(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）：
【化１】
0004665758.tif 000012
〔式中、Ｒ１は次式（ＶＩＩ）：
【化２】
0004665758.tif 000013
（式中、Ｒ４は、水酸基又は水素原子を表し、Ｒ５及びＲ６は、互いに独立し、同一又は異なって、置換されてもよい水酸基を表す。）で示される基を表し、Ｒ２は水素原子、アミノ基、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、Ｒ３−オキシ基又はＲ３−アミノ基（Ｒ３は、置換されてもよい炭素数１〜１５のアルキル基又は置換されてもよい炭素数１〜１５のアシル基を表す。）を表す。〕
で示されるチオヌクレオシド−Ｓ−ニトロシル誘導体又はその塩。
【請求項２】
次式（ＩＩ）：
【化３】
0004665758.tif 000014
〔式中、Ｒ１は次式（ＶＩＩ）：
【化４】
0004665758.tif 000015
（式中、Ｒ４は、水酸基又は水素原子を表し、Ｒ５及びＲ６は、互いに独立し、同一又は異なって、置換されてもよい水酸基を表す。）で示される基を表し、Ｒ２は水素原子、アミノ基、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、Ｒ３−オキシ基又はＲ３−アミノ基（Ｒ３は、置換されてもよい炭素数１〜１５のアルキル基又は置換されてもよい炭素数１〜１５のアシル基を表す。）を表す。〕
で示されるチオヌクレオシド−Ｓ−ニトロシル誘導体又はその塩。
【請求項３】
次式（ＩＩＩ）：
【化５】
0004665758.tif 000016
〔Ｒ１は次式（ＶＩＩ）：
【化６】
0004665758.tif 000017
（式中、Ｒ４は、水酸基又は水素原子を表し、Ｒ５及びＲ６は、互いに独立し、同一又は異なって、置換されてもよい水酸基を表す。）で示される基を表し、Ｒ２’は酸素原子、硫黄原子又はイミノ基を表す。〕
で示されるチオヌクレオシド−Ｓ−ニトロシル誘導体又はその塩。
【請求項４】
次式（ＩＶ）：
【化７】
0004665758.tif 000018
〔式中、Ｒ１は次式（ＶＩＩ）：
【化８】
0004665758.tif 000019
（式中、Ｒ４は、水酸基又は水素原子を表し、Ｒ５及びＲ６は、互いに独立し、同一又は異なって、置換されてもよい水酸基を表す。）で示される基を表し、Ｒ２は水素原子、アミノ基、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、Ｒ３−オキシ基又はＲ３−アミノ基（Ｒ３は、置換されてもよい炭素数１〜１５のアルキル基又は置換されてもよい炭素数１〜１５のアシル基を表す。）を表す。〕
で示されるチオヌクレオシドとニトロシル化合物とを反応させることを特徴とするチオヌクレオシド−Ｓ−ニトロシル誘導体の製造方法。
【請求項５】
次式（Ｖ）：
【化９】
0004665758.tif 000020
〔式中、Ｒ１は次式（ＶＩＩ）：
【化１０】
0004665758.tif 000021
（式中、Ｒ４は、水酸基又は水素原子を表し、Ｒ５及びＲ６は、互いに独立し、同一又は異なって、置換されてもよい水酸基を表す。）で示される基を表し、Ｒ２は水素原子、アミノ基、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、Ｒ３−オキシ基又はＲ３−アミノ基（Ｒ３は、置換されてもよい炭素数１〜１５のアルキル基又は置換されてもよい炭素数１〜１５のアシル基を表す。）を表す。〕
で示されるチオヌクレオシドとニトロシル化合物とを反応させることを特徴とするチオヌクレオシド−Ｓ−ニトロシル誘導体の製造方法。
【請求項６】
次式（ＶＩ）：
【化１１】
0004665758.tif 000022
（Ｒ１は次式（ＶＩＩ）：
【化１２】
0004665758.tif 000023
（式中、Ｒ４は、水酸基又は水素原子を表し、Ｒ５及びＲ６は、互いに独立し、同一又は異なって、置換されてもよい水酸基を表す。）で示される基を表し、Ｒ２’は酸素原子、硫黄原子又はイミノ基を表す。）
で示されるチオヌクレオシドとニトロシル化合物とを反応させることを特徴とするチオヌクレオシド−Ｓ−ニトロシル誘導体の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の誘導体又はその塩を含む１２〜２２塩基の長さを有するオリゴ核酸。
【請求項８】
少なくとも１５塩基の長さを有するものである請求項７記載のオリゴ核酸。
【請求項９】
請求項７又は８記載のオリゴ核酸とその相補鎖とを反応させることにより、前記オリゴ核酸に含まれるニトロシル基をその相補鎖中の対応塩基に転移させることを特徴とするニトロシル基の転移方法。
【請求項１０】
請求項７又は８記載のオリゴ核酸とその相補鎖とを反応させ、得られる反応産物を酸性条件下で処理することを特徴とする塩基配列の変異誘発方法。
【請求項１１】
塩基配列が、オリゴ核酸中の誘導体に対応する塩基配列である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
変異がウラシルへの変異である請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項７及び８記載のオリゴ核酸からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む、塩基配列の変異誘発剤。
【請求項１４】
請求項７及び８記載のオリゴ核酸からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む、塩基配列の変異誘発用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、核酸を操作する技術の分野に属し、特に、特定の塩基を認識して配列特異的にニトロシル基を転移するオリゴ核酸を得るのに有用な新規化合物であるチオヌクレオシド−Ｓ−ニトロシル誘導体に関する。
【背景技術】  特定の遺伝子の核酸に対して、その核酸配列に特異的なオリゴ核酸あるいは核酸類似体を特異的に結合させ、化学結合を形成し、遺伝子発現を制御する方法が知られている（「ゲノムケミストリー」、関根／斉藤編、講談社、２００３年、東京など）。特に最近、化学結合の構造によっては結合部位において点変異を誘起できることが示された（例えば、Ｎａｇａｔｓｕｇｉ，Ｆ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｓ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐ．Ｓ．，Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．３１（６），ｅ３１（２００３）など）。このように配列特異的に点変異を誘起する方法は、生化学的な実験ツールとして利用されるばかりでなく、遺伝子の異常を含む様々な病気の根本的な治療に応用できる可能性があることから、生化学および医学・薬学の分野において大きな関心が持たれている。
一方、一酸化窒素（ＮＯ）は細胞内情報伝達物質として重要な働きをもっている（例えば、Ｌ．Ｊ．Ｉｇｎａｒｒｏ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，６７（１），１，（１９９０）など）。また生体内ではＳ−ニトロソチオールが一酸化窒素（ＮＯ）運搬体として作用していると考えられている（例えば、Ｄ．Ｌ．Ｈ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，３２，８６９（１９９９）など）。一酸化窒素（ＮＯ）は、情報伝達の役割以外に生体内で酸化剤として作用し、ＤＮＡ又はＲＮＡ中の塩基と反応し、点変異の原因となることがあると考えられている。そして、化学的な実験では、非特異的に変異が誘起されることが示されている（例えば、Ｊ．Ｌ．Ｃａｕｌｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｓ．Ｗｉｓｈｎｏｋ，Ｓ．Ｒ．Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（２１），１２６８９（１９９８）；Ｎ．Ｙ．Ｔｒｅｔｙａｋｏｖａ，Ｓ．Ｂｕｒｎｅｙ，Ｂ．Ｐａｍｉｒ，Ｊ．Ｓ．Ｗｉｓｈｎｏｋ，Ｐ．Ｃ．Ｄｅｄｏｎ，Ｇ．Ｎ．Ｗｏｇａｎ，Ｓ．Ｒ．Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４４７（２），２８７（２０００）など。）
最近、修飾オリゴヌクレオチドを用いてミスマッチを含む２重挿入部分を作製し、ＤＮＡ鎖交換によるＤＮＡ修復方法が報告された（Ｍ．Ｄ．Ｄｒｕｒｙ，Ｅ．Ｂ．Ｋｍｉｅｃ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１（３），８９９（２００３））。しかしながら、この方法は、モデル実験系ではあるが修復効率が低く、また細胞系への展開に関しても多くの解決すべき課題を持っている。
【発明の開示】
本発明は、チオヌクレオシド−Ｓ−ニトロシル誘導体、標的核酸に特異的にニトロシル基を転移するオリゴ核酸及び配列特異的変異誘発方法を提供することを目的とする。
本発明者は上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、天然の核酸塩基の基本構造のカルボニル基をチオカルボニル基に変換した構造を組み込んだオリゴヌクレオチドを利用し、ニトロシル化を行うことによって新規なニトロシル化合物を含むオリゴヌクレオチドの合成に成功した。さらに、このオリゴヌクレオチドが配列特異的にかつ塩基特異的に、ニトロシル基を転移させることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）次式（Ｉ）：
0004665758.tif 000002
〔式中、Ｒ１はリボース、２−デオキシリボース又はこれらの誘導体を表し、Ｒ２は水素原子、アミノ基、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、Ｒ３−オキシ基又はＲ３−アミノ基（Ｒ３は、置換されてもよい炭素数１〜１５のアルキル基又は置換されてもよい炭素数１〜１５のアシル基を表す。）を表す。〕
で示されるチオヌクレオシド−Ｓ−ニトロシル誘導体又はその塩。
（２）次式（ＩＩ）：
0004665758.tif 000003
〔式中、Ｒ１はリボース、２−デオキシリボース又はこれらの誘導体を表し、Ｒ２は水素原子、アミノ基、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、Ｒ３−オキシ基又はＲ３−アミノ基（Ｒ３は、置換されてもよい炭素数１〜１５のアルキル基又は置換されてもよい炭素数１〜１５のアシル基を表す。）を表す。〕
で示されるチオヌクレオシド−Ｓ−ニトロシル誘導体又はその塩。
（３）次式（ＩＩＩ）：
0004665758.tif 000004
（Ｒ１はリボース、２−デオキシリボース又はこれらの誘導体を表し、Ｒ２’は酸素原子、硫黄原子又はイミノ基を表す。）
で示されるチオヌクレオシド−Ｓ−ニトロシル誘導体又はその塩。
（４）次式（ＩＶ）：
0004665758.tif 000005
〔式中、Ｒ１はリボース、２−デオキシリボース又はこれらの誘導体を表し、Ｒ２は水素原子、アミノ基、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、Ｒ３−オキシ基又はＲ３−アミノ基（Ｒ３は、置換されてもよい炭素数１〜１５のアルキル基又は置換されてもよい炭素数１〜１５のアシル基を表す。）を表す。〕
で示されるチオヌクレオシドとＳ−ニトロシル化合物とを反応させることを特徴とするチオヌクレオシド−Ｓ−ニトロシル誘導体の製造方法。
（５）次式（Ｖ）：
0004665758.tif 000006
〔式中、Ｒ１はリボース、２−デオキシリボース又はこれらの誘導体を表し、Ｒ２は水素原子、アミノ基、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、Ｒ３−オキシ基又はＲ３−アミノ基（Ｒ３は、置換されてもよい炭素数１〜１５のアルキル基又は置換されてもよい炭素数１〜１５のアシル基を表す。）を表す。〕
で示されるチオヌクレオシドとＳ−ニトロシル化合物とを反応させることを特徴とするチオヌクレオシド−Ｓ−ニトロシル誘導体の製造方法。
（６）次式（ＶＩ）：
0004665758.tif 000007
〔式中、Ｒ１はリボース、２−デオキシリボース又はこれらの誘導体を表し、Ｒ２’は酸素原子、硫黄原子又はイミノ基を表す。〕
で示されるチオヌクレオシドとＳ−ニトロシル化合物とを反応させることを特徴とするチオヌクレオシド−Ｓ−ニトロシル誘導体の製造方法。
（７）前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の誘導体又はその塩を含むオリゴ核酸。
本発明のオリゴ核酸としては、例えば少なくとも１２塩基の長さを有するものが挙げられる。
（８）前記（７）記載のオリゴ核酸と該オリゴ核酸に対する相補鎖とを反応させることにより、前記オリゴ核酸に含まれるニトロシル基をその対応塩基に転移させることを特徴とするニトロシル基の転移方法。
（９）前記（７）記載のオリゴ核酸とその相補鎖とを反応させ、得られる反応産物を酸性条件下で処理することを特徴とする塩基配列の変異誘発方法。
本発明の変異誘発方法によれば、オリゴ核酸とその相補鎖との反応産物において、前記オリゴ核酸に含まれるニトロシル基をその相補鎖側の対応塩基に転移させることにより、当該対応塩基をウラシルに変異させることができる。
（１０）前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の誘導体並びに前記（７）記載のオリゴ核酸からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む、塩基配列の変異誘発剤又は塩基配列の変異誘発用キット。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の誘導体によるニトロシル基の転移を示す図である。
図２は、Ｎ−ニトロソ体のカルボニル基への加水分解反応を示す図である。
図３は、本発明のヌクレオシド誘導体の合成工程を示す図である。
図４は、本発明のヌクレオシド誘導体のＨＰＬＣの結果を示す図である。
図５は、本発明のニトロシル化オリゴ核酸の合成工程を示す図である。
図６は、ニトロシル化オリゴ核酸生成のＨＰＬＣの結果を示す図である。
図７は、ニトロシル化オリゴ核酸ＤＡＦ−２の蛍光強度の増大曲線を示す図である。
図８は、オリゴヌクレオチドとその相補鎖の配列およびそれらの反応を示す図である。
図９は、ＮＯ−転移反応を行ったＨＰＬＣの結果を示す図である。
図１０は、オリゴヌクレオチド７を用いてＮＯ−転移反応を行った経時変化を示す図である。
図１１は、オリゴヌクレオチド７とオリゴヌクレオチド９とのＤＡＦ−２との反応生成物を分析し、ＮＯの存在を確認したＨＰＬＣ図である。
図１２は、オリゴヌクレオチド８にＮＯ−転移が起こり生成した９の酵素分解物をＨＰＬＣ分析することによりシチジンがデオキシウリジンおよびにシチジンジアゾエート体に変異したことを示す図である。
図１３は、オリゴヌクレオチド８にＮＯ−転移が起こり生成した９の酵素分解物をＨＰＬＣ分析することにより５メチルシチジンがチミジンおよび５メチルシチジンンジアゾエート体に変異したことを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の誘導体は、チオヌクレオシドの硫黄原子上にニトロシル基が結合した構造を有することを特徴とする。また、本発明の誘導体は、特定の塩基を認識しこれに結合することにより、自己が持つニトロシル基を相手の塩基に転移させることを特徴とするものである。
１．チオヌクレオシド−Ｓ−ニトロシル誘導体
上記の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で示される本発明の化合物（チオヌクレオチド−Ｓ−ニトロシル誘導体）において、Ｒ１はリボース、２−デオキシリボース又はこれらの誘導体を表す。Ｒ２は、水素原子、アミノ基、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、Ｒ３−オキシ基、Ｒ３−アミノ基を表す。Ｒ２’は酸素原子、硫黄原子又はイミノ基を表す。
ここでＲ３は、置換されてもよい炭素数１〜１５のアルキル基又は置換されてもよい炭素数１〜１５のアシル基を表す。但し、アルキル基又はアシル基の炭素数は、好ましくは１〜１０であり、さらに好ましくは１〜５である。
アルキル基としては、直鎖、分枝鎖又は環状のいずれでもよく、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ドデシル基等が挙げられる。
炭素数１〜１５のアシル基とは、直鎖状又は分岐して、置換されてもよいアルキルアシル基、置換されてもよいシクロアルキルカルボニル基、又は置換されてもよいベンゾイル基等を表す。
例えば、アルキルアシル基としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ｎ−ブチリル基、イソブチリル基、２−メチルブチリル基、３−メチルブチリル基、ピバロイル基、バレリル基、２−メチルバレリル基、カプロイル基、ヘプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基等が挙げられる。
また、シクロアルキルカルボニル基としては、シクロプロパンカルボニル基、シクロヘキサンカルボニル基、シクロペンタンカルボニル基等が挙げられる。
置換されてもよいベンゾイル基において、フェニル基上の置換基は無置換でもよく、フェニル基上の２位、３位、４位のいずれかの位置が置換されてもよい。また、複数の位置に置換基があってもよく、その場合の置換基は同一であってもそれぞれ異なるものでもよい。
フェニル基上の置換基としては、例えばアルキル基（メチル基、エチル基、イソプロピル基等）；アルキルオキシ基（メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基等）；置換又は無置換アミノ基（ニトロ基、アミノ基、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、ｉ−プロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等）；ハロゲン基（フルオロ基、クロロ基、ブロモ基等）；アシル基（ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ベンゾイル基等）；アシルオキシ基（ホルミルオキシ基、アセチルオキシ基、プロピオニルオキシ基、ベンゾイルオキシ基等）；アミド基（ホルムアミド基、アセトアミド基、ベンズアミド基等）；芳香環（フェニル基等）などが挙げられる。
置換されてもよいベンゾイル基としては、具体的にはベンゾイル基、２−メトキシベンゾイル基、３−メトキシベンゾイル基、４−メトキシベンゾイル基、２−メチルベンゾイル基、３−メチルベンゾイル基、４−メチルベンゾイル基、２−ニトロベンゾイル基、３−ニトロベンゾイル基、４−ニトロベンゾイル基、３，５−ジニトロベンゾイル基、２−アミノベンゾイル基、３−アミノベンゾイル基、４−アミノベンゾイル基、４−ジメチルアミノベンゾイル基、２−クロロベンゾイル基、３−クロロベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基、２−ブロモベンゾイル基、３−ブロモベンゾイル基、４−ブロモベンゾイル基、３，５−ジクロロベンゾイル基、２，４−ジクロロベンゾイル基、パークロロベンゾイル基、４−フェニルベンゾイル基等が挙げられる。
リボース又はデオキシリボースは、次式（ＶＩＩ）：
0004665758.tif 000008
で示されるものである。ここで、式（ＶＩＩ）において、Ｒ４は、水酸基（リボースの場合）又は水素原子（デオキシリボースの場合）を表す。Ｒ５及びＲ６は、リボース及びデオキシリボース並びにこれらの誘導体のいずれの場合であっても、互いに独立し、同一又は異なって、例えば水素原子、ハロゲン基、置換されてもよい水酸基を表す。
Ｒ５及び／又はＲ６においてハロゲン基とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を表す。また、Ｒ４及び／又はＲ５において置換された水酸基としては、一般的な水酸基の保護基となりうる置換基により置換された水酸基（例えばカルボン酸エステル、スルホン酸エステル、エーテル、ウレタン、シリル基等）を表す。
水酸基の保護基としては、アルキル基（メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ベンジル基、２−メトキシベンジル基、３−メトキシベンジル基、４−メトキシベンジル基、２−メチルベンジル基、３−メチルベンジル基、４−メチルベンジル基、メトキシエチル基、エトキシエチル基、ベンジルオキシメチル基、ベンジルオキシエチル基、アセトキシメチル基、アセトキシエチル基、ベンゾイルオキシメチル基、ベンゾイルオキシエチル基等）；アリール基（フェニル基、２−メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−フェニルフェニル基、２−ピリジニル基、３−ピリジニル基、４−ピリジニル基等）；アシル基（ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ベンゾイル基、２−メトキシベンゾイル基、３−メトキシベンゾイル基、４−メトキシベンゾイル基、２−メチルベンゾイル基、３−メチルベンゾイル基、４−メチルベンゾイル基、２−ニトロベンゾイル基、３−ニトロベンゾイル基、４−ニトロベンゾイル基、４−フェニルベンゾイル基等）；ウレタン基（アミノカルボニル基、ジメチルアミノカルボニル基、メチルアミノカルボニル基、エチルアミノカルボニル基、ジエチルアミノカルボニル基、フェニルアミノカルボニル基等）；スルホン酸エステル基（メタンスルホニル基、エタンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基、２−メチルベンゼンスルホニル基、３−メチルベンゼンスルホニル基、４−メチルベンゼンスルホニル基、トリフルオロメタンスルホニル基、トリクロロメタンスルホニル基等）；シリル基（トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基等）が挙げられる。
本発明の式（Ｉ）に示される化合物のうち、好ましい例としてはＲ１がデオキシリボースであり、かつ、Ｒ２がアミノ基のものが挙げられる。さらに好ましくは、Ｒ１がリボース又はデオキシリボースの３’，５’−ビス−ｔ−ブチルジメチルシリル誘導体であり、かつ、Ｒ２がアミノ基のものが挙げられる。
本発明の式（ＩＩ）に示される化合物のうち、好ましい例としてはＲ１がデオキシリボースであり、かつ、Ｒ２がアミノ基のものが挙げられる。さらに好ましくは、Ｒ１がリボース又はデオキシリボースの３’，５’−ビス−ｔ−ブチルジメチルシリル誘導体であり、かつ、Ｒ２がアミノ基のものが挙げられる。
本発明の式（ＩＩＩ）に示される化合物のうち、好ましい例としてはＲ１がデオキシリボースであり、かつ、Ｒ２’が酸素原子又はイミノ基のものが挙げられる。さらに好ましくは、Ｒ１がリボース又はデオキシリボースの３’，５’−ビス−ｔ−ブチルジメチルシリル誘導体であり、かつ、Ｒ２’が酸素原子又はイミノ基のものが挙げられる。
２．本発明の化合物の製造
一般式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で示される本発明の化合物は、既知の反応を工夫することにより合成することができる。
（１）式（Ｉ）で示される化合物の製造
本発明において、式（Ｉ）で示される化合物を製造する場合は、次式（ＩＶ）：
0004665758.tif 000009
（Ｒ１及びＲ２は前記と同様である。）で示されるチオヌクレオシド化合物とニトロシル化合物とを反応させる。反応の一例を以下に示す。
すなわち、（ＩＶ）に示す化合物が水溶性の場合は、炭酸緩衝液（ｐＨ１０）に溶解し、約０．５ｍＭ濃度の溶液を調製する。この溶液にニトロシル化試薬（約１ｍＭ）を加え室温で１２時間反応させる。反応液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、溶媒：０．１Ｍ酢酸トリエチルアミン−アセトニトリル：１０％から３０％、リニアグラジエント、２５４ｎｍで検出）で精製し、目的のＳ−ニトロシル体を得る。（ＩＶ）に示す化合物が難水溶性の場合は、有機溶媒（例えばアセトニトリルあるいはメタノールなど）に溶解し、トリエチルアミンを原料の１０倍当量加えて反応させる。ニトロシル化試薬としては、例えばＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン、一酸化窒素などが挙げられる。
亜硝酸ナトリウムを用いて反応を行う場合には、酸性緩衝液（ｐＨ３）に溶解し、約１．０倍当量用いて行う。
（２）式（ＩＩ）で示される化合物の製造
また、式（ＩＩ）で示される化合物を製造する場合は、次式（Ｖ）：
0004665758.tif 000010
（Ｒ１及びＲ２は前記と同様である。）
で示されるチオヌクレオシドとニトロシル化合物とを反応させる。反応の一例を以下に示す。
すなわち、（Ｖ）に示す化合物が水溶性の場合は、炭酸緩衝液（ｐＨ１０）に溶解し、約０．５ｍＭ濃度の溶液を調製する。この溶液にニトロシル化試薬（約１ｍＭ）を加え室温で１２時間反応させる。反応液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、溶媒：０．１Ｍ酢酸トリエチルアミン−アセトニトリル：１０％から３０％、リニアグラジエント、２５４ｎｍで検出）で精製し、目的のＳ−ニトロシル体を得る。（ＩＶ）に示す化合物が難水溶性の場合は、有機溶媒（例えばアセトニトリルあるいはメタノールなど）に溶解し、トリエチルアミンを原料の１０倍当量加えて反応させる。ニトロシル化試薬としては、例えばＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン、一酸化窒素などが挙げられる。
亜硝酸ナトリウムを用いて反応を行う場合には、酸性緩衝液（ｐＨ３）に溶解し、約１０倍当量用いて行う。
（３）式（ＩＩＩ）で示される化合物の製造
式（ＩＩＩ）で示される化合物を製造する場合は、次式（ＶＩ）：
0004665758.tif 000011
（Ｒ１及びＲ２’は前記と同様である。）
で示されるチオヌクレオシドとニトロシル化合物とを反応させる。反応の一例を以下に示す。
すなわち、（ＶＩ）に示す化合物が水溶性の場合は、炭酸緩衝液（ｐＨ１０）に溶解し、約０．５ｍＭ濃度の溶液を調製する。この溶液にニトロシル化試薬（約１ｍＭ）を加え室温で１２時間反応させる。反応液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、溶媒：０．１Ｍ酢酸トリエチルアミン−アセトニトリル：１０％から３０％、リニアグラジエント、２５４ｎｍで検出）で精製し、目的のＳ−ニトロシル体を得る。（ＩＶ）に示す化合物が難水溶性の場合は、有機溶媒（例えばアセトニトリルあるいはメタノールなど）に溶解し、トリエチルアミンを原料の１０倍当量加えて反応させる。ニトロシル化試薬としては、例えばＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン、一酸化窒素などが挙げられる。
亜硝酸ナトリウムを用いて反応を行う場合には、酸性緩衝液（ｐＨ３）に溶解し、約１０倍当量用いて行う。
（４）本発明の化合物の塩
上記一般式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で示される本発明の化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩を形成する場合があるが、このような塩も本発明の範囲に包含される。本発明の化合物を生体に適用可能なオリゴ核酸及びその製造中間体として用いる場合には、塩としては生理的に許容されるものが好ましい。塩基付加塩としては、例えば、トリエチルアミン、ジメチルアミン、アンモニア、ジエチルアミン等のアミン類の塩、又はナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウム等の金属類の塩を挙げることができる。酸付加物として例えば、塩酸、硫酸、若しくは過塩素酸等の鉱酸類の塩；又はシュウ酸、フマル酸、マレイン酸、酢酸、プロピオン酸、メタンスルフォン酸若しくはｐ−トルエンスルフォン酸等の有機酸等との塩を挙げることができる。
３．オリゴ核酸
一般式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で示される本発明の化合物はヌクレオシドであるため、これにリン酸をエステル結合させるとヌクレオチドとなり、核酸の構成成分となる。
このようにして得られたヌクレオチドは、適当なオリゴ核酸に組み入れて、配列特異的にニトロシル基を転移するオリゴ核酸として使用することができる。「ニトロシル基を転移する」とは、本発明のオリゴ核酸中のニトロシル基（本発明の化合物中に存在するニトロシル基）を、当該オリゴ核酸と反応する相手側の核酸中の塩基であって２本鎖（錯体）を形成している当該相手側の塩基（標的塩基ともいう）に転移することを意味する（図１）。
本発明のオリゴ核酸の配列は、特に限定されるものではなく、鋳型となる核酸配列に応じて設計することも、ランダムな塩基配列となるように設計することもできる。ある遺伝子の塩基配列にニトロシル基を転移させようとする場合は、当該遺伝子の標的塩基配列に相補的となるようにオリゴ核酸を設計することができる（この場合、本発明のオリゴ核酸側から見れば、当該遺伝子の塩基配列がオリゴ核酸の相補鎖となる）。本発明のオリゴ核酸をランダムな塩基配列となるように設計した場合は、そのいずれかの塩基にニトロシル基が導入されている。従ってこれらのニトロシル基を転移させるように、上記ランダムな塩基配列に相補的な配列を有する核酸を合成することができる（この場合、本発明のオリゴ核酸側から見れば、その合成された核酸がオリゴ核酸の相補鎖となる）。
本発明のオリゴ核酸配列の長さは、その標的塩基に本発明の化合物中のニトロシル基を転移することができる限り特に限定されるものではない。本発明においては、少なくとも１２塩基を有していることが好ましく、１５〜２２塩基であることがより好ましい。本発明の化合物をオリゴ核酸中に組み入れる位置は、任意の位置でよいが、特に配列特異性を発現させる場合には、本発明の化合物が、好ましくはオリゴ核酸の両末端から３番目より内側に位置するように組み入れるとよい。例えば、図５において、本発明のオリゴ核酸７は１６塩基を有しており、そのうち本発明の化合物は５番目に位置している。さらに、本発明のオリゴ核酸中に含まれる本発明の化合物は、１箇所である必要はなく、複数箇所であってもよい。すなわち、本発明のオリゴ核酸において、ニトロシル基を導入する標的塩基の数は特に限定されるものではない。そして、誘導体の存在位置が複数箇所の場合は、２箇所以上連続してもよく、不連続でもよい。
オリゴ核酸の製造は、既知の方法、市販の核酸合成用試薬及び核酸合成装置より合成することができる。以下に式（ＩＶ）［Ｒ１が２−デオキシリボースのもの］を用いた合成例について記す。式（ＩＶ）の５’−Ｏ−ｐ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−ジイソプロピルフォスフォロアミダイト）体（約８０ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルに溶解し、ＤＮＡ自動合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）に装着する。合成装置内蔵の標準プログラムによって、１μｍｏｌカラムを用いて合成し、合成終了後、２８％アンモニア水中にて固相カラムから切り出し、５５℃にて５時間加温して塩基の脱保護を行い、ＯＤＳカラムを接続したＨＰＬＣにて精製する（ＯＤＳカラム、アセトニトリル−０．１Ｍ  ＴＥＡＡ＝１０％−４０％リニアグラジュエント／２０分）。さらに、ポーラスカラムでｐ−ジメトキシトリチル基の脱保護および精製を行う（５０ｍＭ酢酸アンモニア，ｐＨ１０→５％アセトニトリル−５０ｍＭ酢酸アンモニア→２％トリフルオロ酢酸→５０ｍＭ酢酸アンモニア→６５％メタノール）。純度検定および構造確認は、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｏｙａｇｅｒ  Ｅｌｉｔｅ，３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｐｉｃｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｍａｔｒｉｘ）による分子量測定によって行うことができる。
４．ニトロシル基の転移反応
一般式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で示される化合物がニトロシル基を転移する機構は、図１に示すように相補的な水素結合で形成される錯体構造中で実現される。なお、このような機能を損なわない限り、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）において複素環に結合しているＲ２には、水素原子、アミノ基、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、Ｒ３−オキシ基、Ｒ３−アミノ基、あるいはその他のヘテロ原子（Ｒ３は前記と同様である）を導入することも可能である。
反応条件は、例えば、一般式（Ｉ）で示される化合物を組み込んだ核酸（約２５μＭ）と相補的な配列のＤＮＡ（約２５μＭ）を０．０５Ｍ  ＭＥＳ，０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、室温で反応させる。反応の進行はＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、アセトニトリル−０．１Ｍ  ＴＥＡＡ＝１０％−４０％リニアグラジュエント／２０分）で追跡することができる。
一般式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で示される本発明の化合物は、その塩基の種類に応じて遺伝子の特定の塩基を認識し、これに結合することができ、さらに、化合物（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）から製造され該化合物を構成成分として含有するオリゴ核酸は、そのような塩基を含む１本鎖核酸とハイブリダイズさせて２本鎖を形成することができる。
ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で行われる。ストリンジェントな条件とは、例えば、塩（ナトリウム）濃度が５０〜９００ｍＭであり、温度が１０〜５０度Ｃ、好ましくは塩（ナトリウム）濃度が５０〜１５０ｍＭであり、温度が２５度Ｃでの条件をいう。
本発明において、ニトロシル基転移反応を行う対象となる塩基は、特に限定されるものではなく、プリン塩基（アデニン、グアニン）及びピリミジン塩基（シトシン、チミン）のどちらでもよい。  例えば、下記の実施例に示すように、塩基構造として式（Ｉ）に示すプリン塩基（例えばグアニン）を用いた場合には、化合物（Ｉ）は対応するシトシン塩基を認識し、この塩基を含む核酸に対して特異的にニトロシル基転移反応を実現するのに有用である。なお、「対応する」とは、それぞれの塩基に対して相補的であることを意味する。従って、例えばグアニンに対応する塩基はシトシンとなる。
水素結合形成のための塩基が他のものでも同様であり、式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）におけるピリミジン塩基（シトシン、チミン）を使用した場合は、対応する塩基（それぞれＧ、Ａ）に対する反応も可能である。
反応は、図１に示す水素結合錯体内で実現される。さらに、Ｎ−ニトロソシトシンはウラシルに加水分解されることが報告されている（例えばＲ．Ｇｌａｚｅｒ，Ｒ．Ｓｕｎｄｅｅｐ，Ｍ．Ｌｅｗｉｓ，Ｍ．−Ｓ．Ｓｏｎ，Ｓ．Ｍｅｙｅｒ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，６１０８（１９９９）など）。そこで、本発明においては、配列特異的にシチジンをデオキシウリジンに変換することができる（図２）。すなわち、オリゴ核酸中のシトシンがウラシルに変異する。このときの変換反応は、酸性条件下で行われる。酸性条件は水溶液あるいは有機緩衝溶液などの反応溶液に、塩酸、酢酸、硫酸、リン酸などを加えｐＨ２〜６、好ましくは４〜５に調節する。さらに各種の有機酸などを用いてｐＨを調整することもできる。反応温度は１０〜３０℃、好ましくは１５〜２５℃であり、反応時間は１０〜４０時間、好ましくは２０〜３０時間である。
本発明の化合物は、配列特異的ニトロシル基転移反応によりＮＯ活性種を特定の場所に運ぶ、いわゆるドラッグデリバリー用化合物として利用することが可能である。
５．塩基配列の変異誘発剤又は変異誘発用キット
本発明の化合物又はオリゴ核酸は、塩基配列の変異誘発剤又は変異誘発用キットとして使用することができる。本発明の変異誘発剤又はキットは、本発明の化合物又はオリゴ核酸のうち少なくとも１つを含むものであり、全部を含めることもできる。「塩基配列」とは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどの核酸の塩基配列を意味し、生物由来のものであると人工的に合成されたものであるとを問わない。鋳型となる核酸は、細菌、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、あるいは哺乳動物などから公知手法により採取することができ、ゲノム、プラスミドなど、核酸を有するあらゆるものを使用することができる。
オリゴ核酸は、上記鋳型核酸の塩基配列のうち、変異を誘発させたい塩基の位置と同じ位置に本発明の化合物が位置するように、すなわち、鋳型となる塩基配列にハイブリダイズするように合成する。合成後は、目的の鋳型核酸とハイブリダイズさせ、前記のニトロシル転移反応を行い、前記の酸性条件下で処理すればよい。
本発明のキットには、本発明の化合物のほか、ハイブリダイゼーション溶液、洗浄用緩衝液、蛍光発色試薬などを含めることができる。
【実施例】  以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕  チオヌクレオシド−Ｓ−ニトロシル誘導体の合成
既知の方法（Ｍ．Ｋａｄｏｋｕｒａ，Ｔ．Ｗａｄａ，Ｋ．Ｓｅｉｏ，ａｎｄ  Ｍ．Ｓｅｋｉｎｅ  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６５，５１０４−５１１３（２０００））により合成した２’−デオキシ−６−チオグアノシン（ｔ−ブチルジメチルシリル誘導体）（０．２５μｍｏｌ）、ＳＮＡＰ（２，Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン）（０．２５μｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．２８μｍｏｌ）のメタノール溶液（５００μｌ）を０℃にて攪拌した。反応液を直接ＨＰＬＣ−ＭＳに注入し、ＥＳＩ−ＭＳを測定した（図４）。ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。
カラム：Ｓｙｍ，ｅｔｒｙ  Ｃ１８  ２ｘ５０ｍｍ
カラム温度：２５℃
移動相：Ａ＝Ｈ２Ｏ，Ｂ＝ＭｅＯＨ，％Ｂ＝６０−１００％／５ｍｉｎ  ｔｈｅｎ  １００％  ２０ｍｉｎ
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ：２５４ｎｍ
ＨＰＬＣ溶出液をスプリッターで分離し、約１／４０（約５μＬ）を質量分析器に導入した。質量分析はポジティブモードＥＳＩ−ＴＯＦで行った。ＭＳ条件（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｒｉｎｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  ５２９９）は、Ｓｐｒａｙ  Ｔｉｐ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，４００６，Ｎｏｚｚｌｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ３００，Ｎｏｚｚｌｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  １４０により行った。
質量分析結果を以下に示す。
ｔＲ  １．１ｍｉｎ，ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ｆｏｕｎｄ  ５４１．１７０５，ｃａｌｃｌｄ  ５４１．２４４３  ｆｏｒ  ３（Ｃ２２Ｈ４０Ｎ６Ｓ１Ｏ４Ｓｉ２），ｔＲ  ７．８ｍｉｎ，ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ｆｏｕｎｄ  ７０１．４３４３，ｃａｌｃｌｄ  ７０１．３００１  ｆｏｒ  ４（ＣＨＮＳＯＳｉ），ｔＲ  １５．０ｍｉｎ，ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋  ｆｏｕｎｄ  １０２１．４９７２，ｃａｌｃｌｄ  １０２１．４８５４  ｆｏｒ  ５（Ｃ４４Ｈ８０Ｎ１０Ｓ２Ｏ６Ｓｉ４）．
図４で示した時間経過の観察から、図３のスキーム３又は４に示す化合物が合成されていることが示された。
〔実施例２〕  オリゴ核酸の合成
既知の方法で合成したＳ−（２−シアノエチル）−２’−デオキシ−６−チオグアノシンの５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）体を、ＤＮＡ合成装置（型名：ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によりオリゴヌクレオチドに導入した。その後、２８％アンモニア水中、５５℃で５時間加熱することによりオリゴヌクレオチド６（図５のスキーム６：配列番号１）を得た。オリゴヌクレオチド６（１５０ｎｍｏｌ）及びＳＮＡＰ（３μｍｏｌ）を炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０．０）３００μｌに溶解し、室温で１２時間放置した。ＨＰＬＣで反応の進行を確認した後、同じＨＰＬＣ条件で新しく生成したピークを単離した。その結果、図５のスキーム７に示すオリゴヌクレオチド７（配列番号２）を得た。２６０ｎｍでのＵＶ吸光度により、収率は３１％であった。また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳによる分子量測定を行った結果、理論値４７９７．７６に対応する分子量４７９６．６９の測定値を観測した。
〔実施例３〕  ヌクレオチド７の分解による［ＮＯ＋］の発生試験
蛍光セル中にオリゴヌクレオチド７（図５）のＭＥＳ緩衝溶液（０．０５Ｍ  ＭＥＳ，０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５およびｐＨ７に調整、１．５ｍＬ、オリゴヌクレオチド７：０．５μＭ）を入れ、この溶液にＤＡＦ−２（ｄｉａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ、最終濃度４μＭ）を加え２５℃にて撹拌した。この反応溶液の蛍光スペクトル（励起波長４８８ｎｍ，蛍光波長５００−６００ｎｍ）を経時的に測定した。また、同時にこの溶液から経時的に１μｌをサンプリングし、ＨＰＬＣに注入してオリゴヌクレオチド７からオリゴヌクレオチド６への変化を観測した。
カラム：Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＭＳ（４．６ｘ２５０ｍｍ）；
移動相：Ａ：０．１Ｍ  ＴＥＡＡ  Ｂｕｆｆｅｒ，Ｂ：ＣＨ３ＣＮ，
Ｂ：１０％  ｔｏ  ３０％／２０ｍｉｎ，４０％／３０ｍｉｎ，ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ；
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ；ＵＶ−ｍｏｎｉｔｏｒ：２６０ｎｍ．
５１２ｎｍにおける蛍光強度の相対値及びオリゴヌクレオチド６への変化率をグラフに表した（図６）。ｐＨ５ではオリゴヌクレオチド７からオリゴヌクレオチド６への変化と、同時に測定したＤＡＦ−２の蛍光強度の増大曲線（図７）とがよく一致する傾向を示した。
図７において、各グラフの記号の内容は以下の通りである。
●：ｐＨ５における反応でのＤＡＦ−２（ｄｉａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎｅ）の蛍光強度（相対的なＮＯ濃度を示す）。
★：ｐＨ７における反応でのＤＡＦ−２の蛍光強度
■：ｐＨ５における反応での６の相対濃度：チオグアノシン体の再生を示す。
▲：ｐＨ７における反応での６の相対濃度
このことから、オリゴヌクレオチド７からオリゴヌクレオチド６への変化に伴い、［ＮＯ＋］等価化学種がオリゴヌクレオチド７から溶液に放出されたことが示された。一方、ｐＨ７の反応溶液ではオリゴヌクレオチド７からオリゴヌクレオチド６への変化は殆ど起こらず、またＤＡＦ−２の蛍光強度にも殆ど変化がなかった（図７）。これらの結果から、オリゴヌクレオチド７は安定な［ＮＯ＋］等価化学種の前駆体となっていることが判明した。
〔実施例４〕オリゴヌクレオチド７とその相補的オリゴヌクレオチド８との反応
図８のオリゴヌクレオチド７（ＯＤＮ（７），）及びその相補鎖オリゴヌクレオチド８（ＯＤＮ（８））を用いて、２本鎖ＤＮＡ内ＮＯ−転移反応を行った。
反応は、ＯＤＮ（７）及びＯＤＮ（８，１０−１２）の各１０μＭ、または１ｍＭグルタチオンを用いて、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＭＥＳバッファー中ｐＨ７、２５℃で行った。
ＯＤＮ（６）：配列番号１
ＯＤＮ（７）：配列番号２
ＯＤＮ（８）：配列番号３
ＯＤＮ（９）：配列番号４
ＯＤＮ（１０）：配列番号５
ＯＤＮ（１１）：配列番号６
ＯＤＮ（１２）：配列番号７
反応混合物は、ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣの条件を以下に示す。
ＯＤＳ  ｃｏｌｕｍｎ，１ｍＬ／ｍｉｎ
移動相：Ａ：０．１Ｍ  ＴＥＡＡ  Ｂｕｆｆｅｒ，Ｂ：ＣＨ３ＣＮ，Ｂ：１０％  ｔｏ  ３０％／２０ｍｉｎ，４０％／３０ｍｉｎ
ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ
モニター：２６０ｎｍ
結果を図９及び１０に示す。ＯＤＮ（７）を、ｄＣ（シチジン）又はｄｍＣ（５−メチルシチジン）を有するＯＤＮ（８）と反応させると、ＯＤＮ（７）から６（配列番号１）への急速な変換反応が起こった。これに対し、ｄＴ、ｄＡ又はｄＧを有するＯＤＮ（８）との反応速度は、バックグラウンドレベルであった。従って、ＯＤＮ（７）は、ｄＣ及びｄｍＣに対して高い選択性を有することが明確に示された。標的部位とは異なる部位にｄＣを有するＯＤＮ（１０−１２）の場合は転移反応はなく、このことはＯＤＮ（７）の高い部位選択性を有することを示すものである。また、グルタチオンは生理的濃度条件下（１ｍＭ）ではＯＤＮ（７）と反応しなかった。これらの結果は、ＯＤＮ（７）の高い選択的反応性は、二重鎖ＤＮＡ中のＳ−ＮＯチオグアノシンと標的ｄＣ又はｄｍＣとの間における十分な近接効果によるものであることを示している。
〔実施例５〕Ｓ−ＮＯオリゴヌクレオチド７およびＮＯ転移オリゴヌクレオチド８とＤＡＦ−２との反応
オリゴヌクレオチド７とオリゴヌクレオチド８（Ｘ＝Ｃ）との反応溶液にＮＯ検出蛍光色素であるＤＡＦ−２を共存させて蛍光スペクトルの変化を追跡したところ、蛍光強度は殆ど変化しなかった。このことから、この反応でオリゴヌクレオチド７から放出された［ＮＯ＋］等価化学種は溶液中に放出されていないことが確認された。ＮＯが化合物２から３に転移することは、蛍光試薬ＤＡＦ−２を用いて確認した（図１１）。ＯＤＮ（７）とＤＡＦ−２とを混合してｐＨ３、室温で２０分インキュベートし、混合物をＮａＯＨ溶液によりｐＨ１０まで上げてアルカリ化した後、ＨＰＬＣを行った。ＮＯ種の存在はＤＡＦ−２のトリアゾール誘導体のピークを検出することにより明確に証明された。また、ＤＡＦ−２を、転移反応８時間目の反応混合物から単離したＯＤＮ（９）（Ｘ＝ｄＣ又はｄｍＣ）と混合し、上記と同様にしてＤＡＦ−２トリアゾール誘導体のピークを検出した。その結果、ＯＤＮ（７）について得られた結果とほとんど同一の強度のピークが表れた。これらの結果は、ＮＯがＯＤＮ（７）からＯＤＮ（８）（Ｘ＝ｄＣ，ｄｍＣ）に高効率で転移され、ＮＯ転移ＯＤＮ（９）は、単離条件下では安定であることを明確に示している。
〔実施例６〕反応後の相補的オリゴヌクレオチド９（Ｘ＝Ｃ）の酸処理および酵素加水分解
図１２に示すように、オリゴヌクレオチド７とオリゴヌクレオチド８をそれぞれ約２０μＭ含むＭＥＳ緩衝溶液（０．０５Ｍ  ＭＥＳ，０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７）を、２５℃で８時間反応させた。その後、溶液をｐＨ５に調整し同じ温度でさらに３０時間放置した。この反応混合物からオリゴヌクレオチド９をＨＰＬＣにより単離し、凍結乾燥した。
ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。
カラム：Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＭＳ（４．６ｘ２５０ｍｍ）
移動相：Ａ＝０．１Ｍ  ＴＥＡＡバッファー、Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ，１０％  ｔｏ  ３０％／２０ｍｉｎ，４０％／３０ｍｉｎ，ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
ＵＶモニター：２６０ｎｍ
単離したオリゴヌクレオチド９を酵素により加水分解し、生成するヌクレオシドをＨＰＬＣで分析した。酵素分解およびＨＰＬＣ条件は以下の通りである。
酵素分解反応
ＢＡＰ：ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ
ＶＰＤＥ：ｖｅｎｏｍ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ
緩衝液：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２，３７度Ｃ  ｐＨ７．
ＨＰＬＣ条件
カラム：Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＭＳ（４．６ｘ２５０ｍｍ）
移動相：Ａ＝０．１Ｍ  ＴＥＡＡバッファー、Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ，１０％  ｔｏ  ３０％／２０ｍｉｎ，４０％／３０ｍｉｎ，ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
ＵＶモニター：２６０ｎｍ
酵素分解物の分析結果ではオリゴヌクレオチド９に含まれるＣ，Ｇ，Ａに加えて、２’−デオキシウリジンとシチジンジアゾエートがそれぞれ８％および１４％で得られた（図１２）。従って、オリゴヌクレオチド９の１２番目の塩基Ｃ（３’末端から５番目）がオリゴヌクレオチド８の対応塩基（Ｘ＝ｄＵ）と変化したこと（シトシンからウラシルへの変異）が示された。
〔実施例７〕反応後の相補的オリゴヌクレオチド９（Ｘ＝５−メチルＣ）の酸処理および酵素加水分解
図１３に示すように、オリゴヌクレオチド７とオリゴヌクレオチド８をそれぞれ約２０μＭ含むＭＥＳ緩衝溶液（０．０５Ｍ  ＭＥＳ，０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７）を、２５℃で８時間反応させた。その後、溶液をｐＨ５に調整し，ＣａＣｌ２  ＺｎＣｌ２，あるいはＭｇＣｌ２を加え（５ｍＭ）、同じ温度でさらに１日放置した。この反応混合物からオリゴヌクレオチド９をＨＰＬＣにより単離し、凍結乾燥した。これをＢＡＰ及びＢＰＤＥで加水分解した後、ＨＰＬＣにかけた。酵素反応条件およびＨＰＬＣ条件は以下の通りである。
酵素分解反応
ＢＡＰ：ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ
ＶＰＤＥ：ｖｅｎｏｍ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ
緩衝液：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２，３７度Ｃ  ｐＨ７．
ＯＤＳ  ｃｏｌｕｍｎ，４．６×２００ｍｍ，
移動相：Ａ＝５０ｍＭ  ＨＣＯＯＮＨ４、Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ，２  ｔｏ  ２０％／５０ｍｉｎ，ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
ＵＶモニター：２５４ｎｍ
対照実験は、ＯＤＮ（１）及び標的ＯＤＮ（３）を用い、上記方法と同様にして行った。
結果を図１３に示す。図１３において、明らかにｄＴが生成していることが確認された。さらにアステリクス（＊）で記したピークは、既報（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．００２，１０，１０６３−１０６７）の通り合成したｄｍＣ−ジアゾエートの保持時間と同じ時間を示す。注目すべきことに、ｄｍＣからｄＴへの転換比は４２％であり、ｄｍＣ−ジアゾエート（１３％）とともに高い値が得られた（図１３）。
ｄＧ又はｄＡの脱アミノ化産物の生成を示す大きなピークが無いことから、このＮＯ−転移反応が高い塩基選択性を有することを示している。これらの結果からＮＯはｄＣ及びｄｍＣのアミノ基に転移することが示された。また、ＤＡＦ−２実験の項で記述したように、ＯＤＮ（９）中のＮ−ＮＯ種は安定であるため、酵素反応によりｄＣ又はｄｍＣが観測される理由は、現段階では、Ｎ−ＮＯ種が酵素加水分解反応の間にｄＣ又はｄｍＣに戻るものと予想される。
上記のように、ＮＯ−転移及びそれに続く脱アミノ化の効率は、ＮＯガス又は他のニトロシル化剤を用いた従来の方法と比較して極めて高い。従って、本発明は、ＤＮＡ傷害におけるＮＯの役割を理解するために有用である。また、本発明の新規ＮＯ−送達方法を応用して、選択的に翻訳又は重合ステップでの部位特異的変異誘発を行うことが可能となる。
【産業上の利用可能性】  本発明により、チオヌクレオシド−Ｓ−ニトロシル誘導体が提供される。本発明の誘導体は、そのニトロシル基を配列特異的かつ塩基特異的に転移させることができ、相補鎖の塩基を置換させることができるため、標的塩基の点変異誘発用ツールとして有用である。
【配列表フリーテキスト】  配列番号１：合成ヌクレオチド
配列番号１：ｎはａ，ｇ，ｃ又はｔのチオヌクレオチド誘導体を表す（存在位置：５）
配列番号２：合成ヌクレオチド
配列番号２：ｎはａ，ｇ，ｃ又はｔのチオヌクレオチドニトロシル誘導体を表す（存在位置：５）
配列番号３：合成ヌクレオチド
配列番号３：ｎはａ，ｇ，ｃ又はｔを表す（存在位置：１２）。
配列番号４：合成ヌクレオチド
配列番号４：ｎはａ，ｇ，ｃ又はｔのニトロシル誘導体を表す（存在位置：１２）。
配列番号５：合成ヌクレオチド
配列番号６：合成ヌクレオチド
配列番号７：合成ヌクレオチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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