(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体上に所望の物質を固定化するために用いられる水溶性のポリマーであって、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有し、かつ、前記水溶性ポリマーが分子全体として電気的に中性なポリマーから成り、該水溶性ポリマーが、ポリ（エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート−光反応性アクリル酸アミド）共重合体である、物質固定化剤。
【請求項２】
前記ポリ（エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート−光反応性アクリル酸アミド）共重合体が、下記式で表わされる構造を有する請求項１記載の物質固定化剤。
【化１】
0004630817.tif 000020
【請求項３】
前記水溶性ポリマーの分子量が５００ないし５００万である請求項１又は２記載の物質固定化剤。
【請求項４】
基体に固定化する物質が、ポリペプチド、多糖類、核酸、脂質並びに細胞及びその構成要素から成る群から選ばれる請求項１ないし３のいずれか１項に記載の物質固定化剤。
【請求項５】
基体に固定化すべき物質と、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の物質固定化剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布し、光照射することを含む、基体上への物質の固定化方法。
【請求項６】
基体に固定化する物質が、ポリペプチド、多糖類、核酸、脂質並びに細胞及びその構成要素から成る群から選ばれる請求項５記載の方法。
【請求項７】
請求項５又は６記載の方法により前記物質が固定化された基体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド、核酸、脂質等の所望の物質を基体上に固定化するための物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、抗体又は抗原をプレート上に固定化した、免疫測定のためのイムノプレートや、核酸をチップ上に固定化したＤＮＡチップ等が広く用いられている。従来、基体上にタンパク質や核酸を固定化する方法の１つとして、物理吸着が広く用いられている。すなわち、例えばポリスチレンのような疎水性の基体と、基体上に固定化すべきタンパク質や核酸の水溶液とを接触させて放置することにより、物理吸着によってタンパク質や核酸が基体上に固定化される。
【０００３】
しかしながら、物理吸着を用いる方法では、基体と固定化物質との結合が弱く、物質を固定化した基体の安定性が不十分であるという問題がある。また、目的のタンパク質や核酸で被覆されなかった領域への非特異吸着を防止するために、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、スキムミルク等のタンパク質（タンパク質を固定化する場合）や、サケ精子ＤＮＡ等のＤＮＡ（ＤＮＡを固定化する場合）でブロッキングすることが行われているが、ブロッキングによる非特異吸着の防止効果も必ずしも満足できるものではない。
【０００４】
また、基体上の官能基と、固定化すべきタンパク質や核酸の官能基とを共有結合させることにより基体上にタンパク質や核酸を固定化することも行われている。しかしながら、この方法では、用いる官能基が物質の活性部位の中又はその近傍にある場合には、固定化により物質の活性が失われてしまう。また、適当な官能基が存在しない場合には、この方法により固定化することができない。また、物理吸着の場合と同様、ブロッキングにより非特異吸着が防止されているが、その防止効果は必ずしも満足できるものではない。
【０００５】
以上の従来技術を記載した文献として次のものを挙げることができる。
【０００６】
一方、光反応性基を利用して物質を基板に固定化することも知られている（Y. Ito and M. Nogawa, "Preparation of a protein micro-array using a photo-reactive polymer for a cell adhesion assay," Biomaterials, 24、3021-3026 (2003))。しかしながら、この方法では、非特異吸着を防止するための配慮は特にされてはいない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１１−３３７５５１号公報
【特許文献２】特開２００１−３３７０８９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Y. Ito and M. Nogawa, "Preparation of a protein micro-array using a photo-reactive polymer for a cell adhesion assay," Biomaterials, 24、3021-3026 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、基体上に種々の固定化すべき物質を共有結合により固定化することができ、かつ、非特異吸着の防止効果に優れた、物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体を提供することである。
【００１０】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、分子全体として電気的に中性な水溶性のポリマーを物質固定化剤に利用することにより、非特異吸着を有効に防止できることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、基体上に所望の物質を固定化するために用いられる水溶性のポリマーであって、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有し、かつ、前記水溶性ポリマーが分子全体として電気的に中性なポリマーから成り、該水溶性ポリマーが、ポリ（エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート−光反応性アクリル酸アミド）共重合体である、物質固定化剤を提供する。
【００１２】
また、本発明は、基体に固定化すべき物質と、上記本発明の物質固定化剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布し、光照射することを含む、基体上への物質の固定化方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の方法により前記物質が固定化された基体を提供する。
【００１３】
本願発明により、基体上に固定化すべき物質を共有結合により固定化することができ、かつ、非特異吸着の防止効果に優れた、物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体が提供された。本発明によれば、固定化すべき物質を、その種類に関係なく共有結合により固定化することができ、安定な固定化基板を得ることができる。また、本発明の物質固定化剤を用いて物質を固定化すると、非特異吸着が効果的に防止される。さらに、本発明の物質固定化剤を用いて物質を固定化する場合、選択露光を行うことにより、固定化物質のパターニングも可能であり、容易にマイクロアレイ等の任意のパターンに物質を固定化することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
上記の通り、本発明の物質固定化剤は、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有し、かつ、前分子全体として電気的に中性なポリマーから成る。ここで、「分子全体として電気的に中性」とは、中性付近のpH（pH6〜8)の水溶液中で電離してイオンになる基を有さないか、又は有していても陽イオンになるものと陰イオンになるものを有していて、その電荷の合計が実質的に０になることを意味する。ここで「実質的に」とは、電荷の合計が０になるか、又は０にはならないとしても本発明の効果に悪影響を与えない程度に小さいことを意味する。
【００１５】
本発明の物質固定化剤は、水溶性であり、水に対する溶解度（水１００ｇに溶解するグラム数）は、好ましくは５以上である。
【００１６】
水溶性ポリマーの好ましい例として、下記一般式[I]で表される構造を有する単位と、下記一般式[II]で示される構造を有する単位を含むポリマーを挙げることができる。
【００１７】
【化１】
0004630817.tif 000002
【００１８】
【化２】
0004630817.tif 000003
【００１９】
（ただし、一般式[I]及び[II]中、Ｘ及びＹは、互いに独立して、重合した状態の重合性原子団を表し、Ｒ１は光反応性基を有する原子団を表し、一般式[I]及び[II]で表される単位は、それぞれ２個以上であり、かつ、一般式[I]で表される単位の数は、一般式[II]で表される単位の数よりも大きい)。
（上記一般式[I]で表される構造を有する単位を以下、便宜的に「単位[I]」と言うことがある。また、上記一般式[II]で示される構造を有する単位を、以下、便宜的に「単位[II]」と言うことがある。）
を挙げることができる。
【００２０】
上記ホスホリルコリン含有ポリマーは、生体膜が種々の物質と接触するにもかかわらず、非特異吸着がほとんど起きないことに着目し、生体膜の構成成分であるホスホリルコリンを含む高分子を利用して、所望の物質を基体に固定化することにより非特異吸着を有効に防止できるのではないかという着想に基づいて発明されたものである。
【００２１】
単位[I]は、ホスホリルコリン基を含む単位であり、Ｘは重合した状態の重合性原子団を表す。Ｘとしては、ビニル系モノマー残基が好ましい。単位[I]としては、下記一般式[V]に示されるものが好ましい。
【００２２】
【化３】
0004630817.tif 000004
【００２３】
（ただし、式中、Ｘ’は、ビニル部分が付加重合している状態のメタクリルオキシ基、メタクリルアミド基、アクリルオキシ基、アクリルアミド基、スチリルオキシ基又はスチリルアミド基を表し、Ｒ１は単結合又は炭素数１〜１０のアルキレン基（ただし１個又は２個のヒドロキシル基で置換されていてもよい）を表す)。
【００２４】
このような単位の好ましい具体例として、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、Ｎ−（２−メタクリルアミド）エチルホスホリルコリン、４−メタクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、10-メタクリロイルオキシデシルシルホスホリルコリン、ω−メタクリロイルジオキシエチレンホスホリルコリン又は４−スチリルオキシブチルホスホリルコリンに由来する（すなわち、これらの単位を重合させた）単位を挙げることができる。これらの中でも２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来する単位が特に好ましい。
【００２５】
一方、単位[II]中の光反応性基の好ましい例としてアジド基(-N3)を挙げることができるがこれに限定されるものではない。また、一般式[II]のＹとしては、ビニル系モノマー残基が好ましい。単位[II]の好ましい例として、下記一般式[VI]で示されるものを挙げることができる。
【００２６】
【化４】
0004630817.tif 000005
【００２７】
（ただし、Ｙ’は、ビニル部分が付加重合している状態のメタクリルオキシ基、メタクリルアミド基、アクリルオキシ基、アクリルアミド基、スチリルオキシ基又はスチリルアミド基を表し、Ｒ２は単結合、炭素数１〜１０のアルキレン基（ただし１個又は２個のヒドロキシル基で置換されていてもよい）、フェニレン基（ただし、１〜３個の炭素数１〜４のアルキル基又はヒドロキシル基で置換されていてもよい。）
【００２８】
単位[I]の数は単位[II]の数よりも大きく、その比率は、特に限定されないが、１００：２〜１００：５０程度が好ましく、特に１００：５〜１００：２０程度が好ましい。このように、ポリマーは、ホスホリルコリン基を有する単位[I]から主として成ることにより、非特異吸着が効果的に防止される。また、水溶性ポリマーの分子量は、特に限定されないが、通常、1,000〜1,000,000程度であり、好ましくは、5,000〜100,000程度である。
【００２９】
上記水溶性ポリマーは、単位[I]と単位[II]のみから成るものが好ましいが、本発明の効果に悪影響を与えない範囲で他の重合性モノマー由来の単位を含んでいてもよい。このような他の単位の割合は、本発明の効果に悪影響を与えない範囲であれば特に限定されないが、通常、通常、ポリマー中の全単位中の３０モル％以下、好ましくは１０モル％以下である。
【００３０】
上記水溶性ポリマーの好ましい例として、下記一般式[III]で表すものを挙げることができる。
【００３１】
【化５】
0004630817.tif 000006
【００３２】
（ただし、式中、Ｘ’、Ｙ’、Ｒ１、Ｒ２は上記定義と同じ意味を表し、ｎ及びｍは、互いに独立して２以上の整数であり、かつ、ｎはｍよりも大きく、Ｘ’を含む単位とＹ’を含む単位はランダムな順序で結合している。）
【００３３】
上記一般式[III]で示される化合物の中でも、特に下記式[IV]で示されるポリマーが好ましい。
【００３４】
【化６】
0004630817.tif 000007
【００３５】
（ただし、n'は５０ないし２００の整数、m'は５ないし４０の整数を表し、ホスホリルコリン含有単位と、アジドフェニル基含有単位はランダムな順序で結合している）。
【００３６】
上記水溶性ポリマーは、上記した単位[I]及び単位[II]を単に重合させることにより製造することができる。あるいは、側鎖（ホスホリルコリン基含有基及び光反応性基含有基)を含まない主鎖のポリマーを先に合成し、後から側鎖を結合してもよい。また、ホルホリルコリン基含有基を有する単位[I]と、光反応性基を有さない単位[II]とを先ず重合し、後から光反応性基含有基を結合させてもよい。下記の実施例ではこの方法を採用している。なお、モノマーの重合や、側鎖の結合は、当業者の技術常識に従って容易に実施することができるし、下記の実施例にもその一例が具体的に記載されている。
【００３７】
また、本発明に用いられる水溶性ポリマーとしては、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有するノニオン性水溶性高分子（ポリマー）を好ましい例として挙げることができる。ノニオン性水溶性高分子は、上記したホスホリルコリン含有ポリマーと同等の非特異吸着防止効果を有し、それでいてホスホリルコリン含有ポリマーよりも安価に製造又は入手可能であるという利点を有する。
【００３８】
ここで、「ノニオン性」とは、中性付近のpH（pH6〜8)の水溶液中で電離してイオンになる基を実質的に有さないことを意味する。ここで「実質的に」とは、このような基を全く含まないか、又は含んでいるとしても本発明の効果に悪影響を与えない程度に微量（例えば、このような基の数が炭素数の１％以下）であることを意味する。
【００３９】
ノニオン性水溶性高分子の分子量は、特に限定されないが、通常、３５０〜５００万程度であり、好ましくは、５００〜数１０万程度である。
【００４０】
このようなノニオン性水溶性高分子の好ましい例として、ポリエチレングリコール(PEG)やポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール；ビニルアルコール、メチルビニルエーテル、ビニルピロリドン、ビニルオキサゾリドン、ビニルメチルオキサゾリドン、2-ビニルピリジン、4-ビニルピリジン、N-ビニルサクシンイミド、N-ビニルホルムアミド、N-ビニル-N-メチルホルムアミド、N-ビニルアセトアミド、N-ビニル-N-メチルアセトアミド、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、N,N-ジメチルアクリルアミド、N-iso-プロピルアクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド、メチロールアクリルアミド、アクリロイルモルホリン、アクリロイルピロリジン、アクリロイルピペリジン、スチレン、クロロメチルスチレン、ブロモメチルスチレン、酢酸ビニル、メチルメタクリレート、ブチルアクリレート、メチルシアノアクリレート、エチルシアノアクリレート、n-プロピルシアノアクリレート、iso-プロピルシアノアクリレート、n-ブチルシアノアクリレート、iso-ブチルシアノアクリレート、tert-ブチルシアノアクリレート、グリシジルメタクリレート、エチルビニルエーテル、n-プロピルビニルエーテル、iso-プロピルビニルエーテル、n-ブチルビニルエーテル、iso-ブチルビニルエーテル、tert-ブチルビニルエーテルなどのモノマー単位を単独か混合物を構成成分とするノニオン性のビニル系高分子；ゼラチン、カゼイン、コラーゲン、アラビアガム、キサンタンガム、トラガントガム、グアーガム、プルラン、ペクチン、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、キトサン、キチン誘導体、カラギーナン、澱粉類（カルボキシメチルデンプン、アルデヒドデンプン）、デキストリン、サイクロデキストリン等の天然高分子、メチルセルロース、ビスコース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースのような水溶性セルロース誘導体等の天然高分子を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。これらのうち、特に好ましいものはポリエチレングリコール、ポリ（メタ）アクリルアミド（本明細書及び特許請求の範囲において、「（メタ）アクリル」は、「メタクリル」又は「アクリル」を意味する）及びポリ（グリシジル（メタ）アクリレート）であり、これらの中で特に好ましくは、ポリエチレングリコールである。
【００４１】
上記したノニオン性水溶性高分子は、１分子当り少なくとも２個の光反応性基を有する。ノニオン性水溶性高分子１分子当りの光反応性基の数は、２個以上であれば、特に限定されるものではないが、あまりに多すぎると、非特異吸着が増大する恐れがあるので、高分子を構成する炭素数（側鎖の炭素を含まない）の１０％以下が好ましく、さらに好ましくは５％以下である。光反応性基の好ましい例としてアジド基(-N3)を挙げることができるがこれに限定されるものではない。光反応性基の具体例としてフェニルアジド基、アセチル基、ベンゾイル基が挙げられるが、特に好ましくはフェニルアジド基である。アジド基等の光反応性基は、ノニオン性水溶性高分子に直接結合していてもよいが、任意のスペーサー構造を介してノニオン性水溶性高分子に結合されていてもよく、通常、後者の方が製造が容易であり好ましい。後者の場合、スペーサー構造は、何ら限定されるものではなく、例えば炭素数１〜１０のアルキレン基（ただし１個又は２個のヒドロキシル基で置換されていてもよい）、フェニレン基（ただし、１〜３個の炭素数１〜４のアルキル基又はヒドロキシル基で置換されていてもよい）等を挙げることができる。
【００４２】
ノニオン性水溶性高分子への光反応性基の導入は、常法に基づき容易に行うことができる。例えば、官能基を有するノニオン性水溶性高分子と、該官能基と反応する官能基を有するアジド化合物を反応させて、ノニオン性水溶性高分子にアジド基を結合させることができる。好ましいノニオン性水溶性高分子であるポリエチレングリコールを用いる場合、両末端にアミノ基やカルボキシル基を有するポリエチレングリコールが市販されているので、このような市販の官能基含有ポリエチレングリコールの官能基に、アジド基含有化合物を反応させてポリエチレングリコールにアジド基を結合させることができる。下記実施例にも、複数のこのような方法が具体的に記載されている。あるいは、ノニオン性水溶性高分子が水溶性ビニル系高分子のように、モノマーの重合により形成されるものである場合には、水溶性ビニル系高分子の主な構成単位となるビニル系モノマーと、光反応性ビニル系モノマーとを共重合させることにより光反応性基を有するノニオン性水溶性高分子を製造することもできる。この方法により得られる光反応性水溶性ビニル系高分子の好ましい例として、ポリ（（メタ）アクリルアミド−光反応性（メタ）アクリル酸アミド）共重合体及びポリ（グリシジル（メタ）アクリレート−光反応性（メタ）アクリル酸アミド）共重合体、ポリ（エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート−光反応性アクリル酸アミド）共重合体等を挙げることができ、これらを製造する方法は、下記実施例に具体的に記載されている。
【００４３】
本発明の物質固定化剤を用いて固定化される物質は、特に限定されないが、ポリペプチド（糖タンパク質及びリポタンパク質を包含する）、核酸、脂質並びに細胞（動物細胞、植物細胞、微生物細胞等)及びその構成要素（核、ミトコンドリア等の細胞内小器官、細胞膜や単位膜等の膜等を包含する）を例示することができる。本発明の物質固定化剤に光反応性基として用いられるアジド基は、光を照射することにより窒素分子が離脱すると共に窒素ラジカルが生じ、この窒素ラジカルは、アミノ基やカルボキシル基等の官能基のみならず、有機化合物を構成する炭素原子とも結合することが可能であるので、ほとんどの有機物を固定化することが可能である。
【００４４】
基体としては、少なくともその表面が、上記光反応性基と結合し得る物質から成るものであれば特に限定されず、マイクロプレート等で広く用いられているポリスチレンをはじめ、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートやポリプロピレン等の有機物から成るものを例示することができる。ガラス板にシランカップリング剤をコーティングしたもの等も用いることができる。また、基体の形態は何ら限定されるものではなく、マイクロアレイ用基板のような板状のものや、ビーズ状、繊維状のもの等を用いることができる。さらに、板に設けられた穴や溝、例えば、マイクロプレートのウェル等も用いることができる。本発明の物質固定化剤は、これらのうち、特にマイクロアレイ用に適している。
【００４５】
本発明の物質固定化剤を用いて、基体上に所望の物質を固定化することは、次のようにして行うことができる。先ず、基体に固定化すべき物質と、本発明の物質固定化剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布する。この場合、水溶液中の物質固定化剤の濃度（重量基準）は、特に限定されないが、通常、0.005％〜10%程度であり、好ましくは0.04〜1%程度である。また、固定化すべき物質の濃度（重量基準）は、通常、用いる物質固定化剤の１０倍ないし２００倍程度であり、好ましくは２０倍ないし１００倍程度である。
【００４６】
次に、塗布した液を好ましくは乾燥した後、光を照射する。光は、用いる光反応性基がラジカルを生じさせることができる光であり、光反応性基としてアジド基を用いる場合には、紫外線が好ましい。照射する光線の線量は、特に限定されないが、通常、１cm2当たり１ｍW〜100mW程度である。
【００４７】
光を照射することにより、ポリマー中の光反応性基がラジカルを生じ、ポリマーが基体及び固定化すべき物質の双方と共有結合する。その結果、固定化すべき物質がポリマーを介して基体に固定化される。光反応性基として用いられるアジド基は、光を照射することにより窒素分子が離脱すると共に窒素ラジカルが生じ、この窒素ラジカルは、アミノ基やカルボキシル基等の官能基のみならず、有機化合物を構成する炭素原子とも結合することが可能であるので、ほとんどの有機物を固定化することが可能である。なお、本発明の方法では、光反応性基により生じるラジカルを利用して結合反応を行うので、固定化すべき物質の特定の部位と結合するのではなく、ランダムな部位と結合する。従って、活性部位が結合に供されて活性を喪失する分子も当然出てくると考えられるが、活性部位に影響を与えない部位で結合する分子も当然存在するので、本発明の方法によれば、従来、適当な置換基が活性部位又はその近傍にあるために、共有結合で固定化することが困難であった物質であっても、全体として活性を喪失させることなく、共有結合により基体に固定化することができる。
【００４８】
光が照射されなかった部分では、光反応性基が基体及び物質に結合しないので、洗浄すればポリマーも物質も除去される。従って、フォトマスク等を介して選択露光を行うことにより、任意のパターンで物質を固定化することができる。従って、選択露光により、マイクロアレイ等の任意の種々の形状に物質を固定化することができるので、非常に有利である。
【００４９】
あるいは、本発明の物質固定化剤と、固定化すべき物質の混合物を基体上にマイクロスポッティングし、基体の全面を光照射してもよい。マイクロスポッティングは、液を基体上に非常に狭い領域に塗布する手法であり、DNAチップ等の作製に常用されており、そのための装置も市販されているので、市販の装置を用いて容易に行うことができる。あるいは、先ず、基体上に本発明の物質固定化剤を全面にコーティングし、その上に固定化すべき物質をマイクロスポッティングし、次いで基体の全面に光照射してもよい。この場合、固定化すべき物質のスポットが、物質固定化剤の層の上に形成され、物質固定化剤を介して基体に共有結合で固定化される物質の割合が高くなる。さらに、基体上に本発明の物質固定化剤をマイクロスポッティングし、その上に固定化すべき物質をマイクロスポッティングし、次いで基体の全面に光照射してもよい。この場合にも固定化すべき物質のスポットが、物質固定化剤の層（それぞれ分離したスポット）の上に形成され、物質固定化剤を介して基体に共有結合で固定化される物質の割合が高くなる。
【００５０】
本発明の方法は、抗体若しくはその抗原結合性断片又は抗原を固定化した免疫測定用プレートの作製、ＤＮＡやＲＮＡを基板上に固定化した核酸チップ、マイクロアレイ等の作製に好適に用いることができるがこれらに限定されるものではなく、例えば、細胞全体やその構成要素の固定化等にも適用することができる。
【００５１】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５２】
参考例１    物質固定化剤の製造（その１）
下記の合成スキームにより光反応性メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)ポリマーを合成した。
【００５３】
【化７】
0004630817.tif 000008
【００５４】
2mLのPMAc水溶液(5wt%=50mg/mL)(PMAcは２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(90%)とメタクリル酸(10%)のランダム共重合体で上記反応式中の化合物１)に12.44mgの４−アジドアニリンと、17.47mgの水溶性カルボジイミド(WSC)を混合し，最終的に純水で100mLにメスアップした。pH7で24時間撹拌（冷蔵庫中４℃）し、反応終了後，透析カセット(PIERCE社製）で、外液からアジドアニリンのUV吸収がなくなるまで透析。最後に凍結乾燥し光反応性MPCポリマーを得た。
【００５５】
試験例１    光反応性ＭＰＣポリマーの非特異吸着性
参考例１で製造した光反応性ＭＰＣポリマーの非特異吸着性を、以下のようにFITC化タンパク質又は細胞と接触させることにより調査した。
【００５６】
(1)  MPCポリマーの基板上への結合
参考例１で製造した光反応性MPCポリマーを、純水に10 mg/mlの濃度で溶解し、ポリスチレン基板（直径2ｃｍ)上に２５μｌ塗布して風乾した。次に、幅１００μｍのストライプパターンを有するフォトマスクを介して紫外線（波長260ｎｍ）を選択照射した（照射量16mW/cm2)。次いで、水洗し、ポリスチレン基板上に光反応性MPCポリマーをストライプ状に固定化した。
【００５７】
(2)  FITC（フルオレッセインイソチオシアネート）化タンパク質の吸着
FITC-BSA（シグマ社より市販）水溶液(濃度10 mg/ml)、FITC-IgG（シグマ社より市販）水溶液(濃度2 mg/ml)又はFITC-フィブリノーゲン水溶液（濃度 3.7 mg/370μｌ)を、上記パターンが形成された基板上に５０μｌ載せ、３７℃で１０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、乾燥させ、蛍光顕微鏡で観察した。
【００５８】
その結果、光反応性MPCポリマーが固定化されていない領域にのみ蛍光が見られ、極めて明瞭なストライプパターンが観察された。これにより、MPCポリマーがタンパク質を非特異吸着しないことが確認された。
【００５９】
なお、上記試験に用いたFITC-フィブリノーゲンは、次のようにして調製した。すなわち、フィブリノーゲン２０ｍｇにFITC-I 0.1 mgを加えて５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液(pH 8.5) 7 mlに溶解し、４℃で一夜反応させ、排除分子量３０００のフィルターで遠心濃縮した。脱塩のため、MilliQ水（商品名）で3回遠心分離した。その後、凍結乾燥して3.7 mgのFITC-フィブリノーゲンを得た。
【００６０】
(3)  細胞の吸着
参考例１で調製した光反応性MPCポリマーを、上記と同様にポリスチレン基板上にパターンをつけて固定化し、水洗後、７０％エタノールを用いて滅菌し、滅菌水で洗浄した。得られた基板をそのままで、又は1% BSA/PBS溶液若しくは1%フィブリノーゲン/PBS溶液２５０μｌを基板に載せて３７℃で１０分間反応させ、水洗後、細胞の吸着試験に供した。用いた細胞は、Cos 7細胞（理化学研究所  細胞バンクより市販）及びRaw 246細胞（理化学研究所  細胞バンク社より市販）であった。細胞を基板上に播き、１時間後及び４時間後に顕微鏡で観察した。
【００６１】
その結果、光反応性MPCポリマーを固定化した領域には、細胞がほとんど吸着されず、細胞がストライプ状に吸着された。とりわけ、光反応性MPCポリマー単独の場合及び光反応性MPCポリマーにフィブリノーゲンを塗布した基板で明瞭なストライプパターンが観察された。
【００６２】
参考例２    免疫測定
以下に記載する方法により、本発明の方法により作製した、コラーゲン固定化基板を用いて、コラーゲンを検出する免疫測定を行った。
【００６３】
方法
(i) 0.1%光反応性ＭＰＣポリマー（参考例１で製造したもの)水溶液と0.5%コラーゲン水溶液を1:10で混合。
(ii)  35mmポリスチレンディッシュに3μlのMPC/コラーゲン水溶液をスポット。
(iii)  乾燥後、ＵＶ照射（波長260nm、照射量16mW/cm2、10秒間)により固定化。
(iv)  ＰＢＳで3回洗浄。
(v) 一次抗体として抗コラーゲン抗体（モノサン社より市販）（5μg/ml）又は抗ヒトCD3抗体（ファーミンジェン社より市販）（5μg/ml）をスポット上に100μｌ添加、室温で4時間インキュベーション。
(vi) ＰＢＳで3回洗浄後、FITC標識二次抗体（抗ラビットIgG  あるいはマウス  IgG抗体）（アマーシャム社より市販）（5000倍希釈）100μl添加、室温で１時間インキュベーション。
(vii) PBSで３回洗浄後、蛍光顕微鏡にて観察。
(viii)  コントロールとしてMPCポリマーのみをスポットしたもの、またタカラ社製Hubbleスライドガラスにポリマー無しでコラーゲン溶液のみをスポットしたもので同様の操作を行った。さらに、コントロールとして、負電荷のみを有するアジドフェニル基導入ポリアクリル酸（PAAｃ）とコラーゲンの水溶液、又は正電荷のみを有するアジドフェニル基導入ポリアリルアミン（PAAｍ）とコラーゲンの水溶液を同様にポリスチレン基板上にスポットしたものを用いて同様の操作を行った。
【００６４】
結果と考察
抗コラーゲン抗体による免疫染色後、蛍光顕微鏡によりMPCポリマー／コラーゲンスポットに蛍光が観察され、抗CD3抗体では染色されず、コラーゲンが特異的に染色されることが確認された。コントロールとして行ったMPCポリマーのみのスポットではほとんど蛍光は無く、負電荷のみを有するアジドフェニル基導入ポリアクリル酸（PAAｃ）とコラーゲンでも、蛍光はなかった。正電荷のみを有するアジドフェニル基導入ポリアリルアミン（PAAｍ）では、抗体の種類によらず非特異的な染色が起こった。以上のことから、MPCポリマーの非特異的吸着が少ない特性を実証することが出来た。コントロールとしてタカラ社製のHubbleスライドガラスへコラーゲンの固定化を行ったが、スポット上に蛍光は観察されなず、この場合にはコラーゲンは固定化できなかったと考えられる。以上よりMPCポリマーを用いてタンパク質の共有固定化が可能となり、非特異的吸着を抑制し、有効であることが明らかになった。なお、結果を下記表１にまとめて示す。
【００６５】
【表１】
0004630817.tif 000009
【００６６】
参考例３    物質固定化剤の製造（その２）
【００６７】
(1)   N-(4-アジドベンゾイロキシ）スクシンイミドの合成
【００６８】
【化８】
0004630817.tif 000010
【００６９】
4-アジド安息香酸（東京化成(株)より市販）600mgとN-ヒドロキシスクシンイミド（和光純薬(株)より市販）420mgを1,4-ジオキサン 40mlに溶解し、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（和光純薬(株)より市販）760mgを加えて室温で攪拌しながら反応を開始した。24時間後、副生成物をろ紙でろ去し、ろ液は減圧下で溶媒を留去した。得られた生成物は、1,4-ジオキサンとジエチルエーテルを用いて2回再結晶して精製した。その結果、675mgのN-(4-アジドベンゾイロキシ）スクシンイミドを得た(収率70.6%)。
【００７０】
(2)  ポリエチレングリコールへのアジド基の導入
【００７１】
【化９】
0004630817.tif 000011
【００７２】
100mgのポリ（エチレングリコール）ビス (3-アミノプロピル)末端（Aldrich社より市販、平均分子量1500、以下、便宜的に「PEG-NH2」と言うことがある）と68.6mgの(1)で製造したN-(4-アジドベンジロキシ)スクシンイミドをジメチルホルムアミド（和光純薬（株）より市販）10mlに溶解し、pH6で4℃で24時間攪拌した。反応終了後、エバポレータにより減圧下でDMFを留去し、純水を入れ、未反応物を沈殿させた。沈殿物を遠心分離により、沈降させ上清を回収し、凍結乾燥により光反応性PEG-NH2（NH2基は、アジド化合物との結合に消費されてもはや存在しないが便宜的にこのように記載する）を得た。
【００７３】
参考例４    物質固定化剤の製造（その３）
【００７４】
【化１０】
0004630817.tif 000012
【００７５】
100mgのポリ（エチレングリコール）ビス（カルボキシメチル）エーテル（Aldrich社より市販、平均分子量600、以下、便宜的に「PEG-COOH」と言うことがある））と113.3mgの4-アジドアニリンと127mgの水溶性カルボジイミドを純水10mlに溶解し、pH6で4℃で24時間攪拌した。反応終了後、水酸化ナトリウムによりpH12にし、未反応物を沈殿させた。沈殿物を遠心分離により沈降させ、上清を回収し、分液ロートにてクロロホルムで脱塩した（pHが中性になるまで繰り返した）。そして凍結乾燥により光反応性PEG-COOHを得た（COOH基は、アジド化合物との結合に消費されてもはや存在しないが便宜的にこのように記載する）。
【００７６】
参考例５      物質固定化剤の製造（その４）
(1)    N-アジドフェニルアクリル酸アミドの合成
【００７７】
【化１１】
0004630817.tif 000013
【００７８】
4-アジドアニリン（Aldrich社より市販）341.2 mgとN-アクリロキシスクシンイミド（Aldrich社より市販）169.1mgをDMF10mlに溶解し、4℃で攪拌しながら反応を開始した。24時間後、再結晶により精製した。その結果、N-アジドフェニルアクリル酸アミドを得た。
【００７９】
(2)    光反応性ポリ（アクリルアミド−N-アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体の合成
【００８０】
【化１２】
0004630817.tif 000014
【００８１】
639.7mgのアクリルアミド（和光純薬市販）と160mgのN-アジドフェニルアクリル酸アミドをエタノール30mlに溶解し、重合開始剤として2,2’-アゾビスイソブリロニトリル（和光純薬より市販）を82.1ｍｇ添加し、攪拌しながら60℃で反応を開始した。5時間後、アセトンへの再沈殿により重合物を精製し、減圧乾燥により光反応性ポリ（アクリルアミド−N-アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体を得た。
【００８２】
参考例６    物質固定化剤の製造（その５）
光反応性ポリ（グリシジルメタクリレート−N-アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体の合成
【００８３】
【化１３】
0004630817.tif 000015
【００８４】
1.28gのグリシジルメタクリレート（Aldrich社より市販）と160mgのN-アジドフェニルアクリル酸アミドをメタノール30mlに溶解し、重合開始剤として2,2’-アゾビスイソブリロニトリルを16.42ｍｇ添加し、攪拌しながら60℃で反応を開始した。5時間後、ジエチルエーテルへの再沈殿により重合物を精製し、減圧乾燥により光反応性ポリ（グリシジルメタクリレート−N-アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体を得た。水酸化ナトリウム（pH12）による処理によりエポキシ基をグリセロール化させ、水溶性とした。
【００８５】
比較例１    光反応性ポリアクリル酸の製造
光反応性ポリアクリル酸は、次のように調整した。720mgのポリアクリル酸（和光純薬社より市販、平均分子量1,000,000）と170.6mgの4-アジドアニリンと1.917gの水溶性カルボジイミドを純水100mlに溶解し、ｐH7.0、4℃で24時間攪拌した。反応終了後、外液からアジドアニリンのUV吸収がなくなるまで透析を行った。最後に凍結乾燥し光反応性ポリアクリル酸ポリマーを得た。
【００８６】
比較例２    光反応性ポリアリルアミンの製造
比較例１の方法において、ポリアクリル酸をポリアクリルアミンに代えた同様な方法により光反応性ポリアクリルアミンを製造した。
【００８７】
参考例７    免疫測定
(1)  コラーゲン固定化基体の作製及びそれを用いた抗コラーゲン抗体の免疫測定
以下の手順により、参考例３ないし６、又は参考例１、比較例１若しくは比較例２で製造した物質固定化剤を用い、コラーゲンを固定化した基体（ポリスチレンディッシュ）を作製し、これを用いて抗コラーゲン抗体の免疫測定を行った。
【００８８】
(i) 上記作成した光反応性PEG-NH2（参考例３）、光反応性PEG-COOH（参考例４）、光反応性ポリ（アクリルアミド−N-アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体（参考例５）又は光反応性ポリ（グリシジルメタクリレート−N-アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体（参考例６）（0.125wt%）とコラーゲン（0.25wt%）を1：1で混合。
(ii) 35mmポリスチレンディッシュに0.5μlのポリマー/コラーゲン水溶液をスポット。
(iii) 乾燥後、UV照射（波長260nm、照射量40mW/cm2、10秒間）により固定化。
(iv) PBS(0.1%tween20)で3回洗浄。
(v) 一次抗体として抗コラーゲン抗体（モノサン社より市販）10倍希釈溶液（1%BSA/PBS）又はマウスIgG抗体（Santa cruz biotechnology社より市販）40倍希釈溶液（1%BSA/PBS）をスポット状に100μl添加、室温で3時間インキュベーション。
(vi) PBS(0.1%Tween20（商品名）)で3回洗浄後、FITC標識二次抗体（抗ラビットIgG抗体あるいはマウスIgG抗体）（アマシャム社より市販）20倍希釈溶液（1%BSA/PBS）を100μl添加、室温で1時間インキュベーション。
(vii) PBS(0.1%Tween20(商品名）)で3回洗浄後、蛍光顕微鏡にて観察。
(viii)光反応性MPCポリマー（参考例１）、比較として光反応性ポリアクリル酸（比較例１）、光反応性ポリアリルアミン（比較例２）およびコントロールとして各例において物質固定化剤のみをスポットしたもので同様の操作を行った。
【００８９】
(2)  結果
下記表２に示すように、抗コラーゲン抗体による免疫染色後、PEG-NH2（参考例３）／コラーゲンスポット及びPEG-COOH（参考例４）／コラーゲンスポット、ポリ(アクリルアミド−N-アジドフェニルアクリル酸アミド)共重合体（参考例５）／コラーゲンスポット、ポリ（グリシジルメタクリレート−N-アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体（参考例６）／コラーゲンスポットで蛍光が観察され、抗IgG抗体スポットでは蛍光は観察されなかった。これによりコラーゲンが特異的に染色されたことが確認できた。PEG-NH2（参考例３）、PEG-COOH（参考例４）では蛍光強度もMPCポリマー／コラーゲンスポット（参考例１）を抗コラーゲン抗体で染色した場合とほぼ同等であり、ポリ(アクリルアミド−N-アジドフェニルアクリル酸アミド)共重合体（参考例５）、ポリ（グリシジルメタクリレート−N-アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体（参考例６）では約1/2の蛍光強度を示した。それに対して、負電荷のみを有する光反応性ポリアクリル酸／コラーゲンスポット（比較例１）では、蛍光は無く、正電荷のみを有する光反応性ポリアリルアミン／コラーゲン（比較例２）では、抗体の種類によらず非特異的な染色が起こった。以上より光反応性ポリエチレングリコールはMPCポリマーと同等にタンパク質を固定化することができ、また非特異的吸着を抑制することが明らかとなった。また、ポリ(アクリルアミド−N-アジドフェニルアクリル酸アミド)共重合体（参考例５）、ポリ（グリシジルメタクリレート−N-アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体（参考例６）においてもポリエチレングリコール（参考例３、４）よりはタンパク質の固定化量は低いが、固定化は可能であり、非特異的吸着も抑制することができる。
【００９０】
【表２】
0004630817.tif 000016
【００９１】
実施例１    物質固定化剤の製造（その６）
１．  N-アジドフェニルアクリル酸アミドの合成
【００９２】
【化１４】
0004630817.tif 000017
【００９３】
4-アジドアニリン塩酸塩（Aldrich社より市販）300.02 mgを97mlの純水に溶解し、その溶液に2mol/lのNaOH水溶液を3ml加えた。次にアクリル酸クロリド（東京化成工業より市販）200mgをジクロロメタンで希釈し、13mlにしたものをゆっくりと攪拌しながら滴下し、滴下終了後、密栓し1時間強攪拌した。析出した固体をろ過により回収、ジクロロメタン相はクロロホルム80mlを加えて分液した。分液した有機層を乾燥させ、固体を回収した。その結果、N-アジドフェニルアクリル酸アミドを得た。
【００９４】
２．  光反応性ポリ（エチレングリコールモノメタクリレート−N-アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体の合成
【００９５】
【化１５】
0004630817.tif 000018
【００９６】
300ｍｌナス型フラスコにN-アジドフェニルアクリル酸アミド49.90ｍｇ、PEG（重合度n=8)モノメタクリレート2225.2ｍｇを43ｍｌの酢酸エチルに溶解させアゾビスイソブチロニトリル(AIBN)を6.31ｍｇ入れて窒素で満たし密栓し、湯浴で60℃、6時間攪拌した。加熱を止めてある程度溶媒を留去させた後ジエチルエーテルに移しソニケーターを30分かけた。固体を回収し、減圧乾燥を2時間行った。その結果、光反応性ポリ（エチレングリコールモノメタクリレート−N-アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体を得た。
【００９７】
実施例２    アレルゲン固定化基体の作製及びそれを用いたアレルゲン抗体の免疫測定
スギ及びダニアレルゲン（生化学工業(株)より市販）を純水で0.25wt%に調整し、参考例1又は実施例１で製造した光反応性ポリマー（0.125wt%）と1：1（V/V）で混合した。混合したアレルゲン／ポリマー溶液をポリスチレン基板上に0.5μlスポットして風乾した。次に紫外線（波長260nm、照射量15mW／cm2）を照射してポリスチレン基板上にアレルゲンを固定化した。
【００９８】
次いでPBS(0.1%tween20)で洗浄し、一次抗体としてアレルゲン抗体（生化学工業(株)より市販）をヒト血清で100μg/mlに調整したものをスポット上に10μl添加し、室温で2時間反応させた。次にPBS(0.1%tween20)で洗浄し、HRP標識二次抗体（アマシャムバイオサイエンス社より市販）を10%BSA/PBSで100倍に希釈したものをスポット上に10μl添加し、室温で1時間反応させた。PBS(0.1%tween20)で洗浄後、化学発光試薬ECL advance（アマシャムバイオサイエンス社より市販）を10μl添加し、ゲル撮影装置により30秒間露光した画像を得た。得られた画像を解析ソフトにより数値化した。
【００９９】
以下の表３に数値化した発光強度を纏めて示す。
【０１００】
抗体濃度100ng/mlで最も高い発光強度を示したのは、PEGと、実施例１の共重合体であった。また、抗体濃度が0の時の発光強度が低いのも実施例１の共重合体であり、非特異的吸着が最も少ないことがわかった。
【０１０１】
以上の結果より、アレルゲン固定化量が多く、非特異的吸着の少ない実施例１の共重合体がアレルゲンアレイに使用するマトリックスに最も適していることがわかった。
【０１０２】
【表３】
0004630817.tif 000019
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本願発明は、基体上に固定化すべき物質を共有結合により固定化することができ、かつ、非特異吸着の防止効果に優れた、物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体に係る。本発明によれば、固定化すべき物質を、その種類に関係なく共有結合により固定化することができ、安定な固定化基板を得ることができる。また、本発明の物質固定化剤を用いて物質を固定化すると、非特異吸着が効果的に防止される。さらに、本発明の物質固定化剤を用いて物質を固定化する場合、選択露光を行うことにより、固定化物質のパターニングも可能であり、容易にマイクロアレイ等の任意のパターンに物質を固定化することができる。従って、本願発明は、各種マイクロアレイの作製等に有用である。