(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４１のＴ．  ｒｅｅｓｅｉ  ＥＧＩＩＩセルラーゼの配列を有する前駆体アミノ酸配列から修飾されたアミノ酸配列を含有するセルラーゼであって、
修飾は２０１番目のプロリンのシステインへの置換を含み、該アミノ酸の番号は図１１に示した番号に従い；
前記セルラーゼは、前駆体アミノ酸配列を有するセルラーゼと比較して、増強された熱安定性を有する、
前記セルラーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載のセルラーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項４】
請求項２に記載のポリヌクレオチド又は請求項３に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載のセルラーゼの製造方法であって、
（ａ）前駆体アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを修飾し、請求項２で定義されたセルラーゼをコードする修飾ポリヌクレオチドを製造し；
（ｂ）前記修飾ポリヌクレオチドを宿主細胞で発現させ；そして
（ｃ）発現されたセルラーゼタンパク質を精製する、
ことを含む、前記製造方法。
【請求項６】
バイオマス還元における請求項１に記載のセルラーゼの使用。
【請求項７】
洗浄製品における請求項１に記載のセルラーゼの使用。
【請求項８】
織物処理組成物における請求項１に記載のセルラーゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、改良されたタンパク質、特に、相同のまたは関連するタンパク質からの残基の補充（recruitment）によって改変された安定特性を有する酵素に関し、および、このような的確に改良されたタンパク質の開発を可能にする有効な方法に関する。
発明の背景
様々な用途におけるタンパク質の有用性を増すために、タンパク質の機能特性を改良する方法が広く実践されている。このような技術としては、特定のアミノ酸の特性および／またはタンパク質の構造に基づき、特に関連するかまたは実験的な証拠に基づき関連が示されるような特定のアミノ酸残基を分離し、選択するための、タンパク質工学および部位特異的変異導入の使用を多くの場合含む。例えば、Estell等の米国特許第４，７６０，０２５号は、なかでもメチオニン、リシン、トリプトファンおよびシステインのような特に酸化を受けやすい残基を変更することにより、安定性を増すための、酸化に不安定な酵素の修飾を示唆する。Koths等の米国特許第４，７５２，５８５号は、保存的アミノ酸をそれぞれクロラミンＴの酸化を受けやすいメチオニン残基に置換することによって、治療用タンパク質の酸化安定性を改良する方法を示す。Barr等の米国特許第４，７３２，９７３号は、ヒトα1−アンチトリプシンの活性部位メチオニンを、酸化に安定なアミノ酸に置換することを示す。
【０００２】
これまでに提案されたさらなる技術として、進化的に近いタンパク質に対するタンパク質の相同性モデリングがあり、それによってタンパク質工学に関する基礎を得ることができる。Siezen et al., Protein Engineering, vol.4, no.7, pp.719-737(1991) において、より安定な酵素の特徴を標的に含ませるか複写することによって、工業的プロセスで用いられるプロテアーゼの特性を改良する方法が開示されている。その上、これらの技術は、より望ましいタンパク質の特性を、より望ましくないタンパク質へ付与することを必要とする。しかしながら実際には、そのより望ましいタンパク質とは、改良された特性を発揮することが望まれる標的である。したがって、このようなタンパク質をより望ましいものに調整することは困難なのである。したがって研究者は、改良のための、知識に基づかない（non-knowledge based）技術に注目している。
【０００３】
知識に基づかない変異方法は、関心のあるタンパク質に関する情報が欠如している場合、または、知識に基づく技術がうまくいかない場合に必要となる。典型的な知識に基づかない技術として、ランダム変異導入、エラーを起こしやすいＰＣＲ、および、ＰＣＲテンプレートスイッチング技術などのよく知られた方法があり、さらに、例えばStemmer等の米国特許第５，６０５，７９３号で説明されているシャッフリングのような近年開発されたものもある。ランダム変異導入は長年用いられており、文献でその多様なレベルの成功が報告されている。しかしながら、ランダム変異導入は、潜在的な変異体が多数あるために、成功するときと失敗するときがある。例えば、３００個のアミノ酸からなるタンパク質は、３００20のオーダーの可能な数のランダム変異体を有する。これほどの数の変異体を調製し、発現し、スクリーニングすることは、たとえ昨今のマススクリーニング技術を用いたとしても不可能である。Stemmerまたは他の分子育種技術で説明されている「遺伝子シャッフリング」のような定行進化技術は、利用可能な変異体のプールによって制限される。しかしながら変異体のプールは、タンパク質に関する知識が不十分な場合、天然型またはランダム変異の何れかから製造されなければならない。しかしながらこの変異体のプールは、無理のない成功に必要な、多様な生物種の最適に焦点の合ったプールを提供しない可能性がある。
【０００４】
より安定な酵素を製造するために、タンパク質工学の分野において相当数の取り組みがなされている。それでもなお、多くの重要なタンパク質における莫大な情報があれば、生物の多様性の範囲を完全に利用するために、変異体分子のプールを特定の効果に対して聡明に集中させる改良法が開発されるに違いない。以下に開示されるように、本発明者等は、新規の知識に基づいた変異導入技術を開発し、改良された性能、即ち機能性を有する新規なタンパク質を製造するという観点において、優れた利用可能性を提供する。本発明の技術を実施することによって、研究者は、望ましい「成功の」タンパク質の選択を容易にする、目的にかなった変異体プールを得ることができる。
【０００５】
発明の概要
特定の機能特性についてタンパク質の性能を改良する問題に直面した研究者は、タンパク質中に適切な変異を入れることを決定することについて深刻な問題にしばしば遭遇する。知識に基く変異導入方法にとって、多くのタンパク質の結晶構造がわからないことや、結晶構造が既知の比較タンパク質との低相同性アラインメントを伴う不確実さは、深刻な障害である。さらにその上、ランダム変異導入技術、または、分子育種のような他の知識に基かない変異方法はしばしば、最適な変異導入が一様に生じているという保証もなく大量の変異体をスクリーニングすることを必要とする、成功するか失敗するかわからない方法である。しかしながら、ある種の特徴について改良を試みる研究者はしばしば、関連する一次構造を有するファミリーを入手するが、それらの多くは改良を試みられているタンパク質より機能の点で劣っている。このようなことは、最良のタンパク質が最初の標的としてしばしば選択されるという事実により自然に起こる。しかしながら、この「最良のタンパク質」は、改良することによって大きな商業的または工業的利益を生むこともあるが、顕著な欠点を有する。ゆえに、研究者にとって、目的タンパク質の望ましい特性を減じないで他の特性を改良する様式で、どのようにタンパク質を修飾するかを決定する問題が残される。この場合、本明細書中の上記科学者たちは、より望ましくないタンパク質、すなわち安定性または活性の劣る酵素のアライメントを用いることにより、「最良のタンパク質」によって受け入れられ、それらの良い特性を不当に破壊しない点で大いに成功の見込みがあるアミノ酸修飾を推測することが可能であると決定した。事実、選択された改変が目的のプロセスで機能することになることを現実が既にしばしば確認したとおり、その成功の見込みは大いに高められる。
【０００６】
本発明の目的は、例えば、増強されたアルカリ安定性、ｐＨ安定性、熱安定性、増強された酸化安定性、増強された触媒活性、および、改良された基質または標的結合性、を含む、改良された機能特性を有するタンパク質を得る方法を提供することである。
【０００７】
本発明のさらなる目的は、タンパク質を提供することであり、例えば、増強されたアルカリ安定性、ｐＨ安定性、熱安定性、増強された酸化安定性、増強された触媒活性、および、改良された基質または標的結合性を有する酵素である。
【０００８】
本発明は、工程：（ａ）第１タンパク質および第２相同タンパク質の一次アミノ酸配列を決定し、前記一次アミノ酸配列を並べ、一次アミノ酸配列アライメントを製造するが、前記第２相同タンパク質は、前記第１タンパク質より、望ましい特性についてより望ましくない特性を有し；（ｂ）前記一次アミノ酸配列の配列アライメントにおいて、前記第１タンパク質と前記第２相同タンパク質との間の対応する位置で異なる残基を同定し；（ｃ）前記第１タンパク質において、工程（ｂ）で選択された少なくとも１つの前記異なる残基に対応して置換、欠失または付加がなされている変異タンパク質を調製し；（ｄ）機能特性について改良された性能に関して前記変異タンパク質をスクリーニングし；（ｅ）改良された性能を有する前記変異タンパク質の同一性を、選択し、決定する工程（ｅ）と、前記改良された変異タンパク質は、前記第１タンパク質および前記第２相同タンパク質両方からの少なくとも１つの残基において異なり、前記改良された第１タンパク質は前記望ましい特性について改良された機能を有するものである；を含む、第１タンパク質の望ましい特性を改良する方法を提供する。好ましくは、前記第１タンパク質の２以上の第２相同タンパク質とのアラインメントを作成し、そして工程（ｃ）で選択された置換は、変異のために選択された特定の位置において、第２相同タンパク質の重要な部分または全体に存在する残基から選択される。好ましくは、前記改良されたタンパク質は、前駆体アミノ酸配列に対応するタンパク質に比べて、アルカリ、ｐＨ、熱または酸化に関して改良された安定性の特性を有する。また好ましくは、前記タンパク質は酵素であり、より好ましくはα−アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼまたはプロテアーゼである。
【０００９】
本発明の他の実施形態において、（ａ）少なくとも２つの比較タンパク質の一次アミノ酸配列を並べるが、該比較タンパク質のうち１つは、望ましい特性についてより望ましくない性能を有するものであり；（ｂ）少なくとも２つの比較酵素間で残基が異なる位置を同定し、望ましい特性についてより望ましくない性能を有する比較タンパク質中で同定された位置に存在する残基を決定し；（ｃ）工程（ｂ）で決定された１以上の残基を選択し；（ｄ）工程（ｃ）で残基が選択された前記比較タンパク質中の位置に対応する位置で、前記第１タンパク質中の選択された残基を置換、欠失または付加させることにより前記第１タンパク質を改変すること；を含むが、但し、前記目的タンパク質は、前記第１タンパク質および前記比較タンパク質両方からの少なくとも１つの残基において異なり、前記改良された第１タンパク質は、前記望ましい特性について改良された機能を有する、第１タンパク質と比べて望ましい特性が改良された目的タンパク質を製造する方法が提供される。
【００１０】
好ましい実施形態において、２以上の第２相同タンパク質で比較を行い、安定性の劣る第２相同タンパク質中のすべてまたは数個の中にのみ存在する残基を第１タンパク質に補充し、改良されたタンパク質を製造する。
【００１１】
本発明の組成物の実施形態において、本発明の方法による修飾を含む改良されたタンパク質が得れらる。
本発明の利点は、前記特性について異なる２個の相同タンパク質の配列を並べて分析する簡単な技術によって、より望ましい特性を有するタンパク質を製造することができる点である。
【００１２】
本発明の他の利点は、変異体に関する知識に基かない方法と対照的に可能性のある変異体のプールを、より簡単にスクリーニングされる変異体数まで顕著に減らすことができる点である。
【００１３】
本発明のさらに他の利点は、改良されるタンパク質の三次構造に関する情報は必要でなく、単に相同タンパク質の配列アライメントがあればよい点である。
本発明のさらに他の利点は、より望ましくないタンパク質から得られた情報に基き優れたタンパク質をさらに改良することができる点であり、それにより、このような改良タンパク質を開発するのに利用される情報の蓄積を増すことができる。
【００１４】
詳細な説明
「発現ベクター」とは、ＤＮＡ構築物を意味し、適切なホスト中で前記ＤＮＡを発現させることが可能な適切な制御配列と操作可能に結合しているＤＮＡ排列を含む。このような制御配列は、転写をもたらすためのプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボゾーム結合部位をコードする配列、および、転写や翻訳の終結を制御する配列、を含んでよい。バチルス属ホスト中で発現が望まれる場合、好ましいプロモーターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｐｒＥプロモーターである。ベクターはプラスミド、ファージ粒子、または、単に可能性のあるゲノミックインサートでよい。適切なホストに形質転換されれば、ベクターは複製され、ホストゲノムとは独立して作動するか、またはある場合にはゲノム自身に統合されてよい。プラスミドが現在最もよく使用されるベクターの形態であるため、プラスミドとベクターとが交換可能に用いられることがあるが、本発明は、同等の機能を有し、当業界で周知であるかまたは周知になりつつあるような他の発現ベクターの形態を含むことを意図する。
【００１５】
「ホスト株」または「ホスト細胞」とは、本発明によるタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターにとって適切なホストを意味する。本発明において有用なホスト細胞とは、一般的に、原核細胞または真核細胞ホストであり、本発明に従い与えられたタンパク質の発現が達成され得る任意の形質転換可能な微生物を含む。当業者であれば、特定のタンパク質とともに用いるための、適切なホスト細胞を含む適切な発現や分泌の機構を熟知することになる。例えば、特定のタンパク質が由来するのと同じ種または属のホスト株が適しており、例えばバチルス属由来のα−アミラーゼの場合、適切なホスト細胞は、バチルス株であり得る。この場合、α−アミラーゼ陰性のバチルス株（遺伝子が欠失してるもの）、および／または、α−アミラーゼおよびプロテアーゼを欠失させたバチルス株（ΔamyE, Δapr, Δnpr）が、好ましく使用される。ホスト細胞に、組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターを、形質転換またはトランスフェクトさせる。このような形質転換ホスト細胞は、タンパク質をコードしたベクターやその改造体（変異体）を複製するかまたは所望のタンパク質を発現することができる。
【００１６】
「組換えタンパク質」とは、天然に生産されるタンパク質またはタンパク質前駆体配列と比較して、１以上のアミノ酸が置換、挿入または欠失されている配列をコードした変異ＤＮＡ配列が得られるように、天然に生産されるタンパク質またはタンパク質前駆体をコードするＤＮＡ配列を修飾して生産されるタンパク質を意味する。ここで用いられているように、前駆体タンパク質（または酵素）という用語は、化学反応における特有な表現の直前の前駆体ではなく、修飾がなされる親タンパク質の意味である。従って、それは修飾を規定する前駆体であるが、実際の改変または修飾は、該前駆体をコードするＤＮＡ中の改変においてその基準を有することになり、続いてそのＤＮＡを形質転換し、発現し、修飾を内包するタンパク質生産物を分泌する。
【００１７】
本発明による改良されたタンパク質は、前駆体タンパク質（または、ここでは「第１タンパク質」とも呼ばれる）のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含み、前駆体タンパク質中の特定の修飾はここで提供されるようなものである。前駆体タンパク質は、天然に生じるタンパク質または組換えタンパク質であり得る。改良されたタンパク質のアミノ酸配列は、前駆体アミノ酸配列の１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入によって前駆体タンパク質のアミノ酸配列に由来する。このような修飾は、一般的には、前駆体タンパク質自身を操作するよりむしろ、前駆体タンパク質のアミノ酸配列をコードする前駆ＤＮＡ配列のものである。前駆体のＤＮＡ配列のこのような操作のための適切な方法は、ここで開示されている方法および同じ所有者の米国特許第４，７６０，０２５号および第５，１８５，２５８号が挙げられ、ここに引用することによって本明細書に含められる。
【００１８】
「望ましい特性」とは、タンパク質を改良することが望まれる、あらゆる特性を意味する。このような望ましい特性は、例えば熱、ｐＨ、アルカリ、酸化または化学的安定性などの機能的特性、触媒活性、基質結合性、受容体結合性、アレルゲン性、抗菌活性、またはその他あらゆるタンパク質に関する望ましい特徴を含む。
【００１９】
「一次アミノ酸配列アライメント」とは、配列の同一性を有意な度合いで得るための、少なくとも２つのタンパク質の一次配列のアライメントを意味する。種々のアライメントアルゴリズムは、当業者にとって適切であり、日常的に使用されるような市販のソフトウェアの形態で存在する。これらのプログラムは、結果が得られるように作用するかもしれない種々のアルゴリズムパラメータの入力を提供する。しかしながら、本発明は、あらゆる特定の配列アライメントアルゴリズムに関しての選択を必要とせず、選択は、一般的に、パラメータを最適化しうるものである。一般的に、アライメントは近似とみなされており、即ち、アライメントを最適化する種々の方法を用いて、わずかに異なる変異体プールを有利に提供することによりそれから選択するべきである。その上で、本発明の利点は、改良されたタンパク質を選択するために変異タンパク質の目的プールを生産することであるため、本発明は、アライメントを決定するのに用いられるプログラムまたはパラメータに拘わらず等しく応用可能であるべきである。
【００２０】
本発明の一実施形態によれば、望ましい特性についてその性能を改良するために、タンパク質は以下のように修飾される。「第１タンパク質」と称される修飾されるタンパク質の一次アミノ酸配列を、望ましい特性についてより望ましくない性能を有する比較用「第２相同タンパク質」の一次アミノ酸配列とともに並べる。そのアライメントから残基が異なる位置を決定し、そして第２相同タンパク質配列中のそれらの位置に存在する残基を決定する。続いて、前段階で選択された少なくとも１つの残基を、第１タンパク質のアミノ酸配列に組み入れる。ここで発明者が驚きと共に確認したように、この様式において生産された修飾タンパク質は、望ましい特性について改良された性能を有する有意な確率を有する。従って、この様式によって生産された変異タンパク質のプールは、置換、欠失または付加された同定された残基の様々な組み合わせを有し、おそらくは改良されたタンパク質のプールを含み、次に「成功」に関してそれらの中から選択することができる。
【００２１】
バリエーションにおいて、２より多い一次アミノ酸配列のアライメントを得ることができる。この実施形態においては、第１タンパク質を、２以上の第２相同タンパク質の一次アミノ酸配列とともに並べるが、各第２相同タンパク質の一次アミノ酸配列は、第１タンパク質に比べてそれほど有用でない活性を有する種々のタンパク質に対応する。このアライメントから、第１タンパク質の一次アミノ酸配列と、２以上の第２相同タンパク質の一次アミノ酸配列との間で差異があるような位置において、２以上の第２相同タンパク質中に存在する残基を選択する。利用可能な変異体のプールを拡張する別な一つの方法において、第１タンパク質と第２相同タンパク質との間のバリエーションのそれぞれを、変異体を得るための基準として用い得る。他の好ましい選択可能な方法は、改良された機能特性を選択された変異タンパク質にうまく付与するのに最適な数に利用可能な変異体の数を制限し、第２相同タンパク質の各々が同一の残基を含むような差異のみを選択する。
【００２２】
上記方法のバリエーションの一つにおいて、アライメントは、第１タンパク質とは直接的に比較されない２以上の第２相同タンパク質により用意される。例えば、それぞれが第１タンパク質とともに並べられることができる２つの比較相同タンパク質を並べることにより、どこの残基が異なるのかを決定する。続いて得られたアライメントを分析し、望ましさの劣る性能を有する一つまたは複数の比較タンパク質中に存在する残基を決定し、続いて第１タンパク質の対応する位置において、その残基を置換、欠失または付加する。この実施形態において、比較のタンパク質は、第１タンパク質より優れているかまたは劣っている必要性はなく、目的のタンパク質を改変するために選択される残基が、望ましい特性についてより望ましくない性能を有する、相同の比較タンパク質から得られればよい。加えて、２より多い第２相同タンパク質の一次アミノ酸配列を並べ、そしてそれらから、様々な第２相同タンパク質の、望ましい特性に関する性能に基き、残基を選択することができる。
【００２３】
驚くべきことに、かつ意外なことに、出願人は、２以上の相同かまたは関連するタンパク質のアライメントを用意し、望ましい特性についてより望ましくない性能を有するタンパク質中の様々な位置に存在する残基を照合することによって、改良された機能特性を有するタンパク質を得られるかもしれないということを見出した。例えば、第１タンパク質と、望ましい機能特性についてより望ましくない性質を有する第２相同タンパク質とを比較し、異なる残基を同定し、上記の異なる変異に基いて変異体のプールを用意製し、そして第１タンパク質に比べて望ましい特性について改良された変異体を選択することによって、望ましい特性において有利な改良体が、このような修飾を有意な確率で得られるかもしれない。すなわち本発明の優れた用途の一つは、（ランダム変異体のプールと比較して）比較的数が少なく扱いやすい変異体プールを生ずることであり、第１タンパク質と比較して顕著に改良された機能特性を有するタンパク質をそれらから選択することができる。さらにその上、詳細な構造や機能の情報がなくても、このような結果を得ることができる。
【００２４】
並べられたタンパク質は、必ずしも匹敵する活性や機能を有していなくてもよい。しかしながら、好ましい実施形態において、上記タンパク質は、匹敵する活性、すなわち類似の生物学的活性、機能、触媒活性、または、特異的タンパク質を分類するのに一般的に用いられるその他の基準を有する。しかしながら、本発明は、現実が確認してきた位置を決定することに基き、ホスト生物に対してその価値を顕著に作用させることなく残基はタンパク質の構造中に存在し得るものであり、比較されたタンパク質の全ての特徴が同一である必要は無く、単にいくらか相同であるだけでよい。「実質的に相同」とは、それらの配列が意味を持って配列され、主要な構造上、機能上または触媒の部位を規定し得るように、タンパク質が保存された、即ち同一のアミノ酸を有意なレベルで有することである。好ましくは、第１タンパク質および第２相同タンパク質は、少なくとも３０％、好ましくは５０％の配列同一性、より好ましくは７０％の配列同一性、最も好ましくは８５％の配列同一性を含む。
【００２５】
好ましい実施形態において、上記タンパク質は酵素である。上記酵素は、加水分解酵素、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼまたはリガーゼの５つの主要な酵素分類に含まれる任意の酵素を含む。本発明から利益を得ることのできる酵素の特定の例は、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、ヘミセルラーゼ、グルコアミラーゼ、エステラーゼ、ラクターゼ、ポリガラクツロナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リグニナーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、または、密接に関連する任意の酵素や低い安定性の相同物が挙げられる。
【００２６】
本発明の方法および構成の代表例として、α−アミラーゼを以下に説明する。ここで用いられる「α−アミラーゼ」とは、例えばデンプン、アミロペクチンまたはアミロースポリマー中のα（１−４）グリコシド結合を開裂させるかまたは加水分解する酵素活性を有するものを意味する。α−アミラーゼは、天然に生産されるα−アミラーゼおよび組換えα−アミラーゼを含む。本発明において好ましいα−アミラーゼは、バチルス種、特にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから誘導されたものであり、同様に、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（すなわち、Ａ．ｏｒｙｚａｅおよびＡ．ｎｉｇｅｒ）のような真菌類のα−アミラーゼに由来する。従って、本発明におけるα−アミラーゼは、前駆体α−アミラーゼに由来する。前駆体α−アミラーゼは、α−アミラーゼを生産することのできる任意の源より生産される。好ましいα−アミラーゼの源は、菌類、細菌、植物または動物を含む原核生物または真核生物である。前駆体α−アミラーゼは、好ましくはバチルス属によって生産され、より好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓによって生産され、最も好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓによって生産される。
【００２７】
これまで、配列決定された植物、哺乳動物および細菌にわたるほとんど全てのエンドアミラーゼ間で相同性が見出されている(Nakajima et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., vol.23, pp.355-360 (1986); Rogers, Biochem. Biophys. Res. Commun., vol.128, pp.470-476 (1985); Janecek, Eur. J. Biochem., vol.224, pp.519-524 (1994))。ある種のバチルス属のアミラーゼにおいて、特に高い相同性を示す４つの領域があり、図５に示すように、下線で示された部分は、高い相同性を示す部分である。配列アライメントは、バチルス属のエンドアミラーゼ間の関係をマッピングすることにも用いられている(Feng et al., J. Molec. Evol., vol.35, pp.351-360 (1987))。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓとＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓとの間の相対的な配列相同性は、約６６％であり、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓとＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓとの間では、約８１％であり、これはHolm et al., Protein Engineering, vol.3, No.3, pp.181-191(1990) において決定された。一次構造に対する相同性を確立するために、前駆体α−アミラーゼのアミノ酸配列を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼ一次配列と直接比較し、特に、配列が既知の全α−アミラーゼにおいて不変であることが知られている残基群と直接比較する（例えば図７を参照）。さらに、ブタ膵臓のα−アミラーゼ(Buisson et al, EMBO Journal vol.6, pp.3909-3916 (1987); Qian et al., Biochemistry, vol.33, pp.6284-6294 (1994); Larson et al., J. Mol. Biol., vol.235, pp.1560-1584 (1994))：Ａｓｐｅｌｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴａｋａ−アミラーゼＡ（Taka-amylase A）(Matsuura et al., J. Biochem. (Tokyo), Vol. 95, pp.697-702 (1984))：および、Ａ．ｎｉｇｅｒからの酸α−アミラーゼ(Boel et al., Biochemistry, vol. 29, pp.6244-6249 (1990)) について報告された結晶構造の三次構造分析によって均等な残基を決定することも可能であり、前の二つの構造は類似しており、そしてオオムギのα−アミラーゼ (Vallee et al., J. Mol. Biol., vol.236, pp.368-371(1994); Kadziola, J. Mol. Biol., vol.239, pp.104-121 (1994))について報告された結晶構造の三次構造分析により同等の残基を決定することも可能である。いくつかの予備的な研究が公表されている(Suzuki et al, J. Biochem., vol.108, pp.379-381 (1990): Lee et al. Arch. Biochem. Biophys, vol.291, pp.255-257 (1991); Chang et a1, J. Mol. Biol., vol.229, pp.235-238 (1993): Mizuno et al., J. Mol. Biol., vol.234, pp.1282-1283 (1993))が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼに関して公表された構造はたった一つしかない(Machius et al., J. Mol. Biol. vol.246, pp.545-549 (1995))。しかしながら、多くの研究者は、グルカナーゼとの間の共通の超二次構造(MacGregor et a1., Biochem. J., vol.259, pp.145-152 (1989))、および、α−アミラーゼおよび他のデンプンを代謝する酵素のなかで共通の超二次構造(Jaspersen, J. Prot. Chem. vol.12, pp.791 -805 (1 993); MacGregor, Starke, vol.45, pp.232-237 (1993))、ならびに、α−アミラーゼと類似の超二次構造を有する酵素との間の配列の類似性(Janecek, FEBS Letters, vol.316, pp.23-26 (1993); Janecek et al, J. Prot. Chem., vol.12, pp.509-514 (1993))を予測している。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの酵素に関する構造が、Ｔａｋａ−アミラーゼＡの構造のモデルとされてきた(Holm et al., Protein Engineering, vol.3, pp.181-191 (1990))。図７に示した高度に保存された４つの領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓの番号付けシステムによれば、Ｈｉｓ＋１０５、Ａｒｇ＋２２９、Ａｓｐ＋２３１、Ｈｉｓ＋２３５、Ｇｌｕ＋２６１およびＡｓｐ＋３２８を含み、活性部位の一部と考えられる多くの残基を含む(Matsuura et al., J. Biochem. (Tokyo), vol.95, pp.697-702 (1984): Buisson et a1., EMBO Journal, vol.6, pp.3909-3916 (1987); Vihinen et al., J. Biochem., vol.107, pp.267-272 (1990))。細菌のアミラーゼハイブリッド酵素の結晶構造は、ＰＣＴ公報ＷＯ９６／２３８７４に公開されている。
【００２８】
上述したように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓからのα−アミラーゼは、全て有意な相同性を有する。しかしながら、例えば高温（９０℃を超過する）、低ｐＨ（ｐＨ４〜６）、および低カルシウムなどの工業的なデンプン液化の条件下で、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓから得られたα−アミラーゼは最も満足できる性能を示す。それにもかかわらず、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼでさえ、より安定な望ましい代替物を製造する液化条件下で、望ましくない不安定性な状態になりやすい。従って、液化プロセスにおける用途に関して望まれる酵素特性を得るために、分子を生産するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓに関して、多くの研究がなされている。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのα−アミラーゼの配列を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓからのα−アミラーゼの配列に対して並べることによって、相同体間で異なる残基を同定することが可能である。続いて本発明によれば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのα−アミラーゼと比べて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓからのα−アミラーゼにおいて残基が異なる位置を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのα−アミラーゼ中の残基の置換のために選択する。好ましくは、置換された残基は、実際には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのいずれかのα−アミラーゼ中に存在する残基と同一である。より好ましくは、置換された残基は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ両方のα−アミラーゼ中に存在する残基と同じである。
【００２９】
ここで特に同定されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓを置換するための残基は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓおよび／またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのα−アミラーゼ中の対応する位置の残基とは異なるものであり、特にＡ３３、Ａ５２、Ｓ８５、Ｎ９６、Ｈ１３３、Ｓ１４８である。これらの残基の特に好ましい置換は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのα−アミラーゼ中に存在する残基から選択され、かつＡ３３Ｓ、Ａ５２Ｓ、Ｎ９６Ｑ、Ｈ１３３Ｙ、Ｓ１４８Ｎ、Ａ２０９Ｖ、Ａ２６９Ｋ、Ａ３７９Ｓおよび／またはＡ４３５Ｓに対応するものであって、全ては安定性に貢献すると考えられている。さらに、Ａ８５Ｄ変異体は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓからのみ補充され、これも安定性の利益を提供する。上記の残基は、性能的な利益を提供する他の修飾体との組み合わせにおいて変更されてもよい。
【００３０】
本発明により改良されたタンパク質は改良された性能特徴を示し、それにより、タンパク質が一般的に用いられかつ改良された安定性が望まれる様々な応用において、それらのタンパク質を特に有用にする。例えば、α−アミラーゼを含む酵素は、本発明によって、改良された熱安定性、改良されたｐＨ安定性および／または改良された酸化安定性を示す。増強された熱安定性は、それらを含む製品の貯蔵寿命を延長することや、高温での用途において有用になる。増強された酸化安定性または増強された性能は、洗浄製品において特に望ましく、このような洗浄製品に用いられている漂白剤、過ホウ酸塩、過炭酸塩または過酸の存在下における酵素の貯蔵寿命を延長する。本発明におけるα−アミラーゼは、デンプンに関するプロセス、特に酸化および熱安定性が特に重要なデンプン液化において、特に有用である。改良された安定性を有するセルラーゼも本発明において開示され、そして例えばバイオマス還元（biomass reduction）、洗浄製品および織物処理組成物において特に有用である。
【００３１】
本発明のさらなる実施形態は、本発明に係るタンパク質をコードするＤＮＡ、および、このようなＤＮＡを含む発現ベクターである。ＤＮＡ配列は、従来周知の技術を用いて、適切な発現ベクター中の発現制御配列にそれらを結合させるように処理し、その発現ベクターを適切なホストに形質導入することによって、発現させてよい。本発明のＤＮＡ配列を発現させるのに、多様な種類のホスト／発現ベクターの組み合わせを用いてよい。有用な発現ベクターとしては、例えば、この目的に有用な染色体のまたは非染色体セグメント、および、様々な既知のプラスミドやファージなどの合成ＤＮＡ配列が挙げられる。加えて、多様な発現制御配列が一般的にこれらのベクターに用いることができる。例えば、バチルス属から得られたα−アミラーゼとともに、出願人は、バチルス属の形質転換体にとって好ましい発現制御配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓから誘導されたａｐｒＥシグナルペプチドであることを見出した。
【００３２】
多様なホスト細胞も本発明のＤＮＡ配列を発現するのに有用である。これらのホストは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、様々な菌類、酵母および動物細胞のような、周知の真核ホストまおよび原核ホストを含んでよい。精製や下流のム処理が容易であるために、本発明のタンパク質を細胞外に発現するホストが好ましい。本発明の改良されたタンパク質の発現および精製は、このようなプロセスを行うために当業界で認められる手段によってなされ得る。
【００３３】
以下に実施例を記載するが、これは特許請求の範囲を限定するために解釈されるべきではない。ここで用いられる略語、特にアミノ酸の３文字または１文字表記は、Dale, J.W., Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley & Sons, (1989) Appendix Bに説明されている。
【００３４】
実施例
実施例１
プラスミドｐＨＰ．ＢＬの構築
図３に示されるα−アミラーゼ遺伝子を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＮＣＩＢ８０６１（Gray et al., J. Bacteriology, vol.166, pp.635-643 (1986)）からクローニングした。その１．７２ｋｂのＰｓｔＩ−ＳｓｔＩフラグメントは、シグナル配列の少なくとも３個の残基、成熟したタンパク質全体、および、末端領域をコードしており、Ｍ１３ｍｐ１８にサブクローニングされた。以下に示す形態の、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎの転写調節末端(Wells et al., Nucleic Acid Research, vol.ll, pp.7911-7925 (1983))を含むように設計された合成オリゴヌクレオチドカセットを用いて、合成ターミネーターをＢｃｌＩ部位およびＳｓｔＩ部位の間に挿入した。
【００３５】
【化１】
0004658433.tif 000002
【００３６】
ｐＢＬａｐｒプラスミドを、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼに関する遺伝子を含むように構築した。図７で説明されているように、ｐＢＬａｐｒは、ｐＢＲ３２２からのアンピシリン耐性遺伝子およびｐＣ１９４からのクロラムフェニコール耐性遺伝子、ａｐｒＥプロモーターおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼをコードする遺伝子（「ＢＬ  ＡＡ」）を含む、６．１ｋｂのプラスミドである。ａｐｒＥプロモーターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのアルカリプロテアーゼのプロモーターおよびシグナル配列をコードする６６０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩフラグメントで構成された。Ｐｓｔｌ部位を除去し、ＳｆｉＩ部位をａｐｒＥ／ＢＬ  ＡＡ結合部の近くに付加した。ＢＬ  ＡＡ遺伝子は、上述した１７２０ｂｐのＰｓｔＩ−ＳｓｔＩフラグメントに含まれる。ここで説明される実験において、ｐＢＬａｐｒは、成熟アミラーゼに関するコード配列の開始部位の５’末端に隣接するＳｆｉＩ部位で構成されている。特に、ｐＢＬａｐｒ構造の５’末端は、ｐＢＬａｐｒからＭ１３ＢＭ２０（ベーリンガーマンハイム社）へ、ＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩＩフラグメントをサブクローニングし、以下に示す変異オリゴヌクレオチドに関するコード鎖の鋳型を得た。
【００３７】
【化２】
0004658433.tif 000003
【００３８】
このプライマーをＳｆｉＩ部位（下線で示す）に導入した。それにより、この特定の制限部位が存在することによってスクリーニングされ得る正しい形態にした。ＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＨフラグメントをｐＢＬａｐｒベクターへサブクローニングにより戻すことにより、ＳｆｉＩ部位を有するプラスミドのバージョン（version）を得た。
【００３９】
プラスミドｐＨＰ１３（Haima et al., Mol. Gen. Genet., VOl. 209, pp.335-342 (1987)）（図６）を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、得られたベクターを、ポリアクリルアミドゲル上で精製し、溶離した。プラスミドｐＥｈａｐｒを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、別のインキュベーションで、Ａｓｐ７１８およびＥｃｏＲＩで消化し、ゲルで精製した。二つのバンド、すなわちＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８（１２０３ｂｐ）およびＡｓｐ７１８−ＥｃｏＲＩ（１２５３ｂｐ）をゲルで精製し、ゲルから溶離し、３ウェイライゲーション（3-way ligation）によってベクターに結合し、プラスミドｐＨＰ．ＢＬを得た。当該プラスミドをα−アミラーゼの発現に用いた（図８）。
【００４０】
実施例２
アスパラギン１８８に関する置換を含むα−アミラーゼをコードするプラスミドの構築
天然に存在する各アミノ酸によるＡｓｎ１８８（「Ｎ１８８」）の置換をコードする変異プライマー群を合成し、そして図１に示す（配列番号４〜２２）。これらの変異をコードするα−アミラーゼ遺伝子変異体を、図９に要約される方法によって、図２に示すＰＣＲプライマー（配列番号２３〜３２）を用いてＰＣＲで製造した。
【００４１】
段階（１）：変異プライマーを、ＰＣＲプライマーのＰＣＲ  Ａ＋およびＰＣＲ  Ｂ−のためのテンプレートとして用い、伸長した（６１ｂｐ）二重鎖ＤＮＡを得た。それぞれ、１８８位に異なるアミノ酸の置換を含み、Ｎ１８８Ｍ以外は全て、異なる制限部位を含んだ。はじめに、ＰＣＲプライマーを、３５℃で５分間アニールし、続いてＴａｑポリメラーゼにより７５℃で１分間ＤＮＡ伸長した。次に二重鎖ＤＮＡを９５℃で１分間解離し、続いてアニーリング段階および伸長段階を行った。解離、アニーリングおよび伸長のサイクルを、総計３０サイクル続けた。
【００４２】
段階（２）：１８８位の上流および下流のＤＮＡを、それぞれ別のＰＣＲ反応で合成した。テンプレートとしてはｐＢＬａｐｒを用い、ＰＣＲプライマーとしては、上流のＤＮＡに関してはＬＡＡｆｓ５（配列番号２７）およびＰＣＲ  Ａ−（配列番号２４）を用い、下流のＤＮＡに関してはＰＣＲ  Ｂ＋（配列番号２５）およびＰＣＲ  Ｃｌａ−ＳａｌＩ（配列番号２８）を用いた。ＤＮＡを９５℃で１分間解離し、４５℃で３分間アニールし、６８℃で３分間伸長させた。上流の部分は２９０ｂｐであり、下流は４９８ｂｐである。この方法を、ｐｆｕポリメラーゼを用いて１８サイクル繰り返した。同じＰＣＲ方法を、段階（３）および（４）で用いた。
【００４３】
段階（３）：段階（２）で説明したＤＮＡの上流部分を、段階（１）で説明した二重鎖の変異プライマーに付加した。プライマーＬＡＡｆｓ５（配列番号２７）およびＰＣＲ  Ｂ−（配列番号２６）を用いた。３つのテンプレート間で２４ｂｐのオーバーラップが生じるようにプライマーを設計し、ここに２ピースのＤＮＡを付着させることができる。
【００４４】
段階（４）：段階（２）で示されたＤＮＡの下流部分と、段階（３）の生産物とを結合して、目的の生産物を得た。２つのＰＣＲ産物間にある２４ｂｐのオーバーラップにより、結合が可能である。用いられたプライマーは、ＬＡＡｆｓ５（配列番号２７）およびＰＣＲ  ＣｌａＩ−ＳａｌＩ（配列番号２８）であった。
【００４５】
段階（５）：特異的な制限部位、すなわちＡｓｐ７１８およびＢｓｓＨＩＩは、それぞれ１８８部位の上流および下流に存在する。目的のＰＣＲ産物は、Ａｓｐ７１８およびＢｓｓＨＩＩで分解され、３３３ｂｐのフラグメントをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ｐＨＰ．ＢＬベクターにサブクローニングし、ｐＨＰ．Ｎ１８８Ｘを得た。
【００４６】
変異を、ジデオキシ配列解析によって確認した（Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol.74, pp.5463-5467 (1977)）。
図３で用いられたＤＮＡ配列および番号付けシステムを参照すると、＋１８８アミノ酸の位置をコードするコドンは、８１２〜８１４番の塩基対にある。ＰＣＲプライマーＡ＋およびＡ−は、７８４〜８０７番の塩基対に相当する。ＰＣＲプライマーＢ＋およびＢ−は、８１２〜８４４番の塩基対に相当する。ＰＣＲプライマーＬＡＡｆｓ５の５’末端は、５１８番の塩基対に相当する。ＰＣＲプライマーＰＣＲ  Ｃｌａｌ−Ｓａｌｌの５’末端は、１３１７番の塩基対に相当する。Ａｓｐ７１８部位は、７２４番の塩基対に相当する。ＢｓｓＨＩＩ部位は、１０５３番の塩基対に相当する。
【００４７】
実施例３
Ｍ１５およびＮ１８８における変異をコードするプラスミドの構築
１５位のアミノ酸がメチオニンからスレオニンに置換されたｐＢＬａｐｒプラスミドを、米国特許出願第０８／１９４，６６４（ＰＣＴ公報ＷＯ９４／１８３１４）に従って構築した。このプラスミド（ｐＢＬａｐｒＭ１５Ｔ）を、ＳｆｉＩおよびＡｓｐ７１８で分解し、４７７ｂｐフラグメントをｐＨＰ．ＢＬにサブクローニングし、ｐＨＰ．Ｍ１５Ｔを製造した。上述した実施例１と同様の方法で、ｐＨＰ．Ｍ１５Ｔを、Ａｓｐ７１８およびＢｓｓＨＩＩで分解し、ゲルで精製し、該ゲルから溶離した。続いて、Ａｓｐ７１８−ＢｓｓＨＩＩを含む３３３ｂｐのフラグメント、および、ｐＨＰ．Ｎ１８８ＳからのフラグメントをｐＨＰ．Ｍ１５Ｔにサブクローニングし、プラスミドｐＨＰ．Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓを得た。同様の方法で、プラスミドｐＢＬａｐｒＭ１５ＬおよびｐＨＰ．Ｎ１８８Ｙを用いて、プライマーｐＨＰ．Ｍ１５Ｌ／Ｎ１８８Ｙを構築した。
【００４８】
実施例４
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのプラスミドによる形質転換、変異α−アミラーゼの発現および精製
実施例１〜３で説明したプラスミドによる形質転換の後、α−アミラーゼをＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓで発現させた。ｐＨＰ１３は、Ｅ．ｃｏｌｉやＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中で複製させることができる。異なる変異を含むプラスミドを、Anagnostopoulos et al., J. Bacter., vol.81 , pp.741-746 (1961)に説明されているように、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＭ２９４を用いて構築し、該プラスミドを分離し、続いてＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓを形質転換した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ株は二種のプロテアーゼ（Δａｐｒ、Δｎｐｒ）（例えば、Ferrari等の米国特許第５，２６４，３６６号を参照）およびアミラーゼ（ΔａｍｙＥ）（例えば、Stahl et al., J. Bacter., vol.158, pp.411-418 (1984)を参照）によって溶解させた。Ｍ１５Ｌ／Ｎ１８８Ｙを発現するＢａｃｉｌｌｕｓ株は、１％の不溶性スターチを含む寒天プレート上で、Ｍ１５Ｌを発現する株より大きい透明ゾーンを形成することから、デンプン分解活性が増強されていることがわかった。形質転換後、ｓａｃＵ（Ｈｙ）変異体（Henner et al., Bacter., vo1., 170, pp.296-300 (1988)）を、ＰＢＳ−１で媒介される導入方法（Hoch, J. Bact., vol.154, pp.1513-1515 (1983)）によって導入した。
【００４９】
分泌されたアミラーゼを、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの培養物から普通に以下のようにして回収した。培養物を、硫酸アンモニウムで２０％飽和に調節し、４℃で１時間攪拌した。遠心分離した後に得られた上清を、硫酸アンモニウム７０％飽和に調節し、４℃で１時間攪拌した。その上清を遠心分離した後に得られた沈殿を、ｐＨ６．０で５ｍＭの塩化カルシウムを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウムに再溶解し、ろ過滅菌した。
【００５０】
実施例５
α−アミラーゼ活性を決定するための分析
可溶性基質分析（Soluble Substrate Assay）：速度分析を、Megazyme (Aust.) Pty. Ltd.が販売するエンド−ポイントアッセイキット（end-point assay kit）に基き行った。バイアル中の基質（ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド、ＢＰＮＰＧ７）を、１０ｍｌの滅菌水で溶解し、続いて分析緩衝液（５０ｍＭマレイン酸緩衝液、ｐＨ６．７、５ｍＭ塩化カルシウム、０．００２％Ｔｗｅｅｎ２０）で１：４に希釈した。分析は、２５℃のキュベット中で、１０μｌのアミラーゼを７９０μｌの基質に加えることによってなされた。７５秒間反応させた後に４１０ｎｍでの吸収が変化する速度を測定し、これを加水分解の速度とした。その結果によれば、０．２吸収単位／分（absorption units/min）の速度まで直線であった。
【００５１】
α−アミラーゼのタンパク質濃度は、Bradford, Anal. Biochem., vol. 72, p. 248 (1976)に基く、ウシ血清アルブミンを標準に用いた標準的なバイオラッドアッセイ（Bio-Rad Laboratories）により測定された。
【００５２】
デンプン加水分解分析：デンプンに対するα−アミラーゼ活性は、デンプンがヨウ素を含む青色複合体を形成する能力、および、デンプンが加水分解されてデキストリン分子に分解されるときにその色が消失することによる分析方法によって決定された。α−アミラーゼ活性は、分解されて、デンプンがデキストリンの状態になったことを示す色の変化に必要な時間において決定された。
【００５３】
用いられた試薬は以下のとおりである。
リン酸緩衝液−リン酸２水素カリウム（３４０ｇ）および水酸化ナトリウム（２５.３ｇ）を、水に溶解し、〜２リットルに希釈した。該緩衝液を室温まで冷やし、ｐＨを６.２±０．１に調節した。該緩衝液をメスフラスコで２リットルに希釈した。
【００５４】
デンプン基質−１０ｇの可溶性リントナーデンプン（lintner starch）を、５０ｍｌの水に懸濁し、〜３００ｍｌの沸騰水中に投入した。その懸濁液を再び沸騰するまで加熱し、一定してかき混ぜながら５分間煮沸した。そのデンプン溶液を一定してかき混ぜながら室温まで冷やし、１２５ｍｌのリン酸緩衝液を添加した。溶液を５００ｍｌに水で希釈した。デンプン基質は、毎日新たに作成した。
【００５５】
保存ヨウ素溶液−ヨウ素の結晶（５.５ｇ）およびヨウ化カリウム（１１.０ｇ）を、水に溶解し、体積測定により２５０ｍｌに希釈した。その溶液を暗所に保存した。
【００５６】
希釈ヨウ素溶液−ヨウ化カリウム（２０ｇ）および２ｍｌの保存ヨウ素溶液を水に溶解し、体積測定により５００ｍｌに希釈した。溶液は、毎日新たに作成した。
【００５７】
酵素希釈溶液−塩化カルシウム（１１.１ｇ）を４リットルの水に溶解した。全ての試薬で用いられた水はいずれも蒸留水または脱イオン水であった。
α−アミラーゼサンプルを、１０〜１５ＬＵ／ｍｌ（以下で定義される）の範囲で、酵素希釈溶液で希釈した。多くの市販のα−アミラーゼ製品において、適切な希釈は、２０００倍であることがわかった。希釈ヨウ素溶液を５ｍｌずつ１３×１００ｍｍの試験管に分配し、１０ｍｌのデンプン基質を２３×２００ｍｍの試験管に入れた。全ての試験管を３０℃のウォーターバス中に置いた。特殊なα−アミラーゼカラーディスクを備えたＨｅｌｌｉｇｅ  ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ（カタログ番号  ６２０−ｓ５）を用いて、読み取りを行った。５ｍｌの希釈酵素（３０℃）を、デンプン基質と混合し、時間計測をはじめた。適切な時間間隔で、例えば、反応初期１分間および反応後期１５秒間の間隔で、酵素−基質混合物１ｍｌを希釈ヨウ素溶液を含む試験管に移送した。デンプンヨウ素溶液を混合し、１３ｍｍの精密角型試験管に移送し、その色を、Ｈｅｌｌｉｇｅ  ｃｏｍｐａｒａｔｏｒの標準α−アミラーゼカラーディスクと比較した。エンドポイントの時間が近づいてきたときに、サンプルを０.２５分の間隔で分取した。
【００５８】
サンプルの色とカラーディスクの色とが合致するのに要する時間を記録し、活性（グラムまたはｍｌあたりの液化量（liquefon）において）を以下の式に従って計算した。
【００５９】
【数１】
ＬＵ／ｍｌまたはＬＵ／ｇ＝
式中、ＬＵは液化量単位（liquefon unit）であり、Ｖは酵素の量（５ｍｌまたはグラム）であり、ｔはデキストリン化する時間（分）であり、Ｄは希釈ファクター（希釈された酵素のｍｌまたはｇで希釈液量を割った値）である。
【００６０】
実施例６
熱安定性に関する、追加の変異α−アミラーゼの調製および試験
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｌａｃｉｅｎｓは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓが生産するα−アミラーゼより安定性の劣るα−アミラーゼを生産する。これらのアミラーゼの配列から、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓと比べてＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓにおいて異なる残基を同定した。この分析から、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｌｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ両方において対応する残基は同一であるがＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓとは異なるような５つの位置の１以上の位置で置換された、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓの配列に基く変異α−アミラーゼを製造した。該５つの位置とは、Ｍ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８５／Ａ２０９Ｖと組み合わされたＡ３３Ｓ、Ａ５２Ｓ、Ｎ９６Ｑ、Ｓ１４８Ｎ、Ａ３７９Ｓであり、これらと、Ｍ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８５／Ａ２０９Ｖの置換のみを含む変異体と比較した。加えて変異体Ｓ８５Ｄを組み込み、これは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのα−アミラーゼからのみ補充されたことを示す。望ましい変異体を得るために適切なＰＣＲプライマーを用いたことを除いては、実施例１〜４に記載の方法に従って変異体を製造した。
【００６１】
様々な変異体における熱失活の速度を、以下の方法によって測定した。アミラーゼ保存溶液を、２０ｍＭ酢酸アンモニウム、４ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ６．５の溶液中でよく透析した。安定性の測定のために、この保存溶液を、天然型アミラーゼの迅速な失活を誘導するように調製された溶液で５０倍超に希釈した。該溶液は、５０ｍＭ酢酸アンモニウム、５ｍＭ  ＣａＣｌ2、０.０２％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ４.９または４.８であり、最終濃度は３０〜５０μｇ／ｍｌであった。６個のエッペンドルフチューブに上記希釈された溶液を１００μｌずつ入れ、８２〜８３℃のウォーターバス中に置いた。一定時間でエッペンドルフチューブを取り出し、３０秒〜５分の間隔で測定し、失活を止めるために氷上においた。実施例５で説明した可溶性基質を用いて残存活性を分析した。活性の自然対数をインキュベート時間に対してプロットし、失活に関する速度定数を直線の傾きから得た。ｌｎ（２）を速度定数で割ることによって半減期を計算した。様々な変異体に関する結果を表１〜４に示す。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
【表２】
0004658433.tif 000005
【００６４】
【表３】
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【００６５】
【表４】
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【００６６】
実施例７
より安定なセルラーゼの安定性の改良のための、より安定でないセルラーゼからの残基のより安定なセルラーゼへの補充
様々な種からのＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＥＧＩＩＩセルラーゼの相同体を得て、熱安定性を試験した。セルラーゼは、（Ａ）Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ、（Ｂ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ、（Ｃ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ、（Ｄ）Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  （１）、（Ｅ）Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ（２）、（Ｆ）Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  （３）および（Ｇ）Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａから得られた。上記のなかでもセルラーゼ（ａ）〜（ｆ）は、分析条件下でＥＧＩＩＩより熱的に安定ではない。セルラーゼ（ｇ）はＥＧＩＩＩより安定である。従って、これらのセルラーゼが並べられた配列（図１１に示す）から、より安定なセルラーゼに比べてより安定でないセルラーゼ中に存在する残基をピックアップすることができる。表の読み取りをわかりやすくするために、変異が記録された位置は太字で強調されている。続いてＥＧＩＩＩの変異体をこの情報に基き調製した。加えて、変異セルラーゼ（ｇ）は、ＥＧＩＩＩからの補充に基き調製された。
【００６７】
平衡円２色性を、Ａｖｉｖ市販の５ポジション熱電流セルホルダーを備えたＡｖｉｖ  ６２ＤＳまたは６２ＡＤＳ分光光度計によって測定した。緩衝液は、酢酸でｐＨ８.０に調節した５０ｍＭビス−トリスプロパンおよび５０ｍＭ酢酸アンモニウムであった。各実験において最終的なタンパク質濃度は、５〜３０μＭの範囲であった。経路の長さ（path length）０.１ｃｍのセル中でデータをとった。
【００６８】
２６５〜２１０ｎｍにおいてスペクトルを収集した。２１７ｎｍで、３０〜９０℃の範囲で熱変性させ、２℃毎にデータをとった。各温度における平衡時間は、０.１分であり、サンプルあたり４秒間データをとった。
【００６９】
ｐＨ８.０サンプルの残りを、５×４００μＬに分配した。２個のサンプルを酢酸でｐＨ５および７に調節し、他の２個を水酸化ナトリウムでｐＨ９および１０に調節した。全てのサンプルを上述したように同時に熱変性させた。
【００７０】
表５において、より安定でないセルラーゼからＥＧＩＩＩへの補充に基き調製された２４個の変異体、および、ＥＧＩＩＩからのHumicola griseaから分離された相同体への補充に基き調製された３個の変異体を示す（表５におけるH.griseaに対する番号付けは、図１１のＥＧＩＩＩの番号付けに基くことに留意すること）。これらのうち有意な数が、天然型分子（ＥＧＩＩＩまたはセルラーゼ（ｇ）のいずれか）より改良された安定性を有ししており、それらを表５において太字で示す。
【００７１】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼからのＡｓｎ１８８の特異的変異導入の間に有用な変異オリゴヌクレオチドを説明する。オリゴヌクレオチド構造を説明する図１〜１１において、太字の文字はオリゴヌクレオチドによって導入された塩基の変更を示し、下線はオリゴヌクレオチドによって導入された制限エンドヌクレアーゼ部位を示す。
【図２】  図２は、変異オリゴヌクレオチドテンプレートのＰＣＲ処理に用いられるＰＣＲプライマーを説明する。
【図３】  図３は、Gray et al., J. Bacteriology, vol.166, pp.635-643 (1986)によって説明されている、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ＮＣＩＢ  ８０６１）のα−アミラーゼに関する遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号３３）、および、翻訳産物から導き出されたアミノ酸配列（配列番号４１）を説明する。
【図４】  図４は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからの成熟α−アミラーゼ酵素のアミノ酸配列（配列番号３４）を説明する。
【図５】  図５は、３種のバチルス属のα−アミラーゼの一次構造のアライメントを説明する。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼ（Ａｍ−Ｌｉｃｈ）（配列番号３５）は、Gray et al., J. Bacteriology. vol.1 66, pp.635-643 (1986)によって説明されており、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのα−アミラーゼ（Ａｍ−Ａｍｙｌｏ）（配列番号３６）は、Takkinen et al., J. Biol Chem., vol.258, pp.1007-1013 (1983)によって説明されており、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのα−アミラーゼ（Ａｍ−Ｓｔｅａｒｏ）（配列番号３７）は、Ihara et al., J. Biochem., vol.98, pp.95-103 (1985)によって説明されている。
【図６】  図６は、プラスミドｐＨＰ１３を説明し、ここでＣｍRはクロラムフェニコール耐性、ＥｍRはエリスロマイシン耐性、および、Ｒｅｐ  ｐＴＡ１０６０はプラスミドｐＴＡ１０６０からの複製のオリジンを意味する。
【図７】  図７は、ｐＢＬａｐｒプラスミドを説明し、ここでＢＬ  ＡＡはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼ遺伝子、ａｐｒＥはａｐｒＥ遺伝子の領域をコードするプロモーターおよびシグナルペプチド、ＡｍｐＲはｐＢＲ３２２からのアンピシリン耐性遺伝子、ＣＡＴはｐＣｌ９４からのクロラムフェニコール耐性遺伝子を意味する。
【図８】  図８は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼをコードするｐＨＰ．ＢＬプラスミドを説明する。
【図９】  図９は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓから得られるα−アミラーゼに対応する変異オリゴヌクレオチドを製造するのに用いられたＰＣＲ方法の模式図である。
【図１０】  図１０は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼにおけるシグナル配列−成熟タンパク質の結合（配列番号３８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｐｒＥのα−アミラーゼにおけるシグナル配列−成熟タンパク質の結合（配列番号３９）、および、ｐＢＬａｐｒ（配列番号４０）におけるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼにおけるシグナル配列−成熟タンパク質の結合を説明する。
【図１１】  図１１は、Ｔｒｉｃｈｏｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（ＥＧＩＩＩ）（配列番号４１）、Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ（配列番号４２）、Ａｓｐｅｌｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ（配列番号４３）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ（配列番号４４）、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  （配列番号４５）、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ（１）（配列番号４６）、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｅｓｕｍ（２）（配列番号４７）、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ（３）（配列番号４８）から得られた特定のセルラーゼに相当する、８個の相同なエンドヌクレアーゼ酵素の配列アライメントを説明する。番号付けは、ＥＧＩＩＩの番号付けに基づく。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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