(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遊離形、溶媒和物または塩の溶媒和物の形態の、式：
【化１】
0004795931.tif 000059
［式中、
Ｒ１は、水素、ヒドロキシまたはメチルカルボニルオキシを表し、
Ｒ２は、シクロヘキシルまたはシクロヘキサ−２−エニル（ここで、シクロヘキシルは０〜２個のヒドロキシ基で置換されていてもよい）を表し、
そして、
Ｒ３は、水素またはヒドロキシを表す］
の化合物。
【請求項２】
式：
【化２】
0004795931.tif 000060
（式中、Ｒ１およびＲ３は、請求項１に述べられた意味を有する）
の化合物、
式：
【化３】
0004795931.tif 000061
（式中、Ｒ１およびＲ３は、請求項１に述べられた意味を有する）
の化合物、
式：
【化４】
0004795931.tif 000062
（式中、Ｒ１およびＲ３は、請求項１に述べられた意味を有する）
の化合物、および
式：
【化５】
0004795931.tif 000063
（式中、Ｒ１およびＲ３は、請求項１に述べられた意味を有する）
の化合物から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式：
【化６】
0004795931.tif 000064
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、請求項１に述べられた意味を有する）
である請求項１記載の化合物。
【請求項４】
（１Ｒ,４Ｒ,５Ｓ）−１−［（Ｓ）−（１Ｓ）−２−シクロヘキセン−１−イル（ヒドロキシ）メチル］−４−ヘキシル−５−メチル−６−オキサ−２−アザビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン：
【化７】
0004795931.tif 000065
（１Ｒ,４Ｒ,５Ｓ）−１−［（Ｓ）−（１Ｓ）−２−シクロヘキセン−１−イル（ヒドロキシ）メチル］−４−［１−ヒドロキシ−ヘキシル］−５−メチル−６−オキサ−２−アザビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン：
【化８】
0004795931.tif 000066
および
（１Ｒ,４Ｒ,５Ｓ）−１−［（１Ｒ）−２−シクロヘキセン−１−イルメチル］−４−ヘキシル−５−メチル−６−オキサ−２−アザビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン：
【化９】
0004795931.tif 000067
から選択される、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
遊離形、溶媒和物または塩の溶媒和物の形態の、式：
【化１０】
0004795931.tif 000068
［式中、
Ｒ４は、水素またはヒドロキシを表し、
Ｒ５は、シクロヘキシルまたはシクロヘキサ−２−エニル（ここで、シクロヘキシルは０〜２個のヒドロキシ基で置換されていてもよい）を表し、
Ｒ６は、水素またはヒドロキシを表し、
そして、
Ｒ７は、ヒドロキシまたは
【化１１】
0004795931.tif 000069
（上記において、Ｒ８は、水素またはメチルを表し、
そして、＊は、分子に結合する位置を表す）
から成る群の式の置換基を表す］
の化合物。
【請求項６】
式：
【化１２】
0004795931.tif 000070
［式中、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、請求項５に述べられた意味を有し、そして、
Ｒ７は、ヒドロキシまたは式：
【化１３】
0004795931.tif 000071
（式中、Ｒ８は、請求項５に述べられた意味を有する）
の置換基を表す］
の化合物、および
式：
【化１４】
0004795931.tif 000072
（式中、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、請求項５に述べられた意味を有し、
Ｒ７は、
【化１５】
0004795931.tif 000073
から成る群の式の置換基を表す）
の化合物から選択される、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
式：
【化１６】
0004795931.tif 000074
（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、請求項５に述べられた意味を有する）
である請求項５記載の化合物。
【請求項８】
（３Ｓ,４Ｒ）−２−［（Ｓ）−（１Ｓ）−２−シクロヘキセン−１−イル（ヒドロキシ）メチル］−３−ヒドロキシ−４−［１−ヒドロキシヘキシル］−３−メチル−５−オキソ−Ｄ−プロリン：
【化１７】
0004795931.tif 000075
Ｎ−アセチル−Ｓ−（｛（２Ｒ,３Ｓ,４Ｒ）−２［（Ｓ）−（１Ｓ）−２−シクロヘキセン−１−イル（ヒドロキシ）メチル］−４−ヘキシル−３−ヒドロキシ−３−メチル−５−オキソ−２−ピロリジニル｝カルボニル）システイン：
【化１８】
0004795931.tif 000076
および
メチル−Ｎ−アセチル−Ｓ−（｛（２Ｒ,３Ｓ,４Ｒ）−２−［（Ｓ）−（１Ｓ）−２−シクロヘキセン−１−イル（ヒドロキシ）−メチル］−４−ヘキシル−３−ヒドロキシ−３−メチル−５−オキソ−２−ピロリジニル｝カルボニル）システイナート：
【化１９】
0004795931.tif 000077
から選択される請求項７記載の化合物。
【請求項９】
式：
【化２０】
0004795931.tif 000078
（式中、Ｒ１およびＲ３は、請求項１に述べられた意味を有する）
の化合物および／または式：
【化２１】
0004795931.tif 000079
［式中、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、請求項５に述べられた意味を有し、そして、
Ｒ７は、ヒドロキシまたは式：
【化２２】
0004795931.tif 000080
（式中、Ｒ８は、請求項５に述べられた意味を有する）
の置換基を表す］
の化合物の製造方法であって、配列番号１を有するストレプトミセス属菌株ＪＳ３６０（寄託番号ＤＳＭ１５３２４）である微生物を醗酵培地で培養し、式（Ｉｂ）および（IIｂ）の化合物の少なくともいずれかを培養培地から回収することを特徴とする、上記方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物を有効成分とする、急性および慢性炎症過程または癌の処置用医薬。
【請求項１１】
請求項５〜８のいずれかに記載の化合物を有効成分とする、急性および慢性炎症過程または癌の処置用医薬
【請求項１２】
配列番号１を有するストレプトミセス属菌株ＪＳ３６０（寄託番号ＤＳＭ１５３２４）である微生物。
【請求項１３】
請求項９に記載の、式（Ｉｂ）の化合物および／または式（IIｂ）の化合物の製造方法で使用するための、配列番号１を有するストレプトミセス属菌株ＪＳ３６０（寄託番号ＤＳＭ１５３２４）である微生物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、置換複素環、その製造方法、および薬剤、特に、炎症疾患、言い換えれば、喘息、または癌の処置のための薬剤としての使用に関する。
【０００２】
多触媒性プロテイナーゼまたはプロテアソームは、大部分の細胞タンパク質のＡＴＰ依存性タンパク質分解を担う高度に保存された細胞構造である。２０Ｓ（７００−ｋＤａ）プロテアソームは、活性部位でスレオニン残基を含んでいる新しいタイプのメカニズムを有する少なくとも５つの異なったタンパク質分解活性を含んでいる（Coux, O., Tanaka, K. and Goldberg, A. 1996 Ann. Rev. Biochem. 65:801-47）。
【０００３】
この２０Ｓプロテアソームは、タンパク質分解コアを含んでいるが、その構造の両端で、それ自体が多数のＡＴＰアーゼ活性を含んでいる１９Ｓキャップと複合体とならない場合は、インビボでタンパク質を分解することは不可能である。こうしたより大きな構造は、２６Ｓプロテアソームとして知られており、８.５−ｋＤａのポリペプチドであるユビキチンの多数の分子を添加することによって分解の標的にされたタンパク質を急速に分解する。
【０００４】
現在では、プロテアソームが、細胞分裂、抗原処理（antigen processing）および転写因子、腫瘍遺伝子産物およびサイクリンのような短命の調節タンパク質の分解のような数多くの多様な細胞機能につながる分解経路に関与している主要なリソソーム外タンパク質分解システムであることが十分に確立されている（Ciechanover, A. 1994 Cell 79:13-21にレビューされている）。プロテアソームの主要な機能は、タンパク質分解を触媒し、小さなペプチドとすることである。しかしながら、ユビキチン−プロテアソーム経路は、大きな不活性な前駆体の活性タンパク質への調節されたタンパク質分解プロセシングを触媒することができることも示されてきた。これに関し最も立証・文書化されている事例には、転写因子ＮＦ−κＢの活性化が含まれる（Palombella, V. J., Rando, O. J., Goldberg, A. L., and Maniatis, T. 1994 Cell 78:773-785）。ＮＦ−κＢの活性形態は、ｐ６５およびｐ５０サブユニットから構成されるヘテロダイマーである。後者は、不活性前駆体形態、すなわち、ｐ５０の１０５−ｋＤａのポリペプチド前駆体であるｐ１０５で、細胞のサイトゾル中に存在する。ｐ５０を生成するｐ１０５のタンパク質分解プロセシングは、ユビキチン−プロテアソーム経路を介して起こる。更に、処理されたｐ５０およびｐ６５は、阻害タンパク質ＩκＢとの不活性な複合体としてサイトゾル内で維持される。炎症シグナルは、ＩκＢを完全に分解するシグナル伝達経路を開始することによってＮＦ−κＢを活性化させ、そして、また、ｐ１０５のプロセシングを刺激してｐ５０にする。したがって、二つのタンパク質分解現象は、両方ともユビキチン−プロテアソーム経路によって支配され、ＮＦ−κＢのシグナル誘発活性化に必要である。
【０００５】
ＮＦ−κＢは、一旦活性化されると核に移動し、そこで、免疫および炎症応答に関係している著しく多様な一連の遺伝子の調節に中心的な役割を果たす（Grilli et al., International Review of Cytology (1993) 143:1-62）。たとえば、ＮＦ−κＢは、ＴＮＦ−α遺伝子および細胞接着分子、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＩＣＡＭ、およびＶＣＡＭをコードしている遺伝子のような炎症応答に関与している遺伝子のいくつかの発現に必要である（Collins, T., Lab. Invest. (1993) 68:499）。ＮＦ−κＢは、またＩＬ−２、ＩＬ−６、顆粒球コロニー刺激因子、およびＩＦＮ−βのような多数のサイトカイン遺伝子の発現に必要である。誘導性酸化窒素合成酵素もまたＮＦ−κＢの調節制御のもとにある。プロテアソーム阻害剤は、ＩκＢα分解およびＮＦ−κＢの活性化を遮断する（Palombella et al. ＷＯ  ９５／２５５３３（１９９５年９月２８日公開）；Traenckner, et al., EMBO J.(1994) 13:5433）。プロテアソーム阻害剤はまた、ＴＮＦ−αによって誘導された白血球接着分子、Ｅ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１、およびＩＣＡＭ−１の発現も遮断する（Read, et al., Immunity (1995) 2:493）。
【０００６】
プロテアソームがＮＦ−κＢの活性化において重要な事象を演じるという事実は、プロテアソームタンパク質分解に向けられる阻害剤を使用することにより、臨床的に利用することが可能であるであろう。ある疾患においては、活性ＮＦ−κＢの正常機能は、炎症応答において観察されるようにヒトの健康に有害でありうる。したがって、ＮＦ−κＢ活性化阻害剤は、細胞接着分子またはサイトカインのような様々な炎症分子の分泌を妨げる能力によって、たとえば、アレルギー、ＣＯＰＤ、気道炎症および喘息、ＡＲＤＳ（急性呼吸促迫症候群）、ＡＩＤＳ、骨関節炎および関節リウマチを含む炎症性疾患；潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む炎症性腸疾患；敗血症；移植拒絶、並びに脳卒中および心筋梗塞を含む虚血性または再還流損傷のような炎症性疾患の処置において有用性がある可能性を有する。ＮＦ−κＢの活性化はまた血管新生に不可欠であるので、プロテアソーム阻害剤は、異常な新血管新生に関連する疾患の処置に有用性を有する可能性がある。
【０００７】
ｐ５３は、腫瘍性タンパク質として最初に述べられたが、その後多くの細胞プロセスに関与していることが示された（Ko, L. J. および Proves, C. 1996 Genes Dev. 10, 1054-1072 によってレビューされている）。ｐ５３は、ＤＮＡ損傷、ウイルス性感染および成長因子の除去を含む多くの異なる刺激作用を通して、造血性セルラインのいくつかにおいてアポトーシスを誘導することが示されてきた（Oren, M., 1994 Semin. Cancer Biol. 5, 221-227）。しかしながら、アポトーシスは、ｐ５３非依存性方法で、たとえば、グルココルチコイド作用によって誘導することができることに注目することが重要である。ｐ５３を誘導すると、アポトーシスによる細胞死はもちろん細胞周期のＧ１フェーズにおける細胞成長停止（arrest）につながる。こうした機能のいずれによっても、ｐ５３はＤＮＡ損傷を制御し、それによって、細胞が分裂するときに、ＤＮＡ変異が拡大するのが減少する。ｐ５３は、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子、ｐ２１を誘導することによってＧ１で細胞を停止させ、次いで網膜芽細胞腫遺伝子産物の低リン酸化型を蓄積させる。ｐ５３は、ＤＮＡ損傷の後の細胞におけるチェックポイントとして作用し、それは、最初に細胞分裂の停止およびアポトーシスを引き起こすと考えられる。ｐ５３分解は、ユビキチン−プロテアソーム経路を介することが知られており、そして、ｐ５３分解を阻止することは、アポトーシスを誘導する可能性のある様式である。もう一つの可能性のあるプロテアソーム阻害剤の有用性は、異常な細胞増殖から生じる疾患の処置にあるということができる。
【０００８】
ユビキチン−プロテアソーム経路が、有糸分裂からの出口を支配し、細胞が細胞周期の次の期に進むことを可能にするサイクリンの分解を調節するために重要であることは、文書で十分立証されている。したがって、プロテアソーム阻害剤を用いて、サイクリンの分解を阻害すれば、成長停止が起こる。それゆえ、プロテアソーム阻害剤のもう一つの可能性のある有用性は、加速された細胞分裂（accelerated cell division）から生じる疾患の処置にそれらを用いることである。こうした疾患には、癌、心筋炎、血管形成術後の再狭窄のような心臓血管系疾患、狼瘡、多嚢胞性腎疾患、真菌感染のような腎疾患、乾癬、創傷治癒異常、ケロイドのような皮膚疾患、自己免疫、急性および遅延型過敏症、移植片対宿主疾患、移植片拒絶のような免疫疾患および多発性硬化症および急性播種性脳脊髄炎のような神経免疫疾患が含まれる。
【０００９】
微生物の代謝産物のいくつかは、プロテアソームを阻害することがわかってきた。たとえば、いくつかのペプチド化合物が、こうした標的の強力な阻害剤として、ＴＭＣ−９６シリーズ（Y. Koguchi et al., J. Antibiot., 1999, 52, 63-65 および J. Antibiot., 2000, 53, 1069-1076）のようなストレプトミセス類およびＴＭＣ−９５シリーズ（J. Kohno et al., J. Org. Chem., 2000, 65, 990-995）のような真菌（fungi）から報告されてきた。ベータ−ラクトン部分を有する非ペプチド系放線菌代謝産物あるいはこれらのそれぞれのケミカルアナログもまたこうした標的に強力に相互作用すると言われてきた。こうしたものの中で、海洋放線菌サリノスポラｓｐ.（Salinospora sp.）からのサリノスポラミド類（Salinosporamides）が、ＷＯ０２／４７６１０および R. Feling et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2003, 42, 355-357 (サリノスポラミドＡ）から知られており、そして、ラクタシスチンβ−ラクトン（lactacystin β-lactones）が、ＷＯ９６／３２１０５、ＷＯ９９／１５１８３およびＷＯ９９／０９００６から知られている。
【００１０】
サリノスポラミドＥおよびサリノスポラミドＧは、10th Internat. Symp. on Marine Natural Prod. in Okinawa 2001 から知られており、“サリノスポラミド−Ａ”は、50th Annual Congress Society for Medicinal Plant Research in Barcelona, Spain, 8-12 September 2002 から知られている。
【化１】
0004795931.tif 000002
【００１１】
本発明は、今までにない強力なプロテアソームの阻害を示す新規な置換複素環、および図５および配列表に開示されている配列番号１を有するストレプトミセス属の新規な放線菌ＪＳ３６０（ＤＳＭ １５３２４）から、これらの化合物を単離することに関する。
【００１２】
本発明は、式：
【化２】
0004795931.tif 000003
［式中、
Ｒ１は、水素、ヒドロキシまたはメチルカルボニルオキシを表し、
Ｒ２は、シクロヘキシルまたはシクロヘキサ−２−エニル（ここで、シクロヘキシルは０〜２個のヒドロキシ基で置換されていてもよい）を表し、
そして、
Ｒ３は、水素またはヒドロキシを表す］
の化合物に関する。
【００１３】
本発明による化合物は、またそれらの塩、溶媒和物またはその塩の溶媒和物の形で存在することができる。
【００１４】
本発明による化合物は、その構造によっては、立体異性体形態（エナンチオマー、ジアステレオマー）で存在しうる。それゆえ、本発明は、エナンチオマーまたはジアステレオマーおよびそれらのそれぞれの混合物に関する。エナンチオマーおよび／またはジアステレオマーのかかる混合物は、公知の方法で立体異性的に単一の構成物に分離することができる。
【００１５】
本発明はまた、化合物の構造によっては、その化合物の互変異性体に関する。
【００１６】
本発明における塩とは、好ましくは、本発明による化合物の生理学的に許容される塩である。
【００１７】
化合物（Ｉ）の生理学的に許容される塩には、鉱酸、カルボン酸およびスルホン酸の酸付加塩、たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸および安息香酸の塩が含まれる。
【００１８】
化合物（Ｉ）の生理的に許容される塩はまた、たとえば、好ましくは、アルカリ金属塩（たとえば、ナトリウム塩およびカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（たとえば、カルシウム塩およびマグネシウム塩）およびアンモニアまたは炭素原子１〜１６を有する有機アミン（例証的且つ好ましくは、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、ジメチルアミノエタノール、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ジヒドロアビエチルアミン（dihydroabietylamine）、アルギニン、リシン、エチレンジアミンおよびメチルピペリジンなど）から誘導されるアンモニウム塩のような通例の塩基の塩が含まれる。
【００１９】
本発明における溶媒和物とは、固体または液体状態で溶媒分子と配位結合し、複合体（complex）を形成する化合物の形態である。水和物は、溶媒和物の特別な形態であり、そこでは、水と配位結合する。
【００２０】
図面の説明
図１：３０リットルスケールでの菌株ＪＳ３６０（strain JS360）の醗酵の時間経過。
図２：３０リットルスケールでの菌株ＪＳ３６０の醗酵の粗抽出物からの実施例１〜７の単離スキーム。
図３：分取ＨＰＬＣ後の実施例１のＨＰＬＣクロマトグラム、ＨＰＬＣ−ＵＶおよびＨＰＬＣ−ＥＳＩ ＬＣ−ＭＳスペクトル。
図４：実施例１のプロトンスペクトル。
図５：配列番号１：部分的１６Ｓ ｒＤＮＡ、菌株ＪＳ３６０／ＤＳＭ １５３２４の部分配列。
図６：サリノスポラｓｐ.およびＪＳ３６０の関係を示す樹状図。
ツリー（tree）の下のスケールは、配列間の距離を示す。単位は、置換現象（substitution events）の数を示す。サリノスポラｓｐ.は、上方の枝でクラスター形成しており、一方、ＪＳ３６０および同様の配列は、下方の枝でクラスター形成している。
図７：水素原子以外を番号付与した、実施例１のオルテップ−プロット（Ortep-Plot）（５０％）。
図８：極性および非極性層を示しているａおよびｃ軸に沿って見た実施例１の結晶充填（crystal packing）。
【００２１】
別の実施態様では、本発明は、
［式中、
Ｒ１が、水素またはヒドロキシを表し、
Ｒ２が、シクロヘキシルまたはシクロヘキサ−２−エニル（ここで、シクロヘキシルは０〜２個のヒドロキシ基で置換されていてもよい）を表し、
そして、
Ｒ３が、水素またはヒドロキシを表す］
の式（Ｉ）による化合物に関する。
【００２２】
別の実施態様では、本発明は、式：
【化３】
0004795931.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、上記に述べられた意味を有する）
による化合物に関する。
【００２３】
別の実施態様では、本発明は、
（１Ｒ,４Ｒ,５Ｓ）−１−［（Ｓ）−（１Ｓ）−２−シクロヘキセン−１−イル（ヒドロキシ）メチル］−４−ヘキシル−５−メチル−６−オキサ−２−アザビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン：
【化４】
0004795931.tif 000005
（１Ｒ,４Ｒ,５Ｓ）−１−［（Ｓ）−（１Ｓ）−２−シクロヘキセン−１−イル（ヒドロキシ）メチル］−４−［１−ヒドロキシ−ヘキシル］−５−メチル−６−オキサ−２−アザビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン：
【化５】
0004795931.tif 000006
および
（１Ｒ,４Ｒ,５Ｓ）−１−［（１Ｒ）−２−シクロヘキセン−１−イルメチル］−４−ヘキシル−５−メチル−６−オキサ−２−アザビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン：
【化６】
0004795931.tif 000007
のような式（Ｉ）による化合物に関する。
【００２４】
別の実施態様では、本発明は、式：
【化７】
0004795931.tif 000008
［式中、
Ｒ４は、水素またはヒドロキシを表し、
Ｒ５は、シクロヘキシルまたはシクロヘキサ−２−エニル（ここで、シクロヘキシルは０〜２個のヒドロキシ基で置換されていてもよい）を表し、
Ｒ６は、水素またはヒドロキシを表し、
そして、
Ｒ７は、ヒドロキシまたは
【化８】
0004795931.tif 000009
（上記において、Ｒ８は、水素またはメチルを表し、
そして、＊は、分子に結合する位置を表す）
から成る群の式の置換基を表す］
による化合物に関する。
【００２５】
別の実施態様では、本発明は、式：
【化９】
0004795931.tif 000010
［式中、
Ｒ４は、水素またはヒドロキシを表し、
Ｒ５は、シクロヘキシルまたはシクロヘキサ−２−エニル（ここで、シクロヘキシルは０〜２個のヒドロキシ基で置換されていてもよい）を表し、
Ｒ６は、水素またはヒドロキシを表し、
そして、
Ｒ７は、ヒドロキシまたは、式：
【化１０】
0004795931.tif 000011
（式中、Ｒ８は、水素またはメチルを表し、
そして、＊は、分子に結合する位置を表す）
の置換基を表す］
による化合物に関する。
【００２６】
別の実施態様では、本発明は、式：
【化１１】
0004795931.tif 000012
（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、上記に述べられた意味を有する）
による化合物に関する。
【００２７】
別の実施態様では、本発明は、
（３Ｓ,４Ｒ）−２−［（Ｓ）−（１Ｓ）−２−シクロヘキセン−１−イル（ヒドロキシ）メチル］−３−ヒドロキシ−４−［１−ヒドロキシ−ヘキシル］−３−メチル−５−オキソ−Ｄ−プロリン：
【化１２】
0004795931.tif 000013
Ｎ−アセチル−Ｓ−（｛（２Ｒ,３Ｓ,４Ｒ）−２［（Ｓ）−（１Ｓ）−２−シクロヘキセン−１−イル（ヒドロキシ）メチル］−４−ヘキシル−３−ヒドロキシ−３−メチル−５−オキソ−２−ピロリジニル｝カルボニル）システイン：
【化１３】
0004795931.tif 000014
および
メチル−Ｎ−アセチル−Ｓ−（｛（２Ｒ,３Ｓ,４Ｒ）−２［（Ｓ）−（１Ｓ）−２−シクロヘキセン−１−イル（ヒドロキシ）メチル］−４−ヘキシル−３−ヒドロキシ−３−メチル−５−オキソ−２−ピロリジニル｝カルボニル）システイナート（cysteinate）：
【化１４】
0004795931.tif 000015
のような式（ＩＩ）による化合物に関する。
【００２８】
別の実施態様では、本発明は、配列番号１（図５および配列表）を有しているストレプトミセス属の放線菌（Actinomycete）に関する。
【００２９】
別の実施態様においては、本発明は、以下の方法に関する：
［Ａ］配列番号１を有するストレプトミセス属の放線菌ＪＳ３６０（ＤＳＭ １５３２４）から醗酵および単離によって化合物を製造することを特徴とする、一般式：
【化１５】
0004795931.tif 000016
（式中、Ｒ１およびＲ３は、上記に述べられた意味を有する）
の化合物を合成する方法、
または、
【００３０】
［Ｂ］式（Ｉｂ）の化合物における二重結合の水素添加（hydrogenation）によって化合物を製造することを特徴とする、一般式：
【化１６】
0004795931.tif 000017
（式中、Ｒ１およびＲ３は、上記に述べられた意味を有する）
の化合物を合成する方法、
または、
【００３１】
［Ｃ］式（Ｉｂ）の化合物における二重結合の水和反応（hydration）によって化合物を製造することを特徴とする、一般式：
【化１７】
0004795931.tif 000018
（式中、Ｒ１およびＲ３は、上記に述べられた意味を有し、そして、ヒドロキシ基は炭素原子１または２に結合している）
の化合物を合成する方法、
または、
【００３２】
［Ｄ］式（Ｉｂ）の化合物における二重結合の酸化（oxidation）によって化合物を製造することを特徴とする、一般式：
【化１８】
0004795931.tif 000019
（式中、Ｒ１およびＲ３は、上記に述べられた意味を有する）
の化合物を合成する方法、
または、
【００３３】
［Ｅ］配列番号１を有するストレプトミセス属の放線菌から醗酵および単離によって化合物を製造することを特徴とする、一般式：
【化１９】
0004795931.tif 000020
［式中、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記に述べられた意味を有し、そして、
Ｒ７は、ヒドロキシまたは式：
【化２０】
0004795931.tif 000021
（式中、Ｒ８は、上記に述べられた意味を有する）
の置換基を表す］
の化合物を合成する方法、
または、
【００３４】
［Ｆ］式：
【化２１】
0004795931.tif 000022
（式中、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記に述べられた意味を有する）
の化合物をチオールと反応させて、化合物を製造することを特徴とする、一般式：
【化２２】
0004795931.tif 000023
（式中、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記に述べられた意味を有し、
Ｒ７は、
【化２３】
0004795931.tif 000024
から成る群の式の置換基を表す）
の化合物を合成する方法に関する。
【００３５】
式（Ｉ）は、式（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）および（Ｉｅ）の化合物を含む。
式（ＩＩ）は、式（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）および（ＩＩｄ）の化合物を含む。
【００３６】
方法［Ａ］および［Ｅ］は、実験の部で述べられているように行うか、またはストレプトミセスｓｐ.ＪＳ３６０を、液内好気条件下、水性栄養培地で醗酵させる。典型的には、微生物は、炭素源およびタンパク質材料（proteinaceous material）を含んでいる栄養培地で醗酵させる。好ましい炭素源には、グルコース、ブラウンシュガー、蔗糖、グリセロール、でんぷん、とうもろこしでんぷん、乳糖、デキストリン、糖蜜およびそれらの類似物が含まれる。好ましい窒素源としては、綿実粉、コーンスティープリカー、イースト、ミルクソリッドを含んでいる自己分解ビール酵母（autolyzed brewer's yeast with milk solids）、大豆ミール、綿実ミール、コーンミール、ミルクソリッド、カゼインすい臓消化物（pancreatic digest of casein）、蒸留ソリッド（distiller's solids）、動物ペプトン液、肉骨破砕物およびその類似物が含まれる。こうした炭素源と窒素源を組み合わせることによって有利に使用することができる。微量の金属、たとえば、亜鉛、マグネシウム、マンガン、コバルト、鉄などは、水道水および未精製成分が培地成分として使用されるので、醗酵培地には加える必要がない。
【００３７】
化合物の製造は、満足のいく微生物の増殖に役立つ約２３℃と３２℃の間の任意の温度、好ましくは約２８℃で誘導される。通常、化合物の最適な産生物は、約２〜６日の醗酵、好ましくは約４〜５日の醗酵で得られる。醗酵ブロス（fermentation broth）は、普通、醗酵の間、弱ないし中度の酸性に維持し、そして、ｐＨ４〜４.５で醗酵が終了するのが有利である。最終ｐＨは、もしあるとすると、一部では存在する緩衝剤に依存しており、そして、一部では、培地の最初のｐＨに依存している。有利には、滅菌前に約ｐＨ６.５〜７.５、好ましくは７.２に調整する。
【００３８】
産生物は、振とうフラスコ内で取り出すが、また固体培地および攪拌醗酵槽内でも取り出す。増殖が振とうフラスコまたは大きな容器およびタンクで行われる場合は、接種する微生物のスポア形態ではなく、増殖形態を使用し、化合物産生の大幅な遅れおよびそれに伴う装置の非効率な使用を避けることが好ましい。したがって、この培地に土壌からの試料を接種するか、または傾斜培養によって増殖型種菌を水性栄養培地に産生させることが望ましい。このように、若い、活発な増殖型種菌が確保された場合は、それを無菌的に微生物醗酵用の他の振とうフラスコまたは他の適切な器具に移す。増殖型種菌を産生させる培地は、十分な微生物の増殖が得られる限り、化合物を産生させるのに使用したものと同様でも、または異なるものでよい。
【００３９】
一般に、攪拌容器内での液内好気性醗酵におけるストレプトミセスｓｐ.ＪＳ３６０の植え付けおよび醗酵および化合物産生が利用される。産生は、使用される容器、醗酵槽および出発時の処理（starter proceedings）には無関係である。化合物は、また、振とうフラスコ培養によって得ることもできる。大量醗酵には、増殖型種菌を使用することが好ましい。この増殖型種菌は、スポア型、菌糸体断片、またはこの生物の凍結乾燥塊を少量の培地に接種することによって調製される。次いで、この増殖型種菌は醗酵容器に移され、そこで、適切なインキュベーション時間の後、化合物が最適の収量で産生される。
【００４０】
好気的液内培養プロセスでは慣習的であるように、培地には無菌空気が送られる。効率的な生物増殖には、使用される空気量は、毎分あたりの培地量あたりの空気量（ｖｖｍ）約０.２５〜約０.５の範囲である。１０リットル容器での最適率は、攪拌が従来から使用されている回転子（impellers rotating）によって約２４０ｒｐｍで提供されると、約０.３ｖｖｍである。泡立ちが問題となる場合は、シリコンのような少量（すなわち１ｍｌ／ｌ）の消泡剤を醗酵培地に添加することが必要である。好ましい醗酵条件および培地は、一般的実験手順に示す。
【００４１】
化合物は、醗酵ブロスの培養濾過液内はもちろん、醗酵したストレプトミセスｓｐ.ＪＳ３６０のバイオマス内に存在している。この培養ブロスは、フィルタープレスを用いて濾過することによって分離することができる。
【００４２】
醗酵ブロスから化合物を単離および精製するには、様々な処理、たとえば、クロマトグラフィーによる吸着処理に続く適切な溶媒での溶出、カラムクロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、および溶媒からの結晶化およびその組み合わせが使用されうる。
【００４３】
好ましい回収プロセスでは、化合物を、発泡液全体（whole beer）から、菌糸体からまたは上澄み液の抽出物から抽出する。後者の場合では、ＸＡＤ、ＨＰ２０または Bayer Lewapol のような吸着レジンを用いて調製することができる。カラムクロマトグラフィーによる手法が、好ましくは、シリカゲルまたは修飾シリカゲルを用いて、初期精製を行うのに使用される。化合物の最終精製は、好ましくは、分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってなされる。
【００４４】
工程［Ｂ］における水素添加は、パラジウム／炭素（palladium/charcoal）のような触媒および適切な溶媒中の水素の存在下で、０℃〜＋１００℃の温度範囲、常圧かまたは３バールまでの高圧で行われる。
【００４５】
適切な溶媒は、すなわち、ジエチルエーテル、メチル−ｔ−ブチルエーテル、ジオキサンまたはテトラヒドロフランのようなエーテル、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノールまたはｔ−ブタノールのようなアルコールであり、好ましいものとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノールまたはテトラヒドロフランである。
【００４６】
工程［Ｃ］における水和反応（hydration）は、たとえば、テトラヒドロフラン中のジボラン（Ｂ２Ｈ６）、続いて過酸化水素を用いて、酸化的後処理（oxidative work-up）とともに、ヒドロホウ素化（hydroboration）によって行われる。別法としては、エポキシドを生成し、還元法によってそれを開裂させることができる。工程のすべては、−７８℃〜＋２５℃の温度範囲で適切な溶媒中で、常圧かまたは３バールまでの高圧で行われる。
【００４７】
適切な溶媒は、すなわち、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、tert−ブチル−メチルエーテル、およびその関連溶媒である。
【００４８】
工程［Ｄ］における酸化は、過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）または四酸化オスミウム（ＯｓＯ４）を用いて、キラルまたはアキラルジヒドロキシル化方法によって行うことができる。四酸化オスミウムの場合では、たとえば、Ｎ−メチル−モルホリン−Ｎ−オキシドである第三級アミンＮ−オキシドまたはフェリシアン化カリウム（Ｋ３ＦｅＣＮ６）のような他の酸化剤が使用される場合は、触媒量で十分でありうる。工程のすべては、０℃〜＋１００℃の温度範囲で適切な溶媒中で、常圧かまたは３バールまでの高圧で行われる。
【００４９】
適切な溶媒としては、たとえば、エタノールまたはｔ−ブタノールのようなアルコールがあるが、その際適切な量の水が加えられる。
【００５０】
工程［Ｆ］におけるチオールとの反応は、０℃〜５０℃の温度範囲で適切な溶媒中で、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンのような塩基の存在下で、常圧で行われる。
【００５１】
適切な溶媒としては、すなわち、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、およびその関連溶媒がある。
【００５２】
本発明による化合物は、予測できない、有用な薬理学的および薬物動態学的活性スペクトラムを示す。それゆえ、こうした化合物は、ヒトおよび動物の疾患の処置および／または予防のための薬剤としての使用に適している。
【００５３】
本発明による化合物は、その薬理学的特性のため、トキシンショック症候群、エンドトキシンショック、結核、アレルギー、アテローム性動脈硬化症、乾癬性関節炎、ライター症候群、痛風、外傷性関節炎、風疹性関節炎および急性滑膜炎、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、骨関節炎、痛風関節炎および他の関節炎性症状、敗血症、敗血性ショック、グラム陰性敗血症、脳性マラリア（cerebral malaria）、髄膜炎、虚血性および出血性卒中、神経外傷／開放性または閉鎖性頭部損傷、珪肺病、肺筋肉骨化症（pulmonary sarcososis）、骨吸収疾患（bone resorption disease）、骨粗鬆症、再狭窄、心臓・脳・腎臓再流障害、血栓症、糸球体腎炎、慢性腎疾患、糖尿病、糖尿病性網膜症、黄斑変性、移植片対宿主反応、同種異系移植片拒絶、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、神経変性疾患、筋肉変性（muscle degeneration）、血管形成疾患（angiogenic disease）、湿疹、接触性皮膚炎、乾癬、日光皮膚炎（sunburn）、結膜炎、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気道炎症、喘息、熱病（fever）、歯周病、発熱（pyresis）、アルツハイマーおよびパーキンソン病および疼痛、特にＣＯＰＤおよび喘息のような急性および慢性炎症過程の有効な処置を提供するのに、単独で、または他の活性成分と組み合わせて、有用である。
【００５４】
本発明による化合物は、また、卵巣癌または大腸・結腸癌（colon cancer）、腫瘍の増殖および転移のような癌、自己免疫疾患、心筋炎、血管形成術後の再狭窄のような心臓血管系疾患、狼瘡、多嚢胞性腎疾患のような腎疾患、真菌感染、ＨＩＶのようなウイルス感染、細菌性感染、乾癬、創傷治癒異常、ケロイドのような皮膚疾患、自己免疫疾患、急性および遅延型過敏症、移植片対宿主疾患、移植片拒絶のような免疫疾患、および多発性硬化症および急性播種性脳脊髄炎のような神経免疫疾患の処置に有効である。
【００５５】
別の実施態様では、本発明は、少なくとも１つの一般式（Ｉ）の化合物および薬理学的に許容される希釈剤（diluent）を含んでいる組成物、および急性および慢性炎症過程または癌の処置のためのかかる組成物の使用、および一般式（Ｉ）の化合物を慣習的な補助剤とともに、適切な適用形態にすることを特徴とするかかる組成物の製造方法に関する。一般式（Ｉ）の化合物は、それゆえ、薬剤、特に、急性および慢性炎症過程、ことに、ＣＯＰＤ、または癌の処置のための薬剤を製造するために有用である。
【００５６】
上記の疾患を処置する場合、本発明による化合物は、非全身的または全身的活性を発揮することができるが、後者が好ましい。全身的活性を得るためには、活性化合物を、とりわけ、経口または非経腸的に投与することができ、経口投与が好ましい。非全身的活性を得るためには、活性化合物を、とりわけ、局所的に投与することができる。
【００５７】
非経腸投与の場合、粘膜への投与（すなわち、バッカル、舌、舌下、直腸、鼻、肺、結膜または膣内）または体の内部への投与が特に適切である。投与は、吸収を避けること（すなわち、心臓内、動脈内、静脈内、脊髄内または腰椎内投与）または吸収を組み込むこと（すなわち、皮内、皮下、経皮、筋肉内または腹腔内投与）によって行うことができる。
【００５８】
上記の目的の場合、活性化合物をそれ自体、または投与形態にして投与することができる。
【００５９】
経口投与の場合の適切な投与形態は、とりわけ、普通および腸溶性被覆錠、カプセル、被覆錠、ピル、顆粒、ペレット、散剤、固体および液体エアーゾール、シロップ、乳剤、懸濁剤および溶液である。非経腸投与の場合の適切な投与形態は、注射および点滴溶液である。
【００６０】
活性化合物は、０.００１〜１００重量％の濃度で投与形態中に存在することができるが；好ましくは、活性化合物の濃度は、０.５〜９０重量％、すなわち、特定の投薬量範囲を可能にするのに十分である量である。
【００６１】
活性化合物は、不活性な非毒性の医薬的に適切な補助剤、たとえば、賦形剤（excipients）、溶媒、媒体（vehicles）、乳化剤、および／または分散剤を用いて、公知の方法で上記の投与形態に変換されうる。
【００６２】
次の補助剤を例として挙げることができる：水、粉末化した天然または合成ミネラル（たとえば、タルクまたはシリケート）、糖（たとえば、乳糖）のような固形の賦形剤、パラフィンのような非毒性有機溶媒、植物油（たとえば、ゴマ油）、アルコール（たとえば、エタノール、グリセロール）、グリコール（たとえば、ポリエチレングリコール）、乳化剤、分散剤（たとえば、ポリビニルピロリドン）および滑沢剤（たとえば、硫酸マグネシウム）。
【００６３】
経口投与錠剤の場合は、もちろん、デンプン、ゼラチンおよびこれに類するもののような添加剤と同様に、クエン酸ナトリウムのような添加剤をも含むことができる。香味増強剤または着色剤もまた経口投与用水性製剤に加えることができる。
【００６４】
非経腸投与の場合、効果的な結果を得るためには、約０.００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０.０１〜１ｍｇ／ｋｇ（体重）の量を投与することが一般的に有利であることがわかってきている。経口投与の場合は、その量は、約０.０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）である。
【００６５】
しかしながら、特定の状況においては、すなわち、体重、適用ルート、活性成分に対するそれぞれ個々の反応、製剤方法および適用がなされる時間または間隔いかんによって、上述した量を逸脱することも必要でありうる。たとえば、上述の最小量より少ない量で済ますことで十分である場合もありうることであり、一方、他の場合では、上述の上限を超えなければならないであろう。より多い量を適用する場合は、それらの量を一日にわたり、複数回のそれぞれ個々の投与量に分けることが望ましいといえる。
【００６６】
以下に述べる試験および実施例におけるパーセンテージは、特に述べない限り、重量によるものであり、部（パート）も重量によるものである。液体／液体溶液で報告されている溶媒比、希釈比および濃度は、それぞれ、容積（volume）に基づくものである。
【００６７】
Ａ．実施例
次の略語が明細書で使用される
【表１】
0004795931.tif 000025
【００６８】
全般的実験手順
化学薬品を、Merck（Darmstadt, Germany）または Sigma-Aldrich（Deisenhofen, Germany）から分析グレードで得る。ＮＭＲスペクトルは、Bruker DRX 500 スペクトロメータ（５００.１３ＭＨｚプロトン周波数（proton frequency）で作動）を用いて、ＤＭＳＯ−ｄ６で記録される。
【００６９】
ＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、以前に述べられている方法を少し変更したものに基づいて（M.Stadler et al., Phytochemistry 2001, 56, 787-793）、正および負のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）方式であるＬＣＴ質量分析計（Micromass, Manchester, UK) と連結している Agilent HP1100 液体クロマトグラフを用いて行われる。Waters symmetry column が固定相として使用される。移動相Ａ：水中で０.１％ギ酸、移動相Ｂ：アセトニトリル中で０.１％ギ酸；グラジエント：０〜１分１００％Ａ、１〜６分９０％Ｂまで、６〜８分１００％Ｂまで、８〜１０分１００％Ｂまで。ＬＣ−ＭＳスペクトルは、１５０と１.６００の間の分子量の範囲で記録される。
【００７０】
ＨＰＬＣ−ＵＶ／Ｖｉｓ分析は、G1312A 二重ポンプ（binary pump）システム、G1315A ダイオードアレイ検出器、G1316A カラムコンパートメント、G1322A 脱気器具（degaser）および G1313A 自動インジェクターを含んでいる HP1100 シリーズ分析用ＨＰＬＣシステム(Agilent, Waldbronn, Germany) に関する M. Stadler et al., Mycol. Res., 2001, 105, 1190-1205 に準じて行われる。移動相としては、０.０１％リン酸：アセトニトリルが選択され、一方、Merck (Darmstadt, Germany) Lichrospher RP18 カラム（１２５×４ｍｍ、粒子サイズ７μｍ）が固定相として供される。試料サンプル（主要なメタボライトの濃度に従って、２〜１０μｇのメタノールに溶解する物質に相当する）は、次のグラジエント（１０分で０％アセトニトリルから１００％アセトニトリルまでの直線で、その後、５分間、１００％アセトニトリルで均一溶媒条件（isocratic conditions）で、続いて、５分間でカラムを再生する）で、流量１ｍｌ／分、４０℃で分析される。ＨＰＬＣ−ＵＶクロマトグラムを、参照波長を５５０ｎｍ、バンド幅を８０ｎｍとして、２１０ｎｍで記録する。ダイオードアレイ検出（ＤＡＤ）を使用し、２１０〜６００ｎｍの範囲でＨＰＬＣ−ＵＶ／Ｖｉｓスペクトルを記録する。HP ChemStation ソフトウエアを、粗抽出物の較正標準化合物（calibrated standard compounds）を自動的にサーチする場合に備えておく。
【００７１】
分取ＨＰＬＣは、Gilson Unipoint ソフトウエア、306 二重ポンプシステム、205 フラクションコレクター、119 UV-Vis 検出器、806 マノメトリーモジュール（manometric module）、および811C 動的ミキサー（dynamic mixer）を含んでいる、分取ＨＰＬＣシステム（Gilson Abimed, Ratingen, Germany）で、下記に述べた様々なグラジエントおよび固定相を用いて室温で行われる。
【００７２】
ＮＭＲスペクトルは、５００.１３ＭＨｚプロトン周波数で作動させて、Bruker DMX500で記録される。スペクトルのすべては、３０２ＫでＤＭＳＯ−ｄ６溶液で測定される。溶媒ピークは、プロトンと炭素の両方のケミカルシフト（δＨ：２.５０、δｃ：３９.５）のための内部標準として使用される。
【００７３】
菌株ストレプトミセスｓｐ.ＪＳ３６０の特徴解析および維持
培地
酵母−麦芽−グルコース（ＹＭＧ）培地：Ｄ−グルコース０.４％、麦芽抽出物１％、酵母抽出物０.４％、ｐＨ７.２。
Ｑ６培地：Ｄ−グルコース０.４％、グリセロール２％、綿実ミール１％、水道水、ｐＨ７.２。
Ｃ培地：Ｄ−グルコース１％、酵母抽出物１％、ＮＺアミン（Sheffield Chemicals, Sheffield, U,.K., Lot ONA 20 2）０.５％、可溶性デンプン２％、ｐＨ調整なし。
ＧＳ培地：Ｄ−グルコース２％、脱油大豆ミール（Soyamin 50T, Degussa, Duesseldorf, Germany）２％、可溶性デンプン２％、炭酸カルシウム０.５％、塩化ナトリウム０.２５％、硫酸マグネシウム０.０５％、リン酸二水素カリウム０.０２５％、ｐＨは６.５〜６.８に調整。
ＭＣ培地：Ｄ−グルコース１％、酵母抽出物０.５％、脱油大豆ミール（Soyamin 50T, Degussa, Duesseldorf, Germany）１％、可溶性デンプン１％、塩化ナトリウム０.５％、炭酸カルシウム０.３％、ｐＨは７.２に調整（０.１Ｎ水酸化ナトリウム溶液）。
【００７４】
ＭＣＰＭ培地：Diamalt Maltzin ヘル（hell）（Meistermarken GmbH, Bremen, Germany）４.５％、ＮＺアミン（Sheffield Chemicals, Sheffield, U.K., Lot ONA 20 2）１％、塩化ナトリウム０.３％、リン酸二水素カリウム０.１％、硫酸マグネシウム０.０５％、硫酸第一鉄０.０１％、ｐＨ６.８。
ＭＳ培地：マンニトール２％、脱脂大豆ミール（Soyamin 50T, Degussa, Duesseldorf, Germany）２％、炭酸カルシウム０.３％、ｐＨは７.５に調整。
ＳＰ培地：マンニトール３％、酵母抽出物０.７５％、可溶性デンプン０.２％、大豆ペプトン（Merck, Darmstadt, Germany # 107212.0500）０.５％、ｐＨは６.０に調整（塩酸）。
【００７５】
菌株ＪＳ３６０は、日本で集められた土壌サンプルから得られる。これは、液体窒素のもと１０％グリセロール中に、Bayer AG 培養物コレクション（culture collection）(Wuppertal, Germany）に保存されている。これはまた、２００２年１１月２７日に、寄託番号ＤＳＭ１５３２４のもとで、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany）に寄託されている。
【００７６】
菌株の同定
菌株ＪＳ３６０の形態学的、培養的および生理学的特徴は、この菌株がストレプトミセス属の未記載種に相当することを示している。
【００７７】
形態学
２８℃で１２日間インキュベーションすると、ＹＭＧ培地で菌株ＪＳ３６０の一つのコロニーは直径２４ｍｍに達する。このコロニーは、白色のふわふわした空中の菌糸体を作り出すが、一方、培養基（substrate）の菌糸体はクリーム状である。培養物の裏面は赤褐色であり、そして、赤色素は、培地中に放出される。
【００７８】
１６Ｓ ｒＤＮＡ（配列番号１）の配列解読
菌株ＪＳ３６０をその分類学上の位置において更に特徴付けるために、１６Ｓ ｒＤＮＡ（配列番号１）配列の比較が行われる。したがって、Mincer TJ, Jensen PR, Kaufmann CA, Fenical W. 2002. Appl. Environ. Microbiology 60 (10) 5005-5011 a PCR using primers 41f and 1486r-P（未発表）に準じて、５０℃のアニーリング温度で標準熱プロフィールを適用して、ＤＮＡ抽出および１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の主要な部分のシーケンシングを増幅させる。増幅産物を、ＤＮＡ結合常磁性ビーズ（Mag Prep PCR Clean Up Kit, Tecan Schweiz AG, Hornbrechtikon, Switzerland）を用い、製造業者によって提供されているプロトコールを使用して精製する。
【００７９】
ヌクレオチド配列は、Thermo Sequenase Cy5.5 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Amersham Biosciences）、プライマー４１ｆ、および LI-COR 4200 Genetic Analyzer (LI-COR Inc. Lincoln, Nebraska, USA）を使用するサイクルシーケンシング法によって得られる。決定された配列に類似する配列のサーチおよび付随するベストマッチ（best matches）とのアラインメントについては、Europaean Bioinformatics Institute (EBI)（http;//www.ebi.ac.uk/fasta33/）によるオンラインサービスとして提供されているＦＡＳＴＡによってなされる。ベストマッチを示す配列は、LASERGENE ソフトウエア (DNASTAR Inc, Madison, Wisconsin, USA) の MegAlign モジュールのためのインプットとして使用されるデータベースから得られる。Mincer et al., Appl. Environm. Microbiol., 2002, 68, 5005-5011 によって公表されているサリノスポラｓｐ.の配列も考慮される。
【００８０】
次のヌクレオチド配列が比較のために使用される：
【表２】
0004795931.tif 000026
【００８１】
約２４０塩基の配列が菌株ＪＳ３６０から得られる（図５）。この配列は、ＥＭＢＬデータバンクの類似の配列をサーチするためにＦＡＳＴＡ入力として使用される。この配列は、ストレプトミセスの構成員（members）の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と密接に関連があることが判明する。三つのベストマッチの中には、二つのそれぞれ、土壌およびミミズ（earthworm）に起源する名前のないストレプトミセス単離物があり、そして、一つは、ストレプトミセス・シンナバリヌスの単離物である。こうした三つとＪＳ３６０から得られた配列の間での類似性は、９１％の範囲内である。データベースの中には、同一の配列は見出されない。ＪＳ３６０の配列と、三つの最も類似する配列および六つのサリノスポラ種の配列を含めてアラインメント（Clustal 法）が行われる。このアラインメントから、樹状図が、系統発生的関係を示すものとして作図される。サリノスポラｓｐ.とＪＳ３６０を含んでいる群の間に明確な違いがあるとことが判明する（図６）。この結果によると、ＪＳ３６０は、サリノスポラｓｐｐ.と明確に異なることが示される。この菌株は、その部分的な１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列のアラインメントから結論付けられる通り、ストレプトミセス属に属する。
【００８２】
菌株ＪＳ３６０の醗酵および抽出
１：シード（seed）培養
２ｍｌの１０％グリセロール培養物を使用して、無菌ＹＭＧ培地１５０ｍｌを含む１リットルのエルレンマイヤーフラスコに接種し、２８℃、２４０ｒｐｍで、回転振とう機（rotary shaker）によって７２〜９６時間増殖させる。
【００８３】
２：フラスコスケールでの菌株ＪＳ３６０の醗酵
十分増殖したＹＭＧシード培養（フラスコあたり２ｍｌ接種）で接種後、菌株ＪＳ３６０を、１５０ｍｌのＱ６培地（上記参照）を含んでいる、１０個の１リットルエルレンマイヤーフラスコ内で増殖させ、次いで、２８℃、２４０ｒｐｍで、回転振とう機によって１１８時間増殖させる。醗酵の間、毎日、サンプルをとる。ｐＨを決定し、次いで、遊離のグルコースを Bayer Diastix Harnzuckerstreifen を用いて評価する。湿った菌糸体を液体から遠心分離（１０分、３０００×ｇ）によって分離し、２リットルのアセトンで抽出する。このアセトンを真空内（４０℃）で蒸発させる。残存している水性残渣を水で５００ｍｌまで希釈し、等量の酢酸エチルで３回抽出する。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、真空内（４０℃）で蒸発させ、８３０ｍｇの粗抽出物を得、それを、その後、下記（単離）で述べるように分取ＨＰＬＣにかける。
【００８４】
培養液を５００ｍｌの Bayer Lewapol CA 9225 レジンを含有する吸着カラムに適用し、１リットルの水ですすぐ。カラムを１.５リットルのアセトン：メタノール（４：１）で溶出させる。溶媒を真空内（４０℃）で蒸発させる。残存している水性残渣を水で５００ｍｌまで希釈し、等量の酢酸エチルで３回抽出する。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、真空内（４０℃）で蒸発させ、６５０ｍｇの粗抽出物を得、それを、その後、下記（単離）で述べるように分取ＨＰＬＣにかける。
【００８５】
３：３０リットルスケール（攪拌発酵槽）での菌株ＪＳ３６０の醗酵
３０リットルのＱ６培地が入っている４０リットルのバイオスタットＰ醗酵槽（Biostat P fermentor）（Braun Bioengeneering, Melsungen, Germany）をインサイツ（in situ）滅菌し（１２１℃、１時間、１.１バール）、７６時間増殖させた二つの十分生育した１５０ｍｌのＹＭＧシード培養液を接種する。産生用培養物（production culture）を、攪拌（２４０ｒｐｍ）および通気（０.３ｖｖｍ）のもとで生育させる。ｐＨを決定し、遊離のグルコースを Bayer Diastix Harnzuckerstreifen を用いて評価する。更に、醗酵槽に Braun 酸素電極を設置し、培養ブロスの酸素飽和度を決定する。無菌状態のもとで取得され、同量の酢酸エチルで抽出された５０ｍｌのサンプルから調製された粗抽出物の分析ＨＰＬＣは、実施例１の検出手段として供される。実施例２〜５および７は、また醗酵の間にもＨＰＬＣ−ＭＳによって検出されるが、量が乏しいことと使用するＨＰＬＣシステムにおける類似した保持時間を有する共溶出する他の代謝産物のため、天然粗抽出物中では評価することはできない。酢酸エチル抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾燥し、メタノールに再度溶解し、次に、全般的実験手順に述べられているＨＰＬＣ−ＵＶシステムを用いて分析する。３０リットルのＱ６培地におけるＪＳ３６０の醗酵の典型的な時間過程が、図１に示されている。酸素飽和値から推定して、培養が十分に飽和状態になる間、ｐＨは、約４.５の値まで下がる。培地内の遊離のグルコースが消費された後、実施例１の産生は、分析ＨＰＬＣ方法によって評価されるように、約６０時間の醗酵で開始され、１１４時間後、最適条件に達する。次いで、後半の段階になると、実施例１の分解が見られるので、培養物は回収される。培養物の回収の後、液を菌糸体から遠心分離（１０分、３０００×ｇ）によって分離し、次いで、Bayer Lewapol CA9225 吸着レジンが詰められたカラムにアプライし、５リットルの水ですすぐ。このカラムは、その後、６リットルのアセトン：メタノール４：１で溶出される。溶出液を真空内（４０℃）で蒸発させ、水性残渣を得、そして、これを水で１リットルに希釈し、１リットルの酢酸エチルで３回抽出する。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、真空内（４０℃）で蒸発させる。その結果生じる抽出物（２２.７ｇ）を、その後、下記（単離）に述べられているように分取ＨＰＬＣにかける。
【００８６】
この菌糸体を各５リットルのアセトンで３回抽出し、次に、このアセトンを真空内（４０℃）で蒸発させ、水性残渣を得、そして、これを水で１リットルに希釈し、１リットルの酢酸エチルで３回抽出する。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、真空内（４０℃）で蒸発させる。その結果生じる抽出物（１３.４ｇ）を、その後、下記（単離）に述べられているように分取ＨＰＬＣにかける。
【００８７】
４．他の培養培地（フラスコスケール）での醗酵
菌株ＪＳ３６０を、実施例１および化学的関連代謝産物の産生を最適化する試みで、様々な他の培地で増殖する。この目的のために、振とうフラスコ醗酵が、Ｑ６培地におけるものについて述べられたのと同様な方法で行われる（上記２参照）。１５０ｍｌの培地が入っている１リットルのエルレンマイアーフラスコを、２８℃、２４０ｒｐｍで、回転振とう機によって１１８時間まで増殖させる。醗酵の間、毎日、サンプルとる。ｐＨを決定し、次いで、遊離のグルコースを Bayer Diastix Harnzuckerstreifen を用いて評価する。一定量の培養ブロス（５０ｍｌ）を酢酸エチルで抽出する。こうした酢酸エチル抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾燥し、メタノールに再度溶解し、次に、全般的実験手順に述べられているＨＰＬＣ−ＵＶおよびＨＰＬＣ−ＭＳシステムを用いて分析する。保持時間とスペクトルを比較することにより、実施例１および関連化合物を次の培地：ＹＭ培地、Ｃ培地、ＧＳ培地、ＭＣ培地、ＭＣＰＭ培地、ＭＳ培地およびＳＰ培地で７２〜９６時間の醗酵後、検出する。しかしながら、実施例１の最も高い収量は、Ｑ６およびＧＳ培地で観察される。
【００８８】
実施例１
（１Ｒ,４Ｒ,５Ｓ）−１−［（Ｓ）−（１Ｓ）−２−シクロヘキセン−１−イル（ヒドロキシ）メチル］−４−ヘキシル−５−メチル−６−オキサ−２−アザビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン
【化２４】
0004795931.tif 000027
製造は下記参照。
【００８９】
実施例２
（１Ｒ,４Ｒ,５Ｓ）−１−［（Ｓ）−（１Ｓ）−２−シクロヘキセン−１−イル（ヒドロキシ）メチル］−４−［１−ヒドロキシ−ヘキシル］−５−メチル−６−オキサ−２−アザビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン
【化２５】
0004795931.tif 000028
製造は下記参照。
【００９０】
実施例３
（１Ｒ,４Ｒ,５Ｓ）−１−［（１Ｒ）−２−シクロヘキセン−１−イルメチル］−４−ヘキシル−５−メチル−６−オキサ−２−アザ−ビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン
【化２６】
0004795931.tif 000029
製造は下記参照。
【００９１】
実施例４
（３Ｓ,４Ｒ）−２−［（Ｓ）−（１Ｓ）−２−シクロヘキセン−１−イル（ヒドロキシ）メチル］−３−ヒドロキシ−４−［１−ヒドロキシ−ヘキシル］−３−メチル−５−オキソ−Ｄ−プロリン
【化２７】
0004795931.tif 000030
製造は下記参照。
【００９２】
実施例５
Ｎ−アセチル−Ｓ−（｛（２Ｒ,３Ｓ,４Ｒ）−２−［（Ｓ）−（１Ｓ）−２−シクロヘキセン−１−イル（ヒドロキシ）メチル］−４−ヘキシル−３−ヒドロキシ−３−メチル−５−オキソ−２−ピロリジニル｝カルボニル）システイン
【化２８】
0004795931.tif 000031
製造は下記参照。
【００９３】
実施例６
メチル−Ｎ−アセチル−Ｓ−（｛（２Ｒ,３Ｓ,４Ｒ）−２−［（Ｓ）−（１Ｓ）−２−シクロヘキセン−１−イル（ヒドロキシ）メチル］−４−ヘキシル−３−ヒドロキシ−３−メチル−５−オキソ−２−ピロリジニル｝カルボニル）システイナート
【化２９】
0004795931.tif 000032
製造は下記参照。
【００９４】
実施例７
（３Ｓ,４Ｒ）−２−［（Ｓ）−（１Ｓ）−２−シクロヘキセン−１−イル（ヒドロキシ）メチル］−３−ヒドロキシ−４−ヘキシル−３−メチル−５−オキソ−Ｄ−プロリン
【化３０】
0004795931.tif 000033
製造は下記参照。
【００９５】
実施例２〜７の立体化学は、Ｘ線解析によって決定される実施例１の構造に準じて描かれる。
【００９６】
実施例１〜７の単離
１．振とうフラスコ醗酵からの物質
粗抽出物（それぞれ、菌糸体から６２０ｍｇおよび培養液から８３０ｍｇ）を５ｍｌのメタノールに溶解し、そして、Bond Elut C18 500mg 固相抽出カートリッジ (Baker, Deventer, The Netherlands）によって濾過し、MZ Analysentechnik (Mainz, Germany) Kromasil RP18 カラム（粒子径、７μｍ；２５０×４０ｍｍ）にアプライする。移動相として、０.０１％ＴＦＡ：アセトニトリルのグラジエントを、流量１０ｍｌ／分：ｔ＝０分で２０％アセトニトリル；直線グラジエント：２０％〜５０％アセトニトリル（４０分で）；その後５０％〜１００％アセトニトリル（２０分で）の直線グラジエント；その後、３０分間、７５％アセトニトリル（均一溶媒条件）で使用し、その後、このカラムを再生する。フラクションを２１０ｎｍでのＵＶ吸着（adsorption）に従って合わせる。実施例１は、保持時間（Ｒｔ）８０〜８３分で溶出され、菌糸体抽出物から１４ｍｇ、培養液抽出物から１.５ｍｇの量でそれぞれ得られる。実施例２〜５および７は、少ない方の中間フラクション中に存在し、この抽出物から精製するために単離せず、一方、実施例６は、まったく検出されない。
【００９７】
２：３０リットルスケール醗酵からの物質
上記に述べられているように調製された粗抽出物（菌糸体から１３.４ｇ、培養液から２２.７ｇ）の２.５〜３グラムの試料を、メタノール５ｍｌに溶解し、そして、Bond ElutC18 500mg 固相抽出カートリッジ（Baker, Deventer, The Netherlands）によって濾過し、MZ Analysentechnik（Mainz, Germany) Kromasil RP18 カラム（粒子径、７μｍ；２５０×４０ｍｍ；移動相、０.０１％ＴＦＡ：アセトニトリル）にアプライする。移動相として、０.０１％ＴＦＡ：アセトニトリルのグラジエントを、流量１０ｍｌ／分：ｔ＝０分で２０％アセトニトリル；直線グラジエント：２０％〜５０％アセトニトリル（４０分で）；その後５０％〜１００％アセトニトリル（２０分で）の直線グラジエント；その後、３０分間、７５％アセトニトリル（均一溶媒条件）で使用し、その後、このカラムを再生する。フラクションを２１０ｎｍでのＵＶ吸着に従って合わせる。５つの生物学的活性のある中間生成物（intermediate product）がこのようにして得られる。このグラジエントシステムにおいて保持時間（Ｒｔ）が次のように確認される：６１〜６４分、中間生成物１（実施例４および７を含む）、６５〜７１分、中間生成物２（実施例５および６を含む）、７２〜７９分、中間生成物３（実施例２を含む）、７９〜８５分、中間生成物４（実施例１を含む）および８６〜９３分、中間生成物５（実施例３を含む）。
【００９８】
中間生成物１〜５における活性成分の最終精製は、分取逆相ＨＰＬＣによって行われ、そこでは、流量７ｍｌ／分、固定相としてMZ Analysentechnik Inertsil C18 カラム（７μｍ；２５０×３０ｍｍ）、および次のグラジエントを用いる。均一溶媒条件、ｔ＝０分＝＞ｔ＝３０分；その後、直線グラジエント、３０％アセトニトリル＝＞１００％アセトニトリル（５０分で）、その後、均一溶媒条件（１００％アセトニトリル）２０分間、その後、カラムを再生。実施例１〜６の収量およびＲｔを、表１にまとめる。単離のための全般的なスキームを図２に例示説明する。
【００９９】
表１
【表３】
0004795931.tif 000034
【０１００】
実施例１〜７の特徴解析
実施例１〜６は、全般的実験手順に述べられた方法を用いてＨＰＬＣ−ＵＶおよびＨＰＬＣ−ＭＳによって検出される。分析ＨＰＬＣシステムでのこうした特徴を、表２にまとめる。使用グラジエントでの実施例１の検出が、図３に図解されている。実施例１、２、４および７は、それらの分子ピークに関して確定的な結果を提供しているが、実施例３のＬＣ−ＭＳは、単にポジティブＥＳＩモードにおける分子ピークを明らかにしているのみであり、一方、ネガティブＥＳＩモードにおける二酸化炭素の低下によって、より小さな主要なマスフラグメントが観察される。実施例５と６においては、使用されたＨＰＬＣ−ＭＳの条件下でダイマーが容易に形成され、主要なＬＣ−ＭＳシグナルはこうしたダイマーに関するものであり、一方、分子ピークは単にマイナーなシグナルを構成するに過ぎない。こうした特徴はまた、醗酵ブロス、および抽出、下流の加工処理（downstream processing）およびクロマトグラフィーの間に得られる中間フラクションの分析ＨＰＬＣによって実施例を同定するのに役に立つ。
【０１０１】
表２
【表４】
0004795931.tif 000035
【０１０２】
実施例１〜７の構造は、低分解能および高分解能ＬＣ−ＭＳスペクトロメトリーおよび一および二次元ＮＭＲ（核磁気共鳴）スペクトロスコピーによって決定される。機器パラメーターについては、全般的実験手順を参照。
【０１０３】
ＮＭＲデータは、シクロヘキシル環内のｃｉｓ−二重結合の存在を明らかにする。ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣおよびＣＯＳＹ／ＴＯＣＳＹデータを綿密に分析することによって、シクロヘキセニルカルビノール部分（cyclohexenylcarbinol moiety）とともに、サリノスポラミドＡに見出されたものと同一である二環式環構造を確立することが可能となる。ＨＳＱＣデータによれば、各分子内に少なくとも二つのメチル基が存在していることが示される。ＴＯＣＳＹとＨＭＢＣで、枝わかれしていないヘキシル部分が同定される。ＣＯＳＹスペクトル内のはっきりとしたクロスピークにより、この鎖はヘテロ環の環システム内の２の位置にあると突きとめられる。実施例７（実施例１と比較して）および実施例４（実施例２と比較して）は、ＮＭＲおよびＭＳデータによって、対応するベータ−ラクトン分子のそれぞれのｓｅｃｏ−体（seco-forms）を構成することが明らかにされる。更に１２の位置（実施例２および４）でのヒドロキシ基の存在（サリノスポラミドＡと比較して）については、多重度および特徴的な炭素およびプロトンケミカルシフトによって明らかになる。
【０１０４】
実施例５および６のＮＭＲスペクトルは、Ｎ−アシル化システイン部分に属する完全な新規なシグナルのサブセットを示す。このＮ−アセチル−システインは、その前のベータラクトン環のカルボニル基、または実施例７のカルボキシル基をそれぞれ介してヘテロ環の環構造に結合している。チオエステル結合は、カルボニルケミカルシフト（＞２００ｐｐｍ）およびシステインのベータ−水素に対するＨＭＢＣ誘導結合性（HMBC derived connectivity）によって同定される。システイン残基内のすべての結合性は、ＨＭＢＣおよびＣＯＳＹスペクトル内の対応するシグナルを割り当てることによって確立される。したがって、実施例５および６の構造は、ラクタシスチンの構造と類似している。
【０１０５】
スペクトルデータ
実施例１
１H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 0.87 (t), 1.28 (m), 1.29 (m), 1.23 (m), 1.40 (m), 1.45 (m), 1.47 (m), 1.54 (m), 1.58 (m), 1.68 (m), 1.74 (s), 1.80 (m), 1.90 (m), 2.29 (m), 2.41 (t), 3.65 (m), 5.47 (m), 5.73 (m), 5.81 (m), 8.92 (s）.
13C-NMR (DMSO-d6): δ = 13.8, 21.7, 21.8, 24.2, 25.2, 26.1, 26.8, 28.5, 30.8, 37.3, 47.5, 69.3, 78.4, 86.4, 127.8, 128.6, 169.1, 174.1.
【０１０６】
実施例２
１H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 0.88 (t), 1.27 (m), 1.29 (m), 1.35 (s), 1.37 (m), 1.49 (m), 1.58 (m), 1.59 (m), 1.71 (m), 1.75 (m), 1.93 (m), 2.35 (d), 2.76 (m), 3.49 (m), 4.00 (d), 4.68 (m), 5.70 (m), 5.91 (m), 6.11 (br.), 8.52 (s）.
13C-NMR (DMSO-d6): δ = 13.4, 21.0, 21.4, 23.7, 24.2, 29.6, 30.1, 31.5, 36.1, 54.6, 69.4, 75.0, 76.0, 76.5, 127.9, 170.9, 172.3.
【０１０７】
実施例３
１H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 0.88 (t), 1.27 (m), 1.30 (m), 1.31 (m), 1.33 (m), 1.46 (m), 1.48 (m), 1.50 (m), 1.61 (s), 1.62 (m), 1.63 (m), 1.76 (m), 1.92 (m), 2.27 (m), 2.55 (t), 5.45 (m）; 5.68 (m), 8.98 (s）.
13C-NMR (DMSO-d6): δ = 13.3, 19.6, 21.4, 24.0, 24.2, 26.5, 28.2, 28.5, 29.9, 30.9, 32.5, 46.7, 74.0, 86.1, 127.7, 130.9, 170.4, 170.8.
【０１０８】
実施例４
１H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 0.82 (m), 1.17 (m), 1.20 (m), 1.24 (m), 1.32 (m), 1.47 (m), 1.60 (m), 1.62 (m), 1.63 (m), 1.84 (m), 2.08 (m） 2.44 (d), 3.68 (m), 3.80 (m), 5.60 (m), 5.76 (m）.
13C-NMR (DMSO-d6): δ = 13.1, 20.1, 20.6, 21.0, 23.5, 23.6, 30.5, 33.5, 37.7, 52.7, 67.1, 73.6, 75.2, 80.1, 126.3, 128.6, 171.2, 176.5.
【０１０９】
実施例５
１H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 0.87 (m), 1.09 (m), 1.24 (m), 1.25 (m), 1.27 (m), 1.33 (m), 1.35 (m), 1.37 (m), 1.44 (m), 1.46 (m), 1.50 (m), 1.61 (m), 1.64 (m), 1.84 (s), 1.87 (m), 2.13 (m), 2.47 (t), 2.96 (m), 3.30 (m), 3.78 (m), 4.36 (m), 5.64 (m), 5.79 (m）.
13C-NMR (DMSO-d6): δ = 13.9, 20.8, 21.7, 22.0, 22.1, 22.2, 23.4, 24.3, 26.8, 27.7, 28.7, 29.2, 31.1, 38.1, 50.3, 51.0, 75.3, 79.7, 80.6, 127.0, 129.3, 169.3, 178.9, 201.2.
【０１１０】
実施例６
１H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 0.87 (m), 1.09 (m), 1.24 (m), 1.25 (m), 1.27 (m), 1.33 (m), 1.35 (m), 1.37 (m), 1.44 (m), 1.46 (m), 1.50 (m), 1.61 (m), 1.64 (m), 1.84 (s), 1.87 (m), 2.13 (m), 2.47 (t), 3.00 (m), 3.24 (m), 3.64 (s), 3.78 (m), 4.39 (m), 5.64 (m), 5.79 (m）. 
13C-NMR (DMSO-d6): δ = 13.6, 20.8, 21.7, 22.0, 22.1, 23.4, 24.3, 26.8, 27.7, 28.7, 29.3, 31.1, 38.1, 50.3, 51.4, 51.8, 75.3, 79.7, 80.6, 127.0, 129.3, 169.3, 171.0, 178.9, 201.2.
【０１１１】
実施例７
１H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 0.86 (t), 1.25 (m), 1.26 (m), 1.33 (m), 1.34 (m), 1.36 (m), 1.44 (m), 1.46 (s), 1.51 (m), 1.66 (m), 1.67 (m), 1.88 (m), 2.12 (m), 2.45 (t), 3.77 (d), 5.64 (m), 5.82 (m), 7.66 (s）. 
13C-NMR (DMSO-d6): δ = 13.8, 20.3, 21.5, 21.7, 23.3, 24.4, 26.5, 27.9, 28.9, 31.0, 38.5, 50.5, 74.6, 75.5, 80.4, 127.4, 129.7, 177.5.
【０１１２】
ＮＭＲ−ピーク−リストの解明：
実施例１：Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝ＯＨ、実施例２：Ｒ１＝ＯＨ、Ｒ２＝ＯＨ、実施例３：Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝Ｈ
【化３１】
0004795931.tif 000036
【０１１３】
実施例４、実施例５：Ｒ８＝Ｈ、実施例６：Ｒ８＝ＣＨ３、実施例７（立体化学はＮＭＲによっては決定されなかった）。
【化３２】
0004795931.tif 000037
【０１１４】
表３ａ
ＤＭＳＯ−ｄ６内で５００ＭＨｚ、３０２Ｋで測定された実施例１〜３のケミカルシフト。
【表５】
0004795931.tif 000038
＋＋これらの共鳴アサインメント（帰属）は、相互に交換されうる。
【０１１５】
表３ｂ
ＤＭＳＯ−ｄ６内で５００ＭＨｚ、３０２Ｋで測定された実施例４〜６のケミカルシフト。
【表６】
0004795931.tif 000039
【０１１６】
表３ｃ
ＤＭＳＯ−ｄ６内で５００ＭＨｚ、３０２Ｋで測定された実施例７のケミカルシフト。
【表７】
0004795931.tif 000040
【０１１７】
表４ａ
ＤＭＳＯ−ｄ６内で５００ＭＨｚ、３０２Ｋで測定された実施例１〜３のケミカルシフト。
【表８】
0004795931.tif 000041
【０１１８】
表４ｂ
ＤＭＳＯ−ｄ６内で５００ＭＨｚ、３０２Ｋで測定された実施例４〜６のケミカルシフト。
【表９】
0004795931.tif 000042
【０１１９】
表４ｃ
ＤＭＳＯ−ｄ６内で５００ＭＨｚ、３０２Ｋで測定された実施例７のケミカルシフト。
【表１０】
0004795931.tif 000043
【０１２０】
高分解能マススペクトロメトリー
実施例１：ＥＳＩ−；質量実測値：３３４.１９７７、計算値：３３４.２０１４（分子式Ｃ１９Ｈ２８ＮＯ４につき４.１ｍＤａの偏差に相当する）。
実施例２：ＥＳＩ−；質量実測値：３５０.１９６８、計算値：３５０.１９６７（分子式Ｃ１９Ｈ２８ＮＯ５につき０.１ｍＤａの偏差に相当する）。
実施例３：ＥＳＩ＋；質量実測値：２７６.２３８８、計算値：２７６.２３２７（分子式Ｃ１８Ｈ３０ＮＯにつき６.１ｍＤａの偏差に相当する）。ここで、フラグメント（Ｍ−ＣＯ２）のみが、ＥＳＩ条件で観察される。
実施例４：ＥＳＩ＋；質量実測値：３６８.２１０７、計算値：３６８.２０７３（分子式Ｃ１９Ｈ３１ＮＯ６につき３.３ｍＤａの偏差に相当する）。
実施例５：ＥＳＩ−；質量実測値：４９７.２３２２、計算値：４９７.２３２１（分子式Ｃ２４Ｈ３８Ｎ２Ｏ７Ｓにつき０.０ｍＤａの偏差に相当する）。
実施例６：ＥＳＩ−；質量実測値：５１１.２５９４、計算値：５１１.２４７８（分子式Ｃ２５Ｈ４０Ｎ２Ｏ７Ｓにつき１１.６ｍＤａの偏差に相当する）。
実施例７：ＥＳＩ＋；質量実測値：３５４.２２６８、計算値：３５４.２２８０（分子式Ｃ１９Ｈ３２ＮＯ５につき１.３ｍＤａの偏差に相当する）。
【０１２１】
実施例１の一つの結晶Ｘ線構造解析および絶対立体配置（absolute configuration）の決定
実施例１のいくつかの結晶を、４６℃でプロパノール／ジアセトンアルコール９７：３の飽和溶液をゆっくり蒸発させて結晶化させる。Ｘ線源としてＣｕｋα−放射を用いて、−１８３.５℃、寸法（dimension）０.３０×０.２０×０.０３ｍｍ３で、全データセットを適切な結晶から集める。構造プロポーザルが、キラルスペースグループＰ２１２１２１（図７参照）を用いて、斜方晶セル内で得られる。この結晶セルは、非常に大きな軸（extreme large axes）を有し、同一のキラリティを持つ実施例１の１２の独立した分子を含んでいる。分子のすべては、異なる立体配座を示す。この分子を、極性層および無極性層内に入れる（図８参照）。一つの極性層は、水素結合に沿って、二次元的に結合される。実施例１の絶対立体配置は、このようにして、Ｒ（Ｃ２）；Ｓ（Ｃ４）；Ｒ（Ｃ５）；Ｓ（Ｃ６）；Ｓ（Ｃ７）で決定され、標準偏差０.２で０.０の Flack パラメーターを得る（H.-D. Flack, Acta Cryst., 1983, A39, 876-881）。期待値は、真の（correct）絶対構造の場合は０であり（３ esd's 以内で）、逆の（inverted）絶対構造の場合は＋１である。
【０１２２】
実施例１のＸ線構造におけるキラル中心の番号付与：
【化３３】
0004795931.tif 000044
【０１２３】
Ｘ線解析のデータ回収： Proteum CCD 領域検出器（area detector）、Ｃｕｋα−放射付のＦＲ５９１回転陽極、モノクロメータとしての Montel ミラーおよび Kryoflex 低温装置（Ｔ＝９０Ｋ）を備えた Bruker-Nonius 回折計で測定がなされる。測定は、４.６９〜５４.３３°の範囲でなされる。２０５８４５個のリフレクション（reflections）が集められるが、その内２６９９５個のリフレクションがユニーク（unique）である（Ｒｉｎｔ＝０.１０７３）。フルスフィアデータコレクション（Fullsphere data collection）ωおよびψがスキャンされる。使用プログラム：データ収集 Proteum V.1.37 (Bruker-Nonius 2002)、データ還元 Saint Plus Version 1.6 (Bruker-Nonius 2002) および吸収の収集（absorption correction）SADABS V. 2.03 (2002) 。
【０１２４】
構造の解明および洗練化： SHELXTL Version 6.10 (Sheldrick 2000, University of Goettingen, Germany)；２１１１９Ｆｏ＞４ｓｉｇ（Ｆｏ）、２６２９  洗練化パラメーター（refined parameters）、Ｒ１＝０.０７９６、ｗＲ２＝０.１８９２、Ｆ２への良好なフィット＝１.０８３、Flack パラメーター０.０（２）、最大残留電子密度（maximum residual electron density）０.４６４（−０.３１４）ｅÅ３。
【０１２５】
結晶データ：Ｃ１９Ｈ２９Ｎ１Ｏ４×１２、Ｍｒ＝３３５.２６（４０２３.１７）；斜方晶；空間群Ｐ２１２１２１、ａ＝１３.０６２４（２）Å、ｂ＝２９.０５４３（５）Å、ｃ＝５８.４５５９（１１）Å、Ｖ＝２２１７８.２（７）Å３、Ｚ＝４、ρｃａｌ＝１.２０５Ｍｇ／ｍ３、μ＝０.６７４ｍｍ−１。
【０１２６】
化合物の製造方法
液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）：アセトニトリル−水（９：１〜１：９）の混合物を１ｍｌ／分の流速で流す Micromass Platform LC (Shimadzu Phenomenex ODS カラム（４.６ｍｍφＸ３０ｍｍ）付）。マススペクトルは、エレクトロスプレー（ＥＳ）イオン化法を用いて得られた。
質量決定（Mass determination）：Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ  ＭＡＴ９５。
融点は補正されていない。
【０１２７】
１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Bruker DRX-300（１Ｈに３００ＭＨｚ）スペクトロメータか、Brucker 500 UltraShieledTM（１Ｈに５００ＭＨｚ）のどちらかを用いて記録した。ケミカルシフトは、ゼロｐｐｍの内部標準としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を用いて、百万分率（ｐｐｍ）で報告される。結合定数（Ｊ）は、ヘルツで与えられ、その省略形ｓ、ｄ、ｔ、ｑ、ｍ、およびｂｒは、それぞれ一重線、二重線、三重線、四重線、多重線および幅広を表す。
【０１２８】
ＴＬＣは、シリカゲルを予め被覆したプレート（Merck silica gel 60 F-254）で行われた。シリカゲル（WAKO-gel C-200（７５〜１５０μｍ））が、カラムクロマトグラフィー分離のすべてに用いられた。化学品のすべては、試薬レベルであり、Sigma-Aldrich、Wako pure chemical industries, Ltd., Great Britain、Tokyo kasei kogyo Co., Ltd.、Nacalai tesque, Inc.、Watanabe Chemical Ind. Ltd.、Maybridge plc, Lancaster Synthesis Ltd.、Merck KgaA, Germany または Kanto Chemical Co., Ltd. から購入された。
【０１２９】
出発物質はすべて、商業的に入手可能か、または文献に引用された方法を用いて製造することができる。
【０１３０】
実施例１
１−（シクロヘキサ−２−エニル−ヒドロキシ−メチル）−４−ヘキシル−５−メチル−６−オキサ−２−アザ−ビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン
【化３４】
0004795931.tif 000045
ジクロロメタン（１０ｍｌ）中の２−（シクロヘキサ−２−エニル−ヒドロキシ−メチル）−４−ヘキシル−３−ヒドロキシ−３−メチル−５−オキソ−ピロリジン−２−カルボン酸（実施例７）（１３０ｍｇ、０.３７ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でトリエチルアミン（０.１５ｍｌ、１.１ｍｍｏｌ）およびＢＯＰＣｌ（１４０ｍｇ、０.５５ｍｍｏｌ）を加えた。１時間攪拌後、炭酸水素ナトリウム飽和溶液（２０ｍｌ）をそこに加え、次いで、有機層を酢酸エチルで抽出し、塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝３／１−１／１）によって精製すると、目的物（９８ｍ、７９％）が得られた。
融点：１５７℃；
ＬＣＭＳ（４分の方法）：Ｒｔ＝２.５６分、ｍ／ｚ＝３３６（Ｍ＋Ｈ）＋；
１H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.87 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.10-1.70 (13H, m), 1.74 (3H, s), 1.82 (1H, m), 1.92 (2H, m), 2.29 (1H, m), 2.41 (1H, d, J = 5.8 Hz), 3.66 (1H, t, J = 8.9 Hz), 5.49 (1H, d, J = 7.9 Hz), 5.70 (1H, m), 5.80 (1H, d, J = 11.5 Hz), 8.91 (1H, s）.
【０１３１】
実施例２
１−（シクロヘキサ−２−エニル−ヒドロキシ−メチル）−４−（１−ヒドロキシ−ヘキシル）−５−メチル−６−オキサ−２−アザ−ビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン
【化３５】
0004795931.tif 000046
ジクロロメタン（１４ｍｌ）中の２−（シクロヘキサ−２−エニル−ヒドロキシ−メチル）−３−ヒドロキシ−４−（１−ヒドロキシ−ヘキシル）−３−メチル−５−オキソ−ピロリジン−２−カルボン酸（実施例４）（２３９ｍｇ、０.６５ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でトリエチルアミン（０.２７ｍｌ、１.９ｍｍｏｌ）およびＢＯＰＣｌ（２４７ｍｇ、０.９７ｍｍｏｌ）を加えた。１時間攪拌後、炭酸水素ナトリウム飽和溶液（２０ｍｌ）をそこに加え、次いで、有機層を酢酸エチルで抽出し、塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝３／１−１／１）によって精製すると、目的物（９２ｍｇ、４０％）が得られた。
融点：１４４℃；
ＬＣＭＳ（４分の方法）：Ｒｔ＝２.５５分、ｍ／ｚ＝３５２（Ｍ＋Ｈ）＋；
1H-NMR (500Mz, DMSO-d6）: δ = 0.87 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.17-1.33 (6H, m), 1.46-1.52 (3H, m), 1.77 (3H, s), 1.54-1.86 (3H, m), 1.92 (2H, m), 2.29 (1H, m), 2.57 (1H, d, J = 5.7 Hz), 3.65 (1H, t, J = 8.8 Hz), 3.92 (1H, m), 4.77 (1H, d, J = 3.8 Hz), 5.48 (1H, d, J = 7.9 Hz), 5.72 (1H, m), 5.80 (1H, d, J = 10.4 Hz), 9.07 (1H, s）.
【０１３２】
実施例８
１−（シクロヘキシル−ヒドロキシ−メチル）−４−ヘキシル−５−メチル−６−オキサ−２−アザ−ビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン
【化３６】
0004795931.tif 000047
ジクロロメタン（２ｍｌ）中の１−（シクロヘキサ−２−エニル−ヒドロキシ−メチル）−４−ヘキシル−５−メチル−６−オキサ−２−アザ−ビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン（実施例１）（１００ｍｇ、０.３ｍｍｏｌ）および１０％Ｐｄ−Ｃ（５ｍｇ）の懸濁液に、水素を注意深く加えた。室温で３時間攪拌後、触媒を濾過によって除いた。残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）によって精製すると、目的物（５０ｍｇ、５０％）が得られた。
融点：１６７℃；
ＬＣＭＳ（４分の方法）：Ｒｔ＝２.７３分、ｍ／ｚ＝３３８（Ｍ＋Ｈ）＋；
１H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.87 (3H, t, J = 6.9 Hz), 0.90-1.35 (12H, m), 1.73 (3H, s), 1.40-1.86 (9H, m), 2.40 (1H, t, J = 7.6 Hz), 3.67 (1H, t, J = 7.9 Hz), 5.23 (1H, d, J = 7.9 Hz), 8.85 (1H, s）.
【０１３３】
実施例９
（１Ｓ）−シクロヘキサ−２−エン−１−イル［（１Ｒ,４Ｒ,５Ｓ）−４−ヘキシル−５−メチル−３,７−ジオキソ−６−オキサ−２−アザビシクロ［３.２.０］ヘプタ−１−イル］メチルアセタート
【化３７】
0004795931.tif 000048
ピリジン（０.００２ｍｌ）中の（１Ｒ,４Ｒ,５Ｓ）−１−［（１Ｓ）−シクロヘキサ−２−エン−１−イル（ヒドロキシ）メチル］−４−ヘキシル−５−メチル−６−オキサ−２−アザビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン（実施例１）（８.３０ｍｇ、０.０２５ｍｍｏｌ）と無水酢酸（２.７８ｍｇ、０.０２７ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で１８時間攪拌した。このあと、この混合物をトルエンで希釈し、減圧下で濃縮し、（１Ｓ）−シクロヘキサ−２−エン−１−イル［（１Ｒ,４Ｒ,５Ｓ）−４−ヘキシル−５−メチル−３,７−ジオキソ−６−オキサ−２−アザビシクロ［３.２.０］ヘプタ−１−イル］メチルアセタート（９.００ｍｇ、９６％）を得た。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝３７８（Ｍ＋Ｈ）＋；
１H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 0.87 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.22-1.34 (6H, m), 1.40-1.85 (8H, m), 1.70 (3H, s), 1.85-2.02 (3H, m), 2.07 (3H, s), 2.67 (1H, dd, J = 8.0, 5.5 Hz), 5.19 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.41 (1H, dd, J = 10.5, 2.1 Hz), 5.74 (1H, m), 8.17 (1H, s）.
【０１３４】
実施例１０
２−（シクロヘキサ−２−エニル−ヒドロキシ−メチル）−４−ヘキシル−３−ヒドロキシ−３−メチル−５−オキソ−ピロリジン−２−チオカルボン酸Ｓ−ベンジルエステル
【化３８】
0004795931.tif 000049
ジクロロメタン（２ｍｌ）中の１−（シクロヘキサ−２−エニル−ヒドロキシ−メチル）−４−ヘキシル−５−メチル−６−オキサ−２−アザ−ビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン（実施例１）（３０ｍｇ、０.０９ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（３７μｌ、０.２７ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でベンジルヒドロスルフィド（benzyl hydrosulfide）（０.１ｍｌ）を加えた。４時間攪拌後、混合物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサンのみ−ヘキサン／酢酸エチル＝３／１−１／１）で精製すると、目的物を得、これをヘキサンで洗浄すると、白色固体（２５ｍｇ、６１％）を得た。
融点：１３８℃；
ＬＣＭＳ（４分の方法）：Ｒｔ＝２.９２分、ｍ／ｚ＝４６０（Ｍ＋Ｈ）＋；
１H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.86 (3H, t, J = 6.9 Hz), 0.98 (1H, m), 1.46 (3H, s), 1.12-1.58 (13H, m), 1.81 (2H, m), 2.07 (1H, m), 2.43 (1H, m), 3.79 (1H, t, J = 6.5 Hz), 4.00 (1H, d, J = 13.8 Hz), 4.09 (1H, d, J = 13.8 Hz), 4.84 (1H, s), 5.00 (1H, d, J = 7.6 Hz), 5.60 (1H, m), 5.76 (1H, d, J =12.0 Hz), 7.18-7.32 (5H, m), 8.14 (1H, s）.
【０１３５】
実施例１１
２−（シクロヘキサ−２−エニル−ヒドロキシ−メチル）−４−ヘキシル−３−ヒドロキシ−３−メチル−５−オキソ−ピロリジン−２−チオカルボン酸Ｓ−（２−アセチルアミノ−エチル）エステル
【化３９】
0004795931.tif 000050
ジクロロメタン（１ｍｌ）中の１−（シクロヘキサ−２−エニル−ヒドロキシ−メチル）−４−ヘキシル−５−メチル−６−オキサ−２−アザ−ビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン（実施例１）（２０ｍｇ、０.０６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２５μｌ、０.２７ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でチオール（０.０５ｍｌ）を加えた。１時間攪拌後、混合物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサンのみ−ヘキサン／酢酸エチル＝３／１−１／１）で精製すると、目的物を得、これをヘキサンで洗浄すると、白色固体（１０ｍｇ、３７％）を得た。
融点：８２℃；
ＬＣＭＳ（４分の方法）：Ｒｔ＝２.３８分、ｍ／ｚ＝４５５（Ｍ＋Ｈ）＋；
１H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ =0.86 (3H, t, J = 6.8 Hz), 1.09 (1H, m), 1.44 (3H, s), 1.19-1.55 (11H, m), 1.62 (2H, m), 1.79 (3H, m), 1.85 (2H, m), 2.13 (1H, m), 2.44 (1H, m), 2.82 (2H, m), 3.13 (2H, m), 3.79 (1H, t, J = 7.0 Hz), 4.76 (1H, s), 5.02 (1H, d, J = 7.6 Hz), 5.63 (1H, m), 5.79 (1H, d, J = 10.1 Hz), 7.93 (1H, m), 8.18 (1H, s）.
【０１３６】
実施例１２
３−［２−（シクロヘキサ−２−エニル−ヒドロキシ−メチル）−４−ヘキシル−３−ヒドロキシ−３−メチル−５−オキソ−ピロリジン−２−カルボニルスルファニル］−プロピオン酸メチルエステル
【化４０】
0004795931.tif 000051
ジクロロメタン（１ｍｌ）中の１−（シクロヘキサ−２−エニル−ヒドロキシ−メチル）−４−ヘキシル−５−メチル−６−オキサ−２−アザ−ビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン（実施例１）（２０ｍｇ、０.０６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２５μｌ、０.１８ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でチオール（０.０５ｍｌ）を加えた。４時間攪拌後、混合物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサンのみ−ヘキサン／酢酸エチル＝３／１−１／１）で精製すると、目的物を得、これをヘキサンで洗浄すると、白色固体（１０ｍｇ、３７％）を得た。
融点：６４℃；
ＬＣＭＳ（４分の方法）：Ｒｔ＝２.６４分、ｍ／ｚ＝４５６（Ｍ＋Ｈ）＋；
１H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.86 (3H, t, J = 6.9 Hz), 1.09 (1H, m), 1.43 (3H, s), 1.15-1.54 (11H, m） 1.61 (2H, m), 1.86 (2H, m), 2.12 (1H, m), 2.44 (1H, t, J = 5.9 Hz), 2.56 (2H, t, J = 6.8 Hz), 2.95 (2H, t, J = 7.1 Hz), 3.60 (3H, s), 3.77 (1H, t, J = 7.1 Hz), 4.76 (1H, s), 5.01 (1H, d, J = 7.7 Hz), 5.63 (1H, m), 5.78 (1H, d, J = 11.9 Hz), 8.18 (1H, s）.
【０１３７】
実施例１３
２−（シクロヘキサ−２−エニル−ヒドロキシ−メチル）−４−ヘキシル−３−ヒドロキシ−３−メチル−５−オキソ−ピロリジン−２−チオカルボン酸Ｓ−シクロヘキシルエステル
【化４１】
0004795931.tif 000052
ジクロロメタン（１ｍｌ）中の１−（シクロヘキサ−２−エニル−ヒドロキシ−メチル）−４−ヘキシル−５−メチル−６−オキサ−２−アザ−ビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン（実施例１）（２０ｍｇ、０.０６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（８３μｌ、０.６ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でチオール（０.１ｍｌ）を加えた。４０時間攪拌後、混合物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサンのみ−ヘキサン／酢酸エチル＝３／１−１／１）で精製すると、目的物を得、これをヘキサンで洗浄すると、白色固体（１６ｍｇ、５９％）を得た。
融点：８５℃；
ＬＣＭＳ（４分の方法）：Ｒｔ＝３.０４分、ｍ／ｚ＝４５２（Ｍ＋Ｈ）＋；
１H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.86 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.43 (3H, s), 1.09-1.56 (18H, m), 1.56-1.73 (4H, m), 1.74-1.89 (4H, m), 2.15 (1H, m), 2.42 (1H, m), 3.36 (1H, m), 3.79 (1H, t, J = 6.6 Hz), 4.69 (1H, s), 4.94 (1H, d, J = 7.6 Hz), 5.64 (1H, m), 5.78 (1H,d, J = 10.1 Hz), 8.02 (1H, s）.
【０１３８】
実施例１４
２−（シクロヘキサ−２−エニル−ヒドロキシ−メチル）−３−ヒドロキシ−４−（１−ヒドロキシ−ヘキシル）−３−メチル−５−オキソ−ピロリジン−２−チオカルボン酸Ｓ−ベンジルエステル
【化４２】
0004795931.tif 000053
ジクロロメタン（２ｍｌ）中の１−（シクロヘキサ−２−エニル−ヒドロキシ−メチル）−４−（１−ヒドロキシ−ヘキシル）−５−メチル-６−オキサ−２−アザ−ビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン（実施例２）（３０ｍｇ、０.０９ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（３６μｌ、０.２６ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でベンジルヒドロスルフィド（benzyl hydrosulfide）（０.０５ｍｌ）を加えた。４時間攪拌後、混合物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサンのみ−ヘキサン／酢酸エチル＝３／１−１／１）で精製すると、目的物を得、これをヘキサンで洗浄すると、白色固体（１７ｍｇ、４１％）を得た。
融点：１２３℃；
ＬＣＭＳ（４分の方法）：Ｒｔ＝２.８４分、ｍ／ｚ＝４７６（Ｍ＋Ｈ）＋；
１H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.87 (3H, t, J = 7.0 Hz), 0.94 (1H, m), 1.49 (3H, s), 1.14-1.56 (9H, m), 1.71 (2H, m), 1.81 (2H, m), 2.08 (1H, m), 2.48 (1H, m), 3.77 (1H, t, J = 7.3 Hz), 3.82 (1H, m), 4.01 (1H, d, J = 13.8 Hz), 4.11 (1H, d, J = 13.9 Hz), 5.11 (1H, d, J = 7.3 Hz), 5.20 (1H, d, J = 2.9 Hz), 5.48 (1H, s), 5.61 (1H, m), 5.75 (1H, d, J =10.7 Hz), 7.17-7.32 (5H, m), 8.45 (1H, s）.
【０１３９】
実施例１５
２−（シクロヘキサ−２−エニル−ヒドロキシ−メチル）−３−ヒドロキシ−４−（１−ヒドロキシ−ヘキシル）−３−メチル−５−オキソ−ピロリジン−２−チオカルボン酸Ｓ−（２−アセチルアミノ−エチル）エステル
【化４３】
0004795931.tif 000054
ジクロロメタン（２ｍｌ）中の１−（シクロヘキサ−２−エニル−ヒドロキシ−メチル）−４−（１−ヒドロキシ−ヘキシル）−５−メチル−６−オキサ−２−アザ−ビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン（実施例２）（３０ｍｇ、０.０９ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（３６μｌ、０.２６ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でチオール（０.０５ｍｌ）を加えた。１時間攪拌後、混合物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサンのみ−ヘキサン／酢酸エチル＝３／１−１／１）で精製すると、目的物を得、これをヘキサンで洗浄すると、白色固体（２５ｍｇ、６２％）を得た。
融点：８０℃；
ＬＣＭＳ（４分の方法）：Ｒｔ＝２.１９分、ｍ／ｚ＝４７１（Ｍ＋Ｈ）＋；
１H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.87 (3H, t, J = 6.3 Hz), 1.48 (3H, s), 1.01-1.75 (12H, m), 1.79 (3H, s), 1.87 (2H, m), 2.14 (1H, m), 2.48 (1H, m), 2.84 (2H, t, J = 7.0 Hz), 3.13 (2H, m), 3.77 (1H, t, J = 7.0 Hz), 3.82 (1H, m), 5.11 (1H, d, J = 7.3 Hz), 5.19 (1H, m), 5.41 (1H, s), 5.64 (1H, m), 5.77 (1H, d, J = 10.1 Hz), 7.93 (1H, m), 8.49 (1H, s）.
【０１４０】
実施例１６
［２−（シクロヘキサ−２−エニル−ヒドロキシ−メチル）−３−ヒドロキシ−４−（１−ヒドロキシ−ヘキシル）−３−メチル−５−オキソ−ピロリジン−２−カルボニルスルファニル］−酢酸メチルエステル
【化４４】
0004795931.tif 000055
ＴＨＦ（３ｍｌ）中の２−（シクロヘキサ−２−エニル−ヒドロキシ−メチル）−３−ヒドロキシ−４−（１−ヒドロキシ−ヘキシル）−３−メチル−５−オキソ−ピロリジン−２−カルボン酸（実施例２）（５０ｍｇ、０.１４ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でトリエチルアミン（５７μｌ、０.４ｍｍｏｌ）、チオール（０.０５ｍｌ）およびＢＯＰＣｌ（５２ｍｇ、０.２ｍｍｏｌ）を加えた。３時間攪拌後、炭酸水素ナトリウム飽和溶液（１０ｍｌ）をそこに加え、次いで、有機層を酢酸エチルで抽出し、塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝３／１−１／1）によって精製すると、目的物（２１ｍｇ、３４％）が得られた。
融点：７５℃；
ＬＣＭＳ（４分の方法）：Ｒｔ＝２.４６分、ｍ／ｚ＝４５８（Ｍ＋Ｈ）＋；
１H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.86 (3H, t, J = 6.9 Hz), 1.02 (1H, m), 1.19-1.39 (7H, m), 1.46 (3H, s), 1.56-1.76 (4H, m), 1.86 (2H, m), 2.17 (1H, m), 2.48 (1H, m), 3.61 (3H, s), 3.68 (2H, s), 3.74 (1H, t, J = 7.2 Hz), 3.80 (1H, m), 5.13 (1H, d, J = 7.3 Hz), 5.17 (1H, d, J = 2.8 Hz), 5.45 (1H, s), 5.64 (1H, m), 5.78 (1H, d, J = 10.4 Hz), 8.57 (1H, s）.
【０１４１】
実施例１７
２−（シクロヘキシル−ヒドロキシ−メチル）−４−ヘキシル−３−ヒドロキシ−３−メチル−５−オキソ−ピロリジン−２−チオカルボン酸Ｓ−ベンジルエステル
【化４５】
0004795931.tif 000056
ジクロロメタン（２ｍｌ）中の１−（シクロヘキシル−ヒドロキシ−メチル）−４−ヘキシル−５−メチル−６−オキサ−２−アザ−ビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン（実施例８）（２０ｍｇ、０.０６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２５μｌ、０.１８ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でベンジルヒドロスルフィド（０.０５ｍｌ）を加えた。１８時間攪拌後、混合物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサンのみ−ヘキサン／酢酸エチル＝３／１−１／１）で精製すると、目的物を得、これをヘキサンで洗浄すると、白色固体（１５ｍｇ、５５％）を得た。
融点：１８１℃；
ＬＣＭＳ（４分の方法）：Ｒｔ＝２.８９分、ｍ／ｚ＝４６２（Ｍ＋Ｈ）＋；
１H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.86 (3H, t, J = 7.0 Hz), 0.87-1.05 (4H, m), 1.20-1.50 (15H, m), 1.45 (3H, s), 1.56 (1H, m), 1.79 (1H, m), 2.42 (1H, t, J = 6.3 Hz), 3.75 (1H, dd, J = 5.4, 7.0 Hz), 4.00 (1H, d, J = 13.9 Hz), 4.10 (1H, d, J = 13.9 Hz), 4.79-7.83 (2H, m), 7.20-7.30 (5H, m), 7.85 (1H, s）.
【０１４２】
実施例１８
３−［２−（シクロヘキシル−ヒドロキシ−メチル）−４−ヘキシル−３−ヒドロキシ−３−メチル−５−オキソ−ピロリジン−２−カルボニルスルファニル］−プロピオン酸メチルエステル
【化４６】
0004795931.tif 000057
ジクロロメタン（１ｍｌ）中の１−（シクロヘキシル−ヒドロキシ−メチル）−４−ヘキシル−５−メチル-６−オキサ−２−アザ−ビシクロ［３.２.０］ヘプタン−３,７−ジオン（実施例８）（２０ｍｇ、０.０６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２５μｌ、０.１８ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でチオール（０.０５ｍｌ）を加えた。１８時間攪拌後、混合物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサンのみ−ヘキサン／酢酸エチル＝３／１−１／１）で精製すると、目的物を得、これをヘキサンで洗浄すると、白色固体（１４ｍｇ、５２％）を得た。
融点：１３２℃；
ＬＣＭＳ（４分の方法）：Ｒｔ＝２.６６分、ｍ／ｚ＝４５８（Ｍ＋Ｈ）＋；
１H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.86 (3H, t, J = 6.9 Hz), 1.43 (3H, s), 0.85-1.90 (21H, m), 2.41 (1H, m), 2.55 (2H, m), 2.96 (2H, m), 3.23 (3H, s), 3.73 (1H, t, J = 5.6 Hz), 4.73 (1H, s), 4.83 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.95 (1H, s）.
【０１４３】
Ｂ．生理学的活性の評価
本発明による化合物のインビトロでの効果を次のアッセイで示すことができる：
ＨＴＳアッセイ
試験化合物を１５０μＭのＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡを含んでいる５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.００５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０.０７５％ＳＤＳで６倍に希釈する。
【０１４４】
１５３６ウエル黒色プレートの各ウエルに、２μｌの希釈化合物溶液をピペットで加え、次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、０.５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.００５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に溶解されている３μｌの０.５μｇ／ｍｌ２０Ｓプロテアソーム（哺乳類、AFFINITI, Exeter, U. K.）を加える。室温での１時間のインキュベーションの後、反応を１３μＭ Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈ ３μｌを加えることによって終了させ、次に、蛍光強度をλｅｘ ３５５ｎｍおよびλｅｍ ４６０ｎｍで ARVO 多標識カウンター（Perkin Elmer、東京、日本）を使用して測定する。
【０１４５】
プロテアソーム阻害アッセイ
試験化合物を、ポリプロピレン９６ウエルプレートにおいて２.５％ＤＭＳＯ中で種々の濃度に希釈する。内部コントロールとして、ＭＧ−１３２（Cat.#3175-v；ペプチド研究所；大阪；日本）を、試験化合物についてと同じ手順を用いて希釈する。希釈ワーキング溶液（１０μｌ／ウエル）をポリプロピレン９６ウエルプレートに移す。アッセイバッファーは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.００５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０.００５％ＳＤＳからなり、ストック溶液として１０×濃度に調製される。ペプチド基質（Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ；3120v；ペプチド研究所；大阪；日本）は、１００％ＤＭＳＯ内で１０ｍＭで保存される。このペプチド基質を１.２５×濃度のアッセイバッファー中で１２５μＭに希釈し、この基質溶液４０μｌを化合物溶液に加える。この化合物と基質を室温で１０分間プリインキュベートする。次いで、化合物と基質の混合物（１０μｌ／ウエル）を黒色非被覆３８４ウエルアッセイプレート（Nunc）に移し、自己蛍光放出を４６０ｎｍ（λｅｘ、３６０ｎｍ）で ARVO 蛍光プレートリーダー（Perkin Elmer、東京、日本）を使用して測定する。
【０１４６】
ヒト赤血球Ｓ２０プロテアソームを Affinity research products Ltd (Cat# PW8720; Exeter, UK) から得て、−８０℃で保存する。このプロテアソームを１×濃度のアッセイバッファーで１／１０００に希釈し、１０μｌをプレート内で基質および阻害剤混合物に加える。タンパク質分解反応は、室温で行われる。蛍光放出を９０分間、連続的に測定する。化合物のＩＣ５０値は、反応初期速度で決定される。表Ａに抜粋データを示す。
【０１４７】
表Ａ
【表１１】
0004795931.tif 000058
【０１４８】
キモトリプシンアッセイ
試験化合物をポリプロピレン９６ウエルプレート内で２.５％ＤＭＳＯ中で種々の濃度に希釈する。内部コントロールとして、キモスタチン（Cat.#4063, ペプチド研究所；大阪；日本）を、試験化合物についてと同じ手順を用いて希釈する。希釈ワーキング溶液（１０μｌ／ウエル）をポリプロピレン９６ウエルプレートに移す。アッセイバッファーは、５０ｍＭ ＴＥＳ（ｐＨ８.０）、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０.１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡからなり、ストック溶液として１０×濃度に調製される。ペプチド基質（Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ；3120v；ペプチド研究所；大阪；日本）は、１００％ＤＭＳＯ中、１０ｍＭで保存される。このペプチド基質を１.２５×濃度のアッセイバッファー中で５０μＭに希釈し、この基質溶液４０μｌを化合物溶液に加える。この化合物と基質を室温で１０分間予めインキュベートする。次いで、化合物と基質の混合物（１０μｌ／ウエル）を黒色非被覆３８４ウエルアッセイプレート（Nunc）に移し、自己蛍光放出を４６０ｎｍ（λｅｘ、３６０ｎｍ）で ARVO 蛍光プレートリーダー（Perkin Elmer、東京、日本）を使用して測定する。
【０１４９】
ヒトキモトリプシンを Calbiochem (Cat.# 230900) から得て、−２０℃で保存されている５０％グリセロール中で０.５ｍｇ／ｍｌに希釈する。このキモトリプシンストック溶液を１×濃度のアッセイバッファー中で１８ｎｇ／ｍｌに希釈し、１０μｌをプレート内で基質および阻害剤混合物に加える。タンパク質分解反応は、室温で行われる。蛍光放出を６０分間、連続的に測定する。化合物のＩＣ５０値は、反応初期速度で決定される。
【０１５０】
トリプシンアッセイ
試験化合物をポリプロピレン９６ウエルプレート内で、２.５％ＤＭＳＯ中、種々の濃度に希釈する。内部コントロールとして、ロイペプチン（Cat.# 4041-v；ペプチド研究所；大阪；日本）を、試験化合物についてと同じ手順を用いて希釈する。希釈ワーキング溶液（１０μｌ／ウエル）をポリプロピレン９６ウエルプレートに移す。アッセイバッファーは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０.１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ ５０ｍＭからなり、ストック溶液として１０×濃度に調製される。ペプチド基質（Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡ；3135-v ペプチド研究所；大阪；日本）は、１００％ＤＭＳＯ中、１ｍＭで保存される。このペプチド基質を１.２５×濃度のアッセイバッファー中で１５μＭに希釈し、この基質溶液４０μｌを化合物溶液に加える。この化合物と基質を室温で１０分間予めインキュベートする。次いで、化合物と基質の混合物（１０μｌ／ウエル）を黒色非被覆３８４ウエルアッセイプレート（Nunc）に移し、自己蛍光放出を４６０ｎｍ（λｅｘ、３６０ｎｍ）で ARVO 蛍光プレートリーダー（Perkin Elmer、東京、日本）を使用して測定する。
【０１５１】
トリプシンを Calbiochem から得て、１ｍＭ ＨＣｌ中で１ｍｇ／ｍｌに希釈し、−２０℃で保存する。このトリプシンストック溶液を１×濃度のアッセイバッファー中で１ｎｇ／ｍｌに希釈し、１０μｌをプレート内で基質および阻害混合物に加える。タンパク質分解反応は、室温で行われる。蛍光放出を６０分間、連続的に測定する。化合物のＩＣ５０値は、反応初期速度で決定される。
【０１５２】
Ａ５４９細胞におけるＴＮＦαによって誘発されるＲＡＮＴＥＳ産生
Ａ５４９ヒト肺上皮細胞株（ATCC #CCL-885）を、１０％ＦＣＳ（Gibco）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｍＭグルタミンを補充したダルベッコ変法イーグル培地（D-MEM, Nikken Biomedical Institute）中で維持する。Ａ５４９細胞（８０μｌ／ウエル内で４×１０４細胞）を、９６ウエル平底組織培養プレート内で１時間、溶剤（０.１％ＤＭＳＯ）または試験化合物で処理する。次いで、細胞を１００ｎｇ／ｍｌＴＮＦ−αで２４時間刺激する。２４時間後に回収される上清のＲＡＮＴＥＳの濃度を、製造業者の推奨（R&D Systems, Oxon, UK）に従って、定量的サンドイッチ蛍光免疫アッセイ技法を用いて決定する。
【０１５３】
Ａ５４９細胞におけるＴＮＦαによって誘発されるＩκＢα分解
６ウエルプレート内で増殖しているサブコンフルエントなＡ５４９細胞を３７℃で３０分間、様々な濃度の阻害剤または溶剤（vehicle）（０.１％ＤＭＳＯ）で前処理する。次いで、細胞を処理せずにおくか、または１０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ−αで所定の時間刺激する。この細胞を冷却したＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌ ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーによって氷上で溶解する。細胞溶解物を少しの間超音波処理し、遠心分離し、次に、抗ＩκＢα（New England Biolabs #9242）を製造業者の推奨に従って用いて、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析に付す。
【０１５４】
ＭＤＡ ＭＢ２３１およびＨ４６０腫瘍細胞増殖の阻害
１０％ウシ胎児血清を含んでいる完全培地にウエルあたり３０００細胞で、９６ウエルアッセイプレート内に細胞（３０００）を播き、３７℃で２４時間インキュベートする。播いた後２４時間たってから、化合物を、ＤＭＳＯの最終濃度は０.１％として、最終濃度範囲が１０μＭから１０ｎＭまでで連続的に希釈して、加える。細胞は、化合物添加後、完全増殖培地中、３７℃で７２時間インキュベートする。Promega Cell TiterGlo ATP Luminescent アッセイキット (Promega Corp）を使用して、細胞数の間接的測定としての細胞ＡＴＰ量に基づいて、ウエルあたりの生存細胞の数を発光シグナルの測定によって決定する。試験化合物とのインキュベーション後７２時間たってから読み取られた値は、０日の値から差し引かれる。ＩＣ５０値は、Analyze 5 プログラムで決定される。
細胞型にわたる平均シグナル／ノイズ比＝３〜５倍。
【０１５５】
Ｃ．医薬組成物に関する適切な例
本発明による化合物は、次のように医薬製剤に変換することができる：
錠剤
組成
実施例１の化合物１００ｍｇ、乳糖（一水和物）５０ｍｇ、トウモロコシ澱粉（天然）５０ｍｇ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ２５）（BASF, Ludwigshafen, Germany）１０ｍｇおよびステアリン酸マグネシウム２ｍｇ。
錠剤重量２１２ｍｇ、直径８ｍｍ、曲率半径１２ｍｍ。
製造
活性成分、乳糖および澱粉の混合物を、水に溶かした５％ＰＶＰ溶液（ｍ／ｍ）で顆粒化する。顆粒を、乾燥し、次いで、５分間、ステアリン酸マグネシウムと混合する。この混合物を、慣用の錠剤圧縮機で、成型する（錠剤のフォーマット：上記参照）。適用される成型力（moulding force）は、標準的には１５ｋＮである。
【０１５６】
経口投与用懸濁液
組成
実施例１の化合物１０００ｍｇ、エタノール（９６％）１０００ｍｇ、Rhodigel（ＦＭＣ、ペンシルバニア、ＵＳＡのキサンタンゴム）４００ｍｇおよび水９９ｇ。
本発明による化合物の単回服用容量である１００ｍｇは、経口用懸濁液１０ｍｌによって提供される。
製造
Rhodigel をエタノール中で懸濁し、そして、活性成分を懸濁液に加える。水を攪拌しながら加える。ロジゲルが完全に膨潤するまで、約６時間攪拌を継続する。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】図１は、３０リットルスケールでの菌株ＪＳ３６０の醗酵時間の経過を示す。
【図２】図２は、３０リットルスケールでの菌株ＪＳ３６０の醗酵の粗抽出物からの実施例１〜７の単離スキームを示す。
【図３】図３は、分取ＨＰＬＣ後の実施例１のＨＰＬＣクロマトグラム、ＨＰＬＣ−ＵＶおよびＨＰＬＣ−ＥＳＩ ＬＣ−ＭＳスペクトルを示す。
【図４】図４は、実施例１のプロトンスペクトルを示す。
【図５】図５は、配列番号１：部分的１６Ｓ ｒＤＮＡ、菌株ＪＳ３６０／ＤＳＭ １５３２４の部分配列を示す。
【図６】図６は、サリノスポラｓｐ.およびＪＳ３６０の関係を示す樹状図である。
【図７】図７は、水素原子以外を番号付与した、実施例１のオルテップ−プロット（５０％）を示す。
【図８】図８は、極性および非極性層を示しているａおよびｃ軸に沿って見た実施例１の結晶充填を示す。
【図１】
0004795931.tif 000081
【図２】
0004795931.tif 000082
【図３】
0004795931.tif 000083
【図４】
0004795931.tif 000084
【図５】
0004795931.tif 000085
【図６】
0004795931.tif 000086
【図７】
0004795931.tif 000087
【図８】
0004795931.tif 000088
【配列表】
0004795931000001.app