(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも骨形成促進物質と高分子ゲル微粒子（ナノゲル）としてコレステロール置換プルラン（CHP）およびその誘導体を含有する骨形成用生体材料であって、高分子ゲル微粒子が重合性基で修飾及びチオール基を有する水溶性ポリマーと架橋している骨形成用生体材料。
【請求項２】
チオール基を有する水溶性ポリマーがチオール基を有するポリエチレンオキシドである請求項１に記載の骨形成用生体材料。
【請求項３】
骨形成促進物質が非ペプチド性である請求項１又は２に記載の骨形成用生体材料。
【請求項４】
骨形成促進物質がプロスタグランジン受容体制御薬である請求項１〜３のいずれか一に記載の骨形成用生体材料。
【請求項５】
CHPにアミノ基またはカルボキシル基が導入されている請求項１〜４のいずれか一に記載の骨形成用生体材料。
【請求項６】
重合性基がアクリロイル基である請求項１〜５のいずれか一に記載の骨形成用生体材料。
【請求項７】
骨形成促進物質の高分子ゲル微粒子に対する重量比が6×10-6〜2×10-2である請求項１〜６のいずれか１項に記載の骨形成用生体材料。
【請求項８】
高分子ゲル微粒子の粒径（直径）が20-500 nmである請求項１〜７のいずれか１項に記載の骨形成用生体材料。
【請求項９】
徐放性製剤である請求項１〜８のいずれか１項に記載の骨形成用生体材料。
【請求項１０】
注射剤、ペースト状、乳剤である請求項１〜９のいずれか１項に記載の骨形成用生体材料。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の骨形成用生体材料を含有する骨疾患予防および／または治療剤。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の骨形成用生体材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は骨形成促進物質とナノゲルを含有する骨形成用生体材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨は再生修復能力が高い組織であるが、重度の粉砕骨折や骨腫瘍の摘出などの大きな損傷は完全には修復されず、骨癒合不全や骨欠損の残存などが生じる。また近年の人口老齢化に伴う骨粗鬆症患者の増加に比例して、骨粗鬆症による骨折の発生頻度が増大している。これらは機能障害や疼痛の原因になり、日常生活動作に支障をきたすため問題となっている。これまでにこれらの損傷の治癒を目的とした骨組織の再生が試みられてきたが、現在のところ目的とする局所において特異的に骨を形成する技術は確立されていない。【０００３】
近年、骨組織の再生に関わる細胞増殖因子やサイトカイン、ホルモンなどの物質が特定されつつあり、それに伴ってこれらの物質を治療へ応用する試みがなされている。このような因子の例として、骨形成タンパク（BMP）、トランスフォーミング成長因子（TGF）等のペプチド性骨形成促進物質が知られている。一方、非ペプチド性骨形成促進物質としては、プロスタグランジンE2、EP4アゴニスト、プロスタグランジンA1誘導体、ビタミンD3誘導体、ベンジルホスホン酸誘導体およびフェノールスルホフタレン誘導体等が報告されている。【０００４】
非ペプチド性骨形成促進物質であるプロスタグランジンE2（以下、PGE2と略称することがある）は、アラキドン酸から精製される生理活性物質で、生体の恒常性維持のために様々な組織で機能する。すでにヒトを含め様々な動物でPGE2の全身および局所投与することにより、骨形成が確認されており、臨床応用への期待が高まっている（非特許文献１）。しかしながら、PGE2は生体内における半減期が短く、一日に数回の投与を数週間続ける必要であることが分かっている（非特許文献２−４）。また、下痢などの副作用を引き起こすことも問題となっている。よって、PGE2を局所において長期間にわたって放出制御する投与技術の開発が求められている。【０００５】
一方、ナノ微粒子とゲルの特性を併せ持つナノメーターサイズ（特に100 nm以下）の高分子ゲル微粒子（ナノゲル）は、特にドラッグデリバリーシステムやナノテクノロジー分野で注目されるようになってきた。一般に化学架橋ナノゲルはマイクロエマルション重合法や高分子分子内での架橋反応により合成されてきた。本発明者らは、疎水化高分子の自己組織化による物理架橋ナノゲルの新規な調製法を報告した（非特許文献５）。すなわち、比較的疎水性の高い疎水基（コレステロール基）を部分的に導入した水溶性多糖類が、希薄水溶液中で自己組織的に会合し、疎水基の会合領域を架橋点とする単分散なナノゲルを形成することを見出した。【０００６】
通常のナノ微粒子は、その表面の特性を利用した研究がほとんどであるが、ナノゲルはさらにその内部の空間に疎水性の薬物やタンパク質といった物質を取り込めるスペースを有することが最大の特色である。特にコレステロール置換プルラン（CHP）のナノゲルは、タンパク質と選択的に相互作用するホストとして機能し、ドラッグデリバリーシステムのキャリアとして有効であることを報告している（非特許文献６−８）。さらに、ナノゲルはシクロデキストリンの添加により崩壊し、取り込んだ物質を放出することが可能である。【０００７】
また、物理架橋点を有することから、架橋構造の動的構造制御が可能である（特許文献９）。疎水基の構造を変えることでゲルネットワークの動的特性を制御しえることやシクロデキストリンとのホスト−ゲスト相互作用を利用することで、ナノゲルの生成と崩壊を動的に制御しえる。この性質を利用して、変性タンパク質の取り込みと放出を制御した人工分子シャペロンの開発に成功している。【０００８】
【特許文献１】WO WO00/12564号公報
【特許文献２】特開平3-232880号公報
【特許文献３】特開平4-364179号公報
【特許文献４】特開平5-294960号公報
【特許文献５】特開平8-231569号公報
【特許文献６】特開平7-29183号誘導体
【特許文献７】特開平8-73746号公報
【特許文献８】欧州公開特許公報第524023号
【非特許文献１】Pilbeam, CC., Harrison, JR., Raisz, LG, In: Bilezikian,JP.,Raisz,LG.,Rodan, GA.,eds. Principlesof bone biology. 2nd ed. San Diego: AcademicPress. vol. 2: p979-994.
【非特許文献２】Suponitzky, I., Weinreb,M.J. Endocrinol. 156, 51-57 (1998).
【非特許文献３】Keila, S., Kelner, A.,Weinreb, M. J. Endocrinol.vol.168, p131-139 (2001).
【非特許文献４】Yoshida, K., Oida, H., Kobayashi, T.,Maruyama, T., Tanaka, M., Katayama, T., Yamaguchi, K., Segi,E., Tsuboyama, T.,Matsushita, M., Ito, K., Ito, Y., Sugimoto,Y.,Ushibuki, F., Ohuchida,S., Kondo,K., Nakamura, T., Narumiya,S.Proc.Natl. Acad. Sci. USA. vol. 99, p4580-4585(2002).
【非特許文献５】Akiyoshi, K., Deguchi,S.,Moriguchi, N., Yamaguchi, S., Sunamoto,J.Macromolecules. vol. 26, p3062-3068 (1993).
【非特許文献６】Akiyoshi, K., Taniguchi, I., Fukui, H., Sunamoto, J. Eur. J. Pharm. vol. 42, p286-290 (1996)
【非特許文献７】Akiyoshi, K., Kobayashi, S., Shichibe, S., Mix, D., Baudys,M.,Kim,S.W.,Sunamoto, J. J. Control. Release. vol. 54,p313-320(1998).
【非特許文献８】Ikuta, Y., Katayama, N., Wang, L., Okugawa,T.,Takahashi,Y.,Schmitt,M., Gu, X., Watanabe, M.,Akiyoshi,K.,Nakamura, H., Kuribayashi,K., Sunamoto,J.,Shiku,H. Blood. vol. 99, p3717-3724 (2002)
【非特許文献９】Morimoto, N., Endo, T., Iwasaki, Y., Akiyoshi,K.Biomacromolecules.vol. 6, p1829-1834 (2005)
【非特許文献１０】Koshihara, Y, Takamori,R,Nomura, K, Sugiura, S, Kurozumi,S.Journal of Pharmacology Experimental Therapeutics, vol258, p1120-1126(1991)
【非特許文献１１】Tenenbaum, HC, Torontali,M,Sukhu, B. Bone, vol13,p249-255 (1992)
【非特許文献１２】Akedo, Y, Hosoi, T, Inoue S, Ikegami, A,Mizuno, Y, Kaneki, M, Nakamura,T, Ouchi, Y, Orimo, H. Biochemicaland Biophysical Research Communications, vol187,p814-820 (1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、骨形成促進物質の長期徐放および局所における機能発現を達成する骨形成用生体材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、ナノゲルについての知見をもとに、ナノゲルを用いた骨形成促進物質のためのドラッグデリバリーシステムの開発が可能であることを見出し、本発明を完成した。つまり、本発明は、
「１．少なくとも骨形成促進物質と高分子ゲル微粒子（ナノゲル）を含有する骨形成用生体材料。
２．骨形成促進物質が非ペプチド性である前項１に記載の骨形成用生体材料。
３．骨形成促進物質がプロスタグランジンE2である前項２に記載の骨形成用生体材料。
４．ナノゲルがコレステロール置換プルラン（CHP）である前項１〜３のいずれか１項に記載の骨形成用生体材料。
５．CHPにアミノ基またはカルボキシル基が導入されている前項４に記載の骨形成用生体材料。
６．ナノゲルが重合性基で修飾されている前項１〜５の何れか１項に記載の骨形成用生体材料。
７．重合性基がアクリロイル基である前項６に記載の骨形成用生体材料。
８．ナノゲルがチオール基を有する水溶性ポリマーと架橋している前項６または７に記載の骨形成用生体材料。  
９．チオール基を有する水溶性ポリマーがポリエチレンオキシドである前項８に記載の骨形成用生体材料。
１０．骨形成促進物質のナノゲルに対する重量比が約6×10-6〜2×10-2である前項１〜９のいずれか１項に記載の骨形成用生体材料。
１１．ナノゲルの粒径（直径）が約20-500 nmである前項１〜７のいずれか１項に記載の骨形成用生体材料。
１２．徐放性製剤である前項１〜１１のいずれか１項に記載の骨形成用生体材料。
１３．注射剤である前項１〜１１のいずれか１項に記載の骨形成用生体材料。
１４．前項１〜１１のいずれか１項に記載の骨形成用生体材料を含有する骨疾患予防および／または治療剤。
１５．前項１〜１３のいずれか１項に記載の骨形成用生体材料の製造方法。」からなる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ナノゲルは骨形成促進物質を効率よく内包し、その血中への拡散を抑制することにより、骨形成促進物質の局所投与におけるキャリアとして機能することが分かった。また、骨形成促進物質含有ナノゲルを水溶性ポリマーにより架橋することによって、局所における長期間にわたる骨形成促進物質の徐放が可能であった。さらに、本発明によれば、少量の骨形成促進物質の投与により目的部位における骨形成が促進された。したがって、本発明により、疎水化多糖ナノゲルをキャリアとして用いることにより、血中への拡散が早い骨形成促進物質を局所において効果的に徐放させ、目的部位において特異的に骨形成を促進させることができるため、本発明の方法は骨形成促進物質の新規投与法として臨床への応用が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、当業者により普通に理解される意味を持つ。以下、本発明について、発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。【００１３】
（骨形成促進物質）
骨形成促進物質としては、現在非ペプチド性およびペプチド性の物質が知られているが、いずれも本発明の製剤に用いることができる。非ペプチド性骨形成促進物質としては、プロスタグランジンE2（非特許文献１〜４）、含硫黄複素環化合物またはその塩（特許文献２〜５）、ベンゾピラン誘導体（特許文献６）、ホスホン酸誘導体またはその塩（特許文献７）、プロスタグランジンA1誘導体（非特許文献１０）、ベンジルスルホン酸誘導体（特許文献８）、ホスホン酸類（非特許文献１１）、ビタミンK2誘導体（非特許文献１２）等が挙げられる。また、ペプチド性骨形成促進物質としては、骨形成タンパク（BMP）、繊維芽細胞増殖因子（FGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、トランスフォーミング成長因子（TGF-β）、インスリン様成長因子-1および2（IGF-1、-2）および副甲状腺ホルモン（PTH）等が例示できる。これら骨形成促進物質の中でも非ペプチド性骨形成促進物質が好ましく、プロスタグランジンE2がより好ましい。また、これら骨形成促進物質は、適宜の割合で2種以上組み合わせて用いても良い。【００１４】
（ナノゲル）
本発明に使用する疎水化高分子からなるナノゲル（ナノゲル）の製造方法は公知である。例えば特許文献１（高純度疎水性基含有多糖類およびその製造方法）に開示がある。それによると、製造方法における第1段階反応は、炭素数12〜50の水酸基含有炭化水素またはステロールと、OCN-R1 NCO（式中、R1は炭素数1〜50の炭化水素基である。）で表されるジイソシアナート化合物を反応させて、炭素数12〜50の水酸基含有炭化水素またはステロールが1分子反応したイソシアナート基含有疎水性化合物を製造する。【００１５】
製造方法における第2段階反応は、前記第1段階反応で得られたイソシアナート基含有疎水性化合物と多糖類とをさらに反応させて、疎水性基として炭素数12〜50の炭化水素基またはステリル基を含有する疎水性基含有多糖類を製造する。この第2段階反応の反応生成物をケトン系溶媒で精製して高純度疎水性基含有多糖類の製造が可能である。使用されうる多糖類としては、デキストラン、マンノース、アミロースなど、疎水基を置換される高分子、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアルギン酸、ポリアルギニン、ポリイソプロピルアクリルアミド（PNIPAM）、MPCからなる群より選択される1種以上である。【００１６】
このうち好適なナノゲルとしてはコレステロール置換プルラン（以下、CHPと略称する。分子量108,000のプルランに100単糖あたりコレステロールが1〜10個、好ましくは1〜数個置換）およびCHP誘導体が例示される。疎水化高分子の性状は、タンパク質のサイズや疎水性の程度により、コレステロール置換量を変え変更可能である。疎水性をコントロールするためには、炭素数10〜30、好ましくは炭素数12〜20程度のアルキル基を導入することも好適である。本発明で使用するナノゲルは、粒径10〜40 nm、好ましくは20〜30 nmである。CHP誘導体の好適な例として、アミノ基あるいはカルボキシル基を導入したCHP誘導体が挙げられる。ナノゲルは既に広く市販されており、本発明では、これら市販品を広く利用可能である。【００１７】
本発明にはCHP誘導体、より詳しくはアミノ基あるいはカルボキシル基を導入したCHP誘導体を用いることができる。【００１８】
１）アミノ基導入CHP誘導体
アミノ基導入CHP誘導体を以下の一般式（I）に示す。
【化１】
0004843797.tif 000002
（式中、n:50〜500の整数、Ｒ1：-(CH2)m-NH2、m:0〜10の整数）【００１９】
一般式（I）において、アミノ基はCHPのグルコース100単糖あたり1〜50、より好ましくは5〜30である。アミノ基はアルキル基で置換されたアルキルアミノ基でもよい。アルキルアミノ基として、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、ブチルアミノ、ペンチルアミノ、ヘキシルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジブチルアミノおよびジペンチルアミノなどの直鎖状または分子鎖状Ｃ１−６アルキル基で置換されたアミノ基が挙げられる。また、芳香族アルキルフェニル基、アルキルベンジル基でもよい。【００２０】
アミノ基の保護基としては、通常のアミノ基の保護基として使用し得るすべての基を含み、例えば、トリクロロエトキシカルボニル、トリブロモエトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、p−ニトロベンジルカルボニル、o−ブロモベンジルオキシカルボニル、（モノ−、ジ−、トリ−）クロロアセチル、トリフルオロアセチル、フェニルアセチル、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、tert−アミルオキシカルボニル、tert−ブトキシカルボニル、p-メトキシベンジルオキシカルボニル、3，4−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、4-（フェニルアゾ）ベンジルオキシカルボニル、2-フルフリルオキシカルボニル、ジフェニルメトキシカルボニル、1，1−ジメチルプロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、フタロイル、スクシニル、アラニル、ロイシル、1−アダマンチルオキシカルボニルおよび8−キノリルオキシカルボニルなどのアシル基；ベンジル、ジフェニルメチルおよびトリチルなどのアルアルキル基；2−ニトロフェニルチオおよび2，4−ジニトロフェニルチオなどのアリールチオ基；メタンスルホニルおよびｐ−トルエンスルホニルなどのアルキル−もしくはアリール−スルホニル基；N,N−ジメチルアミノエチレンなどのジアルキルアミノ−アルキリデン基；ベンジリデン、2−ヒドロキシベンジリデン、2−ヒドロキシ−5−クロロベンジリデンおよび2−ヒドロキシ−1−ナフチルメチレンなどのアルアルキリデン基；3−ヒドロキシ−4−ピリジルメチレンなどのアルアルキリデン基；3−ヒドロキシ−4−ピリジルメチレンなどの含窒素複素環式アルキリデン基；シクロヘキシリデン、2−エトキシカルボニルシクロヘキシリデン、2−エトキシカルボニルシクロペンチリデン、2−アセチルシクロヘキシリデンおよび3，3−ジメチル−5−オキシシクロヘキシリデンなどのシクロアルキリデン基；ジフェニルホスホリルおよびジベンジルホスホリルナドノジアリールーもしくはジアルアルキルホスホリル基；5−メチル−2−オキソ−2H−1,3−ジオキソール−4−イル−メチルなどの置換シリル基などが挙げられる。【００２１】
２）カルボキシル基導入CHP誘導体
カルボキシル基導入CHP誘導体を以下の一般式（II）に示す。
【化２】
0004843797.tif 000003
（式中、n:50〜500の整数、Ｒ2：-(CH2)m-COOH、m:0〜10の整数）【００２２】
一般式（II）において、カルボキシル基はCHPのグルコース100単糖あたり1〜50、より好ましくは5〜30である。カルボキシル保護基としては、通常のカルボキシル基の保護基として使用し得るすべての基を含み、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、iso−プロピル、1，1−ジメチルプロピル、n−ブチルおよびtert−ブチルなどのアルキル基；フェニルおよびナフチルなどのアリール基；ベンジル、ジフェニルメチル、トリチル、p−ニトロベンジル、p−メトキシベンジルおよび（p−メトキシフェニル）メチルなどのアリルアルキル基；アセチルメチル、ベンゾイルメチル、p−ニトロベンゾイルメチル、p−ブロモベンゾイルメチルおよびp−メタンスルホニルベンゾイルメチルなどのアシル−アルキル基；2−テトラヒドロピラニルおよび2−テトラヒドロフラニルなどの含酸素複素環式基；2，2，2−トリクロロエチルなどのハロゲノ−アルキル基；2−（トリメチルシリル）エチルなどのアルキルシリルアルキル基；アセトキシメチル、プロピオニルオキシメチルおよびピバロイルオキシメチルなどのアシルオキシアルキル基；フタルイミドメチルなどのシクロアルキル基；メトキシメチル、メトキシエトキシメチルおよび2−（トリメチルシリル）エトキシメチルなどのアルコキシ−アルキル基；ベンジルオキシメチルなどのアル−アルコキシーアルキル基；メチルチオメチルおよび2−メチルチオエチルなどのアルキルチオ−アルキル基；フェニルチオメチルなどのアリールチオ−アルキル基；1，1−ジメチル−2-プロペニル、3−メチル−3−ブテニルおよびアリルなどのアルケニル基；並びにトリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、ジエチルイソプロピルシリル、tert−ブチルジメチルシリル、tert−ブチルジフェニルシリル、ジフェニルメチルシリルおよびtert−ブチルメトキシフェニルシリルなどの置換シリル基などが挙げられる。【００２３】
一般式（I）および（II）の化合物は、塩とすることもでき、アミノ基またはカルボキシル基における塩を挙げることができる。アミノ基の塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸および硫酸などの鉱酸との塩；酒石酸、ギ酸、クエン酸、トリクロロ酢酸およびトリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸との塩；並びにメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸およびナフタレンスルホン酸などのスルホン酸との塩を挙げることができる。
カルボキシル基の塩としては、例えば、ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；アンモニウム塩；並びにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、N,N−ジメチルアニリン、N−メチルピペリジン、N−メチルモノホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、N−ベンジル−β−フェネチルアミン、1−エフェネミンおよびN,N´−ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩などを挙げることができる。【００２４】
本発明に係るCHP誘導体は、例えば、次に示す調製方法によって合成することができる。
調製方法１：アミノ基導入CHP誘導体
（１）CHPをジメチルアミノピリジン（CHPのグルコース単糖に対して0.1モル比）に溶媒中で反応させる。ここでジメチルアミノピリジンはピリジンであってもよい。また、この反応で使用する溶媒としては、ジメチルスルホキシド／ピリジン、ジメチルホルムアミド／ピリジンなどが挙げられる。この反応は、通常、20〜30℃で、15分間〜2時間、好ましくは25℃で1時間実施すればよい。
（２）（１）で得られた溶液に対し0.5倍容量の4−ニトロフェニルクロロホルメート（CHPのグルコース単糖と等モル比）／ジメチルスルホキシド溶液をゆっくり滴下し、攪拌する。ここで、4−ニトロフェニルクロロホルメートはN,N'-カルボニルイミダゾールであってもよい。この反応は、通常、0〜5℃で、3時間〜6時間、好ましくは0℃で4時間実施すればよい。この反応により、CHPの水酸基がニトロフェニルエステル化された活性化CHPが得られる。
（３）（２）で得られた溶液を、20倍容量の溶媒中にて再沈澱を行う。この反応は、通常、5〜30℃で、30分〜12時間、好ましくは5℃で12時間実施すればよい。また、この反応で使用する溶媒としては、エタノール、エタノール／ジエチルエーテル（v/v＝1/1）などが挙げられる。その後、沈殿物を回収し、常温で減圧乾燥させる。
（４）（３）で得られた沈殿物を減圧乾燥させたものをジメチルスルホキシド／ピリジン混合溶媒に溶解させ、0.03倍容量のエチレンジアミン／ジメチルスルホキシド／ピリジン溶液をゆっくり滴下し、攪拌する。この反応は、通常、20〜30℃で、3日間〜5日間、好ましくは25℃で4日間実施すればよい。この反応により、CHPの水酸基がカルバミン酸エステル化される。
（５）（４）で得られた溶液を、20倍容量の溶媒中にて再沈澱を行う。この反応は、通常、5〜30℃で、30分〜12時間、好ましくは5℃で12時間実施すればよい。また、この反応で使用する溶媒としては、エタノール、エタノール／ジエチルエーテル（v/v＝1/1）などが挙げられる。その後、沈殿物を回収し、常温で減圧乾燥させる。
（６）（５）で得られた沈殿物を減圧乾燥させたものをジメチルスルホキシドに溶解し、蒸留水に対して透析を行う。その後水酸化ナトリウム溶液（pH 12.8）に対する透析を行い、塩酸により中和させた後、さらに蒸留水に対する透析を行い、凍結乾燥させる。通常、透析は20〜25℃で、5日間〜8日間、好ましくは20℃で7日間実施すればよい。【００２５】
調製方法２：カルボキシル導入CHP誘導体
（１）CHP、ジメチルアミノピリジン（CHPのグルコース単糖に対して0.1モル比）に溶媒中で反応させる。また、この反応で使用する溶媒としては、ジメチルスルホキシド／ピリジン、ジメチルホルムアミド／ピリジンなどが挙げられる。この反応は、通常、20〜30℃で、15分〜2時間、好ましくは25℃で1時間実施すればよい。
（２）（１）で得られた溶液に対し0.5倍容量の4−ニトロフェニルクロロホルメート（CHPのグルコース単糖と等モル比）／ジメチルスルホキシド溶液をゆっくり滴下し、攪拌する。ここで、4−ニトロフェニルクロロホルメートはN,N'-カルボニルイミダゾールであってもよい。この反応は、通常、0〜5℃で、3時間〜6時間、好ましくは0℃で4時間実施すればよい。この反応により、CHPの水酸基がニトロフェニルエステル化された活性化CHPが得られる。
（３）（２）で得られた溶液に対し、CHPに対して2.5倍重量のβ−アラニンエチルエステル塩酸塩を添加する。この反応は、通常、20〜30℃で、3日間〜5日間、好ましくは25℃で4日間実施すればよい。この反応により、CHPの水酸基がカルバミン酸エステル化される。
（４）（３）で得られた溶液を、20倍容量の溶媒中にて再沈澱を行う。この反応は、通常、5〜30℃で、30分〜12時間、好ましくは5℃で12時間実施すればよい。また、この反応で使用する溶媒としては、エタノール、エタノール／ジエチルエーテル（v/v＝1/1）、エタノール／ジエチルエーテル（v/v＝8/2）が挙げられる。その後、沈殿物を回収し、常温で減圧乾燥させる。
（５）（４）で得られた沈殿物を減圧乾燥させたものをジメチルスルホキシドに溶解させ、蒸留水による透析を行う。その後水酸化ナトリウム溶液（pH 12.8）に対する溶液を行うことにより、エチル基の脱保護を行う。さらに蒸留水に対する透析を行い、凍結乾燥させる。通常、透析は20〜25℃で、5日間〜8日間、好ましくは20℃で7日間実施すればよい。【００２６】
（骨形成促進物質とナノゲルを含有する製剤の調製）
本発明の製剤の製造方法の具体的な一例を以下に説明する。
（１）ナノゲルを通常約１〜30 mg/ml、好ましくは約10〜20 mg/mlで生理食塩水に分散させる。
（２）骨形成促進物質溶液を調製する。骨形成促進物質を、生理食塩水（0.153 mol/l NaCl）に溶解する。該生理食塩水は、通常約0.0006〜2.4 vol／％、好ましくは約0.006〜0.02 vol／％のエタノールおよび通常約0.0002〜0.8 vol／％、好ましくは約0.002〜0.007 vol／％の界面活性剤を含む。界面活性剤として、Tween-80等が好適に挙げられる。
（３）（２）で得られた骨形成促進物質溶液を（１）で得られたナノゲル溶液で希釈し、通常4〜37℃、好ましくは4℃で、通常12〜24時間、好ましくは24時間静置する。ナノゲルと骨形成促進物質の混合比はナノゲルおよび骨形成促進物質の種類・目的により異なるが、通常は、骨形成物質に対するナノゲルの重量比が約6×10-6〜2×10-2、好ましくは約6×10-6〜2×10-4である。また、混合液における骨形成促進物質の量は骨形成促進物質の種類・目的により異なるが、通常は骨形成促進物質の終濃度が約0.06〜60μg／ml、好ましくは約0.1〜0.6μg／mlとなるように調製する。【００２７】
（骨形成促進物質含有ナノゲル架橋ヒドロゲルの調製）
骨形成促進物質を重合性ナノゲルに含有させた骨形成促進物質含有ナノゲルを、生理条件下におけるマイケル付加反応により、末端にチオール基を持つ水溶性ポリマーと架橋させてヒドロゲルとすることができる。骨形成促進物質含有ナノゲル架橋ヒドロゲルは高い徐放性効果と安定化効果を有するため、局所において長時間にわたる骨形成促進物質の徐放が可能となる。【００２８】
重合性ナノゲルとは、ナノゲルを重合性基（好適には、アクロイル基、メタクリロイル基、ビニルスルホン基等）により修飾することにより得られる。ナノゲルの重合性基による修飾率は、ナノゲルおよび重合性基の種類により適宜異なるが通常は10〜30個／100単糖、好ましくは20〜30個／100単糖である。骨形成促進物質を含有するナノゲル架橋ヒドロゲルの調製方法の具体的な一例を以下に記載する。【００２９】
（１）ナノゲルを重合性基で修飾する。ナノゲル（通常0.25〜2 g、好ましくは0.5〜1 g）およびN, N´−ジメチルアミノピリジン（通常5〜40 ml、好ましくは10〜20 ml）を有機溶媒に溶解する。該有機溶媒の種類はナノゲルおよび重合性基の種類により適宜異なるが、たとえばジメチルスルホキシド（DMSO）、ジメチルホルムアミド等が挙げられる。好ましくはDMSOを用いる。ナノゲルの有機溶媒溶液中の濃度は、ナノゲルおよび有機溶媒の種類などによって異なるが、一般的には約10〜100 mg/ml、好ましくは約50〜100 mg/mlである。
（２）骨形成促進物質溶液を調製する。骨形成促進物質を、生理食塩水（0.153 mol/l NaCl）に溶解する。該生理食塩水は、通常約0.0006〜2.4 vol／％、好ましくは約0.006〜0.02 vol／％のエタノールおよび通常約0.0002〜0.8 vol／％、好ましくは約0.002〜0.007 vol／％の界面活性剤を含む。該界面活性剤として、Tween-80等が好適に挙げられる。
（３）（２）で得られた骨形成促進物質溶液を（１）で得られた重合性ナノゲル溶液で希釈し、通常4〜37℃、好ましくは4℃で、通常12〜24時間、好ましくは24時間静置する。重合性ナノゲルと骨形成促進物質の混合比はナノゲルおよび骨形成促進物質の種類・目的により異なるが、通常は、骨形成物質に対する重合性ナノゲルの重量比が約0.0001〜0.02、好ましくは約0.001〜0.02である。また、混合液における骨形成促進物質の量は骨形成促進物質の種類・目的により異なるが、通常は骨形成促進物質の終濃度が約2〜400μg／ml、好ましくは約20〜400μg／mlとなるように調製する。
（４）チオール基を含む水溶性ポリマーを生理食塩水に溶解し、水溶性ポリマー溶液を調製する。チオール基としては、例えばアルキルチオ基，アラルキルチオ基，アシルチオ基等が挙げられる。末端にチオール基を持つ水溶性ポリマーとして、例えばポリエチレンオキシド、ヒアルロン酸、MPC、ポリアクリル酸等が好適に挙げられる。
（５）（３）で得られた骨形成促進物質含有重合性ナノゲルの 重合性基と（４）で得られた水溶性ポリマー溶液の水溶性ポリマーのモル数が等量となるよう混合する。得られた混合液をパラフィルム（登録商標）上に、通常約2〜10μl、好ましくは約2〜5 μl滴下し、通常約4〜37℃、好ましくは約20〜37℃にて、通常約15〜3時間、好ましくは約30〜2時間静置することにより、骨形成促進物質含有重合性ナノゲル架橋ヒドロゲルが得られる。当該混合液における骨形成促進物質含有重合性ナノゲルの含有量としては、一回投与の製剤あたり、通常約0.06〜12μg、好ましくは約0.6〜12μgである。【００３０】
本発明の製剤を適当な方法で賦形して局所投与用の非経口剤（例えば、筋肉内、皮下、臓器、間接部位などへの注射剤、埋め込み剤、顆粒剤、散剤等の固形製剤、懸濁剤等の液剤）などとして投与することができる。【００３１】
具体的な一例として、注射剤とする場合、骨形成促進物質含有ナノゲルを分散剤（例えば、Tweeen 80、HCO-60等の界面活性剤、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸等の多糖類、ポリソルベート等）、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖等）、緩衝剤（例えば炭酸カルシウム等）、pH調整剤（例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等）などと共に水性懸濁剤とすることにより実用的な注射用製剤が得られる。また、ゴマ油、コーン油などの植物油あるいはレシチンなどのリン脂質を混合したもの、あるいは中鎖脂肪酸トリグリセリドと共に分散させて油性懸濁剤として実際に使用できる注射剤とすることもできる。【００３２】
本発明の製剤は、リン酸またはその塩（例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等）を含有していてもよく、リン酸塩を加えることによって、骨形成促進作用をさらに増強することができる。注射剤にリン酸またはその塩が含まれる場合、該注射剤中のリン酸ナトリウムあるいはリン酸カリウムの濃度は、通常約0.1 mM〜500 mMであり、好ましくは約1 mM〜100 mMである。さらに、所望により低分子量ポリエチレングリコール等を配合してもよい。【００３３】
本発明の製剤は、骨形成促進物質の高い徐放性および安定性を有しており、一回の投与で骨形成を促進することが可能である。骨疾患（例えば、骨折、再骨折、骨粗鬆症、骨ペーチェット病、硬直性脊椎炎、慢性関節リウマチ、変形性膝関節炎およびそれらの類似疾患における関節組織の破壊等）の予防、治療、多発性骨髄腫、肺癌、乳癌等の外科手術後の骨組織修復および歯周疾患等における歯周組織の再生等に用いることができる。【００３４】
また、本発明の製剤は低毒性であり、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ等）に対して安全に用いることができる。本発明の製剤の投与量は、骨形成促進物質の種類と含量、剤型、薬物放出の持続時間、投与対象動物により異なるが、該骨形成促進物質の有効量であれば良い。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例で説明するが、実施例は本発明の一例を示すものであって、その技術的範囲を限定するものではない。【００３６】
実施例１
＜アクリロイル基修飾CHP（CHPA） の合成＞
ナノゲル（CHP）を重合性基（アクリロイル基）で修飾し、重合性ナノゲル（アクリロイル基修飾CHP）を合成した。【００３７】
コレステロール置換プルラン（CHP）（0.5 g、単糖数2.98 mmol）（プルランの分子量108×103、100単糖あたりコレステリル基を1.4個含有）およびN,N'-dimethylaminopyridine（0.01 g、0.0833 mmol）（和光社製）を5 mlの99.0％ジメチルスルホキシド（DMSO）（和光社製）に溶解した。アクリル酸（204〜613 μl、298〜894 mmol（ナカライテスク社製）およびそれと当モル数のN,N'-dicyclohexylcarbodiimide（関東化学社製）を5 mlの99.0% DMSO に溶解し、室温にて30分間撹拌した。当該アクリル酸溶液をCHP溶液に添加し、室温にて2日間撹拌した。反応物を過剰量のエーテルおよびエタノールの混合溶媒（混合比85:15〜100:0）に滴下し、ポリマーを沈殿させた。得られた沈殿物を99.0% DMSOに溶解し、蒸留水で7日間透析した。これを凍結乾燥し、CHPAを得た。アクリロイル基修飾率は、1H-NMRにより決定した。得られたCHPAのアクリロイル基修飾率は、100単糖あたり6〜30個であった。CHPおよびCHPAの化学構造式を図１に示す。【００３８】
実施例２
＜PGE2含有疎水化多糖ナノゲルの調製＞
プロスタグランジンE2（PGE2）をナノゲル（CHP）に内包し、PGE2含有疎水化多糖ナノゲルを調製した。【００３９】
疎水化多糖として、コレステロール置換プルラン（CHP）（プルランの分子量108×103、100単糖あたりコレステリル基を1.4個含有）を用いた。CHPナノゲルを20〜30 mg/mlで生理食塩水（0.153 mol/l NaCl）に分散させた。PGE2を3 vol% エタノールおよび1 vol% Tween 80を含む生理食塩水に3 mg/ml で溶解した。得られたPGE2水溶液を、PGE2の終濃度が0.06〜60 μg/mlとなるようにCHPナノゲル溶液で希釈し、4℃にて一晩静置することにより、PGE2含有CHPナノゲルを得た。【００４０】
実施例３
＜PGE2含有疎水化多糖ナノゲル架橋ヒドロゲルの合成＞
アクリロイル基やメタクリロイル基などの重合性基とチオール基は、生理条件下においてマイケル付加反応により結合する。これを利用し、CHPナノゲルと水溶性ポリマーを架橋したヒドロゲルを合成した。具体的には、PGE2を重合性基（アクリロイル基）で修飾したCHP（以下、重合性CHP）に内包し、末端にチオール基を持つ水溶性ポリマーと架橋させることにより、PGE2含有疎水化多糖ナノゲル架橋ヒドロゲルを合成した。【００４１】
実施例１と同様の方法で調製した重合性CHPナノゲルを15 mg/ml 以上の濃度で生理食塩水に分散させた。PGE2を75 vol% エタノールおよび25 vol% Tween 80を含む生理食塩水に75 mg/ml で溶解した。該PGE2水溶液を、PGE2の終濃度が0.15〜3 mg/mlとなるように重合性CHPナノゲル溶液で希釈し、4℃で一晩静置することにより、PGE2含有重合性CHPナノゲルを得た。末端にチオール基を有する水溶性ポリマーとしてポリエチレンオキシド（PEOSH）（日本油脂社製）を選択した。これを生理食塩水に溶解し、PGE2含有重合性CHPナノゲル溶液に加え、撹拌した。ここで、重合性CHPの重合性基と水溶性ポリマーのチオール基のモル数が等量となるように混合した。得られた混合液をパラフィルム（登録商標）（Pechiney Plastic Packagin社製）上に5μl滴下し、37℃ で10分〜3時間静置することにより、半球状のPGE2含有CHP架橋ヒドロゲルを得た。CHPナノゲル架橋ヒドロゲルの合成の模式図を図２に示す。【００４２】
実施例４
＜PGE2含有疎水化多糖ナノゲルを用いたマウス頭頂骨における骨形成＞
PGE2含有疎水化多糖ナノゲルをマウス頭頂骨に投与し、骨形成を観察した。【００４３】
3週令ICR マウス頭頂骨上に実施例２と同様の方法で調製したPGE2含有CHPを週5回の局所投与を4週間行った。投与は調製したPGE2含有CHP溶液（PGE2 0.6μg/ml）を10 ml投与した。生理食塩水、PGE2、CHP、PGE2含有CHPの4群について評価した（N=5）。投与後4週後屠殺し、頭頂骨を取り出して2次元μCTにより頭頂骨の幅を測定した。全身の骨への影響を調べるために大腿骨の海面骨量を評価した。【００４４】
その結果、図３に示すように、PGE2含有CHPナノゲルの投与によって、頭頂骨の幅が増加した。これに対し、生理食塩水、PGE2のみおよびCHPナノゲルのみでは、変化は認められなかった。また、図４に示すように、投与部位から遠い大腿骨における海面骨量は、PGE2のみの投与においては増加したが、PGE2含有CHPナノゲルにおいてこのような変化は見られなかった。【００４５】
この結果から、CHPナノゲルはPGE2を内包し、内包したPGE2を効率よく徐放することが判明した。また、PGE2のみの投与では容易に血中へ拡散し、副作用を惹起するが、CHPにPGE2を内包することで過剰な拡散の抑制、および投与部位における局所的な作用が可能であることが判明した。【００４６】
実施例５
＜疎水化多糖ナノゲルのPGE2内包・徐放能の評価＞
PGE2含有CHPナノゲルの細胞レベルでの機序を解明するために、骨芽細胞用細胞株MC3T3E1細胞培養系において、アルカリフォスファターゼ（ALP）活性により細胞分化、およびMTT法により細胞増殖を解析した。【００４７】
96穴プレートにおいて5×103個/ウェルでMC3T3E1細胞を播種し、0.5%のCO2存在下で37℃にて1日間培養した。この細胞に、実施例２と同様の方法で調製したPGE2含有CHP溶液（PGE2 10μM）を同濃度になるように添加した。0.5%のCO2存在下で37℃にて24時間培養後、スクレーピングにより細胞を回収し、0.05 mlのリシスバッファーで細胞を溶解した。アルカリフォスファターゼ（ALP）活性の測定は出版されたプロトコールに従い、行った。また、MTT法は出版されたプロトコールにて行った。【００４８】
ALP 活性の測定およびMTT 法による評価の結果、図５に示すようにPGE2のみの添加においては細胞分化および増殖が増加した。これに対し、PGE2含有CHPナノゲルを添加においては、細胞分化・増殖共に変化しなかった。これはCHPナノゲルによりPGE2が効率よくトラップされており、その徐放性により培養液中のPGE2濃度を低濃度に保ったためと考えられる。この結果から、CHPナノゲルによりPGE2の長期徐放が可能であることが示唆された。【００４９】
実施例６
＜PGE2含有疎水化多糖ナノゲル架橋ヒドロゲルを用いたマウス頭頂骨における骨形成＞
PGE2含有疎水化多糖ナノゲルを架橋することにより徐放性の向上と薬物の投与回数および投与量の減少が可能であるか否かを検討するため、PGE2含有疎水化多糖ナノゲル架橋ヒドロゲルをマウス頭頂骨に投与し、骨形成を評価した。【００５０】
PGE2 を0.6、6、12μg含有した実施例３と同様の方法で調製したPGE2含有CHPヒドロゲルを、3週令ICRマウス頭頂骨上に1回埋入した。投与後4週で屠殺し、頭頂骨を取り出して2次元μCTにより頭頂骨の幅を測定した。その結果、図６に示すように頭頂骨の幅の増加が認められた。このことから、CHPナノゲルの架橋により、CHPナノゲルからのPGE2の徐放性の向上、および長期間にわたる制御が可能であることが判明した。【００５１】
実施例７
Bone Morphogenetic Protein(BMP)は異所性の骨形成を誘導する分子として同定され、骨治癒に対する有効性が認められている。しかし、高等動物における新生骨形成の誘導にはマウスやラットに比べて100倍以上のBMP-2が必要と報告されている。これまでにBMPsのdelivery systemとして多くの報告がなされてきたが、それらの多くが抗原性のあるscaffoldや培養細胞を用いており、生体への使用に際しては免疫反応などのリスクを生じ得る。
Cholesterol-bearing pullulan (CHP) ナノゲルはシャペロン活性を持ち、たんぱく質のdelivery systemとして有用であることが報告されている。そこで、今回我々はCHPをrhBMP-2の担体として用い、新生骨形成や骨治癒について検討した。【００５２】
BMP-2(2 mg)含有疎水化多糖ナノゲル架橋ヒドロゲルの合成
CHPAナノゲルを30-50 mg/mlでPBSに分散させた。CHPA水溶液2 mlに、1 mg/ml BMP-2水溶液2 mlを添加し、4℃で一晩静置することにより、CHPAナノゲルにBMP-2を内包させた。PEOSH〔Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl)polyoxyethylene〕をPBSに溶解し、BMP-2内包CHPAナノゲル水溶液4 mlに対してPEOSH水溶液1 mlを加え、すばやく撹拌した。ここで、CHPAのアクリロイル基とPEOSHのチオール基のモル数が等量となるようにした。得られた混合液をパラフィルム(商品名）上に5 ml滴下し、37℃で2時間静置することにより、半球状のBMP-2含有CHPA架橋ヒドロゲルを得た。また、BMP-2の含有量を2 mg以下にする場合は、BMP-2をPBSで希釈して使用した。【００５３】
マウスの側頭骨骨膜上へCHP単独、BMP(2μg)/CHP をimplantationするとBMP/CHP群では新生骨の形成が誘導された。新生骨は術後5日目までに形成が始まり、骨形成性の細胞の誘導、新生骨には血管形成を伴う骨髄組織用構造の形成が認められた。次にBMP/CHPによる骨欠損部への新生骨形成誘導能を検討するためにマウスの頭蓋部に直径、4.6mmの骨欠損を作り、骨欠損部にCHP単独、BMP(2μg)/CHPをimplantationした。4週間後、CHP群ではほとんど骨欠損部の修復は認められなかったが、BMP/CHP群ではほぼ完全に骨の修復が認められた。
最後にCHPからのBMP-2の放出を調べるために骨芽細胞様株であるMC3T3-E1細胞を用いてrhBMP-2、BMP/CHPで処理し、ALP活性を比較した。rhBMP-2群ではBMPの用量依存性にALP活性が上昇したのに対し、BMP/CHP群ではBMP2誘導性のALP活性の上昇が抑制された。BMP/CHP群でALP活性の減少が認められたのは、CHPからのBMP-2放出が少ないためと考えられ、このことは、CHPがBMP-2の保持能が強いことを示唆した。以上のことから、CHPはBMPに対するdelivery systemのscaffoldとして有用であり、骨欠損部への骨形成に有効である可能性が示された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
上記述べてきたように、本発明のナノゲルマテリアルを利用した骨形成促進物質を含む骨形成用生体材料は、薬剤を局所において効果的に徐放させ、目的部位において特異的に骨形成を促進させることができるという利点があり、骨形成促進物質の新規投与法として臨床への応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】CHPおよびCHPAの化学構造式を示す。（実施例１）
【図２】CHPナノゲル架橋ヒドロゲルの合成の模式図を示す。（実施例３）
【図３】PGE2含有CHPナノゲル投与による頭頂骨における骨形成を示す。（実施例４）
【図４】PGE2含有CHPナノゲル投与による大腿骨における海綿骨量増加を示す。（実施例５）
【図５】PGE2含有CHPナノゲル添加による細胞増殖・分化を評価した結果を示す。（実施例５）
【図６】PGE2含有CHPナノゲル架橋ヒドロゲル投与による頭頂骨における骨形成を示す。（実施例６）
【図１】
0004843797.tif 000004
【図２】
0004843797.tif 000005
【図３】
0004843797.tif 000006
【図４】
0004843797.tif 000007
【図５】
0004843797.tif 000008
【図６】
0004843797.tif 000009