(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分枝酵素活性及び少なくとも６０℃の至適温度を有する単離したポリペプチドであって、
ａ）配列番号２の成熟アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチド；
ｂ）（ｉ）前記成熟酵素に相当する配列番号１の核酸配列のヌクレオチド、（ii）配列番号１のｃＤＮＡ配列、又は（iii)（ｉ）若しくは（ii）の相補鎖と、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるポリペプチド、
から成る群から選択される、ポリペプチド。
【請求項２】
Ｎ末端又はＣ末端に別のポリペプチドが融合されている、請求項１に記載のポリペプチドを含んで成る、単離したポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列と５個以下のアミノ酸が異なるアミノ酸配列、から成る、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
Ｅ．コリ（coli）ＤＨ１２Ｓ，ＤＳＭ１２６０７に含まれるプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅに含まれる核酸配列によってコードされる、成熟分枝酵素のアミノ酸配列から成る、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列から成る、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列から成る、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号２のアミノ酸配列から成る、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列又は置換Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐを有するその変異体から成る、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
Ｅ．コリ  ＤＨ１２Ｓ，ＤＳＭ１２６０７に含まれるプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅに含まれる核酸配列によってコードされる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記至適温度が６０℃〜１２０℃の範囲にある、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記至適温度が６０℃〜８０℃の範囲にある、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記至適温度が６５℃である、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
細菌起源の、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ロドサームス（Rhodo thermus ）属の種の細胞に由来する、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
Ｒ．オバメンシス（obamensis ）及びＲ．マリヌス（marinus ）の細胞に由来する、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、核酸配列を含んで成る単離した核酸。
【請求項１７】
分枝酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離した核酸であって：
ａ）配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列；
ｂ）（ｉ）配列番号１の核酸配列、（ii）配列番号１のｃＤＮＡ配列、又は（iii）（ｉ）若しくは（ii）の相補鎖と、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、
から成る群から選択される核酸。
【請求項１８】
Ｅ．コリ（coli）ＤＨ１２Ｓ，ＤＳＭ１２６０７に含まれるプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅに含まれる、分枝酵素をコードする核酸配列から成る、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
適当な発現宿主において前記ポリペプチドの生成を指示する１又は複数の調節配列と作用可能に連結している、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の核酸を含んで成る核酸構築物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸構築物を含んで成る組換え発現ベクター。
【請求項２１】
請求項１９に記載の核酸構築物を含んで成る組換え宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチドを生成する方法であって、（ａ）前記ポリペプチドの生成に適した条件下で請求項２１に記載の宿主細胞を培養し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
【請求項２３】
デンプン様材料を修飾するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の、又は請求項１９に記載の核酸配列によってコードされるポリペプチドの使用。
【請求項２４】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチド及び界面活性剤を含んで成る洗剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の分野
本発明は分枝酵素活性を有するポリペプチド及びそのポリペプチドをコードする単離した核酸配列に関する。本発明は前記核酸配列を含んで成る核酸構築物、ベクター、及び宿主細胞並びに前記ポリペプチドを生成し、そして使用するための方法にも関する。
【０００２】
関連技術の説明
以降ＢＥと表す分枝酵素（ＥＣ２．４．１．１８）はグリコシル転移を触媒して、微生物、植物及び高等生物においてグリコーゲン及びアミロペクチンのα−１，６−グリコシド結合（分枝点）を形成せしめる。グリコーゲン及びアミロペクチンは、微生物、植物及び高等生物におけるエネルギー保存に使用される、高度に分枝化した澱粉材料である。ＢＥは異なる分子間で分枝を形成するだけでなく（分子間転移）、複数の分枝化したグルカンの、同一の分子上の別の部位への転移も触媒する（分子内転移）。
【０００３】
高度に分枝化した澱粉材料は、末修飾の澱粉と比較して高い溶解性、低粘度及び劣化しにくいという様な独特の特性を持ち、これはＥＰＯ  ６９０  １７０に記載されている様に製紙業における表面のサイジング及びコーティングを含む接着性組成物、ＵＳ  ４  ４５４  １６１に記載の食品及び飲料添加物並びに抗デンプン劣化剤における使用のために、それらを興味深いものにしている。
【０００４】
複数の異なる生物に由来する分枝酵素が単離され、そして開示されてきた：例えば、ＵＳ  ４  ４５４  １６１はバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のＢＥを記載し；Ｂｏｙｅｒ  ａｎｄ  Ｐｒｅｉｓｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１６（１６），ｐｐ．３６９３−３６９９，１９７７は、エスクリッチャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のＢＥを記載し；Ｚｅｖｅｒｈｕｉｚｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（８１），ｐｐ．６０８−６１１，１９６４は、アルスロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）由来のＢＥを記載し；Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｂｕｉｌｄｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２０（１），ｐｐ１４−２１，１９７１は、ストレプトコッカス・ミチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）由来のＢＥを記載し；Ｋｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．７８（１），ｐｐ．９−１８，１９８９は、シアノバクテリウム・シネココッカス（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）種のＰＣＣ７９４２由来のＢＥを記載し；Ｒｕｍｂａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１７３（２１），ｐｐ．６７３２−６７４１，１９９１は、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ）由来のＢＥを記載し；Ｋｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３（４），ｐｐ．２２１−２３２，１９９２は、バチルス・カルドリチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のＢＥを記載している。
【０００５】
上文で言及した引用の共通の特徴は、報告された至適温度のいずれも４５℃以上ではないことである。わずかに２つの分枝酵素だけが、それより高い至適温度を有すると開示された：Ｋｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．２３０（１−２），ｐｐ．１３６−１４４，１９９１（更にはＥＰ  ０  ４１８  ９４５）：５３℃の至適温度を有するバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）１５０３−４Ｒの分枝酵素；及びＴａｋａｔａ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６０（９），ｐｐ．３０９６−３１０４，１９９４：約５０℃の至適温度を有するバチルス・ステアロサーモフィルスＴＲＢＥ１４の分枝酵素。
【０００６】
高温で増大する反応速度が得られるため、高い至適温度を有する分枝酵素を使用することは、産業上有利である。それによって、より高い能力が同量の酵素で得られ、そしてより良い生産経済が達成される。更に、高温での処理の実施は、感染の予防により有益である。
【０００７】
分枝酵素活性を有する改良ポリペプチド及びそのポリペプチドをコードする核酸を提供することが本発明の目的である。
【０００８】
本発明の要約
本発明は、分枝酵素活性、及び少なくとも６０℃の至適温度を有する単離したポリペプチドに関する。
【０００９】
本発明は、前記ポリペプチドをコードする単離した核酸配列並びにその核酸配列を含んで成る核酸構築物、ベクター、及び宿主細胞、並びに前記ポリペプチドを生成し、そして使用するための方法にも関する。
【００１０】
本発明の詳細な説明
分枝酵素活性を有するポリペプチド
「分枝酵素活性」とは、グリコーゲン又はアミロペクチンの１，６−α−グリコシド結合の形成を触媒する１，４−α−グルカン分枝活性である（ＥＣ  ２．４．１．１８）。本発明の目的のために、分枝酵素活性は、本明細書の材料と方法の項目の中の標題「分枝酵素活性」に記載されている、Ｔａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４），ｐ．３０９７に記載の方法（アッセイＡ）の改良版に従い決定され得る。
【００１１】
第一の観点において、本発明は分枝酵素活性を有し、そして少なくとも６０℃の至適温度を有する単離したポリペプチドに関し；好ましくは、その至適温度は６０℃〜１２０℃の範囲にあり；更に好ましくは、その至適温度は６０℃〜１００℃の範囲にあり；より更に好ましくは、その至適温度は６０℃〜８０℃の範囲にあり；最も好ましくは、その至適温度は６０℃〜７０℃の範囲にあり；そしてより最も好ましくは、その至適温度は６５℃である。
【００１２】
第一の態様において、本発明のポリペプチドはｐＨ６〜ｐＨ８の範囲で約７０％の相対的活性を保持し；好ましくはｐＨ６〜ｐＨ７の範囲で約８０％の相対的活性を保持し；更に好ましくは、至適ｐＨが約ｐＨ７である。
【００１３】
至適温度及びｐＨを決定するために使用する条件は、本明細書の材料を方法の項目において「分枝酵素活性」の標題のもと記載されているものである。
【００１４】
第二の態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２〜６２１（すなわち、成熟ポリペプチド）に対して、又はＥ．コリＤＳＭ１２６０７に含まれるプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅに含まれる核酸配列によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７０％、更に好ましくは少なくとも約８０％、より更に好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、より最も好ましくは少なくとも約９７％の相同性の値を有する、分枝酵素活性を有するアミノ酸配列を有する（以降、「相同ポリペプチド」と称する）。好ましい態様において、相同ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と、５つのアミノ酸、好ましくは４つのアミノ酸、更に好ましくは３つのアミノ酸、より更に好ましくは２つのアミノ酸、最も好ましくは１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する。
【００１５】
本発明の目的のために、配列のアラインメント及び相同性スコアの計算は、タンパク質及びＤＮＡ、その両方のアラインメントに有用な、完全なＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメントを用いて行われ得る。デフォルトスコアリングマトリックス  ＢＬＯＳＵＭ５０及び同一性マトリックスは、それぞれタンパク質及びＤＮＡのアラインメントに使用される。ギャップの最初の残基についてのペナルティーは、タンパク質で−１２、そしてＤＮＡで−１６であり、一方、ギャップの追加の残基についてのペナルティーは、タンパク質で−２、そしてＤＮＡで−４である。アラインメントは、ＦＡＳＴＡパッケージの第ｖ２０ｕ６版でも行われ得る（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」，ＰＮＡＳ  ８５：２４４４−２４４８、及びＷ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０）「Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＦＡＳＴＰ  ａｎｄ  ＦＡＳＴＡ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３：６３−９８）。タンパク質配列の複数のアラインメントは、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ」を用いて行われ得る（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．（１９９４）ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：（１６７３−４６８０）。ＤＮＡ配列の複数のアラインメントは、アミノ酸を、ＤＮＡ配列に由来する相当するコドンと置き換える鋳型としてタンパク質のアラインメントを用いて行われ得る。
【００１６】
好ましくは、本発明のポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異体；あるいは分枝酵素活性を有するそのフラグメントを含んで成る。更に好ましい態様において、本発明のポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る。別の好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異体；あるいは分枝酵素活性を有するそのフラグメントから成る。別の好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列から成る。
【００１７】
配列番号２のフラグメントは、このアミノ酸配列のアミノ及び／又はカルボキシル末端から欠失した１又は複数のアミノ酸を有するポリペプチドである。
【００１８】
対立変異体とは、同一の染色体の座を占める遺伝子の２又はそれ以上の択一型のいずれかを表す。対立変異は突然変異を介して自然に起こり、そして個体群において多型を生じ得る。遺伝子の突然変異はサイレント（コードされたポリペプチドにおける無変化）であることもあり、又は変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることもある。ポリペプチドの対立変異体は、対立変異体の遺伝子によってコードされるポリペプチドである。
【００１９】
第三の態様において、本発明のポリペプチドは、非常に低いストリンジェントな条件、好ましくは低いストリンジェントな条件、更に好ましくは中程度にストリンジェントな条件、更に好ましくは中程度−高度にストリンジェントな条件、より更に好ましくは高度にストリンジェントな条件、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件のもと、同一の条件下で（ｉ）配列番号１のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチドに含まれるｃＤＮＡ配列、（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の亜配列、又は（ｉｖ）（ｉ），（ｉｉ）、若しくは（ｉｉｉ）の相補鎖とハイブリダイズする核酸プローブとハイブリダイズする核酸配列によってコードされる、分枝酵素活性を有する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。配列番号１の亜配列は少なくとも１００個のヌクレオチド又は好ましくは少なくとも２００個のヌクレオチドであってもよい。更に前記亜配列は、分枝酵素活性を有するポリペプチドフラグメントをコードすることがある。前記ポリペプチドは更に、分枝酵素活性を有するポリペプチドの対立遺伝子変異体又はフラグメントであってもよい。
【００２０】
配列番号１の核酸配列又はその亜配列、及び配列番号２のアミノ酸配列又はそのフラグメントは、当業界で公知の方法に従い、異なる属又は種の菌株から分枝酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定し、そしてクローン化するための核酸プローブを設計するために使用されうる。特に、前記プローブは、標準的なサザンブロッティング方法に従い、その中で相当する遺伝子を同定し、そして単離するために、注目の属又は種のゲノム又はｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために使用され得る。前記プローブは全配列よりもかなり短いことがあるが、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、及び更に好ましくは少なくとも３５ヌクレオチドの長さであるべきである。更に長いプローブも使用することができる。ＤＮＡ及びＲＮＡプローブ、その両方を使用することができる。前記プローブは、典型的に相当する遺伝子を検出するために標識される（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチン、又はアビジンによる）。前記プローブは本発明に包含される。
【００２１】
従って、その様な他の生物から調製したゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは、上述したプローブとハイブリダイズし、そして分枝酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡのためにスクリーニングされ得る。その様な他の生物由来のゲノム又は他のＤＮＡは、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、あるいは他の分離技術によって分離され得る。前記ライブラリー由来のＤＮＡ又は分離したＤＮＡは、ニトロセルロース又は他の適当な担体材料上に移され、そして固定化され得る。配列番号１又はその亜配列と相同なクローン又はＤＮＡを同定するために、前記担体材料はサザンブロットに使用される。本発明の目的のためのハイブリダイゼーションは、前記核酸配列が、配列番号１に示した核酸配列、その相補鎖、又はそれらの亜配列に、非常に低いないし非常に高度なストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを示唆する。前記核酸プローブがこれらの条件下でハイブリダイズする分子は、Ｘ線フィルムを用いて検出される。
【００２２】
好ましい態様において、前記核酸プローブは、配列番号２のポリペプチドをコードする核酸配列、又はその亜配列である。別の好ましい態様において、前記核酸プローブは配列番号１である。別の好ましい態様において、前記核酸プローブは、エスケリッチャ・コリ  ＤＳＭ１２６０７に含まれるプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅに含まれる核酸配列であり（例１を参照のこと）、この中で、前記核酸配列は分枝酵素活性を有するポリペプチドをコードする。
【００２３】
少なくとも１００ヌクレオチドの長さの長いプローブのための、非常に低いないし非常に高度なストリンジェントな条件は、５×  ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌの剪断し、そして変性したサケ精子ＤＮＡ、並びに非常に低い及び低いストリンジェント性のための２５％ホルムアミド、中程度及び中程度−高度にストリンジェント性のための３５％ホルムアミド、又は高度及び非常に高度なストリンジェント性のための５０％ホルムアミドのいずれかにおける、標準的なサザンブロッティング法に従う４２℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして定義される。
【００２４】
少なくとも１００ヌクレオチドの長さのプローブのために、前記担体材料は、最終的に２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、好ましくは少なくとも４５℃（非常に低いストリンジェント性）、更に好ましくは少なくとも５０℃（低いストリンジェント性）、更に好ましくは少なくとも５５℃（中程度のストリンジェント性）、更に好ましくは少なくとも６０℃（中程度−高度なストリンジェント性）、より更に好ましくは６５℃（高度なストリンジェント性）、及び最も好ましくは少なくとも７０℃（非常に高度なストリンジェント性）で、各１５分間、３回洗浄される。
【００２５】
約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの長さの短いプローブのためのストリンジェントな条件は、Ｂｏｌｔｏｎ及びＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ４８：１３９０）に従う計算を用いて算出したＴｍから５℃〜１０℃低い温度で、１ｍｌ当たり０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．０９Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、６ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０，１×デンハルト溶液、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ  一塩基リン酸ナトリウム、０．１ｍＭ  ＡＴＰ、及び０．２ｍｇの酵母ＲＮＡにおいて、標準的なサザンブロッティング法に従うプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及びハイブリダイゼーション後の洗浄として定義される。
【００２６】
約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの長さの短いプローブのための前記担体材料は、１回、６×ＳＣＣ＋０．１％ＳＤＳ中で１５分間、及び２回、６×ＳＳＣを用いて算出したＴｍより５℃〜１０℃低い温度で各１５分間洗浄される。
【００２７】
第四の態様において、本発明は１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＢＥ活性を有する変異体に関する。
【００２８】
変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、１又は複数のアミノ酸残基の挿入若しくは欠失によって、及び／又は異なるアミノ酸残基による１又は複数のアミノ酸残基の置換によって、配列番号２のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドと異なることがある。好ましくは、アミノ酸の変化は前記タンパク質の折りたたみ及び／又は活性に有意に影響を与えない保存的なアミノ酸置換；典型的に１〜約３０アミノ酸のわずかな欠失；わずかなアミノ又はカルボキシル末端の伸長、例えばアミノ末端のメチオニン残基；最大約２０〜２５残基の小さいリンカーペプチド；あるいは正電価の変化又は別の機能により精製を容易にするわずかな伸長、例えばポリヒスチジントラクト、抗原性エピトープ又は結合ドメインという、軽微な性質のものである。
【００２９】
保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）及び小型アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン及びメチオニン）の群内である。一般的には比活性を変えないアミノ酸置換は当業界で既知であり、例えば、Ｈ．ＮｅｕｒａｔｈとＲ．Ｌ．Ｈｉｌｌ（１９７９、「Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）により記載されている。最も普通に発生する交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ及びＡｓｐ／Ｇｌｙならびにこれらの逆である。
【００３０】
第五の態様において、本発明のポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して免疫化学的同一性又は部分的な免疫化学的同一性を有する。免疫化学的特性は、公知のオクタロニー二重免疫拡散法による免疫学的交差反応同定試験によって決定される。具体的には、免疫反応性の、又は配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド若しくはその成熟ポリペプチドのエピトープに結合するポリクローナル抗体を含む抗血清は、Ｈａｒｂｏｅ  ａｎｄ  Ｉｎｇｉｌｄ，Ｉｎ  Ｎ．Ｈ．Ａｘｅｌｓｅｎ，Ｊ．Ｋｒｏｌｌ  ａｎｄ  Ｂ．Ｗｅｅｋｓ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９７３，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２３、又はＪｏｈｎｓｔｏｎｅ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９８２（更に具体的には２７〜３１ページ）に記載されている方法に従いウサギ（又は他のげっ歯類）を免疫化することで調製される。免疫化学的同一性を有するポリペプチドは、同一の様式、例えば沈澱の全体的な融合、同一な沈澱の形態、及び／又は同一な電気泳動の移動度で、特異的な免疫化学的技術を用いて抗血清と反応するポリペプチドである。免疫化学的同一性の更なる説明は、Ａｘｅｌｓｅｎ，Ｂｏｃｋ，ａｎｄ  Ｋｒｏｌｌ，Ｉｎ  Ｎ．Ｈ．Ａｘｅｌｓｅｎ，Ｊ．Ｋｒｏｌｌ，ａｎｄ  Ｂ．Ｗｅｅｋｓ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９７３，Ｃｈａｐｔｅｒ  １０に記載されている。部分的な免疫化学的同一性を有するポリペプチドは、部分的に同一な様式、例えば沈澱の部分的融合、部分的に同一な沈澱の形態、及び／又は部分的に同一な電気泳動の移動度で、特異的な免疫化学的技術を用いて抗血清と反応するポリペプチドである。部分的な免疫化学的同一性の更なる説明は、Ｂｏｃｋ  ａｎｄ  Ａｘｅｌｓｅｎ，Ｉｎ  Ｎ．Ｈ．Ａｘｅｌｓｅｎ，Ｊ．Ｋｒｏｌｌ，ａｎｄ  Ｂ．Ｗｅｅｋｓ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９７３，Ｃｈａｐｔｅｒ  １１に記載されている。
【００３１】
前記抗体は更に、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、例えばＥ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ，ｅｄｉｔｏｒｓ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋの方法に従い調製され、そして使用されうる。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、更に好ましくは少なくとも６０％、より更に好ましくは少なくとも８０％、より更に好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも１００％の分枝酵素活性を有する。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、任意の属の微生物から得られる。本発明の目的のために、「〜から得られる」という用語は、所定の供給源と関連して本明細書中で用いる場合、核酸配列によりコードされるポリペプチドがその供給源により、又は供給源からの核酸が挿入された細胞により生成されることを意味する。好ましい態様において、ポリペプチドは細胞外に分泌される。
【００３４】
本発明のポリペプチドは、細菌ポリペプチドである。例えば、ポリペプチドは、グラム陽性細菌ポリペプチド、例えばバチルス属ポリペプチド、例えばバチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケミホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はバチルス・サーリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ポリペプチド；あるいはストレプトミセスポリペプチド、例えばストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）又はストレプトミセス・ムリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ）ポリペプチド；あるいはグラム陰性細菌ポリペプチド、例えばＥ．コリ又はシュードモナス種ポリペプチドであり得る。
【００３５】
本発明のポリペプチドは、真菌ポリペプチド、更に好ましくは酵母ポリペプチド、例えばカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又はヤローウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ポリペプチド；あるいは更に好ましくは糸状真菌ポリペプチド、例えばアクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オーレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）又はトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ポリペプチドであり得る。
【００３６】
好ましい態様において、ポリペプチドは、サッカロミセス属・カースベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）又はサッカロミセス・オビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）ポリペプチドである。
【００３７】
別の好ましい態様において、ポリペプチドは、アスペルギルス・クレツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フェチズス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レテイキュラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・ザムブチヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・ザルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコセキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・パープロゲヌム（ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、トリコデルマ・ハージアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）ポリペプチドである。
【００３８】
別の好ましい態様において、ポリペプチドはロドサームス・オバメンシス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ）、又はロドサームス・マリヌス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）のポリペプチドである。
【００３９】
更に好ましい態様において、ポリペプチドはロドサームス・オバメンシスのポリペプチドであり、そして最も好ましくは、エスケリッチャ・コリ  ＤＳＭ１２６０７に含まれるプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅに含まれる配列（例１を参照のこと）のコード領域のポリペプチド、例えば配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００４０】
前記の種に関しては、それらが知られている種名にかかわらず、本発明は完全及び不完全状態、ならびにその他の分類学的等価物、例えば無性世代を含んで成ると理解される。適切な等価物の同一性を、当業者は容易に理解する。例えば、ロドサームス・オバメンシスの分類学的等価物は、Ｓａｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４６（４）  ｐｐ．１０９９−１１０４（１９９６）によって定義されている。
【００４１】
これらの種の系統は、多数の培養コレクション、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、Ｊａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ（ＪＣＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）及びＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）において、一般に容易に入手可能である。
【００４２】
更にこのようなポリペプチドは、前記のプローブを用いて、自然（例えば土壌、堆肥、水等）から単離された微生物を含めたその他の供給源から同定され、そして入手され得る。天然生息地から微生物を単離するための技法は、当業界で周知である。次に、別の微生物のゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを同様にスクリーニングすることにより、核酸配列が得られる。ポリペプチドをコードする核酸配列がプローブにより一旦検出されれば、当業者に既知の技法を用いて、配列を単離又はクローン化し得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９（前記）を参照のこと）。
【００４３】
本明細書中で定義する場合、「単離された」ポリペプチドとは、本質的にその他の非分枝酵素ポリペプチドを含まない、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した場合に、少なくとも約２０％純粋な、好ましくは少なくとも約４０％純粋な、更に好ましくは約６０％純粋な、より更に好ましくは約８０％純粋な、最も好ましくは約９０％純粋な、そして更には最も好ましくは約９５％純粋であるポリペプチドである。
【００４４】
本発明の核酸配列によりコードされるポリペプチドは、もう一つのポリペプチドが前記ポリペプチド又はそのフラングメントのＮ末端又はＣ末端で融合される融合ポリペプチド又は開裂可能な融合ポリペプチドも含む。融合ポリペプチドは、別のポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）を本発明の核酸配列（又はその一部）に融合することにより生成される。融合ポリペプチドを生成するための技法は当業界で既知であり、それらがフレーム内にあり、そして融合ポリペプチドの発現が同一プロモーター及びターミネーターの制御下にあるように、ポリペプチドをコードするコード配列をライゲーションすることを含む。
【００４５】
核酸配列
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離した核酸配列にも関する。好ましい態様において、核酸配列は配列番号１に記載される。別の更に好ましい態様において、核酸配列はＥ・コリ  ＤＳＭ１２６０７に含まれるプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅに含まれる配列（例１を参照のこと）である。本発明は、遺伝暗号の縮重の点で配列番号１とは異なる配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列も含んで成る。本発明は、分枝酵素活性を有する配列番号２のフラングメントをコードする配列番号１の亜配列にも関する。
【００４６】
配列番号１の亜配列は配列番号１に包含される核酸配列であるが、但し５’及び／又は３’末端から１又は複数のヌクレオチドが欠失されている。
【００４７】
本発明は、配列番号１のポリペプチドをコードしている配列中に少なくとも１つの変異を含んで成る変異体核酸配列にも関するが、この場合、変異体核酸配列は配列番号２のアミノ酸から成るポリペプチドをコードする。
【００４８】
ポリペプチドをコードする核酸配列を単離又はクローン化するために用いられる技術は当業界で既知であり、その例としては、例えばゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はそれらの組合せが挙げられる。このようなゲノムＤＮＡからの本発明の核酸配列のクローン化は、例えば例１に示す様な周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は共有の構造的特徴でクローン化したＤＮＡフラングメントを検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニングを用いることにより実行され得る（例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、「ＰＣＲ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。その他の核酸増幅法、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、結合活性化転写（ＬＡＴ）及び核酸配列を基にした増幅（ＮＡＳＢＡ）も用い得る。核酸配列は、ロドサームスの菌株、あるいは別の又は関連した生物からクローン化され、したがって、例えば核酸配列のポリペプチドをコードしている領域の対立遺伝子的又は種変異体であり得る。
【００４９】
「単離した核酸配列」という用語は、本明細書中で用いる場合は、その他の核酸配列を本質的に含みない、例えばアガロース電気泳動により決定した場合に、少なくとも約２０％純粋な、好ましくは少なくとも約４０％純粋な、更に好ましくは少なくとも約６０％純粋な、より更に好ましくは少なくとも約８０％純粋な、最も好ましくは少なくとも約９０％純粋である核酸配列を指す。例えば、単離した核酸配列は、その天然の位置からそれが再生成される異なる部位に核酸配列を配置し直すために遺伝子操作に用いられる標準的なクローン化法により得られる。クローン化法は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望の核酸フラングメントの除去及び単離、そのフラングメントのベクター分子への挿入、そして核酸配列の多数のコピー又はクローンが複製される宿主細胞中への組換えベクターの組み込みを含み得る。核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源、又はそれらの任意の組合せのものであり得る。
【００５０】
本発明は、少なくとも約６５％、好ましくは約７０％、好ましくは約８０％、更に好ましくは約９０％、より更に好ましくは約９５％、そして最も好ましくは９７％の、活性ポリペプチドをコードする配列番号１の成熟ポリペプチドのコード配列（すなわち、ヌクレオチド４〜１８６３）とある程度の相同性を有する核酸配列にも関する。本発明の目的のために、２つの核酸配列間の相同性の程度は、タンパク質及びＤＮＡ、その両方のアラインメントに有用な、完全なＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメントを用いて決定する。デフォルトスコアリングＢＬＯＳＵＭ５０及び同一性マトリックスは、それぞれタンパク質及びＤＮＡのアラインメントに使用される。ギャップの最初の残基についてのペナルティーは、タンパク質で−１２、そしてＤＮＡで−１６であり、一方、ギャップの追加の残基についてのペナルティーは、タンパク質で−２、そしてＤＮＡで−４である。アラインメントはＦＡＳＴＡパッケージの第ｖ２０ｕ６版で行う（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，ＰＮＡＳ  ８５：２４４４−２４４８，及びＷ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０）Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＦＡＳＴＰ  ａｎｄ  ＦＡＳＴＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８３：６３−９８）。
【００５１】
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の修飾は、本ポリペプチドと実質的に類似のポリペプチドの合成に必要である。本ポリペプチドと「実質的に類似の」という用語は、非天然形態のポリペプチドを示す。これらのポリペプチドは、何らかの工学処理方法で、その元の供給源から単離されたポリペプチドと異なり、例えば、比活性、熱安定性、至適ｐＨなどで異なる変異体とは異なり得る。変異体配列は、配列番号１の一部をコードするポリペプチドとして示される核酸配列、例えばその亜配列を基礎にして、及び／又は核酸配列によりコードされるポリペプチドの別のアミノ酸配列を生じないが、しかし酵素の生成を意図された宿主生物のコドン使用に対応するヌクレオチド置換の導入により、あるいは異なるアミノ酸配列を生じ得るヌクレオチド置換の導入により構築され得る。ヌクレオチド置換の一般的記載に関しては、例えば、Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」２：９５−１０７を参照のこと。
【００５２】
このような置換は分子の機能に決定的な領域の外側でなすことができ、そして依然として活性なポリペプチドを生じる、ということは当業者には明らかである。本発明の単離した核酸配列によりコードされるポリペプチドの活性に不可欠な、したがって好ましくは置換を受けないアミノ酸残基は、当業界で既知の手法により、例えば部位指定突然変異誘発又はアラニン走査変異誘発により同定され得る（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ、１９８９、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２４４：１０８１−１０８５参照）。後者の技法では、変異は、分子中のあらゆる正に荷電した残基に導入され、その結果生じる変異体分子が分枝酵素活性に関して試験されて、分子の活性に重大であるアミノ酸残基を同定する。基質−酵素相互作用の部位は、核磁気共鳴分析、結晶学又は光親和性標識のような技法により決定されるような三次元構造の分析により決定され得る（例えば、ｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈｅｔ  ａｌ．，１９９２、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、「ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ」３０９：５９−６４を参照のこと）。
【００５３】
本発明はまた、本明細書で定義したように、非常に低いストリンジェントな条件、好ましくは低いストリンジェントな条件、更に好ましくは中程度にストリンジェントな条件、更に好ましくは中程度−高度にストリンジェントな条件、より更に好ましくは高度にストリンジェントな条件、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件のもと、同一の条件下で配列番号１の核酸配列若しくはその相補鎖；又はそれらの対立変異体及び亜配列（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９（前記））とハイブリダイズする核酸プローブとハイブリダイズする、本発明のポリペプチドをコードする単離した核酸配列に関する。
【００５４】
本発明はまた、（ａ）非常に低い、低い、中程度、中程度−高度、高度、又は非常に高度にストリンジェントな条件下で（ｉ）配列番号１のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチドに含まれるｃＤＮＡ配列、（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の亜配列、又は（ｉｖ）（ｉ），（ｉｉ）、若しくは（ｉｉｉ）の相補鎖とハイブリダイズし；そして（ｂ）その核酸配列を単離することによって生成する単離した核酸配列に関する。亜配列は、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドの配列、例えば分枝酵素活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする配列である。
【００５５】
変異体核酸配列の生成方法
本発明は更に、配列番号１のポリペプチドのコード配列又はその亜配列に少なくとも１つの変異を導入することを含んで成る変異体核酸配列の生成方法であって、変異体核酸配列が配列番号２のアミノ酸又は分枝酵素活性を有するそのフラングメントから成るポリペプチドをコードする方法に関する。
【００５６】
一方のヌクレオチドを他方のヌクレオチドに交換するための、変異の核酸配列への導入は、当業界で既知の任意の方法を用いた部位指定突然変異誘発によりなし遂げ得る。特に有用なのは、注目の挿入物を有する超コイル二本鎖ＤＮＡベクターと所望の変異を含む２つの合成プライマーとを用いる手法である。各々がベクターの反対鎖と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼによって温度周期進行中に伸張する。プライマーの組み込み時に、スタガーニックを含む変異化プラスミドが生成される。温度周期進行後、メチル化及び半メチル化ＤＮＡに特異的なＤｐｎＩで生成物を処理して親ＤＮＡ鋳型を消化し、そして変異含有合成ＤＮＡを選択する。当業界で既知のその他の手法も用い得る。
【００５７】
核酸構築物
本発明は、調節（ｃｏｎｔｒｏｌｌ）配列と両立可能な条件下で適切な宿主細胞でのコード配列の発現を指示する１又は複数の調節配列と作用可能に連結した本発明の核酸配列を含んで成る核酸構築物にも関する。発現は、ポリペプチドの生成に関与するあらゆる工程を含むと理解され、その例としては、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾及び分泌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
「核酸構築物」は、天然遺伝子から単離される、あるいはそうでなければ天然には存在しない方法で、結合され、並置される核酸のセグメントを含むよう修飾された一本鎖又は二本鎖の核酸分子と本明細書中では定義される。核酸構築物という用語は、核酸構築物が本発明のコード配列の発現に必要な調節配列をすべて含む場合の発現カセットという用語と同義である。「コード配列」という用語は、そのタンパク質生成物質のアミノ酸配列を直接特定する核酸配列と本明細書中では定義される。コード配列の境界は、一般に、リボソーム結合部位により（原核生物）、又はｍＲＮＡの５’末端のオープンリーディングフレームのすぐ上流に位置するＡＴＧ開始コドンとｍＲＮＡの３’末端のオープンリーディングフレームのすぐ下流に位置する転写ターミネーター配列とにより（真核生物）決定される。コード配列としては、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び組換え核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
本発明のポリペプチドをコードする単離した核酸配列を種々の方法で操作して、ポリペプチドの発現を提供し得る。それをベクターに挿入する前の核酸配列の操作は、発現ベクターによっては望ましいか又は必要である。組換えＤＮＡ法を用いて核酸配列を修飾する技法は、当業界では公知である。
【００６０】
「調節配列」という用語は、本発明のポリペプチドの発現に必要な又は有益なすべての成分を含むと本明細書中では定義される。各々の調節配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して天然のものであるか又は外来のものであり得る。このような調節配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列及び転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。最低限度、調節配列は、プロモーターと、転写及び翻訳停止シグナルを含む。調節配列は、調節配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを容易にする特異的制限部位を導入する目的のためのリンカーを備え得る。「作用可能に連結される」という用語は、調節配列が、ポリペプチドの発現を指示するように、ＤＮＡ配列のコード配列に関連する位置に適切におかれる相対的配置と本明細書中では定義される。
【００６１】
前記調節配列は、核酸配列の発現のために宿主により認識される核酸配列である適切なプロモーター配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を仲介する転写調節配列を含む。プロモーターは、選択宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列、例えば変異体、切頭型及びハイブリッドプロモーターであり得るし、宿主細胞に対して同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。
【００６２】
特に細菌宿主細胞における本発明の核酸構築物の転写を指示するのに適したプロモーターの例は、Ｅ．コリのｌａｃオペロン、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、バチルス・ズブチリスのレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バチルス・リヘニホルミスのα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・ステアロサーモフィラスのマルトース原性アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バチルス・アミロリケファシエンスのα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リヘニホルミスのペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・ズブチリスのｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子及び原核生物β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆｅｔ  ａｌ．，１９７８、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ」７５：３７２７−３７３１）から得られるプロモーター、並びにｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ」８０：２１−２５）である。さらなるプロモーターは、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ」、１９８０、２４２：７４−９４中の“Ｕｓｅｆｕｌｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ”及びＳａｍｂｒｏｏｋｅｔ  ａｌ．，１９８９（前記）に記載されている。
【００６３】
糸状真菌宿主細胞における本発明の核酸構築物の転写を指示するのに適したプロモーターの例は、アスペルギルス・オリザエのＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの酸安定性αアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・アワモリのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リゾムコール・ミエヘイのリパーゼ、アスペルギルス・オリザエのアルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエのトリオースホスフェートイソメラーゼ、アスペルギルス・ニズランスのアセトアミダーゼ及びフザリウム・オキシスポルムのトリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ９６／００７８７）に関する遺伝子から得られるプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（アスペルギルス・ニガーの中性α−アミラーゼ及びアスペルギルス・オリザエのトリオースホスフェートイソメラーゼに関する遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、そしてその変異体、切頭型及びハイブリッドプロモーターである。
【００６４】
酵母菌宿主では、有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビシエのエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエのガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエのアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、及びサッカロミセス・セレビシエの３−ホスホグリセレートキナーゼに関する遺伝子から得られる。酵母菌宿主細胞に対するその他の有用なプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓｅｔ  ａｌ．，１９９２、「Ｙｅａｓｔ」８：４２３−４８８に記載されている。
【００６５】
調節配列は、転写を終結するよう宿主細胞に認識される配列である適切な転写ターミネーター配列でもある。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作用可能に連結される。選択される宿主細胞中で機能性である任意のターミネーターは、本発明に用い得る。
【００６６】
糸状真菌宿主細胞に好ましいターミネーターは、アスペルギルス・オリザエのＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニズランスのアントラニル酸合成酵素、アスペルギルス・ニガーのαグルコシダーゼ及びフザリウム・オキシスポルムのトリプシン様プロテアーゼに関する遺伝子から得られる。
【００６７】
酵母菌宿主細胞に好ましいターミネーターは、サッカロミセス・セレビシエのエノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエのチトクロームＣ（ＣＹＣ１）及びサッカロミセス・セレビシエのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼに関する遺伝子から得られる。酵母菌宿主細胞に有用なその他のターミネーターは、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２（前記）に記載されている。
【００６８】
調節配列は、宿主細胞による翻訳に関して重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である適切なリーダー配列でもある。リーダー配列は、ペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作用可能に連結される。選択される宿主細胞中で機能性である任意のリーダー配列は、本発明に用い得る。
【００６９】
糸状真菌宿主細胞に好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザエのＴＡＫＡアミラーゼ及びアスペルギルス・ニズランスのトリオースホスフェートイソメラーゼに関する遺伝子から得られる。
【００７０】
酵母菌宿主細胞にとって適当なリーダーは、サッカロミセス・セレビシエのエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエの３−ホスフェートグリセレートキナーゼ、サッカロミセス・セレビシエのα因子及びサッカロミセス・セレビシエのアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）に関する遺伝子から得られる。
【００７１】
調節配列は、核酸配列の３’末端に作用可能に連結される配列であって、転写された場合に、ポリアデノシン残基を転写ｍＲＮＡに付加するためのシグナルとして宿主細胞に認識されるポリアデニル化配列でもあり得る。選択された宿主細胞中で機能性である任意のポリアデニル化配列は、本発明に用い得る。
【００７２】
糸状真菌宿主細胞に好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリザエのＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニズランスのアントラニル酸合成酵素、フザリウム・オキシスポルムのトリプシン様プロテアーゼ及びアスペルギルス・ニガーのαグルコシダーゼに関する遺伝子から得られる。
【００７３】
酵母菌宿主細胞に有用なポリアデニル化配列は、Ｇｕｏ及びＳｈｅｒｍａｎ、１９９５、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」１５：５９８３−５９９０に記載されている。
【００７４】
調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に結合されるアミノ酸配列をコードし、細胞の分泌経路にコードされたペプチドを向けるシグナルペプチドのコード領域でもある。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌ポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと、翻訳リーディングフレームで天然に連結したシグナルペプチドのコード領域を固有に含み得る。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来性であるシグナルペプチドのコード領域を含み得る。外来性シグナルペプチドのコード領域は、コード配列がシグナルペプチドのコード領域を天然に含まない場合に必要であり得る。あるいは、外来性シグナルペプチドのコード領域は、ポリペプチドの分泌を増強するために、天然シグナルペプチドのコード領域を単に置換し得る。しかしながら、発現ポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路に向ける任意のシグナルペプチドのコード領域は、本発明に用い得る。
【００７５】
細菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドのコード領域は、バチルス属のＮＣＩＢ１１８３７マルトース原性アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルスのαアミラーゼ、バチルス・リヘニホルミスのズブチリシン、バチルス・リヘニホルミスのβラクタマーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルスの中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）及びバチルス・ズブチリスのｐｒｓＡに関する遺伝子から得られるシグナルペプチドのコード領域である。さらなるシグナルペプチドは、Ｓｉｍｏｎｅｎ及びＰａｌｖａ、１９９３、「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ」５７：１０９−１３７に記載されている。
【００７６】
糸状真菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドのコード領域は、アスペルギルス・オリザエのＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、フミコラ・インソレンスのセルラーゼ及びフミコラ・ラヌギノサのリパーゼに関する遺伝子から得られるシグナルペプチドのコード領域である。
【００７７】
酵母菌宿主細胞に有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエのα因子及びサッカロミセス・セレビシエのインベルターゼに関する遺伝子から得られる。その他の有用なシグナルペプチドのコード領域は、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２（前記）に記載されている。
【００７８】
調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドのコード領域でもある。その結果生じるポリペプチドはプロ酵素又はプロポリペプチド（又はいくつかの場合にはチモーゲン）として知られている。プロポリペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的又は自己触媒的開裂により成熟活性ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドのコード領域は、バチルス・ズブチリスのアルカリ性プロテアーゼ（ａｐｒＥ）、バチルス・ズブチリスの中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、サッカロミセス・セレビシエのα因子、リゾムコール・ミエヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼ及びミセリオフトラ・サーモフィラのラッカーゼ（ＷＯ９５／３３８３６）に関する遺伝子から得られる。
【００７９】
シグナルペプチド及びプロペプチド領域がともにポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、シグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
【００８０】
宿主細胞の増殖に関してポリペプチドの発現の制御（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を可能にする制御配列を付加するのも望ましい。制御系の例は、制御化合物の存在を含めた、化学的又は物理的刺激に対して切り換えられる遺伝子の発現を引き起こすものである。原核生物系における制御系としては、ｌａｃ、ｔａｃ及びｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母菌では、ＡＤＨ２系又はＧＡＬ１系が用いられる。糸状真菌では、ＴＡＫＡαアミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼプロモーター及びアスペルギルス・オリザエのグルコアミラーゼプロモーターが制御配列として用いられる。制御配列のその他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系では、これらの例としては、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、及び重金属を用いて増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合、ポリペプチドをコードする核酸配列は、制御配列と作用可能に連結される。
【００８１】
発現ベクター
本発明は更に、本発明の核酸配列、プロモーター、ならびに転写及び翻訳停止シグナルを含んで成る組換え発現ベクターに関する。前記の種々の核酸及び調節配列は、一緒に連結されて、このような部位でのポリペプチドをコードする核酸の挿入又は置換を可能にするために１又は複数の便利な制限部位を含みうる組換え発現ベクターを生成し得る。あるいは、本発明の核酸配列は、発現のための適切なベクター中に核酸配列又はその配列を含んで成る核酸構築物を挿入することにより発現され得る。発現ベクターを作製する場合、コード配列が発現のための適切な調節配列と作用可能に連結されるように、コード配列はベクター内に位置する。
【００８２】
組換え発現ベクターは、都合良く組換えＤＮＡ法にかけられ得る、そして核酸配列の発現をもたらし得る任意のベクター（例えばプラスミド又はウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性によっている。ベクターは、直鎖状又は閉環状プラスミドであり得る。
【００８３】
ベクターは、自律的複製ベクター、即ち染色体外存在物として存在するベクターであり、その複製は染色体複製とは無関係で、例えば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体又は人工染色体がその例である。ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含み得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入された場合、そのゲノムに組込みされて、それが組込みされた染色体と一緒に複製され得る。更に、宿主細胞のゲノム中に導入される全ＤＮＡ、又はトランスポゾンを一緒に含む単一ベクター又はプラスミド、あるいは２又はそれ以上のベクター又はプラスミドが用いられる。
【００８４】
本発明のベクターは、好ましくは、形質変換した細胞の選択を容易にする１又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、その生成物が殺生物剤又はウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養素要求株に対する原栄養性等を提供する生成物の遺伝子である。細菌選択マーカーの例は、バチルス・ズブチリス又はバチルス・リヘニホルミスからのｄａｌ遺伝子、あるいは抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を付与するマーカーである。酵母菌宿主細胞に適したマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰＩ及びＵＲＡ３である。糸状真菌宿主細胞に用いるための選択マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、ｔｒｐＣ（アントラニル酸合成酵素）、ならびにその等価物が挙げられるが、これらに限定されない。アスペルギルス細胞に用いるのに好ましいのは、アスペルギルス・ニズランス又はアスペルギルス・オリザエのａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子、ならびにストレプトミセス・ヒグロスコピクスのｂａｒ遺伝子である。
【００８５】
本発明のベクターは、好ましくは、宿主細胞ゲノムへのベクターの安定な組込み、又はゲノムと無関係の細胞中でのベクターの自律性複製を可能にする要素を含む。
【００８６】
宿主細胞ゲノムへの組込みのために、ベクターは、相同的又は非相同的組換えにより、ペプチドをコードする核酸配列、又はベクターのゲノムへの安定な組込みのためのベクターのその他の任意の要素に依存し得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞のゲノムへの、相同的組換えによる組込みを指示するための付加的核酸配列を含み得る。付加的核酸配列は、染色体中の正確な位置でベクターを宿主細胞ゲノムの中へ組込ませ得る。正確な位置での組込みの見込みを増大するために、組込み性要素は、好ましくは、十分な数の核酸、例えば１００〜１，５００塩基対、好ましくは４００〜１，５００塩基対、そして最も好ましくは８００〜１，５００塩基対を含むべきであり、これは対応する標的配列と高度に相同性で、相同的組換えの可能性を増強する。組込み要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同の任意の配列であり得る。更に、組込み要素は、非コード又はコード核酸配列であり得る。他方、ベクターは、非相同的組換えにより、宿主細胞のゲノムに組込まれ得る。
【００８７】
自律的複製のために、ベクターは、問題の宿主細胞中でベクターを自律的に複製させ得る複製起点を更に包含し得る。細菌の複製起点の例は、Ｅ．コリ中での複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７及びｐＡＣＹＣ１８４、バチルス菌中での複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０及びｐＡＭβ１の複製起点である。酵母菌宿主細胞で用いるための複製起点の例は、２μの複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組合せ、ならびにＡＲＳ４とＣＥＮ６の組合せである。複製起点は、宿主細胞中でその機能を温度感受性にする突然変異を有するものである（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ）１９７８、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ」７５：１４３３を参照のこと）。
【００８８】
本発明の核酸配列の１つより多いコピーを宿主細胞に挿入して、遺伝子生成物の生成が増大され得る。核酸配列のコピー数の増大は、配列の少なくとも１つの付加的コピーを宿主細胞ゲノムに組込むことにより、又は核酸配列を有する増幅性選択マーカー遺伝子を含入することにより得られるが、この場合、選択マーカー遺伝子の増幅コピーを含む細胞と、それによる核酸配列の付加的コピーが、適切な選択可能な作用物質の存在下で細胞を培養することにより選択され得る。
【００８９】
本発明の組換え発現ベクターを構築するために前記の要素をライゲーションするために用いられる手法は、当業者には周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９（前記）を参照のこと）。
【００９０】
宿主細胞
本発明は更に、本発明の核酸配列を含んで成り、ポリペプチドの組換え体生成に有益に用いられる組換え宿主細胞に関する。本発明の核酸配列を含んで成るベクターは、ベクターが、前記のように染色体組込み物として、又は自己複製染色体外ベクターとして保持されるように、宿主細胞中に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製中に生じた変異のために親細胞と同一でない親細胞の任意の子孫を含む。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその供給源に大いに依存している。
【００９１】
宿主細胞は、単細胞微生物、例えば原核生物、又は非単細胞性微生物、例えば真核生物であり得る。
【００９２】
有用な単細胞性細胞は、細菌細胞、例えばグラム陽性細菌で、その例としては、バチルス属細胞、例えばバチルス・アルカロフィルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュランス、バチルス・クラウシ、バチルス・コアギュランス、バチルス・ラウツス、バチルス・レンツス、バチルス・リヘニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・ズブチリス又はバチルス・スリンギエンシス；あるいはストレプトミセス菌細胞、例えばストレプトミセス・リビダンス又はストレプトミセス・ムリヌス；あるいはグラム陰性細菌、例えばＥ．コリ及びシュードモナス種が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様において、細菌宿主細胞は、バチルス・レンツス、バチルス・リヘニホルミス、バチルス・ステアロサーモフィルス、又はバチルス・ズブチリス細胞である。別の好ましい態様において、バチルス菌細胞は、親アルカリ性バチルス菌である。
【００９３】
細菌宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、コンピテント細胞（例えば、Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｐｉｚｉｚｉｎ、１９６１、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」８１：８２３−８２９又はＤｕｂｎａｕ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ、１９７１、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」５６：２０９−２２１を参照のこと）を用いたプロトプラスト形質変換（例えば、Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ、１９７９、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」１６８：１１１−１１５を参照のこと）、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ａｎｄ  Ｄｏｗｅｒ、１９８８、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」６：７４２−７５１を参照のこと）又は接合（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｅ、１９８７、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」１６９：５７７１−５２７８を参照のこと）により実行され得る。
【００９４】
宿主細胞は、真核生物、例えば哺乳類、昆虫、植物又は真菌細胞であり得る。
【００９５】
好ましい態様において、宿主細胞は真菌細胞である。「真菌」とは、本明細書中で用いる場合には、子嚢菌門、担子菌門、ツボカビ門及び接合菌門（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ」８版１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによる定義）、ならびに卵菌門（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５（前記）ｐ１７１に引用）、そしてすべての糸状胞子真菌（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５（前記））を含む。
【００９６】
更に好ましい態様において、真菌宿主細胞は酵母菌細胞である。「酵母菌」とは、本明細書中で用いる場合には、子嚢胞子形成酵母菌（エンドミケス目）、担子菌形成酵母菌、及び不完全真菌（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する酵母菌が含まれる。酵母菌の分類は将来、変わり得るため、本発明の目的のためには、酵母菌は、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｆ．Ａ．，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，Ｓ．Ｍ．及びＤａｖｅｎｐｏｒｔ，Ｒ．Ｒ．編「Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ」Ｎｏ．９，１９８０）に記載されたように定義する。
【００９７】
より更に好ましい態様において、酵母菌宿主細胞はカンジダ属、ハンセヌラ属、クルイベロミセス属、ピキア属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属又はヤローウィア属の細胞である。
【００９８】
最も好ましい態様において、酵母菌宿主細胞はサッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベリ、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）又はサッカロミセス・オビホルミス細胞である。別の最も好ましい態様において、酵母菌宿主細胞は、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）細胞である。別の最も好ましい態様において、酵母菌宿主細胞はヤローウイア・リポリチカ細胞である。
【００９９】
別の更に好ましい態様において、真菌宿主細胞は糸状真菌細胞である。「糸状真菌」は、真菌門及び卵菌門のすべての糸状形態を含む（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５（前記）により定義）。糸状真菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及びその他の複合多糖で構成される菌糸体壁を特徴とする。植物性成長は菌糸伸張により、そして炭素異化作用は無条件に好気性である。これに対比して、酵母菌、例えばサッカロミセス・セレビシエによる植物性成長は、単細胞性葉状体の出芽によるもので、炭素異化は発酵であり得る。
【０１００】
より更に好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞は、例えばアクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属、フザリウム属、フミコラ属、ムコール属、ミセリオフトラ属、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属又はトリコデルマ属の細胞であるが、これらに限定されない。
【０１０１】
最も好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フェチズス、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・ニズランス、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・オリザエ細胞である。別の最も好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞は、フザリウム・バクトリジオイデス、フザリウム・セレアリス、フザリウム・クルックウェレンセ、フザリウム・クルモルム、フザリウム・グラミネアルム、フザリウム・グラミヌム、フザリウム・ヘテロスポルム、フザリウム・ネグンジ、フザリウム・オキシスポルム、フザリウム・レティキラツム、フザリウム・ロゼウム、フザリウム・ザムブチヌム、フザリウム・ザルコロウム、フザリウム・スポロトリキオイデス、フザリウム・スルフレウム、フザリウム・トルロスム、フザリウム・トリコセキオイデス又はフザリウム・ベネナツム細胞である。より最も好ましい態様において、糸状菌親細胞はフザリウム・ベネナツム（Ｎｉｅｒｅｎｂｅｒｇの新種）の細胞である。別の最も好ましい態様において、糸状真菌親細胞は、フミコラ・インソレンス、フミコラ・ラヌギノサ、ムコール・ミエヘイ、ミセリオフトラ・サーモフィラ、ニューロスポラ・クラッサ、ペニシリウム・パープロゲヌム、シーラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハージアヌム、トリコデルマ・コニンギー、トリコデルマ・ロンギブラキアツム、トリコデルマ・リーセイ又はトリコデルマ・ビリデ細胞である。
【０１０２】
真菌細胞は、それ自体既知の方法での、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質変換、及び細胞壁の再生を含んで成る方法により形質変換され得る。アスペルギルス宿主細胞の形質変換に適した手法は、欧州特許第２３８０２３号、及びＹｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４、  「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  ＳｃｉｅｎｃｅＵＳＡ」  ８１：１４７０−１４７４に記載されている。フザリウム種の形質変換に適した方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、「Ｇｅｎｅ」７８：１４７−１５６及びＷＯ９６／００７８７に記載されている。酵母菌は、Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ  Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．編「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，ｐｐ  １８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｉｔｏｅｔ  ａｌ．，１９８３、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」１５３：１６３；及びＨｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ」７５：１９２０に記載された方法を用いて形質変換し得る。
【０１０３】
生成の方法
本発明はまた、本発明のポリペプチドを生成する方法であって、（ａ）菌株を、前記ポリペプチドを生成することができるその野生型で培養し；そして（ｂ）そのポリペプチドを回収することを含んで成る方法に関する。好ましくは、前記菌株はロドサームス属のものであり、そして更に好ましくはロドサームス・オバメンシスである。
【０１０４】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを生成する方法であって、（ａ）前記ポリペプチドの生成を助成する条件下で宿主細胞を培養し、（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る方法に関する。
【０１０５】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを生成する方法であって、（ａ）宿主細胞をポリペプチドの生成を助成する条件下で培養し、ここで、宿主細胞は配列番号１のポリペプチドのコード領域において少なくとも１つの変異を有する変異体核酸配列を含んで成り、ここで、変異体核酸配列は配列番号２のアミノ酸から成るポリペプチドをコードする、及び（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る方法に関する。
【０１０６】
本発明の生成方法において、細胞は、当業界で既知の方法を用いて、そのポリペプチドの生成に適切な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、ポリペプチドを発現及び／又は単離させるのに適切な培地及び条件下で実施される、振とうフラスコ培養、実験室又は工業的発酵器における小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、フュド  バッチ又は固体状態発酵を含む）により培養し得る。培養は当業界で既知の手順を用いて、炭素源及び窒素源、並びに無機塩を含む適切な栄養培地で行なわれる。適切な培地は、商業的な供給者から入手するか、公表された組成（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎカタログ中に）にしたがって調製し得る。ポリペプチドが栄養培地中に分泌されるなら、ペプチドを培地から直接回収することができる。ポリペプチドが分泌されないなら、細胞溶解物から回収することができる。
【０１０７】
ポリペプチドは、そのポリペプチドに特異的である、当業界で既知の方法を用いて検出し得る。これらの検出方法は、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成又は酵素基質の消失を含み得る。例えば、本明細書に記載したポリペプチドの活性を測定するのに酵素アッセイを用い得る。
【０１０８】
生じたポリペプチドは当業界で既知の方法で回収し得る。例えば、ポリペプチドは、栄養培地から、遠心、ろ過、抽出、スプレー乾燥、蒸発又は沈澱を含むが、これらに限定されない慣用の手順により回収し得る。
【０１０９】
本発明のポリペプチドは、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、疎水性、等電点電気泳動及びサイズ排除）、電気泳動手順（例えば、予備等電点電気泳動）、差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈澱）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は抽出（例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｌａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ編、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９を参照のこと）を含むが、これらに限定されない、当業界で既知の種々の手順により精製し得る。
【０１１０】
植物
本発明はまた、回収可能な量でポリペプチドを発現し、かつ、生成するように、本発明の分枝酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列で形質変換された、遺伝子組換え植物、植物の部分又は植物細胞にも関する。ポリペプチドは植物又は植物の部分から回収し得る。代りに、組み換えポリペプチドを含む植物又は植物部分はそれ自体食品又は飼料の品質を改良するため、例えば、栄養価値、味のよさ及びレオロジー特性を改良するため又は栄養とならない因子を破壊するために用い得る。
【０１１１】
遺伝子組換え植物は双子葉植物又は単子葉植物であり得る。単子葉植物はイネ科植物、例えば、牧草（イチゴツナギ、イネ科イチゴツナギ属）、飼料イネ科植物、例えば、フェスチュカ（ｆｅｓｔｕｃａ）、ロリウム（ｌｏｌｉｕｍ）、温和なイネ科植物、例えば、アグロスチス（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）並びに穀物、例えば、ムギ、オートムギ、ライムギ、オオムギ、コメ、モロコシ及びメイズ（トウモロコシ）である。
【０１１２】
双子葉植物の例は、タバコ、まめ科植物、例えば、ルピナス、ジャガイモ、砂糖大根、えんどう、マメ、ダイズ及びアブラナ科の植物（アブラナ科）、例えば、カリフラワー、ナタネ及び密接に関連するモデル生物アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）である。
【０１１３】
植物の部分の例は茎、カルス、葉、根、果実、種子及び塊茎である。また、特種な植物組織、例えば、葉緑体、アポプラスト（ａｐｏｐｌａｓｔ）、ミトコンドリア、液胞、ペルオキシソーム及び細胞質は植物の部分と考えられる。更に組織の起原が何であれ、あらゆる植物細胞は植物の部分と考えられる。
【０１１４】
また、上記植物の子孫、植物部分及び植物細胞は本発明の範囲内に包含される。
【０１１５】
本発明のポリペプチドを発現する遺伝子組換え植物又は植物細胞は当業界で既知の方法にしたがって構築される。簡単に言うと、本発明のポリペプチドをコードする１又は複数の発現構築物を植物宿主ゲノムに組み込み、得られた変性植物又は植物細胞を遺伝子組換え植物又は植物細胞に伝播することにより、植物又は植物細胞を構築する。
【０１１６】
便利には、発現構築物は、選択された植物又は植物の部分中で核酸配列の発現に必要な適当な制御配列に作用可能に連結した、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構築物である。更に、発現構築物は、発現構築物が組み込まれた宿主細胞及び問題の植物への構築物の導入に必要なＤＮＡ配列（後者は用いられるＤＮＡ導入方法に依存する）を同定するのに有用な選択マーカーを含むことができる。
【０１１７】
制御配列、例えば、プロモーター配列及びターミネーター配列並びに任意にシグナル配列又はトランジット配列の選択は、例えば、ポリペプチドをいつ、どこで、どのように発現させることを望むかに基づいて決定される。例えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現は構成的もしくは誘導的でもよく、又は発達上、段階もしくは組織特異的でよく、そして、遺伝子産物は特定の組織又は植物の部分、例えば、種子又は葉を標的とすることができる。制御配列は、例えば、Ｔａｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，「Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」８６：  ５０６に記載されている。
【０１１８】
構成的発現のために、３５Ｓ−ＣａＭＶプロモーターを用い得る（Ｆｒａｎｃｋ  ｅｔａｌ．，「Ｃｅｌｌ」２１：２８５−２９４、１９８０年）。器官特異的プロモーターは、例えば、貯蔵シンク組織、例えば、種子、ジャガイモ塊茎及び果実（Ｅｄｗａｒｄｓ及びＣｏｒｕｚｚｉ，１９９０，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２４：２７５−３０３）又は代謝シンク組織、例えば、分裂組織（Ｉｔｏｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：  ８６３−８７８）からのプロモーター、種子特異的プロモーター、例えば、コメからのグルテリン、プロラミン、グロブリン又はアルブミンプロモーター（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ３９：８８５−８８９）、レグミンＢ４からのＶｉｃｉａ  ｆａｂａプロモーター及びＶｒｃｉａ  ｆａｂａからの未知の種子タンパク質遺伝子（Ｃｏｎｒａｄｅｔ  ａｌ．，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆＰｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」１５２：７０８−７１１、１９９８年）、種子油体タンパク質からのプロモーター（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」３９：９３５−９４１、１９９８年）、ブラッシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）からの貯蔵タンパク質ｎａｐＡプロモーター又は当業界で既知のあらゆる他の種子特異的プロモーター、例えば、ＷＯ９１／１４７７２号記載のものであり得る。更に、プロモーターは葉特異的プロモーター、例えば、コメ又はトマトからのｒｂｃｓプロモーター（Ｋｙｏｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」１０２：９９１−１０００、１９９３年）、クロレラウィルス  アデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター（Ｍｉｔｒａ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，１９９４，「Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」２６：８５−９３）又はコメからのａｌｄＰ遺伝子プロモーター（Ｋａｇａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」２４８：６６８−６７４）又は傷誘導性プロモーター、例えば、ジャガイモｐｉｎ２プロモーター（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，「Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」２２：５７３−５８８）であり得る。
【０１１９】
プロモーターエンハンサー因子も植物中の酵素の高い発現を達成するのに用い得る。例えば、プロモーターエンハンサー因子は、プロモーターと本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に位置するイントロンであってもよい。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３（上記）は、コメアクチン１遺伝子の第１イントロンを、発現を増強するのに用いることを開示している。
【０１２０】
選択マーカー遺伝子及び発現構築物のあらゆる他の部分は当業界で利用し得るものから選択し得る。
【０１２１】
核酸構築物は、アグロバクテリウムを介する形質変換、ウィルスを介する形質変換、マイクロインジェクション、粒子衝撃（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、微粒子銃形質変換及びエレクトロポレーションを含んで成る、当業界で既知の慣用の技術にしたがって、植物ゲノムに組み込まれる（Ｇａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２４４：  １２９３、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，１９９０，  「Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」８：  ５３５、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ」３３８：２７４）。
【０１２２】
現在、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介する遺伝子導入は遺伝子組換え双子葉植物を発生させるための一般に好まれる方法である（概説のために、Ｈｏｏｙｋａｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，１９９２，「Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」１９：１５−３８を参照のこと）。それは単子葉植物を形質変換するのにも使用され得るが、これらの植物を形質変換するために、他の形質転換法が一般に好ましい。現在、遺伝子組換え単子葉植物を生じさせるために一般的に好まれる方法は胚芽のカルス又は発育中の胚芽の粒子衝撃（形質変換するＤＮＡで被覆された超小型の金又はタングステン粒子）である（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，１９９２，「Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ」２：  ２７５−２８１、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，１９９４，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」５：  １５８−１６２、Ｖａｓｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，「Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」１０：６６７−６７４）。単子葉植物のための他の方法は、Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，「Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」２１：４１５−４２８に記載された、プロトプラスト形質変換に基づく。
【０１２３】
形質変換後、発現構築物を組み込んだ形質変換体は、当業界で公知の方法にしたがって、選択され、そして植物全体へと再生される。
【０１２４】
本発明はまた、（ａ）ポリペプチドの生成を助成する条件下で、本発明の分枝酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る遺伝子組換え植物又は植物細胞を培養し；そして（ｂ）そのポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成する方法にも関する。
【０１２５】
組成物
なお、さらなる観点においては、本発明は本発明のポリペプチドを含んで成る組成物に関する。好ましくは、前記組成物は本発明のポリペプチドが濃縮されている。本文脈においては、用語「濃縮された」は組成物の分枝酵素活性が、例えば、１．１の濃縮率で増加したことを示す。
【０１２６】
前記組成物は主要酵素成分、例えば、単成分組成物として本発明のポリペプチドを含んでよい。あるいは、前記組成物は、複数の酵素活性、例えば、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼを含んで成ることもある。
【０１２７】
前記ポリペプチド組成物は、当業界で既知の方法にしたがって製造することができ、液体又は乾燥組成物の形でよい。例えば、ポリペプチド組成物は顆粒状物又は微顆粒状物の形でよい。組成物に包含されるポリペプチドは当業界で既知の方法にしたがって安定化し得る。
【０１２８】
本発明のポリペプチド組成物の好ましい使用の例を下記に示す。本発明のポリペプチド組成物の投与量及び組成物を用いる他の条件は当業界で既知の方法に基づいて決定し得る。
【０１２９】
洗剤組成物
本発明の分枝酵素は洗剤組成物に加えられてもよく、そしてその結果、その成分となり得る。
【０１３０】
本発明の洗剤組成物は、汚れた織物の前処理に適した洗濯用添加剤組成物及びリンスを加えた織物柔軟剤組成物を含む、手洗い又は洗濯機洗剤組成物として調製され、あるいは通常の塗装面の洗浄作業における使用のための洗剤組成物として調製され、あるいは手洗い又は機械の食器洗い作業のために調製され得る。
【０１３１】
具体的な観点において、本発明は、本発明の分枝酵素を含んで成る洗剤添加物を提供する。前記洗剤添加物及び洗剤組成物は、１又は複数の他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ、及び／又はペルオキシダーゼを含んで成ることもある。
【０１３２】
通常、選択した酵素の特性は選択した洗剤との適合性があるべきであり（すなわち、他の酵素的かつ非酵素的成分との適合性がある至適ｐＨなど）、そして前記酵素は有効量で存在すべきである。
【０１３３】
プロテアーゼ：
適当なプロテアーゼは、動物、植物又は微生物起源のものを含む。微生物起源が好ましい。化学的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理した変異体が含まれる。前記プロテアーゼはセリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性の微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼであってもよい。アルカリ性プロテアーゼの例にはズブチリシンであり、これは特にバチルス属に由来するものであり、例えばズブチリシンＮｏｖｏ、ズブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、ズブチリシン３０９、ズブチリシン１４７及びズブチリシン１６８（ＷＯ８９／０６２７９に記載）である。トリプシン様プロテアーゼの例は、ＷＯ８９／０６２７０及びＷＯ９４／２５５８３に記載のトリプシン（例えばブタ及びウシ起源のもの）及びフザリウム属のプロテアーゼである。
【０１３４】
有用なプロテアーゼの例は、ＷＯ９２／１９７２９，ＷＯ９８／２０１１５，ＷＯ９８／２０１１６、及びＷＯ９８／３４９４６に記載の変異体であり、特に１又は複数の以下の位置：２７，３６，５７，７６，８７，９７，１０１，１０４，１２０，１２３，１６７，１７０，１９４，２０６，２１８，２２２，２２４，２３５及び２７４において置換を有する変異体である。
【０１３５】
好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、Ａｌｃａｌａｓｅ（商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）、Ｐｒｉｍａｓｅ（商標）、Ｄｕｒａｌａｓｅ（商標）、Ｅｓｐｅｒａｓｅ（商標）、及びＫａｎｎａｓｅ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）、Ｍａｘａｔａｓｅ（商標）、Ｍａｘａｃａｌ（商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  ＯｘＰ（商標）、ＦＮ２（商標）、及びＦＮ３（商標）（Ｇｅｎｅｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）を含む。
【０１３６】
リパーゼ：
適当なリパーゼは細菌又は菌起源のものを含む。化学的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理された変異体が含まれる。有用なリパーゼの例は、フミコラ（異名サーモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ））属由来、例えばＥＰ  ２５８  ０６８及びＥＰ  ３０５  ２１６に記載のＨ．ラヌギノサ（Ｔ．ラヌギノサス（ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ））由来又はＷＯ９６／１３５８０に記載のＨ．インソレンス由来のリパーゼ、シュードモナス属のリパーゼ、例えばＰ．アルカリジェネス（ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）若しくはＰ．シュードアルカリジェネス（ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（ＥＰ  ２１８  ２７２）、Ｐ．セパシア（ｃｅｐａｃｉａ）（ＥＰ  ３３１  ３７６）、Ｐ．スタットゼリ（ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（ＧＢ  １，３７２，０３４）、Ｐ．フルオレセンス（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナスＳＰ．菌株ＳＤ７Ｏ５（ＷＯ９５／０６７２０及びＷＯ９６／２７００２）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（ＷＯ９６／１２０１２）由来のもの；バチルスのリパーゼ、例えばＢ．ズブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｄａｒｔｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１３１：２５３−３６０，１９９３）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（ＪＰ６４／７４４９９２）若しくはＢ．プミルス（ｐｕｍｉｌｕｓ）（ＷＯ９１／１６４２２）由来のものを含む。
【０１３７】
他の例は、リパーゼ変異体、例えばＷＯ９２／０５２４９，ＷＯ９４／０１５４１，ＥＰ  ４０７  ２２５，ＥＰ  ２６０  １０５，ＷＯ９５／３５３８１，ＷＯ９６／００２９２，ＷＯ９５／３０７４４，ＷＯ９４／２５５７８，ＷＯ９５／１４７８３，ＷＯ９５／２２６１５，ＷＯ９７／０４０７９及びＷＯ９７／０７２０２に記載のものを含む。
【０１３８】
好ましい市販のリパーゼ酵素はＬｉｐｏｌａｓｅ（商標）及びＬｉｐｏｌａｓｅ  Ｕｌｔｒａ（商標）及びＬｉｐｏｍａｘ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）を含む。
【０１３９】
アミラーゼ：
適当なアミラーゼ（α及び／又はβ）は、細菌又は菌起源のものを含む。化学的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理された変異体が含まれる。アミラーゼは、例えばバチルス属から得たα−アミラーゼ、例えばＢ．リケミホルミスの特別な菌株のアミラーゼを含み、これはＧＢ  １，２９６，８３９で更に詳細に説明されている。
【０１４０】
有用なアミラーゼの例は、ＷＯ９４／０２５９７，ＷＯ９４／１８３１４，ＷＯ９６／２３８７３、及びＷＯ９７／４３４２４に記載の変異体であり、特に１又は複数の以下の位置：１５，２３，１０５，１０６，１２４，１２８，１３３，１５４，１５６，１８１，１８８，１９０，１９７，２０２，２０８，２０９，２４３，２６４，３０４，３０５，３９１，４０８、及び４４４において置換を有する変異体である。
【０１４１】
市販のアミラーゼには、Ｄｕｒａｍｙｌ（商標）、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（商標）及びＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）、Ｒａｐｉｄａｓｅ（商標）及びＰｕｒａｓｔａｒ（商標）（Ｇｅｎｅｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）がある。
【０１４２】
セルラーゼ：
適当なセルラーゼは、細菌又は菌起源のものを含む。化学的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理された変異体が含まれる。適当なセルラーゼは、バチルス、シュードモナス、フミコラ、フザリウム、チエラビア、アクレモニウム属由来のセルラーゼ、例えばＵＳ  ４，４３５，３０７，ＵＳ  ５，６４８，２６３，ＵＳ  ５，６９１，１７８，ＵＳ  ５，７７６，７５７及びＷＯ８９／０９２５９に開示されている、フミコラ・インソレンス、マイセリオフトラ・サーモフィラ及びフサリウム・オキシスポルムから生成される菌のセルラーゼを含む。
【０１４３】
特に適当なセルラーゼは、色の保護の利点を有するアルカリ性又は中性セルラーゼである。その様なセルラーゼの例は、ＥＰ  ０  ４９５  ２５７，ＥＰ  ０  ５３１  ３７２，ＷＯ９６／１１２６２，ＷＯ９６／２９３９７，ＷＯ９８／０８９４０に記載のセルラーゼである。他の例はセルラーゼ変異体、例えばＷＯ９４／０７９９８，ＥＰ  ０  ５３１  ３１５，ＵＳ  ５，４５７，０４６，ＵＳ  ５，６８６，５９３，ＵＳ  ５，７６３，２５４，ＷＯ９５／２４４７１，ＷＯ９８／１２３０７及びＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９に記載されているものである。
【０１４４】
市販のセルラーゼは、Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ（商標）、及びＣａｒｅｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）、Ｃｌａｚｉｎａｓｅ（商標）、及びＰｕｒａｄａｘ  ＨＡ（商標）（Ｇｅｎｅｃｏｒ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｎｃ．）、並びにＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（Ｋａｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む。
【０１４５】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：
適当なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌又は菌起源のものを含む。化学的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理された変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例は、コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属由来、例えばＣ．シネレウス（Ｃｉｎｅｒｅｕｓ）由来のペルオキシダーゼ、並びにＷＯ９３／２４６１８，ＷＯ９５／１０６０２、及びＷＯ９８／１５２５７に記載のそれらの変異体を含む。
【０１４６】
市販のペルオキシダーゼは、Ｇｕａｒｄｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）を含む。
【０１４７】
洗剤酵素は、１又は複数の酵素を含む別々の添加物を加えることによって、あるいはこれらの酵素の全てを含んで成る複合型の添加物を加えることによって洗剤組成物に含めることもできる。本発明の洗剤添加物、すなわち別々の添加物又は複合型の添加物は、例えば顆粒、液体、スラリー等として調製され得る。好ましい洗剤添加物の形態は顆粒、特に無粉塵顆粒、液体、特に安定化液体、又はスラリーである。
【０１４８】
無粉塵顆粒は、例えばＵＳ  ４，１０６，９９１及び４，６６１，４５２に開示されている様に製造することができ、そして任意に当業者に既知の方法によってコーティングされることもある。ロウ性コーティング材料の例は、１０００〜２００００の平均分子量を有するポリエチレンオキシド生成物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０のエチレンオキシド単位を有する、エトキシル化したノニルフェノール；アルコールが１２〜２０の炭素原子を含み、そして１５〜８０のエチレンオキシド単位が存在する、エトキシル化した脂肪アルコール；脂肪アルコール：脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−及びジ−及びトリグリセリドである。流動床技術による適当な模形成コーティング材料の例は、英国特許第１４８３５９１号において与えられている。液体酵素調製物は、例えば確立された方法に従い、多価アルコール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を加えることによって安定することができる。他の酵素安定化剤は当業界で公知である。保護された酵素を、欧州特許第２３８，２１６号に開示された方法に従い調製することができる。
【０１４９】
本発明の洗剤組成物は都合の良い形態、例えば粉末、顆粒、ペースト又は液体として存在することができる。液体洗剤は最大７０％の水及び０〜３０％の有機溶媒を典型的に含む、水性であるか、又は非水性のものであってもよい。
【０１５０】
前記洗剤組成物は、半極性及び／又は陰イオン性及び／又は陽イオン性及び／又は両性であってもよい、１又は複数の界面活性剤を含んで成る。
【０１５１】
前記組成物に含まれる場合、前記洗剤は通常、約１％〜約４０％の直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルファオレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩（脂肪酸アルコール硫酸塩）、アルコールエトキシ硫酸塩、第２級アルカンスルホン酸塩、アルファスルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル又はアルケニルコハク酸、又はセッケンを含むであろう。
【０１５２】
前記組成物に含まれる場合、前記洗剤は通常、約０．２％〜約４０％の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシラート、ノニルフェノールエトキシラート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化した脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド又はグルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（ｇｌｕｃａｍｉｄｅ）を含むだろう。
【０１５３】
前記洗剤は、０〜６５％の洗浄性ビルダー又は錯化剤、例えばゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（例えばＨｏｅｃｈｓｔ社のＳＫＳ−６）を含むことがある。
【０１５４】
前記洗剤は１又は複数のポリマーを含んで成ることがある。例は、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピリジン−Ｎ−オキシド、ポリビニルイミダゾール、ポリカルボキシラート、例えばポリアクリラート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、及びラウリルメタクリル酸／アクリル酸コポリマーである。
【０１５５】
前記洗剤は漂白系を含むことがあり、これはＨ２Ｏ２源、例えば過ホウ酸又は過炭酸を含んで成ることもでき、これは過酸を形成する漂白活性剤、例えばテトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩と組み合わされることもある。あるいは、前記漂白系は、例えばアミド、イミド、又はスルホン型の過酸化物を含んで成ることもある。
【０１５６】
本発明の洗剤組成物の酵素は、常用の安定化剤を用いて安定化することができ、例えばプロピレングリコール若しくはグリセロールなどの多価アルコール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又は例えば芳香族ホウ酸エステルなどのホウ酸誘導体、例えば４−ホルミルフェニルボロン酸であり、そして前記組成物を例えばＷＯ９２／１９７０９及びＷＯ９２／１９７０８に記載されている様に調製することができる。
【０１５７】
前記洗剤はまた、他の常用の洗剤成分、例えば粘土を含む繊維調節剤、泡増幅剤、石けん水抑制剤、防食剤、汚れの懸濁剤、抗−汚れ再沈着剤、染料、殺菌剤、光増白剤、屈水性誘発物質、変色阻害剤、又は香料などを含むことができる。
【０１５８】
現時点で、洗剤組成物において、いずれかの酵素、特に本発明の分枝酵素は、洗浄液１Ｌ当たり０．０１〜１００ｍｇの酵素タンパク質、好ましくは洗浄液１Ｌ当たり０．０５〜５ｍｇの酵素タンパク質、特に洗浄液１Ｌ当たり０．１〜１ｍｇの酵素タンパク質に相当する量で加えられ得ると考えられている。
【０１５９】
本発明の分枝酵素は、引用によって本明細書に組み入れられる、ＷＯ９７／０７２０２に開示されている洗剤調製物に追加として組み入れられ得る。
【０１６０】
使用
本発明はまた、分枝酵素活性を有するポリペプチドを用いる方法を述べる。例えば、本発明のポリペプチドは、デンプン又はデンプン含有材料の修飾のために使用され、その結果その様な材料の特性が向上し得る。
【０１６１】
分枝酵素で修飾され得る材料の例は全ての型（ジャガイモ、トウモロコシ、コムギ）の天然デンプン（未修飾型）、ロウ性デンプン、高アミロースデンプン、アミロース、アミロペクチン、デキストリンを含む化学的に修飾されたデンプン変換型デンプン、架橋型デンプン（ジスターチホスフェート）、デンプンエーテル及びデンプンエステル（酢酸デンプン、ヒドロキシアルキル化デンプン、オクテニルコハク酸デンプン）を含む。
【０１６２】
本発明の分枝酵素は、上述した様なデンプン様材料の修飾にとって有用であり、その結果、修飾された材料は、その意図される目的のために、例えばＵＳ  ４  ４５４  １６１に記載の様な食品生成物、例えば食品及び飲料組成物、食品添加物組成物、医薬製剤、サイジング剤、接着剤等の製造において一層適したものとなる。通常、分枝酵素で修飾した材料は、未修飾のデンプンと比較して高い溶解性、低い粘度及び老化しにくい傾向を有する。これらの特性は、デンプン様材料から調製した食品生成物の特性、特にその様な生成物の保存安定性を改良するために使用され得る。食品生成物の例は、パン、デザート、ケーキ、スナック菓子、ヌードル及びパスタ、ベビーフード、スポーツ飲料、冷凍又は冷蔵加工食品及びペットフードである。酵素的修飾は、食品生成物への添加前にデンプン様材料上で別々に、又は料理の前若しくは直後に酵素を食品材料に加え、食品を直接修飾することによって、そのいずれかで行われ得る。
【０１６３】
紙の表面のサイジング及びコーティングのために使用するデンプン溶液の高い溶解性、低い粘性及び良好な安定性は、ＥＰ  ０  ６９０  １７０に示した様なこれらの利用に、分枝酵素修飾型デンプンを関連づけるのに非常に重要である。
【０１６４】
本発明は以下の例によって更に説明されるが、これは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１６５】
例１
材料と方法
ロドサームス・オバメンシス（ＪＣＭ  ９７８５）は、理化学研究所微生物系統保存施設（日本国埼玉県和光市（３５１−０１９８））から入手した。
【０１６６】
分子クローニング技術は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【０１６７】
以下の市販のプラスミド／ベクターを使用した：
ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オランダ）
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、アメリカ）
ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オランダ）
【０１６８】
以下の菌株は、形質転換及びタンパク質の発現に使用した：
ＴＯＰ１０  Ｅ．コリ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オランダ）
Ｅ．コリ  ＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アメリカ）
【０１６９】
ＳＢ増殖培地（ＤＩＦＣＯ  ♯  ０１２３−１７−３）は、トリプトン／ペプトン、３２ｇ／Ｌ；酵母抽出物、２０ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ、５ｇ／Ｌ；５Ｎ  ＮａＯＨ、１ｍｌ／Ｌから構成されている。
【０１７０】
緩衝液及び基質として使用した化学薬品は、少なくとも試薬等級の市販の製品であった。
【０１７１】
分枝酵素活性
分枝酵素活性は、Ｔａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４），ｐ．３０９７（ａｓｓａｙ  Ａ）に記載されている方法の改良版に従い決定した：５０μｌの酵素溶液を５０μｌの基質溶液で混合し、そして試験温度で３０分間インキュベートする。基質溶液は、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液に溶解した０．１％のＩＩＩ型アミロースである。反応は、２ｍｌのヨウ素試薬の添加によって決定する。ヨウ素試薬は、０．５ｍｌの１Ｎ  ＨＣｌと混合した０．５ｍｌの保存液（０．２６ｇのＩ２及び２．６ｇのＫＩ／１０ｍｌの水）から毎日作り、そして１３０ｍｌに希釈する。混合物は、色を安定化するために室温で１５分間インキュベートする。活性は、試験する試料と、細胞抽出物を水で置換したコントロールとの間のＡ６６０の差異として測定する。１ユニットの分枝酵素活性は、６０℃、ｐＨ７．０で１分当たり１％ずつアミロースーヨウ素複合体のＡ６６０を低下させ得る酵素量として定義される。
【０１７２】
Ｒ．オバメンシスｇｌｇＢプローブの調製
プライマーａ）（配列番号３）及びｂ）（配列番号４）を設計し（報告されている細菌のｇｌｇＢ配列のアラインメントに基づく）、調製し、ロドサームス・オバメンシス由来のゲノムＤＮＡとのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用した。
【０１７３】
配列番号３、ＰＣＲプライマーａ）（上流）：
５′−ＧＡＧＣＡＣＣＣＣＹＴＣＧＡＣＧＧＣＡＧＴＴＧＧ−３′
【０１７４】
配列番号４、ＰＣＲプレイマーｂ）（下流）：
５′−ＣＡＴＣＣＡＩＣＣＷＡＫＲＴＴＣＣＡ−３′
【０１７５】
Ｉ＝イノシン
Ｋ＝Ｇ又はＴ
Ｒ＝Ａ又はＧ
Ｗ＝Ａ又はＴ
Ｙ＝Ｃ又はＴ
【０１７６】
反応成分を混合し〔１×緩衝液（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｊａｐａｎ）中、ゲノムＤＮＡ、０．１ｎｇ／μｌ；ｄＮＴＰ各０．１２５ｍＭ；Ｍｇ２＋、２．５ｍＭ；プライマー、各２ｐＭ；Ｔａｑポリメラーゼ０．０２５Ｕ／μｌ〕、そして以下の条件下でのＰＣＲに適用した：
【表１】
0004732591.tif 000002
【０１７７】
ＰＣＲ反応混合物をアガロースゲル上で分離し、そして増幅したＰＣＲフラグメントの予想されるサイズをＥ．コリｇｌｇＢの配列データから計算し、約５５０ｂｐとした。これらのフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｊａｐａｎ）でゲル精製し、そして次に、Ｔａｋａｒａライゲーションキットバージョン２（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅベクターにライゲーションした。ライゲーション混合物をフェノール／クロロホルムで精製し、そして次にエレクトロポレーションによってＥ．コリＤＨ１２Ｓを形質転換した。得られた形質転換体由来のプラスミド（ｐＭＳｒａ８）を制限酵素で調べ、ロドサームス・オバメンシスｇｌｇＢのインサートのサイズを確認した。
【０１７８】
Ｒ．オバメンシスｇｌｇＢ遺伝子のクローニング
Ｒ．オバメンシスｇｌｇＢプローブとして、ｐＭＳｒａ８の挿入フラグメントを用いて、サザンハイブリダイゼーションをＲ．オバメンシス由来のゲノムＤＮＡ上で行い、サブクローンを生成するのに便利な制限酵素を選択した。３．５ｋｂのハイブリダイズしたＢａｍＨＩフラグメントをｇｌｇＢのサブクローンのために選択した。その結果、Ｒ．オバメンシスのゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、そしてサイズごとに分画したＤＮＡをアガロースゲルから切り出し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）にクローン化した。ＢａｍＨＩのサブライブラリーは、ライゲーションしたクローンがＥ．コリＤＨ１２Ｓ細胞を形質転換することによって行われた。コロニーの拾い上げは、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｊａｐａｎ）を用いて、ＢａｍＨＩのサブライブラリーの形質転換体上で行い、そして次にＤＩＧ標識したＲ．オバメンシスｇｌｇＢプローブにハイブリダイズした。ポジティブコロニーを突き、そしてインサートをＰＣＲで調べた。選択したコロニー由来のプラスミドを調製し、そして配列決定することによって３．５ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントがｇｌｇＢ（ｐＭＳｒａ１０）の５′末端を失っていることが明らかになった。従って、Ｋｐｎｌ及びＳａｌＩで２回消化したＲ．オバメンシスのゲノムＤＮＡから作製した別のサブライブラリーを、Ｒ．オバメンシスｇｌｇＢプローブでスクリーニングし、Ｒ．オバメンシスｇｌｇＢ（ｐＭＳｒａ２９）の５′末端を回収した。構造ｇｌｇＢの全配列は、ｐＭＳｒａ１０及びｐＭＳｒａ２９から入手し、そして全ｇｌｇＢ遺伝子の増幅のためのＰＣＲプライマー（配列番号５及び配列番号６）をこの配列から設計した。
【０１７９】
発現ベクターの構築
それぞれＢｓｐＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素部位を含むプライマーｃ）（配列番号５）及びｄ）（配列番号６）を用いて、全ｇｌｇＢ遺伝子をロドサームス・オバメンシスのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した（ＰＣＲ反応の間の変異を避けるために、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＭａｎｎｈｅｉｍのＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙを使用した）。ＢｓｐＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにするＰＣＲ増幅したフラグメントの切り出しは、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＡへの一方向のクローニングを可能にした。生じたベクターｐＭＳｒａ３３は、ＴＯＰ１０  Ｅ．コリにおける形質転換及びアラビノースによる誘導後にＲ．オバメンシスの分枝酵素を生成した。
【０１８０】
配列番号５、プライマーｃ）；ロドサームス・オバメンシスｇｌｇＢ遺伝子の増幅のためのプライマー（上流）。下線を引いたヌクレオチドが、ＢｓｐＨＩ部位を導入する
５′−ＴＴＣＣＴＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＡＧＡＡＧＡＣＡ−３′
【０１８１】
配列番号６、プライマーｄ）；ロドサームス・オバメンシスｇｌｇＢ遺伝子の増幅のためのＰＣＲプライマー（下流）。下線を引いたヌクレオチドがＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入する：
５′−ＧＴＴＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＧＧＡＣＧＧＣＴＡＣＣ−３′
【０１８２】
生物学的寄託ＤＳＭ  １２６０７
完全なロドサームス・オバメンシスｇｌｇＢ遺伝子を有するプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ（配列番号１）も、Ｅ．コリ  ＤＨ１２Ｓを形質転換させ、これはＤＳＭ  １２６０７としてＤＳＭＺに寄託された（生物学的材料の寄託に記載）。
【０１８３】
タンパク質の発現
Ｒ．オバメンシスの分枝酵素は、ｐＭＳｒａ３３で形質転換したＴＯＰ１０
Ｅ．コリの菌株において異種的に発現した。前記Ｅ．コリの細胞は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを有するＳＢ培地で、２８℃で一晩インキュベートした。０．０００２％のアラビノースを発現の誘導のために加えた。細胞は遠心によって遠心沈澱し、そして２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で再懸濁した。緩衝液の量は、増殖培地の１／２０に相当する。次に、細胞を超音波処理し、そして細片を遠心によって除去した。
【０１８４】
Ｅ．コリからの内因性アミロース分解活性の除去
Ｅ．コリの抽出物から全ての内因性アミロース分解酵素活性を除去することによって、発現した分枝酵素活性を検出するために、ヨウ素法（Ｔａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４），ｐ．３０９７）を使用することが可能になる。従って、ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＡベクターを有し、そしてｇｌｇＢのインサートを持たない（ネガティブコントロール）宿主Ｅ．コリの菌株から、内因性のアミロース分解活性を除くために熱処理が使用できるかどうかを試験した。結果は、６０℃／２０分の処理が、Ｔａｋａｔａ等によって記述されたアミロースーヨウ素アッセイで測定されるバックグラウンドのアミロース分解活性を熱で消滅させるのに十分であり、この中で活性は検出されなかったことを示した。
【０１８５】
Ｒ．オバメンシスの分枝酵素変異体Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐの部分精製
発現したＲ．オバメンシスの分枝酵素の配列決定は、配列番号２の成熟アミノ酸配列と比較して、２つの変化がＰＣＲ反応の間に導入されたことを明らかにした：
ａ）Ｔｙｒ３９７はＣｙｓ３９７へと変化した。
ｂ）Ｌｅｕ４１９はＰｒｏ４１９へと変化した。
この分枝酵素変異体は、以降「Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐ」と表す。
【０１８６】
Ｅ．コリで発現した、置換Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐを有するＲ．オバメンシスの分枝酵素はイオン交換及びハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーによって部分的に精製した。熱処理した細胞抽出物を透析し、そしてＳｕｐｅｒ−Ｑ  Ｔｏｙｏｐｅａｌ（２２ｍｍ×２００ｍｍ、ＴＯＳＯＨ）にかけ、続いて０〜０．６Ｍ  ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）の直線勾配で溶出した。分枝酵素活性を有する画分を回収し、そしてＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｔｙｐｅ  Ｉ（１４ｍｍ×１００ｍｍ、ＢｉｏＲａｄ）にかけ、続いて５〜４００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）の勾配で溶出した。活性を示す画分を回収した。それは、クーマシーブリリアントブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、わずかなバンドと一緒に、１つの主要なバンドを示した。
【０１８７】
分枝結合の形成
α−１，６−分枝結合の形成は、分枝結合アッセイの改良版（ＢＬ  ａｓｓａｙ，Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４０  ２５３−２６０（１９９３））によって確認した。
使用した基質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解した０．５％のＩＩＩ型アミロース（Ｓｉｇｍａ）である。基質（９０μｌ）及び酵素溶液（１０μｌ）を混合し、そして６０℃で３０分間インキュベートし、続いて反応を４分間の煮沸によって停止させた。１０μｌの１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．１）の添加後、５μｌのイソアミラーゼ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｈａｙａｓｈｉｂａｒａ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）又は５μｌの脱イオン水のいずれかを反応混合物に加えた。それを４５℃で４５分間インキュベートした。続いて、反応液を４６０μｌの氷冷エタノールに加え、そして氷上で１０分間保持した、沈澱した糖を１２，０００ｒｐｍで５分間の遠心によって回収し、そして一旦真空で乾燥させ、続いて８μｌの１Ｎ  ＮａＯＨ及び２９２μｌの脱イオン水中で再び溶解した。溶液の還元力は、改良型の３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法（Ｌｕｃｈｓｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏｒｎｅｓｋｙ，１９６２）を用いて測定した。ＤＮＳ溶液は、最初に１０ｍｌの２Ｎ  ＮａＯＨに０．０５ｇの３，５−ジニトロサリチル酸を溶解し、続いて３ｇのロッシェル塩を溶液に加え、そして最後に全量を脱イオン水で１５ｍｌに調整することで調製した。試料溶液（０．２〜０．３ｍｌ）を０．４ｍｌのＤＮＳ溶液と混合し、そして５分間煮沸した。流水による冷却の後、１．８ｍｌの水を反応混合物に加え、そして５２５ｎｍでの吸光度を測定した。還元末端の量は、グルコース量に等しいとして推定した。部分的に精製したＹ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐの試料は、分枝結合の形成の測定のために使用した。表５に示す様に、還元末端はイソアミラーゼ処理によって生成し、示したα−１，６分枝結合はＹ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐによって形成した。
【表２】
0004732591.tif 000003
【０１８８】
例２
分枝酵素変異体Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐについての温度及びｐＨの効果
至適温度及びｐＨを、分枝酵素変異体Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐについて評価した（例１に記載）。
【０１８９】
分枝酵素活性測定に使用したアッセイは、材料と方法に記載した様に行った。Ｒ．オバメンシスの分枝酵素を発現しているＥ．コリ由来の内因性アミロース分解活性を避けるために、細胞抽出物は６０℃で少なくとも２０分間、あらかじめ加熱し、そして細片は遠心によって除去した。続いて、あらかじめ加熱した細胞抽出物をアッセイにかけ、そして分枝酵素活性について解析した。
【０１９０】
至適ｐＨアッセイにおいて、異なる緩衝液を使用して基質溶液を調製した：
ｐＨ＜４        ０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム
４＜ｐＨ＜６    ０．１Ｍ  酢酸ナトリウム
６＜ｐＨ＜１０  ０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ
ｐＨ＞１０      ０．１Ｍ  グリシルグリシン
【０１９１】
酵素（Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐ）を、指示温度で３０分間、ｐＨ７．０でインキュベートした。分枝酵素活性は上述の様に測定した。実験は少なくとも三回一組で行った；平均値及び標準偏差を以下の表２及び表３に示す。
【０１９２】
データは、Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐの至適温度が約６５℃であることを示している。
【表３】
0004732591.tif 000004
【表４】
0004732591.tif 000005
【０１９３】
ｐＨの活性実験は６０℃で行い、そして酵素を３０分間インキュベートした。実験は少なくとも三回一組で行い；平均値及び標準偏差は以下の表４に示す。データは、Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐが約ｐＨ５〜約ｐＨ８の広範な至適ｐＨを有することを示している。
【表５】
0004732591.tif 000006
【０１９４】
例３
分枝酵素変異体Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐによるシクロデキストリンの調製
コメアミロペクチン（Ｍｏｔｙｌ  Ｂ，Ｓｈｉｍａｄａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｊａｐａｎ）を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）中の、置換Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐを有するＲ．オバメンシスの分枝酵素（例１に記載）（４００ユニット／ｇ  デンプン）で、５０℃で１８時間処理した。１５，０００ｒｐｍでの１０分間の遠心による細片の除去後、２倍量のエタノールを溶液に加え、そして沈澱したデキストリンを回収し、そして乾燥させた。約６７ｇのデキストリンを、１００ｇのコメアミロペクチンから得た。分子内分枝結合が酵素処理によって起きたならば、グルコアミラーゼに耐性があるシクロデキストリンが得られるはずである。１ｇの上述したデキストリンを、１５００ユニットのグルコアミラーゼ（リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ種、Ｗａｋｏ  ＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｊａｐａｎ））で、ｐＨ４．１、４０℃で１８時間処理し、そして生じたデキストリンをエタノールによって回収した。約２００ｍｇのデキストリンを得た。酸α−アミラーゼの存在下での処理によって、デキストリンは得られなかった。グルコアミラーゼ耐性デキストリンは、グルコアミラーゼ単独（０．９ユニット／ｇデキストリン）又はグルコアミラーゼとイソアミラーゼの組合わせ（それぞれ０．９ユニット及び２９ユニット／ｇデキストリン）を用いて、ｐＨ４．５、４０℃で１６時間再び処理した。その結果、９０％のデキストリンがグルコアミラーゼ単独で回収され、一方、わずかに１０％のデキストリンが、イソアミラーゼの存在下での処理後に残った。これは、環状デキストリンがＹ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐによって触媒される分子内α−１，６−分枝結合によって形成したことを示した。
【０１９５】
例４
アスペルギルスにおけるＲ．オバメンシスの発現
宿主生物
アスペルギルス・オリザエＢＥＣｈ２は、デンマーク特許出願ＰＡ  １９９９  ０１７２６に記載されている。これは、ＩＦＯ４１７７の変異体である、ＪａＬ２２８の変異体（ＷＯ９８／１２３０００に記載）である。
【０１９６】
Ａ．オリザエの形質転換
アスペルギルス・オリザエの菌株ＢＥＣｈ２を１００ｍｌのＹＰＧ培地に接種し、そして８０ｒｐｍで撹拌しながら３２℃で１６時間インキュベートした。生育した菌糸を濾過によって回収し、０．６Ｍ  ＫＣｌで洗浄し、そしてＧｌｕｃａｎｅｘ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋより入手可）を３０μｌ／ｍｌの濃度で含む３０ｍｌの０．６Ｍ  ＫＣｌ中で再懸濁した。混合物は、プロトプラストが形成するまで、６０ｒｐｍで撹拌しながら３２℃でインキュベートした。残った菌糸を除去するための濾過後、プロトプラストを遠心によって回収し、そしてＳＴＣ緩衝液で２回洗浄した。プロトプラストはヘマタイトメーター（ｈｅｍａｔｉｔｏｍｅｔｅｒ）で計数し、そしてＳＴＣ：ＳＴＰＣ：ＤＭＳＯの溶液（８：２：０．１）中で１．２×１０７プロトプラスト／ｍｌの最終濃度に再懸濁した。約４μｇのＤＮＡを１００μｌのプロトプラストに加え、穏やかに混合し、そして氷上で３０分間インキュベートした。１μｌのＳＴＰＣ緩衝液を混合物に加え、そして３７℃で更に３０分間インキュベートした。５０℃であらかじめ暖めた１０ｍｌのＣｏｖｅのトップアガロースの添加後、反応混合物をＣＯＶＥのアガープレートに注いだ。プレートは、３２℃で５日間又は形質転換体が出現するまでインキュベートした。
【０１９７】
培地及び緩衝溶液
ＣＯＶＥ：１Ｌ当たり、３４２．３ｇのスクロース、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、１０ｍＭのアセトアミド、１５ｍＭのＣｓＣｌ２、３０ｇのアガーノーブル（Ｄｉｆｃｏ）。
ＣＯＶＥ塩溶液：１Ｌ当たり、２６ｇのＫＣｌ、２６ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、７６ｇのＫＨ２ＰＯ４、５０ｍｌのＣｏｖｅ微量金属。
Ｃｏｖｅ微量金属：１Ｌ当たり、０．０４ｇのＮａＢ４Ｏ７−１０Ｈ２Ｏ、０．４ｇのＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ、１．２ｇのＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、０．７ｇのＭｎＳＯ４−Ｈ２Ｏ、０．７ｇのＮａ２ＭｏＯ２−２Ｈ２Ｏ、０．７ｇのＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ。
ＡＭＧ微量金属：１Ｌ当たり、１４．３ｇのＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、２．５ｇのＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＮｉＣｌ２、１３．８ｇのＦｅＳＯ４、８．５ｇのＭｎＳＯ４、３．０ｇのクエン酸。
ＹＰＧ：１Ｌ当たり、４ｇの酵母抽出物、１ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇのＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、５ｇのグルコース、ｐＨ６．０。
ＳＴＣ：０．８Ｍソルビトール、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、２５ｍＭ  ＣａＣｌ２。
ＳＴＰＣ：４０％  ＰＥＧ４０００／ＳＴＣ緩衝液。
Ｃｏｖｅトップアガロース：１Ｌ当たり、３４２．３ｇのスクロース、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、１０ｍＭのアセトアミド、１０ｇの低融点アガロース。
ＭＳ−９：１Ｌ当たり３０ｇのダイズ粉末、２０ｇのグリセロール、ｐＨ６．０。ＭＤＵ−２Ｂｐ：１Ｌ当たり、４５ｇのマルトース−１Ｈ２Ｏ、７ｇの酵母抽出物、１２ｇのＫＨ２ＰＯ４、１ｇのＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、２ｇのＫ２ＳＯ４、５ｇの尿素、１ｇのＮａＣｌ、０．５ｍｌのＡＭＧ微量金属溶液ｐＨ５．０。
【０１９８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング
ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動は、市販のゲルＰＡＧＥＬ  ＡＥ６０００  ＮＰＵ−７．５Ｌ（７．５Ｔ％）を、装置ＡＥ−６４００（Ａｔｔｏ，Ｊａｐａｎ）と一緒に用い、提供されたプロトコールに従い行った。ゲルにおいて分離したタンパク質は、ＡＥ−６６７７  Ｈｏｒｉｚｏｎ  ｂｌｏｔ（Ａｔｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、Ｃｌｅａｒ  Ｂｌｏｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ｐ  ＡＥ−６６５５（Ａｔｔｏ，Ｊａｐａｎ）にトランスファーした。タンパク質の検出は、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｌｏｔ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。
【０１９９】
アスペルギルスのためのＲ．オバメンシスｇｌｇＢの発現プラスミドの構築
Ｒ．オバメンシスｇｌｇＢ遺伝子は、各末端に制限酵素部位ＢｇＩＩＩ及びＸｈｏＩを導入するために、プライマーセットａ）及びｂ）、又はａ）及びｃ）を用いて、Ｒ．オバメンシスのゲノムＤＮＡから増幅した。プライマーｃ）は、Ｃ末端のｇｌｇＢにおいてＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを含んで成るｃ−ｍｙｃエピトープの配列を与える。
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【０２００】
反応成分、すなわち４０ｎｇのＲ．オバメンシスの染色体ＤＮＡ、Ｅｘｐａｎｄ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）の３００ｐｍｏｌの各プライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ及び２．６ユニットのＤＮＡポリメラーゼを、提供されている緩衝液中で混合し、そして以下の条件下でＰＣＲにかけた。
【表６】
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【０２０１】
増幅した１．９ｋｂのフラグメントをＱＩＡ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、そしてＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩでの消化後、それをＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化したｐＣａＨｊ４８３にライゲーションした。プラスミドｐＣａＨｊ４８３は、アスペルギルス・ニガーの中性アミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニジュランスのＴＰＩリーダー配列、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼターミネーター及びマーカーとしてアスペルギルス・ニジュランスのａｍｄＳ遺伝子を有する。プライマーセットａ）及びｂ）で得られたプラスミドはｐＩＨ２８と命名され、そしてプライマーセットａ）及びｃ）で得られたものをｐＩＨ２９と表した。
【０２０２】
Ａ．オリザエにおけるＲ．オバメンシスｇｌｇＢの発現
発現プラスミド、ｐＩＨ２８及びｐＩＨ２９をＮｏｔＩで消化し、そして生じたＲ．オバメンシスｇｌｇＢの発現カセットを含む６ｋｂのフラグメントをＱＩＡ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて精製した。Ａ．オリザエＢＥＣｈ２は各フラグメントで形質転換され、そして選択のポジティブな形質転換体を単離した。形質転換体は５００ｍｌの振とうフラスコ中の１００ｍｌのＭＳ−９に接種し、そして３２℃で１日間培養し、そして３ｍｌの各培養物を振とうフラスコ中の１００ｍｌのＭＤＵ−２Ｂｐに移し、３２℃で２〜３日間培養した。増殖した細胞は３５００ｒｐｍで１５分間の遠心によって採集した。約０．１ｇの回収した細胞を、１００μｌの２倍濃度の試料添加緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２００ｍＭのジチオスレイトール、４％  ＳＤＳ、０．２％のブロモフェノールブルー及び２０％グリセロール）中で懸濁し、そして５分間煮沸した。１４０００ｒｐｍで５分間の遠心後、１０μｌの上清をポリアクリルアミドゲルに載せ、そしてランニング緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１％  ＳＤＳ、１９２ｍＭグリシン）中での、ゲル当たり２０ｍＡの電気泳動にかけた。そのゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。ポジティブな形質転換体は、Ｒ．オバメンシスｇｌｇＢの予想されるサイズ、７２ｋＤａのタンパク質のバンドを示した。ｃ−ｍｙｃタグを有する形質転換体の抽出物を載せたゲルは、一次抗体として抗ｍｙｃ抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び二次抗体として抗マウスＩｇＧ（ｓｉｇｍａ）を用いてウェスタンブロッティングにかけた。ポジティブなシグナルは、７２ｋＤａに相当する位置で得られた。
【０２０３】
例５
Ｒ．オバメンシスの分枝酵素アッセイ並びに温度及びｐＨの効果
宿主菌株由来の内因性アミラーゼ活性を不活性化するために、細胞抽出物を６８℃で３０分加熱した。活性は上述の様に測定した。
【０２０４】
ｐＨの活性プロファイルは６５℃で測定し、そして温度の活性プロファイルはｐＨ７で得た。実験は二回一組又は三回一組のいずれかで行い、そして平均及び標準偏差を以下に示す。
【０２０５】
温度安定性は、次の様にｃ−ｍｙｃタグ無しの、Ｒ．オバメンシスの分枝酵素上で測定した；３０〜５０ユニット／ｍｌ（ｐＨ７）を含む酵素溶液を異なる温度で３０分間インキュベートし、そして続いて残りの分枝酵素活性を測定した。
【０２０６】
データは、Ｒ．オバメンシスの分枝酵素の至適ｐＨ及び温度がそれぞれ約ｐＨ７及び６５℃であることを示唆している。ｃ−ｍｙｃタグの存在は、ｐＨ及び温度のプロファイルに影響を与えなかった。
【表７】
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【表８】
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【表９】
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【０２０７】
生物学的材料の寄託
プラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ内に挿入されたロドサームス・オバメンシス由来の分枝酵素遺伝子（例１を参照のこと）を含むＥ．コリのクローンは、ブダペスト条約の名のもと、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ，Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託され、そして次の寄託番号が与えられた：
寄託                  寄託番号              寄託日
ＮＭＯ４９４４３      ＤＳＭ１２６０７      １９９８年１２月２３日
【０２０８】
前記菌株は、米国特許法施行規則第１．１４条及び米国特許法第１２２条のもとでそれらを名付けるために、特許商標庁長官によって決定されるものにとって、この特許出願の審査の間、前記培養物の入手が可能であることを保証する条件のもとで寄託された。前記寄託は、寄託した菌株の実質的に純粋な培養物を表す。前記寄託は、従属する出願の対応物、又はその孫が提出されている国の外国特許法によって必要とされる場合に入手可能である。しかし、寄託の入手可能性が、政府の指令によって付与される特許権の減損における従属発明を実施する許可を構成しないと理解すべきである。
【０２０９】
本明細書に記載され、そして請求された発明が、本明細書で開示した具体的な態様によって範囲を限定されないのは、これらの態様が本発明の複数の観点の例示として意図されているためである。いずれかの等しい態様が、本発明の範囲内であることが意図されている。実際、本明細書に示し、そして記載したものに加えて、本発明の様々な変更が前述の説明から当業者に明らかとなるだろう。その様な変更は更に、特許請求の範囲に含まれることも意図されている。抵触する場合、定義を含む本開示が調節するだろう。
【０２１０】
様々な引用を本明細書に列記しており、これらの開示は引用によってそれら全体が組み入れられる。
【配列表】
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