＤＲ３領域、そしてさらに詳細には重鎖ＣＤＲ３が、抗体特異性に大部分の責任がある。
【００３１】
哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域は、元来の抗体のエピトープ特異性を保持しながら、同種（ｃｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体または異種（ｈｅｔｅｒｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体の同様の領域と置き換えてもよいことが、現在、当業によく確立されている。これは、非ヒトＣＤＲがヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合し、機能する抗体を産生する、「ヒト化」抗体の開発および使用に最も明らかに示されている。したがって、例えば、ＰＣＴ国際公告第ＷＯ  ９２／０４３８１号は、ネズミＦＲ領域の少なくとも一部がヒト起源のＦＲ領域により置き換えられている、ヒト化ネズミＲＳＶ抗体の産生および使用を解説する。抗原結合能を持つ、損なわれていない抗体の断片を含む、こうした抗体は、しばしば「キメラ」抗体と称される。
【００３２】
したがって、一般の当業者に明らかであろうように、本発明はまた、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｄ断片；Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同ヒトまたは非ヒト配列により置き換えられている、キメラ抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同ヒトまたは非ヒト配列により置き換えられている、キメラＦ（ａｂ’）2断片抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同ヒトまたは非ヒト配列により置き換えられている、キメラＦａｂ断片抗体；およびＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が、相同ヒトまたは非ヒト配列により置き換えられている、キメラＦｄ断片抗体も提供する。本発明はまた、いわゆる一本鎖抗体も含む。したがって、本発明は、胆汁糖タンパク質に特異的に結合する、非常に多くの大きさまたは種類のポリペプチドを含む。これらのポリペプチドは、また、抗体技術以外の供給源から得てもよい。例えば、こうしたポリペプチド結合剤は、溶液中で、固定型でまたはファージディスプレーライブラリーとして容易に調製することが可能な、縮重ペプチドライブラリーにより、提供されてもよい。１つまたはそれ以上のアミノ酸を含むペプチドのコンビナトリアル・ライブラリーもまた、合成してもよい。ペプトイドおよび非ペプチド合成部分のライブラリーをさらに合成してもよい。
【００３３】
ファージディスプレーは、Ｈａｒｔら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：１２４６８（１９９４）に記載されるような方法を用い、本発明にしたがい有用な結合ペプチドを同定するのに、特に有効である。簡潔には、慣用的な方法を用い、４ないし約８０アミノ酸残基の挿入物を展示するファージライブラリーを（例えばｍ１３、ｆｄ、またはラムダファージを用い）調製する。挿入物は、完全に縮重しているまたは偏向（ｂｉａｓｅｄ）アレーに相当してもよい。その後、胆汁糖タンパク質またはその断片に結合する挿入物を持つファージを選択することが可能である。胆汁糖タンパク質またはその断片に結合するファージを再選択する数回の周期を通じ、この方法を繰り返してもよい。反復周期により、特定の配列を持つファージが濃縮される。ＤＮＡ配列解析を行い、発現されたポリペプチドの配列を同定してもよい。胆汁糖タンパク質またはその断片に結合する、配列の最小限の直線部分を決定してもよい。最小直線部分の一部またはすべてに加え、１つまたはそれ以上のさらなる縮重残基をその上流または下流に含む挿入物を含む偏向ライブラリーを用い、該方法を繰り返してもよい。このように、胆汁糖タンパク質を用い、ファージディスプレーライブラリーを含むペプチドライブラリーをスクリーニングし、キラーＴ細胞活性を調節するためのペプチド胆汁糖タンパク質結合剤を同定し、そして選択してもよい。好ましくは、胆汁糖タンパク質結合剤は、胆汁糖タンパク質を架橋する能力に関し、性質決定される。こうした結合分子はまた、記載されるように、スクリーニングアッセイに、診断アッセイに、精製プロトコルに、または薬剤、毒素および／または標識剤（例えば放射性同位体、蛍光分子など）を、胆汁糖タンパク質を細胞表面上に発現する細胞、特にキラーＴ細胞に標的化するのに用いてもよい。こうした胆汁糖タンパク質またはその断片を発現する細胞を無力にするまたは破壊するであろう薬剤分子が当業者に知られ、そして商業的に入手可能である。例えば、イムノトキシン業は、抗体またはその断片により細胞に搬送された際、有効である毒素の例を提供する。毒素の例には、植物または細菌に由来するリボソーム損傷毒素、例えば、リシン、アブリン、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）内毒素、ジフテリア毒素、Ａ鎖毒素、遮断リシンなどが含まれる。
【００３４】
さらに、胆汁糖タンパク質結合断片（ＣＤＲ３領域）を含むものを含む小さいポリペプチドを、組換え手段により、容易に合成しまたは産生し、本発明にしたがい有用な胆汁糖タンパク質結合剤を産生することが可能である。こうした方法は、一般の当業者に周知である。ペプチドは、例えば、商業的に入手可能な自動化ペプチド合成装置を用い、合成することが可能である。ペプチドは、組換え技術により、ペプチドを発現するＤＮＡを発現ベクターに取りこみ、そして該発現ベクターで細胞を形質転換し、該ペプチドを産生することにより、産生することが可能である。
【００３５】
ペプチド胆汁糖タンパク質結合剤を合成するのに用いる、ＣＤＲ領域の配列は、当業に知られる方法により、決定することが可能である。重鎖可変部は、一般的に長さ１００ないし１５０アミノ酸の範囲にわたるペプチドである。軽鎖可変部は、一般的に長さ８０ないし１３０アミノ酸の範囲にわたるペプチドである。およそ３−２５アミノ酸配列しか含まない、重鎖および軽鎖可変部内のＣＤＲ配列は、一般の当業者により、容易に配列決定することが可能である。該ペプチドは、商業的な供給源によってさえ、合成することが可能である。
【００３６】
ペプチドが胆汁糖タンパク質に結合するかどうか決定するため、いかなる既知の結合アッセイを使用してもよい。例えば、ペプチドを表面上に固定し、そしてその後、標識胆汁糖タンパク質と接触させてもよい。ペプチドと相互作用する胆汁糖タンパク質の量またはペプチドに結合しない量をその後、定量化し、該ペプチドが胆汁糖タンパク質に結合するかどうか決定してもよい。前述の抗胆汁糖タンパク質モノクローナル抗体が固定されている表面を、陽性コントロールとして利用してもよい。
【００３７】
胆汁糖タンパク質結合剤のスクリーニングはまた、競合アッセイを利用し、行ってもよい。モノクローナル抗体の結合の減少により示されるように、試験される胆汁糖タンパク質結合剤が、抗胆汁糖タンパク質モノクローナル抗体と競合する場合、該剤および抗胆汁糖タンパク質モノクローナル抗体は、同一のまたは非常に関連しているエピトープに結合する可能性がある。剤が上述の抗胆汁糖タンパク質モノクローナル抗体の特異性を有するかどうか決定する、さらに別の方法は、モノクローナル抗体を、通常反応性である（すなわち結合する）胆汁糖タンパク質とあらかじめインキュベーションし、そしてその後、試験される剤を添加し、試験される該剤が胆汁糖タンパク質に結合する能力において阻害されるかどうか決定することである。試験される該剤が阻害される場合、最も可能性が高いのは、該剤が抗胆汁糖タンパク質モノクローナル抗体と同一のまたは機能的に同等のエピトープおよび特異性を有することである。
【００３８】
一般の当業者に知られる日常的な方法を用い、胆汁糖タンパク質結合剤が、キラーＴ細胞増殖または細胞傷害性を調節するかどうか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで、例えばキラーＴ細胞からのＴＮＦの放出を測定することまたは51Ｃｒ放出アッセイにより（例えば、Ｈｅｒｉｎら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ３９：３９０−３９６，  １９８７を参照されたい）、決定することにより、本発明にしたがい、有用であるかどうか決定することが可能である。他のアッセイは実施例および本明細書の他の場所に記載される。
【００３９】
上述のポリペプチド（例えば抗体）および他の胆汁糖タンパク質結合剤はまた、ヒトにおけるキラーＴ細胞感受性障害に関し、免疫療法的に用いてもよい。胆汁糖タンパク質結合剤と関連して本明細書に用いられる、「免疫療法的」または「免疫療法」という用語は、予防的と共に療法的投与両方を意味する。したがって、該ペプチドは、キラーＴ細胞感受性疾患、例えば腫瘍、移植片拒絶または自己免疫疾患の可能性および／または重症度を減じるため、高リスク患者に投与してもよいし、あるいはこうした疾患が既に明示されている患者に投与してもよい。
【００４０】
本発明の特定の側面は、ｉｎ  ｓｉｔｕで、キラーＴ細胞の細胞傷害性または増殖を特異的に調節するための方法を含む。該方法は、こうした治療が必要な患者に、胆汁糖タンパク質ポリペプチドに選択的に結合する剤を、該患者におけるキラーＴ細胞の細胞傷害性または増殖を亢進させるまたは抑制するのに有効な量で、投与することを含む。実施例に示されるように、キラーＴ細胞が胆汁糖タンパク質を発現するため、キラーＴ細胞の活性が特異的な調節にさらされる。キラーＴ細胞集団を、胆汁糖タンパク質結合剤と接触させる、キラーＴ細胞の細胞傷害性または増殖を特異的に調節するための方法もまた、提供される。胆汁糖タンパク質結合剤を患者に投与すると、またはキラーＴ細胞集団と接触させると、胆汁糖タンパク質の阻害性活性が調節される。キラーＴ細胞活性を増加させるまたは減少させる胆汁糖タンパク質結合剤を、本明細書に記載されるアッセイを用い、そして標準的なキラーＴ細胞細胞傷害性および増殖アッセイ、例えば混合リンパ球反応、クロム放出アッセイ、ＴＮＦ放出アッセイ、およびチミジン取り込みアッセイにしたがい、選択してもよい。一価胆汁糖タンパク質結合剤は、キラーＴ細胞により発現される胆汁糖タンパク質ポリペプチドの架橋を減少させることにより、胆汁糖タンパク質の阻害性シグナルを阻害するであろうし、そして多価胆汁糖タンパク質結合剤（２つまたはそれ以上の胆汁糖タンパク質結合剤を有する）は、キラーＴ細胞により発現される胆汁糖タンパク質ポリペプチドの架橋を増加させることにより、胆汁糖タンパク質の阻害性シグナルを増加させるであろうと考えられる。
【００４１】
定義により、「ｉｎ  ｓｉｔｕ」という用語は、用語ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏを包含しそして含む。本発明の組成物は、多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏ目的に有用である。例えば、本発明の組成物は、キラーＴ細胞増殖または細胞傷害性を阻害する化合物をスクリーニングするのに有用である。こうしたスクリーニングアッセイは、キラーＴ細胞増殖または細胞傷害性を増加させる胆汁糖タンパク質結合剤およびキラーＴ細胞集団を含む、細胞増殖または細胞傷害性アッセイを設定することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことが可能である。潜在的なキラーＴ細胞増殖または細胞傷害性阻害剤を混合物に加え、そして増殖または細胞傷害性に対する影響を測定してもよい。キラーＴ細胞の増殖または細胞傷害性を増加させる剤を、同様のアッセイを用い、スクリーニングしてもよい。したがって、胆汁糖タンパク質に結合し（または天然リガンドなどの他の分子により、胆汁糖タンパク質の活性を調節し）そしてキラーＴ細胞活性を亢進させるまたは抑制する化合物を同定するための方法が、本発明にしたがい、提供される。他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用、例えば研究目的のものが、一般の当業者に知られる。
【００４２】
ｅｘ  ｖｉｖｏ使用もまた、当業者により容易に同定されるであろう。ｅｘ  ｖｉｖｏ使用には、例えば、哺乳動物患者から除去され、そして続いて該哺乳動物患者の体に戻される、キラーＴ細胞の増殖または細胞傷害性の刺激が含まれる。
【００４３】
本発明はまた、異常なキラーＴ細胞活性、例えば細胞傷害性または増殖により特徴付けられる異常を治療するための方法も含む。該方法は、こうした異常を有する患者に、胆汁糖タンパク質に選択的に結合する薬理学的剤を、Ｔ細胞増殖または細胞傷害性を増加させるまたは減少させるのに有効な量で、投与することを含む。
【００４４】
本明細書において、「異常なキラーＴ細胞活性により特徴付けられる異常」は、キラーＴ細胞機能の増加または減少、具体的にはキラーＴ細胞増殖または細胞傷害性の増加または減少が、不利な生理学的結果の改善を生じるような、不利な生理学的結果に関連するいかなる異常でもよいものである。こうした異常には、免疫系の障害、例えば免疫不全、自己免疫および移植片拒絶と共に、微生物または望ましくない細胞増殖、例えば腫瘍による、望ましくない細胞性侵入を含む障害が含まれる。
【００４５】
胆汁糖タンパク質結合剤は、有効な量で投与される。本明細書において、胆汁糖タンパク質結合剤の「有効な量」は、胆汁糖タンパク質阻害性機能を調節し、キラーＴ細胞増殖または細胞傷害性の調節を生じるのに十分な量である。キラーＴ細胞活性の胆汁糖タンパク質阻害を調節することは、異常なキラーＴ細胞活性により特徴付けられる異常に関連する症状が、改善するまたは減少する、望ましい効果を生じるのに十分である。好ましくは、ペプチドの有効量は、ｉｎ  ｖｉｖｏでキラーＴ細胞増殖または細胞傷害性を調節するのに、療法的に有効な量である。一般的に、療法的に有効な量は、患者の年齢、状態、体重および性別と共に、患者における疾患の度合いで変化する可能性があり、そして日常的な実験の題材として当業者により決定することが可能である。投薬量は、いかなる合併症が起きた場合も、個々の医師により、調整することが可能である。療法的に有効な量は、毎日１回またはそれ以上の用量投与で、１日または数日間、典型的には、約０．０１  ｍｇ／ｋｇないし約５００  ｍｇ／ｋｇ、より典型的には、約０．１  ｍｇ／ｋｇないし約２００  ｍｇ／ｋｇ、そしてしばしば、約０．２  ｍｇ／ｋｇないし約２０  ｍｇ／ｋｇの範囲で変化するであろう（もちろん、投与方式および上に論じられる因子に依存する）。
【００４６】
当業の技術の１つは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、剤がキラーＴ細胞増殖または細胞傷害性を調節する能力を測定することにより、胆汁糖タンパク質結合剤の有効量がどのくらいであるか、決定することが可能である。胆汁糖タンパク質結合剤がキラーＴ細胞増殖または細胞障害性を調節する能力を測定するための典型的な方法は、実施例に提供され、そして上に論じられてきている。典型的なアッセイは、胆汁糖タンパク質結合剤がキラーＴ細胞活性をｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏで調節する能力を予測し、そしてしたがって、療法適用のための剤を選択するのに用いることが可能である。
【００４７】
本発明にしたがい、胆汁糖タンパク質結合剤は、薬学的に許容しうる組成物で投与してもよい。一般的に、抗体、抗体断片、および他の胆汁糖タンパク質結合剤（コンビナトリアル・ライブラリーに由来するものなどの小分子を含む）のための薬学的に許容しうるキャリアーは、一般の当業者に周知である。本明細書において、薬学的に許容しうるキャリアーは、活性成分の生物学的活性、すなわち剤がキラーＴ細胞活性を調節する能力の有効性を妨げない、非毒性成分を意味する。薬学的に許容しうるキャリアーには、希釈剤、充填剤（ｆｉｌｌｅｒ）、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤および当業に周知の他の成分が含まれる。ペプチドのための典型的な薬学的に許容しうるキャリアーは、米国特許第５，２１１，６５７号に記載されている。本発明の剤は、経口、非経口または外科的投与のため、固体、半流動体（ｓｅｍｉ−ｓｏｌｉｄ）、液体または気体型、例えば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、デポジトリー（ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）、吸入剤および注射剤の調製に処方してもよい。本発明はまた、局所投与のため処方される、例えば移植による、薬剤組成物も含む。
【００４８】
本発明の方法にしたがい、剤は、注射により、時間にわたる漸次注入により、またはいかなる他の医学的に許容しうる方式により、投与してもよい。投与は、例えば、静脈内、腹腔内、筋内、腔内、皮下または経皮であってもよい。非経口投与のための調製には、無菌水性または非水性溶液、懸濁物および乳化物が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、注射可能な有機エステル、例えばエチルオリエート（ｅｔｈｙｌｏｌｉａｔｅ）である。水性キャリアーには、水、生理食塩水および緩衝媒体を含む、アルコール性／水性溶液、乳化物または懸濁物が含まれる。非経口ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのブドウ糖溶液、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸添加（ｌａｃｔａｔｅｄ）リンゲル溶液、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体および栄養素補充剤（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、電解質補充剤（例えばリンゲルのブドウ糖溶液に基づくものなど）、およびそれらに匹敵するものが含まれる。保存剤および他の添加物もまた、存在してもよく、これらは例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤、および不活性ガス並びにそれらに匹敵するものである。当業者は、これらの代替薬剤組成物を調製するため、不必要な実験に頼ることなく、多様なパラメーターを容易に決定することが可能である。
【００４９】
本発明の方法はまた、胆汁糖タンパク質結合剤を、免疫系障害を治療するための慣用的な療法と共に投与することも含む。たとえば、本発明の方法は、慣用的な治療と同時に実施してもよい。特定の慣用的な治療は、もちろん、障害の性質に依存する。例えば、異常なキラーＴ細胞活性に関連する異常が腫瘍である場合、治療の慣用的な方式は、化学療法である。キラーＴ細胞活性を増加させる（例えば、胆汁糖タンパク質阻害性活性を減少させる）本発明の剤を、亢進した殺腫瘍性効果を提供するため、腫瘍の治療において、化学療法と共に投与してもよい。他の免疫系疾患を、本明細書に記載される胆汁糖タンパク質結合剤およびＴ細胞に結合しそしてＴ細胞機能に影響を及ぼす他の分子、例えば米国特許第５，４３４，１３１号に記載されるようなＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質と共に、同時に治療してもよい。
【００５０】
以下の実施例は、本発明の実施の特定の例を例示するために提供され、そして本発明をこれらの実施例に限定すると見なしてはならない。一般の当業者に明らかであろうように、本発明は、多様な組成物および方法に適用を見出すであろう。
実施例
材料および方法
抗体：３４Ｂ１，２６Ｈ７および５Ｆ４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は以前に説明されているように（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）ＢＡＬＢ／ｃマウスを活性化ヒト粘膜リンパ球株１９１Ｅで免疫することにより産生された。５ｘ１０6リンパ球の３回の腹腔内注射および最後の静脈内注射を２週間間隔で行った。静脈内免疫化３日後、脾臓細胞を単離し、以前に説明されているようにＰＥＧ（ｍ．ｗ．１４５０）存在下、ＮＳ１マウスミエローマ細胞と融合させた。アミノプテリン含有培地でハイブリドーマを選択し、ハイブリドーマ上清は凍結腸および扁桃組織切片の間接免疫ペルオキシダーゼ染色によりスクリーニングした。陽性ハイブリドーマは限界希釈により２回サブクローン化し、プリスタン処理ＢＡＬＢ／ｃマウスへのハイブリドーマ細胞腹腔注射により抗体を含んでいる腹水を産生させた。３４Ｂ１（ＩｇＧ１），２６Ｈ７（ＩｇＧ１）および５Ｆ４（ＩｇＧ１）のアイソタイプはマウスアイソタイプ特異的ｍＡｂ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いるＥＬＩＳＡにより決定された。Ｗ６／３２はヒトＭＨＣクラスＩに特異的なマウスＩｇＧ２ａ  ｍＡｂである（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡのＪａｃｋ  Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ博士より親切にも提供された）。ＯＫＴ３（ＩｇＧ２）はマウス抗ヒトＣＤ３  ｍＡｂである（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡのＲｏｂｅｒｔ  Ｆｉｎｂｅｒｇ博士より親切にも提供された）。ＴＳ２／１８（Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  ＨｏｓｐｉｔａｌのＬｌｙｏｄ  Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ博士より親切にも提供された）は抗ＣＤ２  ｍＡｂ（マウスＩｇＧ２ａ）である。ＯＫＴ１１（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＥｌｌｉｓ  Ｒｅｉｏｎｈｅｒｚ博士より親切にも提供された）は抗ＣＤ２  ｍＡｂ（マウス  ＩｇＧ２９）である。ＯＫＴ４およびＯＫＴ８は各々ヒトＣＤ４およびＣＤ８−αに特異的なマウスＩｇＧ２ａ  ｍＡｂである（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから得られた）。フィコエリトレインに直接結合されたＵＣＨＴ１はヒトＣＤ３−εに特異的なマウスＩｇＧ１  ｍＡｂである（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）。ＭＡ２２（ＣＤ６６ａ；クローンＹＧ−Ｃ９４Ｇ７；ＩｇＧ１）、ＭＡ２６（ＣＤ６６ａ；クローン４．３．１７；ＩｇＧ１）、Ａ２７（ＣＤ６６ｅ；クローン２６／５／１；ＩｇＧ２ａ）、ＭＡ２８（ＣＤ６６ｅ；クローン２６／３／１３；ＩｇＧ１）、ＭＡ３０（ＣＤ６６ｃ；クローン９Ａ６；ＩｇＧ１）、ＭＡ４１（ＣＤ６６ｂ；クローン  ＢＩＲＭＡ１７ｃ；ＩｇＧ１）、ＭＡ６１（ＣＤ６６ｂ；クローン８０Ｈ３；ＩｇＧ１）、ＭＡ７６（ＣＤ６６ａｅ；クローン１２−１４０−４；ＩｇＧ１）、ＭＡ７９（ＣＤ６６ｂ；クローンＢ１３．９；ＩｇＧｌ）、ＭＡ８１（ＣＤ６６ｂ；クローンＧ１０Ｆ５；ＩｇＧ１）、ＭＡ８３（ＣＤ６６ｅ；クローンｂ７．８．５；ＩｇＧ１），ＭＡ８４（ＣＤ６６ｄｅ；クローンＣＯＬ−１）；ＩｇＧ２ａ、ＭＡ８６（ＣＤ６６ａｃｄ���；クローンＢ６．２；ＩｇＧ１）およびＭＡ９１（ＣＤ６６ｅ；クローンＴ８４．６６；ＩｇＧ１）はマウスｍＡｂであり、ＶＩｔｈ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎから得られた。アイソタイプが一致したマウスＩｇＧ１陰性対照ｍＡｂはＫａｋｏｐａｔｔｓ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｒｎａｒｋ）またはＣａｐｐｅｌ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）から購入した。ｍＡｂは常法によりアフィニティー精製およびプロテイン−ＡまたはＧセファロースカラムにより精製した。
【００５１】
細胞および細胞株：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は常法を用い、フィコール−ハイパック比重遠心法により得た。末梢血Ｔ細胞はペニシリン／ストレプトマイシン（１００単位／ｍｌ）、１０ｍＭヘペス  ｐＨ７．４、１０％ウシ胎児血清および１μｇ／フィトヘマグルチン−Ｐ（ＰＨＡ−Ｐ）（Ｍｕｒｅｘ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｄａｒｔｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を含んでいるＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中、ＰＢＭＣを３７℃で７２時間培養することにより刺激した。ヒトｉＩＥＬ細胞株ＥＥＩ−１０（小腸），ＥＥＩ−５（小腸）およびＣＬＩ（大腸）は以前に説明されているように発生させ（Ｃｈｒｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔ．，５８：１５９−１６５，１９９７）、１０％ヒト血清（タイプＡＢ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５単位／ｍｌ  ｒＩＬ−４（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）および２ｎＭ  ｒＩＬ−２（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎより親切にも提供された）を含んでいるＲＰＭＩ−１６４０中で細胞を１μｇ／ｍｌ  ＰＨＡ−Ｐで刺激し、および照射ＰＢＭＣを支持細胞として維持した。ＨＴ２９はＡＴＣＣから得られたヒト腸上皮細胞（ＩＥＣ）株である。ＣＯＳはサル腎臓線維芽細胞株である。これらの後の細胞株は１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン、非必須アミノ酸および１０ｍＭヘペス（完全培地）を含んでいるＲＰＭＩ−１６４０中、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で維持した。
【００５２】
トランスフェクタント：ＢＧＰｘ’分子は以下のように構築した。ヒトＢＧＰｃのＮ末端ドメインおよび膜貫通／細胞質ドメインは各々プライマー対ＢＧＰＡＭＰ−Ｓ：ｃａｕｃａｕｃａｕｃａｕａａｇｃｔｔａｔｇｇｇｇｃａｃｃｔｃ（配列ＩＤ番号：１）およびＮＴＭ−ＡＳ：ｇｃｃａｔｔｔｔｃｔｔｇｇｇｇｃａｂｃｔｃｃｇｇｇｔａｔａｃ（配列ＩＤ番号：２）；ＮＴＭ−Ｓ：ｇｔａｔａｃｃｃｇｇａｇｃｔｇｃｃｃｃａａｇａａａａｔｇｇｃ（配列ＩＤ番号：３）およびＢＧＰＴＲＡＮＳ−ＣＹＴ−ＡＳ：ｃｕａｃｕａｃｕａｃｕａａｇａｃｔａｔｇａａｇｔｔｇｇｔｔｇ（配列ＩＤ番号：４）（ＮＴＭプライマーはＮ末端ドメインの３’末端および膜貫通ドメインの５’末端のハイブリッドであった）を用いるＰＣＲにより別々に増幅した。ＰＣＲ反応液は５μｌの１０ｘＴａｑ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％ゼラチン）、３μｌの１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１μｌの２００μＭの各々のｄＮＴＰ、１μＭの各々のプライマー、１単位のＴａｑポリメラーゼおよび１μｇのｃＤＮＡを５０μｌの最終容量にしたものである。ＰＣＲ反応は、９４℃で１０分、続いて９４℃で１分、５５℃で１分および７２℃で２分を２５サイクル、最後に７２℃での１０分の伸長時間を加える条件で実施した。ＰＣＲ生成物はＳ−３００カラムを通過させた後、５μｌの各々のＰＣＲ生成物が第二のＰＣＲに使用された。ＰＣＲ生成物をアニール化した後、ＢＧＰＡＭＰおよびＴＲＡＮＳ−ＣＹＴ−ＡＳプライマーを反応混合物に加え、前記のようにＰＣＲ反応を実施した。生じたＰＣＲ生成物は使用説明書に詳述してあるようにＣｌｏｎｅＡＭＰシステムを用いてｐＡＭＰ１ベクター内へクローン化し（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＤＨ５α受容細菌を形質転換し、陽性形質転換体はＰＣＲにより選択した。得られたＢＧＰｘ’  ｃＤＮＡは抽出し、常法により配列決定した。ＢＧＰｘ’  ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で切断し、ｐｃＤＮＡ１／Ａｒｎｐベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内へサブクローン化した。このベクター中のＢＧＰｘ’  ｃＤＮＡおよびｐＳＶ２ｎｅｏプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）は各々ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで直線状とし、以前に記載されているように（Ｗａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）安定なＣＨＯ−ＢＧＰｘ’細胞を作り出すため、Ｇ４１８およびＦＡＣＳセルソーターで選択されたＣＨＯ細胞内へ１５：１の比で電気穿孔された。ＢＧＰｘ’、ネオマイシン（Ｎｅｏ）、ＢＧＰｃ（Ｗａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）およびＢＧＰａ（Ｏｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８６：８８１−８８７，１９９２）で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、およびＣＥＡ、ＣＧＭ１、ＮＣＡおよびＣＧＭ６で安定にトランスフェクトされたヒーラー細胞は以前に報告されている（Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。
【００５３】
フローサイトメトリー：単色免疫蛍光のため、約１ｘ１０6細胞を１μｇの一次ｍＡｂを用い、氷上で３０分間染色した。細胞は次に、２％ウシ胎児血清または０．２％ウシ血清アルブミンおよび０．０２％アジ化ナトリウム（ＷＢ）を含んでいるリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、続いてＷＢに希釈した１μｇのヤギ抗マウスフルオレセインイソチオシアネート標識二次抗体（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）と３０分インキュベートした。細胞をＷＢで洗浄し、新鮮なまま試験するかまたは１％パラホルムアミド含有ＰＢＳに再懸濁した。染色および固定された細胞はＥｐｉｃｓ  Ｖフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）またはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で分析した。二色免疫蛍光のためには、染色は上記のように、ただし一次コンジュゲート体とのインキュベーション後、染色された細胞を、２０％正常マウス血清を含んでいるＰＢＳ中で２０分間ブロックし、続いて直接コンジュゲートしたｍＡｂとインキュベートして実施された。
【００５４】
免疫組織化学：組織試料をＯＣＴ化合物（Ａｍｅｓ  Ｃｏ．，Ｅｌｋａｒｔ，ＩＮ）中でマウントし、液体窒素中またはクライオスタット中で凍結し、−７０℃で保存した。４μｍ厚の凍結組織切片はアセトンで５分間固定し、風乾し、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）および３−アミノ−９−エチルカルバゾール（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を色原体として使用する間接免疫ペルオキシダーゼ法（Ｃａｎｃｈｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８０：５６１−５６９，１９９４）により染色した。
【００５５】
ＣＯＳ細胞発現クローニング：ｃＤＮＡライブラリーはベクターｐＡＥＸＦ（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，９３：１１７８０−１１７８５，１９９６）中の、休止および活性化ヒトＰＢＴからの、およびＮＫ細胞からのポリ（Ａ）+ＲＮＡを用いてｐＣＤＭ８ベクター内で構築された。一回目の選択では、ＣＯＳ細胞は１００ｍｍ皿当たり０．２μｇのライブラリーＤＮＡを用いるＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｓｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４：３３６５−３３６９，１９８７）によりトランスフェクトされた。４０時間後、細胞を採取し、３４Ｂ１  ｍＡｂ（腹水を１：５００希釈）とインキュベートし、洗浄し、前に記載されているように抗ＩｇＧ１被覆プレートでより分けた（Ｓｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：２７１４−２７２２，１９８９）。エピソームＤＮＡは付着細胞から調製され、大腸菌内へ再導入し、スフェロプラストのポリエチレングリコール媒介融合によりＣＯＳ細胞内へトランスフェクトし（Ｓｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）、３４Ｂ１  ｍＡｂによるより分けが繰り返された。個々のプラスミドＤＮＡはＤＥＡＥ−デキストラン法によりＣＯＳ細胞内へトランスフェクトされ、７２時間後、間接免疫蛍光およびフローサイトメトリーにより細胞表面発現が分析された。
【００５６】
放射性標識、免疫沈降および電気泳動：一時的トランスフェクション９６時間後、ＣＯＳ細胞を非酵素的にプラスチックペトリ皿から取り除き、以前に記載されているようなラクトペルオキシダーゼ触媒法（Ｂａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：２５９−２６２，１９９４）を用い、Ｎａ−［125Ｉ］で標識した。洗浄後、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリスｐＨ７．８、１０ｍＭヨウ化アセトアミド、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含んでいる免疫沈降緩衝液（ＩＰＢ）中で放射性標識された細胞を溶解した（１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび各々１μｇ／ｍｌのロイペプチン、ペプスタチン、アプロチニンおよびキモスタチン、界面活性剤として１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０）。細胞は氷上で３０−６０分間溶解させ、続いて４℃にて１５分、１４，０００ｇで遠心分離した。遠心分離の上清はＴＬ−１００超遠心機中、１００，０００ｇで４℃にて遠心分離した。この遠心分離からの上清は２０μｌの包装されたプロテインＡセファロースビーズとインキュベートし、４℃で一夜優しく揺り動かした。プロテインＡまたはプロテインＧセファロースビーズへ結合された無関係なアイソタイプｍＡｂまたは正常マウス血清で前もってきれいにした後、プロテインＡまたはＧセファロース（Ｐｈａｒｒｎａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）へ結合させたｍＡｂと４℃で一夜優しく揺り動かすことにより結合特異的免疫沈降を実施し、ビーズは界面活性剤を含んでいるＩＰＢで洗浄した。Ｎ−グリシナーゼ切断のため免疫沈降物を０．８％  β−メルカプトエタノールおよび０．５％ＳＤＳ中で煮沸した後、０．２５Ｍ  Ｎａ−ＨＰＯ4および１ｍＭ  ＥＤＴＡに懸濁した。免疫沈降物は次に１単位のＮ−グリシナーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で処理するか、または３７℃で一夜偽処理し、還元剤を含んでいるＬａｅｍｍｌｉ緩衝液に再懸濁した。可溶化された免疫沈降物は次にＳＤＳ存在下で１２．５％ポリアクリルアミドゲルに溶解した。
【００５７】
可溶性組換え体タンパク質の産生：ヒトＩｇＧ１のＦｃゲノム断片を含んでいるｐＩＧプラスベクター（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）、およびＮ、ＮＡ１Ｂ１およびＮＡ１Ｂ１Ａ２細胞外ドメインを含んでいるＣＤ６６ａ−Ｆｃ可溶性タンパク質、Ｍｕｃ−１８−ＦｃおよびＮＣＡＭ−Ｆｃ構築物のヒンジ（Ｈ）、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの取り込みの詳細は以前に報告されている（Ｔｅｉｘｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｂｕｃｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．，１０９：４３７，１９９６；Ｔｅｉｘｅｉｒａ，１９９６）。ＮＣＡＭ−Ｆｃ、Ｍｕｃ−１８−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＣＤ６６−Ｆｃ（Ｎ−Ｆｃ、ＮＡ１Ｂ１−ＦｃおよびＮＡ１Ｂ１Ａ２−Ｆｃ）ｃＤＮＡｓをＣＯＳ細胞内へトランスフェクトさせ、分泌された可溶性タンパク質は以前に説明されているように（Ｗａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｔｅｉｘｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）プロテインＡセファロースで精製した。
【００５８】
可溶性組換え体タンパク質に結合する抗体の分析：以前に記載されているように（Ｔｅｉｘｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、９６ウェル平底マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ３）を抗ヒトＦｃ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８溶液１００μｌ（１μｇ／ｍｌの最終濃度）で一夜４℃にて被覆した。ウェルを４回洗浄後、０．２５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ  ７．４）を用いて室温で１時間ブロックし、５０μｌの可溶性Ｆｃ構築物のＰＢＳ溶液（１０μｇ／ｍｌの最終濃度）を用いて４℃で一夜被覆した。ＰＢＳでウェルを４回洗浄後、ＰＢＳでいろいろな濃度に希釈されたｍＡｂの５０μｌを１−２時間室温でウェルに加えた。ＰＢＳでウェルを４回洗浄し、１：４０００希釈アルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のＰＢＳ溶液を１時間室温でウェルに加えた。ＰＢＳでウェルを４回洗浄し、２００μｌのパラニトロフェニルホスフェート基質（Ｓｉｇｍａ）を加え、室温で１５−４５分間発色させた。吸光度は４０５ｎｍで決定された。すべての実験は３重に実施され、少なくとも２回繰り返された。
【００５９】
再方向付け溶解：細胞毒性は以前に記載されているように評価された（Ｐｒｏｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：１９４１−１９４８，１９９７）。簡単に言えば、Ｐ８１５肥満細胞腫細胞株を１００μＣｉの［51Ｃｒ］（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用い、３７℃で３０分間標識した。２ｘｌ０3の放射性標識細胞（１００μｌの完全培地）を、１００μｌ完全培地を含む９６ウェルＶ底プレートに３重に入れられている１００μｌの種々の濃度のエフェクターＴ細胞に添加した。標的細胞の添加に先立って、エフェクター細胞はＯＫＴ３  ｍＡｂ（２００μｌ／ｍｌの精製された抗体）および／または３４Ｂ１、２６Ｈ７または５Ｆ４  ｍＡｂ（腹水の１：６００希釈液または種々の濃度の精製抗体）と室温で２０分間インキュベートした。５時間後、１００μｌの上清液をγ−カウンター（ＬＫＢ  Ｗａｌｌａｃ  Ｃｌｉｎｉ  Ｇａｍｍａ  １２７２，Ｆｉｎｌａｎｄ）での分析のために取り出した。自然および最大放出を、各々標的細胞を培地または１％Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０で培養することにより測定した。パーセント毒性は式（実験放出−自然放出）ｘ１００／（最大放出−自然放出）を用いて計算した。
【００６０】
統計：試料間の相違はＳｉｇｍａ  Ｓｔａｔ（Ｊａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）プログラムを使用し、対応のないスチューデントＴ検定で評価した。
実施例１：正常ヒトＩＥＣ細胞表面上の３４Ｂ１関連抗原の構成的発現
ｉＩＥＬ特異的ｍＡｂ（インビトロで増殖させたヒト小腸からのｉＩＥＬ  Ｔ細胞株でマウスを免疫することにより得られた）開発の間、ｍＡｂのある種の分画が正常ヒト小腸の免疫組織化学により示されるようにＩＥＣを染色することが注目された。これらのｍＡｂの３つ、およびそれらが認識する抗原の特性付けは以下に説明されるように特に興味深い。
【００６１】
図１はＩＥＣを認識するが、ｉＩＥＬを認識しない３つのｍＡｂ（３４Ｂ１、５Ｆ４および２６Ｈ７）の同定を示している。パネルＡ−Ｃは材料および方法に説明されたようにヤギ抗マウス西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗体との続いてのインキュベーションで検出される結合により３４Ｂ１（パネルＡ）、５Ｆ４（パネルＢ）および２６Ｈ７（パネルＣ）ｍＡｂで染色された正常大腸の免疫組織学を示している。沈殿した褐色反応生成物は腸細胞上の特異的染色を示している。［倍率２０倍］。正常マウス血清での染色は陰性であった（データは示されていない）。
【００６２】
ヒト腸組織切片の染色はこれらの３つのｍＡｂ（３４Ｂ１、５Ｆ４および２６Ｈ７）のみがＩＥＣを染色することを示した（図１）。これらの抗体でのこのインビトロ組織染色は、正常ヒトＩＥＣ株、ＨＴ２９のフローサイトメトリー分析により確認されるように細胞表面上であるようである。これら３つの抗体は、免疫組織化学で決定されるように（図１）または単離直後にフローサイトメトリーにより決定されるように（データは示されていない）インサイチュではｉＩＥＬを染色しないので、ｉＩＥＬがインビトロ培養過程の間に活性化され、ＩＥＣにより構成的に発現される新生抗原を発現したことが疑われた。
実施例２：３４Ｂ１関連抗原は正常ヒトｉＩＥＬおよび末梢血Ｔ細胞上の活性化抗原である。
【００６３】
ｉＩＥＬ細胞株がＩＥＣで共有されている新生抗原を発現したかどうかを決定するため、ｉＩＥＬの染色をＰＨＡ−Ｐとインビトロで培養した後に試験した。単色フローサイトメトリー分析を、図１で説明したように、小腸に由来する活性化ｉＩＥＬ細胞株、ＥＥＩ−５で実施した。図１に示したように、ｉＩＥＬインサイチュおよび新しく単離されたｉＩＥＬ（データは示されていない）は３４Ｂ１、２６Ｈ７および５Ｆ４  ｍＡｂで染色されなかった。しかしながら、１０−１４日ごとのＰＨＡ−Ｐ活性化で連続細胞株としてインビトロで維持した後、すべてのｉＩＥＬはこれらの３つのｍＡｂにより認識される抗原を発現した（図２Ａ）。小腸から確立されたｉＩＥＬ  Ｔ細胞株、ＥＥＩ−５の染色は（図１Ｂに示されるように９０％ＣＤ８+および１０％ＣＤ４+であった）、すべてのｉＩＥＬがインビトロ活性化後に３つのｍＡｂにより認識される抗原を発現したことを示している。３つのｍＡｂはわずかに異なった染色パターンを示しており、異なった分子または同一分子上の異なったエピトープを認識することを示唆している。同様の観察が大腸から調製されたｉＩＥＬ  Ｔ細胞株、ＣＬＩでなされ、それは４０％ＣＤ８+、３０％ＣＤ４+および３０％二重陰性（ＣＤ４-−ＣＤ８-）であり、この組織部位中のｉＩＥＬのインビボ発現型と一致した（Ｌｕｎｄｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．ｌｍｍｕｎｏｌ．７：１４７３−１４８０，１９９６；データは示されていない）。
【００６４】
しかしながら、ＰＢＴが３４Ｂ１関連抗原を発現し、インビトロでのＰＨＡ−Ｐ刺激後にこの発現を上方制御するので、これらの特徴ではｉＩＥＬを確認できない。図２Ｂは１μｇ／ｍｌ  ＰＨＡ−Ｐ刺激前および３日後、ＣＤ３陽性リンパ球を除いた後に３４Ｂ１、５Ｆ４および２６Ｈ７で、および直接的に結合されたアイソタイプ一致対照抗体による染色バックグラウンドを差し引いた後の二色蛍光分析を示している。厚い黒線はＰＨＡ−Ｐ刺激なしのＰＢＴを示しており、薄い黒線（矢印）はＰＨＡ−Ｐ刺激を示している。ＰＨＡ−Ｐ刺激に先立って、Ｔ細胞の孤立性集団は３４Ｂ１、５Ｆ４および２６Ｈ７ｍＡｂによる染色の増加を示した（図２Ｂ）。ＰＨＡ−Ｐ刺激後、３つすべてのｍＡｂで全集団の染色強度の小さいがしかし有意なシフトが観察された。従って、３４Ｂ１関連抗原は小腸上皮および末梢血中の両方の正常ヒトＴ細胞上の活性化抗原である。
実施例３：３４Ｂ１関連抗原は広範囲の器官の上皮細胞、Ｂ細胞および顆粒球上に発現されている。
【００６５】
前記のデータは３４Ｂ１関連抗原が腸の上皮細胞および活性化Ｔ細胞により発現されていることを示唆している。従って、この細胞発現分布の限定器官調査が行われた。表Ｉにみられるように、３４Ｂ１、２６Ｈ７および５Ｆ４ｍＡｂにより認識される抗原は広範囲の組織で同様に発現されており、問題としている分子は多様な器官系で機能的役割を持っていることが示唆された。３つすべてのｍＡｂは小腸および大腸、胆管樹状構造、腎臓、皮膚および胸腺の上皮細胞上の抗原を一貫して認識した。加えて、いくつかの器官中の散乱顆粒球および扁桃腺の胚中心内の細胞（これらはＢ細胞と一致する）もまた陽性に染色された。顆粒球の染色は末梢血顆粒球の免疫組織化学的分析によっても確認された（データは示されていない）。従って、これらの結果は前記の表現型研究と一緒になって、３４Ｂ１関連抗原は本来広範囲の上皮細胞型、ＢおよびＴリンパ球、顆粒球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＮＫ細胞株の染色に基づいて、データは示されていない）により発現されていることを示唆している。
0004843138.tif 000002
すべての組織の染色は材料および方法に説明されているように行われた。各々の組織に対し、細胞染色は病理学者により決定された不在（−）または存在（＋）として等級分けされた。
実施例４：胆汁糖タンパク質（ＢＧＰ）としての３４Ｂ１関連抗原の同定
３４Ｂ１関連ｍＡｂにより認識される分子を同定するため、休止および活性化ヒトＰＢＴおよびＮＫ細胞からの３つのｃＤＮＡライブラリー混合物でのトランスフェクション後のＣＯＳ細胞発現クローニングによる３４Ｂ１  ｍＡｂのコグネイト抗原をコードしているｃＤＮＡのクローン化に３４Ｂ１  ｍＡｂが使用された。以前の研究がこれらの細胞型における３４Ｂ１、２６Ｈ７および５Ｆ４  ｍＡｂにより認識される抗原の発現を示しているので、これらのｃＤＮＡライブラリーが利用された。一時的にトランスフェクトされたＣＯＳ細胞を３回の免疫選択および３４Ｂ１  ｍＡｂでのより分けにかけた。３回目のより分け後、５０の無作為選択大腸菌形質転換体の１７が３．３ｋｂ挿入物を持つプラスミドを含んでいた。これらのプラスミドの挿入物は制限切断分析で類似していた。これらのプラスミドでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞は３４Ｂ１  ｍＡｂで特異的に染色された。これらのプラスミドの内の一つ、ｐＰＡＮ３．１が更なる特徴付けのために選択された。
【００６６】
このプラスミドは、ＣＯＳ細胞内へトランスフェクトされた場合、３４Ｂ１および５Ｆ４  ｍＡｂにより特異的に認識され、Ｎ−グリカナーゼによる切断後に約７０ｋＤの主バンドおよびより小さい分子量のいくつかの副バンドに分離される（図４）、１２０ｋＤ糖タンパク質の翻訳を指示している。ＢＧＰｂ（レーンａ−ｃ）をコード化しているｐＰＡＮ３．１ベクターまたはｐＣＤＭ８ベクター（レーンｄおよびｅ）で一時的にトランスフェクトされたＣＯＳ細胞および活性化ｉＩＥＬ細胞株、ＥＥＩ−１０（レーンｆおよびｇ）の細胞表面タンパク質を［125Ｉ］で放射性標識し、３４Ｂ１  ｍＡｂ（レーンｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆまたはｆ）かまたは正常マウス血清（レーンａ）で免疫沈降させ、免疫沈降物を還元条件下、Ｎ−グリカナーゼ前処理をして（レーンｃ、ｅおよびｇ）またはせずに（レーンａ、ｂ、ｄおよびｆ）分離した。同一の観察が５Ｆ４および２６Ｈ７  ｍＡｂでなされた（データは示されていない）。同様のタンパク質が３つすべてのｍＡｂにより放射性標識細胞表面ｉＩＥＬタンパク質から免疫沈降された（図４）。両方の鎖上のこのｃＤＮＡの完全ＤＮＡ配列決定はＢＧＰまたはＣＤ６６ａ（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号Ｘ１４８３１）の’ｂ’スプライス変異体と９７％同一であり、すべての相違はコード領域の外側に存在することを明らかにした。ｃＤＮＡは５８ｋＤのポリペプチド主鎖を予言するので、図４のデータはいくつかの炭化水素修飾がＮ−グリカナーゼ切断に比較的抵抗性であることを示唆している。ＢＧＰは免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーの一員であり、他の胎児性癌抗原（ＣＥＡ）またはＣＤ６６ファミリー構成遺伝子のＮ−ドメインと高度に相同的であるＮ−末端免疫グロブリンＶ（ＩｇＶ）関連ドメイン、続いてのいくつかのＩｇＣ２関連ドメインＡ１およびＢ１、およびＢＧＰアイソフォームに独特なＡ２、ＹまたはＺドメインから成っている（Ｗａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｏｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｔｅｉｘｅｉｒａ，１９９４；Ｂａｍｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９９１）。
【００６７】
３４Ｂ１関連ｍＡｂがＢＧＰに対して反応性であることを確認するため、およびこれらのｍＡｂが方向付けられる特異的タンパク質ドメインを決定するため、ＣＤ６６ａのＮ−ドメイン、ＣＤ６６ａのＮＡ１Ｂ１ドメイン、ＣＤ６６ａのＮＡ１Ｂ１Ａ２ドメインおよび陰性対照としてのＮ−ＣＡＭ（ＣＤ５６）を含んでいるＦｃ融合タンパク質での結合アッセイで抗体が試験された。図３Ａは材料と方法で説明されたような、ｍＡｂを試験するためにＥＬＩＳＡで使用されるＦｃ融合タンパク質のスキームダイアグラムである。ＣＤ６６ａのＮ、ＮＡ１Ｂ１およびＮＡ１Ｂ１Ａ２ドメインおよび陰性対照としてのＮ−ＣＡＭ（ＣＤ５６）を含んでいるＦｃ融合タンパク質は材料と方法で説明されたように、３４Ｂ１、５Ｆ４および２６Ｈ７  ｍＡｂは、陽性対照抗体ＭＡ２２、ＭＡ７６およびＭＡ２６と比較してＥＬＩＳＡにおいて試験された（図３Ｂ）。図３Ｂにみることができるように、これらの研究は３つのｍＡｂによるＢＧＰ（ＣＤ６６ａ）の認識を確認し、３つすべてのｍＡｂがＮ−ドメインと反応することを示した。
【００６８】
３４Ｂ１関連ｍＡｂのコグネイト抗原がＢＧＰであったことをさらに確認するため、いくつかのＢＧＰのスプライス変異体（ＢＧＰａ、ＢＧＰｃおよびＢＧＰｘ’）で安定にトランスフェクトされたＣＯＳ細胞、およびＣＤ６６ｂ（ＣＥＡ遺伝子関連番号１、ＣＧＭｌ）、ＣＤ６６ｃ（ＣＥＡ遺伝子関連番号６，ＣＧＭ６）、ＣＤ６６ｄ（非特異的交差反応抗原、ＮＣＡ）およびＣＤ６６ｅ（ＣＥＡ）を含むＣＤ６６血清学的クラスターの他の構成物でトランスフェクトされたヒーラー細胞を染色する能力で３つのｍＡｂが試験された。図５は、３４Ｂ１、５Ｆ４および２６Ｈ７  ｍＡｂｓまたは陰性対照としてのアイソタイプ一致ＩｇＧ１で染色した後の、ＣＨＯのＢＧＰａ、ＢＧＰｃおよびＢＧＰｘ’トランスフェクト体およびヒーラー細胞のＣＥＡ、ＮＣＡ、ＣＣＧＭ６およびＣＧＭ１トランスフェクト体のフローサイトメトリー分析と偽（Ｎｅｏ）形質転換体の比較を示している。すべての形質転換体はトランスフェクトされたｃＤＮＡに特異的な対照ｍＡｂで陽性に染色された（データは示されていない）。ＣＧＭ１（ＣＤ６６ｂ）を除いて、３４Ｂ１  ｍＡｂはすべてのスプライス変異体を含む試験されたＣＤ６６ファミリー構成物をすべて染色した。しかしながら、２６Ｈ７および５Ｆ４  ｍＡｂはＣＤ６６ａスプライス変異体のみを染色し、それらはこの分子のＮ−ドメインに特異的であるらしいことを示唆している。これらの結果は、表現型分類および前記の上皮細胞、顆粒球、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびＮＫ細胞上のＢＧＰの分布、および従来の報告（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｍｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）を一緒にすると、３４Ｂ１、２６Ｈ７および５Ｆ４  ｍＡｂのコグネイト抗原としてのＢＧＰのＮ−ドメイン、およびさらに３４Ｂ１  ｍＡｂが他のＣＤ６６形を認識することを明瞭に同定している。
実施例５：ｉＩＥＬはＣＤ６６ａアイソフォームのみを発現する
活性化ヒトｉＩＥＬはモノクローナル抗体の第６回国際ワークショップで示された、およびすべてのＣＤ６６アイソフォームに特異的であるｍＡｂの一団により染色された。小腸からのヒトｉＩＥＬ細胞株、ＥＥＩ−１０は材料および方法で説明したように一連の抗ＣＤ６６  ｍＡｂでの活性化８日後に染色された。各々のパネルはＣＤ６６特異的ｍＡｂと陰性対照としての正常マウス血清で得られた染色の重ね合わせを示している。ＣＤ６６アイソフォームに対するｍＡｂの特異性はパネルに示されている。活性化ｉＩＥＬは、ＣＤ６６ａ−ｅに特異的なｍＡｂの大集団（ｍＡｂ  ＭＡ２７、ＭＡ２８、ＭＡ３０、ＭＡ４１、ＭＡ６１、ＭＡ７６、ＭＡ７９、ＭＡ８１、ＭＡ８３、ＭＡ８４、ＭＡ８６およびＭＡ９１）での染色に基づくと、ＣＤ６６ａ以外のＣＤ６６アイソフォームを発現しない（図６）。
【００６９】
ＢＧＰとＫＩＲ含有ＩＴＩＭ間の類似性をさらに引き出すため、ＣＤ３結合後のチロシンリン酸化タンパク質のパターンに対するＣＤ６６ａ特異的ｍＡｂの効果をｔｈ４ｅ  Ｅｅｉ−１０細胞株で評価した。ｉＩＥＬ（１ｘ１０6）を０．１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を含んでいる１００μｌのＲＰＭＩ−１６４０中、架橋剤として２０μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）存在下、１００ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３  ｍＡｂおよび１０μｇ／ｍｌの５Ｆ４  ｍＡｂかまたは１０μｇ／ｍｌの正常ＩｇＧ１とインキュベートした。３７℃で２または８分のインキュベーション後、反応を１０ｍＭのＮａ2ＶＯ3（Ｓｉｇｍａ）を含んでいる１ｍｌのＰＢＳで停止させ、ペレットを０．２Ｘ  ＰＢＳ、１００μＭ  Ｎａ2ＶＯ3、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、５ｍＭヨウ化アセトアミドおよび２０μｇ／ｍｌのアプロチニンおよび還元剤として加えられたＬａｅｍｍｌｉ緩衝液を含んでいる１００μｌの溶解緩衝液中で３０分間、氷上でインキュベートした。溶解液を５分間煮沸し、１０％ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎフィルターへウェスタン移送し、ＰＹ２０  ｍＡｂ（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）で免疫ブロットし、西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体（Ｚｙｍｅｄ）で発色させ、化学発光を促進させた。５Ｆ４  ｍＡｂ存在下でのＣＤ３とＯＫＴ３  ｍＡｂとの架橋のアイソタイプ対照抗体との比較は、リン酸化の動力学およびレベルを著しく変化させ、ＢＧＰ架橋の結果としてホスファターゼが活性化されたことを示唆している。
実施例６：ｉＩＥＬに対するキラー阻害レセプターとしてのＢＧＰ機能。
【００７０】
ＢＧＰ特異的ｍＡｂ、３４Ｂ１、２６Ｈ７および５Ｆ４での染色により決定されたように、ＢＧｐが活性化ｉＩＥＬ上で発現されたという観察は、ＢＧＰは主として上皮細胞および顆粒球上で発現される分子としておよび細胞−細胞接着および上皮細胞増殖の制御に関与するとみられていたので、独特でありまた予期されていなかった。ｉＩＥＬおよびＴ細胞上のＢＧＰの機能はしかしながら、一般的には知られていない。重要なことは、ＢＧＰａおよびＢＧＰｂスプライス変異体の細胞質の尾は２１アミノ酸離れて細胞質尾内に２つのＩＴＩＭドメインを含んでおり（ＣＤ６６ｂ−ｅは含んでいない）、ＢＧＰがＴ細胞上の阻害分子として機能するのではないかという可能性を生じさせる（Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｏｂｒｉｎｋ，１９９７）。Ｔ細胞機能におけるＢＧＰ抗原の役割を決定するため、ｉＩＥＬの機能に対する３つのｍＡｂの影響が試験された。
【００７１】
活性化ｉＩＥＬの主たる機能は細胞溶解性エフェクター細胞としての機能である。従って、ｉＩＥＬの細胞溶解性機能に対する３つのｍＡｂの影響が再方向付け溶解アッセイで試験され、その結果が図７に示されている。ＫＪ−３  ｉＩＥＬ細胞株の抗ＣＤ３方向付け溶解（ＯＫＴ３）が、１００：１、５０：１および２５：１のエフェクター：標的比で、１００．０μｇ／ｍｌの濃度のＣＤ６６特異的ｍＡｂ（５Ｆ４または２６Ｈ７）またはアイソタイプ一致ＩｇＧ１抗体の存在または不在下で、材料および方法で説明したように試験された。添加抗体なし（培地）での、および試験抗体単独存在下（２６Ｈ７、５Ｆ４および対照ＩｇＧ１）での細胞溶解もまた示されている。各々の測定に対する平均の標準誤差が示されている。図７に示されているデータは６回の実験を表わしたものである。正常ヒト小腸由来のｉＩＥＬ細胞株、ＥＥＩ−１０が、標的細胞としてＰ８１５マウス肥満細胞腫細胞株を用いる再方向付け溶解アッセイで試験された場合、ＯＫＴ３  ｍＡｂを使用した抗ＣＤ３架橋で著しい細胞毒性が惹起された（しかし架橋なしでは観察されない）（図７）。３４Ｂ１、２６Ｈ７または５Ｆ４  ｍＡｂのどれもが種々の異なった濃度でＰ８１５細胞株の細胞溶解を刺激することができず、架橋ＢＧＰは直接ｉＩＥＬを活性化していないことを示している。しかしながら、３つすべての抗ＢＧＰ  ｍＡｂとの架橋ＢＧＰは、阻害を示さないアイソタイプ一致ＩｇＧ１対照抗体と比較するとＰ８１５細胞株の抗ＣＤ３方向付け細胞溶解の著しい阻害を生じた。５Ｆ４  ｍＡｂは１００：１、５０：１および２５：１のエフェクター：標的比で各々２２％、３５％および３８％程度溶解を阻害した。同じエフェクター：標的比での対照抗体による阻害は−４％、５％および５％であった。さらに、抗ＣＤ３方向付け細胞溶解は、Ｐ８１５細胞株とのＣＤ５８様相互作用を阻害すると期待されるであろうＣＤ２特異的ｍＡｂ、ＴＳ２／１８によっては阻害されず、抗ＣＤ６６ａ  ｍＡｂによる阻害は単に接着に影響するせいではないようであることを示唆している。従って、ＢＧＰの架橋形成はｉＩＥＬの抗ＣＤ３方向付け細胞溶解活性を阻害する。
【００７２】
サイトカイン処理後の早期にｉＩＥＬが採取された場合、Ｐ８１５細胞株に対して有意な量の細胞溶解が観察され、ｉＩＥＬに対して以前に記載されている特性である、サイトカイン誘導キラー活性（リンホカイン活性化キラー活性、ＬＡＫ）と一致している。この細胞溶解性活性が抗ＢＧＰ  ｍＡｂによる阻害の主題でもあるかどうかを試験するため、ｉＩＥＬ細胞株をＢＧＰ特異的ｍＡｂ（ＢＧＰ特異的ｍＡｂのプール）または正常ＩｇＧ１の存在または不在下で、標的としてのＰ８１５細胞に暴露した。ＥＥＩ−１０  ｉＩＥＬ細胞株によるＰ８１５細胞株の毒性に対する抗ＢＧＰ特異的ｍＡｂ  ３４Ｂ１、２６Ｈ７および５Ｆ４の影響は２５：１のエフェクター：標的比で試験された。Ｐ８１５の細胞溶解は２μｇ／ｍｌまたは６μｇ／ｍｌの無関係ＩｇＧ１抗体では影響されなかった。すべての抗ＢＧＰ抗体について細胞毒性の阻害は有意であった（５Ｆ４，ｐ＝０．１５；２６Ｈ７，ｐ＝０．０４８，３４Ｂ１，ｐ＝０．００４；プール，ｐ＝０．００１６）。抗ＢＧＰ  ｍＡｂは、ｍＡｂのプールを用いると各々２μｇ／ｍｌで７０％の高くまで、２μｇ／ｍｌの個々のｍＡｂ量で５０％までの阻害でｉＩＥＬ細胞株の細胞溶解性活性を阻害し、ｉＩＥＬのリンホカイン活性化キラー活性もまた抗ＢＧＰ抗体による阻害の主題であったことを示している。
実施例７：抗ＢＧＰ抗体は異質遺伝子混合リンパ球反応におけるＢＧＰ阻害シグナルを阻害できる。
【００７３】
ヒト末梢血単核細胞（ドナーＡ）を照射し（５００ラド）、フィコール-ハイパック比重遠心法により調製した非照射末梢血単核細胞と９６ウェルＵ底プレート中２００μｌの総容量にて、２ｘ１０6細胞／ウェルの総濃度で４重に同時培養した。９６時間後、ウェル当たり０．５μＣｉの［3Ｈ］−チミジンを加えて１８時間インキュベートし、プレートから採取して計数した。培養条件は添加物を含まないか（培地）または種々の濃度の希釈腹水（マウス抗ヒトＢＧＰモノクローナル抗体３４Ｂ１および５Ｆ４）または正常マウス血清を含んでいる。実験データは表ＩＩに示されており、５回の実験を表すものである。平均±ＳＥが示されている。抗ＢＧＰ抗体存在下でのＴ細胞増殖の増加はＢＧＰ阻害シグナルの阻害と一致している。
0004843138.tif 000003
図８は同様な実験の結果を示している。二人の関係のないヒト研究被験者からの刺激体（照射末梢血単核細胞）および応答体（非照射末梢血単核細胞）が、フィトヘマグルチニン−Ｐ（ＰＨＡ；１μｇ／ｍｌ）、種々の濃度の無関係ＩｇＧ１（１−１００μｇ／ｍｌ）または種々の濃度の抗ＣＤ６６ａ特異的モノクローナル抗体３４Ｂ１、２６Ｈ７または５Ｆ４（１−１００μｇ／ｍｌ）の存在または不在下で、９６ウェル平底プレート中、各々のウェル当たり２ｘ１０5細胞で同時培養された。４日後、最後の１８時間インキュベーションにウェル当たり１μキューリーの3Ｈ−チミジンを加え、増殖の評価のためプレートから採取した。ｙ軸は分当たりのカウント数を示している。各々の測定にＳ．Ｅ．Ｍ．が示されている。
【００７４】
用いられた用語および表現は記述の用語として使用されており、何ら制限するものではなく、そのような用語および表現の使用においては、示されおよび説明された特色の均等物またはそれらの一部を排除することは意図されていず、種々の変形が本発明の範囲内で可能であることが認められる。
【００７５】
本明細書に記載されたすべての参考文献は本明細書において援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＩＥＣを認識するが、休止ｉＩＥＬを認識しない、３つのｍＡｂ（３４Ｂ１、５Ｆ４および２６Ｈ７）の同定を示す。
【図２】  図２は、ｉＩＥＬおよびＰＢＴが、活性化後、３４Ｂ１、５Ｆ４および２６Ｈ７  ｍＡｂにより認識される抗原を発現することを示す。
【図３】  図３は、ＢＧＰのＮ−ドメインが３４Ｂ１関連ｍＡｂの同族（ｃｏｇｎａｔｅ）抗原であることを示す。
【図４】  図４は、３４Ｂ１関連ｍＡｂが、ＣＯＳ細胞トランスフェクタントおよび活性化ｉＩＥＬ上のＢＧＰを特異的に免疫沈降することを示す。
【図５】  図５は、抗ＢＧＰ  ｍＡｂの、他のＣＤ６６ファミリーメンバーに対する特異性を示す。
【図６】  図６は、活性化ヒトｉＩＥＬによるＣＤ６６アイソフォーム発現の解析を示す。
【図７】  図７は、抗ＢＧＰ抗体による、抗ＣＤ３に指示され、そしてリンホカインに活性化されるキラー活性の阻害を示す。
【図８】  図８は、抗ＢＧＰモノクローナル抗体による、ヒト同種異系混合（ａｌｌｏ−ｍｉｘｅｄ）リンパ球反応の阻害を示す。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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0004843138.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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