(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶの機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法であって、ＨＩＶは哺乳類宿主細胞を感染させており、該宿主細胞の膜イオンチャネル機能活性をダウンレギュレートするのに充分な時間および条件下、該哺乳類に、５−（Ｎ,Ｎ−ヘキサメチレン）−アミロライドおよび５−（Ｎ,Ｎ−ジメチル）−アミロライドよりなる群から選択される有効量の剤を投与し、ここに、哺乳類にヒトが含まれないことを特徴とする該方法。
【請求項２】
該膜イオンチャネルがＶｐｕイオンチャネルである請求項１記載の方法。
【請求項３】
該ＨＩＶ機能活性がＨＩＶ複製である請求項１記載の方法。
【請求項４】
該宿主細胞がマクロファージである請求項３記載の方法。
【請求項５】
該宿主細胞が単球である請求項３記載の方法。
【請求項６】
該剤が構造：
【化１】
0004624562.tif 000010
を含む請求項１〜５いずれか１に記載の方法。
【請求項７】
該剤が構造：
【化２】
0004624562.tif 000011
を含む請求項１〜５いずれか１に記載の方法。
【請求項８】
哺乳類におけるＨＩＶ感染またはＡＩＤＳを治療および／または予防する方法であって、該方法は、ＨＩＶ感染した哺乳類宿主細胞のＶｐｕイオンチャネル機能活性をダウンレギュレートするのに充分な時間および条件下、該哺乳類に、５−（Ｎ,Ｎ−ヘキサメチレン）−アミロライドおよび５−（Ｎ,Ｎ−ジメチル）−アミロライドよりなる群から選択される有効量の剤を投与し、ここに、該Ｖｐｕ機能活性が該ＨＩＶの機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害し、ここに、哺乳類にヒトが含まれないことを特徴とする該方法。
【請求項９】
該ＨＩＶ機能活性がＨＩＶ複製である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該宿主細胞がマクロファージである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該宿主細胞が単球である請求項９記載の方法。
【請求項１２】
該剤が構造：
【化３】
0004624562.tif 000012
を含む請求項８〜１１いずれか１に記載の方法。
【請求項１３】
該剤が構造：
【化４】
0004624562.tif 000013
を含む請求項８〜１１いずれか１に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳類におけるＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳの治療的および／または予防的処置用の剤であって、５−（Ｎ,Ｎ−ヘキサメチレン）−アミロライドおよび５−（Ｎ,Ｎ−ジメチル）−アミロライドよりなる群から選択され、ＨＩＶ感染した細胞のＶｐｕイオンチャネル機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害することを特徴とする剤。
【請求項１５】
該機能活性がＨＩＶ複製の媒介である請求項１４記載の剤。
【請求項１６】
構造：
【化５】
0004624562.tif 000014
を含む請求項１４または１５記載の剤。
【請求項１７】
構造：
【化６】
0004624562.tif 000015
を含む請求項１４または１５記載の剤。
【請求項１８】
対象におけるＶｐｕイオンチャネル機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法であって、Ｖｐｕイオンチャネル機能活性を阻害するのに充分な時間および条件下、該対象に、５−（Ｎ,Ｎ−ヘキサメチレン）−アミロライドおよび５−（Ｎ,Ｎ−ジメチル）−アミロライドよりなる群から選択される有効量の剤を投与し、ここに、哺乳類にヒトが含まれないことを特徴とする該方法。
【請求項１９】
該Ｖｐｕイオンチャネル機能活性がＨＩＶ複製のＶｐｕイオンチャネル機能活性である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
該剤が構造：
【化７】
0004624562.tif 000016
を含む請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
該剤が構造：
【化８】
0004624562.tif 000017
を含む請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２２】
Ｖｐｕイオンチャネル機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害するのに用いる、５−（Ｎ,Ｎ−ヘキサメチレン）−アミロライドおよび５−（Ｎ,Ｎ−ジメチル）−アミロライドよりなる群から選択される剤。
【請求項２３】
該Ｖｐｕイオンチャネル機能活性がＨＩＶ複製の媒介である請求項２２記載の剤。
【請求項２４】
構造：
【化９】
0004624562.tif 000018
を含む請求項２２または２３記載の剤。
【請求項２５】
構造：
【化１０】
0004624562.tif 000019
を含む請求項２２または２３記載の剤。
【請求項２６】
Ｖｐｕイオンチャネル機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害するのに使用する医薬組成物であって、５−（Ｎ,Ｎ−ヘキサメチレン）−アミロライドおよび５−（Ｎ,Ｎ−ジメチル）−アミロライドよりなる群から選択される剤ならびに１以上の医薬上許容される担体ならびに／または希釈剤を含む該組成物。
【請求項２７】
該剤が構造：
【化１１】
0004624562.tif 000020
を含む請求項２６記載の医薬組成物。
【請求項２８】
該剤が構造：
【化１２】
0004624562.tif 000021
を含む請求項２６記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般に、ウイルス性機能活性を遅延させ、低下させ、さもなければ、阻害する方法に関し、より詳しくは、Ｖｐｕイオンチャネル機能活性をダウンレギュレートすることによって、ウイルス性機能活性を遅延させ、低下させ、さもなければ、阻害する方法に関する。一層より詳しくは、本発明は、Ｖｐｕイオンチャネル媒介ＨＩＶ複製を阻害することによって、ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳを治療する方法を提供する。
【０００２】
【発明の背景】
この明細書中で引用されたアルファベット順の刊行物の参考文献の詳細を説明の終わりにまとめた。
【０００３】
現在、ＨＩＶ感染に対して完全に有効な単一の治療方法はない。ＨＩＶ複製の多数の異なる局面を標的する薬物を用いた複合治療はＡＩＤＳ症状を改善し、余命を延長化するのに最も有効な方法であることが証明されている［Barry, et al., 1998; Deeks, 1998; Miles,1997; Miles, 1998; Moyle et al., 1998; Rachlis and Zarowny, 1998; Vell et al., 1997; Volberding and Deeks, 1998;および Volberdin, 1998］。例えば、成功した手段は、ウイルス性逆転写酵素およびタンパク質分解酵素を標的する薬物で達成された［Miller and Sarver, 1997; Mitsuya, 1992; Moore, 1997; および Thomas and Brady, 1997］。
【０００４】
タンパク質ＶｐｕはＨＩＶによってコード化されるイオンチャネルを形成し、ＣＤ４ウイルス受容体分子の細胞表面発現のダウンレギュレーション、小胞体からのｇｐ１６０流出の制御および該細胞表面へのその運搬および該細胞表面膜からのビリオン出芽の調節を含むウイルス寿命サイクルにおいて、多数の知られた役割を有する。Ｖｐｕの不存在下、ＨＩＶ複製は、単球およびマクロファージにおいて激しく遅延されることが示されている［Balliet et al., 1994; Westervelt et al., 1992］。それにもかかわらず、Ｖｐｕは、ＨＩＶの「アクセサリー」タンパク質と名付けられている。何故ならば、生体外でのウイルス複製に関し、その知られた機能はいずれも重要ではなさそうだからである。
【０００５】
ＨＩＶ感染を治療し、予防する可能性を向上させるため、ＨＩＶ寿命サイクルの様々な局面を阻害することが可能な分子を同定するという目下の必要がある。本発明につながる研究において、驚くべきことに、本発明者らは、現在の定説にも関わらず、ウイルス複製（および、特にＨＩＶ複製）は、Ｖｐｕイオンチャネル機能を阻害するか、さもなければ、ダウンレギュレートすることによって、遅延させ得ると決定した。さらに、本発明者らは、薬物アミロライドはＨＩＶに対してなんら影響を有しないが、当該ピラジンの５位に位置するＨ２Ｎ基が置換されているアミロライド・アナログがＶｐｕ機能を阻害し、それにより、ＨＩＶ寿命サイクルの継続を阻害することも決定した。
【０００６】
【発明の概要】
本明細書および特許請求の範囲を通して、断りがなければ、「含む（comprise）」なる語、および「含む（comprises）」および「含んでいる（comprising）」のごとき変形は、言明された整数もしくはステップ、または整数もしくはステップの群を包含するが、その他のいかなる整数もしくはステップ、または整数もしくはステップの群の排除を意味しないものと理解される。
【０００７】
本明細書は、プログラムＰａｔｅｎｔＩｎバージョン２．０を用いて作成されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列情報を含有し、本明細書の参考文献一覧の後に示す。各ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、配列表において、数値表示＜２１０＞に続く配列認識番号（例えば、＜２１０＞１、＜２１０＞２など）によって認識される。各ヌクレオチドまたはアミノ酸配列につき、長さ、配列型（ＤＮＡ、タンパク質（ＰＲＴ）など）および起源生体は、それぞれ、数値表示フィールド＜２１１＞、＜２１２＞および＜２１３＞に共される情報により示される。本明細書中に引用されるヌクレオチドおよびアミノ配列は、数値表示フィールド＜４００＞に続く配列認識番号（例えば、＜４００＞１、＜４００＞２など）に共される情報により規定される。
【０００８】
本発明の一つの局面は、ウイルスの機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法を提供し、ここに、ウイルスは哺乳類宿主細胞を感染させており、該方法は、該宿主細胞の膜イオンチャネル機能活性をダウンレギュレートするのに充分な時間および条件下、該哺乳類に有効量の剤を投与することを特徴とする。
【０００９】
本発明のもう一つの局面は、より詳しくは、ＨＩＶの機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法を提供し、ＨＩＶは哺乳類宿主細胞を感染させており、該方法は、該宿主細胞のＶｐｕイオンチャネル機能活性をダウンレギュレートするのに充分な時間および条件下、該哺乳類に有効量の剤を投与することを特徴とする。
【００１０】
本発明のさらにもう一つの局面は、ＨＩＶ複製を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法を提供し、ＨＩＶは哺乳類を感染させており、該方法は、該宿主細胞のＶｐｕイオンチャネル機能活性をダウンレギュレートするのに充分な時間および条件下、該哺乳類に有効量の剤を投与することを特徴とする。
【００１１】
本発明のなおもう一つの局面は、ＨＩＶの機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法を提供し、ＨＩＶは哺乳類マクロファージを感染させており、該方法は、該マクロファージのＶｐｕイオンチャネル機能活性をダウンレギュレートするのに充分な時間および条件下、該哺乳類に有効量の剤を投与することを特徴とする。
【００１２】
本発明のさらになおもう一つの局面は、ＨＩＶ複製を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法を提供し、ＨＩＶは哺乳類宿主細胞を感染させており、該方法は、Ｖｐｕイオンチャネル機能活性を阻害するのに充分な時間および条件下、該宿主細胞に有効量のアミロライド・アナログまたはその機能相当物を接触させることを特徴とする。
【００１３】
本発明のさらなる局面は、ＨＩＶ複製を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法を提供し、ＨＩＶは哺乳類宿主細胞を感染させており、該方法は、ＨＩＶ複製のＶｐｕイオンチャネル媒介を阻害するのに充分な時間および条件下、該宿主細胞に有効量のＨＭＡまたはその機能相当物を接触させることを特徴とする。
【００１４】
本発明のもう一つのさらなる局面は、ＨＩＶ複製を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法を提供し、ＨＩＶは哺乳類宿主細胞を感染させており、該方法は、ＨＩＶ複製のＶｐｕイオンチャネル媒介を阻害するのに充分な時間および条件下、該宿主細胞に有効量のＤＭＡまたはその機能相当物を接触させることを特徴とする。
【００１５】
本発明のさらにもう一つのさらなる局面は、哺乳類におけるＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの治療および／または予防の方法を提供し、該方法は、ＨＩＶ感染した哺乳類宿主細胞のＶｐｕイオンチャネル機能活性をダウンレギュレートするのに充分な時間および条件下、該哺乳類に有効量の剤を投与することを特徴とし、ここに、該Ｖｐｕ機能活性ダウンレギュレーションは、該ＨＩＶの機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する。
【００１６】
本発明のさらになおもう一つのさらなる局面は、哺乳類におけるＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの治療および／または予防の方法を提供し、該方法は、ＨＩＶ感染した哺乳類宿主細胞のＶｐｕイオンチャネル機能活性をダウンレギュレートするのに充分な時間および条件下、該哺乳類に有効量の剤を投与することを特徴とし、ここに、該Ｖｐｕ機能活性ダウンレギュレーションは、ＨＩＶ複製を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する。
【００１７】
本発明の別の局面は、対象における膜イオンチャネル機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法を提供し、該方法は、膜イオンチャネル機能活性を阻害するのに充分な時間および条件下、該対象に有効量のアミロライド・アナログまたはその機能相当物を投与することを特徴とする。
【００１８】
本発明のなお別の局面は、哺乳類におけるＶｐｕイオンチャネル機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法を提供し、該方法は、Ｖｐｕイオンチャネル機能活性を阻害するのに充分な時間および条件下、該対象に有効量のアミロライド・アナログまたはその機能相当物を投与することを特徴とする。
【００１９】
本発明のさらに別の局面は、哺乳類におけるＨＩＶ複製のＶｐｕイオンチャネル媒介を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法を提供し、Ｖｐｕイオンチャネル機能活性を阻害するのに充分な時間および条件下、該哺乳類に有効量のアミロライド・アナログまたはその機能相当物を投与することを特徴とする。
【００２０】
本発明のさらになお別の局面は、上に定義したＶｐｕイオンチャネル機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害するのに有用な剤を提供する。
【００２１】
本発明のさらにもう一つの局面は、Ｖｐｕイオンチャネル機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害するのに用いられ、上に定義した剤および１以上の医薬上許容される担体および／または希釈剤を含む組成物を提供する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明は、宿主細胞がＶｐｕイオンチャネルを発現させるウイルス、特にＨＩＶの複製をこのイオンチャネルの機能を阻害することによって遅延させ得るという驚くべき確認に、部分的に根拠を置く。さらに、アミロライドはＨＩＶ複製に何ら影響を有しないが、アミロライド・アナログは、Ｖｐｕイオンチャネル機能を阻害することによって、ＨＩＶ寿命サイクルを阻害できる。今や、この確認は、限定しないが、アミロライド・アナログのごとき剤をウイルス性症状の治療および予防用の抗菌剤として使用することを許容する。
【００２３】
従って、本発明の一つの局面は、ウイルスの機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法を提供し、ウイルスは哺乳類宿主細胞を感染させており、該方法は、該宿主細胞の膜イオンチャネル機能活性をダウンレギュレートするのに充分な時間および条件下、該哺乳類に有効量の剤を投与することを特徴とする。
【００２４】
「膜イオンチャネル」への言及は、膜を横切ってイオンを輸送する構造への言及と理解すべきである。本発明はイオンチャネルにまで及び、それらは受動的、浸透圧、能動的または交換輸送のごとき手段により機能するであろう。該イオンチャネルは、細胞内または細胞外手段により形成されるであろう。例えば、該イオンチャネルは、細胞によって、その機能を容易にするために天然に形成されるイオンチャネルであろう。あるいは、該イオンチャネルは、細胞外手段により形成されるであろう。細胞外手段は、例えば、導入された化学薬品、薬物またはイオノフォアのごとき他の剤によるか、あるいは、細胞に侵入したウイルスによりコード化されるウイルス性タンパク質の機能活性によるイオンチャネルの形成を含む。好ましくは、本発明のイオンチャネルは、ＨＩＶでの細胞の感染に起因するイオンチャネルであって、より詳しくは、該イオンチャネルはＨＩＶタンパク質Ｖｐｕにより形成される（以下「Ｖｐｕイオンチャネル」という）。
【００２５】
本発明の対象であるイオンチャネルは膜を横切るイオンの輸送を容易にする。該膜はいずれの膜であってよく、外細胞壁形質膜に限定されない。従って、「膜」は、ゴルジ体および小胞体のごとき、いずれの細胞器官を取り巻く膜、外細胞膜、該細胞内部に位置するいずれの外来抗原を取り巻く膜（例えば、ウイルスエンベロープ）または細胞外に位置する外来生体の膜を包含する。膜は、典型的に、必ずではないが、流動的な脂質二重層からなる。該対象イオンチャネルはいずれの構造であってもよい。例えば、Ｖｐｕイオンチャネルは、ＨＩＶ−１によりコード化され、例えば、感染した細胞のゴルジ体または小胞体に関連する内在性膜タンパク質であるＶｐｕにより形成される。以下、「Ｖｐｕイオンチャネル」への言及は、全ての他のイオンチャネルを含むものと読み替えられるべきである。
【００２６】
従って、本発明は、より詳しくは、ＨＩＶの機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法を提供し、ＨＩＶは哺乳類宿主細胞を感染させており、該方法は、該宿主細胞のＶｐｕイオンチャネル機能活性をダウンレギュレートするのに充分な時間および条件下、該哺乳類に有効量の剤を投与することを特徴とする。
【００２７】
「ＨＩＶ」への言及は、いずれのＨＩＶ株への言及として、およびホモログおよび突然変異体を含むものと理解すべきである。
【００２８】
本発明を決して限定することなく、ＶｐｕはＮ−末端膜貫通アンカーおよび親水性細胞質Ｃ−末端ドメインをを持つ約８０個のアミノ酸を含むタンパク質である。該Ｃ−末端ドメインは、典型的には、１２個のアミノ酸配列を含み、それは保存され、リン酸化された２つのセリン残基を含有する［Schubert et al., 1994 および Friborg et al., 1995］。ＶｐｕはＨＩＶ−１によりコード化される膜内在性タンパク質である。それは、感染した細胞中のゴルジおよび小胞体膜に関連するが、人工的に過剰発現させたとき［Schubert et al., 1996a］以外は、ウイルスエンベロープ中にも形質膜中にも検出されていない。本発明を決して限定することなく、Ｖｐｕはホモオリゴマーを形成する能力を有するが、その天然複合体中のサブユニットの正確な数は分かっていない。Ｖｐｕの細胞質ドメインの二次構造および三次折畳みは、ＮＭＲおよびＣＤ分光分析ならびに分子運動計算を組合せることにより決定され［Willbold et al., 1997］、該リン酸化されたセリン残基を含有する短い柔軟なループにより隔たれた２つのα−へリックスが明かにされている。該膜貫通ドメインの最近の構造データ［Wray et al., 1999］は、該領域はα−へリックスであるという理論予測を裏付け、二重層垂線に対して３０゜未満の傾き角であることを示す。２つの分子運動シミュレーション研究が、オリゴマー形成は該膜に広がるα−ヘリックスの束を生じるという仮定に基づき、報告されている［Grice et al., 1997; および Moore et al., 1998］。両方の研究とも５量体複合体の形成を裏付ける。しかしながら、異なる初期条件および束縛パラメータを用いることにより、該複合体中の個々のヘリックスの配向について、異なる結論に達する。かくして、天然Ｖｐｕ複合体の実際の構造は決定すべきものにとどまっている。
【００２９】
本発明者らによりＶｐｕはイオンチャネルを形成することが示されたという事実にもかかわらず、本発明の出現以前は、Ｖｐｕによるイオンチャネル形成はＨＩＶウイルスの寿命サイクルにとって重大な機能であることは知られていなかった。
【００３０】
イオンチャネルの「機能活性」への言及は、イオンチャネルが行うか、または関わるいずれの１以上の機能への言及として理解すべきである。例えば、Ｖｐｕタンパク質コード化イオンチャネルは、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃｌ−およびＰＯ４３−の輸送を容易にすることに加えて、小胞体中のＣＤ４分子の崩壊においても役割を演じる。該Ｖｐｕタンパク質コード化イオンチャネルは、該ＨＩＶ寿命サイクルを媒介することにおいても役割を演じるものと考えられている。なぜならば、このチャネルを不活性化すると、ＨＩＶ寿命サイクル、特に、ＨＩＶの複製が阻害されるからである。しかしながら、本発明は、該ＨＩＶ寿命サイクルおよび、特に、ＨＩＶ複製を阻害するメカニズムによりＨＩＶ感染を処置することには限定されない。むしろ、本発明はＶｐｕイオンチャネル機能活性作用を阻害して、ＨＩＶ生存率または機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害するいずれのメカニズムをも包含するものと理解されるべきである。好ましくは、該機能活性はＨＩＶの複製の媒介である。これに関し、ウイルスの「機能活性」への言及は、ウイルスが行うか、または関わるいずれの１以上の機能への言及として理解されるべきである。これは、例えば、ウイルス複製および出芽を含む。好ましくは、該機能活性はＨＩＶ複製である。
【００３１】
「ＨＩＶ複製」への言及は、ＨＩＶビリオンの構築または放出を阻害することのごとき、ＨＩＶ寿命サイクルのいずれの１以上の段階または局面をも含むものと理解されるべきである。ＨＩＶ複製の該Ｖｐｕ媒介は直接的または間接的手段によるものであろう。該Ｖｐｕイオンチャネルが、いずれかの１以上のその寿命サイクル段階にてＨＩＶと直接相互作用するならば、該Ｖｐｕ媒介は直接的である。それがＨＩＶ以外の分子に作用し、他の分子が該ＨＩＶ寿命サイクルのいずれの１以上の局面または段階を直接的または間接的のいずれかで調節するならば、該Ｖｐｕ媒介は間接的である。従って、本発明の方法は、ＨＩＶ寿命サイクルのいずれの１以上の局面または段階の媒介に結びつくステップのカスケードの導入によるＨＩＶ複製の媒介を包含する。
【００３２】
この好ましい具体例によれば、本発明は、ＨＩＶ複製を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法を提供し、ＨＩＶは哺乳類宿主細胞を感染させており、該方法は、該宿主細胞のＶｐｕイオンチャネル機能活性をダウンレギュレートするのに充分な時間および条件下、該哺乳類に有効量の剤を投与することを特徴とする。
【００３３】
イオンチャネル機能活性および、特に、ＨＩＶ複製のＶｐｕ媒介を「ダウンレギュレートする」への言及は、直接的および間接的の両方のメカニズムによる該活性のいずれかの１以上の局面の部分的または完全阻害への言及として理解されるべきである。例えば、適当な剤は、Ｖｐｕイオンチャネルと直接的に相互作用して、ＨＩＶ複製を妨げるであろうし、あるいは、適当な剤は間接的に作用して、例えば、該Ｖｐｕイオンチャネル以外の分子と相互作用することによって該複製を妨げるであろう。ここに、当該他の分子は該Ｖｐｕイオンチャネルと相互作用し、阻害する。
【００３４】
イオンチャネル機能活性の阻害は、当業者によく知られているであろういずれの適当な方法によって達成することができ、それは、該対象のイオンチャネルの機能をブロックするか、さもなければ、ダウンレギュレートすることができるタンパク質性または非タンパク質性分子をウイルス感染した細胞に接触させることを含む。Ｖｐｕイオンチャネル活性をブロックする分子についてのスクリーニングは、例えば、実施例１１に開示した方法を含むいずれの適当な方法によって達成することができる。イオンチャネル機能活性のダウンレギュレーションは、該対象の宿主細胞のごとき細胞を、該対象のイオンチャネルの機能をブロックするか、さもなければ、ダウンレギュレートすることができる分子を発現する核酸分子でトランスフェクトすることによって達成することができることも理解されるべきである。従って、「剤」への言及は、いずれのタンパク質性または非タンパク質性分子への言及として理解されるべきであって、それは直接的または間接的にＶｐｕイオンチャネル機能活性を阻害する核酸分子を含む。「剤」への言及は、該剤の機能相当物および誘導体への言及を含むと理解されるべきである。
【００３５】
ＨＩＶに感染した「哺乳類宿主細胞」への言及は、ＨＩＶに感染しているいずれの細胞への言及として理解されるべきである。これは、例えば、感染したＣＤ４＋細胞または感染した単球もしくはマクロファージを含む。本発明を決して限定することなく、ＨＩＶ−１がマクロファージ中で感染させ、効率的に複製する能力はＡＩＤＳ発生病理の本質であると考えられる。実際、マクロファージ指向性ＨＩＶ単離体が、ＡＩＤＳ進行のために必要かつ充分であろう。従って、好ましい具体例において、対象のＨＩＶ感染した細胞はＨＩＶ感染したマクロファージもしくは単球である。
【００３６】
この好ましい具体例によれば、ＨＩＶの機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法が提供され、ＨＩＶは哺乳類マクロファージを感染させており、該方法は、該マクロファージのＶｐｕイオンチャネル機能活性をダウンレギュレートするのに充分な時間および条件下、該哺乳類に有効量の剤を投与することを特徴とする。
【００３７】
もう一つの好ましい具体例において、ＨＩＶの機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法が提供され、ＨＩＶは哺乳類マクロファージを感染させており、該方法は、該単球のＶｐｕイオンチャネル機能活性をダウンレギュレートするのに充分な時間および条件下、該哺乳類に有効量の剤を投与することを特徴とする。
【００３８】
関連する局面において、本発明者らは、驚くべきことに、アミロライドのアナログがＶｐｕイオンチャネル機能活性を阻害することも決定した。これは、Ｖｐｕイオンチャネルに対して一見したところ不適合な該対象アナログの構造による予期せぬ結果である。特に、本発明をいずれかの１の理論または作用の態様に限定することなく、アミロライド・アナログは、Ｖｐｕイオンチャネルがブロックされるようにすることによって、細胞からのＨＩＶビリオン放出を阻害すると考えられている。このブロッキングは置換されたアミロライドによって影響をうけるが、置換されていないアミロライドによっては影響されない。置換されていないアミロライドは、ピラジン環の３−および５−位にアミノ基、および６−位にクロロ基を持つピラジノイルグアニジンである。しかしながら、本発明は、この形態のアミロライドのアナログまたはその機能相当物に限定されるものと理解されるべきではない。本発明は、いずれの形態のアミロライドのアナログ、例えば、アミロライドの他の異性体をも包含する。従って、「アミロライド・アナログ」への言及は、例えば、いずれかの位置にて、しかし、より詳しくは、該ピラジン環の６つの位置のいずれかの１以上にての原子または分子の付加、欠失または置換、あるいは、原子または分子の電荷の変化のごとき、付加、欠失または置換を示すいずれのアミロライド分子への言及として理解すべきである。好ましくは、該アミロライド・アナログは、該ピラジン環の５−位にてアミノ基の置換を示すアミロライド分子である。
【００３９】
従って、好ましい具体例において、本発明は、ＨＩＶ複製を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法を提供し、ＨＩＶは哺乳類宿主細胞を感染させており、該方法は、Ｖｐｕイオンチャネル機能活性を阻害するのに充分な時間および条件下、該宿主細胞に有効量のアミロライド・アナログまたはその機能相当物を投与することを特徴とする。
【００４０】
好ましくは、該アミロライド・アナログは該ピラジン環またはその機能相当物の５−位にてアミノ基の置換を含む。一層より好ましくは、該Ｖｐｕイオンチャネル機能活性は、ＨＩＶ複製のＶｐｕイオンチャネル媒介である。
【００４１】
さらにより好ましくは、該アミロライド・アナログは５−（Ｎ,Ｎ−ヘキサメチレン）−アミロライド（本明細書中「ＨＭＡ」という）または５−（Ｎ,Ｎ−ジメチル）−アミロライド（本明細書中「ＤＭＡ」という）である。
【００４２】
この好ましい具体例において、ＨＩＶ複製を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法が提供され、ＨＩＶは哺乳類宿主細胞を感染させており、該方法は、ＨＩＶ複製のＶｐｕイオンチャネル媒介を阻害するのに充分な時間および条件下、該宿主細胞に有効量のＨＭＡまたはその機能相当物を接触させることを特徴とする。
【００４３】
もう一つの好ましい具体例において、ＨＩＶ複製を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法が提供され、ＨＩＶは哺乳類宿主細胞を感染させており、該方法は、ＨＩＶ複製のＶｐｕイオンチャネル媒介を阻害するのに充分な時間および条件下、該宿主細胞に有効量のＤＭＡまたはその機能相当物を接触させることを特徴とする。
【００４４】
最も好ましくは、該アミロライド・アナログは、構造：
【００４５】
【化１３】
0004624562.tif 000002
【００４６】
を含む。
【００４７】
アミロライド・アナログの「機能相当物」および（上記したごとく、該Ｖｐｕイオンチャネル機能活性が阻害されるか、さもなければ、ダウンレギュレートされる程度に）該アミロライド・アナログと同等な機能活性を示すいずれの他のタンパク質性または非タンパク質性剤は、融合タンパク質を含む天然、合成または組換え体起源からの機能的に活性な誘導体、断片、部品、部分および化学的相当物を含む。化学的相当物は必ずしも該対象の剤からは誘導されないであろうが、ある種のコンホメーション類似性を共有するであろう。あるいは、化学的相当物は、特別にデザインされて、該剤のある種の物理化学的特性を真似ることができる。化学的相当物は化学的に合成されるか、または、例えば、天然産物スクリーニングの後に検出することができる。機能相当物は拮抗性または作動性特性も有し、そのような分子の使用が本発明により意図される。
【００４８】
該剤またはその機能相当物がタンパク質性分子である場合、本発明は該タンパク質性分子の機能誘導体にまで及ぶものと理解されるべきである。誘導体は、融合タンパク質を含む天然、合成または組換え体起源からの断片、部品、部分、突然変異体、および模擬体を含む。誘導体はアミノ酸の挿入、欠失または置換から誘導することができる。アミノ酸挿入誘導体は、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合ならびに単一または複数のアミノ酸の配列内挿入を含む。挿入アミノ酸配列変異体は、１以上のアミノ残基が該タンパク質の所定のサイトに導入されるものであるが、得られた産物の適当なスクリーニングにより、無秩序挿入も可能である。欠失変異体は、該配列からの１以上のアミノ酸の除去を特徴とする。置換アミノ酸変異体は、該配列中の少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されたものである。置換アミノ酸変異体の例は、保存アミノ酸置換体である。保存アミノ酸置換体は、典型的に、以下のグループ内での置換を含む：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシンおよびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびトレオニン；リジンおよびアルギニン；および、フェニルアラニンおよびチロシン。アミノ酸配列への付加は、他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質との融合を含む。
【００４９】
本明細書で意図されるタンパク質のホモログは、限定されないが、様々な種から誘導されたタンパク質を含む。
【００５０】
該誘導体は、ペプチド、ポリペプチドまたは他のタンパク質性もしくは非タンパク質性分子に融合した全タンパク質の部品の特定のエピトープを有する断片を含む。例えば、タンパク質（または非タンパク質性分子）またはその誘導体を分子に融合させて、細胞中へのその侵入を容易にすることができる。
【００５１】
「誘導体」への言及は、アナログへの言及も含むと理解されるべきである。本明細書で意図されるアナログは、限定されないが、側鎖の修飾、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質合成中での異常アミノ酸および／またはその誘導体の組込み、および、クロスリンカーおよび該タンパク質性分子またはそれらのアナログにコンホメーション束縛を課す他の方法の使用を含む。
【００５２】
本発明によって意図される側鎖修飾の例は、アルデヒドとの反応後ＮａＢＨ４での還元による還元性アルキル化によるごときアミノ基の修飾；メチルアセトイミダートでのアミジン化（amidination）；無水酢酸でのアシル化；シアナートでのアミノ基のカルバモイル化；２,４,６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）でのアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸でのアミノ基のアシル化；および、ピリドキサール−５−ホスファートに引続くＮａＢＨ４での還元によるリジンのピリドキシル化を含む。
【００５３】
アルギニン残基のグアニジン基は、２,３−ブタジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサールのごとき試薬でのヘテロ環縮合生成物の形成により修飾することができる。
【００５４】
該カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソ尿素形成によるカルボジイミド活性化に引続き、例えば、対応するアミドへの次なる誘導化によって修飾することができる。
【００５５】
スルフィドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドでのカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物での混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応；４−クロロメルクリベンゾアート、４−クロロメルクリフェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノールまたは他の水銀剤を用いる水銀剤誘導体の形成；アルカリｐＨにてのシアナートでのカルバモイル化のごとき方法によって修飾することができる。
【００５６】
トリプトファン残基は、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミドでの酸化または臭化２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルもしくはハロゲン化スルフェニルでのインドール環のアルキル化によって修飾することができる。一方、チロシン残基は、テトラニトロメタンでニトロ化して３−ニトロチロシン誘導体を形成することによって変化させることができる。
【００５７】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体でのアルキル化またはＮ−ジエチルピロカーボナートでのＮ−カルボエトキシル化により達成することができる。
【００５８】
タンパク質合成中に異常アミノ酸またはその誘導体を組込むことの例は、限定されないが、ノルロイシン、４−アミノブチル酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−チエニルアラニンおよび／またはアミノ酸のＤ−異性体の使用を含む。本明細書で意図される異常アミノ酸をテーブル１に示す。
【００５９】
【表１】
0004624562.tif 000003
【００６０】
【表２】
0004624562.tif 000004
【００６１】
【表３】
0004624562.tif 000005
【００６２】
【表４】
0004624562.tif 000006
【００６３】
クロスリンカーは、例えば、ｎ＝１ないしｎ＝６の（ＣＨ２）ｎスペーサー基を有する二官能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのごときホモ−二官能性クロスリンカーおよび、通常は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのごときアミノ反応性部位および別の基に特異的な反応性部位を含有するヘテロ−二官能性試薬を用いて、３Ｄコンホメーションを安定化させるのに用い得る。
【００６４】
該ウイルス阻害の対象は、一般に、限定されないが、ヒト、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、ペット動物（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲された野生動物（例えば、キツネ、シカ）である。好ましくは、該対象はヒトまたは霊長類である。最も好ましくは、該対象はヒトである。
【００６５】
本発明の方法は、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの治療および予防に有用である。例えば、ＨＩＶに感染していることが分かっている対象において、Ｖｐｕイオンチャネル機能活性のダウンレギュレーションを達成して、ＨＩＶの複製を妨害し、それによって、ＡＩＤＳの発症を予防することができる。あるいは、本発明の方法を用いて、血漿中ウイルス量を低下させるか、またはＡＩＤＳ症状を軽減することができる。
【００６６】
本発明の方法は、ＨＩＶ感染の初期に、単球およびマクロファージのごとき細胞型中でのウイルス貯蔵器の形成を妨げるため、あるいは、可能性のあるＨＩＶ感染源に曝される直前もしくはある期間の後に適用される予防的処置としてのいずれかにおいて、特に有用である。
【００６７】
従って、もう一つの局面において、哺乳類におけるＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの治療および／または予防のための方法が提供され、該方法は、ＨＩＶ感染した哺乳類宿主細胞のＶｐｕイオンチャネル機能活性をダウンレギュレートするのに充分な時間および条件下、該哺乳類に有効量の剤を投与することを特徴とし、ここに、該ダウンレギュレーションは該ＨＩＶの機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する。
【００６８】
より詳しくは、本発明は、哺乳類におけるＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの治療および／または予防のための方法を提供し、該方法は、ＨＩＶ感染した哺乳類宿主細胞のＶｐｕイオンチャネル機能活性をダウンレギュレートするのに充分な時間および条件下、該哺乳類に有効量の剤を投与することを特徴とし、ここに、該ＶｐｕイオンチャネルダウンレギュレーションはＨＩＶ複製を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する。
【００６９】
「有効量」への言及は、所望する応答を少なくとも部分的に達成するのに必要な量を意味する。
【００７０】
本明細書中、「治療」および「予防」への言及は、最も広義に解釈されるべきである。「治療」なる語は、必ずしも、哺乳類が完全に回復するまで処置されることを示唆しない。同様に、「予防」は、必ずしも、該対象がいつかは疾患状態にかかることを意味しない。従って、治療および予防は、特定の状態の症状の軽減または、特定の状態を進行させる危険性を妨げるか、さもなければ、低減することを含む。「予防」なる語は、特定の状態の徴候の重篤度を低減することと考えることができる。「治療」は、今ある状態の重篤度または痛烈な発作の頻度も低減するであろう。
【００７１】
好ましくは、該剤はアミロライド・アナログまたはその機能相当物である。一層より詳しくは、該アミロライド・アナログはＨＭＡまたはＤＭＡである。
【００７２】
この方法に従えば、１を超えるタイプの剤を投与するか、または該剤は、知られた抗ウイルス化合物もしくは分子のごときもう一つの剤とともに共投与することができる。「共投与」は、同一もしくは異なる経路での同一製剤もしくは２つの異なる製剤における同時投与または、同一もしくは異なる経路での連続投与を意味する。「連続」投与は、２つのタイプのアミロライド・アナログの投与間、または該アミロライド・アナログと該知られた抗ウイルス化合物もしくは分子との投与間で秒、分、時または日が異なるときを意味する。当該対象の剤および知られている抗ウイルス化合物または分子はいずれの順序でも投与することができる。
【００７３】
投与の経路は、限定されないが、静脈内、腹膜内、皮下、頭蓋内、皮内、筋肉内、眼内、鞘内、大脳内、鼻腔内、注入、経口、経直腸、静脈点滴、貼付および移植を含む。静脈内経路が特に好ましい。
【００７４】
本発明は、さらに、哺乳類におけるＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの治療的または予防的処置用の医薬の製造における該対象の剤の使用にまで及び、ここに、該剤はＨＩＶ感染した細胞のＶｐｕイオンチャネル機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する。
【００７５】
好ましくは、該機能活性はＨＩＶ複製の媒介である。
【００７６】
最も好ましくは、該剤はアミロライド・アナログまたはその機能相当物であり、さらにより好ましくは、ＨＭＡまたはＤＭＡあるいはそれらの機能相当物である。
【００７７】
上記したごとく、本発明者らは、驚くべきことに、アミロライドはＶｐｕイオンチャネル機能活性になんら影響しないにもかかわらず、アミロライド・アナログは機能活性をブロックできることを確認した。
【００７８】
従って、本発明のもう一つの局面は、対象において膜イオンチャネル機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法を提供し、該方法は、膜イオンチャネル機能活性を阻害するのに充分な時間および条件下、該対象に有効量のアミロライド・アナログまたはその機能相当物を投与することを特徴とする。
【００７９】
より詳しくは、本発明は、哺乳類においてＶｐｕイオンチャネル機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法を提供し、該方法は、Ｖｐｕイオンチャネル機能活性を阻害するのに充分な時間および条件下、該哺乳類に有効量のアミロライド・アナログまたはその機能相当物を投与することを特徴とする。
【００８０】
さらにより詳しくは、本発明は、哺乳類においてＨＩＶ複製のＶｐｕイオンチャネル媒介を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害する方法を提供し、該方法は、Ｖｐｕイオンチャネル機能活性を阻害するのに充分な時間および条件下、該哺乳類に有効量のアミロライド・アナログまたはその機能相当物を投与することを特徴とする。
【００８１】
好ましくは、該アミロライド・アナログは、ピラジン環またはその機能相当物の５−位のアミノ基の置換を含む。
【００８２】
一層より好ましくは、該アミロライド・アナログはＨＭＡまたはＤＭＡである。
【００８３】
最も好ましくは、該アミロライド・アナログは構造：
【００８４】
【化１４】
0004624562.tif 000007
【００８５】
を含む。
【００８６】
本発明のなおもう一つの局面は、上に定義したようなＶｐｕイオンチャネル機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害するのに有用な剤を提供する。
【００８７】
好ましくは、該機能活性はＨＩＶ複製の媒介である。
【００８８】
最も好ましくは、該剤はアミロライド・アナログまたはその機能相当物であり、一層より詳しくは、該剤は、ＨＭＡもしくはＤＭＡまたはそれらの機能相当物である。
【００８９】
本発明のさらにもう一つの局面は、Ｖｐｕイオンチャネル機能活性を低下させ、遅延させ、さもなければ、阻害するのに使用され、上で定義したような剤および１以上の医薬上許容される担体および／または希釈剤を含む組成物を提供する。該組成物は２つの異なるタイプの剤または、剤および知られている抗ウイルス化合物もしくは分子も含む。
【００９０】
好ましくは、イオンチャネル機能活性の阻害は、ＨＩＶ複製のＶｐｕイオンチャネル媒介の阻害である。
【００９１】
注射使用に適した組成物は、滅菌水溶液（ここに、水溶性）および滅菌注射液の即席調製用の滅菌粉末を含む。それらは、製造および貯蔵の条件下、安定でなければならず、細菌および真菌のごとき微生物の汚染作用に対して保護されるべきである。該担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物および植物油を含有する溶剤または分散媒体であり得る。微生物の作用からの保護は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの様々な抗菌剤および抗真菌剤により達成し得る。多くの場合、例えば、糖類または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましいであろう。該注射組成物の延長化された吸収は、該組成物において、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる剤の組成物の使用により達成し得る。
【００９２】
滅菌注射液は、必要量の有効成分を上に列挙した様々な他の成分と共に該適当な溶剤に配合し、必要であれば、引続き、例えば、濾過滅菌または他の適当な手段による滅菌により調製する。分散も意図され、これらは、様々な滅菌有効成分を塩基性分散媒体および上に列挙されたものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌賦形剤に配合することによって調製する。滅菌注射液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過した溶液から有効成分に加えていずれのさらなる所望する成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術を含む。
【００９３】
該有効成分が適切に保護されている場合、それらは、例えば、不活性希釈剤とともに、または同化可能な食用担体とともに経口投与することができ、あるいは、それはハードもしくはソフトシェルゼラチンカプセルに封入することができ、あるいは、それは錠剤に成型することができる。経口治療投与につき、該有効成分は補形剤と配合し、経口摂取錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、ウエハス等の形態で使用することができる。そのような組成物および製剤は少なくとも１重量％の有効成分を含有すべきである。該組成物および製剤のパーセンテージは、もちろん、変化させることができ、好都合には、単位重量の約５ないし約８０％の間であろう。そのような治療上有用な組成物中の有効成分の量は、適した用量が得られるような量である。本発明による好ましい組成物または製剤は、経口用量単位形態が約０．１ｎｇおよび２０００ｍｇの間の有効成分を含有するように調製する。
【００９４】
錠剤、トローチ、丸剤、カプセル等は、以下に列記する成分も含有する：ガム、アカシア、トウモロコシデンプンまたはゼラチンのごとき結合剤；ジカルシウムホスフェートのごとき補形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸等のごとき崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのごとき滑沢剤；および、スクロース、ラクトースまたはサッカリンのごとき甘味剤、またはペパーミント、ウィンターグリン油、またはチェリー香味料のごとき香味剤を添加することができる。該用量単位形態がカプセルの場合、それは、上記タイプの原料に加えて、液状担体を含有することができる。様々な他の原料をコーティング剤としてか、さもなければ、該用量単位の物理形態を修飾するために存在させることができる。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルをシェラック、糖または両方で被覆することができる。シロップまたはエリキシルは、該有効成分、甘味剤としてスクロース、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、チェリーまたはオレンジ香味料のごとき染料および香味料を含有することができる。いずれの用量単位形態を調製するのにも用いられるいずれの原料も、医薬上純粋で、適用される量において実質的に非毒性であるべきである。さらに、該有効成分は、徐放性調製物および製剤に配合することができる。
【００９５】
本発明は、クリーム、ローションおよびジェルのごとき局所塗布に適した形態にも及ぶ。そのような形態において、抗凝血ペプチド（the anti-clotting peptides）は、表面バリアの浸透ができるように修飾する必要があるであろう。
【００９６】
医薬上許容される担体および／または希釈剤は、いずれのおよび全ての溶剤、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を含む。医薬上活性な物質についてのそのような媒体および剤の使用は当該分野でよく知られている。いずれかの従来の媒体または剤が該有効成分と適合しない場合を除き、治療組成物におけるそれらの使用が意図される。補足有効成分も該組成物に配合し得る。
【００９７】
投与の容易および用量の均一性のために、非経口組成物を用量単位形態に調剤することが特に有利である。本明細書に用いられる用量単位形態は、処置すべき哺乳類対象に対して一体的な用量として適した物理的に分割された単位を意味し；各単位は所望する治療効果を生じるように算出された所定量の有効成分を必要な医薬担体と一緒に含有する。本発明の新規な用量単位形態の仕様は、（ａ）該有効物質に特有な特徴および達成すべき特定の治療効果、および（ｂ）調合技術に固有の限界に影響され、かつ、それらに直接依存する。
【００９８】
本発明により意図される有効量は、痛みの重篤度および当該受領者の健康および年齢に依存して変化するであろう。一般的に言えば、有効量は、０．０１ｎｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重まで変化するであろう。代替量は、約０．１ｎｇ／ｋｇ体重ないし約１００ｍｇ／ｋｇ体重、または、１．０ｎｇ／ｋｇ体重ないし約８０ｍｇ／ｋｇ体重を含む。
【００９９】
以下の実施例に、本発明のさらなる特徴をより完全に説明する。しかしながら、詳細な説明は単に本発明を例示する目的のためだけに含まれるものと理解すべきである。決して、上記した本発明の広い説明を制限するものとして理解すべきではない。
【０１００】
【実施例】
実施例１
組換えプラスミドｐ２ＧＥＸＶｐｕおよびｐＰＬＶｐｕの構築
Ｖｐｕをコード化するオープンリーディングフレーム（図１ａ）をＨＩＶ−１ゲノム（単離ＨＸＢ２、McFarlane Burnet Centre, Melbourne, Australia）のＮｄｅ １フラグメントのｃＤＮＡクローンからＰＣＲにより増幅した。天然ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene; ０．０３５ Ｕ／μｌ）を選び、該ＰＣＲ反応を触媒して、起こり得るＰＣＲ導入エラーを酵素のプルーフリーディング活性により最小限にした。当該５’、センス、プライマー、ＡＧＴＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＡＣＣＴＡＴＡＣＣ（＜４００＞２）は、ｐ２ＧＥＸ（４１）中のＧＳＴ遺伝子の３’末端とインフレームでクローニングするためのＢａｍＨ１サイト（下線）を挿入する。このプライマーは、該ＨＸＢ２単離体のトレオニンコドンであるｖｐｕ遺伝子の開始コドン（太字ＴはＣを代替する）も修復する。当該３’、アンチセンス、プライマーＴＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＣ（＜４００＞３）は、該ＰＣＲ産物の他の末端にＥｃｏＲ１（下線）を挿入して、クローニングを容易にする。Perkin-Elmer サーモサイクラーにおいて、０．５ｍｌ薄壁エッペンドルフチューブ中で９４℃にて４５秒間、５５℃にて１分間および７２℃にて１分間の３０サイクル後、２６８ｂｐフラグメントを精製し、ＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１で消化し、次いで、同じ２つの酵素での消化により調製されたｐ２ＧＥＸにライゲートした。得られた組換えプラスミドを図１ｂに示す。全Ｖｐｕオープンリーディングフレームおよび、ＢａｍＨ１ならびにＥｃｏＲ１ライゲーションサイトをApplied Biosystems dye-terminaor キットを用いる、環状配列決定により配列決定して、該ＤＮＡ配列を確認した。
【０１０１】
ｐＰＬ４５１発現プラスミドに挿入するためのＶｐｕオープンリーディングフレームを調製するために、先ず、ｐ２ＧＥＸＶｐｕをＢａｍＨ１で消化し、次いで、５’塩基オーバーハングをｄＮＴＰの存在下、クレノウＤＮＡポリメラーゼに充填した。次いで、Ｖｐｕ−コード化フラグメントをＥｃｏＲ１での消化によって遊離させ、寒天ゲルから精製し、Ｈｐａ１およびＥｃｏＲ１で消化されているｐＰＬ４５１にライゲートした。引続いて、ウェスターンブロットは、ｐＰＬＶｐｕ構築物（図１ｃ）が、ＰＲおよびＰＬプロモータのｃＩ８５７レプレッサーを不活性化するために４２℃にて培養へ導入した後、Ｖｐｕを発現したことを確認した。
【０１０２】
実施例２
Ｖｐｕの免疫同定用のポリクローナル抗体の育成
ＶｐｕのＣ−末端の２０個のアミノ酸残基に対応するペプチドＣＡＬＶＥＭＧＶＥＭＧＨＨＡＰＷＤＶＤＤＬ（＜４００＞４）は、Applied Biosystems model 477A machine を用いてBiomolecular Resource Facility （ＡＮＵ、Australia）中で合成する。多重抗原性ペプチド（ＭＡＰ）は、Ｎ−末端システイン残基を介して該ペプチドをポリリジンコアに結合させることによって調製した［Lu et al., 1991］。該ＭＡＰを用いて、ＶｐｕのＣ−末端を認識するポリクローナル抗血清の産生のためにウサギを免疫化した。免疫化のため、１ｍｇのＭＡＰペプチドを１．２５ｍｌのＭＴＰＢＳ（１６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、４ｍＭ ＮａＨＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ  ｐＨ７．３）に溶解し、１．２５ｍｌのフロイント完全アジュバントで乳化させ、該ウサギの背中の複数の皮下部位に注射した。追加免疫注射はフロイント不完全アジュバントを用い、少なくとも４週間の間隔を開け、注射してから１０〜１４日後に血清を採取した。
【０１０３】
実施例３
抗体に関する技術
ペプチド−特異的抗体は、PierceのImmunopureTM Ag/Ab 固定化キットを用いてウサギ血清から精製した。当該合成ペプチドは、該キットの指示に従い、そのＮ−末端システインを介して５ｍｌ Sulfo LinkTM カラムのマトリックスに架橋させ、２．５ｍｌのＶｐｕ免疫活性血清を２０ｍｌのトリスバッファー（１０ｍＭ  ｐＨ７．４）に添加し、該ペプチドカラムに３回通して該抗体の該ペプチドへの暴露を最大限にした。該カラムを２０ｍｌの１０ｍＭ トリスｐＨ７．４に引続き、５００ｍＭ ＮａＣｌで補足した２０ｍｌの同一バッファーで洗浄した。結合した抗体を５ｍｌの１００ｍＭ グリシン／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ２．５中で溶出し、溶出液を２５０μｌの１Ｍ トリスｐＨ９．０の添加により即座に中和し、ＭＴＰＢＳに対して一晩透析した。
【０１０４】
前記したごとく［Harlow and Lane, 1988］、二官能性架橋試薬ジメチルピメルイミダートを用いて、２００μｇの精製した抗体を１００μｇのタンパク質Ａ寒天ビーズ［Schleicher and Schuell］に共有的に架橋させることによって、抗Ｖｐｕ免疫アフィニティーカラムを構築した。
【０１０５】
およそ５倍過剰の精製抗体の存在下で試料をインキュベーションし（室温にて１時間）、引続き、過剰なタンパク質−Ａ寒天の添加、３０分間のインキュベーション、および遠心して該Ｖｐｕ−抗体複合体をペレットにすることによって、Ｖｐｕの免疫沈澱を行った。上清は、後で電気生理学的二重層実験における対照として用い、ウェスターンブロッティングにより試験してＶｐｕが完全に除去されてしまったことを確認した。タンパク質試料は、ミニゲル装置および予め注入されたゲル（Novex）を用いる均一な１８％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。試料は、ゲルに負荷する前に、ＳＤＳ（最終３．２％）およびメルカプトエタノール（最終０．８％）で６０℃にて５分間処理した。タンパク質バンドをクマシーブリリアントブルーＲ２５０で、または銀染色によってかのいずれかで可視化した。
【０１０６】
ウェスターンブロッティングのため、半乾燥の移動装置（Pharmacia LKB）を用いてタンパク質をアクリルアミドゲルからＰＶＤＦ膜に移した。ポリクローナル抗血清または精製抗体、ヤギ抗ウサギアルカリ性ホスファターゼコンジュゲートおよびWestern BlueTM 固定化基質（Promega）との該ブロットの連続する反応の後、Ｖｐｕを検出した。
【０１０７】
実施例４
Ｅ．ＣＯＬＩからの組換えＶＰＵの精製
ｐ２ＧＥＸＶｐｕを含有するＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１−ブルー細胞の培養を３０℃にて激しく曝気しつつ、グルコース（６ｇ／Ｌ）およびアンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）で補足したＬＢ培地中で増殖させて、約２５０クレット単位（Klett units）の密度にし、その時点で、ＩＰＴＧを添加して０．０１ｍＭの最終濃度にし、増殖をさらに４時間続けた。最終培養密度は約２８０クレット単位であった。初期の実験が、大部分の発現されたＧＳＴ−Ｖｐｕ融合タンパク質は細胞デブリおよび膜断片の両方に関連することを明かにしたので、Varadhachary および Maloney の方法［Varadhachary and Maloney, 1990］を採用して、初期精製ステップのために、（細胞デブリと膜断片の両方を結合する）浸透圧的に崩壊した細胞ゴーストを単離した。細胞を収穫し、洗浄し、計量し、ＤＴＴ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）を含有するＭＴＰＢＳ中に再懸濁させて１０ｍｌ／ｇ湿潤重量にした。リゾチーム（０．３ｍｇ／ｍｌ；ニワトリ卵白；Sigma）を添加し、穏やかに揺動しつつ氷上で３０分間に引続き３７℃にて５分間インキュベートした。浸透圧的に増感された細胞を１２,０００ｇにてペレットにし、元の体積にまで水中で再懸濁させて、該細胞を破裂させた。次いで、該懸濁物を１０×バッファー母液を用いて１×ＭＴＰＢＳ／ＤＴＴにし、該ゴーストを遠心により単離し、ＭＴＰＢＳ／ＤＴＴに再懸濁させ、次いで、それに、グリセロール（２０重量％／体積まで）およびＣＨＡＰＳ（２重量％／体積まで）を連続的に添加して、元の体積の４分の１の最終体積を得た。この混合物を氷上で１時間攪拌し、次いで、４００,０００ｇにて１時間遠心して不溶物質を除去した。ＧＳＴ−Ｖｐｕ融合タンパク質は、グルタチオン寒天樹脂（Sigma）上のアフィニティクロマトグラフィーにより、界面活性剤抽出物から精製した。該樹脂をグリセロール（５％）、ＤＴＴ（１ｍＭ）、およびＣＨＡＰＳ（０．５％）を含有する５０ｍＭ トリスｐＨ７．５（バッファーＡ）中で完全に洗浄し、次いで、該融合タンパク質のＶｐｕ部分を遊離させ、ヒト・トロンビンを持つビーズの５０％（ｖ／ｖ）懸濁液の処理によって（１００Ｕ／ｍｌ；３７℃にて１時間）、樹脂結合ＧＳＴから溶出した。ＰＭＳＦ（０．５ｍＭ）を該溶出液に添加して、いずれの残存トロンビン活性をも失活させた。BioRad HPLCに結び付けられ、バッファーＡ中の線形ＮａＣｌ勾配（０〜２Ｍ）で溶出するＭＡ７Ｑ陰イオン交換カラムで、このＶｐｕ画分をさらに精製した。
【０１０８】
該Ｖｐｕを免疫アフィニティーカラム上で以下のように、均質（銀染色ゲル上で決定された）にまで精製した：Ｖｐｕを含有するＨＰＬＣをバッファーＡ中、ＮＡＰカラム上で脱塩し、次いで、該抗体−寒天ビーズと室温にて１時間混合した。該ビーズを完全に洗浄し、Ｖｐｕを該塩濃度を２Ｍまで増加することによって溶出した。タンパク質をBioRadダイ結合アッセイを用いて定量した。
【０１０９】
実施例５
リン脂質べシクルにおけるＶＰＵの再構成
Ｖｐｕを含有するプロテオリポソームを界面活性剤希釈法［New, 1990］によって調製した。クロロホルムに溶解させた脂質（ＰＥ：ＰＣ：ＰＳ；５：３：２；１ｍｇの全脂質）の混合物を窒素ガス流下で乾燥し、ＤＴＴ（１ｍＭ）を含有する０．１ｍｌのリン酸カリウムバッファー（５０ｍＭ  ｐＨ７．４）に再懸濁させた。精製したＶｐｕを含有する２５μｌアリコートを添加し、引続いて、１．２５％（ｗｔ／ｖｏｌ）の最終濃度のオクチルグルコシドを添加した。この混合物を３ラウンドの液体窒素中の凍結、解凍およびバス型超音波発生器中での超音波照射（２０〜３０秒間）に付し、次いで、２００体積のリン酸カリウムバッファー中で急速に希釈した。プロテオリポソームを４００,０００ｇにて１時間の遠心により収集し、約１５０μｌのリン酸バッファー中に再懸濁させた。
【０１１０】
実施例６
イオンチャネル活性の検定
精製Ｖｐｕを別記された標準技術［Miller, 1986;およびPiller et al., 1996]を用いて、平面脂質二重層におけるチャネル活性を誘導するその能力につき試験した。ＣＩＳおよびＴＲＡＮＳチャンバー中の溶液を直径約１００μｍの小さな円形の孔を含有するDelrinTMプラスチック壁で隔て、ここに、それを横切って、高抵抗電気シールを形成するように脂質二重層が塗布されている。二重層はｎ−デセン中のパルミトイル−オレオリ−ホスファチジル−エタノールアミンとパルミトイル−オレオリ−ホスファチジル−コリンとの混合物（８：２）（Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama）から塗布した。該２つのチャンバーの溶液は、様々なＮａＣｌまたはＫＣｌの濃度が添加されたＭＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）を含有した。電流をAxopatchTM200アンプで記録した。該２つのチャンバー間の電気ポテンシャルを±２００ｍＶの間で操作し得た（ＴＲＡＮＳ対接地ＣＩＳ）。界面活性剤溶液としてか、または、リン脂質ベシクルへの該タンパク質の組入れ後に、Ｖｐｕを含有するアリコートを該ＣＩＳチャンバーに添加した。該チャンバーを電流が観察されるまで攪拌した。
【０１１１】
実施例７
ヒトの単球およびマクロファージにおけるＨＩＶ複製への
ＨＭＡおよびＤＭＡの効果の試験
ヒト単球を末梢血液から単離し、２４時間（１日齢単球）か７日間かのいずれか培養して単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）へ分化させた。次いで、これらの細胞をＨＩＶ単離体の細胞フリー調製物に暴露し、該培地の完全アスピレーション前に２時間吸収させ、ウイルスフリー培地で１回洗浄し、新鮮な培地に再懸濁させた。該細胞を感染の２４時間前か、または感染後のいずれかに５０〜１０μＭＨＭＡまたはＤＭＡに暴露した。感染後様々な時間にて、その後のＨＩＶ複製を薬物に暴露した細胞内と、薬物に暴露していない細胞（対照）内とで比較した。ウイルス複製の進行および程度をＨＩＶ ＤＮＡ ＰＣＲ法［Fear et al., 1998］またはＥＬＩＳＡ法のいずれかを用いてアッセイして、培養上清中のｐ２４を定量した［Kelly et al., 1998］。
【０１１２】
実施例８
Ｅ．ＣＯＬＩ中のＶＰＵの発現および精製
プラスミドｐ２ＧＥＸＶｐｕ（図１）を構築して、該ＧＳＴとＶｐｕオープンリーディングフレームとの間のインフレーム遺伝子融合体を生成した。この系は、ＧＳＴのＣ−末端に融合したＶｐｕポリペプチドのＩＰＴＧ−誘発性発現を可能にし、グルタチオン寒天上のアフィニティークロマトグラフィーによる該融合タンパク質の精製を許容した。
【０１１３】
該培養を３０℃にて約２５０〜３００クレット単位にまで増殖させ、低レベルのＩＰＴＧで誘発することによって、ＧＳＴ−Ｖｐｕ発現の最適レベルを得た。該ＧＳＴ−Ｖｐｕを精製するため、該細胞デブリおよび形質膜を含有する合わせた細胞断片を該誘発細胞のリゾチームを処理した後に低速遠心することによって調製した。該ＧＳＴ−Ｖｐｕタンパク質の約５０％を両性イオン界面活性剤ＣＨＡＰＳを用いて、この断片から可溶化し得た。グルタチオン−寒天ビーズを用いるアフィニティクロマトグラフィーを用いて、該融合タンパク質を濃縮し、トロンビンを用いて、該融合タンパク質を融合パートナー間の高親和性トロンビンサイトにて切断してＶｐｕを遊離させた(図２Ａ）。陰イオン交換カラムから溶出した画分において、Ｖｐｕは銀染色ゲル上で可視できる主たるタンパク質であった（図２Ｂ、レーン１）。最後に、Ｖｐｕを免疫アフィニティーカラム上で見かけ上の均一まで精製した（図２Ｂ、レーン２）。（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切出された）タンパク質バンドのＮ−末端アミノ酸配列が該免疫検出されたタンパク質に対応することにより、Ｖｐｕとしてのその同一性を確認した。
【０１１４】
実施例９
脂質二重層においてＶＰＵがイオンチャネルを形成する
Ｖｐｕによるイオンチャネル形成をアッセイするため、平面脂質二重層への再構成を行った。精製した組換えＶｐｕの（７および７０ｎｇの間のタンパク質を含有する）試料を二重層組織のＣＩＳチャンバー中の１ｍｌのバッファーに添加した場合、攪拌期間後に電流の変動が検出され、２ないし３０分間変化した（図３）。チャネル活性が観察されるまでにかかった時間は、ほぼ、該チャンバーに添加したタンパク質の量に相関した。対照バッファーアリコートまたは対照脂質ベシクルを該ＣＩＳチャンバーに添加した場合、チャネルは検出されなかった。それらの対照実験において、チャネル活性が出現せずに１時間以上も攪拌し得た。
【０１１５】
実施例１０
ＶＰＵチャネルの特性
チャネル活性は、５つの独立した精製から調製されたＶｐｕ試料で４０を超える個々の実験において観察した。種々の実験において、該電流の振幅は広い範囲で変化し、ここでも、タンパク質の添加量にほぼ相関するようであった。測定した最大および最小のチャネルは、それぞれ、１４ｐＳおよび２８０ｐＳのコンダクタンスであった。Ｖｐｕを含有する脂質ベシクルを調製し、該二重層に融合させたときは、界面活性剤中の精製タンパク質を添加したときよりも、該チャネルは一貫してより低かった。これは、前者の方法が高濃度の界面活性剤での処理および、大きな凝集の単体への崩壊を促進するであろう希釈ステップを含むからであろう。
【０１１６】
電流振幅と電圧との関係は線形であり、１０倍のＮａＣｌ勾配（５００ｍＭ ＣＩＳ；５０ｍＭ ＴＲＡＮＳ）を含有する溶液中の逆電位は＋３０ｍＶであった（図３Ｂ）。ＮａＣｌの代りにＫＣｌを含有する溶液でも同様の逆電位が観察された。膜のいずれかの側の溶液におけるＮａＣｌまたはＫＣｌのいずれかでの５つの実験において、平均逆電位は３１．０±１．２ｍＶ（±ＳＥＭ）であった。これは、陽イオンのみを選択的に透過させるチャネルについての予測よりもより負であった。Goldman-Hodgkin-Katz式にイオン活性を用いて、約５．５のＰＮａ／ＰＣｌ比を得、それは、チャネルが塩化物イオンも透過させることを示している。Ｎａ Ｃｌ勾配の代りにＮａ−リン酸勾配（１５０ｍ Ｎａ＋＆１００ｍＭ リン酸 ＣＩＳ；１５ｍＭ Ｎａ＋＆１０ｍＭ リン酸 ＴＲＡＮＳ、ｐＨ６．８）を用いた場合、逆電位は３７．１±０．２ｍＶ（±ＳＥＤ、ｎ＝２）であって、約５の陽イオン／陰イオン透過比率を示した。（リン酸溶液に関わる計算については、１価および２価の陰イオンの合計活性を用い、２つの種は等しく透過性であると仮定した。）今度は、電流−電圧曲線は該ＮａＣｌ溶液においては見られなかった整流を示した。Ｖｐｕにより形成されたチャネルは、Ｎａ＋およびＫ＋に対して等しく透過性であり、それよりも低い程度であるが、塩化物イオンならびにリン酸イオンに対しても透過性であると結論付け得る。
【０１１７】
実施例１１
薬物をブロックする電位イオンチャネルの
スクリーニングのためのバイオアッセイ
該Ｖｐｕイオンチャネルをブロックする薬物調査の一部として、新規バイオアッセイが開発され、二重層アッセイで行われたならば、法外に遅いであろうスクリーニング方法を容易にした［Ewart et al., 1996］。このバイオアッセイは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＶｐｕの発現が経膜ナトリウム勾配を消失させる形質膜に配置される能動的Ｖｐｕチャネルを生じるという観察に基づく。このＶｐｕチャネル活性の結果として、細胞内の蓄積がナトリウム依存性共輸送に媒介される代謝物（例えば、プロリンまたはアデニン）は、該代謝物の細胞内レベルが該細胞の増殖の限界に達するまで合成されるよりも速く細胞から流出する。従って、Ｖｐｕを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、アデニンまたはプロリンを欠如する最小限ドロップアウト培地（minimal drop-out media）中で増殖することは不可能である。しかしながら、該Ｖｐｕチャネルをブロックする薬物の存在下、該細胞は、その膜貫通ナトリウム勾配を ―該膜中の他のイオンポンプの作用のおかげで― もう一度再構成することが可能であり、代謝物の流出が妨げられて、増殖を可能とする。ＶｐｕがＥ．ｃｏｌｉの形質膜中でナトリウムチャネルを形成し得ることを立証する実験を以下のように行った：未融合ＮｐｕをＥ．ｃｏｌｉ中で発現するため、該ＶｐｕオープンリーディングフレームをプラスミドｐＰＬ４５１（１９）中へクローン化して、組替えプラスミドｐＰＬ−Ｖｐｕを生成した（図１ｂ）。このベクターにおいて、強力なＰＬおよびＰＲラムダプロモータを用いて、３０℃にて増殖させたとき、非常に抑制され、温度を３７℃および４２℃の間にまで上昇させることによって誘発し得るような温度感受性ｃＩ８５７の制御下でＶｐｕを発現させる。寒天プレート上、ｐＰＬ−Ｖｐｕを含有する細胞は、３０℃および３７℃にてインキュベートしたときは増殖し、４２℃では増殖せず、一方、対照株は４２℃にてよく増殖した。ｐＰＬ−Ｖｐｕを含有する細胞の液体培養を３０℃にてＯＤ６００＝０．８４にまで増殖させ、次いで、４２℃にて２時間増殖を始めた（最終細胞密度はＯＤ６００＝０．７５）。形質膜断片を調製し、ＶｐｕのＣ−末端に特異的に結合する抗体を用いるウェスターンブロットは約１６ｋＤａに単一バンドを検出し、それはＶｐｕが発現され、該膜に関連していることを示している（図２Ａ、レーン５）。
【０１１８】
実施例１２
クロスフィーディング実験は、ＶＰＵを発現する細胞から
プロリンが流出することを明かにする
Ｅ．ｃｏｌｉによるプロリンの摂取はよく特徴付けられており、該細胞内へのアミノ酸の能動的輸送は、エネルギー源としてナトリウム勾配を用いることが知られている［Yamamoto et al., 1994］。プロリン漏洩が起るかどうか検出するため、以下のクロスフィーディングアッセイを用いた：プロリンおよびメチオニン（Ｍｅｔ−、Ｐｒｏ−）に対して栄養素要求性のＥ．ｃｏｌｉ株のローン（lawn）を蒔き、プロリンを欠如するがメチオニンは含有する最小限ドロップアウト培地プレート上にソフト寒天オーバーレイとして注ぎ込んだ。滅菌有孔フィルターディスクをｐＰＬ４５１対照プラスミドまたはｐＰＬ−Ｖｐｕのいずれかを含有するＭｅｔ＋Ｐｒｏ＋株（ＸＬ−１ブルー）で接種し、該ソフト寒天上に載せた。次いで、該プレートを３７℃または３０℃にて２日間インキュベートした。その後、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−株のハロー増殖が、３７℃にてインキュベートされたｐＰＬ−Ｖｐｕを含有する細胞で接種されたディスクを取巻いているのがはっきりと見えた（図４Ａ）。この増殖は、単に、該ディスク上のＶｐｕ−発現細胞からのプロリンの漏洩によるものであろう。そのような漏洩は３７℃にての対照株からも３０℃にて増殖したプレート上のいずれの株の周囲にも見られなかった（図４Ｂ）。
【０１１９】
プロリン輸送とは対照的に、Ｅ．ｃｏｌｉメチオニンパミアーゼはＡＢＣトランスポーターファミリーに属することが知られており［Rosen, 1987］、それゆえ、ＡＴＰにより活性される。上記のものと同一のクロスフィーディング実験は、Ｍｅｅｔ−Ｐｒｏ−株がメチオニンを欠如するが、プロリンを含有する最小限ドロップアウトプレート上に塗り広げられたことを除き、同一のクロスフィーディングを行った。この株の増殖はいずれのディスクの周りでも明白ではなく（図４ｃ）、メチオニンはＶｐｕが発現されてとしても該ＸＬ−１ブルー細胞から漏洩しないことを示す。
【０１２０】
実施例１３
ＶＰＵを発現するＥ．ＣＯＬＩ細胞は、
増殖のため外部培地中にアデニン必要とする
アデニン合成経路における特徴付けられていない突然変異のため、Ｖｐｕを発現するＸＬ１−ブルー株のＥ．ｃｏｌｉ細胞の３７℃における増殖は、該培地中のアデニンの存在に依存した。これは、上記のプロリンクロスフィーディングアッセイよりも一層簡易なＶｐｕイオンチャネル活性のバイオアッセイの開発を可能にする：該ｐＰＬ−Ｖｐｕプラスミドを含有するＸＬ１−ブルーのローンを該培地中にアデニンを欠如する寒天プレートに蒔き、該Ｖｐｕチャネルの阻害につき試験すべき薬物の小アリコートを該寒天上の離れた場所にスポットし、該プレートを３７℃にて適当な時間（１２〜３６時間）インキュベートする。特定の薬物塗布サイトの周りの増殖のハローは、該薬物が、該薬物の不存在下では増殖を妨げるＶｐｕイオンチャネル活性の発現を阻害していたことを示す。
【０１２１】
実施例１４
バイオアッセイは電位チャネルブロッカーとしての
５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）−アミロライドを明かにする
このアッセイを用いて、多数のアマンタジン誘導体を試験したが、チャネル活性に影響しないことが分かった。しかしながら、多数のアミロライド誘導体も試験し、５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）−アミロライド（ＨＭＡ）を塗布したサイト周りの増殖のハローは、この薬物を可能性のあるＶｐｕチャネルブロッカー(図５）と同定した。置換されていないアミロライドはこれらのプレート上で細菌増殖のハローを生じなかった。
【０１２２】
実施例１５
平面脂質二重層実験はＨＭＡを
ＶＰＵチャネルインヒビターと確認する
ＨＭＡによるＶｐｕイオンチャネル活性の阻害が、平面脂質二重層実験において確認され（図６）、濃度５０〜２５０μＭ ＨＭＡが該チャネルを通るイオン流ブロックすることが分かった。元の化合物、アミロライド、および他の誘導体、５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）−アミロライド（ＤＭＡ）も同様に平面脂質２分子層実験において試験した：ＤＭＡはイオンチャネル活性を阻害することが分かったが、ＨＭＡほど効力的ではなかった。アミロライド自体はこれらの濃度にて、チャネルブロッカーとして活性ではなかった。
【０１２３】
実施例１６
ＨＭＡおよびＤＭＡはヒト単球およびマクロファージにおける
ＨＩＶ−１複製を阻害する
次なる試験を行って、ＨＭＡおよびＤＭＡに何らかの抗ウイルス活性があるかどうかを立証した。２つの試験を行って、ヒトの単球およびマクロファージにおけるＨＩＶ複製に対する該薬物の効果を特徴付けた：（ａ）ＰＣＲベースのアッセイを用いて、ＨＩＶゲノムの逆転写から生じる新たに合成したＤＮＡを検出した、ウイルス複製の早い段階；（ｂ）ＥＬＩＳＡ法を用いてウイルス性タンパク質ｐ２４の産生を定量し、該複製プロセスの遅い段階を反映する。該ＰＣＲの結果は、ＤＭＡは、５０μＭにて細胞においてＨＩＶ ＤＮＡの合成を阻害し；ＨＭＡは、５０μＭにて、細胞にとって毒性であった ― この薬物のより低濃度にてさらなる試験を行う。ｐ２４ ＥＬＩＳＡ結果は、ＤＭＡ（５０μＭ、データは示さず）でも、非毒性レベル（１０μＭ）にて使用したときはＨＭＡ（図７）でも、両方でＨＩＶビリオン合成の明確な阻害を示し；図７Ａは単球へのＨＭＡの効果を示し、図７Ｂは、マクロファージへのＨＭＡの効果を示す。
【０１２４】
当業者は、本明細書に記載された本発明が特別に記載されたもの以外の変形および修飾を許容することを認識するであろう。本発明はすべてのそのような変形および修飾を含むと理解されるべきである。本発明は、本明細書に個別にまたは集約的に言及したかあるいは、示した全てのステップ、特徴、組成物および化合物、および、いずれの２以上のステップまたは特徴のいずれのおよび全ての組合せも含む。
【０１２５】
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【図面の簡単な説明】
【図１ａ−ｃ】  図１は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＶｐｕの発現に用いたプラスミドの概略表記である。Ａ．ＨＩＶ−１株ＨＸＢ２ ｃＤＮＡクローンからＰＣＲにより発生したｖｐｕオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコード化されるアミノ酸配列（＜４００＞１）。該ｖｐｕＯＲＦをｐ２ＧＥＸ中のＧＳＴ遺伝子の３’末端にインフレームでクローン化してｐ２ＧＥＸＶｐｕを生じた（Ｂ）。引続き、それをｐＰＬ４５１にクローン化して、プラスミドｐＰＬ＋Ｖｐｕを産生した（Ｃ）。
【図２ａ−ｂ】  図２は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＶｐｕの発現および精製の写真表記である。Ａ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にウェスターンブロッティングを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉエキス中に発現したＶｐｕを検出した。レーン１〜４はｐ２ＧＥＸＶｐｕから発現したＶｐｕの種々の精製段階にての試料を含有する：レーン１、グルタチオン−寒天アフィニティークロマトグラフィーにより単離されたＧＳＴ−Ｖｐｕ融合タンパク質；レーン２、トロンビンの処理により該融合タンパク質から遊離されたＶｐｕ；レーン３、ＨＰＬＣ陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製されたＶｐｕ；レーン４、イムノアフィニティーカラムを通過させた後のＶｐｕ。レーン５およびレーン６、それぞれ、ｐＰＬ＋ＶｐｕまたはｐＰＬ４５１を含有する４２℃誘発細胞から調製した膜ベシクル。Ｂ．銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル：レーン１、ＨＰＬＣ陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製されたＶｐｕ；レーン２、該イムノアフィニティーカラムを通過させた後のＶｐｕ。
【図３ａ−ｂ】  図３は、精製Ｖｐｕを含有するアリコートに脂質二重層を暴露した後に観察されたイオンチャネル活性のグラフ表記である。ＡおよびＢにおいて、ＣＩＳチャンバーは５００ｍＭ ＮａＣｌを含有し、ＴＲＡＮＳチャンバーは５０ｍＭ ＮａＣｌを含有し；両方の溶液は１０ｍＭ ＭＥＳでｐＨ６．０にバッファー化された。Ｂは、Ａに示したものと同様のデータから作成した電流対電位曲線を示す。
【図４ａ−ｃ】  図４は、細菌クロスフィーディングアッセイの写真表記である。全プレートにつき、Ｍｅｔ−、Ｐｒｏ−栄養素要求性株を用いて、ソフト寒天オーバーレイに蒔いた。プレートＡおよびＢは、プロリンのない最小限ドロップアウト培地を含有し；プレートＣにおいて、該培地はメチオニンのないものである。バックグラウンドローンにおける細胞の生存率を制御するため、ＰおよびＭが標識されたディスクは、それぞれ、追加プロリンまたはメチオニンを含有した。ＣおよびＶが標識されたディスクは、それぞれ、プラスミドｐＰＬ４５２またはｐＰＬ＋ｖぷを含有するＭｅｔ＋、Ｐｒｏ＋Ｅ．ｃｏｌｉ細胞で接種された。プレートを３７℃にて（ＡおよびＣ）または３０℃にて（Ｂ）２日間インキュベートし、黒色背景上で、該プレートの下に配置された蛍光ライトからの周辺発光で撮影した。該像を、Novaline Video ゲルドキュメンテーションシステムで記録した。全プレート上でＰまたはＭが標識されたディスクの周り、およびプレートＡ上でＶが標識されたディスクの周りの光ハローはバックグラウンドローン株を示す。
【図５】  図５は、可能性のあるＶｐｕチャネルブロッカーについての薬物のスクリーニングのグラフ表記である。該写真は、アデニン欠如最小限培地−寒天プレートの断面を示し、その上に該Ｖｐｕ発現プラスミドｐＰＬＶｐｕを含有するＸＬ−１−ブルーＥ．ｃｏｌｉ細胞のローンが蒔かれていｒ。番号６〜１１は、３μ滴下で塗布され、該寒天に浸された、試験されている種々の薬物の塗布のサイトに位置している。次いで、プレートを撮影前に３７℃にて４８時間インキュベートした。背景の灰色の影は細菌増殖のない領域に対応する。「１０」周りの明るい円形領域はその場所へのアデニン塗布（正の対象）の結果による細菌細胞増殖を表している。「９」周りの細菌増殖の小さい方のハローは、その場所への５−（Ｎ,Ｎ−ヘキサメチレン）−アミロライドの塗布のためである。
【図６】  図６は、平面脂質二重層における５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）−アミロライドによるＶｐｕイオンチャネル加勢の阻害をグラフ表記である。３つの軌跡は、必要な濃度のＨＭＡの存在下で観察された典型的なＶｐｕチャネル活性を表す。実線はゼロ電流レベルを示す。少なくとも３０秒間の持続時間の連続チャネル記録から算出した平均電流（±偏差）は、３つの薬物濃度のそれぞれにつきグラフにプロットされる。
【図７ａ−ｂ】  図７は、単球および単球由来マクロファージにおけるＨＩＶビリオン産生に対するＨＭＡの効果のグラフ表記である。培養上清中のＨＩＶは、感染後様々な日に、定量ＥＬＩＳＡ法を用いてたｐ２４抗原の検出によりアッセイした。黒塗りのバーは１０μＭ ＨＭＡに暴露されたＨＩＶ感染細胞を表す。斜線のバーは、薬物に暴露されない対照細胞を表す。
【図８】  図８は、アミロライド、ＨＭＡおよびＤＭＡの化学式の概略表記である：Ｒ＝Ｈ２Ｎ、アミロライド；Ｒ＝（ＣＨ３）２Ｎ、ＤＭＡ；Ｒ＝（ＣＨ２）６Ｎ、ＨＭＡ。
【配列表】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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