(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性関節リウマチおよび重症筋無力症からなる群より選択される自己免疫疾患を治療するための医薬組成物であって、前記自己免疫疾患に罹患している対象を治療するために有効な量で、コポリマー１を含む医薬組成物。
【請求項２】
請求項１の医薬組成物であって、当該自己免疫疾患が慢性関節リウマチである組成物。
【請求項３】
請求項１の医薬組成物であって、当該自己免疫疾患が重症性筋無力症である組成物。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか1項の医薬組成物であって、当該コポリマー１の量が少なくとも５ｍｇである組成物。
【請求項５】
請求項４の医薬組成物であって、当該コポリマー１の量が少なくとも１０ｍｇである組成物。
【請求項６】
請求項５の医薬組成物であって、当該コポリマー１の量が少なくとも１５ｍｇである組成物。
【請求項７】
請求項６の医薬組成物であって、当該コポリマー１の量が少なくとも２０ｍｇである組成物。
【請求項８】
請求項１〜３の何れか1項の医薬組成物であって、当該コポリマー１の量が１日につき当該対象の１ｋｇ当たり２５〜２６０μｇである組成物。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか1項の医薬組成物であって、当該医薬組成物が経口的に、局所的にまたは注射により投与される組成物。
【請求項１０】
請求項９の医薬組成物であって、当該医薬組成物が経口的に投与される組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【関連出願】
本願では、仮出願、１９９８年７月２３日出願の６０／０９３，８５９、１９９８年９月２５日出願の６０／１０１，８２５、１９９８年１０月２日出願の６０／１０２，９６０、１９９８年１０月３０日出願の６０／１０６，３５０、および１９９８年１１月１２日出願の６０／１０８，１８４の恩典を請求する1999年7月23日出願のＰＣＴ／ＵＳ９９／１６７４７の恩恵を請求し、これら全ては引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００２】
【政府支援】
本発明は国立衛生研究所が認めたＣＡ４７５５４の下、一部政府後援を受けたものである。
【０００３】
【緒論】
本発明は治療上有効な量の、共重合体１に関連するペプチドまたはポリペプチドを使用する自己免疫疾患を治療するための組成物および方法を提供する。共重合体１はチロシン、アラニン、グルタミン酸およびリジンの合成ランダム線状共重合体の異種混合物であり、適当な治療的用量かつ平均分子サイズで多発性硬化症の治療に使用される。合成ランダム線状共重合体のかかる混合物が共重合体１に見られる４種のアミノ酸のうち３種から本質的になる場合、それらを三元共重合体とよぶ。本発明は一部三元共重合体に関する。好ましくは、三元共重合体はチロシン、アラニンおよびリジンから、またはグルタミン酸、チロシンおよびリジンから、またはグルタミン酸、アラニン、およびリジンからなっている。驚くべきことに、三元共重合体は様々な自己免疫疾患の治療に効力を有し、クラスII主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、ならびに抗原提示細胞と結合する。
【０００４】
【発明の背景】
自己免疫疾患は、生物の免疫系が生物自身のいくつかの組織を「自己」として認識せず、それらを「異物」として攻撃する場合に起こる。通常、自己寛容は発生事象により早期に免疫系内に起こり、生物自身のＴ細胞およびＢ細胞が生物自身の組織と反応することを防いでいる。ＭＨＣ細胞表面タンパク質がＴ細胞と結合し、処理されたペプチドをＴ細胞へ提供することによってこれらの初期免疫応答を調節する手助けをしている。
【０００５】
自己免疫疾患が発現するとこの自己寛容工程は破綻を来す。すぐに生物自体の組織およびタンパク質が「自己抗原」として認識され、生物の免疫系によって攻撃される。例えば、多発性硬化症は免疫系が、神経をおおい、それを保護する働きをするミエリン鞘を攻撃する際に起こる自己免疫疾患であると考えられている。それは脱髄に次ぎ、ニューロンおよび運動機能の喪失を特徴とする進行性疾患である。慢性関節リウマチ（“ＲＡ”）もまた滑膜細胞関節の慢性炎症および活性化Ｔ細胞、マクロファージならびに形質細胞による侵入をはじめとする自己免疫疾患であり、関節軟骨の進行性破壊をもたらすと考えられている。それは最も過酷な関節症である。慢性関節リウマチで攻撃される自己抗原にはコラーゲンII型が候補ではあるが、その性質はあまり分かっていない。
【０００６】
多発性硬化症および慢性関節リウマチが発現する傾向は受け継がれる−これらの疾患は１以上の特異なＭＨＣクラスII対立遺伝子を有する個体でより頻繁に起こる。例えば、受け継いだ慢性関節リウマチ罹病性はＭＨＣクラスII  ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４、またはＤＲＢ１＊０４０５、またはＤＲＢ１＊０１０１対立遺伝子と強く関連している。組織適合遺伝子座抗原（ＨＬＡ）は細胞表面上に見られ、様々な人々の組織の個体性を決定する手助けをする。組織適合遺伝子座抗原の遺伝子は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と同じ染色体６番の領域に位置している。ＭＨＣ領域は体の様々な細胞において数多くの特有のクラスの分子を発現し、その遺伝子は染色体に沿った配列の順番に、クラスＩ、IIおよびIII  ＭＨＣ遺伝子、においてある。クラスＩ遺伝子はＨＬＡ遺伝子からなり、これはさらにＡ、ＢおよびＣ亜区へと細かく分かれる。クラスII遺伝子はＤＲ、ＤＱおよびＤＰ亜区へと細かく分かれる。ＭＨＣ−ＤＲ分子が最もよく知られており、これらはマクロファージ、リンパ系組織の樹状細胞および表皮細胞などの抗原提示細胞の表面に現れる。クラスIII  ＭＨＣ産物は補体系の様々な成分において、ならびにいくつかの非免疫関連細胞において発現される。
【０００７】
ステロイド系ならびに非ステロイド系抗炎症薬（例えば、メトトレキサート）、様々なインターフェロン、およびプロスタグランジン合成のある阻害剤などの数多くの治療薬が自己免疫疾患を治療するために開発されてきた。しかしながらこれらの薬剤は短期間の使用以外では毒性があり、所望でない副作用が生じる可能性がある。その他の治療薬は結合し、および／または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、の炎症性活性を阻害するが、例えば抗ＴＮＦ特異的抗体もしくは抗体断片、またはＴＮＦ受容体の可溶型が、これらの薬剤はＴ細胞表面上のタンパク質を標的とし、一般に抗原提示細胞（ＡＰＣ）との相互作用を妨げる。しかしながら、天然の折り畳まれたタンパク質を含む治療用組成物は、多くの場合、生産、処方、保存および送達させることが難しい。さらに、免疫系の生来の異質性が薬剤の有効性を限定し、自己免疫疾患の長期治療を面倒なものにする。
【０００８】
よって、自己免疫疾患およびその他の免疫疾患を効果的に治療するため、本治療薬の副作用がなく、かつ免疫系の生来の異質性に十分に取り組んだ新規薬剤が必要とされる。
【０００９】
【参照文献】
0004800481.tif 000002
【００１０】
【発明の概要】
驚くべきことに、共重合体１および本発明の三元共重合体を使用して、異種の患者群における様々な自己免疫疾患を治療することができる。これらの三元共重合体は、これらの疾患が進行するにつれて自己抗原を攻撃するＴ細胞のいくつかの生理学的応答を阻害することができる。さらに、共重合体１および本発明の三元共重合体ならびにコペプチドはいろいろな遺伝学的バックグラウンドの抗原提示細胞と、並びに免疫細胞認識を妨害するおよび攻撃するいくつかのクラスII  ＭＨＣ分子と高親和性で結合する。さらに三元共重合体およびコペプチドは共重合体１特異的Ｔ細胞の増殖および機能を刺激し、さらに様々な自己免疫疾患を治療し、予防することができる。
【００１１】
よって、本発明は共重合体１を含んでなるアミノ酸群、すなわち、共重合体１に見られる適当な相対モル比のグルタミン酸、アラニン、リジン、およびチロシン、から選択される３種の異なるアミノ酸を含むポリペプチドを有する薬組成物を提供する。
【００１２】
本発明はまたアミノ酸、チロシン、アラニンおよびリジンから本質的になる、約０．００５〜約０．２５０チロシン、約０．３〜約０．６アラニン、かつ約０．１〜約０．５リジンのモル比の治療上有効な量の三元共重合体および医薬上許容される担体を含む医薬組成物にも向けられる。この三元共重合体が実質的にグルタミン酸を含まないことが好ましい。
【００１３】
本発明はさらに、グルタミン酸、チロシンおよびリジンから本質的になる、約０．００５〜約０．３００グルタミン酸、約０．００５〜約０．２５０チロシン、かつ約０．３〜約０．７リジンのモル比の治療上有効な量の三元共重合体および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。この三元共重合体が実質的にアラニンを含まないことが好ましい。
【００１４】
本発明はまたアミノ酸、チロシン、グルタミン酸およびアラニンから本質的になる、約０．００５〜約０．２５チロシン、約０．００５〜約０．３グルタミン酸、かつ約０．００５〜約０．８アラニンのモル比の治療上有効な量の三元共重合体および医薬上許容される担体を含む医薬組成物にも向けられる。この三元共重合体が実質的にリジンを含まないことが好ましい。
【００１５】
本発明はまた、グルタミン酸、アラニンおよびリジンから本質的になる、約０．００５〜約０．３グルタミン酸、約０．００５〜約０．６アラニン、かつ約０．２〜約０．７リジンのモル比の治療上有効な量の三元共重合体および医薬上許容される担体を含む医薬組成物も提供する。この三元共重合体が実質的にチロシンを含まないことが好ましい。
【００１６】
本発明はまた、自己免疫疾患を治療するための医薬組成物であって、グルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから本質的になる治療上有効な量の共重合体１またはポリペプチド、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
【００１７】
本発明はさらに、哺乳類における自己免疫疾患を治療および予防するための方法であって、共重合体１、または三元共重合体を含む治療上有効な量の組成物を投与することを含む方法を提供する。もう１つの態様では、哺乳類における自己免疫疾患を治療するための方法はさらに免疫攻撃に関連するＴ細胞の増殖を阻害することを含む。もう１つの態様では、哺乳類における自己免疫疾患を治療するための方法は三元共重合体またはコペプチドと抗原提示細胞とを結合させることを含む。さらにもう１つの態様では、哺乳類における自己免疫疾患を治療するための方法は三元共重合体と、自己免疫疾患に関連する主要組織適合遺伝子複合体クラスIIタンパク質とを結合させることを含む。
【００１８】
本発明で意図する自己免疫疾患として、関節炎疾患、脱髄疾患および炎症性疾患が挙げられる。例えば、本組成物で治療することのできる自己免疫疾患には、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、クローン病、慢性自己免疫性血小板減少性紫斑病、大腸炎、接触性過敏症、真性糖尿病、グレーヴズ病、ギラン−バレー症候群、橋本病、特発性粘液水腫、重症性筋無力症、乾癬、尋常性天疱瘡、慢性関節リウマチまたは全身性紅斑性狼瘡がある。本組成物は、これらの１種以上の疾患を治療に使用することができる。
【００１９】
【発明の詳細な記述】
本発明に従い、直線形態でランダム重合した、少なくとも３種の異なるアミノ酸を有するポリペプチドは自己免疫疾患を治療するためには有用である。自己免疫疾患は免疫系が不適当にある組織または細胞を攻撃に応答可能な場合に起こる。本発明のポリペプチドおよびペプチドは、例えば攻撃を担うＴまたはＢ細胞の増殖もしくは働きを抑制することによるか、または組織を構成する細胞表面上のＭＨＣタンパク質と結合することにより組織を攻撃から保護することによって免疫系の攻撃を妨げることができる。
【００２０】
本発明のアミノ酸として、限定されるものではないが、一般に存在する２０のアミノ酸が挙げられる。また天然に存在するものおよび合成誘導体、例えばセレノシステインも含まれる。さらにアミノ酸にはアミノ酸類似体が含まれる。アミノ酸「類似体」は違った配置を有するアミノ酸の化学的に同類形、例えば異性体、またはＬ−配置よりもＤ−配置、または適当なサイズおよび形のアミノ酸を含む有機分子、またはペプチド結合に関連する原子に修飾を受けたアミノ酸であり、ポリペプチドにおける重合の際にはプロテアーゼに耐える。
【００２１】
本明細書および請求項において定義される「アミノ酸」および「アミノ酸配列」には、その配列によって示される天然に存在する２０のアミノ酸の１以上のいずれの残基の一部または全てを含有するアミノ酸誘導体および／またはアミノ酸類似体である１以上の成分を含むことができる。例えば、１以上のチロシン残基を有するアミノ酸配列では、それらの１以上の残基の一部をホモチロシンで置換することができる。さらに、隣接した２つの残基間に１以上の非ペプチドまたはペプチド様結合を有するアミノ酸配列はこの定義に含まれる。
【００２２】
１文字および３文字のアミノ酸コード（および各々が示すアミノ酸）は次の通りである：Ａはａｌａ（アラニン）を意味し；Ｃはｃｙｓ（システイン）を意味し；Ｄはａｓｐ（アスパラギン酸）を意味し；Ｅはｇｌｕ（グルタミン酸）を意味し；Ｆはｐｈｅ（フェニルアラニン）を意味し；Ｇはｇｌｙ（グリシン）を意味し；Ｈはｈｉｓ（ヒスチジン）を意味し；Ｉはｉｌｅ（イソロイシン）を意味し；Ｋはｌｙｓ（リジン）を意味し；Ｌはｌｅｕ（ロイシン）を意味し；Ｍはｍｅｔ（メチオニン）を意味し；Ｎはａｓｎ（アスパラギン）を意味し；Ｐはｐｒｏ（プロリン）を意味し；Ｑはｇｌｎ（グルタミン）を意味し；Ｒはａｒｇ（アルギニン）を意味し；Ｓはｓｅｒ（セリン）を意味し；Ｔはｔｈｒ（トレオニン）を意味し；Ｖはｖａｌ（バリン）を意味し；Ｗはｔｒｐ（トリプトファン）を意味し；およびＹはｔｙｒ（チロシン）を意味する。
【００２３】
「疎水性」アミノ酸とは、本明細書および請求項において脂肪族アミノ酸、アラニン（Ａまたはａｌａ）、グリシン（Ｇまたはｇｌｙ）、イソロイシン（Ｉまたはｉｌｅ）、ロイシン（Ｌまたはｌｅｕ）、プロリン（Ｐまたはｐｒｏ）、およびバリン（Ｖまたはｖａｌ）（括弧内はそれぞれのアミノ酸の１文字および３文字標準コード略語）、および芳香族アミノ酸、トリプトファン（Ｗまたはｔｒｐ）、フェニルアラニン（Ｆまたはｐｈｅ）、およびチロシン（Ｙまたはｔｙｒ）と定義される。タンパク質内に残基として見られる場合、アミノ酸は脂肪族側鎖の長さおよび芳香族側鎖のサイズの関数として疎水性を与える。
【００２４】
「荷電」アミノ酸とは、本明細書および請求項においてこれらの残基を含むタンパク質の水溶液中、生理学的ｐＨ値において陽（ｈｉｓ、ｌｙｓおよびａｒｇ）電荷または陰（ａｓｐおよびｇｌｙ）電荷を与えるアミノ酸、アスパラギン酸（Ｄまたはａｓｐ）、グルタミン酸（Ｅまたはｇｌｕ）、ヒスチジン（Ｈまたはｈｉｓ）、アルギニン（Ｒまたはａｒｇ）およびリジン（Ｋまたはｌｙｓ）と定義される。
【００２５】
本発明により意図されるポリペプチド組成物
本発明のポリペプチドは共重合体１および、共重合体１の４種のアミノ酸、すなわちチロシン、グルタミン酸、アラニンおよびリジンのうち３種から本質的になる三元共重合体を含んでなる。しかしながら、当業者によって、本発明の精神を逸脱することなく、構造的に同類のおよび／または電荷的に同類のアミノ酸を容易に置換することができる。よって本発明はさらに本ポリペプチド中のチロシン、グルタミン酸、アラニンおよびリジンに代わる保存的アミノ酸代替物を意図する。かかる保存的代替物はチロシン、グルタミン酸、アラニンまたはリジンと電荷、疎水性およびサイズがほぼ同じであるそれらのアミノ酸などの構造的に同類のアミノ酸代替物である。例えば、リジンはアルギニンおよびヒスチジンと構造的に同類であり；グルタミン酸はアスパラギン酸と構造的に同類であり；チロシンはセリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびトリプトファンと構造的に同類であり；およびアラニンはバリン、ロイシンおよびイソロイシンと構造的に同類である。保存的代替物および構造的に同類の合成アミノ酸などのこれらのおよびその他のを本発明により意図される。
【００２６】
さらに三元共重合体はｌ−またはｄ−アミノ酸からなっていてもよい。当業者には知られているように、ｌ−アミノ酸は大抵の天然タンパク質に存在する。しかしながら、ｄ−アミノ酸は商業的に入手可能であり、三元共重合体を製造するために用いるアミノ酸のうちいくつかまたは全てに代えて用いてもよい。本発明はｄ−およびｌ−アミノ酸混合物から形成した三元共重合体、ならびにｌ−またはｄ−アミノ酸のいずれかから本質的になる三元共重合体を意図する。
【００２７】
三元共重合体におけるアミノ酸の平均分子量および平均モル分率は様々であってよい。しかしながら、平均分子量の範囲は約２，０００〜約４０，０００ダルトンであると考えられる。好ましい平均分子量の範囲および三元共重合体製造工程については米国特許第５，８００，８０８号で記載され、これは引用することにより本明細書の一部とされる。
【００２８】
１つの態様において、本発明はチロシン、アラニンおよびリジンを含む三元共重合体を提供する。これらの三元共重合体中のアミノ酸の平均モル分率は様々であってよく、例えばチロシンが約０．００５〜約０．２５０のモル分率で存在し；アラニンが約０．３〜約０．６のモル分率で存在し；かつリジンが約０．１〜約０．５のモル分率で存在してもよい。平均分子量は約２，０００〜約４０，０００ダルトンの間であり、好ましくは約３，０００〜約３５，０００ダルトンの間である。さらに好ましい態様において、平均分子量は約５，０００〜約２５，０００ダルトンである。
【００２９】
もう１つの態様において、本発明はチロシン、グルタミン酸およびリジンを含む三元共重合体を提供する。これらのポリペプチド中のアミノ酸の平均モル分率は様々であってよく、例えばグルタミン酸が約０．００５〜約０．３００のモル分率で存在し；チロシンが約０．００５〜約０．２５０のモル分率で存在し；かつリジンが約０．３〜約０．７のモル分率で存在してもよい。平均分子量は約２，０００〜約４０，０００ダルトンの間であり、好ましくは約３，０００〜約３５，０００ダルトンの間である。さらに好ましい態様において、平均分子量は約５，０００〜約２５，０００ダルトンである。
【００３０】
もう１つの態様において、本発明はグルタミン酸、アラニンおよびリジンを含む三元共重合体を提供する。これらのポリペプチド中のアミノ酸の平均モル分率は様々であってよく、例えばグルタミン酸が約０．００５〜約０．３００のモル分率で存在し；アラニンが約０．００５〜約０．６００のモル分率で存在し；かつリジンが約０．２〜約０．７のモル分率で存在してもよい。平均分子量は約２，０００〜約４０，０００ダルトンの間であり、好ましくは約３，０００〜約３５，０００ダルトンの間である。さらに好ましい態様において、平均分子量は約５，０００〜約２５，０００ダルトンである。
【００３１】
もう１つの態様において、本発明はチロシン、グルタミン酸およびアラニンを含む三元共重合体を提供する。これらのポリペプチド中のアミノ酸の平均モル分率は様々であってよく、例えばチロシンが約０．００５〜約０．２５０のモル分率で存在し；グルタミン酸が約０．００５〜約０．３００のモル分率で存在し；かつアラニンが約０．００５〜約０．８００のモル分率で存在してもよい。平均分子量は約２，０００〜約４０，０００ダルトンの間であり、好ましくは約３，０００〜約３５，０００ダルトンの間である。さらに好ましい態様において、平均分子量は約５，０００〜約２５，０００ダルトンである。
【００３２】
さらに好ましい態様において、三元共重合体のアミノ酸のモル分率は共重合体１に対しても好ましいものである。共重合体１中のアミノ酸のモル分率はグルタミン酸（約０．１４）、アラニン（約０．４３）、チロシン（約０．１０）およびリジン（約０．３４）である。共重合体１の最も好ましい平均分子量は約５，０００〜約９，０００ダルトンの間である。
【００３３】
より好ましい三元共重合体のモノマー、グルタミン酸、アラニンおよびチロシンのモル比は約０．２１：約０．６５：約０．１４である。
【００３４】
より好ましい三元共重合体のモノマー、グルタミン酸、アラニンおよびリジンのモル比は約０．１５：約０．４８：約０．３６である。
【００３５】
より好ましい三元共重合体のモノマー、グルタミン酸、チロシンおよびリジンのモル比は約０．２６：約０．１６：約０．５８である。
【００３６】
より好ましい三元共重合体のモノマー、チロシン、アラニンおよびリジンのモル比は約０．１０：約０．５４：約０．３５である。
【００３７】
１つの態様において、本発明の三元共重合体は、好ましくは自己免疫疾患に関連するＭＨＣクラスIIタンパク質と結合可能である。入手可能ないずれの方法を用いても、三元共重合体が１以上のＭＨＣクラスIIタンパク質と結合するかどうかを確かめることができる。例えば、ポリペプチドをリポーター分子（放射性核種またはビオチンなど）で標識し、未精製または純粋なＭＨＣクラスIIタンパク質調整物と混合し、結合していないポリペプチドを除去した後、リポーター分子がＭＨＣクラスIIタンパク質と接触していれば、結合は検出される。
【００３８】
もう１つの態様において、本発明の三元共重合体は、多発性硬化症に関連するＭＨＣクラスIIタンパク質と結合可能である。この態様のポリペプチドは多発性硬化症に関連するＭＨＣクラスIIタンパク質の抗原結合溝に対して共重合体１と同様か、またはより高い親和性を有している。よって、意図するポリペプチドはミエリン自己抗原の結合を阻害するか、またはその結合をＭＨＣクラスIIタンパク質から置き換えることができる。多発性硬化症に関連する１つのＭＨＣクラスIIタンパク質はＨＬＡ−ＤＲ４（ＤＲＢ１＊１５０１）である。
【００３９】
もう１つの態様において、本発明の共重合体１、および三元共重合体は、関節炎疾患、例えば慢性関節リウマチまたは骨関節炎に関連するＭＨＣクラスIIタンパク質と結合可能である。この態様の共重合体１、または三元共重合体は自己免疫疾患に関連するＭＨＣクラスIIタンパク質の抗原結合溝に対してII型コラーゲン２６１−２７３（配列番号３）ペプチドより高い親和性を有している。よって、意図する共重合体１、または三元共重合体はII型コラーゲン２６１−２７３ペプチドの結合を阻害するか、またはそれをＭＨＣクラスIIタンパク質の抗原結合溝から置き換えることができる。クラスII  ＭＨＣタンパク質はほぼ同サイズのαおよびβサブユニットからなり、その双方は膜貫通タンパク質である。ペプチド結合断面はαおよびβサブユニット双方のアミノ末端部分により生ずる。このペプチド結合断面は抗原のＴ細胞への提示部分である。少なくとも３種のタイプのクラスII  ＭＨＣ分子：ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰ分子がある。またそれぞれのタイプのこれらのＨＬＡ分子をコードする数多くの対立遺伝子がある。クラスII  ＭＨＣ分子はＢリンパ球およびマクロファージのような抗原提示細胞の表面で優れた発現がなされる。
【００４０】
本発明の三元共重合体を医薬上許容される担体を含む医薬組成物へ処方することができる。本明細書において用いられる「医薬上許容される担体」には、溶剤、分散媒、コーティング剤、抗菌ならびに抗真菌剤、等張ならびに吸収遅延剤、甘味剤等のいずれかまたは全てが含まれる。医薬上許容される担体は限定されるものではないが、香味剤、甘味剤および特定の治療用組成物を調製するために必要とされる緩衝剤および吸収剤などの多方面にわたる材料をはじめとする広範な材料から調製してもよい。
【００４１】
かかる材料と医薬上有効な物質との併用は当技術分野では十分に公知である。いずれの通常の材料または薬剤が有効成分と不相溶である場合を除き、治療用組成物におけるその使用が考えられる。また補足的な活性成分を組成物に混ぜてもよい。
【００４２】
本発明の組成物を注射可能溶液もしくは懸濁液、スプレー溶液もしくは懸濁液として処方してもよい。
【００４３】
本発明により意図される治療方法
本発明はさらに、哺乳類における自己免疫疾患を治療および予防するための方法であって、共重合体１、すなわちグルタミン酸、チロシン、リジンおよびアラニンを含有するアミノ酸からなる群から選択される、直鎖形態でランダム重合した、少なくとも３種の異なるアミノ酸を含み、当該アミノ酸が直鎖状にランダム重合されたポリペプチドを有する治療上有効な量の組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。１つの態様において、ポリペプチドは共重合体１または三元共重合体である。
【００４４】
本発明により意図する自己免疫疾患として、細胞媒介性疾患（例えば、Ｔ細胞）か、または抗体媒介性（例えば、Ｂ細胞）障害のいずれかが挙げられる。かかる障害は、とりわけ関節炎疾患、脱髄疾患および炎症性疾患である。例えば、本ポリペプチドによって治療できる自己免疫疾患には、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、クローン病、慢性自己免疫性血小板減少性紫斑病、大腸炎、接触性過敏症、真性糖尿病、グレーヴズ病、ギラン−バレー症候群、橋本病、特発性粘液水腫、重症性筋無力症、乾癬、尋常性天疱瘡、慢性関節リウマチまたは全身性紅斑性狼瘡が挙げられる。本組成物を使用して、これらの１種以上の疾患を治療することができる。
【００４５】
本明細書において用いられる「関節炎疾患」とは、慢性関節リウマチの少なくとも１つの症状が哺乳類の少なくとも１つの関節、例えば哺乳類の肩甲関節、膝関節、股関節部、背骨または足指に見られる疾患である。関節炎疾患の例として、複数の関節を襲う関節炎疾患である「多発性関節炎」、２１歳未満のヒトの関節炎疾患である「若年性関節炎」、および好中球減少症、脾腫、体重減少、貧血症、リンパ節障害ならびに皮膚の色素斑の症状が挙げられるフェルティー症候群を含んでよい。
【００４６】
１つの態様において、意図されるポリペプチドが自己免疫疾患に関連したＭＨＣクラスIIタンパク質と結合する限り、いずれの自己免疫疾患も本ポリペプチドによって治療できる。この態様の１つの側面は、抗原性ペプチドとＭＨＣクラスIIタンパク質との結合を阻害するポリペプチドを選択することを含む方法、例えば、工程（ａ）がＭＨＣクラスIIタンパク質−ペプチド複合体に対するクラスII特異的Ｔ細胞応答を阻害するヘテロポリマーを選択することをさらに含んでなる方法、および抗原性ペプチドが自己免疫疾患に関連している方法を提供し、本発明のもう１つの態様において、ＭＨＣクラスIIタンパク質が自己免疫疾患に関連している方法を提供する。
【００４７】
もう１つの態様において、哺乳類における自己免疫疾患を治療するためのその方法には、自己抗原に応答するＴ細胞の増殖または機能を阻害することがさらに含まれている。ＲＡは本ポリペプチドによって治療することができるＴ細胞媒介性自己免疫疾患である。自己免疫疾患および免疫反応の病的進行はＴ細胞が媒介する。抗原との結合およびその認識の下、Ｔ細胞が増殖し、サイトカインを分泌して、さらなる炎症性および細胞傷害性細胞がその部位に増える。本ポリペプチドはサイトカインの分泌や炎症性および細胞傷害性細胞の部位への増加のようなＴ細胞増殖およびＴ細胞機能を阻害する。自己免疫疾患が関節炎疾患である場合、自己抗原はコラーゲンであり、本ポリペプチドはコラーゲン応答性Ｔ細胞の増殖および機能を阻害できる。
【００４８】
もう１つの態様において、哺乳類における自己免疫疾患を治療するためのその方法には、ポリペプチドとマクロファージ、リンパ系組織の樹枝状細胞または表皮細胞などの抗原提示細胞とを結合させることが含まれる。適当な抗原が提示されると、Ｔ細胞の増殖および機能が活性化される。抗原提示細胞と結合することによって本ポリペプチドがＴ細胞活性化を止めるか、そうでなければを妨害すると考えられる。
【００４９】
さらにもう１つの態様において、哺乳類における自己免疫疾患を治療するためのその方法には、ポリペプチドと自己免疫疾患に関連した主要組織適合遺伝子複合体クラスIIタンパク質とを結合させることを含む。クラスII  ＭＨＣタンパク質はＢリンパ球およびマクロファージのような抗原提示細胞の表面で優れた発現がなされる。これらのクラスII  ＭＨＣタンパク質は抗原性ペプチドがＴ細胞に提示される部位であるペプチド結合断面を有する。本ポリペプチドが主要組織適合遺伝子複合体クラスIIタンパク質と結合すると、これらのポリペプチドは抗原提示および／またはＴ細胞活性化を止めるか、そうでなければを妨害することができる。
【００５０】
もう１つの態様において、哺乳類における自己免疫疾患を治療するためのその方法には、ポリペプチドと共重合体１反応性Ｂ細胞抗体および／または共重合体１反応性Ｔ細胞とを結合させることが含まれている。共重合体１反応性ＴＨ２／３Ｔ細胞は共重合体１の治療効果を促進する。共重合体１反応性Ｔ細胞と結合することによって、本ポリペプチドがそれらのＴ細胞増殖、抗炎症性サイトカインの分泌を刺激し、本方法による治療の治療上の利点が高まる。本発明に従って、本ポリペプチドはまた、自己抗原反応性抗体とも結合し、抗体の標的組織へ攻撃を止め、それによって自己免疫疾患の進行を予防する手助けをする。例えば、本ポリペプチドとＭＢＰ特異的抗体とが結合すると、これらの抗体ＭＢＰと結合せず、それによってミエリン髄鞘のＭＢＰの破壊がなされる。
【００５１】
本ポリペプチドは便宜ないずれの経路によって投与してもよい。１つの態様において、本ポリペプチドを注入によって投与し、自己免疫疾患により影響のある組織への送達を促進することができる。よって、本ポリペプチドは、例えば注入、経口摂取、吸入または局所適用してもよい。目的のポリペプチドを局部投与用にクリーム、溶液または懸濁液と混ぜてもよい。本ポリペプチドは経口、局所またはアジュバントを加えない注入による投与が好ましい。
【００５２】
本発明の有用なキット
本発明のもう１つの態様は、分析物とＭＨＣタンパク質との結合をアッセイするキットであって、組換えにより非哺乳類細胞において産生された水溶性ＭＨＣタンパク質、ＭＨＣタンパク質上に結合した分析物の検出する手段、および使用説明書を含んでなるキットを提供する。キットで使用したＭＨＣタンパク質はＭＨＣクラスII  ＨＬＡ−ＤＲ１タンパク質、ＭＨＣクラスII  ＨＬＡ−ＤＲ２タンパク質およびＭＨＣクラスII  ＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質からなる群から選択されるＭＨＣクラスIIタンパク質である。キットはさらに自己抗原性ペプチドを含んでなってもよい。
【００５３】
好ましい態様において、ＭＨＣクラスIIタンパク質は昆虫細胞または酵母細胞のような無脊椎動物または細菌細胞において産生され、そのため抗原断面において結合したペプチドを全く持たない。分析物とＭＨＣタンパク質との結合を検出する手段は、当技術分野において常法の１つに知られている放射線、蛍光測定、化学ルミネセンス、酵素的手段または比色分析手段であってよい。好ましい態様において、ＭＨＣタンパク質はクラスII  ＨＬＡ−ＤＲ１またはＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質である。さらにキットはコラーゲンIIペプチドまたはミエリン塩基性タンパク質、ミエリン乏樹状突起タンパク質由来のペプチドなどの自己抗原性ペプチド、または自己免疫疾患に関わるいくつかの他のタンパク質由来のペプチドを含んでなってもよい。
【００５４】
本発明の三元共重合体の合成
三元共重合体は当業者が利用可能ないずれの手法によっても製造することができる。例えば、三元共重合体は所望のモル分率である溶解状態のアミノ酸を用いるか、または固相合成手法によって縮合条件下で製造することができる。縮合条件として、適当な温度、ｐＨおよび１つのアミノ酸のカルボキシル基ともう１つのアミノ酸のアミノ基とを縮合してペプチド結合を形成するための溶媒条件がある。縮合剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドを使用してペプチド結合の形成を促進してもよい。保護基を使用して側鎖部分およびいくつかのアミノまたはカルボキシル基などの官能基を保護し、所望でない副反応に備えてもよい。
【００５５】
例えば、米国特許第３，８４９，５５０号で開示された工程であって、チロシンのＮ−カルボキシ無水物、アラニン、γ―ベンジルグルタメートおよびＮ−トリフルオロアセチル−リジンを無水ジオキサン中において、ジエチルアミンを開始剤として加えて周囲温度で重合するというを用いることができる。グルタミン酸のγ−カルボキシル基を氷酢酸中、臭化水素によって脱保護できる。トリフルオロアセチル基はリジンから１モルピペリジンにより除去することができる。グルタミン酸、アラニン、チロシンまたはリジンのいずれか１種に関連する反応を選択的に排除することで、その工程を共重合体１中に所望のアミノ酸、例えば、４種のアミノ酸のうち３種だけを含むペプチドおよびポリペプチドを製造するように調整できることは当技術分野における技術の１つによって容易に理解される。適用目的において、「周囲温度」および「室温」は摂氏約２０〜約２６度（℃）の範囲の温度を意味する。
【００５６】
三元共重合体の平均分子量はポリペプチド合成中または三元共重合体を製造した後に調整できる。ポリペプチド合成中に平均分子量を調整するため、ポリペプチドが所望の適当な長さに達したときに合成が停止するようにアミノ酸の合成条件または量を調整する。合成後、所望の平均分子量を有するポリペプチドがいずれの利用可能なサイズ選択手順によっても得られ、例えば分子量サイジングカラムまたはゲルにおけるポリペプチドのクロマトグラフィーおよび所望の平均分子量範囲の収集による。本ポリペプチドをまた部分的に加水分解して、例えば酸または酵素による加水分解により、高分子量種を排除し、後に精製して酸または酵素を排除することができる。
【００５７】
１つの態様において、本発明は所望の平均分子量を有する三元共重合体を製造する方法であって、保護したポリペプチドと臭化水素酸とを反応させ、所望の平均分子量プロフィールを有するポリペプチドを形成することを含む方法を提供する。反応は１以上の試験反応によって予め決められた時間および温度で行う。試験反応中、時間および温度を変化させ、試験ポリペプチドの所与のバッチについての平均分子量範囲を決定する。ポリペプチドのそのバッチに最適な平均分子量範囲を与える試験条件をバッチに対して用いる。よって所望の平均分子量プロフィールを有するポリペプチドは保護されたポリペプチドと臭化水素酸とを試験反応によって予め決められた時間および温度で反応させることを含む方法により製造することができる。
【００５８】
好ましい態様において、所与のバッチの保護されたポリペプチドの試験サンプルを臭化水素酸と約２０〜２８℃で約１０〜５０時間反応させる。数回試験反応を行うことによってそのバッチの最良の条件を決める。例えば、１つの態様において保護したポリペプチドを臭化水素酸と約２６℃で約１７時間反応させる。
【００５９】
以下の実施例は、そのある特定の典型的な態様をどのようになされるかが示すという観点で詳細に本発明を記載するものであるが、材料、装置および処理工程については単に例示を意図した例であるものと理解される。特に、本発明は本明細書において記載される方法、材料、条件、処理パラメーター、装置等を限定すものではない。
【００６０】
本願中では、様々な公報、特許および特許出願が参照されている。これらの公報、特許および特許出願の教示および開示は全て引用することにより本明細書の一部とし、本発明が属する技術分野の状況を十分に記載するものである。
【００６１】
当業者ならば本明細書において開示される本発明の原理の変形をなし得るものと理解、推測されるべきであり、かかる改変は本発明の範囲内に含めるものとする。
【００６２】
【実施例】
実施例１
ポリペプチドの製造
保護ポリペプチドの調製
保護ポリペプチドをTeitelbaum et el.により記載されるように、ジオキサンに溶解した、Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）で封鎖したアミノ酸チロシン、アラニン、グルタミン酸およびトリフルオロアセチルリジンを用いて調製する。1 EUR. J. IMMUN. 242 (1971).グルタミン酸のカルボキシ化基をベンジル（ＢＺ）基で封鎖する。
【００６３】
重合処理を０．０１〜０．０２％ジエチルアミンの添加によって開始する。反応混合物を室温で２０時間攪拌し、次いで水に注ぐ。保護されたポリペプチド生成物を濾過し、水で洗浄し、乾燥させる。グルタミン酸残基からのγ−ベンジル封鎖基の除去は保護ポリペプチドを氷酢酸中の３３％臭化水素酸で室温で６〜１２時間攪拌しながら処理することによって行う。生成物を過剰な水に注ぎ、濾過し、洗浄し、乾燥させて保護ポリペプチドを得る。
【００６４】
分子量７，０００±２，０００Ｄａを有するポリペプチドの調製
γ−ベンジル保護ポリペプチドを酢酸中の３３％ＨＢｒで処理することで、グルタミン酸残基のγ−カルボキシレートからのベンジル保護基の除去が保証されるだけでなく、そのポリペプチドがより小さなポリペプチドへと切断される。
【００６５】
分子量７，０００±２，０００ダルトンのポリペプチドを得るために必要な時間は反応温度および保護ポリペプチドのサイズに依存している。２０〜２８℃の間の温度において各バッチの試験反応を種々の時間、例えば１０〜５０時間で行う。時間に対して得られた平均分子量曲線を引く。分子量７，０００±２，０００Ｄａを得るために必要な時間は曲線から算出され、反応は大規模に行われる。平均して、２６℃では分子量７，０００±２，０００Ｄａを有するポリペプチドの混合物を得るための時間は１７時間である。生成物を過剰な水に注ぎ、濾過し、洗浄し、乾燥させて所望の平均分子量範囲を有するポリペプチドを得る。
【００６６】
ポリペプチドを含む低毒性リジンの調製
保護されたトリフルオロアセチルポリペプチド（２０ｇ）を１リットルの水に分散させ、ピペリジン１００ｇを加える。混合物を室温で２４時間攪拌し、濾過する。未精製のポリペプチド溶液を透析バッグに分配し、ｐＨ８に達するまで１０〜２０℃において水で透析する。このポリペプチド溶液を０．３％酢酸で透析した後、再度ｐＨ５．５〜６．０となるまで水で透析する。次いでこの溶液を濃縮し、凍結乾燥する。
【００６７】
分子量７，６００ＴＧＡ、ポリ［Ｌ−Ｔｙｒ０．１３６、Ｌ−Ｇｌｕ０．２１、Ｌ−Ａｌａ０．６４８］の合成
１）原料：
Ｌ−Ａｌａ−ＮＣＡ                １８．７４ｇ
Ｌ−Ｔｙｒ−ＮＣＡ                ６．５ｇ
５−ＢＺ−Ｌ−Ｇｌｕ−ＮＣＡ      １３ｇ
ジエチルアミン                    ０．１６５ｇ
ジオキサン                        ７９０ｍｌ
ＨＢｒ／ＡｃＯＨ（３３％）        ４８０ｍｌ
フェノール                        ４．８ｇ
ピペリジン                        １３．２ｍｌ
脱イオン水
酢酸
２）手順
Ｌ−Ｔｙｒ−ＮＣＡ（６．５ｇ）をジオキサン（２１１ｍｌ）に入れ、６０℃で１０分間加熱した後、濾過する。５−ＢＺ−Ｌ−Ｇｌｕ−ＮＣＡ（１３ｇ）ををジオキサン（２２６ｍｌ）に入れ、２０〜２５℃で１０分間攪拌した後、濾過する。Ｌ−Ａｌａ−ＮＣＡ（１８．７４ｇ）をジオキサン（３５０ｍｌ）に入れ、２０〜２５℃で１０分間攪拌した後、濾過する。
【００６８】
磁気撹拌装置を備えた２ＬエルレンマイヤーにＬ−Ｔｙｒ−ＮＣＡ溶液、５−ＢＺ−Ｌ−Ｇｌｕ−ＮＣＡ溶液およびＬ−Ａｌａ−ＮＣＡ溶液を仕込む。ジオキサン（２．５ｍｌ）中のジエチルアミン（０．１６５ｇ）を反応混合物へ投入し、２０〜２５℃で２０時間攪拌する。この反応混合物を脱イオン水（１Ｌ）に加え、濾過し、６０℃で真空乾燥させる。収量−２５．８ｇ。
【００６９】
ＨＢｒ／ＡｃＯＨ（３３％；４８０ｍｌ）中のフェノール（４．８ｇ）の溶液を２０時間攪拌する。磁気撹拌装置を備えた２ＬエルレンマイヤーにＨＢｒ／ＡｃＯＨ、ポリ［５−ＢＺ−Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｌ−Ｔｙｒ］の溶液を仕込み、２６±１℃で１６時間攪拌する。この反応混合物を脱イオン水（２Ｌ）に加え、１時間攪拌する。沈殿を濾過し、ｐＨが６になるまで脱イオン水で洗浄する。生成物を空気循環炉において４０℃で約４０時間乾燥させる。収量−２４ｇ。
【００７０】
磁気撹拌装置を備えた２Ｌエルレンマイヤーにピペリジン（１３．２ｍｌ）、脱イオン水（１２００ｍｌ）およびポリ［Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｌ−Ｔｙｒ］を仕込んだ後、２０〜２５℃で２４時間攪拌する。得られた溶液はもとの体積の３分の２が排除されるまで、排除限界５０００ダルトンのポリエーテルスルホン膜で限外濾過する。新たな脱イオン水を加えてもとの体積に戻す。ＨＰＬＣにより不純物含量が１％未満になるまでこの工程を５回繰り返す。得られた溶液（全量）を酢酸でｐＨ４．４まで酸性化する。ｐＨが５．５〜６になるまで溶液を限外濾過し、体積を３分の１に減らす。得られた溶液は凍結乾燥する。
【００７１】
分子量８８５０ＧＡＬ、ポリ［Ｌ−Ｇｌｕ０．１５３、Ｌ−Ａｌａ０．４７９、Ｌ−Ｌｙｓ０．３６５］の合成
１）原料：
Ｌ−Ａｌａ−ＮＣＡ                １４ｇ
Ｎ６−ＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ  ２２．９ｇ
５−ＢＺ−Ｌ−Ｇｌｕ−ＮＣＡ      ９．８ｇ
ジエチルアミン                    ０．１２ｇ
ジオキサン                        ８５０ｍｌ
ＨＢｒ／ＡｃＯＨ（３３％）        ４８０ｍｌ
フェノール                        ４．８ｇ
ピペリジン                        １３．２ｍｌ
脱イオン水
酢酸
２）手順
ジオキサン（４２０ｍｌ）中のＮ６−ＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ（２２．９ｇ）を２０〜２５℃で１０分間攪拌し、濾過する。ジオキサン（１７０ｍｌ）中の５−ＢＺ−Ｌ−Ｇｌｕ−ＮＣＡ（９．８ｇ）を２０〜２５℃で１０分間攪拌し、濾過する。ジオキサン（２６０ｍｌ）中のＬ−Ａｌａ−ＮＣＡ（１４ｇ）を２０〜２５℃で１０分間攪拌し、濾過する。磁気撹拌装置を備えた２ＬエルレンマイヤーにＮ６−ＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ溶液、５−ＢＺ−Ｌ−Ｇｌｕ−ＮＣＡ溶液およびＬ−Ａｌａ−ＮＣＡ溶液を仕込む。ジオキサン（２．５ｍｌ）中のジエチルアミン（０．１２ｇ）を加え、反応混合物を２０〜２５℃で２０時間攪拌する。この反応混合物を脱イオン水（１Ｌ）に加え、濾過し、６０℃で真空乾燥させる。
【００７２】
ＨＢｒ／ＡｃＯＨ（３３％；４８０ｍｌ）中のフェノール（４．８ｇ）の溶液を２０時間攪拌する。磁気撹拌装置を備えた２ＬエルレンマイヤーにＨＢｒ／ＡｃＯＨ、ポリ［５−ＢＺ−Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ａｌａ、Ｎ６−ＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ］（２４ｇ）の溶液を仕込み、２６±１℃で１６時間攪拌する。この反応混合物を脱イオン水（２Ｌ）に加え、１時間攪拌する。沈殿を濾過し、ｐＨが６になるまで脱イオン水で洗浄する。生成物を空気循環炉において４０℃で約４０時間乾燥させる。
【００７３】
磁気撹拌装置を備えた２Ｌエルレンマイヤーにピペリジン（１３．２ｍｌ）、脱イオン水（１２００ｍｌ）およびポリ［Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ａｌａ、Ｎ６−ＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ］を仕込んだ後、２０〜２５℃で２４時間攪拌する。この溶液をもとの体積の３分の２が排除されるまで、排除限界５０００ダルトンのポリエーテルスルホン膜で限外濾過する。新たな脱イオン水を加えてもとの体積に戻す。（ＨＰＬＣにより）不純物含量が１％未満になるまでこの工程を５回繰り返す。得られた溶液（全量）を酢酸でｐＨ４．４まで酸性化する。ｐＨが５．５〜６になるまで溶液を限外濾過し、体積を３分の１に減らす。得られた溶液は凍結乾燥する。
【００７４】
分子量１１，０５０ＴＧＬ、ポリ［Ｌ−Ｔｙｒ０．１６２、Ｌ−Ｇｌｕ０．２５９、Ｌ−Ｌｙｓ０．５７９］の合成
１）原料：
５−ＢＺ−Ｌ−Ｇｌｕ−ＮＣＡ      １０．３４ｇ
Ｎ６−ＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ  ２４．１６ｇ
Ｌ−Ｔｙｒ−ＮＣＡ                ５．２ｇ
ジエチルアミン                    ０．０９５ｇ
ジオキサン                        ８１０ｍｌ
ＨＢｒ／ＡｃＯＨ（３３％）        ４６０ｍｌ
フェノール                        ４．６ｇ
ピペリジン                        １５０ｍｌ
脱イオン水
酢酸
２）手順
ジオキサン（１８０ｍｌ）中のＬ−Ｔｙｒ−ＮＣＡ（５．２ｇ）を６０℃で１０分間加熱し、濾過する。ジオキサン（４５０ｍｌ）中のＮ６−ＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ（２４．１６ｇ）を２０〜２５℃で１０分間攪拌し、濾過する。ジオキサン（１８０ｍｌ）中の５−ＢＺ−Ｌ−Ｇｌｕ−ＮＣＡ（１０．３５ｇ）を２０〜２５℃で１０分間攪拌し、濾過する。
【００７５】
磁気撹拌装置を備えた２ＬエルレンマイヤーにＮ６−ＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ溶液、Ｌ−Ｔｙｒ−ＮＣＡ溶液および５−ＢＺ−Ｌ−Ｇｌｕ−ＮＣＡ溶液を仕込む。ジオキサン（２．５ｍｌ）中のジエチルアミン（０．０９５ｇ）を投入し、反応混合物を２０〜２５℃で２０時間攪拌する。この反応混合物を脱イオン水（０．７Ｌ）に加え、濾過し、６０℃で真空乾燥させる。
【００７６】
ＨＢｒ／ＡｃＯＨ（３３％；４６０ｍｌ）中のフェノール（４．６ｇ）の溶液を２０時間攪拌する。磁気撹拌装置を備えた２ＬエルレンマイヤーにＨＢｒ／ＡｃＯＨおよびポリ［５−ＢＺ−Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｎ６−ＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ］の溶液を仕込む。この混合物を２６±１℃で１６時間攪拌し、次いで混合物を脱イオン水（１．５Ｌ）に加え、１／２時間攪拌する。沈殿を濾過し、ｐＨが５．５になるまで脱イオン水で洗浄する。
【００７７】
磁気撹拌装置を備えた２Ｌエルレンマイヤーにピペリジン（１５０ｍｌ）、脱イオン水（１４００ｍｌ）およびポリ［Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｎ６−ＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ］（５０ｇ）を仕込み、２０〜２５℃で２４時間攪拌する。ポリ［Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ］の得られた溶液をもとの体積の３分の２が排除されるまで、排除限界５０００ダルトンのポリエーテルスルホン膜で限外濾過する。新たな脱イオン水を加えて原体積に戻す。（ＨＰＬＣにより）不純物含量が１％未満になるまでこの工程を５回繰り返す。得られた溶液（全量）を酢酸でｐＨ４．２まで酸性化する。ｐＨが５．５〜６になるまで溶液を限外濾過し、体積を３分の１に減らす。得られた溶液は凍結乾燥する。
【００７８】
分子量２０，０００ＴＡＬ、ポリ［Ｌ−Ｔｙｒ０．１０２、Ｌ−Ａｌａ０．５４２、Ｌ−Ｌｙｓ０．３５３］の合成
１）原料：
Ｌ−Ａｌａ−ＮＣＡ                １４ｇ
Ｎ６−ＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ  ２２．９ｇ
Ｌ−Ｔｙｒ−ＮＣＡ                ４．９ｇ
ジエチルアミン                    ０．１ｇ
ジオキサン                        ８５０ｍｌ
ＨＢｒ／ＡｃＯＨ（３３％）        ５００ｍｌ
フェノール                        ５ｇ
ピペリジン                        １６２ｍｌ
脱イオン水
酢酸
２）手順
ジオキサン（１７０ｍｌ）中のＬ−Ｔｙｒ−ＮＣＡ（４．９ｇ）を６０℃で１０分間加熱し、濾過する。ジオキサン（４１７ｍｌ）中のＮ６−ＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ（２２．９ｇ）を２０〜２５℃で１０分間攪拌し、濾過する。ジオキサン（２６０ｍｌ）中のＬ−Ａｌａ−ＮＣＡ（１４ｇ）を２０〜２５℃で１０分間攪拌し、濾過する。
【００７９】
磁気撹拌装置を備えた２ＬエルレンマイヤーにＮ６−ＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ溶液、ジオキサン中のＬ−Ｔｙｒ−ＮＣＡ溶液およびＬ−Ａｌａ−ＮＣＡ溶液を仕込む。ジオキサン（２ｍｌ）中のジエチルアミン（０．１ｇ）を投入し、混合物を２０〜２５℃で２０時間攪拌する。この反応混合物を脱イオン水（１Ｌ）に加え、濾過し、６０℃で真空乾燥させる。
【００８０】
ＨＢｒ／ＡｃＯＨ（３３％；５００ｍｌ）中のフェノール（５ｇ）の溶液を２０時間攪拌する。磁気撹拌装置を備えた２ＬエルレンマイヤーにＨＢｒ／ＡｃＯＨおよびポリ［Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｎ６−ＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ］の溶液を仕込み、２６±１℃で１６時間攪拌する。次いで反応混合物を脱イオン水（２Ｌ）に加え、１／２時間攪拌する。沈殿を濾過し、ｐＨが５．５になるまで脱イオン水で洗浄する。
【００８１】
磁気撹拌装置を備えた２Ｌエルレンマイヤーにピペリジン（１６２ｍｌ）、水（１５００ｍｌ）およびポリ［Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｎ６−ＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ］（３０ｇ）を仕込み、２０〜２５℃で２４時間攪拌する。ポリ［Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ］の得られた溶液をもとの体積の３分の２が排除されるまで、排除限界５０００ダルトンのポリエーテルスルホン膜で限外濾過する。新たな脱イオン水を加えて原体積に戻す。（ＨＰＬＣにより）不純物含量が１％未満になるまでこの工程を５回繰り返す。得られた溶液（全量）を酢酸でｐＨ４．４まで酸性化する。ｐＨが５．５〜６になるまで溶液を限外濾過し、体積を３分の１に減らす。得られた溶液は凍結乾燥する。
【００８２】
実施例２
低分子量ポリペプチド
インビボ試験
平均分子量７．３および８．４ＫＤａ（４０ＫＤａを超える共重合体１種が２．５％未満）ならびに２２ＫＤａ（４０ＫＤａを超える共重合体１種が５％を超える）を有する３バッチの共重合体１を以下に記載する毒性試験に付した。各試験群には５匹のマウスを使用した。
【００８３】
方法
共重合体１を蒸留水に溶解し、有効成分２ｍｇ／ｍｌの溶液を得る。それぞれのマウスには外側尾部静脈に試験溶液０．５ｍｌを注入する。４８時間マウスの死亡数および関連した臨床徴候を観察した。注入後１０分、２４時間および４８時間において観察結果を記録した。４８時間終了時に全ての動物が生存しており、かつ悪い徴候が見られなかった場合、そのバッチは「非毒性」とする。しかしながら１匹以上のマウスが死亡するか、または悪い徴候が見られた場合、そのバッチは「毒性」とする。
【００８４】
結果
平均分子量２２ＫＤａの共重合体１ポリペプチドで処置した場合、５匹のマウスのうち３匹が４８時間後に死亡した。よってこの平均分子量の高いバッチを「毒性」とする。平均分子量７．３および８．４ＫＤａを有する共重合体１バッチはともに「非毒性」とした。
【００８５】
インビトロにおけるラット好塩基性白血病細胞脱顆粒試験
好塩基性細胞からのヒスタミン（またはセロトニン）放出は即時型過敏症のインビトロモデルである。ラット好塩基性白血病細胞系統、ＲＢＬ−２Ｈ０は均質であり、培養で維持することが容易であるが、脱顆粒に関する試験に対して高い感受性があり、かつ再現性ある系である。E. L. Basumian, et al., 11 EUR. J. IMMUNOL. 317 (1981).ヒスタミン放出に対する生理学的な刺激には、複雑な生化学的カスケードを誘発する抗原と膜結合ＩｇＥ分子との結合が含まれる。脱顆粒は様々なポリペプチドおよび合成重合体、例えばポリリジンをはじめとする非ＩｇＥ媒介性刺激によって誘導される。R. P. Siraganian, TRENDS IN PHARMACOLOGICAL SCIENCES 432 (Oct, 1983).従って、ＲＢＬ脱顆粒試験を使用して、実質的な脱顆粒を引き起こし、それによって所望でない局所および／または全身性の副作用を誘起し得るそのＣＯＰ−１のバッチを選抜する。
【００８６】
方法
ラット好塩基性白血病細胞（ＲＢＬ−２Ｈ０）に［Ｈ３］−セロトニンを与え、次いで試験すべきＣＯＰ−１  １００μｇとともにインキュベートする。非特異的脱顆粒を誘導するＣＯＰ−１のバッチは培地に［Ｈ３］−セロトニンを放出する。培地中の放射性をシンチレーションカウンターで測定し、細胞に組み込まれた全放射性標識セロトニンはペレット細胞で求める。脱顆粒％は組み込まれた全てのセロトニンから放出されたセロトニンの割合％として算出する。
【００８７】
結果
平均分子量８，２５０〜１４，５００間の４つのバッチの共重合体１では分子量４０ｋＤａを超える種の％およびＲＢＬの脱顆粒の両方について分析した。結果は表１にまとめられている。
【００８８】
表１
【表１】
0004800481.tif 000003
わかるように、平均分子量の高い種の％が低い（２．５％未満）場合には、セロトニン放出％も低く、逆もまた同じである。これらのデータでは平均分子量の高い共重合体１ポリペプチドよりも平均分子量の低い共重合体１ポリペプチドの方が好ましいことを示している。
【００８９】
実施例３
ポリペプチドによるＥＡＥの抑制
疾患誘発前にフロイントの不完全アジュバント中の共重合体１を注入することで実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を抑制することができる。この抑制はミエリン塩基性タンパク質と交差反応をするＴＨ２タイプの共重合体１特異的サプレッサーＴ細胞が媒介していると思われる。Lando et al., 123 J. IMMUNOL. 2156 (1979); Aharoni et al., 17 EUR. J. IMMUNOL. 23 (1993); Aharoni et al., 94 PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 10821 (1997).他の研究者が多発性硬化症患者における共重合体１の治療効果もＴＨ２細胞の誘導に関連していることも認めている。Lahat et al., 244 J. Neuro. 129 (1997).本実施例ではＥＡＥは本発明の種々のポリペプチドによって抑制される。
【００９０】
方法
共重合体１
平均分子量６０００Ｄａおよび５８００Ｄａを有する共重合体１バッチ、それぞれ＃０２０９５および５５４９５はTeva Pharmaceutical Industries(Petach Tikva, Israel)から入手した。
【００９１】
三元共重合体
４種の三元共重合体はTeva Pharmaceutical Industries(Petach Tikva, Israel)から入手した。これらの三元共重合体の特性は以下の通りである。
【００９２】
１）ＧＡＬ三元共重合体（ＳＤ−１６８９）は次のモル分率のアミノ酸グルタミン酸（０．１５３）、アラニン（０．４７９）およびリジン（０．３６５）を含むポリペプチド混合物である。ＧＡＬ平均分子量の範囲は約４６５０ダルトン〜約２０，０５０ダルトンである。このＧＡＬ調製物の平均分子量は８８５０ダルトンである。
【００９３】
２）ＴＧＡ三元共重合体（ＳＤ−１６９０）は次のモル分率のアミノ酸チロシン（０．１３６）、グルタミン酸（０．２１０）およびアラニン（０．６４８）を含むポリペプチド混合物である。ＴＧＡ平均分子量の範囲は約１０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンである。このＴＧＡ調製物の平均分子量は７６００ダルトンである。
【００９４】
３）ＴＡＬ三元共重合体（ＳＤ−１６９１）は次のモル分率のアミノ酸チロシン（０．１０２）、アラニン（０．５４２）およびリジン（０．３５３）を含むポリペプチド混合物である。ＴＡＬ平均分子量の範囲は約５７００ダルトン〜約３４，４００ダルトンである。このＴＡＬ調製物の平均分子量は２０，０００ダルトンである。
【００９５】
４）ＧＴＬ三元共重合体（ＳＤ−１６９７）は次のモル分率のアミノ酸グルタミン酸（０．２５９）、チロシン（０．１６２）およびリジン（０．５７９）を含むポリペプチド混合物である。ＧＴＬ平均分子量の範囲は約４，０００ダルトン〜約２３，５００ダルトンである。このＧＴＬ調製物の平均分子量は１１０５０ダルトンである。
【００９６】
アミノ酸アラニン、グルタミン酸およびチロシンの１：１：１混合物を含むポリペプチド混合物からなり、平均分子量２６，７００Ｄａを有する対照ポリペプチドを使用する。このポリペプチドはSigma Chemical Company(St. Louis, MO)から入手する。
【００９７】
ＥＡＥの誘発
２〜３ヶ月齢の雌（ＳＪＬ／Ｊ×ＢＡＬＢ／ｃ）ＦＩマウスに４ｍｇ／ｍｌＨ３７Ｒａを添加したフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）と１：１比で乳化したマウス脊髄ホモジネート（３．５ｍｇ／マウス）を４本全ての足蹠に注入する。直後および４８時間後に、百日咳毒（０．２５ｍｌ、２５０ｎｇ、Sigma）を静脈注入する。誘発後１０日目から毎日、ＥＡＥの臨床徴候についてマウスを調べ、Lando et al., 123 J. IMMUNOL. 2156 (1979)に記載される０〜５段階で評価する。
【００９８】
不完全アジュバントの注入によるＥＡＥの抑制
試験するポリペプチド（１０ｍｇ／マウス）をフロイントの不完全アジュバント（ＩＣＦＡ）にて項部領域の２、３箇所に皮下注入する。ＥＡＥは上記のように３週間後に誘発される。
【００９９】
経口投与によるＥＡＥ抑制
第２の試験では、ＥＡＥ誘発前に２〜３日の間隔で雌ルイスラットに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した５ｍｇ／ｋｇのモルモットＢＰまたは共重合体１を与える。ＥＡＥは４ｍｇ／ｍｌ結核菌（Ｈ３７Ｒａ）(Difco, Lab, Detroit, Mich.)を含むＣＦＡと１：１で乳化した２５μｇモルモットＭＢＰの注入により、最終供給後２日目に誘発される。２本の後肢の足蹠それぞれに全容量０．１ｍｌを注入する。対照ラットはリン酸緩衝生理食塩水を与えたモックである。
【０１００】
ラットにおけるＥＡＥの予防に対する共重合体１の経口投与効果をHiggins et al., 140 J. IMMUNOL. 440 (1988)の方法によりモルモットＭＢＰを与えたラットのものと比較する。
【０１０１】
誘発後１０日目から毎日、病徴についてマウスを調べた。ＥＡＥは次のように評価する：０＝症状無し；１＝脆弱な尾；２＝後肢麻痺；３＝四肢全て麻痺；４＝瀕死の状態；および５＝死亡。
【０１０２】
結果
不完全アジュバントの注入によるＥＡＥの抑制
表２はＥＡＥ誘発前に本発明のポリペプチドをＩＣＦＡにて注入投与する効果を示している。試験した４種のポリペプチドのうち共重合体１およびＴＡＬで最大のＥＡＥ抑制がもたらされた。ＧＴＬもまた優れた抑制活性を示した。ＧＡＬおよびＴＧＡは幾分効力が低かった。
【０１０３】
表２  本発明のポリペプチドの注入によるマウスにおけるＥＡＥ抑制
【表２】
0004800481.tif 000004
＊ＭＭＳ＝平均最高点
Ｄ−共重合体１は共重合体１のモル比におけるｄ−リジン、ｄ−チロシン、ｄ−グルタミン酸およびｄ−アラニンの共重合体である。
【０１０４】
表３は経口投与した共重合体１のルイスラットにおけるＥＡＥの臨床徴候の予防に対する効力をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）単独またはモルモット塩基性タンパク質（ＧＰＢＰ）を受けたラットと比較して示している。
【０１０５】
表３  本発明のポリペプチドの経口投与によるラットにおけるＥＡＥ抑制
【表３】
0004800481.tif 000005
それぞれの数値は３〜５つの独立した試験の累積結果である。ｐ値は対照（ＰＢＳ）群との差の統計的有意性を示す。平均最高点は全ての群に対して算出する。
【０１０６】
これらのデータは本発明のポリペプチドを経口によるか、または注入によるいずれかで投与する場合にＥＡＥの徴候および重症度を抑えるために治療上有効であることを示している。
【０１０７】
実施例４
抗原提示細胞との結合
本ポリペプチドのいくつかは効率的に抗原提示生細胞と結合する。
【０１０８】
方法
共重合体１
平均分子量６０００Ｄａおよび５８００Ｄａを有する共重合体１バッチ、それぞれ＃０２０９５および５５４９５はTeva Pharmaceutical Industries(Petach Tikva, Israel)から入手した。
【０１０９】
三元共重合体
ＧＡＬ、ＴＧＡ、ＴＡＬ、ＧＴＬおよび対照ポリペプチドは上記実施例３に記載される通りである。
【０１１０】
抗原のビオチン化
共重合体１および三元共重合体のビオチン化はFridkis-Hareli et al. 91 PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 4872 (1994)に従い、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(Sigma)を用いて０℃で行う。
【０１１１】
ビオチン化した抗原と抗原提示細胞との結合
ビオチン化したポリペプチドを蛍光標識ストレプトアビジンおよびＦＡＣＳ解析を用いて、マウスおよびヒト起源の抗原提示生細胞との結合を調べた。（ＳＪＬ／Ｊ×ＢＡＬＢ／ｃ）ＦＩマウス由来の付着脾臓細胞、またはＤＲ７．ｗＩＩハプロタイプのＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞（１×１０８／１００μｌ）を０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ１００μｌに溶解したビオチン化共重合体１または三元共重合体５０μｇとともに３７℃で２０時間インキュベートした。次いで細胞を細胞懸濁液濃度０．５μｇ／１００μｌにおいてフィコエリトリンを結合したストレプトアビジン（Jackson Immuno Research, West Grove, PA）とともに４℃で３０分間インキュベートした。それぞれのインキュベーションの後、細胞を０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄した。その後、細胞をフローサイトメトリーによりＦＡＣＳスキャン(Becton-Dickinson, Mountain View, CA)を使用して解析した。各解析では５０００細胞を試験した。死んだ細胞は前方および側方光散乱(forward and side-angle light scatter)に基づいて排除した。
【０１１２】
エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂ細胞系統
ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系統をTeitelbaum et al. 89 PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 137 (1992)に従って誘導した。約２０×１０６末梢血単核細胞をＢ９５．８細胞系統上清とともに３７℃で１時間培養した。この細胞を次いで洗浄し、１０％ＦＣＳおよびシクロスポリンＡ（１０μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ培地で培養し、Ｔ細胞を涸渇させた。
【０１１３】
結果
表４は三元共重合体および共重合体１ポリペプチドとマウス脾臓マクロファージおよびヒトＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系統を含む抗原提示生細胞との結合を示している。結合率％および細胞染色強度の両方を示すデータである（表４  Ｉ＋II）。ＴＡＬは共重合体１よりいっそう優れ、最大の効率で結合した。ＧＡＬおよびＧＴＬもまた極めて首尾よく結合し、共重合体１と同じかまたは幾分かさらに優れていた。ＴＧＡはうまく結合したが、共重合体１より幾分か劣っていた。
【０１１４】
結合強度によって表される（表４）ように、ＴＡＬが（ＳＪＬ／Ｊ×ＢＡＬＢ／ｃ）Ｆ１マウスの脾臓マクロファージおよび正常ＤＲ７．ｗ１１ドナー由来のＥＢＶ形質転換Ｂ細胞と最大の効率で結合した。
【０１１５】
表４  三元共重合体と抗原提示細胞との結合
Ｉ．マウス脾臓マクロファージ由来の抗原提示細胞
【０１１６】
【表４−１】
0004800481.tif 000006
＊ＭＦＩ＝平均蛍光強度
II．ヒトＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系統由来の抗原提示細胞
【０１１７】
【表４−２】
0004800481.tif 000007
＊ＭＦＩ＝平均蛍光強度
実施例５
本ポリペプチドは精製したヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と結合する
本実施例では本発明のポリペプチドがヒトＢ細胞およびＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ２およびＨＬＡ−ＤＲ４分子などの高い親和性を有する精製したヒトリンパ球抗原（ＨＬＡ）と結合することを示している。
【０１１８】
方法
細胞系統および抗体
ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２および−ＤＲ４分子のイムノアフィニティー精製に使用したホモ接合ＥＢＶ形質転換ヒトＢリンパ球系統はそれぞれ、ＬＧ−２（ＤＲＢ１）、ＭＧＡＲ（ＤＲＢ１−１５０１）およびＰｒｅｉｓｓ（ＤＲＢ−０４０１／ＤＲＢ４−０１０１）であった。
【０１１９】
細胞は１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリンＧおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０の入ったローラーボトルで増殖させ、−８０℃でペレットとして保存した。抗ＤＲハイブリドーマＬＢ３．１（ＩｇＧ２ｂ）は血清フリー培地（Macrophage-SFM, Gibco BRL）で増殖させる。Gorga et al., 103 CELL. IMMUNOL. 160 (1986)参照。
【０１２０】
タンパク質精製
ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２および−ＤＲ４分子のイムノアフィニティー精製はGorga et al., 262 J. BIOL. CHEM. 16087 (1987)により従前に報告されたように僅かに改変をして行う。手短に言えば、ＬＧ−２、ＭＧＡＲおよびＰｒｉｅｓｓ細胞由来の洗浄剤に可溶性の膜調製物を約１１ｍｌ／時間の流量で一連のカラムに以下の順序：セファロースＣＬ−６Ｂ（３０ｍｌ）、正常マウス血清−Ａｆｆ−ゲル１０（１０ｍｌ）、タンパク質Ａ−セファロースＣＬ−４Ｂ（５ｍｌ）およびＬＢ３．１−タンパク質Ａ−セファロースＣＬ−４Ｂ（５ｍｌ）に通した。ＬＢ３．１イムノアフィニティーカラムに通す前ではＤＲ２ａ（ＤＲＢ５＊０１０１）およびＤｒｗ５３（ＤＲＢ４＊０１０１）、すなわちＤＲＢ１対立遺伝子に関連するＤＲ遺伝子の産物がＭＧＡＲおよびＰｒｉｅｓｓ溶解物から除かれておらず、ＤＲ２およびＤＲ４調製物が５〜１０％の量で混入していた。後の全ての工程はGorga et al., 262 J. BIOL. CHEM. 16087 (1987)により従前に記載される通りであった。溶出物を０．１％デオキシコレート、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で透析し、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３０メンブラン(Aamicon)で濃縮する。タンパク質濃度はビシンコ硝酸(bicinchonitric acid)アッセイ(Pierce Chemical Co.)により求めた。
【０１２１】
ポリペプチドおよびコントロール抗原
方法
共重合体１
平均分子量５８００ダルトンおよび８，１５０ダルトンを有する共重合体１バッチ、それぞれ＃５５４９５および５２５９６はTeva Pharmaceutical Industries(Petach Tikva, Israel)から入手した。共重合体１バッチ５２５９６は１チロシン：１．５グルタミン酸：４．３アラニン：３．１リジンのモル比を有していた。
【０１２２】
ミエリン塩基性タンパク質およびヘマグルチニンのコントロール
ペプチド
ＭＢＰタンパク質はApplied Biosystems ペプチドシンセサイザーにおいて固相手法を用いて合成した。Barany et al., THE PEPTIDES 1 (1979).ペプチドは逆相ＨＰＬＣにより精製した。使用したペプチドは配列ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（ＭＷ１７１８）（配列番号２）を有するＨＡ３０６−３１８および配列ＤＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＰ（ＭＷ２５２９）（配列番号１）を有するＭＢＰ８４−１０２であった。
【０１２３】
三元共重合体
ＧＡＬ、ＴＧＡ、ＴＡＬ、ＧＴＬおよび対照ポリペプチドは上記実施例３に記載される通りである。
【０１２４】
ポリペプチド標識
様々なポリペプチドのビオチン化は実施例４の通りに行う。未反応のビオチンは透析(Spectra/Por（登録商標）メンブラン  ＭＷＣＯ５００、Spectrum Medical Industries)により除く。
【０１２５】
クラスII  ＭＨＣタンパク質と結合するポリペプチドのアッセイ
溶液：このアッセイに使用する溶液は以下の通りである。結合バッファーは特に断りのない限り、２０ｍＭ  ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、１％  ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３、ｐＨ５．０である。ＰＢＳは１５０ｍＭ塩化ナトリウム、７．５ｍＭリン酸ナトリウム、二塩基性、２．５ｍＭリン酸ナトリウム、一塩基性、ｐＨ７．２である。ＴＢＳは１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２．７ｍＭ塩化カリウムである。ＴＴＢＳはＴＢＳに０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を加えたものである。
【０１２６】
マイクロタイターアッセイプレート調製：９６ウェルマイクロタイターイムノアッセイプレート（ＰＲＯ−ＢＩＮＤ（商標）、Falcon）を、ＰＢＳ（全１００μｌ）中のアフィニティー精製したＬＢ３．１モノクロナール抗体１μｇ／ウェルで４℃で１８時間被覆した。次いでウェルを３％ＢＳＡ含有ＴＢＳで３７℃で１時間封鎖し、ＴＴＢＳで３回洗浄した。サンプルを加える前にそれぞれのウェルにＴＢＳ／１％ＢＳＡ  ５０μｌを加えた。
【０１２７】
結合反応：洗浄剤可溶性ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２および−ＤＲ４分子（０．５μｇ／サンプル）を結合バッファー５０μｌ中、様々な濃度においてビオチン化ペプチドとともに３７℃で４０時間インキュベートし、調製したマイクロタイターアッセイプレートへ移し、ポリペプチド−クラスII複合体を捕獲するために３７℃で１時間インキュベートした。
【０１２８】
阻害反応：結合バッファー５０μｌ中、最終濃度１．５μＭのビオチン化ポリペプチドを非標識ポリペプチド、および阻害剤として使用するペプチドＨＡ３０６−３１８（配列番号２）またはＭＢＰ８４−１０２（配列番号１）、およびＨＬＡ−ＤＲ分子とともに３７℃で４０時間同時インキュベートした。
【０１２９】
クラスII／ポリペプチド複合体の検出：結合したポリペプチド−ビオチンをストレプトアビジン結合アルカリ性ホスファターゼを用いて以下のように検出する。プレートをＴＴＢＳで３回洗浄し、ストレプトアビジン結合アルカリ性ホスファターゼ（１：３０００、BioRad）１００μｌとともに３７℃で１時間インキュベートし、次いでトリエタノールアミンバッファー（BioRad）中のｐ−ニトロフェニルホスフェートを加えた。４１０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレート読取装置(Dynatech ＭＲ４０００)によりモニターする。
【０１３０】
結果
クラスII  ＭＨＣタンパク質と結合する三元共重合体
洗浄剤可溶性ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ２およびＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質はそれぞれ、ホモ接合ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系統ＬＧ−２（ＤＲＢ１＊０１０１）、ＭＧＡＲ（ＤＲＢ１＊１５０１）およびＰｒｉｅｓｓ（ＤＲＢ１＊０４０１）からFridkis-Hareli et al. 160 J. IMMUNOL. 4386 (1998)により従前に記載されるように精製した。共重合体１の３種の異なる調製物は高い親和性を有するこれらの分子と結合した。Ｉｄ．三元共重合体のＨＬＡ−ＤＲタンパク質に対する親和性を求めるため、ビオチン化三元共重合体の結合アッセイを行い、共重合体１と比較した。ポリペプチドをある範囲の濃度で精製したＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ２およびＨＬＡ−ＤＲ４分子とともにｐＨ５．０でインキュベートし、次いでクラスII特異的ｍＡｂによる捕獲およびアルカリ性ホスファターゼ−ストレプトアビジンによる検出を行った。
【０１３１】
ＴＡＬおよび共重合体１の洗浄剤可溶性ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ４分子との結合はＧＡＬ、ＴＧＡまたはＧＴＬのものより優れている。しかしながら、ＧＴＬおよび共重合体１は飽和結合曲線（図２Ａ）および結合データの二重逆数プロットから算出したＫα値（図２Ｂ、表５）に基づき、ＨＬＡ−ＤＲ２に対して他のポリペプチドより優れた結合をした。
【０１３２】
ビオチン化共重合体１および以下の非標識の阻害剤：共重合体１、ＴＡＬ、ＴＧＡ、ＧＡＬ、ＴＧＬ、ＭＢＰ８４−１０２およびＨＡ３０６−３１８ポリペプチド（図３）について競合的結合アッセイを行った。ＭＢＰ８４−１０２（配列番号１）ペプチドは共重合体１とＨＬＡ−ＤＲ２との結合の不十分な阻害剤である。ビオチン化共重合体１と洗浄剤可溶性ＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４分子との結合は非標識ＴＧＡ、ＴＡＬ、ＨＡ３０６−３１８（配列番号２）および共重合体１により効率的に阻害される。しかしながら、ビオチン化共重合体１と洗浄剤可溶性ＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４分子との結合のＴＧＬによる阻害は阻害量（ＩＣ５０）によって示される（図３、表５）ように１０倍低い。同様に、ＧＡＬもまた共重合体１とＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４分子との結合の不十分な阻害剤である。一般にＨＬＡ−ＤＲ２との結合パターンはＨＬＡ−ＤＲ１に見られるものと同じである（表５）。これらの結果は３種のアミノ酸のポリペプチド、特にＴＡＬおよびＴＧＡが抗原性ペプチドおよび共重合体１のものと同じ親和性範囲を有するクラスII  ＭＨＣ分子と結合することを示している。よって、ＴＡＬおよびＴＧＡが共重合体１と結合するクラスII  ＭＨＣ分子に対する有効な競合物である。これらの結合能力に基づき、ポリペプチドを以下のオーダー：
（Ａ）ＨＬＡ−ＤＲ１との結合：共重合体１＞ＴＡＬ＞ＧＴＬ＞ＴＧＡ＞＞ＧＡＬ；
（Ｂ）ＨＬＡ−ＤＲ２との結合：共重合体１＞ＧＴＬ＞ＴＡＬ＞ＧＡＬ＞ＴＧＡ；
（Ｃ）ＨＬＡ−ＤＲ４との結合：ＴＡＬ＞共重合体１＞＞ＴＧＡ＞ＧＴＬ＞ＧＡＬ；
に並べることができる。
【０１３３】
表５  本ポリペプチドの精製したヒトＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２および−ＤＲ４分子に対する親和性
【表５】
0004800481.tif 000008
１  平均分子量５，８００を有する共重合体１ポリペプチド；分子量２０，０００のＴＡＬ；分子量８，８５０のＧＡＬ；分子量７，６００のＴＧＡ；および分子量１１，０５０のＴＧＬをある濃度範囲で精製したＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２および−ＤＲ４分子とともにｐＨ５．０でインキュベートし、次いでクラスII特異的ｍＡｂによる捕獲およびアルカリ性ホスファターゼ−ストレプトアビジンによる検出を行った。
【０１３４】
２  洗浄剤可溶性ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２および−ＤＲ４分子を材料および方法において記載されるように精製した。
【０１３５】
３  Ｋα、平衡時における解離定数は二重逆数プロット（図２Ｂ）の傾きから算出し、×１０−８Ｍとして表す。
【０１３６】
４  ＩＣ５０、５０％阻害を与える阻害濃度は競合的結合アッセイ（図３）に基づいて算出し、×１０−６Ｍとして表す。
【０１３７】
５  ＧＡＬのＩＣ５０値は１０００μＭ未満では正確に求めることができなかった（図３参照）。
【０１３８】
ポリペプチドとＨＬＡ−ＤＲ分子との結合における超抗原の効果
細菌超抗原ＳＥＡ、ＳＥＢおよびＴＳＳＴ−１は精製したＨＬＡ−ＤＲ分子と非常に高濃度でしか結合しない共重合体１を阻害することが示されてきた。Fridkis-Hareli et al. 160 J. IMMUNOL. 4386 (1998).三元共重合体と精製したＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ２およびＨＬＡ−ＤＲ４分子との結合におけるこれらの超抗原の効果を試験するため、非標識のＳＥＡ、ＳＥＢおよびＴＳＳＴ−１ついて競合的結合アッセイを行った。
【０１３９】
ＳＥＡ、ＳＥＢおよびＴＳＳＴ−１
ＴＡＬとＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ２およびＨＬＡ−ＤＲ４との結合は高モル比にある超抗原によってのみ阻害される、例えばＴＡＬ結合を阻害するには５０倍の量の超抗原が必要とされる（図４Ａ）。しかしながら、ＴＧＡおよびＧＡＬとの結合は超抗原によってより示差的に阻害され（図４ＢおよびＣ）、これらのポリペプチドが親和性のより低いＨＬＡ抗原と結合することを示している。
【０１４０】
実施例６
ＭＢＰにより誘導されるＴ細胞増殖の阻害
本実施例では通常、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）によって活性化されるＴ細胞の増殖を本ポリペプチドへの同時暴露によって阻害できることを示している。
【０１４１】
方法
共重合体１
平均分子量６０００Ｄａおよび５８００Ｄａを有する共重合体１バッチ、それぞれ＃０２０９５および５５４９５はTeva Pharmaceutical Industries(Petach Tikva, Israel)から入手した。
【０１４２】
ミエリン塩基性タンパク質ペプチドはApplied Biosystems ペプチドシンセサイザーにおいて固相手法を用いて合成した。Barany et al., THE PEPTIDES 1 (1979).ペプチドは逆相ＨＰＬＣにより精製した。使用したペプチドは配列ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（ＭＷ１７１８）（配列番号２）を有するＨＡ３０６−３１８および配列ＤＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＰ（ＭＷ２５２９）（配列番号１）を有するＭＢＰ８４−１０２であった。
【０１４３】
三元共重合体
ＧＡＬ、ＴＧＡ、ＴＡＬ、ＧＴＬおよび対照ポリペプチドは上記実施例３に記載される通りである。
【０１４４】
Ｔ細胞系統およびクローン
ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）特異的Ｔ細胞は１０日前に４ｍｇ／ｍｌの結核菌Ｈ３７Ｒａを添加したフロイントの完全アジュバントで乳化したＭＢＰの８４−１０２ペプチド２０μｇで免役したマウスの脾臓を起源とする。細胞を培養し、免疫化抗原（０．２〜１ｍｇ／プレート）を用いて１％自己血清を添加した培地（ＲＰＭＩ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）中でインビトロ選択した。４日後、細胞を１０％ＦＣＳ含有培地へ移し、ＣｏｎＡ活性化正常脾臓細胞の１０％上清ならびにＴ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）を添加した。１４〜２１日ごとに細胞の同系照射（３０００ｒａｄ）脾臓細胞（５０×１０６／プレート）に現れる免疫化抗原への３日間の暴露によって刺激し、次いでＴＣＧＦ培地において増殖させた。Ｔ細胞のクローニングは抗原（２〜１０μｇ／ウェル）および照射同系脾臓細胞（５０×１０６／ウェル）の存在下、マイクロタイタープレートにおいて０．３細胞／ウェルにおける制限希釈によって行われる。
【０１４５】
ヒトＴ細胞系統はTeitelbaum et al. 89 PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 137 (1992)に従って末梢血単核細胞から誘導した。約５×１０６細胞を共重合体１またはＭＢＰ（５０μｇ／ｍｌ）とともに１０％熱失活自己血清を添加した培地を入れた２４ウェル培養プレートの各ウェルでインキュベートした。培養７日後、細胞を１０％ウシ胎児血清および組換えヒトインターロイキン−２（２０単位／ｍｌ）を含有する培地へ移した。細胞を照射（３０００ｒａｄ）自己単核細胞に現れる抗原へ１４〜１８日ごとに定期的に暴露しながらこの培地で連続増殖させた。
【０１４６】
増殖アッセイ
Ｔ系統の細胞またはクローンを抗原刺激後１０〜２１日間、その特異的増殖応答について試験した。Ｔ細胞（１．５×１０４）を５×１０５照射脾臓細胞および最終用量０．２ｍｌの指示された抗原とともに１０％ＦＣＳ培地で三重培養した。４８時間のインキュベーション終了時に培地に１μＣｉ［３Ｈ］−チミジン（標準偏差＜平均ｃｐｍの２０％）を適用し、６〜１２時間後に回収した。
【０１４７】
阻害研究
Ｔ細胞増殖応答の阻害を様々な濃度の共重合体１および三元共重合体に加え、増殖アッセイ系に対して刺激となるＭＢＰ抗原を加えて調べた。阻害は式２：
阻害％＝
［1−(阻害剤のある場合のcpm/阻害剤のない場合のcpm)］×100
を用いて阻害％として算出する。
【０１４８】
結果
図１は共重合体１および三元共重合体がどのようにあるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチドに特異的なＴ細胞増殖をもたらしているかを示している。一般に、Ｔ細胞はそれらが感作する抗原に暴露された際に増殖する。よってＭＢＰおよび、特にＭＢＰからのある抗原性ペプチドはＭＢＰ特異的Ｔ細胞の増殖を刺激する。
【０１４９】
共重合体１および三元共重合体はＭＢＰの８４−１０２ペプチドに特異的であるＴ細胞の増殖は刺激しなかった。それよりも、それらはこのＭＢＰ抗原に暴露されたＴ細胞の増殖をかなり阻害した。
【０１５０】
ＴＡＬはＭＢＰ８４−１０２抗原に特異的なＴ細胞の増殖の阻害について最も有効であった。ＴＡＬによる阻害は共重合体１によるものよりいっそう大きいものだった。ＴＧＡが誘導したＴ細胞増殖はより低かった。ＧＡＬおよびＧＴＬは共重合体１と同様な用量応答によりＴ細胞増殖を阻害した。
【０１５１】
実施例７
三元共重合体はいくつかの共重合体１特異的Ｔ細胞により認識される
三元共重合体はいくつかの共重合体１特異的Ｔ細胞系統を刺激して増殖させ、サイトカイン、ＩＬ−４を分泌させることができる。
【０１５２】
方法
共重合体１
平均分子量６０００Ｄａおよび５８００Ｄａを有する共重合体１バッチ、それぞれ＃０２０９５および５５４９５はTeva Pharmaceutical Industries(Petach Tikva, Israel)から入手した。
【０１５３】
ミエリン塩基性タンパク質ペプチドはApplied Biosystemsペプチドシンセサイザーにおいて固相手法を用いて合成した。Barany et al., THE PEPTIDES 1 (1979).ペプチドは逆相ＨＰＬＣにより精製した。使用したペプチドは配列ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（ＭＷ１７１８）（配列番号２）を有するＨＡ３０６−３１８および配列ＤＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＰ（ＭＷ２５２９）（配列番号１）を有するＭＢＰ８４−１０２であった。
【０１５４】
三元共重合体
ＧＡＬ、ＴＧＡ、ＴＡＬ、ＧＴＬおよび対照ポリペプチドは上記実施例３に記載される通りである。
【０１５５】
Ｔ細胞系統およびクローン
マウスＴ細胞系統およびクローンをAharoni et al., 23 Eur. J. Immunol. 17 (1993); Aharoni et al., 94 PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 10821 (1997)に従って確立した。共重合体１に特異的な系統はマウス脾臓を起源とし、それは１５〜３５日前にフロイントの不完全アジュバント(Difco)で乳化した共重合体１  ５〜１０ｍｇを各マウスに皮下注入して、ＥＡＥに対する感受性を鈍らせておいた。また、共重合体１に特異的な系統は１０日前に４ｍｇ／ｍｌの結核菌Ｈ３７Ｒａ(Difco)を添加したフロイントの完全アジュバント(Difco)で乳化した共重合体１  ２００μｇで免役したマウスのリンパ節から得た。
【０１５６】
共重合体１特異的Ｔ細胞系統を用い、Ｔ細胞クローンはＬＮ−１、ＬＮ−２、Ｓ−３、５−２２−５、Ｃ−１４およびＣ−５２を用いた。ＬＮ−２抗体はＣＦＡ中の共重合体１を注入した（ＳＪＬ／ＢＡＬＢ／ｃ）Ｆ１マウスのリンパ節から誘導した。５−２２−５抗体はAharoni et al., 23 EUR. J. IMMUNOL. 17 (1993); Aharoni et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 10821 (1997)に従ってＣＦＡ中の共重合体１を注入した（ＳＪＬ／ＢＡＬＢ／ｃ）Ｆ１マウスの脾臓から得た。
【０１５７】
ヒトＴ細胞クローンはTeitelbaum et al. 89 PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 137 (1992)に従って末梢血単核細胞から誘導した。約５×１０６細胞を共重合体１またはＭＢＰ（５０μｇ／ｍｌ）とともに１０％熱失活自己血清を添加した培地を入れた２４ウェル培養プレートの各ウェルでインキュベートした。培養７日後、細胞を１０％ウシ胎児血清および組換えヒトインターロイキン−２（２０単位／ｍｌ）を含有する培地へ移した。細胞を照射（３０００ｒａｄ）自己単核細胞に現れる抗原へ１４〜１８日ごとに定期的に暴露しながらこの培地で連続増殖させた。Ｃ−５２  Ｔ細胞クローンもまたTeitelbaum et al. 89 PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 137 (1992)に従ってＤＲ７．ｗ１１ドナーから誘導した。
【０１５８】
増殖アッセイ
Ｔ系統の細胞またはクローンを抗原刺激後１０〜２１日間、その特異的増殖応答について試験した。Ｔ細胞（１．５×１０４）を５×１０５照射脾臓細胞またはヒトＥＢＶ形質転換Ｂ細胞（５×１０４）および最終用量０．２ｍｌの指示された抗原とともに１０％ＦＣＳ培地で三重培養した。４８時間のインキュベーション終了時に培地に１μＣｉ［３Ｈ］−チミジンを適用し、６〜１２時間後に回収した。その三重培養の平均偏差は２０％未満であった。
【０１５９】
＜＜Ｐ５１＞＞
細胞系統はＴＡＬとのみ交差反応した。ＧＴＬと交差反応した細胞系統はなく、またはＴＧＡと同じアミノ酸を有するがＴＧＡまたは共重合体１とは異なるモル分率にあるＡＧＴ（１：１：１）と交差反応した細胞系統はなかった。
【０１６０】
表６  三元共重合体と共重合体１特異的Ｔ細胞系統およびクローンに対する共重合体１との交差反応性
Ｉ．ネズミＴ細胞系統およびクローン
【０１６１】
【表６−１】
0004800481.tif 000009
＊ｐｒｏｌ＝増殖による測定.‡ＩＬ−４＝インターロイキン−４による測定
II．ヒトＴ細胞クローン
【０１６２】
【表６−２】
0004800481.tif 000010
実施例８
三元共重合体は抗共重合体１抗体と交差反応をする
共重合体１に対して向けられた抗体はチロシン、グルタミン酸またはアラニンのいずれかを欠いた三元共重合体と交差反応をする。しかしながら、リジンを欠いた三元共重合体については抗共重合体１抗体によって有効に認識されていない。
【０１６３】
抗体
マウス抗ＭＢＰおよび抗共重合体１モノクロナール抗体はＳＪＬ／ＪマウスのＭＢＰ−または共重合体１免疫化脾臓細胞とＮＳＯ／１ネズミ形質細胞腫細胞系統との融合により得た。Teitelbaum et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9528 (1991)。
【０１６４】
ラジオイムノアッセイ
軟質プラスチックマイクロタイタープレートを共重合体１または三元共重合体（２μｇ／ｍｌ）で被覆した。室温で１６時間インキュベートした後、プレートを３回洗浄し、２％ウシ血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％アジ化ナトリウム、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５単位／ｍｌのヘパリンを含有するＰＢＳ（“ＰＢＳバッファー”）で２時間飽和させた。モノクロナール抗体上清（５０μｌ）を２時間のインキュベーションの間にウェルに加え、ウェルを再度ＰＢＳバッファーで洗浄した。１２５Ｉ−標識ヤギ抗マウスＦａｂ抗体（１×１０５ｃｐｍ／ウェル）を４℃で一晩のインキュベーションの間に加えた。十分洗浄した後、放射能をγ計数装置で測定する。
【０１６５】
方法
抗体交差反応性のＥＬＩＳＡアッセイ
抗共重合体１ポリクロナール抗体および２μｇ／ｍｌ三元共重合体調製物で被覆したマイクロタイタープレートを用い、標準ＥＬＩＳＡアッセイを行う。
【０１６６】
共重合体１
以下のアミノ酸組成を有する共重合体１をTeva Pharmaceutical Industries(Petach Tikva, Israel)から入手する。
【０１６７】
アミノ酸 モル分率
Ｌ−グルタミン酸    ０．１４１
Ｌ−アラニン        ０．４２７
Ｌ−チロシン        ０．０９５
Ｌ−リジン          ０．３３８
三元共重合体
実施例１の４種の三元共重合体を使用した。
【０１６８】
結果
表７は抗共重合体１ポリクロナール抗体がチロシン、グルタミン酸またはアラニンのいずれかを欠いた三元共重合体と交差反応をすることを示している。グルタミン酸を欠いた三元共重合体（ＴＡＬ）との結合率は相対的に高く、これはその平均分子量が高いことから明白であろう。リジンを欠いた三元共重合体は抗共重合体１抗体によって有効に認識されていない。これらのデータはリジンのような荷電アミノ酸が共重合体１および三元共重合体の認識および結合においてある役割を演じていることを示唆している。
【０１６９】
表７
【表７】
0004800481.tif 000011
＊ダルトン  ‡n.d.−測定不可
三元共重合体と共重合体１反応性モノクロナール抗体との交差反応性
Ｂ細胞応答レベルにおける三元共重合体と共重合体１との交差反応性をモノクロナール抗体（ｍＡｂｓ）を用いて調べる。そのモノクロナール抗体は共重合体１およびＭＢＰ（ｍＡｂｓ２−２−１８および３−１−４５）の双方と反応性があるか、または共重合体１（ｍＡｂｓ３−３−９および５−７−２）とのみ反応性があるかのいずれかである。Teitelbaum et al. 88 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9528 (1991)参照。
【０１７０】
表８は三元共重合体がこれらのｍＡｂｓとの結合能力において異なっていたことを示している。ＴＧＡおよびＧＴＬは共重合体１特異的ｍＡｂｓのいずれによっても認識されなかった。一方、ＴＡＬおよびＧＡＬは共重合体１および共重合体１と同等の親和性を有するＭＢＰ特異的ｍＡｂｓと結合した。ＧＡＬおよびＴＡＬは１種のｍＡｂｓ、すなわち５−７−２との結合においてのみ異なり、それはＴＡＬとは結合したが、ＧＡＬとは結合しなかった。
【０１７１】
表８  三元共重合体とＭＢＰ−および共重合体１−反応性Ｂ細胞抗体との交差反応性
【表８】
0004800481.tif 000012
２−２−１８は共重合体１との交差反応性のある抗マウスＭＢＰモノクロナール抗体である
３−１−４５はＭＢＰとの交差反応性のある抗共重合体１モノクロナール抗体である
３−３−９はＭＢＰとの交差反応性のない抗共重合体１モノクロナール抗体である
５−７−２はＭＢＰとの交差反応性のない抗共重合体１モノクロナール抗体である
実施例９
共重合体１および三元共重合体はヒト白血球抗原との結合においてコラーゲンと競合し、コラーゲン特異的Ｔ細胞応答を阻害する
本実施例では共重合体１、ＴＡＬ、ＧＡＬ、ＧＴＬおよびＴＧＡがＭＨＣタンパク質との結合において慢性関節リウマチ関連免疫ドミナントコラーゲン抗原、ＣII２６１−２７３（配列番号３）と競合していることを示している。
【０１７２】
方法
タンパク質発現および精製
組換えＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ４分子（それぞれＤＲＡ／ＤＲＢ１＊０１０１および＊０４０１によりコードされる）はStern, L. et al. 68 CELL 465 (1992)およびDessen, A. et al. 7 IMMUNITY 473 (1997)に記載されるようにキイロショウジョウバエ属(Drosophila)Ｓ２細胞で発現した。細胞は０〜５％ウシ胎児血清(Sigma)を添加したＥｘｃｅｌｌ４０１培地(Sigma, St. Louis, MO)の入ったローラーボトルで２６℃で増殖させた。ＣｕＳＯ４を最終濃度１ｍＭまで添加することによって細胞を誘導し、次いでさらに４〜５日間インキュベートした。組換えＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ４のイムノアフィニティー精製はStern, L. et al. 68 CELL 465 (1992)およびDessen, A. et al. 7 IMMUNITY 473 (1997)により従前に報告されたように行う。回収した細胞の上清を連続してＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＧおよびＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＬＢ３．１カラムに通し、続いて結合したＨＬＡ−ＤＲを５０ｍＭ  ３シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、ｐＨ１１．５で溶出し、２００ｍｍホスフェート（ｐＨ６．０）で中和する。この溶出物をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ１０メンブラン(Amicon)で濃縮する。タンパク質濃度はビシンコニン酸(bicinchoninic acid)アッセイ(Pierce Chemical Co.)により求めた。
【０１７３】
ポリペプチド標識
本ポリペプチドおよびＨＡ３０６−３１８ペプチドは実施例４および７のようにビオチン化した。
【０１７４】
クラスII  ＭＨＣタンパク質結合アッセイ
このアッセイでは、組換えにより産生した水溶性タンパク質をビオチン化した本発明のポリペプチド、および様々な量の非標識競合物ポリペプチド、コラーゲンＣIIペプチドまたはインフルエンザウイルスＨＡペプチドとともにインキュベートした。アッセイはアフィニティー精製したＬＢ３．１モノクロナール抗体で被覆した９６ウェルマイクロタイターイムノアッセイプレート（ＰＲＯ−ＢＩＮＤ（商標）、Falcon）で行った。抗体被覆は１０．０μｇ／ｍｌＬＢ３．１モノクロナール抗体１００μｌを各ウェルに入れ、４℃で１８時間インキュベートすることによって行った。次いでマイクロタイターウェルを３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で３７℃で１時間封鎖し、ＴＴＢＳで３回洗浄した。サンプルを加える前にそれぞれのウェルに１％ＢＳＡ含有ＴＢＳ  ５０μｌを加える。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は１５０ｍＭ塩化ナトリウム、７．５ｍＭリン酸ナトリウム、二塩基性、２．５ｍＭリン酸ナトリウム、一塩基性、ｐＨ７．２である。Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）は１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ８．０、２．７ｍＭ塩化カリウムである。ＴＴＢＳはＴＢＳに０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２Ｇを加えたものである。このアッセイで使用するその他の溶液はFridkis-Hareli et al. 160 J. IMMUNOL. 4386 (1998)に記載されている。
【０１７５】
結合解析は水溶性ＤＲ分子をビオチン化した本発明のポリペプチド、および様々な濃度の非標識阻害剤（共重合体１、ＴＡＬ、ＧＡＬ、ＧＴＬ、ＴＧＡ、コラーゲンＣII２６１−２７３ペプチドまたはＨＡ３０６−３１８ペプチド）とともにインキュベートすることによって行う。コラーゲン型ＣIIペプチド２６１−２７３は配列番号３（ＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥＰ）を有し、分子量は１５１６である。使用するＤＲ濃度は０．１５μＭである。ビオチン化した共重合体１または三元共重合体の最終濃度は１．５μＭである。インキュベーションは結合バッファーｐＨ５．０  ５０μｌ中、３７℃で４０時間である。
【０１７６】
結合した標識をストレプトアビジン結合アルカリ性ホスファターゼを用いて以下のように検出する。プレートをＴＴＢＳで３回洗浄し、ストレプトアビジン結合アルカリ性ホスファターゼ（１：３０００、BioRad, Richmond, VA）１００μｌとともに３７℃で１時間インキュベートし、次いでトリエタノールアミンバッファー（BioRad）中のｐ−ニトロフェニルホスフェートを加えた。４１０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレート読取装置(ＭＲ４０００型、Dynatech, Chantilly, VA)によりモニターする。
【０１７７】
Ｔ細胞ハイブリドーマおよび抗原提示細胞（ＡＰＣ）結合アッセイ
共重合体１および三元共重合体がコラーゲンＣIIペプチドに応答するＴ細胞の活性化を阻害することができるかを確かめるため、それらを調べた。マウスＤＲ１制限３．１９および１９．３  Ｔ細胞ハイブリドーマおよびマウスＤＲ４制限３８３８およびＤ３  Ｔ細胞ハイブリドーマを使用した。Rosloniec. E. F., et al., 185 J. EXP. MED. 1113-1122 (1997); Andersson, E. C., et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1998).抗原提示細胞（ＡＰＣ）はＤＲ１とトランスフェクトしたＬ細胞（Rosloniec. E. F., et al., 185 J. EXP. MED. 1113-1122 (1997)により得られるＬ５７．２３細胞系統）、ＤＲ４とトランスフェクトしたＬ細胞、およびＰｒｉｅｓｓ（ＤＲＢ１＊０４０１／ＤＲＢ４＊０１０１）であった。Ｔ細胞刺激試験は全量０．２ｍｌで９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて行った。照射（３０００−ｒａｄ）したＡＰＣ（２．５×１０４／ウェル）をＣII２６１−２７３（４０μｇ／ｍｌ）および様々な濃度の本ポリペプチドとともに、３７℃で２時間同時インキュベートし、次いでＴ細胞（５×１０４／ウェル）を加え、インキュベーションを３７℃で２４時間続ける。上清（３０μｌ）を除去し、ＩＬ−２依存性ＣＴＬ−Ｌ（５×１０４／ウェル）とともに１２時間インキュベートした後、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）で１２時間標識した。プレートを回収し、放射能を１４５０マイクロベータプラス液体シンチレーションカウンター(Wallac, Gaithersburg, MD)を使用してモニターする。
【０１７８】
結果
クラスII  ＭＨＣタンパク質結合アッセイ
昆虫細胞で産生させた組換え水溶性ＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４タンパク質には大抵結合した自己抗原または他のペプチドがなかった。このため、タンパク質を産生した昆虫細胞から得られるデータによってポリペプチドに対する実際の結合親和性がより正確に示される。Fridkis-Hareli et al. 160 J. IMMUNOL. 4386 (1998)（この全ての内容は引用することにより本明細書の一部とされる）。
【０１７９】
それぞれの共重合体１および三元共重合体とＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ２およびＨＬＡ−ＤＲ４分子との競合的結合を図５に示す。それぞれの共重合体１（ＹＥＡＫ、図５Ａ、上のパネル）および三元共重合体との結合は５０％阻害に必要なＣII２６１−２７３（配列番号３）ペプチド量によってわかるように、ＣII２６１−２７３（配列番号３）ペプチドのものより強い。また上記のことからわかるように、ＴＡＬは共重合体１との結合よりも高い親和性によってＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ４分子と結合した。非標識ＴＡＬ（ＹＡＫ、図５Ａ、下のパネル）ポリペプチドによる阻害の動態もまたインフルエンザウイルスペプチドＨＡ３０６−３１８（配列番号２）のものよりも幾分か優れていた。しかしながら、インフルエンザウイルスペプチドＨＡ３０６−３１８はＣII２６１−２７３ペプチドよりもさらに効率的に共重合体１との結合および三元共重合体との結合を阻害した。
【０１８０】
Ｔ細胞ハイブリドーマおよび抗原提示細胞結合アッセイ結果
共重合体１および三元共重合体はＣIIコラーゲンペプチドによるＤＲ１制限Ｔ細胞の活性化も阻害した（図６）。Ｔ細胞の活性化はＤＲ１制限ＣII特異的Ｔ細胞ハイブリドーマによるＩＬ−２産生を観察することによって検出した。様々な濃度のコラーゲンペプチドＣII２６１−２７３（配列番号３）を本ポリペプチドの１つとともに同時インキュベートし、次いでＴ細胞（指示したクローン３．１９または１９．３）を加え、その混合物をさらにインキュベートした。このインキュベートした細胞の上清を除去し、上清によってＩＬ−２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ−Ｌ）の増殖が誘導されたかどうかを観察することによってＩＬ−２についてアッセイした。ＴＡＬによる阻害の程度を塗りつぶした円（●）で示し、ＴＧＡによるものを塗りつぶした三角形（▲）で、ＧＴＬによるものを開いた三角形（△）で、および共重合体１によるものを塗りつぶした四角形（■）で示す。縦軸で示したＣＴＬ−Ｌ増殖の阻害％を式１を用いて算出した。
【０１８１】
また、ＴＡＬは最有力の阻害剤である。しかしながら、ＧＴＬおよび共重合体１もまたＣIIコラーゲンペプチドによるＴ細胞活性化の有力な阻害剤であった。ＴＧＡの活性化阻害はそれほど有効ではなかった。同様な結果が共重合体１および三元共重合体の他のバッチからも得られた。
【０１８２】
図７で示すように、ＤＲ４制限Ｔ細胞の活性化の同様な阻害が見られた。ＩＬ−２産生を用いてＤＲ４制限ＣII特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ（３８３８およびＤ３）の活性化を評価した。様々なポリペプチドの存在によってＩＬ−２産生が阻害され、それらがＤＲ４制限Ｔ細胞活性化を阻害したことが分かった。図７Ａは照射した３８３８またはＤ３  Ｐｒｉｅｓｓ細胞を一定濃度４０μｇ／ｍｌのコラーゲンペプチドＣII２６１−２７３（配列番号３）および様々な濃度のポリペプチドとともに、３７℃で２時間同時インキュベートする効果を示す。図７ＢはＨＬＡ−ＤＲ４をコードする遺伝子とトランスフェクトしたＬ細胞を一定濃度４０μｇ／ｍｌのコラーゲンペプチドＣII２６１−２７３（配列番号３）および様々な濃度のＧＡＬ、ＴＡＬ、ＧＴＬ、ＴＧＡおよび共重合体１とともに、３７℃で２時間インキュベートする効果を示す。次いでＴ細胞（指示したクローン３８３８またはＤ３）を加え、サンプルをさらに３７℃で２４時間インキュベートした。次いで上清（３０μｌ）を除去し、ＩＬ−２産生により誘導されるＩＬ−２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ−Ｌ）の増殖による活性化についてアッセイした。各ポリペプチド混合物を二重試験した。本ポリペプチドの濃度は横軸で示す。ＴＡＬによる阻害の程度を塗りつぶした円（●）で示し、ＴＧＡによるものを塗りつぶした三角形（▲）で、ＧＴＬによるものを開いた三角形（△）で、および共重合体１によるものを塗りつぶした四角形（■）で示す。縦軸で示したＣＴＬ−Ｌ増殖の阻害％を式１を用いて算出した。
【０１８３】
実施例１０
共重合体１は重症性筋無力症抗原性ペプチドに応答するＴ細胞の活性化を阻害する
方法
共重合体１
共重合体１はTeva Pharmaceutical Industries(Petach Tikva, Israel)から入手した。
【０１８４】
重症性筋無力症関連ペプチドはApplied Biosystems ペプチドシンセサイザーにおいて固相手法を用いて合成した。Barany et al., THE PEPTIDES 1 (1979).ペプチドは逆相ＨＰＬＣにより精製した。使用したペプチドはｐ２５９ペプチドであった、Zisman et al., Hum Immunol 1995 Nov; 44 (3): 121-30; Brocke et al., Immunology 1990 Apr, 69 (4): 495-500参照。
【０１８５】
ＩＬ−２分泌
重症性筋無力症ペプチドおよび／または共重合体１に応答する細胞系統ＷＣＢ  ＡＢによるＩＬ−２分泌を評価した。細胞（１．５×１０４）を指示した抗原とともにインキュベートした。細胞系統ＷＣＢ  ＡＢによるＩＬ−２分泌をそのＴ細胞系統の活性化の尺度として用いた。
【０１８６】
結果
表９はｐ２５９ペプチドがＴ細胞分泌を刺激することを示している。しかしながら、共重合体１をｐ２５９ペプチドとともにインキュベートするとＩＬ−２のＴ細胞分泌は用量に関連して阻害される。共重合体１  １００μＭではＩＬ−２分泌の約９１％が阻害され（表１０）、共重合体１がＴ細胞活性化の有力な阻害剤であることが示される。
【０１８７】
表９  ｐ２５９に応答するＷＣＢ  ＡＢ系統からのＩＬ−２分泌
【表９】
0004800481.tif 000013
表１３  Ｃｏｐ１単独または２μＭ  ｐ２５９＋Ｃｏｐ１に応答するＷＣＢ  ＡＢ系統からのＩＬ−２分泌
【表１０】
0004800481.tif 000014
吸光度は３サンプルの平均である。信頼値はブランクの吸光度に対して算出した（％ＣＶ＝ＳＤ／（平均−ブランク）＊１００）.
【図面の簡単な説明】
以下の通り、使用する。
“ＧＡＬ”はグルタミン酸、アラニンおよびリジンのランダム三元共重合体であり；
“ＴＧＡ”または“ＹＥＡ”はチロシン、グルタミン酸およびアラニンのランダム三元共重合体であり；
“ＧＴＬ”または“ＹＥＫ”はグルタミン酸、チロシンおよびリジンのランダム三元共重合体であり；および
“ＹＥＡＫ”は共重合体１である。
【配列表】
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【図面の詳細な説明】
【図１】  あるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチドに特異的であるＴ細胞の増殖における共重合体１または三元共重合体の効果を示す。いくつかの本発明の三元共重合体はミエリン塩基性タンパク質抗原、ＭＢＰ  ８４−１０２（配列番号１）に特異的であるＴ細胞系の増殖を阻害する。以下の符号：共重合体１（●）；ＧＡＬ（□）；ＴＧＡ（△）；ＴＡＬ（○）；ＧＴＬ（×）を用いた。図１ＡはＭＢＰ  ８４−１０２ペプチド（０．５ｇ／ウェル）に特異的なマウスＴ細胞クローンＭＢＰ−ｓｐ−１の増殖阻害を示す。対照として、阻害剤無しでＭＢＰ  ８４−１０２（配列番号１）により刺激したマウスＴ細胞クローンＭＢＰ−ｓｐ−１の増殖は２１，１４５ｃｐｍであった。図１ＢはＭＢＰ  ８４−１０２ペプチド（０．１２５ｇ／ウェル）に対するヒトＴ細胞クローンＧＰ−２５の応答の阻害を示す。阻害剤無しでＭＢＰ  ８４−１０２（配列番号１）により刺激したヒトＴ細胞クローンＧＰ−２５の増殖は１１，４４２ｃｐｍであった。
【図２Ａ】  クラスII主要組織適合分子ＤＲ１（上）、ＤＲ２（中間）およびＤＲ４（下）に対する本ポリペプチドの結合と、共重合体１の結合を比較する。共重合体１（■）による結合と、以下のビオチン化した三元共重合体：ＧＡＬ（□）；ＴＧＡ（▲）；ＧＴＬ（△）；およびＴＡＬ（◆）による結合とを比較した。クラスII主要組織適合分子の量は０．５μ／サンプルにおいて一定に保ち、ペプチド濃度をｙ軸で示すように０〜８μＭ間で変化させた。結合は３７℃、ｐＨ５．０で４０時間であった。ＬＢ３．１抗体でポリペプチド−クラスII複合体を捕獲し、ストレプトアビジン結合アルカリ性ホスファターゼと反応させた後に４１０ｎｍで吸光度をモニターして、結合したビオチン化ポリペプチド量を検出することによって結合を検出した。
【図２Ｂ】  図２Ａで得られた結合データのラインウィーバー−バークプロットである。
【図３】  本ポリペプチドによる共重合体１とクラスII主要組織適合分子との結合の拮抗阻害を示す。精製したＨＬＡ−ＤＲ１（上）、ＨＬＡ−ＤＲ２（中間）およびＨＬＡ−ＤＲ４（下）分子を単独で、または以下の非標識のポリペプチド：共重合体１（■）；ＧＡＬ（□）；ＴＧＡ（▲）；ＧＴＬ（△）；およびＴＡＬ（◆）のうち１つの存在下で、のいずれかにおいて、一定量（１．５μＭ）のビオチン化共重合体１とともにインキュベートした。これらのポリペプチドによる阻害をミエリン塩基性タンパク質抗原  ＨＡ  ３０６−３１８（○）（配列番号２）による阻害とを比較した。結合は３７℃、ｐＨ５．０で４０時間であった。ｙ軸で示すように非標識のポリペプチド量を０．１〜１０００μＭ間で変化させた。結合率は式１：
阻害％＝100―（競合物のある場合のシグナル−バックグラウンド）×100／（競合物のない場合のシグナル−バックグラウンド）
により阻害％として示す。
【図４Ａ】  細菌性超抗原ＳＥＡ、ＳＥＢおよびＴＳＳＴ−１によるＴＡＬとクラスII主要組織適合分子との結合の拮抗阻害を示す。精製したＨＬＡ−ＤＲ１（上）、ＨＬＡ−ＤＲ２（中間）およびＨＬＡ−ＤＲ４（下）分子を漸増濃度の非標識細菌性超抗原ＳＥＡ（□）；ＳＥＢ（■）；またはＴＳＳＴ−１（●）の存在下で一定量のビオチン化ＴＡＬとともにインキュベートした。結合は３７℃、ｐＨ５．０で４０時間であった。ｙ軸で示すように超抗原量を０．１〜１０００μＭ間で変化させた。結合率は式１により阻害％として示す。
【図４Ｂ】  細菌性超抗原ＳＥＡ、ＳＥＢおよびＴＳＳＴ−１によるＴＧＡとクラスII主要組織適合分子との結合の拮抗阻害を示す。精製したＨＬＡ−ＤＲ１（上）、ＨＬＡ−ＤＲ２（中間）およびＨＬＡ−ＤＲ４（下）分子を漸増濃度の非標識細菌性超抗原ＳＥＡ（□）；ＳＥＢ（■）；またはＴＳＳＴ−１（●）の存在下で一定量のビオチン化ポリペプチドＴＧＡとともにインキュベートした。結合は３７℃、ｐＨ５．０で４０時間であった。ｙ軸で示すように超抗原量を０．１〜１０００μＭ間で変化させた。結合率は上記式１により算出した阻害％として示す。
【図４Ｃ】  細菌性超抗原ＳＥＡ、ＳＥＢおよびＴＳＳＴ−１によるＧＡＬとクラスII主要組織適合分子との結合の拮抗阻害を示す。精製したＨＬＡ−ＤＲ１（上）およびＨＬＡ−ＤＲ２（下）分子を漸増濃度の非標識細菌性超抗原ＳＥＡ（□）；ＳＥＢ（■）；またはＴＳＳＴ−１（●）の存在下で一定量のビオチン化ポリペプチドＧＡＬとともにインキュベートした。結合は３７℃、ｐＨ５．０で４０時間であった。ｙ軸で示すように超抗原量を０．１〜１０００μＭ間で変化させた。結合率は上記式１により算出した阻害％として示す。
【図５Ａ】  本発明の三元共重合体による標識分子とＭＨＣクラスII精製タンパク質との結合の阻害を示す。図５ＡはＭＨＣ  ＨＬＡ−ＤＲ１タンパク質との結合の阻害を示す。
【図５Ｂ】  図５ＢはＭＨＣ  ＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質との結合の阻害を示す。非標識の競合物として、本発明の三元共重合体、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）ペプチド３０６−３１８（配列番号２）、およびII型コラーゲン（ＣII）ペプチド２６１−２７３（配列番号３）が挙げられる。非標識の競合物の濃度は横軸で示す。各パネルでは、ＣII  ２６１−２７３（配列番号３）による阻害を開いた円（○）で示し、ＨＡ  ３０６−３１８（配列番号２）による阻害を塗りつぶした円（●）で示し、本発明の三元共重合体各々による阻害を開いた三角形もしくは四角形、または塗りつぶした三角形もしくは四角形で示す。ＧＴＬによる阻害の程度を開いた三角形（△）を用いて示し、ＴＡＬによるものを塗りつぶした三角形（▲）で、ＴＧＡによるものを開いた四角形（□）で、および共重合体１によるものを塗りつぶした四角形（■）で示す。観察され、縦軸で示した結合率は上記式１を用いて阻害％として算出した。
【図６】  本発明の様々なポリペプチドの存在下におけるＤＲ１制限ＣII特異的Ｔ細胞ハイブリドーマによるＩＬ−２産生の阻害を示す。照射したＬ５７．２３細胞（ＨＬＡ−ＤＲ１をコードする遺伝子とトランスフェクトした繊維芽細胞）をコラーゲンペプチドＣII２６１−２７３（４０μｇ／ｍｌ）および横軸で示す様々な濃度の本ポリペプチド各々とともに、２組、３７℃で２時間同時インキュベートし、次いでＴ細胞（指示したクローン３．１９または１９．３）を加え、その混合物をさらに３７℃で２４時間インキュベートした。上清（３０μｌ）を次いで除去し、ＩＬ−２により誘導されるＩＬ−２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ−Ｌ）の増殖による活性化についてアッセイした。
ＴＡＬによる阻害の程度を塗りつぶした円（●）で示し、ＴＧＡによるものを塗りつぶした三角形（▲）で、ＧＴＬによるものを開いた三角形（△）で、および共重合体１によるものを塗りつぶした四角形（■）で示す。縦軸で示したＣＴＬ−Ｌ増殖の阻害％を式１に従って算出した。
【図７Ａ】  本発明の様々なポリペプチドの存在下におけるＤＲ４制限ＣII特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ（３８３８およびＤ３）によるＩＬ−２産生の阻害を示す。図７Ａは照射した３８３８またはＤ３  Ｐｒｉｅｓｓ細胞を一定濃度４０μｇ／ｍｌのコラーゲンペプチドＣII２６１−２７３（配列番号３）および様々な濃度の本ポリペプチド各々とともに、３７℃で２時間同時インキュベートする効果を示す。
【図７Ｂ】  図７ＢはＨＬＡ−ＤＲ４をコードする遺伝子とトランスフェクトしたＬ細胞を一定濃度４０μｇ／ｍｌのコラーゲンペプチドＣII２６１−２７３（配列番号３）および様々な濃度の本ポリペプチド各々とともに、３７℃で２時間インキュベートする効果を示す。次いでＴ細胞（指示したクローン３８３８またはＤ３）を加え、サンプルをさらに３７℃で２４時間インキュベートし、図６に記載したように上清をアッセイした。各ポリペプチドを二重試験した。本ポリペプチドの濃度は横軸で示す。この図面では図６と同じ符号を用いた。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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