(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒球コロニー刺激因子、および肝細胞増殖因子または線維芽細胞増殖因子を有効成分として含む虚血性疾患治療剤。
【請求項２】
顆粒球コロニー刺激因子と、肝細胞増殖因子または線維芽細胞増殖因子とを組み合わせることを特徴とする虚血性疾患治療剤。
【請求項３】
顆粒球コロニー刺激因子を含有し、肝細胞増殖因子または線維芽細胞増殖因子と組み合わせて用いることを特徴とする、虚血性疾患治療剤。
【請求項４】
虚血性疾患が、外傷、移植時の拒絶反応、虚血性脳血管障害、虚血性腎疾患、虚血性肺疾患、感染症に関連する虚血性疾患、四肢の虚血性疾患または虚血性心疾患である請求項１〜３のいずれか１項に記載の虚血性疾患治療剤。
【請求項５】
虚血性疾患が、脳卒中、脳梗塞、虚血性心筋症、心筋梗塞症、虚血性心不全または閉塞性動脈硬化症である請求項１〜３のいずれか１項に記載の虚血性疾患治療剤。
【請求項６】
虚血性疾患が、閉塞性動脈硬化症である請求項１〜３のいずれか１項に記載の虚血性疾患治療剤。
【請求項７】
抗血小板剤、血管拡張剤、微小循環改善剤、抗凝固剤または高脂血症治療剤等、臨床的に虚血性疾患の薬物療法として使用される薬剤と、請求項１〜５のいずれか１項に記載の虚血性疾患治療剤とを含有する虚血性疾患の治療剤。
【請求項８】
抗血小板剤、血管拡張剤、微小循環改善剤、抗凝固剤または高脂血症治療剤等、臨床的に虚血性疾患の薬物療法として使用される薬剤と、請求項１〜５のいずれか１項に記載の虚血性疾患治療剤とを組み合わせることを特徴とする虚血性疾患の治療剤。
【請求項９】
抗血小板剤、血管拡張剤、微小循環改善剤、抗凝固剤または高脂血症治療剤等、臨床的に閉塞性動脈硬化症の薬物療法として使用される薬剤と、請求項６に記載の虚血性疾患治療剤とを含有する閉塞性動脈硬化症の治療剤。
【請求項１０】
抗血小板剤、血管拡張剤、微小循環改善剤、抗凝固剤または高脂血症治療剤等、臨床的に閉塞性動脈硬化症の薬物療法として使用される薬剤と、請求項６に記載の虚血性疾患治療剤とを組み合わせることを特徴とする閉塞性動脈硬化症の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および血管新生作用を有する因子を有効成分として含む虚血性疾患治療剤、すなわち虚血性疾患治療用組成物に関する。
【背景技術】  本発明は虚血性疾患治療剤に関する発明であるが、まず、虚血性疾患の代表的疾患の一つである閉塞性動脈硬化症について説明する。
閉塞性動脈硬化症は、動脈硬化（粥状硬化）性病変によって主に脂肪からなる粥状物質が動脈壁内膜に沈着し、四肢、特に下肢の主幹動脈に閉塞あるいは狭窄が生じ、その末梢に虚血性障害が生じる疾患である。臨床症状としては冷感や痺れ感、間欠性跛行、安静時疼痛、潰瘍・壊死に分類される。本邦における閉塞性動脈硬化症患者は約１０万人はいると見られ（多田裕輔：治療学、３１巻２８９−２９２頁；１９９７年）、高齢者人口の増加や食事の欧米化により今後も増加するものと考えられている。
閉塞性動脈硬化症に対する治療法としては、症状や患者の状態などにより、運動療法、薬物療法、血行再建術が行われている。その他、現在重症虚血肢の切断を回避するための施行として、血管新生を促す血管新生療法（遺伝子治療、自家骨髄細胞移植など）が検討されている。これらの療法により、現在では閉塞性動脈硬化症の治療に一定の成果があがっているものの、それぞれの療法には以下に示す問題点が存在している。
運動療法は軽度の症例で歩行距離の延長効果を認める例があるものの、本療法の効果は予想が難しい。また、歩行距離の延長効果があっても患者がこれに満足しておらず、血行再建術を希望する場合が３０％あったという報告もあり（太田敬：日本医事新報、３９３５号２５−２９頁；１９９９年）、あまり効果的な治療法とはいえないのが現状である。
薬物療法については、主として処方されている抗血小板剤は病状の悪化を防ぐ程度のものであり、最近開発が進んでいる微小循環の血流改善剤や酸素運搬能改善剤にしても軽度な症例に適応が期待されているのみである。いずれにしても閉塞性動脈硬化症に対する根本的な治療薬はないのが現状である。
これに対し、血行再建術は現在のところ最も効果的な治療法であり、患者の状態、病変の部位や範囲に応じて経皮的血管形成術やバイパス手術が行われる。しかし、これらは手術を伴う大掛かりなものであり、手術に伴う合併症や死亡例があるほか、長期生存が期侍できない場合もある等の問題がある。
血管新生因子を用いた遺伝子治療は側副血行を発達させて虚血を改善しようとするものである。血管新生因子としては血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等が知られている。我が国ではヒトＨＧＦを用いた臨床研究が進行中である。重症虚血肢例を対象にＨＧＦのプラスミドを用いて下肢筋肉へ筋肉内注射する方法検討され、その効果に期待が持たれている。しかし、いまだ実験治療の域を出ておらず、安全性や効果に関しての評価が固まっていないため一般には普及していない。
また、最近になって注目されている自家骨髄細胞の筋肉内移植は、骨髄細胞を患部近傍の筋肉中に移植し、血管内皮細胞に分化させて血管形成することで治療を行うという療法である。自家骨髄細胞移植は免疫系への副作用もなく、動物モデルにおいて骨髄細胞の内皮細胞への分化や血管数の増加が認められている。今後、症例数を増やしてその効果に関する評価をする必要があるものの、重症例でも治療できることから、将来的な治療法として期待されている。しかし、臨床では全身麻酔下で骨髄を採取することから、これに伴う患者および医療スタッフの負担が大きいことが一つの問題点であると考えられる。
最近の研究により、骨髄中ばかりでなく末梢血中にも血管内皮細胞に分化しうる造血幹細胞（内皮細胞に分化するという機能の観点から「内皮細胞の前駆細胞」と呼ばれるが、この細胞ももともと造血幹細胞から派生してきているため、本明細書では内皮細胞にもなりうる細胞集団という概念で「造血幹細胞」という語句を使用する）が存在し、これが血管新生に関与するということがわかってきた（Ｑｕｎ  Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ｖｏｌ．９２，３６２−３６７，１９９８；Ｔａｋａｙｕｋｉ  Ａｓａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｏｌ．８５，２２１−２２８，１９９９；Ｍａｒｉｏ  Ｐｅｉｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ｖｏｌ．９５，９５２−９５８，２０００）。従って、末梢血中の造血幹細胞を採取してこれを患部近傍の筋肉中に移植することにより、閉塞性動脈硬化症を治療できることが期待される。この場合、末梢血幹細胞の採取に関わる患者および医療スタッフの負担が骨髄中の幹細胞を移植する場合よりも軽くなる事が利点であるが、通常、末梢血中の造血幹細胞の存在頻度はきわめて低いため、閉塞性動脈硬化症の治療に必要かつ十分量の造血幹細胞が得られるかどうかははなはだ疑問である。
ヒトＧ−ＣＳＦは顆粒球系造血前駆細胞の分化増殖因子として発見された造血因子であり、生体内では好中球造血を促進することから、骨髄移植や癌化学療法後の好中球減少症治療剤として臨床応用されている。また、上記作用のほかにもヒトＧ−ＣＳＦは造血幹細胞に作用してその増殖分化を刺激する作用や骨髄中の造血幹細胞を末梢血中に動員する作用がある。実際に、後者の作用に基づいて、臨床の現場では強力な化学療法を施行した後の癌患者の造血回復促進を目的として、ヒトＧ−ＣＳＦにより動員された末梢血造血幹細胞を移植する末梢血幹細胞移植術が行われている。Ｇ−ＣＳＦのこの造血幹細胞動員作用は同じ顆粒球系の造血因子であるＧＭ−ＣＳＦに比べるとはるかに強力である。また、副作用が少ないという点からもＧ−ＣＳＦはＧＭ−ＣＳＦに対する優位性を有している。
ＨＧＦは種々の間葉系細胞によって産生され、多くの上皮系細胞、ニューロン、内皮細胞、一部の間葉系細胞を標的とするタンパク質である。細胞増殖促進活性に加え、細胞運動性促進活性、上皮形態形成（管腔構造など）誘導活性をもつことが知られている。成体において肝臓をはじめ腎臓、肺、消化管の再生を促す器官再生因子として機能することから、臓器疾患の治療薬となることが期待されている。
【発明の開示】
閉塞性動脈硬化症患者に骨髄細胞を筋肉内移植することによる治療に先立って、Ｇ−ＣＳＦを投与することにより骨髄中の造血幹細胞の頻度が高くなる事が期待できることから、骨髄細胞採取時の骨髄穿刺回数を少なくすることができ、患者の負担を軽減できる。この際、移植する造血幹細胞を末梢血から得ることにより、更に患者および医療スタッフの負担を軽減することができる。更には、末梢血中の造血幹細胞は血管形成に寄与することが示されているため、Ｇ−ＣＳＦの投与により末梢血中の造血幹細胞を増加させることでこれを促進することが考えられる。従って、患者にＧ−ＣＳＦを投与しただけで、閉塞性動脈硬化症を治療できることが期待される。このＧ−ＣＳＦ投与による閉塞性動脈硬化症の治療は、造血幹細胞の採取や移植をしなくてすむという点で、患者や医療スタッフに対する負担がはるかに軽くなる事は明らかである。
さらに血管新生因子を用いた遺伝子治療と併用することで治療効果の増大が期待される。すなわち、Ｇ−ＣＳＦを造血幹細胞に作用させてその増殖分化を刺激し、骨髄中の造血幹細胞を末梢血中に動員してｖａｓｃｕｌｏｒｇｅｎｅｓｉｓを促進させるとともに、ＨＧＦ又はＦＧＦによりａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓを促進させ、両方の異なる作用を活かし、結果として血管新生作用の相加または相乗効果が予測できる。
Ｇ−ＣＳＦを用いた閉塞性動脈硬化症の治療は、重症な患者にも効果が期待できることから患者にとっては大きな福音となるが、血管内皮前駆細胞の分化増殖を促進する血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等の血管新生作用を有する因子あるいはその遺伝子治療と併用すれば更にその治療効果が増大することが期待される。この場合、これらの因子あるいはその遺伝子を患者に、たとえば患部近傍に投与することができる。同様に、臨床的に閉塞性動脈硬化症の薬物療法として使用されている抗血小板剤、血管拡張剤、微小循環改善剤、抗凝固剤、高脂血症治療剤等と併用してもその治療効果が増大することが期待される。
以上の検討の結果、本発明者らは、Ｇ−ＣＳＦとともに、血管新生因子としてＨＧＦ又はＦＧＦを投与すると、虚血血管において特に高い改善効果が得られることを見出し、本発明を完成した。
したがって、本発明は、Ｇ−ＣＳＦ、およびＨＧＦ又はＦＧＦを有効成分として含む虚血性疾患治療剤を提供するものである。
さらに、本発明の治療剤は、同じ虚血性疾患である下記の疾患の治療剤としても応用可能である。すなわち、本発明は、Ｇ−ＣＳＦ、およびＨＧＦ又はＦＧＦを有効成分として含む外傷、移植時の拒絶反応、虚血性脳血管障害（脳卒中、脳梗塞など）、虚血性腎疾患、虚血性肺疾患、感染症に関連する虚血性疾患、四肢の虚血性疾患、虚血性心疾患（虚血性心筋症、心筋梗塞症、虚血性心不全など）等の治療剤を提供するものである。
また、本発明は、閉塞性動脈硬化症の治療剤を提供するものである。
さらに、本発明は、血管再生剤または筋肉再生剤を提供するものである。
【図面の簡単な説明】  図１は、左足を虚血させたマウスに生理食塩水（対照）、ＨＧＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＨＧＦ＋Ｇ−ＣＳＦをそれぞれ投与することにより、下肢筋肉重量比（％）に及ぼす影響を調べた図である。
図２は、左足を虚血させたマウスに生理食塩水（対照）、ＨＧＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＨＧＦ＋Ｇ−ＣＳＦをそれぞれ投与することにより、下肢血流比（％）に及ぼす影響を調べた図である。
図３は、左足を虚血させたマウスに生理食塩水（対照）、ＨＧＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＨＧＦ＋Ｇ−ＣＳＦをそれぞれ投与することにより、血流速度に及ぼす影響を調べた図である。赤い部分が最も高速な部分であり、黄、緑、青の順で低速部分を示す。
図４は、Ａは、左足を虚血させたマウスに、生理食塩水（対照：ＨＧＦ−、Ｇ−ＣＳＦ−）、ＨＧＦプラスミド（ＨＧＦ＋、Ｇ−ＣＳＦ−）、Ｇ−ＣＳＦ（ＨＧＦ−、Ｇ−ＣＳＦ＋）、Ｇ−ＣＳＦ＋ＨＧＦプラスミド（ＨＧＦ＋、Ｇ−ＣＳＦ＋）をそれぞれ投与することにより、ＧＦＰ陽性細胞数比率に及ぼす影響を調べた蛍光顕微鏡写真である。緑はＧＦＰ陽性細胞、青は核を示す。Ｂは、顕微鏡写真から計測したＧＦＰ陽性細胞数をスコア化したグラフである。
図５は、Ａは、左足を虚血させたマウスに、生理食塩水（対照：ＨＧＦ−、Ｇ−ＣＳＦ−）、ＨＧＦプラスミド（ＨＧＦ＋、Ｇ−ＣＳＦ−）、Ｇ−ＣＳＦ（ＨＧＦ−、Ｇ−ＣＳＦ＋）、Ｇ−ＣＳＦ＋ＨＧＦプラスミド（ＨＧＦ＋、Ｇ−ＣＳＦ＋）をそれぞれ投与することにより、ｖＷＦ陽性細胞数比率に及ぼす影響を調べた蛍光顕微鏡写真である。赤はｖＷＦ陽性細胞、青は核を示す。Ｂは、顕微鏡写真から計測したｖＷＦ陽性細胞数をスコア化したグラフである。
図６は、Ａは、ＧＦＰ陽性細胞（緑）、血管内皮細胞（赤）及び核（青）の蛍光顕微鏡写真、並びにその重ね合わせ写真を示す。Ｂは、ＧＦＰ陽性細胞（緑）、血管平滑筋細胞（赤）及び核（青）の蛍光顕微鏡写真、並びにその重ね合わせ写真を示す。
図７は、Ａは、ＧＦＰ陽性細胞（緑）、骨格筋細胞（赤）及び核（青）の蛍光顕微鏡写真、並びにその重ね合わせ写真を示す。Ｂは連続切片の重ね合わせ写真を示す。
図８は、左足を虚血させたマウスに、生理食塩水（ａ：手術翌日、ｂ：投与４週間後）、ＨＧＦプラスミド（ｃ：投与４週間後）、Ｇ−ＣＳＦ（ｄ：投与４週間後）、Ｇ−ＣＳＦ＋ＨＧＦプラスミド（ｅ：投与４週間後）をそれぞれ投与し、下肢血流速度に及ぼす影響を調べた図である。「＊」はｐ＜０．０５（ｖｓ．生理食塩水投与群）、「＋」はｐ＜０．０１（ｖｓ．生理食塩水投与群）を示す。また、「＃」はｐ＜０．０５（ｖｓ．ＨＧＦプラスミド群）、「§」はｐ＜０．０５（ｖｓ．Ｇ−ＣＳＦ群）を示す。
図９は、投与４週後における下肢損傷の度合いをスコア化したグラフである。白は壊死なし、グレーは爪先壊死、黒は肢壊死を示す。
図１０は、左足を虚血させたマウスに、生理食塩水、Ｇ−ＣＳＦ、ＨＧＦプラスミド、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ＋ＨＧＦプラスミド、Ｇ−ＣＳＦ＋ＦＧＦをそれぞれ投与し、４週間後に下肢血流速度に及ぼす影響を調べた図である。「＊」はｐ＜０．０５（ｖｓ．生理食塩水投与群）、「†」はｐ＜０．０１（ｖｓ．生理食塩水投与群）を示す。また、「＃」はｐ＜０．０５（ｖｓ．Ｇ−ＣＳＦ群）、「§」はｐ＜０．０５（ｖｓ．ＨＧＦプラスミド群）、「¶」はｐ＜０．０５（ｖｓ．ＦＧＦ群）を示す。
図１１は、投与４週後における下肢損傷の度合いをスコア化したグラフである。白は壊死なし、グレーは爪先壊死、黒は肢壊死を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明はＧ−ＣＳＦ、およびＨＧＦまたはＦＧＦを含有する虚血性疾患治療剤に関する。
本発明において「虚血性疾患」とは、血液供給の器質的障害（例えば、動脈の狭窄など）による局所性貧血に関連する疾患のことをいう。虚血性疾患の例としては、例えば、外傷、移植時の拒絶反応、虚血性脳血管障害（脳卒中、脳梗塞など）、虚血性腎疾患、虚血性肺疾患、感染症に関連する虚血性疾患、四肢の虚血性疾患、虚血性心疾患（虚血性心筋症、心筋梗塞症、虚血性心不全など）を挙げることができる。
また、本発明はＧ−ＣＳＦ、およびＨＧＦまたはＦＧＦを含有する血管再生剤または筋肉再生剤に関する。
ヒトＧ−ＣＳＦはアミノ酸１７４残基からなる公知タンパク質である。
本発明の虚血性疾患治療剤の有効成分としてＧ−ＣＳＦを用いる場合は、どのようなＧ−ＣＳＦでも用いることができるが、高度に精製されたＧ−ＣＳＦが好ましい。具体的には、哺乳動物Ｇ−ＣＳＦ、特にヒトＧ−ＣＳＦ又はこれらと実質的に同様の生物学的活性を有するものが挙げられる。Ｇ−ＣＳＦの由来は特に限定されず、天然由来のＧ−ＣＳＦ、遺伝子組換え法により得られたＧ−ＣＳＦなどを用いることができる。遺伝子組換え法により得られるＧ−ＣＳＦは、天然由来のＧ−ＣＳＦとアミノ酸配列が同一のもの（例えば、特公平２−５３９５号、特開昭６２−２３６４８８号など）、あるいは該アミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸を欠失、置換及び／又は付加したもので、天然由来のＧ−ＣＳＦと同様の生物学的活性を有するもの等であってもよい。例えば、部位特異的変異誘発法（Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ  Ｈ．Ｊ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列に適宜変異を導入することにより、Ｇ−ＣＳＦと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｌ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００；Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２４，１４３１−１４３３；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
したがって、Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、Ｇ−ＣＳＦと機能的に同等なポリペプチドもまた本発明の虚血性疾患治療剤に用いることができる。このようなポリペプチドにおけるアミノ酸の変異数は、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内）である。
置換変異体においては、アミノ酸側鎖の性質が保存された他のアミノ酸に置換されていることが望ましい。アミノ酸側鎖の性質が保存されたアミノ酸とは例えば、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸又はアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加されたポリペプチドには、Ｇ−ＣＳＦを含む融合ポリペプチドが含まれる。融合ポリペプチドは、Ｇ−ＣＳＦと他のポリペプチドとが融合したものであり、このようなポリペプチドも本発明に用いることができる。融合ポリペプチドを作製するには、例えば、Ｇ−ＣＳＦをコードするＤＮＡと他のポリペプチドをコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを好適な発現ベクターに導入し、好適な宿主で発現させればよい。Ｇ−ＣＳＦとの融合に付される他のポリペプチドは、融合ポリペプチドがＧ−ＣＳＦと同等の生物学的活性を保持する限り特に限定されるものではない。
Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列を変化させたＧ−ＣＳＦ誘導体については既に数多くの報告があるので、これら公知のＧ−ＣＳＦ誘導体を用いることも可能である（例えば、ＵＳＰ５，５８１，４７６号、ＵＳＰ５，２１４，１３２号、ＵＳＰ５，３６２，８５３号、ＵＳＰ４，９０４，５８４号など）。
さらに、化学修飾したＧ−ＣＳＦを用いることも可能である。化学修飾したＧ−ＣＳＦの例としては、例えば、糖鎖の構造変換・付加・欠失操作を行ったＧ−ＣＳＦや、ポリエチレングリコール等の化合物を結合させたＧ−ＣＳＦなどを挙げることができる（例えば、ＵＳＰ５，８２４，７７８号、ＵＳＰ５，８２４，７８４号、ＷＯ９６／１１９５３号、Ｗ０９５／２１６２９号、Ｗ０９４／２００６９号、ＵＳＰ５，２１８，０９２号、特開平４−１６４０９８号など）。
本発明におけるＧ−ＣＳＦは、いかなる方法で製造されたものでもよく、例えば、ヒト腫瘍細胞の細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したＧ−ＣＳＦ、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌；酵母；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞などの哺乳類細胞；昆虫細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したＧ−ＣＳＦなどを用いることができる（例えば、特公平１−４４２００号公報、特公平２−５３９５号公報、特開昭６２−１２９２９８号公報、特開昭６２−１３２８９９号公報、特開昭６２−２３６４８８号公報、特開昭６４−８５０９８号公報）。
このようなＧ−ＣＳＦの製造方法は、上項で規定したものが製造される限りはその方法は問わず、具体的にはＧ−ＣＳＦ産生腫瘍やＧ−ＣＳＦ産生ハイブリドーマ、さらには遺伝子組換えによりＧ−ＣＳＦ産生能を賦与した形質転換宿主を用いて製造されるが、製造するＧ−ＣＳＦの構造により製造工程の適当な段階で改変操作やさまざまな修飾操作が適宜適用される。なお、遺伝子組換えにより製造する場合にはその宿主は問わず、大腸菌・動物細胞等、通常用いられる宿主が採用される。
又、本発明においては、Ｇ−ＣＳＦはタンパク質として投与してもよいが、遺伝子治療のようにＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を投与してもよい。
ＨＧＦは、６９ｋＤａのα鎖と３４ｋＤａのβ鎖から成る公知のヘテロ二量体タンパク質である。
ＨＧＦの投与方法は特に限定されず、ＨＧＦをタンパク質として投与してもよいが、遺伝子治療のようにＨＧＦをコードする遺伝子を投与することが好ましい。ＨＧＦをコードする遺伝子は、通常、発現カセットを含む発現ベクター等として投与されるのが一般的である。ベクターは特に限定されず、非ウイルスベクターを用いてもよいし、ウイルスベクターを用いてもよい（別冊実験医学、「遺伝子導入と発現解析実験方法」、羊土社、１９９７；別冊実験医学、「遺伝子治療の基礎技術」、羊土社、１９９６など）。ベクターの例としては、プラスミドベクター、ウイルスベクター、ファージベクター、コスミドベクター、ＹＡＣベクターなどを挙げることができる。発現ベクターには、通常、プロモーター等の調節要素や抗生物質耐性遺伝子などが含まれる。
遺伝子の導入方法はどのような方法を用いてもよく、例えば、リン酸カルシウム共沈法、リポフェクション法、リポソームを用いた導入方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡ法、レセプター介在性遺伝子導入方法、遺伝子銃を用いた方法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管を用いた方法などを用いることが可能である。また、本発明においては遺伝子を直接体内に導入してもよいし、取り出した細胞に遺伝子を導入した後に該細胞を体内に戻してもよい。
ＨＧＦやＨＧＦ発現ベクター（ＨＧＦ発現プラスミド）については、既に多数の報告がされているので、当業者は適宜選択して投与することが可能である（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｔ．，Ｈａｇｉｙａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  １９８９，３４２，４４０−４４３；Ｈａｙａｓｈｉ，Ｓ．，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｒ．，Ｈｉｇａｋｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９６，２２０，５３９−５４５；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｒ．，Ｓａｋａｋｉ，Ｍ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００２，１０５，１４９１−１４９６など）。又、ＨＧＦをコードする遺伝子の投与方法は当業者に公知の方法で行うことが可能である（例えば、ＷＯ０１／３２２２０、ＷＯ０１／２６６９４、ＷＯ９７／０７８２４、ＷＯ０１／２１２１４など）。
又、ＨＧＦをタンパク質として投与する場合は、どのようなＨＧＦでも用いることができるが、高度に精製されたＨＧＦが好ましい。具体的には、哺乳動物ＨＧＦ、特にＨＧＦ又はこれらと実質的に同様の生物学的活性を有するものが挙げられる。ＨＧＦの由来は特に限定されず、天然由来のＨＧＦ、遺伝子組換え法により得られたＨＧＦなどを用いることができる。遺伝子組換え法により得られるＨＧＦは、天然由来のＨＧＦとアミノ酸配列が同一のもの（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：Ｍ７３２３９、Ｍ７３２４０、Ｍ２９１４５、Ｌ０２９３１、Ｍ６０７１８など）、あるいは該アミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸を欠失、置換及び／又は付加したもので、天然由来のＨＧＦと同様の生物学的活性を有するもの等であってもよい。例えば、部位特異的変異誘発法（Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ，Ｈ．Ｊ．，１９８７  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、ＨＧＦのアミノ酸配列に適宜変異を導入することにより、ＨＧＦと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，１９８４，５６６２−５６６６；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｌ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０，１９８２，６４８７−６５００；Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１９８４，１４３１−１４３３；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒＨａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９，１９８２，６４０９−６４１３）。
したがって、ＨＧＦのアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、ＨＧＦと機能的に同等なポリペプチドもまた本発明の虚血性疾患治療剤に用いることができる。このようなポリペプチドにおけるアミノ酸の変異数は、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内）である。
ＨＧＦの置換変異体においては、Ｇ−ＣＳＦの場合と同様に、アミノ酸側鎖の性質が保存された他のアミノ酸に置換されていることが望ましい。ＨＧＦのアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加されたポリペプチドには、ＨＧＦを含む融合ポリペプチドが含まれる。融合ポリペプチドは、ＨＧＦと他のポリペプチドとが融合したものであり、このようなポリペプチドも本発明に用いることができる。融合ポリペプチドを作製するには、例えば、ＨＧＦをコードするＤＮＡと他のポリペプチドをコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを好適な発現ベクターに導入し、好適な宿主で発現させればよい。ＨＧＦとの融合に付される他のポリペプチドは、融合ポリペプチドがＨＧＦと同等の生物学的活性を保持する限り特に限定されるものではない。
なお、本発明のＨＧＦをコードする遺伝子には、このようなＨＧＦと機能的に同等なポリペプチドをコードする遺伝子も含まれる。
ＦＧＦには、酸性ＦＧＦ（ＦＧＦ１、１４０アミノ酸）と塩基性ＦＧＦ（ＦＧＦ２、１５５〜１５７アミノ酸）がある。さらに、機能的に類似したものとして、ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）、ＦＧＦ４（ｈｓｔ−１）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ｈｓｔ−２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ：ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ８（ＡＩＧＦ：ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ９（ＧＡＦ：Ｇｌｉａ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）などがある。本発明において「ＦＧＦ」とは、これら全てを含有する。
ＦＧＦの投与方法は特に限定されず、ＦＧＦをタンパク質として投与してもよいし、遺伝子治療のようにＦＧＦをコードする遺伝子を投与してもよい。ＦＧＦをコードする遺伝子は、通常、発現カセットを含む発現ベクター等として投与されるのが一般的である。ベクターは特に限定されず、非ウイルスベクターを用いてもよいし、ウイルスベクターを用いてもよい（別冊実験医学、「遺伝子導入と発現解析実験方法」、羊土社、１９９７；別冊実験医学、「遺伝子治療の基礎技術」、羊土社、１９９６など）。ベクターの例としては、プラスミドベクター、ウイルスベクター、ファージベクター、コスミドベクター、ＹＡＣベクターなどを挙げることができる。発現ベクターには、通常、プロモーター等の調節要素や抗生物質耐性遺伝子などが含まれる。
遺伝子の導入方法はどのような方法を用いてもよく、例えば、リン酸カルシウム共沈法、リポフェクション法、リポソームを用いた導入方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡ法、レセプター介在性遺伝子導入方法、遺伝子銃を用いた方法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管を用いた方法などを用いることが可能である。また、本発明においては遺伝子を直接体内に導入してもよいし、取り出した細胞に遺伝子を導入した後に該細胞を体内に戻してもよい。
ＦＧＦやＦＧＦ発現ベクター（ＦＧＦ発現プラスミド）については、既に多数の報告がされているので、当業者は適宜選択して投与することが可能である（Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１３，１８９−１９４，（１９８７）、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：Ｊ０４５１３、Ｍ２７９６８）。又、ＦＧＦをコードする遺伝子の投与方法は当業者に公知の方法で行うことが可能である（例えば、Ｊｅｊｕｒｉｋａｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６７（２），１３７−１４６，（１９９７）、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  Ｐ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，３（３），１５６−１６８，（１９９８）、Ｒｕｆｆｉｎｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，８（１６），１２０７−１２１３，（２００１）、など）。
又、ＦＧＦをタンパク質として投与する場合は、どのようなＦＧＦでも用いることができるが、高度に精製されたＦＧＦが好ましい。具体的には、哺乳動物ＦＧＦ、特にヒトＦＧＦ又はこれらと実質的に同様の生物学的活性を有するものが挙げられる。ＦＧＦの由来は特に限定されず、天然由来のＦＧＦ、遺伝子組換え法により得られたＦＧＦなどを用いることができる。遺伝子組換え法により得られるＦＧＦは、天然由来のＦＧＦとアミノ酸配列が同一のもの（例えば、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１３：１８９−１９４，１９８７．ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：Ｊ０４５１３、Ｍ２７９６８など）、あるいは該アミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸を欠失、置換及び／又は付加したもので、天然由来のＦＧＦと同様の生物学的活性を有するもの等であってもよい。例えば、部位特異的変異誘発法（Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ，Ｈ．Ｊ．，１９８７  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、ＦＧＦのアミノ酸配列に適宜変異を導入することにより、ＦＧＦと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，１９８４，５６６２−５６６６；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｌ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０，１９８２，６４８７−６５００；Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１９８４，１４３１−１４３３；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒＨａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９，１９８２，６４０９−６４１３）。
したがって、ＦＧＦのアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、ＦＧＦと機能的に同等なポリペプチドもまた本発明の虚血性疾患治療剤に用いることができる。このようなポリペプチドにおけるアミノ酸の変異数は、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内）である。
ＦＧＦの置換変異体においては、Ｇ−ＣＳＦの場合と同様に、アミノ酸側鎖の性質が保存された他のアミノ酸に置換されていることが望ましい。ＦＧＦのアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加されたポリペプチドには、ＦＧＦを含む融合ポリペプチドが含まれる。融合ポリペプチドは、ＦＧＦと他のポリペプチドとが融合したものであり、このようなポリペプチドも本発明に用いることができる。融合ポリペプチドを作製するには、例えば、ＦＧＦをコードするＤＮＡと他のポリペプチドをコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを好適な発現ベクターに導入し、好適な宿主で発現させればよい。ＦＧＦとの融合に付される他のポリペプチドは、融合ポリペプチドがＦＧＦと同等の生物学的活性を保持する限り特に限定されるものではない。
なお、本発明のＦＧＦをコードする遺伝子には、このようなＦＧＦと機能的に同等なポリペプチドをコードする遺伝子も含まれる。
さらに、本発明において、化学修飾したＨＧＦ又はＦＧＦを用いることも可能である。化学修飾したＨＧＦ又はＦＧＦの例としては、例えば、糖鎖の構造変換・付加・欠失操作を行ったＨＧＦや、ポリエチレングリコール等の化合物を結合させたＨＧＦ又はＦＧＦなどを挙げることができる。
本発明で用いるＨＧＦ又はＦＧＦは、いかなる方法で製造されたものでもよく、例えば、ヒト腫瘍細胞の細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したＨＧＦ又はＦＧＦ、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌；酵母；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞などの哺乳類細胞；昆虫細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したＨＧＦ又はＦＧＦなどを用いることができる。このようなＨＧＦ又はＦＧＦの製造方法は、上項で規定したものが製造される限りはその方法は問わず、遺伝子組換え等によりＨＧＦ又はＦＧＦ産生能を賦与した形質転換宿主を用いて製造されるが、製造するＨＧＦ又はＦＧＦの構造により製造工程の適当な段階で改変操作やさまざまな修飾操作が適宜適用される。なお、遺伝子組換えにより製造する場合にはその宿主は問わず、大腸菌・動物細胞等、通常用いられる宿主が採用される。
Ｇ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦは既に市販されており、これら市販のものを用いることも可能である。
本発明の虚血性疾患治療剤は、医薬製剤としての形態を取るために必要な製剤担体や賦形剤を、さらには安定化剤や吸着防止剤を含むことができ、剤形も注射剤（皮下、皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内など）・デポ製剤・経鼻剤・経口剤（錠剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤など）・経肺剤・経皮剤・経粘膜剤等、適当なものを選択することができ、必要に応じて適当なデバイスを用いることができる。
本発明の虚血性疾患治療剤には、その投与方法や剤形に応じて必要により、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を適宜添加することができる。
懸濁剤の例としては、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができる。
溶液補助剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができる。
安定化剤としては、デキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることができる。
等張化剤としては例えば、Ｄ−マンニトール、ソルビート等を挙げることができる。
保存剤としては例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができる。
吸着防止剤としては例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。
含硫還元剤としては例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。
酸化防止剤としては例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。
さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含んでいてもよい。
本発明の虚血性疾患治療剤に含まれるＧ−ＣＳＦの投与量および投与回数は対象となる患者の病状を考慮して決めることができるが、投与量は通常成人一人当たり０．１〜５００μｇ／ｋｇ／ｄａｙ、好ましくは１〜５０μｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量であり、また、投与回数は１週間に１〜７日間、１日に１〜３回投与することができる。投与方法は、静脈内、皮下、筋肉内投与などが好ましい。
Ｇ−ＣＳＦ遺伝子として投与される場合には、成人一人当たり０．１μｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇであり、リポソームの形態をとる場合は、ＨＧＦ遺伝子として成人一人当たり約１μｇ〜約４ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜約４００μｇの範囲で投与量が選択される。
本発明において、ＨＧＦ遺伝子を投与する場合、治療目的の疾患、症状などに応じた適当な投与方法・投与部位が選択される。投与部位としては、筋肉への投与が好ましい。また、投与方法としては、非経口的に投与することが好ましい。
投与量は、患者の症状等によって異なるが、ＨＧＦ遺伝子として成人一人当たり０．１μｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇである。リポソームの形態をとる場合は、ＨＧＦ遺伝子として成人一人当たり約１μｇ〜約４ｍｇの範囲、好ましくは約１０μｇ〜約４００μｇの範囲で投与量が選択される。投与回数は、適宜患者の症状に応じて選択される。数日ないし数週間に１回投与するのが好適であり、好ましくは各週１回で複数回投与される。より好ましくは８回投与される。
ＨＧＦをタンパク質として投与する場合は、投与量および投与回数は対象となる患者の病状を考慮して決めることができるが、投与量は通常成人一人当たり０．１〜５００μｇ／ｋｇ／ｄａｙ、好ましくは１〜５０μｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量であり、また、投与回数は１週間に１〜７日間、１日に１〜３回投与することができる。投与方法は、静脈内、皮下、筋肉内投与などが好ましい。
本発明において、ＦＧＦ遺伝子を投与する場合、治療目的の疾患、症状などに応じた適当な投与方法・投与部位が選択される。投与部位としては、筋肉への投与が好ましい。また、投与方法としては、非経口的に投与することが好ましい。
投与量は、患者の症状等によって異なるが、ＦＧＦ遺伝子として成人一人当たり０．１μｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇである。リポソームの形態をとる場合は、ＦＧＦ遺伝子として成人一人当たり約１μｇ〜約４ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜約４００μｇの範囲で投与量が選択される。投与回数は、適宜患者の症状に応じて選択される。数日ないし数週間に１回投与するのが好適であり、好ましくは各週１回で複数回投与される。より好ましくは８回投与される。
ＦＧＦをタンパク質として投与する場合は、投与量および投与回数は対象となる患者の病状を考慮して決めることができるが、投与量は通常成人一人当たり０．１〜５００μｇ／ｋｇ／ｄａｙ、好ましくは１〜５０μｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量であり、また、投与回数は１週間に１〜７日間、１日に１〜３回投与することができる。投与方法は、静脈内、皮下、筋肉内投与などが好ましい。
しかし、本発明はＧ−ＣＳＦ、およびＨＧＦ又はＦＧＦの用量によって限定されるものではない。本発明において、Ｇ−ＣＳＦ、およびＨＧＦ又はＦＧＦは１つの製剤として調製し投与することができる。また、それぞれ調製し、別々に投与することも可能である。
本発明の虚血性疾患治療剤を用いることにより、造血幹細胞の数を増加させることができ、これを骨髄または末梢血から採取して患者自身に自家骨髄移植することにより、末梢血中での血管形成に寄与し、虚血性疾患を治療することが可能である。また、本発明の治療剤を投与することにより末梢血中に造血幹細胞が動員されるため、造血幹細胞の採取や移植をすることなく、虚血性疾患を治療することも可能である。
また、抗血小板剤、血管拡張剤、微小循環改善剤、抗凝固剤、高脂血症治療剤等のこれまでに用いられている虚血性疾患に効果が期待できる薬剤、さらには遺伝子治療との併用も可能である。
以下、本発明を実験例（薬理効果）、実施例（製剤例）をあげて更に詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】  実験例１（薬理効果）
（１）  野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、８〜１０週齢；ＣＬＥＡ、東京、日本）の全身に致死量の放射線（８５０ｃＧｙ）を単回照射した。ＧＦＰトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、１０〜１２週齢）（Ｏｋａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．４０７，３１３−３１９）より骨髄細胞（５×１０６個）を採取し、尾静脈より野生型マウスに移植した。移植２ヶ月後、左大腿動脈を２ヶ所で結紮して下肢虚血モデルを作製し、生理食塩水投与群、Ｇ−ＣＳＦ投与群、ＨＧＦプラスミド投与群、Ｇ−ＣＳＦ＋ＨＧＦプラスミド投与群の４群に無作為にわけた（各群５匹）。ＨＧＦプラスミド（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｔ．，Ｈａｇｉｙａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８９，３４２，４４０−４４３；Ｈａｙａｓｈｉ，Ｓ．，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｒ．，Ｈｉｇａｋ，ｉ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９６，２２０，５３９−５４５；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｒ．，Ｓａｋａｋｉ，Ｍ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００２，１０５，１４９１−１４９６）は、プラスミド精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、製造者のプロトコールにしたがい調製した。生理食塩水投与群とＧ−ＣＳＦ（組換えヒトＧ−ＣＳＦ（中外製薬（株）製））（３００μｇ／ｋｇ／ｄａｙ）投与群はそれぞれ結紮後２４時間より１０日間皮下投与を行った。ＨＧＦプラスミド群は５００μｇ／匹を結紮後２４時間に筋肉内注射にて投与した。Ｇ−ＣＳＦ＋ＨＧＦプラスミド投与群は、結紮後２４時間にＨＧＦを筋肉内注射し（５００μｇ／匹）、その後直ちにＧ−ＣＳＦ投与（３００μｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を１０日間行った。
投与４週後における下肢筋肉重量比（図１）、下肢血流比（図２）、および各群のマウスの代表的な血流速度（図３）を図に示す。また、実験データを表１に示す。
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Ｇ−ＣＳＦ、ＨＧＦプラスミド単独投与群でも生理食塩水投与群に比較して改善傾向を示したが、Ｇ−ＣＳＦ＋ＨＧＦプラスミド投与群では他の群に比べて、下肢筋肉重量比、下肢血流比、血流速度ともに有意な回復を認め、下肢の損傷が軽減された。
以上より、ＨＧＦとＧ−ＣＳＦの組み合わせにより、それぞれ単独での治療に比べ、その治療効果が増大することが示唆された。
（２）  次に組織学的な観察を行うために、上記と同様の処置を行った野生型マウスをケタミン（３０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（６ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、下肢血管をＰＢＳで灌流し、ＰＢＳに溶解した４％パラホルムアルデヒドで灌流固定した。虚血下肢筋肉を取り出し、ＯＣＴ化合物（Ｍｉｌｅｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）中に包埋後、液体窒素で急速凍結してスライス切片を作製した。凍結切片（６μｍ）をＰＢＳで洗浄し、抗体を用いて４℃で一晩染色した。抗体は、血管内皮細胞の染色には抗フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）抗体（ｃｌｏｎｅ  Ｆ８／８６；ＤＡＫＯ）を、血管平滑筋細胞の染色にはα−平滑筋アクチン抗体（ｃｌｏｎｅ  １Ａ４；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、そして骨格筋細胞の染色には抗アクチニン抗体（ｃｌｏｎｅ  ＥＡ−５３；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）をそれぞれ用いた。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＲＩＴＣ（ＤＡＫＯ，Ｊａｐａｎ）結合２次抗体とともに４℃で４時間インキュベートした（赤）。核はＴＯＴＯ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）で染色（青）した。免疫染色した切片を共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５１０ＭＥＴＡ；Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した（図４Ａ及び図５Ａ）。
また、共焦点レーザー顕微鏡で撮影した画像をコンピュータに取り込み、ＮＩＨイメージで解析した。生理食塩水投与群（ＨＧＦ−、Ｇ−ＣＳＦ−）の切片あたりの有核細胞数に対する、ＧＦＰ陽性細胞数（図４Ｂ）及びｖＷＦ陽性細胞（図５Ｂ）を計算した。
更に、連続切片における典型的なＧＦＰ陽性細胞と血管内皮細胞の写真を重ね合わせものを図６Ａに、ＧＦＰ陽性細胞と血管平滑筋細胞の写真を重ね合わせたものを図６Ｂに、ＧＦＰ陽性細胞と骨格筋細胞の写真を重ね合わせものを図７Ａに示す。
下肢筋肉の免疫染色により、骨髄細胞由来のＧＦＰ陽性細胞が血管平滑筋細胞や血管内皮細胞に分化していることが明らかとなった。ＨＧＦプラスミド単独投与群でも生理食塩水投与群に比較して血管再生が亢進されたが、Ｇ−ＣＳＦ＋ＨＧＦプラスミド投与群では他の群に比べ相乗的な血管再生を示した。また、骨髄細胞由来の再生下肢筋肉も認められた。下肢損傷に対するＧ−ＣＳＦとＨＧＦの併用治療効果は、虚血肢における血管や下肢筋肉の再生に基因する作用であると考えられる。
実験例２（薬理効果）
ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ）の左大腿動脈を２ヶ所で結紮して下肢虚血モデルを作製し、生理食塩水群（２０匹）、ＨＧＦプラスミド群、Ｇ−ＣＳＦ群、Ｇ−ＣＳＦ＋ＨＧＦプラスミド群（各群１０匹）の４群に無作為にわけた。実験例１と同様にして、生理食塩水投与群とＧ−ＣＳＦ（３００μｇ／ｋｇ／ｄａｙ）投与群はそれぞれ結紮術後２４時間より１０日間皮下投与を行った。ＨＧＦプラスミド群は５００μｇ／匹を術後２４時間後に筋肉内注射にて投与した。Ｇ−ＣＳＦ＋ＨＧＦプラスミド投与群は、術後２４時間後にＨＧＦを筋肉内注射し（５００μｇ／匹）、その後直ちにＧ−ＣＳＦ投与（３００μｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を１０日間行った。投与４週後における各群のマウスの代表的な血流速度を図８に示す。なお、血流速度は平均±ＳＥＭで示し、平均値間の有意差はＡＮＯＶＡにより算出した。比較は、ｌｏｇ−ｒａｎｋ検定又はノンパラメトリックなＦｉｓｈｅｒの多重比較検定で行った。「＊」はｐ＜０．０５（ｖｓ．生理食塩水投与群）、「＋」はｐ＜０．０１（ｖｓ．生理食塩水投与群）を示す。また、「＃」はｐ＜０．０５（ｖｓ．ＨＧＦプラスミド群）、「§」はｐ＜０．０５（ｖｓ．Ｇ−ＣＳＦ群）を示す。
また、投与４週後における下肢損傷の度合いをスコア化して評価した（図９）。白は壊死なし、グレーは爪先壊死、黒は肢壊死を示す。
Ｇ−ＣＳＦ、ＨＧＦプラスミド単独投与群でも生理食塩水投与群に比較して有意な下肢血流改善効果を示したが、Ｇ−ＣＳＦ＋ＨＧＦプラスミド群では他の群に比べ更に有意で相乗的な下肢血流回復効果を示した。この効果は、野生型マウス（実験例１）における成績と同様な傾向を示したが、ヌードマウスの方がより顕著な効果が認められた。また、下肢の損傷も有意に改善された。
実験例３（薬理効果）
ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ）の左大腿動脈を２ヶ所で結紮して下肢虚血モデルを作製し、生理食塩水群（２０匹）、Ｇ−ＣＳＦ群、ＨＧＦプラスミド群、ＦＧＦ群、Ｇ−ＣＳＦ＋ＨＧＦプラスミド群、Ｇ−ＣＳＦ＋ＦＧＦ群（各群５匹）の６群に無作為にわけた。実験例１と同様にして、生理食塩水投与群とＧ−ＣＳＦ（３００μｇ／ｋｇ／ｄａｙ）投与群はそれぞれ結紮術後２４時間より１０日間皮下投与を行った。ＨＧＦプラスミド群は５００μｇ／匹を術後２４時間後に筋肉内注射にて投与した。ＦＧＦ群は、ＦＧＦ（トラフェルミン：科研製薬製）５００μｇ／匹を術後２４時間後に筋肉内注射にて投与した。Ｇ−ＣＳＦ＋ＨＧＦプラスミド投与群は、術後２４時間後にＨＧＦを筋肉内注射し（５００μｇ／匹）、その後直ちにＧ−ＣＳＦ投与（３００μｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を１０日間行った。Ｇ−ＣＳＦ＋ＦＧＦ投与群は、術後２４時間後にＦＧＦを筋肉内注射し（５００μｇ／匹）、その後直ちにＧ−ＣＳＦ投与（３００μｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を１０日間行った。投与４週後における各群のマウスの代表的な血流速度を図１０に示す。なお、血流速度は平均±ＳＥＭで示し、平均値間の有意差はＡＮＯＶＡにより算出した。比較は、ｌｏｇ−ｒａｎｋ検定又はノンパラメトリックなＦｉｓｈｅｒの多重比較検定で行った。「＊」はｐ＜０．０５（ｖｓ．生理食塩水投与群）、「†」はｐ＜０．０１（ｖｓ．生理食塩水投与群）を示す。また、「＃」はｐ＜０．０５（ｖｓ．Ｇ−ＣＳＦ群）、「§」はｐ＜０．０５（ｖｓ．ＨＧＦプラスミド群）、「¶」はｐ＜０．０５（ｖｓ．ＦＧＦ群）を示す。
また、投与４週後における下肢損傷の度合いをスコア化して評価した（図１１）。白は壊死なし、グレーは爪先壊死、黒は肢壊死を示す。
Ｇ−ＣＳＦ、ＦＧＦ単独投与群でも生理食塩水投与群に比較して有意な下肢血流改善効果を示したが、Ｇ−ＣＳＦ＋ＦＧＦ群では他の群に比べ更に有意で相乗的な下肢血流回復効果を示した。この効果は、野生型マウス（実験例１）における成績と同様な傾向を示したが、ヌードマウスの方がより顕著な効果が認められた。また、下肢の損傷も有意に改善された。
実施例１（製剤例）
ヒトＧ−ＣＳＦ（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）５０μｇ／ｍＬに、非イオン性界面活性剤であるポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０：ポリオキシエチレンソルビンモノラウレート）を０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加え、ＮａＣｌにて浸透圧を１にあわせた後、０．２２μｍのポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌する。得られた溶液を滅菌処理を施したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓で打栓し、続いてアルミニウムキャップにて巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用製剤は１０℃以下の冷暗所に保存する。
実施例２（製剤例）
ヒトＧ−ＣＳＦ（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）１００μｇ／ｍＬに、非イオン性界面活性剤であるポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０：ポリオキシエチレンソルビンモノオレエート）を０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加え、ＮａＣｌにて浸透圧を１にあわせた後、０．２２μｍのポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌する。得られた溶液を滅菌処理を施したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓で打栓し、続いてアルミニウムキャップにて巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用製剤は１０℃以下の冷暗所に保存する。
実施例３（製剤例）
ヒトＧ−ＣＳＦ（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）５０μｇ／ｍＬに、非イオン界面活性剤であるポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０：ポリオキシエチレンソルビンモノラウレート）０．１ｍｇ／ｍＬ、ＨＡＳ１０ｍｇ／ｍＬ及びマンニトール５０ｍｇ／ｍＬとなるように加えて溶解した後、０．２２μｍのポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌する。得られた溶液を滅菌処理を施したバイアル瓶に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を半打栓し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥剤を得た。この注射用凍結乾燥剤は室温以下の温度条件に保存し、注射用蒸留水にて用時溶解して使用する。
【産業上の利用の可能性】
本発明のＧ−ＣＳＦ、およびＨＧＦまたはＦＧＦを有効成分として含む虚血性疾患治療剤は、実験例１〜３で示したように閉塞性動脈硬化症の比較的重症の症例に対する治療効果が期待できる。このＧ−ＣＳＦ、およびＨＧＦまたはＦＧＦの効果は、血管新生の促進に基づくものと推測されることから、他の虚血性疾患すなわち、外傷、移植時の拒絶反応、虚血性脳血管障害（脳卒中、脳梗塞など）、虚血性腎疾患、虚血性肺疾患、感染症に関連する虚血性疾患、四肢の虚血性疾患、虚血性心疾患（虚血性心筋症、心筋梗塞症、虚血性心不全など）に対する治療効果も期待できる。本発明による治療は、従来の治療法と比較して簡便、安全かつ効果的である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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