(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を経て調製される、ほ乳動物の心臓組織由来の多能性幹細胞を調製する方法であって、前記多能性幹細胞が少なくとも心筋細胞、平滑筋細胞、及び血管内皮細胞に分化する能力を有するものである前記方法：
（ｉ）ほ乳動物から採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製する工程、
（ｉｉ）密度勾配法により、上層に細胞破砕物及び底に血球成分を分画して、上記細胞懸濁液から心臓組織由来細胞群を界面に存在する細胞集団として分離する工程、及び
（ｉｉｉ）得られた心臓組織由来細胞群を、繊維芽細胞成長因子及び上皮細胞増殖因子を含有する培地で浮遊培養した後、浮遊状のスフェアーを形成している細胞を選択し分離する工程。
【請求項２】
多能性幹細胞が、ｃ−ｋｉｔ陰性及びＣＤ３４陰性である、請求項１に記載の調製方法。
【請求項３】
多能性幹細胞が、更にＣＤ１０５陽性である、請求項２に記載の調製方法。
【請求項４】
多能性幹細胞がヒト由来である、請求項１に記載の調製方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載の調製方法によって得られる、ヒトの心臓組織由来であって、ｃ−ｋｉｔ陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１０５陽性及びＣＤ９０陽性であり、心筋細胞、平滑筋細胞、及び血管内皮細胞に分化する能力を有する、分離された多能性幹細胞。
【請求項６】
ヒトの心臓組織由来であって、ｃ−ｋｉｔ陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１０５陽性及びＣＤ９０陽性であり、心筋細胞、平滑筋細胞、及び血管内皮細胞に分化する能力を有する、分離された多能性幹細胞。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の幹細胞、及び薬学的に許容される担体を含有する、組織又は臓器の疾患の治療用組成物。
【請求項８】
請求項５又は６に記載の幹細胞、及び薬学的に許容される担体を含有する、心疾患の治療用組成物。
【請求項９】
請求項５又は６に記載の幹細胞の、心疾患の治療用組成物を調製するための使用。
【請求項１０】
請求項５又は６に記載の幹細胞の、組織又は臓器の疾患の治療用組成物を調製するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心臓組織由来の多能性幹細胞、特に心筋細胞への分化能に優れている多能性幹細胞に関する。更に、本発明は、該幹細胞の調製方法、及び該幹細胞を利用した心疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医学において、幹細胞を移植することにより、目的とする組織及び臓器を修復し、再生する医療技術が精力的に研究されている。これまでに、各種組織や臓器の成熟細胞に分化する幹細胞が見出され、細胞移植への臨床的応用が検討されている。【０００３】
例えば、心臓組織由来の心筋幹細胞として、c-kit陰性／CD31陽性／CD34陰性／Sca-1陽性のマウス幹細胞（非特許文献１参照）やc-kit陽性／CD31陽性／CD34陽性のラット幹細胞（非特許文献２及び３参照）が報告されている。しかしながら、前者の心筋幹細胞ではヒトでの検討はなされておらず、臨床的に実用できるかが明らかにされていない。また、後者の心筋幹細胞では、単離が極めて困難であることに加え、増殖能が乏しく移植目的の大量培養に適していないという欠点がある。また、上記の両心筋幹細胞は、多能性幹細胞ではなく、あくまで心臓への細胞移植にのみに適用されるものである。【０００４】
また、心筋幹細胞に関しては、心臓組織由来の心筋幹細胞の他に、骨髄由来の造血細胞や間葉系幹細胞を中心に心筋細胞に分化する幹細胞の検索が行われているが、従来報告されている細胞では、心筋細胞への分化度は極めて低く、臨床的に実用できるものではない。【０００５】
このように、幹細胞として機能し得る細胞は見出されていても、実際に臨床的に実用可能なものは殆ど知られていないのが現状である。このような従来技術を背景として、心筋細胞を初めとする各種成熟細胞への分化能を有し、再生治療方法に実用可能な多能性幹細胞の開発が望まれている。【０００６】
なお、これまでに、筋肉起源のc-kit陰性／c-met陰性／CD34陰性／Sca-1陰性／Pax(3/7)陰性の心筋細胞前駆細胞は、自発的に拍動する心筋細胞への分化能を有していることが報告されている（特許文献１参照）。しかしながら、この特許文献１に記載された幹細胞は、筋肉を起源とすることにより単離できるものであり、心臓組織からは単離できないことが分かっている（特許文献１の実施例１１参照）。
【特許文献１】ＷＯ２００３／０３５８３８
【非特許文献１】Oh H., et. Al., “Cardiac progenitor cells from adult myocardium: Homing, differentiation, and fusion after infarction”, Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 100, 12313-12318, October 14, 2003
【非特許文献２】Messina E., et. Al., “Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart”, Circ Res., Vol. 95, 911-921, 2004
【非特許文献３】Beltrami AP., et. Al., “Adult cardiac stem cells aremultipotent and support myocardial regeneration”, Cell, Vol. 114, 763-776, September 19, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、上記従来技術の課題を解決することである。詳細には、本発明は、再生治療方法に実用可能な幹細胞を提供すること、及び該細胞を利用して再生治療を行う技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製し、該細胞懸濁液を利用して、(1)密度勾配法による細胞の分離、(2)繊維芽細胞成長因子及び上皮細胞増殖因子を含有する培地での浮遊培養、(3)浮遊状のスフェアーを形成している細胞塊を選択分離することにより、特に心筋細胞への分化能に優れた多能性幹細胞が得られることを見出した。また、該幹細胞は、上記した分化能のみならず、自己複製能の点でも優れており、細胞移植による再生治療に実用化できることを確認した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に検討を重ねることによって完成したものである。【０００９】
即ち、本発明は、下記に掲げる多能性幹細胞の調製方法を提供する：
項１．  下記工程を経て調製される、ほ乳動物の心臓組織由来の多能性幹細胞を調製する方法：
(i)ほ乳動物から採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製する工程、
(ii)密度勾配法により、上記細胞懸濁液から心臓組織由来細胞群を分離する工程、及び
(iii)得られた心臓組織由来細胞群を、繊維芽細胞成長因子及び上皮細胞増殖因子を含有する培地で浮遊培養した後、浮遊状のスフェアーを形成している細胞を選択し分離する工程。
項２．  多能性幹細胞が、c-kit陰性、CD31陰性及びCD34陰性である、項１に記載の調製方法。
項３．  多能性幹細胞が、更にCD105陽性である、項２に記載の調製方法。
項４．  多能性幹細胞がヒト由来である、項１に記載の調製方法。
項５．  多能性幹細胞が、少なくとも心筋細胞に分化する能力を有するものである、項１に記載の調製方法。
項６．  多能性幹細胞が、心筋細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、グリア細胞、及び上皮細胞よりなる群から選択される１種又は２種以上の細胞に分化する能力を有するものである、項１に記載の調製方法。【００１０】
また、本発明は、下記に掲げる多能性幹細胞を提供する：
項７．  項１乃至６のいずれかに記載の調製方法によって得られる、ほ乳動物の心臓組織由来の多能性幹細胞。
項８．  c-kit陰性、CD31陰性及びCD34陰性である、ほ乳動物の心臓組織由来の多能性幹細胞。
項９．  CD105陽性である、項８に記載の幹細胞。
項１０．  ほ乳動物がヒトである、項８に記載の幹細胞。
項１１．  少なくとも心筋細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞である、項８に記載の幹細胞。
項１２．  心筋細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、グリア細胞、及び上皮細胞よりなる群から選択される１種又は２種以上の細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞である、項８に記載の幹細胞。【００１１】
また、本発明は、下記に掲げる治療方法を提供する：
項１３．  項８乃至１２のいずれかに記載の幹細胞の治療有効量を、患者の組織又は臓器に移植することを特徴とする、組織又は臓器の疾患の治療方法。
項１４．  心疾患の治療方法である、項１３に記載の治療方法。
項１５．  心疾患の治療方法であって下記工程を含有する、項１３に記載の治療方法：
(i)ヒトから採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製する工程、
(ii)密度勾配法により、上記細胞懸濁液から心臓組織由来細胞群を分離する工程、
(iii)得られた心臓組織由来細胞群を、繊維芽細胞成長因子及び上皮細胞増殖因子を含有する培地で浮遊培養した後、浮遊状のスフェアーを形成している細胞を選択し分離する工程、
(iv)上記工程(iii)で分離した細胞を増殖させる工程、及び
(v)上記工程(iv)で増殖させた細胞の治療有効量を心疾患の患者の心臓に移植する工程。【００１２】
更に、本発明は、下記に掲げる組成物を提供する：
項１６．  項８乃至１２のいずれかに記載の幹細胞、及び薬学的に許容される担体を含有する、組織又は臓器の疾患の治療用組成物。
項１７．  項８乃至１２のいずれかに記載の幹細胞、及び薬学的に許容される担体を含有する、心疾患の治療用組成物。【００１３】
そして更に、本発明は、下記に掲げる態様の幹細胞の使用を提供する：
項１８．  項８乃至１２のいずれかに記載の幹細胞の、心疾患の治療用組成物を調製するための使用。
項１９  項８乃至１２のいずれかに記載の幹細胞の、組織又は臓器の疾患の治療用組成物を調製するための使用。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、心臓組織に由来し、心筋細胞、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞等に分化して、心臓を初めとする各種組織や臓器を再生できる幹細胞を提供する。故に、本発明の多能性幹細胞によれば、細胞移植という新たな手法により、各種組織や臓器の疾患の治療が可能になる。【００１５】
また、本発明の多能性幹細胞は、心臓組織由来の細胞群を特定条件下で浮遊培養し、浮遊状態のスフェアーを取得するという簡便な方法で取得できるという利点があり、臨床上の有用性が高い。また、このように浮遊状態のスフェアーを取得することにより、単一細胞から増殖した幹細胞が選択分離されるので、幹細胞自体の均一性が高いという利点も得られ、臨床上の有用性が高い。【００１６】
更に、本発明の多能性幹細胞は、特に心筋細胞への分化能が優れているので、心臓移植に頼らざるを得ない重症心不全患者に細胞移植による新たな治療方法を提供でき、心臓移植に替わる心臓疾患の治療方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】パーコールの密度勾配遠心法により分離したマウス由来の心臓組織由来細胞群を浮遊培養した後に形成された浮遊状のスフェアー（細胞塊）を示す写真である。図１中、Ａ、Ｃ、Ｅ及びＧは蛍光顕微鏡にて撮影した写真を示し、Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＨは位相差顕微鏡により撮影した写真であり、ＡとＢ、ＣとＤ、ＥとＦ、ＧとＨは、それぞれ同一視野を撮影したものである。Ａ及びＢは、野生型マウス由来のスフェアーとGFP発現マウス由来のスフェアーが混在して浮遊している状態を示している。Ｃ及びＤは、GFP発現マウス由来のスフェアーを示している。Ｅ及びＦは、野生型マウス由来のスフェアーを示している。Ｇ及びＨは、野生型マウス由来の細胞とGFP発現マウス由来の細胞が混合して形成されているスフェアーを示している。
【図２】マウス由来のスフェアー形成細胞の各種細胞表面抗原（Sca-1、c-kit、CD34、CD45、CD31、CD38、CD90及びCD105）をFACS分析した結果である。図中、太(濃)線がスフェアー形成細胞の分析結果であり、細(薄)線がコントロール（標識無しの細胞）の分析結果である。
【図３】マウス由来のスフェアー形成細胞及びES細胞における各種マーカー（Bmi 1、TERT、Bcrp 1、Oct 4、UTF 1、Nanog、Brachyury、Sox 2、Nestin、Islet 1）の発現をPCRにより分析した結果を示す図である。なお、本分析では、GAPDHをコントロールとした。
【図４】パーコールの密度勾配遠心法により分離したマウス由来の心臓組織由来細胞群を浮遊培養した後に形成された浮遊状のスフェアーについて、ブロモデオキシウリジン（BrdU）の発現を観察した結果を示す図である。図中、ＡはBrdU染色したスフェアーの像を示し、ＢはＡの位相差像を示す。
【図５】パーコールの密度勾配遠心法により分離したマウス由来の心臓組織由来細胞群を浮遊培養した後に形成された浮遊状のスフェアーについて、テロメラーゼの発現を分析した結果を示す図である。
【図６】GFP発現マウス由来のスフェアー形成細胞を心筋細胞に分化誘導する過程において観察した細胞の形状を示す図である。図６中、Ａは蛍光観察した像を示し、ＢはＡと同一視野の位相差像を示す。
【図７】マウス由来のスフェアー形成細胞から分化した心筋細胞の写真である。図７中、ＢはＡを拡大したものである。
【図８】スフェアー形成細胞から分化した心筋細胞の各種マーカー（Nkx 2.5、GATA 4、ANP、トロポニン−I(TnI)、MLC2v、MLC2a、α-MHC(α-myosin heavy chain)、β-MHC(β-myosin heavy chain)、GAPDH）の発現をPCRにより分析した結果を示す図である。
【図９】スフェアー形成細胞、及び該細胞から分化した各種細胞の写真を示す図である。図９中、Ａはスフェアー形成細胞；Ｂはスフェアー形成細胞から分化した平滑筋細胞；Ｃはスフェアー形成細胞から分化した血管内皮細胞；Ｄはスフェアー形成細胞から分化した脂肪細胞；Ｅはスフェアー形成細胞から分化したグリア細胞；及びＦはスフェアー形成細胞から分化した上皮細胞を示す。
【図１０】実施例１で得られたマウス由来スフェアー形成細胞（多能性幹細胞）をマウス梗塞心筋に移植し、該細胞のマウスの心筋における生着の状態を示す図である。Ａは、ホスト心筋におけるスフェアー形成細胞（緑色）の生着を示す図である。Ｂは、Ａ図と同一視野において、cTnT染色（赤色を呈する）した結果を示す図である。Ｃは上記Ａ及びＢを重ね合わせた図であり、ＤはＣを拡大した図である。
【図１１】パーコールの密度勾配遠心法により分離したヒト由来の心臓組織由来細胞群を浮遊培養した後に形成された浮遊状のスフェアー（細胞塊）を示す写真である。図１１中、Ａは培養１日後に観察されたスフェアーを示し、Ｂは培養７日後に観察されたスフェアーを示す。
【図１２】ヒト由来のスフェアー形成細胞の各種マーカー（Rex 1、TERT、Oct 4、Nanog、Brachyury、Sox 2）の発現をPCRにより分析した結果を示す図である。
【図１３】ヒト由来のスフェアー形成細胞の各種細胞表面抗原（c-kit、CD34、CD90及びCD105）をFACS分析した結果である。図中、太(濃)線がスフェアー形成細胞の分析結果であり、細(薄)線がコントロール（標識無しの細胞）の分析結果である。
【図１４】ヒト由来のスフェアー形成細胞から分化した心筋細胞の写真である。
【図１５】ヒト由来スフェアー形成細胞から分化した心筋細胞の各種マーカー（Nkx-2.5、GATA4、ANP、α-ca-actin、TnT、MLC2v、MLC2a、α-MHC(α-myosin heavy chain)、β-MHC(β-myosin heavy chain)）の発現をPCRにより分析した結果を示す図である。なお、本分析では、βactinをコントロールとした。
【図１６】ヒト由来スフェアー形成細胞から分化した平滑筋細胞の写真である。
【図１７】ヒト由来スフェアー形成細胞から分化した平滑筋細胞の各種マーカー（SM-22α及びcalponin）の発現をPCRにより分析した結果を示す図である。なお、本分析では、βactinをコントロールとした。
【図１８】ヒト由来スフェアー形成細胞から分化した血管内皮細胞の写真である。
【図１９】ヒト由来スフェアー形成細胞から分化した血管内皮細胞の各種マーカー（CD31及びVEGF-R2）の発現をPCRにより分析した結果を示す図である。なお、本分析では、βactinをコントロールとした。
【図２０】実施例３で得られたヒト由来スフェアー形成細胞（多能性幹細胞）をマウス梗塞心筋に移植し、該細胞のマウスの心筋における生着の状態を示す図である。Ａは、ホスト心筋において、ヒト由来スフェアー形成細胞が心筋細胞に分化し、生着した細胞（cTnI染色により赤色を呈する）を示す図である。Ｂは、Ａと同一視野においてDAPIを用いて細胞内の核を青色に染色した図と、Ａを重ね合わせた図である。Ｃは、心筋梗塞中心部にも、ヒト由来スフェアー形成細胞が分化した心筋細胞（cTnI染色により赤色を呈する）が生着していることを示している図である。Ｄは、菲薄化した梗塞巣内に、ヒト由来スフェアー形成細胞が心筋細胞に分化して生着した細胞（cTnI染色により赤色を呈する）を示している図である。Ｅは、Ｄと同一視野においてDAPIを用いて細胞内の核を青色に染色した図と、Ｄを重ね合わせた図である。Ｆは、DAPIを用いて青色に染色された核と、CD31の染色により赤色に染色されたCD31陽性血管内皮細胞を示す図であり、ヒト由来スフェアー形成細胞から分化したCD31陽性血管内皮細胞が生着していることを示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。【００１９】
Ａ．本発明の幹細胞の調製方法
以下、本発明の多能性幹細胞の調製方法を工程毎に詳述する。
１．細胞懸濁液の調製
まず、ほ乳動物から採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製する（工程(i)）。【００２０】
本発明では、多能性幹細胞の採取源となる心臓組織は、ほ乳動物由来のものである限り、特に制限されない。本発明において、ほ乳動物としては、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サル、ヒト等が挙げられる。調製される多能性幹細胞をヒトの心疾患の治療に使用する場合には、ヒト由来であることが好ましい。また、本工程で使用される心臓組織の部位についても特に制限されるものではない。【００２１】
ほ乳動物からの心臓組織片の採取は、通常の外科的手法により心臓組織片を摘出することにより行われる。また、摘出された心臓組織片は、酵素処理に先立って、心臓組織以外の組織（例えば、血管、神経組織等）を極力取り除いておくことが望ましい。また、酵素処理の効率を高めるために、採取された心臓組織片は、約１ｍｍ３以下の断片になるまで細切した後に酵素処理に供することが望ましい。【００２２】
また、酵素処理は、生体組織片から細胞懸濁液を調製する際に一般的に使用される酵素を使用して行われる。使用される酵素として、具体的には、コラーゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン等のプロテアーゼが例示される。これらの中で、好ましくはコラーゲナーゼが挙げられる。かかるコラーゲナーゼとして、具体的には、collagenase type 2（Worthington社製；205U/mg）が例示される。なお、本明細書において、コラーゲナーゼ１Ｕとは、ｐＨ7.5、37℃、５時間で、コラーゲンから１μモルのＬ−ロイシンを遊離できる酵素量を表す。【００２３】
また、酵素処理条件についても、特に制限されないが、一例として、下記酵素処理条件が例示される：
酵素濃度：例えば、collagenase type 2（Worthington社製；205U/mg）を使用する場合であれば、マウス由来の心筋組織を処理する場合、通常0.1〜0.3重量％、好ましくは0.2重量％程度；ヒト由来の心筋組織を処理する場合、通常0.2〜0.6重量％、好ましくは0.4重量％程度となる濃度が挙げられる。また、例えば、酵素濃度は、心筋組織100mg当たり、通常4100〜12300Ｕ、好ましくは8200Ｕ程度となる濃度が例示される。
処理温度：通常37℃程度となる温度が挙げられる。
処理時間及び回数：通常20〜30分の処理時間で酵素処理を2回繰り返す条件、好ましくは20分程度の処理時間で酵素処理を2回繰り返す条件が挙げられる。【００２４】
斯くして得られた細胞懸濁液は、酵素処理後に、遠心分離して上清を除去し、細胞の生育に適した培地を添加しておくことが望ましい。細胞の生育に適した培地としては、例えば１０容量％び牛胎児血清（ＦＢＳ）及び1容量％のペニシリン−ストレプトマイシン（5000U/ml penicillin及び5000μg/ml streptomycin sulfateの混合物）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）培地が例示される。【００２５】
２．心臓組織由来細胞群の分離
次いで上記細胞懸濁液から、密度勾配法により心臓組織由来細胞群を分離する（工程(ii)）。【００２６】
本工程において、心臓組織由来細胞群の分離は、細胞の分離に通常採用されている密度勾配法により実施することができる。心臓組織由来細胞群の分離の好ましい実施態様の一例として、パーコール（percoll）の密度勾配遠心法により心臓組織由来細胞群を分離する方法が例示される。パーコールの密度勾配遠心法は、シリカゲルの一種であるパーコールを用いて遠心分離する公知の方法であり、パーコールを層状に用いているため、遠心力により細胞を破壊することなく分離することができる。【００２７】
パーコールの密度勾配遠心法により、上記細胞懸濁液から目的の幹細胞を含む心臓組織由来細胞群を分離するには、例えば、上記細胞懸濁液を、３０容量％パーコール溶液及び７０容量％パーコール溶液からなる不連続密度勾配にて、室温で１０００Ｇで２０分間遠心分画すればよく、これによって３０容量％パーコール溶液と７０容量％パーコール溶液の界面に、目的の幹細胞を含む心臓組織由来細胞群が得られる。【００２８】
３．多能性幹細胞の分離
次いで、上記工程(ii)で得られた心臓組織由来細胞群を、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ；epidermal growth factor）及び繊維芽細胞成長因子(ＦＧＦ；fibroblast growth factor)を含有する培地で浮遊培養した後に、浮遊状のスフェアー（細胞塊）を形成している細胞を選択し分離する（工程(iii)）。【００２９】
当該浮遊培養に先立って、上記工程(ii)で得られた心臓組織由来細胞群を更に酵素処理に供して、細胞同士の結合や付着を解消しておくことが望ましい。かかる酵素処理の具体的方法については、特に制限されず、プロテアーゼ等を使用した公知の方法により行うことができる。該酵素処理の一例として、心臓組織由来細胞群を０．０５重量％のトリプシン及び０．５３ｍＭのＥＤＴＡを含有する溶液で、３７℃で１０分間程度処理する方法が例示される。また、当該酵素処理後にはプロテアーゼ阻害剤を添加し、プロテアーゼ活性を失活させた後に本工程(iii)に供されることが望ましい。【００３０】
本工程で使用される培地は、通常の細胞培養（浮遊培養）に使用される培地に、上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子が添加されていればよい。該培地の好適なものとして、例えば、ヒト血清又は牛血清アルブミンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２ＨＡＭ培地に、上記上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子が添加されてる培地が例示される。また、本工程で使用される培地は、必要に応じて、ストレプトマイシン、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質；B27サプリメント（GIBCO社製）；HEPES（5mM）等を含有していてもよい。【００３１】
また、本工程で培地に添加される上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子の割合については、例えば、上皮細胞増殖因子が10〜20ng/ml、好ましくは20ng/ml程度であり、繊維芽細胞成長因子が10〜40ng/ml、好ましくは40ng/ml程度が例示される。【００３２】
本工程において、培養開始時の細胞濃度が1×104〜2×104cells/ml、好ましくは2×104cells/mlとなるように設定して、培養を行うことが望ましい。【００３３】
本工程における浮遊培養は、通常３７℃で、５％ＣＯ２下で、通常14〜21間、好ましくは14日間行う。【００３４】
斯くして培養を行うことにより、多能性幹細胞が細胞分裂を繰り返してスフェアー（細胞塊）を形成し、これが培養液中に浮遊する。従って、このスフェアーを回収することにより、目的とする多能性幹細胞を取得することができる。【００３５】
Ｂ．多能性幹細胞の特徴
斯くして得られる、ほ乳動物の心臓組織由来の多能性幹細胞は、自己複製能と共に、心筋細胞を初めとする各種成熟細胞に分化する能力を備えている。当該多能性幹細胞が分化可能な細胞の一例として、心筋細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、グリア細胞、及び上皮細胞が例示される。特に、当該多能性幹細胞は、心筋細胞への分化能に優れていることが１つの特徴として挙げられる。【００３６】
また、上記調製方法により得られる多能性幹細胞の細胞表面抗原の特性として、c-kit陰性、CD31陰性及びCD34陰性が挙げられる。更に、当該多能性幹細胞の一例として、細胞表面抗原の特性としてCD105陽性を示すものが挙げられる。また、当該多能性幹細胞の一例として、細胞表面抗原の特性としてSca-1陽性、CD45陰性、CD38陽性、及びCD90陽性を示すものが挙げられる。このような細胞表面抗原の特性は、公知の方法で特定することができる。このような細胞表面抗原の特性を有する多能性幹細胞は、上記浮遊培養（上記工程(iii)）を行う方法以外に、上記工程(ii)で得られた心臓組織由来細胞群から、前述する細胞表面抗原の特徴を有する細胞を公知の方法で分取することにより取得することもできる。このように細胞を分取する方法の一例として、ソーテイング機能を備えるフローサイトメーターを用いる方法が挙げられる。【００３７】
Ｃ．多能性幹細胞の培養（増殖）
上記多能性幹細胞を、上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子を含有する培地で培養することにより、該多能性幹細胞を増殖させることができる（工程(iv)）。【００３８】
本工程では、培養に先立って、上記工程(iii)で得られたスフェアーをプロテアーゼで処理してスフェアーを分解して、多能性幹細胞を浮遊させておくことが望ましい。このように多能性幹細胞を浮遊させる方法としては、例えば、0.05重量％の濃度のトリプシンで、37℃で20分間程度処理する方法が例示される。当該プロテアーゼ処理後には、プロテアーゼ阻害剤を添加して、プロテアーゼの作用を阻害しておくとよい。【００３９】
また、本工程で使用される培地には、前記工程(iii)で使用される培地と同様である。【００４０】
本工程において、例えば、培養開始時の細胞濃度を20cells/μlとして、３７℃、５％ＣＯ２下で、通常１４〜２１日間培養を行うことにより、上記多能性幹細胞を所望量に増殖させることができる。【００４１】
Ｄ．多能性幹細胞の目的細胞への分化誘導
上記多能性幹細胞を、心筋細胞を初めとする各種細胞に分化誘導させる方法としては、例えば、増殖させた上記多能性幹細胞を、デキサメサゾンを含有する培地で培養する方法が挙げられる。【００４２】
分化誘導に使用される培地において、添加されるデキサメサゾンの割合については、心筋細胞への分化誘導が可能である限り特に制限されないが、通常、培地中にデキサメサゾンが1×10-8モル/l程度の割合で含まれていればよい。【００４３】
分化誘導に使用される培地の種類については特に制限されないが、好適な培地としてＭＥＭ培地（minimum essential medium、GIBCO社製）に、デキサメサゾンが添加されている培地が例示される。また、該培地は、多能性幹細胞の増殖に使用する培地と同様に、必要に応じて、ストレプトマイシン、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質；HEPES（5mM）等を含有していてもよい。【００４４】
上記培地を用いて、通常３７℃で、５％ＣＯ２下で、通常７〜２１日間、好ましくは１４日間程度、上記多能性幹細胞を培養することにより、一定の割合で上記多能性幹細胞を心筋細胞を初めとする各種細胞に分化誘導することができる。【００４５】
特に、デキサメサゾンを含有する培地で培養する上記方法は、上記多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導させるのに好適に採用される。【００４６】
また、上記培地を使用する分化誘導方法の他に、平滑筋細胞への分化誘導方法として、増殖させた上記多能性幹細胞を、血小板由来増殖因子（PDGF-BB）を含有する培地で培養する方法が挙げられる。当該方法において、培地中の血小板由来増殖因子濃度は通常10ng/ml程度であり、培養条件としては、上記心筋細胞への分化誘導の場合と同様である。【００４７】
更に、上記培地を使用する分化誘導方法の他に、血管内皮細胞に分化誘導させる方法として、増殖させた上記多能性幹細胞を、血管内皮成長因子（VEGF）を含有する培地で培養する方法が挙げられる。当該方法において、培地中の血管内皮成長因子濃度は通常10ng/ml程度であり、培養条件としては、上記心筋細胞への分化誘導の場合と同様である。【００４８】
Ｅ．疾患の治療方法
上記多能性幹細胞は、各種組織又は臓器の再生や修復に使用することができる。具体的には、組織又は臓器に疾患がある患者に、上記多能性幹細胞の治療有効量を組織又は臓器の疾患部位に移植することにより、該疾患を治療することができる。【００４９】
上記多能性幹細胞を用いた治療において、対象となる疾患として、好ましくは、心疾患が挙げられる。上記多能性幹細胞は心臓組織由来のものであり、心筋細胞への分化能は特に優れているので、上記疾患の中でも心疾患に対する治療に好適に使用される。【００５０】
対象となる心臓疾患としては、心筋若しくは冠動脈に障害を来し、収縮力が低下するような心臓疾患が挙げられ、具体的には、心筋梗塞、拡張型心筋症、虚血性心疾患、うっ血性心不全等が例示される。【００５１】
多能性幹細胞を移植する方法として、例えば、治療目的の組織又は臓器の疾患部位にカテーテルを利用して上記多能性幹細胞を注入する方法、或いは切開して治療目的の組織又は臓器の疾患部位に上記多能性幹細胞を直接注入する方法等が挙げられる。【００５２】
また、患部に移植される多能性幹細胞の投与量については、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢や性別等に応じて、適宜設定すればよいが、例えば、１回の移植において1.0×106〜1.0×108個の多能性幹細胞を投与することができる。【００５３】
本発明の治療方法では、疾患を有する患者以外の者から採取した多能性幹細胞を使用してもよいが、拒絶反応を抑制する観点から、患者自身の心臓組織由来の多能性幹細胞を使用することが望ましい。【００５４】
なお、本発明の治療方法には、心疾患の治療方法として、下記の態様の方法が包含される：
下記工程(i)〜(v)を含有する心疾患の治療方法：
(i)ヒトから採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製する工程、
(ii)密度勾配法により、上記細胞懸濁液から心臓組織由来細胞群を分離する工程、及び
(iii)得られた心臓組織由来細胞群を、繊維芽細胞成長因子及び上皮細胞増殖因子を含有する培地で浮遊培養した後に、浮遊状のスフェアーを形成している細胞を選択し分離する工程、
(iv)上記工程(iii)で分離した細胞を増殖させる工程、及び
(v)上記工程(iv)で増殖させた細胞を心疾患の患者の心臓に移植する工程。【００５５】
Ｆ．組織又は臓器の疾患の治療用組成物
前述するように、上記多能性幹細胞は、組織又は臓器の疾患の治療に有用である。故に、本発明は、更に、上記多能性幹細胞、及び薬学的に許容される担体を含有する組織又は臓器の疾患の治療用組成物を提供する。当該組成物は、組織又は臓器の疾患の治療において、疾患部位に投与されることにより使用される。【００５６】
ここで、薬学的に許容される担体としては、例えば、生理食塩水、緩衝液等が使用される。また、当該治療用組成物における上記多能性幹細胞の配合量については、患部に移植される多能性幹細胞の量に基づいて適宜設定される。【００５７】
特に、上記多能性幹細胞は心臓組織由来のものであり、心筋細胞への分化能が優れているので、当該組成物は、心疾患の治療用組成物として好適である。
【実施例】
【００５８】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【００５９】
実施例１
マウス由来多能性幹細胞の取得及び該幹細胞の分化誘導
（１）細胞懸濁液の調製
6〜8週齢の雌C57Bl/6Jマウス（清水実験材料株式会社製）（以下、野生型マウスと表記することもある）又は同マウスに緑色蛍光色素タンパク(GFP)発現能を付与したマウス（以下、GFP発現マウスと表記することもある）を、ジエチルエーテル麻酔下に用手的に頸椎脱臼にて安楽死させ、70容量%エチルアルコール水溶液に浸して全身を消毒した。前もって高圧蒸気滅菌を施した尖鋭のピンセット及びはさみを用い、胸骨正中切開した後、心臓を摘出した。摘出した心臓を氷上の冷PBS（Phosphate buffered saline）入りシャーレ内に置いて、23ケージ針付き注射器を用い、大動脈弁輪部から2mlの冷PBSを３回注入し、心臓内の血液を除去した。次いで、心臓中間部に切開を入れ、新たな冷PBS入りシャーレ内で心腔内を洗浄した。更に、この心腔内の洗浄を二回繰り返し、最後にPBSを除去した。その後、滅菌済みのはさみを用いて破砕した心臓組織断片を約1mm3以下になるまで細切した。細切した心臓組織片（約100mｇ）を100ml容三角フラスコに移し、更に0.2重量% collagenase type2 (Worthington社製)含有溶液20mlを添加し、37℃恒温漕内で20分間震盪して酵素処理を行った。次いで、更に10mlの電動ピペッターを用いて3ml/secの速度でピペッティングを行い、よく撹拌した後、更に0.1重量% DNAse I(Worthington社製)含有溶液2.2mlを添加し、37℃恒温漕内で3分間震盪した。かかる酵素処理後、20mlの10容量%FBS(牛胎仔血清)(Hyclone社製)及び1容量%ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するDMEM(GIBCO社製)培地（以下、「培地１」と表記する）を加えて酵素を中和し、細胞含有液を調製した後、70μm cell strainer(FALCON社製)及び40μm cell strainer(FALCON社製)で濾過した。濾過後の細胞含有液を1500rpmで5分間遠心分離して、その上清を除去した後に、10mlの培地１を添加して細胞懸濁液（以下、細胞懸濁液１と表記する）を調製し、これを氷中保存した。また、100ml容三角フラスコに残存した心臓組織片に対しても、再度同様の処理を行い、同様に細胞懸濁液（以下、細胞懸濁液２と表記する）を調製した。斯くして得られた細胞懸濁液１及び２を混合し、以下記載する工程に供した。【００６０】
（２）パーコールの密度勾配遠心法による心臓組織由来細胞群の分離
パーコール（percoll）原液（Amersham Biosciences社製）：10×PBS(-)(GIBCO社製) = 9:1（容量比）の溶液をパーコールストックとした。パーコールストックを1×PBS(-)(GIBCO社製)で希釈し、パーコールストックの濃度が30容量%、70容量%の溶液を作成した。30容量%パーコール溶液にはフェノールレッド(SIGMA社製)を0.1容量%加えて着色した。容量15mlの円錐状チューブに、まず30容量％パーコール溶液を3ml注ぎ、続いて電動ピペッターを用いて30容量%パーコール溶液の下層に70容量% パーコール溶液を慎重に加えた。続いて、野生型マウス又はGFP発現マウス由来の上記細胞縣濁液3mlを30容量％パーコール溶液の上層に慎重に重層した。室温、1000G 20分で、加速減速を極力遅くして遠心分画した。遠心後、目的の細胞集団は、30容量%パーコール溶液と70容量%パーコール溶液の界面に分布していることが確認された。また、一番底には血球成分が分布しており、30容量%パーコールの上層には主に細胞破砕物が分布していることが確認された。パスツールピペットにてまず細胞破砕物を除去した後、別のピペットで界面に存在する目的の細胞集団を容量50mlの円錐状チューブに回収した。円錐状チューブに、DMEM/F12Ham(GIBCO社製)培地を30ml加え、十分に撹拌した後、遠心して上清を除去した。次いで、トリプシン-EDTA（0.05重量％トリプシン、0.53mM EDTA・4Na含有）(GIBCO社製)溶液1mlを添加して、37℃恒温漕内で10分間震盪し、細胞同士の凝集や結合を解消させた。次いで、トリプシン阻害剤（Roche社製）500μlを添加し、更にDMEM/F12Ham培地(GIBCO社製)8.5mlを添加し、十分に懸濁した後、細胞数を血球計算盤でカウントした。【００６１】
（３）スフェアーの形成−１
上記（２）で得られた、野生型マウス又はGFP発現マウス由来の心臓組織由来細胞群を、mouse expansion medium［DMEM/F12Ham (GIBCO社製)、2重量％B27サプリメント(GIBCO社製)、1容量% penicillin-streptomycin、40ng/ml recombinant human basic FGF(Promega社製)、及び20ng/ml mouse EGF (SIGMA社製)含有］を用いて、細胞培養ディッシュ（noncoat cell culture dish）（Becton Dickinson社製）上で、37℃、5％ＣＯ２下で14日間、浮遊培養を行った。なお、培養開始時の細胞濃度は、2.0×104cells/mlになるように設定した。【００６２】
斯くして培養した後、培養液に浮遊しているスフェアー（細胞塊）を回収した。【００６３】
（４）スフェアーの形成−２
参考として、上記(2)で得られた野生型マウス心臓組織由来細胞群と、上記(2)で得られたGFP発現マウス心臓組織由来細胞群とを１：１の比率で混合して、上記（３）と同様の条件で浮遊培養を行った。【００６４】
培養後の培養液に浮遊するスフェアーを観察した結果を図１に示す。図１中、Ａ、Ｃ、Ｅ及びＧは蛍光顕微鏡にて撮影した写真を示し、Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＨは位相差顕微鏡により撮影した写真を示す。なお、蛍光顕微鏡ではGFP発現マウス由来のスフェアーのみが観察され、位相差顕微鏡では野生型マウス及びGFP発現マウスの双方のスフェアーが観察される。ＡとＢ、ＣとＤ、ＥとＦ、ＧとＨは、それぞれ同一の被写体を撮影したものである。Ａ及びＢの写真から、培養液中に、野生型マウス由来のスフェアーとGFP発現マウス由来のスフェアーが混在していることが確認された。また、Ｃ及びＤの写真には、共に同一形状のスフェアーが観察されていることから、Ｃ及びＤの被写体のスフェアーはGFP発現マウス由来のものであることが確認された。一方、Ｅの写真には、スフェアーは撮影されなかったが、Ｆの写真にはスフェアーが観察されたことから、Ｅ及びＦの被写体のスフェアーは野生型マウス由来のものであることが明らかである。また、Ｇ及びＨの写真では、相異なる形状のスフェアーが観察されたことから、Ｇ及びＨの被写体のスフェアーは、野生型マウス由来の細胞とGFP発現マウス由来の細胞が混合して形成されたことが明らかとなった。【００６５】
（５）スフェアー形成細胞の増殖
回収したスフェアーを2mlのDMEM/F12Ham(GIBCO社製)培地に入れ、よく混合した後に、これを遠心分離（4℃、1500rpm、５分間）して、上清を十分に除去した。次いで、トリプシン-EDTA（0.05重量％トリプシン、0.53mM EDTA・4Na含有）(GIBCO社製)溶液1mlを添加し、37℃恒温漕内で20分間震盪することにより、スフェアーを分解して、スフェアーを形成している細胞（以下、スフェアー形成細胞と表記する）を浮遊させた。次いで、トリプシン阻害剤（Roche社製）500μlを添加し十分に懸濁した後、細胞数を血球計算盤でカウントした。【００６６】
斯くして浮遊させたスフェアー形成細胞を、mouse expansion medium［DMEM/F12Ham (GIBCO社製)、2重量％B27サプリメント(GIBCO社製)、1容量% penicillin-streptomycin、40ng/ml recombinant human basic FGF(Promega社製)、及び20ng/ml mouse EGF (SIGMA社製)含有］を用いて、培養開始時の細胞濃度を20cells/μｌとして、フィブロネクチンコーティング細胞培養ディッシュ上で、37℃、5％ＣＯ２下で3日間培養を行った。【００６７】
（６）スフェアー形成細胞の特徴の確認
上記（５）で増殖させたスフェアー形成細胞について各種細胞表面抗原（Sca-1、c-kit、CD34、CD45、CD31、CD38、CD90及びCD105）をFACS分析した。得られた結果を図２に示す。この結果から、得られたスフェアー形成細胞はc-kit陰性、CD31陰性及びCD34陰性であると共に、CD105陽性であることが確認された。また、該細胞は、Sca-1陽性、CD45陰性、CD38陽性、及びCD90陽性であることも確認された。【００６８】
更に、上記（５）で増殖させたスフェアー形成細胞について、各種マーカー（Bmi 1、TERT、Bcrp 1、Oct 4、UTF 1、Nanog、Brachyury、Sox 2、Nestin、及びIslet 1）の発現を、PCRにより分析した。得られた結果を図３に示す。この結果、スフェアー形成細胞は、胚性幹細胞のマーカーであるOct 4及びUTF 1の発現が認められないことが確認された。一方、該細胞は、中胚葉系幹細胞のマーカーであるBrachyuryや、外胚葉系幹細胞のマーカーであるSox 2及びNestinの発現が認められた。また、該細胞は、Bmi 1やTERTを強く発現していることから、自己複製能が高いことが示唆された。【００６９】
また、上記（３）で得られたスフェアーをサイトスピンにてスライドに付着させ、ブロモデオキシウリジン（BrdU）染色を行い、スフェアー形成細胞内のBrdUの有無を確認した。この結果を図４に示す。図４から分かるように、スフェアー形成細胞の約半数がBrdU陽性であり、細胞分裂が盛んに起きていることが確認された。【００７０】
そして更に、上記（３）で得られたスフェアーにおけるテロメラーゼの発現を分析した。なお、分析には、5、10又は30個のスフェアーをサンプルとして、これを加熱処理（85℃、15分間）をしたもの（heat(+)）と加熱処理していないもの（heat(-)）を使用し、更に対照サンプルとして、テロメア陽性細胞（positive control）、培地のみ（negative control）、テロメアテンプレート（positive template）についても分析した。得られた結果を図５に示す。この結果、上記（３）で得られたスフェアーには、テロメラーゼが強く発現しているこが確認された。【００７１】
（７）心筋細胞への分化の確認
上記（５）で増殖させたスフェアー形成細胞を遠心分離により回収し、該細胞を1×10-8モル/lのデキサメサゾン及び1容量%のpenicillin-streptomycinを含有するＭＥＭ培地（GIBCO社製）で、37℃、5％ＣＯ２下で21日間培養した。かかる培養により、上記スフェアー形成細胞が拍動性の心筋細胞に分化することが確認された。また、培養中の細胞の形態を観察した写真を図６に示す。図６に示すように、スフェアー形成細胞は、心筋細胞への分化過程において同心円状に増殖して分化することが分かった。なお、心筋細胞への分化は、下記の分析結果からも確認された。
＜心筋特異的トロポニン−Ｉ染色による分析＞
培養21日後の細胞を心筋特異的トロポニン−Iで染色して観察したところ、心筋細胞の存在が確認された（図７図参照）。
＜PCRによる分析＞
PCRにより、分化誘導開始21日後において、培養細胞の各種マーカー（Nkx 2.5、GATA 4、ANP、トロポニン−I(TnI)、MLC2v、MLC2a、α-MHC(α-myosin heavy chain)、β-MHC(β-myosin heavy chain)）の発現を分析した。得られた結果を図８に示す。この結果、心筋細胞のマーカーであるcTnI、及びα-MHCの発現が強く認められることが確認された。【００７２】
（８）他の細胞への分化の確認
上記（５）で増殖させたスフェアー形成細胞（図９のＡ参照）について、平滑筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、グリア細胞、及び上皮細胞への分化能を確認するために、下記の方法で分化誘導を行った。【００７３】
（８−１）平滑筋細胞への分化
上記（５）で増殖させたスフェアー形成細胞を遠心分離により回収し、該細胞を、1×10-8Ｍのデキサメサゾンを含むＭＥＭ培地（GIBCO社製）で、37℃、5％ＣＯ２下で14日間培養した。培養後の細胞をα-SMA（α-smooth muscle actin）を用いて染色して観察したところ、平滑筋細胞の存在が確認された（図９のＢ参照）。【００７４】
（８−２）血管内皮細胞への分化
上記（５）で増殖させたスフェアー形成細胞を遠心分離により回収し、該細胞を1×10-8Ｍのデキサメサゾンを含むＭＥＭ培地（GIBCO社製）で、37℃、5％ＣＯ２下で14日間培養した。培養後の細胞をCD31を用いて染色して観察したところ、CD31陽性の血管内皮細胞の存在が確認された（図９のＣ参照）。【００７５】
（８−３）脂肪細胞への分化
上記（５）で増殖させたスフェアー形成細胞を遠心分離により回収し、該細胞を1×10-8Ｍのデキサメサゾンを含むＭＥＭ培地（GIBCO社製）で、37℃、5％ＣＯ２下で14日間培養した。培養後の細胞に対してoil-red染色を行って観察したところ、oil-red陽性の脂肪細胞の存在が確認された（図９のD参照）。【００７６】
（８−４）グリア細胞への分化
上記（５）で増殖させたスフェアー形成細胞を遠心分離により回収し、該細胞を1×10-8Ｍのデキサメサゾンを含むＭＥＭ培地（GIBCO社製）で、37℃、5％ＣＯ２下で14日間培養した。培養後の細胞の形態的特徴を観察したところ、グリア細胞の存在が確認された（図９のＥ参照）。【００７７】
（８−５）上皮細胞への分化
上記（５）で増殖させたスフェアー形成細胞を遠心分離により回収し、該細胞を1×10-8Ｍのデキサメサゾンを含むＭＥＭ培地（GIBCO社製）で、37℃、5％ＣＯ２下で14日間培養した。培養後の細胞の形態的特徴を観察したところ、上皮細胞の存在が確認された（図９のＦ参照）。【００７８】
（９）結果
以上に示す実施例１の結果から、得られたスフェアー形成細胞は、自己複製能と共に、各種細胞に分化する特性を備えており、多能性幹細胞であることが明らかとなった。【００７９】
実施例２
マウス由来心筋幹細胞の移植
上記実施例１で得られたGFP発現マウス由来のスフェアー形成細胞（多能性幹細胞）を、mouse expansion medium［DMEM/F12Ham (GIBCO社製)、2重量％B27サプリメント(GIBCO社製)、1容量% penicillin-streptomycin、40ng/ml recombinant human basic FGF(Promega社製)、及び20ng/ml mouse EGF (SIGMA社製)含有］で培養して増殖させた。次いで、増殖させた幹細胞（約1×106cells）を、15μlのPBS(-)(GIBCO社製)に懸濁し、これを、BD Ultra Fine IIランセット(Becton Dickinson社製)を用いて、10〜12週齢のN0D/SCIDマウス（Jackson Laboratoryより購入）に作成した梗塞心筋に移植した。幹細胞の移植21日後に、マウスから心臓を摘出した。摘出した心臓の心筋について、緑色蛍光（GFP）発色する幹細胞のホスト心筋への生着を確認した（図１０のＡ図参照）。また、図１０のＡ図と同一視野において、cTnT染色（赤色として認識される）を行った（図１０のＢ図参照）。図１０のＡ及びＢ図を重ね合わせると、幹細胞の存在（緑色）と、cTnI発現の存在（赤色）が重なっており（図１０のＣ及びＤ図参照）、移植した心臓組織由来の幹細胞が心筋細胞に分化し、心臓の修復に寄与していることが確認された。【００８０】
実施例３
ヒト由来多能性幹細胞の取得及び該幹細胞の各種細胞への分化誘導
ヒトから採取した心臓組織片を用いて、上記実施例１に記載の「（１）細胞懸濁液の調製」及び「（２）パーコールの密度勾配遠心法による心臓組織由来細胞群の分離」の方法に従って、ヒト心臓組織由来の細胞群を分離した。【００８１】
次いで、得られた細胞群を用いて、上記実施例１に記載の「（３）スフェアーの形成−１」の方法に従って培養を行い、スフェアーを形成させた。培養１日後及び７日後に培養液中に浮遊しているスフェアーを撮影した顕微鏡写真を図１１に示す。培養後、スフェアーを回収することにより、ヒト心臓組織由来のスフェアー形成細胞（多能性幹細胞）を取得した。【００８２】
回収したスフェアー形成細胞を、上記実施例１に記載の「（５）スフェアー形成細胞の増殖」の方法に従って培養を行い増殖させた。培養後のスフェアー形成細胞について、各種マーカー（Rex 1、TERT、Oct 4、Nanog、Brachyury、Sox 2）の発現を、PCRにより分析した。得られた結果を図１２に示す。この結果から、ヒト心臓組織由来のスフェアー形成細胞は、外胚葉系幹細胞や胚性幹細胞と同様の分化特性を備えていることが確認された。【００８３】
また、増殖させたスフェアー形成細胞について各種細胞表面抗原（c-kit、CD34、CD90及びCD105）について分析した。分析結果を図１３に示す。この結果から、ヒト由来のスフェアー形成細胞は、c-kit陰性、CD34陰性、CD90陽性及びCD105陽性であることが確認された。【００８４】
心筋細胞への分化
増殖させたスフェアー形成細胞を、上記実施例１に記載の「（７）心筋細胞への分化の確認」の方法に従って、心筋細胞への分化誘導を行った。これによって、ヒト心臓組織由来のスフェアー形成細胞が、拍動する心筋細胞に分化することが確認された。なお、心筋細胞への分化は、下記の分析結果からも確認された。
＜ヒト心筋特異的トロポニン−T染色による分析＞
分化誘導後の細胞をヒト心筋特異的トロポニン−Tで染色して観察したところ、心筋細胞の存在が確認された（図１４図参照）。
＜PCRによる分析＞
分化誘導開始２１日後の細胞について、各種マーカー（Nkx-2.5、GATA4、ANP、α-ca-actin、TnT、MLC2v、MLC2a、α-MHC(α-myosin heavy chain)、β-MHC(β-myosin heavy chain)、βactin）の発現を、PCRにより分析した。得られた結果を図１５に示す。図１５から分かるように、デキサメサゾンの存在下で培養することによって、上記各種マーカーが発現されており、上記ヒト心臓組織由来スフェアー形成細胞が心筋細胞に分化したことが確認された。【００８５】
平滑筋細胞への分化
増殖させたスフェアー形成細胞を、上記実施例１に記載の「（８−２）血管内皮細胞への分化」の方法に従って、分化誘導を行った。これによって、ヒト心臓組織由来のスフェアー形成細胞が、平滑筋細胞に分化することが確認された。なお、心筋細胞への分化は、下記の分析結果からも確認された。
＜顕微鏡による分析＞
分化誘導後の細胞について、α-SMAを染色して観察したところ、平滑筋細胞の存在が確認された（図１６図参照）。
＜PCRによる分析＞
分化誘導開始２１日後の細胞について、各種マーカー（SM-22α及びcalponin）の発現を、PCRにより分析した。得られた結果を図１７に示す。図１７から分かるように、分化誘導後には、上記各種マーカーが発現されており、上記ヒト心臓組織由来スフェアー形成細胞が平滑筋細胞に分化したことが確認された。【００８６】
血管内皮細胞への分化
増殖させたスフェアー形成細胞を、上記実施例１に記載の「（４）他の細胞への分化の確認」の方法に従って、内皮細胞への分化誘導を行った。これによって、ヒト心臓組織由来のスフェアー形成細胞が、血管内皮細胞に分化することが確認された。なお、血管内皮細胞への分化は、下記の分析結果からも確認された。
＜顕微鏡による分析＞
分化誘導後の細胞について、CD31を染色して観察したところ、内皮細胞の存在が確認された（図１８図参照）。
＜PCRによる分析＞
分化誘導後の細胞について、各種マーカー（CD31及びVEGF-R2）の発現を、PCRにより分析した。得られた結果を図１９に示す。図１９から分かるように、分化誘導後には、上記各種マーカーが発現されており、上記ヒト心臓組織由来スフェアー形成細胞が血管内皮細胞に分化したことが確認された。【００８７】
結果
以上に示す実施例３の結果から、得られたヒト由来スフェアー形成細胞は、自己複製能と共に、各種細胞に分化する特性を備えており、多能性幹細胞であることが確認された。【００８８】
実施例４
ヒト由来心筋幹細胞の移植
上記実施例３で得られたヒト心臓組織由来スフェアー形成細胞（多能性幹細胞）を、human expansion medium［DMEM/F12Ham(GIBCO社製)、1容量% penicillin-streptomycin、40ng/ml recombinant human basic FGF(Promega社製)、及び20ng/ml human EGF(SIGMA社製)含有］で培養して増殖させた。次いで、増殖させたヒト心臓組織由来多能性幹細胞（約1×106cells）を、上記実施例２と同様の方法で虚血心筋マウスに移植した。心筋幹細胞の移植２１日後に、マウスから心臓を摘出した。摘出した心臓の心筋について、細胞内の核をDAPI（4'6-diamino-2-pheny1indo1e）を用いて青色に染色し、更にスフェアー形成細胞から分化した心筋細胞をヒト心筋特異的トポロニン−Tを用いて赤色に染色した。この結果、菲薄化した梗塞巣内に移植したヒト心臓組織由来細胞が遊走し生着しており、主に心内膜側に新たな心筋細胞が再生されていることが確認された（図２０のＡ−Ｅ参照）。また、摘出した心臓について、併せて、CD31の染色を行ったところ、ヒト心臓組織由来細胞が血管内皮細胞にも分化して生着していることが確認された（図２０のＦ参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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