(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法であって、
−一連の励起光によって測定容量中の蛍光粒子を励起して蛍光を放射するステップ、
−検出手段を用いて、光子カウントのシーケンスを検出することによって、放射された蛍光をモニターするステップ、
−所定幅のカウント時間区間における光子カウント数を決定するステップ、
−前記カウント時間区間において、前記励起パルスに対する光子カウントの検出遅延時間を決定するステップ、
−前記検出遅延時間の関数を決定するステップ、
−少なくとも２つの独立変数の確率関数
【数１】
0004776854.tif 000040
を実験的に決定するステップ、
ここで、１つの独立変数（ｎ）は、前記光子カウント数であり、別の独立変数（ｔ）は、前記検出遅延時間の関数である、
−前記実験的に決定された確率関数を、該実験的に決定された確率関数に対応し、少なくとも２つの独立変数の関数を用いて決定される理論的な確率関数Ｐ（ｎ，ｔ，．．．）によってフィッティングして、少なくとも粒子の比明度と粒子の蛍光寿命とを求めることにより粒子の分布を決定するステップ、
ここで、前記理論的な確率関数Ｐ（ｎ，ｔ，．．．）は、その生成関数
【数２】
0004776854.tif 000041
によって計算される、蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法。
【請求項２】
前記検出遅延時間の関数が、同じカウント時間区間において検出される光子カウントの検出遅延時間の次数に関して不変である、請求項１に記載の蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法。
【請求項３】
対応する励起パルスに対する光子カウントの検出時間が、前記検出遅延時間と線形関係を有する整数によって表される、請求項１又は２に記載の蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法。
【請求項４】
前記検出遅延時間の関数が、前記整数の合計又は平均である、請求項３に記載の蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法。
【請求項５】
前記実験的に決定された確率関数の独立変数がｎ、ｔの２つである場合、前記粒子の分布は、前記実験的に決定された確率関数に対応する理論的な確率関数Ｐ(ｎ，ｔ)の生成関数
【数３】
0004776854.tif 000042
によって計算され、前記理論的な確率関数Ｐ（ｎ，ｔ）によって前記実験的に決定された確率関数をフィッティングして、決定される、請求項１〜４のいずれかに記載の蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法。
【請求項６】
前記理論的な確率関数の計算において、光学的な空間明度関数Ｂ（ｒ）は、容量要素ｄＶとの関係によって明らかになる、請求項１〜５のいずれかに記載の蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法。
【請求項７】
前記空間明度関数Ｂ（ｒ）を用いてｕ＝ｌｎ（Ｂ（０）／Ｂ（ｒ））によって表される変数ｕと容量要素ｄＶとの間の関係が、
【数４】
0004776854.tif 000043
である。ここで、Ｂ（０）は最大明度であり、Ａ０、ａ１、ａ２及びａ３は、前記空間明度関数Ｂ（ｒ）の経験的パラメーターである、請求項６に記載の蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法。
【請求項８】
前記理論的な確率関数の計算において、実験から決定される、実験装置の時間応答関数を考慮する、請求項１〜７のいずれかに記載の蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法。
【請求項９】
異なる理論的な確率関数の一組を決定する、
ここで、各確率関数は、互いに異なる幅のカウント時間区間において決定される光子カウント数に依存する、請求項１〜８のいずれかに記載の蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法。
【請求項１０】
前記カウント時間区間が連続している、請求項１〜９のいずれかに記載の蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法。
【請求項１１】
前記カウント時間区間が重なり合っている、請求項１〜９にいずれかに記載の蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法。
【請求項１２】
拡散係数が、前記粒子の分布を決定するステップにおいて用いる関数のさらに別の独立変数である、請求項１〜１１のいずれかに記載の蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法。
【請求項１３】
測定容量当たりの粒子の濃度が、約１粒子以下に設定される、請求項１〜１２のいずれかに記載の蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法。
【請求項１４】
１つ、２つ又はそれ以上のアバランシェフォトダイオード又は光電子増倍管のいずれかの光子検出器が、前記検出手段として使用される、請求項１〜１３のいずれかに記載の蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法。
【請求項１５】
少なくとも２つの光子検出器が、異なる波長又は偏光の蛍光をモニターする前記検出手段として使用される、請求項１〜１３のいずれかに記載の蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法。
【請求項１６】
前記蛍光粒子が、ホモジニアスな蛍光アッセイに適用される、請求項１〜１５のいずれかに記載の蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法。
【請求項１７】
ハイスループット薬剤スクリーニング、分子の性質の最適化及び特異的な細胞群の同定に使用するための、請求項１〜１６のいずれかに記載の蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法。
【請求項１８】
前記生成関数は、ｉを蛍光種のインデックスとして、見掛けの濃度をｃｉ、粒子の比明度をｑｉ、容量要素をｄＶ、１個の光子の積算遅延時間の確率分布の生成関数をＧｉ（η｜１）、空間明度関数をＢ（ｒ）、前記カウント時間区間をＴとするとき、
【数５】
0004776854.tif 000044
で表される、請求項５に記載の蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法。
【請求項１９】
前記粒子の分布を決定するステップは、前記フィッティングを、Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムを用いて行う、請求項１〜１８のいずれかに記載の蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法及び前記方法の適用に関する。
【０００２】
蛍光の利用は、様々な科学的適用において、高い感度を示すため、過去数十年の間に急速に進歩している。器械工学（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、データ分析、プローブ及び使用における新たな開発の結果、約１５０年前に発見された現象に基づく技術は、高い評価を得た（ストークス（Ｓｔｏｋｅｓ）、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄ． １４２， ４６３−５６２， １８５２）。物理化学、生物学及び医学（ｍｅｄｉｃｉｎｅ）における多数の適用において、蛍光は、希薄溶液中の化学的結合反応の高感度検出手段として使用される。薬剤スクリーニング及び薬学的アッセイの開発は、この種の適用分野の例である。
【０００３】
全体の強度又は異方性のような顕微鏡でしか判別できない蛍光特性における変化の検出に基づく古典的な方法のほかに、ここ１０年の間に、単一分子に特有な性質に基づいて種を区別する、多数の異なる変動法（ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ）が開発された。単一分子の感度を用いる最も複雑な蛍光技術の１つは、まず第一に、異なる並進拡散係数に基づき、異なる種を区別し得る蛍光相関顕微鏡法（ＦＣＳ）である（マグデ（Ｍａｇｄｅ）ら，Ｐｈｙｓ． Ｒｅｖ． Ｌｅｔｔ．２９， ７０４−７０８， １９７２；エルソン（Ｅｌｓｏｎ）ら， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ １３， １−２７， １９７４；リグラー（Ｒｉｇｌｅｒ）ら， Ｅｕｒ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ． ２２， １６９−１７５， １９９３）。最近、異なる蛍光種を、それらの比明度によって識別する蛍光強度分布分析（ＦＩＤＡ）が、この蛍光変動法と同等なものであることが見出された（カスク（Ｋａｓｋ）ら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６，１３７５６−１３７６１， １９９９）。“比明度”という語は一般に、試料中のある位置、通常は、明度プロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅ）変動の値が単一である位置に置かれた所定の種の粒子によって発せられる光からの、検出器の平均カウント（ｍｅａｎ ｃｏｕｎｔ ｒａｔｅ）を意味する。
【０００４】
単一の特異的物性に基づいて種を区別する、ＦＣＳやＦＩＤＡのような方法のほかに、蛍光の異なる偏光成分又は放射バンドをモニターする２つの検出器を用いる二次元法が開発されている。特に、蛍光相互相関（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）分析及び二次元蛍光強度分布分析（２Ｄ−ＦＩＤＡ）は、２つのタイプの比明度に基づき種を認識する方法である（カスク（Ｋａｓｋ）ら，Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ５５， ２１３−２２０， １９８９； シュウィル（ＳｃｈｗｉｌｌｅＩ）ら，Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ７２， １８７８−１８８６， １９９７；カスク（Ｋａｓｋ）ら，Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ７８， ２０００）。
【０００５】
ＦＣＳ、ＦＩＤＡ及び上記二次元法は、変動分光学の統計学的な方法であるのに対し、個々の分子を同定することを目的とする、別の幅広い分野の研究も行われている。多くの適用は、分子の直接的な環境のあらゆる変化に反応する固有の（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）分子の性質として、蛍光寿命を利用する。しかし、上記の変動法と違い、蛍光寿命分析（ＦＬＡ）は、基本的に顕微鏡的な技術であり、モニターされる試料容量における分子数変動を必要とせずに、異なる蛍光遅延（ｄｅｃａｙ）時間を識別することができる。従って、蛍光寿命の測定は、高試料濃度のキュベット（ｃｕｖｅｔｔｅｓ）において通常行われる。しかし、この手段の欠点は、遅延時間ヒストグラムを検出するために実験的に集められた励起光（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）が、区別するのが困難な異なる種からの寄与を受けることである。また、ＦＬＡは、低い耐久性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）しかもたず、わずかに誤った仮定により、大きく誤った結果がもたらされる。
【０００６】
それに対し、寿命実験も、非常に低い平均粒子数に適用されている。古典的なＦＬＡと対比されるこのアプローチは、バースト積算（ｂｕｒｓｔ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）蛍光寿命分析（ＢＩＦＬ）として紹介された（ケラー（Ｋｅｌｌｅｒ）ら，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ５０， １２Ａ−３２Ａ， １９９６）。ＢＩＦＬは、ある閾値強度以上の単一分子からの蛍光バースト（ｂｕｒｓｔｓ）を調べる。その欠点は、測定容量当たりの濃度が１粒子よりもはるかに低いときにしか適用できないため、比較的長いデータ収集時間を必要とすることである。
【０００７】
蛍光寿命実験が、時間相関単一光子カウント（ｔｉｍｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｓｉｎｇｌｅ ｐｈｏｔｏｎ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）（ＴＣＳＰＣ）とともに時間領域において行われる場合、単一光子の遅延時間ｔを検出するための励起は、ヒストグラムにまとめて記録される。蛍光寿命を得るために、理論分布Ｐ（ｔ）を、これらの実験データに対してフィッティングさせる（ｆｉｔｔｅｄ）。通常、Ｐ（ｔ）は、それぞれの機械応答関数（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）（ＩＲＦ）に関連する単一又は多数の指数遅延関数（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｄｅｃａｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）によって示される。この種の分析により、試料の構成物質の特徴付けが、それらの個々の寿命τによって行われ得るのに対し、それらの濃度ｃ、及び比明度ｑの決定はできず、その積ｑｃのみが決定され得る。
【０００８】
従って、本発明の目的は、個々の粒子の特徴付けを、それらの蛍光粒子に基づいて行い得る、高い精度及び耐久性を有する方法を提供することである。
【０００９】
本発明によれば、以下の段階を含む、蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法が提供される。まず最初に、測定容量中の粒子が、一連の励起パルスによって励起され、放射された蛍光が、光子カウントのシーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を検出することによってモニターされる。この目的のために、共焦点エピイルミネーテッド（ｅｐｉ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｄ）顕微鏡が、高反復速度（例えば１００ＭＨｚ）のレーザーパルス励起光と組み合わせて使用されることが好ましい。所定幅のカウント時間区間における光子カウント数、並びに対応する励起パルスに対する光子カウントの検出遅延時間が決定される。以下に詳述するように、前記検出遅延時間の関数が得られ、次の段階として、少なくとも２つの独立変数（ａｒｇｕｍｅｎｔｓ）の確率関数
【数１】
0004776854.tif 000002
が決定される。式中、１つの独立変数は、光子カウント数であり、別の独立変数は、検出遅延時間の前記関数である。その後、前記確率関数
【数２】
0004776854.tif 000003
に基づき、少なくとも２つの独立変数の関数として、粒子の分布が決定される。式中、一つの独立変数は粒子の比明度（またはその測度（ｍｅａｓｕｒｅ））であり、別の独立変数は、粒子の蛍光寿命（又はその測度）である。蛍光強度及び寿命分布分析（ＦＩＬＤＡ）と呼ばれる本発明による方法は、完全な濃度、即ち、従来のＦＬＡでは直接得られない量を決定することができる。本発明によるこのような相関法において使用される場合、組み合わされた情報（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により、ＦＩＤＡ及び蛍光寿命分析のみと比較して、大幅に向上した精度が得られる。ある閾値強度以上の単一分子からの蛍光バーストを調べるＢＩＦＬと比較して、ＦＩＬＤＡは、好ましくは、全てのデータの連続（ｗｈｏｌｅ ｄａｔａ ｓｔｒｅａｍ）の相対的な変動を分析するので、異なる分子からの同時光子放射の可能性を明らかにする。従って、本発明は、ＢＩＦＬよりも、はるかに高濃度において使用することもできる。
【００１０】
以下に、基本的な理論並びに好ましい態様を詳述し、シミュレーションされた実験的データへ適用する。異なる種の区別における顕著な能力が、カルモデュリン（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）のペプチドリガンドへの結合の定量化によって示され、生命科学における幅広い利用可能性が約束される。
【００１１】
先に略述したように、本発明は、少なくとも二次元の方法に基づき、試料中の異なる蛍光粒子種が、比明度並びに寿命値によって、お互いに区別される。しかし、いくつかの場合には、異なる色又は偏光の蛍光をモニターする２つの異なる光子検出器に関して、更なる粒子の性質、例えばそれらの拡散係数又は明度を考慮することが有利なこともある。これらの場合には、本発明の方法は、二次元だけよりもさらに高次元であり、確率関数の式中で点によって示される。しかし、分かりやすくするために、以下の説明のほとんどが、二次元の場合において詳述される。
【００１２】
本発明により、試料の異なる種を、それらの寿命τ、明度値ｑによって識別し、並びにそれらの完全な濃度ｃを決定するのに適した方法が開発された。重要な点（ｋｅｙ）は、理論的に表された予想される分布Ｐ（ｎ，ｔ）を適用し、検出された光子カウント数ｎ、及び積算遅延時間ｔの測定された二次元ＦＩＬＤＡ分布
【数８】
0004776854.tif 000004
を分析することである。以下に、測定された二次元ＦＩＬＤＡ分布をフィッティングし得る、迅速かつ効率的なアルゴリズムが得られる、ＦＩＤＡの理論の拡張（カスク（Ｋａｓｋ）ら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６， １３７５６−１３７６１， １９９９）を示す。生成関数の表現を用いて、問題は、まず単一種のものに低減される。単一種の場合、Ｐ（ｎ，ｔ）は、光子カウント数分布Ｐ（ｎ）及び光子カウントｎにおける積算遅延時間Ｐ（ｔ｜ｎ）という、２つの因子の積として表される。Ｐ（ｎ）は、ＦＩＤＡの理論によって算出され、Ｐ（ｔ｜ｎ＝１）＝Ｐ（ｔ）は、ＦＬＡの理論によって算出されるので、Ｐ（ｔ｜１）からＰ（ｔ｜ｎ）を算出することだけが更に必要である。
【００１３】
本発明によるＦＩＬＤＡ理論の主な好ましい構成部は、生成関数の概念である。確率分布Ｐ（ｎ，ｔ）の生成関数は、
【数９】
0004776854.tif 000005
と定義される。
【００１４】
各光子の検出遅延時間ｔは、不連続の（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）区間において表される。この定義において、生成関数の独立関数ξ及びηを、ｅｉφの形で選択することが都合がよい。この選択のため、Ｇ（ξ，η）及びＰ（ｎ，ｔ）は、迅速なアルゴリズムによって算出され得る二次元フーリエ変換によって相互に関係付けられる（ブリハム（Ｂｒｉｇｈａｍ）， Ｔｈｅ Ｆａｓｔ Ｆｏｕｒｉｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ， プレンティス−ホール（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ）， エングウッド・クリフス（Ｅｎｇｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ）， ＮＪ， １９７４）。
【００１５】
Ｐ（ｎ，ｔ）及びＧ（ξ，η）に含まれる寄与がどの程度異なるかを比較すると、生成関数を表すことが都合がよい理由が、明らかになる。例えば、別々に分布Ｐ１（ｎ，ｔ）及びＰ２（ｎ，ｔ）をもたらし得る２つの独立した蛍光種を有するならば、得られる分布は、
【数１０】
0004776854.tif 000006
というたたみ込み（ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）として表されるのに対し、生成関数の表現では、この関係は、
【数１１】
0004776854.tif 000007
という簡単な積として表される。
【００１６】
たたみ込みの計算は、非常に時間がかかるが、積の計算は、迅速かつ簡単である。更に、２より多い種に対する式３の一般化は、簡単である。式３は、積によるこの説明を、数種の成分の場合に簡単に拡張するので、単一種の理論的な説明の知識で、既に十分である。従って、以下において、単一種の場合について考察する。
【００１７】
各光子の検出遅延時間の確率分布は、あらかじめ放出又は検出された光子の数や光子を放出する分子の座標のいずれにも依存しない、所定の種を特徴付ける関数として考察され得る。これは、Ｐ（ｎ，ｔ）が
Ｐ（ｎ，ｔ）＝Ｐ（ｎ）Ｐ（ｔ｜ｎ）， （４）
として得られ得ることを意味する。ここで、Ｐ（ｔ｜ｎ）は、ｎ個の光子の積算検出遅延時間の確率分布であり、Ｐ（ｎ）は、所定のカウント時間区間内にｎ個の光子を検出するための確率関数である。Ｐ（ｔ｜ｎ）は、ｎ回のたたみ込みによってＰ（ｔ｜１）から計算されるので、Ｐ（ｔ｜ｎ）の一次元生成関数は、Ｐ（ｔ｜１）の生成関数のｎ乗である：
【数３】
0004776854.tif 000008
【００１８】
式４及び式５を式１に置換すると、以下の式が得られる：
【数１３】
0004776854.tif 000009
【００１９】
式６によれば、所定のη値に対応するＧ（ξ，η）−マトリックスの各カラムは、関数Ｐ（ｎ）［Ｇ（η｜１）］ｎの一次元フーリエ変換であり、一方、式７によれば、Ｇ（ξ，η）−マトリックスの各成分は、ξＧ（η｜１）点におけるＰ（ｎ）のフーリエイメージとして表され得る。
【００２０】
Ｇ（η｜１）は、特別な種から生じる光子の予想される検出遅延時間分布Ｐ（ｔ｜１）の生成関数（ここでは、一次元フーリエ変換）である。関数Ｐ（ｔ｜１）は、ＩＲＦ及び所定の種を特徴付ける遅延時間との指数関数の周期的なたたみ込みである。
【００２１】
どのようにＰ（ｎ）を算出するかという問題は、カスク（Ｋａｓｋ）らによって説明されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６， １３７５６−１３７６１， １９９９； この内容は、本明細書に開示として援用される）。Ｐ（ｎ）は、その生成関数によって（ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｅｌｐ ｏｆ）算出され、単一種の場合には、
【数４】
0004776854.tif 000010
として表される。ここで、Ｂ（ｒ）は、空間（ｓｐａｔｉａｌ）明度関数であり、ｑは、見掛けの（ａｐｐａｒｅｎｔ）比明度であり、Ｔは、カウント時間区間の幅であり、ｃは、見掛けの濃度であり、ｄＶは、容量要素である。式８の右辺の積分は、数値的に（ｎｕｍｅｒｉｃａｌｌｙ）算出され得る。空間明度と対応する容量要素との関係（式８の右辺の計算に必要とされる）は、好ましくは、３つの補正パラメーター、ａ１、ａ２、及びａ３の経験から得られた式によって表される。
【数５】
0004776854.tif 000011
ここで、ｕ＝ｌｎ［Ｂ（０）／Ｂ（ｒ）］であり、Ａ０は、容量の単位を選ぶために使用される係数である。但し、空間明度Ｂ及び容量要素ｄＶの関係は、
【数６】
0004776854.tif 000012
によっても表され得る。真の濃度と見掛けの濃度との関係及び真の比明度と見掛けの比明度との関係は、ＦＩＭＤＡの理論において得られる（パロ（Ｐａｌｏ）ら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ． ７９， ２８５８−２８６６， ２０００： この内容は、本明細書に開示として援用される）。
【００２２】
以下に、ｃａｐｐ及びｑａｐｐがどの程度Ｔに依存するかを予想する理論を示す。単一種の場合を研究し、式３に対応する分布の第一及び第二階乗キュムラントを算出する。階乗キュムラントは、
【数１７】
0004776854.tif 000013
として定義され、
【数１８】
0004776854.tif 000014
が得られる。ここで、一般化条件
【数１９】
0004776854.tif 000015
が使用される。（注；式９ｂ及び９ｃは、キアン（Ｑｉａｎ）及びエルソン（Ｅｌｓｏｎ）の式と完全に一致する（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ． ５７： ３７５３８０， １９９０）。式９ｂから、
【数２０】
0004776854.tif 000016
という結論が得られる。ここで、
【数２１】
0004776854.tif 000017
は、平均カウントであり、Ｔの選択に依存しない。カウント数分布Ｐ（ｎ；Ｔ）の第二キュムラント及び蛍光強度の自己相関関数
【数２２】
0004776854.tif 000018
との以下の関係
【数２３】
0004776854.tif 000019
を用いることにより進められるであろう。
【００２３】
【数２４】
0004776854.tif 000020
という表記を導入することにより、式９ｇ及び９ｃから、
【数２５】
0004776854.tif 000021
が得られる。
【００２４】
式９ｆ及び９ｉから、
【数２６】
0004776854.tif 000022
が得られる。
【００２５】
Ｐ（ｎ，ｔ）の生成関数の理論式を得る最後の段階として、式７及び式８を組み合わせて
【数２７】
0004776854.tif 000023
を得る。
【００２６】
式１０は、コンパクトな理論式である。Ｇ（ξ，η）の蛍光寿命への依存は、関数Ｇ（η｜１）のみによって表される。しかし、２つの一次元分布Ｐ（ｎ）及びＰ（ｔ｜１）は、単一種に対してＧ（ξ，η）の結果を完全に決定することは、式１０からよりも、式６からの方がより明確であり得る。多数の種に対し、式３及び１０から、
【数２８】
0004776854.tif 000024
が得られる。ここで、下付き文字ｉは、異なる種を意味する。
【００２７】
不連続なフーリエ変換アルゴリズムは、確率分布から生成関数を算出する場合、またはその逆の場合に使用され得る。これは、生成関数が、周期的な独立変数の関数として人為的に（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ）考慮されていることを意味する。従って、周期が規定されるべきである。カウント数の大きさ（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）では、ｎ値での期間を規定することが都合がよい。ここで、Ｐ（ｎ）は、実際はゼロに低下する。検出遅延時間の大きさでは、２つの異なる期間の値が考慮されるべきである。
【００２８】
Ｐ（ｔ｜１）を計算する場合、選ばれた周期は、レーザー励起期間と一致すべきである。ここで、蛍光遅延変動は、パルス期間Ｎｌの間、ゼロになる必要がないことが考慮される。連続励起パルス０＜ｔ≦Ｎｌの間に、Ｐ（ｔ｜１）が算出されると、その後、区間Ｎｌ≦ｔ≦Ｎｔにおいて、関数はゼロに引き伸ばされる（ｐａｄｄｅｄ ｂｙ ｚｅｒｏｓ）。ここで、Ｎｔは、ｔ次元でのＰ（ｎ，ｔ）の周期の値を意味する。Ｎｔの値は、分布Ｐ（ｎ，ｔ）が実際にゼロになるところに選択される。その後、式６は、Ｐ（ｎ，ｔ）のフーリエイメージの計算に適用される。
【００２９】
上記に説明したように、Ｐ（ｔ｜１）及びその生成関数を計算するとき、選択された確率分布の期間は、レーザー励起期間と当然一致すべきである。パルス期間を幅ΔのＮｌ検出遅延時間区間に分割するとすると、δ−励起に対応する、理想的な区分された（ｐｅｒｉｏｄｉｚｅｄ）確率分布は、区間０＜ｔ≦Ｎｌにおいて、
【数７】
0004776854.tif 000025
として表される。τは、蛍光寿命を示す。（同様に区分された関数である）時間応答関数Ｒ（ｔ）による、Ｐδ（ｔ）のたたみ込みの最も簡単な計算方法は、フーリエ変換による、
【数８】
0004776854.tif 000026
である。
【００３０】
正確さのために、Ｐ（ｔ｜１）は、高時間分解能で計算され得る。後述の実験２で行われたように、例えば、ここでは８倍高い分解能を使用し得る。区間０＜ｔ≦ＮｌにおいてＰ（ｔ｜１）を計算し、その後、区間Ｎｌ≦ｔ＜Ｎｔにおいて一連のゼロによって、関数を補正する。ここで、Ｎｔは、ｔ次元でのＰ（ｎ，ｔ）の区分の値を示す。
【００３１】
フィッティングの加重値（Ｗｅｉｇｈｔｓ ｏｆ Ｆｉｔｔｉｎｇ）
単純化のために、連続したカウント時間区間におけるカウント数は独立していると推定され得る。分子座標は少しのカウント区間において大きく相関するので、この推定は、厳密には正しくないが、所定の対（ｐａｉｒ）（ｎ，ｔ）を有するイベント数は、平均付近で二項分布している。ここで、Ｍは実験当たりのカウント時間区間の数である。これにより、最小二乗の式（ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ ｐｒｏｂｌｅｍ）
【数９】
0004776854.tif 000027
の加重値Ｗ（ｎ，ｔ）に関する以下の式が得られる：
【数１０】
0004776854.tif 000028
ここで、χ２は、最小二乗パラメーターであり、
【数１１】
0004776854.tif 000029
は、測定されたＦＩＬＤＡヒストグラムであり、Ｐ（ｎ，ｔ）は、理論分布である。
【００３２】
式１２の加重値Ｗ（ｎ，ｔ）は、フィッティングに対して非常に良好であるが、この目的のために使用されると、過小評価された（ｕｎｄｅｒｅｓｔｉｍａｔｅｄ）統計的誤差が生じるであろう。従って、ＦＩＬＤＡの統計的誤差は、一連の実験的なシミュレーションされたデータから決定された。
【００３３】
より一般的な態様における本発明に戻ると、確率関数の第二独立変数は、各光子の単なる個々の検出遅延時間であるだけでなく、むしろ所定のカウント時間区間において検出された光子全てに対する積算検出遅延時間のような、その関数である。但し、分子は、単一の励起パルスから２つの光子をほとんど放出することができないが、以下に示す実施例において、カウント時間区間当たり１０，０００励起パルスがあり、それにより、この時間中、単一分子からの数１０個の光子を検出することができる理由が説明される。第二独立変数の有利な選択は、特に、測定容量当たり１分子よりわずかに低いだけである、本方法を実施するための光学濃度が使用されるならば、短い時間区間において測定される一連の光子は、単一分子によって放出されそうであるという、蛍光の性質に関連する。古典的な寿命分析では、この情報はない。この理由により、試料中に存在する２つの粒子種の比明度値が同じであるとしても、本発明による方法は、より正確な分析方法であることがわかる。
【００３４】
好ましい態様では、検出遅延時間の前記関数は、同じカウント時間区間において検出される光子カウントの検出遅延時間の次数（ｏｒｄｅｒ）に関して不変である。好ましくは、検出遅延時間の前記関数は、合計又は平均である。各光子の検出遅延時間、即ち、対応する励起パルスに対する光子カウントの検出時間は、検出遅延時間との既知の関係を有する整数によって表され得る。この関係は、理想的には、擬似線形（ｑｕａｓｉ−ｌｉｎｅａｒ）である。検出遅延時間の関数は、好ましくは前記整数の合計又は平均である。
【００３５】
更に好ましい態様では、粒子の分布は、対応する理論的な確率関数Ｐ（ｎ，ｔ，．．．）によって実験的に決定された確率関数
【数３４】
0004776854.tif 000030
をフィッティングすることによって決定される。この理論分布Ｐ（ｎ，ｔ，．．．）は、好ましくはその生成関数
【数３５】
0004776854.tif 000031
によって算出される。単一の検出器の場合には、上記に説明したように、実験的に決定された確率関数は、二次元関数である；故に、対応する理論的な確率関数Ｐ（ｎ，ｔ）によって実験的に決定される確率関数
【数３６】
0004776854.tif 000032
をフィッティングすることによって、粒子の分布を決定することが好ましい。後者は、好ましくは、その生成関数
【数３７】
0004776854.tif 000033
によって算出される。
【００３６】
光子カウント数（ｎ）、好ましくは積算検出遅延時間（ｔ）の測定された二次元分布をフィッティングすることによって本発明が行われる限り、基本的な問題は、理論的な確率分布Ｐ（ｎ，ｔ）の計算式である。確率分布の両独立変数は、加法的（ａｄｄｉｔｉｖｅ）変数の典型的な例である：例えば、１つの分子が積算検出遅延時間ｔ１のｎ１光子を放出し、別の分子が積算検出遅延時間ｔ２のｎ２光子を放出すると、それらは、積算検出遅延時間ｔ１＋ｔ２のｎ１＋ｎ２光子を一緒に放出する。この場合、上述のように、対象となる確率分布を表す場合に生成関数の表現を選択することが適当である。
【００３７】
理論分布Ｐ（ｎ，ｔ，．．．）の計算において考慮されるべき実験器具の時間（ｔｅｍｐｏｒａｌ）応答関数を決定することが更に好ましい。この時間応答関数は、分離実験から決定され得る。
【００３８】
さらに好ましい態様において、前記幅のカウント時間区間の一組の異なる値が使用され、前記幅は、前記確率関数のもう１つの独立変数である。この特別な場合には、粒子の拡散係数（又はその測度）は、有利に決定され得る。その結果、それは、粒子の分布関数の第三独立変数になる。本発明のこの態様は、蛍光強度寿命多重分布分析（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｆｅｔｉｍｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＦＩＬＭＤＡ）と呼ばれる。
【００３９】
カウント時間区間は、連続した時間であることもあり、重なり合っていることもある。
【００４０】
上記のように、測定容量当たりの粒子濃度を、約１分子以下に選択することが好ましい。測定容量当たり１粒子よりもはるかに低い濃度で行われる場合、データ収集時間のほとんどは待ち時間に、即ち測定容量に粒子がない状態で費やされるので、実験による意味のある情報の取得はゆっくり行われる。これは、ハイスループットスクリーニング（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）実験において特に好ましくない状態であろう。
【００４１】
前記検出手段として、１つ、２つ又はそれ以上の光子検出器、好ましくはアバランシェ・フォトダイオード又は光電子増倍管が使用される。少なくとも２つの光子検出器は、例えば、異なる色又は偏光の蛍光をモニターするために使用され得る。
【００４２】
本発明による方法は、ハイスループットスクリーニングアッセイの実施、アッセイ開発及び診断目的に特に適している。しかし、それは、生命科学及び関連する技術に幅広く適用することができる。
【００４３】
本発明によれば、変動する蛍光強度のモニターには、共焦点技術が特に適している。上記に略述したように、それらは、生体臨床医学などのような、幅広い適用分野に適用され得る。共役（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）焦点（共焦点）技術は、試料上の回折制限（ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ−ｌｉｍｉｔｅｄ）スポットに鋭く焦点を合わせられる光の点光源の使用に基づいている。放射された光は、観察範囲を、照明スポットと正確に一致する範囲に単離する空間フィルター（ピンホール）によって観察される。従って、照明穴及び検出穴は、お互いに光学的に接合されている。対物レンズの光の他に焦点面から生じる光が拒絶され、それにより、非常に小さな深さの場（ｆｉｅｌｄ）が効率的に提供される。従って、本発明の特に好ましい態様では、蛍光強度のモニターのために、共焦点顕微鏡が使用される。高いシグナル−ノイズ比（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ−ｒａｔｉｏ）を得るためには、励起光（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｒａｄｉａｔｉｏｎ）（１４）を提供するための光源（１２）、測定容量（２６）へ励起光（１４）の焦点を合わせるための対物レンズ（２２）、測定容量（２６）から射出された（ｓｔｅｍｓ）放射光（ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｒａｄｉａｔｉｏｎ）（３０）を検出するための検出器（４２）、及び放射光（３０）又は励起光（１４）の中心部を遮蔽するために放射光（３０）又は励起光（１４）の経路（３２）に位置する不透明手段（４４）を含む装置を用いて蛍光をモニターすることが有用である。図６に詳述した光学装置を使用することが特に好ましいこともある。
【００４４】
ヒストグラム（又は確率関数）の第二確率変数が、所定のカウント時間区間において測定される光子数における検出遅延時間に対する励起光の合計又は平均であることが好ましいので、既知の多次元蛍光変動法と比べて、本発明による方法は、非常に特別である。単独で用いる場合、どのような値であっても、この変数は非常に小さい。それは、光子カウント数と関連する場合にのみ、その意味を持つ。明度及び寿命分析を組み合わせる場合、２つの変数の直接的な選択は、光子カウント数及び検出遅延時間に対する個々の励起光である；しかし、本発明の選択により、直接的な選択よりもはるかに正確な方法が得られる。この特別な選択の成功の別の理由は、ヒストグラム（又は確率関数）のフィット関数が、そのフーリエ変換により、即ち、生成関数の表現を用いて、迅速に算出され得ることである。
【００４５】
本発明は、以下の図及び実施例によって説明されるが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４６】
図１：（Ａ）Ｔ＝２ｓのデータ収集時間でのＢｏｄｉｐｙ６３０／６５０溶液からのＦＩＬＤＡヒストグラム。（Ｂ）（Ａ）のＦＩＬＤＡヒストグラムに対する式１０のフィッティングの加重残差（ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｒｅｓｉｄｕａｌｓ）（式１２により加重）。フィッティングにより、ｃ＝２．３、ｑ＝２３．２ｋＨｚ、τ＝３．３ｎｓ、及びχ２ ＝１．１の値が得られた。
【００４７】
図２：ＦＩＬＤＡ（本発明）、ＦＬＡ（従来技術）、及びＦＩＤＡ（従来技術）のＣＶ’ｓの蛍光種濃度への依存状態。３つの方法それぞれに対する１００個のランダムヒストグラムを、２０秒のデータ収集時間において、２つの蛍光種の１：１混合物に対してシミュレーションした。シミュレーションのための入力パラメーターは、濃度ｃ１=ｃ２(ｘ軸)、明度ｑ１=３０ｋＨｚ、及びｑ２=１５ｋＨｚ、寿命τ１=３．０ｎｓ、及びτ２=１．５ｎｓであった。全てのパラメーター（ＦＩＬＤＡにおけるｃ１、ｃ２、ｑ１、ｑ２、τ１、τ２；ＦＩＤＡにおけるｃ１、ｃ２、ｑ１、ｑ２及びＦＬＡにおけるｃ１ｑ１、ｃ２ｑ２、τ１、τ２）は、フィッティングされた。第二（弱い方の）成分の濃度値ｃ２のＣＶを、このグラフにプロットする。１００個のヒストグラムの分析により、標準誤差の７．１パーセントの精度が得られる。
【００４８】
図３：ＦＩＬＤＡのＣＶ’ｓのデータ収集時間Ｔ（上方ｘ軸）への依存状態。以下の入力パラメーターを有する１：１色素混合物の１００個のシミュレーションされたヒストグラムにおいて、分析を行った：濃度ｃ１＝ｃ２＝０．２、明度ｑ１＝３０ｋＨｚ、及びｑ２＝１５ｋＨｚ、寿命τ１＝３．０ｎｓ、及びτ２＝１．５ｎｓ。１００個のヒストグラムの分析により、標準誤差の７．１パーセントの精度が得られる。線形依存状態を明らかにするために、下方ｘ軸に、Ｔ−１／２を示す。
【００４９】
図４：ＦＩＬＤＡ（データ収集時間Ｔ＝２ｓ、１０回繰り返された測定の平均からの誤差バー）によってモニターした、ラベルされたターゲットペプチドＨＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＫ−ＮＨ２のカルモデュリンへの結合。データの双曲線補正から、実線が得られ、それにより結合定数ＫＤ＝３８±３ｎＭが得られる。
【００５０】
図５：実験２のヒストグラムの強度グラフの説明。Ｘ軸は、光子遅延時間に対して平均化されたパルスであり、ｙ軸は、光子カウント数である。濃色部の（ｄａｒｋｅｒ）強度は、高いイベント数に対応する。
【００５１】
図６は、本発明による方法の実施において使用される装置の一態様を示す。装置１０は、可干渉性単色励起光１４の束によって試料を照らすための光源として働くレーザー１２を含む。励起光１４は、レンズ１６によって平行にされ、二色性鏡２０に到達する。好ましくは、光学軸１８と二色性鏡２０の間の角度は４５°である。二色性鏡２０は、試料容量２６内で、焦点２４を有する対物レンズ２２の方向へ励起光１４を反射する。試料容量２６及び対物レンズ２２は、透明カバーガラス２８によって、例えば試料に設置される市販のマイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏ−ｔｉｔｅｒｐｌａｔｅ）の底部によって、お互いに分離されることが好ましい。試料は、蛍光ラベルされた分子又は他の粒子を含むことが好ましい。適当な励起光１４による励起により、試料中に存在する分子又は他の粒子は、光３０を放射する。放射光３０は、対物レンズ２２を通り、励起光３０を通す二色性鏡２０に達する。その後、放射光は、光学軸３２上のフィルター３４及びコリメーターレンズ３６を通る。ピンホール３８は、コリメーターレンズ３６の焦点に置かれる。ピンホール３８を通った放射光３０は、更なるレンズ４０に達し、その後、光検出器４２によって検出される。放射光３０の経路内、特に二色性鏡２０と光検出器４２との間に、放射光３０の中心部を通すことができない不透明手段４４が設けられる。この放射光３０の中心部は、励起光１４の焦点２４の前又は後ろにある光学軸３２上の範囲から射出される。焦点２４又はその直接近接する部分から射出される放射光３０は、ピンホール３８を通り、光検出器４２に達する。不透明手段４４を放射光３０の経路内に置く代わりに、励起光１４の経路も、不透明手段４４を設置するのに適している。特に、不透明手段４４は、レーザー１２と二色性鏡２０との間に置くことができる。ここで詳述したように、本発明による方法における不透明手段４４の使用により、シグナル−ノイズ比が向上する。
【００５２】
【実施例】
実験１
材料及び方法
実験装置
蛍光相関顕微鏡法（リグラー（Ｒｉｇｌｅｒ）ら， Ｅｕｒ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ２２， １６９−１７５， １９９３；コッペル（Ｋｏｐｐｅｌ）ら， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． １６， １３１５−１３２９， １９７６）において使用されるように、標準のエピイルミネーテッド共焦点顕微鏡（コンフォコル（ＣｏｎｆｏＣｏｒ）； エボテックバイオシステムズ（ＥＶＯＴＥＣ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）及びカールツァイス（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）、ドイツ）は、本発明による、このＦＩＬＤＡ実験の中心光学部である。ＦＩＬＤＡは、連続的な比明度と時間によって決まる（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ）蛍光寿命分析の両方を組み合わせるので、励起のために、高速パルス（ｆａｓｔ ｐｕｌｓｅｄ）レーザーダイオード（クリスタル社（Ｃｒｙｓｔａｌ ＧｍｂＨ）、ベルリン、ドイツ、６３５ｎｍ、１ｍＷ）を使用する。１００ＭＨｚの反復速度では、それは、強度変動検出に対して、ある程度（ｑｕａｓｉ）連続した波として現れるのに対して、１．５ｎｓのパルス幅において、１０ｎｓの一致した（ａｃｃｏｒｄｉｎｇ）パルス距離でも、使用される色素の蛍光寿命の十分正確な試験が可能である（Ｃｙ５，オキサジン色素ＭＲ１２１，オキサジン色素ＥＶＯｂｌｕｅ３０，Ｂｏｄｉｐｙ６３０／６５０）。
【００５３】
蛍光の励起のために、レーザー光をビーム伸張器に通し、二色性鏡（６３５ＬＰ，クロマ（Ｃｈｒｏｍａ），ブラトレボロ（Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ），ＶＴ， ＵＳＡ）によって、顕微鏡対物レンズ（Ｕａｐｏ／３４０，４０ｘ， Ｎ．Ａ．１．１５， オリンパス光学株式会社（ＯｌｙｍｐｕｓＯｐｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， 東京、日本） に向ける。二色性鏡、スペクトル帯域フィルター（６７０ＤＦ４０，オメガ（Ｏｍｅｇａ），ブラトレボロ（Ｂｒａｔｔｌｒｂｏｒｏ），ＶＴ， ＵＳＡ）を介して同じ対物レンズによって蛍光を集め、焦点を外れた光を拒絶するために働く共焦点ピンホールに焦点を合わせる。７０μｍのピンホールを通る光を、ケイ素光子カウントアバランシェダイオード（ＳＰＣＭ−ＡＱ−１３１，ＥＧ＆Ｇ オプトエレクトロニクス（Ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ），ボードロイル（Ｖａｕｄｒｅｕｉｌ），ケベック（Ｑｕｅｂｅｃ），カナダ）によって検出する。
【００５４】
検出器パルス並びにレーザートリガーパルスは、コンピューター差込み式カードに通される。エボテック（ＥＶＯＴＥＣ）製のこのカードは、２つのサブユニットからなり、その一方は、時間相関単一光子カウント（ＴＣＳＰＣ）モジュールである。このモジュールは、付随するレーザーパルスに対する光子カウントの遅延時間を検出している。時間をデジタル化する変換器（ｔｉｍｅ−ｔｏ−ｄｉｇｉｔａｌ ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）（ＴＤＣ）は、７０ｐｓの分解能及び２ＭＨｚの変換速度で、この時間情報を定量化する。他方のサブユニットは、首尾よく検出された光子カウントの全ての対の間の時間の不足（光子間隔時間）を得るための、５０ｎｓの時間分解能の内部時計を用いる電子カウンターである。従って、検出される光子カウント毎に、２つの独立した時間、即ち、蛍光寿命情報を含む、一致したレーザーパルスに対する光子カウントの顕微鏡でしか判別できない遅延時間（ｎｓ）、並びに蛍光強度及び変動情報をコードする顕微鏡でしか判別できない光子間隔時間（μｓ〜ｍｓ）が同時に記録される。これらの蛍光から、生データの２つの一次元ヒストグラム、即ち、（ｉ）１００μｓのカウント時間区間において収集された光子カウント数分布（ＦＩＤＡ）、及び（ｉｉ）遅延時間分布（ＦＬＡ）が算出される。更に、１００μｓのカウント時間区間にわたって積算された光子カウント数及び遅延時間の両方を含む二次元ＦＩＬＤＡヒストグラムが、本発明によって確立される。
【００５５】
ＦＣＳ測定から、蛍光色素ＭＲ１２１、ＥＶＯｂｌｕｅ３０及びＢｏｄｉｐｙ６３０／６５０の平均拡散時間は、２００μｓに決定された。Ｄ＝３×１０−６ｃｍ２ ／ｓの拡散定数において、これにより、０．５μｍの動径１／ｅ２ −半径が得られる（リグラー（Ｒｉｇｌｅｒ）ら， Ｅｕｒ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ２２， １６９−１７５， １９９３）。対物レンズ下の時間平均（ｔｉｍｅ−ａｖｅｒａｇｅｄ）レーザービームパワーは、２００μＷであった。
【００５６】
実験手順
装置を評価する（ｇａｇｅ）ために、４つの異なるキャリブレーション（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）測定、即ち、（ｉ）ＴＤＣの不均一なチャンネル幅に対するデータを集めるための光子のランダム光源としての日光、（ｉｉ）装置のＩＲＦを決定するための純粋なバッファー又は水試料からの付随するレーザーの散乱光、（ｉｉｉ）式９の空間明度パラメーターを決定するための純粋な色素溶液、及び（ｉｖ）暗色（ｄａｒｋ）散乱ラマンカウントの独立した評価を得るための純水における測定を行った。後者は、既に存在する２つの“種”と見なされる。それらはいずれも、ポアソニアン（Ｐｏｉｓｓｏｎｉａｎ）カウント数分布を有するが、大きく異なる遅延時間分布を有する。
【００５７】
一例として、図１Ａは、約１ｎＭのＢｏｄｉｐｙ６３０／６５０溶液の、得られたＦＩＬＤＡヒストグラムを示す。ｘ軸は、遅延時間の合計を表すのに対し、ｙ軸は、上記のような光子カウント数を表す。このヒストグラムのためのデータを２秒間収集した。式１１のフーリエ変換に対してこの二次元ヒストグラムをフィッティングすることにより、測定容量中の分子の濃度又は平均数ｃ＝２．３、比明度ｑ＝２３．２ｋＨｚ、並びに、ＦＩＤＡ及びＦＬＡのみによって決定される値（データは示されていない）、及び先に記したＢｏｄｉｐｙ６３０／６５０に対する寿命と一致する蛍光寿命τ＝３．３ｎｓが得られる。フィッティングの良さを判断するために、図１Ｂは、χ２＝１．１の最小二乗値において、加重残差
【００５８】
【数３８】
0004776854.tif 000034
を示す。
【００５９】
データシミュレーション
慎重に（ｄｅｌｉｂｅｒａｔｅｌｙ）選択されたパラメーター（明度及び蛍光寿命値）を示す分子の混合物を含む実際の試料は、調製することが困難である。従って、ある評価は、シミュレーションデータを用いて行われる。ＦＩＬＤＡ（本発明）、ＦＩＤＡ（従来技術）、及びＦＬＡ（従来技術）に対する多数のヒストグラム組は、他に詳述されたアルゴリズムによってシミュレーションされた（パロ（Ｐａｌｏ）ら，Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ７９， ２８５８−２８６６， ２０００； この内容は、本明細書に開示として援用される）。このアルゴリズムは、個々の分子のランダムウォーク（ｒａｎｄｏｍ ｗａｌｋ）及び明度積分（ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ ｉｎｔｅｇｒａｌｓ）のランダムカウント数への変換を含む。このアルゴリズムの修正として、所定の種の寿命に依存するランダム検出遅延時間が、各光子に対して更に定められ、シミュレーションで使用されるＩＲＦは、実際の実験と同一に選択された。得られたランダムカウント数及び検出遅延時間は、その後、ＦＩＬＤＡ、ＦＩＤＡ及びＦＬＡに対するヒストグラムを計算するために使用された。
【００６０】
シミュレーションは、得られたパラメーターの統計的誤差を評価するために適したツールであると考えられる。この目的のために、典型的には、所定の分子パラメーター組を用いる４０〜１００回の実際の実験（Ｎ＝４０−１００ ｒｅａｌｉｚａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）がシミュレーションされた。
【００６１】
フィッティング
実験的な、又はシミュレーションされたＦＩＬＤＡ（本発明）、ＦＩＤＡ（従来技術）、及びＦＬＡ（従来技術）分布を、標準マークオート（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）アルゴリズムを用いてフィッティングした。ＦＩＤＡのために設計されたフィッティングプログラムは、基本的には式８を使用するのに対し、ＦＩＬＤＡのためのものは、式１１に基づいている。ＦＬＡのためのフィット曲線は、上記のように、Ｐ（ｔ｜１）の計算のみによるため、ＦＩＬＤＡの場合よりもはるかに簡単である。
【００６２】
生化学的システム：カルモデュリン−ペプチド相互作用
カルモデュリン（ＭＷ１６．７ｋＤａ）は、様々なＣａ２＋依存性細胞シグナル経路に関連する調節蛋白質である（クリー（Ｋｌｅｅ），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７， ６６４５−６６５３， １９８８）。微小な（ａｔｏｍｉｃ）分解能における構造は、溶液中のカルモデュリンに対し、可撓性リンカーによって結合する（イクラ（Ｉｋｕｒａ）ら，Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ １３， ３９１−４００， １９９２）２つのＣａ２＋結合部位をそれぞれ有する２つの同様のドメインを同定した（バブ（Ｂａｂｕ）ら，Ｎａｔｕｒｅ ３１５， ３７−４０， １９８５； バブ（Ｂａｂｕ）ら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０４， １９１−２０４， １９８８； チャトパドヒアヤ（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ）ら，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２８， １１７７−１１９２， １９９２； ウィルマン（Ｗｉｌｍａｎｎ）ら，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｎｏｉｓｙ−ｌｅ−ｇｒａｎｄ，４６， ８８３−８９４， ２０００）。Ｃａ２＋の結合において、ほとんどのターゲット蛋白質に対して結合部位を形成するそれら残基は、溶媒にさらされる。ターゲットペプチドの１つからの関連するペプチド配列（例えば、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼ、ｓｍ−ＭＬＣＫ）は、ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡであり、ターゲットペプチドとして選択された。Ｃ末端において、色素（例えばＭＲ１２１）によってＣ末端をラベルするために、更なるリシンが導入された。ターゲットペプチドの優勢な（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ）相互作用部位（両方のカルモデュリンドメインと相互作用する）は、Ｃ末端及びＮ末端として同定されたので（メドール（Ｍｅａｄｏｒ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７， １２５１−１２５５， １９９２； メドール（Ｍｅａｄｏｒ）ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２， １７１８−１７２１， １９９２）、色素の分子環境は、結合において変化すべきである。従って、蛍光寿命、分子強度、並びにＦＩＬＤＡデータは、結合イベントを示すべきである。
【００６３】
カルモデュリンは、ＢＩＯＭＯＬから購入した（ウシ脳由来、ＬＯＴ＃Ｐ４６３９ｃ、１ｍｇ、凍結乾燥）。ｐＨ８の２５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌに蛋白質を溶解し、４℃でアリコートに貯蔵した。ペプチド（Ｈ−ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＫ−ＮＨ２）は、エボテック（ＥＶＯＴＥＣ）で合成され、Ｃ末端のリシンにおいて、オキサジン色素ＭＲ１２１（吸収極大（Ａｂｓ．ｍａｘ．）＝６６１ｎｍ）でラベルされた。全ての実験で使用したバッファーは、ｐＨ８の２５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１ｍＭＣａＣｌ２、１００ｍＭＫＣｌ、及び０．０５％のプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）を含んでいた。カルモデュリン及び蛍光ラベルされたペプチドは、測定前に１０分間、インキュベートされた。
【００６４】
蛍光色素及びプローブの取り扱い
使用した色素は、Ｂｏｄｉｐｙ６３０／６５０（モレキュラー・プローブズ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ，ＵＳＡ）、シアニン５（Ｃｙ５）（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）， Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）、ＭＲ１２１（ロシュ・ディアグノスティクス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）， Ｐｅｎｚｂｅｒｇ， ドイツ）、及びＥＶＯｂｌｕｅ（エボテックバイオシステムズ（ＥＶＯＴＥＣ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ） ＡＧ， ハンブルグ、ドイツ）であった。これらはすべて、６３５ｎｍ付近に励起極大を有する。色素溶液は、超純水中で調製した。
【００６５】
試料として、１ｎＭの付近の濃度で蛍光プローブを調製した。ガラス表面へ分子が吸着する可能性があるので、希釈率から、それらの濃度値を決定することは適当ではない。さらに良好な評価は、ＦＩＬＤＡそのものによって得られる。なぜなら、この方法により、完全な濃度が得られるからである。全ての実験は、２２℃の室温において行われた。
【００６６】
結果
新たな方法は、シミュレーションされたデータから、又は同じ装置及び同じ光子カウントシーケンスを利用する、簡単なテスト実験から得られる統計的誤差に基づいて、既知の方法と比較される場合も、最も良好に評価される。従って、本発明による方法（ＦＩＬＤＡ）は、最初の段階において、異なる色素溶液及び混合物に適用され、結果は、ＦＬＡ及びＦＩＤＡのものと比較された。
【００６７】
テスト実験及びデータシミュレーション
まず、総色素濃度約１ｎＭのＥＶＯｂｌｕｅ３０及びＭＲ１２１の２：１色素混合物における一連の４０回の測定を行い、ＦＩＬＤＡ、ＦＩＤＡ及びＦＬＡのデータを並行して収集した。この一連の実験は、それぞれＴc＝２ｓの継続期間で、同様の分子パラメーターを用いて、シミュレーション中繰り返された。全てのデータは、それぞれの色素溶液における実験から、あらかじめ決定された様々な数の固定された（ｆｉｘｅｄ）パラメーターによってフィッティングされた。３つの方法全てにおいて評価したパラメーターを、表１にまとめる。単一種の特別な場合では、ＦＩＬＤＡは、ＦＩＤＡとＦＬＡとの簡単な組み合わせよりも、統計的により正確なことは決してない。全ての分子は同じであり、個々の分子のバーストによる遅延時間のグループ化から得ることはできないので、このことが予想され得る。しかし、２つの色素の混合物に関して、全てのデータ組におけるフィッティングの結果、方法及びフリーのパラメーターの数に依存して、共焦点容量当たりの分子数ｃ１及びｃ２、それらの明度値ｑ１及びｑ２、並びに寿命τ１及びτ２の異なる平均値及び統計的誤差が得られる。表１では、これら誤差は、標準偏差の平均値に対する比として、括弧内に示されている（偏差の係数、ＣＶ）。なお、もう一度言うと、従来技術ＦＬＡのみが、ｃ１及びｃ２の代わりに、積ｃ１ｑ１及びｃ２ｑ２を示す。Ｃ１及びＣ２が、フィッティングされるたった２つのパラメーターであるならば、即ち、明度及び／又は寿命値の両方が、表１からあらかじめ決定される値に固定されるならば、ＦＩＬＤＡ及びＦＬＡは、精度がほとんど同じであるのに対し、ＦＩＤＡは、より高いＣＶ値を有する。このストラテジーは、例えば、一方が蛍光性である２つの分子の結合をモニターする、多数の生物学的アッセイに適用され得る。ここで、フリーの、及び結合している状態の蛍光性化合物の特異的な量を、実際にあらかじめ決定し、２つの濃度のみをフィッティングすることができる。しかし、非常に頻繁に、このスキームは、使用することができないが、より多数のパラメーターがフィッティングされなければならない。これは、関連する多数の結合部位があり、複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）の比明度が、結合の大きさに依存するため、固定され得ないという事実によるものであり得る。別の例は、薬剤スクリーニングにおいて行われ、そこでは、ある化学的、又は天然の化合物は、生物学的ターゲットに対して試験される。それら化合物は、主として非蛍光性であると推定されるが、いくつかの場合には、自己蛍光性であることが分かる。これらの試料は、自己蛍光性化合物を特徴付けるが、前もって知られていない更なるパラメーターを用いて、２＋１成分モデルに対してフィッティングされ得る。
【００６８】
ここで、本発明のＦＩＬＤＡの優位性（ｓｕｐｅｒｉｏｒｉｔｙ）が明らかになる。４つのフリーのパラメーターがあるならば、例えば、２つの寿命パラメーターが、同様にフィッティングされる場合、ＦＬＡと比較したＦＩＬＤＡの統計的誤差は、約１／２に（ｂｙ ａ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｂｏｕｔ ２）減少する。統計的誤差がＦＩＤＡからのもの及びフリーの作動（ｒｕｎｎｉｎｇ）明度値と比較される場合、この除数（ｆａｃｔｏｒ）は、さらに大きい。更に、６個のフィッティングされたパラメーターの場合、ＦＩＬＤＡは、低いＣＶ値において、やはり説得力のある（ｃｏｎｖｉｎｃｉｎｉｇ）結果をもたらす。
【００６９】
【表１】
表１：２秒のデータ収集時間での、ＭＲ１２１とＥＶＯｂｌｕｅ３０との色素混合物における、ＦＩＬＤＡ（本発明）、ＦＬＡ（従来技術）、及びＦＩＤＡ（従来技術）の可変性の係数（ＣＶ’ｓ）：実験的データとシミュレーションされたデータとの比較
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４０回の繰り返し測定において、ＣＶ’ｓを測定した。実験データの分析の平均の結果は、シミュレーションアルゴリズムに対するインプットとして使用された：濃度ｃ１＝０．２４及びｃ２＝０．４４、明度ｑ１＝１７．５ｋＨｚ及びｑ２＝７．５ｋＨｚ、寿命τ１＝１．７２ｎｓ及びτ２＝０．５４ｎｓ。
（ａ）：ＦＬＡにより、ｃ１及びｃ２よりもむしろｃ１ｑ１及びｃ２ｑ２が得られる；
ｘ：分析により５０％以上のＣＶ’ｓが得られた；
（）：シミュレーションされたデータにおける分析のＣＶ’ｓ；
＃：最もよく知られた値に固定した。
【００７０】
しかし、実用上の観点から、ＦＩＬＤＡは、この高い精度を幅広い範囲の濃度にわたり維持するか否かという問題がある。従って、異なる濃度の２つの蛍光種の１：１混合物において、一連の１００個のヒストグラムを、ＦＩＬＤＡ（本発明）、ＦＩＤＡ（従来技術）、及びＦＬＡ（従来技術）に対してシミュレーションし、結果を再度比較した。両方の種に対して、２倍異なる比明度（ｑ１＝３０ｋＨｚ及びｑ２＝１５ｋＨｚ）並びに寿命（τ１＝３．０ｎｓ及びτ２＝１．５ｎｓ）を選択したが、拡散時間は同じ（２００μｓ）にした。フィッティングされた全てのパラメーターを有する２つの成分モデルに対して、全てのヒストグラムをフィッティングした。非常に低い濃度、並びに非常に高い濃度において、全ての方法は、データ獲得時間Ｔc＝２ｓにおいて、明確に種を区別することが困難であったので、この時間を、Ｔc＝２０ｓに延長した。図２は、最も弱いシグナルのＣＶ値によって表される蛍光色素濃度ｃ２における、３つの方法全ての統計的誤差の依存性を示す。測定容量当たりの濃度ｃ＜５分子の範囲内では、ＦＩＬＤＡは、最も低い誤差を示すのに対し、はるかに高い濃度においてのみ、ＦＬＡは、統計的により正確である。ＦＬＡは、濃度と線形的に比例する検出された光子の数にのみ依存するので、このことは、驚くべきことではない。それに対して、ＦＩＬＤＡ及びＦＩＤＡは、∝ｃ−１／２に応じて減少する蛍光シグナルの相対的な変動を感知する。極めて低い濃度では、蛍光シグナルは、基本的に、２０秒のデータ収集時間中は結局検出され得ない稀な（ｒａｒｅ）単一分子イベントからなる。しかし、より長い獲得時間では、これら稀なイベントは、従来のＦＬＡよりも、ＦＩＬＤＡのような変動方によって、はるかに良好に得ることができる（ａｐｐｒｏａｃｈａｂｌｅ）。
【００７１】
Ｔｃ−１／２における異なるＦＩＬＤＡパラメーターの統計的誤差の線形依存性を、図３に示す。プロットされたＣＶは、上記と同じシミュレーションスキームから得られるが、単一濃度はｃ１＝ｃ２＝０．２である。パラメーターを固定しなくても、即ち、事前の情報を用いなくても、正当な（ｒｅａｓｏｎａｂｌｅ）ＣＶ値は、１０秒のデータ獲得時間で既に得られ得ることを、明らかに知ることができる。
【００７２】
生化学的システム
ＦＩＬＤＡの実験的利用を、先に紹介したカルモデュリン−ペプチド相互作用の結合定数の決定よって示す。この目的のために、ラベルされたペプチド（ＨＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＫ−ＮＨ２（ＭＲ１２１））濃度を２．５ｎＭで一定に保ちつつ、滴定実験を行い、一方、カルモデュリンを滴定した（０、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、１０μＭ、５０μＭ）。同じ条件下、即ち、同じバッファー、同じ励起パワー、及び測定当たり２秒の同じデータ獲得時間において、全ての実験を行い、試料当たり１０回繰り返した。
【００７３】
最初の段階として、純粋なペプチド溶液に適用された単一成分分析から、寿命τｆｒｅｅ＝１．９０±０．０２ｎｓ及び比明度ｑｆｒｅｅ＝６．５±０．３ｋＨｚを決定した。２．５ｎＭのペプチドへ過剰なカルモデュリン（５０μＭ）を加えると、大部分のペプチドがカルモデュリンに結合された試料が得られた。色素の分子環境の変化（例えば、極性の低下）を示すフリーのペプチドと比較して、複合体は、より長い蛍光寿命τｂｏｕｎｄ＝３．００±０．０１ｎｓ及びより高い比明度ｑｂｏｕｎｄ＝１５．０±０．６ｋＨｚの両方を特徴とする。この混合物は、その後、方法によって、τｆｒｅｅ及び／又はｑｆｒｅｅを固定して、２成分フィッティングを用いて、３つの方法全て（ＦＩＬＤＡ、ＦＩＤＡ及びＦＬＡ）によって分析された。
【００７４】
次の段階として、全ての（ｗｈｏｌｅ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ）カルモデュリン濃度に対して、二成分分析を適用した。これらの研究において、結合又は非結合ペプチドに対して、寿命及び比明度を、上記の値に固定した。このように、ＦＩＬＤＡは、結合ペプチド、即ちカルモデュリン−ペプチド複合体の濃度ｃｂｏｕｎｄ、及び非結合、即ちフリーのペプチドの濃度ｃｕｎｂｏｕｎｄを決定する。これにより、結合ペプチドの割合ｆｂｏｕｎｄ＝（ｃｂｏｕｎｄ／（ｃｂｏｕｎｄ＋ｃｕｎｂｏｕｎｄ）を計算することができ、これを、図４において、添加されたカルモデュリンの濃度に対してプロットした（黒点、１０回の測定の平均からエラーバーを得る）。実線は、データに対する双曲線フィッティングを示し、カルモデュリン−ペプチド相互作用の結合定数ＫＤ＝３８±３ｎＭが得られる。１７±１ｎＭ及び２９±４ｎＭという類似のＫＤ値をそれぞれ有するＦＬＡおよびＦＩＤＡ（データは示していない）によって、類似の（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ）結合曲線が得られた。これらの値は、文献（バース（Ｂａｒｔｈ）ら，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， ２１７４−２１８３， １９９８）に報告されているアフィニティーとよく一致し、ＦＩＬＤＡが、生化学的システムの反応性をモニターするのに適した方法であることを示す。
【００７５】
可能な薬剤スクリーニング適用に関するこの実験の統計的精度についてのいくつかの情報を得るために、結合曲線のＺ’−値が算出され得る。これは、結合ペプチド溶液（５０μＭカルモデュリン、ｈｉｇｈ）及び純粋なペプチド溶液（０カルモデュリン、ｌｏｗ）の２成分分析から得られる結合ペプチドの割合ｆｂｏｕｎｄの平均値ｆｈｉｇｈ及びｆｌｏｗ、並びにそれらの標準偏差ｓｔｄｅｖ（ｆｈｉｇｈ）及びｓｔｄｅｖ（ｆｌｏｗ）に対してそれぞれ行われる。
【数３９】
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【００７６】
Ｚ’−値は、ｆｂｏｕｎｄの決定の、そのダイナミックレンジ（ｄｙｎａｍｉｃ ｒａｎｇｅ）に対する統計的誤差を説明する。従って、それは、結合度、又は一般的には生化学的システムの何らかの反応度を確認するための、ある読み出し及び分析方法の実現可能性及び有効性を判断するための非常に重要な統計的パラメーターである。その最大値は、Ｚ’＝１．０であり、一方、一般に、薬剤スクリーニング適用では、Ｚ’＞０．５の前提条件（ｐｒｅｒｅｑｕｉｓｉｔｅ）が必要とされる。
【００７７】
図４から、本発明の方法及び２秒のデータ獲得時間を用いて、カルモデュリン−ペプチド相互作用に対して、０．９７±０．０１のＺ’−値が得られる。比較のため、従来技術のＦＬＡ及び従来技術のＦＩＤＡの適用は、０．９２±０．０２及び０．７３±０．０７のＺ’−値をそれぞれ示す。１に近いＺ’−値では、全ての方法は、薬剤スクリーニングにおいて非常に良好に使用可能である。
【００７８】
しかし、薬剤スクリーニング適用では、できるだけ読み出し時間を最短化しようとしている。従って、カルモデュリン−ペプチド相互作用のＦＩＬＤＡのＺ’−値は、データ獲得時間を短くして決定された；Ｔ：Ｚ’（Ｔ＝１ｓ）＝０．８５±０．０４、Ｚ’（Ｔ＝０．５ｓ）＝０．８１±０．０５、Ｚ’（Ｔ＝１００ｍｓ）＝０．５４±０．１１、及びＺ’（Ｔ＝５０ｍｓ）＝０．３５±０．１６（１００ｍｓ以下のデータ獲得時間において、ＦＩＬＤＡは、マイナスのＺ’値を示すため、適用可能ではなくなる）。従って、本発明の“ＦＩＬＤＡ”は、１ｓ〜１００又は５０ｍｓ以下の読み出し時間でも、効率的な薬剤スクリーニングのための前提条件を満たす方法である。
【００７９】
実験２
装置の基本的な部分として、パルスレーザー、時間を振幅に変換する変換器（ｔｉｍｅ ｔｏ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）（ＴＡＣ）及びデータ獲得カードと組み合わせて、エピイルミネーテッド共焦点顕微鏡を使用する。検出された各光子について、２つの時間間隔、即ち、先の光子カウントから通された時間及び光子検出とその結果生じるレーザーパルスとの間の時間間隔、を同時に決定して節約した（ｓａｖｅｄ）。ＴＡＣの時間分解能を７０ｐｓにして、最初の時間間隔を、５０ｎｓのカードクロック（ｃａｒｄ ｃｌｏｃｋ）期間の単位で測定する。生データから、所定幅のカウント時間区間（通常１００μｓ）及び遅延時間の所定の分解能値（２８０又は５６０ｐｓ）において、ＦＩＤＡ（従来技術）、ＦＬＡ（従来技術）、及びＦＩＬＤＡ（本発明）に対して、一次元又は二次元分布を算出した。一連の測定において、ＴＡＣのチャンネル幅が一定でない場合の他のデータを修正するために、光子のランダム光源として日光をモニターする検出器を用いて、少なくとも１つの測定を行った。白濁した（ｍｉｌｋｙ）試料からの付随するレーザーの散乱光をモニターする検出器を用いて別の測定を行い、装置の点拡張機能（ｐｏｉｎｔ ｓｐｒｅａｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を決定した。また、常に存在する２つの“種”と考えられている暗色散乱ラマンカウントの独立した評価を得るためには、純水における測定が有用であった。それらは、いずれもポアソニアンカウント数分布を有するが、非常に異なる遅延時間分布を有する。
【００８０】
１０−９Ｍ付近の濃度の一連の水性の純粋な色素溶液、並びに約１：１の濃度比のそれらの混合物を、試料として調製した。色素がガラス表面に吸着する可能性があるので、希釈率から色素の濃度値を決定することは適当ではない；はるかに良好な評価は、ＦＩＬＤＡそのものである。使用された色素は、Ｂｏｄｉｐｙ６３０、Ｃｙ５、及びＵＲ１２１であった。室温で実験を行った。
【００８１】
図５は、本実験の測定されたヒストグラムの強度グラフを示す。Ｘ軸は、光子遅延時間に対する平均化されたパルスである；ｙ軸は、光子カウント数であり、高強度は高イベント数に対応する。図５では、強度グラフとして、測定された分布
【数１２】
0004776854.tif 000037
の３つの例を示す。２つの例は単一種に対するものであり、３つ目の例は、それらの混合物に対するものである（Ｍは、実験当たりのカウント時間区間の総数である）。データ点（ｎ，ｔ）＝（１，０）及び（１，１）（励起パルスの上端（ｒａｉｓｉｎｇ ｅｄｇｅ）の最も低い部分に相当）が、標準偏差の５単位までフィッティング曲線からしばしば外れることを除き、フィッティングの加重残差（示されていない）は、無作為に分散している。上方のグラフは、Ｃｙ５溶液（３つの色素の中で寿命が最も短い）において測定された分布＃１２を視覚化し、中間のグラフは、Ｂｏｄｉｐｙ６３０溶液（寿命が最も長い）において測定された分布＃７であり、一番下のグラフは、これら色素の混合物に対応する分布＃３０でる。実際は、技術的にフィッティングされる関数のｘ−独立変数は、平均遅延時間よりもむしろ合計であるが、平均遅延時間の分布関数は、視覚的により有益に見える。
【００８２】
この実験の応答関数の半値全幅（Ｆｕｌｌ ｗｉｄｔｈ ａｔ ｈａｌｆ ｍａｘｉｍｕｍ）（ＦＷＨＭ）は、約２ｎｓであり、１０ｎｓのパルス期間の場合と比較してもはるかに幅広く、３つの色素の中の２つの色素の寿命を超えているが、それは、二倍の寿命の違いがある２つの成分を区別するために、依然として適用可能である。水からの暗色散乱カウントは、それぞれ０．２０及び０．２９ｋＨｚに決定され、蛍光試料からのデータをフィッティングする場合のこれらの値に固定された。
【００８３】
本発明によって、単一種におけるデータから、空間調節パラメーターａ１及びａ２の値を評価することができるが、低いパワーのパルスレーザーによって得られ得るｑの完全な値は比較的低いので、対応する統計的誤差は高く、約２０パーセントである。しかし、その後の分析の結果は、調節パラメーターの正確な値には、ほんのわずかしか依存しない。従って、連続レーザー励起において、ＦＩＤＡによって決定されたおよその（ｒｏｕｎｄｅｄ）値におけるａ１及びａ２、ａ１＝−０．４０及びａ２＝０．０８は、簡単に固定された。
【００８４】
暗色散乱カウント及び空間パラメーターの値を固定した後、フィッティングのパラメーターは、各種当たりの濃度（ｃ）、比明度（ｑ）及び寿命（τ）のみである。実際に、単一種と仮定すれば、単一種から得られた分布を、良好にフィッティングできたのに対して、二成分混合物から得られた分布は、無作為に分布した残差（ｒａｎｄｏｍｌｙ ｓｃａｔｔｅｒｅｄ ｒｅｓｉｄｕａｌｓ）を得るためには、二成分分析が必要であった。示された新しい蛍光変動法は、２つの蛍光成分の分離、それらの濃度の決定並びに蛍光の比明度及び寿命におけるそれらの特徴付けのための高感度法として使用され得ることが、最初のテスト実験後、既に示された。但し、あらかじめ決定された値にさらに多くのパラメーターを固定することにより、統計的誤差を、大きく低減することができる；これは、薬剤スクリーニングにおける標準的な理解（ｇｒｉｐ）である。
【００８５】
実験３
式１２の加重値を用いて、多数の選択された場合における、本発明の理論的な誤差を算出し、蛍光強度分布分析（ＦＩＤＡ）及び蛍光寿命分析（ＦＬＡ）の対応する誤差と比較した。二成分の場合のいくつかの結果を、表２に示す。本発明による方法は、ＦＩＤＡ又はＦＬＡ（２つの特異的な量であるｑ及びτによって種が認識される場合）よりも質的に強力な方法であるだけでなく、その最適濃度範囲内で、その統計的誤差がより低いことを指摘する価値がある。ＦＩＬＤＡ及びＦＩＤＡが、本質的に変動法として、それらの能力を失うが、ＦＬＡは失わない、極めて高い濃度値においてのみ、ＦＬＡは、３つの方法の中で統計的に最も正確である。
【００８６】
【表２】
表２二成分ＦＩＬＤＡ（本発明）、ＦＩＤＡ（従来技術）及びＦＬＡ（従来技術）の統計的誤差
全ての場合に、Ｔ＝１００μｓ、ｃ１＝ｃ２、ｑ１＝５０ｋＨｚ、ｑ２＝２５ｋＨｚ、τ１＝３ｎｓ、τ２＝１．５ｎｓ、暗色カウント０．２ｋＨｚ、散乱カウント１ｋＨｚ、継続時間２０ｓ。
0004776854.tif 000038
【００８７】
【表３】
表３本発明によるＦＩＬＤＡ実験の結果
示した誤差値は、理論的加重値に対応する統計的誤差である。
0004776854.tif 000039
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｔ＝２ｓのデータ収集時間でのＢｏｄｉｐｙ６３０／６５０溶液からのＦＩＬＤＡヒストグラム（Ａ）、及び（Ａ）のＦＩＬＤＡヒストグラムに対する式１０のフィッティングの加重残差（式１２により加重）（Ｂ）を示す。
【図２】ＦＩＬＤＡ（本発明）、ＦＬＡ（従来技術）、及びＦＩＤＡ（従来技術）のＣＶ’ｓの蛍光種濃度への依存状態を示す。
【図３】ＦＩＬＤＡのＣＶ’ｓのデータ収集時間Ｔ（上方ｘ軸）への依存状態を示す。
【図４】ＦＩＬＤＡ（データ収集時間Ｔ＝２ｓ、１０回繰り返された測定の平均からの誤差バー）によってモニターした、ラベルされたターゲットペプチドＨ−ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＫ−ＮＨ２のカルモデュリンへの結合を示す。
【図５】実験２のヒストグラムの強度グラフの説明である。
【図６】本発明による方法の実施において使用される装置の一態様を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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