(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリスルホンを含む多孔性材料または凹凸のある材料を含む比表面積が０．１ｍ２／ｇ以上の支持体にポリエチレンイミンが付与されている、支持体表面積１ｍ２あたりの血漿量が３．３×１０２ｍｌ／ｍ２である条件で吸着操作を施したときに、該血漿中に含まれている初期濃度２μｇ／ｍｌの酸化低密度リポ蛋白の吸着除去率が５６％以上であることを特徴とする酸化低密度リポ蛋白吸着用吸着材。
【請求項２】
支持体表面積１ｃｍ２あたり、５×１０−２ｍＭの酸性染料の染色液を１．２５ｍｌ用い、ｐＨ３、温度３７℃、５時間という条件下で該支持体を染色したとき、該支持体に吸着した染料の量が１２ｎｍｏｌ／ｃｍ２以上であることを特徴とする請求項１に記載の酸化低密度リポ蛋白吸着用吸着材。
【請求項３】
支持体に親水性高分子がブレンドされた素材からなることを特徴とする請求項１または２に記載の酸化低密度リポ蛋白吸着用吸着材。
【請求項４】
親水性高分子がポリビニルピロリドンであることを特徴とする請求項３記載の酸化低密度リポ蛋白吸着用吸着材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、過酸化脂質吸着材に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、心疾患をもつ患者や人工透析患者は動脈硬化を呈している場合が多く、血中の過酸化脂質濃度が増大している。
【０００３】
過酸化脂質の中でも、特に酸化低密度リポ蛋白（以下、ＬＤＬという）は様々な生物作用をもっており、内皮細胞から一酸化窒素（ＮＯ）産生を抑制するなどの作用以外にも、単球を内皮下に遊送、集積させ、そのものをマクロファージとさせ、酸化ＬＤＬそれ自身を取り込み泡沫細胞とさせ、動脈壁のプラーク形成を促進するほか、内皮細胞や平滑筋細胞傷害を促進するなど、動脈硬化の発症、進展に重要な役割を果たしている。従って、血中から過酸化脂質、特に酸化ＬＤＬを除去することが望まれている。これまで血中の過酸化脂質濃度を低下させる有効な手段はなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、かかる従来技術の欠点を改良し、特に、過酸化脂質を吸着除去できる吸着材を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため、本発明は次の構成を有する。
「比表面積が０．１ｍ2／ｇ以上の支持体にカチオン性ポリマーが付与されていることを特徴とする過酸化脂質吸着材。」
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の過酸化脂質吸着材は、比表面積が０．１ｍ2／ｇ以上の支持体にカチオン性ポリマーが付与されていることを特徴とする。支持体の比表面積が０．１ｍ2／ｇ以上であることにより、効率的に過酸化脂質を除去することができる。比表面積がそれ以下の支持体では効率的に過酸化脂質を除去できない。
【０００７】
カチオン性ポリマーとしては、１級、２級、３級アミノ基、４級アンモニウム塩を有するアミノ基含有ポリマー、アジリジン（エチレンイミン）化合物を有するポリマー、キチン、キトサン、アクリルアミド系ポリマー、およびこれらの共重合体またはノニオン、アニオン性化合物との共重合体などが挙げられる。また、該ポリマーは直鎖状、分岐状、環状、いずれであってもよい。また、分子量は６００以上の化合物のことをいう。
【０００８】
アミノ基含有ポリマーの例として、ポリアルキレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ジエチルアミノエチルデキストランおよびそれらに置換基の導入されたもの、およびこれらの構成するモノマー単位からなる共重合体などが挙げられる。
【０００９】
ポリエチレンイミン誘導体としては、ポリエチレンイミンをアルキル化、カルボキシル化、フェニル化、リン酸化、スルホン化など種々の割合で誘導体化したものが上げられる。
【００１０】
ポリエチレンイミンには、分子量６００以上の直鎖状、分岐状のものが用いられる。
【００１１】
カチオン性ポリマーの中でも毒性の低さ、入手のしやすさ、取り扱いのしやすさなどから分岐状のポリエチレンイミンが好適に用いられる。
【００１２】
付与されるカチオン性ポリマーの量は、過酸化脂質の除去量を増やすためにできるだけ多いことが好ましい。支持体におけるカチオン性ポリマーの含有量は、該支持体を、酸性染料の染色液を用いて染色した場合の染料の吸着量と比例する。５×１０-2ｍＭのアシッドオレンジ７染色液（ｐＨ３）を、支持体表面積１ｃｍ2あたり１．２５ｍｌ用い、その中に支持体を３７℃で５時間浸漬する。染色液の４７５ｎｍにおける吸光度を測定して、染色操作前後の溶液中のアシッドオレンジ７の量を定量することにより、その減少量から支持体に吸着したアシッドオレンジ７量を算出できる。支持体表面積１ｍ2あたりの血漿量が３．３×１０2ｍｌ／ｍ2である条件で吸着操作を施したときに、該血漿中に含まれている初期濃度２μｇ／ｍｌの酸化低密度リポ蛋白の吸着除去率が４５％以上の吸着材を得るためには、上記の染色量は、支持体表面積あたり１２ｎｍｏｌ／ｃｍ2以上であることが望ましい。
【００１３】
本発明の支持体の素材としては、医療用に用いられている素材が好ましく、例えば、ポリ塩化ビニル、セルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタンなどが挙げられる。この中でも特にポリスルホンは成形が容易であるため、好適に用いられる。
【００１４】
本発明で用いられるポリスルホンは、主鎖に芳香環、スルフォニル基およびエーテル基をもつもので、例えば、次式（１）、（２）の化学式で示されるポリスルホンが好適に使用されるが、本発明ではこれらに限定されない。式中のｎは、５０〜８０の整数である。
【００１５】
【化１】
0004843841.tif 000002
【００１６】
ポリスルホンの具体例としては、”ユーデル”Ｐ−１７００、Ｐ−３５００（テイジンアモコ社製）、”ウルトラソン”Ｓ３０１０、Ｓ６０１０（ＢＡＳＦ社製）、ビクトレックス（住友化学）、レーデルＡ（テイジンアモコ社製）、”ウルトラソン”Ｅ（ＢＡＳＦ社製）等のポリスルホンが挙げられる。また、本発明で用いられるポリスルホンは上記式（１）および／または（２）で表される繰り返し単位のみからなるポリマーが好適ではあるが、本発明の効果を妨げない範囲で他のモノマーと共重合していても良い。他の共重合モノマーは１０重量％以下であることが好ましい。
【００１７】
本発明においては、本来除去すべきでない酸化されていない正常な脂質の除去を抑制し、過酸化脂質のみを選択的に除去するという観点から、親水性高分子をブレンドすることが好ましい。親水性高分子としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン等が、血液適合性の点で好ましい。また、親水性高分子については、カチオン性ポリマーと放射線架橋できるものであるとより好ましい。ポリスルホンとの相溶性から、特にポリビニルピロリドンが好ましい。
【００１８】
ポリビニルピロリドンは、支持体となる素材と積層されていても良いが、混合ないしは相溶されている方が好ましい。
【００１９】
ポリビニルピロリドンとしては、市販されている重量平均分子量３６万、１６万、４万、１万のものが好適に用いられるが、もちろんそれ以外の分子量のものを使用してもかまわない。ポリビニルピロリドンの重量平均分子量は２０００〜２００００００が好ましく、１００００〜１５０００００がより好ましい。なお、前記分子量は原料段階での分子量であり、最終製品においては、放射線架橋などにより分子量は前記値より遙かに大きなものとなっている場合もある。また、本発明で用いられるポリビニルピロリドンは、支持体となる素材とブレンドして用いる場合、ホモポリマーが好適ではあるが、本発明の効果を妨げない範囲で他のモノマーと共重合していても良い。他の共重合モノマーは１０重量％以下であることが好ましい。
【００２０】
なお、前記以外のポリマーなどが、本発明の効果を妨げない範囲で混合されていても良いが、そのようなその他の素材は、支持体全重量中、１０重量％以下であることが好ましい。
【００２１】
支持体はポリスルホンとポリビニルピロリドン（重量比率２０：１〜１：５が好ましく、５：１〜１：１がより好ましい）を良溶媒（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジオキサンなどが好ましい）または良溶媒を含む混合溶液に溶解させた原液（濃度は、１０〜３０重量％が好ましく、１５〜２５重量％がより好ましい）を成形することにより得られる。
【００２２】
支持体形状は、平膜、中空糸膜、繊維状、粒状などどういう形状であってもよいが、支持体が多孔性材料の場合、表面積を有効にするためには孔径が３０ｎｍ以上であることが望ましい。
【００２３】
支持体が多孔性材料および凹凸のある材料の場合の比表面積は、水銀圧入法により得られる水銀圧入曲線から計算によって求めることができる。市販の人工透析膜のような内表面の膜の孔径が小さい中空糸膜の場合、内表面しか有効に使用できないため、実際に有効となる比表面積は内表面積の大きさ／支持体の重量から算出される値が実際の比表面積となり、０．１ｍ2／ｇを下回り、満足できる吸着性能が得られず好ましくない。
【００２４】
本発明の過酸化脂質吸着材は、前記支持体とカチオン性ポリマーの共存下で放射線照射または加熱処理することにより製造することができる。これにより支持体表面積１ｍ2あたりの血漿量が３．３×１０2ｍｌ／ｍ2である条件で吸着操作を施したときに、該血漿中に含まれている初期濃度２μｇ／ｍｌの酸化ＬＤＬの吸着除去率が４５％以上達成できることを見いだした。ただし、ここでいう支持体表面積とは、支持体の細孔部分や凹凸を含めない表面積のことをいう。
【００２５】
支持体にカチオン性ポリマーを付与させるには、製造時に支持体を構成する素材にカチオン性ポリマーを混合させたり、支持体を成形後、カチオン性ポリマーの溶液に浸漬させたりする方法などがある。この中で、支持体を成形後、カチオン性ポリマー溶液に浸漬させる方法は、容易に生産に適用することができる利点がある。
【００２６】
支持体とカチオン性ポリマーの共存下で放射線照射または加熱処理する方法としては、支持体をカチオン性ポリマー溶液に浸漬した状態で放射線照射または加熱処理する方法、支持体をカチオン性ポリマー溶液に浸漬させた後、溶液を除去し、湿潤状態で放射線照射または加熱処理する方法、支持体をカチオン性ポリマー溶液に浸漬させ、溶液を水洗除去し、カチオン性ポリマーを支持体に吸着させた状態で放射線照射または加熱処理する方法などが挙げられる。
【００２７】
支持体を浸漬するカチオン性ポリマー溶液の濃度はカチオン性ポリマーの固定化量および酸化ＬＤＬの吸着除去率から０．０５ｗｔ％以上であることが望ましい。
【００２８】
以下、本発明の過酸化脂質吸着材の性能測定条件を記載する。
（１）抗酸化ＬＤＬ抗体の作製
板部らが作製したものを用いた（Ｈ．Ｉｔａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５２７４、１９９４）。すなわち、ヒト粥状硬化病巣ホモジェネートをマウスに注射して免疫、そのマウスの脾臓からハイブリドーマを作製し、硫酸銅処理ＬＤＬと反応するものを選別した。抗体クラスは、マウスＩｇＭで、未処理ＬＤＬ、アセチルＬＤＬ、マロンジアルデヒドＬＤＬとは反応しない。フォスファチジルコリンのアルデヒド誘導体やヒドロペルオキシドを含めていくつかのフォスファチジルコリン過酸化反応生成物と反応する。１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解したものを用いた（蛋白濃度０．６０ｍｇ／ｍｌ）。
（２）酸化ＬＤＬの調製
市販のＬＤＬ（フナコシ製）を脱塩した後、０．２ｍｇ／ｍｌとなるようにリン酸緩衝液（以下ＰＢＳという）で希釈後、０．５ｍＭ硫酸銅水溶液を１ｗｔ％添加し、３７℃で１６時間反応させた。２５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（以下ＥＤＴＡという）を１ｗｔ％、１０ｗｔ％アジ化ナトリウムを０．０２ｗｔ％となるように添加したものを酸化ＬＤＬ標品とした。
（３）吸着操作
健常者血漿（日本人、３０歳）に上記酸化ＬＤＬを２μｇ／ｍｌとなるように添加した。
【００２９】
容積２．０ｃｃのポリプロピレン製の遠心管（エッペンドルフ）に表面積が９ｃｍ2の本発明の吸着材を５ｍｍ角にきざんで入れ、上記血漿０．３ｍｌを添加して吸着材に血漿を浸漬し、３７℃で４時間静置した（支持体表面積１ｍ2あたりの血漿量は３．３×１０2ｍｌ／ｍ2）。
【００３０】
吸着前後の血漿中の酸化ＬＤＬ濃度を定量することにより、吸着除去率を下記式により算出した。
【００３１】
吸着除去率（％）＝１００×（吸着前の濃度−吸着後の濃度）／吸着前の濃度（４）酸化ＬＤＬ濃度の測定
抗酸化ＬＤＬ抗体をＰＢＳで５μｇ／ｍｌに希釈し、９６穴のプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で２時間震盪した後、４℃にて一晩以上壁に吸着させた。
【００３２】
ウェル中の抗体溶液を捨て、１ｗｔ％Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｍｉｎ（ＢＳＡ、”フラクションＶ”、生化学工業）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を２００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で２時間震盪して壁をブロッキングした後、ウェル中のＢＳＡ溶液を捨て、酸化ＬＤＬを含んだ血漿および検量線作成用のスタンダード（０〜２μｇ／ｍｌの酸化ＬＤＬを含むＰＢＳ緩衝液）を１００μｌ／ウェルずつ分注した。その後、室温で３０分震盪した後、４℃で一晩放置した。
【００３３】
室温に戻し、ウェル中の溶液を捨て、０．０５ｗｔ％”トゥイーン−２０”（片山化学）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でウェルを３回洗浄した。洗浄したウェルにＰＢＳで２０００倍に希釈したヒツジ抗アポＢ抗体（ＴＨＥ  ＢＩＮＤＩＮＧ  ＳＩＴＥ）を１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で２時間震盪した後、ウェル中の抗アポＢ抗体を捨て、０．０５ｗｔ％”トゥイーン−２０”を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でウェルを３回洗浄した。洗浄したウェルに２ｗｔ％”ブロックエース”（大日本製薬）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２０００倍に希釈したアルカリ性フォスファターゼ標識ロバ抗ヒツジＩｇＧ抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）を１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で２時間震盪した。その後、ウェル中の標識抗体を捨て、０．０５ｗｔ％トゥイーン−２０を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でウェルを３回洗浄し、さらにトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。続いて、ｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ）の１ｍｇ／ｍｌ溶液（０．０００５Ｍ  ＭｇＣｌ2、１Ｍジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８）を１００μｌ／ウェルずつ分注し、適当な時間室温で反応させた後、４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。スタンダードの結果から検量線を引き、酸化ＬＤＬ濃度を決定した。
【００３４】
【実施例】
実施例１
ポリスルホン（テイジンアモコ社製”ユーデル”Ｐ−３５００）１８重量部、ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製Ｋ３０）９重量部をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド７２重量部、水１重量部に加え、９０℃１４時間加熱溶解した。この溶液を０．１ｍｍスペーサー付きのガラス板に塗布し、ドクターブレードにて溶液を引き延ばしたものを水中にいれて、凝固させ、ポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンドからなる平膜状の支持体を作成した。この支持体の比表面積は１１．９ｍ2／ｇであった。
【００３５】
上記、ポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンド支持体を十分水洗した後、１ｗｔ％のポリエチレンイミン（分子量１万、和光純薬製）水溶液に浸漬して、２５ｋＧｙにてγ線照射した。放射線処理した支持体は、十分水洗した後、吸着実験に供した。
【００３６】
実施例２
実施例１と同様にしてポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンド支持体を作成し、０．１ｗｔ％のポリエチレンイミン水溶液に浸漬して、２５ｋＧｙにてγ線照射したものを作成した。
【００３７】
比較例１
実施例１と同様にしてポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンド支持体を作成し、１ｗｔ％のポリエチレンイミン水溶液の代わりに水を充填して、２５ｋＧｙにてγ線照射したものを作成した。
【００３８】
比較例２
実施例１と同様にしてポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンド支持体を作成し、１ｗｔ％のポリエチレンイミン水溶液に浸漬した後、水溶液を抜き出し、窒素ガスを容器内に充填し、支持体は濡れた状態で、２５ｋＧｙにてγ線照射したものを作成した。
【００３９】
比較例３
実施例１と同様にしてポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンド支持体を作成し、１ｗｔ％のポリエチレンイミン水溶液に浸漬した後、水溶液を抜き出し、支持体を水洗した後、水を充填し、ポリエチレンイミンを支持体に吸着させた状態で、２５ｋＧｙにてγ線照射したものを作成した。
【００４０】
実施例３
実施例１と同様にしてポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンド支持体を作成し、０．０１ｗｔ％のポリエチレンイミン水溶液に浸漬して、２５ｋＧｙにてγ線照射したものを作成した。
【００４１】
比較例４
実施例１と同様にしてポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンド支持体を作成し、１ｗｔ％のポリエチレンイミン水溶液に浸漬した後、水溶液を抜き出し、そのままポリエチレンイミン溶液で濡れた状態で、１４０℃で２時間加熱処理したものを作成した。
【００４２】
実施例１〜３および比較例１〜４における酸化ＬＤＬの吸着除去率の結果を表１に示した。
【００４３】
【表１】
0004843841.tif 000003
【００４４】
【発明の効果】
本発明により、血液浄化器などの用途に用いられ、特に心疾患患者や透析患者において動脈硬化の進展を予防したり、その発症を未然に防ぐような場合に好適に用いられる過酸化脂質吸着材を提供することができる。