(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の卵巣表層上皮細胞を培養し、human papilloma virus（ＨＰＶ）のＥ７の遺伝子を、pCLXSNプロウイルスベクター及び／またはpMSCVプロウイルスベクターを用いて導入後、human telomerase reverse transcriptase （ｈＴＥＲＴ）の遺伝子を、pCLXSNプロウイルスベクター及び／またはpMSCVプロウイルスベクターを用いて追加導入することによりなる不死化卵巣表層上皮細胞の製造方法。
【請求項２】
不死化卵巣表層上皮細胞の染色体の数が４６個であることを特徴とする請求項１に記載の不死化卵巣表層上皮細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物の卵巣表層上皮不死化細胞、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
厚生労働省による統計によれば、平成１３年度における卵巣の悪性腫瘍による死亡数は４１５４人で、死亡率は１０万人に対して６．５人である。女性の悪性腫瘍による死亡の中では、子宮癌に次いで９番目に多い。
【０００３】
卵巣は妊娠成立のために精巧かつ緻密に仕組まれた臓器で、卵胞形成、排卵ならびに黄体形成といったおよそ一ヶ月の排卵周期を約４０年間繰り返し、生命の誕生へと導くとともに、卵胞や黄体から産生される性ステロイドホルモンによって身体のさまざまな機能を調節している。
【０００４】
卵巣は表層から順に、表層上皮、白膜、皮質、髄質によって構成されている。卵巣腫瘍は、表層上皮、卵胞壁、卵子のそれぞれに由来する表層上皮性・間質性腫瘍、性索間質性腫瘍、胚細胞腫瘍の３つに大別され、更に悪性度から、良性、境界悪性、悪性に分類される。この卵巣の表面を覆っている一層の卵巣表層上皮細胞から、いわゆる卵巣癌（上皮性卵巣癌）が発生すると考えられている。そして、悪性卵巣腫瘍の９割を占めるのが上皮性卵巣癌である。
【０００５】
上皮性卵巣癌は卵巣表層上皮より発生するといわれているが、子宮頚癌とヒト乳頭腫ウイルス、子宮体癌とエストロゲンに相当するような病因が現在のところ明らかにされていない。これは、他の２つの疾患と比べると上皮性卵巣癌は腹腔内という不可視領域に発生し、しかも一般に無症状であることから、上皮性卵巣癌患者の３分の２が臨床的に進行した状態で発見され、初期の癌病巣や前癌病変を捉えることが困難であることからも、上皮性卵巣癌の発生機序は未だ分かっていない。
【０００６】
上皮性卵巣癌は、まず、手術によって病変を取り除くことが基本の治療となるが、進行した上皮性卵巣癌は、一般に腹腔内に播種性に転移をきたしており、手術だけでは病変を全て取り除くことができないことが多い。この場合は術後に抗ガン剤よる治療が必要となる。現在、多種類の抗ガン剤があり、抗ガン剤の選択と組み合わせが、上皮性卵巣癌の治療の重要な課題となっている。
【０００７】
上皮性卵巣癌の発癌機構が不明であるため、初期の癌を同定できる有用な検査方法は見つかっていない。この卵巣癌の発癌機構を解明するためには、発生母細胞と考えられている卵巣表層上皮を用いた上皮性卵巣癌のモデルを作成することで、この発癌機構を解明することがもっとも有効な手段と考えられる。現在、数万の遺伝子発現を同時に調べることが可能である遺伝子チップの開発が進み、これを用いて種々の癌の発癌機構の解明が行われている。しかし、上皮性卵巣癌の場合、遺伝子発現の変化を調べるための対照となる卵巣癌の発生母細胞が必要である。
【０００８】
そこで、特許文献１に記載されているように正常の卵巣表層上皮を採取し、人工的に培養し、この細胞を増殖させることが必要となる。しかし、この細胞は採取するのが困難である上、採取ができても人工的に培養を行い、継代をして行く過程で増殖能を失ってしまう。そのために、この細胞を不死化させ、安定した増殖を有する細胞が必要となる。この不死化した卵巣表層上皮細胞が得られれば、これらの研究が飛躍的に進むと考えられる。また、テーラーメイド医療における卵巣癌に対する抗癌剤の選択においても、遺伝子チップを用いた卵巣癌の遺伝子発現パターンを調べることが有効であり、この遺伝子発現をみるための対照として、安定して増殖する卵巣表層上皮細胞が必要である。
【特許文献１】特開２０００−２５３８７２
【０００９】
上皮性卵巣癌の発生機序を解明するため、あるいは、抗癌剤の選択を決定するためとなる不死化卵巣表層上皮細胞を製造する試みは幾つか報告されている。例えば、本発明者等は、非特許文献１で、卵巣上皮細胞をSV40 largeT（LT）抗原の導入によって不死化細胞を得たことを報告している。しかし、非特許文献１の方法で得た不死化細胞は、正常の卵巣表層上皮でみられるような染色体数４６とは大きく異なり、比較例１に示したように染色体数が大きく変化していた。この非特許文献１の方法で得た不死化細胞の染色体数はむしろ癌細胞に近いものであり、腫瘍を形成するものもあり、正常卵巣表層上皮細胞に代わる細胞として使用するには充分でなかった。
【非特許文献１】Nitta M, Katabuchi H, OhtakeH, Tashiro H, Yamaizumi M,       Okamura H, Gynecol Oncol 81: 10-17, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、上記の従来用いられてきた技術の欠点を克服することにあり、染色体数が生体内にある正常卵巣表層上皮細胞と同数の染色体数を有する不死化卵巣表皮上皮細胞、およびその不死化卵巣表皮上皮細胞を製造する方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち本発明は、染色体数が４６個の不死化ヒト卵巣表皮上皮細胞である。
【００１２】
本発明はまた、別の面から見ると、哺乳動物の卵巣表層上皮細胞を採取培養し、human
papilloma virus（ＨＰＶ）のＥ７の遺伝子を、ベクターを用いて導入後、human telomerase reverse transcriptase（ｈＴＥＲＴ）の遺伝子を、ベクターを用いて追加導入することによりなる不死化卵巣表層上皮細胞の製造方法である。
【００１３】
ベクターは、pCLXSNプロウイルスベクター、及び／またはpMSCVプロウイルスベクターであることが好ましい。
【００１４】
不死化卵巣表層上皮細胞の染色体の数は、４６個であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法で、安定した卵巣表層上皮の不死化細胞を得ることができる。本発明の方法で得られた卵巣表皮細胞は、後述の実施例に示すように不死化されており、かつ、染色体数が生体内の正常卵巣表層上皮細胞のそれと同数である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の実施の形態につき説明する。本発明は、染色体数が４６個のヒト卵巣表層上皮不死化細胞であり、その卵巣表層上皮不死化細胞を遺伝子導入により製造する方法からなる。
【００１７】
本発明は、ヒトの卵巣の上皮細胞を対象とする。ヒトの卵巣は表層から順に、表層上皮、白膜、皮質、髄質から構成されている。卵巣の首座は卵胞の発育と排卵、そして内分泌機能が営まれる皮質にある。
【００１８】
表層上皮には卵巣を包む１層の細胞群が存在する。これが卵巣表層上皮細胞で、卵巣全体の１重量％にも満たない。ヒト正常卵巣の表層上皮の大部分は扁平であるが、立方状や高円柱状、アポクリン細胞にみられる断頭様分泌像など細胞レベルの形態学的変化を示す。超微形態学的には、半球状の細胞が規則的に１列に配列し、その表面には多数の微絨毛が観察される。
【００１９】
本発明の細胞は、哺乳動物の正常卵巣の表層上皮細胞と同等の形態を示し、染色体の数は４６個であり、しかも不死化された細胞である。なお、本発明でいう不死化細胞とは、継代培養５０回以上でも細胞分裂を繰り返す能力のある細胞をいう。  
【００２０】
本発明の不死化卵巣の表層上皮細胞の製造方法につき説明する。本発明の不死化卵巣の表層上皮細胞の製造方法では、正常な卵巣表層上皮細胞にヒトパピローマウイルス（human papilloma virus／ＨＰＶ）のＥ７遺伝子とテロメラーゼ活性をもたらすヒトテロメラーゼ逆転写酵素（human
telomerase reverse transcriptase/hTERT）の遺伝子を導入する。ＨＰＶは、パポバウイルスの１種で、いぼや子宮頚癌の前癌病変である子宮頚部異形成に関連するウイルスとして知られており、１００種類以上のタイプが分離されている。ＨＰＶは非ヒト動物には感染しない。ＨＰＶは２本鎖環状のＤＮＡを持っている。ＨＰＶはエンベロープを有しない正２０面体ＤＮＡウイルスである。
【００２１】
ＨＰＶは、ウイルスの複製と形質転換の機能に係わる初期遺伝子であるＥ１〜Ｅ７と、ウイルスのキャプシド蛋白質をコードする後期遺伝子、Ｌ１とＬ２とからなっている。
【００２２】
このうちＥ６遺伝子産物は、ｐ５３癌抑制遺伝子産物に結合して、発癌の抑制に働くＤＮＡ修復酵素ｐ５３の働きを減弱させる。Ｅ７遺伝子産物は、細胞分裂周期の調節に重要な役割を果たす癌抑制遺伝子産物であるＲＢ蛋白と結合し転写因子Ｅ２Ｆを活性化することで，細胞分裂周期を促進する方向に働く。これらのＥ６やＥ７遺伝子はＨＰＶから制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ等により切り出して用いることができる。
【００２３】
本発明の製造方法では、卵巣表層上皮細胞の不死化に必要なテロメラーゼ活性を有するようにするため、Ｅ７遺伝子を挿入した細胞にhTERT遺伝子を導入する。これによってテロメラーゼが活性化され、テロメアを延長する作用を示す。テロメアは、公知のごとく染色体の末端部にある特殊な構造体で、ＴＴＡＧＧＧという塩基配列が繰り返す構造からなっているが、細胞分裂ごとに50〜200bpずつ短縮していく。この短縮がおこるために染色体が不安定化し、分裂予備能が減少し、アポトーシスを起こしたりする。hTERTを導入することでテロメラーゼが活性化すると、テロメアの反復配列が延長するために、分裂予備能は減少することなく染色体も安定化した状態に保たれる。
【００２４】
本発明の不死化細胞の製造方法では、上記Ｅ７遺伝子とhTERT遺伝子を卵巣表層上皮細胞のゲノムに導入する。Ｅ７遺伝子とhTERT遺伝子をゲノムに導入するためには、ベクターを用いる。
【００２５】
遺伝子導入用ベクターとしては、ウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノアソシエーテッドウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。これらの中では、レトロウイルスベクターが、導入効率が高いため好ましい。レトロウイルスベクターの中では、イムゲネックス（Imgenex）社より入手できるpCLXSN ベクター（Imgenex Corp）とクロンテックス（Clonetech）社から入手できるpMSCVプロベクターが特に好ましい。
【００２６】
ベクターを、細胞株中にトランスフェクションする方法としては、公知の各種の方法を採用することができる。例えば、レトロウイルスベクターによる感染、リン酸カルシウム沈殿法、エレクトロポーション法または、脂質、またはリン脂質を用いたリポフェクション法等のトランスフェクション技術が採用される。これらのうちでは、レトロウイルス感染によるトランスフェクションが、効率が良いために最も好ましい。
【００２７】
上皮細胞を培養するための培地としては、通常はNa、Mg、Ca等の金属イオンを含んだ生理食塩水に各種アミノ酸、例えばL-Arg、L-Cys、L-Gln、L-His、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、各種アミノ酸、及び各種ビタミン、例えば葉酸、パントテン酸、ニコチンアミド、ピリドキサール、リボフラビン等を含む市販の細胞培養基本培地、あるいは該基本培地にインスリン、トランスフェリン、ＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、牛血清アルブミン、亜セレン酸ナトリウム等の培地添加物を添加した培地等を用いることができる。これらの市販されている培地の中では、例えば、デルベッコ改質イーグル培地（Dulbecco
MEM）としてタカラバイオ社から入手できる培地等を用いることができる。
【００２８】
上記培地を入れて培養するための容器としては、動物細胞培養用の公知の各種容器を用いることができる。このような容器としては例えば、ペトリ皿、シャーレ等を挙げることができる。
【００２９】
本発明の卵巣表層上皮不死化細胞の製造方法につき手順を追って説明すると、まず、ヒトの卵巣組織を入手し、卵巣の表層上皮細胞を分離し採取する。この採取した卵巣上皮細胞は、精製、純化する。
【００３０】
遺伝子組替えのために、上記したベクター、好ましくは、pCLXSNベクター（イムゲネックス社製／Imgenex
Corp）とpMSCVプロベクターを準備する。このベクターを用いてＨＰＶウイルスのＥ７遺伝子とhTERT遺伝子を導入する。導入遺伝子は予めＰＣＲ等の手法によりＤＮＡをコピーしておくことが好ましい。
【００３１】
ベクターに目的の遺伝子を導入するには、公知のごとく例えば制限酵素／ＤＮＡリガーゼを用いることにより行うことができる。また、エンハンサー、プロモーターとスプライシングシグナルの間にＥ７またはhTERTのｃＤＮＡを組込む公知の方法を用いることができる。ＨＰＶのＥ７遺伝子、及び／または、hTERT遺伝子とはそれぞれ別のベクターに組み込み、最初にＨＰＶのＥ７遺伝子を、次いでhTERT遺伝子を導入するようにした方が染色体数の分布の狭い卵巣表皮不死化細胞が得られるため、好ましい。
【００３２】
上記方法で製造したレトロウイルスベクターは２９３細胞にて増殖させ、精製することが可能である。
【００３３】
上記方法で得たＨＰＶのＥ７遺伝子、及びhTERT遺伝子を組み込んだpCLXSN、pMSCVプロレトロウイルスベクターを上記した公知の方法にて、初期培養した卵巣表層上皮細胞に感染させ、遺伝子を導入する。
【００３４】
ベクターにより細胞内にＨＰＶのＥ７遺伝子およびhTERT遺伝子を導入した卵巣表層上皮細胞は、通常３０〜３８℃、好ましくは３７℃で保温した培養容器で培養する。炭酸ガス５％程度に生体内に近い状態とした方が好ましい。細胞が培養容器に接着した後、細胞が増殖し、培養容器の底で細胞がコンフルエントになったら、例えばトリプシン−ＥＤＴＡ等の細胞解離剤により細胞を培養器の底より遊離させ個々の細胞に単離させた後、別の培養容器に移し継代を行う。培地は適宜交換を行う。この後は適宜継代を繰り返す。
【００３５】
通常の卵巣表層上皮細胞は、７〜８回程度継代培養を繰り返すと分裂しなくなるが、本発明の方法で製造された不死化卵巣表層上皮細胞は、実施例に示したように５０回継代を繰り返した後も分裂して増殖する能力を有している。
【実施例】
【００３６】
実施例を挙げて本発明につき詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら制約されるものではない。
【００３７】
（実施例１）
（上皮細胞の採取）
手術患者から同意を得て医学的適応で摘出された正常卵巣からスクレイピング（擦過）法で卵巣表層上皮（ＯＳＥ）細胞を採取した。
【００３８】
ベクターとしては、pCLXSNプロウイルスベクター、及びpMSCVプロウイルスベクターを用いた。このpCLXSNならびにpMSCVプロウイルスベクターはイムゲネックス（Imgenex）社ならびにクローンテック（Clonetech）社から入手したものを用いた。
【００３９】
国立がんセンターウイルス部にて、Ｅ７遺伝子ならびにhTERT遺伝子を組み込み製造したpCLXSNならびにpMSCVプロウイルスベクターを用いた。
【００４０】
ＤＮＡ導入の１日前に、５ｘ１０５個のＯＳＥ細胞を洗浄し、１００ｍｍの培養皿（ベクトン−ディッキンソン社製）に散布し、予備培養した。予備培養の後、上記方法で製造したＥ７遺伝子導入レトロウイルスベクターを卵巣表層上皮細胞に感染することで導入した。Ｅ７遺伝子を導入した細胞群を５％ＣＯ２の存在下で３５℃、２４時間培養を行った。次いでhTERT遺伝子導入ウイルスベクターを、同じ方法により卵巣表層上皮細胞内に導入した。
【００４１】
得られた細胞が目的の遺伝子組替え細胞であるかどうかは、免疫蛍光検査で確認した。次ぎに、ＤＮＡ含有培地を除き、細胞を燐酸含有食塩水で２回洗浄し、遺伝子組替えＯＳＥ細胞を、新鮮な１５％牛胎児血清（FBS）を含むＧＩＢＣＯ社製デルベッコ改質イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２ １：１ 混合液、１００U/mlペニシリンＧ１００μg/mlストレプトマイシン）で、培養容器に入れ、３７℃、５％ＣＯ２の存在下で培養を行った。培養容器としては、３０ｍｍのプラスチック容器（ベクトン−デキンソン社製）を用いた。
【００４２】
培養ＯＳＥ細胞がディッシュの底を一様に占拠した後、培養細胞を０．２５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ溶液により培養用容器から剥離し、それを８等分し、それぞれを新しい培地で培養し、継代した。培地はその２／３を除去し、新しい培地を加えた。培養は当初はＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２の１０％ＦＢＳ中で、安定後はＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２の２％ＦＢＳ中で行なった。
【００４３】
（評価）  
上記の方法で５０継代培養したＯＳＥ不死化細胞は、免疫染色においてサイトケラチン陽性、ビメンチン陽性、ＥＭＡ陰性で、また、形態学的にも不死化処理前のヒト卵巣表層上皮細胞と同じであった。また、ウエスタンブロットにてｐ５３ならびにｐ１６の発現の抑制が、トラップアッセイにてテロメラーゼの活性化が確認された。
【００４４】
上記方法で得たＯＳＥ細胞について、トリパンブルーを用いて経時的に細胞数を測定した。２５ｃｍ２のコーニング社製フラスコに２．５ｘ１０５個の細胞を播種し、３日目より毎日細胞数を測定した。その結果倍加時間は３６時間であった。
【００４５】
上記方法で得たＯＳＥ細胞について、染色体分析を行った。染色体分析はＧ−バンド（ｂａｎｄ）法により行った。またこの細胞の４８時間ＰＨＡ無添加で着床培養後、細胞の染色体の数と核型とを測定した。
【００４６】
染色体標本は通常の空気乾燥法にて作成しトリプシン−ギムザ染色法にて染色した後顕微鏡観察した。結果を表１に示す。検査した５０個の細胞全てが染色体数４６個と２倍体であった。核型分析においては、若干の異常が認められた。
【００４７】
【表１】
0004613263.tif 000002
【００４８】
（参考例１）
実施例１において、Ｅ７遺伝子の代わりにＥ６遺伝子とＥ７遺伝子との混合物を用いる以外は実施例１と同様に行った。結果を表２に示す。
【００４９】
（評価）  
不死化細胞は、免疫染色においてサイトケラチン陽性、ビメンチン陽性、EMA陰性で、初期のヒト卵巣表層上皮細胞と同じであった。染色体分析では、４４個の染色体数を中心に４３から５５までと２倍体の染色体数が分布していた。
【００５０】
【表２】
0004613263.tif 000003
【００５１】
（比較例１）
非特許文献１に記載されたＳＶ４０largeT抗原を用いて不死化したヒト卵巣表層上皮細胞を製造した。得られたヒト卵巣表層上皮不死化細胞の中で正常卵巣表層上皮細胞の性格に近い細胞株の染色体分析を行った。分析結果を表３に示す。染色体分析では５８個の染色体数を中心に５５から６３まで分布していた。
【００５２】
【表３】
0004613263.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の方法で得られたヒト不死化卵巣表層上皮細胞株は、上皮性卵巣癌の発現機構の解明を行っていく上で非常に有用な細胞である。例えば、上皮性卵巣癌において、ある種の遺伝子発現が癌化にともなって亢進または減弱しているかどうかを判定する上で、この癌の発生母細胞の発現との比較が必須であり、不死化したヒト卵巣表層上皮細胞は安定したコントロール細胞として使用することができる。
【００５４】
また、卵巣癌における多種類の遺伝子発現パターンの解析による抗癌剤の選択が重要視されてきており、その発現パターンの解析に必要なｃＤＮＡ発現アレイ等の需要の増加が予想される。このｃＤＮＡ発現アレイ安定したコントロール細胞としても、この不死化した卵巣表層上皮細胞は有用であると考えられる。