(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物の腫瘍-宿主相互作用への影響をアッセイする方法であって、
免疫無防備状態のトランスジェニックマウスを前記薬物と接触させる工程、ここで、前記マウスは、第１の蛍光タンパク質に適合した励起照射にさらした時に前記蛍光タンパク質によって放出される光の色が完全に現れるように基本的にすべての組織において前記蛍光タンパク質を発現するが、マウスの免疫無防備状態の表現型は維持しており、前記マウスには腫瘍細胞が移植されており、また前記腫瘍細胞は、第１の蛍光タンパク質とは異なる発光スペクトルを有する第２の蛍光タンパク質を発現するよう改変されている、；
前記第１および第２の蛍光タンパク質の発光を観察することによって、腫瘍−宿主細胞相互作用を画像化する工程；および
結果として得られた画像を前記薬物と接触させなかった対照マウスとを比較する工程；
を含んでなる、前記方法。
【請求項２】
前記観察が生きている無傷のマウスの全身イメージングによる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍細胞が前記マウスに同所移植される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第１の蛍光タンパク質が緑色であり、第２の蛍光タンパク質が赤色である請求項１−３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
免疫無防備状態のマウスがnu/nuマウスである請求項１−４のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、免疫無防備状態を維持する一方で、複数の組織において緑色蛍光タンパク質（GFP)を可視的に発現する、トランスジェニック胸腺欠損ヌードマウスの作製および使用に関する。こうしたマウスを、前記マウスに存在する腫瘍ならびに転移の可視化を含めた、細胞および組織の全身の光学イメージングに使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
緑色蛍光タンパク質（GFP)の発色団は65位から67位のアミノ酸Ser-Tyr-Glyの環状化を含む（Cody, .C.Wら、Biochemistry 32, 1212-1218, 1993）。オワンクラゲからの基質は蛍光の産生のためには必要ではない（Chalfie, Mら、Science (1994) 263:802-805）。
【０００３】
異系、すなわちシノラブディス・エレガンス（Chalfie, Mら、Science (1994) 263:802-805）でのGFPの発現は、in vivoでのマーカーとしてこの単純なレポーター遺伝子の将来性を実証した。キイロショウジョウバエ（Wang, Sら、Nature (1994) 369:400-403）、ゼブラフィッシュ（Peters, K. G.ら、Dev. Biol. (1995) 171:252-257; Amsterdam, Aら、Dev. Biol. (1995) 171:123-129）、タマホコリカビおよびシロイヌナズナ（Sheen, J.ら、Plant J. (1995) 8:777-784; Hu, W.ら、FEBS Lett. (1995) 369:331-334）などのトランスジェニック動物および植物は野性型GFPを使用してそれ以来作成された。
【０００４】
Okabeら（「偏在する緑色細胞の供給源としての”緑色マウス”」、FEBS Lett. (1997) 407:313-319）は、野生型GFPをpCAGGS（ニワトリβ-アクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルスエンハンサー、β-アクチンイントロンならびにウシ グロビンポリアデニル化シグナル（Niwa, H.ら、Gene (1991) 108:193-199)を含有する）内に挿入し、トランスジェニックマウス系統を作製した（Ikawa, M.ら、FEBS Lett. (1995) 375:125-128; およびIkawa, M., Dev. Growth Diff. (1995) 37: 455-459）。鮮やかな緑色発光が、上記トランスジェニックマウス系統のうち20を超える系統の筋肉および膵臓において観察されたが、GFP発現は常にどこにでも存在するわけではなく、他の組織では発光を肉眼で見ることはできなかった。改変蛍光スペクトルおよび増加した減衰係数を有する種々の変異GFPが作製された（Delagrave, Sら、BioTechnology (1995) 13:151-154；Heim, Rら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:12501-12504）。Okabeらは、上記発現系でヒト化強化緑色蛍光タンパク質（EGFP)（S65T+F64L)を使用した。EGFP構築体を用いて作製したトランスジェニックプライスマウスは、着床前の胚から成体段階に至るまで全身でEGFPトランスジーンを発現する。
【０００５】
緑色の雄の精子と受精した野生型卵は2細胞期には緑色でないが、その後、胚発生の次の段階の後に緑色となった。新生仔は緑色蛍光を発した。血管はEGFPを有する系統において「明らかな発色」と分類された。これらの動物の毛は緑色ではなかった。トランスジェニックマウスは毛および赤血球を除いて一様に緑色であった。脳、肝臓、腎臓、副腎および精巣、肺、筋肉、心臓、腸、ならびに脂肪組織、胸腺、脾臓および精細胞は青い励起光を照射したときに緑色蛍光を発した。コドン使用のヒト化への変更は、EGFPの普遍的発現の原因となっている可能性がある。
【０００６】
クラゲにおいて、GFPは通常ミクロボディ様ルミゾーム中に隔離されている。トランスジェニックマウスにおいて、GFPが発現し、細胞質ゾル中に均一に分布した。トランスジェニック系統は相当量のEGFPの発現にもかかわらず正常であった。したがってEGFPは無毒のように見えた。
【０００７】
本明細書において文書の引用は、いずれも関連先行技術であるとの自認を意図するものではない。日付に関するあらゆる記述、または文書の内容に関する説明は本出願人に入手可能な情報に基づいており、日付の正確さ、もしくは文書の内容に関する承認をなすものではない。
【発明の開示】
【０００８】
明らかでない理由によって、トランスジェニック胸腺欠損nu/nuマウスは極めてまれである。本発明はこのようなGFP発現トランスジェニックヌードマウスの製造を提供する。このマウスは、in vivoでの細胞および組織の画像化に一般に有用である。さらに、これらのマウスは、とりわけ他の種由来の移植された細胞もしくは組織のレシピエントとして使用できるが、これらは本発明のトランスジェニックマウスのGFP発現細胞および組織を背景に観察される。その他、移植された細胞もしくは組織は、それに限定するわけではないが別の蛍光タンパク質のような、目に見える指標を発現する。移植された細胞もしくは組織は、本発明のトランスジェニックマウスのGFP発現細胞および組織を背景として対比によって観察することもできる。
【０００９】
移植された細胞もしくは組織は、その増殖特性および／または広がりをモニターすべき腫瘍細胞、またはそうでなければ癌性の細胞を包含することができる。これらの細胞は、上記のとおり、目に見える指標を発現することもあり、また発現することもできる。
【００１０】
本発明のマウスは、宿主であるマウスの組織
と移植された細胞もしくは組織との間の相互作用に対するさまざまな薬剤の効果をスクリーニングするのに使用することもできる。こうした薬剤の例としては、宿主-移植片相互作用を調節する、または移植された細胞もしくは組織の増殖および広がりを調節する、薬物もしくは候補薬物がある。
【００１１】
本発明のマウスは、さらなる検討を目的とする、および／または別の動物もしくは胚への移植を目的とする、GFP発現細胞もしくは組織の供給源として使用することもできる。場合によっては、このような移植は事実上連続的であって、一実施形態として加齢を研究するために使用することができる。本発明のマウスからのその他の細胞および組織はGFPを発現する胚および幹細胞を包含し、胚細胞および成体幹細胞を含むがこれらに限定されるものではない。
【００１２】
本発明は、またGFP発現マウスをnu/nuマウスと初回交配することによるGFP発現胸腺欠損nu/nuマウスの作製を提供する。
そこで一代雑種(F1)を集め、相互に交配させてGFP発現nu/nuマウスを含めた子孫を生み出す。その後F1×F1交配から得られた雄および雌のGFP発現nu/nuマウスを用いて、GFP発現nu/nuマウス子孫を作り出す。これらの結果として得られたマウスをnu/nu GFP非発現nu/nuマウスと交配してGFP発現nu/nuマウスを維持することができる。
【００１３】
さらに、本発明のマウスはGFPを発現するとして記載される。「GFP」は、種々の色の自動蛍光タンパク質（一般的に緑色蛍光タンパク質（GFP)のとして知られている。）の一般名であることが良く知られている。本明細書で使用される「GFP」は、どのような波長であれ蛍光を発する蛍光タンパク質および強化された形のGFP、ならびに発光オワンクラゲ緑色蛍光タンパク質を表す。当業界で広く知られている、たとえば蛍光色素といった、目に見える指標で標識された移植された細胞もしくは組織の性状は、宿主において発現される蛍光タンパク質と比較して、移植される細胞もしくは組織において異なる色の蛍光タンパク質が使用されるように選択される。限定的でない例として、本発明のトランスジェニックnu/nu マウスにおいて緑色GFPが発現されるならば、その場合移植される細胞もしくは組織は赤色蛍光タンパク質（RFP）を発現することができる。
【００１４】
さらに、複数の細胞もしくは組織を移植する場合には、異なる色による標識が本発明によって与えられ、複数の細胞もしくは組織を同時に可視化、および／または追跡することを可能にする。限定的でない他の蛍光色の例は、黄、青および近赤外を包含する。他の蛍光指標の発現は状況に応じて個々の細胞型、遺伝子もしくは方法に特異的であってもよい。このような特異性を与える方法の限定的でない例は、蛍光指標をコードする配列を、細胞特異的なプロモーター、特定の活性化事象に対して反応するプロモーター、当該の特定の遺伝子発現を制御するプロモーター、および当該の細胞プロセスに含まれる遺伝子産物の発現を制御するプロモーターの調節制御下となるように機能的に連結することを包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、GFPを発現する胸腺欠損nu/nuマウスならびにそれらを作製し使用する方法に関する。このマウスは基本的にすべての組織において、好ましくは発光を肉眼で見ることができるレベルで、GFPを発現する。それとは別にこのマウスは胸腺欠損nu/nuマウスであって、そのまま使用することもできるし、またこれに限定されるわけではないが、ヒト腫瘍組織の移植片もしくは他の異種移植片を受け入れるための宿主としての使用を含む。
【００１６】
マウスを、GFPを発現する細胞および／または組織の供給源として使用することもできる。このような組織の限定的でない例は、胚もしくは胚組織；幹細胞、ならびに脳、肝臓、腎臓、副腎、精巣（精細胞を含める）、肺、筋肉、心臓、腸、卵巣および脾臓の細胞もしくは組織、ならびに脂肪組織を包含する。
【００１７】
一形態において、本発明のマウスは、Yangら（”Visualizing Gene Expression by Whole-Body Fluorescence Imaging.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000)97:12278-12282）によって示されたように、非侵襲的手法で遺伝子発現を可視化し、無傷の動物において導入遺伝子の発現を可視化することができる。そうしたシステムは、無傷の生きたマウスの主要な臓器において導入遺伝子発現の迅速な可視化を可能にするが、その可視化は簡単、迅速でしかも非常に割安である。GFPのような標識が脳、肝臓、膵臓、前立腺および骨髄といった細胞内に発現され、その蛍光は全身の光学画像として記号化される。限定的でない例として、透過照射エピ蛍光解剖顕微鏡を用いて高倍率のイメージングを行うことができる一方で、蛍光ライトボックス上で、熱電冷却型カラー電荷結合装置カメラによって直視して、低倍率のイメージングを行うことができる。
【００１８】
本発明のヌードマウスは発現可能なベクターが産生する蛍光タンパク質（20-100μl PBSおよび10%グリセロール中のアデノウイルスGFPの8×1010プラーク形成単位／mlであるがそれに限定されない）を、脳、肝臓、膵臓、前立腺もしくは骨髄といった組織内に直接注入することによって、標識することができる。注入後5-8時間以内に、脳のような組織内で発現されたGFPの蛍光が目に見えるようになり、全身画像がビデオの速度で記録される。GFP蛍光は少なくとも12時間増加を続け、4ヶ月に至るまで肝臓のような組織において検出可能な状態を保つ。外来の造影剤も放射性物質も長い処理時間も必要なしにリアルタイム記録をとることができる（この場合、ベクターが産生するGFPはマウスにおいて発現するGFPと同じではない）。この方法は、発現される遺伝子もしくはプロモーターがベクターが産生するGFPと融合し、または機能しうるように結合していることのみを必要とし、それによって、比較的不透明な生物において、適当なタグを付けた遺伝子の治療上ならびに診断上の可能性に関する研究が可能になる。
【００１９】
別の態様において、全身の光学イメージングシステムを記載するYangら（”Whole-Body Optical Imaging of Green Fluorescent Protein-Expressing  Tumors and Metastases、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000) 97:1206-1211）によって教示されるように本発明のマウスを画像化して使用することもできる。外部にあり、非侵襲的な全身画像化システムが好ましい。このようなシステムは、これまでに例のない、細胞の増殖および広がりに関する連続視覚化モニタリングを与えるが、これは無傷の動物内での移植された（しかも場合によっては癌性の）細胞もしくは組織が示すものを包含する。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、本発明のマウスは、生きたマウスにおいて増殖し転移する、移植された蛍光を発する腫瘍を含有する。このような腫瘍の限定的でない例は、Yangら（上記）に記載の非常に高レベルのGFPを安定して発現するヒトおよび齧歯動物の腫瘍を包含する。本発明のnu/nuマウスにおいて発現されるGFP以外のGFPを発現する腫瘍が好ましい。
【００２１】
限定的でない例として、B16F0-GFPマウス黒色腫細胞が6週齢の本発明のヌードマウスの尾静脈または門脈に注入される。全身の光学画像を用いて、たとえば脳、肝臓および骨に発現するような、転移病変が示される。B16F0-GFP細胞は容易に可視化され、上記器官のそれぞれにおいて腫瘍増殖のリアルタイムの定量的な測定を与える。
【００２２】
別の非限定的な例として、AC3488-GFPヒト大腸癌を外科的に本発明のヌードマウスに同所移植することができる。全身光学画像を用いて、リアルタイムで、原発性大腸癌、ならびに肝臓および骨格におけるその転移病変の増殖を示すことができる。
【００２３】
転移および微小転移が画像化される深さはそれらのサイズによる。60-mmの直径の腫瘍は0.5ｍｍの深さで検出可能であるが、1,800mmの腫瘍は2.2-mmの深さで可視化される。強力なGFP蛍光で可能となった、簡単で、進行する腫瘍の非侵襲的で高度に選択的な画像化は、本発明のマウス中での腫瘍の進行および転移の詳細な画像化を可能とする。本発明はまた、そのようなマウスを用いて癌増殖のモジュレーターを同定し、またはスクリーニングする方法を提供する。ある実施形態において、可能性のある化学療法薬による阻害を確認するためにその方法を使用することができる。
【００２４】
Yangら（”Whole-Body and Intravital Optical Imaging of Angiogenesis in Orthotopically Implanted Tumors,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2001) 98:2616-2621）によって教示されるように血管新生を画像化するために本発明のマウスを使用することもできる。したがって、本発明は腫瘍が引き起こす血管新生をアッセイする方法も提供するものである。こうした方法は、本発明のヌードマウスへの移植のためにGFPで標識された腫瘍を使用することによって、同所移植モデルを血管新生の測定用に適合させるものである。異なる色を発するGFPを使用することによって、ヌードマウスのGFP発現毛細血管が腫瘍の蛍光を背景として明確に可視化され、リアルタイムで、生体内でも、全身像によっても調べられる。好ましくは上記がヒトの腫瘍について実施され、同所移植されたヒト膵癌の生体内画像が原発および転移部位に血管新生毛細血管を示すことが可能となる。血管新生の量的なタイムコースは、同所性に増殖するヒト前立腺腫瘍について測定することができ、19日間にわたって単一のヌードマウスの生体内で画像化される。
【００２５】
蛍光性Lewis肺癌細胞を本発明のヌードマウスの足蹠の皮下部位に注入することによって、腫瘍血管新生に関する全身の光学イメージングが示される。足蹠は比較的光透過性であって、内在する血管が比較的少なく、したがって無傷な動物において腫瘍血管新生（毛細血管の増加）の定量的なイメージングが可能となる。
【００２６】
もう一つの実施形態において、GFPを発現するヒト乳癌MDA-MB-435をヌードマウスの脂肪体に同所移植することができるが、その後それを画像化して、20週間まで、またはそれを越えるような長期間にわたって連続的に血管密度の変化、特に増加を検出する。上記のように血管新生に対する薬剤の影響を観察することによって、このように効果的で臨床に適した血管新生ヌードマウスモデルを、生理的な微小環境において腫瘍血管新生を阻害または促進する薬剤のリアルタイムin vivo評価のために使用することもできる。
【００２７】
さらに別の態様において、本発明のマウスを、Yangら（”Direct External Imaging of Nascent Cancer, Tumor Progression, Angiogenesis, and Metastasis on Internal Organs in the Fluorescent Orthotopic Model,”Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2002) 99:3824-3829）によって記載されたのと同様に使用して、介在する組織、もっとも特徴的には皮膚、による光散乱に起因する外部イメージングの感度の限界を乗り越えることができる。したがって、本発明はシグナルの減衰を顕著に減少させ、検出感度を何倍にも高めるために光路に可逆的な皮弁を切開することを提示する。観察可能な組織の深さが大きく増大し、以前は隠されていた多くの腫瘍が明瞭に観察可能となる。
【００２８】
ある実施形態において、蛍光タンパク質を発現する単一の腫瘍細胞を脳に接種して、頭皮皮弁を通して画像化する。いくつかの細胞に相当する肺腫瘍の微小病巣が胸壁上の皮弁を通して見られる一方、対側転移は対応する皮弁を通して画像化される。膵臓腫瘍およびその血管形成微小血管は、腹膜壁皮弁を用いて画像化される。肝臓上の皮弁は、同所移植された腫瘍に由来する生理学的に関連性のある微小転移の画像化を可能にする。門脈内注入に起因する肝臓上の単一腫瘍細胞も検出可能である。2つの異なるGFPを発現する細胞もしくは組織、たとえばヌードマウス組織と移植された組織、または2つの移植された組織、もまた皮弁を用いて可視化することができる。前立腺もしくは周辺領域の領域を可視化するために下腹部の皮弁を使用することが特に好ましい。
【００２９】
移植用の細胞または組織にGFPを与える方法は周知のことである。標準的な方法を用いて、腫瘍細胞に1または複数の蛍光タンパク質のための発現系を与えることができる。当該細胞にin vitroで形質導入し、in vitroもしくはin vivoで増殖させて腫瘍とし、その結果得られた腫瘍をモデル被験体に移植することができる。細胞を注入し、または外科的に移植することができる。外科的な同所移植が好ましい。しかしながら、蛍光タンパク質を安定して発現する、改変された腫瘍細胞をモデルに与える他の方法も使用することができる。さらに、動物内にすでに存在する腫瘍に感染させることによって、内因性腫瘍もしくは導入された腫瘍を有する本発明のヌードマウスにウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターを与えることができる。このベクターは、好ましくは、前から存在している腫瘍に局所的に直接導入される。
【００３０】
一般に、観察のために蛍光発光に依存する、腫瘍の進行、血管新生、および／または転移に関するモデルはいずれも、本発明のマウスおよび方法とともに使用することができる。本発明の方法は可逆的に開閉できる皮弁を提供することを含む。一般的には、動物を麻酔した後、皮膚に円弧の形の切開を行い、皮下結合組織を分離して皮弁を開閉可能とする。皮弁は、縫合によって閉じることができる。このように、本発明は、本発明のヌードマウスに基づいて腫瘍モデル系の体内の器官に関して行う観察を提供する。
【００３１】
開放された皮弁から直接、標識された腫瘍細胞を観察できることは、本発明のモデル系の感度および解像度を大いに高める。このモデルを使用して、状況の進行を簡単にモニターすることができ、あるいは、まったく治療しない場合よりも否定的な結果をもたらしうる影響を評価するのはもちろん、可能性のある治療法を評価する手段としても使用することができる。この場合、化合物および／またはプロトコールが実験動物に与えられ、その化合物および／またはプロトコールの存在しない対照と比較される。これらの実験条件下で、腫瘍の進行、血管新生および／または転移を強めることは、その化合物および／またはプロトコールが当該被験体に対して有害であることを示し、同様に、上記の事項のいずれかを阻害することは、その化合物および／またはプロトコールを可能性のある治療法と認定する。
【００３２】
多くの場合、単一腫瘍の転移を観察するために単一色が用いられる。しかしながら、本発明の方法はそれぞれ異なる色の蛍光タンパク質で標識された2個以上の腫瘍を同時に観察することを包含する。この方法を利用することによって、複数の腫瘍進行に関する複数の観察が得られるのみならず、それぞれの腫瘍の他に対する効果もしくは干渉を直接観察することもできる。
【００３３】
本発明の方法は多くの利点を有する。第1に、感度が高まったことによって、蛍光を発する宿主細胞および組織を背景として、わずかに１もしくは2つの移植細胞の観察が可能となる。第2に、血管新生が直接観察可能であって、これは化合物およびプロトコール案の治療上の有効性を評価する際にきわめて重要である。第3に、複数の移植された組織（たとえば腫瘍）を同時に観察することが可能である。このことは、異なる組織もしくは腫瘍の間に干渉現象があるために、特に重要である。複数の異なる色を使用することができるため、別々の組織もしくは腫瘍の相互作用を直接観察することができる。第4に、免疫無防備状態の蛍光齧歯動物において相当長期間にわたって観察を行うことが可能であるため、活発に増殖する細胞と休止細胞を区別することができる。したがって、本発明の方法によって休止細胞の存在を確定することができる。
【００３４】
もう一つの態様において、本発明のマウスは、ヌードマウス組織のGFPを背景として画像を生じさせるために、検出可能な、好ましくは肉眼で見える、化合物を注入することができる。限定的ではない例として、目に見える指示薬、たとえば色素を本発明のマウスの血流に注入して循環系のすべてもしくは一部を可視化することができる。これは、マウスの血液細胞が目に見えるGFPを発現せず、血流が検出可能な発光のない状態となっている場合に特に適している。
【００３５】
本発明を一般的に記載したが、同様なことは実例によって提供される以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるが、特別の定めのない限り、本発明を限定することを意図したものではない。
【実施例１】
【００３６】
GFP発現ヌードマウスの作製
C-57 B16-GFPマウスをnu/nuマウスと交配した。
F1世代を集めて相互に交配した。2匹のまれなGFP nu/nuマウス、1匹の雄と1匹の雌が得られた。このGFP nu/nu雄およびGFP nu/nu雌を互いに交配して、同腹の6匹のGFP nu/nuマウスを作製した。
雄のGFP nu/nuマウスを雌のnu/nu非GFPマウスと交配した。9匹のヌードnu/nu出生仔が生まれた。すべてが全体的に蛍光を発現した。