(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）非経口組成物中で通常使用される水性バッファー溶液とエリスロポイエチンを含む水性相、ならびに
（ｂ）１ないし６個の炭素原子の低級アルカノールのアルコール溶媒中に、
（ｉ）水素化レシチン、（ii）オレイン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジ−パルミトイルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジミリスチルホスファチンジン酸（ＤＭＰＡ）、オレイルアミン及びステアリルアミンから選択される荷電された電気的陽性又は電気的陰性の脂質化合物と、（ｉｉｉ）コレステロール、コレステロールエステル、ポリエチレングリコール−コレステロール及びヘミコハク酸コレステロールから選択される誘導体を含む溶液を調製し、次いで、該溶液を高速ホモジナイザー中の水性バッファー溶液中に注入することにより作製された単一の二重層リポソームを含む脂質相
を含んでなり、かつ、
（ｃ）該エリスロポイエチンが骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球細胞の生産を増加させる生物学的特性を有する有効量で存在し、該エリスロポイエチンが（ｂ）の工程で単一の二重層リポソームとインキュベートされることで外部水性相中に分散されており、かつ、該リポソーム内に実質的に取り込まれていない、ことを特徴とする、リポソームを基礎にした非経口投与用組成物。
【請求項２】
更に安定剤としてのアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項１記載のリポソームを基礎にした非経口組成物。
【請求項３】
安定剤がグリシンである、請求項２記載のリポソームを基礎にした非経口投与用組成物。
【請求項４】
荷電された電気的陽性又は電気的陰性の脂質化合物が、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジ−パルミトイルグリセロール（ＤＰＰＧ）、オレイルアミン及びステアリルアミンから選択される、請求項１ないし請求項３のいずれか１項記載のリポソームを基礎にした非経口投与用組成物。
【請求項５】
バッファーがリン酸二水素ナトリウム二水和物、リン酸水素二ナトリウム二水和物、及びそれらの混合物から選択される、請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載の、リポソームを基礎にした非経口投与用組成物。
【請求項６】
更に安息香酸及びパラベンから選択される保存剤を含んでなることを特徴とする、請求項１ないし請求項５のいずれか１項に記載の、リポソームを基礎にした非経口投与用組成物。
【請求項７】
更にトコフェロール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、パルミチン酸アスコルビル及びエデト酸塩から選択される抗酸化剤を含んでなることを特徴とする、請求項１ないし請求項６のいずれか１項記載の、リポソームを基礎にした非経口投与用組成物。
【請求項８】
次の組成、
ｇ／１００ｇ
エリスロポイエチン                      ２００，０００Ｕ〜百万単位
水素化レシチン（大豆）                  ０．５〜５．０００
コレステロール                          ０．１〜１．０００
荷電脂質                                ０．０５〜０．５
エタノール                              ０．５〜５．０００
グリシン                                ０．０〜１．００
バッファー                              ０ないし２．０
その他の、場合による添加剤及び水        適量、全１００．０、
をもつことを特徴とする、請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の、リポソームを基礎にした非経口投与用組成物。
【請求項９】
次の組成、
ｇ／１００ｇ
エリスロポイエチン                      百万単位
水素化レシチン（大豆）                  ０．５００
コレステロール                          ０．１００
ＤＰＰＡ−Ｎａ                          ０．０４０
薬局法非変性エタノール                  ０．５００
リン酸二水素ナトリウム二水和物          ０．１１６４
リン酸水素二ナトリウム二水和物          ０．２２２５
塩化ナトリウム                          ０．５８４
精製水                                ９７．９３７１、
をもつことを特徴とする、請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の、リポソームを基礎にした非経口投与用組成物。
【請求項１０】
貧血の処置のための製薬学的調製物としての使用のための請求項１ないし請求項９のいずれか１項に記載の、リポソームを基礎にした非経口投与用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明はエリスロポイエチンの、リポソームを基礎にした調製物に関する。なかでも、本発明は、優れた安定性を示す、エタノール注入法により調製されたエリスロポイエチンの、リポソームを基礎にした、非経口投与形態に関する。
【０００２】
（発明の背景）
エリスロポイエチン（ＥＰＯ）は赤血球細胞合成の調節に関与する主要な因子として働く糖蛋白である。エリスロポイエチンは腎臓で生産され、骨髄内の前駆細胞を刺激してそれらを分割させ、成熟赤血球細胞に分化させることにより作用する。遺伝子組み換えにより生産された１６５アミノ酸の糖蛋白は、慢性腎不全、ジドビジン(zidovidine)処置ＨＩＶ感染患者、化学療法中の癌患者に伴う貧血を含む、様々な形態の貧血の処置における有効な治療剤として、ある期間入手可能であった。糖蛋白は静脈内（ＩＶ）又は皮下（ＳＣ）注射のどちらかとして非経口的に投与される。
【０００３】
現在使用されている非経口調製物は、担体としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む、ＩＶ又はＳＣ注射用の通常の滅菌バッファー水溶液である。このような調製物は商品名ＥＰＯＧＥＮ(R)及びＰＲＯＣＲＩＴ(R)として、米国内で市販されている。これらの製品は保存剤を含まない１回投与量１ｍｌ中、又は２ｍｌの数回投与用保存バイアル中にエリスロポイエチンを含む。
【０００４】
これらの調製物は著しく有効であることが証明されたが、担体としてのヒト血清アルブミンの使用には幾つかの欠点が伴う。ＨＳＡは天然源から得られるので、ＨＩＶ又は肝炎のような感染性疾患作用物質の担体としての潜在的な危険物であり得るので、材料の注意深いスクリーニングを実施しなければならない。更に、適切な品質のＨＳＡの入手可能性がしばしば問題になる可能性がある。従って、担体としてＨＳＡの使用を回避するようなエリスロポイエチンの注射可能な調製物の必要性が存在する。
【０００５】
従って、担体としてＨＳＡの使用を回避する、エリスロポイエチンの改善された調製物を提供する試みが実施されてきた。同時に、その調製物は安定で、長期間の貯蔵寿命を提供しなければならない。更に、調製物は、それがその中に含まれるバイアルの表面に付着する活性成分に伴う問題を回避しなければならない。
【０００６】
リポソームは球状の二重層に配列された、両親媒性の脂質を含んでなる小胞である。リポソームは水のチャンネルにより分離された多数の同心的脂質の二重層（多重ラメラ小胞又はＭＬＶ）を含むか、又は代替的には小さい単ラメラ小胞（ＳＵＶ）又は大きい単ラメラ小胞（ＬＵＶ）のどちらかの可能性がある、単一の二重層（単ラメラ小胞）を含んでいてもよい。脂質の二重層は疎水性の「尾」部分及び親水性の「頭」部分をもつ２種類の脂質の単一層からなる。膜の二重層中で、脂質の単一層の「尾」は二重層の中心に向けて配向し、一方、親水性の「頭」部は水相に向かけて配向する。
【０００７】
リポソームは水の内側又は二重層の間に親水性化合物を捕捉すること、あるいは二重層内に疎水性化合物を捕捉することにより様々な物質を封入するために使用することができる。従って、それら、低い水溶性を示すか又は治療的用量において許容できない毒性を示す化合物を封入することにより生物学的に活性な物質を送達するために特に有用である。
【０００８】
単一の二重層のみをもつリポソームの製造の具体的な方法は欧州特許第２５３  ６１９号に開示されている。様々な活性物質のリポソーム調製物が以前から知られており、エリスロポイエチンのリポソーム調製物が提唱されてきた。例えば、Ｍａｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８５：４４０−４４５（１９９６）は、逆相蒸発小胞法によりリポソームが調製される、経口投与を意図されたリポソームのエリスロポイエチン調製物につき開示している。その調製物は経口投与を目的としているので、リポソーム中へのＥＰＯの高率の取り込みが好ましい。しかし、小さい小胞中への高率の封入を示すこのような調製物は肝臓内への集中を示し、有毒症状をもたらす可能性がある。更に、そこで使用された製造法は特別な原料（例えばポリグリセリン・リン脂質）及び有機溶媒の使用を必要とする。更に、その中で使用された逆相法は非封入ＥＰＯの高度の喪失を被り、それは望ましくなく、高価である。
【０００９】
従って本発明の目的は、担体としてのＨＳＡの使用を回避し、長期の貯蔵寿命期間にわたる、許容できる長期の安定性を提供し、そして、大規模製造に耐える工程により製造することができる、ＥＰＯに適した非経口調製物を提供することであった。
【００１０】
（発明の要約）
（ａ）  エリスロポイエチン又は骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球細胞の生産を増加させる生物学的特性を有するエリスロポイエチンの製薬学的に許容できる誘導体を含んでなる、有効量の活性成分、
（ｂ）（ｉ）  レシチン又は水素化レシチン、
（ii）  場合により、荷電された電気的陽性又は電気的陰性の脂質化合物、及び
（iii）  コレステロールあるいは、コレステロールエステル、コレステ
ロールのポリエチレングリコール誘導体（ＰＥＧ−コレステロー
ル）、及びコレステロールの有機酸誘導体、から選択されるコレ
ステロールの誘導体、
を含んでなる脂質相、並びに
（ｃ）  リン酸バッファー水溶液、
を含んでなる、リポソームを基礎にした非経口組成物。
【００１１】
本発明に従う組成物は、脂質相のアルコール溶液を調製し、その溶液を、高速度ホモジナイザー中に含まれたバッファー水溶液中に圧力下で注入することにより製造される単一の二重層リポソームを含んでなる。このように調製されたリポソームをエリスロポイエチン活性成分とともにインキュベーションして、本発明のリポソーム分散物を形成する。
【００１２】
好ましくはその活性成分は、エリスロポイエチン及び骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球細胞の生産を増加させる生物学的特性をもつその誘導体である。ＥＰＯ糖蛋白は天然源から得るか又は、引用により本明細書に取り込まれている、米国特許第４，７０３，００８号、同第５，４４１，８６８号、同第５，５４７，９３３号、同第５，６１８，６９８号及び同第５，６２１，０８０号に開示されているような既知の方法を使用して、遺伝子組み換えにより製造することができる。
【００１３】
本発明に従うと、極めて予期せぬことには、本明細書に記載の穏やかな条件下で調製されたリポソームのＥＰＯ組成物が改善された安定性を示す、すなわちリポソーム自体が安定であり、同時に生物学的に有効な物質の化学的劣化及び凝集が最小になることが発見された。更なる予期せぬ利点として、たとえＥＰＯがリポソーム内に実質的には取り込まれておらず、その代わりに、本質的には、リポソーム分散物として間隙液中に含まれているにもかかわらず、ＥＰＯ活性成分がバイアル容器又はＩＶ管の表面に付着しない。
【００１４】
（詳細な説明）
本発明に使用される活性成分はエリスロポイエチン及び骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球細胞の生産を増加させる生物学的特性をもつエリスロポイエチンの誘導体である。本発明のリポソーム分散物は、慢性腎不全、ジドビジン処置ＨＩＶ感染患者、化学療法中の癌患者に伴う貧血を含む、様々な形態の貧血のような赤血球細胞の生産低下又は障害を特徴とする血液障害の処置における非経口調製物として有用である。それはまた、鎌状細胞疾患、ベータサラセミア、嚢胞性繊維症、妊娠及び月経障害、早産の初期貧血、脊髄傷害、宇宙飛行、急性失血、老化等、のような血液学的異常の、様々な疾病状態、障害及び症状の処置における適用を有する可能性がある。好ましくは、本発明のＥＰＯ組成物は、非経口投与（例えばＩＶ、ＩＭ、ＳＣ又はＩＰ）される。有効用量は処置される症状及び投与経路に応じて著しく変動することが予期されるが、活性物質を０．１（〜７Ｕ）ないし１００（〜７０００Ｕ）μｇ／体重１ｋｇの範囲内であると予期される。貧血症状の処置に好ましい用量は毎週３回、約５０ないし約３００単位／ｋｇである。
【００１５】
本発明のＥＰＯリポソーム分散物は概括的に、組成物１００グラム当たり、約２００，０００単位ないし約百万単位のＥＰＯ糖蛋白を含む。活性ＥＰＯ成分は、
（ａ）（ｉ）  レシチン又は水素化レシチン、
（ii）  場合により、荷電された電気的陽性又は電気的陰性の脂質化合物、及び
（iii） コレステロールあるいは、コレステロールエステル、コレステロールのポリエチレングリコール誘導体（ＰＥＧ−コレステロール）、及びコレステロールの有機酸誘導体、から選択されるコレステロールの誘導体、並びに
（ｉｖ）１ないし６個の炭素原子の低級アルカノールからなるアルコール成分、を含んでなる脂質相、並びに
（ｂ）  バッファー水溶液、
から形成されたリポソーム懸濁物中に分散される。
【００１６】
特に、引用により本明細書に取り込まれている欧州特許第０  ２５３  ６１９号に記載の方法に従って製造されたこのような調製物は、それを、従来の当該技術分野の組成物を含むＨＳＡに対する適切な代替物にさせるような特徴を示す。
【００１７】
レシチンは精製形態の天然のレシチンとして又は、好ましくは、より安定な水素化レシチンとしてのどちらでも使用することができるが、後者の使用は安定剤の濃度の減少を可能にする。レシチン成分は概括的に、組成物１００グラム当たり約０．５ないし５．０グラムの量で存在する。好ましくは、水素化レシチンは、ＥＰＯ及びリポソームの安定性に否定的な様態で影響を与える可能性がある、検出可能な濃度の触媒を含まない、良質の物でなければならない。
【００１８】
コレステロールは組成物１００グラム当たり、０．１ないし１．０グラムの範囲の量でリポソーム安定剤として使用される。コレステロールに加えて、コレステロールエステル、コレステロールのポリエチレングリコール誘導体（ＰＥＧ−コレステロール）、並びにコレステロールの有機酸誘導体、例えばヘミコハク酸コレステロール、のようなその他のコレステロール誘導体を使用することができる。
【００１９】
電気的に陽性又は電気的に陰性の脂質は陽性又は陰性に荷電した成分を有する脂質化合物である。電気的に陽性の脂質はオレイルアミン又はステアリルアミンである。電気的に陰性の脂質は、オレイン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジ−パルミトイルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、又はジミリスチルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）のようなホスファチジン酸である。これらの荷電脂質の使用は、リポソームを沈澱させない、蛋白光の分散物を確実に生成する荷電リポソームを生成させる。前記のように、たとえ活性成分がリポソーム内に取り込まれず、単に荷電リポソームを含む分散物として存在する場合ですら、活性エリスロポイエチン糖蛋白がその投与のために使用された容器又はケイ素管のガラス壁に付着しないという結果は極めて予想外のものである。
【００２０】
エタノール注入法の使用により調製される組成物中には概括的に、組成物１００グラム当たり、約０．５ないし約５．０グラムの範囲の量の、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等のような１ないし６個の炭素原子の低級アルカノールからなるアルコール成分が含まれる。エタノールが好ましい。
【００２１】
水性バッファーの成分は非経口組成物中のバッファーとして通常使用される典型的な酸の塩から選択される。その例はクエン酸、酢酸及びリン酸塩を含む。リン酸塩バッファーが好ましい。その例は、リン酸二水素ナトリウム二水和物、又はリン酸水素二−ナトリウム二水素物及びそれらの混合物を含む。好ましくは、０ないし２．０ｇ／１００ｇの範囲の量のリン酸二水素ナトリウム二水和物及びリン酸水素二−ナトリウム二水素物の混合物が使用される。
【００２２】
凝集物の形成を防止するために、場合によっては、組成物にグリシンのような安定剤を添加することができる。しかし、殆どの場合に、リポソームは組成物中で担体としてのみならず、安定剤として働くので、このような安定剤は必要ではない。
【００２３】
本発明のリポソームを基礎にした組成物は、引用により本明細書に取り入れられている、欧州特許第２５３６１９号に記載の、リポソーム組成物製造のための当該技術分野で既知の方法を適用することにより調製される。この方法においては、単一の二重層リポソームは、リン脂質及び活性成分のエタノール溶液を調製し、この溶液を、高速ホモジナイザー中に含まれたバッファー水溶液中に圧力下で注入することにより調製される。リポソームは自然に形成されて、１μｍ未満の直径をもつリポソームを提供する。なかでも、本発明の方法に従うリポソームは精製水中でバッファー水溶液を形成することにより製造される。それとは別に、レシチン、コレステロール及び荷電脂質成分をエタノールのようなアルコール溶液に溶解する。水溶液を高性能ホモジナイザーに接続して、循環させ、アルコール溶液をホモジナイザーに直接注入する。１μｍ未満のリポソームが自然に形成される。次いで、このように形成されたリポソームをＥＰＯ活性成分とともにインキュベーションすると、本発明のリポソーム分散物が形成される。
【００２４】
厳密に規定された直径をもつリポソームを含む透明なリポソーム分散物を得るためには、約８０〜１００ｎｍの直径をもつリポソームをもたらす、約０．０５〜０．０８ｍｍの孔をもつフィルターを通してリポソームを押し出すことが好ましい。この追加的な粉末度調節段階は、あらゆる凝集物を容易に検出し、血液中の循環時間を延長するために、透明な溶液を確実に生成するために使用される。
【００２５】
前記のように、最近発売されたエリスロポイエチン組成物は、安定性を維持し限定された貯蔵寿命をもつために、Ｔｗｅｅｎｓ、アミノ酸等のような安定剤を含むか又は凍結乾燥して貯蔵されている。本発明のリポソーム組成物は優れた安定性を示す、すなわち、リポソーム自体が安定で、同時に、生物学的に有効な物質の分解及び凝集が最小にされることが判明した。産業的適用にとって非常に重要な、２年までの貯蔵寿命が達せられた。この改善された安定性は、本発明の優れた、穏やかな製造技術並びに調製物の成分及び組成に起因する可能性がある（文献に記載の調製物と比較されると、定性的及び定量的観点の両方から）。
【００２６】
組成物の安定性は更に、トコフェロール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、パルミチン酸アスコルビル、あるいは、例えばエデト酸二ナトリウムのようなエデト酸塩（ここで、エデト酸塩は更に、存在する可能性のある重金属と結合している）のような抗酸化剤の添加により増強され得る。安定性は更に、安息香酸及びパラベン、例えばメチルパラベン及び／又はプロピルパラベン、のような保存剤の添加により増強され得る。
【００２７】
好ましい組成物は次の概括的処方、
0004613294.tif 000002
のものである。
【００２８】
本発明の具体的な利点を次の実施例により更に具体的に示す。
【００２９】
【実施例】
（実施例１）  リポソームを基礎にした分散物
次の組成、
0004613294.tif 000003
のリポソームを基礎にした分散物を欧州特許第０  ２５３  ６１９号に記載の方法に従って製造した。
方法
リポソームを８０℃で、注射用水中の、リン酸二水素ナトリウム二水和物、リン酸水素二−ナトリウム二水和物及び塩化ナトリウムの電解質水溶液（バッファー）を形成することにより製造する。別に、レシチン及びコレステロールを５５℃〜７０℃で、エタノールのようなアルコール溶液中に溶解する。水溶液を高性能ホモジナイザーに接続して、循環をもたらし（ケトル１）、アルコール溶液（ケトル２）をホモジナイザー中に直接注入する。全工程中、エタノール溶液に窒素をパージした。１μｍ未満のリポソームが自然に形成される。厳密に規定された直径をもつリポソームを形成するために、リポソーム分散物を規定された孔（例えば０．８と０．５μｍ）をもつ核膜孔フィルターを通して押し出した。エリスロポイエチンをリポソーム分散物とともに温置し、後に１回滅菌濾過した。滅菌条件下でバイアルの充填を実施した。
技術的データ
ホモジナイザー速度、１３，０００ｒｐｍまで
エタノール溶液の流速、２０〜１００ｍｌ／ｓ
（実施例２）  リポソームを基礎にした分散物
組成
0004613294.tif 000004
方法
実施例２のリポソーム分散物は、ＤＰＰＡ−Ｎａが、エタノール注入実施前にレシチン及びコレステロールとともにエタノール溶液に添加されることを除いて実施例１の方法に従って調製される。
（実施例３）  リポソームを基礎にした分散物
組成
0004613294.tif 000005
方法
実施例３のリポソーム分散物は実施例２の方法に従って調製される。
（実施例４）  安定性試験
２バッチのリポソームのエリスロポイエチン調製物を実施例１及び２に従って製造した。そのバッチを様々な時間において安定性を測定した。使用されたインビトロ及びインビボの生物検定方法は以下に示される。その結果は表１及び２に示される。
【００３０】
【表１】
0004613294.tif 000006
【００３１】
【表２】
0004613294.tif 000007
【００３２】
インビボ生物検定
前以て低酸素症にさせた赤血球増加症のマウスのエリスロポイエチン生物検定、
マウスを１８時間、減圧下に置く。次の６時間、マウスを外気圧下に置く。この方法を次の１４日間繰り返す。３日後に、外気圧下でマウスにエリスロポイエチンを投与する。１日後に59ＦｅＣｌ3を含む溶液を注射する。更に２日後に、血液を分析し、赤血球中への59ＦｅＣｌ3の取り込みを測定する。
インビトロ生物検定
インビトロの生物検定はエポエチンアルファの生物学的活性を正確に定量することを目的とした、細胞を基礎にした生物検定である。
【００３３】
試料を最初に、組織培養培地中に希釈し、次いでＨＥＰ．Ｇ２の細胞培養物で処理する。この粘着性細胞系はシアル酸除去蛋白を除去するその能力において、肝臓組織のその能力を保持する。同様な代謝過程がインビボで起こり、シアル酸除去エリスロポイエチンの活性減少をもたらすことが知られている。ＨＥＰ．Ｇ２細胞による処理は培地からのエポエチンアルファ中のシアル酸含有エリスロポイエチンを除去しないであろう。従ってインビトロの生物検定はマウスのインビボ検定を模倣している。
【００３４】
第２の段階において、残りのエリスロポイエチンをＨＥＰ．Ｇ２細胞から分離し、Ｂ６ＳＵｔＡ細胞系を使用して細胞の増殖の測定を実施した。これらの細胞はエリスロポイエチンの存在下で成長し、成長の度合はエリスロポイエチンの量に比例する。次いで、細胞の成長をＭＴＴが細胞に添加される時に生成される色素の量により測定する。発色された色は細胞数及びＢ６ＳＵｔＡ細胞の減少している活性に正比例する。
結論
データは両調製物に対する２４カ月までの良好な安定性を示す。