(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（１−ピペラジニルスルホニル）フェニル］−Ｎ’−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素またはその医薬上許容される塩。
【請求項２】
医薬上許容される塩が、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、フェニル酢酸塩およびマンデル酸塩から選択される、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｎ−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（１−ピペラジニルスルホニル）フェニル］−Ｎ’−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規スルホンアミド置換ジフェニル尿素化合物、医薬組成物、その製造法およびＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２およびＥＮＡ−７８介在疾患の治療におけるその使用に関する。
【０００２】
発明の背景
インターロイキン−８（ＩＬ−８）に対しては様々な名称、例えば好中球誘引／活性化タンパク質−１（ＮＡＰ−１）、単球由来好中球走化性因子（ＭＤＮＣＦ）、好中球活性化因子（ＮＡＦ）およびＴ−細胞リンパ球走化性因子が用いられている。インターロイキン−８は、好中球、好塩基球およびＴ−細胞のサブセットに対する化学誘引物質である。これは、ＴＮＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βまたはＬＰＳに曝露されたマクロファージ、線維芽細胞、内皮細胞および上皮細胞を含むほとんどの有核細胞により、およびＬＰＳまたはＦＭＬＰのような走化性因子に曝露された場合に好中球自体により産生される。M. Baggiolini et al.,  J. Clin. Invest. 84, 1045 (1989); J. Schroder et al,  J. Immunol. 139, 3474 (1987)およびJ. Immunol. 144, 2223 (1990) ; Strieter, et al.,  Science 243, 1467 (1989)およびJ. Biol. Chem. 264, 10621 (1989); Cassatella et al.,  J. Immunol. 148, 3216 (1992)。
【０００３】
また、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγおよびＮＡＰ−２は、ケモカインファミリーに属する。ＩＬ−８と同様に、これらのケモカインも異なる名称により示されてきた。例えば、ＧＲＯα、β、γが、それぞれ、ＭＧＳＡα、βおよびγ（黒色腫増殖刺激活性）を意味している。Richmond et al., J. cell Physiology 129, 375 (1986)およびChang et al., J. Immunol 148, 451 (1992)を参照。ＣＸＣモチーフの直前にＥＬＲモチーフを有するαファミリーのケモカインはすべてＩＬ−８Ｂ受容体（ＣＸＣＲ２）に結合する。
【０００４】
ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２およびＥＮＡ−７８は、インビトロで多くの機能を刺激する。これらはすべて好中球に対して化学誘引性を有することが示されたが、ＩＬ−８およびＧＲＯαは、Ｔ−リンパ球および好塩基球走化性活性が示された。加えて、ＩＬ−８は正常な個体およびアトピー性個体由来の両方の好塩基球からのヒスタミン放出を誘発しうる。加えて、ＧＲＯ−αおよびＩＬ−８は、好中球からのリソソーム酵素放出および呼吸バーストを誘発しうる。また、ＩＬ−８は、新たにタンパク質を合成することなく、好中球上でのＭａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）の表面発現を増加させることが示された。このことは、好中球が血管内皮細胞に付着することを増加させる一因になりうる。多くの既知の疾患が、大量の好中球浸潤により特徴付けられる。ＩＬ−８、Ｇｒｏα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγおよびＮＡＰ−２は、好中球の蓄積および活性化を促進するので、これらのケモカインは、乾癬および関節リウマチを含む広範囲に及ぶ急性および慢性炎症性障害と関係付けられてきた。Baggiolini et al., FEBS Lett. 307, 97 (1992) ；Miller et al., Crit. Rev. Immunol. 12, 17 (1992)；Oppenheim et al., Annu. Rev. Immunol. 9, 617 (1991); Seitz et al., J. Clin. Invest. 87, 463 (1991) ；Miller et al., Am. Rev. Respir. Dis. 146, 427 (1992)；Donnely et al., Lancet 341, 643 (1993)。加えて、ＥＬＲケモカイン（ＣＸＣモチーフの直前にアミノ酸ＥＬＲモチーフを含有するもの）はまた、血管形成とも関連付けられてきた。Strieter et al., Science 258, 1798 (1992)。
【０００５】
インビトロで、ＩＬ−８、Ｇｒｏα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγおよびＮＡＰ−２は、７回膜貫通型Ｇ−タンパク質結合ファミリーの受容体と、特に、ＩＬ−８受容体、最も顕著には、ＩＬ−８β受容体（ＣＳＣＲ２）と結合してそれを活性化することにより、好中球形状変化、走化性、顆粒放出および呼吸バーストを誘発する。Thomas et al.,  J. Biol. Chem. 266, 14839 (1991)；およびHolmes et al., Science 253, 1278 (1991)。この受容体ファミリーのメンバーに対する非ペプチド性小型分子アンタゴニストの開発が進められてきた。総説については、R. Freidinger in:  Progress in Drug Research, Vol. 40, pp. 33-98, Birkhauser Verlag, Basel 1993.  Henceを参照。ＩＬ−８受容体は新規抗炎症剤の開発のための有望な標的である。
【０００６】
２つの高親和性ヒトＩＬ−８受容体（７７％相同性）が特徴付けられている：ＩＬ−８Ｒαは、ＩＬ−８のみと高親和性で結合し、ＩＬ−８ＲβはＩＬ−８に対して高親和性で結合し、ならびにＧＲＯ−α、ＧＲＯβ、ＧＲＯγおよびＮＡＰ−２に関しても同様である。Holmes et al., supra; Murphy et al., Science 253, 1280 (1991)；Lee et al., J. Biol. Chem. 267, 16283 (1992) ； LaRosa et al., J. Biol. Chem. 267, 25402 (1992) ；およびGayle et al., J. Biol. Chem. 268, 7283 (1993)を参照。
【０００７】
当該分野において、ＩＬ−８αまたはβ受容体に結合することができる化合物に対する処理が依然として必要とされている。したがって、ＩＬ−８産生の増加（好中球およびＴ−細胞サブセットの炎症部位への走化性に関与する）に付随する症状は、ＩＬ−８受容体結合の阻害剤である化合物により恩恵が得られるだろう。
【０００８】
発明の概要
本発明は、ケモカインが、ＩＬ−８ａまたはｂ受容体に結合するケモカイン介在疾患の治療方法であって、有効量の式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩を投与することを含む方法を提供する。特に、ケモカインはＩＬ−８である。
また、本発明は、ＩＬ−８のその受容体への結合の阻害が必要な哺乳類における該阻害方法であって、該哺乳類に、有効量の式（Ｉ）で示される化合物を投与することを含む方法に関する。
また、本発明は、式（Ｉ）で示される新規化合物および式（Ｉ）で示される化合物および医薬担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【０００９】
本発明において有用な式（Ｉ）で示される化合物は、下記構造式：
【化１】
0004843220.tif 000002
［式中：
Ｒｂは、独立して、水素、ＮＲ６Ｒ７、ＯＨ、ＯＲａ、Ｃ１−５アルキル、アリール、アリールＣ１−４アルキル、アリールＣ２−４アルケニル；シクロアルキル、シクロアルキルＣ１−５アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールＣ１−４アルキル、ヘテロアリールＣ２−４アルケニル、ヘテロサイクリック、ヘテロサイクリックＣ１−４アルキルまたはヘテロサイクリックＣ２−４アルケニル基であり、これらの基はすべて、ハロゲン；ニトロ；ハロ置換Ｃ１−４アルキル；Ｃ１−４アルキル；アミノ、モノまたはジ−Ｃ１−４アルキル置換アミン；ＯＲａ；Ｃ（Ｏ）Ｒａ；ＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲａ；ＯＣ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７；ヒドロキシ；ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒａ；Ｓ（Ｏ）ｍ’Ｒａ；Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７；Ｃ（Ｏ）ＯＨ；Ｃ（Ｏ）ＯＲａ；Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７；ＮＨＳ（Ｏ）２Ｒａにより、独立して１〜３回置換されていてもよく、別に、２個のＲｂ置換基は結合して、炭素に加えて、独立して１〜３個のＮＲａ、Ｏ、Ｓ、ＳＯまたはＳＯ２基により置換されていてもよく、含有していてもよい、不飽和であってもよい３〜１０員環を形成してもよく；
【００１０】
Ｒａは、アルキル、アリール、アリールＣ１−４アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールＣ１−４アルキル、ヘテロサイクリック、ＣＯＯＲａまたはヘテロサイクリックＣ１−４アルキル基であり、これらの基はすべて置換されていてもよく；
ｍは、１〜３の整数であり；
ｍ’は、０または１または２の整数であり；
ｎは、１〜３の整数であり；
ｑは、０または１〜１０の整数であり；
ｔは、０または１または２の整数であり；
ｓは、１〜３の整数であり；
【００１１】
Ｒ１は、独立して、水素；ハロゲン；ニトロ；シアノ；Ｃ１−１０アルキル；ハロ置換Ｃ１−１０アルキル；Ｃ２−１０アルケニル；Ｃ１−１０アルコキシ；ハロ置換Ｃ１−１０アルコキシ；アジド；Ｓ（Ｏ）ｔＲ４；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＳ（Ｏ）ｔＲ４；ヒドロキシ；ヒドロキシ置換Ｃ１−４アルキル；アリール；アリールＣ１−４アルキル；アリールＣ２−１０アルケニル；アリールオキシ；アリールＣ１−４アルキルオキシ；ヘテロアリール；ヘテロアリールアルキル；ヘテロアリールＣ２−１０アルケニル；ヘテロアリールＣ１−４アルキルオキシ；ヘテロサイクリック、ヘテロサイクリックＣ１−４アルキル；ヘテロサイクリックＣ１−４アルキルオキシ；ヘテロサイクリックＣ２−１０アルケニル；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＮＲ４Ｒ５；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５；Ｃ２−１０アルケニルＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ１０；Ｓ（Ｏ）３Ｒ８；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（Ｏ）Ｒ１１；Ｃ２−１０アルケニルＣ（Ｏ）Ｒ１１；Ｃ２−１０アルケニルＣ（Ｏ）ＯＲ１１；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（Ｏ）ＯＲ１１；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＯＣ（Ｏ）Ｒ１１；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｒ１１；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（ＮＲ４）ＮＲ４Ｒ５；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＮＲ４Ｃ（ＮＲ５）Ｒ１１；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ１３；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＳ（Ｏ）２ＮＲ４Ｒ５から選択されるか；あるいは、２個のＲ１基は一緒になって、Ｏ−（ＣＨ２）ｓＯまたは５〜６員の飽和または不飽和環を形成し、ここに、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロサイクリック基は置換されていてもよく；
【００１２】
Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、置換されていてもよいＣ１−４アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリールＣ１−４アルキル、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロアリールＣ１−４アルキル、ヘテロサイクリック、ヘテロサイクリックＣ１−４アルキルであるか、あるいは、Ｒ４およびＲ５はそれらが結合している窒素と一緒になって、Ｏ／Ｎ／Ｓから選択される付加的なヘテロ原子を含有していてもよい５〜７員環を形成してもよく；
Ｒ６およびＲ７は、独立して、水素、またはＣ１−４アルキル、ヘテロアリール、アリール、アルキルアリール、アルキルＣ１−４ヘテロアルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ７は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、酸素、窒素または硫黄から選択される付加的なヘテロ原子を含有していてもよく、置換されていてもよい５〜７員環を形成してもよく；
【００１３】
Ｙは、水素；ハロゲン；ニトロ；シアノ；ハロ置換Ｃ１−１０アルキル；Ｃ１−１０アルキル；Ｃ２−１０アルケニル；Ｃ１−１０アルコキシ；ハロ置換Ｃ１−１０アルコキシ；アジド；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＳ（Ｏ）ｔＲａ、（ＣＲ８Ｒ８）ｑＯＲａ；ヒドロキシ；ヒドロキシ置換Ｃ１−４アルキル；アリール；アリールＣ１−４アルキル；アリールオキシ；アリールＣ１−４アルキルオキシ；アリールＣ２−１０アルケニル；ヘテロアリール；ヘテロアリールアルキル；ヘテロアリールＣ１−４アルキルオキシ；ヘテロアリールＣ２−１０アルケニル；ヘテロサイクリック；ヘテロサイクリックＣ１−４アルキル；ヘテロサイクリックＣ２−１０アルケニル；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＮＲ４Ｒ５；Ｃ２−１０アルケニルＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ１０；Ｓ（Ｏ）３Ｒ８；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（Ｏ）Ｒ１１；Ｃ２−１０アルケニルＣ（Ｏ）Ｒ１１；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（Ｏ）ＯＲ１１；Ｃ２−１０アルケニルＣ（Ｏ）ＯＲ１１；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＯＣ（Ｏ）Ｒ１１；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｒ１１；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ１３；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＳ（Ｏ）２ＮＲ４Ｒ５；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（ＮＲ４）ＮＲ４Ｒ５；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＮＲ４Ｃ（ＮＲ５）Ｒ１１であるか；あるいは、２個のＹ基は一緒になって、Ｏ−（ＣＨ２）ｓ−Ｏまたは５〜６員の飽和または不飽和環を形成してもよく、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロサイクリック、ヘテロサイクリックアルキル基は置換されていてもよく；
【００１４】
Ｒ８は、水素またはＣ１−４アルキルであり；
Ｒ９は、水素またはａＣ１−４アルキルであり；
Ｒ１０は、Ｃ１−１０アルキルＣ（Ｏ）２Ｒ８であり；
Ｒ１１は、水素、置換されていてもよいＣ１−４アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリールＣ１−４アルキル、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロアリールＣ１−４アルキル、置換されていてもよいヘテロサイクリックまたは置換されていてもよいヘテロサイクリックＣ１−４アルキルであり；
Ｒ１３は、適当には、Ｃ１−４アルキル、アリール、アリールＣ１−４アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールＣ１−４アルキル、ヘテロサイクリックまたはヘテロサイクリックＣ１−４アルキルである］
により示される化合物またはその医薬上許容される塩である。
【００１５】
発明の詳細な記載
また、式（Ｉ）で示される化合物は、ＩＬ−８αおよびβ受容体に結合するＩＬ−８または他のケモカインを阻害する必要がある、ヒト以外の他の哺乳類の獣医学的治療にも関連して用いられる。哺乳類の、治療的または予防的に治療されるケモカイン介在疾患は、治療方法のセクションに記載するような病態を含む。
【００１６】
適当には、Ｒｂは、独立して、水素、ＮＲ６Ｒ７、ＯＨ、ＯＲａ、Ｃ１−４アルキル、アリール、アリールＣ１−４アルキル、アリールＣ２−４アルケニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールＣ１−４アルキル、ヘテロアリールＣ２−４アルケニル、ヘテロサイクリック、ヘテロサイクリックＣ１−４アルキルまたはヘテロサイクリックＣ２−４アルケニル基であり、これらのすべての基は、ハロゲン；ニトロ；ハロ置換Ｃ１−４アルキル；Ｃ１−４アルキル；アミノ、モノまたはジ−Ｃ１−４アルキル置換アミン；シクロアルキル、シクロアルキルＣ１−５アルキル、ＯＲａ；Ｃ（Ｏ）Ｒａ；ＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲａ；ＯＣ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７；アリールオキシ；アリールＣ１−４オキシ；ヒドロキシ；Ｃ１−４アルコキシ；ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒａ；Ｓ（Ｏ）ｍ’Ｒａ；Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７；Ｃ（Ｏ）ＯＨ；Ｃ（Ｏ）ＯＲａ；Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７；ＮＨＳ（Ｏ）２Ｒａにより、独立して、１〜３回置換されていてもよい。別に、２つのＲｂ置換基は結合して、炭素に加えて、独立して１〜３個のＮＲ９、Ｏ、Ｓ、ＳＯまたはＳＯ２基により置換されていてもよく、含有していてもよい、不飽和であってもよい３〜１０員環を形成することができる。
【００１７】
適当には、Ｒａは、アルキル、アリール、アリールＣ１−４アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールＣ１−４アルキル、ヘテロサイクリックまたはヘテロサイクリックＣ１−４アルキル基であり、これらの基はすべて、置換されていてもよい。
【００１８】
適当には、Ｒ１は、独立して、水素；ハロゲン；ニトロ；シアノ；ハロ置換Ｃ１−１０アルキル、例えば、ＣＦ３；Ｃ１−１０アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、またはｎ−プロピル；Ｃ２−１０アルケニル；Ｃ１−１０アルコキシ、例えば、メトキシまたはエトキシ；ハロ置換Ｃ１−１０アルコキシ、例えば、トリフルオロメトキシ；アジド；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＳ（Ｏ）ｔＲ４（ここに、ｔは０、１または２である）；ヒドロキシ；ヒドロキシＣ１−４アルキル、例えば、メタノールまたはエタノール；アリール、例えば、フェニルまたはナフチル；アリールＣ１−４アルキル、例えば、ベンジル；アリールオキシ、例えば、フェノキシ；アリールＣ１−４アルキルオキシ、例えば、ベンジルオキシ；ヘテロアリール；ヘテロアリールアルキル；ヘテロアリールＣ１−４アルキルオキシ；アリールＣ２−１０アルケニル；ヘテロアリールＣ２−１０アルケニル；ヘテロサイクリックＣ２−１０アルケニル；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＮＲ４Ｒ５；Ｃ２−１０アルケニルＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ１０；Ｓ（Ｏ）３Ｈ；Ｓ（Ｏ）３Ｒ８；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（Ｏ）Ｒ１１；Ｃ２−１０アルケニルＣ（Ｏ）Ｒ１１；Ｃ２−１０アルケニルＣ（Ｏ）ＯＲ１１；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（Ｏ）Ｒ１１；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（Ｏ）ＯＲ１１；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＯＣ（Ｏ）Ｒ１１；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｒ１１；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（ＮＲ４）ＮＲ４Ｒ５；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＮＲ４Ｃ（ＮＲ５）Ｒ１１；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ１３；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＳ（Ｏ）２ＮＲ４Ｒ５から選択される。すべてのアリール、ヘテロアリールおよびヘテロサイクリック含有基は、下記するように置換されていてもよい。
【００１９】
本明細書で用いられる場合、「アリール、ヘテロアリールおよびヘテロサイクリック含有基」なる用語は、環およびアルキルの両方、または含まれる場合、アルケニル環、例えばアリール、アリールアルキルおよびアリールアルケニル環を意味する。「基」および「環」なる用語は、全体にわって相互に用いることができる。
【００２０】
適当には、Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、置換されていてもよいＣ１−４アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリールＣ１−４アルキル、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロアリールＣ１−４アルキル、ヘテロサイクリック、ヘテロサイクリックＣ１−４アルキルであるか、あるいはＲ４およびＲ５は、それらが結合している窒素と一緒になって、Ｏ／Ｎ／Ｓから選択される付加的なヘテロ原子を含有していてもよい５〜７員環を形成する。
【００２１】
適当には、Ｒ８は、独立して、水素またはＣ１−４アルキルである。
適当には、Ｒ９は、水素またはＣ１−４アルキルである。
適当には、ｑは、０または１〜１０の整数である。
【００２２】
適当には、Ｒ１０は、Ｃ１−１０アルキルＣ（Ｏ）２Ｒ８、例えば、ＣＨ２Ｃ（Ｏ）２ＨまたはＣＨ２Ｃ（Ｏ）２ＣＨ３である。
適当には、Ｒ１１は、水素、Ｃ１−４アルキル、アリール、アリールＣ１−４アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールＣ１−４アルキル、ヘテロサイクリックまたはヘテロサイクリックＣ１−４アルキルである。
【００２３】
適当には、Ｒ１２は、水素、Ｃ１−１０アルキル、置換されていてもよいアリールまたは置換されていてもよいアリールアルキルである。
適当には、Ｒ１３は、Ｃ１−４アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールＣ１−４アルキル、ヘテロサイクリックまたはヘテロサイクリックＣ１−４アルキルであり、すべてのアリール、ヘテロアリールおよびヘテロサイクリック含有基は、置換されていてもよい。
【００２４】
適当には、Ｙは、独立して、水素；ハロゲン；ニトロ；シアノ；ハロ置換Ｃ１−１０アルキル；Ｃ１−１０アルキル；Ｃ２−１０アルケニル；Ｃ１−１０アルコキシ；ハロ置換Ｃ１−１０アルコキシ；アジド；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＳ（Ｏ）ｔＲａ；ヒドロキシ；ヒドロキシＣ１−４アルキル；アリール；アリールＣ１−４アルキル；アリールオキシ；アリールＣ１−４アルキルオキシ；ヘテロアリール；ヘテロアリールアルキル；ヘテロアリールＣ１−４アルキルオキシ；ヘテロサイクリック、ヘテロサイクリックＣ１−４アルキル；アリールＣ２−１０アルケニル；ヘテロアリールＣ２−１０アルケニル；ヘテロサイクリックＣ２−１０アルケニル；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＮＲ４Ｒ５；Ｃ２−１０アルケニルＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ１０；Ｓ（Ｏ）３Ｈ；Ｓ（Ｏ）３Ｒ８；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（Ｏ）Ｒ１１；Ｃ２−１０アルケニルＣ（Ｏ）Ｒ１１；Ｃ２−１０アルケニルＣ（Ｏ）ＯＲ１１；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（Ｏ）ＯＲ１２；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＯＣ（Ｏ）Ｒ１１；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＣ（ＮＲ４）ＮＲ４Ｒ５；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＮＲ４Ｃ（ＮＲ５）Ｒ１１；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｒ１１；（ＣＲ８Ｒ８）ｑＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ１３；または（ＣＲ８Ｒ８）ｑＳ（Ｏ）２ＮＲ４Ｒ５から選択されるか；あるいは２つのＹ基は一緒になって、Ｏ−（ＣＨ２）ｓ−Ｏまたは５〜６員の飽和または不飽和環を形成してもよい。アリール、ヘテロアリールおよびヘテロサイクリック含有基は、すべて本明細書に記載のように置換されていてもよい。
【００２５】
適当には、ｓは、１〜３の整数である。
Ｙがジオキシブリッジを形成する場合、ｓは、好ましくは１である。Ｙが付加的な不飽和環を形成する場合、好ましくは、それはナフチレン環系を構成する６員環である。これらの環系は、上記と同意義の他のＹに１〜３回置換されていてもよい。
適当には、Ｒａは、アルキル、アリールＣ１−４アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１−４アルキル、ヘテロサイクリックまたはヘテロサイクリックＣ１−４アルキルであり、これらのすべての基は、置換されていてもよい。
【００２６】
Ｙは、好ましくは、ハロゲン、Ｃ１−４アルコキシ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリールオキシまたはアリールアルコキシ、メチレンジオキシ、ＮＲ４Ｒ５、チオＣ１−４アルキル、チオアリール、ハロ置換アルコキシ、置換されていてもよいＣ１−４アルキルまたはヒドロキシアルキルである。Ｙは、より好ましくは、モノ置換ハロゲン、ジ置換ハロゲン、モノ置換アルコキシ、ジ置換アルコキシ、メチレンジオキシ、アリールまたはアルキルであり、より好ましくは、これらの基は、２’−位または２’−、３’−位でモノまたはジ置換される。
Ｙ環のいずれかの位置において置換されていてもよい場合、ｎは、好ましくは、１である。Ｒ１およびＹの両方ともが水素でありうるが、少なくとも１つの環が、好ましくは両方の環が置換されていることが好ましい。
【００２７】
本明細書で用いられる場合「置換されていてもよい」なる用語は、特記しない限り、ハロゲン、例えば、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素；ヒドロキシ；ヒドロキシ置換Ｃ１−１０アルキル；Ｃ１−１０アルコキシ、例えば、メトキシまたはエトキシ；Ｓ（Ｏ）ｍ’Ｃ１−１０アルキル（ここに、ｍ’は０、１または２である）、例えば、メチルチオ、メチルスルフィニルまたはメチルスルホニル；アミノ、モノおよびジ−置換アミノ、例えば、ＮＲ４Ｒ５基；ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ４；Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５；Ｃ（Ｏ）ＯＨ；Ｓ（Ｏ）２ＮＲ４Ｒ５；ＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ２０、Ｃ１−１０アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、またはｔ−ブチル；ハロ置換Ｃ１−１０アルキル、例えば、ＣＦ３；置換されていてもよいアリール、例えば、フェニルまたは置換されていてもよいアリールアルキル、例えば、ベンジルまたはフェネチル、置換されていてもよいヘテロサイクリック、置換されていてもよいヘテロサイクリックアルキル、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロアリールアルキルを意味し、ここに、これらのアリール、ヘテロアリールまたはヘテロサイクリック基は、ハロゲン；ヒドロキシ；ヒドロキシ置換アルキル；Ｃ１−１０アルコキシ；Ｓ（Ｏ）ｍ’Ｃ１−１０アルキル；アミノ、モノおよびジ−置換アルキルアミノ、例えば、ＮＲ４Ｒ５基；Ｃ１−１０アルキルまたはハロ置換Ｃ１−１０アルキル、例えば、ＣＦ３により１または２回置換されていてもよい。
【００２８】
Ｒ２０は、適当には、Ｃ１−４アルキル、アリール、アリールＣ１−４アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールＣ１−４アルキル、ヘテロサイクリックまたはヘテロサイクリックＣ１−４アルキルである。
【００２９】
適当な医薬上許容される塩は、当業者によく知られており、無機および有機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、シュウ酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、安息香酸、サリチル酸、フェニル酢酸およびマンデル酸の塩基性塩を含む。加えて、また、式（Ｉ）で示される化合物の医薬上許容される塩は、医薬上許容されるカチオンと形成されうる。適当な医薬上許容されるカチオンは、当業者によく知られており、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび四級アンモニウムカチオンを含む。
【００３０】
本明細書で用いられる場合、以下の用語は、下記の通り：
・「ハロ」は、すべてのハロゲン、クロロ、フルオロ、ブロモおよびヨウドである。
・「Ｃ１−１０アルキル」または「アルキル」は、鎖長を特記しない限り、１〜１０個の炭素原子の、直鎖または分枝鎖基を意味し、限定するものではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル等を含む。
【００３１】
・「シクロアルキル」は、３〜８個の炭素の環状基を意味するのに用いられ、限定するものではないが、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル等を含む。
・「アルケニル」は、鎖長が特記されない限り、２〜１０個の炭素原子の直鎖または分枝鎖を意味するのに用いられ、限定するものではないが、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル等を含む。
【００３２】
・「アリール」は−フェニルおよびナフチルである。
・「ヘテロアリール」（単独またはいずれの組み合わせ、例えば「ヘテロアリールオキシ」または「ヘテロアリールアルキル」においても）は、１または２個の環が、Ｎ、ＯまたはＳからなる群から選択される１または２個のヘテロ原子を含有する、５〜１０員の芳香環系であり、限定するものではないが、ピロール、ピラゾール、フラン、チオフェン、キノリン、イソキノリン、キナゾリニル、ピリジン、ピリミジン、オキサゾール、テトラゾール、チアゾール、チアジアゾール、トリアゾール、イミダゾールまたはベンズイミダゾールである。
【００３３】
・「ヘテロサイクリック」（単独またはいずれの組み合わせ、例えば「ヘテロサイクリックアルキル」においても）は、１個またはそれ以上の環が、Ｎ、ＯまたはＳからなる群から選択される１個またはそれ以上のヘテロ原子を含有する飽和または部分的に不飽和の４〜１０員環系であり；例えば、限定するものではないが、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、テトラヒドロピラン、チオモルホリンまたはイミダゾリジンを含む。さらに、硫黄は、スルホンまたはスルホキシドに酸化されていてもよい。
【００３４】
・「アリールアルキル」または「ヘテロアリールアルキル」または「ヘテロサイクリックアルキル」は、特記しない限り、上記と同意義のアリール、ヘテロアリールまたはヘテロサイクリック基に結合した上記したＣ１−１０アルキルを意味するのに用いられる。
【００３５】
・「スルフィニル」は、対応するスルフィドのオキシドＳ（Ｏ）であり、「チオ」なる用語は、スルフィドを意味し、「スルホニル」なる用語は、完全に酸化されたＳ（Ｏ）２基である。
【００３６】
・「２個のＲ１基（または２個のＹ基）は、一緒になって、５または６員の飽和または不飽和環を形成する」は、ナフタレンのような芳香環系の形成を意味するのに用いられるか、あるいは、６員の部分的に飽和または不飽和環、例えばＣ６シクロアルケニル、すなわちヘキセンまたはＣ５シクロアルケニル基、例えばシクロペンテンに結合するフェニル基である。
【００３７】
式（Ｉ）で示される代表的な化合物は：
Ｎ−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル）−フェニル］−Ｎ’−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素；
Ｎ−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（４−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−１−スルホニル）フェニル］−Ｎ’−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素；
Ｎ−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（１−ピペラジニルスルホニル）フェニル］−Ｎ’−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素またはその医薬上許容される塩を含む。
【００３８】
上記した 化合物は、以前の最も密接に関係する対応特許と比較してその発展の可能性がある特徴を改善している。加えて、治療の標的に対する効力も維持、あるいは改善されている。
【００３９】
調製方法
式（Ｉ）で示される化合物は、下記スキーム１に説明する合成方法を用いて得ることができる。これらのスキームにおいて提供される合成方法は、本明細書に概要を記載した反応との適合性が得られるように、適当な保護された任意の置換基を用いて反応させられる、種々の異なるＲ、Ｒ’およびアリール（置換されていてもよい）基を有する式（Ｉ）で示される化合物の製造に用いることができる。これらの場合、続く脱保護により、一般的に開示されている性質の化合物が得られる。一旦尿素核が確立すると、これらの式で示されるさらなる化合物は、当該分野でよく知られている官能基相互変換に関する標準的な方法を用いることにより調製することができる。
【００４０】
【化２】
0004843220.tif 000003
【００４１】
実施例１
１ａ）２−クロロ−３−フルオロ安息香酸
２０ｍＬのＴＨＦ中の３−フルオロ安息香酸（４．０２ｇ、２８．７１ｍｍｏｌ）の溶液を、５０ｍＬのＴＨＦ中のＴＭＥＤＡ（１０．００ｍＬ、６６．３ｍｍｏｌ）および１．３Ｍのｓｅｃ−ＢｕＬｉ（４８ｍＬ、６２．４ｍｍｏｌ）の懸濁液に、−９０℃で滴下した。混合物を−９０℃で３５分間撹拌した。混合物を−７８℃に加温し、５０ｍＬのＴＨＦ中のヘキサクロロエタン（２７．０ｇ、１１３．９ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。２０時間後、反応を水でクエンチし、ジエチルエーテルで希釈した。二層を、濃ＨＣｌで約１〜２のｐＨに調製した。有機層を水、ブラインで洗浄し、乾燥し、濃縮して、黄褐色固体として３０．４ｇの粗物質を得、これをヘキサンで洗浄し、３．７２８ｇ（７４％）の所望の生成物１ａを得た（淡黄褐色固体）。ＭＳ（ｍ／ｚ）１７５．２（Ｍ＋Ｈ）
【００４２】
１ｂ）３−クロロ−２−フルオロ−ベンゾイルアジド
２５ｍＬのオキサリルクロライド中の２−クロロ−３−フルオロ安息香酸（実施例１ａ）（２．７０４ｇ、１５．５４ｍｍｏｌ）の懸濁液を２時間加熱還流した。溶液を冷却し、濃縮して、粗酸塩化物（３．１３ｇ）を褐色液体として得、これを次の工程に直接用いた。
１０ｍＬの水中のＮａＮ３（２．７９ｇ、４３ｍｍｏｌ）の溶液を、２０ｍＬのアセトン中の酸塩化物（３．１３ｇ）の溶液に０℃で滴下した。１５分後、溶液をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、水およびブラインで洗浄した。有機層を乾燥し、濃縮して、褐色液体を得、これを酢酸エチル／ヘキサン（５／９５、ｖ／ｖ）を用いてシリカゲルにより濾過して、２．９７ｇ（９６％）の１ｂ（無色の液体）を得た。化合物をさらに生成することなく用いた。
【００４３】
１ｃ）２−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−６−クロロ−ベンゾオキサゾール−７−スルホニル）−ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
１００ｍＬのＴＨＦ中の２−ｔｅｒｔ−ブチル−６−クロロ−ベンゾオキサゾール−７−スルホニルクロライド（１０．７５ｇ、３４．９ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却して、Ｅｔ３Ｎ（３．４７ｍＬ、２４．９ｍｍｏｌ）、ついで、Ｂｏｃ−ピペラジン（５．０ｇ、２６．８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を２０時間撹拌し、室温に加温した。混合物を水に注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出し、水で洗浄した；有機層を乾燥し、濃縮した。酢酸エチル／ヘキサン（３０／７０、ｖ／ｖ）で溶出するシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製して、１１．１２ｇ（９１％）の所望の生成物１ｃを得た。ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）４５８．２（Ｍ＋Ｈ）
【００４４】
１ｄ）４−（３−アミノ−６−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホニル）−ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル．
ジオキサン（２０ｍＬ）中の出発物質１ｃ（１１．１２ｇ）の溶液を、水（１１ｍＬ）および濃Ｈ２ＳＯ４（１１ｍＬ）で処理した。混合物を１２時間加熱還流した。反応混合物を濃縮し、ついで、残渣を、５０％のＮａＯＨ水溶液で塩基性化して約ｐＨ１４にした。（Ｂｏｃ）２Ｏ（５．６ｇ、１．０５等量）および１００ｍＬのＡｃＯＥｔを加え、得られた混合物を室温にて１６時間撹拌した。混合物を分離し、水層をＥｔＯＡｃで抽出し、有機層を合して、乾燥し、濃縮した。酢酸エチル／ヘキサン（３０／７０、ｖ／ｖ）で溶出するシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製して８．１８ｇ（８５％）の所望の生成物１ｄを得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ６．８５（ｍ，２Ｈ），３．４８（ｔ，４Ｈ），３．２５（ｔ，４Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ）
【００４５】
１ｅ）４−（６−クロロ−３−［３−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）−ウレイド］−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホニル）−ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の１ｄ（３．８ｇ、９．７ｍｍｏｌ）および３−クロロ−２−フルオロベンゾイルアジド（１ｂ）（２．９ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）の溶液を、室温にて１８時間撹拌した。混合物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄して、粗物質を得た。酢酸エチル／ヘキサン（２０／８０、ｖ／ｖ）で溶出してシリカゲルのカラムクロマトグラフィーに溶出して、３．６ｇ（６６％）の１ｅを得た。ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）５６２．８（Ｍ＋Ｈ）
【００４６】
１ｆ）１−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）−３−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペラジン−１−スルホニル）−フェニル］−尿素塩酸塩
ジオキサン中の２０ｍＬの４ＮのＨＣｌ中の３．６ｇＢｏｃ−生成物の溶液を、室温にて２時間撹拌し、溶媒を蒸発させた。残渣をメタノールおよび酢酸エチルから再結晶して、標題生成物（２．９ｇ）（６０％）を得た。ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）４６３．０（Ｍ＋Ｈ）
【００４７】
実施例２
２ａ）ｔｅｒｔ−ブチル−６−クロロ−７−（４−（２−メトキシエチル）−ピペラジン−１−スルホニル］−ベンゾオキサゾール
実施例１ｃに記載の一般方法に従って、２−ｔｅｒｔ−ブチル−６−クロロ−ベンゾオキサゾール−７−スルホニルクロライドを、２−メトキシ−エチル−ピペラジンとカップリングさせて、所望の生成物２ａ（１．１１ｇ）（８２％）を得た。ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）４１６．２（Ｍ＋Ｈ）
【００４８】
２ｂ）６−アミノ−３−クロロ−２−［４−（２−メトキシエチル）−ピペラジン−１−スルホニル］−フェノール
実施例１ｄに記載の一般方法に従って、ｔｅｒｔ−ブチル−６−クロロ−７−（４−２−メトキシ−エチル）−ピペラジン−１−スルホニル］−ベンゾオキサゾールを加水分解して、粗２ｂを得、これをさらに精製することなく次の工程に用いた。
【００４９】
２ｃ）１−（２−クロロ−３−フルオロ−フェニル）−３−｛４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−［４−（２−メトキシエチル）−ピペラジン−１−スルホニル］−フェニル｝−尿素
実施例１ｅに記載の一般方法に従って、６−アミノ−３−クロロ−２−［４−（２−メトキシル−エチル）−ピペラジン−１−スルホニル］−フェノールおよび３−クロロ−２−フルオロベンゾイルアジドをカップリングさせ、１６８ｍｇ（２ａから２０％）の生成物２ｃ（ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によりトリフルオロ酢酸塩として単離した）を得た。ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）５２１．２（Ｍ＋Ｈ）
【００５０】
２ｄ）１−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）−３−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−１−スルホニル］−フェニル｝−尿素
Ａｒ雰囲気下、３ｍＬのジクロロメタン中の２ｃトリフルオロ酢酸塩（１００ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の懸濁液に、三臭化ホウ素（０．６３ｍＬ、０．６３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、室温にて一晩撹拌した。メタノールでクエンチした後、固体が精製した。混合物を濾過し、固体を回収した。アセトニトリル／水／０．１％のＴＦＡ（１０分間で１０／９０、ｖ／ｖ〜９０／１０、ｖ／ｖ）で溶出するＧｉｌｓｏｎＨＰＬＣで精製して、６６ｍｇ（７６％）の標題化合物２ｄを得た。ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）５０７．２（Ｍ＋Ｈ）
【００５１】
３ａ）２−ｔｅｒｔ−ブチル−６−クロロ−７−（４−メチルピペラジン−１−スルホニル）−ベンゾオキサゾール
実施例１ｃに記載の一般方法に従って、２−ｔｅｒｔ−ブチル−６−クロロ−ベンゾオキサゾール−７−スルホニルクロライドを、メチル−ピペラジンとカップリングさせて、所望の生成物３ａ（６００ｍｇ）（５３％）を得た。ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）３７２．０（Ｍ＋Ｈ）
【００５２】
３ｂ）６−アミノ−３−クロロ−２−（４−メチルピペラジン−１−スルホニル）−フェノール
実施例１ｄに記載の一般方法に従って、２−ｔｅｒｔ−ブチル−６−クロロ−７−（４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル）−ベンゾオキサゾールを加水分解して、３ｂ（４４１ｍｇ）（８９％）を得た。ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）３０６．２（Ｍ＋Ｈ）
【００５３】
３ｃ）１−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）−３−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（４−メチルピペラジン−１−スルホニル）−フェニル］−尿素
実施例１ｅに記載の一般方法に従って、６−アミノ−３−クロロ−２−（４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル）−フェノールおよび３−クロロ−２−フルオロ−ベンゾイルアジド（１ｂ）を、カップリングさせて、２０３ｍｇ（３０％）の標題化合物３ｃを得た。ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）４７７．０（Ｍ＋Ｈ）
【００５４】
治療方法
式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩は、ヒトまたは他の哺乳類における、かかる哺乳類の細胞、例えば、限定するものではないが、単球および／またはマクロファージ、またはＩ型受容体もしくはＩＩ型受容体とも称されるＩＬ−８α受容体もしくはβ受容体に結合する他のケモカインによる過剰または未制御のＩＬ−８サイトカイン産生により悪化するかまたは引き起こされる病態の予防または治療的処置用の医薬の製造において用いることができる。
【００５５】
したがって、本発明は、ケモカインがＩＬ−８αまたはβ受容体に結合するケモカイン介在疾患の治療方法であって、有効量の式（Ｉ）で示される化合物または医薬上許容される塩を投与することを含む方法を提供する。特に、ケモカインは、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８である。
【００５６】
式（Ｉ）で示される化合物は、サイトカイン機能、特に、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８を阻害して、生理学的機能を正常なレベルまたは場合によっては正常下レベルに生物学的にダウンレギュレートして病態を改善するのに十分な量で投与される。例えば、本発明に関するＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８の異常なレベルとは、（ｉ）１ピコグラム／ｍＬ以上の遊離ＩＬ−８のレベル；（ｉｉ）正常な生理学的レベルより高いいずれかの細胞性ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８；または（ｉｉｉ）ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８を各々産生する細胞または組織における基底レベル以上のＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８の存在である。
【００５７】
式（Ｉ）で示される化合物は、一般的には、ＷＯ９６／２５１５７およびＷＯ９７／２９７４３（出典明示により本明細書に組み入れる）に記載されている化合物よりもより長いｔ１／２および改善された経口生物学的利用能を有することが示されている。
【００５８】
過剰または非制御ＩＬ−８産生が、疾患の悪化および／または発生に関与している多くの病態がある。ケモカイン介在疾患は、乾癬、アトピー性皮膚炎、関節炎（骨関節炎または関節リウマチ）、喘息、慢性閉塞性肺疾患、成人呼吸窮迫症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、卒中、敗血性ショック、内毒素性ショック、グラム陰性菌敗血症、毒性ショック症候群、心臓性および腎性再潅流傷害、糸球体腎炎、血栓症、移植片対宿主反応、アルツハイマー病、同種移植拒絶反応、マラリア、再狭窄、血管形成、アテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症、歯肉炎、ウイルス性疾患、例えば、ライノウイルスまたは望ましくない造血幹細胞放出を含む。
【００５９】
これらの疾患は、主に、大量の好中球浸潤、Ｔ細胞浸潤または新生血管成長により特徴付けられ、好中球の炎症部位への走化性または内皮細胞の定方向増殖を引き起こすＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８産生の増加に付随する。他の炎症性サイトカイン（ＩＬ−１、ＴＮＦおよびＩＬ−６）とは対照的に、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８は、好中球走化性、限定するものではないがエラスターゼ放出を包含する酵素放出ならびにスーパーオキシド産生および活性化を促進する独特の性質を有する。ＩＬ−８Ｉ型またはＩＩ型受容体を介して作用するα−ケモカイン、特に、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８は、内皮細胞の定方向増殖を促進することにより腫瘍の新生血管形成を促進することができる。したがって、ＩＬ−８誘発性走化性または活性化の阻害は、好中球浸潤を直接的に減少させる。
【００６０】
最近の証拠は、また、ＨＩＶ感染症の治療におけるケモカインの役割を示している。Littleman et al., Nature 381, pp. 661 (1996)およびKoup et al., Nature 381, pp. 667 (1996)。
【００６１】
また、最近の証拠は、アテローム性動脈硬化症の治療におけるＩＬ−８阻害剤の使用を示している。第１の文献、Boisvert et al., J. Clin. Invest, 1998, 101:353-363は、骨髄移植を介して、幹細胞（および、したがって、単球／マクロファージ）上にＩＬ−８受容体が存在しないことがＬＤＬ受容体欠損マウスにおいてアテローム性硬化性斑の進行を減少させることを証明している。さらなる支持文献には以下のものがある：Apostolopoulos, et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1996, 16:1007-1012；Liu, et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol, 1997, 17:317-323；Rus, et al., アテローム性動脈硬化症. 1996, 127:263-271；Wang et al., J. Biol. Chem. 1996, 271:8837-8842；Yue, et al., Eur. J. Pharmacol. 1993, 240:81-84；Koch, et al., Am. J. Pathol., 1993, 142:1423-1431；Lee, et al., Immunol. Lett., 1996, 53, 109-113；およびTerkeltaub et al., Arterioscler. Thromb., 1994, 14:47-53。
【００６２】
また、本発明は、式（Ｉ）で示されるケモカイン受容体アンタゴニスト化合物による、ＣＮＳ損傷の急性発症における治療方法、およびＣＮＳ損傷に罹患し易いと考えられる個体における予防方法を提供する。
【００６３】
本明細書で定義されるＣＮＳ損傷は、手術によるような開放性もしくは穿通性頭部外傷、または頭部への損傷によるような非開放性頭部外傷の両方を含む。また、特に、脳領域の虚血性発作もまたこの定義に含まれる。
【００６４】
虚血性卒中は、通常、血管の塞栓、血栓または局所性アテローム性閉鎖の結果として、特定の脳領域への不十分な血液供給により引き起こされる限局性神経障害であると定義できる。この領域における炎症性サイトカインの役割が明らかになってきており、本発明は、これらの損傷の有効な治療方法を提供する。これらのような急性損傷について利用可能な治療法は比較的少ない。
【００６５】
ＴＮＦ−αは、内皮白血球接着分子発現を含む炎症誘発作用を有するサイトカインである。白血球は虚血性脳病変へ浸潤し、したがって、ＴＮＦのレベルを阻害するかまたは減少させる化合物は、虚血性脳損傷の治療に有用である。Liu et al., Stroke, Vol. 25., No. 7, pp. 1481-88 (1994) （出典明示により本明細書に組み入れる）を参照のこと。
【００６６】
非開放性頭部損傷のモデルおよび５−ＬＯ／ＣＯ混合薬剤での処置は、Shohami et al., J. of Vaisc & Clinical PhysiologyおよびPharmacology, Vol. 3, No. 2, pp. 99-107 (1992) （出典明示により本明細書に組み入れる）において検討されている。浮腫形成を減少させる処置は、これらの治療される動物における機能的結果を改善することが見出された。
【００６７】
式（Ｉ）で示される化合物を、例えば、好中球走化性および活性化の減少により証明されるような、ＩＬ−８αまたはβ受容体と結合するＩＬ−８がこれらの受容体と結合するのを阻害するのに十分な量で投与する。式（Ｉ）で示される化合物がＩＬ−８結合の阻害剤であるという知見は、本明細書において記載するインビトロ受容体結合検定における式（Ｉ）で示される化合物の効果に基づいている。式（Ｉ）で示される化合物はＩＬ−８ ＩＩ型受容体の阻害剤であることが明らかにされた。
【００６８】
本明細書において用いる場合、「ＩＬ−８媒介疾患または病態」なる用語は、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８が、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８その物を産生することにより、またはＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８が限定するものではないがＩＬ−１、ＩＬ−６またはＴＮＦなどの別のモノカインを放出させることにより役割を果たす全ての病態を意味する。したがって、例えば、ＩＬ−１が主成分であり、その産生または作用がＩＬ−８に応答して悪化または分泌される病態は、ＩＬ−８により媒介される病態であると考えられる。
【００６９】
本明細書において用いる場合、「ケモカイン媒介疾患または病態」なる用語は、ＩＬ−８αまたはβ受容体と結合するケモカイン、例えば、限定するものではないがＩＬ−８、ＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８などが役割を果たす全ての病態を意味する。これは、ＩＬ−８が、ＩＬ−８その物を産生することにより、またはＩＬ−８が、限定するものではないがＩＬ−１、ＩＬ−６またはＴＮＦ等の別のモノカインを放出させることにより役割を果たす病態を含む。したがって、例えば、ＩＬ−１が主成分であり、その産生または作用がＩＬ−８に応答して悪化または分泌される病態は、ＩＬ−８により媒介される病態であると考えられる。
【００７０】
本明細書において用いる場合、「サイトカイン」なる用語は、細胞の機能に影響を与え、免疫、炎症または造血応答における細胞間の相互作用を調節する分子である分泌ポリペプチドを意味する。サイトカインは、限定するものではないが、どの細胞が産生するかにかかわらず、モノカインおよびリンホカインを含む。例えば、モノカインは、一般に、単核細胞、例えば、マクロファージおよび／または単球により産生および分泌されるものをいう。しかしながら、ナチュラルキラー細胞、線維芽細胞、好塩基球、好中球、内皮細胞、脳星状細胞、骨髄ストローマ細胞、表皮性ケラチノサイトおよびＢ−リンパ球などの多くの他の細胞もまたモノカインを産生する。リンホカインは、一般に、リンパ球により産生されるものをいう。サイトカインの例としては、限定するものではないが、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）および腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦ−β）が挙げられる。
【００７１】
本明細書において用いる場合、「ケモカイン」なる用語は、上記した「サイトカイン」なる用語と同様に、細胞の機能に影響を与え、免疫、炎症または造血応答における細胞間の相互作用を調節する分子である分泌ポリペプチドを意味する。ケモカインは主に細胞膜貫通を介して分泌され、特定の白血球、好中球、単球、マクロファージ、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞、内皮細胞および平滑筋細胞の走化性および活性化を引き起こす。ケモカインの例としては、限定するものではないが、ＩＬ−８、ＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−β、ＰＦ４、ならびにＭＣＰ１、２および３が挙げられる。
【００７２】
式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩を治療において用いるためには、通常、これを標準的な医薬手法に従って医薬組成物に処方する。したがって、また、本発明は、有効で非毒性である量の式（Ｉ）で示される化合物および医薬上許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物に関する。
【００７３】
式（Ｉ）で示される化合物、その医薬上許容される塩およびこれを配合した医薬組成物は、好都合には、薬剤投与に慣用的に用いられる経路のいずれか、例えば、経口、局所、非経口または吸入によって投与される。式（Ｉ）で示される化合物は、それを慣用的な方法に従って標準的医薬担体と組み合わせることにより調製される慣用的な投与剤形で投与される。式（Ｉ）で示される化合物は、また、公知の第２の治療上活性な化合物と組合せて慣用的な投与形態で投与することができる。これらの方法は、成分を、所望の調製物に適するように、混合し、造粒し、ついで、圧縮または溶解させることからなる。医薬上許容される担体または希釈剤の形態および特性は、組合せる有効成分の量、投与経路および他のよく知られている要因に依存すると考えられる。担体は、他の処方成分と適合し、レシピエントに有害でないという意味で「許容され」なければならない。
【００７４】
用いられる医薬担体は、例えば、固体または液体のいずれでもよい。固体担体の例は、ラクトース、白土、シュークロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などである。液体担体の例は、シロップ、落花生油、オリーブ油、水などである。同様に、担体または希釈剤は、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどの当該分野で公知の遅延性物質を単独でまたはワックスと共に含んでもよい。
【００７５】
広範囲に及ぶ医薬形態を用いることができる。したがって、固体担体を用いる場合、製剤は、錠剤にしたり、粉末またはペレット形態でハードゼラチンカプセル中に入れたり、トローチまたはロゼンジの形態にすることができる。固体担体の量は、広範囲に及ぶが、好ましくは、約２５ｍｇ〜約１ｇである。液体担体を用いる場合、製剤は、シロップ、エマルジョン、ソフトゼラチンカプセル、滅菌注射液、例えば、アンプルまたは非水性液体懸濁液の形態にされる。
【００７６】
式（Ｉ）で示される化合物は、局所的に、すなわち、非全身性投与により投与される。これは、式（Ｉ）で示される化合物の表皮へまたは口腔内への外用、およびかかる化合物の耳、目および鼻への滴下注入を含み、化合物が著しく血流に入らないようにする。これに対して、全身性投与は、経口、静脈内、腹腔内および筋肉内投与を意味する。
【００７７】
局所投与に適した処方は、皮膚を通して炎症部位へ浸透するのに適した液体または半液体製剤、例えば、塗布剤、ローション、クリーム、軟膏またはペースト、および目、耳または鼻への投与に適した滴剤を含む。有効成分は、局所投与の場合、処方物の０．００１％ｗ／ｗ〜１０％ｗ／ｗ、例えば、１重量％〜２重量％を含む。しかしながら、それを処方物の１０％ｗ／ｗほども含んでもよいが、好ましくは、５％ｗ／ｗ未満、より好ましくは、０．１％〜１％ｗ／ｗ含む。
【００７８】
本発明のローションは、皮膚または目への適用に適したものを含む。眼ローションは、所望により殺菌剤を含んでもよい無菌水溶液を含み、滴剤の調製法と類似の方法により調製される。皮膚へ適用するためのローションまたは塗布剤は、また、アルコールまたはアセトンなどの皮膚の乾燥を促進し、冷却する薬剤および／またはグリセロールなどの保湿剤またはヒマシ油もしくは落花生油などの油を含んでもよい。
【００７９】
本発明のクリーム、軟膏またはペーストは、外用のための有効成分を含む半固体処方物である。これらは、有効成分を微粉末または粉末形態で、単独または水性または非水性流体中溶液または懸濁液の形態で、適当な機械を用いて、グリース状または非グリース状基剤と混練することにより調製される。基剤は、炭化水素、例えば、固型、軟または流動パラフィン、グリセロール、ミツロウ、金属石鹸；漿剤；扁桃油、トウモロコシ油、落花生油、ヒマシ油またはオリーブ油などの天然起源の油；羊毛脂もしくはその誘導体またはステアリン酸もしくはオレイン酸などの脂肪酸などをアルコール、例えば、プロピレングリコールまたはマクロゲルとともに含んでもよい。処方物は、いずれの適当な界面活性剤、例えば、アニオン、カチオンまたは非イオン性界面活性剤、例えば、ソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体を配合してもよい。懸濁化剤、例えば、天然ガム、セルロース誘導体または無機物質、例えば、ケイ酸質シリカ（silicaceous silicas）および他の成分、例えばラノリンを含んでいてもよい。
【００８０】
本発明の滴剤は、滅菌水性または油性溶液または懸濁液を含んでいてもよく、有効成分を殺菌剤および／または殺真菌剤および／または他の適当な保存剤の適当な水溶液に溶かし、好ましくは、界面活性剤を配合することにより調製される。ついで、得られた溶液を濾過により清澄化し、適当な容器に移し、ついで、これを密封し、オートクレーブ処理または９８〜１００℃に半時間維持することにより滅菌する。別法として、溶液を濾過滅菌し、無菌技法により容器に移す。滴剤に配合するのに適した殺菌剤および殺真菌剤の例は、硝酸フェニル水銀または酢酸フェニル水銀（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）および酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）である。油性溶液の調製に適した溶媒としては、グリセロール、希アルコールおよびプロピレングリコールが挙げられる。
【００８１】
式（Ｉ）で示される化合物は、非経口的、すなわち、静脈内、筋肉内、皮下、鼻内、直腸内、膣内または腹腔内投与により投与される。皮下および筋肉内形態の非経口投与が一般に好ましい。かかる投与に適する投与剤形は慣用技術により調製される。式（Ｉ）で示される化合物は、また、吸入、すなわち、鼻内または経口吸入投与によっても投与することができる。エアゾール処方物または定量型吸入器などのかかる投与に適した投与形態は、慣用的な技術により調製される。
【００８２】
式（Ｉ）で示される化合物に関して本明細書に記載したあらゆる使用法に関して、１日の経口投与量は、好ましくは、全体重１ｋｇあたり約０．０１〜約８０ｍｇである。１日の非経口投与量は、全体重１ｋｇあたり約０．００１〜約８０ｍｇである。１日の局所投与量は、好ましくは、０．１ｍｇ〜１５０ｍｇであり、１日に１〜４回、好ましくは、２または３回投与する。１日の吸入量は、好ましくは、１日に約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇである。式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩の最適量および個々の投与間隔は、治療する症状の性質および程度、投与の形態、経路および部位、ならびに治療する個々の患者により決定されること、およびこのような最適値は慣用技術により決定できることも当業者には理解できるであろう。また、最適な治療単位、すなわち、特定の日数の間、１日につき投与される式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩の投与回数は、慣用的な治療単位決定試験を用いて当業者により確認できることも、当業者には理解できるであろう。
【００８３】
単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではない以下の生物学的実施例を引用して本発明を記載する。
【００８４】
生物学的実施例
本発明の化合物のＩＬ−８、およびＧｒｏ−αケモカイン阻害効果を以下のインビトロ検定により測定した：
受容体結合検定：
比活性が２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌである[125Ｉ]ＩＬ−８（ヒト組換体）をイリノイ州アーリントン・ハイツのアマシャム・コーポレイション（Amersham Corp.）から入手した。Ｇｒｏ−αをエヌイーエヌ−ニュー・イングランド・ニュークリア（NEN-New England Nuclear）から入手した。他の薬品はすべて分析用であった。すでに開示されているようにして（Holmes et al., Science, 1991, 253, 1278）、高レベルの組換えヒトＩＬ−８αおよびβ型受容体を、個別に、チャイニーズハムスター卵巣細胞において発現させた。すでに開示されているプロトコル（Haour et al., J. Biol. Chem., 249, pp 2195−2205 (1974)）に従って、チャイニーズハムスター卵巣膜をホモジナイズした。ただし、ホモジナイゼーション緩衝液を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、０．５ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、１ｍＭのＰＭＳＦ（α−トルエンスルホニルフルオリド）、０．５ｍｇ／Ｌのロイペプチン、ｐＨ７．５に変更した。膜タンパク質濃度を、ピアス・カンパニー（Pierce Co.）のミクロ検定キットを用いて、ウシ血清アルブミンを標準として用いて測定した。すべての検定は、９６−ウェルマイクロプレートフォーマットで行った。各反応混合物は、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＮａＣｌおよび０．０３％のＣＨＡＰＳを含有する２０ｍＭのビス−トリスプロパンおよび０．４ｍＭのＴｒｉｓのＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中１２５Ｉ ＩＬ−８（０．２５ｎＭ）または125Ｉ Ｇｒｏ−αおよび０．５μｇ／ｍＬのＩＬ−８Ｒαまたは１．０μｇ／ｍＬのＩＬ−８Ｒβ膜を含有した。加えて、あらかじめＤＭＳＯに溶解させて最終濃度を０．０１ｎＭ〜１００ｕＭにした目的の薬物または化合物を添加した。検定を、125Ｉ−ＩＬ−８の添加により開始した。室温で１時間後、Ｔｏｍｔｅｃ ９６−ウェルハーベスターを用いて１％ポリエチレンイミン／０．５％のＢＳＡでブロックしたガラス繊維フィルターマット上にてプレートを収穫し、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓのＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＣＨＡＰＳ（Ｈ７．４）で３回洗浄した。ついで、フィルターを乾燥させ、Ｂｅｔａｐｌａｔｅ液体シンチレーションカウンターで計数した。組換えＩＬ−８ＲαまたはＩ型受容体は、また、本明細書において非許容受容体とも称され、組換えＩＬ−８ＲβまたはＩＩ型受容体は許容受容体と称される。
【００８５】
式（Ｉ）で示される代表的化合物、実施例１〜３は、本アッセイで、ＩＣ５０レベルが３０μＭ未満の正の阻害活性を示した。
【００８６】
走化性検定
Current Protocols in Immunology, vol. I, Suppl 1, Unit 6.12.3.（その開示内容は、全体として出典明示により本明細書の一部とする）に記載されているようにして好中球走化性検定法でこれらの化合物のインビトロ阻害特性を測定する。Current Protocols in Immunology Vol. I, Suppl 1 Unit 7.23.1（その開示内容は、全体として出典明示により本明細書の一部とする）に開示されているようにしてヒト血液から好中球を単離する。化学誘引物質ＩＬ−８、ＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γおよびＮＡＰ−２を０．１〜１００ｎＭの濃度で４８マルチウェルチャンバー（メリーランド州キャビン・ジョンのニューロ・プローブ（Neuro Probe））の下部チャンバーに入れる。２つのチャンバーは５μｍポリカーボネートフィルターで隔てられている。本発明の化合物を試験する場合、細胞を上部チャンバーに添加する直前に、該化合物を細胞と混合する（０．００１−１０００ｎＭ）。インキュベーションは、５％ＣＯ２を有する加湿インキュベータ中にて約３７℃で約４５〜９０分間行う。インキュベーション期間の最後に、ポリカーボネート膜を取り出し、最上部を洗浄し、ついで、該膜を、Ｄｉｆｆ Ｑｕｉｃｋ染色プロトコル（アメリカ合衆国イリノイ州マックゴー・パークのバクスター・プロダクツ（Baxter Products））を用いて染色する。ケモカインに対して走化性を示した細胞を顕微鏡を用いて目視により計数する。一般に、各サンプルについて４つのフィールドを計数し、これらの数を平均して、移動した細胞の平均数を求める。各サンプルを三重に試験し、各化合物を少なくとも４回繰り返し試験する。特定の細胞（正の対照細胞）には化合物を添加せず、これらの細胞は細胞の最大走化性応答を示す。負の対照（刺激しない）が望ましい場合には、下部チャンバーにケモカインを添加しない。正の対照と負の対照との差異は、細胞の走化性活性を表す。
【００８７】
エラスターゼ放出検定：
ヒト好中球からのエラスターゼ放出を防止する能力について本発明の化合物を試験する。Current Protocols in Immunology Vol. I, Suppl 1 Unit 7.23.1.に記載されているようにしてヒト血液から好中球を単離する。リンゲル溶液（ＮａＣｌの１１８、ＫＣｌの４．５６、ＮａＨＣＯ３の２５、ＫＨ２ＰＯ４の１．０３、グルコースの１１．１、ＨＥＰＥＳの５ｍＭ、ｐＨ７．４）中に懸濁したＰＭＮの０．８８×１０６細胞を、５０μｌの容量で９６ウェルプレートの各ウェルに入れる。このプレートに、５０μｌの容量の試験化合物（０．００１〜１０００ｎＭ）、５０μｌ（２０μｇ／ｍｌ）の容量のシトカラシンＢおよび５０μｌの容量のリンゲル緩衝液を添加する。これらの細胞を５分間加温（３７℃、５％のＣＯ2、９５％のＲＨ）した後、最終濃度０．０１〜１０００ｎＭのＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγまたはＮＡＰ−２を添加した。該反応を４５分間進行させた後、９６ウェルプレートを遠心分離し（８００×ｇ、５分）、上清１００ｕｌを取り出した。この上清を第２の９６ウェルプレートに添加し、ついで、リン酸緩衝生理食塩水に溶解した人工エラスターゼ基質（ＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＡＭＣ、カリフォルニア州ラ・ジョラのノヴァ・ビオケム（Nova Biochem））を最終濃度６μｇ／ｍｌになるように添加する。直ちに、プレートを蛍光９６ウェルプレートリーダー（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ ２３５０、マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポア（Millipore））に入れ、Nakajima et al., J. Biol Chem 254 4027 (1979) の方法に従って３分間隔でデータを集める。ＰＭＮから放出されたエラスターゼの量を、ＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＡＭＣ分解速度を測定することにより計算する。
【００８８】
ＴＮＦ−α外傷性脳傷害検定
この検定は、ラットにおいて実験的に誘発した側液衝撃外傷性脳傷害（ＴＢＩ）の後に起こる特定の脳領域における腫瘍壊死因子ｍＲＮＡの発現を調べるために行う。成体スプレーグ−ドーリーラット（ｎ＝４２）をペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔し、左側頭頭頂皮質上に集中する中度の重篤度（２．４ａｔｍ）の側液衝撃脳傷害（ｎ＝１８）、または「擬似」処置（麻酔、および傷害を伴わない手術、ｎ＝１８）を与えた。傷害の１時間後、６時間後および２４時間後に動物を断頭により屠殺し、脳を取り出し、左（傷害）頭頂皮質（ＬＣ）、対側性右皮質の対応する領域（ＲＣ）、傷害頭頂皮質と隣接する皮質（ＬＡ）、右皮質における対応する隣接領域（ＲＡ）、左海馬（ＬＨ）および右海馬（ＲＨ）の組織試料を調製する。全ＲＮＡを単離し、ノーザンブロットハイブリダイゼーション処理し、ＴＮＦ−α正対照ＲＮＡと比較して定量化する（マクロファージ＝１００％）。傷害の１時間後、損傷した半球において、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡ発現の著しい増加がＬＨ（正対照の１０４±１７％、擬似処置と比較してｐ＜０．０５）、ＬＣ（１０５±２１％、ｐ＜０．０５）およびＬＡ（６９±８％、ｐ＜０．０１）にて見られる。傷害の６時間後、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡ発現の増加がまたＬＨ（４６±８％、ｐ＜０．０５）、ＬＣ（３０±３％、ｐ＜０．０１）およびＬＡ（３２±３％、ｐ＜０．０１）にて見られ、２４時間後まで続く。対側性半球において、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡの発現は、傷害の１時間後には、ＲＨ（４６±２％、ｐ＜０．０１）、ＲＣ（４±３％）およびＲＡ（２２±８％）において増加し、６時間後にはＲＨ（２８±１１％）、ＲＣ（７±５％）およびＲＡ（２６±６％、ｐ＜０．０５）において増加するが、２４時間後には増加しない。擬似処置（傷害を伴わない手術）またはナイーブ動物においては、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡの発現の一貫した変化は、いずれの時点でもいずれの半球における６つの脳領域のいずれにおいても見られない。これらの結果は、側矢状液衝撃脳傷害後、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡの一時的発現が、損傷してない半球のものを含めて特定の脳領域において変えられることを示す。ＴＮＦ−αは、神経成長因子（ＮＧＦ）を誘発でき、活性化星状細胞からの他のサイトカインの放出を刺激するので、ＴＮＦ−αの遺伝子発現におけるこの外傷後の変化は、ＣＮＳ外傷に対する急性応答および再生性応答の両方において重要な役割を果たす。
【００８９】
ＩＬ−１β ｍＲＮＡについてのＣＮＳ傷害モデル
この検定は、ラットにおいて実験的側液衝撃外傷性脳傷害（ＴＢＩ）後の特定の脳領域におけるインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）ｍＲＮＡの局所的発現を特徴付ける。成体スプレーグ−ドーリーラット（ｎ＝４２）をペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔し、左側頭頭頂皮質上に集中する中度の重篤度（２．４ ａｔｍ）の側液衝撃脳傷害（ｎ＝１８）、または「擬似」処置（麻酔、および傷害を伴わない手術、ｎ＝１８）を与えた。傷害の１時間後、６時間後および２４時間後に動物を屠殺し、脳を取り出し、左（傷害）頭頂皮質（ＬＣ）、対側性右皮質の対応する領域（ＲＣ）、傷害頭頂皮質と隣接する皮質（ＬＡ）、右皮質における対応する隣接領域（ＲＡ）、左海馬（ＬＨ）および右海馬（ＲＨ）の組織試料を調製する。全ＲＮＡを単離し、ノーザンブロットハイブリダイゼーション処理し、脳組織ＩＬ−１β ｍＲＮＡの量を、同一ゲル上に負荷したＩＬ−１β正マクロファージＲＮＡの相対的な放射能の％として表す。脳傷害の１時間後、損傷した半球において、ＩＬ−１β ｍＲＮＡの発現の著しくかつ有意な増加がＬＣ（正対照の２０．０±０．７％、ｎ＝６、擬似処置動物と比較してｐ＜０．０５）、ＬＨ（２４．５±０．９％、ｐ＜０．０５）およびＬＡ（２１．５±３．１％、ｐ＜０．０５）にて見られ、傷害の６時間後まで、ＬＣ（４．０±０．４％、ｎ＝６、ｐ＜０．０５）およびＬＨ（５．０±１．３％、ｐ＜０．０５）にて上昇し続ける。擬似処置またはナイーブ動物においては、ＩＬ−１β ｍＲＮＡの発現は、個々の脳領域のいずれにおいても見られない。これらの結果は、ＴＢＩ後、ＩＬ−１β ｍＲＮＡの一時的発現が特定の脳領域において局部的に刺激されることを示す。ＩＬ−１βのようなサイトカインにおけるこれらの局部的変化は、外傷後において役割を果たす。
【００９０】
本明細書にて引用した特許および特許出願を包含するがこれらに限定されない全ての刊行物は、個々の刊行物が十分に開示されているかの如く具体的かつ個別的に出典明示により本明細書の一部とすることが明示されているかのように出典明示により本明細書の一部とする。
【００９１】
好ましい実施態様を包含する上記記載事項は本発明を十分に開示する。本明細書に具体的に開示した実施態様の変更および改良は特許請求の範囲の範囲内に含まれる。さらに推敲することなく、当業者は上記記載事項を用いて本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、本明細書における実施例は単に例示的であって、如何なる場合も本発明の範囲を制限するものではないと考えられる。排他的性質および優先権を主張する本発明の実施態様は特許請求の範囲に定義するとおりである。