(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリンを製造する方法であって：
（ａ）プロインスリンおよび該プロインスリンのＮ末端に結合した、ヒトＣｕＺｎＳＯＤのＮ末端から誘導された、６２アミノ酸長を有し、且つ、前記６２アミノ酸の次にアルギニンを有し、且つ、６位及び５７位のシステイン残基がセリン残基に置換されたリーダーペプチドを含んでなるハイブリッドポリペプチドをコードするＤＮＡを含んだバクテリア細胞を、前記ＤＮＡがその発現を指令するように処理し、前記ハイブリッドポリペプチドを単離することと；
（ｂ）最初に前記ハイブリッドポリペプチドに対して亜硫酸分解を施すことなく、前記プロインスリンを含むハイブリッドポリペプチドを折り畳んでＣｙｓB7−ＣｙｓA7、ＣｙｓB19−ＣｙｓA20、およびＣｙｓA6−ＣｙｓA11の間の三つのジスルフィド結合を形成すること（Ｃｙｓ残基の番号付けは、成熟インスリンにおけるそれらの番号付けに従う）、その際の折り畳み条件は、前記ハイブリッドポリペプチドをｐＨ8.5〜12.0においてインキュベートすることである；
（ｃ）上記の結果得られた、折り畳まれ且つジスルフィド結合したハイブリッドポリペプチドを酵素的に開裂させて、インスリンを生成させることと；
（ｄ）生成されたインスリンを精製することと
を具備した方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記の工程（ｂ）が更に、前記ハイブリッドポリペプチドを、4〜37℃でインキュベートすることを具備する方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記の工程（ｂ）が更に、前記ハイブリッドポリペプチドを、1〜30時間インキュベートすることを具備する方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の方法であって、前記折り畳みがアスコルビン酸の存在下で行われる方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記アスコルビン酸の濃度が、折り畳み混合物中に存在するＳＨ基１モル当たり２モルである方法。
【請求項６】
請求項３または４に記載の方法であって、前記インキュベーションの時間が５時間である方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって：前記工程（ｃ）は更に、
（ｉ）  ｐＨを８．８〜９．０に調節することと；
（ｉｉ）前記ハイブリッドポリペプチドを、１６〜３７℃で３０分〜１６時間だけ、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢで開裂することと；
を具備する方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記工程（ｄ）は更に、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィーおよびＲＰ−ＨＰＬＣによる精製を具備している方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記工程（ｄ）は更に、限外濾過およびＣＭ−セファロースクロマトグラフィーによる精製を具備している方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記工程（ｄ）は更に、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィーおよびフェニル−セファロースクロマトグラフィーによる精製を具備する方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、前記プロインスリンハイブリッドポリペプチドは、ＡＴＣＣ受付番号第６９３６１号の下に寄託されたプラスミドによって発現される方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記プロインスリンハイブリッドポリペプチドは、ＡＴＣＣ受付番号第６９３６３号の下に寄託されたプラスミドによって発現される方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、前記プロインスリンハイブリッドポリペプチドは、ＡＴＣＣ受付番号第６９３６２号の下に寄託されたプラスミドによって発現される方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、前記ハイブリッドポリペプチドが前記細胞から回収される方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）における処理には、グルコース、グリセロールまたはガラクトースの存在下での発酵が含まれる方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、前記回収工程は、
（ｉ）  前記バクテリア細胞の細胞壁またはその断片を破壊して細胞溶解物を製造することと、
（ｉｉ）該溶解物から遠心によって細胞内沈殿物を単離することと、
（ｉｉｉ）この沈殿物を可溶化することと、
を具備する方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、前記工程（ｂ）におけるｐＨが、１１．００〜１１．２５である方法。
【発明の詳細な説明】
本件出願は、1993年12月29日に出願された米国特許出願第08／175,298号の一部継続出願である。
〔発明の背景〕
この明細書の全体を通して、種々の刊行物が括弧内のアラビア数字によって引用される。これら参照文献の完全な書誌的引用は、請求の範囲の直前の明細書末尾に掲載されている。これら刊行物の開示は、本発明が属する技術の状態をより完全に記載するために、その全体が、本明細書の一部をなす参照として本明細書に組み込まれる。
インスリンは、グルコース代謝を制御するために不可欠なポリペプチドホルモンであり、糖尿病、即ち、インシュリンの不十分な供給を特徴とする代謝障害の患者に対して毎日投与される。
イン・ビボにおいて、このホルモンは最初は長い前駆体分子として合成され、続いて、Ａ鎖およびＢ鎖からなるその生物学的に活性な形に加工される。より詳細には、プレプロインスリンの遺伝子が膵臓内分泌腺のベータ細胞内でｍＲＮＡ前駆体に転写され、次いで、これがスプライスされて成熟ｍＲＮＡを生成する。このｍＲＮＡはプレプロインスリン（ＮＨ2−プレ領域−Ｂ鎖−Ｃペプチド−Ａ鎖−ＣＯＯＨ）に翻訳され、これはプロインスリンを経て最終的にはインスリンへと逐次プロセッシングされる。このプロセッシングの第一工程は、蛋白分解によるプレ領域の除去であるが、この領域は、粗面小胞体のミクロソーム膜を通して発生期の鎖を移行させるための疎水性シグナル配列として働くものである。ヒト・プレプロインスリンにおいて、プレ領域の長さは２４アミノ酸である。
プロインスリンにおいては、成熟インスリンになるポリペプチド鎖の二つの領域、即ち、Ｂ鎖およびＡ鎖がＣペプチド（またはＣ鎖）によって相互に結合され、これはＮ末端およびＣ末端に２対の塩基性アミノ酸を含んでいる。殆どのＣペプチドにおいて、これらの対はＡｒｇ−ＡｒｇおよびＬｙｓ−Ａｒｇである。２対の隣接する塩基性アミノ酸を含むこのヒトＣペプチドは、３５アミノ酸を含んでいる。このＣペプチドは、Ｂ切片とＡ切片との間での適切なジスルフィド結合の形成を補助するために、ポリペプチドの二つの部分を結合する。従って、Ｃペプチドの役割は、その構造に大きく依存することはない。事実、より短い合成ブリッジでこれを置換しても、プロインスリン分子の適正な折り畳みは可能である（１，２）。
プロインスリンは、二つの中間鎖ジスルフィド結合およびＡ鎖内の一つのジスルフィド結合の同時酸化を伴って折り畳まれる。成熟化の最終工程では、塩基性アミノ酸でのタンパク分解酵素による開裂によってＣペプチドが放出され、成熟インスリンが形成される（３）。ヒト・インスリンにおいて、Ａ鎖の長さは２１アミノ酸であり、Ｂ鎖の長さは３０アミノ酸である。
インスリンの世界的な需要は年間数トンを越え、深刻な供給不足の状態にある。従来、インスリンは制限動物供給源、主にウシおよびブタの膵臓調製物から製造されており、これらはヒト・インスリンとは異なるので、不利な免疫反応を誘発する可能性がある。
1960年代に行われた研究によって、インスリンのイン・ビトロでの製造が実証された。インスリン合成は、Ａ鎖およびＢ鎖をそのＳ−スルホネート形で結合することによって（４）、または還元されたプロインスリンの自然再酸化（５）によって達成された。後者の方法は、酸化混合物におけるタンパク濃度が非常に低いために、大規模のインスリン製造には実際的ではなかった。続いて、インスリンは、トリプシン処理およびカルボキシペプチダーゼＢ処理の後に回収することができた。
最近になって、半合成および生合成（組み替え）のヒト・インスリンが入手可能になっている。半合成のヒト・インスリンは、Ｂ鎖の位置３０におけるアラニン（ブタインスリンとヒト・インスリンの間の唯一の相違）をトリプシン触媒によりスレオニンで交換することによって、ブタ・インスリンから製造される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または酵母において製造された組み替えヒト・インスリンは、最終的には他の全ての製造経路を置き換えてしまうことになるであろう。
生合成的な組み替えヒト・インスリンは、現在のところ、二つの経路の何れかによって製造されている。一つは、Ａ鎖およびＢ鎖を大腸菌の中で別々に製造し、その後にこれらを結合することであり（７，８）、他の一つは、大腸菌（１，８）または酵母（２，９）の何れかにおいて発現されたプロインスリン様ポリペプチドの酵素的変換によるものである。
殆どの場合、プロインスリンは、細胞間の沈積タンパクとして蓄積するハイブリッドタンパクとして産生される。このハイブリッドは、通常は精製され、ＣＮＢｒにより開裂されて、プロインスリンポリペプチドが放出される。後者は更に、酸化的亜硫酸分解によって、プロインスリンＳ−スルホン酸塩に修飾される。このプロインスリンＳ−スルホン酸塩は、次いで精製され、還元性条件下でプロインスリンに折り畳まれる（８）。プロインスリンのインスリンへの変換は、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢの組み合わされた作用によって達成される（６）。
ノボノルディスクＡ／Ｓに譲渡された特許ＥＰ195691 Ｂ１には、Ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａの式で表されるプロインスリンと、酵母の中でインスリンを製造するためのその使用が記載されている。
カイロンコーポレーションに譲渡された特許ＥＰ196056 Ｂ１には、酵母によって産生されたｈＳＯＤ−プロインスリンタンパクが記載されている。このｈＳＯＤ−プロインスリンタンパクは、折り畳みに先立って、臭化シアノーゲン開裂および亜硫酸分解を受ける。
ヘキストはＥＰＯ公報第379162号において、「インスリン前駆体の不正確な組み換え体」（即ち、間違ったまたは部分的に間違った分子間ジスルフィド架橋を有する組み換えインスリン生成物）が、有機還元系の存在下で、その不正確な組み換え体を水性媒質中の過剰なメルカプタンと反応させることによって、亜硫酸分解を用いずに、「正しい」インスリン生成物に変換できることを記載している。オリジナルの亜硫酸分解工程は、融合ポリペプチドからアミノ酸またはペプチド基が解列（化学的または酵素的に）された後に行われ（これは宿主細胞の溶解の後に起きる）、それからインスリン前駆体の６つのシステインがそのＳ−スルホン酸塩に変換される。その後のタンパクの復元工程において、三つの正しいジスフフィド架橋の形成によって、このプロインスリンＳ−スルホン酸塩から天然のプロインスリンが製造される。
ヘキストは更に、ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ91／03550号において、所望のタンパク（例えばプロインスリン）および「バラスト成分」を含む融合タンパクの製造方法を開示している。亜硫酸分解は折り畳まれる前に行われるのに対して、「バラスト成分」は、折り畳みの後に、プロインスリンのＣ鎖と同時に開裂される。
加えて、ヘキストはＥＰ347781 Ｂ１において、「ミニプロインスリン」（Ｂ−Ａｒｇ−Ａ）、並びにモノ−Ａｒｇインスリンおよびインスリンの製造のためのその使用を記載している。更に、Ｂ−Ａｒｇ−Ａおよび「バラスト成分」を含む融合タンパクを記載している。この「バラスト成分」は臭化シアノーゲンによって開裂され、亜硫酸分解はポリペプチドの折り畳みの前に行われる。
本発明は、改善された効率的なプロセスによる組み換えヒト・インスリンの製造を開示する。リーダー配列を含む組み換えプロインスリンハイブリッドポリペプチドは、大腸菌の中で合成される。部分的な精製の後、これは正しい折り畳みを許容する条件下で、リーダーペプチドが付着されたまま折り畳まれる。次いで、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢを組み合わせた処理によって、生物学的に活性なヒト・インスリンが製造されるが、ここでは、これらの酵素がリーダーペプチドおよびＣ鎖を同時に開裂する。こうして製造された精製ヒト・インスリンは、天然に存在するヒト・インスリンと同一である。
ハイブリッドポリペプチドのＣＮＢｒ開裂および豊富に存在するＳＨ基の保護に用いられる亜硫酸分解に含まれる危険で且つ面倒な手法は、この新規な方法から排除される。何故なら、リーダーペプチドおよび保護されていないシステイン残基が存在していても、全体のプロインシュリンハイブリッドポリペプチドを天然の構造へと効率よく折り畳むことができるからである。活性な組み換えヒト・インスリンは酵素的開裂によって放出され、その後に精製される。
【図面の簡単な説明】
図３〜図５に示されている三つのプラスミドの制限酵素地図は、これらプラスミドに存在する全ての制限酵素部位を同定してはいない。しかし、本発明の理解に必要な制限酵素部位は示されている。
図  １：プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒの発現により生成した、折り畳まれ且つジスルフィド結合したプロインスリンハイブリッドポリペプチドの酵素的開裂による、ヒト・インスリンの生成。ＳＯＤリーダー配列の一部のみが示されている。
図  ２：プラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴまたはプラスミドｐλＢＡＳＴ−ＬＡＴの発現により生成した、折り畳まれ且つジスルフィド結合したプロインスリンハイブリッドポリペプチドの酵素的開裂による、ヒト・インスリンの生成。ＳＯＤリーダー配列の一部のみが示されている。
図  ３：プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒ、即ち、ＡＴＣＣ受付番号第69362号の下にＡＴＣＣに寄託されたＳＯＤ−プロインスリンハイブリッドポリペプチドをコードする発現プラスミドの構造。
図  ４：ｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴ、即ち、ＡＴＣＣ受付番号第69361号の下にＡＴＣＣに寄託されたＳＯＤ−プロインスリンハイブリッドポリペプチドをコードする発現プラスミドの構造。
図  ５：ｐλＢＡＳＴ−ＬＡＴ、即ち、ＡＴＣＣ受付番号第69363号の下にＡＴＣＣに寄託されたＳＯＤ−プロインスリンハイブリッドポリペプチドをコードする発現プラスミドの構造。
図  ６：プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒによって発現されたＳＯＤ−プロインスリンハイブリッドポリペプチドのアミノ酸配列および対応するＤＮＡヌクレオチド配列。
図  ７：プラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＲおよびｐλＢＡＳＴ−ＬＡＴによって発現されたＳＯＤ−プロインスリンハイブリッドポリペプチドのアミノ酸配列および対応するＤＮＡヌクレオチド配列。
図  ８：折り畳み混合物のｐＨの関数としての、プラスミドｐＢＡＳＴ−ＬＡＴによって発現されたプロインスリンハイブリッドポリペプチドからのヒト・インスリンの製造
４℃の100ｍＭグリシン緩衝液中において示される種々のｐＨで約１６時間、１ｍｇ／ｍＬまたは0.5ｍｇ／ｍＬのハイブリッドポリペプチドを用いて、プロインスリンハイブリッドポリペプチド（実施例２に記載したようにして製造されたもの）の折り畳みが行われた。この折り畳まれた物質を、37℃およびｐＨ９で30分間、トリプシン（１：500w/w）（シグマ社）およびカルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＣ，シグマ社、１：200w/w）で処理し、125Ｉインスリン（アマーシャム社）およびヒト組み換えインスリン（カルビオケム（Calbiochem）社）を標準として利用した放射免疫試験により、免疫反応性（ＩＲ）インスリンについて試験した。
図  ９：プラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴにより発現されたプロインスリンハイブリッドポリペプチドからの、ヒト・インスリンの製造
プロインスリンハイブリッドポリペプチド（実施例２に記載したようにして製造したもの）を、約３０ｍｇ／ｍＬの濃度で８Ｍ尿素、５ｍＭ・ＨＣｌ中に溶解し、１００ｍＭグリシン−ＮａＯＨ、ｐＨ11.0中に１ｍｇ／ｍＬまで希釈した。２２℃（室温）において２０時間、折り畳みを行った。次いで、ＨＣｌを用いて溶液をｐＨ8.8に調節した。カルボキシペプチダーゼＢ（１：1000w/w、シグマ社）およびトリプシン（１：2000w/w、シグマ社）を添加し、この反応混合物を37℃で60分間インキュベートした。消化混合物をｐＨ３にまで酸性化し、次いで１０ｍＭ・ＨＣｌで希釈した。150μＬのアリコートを、31.5％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルを含有する50ｍＭテトラエチルアンモニウムホスフェート、162ｍＭ・ＮａＣｌ4、ｐＨ３で平衡化した250×４ｍｍ、５μリクロスフェア（Lichrosphere）（メルク社）上での逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって分析した。このカラムを、75分間、１ｍＬ／分の流速で、31.5〜40.5％のアセトニトリル線形勾配を用いて展開した。吸光度を220ｎｍでモニターした。
Ａ：５μｇの標準インスリン（ベーリンガーマンハイム社）
Ｂ：酵素処理に従って製造された組み換えヒト・インスリン
Ｃ：折り畳まれたＳＯＤ−プロインスリンハイブリッドポリペプチド
図１０：折り畳み混合物におけるｐＨの関数としての、プラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴによって発現されたプロインスリンハイブリッドポリペプチドからのヒト・インスリンの製造
プロインスリンハイブリッドポリペプチド（実施例２に記載したようにして製造したもの）を、指示したｐＨ値を有する100ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液中に１ｍｇ／ｍＬまで希釈し、22℃で16時間の折り畳みを行った。図９で説明したようにして、酵素処理およびＲＰ−ＨＰＬＣ分析を行った。このハイブリッドポリペプチドから製造された組み換えヒト・インスリンの量を、標準インスリンと同じ保持時間を有するピークの面積に従って計算した。
図１１：折り畳み混合物におけるアスコルビン酸濃度の関数としての、プラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴによって発現されたプロインスリンハイブリッドポリペプチドからのヒト・インスリンの製造
指示されている濃度のアスコルビン酸の存在下において、22℃、ｐＨ11.2の100ｍＭグリシン−ＮａＯＨ中の１ｍｇ／ｍＬで、ＳＯＤ−プロインスリンハイブリッドポリペプチド（実施例２に記載したようにして製造したもの）の折り畳みを行った。サンプルを、５時間および25時間の折り畳み時間の後に、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢで処理した（図９）。組み換えヒト・インスリン製造を、ＲＰ−ＨＰＬＣ上で分析した（図９）。
図１２：プラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴにより発現されたプロインスリンハイブリッドポリペプチドから製造された、ヒト・インスリンの真正性
ＳＯＤ−プロインスリンハイブリッドポリペプチド（実施例２に記載したようにして製造したもの）の折り畳みを、100ｍＭグリシン−ＮａＯＨ、ｐＨ11.2および1.2ｍＭアスコルビン酸中の１ｍｇ／ｍＬにおいて、22℃で16時間行った。酵素処理に続いて（図９に示した通り）、当該混合物を、20ｍＭ・Tris−ＨＣｌ、ｐＨ８中で平衡化されたＤＥＡＥ−セファロースカラム上でクロマトグラフィーにかけた。０〜0.4ｍＭ・Tris−ＨＣｌ、ｐＨ８の線形勾配で、組み換えヒト・インスリンを溶出した。ピーク画分をプールして、ＨＣｌでｐＨ３に酸性化した。ＲＰ−ＨＰＬＣによって、組み換えヒト・インスリンをインスリン様分子から更に精製した。主ピークを回収し、0.25Ｍ酢酸中のセファデックスＧ−２５カラム上で脱塩し、凍結乾燥した。サンプル（５μｇの組み換えヒト・インスリン）を10ｍＭ・ＨＣｌ中で調製し、同じ条件下でＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。
Ａ：標準インスリン
Ｂ：ＨＰＬＣ精製された組み換えヒト・インスリン
Ｃ：ＨＰＬＣ精製された組み換えヒト・インスリンおよび標準インスリンを組み合わせたサンプル
図１３：プラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴにより発現されたプロインスリンハイブリッドポリペプチドからの、折り畳み混合物中のタンパク濃度の関数としてのヒト・インスリンの製造
ＳＯＤ−プロインスリンハイブリッドポリペプチド（実施例２に記載されたようにして製造されたもの）を、指示したように0.5ｍｇ／ｍＬ〜10ｍｇ／ｍＬの最終タンパク濃度で、100ｍＭ・グリシン−ＮａＯＨ中において折り畳みを行った。夫々の折り畳み混合物に、ＳＨ基１モル当たり2.5モルのアスコルビン酸を補充した。折り畳みは、24℃（室温）で16時間行われた。酵素処理およびＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、図９に記載したようにして行った。
図１４：プラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴにより発現されたプロインスリンハイブリッドポリペプチドからの、折り畳み時間の関数としてのヒト・インスリンの製造
細胞内沈積物を、20ｍＭグリシン−ＮａＯＨ、33μＭ・ＥＤＴＡ、ｐＨ11.2の中に約2.6Ａ280／ｍＬの濃度で溶解した。10Ｎ水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨを１２に調節した。この溶液を10分間攪拌した。濃塩酸を用いてｐＨを11.2に滴定した。活性炭（酸洗浄したもの、シグマ社）を0.1％ w/vの最終濃度にまで添加し、この混合物を30分間攪拌した。この懸濁液を20℃で遠心した（20分、12000ｒｐｍ）。清澄化された上清は約2.15のＡ280を有していた。アスコルビン酸を、３ｍＭの最終濃度にまで添加した。室温（22〜23℃）で激しく攪拌しながら、指示したようにして、プロインスリンハイブリッドポリペプチドの折り畳みを行った。実験に沿った種々の時点（溶解から出発して）で、10ｍＬのアリコートを抜き取り、ｐＨ8.8に滴定し、50μＭ・ＺｎＣｌ２の存在下において、カルボキシペプチダーゼＢ（１：1000w/w）およびトリプシン（１：2000w/w）を用いて37℃で１時間消化した。酸性化によって消化を停止させた。夫々の消化されたサンプル中のインスリン濃度を、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって図９に示すようにして決定した。折り畳み反応の進行は、インスリンの増大（消化後）および遊離チオール基レベルの減少によって示され、後者はエルマン反応によって試験される（１６）。
〔発明の概要〕
本発明は、ヒト・インスリンの製造方法であって、プロインスリンを含有するハイブリッドポリペプチドを、正しいジスルフィド結合の形成を可能にする条件下で折り畳むことと、この折り畳まれたジスルフィド結合したハイブリッドポリペプチドを酵素的に開裂させて活性なヒト・インスリンを生成させることと、この活性なヒト・インスリンを精製することとを具備した方法を提供する。
本発明は更に、プロインスリンと、該プロインスリンのＮ末端に結合したリーダーペプチドとを含有するポリペプチドであって、該ポリペプチドが折り畳まれており、且つ正しいジスルフィド結合を含んでいるポリペプチドを提供する。
〔発明の詳細な説明〕
プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒ、ｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴおよびｐλＢＡＳＴ−ＬＡＴは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従い、これを満たすように、1993年７月26日に、夫々ＡＴＣＣ受付番号第69362号、第69361号および第69363号として、郵便番号20852メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ12301のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された。
ここで用いるハイブリッドポリペプチドは、所望のポリペプチドに共有結合されたリーダーペプチドを含んでいる。この本発明のハイブリッドポリペプチドは、プロインスリンと、リーダーペプチドとして好ましくはＳＯＤとを含んでいる。
ここで用いる折り畳みには、折り畳み前のＣＮＢｒ開裂を伴わず、且つ折り畳み前のＳＨ基を保護するための亜硫酸分解を伴わない、プロインスリンを含有するハイブリッドポリペプチドの折り畳みが含まれ、この折り畳みはハイブリッドポリペプチドにおける正しいジスルフィド結合形成を可能にする。
ここで用いるハイブリッドポリペプチドの正しいジスルフィド結合形成には、インスリンのＣｙｓB7−ＣｙｓA7、ＣｙｓB19−ＣｙｓA20、およびＣｙｓA6−ＣｙｓA11の間の三つのジスルフィド結合の形成が含まれる（Ｃｙｓ残基の番号付けは、成熟インスリンにおけるそれらの番号付けに従っている）。
ここで用いるプロインスリンは、Ｎ末端からＣ末端に向かう順序で、インスリンのＢ鎖、Ｃ鎖およびＡ鎖を含んでいる。
ここで用いるインスリンのＣ鎖ペプチドは、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢによって開裂除去することができる、天然に存在するＣペプチドおよび他の何れかのオリゴペプチド、ジペプチドまたは単一アミノ酸を含んでいる。
ここで用いるリーダーペプチドは、折り畳みおよびジスルフィド結合形成を可能にし、且つトリプシンによって開裂され得る、インスリンのＢ鎖に共有結合した何らかのペプチドまたはポリペプチドを含んでいる。このリーダーペプチドは、好ましくはＳＯＤである。
ここで用いるＳＯＤには、ＣｕＺｎＳＯＤまたはＭｎＳＯＤのアミノ酸配列の実質的な部分を含んでおり、また該部分は必ずしもＳＯＤの生物学的活性を有しておらず、また天然に存在するＳＯＤのアミノ酸配列と比較したときにこのような部分と同一のアミノ酸配を有していない。ＳＯＤをコードするＤＮＡは、当業者に公知の方法（例えば、Bauer et al.（1985）,Gene 37:73-81）によって突然変異させてもよい。
リーダーペプチドは、ＳＯＤの代わりに、他の何れかのペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク、またはこのようなペプチド、ポリペプチドもしくはタンパクのアミノ酸配列の何れかの実質的部分を含んでいてもよい。このような部分は、必ずしも前記ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパクの生物学的活性を有しておらず、またまた天然に存在するペプチド、ポリペプチドもしくはタンパクのアミノ酸配列と比較したときにこのような部分と同一のアミノ酸配を有していない。しかし、このリーダーペプチドは、ハイブリッドポリペプチドの折り畳みおよび正しいジスルフィド結合形成を許容しなければならない。
ここで用いるインスリンは、天然に存在するインスリンの相同体を含み得る。
本発明の方法により製造されるインスリンポリペプチドに関連してここで用いる「相同体」の用語は、インスリンと実質的に同じアミノ酸配列を有し、且つ実質的に同じ生物学的活性を有するポリペプチドを意味する。従って、相同体は、それがインスリンの生物学的活性を保持することを前提として、本発明の方法によって製造されたインスリンポリペプチドとは、１以上の不可欠でないアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって異なり得る。当業者は、確立された周知の方法を用いて、何れのアミノ酸残基が付加、欠失または置換（どのアミノ酸で置換すべきかをも含む）され得るかを容易に決定することができ、このような方法には、例えば主題のポリペプチドに関するポリペプチド相同体のバクテリア発現をコードするＤＮＡの設計および製造、部位特異的突然変異誘発技術によるｃＤＮＡ配列およびゲノム配列の修飾、組み換えタンパクおよび発現ベクターの構築、当該ポリペプチドのバクテリア発現、および従来の生物化学的試験を用いた当該ポリペプチドの生物化学的活性の測定のための従来の方法が含まれる。
インスリン相同体に関する上記の定義は、プロインスリンの相同体に対しても同様に適用される。
本発明の方法によって製造されたインスリン相同体の例は、天然に存在するインスリンの全ての残基よりも少ない残基を含む欠失相同体、特定された１以上の残基が他の残基で置換された置換相同体、特定された１以上のアミノ酸残基がインスリンポリペプチドの末端または中間部分に付加された付加相同体であり、これらは全てインスリンの生物学的活性を共有する。
相同体の例は、ＥＰＯ特許出願ＥＰ384472号に開示されたインスリン類縁体、並びに「シェアホルダー1992へのイーライリリー・アンド・カンパニー報告」に開示されたイーライリリーのインスリン類縁体「ヒューマローグ（Humalog）」である。
実質的に同じアミノ酸は、ここでは、アミノ酸配列中にアミノ酸の置換および／または欠失および／または付加を包含するものとして定義されており、また例えば文献（Albert L.Lehninger,Biochemistry,second edition,Worth Publishers Inc.（1975）,Chapter 4;Creighton,protein Structure,a Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press,Oxford,England（1989）;and Margaret O.Dayhoff,Atlas of Protein Sequence and Structure,Volume 5,The National Biomedical Research Foundation（1972）,Chapter 9）に記載された相同性または等価な基に従って、10までの残基を包含し得る。このような置換は当業者に周知である。
インスリンポリペプチドをコードするＤＮＡは、当業者に周知の方法（例えば、Bauer et al.（1985）,Gene 37:73-81）によって突然変異させてもよい。次いで、この突然変異された配列は、ここに記載したような適切な発現ベクター中に挿入し、該ベクターを細胞中に導入し、次いで突然変異ＤＮＡがポリペプチド相同体の発現を指令するように処理すればよい。
プロインスリンを含有するハイブリッドポリペプチドをコードする配列を含んだ本発明のプラスミドは、バクテリア、酵母、真菌または哺乳類細胞内でのクローン化された遺伝子の発現に必要な調節要素が、当該ハイブリッドポリペプチドをコードする核酸に対して位置するように含まれている、バクテリア、酵母、真菌、或いはＣＨＯ、ニワトリ胚、繊維芽細胞または他の公知の細胞系のような哺乳動物細胞での発現に適用すればよい。発現に必要な調節要素には、ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモータ配列およびリボゾームに結合するためのリボソーム結合部位が含まれる。
本発明のプラスミドは、プロインスリンを含有するハイブリッドポリペプチドを発現する。
当業者は、この出願に関連して寄託されたプラスミドを、公知の技術（例えば部位特異的突然変異誘発、またはリンカー類の挿入）によって、相同性ポリペプチドの発現をコードするように容易に改変し得ることを理解するであろう。
このような技術は、文献（例えば、Ssmbrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.（1989）Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されている。
適切な調節要素は、プロインスリンを含有したハイブリッドポリペプチドをコードするＤＮＡに対して、当該ハイブリッドポリペプチドを適切なホスト細胞中で発現させるように、プラスミド内に位置付けられる。本発明の好ましい態様において、この調節要素は、当該ハイブリッドポリペプチドをコードするＤＮＡの上流に近接して位置付けられる。
プロインスリンを含有するハイブリッドポリペプチドをコードするＤＮＡから転写されたｍＲＮＡをホスト細胞内のリボゾームに結合できるようにするための、ｄｅｏＲＢＳのような種々のリボソーム結合部位（ＲＢＳ’ｓ）もまた、本発明の中に含まれる。
本発明のプラスミドはまた、ＡＴＧ開始コドンをも含んでいる。プロインスリンを含んだ当該ハイブリッドポリペプチドをコードするＤＮＡは、このＡＴＧ開始コドンと同じフェーズにある。
本発明のプラスミドはまた、宿主細胞中で自立的に複製できるバクテリアプラスミド由来の複製起源を有するＤＮＡ配列をも含んでいる。適切な複製起源は、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ受付番号37017）由来のように、多くの起源から得ることができる。
本発明のプラスミドはまた、薬剤耐性遺伝子（例えばアンピシリン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリンに対する耐性）のように、当該プラスミドがホスト細胞内に存在するときに現れる、選別可能または同定可能な発現型的特徴に関連した遺伝子を含有したＤＮＡ配列をも含んでいる。
当該ハイブリッドポリペプチド（プロインスリンを含有したもの）をコードする核酸を発現させるために用い得るベクターの例は、バクテリアウイルス（例えばラムダファージのようなバクテリオファージ）のようなウイルス、コスミド、プラスミド、およびその他のベクターである。プロインスリンを含有するハイブリッドポリペプチドをコードする遺伝子は、当該技術で周知の方法によって適切なベクターの中に挿入される。例えば、従来の制限エンドヌクレアーゼ酵素部位を用いて挿入物ＤＮＡおよびベクターＤＮＡを開裂し、夫々の塩基対が相互に相補的である相補的末端を作製することができ、次いで、両者をＤＮＡリガーゼを用いて連結することができる。
或いは、ベクターＤＮＡにおける制限部位に対して相補的な塩基配列を有する合成リンカーを、挿入物ＤＮＡに連結し、次いで、これを当該部位で切断する制限酵素で消化することができる。他の手段もまた利用可能である。
好ましいバクテリアホスト細胞は大腸菌（E.coli）細胞である。適切な大腸菌細胞の例は、Ｓφ７３３株（ｃｙｔＲｓｔｒＡ）または４３００株であり、他の大腸菌株および他のバクテリアもまた、当該プラスミドのためのホストとして用いることができる。
ホストとして用いられるバクテリアは、栄養要求性株（例えばＡ１６４５）、無機栄養要求性株（例えばＡ４２５５）および溶解性株；Ｆ+株およびＦ-株；λプロファージのｃＩ８５７リプレッサ配列を含む株（例えばＡ１６４５およびＡ４２５５）並びにｄｅｏリプレッサおよび／またはｄｅｏ遺伝子を欠失した株（ヨーロッパ特許出願公報第０３０３９７２号参照）を含む如何なる株であってもよい。大腸菌株Ｓφ７３３および大腸菌株４３００は、夫々、ＡＴＣＣ受付番号第６９３６１号および第６９３６３号の下に寄託されている。
上記の全ての大腸菌ホスト株は、当該技術において周知の方法、例えば臭化エチジウム法（R.P.Novick in Bacteriol.Rewiew 33,210（1969））によって、それらに含まれているプラスミドを取り出すことができる。
本発明は、インスリンを製造する方法であって、プロインスリンを含有するハイブリッドポリペプチドを、正しいジスルフィド結合の形成を許容する条件下で折り畳むことと、この折り畳まれ且つジスルフィド結合したハイブリッドポリペプチドを酵素的に開裂させて、インスリンを生成させることと、このインスリンを精製することとを具備した方法を提供する。このインスリンは商業的に入手可能なヒト・インスリンの活性および特性を有している。
好ましい態様において、この折り畳みは、当該ハイブリッドポリペプチドを、約8.5〜12.0のｐＨにおいて、約４〜37℃で約１〜30時間インキュベートすることを具備している。
他の好ましい態様において、この折り畳みは、当該ハイブリッドポリペプチドを、アスコルビン酸の存在下に、約8.5〜12.0のｐＨにおいて、約４〜37℃で約１〜30時間インキュベートすることを具備している。
特に好ましい態様において、折り畳みの際のｐＨは11.0〜11.25である。
他の特に好ましい態様において、アスコルビン酸の濃度は、折り畳み混合物中に存在するＳＨ基１モル当たり約２モルである。
更に別の態様において、インキュベーション時間は約５時間である。
他の態様において、酵素的に開裂させる工程は、ｐＨを約8.8〜9.0に調節することと、前記ハイブリッドポリペプチドを、16〜37℃で約30分〜約16時間だけ、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢで開裂することとを具備している。
他の態様において、前記の精製工程は、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィーおよびＲＰ−ＨＰＬＣを含んでいる。
更に別の態様において、前記の精製工程は、更に、限外濾過およびＣＭ−セファロースクロマトグラフィーを具備する。
特に好ましい態様において、前記の精製工程は、更に、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィーおよびフェニル−セファロースクロマトグラフィーを具備する。
特に好ましい態様において、前記ハイブリッドポリペプチドは、ＡＴＣＣ受付番号第６９３６１号の下に寄託されたプラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴによって発現される。
他の好ましい態様において、前記ハイブリッドポリペプチドは、ＡＴＣＣ受付番号第６９３６３号の下に寄託されたプラスミドｐλＢＡＳＴ−ＬＡＴによって発現される。
他の態様において、前記ハイブリッドポリペプチドは、ＡＴＣＣ受付番号第６９３６２号の下に寄託されたプラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒによって発現される。
好ましい態様において、前記ハイブリッドポリペプチドは、該ハイブリッドポリペプチドをコードするＤＮＡを含むバクテリア細胞を、該ＤＮＡがその発現を指令するように処理することと、前記細胞から当該ハイブリッドポリペプチドを回収することとによって得られる。
前記の処理には、グルコース、グリセロールまたはガラクトースの存在下での発酵が含まれることが想定される。
更に、前記細胞からの前記ハイブリッドポリペプチドの回収は、前記バクテリア細胞の細胞壁またはその断片をを破壊して細胞溶解物を製造することと、該溶解物から遠心によって細胞内沈殿物を単離することと、この沈殿物を可溶化することと、必要に応じ、クロマトグラフィーまたは限外濾過によって当該ハイブリッドポリペプチドを精製することとを具備することが想定される。
本発明は更に、プロインスリンおよび該プロインスリンのＮ末端に結合したリーダーペプチドとを含有するポリペプチドであって、該ポリペプチドは折り畳まれ、且つ正しいジスルフィド結合を含んでいるポリペプチドを提供する。
好ましい態様において、前記リーダーペプチドは、ＣｕＺｎＳＯＤのＮ末端から誘導される。
特に好ましい態様において、前記リーダーペプチドは６２アミノ酸を含んでおり、その前にはアミノ酸Ｍｅｔが先行し、その後にはＡｒｇ残基が続いている。
好ましい態様において、前記プロインスリンは、単一のＡｒｇ残基によってインスリンＡ鎖に結合されたインスリンＢ鎖を含んでいる。
他の態様において、前記プロインスリンは、ジペプチドＬｙｓ−ＡｒｇによってインスリンＡ鎖に結合されたインスリンＢ鎖を含んでいる。
上記二つのプロインスリン分子は、ハイブリッドタンパクとして製造されなければならず、そうでなければ発現レベルは極端に低く、商業的重要性はない。
全ての好ましい態様において、リーダーペプチドのシステイン残基はセリン残基で置換されている。
〔実施例〕
以下の実施例は、本発明の理解を補助するために挙げられるものであり、如何なる意味においてもその範囲を限定しようとするものではなく、そのように解釈されてはならない。下記の実施例には、ベクター類の構築、ポリペプチドをコードする遺伝子のかかるベクターへの挿入、または得られたプラスミドのホストへの導入に用いられる従来の方法の詳細な説明は含まれていない。また、これらの例には、このようなホスト・ベクター系によって製造されたポリペプチドを試験するために用いられる従来の方法の詳細な説明は含まれていない。このような方法は当業者に周知であり、例えば下記のものを含む多くの刊行物中に記載されている。
Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.（1989）Molecular Cloning:A laboratory Manual,2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press.
実施例１
ＳＯＤプロインシュリン・ハイブリッドポリペプチドを発現する産生プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒ、ｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴおよびｐλＢＡＳＴ−ＬＡＴの構築
deo Ｐ１Ｐ２又はλPＬプロモーターの何れかの制御下で大腸菌中でハイブリッド蛋白を過剰生産するバクテリア性発現ベクターを構築した。インシュリンＢ鎖−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−インシュリンＡ鎖をコードする発現ベクターを宿すバクテリアは検出可能なポリペプチドを産生しないことがわかっていたので、プロインシュリンは、ハイブリッド蛋白として産生された。このハイブリッド蛋白は、ＣｕＺｎＳＯＤ（１１）のＮ末端から誘導されたリーダーペプチド（６２アミノ酸長）を含んでおり、その該Ｎ末端においてＭｅｔ残基が先行しており、そのＣ末端には、それをインシュリンＢ鎖につなげているＡｒｇ残基が続いている。インシュリンＢ鎖は、Ｌｙｓ−Ａｒｇ又はＡｒｇからなる短Ｃ鎖ペプチドによってインシュリンＡ鎖に連結されている。ＳＯＤ部分に元々存在する二つのシステインは、セリン残基によって置換された。
Ａ．  プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒ
一連のプラスミドが構築され、最終的にｐＢＡＳＴ−Ｒを得た。ｐＢＡＳＴ−Ｒは、適切な大腸菌ホスト細胞の形質転換に際して、ヒトインシュリン生産に有用なプロインシュリン・ハイブリッドポリペプチドの有効な発現を指令することができた。
ＳＯＤインシュリンＢ鎖−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−インシュリンＡ鎖ハイブリッド・ポリペプチドをコードするプラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒの構造を図３に示す。該ハイブリッド・ポリペプチドのＤＮＡ配列および対応アミノ酸配列は、図６に示される。
プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒは、約４３８０ｂｐ長で、下記要素からなる（反時計周りの方向で）。
１．テトラサイクリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２上のAat II-Msc I部位にわたる１５２１ｂｐ長のＤＮＡ断片。
２．一部を切り取ったアンピシリン耐性遺伝子およびＤＮＡ複製起源を含むｐＢＲ３２２上のＳｃａＩ−ＨａｅＩＩ部位にわたる１４９７ｂｐ長のＤＮＡ断片。
３．deo P1P2プロモーターおよびリボソーム結合部位（（ＰＢＳ）（１３）を含む大腸菌ＤＮＡ上のＡｖａＩＩ−ＮｄｅＩ部位にわたる９３０ｂｐ長のＤＮＡ断片。
４．ヒトＣｕＺｎＳＯＤ ｃＤＮＡのＮｄｅＩ−ＰｐｕＭＩ部位にわたる１８８ｂｐ長のＤＮＡ断片。成熟ＳＯＤの６位、５７位のシスチンは、セリン残基とオリゴヌクレオチドの部位指向性変異誘発（１２）によって置換された。
５．ＰｐｕＭＩおよびＢａｍＨＩ末端を持つ１７２ｂｐ長の合成ＤＮＡ断片。この領域は、ＡｒｇインシュリンＢ鎖Ｌｙｓ−ＡｒｇインシュリンＡ鎖をコードする。
６．ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ末端を持つ合成３６ｂｐマルチクローニング部位ポリリンカー。
７．ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡａｔＩＩ末端（１０）を持つＴｒｐＡ転写ターミネーターを含む合成４４ｂｐオリゴヌクレオチド。
テトラサイクリン耐性を与え、ＳＯＤインシュリンＢ鎖−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−インシュリンＡ鎖ハイブリッドポリペプチドをコードするプラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒは、大腸菌株Ｓφ７３３（ｃｙｔＲｓｔｒＡ）に導入され、かつ１９９３年７月２６日にＡＴＣＣ寄託番号６９３６２でＡＴＣＣに寄託された。
Ｂ．プラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴ
他の一連のプラスミドが構築され、最終的にｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴを得た。
ｐＤＡＢＳＴは、適切な大腸菌ホスト細胞を形質転換したときに、ヒト・インシュリン生産に有用なプロインシュリン・ハイブリッドポリペプチドの効率的な高レベルの発現を指令することができた。
ＳＯＤインシュリンＢ鎖−Ａｒｇ−インシュリンＡ鎖ハイブリッド・ポリペプチドをコードするプラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴの構造を図４に示す。該ハイブリッド・ポリペプチドのＤＮＡ配列および対応アミノ酸配列は、図７に示される。プラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴは、約４３７７ｂｐ長で、下記要素からなる（反時計周りの方向で）。
１．テトラサイクリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２上のAat II-Msc I部位にわたる１５２１ｂｐ長のＤＮＡ断片。
２．一部を切り取ったアンピシリン耐性遺伝子およびＤＮＡ複製起源を含むｐＢＲ３２２上のＳｃａＩ−ＨａｅＩＩ部位にわたる１４９７ｂｐ長のＤＮＡ断片。
３．deo P1P2プロモーターおよびリボソーム結合部位（ＰＢＳ）（１３）を含む大腸菌ＤＮＡ上のＡｖａＩＩ−ＮｄｅＩ部位にわたる９３０ｂｐ長のＤＮＡ断片。
４．ヒトＣｕＺｎＳＯＤ ｃＤＮＡのＮｄｅＩ−ＰｐｕＭＩ部位にわたる１８８ｂｐ長のＤＮＡ断片。成熟ＳＯＤの６位、５７位のシスチンは、セリン残基と置換されこの断片のＧＣ配合率は、オリゴヌクレオチドの部位指向性変異誘発（１２）によって３８％まで削減された。
５．ＰｐｕＭＩおよびＢａｍＨＩ末端を持つ１６９ｂｐ長の合成ＤＮＡ断片。この領域は、ＡｒｇインシュリンＢ鎖−Ａｒｇ−インシュリンＡ鎖をコードする。
６．ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ末端を持つ合成３６ｂｐマルチクローニング部位ポリリンカー。
７．ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡａｔＩＩ末端（１０）を持つＴｒｐＡ転写ターミネーターを含む合成４４ｂｐオリゴヌクレオチド。
テトラサイクリン耐性を与え、ＳＯＤインシュリンＢ鎖−Ａｒｇ−インシュリンＡ鎖ハイブリッドポリペプチドをコードするプラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴは、大腸菌株Ｓφ７３３（ｃｙｔＲｓｔｒＡ）に導入され、かつ１９９３年７月２６日にＡＴＣＣ寄託番号６９３６１でＡＴＣＣに寄託された。
Ｃ．プラスミド  ｐλＢＡＳＴ−ＬＡＴ
また別の一連のプラスミドが構築され、プラスミドｐλＢＡＳＴ−ＬＡＴを得た。これは、遺伝子加工された大腸菌ホスト細胞（ｃＩ８５７リプレサーを宿す）の形質転換に際して、ヒトインシュリン生産に有用なプロインシュリン・ハイブリッド・ポリペプチドの効率的な発現を指令することができた。
ＳＯＤインシュリンＢ鎖−Ａｒｇ−インシュリンＡ鎖ハイブリッド・ポリペプチドをコードするプラスミドｐλＢＡＳＴ−ＬＡＴの構造を図５に示す。該ハイブリッド・ポリペプチドのＤＮＡ配列および対応アミノ酸配列は、図７に示される。プラスミドｐλＢＡＳＴ−ＬＡＴは、約３７７７ｂｐ長で、下記要素からなる（反時計周りの方向で）。
１．テトラサイクリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２上のAat II-Msc I部位にわたる１５２１ｂｐ長のＤＮＡ断片。
２．一部を切り取ったアンピシリン耐性遺伝子およびＤＮＡ複製起源を含むｐＢＲ３２２上のＳｃａＩ−ＨａｅＩＩ部位にわたる１４９７ｂｐ長のＤＮＡ断片。
３．λPＬプロモーターおよびＡｖｒＩＩ−ＮｄｅＩ３０ｂｐ長のdeoリボソーム結合部位を含むプラスミドｐＳＯＤα１３（１４）上のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位にわたる３３０ｂｐ長のＤＮＡ断片。
４．ヒトＣｕＺｎＳＯＤ ｃＤＮＡのＮｄｅＩ−ＰｐｕＭＩ部位にわたる１８８ｂｐ長のＤＮＡ断片。成熟ＳＯＤの６位、５７位のシスチンは、セリン残基と置換され、およびこの断片のＧＣ配合率は、オリゴヌクレオチドの部位指向性変異誘発（１２）によって３８％まで削減された。
５．ＰｐｕＭＩおよびＢａｍＨＩ末端を持つ１６９ｂｐ長の合成ＤＮＡ断片。この領域は、Ａｒｇ−インシュリンＢ鎖−ＡｒｇインシュリンＡ鎖をコードする。
６．ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ末端を持つ合成３６ｂｐマルチクローニング部位ポリリンカー。
７．ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡａｔＩＩ末端（１０）を持つＴｒｐＡ転写ターミネーターを含む合成４４ｂｐオリゴヌクレオチド。
テトラサイクリン耐性を与え、λＰＬプロモータの制御下にあるＳＯＤインシュリンＢ鎖−Ａｒｇ−インシュリンＡ鎖ハイブリッドポリペプチドをコードするプラスミドｐλＢＡＳＴ−ＬＡＴは、大腸菌株４３００（Ｆ−、ｂｉｏ、ｃＩ８５７）に導入され、かつ１９９３年７月２６日にＡＴＣＣ寄託番号６９３６３でＡＴＣＣに寄託された。
バクテリア性細胞は、３０℃で増殖された。４２℃に温度を移すと、ハイブリッドポリペプチドの産生が誘導された。
実施例２
発酵、育成条件、ＳＯＤプロインシュリン・ハイブリッド・ポリペプチドの精製
Ｉ．保存培養
プラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴ（又は、ｐＢＡＳＴ−Ｒ）を宿す大腸菌菌株Ｓφ７３３の保存培養を、テトラサイクリン（１０ｍｇ／Ｌ）を補給したカゼイン培地（２０ｇ／Ｌカゼイン加水分解物、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物および５ｇ／ＬＮａＣｌ）上にて生育させた。該培養物を凍結培地で２倍に希釈し、-８０℃で保存した。
凍結培地：５００ｍｌ当たり
Ｋ2ＨＰＯ4              6.3g
ＫＨ2ＰＯ4              1.8g
クエン酸ソーダ          0.45g
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ      0.09g
（ＮＨ４）2ＳＯ4        0.9g
グリセロール            44g
ＩＩ．接種物
接種物を、製造培地（下記参照）で増殖した。振盪フラスコ中の滅菌培地は、保存培産物から接種され、１５時間、振盪機上で３７℃および約２００ｒｐｍでインキュベートされた。必要な時は、接種物増殖の次のステージを攪拌エアレーション発酵機中で実施した。２−１０％フラスコ培地が滅菌培地に播種され、１５時間３７℃、ｐＨ７±０．５で、約２０％の空気飽和を上回る溶存酸素レベルを維持するように攪拌・エアレーションしながらインキュベートした。
製造培地：
Ｋ2ＨＰＯ4              8g/l
ＫＨ2ＰＯ4              2g/l
クエン酸ソーダ          2g/l
ＮＨ4Ｃｌ               3g/l
Ｋ2ＳＯ4                0.6g/l
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ      0.04g/l
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ      0.4g/l
ＣａＣｌ2・２H２Ｏ      0.02g/l
微量成分溶液            3g/l
テトラサイクリン        0.01/l
グルコース              2g/l
グリセロール            1ml/l
微量成分溶液
ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ        1g/l
ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ      2.78g/l
ＣｏＣｌ2・７Ｈ2Ｏ      2g/l
Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ   2g/l
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ      3g/l
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ    1.85g/l
Ｈ3ＢＯ3                0.5g/l
ＨＣＬ  （３２％）      100ml/l
製造培地に0.5-10％の接種培地を接種し、３７℃でインキュベートした。攪拌エアレーション速度を２０％の空気飽和率を超えた溶存酸素レベルが維持されるように設定した。pHをアンモニアによって７±0.2に維持した。
５０％グルコースおよび３０％グリセロールの滅菌溶液がエネルギーおよび炭素源を供給するために注入された。細胞濃度がＯＤ660値２５に達したら、１０％のグルコースおよび３０％のグリセロールの滅菌溶液が注入され、約５時間、細胞濃度が約ＯＤ6６０の値に達するまで生育が続けられた。次に、該培養物を冷却し、細胞を遠心分離によって回収した。グルコース、グリセロール、ガラクトースあるいはその組み合せの何れかの炭素源存在下で大腸菌の発酵をさせると、ＳＯＤプロインシュリン・ハイブリッドポリペプチドの発現が促進された。
IV  精製
プラスミドｐＢＡＳＴ−ＲおよびｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴによって発現されたＳＯＤ-プロインシュリン・ハイブリッドポリペプチドは、細胞内沈殿物中に蓄積した。該沈殿物は、下記手段によって単離された。１ｇ（湿重量）のバクテリアケーキを、５０mM Tris-HCl,pH8,10mM EDTAを含む緩衝液（１０ｍｌ）中に懸濁し、ライソザイム（メルク（Merck）、２５００μ／ｍｌ）で３７℃、２時間で処理した。該混合物は、次に超音波処理され、ノニデット−（Nonidet）-P-40（シグマ）又はトリトン（Triton）Ｘ１００を最終濃度２％まで加え、２時間室温で攪拌された。該沈殿物は遠心分離でペレット状とされ、水で洗浄された。
ハイブリッドポリペプチドは、アニオン交換クロマトグラフィーで、下記のようにほぼ等質になるまで精製された。沈殿物は、８Ｍの尿素、２０mM Tris-HCl,200mM βメルカプトエタノール、ｐＨ８．２中に溶解された。該溶液は、遠心分離によって浄化され、８Ｍの尿素、２０mM Tris-HCl,200mM βメルカプトエタノール、ｐＨ８．２で予め平衡化されたＤＥＡＥセファロース・ファストフロー（Fast-Flow）カラム（ファルマシア、ＬＫＢ）でクロマトグラフ処理された。通過物を収集し、ハイブリッド蛋白を（ＮＨ4）2ＳＯ4の４０％飽和で沈澱させるか、或いは１０Ｋ膜上で限外濾過によって濃縮され、その後１００ｍＭグリシンＨＣｌ、ｐＨ3.1で透過濾過された。
別法として、プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒにより発現されたＳＯＤ-プロインシュリン・ハイブリッドポリペプチドが、８Ｍの尿素、２０mMジチオスレイトール,50mM酢酸ナトリウム、ｐＨ５の中にに溶解され、一連の１００kＤおよび５０ｋＤ膜（フィルトロン）を通して限外濾過を行なうことによって、ほぼ等質になるまで精製された。ハイブリッドポリペプチドを１０ｋＤ膜上で濃縮して、（ＮＨ4）2ＳＯ4の４０％飽和で沈殿させた。
実施例３
ＳＯＤ-プロインシュリン・ハイブリッドポリペプチドの折り畳みおよび酵素的開裂
（ＮＨ4）2ＳＯ4沈殿又は限外濾過（実施例２）によって得られたプロインシュリン・ハイブリッドポリペプチドを、８Ｍの尿素、5mM HCl中に溶解し、100ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ8.5-12中に,最終濃度1mg/mlで希釈した。
Ａ．プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒによって発現されるＳＯＤ-プロインシュリン・ハイブリッドポリペプチドは、正常なジスルフィド結合が可能となるように、約４〜３７℃において、１〜２４時間かけて折りたたまれた。
折り畳まれたジスルフィド結合ハイブリッドポリペプチドを含む溶液のｐＨは、ＨＣｌで約8.8〜9.0に調節され、該蛋白は、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢで、１６〜３７℃で、３０〜１２０分かけて処理された。
多くの実験を行なった後、至適条件が以下の通りである事が分かった。プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒによって発現されるハイブリッドポリペプチドを８Ｍ尿素、５mM HCl中に溶解し、１００mMグリシン緩衝液、pH11.0（図８）中に最終濃度約１mg/mlで、希釈した。その後、２５℃６−１６時間かけてハイブリッドポリペプチドの折り畳みが起こった。折り畳まれた後、ジスルフィド結合ハイブリッドポリペプチドは、トリプシン（１：５００w/w）およびカルボキシペプチダーゼＢ（１：２００ｗ／ｗ）で、３７℃で３０−６０分かけて開裂された。
プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒによって発現される折り畳まれたジスルフィド結合プロインシュリン・ハイブリッドポリペプチドが酵素によって開裂され、インシュリンを生成することが図１に図解されている。
Ｂ．プラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴによって発現されたＳＯＤプロインシュリン・ハイブリッドポリペプチドは、正常なジスルフィド結合が可能となるように約７〜３１℃約５〜３０時間かけて、折り畳まれた。
折り畳まれたジスルフィド結合ハイブリッドポリペプチドを含む溶液のｐＨは、HClによって約8.8-9.0に調節された。該蛋白は22-37℃で３０分から１６時間かけて、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢで処理された。
多くの実験を行った後、至適条件が以下の通りである事がわかった。プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒによって発現されるハイブリッドポリペプチドは８Ｍ尿素、５mM HCl中に溶解され、１００mMグリシン緩衝液、pH11.0-11.25（図８）中に最終濃度約１mg/mlで希釈された。その後、２５℃で５時かけてハイブリッドポリペプチドの折り畳みが起こった。折りたたまれた後、ジスルフィド結合ハイブリッドポリペプチドは、トリプシン（１：15,000w/w）およびカルボキシペプチダーゼＢ（１：10.000ｗ／ｗ）で、２５℃で１６時で開裂された。
プラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴによって発現される折り畳まれたジスルフィド結合プロインシュリン・ハイブリッドポリペプチドを酵素によって開裂してインシュリンを生成することが、図２に図解されている。
上記ＡおよびＢ両者に特異的な条件の例が、図８〜１４の説明に詳述されている。
実施例４
プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒによって発現されるＳＯＤプロインシュリン・ハイブリッドポリペプチドからのヒトインシュリンの蛋白分析および精製
プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒによって発現されるＳＯＤプロインシュリン・ハイブリッドポリペプチドからヒトインシュリンが発生することは、商業的に入手可能なヒトインシュリン（Calbiochem）を標準として使用して、ラジオイムノアッセイおよびＲＰ−ＨＰＬＣによって確認された。組み替えヒトインシュリンの理論的生産量は、プロインシュリン・ハイブリッドポリペプチドのアミノ酸配列によって計算したところ、45.6%であった。図８からも明らかなように、至適な折り畳みは、ｐＨ１１で起こる。このｐＨ値におけるインシュリン生産量は、理論的生産量の約８０％となる（投入されたハイブリッドポリペプチドの約４０％に匹敵する）。プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒによって発現されるプロインシュリンハイブリッドポリペプチド起源のヒトインシュリンは、ＰＲ−ＨＰＬＣによって検出される。バイダック（Vydac）218TP54,250x4.6mm I.D.（分離グループ）、５μｍ、３００オングストロームの粒子サイズのカラムを室温にて流速１ml/分で使用した。水中0.1%トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、溶出液Ａ、およびアセトニトリル中0.08%TFAを溶出液Ｂとして使用した。カラムを平衡化緩衝液（２５％溶出液Ｂ）で５分間洗浄し、その後、２５−５０％の溶出液Ｂの直線勾配を37.5分間行なった。吸光度を２２０nm又は280nmで調べた。折り畳まれたジスルフィド結合ハイブリッド・ポリペプチドの酵素消化後ヒトインシュリンを、逆層高圧液体クロマトグラフを使用して分析すると、標準ヒトインシュリンと同様の保持時間を持つ主要ピークが表われた。
２６ｍｇおよび１３ｍｇのヒトインシュリンを夫々産生する二つの小規模バッチを調整した。ヒトインシュリンは、３Ｋ又は５Ｋ膜（フィルトロン）上で限外濾過され、続いてＣＭセファロース・クロマトグラフィー（クエン酸緩衝液、pH３）によって、酵素処理された溶液（ｐＨ９）から精製された。ピーク分画は脱塩され、凍結乾燥され、Ｎ末端配列分析およびアミノ酸分析に供された。組み替えヒトインシュリンの両バッチのアミノ酸組成は、天然のヒトインシュリン（表１参照、調整物１）と本質的に同一であった。該インシュリン調整物のアミノ末端における５つのアミノ酸の配列を、エドマン分解で決定した。ヒトインシュリンのＡ鎖Ｂ鎖の両方のアミノ末端と同一であることが分かり、インビトロ産物の信憑性が確認された。
しかしながら、配列分析の結果、該分子の約２５％において１位に余分なＡｒｇ残基が存在している事がわかった。この結果は、lysとArgの間、つまり、内部リンカー配列Lys-Argのトリプシン開裂に対応し、これによって該Ａ鎖のアミノ末端上に余分なＡｒｇ残基が残る。
ｐＨ１１で反応を行なうことにり、ＡｒｇのＣ末端にトリプシンによる特異的な加水分解が起こることが可能であることがわかった。この高ｐＨでは、ｌｙｓの殆どのεアミノグループは帯電されない（ｐＫ＝10.3）ので、これによって選択的開裂が可能となる。ｐＨ１１でトリプシン工程（表１参照、調整物２）を行ない、続いてｐＨ8.5でカルボキシルペプチダーゼＢ消化を行う事によって、精製されたインシュリン１mgおよび6.5mgを産生する２バッチが得られた。Ｎ末端シークエンスによって、余分のＡｒｇを含むインシュリンの量が約５％にまで削減されたことがわかった。
0004624495.tif 000002
調製物１および２には、プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒによって発現されるプロインシュリン・ハイブリッドポリペプチド起源の組替えヒトインシュリンのアミノ酸組成を示す。トリプシン開裂はｐＨ９（調製物１）又はｐＨ１１（調製物２）の何れかで行なわれた。
アミノ酸分析は、精製されたインシュリン調製物の過ギ酸酸化および気相加水分解の後に行われた。
実施例５
プラスモドｐＢＡＳＴ−Ｒによって発現されるＳＯＤプロインシュリン・ハイブリッド・ポリペプチドから産生された精製ヒトインシュリンのペプチド分析
上記実施例に記載したようにして産生された精製ヒトインシュリンは、グルタミル残基のカルボキシル側にあるペプチド結合を加水分解するエンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ（Ｓｉｇｍａ）を使用したペプチド分析に供された。
より詳細には、プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒによって発現された、折り畳まれたジスルフィド結合プロインシュリン・ハイブリッド・ポリペプチドの開裂によって産生されたインシュリンサンプル（１００μｇ）は、100μlの0.1M Tris-HCl、ｐＨ7.8中で５μｇＧｌｕ−Ｃで６時間３７℃で消化された。ＨＰＬＣ分析を次のように行なった。商業的に入手可能な（コントロール）インシュリンおよび折り畳まれたジスルフィド結合プロインシュリン・ハイブリッド・ポリペプチドの開裂によって産生されたインシュリンサンプルは、ｐＨ約３にまで酸性化され、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分離された。バイダック（Ｖｙｄａｃ）２１８ＴＰ５４、２５０ｘ4.6mm ID,5μm,300オングストロームの粒子サイズのカラムを使用した。このカラムは、31.5%（v/v）アセトニトリルを含む５０ｍＭのリン酸テトラエチルアンモニウム、１６２mM ＮａＣｌＯ4、ｐＨ３、で平衡化され、３５〜４５％のアセトニトリルの直線勾配で、７５分間、流速１ｍｌ／分で展開された。吸光度を、２２０nmで調べた。
すべての予想されるペプチドは、たとえ断片のうち一つに対応したピーク小さな肩ピークが続き、これがdes-Thr（B30）インシュリン様分子（１５）に多分に関係していたとしても、コントロール反応と同じ様に発生された。
プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒによって発現される組替えポリペプチドは、天然のヒトインシュリンの配列を含む事が実施例４および５から分かる。組替え蛋白の小部分では、Ａｒｇ（ＡＯ），デスアミドインシュリン様分子またはデススレオニン（Ｂ３０）インシュリン様分子のような構成型を産生した。
これらの不要な副産物は、上記に述べたようなＲＰ−ＨＰＬＣといったクロマトグラフィーを用いて排除できる。
実施例６
プラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴによって発現されるプロインシュリン・ハイブリッドポリペプチドから産生されるヒトインシュリンのタンパク分析および精製
Ａｒｇ（Ａｏ）インシュリン副産物の生成を回避（実施例４および５）するために、プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒによって発現されるプロインシュリン・ハイブリッドポリペプチドのＡ鎖およびＢ鎖の間にＬｙｓ−Ａｒｇ残基のみをコードするＤＮＡとは全く異なり、プロインスリン・ハイブリッド・ポリペプチドのＡ鎖およびＢ鎖の間にＡｒｇ残基のみをコードしているＤＮＡを含むように、発現プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒを変更した。この結果、発現ｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴ（実施例１Ｂ）およびｐλＢＡＳＴ−ＬＡＴ（実施例１Ｃ）が得られた。
新発現プラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴによって発現された折り畳まれたジスルフィド結合プロインシュリン・ハイブリッドポリペプチドのトリプシンおよびＣＰＢによる酵素処理の後、インシュリンは効率的に産生された。インシュリン様汚染物の存在は低かった（図９）。折り畳みは、ｐＨ11.25（図１０）で至適に行なわれ、反応混合物中、ＳＨ基一モルあたり約２モルのアスコルビン酸の存在下で、著しく増大した（図１１）。
プロインシュリン・ハイブリッド・ポリペプチドから産生されるインシュリン産生における蛋白濃度の影響が、別の至適折り畳み条件下における一連の反応で確認された。蛋白濃度が1.5mg/mlを超過しない場合に、至適産生が得られた（図１３）。
インシュリンを、ＤＥＡＥセファロースクロマトグラフイー、続いてＲＰ−ＨＰＬＣによって（図９に記載のように）精製された。図１２から明らかなように、産生された組替えヒトインシュリンは、標準（商業的に入手可能な）ヒトインシュリンと同じ保持時間を持っていた。精製された組替えヒトインシュリン調製物のアミノ酸組成は、標準インシュリン（表２、組替えインシュリン）と同一であった。
表２は、プラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴによって発現されるプロインシュリンハイブリッドポリペプチドから産生されるインシュリンは、実施例４に記載されたように、インシュリンＡ鎖に付着した余分のＡｒｇ残基（Ａｒｇ（ＡＯ）インシュリン）をもっていなかった事を示している。このように、インシュリン産生に好適なプラスミドは、プラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴであり、プロインシュリンハイブリッドポリペプチドの好適な配列は、図７に示されたものである。
0004624495.tif 000003
標準ヒトインシュリンおよびプラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴによって発現されるプロインシュリンハイブリッドポリペプチドから生産される組替えヒトインシュリンのアミノ酸組成を示す。
精製インシュリン調製物の過ギ酸酸化およびガス層加水分解後、アミノ酸分析が行なわれた。
実施例７
粗製細胞内沈殿物から、プラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＬＡＴにより発現されたプロインシュリン・ハイブリッド・ポリペプチドからのヒトインシュリンの製造
プロインシュリン・ハイブリッドポリペプチドを折り畳み、酵素変換してインシュリンとする改良方法が、粗製細胞内沈殿物を使用することによって、実施例２のパートＩＶに記載されたような初期精製工程を必要とせずに実施された。折り畳まれたジスルフィド結合プロインシュリン・ハイブリッド・ポリペプチドをトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢによって酵素的に切断した後に、インシュリンは有効に産生された（図１４、および表３）。インシュリン産生は、ｐＨ１２における沈殿物溶解工程（図１４）で測定されたように、初期蛋白濃度（Ａ280）に対するパーセンテージとして計算された。粗細胞内沈殿物起源のＳＯＤプロインシュリン・ハイブリッド・ポリペプチドの折り畳みが、実験開始後約4.5時間で至適になっていることがわかった（図１４）。
表３には、ＯＤ660値４５の１リットル発酵培養から調製された粗製細胞内沈殿物からの、プラスミドｐＢＡＳＴ−ＬＡＴによって発現されたプロインシュリン・ハイブリッド・ポリペプチドからのインシュリンの部分的精製物についてまとめてある。溶解および折り畳みが、図１４において記載されたように実施された。溶解から4.5時間目に、折り畳まれ且つジスルフィド結合したプロインシュリン・ハイブリッド・ポリペプチドを含む折り畳みバルク溶液が、ｐＨ８．８まで、濃縮塩酸で滴定された。ＺｎＣｌ2（５０μＭ最終濃度まで）、カルボキシペプチダーゼＢ（１：４０００ｗ／ｗ）およびトリプリン（１：６０００ｗ／ｗ）が加えられた。消化を３時間３７℃で行ない、フッ化フェニルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）の添加によって終わらせて、最終濃度を0.5ｍＭとした。図９に記載されたようなＨＰＬＣによる分析では、１６９ｍｇのインシュリン産生が示された。インシュリンは、一連のアニオン交換および疎水性クロマトグラフィー工程によって精製された。消化された折り畳み混合物を、１ミリリットル樹脂あたり約５０Ａ280ユニットで20mM Tris-HCl,10mM NaCl pH8緩衝液中で前平衡化されたＤＥＡＥセファロース・ファスト・フローカラム（ファルマシア）に入れた。結合した物質を２０mM Tris-HCl、１００mM NaCl,pH8緩衝液で洗浄し、同緩衝液中で２５０ｍＭ NaClでインシュリンが抽出された。インシュリンを含む貯蔵分画は、投入された蛋白の２０％にあたり、純度は３７.1%であった。硫酸アンモニウムをＤＥＡＥ溶出貯蔵物中に濃度が４１０mMとなるまで添加し、２０mM Tris HCl,540mM硫酸アンモニウム中で、樹脂１ミリリットルに付き１２Ａ280ユニットで前平衡化されたフェニルセファロース・ファスト・フローカラム中に入れた。結合物を平衡緩衝液で洗浄し、インシュリンを２０mM Tris HCl、２２０ｍＭ硫酸アンモニウム、ｐＨ８緩衝液で溶出させた。インシュリンを含む分画は、投入された蛋白の42.3％にあたり、純度は74.1%であった。この部分精製工程の結果、標準のインシュリンと同一の120mgのインシュリンが産生され、これは、5.16%のインシュリン産生に匹敵する。インシュリンは、例えばゲル濾過、ＲＰ−ＨＰＬＣおよび結晶化等の公知の方法を使用して更に精製が行われた（１７）。
0004624495.tif 000004
Ａ280は、夫々の精製工程における２８０ｎｍでの全吸収を表す。インスリンの存在は、図９について説明したようにして、標準インスリンの主インスリンピークに対応して、ＨＰＬＣ分析により標準インスリンと比較して決定された。
〔参照文献〕
0004624495.tif 000005
0004624495.tif 000006
【図１】
0004624495.tif 000007
【図２】
0004624495.tif 000008
【図３】
0004624495.tif 000009
【図４】
0004624495.tif 000010
【図５】
0004624495.tif 000011
【図６】
0004624495.tif 000012
【図７】
0004624495.tif 000013
【図８】
0004624495.tif 000014
【図９】
0004624495.tif 000015
【図１０】
0004624495.tif 000016
【図１１】
0004624495.tif 000017
【図１２】
0004624495.tif 000018
【図１３】
0004624495.tif 000019
【図１４】
0004624495.tif 000020