(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列からなるバベシア・カバリ（Babesia caballi）のメロゾイトのロプトリーの４８ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
配列番号１に示す塩基配列からなる請求項１に記載の遺伝子。
【請求項３】
配列番号２に示すアミノ酸配列からなることを特徴とするバベシア・カバリのメロゾイトのロプトリーの４８ｋＤａ組換えタンパク質。
【請求項４】
配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するｃＤＮＡを組み込んだＤＮＡベクターによって形質転換された宿主より発現される、請求項３に記載の組換えタンパク質。
【請求項５】
当該ｃＤＮＡが配列番号１に示す塩基配列からなるｃＤＮＡである、請求項３または４に記載の組換えタンパク質。
【請求項６】
配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するｃＤＮＡを組み込んだファージを大腸菌に感染させて調製した、バベシア・カバリのメロゾイトのロプトリーの４８ｋＤａタンパク質を発現する組換えファージ溶原菌。
【請求項７】
当該ｃＤＮＡが配列番号１に示す塩基配列からなるｃＤＮＡである。請求項６に記載の組換えファージ溶原菌。
【請求項８】
請求項３から５のいずれかに記載のバベシア・カバリのメロゾイトのロプトリーの４８ｋＤａ組換えタンパク質からなる抗原。
【請求項９】
請求項８に記載の抗原を用いてウマ血液中のバベシア・カバリ抗体を特異的に検出することを特徴とするウマバベシア病の診断方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ウマバベシア原虫の一種であるバベシア・カバリ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｂａｌｌｉ；以下、「ＢＣ」ともいう）のメロゾイトに由来するタンパク質、それをコードする遺伝子、該タンパク質に特異的な抗体およびそれらを用いたウマバベシア病の診断方法に関する。
背景技術
ウマバベシア病はダニが媒介する原虫病であり、病原体であるウマバベシア原虫はバベシア属に属するバベシア・カバリおよびバベシア・エクイ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｅｑｕｉ；以下、「ＢＥ」ともいう）の２種類が知られている。
ウマバベシア病は、南ヨーロッパ、アジア、ロシア、中近東、アフリカおよび中南米など世界中に広く分布している。本病は臨床上、高熱を発し、貧血および黄疸を主徴とし、急性ないし慢性に経過する。急性症の場合、その死亡率は２種類ある病原体によって若干異なるが、約１０％、まれには５０％に達することもあるといわれている。一方、予後は病原体により症状が異なり、いずれも耐過後は末梢血液中から原虫が消失するが、ＢＥの場合は終生原虫保有ウマとなることが知られている。
近年の国際的なウマの取り引きの増加は、清浄国である北アメリカ、オーストラリア、および日本を含む極東への本病の拡散の可能性を含んでいることから、早期診断による感染ウマの摘発が極めて重要となっている。このように感染が認められたウマについては拡散防止のために殺処分されることになるが、上記のようにＢＣ感染の場合は、感染後に原虫が消失することから、ＢＣ感染ウマは隔離、係留しておけば殺処分をしなくて済むケースがある。また、感染原虫種により治療法も異なってくる。従って、いずれの種のバベシア原虫に感染しているかを正確に診断することは、特に高価な競争馬においては重要な問題となっている。
ウマバベシア原虫の生活史はマラリア原虫と類似している。すなわち、宿主の血液に入った種虫（スポロゾイト；ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）は直ちに赤血球に侵入しメロゾイト（ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ）となる。メロゾイトは赤血球中でさらに分裂（シゾント；ｓｃｈｉｚｏｎｔ）して数を増す。赤血球の破壊に伴いメロゾイトは放出され、他の赤血球に感染する。メロゾイトが寄生している赤血球を媒介者であるマダニが吸血によって摂取すると、マダニ腸管内でメロゾイトのうちある個体は配偶子母細胞となり、有性的な配偶子を形成する。こうして形成された雌雄の配偶子の合体によって生じたチゴート（ｚｙｇｏｔｅ）は、マダニ腸細胞内に侵入し、スポロキネート（ｓｐｏｒｏｋｉｎｅｔｅ）を経た後、マダニ体内の各臓器内でさらに分裂して、最終的にマダニ唾液腺に到って多数の種虫となり、新たな感染を引き起こす。
ウマバベシア病の感染の診断は、通常、上記ウマバベシア原虫の生活史のうち、ウマ血中に存在するメロゾイトまたはそれに対する抗体を検出することにより行う。
ウマバベシア病の感染の診断には、現在のところ、主に補体結合反応（以下、「ＣＦ」ともいう）と間接蛍光抗体法（以下、「ＩＦＡ」ともいう）が用いられているが、検出感度が低いことから感染初期やキャリアー状態のウマを見逃すおそれが指摘されている。また、これらの血清学的診断法は特異性の点でも問題を伴うことが多い。
さらに、これらの診断法は、本病に感染したウマの血液より分離した原虫を抗原として利用したものであるため、抗原の作製コストおよびその品質のバラツキが問題となる。特にＢＣについては、感染したウマは原虫の増殖がまだ低い段階でも発熱・貧血を主徴とする激烈な症状を呈して死亡してしまうため、抗原の入手が極めて困難であり、安定した診断法の確立が妨げられている。
ＣＦやＩＦＡに代わる診断法として、近年、ウエスタンブロット法［Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． ２２（５）：６２７−６３０（１９９２）］、ＥＬＩＳＡ［Ｖｅｔ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２０：４３−４８（１９８６）；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． ２４（３）：３４１−３４６（１９９４）；Ｖｅｔ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． ６８：１１−２６（１９９７）］、ＤＮＡプローブを用いた方法［Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ １０２：３５７−３６５（１９９１）；Ｖｅｔ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． ７３：５３−６３（１９９７）］が報告されている。しかしながら、ウエスタンブロット法では検出感度の点、ＥＬＩＳＡではＢＥとの類症鑑別における特異性の点あるいは抗原入手の困難性の点、ＤＮＡプローブを用いた方法ではオートラジオグラフィーなど特殊な機器を必要とする点等で問題があり、更なる改善が必要な状況にある。
以上のことから、特異性に優れるＢＣ原虫の有用な診断用抗原を安定して供給することを可能にしうる技術を開発することが、本病を予防、制圧する上で重要な課題と考えられる。
発明の開示
かかる状況下、本発明者らは、ＢＣの虫体抗原を大量に生産する方法を開発すべく遺伝子組換えによる方法について鋭意研究を重ねた結果、かかる目的に有用なＢＣのタンパク質をコードする遺伝子を単離精製することに成功した。該遺伝子を用いれば、ＢＣの虫体タンパク質を組換えＤＮＡ技術により大量に生産することができる。
すなわち、本発明は、バベシア・カバリのメロゾイトのタンパク質をコードする遺伝子、バベシア・カバリのメロゾイトの組換えタンパク質、バベシア・カバリのメロゾイトのロプトリー（ｒｈｏｐｔｒｙ）（放出体（ｅｘｔｒｕｓｏｍｅ）の一種）の４８ｋＤａタンパク質と特異的に結合しうる抗体、該組換えタンパク質を抗原として用いてウマ血液中のバベシア・カバリ抗体を特異的に検出することを特徴とするウマバベシア病の診断方法、および該抗体を用いてウマ血液中のバベシア・カバリのメロゾイトの存在を検出することを特徴とするウマバベシア病の診断方法を提供するものである。
本発明の第一の側面は、ＢＣのメロゾイトのロプトリーの４８ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子に関する。本発明の遺伝子は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、または当該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＣのメロゾイトのロプトリーの４８ｋＤａタンパク質より誘導される抗体または抗血清に対して免疫学的活性を有するタンパク質をコードするものである。
本発明の遺伝子は、好ましくは、配列番号１に示す塩基配列を有する。本発明の遺伝子はまた、配列番号１に示す塩基配列に相補性を有する塩基配列にハイブリダイズし、かつＢＣのメロゾイトのロプトリーの４８ｋＤａタンパク質より誘導される抗体または抗血清に対して免疫学的活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するものである。
本発明の遺伝子およびその断片はまた、ＤＮＡプローブ法やＰＣＲ法を用いることによりウマバベシア病の診断に適用することも可能である。
本発明の第二の側面は、バベシア・カバリのメロゾイトの組換えタンパク質に関する。本発明の組換えタンパク質は、好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるものである。本発明の組換えタンパク質はまた、配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつバベシア・カバリのメロゾイトのロプトリーの４８ｋＤａタンパク質より誘導される抗体または抗血清に対して免疫学的活性を有するものである。
本発明の組換えタンパク質は、たとえば、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するｃＤＮＡを組み込んだＤＮＡベクターによって形質転換された宿主より発現させることができる。本発明の組換えタンパク質はまた、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するｃＤＮＡを組み込んだファージを大腸菌に感染させて調製した組換えファージ溶原菌より発現させることができる。
本発明の第三の側面は、バベシア・カバリのメロゾイトのロプトリーの４８ｋＤａタンパク質と特異的に結合しうる抗体に関する。本発明の抗体が結合するバベシア・カバリのメロゾイトのロプトリーの４８ｋＤａタンパク質は、天然由来であっても組換えにより製造されたものであってもよい。本発明の抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。このようなモノクローナル抗体としては、以下に記載するＢＣ１１ＤとＢＣ２３３Ｄが挙げられる。
本発明の第四の側面は、上記バベシア・カバリのメロゾイトの組換えタンパク質からなる抗原に関する。該抗原はウマ血液中のバベシア・カバリ抗体を特異的に検出するために用いることができ、かくしてウマバベシア病を診断することができる。すなわち、本発明の第五の側面は、該組換えタンパク質を抗原として用いてウマ血液中のバベシア・カバリ抗体を特異的に検出することを特徴とするウマバベシア病の診断方法に関する。
本発明の第六の側面は、本発明の抗体を用いてウマ血液中のバベシア・カバリのメロゾイトの存在を検出することを特徴とするウマバベシア病の診断方法に関する。
ウマバベシア病の具体的な診断方法としては、ＥＬＩＳＡ、イムノクロマト法や凝集法等が挙げられる。
なお、本明細書中に引用した特許、刊行物、文献はすべて、参照のため本明細書中に引用される。
発明を実施するための最良の形態
本発明のＢＣのメロゾイトのロプトリーの４８ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子は、たとえば以下の方法によって得ることができる。すなわち、Ａｖａｒｚｅｄらの方法［Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ． ５９（６）、４７９〜４８１（１９９７）］に従い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養によりＢＣ感染赤血球（赤血球内寄生率：約１０％）を得る。次に、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉらの方法［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２、１５６−１５９（１９８７）］に従い、グアニジニウム−フェノール−クロロホルム法によりトータルＲＮＡを抽出し、ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ  ３０（Ｔａｋａｒａ社製）によりｍＲＮＡを分離精製した後、Ｚａｐ−ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．製）を用いてｃＤＮＡを合成する。このｃＤＮＡをλＺａｐ  ＩＩファージベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．製）に挿入後、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩパッケージングシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．製）を用いパッケージングし、ｃＤＮＡライブラリーを構築する。得られたｃＤＮＡライブラリーは、ＢＣメロゾイト４８ｋＤａタンパク質を認識するモノクローナル抗体を用いてイムノスクリーニングを行い、ｃＤＮＡクローンを得る。このｃＤＮＡクローンをｉｎ  ｖｉｖｏエキシジョンによりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローンとして回収する。
このようにして得られたクローンのｃＤＮＡインサートの塩基配列を、たとえばＳａｎｇｅｒらのダイデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４、５４６３（１９７７）］を用いてヌクレオチド配列を決定する。以上のようにして得られたｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１に示すように全長１，８２８塩基対であり、配列番号１または２に示すＢＣメロゾイト４８ｋＤａタンパク質のアミノ酸配列に対応する構造遺伝子全長１，３７４塩基対を含んでいる。上記のようにして得られるｃＤＮＡは、そのまま、または５’末端を修飾した上で公知の発現ベクター中に公知の方法によりプロモーターの下流に挿入する。ついで、上記ｃＤＮＡを挿入した発現ベクターを、大腸菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、公知の細胞中に公知の方法により導入することができる。
産業上の利用可能性
本発明により、バベシア・カバリのメロゾイトのロプトリーの４８ｋＤａタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子を組換えＤＮＡ技術により、大量かつ安定に生産することが可能となる。本発明の遺伝子、または上記のように本発明の遺伝子を導入した細胞から得られるタンパク質およびそれらの一部からなるポリペプチドは、ウマ血液中のＢＣのメロゾイト抗体を検出するための抗原として用いることによりウマバベシア病の診断に用いることができる。かくして得られたタンパク質およびそれらの一部からなるポリペプチドはまた、ＢＣのメロゾイト抗体、とりわけＢＣのメロゾイトに対するモノクローナル抗体を作製するための抗原としても用いることができ、かくして作製された抗体はウマ血液中のＢＣのメロゾイトを特異的に検出することによりウマバベシア病の診断に用いることができる。
実施例
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
実施例１：バベシア・カバリのメロゾイトのｃＤＮＡライブラリーの構築
ＢＣ感染赤血球（赤血球内寄生率：約１０％）は、Ａｖａｒｚｅｄらの方法［Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ． ５９（６）、４７９〜４８１（１９９７）］に従い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養により得た。すなわち、ＢＣ（ＵＳＤＡ株）感染ウマより抗凝固剤としてＥＤＴＡを含むチューブに採取した血液を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地で遠心洗浄し、ｂｕｆｆｙ  ｃｏａｔを除いた。遠心洗浄後、上清を除去し、沈渣の５０μｌを４０％ウマ血清加ＲＰＭＩ１６４０培地（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０μｌ正常ウマ赤血球含）の１ｍｌの比率で混合し、２４穴マイクロプレートに１穴あたり１ｍｌずつ分注した。マイクロプレートは５％ＣＯ２、２％Ｏ２、９３％Ｎ２、３７℃の条件下で培養した。培養中、毎日、新鮮培地と交換し、ギムザ染色により寄生率を測定しながら適宜継代を行った。
このようにして得られたＢＣ感染赤血球からのｃＤＮＡライブラリーの構築は、筏井らの報告［第１２６回日本獣医学会講演要旨集、１９１頁、（１９９８）］に示す方法で行われた。すなわち、得られたＢＣ感染赤血球から、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉらの方法［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２、１５６−１５９（１９８７）］に従い、グアニジニウム−フェノール−クロロホルム法によりトータルＲＮＡを抽出し、ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ  ３０（Ｔａｋａｒａ社製）によりｍＲＮＡを分離精製した後、Ｚａｐ−ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．製）を用い、該キットに添付のプロトコールに従ってｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをλＺａｐ  ＩＩファージベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．製）に挿入後、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩパッケージングシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．製）を用い、該キットに添付されているプロトコールに従ってパッケージングし、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。
実施例２：バベシア・カバリのメロゾイトの４８ｋＤａ抗原を認識するモノクローナル抗体の作出
免疫原として、リン酸緩衝食塩液０．１ｍｌあたりＢＣ感染ウマより得られたメロゾイトの１×１０８個を含むように調製された浮遊液をフロイントの完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）とともに乳化したものを、７週齢メスのＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内および皮下に、１匹あたり０．２ｍｌを接種した。追加免疫として、同量のメロゾイトをフロイントの不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）とともに乳化したものを２週間間隔で３回接種した。４回目免疫から３日後、メロゾイトを静注し、さらに３日後に解剖し脾臓を摘出した。脾臓細胞はポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）によりＳｐ−２マウスミエローマ細胞と融合させた。
ハイブリドーマ細胞は、ＨＡＴ培地（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）およびＢｒｉ  Ｃｌｏｎｅ（ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）添加ＧＩＴ培地（Ｗａｋｏ社製）を用い、定法に従い選別された。各ハイブリドーマは、培養上清について、冷アセトン固定ＢＣ感染赤血球塗抹標本を用いた間接蛍光抗体法によりスクリーニングしたところ、６種のクローンが得られた。このうち２種のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、ＢＣメロゾイト可溶化抗原を用いたウエスタンブロット法により、同一の４８ｋＤａ抗原を認識することが判明し、これらをＢＣ１１ＤとＢＣ２３３とした。ＢＣ１１ＤとＢＣ２３３Ｄの産生するモノクローナル抗体は、ウエスタンブロットにおいて、ともにＢＥおよび非感染ウマ赤血球には反応しないことが確認された。これら４８ｋＤａを認識するモノクローナル抗体は共焦点レーザー顕微鏡での観察により、ロプトリーを認識するものであった（図１）。このようにして得られたハイブリドーマクローンが産生するモノクローナル抗体のサブクラスおよびＬ鎖型については、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて決定され、それぞれＩｇＧ２ａとＩｇＧ１であった。
実施例３：ＢＣのメロゾイトのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングおよびｃＤＮＡクローンのシークエンシング
一次抗体として実施例２で得られた４８ｋＤａタンパク質を認識するＢＣ１１Ｄの産生するモノクローナル抗体培養上清を１％牛血清アルブミン加ＰＢＳにより５倍希釈したものを、二次抗体として該一次抗体に結合可能なアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製）を１％牛血清アルブミン加ＰＢＳにより２０，０００倍希釈したものを用い、実施例１で得られたｃＤＮＡライブラリーをイムノスクリーニングすることで陽性プラークを回収し、クローニングを行った。得られたｃＤＮＡクローンＢＣ４８をｉｎ  ｖｉｖｏエキシジョンによりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）プラスミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．製）に挿入し、その後、各ｃＤＮＡを制限酵素で切断し、サブクローニングした。挿入ＤＮＡはＭ１３リバースおよびユニバーサルプライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．製）を用いたダイプライマー法により、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ３７７シーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いてヌクレオチド配列を決定した。シークエンスデータはＧｅｎｅ  Ｗｏｒｋｓ（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．製）を用いて解析された。その結果、ＢＣのメロゾイト４８ｋＤａ抗原をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１に示す通り、全長１，８２８塩基対であり、配列番号１に示すＢＣメロゾイト４８ｋＤａタンパク質のアミノ酸配列に対応する構造遺伝子全長１，３７４塩基対を含んでいることがわかった。
なお、上記ｃＤＮＡクローンＢＣ４８がプラスミドベクターｐＧＥＸ４Ｔ−３に組み込まれたｐＧＥＸ／ＢＣ４８は、大腸菌にトランスフェクション後、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ／ＧＳＴ−ＢＣ４８として、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６））にて１９９９年６月１６日に受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６１として寄託されている。
実施例４：組換えＢＣメロゾイトタンパクの作製
次にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）プラスミドベクターに挿入されているｃＤＮＡを、制限酵素、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切り出し、ｐＧＥＸ４Ｔ−３プラスミドベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．製）のＥｃｏＲＩとＸｈｏＩサイトに挿入した（図２）。このプラスミドベクターを、大腸菌（ＢＬ２１株）にトランスフェクトし、定法に従いイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導し発現させた。
発現させた大腸菌の菌液５００ｍｌを４℃にて６，０００ｒｐｍで１０分間遠心を行った後、上清を捨てた。沈渣を１０ｍｌのｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。破砕菌体液に１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を最終濃度が１％になるように添加後、４℃にて１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心を行い、上清を回収した。回収した上清にグルタチオンセファロース４Ｂビーズ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  ｂｅａｄｓ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．製）５０％スラリーの０．２ｍｌを加え、４℃にて３０分間混和した後、４℃にて３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を捨てた。０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）１ｍｌで混和した後、４℃にて５，０００ｒｐｍで１０秒間遠心し、上清を捨て洗浄した。同様の操作を２回繰り返し洗浄を行った。トロンビン分散用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）１ｍｌを加え、混和後、４℃にて５，０００ｒｐｍで１０秒間遠心し、上清を捨てた。最終濃度２０Ｕのトロンビンを含む分散用緩衝液の０．５ｍｌを加え、４℃にて一夜混和した。４℃にて３，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を回収したものを組換えタンパク質とした［Ｓｃｈｅｌｐら、Ａｐｐｌ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． ３６、１〜１０（１９９５）参照］。
得られた組換えタンパク質はニトロセルロースメンブラン（ＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｃ  ｅｘｔｒａ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）にブロッティングした後、一次抗体として実施例２で作製したＢＣ１１Ｄが産生するモノクローナル抗体を、二次抗体として該一次抗体に結合可能なペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製）を用いたウエスタンブロット法を実施した。その結果、実施例２で作製したＢＣ１１Ｄが産生するモノクローナル抗体と反応することが確認され、発現タンパク質の分子量は、ＢＣ原虫由来の分子量４８ｋＤａタンパク質と一致していた（図３）。
実施例５：組換え抗原を用いたＥＬＩＳＡによるＢＣおよびＢＥの類症鑑別
ＥＬＩＳＡはＴａｋｕｍｉらの報告［Ｊｐｎ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ． ５２（２）、２４１〜２５０（１９９０）］を参考に行った。すなわち、実施例４で得られた発現タンパク質を０．０５Ｍ炭酸重炭酸バッファー（ｐＨ９．６）で希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートに５０μｌ／穴ずつ分注し、４℃にて一晩、固相化した。固相化終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳで１回洗浄し、３％スキムミルク添加ＰＢＳを１００μｌ／穴ずつ分注し、３７℃にて６０分間ブロッキングした。ブロッキング終了後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳで１回洗浄した。次に、３％スキムミルク添加ＰＢＳで１／８０倍希釈した検体を５０μｌ／穴ずつ分注し、３７℃にて６０分間反応させた。なお、検体は、日本中央競馬会競走馬総合研究所において、ＢＣまたはＢＥを実験的に感染させたウマより得られた血清、並びにＢＣおよびＢＥ非感染ウマ血清を用いた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳで６回洗浄し、３％スキムミルク添加ＰＢＳで１／４，０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウマＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）を５０μｌ／穴ずつ分注し、３７℃にて６０分間反応させた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳで６回洗浄し、基質液として，０．１Ｍクエン酸、０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．００３％過酸化水素水、および０．３ｍｇ／ｍｌの２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（Ｓｉｇｍａ社製）を溶解したものを１００μｌ／穴ずつ分注し、室温にて６０分間反応させた。反応終了後、波長４１５ｎｍにおける各穴の吸光度を測定した。その結果を表１に示した。
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ここで、ＢＣ陰性ウマ血清を検体としたＥＬＩＳＡ実施結果より、本ＥＬＩＳＡ法では陽性限界は０．２であることが明らかとなっている。ＥＬＩＳＡの結果、該抗原を用いたＥＬＩＳＡでは、ＢＣおよびＢＥ非感染ウマ血清、およびＢＥ感染ウマ血清では、ＥＬＩＳＡ値がいずれも０．２以下であったのに対し、ＢＣ感染ウマ血清ではＥＬＩＳＡ値が０．３１９〜０．８０５を示し、その特異性が確認された。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のモノクローナル抗体ＢＣ１１Ｄのバベシア・カバリに対する反応性を示す共焦点レーザー顕微鏡像を示す写真である。
図２は、配列番号１に示す塩基配列を有する、ＢＣのメロゾイトのロプトリーの４８ｋＤａタンパク質をコードするｃＤＮＡクローンＢＣ４８を組み込んだｐＧＥＸ／ＢＣ４８の構築を示す模式図である。
図３は、ファージクローンＢＣ４８由来溶原菌より発現されたタンパク質と、ＢＣメロゾイト４８ｋＤａを認識するモノクローナル抗体ＢＣ１１Ｄとの反応性を示すウエスタン・ブロット像を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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