(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳児後期ニューロンセロイド脂褐素沈着症（ＬＩＮＣＬ）を処置するための組成物であって、
ＣＬＮ２タンパク質
を含み、該ＣＬＮ２タンパク質は不活性な前酵素であり、該ＣＬＮ２タンパク質は、罹患細胞のリソソームにおけるミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットｃのレベルを減少させる、組成物。
【請求項２】
前記罹患細胞が神経細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＣＬＮ２タンパク質が組換えタンパク質である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
注射により投与されることを特徴とする、請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
取り込みインヒビターと組み合わせて投与されることを特徴とし、該取込みインヒビターはマンノース−６−リン酸である、請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明に至った研究は、ＮＩＤＤＫ助成金番号ＤＫ４５９９２により少なくとも一部支援された。従って、米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００２】
（発明の背景）
ニューロンセロイド脂褐素沈着症（ＮＣＬ）は、乳児、小児および成人に罹患し、そして１００，０００名の生児出生において２名と４名との間の頻度で発生する密接に関連した遺伝性神経変性障害の群である。ＮＣＬの形態の大部分は、小児に罹患し、それらの初期の症状および疾患の進行は、同様の傾向がある。初期の診断は、頻繁に、視力の問題、挙動の変化および痙攣（ｓｅｉｚｕｒｅ）に基づく。進行は、精神的能力の低下、ますます重篤かつ治療不可能になる痙攣、失明、運動技能の喪失により反映されるが、さらなる進行は、痴呆または植物状態を生じ得る。ＮＣＬのための有効な処置はなく、全ての小児期の形態は、いずれは死をもたらす。いくつかの形態のＮＣＬは、発症の年齢、臨床的病理状態、および遺伝連鎖に従って区別される。これらの形態としては、乳児ＮＣＬ（ＩＮＣＬ、ＣＬＮ１）、古典的乳児後期ＮＣＬ（ＬＩＮＣＬ、ＣＬＮ２）、若年性ＮＣＬ（ＪＮＣＬ、ＣＬＮ３）、成人ＮＣＬ（ＣＬＮ４）、２つの異型のＬＩＮＣＬ（ＣＬＮ５およびＣＬＮ６）、およびおそらく他の非定型形態が挙げられる。
【０００３】
ＣＬＮ２の遺伝子およびタンパク質（米国特許出願第０８／９３１，６０８号（１９９７年９月１６日出願）、およびＳｌｅａｔら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：１８０２−１８０５に記載される）は、変異した場合、常染色体劣性疾患である古典的乳児後期ニューロンセロイド脂褐素沈着症（ＬＩＮＣＬ、ＯＭＩＭ２０４５００）を生じる。ＣＬＮ２はタンパク質リソソーム酵素トリペプチジルペプチダーゼＩ（ＣＬＮ２タンパク質、ＣＬＮ２遺伝子産物、ＴＰＰ−１、ＥＣ３．４．１４．９とも呼ばれる）をコードし（Ｓｌｅａｔら、ＶｉｎｅｓおよびＷａｒｂｕｒｔｏｎ（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４４３  １３１−１３５）、この酵素は、ＬＩＮＣＬに存在しないまたはＬＩＮＣＬにおいて変異した４６ｋＤａリソソームタンパク質である。これがない場合、主要な同定可能な成分がミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットｃである貯蔵物質は、ニューロンおよび他の細胞型において罹患患者のリソソームに蓄積する（Ｐａｌｍｅｒら（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．５７：２６０−２６５）。ＣＬＮ２に基づいて、ＬＩＮＣＬおよび関連疾患の処置のために治療的適用を開発する必要がある。現在では、この疾患のための有効な処置は存在せず、代表的には、６歳〜１５歳の間に死亡する（Ｍｏｌｅ（１９９８）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．５：２８７−３０３）。
【０００４】
酵素置換治療は、罹患細胞において機能的ＣＬＮ２タンパク質の不十分な量により特徴付けられるＬＩＮＣＬのようなリソソーム蓄積症（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｓｔｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）についての望ましい処置である。酵素置換治療において、組換え（または天然）酵素は、罹患細胞に投与されて、代謝欠陥を較正する。これは、ゴーシェ病について成功したことが証明されたアプローチである。グルコセレブロシダーゼの投与は、ゴーシェ病を有する多くの患者の処置において顕著に有効であることが証明され（Ｂｒａｄｙ，Ｒ．Ｏ．およびＢａｒｔｏｎ，Ｎ．Ｗ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｅｄ  Ｍｅｔａｂ  Ｂｉｏｌ  ５２，１−９）、多くの他のリソソーム蓄積障害について臨床試験が進行している（Ｓｃｈｉｆｆｍａｎｎら（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７，３６５−３７０；Ｂｉｊｖｏｅｔら（１９９０）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ８，２１４５−２１５３；Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｔ．およびＡｍａｌｆｉｔａｎｏ，Ａ．（２０００）Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ  ６，２４５−２５１；Ｄｏｗｎｓ−Ｋｅｌｌｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２０００）；Ｋａｙｅ（２００１）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｏｐｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３：２４９−２５６；Ｋａｋｋｉｓら（２００１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．７２：１９９−２０８；Ｂｙｅｒら（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．４７：７４３−７４９；ＢｒａｄｙおよびＳｃｈｉｆｆｍａｎ（２０００）ＪＡＭＡ  ２８４：２７７１−２７７５；Ｖｏｇｌｅｒら（１９９９）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．４５：８３８−８４４；Ｚｉｒｚｏｗら（１９９９）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２４：３０１−３０５；ＰｌａｔｔおよびＢｕｔｔｅｒｓ（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：４２１−４３０；Ｃｒａｗｌｅｙら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：６５１−６６２；ＢｒａｄｙおよびＢａｒｔｏｎ（１９９７）Ｌｉｐｉｄｓ  Ｍａｒｃｈ  ３１  Ｓｕｐｐｌ．Ｓ１３７−１３９；Ｂａｒｔｏｎら（１９９３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２８：１５６４，１５６７，１５６８）。
【０００５】
（発明の要旨）
本発明の目的は、罹患細胞における機能的ＣＬＮ２タンパク質の不十分な量により特徴付けられる障害を有する患者がＣＬＮ２タンパク質の不足により引き起こされる症状を低減または排除するために有効な量のＣＬＮ２タンパク質を患者に投与することにより処置され得る治療を提供することである。
【０００６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、罹患細胞において欠乏した量の機能的ＣＬＮ２タンパク質によって特徴付けられる障害を有する患者に対して、ＣＬＮ２タンパク質における欠乏によって引き起こされる症状を減少または排除するのに有効な量のＣＬＮ２タンパク質を投与することによって、この患者を処置するための方法に関する。あるいは、投与されるＣＬＮ２タンパク質の量は、その細胞においてＣＬＮ２タンパク質の正常なレベルが回復されるような量であり得る。
【０００７】
ＣＬＮ２の投与が効果的な治療レジメンである患者は、好ましくはヒトであるが、任意の動物であっても良い。従って、当業者に容易に理解され得るように、本発明の方法および薬学的組成物は、任意の動物（特に哺乳動物（家庭内動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）（例えば、ネコまたはイヌ被験体）、家畜動物（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）（例えば、限定されないが、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、およびブタ被験体）、野生動物（野生にいるにせよ捕まっているにせよ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコなど）、トリ種（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、鳴禽類など）が挙げられるが、限定するわけではない）に対する投与、すなわち、獣医学的な使用に特に適する。
【０００８】
このような障害において、患者の特定の細胞は、十分な機能的ＣＬＮ２タンパク質を有さない。機能的によって、ＣＬＮ２タンパク質が、例えば、存在しないかまたは不活性か、あるいは不適切なレベルで存在し得ることが意味される。この障害は、種々の細胞型のサンプルを取ること、そして公知の方法によって、ＣＬＮ２タンパク質が発現していないか、またはさもなくば規定されるように機能的ではないかを検出することによって、決定され得る。このような方法としては、酵素活性アッセイ、顕微鏡検査、免疫蛍光、および核酸ハイブリダイゼーション（例えば、米国第０８／９３１，６０８号およびＳｌｅａｔら（１９９７）において記載されるタンパク質および核酸を使用する）が挙げられ得る。罹患細胞は、いずれの細胞型または組織型にも属し得るが、好ましくはニューロンである。このような障害の存在はまた、発作および運動技能の喪失のような身体的な症状によって検出され得る。
【０００９】
好ましくは、障害は、罹患細胞（特に、ニューロン）のリソソームにおける１つ以上の貯蔵産物の蓄積によって特徴付けられる。障害を検出する１つの様式は、リソソームが貯蔵物質を蓄積していることを発見することであり、この発見は、顕微鏡検査または免疫蛍光などの公知の方法によってなされ得る。リソソームにおいて検出された貯蔵物質の例は、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットｃである。ＣＬＮ２タンパク質での首尾良い処置は、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ、特に罹患細胞（例えば、ニューロン）のリソソームにおけるサブユニットｃを、減少もしくは排除する。罹患細胞のリソソームにおけるミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットｃのような貯蔵物質の排除を検出することは、上記のような公知の方法によって行われ得る。このような障害の例は、ＬＩＮＣＬである。
【００１０】
ＣＬＮ２タンパク質は、不活性のプロ酵素（またはプロドラッグ）の形態、またはより短い活性形態で存在し得る。これらのうちのどちらかは、天然に単離されても良いし、または組換え体でも良い。例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において産生される場合、そのプロ酵素形態のＣＬＮ２タンパク質が得られる。この形態は、酸性化の後に活性形態に転換する。従って、プロ酵素は、リソソームに送達されるまで不活性なままである、高度に適したプロドラッグであり、その酸性環境がそのプロ酵素を活性化する。任意のこれらの形態におけるＣＬＮ２タンパク質を得ることは、以下および米国第０８／９３１，６０８号およびＳｌｅａｔら（１９９７）において詳細に記載される。簡単にいうと、ＣＬＮ２タンパク質は、公知の方法を使用して、正常脳サンプルおよびＬＩＮＣＬ脳サンプルからマンノース−６−リン酸含有糖タンパク質を精製すること、ならびに、正常な試料には存在するがＬＩＮＣＬ試料には存在しないタンパク質バンドを単離することによって、ヒト脳サンプルから単離される。一旦タンパク質が得られると、対応する遺伝子およびｃＤＮＡもまた、公知の方法を使用して単離される。次いで組換えタンパク質が、公知の方法を使用してｃＤＮＡから生成される。上記のいずれの形態のＣＬＮ２タンパク質も、マンノース−６−リン酸化されていても良いし、またはマンノース−６−リン酸化されていなくても良い。
【００１１】
ＣＬＮ２タンパク質は、単独で使用されても良いし、または他の活性成分と共に使用されても良い。ＣＬＮ２タンパク質は、公知の方法によってポリアルキレングリコール部分に結合しても良いし、または、キメラタンパク質（例えば、抗体もしくはその一部、トランスフェリン、ホルモン、または増殖因子に連結するような）の一部として使用されても良い。ＣＬＮ２タンパク質は、プロドラッグの形態で、すなわち、（例えば、上記のように）一旦投与されると活性になる安定で不活性な形態で、提供され得る。本発明は、所望の細胞または組織（例えば、脳）を標的化するために、ＣＬＮ２に結合した標的化分子、ＣＬＮ２をコードするＤＮＡベクター（ウイルスを含む）、およびキャリア（すなわち、リポソーム）を提供する。本明細書中で使用される場合、「標的化分子」とは、インビボで投与される場合に所望の位置に局在化する分子を意味すべきである。種々の実施形態において、標的化分子は、ペプチドもしくはタンパク質、抗体、レクチン、糖質、またはステロイドであり得る。１つの実施形態において、標的化分子は、標的細胞の内部移行するレセプターのタンパク質リガンドまたはペプチドリガンドである。特定の実施形態において、標的化分子は、周知のＲＧＤ配列を含むペプチド、または癌細胞のような細胞の表面でＲＧＤレセプターと結合するその改変体（例えば、ＲＧＤ配列を認識するレセプターを有するヒト卵）である。他のリガンドとしては、限定されないが、トランスフェリン、インスリン、アミリンなどが挙げられる。レセプターのインターナリゼーションは、ＣＬＮ２タンパク質の細胞内への送達を促進するのに好ましい。別の実施形態において、標的化分子は、抗体である。好ましくは、標的化分子は、モノクローナル抗体である。１つの実施形態において、架橋を促進するために、抗体が２つの重鎖および軽鎖のヘテロダイマーに還元されるか、またはＦ（ａｂ）２フラグメントが還元され、そして還元したスルフヒドリルを介してＣＬＮ２が減少および架橋され得る。標的化分子として使用するための抗体は、細胞表面抗原に特異的である。１つの実施形態において、抗原は、レセプターである。例えば、癌細胞（例えば、黒色腫細胞）上のレセプターに特異的な抗体が、使用され得る。本発明はさらに、他の標的化分子（例えば、レクチン、糖質、タンパク質およびステロイド）の使用を提供する。
【００１２】
このＣＬＮ２タンパク質は、薬学的に受容可能なキャリアおよび／または賦形剤と共に組成物で投与され得る。句「薬学的に受容可能な」は、生理学的に寛容であってかつ投与したときに望まない反応（例えば、胃の不調（ｇａｓｔｒｉｃ  ｕｐｓｅｔ）、眩暈感、アレルギー反応など）を代表的には生じない分子的実体および組成物をいう。好ましくは、本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能な」は、連邦政府または州政府の規制当局によって認可されたか、または動物における用途、およびより具体的にはヒトにおける用途のための合衆国薬局方もしくは他の一般的に認知された薬局方に列挙されていることを意味するが、本発明の薬学的に受容可能なキャリアは、それ自体が認可されることなしに、このような認可されたキャリアの特性を共有し得る。用語「キャリア」とは、化合物と共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、滅菌された液体（例えば、水および油であり、石油起源、動物起源、植物起源または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）であり得る。水または水溶液、生理食塩水溶液およびブドウ糖水溶液およびグリセロール溶液が、好ましくは、特に注射溶液のための、キャリアとして使用される。適切な薬学的キャリアは、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
【００１３】
本発明の組成物は、好ましくは、細胞表面レセプターによるＣＬＮ２タンパク質の局所的なクリアランスを減少する摂取阻害剤を含む。この補助によって、ＣＬＮ２タンパク質が均一に投与され、その結果、投与部位に近い少数の細胞がＣＬＮ２タンパク質の殆どの量を受けるのではなく、より多くの細胞がいくらかのＣＬＮ２タンパク質を得ることを確実にする。クリアランス機構は、細胞表面レセプター（例えば、マンノースレセプター、アシアログリコプロテインレセプター、およびマンノース−６−リン酸レセプター）によるエンドサイトーシスを含む。従って、好ましい摂取阻害剤は、マンノース−６−リン酸である。この摂取阻害剤は、ＣＬＮ２タンパク質と共に組成物として投与され得るか、または別々ではあるが同時に投与され得るか、あるいはこれら２つは、摂取阻害剤が所望の効果を有し得る限りにおいて、異なった時刻で投与され得る。
【００１４】
ＣＬＮ２タンパク質の欠乏に起因する症状を軽減するか、またはこれらを取り除くために有効なＣＬＮ２タンパク質の量は、当業者によって容易に決定される。上で議論したように、症状の緩和（すなわち、軽減または除去）は、患者の身体的状況（例えば、発作の休止または発作の量もしくは強度における減少）に対して決定され得る。あるいは、状態の軽減を確認するために、リソソーム中に存在する貯蔵産物の量を決定し、そして正常なコントロール細胞と比較することによって、この測定を細胞サンプル（例えば、脳ニューロン）に基づいて行い得る。従って、この投薬量は、患者の年齢、大きさ、および状態に依存して当業者によって決定され得る。あるいは、投与されるＣＬＮ２タンパク質の量は、例えば、正常細胞との比較によって決定した場合、細胞中の正常なレベルのＣＬＮ２タンパク質を回復させるほどであり得る。好ましい処置において、ＣＬＮ２タンパク質の有効量は、罹患した細胞が、約１．０ｎＭ〜約１００ｎＭのＣＬＮ２タンパク質を受け取るほどである。罹患した細胞が約１．０ｎＭ〜約１００ｎＭのＣＬＮ２タンパク質を受けることを確実にするために使用される投薬量は、例えば、どれ程の（例えば）注射されるＣＬＮ２または経口によるＣＬＮ２または吸入されるＣＬＮ２が所望の細胞レベルを提供するために必要であるかを決定するための公知の方法によって、投与後の生検および処置された細胞の分析から当業者によって決定され得る。摂取阻害剤が投与される場合、この摂取阻害剤は、投与部位近傍におけるＣＬＮ２タンパク質の即時のクリアランスを阻害する濃度であるべきである。このような投薬量は、当業者によって決定され得る。この摂取阻害剤がマンノース−６−リン酸である場合、５ｍＭが好ましい投薬量である。
【００１５】
本発明に従って、このＣＬＮ２タンパク質またはＣＬＮ２タンパク質を含む組成物は、非経口的、経粘膜的（例えば、経口、経鼻、または直腸的）または経皮的に導入され得る。好ましくは、投与は、注射、特に、腸管外（例えば、静脈注射を介する）投与および以下を含むがこれらに限定されない投与による：小動脈内投与、筋内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、脳室内投与および頭蓋内投与。
【００１６】
ＣＬＮ２タンパク質またはＣＬＮ２組成物は、ビヒクル、特にリポソームで送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら、ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、同書、ｐｐ．３１７−３２７を参照のこと；一般的には同書のものを参照のこと）。全身的な副作用を軽減し細胞透過性を向上させるために、これはＣＬＮ２を導入するのに好ましい方法であり得る。
【００１７】
ＣＬＮ２タンパク質またはＣＬＮ２組成物は、制御放出系で送達され得る。例えば、これは静脈内注入、移植可能な浸透圧ポンプ（ｏｓｍｏｔｉｃ  ｐｕｍｐ）、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与様式を使用して送達され得る。１つの実施形態において、ポンプを使用し得る（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子物質を使用し得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）もまた参照のこと）。なお別の実施形態において、制御放出系を、治療標的の近傍に位置付け得、従って、これはわずかな全身用量のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、前出、ｖｏｌ．２、ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照のこと）。好ましくは、制御放出デバイスを被験体の部位ＬＩＮＣＬ罹患組織の近傍に導入する。他の制御放出系はＬａｎｇｅｒによる総説（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））で議論されている。
【００１８】
以下の実施例は、例示的なものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書中に記載の発明に加え、本発明の種々の改変が、当業者にとって前述の記載および添付の図面から明らかである。このような改変は、本発明および特許請求の範囲にあることが意図される。
（実施例）
（プラスミド構築、細胞選択、および遺伝子増幅）
ＣＨＯ細胞を、リポフェクタミン手順（Ｇｉｂｃｏ）を使用してＰｖｕＩ線形化ｐＭＳＸＮＤ１  ＣＬＮ２（発現ベクターｐＭＸＮＳ［８］中の、ヒトＣＬＮ−２  ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０１７４５６，１７５Ａｒｇ改変体）のヌクレオチド１位〜１７０７位に対応するフラグメント）で、トランスフェクトした。適切なトランスフェクト体を、７００μｇ／ｍｌのＧ４１８を用いる選択によって単離し、そして個々のクローンをクローニングシリンダーで単離した。選択コロニーを、ヌクレオチド／１０％透析ＦＢＳを含まないα−ＭＥＭ中の０．２μＭのＭＴＸで処理し、遺伝子増幅を起こした細胞を選択した。細胞が耐性となった場合、このＭＴＸ濃度を上昇し、そしてこの手順を繰り返した。１２サイクルの選択後、４００μＭのメトトレキサートに耐性な細胞を得た。
【００１９】
（酵素アッセイ）
ＴＰＰ−Ｉ活性アッセイを、ＶｉｎｅｓおよびＷａｒｂｕｒｔｏｎ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１９９８  １３８４  ２３３〜４２頁）の方法の改変形を用いて実施した。他のように示さない限り、サンプルを、１５０ｍＭのＮａＣｌ／０．１％のトライトンＸ−１００／５０ｍＭのギ酸（ｐＨ３．５）中で、３７℃にて３０分間プレインキュベートして、プロＣＬＮ２を活性酵素に変換した。
【００２０】
（ＣＨＯ細胞における組換えＣＬＮ２タンパク質の産生）
全長のヒトＣＬＮ２  ｃＤＮＡを、ｐＭＳＸＮＤ１ベクター（Ｓ−Ｊ  ＬｅｅおよびＤ  Ｎａｔｈａｎｓ，１９８８  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３  ３５２１〜７）中にクローニングした。得られたプラスミドは、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅ）Ｉプロモーターによって駆動するＣＬＮ２発現カセット、Ｇ４１８選択のためのネオマイシン耐性カセット、およびメトトレキサート（ＭＴＸ）耐性のためのジヒドロ葉酸還元酵素発現カセットを含む。ＣＨＯ細胞にリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ）を用いて線状化プラスミドをトランスフェクトし、そして安定にトランスフェクトされたクローンをＧ４１８選択後に単離した。馴化培地中のＴＰＰ−Ｉ活性をアッセイし、そして最も高い発現体（ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）をＭＴＸで処理して、遺伝子増幅を生じたクローンについて選択した。馴化培地中のＴＰＰ−Ｉ活性レベルは、トランスフェクションおよびＧ４１８選択後には、内因性レベルの約１５倍増加し、そしてさらに、ＭＴＸ増幅後には、トランスフェクトしていない細胞の１０００倍を超えるまでに増加した（図１）。
【００２１】
培養条件を、産生系を最適にする企図で評価した。本発明者らは、ウシ胎仔血清を含むかまたは含まない異なる形の標準培地、血清を減少させた培地、およびＣＨＯ細胞のために特殊化した低タンパク質処方物を含む、種々の増殖培地を比較した。代表的な実験を、図２に示す。Ｇｉｂｃｏ  ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ培地が最も良い収量を生じた。しかし、この培地は、後続の精製を妨害し得るタンパク質成分を含む。従って、タンパク質を含まない培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２は、約１／２の収量を生じるが、本発明者らは、この培地を産生目的のために用いることを選択した。
【００２２】
（組換えＣＬＮ２タンパク質の精製および特徴付け）
ＣＨＯ細胞の培養培地をＹＭ−３０膜を通す限外ろ過によって濃縮し、そして緩衝液を低塩溶液に交換した。この物質を、Ｕｎｏ  Ｑ１２カラム（ＢｉｏＲａｄ）の陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。ＴＰＰ−Ｉ活性プロフィールは、ＣＬＮ２タンパク質が、約１５０ｍＭのＮａＣｌで溶出する主要なＯＤ２８０ピークを示すことを明らかにする。この原料物質中に存在するこれらのタンパク質とこのピークの陰イオン交換画分中に存在するタンパク質とを、変性ＰＡＧＥ（１０％  ＮｕＰＡＧＥ，Ｎｏｖｅｘ）およびクマシーブルー染色により比較すると、６５ｋＤａのＣＬＮ２タンパク質が馴化培地中の主なタンパク質であり、そして少量の成分のほとんどがイオン交換クロマトグラフィーによって除去されていることを示す（図４）。
【００２３】
ピーク画分をプールし、そしてＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２ゲル分画カラムに適用した。このタンパク質は単一ピーク画分として溶出し、ゲルろ過標準物と比較すると、６５ｋＤａの球状タンパク質として溶出する（図５）。これは、ＣＬＮ２タンパク質前駆体がｐＨ７．４の溶液中で単量体として存在することを示す。ここで留意すべきことは、不活性なＣＬＮ２前駆体が酸性のｐＨで自己活性化をして４６Ｋｄａの活性ＣＬＮ２タンパク質になるので、全てのクロマトグラフィーをわずかにアルカリ性のｐＨ（ｐＨ７．４〜８．０）で実施したことである（以下を参照のこと）。
【００２４】
理想的には、酵素補充療法に用いられる組換えＣＬＮ２タンパク質は、このタンパク質がエンドサイトーシスされてリソソームに送達されるように、マンノース６−リン酸を含むべきである。このタンパク質のマンノース６−リン酸化状態を研究するために、組換えプロＣＬＮ２を、固定化した可溶性の陽イオン非依存性マンノース６−リン酸レセプターのカラムに適用した。このカラムを、カラム緩衝液で洗浄した。このカラム緩衝液は、グルコース６−リン酸（これは、マンノース６−リン酸レセプターに結合せず、そしていくつかの非特異的結合物質を潜在的に遊離し得る）、マンノース６−リン酸、およびグリシン緩衝液（密接に結合した物質または非特異的に結合した物質を溶出するため）を含有した。その画分を、自己活性化後のＴＰＰ−Ｉ活性アッセイ（図６）によってかまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（データは示さない）によって分析した。ＣＬＮ２タンパク質の基本的に全ては、カラムに保持されており、そしてこのＣＬＮ２タンパク質を、マンノース６−リン酸で特異的に溶出した。これは、ＣＨＯ細胞において産生された組換えＣＬＮ２タンパク質がマンノース６リン酸化されていることを示す。
【００２５】
（ＣＬＮ２タンパク質／ＴＰＰ−Ｉの自己触媒プロセシング）
中性またはアルカリ性のｐＨに維持されている場合、精製したＣＨＯ細胞産生ヒト組換えＣＬＮ２タンパク質は、変性ＰＡＧＥによりみかけの大きさ約６５ＫＤａを有する（図４および図７ａ）。エドマン分解法は、アミノ末端（ＳＹＳＰＥ．．．）が翻訳されたＣＬＮ２メッセージの残基２０に対応することを示した。これは、プロＣＬＮ２タンパク質を生じるように残基１９の後を切断されるシグナル配列を有するプレプロタンパク質として、ＣＬＮ２タンパク質が合成されることを示す。酸性のｐＨでインキュベーションする際、この６５ＫＤａのタンパク質は、翻訳されたＣＬＮ２メッセージの残基１９６に対応するアミノ末端（ＬＨＬＧＶ）を有する、４６ＫＤａ種に変換される。このアミノ末端は、ヒト脳から単離された内因性ＣＬＮ２タンパク質と同一である（Ｓｌｅａｔら  １９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７  １８０２〜１８０５頁）。昆虫細胞において産生された極めて精製された組換えＣＬＮ２タンパク質の反応速度分析は、そのタンパク質分解プロセシングが酵素活性の獲得によって達成されることを示す（図７ｂ）。（ここで、留意すべきことは、ＣＨＯ細胞調製物を本出願中に記載される他の全ての実験について用いることである。ＣＨＯ細胞調製物が利用可能となる前に、この昆虫細胞調製物をこの分析に用いた。予備実験は、自己触媒プロセシングに関して、この２つの調製物が本質的に同一であることを示す）。これらのデータは、ＣＬＮ２タンパク質が不活性酵素前駆体として合成され、そして酸性化の際、酵素的に活性な種に自己分解されることを示す。
【００２６】
（ＬＩＮＣＬ線維芽細胞によるＣＬＮ２の取り込み）
本発明者らは、組換えＣＬＮ２タンパク質がＬＩＮＣＬ細胞に標的化され得るか否かを決定するために主な実験の吟味を行った。コンフルエントなＬＩＮＣＬ線維芽細胞を漸増濃度の精製ＣＬＮ２前駆体タンパク質とともに、１日間、２日間、４日間および８日間インキュベートした。細胞を、ＴＰＰ−Ｉ活性についてアッセイした。データは、組換えＣＬＮ２タンパク質の非存在下で培養した代表的な標準コントロールのヒト線維芽細胞の活性と比較して表す。その取り込みは、時間および添加した内因性酵素の濃度の関数として増加する（図８）。その活性アッセイは、比較的大量のＣＬＮ２タンパク質がＬＩＮＣＬ細胞に送達され得ることを示す。１０ｎＭ以上の濃度のＣＬＮ２タンパク質に曝露した１日後、ＬＩＮＣＬ線維芽細胞の活性は、標準コントロールの線維芽細胞の活性と等価であった。８日後、ＣＬＮ２タンパク質の細胞内蓄積は、約５倍までコントロールの線維芽細胞の細胞内蓄積を超えた。ここで、留意すべきことは、活性の経時的な増加は、組換えＣＬＮ２タンパク質が１０％のＦＢＳを含む培養培地において安定であることを示す。コントロール実験は、その取り込みの全てではなくともほとんどが、マンノース６−リン酸レセプター媒介エンドサイトーシスを介して生じることを示した（図８）。
【００２７】
エンドサイトーシスされた酵素の安定性を決定するため、ＬＩＮＣＬ細胞の複製ウェルを、組換えＣＬＮ２タンパク質を含む完全培地中で１日間増殖させた。この培地を除去し、そして完全培地で置き換えた。ウェルを、直ちに（０日目）あるいは外因性ＣＬＮ２タンパク質の非存在下での培養のさらなる１、２、または７日後のいずれかでＴＰＰ−Ｉ活性について分析した。細胞内活性レベルは、少なくとも３日間定常のままであり、そして酵素回収後７日は通常のレベルの７０％をなお維持したままであることがわかった（図９）。このことは、内部移行ＣＬＮ２タンパク質はほとんど安定であり、１週間より長い半減期を有することを示す。
【００２８】
（免疫蛍光分析）
本発明者らは、共焦点顕微鏡および抗ＣＬＮ２タンパク質抗血清を用いる免疫蛍光染色を使用して、ＬＩＮＣＬ細胞へ送達される組換えＣＬＮ２タンパク質の細胞内位置を決定した。３２ｎＭのＣＬＮ２タンパク質と共に１日間インキュベートした細胞を分析する場合、ＬＩＮＣＬ線維芽細胞の染色パターンは、正常な線維芽細胞の染色パターンとは区別がつかなかった（図１０）。染色パターンは、リソソームマーカー（リソソーム画分への組換え酵素の正しい送達を示す）に対して特有である。
【００２９】
（培養ニューロンによるＣＬＮ２タンパク質の取り込み）
組換え酵素がニューロンへ送達される能力を決定するために、本発明者らは、ラット小脳顆粒ニューロンを漸増濃度のＣＬＮ２タンパク質と共に１日間培養し、そして細胞内ＴＰＰ−Ｉ活性を速度論的アッセイを用いて分析した。
【００３０】
小脳顆粒ニューロンを、記載されるように生後８日目のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット子から調製した（Ｍｅｉｎｅｒｓら（１９９９）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９，８４４３−８４５３）。この細胞を、１５０，０００細胞／ｃｍ２の密度で４８ウェルプレートへプレートした。細胞がコンフルエントである場合、培地を、示された濃度の精製された組換えヒトＣＬＮ２タンパク質（０．５ｍｌ）を含む新鮮培地で置き換えた。処理後直ちに、細胞を室温にてＰＢＳ（０．５ｍｌ）で３回洗浄し、次いで氷水浴に皿を置くことによって速やかに冷却した。この細胞を１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（０．２ｍｌ／ウェル）を添加することによって溶解し、そしてロッキングプラットフォーム上で４℃にて１時間インキュベートした。この溶解産物をマイクロフュージチューブに移し、そして１３，０００×ｇで２０分間遠心分離した。この上清を、酵素活性およびタンパク質（Ｌｏｗｒｙら（１９５１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９３，２６５−２７５）アッセイのために使用した。
【００３１】
サンプルを処理する方法に依存して（図１２、凡例）、ＴＰＰ−Ｉ活性は、ニューロン内に存在する成熟ＣＬＮ２タンパク質（三角）または前駆体および成熟ＣＬＮ２タンパク質の両方（丸）のいずれかを表わす（図１２）。内因性のレベルよりもＴＰＰ−Ｉ活性の有意な増加があり（Ｍ６Ｐの非存在下で＞３ｎＭおよびＭ６Ｐの存在下で＞１０ｎＭ）、従ってエンドサイトーシスされたタンパク質の確かな推定を可能にする組換えＣＬＮ２タンパク質の濃度で、約８０％のエンドサイトーシスされたＣＬＮ２タンパク質が成熟形態であった（図１２）。これは、酵素が酸性の細胞内画分に標的化されるが、このプロセスは線維芽細胞においてよりも緩やかであるかまたは効率的でないことを示す。また、線維芽細胞とは異なり、取り込みは、高いＣＬＮ２タンパク質濃度では飽和しなかった。しかし、Ｍ６Ｐ阻害可能な取り込みは飽和でき（図１２、挿入図、ＥＣ５０  ６〜８ｎＭ）、高い濃度で、ＭＰＲ独立性機構を介するかなりの取り込みが存在したことを示した。それにもかかわらず、ＭＰＲ独立性機構が優先される場合でさえ、約８０％のエンドサイトーシスされた酵素は、活性形態へ変換され、組換えＣＬＮ２タンパク質の適切なリソソーム標的化を示した。
【００３２】
ここで示す結果は、組換えＣＬＮ２タンパク質が、ＬＩＮＣＬ線維芽細胞によって効率的にエンドサイトーシスされ、そしてリソソームに対して標的化されることを示す。しかし、ＬＩＮＣＬに対する潜在的な治療として酵素置換を考慮する場合、エンドサイトーシスされた酵素がネイティブの酵素と機能的に等価であり、そして疾患の生化学的表現型を補正し得ることを示すことが重要である。ＬＩＮＣＬに対する生化学的な顕著な特徴は、リソソームにおけるミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットｃ（サブユニットｃ）の蓄積である。本発明者らは、ＣＬＮ２タンパク質の存在または非存在下でＬＩＮＣＬ線維芽細胞を培養し、そしてウェスタンブロッティングによってサブユニットｃの相対的レベルを決定した（図１１）。酵素処理は、サブユニットｃを影響を受けていないコントロール線維芽細胞のレベルに到達するレベルまで劇的に減少し（図１１）、組換えＣＬＮ２タンパク質がＬＩＮＣＬ細胞における代謝欠陥を補正し得ることを示した。
【００３３】
上の実施例は、組換えヒトＣＬＮ２タンパク質のための産生システムを提供し、そしてこのタンパク質がＣＬＮ２タンパク質欠失ＬＩＮＣＬ線維芽細胞のリソソームへ送達され、そして代謝欠陥を補正し得ることを示す。類似のＣＨＯベースの産生システムが、タンパク質特徴付けおよび酵素置換研究のために大量の他のリソソーム酵素を産生するために用いられている（Ｋａｋｋｉｓら（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ５，２２５−２３２；Ｉｏａｎｎｏｕら（１９９２）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１９，１１３７−１１５０；Ｂｉｅｌｉｃｋｉ，Ｊ．ら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３２９，１４５−１５０；Ｍａｒｔｉｎｉｕｋら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２７６，９１７−９２３）。本発明者らの知見とは対照的に、所定の組換えリソソーム酵素の過剰発現は代表的にその不均衡性分泌を生じる（Ｋａｋｋｉｓ，Ｉｏａｎｎｏｕ）。
【００３４】
ＣＬＮ２タンパク質前駆体の特徴は、成熟タンパク質の特徴とは多くの局面で異なる。最初に、前駆体は、酵素的に不活性であるが、酸性化した場合、自触反応的に成熟形態（活性形態）へプロセスされる。次に、成熟酵素は、中性ｐＨで３７℃にてインキュベートした場合、速やかに不活化される（Ｓｏｈａｒら（１９９９）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７３，７００−７１１；Ｖｉｎｅｓ，Ｄ．およびＷａｒｂｕｒｔｏｎ，Ｍ．Ｊ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １３８４，２３３−２４２）。対照的に、プロ酵素は、中性ｐＨで安定であり（図４）、そしてその後活性形態へ変換され得る（図１２）。最後に、プロ酵素および成熟酵素の四次構造および物理的な特徴は、完全に異なることが明らかである。例えば、哺乳動物組織からの成熟ＣＬＮ２タンパク質／ＴＰＰ−Ｉの精製のための公開されている手順は、界面活性剤を利用して溶液中のタンパク質を維持することである（ＶｉｎｅｓおよびＷａｒｂｕｒｔｏｎ；Ｄｏｅｂｂｅｒら（１９７８）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １０３，１７９４−１８０４；ＭｃＤｏｎａｌｄら（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １２６，６３−７１；Ｗａｔａｎａｂｅら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  ２７，８６９−８７７；Ｐａｇｅら（１９９３）Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３０６，３５４−３５９；Ｊｕｎａｉｄら（２０００）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７４，２８７−２９４）、そしてゲル濾過分析は、成熟タンパク質が２５０〜７００ＫＤａの凝集物を形成することを示す（ＭｃＤｏｎａｌｄら；Ｐａｇｅら）。対照的に、本発明者らは、プロ酵素が可溶性モノマーとして機能することを本明細書で示す。
【００３５】
ＣＨＯ細胞から産生される組換えＣＬＮ２タンパク質は、ＬＩＮＣＬにおける酵素置換療法に有用であると思われる多くの特性を有する。第１に、この前酵素は、リソソームに送達されるまで細胞外環境において不活性かつ安定であり、そしてその成熟形態は不安定で、中性ｐＨでわずかな活性しか有さず、酵素投与後のＴＰＰ−Ｉ活性による細胞外構造の所望されないタンパク質分解についての影響が最小化されるはずである。第２に、このタンパク質は、Ｍ６Ｐ媒介エンドサイトーシス（線維芽細胞およびニューロン）によりリソソームに効果的に送達され、そして他のエンドサイトーシス性の機構（ニューロン）により送達される可能性がある。第３に、飲食された酵素は、ＬＩＮＣＬ線維芽細胞の欠乏性ＴＰＰ−Ｉ活性を回復させる。第４に、内部移行された（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ）ＣＬＮ２タンパク質は、この疾患の生化学的マーカー（すなわち、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットｃの貯蔵）を逆転させ得る。最後に、この内部移行された活性タンパク質は、リソソーム中で長い半減期を有し、これは、投薬レジメンを考慮する際に重要である。
【００３６】
本発明者らの結果は、大量の組換えＣＬＮ２タンパク質が本発明者らのＣＨＯ細胞系から容易に獲得され得ることを示した。このことは、動物モデルにおける酵素置換研究およびＬＩＮＣＬの処置のための新規の送達方法の開発を促進する。
【００３７】
核酸またはポリペプチドについて与えられる全ての塩基の大きさおよびアミノ酸の大きさ、ならびに全ての分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）値または分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ）値はおよそであり、そして説明のために提供される。
【００３８】
本発明は、本願に記載される特定の実施形態に関して限定されるべきではなく、これらは、本発明の個々の局面の１つの例示として意図される。本明細書中で列挙される方法および装置に加えて、本発明の範囲内の機能的に等価な方法および装置は、前述の説明および添付の図面から当業者に明らかである。このような改変およびバリエーションは、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。本願中で引用される各参考文献、特許および特許出願の内容は、本明細書中で、その全体において、参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＣＨＯ細胞におけるＣＬＮ２タンパク質発現レベルの比較を示す。接着性細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２においてコンフルエントになるまで増殖させた。培地を０日目に無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２と交換した。馴化培地を２日目に回収し、プロＣＬＮ２タンパク質が活性酵素に変換されるように酸性化した後にＴＰＰ−Ｉ活性についてアッセイした。
【図２】  図２は、異なる培養培地中のＣＬＮ２タンパク質分泌の比較を示す。６ウェルプレートにおいて、接着性細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２においてコンフルエントになるまで増殖させた。培地を、０日目に、示された培養培地５ｍｌと交換し、示されるように、酵素活性測定のために０．１ｍｌを取り出した。
【図３】  図３は、組換えＣＬＮ２タンパク質の陰イオン交換クロマトグラフィーを示す。ＣＬＮ２タンパク質を過剰発現する、コンフルエントな接着性ＣＨＯ細胞を含む１２の１５０ｃｍ２ディッシュからの物質を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中（８２ｍｌ／ウェル）で８日間培養した。培地を取り出し、０．２ミクロン酢酸セルロースメンブレンを通して濾過し、ＹＭ−３０メンブレン（Ａｍｉｃｏｎ）を備えた攪拌セル装置中に配置した。このサンプルを濃縮し、緩衝液を５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０に交換し、最終容量を４０ｍＬにした。このサンプルを、１５×６８ｍｍのＵｎｏＱ１２カラムに流速２ｍｌ／分でアプライした。このカラムを、５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０で洗浄し、４０カラム容積の直線勾配（５０〜５２５ｍＭのＮａＣｌ）で溶出した。画分（ロードおよび洗浄の間は４ｍｌ、勾配溶出の間は２ｍｌ）を回収し、ＴＰＰ−Ｉ酵素活性について分析した。２００〜２２５ｍｌで溶出したプールした画分は、１．３４５ｍｌ／ｍｇ／ｃｍの吸光率を用いてＯＤ２８０から計算されるように、１７ｍｇのプロＣＬＮ２を含んでいた。クロマトグラフィーを、Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、４℃で行った。
【図４】  図４は、陰イオン交換クロマトグラフィーの前および後の、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の馴化培地のゲル電気泳動を示す。「ロード」および「ＡＥＸ」とあらわしたレーンは、図３において示した陰イオン交換カラムのそれぞれ、４０ｍｌの出発物質および２０８〜２０９ｍｌで溶出した２ｍｌのピーク画分のうちの７．５μｌをあらわす。ゲル（１０％  ＮｕＰＡＧＥ，Ｎｏｖｅｘ）を、クーマシーブリリアントブルーで染色した。
【図５】  図５は、プロＣＬＮ２タンパク質の分析的ゲル濾過を示す。アニオン交換精製されたプロＣＬＮ２（０．１４ｍｌの０．５９ｍｇ／ｍｌタンパク質）を、セファロース  １２ＨＲ  １０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライした。このカラムを、リン酸緩衝化生理食塩水を用いて、０．５ｍｌ／分の速度で溶出した。このカラムを、ブルーデキストランを使用して、同じ条件下で較正して、間隙容積および球状標準タンパク質（ウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ）、チキンオボアルブミン（４３ｋＤａ）、キモトリプシノゲン（２８ｋＤａ）およびシトクロムｃ（１２．４ｋＤａ））を決定した。
【図６】  図６は、プロＣＬＮ２タンパク質のマンノース６−リン酸レセプタークロマトグラフィーを示す。サンプル（０．２ｍｌの０．５８ｍｇ／ｍｌアニオン交換精製したプロＣＬＮ２タンパク質）を、１．５ｃｍ３  ａｆｆｉｇｅｌ  １０（ＢｉｏＲａｄ）−固定化可溶性カチオン−独立マンノース６−リン酸レセプターにアプライした（約２．５ｍｇレセプター／ｃｍ３樹脂）。このカラムを、１．５ｍｌの緩衝液Ａ（０．２％のｔｗｅｅｎ−２０および５ｍＭのβ−グリセロリン酸を含むリン酸緩衝化生理食塩水）で５回、１００ｍＭのグルコース６−リン酸を含む１ｍｌの緩衝液Ａで５回、１０ｍＭのマンノース６−リン酸を含む１ｍｌの緩衝液Ａで５回、および１ｍｌの１．０Ｍグリシン（ｐＨ２．５）で４回洗浄した。画分を、ＴＰＰ−Ｉ活性について分析した。
【図７】  図７は、組換えヒトＣＬＮ２タンパク質の自己活性化を示す。
パネルＡ。ＣＨＯ細胞から産生された組換えヒトプロＣＬＮ２タンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水中に維持または１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／５０ｍＭ  蟻酸（ｐＨ３．５）緩衝液に希釈し、そして３７℃で１６時間インキュベートした。サンプルを、還元変性ゲル（ＭＥＳ泳動緩衝液を含むＮｏｖｅｘ  ＮｕＰＡＧＥ  ビス−トリスゲル）にアプライし、そしてタンパク質をクーマシーブルー染色によって可視化した。左のレーンに示される予め染色された分子量標準のサイズを、供給者（Ｎｏｖｅｘ）によって示される補正された分子量に従って列挙した。
パネルＢ。昆虫細胞によって産生された組換えヒトプロＣＬＮ２タンパク質を含む１５０ｍＭのＮａＣｌ／２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）／０．２％のＴｗｅｅｎ２０を、室温で酸緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ／０．１％のｔｒｉｔｏｎＸ−１００／酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０））に希釈した。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液に希釈し、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｎｏｖｅｘ）において分離し、そして銀染色によって分析した（上のパネル）。レーン１は、ゼロ時間を示し（酸状態に曝露せずに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に直接希釈されたサンプル）、レーン２〜１０は、酸緩衝液に希釈後、０．５、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、９０および１２２分間置いたサンプルを示す。分子量標準のサイズを、右に示す。このゲルを、スキャンし、そして成熟形態への変換を計算した（下のバンドの強度を、上のバンドおよび下のバンドの強度の合計に対して正規化した）（グラフ、白丸）。サンプルをまた、ＴＰＰ−Ｉアッセイ緩衝液に希釈し、そして基質の加水分解の初速度を、決定した（グラフ、四角の記号）。この実験で使用した精製したＣＬＮ２タンパク質は、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを含むＣＨＯ細胞において産生されたＣＬＮ２タンパク質とは異なった。従って、グロコシル化におけるこのさらなる差異は、２つの調製物の分子量の明らかなわずかな差異が原因である。しかし、２つの調製物由来のプロＣＬＮ２タンパク質および成熟ＣＬＮ２タンパク質のアミノ末端は同一であった。
【図８】  図８は、ＬＩＮＣＬ線維芽細胞による組換えヒトＣＬＮ２タンパク質の取り込みを示す。４８ウェルプレート中のコンフルエントなＬＩＮＣＬ線維芽細胞を、示した濃度のアニオン交換精製したプロＣＬＮ２タンパク質およびゲル濾過精製したプロＣＬＮ２タンパク質を含む１ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０／１０％  ＦＢＳと共にインキュベートした。示した場合、培地はまた、１０ｍＭのマンノース６−リン酸を含んだ。示した時点で、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で３回リンスし、そして４℃で１％のｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０／１５０ｍＭのＮａＣｌ／１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）を用いて溶解した。この溶解物を、ＴＰＰ−Ｉ活性について分析した。活性を、正常コントロール線維芽細胞をプレートしたウェルに対して正規化する。
【図９】  図９は、ＬＩＮＣＬ線維芽細胞における組換えヒトＣＬＮ２タンパク質の安定性を示す。細胞を、図８に記載されるように、１０ｎＭ、３１ｎＭまたは１００ｎＭのいずれかのプロＣＬＮ２タンパク質と共に２４時間インキュベートした。培地を、除去し、そして細胞を、ＲＰＭＩ  １６４０／１０％  ＦＢＳで１回リンスした。新鮮なＲＰＭＩ  １６４０／１０％  ＦＢＳを、添加し、そしてインキュベーションは、１、３または７日間行い、そして細胞を、図８に示されるように処理した。
【図１０】  図１０は、正常線維芽細胞およびＬＩＮＣＬ線維芽細胞おけるＣＬＮ２の免疫蛍光検出を示す。ＬＩＮＣＬ細胞を、カバーガラスにプレートし、そして１０ｍＭのマンノース６−リン酸の存在または非存在において、増殖培地（ＲＰＭＩ  １６４０／１０％  ＦＢＳ）単独で、または３２ｎＭのＣＬＮ２タンパク質を含む増殖培地（ＲＰＭＩ  １６４０／１０％  ＦＢＳ）中で培養した。細胞を、Ｂｏｕｉｎの固定液で固定し、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００／リン酸緩衝化生理食塩水で透過化し、ブロッキング緩衝液（３％のＢＳＡ／０．２％のＴｗｅｅｎ２０／５００ｍＭのＮａＣｌ／リン酸緩衝化緩衝液）でブロッキングし、そしてウサギ抗ＣＬＮ２タンパク質抗血清（ブロッキング緩衝液に１：１００希釈）と共にインキュベートした。結合した抗体を、ＦＩＴＣヤギ抗ウサギ抗体を使用して検出した。ＲＰＭＩ  １６４０／１０％  ＦＢＳで増殖した正常コントロール細胞は、同時にプローブ化した。
【図１１】  図１１は、正常線維芽細胞およびＬＩＮＣＬ線維芽細胞におけるミトコンドリアＡＴＰ合成酵素ｃサブユニットを示す。コンフルエントの線維芽細胞を、示した場合、７日間、３０ｎＭのＣＬＮ２タンパク質を含むＲＰＭＩ  １６４０／１０％  ＦＢＳ中で培養した。細胞を、リチウムドデシルスルフェートサンプル緩衝液に可溶化し、そしてＭＥＳ泳動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐｒｅｃａｓｔ  ＮｕＰＡＧＥ  １０％  Ｂｉｓ−ＴｒｉｓゲルにおいてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ウエスタンブロティングを、ミトコンドリアＡＴＰ合成酵素サブユニットｃ［４］に対するウサギ抗体および増強した化学発光（Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ，ＮＥＮ）を使用して実施した。
【図１２】  図１２は、ラット小脳顆粒神経細胞による組換えＣＬＮ２タンパク質の取り込みを示す。小脳顆粒神経細胞を、１０ｍＭのＭ６Ｐの存在（塗りつぶした記号）または非存在（白記号）において、示した濃度のＣＬＮ２タンパク質を含む培地中で、４８ウェルプレート中で１日間培養した。細胞を、実験手順に記載されるように溶解し、次いで、プロ酵素を活性化するための３７℃、ｐＨ３．５の緩衝液での３０分間のプレインキュベーション（丸）またはプロ酵素の活性化を防止するための０℃ｐＨ７．５の緩衝液で３０分間のプレインキュベーション（三角）の後、動力学アッセイ（図３を参照のこと）を使用してＴＰＰ−Ｉ活性についてアッセイした。点線は、内因性のＴＰＰ−Ｉ活性レベルを示す。データは、３連の測定の平均±標準誤差を示す。データを、Ｐｒｉｓｍ３．０を使用してシグモイドの用量反応モデルに合わせた。この挿入は、予め活性化されたサンプルを示す丸と予め活性化されていないサンプルを示す三角で見られるように、Ｍ６Ｐの非存在下でインキュベーションした細胞に関連する活性とＭ６Ｐの存在下でインキュベーションした細胞に関連する活性との間の差異を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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