(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体を導入された混合体における液体の存在を検出する方法において、検出方法が：
前記液体を含んでいないけれども、波長λの励起信号の作用により蛍光波長λｉの蛍光信号を放出することができる少なくとも一つの成分Ｃｉを含んでいる第一混合体を作る段階（１）と；
前記波長λの光信号により前記第一混合体を励起する段階（２）と；
前記液体の前記蛍光信号の寿命τ１に近い時間Δｔの間に、前記第一混合体により放出された蛍光信号Ｓ１を測定する段階（３）であって、測定された前記蛍光信号Ｓ１の函数である基準量Ｒ０をもたらす（４）ようになっている、測定する段階（３）と；
前記第一混合体を作っている成分に同一な成分と、前記液体の所定量とから前記混合体を作る段階（５，１０）と；
波長λの光信号により、前記混合体を励起する段階（６）と；
前記液体の前記蛍光信号の寿命τ１に近い時間Δｔの間に前記混合体により放出された蛍光信号Ｓ１１を測定する段階（７）であって、測定された蛍光信号Ｓ１１の函数である量Ｒをもたらす（８）ようになっている、測定する段階（７）と；
量Ｒを量Ｋ×Ｒ０と比較する段階（９）であって、Ｒ０は基準量であり、Ｋは係数であって、前記Ｒ及びＲ０が同時に測定される場合Ｋは１より大きな係数となり、前記Ｒ及びＲ０が異なる時間に測定される場合Ｋ１は１より小さな係数となる段階と；
を含んでいることを特徴とする検出方法。
【請求項２】
前記混合体が、前記液体の前記所定量を前記第一混合体に導入すること（５）により作られることを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記液体の前記所定量が、ピペット操作により導入される（５）ことを特徴とする、請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記混合体が、前記液体の前記所定量を実質的に前記第一混合体と同一の第二混合体に混合することにより作られること（１０）を特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
【請求項５】
前記第一混合体と前記液体を含んでいる前記混合体とは、各々が構成される構成成分をピペット操作により作られることを特徴とする、請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
量Ｒ０及びＲが、それぞれ測定された蛍光信号Ｓ１及びＳ１１に等しいことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項７】
前記量Ｒ０が、時間Δｔに属さない集積時間ΔＴの間に測定された前記第一混合体により放出された蛍光信号Ｓ２に対する前記測定された蛍光信号Ｓ１の比率に等しいことと、前記量Ｒは、前記集積時間ΔＴの間に計測された前記混合体により放出された蛍光信号Ｓ２２に対する測定された蛍光信号Ｓ１１の比率に等しいこととを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項８】
第一成分Ｃ１が蛍光波長λ１に関連するものであり、そして第二成分Ｃ２が蛍光波長λ２に関連するものであって、蛍光信号Ｓ１及びＳ１１の波長は、前記蛍光波長λ１、λ２のどちらかであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項９】
前記第一成分Ｃ１が、緩衝剤で処理した希土類キレート又はクリプテートにより標識化された生物学的活性分子を含んでいる配合体であって、かつ前記第二成分Ｃ２が、緩衝剤で処理した蛍光アクセプター化合物により標識化された生物学的活性分子を含んでいる配合体であり、波長λはほぼ３００nmと４００nmとの間であり、波長λ１はほぼ５００nmと７５０nmとの間であり、波長λ２はほぼ５５０nmと８５０nmとの間であることを特徴とする、請求項８に記載の検出方法。
【請求項１０】
生物学的活性分子は、抗体、抗原、ペプチド、蛋白質、レセプター、リガンド、核酸、ヌクレオチド又は薬剤から選択されていることと；蛍光アクセプター化合物は、フィコビリンプロテイン（アロフィコシアニン、アロフィコシアニンＢ、Ｃ−フィコシアニン若しくはＲ−フィコシアニン）又は蛍光有機分子から選択されていることと；を特徴とする、請求項９に記載の検出方法。
【請求項１１】
蛍光信号Ｓ１１及びＳ２２の蛍光波長は、Ｓ１及びＳ２の蛍光波長がλ１である場合のλ１、又はＳ１及びＳ２の蛍光波長がλ２である場合のλ２のどちらかであることを特徴とする、請求項８が請求項７の従属請求項である場合の請求項８〜１０のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１２】
前記液体がしょう液であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１３】
前記第一混合体を作る段階（１）と、前記第一混合体を励起する段階（２）と、前記第一混合体により放出された蛍光信号の測定段階（３）とは、Ｍが１以上の整数であるＭ個のサンプルに対し実施されていることと；前記混合体がＮ個の独立ウェルにおいて作られ、ＮはＭ以上の整数であり、前記混合体を励起する段階と、前記混合体により放出された蛍光信号を測定する段階とが、Ｎ個の独立ウェル各々に対して実施されることと；を特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１４】
液体のピペット操作における誤操作において、誤操作が、請求項３、又は５、又は請求項６〜１３が請求項３の従属請求項である場合の請求項６〜１３のいずれか一項に記載の検出方法を利用していることを特徴とする誤差検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、混合体における液体の存在を検出する装置に関する。
【０００２】
本発明は、ピペット操作により混合体に導入された液体、例えばしょう液の存在を検出することに関連してより詳細に説明される。
【０００３】
液体のピペット操作は、吸引により液体をピペットに充填する操作である。ピペット操作は、例えば実験室において種々の液体を一般にウェルと呼ばれる試験セルに導入するために使われている。液体は、試験結果が有効なものとなるように十分な量を、試験セルに導入しなければならない。ピペット操作の間違いは重大な問題を引き起こす。これはとくに次のような場合であって、ピペット操作により吸引される液体が、例えばがんのスクリーニングのような病理スクリーニング試験を実施するためのしょう液の場合である。
【０００４】
ほとんどの自動分析器はピペット操作の誤差検出装置を備えていない。公知で唯一の装置は、ピペット操作時において実施される測定にもとづくものである。これらは、圧力測定（空気のピペット操作と液体のピペット操作との間における圧力差の測定）、あるいはピペット操作時における液体の検出信号の測定である。
【０００５】
米国特許第４７９４０８５号明細書は、液体のピペット操作の誤差検出装置を開示している。そのような装置は、大きくして使用することがむつかしい特殊な圧力測定手段の使用を必要とする。さらにピペット操作時における液体の途切れだけを検出することができる。途切れにもとづかない誤まったピペット操作を検出することはできない。
【０００６】
本発明は前述の欠点のないものである。
【０００７】
従って本発明は、混合体における液体の存在を検出する方法に関するものであって、検出方法が：
検出される液体を含んでいない第一混合体を作る段階と；
波長λの光信号により第一混合体を励起する段階と；
検出される液体の寿命τ１特性に近い時間Δｔを通して、第一混合体により放出された蛍光信号Ｓ１を測定する段階であって、測定された蛍光信号Ｓ１の函数である基準量Ｒ０をもたらすようになっている、測定する段階と；
第一混合体を作っている成分に同一な成分と、検出される液体の量とから混合体を作る段階と；
波長λの光信号により、混合体を励起する段階と；
寿命τ１に近い時間Δｔを通して、混合体により放出された蛍光信号Ｓ１１を測定する段階であって、測定された蛍光信号Ｓ１１の函数である量Ｒをもたらすようになっている、測定する段階と；
量Ｒを量Ｋ×Ｒ０と比較する段階と；
を含んでいることを特徴としている。
【０００８】
表現“寿命τ１に近い時間Δｔ”は、時間が寿命τ１に十分近いので、液体の存在している混合体において、検出された信号はこの液体が存在していることを疑う余地もなく示している。
【０００９】
本発明の第一実施例において、混合体は、検出される液体の量を第一混合体に導入することにより作られる。
【００１０】
本発明の第二実施例において、混合体は、検出される液体の量を第一混合体と実質的に同一の第二混合体に混合することにより作られる。
【００１１】
検出される液体を含んだ混合体はＮ個の独立ウェルに分配されてもよくて、Ｎは整数である。第一混合体を作る段階と、第一混合体を励起する段階と、第一混合体により放出された蛍光信号の測定段階と、基準量Ｒ０の計算段階とは、Ｍが１以上でＮ以下の整数であるＭ個のサンプルに対し実施されており；ところが混合体を励起する段階と、混合体により放出された蛍光信号を測定する段階と、量Ｒを計算する段階と、ＲとＫ×Ｒ０とを比較する段階とが、Ｎ個の独立ウェル各々に対して実施されている。
【００１２】
混合体を作る際、検出される液体のピペット操作が介在する場合、本発明による方法は、ピペット操作の誤差を検出できるようになっている。従って本発明は、液体のピペット操作における誤差検出方法に関するものでもあって、その誤差検出方法は、本発明による前述の方法のような液体の存在検出方法を使用していることを特徴としている。
【００１３】
さらに、液体の存在は非常に精度高く検出することができる。定性的測定（液体の存在：有無）だけではなく定量的な測定をも可能としている。本発明の他の利点は、液体を混合体に導入した後は、いつでも液体の検出が可能なことである。
【００１４】
本発明のさらなる特徴と利点とは、添付図面を参照して本発明の実施例の説明を検討することにより明瞭になるであろう。
【００１５】
すべての図において、同一符号は同一部品を示している。
【００１６】
以下の説明において、存在を検出される液体は、限定するものではないが例としてしょう液（serum ）である。しかしながら本発明は、時間分散蛍光発光（emission of time-resolved fluorescence）により検出可能なより一般的ないずれの種類の液体にも関するものである。
【００１７】
図１は本発明による液体の存在検出方法の第一実施例のフローチャートを示す。
【００１８】
本発明の第一実施例による方法は、第一混合体を作る段階から始まる。第一混合体はどのようなしょう液も含んでいない。第一混合体は、波長λの励起信号の作用により、波長λｉの蛍光信号を放射することが可能な少なくとも一つの成分Ｃｉを含んでいる。
【００１９】
波長λの光信号により第一混合体を励起する段階２が段階１に続く。波長λの光信号の作用により、蛍光信号が混合体の一成分（又は複数成分）Ｃｉにより放出される。
【００２０】
複数成分の混合体による蛍光信号の発光により生じる逆励起の時間分散スペクトルの解析は、パルス励起として放出された信号が個々の信号の合計であって、個々の信号各々は混合体の一つの成分Ｃｉの特性であることを示している。従って、蛍光信号Ｆは以下の式で表わすことができて：
Ｆ＝Σ（Ａｉ×ｅｘｐ（−ｔ／τｉ））、
上式においてＡｉ及びτｉは、成分Ｃｉの個々の信号特性における振幅と寿命とをそれぞれ表わしている。
【００２１】
しょう液の場合、例えば、陽子で計数するために使用するフォトマルチプライヤーにもとづく読取装置を介して見られる蛍光信号は、Ｓμｓオーダの表命τ１により特性づけられる。
【００２２】
蛍光測定段階３が励起段階２に続く。蛍光信号Ｓ１は、検出する信号の寿命特性に近い時間幅Δｔ内で測定される。検出される液体がしょう液の場合Δｔは、例えば、混合体の励起直後から始まる時間間隔（５μｓ、２０μｓ）である。従って測定された信号は、計算段階４における基準量Ｒ０の計算に使用される。
【００２３】
本発明の方法の第一変更例において、基準量Ｒ０は測定された信号Ｓ１に等しい。第二変更例において、第二蛍光信号Ｓ２は、段階３において、時間Δｔに属さない時間幅ΔＴにおいて測定される。時間幅ΔＴは、例えば、混合体の励起直後から継続する時間間隔（１００μｓ、３０００μｓ）であってもよい。従って、段階４において計算された基準量Ｒ０は信号Ｓ２に対する信号Ｓ１の比率に等しくなる。
【００２４】
本発明の方法の第二変更例においてＲ０は次のように表わすことができる：
Ｒ０＝Ｓ１／Ｓ２
【００２５】
基準量Ｒ０をＳ１とＳ２との比率の形で確立することの利点は以下で明らかにされる（例えば段階８）。
【００２６】
蛍光が測定されると、しょう液は段階５において混合体に導入される。波長λの信号により混合体を励起する段階６が、段階５に続き、そして新しく蛍光を測定する（段階７）が段階６に続く。従って、蛍光信号Ｓ１１は前述したように時間幅Δｔにおいて測定される。続いて段階８において、Ｓ１１は、混合体に存在するしょう液量の函数である量Ｒの計算に使用される。
【００２７】
本発明の方法の前述した第一変更例において、量Ｒは測定された信号Ｓ１１に等しい。第二変更例において、第二信号Ｓ２２が段階７で測定される。信号Ｓ２２は前述したように時間幅ΔＴにおいて測定される。段階８において計算された量Ｒは、従って信号Ｓ２２に対する信号Ｓ１１の比率に等しくなる。従ってＲは次のように表わすことができる：
Ｒ＝Ｓ１１／Ｓ２２
【００２８】
信号Ｓ１１は検出されたしょう液の量に比例している。信号Ｓ１１を信号Ｓ２２で割り算した因数は、しょう液に誘発された、混合体の光学的吸収率を考りょすることにより、測定値Ｓ１１を基準化することを可能にしている。従って、量Ｒは、しょう液の吸収特性とは無関係で、しょう液信号の相対レベルだけを表わしている。
【００２９】
量ＲとＫ×Ｒ０に等しい量との間の比較が行なわれる（段階９）。ＲがＫ×Ｒ０以上である場合、段階５において混合体へ導入されたしょう液量は十分なものと見なされる。導入量が不十分と見なされる場合、しょう液を導入する新しい段階が実施される（段階５へもどる）。例えばどのような正しくない検出をも回避するために、係数ＫはＲの静的変動を考りょして選択することができる。Ｒ及びＲ０が誘導サイクルにおいて実質的に同時に測定される場合、係数Ｋは１より大きい数となる。Ｒ及びＲ０が誘導サイクルにおいて実質的に異なる時点で測定される場合、誘導時における信号変動のために、係数Ｋは１未満となるかも知れない。
【００３０】
ある用途において、試験する成分の混合体が独立したＮ本のウェルに分配される。段階２、３及び４はＮ本のウェルの数本だけあるいは１本だけに対して実施されるのに対し、段階５、６、７、８及び９はＮ本すべてに関係している。
【００３１】
図２は、本発明による検出方法の第二実施例のフローチャートを示している。
【００３２】
本発明の検出方法の第二実施例も、前述したような、第一混合体を作る段階（１）と、第一混合体の励起段階（２）と、第一混合体により発光された蛍光信号の測定段階（３）と、基準量Ｒ０の計算段階（４）とを含んでいる。
【００３３】
本発明の第二実施例において、検出される液体を含んでいる混合体が、検出される液体を第一混合体に導入することによるのではなく、検出される液体量を第一混合体と実質的に同一である第二混合体に混合することにより作られる（段階１０において）。表現“第一混合体と実質的に同一である第二混合体”は、第二混合体が第一混合体と実質的に同一量の同一成分を含んでいるとの意味であることを理解するべきである。検出される液体を含んでいる混合体は、混合体を構成する種々の構成成分をピペットで操作することにより作られてもよい。
【００３４】
混合体が製造されると、本発明の第二実施例には、混合体の励起（段階６）と蛍光の測定（段階７）と量Ｒの計算（段階８）との連続する段階が含まれている。続いて量Ｒは量Ｒ０と比較される（段階９）。ＲがＫ×Ｒ０以上である場合、段階１０において作られた混合体におけるしょう液含有量は十分であると見なされる。しょう液量が不十分であると見なされる場合新しい混合体が作られねばならない（段階１０へ戻る）。
【００３５】
本発明の第二実施例の変更例において、第一混合体も波長λにおいて蛍光特性を示さない液体を含んでいる。蛍光特性の観点からすると不活性なこの液体は、第一混合体が検出される液体を含んでいる混合体の全体積に実質的に同一な全体積となることを可能にしている。従って測定装置の最適設定を保証することが可能となる。
【００３６】
一般に本発明は、存在を検出される液体以外の混合体の成分も時間分散蛍光により測定する場合の用途においても特に利点のあることが判明している。
【００３７】
従って、意図する蛍光を測定するために使用する装置は、混合体に存在している液体が十分であるかどうかを示す測定を行なうためにも使用することができる。従って利点のあることに、液体検出用のさらなる装置は必要とされない。
【００３８】
これは、例えば蛍光同位体を用いた免疫試験のような生物検定を行なう場合である。欧州特許出願公開第５３９４７７号明細書に開示されているような、均一相における時間分散蛍光を用いた免疫試験の場合、成分の混合体はドナー配合体（donor conjugate ）とアクセプター配合体（acceptor comjugate）とを含んでいる。ドナー配合体は、緩衝剤で処理した希土類キレートあるいはクリプテートにより標識化された、生物学的活性分子を含んでいてもよくて、アクセプター配合体は、緩衝剤で処理した蛍光アクセプター化合物により標識化された生物学的活性分子を含んでいてもよい。これに制限するものではないが例として、生物学的活性分子は、抗体、抗原、ペプチド、蛋白質、レセプター、リガンド、核酸、ヌクレオチド又は薬剤から選択されてもよくて、蛍光アクセプター化合物は、蛍光フィコビリンプロテイン（アロフィコシアニン、アロフィコシアニンＢ、Ｃ−フィコシアニン若しくはＲ−フィコシアニン）又は蛍光有機分子から選択されてもよい。
【００３９】
これらの生物検定に使用された希土類のクリプテートは、出願人CIS BIO International により出願された欧州出願公開第１８０４９２号（ＥＰ０１８０４９２）、第３２１３５３号（ＥＰ０３２１３５３）及び第６０１１１３号（ＥＰ０６０１１１３）明細書に開示されている。
【００４０】
図３に図示した装置は、前述したような生物検定用の蛍光測定装置を示している。例示として図３に例示の装置は、本発明による方法を実施するための時間分散式蛍光測定装置の実施例である。
【００４１】
これに限定するものではないが、以下の説明における例において、ドナー配合体は緩衝剤で処理したユーロピウム・クリプテートにより標識化された抗体を含んでいる配合体であり、アクセプター配合体は蛍光アクセプター化合物により標識化された抗体を含んでいる配合体である。混合体に導入される液体はしょう液である。
【００４２】
図３における装置は、３３７nmの波長を放出する窒素レーザ源１１と、３３７nm帯域用バンドパスフィルタ１３に接続した焦点合わせ用レンズ１２と、ダイクロイックミラー１４と、集光対物レンズ１５と、ダイクロイックビームスプリッタ１６と、焦点合わせ用レンズ１８に接続した６６５nm帯域用バンドパスフィルタ１７と、焦点合わせ用レンズ２０に接続した６２０nm帯域用バンドパスフィルタ１９と、６６５nmの波長の陽子検出用フォトマルチプライヤーＰＭＴＡと、６２０nmの波長の陽子検出用フォトマルチプライヤーＰＭＴＢと、調査される混合体（アクセプター配合体、ドナー配合体及びしょう液）の入っている試験セル２１とを備えている。
【００４３】
ダイクロイックミラー１４は、レーザ源１１により放出された光を、焦点を合わせ（１２）かつフィルタ（１３）した後に試験セル（２１）へ導入することを可能にしている。混合体の成分は受光した光により励起される。アクセプターにより放出された６６５nmの波長における検量用蛍光信号はフォトマルチプライヤーＰＭＴＡにより測定される。同時にユーロピウム・クリプテートにより放出された６２０nmにおける蛍光信号はフォトマルチプライヤーＰＭＴＢにより測定される。ユーロピウム・クリプテートにより放出された信号は基準信号として使用される。測定結果は、ユーロピウム・クリプテートにより放出された基準信号に対する、アクセプターにより放出された検量用信号の比率の形になる。従って励起エネルギのあるいは放射エネルギの吸収は、比率を修正することなしに弱い信号を提供することができる。
【００４４】
図３に図示するような装置を使用している本発明による方法の実施に関連して、波長λの励起信号は、レーザ源１１により放出された３３７nmの波長の信号であって、しょう液の寿命τ１に近い時間Δｔを通して測定された信号Ｓ１及びＳ１１は、波長が６２０nmか６６５nmかのどちらかに等しい信号であり、さらに時間Δｔに属さない時間ΔＴを通して測定された信号Ｓ２及びＳ２２は、波長が６２０nmか６６５nmかのどちらかに等しい信号である。
【００４５】
前述したように、図３における蛍光測定装置はドナー配合体及びアクセプター配合体における広範囲に使用することができる。従ってレーザ源１１は、波長がほぼ３００nmと４００nmとの間で変化する光源であってもよい。同様に、ドナー配合体により放出された蛍光信号は、ほぼ５００nmと７５０nmとの間で変化する波長λ１であってもよく、さらにアクセプター配合体により放出される蛍光信号は、ほぼ５５０nmと８５０nmとの間で変化する波長λ２であってもよい。
【００４６】
従って本発明による方法は、励起信号の波長が、例えばほぼ３００nmと４００nmとの間にあって、さらに蛍光信号Ｓ１、Ｓ２、Ｓ１１及びＳ２２の波長が、例えば〔５００nm−７５０nm〕の範囲に、又は〔５５０nm−８５０nm〕の範囲にある、実施例にも関連する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明による検出方法の第一実施例のフローチャートを示す。
【図２】  図２は、本発明による検出方法の第二実施例のフローチャートを示す。
【図３】  図３は、本発明による検出方法を実施するための計測装置の実施例を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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