(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜３のいずれかの配列からなるペプチド
【請求項２】
配列番号１〜３のいずれかの配列からなるペプチドを提示した抗原提示細胞。
【請求項３】
配列番号１〜３のアミノ酸配列からなるペプチド群から選択される一つ以上のペプチドを含有する癌ワクチン。
【請求項４】
配列番号１〜３のいずれかの配列からなるペプチドを提示した抗原提示細胞を含有する癌ワクチン。
【請求項５】
配列番号１〜３のいずれかの配列からなるペプチドを提示した抗原提示細胞によって誘導され、ＳＯＸ６を発現する細胞を認識するＴ細胞を含有する癌ワクチン。
【請求項６】
ＳＯＸ６を発現する癌細胞に対する癌ワクチンであることを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の癌ワクチン。
【請求項７】
グリオーマに対する癌ワクチンであることを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の癌ワクチン。
【請求項８】
肝癌、肺癌、膵癌、食道癌、メラノーマ、前立腺癌、乳癌、腎癌、または白血病に対する癌ワクチンであることを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の癌ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、腫瘍免疫学において、免疫細胞による腫瘍抗原認識機構がかなり解明されてきた。それによると、まず、抗原提示細胞である樹状細胞（dendritic cells または ＤＣ）は、細胞内で、腫瘍が発現するタンパク質を分解する際に生じた８〜１０個のアミノ酸からなる抗原ペプチドを、主要組織適合性抗原複合体（major histocompatibility complex または ＭＨＣ；ヒトでは、human leukocyte antigen または ＨＬＡ）と共に細胞表面に提示する。細胞障害性Ｔ細胞（cytotoxic T lymphocyte または ＣＴＬ）は、樹状細胞表面のＨＬＡクラスＩに結合した抗原ペプチドを認識し、活性化・増殖し、腫瘍内に侵入し、抗原ペプチドが由来するタンパク質を有する腫瘍細胞に対し細胞障害を生じる（ Arch.Surg. (1990) 126: 200〜205 ）。【０００３】
この機構を利用して、腫瘍の治療方法として癌ワクチンが開発されてきた。例えば、腫瘍特異的タンパク質由来の抗原ペプチドを細胞表面に提示する樹状細胞をin vitroで作製し、増殖させ、腫瘍患者に投与したり、その樹状細胞によって教育された細胞障害性Ｔ細胞を投与したりすることにより、腫瘍患者の体内で腫瘍免疫を誘導させる。あるいは、腫瘍特異的タンパク質を腫瘍患者に投与し、患者の体内で、腫瘍免疫機構の全過程を誘導させるのである（ Science (1991) 254: 1643−1647; Exp.Med. (1996) 183: 1185−1192; J.Immunol. (1999) 163: 4994−5004; Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1995) 92: 432−436; Science (1995) 269: 1281−1284; J.Exp.Med. (1997) 186: 785−793）。【０００４】
メラノーマ特異的腫瘍抗原については臨床試験における成果が報告されている。例えば、メラノーマ抗原ｇｐ１００ペプチドをメラノーマ患者に皮下投与し、インターロイキン−２を静脈内投与することにより、４２％の患者で腫瘍の縮小が認められている（Nature Medicine (1998) 4: 321）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、腫瘍免疫を効率的に誘導することのできる腫瘍特異的タンパク質は、一部の腫瘍において、ほんの少数の例が知られているだけである。【０００６】
そこで、本発明は、腫瘍免疫を効率的に誘導できるペプチド、そのペプチドを含有する組成物、そのペプチドを提示した抗原提示細胞、この抗原提示細胞によって刺激されたＴ細胞、およびこれらのペプチドや細胞を利用した癌ワクチン、及びそれらを用いた腫瘍患者の治療方法を提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、転写因子であるＳＯＸ６が、グリオーマに発現していることを既に見いだしていたが（Ueda et al., Oncogene 23, 1420-1427, 2004）、他の腫瘍においても発現していることを見出した（実施例２参照）。この知見に基づき、ＳＯＸ６の様々な部分ペプチドに対し、ＨＬＡクラスＩ拘束性に細胞障害性Ｔ細胞に認識されるかどうか調べたところ、樹状細胞に添加したとき、効率よく細胞障害性Ｔ細胞によって認識されるいくつかの部分ペプチドを同定することができ、本発明の完成に至った。【０００８】
本発明にかかるペプチドは、配列番号１〜３のいずれかの配列を有する。これらのペプチドを提示した抗原提示細胞、及びこの抗原提示細胞によって誘導され、ＳＯＸ６を発現する細胞を認識するＴ細胞も、本発明の技術的範囲に属する。このＴ細胞は細胞障害性Ｔ細胞であることが好ましく、ＳＯＸ６を発現する細胞は、グリオーマ、肝癌細胞、肺癌細胞、膵癌細胞、食道癌細胞、メラノーマ細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、腎癌細胞、または白血病細胞であることが好ましい。【０００９】
さらに、本発明にかかる癌ワクチンは、配列番号１〜３から選択される一つ以上のペプチド、上記抗原提示細胞、上記Ｔ細胞のうち、少なくとも一つを含有する。この癌ワクチンは、ＳＯＸ６を発現する癌細胞に対する癌ワクチンであり、特に細胞グリオーマ、肝癌、肺癌、膵癌、食道癌、メラノーマ、前立腺癌、乳癌、腎癌、または白血病に対する癌ワクチンであることが好ましい。【００１０】
本発明にかかる腫瘍治療方法は、ヒト及びヒト以外の脊椎動物に対しこの癌ワクチンを用いることを特徴とする。【００１１】
−関連文献とのクロスリファレンス−
なお、本出願は、２００５年１月１９日出願の日本国出願番号特願２００５−１２０９２の優先権の利益を主張し、これを引用することにより本明細書に含める。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明における実施例において、ＨＬＡ−Ａ２４と結合することが予想されたＳＯＸ６由来のペプチドを添加された樹状細胞との共培養により誘導された細胞障害性Ｔ細胞（エフェクター細胞）を、それらＨＬＡ−Ａ２４結合性のＳＯＸ６由来のペプチドを提示した樹状細胞をターゲットとして共培養した時に、放出されるIFN-γを測定した結果を表すグラフである。
【図２Ａ】本発明における実施例において、定量的ＲＴ−ＰＣＴによるＳＯＸ６の発現解析の結果を示した図である。
【図２Ｂ】本発明における実施例において、ウエスタン・ブロッティングによるＳＯＸ６の発現解析の結果を示した図である。
【図３】本発明における実施例において、ＨＬＡ−Ａ２４と結合することが予想されたＳＯＸ６由来のペプチドを添加された樹状細胞との共培養により誘導された細胞障害性Ｔ細胞（エフェクター細胞）を、ＨＬＡ−Ａ２４及びＳＯＸ６を発現するグリオーマ細胞（ＫＮＳ−８１）をターゲットとして共培養した時に、放出されるIFN-γを測定した結果を表すグラフである。
【図４】本発明における実施例において、ＨＬＡ−Ａ２４０２の健常人末梢血から単離され、ＳＯＸ６由来のペプチドＳＯＸ６−５０４及びＳＯＸ６−６２８を添加された樹状細胞との共培養により誘導された細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ：エフェクター細胞）に対し、ＣＩＲ−Ａ２４０２、ＣＩＲ−Ａ２４０２−ＳＯＸ６、Marcus、ＳＦ１２６、ＫＮＳ−４２、ＨｅｐＧ２、ＰＣ９をターゲット細胞として共培養した時に算出した、ターゲット細胞の特異的溶解率を示したグラフである。
【図５】本発明における実施例において、ＨＬＡ−Ａ２４０２のグリオーマ患者末梢血から単離され、ＳＯＸ６由来のペプチドＳＯＸ６−５０４及びＳＯＸ６−６２８を添加された樹状細胞との共培養により誘導された細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ：エフェクター細胞）に対し、ＣＩＲ−Ａ２４０２、ＣＩＲ−Ａ２４０２−ＳＯＸ６、Marcus、ＳＦ１２６、ＫＮＳ−４２をターゲット細胞として共培養した時に算出した、ターゲット細胞の特異的溶解率を示したグラフである。
【図６】本発明における実施例において、ＨＬＡ−Ａ２４０２の健常人末梢血から単離され、ＳＯＸ６由来のペプチドＳＯＸ６−５０４（Ａ）またはＳＯＸ６−６２８（Ｂ）を添加された樹状細胞との共培養により誘導された細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ：エフェクター細胞）に対し、（Ａ）Marcus、ＣＩＲ−Ａ２４０２（ＳＯＸ６−５０４）、ＣＩＲ−Ａ２４０２（ＣＭＶ）、ＣＩＲ−Ａ２４０２または（Ｂ）Marcus、ＣＩＲ−Ａ２４０２（ＳＯＸ６−６２８）、ＣＩＲ−Ａ２４０２（ＣＭＶ）、ＣＩＲ−Ａ２４０２をターゲット細胞として共培養した時に算出した、ターゲット細胞の特異的溶解率を示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。【００１４】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。【００１５】
＝＝ＨＬＡクラスＩと結合性が高いペプチドのスクリーニング＝＝
ウエブサイト上のデータベースであるBioInformatics & Molecular Analysis Section (BIMAS) のHLA Peptide Binding predictions Program を用い、ＳＯＸ６遺伝子がコードするアミノ酸配列から、ＨＬＡクラスＩと結合性が高い、９〜１０アミノ酸残基のペプチド配列を特定した。日本人のＨＬＡクラスＩのタイプは、ＨＬＡ−Ａ２とＨＬＡ−Ａ２４が多く、これらで日本人全体の約８０％をカバーする。なお、日本人に多いＨＬＡ−Ａの遺伝子型として、ＨＬＡ−Ａ２はＡ０２０１及びＡ０２０６、ＨＬＡ−Ａ２４はＡ２４０２が挙げられ、本明細書では、細胞の遺伝子型としてＡ０２０１、Ａ２４０２と記載した場合、記載したアレルを少なくとも一つ有することを意味する。【００１６】
ここでは、Ａ２４に対する結合性についてスクリーニングした。表１に、このスクリーニングによって得られたスコアの高いペプチド配列の例を示す。【００１７】
0004840866.tif 000002
【００１８】
これらのペプチドを実際に合成し、抗原として抗原提示細胞である樹状細胞表面に投与したとき、ＨＬＡクラスＩ分子に結合することにより細胞表面に提示され、細胞障害性Ｔ細胞に認識されることで特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導できるペプチドを同定するため、樹状細胞と共培養された細胞障害性Ｔ細胞のヒト・グリオーマ細胞に対する反応性を調べた。その結果、配列番号１〜３のペプチドを細胞表面に提示する樹状細胞が効率よく細胞障害性Ｔ細胞を刺激し、また各ペプチドの刺激により樹立された細胞障害性Ｔ細胞がＳＯＸ６を発現するグリオーマ細胞を効率よく認識することが明らかになった。【００１９】
以下の実施例には、これらの実験結果を示すことにより、配列番号１〜３のペプチドを抗原提示細胞に添加すると、それらのペプチドがＨＬＡ上に提示され、共培養したＴ細胞を刺激することにより抗原特異的なＴ細胞を誘導し、この抗原特異的なＴ細胞はＳＯＸ６を発現するグリオーマ細胞と反応するか、またはＳＯＸ６を発現する細胞に対し細胞障害性を有することを示す。このことから、配列番号１〜３のペプチド、そのペプチドを細胞表面に提示した抗原提示細胞、及びその抗原提示細胞の刺激によって樹立された細胞障害性Ｔ細胞は、グリオーマに対する癌ワクチンとして有用であることがわかる。【００２０】
＝＝癌ワクチンの投与方法＝＝
現在、癌ワクチンとして、腫瘍特異的癌抗原、癌抗原提示抗原提示細胞、または癌抗原反応性細胞障害性Ｔ細胞を腫瘍患者に投与する方法が開発されている。本発明においては、ＳＯＸ６の部分ペプチドを用いているので、治療（予防も含まれる）対象となる腫瘍は、ＳＯＸ６が発現している腫瘍であれば何でもよく、特にＳＯＸ６を高レベルに発現しているグリオーマ、肝癌、肺癌、膵癌、食道癌、メラノーマ、前立腺癌、乳癌、腎癌、または白血病も治療対象の一つとなる。主な治療対象は、こうした腫瘍を有するヒト患者であるが、腫瘍を有するヒト以外の脊椎動物でもかまわない。【００２１】
治療対象となる腫瘍を有する患者に対し投与する癌ワクチンは、腫瘍特異的癌抗原となりうる配列番号１〜３をもつペプチドを含有してもよい。この場合、あらかじめ患者のＨＬＡクラスＩのタイプを調べ、それに適したペプチドを用いる。ここでは、患者のＨＬＡクラスＩタイプがＡ２４である場合に、配列番号１〜３のペプチドを投与する。投与するペプチドは、一種類であっても複数種類であってもよい。投与部位に関しては、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、腹腔内投与などが考えられ、特に限定されることはない。また、投与する際には、免疫誘導能を高めるアジュバントなどとともにペプチドを投与してもよい。また、投与されるペプチドは、生体内で分解されにくくするような修飾が施されていてもよい。【００２２】
また、上記癌ワクチンは、配列番号１〜３を有するペプチドを提示した抗原提示細胞を含有してもよい。ここで、細胞表面に提示されているペプチドは、配列番号１〜３を有するペプチドそのものでもよく、糖やリン酸などで修飾されてもよい。抗原提示細胞としては、樹状細胞の他にマクロファージ、Ｂ細胞等が考えられるが、抗原提示能の高さなどから、樹状細胞が好ましい。以下、樹状細胞の単離方法の例を記述する。【００２３】
まず、脊椎動物個体の末梢血から単核球を単離する。この単核球は、治療対象となる個体自身から分離することが好ましいが、他の個体から単離してもよい。また、この単核球はＣＤ１４陽性であることが好ましい。単離した単核球を、GM-CSF とIL-4 で7 日前後培養すると、未熟な樹状細胞に分化誘導することができる。このようにして分化誘導された樹状細胞は、抗原提示分子であるＭＨＣ分子を高発現している。この未熟な樹状細胞のＨＬＡクラスＩタイプを調べ、Ａ２４である場合は、配列番号１〜３のペプチドを添加する。添加するのは、人工合成ペプチドに限らず、ペプチドを発現させた細胞の抽出物（extractやlysate）や精製物などでもよい。こうして得られた抗原提示樹状細胞を、腫瘍を有する個体に投与する。投与部位に関しては、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、リンパ節内投与などが考えられ、特に限定されることはないが、生理的な樹状細胞の抗原提示が、樹状細胞投与部位の所属リンパ節にて行なわれることを考えると、リンパ節内への直接投与が好ましい。【００２４】
また、上記癌ワクチンは、配列番号１〜３由来のペプチドを提示した抗原提示細胞の刺激によって樹立されたＴ細胞を含有してもよい。配列番号１〜３由来のペプチドを提示した抗原提示細胞に対し、Ｔ細胞を共培養し、抗原提示細胞で刺激する。このようにして樹立されたＴ細胞を腫瘍を有する個体に投与してもよい。ここでのＴ細胞は、細胞障害性Ｔ細胞が好ましいが、ヘルパーＴ細胞等でもよい。投与部位に関しては、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、腫瘍内投与などが考えられ、特に限定されることはないが、細胞障害性Ｔ細胞の場合、抗原を発現する細胞を直接攻撃できるため、腫瘍内投与が好ましい。
【実施例】
【００２５】
＜実施例１＞抗原を提示した樹状細胞による細胞障害性Ｔ細胞の活性化
＝＝実験初日＝＝
ＨＬＡクラス１のタイプがＡ２４（遺伝子型はＡ２４０２）の健常人末梢血から、以下のように単核球を分離した。まず、ヘパリン５ｍｌで洗浄したシリンジで、末梢血を５０ｍｌ採血した。等量のLymphoprep (Fresenius kabi Norge AS, Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway) を転倒混和し、遠心（20℃、2000 rpm、35分間 、ブレーキなし）し、中間層を吸引して採取した。これにＰＢＳを加えて再混濁し、遠心（20℃、2000 rpm、10分間）する操作を３回繰り返して、得られた単核球を洗浄した。【００２６】
この単核球を初代細胞培養用培養皿(FALCON MULTIWELL PRIMARIA 24 well)に５ｘ１０６個/ウエルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で４時間培養した。培養液はAIM-V(GIBCO)とRPMI-1640を1:1に混合したもの（基本培養液）を用いた。培養皿の底面に接着した細胞を回収し、４ｘ１０５個/ウエルの密度で新しい２４ウエルの培養皿に播種し、GM-CSF(10ng/ml), IL-4(1ng/ml)添加した基本培養液を用いて、３７℃、５％ＣＯ２存在下で７日間培養し、樹状細胞を分化させた。【００２７】
＝＝実験７日目＝＝
培養７日目に分化した樹状細胞を抗原提示細胞（antigen presenting cells;ＡＰＣｓ）として用いた。得られた樹状細胞をirradiate (60Gy)したのち、合成・精製したペプチド(配列番号１〜３及び５のＳＯＸ６由来のペプチド)を１０μＭ添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２時間培養して細胞に結合させ、ＰＢＳで２回洗浄し、刺激細胞（stimulator cells）とした。なお、コントロールとして、ＳＯＸ６由来のペプチドのかわりにサイトメガロウィルス(ＣＭＶ)由来のペプチド（配列番号４：ＱＹＤＰＶＡＡＬＦＦ、Provenzano et al., Transfusion 43, pp1567-1574参照）を用いた実験を行った。【００２８】
一方、この日（培養７日目当日）、実験１５日目に樹状細胞を得るために、初日と同じ操作で単核球を培養した。【００２９】
その過程で、単核球を４時間培養後、培養皿に接着せず、培養上清に浮遊している細胞を回収し、１ｘ１０７個の細胞に対しIMag anti-human CD8 particules -DM (BD Biosciences社)１００μlを、４℃、３０分間反応させた。磁石を用いてＣＤ８陽性細胞を吸着・回収し、応答細胞（responder cells）とした。【００３０】
このようにして得られた応答細胞２ｘ１０５個を、上記刺激細胞のウエルに添加し、共培養した。なお、培養液として、IL-1α(10 unit/ml), IL-2(20 unit/ml), IL-4(1 ng/ml), IL-6(125 unit/ml), IL-12(1 ng/ml)を添加した基本培養液を用いた。【００３１】
＝＝実験１５日目＝＝
培養７日目から培養し、分化させた樹状細胞を用いて、上記と同様の操作で刺激細胞を調整した。  
また、培養７日目より刺激細胞と共培養した応答細胞を回収し、新たに調整した刺激細胞と、同様に共培養した。ただし、培養液は培養７日目に用いた上記培養液においてＩＬ−１２を含まない培養液を用いた。  
なお、実験２２日目に樹状細胞を得るための単核球の培養を、同様にして、新たに始めておいた。【００３２】
＝＝実験２２日目＝＝
実験１５日目と同様に、刺激細胞と共培養を続けている応答細胞を回収し、新たに調整した刺激細胞と共培養した。  
なお、樹状細胞を得るための単核球の培養を始めたが、２４ウエルの培養皿ではなく、９６ウエルの培養皿を用い、４ｘ１０４個／ウエルに調整して播種し、培養した。【００３３】
＝＝実験２９日目＝＝
９６ウエルで培養した単核球を用いて分化誘導した樹状細胞に、０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭの各濃度のＳＯＸ６由来のペプチドあるいは０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭの各濃度のＣＭＶ由来のペプチドを添加して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２時間培養して細胞に結合させ、ＰＢＳで２回洗浄し、ターゲット細胞として用いた。  
共培養を続けている応答細胞を回収し、エフェクター細胞として２ｘ１０４個に調整した細胞を、こうして新たに調整したターゲット細胞のウエルに添加し、共培養した。【００３４】
＝＝実験３１日目＝＝
上記共培養から培養上清を回収し、以下のようにIFN-γELISAを行った。【００３５】
前日に、一次抗体(anti-human IFN-γ monoclonal Ab, Endogen)を０．５μｇ／ｍｌにＰＢＳで希釈し、９８ウエル・プレート（Nunc Maxisorp）に１ウエルあたり１００μｌを添加し、４℃で一晩放置してプレートをコートした。実験当日、１ウエルあたり３００μｌの５％ＦＣＳ含有ＰＢＳで室温１時間処理し、ブロッキングした。ウエルを０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで３回洗浄した後、共培養から回収した培養上清５０μｌを添加し、ビオチン化２次抗体（Endogen、５％ＦＣＳ含有ＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに調整したもの）を５０μｌ添加し、室温で２時間放置した。ウエルを０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで３回洗浄した後、ストレプトアビジン結合ＨＲＰ (ExtraAvidine peroxidase conjugate, SIGMA E-2886、５％ＦＣＳ含有ＰＢＳで４０００倍希釈したもの)を１００μｌ添加し、 室温で３０分放置した。ウエルを０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで３回洗浄した後、ＴＭＢを基質にして発色させた（ＴＭＢは、TMB tablet 1錠をＤＭＳＯ１ｍｌに溶解しリン酸クエン酸バッファー９ｍｌを加えて調整した）。２５μｌの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加し、反応を停止した。プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定し、既知の濃度のIFN-γで予め作製した標準曲線からIFN-γの濃度を算出し、結果を図１に示した。【００３６】
＝＝結果＝＝
ＨＬＡ−Ａ２４に結合し得ると予想されたＳＯＸ６由来ペプチド（表１参照）のうち、ＳＯＸ６−３６０、ＳＯＸ６−５０４、およびＳＯＸ６−６２８を添加された樹状細胞との共培養により刺激された細胞障害性Ｔ細胞（エフェクター細胞）は、各々の抗原ペプチドを提示した樹状細胞をターゲットとして共培養した時、様々なコントロールに比して、IFN-γ放出量が増加した（図１）。このことは、ＳＯＸ６ペプチドに由来するペプチド（ＳＯＸ６−３６０、ＳＯＸ６−５０４、およびＳＯＸ６−６２８）を抗原提示細胞に添加すると、それらのペプチドを提示する抗原提示細胞が得られ、得られた抗原提示細胞によってＴ細胞を刺激することにより各ペプチドを特異的に認識するＴ細胞が誘導されたことを示す。【００３７】
＜実施例２＞ＳＯＸ６由来ペプチドによる刺激によって樹立された細胞障害性Ｔ細胞のＳＯＸ６発現細胞に対する反応性
［１］ＳＯＸ６の発現解析
ＳＯＸ６を発現している細胞を明らかにすることにより、具体的にどのような細胞が、本発明の方法の対象となるかを調べた。【００３８】
＝＝ＲＴ−ＰＣＲによる解析＝＝
ヒト正常組織（成人脳及び精巣、及びヒト胎児脳）、グリオーマ細胞株（ＧＩ−１、Ｕ８７、及びＴ９８Ｇ）、患者から単離されたグリオーマ組織（グリオブラストーマ組織、及びアストロサイトーマ組織）、ヒト腫瘍細胞株（８８８ｍｅｌ、９２８ｍｅｌ、５８６ｍｅｌ、ＬＫ２、ＰＣ９、ＬＵ９９、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＡ、ＴＥ８、ＰＫ５６、ＰＫ１、ＰＣ３、ＭＤＡ２３１、ＲＣＣ６、ＲＣＣ８、ＫＵ７、及びＭｏｌｔ４）におけるＳＯＸ６のｍＲＮＡの発現を定量的ＰＣＲにより解析した。【００３９】
ＲＮＡを単離する材料としての細胞は、以下のように入手した。まず、グリオーマ細胞株SF126とMarcusはHealth Science Research Resources Bank (Osaka, Japan)から購入した。U-87-MG とT98G (glioma), GI-1 (gliosarcoma), 888mel, 928mel と586mel (melanoma) Molt4 (leukemia and lymphoma), PC9, LU99, LK2, RERF-LC-MA (lung cancer), RCC6 and RCC8 (renal cell cancer), TE8 (esophageal cancer), PK1 と PK59 (pancreas cancer) 、MDA231 (breast cancer) は American Type Culture Collection (Manassas, VA)より購入した。また、グリオーマ組織は、慶應義塾大学倫理委員会承認(No. 12-21-2)の説明文に対して同意の得られた手術患者の腫瘍検体より得た。これらの細胞株、または組織から、RNeasy（キアゲン社）を用いて全ＲＮＡを単離した。また、ヒト正常組織の全ＲＮＡはCLONTECH Laboratories, Inc.より購入した。これらの全ＲＮＡに対し、AMV Reverse transcriptase XL (Takara Bio Inc.,Ohtsu,Japan)及びオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。【００４０】
これらのｃＤＮＡに対し、以下のように定量的ＰＣＲを行い、ＳＯＸ６のｍＲＮＡの発現について検討した。ＳＯＸ６に対するプライマーは
forward primer, ５'-ＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＡＧＣ-３'（配列番号６）
reverse primer, ５'-ＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＡＴＴＣＡＴＴＧＣ-３'（配列番号７）
を用い、 内部コントロールとしてのβ-actinに対するプライマーは
forward primer, ５'-ＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧＡＡＧ-３'（配列番号８）
reverse primer, ５'-ＧＣＣＧＡＴＣＣＡＣＡＣＧＧＡＧＴＡＣＴ-３'（配列番号９）
を用いた。定量的ＰＣＲの条件は９５℃１０分、その後、変性を９５℃で３０秒，アニーリングを６０℃で１分の過程を５０サイクル行い、最後に伸長反応を７２℃で１分間行った。結果を図２Ａに示した。なお、各組織でのＳＯＸ６の発現量は、それぞれの組織におけるβアクチンの発現量で標準化した。【００４１】
＝＝ウエスタン・ブロッティングによる解析＝＝
次に、タンパク質レベルでのＳＯＸ６の発現をウエスタン・ブロッティングによって調べた。まず、上記と同様にして得られた細胞を回収し、破砕バッファー(最終濃度20mM HEPES、最終濃度0.25Mショ糖を純水950mlに加え、PH 7.5に調整した)と共にDounce型ホモジナイザーにいれ、氷上にて細胞を破砕した。破砕液を1000gで7分間遠心し、上清を破棄し、核や未破砕細胞を含む沈殿を回収した。この沈殿に、ＳＤＳゲル用ローディングバッファーを加えて溶解し、電気泳動用サンプルとした。これらのサンプルを、ＳＤＳ-ＰＡＧＥを用い、各レーンに２０μｇずつ泳動した。メンブレンにトランスファーし、１０μｇ／ｍｌに調製した抗ＳＯＸ６抗体（CHEMICON社）によってＳＯＸ６タンパク質を認識し、AP結合ヤギ抗ウサギIgG (Fc) 抗体 (２０００倍希釈、Cappel, Aurora, Ohio)を反応させた後、Nitro blue tetrazolium (Boehringer Mannheim, GmbH, Germany) と 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)の混合液にて発色させた。結果を図２Ｂに示した。【００４２】
＝＝結果＝＝
ＳＯＸ６は、これまでに発現が報告された、ヒト胎児脳、成人精巣、グリオーマ細胞株、グリオーマ組織のみならず、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、扁平上皮肺癌、食道癌、膵癌、前立腺癌、乳癌、腎癌、慢性骨髄性白血病、Ｔ細胞性白血病由来の細胞株においても、発現が検出された。（図２Ａ）。【００４３】
一方、正常組織におけるＳＯＸ６タンパク質の発現は、精巣以外では検出されなかった（図２Ｂ）。更に、ＳＯＸ６は、グリオーマ細胞株（Ｍａｒｃｕｓ、Ｕ８７、ＫＮＳ-４２、ＳＦ１２６）だけでなく、肺癌細胞株（ＰＣ９）、肝細胞癌株（ＨｅｐＧ２）、膵臓癌株（Ｐａｎｃ-１）においては、タンパク質レベルでも発現が検出された。【００４４】
以上より、ＳＯＸ６は、ヒト成人正常組織においては精巣しか発現が検出されないものの、腫瘍細胞においては、広く発現が検出された。このことは、ＳＯＸ６由来のペプチドを用いた癌ワクチンが、グリオーマだけでなく、多種の腫瘍に効果があることを示している。さらに、正常組織では、ほとんど発現が検出されないため、この癌ワクチンは副作用が少ないと考えられる。【００４５】
［２］エフェクター細胞から放出されるIFN-γ量による、ＳＯＸ６発現細胞に対する反応性の評価
＝＝実験２９日目＝＝
この日まで、実施例１と同様にしてエフェクター細胞を調整した。なお、単核球を得る健常人のＨＬＡクラス１のタイプをＡ２４（遺伝子型はＡ２４０２）とし、添加したペプチドとして配列番号１〜３のペプチドを用い、コントロールのペプチドとしてＣＭＶ由来のペプチド（配列番号４：ＱＹＤＰＶＡＡＬＦＦ）を用いた。【００４６】
一方、マイトマイシン(２００pg/ml)を添加した培養液（AIM-V(GIBCO)とRPMI-1640を1:1に混合したもの）を用い、３７℃、５％ＣＯ２存在下で、ヒト・グリオーマ細胞ＫＮＳ−８１(ＨＬＡ−Ａ２４とＳＯＸ６が共に発現しており、ＨＬＡ−Ａ２は発現していない細胞)を６０分間培養したのち、５回ＰＢＳで洗浄した後、９６ウエルの培養皿(COSTER 3595-96 well)に、５ｘ１０３個／ウエルに調整し、ターゲット細胞として播種した。【００４７】
このターゲット細胞に対し、エフェクター細胞を０個(グラフでは、エフェクター細胞：ターゲット細胞（E/T ratio）=0)、５ｘ１０４個(E/T ratio=10)、１ｘ１０５個(E/T ratio=20)、２ｘ１０５個(E/T ratio=40)のそれぞれを加え、共培養した。【００４８】
なお、コントロールとして、ヒト・グリオーマ細胞ＫＮＳ−８１の代わりに、ＣＩＲ−２４細胞(ＨＬＡ−Ａ２４が発現しており、ＳＯＸ６は発現していない細胞)とグリオーマ細胞Ｕ８７ (ＨＬＡ−Ａ２とＳＯＸ６が共に発現しており、ＨＬＡ−Ａ２４は発現していない細胞)を用いて、実験を行った。【００４９】
＝＝実験３１日目＝＝
上記共培養から培養上清を回収し、IFN-γELISAを行った。図３に結果を示す。【００５０】
＝＝結果＝＝
ＳＯＸ６由来の部分ペプチド（ＳＯＸ６−５０４、およびＳＯＸ６−６２８）を用いて誘導された細胞障害性Ｔ細胞（エフェクター細胞）は、ターゲット細胞であるグリオーマ細胞（ＫＮＳ−８１）に反応して、コントロールに比して細胞数比依存的にIFN-γ放出量の増加を示した（図３）。このことは、ＳＯＸ６−５０４またはＳＯＸ６−６２８を提示している抗原提示細胞を用いて刺激することにより樹立したＴ細胞は、ＳＯＸ６とＨＬＡ−２４を発現しているグリオーマ細胞（ＫＮＳ−８１）を特異的に認識し得ることを示す。樹立したＴ細胞はＵ８７（ＨＬＡ−Ａ２０１とＳＯＸ６が共に発現しているがＨＬＡ−Ａ２４は発現していない細胞）に反応しないことから、これらのＳＯＸ６特異的Ｔ細胞はＨＬＡ−Ａ２４拘束性に抗原を認識することが示された。【００５１】
［３］エフェクター細胞の細胞傷害活性による、ＳＯＸ６発現細胞に対する反応性の評価
＝＝実験２８日目＝＝
この日まで、実施例１と同様にしてエフェクター細胞を調整した。なお、単核球を得る人のＨＬＡクラス１のタイプをＡ２４（Ａ２４０２）とし、添加したペプチドとして配列番号１及び２のペプチドを用いた。なお、本実施例では、単核球を得るための末梢血には、健常人末梢血（結果は図４）だけでなく、グリオーマ患者末梢血（結果は図５）も用いた。【００５２】
ターゲット細胞として、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ欠損ヒトＢ細胞株ＣＩＲにＨＬＡ−Ａ２４０２のｃＤＮＡを導入したＣＩＲ−Ａ２４０２、ＣＩＲ−Ａ２４株にＳＯＸ６遺伝子を導入したＣＩＲ−Ａ２４０２−ＳＯＸ６、ＣＩＲにＨＬＡ−Ａ０２０１のｃＤＮＡとＳＯＸ６遺伝子を導入したＣＩＲ−Ａ０２０１−ＳＯＸ６、ＨＬＡ−Ａ２４とＳＯＸ６を共に発現しているグリオーマ細胞（Marcus、ＳＦ１２６、ＫＮＳ−４２）、ＨＬＡ−Ａ２４とＳＯＸ６を共に発現している他の癌細胞（肝細胞癌由来ＨｅｐＧ２、肺癌由来ＰＣ９）を準備した。なお、ＣＩＲ−Ａ２４０２−ＳＯＸ６細胞及びＣＩＲ−Ａ０２０１−ＳＯＸ６細胞でＳＯＸ６が発現していることは、上記ウエスタン・ブロッティングによって確認した（図２Ｂ）。【００５３】
これらの細胞５Ｘ１０６個に対して５００μｌのFetal Bovine Serum（ＦＢＳ）、５１Ｃｒ（１．８５ＭＢｑ／５０μｌ）を５０μｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で６０分振蕩培養した。その後洗浄を３回行い、５ｘ１０３／１００μｌに調整して９６穴プレート（COSTER 3595-96 well）の各ウエルに１００μｌずつ添加した。【００５４】
この５１Ｃｒでラベルしたターゲット細胞に対し、ウエルあたり、エフェクター細胞を３ｘ１０５個（E/T ratio=60）、１．５ｘ１０５個（E/T ratio=30）、７．５Ｘ１０４個（E/T ratio=15）のそれぞれを加え、３７℃、５％ＣＯ２存在下で４時間培養した。【００５５】
各ウエルのcpm(cpm experimental release)を計測し、特異的溶解率（Percentage of specific lysis)を以下の式から算出した。  
特異的溶解率= (cpm−csr)/(cmr−csr) x100
（なお、csr(cpm spontaneous release)はエフェクター細胞を含まない培地を添加したウエルのcpmであり、cmr(cpm maximal release)はエフェクター細胞を含まない０．１％ Triton Xを添加したウエルのcpmである。）【００５６】
＝＝結果＝＝
ＣＩＲ−Ａ２４−ＳＯＸ６、グリオーマ細胞由来Marcus、グリオーマ細胞由来ＳＦ１２６、グリオーマ細胞由来ＫＮＳ−４２、肝癌由来ＨｅｐＧ２、肺癌由来ＰＣ９は、ＨＬＡ−Ａ２４とＳＯＸ６を発現している細胞である。図４（健常人由来の末梢血リンパ球からＣＴＬを誘導した場合）及び図５（グリオーマ患者由来の末梢血リンパ球からＣＴＬを誘導した場合）に示したように、ＳＯＸ６−５０４またはＳＯＸ６−６２８を添加され樹状細胞との共培養により刺激された細胞障害性Ｔ細胞（エフェクター細胞）であるＣＴＬ（ＳＯＸ６−５０４）とＣＴＬ（ＳＯＸ６−６２８）は、これらのＨＬＡ−Ａ２４とＳＯＸ６を発現している細胞をE/T ratio依存性に溶解した。【００５７】
一方、ＳＯＸ６を発現しているがＨＬＡ−Ａ２４を発現していない細胞ＣＩＲ−Ａ０２０１−ＳＯＸ６や、ＨＬＡ−Ａ２４を発現しているがＳＯＸ６を発現していない細胞ＣＩＲ−Ａ２４０２に対する溶解性が低いことから、ＣＴＬ（ＳＯＸ６−５０４）とＣＴＬ（ＳＯＸ６−６２８）は、ＨＬＡ拘束性にＳＯＸ６を発現する細胞を広く、特異的に傷害し得ることが示された。【００５８】
［４］エフェクター細胞のターゲット細胞に対する特異性
ＳＯＸ６由来のペプチドの刺激により樹立したエフェクター細胞の、ＳＯＸ６と無関係なペプチドを表面に有する細胞に対する細胞障害活性を調べることにより、エフェクター細胞のターゲット細胞に対する特異性を調べた。【００５９】
基本的には、実施例２と同様に実験を行ったが、ターゲット細胞として、
（１）ＨＬＡ-Ａ２４とＳＯＸ６が共に発現しているグリオーマ細胞株Marcus
（２）ＨＬＡ-Ａ２４を発現していてＳＯＸ６を発現していないＣＩＲ-Ａ２４０２に、配列番号１を有するペプチドＳＯＸ６-５０４を結合させたＣＩＲ-Ａ２４０２（ＳＯＸ６-５０４）または配列番号２を有するペプチドＳＯＸ６-６２８を結合させたＣＩＲ-Ａ２４０２（ＳＯＸ６-６２８）
（３）非特異的細胞障害を測定するためのコントロールとして、ＣＩＲ-Ａ２４０２に対し、ＣＭＶ由来の無関係なペプチド（配列番号４）を結合させたＣＩＲ-Ａ２４０２（ＣＭＶ）
（４）無処理のＣＩＲ-Ａ２４０２
を用いた。実施例３−１に記載の手順にて、上記細胞を５１Ｃｒでラベルし、５ｘ１０３／１００μlに調整して９６穴プレートの各ウエルに１００μlずつ添加した。【００６０】
エフェクター細胞として、ペプチドＳＯＸ６-５０４の刺激により樹立したＣＴＬ（ＳＯＸ６-５０４）とペプチドＳＯＸ６-６２８の刺激により樹立したＣＴＬ（ＳＯＸ６-６２８）を準備した。エフェクター細胞はウエルあたり１ｘ１０５個（ET ratio＝２０：１を、９６穴プレート上のターゲット細胞に添加した。これらを３７℃、５％ＣＯ２存在下で４時間培養後、各ウエルの cpm (cpm experimental release)を計測し、特異的溶解率（Percentage of specific lysis)を上記式から算出した。図６に結果を示す。【００６１】
ＣＴＬ（ＳＯＸ６-５０４）及びＣＴＬ（ＳＯＸ６-６２８）は、ＨＬＡ-Ａ２４とＳＯＸ６が共に発現しているMarcusや、ＳＯＸ６由来のペプチドＳＯＸ６-５０４またはＳＯＸ６-６２８を結合させたＣＩＲ-Ａ２４０２に対する溶解率は、無関係なペプチドであるペプチドを結合させたＣＩＲ-Ａ２４０２や無処理のＣＩＲ-Ａ２４０２に対する溶解率に比べて高かった。このことから、ＣＴＬ（ＳＯＸ６-５０４）及びＣＴＬ（ＳＯＸ６-６２８）は、それぞれＳＯＸ６-５０４及びＳＯＸ６-６２８を提示した細胞に対し、特異的に細胞障害を起こすことが示された。【００６２】
このように、本実施例では、ＳＯＸ６由来のペプチドで誘導されたエフェクター細胞のターゲット細胞に対する特異性が高いことが示され、従って、ＳＯＸ６由来のペプチドが癌ワクチンとして用いられた時、副作用が低いと考えられる。【００６３】
＜結論＞
以上より、ＳＯＸ６に由来する配列１〜３を有するペプチドを用いて、それらの抗原ペプチドを提示した抗原提示細胞を作製することができ、さらに、その抗原提示細胞によって刺激することにより、各ペプチドのみならずＳＯＸ６を発現した細胞を認識する、特異的Ｔ細胞が誘導される。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明によって、腫瘍免疫を効率的に誘導できるペプチド、そのペプチドを含有する組成物、そのペプチドを提示した抗原提示細胞、この抗原提示細胞によって刺激されたＴ細胞、およびこれらのペプチドや細胞を利用した癌ワクチン、及びそれらを用いた腫瘍患者の治療方法を提供することが可能になった。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図３】
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【図２Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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