(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の体液中に存在する癌関連マーカータンパク質を検出する体外試験法であって、
(ａ)該哺乳動物の体液試料を該マーカータンパク質の少なくとも１個のエピトープに対する抗体と接触させること、および
(ｂ)該抗体と該試料中の何れかのマーカータンパク質との間で形成された何れかの複合体の存在を検出すること、
の各段階を包含し、該抗体が、該試料が得られた哺乳動物と同一種から誘導された、該癌関連マーカータンパク質に対する哺乳動物自己抗体であって、該癌関連マーカータンパク質が野生型タンパク質の修飾形態である、方法。
【請求項２】
該試料が、前新生物または癌に対して実質的に無症候性である哺乳動物から得られている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該試料が、癌に対して症候性である哺乳動物から得られている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該試料が、癌の治療を受けた哺乳動物から得られている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該哺乳動物がヒトであり、かつ該自己抗体がヒト自己抗体である、請求項１ないし４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
該体液が血漿、血清、全血、尿、糞、リンパ液、脳脊髄液または吸引乳である、請求項１ないし５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
該癌関連マーカータンパク質が、リンパ腫、白血病、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮頚部癌、卵巣癌、子宮内膜癌または皮膚癌関連である、請求項１ないし６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
該癌関連マーカータンパク質が乳癌関連マーカータンパク質である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該癌関連マーカータンパク質が癌関連形態のＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質である請求項１ないし８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
該癌関連マーカータンパク質が、初期乳癌に関連する癌関連形態のＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質である請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
該癌関連マーカータンパク質が、進行乳癌に関連する癌関連形態のＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質である請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
該自己抗体が初期乳癌の患者から単離された単球から得られる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
該自己抗体が進行乳癌の患者から単離された単球から得られる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
該自己抗体が不死化細胞または細胞群によって産生されている、請求項１ないし１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
該自己抗体がポリクローナル抗体である、請求項１ないし１４の何れかに記載の抗体。
【請求項１６】
該自己抗体が固体表面に固定されている、請求項１ないし１５の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
該自己抗体と、該試料中に存在する何れかの癌関連マーカータンパク質との間で形成された何れかの複合体が、該マーカータンパク質の少なくとも１個のエピトープに特異的な２次抗体もしくは自己抗体を用いて検出され、該２次自己抗体が検出可能な標識を付されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該試料に加えて、該自己抗体によって認識される少なくとも１個のエピトープを有する、標識された癌関連マーカータンパク質が加えられている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
処置後に癌の再発をスクリーンし、全身的処置を監視しまたは処置を選択するための、請求項１ないし１８の何れかに記載された方法の使用。
【請求項２０】
哺乳動物の野生型タンパク質の修飾形態である癌関連マーカータンパク質の少なくとも１個のエピトープに特異性を有する哺乳動物自己抗体を含む診断用試薬。
【請求項２１】
体液試料中の哺乳動物癌関連マーカータンパク質の存在を検出するために使用する、請求項２０に記載の診断用試薬。
【請求項２２】
該自己抗体がヒト自己抗体であり、かつ該マーカータンパク質がヒト癌関連マーカータンパク質である、請求項２０または２１に記載の試薬。
【請求項２３】
該自己抗体が、リンパ腫、白血病、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮頚部癌、卵巣癌、子宮内膜癌または皮膚癌に関連する癌関連マーカータンパク質の少なくとも１個のエピトープに特異性を有する、請求項２１または２２の何れかに記載の試薬。
【請求項２４】
該自己抗体が、乳癌関連マーカータンパク質の少なくとも１個のエピトープに特異性を有する、請求項２３に記載の試薬。
【請求項２５】
該マーカータンパク質が、癌関連形態のＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質である、請求項２０ないし２４の何れかに記載の試薬。
【請求項２６】
該マーカータンパク質が、初期乳癌に関連する癌関連形態のＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質である、請求項２４に記載の試薬。
【請求項２７】
該マーカータンパク質が、進行乳癌に関連する癌関連形態のＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質である、請求項２４に記載の試薬。
【請求項２８】
該自己抗体が、初期乳癌患者から単離された単球から得られる、請求項２６に記載の試薬。
【請求項２９】
該自己抗体が、進行乳癌患者から単離された単球から得られる、請求項２７に記載の試薬。
【請求項３０】
哺乳動物の野生型タンパク質の修飾形態である癌関連マーカータンパク質の少なくとも１個のエピトープに対する自己抗体を産生し得る、固定化細胞群。
【請求項３１】
ヒト癌関連マーカータンパク質の少なくとも１個のエピトープに対する自己抗体を産生し得る、請求項３０に記載の固定化細胞群。
【請求項３２】
該自己抗体が、リンパ腫、白血病、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮頚部癌、卵巣癌、子宮内膜癌または皮膚癌に関連する癌関連マーカータンパク質の少なくとも１個のエピトープに対するものである、請求項３１に記載の固定化細胞群。
【請求項３３】
該自己抗体が、乳癌関連マーカータンパク質のエピトープに対するものである、請求項３２に記載の固定化細胞群。
【請求項３４】
該自己抗体が、癌関連形態のＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質に対するものである、請求項３１から３３の何れかに記載の固定化細胞群。
【請求項３５】
該自己抗体が、初期乳癌に関連する癌関連形態のＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質に対するものである、請求項３３に記載の固定化細胞群。
【請求項３６】
該自己抗体が、進行乳癌に関連する癌関連形態のＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質に対するものである、請求項３３に記載の固定化細胞群。
【請求項３７】
癌または他の新生物を有する患者または患者群から単離されたＢリンパ球から得られる、請求項３０から３６の何れかに記載の固定化細胞群。
【請求項３８】
該細胞群が、初期乳癌の患者または患者群から単離されたＢリンパ球から得られる、請求項３５に記載の固定化細胞群。
【請求項３９】
該細胞群が、進行乳癌の患者または患者群から単離されたＢリンパ球から得られる、請求項３６に記載の固定化細胞群。
【請求項４０】
(ａ)自己抗体としての同じ種由来の癌関連マーカータンパク質に対する哺乳動物自己抗体；および
(ｂ)該自己抗体と該癌関連マーカータンパク質の間の複合体の形成を検出する手段：
を含む、哺乳動物の体液に存在する野生型タンパク質の修飾形態である癌関連マーカータンパク質の検出用キット。
【請求項４１】
該自己抗体がヒト自己抗体である、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
該マーカータンパク質がリンパ腫、白血病、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮頚部癌、卵巣癌、子宮内膜癌または皮膚癌に関連する癌関連タンパク質である、請求項４０または４１に記載のキット。
【請求項４３】
該マーカータンパク質が乳癌関連マーカータンパク質である、請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
該マーカータンパク質が癌関連形態のＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質である、請求項４０から４３の何れかに記載のキット。
【請求項４５】
該マーカータンパク質が初期乳癌に関連する癌関連形態のＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質である、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
該マーカータンパク質が進行乳癌に関連する癌関連形態のＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質である、請求項４４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
(技術分野)
本発明は、哺乳動物の体液中で癌マーカータンパク質の存在を検出するための高感度かつ高特異的方法、該方法において使用する自己抗体類、これらの自己抗体類を得るための不死化細胞、および該方法を実施するためのキットに関する。これらの方法は、無症候性患者における発癌性または発癌前(pre-neoplastic)変化の早期検出、癌進展状況のモニター、以前に抗―癌処置を受けたことのある患者の病状再発スクリーニング、患者の全身的処置の効力モニター、および個々の患者に最適の処置決定、に有用である。
【０００２】
(背景技術)
癌細胞および前新生物細胞は、癌関連マーカータンパク質を産生する特徴がある。これらは、しばしば野生型タンパク質の変形した形態を構成するが、それらは遺伝子変異または翻訳後のプロセシングの変化の結果として癌細胞により産生されるものである。あるいは、癌マーカーは、通常、遺伝子増幅または異常転写規制の結果として、腫瘍細胞中で過剰発現したタンパク質でもあり得る。ある場合には、これら２種の現象は同時に生起し、病状進展中を通じて修飾タンパク質を集積し続ける。例えば、Ｒａｓ、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ＭＵＣ−１、ｃ−ｅｒｂβ２などの修飾形態が、各種の癌に関連するものとして見出されている。
【０００３】
癌関連タンパク質は、前癌細胞または癌細胞を保有する個体の組織および体液中の何れにおいても見出されている。それらのレベルは発癌過程の早期段階においては極めて低いが、病状が進展する間に増加する。これらのタンパク質の検出は、日常の検査において癌の診断に都合良く用いられているが、残念なことに、これらのアッセイには種々の制約がある。殊に、標準的な検査用に入手できる抗体商品は、通例、処置が最も効果的な病状のごく早期の段階、例えば無症候性患者で見られるような低レベルの癌関連タンパク質の検出には感度が不充分である。加えて、大部分の抗体商品は、癌関連マーカーの修飾形態には特異的でなく、これらのタンパク質の野生型形態と交叉反応する。そのため、これらの抗体商品は、通例、癌が進行した段階で起こる、癌マーカータンパク質の血清レベル中での実質的増加の検出においてのみ有用であるに過ぎなかった。
【０００４】
例えば、商品アッセイＣＡ１５−３は、ＭＵＣ１の修飾および非修飾形態の両方を検出し、ＭＵＣ１の血清レベルの上昇がその特徴である、転移乳癌の診断には有用である。しかしながら、このアッセイは、新生物または初期(primary)乳癌のスクリーニングには、これらの段階においてはＭＵＣ１の血清レベルが健常者におけるそれと有意に異ならないので、使用できない(Robertson et al. (1990), Eur. J. Cancer 26: 1127-1132)。他のマーカー、例えば、癌胎児抗原(ＣＥＡ)およびマーカーＣＡ１９.９は、転移乳癌および結腸直腸癌を有する患者の血清中で上昇するが、初期癌の患者ではそうならないと報告されている(Robertson et al. (1991), Cancer Immunol.Immunother. 133: 403-410; Thomas et al. (1991) Br. J. Cancer 63: 975-976)。これらの癌マーカーの場合、また、入手可能なアッセイ商品は、タンパク質の修飾形態と野生型形態とを区別できないため、使用上の制約がある。さらに、入手可能な抗体商品は、正常形態の癌関連タンパク質と交叉反応することにより、偽陽性結果を導くこともある。従って、この分野では、これらのアッセイに使用し、前癌性および早期の発癌性修飾を検出するための、より鋭敏でかつ特異的な抗体が必要とされている。
【０００５】
(発明の開示)
本明細書中で使用するとき、「癌関連マーカータンパク質」、「癌関連タンパク質」、「マーカータンパク質」または「癌マーカー」の各用語は、すべて、癌関連の野生型タンパク質の修飾形態を意味する。
【０００６】
癌マーカーは、しばしば、個体の免疫系により異種分子と認識され、自己免疫応答を誘発させるというように、対応する野生型タンパク質と相違する。この免疫応答は、体液性であり、癌マーカータンパク質に対する自己抗体を産生させ得る。自己抗体は、実際は当該個体由来の抗原であっても当該個体の免疫系が異種のものと認識する抗原に対して自然に生じる抗体である。例えば、ｐ５３、ＭＵＣ−１、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２およびＲａｓタンパク質などの修飾形態は、自己抗体の産生を誘発し得る。本明細書中で使用するとき、「自己抗体」の用語は、その抗体が、個体の循環系内に天然に生じる自己起源抗原に対する抗体であるか、または、天然に生じる抗体の特性を示しそれ故に当該自己起源抗原を認識するが、例えば不死化細胞により体外で産生させた抗体、であることを意味する。
【０００７】
下記の実施例に記載するように、驚くべきことに本発明者は、癌患者がつくる自己抗体が、同じ患者または他の癌患者に由来する癌関連マーカーを特異的に認識し、これらのタンパク質の野生型と非常に低い交叉反応性を示すことを見出した。さらに、本発明者は、上記自己抗体は、通常の試験で現在用いられている抗体よりも大変高い感受性を有し、したがって少量の癌関連マーカータンパク質を検出することができることを見出した。癌患者がつくる自己抗体を用いると、従来と異なる信頼性の高い感度のよい試験法を設計して、個体における前新生物的変化または発癌性変化の検出を、その非常に初期の段階からなし得る。このアッセイはまた、ヒト以外の哺乳動物における癌または前段階の腫瘍を検出にも適用できる。それには、試験しようとする動物と同種の哺乳動物がつくる自己抗体、またはそれと同じ特性を有する自己抗体を使用する。
【０００８】
本発明は、前新生物または癌を検出するための感度のよい特異的アッセイ系を提供する。これによって、癌関連マーカータンパク質の検出が癌の初期段階から可能となる。
【０００９】
従って、第１態様において、本発明は、哺乳動物の体液中に存在する癌関連マーカータンパク質を検出する体外試験法を提供する。この方法は下記の段階を包含する。
【００１０】
(ａ)該哺乳動物の体液試料を該マーカータンパク質の少なくとも１個のエピトープに対する抗体と接触させること、および
【００１１】
(ｂ)該抗体と該試料中の何れかのマーカータンパク質との間で形成された何れかの複合体の存在を検出すること。
【００１２】
なお、該抗体は、該試料が得られた哺乳動物と同一種から誘導された該癌関連マーカータンパク質に対する哺乳動物自己抗体である。
【００１３】
該複合体の存在は、該哺乳動物中の癌関連マーカータンパク質の存在についての指標である。
【００１４】
本明細書の用語「誘導された」は、該種から単離された自己抗体(単数および複数)、または該種から単離された自己抗体(単数および複数)と同じ特性を有する自己抗体(単数および複数)を意味する。
【００１５】
本発明の方法は、特定の癌関連マーカータンパク質に対する単一の自己抗体を用い得る。あるいは、多数の癌関連マーカータンパク質を認識する自己抗体のパネルを、特定の個体に存在する癌マーカーのプロファイルを得るために使用できる。この方法は、信頼性の高い診断法であり、各個体についての最も適切な処置の選択において有用な情報を提供する。
【００１６】
本発明のアッセイ法は、検出しようとする癌の性質に応じて、患者の体液試料について行われる。体液としては、血漿、血清、全血、尿、糞、リンパ液、脳脊髄液、吸引乳などがある。このアッセイは、身体を傷つけないので、前新生物的または発癌性の変化を選別するために必要に応じて何回も繰り返すことができる。さらに、疾患の進展の追跡、疾患の再発の検査、処置効果の確認、各患者にとっての最も適切な処置の選択のために繰り返して行うことができる。
【００１７】
本発明方法は、免疫化学の分野の当業者によく知られた免疫学的技術を用いて行い得る。例えば、ＥＬＩＳＡや放射免疫検定法などの方法を用い得る。一般的に、適当な自己抗体を固体表面に固定し、試験する試料を自己抗体に接触するようにする。自己抗体により認識される癌マーカータンパク質が試料中に存在すると、自己抗体−マーカー複合体が形成する。次いで複合体を、例えば、マーカータンパク質のエピトープを特異的に認識する標識２次抗体に配向させるか、それを用いて定量測定を行う。２次抗体は、例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)やアルカリホスファターゼ(ＡＰ)などの生化学的マーカーで標識できる。そして、複合体の検出は、比色産物、化学ルミネッセンス産物あるいは蛍光産物をつくる酵素の基質を加えて完了できる。あるいは、複合体の存在は、検出可能標識、例えば、適当な酵素で標識されたマーカータンパク質を加えて測定できる。この場合、測定された酵素活性の量は、形成した複合体の量に逆比例し、試料中の抗原の存在を測定するために参照として負のコントロールを必要とする。複合体を検出する別の方法では、放射性同位元素で標識された抗体または抗原を使用し、放射活性を測定する。
【００１８】
本発明の方法を、サンプル中における癌マーカータンパク質の存在または非存在を測定する定性形式、またはさらに加えて、サンプル中に存在する癌マーカータンパク質の量の測定値を得ることができる定量形式で実施することができる。サンプル中に存在するマーカータンパク質の量を、上記の何れの技術を利用して測定してもよい。この場合は、アッセイを行なう前に、このアッセイで使用されるものと同じ検出反応を使用して、既知濃度の癌マーカータンパク質を含む一連の標準サンプルから、得られたシグナルの測定による標準曲線を描く必要がある。サンプル中に存在するスクリーンされる癌マーカーの量を、こうして、標準曲線に補間する。
【００１９】
サンプル中、たくさんの癌マーカータンパク質の存在を検証することが必要である場合は、本発明のアッセイを、マルチウェルアッセイプレート中で、利用される異なる自己抗体それぞれを異なるウェル中に入れて行なってもよい。
【００２０】
本発明の方法を、様々な臨床的状況、例えば、癌の進展に対する個々の疾病素質の評価、無症候性患者における前新生物のまたは発癌性修飾の検出、初期または２次癌の診断、患者における疾患の進行のモニタリング、以前に癌細胞を保有すると診断され、そしてこれらの細胞の数を減少させる治療を経験している患者における発癌性修飾の再発のスクリーニング、または癌を罹患する患者に対するより適切な抗癌処置の選択など、で使用することができる。本発明の方法は、上記記載の、同じ臨床状況における獣医学での使用にも適切である。
【００２１】
本発明のアッセイ方法を使用して、多様な癌、例えばリンパ腫、白血病、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮頚部癌、卵巣癌、子宮内膜癌、および皮膚癌など、に関連する癌マーカータンパク質を検出してもよい。
本発明の方法は、特に、初期乳癌(ＰＢＣ)および進行乳癌(ＡＢＣ)の検出およびモニターに適している。
【００２２】
本発明の第２の態様では、自己抗体および、アッセイで使用される該自己抗体を含む薬剤を提供し、これは哺乳動物の癌関連マーカータンパク質の少なくとも１つのエピトープを本質的に認識する。このような自己抗体を、該哺乳動物(好ましくはヒト)の血液または末梢血単球から単離してもよい。あるいは、この自己抗体を不死化されたＢリンパ球から調製し、そして哺乳動物自身に起因する抗原を検出することができる。本発明の態様による自己抗体を含む薬剤は、特に、体液中の、哺乳動物の癌関連マーカータンパク質の検出での使用に適切である。アッセイの使用に好ましい自己抗体として、糖タンパク質ＭＵＣ１(Batra, SK. et al. (1992) Int J. Pancreatology 12: 271-283)、シグナル伝達／細胞周期調節タンパク質ｃ−ｍｙｃ(Blackwood, E. M. et al. (1994) Molecular Biology of the Cell 5: 597-609)、ｐ５３(Matlashewski, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 3257-3262)、ｃ−ｅｒｂβ２(Dsouza, B. et al. (1993) Oncogene 8: 1797-1806)およびＲａｓ(Gnudi, L. et al. (1997) Mol. Endocrinol. 11: 67-76)の癌関連形態に対するものが含まれる。しかしながら、その他の癌関連マーカータンパク質に対する自己抗体をアッセイで使用してもよい。乳癌の検出に特に好ましいものは、初期乳癌に関連する、修飾されたＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２、またはＲａｓタンパク質に対する自己抗体、および進行乳癌に関連する、修飾されたＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃｅｒｂβ２、またはＲａｓタンパク質に対する自己抗体である。これらの自己抗体は、好ましくは癌マーカータンパク質が関連するものと同型の癌と診断された患者から得たものである。
【００２３】
本発明は、上記の自己抗体を調製することができる不死化した細胞群も提供する。
本発明の細胞群を、当業者に知られている何れの方法で調製してもよい。以下の実施例１に詳述するように、癌と診断された患者のＢ細胞を、例えば、エプスタイン・バーウイルスを用いて不死化してもよい。ＥＬＩＳＡまたは何れの同様の技術を実施して、固体担体上で固定化された、癌に冒された患者から得られるマーカータンパク質を利用して、自己抗体の産生をスクリーンしてもよい。
【００２４】
本発明は、さらに、哺乳動物の生物学的体液中の１またはそれ以上の癌関連マーカータンパク質の検出用キットを提供する。このようなキットは、少なくとも、癌関連マーカータンパク質の１またはそれ以上のエピトープに対する哺乳動物の自己抗体、および自己抗体と癌関連マーカータンパク質との複合体形成の検出手段を含む。好ましくは、自己抗体は固体表面で固定化される。
【００２５】
本発明は、後記の実施例および添付図面の記載によってさらに理解される：
図１は、乳癌を有すると診断された６人の患者(１ないし４、初期乳癌を有する、７および１１、進行乳癌を有する)に由来するＢ細胞によって産生された自己抗体の応答性を試験するためのＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。自己抗体の各群について、Ｂ細胞を取得した同じ患者から、他の患者からまたは通常の被験者から精製されたＭＵＣ１タンパク質を、固定化された抗原として使用した。平行検定において、マウスモノクローナルＢ５５抗ＭＵＣ１抗体の応答性が、比較コントロールとして含まれる。ＰＢＳまたは４人の健康な被験者(Ｎ１０、Ｎ１２、Ｎ１３およびＮ１４)に由来するＢリンパ球によって産生された抗体を、ネガティブコントロールとして使用する。０.２５ＭのグリシンｐＨ２.５を使用して、ＭＵＣ１をイムノアフィニティーカラムから抽出した。
【００２６】
図２は、初期乳癌を有すると診断された患者に由来するＢ細胞から取得した自己抗体の応答性を、様々な起源のＭＵＣ１タンパク質で評価するＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。Ｂ５５の応答性は、比較コントロールとして含まれる。ＰＢＳをネガティブコントロールとして使用する。
【００２７】
図３は、初期乳癌を有すると診断された患者に由来するＢ細胞によって産生された自己抗体の、(ａ)進行乳癌を有する患者の血清からまたは(ｂ)正常の個体の尿から単離されたＭＵＣ１タンパク質に対する結合を測定する、表面プラスモン共鳴実験の結果を示す。
【００２８】
図４は、進行乳癌を有する患者の血清からの、イムノアフィニティー精製ＭＵＣ１抗体に対して使用されたペプチドの配列を示す。
【００２９】
図５は、(２)初期乳癌または(３)進行乳癌を有する患者からの固定化された自己抗体を使用して、進行乳癌を有すると診断された患者の血清からまたは健康な個体の尿から精製されたＭＵＣ１タンパク質を検出するＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。抗ＭＵＣ１のＣ５９５抗体(１)を利用する平行の結果は、比較例として含まれる。
【００３０】
図６は、初期乳癌を有する患者のＢ細胞からの固定化された自己抗体を利用して、健康な個体からまたは初期もしくは進行乳癌を有すると診断された患者からの血清試料におけるＭＵＣタンパク質を検出するＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。平行検定においてＣ５９５抗体で取得された結果は、比較例に含まれる。
【００３１】
図７は、初期乳癌を有する患者のＢ細胞からの固定化された自己抗体を使用して、疾患の進行全期にわたって、進行乳癌を有する患者からの逐次血清試料におけるＭＵＣ１タンパク質を検出するＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。平行検定においてモノクローナルＣ５９５抗体でまたは商業的ＣＡ１５−３検定で取得された結果は、比較例として含まれる。
【００３２】
図８は、乳癌患者からの血清の応答性をＡＢＣ  ＭＵＣ１および尿のＭＵＣ１で定量するいくつかの結果を示す。
【００３３】
実施例１：単核細胞の不死化
製造業者の指示に詳しく記載されている通り、リンパ球分離媒体(ＩＣＮフロー)を使用して、末梢血単核細胞を患者または健常な個体由来のヘパリン処置した血液試料４ｍｌから精製した。単離した単核細胞をＰＢＳで洗浄して、Ｂ９５−８マーモセットの形質転換した白血球のＥＢＶ産生セルライン由来のエプスタイン・バーウイルス(ＥＢＶ)の半精製した調製物１ｍｌに再び懸濁させた。次いで、５％ＣＯ２中、その細胞を３７℃で１時間インキュベートして、１７０００ｒｐｍで遠心分離した。ＥＢＶ上清を除去して、その単核細胞をＲＰＭＩ媒体で３回洗浄し、１０％ウシ胎児血清および５μｇ／ｍｌフィトヘムアグルチニン(ＰＨＡ−Ｐ)を補ったＲＰＭＩ媒体に再び懸濁させて、マルチウェル組織培養プレートに播種した。その媒体を３日毎に交換して、自己抗体源として使用した。
【００３４】
実施例２：自己抗体と様々な源由来のＭＵＣ１抗原との反応性の評価
方法：
１)ＭＵＣ１抗原の免疫親和性精製
次のプロトコルに従って、初期乳癌もしくは進行乳癌と診断された患者の血清から、または健常な被験者の尿から、ＭＵＣ１を精製した。
【００３５】
マウスのモノクローナルＢ５５抗体(Ellisら(1984)Histopathology 8:501-516により、そして国際特許出願番号ＷＯ８９／０１１５３に記載されている通り、ＮＣＲＣ  １１としても知られている)をＣＮＢｒセファロースビーズにコンジュゲートさせた。血清または尿試料をＰＢＳで１／１０に希釈して、抗体をコンジュゲートさせたセファロースビーズと共に回転させながら４℃で一晩インキュベートした。そのビーズを遠心分離して、上清を除去した。そのビーズへ非特異的に結合した分子を全て除去するために、これらをＰＢＳで５回または洗浄用緩衝液が２８０ｎｍで吸光度を示さなくなるまで洗浄した。そのビーズをＰＢＳに再び懸濁させ、１０分間回転させ、遠心分離して、上清を除去することにより、各々の洗浄を行った。洗浄したビーズを０.２５Ｍグリシン(ｐＨ２.５)に再び懸濁させ、室温で１０分間回転させて、遠心分離した。上清を除去し、ＴＲＩＳの添加によりｐＨ７に調節して、標識した「グリシン画分」を４℃で保存した。次いで、そのビーズを２５ｍＭジエチルアミン(ＤＥＡ)(ｐＨ１１)に再び懸濁させ、室温で１０分間回転させて、遠心分離した。上清を再び除去し、ＴＲＩＳの添加によりｐＨ７に調節して、標識した「２５ＤＥＡ画分」を４℃で保存した。最後に、そのビーズを１００ｍＭＤＥＡ(ｐＨ１１)に再び懸濁させ、室温で１０分間回転させて、遠心分離した。上清を除去し、ＴＲＩＳの添加によりｐＨ７に調節して、標識した「１００ＤＥＡ画分」を４℃で保存した。モノクローナル抗体Ｂ５５またはＣ５９５(Cancer Research Campaignから入手可能な、ＮＣＲＣとしても知られている)を使用して、３つの画分におけるＭＵＣ１の存在をＥＬＩＳＡにより確認した。混入している免疫グロブリンを除去するために、画分をＤＴＴ(５０ｍＭまで)と共に３０分間インキュベートし、次いで、ヨードアセトアミド(７５ｍＭまで)と共にインキュベートした後、Ｓ３００カラムでゲル濾過にかけた。画分をＥＬＩＳＡによりＭＵＣ１含量に関してアッセイした。先のバッチと同等の吸光度が得られるよう、ＭＵＣ１を含む画分を力価測定した。
【００３６】
２)ＥＬＩＳＡアッセイ
上記のようにして得た、様々なＭＵＣ１調製物をＰＢＳで適当に希釈し、９６ウェルのマイクロタイターアッセイプレートに１ウェルあたり５０μｌで入れ、一晩放置して乾燥させた。次いで、そのプレートをＰＢＳ／Tweenで１回洗浄して、残留する塩の結晶を除去し、ＰＢＳ中の２％(ｗ／ｖ)ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)の新たな溶液で６０分間ブロックして、ＰＢＳ／Tweenで３回洗浄した。初期または二次乳癌と診断された患者から得られた、不死化したリンパ球の培養液上清を１ウェルあたり５０μｌで３回に分けて入れた。比較コントロールとして、マウスのモノクローナル抗ＭＵＣ１抗体Ｂ５５も３回に分けて入れた。そのプレートを振盪しながら室温で６０分間インキュベートして、ＰＮＳ／Tweenで４回洗浄した。ＨＲＰをコンジュゲートした抗ヒトまたは抗マウスの二次抗体(Ｄａｋｏから得られる)５０μｌを製造業者により推奨される希釈で各々のウェルに加えて、振盪しながら室温で６０分間インキュベートした。次いで、そのプレートを再びＰＢＳ／Tweenで４回洗浄した。テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)５０μｌを各々のウェルに加えて、そのアッセイプレートの各々のウェルに関する６５０ｎｍでの光学密度(ＯＤ)を１０分間にわたり動態学的に読取った。
【００３７】
結果
図１は、該抗体を採取した同じ患者から、もしくは別の患者もしくは健康な対象から、精製したＭＵＣ１抗体を用いて、乳癌と診断された６人の患者(初期乳癌に対して１〜４、進行乳癌に対して７および１１)から得たリンパ球によって産生された自己抗体の反応性を評価するためのＥＬＳＩＡアッセイの結果を示す。この実験で使用した健康な対象は、臨床的におよび／もしくはマモグラフィー法の乳癌の形跡を示さない女性であった。モノクローナル抗ＭＵＣ−１  Ｂ５５抗体の反応性を、比較コントロールとして測定した。４人の健康な対象(Ｎ１０からＮ１４)から得たリンパ球によって産生された抗体を、負のコントロールとして使用した。
【００３８】
得られた結果によると、乳癌患者から得たＢリンパ球は、同一もしくは異なる患者の双方から単離されたＭＵＣ１タンパク質を認識し得る自己抗体を産生することが示される。さらに、これらの自己抗体は、高い特異性によって癌患者に存在するＭＵＣ１と結合し、健康な個人から単離されたＭＵＣ１との反応性をほぼ完全に示さない。これらの結果は再現性が高く、異なる自己抗体は、異なった供給源から精製されたＭＵＣ１タンパク質と非常に似た反応性プロファイルを示す。また、さらに、得られた該結果は、癌関連ＭＵＣ１に対する自己抗体の感受性が、モノクローナルＢ５５抗体で観察された感受性以上に強いことを示す。さらに、正常患者のリンパ球によって産生された抗体は、このプロファイルを示さなかった。
【００３９】
図２は、Ｂ５５の反応性と比較した異なる供給源からのＭＵＣ１タンパク質を有する初期乳癌患者から誘導された不死化Ｂリンパ球によって分泌された自己抗体の反応性を示す。異なる自己抗体の反応性プロファイルもまた、再現性が高い。自己抗体は、癌患者の血漿に存在するＭＵＣ１に関して高い特異性を示し、健康な個人から、もしくは乳癌細胞系ＺＲ７５−１から単離されたＭＵＣ１に対する親和性を殆ど示さない。さらに、初期乳癌もしくは進行乳癌どちらにも関連するＭＵＣ１タンパク質に対する自己抗体親和性は、Ｂ５５に関して測定した親和性以上に高い。
【００４０】
実施例３：表面プラスモン共鳴による自己抗体の親和性測定
方法
表面プラスモン共鳴は、Iasys Biosensor Plus (Affinity Sensor由来)で行なった。進行乳癌患者および正常な個人からのＭＵＣ１タンパク質を、使用説明書にしたがってアミノシラン被覆細胞に付着させ、該細胞を１％(ｗ／ｖ)ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)によってブロックした。１％ＰＶＰによってのみ被覆されたコントロール細胞も作った。初期乳癌患者のＢ細胞から得た異なる希釈率の培養上清の結合を、以下の実験条件を用いて測定した：
サンプリング間隔：              ０.３ｍｓｅｃ
撹拌速度    ：                  ７０ｒｐｍ
温度        ：                  ２４℃
結合時間    ：                  ３分
ＰＢＳによる分離：              ２分
２０ｍＭ  ＨＣｌによる再生：    ３分
ＰＢＳによる再平衡        ：    ５分
【００４１】
結果
図３は、初期乳癌患者から得たＢリンパ球により生じた自己抗体が、他の癌患者から単離されたＭＵＣ１に対し、健常者から単離したＭＵＣ１よりもより高い親和性で結合することを示す。
【００４２】
実施例４：自己抗体を使用するＥＬＩＳＡアッセイにおけるＭＵＣ１抗原の検出方法：
１)血清由来の抗−ＭＵＣ１自己抗体の精製
図４に示した配列を伴う、ＭＵＣ１ペプチドＴＡＰ２をＣＮＢｒ−セファロースビーズに結合させた。進行乳癌と診断された患者からプールした血清をＰＢＳで１／１０に希釈し、ローリングしながら一晩４℃で結合セファロースビーズでインキュベーションした(ビーズ１ｍｌに対し血清２５ｍｌの割合)。遠心分離後、上清を除きビーズを５回ＰＢＳで、または２８０ｎｍ吸収がゼロになるまで洗浄した。各洗浄は、ＰＢＳ中にビーズを再懸濁し、１０分間ローリングし、遠心分離し、そして上清を除くことにより行った。当該ビーズをＰＢＳ中の３Ｍチオシアン酸ナトリウム１ｍｌ中に再懸濁し、１０分間室温でローリングし、遠心分離した。当該上清を取り出し、４℃のＰＢＳで透析した。次いで、抗−ＭＵＣ１成分を、配列ＡＰＤＴＲＴＰＡＰＧを有しＢＳＡと複合化したＭＵＣ１ペプチドおよび進行乳癌患者から単離したＭＣＵ１の両方を固定化抗原として用いるＥＬＩＳＡにより確認した。
【００４３】
２)抗−ＭＵＣ１自己抗体のビオチン化
上記のように得られた自己抗体を、遠心分離フィルターを用い１００μｌの体積にまで濃縮し、次いで、０.１四ホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８.８で体積１ｍｌに希釈した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン２０μｇを添加し,自己抗体／ビオチン溶液をローリングしながら室温で４時間インキュベーションした。当該反応は、１Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ  １０μｌを加えることにより停止し、１０分間インキュベーションした。次いで当該自己抗体を６時間３０分間４℃でＰＢＳで透析し、非結合ビオチンを除去した。自己抗体溶液のアリコートを凍結し、使用するまで暗室で−２０℃で保存した。
【００４４】
３)ＥＬＩＳＡアッセイ
初期乳癌または進行乳癌の患者から得られたリンパ球またはモノクローナル抗−ＭＵＣ１  Ｃ５９５抗体の培養上清を９６ウェルマイクロタイターアッセイプレートにウェルあたり５０μｌでプレートし、４℃で一晩インキュベーションした。次いで、当該プレートをＰＢＳ／Tweenで４回洗浄し、ＰＢＳ中の２％(ｗ／ｖ)ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)の新しい溶液で６０分間ブロッキングし、ＰＢＳ／Tweenで２回洗浄した。種々の源からのＭＵＣ１をウェルあたり５０μｌ加えた。室温で６０分間のインキュベーション後、当該プレートを再びＰＢＳ／Tweenで４回洗浄した。適当なビオチン化二次抗体５０μｌ、上記のように調製した、Ｃ５９５または進行乳癌患者由来の血清のプールから精製した自己抗体を各ウェルに添加し、室温で６０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／Tweenで４回洗浄後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ５０μｌを各ウェルに加え、室温で６０分間インキュベーションした。当該プレートを再び４回洗浄し、ＴＭＢ５０μｌを各ウェルに加え、アッセイプレートの各ウェルについて６５０ｎｍで光学濃度(ＯＤ)を１０分間にわたり動力学的に読み取った。
【００４５】
結果
図５は、モノクローナル抗−ＭＵＣ１  Ｃ５９５抗体によるパラレルアッセイにおいて得られたものと比較する、初期乳癌または進行乳癌患者から得たＢリンパ球により生じた自己抗体を固定化抗体として使用するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。当該データは、乳癌患者由来の自己抗体が癌に関連するＭＵＣ１タンパク質の修飾形態を特異的に検出するＥＬＩＳＡアッセイに使用され得ることを示唆する。これらのアッセイは、より感受性が高く、モノクローナル抗体Ｃ５９５を使用するものより高い特異性を示す。
【００４６】
実施例５：患者の血清試料におけるＭＵＣ１タンパク質を検出するためのアッセイの使用。
ＥＬＩＳＡアッセイを、実施例４に記載のように、健康個体または、初期または進行乳癌の患者からの血清試料で、固定化抗体として、初期乳癌の患者由来のＢリンパ球から作った自己抗体を使用して行った。モノクローナル抗−ＭＵＣ１抗体Ｃ５９５を使用したパラレルアッセイを、同じ試料で行った。図６に示す結果は、自己抗体を使用したアッセイが、乳癌の患者の血中に循環しているＭＵＣ１で高感受性で検出できることを示す。加えて、モノクローナル抗体Ｃ５９５の使用とは反対に、このアッセイはＭＵＣ１の癌関連形に非常に高い特異性を有する。
【００４７】
実施例６：疾患の進行をモニターするためのアッセイの使用。
ＥＬＩＳＡアッセイを、実施例４のように、疾患の進行を通して、転移癌と診断された患者由来の連続血清試料において、固定化抗体として初期乳癌の患者由来のＢリンパ球から作った自己抗体、またはモノクローナル抗−ＭＵＣ１  Ｃ５９５を使用して行った。市販のアッセイＣＡ１５−３も同じ試料で行った。図７は、自己抗体を用いるアッセイが患者における癌の進行の追跡に使用できることを示し、アッセイで検出されたＭＵＣ１の増加したレベルが、疾患の悪化を示す。データは、自己抗体の使用が、Ｃ９５９抗体またはＣＡ１５−３アッセイのいずれかで得られるよりも疾患の発症をより良く表す結果を導くことも証明する。
【００４８】
実施例７：尿またはＡＢＣ  ＭＵＣ１への抗−ＭＵＣ１自己抗体の特異性の比較方法：
ＡＢＣ  ＭＵＣ１(進行乳癌と診断された患者の血清から単離したＭＵＣ１)および尿ＭＵＣ１の調製物は、実施例２に記載のように調製した。
【００４９】
一定量のＡＢＣおよび尿ＭＵＣ１調製物をマイクロタイタープレートウェル上に、別々に等量のＮＣＲＣ−１１結合となる濃度で乾燥させた。２％ＰＶＰでブロック後、乳癌の患者から採取し、ＰＣＳで１／１００に希釈した血漿試料をウェルに添加し、血漿中の抗−ＭＵＣ１抗体を結合させた。洗浄後、結合抗体を抗−ヒトＩｇＭ−ＨＲＰおよび抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ接合体とプローブさせた。
【００５０】
結果
図８は、乳癌患者由来の血清のＡＢＣと尿ＭＵＣ１との多数の反応性の測定の結果を示す。大多数の患者由来の血漿は、尿ＭＵＣ１と比較して、ＡＢＣ  ＭＵＣ１に大きな特異性を明らかに示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  乳癌を有すると診断された６人の患者(１ないし４、初期乳癌を有する、７および１１、進行乳癌を有する)に由来するＢ細胞によって産生された自己抗体の応答性を試験するためのＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。自己抗体の各群について、Ｂ細胞を取得した同じ患者から、他の患者からまたは通常の被験者から精製されたＭＵＣ１タンパク質を、固定化された抗原として使用した。平行検定において、マウスモノクローナルＢ５５抗ＭＵＣ１抗体の応答性が、比較コントロールとして含まれる。ＰＢＳまたは４人の健康な被験者(Ｎ１０、Ｎ１２、Ｎ１３およびＮ１４)に由来するＢリンパ球によって産生された抗体を、ネガティブコントロールとして使用する。０.２５ＭのグリシンｐＨ２.５を使用して、ＭＵＣ１をイムノアフィニティーカラムから抽出した。
【図２】  初期乳癌を有すると診断された患者に由来するＢ細胞から取得した自己抗体の応答性を、様々な起源のＭＵＣ１タンパク質で評価するＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。Ｂ５５の応答性は、比較コントロールとして含まれる。ＰＢＳをネガティブコントロールとして使用する。
【図３】  初期乳癌を有すると診断された患者に由来するＢ細胞によって産生された自己抗体の、(ａ)進行乳癌を有する患者の血清からまたは(ｂ)正常の個体の尿から単離されたＭＵＣ１タンパク質に対する結合を測定する、表面プラスモン共鳴実験の結果を示す。
【図４】  進行乳癌を有する患者の血清からの、イムノアフィニティー精製ＭＵＣ１抗体に対して使用されたペプチドの配列を示す。
【図５】  (２)初期乳癌または(３)進行乳癌を有する患者からの固定化された自己抗体を使用して、進行乳癌を有すると診断された患者の血清からまたは健康な個体の尿から精製されたＭＵＣ１タンパク質を検出するＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。抗ＭＵＣ１のＣ５９５抗体(１)を利用する平行の結果は、比較例として含まれる。
【図６】  初期乳癌を有する患者のＢ細胞からの固定化された自己抗体を利用して、健康な個体からまたは初期もしくは進行乳癌を有すると診断された患者からの血清試料におけるＭＵＣタンパク質を検出するＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。平行検定においてＣ５９５抗体で取得された結果は、比較例に含まれる。
【図７】  初期乳癌を有する患者のＢ細胞からの固定化された自己抗体を使用して、疾患の進行全期にわたって、進行乳癌を有する患者からの逐次血清試料におけるＭＵＣ１タンパク質を検出するＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。平行検定においてモノクローナルＣ５９５抗体でまたは商業的ＣＡ１５−３検定で取得された結果は、比較例として含まれる。
【図８】  乳癌患者からの血清の応答性をＡＢＣ  ＭＵＣ１および尿のＭＵＣ１で定量するいくつかの結果を示す。
【図１】
0004665069.tif 000002
【図２】
0004665069.tif 000003
【図３】
0004665069.tif 000004
【図４】
0004665069.tif 000005
【図５】
0004665069.tif 000006
【図６】
0004665069.tif 000007
【図７】
0004665069.tif 000008
【図８】
0004665069.tif 000009