(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースおよびペントース糖の混合物を含有する培地中でエシェリヒア属に属するＬ−アミノ酸生産細菌を培養し、同培地からＬ−アミノ酸を回収する、Ｌ−アミノ酸の製造方法であって、前記細菌がｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座の発現量が増加するように改変された細菌であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座の発現量は、前記ｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座のコピー数を増加させることにより、又は前記遺伝子座の発現が高められるように発現制御配列を改変することにより増加した、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座を保持する低コピーベクターで、前記細菌を形質転換することにより、前記コピー数が増加している、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座は、エシェリヒア属細菌に由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ペントース糖はアラビノースおよびキシロースである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記糖の混合物は、セルロース系バイオマスから得られる糖の原料混合物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記生産されるＬ−アミノ酸はＬ−ヒスチジンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌は、Ｌ−ヒスチジン生合成遺伝子の発現が高められた、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記生産されるＬ−アミノ酸はＬ−スレオニンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌は、Ｌ−スレオニン生合成遺伝子の発現が高められた、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生産されるＬ−アミノ酸はＬ−リジンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１２】
前記細菌は、Ｌ−リジン生合成遺伝子の発現が高められた、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生産されるＬ−アミノ酸はＬ−グルタミン酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１４】
前記細菌は、Ｌ−グルタミン酸生合成遺伝子の発現が高められた、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生産されるＬ−アミノ酸はＬ−トリプトファンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１６】
前記細菌は、Ｌ−トリプトファン生合成遺伝子の発現が高められた、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペントース発酵によるＬ−アミノ酸の製造法、より具体的には、炭素源としてグルコースとともにアラビノースおよび／またはキシロースの混合物の発酵により、キシロース資化遺伝子の発現が高められた細菌を用いて、Ｌ−アミノ酸を製造する方法に関する。セルロース系バイオマスからのヘミセルロース分画のヘキソースおよびペントースの混合物を含む高価でない炭素源は、Ｌ−アミノ酸、例えば、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−トリプトファンの商業的生産に利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｌ−アミノ酸は、種々の微生物株を用いた発酵法により工業的に生産されてきた。この方法に用いる発酵培地は、通常、十分な量の種々の炭素源および窒素源を含有している。
【０００３】
通常、炭素源としてヘキソース、ペントース、トリオースのような各種炭水化物、各種有機酸およびアルコールが使用されている。ヘキソースとしては、グルコース、フルクトース、マンノース、ソルボース、ガラクトース等が挙げられる。ペントースとしては、アラビノース、キシロース、リボース等が挙げられる。しかし、上述の炭水化物、および、産業的に現在使用される、糖蜜、トウモロコシ、サトウキビ、デンプン、それらの加水分解物等のような他の従来の炭素源は、多少高価である。したがって、もっと低い価格の代替のＬ−アミノ酸生産源が望まれている。
【０００４】
セルロース系バイオマスは、容易に入手可能であり、炭水化物、トウモロコシ、サトウキビまたは他の炭素源よりも安価であることから、Ｌ−アミノ酸生産用の好適な原料である。バイオマス中のセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの通常の量は、およそセルロース４０〜６０％、ヘミセルロース２０〜４０％、リグニン１０〜２５％、他の構成成分１０％である。セルロース画分は、ヘキソース糖、通常はグルコースのポリマーから構成される。ヘミセルロース画分は、キシロースおよびアラビノースを含むペントース糖から主として構成される。種々のバイオマス供給源の組成を表１に示す（http://www.ott.doe.gov/biofuels/understanding_biomass.html）。
【０００５】
【表１】
0004665567.tif 000002
【０００６】
１５０以上のバイオマスサンプルの組成に関するより詳細な情報は、「バイオマス原料組成および特性データベース（Biomass Feedstock Composition and Property Database）」に要約されている（http://www.ott.doe.gov/biofuels/progs/search1.cgi）。
【０００７】
使用可能な発酵原料、通常は炭水化物の混合物へのセルロース系バイオマスの効果的な変換のための工業プロセスは、近い将来に開発されると予測される。したがって、有用な化合物の生産のためのセルロースおよびヘミセルロースのような再生可能なエネルギー源の利用は、近い将来に増加すると予測される（Aristidou A., Pentila. M., Curr. Opin.
Biotechnol, 2000, Apr., 11:2, 187-198）。しかし、大部分の公表論文および特許、または特許出願は、代替燃料として有用であると期待されるエタノールの生産のための生体触媒（細菌および酵母）によるセルロース系バイオマスの利用について記載している。かかるプロセスとしては、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）の種々の改変株（Deanda K. et al, Appl. Environ. Microbiol., 1996 Dec., 62:12, 4465-70; Mohagheghi A. et al, Appl. Biochem. Biotechnol., 2002, 98-100:885-98; Lawford H.G., Rousseau J.D., Appl. Biochem. Biotechnol, 2002, 98-100:429-48; ＰＣＴ出願ＷＯ９５／２８４７６号、同ＷＯ９８／５０５２４号）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）の改変株（Dien B.S. et al, Appl. Biochem. Biotechnol, 2000, 84-86:181-96; Nichols N.N. et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001 Jul, 56:1-2, 120-5; 米国特許第５，０００，０００号）を用いたセルロール系バイオマスの発酵が含まれる。キシリトールは、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）を用いたヘミセルロース糖からのキシロースの発酵により生産することができる（Walthers T. et al, Appl. Biochem. Biotechnol., 2001, 91-93:423-35）。１，２−プロパンジオールは、アラビノース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、マルトース、スクロース、キシロース、およびそれらの組合せの組換えエシェリヒア・コリ菌株を用いた発酵により生産することができる（米国特許第６，３０３，３５２号）。また、３−デヒドロシキミ酸は、エシェリヒア・コリ菌株を用いたグルコース／キシロース／アラビノース混合物の発酵により得ることができることが示された。キシロースまたはグルコースのいずれかを単独で炭素源として使用した場合に対して、グルコース／キシロース／アラビノース混合物を炭素源として使用した場合に、３−デヒドロシキミ酸の最高濃度および収率が得られた（Kai Li and J.W. Frost, Biotechnol. Prog., 1999, 15, 876-883）。
【０００８】
エシェリヒア・コリは、Ｌ−アラビノースおよびＤ−キシロースのようなペントースを利用することができることが報告されている（Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）。細胞へのＬ−アラビノースの輸送は、２つの誘導系、すなわち（１）ａｒａＥ遺伝子によりコードされる低親和性パーミアーゼ（Ｋｍ約０．１ｍＭ）、および（２）ａｒａＦＧオペロンによりコードされる高親和性（Ｋｍ１〜３μＭ）系により行われる。ａｒａＦ遺伝子は、化学走化性受容体機能を有するペリプラズム結合タンパク質（３０６アミノ酸）をコードし、ａｒａＧ遺伝子座は、内膜タンパク質をコードする。前記糖は、ａｒａＢＡＤオペロンによりコードされる酵素セット、すなわちアラビノースをＬ−リブロースに可逆的に変換するイソメラーゼ（ａｒａＡ遺伝子によりコードされる）、ケトースをＬ−リブロース５−リン酸にリン酸化するキナーゼ（ａｒａＢ遺伝子によりコードされる）、およびＤ−キシルロース−５−リン酸の形成を触媒するＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ（ａｒａＤ遺伝子によりコードされる）により代謝される（Escherichia coli
and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）。
【０００９】
エシェリヒア・コリのほとんどの株がＤ−キシロース上で生育するが、Ｋ−１２株が同化合物上で生育するには突然変異が必要である。このペントースの利用は、２つの誘導性パーミアーゼ（Ｄ−リボースにもＤ−アラビノースにも活性でない）による細胞質膜を横切った輸送、Ｄ−キシルロースへの異性化、およびＤ−キシルロース５−リン酸を生じるキシルロースのＡＴＰ依存性リン酸化に関与する、誘導性かつ異化代謝産物抑制性の経路によるものである。高親和性（Ｋｍ０．３〜３μＭ）輸送系は、ペリプラズム結合タンパク質（３７，０００Ｄａ）に依存し、おそらく高エネルギー化合物により駆動される。低親和性（Ｋｍ約１７０μＭ）系は、プロトン輸送力により作動される。このＤ−キシロース−プロトン共輸送系は、ｘｙｌＥ遺伝子によりコードされる。Ｄ−キシロースの資化を規定する主な遺伝子クラスターは、ｘｙｌＡＢ（ＲＴ）である。ｘｙｌＡ遺伝子はイソメラーゼ（５４，０００Ｄａ）をコードし、ｘｙｌＢ遺伝子はキナーゼ（５２，０００Ｄａ）をコードする。このオペロンは２つの転写開始点を有し、その一方はｘｙｌＢオープンリーティングフレームの上流に挿入されている。低親和性パーミアーゼは、未関連のｘｙ
ｌＥにより規定されるため、ｘｙｌＦ（ｘｙｌＦＧＨＲ）とも呼ばれているｘｙｌＴ遺伝子座は、おそらく高親和性輸送系をコードし、したがって少なくとも２つの遺伝子（一方はペリプラズムタンパク質に関する遺伝子、もう一方は膜内在性タンパク質に関する遺伝子）を含有しているはずである（Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）。ｘｙｌＦＧＨ遺伝子は、キシロースＡＢＣトランスポーターをコードし、ここでｘｙｌＦ遺伝子は、推定キシロース結合タンパク質をコードし、ｘｙｌＧ遺伝子は、推定ＡＴＰ結合タンパク質をコードし、ｘｙｌＨ遺伝子は、推定膜構成成分をコードし、ｘｙｌＲ遺伝子は、キシロース転写活性化因子をコードする。
【００１０】
トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼに加えて、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース５−リン酸４−エピメラーゼ、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードする上記のエシェリヒア・コリ遺伝子の導入により、ザイモモナス・モビリスのような微生物が、アラビノースおよびキシロースをエタノールへと代謝させることが可能となる（ＷＯ／９５２８４７６号、ＷＯ９８／５０５２４号）。一方、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）およびピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＨ）をコードするザイモモナスの遺伝子は、エシェリヒア・コリ菌株によるエタノール生産に有用である（Dien B.S. et al, Appl. Biochem. Biotechnol, 2000, 84-86:181-96; 米国特許第５，０００，０００号）。
【００１１】
グルコース、並びに、アラビノースおよびキシロースのようなペントースの混合物の発酵により、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−スレオニンおよびＬ−トリプトファンのようなＬ−アミノ酸を生産する方法は、本発明者等により既に開示されている（ロシア特許出願第２００３１０５２６９号）。
【００１２】
しかしながら、現在のところ、ｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座にある遺伝子のようなキシロース資化遺伝子の発現が高められた細菌、またはヘキソースおよびペントース糖の混合物からのＬ−アミノ酸の生産のためのこれらの遺伝子の使用を記載した報告はない。
【発明の開示】
【００１３】
［発明の概要］
本発明の目的は、Ｌ−アミノ酸生産株の生産性を高めること、キシロース資化遺伝子の発現が高められたＬ−アミノ酸生産菌を提供すること、および同細菌を用いて、グルコースのようなヘキソース糖、および、キシロースまたはアラビノースのようなペントース糖の混合物から、Ｌ−アミノ酸を製造する方法を提供することである。セルロース系バイオマスから得られる発酵原料は、培地用の炭素源として使用され得る。この目的は、低コピーベクター上でクローニングされたｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座は、Ｌ−アミノ酸、例えば、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−トリプトファンの生産を高めるという知見により達成された。前記発酵原料上での生育が可能であり、かつＬ−アミノ酸の生産に有効な微生物が使用される。前記発酵原料は、炭素源として、グルコースとともにキシロースおよびアラビノースから構成される。Ｌ−アミノ酸生産株としては、エシェリヒア・コリ菌株が例示される。本発明は、こうして完成された。
本発明の目的は、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）のＬ−アミノ酸生産細菌であって、いずれかのキシロース資化酵素の活性が高められた細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、エシェリヒア（Escherichia）属に属する前記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、パントエア（Pantoea）属に属する前記細菌を提供すること
である。
本発明のさらなる目的は、前記キシロース資化酵素の活性が、ｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座の発現量を増加させることにより高められた前記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、キシロース資化酵素の活性が、ｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座のコピー数を増加させることにより、又は前記遺伝子の発現が高められるように、前記遺伝子の発現制御配列を改変することにより高められた前記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、ｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座を保有する低コピーベクターで、細菌を形質転換することにより前記コピー数が増加している前記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、ｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座が、エシェリヒア属細菌に由来する前記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、グルコースおよびペントース糖の混合物を含有する培地中で前記細菌を培養し、同培地からＬ−アミノ酸を回収する、Ｌ−アミノ酸の製造法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、ペントース糖がアラビノースおよびキシロースである、前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、糖の混合物が、セルロース系バイオマスから得られる糖の原料混合物である、前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、生産されるＬ−アミノ酸がＬ−ヒスチジンである前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記細菌のＬ−ヒスチジン生合成に関する遺伝子の発現が高められた、前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、生産されるＬ−アミノ酸がＬ−スレオニンである前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記細菌のＬ−スレオニン生合成に関する遺伝子の発現が高められた、前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、生産されるＬ−アミノ酸がＬ−リジンである前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記細菌のＬ−リジン生合成に関する遺伝子の発現が高められた、前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、生産されるＬ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸である前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記細菌のＬ−グルタミン酸生合成に関する遺伝子の発現が高められた、前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、生産されるＬ−アミノ酸がＬ−トリプトファンである前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記細菌のＬ−トリプトファン生合成に関する遺伝子の発現が高められた、前記方法を提供することである。
【００１４】
Ｌ−アミノ酸の製造法は、グルコース、及びアラビノース、キシロースなどのペントース糖の混合物の発酵によるＬ−ヒスチジンの生産を包含する。また、Ｌ−アミノ酸の製造法は、グルコース、及びアラビノース、キシロースなどのペントース糖の混合物の発酵によるＬ−スレオニンの生産を包含する。また、Ｌ−アミノ酸の製造法は、グルコース、及びアラビノース、キシロースなどのペントース糖の混合物の発酵によるＬ−リジンの生産を包含する。また、Ｌ−アミノ酸の製造法は、グルコース、及びアラビノース、キシロースなどのペントース糖の混合物の発酵によるＬ−グルタミン酸の生産を包含する。また、Ｌ−アミノ酸の製造法は、グルコース、及びアラビノース、キシロースなどのペントース糖の混合物の発酵によるＬ−トリプトファンの生産を包含する。発酵原料として使用されるグルコースおよびペントース糖の混合物は、セルロース系バイオマス、好ましくはセルロースの加水分解産物などの植物バイオマスの分解産物から得ることができる。
【００１５】
［好ましい実施形態の説明］
本発明においては、「Ｌ−アミノ酸生産細菌」とは、本発明の細菌を培地中で培養した場合、培地中にＬ−アミノ酸を蓄積する能力を有する細菌を意味する。Ｌ−アミノ酸を生産する能力は、育種により、付与または増強され得る。本明細書中で使用される「Ｌ−アミノ酸生産細菌」という用語はまた、野生株または親株よりも多量に培地中にＬ−アミノ酸を生成し、かつ蓄積することが可能な細菌を意味し、好ましくは微生物が０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量の目的Ｌ−アミノ酸を培地中に生成および蓄積することが可能であることを意味する。「Ｌ−アミノ酸」としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレニオン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンおよびＬ−バリンが挙げられる。
【００１６】
腸内細菌科としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、エルヴィニア(Erwinia)属、クレブシエラ（Klebsiella）属、パントエア（Pantoea）属、フォトラブダス（Photorhabdus）属、プロビデンシア(Providencia)属、サルモネラ（Salmonella）属、セラチア(Serratia)属、シゲラ（Shigella）属、モルガネラ（Morganella）属、イエルシニア（Yersinia）属に属する細菌などが挙げられる。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock)で使用されている分類にしたがって腸内細菌科に分類される細菌が挙げられる。この中では、エシェリヒア属およびパントエア属が好ましい。
【００１７】
エシェリヒア属細菌という用語は、微生物学の分野における当業者によって知られている分類にしたがってエシェリヒア属に分類される細菌を意味する。本発明において用いられるエシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリ（E.coli）などが挙げられるが、これに限定されない。
【００１８】
本発明において用いられるエシェリヒア属細菌は特に制限されないが、例えば、ナイトハルトらの著書（Neidhardt,F.C.et.al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C.,1208, table 1）に挙げられたものが含まれる。
パントエア属細菌という用語は、微生物学の分野における当業者によって知られている分類にしたがってパントエア属に分類される細菌を意味する。なお、エンテロバクター・アグロメランスのうちのいくつかの種類は、16ＳrRNAの塩基配列解析などに基づいて、最近、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワーティ（Stewartii）などに分類された。
【００１９】
「キシロース資化酵素の活性が高められた」という表現は、細胞当たりの該酵素の活性が、非改変株、例えば野生株の活性よりも高いことを意味する。例としては、細胞当たりの酵素分子の数が増加する場合、および酵素分子当たりの比活性が増加する場合等が挙げられる。遺伝子によりコードされるタンパク質の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてイムノブロッティングアッセイ（ウェスタンブロッティング分析）を行う方法等を含む既知の方法により測定することができる。さらに、対照として作用することができる野生株としては、例えば、エシェリヒア・コリＫ−１２が挙げられる。キシロース資化酵素の細胞内活性を高める結果として、培地中の、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸および／Ｌ又は−トリプトファンなどのＬ−アミノ酸の蓄積が観察される。
【００２０】
「キシロース資化酵素」としては、キシロース輸送、キシロース異性化およびキシルロースリン酸化の酵素、ならびに調節タンパク質が挙げられる。かかる酵素としては、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ（Xylulokinase）、キシロース輸送体（Xylose transporter）、およびキシロース転写活性化因子などが挙げられる。キシロースイソメラーゼは、Ｄ−キシロースのＤ−キシルロースへの異性化反応を触媒する。キシルロキナーゼは、ＡＴＰを用いたＤ−キシルロースのリン酸化反応を触媒して、Ｄ−キシルロース−５−リン酸塩およびＡＤＰを生じる。キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼのようなキシロース資化酵素の活性の存在は、それぞれ、相当するキシロースイソメラーゼまたはキシルロキナーゼが欠損したエシェリヒア・コリ突然変異体の相補実験により決定される。
【００２１】
「エシェリヒア属細菌」という語句は、該細菌が、微生物学の分野における当業者に既知の分類に従って、エシェリヒア属として分類されることを意味する。本発明で使用されるエシェリヒア属細菌の例は、エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【００２２】
「遺伝子の発現量を増加させる」という語句は、遺伝子の発現量が、非改変株、例えば野生株の発現量よりも高いことを意味する。かかる改変の例としては、細胞当たりに発現される遺伝子の数を増加させること、遺伝子の発現レベルを増加させること等が挙げられる。発現される遺伝子のコピー数の量は、例えば、染色体ＤＮＡの制限酵素処理を行い、続いて遺伝子配列に基づくプローブを用いたサザンブロッティングを行う方法、蛍光ｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等により測定される。遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等を含む各種方法により測定することができる。さらに、対照として作用することができる野生株としては、例えばエシェリヒア・コリＫ−１２が挙げられる。キシロース資化酵素の細胞内活性を高める結果として、キシロースなどのペントース糖を含有する培地中のＬ−ヒスチジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸又はＬ−トリプトファンなどのＬ−アミノ酸の蓄積が観察される。
【００２３】
細菌細胞中のキシロース資化酵素の活性を高めることは、該酵素をコードする遺伝子の発現を増加させることにより達成することができる。キシロース資化遺伝子としては、腸内細菌科の細菌に由来する任意の遺伝子、ならびに高熱性バチルスサブスピーシーズ（thermophilic Bacillus sp.） (Biochem. Mol. Bio. Int., 1996, 39(5), 1049-1062) のような他の細菌に由来する遺伝子が挙げられる。この中では、エシェリヒア属細菌に由来する遺伝子が好ましい。
【００２４】
エシェリヒア・コリ由来のキシロースイソメラーゼ（ＥＣ番号５．３．１．５）をコードする遺伝子は既知であり、ｘｙｌＡと称されている（GenBankアクセッションＮＣ＿０００９１３．１，ｇｉ：１６１３１４３６の配列におけるヌクレオチド番号３７２７０７２〜３７２８３９４）。キシルロキナーゼ（ＥＣ番号２．７．１．１７）をコードする遺伝子は既知であり、ｘｙｌＢと称されている（GenBankアクセッションＮＣ＿０００９１３．１，ｇｉ：１６１３１４３５の配列におけるヌクレオチド番号３７２５５４６〜３７２７０００）。キシロース結合タンパク質輸送系をコードする遺伝子は既知であり、ｘｙｌＦと称されている（GenBankアクセッションＮＣ＿０００９１３．１，ｇｉ：１６１３１４３７の配列におけるヌクレオチド番号３７２８７６０〜３７２９７５２）。キシロース輸送系の推定ＡＴＰ結合タンパク質をコードする遺伝子は既知であり、ｘｙｌＧと称されている（GenBankアクセッションＮＣ＿０００９１３．１，ｇｉ：１６１３１４３８の配列におけるヌクレオチド番号３７２９８３０〜３７３１３７１）。ＡＢＣタイプキシロース輸送系のパーミアーゼ構成成分をコードする遺伝子は既知であり、ｘｙｌＨ遺伝子と称されている（GenBankアクセッションＮＣ＿０００９１３．１，ｇｉ：１６１３１４３９の配列におけるヌクレオチド番号３７３１３４９〜３７３２５３０）。ｘｙｌオペロンの転写調節因子をコードする遺伝子は既知であり、ｘｙｌＲと称されている（GenBankア
クセッションＮＣ＿０００９１３．１，ｇｉ：１６１３１４４０の配列におけるヌクレオチド番号３７３２６０８〜３７３３７８６）。したがって、上述の遺伝子は、遺伝子のヌクレオチド配列に基づいたプライマーを用いて、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、White,
T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)を参照）により得ることができる。
【００２５】
他の微生物由来のキシロース資化酵素をコードする遺伝子は、同様に得ることができる。
【００２６】
エシェリヒア・コリ由来のｘｙｌＡ遺伝子は、以下のタンパク質（Ａ）または（Ｂ）をコードするＤＮＡにより例示される：
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、または
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入あるいは付加を含むアミノ酸配列を有し、かつキシロースイソメラーゼの活性を有するタンパク質。
【００２７】
エシェリヒア・コリ由来のｘｙｌＢ遺伝子は、以下のタンパク質（Ｃ）または（Ｄ）をコードするＤＮＡにより例示される：
（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、または
（Ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入あるいは付加を含むアミノ酸配列を有し、かつキシルロキナーゼの活性を有するタンパク質。
【００２８】
エシェリヒア・コリ由来のｘｙｌＦ遺伝子は、以下のタンパク質（Ｅ）または（Ｆ）をコードするＤＮＡにより例示される：
（Ｅ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、または
（Ｆ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入あるいは付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ該タンパク質の量が、ｘｙｌＡＢおよびｘｙｌＧＨＲ遺伝子によりコードされるタンパク質の量とともに、Ｌ−アミノ酸を生産する細菌中で増加した場合に、培地中のＬ−ヒスチジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−トリプトファンなどのＬ−アミノ酸の蓄積量を増加させる活性を有するタンパク質。
【００２９】
エシェリヒア・コリ由来のｘｙｌＧ遺伝子は、以下のタンパク質（Ｇ）または（Ｈ）をコードするＤＮＡにより例示される：
（Ｇ）配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、または
（Ｈ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入あるいは付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ該タンパク質の量が、ｘｙｌＡＢおよびｘｙｌＦＨＲ遺伝子によりコードされるタンパク質の量とともに、Ｌ−アミノ酸を生産する細菌中で増加した場合に、培地中のＬ−ヒスチジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−トリプトファンなどのＬ−アミノ酸の蓄積量を増加させる活性を有するタンパク質。
【００３０】
エシェリヒア・コリ由来のｘｙｌＨ遺伝子は、以下のタンパク質（Ｉ）または（Ｊ）をコードするＤＮＡにより例示される：
（Ｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｊ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入あるいは付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ該タンパク質の量が、ｘｙｌＡＢおよびｘｙｌＦＧＲ遺伝子によりコードされるタンパク質の量とともに、Ｌ−アミノ酸を生産する細菌中で増加した場合に、培地中のＬ−ヒスチジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−トリプトファンなどのＬ−アミノ酸の蓄積量を増加
させる活性を有するタンパク質。
【００３１】
エシェリヒア・コリ由来のｘｙｌＲ遺伝子は、以下のタンパク質（Ｋ）または（Ｌ）をコードするＤＮＡにより例示される：
（Ｋ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｌ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入あるいは付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ該タンパク質の量が、ｘｙｌＡＢおよびｘｙｌＦＧＨ遺伝子によりコードされるタンパク質の量とともに、Ｌ−アミノ酸を生産する細菌中で増加した場合に、培地中のＬ−ヒスチジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−トリプトファンなどのＬ−アミノ酸の蓄積量を増加させる活性を有するタンパク質。
【００３２】
キシロースイソメラーゼをコードするＤＮＡとしては、タンパク質の活性が失われない限り、タンパク質（Ａ）における１つまたはそれ以上の位置において１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。「数個の」アミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造におけるアミノ酸残基の位置またはタイプに応じて様々であるが、タンパク質（Ａ）に関しては、２〜５０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個であり得る。これは、幾つかのアミノ酸は互いに高い相同性を有しており、またかかるアミノ酸同士の置換は、タンパク質の三次元構造およびその活性にあまり影響を及ぼさないためである。したがって、タンパク質（Ｂ）は、キシロースイソメラーゼに関する全アミノ酸配列に関して、３０〜５０％の、好ましくは５０〜７０％の、より好ましくは７０〜９０％の、特に好ましくは９０％を上回る、最も好ましくは９５％を上回る相同性を有し、かつキシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。同じアプローチおよび相同性決定を、他のタンパク質（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｇ）、（Ｉ）および（Ｋ）にも適用することができる。
【００３３】
タンパク質またはＤＮＡ相同性の度合いを評価するために、ＢＬＡＳＴ検索、ＦＡＳＴＡ検索およびＣｌｕｓｔａｌＷのような幾つかの計算方法を使用することができる。
【００３４】
ＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアラインメント検索ツール）は、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｍｅｇａｂｌａｓｔ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘにより使用される発見的な（heuristic）検索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、Karlin、SamuelおよびStephen F. Altschulの統計学的方法（「一般的なスコアリングスキームを使用することにより、分子配列の特徴の統計学的有意性を評価する方法（Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence
features by using general scoring schemes）」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68、「分子配列における多重ハイスコアリングセグメントに関する用途および統計学（Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences）」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-7）によって検索結果に有意差を付与する。
ＦＡＳＴＡ検索方法は、W.R. Pearsonにより記載されている（「ＦＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡによる迅速かつ高感度な配列比較（Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA）」、Methods in Enzymology, 1990 183:63-98）。
ＣｌｕｓｔａｌＷ方法は、Thompson J.D.、Higgins D.G.およびGibson T.J.により記載されている（「ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：配列重み付け、位置特異的ギャップペナルティおよび重み行列法選択による漸進的多重配列アラインメントの感度の改善（CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence
weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice）」、Nucleic Acids Res. 1994, 22:4673-4680）。
【００３５】
上述のような（Ａ）で定義されるタンパク質に対する変更は通常、タンパク質の活性を保持するような保存的変更である。置換変更としては、アミノ酸配列中の少なくとも１個の残基が除去され、かつ異なる残基がその場所に挿入された変更が挙げられる。上記タンパク質においてもとのアミノ酸に代わって置換されることができ、かつ保存的置換としてみなされるアミノ酸の例としては、ａｌａからｓｅｒまたはｔｈｒへの置換；ａｒｇからｇｌｎ、ｈｉｓまたはｌｙｓへの置換；ａｓｎからｇｌｕ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ｈｉｓ又はａｓｐへの置換；ａｓｐからａｓｎ、ｇｌｕまたはｇｌｎへの置換；ｃｙｓからｓｅｒまたはａｌａへの置換；ｇｌｎからａｓｎ、ｇｌｕ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐまたはａｒｇへの置換；ａｓｎ、ｇｌｕからｇｌｎ、ｌｙｓまたはａｓｐへの置換；ｇｌｙからｐｒｏへの置換；ｈｉｓからａｓｎ、ｌｙｓ、ｇｌｎ、ａｒｇ又はｔｙｒへの置換；ｉｌｅからｌｅｕ、ｍｅｔ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換；ｌｅｕからｉｌｅ、ｍｅｔ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換；ｌｙｓからａｓｎ、ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｈｉｓ又はａｒｇへの置換；ｍｅｔからｉｌｅ、ｌｅｕ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換；ｐｈｅからｔｒｐ、ｔｙｒ、ｍｅｔ、ｉｌｅまたはｌｅｕへの置換；ｓｅｒからｔｈｒ又はａｌａへの置換；ｔｈｒからｓｅｒまたはａｌａへの置換；ｔｒｐからｐｈｅ又はｔｙｒへの置換；ｔｙｒからｈｉｓ、ｐｈｅまたはｔｒｐへの置換；およびｖａｌからｍｅｔ、ｉｌｅ又はｌｅｕへの置換が挙げられる。
【００３６】
（Ａ）で定義されるタンパク質と実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、（Ａ）で定義されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されるように、部位特異的突然変異誘発を用いて修飾することにより得られる。かかる修飾ＤＮＡは、適当な条件下、突然変異を発生させる試薬で処理する従来法により得ることができる。かかる処理としては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミンで処理すること、あるいは該ＤＮＡを保有する細菌をＵＶ照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンまたは亜硝酸のような試薬で処理することなどが挙げられる。
【００３７】
キシロースイソメラーゼをコードするＤＮＡは、天然の多様性に起因する、エシェリヒア属細菌の異なる株で見出され得る変異体を包含する。かかる変異体をコードするＤＮＡは、ストリンジェントな条件下でｘｙｌＡ遺伝子または該遺伝子の一部とハイブリダイズし、かつキシロースイソメラーゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することにより得ることができる。本明細書中で言及される「ストリンジェントな条件」という語句には、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、非特異的ハイブリッドは形成されない条件が含まれる。例えば、ストリンジェントな条件としては、高相同性を有するＤＮＡ、例えば互いに７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件が挙げられる。あるいは、ストリンジェントな条件は、サザンハイブリダイゼーションでの通常の洗浄条件、例えば６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む条件に例示される。洗浄手順の時間は、ブロッティングに使用する膜のタイプに依存し、一般的には、製造業者により推奨される条件に依存する。例えば、ストリンジェントな条件下でＨｙｂｏｎｄ（登録商標）Ｎ＋ナイロン膜(Amersham)を洗浄する推奨時間は１５分である。好ましくは、洗浄は、２〜３回行われる。配列番号１のヌクレオチド配列の部分配列はまた、変異体をコードし、かつｘｙｌＡ遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡ用のプローブとして使用することができる。かかるプローブは、プライマーとして配列番号１のヌクレオチド配列に基づいて設計されるオリゴヌクレオチド、および鋳型として配列番号１のヌクレオチド配列を含有するＤＮＡフラグメントを用いたＰＣＲにより調製され得る。約３００ｂｐ長のＤＮＡフラグメントをプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーションに関する洗浄条件は、例えば、５０℃、２×ＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳであり得る。
【００３８】
その他のキシロース資化酵素と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、上述のような、キシロースイソメラーゼを得るために使用される方法と同様の方法により得ることができる。
【００３９】
タンパク質をコードするＤＮＡによる細菌の形質転換は、例えば、従来法により本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を増加させて、細菌細胞において該タンパク質の活性を高めるというような、細菌細胞へのＤＮＡの導入を意味する。
【００４０】
本発明の細菌はまた、（Ａ）または（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）、（Ｅ）または（Ｆ）、（Ｇ）または（Ｈ）、（Ｉ）または（Ｊ）および（Ｋ）または（Ｌ）で定義されるようなタンパク質をコードするＤＮＡによる上記細菌の形質転換、あるいは細菌の染色体上の上記ＤＮＡの発現調節配列の変更により、本発明のタンパク質の活性が高められた細菌を包含する。
【００４１】
遺伝子発現を高める方法としては、遺伝子コピー数を増加させることが挙げられる。エシェリヒア属細菌において機能することが可能であるベクターへ遺伝子を挿入することにより、遺伝子のコピー数を増加させることができる。かかる目的では、マルチコピーベクターが好ましく使用され得る。好ましくは、低コピーベクターが使用される。低コピーベクターとしては、ｐＳＣ１０１、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９等が例示される。「低コピーベクター」という用語は、細胞当たり最大５コピーのコピー数を有するベクターに関して使用される。形質転換方法には、当業者に既知の任意の方法が含まれる。例えば、ＤＮＡに対する細胞の透過性を増加させるように、レシピエント細胞を塩化カルシウムで処理する方法は、エシェリヒア・コリＫ−１２に関して報告されており(Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970))、この方法を使用してもよい。
【００４２】
遺伝子発現の増強はまた、例えば、相同組換え方法、Ｍｕ組込み方法等による、細菌染色体への遺伝子の多コピーの導入により達成され得る。例えば、１ラウンドのＭｕ組込みにより、最大３コピーの遺伝子の細菌染色体への導入が可能となる。
【００４３】
他方で、遺伝子発現の増強は、自身のプロモーターの代わりに、より強力なプロモーターの制御下に本発明のＤＮＡを置くことにより達成することができる。プロモーター強度は、ＲＮＡ合成開始反応の頻度で定義される。プロモーター強度の評価方法および強力なプロモーターの例は、Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H.により記載されている（エシェリヒア・コリにおけるプロモーター：ｉｎ  ｖｉｖｏでの強度の階層は、代替的構造を示す。（Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures.）EMBO J. 1986, 5, 2987-2994）。例えば、ＰRプロモーターは、強力な構成的プロモーターとして既知である。他の既知の強力なプロモーターは、λファージ等のＰLプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーターである。
【００４４】
翻訳の増強は、本発明のＤＮＡへ、より効率的なシャイン・ダルガーノ配列（ＳＤ配列）を、自身のＳＤ配列の代わりに導入することにより達成することができる。ＳＤ配列は、リボソームの１６Ｓ  ＲＮＡと相互作用する、ｍＲＮＡの開始コドンの上流にある領域である(Shine J. and Dalgarno L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71, 4, 1342-6)。
より強力なプロモーターの使用は、遺伝子コピー数を増加させる方法と組み合わせてもよい。
あるいは、プロモーターは、例えば、プロモーターに突然変異を導入して、プロモーターの下流に位置する遺伝子の転写レベルを増加させることにより高めることができる。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサーにおける幾つかの
ヌクレオチド、特に開始コドンのすぐ上流にある配列の置換がｍＲＮＡの翻訳効率に大いに影響を及ぼすことが知られている。例えば、開始コドンに先立つ３つのヌクレオチドの種類によって、発現レベルが２０倍の範囲で変化することが見出された(Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984)。
【００４５】
染色体ＤＮＡの調製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化および連結、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等に関する方法は、当業者に既知の慣例の方法である。これらの方法は、Sambrook, J., and Russell D., 「Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition」, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載されている。
【００４６】
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を本来的に有する細菌へ上述のＤＮＡを導入することにより得ることができる。あるいは、本発明の細菌は、上記ＤＮＡを保有する細菌へ、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を付与することにより得ることもできる。
【００４７】
エシェリヒア属に属するＬ−アミノ酸生産細菌の例を以下に記載する。
Ｌ−ヒスチジン生産細菌
Ｌ−ヒスチジン生産能を有するエシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ２４株（ＶＫＰＭ  Ｂ−５９４５、ＲＵ２００３６７７号）、エシェリヒア・コリ８０株（ＶＫＰＭ Ｂ−７２７０、ＲＵ２１１９５３６号）、エシェリヒア・コリＮＲＲＬ
Ｂ−１２１１６株〜Ｂ−１２１２１株（ＵＳ４３８８４０５号）、エシェリヒア・コリＨ−９３４２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７５）およびＨ−９３４３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６７６）（ＵＳ６３４４３４７号）、エシェリヒア・コリＨ−９３４１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７４）（ＥＰ１０８５０８７号）、エシェリヒア・コリＡＩ８０／ｐＦＭ２０１株（ＵＳ６２５８５５４号）のような、エシェリヒア属に属するＬ−ヒスチジン生産細菌の菌株等が含まれる。
【００４８】
好ましくは、本発明の細菌は、ヒスチジンオペロン遺伝子の発現を高めるようにさらに改変されたものであ。該ヒスチジンオペロン遺伝子は、好ましくは、Ｌ−ヒスチジン生産細菌に関して、Ｌ−ヒスチジンによるフィードバック阻害が脱感作されたＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｈｉｓＧ遺伝子を含む（ロシア特許第２００３６７７号および同第２１１９５３６号）。
【００４９】
Ｌ−スレオニン生産細菌
本発明のＬ−スレオニンを生産する細菌を得るための親株としては、例えば、エシェリヒア・コリＴＤＨ−６／ｐＶＩＣ４０株（ＶＫＰＭ  Ｂ−３９９６）（米国特許第５，１７５，１０７号、米国特許第５，７０５，３７１号）、エシェリヒア・コリＮＲＲＬ−２１５９３株（米国特許第５，９３９，３０７号）、エシェリヒア・コリＦＥＲＭ  ＢＰ−３７５６株（米国特許第５，４７４，９１８号）、エシェリヒア・コリＦＥＲＭ  ＢＰ−３５１９株およびＦＥＲＭ  ＢＰ−３５２０株（米国特許第５，３７６，５３８号）、エシェリヒア・コリＭＧ４４２株（Gusyatiner et al., Genetika(in Russian), 14, 947-956(1978)）、エシェリヒア・コリＶＬ６４３株およびＶＬ２０５５株（ＥＰ  １１４９９１１  Ａ号）等のような、エシェリヒア属に属するＬ−スレオニンを生産する細菌が含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
ＴＤＨ−６株は、ｔｈｒＣ遺伝子を欠損しており、シュークロース資化性であり、そのｉｌｖＡ遺伝子はリーキー変異を有する。この株はまた、ｒｈｔＡ遺伝子においても突然変異を有しており、これは、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する。Ｂ−３９９６株は、ＲＳＦ１０１０由来のベクターへ、突然変異ｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡ*ＢＣオペロンを挿入することにより得られたプラスミドｐＶＩＣ４０を含有
する。この突然変異ｔｈｒＡ遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に脱感作されたアスパルトキナーゼ ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。Ｂ−３９９６株は、アクセッション番号ＲＩＡ１８６７の下で、the All-Union Scientific Center of Antibiotics(住所Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russian Federation)に、１９８７年１１月１９日に寄託された。この株はまた、アクセッション番号Ｂ−３９９６の下で、the Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM)(住所Dorozhny proezd. 1, Moscow 117545, Russian Federation)に寄託された。
【００５１】
好ましくは、本発明の細菌は、１つまたはそれ以上の下記遺伝子の発現を高めるようにさらに改変される：
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性であるアスパルトキナーゼ ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする突然変異ｔｈｒＡ遺伝子、
ホモセリンキナーゼをコードするｔｈｒＢ遺伝子、
スレオニンシンターゼをコードするｔｈｒＣ遺伝子、
推定膜貫通タンパク質をコードするｒｈｔＡ遺伝子、
アスパラギン酸β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするａｓｄ遺伝子、及び
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）をコードするａｓｐＣ遺伝子。
【００５２】
エシェリヒア・コリのアスパルトキナーゼ ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子は知られている（GenBankアクセッションＮＣ＿０００９１３．２，ｇｉ：４９１７５９９０の配列におけるヌクレオチド番号３３７〜２７９９）。ｔｈｒＡ遺伝子は、エシェリヒア・コリＫ−１２の染色体上のｔｈｒＬ遺伝子とｔｈｒＢ遺伝子との間に位置している。エシェリヒア・コリのホモセリンキナーゼをコードするｔｈｒＢ遺伝子は知られている（GenBankアクセッションＮＣ＿０００９１３．２，ｇｉ：４９１７５９９０の配列におけるヌクレオチド番号２８０１〜３７３３）。ｔｈｒＢ遺伝子は、エシェリヒア・コリＫ−１２の染色体上のｔｈｒＡ遺伝子とｔｈｒＣ遺伝子との間に位置している。エシェリヒア・コリのスレオニンシンターゼをコードするｔｈｒＣ遺伝子は知られている（GenBankアクセッションＮＣ＿０００９１３．２，ｇｉ：４９１７５９９０の配列におけるヌクレオチド番号３７３４〜５０２０）。ｔｈＣ遺伝子は、エシェリヒア・コリＫ−１２の染色体上のｔｈｒＢ遺伝子とｙａａＸオープンリーディングフレームとの間に位置している。３つの遺伝子は、全体で、単一のスレオニンオペロンとして機能する。
【００５３】
スレオニンによるフィードバック阻害に対して耐性であるアスパルトキナーゼ ホモセリンデヒドロキナーゼＩをコードする突然変異ｔｈｒＡ遺伝子、ｔｈｒＢ遺伝子およびｔｈｒＣ遺伝子は、スレオニンを生産するエシェリヒア・コリＶＫＰＭ  Ｂ−３９９６株中に存在する既知のプラスミドｐＶＩＣ４０から、単一のオペロンとして得ることができる。プラスミドｐＶＩＣ４０は、米国特許第５，７０５，３７１号に詳述されている。
【００５４】
ｒｈｔＡ遺伝子は、グルタミン輸送系の構成因子をコードするｇｌｎＨＰＯオペロンに近接したエシェリヒア・コリ染色体上の１８ｍｉｎに存在し、ｒｈｔＡ遺伝子は、ｐｅｘＢ遺伝子とｏｍｐＸ遺伝子との間に位置するＯＲＦ１（ｙｂｉＦ遺伝子、GenBankアクセッション番号ＡＡＡ２１８５４１，ｇｉ：４４０１８１における番号７６４〜１６５１）に一致する。ＯＲＦ１によりコードされるタンパク質を発現するユニットをｒｈｔＡ（ｒｈｔ：ホモセリンおよびスレオニンに対する耐性）遺伝子と称した。また、ｒｈｔＡ２３突然変異は、ＡＴＧ開始コドンから数えて−１位におけるＧからＡへの置換であることが見出された（ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997,
abstract No. 457、欧州特許公開１０１３７６５Ａ号）
【００５５】
エシェリヒア・コリのａｓｄ遺伝子は既に知られており（GenBankアクセッションＮＣ＿０００９１３．１，ｇｉ：１６１３１３０７の配列におけるヌクレオチド番号３５７２５１１〜３５７１４０８）、該遺伝子のヌクレオチド配列に基づくプライマーを利用したＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)を参照）により得ることができる。他の微生物のａｓｄ遺伝子は、同様の方法で得ることができる。
【００５６】
同様に、エシェリヒア・コリのａｓｐＣ遺伝子は既に知られており（GenBankアクセッションＮＣ＿０００９１３．１，ｇｉ：１６１２８８９５の配列におけるヌクレオチド番号９８３７４２〜９８４９３２）、ＰＣＲにより得ることができる。他の微生物のａｓｐＣ遺伝子は、同様の方法で得ることができる。
【００５７】
Ｌ−リジン生産細菌
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産細菌としては、例えば、Ｌ−リジン類縁体に対する耐性を有する突然変異体が含まれる。Ｌ−リジン類縁体は、エシェリヒア属細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地中に存在する場合には、完全にまたは部分的に脱感作される。Ｌ−リジン類縁体としては、例えば、オキサリジン、リジンヒドロキサム酸塩、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム等が含まれるが、これらに限定されない。これらのリジン類縁体に対する耐性を有する突然変異体は、エシェリヒア属細菌を、慣例の人工的な突然変異誘発処理にさらすことにより得ることができる。Ｌ−リジンを生産するのに有用な細菌株の具体例としては、エシェリヒア・コリＡＪ１１４４２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５４３、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１８５、米国特許第４，３４６，１７０号を参照）およびエシェリヒア・コリＶＬ６１１が含まれる。これらの微生物では、Ｌ−リジンによるアスパルトキナーゼのフィードバック阻害は脱感作されている。
【００５８】
ＷＣ１９６株をエシェリヒア・コリのＬ−リジン生産株として使用してもよい。この細菌株は、Ｗ３１１０株にＡＥＣ耐性を付与することにより育種されたものであるが、これは、エシェリヒア・コリＫ−１２に由来する。得られた株はエシェリヒア・コリＡＪ１３０６９株と称して、１９９４年１２月６日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託され、ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６９０のアクセッション番号で受理された。続いて、その株は、１９９５年９月２９日にブタペスト条約の規定により国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２５２のアクセッション番号で受理された（米国特許第５，８２７，６９８号）。
【００５９】
Ｌ−グルタミン酸生産細菌
本発明のＬ−グルタミン酸を生産する細菌を得るための親株としては、例えば、エシェリヒア・コリＶＬ３３４ｔｈｒＣ+株（ＥＰ１１７２４３３号）のようなエシェリヒア属に属するＬ−グルタミン酸生産細菌が含まれるが、これに限定されない。エシェリヒア・コリＶＬ３４４株（ＶＫＰＭ  Ｂ−１６４１）は、ｔｈｒＣ遺伝子およびｉｌｖＡ遺伝子中に突然変異を有するＬ−イソロイシンおよびＬ−スレオニン栄養要求性株である（米国特許第４，２７８，７６５号）。ｔｈｒＣ遺伝子の野生型遺伝子が、野生型エシェリヒア・コリＫ１２株（ＶＫＰＭ  Ｂ−７）細胞で生育させたバクテリオファージＰ１を用いた普遍形質導入の方法により移入された。結果として、Ｌ−イソロイシン栄養要求性株ＶＬ３３４ｔｈｒＣ+（ＶＫＰＭ  Ｂ−８９６１）が得られた。この株はＬ−グルタミン酸を生産することができる。
【００６０】
本発明のＬ−グルタミン酸生産細菌を得るための親株としては、例えば、α−ケトグル
タル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠如しているか、またはα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が減少した突然変異体が含まれる。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠如しているか、またはα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が減少したエシェリヒア属細菌、およびそれらを得る方法は、米国特許第５，３７８，６１６号および同第５，５７３，９４５号に記載されている。具体的には、これらの株には、以下の：
エシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍｒ
エシェリヒア・コリＡＪ１２６２４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８５３）
エシェリヒア・コリＡＪ１２６２８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８５４）
エシェリヒア・コリＡＪ１２９４９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８８１）
が含まれる。
【００６１】
エシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍｒは、エシェリヒア・コリＷ３１１０株のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（これ以降、「ｓｕｃＡ遺伝子」と称する）を破壊することにより得られる。この株はα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
【００６２】
Ｌ−グルタミン酸を生産する細菌の他の例としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠如しているか、またはα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が減少したパントエア属に属する突然変異株が含まれ、上述のようにして得ることができる。かかる株としては、パントエア・アナナティス(Pantoea ananatis)ＡＪ１３３５６株が含まれる（米国特許第６，３３１，４１９号）。パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６は、１９９８年２月１９日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託され、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６６４５のアクセッション番号で受理された。続いて、その株は、１９９９年１月１１日にブタペスト条約の規定により国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１５のアクセッション番号で受理された。パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６は、ＫＧＤＨ−Ｅ１サブユニット遺伝子（ｓｕｃＡ）の破壊の結果、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠如している。上記株は、それが単離および寄託されたときはエンテロバクター・アグロメランスとして同定されたため、エンテロバクター・アグロメランス(Enterobacter agglomerans)ＡＪ１３３５６として寄託された。しかしながら、その株は、近年、１６Ｓ  ｒＲＮＡ等の塩基配列解析に基づいてパントエア・アナナティスとして再類別された。ＡＪ１３３５６は、エンテロバクター・アグロメランスとして上述の寄託機関に寄託されたが、本明細書では、ＡＪ１３３５６は、パントエア・アナナティスとして記載される。
【００６３】
Ｌ−トリプトファン生産細菌
本発明のＬ−トリプトファン生産細菌を得るための親株としては、例えば、突然変異型ｔｒｐＳ遺伝子によりコードされるトリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼを欠損しているエシェリヒア・コリＪＰ４７３５／ｐＭＵ３０２８株（ＤＳＭ１０１２２）およびＪＰ６０１５／ｐＭＵ９１株（ＤＳＭ１０１２３）（米国特許第５，７５６，３４５号）、セリンによるフィードバック阻害から解除されているｓｅｒＡ遺伝子を有するエシェリヒア・コリＳＶ１６４株（ｐＧＨ５）（米国特許第６，１８０，３７３号）、酵素トリプトファナーゼを欠損しているエシェリヒア・コリＡＧＸ１７株（ｐＧＸ４４）（ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６３）およびＡＧＸ６株（ｐＧＸ５０）ａｒｏＰ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６４）（米国特許第４，３７１，６１４号）、ホスホエノールピルビン酸生産能が高められたエシェリヒア・コリＡＧＸ１７／ｐＧＸ５０，ｐＡＣＫＧ４−ｐｐｓ株（ＷＯ９７０８３３３号、米国特許第６，３１９，６９６号）等のようなエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産細菌が含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
既に、ｙｄｄＧ遺伝子は、Ｌ−アミノ酸の生合成経路に関与しない膜タンパク質をコー
ドすることが知られていた。同様に、ｙｄｄＧ遺伝子は、野生型遺伝子が微生物中の多コピーベクター上で増幅される場合、Ｌ−フェニルアラニンおよび幾つかのアミノ酸類縁体に対する耐性を付与することが知られている。さらに、ｙｄｄＧ遺伝子は、さらなるコピーが各々の生産株の細胞に導入される場合に、Ｌ−フェニルアラニンまたはＬ−トリプトファンの生産を高めることができる（ＷＯ０３０４４１９２号）。したがって、Ｌ−トリプトファンを生産する細菌は、ｙｄｄＧオープンリーディングフレームの発現が高められるように、さらに改変されることが望ましい。
【００６５】
Ｌ−アルギニン生産細菌
本発明のＬ−アルギニン生産細菌を得るための親株としては、例えば、エシェリヒア・コリ２３７株（ＶＫＰＭ  Ｂ−７９２５）（米国特許出願ＵＳ２００２０５８３１５号）および突然変異Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼを保有するその派生株（ロシア特許出願第２００１１１２８６９号）、エシェリヒア・コリ３８２株（ＶＫＰＭ  Ｂ−７９２６）（欧州特許出願ＥＰ１１７０３５８号）、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードするａｒｇＡ遺伝子が導入されたアルギニンを生産する株（ＪＰ５７−５６９３Ａ号）等のＬ−アルギニン生産細菌が含まれるが、これらに限定されない。
【００６６】
Ｌ−フェニルアラニン生産細菌
本発明のＬ−フェニルアラニンを生産する細菌を得るための親株としては、例えば、エシェリヒア・コリＡＪ１２７３９株（ｔｙｒＡ：：Ｔｎ１０，ｔｙｒＲ）（ＶＫＰＭ  Ｂ−８１９７）、ｐｈｅＡ３４遺伝子を保有するエシェリヒア・コリＨＷ１０８９株（ＡＴＣＣ５５３７１）（米国特許第５，３５４，６７２号）、エシェリヒア・コリＭＷＥＣ１０１−ｂ株（ＫＲ８９０３６８１）、エシェリヒア・コリＮＲＲＬ  Ｂ−１２１４１株、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１４５株、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１４６株およびＮＲＲＬ  Ｂ−１２１４７株（米国特許第４，４０７，９５２号）のようなエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニンを生産する細菌が含まれるが、これらに限定されない。また、親株として、エシェリヒア・コリＫ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＢ］株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５６６）、エシェリヒア・コリＫ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＤ］株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１２６５９）、エシェリヒア・コリＫ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＴｅｒｍ］株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１２６６２）およびエシェリヒア・コリＫ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＢＲ−ａｒｏＧ４，ｐＡＣＭＡＢ］と称されるＡＪ１２６０４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５７９）を使用してもよい（欧州特許  ４８８４２４
Ｂ１）。
さらに、ｙｅｄＡ遺伝子またはｙｄｄＧ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が高められたエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産細菌もまた使用してもよい（米国特許出願第２００３／０１４８４７３Ａ１および同第２００３／０１５７６６７Ａ１）。
【００６７】
Ｌ−システイン生産細菌
本発明のＬ−システインを生産する細菌を得るための親株としては、例えば、フィードバック耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする種々のｃｙｓＥ遺伝子で形質転換したエシェリヒア・コリＪＭ１５株（米国特許第６，２１８，１６８号、ロシア特許出願第２００３１２１６０１号）、細胞にとって有毒な物質を分泌するのに適したタンパク質をコードする遺伝子が過剰発現されたエシェリヒア・コリＷ３１１０株（米国特許第５，９７２，６６３号）、システインデスルホヒドラーゼ活性が低減されたエシェリヒア・コリ株（ＪＰ１１−１５５５７１Ａ）、ｃｙｓＢ遺伝子によりコードされるシステインレギュロンに関する正の転写調節因子の活性が増大されたエシェリヒア・コリＷ３１１０株（ＷＯ０１／２７３０７Ａ１）等のようなエシェリヒア属に属するＬ−システイン生産細菌が含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
Ｌ−ロイシン生産細菌
本発明のＬ−ロイシン生産細菌を得るための親株としては、例えば、β−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、５，５，５−トリフルオロロイシンを含むロイシン類縁体に対して耐性であるエシェリヒア・コリ株（特公昭６２−３４３９７号および特開平０８−７０８７９号）、ＷＯ９６／０６９２６号に記載される遺伝子操作方法により得られるエシェリヒア・コリ株、エシェリヒア・コリＨ−９０６８株（特開平０８−７０８７９号等のようなエシェリヒア属に属するＬ−ロイシン生産細菌が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
本発明の細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する１つまたはそれ以上の遺伝子の発現を高めることにより改善され得る。例としては、ｌｅｕＡＢＣＤオペロンの遺伝子が含まれ、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害から解除されたイソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードする突然変異型ｌｅｕＡ遺伝子が挙げられる（米国特許第６，４０３，３４２号）。さらに、本発明の細菌は、細菌細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現を高めることにより改善され得る。かかる遺伝子の例としては、ｂ２６８２遺伝子およびｂ２６８３遺伝子（ｙｇａＺＨ遺伝子）（ロシア特許出願第２００１１７６３２号）が含まれる。
【００７０】
Ｌ−プロリン生産細菌
本発明のＬ−プロリン生産細菌を得るための親株としては、例えば、ｉｌｖＡ遺伝子を欠損しており、かつＬ−プロリンを生産することが可能なエシェリヒア・コリ７０２ｉｌｖＡ株（ＶＫＰＭ  Ｂ−８０１２）（欧州特許公開１１７２４３３号）のようなエシェリヒア属に属するＬ−プロリンを生産する細菌が含まれるが、これらに限定されない。本発明の細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する１つまたはそれ以上の遺伝子の発現を高めることにより改善され得る。Ｌ−プロリン生産細菌に関する遺伝子のかかる例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が脱感作されたグルタミン酸キナーゼをコードするｐｒｏＢ遺伝子（ドイツ特許第３１２７３６１号）が含まれる。さらに、本発明の細菌は、細菌細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現を高めることにより改善され得る。かかる遺伝子は、ｂ２６８２遺伝子およびｂ２６８３遺伝子（ｙｇａＺＨ遺伝子）（欧州特許公開１２３９０４１  Ａ２）により例示される。
【００７１】
Ｌ−プロリンを生産するための活性を有するエシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ株：ＮＲＲＬ  Ｂ−１２４０３およびＮＲＲＬ  Ｂ−１２４０４（英国特許第２０７５０５６号）、ＶＫＰＭ  Ｂ−８０１２（ロシア特許出願第２０００１２４２９５）、ドイツ特許第３１２７３６１号に記載されるプラスミド突然変異体、Bloom F.R.等(The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)により記載されるプラスミド突然変異体等が含まれる。
【００７２】
上述のＬ−アミノ酸生産株は、ペントース資化率の増強のために、あるいはＬ−アミノ酸生産能の増強のために、当業者に既知の広範囲の方法によりさらに改変されてもよい。
ペントース糖資化率は、ペントース資化遺伝子、アラビノースに関してはａｒａＦＧおよびａｒａＢＡＤ遺伝子、の増幅により、あるいはｐｔｓＧ突然変異のような、グルコース資化系（ＰＴＳおよび非ＰＴＳ）における突然変異により、さらに高めることができる(Nichols N.N. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001, Jul. 56:1-2, 120-5)。
【００７３】
本発明の方法は、グルコースおよびペントース糖の混合物を含有する培地中でＬ−アミノ酸生産細菌を培養する工程と、培地中にＬ−アミノ酸を蓄積させる工程と、培地からＬ−アミノ酸を回収する工程とを含む、Ｌ−アミノ酸の製造方法を包含する。また、本発明の方法は、グルコースおよびペントース糖の混合物を含有する培地中で本発明のＬ−ヒス
チジン生産細菌を培養する工程と、培地中にＬ−ヒスチジンを蓄積させる工程と、培地からＬ−ヒスチジンを回収する工程とを含む、Ｌ−ヒスチジンの製造方法を包含する。また、本発明の方法は、グルコースおよびペントース糖の混合物を含有する培地中で本発明のＬ−スレオニン生産細菌を培養する工程と、培地中にＬ−スレオニンを蓄積させる工程と、培地からＬ−スレオニンを回収する工程とを含む、Ｌ−スレオニンの製造方法を包含する。また、本発明の方法は、グルコースおよびペントース糖の混合物を含有する培地中で本発明のＬ−リジン生産細菌を培養する工程と、培地中にＬ−リジンを蓄積させる工程と、培地からＬ−リジンを回収する工程とを含む、Ｌ−リジンの製造方法を包含する。また、本発明の方法は、グルコースおよびペントース糖の混合物を含有する培地中で本発明のＬ−グルタミン酸生産細菌を培養する工程と、培地中にＬ−グルタミン酸を蓄積させる工程と、培地からＬ−グルタミン酸を回収する工程とを含む、Ｌ−グルタミン酸の製造方法を包含する。また、本発明の方法は、グルコースおよびペントース糖の混合物を含有する培地中で本発明のＬ−トリプトファン生産細菌を培養する工程と、培地中にＬ−トリプトファンを蓄積させる工程と、培地からＬ−トリプトファンを回収する工程とを含む、Ｌ−トリプトファンの製造方法を包含する。
【００７４】
グルコースのようなヘキソース糖と、キシロースおよびアラビノースのようなペントース糖の混合物は、バイオマスを分解物から得ることができる。グルコース、キシロース、アラビノースおよび他の炭水化物は、蒸気および／または濃酸加水分解、希酸加水分解、セルラーゼなどの酵素を用いた加水分解もしくはアルカリ処理により、植物バイオマスから遊離される。基質がセルロース系物質である場合、セルロースは、糖に加水分解され、同時にまたは別個に、Ｌ−アミノ酸へ発酵される。ヘミセルロースは概して、セルロースよりも糖へ加水分解され易いため、セルロース系物質を予め加水分解して、ペントースを分離した後、蒸気、酸、アルカリ、セルラーゼまたはそれらの組合せによる処理によりセルロースを加水分解して、グルコースを得ることが好ましい。
種々の比のグルコース／キシロース／アラビノースから構成される混合物を、植物加水分解産物に潜在的に由来し得るグルコースおよびペントースの原料混合物の組成に近づけるために、この研究で使用した（実施例の項を参照）。
【００７５】
本発明では、培養、培地からのＬ−アミノ酸の回収および精製等は、従来の、微生物を用いてアミノ酸を生産する発酵方法と同様の手順で実施することができる。培養に使用される培地は、培地が炭素源および窒素源ならびに無機塩類、および必要に応じて加えられる微生物が生育に必要とする適切な量の栄養分を含む限り、合成培地または天然培地のいずれであってもよい。
【００７６】
炭素源は、グルコース、スクロース、アラビノース、キシロースおよび他のペントースならびにヘキソース糖のような各種炭水化物を包含してもよく、Ｌ−アミノ酸生産細菌は、炭素源としてそれらを利用することができる。グルコース、キシロース、アラビノースおよび他の炭水化物は、セルロース系バイオマスから得られる糖の原料混合物の一部であってもよい。
本発明における発酵に適したペントース糖としては、キシロースおよびアラビノースが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
窒素源としては、アンモニア、および硫酸アンモニウムのような種々のアンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトン、ダイズ加水分解産物および消化発酵微生物のような天然窒素源が使用される。無機塩類としては、一リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等が使用される。必要に応じて、幾つかのさらなる栄養分を培地に添加することができる。例えば、微生物が生育にプロリンを要する場合（プロリン栄養要求性）、十分量のプロリンを培養用培地に添加することができる。
【００７８】
好ましくは、振とう培養および通気しながらの攪拌培養のような好気性条件下で、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３８℃の温度で培養を実施する。培地のｐＨは通常、５〜９、好ましくは６．５〜７．２である。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基および緩衝液により調整することができる。通常、１〜５日の培養によって液体培地中に目的Ｌ−アミノ酸が蓄積する。
【００７９】
培養後、細胞のような固形物は、遠心分離または膜濾過により液体培地から除去することができ、続いて目的Ｌ−アミノ酸をイオン交換、濃縮および結晶化法により回収ならびに精製することができる。
【００８０】
実施例
以下の限定されない実施例を参照して、本発明を以下により具体的に説明する。
【実施例１】
【００８１】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体由来のｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座のクローニング
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノム解析に基づいて、遺伝子ｘｙｌＡＢＦＧＨＲは、全部で５５６個のＨｉｎｄIII染色体フラグメントのうちの単一のＨｉｎｄIIIフラグメント（１３．１ｋｂ）としてクローニングすることができる（図１）。この目的で、当該サイズを挿入した状態でエシェリヒア・コリ内に存在することが可能であるベクターｐＵＣ１９を用いて、遺伝子ライブラリーを構築した。
かかるライブラリーを構築するために、ＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡをＨｉｎｄIII制限酵素で消化し、ｐＵＣ１９ベクターをＸｂａＩ制限酵素で消化した。ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ４７０７６、ＡＴＣＣ７００９２６）は、American Type Culture Collection(10801 University Boulevard, Manassas, VA., 20110-2209, U.S.A.)から入手することができる。
【００８２】
続いて、自己連結を防止するように、両方のＤＮＡ調製物中の付着末端をクレノウフラグメントで充填した（２塩基充填）。連結手順後、組換えｐＵＣ１９プラスミドのプールが得られた。ライブラリーのサイズは、２０万個を上回るクローンである。遺伝子ライブラリーは、プラスミド配列に相補的なプライマーおよびクローン化された染色体フラグメントに相補的なプライマーを用いてＰＣＲにより分析した。適切な分子量を有するＤＮＡフラグメントは、ＰＣＲ産物中では見つからず、ｘｙｌＡＢＦＧＨＲオペロンに相当するフラグメントは、構築したライブラリーから欠けていることを意味すると解釈した。この結果は、目的のＨｉｎｄIIIフラグメント中に存在するｍａｌＳ遺伝子、ならびにｙｉａＡおよびｙｉａＢのＯＲＦ（これらは未知の機能を有する）の負の影響に起因する可能性がある。選択の失敗についての別の考え得る理由は、Ｘｙｌ遺伝子座のサイズが大きいことである。この問題を克服するために、改変型ｐＵＣ１９プラスミドに基づいて、新規遺伝子ライブラリーを構築した。主なアプローチは、隣接するｍａｌＳ遺伝子ならびにｙｉａＡおよびｙｉａＢのＯＲＦを含まないフラグメントセットとしてＸｙｌ遺伝子座をクローニングすることである。
【００８３】
この目的で、ＭｌｕＩ制限部位を含有する合成ＤＮＡフラグメントを挿入することにより、プラスミドｐＵＣ１９のポリリンカーを改変させた。２つの遺伝子ライブラリーが、改変型ｐＵＣ１９クローニングベクターにおいて構築された。第１のライブラリーは、ＨｉｎｄIIIおよびＭｌｕＩ制限酵素によるＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡおよび改変型ｐＵＣ１９の消化と、それに続く連結により創出された。ライブラリー容量は、４，０００個を上回るクローンであった。遺伝子ライブラリーは、プラスミド配列に相補的なプライマー、ならびにｘｙｌ遺伝子座のフラグメントｘｙｌＡＢＦＧに相補的であるプライマー
１（配列番号１３）およびプライマー２（配列番号１４）を用いてＰＣＲにより分析した。適切な分子量を有する候補ＤＮＡフラグメントが、ＰＣＲ産物中に見つかった。次の工程は、所定のフラグメントを有する遺伝子ライブラリーを飽和させることであった。この目的のために、元の遺伝子ライブラリーからのＤＮＡを、制限部位が目的フラグメント中には存在しないエンドヌクレアーゼで消化した。それらはＥｃｏ１４７Ｉ、ＫｐｎＩ、ＭｌｓＩ、Ｂｓｔ１１０７Ｉである。濃縮されたライブラリーにおける所定のプラスミドの頻度は、１／８００クローンであった。濃縮されたライブラリーは、上述のようにしてＰＣＲにより分析した。ライブラリーの５回連続した濃縮後に、ｘｙｌＡＢＦＧ遺伝子を含有する細胞集団としてたった１０個のクローンが見出された。遺伝子ｘｙｌＡＢＦＧを有するＨｉｎｄIII−ＭｌｕＩ  ＤＮＡフラグメントを含有する得られたプラスミドをｐＵＣ１９／ｘｙｌＡ−Ｇと称した。次に、ｙｉａＡおよびｙｉａＢのＯＲＦを含有するＨｉｎｄIII−Ｍｐｈ１１０３ＩフラグメントをプラスミドｐＵＣ１９／ｘｙｌＡ−Ｇから排除した。付着末端をクレノウフラグメントで平滑末端化して、ＥｃｏＲＩ制限部位を含有する合成リンカーを連結により挿入した。このようにして、プラスミドｐＵＣ１９／ｘｙｌＡ−Ｇ−２が得られた。次に、得られたｐＵＣ１９／ｘｙｌＡ−Ｇ−２プラスミドを、ＥｈｅＩ制限酵素により切断した。付着末端をクレノウフラグメントで平滑末端化して、ＨｉｎｄIII制限部位を含有する合成リンカーを連結により挿入した。このようにして、ｐＵＣ１９／ｘｙｌＡ−Ｇ−３プラスミドが得られた。ＨｉｎｄIII制限部位に、ｘｙｌＨＲ遺伝子を含有する残りのＤＮＡフラグメントを挿入し、完全ｘｙｌ遺伝子座が得られた。
【００８４】
第２のライブラリーは、ＰｓｔＩおよびＭｌｕＩ制限酵素によるＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡおよび改変型ｐＵＣ１９の消化と、それに続く連結により創出された。ライブラリー容量は、６，０００個を上回るクローンであった。遺伝子ライブラリーは、プラスミド配列に相補的なプライマー、ならびにクローン化された染色体フラグメントに相補的であるプライマー３（配列番号１５）およびプライマー４（配列番号１６）を用いてＰＣＲにより分析した。適当な分子量を有するＤＮＡフラグメントが、ＰＣＲ産物中に見つかった。次の工程は、ＰＣＲ分析を伴う、既知のサイズを有する細胞集団に対する遺伝子ライブラリーの順次的細分化であった。ライブラリーの７回の順次的細分化後に、ｘｙｌＨＲ遺伝子を含有する細胞集団は、たった１０個のクローンを含有していた。この集団の中で、所定のフラグメントＤＮＡが、制限酵素分析により見出された。ｘｙｌＨＲ遺伝子を有するＰｓｔＩ−ＭｌｕＩ  ＤＮＡフラグメントを含有する得られたプラスミドをｐＵＣ１９／ｘｙｌＨＲと称した。次に、プラスミドｐＵＣ１９／ｘｙｌＨＲからのＨｉｎｄIII−ＭｌｕＩ  ＤＮＡフラグメントを、予めＨｉｎｄIIIおよびＭｌｕＩ制限酵素で処理したｐＵＣ１９／ｘｙｌＡ−Ｇ−３プラスミドに連結させた。最終的に、ＭＧ１６５５株の完全ｘｙｌ遺伝子座が得られた。完全ｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座を含有する得られた多コピープラスミドをｐＵＣ１９／ｘｙｌＡ−Ｒと称した。
【００８５】
続いて、ｐＵＣ１９／ｘｙｌＡ−ＲプラスミドからのＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡフラグメントを、予めＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した低コピーベクターｐＭＷ１１９ｍｏｄに再クローニングし、完全ｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座を含有する低コピープラスミドｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒを得た。
低コピーベクターｐＭＷ１１９ｍｏｄは、ＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントの排除により、市販のｐＭＷ１１９ベクターから得られた。このフラグメントは、マルチクローニング部位を含有し、ｌａｃＺ遺伝子の主要部分であった。ｌａｃＺ遺伝子は、ｌａｃＩリプレッサーに関する部位を含有するが、続いて、ｐＵＣ１９／ｘｙｌＡ−ＲプラスミドからのｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座の挿入に必要な、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII部位を含有する合成リンカーを挿入した。
【実施例２】
【００８６】
Ｌ−ヒスチジン生産細菌を用いたグルコースおよびペントースの混合物の発酵によるＬ−ヒスチジンの生産
Ｌ−ヒスチジン生産エシェリヒア・コリ８０株を、グルコースおよびペントースの混合物の発酵によるＬ−ヒスチジンの生産用の株として使用した。エシェリヒア・コリ８０株（ＶＫＰＭ  Ｂ−７２７０）は、ロシア特許ＲＵ２１１９５３６号に詳述されており、１９９９年１０月１５日に、アクセッション番号ＶＫＰＭ  Ｂ−７２７０の下で、the Russian National Collection of Industrial Microorganisms(Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1)に寄託された。次に、それは、２００４年７月１２日にブタペスト条約の規定の下で国際寄託に移管された。ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒプラスミドで８０株を常法により形質転換し、８０／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株を得た。
【００８７】
種培養液を得るために、８０株および８０／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株の両方を、回転振とう機（２５０ｒｐｍ）で２７℃にて６時間、１ｇ／ｌのストレプトマイシンを有するＬ−ブロス２ｍｌを含有する４０ｍｌの試験管（直径１８ｍｍ）中で生育させた。８０／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株に関しては、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンをさらに添加した。続いて、種培養液２ｍｌ（５％）を発酵培地に接種した。回転振とう機（２５０ｒｐｍ）で２７℃にて６５時間、発酵培地２ｍｌを含有する４０ｍｌの試験管中で、発酵を行った。
【００８８】
培養後、培地中に蓄積されたＬ−ヒスチジン量を、ペーパークロマトグラフィにより決定した。移動相の組成は、ブタノール：アセテート：水＝４：１：１（ｖ／ｖ）である。ニンヒドリンのアセトン溶液（０．５％）を可視化試薬として使用した。結果を表２に示す。
【００８９】
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）：
炭水化物（合計）            １００．０
豆濃（ダイズ加水分解物）    ＴＮ（合計窒素）として０．２
Ｌ−プロリン                    ０．８
（ＮＨ４）２ＳＯ４              ２５．０
Ｋ２ＨＰＯ４                      ２．０
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ              １．０
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ              ０．０１
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ              ０．０１
チアミンＨＣｌ                  ０．００１
ベタイン                        ２．０
ＣａＣＯ３                      ６．０
ストレプトマイシン              １．０
炭水化物（グルコース、アラビノース、キシロース）、Ｌ−プロリン、ベタインおよび硫酸マグネシウムを別個に滅菌する。ＣａＣＯ3は、１１０℃で３０分間乾熱滅菌される。ｐＨは、滅菌前にＫＯＨにより６．０に調整される。
【００９０】
表２からわかるように、ｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座の高発現は、キシロースを含有する培地中で培養されるＬ−ヒスチジン生産エシェリヒア・コリ８０株の生産能を向上させた。
【００９１】
【表２】
0004665567.tif 000003
【実施例３】
【００９２】
Ｌ−スレオニン生産細菌を用いたグルコースおよびペントースの混合物の発酵によるＬ−スレオニンの生産
Ｌ−スレオニン生産エシェリヒア・コリＢ−３９９６株を用いて、グルコースおよびペントースの混合物の発酵によるＬ−スレオニンの生産を評価した。ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−ＲプラスミドおよびベクターｐＭＷ１１９によるＢ−３９９６株の形質転換を、ＣａＣｌ2を用いて常法により実施して、それぞれ３９９６／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株および３９９６／ｐＭＷ１１９株を得た。
【００９３】
エシェリヒア・コリＢ−３９９６／ｐＭＷ１１９株およびＢ−３９９６／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株の両方を、３７℃にて１２〜１５時間、ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｌ）およびアンピシリン（１５０ｍｇ／ｌ）を有するＬ−寒天プレート上で生育させた。続いて、炭素源としてキシロース（４％）を含有する発酵培地に、株の１かき分を接種した。２０×２００ｍｍの試験管中のストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を含有する発酵培地２ｍｌ中で、発酵を行った。振とう機で２５０ｒｐｍにて３２℃にて２５時間、細胞を生育させた。
【００９４】
培養後、培地中に蓄積されたＬ−スレオニン量を、ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ）の移動相を用いてペーパークロマトグラフィにより決定した。ニンヒドリンのアセトン溶液（２％）を可視化試薬として使用した。Ｌ−スレオニンを含有するスポットを切り離して、ＣｄＣｌ2の０．５％水溶液中で、Ｌ−スレオニンを溶出させて、Ｌ−スレオニンの量を、５４０ｎｍにて分光光度的に推定した。結果を表３に示す。
【００９５】
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）は以下の通りである：
炭水化物                ４０．０
（ＮＨ４）２ＳＯ４        ２４．０
ＮａＣｌ                  ０．８
ＫＨ２ＰＯ４                ２．０
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ        ０．８
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ        ０．０２
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ        ０．０２
チアミンＨＣｌ            ０．０００２
酵母抽出物                １．０
ＣａＣＯ３              ３０．０
グルコースおよび硫酸マグネシウムを別個に滅菌する。ＣａＣＯ3は、１８０℃で２時間乾熱滅菌する。ｐＨは、７．０に調整する。抗生物質は、滅菌後に培地中に添加する。
【００９６】
【表３】
0004665567.tif 000004
【００９７】
表３からわかるように、ｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座の高発現は、キシロースを含有する培地中で培養されるＬ−スレオニン生産エシェリヒア・コリＢ−３９９６／ｐＭＷ１１９株の生産能を向上させた。
【実施例４】
【００９８】
Ｌ−リジン生産細菌を用いたグルコースおよびペントースの混合物の発酵によるＬ−リジンの生産
Ｌ−リジン生産エシェリヒア・コリＷＣ１９６ΔｃａｄＡΔｌｄｃ株を用いて、グルコースおよびペントースの混合物の発酵によるＬ−リジンの生産を評価した。ＷＣ１９６ΔｃａｄＡΔｌｄｃＣ株は、米国特許第５，８２７，６９８号に記載されるようにｌｄｃＣ遺伝子およびｃａｄＡ遺伝子によりコードされるリジンデカルボキシラーゼの不活性化によりＷＣ１９６株から得られた。ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−ＲプラスミドおよびベクターｐＭＷ１１９によるＷＣ１９６ΔｃａｄＡΔｌｄｃ株の形質転換を、ＣａＣｌ2を用いて常法により実施して、それぞれＷＣ１９６ΔｃａｄＡΔｌｄｃ／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株およびＷＣ１９６ΔｃａｄＡΔｌｄｃ／ｐＭＷ１１９株を得た。
【００９９】
エシェリヒア・コリＷＣ１９６ΔｃａｄＡΔｌｄｃ／ｐＭＷ１１９株およびＷＣ１９６ΔｃａｄＡΔｌｄｃ／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株の両方を、３７℃にて１２〜１５時間、アンピシリン（１５０ｍｇ／ｌ）を有するＬ−寒天プレート上で生育させた。続いて、炭素源としてキシロース（４％）またはキシロース（２％）／グルコース（２％）混合物のいずれかを含有する発酵培地に、株の１かき分を接種した。２０×２００ｍｍの試験管中の発酵培地２ｍｌ中で、発酵を行った。振とう機で２５０ｒｐｍにて３２℃にて２５時間、細胞を生育させた。
【０１００】
培養後、培地中に蓄積されたＬ−リジン量を、ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ）の移動相を用いてペーパークロマトグラフィにより決定した。ニンヒドリンのアセトン溶液（２％）を可視化試薬として使用した。Ｌ−リジンを含有するスポットを切り離して、ＣｄＣｌ2の０．５％水溶液中で、Ｌ−リジンを溶出させて、Ｌ−リジンの量を、５４０ｎｍにて分光光度的に推定した。結果を表４に示す。
【０１０１】
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）は以下の通りである：
炭水化物                    ４０．０
（ＮＨ４）２ＳＯ４            ２４．０
ＫＨ２ＰＯ４                            １．０
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ            １．０
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ            ０．０１
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ            ０．０１
酵母抽出物                    ２．０
ＣａＣＯ３                    ３０．０
グルコースおよび硫酸マグネシウムを別個に滅菌する。ＣａＣＯ3は、１８０℃で２時間乾熱滅菌する。ｐＨは、ＫＯＨにより７．０に調整する。抗生物質は、滅菌後に培地中に添加する。
【０１０２】
【表４】
0004665567.tif 000005
【０１０３】
表４からわかるように、ｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座の高発現は、キシロースを含有する培地中で培養されるＬ−リジン生産エシェリヒア・コリＷＣ１９６ΔｃａｄＡΔｌｄｃ／ｐＭＷ１１９株の生産能を向上させた。
【実施例５】
【０１０４】
Ｌ−グルタミン酸生産細菌を用いたグルコースおよびペントースの混合物の発酵によるＬ−グルタミン酸の生産
Ｌ−グルタミン酸生産エシェリヒア・コリＡＪ１２６２４株を用いて、グルコースおよびペントースの混合物の発酵によるＬ−グルタミン酸の生産を評価した。ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−ＲプラスミドおよびベクターｐＭＷ１１９によるＡＪ１２６２４株の形質転換を、ＣａＣｌ2を用いて常法により実施して、それぞれＡＪ１２６２４／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株およびＡＪ１２６２４／ｐＭＷ１１９株を得た。
【０１０５】
エシェリヒア・コリＡＪ１２６２４／ｐＭＷ１１９株およびＡＪ１２６２４／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株の両方を、３７℃にて１２〜１５時間、アンピシリン（１５０ｍｇ／ｌ）を有するＬ−寒天プレート上で生育させた。続いて、炭素源としてキシロース（４％）を含有する発酵培地に、株の１かき分を接種した。２０×２００ｍｍの試験管中の発酵培地２ｍｌ中で、発酵を行った。振とう機で２５０ｒｐｍにて３２℃にて４８時間、細胞を生育させた。
【０１０６】
培養後、培地中に蓄積されたＬ−グルタミン酸量を、ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ）の移動相を用いてペーパークロマトグラフィにより決定した。ニンヒドリンのアセトン溶液（２％）を可視化試薬として使用した。Ｌ−グルタミン酸を含有するスポットを切り離して、ＣｄＣｌ2の０．５％水溶液中で、Ｌ−グルタミン酸を溶出させて、Ｌ−グルタミン酸の量を、５４０ｎｍにて分光光度的に推定した。結果を表５に示す。
【０１０７】
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）は以下の通りである：
炭水化物                   ４０．０
（ＮＨ４）２ＳＯ４           ２５．０
ＫＨ２ＰＯ４                  ２．０
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ          １．０
チアミンＨＣｌ               ０．０００１
L-イソロイシン               ０．０７
ＣａＣＯ３                  ２５．０
グルコースおよび硫酸マグネシウムを別個に滅菌する。ＣａＣＯ3は、１８０℃で２時間乾熱滅菌する。ｐＨは、ＫＯＨにより７．２に調整する。
【０１０８】
【表５】
0004665567.tif 000006
【０１０９】
表５からわかるように、ｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座の高発現は、キシロースを含有する培地中で培養されるＬ−グルタミン酸生産エシェリヒア・コリＡＪ１２６２４／ｐＭＷ１１９株の生産能を向上させた。
【実施例６】
【０１１０】
Ｌ−トリプトファン生産細菌を用いたグルコースおよびペントースの混合物の発酵によるＬ−トリプトファンの生産
Ｌ−トリプトファン生産エシェリヒア・コリＳＶ１６４／ｐＧＨ５株を用いて、グルコースおよびペントースの混合物の発酵によるＬ−トリプトファンの生産を評価した。ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−ＲプラスミドおよびベクターｐＭＷ１１９によるＳＶ１６４／ｐＧＨ５株の形質転換を、ＣａＣｌ2を用いて常法により実施して、ＳＶ１６４／ｐＧＨ５／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株およびＳＶ１６４／ｐＧＨ５／ｐＭＷ１１９株をそれぞれ得た。
【０１１１】
エシェリヒア・コリＳＶ１６４／ｐＧＨ５／ｐＭＷ１１９株およびＳＶ１６４／ｐＧＨ５／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株の両方を、３７℃にて１２〜１５時間、テトラサイクリン（３０ｍｇ／ｌ）およびアンピシリン（１５０ｍｇ／ｌ）を有するＬ−寒天プレート上で生育させた。続いて、炭素源としてキシロース（４％）またはキシロース（２％）／グルコース（２％）混合物のいずれかを含有する発酵培地に、株の１かき分を接種した。２０×２００ｍｍの試験管中の発酵培地２ｍｌ中で、発酵を行った。振とう機で２５０ｒｐｍにて３０℃にて４８時間、細胞を生育させた。
【０１１２】
培養後、培地中に蓄積されたＬ−トリプトファン量を、ＴＬＣにより決定した。蛍光指
示薬なしのＳｏｒｂｆｉｌシリカゲル０．１１ｍｍ層でコーティングした１０×１５ｃｍのＴＬＣ板(Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russia)を使用することができる。Ｓｏｒｂｆｉｌ板は、プロパン−２−オール：酢酸エチル：２５％アンモニア水：水＝４０：４０：７：１６（ｖ／ｖ）の移動相で展開することができる。ニンヒドリンのアセトン溶液（２％）を可視化試薬として使用した。結果を表７に示す。発酵培地の構成成分を表６に記載するが、滅菌中の不都合な相互作用を回避するために、表に示すようなＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＨの別個の群で滅菌すべきである。
【０１１３】
【表６】
0004665567.tif 000007
溶液Ａは、ＮＨ4ＯＨによりｐＨ７．１に調整した。
【０１１４】
【表７】
0004665567.tif 000008
【０１１５】
表７からわかるように、ｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座の高発現は、キシロースを含有する培地中で培養されるＬ−トリプトファン生産エシェリヒア・コリＳＶ１６４／ｐＧＨ５／ｐＭＷ１１９株の生産能を向上させた。
【０１１６】
以上、本発明を、その好ましい実施形態を参照して詳述してきたが、本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更を行うことができ、また等価物を使用することができることは、当業者に明らかであろう。上述の文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体上のｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座の構造を示す図。図上の矢印は、ＰＣＲで使用したプライマーの位置を示す。
【図１】
0004665567.tif 000009
【配列表】
0004665567000001.app