(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
霊長類の動物における新しい骨成長の誘導に効果的な骨形成ペースト組成物であって：
コラーゲンを含む再吸収性ペーストキャリヤー；
骨形成因子、前記骨形成因子は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６もしくはＢＭＰ−７から選ばれる骨形態発生蛋白質、ＬＩＭ無機質化蛋白質、あるいは、該骨形態発生蛋白質もしくはＬＩＭ無機質化蛋白質をコード化するヌクレオチド配列を含む；および
前記組成物の４０〜８０容量％の量の多孔質粒状無機質、該量は、再吸収性ペーストキャリヤーが再吸収されるにつれ、骨の内方成長のために骨格を与えるのに有効である、
を含む前記骨形成ペースト組成物。
【請求項２】
さらに無機質脱落骨マトリックスを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
無機質脱落骨マトリックスと再吸収性キャリヤーとの比が、重量比で１：４〜３：２である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
組成物が５〜４５重量％の再吸収性キャリヤーを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記無機質が、骨粒子、バイオガラス、燐酸トリカルシウム、ヒドロキシアピタイト、コラリンヒドロキシアピタイト、生体相溶性セラミックおよび非再吸収性生体相溶性有機ポリマーからなる群より選ばれる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記無機質が、燐酸トリカルシウム、二相性燐酸カルシウム、もしくは０．０５０〜５．０ｍｍの平均粒径を有するヒドロキシアパタイト粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記無機質が、０．０５０〜５．０ｍｍの粒度を有する哺乳動物の骨粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記無機質が、０．０５０〜５．０ｍｍの平均粒径を有する皮質のヒトの骨粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
さらに骨形成先祖細胞、自己移植骨髄、同種移植骨髄、形質転換成長因子ベータ、線維芽細胞成長因子、血小板誘導成長因子、インシュリン様成長因子、マイクログロブリンベータ、抗生物質、抗菌剤、湿潤剤、グリセロール、ステロイドおよび非ステロイド抗炎症性化合物からなる群より選ばれる１つ以上の骨形成強化因子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
哺乳動物において新しい骨成長の誘導に効果的な骨形成移植材料であって：
ゼラチンおよびコラーゲンを含む再吸収性ペーストキャリヤー；
無機質脱落骨マトリックス；
骨形成因子、前記骨形成因子は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６もしくはＢＭＰ−７から選ばれる骨形態発生蛋白質、ＬＩＭ無機質化蛋白質、あるいは、該骨形態発生蛋白質もしくはＬＩＭ無機質化蛋白質をコード化するヌクレオチド配列を含む；および
０．０５０〜５．０ｍｍの平均粒径を有する粒状無機質、該無機質は、該組成物の４０〜８０容量％を構成する
を含む前記骨形成移植材料。
【請求項１１】
前記無機質が、ヒトの骨粒子を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記無機質が、非ヒトの骨粒子を含んでなり、該粒子がヒトにおける免疫原性を減少するために処理されている、請求項１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連用途についての言及
本出願は、その内容がすべて本明細書に取り込まれる１９９９年２月４日に出願された米国特許出願シリアル第６０／１１８，６１４号の特権を主張している。
発明の分野
本発明は、一般にペースト形キャリヤーおよび骨形成因子を含む骨形成ペースト組成物に関する。１つの具体的な側面において、本発明は、骨成長のために永続的な骨組みを与えるために、ペースト形キャリヤー、骨形成因子およびかなりの無機質成分を含む骨形成ペースト組成物に関する。本発明は、また骨形成ペースト組成物の製造方法および使用方法に関する。
背景
さらなる背景として、骨移植は、一般に広範囲の筋骨格疾患の治療における治療法を増大するために使用される。移植は、破損修復を増大するため、関節固定を強化するため、および腫瘍の治療後の欠損を充填するために、骨欠損の再建もしくは代替に有効となっている。自己移植技術は、１００年以上に渡って既知であり、移植材料として皮質および格子状の骨の使用が含まれる。自己移植片の使用は、入手できる供与体の材料の限られた量、患者に対する２つの外科的侵入部位の必要性、供与体の部位の病的状態の高発生率、特に血管化移植が含まれるときの技術の冗長かつ複雑な性質、および提供された骨は移植部位の要求に正しく合うようなサイズおよび形状であることがめったにないという事実を含むいくつかの重大な欠陥を呈する。同種移植片は、類似の手順で用いることができる。同種移植片は、患者の対する２部位の外科手術を避け、かつ供与体の部位の病的状態の危険削除という利点を有する。しかし、同種移植片は、病気伝染および免疫抗原性移植拒絶の危険を増大させた。これら新しい危険を減少させるために用いられる手順は、本来有効な移植材料として同種移植片の生存能力を低下させる。同種移植片についての手順は、また依然として冗長かつ複雑であり、限られた源材料に悩み、移植部位の要求に最適に合うように移植片のサイズおよび形状を決定することに同じ限界を有する。
【０００２】
いくつかの組成物が、前記欠陥を減少もしくは回避するために自己移植および同種移植技術を増大もしくは代替するために開発された。ヒドロキシアパタイト、燐酸トリカルシウム（ＴＣＰ）およびコラリンヒドロキシアパタイトなどのセラミックが、骨移植材料における充填剤および／または膨張剤としての使用に有利な骨誘導性マトリックスであることが示されてきた。セラミックは、圧縮強さを加えることができるが、骨誘導特性には欠け、単独に用いられると、剪断および引張強さに欠ける。Ｒ．Ｗ．Ｂｕｃｈｏｌｚ、Ａ．Ｃａｒｌｓｏｎ、Ｒ．Ｅ．Ｈｏｌｍｅｓ、“Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ａｎｄ  ｔｒｉｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｏｎｅ  ｇｒａｆｔ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ”、Ｏｒｔｈｏｐ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．、第１８巻（２）、１９８７、ｐｐ．３２３〜３３４、およびＲ．Ｗ．Ｂｕｃｈｏｌｚ、Ａ．Ｃａｒｌｓｏｎ、Ｒ．Ｅ．Ｈｏｌｍｅｓ、“Ｉｎｔｅｒｐｏｒｏｕｓ  ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ａｓ  ａ  ｂｏｎｅ  ｇｒａｆｔ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  ｉｎ  ｔｉｂｉａｌ  ｐｌａｔｅａｕ  ｆｒａｃｔｕｒｅｓ”、Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．、第２４０巻、１９８９、ｐｐ．５３〜６２。さらに、動物研究において、そのようなセラミックに、有利なレベルの初期先祖細胞を与えるための骨髄および他の骨形成因子を充填できることが示された。Ｈ．Ｏｈｇｕｓｈｉ、Ｖ．Ｍ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、Ａ．Ｉ．Ｃａｐｌａｎ、“Ｈｅｔｅｒｏｔｏｐｉｃ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｐｏｒｏｕｓ  ｃｅｒａｍｉｃｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ”、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．、第７巻、１９８９、ｐｐ．５６８〜５７８。
【０００３】
燐酸カルシウム系セラミックは、いったん移植されるとその再吸収特性において幅広く異なる。他の因子の他に、再吸収速度は、セラミックの表面積で増加する傾向があり、それは今度はセラミックの粒子形状、サイズ、密度および多孔度に依存する。ＴＣＰは、ヒドロキシアパタイトよりも１０〜２０倍速く品質低下する。また部分的に結果として、もし新しい骨の開発がＴＣＰ移植片で確立したなら、ＴＣＰは一般に骨形成の最終段階でヒドロキシアパタイトよりもよく再建される。ＴＣＰは破骨細胞により再吸収され、一方ヒドロキシアパタイトのはるかに遅い再吸収は、主として異物の巨大細胞により生じる。巨大細胞は、それが再吸収するヒドロキシアパタイトの量に限りがある。
【０００４】
純セラミックは、移植の間最適取扱適性を与えないが、優れた生体相溶性特性を与え、既存の骨によく結合する傾向がある。Ｏｈｇｕｓｈｉ等は、セラミックの骨髄浸潤の使用を教示し、一方他の人たちは、所望の形状およびサイズの安定した移植片を与えるために凝固する活用できるペーストを処方するための粒状セラミックを有する種々の結合剤を用いた。Ｃ．Ｐ．Ｄｅｓｉｌｅｔｓ、Ｌ．Ｊ．Ｍａｒｄｅｎ、Ａ．Ｌ．ＰａｔｔｅｒｓｏｎおよびＪ．Ｏ．Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ、“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｏｎｅ−ｒｅｐａｉｒ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ”、Ｊ．Ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、第１巻（３）、１９９０、ｐｐ．１５０〜１５３。
【０００５】
無機質脱落骨マトリックス（ＤＢＭ）調製は、骨移植材料としての使用のために広範囲に研究されてきた。ＤＢＭは、骨から無機質の酸抽出により調製される。それは骨形態発生蛋白質（ＢＭＰｓ）および他の成長因子を含む酸不溶性蛋白質とともに、骨のコラーゲンマトリックスを含む。ＤＭＢは、破砕グラニュール、粉末もしくはチップとして加工され得る。それを、グラニュール、ゲル、スポンジ材料もしくはパテとしての使用のために処方することができ、貯蔵用に凍結乾燥できる。病気伝染から守るために必要とされる殺菌手順は、ＤＢＭにおける有利な成長因子の活性を減少し得る。ＤＢＭは、初期の骨誘導マトリックスを与え、周囲組織から骨先祖細胞の浸潤および分化を含むある程度の骨誘導ポテンシャルを示す。ＤＢＭは、構造強度に欠け、したがって袋状組織、単純な破面、ならびに自己移植片および同種移植片の充填剤などのよく保持された安定した骨格欠損を充填するのに有用であるにすぎない。市販のＤＢＭ製品の例は、ニュージャージー州、ＳｈｒｅｗｂｕｒｙのＯｓｔｅｏｔｅｃｈ製Ｇｒａｆｔｏｎ（登録商標）Ａｌｌｏｇｅｎｉｃ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ、およびカリフォルニア州ＩｒｖｉｎｅのＧｅｎｓｃｉ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製Ｄｙｎａｇｒａｆｔ  （登録商標）である。
【０００６】
前記骨移植材料の種々の組合せが、その個々の欠点なしで個々の成分の利点を得たいという願いで作られてきた。いくつかの組合せは、ある程度の成功を見たが、Ｙ．Ｙａｍａｚａｋｉ、Ｓ．ＳｈｏｄａおよびＳ．Ｏｉｄａの“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｏｓｔｅｏ−Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｃｉｕｍ，  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｄｅｄ  Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ”、Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９８６、ｐｐ．１１は、骨移植材料として個々に有利であると既知の要素すべての組合せが複合移植材料として有利な特性を増加もしくは効果的であるわけではないと、教示している。Ｙａｍａｚａｋｉ等は、ＤＢＭの骨誘導ポテンシャルおよびそれからの骨形成蛋白質抽出物は、ＴＣＰもしくはヒドロキシアパタイトの添加により阻害されることを発見した。一般化された用途で最適であるとわかる骨形成組成物はまだ発見されておらず、見たところよく定められた組成物を用いてすら、治療結果は広範囲に変わる。首尾一貫して強固に骨誘導性、骨伝導性であり、外科的手順で容易に活用でき、骨発達の初期段階の間新しい骨形成に強度および安定性を与えるが、骨形成プロセスの終わりまで本質的に骨の中に完全に取り込まれ、再建される改善された骨形成移植材料に対する需要が、依然として存在する。
【０００７】
ＴＣＰ／ヒドロキシアパタイトおよびコラーゲンの混合セラミックスの組成物は、市販され、移植に先立って自己生産骨髄を充填することにより強化できる。複合材料は、ペーストもしくは柔らかいストリップとして入手でき、移植部位から流れる傾向がある。移植片は、したがって複合材料および周囲の出血が完全に凝固するまで、所定の箇所に用心して保持されなければならない。
【０００８】
グリセロールおよびＤＢＭを含むＧＲＡＦＴＯＮ（登録商標）（米国特許第５，４８１，６０１号参照）として既知の骨ゲルの組成物は、単独に用いることも砂状粉末と混合することもできる。そのような組成物は、骨の空隙、亀裂および穴を充填するために用いられてきた。ＧＲＡＦＴＯＮ（登録商標）は、軟質シートもしくはパテとして入手でき、かくて移植中に組成物をより容易に活用できるようにしている。
【０００９】
米国特許第４，３９４，３７０号および第４，４７２，８４０号においてＪｅｆｆｅｒｉｅｓは、任意にグルタルアルデヒドと架橋される、コラーゲンおよびＤＢＭもしくは可溶化ＢＭＰの骨移植材料組成物を教示している。
【００１０】
米国特許第４，６２０，３２７号においてＣａｐｌａｎ等は、新しい骨もしくは軟骨形成を強化するために、可溶性骨蛋白質と、外因性骨移植片、同種移植片、生分解性素材および人工器官装置を含む骨修復／組込みに移植されるいくつかの固体との化学的架橋による組合せおよび部分的固定化について記載している。米国特許第４，６２３，５５３号においてＲｉｅｓ等は、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイトもしくはＴＣＰのグルタルアルデヒドもしくはホルムアルデヒド架橋について記載している。Ｒｉｅｓは、骨誘導要素を含まず、骨伝導性であるのみとみなされている。
【００１１】
何人かの研究者が、ＴＣＰおよび／またはポリアクチド、ポリグリコリドもしくはそれらのコポリマーなどのバイオポリマー、粒状骨誘導体もしくは脳顔面頭蓋再建のためのＢＭＰの複合材料の使用を提案してきた。ＴＣＰおよびバイオポリマーは、新しい骨形成のために骨組みを与えるであろう。骨誘導体およびＢＭＰは、ＴＣＰおよびバイオポリマーのみで誘導される遅く浅い骨伝導性以上の骨形成を誘導するであろう。Ｄｅｓｉｌｅｔｓ等。
【００１２】
ＰＣＴ  ＷＯ８９／０４６４６においてＪｅｆｆｅｒｉｅｓは、ＤＢＭもしくはＢＭＰをグルタルアルデヒドもしくは他の適宜の架橋剤で表面活性化させ、ついで多孔質固体マトリックスに添加することにより増大した引張強さを有する骨誘導移植材料を記載しているが、それにおいては活性化ＤＢＭもしくはＢＭＰは、固体と反応して複合材料の凝集強さを増大させる。Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓは、また治療過程の間緩やかな有利な放出のために、治療薬剤のマトリックスへの組込みを教示している。
【００１３】
この背景をかんがみると、ヒトを含む哺乳動物における骨成長を有効に誘導し保持する改善された骨形成組成物および方法に対する需要が、依然として存在する。本発明は、これらの需要に向けられている。
発明の要約
本発明は、一般にゼラチンペーストなどのペースト形キャリヤーおよびＢＭＰ−２もしくは他の類似骨形態発生蛋白質などの少なくとも１つの骨形成因子を含む骨形成ペースト組成物を提供する。本発明の特別な特徴は、再吸収性ペーストキャリヤーを含むペースト形組成物における骨芽細胞および破骨細胞刺激骨形成因子の包含が、キャリヤーの急速かつ尚早な再吸収を起こすという発見に関する。このキャリヤーの急速な再吸収が、ペースト形組成物の能力を減少もしくは削除して、組成物を充填した空隙において新しい骨形成を効果的に刺激し、保持することができる。これは、特に、新しい骨形成速度が比較的遅いヒトを含む霊長類の動物の場合である。
【００１４】
したがって、本発明の１つの好ましい実施態様は、霊長類の動物において新しい骨成長の誘導および保持に有効な骨形成ペースト組成物を提供する。移植組成物は、例えば、ゼラチン、ヒアルロン酸および／またはカルボキシメチルセルロースで作られたペーストを含む、再吸収性ペースト形キャリヤーを含む。組成物は、また骨芽細胞および破骨細胞の両方を刺激する骨形態発生蛋白質などの骨形成因子を有効量含む。さらに、組成物は、再吸収性ペーストキャリヤーが破骨細胞活性の刺激により増大した速度で再吸収されるときに、骨内方成長のための骨組みを与えるのに有効な粒状無機質をかなりの量含む。本発明の好ましいそのような組成物が提供されるが、それらにおいては再吸収性ペーストキャリヤーはゼラチンを含み、かつ再吸収性ペーストキャリヤーは、それが移植される哺乳動物の体温以上の温度で流動性であるが、該体温もしくはそれよりやや高い温度で比較的非流動性素材に転移する。
【００１５】
重要なことは、粒状無機質マトリックスは、骨内方成長に有効な骨組みを与えるために、全体としてペースト組成物のかなりの割合を構成する。ほとんどの場合、粒状無機質は、約０．００５〜約５．０ｍｍの平均粒度を有し、全組成物の約２０〜８０容量％、より典型的には約４０〜８０容量％の高レベルを構成する。粒状無機質は、例えば、天然もしくは合成無機質、例えば、骨粒子、Ｂｉｏｇｌａｓｓ（登録商標）、燐酸トリカルシウム、ヒドロキシアパタイト、二相性燐酸カルシウム、コラリンヒドロキシアパタイト、生体相溶性セラミックおよび非再吸収性生体相溶性有機ポリマーからなる群より選ばれる材料を含み得る。二相性燐酸カルシウムは、本発明の使用に特に好ましい合成セラミックであり、有利には、約８０：２０〜約９０：１０の燐酸トリカルシウム対ヒドロキシアパタイトの重量比を有する。
【００１６】
本発明を実施するいくつかの好ましい実施態様において、無機質は、約０．０５０〜約５．０ｍｍの平均粒度を有する格子状もしくは皮質の骨粒子を含む。そのような骨粒子は、ヒトもしくは非ヒト（例、ウシ）起源であり得る。他の実施態様において、無機質は、約０．５０〜約５．０ｍｍの平均粒度を有する燐酸トリカルシウム、二相性燐酸カルシウムもしくはヒドロキシアパタイトを含む。本発明のさらに別の側面において、ペースト組成物は、さらに無機質脱落骨マトリックスを含む。無機質脱落骨マトリックスと再吸収性キャリヤーとの重量比は、好ましくは約１：４〜約３：２である。
【００１７】
本発明の１つの特に好ましい形において、下記を含む、霊長類の動物における新しい骨成長の誘導のための骨形成ペースト組成物が提供される：
（ａ）ゼラチンを含む再吸収性ペーストキャリヤー（該再吸収性ペーストキャリヤーは、霊長類の動物の体温よりも高い温度で流動性であり、そのような体温で非流動性素材に転移ように処方されている）；
（ｂ）無機質脱落骨マトリックス；
（ｃ）骨芽細胞および破骨細胞を刺激する骨形態発生蛋白質、より好ましくはＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−７；および
（ｄ）約０．０５０〜約５．０ｍｍの平均粒度を有し、全移植組成物の約２０〜約８０容量％を構成する皮質もしくは格子状骨粒子。
【００１８】
本発明のさらに他の好ましい実施態様は、本発明の骨形成ペースト組成物を霊長類の動物において所望の新しい骨形成部位に移植する工程を含む、骨外傷、欠損もしくは病気の治療、あるいは哺乳動物における人工関節固定を実施するための方法を提供する。
【００１９】
本発明は、強固に骨誘導性であり、移植前もしくは外科的手順の間のいずれでも正確な形状に形成できる改善された骨形成移植材料を提供する。本発明は、また移植部位で安定した形状を保持し、骨形成が確立される前に移植部位から変形、移動もしくは流出しない移植材料を提供する。重要なことは、本発明は、また強化された骨誘導ポテンシャルを有し、移植の間活用できるマトリックを与えるが充填される空隙内に骨が確立される前に再吸収されない、有利な移植材料も提供する。そのような好ましい組成物は、新しい骨発生のための無機質の骨組みを与えるが、それはついで新しい骨が成熟するにつれて、骨マトリックス内に取り込まれる。本発明は、また骨形成が所望される箇所はどこであれ、骨外傷、病気および欠損を治療するために、そのような組成物の調製方法およびそのような組成物の使用方法も提供する。本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点は、下記記述から容易に明らかとなろう。
好ましい実施態様の説明
本発明の原理の理解を助成するために、これからいくつかの実施態様について言及するが、特定の言語は、同じものを記載するために使用される。しかしながら、本発明の範囲をなんら限定するつもりはなく、本明細書に説明される本発明の原理のそのような変更、改変および用途は、本発明が関与する業界の当業者が通常思い浮かべるように、企図されるものである。
【００２０】
上述のように、本発明は、一般にペースト形キャリヤーおよび骨形態発生蛋白質（ＢＭＰ）などの骨成長誘導量の骨形成因子を含む、骨形成ペースト組成物を提供する。本発明は、霊長類の動物における使用に有効な骨形成ペースト組成物を特徴とし、組成物は高骨誘導ポテンシャルを示し、骨の内方成長を保持する永続的な無機質の骨組みを与える。そのような好ましい組成物は、再吸収性ペースト形キャリヤー、例えば、ゼラチンを含む水性ペースト、および骨芽細胞（生物学的に骨形成を容易にする）および破骨細胞（生物学的に骨の再吸収を容易にする）の両方の作用を刺激する骨形成因子を含む。本発明によれば、そのような骨形成因子、例えば、骨形態発生蛋白質の有効誘導量の組込みは、破骨細胞を再吸収性キャリヤーがあまりにも速く再吸収される程のレベルまで刺激し、組成物の高無機質成分不在の下では、ある場合には組成物の性能をかなりの骨の内方成長が突発的である程までにしてしまうことが発見された。
【００２１】
したがって、本発明の特徴は、組成物中の骨形態発生蛋白質による破骨細胞の相乗作用により尚早に再吸収されない新しい骨形成の骨組みを与えるために、キャリヤーが急速に再吸収された後に移植部位にとどまる比較的遅く再吸収される無機質成分をかなりの量含むペースト形骨成長組成物の提供である。本発明は、またそのような骨形成組成物を、骨外傷、病気および欠損の治療、人工関節固定、および特にヒトを含む霊長類の動物において新しい骨形成が所望される他の治療のために使用する方法も提供する。
【００２２】
一般的に言えば、本発明による組成物は、ペーストの形であり、再吸収性キャリヤー、特にゼラチンペースト、および骨芽細胞と破骨細胞とを刺激するＢＭＰなどの骨形成因子、例えば、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−７、特にＢＭＰ−２、を含む。本発明の好ましい組成物は、またキャリヤー内に分散された粒状多孔質無機質マトリックスをかなりの量（すなわち、少なくとも約２０容量％）含む。そのような組成物は、また他の再吸収性成分、例えば、無機質脱落骨マトリックスも含み得る。
【００２３】
キャリヤーについては、本発明によれば、それは生物学的に再吸収性であり、骨の内方成長の候補部位でその移植および保持を可能とする組成物にペースト形を与えるのに貢献する。好ましいキャリヤーには、生物学的もしくは合成源からの再吸収性高分子、例えば、ゼラチン、ヒアルロン酸カルボキシメチルセルロース、コラーゲン、ペプチドなどが含まれる。より好ましい発明の形では、再吸収性キャリヤー、特にゼラチンは、組成物が、材料が移植される哺乳動物の体温よりも高い温度で流動性であるが、そのような体温もしくはそれよりやや高い温度で比較的非流動性に転移するように、組成物に処方される。再吸収性キャリヤーを、流動性状態が液体もしくは流動性ゲルであり、非流動性状態が安定したゲルもしくは固体であるように、組成物に処方することもできる。本発明のいくつかの実施態様において、再吸収性キャリヤーは、移植片を受ける種から誘導されるゼラチンであり、一方他のものにおいて、ゼラチンは、移植片を受ける哺乳動物以外の種から誘導される。
【００２４】
周知のように、ゼラチンが温かい、もしくは熱い水溶液に可溶化されると、分子は組織化をほとんど有さない。しかし、ゼラチン溶液が冷却されるにつれて、ゼラチン分子は、三次元マトリックスに絡み合い、溶液の粘度は増加する。特有な設定温度では、相転移は、流動性溶液を非流動性ゲルに変える。設定時間、設定温度および結果として得られる非流動性素材の密度は、ゼラチン濃度、分子量およびゼラチン分子の固有粘度を含むいくつかの要因、ならびに組成物のｐＨに依存する。組成物の他の成分は、設定時間および温度に影響を及ぼすことができる。最短設定時間は、典型的にゼラチン分子の等電点においてである。
【００２５】
上記節で示したように、他のキャリヤーをゼラチンの代わりに、もしくはそれに加えて使用して、ペースト組成物を与えることができる。これらの目的のための実例的高分子には、例えば、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、コラーゲン、ペプチドなどが含まれる。再吸収性増粘剤として機能するこれらおよび他の類似の材料は適切であり、本発明の組成物へのそれらの組込みは、本明細書の教示を与えられた当業者の理解範囲内にあろう。
【００２６】
本発明のペースト組成物は、また、例えば、無機質脱落骨マトリックス（ＤＢＭ）を含む他の潜在的骨誘導性物質も含み得る。当業界で既知のように、ＤＢＭは、骨の酸無機質脱落により調製でき、そのようにして調製されると、他の成分の間に骨と酸不溶性蛋白質とのコラーゲンマトリックスを含む。ＤＢＭは、それ自体ほどよく骨誘導性であると先に示したが、骨の内方成長にとって有利な多孔質マトリックスを有する。ＤＢＭの製造方法は、当業界で既知であり、したがって本明細書には詳細しない（例えば、この目的でその内容すべてが本明細書に取り込まれる米国特許第５，４０５，３９０号参照）。好ましい形において、約０．１０〜約１．００ｍｍの粒度を有するＤＢＭが、本発明の組成物内に取り込まれる。ＤＢＭは、移植材料が使用されるような同じもしくは異なる哺乳類種から誘導できる。使用されるときは、ＤＢＭは、好ましくは約１：４〜約３：２のＤＢＭ対再吸収性キャリヤーの重量比で、再吸収性キャリヤーとブレンドされる。市販のＤＢＭ配合物は、組成物の他の要素と均一にブレンドできるなら、本発明の使用に適する。
【００２７】
上で示されるように、本発明の好ましいペースト組成物は、また骨誘導蛋白質もしくはプロモータ（ウイルスベクターなどのベクターに与えられる）と操作的に組み合わされて骨形誘導蛋白質をコード化するヌクレオチド配列などの骨誘導因子、例えば、骨形態発生蛋白質もしくは有効量の蛋白質を生じるために動物の受容体において遺伝子の発言を推進するプロモータと操作上組み合わされて同蛋白質をコード化する遺伝子を含む。本発明による骨形態発生蛋白質（ＢＭＰ）は、骨芽細胞および破骨細胞の分化および機能を刺激できるＢＭＰならいずれでもよい。そのようなＢＭＰの例は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７で、より好ましくはｒｈＢＭＰ−２もしくはｒｈＢＭＰ−７、もっとも好ましくはｒｈＢＭＰ−２である。精製組換え型ＢＭＰｓは、高骨誘導ポテンシャルを与えるために発明の組成物の使用に好まれる。ＢＭＰ遺伝子配列ならびに組換え型および天然誘導ＢＭＰｓを生み出す方法は、当業界で既知であり、この主題に関して追加の情報は、例えば、下記のものが参照できる：米国特許第５，１０８，７５３号；第５，１８７，０７６号；第５，３６６，８７５号；第４，８７７，８６４号；第５，１０８，９２２号；第５，１１６，７３８号；第５，０１３，６４９号；第５，１０６，７４８号；および第４，２９４，７５３号；ならびに国際公開ＷＯ９３／００４３２号；ＷＯ９４／２６８９３；およびＷＯ９４／２６８９２号。骨誘導因子は、ＷＯ９９／０６５６３号に記載されるように、ＬＩＭ無機質脱落蛋白質（ＬＭＰ）もしくはプロモータと操業的に組み合わされて同蛋白質をコード化する遺伝子を取り込む適宜のベクターでもよい（ｇｅｎｂａｎｋ取得番号ＡＦ０９５５８５も参照）。そのようなベクターが本発明により骨形成因子として用いられるときは、好ましくは細胞、例えば、移植片の受容体からの自己細胞と結合して送られる。もっとも好ましくは、ベクターは、受容体の骨髄もしくは抹消血液から誘導される自己白血液細胞と結合して送られる。
【００２８】
骨形成因子は、動物受容体内で骨形成を刺激するのに有効な量で取り込まれる。蛋白質骨形成因子を取り込むより好ましい組成物において、骨形成因子は、全組成物に対して約１：１００〜約１：１０００、より好ましくは約１：１００〜約１：５００の重量比で取り込まれる。理解されるように、骨形成因子がヌクレオチド配列を含むときは、骨形成を誘導する部位で十分な蛋白質の発生を起こすために、十分な量のデリバリービヒクル（ベクター）が取り込まれて、細胞の有意な導入を起こす。
【００２９】
骨形成因子を、いかなる適宜の方法により、例えば、ペーストキャリヤーとのブレンドに先立って無機質粒子に骨形成因子を予備含浸させること、因子をキャリヤーとブレンドすること、もしくは両方により、ペーストに取り込むことができる。代替的に、もしくは追加として、移植の直前に、かなりの量の骨形成因子をキャリヤー／無機質混合物とブレンドすることもできる。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様により用いられる多孔質無機質には、再吸収性キャリヤーとして骨の内方成長のための骨組みを与えるのに有効な天然もしくは合成無機質が含まれ、移植組成物の他のもっと速く再吸収される要素は、再吸収される。実例として、無機質マトリックスは、骨粒子、Ｂｉｏｇｌａｓｓ（登録商標）、燐酸トリカルシウム、二相性燐酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、コラリンヒドロキシアパタイトおよび生体相溶性セラミックからなる群からの１つ以上の材料より選ばれる。二相性燐酸カルシウムは、本発明の使用に特に好ましい合成セラミックである。望ましくは、そのような二相性燐酸カルシウムは、約５０：５０〜約９５：５、より好ましくは約７０：３０〜約９５：５、さらに好ましくは約８０：２０〜約９０：１０、もっとも好ましくは約８５：１５の燐酸トリカルシウム対ヒドロキシアピタイトの重量比を有する。
【００３１】
本発明の別の好ましい側面において、無機質マトリックスは、約０．０５０〜５．０ｍｍの平均粒径を与えるように粉砕された、多分格子状だが好ましくは皮質の骨粒子を含む。ヒトおよび非ヒト両方の骨源が、本発明の使用に適し、骨は自己移植でも、同種移植でも、あるいは移植片を受ける哺乳動物にとってまったく異種移植でもよい。当業界で既知の適切な前処理を、無機質マトリックス内に骨粒子を用いるときに病気伝染および／または免疫抗原性反応の危険を最小限にするために、用いることができる。
【００３２】
本発明の１つの実施態様において、免疫抗原性を減少もしくは除去するために前処理された異種移植骨が、移植組成物に多孔質無機質マトリックスを与えるために用いられる。例えば、骨の焼成もしくは脱蛋白質化を、移植材料への免疫抗原性反応の危険を減少させるために用いることができる。
【００３３】
無機質が本発明の好ましい無機質強化組成物に取り込まれるレベルは、組成物への有利な骨誘導特性付与にとって重要である。一般に、最小限レベルの無機質が、組成物内のＢＭＰの活性に依存する；ＢＭＰの活性が高いほど、ＢＭＰの破骨細胞の相乗作用に逆らうために必要な無機質マトリックスの含有量が大きい。ＢＭＰ濃度が増加するにつれて、もし存在するなら再吸収性キャリヤーおよびＢＭＰの再吸収速度も増加する。結果として、無機質含有量は、組成物の構造的結合性を撤廃せずに新しい骨の内方成長のための骨組みを与えるに十分でなければならない。無機質は、また新しい骨が成熟するにつれて、無機質が組織マトリックスの一体部分となるか、もしくは骨の成長および発達の自然な過程で新しい骨の再建中に再吸収されるようであるべきである。
【００３４】
本発明の好ましい形において、無機質は、組成物の約２０〜約８０容量％、より好ましくは約４０〜約８０容量％を構成する。一般的に言って、ペースト組成物中の無機質の量は、骨の成長が所望される領域での骨組織形成に十分な期間患者の体内にとどまる骨組みを与えるのに十分なものであろう。典型的には、この期間は、約６〜約８週間である。
【００３５】
本発明の組成物のさらなる強化として、当業者は、他の骨形成強化因子を組成物に取り込むことができることを容易に理解するだろう。そのような追加の因子には、限定はされないが、ホスト相溶性骨形成先祖細胞、自己移植骨髄、同種移植骨髄、形質転換成長因子ベータ、骨芽細胞成長因子、血小板誘導成長因子、インシュリン様成長因子、マイクログロブリンベータ、抗生物質、抗菌剤、湿潤剤、グリセロール、ステロイドおよび非ステロイド抗炎症性化合物が含まれる。
【００３６】
使用において、本発明のペースト形移植組成物は、例えば、病気、欠損もしくは外傷の箇所を治療するため、および／または人工関節固定を助成するために、骨の成長が所望される部位に移植される。組成物のペースト形が、空隙、欠損もしくは新しい骨の成長が所望される他の領域内で、配置、造形および／または成形を可能とする。それらが移植される哺乳動物の体温よりも高い温度で流動性であるが、そのような体温もしくはそれに近い温度で非流動性素材に転移する移植組成物の場合、組成物は、それが流動性であるが、存在する骨形成因子を変性させない温度まで加熱され；所望の新しい骨の形状に成形もしくは造形され；骨形成移植材料を、固化後所望の新しい骨形成の部位にある、あるいは移植される非流動性素材に転移するのに十分な温度まで冷却される。他の好ましい状態では、ペースト組成物は、流動性のために体温（約３７℃）以上まで加熱されることを必要とせず、例えば、その場合ペースト組成物は、３７℃以下の温度で流動性であり、加熱で、もしくは別の硬化剤との接触で非流動性素材に硬化もしくは固化する。そのような場合は、骨形成因子の熱誘導変性があまり重要でない点で特に有利である。
【００３７】
いったん位置につくと、本発明のペースト形移植組成物は、例えば、齧歯類の動物もしくはラビットなど、小動物に比べて比較的遅い骨形成速度を示すヒトなどの霊長類の動物被検者においてすら、骨の内方成長を効果的に誘導し、所望の領域に保持する。特に、ペーストキャリヤーは一般的に比較的速く再吸収されるが、かなりの無機質成分は、所望の領域に新しい骨成長を保持するための骨組みとしてとどまる。これに関し、無機質マトリックスが、骨で充填される容積で骨組織を形成するのに十分な期間、典型的には約６〜約８週間、治療被検者に検出できる骨組みを与える量で選ばれ、含まれることが好ましい。これは、ペーストの再吸収性キャリヤーおよび他の速再吸収成分が移植部位から急速に削除されるところですら、効果的な骨形成を容易にする。
【００３８】
本発明の組成物は、中庸もしくは低レベルに血管化される骨もしくは骨部分に使用されるときに、特に有利である。これらの領域は、特に低い骨形成速度を示し、そんなわけでキャリヤーの急速な再吸収は、困難を強化する。中庸もしくはわずかに血管化される部位の例には、例えば、脊椎の横突起もしくは他の後要素、長骨の骨幹、特に脛骨の中骨幹、および頭蓋欠損が含まれる。
【００３９】
本発明のペースト組成物の特に好ましい用途は、例えば、椎体間、後／後外側融合技術を含む、ヒトもしくは他の霊長類の動物における脊椎融合の椎骨間の関節固定を助成するための移植片としてである。霊長類の動物の脊椎における骨形成速度は、全体として比較的遅く、かくて一般に本発明から恩恵を受けるが、後／後外側融合で融合される要素は、特に低レベルの血管化を示し、かくてこれらの要素の融合は、本発明から著しく恩恵を受けると推測される。さらに、本発明の他の側面によれば、本発明の骨形成ペースト組成物を、融合ケージ、合釘、もしくはポケットを有する他の装置、チャンバーもしくは骨形成組成物を含有するための他の腔などの耐力（例、少なくとも約１００００Ｎの圧縮強さを有する）移植装置の上もしくは周りに取り込むことができ、椎体間融合などの脊椎融合に使用できる。
【００４０】
本発明を、これから下記の具体的な実施例を参照してより具体的に説明する。これらの実施例は実例としてであり、本発明を限定するものではないことは、理解されよう。
実施例Ｉ
コラーゲン誘導ゼラチンおよび無機質脱落骨マトリックス（ＤＢＭ）からなるマトリックスの骨形成能力についてｒｈＢＭＰ−２効果を比較するラット研究
体重２００〜２２０ｇの若い成長した雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット３０匹を、無作為に２つの群に割り当てた。各動物に、６個の０．０５０ｍＬ試料を外科移植した。試料は、中心線の両側のまっすぐな腹部筋肉内に切り込んだポケットに挿入された。試料を、胸骨の下から中鼠径部へと延びる線に等間隔を取った１つの側に、３個配置した。
【００４１】
各動物の６個の試料のうち２個は、陽性対照であり、１個はＤＢＭのみ、２番目は０．００４ｍｇのｒｈＢＭＰ−２が吸着されたＨｅｌｉｓｔａｔ（登録商標）Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｓｐｏｎｇｅ（ＡＣＳ）だった。群Iの動物には、ゼラチン／ＤＢＭ注射可能マトリックス（Ｇｅｌａｔｉｎ  Ｂｏｎｅ  Ｐａｓｔｅ）の二重試料および０．００１ｍｇのｒｈＢＭＰ−２と混合したゼラチン骨ペーストの二重試料も与えた。群ＩＩの動物には、０．００２ｍｇのｒｈＢＭＰ−２と混合したゼラチン骨ペーストの二重試料および０．００２ｍｇのｒｈＢＭＰ−２と混合したＤＢＭ（ゼラチン）なしのゼラチンの二重試料を与えた。
【００４２】
各群の動物５匹を、それぞれ２日、１４日および２１日のタイムポイントで犠牲にした。犠牲に際し、移植領域を切開し、アルカリ性ホスファターゼ活性、放射線透過写真、骨密度、組織学および組織体型測定について分析した。
【００４３】
図１は、試料におけるアルカリ性ホスファターゼ活性を示す。増大した活性は、骨先祖細胞による移植片の浸潤を示す。増大活性のタイミングおよび大きさは、移植片の骨誘導ポテンシャルの証拠である。ｒｈＢＭＰ−２を有するゼラチン骨ペースト試料は、対照もしくはゼラチン骨ペーストのみよりも早く、高いアルカリ性ホスファターゼ活性ピークを示した。驚くべきことに、０．００１ｍｇのｒｈＢＭＰ−２試料は、０．００２ｍｇのｒｈＢＭＰ−２試料よりも高い活性ピークを与えた。
【００４４】
図２は、切開移植片のカルシウム含有量を示す。増大したカルシウム含有量は、骨形成を示す。アルカリ性ホスファターゼデータについては、ｒｈＢＭＰ−２を有するゼラチン骨ペースト試料は、移植片の石灰化を始めることにおいて、対照およびｒｈＢＭＰ−２試料なしのゼラチン骨ペーストの両方をしのいだ。もう１つ驚くべきことは、ゼラチン骨ペースト試料中の０．００１ｍｇのｒｈＢＭＰ−２は、ゼラチン骨ペースト試料試料中の０．００２ｍｇのｒｈＢＭＰ−２よりも石灰化開始において効果的だったことである。また、ｒｈＢＭＰ−２の高濃度の２１日試料が、１４日試料に比べて石灰化の減少を示したことも注目に値する。
【００４５】
これらのデータは、骨芽細胞刺激特性のバランスをとるｒｈＢＭＰ−２の破骨細胞の相乗作用を示す；高ｒｈＢＭＰ−２濃度は、無機質マトリックス要素を取り込まないで骨形成プロセスに長引いた骨組みを与えるそのようなマトリックスの骨形成ポテンシャルを制限して、本質的にコラーゲンマトリックスの再吸収を刺激する。０．００４ｍｇのｒｈＢＭＰ−２を含むＡＣＳ対照および０．００２ｍｇのｒｈＢＭＰ−２を含むゼラチン試料が、もっとも容易に再吸収されるマトリックスを有し、ｒｈＢＭＰ−２を含む試料に対してもっとも劣った石灰化性能を与えたことを注目すべきである。図２参照。
実施例２
移植マトリックスを含むｒｈＢＭＰ−２の骨形成を比較するサルの研究
サルの脊椎融合モデルにおける研究が、３つのペースト組成物の効果を決定するために実施された。組成物は、実施例１のゼラチン骨ペースト、自己移植骨チップを含むペースト、および脊椎の単一レベルでｒｈＢＭＰ−２を含むペーストだった。各組成物を、アカゲザルの椎骨の両側融合に使用し、新しい骨形成を誘導するその能力について分析した。それを実施することにおいて、ＣＴスキャンを６ヶ月間に渡って２ヶ月ごとに取った。結果は、実施例１のペーストのみを受けるサルにおいて、および自己移植骨チップを含むペーストにおいて可変の骨成長を示したが、ペーストおよびｒｈＢＭＰ−２を受けるサルにおいてはなんら成長を示さなかった。この観察は、骨成長にマトリックスを残さない、ｒｈＢＭＰ−２含有ペースト内のキャリヤーの尚早な再吸収によるものと推測される。したがって、本発明によるＢＭＰ含有ペーストへのかなりの無機質成分の組込みは、骨の内方成長のために永続的なマトリックスおよび骨組みを与え、かくて性能を向上させる。
【００４６】
本発明を、好ましい実施態様を具体的に参照して、上に詳述した。しかし、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された手順に対して種々の改変および追加がなされ得ることは理解されよう。そのような改変および追加は、保護されることが望まれる。さらに、本明細書に引用された全出版物は、関連業界の技能レベルを示し、個々に取り込まれて十分に記載されるかのように、それぞれのその内容すべてが本明細書に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  無機質脱落骨マトリックス、ゼラチンおよび無機質脱落骨マトリックスのペースト、ならびにコラーゲンスポンジ、ゼラチンおよび無機質脱落骨マトリックスのペーストそれぞれとゼラチンのみのペーストにおけるｒｈＢＭＰ−２の筋肉内ラット移植についての時間の機能としてのｅｘ  ｖｉｖｏアルカリ性ホスファターゼ活性を示す。
【図２】  無機質脱落骨マトリックス、ゼラチンおよび無機質脱落骨マトリックスのペースト、ならびにコラーゲンスポンジ、ゼラチンおよび無機質脱落骨マトリックスのペーストそれぞれとゼラチンのみのペーストにおけるｒｈＢＭＰ−２の筋肉内ラット移植についての時間の機能としての膨張小骨のカルシウム含有量を示す。
【図１】
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【図２】
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