(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−グルタミン酸生産能を有し、かつyhfK遺伝子の発現が増強するように改変された、エシェリヒア属細菌またはパントエア属細菌である微生物を培地中で培養し、該培地中にＬ−グルタミン酸を生成・蓄積せしめ、Ｌ−グルタミン酸を該培地から採取することを特徴とする、Ｌ−グルタミン酸の製造法。
【請求項２】
前記微生物がyhfK遺伝子のコピー数を高めること又はyhfK遺伝子の発現調節配列を改変することにより、yhfK遺伝子の発現が増強するように改変された微生物である、請求項１に記載のＬ−グルタミン酸の製造法。
【請求項３】
yhfK遺伝子が、下記(A)又は(B)に記載のタンパク質をコードする遺伝子である請求項１または２に記載のＬ−グルタミン酸の製造法：
（A）配列番号２または４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（B）配列番号２または４に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−グルタミン酸排出能を有するタンパク質。
【請求項４】
yhfK遺伝子が、配列番号２または４に示すアミノ酸配列と９０％以上相同なアミノ酸配列を有し、かつＬ−グルタミン酸排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１または２に記載のＬ−グルタミン酸の製造法。
【請求項５】
前記yhfK遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、請求項１または２に記載のＬ−グルタミン酸の製造法：
（ａ）配列番号１の１５３０〜３６２０または配列番号３の２０１〜２２８８に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１の１５３０〜３６２０または配列番号３の２０１〜２２８８に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−グルタミン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−グルタミン酸生産微生物及びＬ−グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は調味料原料等として広く用いられている。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（例えば、非特許文献１参照）。その他の菌株を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献１参照）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献２参照）、バチルス属、シュードモナス属、セラチア属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバクター・アエロゲネス）等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献３参照）、エシェリヒア・コリの変異株を用いる方法（例えば、特許文献４参照）等が知られている。また、クレブシエラ属、エルビニア属又はパントテア属、エンテロバクター属に属する微生物を用いたＬ−グルタミン酸の製造法も開示されている（例えば、特許文献５〜７参照）。
【０００３】
また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−グルタミン酸の生合成酵素の活性を増強することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例えば、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌において、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グルタミクム由来のクエン酸シンターゼをコードする遺伝子の導入が、コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（例えば、特許文献８参照）。またコリネ型細菌由来のクエン酸シンターゼ遺伝子のエンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、又はエシェリヒア属に属する腸内細菌への導入が、L-グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（例えば、特許文献９参照）。
【０００４】
アミノ酸等の目的物質の生産能を向上させる方法として、物質の取り込み系、又は排出系を改変する方法が知られている。例えば、物質の取り込み系を改変する方法としては、目的物質の細胞内への取り込み系を欠失又は低下させることにより、目的物質の生産能を高める方法が知られている。具体的にはgluABCDオペロン又はその一部を欠失させ、Ｌ−グルタミン酸の細胞内への取り込みを欠失又は低下させることによってＬ−グルタミン酸の生産能を向上させる方法（例えば、特許文献１０参照）及びプリンヌクレオチドの細胞内への取り込みを弱化することによって、プリンヌクレオチド生産能を強化する方法（例えば、特許文献１１参照）等が知られている。
【０００５】
一方、排出系を改変する方法に関しては、目的物質の排出系を強化する方法、及び目的物質の生合成系の中間体又は基質の排出系を欠損または弱化させる方法が知られている。目的物質の排出系を強化する方法としては、例えばＬ−リジン排出遺伝子(LysE)を強化したコリネバクテリウム属細菌の菌株を用いたＬ−リジンの製造法（例えば、特許文献１２参照）が開示されている。また、Ｌ−アミノ酸の排出に関与することが示唆されているｒｈｔＡ，Ｂ，Ｃ遺伝子を用いたＬ−アミノ酸の製造法も報告されている（例えば、特許文献１３参照）。目的物質の生合成系の中間体又は基質の排出系を欠損等させる方法としては、目的物質がＬ−グルタミン酸の場合に２−オキソグルタレートパーミアーゼ遺伝子を変異又は破壊することにより、目的物質の中間体である２−オキソグルタル酸の排出を弱化する方法が知られている（例えば、特許文献１４参照）。
【０００６】
その他にも、物質の細胞膜の透過に関与するATP結合カセット（ATP Binding cassette）スーパーファミリー（ABCトランスポーター）をコードする遺伝子をアミノ酸の細胞膜輸送が改変された微生物の育種に用いることが示唆されている（例えば、特許文献１５参照）。
【０００７】
Ｌ−グルタミン酸について、コリネ型細菌では、ビオチンや界面活性剤の添加時に細胞膜の膜透過性が変化することにより、細胞内から細胞外にＬ−グルタミン酸が流出する現象が知られており、コリネ型細菌のL-グルタミン酸排出には、排出遺伝子を介在していないことが報告されている。（例えば、非特許文献２参照）。さらに、エシェリヒア属細菌においてＬ−アミノ酸の排出に関与すると予想されるyfiK等の遺伝子を発現増強することにより、Ｌ−グルタミン酸の生産効率が向上したことが報告されている。（例えば、特許文献１６参照）。
しかし、パントエア属細菌や他の微生物では、Ｌ−グルタミン酸排出遺伝子の存在が知られておらず、新規のＬ−グルタミン酸排出遺伝子の創出が望まれていた。
【０００８】
また、Ｌ−グルタミン酸の製造法には、微生物を酸性条件下で培養し、Ｌ−グルタミン酸を析出させながらＬ−グルタミン酸を発酵生産する方法が知られている（例えば、特許文献１７参照）。一般に、Ｌ−グルタミン酸は細胞内に取り込まれると、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによってTCAサイクルの中間体である２−オキソグルタル酸に１段階で変換されるため、細胞内に取り込まれたＬ−グルタミン酸は容易に代謝されると考えられる。しかし、Ｌ−グルタミン酸を析出させる発酵生産においては、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下したエンテロバクター属細菌等が用いられるが、（例えば特許文献７、１７）これらの微生物は、L-グルタミン酸を析出させる条件下ではL-グルタミン酸は電荷を持たないフリー体の形での存在比率が高くなり、これらは容易に細胞膜を透過し、結果として細胞内グルタミン酸濃度が上昇し、生育が阻害される。そこで、上記特許文献１７においては、変異処理により、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損し、かつＬ−グルタミン酸を析出させながら生産することのできる菌株が育種され、Ｌ−グルタミン酸の製造に用いられた。しかしながら、Ｌ−グルタミン酸を析出させながら生産することのできる株は他には知られておらず、さらに、L-グルタミン酸を析出させる条件下において宿主微生物にＬ−グルタミン酸耐性を付与し、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させることのできる遺伝子は知られていなかった。
【０００９】
ｙｈｆＫ遺伝子は大腸菌のゲノム上に存在する遺伝子であり（例えば、非特許文献３参照）、予想されるアミノ酸配列のモチーフやトポロジーなどから何らかのトランスポーターをコードしていると考えられている（例えば、非特許文献４参照）。しかし、該遺伝子をクローニングしたり、発現させて解析した報告はなく、実際の機能は不明であった。
【特許文献１】米国特許第３，２２０，９２９号明細書
【特許文献２】米国特許第３，５６３，８５７号明細書
【特許文献３】特公昭３２−９３９３号公報
【特許文献４】特開平５−２４４９７０号公報
【特許文献５】特開２０００−１０６８６９号公報
【特許文献６】特開２０００−１８９１６９号公報
【特許文献７】特開２０００−１８９１７５号公報
【特許文献８】特公平７−１２１２２８号公報
【特許文献９】特開２０００−１８９１７５号公報
【特許文献１０】欧州特許出願公開１０３８９７０号明細書
【特許文献１１】欧州特許出願公開１００４６６３号明細書
【特許文献１２】国際公開第９７/２３５９７号パンフレット
【特許文献１３】特開２０００−１８９１７７号公報
【特許文献１４】国際公開第０１/０５９５９号パンフレット
【特許文献１５】国際公開第００/３７６４７号明細書
【特許文献１６】特開２０００−１８９１８０号
【特許文献１７】特開２００１−３３３７６９号公報
【非特許文献１】明石邦彦ら著  アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年
【非特許文献２】木村英一郎著  メタボニック  エンジニアリング  オブ  グルタメート  プロダクション（Metabolic engineering of glutamate production）  アドバンスド・バイオケミカル・エンジニアリング・バイオテクノロジー（Adv. Biochem. Eng. Biotechnol.）スプリングバーラグ社  （Springer Verlag）2003;79:37-57. 2003年
【非特許文献３】Science 277(5331):1453-74, 1997年
【非特許文献４】J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 2 (2):195-198, 2000年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、Ｌ−グルタミン酸を効率よく生産することのできる菌株を提供すること、及び該菌株を用いてＬ−グルタミン酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、Ｌ−グルタミン酸耐性に関与する遺伝子としてＬ−グルタミン酸排出遺伝子yhfKを単離し、yhfK遺伝子の発現を強化した菌株は、細胞内のＬ−グルタミン酸濃度を低減させ、Ｌ−グルタミン酸の生産性を向上させることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）  Ｌ−グルタミン酸生産能を有し、かつyhfK遺伝子の発現が増強するように改変された微生物。
（２）  yhfK遺伝子のコピー数を高めること又はyhfK遺伝子の発現調節配列を改変することにより、yhfK遺伝子の発現が増強するように改変された、（１）の微生物。
（３）ｙｈｆＫ遺伝子が、配列番号１０、１１、及び１２から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−グルタミン酸排出活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、（１）の微生物。
（４）  yhfK遺伝子が、下記(A)又は(B)に記載のタンパク質をコードする遺伝子である（１）の微生物：
（A）配列番号２または４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（B）配列番号２または４に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−グルタミン酸排出能を有するタンパク質。
（５）  yhfK遺伝子が、配列番号２または４に示すアミノ酸配列と７０％以上相同なアミノ酸配列を有し、かつＬ−グルタミン酸排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子である、（１）の微生物。
（６）  前記yhfK遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、（１）の微生物：
（ａ）配列番号１の１５３０〜３６２０または配列番号３の２０１〜２２８８に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１の１５３０〜３６２０または配列番号３の２０１〜２２８８に示す塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−グルタミン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（７）  前記微生物が、γ-プロテオバクテリアである、（１）〜（６）のいずれかの
微生物。
（８）  前記微生物がエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌、クレブシエラ属細菌、セラチア属細菌からなる群より選ばれるいずれかの腸内細菌である、（１）〜（７）のいずれかの微生物。
（９）前記微生物が、コリネ型細菌である（１）〜（６）のいずれかの微生物。
（１０）  （１）〜（９）のいずれかの微生物を培地中で培養し、該培地中にＬ−グルタミン酸を生成・蓄積せしめ、Ｌ−グルタミン酸を該培地から採取することを特徴とする、Ｌ−グルタミン酸の製造法。
（１１）  以下の(A)又は(B)に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（A）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（B）配列番号２に示すアミノ酸配列と７１％以上相同なアミノ酸配列を有し、かつＬ−グルタミン酸排出能を有するタンパク質。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の微生物を用いることにより、Ｌ−グルタミン酸を効率よく発酵生産することができる。また、本発明の遺伝子はＬ−グルタミン酸生産菌の育種に好適に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
＜１＞本発明のＬ−グルタミン酸生産微生物
本発明の微生物は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有し、かつyhfK遺伝子の発現が増強するように改変された微生物である。「Ｌ−グルタミン酸生産能」とは、本発明の微生物を培地中で培養したときに、Ｌ−グルタミン酸を細胞又は培地から回収できる程度に、細胞又は培地中に生成、蓄積する能力をいう。Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物としては、本来的にＬ−グルタミン酸生産能を有するものであってもよいが、以下に示すような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用してＬ−グルタミン酸生産能を有するように改変したものや、本発明の遺伝子を導入することによってＬ−グルタミン酸生産能が付与された微生物あってもよい。なお、上記親株は、本来内在的にyhfK遺伝子を有しているものであってもよいし、本来はyhfK遺伝子を有しないが、yhfK遺伝子を導入することにより、L-グルタミン酸排出活性や生産能が向上するものであってもよい。
【００１６】
改変に用いる微生物の親株としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）属などのγ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌や、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌、アリサイクロバチルス（Alicyclobacillus）属、バチルス（Bacillus）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等に属する微生物などが挙げられる。γ−プロテオバクテリアは、NCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock）に開示されている分類により微生物に属するものが利用出来る。
【００１７】
また、安価に大量に入手可能な発酵原料であるメタノールからＬ−アミノ酸を生産出来るメタノール資化性細菌であるメチロフィラス属およびメチロバチラス属微生物等も利用できる。
【００１８】
エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等が挙げられる。エシェリヒア・コリを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、E. coli K12株及
びその誘導体であるエシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC No.47076）、及びW3110株（ATCC No.27325）を用いることができる。エシェリヒア・コリK12株は、1922年にスタンフォード大学で分離されたものであり、λファージの溶原菌であるとともに、F因子を持ち、接合等遺伝的組み換え体の作成が可能である汎用性の高い菌株である。またエシェリヒア・コリＫ１２株のゲノム配列は既に決定されており、遺伝子情報も自由に利用出来る。エシェリヒア・コリＫ１２株や、誘導株を入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所ATCC, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）。
【００１９】
また、エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）等に再分類されているものがある。本発明においては、γ−プロテオバクテリアに分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。パントエア・アナナティスを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１４）、ＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１５）、ＡＪ１３６０１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２０７）及びそれらの誘導体を用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００２０】
本発明でいうコリネ型細菌は、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を有しない桿菌であって、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。
【００２１】
Ｌ−グルタミン酸の製造に好適に用いられるコリネ型細菌としては、例えば以下に示すものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００２２】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム  ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム  ＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム・アルカノリティカム  ＡＴＣＣ２１５１１
コリネバクテリウム・カルナエ  ＡＴＣＣ１５９９１
コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０２０、１３０３２、１３０６０
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）  ＡＴＣＣ１５９９０
コリネバクテリウム・メラセコーラ  ＡＴＣＣ１７９６５
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス  ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９）
コリネバクテリウム・ハーキュリス  ＡＴＣＣ１３８６８
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）  ＡＴＣＣ１４０２０
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）  ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム  ＡＴＣＣ１４０６８
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）  ＡＴＣＣ１３６６５、ＡＴＣＣ１３８６９
ブレビバクテリウム・ロゼウム  ＡＴＣＣ１３８２５
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム  ＡＴＣＣ１４０６６
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス  ＡＴＣＣ１９２４０
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）  ＡＴＣＣ６８７１
ブレビバクテリウム・アルバム  ＡＴＣＣ１５１１１
ブレビバクテリウム・セリヌム  ＡＴＣＣ１５１１２
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム  ＡＴＣＣ１５３５４
【００２３】
メチロフィラス属微生物として具体的には、メチロフィラス・メチロトロファスが挙げられ、代表的な株としてはAS1株（NCIMB10515）等が挙げられる。メチロフィラス・メチロトロファスAS1株はナショナル・コレクション・オブ・インダストゥリアル・アンド・マリン・バクテリア（National Collections of Industrial and Marine Bacteria、住所 NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom）から入手可能である。
【００２４】
メチロバチラス属微生物として具体的には、メチロバチラス・グリコゲネス（Methylobacillus glycogenes）、メチロバチラス・フラゲラタム(Methylobacillu flagellatum)等が挙げられる。メチロバチラス・グリコゲネスとしては、T-11株（NCIMB 11375）、ATCC 21276株、 ATCC 21371株、ATR80株(Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994)、42巻, p67-72に記載）、A513株（Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994)、42巻, p67-72に記載）等が挙げられる。メチロバチラス・グリコゲネスNCIMB 11375株は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストゥリアル・アンド・マリン・バクテリア（National Collections
of Industrial and Marine Bacteria、住所 NCIMB Lts., Torry Research Station 135,
Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom）から入手可能である。また、メチロ
バチラス・フラゲラタムとしては、KT株(Arch. Microbiol., (1988), 149巻、p441-446に記載)等が挙げられる。
【００２５】
上述したような微生物にＬ−グルタミン酸生産能を付与するための改変の方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変する方法を挙げることができる。Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＤＨ」ともいう）、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ（以下、「ＣＳ」ともいう）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「ＰＥＰＣ」ともいう）、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセルムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼなどが挙げられる。これらの酵素の中では、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいずれか１種以上が好ましく、３種全てがより好ましい。
【００２６】
以下に目的遺伝子の発現が増強するように微生物を改変する方法について説明する。
【００２７】
１つ目の方法は、目的遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得られたプラスミドを用いて宿主微生物を形質転換することにより、該遺伝子のコピー数を高める方法である。例えば、目的遺伝子としてＣＳをコードする遺伝子（ｇｌｔＡ遺伝子）、ＰＥＰＣをコードする遺伝子（ｐｐｃ遺伝子）、およびＧＤＨをコードする遺伝子（ｇｄｈＡ遺伝子）を用いる場合、これらの遺伝子はエシェリヒア属細菌、及びコリネバクテリウム属細菌において、既に塩基配列が明らかにされていることから（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２巻、５２４３〜５２４９頁、１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９５巻、９０９〜９１６頁、１９８４年；Ｇｅｎｅ、第２７巻、１９３〜１９９頁、１９８４年；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１４０巻、１８１７〜１８２８頁、１９９４年；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２１８巻、３３０〜３３９頁、１９８９年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６巻、３１７〜３２６頁、１９９２年）、それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが可能である。
【００２８】
形質転換に用いるプラスミドは、腸内細菌群に属する微生物の中で自律複製可能なプラスミドとして、pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29（pHSG、pSTVはタカラバイオ社より入手可）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMWはニッポンジーン社より入手可）等が挙げられる。また、コリネ型細菌用のプラスミドとしては、pAM330(特開昭58-67699号公報)、pHM1519(特開昭58-77895号公報)、pAJ655，pAJ611，pAJ1844(特開昭58-192900号公報)、pCG1(特開昭57-134500号公報)、pCG2（特開昭58-35197号公報），pCG4，pCG11（特開昭57-183799号公報）、pHK4（特開平5-7491号公報）などが挙げられる。なお、プラスミドの代わりにファージＤＮＡをベクターとして用いてもよい。上記ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨの活性を同時に増強するためのプラスミドとして、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子及びｇｄｈＡ遺伝子が組み込まれたRSFCPGを挙げることができる（欧州特許出願公開第0952221号明細書参照）。
【００２９】
メチロフィラス属微生物で機能するベクターとして、具体的には、広宿主域ベクターであるRSF1010及びその誘導体、例えばpAYC32（Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 1986, 16, 161-167）、あるいはpMFY42（gene, 44, 53(1990)）、pRP301、pTB70（Nature, 287, 396, (1980)）等が挙げられる。
【００３０】
形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）などが挙げられる。
あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75
1929 (1978)）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても、微生物の形質転換を行うこともできる。
【００３１】
遺伝子のコピー数を高めることは、目的遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー導入することによっても達成できる。微生物の染色体DNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して、相同組換え法（Experimentsin Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)）により行うことができる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。さらに、Muファージを用いる方法（特開平2-109985号）で宿主染色体に目的遺伝子を組み込むこともできる。
【００３２】
２つ目の方法は、染色体DNA上またはプラスミド上において、目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによって目的遺伝子の発現を増強させる方法である。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、pLプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開WO00/18935に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。エシェリヒア・コリや、パントエア・アナナティスに用いることが出来る、温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えばWO 99/03988号国際公開パンフレットに記載のプラスミドpMAN997やその誘導体等が挙げられる。また、λファージのレッド・リコンビナーゼ（Red recombinase）を利用した方法（Datsenko, K.A., PNAS (2000) 97(12), 6640-6645）によっても、発現調節配列の置換を行うことができる。なお、発現調節配列の改変は、上述したような遺伝子のコピー数を高める方法と組み合わせてもよい。
【００３３】
以上のような方法によりクエン酸シンターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増強するように改変された微生物としては、特開平2001-333769号公報、特開2000-106869号公報、特開2000-189169号公報、特開2000-333769等に記載された微生物が例示できる。
【００３４】
また、Ｌ−グルタミン酸生産能は、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性を増強させることによっても付与することが出来る。６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性を上昇させた微生物としては、特開2003-274988に開示された微生物を挙げることが出来る。
【００３５】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与するための改変は、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることに
より行ってもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。この中では特に、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましい。
【００３６】
上記のような酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、あるいは遺伝子工学的手法によって、上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。遺伝子に変異が導入される部位は、酵素タンパク質をコードするコード領域であってもよく、プロモーター等の発現制御領域であってもよい。また、遺伝子工学的手法には、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いる方法がある。
【００３７】
細胞中の目的酵素の活性が低下または欠損していること、および活性の低下の程度は、候補株の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株と比較することによって確認することができる。例えば、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性は、Reedらの方法（L.J.Reed and B.B.Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61）に従って測定することができる。
【００３８】
エシェリヒア属細菌において２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、特開平5-244970号公報及び特開平7−203980号公報などに記載されている。また、コリネ型細菌において２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、国際公開95/34672号パンフレットに記載されている。さらに、エンテロバクター属細菌については、特開２００１−３３３７６９号公報に開示されている。
【００３９】
２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下した細菌としては、具体的には次のような株が挙げられる。
エシェリヒア・コリAJ12624（FERM BP-3853）
エシェリヒア・コリAJ12628（FERM BP-3854）
エシェリヒア・コリAJ12949（FERM BP-4881）
ブレビバクテリム・ラクトファーメンタム  ΔS株  （国際公開95/34672号パンフレット参照）
パントエア・アナナティス  AJ13601(FERM BP-7207  欧州特許公開明細書1078989)
パントエア・アナナティス  AJ13356(FERM BP-6615 米国特許6.331,419号)
パントエア・アナナティス  SC17sucA(BP-8646)
クレブシエラ・プランティコーラ  AJ13410(FERM BP-6617 米国特許6,197,559号)
尚、SC17sucA株は、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株（2001-333769）のプラスミドを導入する前の菌株であり、プライベートナンバーAJ４１７が付与され、平成１６年２月２６日に独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
【００４０】
本発明の微生物は、上述したようなＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物を、yhfK遺伝子の発現が増強するように改変することによって得ることができる。ただし、先にyhfK遺伝子の発現が増強するように改変を行った後に、Ｌ−グルタミン酸生産能を付与しても
よい。また、yhfK遺伝子の増幅により、Ｌ−グルタミン酸生産能が付与された微生物でもよい。なお、yhfK遺伝子の発現増強は、後述するように、プロモーター改変を始めとする発現調節領域改変などによる内因性yhfK遺伝子の発現増強であってもよいし、yhfK遺伝子を含むプラスミドの導入などによる外因性yhfK遺伝子の発現増強であってもよい。さらに、これらを組み合わせてもよい。
【００４１】
yhfKの発現が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、yhfKのmRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上上昇していることが望ましい。
【００４２】
本発明による「ｙｈｆＫ遺伝子」とは、エシェリヒア・コリのｙｈｆＫ遺伝子、パントエア・アナナティスのyhfK遺伝子等、γ−プロテオバクテリア由来、腸内細菌群のyhfK遺伝子あるいはそのホモログをいう。エシェリヒア・コリのｙｈｆＫ遺伝子としては、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、好ましくは、配列番号３の塩基番号201番目から2288番目の塩基配列を含む遺伝子を例示することができる。（Genbank Accession No.NP_417817.[gi:16131237]）また、パントエア・アナナティス由来のｙｈｆＫ遺伝子としては、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、好ましくは、配列番号１の塩基番号1530番目から3620番目の塩基配列を含むDNAを例示することができる。さらに、GenBank Accession No. AE016992の塩基番号230947〜233037番で示されるシゲラ・フレキシネリ（Shigella flexneri）のyhfK遺伝子、GenBank Accession No. AE008859の塩基番号4272〜6359番で示されるサルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）のyhfK遺伝子を例示することができる。さらに、yhfK遺伝子は、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、エルシニア属等のγ―プロテオバクテリア、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等からクローニングされるものであってもよく、例えば配列番号５、６、あるいは配列番号７、８に示される合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅出来るものであってもよい。
なお、上記シゲラ・フレキシネリ、サルモネラ・ティフィムリウムのyhfK遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸配列と、それぞれ、９９％、８６％相同であり、配列番号２のアミノ酸配列と、それぞれ、７０％、７１％の相同性である。さらに、配列番号２と４のアミノ酸配列の間の相同性は７０％である。アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えばKarlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993))やFASTA(Methods Enzymol., 183, 63
(1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている (http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照)。
【００４３】
yhfK遺伝子ホモログとは、エシェリヒア・コリ、パントエア・アナナティスのyhfK遺伝子構造と高い相同性を示し、かつＬ−グルタミン酸排出機能を持つ遺伝子をいう。
例えば配列番号１０に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子、配列番号１１、１２に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられる。（配列番号１０のアミノ酸配列は、エシェリヒア・コリ、パントエア・アナナティス、シゲラ・フレキシネリ、サルモネラ・ティフィムリウムのyhfKタンパク質の間で保存されている配列、配列番号１１のアミノ酸配列は、エシェリヒア・コリとサルモネラ・ティフィムリウムのyhfKタンパク質の間で保存されている配列、配列番号１２は、エシェリヒア・コリ、サルモネラ・エンテリカのyhfKタ
ンパク質の間で保存されている配列を示す。）yhfK遺伝子ホモログは、例えば、配列番号２または、４のアミノ酸配列全体と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつ、L-グルタミン酸排出活性を有するタンパク質をコードするものを意味する。
【００４４】
ｙｈｆＫ遺伝子は、コードされるタンパク質の活性、すなわち、Ｌ−グルタミン酸排出活性が損なわれない限り、配列番号２又は４のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置で１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものであってもよい。ここで、数個とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個特に好ましくは２〜５個である。
上記置換は機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、phe, trp, tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、leu, ile, val間で、極性アミノ酸である場合には、gln, asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、lys, arg, his間で、酸性アミノ酸である場合には、asp, glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、ser, thr間でお互いに置換する変異である。例えば、配列番号10、11、12のＸの領域を野生型のアミノ酸配列を元にして中性的変異を導入することにより、機能上同一のYhfKタンパクを取得することが出来る。
より具体的には、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、yhfK遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
さらに、yhfK遺伝子は、配列番号２又は４のアミノ酸配列全体に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつ、Ｌ−グルタミン酸排出活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。また、それぞれ導入する宿主により、遺伝子の縮重性が異なるので、それぞれyhfKが導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様にyhfK遺伝子は、Ｌ−グルタミン酸の排出機能を有する限り、Ｎ末端側、C末端側が延長したものあるいは、削られているものでもよい。例えば延長する長さは、アミノ酸残基で50以下、好ましくは20以下、より好ましくは10以下、特に好ましくは5以下である。
【００４５】
このような遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号１、または３に示す塩基配列を改変することによって取得することができる。また、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、配列番号１、または３に示す塩基配列を有する遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、yhfK 遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によっ
て生じるものも含まれる。これらの遺伝子がＬ−グルタミン酸排出活性を有するタンパク質をコードしているか否かは、例えば、これらの遺伝子を適当な細胞で発現させ、培地中に排出されるＬ−グルタミン酸の量を増大させているかを調べることにより、確かめることができる。
【００４６】
ｙｈｆＫ遺伝子は、さらに、配列番号１の塩基番号1530番目から3620番目からなる塩基配列を有するDNA、配列番号３の塩基番号201番目から2288番目からなる塩基配列を有するDNA、またはこれらの塩基配列を有するDNAから調製され得るプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−グルタミン酸排出活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
【００４７】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳさらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００４８】
プローブは、yhfK遺伝子の一部の配列を有するものであってもよい。そのようなプローブは、当業者によく知られた方法により、各遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、各遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCR反応により作製することができる。なお、プローブに300bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、上記の条件でハイブリダイズさせた後の洗いの条件としては、50℃、2×SSC, 0.1%SDSが挙げられる。
【００４９】
上述のようなyhfK遺伝子の発現を増強するための改変は、例えば、遺伝子組換え技術を利用して、細胞中のyhfK遺伝子のコピー数を高めることによって行うことができる。例えば、yhfK遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを微生物に導入して形質転換すればよい。
【００５０】
yhfK遺伝子としてエシェリヒア・コリのyhfK遺伝子を用いる場合、配列番号３の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号７及び８に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、yhfK遺伝子を取得することができる。また、yhfK遺伝子としてパントエア・アナナティスのyhfK遺伝子を用いる場合、配列番号１の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号５及び６に示すプライマーを用いて、パントエア・アナナティスの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって取得することが出来る。他の微生物のyhfK遺伝子も、その微生物において公知のyhfK遺伝子もしくは他種の微生物のyhfK遺伝子又はYhfKタンパク質の配列情報に基づいて作製した例えば配列番号5、6あるいは7、8のオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、微生物の染色体ＤＮＡ又は染色体ＤＮＡライブラリーから、取得することができる。なお、染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である微生物から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【００５１】
次に、PCR法により増幅されたyhfK遺伝子を、宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターDNAに接続して組換えDNAを調製する。宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターとしては、宿主微生物の細胞内において自律複製可能なベクターを挙げることができる。
エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, pTrc99（pHSG、pACYCは宝バイオ社より入手可）, RSF1010, pBR322, pMW219（pMWはニッポンジーン社より入手可）等が挙げられる。
コリネ型細菌で自律複製できるプラスミドとして具体的には、以下のものが例示される。
pAM330 （特開昭58-67699号公報参照）
pHM1519 （特開昭58-77895号公報参照）
pSFK6 （特開2000-262288号公報参照）
pVK7 (米国特許出願公開明細書2003-0175912) 
また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。
【００５２】
メチロフィラス属微生物で自律複製出来るプラスミドとして具体的には、広宿主域ベクターであるRSF1010及びその誘導体、例えばpAYC32（Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 1986, 16, 161-167）、あるいはpMFY42（gene, 44, 53(1990)）、pRP301、pTB70（Nature, 287, 396, (1980)）等が挙げられるyhfK遺伝子と上記プラスミドとを連結して組換えDNAを調製するには、yhfK遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結はT4DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
【００５３】
上記のように調製した組換えDNAを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、コリネ型細菌の形質転換は、電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公報）によっても行うことができる。
【００５４】
一方、yhfK遺伝子のコピー数を高めることは、yhfK遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体DNA上にyhfK遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、yhfK遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。染色体上にyhfK遺伝子が転移したことの確認は、yhfK遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【００５５】
さらに、yhfK遺伝子の発現の増強は、上記した遺伝子コピー数の増幅以外に、国際公開00/18935号パンフレットに記載されたようにして、染色体DNA上またはプラスミド上のyhfK遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することや、yhfKの発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅、yhfKの発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、pLプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、yhfK遺伝子のプロモーター領域に塩基置換等を導入し、より強力なものに改変することも可能である。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。
また、発現量の上昇は、m-RNAの生存時間を延長させることや、酵素タンパク質の細胞内での分解を防ぐことによっても達成可能である。
yhfKのプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することも出来る。これらのプロモーター置換または改変によりyhfK遺伝子の発現が強化される。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いて行うことができる。コリネ型酸菌の温度感受性プラスミドとしては、p48K及びpSFKT2（以上、特開2000-262288号公報）、pHSC4（フランス特許公開1992年2667875号公報、特開平5-7491号公報）等が挙げられる。これらのプラスミドは、コリネ型細菌中で少なくとも25℃では自律複製することができるが、37℃では自律複製できない。なお、発現調節配列の改変は、yhfK遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００５６】
yhfK遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を増強するために、Ｌ−グルタミン酸排出系活性が上昇するような変異をyhfK遺伝子に導入してもよい。yhfK遺伝子によってコードされるタンパク質（YhfKタンパク質）の活性が上昇するような変異としては、yhfK遺伝子の転写量が増大するようなプロモーター配列の変異、及び、YhfKタンパク質の比活性が高くなるようなyhfK遺伝子のコード領域内の変異が挙げられる。
【００５７】
ｙｈｆ遺伝子の発現量の増強は、上述したような方法により、形質転換や相同組み換えによってｙｈｆ遺伝子のコピー数を高めたり、ｙｈｆ遺伝子の発現調節配列を改変したりすることすることや、yhfKの発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅、yhfKの発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成出来る。
【００５８】
本発明の微生物は、ｙｈｆＫ遺伝子の発現が増強することにより、Ｌ−グルタミン酸の排出活性が向上していることが好ましい。「Ｌ−グルタミン酸の排出活性が向上した」ことは、本発明の微生物を培養したときに培地中に排出されるＬ−グルタミン酸の量を、ｙｈｆＫ遺伝子が導入されていない対照のＬ−グルタミン酸生産微生物と比較することによって確認することができる。すなわち、「Ｌ−グルタミン酸の排出活性の向上」は、対照の微生物に比べて、本発明の微生物を培養したときに培地中に蓄積するＬ−グルタミン酸濃度が高くなることによって観察される。また、「Ｌ−グルタミン酸の排出活性の向上」は、本発明の微生物の細胞内においてＬ−グルタミン酸濃度が低下することによっても観察され得る。「Ｌ−グルタミン酸の排出活性」は、野生株またはｙｈｆＫ遺伝子非導入株に比べて、ｙｈｆK遺伝子導入株の細胞内のＬ−グルタミン酸の濃度が、10％以上、好ましくは20％以上、特に好ましくは、30％以上減少していることが好ましい。微生物の絶対的な「Ｌ−グルタミン酸の排出活性」は、微生物の細胞内のＬ−グルタミン酸の濃度と細胞外のＬ−グルタミン酸の濃度の差を測定することによって検出できる。さらに、「Ｌ−グルタミン酸の排出活性」は、反転膜を利用して、ラジオアイソトープにて細胞内のアミノ酸の取り込み活性を測定することによっても検出出来る（J.Biol.Chem 2002 Vol277.No
.51 p49841-49849）。例えば、yhfK遺伝子を発現させた菌体より反転膜小胞を作成し、ATPあるいはその他駆動力となる基質を添加し、RIラベルしたグルタミン酸の取り込み活性を測定することによって測定可能である。また生菌を使用して、ラベル化グルタミン酸と非ラベル化グルタミン酸の交換反応の速度を検出することによっても測定できる。
【００５９】
本発明の微生物は、酸性条件下で培養したときに液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を越える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力（以下、酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能ということがある）を有する微生物であってもよい。このような微生物は、yhfK遺伝子の発現が増強することによって、酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能を有するようになったものであってもよいし、本来的に酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能を有するものであってもよい。
【００６０】
本来的に酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能を有する微生物として具体的には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４）、AJ13356株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５）、及びAJ13601株（FERM BP-7207）（以上、特開２００１−３３３７６９号公報参照）などが挙げられる。パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所）に、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６６４４として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１４が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５５として寄託されたが、近年１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている（後記実施例参照）。また、後述するＡＪ１３３５５から誘導された菌株ＡＪ１３３５６、及びＡＪ１３６０１も、同様にエンテロバクター・アグロメランスとして前記寄託機関に寄託されているが、本明細書ではパントエア・アナナティスと記述する。AJ13601は、１９９９年8月１８日に独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERMP17156として寄託され、２０００年７月６日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。
【００６１】
＜２＞本発明のＬ−グルタミン酸の製造方法
本発明の微生物を培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、Ｌ−グルタミン酸を該培地から採取することにより、Ｌ−グルタミン酸を製造することが出来る。
【００６２】
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
【００６３】
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。無機塩類としてはりん酸塩、マグネ
シウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用できる。
【００６４】
培養は、好ましくは、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを３〜９に制御し、通気培養を行う。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に著量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。
【００６５】
また、Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０を挙げることができる。
【００６６】
培養終了後の培養液からＬ−グルタミン酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【００６７】
［実施例］
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【実施例１】
【００６８】
＜Ｌ−グルタミン酸排出遺伝子の探索＞
Ｌ−グルタミン酸排出遺伝子の探索は以下のようにして行った。Ｌ−グルタミン酸は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによってトリカルボン酸サイクルの中間体である２−オキソグルタル酸に、1段階で変換されるため、グルタミン酸デヒドロゲナーゼやトリカルボン酸サイクルを持つ多くの微生物では、酸性条件で細胞内に流入するＬ−グルタミン酸は容易に代謝されることが予想される。しかし、2-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼを欠損させた株は、酸性条件でＬ−グルタミン酸に対して感受性を示す。ここでは、2-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損株としてパントエア・アナナティスSC17sucA株を用い、酸性条件下でのＬ−グルタミン酸耐性を指標にＬ−グルタミン酸排出系遺伝子の取得を試みた。
【００６９】
野生株であるパントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株より染色体DNAを常法にて抽出し、制限酵素Sau3AIで部分分解後、約10kbの断片を回収し、pSTV28（タカラバイオ社）のBamHIサイトに導入した、プラスミドライブラリーを作成した。このプラスミドライブラリーをSC17sucA株に常法により、エレクトロポレーションにより導入した。なお、SC17sucA株は、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株（特開2001-333769号公報参照）のプラスミドを導入する前の菌株であり、プライベートナンバーAJ４１７が付与され、平成１６年２月２６日に独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM BP-08646  として寄託されている。
【００７０】
プラスミドライブラリーを導入したSC17sucA株を、クロラムフェニコール耐性を指標にL培地（バクトトリプトン10 g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 g、寒天15 gを純水1Lに含む培地、pH7.0）に、最少培地成分（ グルコース0.5g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）を加えたプレートにて選択し、4.33×105個のコロニーを形質転換体として取得した。この4.33×105個の形質転換体をSC17sucAがコロニーを形成できない、
高濃度のＬ−グルタミン酸を含むpH4.5の最少培地（最少培地にＬ−グルタミン酸を30g/L, Ｌ−リジン塩酸塩,、DL-メチオニン,ジアミノピメリン酸各100mg/Lを混合したpH4.5に調整した培地  糖源としてグルコースとシュークロースを用いた）に塗布した。
【００７１】
34℃で3日間培養し、出現したコロニーに導入されているベクターに挿入された遺伝子について解析した。それぞれのライブラリーからプラスミドを抽出して、制限酵素で処理してプラスミドの大きさを確認したところ、炭素源がスクロースである最少培地より取得したクローン１６株中、１５株が同じ制限酵素パターンを示した。炭素源がグルコースである最少培地より取得した１１株のクローン内にも同様の制限酵素パターンを示すプラスミドが導入されており、これをプラスミドLib10と名づけた。
【００７２】
次に、SC17sucAと、プラスミドLib10が導入された菌株、SC17sucALib10を最少培地（グルコース0.5g又はシュークロース0.5g 、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）をpH4.5 に調整し、Ｌ−グルタミン酸を30g/L, リジン,メチオニン,ジアミノピメリン酸各100mg/Lを含有した液体培地で培養し、酸性条件下の高濃度Ｌ−グルタミン酸存在下での最少培地における生育を調べた。
【００７３】
結果を図１に示す。SC17sucAと比べ、プラスミドLib10が導入されたSC17sucALib10は、酸性条件下での高濃度Ｌ−グルタミン酸存在下での生育が大幅に向上することが分かった。従ってLib10内に、酸性下でＬ−グルタミン酸で耐性を示す形質が含まれていると考えられたので、Lib10の塩基配列を決定し、Lib10にコードされているタンパク質の機能について推定することとした。
【００７４】
塩基配列の決定は常法によって行い、GenBankに登録されている遺伝子との相同性を比較した。この領域には、yhfK（AE000411.1:9304..11394）と相同性を有する遺伝子が含まれていた。yhfKに関しては機能未知であることが分かった。
【実施例２】
【００７５】
＜yhfK遺伝子増幅の効果の確認＞
yhfKに関しては、タンパク質のモチーフ検索の結果、トランスポーターをコードしている可能性が示唆されていたため（J.Mol.Microbiol.Biotechnol.(2000) 2 (2):195-198）、上記遺伝子のうち、yhfKに関して単独増幅効果を検証することとした。
【００７６】
配列番号５と配列番号６に示されるオリゴヌクレオチドyhfK-F1,yhfK-R2 を用いて、パントエア・アナナティス野生株No.359（ＡＪ１３３５５）株の染色体を鋳型として、PCRによりyhfK遺伝子断片を増幅した。Promega 社製TAクローニングベクターpGEM-Teasyに連結して、pGEM-yhfKを作成した。PGEM-yhfKをEcoRIで切断し、pSTV28(宝酒造株式会社製)をEcoRIで処理したものと連結しyhfK遺伝子増幅用ベクターpSTV-yhfKを構築した。プラスミドの構築図を図２に示す。
【００７７】
yhfK遺伝子増幅用ベクターpSTV-yhfKと、対照用プラスミドpSTV28、エレクトロポレーションによりSC17sucA株に導入し、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を得た。プラスミドを抽出して確認し、yhfK増幅株をSC17sucA/pSTV-yhfK、対照用のpSTV導入株をSC17sucA/pSTV28と名付けた。
【００７８】
SC17sucA/pSTV-yhfKを最少培地（グルコース0.5g又はシュークロース0.5g 、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）に、Ｌ−グルタミン酸を30g/L, Ｌ−リジン塩酸塩,DL-メチオニン,ジアミノピメリン酸各100mg/Lを含有し、アンモニア水にてpH4.5に調整した
培地に塗布した。SC17sucAがコロニーを形成出来ないのに対し、SC17sucA/pSTV-yhfKは最少培地上でコロニーを形成することを確認した。
【００７９】
次に、最少培地（グルコース0.5g又はシュークロース0.5g 、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）に、Ｌ−グルタミン酸を30g/L, リジン,メチオニン,ジアミノピメリン酸各100mg/Lを含有し、アンモニア水にてpH4.5に調整した液体培地で培養し、酸性条件下での最少培地における生育を調べた。結果を図3に示す。
【００８０】
対照のSC17sucA/pSTV28と比べ、SC17sucA/pSTV-yhfKは、Lib10導入と同様に生育が回復することから、yhfK遺伝子がSC17sucA株に酸性下でのＬ−グルタミン酸耐性の形質を付与することが明らかになった。
【実施例３】
【００８１】
＜yhfK遺伝子増幅の中性pH下でのＬ−グルタミン酸生産の効果＞
次にこの遺伝子が、Ｌ−グルタミン酸生産に与える影響を検討するため、yhfK増幅用プラスミドpSTV-yhfKを配列番号９に示すＬ−グルタミン酸生産用プラスミドRSFCPG を有するＬ−グルタミン酸生産菌SC17sucA/RSFCPG（特開平2001-333769号公報参照）に導入して、Ｌ−グルタミン酸生産における影響を調べた。
【００８２】
SC17sucA/RSFCPGに、調整したpSTV-yhfK、比較対照用のプラスミドpSTV29(宝酒造株式会社製)をエレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、クロラムフェニコール耐性を指標にして、形質転換体を取得した。プラスミドを確認後、yhfK増幅用プラスミド導入株をSC17sucA/ RSFCPG+pSTV-yhfKと、pSTV29導入株をSC17sucA/ RSFCPG+pSTV29と名付けた。
【００８３】
次にSC17sucA/ RSFCPG+pSTV-yhfKと、対象のSC17sucA/ RSFCPG+pSTV29を用いて培養を行い、Ｌ−グルタミン酸の生産能について検討した。
培地は以下の組成で行った。
〔培養培地組成〕
シュークロース              50g/L
MgSO4・7H20                   0.4g/L
KH2PO4                      2.0g/L
酵母エキス                 4.0g/L
FeSO4・7H20                  0.01g/L
MnSO4・5H20                  0.01g/L
Ｌ−リジン塩酸塩           0.4g/L
DL-メチオニン               0.4g/L
ε−ジアミノピメリン酸       0.4g/L
テトラサイクリン塩酸塩      25mg/L
クロラムフェニコール        25mg/L
【００８４】
SC17sucA/ RSFCPG+pSTV29と、SC17sucA/ RSFCPG+pSTV-yhfKをL培地（バクトトリプトン10 g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 g、寒天15 gを純水1Lに含む培地 pH7.0）に、最小培地成分（ グルコース0.5g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 、塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）に25mg/Lのクロラムフェニコール, 12.5mg/Lテトラサイクリンを加えた培地で前培養し、プレート1枚ジャーファメンターに植菌し、34℃、pH6.0にて、通気1/1vvm 34℃で酸素濃度が5％以上になるように攪拌制御を行った。
【００８５】
結果を表１に示す。対照のSC17sucA/RSFCPG+pSTV29と比べ、yhfK増幅株であるSC17sucA/RSFCPG+pSTV-yhfKは、Ｌ−グルタミン酸生産に関して、Ｌ−グルタミン酸蓄積が約3g/L 上昇し、対糖収率で約5％上昇した。
【００８６】
【表１】
0004665558.tif 000002
【実施例４】
【００８７】
＜エシェリヒア・コリのyhfK遺伝子の増幅効果と酸性条件下での増幅効果＞
次にエシェリヒア・コリのyhfK遺伝子のパントエア・アナナティスSC17sucA/RSFCPG株に導入して効果を調べた。
【００８８】
エシェリヒア・コリのGeneBank NC_000913 に登録されているyhfKの配列（配列番号３）を基に、配列番号７、８に示したオリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリ  W3110株（ATCC 27325） の染色体を鋳型にPCR反応を行い、yhfK遺伝子を含む約2.4ｋｂの断片を得た。この断片をEcoRI、PstI処理し、pSTV29（宝酒造株式会社製）の同サイトに連結した。得られたエシェリヒア・コリのyhfK増幅用プラスミドをyhfK増幅用プラスミドpSTV-EcoyhfKとした。構築方法を図２に示す。
【００８９】
得られたエシェリヒア・コリyhfK遺伝子増幅用プラスミドpSTV-EcoyhfKをエレクトロポレーションにより上記のSC17sucA/RSFCPG株に導入し、クロラムフェニコール耐性を指標として形質転換体を得た。得られた株をエシェリヒア・コリyhfK遺伝子増幅株 SC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoyhfKと名付けた。
【００９０】
次にこの菌株についてＬ−グルタミン酸生産培養を行った。次にSC17sucA/RSFCPG+pSTV-yhfKとSC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoyhfKと対象のSC17sucA/RSFCPG+pSTV29を用いて培養を行い、Ｌ−グルタミン酸の生産能について検討した。培養は、菌体を形成させる種培養と、Ｌ−グルタミン酸を生成する本培養の2段階に分けて行った。
【００９１】
種培養は以下の培地組成で行った
〔種培養培地組成〕
シュークロース              50g/L
MgSO4・7H20                   0.4g/L
GD113                       0.1mL/L
(NH4)2SO4                      4g/L
KH2PO4                       2.0g/L
酵母エキス                  4.0g/L
FeSO4・7H20                   0.01g/L
MnSO4・5H20                   0.01g/L
Ｌ−リジン塩酸塩            0.4g/L
DL-メチオニン               0.4g/L
ε−ジアミノピメリン酸       0.4g/L
テトラサイクリン塩酸塩      12.5mg/L
クロラムフェニコール        25mg/L
【００９２】
SC17sucA/RSFCPG+pSTV29株とSC17sucA/RSFCPG+pSTV-yhfK株と SC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoyhfK株とをL培地（バクトトリプトン10 g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 g、寒天15 gを純水1Lに含む培地、pH7.0）に、最小培地成分（ グルコース0.5g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）に25mg/Lのクロラムフェニコール, 12.5mg/Lテトラサイクリンを加えた培地で前培養し、プレート1枚をジャーファメンターに植菌し、34℃、pH6.0にて、通気1/1vvm 34℃で酸素濃度が5％以上になるように約14時間攪拌制御を行った。培養中のpHは、6.0となるようにアンモニアガスを添加することにより調整を行った。培地中の糖の枯渇を指標に種培養を終了した。本培養培地組成は以下に示す。
【００９３】
〔本培養培地組成〕（20％種培養液を植菌した後の濃度）
シュークロース                50g/L
(NH4) 2S04                      5.0g/L
MgSO4・7H20                   0.4g/L
GD113                        0.1mL/L
酵母エキス                  6.0g/L
KH2PO4                       6.0g/L
NaCl                         1.5g/L
FeSO4・7H20                   0.02g/L
MnSO4・5H20                   0.02g/L
Ｌ−リジン塩酸塩              0.8g/L
DL-メチオニン                 0.6g/L
DL-α,ε-ジアミノピメリン酸   0.6g/L
テトラサイクリン塩酸塩      12.5mg/L
クロラムフェニコール        25mg/L
塩化カルシウム二水塩         0.75g/L
パントテン酸カルシウム       12mg/L（パントテン酸添加培養時のみ添加）
【００９４】
得られた菌体60mlを以下の組成の培地を240ml張り込んだ１L容ミニジャーに注入し、pH4.7で培養を行った。本培養培地の50g/Lのシュークロースを消費した時点で、培養中、シュークロース溶液700g/L（W/V）（オートクレーブで殺菌した）をポンプ輸送することによって、小型発酵槽内の糖濃度を5〜20g/Lに調節した。
【００９５】
結果を表２に示す。本培養においては、培養時間を一定にて終了した。エシェリヒア属YhfK遺伝子増幅株であるSC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoyhfK株、パントエア・アナナティスのyhfK遺伝子増幅株であるSC17sucA/RSFCPG+pSTV-yhfK株ともに、比較対照株のSC17sucA/RSFCPG+pSTV29と比べ、大幅にＬ−グルタミン酸の生産性が上昇し、糖消費速度も高く、生産性向上効果とともに、yhfK遺伝子増幅はＬ−グルタミン酸生産培養における生育改善効果があることが明らかになった。
【００９６】
【表２】
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【実施例５】
【００９７】
＜YhfKのＬ−グルタミン酸排出能の確認＞
YhfK遺伝子増幅株の菌体内のＬ−グルタミン酸の濃度を測定した。菌体内のＬ−グルタミン酸の濃度はA.Ishizaki et al, Biotech.Teqniq.(1995) Vol9, No.6,p409-の方法を参考に測定した。500mLのシリコンオイルを張り込んだ1.5mL Tubeに1mL培養液を加え、すぐに遠心機にて15000回転 3分遠心し、チューブの底を切り取り、菌体を回収する。この菌体を200μLの5規定の過塩素酸の入った2mL チューブに入れ、測定まで-80℃にて保存した。この過塩素酸溶液を室温で溶かし、菌体を懸だくし、200mLの2.5モル の炭酸カリウムを添加することにより中和し、遠心にて沈殿を除去後、上澄みを菌体内抽出物としてＬ−グルタミン酸濃度を測定した。
【００９８】
結果を図４に示す。横軸に細胞外のＬ−グルタミン酸濃度、縦軸に細胞内のＬ−グルタミン酸濃度を示す。対象であるSC17sucA/RSFCPG+pSTV29株が、細胞内でのＬ−グルタミン酸濃度が、細胞外でのＬ−グルタミン酸濃度と比べて高いのに対し、SC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoyhfK、SC17sucA/RSFCPG+pSTV-yhfKは、細胞内でのＬ−グルタミン酸濃度が、細胞外のＬ−グルタミン酸濃度より低いことが明らかになった。この結果、yhfK遺伝子増幅株である、SC17sucA/RSFCPG pSTV-EcoyhfK、SC17sucA/RSFCPG pSTV-yhfKは、細胞内のＬ−グルタミン酸をより細胞外に排出しやすくなったことを示している。従ってyhfKは、細胞内のＬ−グルタミン酸を細胞外に排出するＬ−グルタミン酸排出タンパク質をコードしている遺伝子であることが明らかになった。
【実施例６】
【００９９】
＜エシェリヒア・コリでのyhfK遺伝子増幅によるＬ−グルタミン酸生産能の確認＞
次にパントエア・アナナティス由来のyhfK遺伝子をエシェリヒア・コリに導入して増幅効果を検討した。
【０１００】
上述のパントエア・アナナティス由来のyhfK遺伝子増幅用ベクターpSTV-yhfKと、対照用プラスミドpSTV28をエレクトロポレーションによりエシェリヒア・コリの野生株であるW3110株に導入し、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を得た。yhfK増幅株をW3110/pSTV-yhfK、対照用のpSTV29導入株をW3110/pSTV29と名付けた。
【０１０１】
次にW3110/pSTV-yhfKと対照のW3110/pSTV29を用いて培養を行い、Ｌ−グルタミン酸の生産能について検討した。W3110/pSTV-yhfKと対照のW3110/pSTV29とをL培地（バクトトリプトン10 g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 g、寒天15 gを純水1Lに含む培地、pH7.0）に、クロラムフェニコールを加えた培地で前培養し、Nunc社製1mL容エーゼ1かきを以下の組成の培地で5mL張り込みの試験管に植菌しpH7.0で34℃にて16時間振とう培養した。
【０１０２】
〔培養培地組成〕
グルコース               40g/L
MgSO4・7H20                1.0g/L
(NH4)2SO4                  20g/L
KH2PO4                     1.0g/L
酵母エキス               1.0g/L
FeSO4・7H20                0.01g/L
MnSO4・5H20                0.01g/L
クロラムフェニコール    25mg/L
炭酸カルシウム            30g/L
（pH7.0に調整）
【０１０３】
【表３】
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【０１０４】
パントエア・アナナティスのyhfK遺伝子増幅株であるエシェリヒア・コリ  W3110 /pSTV-yhfK216は、対照のベクター導入株W3110/pSTV29株と比べて、大幅にＬ−グルタミン酸の蓄積が上昇した。
【実施例７】
【０１０５】
＜コリネ型細菌でのyhfK遺伝子増幅によるＬ−グルタミン酸生産能の確認＞
コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産株としてコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869株を用いることが出来る。またyhfK増幅株の親株としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させた菌株が好適である。ATCC13869株のyhfK増幅株は例えば以下のような方法で構築することが出来る。
yhfK遺伝子は、エシェリヒア・コリ、パントエア・アナナティス等の腸内細菌の染色体を鋳型にして、yhfKと相補的な合成オリゴヌクレオチド、例えば、配列番号5,6あるいは7,8のプライマーを用いてPCRにて増幅出来る。得られたPCR産物は、pCG1由来のエシェリヒア・コリネ型細菌のシャトルベクターpVK７(米国特許出願公開明細書2003-0175912)にクローニングし、yhfK増幅用プラスミドpVK9yhfKと命名する。  pVK７yhfKと比較対照用プラスミドpVK7を形質転換し、カナマイシン耐性株を得る。このようにして、yhfK増幅株ATCC13869/pVK9yhfK,比較対照用プラスミド導入株ATCC13869/pVK9を取得出来る。
【０１０６】
ATCC13869/pVK7yhfKとATCC13869/pVK7株をCMDX固体培地（5 g/L  グルコース, 10 g/L ペプトン, 10 g/L酵母エキス, 1 g/L of リン酸2カリウム, 0.4 g/L , 10 mg/L FeSO4・7H2O, 10 mg/L MnSO4・4 to 5H2O, 3 g/L Urea, 2 g/L 大豆タンパク質加水分解物, 20 g/L 寒天, pH 7.5）で18〜24時間培養する。
生育した菌体を20mlのフラスコ培地（グルコース30g/l,  硫酸アンモニウム  15g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1
200μg/l, Biotin 300μg/l, 大豆加水分解物（T-N）0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整：オートクレーブ115℃10分）に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で20-40時間振とう培養を行う。培養終了後、残糖とＬ−グルタミン酸の濃度をバイオテックアナライザーで測定する。このような方法でＬ−グルタミン酸生産能の向上したコリネ型細菌のyhfK増幅株を取得することが出来る。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明の微生物を用いることにより、Ｌ−グルタミン酸の生産効率を向上させることが出来る。Ｌ−グルタミン酸は調味料原料等として有用なアミノ酸である。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】パントエア・アナナティスの対照株（A）、及びyhfK遺伝子を含むプラスミド（Lib10）増幅株（B）の生育曲線を示す図。
【図２】パントエア・アナナティスのyhfK遺伝子増幅用ベクター（A）、エシェリヒア・コリのyhfK遺伝子増幅用ベクター（B）の構築手順を示す図。
【図３】パントエア・アナナティスの対照株、プラスミド（Lib10）増幅株及びyhfK遺伝子増幅株の生育曲線を示す図。
【図４】パントエア・アナナティス及びエシェリヒア・コリ由来のyhfK遺伝子増幅株の細胞内外のＬ−グルタミン酸濃度の比較を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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