(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンの組成を決定する方法であって、該方法は、ＮＭＲ分光法を用いて該グリコサミノグリカンのグルコサミン（Ａ）−ウロン酸（Ｕ）結合の測定値を得る工程、および該Ｕ−Ａ結合の硫酸化パターンの決定を可能にするキャピラリー電気泳動により該グリコサミノグリカンのＵ−Ａ結合の測定値を得る工程、および
該ＮＭＲ分光法およびキャピラリー電気泳動からの該測定値と一致する該グリコサミノグリカンのあり得る配列を、Ａ残基およびＵ残基から構成される二糖構築ブロックの硫酸化パターンおよびＵ残基のエピマー化の両方をコードする数的なＰＥＮフレームワークを使用することにより決定する工程
を包含し、そして
ここで、該決定工程は、該ＮＭＲ分光法からの該測定値に基づいて、あり得る配列のリストを構成する工程、および数的なＰＥＮフレームワークを使用することによりキャピラリー電気泳動からの該測定値と一致しない配列を、該あり得る配列のリストから排除する工程を包含する、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記キャピラリー電気泳動はまた、前記グリコサミノグリカンまたはそのフラグメントの還元末端または非還元末端を区別する、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記グリコサミノグリカンが前記キャピラリー電気泳動の前に化学的に分解される、方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、前記グリコサミノグリカンが前記キャピラリー電気泳動の前に末端標識される、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記キャピラリー電気泳動はまた、前記グリコサミノグリカンまたはそのフラグメントの還元末端のサインを決定する、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記ＮＭＲ分光法はまた、前記グリコサミノグリカンまたはそのフラグメントの硫酸化パターンの決定を含む、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、ここで、該方法は、Ａ−Ｕ結合およびＵ−Ａ結合の測定値に基づいて、前記ヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンの可能な配列のリストを作成する工程をさらに包含する、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記ＮＭＲ分光法は、１Ｄプロトンまたは２Ｄ  ＣＯＳＹ／ＴＯＣＳＹである、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記グリコサミノグリカンが前記キャピラリー電気泳動法の前に消化されてフラグメントを生成する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記フラグメントは、酵素的消化により生成される、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記酵素的消化は、完全である、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記ＮＭＲはまた、還元末端および非還元末端の両方を同定および定量するために行われる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、多糖の組成情報および配列情報を分析するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ヘパリンおよび硫酸ヘパラングリコサミノグリカンは、種々の生理状態および病理学的状態に関する酸性多糖複合体である。生物学の種々の領域における進歩は、血栓症（Ｐｅｔｉｔｏｕら、１９９９）、新脈管形成（Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎら、１９９７）、ウイルス侵襲（Ｃｈｅｎら、１９９７；Ｆｒｙら、１９９９；Ｓｈｕｋｌａら、１９９９）および腫瘍増殖（Ｈｕｌｅｔｔら、１９９９；Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら、１９９９；Ｌｉｕら、２００２）を含めた重要な生物学的プロセスにおけるＨＳＧＡＧの強力な役割を解明した（ＣａｓｕおよびＬｉｎｄａｈｌ、２００１；Ｌｉｎｄａｈｌ、２０００；ＳａｓｉｓｅｋｈａｒａｎおよびＶｅｎｋａｔａｒａｍａｎ、２０００；Ｓｈｒｉｖｅｒら、２００２）。ＨＳＧＡＧポリマーの繰り返し単位は、ウロン酸（Ｕ）を含む二糖であり、ウロン酸は、α−Ｄ−グルコサミン残基（Ａ）に１→４に結合した二つの異なるエピ異性体形態−α−Ｌ−イズロン（Ｉ）またはβ−Ｄ−グルクロン（Ｇ）中に存在し得る。ウロン酸の２−Ｏ位置、グルコサミンの３−Ｏおよび６−Ｏ位置における硫酸化およびグルコサミンのＮ位置の硫酸化またはアセチル化の形態中の二糖単位内に変異がある（ＣａｓｕおよびＬｉｎｄａｈｌ、２００１）。
【０００３】
おそらく、ＨＳＧＡＧにおける最も研究されている構造−活性関係は、抗トロンビン−ＩＩＩに特異的に結合し、活性化し、それによって血液凝固カスケードにおいて阻害的な役割を果たすヘパリン中の五糖の配列である（ＢｏｕｒｉｎおよびＬｉｎｄａｈｌ、１９９３）。ヘパリンおよびその誘導体である低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）は、手術後の深部静脈血栓の防止（Ｂｒｅｄｄｉｎ、２０００）および冠状動脈侵襲手順後の心筋梗塞の防止（Ｃｏｈｅｎ、１９９９）に対して最も広く使用されている臨床的薬剤である。ヘパリンの抗血液凝固特性に基づいて、ヘパリンの新規の治療的用途が、予見されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、２００１）。五糖の合成版は、抗血栓剤として使用されてきた（Ｔｕｒｐｉｅら、２００１）。
【０００４】
ＨＳＧＡＧの構造−活性関係を理解するために、ゲル電気泳動（Ｔｕｒｎｂｕｌｌら、１９９９）、ＨＰＬＣ（Ｖｉｖｅｓら、１９９９）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）（Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎら、１９９９）およびナノエレクトロスプレー質量分析法（Ｐｏｐｅら、２００１）を含むオリゴ糖配列決定のためのいくつかの分析手段が開発されてきた。これらの分析手段は、一組の解重合酵素および他の化学的方法を使用して、そして、より小さいフラグメントの特定の特性に基づいたオリゴ糖の配列を決定して、ＨＳＧＡＧオリゴ糖を小さいフラグメントに分割するために適用されてきた（Ｋｒｅｕｇｅｒら、２００１）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、一部は、オリゴ糖（例えば、ＨＳＧＡＧ）を分析するための分析手段に関する。オリゴ糖の配列および／または組成の決定は、重要な生物学的プロセスにおけるオリゴ糖の構造−機能関係を解明するのに役立つ。
【０００６】
いくつかの局面では、オリゴ糖の組成を決定する方法が提供される。その方法は、ＮＭＲ分光法を使用したオリゴ糖の第一の特性の測定値の獲得に関し、そして、第二の実験法によるオリゴ糖の第二の特性の測定値の獲得に関し、ここで、第一の特性および第二の特性は、組成を決定する。一つの実施形態において、オリゴ糖の第二の特性は、キャピラリー電気泳動により測定される。
【０００７】
オリゴ糖を分析する方法は、他の局面に従って提供される。その方法は、オリゴ糖を分析するための、第一の実験法によるオリゴ糖の第一型の二糖結合の測定値の獲得および第二の実験法によるオリゴ糖の第二型の二糖結合の測定値の獲得に関する。一つの実施形態において、第一型の二糖結合は、ＮＭＲ分光法により測定される。別の実施形態において、第二型の二糖結合は、キャピラリー電気泳動により測定される。
【０００８】
別の局面に従うと、オリゴ糖を分析する方法は、オリゴ糖を分析するための、ＮＭＲ分光法によるオリゴ糖の第一の特性を同定すること、およびキャピラリー電気泳動によってオリゴ糖の第二の特性を同定することによって提供される。
【０００９】
いくつかの実施形態におけるその方法は、ＮＭＲ分光法および第二の実験法の測定値と一致したオリゴ糖の可能な配列の決定に関する。
【００１０】
他の実施形態において、その方法は、ＮＭＲ分光法の測定値に基づいた可能な配列のリストの構築および第二の実験法の測定値と一致しない可能な配列のリストからの配列の除去に関する。
【００１１】
第二の実験法は、オリゴ糖またはそのフラグメントの還元末端および非還元末端を区別するために使用され得る。一つの実施形態において、第二の実験法は、化学的分解を含む。別の実施形態において、第二の実験法は、末端標識化を含む。
【００１２】
第二の実験法はまた、オリゴ糖またはそのフラグメントの末端の還元の形跡を決定するために使用され得る。一つの実施形態において、還元末端の形跡は、キャピラリー電気泳動を用いて決定される。第二の実験法は、第二型の二糖結合の硫酸化パターンの決定を可能にし得る。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＮＭＲ分光法は、オリゴ糖またはそのフラグメントの硫酸化パターンの定量を含む。別の実施形態において、ＮＭＲは、還元末端および非還元末端両方を特定し、定量化するために実施される。
【００１４】
この方法は、第３の実験法から得られる測定値と一致しない配列をさらに除去するために、第３の実験法によるオリゴ糖の追加特性の特性の尺度を獲得する工程を必要に応じて包含し得る。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ＮＭＲ分光法は、１Ｄプロトンまたは２Ｄ  ＣＯＳＹ／ＴＯＣＳＹである。他の実施形態において、ＮＭＲ分光法は、ＨＳＱＣ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹまたはＲＯＥＳＹである。ＮＭＲ分光法はまた、上記の任意の組み合わせであり得る。
【００１６】
ＮＭＲ分光法は、そのインタクトな形態のオリゴ糖上で実施され得る。あるいは、断片化された形態のオリゴ糖上で実施され得る。この断片化された形態は、酵素消化によって産生され得る。代替手段で、酵素分解は、完全であるかまたは部分的であり得る。
【００１７】
第２の実験法はまた、オリゴ糖を断片化された形態（例えば、必要に応じて、酵素消化によって産生される）に消化する工程を包含し得る。一つの実施形態において、酵素消化は完全である。
【００１８】
別の局面において、オリゴ糖の可能な配列リストを作成する方法を提供する。この方法は、ＮＭＲ分光法および第２の実験法を実施することによって、オリゴ糖の特性セットを定義する工程（ここで、ＮＭＲ分光法は、第１のタイプの二糖類結合の測定値を提供し、そして第２の実験法は、第２のタイプの二糖類結合の測定値を提供する）、およびオリゴ糖の特性セットに基づく可能な配列リストを構築する工程を包含する。一つの実施形態において、ＮＭＲ分光法は、オリゴ糖の単糖類組成の測定を含む。
【００１９】
この方法は、非文字値として、特性を表すデータ構造を含み得る。一つの実施形態において、このデータ構造は、各々のタイプの単糖についての値を含む。別の実施形態において、このデータ構造は、各々のタイプの二糖類結合についての値をコード化する。別の実施形態において、この値は二進法である。
【００２０】
この方法から生成されたオリゴ糖の可能な配列リストもまた、提供する。
【００２１】
上記の局面および実施形態において、「第１」および「第２」の実験法の表示は、この実験が実施されなければならない順位を示すことを意図しない。いくつかの実施形態において、ＮＭＲ分光法は他の実験法の前に実施され得るが、他の実施形態において、ＮＭＲ分光法は別の方法の後に実施され得る。さらに他の実施形態において、２つ以上の実験法が同時に実施され得る。
【００２２】
本発明の各々の実施形態は、本明細書でなされた種々の詳述を含み得る。従って、任意の一つのエレメントまたはエレメントの組み合わせを含む本発明の各々の詳述は、本発明の各々の局面において、必要に応じて含まれ得ることが理解される。
【００２３】
（詳細な説明）
ヘパリンおよびヘパラン硫酸グリコサミノグリカン（ＨＳＧＡＧ）は、多数のシグナル伝達分子、酵素、病原体に結合し、かつ細胞増殖および発生から抗凝血およびウイルス侵入までにわたる重要な生物学的プロセスを調節する、細胞表面多糖類である。ヘパリンは、数十年間、種々の臨床応用において抗凝血剤として広く使用されている。ＨＳＧＡＧの異質性および複雑性は、それらの精製および構造機能関係の特徴付けに対する重要な課題を呈示する。
【００２４】
ゲル電気泳動、クロマトグラフィーおよび質量分析法を含むいくつかの分析技術は、少量のＨＳＧＡＧオリゴ糖類の配列を決定するために首尾よく適用された。ほとんどのこれらの技術の成功のための前提条件は、酵素的および化学的分解方法の組み合わせを使用する、ＨＳＧＡＧオリゴ糖類のより小さな断片への予測可能でかつ制御された脱重合である。重要なことに、これらの配列決定戦略のいくつかのために、複数のエキソ型酵素の使用は、二糖類ユニットの異なる修飾を正確に決定するために必要とされる。
【００２５】
オリゴ糖類を特徴づける試験的方法を利用する方法論が、開発された。本発明は、いくつかの局面において、ＨＳＧＡＧのようなオリゴ糖類を分析するための方法に関連する。これらの方法は、ある実施形態の中で、オリゴ糖類の分析を通してサンプル中のオリゴ糖類の存在または同一性を決定することを包含する。他の実施形態では、サンプル中のオリゴ糖類の純度を評価するための方法が、提供される。用語「分析する」は、本明細書で使用されるように、オリゴ糖類の一つ以上の特性の識別を指す。いくつかの実施例では、その分析は、広範囲であり得、かつオリゴ糖類の組成に関するかなりの情報を提供し得る。用語、分析するは、オリゴ糖類の配列を決定するかまたはオリゴ糖類の組成を決定することを包含し得る。用語「組成を決定する」は、オリゴ糖類の、そのオリゴ糖類が他のオリゴ糖類から区別され得るために十分な特性の識別を指す。この特性に関する情報が、本発明者らにより生成された数的なＰＥＮフレームワークを使用して編成される場合、基礎的要素の順序と連結情報を含めて、オリゴ糖類の配列は、編成され得る。
【００２６】
オリゴ糖類の分析は、単量体の特性と連結情報との識別を含み得る。オリゴ糖類の単糖類と二糖類との間の連結の型を識別することの重要性は、例としてＨＳＧＡＧを使用して例示され得る。ＨＳＧＡＧポリマーの繰り返しユニットは、ウロン酸（Ｕ）（それは２つの異なるエピマー型、β−Ｄ−グルクロン酸（Ｇ）のα−Ｌ−イズロン酸（Ｉ）で存在し得、１→４でα−グルコサミン残基（Ａ）に連結される）を含む二糖類である。この二糖類ユニットの中の変化が、グルコサミンのＮ位の硫酸化またはアセチル化の形式で存在する。特徴的なプロトンおよび１３Ｃ化学シフトは、共通に生じる単糖類およびヘパリンについて識別され、そして、これらの単糖類の相対存在量は、プロトンシグナルの積分により定量的に決定され得る。単糖類の特徴付けに加えて、グルコサミンのアノマープロトンシグナルは、近隣のウロン酸に関する連結情報（Ａ−Ｕ連結）を、規定されたエピマー状態および硫酸化状態と同一視するためにさらに解析され得る。
【００２７】
オリゴ糖類の組成は、オリゴ糖類の特性を測定するための２つ以上の実験技術を使用する、本明細書に記載の方法により決定され得る。この実験技術のうちの一つは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）である。ＮＭＲの利用により、ＨＳＧＡＧオリゴ糖類の配列を決定するために必要な試験的束縛の数は減少され得る。ＮＭＲは、少なくとも一つの他の型の実験技術とともに利用され得る。ＮＭＲおよびキャピラリー電気泳動（ＣＥ）データセットと、ＰＥＮフレームワークの支援との統合により、適切な感度のためのさらにより多くのサンプルおよびより精巧な機器が必要となり得るＮＯＥＳＹ／ＲＯＥＳＹ実験についての必要性を縮小し得ることは、本明細書に呈示された。
【００２８】
それゆえ、オリゴ糖類の配列を決定するためのオリゴ糖類を分析する方法が、提供される。数的なＰＥＮフレームワークを使用して、成分分析に由来する情報、例えば、２つの別個の連結データセットは、迅速で、系統的でかつ不偏性の様式で配列を構築するように編成され得る。ＰＥＮフレームワークの数的な性質は、単純な数学的演算を使用して単糖類、二糖類Ｕ−ＡおよびＡ−Ｕ連結情報の間で移動することを促進し、それゆえＨＳＧＡＧ配列に迅速に到達する系統的かつ不偏性の方法を促進する。
【００２９】
以下で考察される実施例は、本明細書中で記載される方法論および計算機アプローチの使用を実証する。実施例１および２は、Ｉ２ＳおよびＧの両方を含む五糖類を記載する。これらの実施例は、本明細書中で記載される分析方法の適用のための還元末端（メチル化）の痕跡を測定するための有用性を実証する。一旦Ａ−Ｕ結合およびＵ−Ａ結合の全てが測定されると、還元末端および非還元末端の知識は、前後に移動させることによる配列決定を可能にする。十糖類Ｈ１０は、分析手段の組み合わせを使用して特徴付けられ、かつ立証される最も複雑な十糖類の１つである。
【００３０】
実施例３は、過去におけるＨ１０の特徴付けのために使用されてきた他の分析手段と比較して、本明細書中で記載される方法の効力を強調する。この十糖類についての以前の配列決定アプローチは、数多くの工程を必要とした。本明細書中に記載される方法を使用して、本発明者らは、実験データの最小限のセットを使用して定量的に決定されたＡ−Ｕ結合情報およびＵ−Ａ結合情報の２つの異なるセットを得ることにより付勢のない様式でＨ１０の配列に到達した。この実施例は、ＮＭＲデータから得られる結合および単糖類組成物を満たす配列の全ての可能性のある組み合わせの列挙を構築し、そしてＣＥデータを満足しない配列を削除する、計算機方法の融通性を例示する。
【００３１】
従って、可能性のある配列の列挙は、同定される特性（例えば、電荷、オリゴ糖類単位の性質および数、単位の化学的置換基の性質および数、二糖類結合、還元末端および非還元末端、ならびにオリゴ糖類の立体特異性（これらは、実験的方法の測定から決定されるオリゴ糖類の基本構成ブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）についての情報を明らかにする）のような）に基いて構成され得る。
【００３２】
オリゴ糖類の構造的特性は、オリゴ糖類の機能についての有用な情報を提供し得る。例えば、オリゴ糖類の特性は、オリゴ糖類の単位の全体的な配列を解明し得、これは、オリゴ糖類の同定のために有用である。同様に、オリゴ糖類の配列が以前に未知であった場合、オリゴ糖類の構造的特性は、オリゴ糖類を、既知の機能を有する既知のオリゴ糖類に対して比較するために有用である。オリゴ糖類の特性はまた、オリゴ糖類が正味の電荷を有し、または荷電された領域を有することを解明し得る。この情報は、オリゴ糖類が相互作用し得る化合物を同定するのに、またはオリゴ糖類のどの領域が結合相互作用に関与し得、または特異的な機能を有し得るのかを予測するために有用である。
【００３３】
本発明は、オリゴ糖類の特性を同定するために有用である。本明細書中で使用される「特性」は、オリゴ糖類についての情報（例えば、構造的情報）を提供するオリゴ糖類の特徴（例えば、構造的特徴）である。オリゴ糖類のいくつかの特性の収集は、化学的単位またはオリゴ糖類全体さえ同定するのに十分な情報を提供し得、しかし、オリゴ糖類の特性自体は、化学的単位またはオリゴ糖類の化学的基礎を包含しない。オリゴ糖類の複雑性に起因して、特性は、オリゴ糖類の単量体の構成ブロックの型を同定し得る。オリゴ糖類の単位は、その基本的な化学的構造に加えて、より多くの変数を有する。例えば、オリゴ糖類は、基本構成ブロック上のいくつかの部位にてアセチル化または硫酸化され得、あるいはこれは電荷を有していても有していなくても良い。従って、オリゴ糖類の１つの特性は、オリゴ糖類の１つ以上の基本構成ブロックの固有性であり得る。
【００３４】
しかし、基本構成ブロックのみは、糖類または二糖類の置換基の電荷および性質についての情報を提供しないかもしれない。例えば、ウロン酸の構成ブロックは、イズロン酸またはグルクロン酸であり得る。これらの構成ブロックの各々は、構成ブロックの構造に複雑性を付加するさらなる置換基を有し得る。しかし、単一の特性は、オリゴ糖類の完全な構成ブロックの同定に加えて、このようなさらなる置換電荷を同定しないかも知れない。しかし、この情報は、いくつかの特性から集められ得る。従って、本明細書中で使用されるようなオリゴ糖類の特性は、オリゴ糖類の単糖類または二糖類の構成ブロックを包含する。本明細書中で記載されるＮＭＲ法は、基本的な単糖類構成ブロックについての情報を同定するために有用である。
【００３５】
上記オリゴ糖に関する構造情報を提供する特性の型は、電荷、分子量、硫酸化もしくはアセチル化の性質および程度、または糖の型のような、特性である。特性としては、電荷、キラリティー、置換基の性質、置換基の量、分子量、分子長、置換基もしくはユニットの組成比、またはオリゴ糖の基礎構成ブロックの型、疎水性、酵素感受性、親水性、二次構造および立体構造（すなわち、らせんの位置）、置換基の空間分布、ある改変セット対別の改変セットの比（すなわち、Ｎ−硫酸化に対する２−Ｏ硫酸化の相対量、またはグルコン酸に対するイズロン酸の比）、タンパク質結合部位、および結合情報が、挙げられるが、これらに限定されない。他の特性は、当業者によって容易に同定される。置換基とは、本明細書中で使用される場合、あるユニットを置換するがそれらのユニット自体ではない、原子または原子群である。
【００３６】
ＮＭＲの使用は、オリゴ糖の完全配列を同定するために充分な特性情報を誘導するために必要な実験的制約数を有意に減少し得ることが、発見されている。特定の結合および単糖組成に関する情報を提供することによって、ＮＭＲは、配列決定技術を劇的に改善する。
【００３７】
従って、上記の方法の一実施形態は、Ａ−Ｕ結合を測定するためのＮＭＲの強度と、オリゴ糖の配列を構築するためにＣＥから得られるＵ−Ａ結合情報の直交セットを利用する。ＮＭＲは、インタクトなオリゴ糖の配列を規定する多数のパラメーター（単糖組成、硫酸化パターン、およびグルコサミンとウロン酸との間の結合（Ａ−Ｕ）が挙げられる）を決定するために使用され得る強力なツールである。これらのパラメーターは、配列長および構成ブロックの変動性とは独立して、一連の単一１Ｄプロトン実験と２Ｄ  ＣＯＳＹ／ＴＯＣＳＹ実験とを使用して、容易に決定され得る。従って、ＮＭＲから得られた隣接する単糖間の個別の結合情報（Ａ−Ｕ結合情報）を、単一のキャピラリー電気泳動実験から得られるＵ−Ａ結合情報と合わせることによって、ＨＳＧＡＧオリゴ糖の配列に容易に到達する。
【００３８】
過去に、ＨＳＧＡＧのＮＭＲスペクトルの解釈は、プロトンシグナルの重複と、測定可能な結合定数がないこととに起因して、特定の制限を有していた。また、この技術の感度は、クロマトグラフィー溶出液の検出に基づく技術（Ｔｕｒｎｂｕｌｌら、１９９９；ｌＶｉｖｅｓら、１９９９；Ｋｒｅｕｇｅｒら、２００１）および質量分析に基づく技術（Ｐｏｐｅら、２００１；Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎら、１９９９）の感度よりも低い。従って、少量でしか入手可能ではないサンプルを特徴付けることは、非常に困難であった。これらの制限にも関わらず、ＮＭＲは、配列決定において有用な強力な分析情報を提供し得ることが、発見されている。
【００３９】
ＮＭＲ分光法は、分子構造の決定を可能にする分析ツールである。いくつかの核の磁気特性を利用して、その核の核スピンが、外部磁界を用いてランダムに方向付けられ得る。方向付けられた核は、その後、正確な周波数で照射され、その核は、エネルギーを吸収して、より高エネルギー状態に遷移する。弛緩の際に、このエネルギーは、放出され、そして種々のＮＭＲシステムで検出される。この核の照射は、パルス状に生じる。基礎的一次元（１Ｄ）ＮＭＲにおいて、その励起は、１つのパルスから生じ、放出された放射線が、遊離誘導減衰（ＦＩＤ）として検出される。２次元（２Ｄ）ＮＭＲ分光法において、その核は、２つのパルスを用いて照射され、そのＦＩＤの獲得が、それらのパルス間で減衰しつつ、多時点で生じる。
【００４０】
ＣＯＳＹ、ＴＯＳＣＹ、ＮＯＥＳＹ、およびＲＯＥＳＹを含む、多くの型の２Ｄ分光法が存在する。ＣＯＳＹ（相関分光法）は、隣接するプロトンから生じるエネルギーを決定する際に役立つ。これは、重複または二次結合が存在する場合に、有用である。ＣＯＳＹにおけるスピン−スピンカップリングは、そのスペクトルが結合相互作用を介して生じることを可能にする。結合相互作用を介して測定可能な別の２Ｄ  ＮＭＲ技術は、ＴＯＳＣＹ（総合（ｔｏｔａｌ）相関分光法）である。これは、スピン系内でシグナルを生じるプロトンを同定する。ＣＯＳＹおよびＴＯＳＣＹは、より強力な構造分析のために合わされ得る。
【００４１】
他の２Ｄ  ＮＭＲ技術は、空間相互作用を介する測定を可能にする。これらの方法は、ＮＯＥＳＹ（核オーバーハウザー効果分光法）およびＲＯＥＳＹ（回転（ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ）核オーバーハウザー効果分光法）と呼ばれる。ＮＯＥＳＹは、結合によって直接には結合していない空間的に近接するプロトンから放出されるシグナルを同定する。ＮＯＥＳＹスペクトルは、効果的に測定され得る照射時の隣接する核からの多重項強度の変化として、空間的相関を介して生じる。ＮＯＥＳＹシグナルが弱い場合、ＲＯＥＳＹが使用され得る。ＲＯＥＳＹは、同様な技術であるが、但し、負である交差ピークを有する。他の技術が使用され得、それは、当業者にとって明らかである。
【００４２】
本明細書中で記載される方法において有用なＮＭＲ分光法は、いくつかの実施形態において、１Ｄプロトンまたは２Ｄ  ＣＯＳＹ／ＴＯＣＳＹであり得る。１ＤプロトンＮＭＲおよび２Ｄ  ＣＯＳＹ／ＴＯＣＳＹ  ＮＭＲスペクトルは、オリゴ糖配列を規定する複数のパラメーター（単糖組成、硫酸化状態およびＡ−Ｕ結合情報を含む）に関する量的情報を提供する。さらに、ＮＭＲは、配列中のイズロン酸およびグルクロン酸の含量の直接定量のための正確な方法を提供する。
【００４３】
キャピラリーゲル電気泳動の方法において、反応サンプルは、小さい直径のゲル充填されたキャピラリーによって分析され得る。小さい直径のキャピラリー（５０μｍ）は、電気泳動の間に発生した熱の効率的な放散を可能にする。従って、高い電界強度が、過剰なジュール加熱（４００Ｖ／ｍ）を伴うことなく使用され得、分離時間を約２０分／反応ランまで下げ、従って、従来のゲル電気泳動を超えて分解能を上げる。さらに、多くのキャピラリーが、並行して分析され得、生成したオリゴ糖の情報の拡充を可能にする。
【００４４】
現在、糖フラグメントは、２３２ｎｍ（ヘパリナーゼ切断の際に生成するΔ４，５二重結合が吸収する波長）でモニタリングすることによって、キャピラリー電気泳動において検出される。しかし、他の検出方法が可能である。第１に、ヘパリンフラグメントの亜硝酸切断、続く３Ｈ−ホウ化水素ナトリウムでの還元により、３Ｈ放射性タグを有する分解フラグメントを生じる。このことは共に、キャピラリー電気泳動（放射能をカウント）または質量分析法（質量の増加によって）により追跡され得るタグをあらわす。放射能を使用する別の方法は、Ｓ３５でヘパリンフラグメントを標識することである。３Ｈ標識フラグメントを検出可能なタイプと同様に、Ｓ３５標識フラグメントは、放射能検出（ＣＥ）または質量差（ＭＳ）の測定に有用であり得る。
【００４５】
特にＳ３５の場合、この検出は強力である。この場合、ヒトスルホトランスフェラーゼが、特定の残基を特異的に標識するために使用され得る。これは、さらなる構造情報を与える。
【００４６】
亜硝酸分解フラグメントは、ヘパリン由来のフラグメントとは異なり、ＵＶ吸収発色団を有さない。ＣＥについて、適切な発色団を欠くフラグメントをモニタリングするために、２つの方法が使用され得る。第１は、フラグメントの間接的検出である。本発明者らは、適切なバックグラウンド吸収体（例えば、１，５−ナフタレンジスルホン酸）を用いる本発明者らのＣＥ法を用いて、ヘパリンフラグメントを検出し得る。検出のための第２の方法は、糖による金属イオンのキレート化を包含する。糖−金属錯体は、不飽和二重結合をモニタリングするのと同様に、ＵＶ−Ｖｉｓを使用して検出され得る。
【００４７】
還元末端または非還元末端を決定するために、種々の実験法が使用され得、この方法としては、化学分解、末端標識化およびキャピラリー電気泳動が挙げられる。いくつかの実施形態において、これらの末端は、還元末端または非還元末端の特徴を測定することによって決定され得る。いくつかのオリゴ糖について、還元末端の特徴は、メチル化であり、この特徴はまた、キャピラリー電気泳動および当該分野で公知の他の方法によって決定され得る。
【００４８】
オリゴ糖の還元末端は、例えば、質量タグを使用して、非還元末端から区別され得る。これらのタグのすべては、アノマーＯＨ（オリゴ糖の還元末端に存在する）との選択的化学的性質を含み、従ってこの鎖の還元末端で標識化が生じる。１つの一般的なタグは、２−アミノ安息香酸であり、これは蛍光性である。一般に、タグは、以下のタイプの化学的性質を含む：（１）イミン（すなわち、２−アミノ安息香酸）を形成するアノマー位とアミンの反応、ヒドラゾンを形成するヒドラジン反応、およびセミカルバジドを形成するアノマーＯＨとセミカルバゾンとの反応。一般に使用されるタグ（２−アミノ安息香酸以外）としては、以下の化合物が挙げられる：
１．セミカルバジド
２．ジラールＰ試薬
３．ジラールＴ試薬
４．ｐ−アミノ安息香酸エチルエステル
５．ビオチン−ｘ−ヒドラジド
６．２−アミノベンズアミド
７．２−アミノピリジン
８．アントラニル酸
９．５−[（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノ]−フルオレセイン
１０．８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸
１１．２−アミノアクリドン。
【００４９】
本発明のいくつかの局面において、その特性は、インタクトな形態またはフラグメント化形態のオリゴ糖について決定され得る。本発明のいくつかの実施形態において、オリゴ糖のフラグメントは、酵素分解によって生成され得る。いくつかの実施形態において、消化は、完全消化であるかまたは部分消化であり得る。
【００５０】
オリゴ糖フラグメントは、へパリン溶解酵素のような酵素または亜硝酸を使用して分解され得、そしてそれらはまた、スルフェート基を先に述べた位置に移動させるか、またはスルフェート基をその位置から移動させる異なる酵素を使用して改変され得る。改変酵素は、外部溶解性（ｅｘｏｌｙｔｉｃ）および非プロセッシブ（ｎｏｎ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）であり、これは、これらが、非還元末端で一度だけ作用し、鎖の残りを連続的に改変することなく、へパリン鎖を放すことを意味する。二糖単位の改変可能位置の各々について、改変酵素が存在する。スルフェート基を追加する酵素は、スルホトランスフェラーゼと呼ばれ、スルフェート基を除去する酵素は、スルファターゼと呼ばれる。改変酵素としては、２−Ｏスルファターゼ／スルホトランスフェラーゼ、３−Ｏスルファターゼ／スルホトランスフェラーゼ、６−Ｏスルファターゼ／スルホトランスフェラーゼ、およびＮ−デアセチラーゼ−Ｎ−スルホトランスフェラーゼが挙げられる。これらの酵素の機能は、それらの名前から明らかであり、例えば、２−Ｏスルホトランスフェラーゼは、スルフェート基をイズロン酸の２−Ｏ位置に移動させ（２−Ｏスルフェート化グルクロン酸は、ＨＳＧＡＧ鎖のまれな存在である）、２−Ｏスルファターゼは、スルフェート基を、イズロン酸の２−Ｏ位から除去する。
【００５１】
ＨＳＧＡＧ分解酵素としては、ヘパリナーゼ−Ｉ、ヘパリナーゼ−ＩＩ、ヘパリナーゼ−ＩＩＩ、Ｄ−グルクロニダーゼおよびＬ−イズロニダーゼが挙げられる。ヘパリナーゼは、ウロン酸の前に、グリコシド結合で切断する。ヘパリナーゼＩは、２−Ｏスルフェート化イズロン酸の前に、グリコシド連結で切り取る。ヘパリナーゼ−ＩＩＩは、非スルフェート化グルクロン酸の前にグリコシド連結で切断する。ヘパリナーゼ−ＩＩは、Ｈｅｐ−Ｉ切断可能部位およびＨｅｐ−ＩＩＩ切断可能部位の両方で切断する。ヘパリナーゼによる切断後、切断が生じる前に、ウロン酸は、イズロン酸対グルクロン酸の情報を失う。なぜなら、二重結合は、ウロン酸のＣ４原子とＣ５原子との間で作られるからである。
【００５２】
グルクロニダーゼおよびイズロニダーゼは、それらの名前が示唆するように、グルクロン酸およびイズロン酸のそれぞれの後に、グリコシド連結で切断する。亜硝酸は、Ｎ−スルフェート化ヘキソサミンの後のグリコシド連結でランダムに切り取り、そして６員ヘキソサミン環を５員無水マンニトール環に変換する。
【００５３】
本明細書中において使用されるように、用語「オリゴ糖（オリゴサッカリド）」は、用語「多糖（ポロサッカリド）」と交換可能に使用される。「オリゴ糖」は、連結される糖（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）単位または糖（ｓｕｇａｒ）単位から構成されるバイオポリマーである。オリゴ糖の連結された単位に関して本明細書中に記載されるように、「連結される」または「連結」は、２つの実体が、任意の物理化学手段によって互いに結合されることを意味する。当業者に公知の任意の連結（共有または非共有）を、包含する。このような連結は、当業者に周知である。天然の連結（特定のオリゴ糖の化学単位を接続する天然に通常見出される連結である）は、最も一般的である。天然の連結としては、例えば、アミド連結、エステル連結およびチオエステル連結が挙げられる。しかし、本発明の方法によって分析されるオリゴ糖単位は、合成連結または改変連結によって連結され得る。この単位が共有結合によって連結されるオリゴ糖が、最も一般的であるが、水素結合などをまた含む。
【００５４】
オリゴ糖は、複数の化学単位から構成される。本明細書中において使用される「化学単位」は、他の構築ブロックまたはモノマーに直接的または間接的に連結してオリゴ糖を形成し得る構築ブロックまたはモノマーである。オリゴ糖は、好ましくは、少なくとも２つの異なる連結単位のオリゴ糖である。オリゴ糖は、互いに連結される単糖から構成されるバイオポリマーである。多くのオリゴ糖において、オリゴ糖の基礎的な構築ブロックは、実際には、反復または非反復であり得る二糖単位である。従って、オリゴ糖に関して使用される場合の単位は、オリゴ糖の基礎的な構築ブロックをいい、これには、モノマー構築ブロック（単糖）またはダイマー構築ブロック（二糖）が挙げられ得る。
【００５５】
「複数の化学単位」は、互いに連結される少なくとも２つの単位である。オリゴ糖は、ネイティブまたは天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）オリゴ糖（天然に存在する）あるいは非天然（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）オリゴ糖（天然に存在しない）であり得る。オリゴ糖は、代表的に、天然オリゴ糖の少なくとも１部を含む。オリゴ糖は、単離または新たに合成され得る。例えば、オリゴ糖は、天然の供給源から単離され得る（例えば、切断またはゲル分離によって精製される）か、または例えば、化学合成によって合成され得る。
【００５６】
オリゴ糖の特性を表すためのデータ構造もまた、提供される。いくつかの実施形態において、データ構造は、非特徴的な値として特性を表す。これらの値は、いくつかの実施形態において、バイナリ値であり得る。いくつかの実施形態において、構築ブロックは、オリゴ糖の単糖および二糖の連結の型である。
【００５７】
化学的および酵素ツール、続いて、数値分析を使用する多糖のための迅速配列決定方法は、以下に詳細に記載される：Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，５３７−５４２（１９９９）、および米国特許出願番号０９／５５７，９９７および０９／５５８，１３７（両方が、２０００年４月２４日に出願され、共通の発明者の要件を有する）（これらの全てが、具体的に本明細書中で参考として援用される）。
【実施例】
【００５８】
（材料および方法）
合成ペンタサッカリドＰ１およびＰ２（ＡＴ−ＩＩＩ結合のための、ヘパリンの活性配列に対応する）は、Ｍ．Ｐｅｔｉｔｏｕ，Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ，Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，Ｆｒａｎｃｅから寄贈された。デカサッカリドＨ１０（親切にも、Ｒ．Ｊ．Ｌｉｎｈａｒｄｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ）により寄贈された）を、ブタ粘膜ヘパリンのヘパリナーゼ消化物を、以前に記載されるように（Ｔｏｉｄａら，１９９６）、ＡＴ−ＩＩＩカラムで分画することにより得た。
【００５９】
（ＮＭＲ分光法：）
オリゴ糖サンプルを、２ｍｇのペンタサッカリドおよび１５０μｇのＨ１０を０．５ｍｌのＤ２Ｏ  ９９．９９％に溶解することによって調製した。Ｈ１０中の常磁性イオンによって引き起こされたシグナルの拡がりに起因して、重水素化ＥＤＴＡをサンプルに添加して、これらのイオンを除去した（Ｎｅｖｉｌｌｅら，１９８９）。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、残りの水シグナルの予備飽和および１２秒のリサイクル遅延を伴うＢｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ  ５００分光光度計で、５００ＭＨｚにおいて６０℃で記録した；４５°パルスを使用した。２Ｄ  ＤＱＦ−ＣＯＳＹ（二重量子フィルタ（Ｄｏｕｂｌｅ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｆｉｌｔｅｒｅｄ）−ＣＯＳＹ）およびＴＯＣＳＹを、ＴＰＰＩ（時間比例相増加（Ｔｉｍｅ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｐｈａｓｅ  Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ））を使用して相敏感モードで測定し、シフトした平方正弦ベル関数（ｓｈｉｆｔｅｄ  ｓｑｕａｒｅ  ｓｉｎｅ−  ｂｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を、フーリエ変換の前に適用した。各ＦＩＤについて３２回および５１２回の走査を、それぞれ、ペンタサッカリドおよびデカサッカリドに使用した。
【００６０】
（キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を用いた組成分析：）
オリゴ糖の組成分析を、以前に記載されるように（Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎら，１９９９）、３０μＭサンプルの徹底的な酵素消化、続いて、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって完了した。簡潔には、１ｎｍｏｌのオリゴ糖に、２５ｍＭ  酢酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で、２００ｎＭのヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを添加した。反応を、３０℃で一晩進め、次いで、泳動緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／リン酸塩／１０μＭ硫酸デキストラン、ｐＨ２．５）を用いて逆極性でＣＥにより分析した。
【００６１】
（ＣＥデータおよびＮＭＲデータの、ＰＥＮフレームワークを使用する制約としての組み込み：）
ＰＥＮは、一連の、＋または−サインビットとしてウロン酸の二進法オン／オフ状態およびエピマー化として二糖構成ブロックの硫酸化パターンをコードする数値表記法である。これは、サイン付き１６進法符号化スキーム（ｓｉｇｎｅｄ  ｈｅｘａｄｅｃｉｍａｌ  ｃｏｄｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ）（Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎら，１９９９）をもたらす。ＰＥＮフレームワークは、本来、Ｕ−Ａ二糖構築ブロック（Ｄｉ）をコードするために開発されたが、このフレームワークを、ウロン酸単糖（Ｕ）を表すための基数（ｂａｓｅ）４コードおよびグルコサミン単糖（Ａ）を表すための基数８コードに数学的に分解した（図１）。ΔＵ−Ａ連結について、Ｇ／Ｉ位置において使用される＊は、ウロン酸のエピマー状態が未確認であることを示すことに注意のこと。Ａ−Ｕ連結を示すサイン付き１６進法コードが、本来のＰＥＮフレームワークから、Ａをコードする３つの二進法ディジットおよびＵをコードする２つの二進法ディジットの再配列（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を含むことに注意することもまた重要である。再配列の結果として、＋および−サインは、ウロン酸のエピマー状態の代わりに、グルコサミンの６−Ｏ硫酸化（ここで＋は、硫酸化されていないことを示し、−は、硫酸化されていることを示す）を表すために使用される。なぜなら、６−Ｏ硫酸化は、Ａ−Ｕ二糖コードの最も左の位置にあるからである。従って、Ａ−Ｕ二糖を表すために追加された「余分の」二進法ディジットはなく、本発明者らは、サイン付きの基数１６１６進法コードをなお使用する。さらに、ＰＥＮフレームワークもまた、ウロン酸のエピマーおよび硫酸化状態をコードする２ビットで、グルコサミンの硫酸化状態をコードする３ビットを移項することにより、Ａ−Ｕ二糖単位（Ｄｉ’）をコードするために使用した（表１）。ＮＭＲデータおよびＣＥデータから得た情報を、Ａに示す。列１〜３は、グルコサミン残基の間の連結の数を示す（灰色で着色）。列４のウロン酸は、ＮＭＲデータから得た。列５〜７は、ＣＥデータから得た、ウロン酸とグルコサミンとの間の連結を示す。単糖組成を満足する配列およびＡ−Ｕ連結情報（Ｄｉ’）を、Ｂに示す。ＣＥデータからのＵ−Ａ連結の適用は、ＬＮＭＲを最後の正しい配列にする。
【００６２】
【表１】
0004657726.tif 000002
【００６３】
0004657726.tif 000003
【００６４】
２Ｄ  ＣＯＳＹを伴う１−ＤプロトンＮＭＲスペクトル、ＨＳＱＣ（異種核単一量子コヒーレンス）およびＴＯＣＳＹスペクトルは、構成単糖の大部分の環プロトンの化学シフトおよびカップリング定数についてのデータを提供する。このデータは、単糖（ＵｉおよびＡｉ）を特有に同定し、配列の所定の長さに対する単糖の数を得るために使用される。グルコサミン単糖の正体に加えて、それらの特徴的なアノマー化学シフトを、隣接するウロン酸へのそれらの連結（Ｄｉ’二糖を規定するＡｉ−Ｕｉ連結）を同定するためにさらに分解した。Ｕｉ、ＡｉおよびＤｉ’情報を使用して、このデータ（ＬＮＭＲ）を満足するあり得る配列全てのリストを構築した。ＬＮＭＲにおける配列は、一般に存在する配列に何ら偏ることなく、包括的なサンプル空間を表す。
【００６５】
ＣＥを使用する二糖組成分析は、ΔＵ−Ａ二糖の硫酸化パターンについての正確な情報を提供し、従って、Ｕ−Ａ連結（±Ｄｉ）の全てを同定し、この連結のサインビットは、Δ４〜５不飽和結合に起因して既知でない。ＣＥデータから得た二糖連結±Ｄｉを組み込むことは、ＬＮＭＲから大部分の配列を排除して、単一の配列に収束させる。
【００６６】
（結果）
（実施例１：五糖類Ｐ１）
単糖類のアノマープロトンのいくつかの特徴的な化学シフトが、五糖類の１ＤプロトンＮＭＲスペクトルにおいて観察された（図２Ａ）。１Ｄプロトンシグナルを、２Ｄ  ＣＯＳＹスペクトルおよびＴＯＣＳＹスペクトルと共に使用して、単糖類を帰属した。５．６４８ｐｐｍ、５．４３８ｐｐｍおよび５．０４１ｐｐｍにおけるシグナルパターンを、Ｎ−硫酸化グルコサミン（ＡＮＳ，６Ｘ）のアノマープロトンに帰属した。さらに、これらの全てのグルコサミンの６−Ｏ硫酸化を、ＴＯＣＳＹによって確認した。３．４３／５７．５ｐｐｍにおけるシグナルは、還元末端に結合したＯ−メチル基の存在を示す。さらに、還元末端におけるメチル基の存在もまた、代表的な還元末端の炭素の化学シフト（９２〜９３ｐｐｍ）の非存在を説明する。５．２５１および４．６３５における化学シフトは、それぞれＩ２ＳおよびＧと一致する。５．６４８および５．４３８におけるアノマープロトンのシグナルは、それぞれＡＮＳ，６Ｓ−Ｉ２ＳおよびＡＮＳ，６Ｓ−Ｇから生じるとして、さらに区別される。
【００６７】
これらのピークの積分（Ｇｕｅｒｒｉｎｉら、２００１）は、グルコサミンの相対モル存在比を、ＡＮＳ，６Ｓ−Ｉ２Ｓ：ＡＮＳ，６Ｓ−Ｇ：ＡＮＳ，６Ｓ＝１：１：１として、およびウロン酸の相対モル存在比を、Ｉ２Ｓ：Ｇ＝１：１として与えた。従って、１Ｄ  ＮＭＲデータおよび２Ｄ  ＮＭＲデータから、この配列を含む単糖類の同一性Ａｉ＝［５８；５８；５８（ＡＮＳ，６Ｓ）］、Ｕｉ＝［１４（Ｉ２Ｓ）：２４（Ｇ）］、および相対存在比（ｍ５＝３、ｎ
１＝ｎ２＝１）を決定した。さらに、結合Ｄｉ’＝［−５１６（ＡＮＳ，６Ｓ−Ｉ２Ｓ）；−６１６（ＡＮＳ，６Ｓ−Ｇ）］もまた、ＮＭＲデータから得られた。ＮＭＲデータからのこの情報に基づいて、２つの可能な（ＬＮＭＲ）五糖類配列が存在し得る：５８  １４  ５８  ２４  ５８（ＡＮＳ，６Ｓ−Ｉ２Ｓ−ＡＮＳ，６Ｓ−Ｇ−ＡＮＳ，６Ｓ，ＯＭｅ）および５８  ２４  ５８  １４  ５８（ＡＮＳ，６Ｓ−Ｇ−ＡＮＳ，６Ｓ−Ｉ２Ｓ−ＡＮＳ，６Ｓ，ＯＭｅ）。
【００６８】
五糖類のヘパリナーゼでの完全な消化によって形成されるフラグメントのキャピラリー電気泳動は、三硫酸化ΔＵ２ＳＡＮＳ，６Ｓおよび二硫酸化二糖類ΔＵＡＮＳ，６Ｓに対応する２つのピークを生じ、±Ｄｉ＝［±Ｄ１６；±５１６］を規定した。これらの２つの二糖類の相対モル存在比を、ＣＥシグナルの積分および内部較正を使用するピーク面積の標準化によって、１：１と計算した。±Ｄ１６二糖類の移動時間は、標準とわずかに異なった。このことは、メチル化グルコサミンが、三硫化±Ｄ１６二糖類の一部であることを示す。従って、ＣＥからのデータは、メチル化された還元末端二糖類の硫酸化状態を決定する。ＣＥデータからの制約を組み込むことによって、ＬＮＭＲから配列の１つを排除し、これによって、５８  ２４  ５８  １４  ５８（ＡＮＳ，６Ｓ−Ｇ−ＡＮＳ，６Ｓ−Ｉ２Ｓ−ＡＮＳ，６Ｓ，ＯＭｅ）に収束させた。
【００６９】
（実施例２：五糖類（Ｐ２））
１Ｄプロトンスペクトル（図２Ｂ）から、シグナルパターン（５．６４／９９．６ｐｐｍ、５．５０／９８．１ｐｐｍにおけるアノマーピーク）は、Ｎ−硫酸化，６−Ｏ−硫酸化グルコサミン（ＡＮＳ，６Ｓ）および余分の３−Ｏスルフェート基を有するＡ＊と一致する。実施例１と同様に、３．４３／５７．５ｐｐｍにおけるシグナルパターンは、メチル化された還元末端を有するグルコサミンに対応する。また、５．６４ｐｐｍにおけるアノマー化学シフトは、実施例１に示されるように、Ｇに結合したＡＮＳ，６Ｓから生じる。５．２０／１０１．７ｐｐｍおよび４．７８／７２．４ｐｐｍにおけるシグナルは、Ｉ２Ｓ残基のＨ１およびＨ５と一致し、そして４．６／１０３．３ｐｐｍにおけるアノマーシグナルは、Ｇと一致する（ＭｕｌｌｏｙおよびＪｏｈｎｓｏｎ，１９８７；Ｙａｔｅｓら、１９９６）。従って、Ｕｉ＝［１４（Ｉ２Ｓ）；２４（Ｇ）］およびＡｉ＝［５８；５８（ＡＮＳ，６Ｓ）；７８（Ａ＊）］である。この場合において、本発明者らは、Ｄｉ’の２つの要素のうちの一方のみを、［−６１６（ＡＮＳ，６Ｓ−Ｇ）］と規定した。ＮＭＲデータからの妨害を制約として組み込むことによって、本発明者らは、ＬＮＭＲ＝２の配列を得た：５８  ２４  ７８  １４  ５８（ＡＮＳ，６Ｓ−Ｇ−Ａ＊−Ｉ２Ｓ−ＡＮＳ，６Ｓ，ＯＭｅ）および７８  １４  ５８  ２４  ５８（Ａ＊−Ｉ２Ｓ−ＡＮＳ，６Ｓ−Ｇ−ＡＮＳ，６Ｓ，ＯＭｅ）。
【００７０】
ＣＥを使用する二糖類組成分析は、シフトした移動時間を有する三硫酸化二糖類に対応する単一のピークを生じた。このことは、メチル化グルコサミンの存在を示す（±Ｄｉ＝［±Ｄ１６］）。ＣＥからのデータを使用して、ＬＮＭＲからの配列の１つを排除して、正しい配列５８  ２４  ７８  １４  ５８（ＡＮＳ，６Ｓ−Ｇ−Ａ＊−Ｉ２Ｓ−ＡＮＳ，６Ｓ，ＯＭｅ）を得た。この配列は、ＡＮＳ，６Ｓ−Ｇ結合が、３−Ｏ硫酸化Ａ＊の存在に起因して、ヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩおよびヘパリナーゼＩＩＩによる切断に対して耐性であるという概念と一致する（Ｓｈｒｉｖｅｒ，Ｚら、２０００）。従って、単一の二糖類のみが、ＣＥを使用して観察された。
【００７１】
（実施例３：十糖類（Ｈ１０））
最初の２つの合成五糖類の例は、本発明者らのアプローチの方法論を明らかに概説するが、この方法は、より長く、より複雑なヘパリン由来のオリゴ糖類（Ｈ１０）によって、よりよく説明される。この配列は、現在、ヘパリン由来のオリゴ糖類配列のうちで、これまでの最も複雑なものである。大きな努力が、Ｈ１０の単離および配列決定につぎ込まれたことを指摘することが、重要である（Ｔｏｉｄａら、１９９６）。その複雑さに起因して、過去において、その構造決定における不正確さが存在し、そしてほんの最近、分析ツールの組み合わせを使用して、この配列が確立された（Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎら、１９９９；Ｓｈｒｉｖｅｒら、２０００）。ＮＭＲ分光法が、過去において、その配列を確証するために使用された（Ｓｈｒｉｖｅｒら、２０００）が、単糖類の組成のみが確立され、そして決定された配列に基づくＮＭＲデータの解析に、偏りが存在した。これらの例を使用して、本発明者らは、複雑なヘパリン由来のオリゴ糖類の構造の、偏りのない帰属を提供する際の本発明者らのアプローチの融通性を強調する。
【００７２】
Ｈ１０のプロトンスペクトルのシグナルラインの広がり（図３Ａ）は、常磁性のイオンと負に帯電した基との複合体形成によって起きる。ＥＤＴＡの添加によって、これらの常磁性イオンが除去されることにより、より良い解像度のスペクトル（図３Ｂ）が提供される（Ｎｅｖｉｌｌｅら，１９８９）。
【００７３】
アノマー性シグナル（図３Ｃ）およびそのそれぞれのプロトンパターン（表２）の帰属は、ＣＯＳＹ実験およびＴＯＣＳＹ実験によって実行した。
【００７４】
（表２：Ｈ１０サンプルの構成単糖の１Ｈ化学シフト）
化学シフトは、標準としてのプロピオン酸トリメチルシリル（ＴＳＰ）よりも下のｐｐｍとして与える。
【００７５】
【表２】
0004657726.tif 000004
【００７６】
ａ−２つの単糖残基
ｂ−非還元性ΔＵユニットによる後のＡＮＳ，６Ｓ残基のＨ４化学シフト。
【００７７】
４．２ｐｐｍと４．４ｐｐｍとの間で検出されるシグナルは、６−Ｏ硫酸化グルコサミン由来のＨ−６プロトンに一致する。しかし、この化学シフトは、スペクトルの混み合った領域にあるので、かつサンプル中の微量な不純物の存在に起因して、６−Ｏ硫酸基を含むグルコサミンのモル存在量を正確に決定することは、可能ではなかった。しかし、ＣＥを使用したＨ１０の二糖組成分析は、３：１：１の比で、３つの主要な二糖成分（ΔＵ−ＡＮＳ，６Ｓ、ΔＵ−ＡＮｃ，６Ｓ、ΔＵ−Ａ＊）の存在を示した（それぞれ，±Ｄｉ＝［±Ｄ；±４；±７］を与えた）。従って、ＣＥからのデータは、すべてのグルコサミンの６−Ｏ硫酸化を定めた。
【００７８】
シグナル積分によって計算したグルコサミン単糖の相対存在量は、５８（ＡＮＳ，６Ｓ）：７８（Ａ＊）：４８（ＡＮｃ，６Ｓ）＝３：１：１であり、従って、Ａｉ＝［５８；５８；５８；７８；４８］であった。５．２０ｐｐｍおよび５．０１９ｐｐｍでの２つのαアノマー性シグナルは、化学シフトパターンによって実証されるように、それぞれ２−Ｏ硫酸化イズロン酸および非硫酸化イズロン酸から生じる。このスペクトルの唯一のβプロトンシグナル（４．６６９ｐｐｍ）は、グルクロン酸残基に属する。６ｐｐｍおよび５．５２１ｐｐｍでのプロトンは、ΔＵ残基のＨ４およびＨ１に属する。４．６３５ｐｐｍのＨ２は、不飽和ウロン酸残基が、２−Ｏ硫酸化されていることを示す。Ｉ２Ｓ：Ｉ：Ｇ：ΔＵ２Ｓとして計算したウロン酸単糖の相対存在量は、それぞれ２：１：１：１の比で同定され、それによって、Ｕｉ＝［１４；１４；０４；２４；（＊１）４］を規定した（ここで、このビットは、規定されていないので、＊は、ΔＵを表す）。
【００７９】
５．３６９ｐｐｍのシグナルの化学シフトは、Ｉと結合したＡＮＳ，６Ｓと一致する。ＡＮＡｃ，６Ｓの１Ｈアノマー性化学シフトは、ＡＮＡｃ，６Ｓ−Ｉ（５．１４〜５．１８ｐｐｍ）結合およびＡＮＡｃ，６Ｓ−Ｇ（５．３０〜５．３６ｐｐｍ）結合とは異なっている（Ｃｏｈｅｎ，１９９９；Ｃｈｕａｎｇら，２００１）。５．３６８ｐｐｍのアノマー性プロトンは、配列中でのＡＮＡｃ，６Ｘ−Ｇ結合の存在を確認する。５．４２での化学シフトは、ＡＮＳ，６Ｓと結合したＡＮＳ，６Ｓおよび還元末端のＩ２Ｓの両方と一致する。ΔＵ残基は、ＡＮＳ，６Ｓユニットと結合しており、第２のＡＮＳ，６Ｓは、Ｉと結合しているので、還元末端について２つの可能性が残る。一方は、ＡＮＳ，６Ｓを有する還元末端、他方は、Ａ＊を有する還元末端である。しかし、Ａ＊に関する化学シフトパターン（Ｈ１，５．４６４ｐｐｍ；Ｈ２，３，４８０ｐｐｍ；Ｈ３，４．５６４ｐｐｍ，Ｈ４，４．０４１ｐｐｍ）は、還元末端にこの残基を有するヘパリンテトラサッカリドについて、Ｙａｍａｄａら（１９９３）によって見出されたものと同じである（Ｙａｍａｄａらの論文中の化学シフトは、本発明者らの値に対して、組織的に約−０．０３ｐｐｍシフトしている）。従って、Ａ＊のシグナルパターンは、還元末端でのその位置に一致する。これらのシグナルの相対存在量に基づいて、Ｄｉ’のすべての要素を、［−５１６；−５１６；−４１６；−２１６］として規定した。ＰＥＮフレームワークＬＮＭＲ＝１２配列を使用して、Ａｉ、ＵｉおよびＤｉ’を約数へと変換した（表１）。
【００８０】
±Ｄｉに対応する二糖結合を含まないＬＮＭＲから配列を取り除くことによって、１つの配列ＤＤＤ４−７が生じた。この配列は、以前に得られたＨ１０配列に一致する（Ｓｈｒｉｖｅｒら，２００１）。
【００８１】
これまでに記載した明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするために十分であると考えられる。実施例は、本発明の１つの局面の一例示として意図され、他の機能的に等価な実施形態は、本発明の範囲内であるので、本発明は、提供した実施例によってその範囲が制限されるべきではない。本明細書において示したものおよび記載したものに加えて、本発明の種々の改変が、これまでの記載から当業者に明らかとなり、添付した特許請求の範囲の範囲内にある。本発明の利点および目的は、必ずしも、本発明の各実施形態によって包含されるわけではない。
【００８２】
本出願に引用されるすべての参考文献、特許および特許公開が、本明細書に参考として援用される。
【００８３】
【化１】
0004657726.tif 000005
【００８４】
【化２】
0004657726.tif 000006
【００８５】
【化３】
0004657726.tif 000007
【００８６】
【化４】
0004657726.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、硫酸化の位置がＸとして示されるヘパリンおよびヘパラン硫酸多糖（左）の二糖類構築ブロックの説明である（Ｙ位置は、硫酸化され得るかアセチル化され得る）（Ａ）。ＰＥＮフレームワークにおける二糖類繰返し単位を表す１６進コード（中央）は、本発明者らの以前の研究（Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎら，１９９９）に記載した。ウロン酸についての基数４コードおよびグルコサミンについての基数８（８進）コードに対する二糖類１６進コードの分解は、（ｉ）ウロン酸について基数４コード、（ｉｉ）グルコサミンについての８進コード、（ｉｉｉ）Ａ−Ｕ結合についてサインされた１６進コードならびに（ｉｖ）本研究で使用されるオリゴ糖で観察されたΔＵ−Ａ結合（Ｂ）に示す。
【図２】図２は、（Ａ）合成五糖類Ｐ１のｌＨ  ５００ＭＨｚスペクトル、（Ｂ）合成五糖類Ｐ２のｌＨ  ５００ＭＨｚスペクトルを示す。従って、構成する単糖の特徴的なプロトン化学シフトをマークする。
【図３】図３は、Ｈ１０十糖類のｌＨ  ５００ＭＨｚスペクトルを例示する（Ａ）。線の広がりは、常磁性不純物の存在のためである；重水素化ＥＤＴＡの添加は、より良い分解スペクトルを提供する（Ｂ）。信号指定を用いたアノマー領域の拡大を（Ｃ）に示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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