(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一粒子及び前記第一粒子に固定された第一結合性物質を有する第一プローブと、前記第一粒子と比重が異なる第二粒子及び前記第二粒子に固定された第二結合性物質を有する第二プローブと、前記第一結合性物質が結合し得る第一部分及び前記第二結合性物質が結合し得る第二部分を有する標的物質とを反応させて得られる反応混合物から、前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質との結合体を分離する方法であって、
前記反応混合物を、前記第一粒子よりも比重が大きく、前記第二粒子よりも比重が小さく、かつ前記結合体よりも比重が小さい液体、又は前記第一粒子よりも比重が小さく、前記第二粒子よりも比重が大きく、かつ前記結合体よりも比重が大きい液体と混合した後、沈降物及び浮上物が形成されるまで静置する工程を含む前記方法。
【請求項２】
前記第一粒子及び／又は第二粒子が磁性粒子であり、
前記反応混合物が、前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを容器内に収容された反応溶媒中で反応させた後、前記容器の外壁面近傍に磁石を配置した状態で前記反応溶媒を除去して得られたものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第一粒子が非磁性粒子であり、前記第二粒子が磁性粒子である請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記第一粒子及び／又は前記第二粒子が磁性粒子であり、前記第一プローブ、前記第二プローブ、前記標的物質及び反応溶媒を容器に収容する工程、前記容器の外壁面の所定領域を通じて前記容器内の前記磁性粒子に磁石を作用させる工程、前記磁石の作用を解除する工程、並びに前記所定領域の位置を変化させながら前記磁石を作用させる工程及び前記磁石の作用を解除する工程を繰り返す工程を含む反応方法により、前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを反応させることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記磁石を作用させる工程において、前記所定領域と前記磁石とを近接させることにより前記磁石を作用させ、
前記磁石の作用を解除する工程において、前記所定領域と前記磁石とを離反させることにより前記磁石の作用を解除し、
前記磁石を作用させる工程及び前記磁石の作用を解除する工程を繰り返す工程において、前記所定領域の位置を変化させながら前記所定領域と磁石との近接及び離反を繰り返す請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記所定領域の位置を前記容器の周方向又は長手方向に変化させる請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
第一粒子及び前記第一粒子に固定された第一結合性物質を有する第一プローブと、第二粒子及び前記第二粒子に固定された第二結合性物質を有する第二プローブとを用いて、前記第一結合性物質が結合し得る第一部分及び前記第二結合性物質が結合し得る第二部分を有する標的物質を検出する方法であって、
前記第一粒子として標識化粒子を選択し、前記第二粒子として前記第一粒子よりも比重が大きい粒子を選択する第一工程、
前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを反応させ、反応混合物を得る第二工程、
前記反応混合物を、前記第一粒子よりも比重が大きく、前記第二粒子よりも比重が小さく、かつ前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質との結合体よりも比重が小さい液体と混合した後、沈降物及び浮上物が形成されるまで静置する第三工程、及び
前記沈降物に含まれる前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質との結合体を、前記第一粒子の標識に基づき検出する第四工程を含む前記方法。
【請求項８】
第一粒子及び前記第一粒子に固定された第一結合性物質を有する第一プローブと、第二粒子及び前記第二粒子に固定された第二結合性物質を有する第二プローブとを用いて、前記第一結合性物質が結合し得る第一部分及び前記第二結合性物質が結合し得る第二部分を有する標的物質を検出する方法であって、
前記第一粒子として標識化粒子を選択し、前記第二粒子として前記第一粒子よりも比重が小さい粒子を選択する第一工程、
前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを反応させ、反応混合物を得る第二工程、
前記反応混合物を、前記第一粒子よりも比重が小さく、前記第二粒子よりも比重が大きく、かつ前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質との結合体よりも比重が大きい液体と混合した後、沈降物及び浮上物が形成されるまで静置する第三工程、及び
前記浮上物に含まれる前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質との結合体を、前記第一粒子の標識に基づき検出する第四工程を含む前記方法。
【請求項９】
前記第一工程において、前記第一粒子及び／又は前記第二粒子として磁性粒子を選択し、
前記第二工程において、前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを容器内に収容された反応溶媒中で反応させた後、前記容器の外壁面近傍に磁石を配置した状態で前記反応溶媒を除去し、前記反応混合物を得る請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
前記第一工程において、前記第一粒子として非磁性粒子を選択し、前記第二粒子として磁性粒子を選択する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記第一工程において、前記第一粒子及び／又は前記第二粒子として磁性粒子を選択し、
前記第二工程において、前記第一プローブ、前記第二プローブ、前記標的物質及び反応溶媒を容器に収容する工程、前記容器の外壁面の所定領域を通じて前記容器内の前記磁性粒子に磁石を作用させる工程、前記磁石の作用を解除する工程、並びに前記所定領域の位置を変化させながら前記磁石を作用させる工程及び前記磁石の作用を解除する工程を繰り返す工程を含む反応方法により前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを反応させる請求項７又は８記載の方法。
【請求項１２】
前記第二工程において、前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを反応させた後、前記容器の外壁面近傍に磁石を配置した状態で前記反応溶媒を除去し、前記反応混合物を得る請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記第一工程において、前記第一粒子として非磁性粒子を選択し、前記第二粒子として磁性粒子を選択する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記第一工程において、前記第二粒子として磁性粒子を選択し、
前記第二工程において、前記標的物質を含有する試料と前記第二プローブとを混合し、磁力制御により前記第二プローブと前記標的物質との結合体を回収し、前記第二プローブと前記標的物質との結合体と前記第一プローブとを反応させる請求項７〜１３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、第一プローブと第二プローブと標的物質とを反応させて得られる反応混合物から第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を分離する方法、第一プローブと第二プローブと標的物質とを反応させる方法、及び第一プローブと第二プローブとを用いて標的物質を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  標的核酸の検出方法として、例えば、標的核酸の第一セグメントにハイブリダイズする第一オリゴヌクレオチド及び第一オリゴヌクレオチドに付加された標識からなる検出用プローブと、標的核酸の第二セグメントにハイブリダイズする第二オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドに付加された捕捉基からなる捕捉用プローブとを利用する方法が知られている（特許文献１参照）。この方法では、検出用プローブと捕捉用プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション体を形成させた後、捕捉用プローブの捕捉基を利用して上記ハイブリダイゼーション体を分離し、上記ハイブリダイゼーション体を検出用プローブの標識に基づき検出する。【０００３】  上記方法において、第一オリゴヌクレオチドに付加する標識として標識化粒子を利用すれば、標識強度が増強され、標的核酸の検出精度を向上させることができる。したがって、標的核酸の量が少なくても（すなわち標的核酸をＰＣＲ等により増幅しなくても）標的核酸を検出することができる。【０００４】  また、上記方法において、第二オリゴヌクレオチドに付加する捕捉基として磁性粒子を利用すれば、磁力制御により上記ハイブリダイゼーション体の形成及び分離を容易かつ迅速に行うことができる。磁力制御による磁性粒子の分離方法としては、例えば、分注機を利用した方法（特許文献２及び３参照）が知られている。この方法では、容器内から液体を吸引及び吐出する分注機のピペットチップに磁石を配置し、磁石を作用させて、ピペットチップ内に吸引された液体中の磁性粒子をピペットチップの内壁面に保持する一方、磁石の作用を受けなくすることによって、磁性粒子をピペットチップの内壁面から離脱させて液体とともにピペットチップ外へ吐出する。
【特許文献１】  特開平６−３１１８９９号公報
【特許文献２】  特許第３１１５５０１号公報
【特許文献３】  特開平８−３２０２７４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  上記方法において、標識化粒子及び標識化粒子に固定された第一オリゴヌクレオチドを有する第一プローブと、磁性粒子及び磁性粒子に固定された第二オリゴヌクレオチドを有する第二プローブとを利用する場合、第一プローブと第二プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション体は、標識化粒子及び磁性粒子を含む巨大な分子となる。したがって、分注機を利用して上記ハイブリダイゼーション体の形成及び分離を行なうと、分注機の吸引及び吐出時の衝撃により、上記ハイブリダイゼーション体の破壊、分解等が生じるおそれがある。【０００６】  そこで、本発明は、第一粒子（例えば標識化粒子）及び第一粒子に固定された第一結合性物質（例えば第一オリゴヌクレオチド）を有する第一プローブと、第二粒子（例えば磁性粒子）及び第二粒子に固定された第二結合性物質（例えば第二オリゴヌクレオチド）を有する第二プローブと、標的物質（例えば標的核酸）とを反応させて得られる反応混合物から、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体に破壊、分解等が生じない穏やかな条件下、当該結合体を分離する方法を提供することを目的とする。【０００７】  また、本発明は、第一粒子（例えば標識化粒子）及び第一粒子に固定された第一結合性物質（例えば第一オリゴヌクレオチド）を有する第一プローブと、第二粒子（例えば磁性粒子）及び第二粒子に固定された第二結合性物質（例えば第二オリゴヌクレオチド）を有する第二プローブと、標的物質（例えば標的核酸）とを、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体に破壊、分解等が生じない穏やかな条件下で反応させる方法を提供することを目的とする。【０００８】  さらに、本発明は、第一粒子（例えば標識化粒子）及び第一粒子に固定された第一結合性物質（例えば第一オリゴヌクレオチド）を有する第一プローブと、第二粒子（例えば磁性粒子）及び第二粒子に固定された第二結合性物質（例えば第二オリゴヌクレオチド）とを用いて、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体に破壊、分解等が生じない穏やかな条件下、標的物質（例えば標的核酸）を検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  上記課題を解決するために、本発明は、第一発明として、第一粒子及び前記第一粒子に固定された第一結合性物質を有する第一プローブと、前記第一粒子と比重が異なる第二粒子及び前記第二粒子に固定された第二結合性物質を有する第二プローブと、前記第一結合性物質が結合し得る第一部分及び前記第二結合性物質が結合し得る第二部分を有する標的物質とを反応させて得られる反応混合物から、前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質との結合体を分離する方法であって、前記反応混合物を、前記第一粒子よりも比重が大きく、前記第二粒子よりも比重が小さく、かつ前記第一粒子及び前記第二粒子からなる粒子複合体よりも比重が小さい液体、又は前記第一粒子よりも比重が小さく、前記第二粒子よりも比重が大きく、かつ前記第一粒子及び前記第二粒子からなる粒子複合体よりも比重が大きい液体と混合した後、沈降物及び浮上物が形成されるまで静置する工程を含む前記方法を提供する。【００１０】  第一プローブと第二プローブと標的物質とを反応させて得られる反応混合物には、未反応の第一プローブ（標的物質と結合していない第一プローブ）、未反応の第二プローブ（標的物質と結合していない第二プローブ）、未反応の標的物質（第一プローブ及び第二プローブのいずれとも結合していない標的物質）、第一プローブと標的物質との結合体、第二プローブと標的物質との結合体、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体等が含まれ得る。但し、必ずしもこれらの全てが反応混合物に含まれるわけではなく、例えば、反応手順、反応条件等によっては、第一プローブと標的物質との結合体、第二プローブと標的物質との結合体等が含まれない場合もある。【００１１】  第一粒子の質量及び体積は第一結合性物質の質量及び体積よりも遥かに大きく、第二粒子の質量及び体積は第二結合性物質の質量及び体積よりも遥かに大きく、第一粒子及び第二粒子の質量及び体積は標的物質の質量及び体積よりも遥かに大きいので、第一プローブの比重は第一粒子の比重に、第二プローブの比重は第二粒子の比重に、第一プローブと標的物質との結合体の比重は第一粒子の比重に、第二プローブと標的物質との結合体の比重は第二粒子の比重に、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体の比重は第一粒子及び第二粒子からなる粒子複合体の比重に近似することができる。【００１２】  したがって、第一粒子の比重よりも第二粒子の比重の方が大きい場合、反応混合物を、第一粒子よりも比重が大きく、第二粒子よりも比重が小さく、かつ第一粒子及び第二粒子からなる粒子複合体よりも比重が小さい液体と混合した後、静置すると、未反応の第二プローブ、第二プローブと標的物質との結合体及び第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体は沈降し、未反応の第一プローブ及び第一プローブと標的物質との結合体は浮上する。【００１３】  一方、第一粒子の比重よりも第二粒子の比重の方が小さい場合、反応混合物を、第一粒子よりも比重が小さく、第二粒子よりも比重が大きく、かつ第一粒子及び第二粒子からなる粒子複合体よりも比重が大きい液体と混合した後、静置すると、未反応の第二プローブ、第二プローブと標的物質との結合体及び第一プローブ��第二プローブと標的物質との結合体は浮上し、未反応の第一プローブ及び第一プローブと標的物質との結合体は沈降する。【００１４】  このとき、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体には重力及び浮力以外の力は加わらないので、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体に破壊、分解等は生じない。したがって、第一発明によれば、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体に破壊、分解等が生じない穏やかな条件下、当該結合体を沈降物又は浮上物として分離することができる。【００１５】  沈降物又は浮上物には、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体とともに、未反応の第二プローブ及び第二プローブと標的物質との結合体が含まれ得るが、未反応の第一プローブ及び第一プローブと標的物質との結合体は含まれ得ない。このことは、第一プローブが標識化されており（例えば、第一粒子が標識化粒子であり）、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を当該標識に基づき検出する場合に重要となる。【００１６】  第一発明において、第一プローブと第二プローブと標的物質との反応は反応溶媒中で行なわれるので、反応混合物には反応溶媒が含まれ得る。反応溶媒を含む反応混合物を上記液体と混合する場合、上記液体の比重は反応溶媒の混入によって変動する。変動後も比重に関する上記条件を満たせば問題はないが、変動後に上記条件を満たさなければ、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を沈降物又は浮上物として分離することができない。したがって、反応混合物に含まれる反応溶媒の量を出来る限り減少させ、上記液体の比重の変動を出来る限り防止することが好ましい。【００１７】  そこで、第一発明において、前記第一粒子及び／又は第二粒子が磁性粒子であり、前記反応混合物が、前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを容器内に収容された反応溶媒中で反応させた後、前記容器の外壁面近傍に磁石を配置した状態で前記反応溶媒を除去して得られたものであることが好ましい。【００１８】  本態様によれば、反応混合物に含まれる反応溶媒の量を減少させることにより、上記液体の比重の変動を防止することができる。また、本態様によれば、反応溶媒を除去する際、磁性粒子に磁石が作用することにより、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を容器内に保持することができるので、反応混合物に含まれる当該結合体の量の減少を防止することができる。【００１９】  本態様において、前記第一粒子が非磁性粒子であり、前記第二粒子が磁性粒子であることが好ましい。この場合、磁性粒子に磁石が作用することにより、未反応の第二プローブ、第二プローブと標的物質との結合体及び第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を容器内に保持することができる一方、未反応の第一プローブ及び第一プローブと標的物質との結合体を反応溶媒とともに除去することができるので、反応混合物に含まれる未反応の第一プローブ及び第一プローブと標的物質との結合体の量を減少させることができる。したがって、反応混合物を上記液体と混合して沈降物又は浮上物を形成させる際、未反応の第一プローブ及び第一プローブと標的物質との結合体が、第一プローブと第二プローブと��的物質との結合体を含む沈降物又は浮上物に混入する可能性を低減させることができる。【００２０】
本態様において、前記第一粒子及び／又は前記第二粒子が磁性粒子であり、前記第一プローブ、前記第二プローブ、前記標的物質及び反応溶媒を容器に収容する工程、前記容器の外壁面の所定領域を通じて前記容器内の前記磁性粒子に磁石を作用させる工程、前記磁石の作用を解除する工程、並びに前記所定領域の位置を変化させながら前記磁石を作用させる工程及び前記磁石の作用を解除する工程を繰り返す工程を含む反応方法により、前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを反応させることが好ましい。
【００２１】  容器の外壁面の所定領域を通じて容器内の磁性粒子に磁石を作用させると、磁性粒子を含む分子（第一粒子が磁性粒子である場合、未反応の第一プローブ及び／又は第一プローブと標的物質との結合体を意味し、第二粒子が磁性粒子である場合、未反応の第二プローブ及び／又は第二プローブと標的物質との結合体を意味する）は、反応溶媒中を所定領域の方向へ移動する。移動中に、磁性粒子を含む分子の一部は他の分子と遭遇して反応する（未反応の第一プローブは標的物質と反応し、第一プローブと標的物質との結合体は未反応の第二プローブと反応し、未反応の第二プローブは標的物質と反応し、第二プローブと標的物質との結合体は未反応の第一プローブと反応する）。磁性粒子を含む分子の残部は他の分子と反応することなく、最終的に容器の内壁面まで移動し、容器の内壁面に付着する。【００２２】  磁性粒子を含む分子が容器の内壁面に付着する前又は付着した後に磁石の作用を解除すると、磁性粒子を含む分子は再び反応溶媒中に浮遊し、磁石の作用を受け得る状態となる。【００２３】  所定領域の位置を変化させ、変化後の所定領域を通じて容器内の磁性粒子に磁石を作用させると、磁性粒子を含む分子は、反応溶媒中を変化後の所定領域の方向へ移動する。したがって、所定領域の位置を変化させながら第二工程及び第三工程を繰り返すと、磁性粒子を含む分子は、移動方向を変化させながら反応溶媒中を移動する。これにより、磁性粒子を含む分子と他の分子との遭遇確率が向上し、磁性粒子を含む分子と他の分子との反応を促進させることができる。このとき、磁石の磁気量（磁荷）等を調節し、磁性粒子を含む分子の移動速度を調節することにより、第一プローブと第二プローブと標的物質とを、第一プローブと第二プローブと標的物質の結合体に破壊、分解等が生じない穏やかな条件下で反応させることができる。【００２４】
本態様において、前記磁石を作用させる工程において、前記所定領域と前記磁石とを近接させることにより前記磁石を作用させ、前記磁石の作用を解除する工程において、前記所定領域と前記磁石とを離反させることにより前記磁石の作用を解除し、前記磁石を作用させる工程及び前記磁石の作用を解除する工程を繰り返す工程において、前記所定領域の位置を変化させながら前記所定領域と磁石との近接及び離反を繰り返すことが好ましい。
【００２５】  本態様によれば、磁石の磁気量（磁荷）、容器と磁石との距離、近接速度、離反速度等を調節することにより、第一プローブと第二プローブと標的物質とを、第一プローブと第二プローブと標的物質の結合体に破壊、分解等が生じない穏やかな条件下で反応させることができる。【００２６】  第二発明において、前記所定領域の位置を前記容器の周方向又は長手方向に変化させることが好ましい。
本態様によれば、磁性粒子を含む分子が反応溶媒中を様々な方向に移動するので、磁性粒子を含む分子と他の分子との遭遇確率がより一層向上し、磁性粒子を含む分子と他の分子との反応をより一層促進させることができる。【００２７】  上記課題を解決するために、本発明は、第三発明として、第一粒子及び前記第一粒子に固定された第一結合性物質を有する第一プローブと、第二粒子及び前記第二粒子に固定された第二結合性物質を有する第二プローブとを用いて、前記第一結合性物質が結合し得る第一部分及び前記第二結合性物質が結合し得る第二部分を有する標的物質を検出する方法であって、前記第一粒子として標識化粒子を選択し、前記第二粒子として前記第一粒子よりも比重が大きい粒子を選択する第一工程、前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを反応させ、反応混合物を得る第二工程、前記反応混合物を、前記第一粒子よりも比重が大きく、前記第二粒子よりも比重が小さく、かつ前記第一粒子及び前記第二粒子からなる粒子複合体よりも比重が小さい液体と混合した後、沈降物及び浮上物が形成されるまで静置する第三工程、及び前記沈降物に含まれる前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質との結合体を、前記第一粒子の標識に基づき検出する第四工程を含む前記方法を提供する。【００２８】  上記課題を解決するために、本発明は、第四発明として、第一粒子及び前記第一粒子に固定された第一結合性物質を有する第一プローブと、第二粒子及び前記第二粒子に固定された第二結合性物質を有する第二プローブとを用いて、前記第一結合性物質が結合し得る第一部分及び前記第二結合性物質が結合し得る第二部分を有する標的物質を検出する方法であって、前記第一粒子として標識化粒子を選択し、前記第二粒子として前記第一粒子よりも比重が小さい粒子を選択する第一工程、前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを反応させ、反応混合物を得る第二工程、前記反応混合物を、前記第一粒子よりも比重が小さく、前記第二粒子よりも比重が大きく、かつ前記第一粒子及び前記第二粒子からなる粒子複合体よりも比重が大きい液体と混合した後、沈降物及び浮上物が形成されるまで静置する第三工程、及び前記浮上物に含まれる前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質との結合体を、前記第一粒子の標識に基づき検出する第四工程を含む前記方法を提供する。【００２９】  第三発明及び第四発明によれば、第一発明と同様に、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体に破壊、分解等が生じない穏やかな条件下、当該結合体を沈降物又は浮上物として分離することができる。沈降物又は浮上物には、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体とともに、未反応の第二プローブ及び第二プローブと標的物質との結合体が含まれ得るが、未反応の第一プローブ及び第一プローブと標的物質との結合体は含まれ得ない。したがって、沈降物又は浮上物に含まれる第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を、第一粒子の標識に基づき検出することができる。【００３０】  第三発明及び第四発明では、前記第一工程において、前記第一粒子及び／又は前記第二粒子として磁性粒子を選択し、前記第二工程において、前記第���プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを容器内に収容された反応溶媒中で反応させた後、前記容器の外壁面近傍に磁石を配置した状態で前記反応溶媒を除去し、前記反応混合物を得ることが好ましい。【００３１】  本態様によれば、反応混合物に含まれる反応溶媒の量を減少させることにより、上記液体の比重の変動を防止することができる。また、本態様によれば、反応溶媒を除去する際、磁性粒子に磁石が作用することにより、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を容器内に保持することができるので、反応混合物に含まれる当該結合体の量の減少を防止することができる。【００３２】  本態様では、前記第一工程において、前記第一粒子として非磁性粒子を選択し、前記第二粒子として磁性粒子を選択することが好ましい。これにより、未反応の第二プローブ、第二プローブと標的物質との結合体及び第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を容器内に保持することができる一方、未反応の第一プローブ及び第一プローブと標的物質との結合体を反応溶媒とともに除去することができるので、反応混合物に含まれる未反応の第一プローブ及び第一プローブと標的物質との結合体の量を減少させることができる。したがって、反応混合物を上記液体と混合して沈降物及び浮上物を形成させる際、未反応の第一プローブ及び第一プローブと標的物質との結合体が、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を含む沈降物又は浮上物に混入する可能性を低減することができ、沈降物又は浮上物に含まれる第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体の検出精度を向上させることができる。【００３３】  第三発明及び第四発明では、前記第一工程において、前記第一粒子及び／又は前記第二粒子として磁性粒子を選択し、前記第二工程において、第二発明の方法により前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを反応させることが好ましい。【００３４】  本態様によれば、第二発明と同様に、第一プローブと第二プローブと標的物質とを、第一プローブと第二プローブと標的物質の結合体に破壊、分解等が生じない穏やかな条件下で反応させることができる。【００３５】  本態様では、前記第二工程において、前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを反応させた後、前記容器の外壁面近傍に前記磁石を配置した状態で前記反応溶媒を除去し、前記反応混合物を得ることが好ましい。これにより、反応混合物に含まれる反応溶媒の量を減少させ、上記液体の比重の変動を防止することができる。また、反応溶媒を除去する際、磁性粒子に磁石が作用することにより、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を容器内に保持することができるので、反応混合物に含まれる当該結合体の量の減少を防止することができる。【００３６】  本態様では、前記第一工程において、前記第一粒子として非磁性粒子を選択し、前記第二粒子として磁性粒子を選択することが好ましい。これにより、未反応の第二プローブ、第二プローブと標的物質との結合体及び第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を容器内に保持することができる一方、未反応の第一プローブ及び第一プローブと標的物質との結合体を反応溶媒とともに除去することが���きるので、反応混合物に含まれる未反応の第一プローブ及び第一プローブと標的物質との結合体の量を減少させることができる。したがって、反応混合物を上記液体と混合して沈降物及び浮上物を形成させる際、未反応の第一プローブ及び第一プローブと標的物質との結合体が、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を含む沈降物又は浮上物に混入する可能性を低減することができ、沈降物又は浮上物に含まれる第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体の検出精度を向上させることができる。【００３７】  第三発明及び第四発明では、前記第一工程において、前記第二粒子として磁性粒子を選択し、前記第二工程において、前記標的物質を含有する試料と前記第二プローブとを混合し、磁力制御により前記第二プローブと前記標的物質との結合体を回収し、前記第二プローブと前記標的物質との結合体を前記第一プローブと反応させることが好ましい。【００３８】  本態様によれば、試料に含まれる夾雑物が反応混合物に混入することを防止することができるので、標的物質の検出精度を向上させることができる。
【発明の効果】
【００３９】  本発明によれば、第一粒子（例えば標識化粒子）及び第一粒子に固定された第一結合性物質（例えば第一オリゴヌクレオチド）を有する第一プローブと、第二粒子（例えば磁性粒子）及び第二粒子に固定された第二結合性物質（例えば第二オリゴヌクレオチド）を有する第二プローブと、標的物質（例えば標的核酸）とを反応させて得られる反応混合物から、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体に破壊、分解等が生じない穏やかな条件下、当該結合体を分離する方法が提供される。【００４０】  また、本発明によれば、第一粒子（例えば標識化粒子）及び第一粒子に固定された第一結合性物質（例えば第一オリゴヌクレオチド）を有する第一プローブと、第二粒子（例えば磁性粒子）及び第二粒子に固定された第二結合性物質（例えば第二オリゴヌクレオチド）を有する第二プローブと、標的物質（例えば標的核酸）とを、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体に破壊、分解等が生じない穏やかな条件下で反応させる方法が提供される。【００４１】  さらに、本発明によれば、第一粒子（例えば標識化粒子）及び第一粒子に固定された第一結合性物質（例えば第一オリゴヌクレオチド）を有する第一プローブと、第二粒子（例えば磁性粒子）及び第二粒子に固定された第二結合性物質（例えば第二オリゴヌクレオチド）とを用いて、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体に破壊、分解等が生じない穏やかな条件下、標的物質（例えば標的核酸）を検出する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】  粒子の構成材料は、本発明の方法で使用される各種液体（例えば、反応溶媒、洗浄液等）に不溶性である限り特に限定されるものではなく、その具体例としては、スチレン、クロルスチレン、クロロメチルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、スチレンスルホン酸ナトリウム、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ポリオキシエチレン、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニル、トリブロモプロピルアクリレート、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、臭化ビニル等の芳香族ビニル化合物、α，β−不飽和カルボン酸のエステル類又はアミド類、α，β−不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物、共役ジエン化合物、低級脂肪酸ビニルエステル等の１種以上を重合して得られるポリマー；アガロース、デキストラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース等の多糖類の架橋体；メチル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン等の蛋白質の架橋体；ガラス、セラミックス等の無機材料；鉄、シリコン等の金属；これらの複合材料等が挙げられる。【００４３】  磁性粒子に含まれる磁性を示す物質（磁性体）は特に限定されるものではなく、その具体例としては、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ等の金属；Ｆｅ−Ｎｉ、Ｆｅ−Ｃｏ、Ｆｅ−Ａｌ、Ｆｅ−Ｓｉ−Ａｌ、Ｆｅ−Ｎｉ−Ｍｏ、Ａｌ−Ｎｉ−Ｃｏ、Ｓｍ−Ｃｏ、Ｎｄ−Ｆｅ−Ｂ等の合金・金属間化合物；Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ２Ｏ３−ＮｉＯ−ＺｎＯ、Ｆｅ２Ｏ３−ＣｕＯ−ＺｎＯ、Ｆｅ２Ｏ３−ＭｎＯ−ＺｎＯ等のフェライト化合物が挙げられる。【００４４】  磁性粒子としては、例えば、強磁性粒子、磁化率の大きい常磁性粒子等を使用することができる。磁石を作用させた後の液体への分散性を向上させるためには残留磁化が小さいことが好ましく、磁石との反応性を向上させるためには飽和磁化が大きいことが好ましい。また、磁性粒子は異方性であってもよいが等方性であることが好ましい。【００４５】  粒子の形状は特に限定されるものではなく、その具体例としては球状が挙げられる。また、粒子の粒径は、静置された液体中において粒子が重力及び浮力の影響により沈降又は浮上し得る限り特に限定されるものではなく、その具体的な範囲は例えば直径約０．１μｍ〜約１００μｍである。【００４６】  標識化粒子の標識は特に限定されるものではなく、その具体例としては、ＭａｒｉｎｅＢｌｕｅ，Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ，Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ，Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ，ＣｙＣｈｒｏｍｅ，ＰｅｒＣＰ，Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ，Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ，ＰｈａｒＲｅｄ等の他、Ｃｙ２，Ｃｙ３，Ｃｙ３．５，Ｃｙ５，Ｃｙ７等のＣｙ系色素、Ａｌｅｘａ−４８８，Ａｌｅｘａ−５３２，Ａｌｅｘａ−５４６，Ａｌｅｘａ−６３３，Ａｌｅｘａ−６８０等のＡｌｅｘａ系色素、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ，ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−等のＢＯＤＩＰＹ系色素等の蛍光性化合物による蛍光標識；ルミノール、ルシゲニン、アクリジウムエステル等の化学発光性化合物による化学発光標識；アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素による酵素標識；ルシフェラーゼ、ルシフェリン等の生物発光性化合物による生物発光標識等が挙げられる。これらの標識は常法に従って検出することができる。【００４７】  標的物質は特に限定されるものではなく、その具体例としては、核酸、タンパク質、抗原、抗体、酵素、糖鎖等の生体物質が挙げられる。なお、核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。【００４８】  結合性物質は、標的物質と結合し得る限り特に限定されるものではなく、その具体例としては、核酸、タンパク質、抗原、抗体、酵素、糖鎖等の生体物質が挙げられる。標的物質と結合性物質との組み合わせの具体例としては、核酸／相補的核酸、受容体タンパク質／リガンド、酵素／基質、抗体／抗原等が挙げられる。【００４９】  第一結合性物質及び第二結合性物質は、標的物質の異なる部分（第一部分及び第二部分）に結合するので、第一プローブ及び第二プローブは標的物質に同時に結合することができる。【００５０】  結合性物質は、標的物質に特異的に結合することが好ましい。「特異的に結合する」とは、標的物質の所定部分以外には結合しないことを意味する。標的物質及び結合性物質が核酸である場合、「特異的に結合する」とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを意味し、ストリンジェントな条件としては、例えば、２℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件、好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件が挙げられる。【００５１】  １個の粒子に固定される結合性物質の数は特に限定されるものではなく、１個であってもよいし複数個であってもよいが、通常は複数個である。【００５２】  粒子への結合性物質の固定は、種々の結合様式によって行なうことができる。結合様式の具体例としては、ストレプトアビジン又はアビジンとビオチンとの特異的相互作用、疎水性相互作用、磁性相互作用、極性相互作用、共有結合（例えば、アミド結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合等）の形成、架橋剤による架橋等が挙げられる。これらの結合様式による固定が可能となるように、公知の技術を用いて、粒子表面又は結合性物質に適当な化学修飾を施すことができる。【００５３】  ストレプトアビジン又はアビジンとビオチンとの特異的相互作用以外にも、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルやコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、核酸／相補的核酸、受容体タンパク質／リガンド、酵素／基質、抗体／抗原、ＩｇＧ／プロテインＡ等の特異的相互作用を利用して、粒子への結合性物質の固定を行うこともできる。【００５４】  アビジン又はストレプトアビジンとビオチンとの相互作用を利用する場合には、例えば、ビオチンを導入した結合性物質（例えば、５’末端をビオチン化したプライマーを用いてＰＣＲを行なうことにより得られたビオチン化核酸）を、アビジン又はストレプトアビジンでコーティングされた粒子に結合させることができる。【００５５】  共有結合の形成を利用する場合には、粒子表面又は結合性物質に存在する官能基を利用して共有結合を形成させることができる。共有結合を形成し得る官能基の具体例として、カルボキシル基、アミノ基、水酸基等が挙げられる。例えば、粒子の表面にカルボキシル基が存在する場合には、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等のカルボジイミド類でカルボキシル基を活性化させた後、結合性物質に存在するアミノ基と反応させることにより、粒子と結合性物質とをアミド結合させることができる。また、粒子の表面にアミノ基が存在する場合には、無水コハク酸等の環状酸無水物を用いてアミノ基をカルボキシル基に変換した後、結合性物質に存在するアミノ基と反応させることにより、粒子と結合性物質とをアミド結合させることができる。【００５６】  架橋剤による架橋を利用する場合には、架橋対象物質が有する官能基と反応し得る種々の架橋剤を使用できる。架橋剤の具体例としては、二官能性試薬、三官能性試薬等の多官能性試薬が挙げられる。このような多官能性試薬の具体例としては、Ｎ−スクシンイミジル（４−イオードアセチル）アミノベンゾエート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ（４−ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ）（ＳＩＡＢ）、ジマレイミド（ｄｉｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ジチオ−ビス−ニトロ安息香酸（ｄｉｔｈｉｏ−ｂｉｓ−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−Ｓ−ａｃｅｔｙｌ−ｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ）（ＳＡＴＡ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（ＳＭＣＣ）、６−ヒドラジノニコチミド（６−ｈｙｄｒａｚｉｎｏｎｉｃｏｔｉｍｉｄｅ）（ＨＹＮＩＣ）等が挙げられる。【００５７】  第一プローブと第二プローブと標的物質とを反応させる際に使用される反応溶媒は、当該反応を妨害しない限り特に限定されるものではなく、例えば、緩衝液が挙げられる。反応溶媒の組成は、標的物質及び結合性物質の種類等に応じて適宜調節することができる。【００５８】  第一プローブと第二プローブと標的物質とを反応させる際、第一プローブ、第二プローブ、標的物質及び反応溶媒の容器への収容順序は特に限定されるものではなく、任意の順序で別々に収容してもよいし、任意に組み合わせた２種類以上を同時に収容してもよい。第一プローブと標的物質とを同時に収容する際、第一プローブと標的物質とは結合した状態であっても結合していない状態であってもよい。第二プローブと標的物質とを同時に収容する場合も同様である。【００５９】  第一プローブと第二プローブと標的物質とを反応させる際の反応条件（例えば、反応温度、反応時間等）は、標的物質及び結合性物質の種類等に応じて適宜調節することができる。【００６０】  第一粒子よりも比重が大きく、第二粒子よりも比重が小さく、かつ第一粒子及び第二粒子からなる粒子複合体よりも比重が小さい液体、又は第一粒子よりも比重が小さく、第二粒子よりも比重が大きく、かつ第一粒子及び第二粒子からなる粒子複合体よりも比重が大きい液体は、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体が安定して存在し得る限り特に限定されるものではなく、その具体例としては、水溶性非イオン性ポリマー水溶液（例えばフィコール（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）溶液）、ショ糖水溶液、ポリエチレングリコール水溶液、グリセロール水溶液等が挙げられる。この中でも特に好ましいものとして、フィコール水溶液が挙げられる。フィコールはショ糖とエピクロルヒドリンの共重合体（分子量約４０万）であり、フィコールの濃度を変化させることにより、種々の比重の水溶液を調製することができる。液体は１種類の液体からなってもよいし、２種類以上の液体の混合液であってもよい。液体の比重は、液体の種類、濃度等によって適宜調節することができる。【００６１】  粒子の比重は構成材料の種類、含有量等によって適宜調節することができる。第一粒子として標識化非磁性粒子を選択し、第二粒子として第一粒子よりも比重が大きい磁性粒子を選択する場合、第一粒子の比重は例えば３未満（具体的範囲は例えば１．０３〜３）とすることができ、第二粒子の比重は例えば３以上とすることができる。【００６２】  粒子の比重は質量及び体積に基づいて算出することができる。また、第一粒子及び第二粒子からなる粒子複合体の比重は、第一粒子及び第二粒子の合計質量及び合計体積に基づいて算出することができる。すなわち、第一粒子及び第二粒子の合計質量と、第一粒子及び第二粒子の合計体積と同体積の標準物質（通常、４℃における水）との比として算出することができる。【００６３】  反応混合物を、第一粒子よりも比重が大きく、第二粒子よりも比重が小さく、かつ第一粒子及び第二粒子からなる粒子複合体よりも比重が小さい液体、又は第一粒子よりも比重が小さく、第二粒子よりも比重が大きく、かつ第一粒子及び第二粒子からなる粒子複合体よりも比重が大きい液体と混合する際、反応混合物を当該液体へ添加してもよいし、当該液体を反応混合物へ添加してもよい。【００６４】  磁石の種類は特に限定されるものではなく、永久磁石及び一時磁石のいずれを使用してもよい。永久磁石としては、アルニコ磁石、フェライト磁石、希土類金属磁石等が挙げられる。一時磁石としては、電磁石等が挙げられる。【００６５】  「容器の外壁面の所定領域」という用語は、１つの所定領域又は異なる複数の所定領域を意味する。したがって、「容器の外壁面の所定領域を通じて容器内の磁性粒子に磁石を作用させる」には、１つの所定領域を通じて磁石を作用させる場合及び異なる複数の所定領域を通じて磁石を作用させる場合が含まれる。異なる複数の所定領域を通じて磁石を作用させる場合、各領域に対して異なる磁石を使用してもよいし、同一の磁石を使用してもよい。所定領域の位置、面積、形状等は特に限定されるものではない。変化前の所定領域と変化後の所定領域とは連続していてもよいし不連続であってもよい。変化前の所定領域と変化後の所定領域とは、一部を共有する領域であってもよいし、共有する部分を持たない領域であってもよい。所定領域の位置の変化態様は特に限定されるものではなく、例えば、容器の周方向、容器の長手方向、これらを組み合わせた方向への変化が挙げられる。【００６６】  容器の外壁面の所定領域を通じて容器内の磁性粒子に磁石を作用させる方法は特に限定されるものではなく、例えば、所定領域と磁石とを近接させることにより磁石を作用させることができる。この際、使用する磁石は永久磁石であってもよいし一時磁石であってもよい。一時磁石を使用する場合には、近接前から励磁状態としてもよいし、近接後に励磁状態としてもよい。近接状態にあるときの所定領域と磁石との距離は、磁石の磁気量（磁荷）等に応じて適宜調節することができる。所定領域と磁石とを近接させる際、容器を固定した状態で磁石を移動させてもよいし、磁石を固定した状態で容器を移動させてもよし、磁石及び容器をともに（例えば同一方向又は逆方向に）移動させてもよい。【００６７】  磁石の作用を解除させる方法は特に限定されるものではなく、例えば、所定領域と磁石とを離反させることにより磁石の作用を解除することができる。一時磁石を使用する場合には、近接させた状態で非励磁状態とすることにより磁石の作用を解除することができる。離反状態にあるときの所定領域と磁石との距離は、磁石の磁気量（磁荷）等に応じて適宜調節することができる。所定領域と磁石とを離反させる際、容器を固定した状態で磁石を移動させてもよいし、磁石を固定した状態で容器を移動させてもよし、磁石及び容器をともに（例えば同一方向又は逆方向に）移動させてもよい。【００６８】  磁石は、所定領域の位置の変化前後で同一のものを使用してもよいし、異なるものを使用してもよいし、同一の磁石の異なる部分を使用してもよい。
容器の外壁面の所定領域を通じた磁石の作用及びその解除を繰り返す回数は特に限定されるものではないが、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体が十分量形成される回数であることが好ましい。【００６９】  容器の外壁面近傍に磁石を配置した状態で反応溶媒を除去する際、磁石の配置位置は特に限定されるものではないが、容器の下部又は底部の外壁面近傍であることが好ましい。磁石と容器の外壁面との距離は、磁石が容器内の磁性粒子に作用し得る限り特に限定されるものではなく、磁石の磁気量（磁荷）等に応じて適宜調節することができる。【００７０】  容器としては、有底筒状容器等の一般的に使用される容器の他、無底筒状容器（例えばピペットチップ等）を使用することができる。無底筒状容器内には、液体を吸引した状態で保持することができる。
容器は透明又は半透明であることが好ましい。これにより、容器内から発せられる光（例えば、蛍光、化学発光等）を容器外で検出することができる。透明又は半透明の材料としては、プラスチック、ガラス等が挙げられる。【００７１】  沈降物又は浮上物に含まれる第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を検出する際、沈降物又は浮上物を回収することなく検出してもよいが、沈降物又は浮上物を回収した後に検出することが好ましい。沈降物又は浮上物は液体とともに回収してもよい。沈降物は、例えば、液体の上清を除去した後、液体の残部として回収することができる。浮上物は、例えば、液体の上清として回収することができる。【００７２】  標的物質を含有する試料は特に限定されるものではなく、その具体例としては、血液、血清、血漿、糞尿、脳脊髄液、精液、唾液、細胞溶解液、組織溶解液、細胞培養物、組織培養物等の生物材料が挙げられる。【００７３】  磁力制御により第二プローブ（第二プローブが有する第二粒子は磁性粒子である）と標的物質との結合体を回収する方法は、磁性粒子の挙動を制御し得る限り特に限定されるものではない。例えば、容器内から液体を吸引及び吐出する分注機のピペットチップに磁石を配置し、磁石を作用させて、ピペットチップ内に吸引された液体中の当該結合体をピペットチップの内壁面に保持する一方、磁石の作用を受けなくすることによって、当該結合体をピペットチップの内壁面から離脱させて液体とともにピペットチップ外へ吐出することにより、当該結合体を回収することができる。【００７４】  以下、本発明に係る標的物質の検出方法の一実施形態を図面に基づいて説明する。
図１は、本実施形態で使用される分注機の概略図であり、図２〜７は本実施形態の各ステップを表す概略断面図である。【００７５】  本実施形態で使用される分注機は、図１に示すように、ピペットチップ１０と、ピペットチップ１０の上端開口部に着脱自在に装着されたノズル２０と、ノズル２０を通じてピペットチップ１０内を減圧又は加圧してピペットチップ１０への液体の吸引又はピペットチップ１０からの液体の吐出を行う液体吸引・吐出装置（図示せず）と、ピペットチップ１０を所望の方向（例えば、上下方向、左右方向）に移動させるピペットチップ移動装置（図示せず）と、磁石３０と、磁石３０をピペットチップ１０に対して近接及び離反する方向に移動させる磁石移動装置（図示せず）と、各装置の動作を制御する制御装置（図示せず）とを備えている。【００７６】  ピペットチップ１０は、容器２内に挿入される先端部１１と、液体を貯溜する太径の貯溜部１２と、先端部１１及び貯溜部１２を連通させる細径の液通路１３とを有している。液通路１３は、ピペットチップ１０に近接した磁石３０の作用が及ぼされる分離領域部１３０を有している。液体吸引・吐出装置は、例えばシリンジ等であり、磁石３０は、例えば永久磁石、電磁石等である。【００７７】  本実施形態では、まず、図２（ステップａ）に示すように、容器２ａ内の液体試料Ｌ１をピペットチップ１０内へ吸引する。液体試料Ｌ１は、例えば、血液、血清、血漿、糞尿、脳脊髄液、精液、唾液、細胞溶解液、組織溶解液、細胞培養物、組織培養物等の生物材料である。液体試料Ｌ１には、標的核酸Ｔとともに様々な夾雑物（例えば、標的核酸以外の核酸、タンパク質、脂質等）（図示せず）が含まれている。【００７８】  次いで、図２（ステップｂ）に示すように、ピペットチップ１０を移動させて、ピペットチップ１０内の液体試料Ｌ１を容器２ｂ内に吐出する。容器２ｂ内にはプローブＰ１の懸濁液Ｌ２が収容されており、ピペットチップ１０内の液体試料Ｌ１を容器２ｂ内に吐出することにより、液体試料Ｌ１と懸濁液Ｌ２との混合液Ｌ３が調製される。図２及び図１１に示すように、プローブＰ１は磁性粒子ＭＢ及び磁性粒子ＭＢに固定されたオリゴヌクレオチドＮ１からなる。図１１に示すように、オリゴヌクレオチドＮ１は、標的核酸Ｔの領域Ｒ１と相補的な塩基配列からなり、標的核酸Ｔの領域Ｒ１に特異的にハイブリダイズすることができる。【００７９】  次いで、図２（ステップｃ）に示すように、混合液Ｌ３のピペットチップ１０内への吸引及びピペットチップ１０からの吐出を繰り返す。これにより、プローブＰ１と標的核酸Ｔとが反応して、プローブＰ１と標的核酸Ｔとのハイブリダイゼーション体Ｃ１が形成される。【００８０】  次いで、図２（ステップｄ）に示すように、容器２ｂ内の混合液Ｌ３をピペットチップ１０内へ吸引する。このとき、図２（ステップｄ）に示すように、磁石３０はピペットチップ１０に近接する方向に移動する。したがって、混合液Ｌ３がピペットチップ１０の液通路１３を通過するとき、磁性粒子ＭＢを含む分子（未反応のプローブＰ１及びハイブリダイゼーション体Ｃ１）は、磁石３０の作用により液通路１３の内壁面に捕集され、磁石３０の作用が及ぶ液通路１３の内壁面には、未反応のプローブＰ１及びハイブリダイゼーション体Ｃ１を含む凝集物Ｇ１が形成される。【００８１】  次いで、図３（ステップｅ）に示すように、凝集物Ｇ１を除く混合液Ｌ３をピペットチップ１０内から容器２ｂ内へ吐出する。このとき、混合液Ｌ３を吐出しても、凝集物Ｇ１はピペットチップ１０の液通路１３の内壁面に付着した状態で保持される。【００８２】  次いで、図３（ステップｆ）に示すように、ピペットチップ１０を移動させて、容器２ｃ内の洗浄液Ｌ４のピペットチップ１０内への吸引及びピペットチップ１０からの吐出を繰り返す。このとき、図３（ステップｆ）に示すように、磁石３０は、ピペットチップ１０から離反する方向に移動し、凝集物Ｇ１の保持状態を解除する。したがって、凝集物Ｇ１に含まれる未反応のプローブＰ１及びハイブリダイゼーション体Ｃ１は洗浄液Ｌ４に分散して洗浄される。【００８３】  次いで、図３（ステップｇ）に示すように、容器２ｃ内の洗浄液Ｌ４をピペットチップ１０内へ吸引する。このとき、図３（ステップｇ）に示すように、磁石３０は、再びピペットチップ１０に近接する方向に移動する。したがって、洗浄液Ｌ４がピペットチップ１０の液通路１３を通過するとき、磁性粒子ＭＢを含む分子（未反応のプローブＰ１及びハイブリダイゼーション体Ｃ１）は、磁石３０の作用により液通路１３の内壁面に捕集され、磁石３０の作用が及ぶ液通路１３の内壁面には、未反応のプローブＰ１及びハイブリダイゼーション体Ｃ１を含む凝集物Ｇ１が形成される。【００８４】  次いで、図３（ステップｈ）に示すように、凝集物Ｇ１を除く洗浄液Ｌ４をピペットチップ１０内から容器２ｃ内に吐出する。このとき、洗浄液Ｌ４を吐出しても、凝集物Ｇ１はピペットチップ１０の液通路１３の内壁面に付着した状態で保持される。【００８５】  次いで、図４（ステップｉ）に示すように、ピペットチップ１０を移動させて、容器２ｄ内の液体Ｌ５のピペットチップ１０内への吸引及びピペットチップ１０からの吐出を繰り返す。このとき、図４（ステップｉ）に示すように、磁石３０は、ピペットチップ１０から離反する方向に移動し、凝集物Ｇ１の保持状態を解除する。したがって、凝集物Ｇ１に含まれる未反応のプロープＰ１及びハイブリダイゼーション体Ｃ１は液体Ｌ５に分散する。液体Ｌ５は、例えば、緩衝液である。【００８６】  こうして、図４（ステップｊ）に示すように、未反応のプローブＰ１及びハイブリダイゼーション体Ｃ１を含み、それ以外の夾雑物をほとんど含まない液体Ｌ５が容器２ｄ内に調製される。液体Ｌ５に夾雑物がほとんど含まれないことにより、標的核酸Ｔの検出精度を向上させることができる。なお、図示していないが、液体５には、未反応の標的核酸Ｔが含まれ得る。【００８７】  次いで、図４（ステップｋ）に示すように、容器２ｄ内の液体Ｌ５にプローブＰ２を混合する。図４及び図１１に示すように、プローブＰ２は標識化非磁性粒子ＬＢ及び標識化非磁性粒子ＬＢに固定されたオリゴヌクレオチドＮ２からなる。図１１に示すように、オリゴヌクレオチドＮ２は、標的核酸の領域Ｒ２に相補的な塩基配列からなり、領域Ｒ２に特異的にハイブリダイズすることができる。標識化非磁性粒子Ｌ���としては、磁性粒子ＭＢよりも比重が小さい粒子が選択される。【００８８】  なお、容器２ｄの周囲には、２個の磁石３ａ及び３ｂが容器２ｄの外壁面から離反した状態で配置されている（図５（ステップ１）参照）。磁石３ａ及び３ｂは容器２ｄの外壁面から離反した状態で配置されているので、磁石３ａ及び３ｂの作用は容器２ｄ内の磁性粒子ＭＢに及んでいない。【００８９】  次いで、図５（ステップ１）に示すように、容器２ｄの外壁面の領域Ｆ１から離反した状態にある磁石３ａを領域Ｆ１に近接させる。このとき、図５（ステップ１）に示すように、磁石３ｂは、容器２ｄの外壁面の領域Ｆ２から離反したままの状態にある。磁石３ａを領域Ｆ１に近接させると、磁性粒子ＭＢに磁石３ａが作用し、ハイブリダイゼーション体Ｃ１は、液体Ｌ５中を領域Ｆ１の方向に向かって移動する。ハイブリダイゼーション体Ｃ１のうちの一部は、移動中にプローブ２と遭遇して反応し、プローブＰ１とプローブ２と標的核酸Ｔとのハイブリダイゼーション体Ｃ２が形成される。ハイブリダイゼーション体Ｃ１の残部は、プローブ２と遭遇することなく、最終的には容器２ｄの内壁面まで移動し、容器２ｄの内壁面に付着する。【００９０】  次いで、図５（ステップｍ）に示すように、磁石３ａを領域Ｆ１から離反させた後又は離反させながら、領域Ｆ２から離反した状態にある磁石３ｂを領域Ｆ２に近接させる。磁石３ａを領域Ｆ１から離反させると、ハイブリダイゼーション体Ｃ１は再び液体Ｌ５中に浮遊する。磁石３ｂを領域Ｆ２に近接させると、磁性粒子ＭＢに磁石３ｂが作用し、液体Ｌ５中に浮遊しているハイブリダイゼーション体Ｃ１は、液体Ｌ５中を領域Ｆ２の方向に向かって移動する。ハイブリダイゼーション体Ｃ１のうちの一部は、移動中にプローブ２と遭遇して反応し、ハイブリダイゼーション体Ｃ２が形成される。ハイブリダイゼーション体Ｃ１の残部は、プローブ２と遭遇することなく、最終的には容器２ｄの内壁面まで移動し、容器２ｄの内壁面に付着する。【００９１】  次いで、図５（ステップｎ）に示すように、磁石３ｂを領域Ｆ２から離反させた後又は離反させながら、領域Ｆ１から離反した状態にある磁石３ａを領域Ｆ１に近接させる。ステップｍと同様に、ハイブリダイゼーション体Ｃ１のうちの一部は、移動中にプローブ２と遭遇して反応し、ハイブリダイゼーション体Ｃ２が形成される。ハイブリダイゼーション体Ｃ１の残部は、プローブ２と遭遇することなく、最終的には容器２ｄの内壁面まで移動し、容器２ｄの内壁面に付着する。【００９２】  次いで、図６（ステップｏ）に示すように、ステップｍ及びステップｎを所定回数繰り返す。ステップｍ及びステップｎを繰り返す回数は特に限定されるものではないが、ハイブリダイゼーション体Ｃ２が十分量形成される回数であることが好ましい。ハイブリダイゼーション体Ｃ２が十分量形成されることにより、標的核酸Ｔの検出精度を向上させることができる。【００９３】  ステップ１〜ｏにおいて、磁石３ａ及び３ｂの磁気量（磁荷）、容器２ｄと磁石３ａ又は３ｂとの距離、近接速度、離反速度等が調節され、ハイブリダイゼーション体Ｃ２に破壊、分解等が生じない穏やかな条件下でハイブリダイゼーション体Ｃ２が���成される。【００９４】  次いで、図６（ステップｐ）に示すように、容器２ｄの底部の外壁面近傍に磁石３ｃを配置する。磁性粒子ＭＢに磁石３ｃが作用することにより、ハイブリダイゼーション体Ｃ２は、未反応のプローブＰ１及びハイブリダイゼーション体Ｃ１とともに、容器２ｄの底部の方向へ移動し、最終的には底部の内壁面に付着した状態で保持される。一方、未反応のプローブＰ２は、その分子中に磁性粒子ＭＢを含まないので、磁石３ｃの作用を受けず、液体Ｌ５に浮遊したままの状態にある。【００９５】  次いで、図６（ステップｑ）に示すように、容器２ｄの底部の外壁面近傍に磁石３ｃを配置した状態で、容器２ｄ内の液体Ｌ５の上清を除去する。これにより、液体Ｌ５の上清に含まれる未反応のプローブＰ２は除去され、液体Ｌ５の残部に含まれる未反応のプローブＰ２は少量となる。液体Ｌ５の上清を除去する際、ハイブリダイゼーション体Ｃ２は容器２ｄの底部の内壁面に付着した状態で保持されるので、ハイブリダイゼーションＣ２の量の減少は防止される。【００９６】  次いで、図７（ステップｒ）に示すように、容器２ｄ内に、標識化非磁性粒子ＬＢよりも比重が大きく、磁性粒子ＭＢよりも比重が小さく、かつ標識化非磁性粒子ＬＢ及び磁性粒子ＭＢからなる粒子複合体よりも比重が小さい液体Ｌ６を注入する。このとき、容器２ｄ内の液体Ｌ５の量は、液体Ｌ５と液体Ｌ６と混合して得られる液体７の比重が、標識化非磁性粒子ＬＢよりも比重が大きく、磁性粒子ＭＢよりも比重が小さく、かつ磁性粒子ＭＢ及び標識化非磁性粒子ＬＢからなる粒子複合体よりも比重が小さくなるように調節しておく。【００９７】  こうして、図７（ステップｓ）に示すように、未反応のプローブＰ１、未反応のプローブＰ２、ハイブリダイゼーション体Ｃ１及びハイブリダイゼーション体Ｃ２が分散した液体Ｌ７が得られる。【００９８】  次いで、図７（ステップｔ）に示すように、液体Ｌ７を静置する。
磁性粒子ＭＢの質量及び体積はオリゴヌクレオチドＮ１の質量及び体積よりも遥かに大きく、標識化非磁性粒子ＬＢの質量及び体積はオリゴヌクレオチドＮ２の質量及び体積よりも遥かに大きく、磁性粒子ＭＢ及び標識化非磁性粒子ＬＢの質量及び体積は標的核酸Ｔの質量及び体積よりも遥かに大きいので、プローブＰ１の比重は磁性粒子ＭＢの比重に、プローブＰ２の比重は標識化非磁性粒子ＬＢの比重に、ハイブリダイゼーション体Ｃ１の比重は磁性粒子ＬＢの比重に、ハイブリダイゼーション体Ｃ２の比重は磁性粒子ＭＢ及び標識化非磁性粒子ＬＢからなる粒子複合体の比重に近似することができる。したがって、液体Ｌ７を静置すると、未反応のプローブＰ１、ハイブリダイゼーション体Ｃ１及びハイブリダイゼーション体Ｃ２は沈降する一方、未反応のプローブＰ２は浮上する。このとき、ハイブリダイゼーション体Ｃ２には重力及び浮力以外の力は加わらないので、ハイブリダイゼーション体Ｃ２に破壊、分解等は生じない。このようにして、ハイブリダイゼーションＣ２に破壊、分解等が生じない穏やかな条件下、ハイブリダイゼーションＣ２は沈降物として分離される。【００９９】  沈降物には、ハイブリダイゼーション体Ｃ２とともに、未反応のプローブＰ１及びハイブリダイゼーション体Ｃ１は含まれるが、未反応のプローブＰ２は含まれない。このことは、標識化非磁性粒子ＬＢの標識に基づいて、ハイブリダイゼーションＣ２を検出する際に重要となる。【０１００】  次いで、図７（ステップｓ）に示すように、液体Ｌ７の上清を除去する。これにより、未反応のプローブＰ２を含む浮上物は除去され、液体Ｌ７の残部には、未反応のプローブＰ１、ハイブリダイゼーション体Ｃ１及びハイブリダイゼーション体Ｃ２を含む沈降物が残る。【０１０１】  次いで、標識化非磁性粒子ＬＢの標識に基づいて、沈降物に含まれるハイブリダイゼーション体Ｃ２を検出する。【０１０２】  標識が蛍光標識である場合、励起光を照射して標識化非磁性粒子ＬＢを発光させ、その発光量をＣＣＤカメラ、蛍光スキャナー、分光蛍光光度計、光電子増倍管（ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  ｔｕｂｅ：ＰＭＴ）等の光学測定装置で測定する。また、標識が化学発光標識である場合、過酸化水素水等の発光トリガー液を供給して標識化非磁性粒子ＬＢを発光させ、その発光量をＰＭＴ等の光学測定装置で測定する。また、標識が酵素標識である場合、基質液を分注した後、反応停止液を供給し、所定波長の測定光を照射してその吸光度を測定する。【０１０３】  本実施形態において、２種類以上の標的核酸を並列して検出することもできる。例えば、２種類の標的核酸Ｔ及びＴ’を並列して検出する場合、標的核酸Ｔの検出にはプローブＰ１及びプローブＰ２を使用し、標的核酸Ｔ’の検出にはプローブＰ１’及びプローブＰ２’を使用する。プローブＰ１’は磁性粒子ＭＢ’及び磁性粒子ＭＢ’に固定されたオリゴヌクレオチドＮ１’からなる。オリゴヌクレオチドＮ１’は、図１１に示すように、標的核酸Ｔ’の領域Ｒ１’と相補的な塩基配列からなり、標的核酸Ｔ’の領域Ｒ１’に特異的にハイブリダイズすることができる。また、プローブＰ２’は標識化非磁性粒子ＬＢ’と標識化非磁性粒子ＬＢ’に固定されたオリゴヌクレオチドＮ２’からなる。オリゴヌクレオチドＮ２’は、図１１に示すように、標的核酸Ｔ’の領域Ｒ２’と相補的な塩基配列からなり、標的核酸Ｔ’の領域Ｒ２’に特異的にハイブリダイズすることができる。標識化非磁性粒子ＬＢの標識と標識化非磁性粒子ＬＢ’の標識とは区別して検出可能な標識である。蛍光標識の場合、蛍光性化合物の種類や量比を異なるものとすることにより、標識化非磁性粒子ＬＢの標識と標識化非磁性粒子ＬＢ’の標識とを区別して検出することができる。【０１０４】  本実施形態において、標識化非磁性粒子ＬＢとして、磁性粒子ＭＢよりも比重が大きい粒子を選択し、液体Ｌ６として、標識化非磁性粒子ＬＢよりも比重が小さく、磁性粒子ＭＢよりも比重が大きく、かつ磁性粒子ＭＢ及び標識化非磁性粒子ＬＢからなる粒子複合体よりも比重が大きい液体を選択することができる。この場合、液体Ｌ７を静置すると、未反応のプローブＰ１、ハイブリダイゼーション体Ｃ１及びハイブリダイゼーション体Ｃ２は浮上する一方、未反応のプローブＰ２は沈降するので、ハイブリダイゼーション体Ｃ２を含む浮上物を回収し、標識化非磁性粒子ＬＢの標識に基づいて、浮上物に含まれるハイブリダイゼーション体Ｃ２を検出する。【０１０５】  本実施形態では、容器２ｄの外壁面の所定領域と磁石３ａ又は３ｂとを近接及び離反させる際、容器２ｄを固定した状態で磁石３ａ又は３ｂを容器２ｄに対して近接及び離反する方向に移動させたが、磁石３ａ又は３ｂを固定した状態で容器２ｄを磁石３ａ又は３ｂに対して近接及び離反する方向に移動させてもよい。また、容器２ｄ及び磁石３ａ又は３ｂをともに（例えば同一方向又は逆方向へ）移動させてもよい。【０１０６】  本実施形態では、容器２ｄの外壁面の所定領域の位置を、領域Ｆ１から領域Ｆ２へ及び領域Ｆ２から領域Ｆ１へ変化させたが、所定領域の位置の変化はこれに限定されるものではない。所定領域の位置を様々な位置に変化させれば、磁性粒子ＭＢを含む分子を様々な方向へ移動させることができので、プローブＰ１とプローブＰ２と標的核酸Ｔとの遭遇確率が向上し、プローブＰ１とプローブＰ２と標的核酸Ｔと反応を促進させることができる。【０１０７】  容器２ｄの外壁面の所定領域の位置は、例えば、容器２ｄの周方向、容器の長手方向又はこれらを組み合わせた方向に変化させることができる。
例えば、図８（ａ）に示すように、円筒状部材４の外壁面近傍に複数個の磁石３ａ〜３ｈを配置し、容器２ｄを回転させながら円筒状部材４の内壁面に沿って移動させることにより、容器２ｄの外壁面の所定領域の位置を容器２ｄの周方向に変化させながら、所定領域を通じて容器２ｄ内の磁性粒子ＭＢに各磁石を作用させることができる。この際、図８（ｂ）に示すように、容器２ｄの外壁面に複数の凸部２１を設けるとともに、円筒状部材４の内壁面に複数の凹部４１を設け、凸部２１と凹部４１を順次嵌合させることにより、容器２ｄを回転させながら円筒状部材４の内壁面に沿って移動させることができる。なお、図８（ａ）及び（ｂ）では、円筒状部材４の外壁面近傍に８個の磁石を配置したが、磁石の個数及び配置位置は適宜変更可能である。【０１０８】  また、図９に示すように、Ｎ極及びＳ極を適宜配列させたリング状磁石５の貫通孔内に円柱状部材６を配置し、容器２ｄを回転させながら円柱状部材６の外壁面に沿って移動させることにより、容器２ｄの外壁面の所定領域の位置を容器２ｄの周方向に変化させながら、各所定領域を通じて容器２ｄ内の磁性粒子にリング状磁石５を作用させることができる。この際、図８（ｂ）と同様に、容器２ｄの外壁面に複数の凸部を設けるとともに、円柱状部材６の外壁面に複数の凹部を設け、凸部と凹部を順次嵌合させることにより、容器２ｄを回転させながら円柱状部材６の外壁面に沿って移動させることができる。【０１０９】  また、図１０（ａ）及び（ｂ）に示すように、容器２ｄの外壁面近傍に配置した磁石３ａ又は３ｂをそれぞれ容器２ｄの長手方向（図１０では上下方向）に移動させることにより、容器２ｄの外壁面の所定領域の位置を容器２ｄの長手方向に変化させながら、各所定領域を通じて容器２ｄ内の磁性粒子に磁石３ａ又は３ｂを作用させることができる。磁石３ａ又は３ｂの形状は、図１０（ｂ）に示すように、容器２ｄの外壁面に沿った形状とすることができる。【０１１０】  本実施形態において、磁石３ａ又は３ｂが電磁石等の一時磁石である場合、磁石３ａ又は３ｂを容器２ｄに近接させる前から励磁状態としてもよいし、近接させた後に励磁状態としてもよい。また、磁石の作用を解除する際、容器２ｄに近接させた状態で非励磁状態とすることにより磁石の作用を解除してもよい。
本実施形態では、容器２ｄとして有底筒状容器を使用したが、ピペットチップ１０のような無底筒状容器を使用してもよい。無底筒状容器内には、液体を吸引した状態で保持することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】  本発明の方法の一実施形態で使用される分注機の概略断面図である。
【図２】  同本実施形態の各ステップ（ステップａ〜ｄ）を示す概略断面図である。
【図３】  同実施形態の各ステップ（ステップｅ〜ｈ）を表す概略断面図である。
【図４】  同実施形態の各ステップ（ステップｉ〜ｋ）を表す概略断面図である。
【図５】  同実施形態の各ステップ（ステップｌ〜ｎ）を表す概略断面図である。
【図６】  同実施形態の各ステップ（ステップｏ〜ｑ）を表す概略断面図である。
【図７】  同実施形態の各ステップ（ステップｒ〜ｕ）を表す概略断面図である。
【図８】  （ａ）は、容器の外壁面の所定領域の位置を容器の周方向に変化させながら、所定領域を通じて容器内の磁性粒子に磁石を作用させる方法の一実施形態を示す概略平面図であり、（ｂ）は、同方法の他の実施形態を示す概略平面図である。
【図９】  容器の外壁面の所定領域の位置を容器の周方向に変化させながら、所定領域を通じて容器内の磁性粒子に磁石を作用させる方法の他の実施形態を示す概略平面図である。
【図１０】  （ａ）は、容器の外壁面の所定領域の位置を容器の長手方向に変化させながら、所定領域を通じて容器内の磁性粒子に磁石を作用させる方法の一実施形態を示す概略側面図であり、（ｂ）は、同方法の他の実施形態を示す斜視図である。
【図１１】  プローブと標的核酸との結合状態を示す模式図である。
【符号の説明】
【０１１２】Ｔ…標的核酸（標的物質）
Ｐ１…プローブ（第二プローブ）
ＭＢ…磁性粒子（第二粒子）
Ｎ１…オリゴヌクレオチド（第二結合性物質）
Ｐ２…プローブ（第一プローブ）
ＬＢ…標識化非磁性粒子（第一粒子）
Ｎ２…オリゴヌクレオチド（第一結合性物質）
Ｃ１…ハイブリダイゼーション体（第二プローブと標的物質との結合体）
Ｃ２…ハイブリダイゼーション体（第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体）
Ｌ１…液体試料（標的物質を含有する試料）
２ａ，２ｂ，２ｃ，２ｄ…容器
３ａ，３ｂ，３ｃ，３ｄ，３ｅ，３ｆ，３ｇ，３ｈ…磁石
Ｆ１，Ｆ２…容器の外壁面の領域（容器の外壁面の所定領域）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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