(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
R1-X-Z'-R2
｛ここで、Xは式
(RK)YY(RK)(WI)(RK)
（１，４，５及び６位の二者択一のアミノ酸残基を括弧内に示す）のヘキサペプチドを表し、
Z'は、K8 (配列番号73), K7 (配列番号74), K6 (配列番号75), K5 (配列番号76), 及びK4 (配列番号77);から成る群から選択される、荷電ペプチド鎖を表し；
R1はH又はアシル基を表し；
R2はNR3R4（ここで、R3及びR4のそれぞれが独立して水素、C(1-6)-アルコキシ、アリールオキシ又は低級アルキルを表す）を表し；あるいはR2はOHを表す｝の、ペプチド複合体（ペプチド複合体中のアミノ酸残基は全てL型である）；あるいは適当な有機若しくは無機酸とそれらの塩、水和物又は溶媒和物、あるいはＣ末端がアミド化され、又はエステル化された誘導体。
【請求項２】
R1がアセチル又はトリフルオロアセチルを表す、請求項１に記載のペプチド複合体。
【請求項３】
R2がNH2を表し、又はR2がNR3R4（ここで、R3及びR4のそれぞれが独立して水素、メチル又はエチルを表す）を表す、請求項１又は２に記載のペプチド複合体。
【請求項４】
前記ヘキサペプチドXが、KYYRWK（配列番号11）, RYYRWR（配列番号3）, RYYRWK（配列番号1）, RYYRIK（配列番号5）, RYYRIR（配列番号21）, RYYKIK（配列番号7）, RYYKIR（配列番号8）, RYYKWR（配列番号9）,及びRYYKWK（配列番号10）から成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
【請求項５】
【表１】
0004624639.tif 000018
から成る群から選択される、請求項１に記載のペプチド複合体、そのC末端遊離酸、そのエステル化誘導体、あるいはその医薬として許容される酸付加塩。
【請求項６】
化合物1A  Ac-RYYRWKKKKKKK-NH2x9CH3COOH
又は化合物1C  Ac-RYYRWKKKKKKK-NH2x9HClである、請求項５に記載のペプチド複合体。
【請求項７】
X-Z'が、KYYRWKK6（配列番号53）, RYYRWKK6（配列番号35）, RYYRWRK6（配列番号38）, RYYRIKK6（配列番号41）, 及び RYYRWK5（配列番号83）、から成る群から選択される、請求項１に記載のペプチド複合体。
【請求項８】
正電荷及び負電荷の対イオンであって、医薬として許容される陰イオンである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド複合体を含んで成る生物学的活性物質。
【請求項９】
前記負電荷の対イオンがCH3COO-, CF3COO-, Cl-, SO32-,マレイン酸塩又はオレイン酸塩である、請求項８に記載の生物学的活性物質。
【請求項１０】
活性化合物として、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド複合体又は請求項８に記載の生物学的活性物質及び医薬として許容される担体又は希釈剤を含んで成る医薬組成物。
【請求項１１】
非経口投与のための、シロップ、落花生油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレン及び水から成る群から選択される液体担体を更に含んで成る、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
単位剤形中に、前記化合物を0.1〜10mg含む、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
末梢投与にのみ適合された形態の請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
医療方法における使用のための請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド複合体又は請求項８又は９に記載の生物学的活性物質。
【請求項１５】
低ナトリウム血症又は低カリウム血症の処置及び／又は予防のための薬剤の製造のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド複合体又は請求項８又は９に記載の生物学的活性物質の使用。
【請求項１６】
前記低ナトリウム血症又は低カリウム血症が心不全と関連する、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記低ナトリウム血症又は低カリウム血症がチアジド及び／又はループ利尿薬による強力な利尿治療と関連する、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
選択的水利尿のための薬剤の製造のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド複合体又は請求項８又は９に記載の生物学的活性物質の使用。
【請求項１９】
水分保持性の症状の予防及び／又は処置のための薬剤の製造のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド複合体又は請求項８又は９に記載の生物学的活性物質の使用。
【請求項２０】
前記水分保持性の症状が鬱血性心不全、肝硬変、ネフローゼ症候群又は高血圧である。請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
多臓器不全の処置及び／又は予防のための薬剤の製造のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド複合体又は請求項８又は９に記載の生物学的活性物質の使用。
【請求項２２】
急性腎不全の処置及び／又は予防のための薬剤の製造のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド複合体又は請求項８又は９に記載の生物学的活性物質の使用。
【請求項２３】
高濃度のノシセプチンと関連する病状の処置において使用され得る薬剤の製造のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド複合体又は請求項８又は９に記載の生物学的活性物質の使用。
【請求項２４】
浮腫を処置するための薬剤の製造のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド複合体又は請求項８又は９に記載の生物学的活性物質の使用。
【請求項２５】
前記薬剤が利尿薬と組み合わせて投与するために調製される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
浮腫が冠状動脈心不全と関連する、請求項２４又は２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記利尿薬がループ利尿薬である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド複合体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項２８に記載のポリヌクレオチドを含んで成り、且つ前記ペプチド複合体を発現することができる組換え宿主細胞。
【請求項３０】
天然ポリペプチド配列を有する請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド複合体を産生するための方法であって、
請求項２９に記載の組換え宿主細胞を、前記ペプチド複合体の産生を可能にする条件下で培養し；
培養液から前記ペプチド複合体を単離すること、
を含んで成る方法。
【請求項３１】
液相又は固相技術に従い、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド複合体を合成する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本仮特許出願は、２０００年１２月６日に出願された米国仮特許出願番号60/251,671の一部継続出願である、Larsen, B. D等によって２００１年６月１３日に出願され、Novel Peptide Conjugatesと題された米国の一部継続出願である。本出願は、２０００年１０月５日に出願されたデンマーク特許出願DK PA2000 01485及び２０００年６月１６日に出願されたDK PA2000 00944に対して優先権を主張するものである。２００１年６月１３日に出願に出願された前記米国仮特許出願；60/251,671;DK PA2000 01485;及びDK PA2000 00944に開示されているものは、引用によってそれぞれ本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、興味深い薬理活性を有する新規ペプチド複合体、新規ペプチド複合体の製造方法、当該ペプチド複合体を含む医薬組成物、及び医薬の製造のための当該ペプチド複合体の使用、に関する。
【０００３】
背景
内在性オピオイド様ペプチドであるノシセプチン（オルファニンＦＱとも称される）は、中枢神経系で最初に論じられ、そしてこの分野での多くの研究がCNSの効果に集中した。ノシセプチンは、オピオイド受容体の３つの古典的なサブタイプに対するものよりも遙かに大きな親和性で、ORL1(opioid receptor-like one)と命名された特異的受容体と結合する。CNSにおけるノシセプチンの作用には、痛覚過敏／痛覚鈍麻、食欲及び囓りたくなる気持ちの刺激、運動量の増大（少量）又は低下（大量）、学習障害、及び神経不安、がある。しかし、ノシセプチンは更にCNSの外側で重要な作用を発揮する。このように、低量のノシセプチンが、腎臓の水分排泄を増大し、且つ尿中のナトリウム排泄を低下させることで（すなわち、選択的な水利尿を生み出す）、この化合物を低ナトリウム血症の処置にとって興味深いものとする(Daniel R. Kapusta, Life Science, 60:15-21, 1997)（米国特許題5,840,696号)。中枢に投与され(i.c.v)、又は大量に末梢から投与された場合(i.v.ボーラス又は輸液）、ノシセプチンは血圧、心拍数及び末梢交感神経活性を低下させる。
【０００４】
Dooley等(The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 283(2):735-741, 1997)は、アミノ酸配列Ac-RYY(RK)(WI)(RK)-NH2（ここで、括弧は、アミノ酸残基が変更可能であることを示す）を有する正電荷のヘキサペプチドがノシセプチン受容体ORL1の部分アゴニストとして働くことを示した。当該ヘキサペプチドは、コンビナトリアルペプチドライブラリーから同定されたものであり、そして当該配列はノシセプチンヘプタデカペプチドに対する相同性又は類似性のない独特なものである。しかしながら、当該ヘキサペプチドは不安定すぎて満足の行く医薬を産生し得ない。
【０００５】
WO 99/44627は、次の症状：偏頭痛、II型糖尿病、敗血症ショック、炎症及び血管運動神経障害の処置のための医薬組成物の製造のための、Dooley等によって発見されたヘキサペプチドを含むヘキサペプチドの使用を開示している。それは、ヘキサペプチドAC-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-NH2が脊髄刺激に対する応答の低下を阻害することを示している。
【０００６】
Dooley等によって発見されたヘキサペプチドを含むORL1アゴニスト及び真のノシセプチン類似体が、脳に曝露された場合に、ラットにおいて水利尿を誘発するのに必要なもの以上の投与量で観察される深刻なCNSの副作用を有することが予想されることを考慮して、本発明の主要な目的には、前記ヘキサペプチドのノシセプチン様活性又はORL1受容体への結合活性を有するが、CNSの外側で選択的に働く新規複合ペプチドを提供することがある。本発明の更なる目的は、前記ヘキサペプチドのノシセプチン様活性又はORL1受容体への結合活性を有し、且つ向上した安定性を有する新規複合ペプチドを提供することである。更に、本発明の目的は、ノシセプチン様活性又はORL1受容体及び／又は腎組織においてまだ同定されていない受容体への結合活性を有する新規複合ペプチドを提供することである。
【０００７】
この目的は、短い荷電ペプチド鎖に対する複合によってＣ及び／又はＮ末端が修飾されたヘキサペプチドを含んで成る、本発明のペプチド複合体によって達成される。
【０００８】
本発明の要約
一般式I
R1-Z-X-Z'-R2        (I)
{ここで、Xは式II
A1-A2-A3-A4-A5-A6        (II)
（ここで、A1はArg, Lys, His又はAspを表し、A2はTyr, Trp,又はPheを表し、A3はTyr, Asn, Trp又はPheを表し、A4はLys, Arg又はHisを表し、A5はPhe, Tyr, Trp, Leu, Val又はIleを表し、そしてA6はArg, Lys又はHisを表し、そして、前記ヘキサペプチドの各アミノ酸残基はL又はD型であってもよい）のヘキサペプチドを表し；
Zは、D又はL配置を有する４〜２０アミノ酸残基の荷電ペプチド鎖を表し、又は存在しておらず；そしてZ'はD又はL配置を有する４〜２０アミノ酸残基の荷電ペプチド鎖を表し、又は存在しておらず、但し、Z及びZ'の両方が存在していないことはない；
R1はH又はアシル基を表し；
R2はNR3R4（ここで、R3及びR4のそれぞれが独立して水素、C(1-6)-アルコキシ、アリールオキシ又は低級アルキルであって、本明細書で定義されるものを表す）を表し；あるいはR2はOHを表す｝のペプチド複合体；並びに適当な有機又は無機酸とそれらの塩、水和物及び溶媒和物、並びにＣ末端がアミド化され、又はエステル化された誘導体。
【０００９】
本発明のペプチド複合体は、好ましくは医薬として許容される酸との酸付加塩を形成することがあり、そしてこれらの塩は本発明の範囲に含まれる。当該化合物は、それらの純粋な型で医薬として役割を果たすことがある。しかし、当該化合物は、好ましくは錠剤、カプセル、溶液及び懸濁液を含む固体又は液体製剤のいずれかに組み入れられる。その様な製剤の他の組成物は、担体、希釈剤、緩衝剤、浸透圧調製剤及び保存剤を含んでもよい。固体製剤は経口投与に特に適しており、一方、溶液は注射(i.v., i.m. i.p.又はs.c.)又は鼻腔内投与にとって最も有用である。
【００１０】
ノシセプチン様活性又はORL1受容体への結合活性を有するが、CNSの外側で働く本発明のペプチド複合体は、選択的な腎の作用が必要とされ又は好ましい、ORL1に関連する末梢の疾患及び病気の処置に特に有用である。更に具体的には、本発明のペプチド複合体は、有意な、ナトリウム保持性で且つカリウム保持性の水利尿作用を示し、これは低ナトリウム血症及び／又は低カリウム血症と関連する、浮腫を形成する病理学的症状の処置において有益である。本発明のペプチド複合体は、ヒトの医学的処置に、そして家畜、例えばウマ及びウシの浮腫形成期の間の利尿薬としての獣医の使用に有用である。本発明の化合物の特定の利益は、Dooley等によって開示されたヘキサペプチド[1]と比較した際の、血漿中でのそれらの安定性にある。
【００１１】
本発明の新規ペプチド複合体は、前記ペプチド複合体と特異的に結合することができる抗体の調製において有用である。本発明のペプチド複合体又はそれらの断片に対して産生した抗体も開示する。
【００１２】
本発明の詳細な説明
電荷ペプチド部分のカップリングは、正に荷電したヘキサペプチド(RK)YY(RK)(WI)(RK)に対する極性の増大又はそれらの荷電の増大を誘導して、安定性及び親水性が増強したペプチド複合体をもたらす。前記カップリングはまた、ペプチド複合体が血液−脳関門を越える可能性を低下させると考えられる。一方、予備的なデータは、K6によるＣ末端の修飾が、1D-NMRスペクトルで決定した場合に、ヘキサペプチドXのαヘリックス構造を誘導するように見えることを示唆している。本発明の好ましい態様において、式IIは、アミノ酸配列(RK)YY(RK)(WI)(RK)（ここで、１，４，５及び６位の二者択一のアミノ酸残基を括弧内に示す）によって表される。あるいは、１，４及び６位のアミノ酸残基R及びKは、Orn, Dab又はDapaでそれぞれ置換されてもよい。本発明の好ましい態様において、Zは４〜２０アミノ酸残基の負電荷のペプチド鎖を表し、Z'は４〜２０アミノ酸残基の正電荷のペプチド鎖を表し、R1はAc又はTfaを表し、そしてR2はNH2を表し、又はR2はNR3R4（ここで、R3及びR4のそれぞれが独立して水素、メチル又はエチルを表す）。
【００１３】
前記ヘキサペプチドXは、好ましくはKYYRWR, RYYRWR, KWRYYR, RYYRWK, RYYRWK（全てD）,RYYRIK, RYYRIR, RYYKIK, RYYKIR, RYYKWR,及びRYYKWKから成る群、更に好ましくはRYYRWR, RYYRWK, RYYRIK, RYYKWR, 及びRYYKWKから成る群から選択され、更に好ましくは前記ヘキサペプチドXはRYYRWK又はKYYRWK（ここで、アミノ酸残基は特に断らない限りL型である）である。更に、Z及びZ'のそれぞれのアミノ酸残基数は好ましくは４〜１０又は５〜１０である。
【００１４】
Zのアミノ酸残基は、D又はL配置を有するQ, T, S, P, N, E, 及びDから成る群から選択され、且つZのＮ末端アミノ酸がD又はL配置を有するQ, T, N及びSから成る群から選択され、且つ残りのアミノ酸残基がP, D及びEから成る群から選択されることが好ましい。更に具体的には、Zは、例えばN(E)7, N(E)6, N(E)5, N(E)3, S(E)7, S(E)6, S(E)5, S(E)3, NP(E)4, NP(E)5, N(D)7, N(D)6, N(D)5, N(D)3, Q(E)7, Q(E)5, Q(E)3, QN(D)7, Q(D)6, Q(D)5, 及びQ(D)3から成る群から選択され、好ましくはZはN(E)5である。
【００１５】
Z'のアミノ酸残基は、D又はL配置を有するA, G, K, 及びRから成る群から選択され、好ましくはKであり、更に好ましくは、Z'はA(K4)G, K5G, AK5, H6, K10, K8, K5,及びK4から成る群から選択されることが好ましい。
【００１６】
複合体Z-X-Z'の例は、N(E)5RYYRWKK6, N(E)5RYYRWK, RYYRWKK6, N(E)5RYYRWRK6, N(E)5RYYRWR, RYYRWRK6, N(E)5RYYRIKK6, N(E)5RYYRIK,及びRYYRIKK6である。
【００１７】
本発明の例示的な化合物は：Ac-RYYRWKK6-NH2, Ac-K6RYYRWK-NH2, N(E)5RYYRWKK6-NH2,並びにそれらの塩、好ましくは医薬として許容される塩、水和物、溶媒和物及び誘導体であって、Ｃ末端誘導体、例えば遊離カルボン酸を含むものである。
【００１８】
本発明の更に好ましい態様は、一般式III
R1-X-Z'-R2        (III)
（ここで、R1, X, Z'及びR2は上文で定義したものと同一の意味を有し、そして、それらの塩、水和物及び溶媒和物並びに適当な有機又は無機酸でＣ末端側がアミド化され、又はエステル化されたそれらの誘導体である）によって表される。式IIIの好ましいペプチド複合体において、R1はAcを表し、Xは式(RK)YY(RK)(WI)(RK)（ここで、１，４，５及び６位の二者択一のアミノ酸残基を括弧内に示す）のヘキサペプチドを表し、Z'はKn（ここで、nは５，６又は７から選択される整数である）、そしてR2はNH2を表す。Xは好ましくはKYYRWK, RYYRWR, RYYRWK RYYRWK(全てD), KWRYYR, RYYRIK, RYYKWR,及びRYYKWKから成る群から選択される。式I及びIIIのペプチド複合体は、任意に更に輸送部分又はアフィニティータグ、例えばH6に連結され、ここで、当該ペプチド複合体と前記輸送部分又はアフィニティータグとの間に連結は、任意な都合のよい共有結合によるものであってもよい。前記輸送部分は、好ましくはHIV tatペプチド残基49-57, HIV tatペプチド残基49-56, tat配列YGRKKRRQRRR, 6から20個の残基を有するポリアルギニンペプチド、例えばR6, 及び伝達ペプチド配列、例えば次のペプチド配列：YARKARRQARR, YARAAARQARA, YARAARRAARR, YARAARRAARA, ARRRRRRRRR,及びYAAARRRRRRRから成る群から選択され、これらは引用によって本明細書に組み入れられるWO 99/29721及び米国特許第6,221,355号に開示されている（配列番号３〜８）。
【００１９】
式I及びIIIの化合物のペプチド配列は、任意に全てD型、逆(retro)型又は逆の全てD型であり、ここで、全てD型が更に好ましい。任意に、式I及びIIIのX配列は、それぞれ上文で定義したような、全てD型、逆(retro)型又は逆の全てD型の式IIのペプチド配列又はヘキサペプチド(RK)YY(RK)(WI)(RK)である。
【００２０】
本発明の例示的な化合物を、次の表１に示す：
【表２】
0004624639.tif 000002
並びにそれらの塩、水和物、溶媒和物、及びＣ末端誘導体、例えば遊離カルボン酸。他の好ましい化合物は、
Ac-KWRYYNKKKKKK-NH2
Ac-KWRYYRKKKKKK-NH2及び
Ac-KWRYYRKKKKKK-NH2(全てD)並びにそれらの塩、水和物、溶媒和物及びＣ末端誘導体、例えば遊離カルボン酸である。
【００２１】
本発明の化合物の、有機酸及び無機酸による酸付加塩の例は、
化合物1A  Ac-RYYRWKKKKKKK-NH2x9CH3COOH
及び化合物1C  Ac-RYYRWKKKKKKK-NH2x9HCl
である。
【００２２】
本発明のペプチド複合体は、好ましくは、引用によって本明細書に組み入れられるWO 98/11125に開示されている合成方法を用いて、そして好ましくはその中の例１５に開示されている方法を用いて調製される。前記合成方法は、トリフルオロ酢酸塩の対イオンを有し、且つ薬剤の製造に適していると思われる一次ペプチド産物をもたらし得る。しかしながら、多くの場合において、トリフルオロ酢酸から医薬として許容され、又は好ましい陰イオン、例えば酢酸への対イオンの交換を実施することは有益であることがある。これは、イオン交換クロマトグラフィーによって達成されうる。あるいは、一次ペプチド産物は、精製された塩酸塩を得るために、繰り返し凍結乾燥され、そして希塩酸に溶解されることがある。
【００２３】
更に本発明には、好ましくは末端のシステイン残基を介して担体とカップリングした、式II又は式(RK)YY(RK)(WI)(RK)のX配列の一部又は全部並びに／あるいはZ配列又はZ'配列の一部又は全部を含んで成る式I又はIIIのペプチド複合体あるいはそれらのエピトープフラグメントの、前記ペプチド複合体又は前記X配列と特異的に結合することができる抗体を産生するための使用が含まれる。末端のCys残基は、任意に、前記ペプチド複合体又はそれらの前記エピトープフラグメントの末端のアミノ酸残基の１つのCys残基による置換を介して得られ、あるいは前記ペプチド複合体又はそれらの前記エピトープフラグメントは更に、その末端の１つにCys残基を含んで成る。本発明のペプチド複合体と特異的に結合することができる抗体を産生するのに有用な、末端にＣを有するペプチドフラグメントの例は、RYYRWKC, KYYRWKC, CWKKKKKKK, CKKKKKKK及びCWKKKKKKである。更に、本発明のペプチド複合体とかなりの配列相同性を有するペプチドフラグメントは、本発明のペプチド複合体と特異的に結合することができる抗体を産生するために使用され得る。例として、CAPPSKKKKKK, CAAPKKKKKK, CPPSKKKKKK等がある。任意に、Cys末端を有する前述の各ペプチド複合体は、少なくとも１つのD型のアミノ酸を有してもよい。
【００２４】
後文で更に詳細に論じるように、当該新規ペプチド複合体は、単独の活性物質として、あるいは１又は複数の医薬例えば以下に具体的に示されるものと一緒に投与され得る。
【００２５】
詳細な説明及び特許請求の範囲を通じて、天然アミノ酸の一文字表記は、天然アミノ酸の三文字表記と同様に使用され、そして他のα−アミノ酸のための三文字表記、例えばオルニチン(Orn), 2,4-ジアミノブタン酸(Dab)及び2,3-ジアミノプロパン酸(Dapa)も一般的に許容される。L又はD型と示されていない場合、問題のアミノ酸は天然のL型を有していると考えられ、これについてはPure & Appl. Chem. Vol. 56(5)pp595-624(1984)を参照のこと。何も断りのない限り、本発明の化合物のＣ末端アミノ酸は遊離カルボン酸として存在すると理解されるべきであり、これは「-OH」としても表されることがある。Biochem, J., 1984, 219, 345-373; Eur. J. Biochem., 1984, 138, 9-37; 1985, 152, 1;1993, 213, 2;Internat. J. Pept. Prot. Res., 1984, 24 p84; J.Biol. Chem., 1985, 260, 14-42; Pure Appl. Chem. 1984, 56, 595-624; Amino Acids and Peptides, 1985, 16, 387-410; Biochemical Nomenclature and Related Documents, 2nd eddition, Portland Press, 1992, pages 39-69; Copyright IUBMB and IUPACを参照のこと。式I又はIIIのペプチド複合体の「逆型」の用語は、式I又はIIIの逆のアミノ酸配列を有するペプチドを言及する。式I又はIIIのペプチド複合体の「全てD型」の用語は、全てのアミノ酸単位がD型にあるペプチドを言及する。式I又はIIIのペプチド複合体の「逆の全てD型」の用語は、式I又はIIIの逆のアミノ酸配列を有し、且つ全てのアミノ酸単位がD型(逆の反転型(retro-inverse form))にあるペプチドを言及する。任意に、本発明のペプチド複合体において、式II又は式(RK)YY(RK)(WI)(RK)によって定義される配列は全てD型、逆型又は逆の全てD型である。D-アミノ酸は、プロテアーゼに富む環境において安定な非天然アミノ酸である。従って、タンパク質分解に対して本発明のペプチド複合体を安定化する有用な方法は、L-アミノ酸を相当するD-アミノ酸で置換することである。用語「エピトープフラグメント」は、例えば５〜８アミノ酸単位を有するペプチド配列の短縮され、又は短くされた部分を言及し、そして抗原応答を誘発することができる。
【００２６】
用語「アルキル」は、任意な炭素原子からの水素原子の除去によってアルカンから誘導した一価の基:CnH2n+1-を言及する。非分枝アルカンの末端炭素原子からの水素原子の除去によって誘導した当該基は、標準的なアルキル(n-アルキル)基:H[CH2]n-のサブクラスを形成する。RCH2-, R2CH-(RはHではない),及びR3C-(RはHではない)の基は、それぞれ第一級、第二級、及び第三級アルキル基である。「アルキル」は任意なアルキル基を言及し、そしてC(1-6)アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル及びヘキシル並びにそれらのあらゆる異性体を含む。「低級アルキル」とは、C(1-6)アルキル、好ましくはC(1-4)アルキル、更に好ましくはメチル及びエチルを意味する。
【００２７】
用語「C(1-6)アルコキシ」は、式R-O-（ここで、RはC(1-6)アルキルを表す）のエステル基を言及する。用語「アリールオキシ」は、式R-O-（ここで、Rは、任意に低級アルキル基で置換されたフェニル又はナフチルを表す）のエステル基を表す。
【００２８】
用語「アシル」は、本明細書で使用する場合、RkE(=O)l(OH)m(lは0ではない)から、それぞれヒドロキシルカチオンHO+、ヒドロキシルラジカルHO・又はヒドロキシルアニオンHO-を除去することによって公式上形成したアシルラジカル、及びそのような中間体の置換類似体を含む。アシルラジカルは、公式上、オキソ酸の酸産生因子上に不対電子又は正電荷を有する限界構造によって表されうる。アシルラジカルは、例えばRC・(=O), RS・(=O)2である。
【００２９】
用語「アシル化」は、本明細書で使用する場合、問題の化合物がアシル基を有することを示す。アシル基は、一般式RkE(=O)l(OH)m(lは0ではない)を有するオキソ酸、例えばカルボン酸から１又は複数のヒドロキシル基を除去することによって形成し、そしてそのようなアシル基の置換類似体は、例えばCH3C(=O)-, CH3(=NR)-, CH3C(=S)-, PhS(=O)2-, HP(=N)-である。有機化学において、断りのないアシル基は通常カルボン酸のアシル基である。International Union of Pure and Applied Chemistry, Recommendations on Organic & Biochemical Nomenclature, Symbols & Terminology etc. IUPAC Recommendations 1994を参照のこと。「Ac」はアセチル基を示し、そして「Tfa」はトリフルオロアセチル基を示す。
【００３０】
用語「ペプチド複合体」は、本明細書で使用する場合、ペプチド結合又は相当する生物学的等価性の結合、例えばTayar et al., Amino Acids(1995)8:125-139の表１に記載のペプチド結合様のものを介する少なくとも２つのペプチド配列間の融合体を示す。
【００３１】
用語「輸送部分」は、本明細書で使用する場合、生体膜を通過する分子、例えばポリペプチドを送り届ける際に働く化学物質を示す。WO 98/52612に開示されている輸送ポリマーは、引用によって全て本明細書に組み入れられる。本発明のペプチド複合体は、共有結合を介して前記輸送部分に連結する。用語「HIV tatペプチド残基49-57」は、WO 91/09958に開示されている配列RKKRRQRRRを有する輸送部分を言及する。
【００３２】
「アゴニスト」は、受容体と相互作用することができ、且つその受容体に特徴的な生理学的又は薬理学的応答（収縮、弛緩、分泌、酵素の活性化等）を開始することができる内在物質又は薬物を言及する。
【００３３】
「アンタゴニスト」は、別の生理学的作用に対抗する薬物又は化合物を言及する。受容体レベルで、それは別の生物活性剤によって通常誘導される受容体関連型の応答に対抗する化学物質である。
【００３４】
「部分アゴニスト」は、薬物の適用量に関係なく、受容体群の最大の活性化を誘導することができないアゴニストを言及する（固有活性も参照のこと）。「部分アゴニスト」はまた、所定の組織において「中程度の固有効果を有するアゴニスト」とも称されることがある。更に、部分アゴニストは、同一の受容体に対して働く完全アゴニストの作用と拮抗し得る。
【００３５】
「受容体」は、分子メッセンジャーとして働く化合物（神経伝達物質、ホルモン、リンホカイン、レクチン、薬物等）を特異的に認識し、且つそれと結合する細胞内の又は細胞上の分子又はポリマー構造を言及する。
【００３６】
用語「塩」は、本明細書で使用する場合、無機酸又は有機酸及び／又は塩基によって形成した酸性及び／又は塩基性の塩、好ましくは塩基性塩を表す。医薬として許容される塩が好ましい場合、特に薬剤として本発明の化合物を利用する場合、他の塩は、例えばこれらの化合物を加工する際における有用性を見出し、又は非薬物型の使用が考慮される。これらの化合物の塩は、当業界で認識されている技術によって製造されうる。その様な医薬として許容される塩の例は、限定しないが、無機及び有機性の酸付加塩、例えばそれぞれ塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩又はリン酸塩及び酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、イソチオネート(isothionate)、酢酸テオフィリン、サリチル酸塩等を含む。低級アルキル第四級アンモニウム塩等も適している。「医薬として許容されるアニオン」は、本明細書で使用する場合、CH3COO-, CF3COO-, Cl-, SO32-,マレイン酸塩及びオレイン酸塩から成る群を含む。
【００３７】
用語「末梢投与」は、中枢神経系への直接的な活性物質の送達を排除した全ての投与形態を含む。「中枢投与」は、本明細書で使用する場合、中枢神経系への直接的な投与、例えば脳室内投与(i.c.v.投与)を意味する。
【００３８】
用語「低ナトリウム血症」は、本明細書で使用する場合、必ずしも限定しないが、次の医学的症状：
例えば高脂血症、高蛋白質血漿又は前立腺／膀胱腫瘍の後部尿道の切除と関連する正常な血漿の浸透圧を特徴とする、偽性低ナトリウム血症、及び
例えば、高血糖及びマンニトールと関連する血漿の浸透圧の増大；
例えば、外皮損傷；発汗、火傷；胃腸管の損傷：嘔吐、チューブドレナージ、瘻孔、閉塞、下痢；腎損傷：利尿、浸透圧利尿、偽低アルドステロン症、塩喪失性の腎障害、閉塞後利尿、非尿量減少性急性尿細管壊死と関連する一次的なNa+の減少（二次的な水分の増大）を特徴とする、低浸透性低ナトリウム血症；
例えば一次多飲症；溶質摂取量の低下（例えば、ビール飲水狂）；痛み、吐き気、薬物に起因するAVP（バソプレッシン）の放出；不適切なAVP分泌の症候群；糖質コルチコイド欠損症；甲状腺機能低下症及び慢性腎不全と関連する一次的な水分の増大（二次的なNa+の減少）；並びに
例えば、心不全、肝硬変及びネフローゼ症候群と関連する、一次的なNa+の増大、を含む。
【００３９】
鬱血性心不全(CHF)
鬱血性心不全(CHF)は、心臓機能の異常が、代謝組織が必要とするものに合う速度で血液を送り出す心臓の疾患を原因とする病状である。CHFの根本にある原因（例えば、虚血性心不全、動脈高血圧症、拡張型心筋症、心臓弁膜症、貧血症等）にも関わらず、心不全の主要な臨床的発現は呼吸困難であり、これは、病気が進行するにつれ、あまり激しくない運動で現れる。ニューヨーク心臓協会(NYHA)の機能的分類に従い、CHFの患者は４つのクラス（クラスI、クラスII、クラスIII、クラスIV）のうちの１つに分類されうる。この機能的分類は世界中で使用されており、そして左心室駆出分画率とは無関係に死亡率と強力に関係している。
【００４０】
鬱血性心不全は、神経液性の調節の複合的な系を特徴とする。主要機構は、交感神経系の活性化、レニン−アンギオテンシン−アルドステロン系の刺激、及びバソプレッシン放出の刺激、である。これらの影響は体血管抵抗を上昇させ、そしてナトリウム及び水分の貯留を増大させ、一方、カリウム排泄が高アルドステロン症に起因して増大する。水分を貯留する機構の活性化に起因して、末期のCHFの患者は水分を排泄する能力が低下し、そして水分の摂取が制限されない限り、これらの患者は、希釈性低ナトリウム血症を発症する大きな危険性がある。
【００４１】
CHFの現在の治療
医療処置の目的は、心筋機能をあまり重度に危うくすることなく、衰弱させる症状から患者を楽にすることである。CHFの進行の間、当該医療処置は、作用部位を変えて薬物を添加することによって強められる。心不全の現在の処置は、３つのカテゴリー：（１）前負荷及び後負荷を含む心臓の作業負荷の低下；（２）水分及び塩の過剰な貯留の調節；（３）心筋収縮能の増強、に分類されうる。NYHAのクラスIVの患者は、最大量の血管拡張薬、例えばACE阻害剤、ヒドララジン、アルファ−アドレナリン阻害剤、及び硝酸塩で通常処置される。しかしながら、水分及び塩の貯留に起因する肺の鬱血は、これらの患者にとってなおも主要な問題である。全てのクラスに由来する薬物を用いた強い医学的治療にも関わらず、死亡率及び疾病率は、CHFを有する患者においてなおも非常に高い。
【００４２】
重度の心不全(NYHAのクラスIII-IV)の患者は、通常、管状の作用部位が異なる少なくとも２つの異なる利尿薬の組み合わせを必要とする。最も一般的に使用されるのは、ループ利尿薬（例えば、フロセミド、ブメタニド）とチアジド系利尿薬（例えばクロロチアジド、ベンドロフルメチアジド）の組み合わせである。大量のこの組み合わせは、ナトリウム利尿を生み出すのに最も有効な治療である（最大有効性は、ループ利尿薬の場合、濾過した負荷量の約３０％であり、そしてチアジドの場合約１０％である）。しかしながら、遠位集合管（すなわち、希釈部分）におけるチアジド感受性ナトリウム再吸収の阻害は、高張性の尿を生み出すことがあり、そして希釈性低ナトリウム血症に寄与することがある。高アルドステロン症及び集合管へのナトリウムの輸送における関連した増大は、集合管におけるナトリウム−カリウム交換を刺激してカリウム利尿をもたらす。このように、ループ利尿薬とチアジド系利尿薬を用いる複合療法は、心不全の患者における、低ナトリウム血症及び低カリウム血症の両方の最も一般的な原因である。カリウム保持性利尿薬（例えば、スピノラクトン、アミロリド）は、チアジド系利尿薬又はループ利尿薬と組み合わせて使用され得るが、これらの化合物の芳しくない最大有効性（濾過水の最大３％）がこれらの薬物を弱い利尿薬にする。更に、高アルドステロン症により、末期のCHFの患者は、低カリウム血症を発症する危険性が大きい。
【００４３】
安静時の呼吸困難、起座呼吸及び発作性の夜行性呼吸困難のような症状が、ループ利尿薬を用いた最大限の医学的処置にも関わらず続く場合（＝ループ利尿薬耐性CHF又は難治性CHF）、生命を脅かす肺の鬱血を回避するための追加の利尿薬治療が必要である。チアジド系利尿薬は、しばしば、ループ利尿薬の治療効果が不足の場合に最初に選択される薬物として添加される。ループ利尿薬＋チアジド系利尿薬の組み合わせは、有効なナトリウム利尿を生み出すが、ネフロンのチアジド感受性希釈部分におけるナトリウム再吸収の阻害は、しばしば高張性の尿をもたらし、これはしばしば重度の電解質平衡異常をもたらすことがある。このように、ループ利尿薬とチアジド系利尿薬の組み合わせは、NYHAのクラスIVの心不全を有する患者における低カリウム血症及び低ナトリウム血症の最も一般的な原因である[3]。
【００４４】
低カリウム血症は、不整脈の発症のための主要な原因となる機構であり、そしてCHFの予後は、血漿カリウムレベルが3.3mM未満に落ち込む場合に芳しくない。更に、ジゴキシンで処置したCHFの患者において、低カリウム血症は、重度で且つ潜在的に致死的な合併症である、ジギタリス中毒の最も一般的な促進原因である。
【００４５】
重度の心不全を有する患者において、ループ利尿薬とチアジド系利尿薬の複合治療は、増大したナトリウム減少及び水分排泄障害の結果として、低張性低ナトリウム血症をしばしばもたらす。低ナトリウム血症が、脳が適応することができるよりも早く発症する場合、脳浮腫の症状が発症する（例えば、頭痛、吐き気、嘔吐、衰弱、協調不能、振戦、狂乱状態、並びに最終的には発作及び昏睡）。ナトリウムの血清レベル(S-Na)が1mmol/l/時間を越す割合で120mM未満に落ち込んだ場合には死を招く。低ナトリウム血症が更に漸次的に発症する場合、当該症状はより微妙ではっきりせず、且つ非特異的であり、そしてそれらは低いS-Naレベルでさえ起こる傾向にある。典型的に、症状は、人格の変化（憂鬱、非協力的、混乱）、摂食障害、吐き気、筋肉の弱さ、及び急激な腹痛を含む。S-Naが120mM未満である場合、攪乱、吐き気、及び発作が起こりうる。
【００４６】
クラスIVは、末期の心不全を有する患者の群を表す。特徴的な臨床的発現の中でも、安静時の呼吸困難が最も特筆すべき症状である。心不全が進行するにつれ、呼吸困難は、徐々に激しくない運動で現れるが、末期の心不全の間、呼吸困難は、横になっていても普通にみられる（起座呼吸）。当該患者は、充血した肺血管及び間質肺浮腫を有しており、これはしばしば放射線試験上での証拠でとなる。起座呼吸を有する患者は、肺の鬱血を緩和するために自身の頭を上げなければならず、そして彼らはしばしば重度の咳の発作及び息切れした感覚により夜中に起きる（夜間性呼吸困難）。この症状は極めて恐ろしく、そしてその不安はしばしば心不全の症状をより悪くする。
【００４７】
クラスIVの患者における肺の鬱血に加えて、低下した心臓の機能は、肝臓及び門脈系の鬱血と関連し、これが摂食障害、吐き気及び腹痛を生む。クラスIVに属する患者は、極端に高い１年の死亡率（３０〜８０％）を有する。主要な死亡原因は、突然死であり（４０％）、そして鬱血性の心不全の悪化である（４０％）。芳しくない予後と関連する因子の中には、低駆出分画（＜２５％）、酸素摂取の低下、血清ナトリウム濃度の低下（<133mM)、及び血清カリウム濃度の低下(<3mM)がある[3]。本発明のペプチド複合体は、肺の鬱血を緩和し、前負荷及び後負荷を低下させ、心拍出量及び酸素摂取を増大させ、そして低ナトリウム血症及び低カリウム血症を予防する能力を示す、有利な薬理学的プロファイルを示す。
【００４８】
心拍出量が低下する場合、最終的に異常な体液の蓄積をもたらす、一連の代償性の調整が起こる。NYHAのクラスIからIIIのCHF患者における、異常な体液の蓄積及び付随する血液容量の膨張は、心拍出量及び命にかかわる臓器への灌流を維持する傾向にある重要な代償性の機構を構成する。しかしながら、末期の心不全において（NYHAのクラスIV）、心室は低下して平らになった機能曲線上で作用し、そして末期の心不全において、当該患者は、スターリングの容量−心拍出量曲線の下向きの部分で終わる。このように、これらの患者は、血液容量を調節し、且つ生命を脅かす肺浮腫を予防するために、効果的な利尿治療を必要とする。心不全、例えばループ利尿薬耐性の難治性疾患における本発明のペプチド複合体の有利な効果は、血液容量及び肺の鬱血を減少させることである。当該患者が前記曲線の平坦部分上にある場合、心拍出量はわずかに低下し、そして当該患者が前記曲線の下向き部分上にある場合、心拍出量は増大しうる[3]。
【００４９】
ナトリウム及びカリウム保持性の水利尿薬として独特の薬理学的プロファイルを有することで、本発明のペプチド複合体、例えば化合物１は、もはや大量のループ利尿薬に対して十分に応答しない、難治性の心不全を有する患者におけるCHF症状の処置にとって理想的な候補薬物を代表する。これらの患者において、ループ利尿薬に対する追加の又は組み合わせの治療としての当該新規ペプチド複合体は、他の利尿薬で見られる加速したナトリウム及びカリウムの減少無しに、有効な利尿を促進しうる。同じ独特な薬理学的プロファイルも、低ナトリウム血症、腎疾患、並びにネフローゼ症候群及び肝硬変と関連する浮腫の処置において有利であることを示す。
【００５０】
薬理学
マウスの輸精管アッセイ
本発明の化合物は、例えばノシセプチンアゴニスト又は部分アゴニストとして薬理学的に活性であり、そして活性を示すのに有用な方法はHughes J., Kosterlitz H. W., Leslie F. M.:Effect of morphine on adrenergic transmission in the mouse vas deferens. Assessment of agonist and antagonist potencies of narcotic analgesics [4]に記載されている。単離された電気刺激したマウス輸精管の調製物は、in vitroでオピオイドアゴニスト及びアンタゴニストの機能的薬理学的作用を評価するために幅広く使用されている[5]。マウス輸精管は、３つのオピオイド受容体型を全て有しており、そしてそれに続く研究は、マウス輸精管アッセイがノシセプチンにも感受性があることを記載している[6]。
【００５１】
３０〜４０gの重さの、雄性のNMRIアルビノマウス由来の輸精管を、SCHULER organ bath Type 809, Hugo Sachs Elektronik(Germany)内に据え、そして３７℃の改良型クレブス溶液(NaCl 6,9g/L, KCl 0,35g/L, KH2PO4 0,16g/L, NaHCO3 2,1g/L, グルコースH2O 2,0g/L, CaCl2 2,52mL/L)で灌流した。当該溶液は、実験の間、Caorbgenガス(95% 02及び5% CO2)を通気された。当該組織は、HSE Stimulator I Type 215を用いて、organ bath中で直接的に２つの銀の電極を介して電気的に刺激された。組織の刺激は、100msの頻度でそれぞれ1msの期間、60s毎に102パルス流し、極量以上の電圧（１５ボルト）を適用することによって実施した。濃度応答曲線は、マウス輸精管の平滑筋を弛緩する試験物質をorgan bathに蓄積的に加えることによって描かれた。当該アッセイにおいて使用した試験物質は、等張食塩水溶液中のノシセプチン、化合物１（等張食塩水溶液中でトリフルオロ酢酸塩として）、化合物２（等張食塩水溶液中でトリフルオロ酢酸塩として）、及びヘキサペプチドAc-RYYRWK-NH2（等張食塩水中でトリフルオロ酢酸塩として）であった。本発明のペプチド複合体は、マウス輸精管(MVD)アッセイにおいて生物学的に活性であるが、当該化合物は、効力の変化につれ、電気的に誘導した濃度のマウス輸精管を阻害する：ノシセプチン＞化合物１＝化合物２＞＞Ac-RYYRWK-NH2（データは示さない）。
【００５２】
マウス輸精管アッセイにおけるノシセプチン誘導型弛緩に対するAc-RYYRWK-NH2及び化合物１の作用も試験された。これらの実験結果を図１に示す。これらのデータは、部分アゴニストAc-RYYRWK-NH2[1]及び化合物１と称されるペプチド複合体が、ノシセプチン誘導型平滑筋弛緩を阻害することを示す。Schildの式を用いて[7]、アンタゴニストとして化合物の親和性を示すpA2値が算出された。これらの結果を表２に示す：
【表３】
0004624639.tif 000003
【００５３】
これらのデータは、化合物１が、MVDアッセイにおいて、ノシセプチン誘導型平滑筋弛緩に対して、非複合型ヘキサペプチドAc-RYYRWK-NH2よりもアンタゴニストとして約５０倍強力であることを示す。
【００５４】
in vivoでの研究
これまでの研究は、意識のあるラットの中枢に（脳室内に、i.c.v.）又はi.v.注入として投与された場合、ノシセプチンが尿流量の著しい増大及び尿中のナトリウム排泄の低下（すなわち、水利尿性の応答）をもたらすことを示した[8-10]。意識のあるラットのモデルにおいて、当該動物は、膀胱、大腿動脈、及び大腿静脈内に長期にわたりカテーテルを備え付けられている。当該動物は、等張食塩水を用いた、50μl/分の連続i.v.注入を受ける。尿は、１０分毎の連続的な尿の回収期間でバイアルに回収される。２回のコントロール期間の後、試験化合物が投与され、そして分画された尿の回収（１０分の期間）は、少なくとも２時間続けられる。ナトリウム及びカリウムの尿濃度は、内部標準としてセシウムを用いて炎光光度計(Instrumentation Laboratory 943)によって決定される。
【００５５】
本発明のペプチド複合体の利尿作用は、意識のあるラットにおいて決定され、ここで、化合物１は強力且つ持続性の利尿性の応答を誘導する。ノシセプチン(Phoenix Pharmaceuticals)及び化合物１のi.v.注入によって生み出された心血管及び腎臓の応答は、意識のあるSparague Dawleyラットにおいて研究された。当該結果を図２〜８に示し、ここで、HRは心拍数であり、MAPは平均動脈圧であり、Vは尿流量であり、UNaVはナトリウムの尿排泄量であり、RSNAは、コントロールレベルの%として表した腎臓の交感神経活性であり、Cosmは浸透圧性のクリアランスであり、そしてCH2Oは遊離水のクリアランスである。
【００５６】
図２は、i.v.注入したノシセプチン(11nmol/kg/分)の典型的な心血管及び腎臓の応答を示す。ノシセプチンは、恐らく動脈の平滑筋の弛緩に起因してMAPを有意に低下させる[11]。
【００５７】
図３は、i.v.注入した化合物１(1及び0.1nmol/kg/分)の有意な利尿性応答(Vμl/分)及び抗ナトリウム排泄増加性応答(UNaVμeq/分)を示す。i.v.のノシセプチンと同様に、化合物１は、HRに対するわずかな作用により、わずかではあるがMAPの有意な低下を生んだ。化合物１を注入した全てのラットが、ノシセプチン処置と通常関連する食欲の増大、鎮静、又は行動変化の徴候を全く示さなかった。
【００５８】
図４は、化合物１（1及び0.1nmol/kg/分)のi.v.注入の間に観察された浸透圧クリアランスの低下及び遊離水クリアランスの増大を示す。
【００５９】
図５は、1nmol/kg/分の化合物１及び11nmol/kg/分のノシセプチンのi.v.注入によって誘発されたV及びUNaVの、同程度の変化を例示する。
【００６０】
図６は、0.1nmol/kg/分の化合物１及び1.1nmol/kg/分のノシセプチンのi.v.注入によって誘発されたV及びUNaVの、同程度の変化を例示する。図５及び６で提示したデータは共に、化合物１が、真のノシセプチンと比較して、同程度の利尿性応答及び抗ナトリウム排泄増加性応答の産生において約１０倍以上効能がある事を示唆する。化合物１注入の利尿作用は、i.v.ノシセプチン注入のものより、長期間持続する傾向にあった。
【００６１】
更に、心拍数、動脈圧及びRSNAに対するノシセプチン(30及び100nmol/kg, Phoenix Pharmaceuticals)及びノシセプチン-NH2(30nmol/kg)のi.v.ボーラス投与の作用が、６匹の意識のあるSparague-Dawleyラットの群で研究された。ボーラス注入は、迅速な徐脈、低血圧応答及び初期のRSNA抑制をもたらした（データは示さない）。化合物１(30nmol/kg)の同様のi.v.ボーラス注射は、心拍数、血圧又はRSNAにおいて何ら変化をもたらさなかった。更に、この用量で試験したラットは、食欲の刺激又は行動変化の徴候を何ら示さない。これと同一のラットにおける化合物１（30nmol/kg)のi.v.ボーラス注射は、著しい利尿性(V)及び水利尿性(UNaV)の応答をもたらした（データは示さない）。上述した実験で得られた化合物１に対するin vivoでの応答の要約を以下の表３に示す：
【表４】
0004624639.tif 000004
【００６２】
これらの研究から、化合物１は、摂食又は行動変化を誘発するのに必要とされるものよりも遙かに低いi.v.注入量で有意な利尿性応答（例えば、鎮静、探索行動の増大、カタレプシー、痙攣等）を誘発するようである。更に、図３に示した研究における化合物１(1nmol/kg/分)の、１２０分のi.v.注入の後、ノシセプチンのi.v.ボーラス注射に対するHR及びMAP応答が試験された。これらの研究において、典型的な徐脈及び低血圧（開始が早く且つ程度が大きい）が、試験した全てのラット(n=6)で完全に防がれた。
【００６３】
追加の一連の用量−応答研究において、化合物１に対する心血管及び腎臓の応答が、i.v.ボーラス注射(10(n=6), 30(n=4), 100(n=6)又は300(n=4)nmol/kg i.v.)の後、又は連続i.v.注入(0.1(n=6), 1(n=6)又は10nmol/kg/分(n=6))後のいずれかに研究された。尿流量及び尿中のナトリウム排泄の安定化の後に、尿が２０分のコントロール期間の間に回収された。この後、i.v.ボーラス注射を行い、又はi.v.注入物(infusate)が化合物１を含む等張食塩水溶液に切り換えられた(i.v.注入実験）。薬物投与の時間から、実験用の尿試料（１０分連続の期間）が８０分採取された。
【００６４】
給餌応答観察
各実験の開始１時間前に、小球状の食餌（標準的な齧歯類のえさ）が、ラットの入れ物の穴を介してラットが手に入れられるように据えられた。給餌応答の回数及び時間（すなわち、ラットが小球状の食餌を食べ始める時間）が、薬物投与の前後に記録された。ポジティブな給餌応答が観察された場合、前記小球は、心拍数及び／又は平均動脈圧における給餌誘導型の変化を防ぐために、抑制帯(restrainer)から除去された。１０分間隔で、小球状の食餌がラットに提示され、給餌応答の期間を決定された。
【００６５】
意識のある、長期にわたりカテーテルが挿入されたラットにおけるこの一連の研究において、化合物１のi.v.ボーラス注射が選択的な水利尿をもたらすことが証明された。データを以下の表４に示す。
【表５】
0004624639.tif 000005
【００６６】
★は、30nmol/kgのi.v.ボーラスで試験した４匹のラットのものを示し、１匹のラットが、８０分の実験期間の間の様々な時点で給餌応答を示した。
★★は、100nmol/kgのi.v.ボーラスで試験した６匹のラットのものを示し、３匹のラットが、i.v.ボーラスZP120C投与から３０分以内に給餌応答を誘発した。給餌応答は、残りの３匹において、試験期間（８０分）を過ぎても観察されなかった。
★★★は、300nmol/kgのi.v.ボーラスで試験した４匹のラットのものを示し、２匹のラットが８０分の実験期間の間の様々な時点で給餌応答を示した。
【００６７】
連続的i.v.注入として投与された場合、選択的な水利尿性の応答（抗ナトリウム排泄と関連する利尿）が1及び10nmol/kg/分で観察された（表５）。
【表６】
0004624639.tif 000006
【００６８】
★は、10nmol/kg/分で試験した６匹のラットのものを示し、４匹のラットが給餌応答を誘発せず、そして２匹のラットが、８０分の注入研究の残り１０分の間に食餌した。
【００６９】
合計して、これらの用量−応答研究は、化合物１が、心血管機能の著しい変化を誘発するのに必要とされるものよりも遙かに低いi.v.注入及びi.v.注射の用量で有意な水利尿性の応答をもたらすことを示す。これは、著しい徐脈応答及び低血圧応答によって起こる、内因性のノシセプチンによってもたらされる利尿(i.v.ボーラス及びi.c.v.注射)、及び腎臓の交感神経仮性の同時阻害(i.c.v注射)と対照的である[8-10]。これらの観察は、内因性のORL1リガンドであるノシセプチンと異なり、化合物１は、反対の、全身性の心血管の事象を誘発するために必要とされるものよりも実質的に低い治療量で、水利尿薬として、患者における臨床的な有用性を有する。我々は、CNSへの化合物１のより少ない浸透が、内因性のノシセプチンと比較してより選択的な、新規化合物の腎臓での作用によって説明され得ると考えられる。
【００７０】
総胆管の結紮によって誘導された肝硬変を有するラットは、２〜４週間以内に強烈な水分及びナトリウムの保持並びに腹水症を発生する。肝硬変ラットにおいて乱れたナトリウムと水分平衡は、肝硬変を有する患者における浮腫及び腹水症の重大な臨床的所見と一致している。浮腫を形成する状態の実験モデルにおいて化合物１の有効性を試験するために、化合物１の急性i.v.ボーラス注射(65nmol/kg)に対する利尿性の応答が、４週間前に総胆管の結紮によって誘導された肝硬変を有するラットにおいて評価された。実験の前に、ラットは、膀胱、並びに大腿静脈及び動脈において、長期にわたりカテーテルを備え付けられた。化合物１に対する腎臓の応答は、偽の処置を受けたコントロールラットと比較された。化合物１は、全動物において糸球体濾過の変化無しにナトリウム及びカリウムの尿排泄の減少と関連した、遊離水のクリアランス（水利尿）の著しい増大をもたらした。腎臓の応答は、肝硬変のラット及びコントロールのラットと同様であった。偽の処置を受けたコントロール動物における65nmol/kgのi.v.投与後の、尿流量、ナトリウム及びカリウム排泄の相対的な変化を図７に要約する。
【００７１】
図８で例示するように、肝硬変のラットは、コントロール動物と比較して、薬物投与の前のナトリウム排泄が有意に低かった。このことは、肝硬変のラットが重度のナトリウム保持を有していたことを示しており、これはヒトの肝硬変の特徴である著しいナトリウム保持と一致している。化合物１は、全動物において糸球体濾過の変化無しにナトリウム及びカリウムの分画排泄の減少と関連した、尿流量及び遊離水のクリアランス（水利尿）の著しい増大をもたらした。腎臓の応答は、肝硬変のラット及びコントロールのラットと同様であった。偽の処置を受けたコントロール動物及び肝硬変動物における65nmol/kgのi.v.投与後の、尿流量、分画ナトリウム排泄及び分画カリウム排泄の相対的な変化を図８に要約する。これらの結果は、本発明の化合物、例えば化合物１が、浮腫形成状態、例えば肝硬変、鬱血性心不全、ネフローゼ症候群及び腎不全における浮腫、低カリウム血症、及び低ナトリウム血症の処置において有用である。
【００７２】
急性タキフィラキシーが化合物１を用いるi.v.処置の間に発症するか否かを評価するために、追加の一連の実験が実施された。長期にわたり器具を備え付けられたラットは、担体(150mMグルコース)又は化合物１(1nmol/kg/分)を２時間注入され、同時に、水分平衡がコンピューター作動の、サーボ制御i.v.容量交換システムを用いて維持された[2]。急性タキフィラキシーは、意識のあるイヌにおいて、バソプレッシンアンタゴニストSKF 101926の繰り返しのi.v.投与の間に観察され[12]、そして長期にわたる処置の間の耐性が、選択的V2受容体アンタゴニストOPC-31260で報告された[13]。
【００７３】
化合物１は、合計１２時間の注入期間持続する維持された水利尿性応答を誘発し、これは急性タキフィラキシーがこの化合物による処置の間に発症しないことを示唆している。化合物１の1nmol/kg/分のi.v.注入は、同一のモデルで試験された場合、選択的バソプレッシン２型受容体アンタゴニストOPC-31260の最大用量で見られた応答（図９）と同程度の水利尿性応答を誘発した[2]。この実験において、1nmol/kg/分の化合物１は、動脈血圧、心拍数、腎臓の血流、糸球体濾過速度又は近位尿細管の再吸収における不随の変化無しに水分の再吸収を阻害した。これらの実験は、化合物１がバソプレッシン２型受容体アンタゴニストで得ることができるものと類似の最大水利尿効果を有する。しかし、急性タキフィラキシーは化合物１による最初の処置から１２時間以内に発症せず、そしてこの所見はバソプレッシン２型受容体アンタゴニストと比較した場合の化合物１の更なる治療的利点を表す。更に、バソプレッシン２型受容体アンタゴニストは、腎臓での電解質の処理に影響を及ぼさないが、本発明の化合物はナトリウム及びカリウムの尿排泄を低下させる。
【００７４】
in vivoの心不全モデルにおいて本発明の化合物の作用を試験するために、低心拍出量性心不全の慢性モデルが使用される。要約すると、当該ラットは1:1 N2O/O2ガス混合物中の4%ハロタンを有する吸入チャンバーにおいて麻酔される。気管内チューブの挿入後、当該動物は、1:1 N2O/O2ガス混合物中の１%ハロタンを人工的に通気された。一回換気量及び呼吸数が7.35〜7.46の動脈のpHを維持するために調整される。手術の間、当該動物は３７〜３８℃の直腸温で維持された、加熱されたテーブル上に据えられる。鬱血性心不全を生み出すために使用される左冠状動脈の結紮は、胸骨傍の開胸術を介して実施され、そして６−０の絹縫合が、肺動脈幹と左外耳との間に据えられる。偽の処置は、左冠状動脈を結紮することなく実施される。術後の痛みを最小化するために、ラットは処置後に２日間、１日２回皮下注射で0.2mg/kgのブプレノルフィンを用いて処置される。心臓手術の２週間後、長期間、Tygonカテーテルが大腿動脈及び静脈内に挿入され、そして膀胱カテーテルが膀胱に挿入される。血管カテーテルにおける凝固を防ぐために、これらの系は1ml当たり1,000ユニットのヘパリン及び1ml当たり1,000ユニットのストレプトキナーゼを有する50%デキストロースで満たされる。生理学的な試験が心臓手術から３週間後に実施されるのは、左冠状動脈の結紮後の機能的悪化がこの時期に通常最大であることによる。腎機能の研究は上述の通りに実施される。心不全の程度を評価するために、当該ラットは1:1 N2O/O2中のハロタンで麻酔され、挿管され、そして人工通気され、そしてTygonカテーテルが、左心室拡張終期圧(LVEDP)を評価するために、右頸動脈を介して左心室内に挿入される。LVEDPの正確な測定は、意識のある状態で記録された平均動脈圧と同レベルを、負荷後、麻酔の間維持するためにハロタンの濃度を調整することによって実施される。この動物モデルは、低心拍出量、ナトリウム及び水分保持、及び浮腫の形成という臨床的な特徴を、ヒト心不全の最も一般的な形態で共有する[15]。
【００７５】
ネフローゼ症候群のin vivoモデルにおいて本発明の化合物の作用を試験するために、アドリアマイシン誘導型ネフローゼ症候群の慢性モデルが使用される。ネフローゼ症候群は、通常の生理食塩水に溶解した10mg/mlの濃度のアドリアマイシン（＝ドキソルビシン、Sigma Chemical, St. Louis, MO）の7〜8mg/kgの単回の静脈内注射で誘導される。このモデルにおいて、蛋白尿が7.5mg/kgの単回の静脈内注射から４〜５日後に開始する。糸球体の変化、蛋白尿、ナトリウム及び水分保持、並びに浮腫の形成を伴う当該症候群の完全な発現は、１３〜１５日後に発症する[15;16]。
【００７６】
肝硬変のin vivoモデルにおいて本発明の化合物の作用を試験するために、総胆管の結紮によって誘導された胆汁性肝硬変の慢性モデルが使用される[17]。閉塞してから２８日後に、当該ラットは、ナトリウム及び水分保持、並びに腹水症を関連する進行性の肝硬変を発症する[15]。
【００７７】
急性腎不全を含む多臓器不全のin vivoモデルにおいて本発明の化合物を試験するために、麻酔及び手術の間の出血によって誘発された臓器不全のモデルが使用される。このモデルにおいて、ラットは、等張性塩溶液又は本発明の化合物を麻酔の１５分前に注入される。続いて、当該動物はイソフラン(N2O/O2混合物中で3%）で麻酔され、そして手術（長期にわたる膀胱のカテーテル化＋大腿静脈及び動脈；３０分）；出血（20ml/kg体重；４５分）、及び回収（血液交換；１２０分）の周期にかけられる。連続１０分の尿試料を全体にわたって回収し、そしてラットは開腹のために７日間放置させられる。出血事象の後、尿の回収物及び血液試料が、尿産生、並びにクレアチニン及び尿素の血清濃度によって決定した場合の回収を評価するために回収される。最終的に７日目に、ラットは全臓器の組織学的試験のために犠牲となる。このモデルを用いて、Kapusta等は、カッパーオピオイドアゴニストU-50, 488Hが多臓器不全（腎臓、肺、腸）を予防し、そして手術の麻酔の間に誘発された出血事象の後の生存を増大する[16]。
【００７８】
要約すると、in vivoの研究は、化合物１が強力なナトリウム及びカリウム保持性の水利尿薬であることを示した。その末梢性の作用に加えて、ノシセプチンは、交感神経活性、動脈血圧及び心拍数の、中枢を介した低下を誘発する[10;19:20]。更に、ノシセプチンは、in vitro及びin vivoで共に、脊髄の節前神経の活性を抑えることによって、脊髄の交感神経の伝導を低下させる[21]。大動脈洞の圧受容体の神経除去と比較した場合の、ラットにおける低下した交感神経活性、血圧及び心拍数の迅速な開始及び類似の時間の関係は、ノシセプチンの心血管性の作用が心血管系に対する交感神経活性の阻害によって大きく阻害されることを示唆している[10]。このように、ノシセプチン誘導型の低血圧及び徐脈に対する化合物１の阻害作用は、化合物１が心拍数及び血圧の神経性の調整に対するノシセプチンの作用と拮抗することができることを示唆する。化合物１がin vivoでノシセプチンアンタゴニストとして働くという所見は、化合物１がマウス輸精管モデルにおけるノシセプチンの平滑筋弛緩作用と拮抗するという事実によって支持される。このように、内因性のノシセプチンと反対に、化合物１は、著しい徐脈及び低血圧を生まない用量で、尿流量を増大させ、そしてナトリウム及びカリウムの尿排泄を低下させる。
【００７９】
ORL1に対する化合物１の結合のin vitroでの研究
一連の結合アッセイにおいて、化合物１が高い親和性で且つ高い特異性でヒトノシセプチン受容体(すなわちORL1)に結合することが示された。
【００８０】
ヒトORL1受容体を用いてトランスフェクションしたHEK293細胞を用いて、化合物１が、Ki=0.26nMで、[3H]標識したノシセプチンの特異的な結合を置換することが示された。
【００８１】
更に、化合物１は、0.1, 10, 及び1000nMでの５つのオピオイド（非選択的オピエート、δ、κ、μ、及びORL1）、３つのバソプレッシン(V1a, V1b及びV2)受容体結合アッセイ、並びに10μMでの４０個の異なる受容体の、取り込み(uptake)、及びイオンチャンネル結合部位(A1, A2,α1,α2,β1, NE取り込み(uptake), AT1, BZD, B2(h), CCKA(〜CCK1) D1, D2, ETA(h), GABA, NMDA, H1, M, NK1(h), Y, N, オピエート, PCP, 5-HT, 5-HT1B, 5HT2A, 5-HT取り込み, σ, V1)で試験された。これらの実験は、化合物１が、ORL1受容体以外の受容体と全く結合しない又はごくわずかに結合する、選択的ORL1受容体リガンドであることを証明した。更に、ヒトORL1受容体を発現するトランスフェクションしたHEK293細胞において、化合物１が、EC50=0.54nMで且つノシセプチンと比較して92%の相対最大値で、cAMPのフォルスコリン誘導型の形成を阻害する。これらの結果は、化合物１が選択的なORK1受容体アゴニストであることを示唆している。
【００８２】
IC50(nM)値として計算された、CHO細胞で発現したヒトORL1受容体に対する本発明の化合物の結合を示すデータ（全て１つの実験に基づく）を以下の表６に示す。ORL1受容体はcAMPにネガティブに結合するので、ORL1アゴニストの作用はフォルスコリン誘導型のcAMPの形成の阻害として検出される。本発明の６つの化合物は、CHO細胞で発現したhORL1受容体に対する効果について試験された。EC50(nM)の値は、全て１つの実験に基づいている（データは表６に示す）。
【表７】
0004624639.tif 000007
【００８３】
ヒトORL1受容体に関する、公表された研究の多くが、当該受容体のCNS作用に対して集中している。しかし、本明細書に記載の研究は、腎臓における、化合物１によって媒介される作用に集中している。ORL1受容体がヒト腎臓に存在するか否かを決定するために、ヒト脳において発現したORL1受容体と相同性のあるPCTプライマーが構築された。ヒト腎臓RNAから単離された全RNAは、PCR解析のための材料を得るために最初の鎖の合成にかけられた。この解析は、ORL1受容体の449bpフラグメントを示し、これは当該受容体がヒト腎臓で発現し、そしてそれ故に本発明のORL1リガンドがヒトの腎臓で機能することが予想されることを示す。
【００８４】
in vitroでの安定性
ペプチドの分解は、酵素の存在下で、例えば血流でほとんど例外なく見られる。推定される薬物の重要な特徴は、それがin vivoで素速く分解するか否か、又はそれがより長期間その作用を行使することができるか否か、である。本発明のペプチド複合体の安定性を試験することができるように、ヘパリンで安定化されたマウス血漿（Harlan Seralab, UKから購入）において分解が試験された。
【００８５】
方法
安定性の研究は、３つ一組で行った。100μLの、試験化合物（ペプチド複合体）の1mg/mL溶液を、３７℃でインキュベートした、900μLの血漿を含むエッペンドルフチューブに添加した。添加直後に、100μLの試料を除去し、そして10μLの抽出溶液(50%TFA（トリフルオロ酢酸）/MeCN, v/v)を含む、エッペンドルフチューブに添加した。この試料は、t=0を構成する。次に、試料はt=15,30,60,120,180,240,300,及び360分で除去され、そしてt=0の場合と同様に処理された。当該試料を20,000xgで遠心し、そして上清をバイアルに移し、そして高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によって解析した。
【００８６】
当該解析は、４つ一組のポンプを有するHP1100 HPLC上で実施した。使用したカラムはVydac 201SP5215であり、そして当該装置はオートサンプラー、カラムオーブン、可変性のUV検出器及び蛍光検出器を含んで成る。当該過程は、ChemStationソフトウェアによって調整される。グラジエント溶液は、溶媒A及びBから構成され、これは、それぞれ0.02%n-ヘプタフルオロ酪酸(HFBA)/ミリQ水(MQW)と0.02%HFBA/90%MeCN/MQWを含んでいる。分離は、0.250mL/分の流速での、１５分以内の、5-100%の直線勾配を用いて３０℃で実施された。この研究で使用されたクロマトグラフィーは、254nmの波長でのUV検出によって得られた。既知のスタンダードとの比較して試験ペプチドとして得られたピークは、各時点の濃度の測定としてピーク面積を生成するために組み込まれた。これらの値はマイクロソフトエクセルに移され、この中で、Ac-RYYRWK-NH2及び化合物１についての半減期(t1/2)及び速度定数(Kobs)が当該式に当てはめることによって決定された。図１０に例示するように、非複合型物質Ac-RYYRWK-NH2の分解速度は、化合物１のものより有意に速かった(Ac-RYYRWK-NH2:t1/2=2-5分（推定）及び化合物１:t1/2=358+/-36分)。
【００８７】
これらのデータは、複合型ペプチド化合物１が、ヘパリン化したマウス血漿において非複合型ヘキサペプチドAc-RYYRWK-NH2よりも有意に安定であることを示す。このように、本発明は更に、本明細書で定義したようなペプチド配列Z'、好ましくはK6配列のZ'を以下のヘキサペプチドのＣ末端に結合したペプチドを介して連結することによって、ヘキサペプチド、好ましくは本明細書の式IIのヘキサペプチド、そして更に好ましくはヘキサペプチドRYYRWKの安定性を増強する方法に関する。
【００８８】
ヘパリン化したヒト血漿における安定性
更に、本発明の化合物１の分解は、ヘパリン化したヒト血漿において研究された。以下の表７は、Ac-RYYRWK-NH2及びノシセプチン-NH2と比較した本発明の化合物１の分解の半減期(T1/2)を示す。当該表から、１６時間以上の半減期を有する本発明の化合物１が、１時間未満の半減期を有するAc-RYYRWK-NH2、及び約１．５時間の半減期を有するノシセプチン-NH2よりも血漿中でかなり安定である。
【表８】
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【００８９】
in vitroでの血漿の安定性の解析方法
ペプチドの安定性はヒト血漿中で解析される。当該ペプチドは血漿中で３７℃でインキュベートされ、そして、化合物１の場合t=0〜t=32の間に約８回の一定間隔で、そして化合物CE1の場合t=0〜t=32の間に９回の一定間隔で採集された試料がHPLCによって解析される。
【００９０】
HPLC解析にとって適当な条件（カラム、溶媒、グラジエント、及び温度）は、薬物ピークと血漿ピークが同一の保持時間を有さないことを保証するために推定される。これは、薬物、血漿の順次注射、及び薬物と血漿の同時注射、それに続く満足のいく分離が得られるまでのLC法のパラメーターの最適化、によって行われる。３つの平衡して行った実験は、各血漿型につき実施される。100μlのペプチドがt=0のときの900μlの血漿と混合され、そして３７℃でインキュベートされる（薬物−血漿混合物濃度0.1mg/ml）。100μlの薬物−血漿混合物試料が適当な間隔で除去され、そして分解は10μlのMeCN:TFA 50:50v/vを用いる試料の沈殿によって停止される。同一の方法で処理された薬物を含まないコントロールの血漿試料も採集される。血漿試料は、周囲温度で、12,000rpm（エッペンドルフ遠心機）で１５分間遠心される。生じた上清溶液は、300μlのHPオートサンプラーバイアルに移され、そしてHPLCによって解析される。HPLC解析は、以下のように実施される：
【表９】
0004624639.tif 000009
【表１０】
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【００９１】
試料は、以下の順序で解析される：ブランク、0.1mg/mlのペプチド、ペプチドを含まない血漿、t=0の３つの並列の試料、t=5分の３つの並列の試料、t=60分の３つの並列の試料等。そして最終的にt=0の３つの並列の試料が、解析の間に全く分解せず、又は他の不具合が無いことを保証するために繰り返される。試料濃度（mAUのピークの高さ）が時間に対してプロットされ、そして単一の指数関数的減退を描く関数に適合される（エクセル）。血漿中の前記ペプチドの半減期は、平均(n=3)±標準偏差として表７に提示される。
【００９２】
組成物
本発明はまた、本明細書で定義したような薬理学的に活性なペプチドを医薬として許容される担体及び／又は希釈剤と組み合わせて含んで成る組成物に関する。その様な組成物は、皮下、非経口（静脈内、腹腔内）、筋肉内、直腸、硬膜外、気管内、鼻腔内、経皮、経膣、頬側、経眼、又は経肺の投与に適合した形態、好ましくは末梢の経路による投与に適した形態であってもよく、あるいは経口投与に適しているか、又は非経口投与に適している。他の好ましい投与経路は、皮下、腹腔内及び静脈内であり、そしてその様な組成物は、当業者に周知の方法、例えば"Remington's Pharmaceutical Sciences", 17.Ed. Alfonso R. Gennaro(Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985及びその最新版並び"Drugs and the Pharmaceutical Sicence" series, Marcel Dekkerのモノグラフに一般的に記載されているようなもので調製されうる。当該組成物は、常用の形態で、例えば注射の場合には溶液及び懸濁液で、カプセル及び錠剤で、好ましくは腸溶性製剤の形態で出現することもあり、例えば経口投与の場合US 5,350,741に開示されているようなものである。
【００９３】
利用される医薬担体又は希釈剤は、常用の固体又は液体担体であってもよい。固体担体の例としては、ラクトース、白土、スクロース、シクロデキストリン、タルク、ゼラチン、寒天ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はセルロースの低級アルキルエーテルがある。液体担体の例としては、シロップ、落花生油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレン及び水がある。同様に、当該担体又は希釈剤は当業界で知られている任意な徐放剤、例えば、単独の又はワックスと混合したモノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリンを含むことがある。
【００９４】
固体担体が経口投与に使用される場合、調製物は錠剤化され、粉末又は小球の形態で硬ゼラチンカプセル内に据えられることがあり、あるいはそれはトローチ又はロゼンジの形態であってもよい。固体担体の量は広範に変化するが、通常約25mg〜約1gである。
【００９５】
常用の錠剤化技術で調製されうる典型的な錠剤は：
コア：活性化合物（遊離化合物又はその塩として）100mg；コロイド状二酸化ケイ素(Aerosil)1.5mg；セルロース、ミクロクリスタリン(Avicel)70mg；改質型セルロースガム(Ac-Di-Sol)7.5mg；ステアリン酸マグネシウム。コーティング：HPMC 約9mg；Mywacett 9-40T（フィルムコーティングのための可塑剤として使用されるアシル化モノグリセリド）約0.9mg、
を含んでもよい。
【００９６】
液体担体が使用される場合、調製物はシロップ、エマルジョン、軟ゼラチンカプセル、滅菌注射液、例えば水性又は非水性液体懸濁液又は溶液の形態であってもよい。
【００９７】
当該組成物はまた、局所的又は全身性の注射又は注入に適した形態であってもよく、そして例えば滅菌水又は等張性生理食塩水又はグルコース溶液で調製されてもよい。本発明の組成物は、中枢から投与可能な形態を除き、末梢からの投与にのみ適した形態にあることが好ましい。当該組成物は、当業界で周知の常用の滅菌技術によって滅菌されることがある。生じた水性溶液は、使用のために梱包されることがあり、又は無菌条件下で濾過されることがあり、そして凍結乾燥されることがあり、凍結乾燥された調製物は、投与の前に滅菌水溶液と組み合わされる。当該組成物は、適当な生理学的条件に必要な場合に医薬として許容される補助物質、例えば緩衝液、等張性調整剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等を含むことがある。
【００９８】
静脈内注射のためのペプチド複合体製剤：
複数回の投与製剤は、滅菌等張性生理食塩水中で本発明の化合物として調製され、蓋付きバイアル中で保存されることがあり、そして必要により、保存剤が添加される（例えば安息香酸塩）。一定量の製剤は、滅菌等張性生理食塩水中で本発明の化合物の溶液として調製され、ガラスアンプル中で保存され、そして必要により不活性ガスで満たされる。当該化合物の各用量は、必要により不活性ガスで満たされた、アンプル又は蓋付きバイアル中で乾燥して保存される。複数回の投与製剤は、当該化合物の最高の安定度を要求する。
【００９９】
経鼻投与の場合、当該調製物は液体担体、特にエアロゾル適用の場合水性担体中で溶解され、又は懸濁された本発明の化合物を含んでもよい。当該担体は、添加剤、例えば可溶化剤、例えばプロピレングリコール、界面活性剤、例えば胆汁酸塩又はポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、吸収促進剤、例えばレシチン（ホスファチジルコリン）又はシクロデキストリン、保存剤、例えばパラベンを含むことがある。
【０１００】
本発明の好ましい態様において、式I, II又はIIIの化合物は患者１日当たり約0.001〜約10g、好ましくは患者１日当たり約1〜約1000mg、更に好ましくは患者１日当たり約10〜約100mgの範囲、患者１日当たり約50mgの用量として投与される。経口投与に適合した医薬組成物は、典型的に約1〜約100mgに及ぶ式I又はIIの化合物の量を単位剤形に含む。非経口投与に適合した医薬組成物は、典型的に約0.1mg〜約10mgに及ぶ式I又はIIの化合物の量を単位剤形に含む。
【０１０１】
本発明はまた、治療における使用のための、本明細書に開示したようなペプチド複合体又はそれらの誘導体若しくは塩である、医薬として許容される活性化合物、及び治療、例えばORLに関連する末梢の疾患及び病気の処置における使用のための、医薬組成物の製造のための、本明細書で定義したようなそれらの使用、に関する。好ましくは、医薬組成物は、経口投与に適している。本発明の新規ペプチド複合体の治療上の使用は、比較的低量の、すなわち好ましくは患者１日当たり約50mg未満の活性化合物を用いて、水分の腎排泄を増大させ、且つ尿中のナトリウム及びカリウムの排泄を低下させ（すなわち、選択的な水利尿）、そしてより大量の活性化合物を用いて、反射性頻拍症無しに血圧を低下させ、且つ食欲を増大させるためにある。
【０１０２】
特定の態様において、本発明に従うペプチド複合体は、ノシセプチン様活性を有する化合物を用いる処置に影響を受けやすい特異的な疾患又は病気の処置において、中枢神経系への当該ペプチド複合体の乏しい侵入に起因するCNSの副作用を回避するために使用され得る。
【０１０３】
特定の態様において、本発明に従うペプチド複合体は、ノシセプチン受容体、例えばORL1上で働く臨床的な有用性に依存するアゴニスト又は部分アゴニストとして、あるいは阻害剤として、特に前記受容体が末梢組織に見られる場合に使用され得る。このように、式I又はIIIのペプチド複合体は、高められた状態のノシセプチンと関連する病状の処置において使用され得る薬剤の製造のために使用される。
【０１０４】
特定の態様において、本発明に従うペプチド複合体は、低ナトリウム血症及び／又は低カリウム血症の処置及び／又は予防のための薬剤の製造のために、そして低ナトリウム血症及び／又は低カリウム血症の処置し、そして／あるいは予防する方法において使用され得る。
【０１０５】
更に、本発明に従うペプチド複合体は、ナトリウム及びカリウムを保持する症状並びに急性腎不全の処置及び／又は予防のための薬剤の製造のために、そして多臓器不全並びにナトリウム及び水分を保持する症状並びに急性腎不全を処置し、そして／あるいは予防する方法において使用され得る。更に、本発明に従うペプチド複合体は、細胞外液量の増大と関連する臓器不全の症状であって、
１．鬱血性心不全（ここで、当該心不全は、心臓収縮又は心臓拡張の、高心拍出量又は低心拍出量、急性又は慢性、右側又は左側、そして前方又は後方として説明されることがある。本発明のペプチドの治療作用の研究のための予測されるin vivoの心不全モデルの例は、引用によって組み入れられる[15]、左冠状動脈の結紮によって誘導される低心拍出量の意識のあるラットモデルである）。
２．肝硬変（ここで、当該肝硬変は、アルコール性肝臓疾患；壊死後性肝硬変（感染性疾患、遺伝性代謝疾患、薬物及び毒素、炎症及び他の疾患によって引き起こされるもの）；胆汁性肝硬変（原発性又は続発性）；長期の、重度の右側の鬱血性心不全に起因する心臓性肝硬変；代謝性、遺伝性、薬物関連性又は他の型の肝硬変に関連することがある。本発明のペプチドの治療作用の研究のための予測されるin vivoの肝硬変モデルの例は、総胆管の結紮によって誘導される[15]肝硬変の、意識のあるラットモデルである）。
３．薬物又は毒素誘導型の全身性及び／又は腎臓の疾患と関連するネフローゼ症候群（本発明のペプチドの治療作用の研究のための予測されるin vivoのネフローゼ症候群モデルの例は、アドリアマイシンのi.v.投与によって誘導される[15]肝硬変の、意識のあるラットモデルである）。
４．高血圧（当該高血圧は、内分泌腺、腎臓、又は中枢神経系において薬物、毒素又は疾患に対して原発性（特発性）又は続発性であってもよい。本発明のペプチドの治療作用の研究のための予測されるin vivoの高血圧モデルの例は、自然発生的に高血圧のラット又はDahl食塩感受性ラットである）。
５．急性腎不全を含む出血性ショックの間に誘発される多臓器不全（麻酔、手術及び出血の間に誘発される多臓器不全（腎臓、肺、腸）の予想されるin vivoモデルの例は、引用によって本明細書に組み入れられる、Kapusta et al.[18]に記載されている）。
６．急性腎不全（当該疾患の病原は、腎前性又は個々の腎臓の原因のいずれかに関連することがある）：
腎前性高窒素血症、例えば以下の症状：
I.血液量不足症
A.出血、火傷、脱水症状
B.胃腸液の減少：嘔吐、外科的なドレナージ、下痢
C.腎臓の液体の減少：利尿薬の、浸透圧利尿（例えば、糖尿病）、低アドレナリン症
D.血管外空間における金属イオン封鎖：膵炎、腹膜炎、外傷、火傷、重度の低アルブミン血症；
II.低心拍出量
A.心筋、血管及び心膜の疾患、不整脈、タンポナーデ
B.他のもの：肺高血圧症、大量の肺塞栓症、陽圧機械的換気法；
III.変化した腎臓の全身の血管抵抗性比
A.血管拡張：敗血症、抗高血圧、後負荷の軽減、麻酔、アナフィラキシー
B.腎臓の血管収縮：高カルシウム血症、ノルエピネフリン、エピネフリン、シクロスポリン、アンフォテリシンB
C.腹水症を有する肝硬変（肝腎症候群）；
IV.腎臓の自己制御応答障害を有する腎臓の血流低下
シクロオキシゲナーゼ阻害剤、アンギオテンシン変換酵素阻害剤；
V.過粘稠度症候群（まれ）
多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、多血症
【０１０６】
急性腎不全は更に、
遺伝性の腎性高窒素血症、例えば以下の症状：
I.腎血管閉塞（両方又は１つの機能している腎臓を有する一方のもの）
A.腎動脈閉塞：アテロームプラーク、血栓症、塞栓症、解離性動脈瘤、血管炎
B.腎静脈閉塞：血栓症、圧縮；
II.糸球体又は腎微小血管系の疾患
A.糸球体腎炎及び血管炎
B.溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、播種性血管内凝固症候群、妊娠中毒症、加速性高血圧症、放射性腎炎、全身性エリテマトーデス、強皮症；
III.急性細尿管壊死
A.虚血：前腎性高窒素血症（血液量不足症、低心拍出量、腎血管収縮、全身性血管拡張）、出産に伴う余病（胎盤早期剥離、分娩後出血）
B.毒素
1.外因性：放射性造影剤、シクロスポリン、抗生物質（例えばアミノグリコシド）、化学治療物質（例えばシスプラチン）、有機溶媒（例えばエチレングリコール）、アセトアミノフェン、不法な堕胎薬
2.内因性：横紋筋融解、溶血、尿酸、シュウ酸塩、プラズマ細胞疾患（例えば骨髄腫）；
IV.間質性腎炎
A.アレルギー：抗生物質（例えば、−ラクタム、スルホンアミド、トリメトプリム、リファンピシン）、非ステロイド性抗炎症剤、利尿薬、カプトプリル
B.感染：細菌（例えば急性腎盂腎炎、レプトスピラ症）、ウイルス（例えばサイトメガロウイルス）、真菌（例えばカンジダ症）
C.浸潤：リンパ腫、白血病、サルコイドーシス
D.特発性；
V.管内沈積及び閉塞
A.骨髄腫タンパク質、尿酸、シュウ酸塩、アシクロビル、メトトレキセート、スルホンアミド；
VI.腎臓同種移植の拒絶反応、
を含む。
【０１０７】
本発明のペプチドの治療作用の研究のための予測されるin vivoの腎前性高窒素血症モデルの例は、引用によって本明細書に組み入れられる[22]、出血によって加速されうる、ノルエピネフリン及び腎動脈クランプラット虚血性急性腎不全モデルである。
【０１０８】
本発明のペプチドの治療作用の研究のための予測されるin vivoの遺伝性の腎性高窒素血症モデルの例は、引用によって本明細書に組み入れられる[23]、ゲンタマイシン誘導型急性腎不全モデルである。
【表１１】
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【表１２】
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【０１０９】
ペプチドの調製
本明細書のペプチド複合体のペプチドは、好ましくはペプチド合成法を用いて調製されるが、当業者に知られている一般的な方法及び原理を用いる組換えＤＮＡ技術によっても調製されうる。このように、本発明は更に、式I又はIIIのペプチドを含んで成るポリペプチド配列をコードする核酸配列；当該核酸配列を有するベクター、及び当該核酸配列を含んで成り、且つ前記ポリペプチド配列を発現することができる宿主細胞、に関する。
【０１１０】
本発明のペプチド複合体をコードする核酸配列は、確立された標準的方法、例えばS.L.Beaucage and M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, pp. 1859-1869に記載の亜リン酸アミダイト法、又はMatthes et al., EMBO Journal 3, 1984, pp. 801-805に記載の方法によって合成的に調製されうる。亜リン酸アミダイト法に従い、オリゴヌクレオチドが、例えば自動ＤＮＡ合成機で合成され、精製され、アニール化され、ライゲーションされ、そして適当なベクター内にクローニングされる。ペプチドXをコードする核酸配列を単離し、又はクローニングするために使用される技術は当業界で知られており、そしてゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はそれらの組み合わせを含む。その様なゲノムＤＮＡからの本発明の核酸配列のクローニングは、例えば周知のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)又は共通の構造的特徴によりクローニングされたＤＮＡを検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニングによって達成されうる。例えばInnis et al., 1990, A Guide to Methods and Application, Academic Press, New Yorkを参照のこと。他の核酸増幅方法、例えばリガーゼ連鎖反応(LCR)、LAT(Ligated activated transcription)法及び核酸配列を基にした増幅(NASBA)が使用され得る。続いて、それはZをコードする核酸配列とライゲーションされ得る。
【０１１１】
続いて、前記複合体をコードする核酸配列は、簡便に組換えＤＮＡ法にかけられ得る任意なベクターであってもよい組換え発現ベクターに挿入される。ベクターの選択は、導入すべき宿主細胞にしばしば依存する。このように、当該ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、複製が染色体の複製から独立している、染色体外部分として存在するベクター、
例えばプラスミドであってもよい。あるいは、当該ベクターは、宿主細胞に導入された場合に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そしてそれが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。当該ベクターにおいて、本発明の複合体をコードする核酸配列は、適当なプロモーター配列と作用可能に連結されるべきである。当該プロモーターは、選択した宿主細胞において転写活性を示す任意な核酸配列であってもよく、そして宿主細胞と同種又は異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来してもよい。前記複合体をコードする核酸配列の転写を、特に細菌宿主細胞において指示するのに適したプロモーターの例は、E.コリ(E. coli)のlacオペロン、ストレプトミセス・コエリコロール(Streptomyces coelicolor)アガラーゼ遺伝子(dagA)、及び原核生物のベータラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター(Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731)、並びにtacプロモーター(DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21 25)である。更なるプロモーターは、Useful proteins from recombinant bacteria, Scientific American, 1980, 242:74-94;及びSambrook et al., 1989（上記）に記載されている。酵母宿主において、有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)エノラーゼ(ENO-1)遺伝子、サッカロミセス・セレビシアエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ADH2/GAP)、及びサッカロミセス・セレビシアエ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Romanos et al., 1992, Yeast 8:423-488に記載されている。
【０１１２】
前記複合体をコードする核酸配列はまた、適当なターミネーター、例えばヒト成長ホルモンターミネーター(Palmiter et al., Science 222, 1983, pp.809-814)と作用可能に連結され得る。酵母宿主細胞にとって好ましいターミネーターは、サッカロミセス・セレビシアエエノラーゼ、サッカロミセス・セレビシアエチトクロムC(CYC1)、又はサッカロミセス・セレビシアエグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子から得られる。
【０１１３】
前記ベクターは、更にポリアデニル化シグナル（例えばSV40由来のもの又はアデノウイルス5 Elb領域）、転写促進配列（例えば、SV 40のエンハンサー）及び翻訳促進配列（例えば、アデノウイルスVA RNAをコードするもの）を含んで成る。酵母宿主細胞にとって有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellluar Biology 15:5983-5990に記載されている。
【０１１４】
前記組換え発現ベクターは更に、問題の宿主細胞でベクターに複製させることができるＤＮＡ配列を含んで成ることもある。その様な配列の例は（宿主細胞が哺乳類細胞である場合）、SV40又はポリオーマの複製領域である。細菌の複製起点の例は、プラスミドpBR322, pUC19, pACYC177, pACYC184, pUB110, pE194, pTA1060,及びpAMβ1の複製起点である。宿主細胞での使用のための複製起点の例は、2ミクロンの複製起点、CEN6とARS4の組み合わせ、CEN3とARS1の組み合わせである。複製起点は、宿主細胞内でその機能を温度感受性にせしめる変異を有するものであってもよい（例えば、Ehrlich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1433を参照のこと)。
【０１１５】
ベクターは更に、選択マーカー、例えばその産物が宿主細胞における欠損を補完する遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)又は薬物、例えばネオマイシン、ゲンチシン、アンピシリン、又はハイグロマイシンに対する耐性を付与するもの、を含んで成ることもある。宿主細胞に適したマーカーは、ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1,及びURA3である。
【０１１６】
複合体をコードする核酸配列、プロモーター及びターミネーターをそれぞれライゲーションし、そしてそれらを複製に必要な情報を含む適当なベクターに挿入するために使用する手順は、当業者に周知である（例えば、Sambrook et al., （上記）を参照のこと）。
【０１１７】
発現ベクターが導入される宿主細胞は、複合体を産生することができるいずれの細胞であってもよく、そしてそれは真核細胞、例えば無脊椎動物細胞又は脊椎動物細胞、例えばアフリカツメガエルの卵母細胞又は哺乳類細胞、特に昆虫及び哺乳類細胞であってもよい。適当な哺乳類細胞系の例は、COS, BHK又はCHO細胞系である。哺乳類細胞を感染させ、そして細胞に組み込まれたDNA配列を発現するための方法は、例えば、
【表１３】
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に記載されている。
【０１１８】
宿主細胞は更に、単細胞の病原、例えば原核生物、非単細胞病原、例えば真核生物であってもよい。有用な単細胞は、細菌細胞、例えば、限定しないがバチルス(Bacillus)細胞又はストレプトミセス細胞を含むグラム陽性細菌、又はグラム陰性細菌、例えばE.コリ及びシュードモナス(Pseudomonas)種である。細菌宿主細胞の形質転換は、例えば、プロトプラスト形質転換（例えば、Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168:111-115を参照のこと）によって、コンピテント細胞（例えば、Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81:823-829,又はDubnar and Davidoff Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56:209-221を参照のこと)を用いることによって、エレクトロポレーション（例えば、Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751を参照のこと)によって、又は接合（例えば、Koehler and Throme, 1987, Journal of Biotechnology 169:5771-5278を参照のこと）によって達成され得る。
【０１１９】
宿主細胞は、真菌細胞、例えばニューロスポラ(Neurospora)、オイペニシリウム(Eupenicillium)（＝ペニシリウム(penicillium)）、エメリセラ(Emericella)（＝アスペルギルス(Aspergillus)）、ユーロチウム(Eurotium)（＝アスペルギルス）であってもよい。真菌宿主細胞は、酵母細胞であってもよい。「酵母」は、本明細書で使用する場合、子嚢胞子属の酵母（エンドミセタレス(endomycetales)）、担子胞子属の酵母、及び不完全菌類に属する酵母（ブラストミセテス(Blastomycetes)）を含む。当該細胞を培養するために使用される培地は、哺乳類細胞の増殖に適した任意な常用の培地、例えば適当な添加物を含む、血清培地又は無血清培地、あるいは昆虫、酵母又は真菌細胞の増殖に適した培地であってもよい。適当な培地は業者から購入可能であるか、又は公開された製法（例えば、American Type Culture Collectionのもの）に従い調製されうる。
【０１２０】
次のように、本発明は更に、天然ポリペプチド配列を有する式I又はIIIのペプチド複合体を産生するための方法であって、
核酸コンストラクト又はベクター内に含まれた、式I又はIIIのペプチド配列を含んで成るポリペプチド配列をコードする核酸配列及び選択マーカーを、組換え宿主細胞を得るために宿主細胞に導入し；
前記組換え宿主細胞を選択し；
前記組換え宿主細胞を、前記ポリペプチド配列の産生を可能にする条件下で培養し；
培養液から前記ポリペプチド配列を単離し；そして
任意に、前記ペプチド複合体を得るために適当なプロテアーゼを用いて前記ポリペプチド配列を開裂すること、
を含んで成る方法に関する。
【０１２１】
このようにして調製された天然ポリペプチド配列を有する式I又はIIIのペプチド複合体は、続いて、遠心又は濾過によって培養液から宿主細胞を分離し、塩、例えば硫酸アンモニウムによって上清又は濾液のタンパク質性成分を沈殿させ、様々なクロマトグラフィー手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等によって精製すること、を含む常用の手段によって培養液から回収されうる。非天然誘導体を得るための化学的な修飾手段が更に利用されうる。
【０１２２】
本発明のペプチドは、当業界で本質的に知られている方法によって調製されうる。つぎのように、ペプチド配列X及びZは標準的なペプチド調製技術、例えば溶液合成又はメリフィールド型固相合成によって調製されうる。Boc(tert-ブチルオキシカルボニル)及びFmoc(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)のストラテジーは共に利用可能である。
【０１２３】
好ましい合成方法は、式IV(X-Z')のペプチド複合体の調製方法であって、
a)活性型の、適当な保護基、例えばN-α保護基を有する、アミノ酸又はジペプチドを固定化されたペプチド配列H-Z'-SSMに結合させて固定化N-α保護ペプチドフラグメントを形成し、
b)前記N-α保護基を除去して、保護されていないN末端を有する固定化保護ペプチドフラグメントを形成し、
c)カルボキシル活性型の、適当な保護基、例えばN-α保護基を有する追加のアミノ酸又はジペプチドを、固定化されたペプチドフラグメントのN末端に結合させ、そして、所望のペプチド配列Xが得られるまで段階b)及びc)の除去／結合段階を繰り返し、そして次に、
d)固体の支持材料からペプチド複合体を開裂する、
段階を含んで成る方法、
及び式V(Z-X)のペプチド複合体の調製方法であって、
a)活性型の、適当な保護基、例えばN-α保護基を有するアミノ酸又はジペプチドを固体支持材料(SSM)に結合させて、固定化された保護アミノ酸又は保護ジペプチドを形成し、
b)前記N-α保護基を除去して、保護されていないN末端を有する固定化されたアミノ酸又はペプチドフラグメントを形成し、
c)カルボキシル活性型の、適当な保護基、例えばN-α保護基を有する追加のアミノ酸又はジペプチドを、固定化されたアミノ酸又はペプチドフラグメントのN末端に結合させ、そして、所望のペプチド配列Xが得られるまで段階b)及びc)の除去／結合段階を繰り返し、
d)カルボキシル活性型の、適当な保護基、例えばN-α保護基を有する追加のアミノ酸又はジペプチドを、固定化されたペプチドフラグメントのN末端に結合させ、そして、所望のペプチド配列Zが得られるまで段階b)及びd)の除去／結合段階を繰り返し、そして次に、
e)固体の支持材料からペプチド複合体を開裂する、
段階を含んで成る方法、
並びに、更に式VI(Z-X-Z')のペプチド複合体の調製方法であって、
a)カルボキシル活性型の、適当な保護基、例えばN-α保護基を有するアミノ酸又はジペプチドを固定化されたペプチド配列H-Z'-SSMに結合させて、固定化された保護ペプチドフラグメントを形成し、
b)前記N-α保護基を除去して、保護されていないN末端を有する固定化されたペプチドフラグメントを形成し、
c)カルボキシル活性型の、適当な保護基、例えばN-α保護基を有する追加のアミノ酸又はジペプチドを、固定化されたペプチドフラグメントのN末端に結合させ、そして、所望のペプチド配列Xが得られるまで段階b)及びc)の除去／結合段階を繰り返し、
d)カルボキシル活性型の、適当な保護基、例えばN-α保護基を有する追加のアミノ酸又はジペプチドを、固定化されたペプチドフラグメントのN末端に結合させ、そして、所望のペプチド配列Zが得られるまで段階b)及びd)の除去／結合段階を繰り返し、そして次に、
e)固体の支持材料からペプチド複合体を開裂する、
段階を含んで成る方法、を含む。
【０１２４】
実験手順
装置及び合成のストラテジー
ペプチドは、N-α保護基として9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)を、そして側鎖の官能性のために適当な一般的な保護基を用いて、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中でバッチ式で合成された。
【０１２５】
溶媒
溶媒DMF（N,N-ジメチルホルムアミド、Riedel de-Haen, Germany)は、強力な陽イオン交換樹脂(Lewatit S 100 MB/H strong acid, Bayer AG Leverkusen, Germany)を充填したカラムを通過させることによって精製され、そして、遊離アミンが存在する場合には黄色(Dhbt-O-陰イオン)を示す3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ1,2,3-ベンゾトリアジン(Dhbt-OH)の添加によって、使用の前に遊離アミンについて解析された。溶媒DCM（ジクロロメタン、研究用、Riedel de-Haen, Germany）は、精製無しに直接使用された。アセトニトリル(HPLC用、Lab-Scan, Dublin Ireland)は精製無しに直接使用された。
【０１２６】
アミノ酸
Fmoc保護アミノ酸は、適当な側鎖保護型でAdvanced ChemTech(ACT)から購入した。
【０１２７】
結合試薬
結合試薬ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)は、Riedel de-Haen(Germany)から購入した。
【０１２８】
固体支持体
ペプチドは、TentaGel S樹脂0,22-0,31mmol/g上で合成した。TentaGel S-Ram, TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc(Rapp polymere, Germany)は、C末端をアミド化したペプチドが好ましい場合に使用され、TentaGel S PHB Lys(Boc)Fmocは、C末端の遊離カルボン酸が好ましい場合に使用された。
【０１２９】
触媒及び他の試薬
ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)はAldricj(Germany)から、ピペリジン及びピリジンはRiedel de-Haen(Frankfurt, Germany)から購入した。エタンジチオールは、Riedel de-Haen(Frankfurt, Germany)から購入した。3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ1,2,3-ベンゾトリアジン(Dhbt-OH)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(HOAt)は、Fluka(Switzerland)から購入した。無水酢酸はFlukaから購入した。
【０１３０】
結合手順
アミノ酸は、DIC/DMFによって適当なN-α保護アミノ酸とHObt又はHOAtから作られた、in situで生成したHObt又はHOAtエステルとして結合した。アシル化は、ニンヒドリン試験によって検査され、これは当該試験の間にFmocの脱保護を防ぐために８０℃で実施した(Laresn, B. D.及びHolm, A., Int. J. Peptide Protein Res. 43, 1994,1-9)。
【０１３１】
N-α保護基(Fmoc)の脱保護
Fmoc基の脱保護は、２０％ピペリジン/DMFを用いて処理し(1x5分及び1x10分）、続いて、排出されたDMFに対するDhbt-OHの添加後に黄色が検出されなくなるまでDMFを用いて洗浄(それぞれ5x15ml、5分)することによって実施した。
【０１３２】
HOBt-エステルの結合
３等量のN-αアミノ保護アミノ酸を、３等量のHObt及び３等量のDICと一緒にDMF中に溶解し、そして次に樹脂に添加した。
【０１３３】
無水酢酸によるN-末端アミノ基のアセチル化
４０等量の無水酢酸を、５等量のピリジンと一緒にDMF中に溶解し、そして次に樹脂に加えた。アシル化は、上述のようなニンヒドリン試験によって検査した。
【０１３４】
トリフルオロ酢酸エチルによるN末端アミノ基のトリフルオロアセチル化
３０等量のトリフルオロ酢酸エチルを、１０等量のトリエチルアミンと一緒にジクロロメタン中で溶解し、そして次に樹脂に加えた。アシル化は、上述のようなニンヒドリン試験によって検査した。
【０１３５】
酸による樹脂からのペプチドの開裂
ペプチドは、９５％トリフルオロ酢酸(TFA, Riedel de-Haen, Frankfurt, Germany)−水v/v又は９５％TFA及び5%エタンジチオールv/vを用いる室温での２時間の処理によって樹脂から開裂された。濾過した樹脂を９５％TFA-水で洗浄し、そして濾液及び洗浄液を減圧下で蒸発させた。残査をエーテルで洗浄し、そして酢酸−水から凍結乾燥した。粗製凍結乾燥産物は、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によって解析され、そして質量分析(MS)によって同定された。
【０１３６】
TentaGel樹脂(PEG-PS)上でのバッチ式ペプチド合成
TentaGel樹脂(1g, 0.23-0.24mmol/g)を濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に据えた。当該樹脂をDMF(15ml)中で膨潤させ、そしてリンカーTentaGel S-RAM上又はTentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc上の最初のアミノ酸上の、開始Fmoc基を除去するために、２０％ピペリジン／DMFで処理した。当該樹脂を排出し、そして、排出されたDMFに対するDhbt-OHの添加後に黄色が検出されなくなるまで、DMFで洗浄した。前記配列に従うアミノ酸は、上述のように、Fmoc-保護HObtエステル（３等量）を実施した場合のように結合された。結合は、特に断らない限り２時間続けた。当該樹脂を排出し、そして、過剰な試薬を除去するためにDMFで洗浄した（それぞれ5x15ml、5分）。全てのアシル化が、上述のようにニンヒドリン試験によって検査された。合成完了後、ペプチド樹脂はDMF（それぞれ3x15ml,5分）、DCM（それぞれ3x15ml, 1分）、そして最後にジエチルエーテル（それぞれ3x15ml,1分）で洗浄され、そして真空で乾燥された。当該ペプチドは、上述のように樹脂から開裂され、そして粗製ペプチド産物は以下の通りに解析され、そして精製された。
【０１３７】
HPLC条件
勾配HPLC解析は、HP 1100 Quaternary Pump, HP 1100 Autosampler, HP 1100 Column Thermostat及びHP 1100 Multiple Wavelength Detectorから成るHewlett Packerd HP 1100 HPLCを用いて実施した。LCソフトウェア(rev. A.06.01)のためのHewlett Packerd chemstationが、装置の制御及びデータ収集に使用された。以下のカラム及びHPLC緩衝液系が使用された：
【表１４】
0004624639.tif 000014
【表１５】
0004624639.tif 000015
【０１３８】
粗製ペプチドのHPLC精製
粗製ペプチド産物は、PerSeptive Biosystems VISION Workstationで精製された。VISIONソフトウェアが装置の制御及びデータ収集に使用された。いかのカラム及びHPLC緩衝液系が使用された：
【表１６】
0004624639.tif 000016
【０１３９】
質量分析
ペプチドは、1〜10mg/mlの濃度を示すように、スーパーグラジエントメタノール(Labscan, Dublin, Ireland)、ミリQ水(Millipore, Bedford, MA)及びギ酸(Merck, Damstadt, Germany)(50:50:0.1 v/v/v)中で溶解した。ペプチド溶液(20ml)は、LCT質量分析計(Micromass, Manchester, UK)を用いるESI-TOF-MSによって肯定極性モードで解析された。
【０１４０】
抗体の調製及び使用
本発明の抗体は、当業界で一般的に知られている技術によって調製されうる。好ましい抗体は、ペプチド又はペプチド複合体の精製試料に対して産生する。その様な抗体を生成するために適したペプチド及びペプチド複合体は、以下の例２２−２３を含む適用を通じて開示されている。本発明の多くのポリクローナル抗体が、ことのほか良好で且つ特異的な結合を特徴づけているが、いくつかの適用の場合、モノクローナル抗体を適用することが有用であり、又はより有用であると思われる。一般的に、Harlow, E and D, Lane in Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY(ポリクローナル及びモノクローナル抗体を生成し、そして用いるための方法を開示している）を参照のこと。
【０１４１】
一般的に、抗体は、本明細書に示したようなペプチド又はペプチド複合体の精製試料又は半精製試料を単独で、又は担体と一緒に用いて哺乳類を免疫化することによって調製されうる。適当な哺乳類として、典型的な研究動物、例えばヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ラット及びマウスがある。ラット及びマウス、特にマウスは、モノクローナル抗体を得るのに好ましい。抗原は、多くの適当な経路のうちのいずれか、例えば皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮内注射によって哺乳類に投与されうる。最適な免疫間隔、免疫量等は、比較的広範に変更することができ、そして経験的にこの開示に基づいて決定されうる。典型的な手順は、何ヶ月もかかる、複数回の抗原の注射を包含する。抗体は、標準的な技術によって免疫化動物の血清から回収され、そして使用されるペプチド又はペプチド複合体に特異的な抗体を見つけるためにスクリーニングされる。モノクローナル抗体は、抗体を産生する細胞で、且つハイブリドーマ細胞を形成するための標準的な融合技術を用いることによってモノクローナル抗体を産生するために使用される細胞において産生され得る。G. Kohler, et al., Nature, 256:456(1975)を参照のこと。典型的に、これはハイブリッド細胞を産生するために、不死化細胞系、例えば骨髄腫細胞と抗体産生細胞との融合を包含する。あるいは、モノクローナル抗体は、Huse, et al., Science, 256:1275(1989)の方法によって細胞から産生され得る。
【０１４２】
更に、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を生成し、そして用いることに関する追加情報については、Harlow, E and D, Lane（上記）を参照のこと。本発明に従い使用され得る様々な適当な抗体の精製戦略が報告されている。
【０１４３】
モノクローナル抗体が所望とされる態様において、１つの適当なプロトコールは、約２〜７ヶ月の期間をかけて実施された、精製したペプチド複合体を含んで成る組成物によるマウスの腹腔内免疫化を提供する。続いて、脾臓細胞が免疫化マウスから摘出され得る。免疫化マウス由来の血清は、脾臓細胞の切除前に、特定のペプチド複合体に特異的な抗体の力価についてアッセイされる。切除された脾臓細胞は、続いて、マーカー、例えばヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損(HGPRT)又はチミジンキナーゼ欠損(TK-)を有する適切な同種又は異種（好ましくは同種）のリンパ球系に融合される。好ましくは、骨髄腫細胞は、リンパ球系として適用されうる。骨髄腫細胞及び脾臓細胞は、例えば約１：４（骨髄腫細胞：脾臓細胞）の比率で一緒に混合される。細胞は、ポリエチレングリコール(PEG)法によって融合される。G. Kohler, et al., Nature（上記）を参照のこと。このようにしてクローン化されたハイブリドーマは、培養液、例えばRPMI-1640中で生育される。G. E. More, et al., Journal of American Medical Association, 199:549(1967)を参照のこと。融合過程後に生育したハイブリドーマは、適用される抗原に特異的に結合する抗体の分泌のために、例えば放射線免疫アッセイ又は酵素免疫アッセイによってスクリーニングされ、例えば精製ペプチド複合体には結合するが、他の関係ないコントロールペプチドとは結合しない抗体が選択される。好ましくは、ELISA又は関連する免疫学的アッセイがスクリーニングのために適用される。その様なスクリーニングでポジティブな結果を示すハイブリドーマは、限界希釈法によって広げられ、そしてクローニングされ得る。更なるスクリーニングは、好ましくは溶液中でペプチド複合体と結合し得る抗体を選択するために実施される。単離した抗体は、アフィニティークロマトグラフィーを含むほぼ任意な適当な免疫学的技術によって精製され得る。
【０１４４】
本発明の抗体の分子量は、複数の要因、例えば使用目的、及び当該抗体が複合され、又は組換え的に融合された毒素、医薬、又は検出標識を含むか否か、等に依存して変化しうる。通常、本発明の抗体は、約20〜150kDaの分子量を有する。その様な分子量は、分子量サイズ決定法、例えばSDS-PAGEゲル電気泳動、続くタンパク質染色又はウェスタンブロット解析によって直ちに決定されうる。
【０１４５】
本発明のポリクローナル抗体を生成するのに好ましいペプチド複合体は、例えば例２２〜２３に開示されている。
【０１４６】
「特異的な結合」の用語又は関連する用語は、それが抗体とペプチド又はペプチド複合体の抗原との関係と関連する場合、抗体が特定の抗原と免疫複合体を形成し、そして他の抗原（例えば関連又は非関連ペプチド複合体）とは形成しないことを意味する。その様な特異的な結合を検出し、そして任意に定量するための方法は、標準的な免疫アッセイ、例えばELISA、抗体捕獲及び抗原捕獲アッセイを含む。本発明の好ましい抗体は、目的のペプチド又はペプチド複合体抗原と特異的に結合する。例えば、以下の例２３を参照のこと。
【０１４７】
以下の例は、本発明の好ましい観点をしてきするためのものであって、本発明の範囲を示すことを意図するものではない。
【０１４８】
合成例
例１．化合物１Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2のTentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc上での合成
乾燥TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc(0.24mmol/g, 1g)を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に据え、そしてN末端アルギニンの結合が終了するまで、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」で記載したように処理した。全ての結合を一晩続けた。Fmoc基の脱保護の後、N末端のアミノ基は、上述の通りにアセチル化された。結合を一晩続けた。アシル化は、前述の通りに検査した。合成が完了した後、ペプチドを上述の通りに樹脂から開裂した。粗製生成物の収率は390mgであった。上述の調製用のHPLCを用いた精製の後、210mgのペプチド生成物が95%よりもよい収率で回収され、そしてペプチドの同一性がMSで確認された（測定された分子量1780.25、計算上の分子量1780.11）。
【０１４９】
例２．化合物１A Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2x9AcOH（酢酸塩）の合成。化合物１のトリフルオロ酢酸塩から酢酸塩への対イオン交換。
化合物１の精製した合成ペプチド産物は、粗製合成ペプチド産物の精製に使用したHPLC緩衝液中でのトリフルオロ酢酸(0.1%, v/v)の存在により、トリフルオロ酢酸塩Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2x9TFAとして単離される。
【０１５０】
対イオンであるトリフルオロ酢酸塩を酢酸塩で交換するために、ペプチド溶液を、酢酸塩上に強塩基イオン交換樹脂(Dowex 1x8)を充填したカラムを通過させた。
【０１５１】
1gの化合物１を40mlの水に溶解する。溶液を、40mlの、酢酸塩上の強塩基イオン交換樹脂(Dowex 1x8；容量1.33meq/ml樹脂)を含むカラムに通過させる。当該樹脂を4x30mlの水で洗浄し、そして溶出液を回収し、そして凍結乾燥し、HPLC解析に従い98%の純度を有する792mgの酢酸塩（吸湿性）が生成した。
【０１５２】
例３．化合物1C Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2x9HCl（塩酸塩）の合成。化合物１のトリフルオロ酢酸塩(Tfa)から塩酸塩(Cl-)への対イオン交換。
100mgの化合物１を50mlの0.1M塩酸中で溶解し、そして生じた溶液を凍結乾燥した。残りを50mlの水に溶解し、そして凍結乾燥して、HPLCに従い97%の純度を有する74mgの塩化物塩が生成した。
【０１５３】
例４．化合物２Ac-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-NH2のTentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc上での合成
乾燥TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc(0.24mmol/g, 1g)を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に据え、そしてN末端リジンの結合が終了するまで、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」で記載したように処理した。全ての結合を一晩続けた。Fmoc基の脱保護の後、N末端のアミノ基は、上述の通りにアセチル化された。結合を一晩続けた。アシル化は、前述の通りに検査した。合成が完了した後、ペプチドを上述の通りに樹脂から開裂した。粗製生成物の収率は231mgであった。上述の調製用のHPLCを用いた精製の後、126mgのペプチド生成物が93%よりもよい収率で回収され、そしてペプチドの同一性がMSで確認された（測定された分子量1780.25、計算上の分子量1780.11）。
【０１５４】
例５．化合物３H-Asn-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2のTentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc上での合成
乾燥TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc(0.24mmol/g, 1g)を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に据え、そしてN末端アスパラギンの結合が終了するまで、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」で記載したように処理した。全ての結合を一晩続けた。Fmoc基の脱保護の後、N末端のアミノ基は、上述の通りにアセチル化された。結合を一晩続けた。アシル化は、前述の通りに検査した。合成が完了した後、ペプチドを上述の通りに樹脂から開裂した。粗製生成物の収率は212mgであった。上述の調製用のHPLCを用いた精製の後、112mgのペプチド生成物が98%よりもよい収率で回収され、そしてペプチドの同一性がMSで確認された（測定された分子量2497.25、計算上の分子量2497.35）。
【０１５５】
例６．化合物４Ac-Arg-Tyr-Asn-Arg-Trp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2のTentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc上での合成
乾燥TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc(0.24mmol/g, 1g)を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に据え、そしてN末端アルギニンの結合が終了するまで、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」で記載したように処理した。全ての結合を一晩続けた。Fmoc基の脱保護の後、N末端のアミノ基は、上述の通りにアセチル化された。結合を一晩続けた。アシル化は、前述の通りに検査した。合成が完了した後、ペプチドを上述の通りに樹脂から開裂した。粗製生成物の収率は502mgであった。上述の調製用のHPLCを用いた精製の後、272mgのペプチド生成物が98%よりもよい収率で回収され、そしてペプチドの同一性がMSで確認された（測定された分子量1731.25、計算上の分子量1731.09）。
【０１５６】
例７．化合物５Ac-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Trp-Arg-Tyr-Tyr-Asn-NH2のTentaGel S RAM上での合成
乾燥TentaGel S RAM(0.24mmol/g, 1g)を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に据え、そしてN末端リジンの結合が終了するまで、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」で記載したように処理した。全ての結合を一晩続けた。Fmoc基の脱保護の後、N末端のアミノ基は、上述の通りにアセチル化された。結合を一晩続けた。アシル化は、前述の通りに検査した。合成が完了した後、ペプチドを上述の通りに樹脂から開裂した。粗製生成物の収率は586mgであった。上述の調製用のHPLCを用いた精製の後、365mgのペプチド生成物が99%よりもよい収率で回収され、そしてペプチドの同一性がMSで確認された（測定された分子量1738.0、計算上の分子量1738.05）。
【０１５７】
例８．化合物６Ac-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Trp-Arg-Tyr-Tyr-Arg-NH2のTentaGel S RAM上での合成
乾燥TentaGel S RAM(0.23mmol/g, 1g)を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に据え、そしてN末端リジンの結合が終了するまで、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」で記載したように処理した。全ての結合を一晩続けた。Fmoc基の脱保護の後、N末端のアミノ基は、上述の通りにアセチル化された。結合を一晩続けた。アシル化は、前述の通りに検査した。合成が完了した後、ペプチドを上述の通りに樹脂から開裂した。粗製生成物の収率は437mgであった。上述の調製用のHPLCを用いた精製の後、257mgのペプチド生成物が98%よりもよい収率で回収され、そしてペプチドの同一性がMSで確認された（測定された分子量1780.0、計算上の分子量1780.11）。
【０１５８】
例９．化合物７Ac-D-Lys-D-Lys-D-Lys-D-Lys-D-Lys-D-Lys-D-Lys-D-Trp-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-D-Arg-NH2のTentaGel S RAM上での合成
乾燥TentaGel S RAM(0.23mmol/g, 1g)を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に据え、そしてN末端D-リジンの結合が終了するまで、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」で記載したように処理した。全ての結合を一晩続けた。Fmoc基の脱保護の後、N末端のアミノ基は、上述の通りにアセチル化された。結合を一晩続けた。アシル化は、前述の通りに検査した。合成が完了した後、ペプチドを上述の通りに樹脂から開裂した。粗製生成物の収率は410mgであった。上述の調製用のHPLCを用いた精製の後、263mgのペプチド生成物が98%よりもよい収率で回収され、そしてペプチドの同一性がMSで確認された（測定された分子量1780.13、計算上の分子量1780.11）。
【０１５９】
例１０．化合物８Ac-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-D-Arg-D-Trp-D-Lys-D-Lys-D-Lys-D-Lys-D-Lys-D-Lys-D-Lys-NH2のTentaGel S RAM上での合成
乾燥TentaGel S RAM(0.23mmol/g, 1g)を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に据え、そしてN末端D-アルギニンの結合が終了するまで、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」で記載したように処理した。全ての結合を一晩続けた。Fmoc基の脱保護の後、N末端のアミノ基は、上述の通りにアセチル化された。結合を一晩続けた。アシル化は、前述の通りに検査した。合成が完了した後、ペプチドを上述の通りに樹脂から開裂した。粗製生成物の収率は419mgであった。上述の調製用のHPLCを用いた精製の後、205mgのペプチド生成物が97%よりもよい収率で回収され、そしてペプチドの同一性がMSで確認された（測定された分子量1780.0、計算上の分子量1780.11）。
【０１６０】
例１１．化合物９Ac-Lys-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2のTentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc上での合成
乾燥TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc(0.24mmol/g, 1g)を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に据え、そしてN末端リジンの結合が終了するまで、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」で記載したように処理した。全ての結合を一晩続けた。Fmoc基の脱保護の後、N末端のアミノ基は、上述の通りにアセチル化された。結合を一晩続けた。アシル化は、前述の通りに検査した。合成が完了した後、ペプチドを上述の通りに樹脂から開裂した。粗製生成物の収率は445mgであった。上述の調製用のHPLCを用いた精製の後、287mgのペプチド生成物が96%よりもよい収率で回収され、そしてペプチドの同一性がMSで確認された（測定された分子量1752.0、計算上の分子量1752.1）。
【０１６１】
例１２．化合物１０Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Ile-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2のTentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc上での合成
乾燥TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc(0.24mmol/g, 1g)を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に据え、そしてN末端アルギニンの結合が終了するまで、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」で記載したように処理した。全ての結合を一晩続けた。Fmoc基の脱保護の後、N末端のアミノ基は、上述の通りにアセチル化された。結合を一晩続けた。アシル化は、前述の通りに検査した。合成が完了した後、ペプチドを上述の通りに樹脂から開裂した。粗製生成物の収率は376mgであった。上述の調製用のHPLCを用いた精製の後、134mgのペプチド生成物が97%よりもよい収率で回収され、そしてペプチドの同一性がMSで確認された（測定された分子量1707.0、計算上の分子量1707.11）。
【０１６２】
例１３．化合物１１Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys--Ala-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2のTentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc上での合成
乾燥TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc(0.24mmol/g, 1g)を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に据え、そしてN末端アルギニンの結合が終了するまで、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」で記載したように処理した。全ての結合を一晩続けた。Fmoc基の脱保護の後、N末端のアミノ基は、上述の通りにアセチル化された。結合を一晩続けた。アシル化は、前述の通りに検査した。合成が完了した後、ペプチドを上述の通りに樹脂から開裂した。粗製生成物の収率は429mgであった。上述の調製用のHPLCを用いた精製の後、260mgのペプチド生成物が96%よりもよい収率で回収され、そしてペプチドの同一性がMSで確認された（測定された分子量1723.0、計算上の分子量1723.05）。
【０１６３】
例１４．化合物１２Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2のTentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc上での合成
乾燥TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc(0.24mmol/g, 1g)を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に据え、そしてN末端アルギニンの結合が終了するまで、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」で記載したように処理した。全ての結合を一晩続けた。Fmoc基の脱保護の後、N末端のアミノ基は、上述の通りにアセチル化された。結合を一晩続けた。アシル化は、前述の通りに検査した。合成が完了した後、ペプチドを上述の通りに樹脂から開裂した。粗製生成物の収率は426mgであった。上述の調製用のHPLCを用いた精製の後、266mgのペプチド生成物が98%よりもよい収率で回収され、そしてペプチドの同一性がMSで確認された（測定された分子量1651.88、計算上の分子量1652.01）。
【０１６４】
例１５．化合物１３Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Cys-NH2のTentaGel S RAM上での合成
乾燥TentaGel S RAM(0.24mmol/g, 1g)を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に据え、そしてN末端アルギニンの結合が終了するまで、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」で記載したように処理した。全ての結合を一晩続けた。Fmoc基の脱保護の後、N末端のアミノ基は、上述の通りにアセチル化された。結合を一晩続けた。アシル化は、前述の通りに検査した。合成が完了した後、ペプチドを上述の通りに樹脂から開裂した。粗製生成物の収率は465mgであった。上述の調製用のHPLCを用いた精製の後、313mgのペプチド生成物が91%よりもよい収率で回収され、そしてペプチドの同一性がMSで確認された（測定された分子量1883.0、計算上の分子量1883.12）。
【０１６５】
例１６．化合物１５Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-Cys-NH2のTentaGel S RAM上での合成
乾燥TentaGel S RAM(0.24mmol/g, 1g)を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に据え、そしてN末端アルギニンの結合が終了するまで、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」で記載したように処理した。全ての結合を一晩続けた。Fmoc基の脱保護の後、N末端のアミノ基は、上述の通りにアセチル化された。結合を一晩続けた。アシル化は、前述の通りに検査した。合成が完了した後、ペプチドを上述の通りに樹脂から開裂した。粗製生成物の収率は249mgであった。上述の調製用のHPLCを用いた精製の後、190mgのペプチド生成物が94%よりもよい収率で回収され、そしてペプチドの同一性がMSで確認された（測定された分子量1114.50、計算上の分子量1114.55）。
【０１６６】
例１７．化合物１６H-Cys-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2のTentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc上での合成
乾燥TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc(0.24mmol/g, 1g)を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に据え、そしてN末端システインの結合が終了するまで、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」で記載したように処理した。全ての結合を一晩続けた。Fmoc基の脱保護の後、N末端のアミノ基は、上述の通りにアセチル化された。結合を一晩続けた。アシル化は、前述の通りに検査した。合成が完了した後、ペプチドを上述の通りに樹脂から開裂した。粗製生成物の収率は359mgであった。上述の調製用のHPLCを用いた精製の後、242mgのペプチド生成物が98%よりもよい収率で回収され、そしてペプチドの同一性がMSで確認された（測定された分子量1240.76、計算上の分子量1240.78）。
【０１６７】
例１８．化合物１７H-Cys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2のTentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc上での合成
乾燥TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc(0.24mmol/g, 1g)を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に据え、そしてN末端システインの結合が終了するまで、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」で記載したように処理した。全ての結合を一晩続けた。Fmoc基の脱保護の後、N末端のアミノ基は、上述の通りにアセチル化された。結合を一晩続けた。アシル化は、前述の通りに検査した。合成が完了した後、ペプチドを上述の通りに樹脂から開裂した。粗製生成物の収率は287mgであった。上述の調製用のHPLCを用いた精製の後、205mgのペプチド生成物が90%よりもよい収率で回収され、そしてペプチドの同一性がMSで確認された（測定された分子量888.5、計算上の分子量888.61）。
【０１６８】
例１９．化合物１８Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Cys-NH2のTentaGel S RAM上での合成
乾燥TentaGel S RAM(0.24mmol/g, 1g)を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に据え、そしてN末端アルギニンの結合が終了するまで、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」で記載したように処理した。全ての結合を一晩続けた。Fmoc基の脱保護の後、N末端のアミノ基は、上述の通りにアセチル化された。結合を一晩続けた。アシル化は、前述の通りに検査した。合成が完了した後、ペプチドを上述の通りに樹脂から開裂した。粗製生成物の収率は465mgであった。上述の調製用のHPLCを用いた精製の後、313mgのペプチド生成物が91%よりもよい収率で回収され、そしてペプチドの同一性がMSで確認された（測定された分子量1883.00、計算上の分子量1883.12）。
【０１６９】
例２０．化合物１４Tfa-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2のTentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc上での合成
乾燥TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc(0.24mmol/g, 1g)を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に据え、そしてN末端アルギニンの結合が終了するまで、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」で記載したように処理した。全ての結合を一晩続けた。Fmoc基の脱保護の後、N末端のアミノ基は、上述の通りにアセチル化された。結合を一晩続けた。アシル化は、前述の通りに検査した。合成が完了した後、ペプチドを上述の通りに樹脂から開裂した。粗製生成物の収率は392mgであった。上述の調製用のHPLCを用いた精製の後、105mgのペプチド生成物が96%よりもよい収率で回収され、そしてペプチドの同一性がMSで確認された（測定された分子量1834.25、計算上の分子量1834.08）。
【０１７０】
例２１．化合物CE1 Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-NH2のTentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc上での合成
乾燥TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc(0.24mmol/g, 1g)を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に据え、そしてN末端アルギニンの結合が終了するまで、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」で記載したように処理した。全ての結合を一晩続けた。Fmoc基の脱保護の後、N末端のアミノ基は、上述の通りにアセチル化された。結合を一晩続けた。アシル化は、前述の通りに検査した。合成が完了した後、ペプチドを上述の通りに樹脂から開裂した。粗製生成物の収率は143mgであった。上述の調製用のHPLCを用いた精製の後、52mgのペプチド生成物が97%よりもよい収率で回収され、そしてペプチドの同一性がMSで確認された（測定された分子量1011.54、計算上の分子量1011.54）。
【０１７１】
例２２．免疫原の産生
化合物１に特異的な抗体は、N末端(Ac-RYYRWKC-NH2)、C末端(H-CAPPSKKKKKK-NH2)及び結合化学に適合するための末端にCys残基を有する全長分子である化合物１３、に相当するペプチドを複合することによって産生した。Ac-RYYRWKC-NH2及びH-CAPPSKKKKKK-NH2は、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)及び市販の陽イオン化したウシ血清アルブミン(Supercarrier, Pierce Chemical)と結合された。生じたKLH及びSupercarrier複合体を組み合わせ、そしてウサギに注射した。化合物１３を精製したタンパク質誘導体(PPD)と複合し、そしてBCGで初回刺激されたヤギに注射した。免疫化は、フロイント完全アジュバントの乳濁液中での免疫原の最初の免疫化の標準的なプロトコール、続くフロイント不完全アジュバント中の免疫原の乳濁液を用いる追加免疫の措置及び抗体力価が許容レベルになるまでの試験出血、に従った。抗体は、イムノグロブリンのIgGサブクラスに特異的なプロテインGカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによって一段階で精製された。
【０１７２】
例２３．抗体の産生
抗体は、通常、既に論じられた系に沿って調製した。４つの代表的なポリクローナル抗体が特許請求の範囲に記載の一般式を満たすペプチドに対して産生された。これらは、化合物１のN末端配列を組み込んだペプチド、化合物１のC末端配列を組み込んだ２つのペプチド、及び化合物１の全長配列を組み込んだ２つのペプチド、を含んで成る。これらのペプチドは、それぞれ化合物１５，１６，１７，又は１８と表され、そして次の配列を有する：Ac-RYYRWKKKKKKKC-NH2（化合物１５）；CAPPSKKKKKK-NH2（化合物１６）；CKKKKKK-NH2（化合物１７）及びAc-RYYRWKKKKKKKC-NH2（化合物１８）。化合物１５，１６，及び１７に対するポリクローナル抗体をウサギにおいて産生し、そして化合物１８に対するものをヤギで産生した。これらのポリクローナル抗体は、高度に特異的であり、且つ、当該抗体を、抗原として化合物１を適用し、そして市販のHRP複合抗IgG抗体によって結合した抗体の比色検出を用いるELISA型のアッセイで評価した場合、添付した表に列記した力価をもたらす。複数の抗体についての予備的な試験も、上述の標準的ELISAアッセイにおいて、化合物１に対して低い配列類似性の抗原と交差反応しないことを示す。表７を以下に示す。
【表１７】
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【０１７３】
この例で開示したペプチド複合体化合物に関連する更なる情報については、上文の実施例及び考察を参照のこと。
【０１７４】
この明細書で開示した全ての引用文献が、引用によって本明細書に組み入れられる。
【０１７５】
本発明は特定の態様に関して記載されているが、本発明の修飾及び変更は、特許請求の範囲で限定される、本発明の範囲から逸脱するものでないと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、マウス輸精管におけるノシセプチン誘導型弛緩に対する試験物質(AcRYYRWK-NH2及び化合物１)の蓄積的添加の作用の、濃度応答曲線を示す。
【図２】  図２は、i.v.注入した化合物１(11nmol/kg/分)の心血管及び腎臓の応答を示す；HRは心拍数（１分当たりの拍動, bpm）であり、MAPは平均動脈圧(mmHg)であり、Vは尿流量（μL/分）であり、UNaVはナトリウムの尿排泄量（μeq/分)である。
【図３】  図３は、i.v.注入した化合物１(1及び0.1nmol/kg/分)の心血管及び腎臓の応答並びに腎臓の交感神経活性をコントロールレベルのパーセンテージ(RNSAm %)として示す。
【図４】  図４は、化合物１（1及び0.1nmol/kg/分)のi.v.注入の間に観察された浸透圧クリアランス(COsm)の低下及び遊離水クリアランス(CH2O)の増大を示す。
【図５】  図５は、1nmol/kg/分の化合物１及び11nmol/kg/分のノシセプチンのi.v.注入によって誘発された心血管及び腎臓の応答(V及びUNaV)の、同程度の変化を例示する。
【図６】  図６は、0.1nmol/kg/分の化合物１及び1.1nmol/kg/分のノシセプチンのi.v.注入によって誘発された心血管及び腎臓の応答(V及びUNaV)の、同程度の変化を例示する。
【図７】  図７は、正常なラットにおける、化合物１のi.v.投与(65nmol/kg i.v.)（矢印）の後の、尿流量、ナトリウム及びカリウム排泄の変化の関係を例示する。データは、化合物１のi.v.投与前のレベル（パーセンテージ）と比較して表す。
【図８】  図８は、正常なラット及び肝硬変のラットにおける、化合物１のi.v.投与(65nmol/kg i.v.)の後の、尿流量、遊離水クリアランス、分画ナトリウム排泄、及び分画カリウム排泄の変化を例示する。
【図９】  図９は、利尿薬として最大の用量の選択的バソプレッシン２型受容体アンタゴニストOPC-31260(0.8mg/kg/時間;n=8([2]由来のデータ))又は化合物１(12nmol/kg/分)の定常状態でのi.v.注入の間の水の分画排泄(V/GFR)を例示する。代償的な体液量の恒常性機構の活性化を防ぐために、体液量の減少は、150mMグルコースによる、コンピューター作動のサーボ制御静脈内体液量交換によって防がれた。
【図１０】  図１０は、化合物１及びAc-RYYRWK-NH2の、ヘパリン化しマウスの血漿中での分解速度を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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