(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
センソの水溶性抽出物を含む免疫活性増強剤であって、
前記センソの水溶性抽出物は、分子量が１１８，０００〜２１４，０００のタンパク質、糖タンパク質および多糖類のいずれか１以上であることを特徴とする免疫活性増強剤。
【請求項２】
センソの水溶性抽出物を含む免疫活性増強剤であって、
前記センソの水溶性抽出物は、分子量が６，８００〜２０，８００のタンパク質、糖タンパク質および多糖類のいずれか１以上であることを特徴とする免疫活性増強剤。
【請求項３】
リンパ球の幼若化促進作用を有することを特徴とする請求項１又は２記載の免疫活性増強剤。
【請求項４】
インターロイキン２およびインターロイキン１２の産生促進作用を有することを特徴とする請求項１又は２記載の免疫活性増強剤。
【請求項５】
ナチュラルキラー細胞活性増強作用を有することを特徴とする請求項１又は２記載の免疫活性増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫活性増強剤、並びにそれが含まれた食品及び医薬部外品に関する。
【背景技術】
【０００２】
センソはシナヒキガエル（Bufo bufo gargarizans CantorまたはBufo melanostictus Schneider）の毒腺分泌物を固めたものであり、古来より強心剤や抗炎症剤の成分として用いられている生薬である。その薬理作用成分としてbufalin、cinobufagin、resibufogeninといったブファジエノリド類が知られており、強心、呼吸興奮、利尿、抗腫瘍作用および腫瘍細胞アポトーシス誘導といった薬理作用が報告されている(特許文献１)。
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−２７９０６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながらこれらの成分のみでセンソの持つ生理作用全てを説明することは難しい。センソにはタンパク質や多糖類が比較的多く含まれているが、これら高分子成分の生理活性に関する報告はいままで存在しない。また、ある種のヒキガエルの皮膚には細菌に対して抗菌作用を発現するペプチド類が含まれていることが知られているものの、センソ成分にそのような物質が含まれているという報告はない。
【０００５】
そこで、本発明は、免疫系、すなわちウイルス、細菌や悪性腫瘍細胞のような生体異物からの防御系に関して有用な免疫増強剤を見出し、それを含有する食品、医薬部外品又は医薬品を提供することである。  
【０００６】
また、日本人の死因の第一位は依然として悪性新生物すなわち悪性腫瘍である。生体の免疫能を向上させることは悪性腫瘍細胞のような生体異物の体内での増殖を未然に防ぐことにつながる。腫瘍細胞の増殖抑制剤について、現在まで種々のものが開発されているが、有効で、且つ副作用の少ない薬物の開発が望まれている。また、セルフメデイケーションの観点から、直接腫瘍細胞に対して作用はしないものの、生体の持つ免疫機能を活性化させて腫瘍の増殖を未然に防ぐような食品や医薬部外品の開発も望まれる。そこで、本発明は新たな抗腫瘍作用を有する免疫活性増強剤、並びにそれが含まれた食品及び医薬部外品を提供することを目的とする。
【０００７】
さらに、免疫能はストレスや加齢によって低下することが知られている。ストレス社会、高齢化社会と呼ばれる現代において、免疫能の低下による種々の外来異物（病原細菌、ウイルス等）に対する易感染性は、人々の生産能力のみならず、quality of life (QOL) の低下を招く。そこで、本発明は生体の免疫能を亢進させ、生産能力やQOL低下を間接的にでも抑えうるような免疫活性増強剤、並びにそれが含まれた食品及び医薬部外品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
以上の目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、センソの水溶性抽出物が免疫活性増強に優れていることを見出した。すなわち、本発明は、センソの水溶性抽出物を含むことを特徴とする免疫活性増強剤である。
【発明の効果】
【０００９】
以上のように、本発明によれば、センソの水溶性抽出物を含ませることにより、免疫系、すなわちウイルス、細菌や悪性腫瘍細胞のような生体異物からの防御系に関して有用な免疫活性増強剤、並びにそれが含まれた食品及び医薬部外品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明に係る免疫活性増強剤は、リンパ球の幼若化促進作用、インターロイキン２及びインターロイキン１２の産生促進作用並びにナチュラルキラー細胞活性増強作用のうち少なくとも1以上の作用を有することが望ましい。
【００１１】
本発明に係る免疫活性増強剤において、前記センソの水溶性抽出物は、分子量が１１８，０００〜２１４，０００のタンパク質、糖タンパク質および多糖類のいずれかであるか、あるいは分子量が６，８００〜２０，８００のタンパク質、糖タンパク質および多糖類のいずれかであることが望ましい。
【００１２】
本発明に係る免疫活性増強剤は、免疫原製剤、又は抗悪性腫瘍剤といった組織細胞剤としての用途を有し、液剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤の形で経口投与もしくは非経口投与（脳内、筋肉内、皮下静脈内、点滴静注など）される。
【００１３】
投与量は症状の程度、疾患の相違、患者の年齢、体重、健康状態、同時処理がある場合はその種類、所望の効果の性質、処置頻度などによって異なり、特に限定されないが、成人1日あたり経口では、原生薬量に換算して約１０ｍｇ〜１０００ｍｇ を1日1回もしくはそれ以上の回数で投与される。
【００１４】
経口投与の場合、それに適用される液剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤などは、それらの組成物中に製剤上一般に使用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤のような添加物を含有してもよい。また、経口用液剤製剤として使用する場合、懸濁液剤、シロップ剤の形態であってもよく、また、使用する前に再溶解させる乾燥生成物の形態であってもよい。さらに、このような液体製剤は普通用いられる添加剤、保存剤のいずれを含有してもよい。
【００１５】
賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、ソルビット、マンニット、結晶セルロース、デンプン、二酸化ケイ素、無機塩類などが、結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ポリビニルピロリドンなどが、崩壊剤としては、例えばデンプン、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、ショ糖脂肪酸エステル、レシチン、ポリソルべート８０、ラウリル硫酸ナトリウムなどが、滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油などが、着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、例えばココア末、ハッカ脳、芳香酸、ハッカ油、竜脳、桂皮末などが用いられる。これらの錠剤、顆粒剤には糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングすることは勿論差し支えない。また、これらの錠剤、顆粒剤、カプセル剤を徐放剤とすることは勿論差し支えない。
【００１６】
注射用の場合、その組成物は安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤などの添加物を含有してもよい。なお、上記組成物は懸濁液、溶液、油剤のような形態であってもよい。
【００１７】
その他の非経口剤としては、直腸内投与のための坐剤が挙げられ、常法に従って製造される。
【００１８】
また、本発明は、上記免疫活性増強剤が含まれたことを特徴とする食品であり、例えばお茶、ジュースといった清涼飲料水、ゼリー、飴、チョコレート、チューインガム、栄養補助食品などがある。また、本発明に係る食品は、健康食品（機能性食品、健康補助食品）などが含まれ、液剤、粉剤、粒剤、カプセル剤、錠剤の形で製造される。
【００１９】
さらに、本発明は、上記免疫活性増強剤が含まれたことを特徴とする医薬部外品であり、例えばのど清涼剤、健胃清涼剤。ビタミン含有保健剤などがあり、液剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤の形で製造される。
【実施例】
【００２０】
次に、本発明に係る免疫活性増強剤の実施例１及び２について説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２１】
まず、センソに１５倍量のmethanolを加えて１０分間振り混ぜ、遠心分離して上清を除去する操作を３回行った後、沈殿に窒素ガスを通気してmethanolを除去し、これに４ mM 2-mercaptoethanol、０．１ ｍＭ phenylmethanesulfonyl fluorideを含む10 mM phosphate buffered saline（ｐＨ ７．４、以下ＰＢＳ）を加えて振り混ぜ、１1時間超音波抽出し、１５，０００ｒｐｍ、 ２５分間、４℃遠心分離後、上清を分取した。上清を透析膜に入れ、水に対して3日間透析し、透析内容物を凍結乾燥し、乾燥粉末（fraction 1）を得た。また、fraction １を取り、これに０．１ ｍＭＭｎＣｌ２および０．１ ｍＭＣａＣｌ２を含むＰＢＳを加えて溶解し、concanavalin A-agaroseに通して非結合成分を除き、 ０．２ Ｍ α-methyl mannoseを含むＰＢＳにて結合成分を溶出させ、溶出液を透析膜に入れて水に対して２日間透析し、透析内容物を凍結乾燥して乾燥粉末（fraction 2）を得た。これらfraction１に係る乾燥粉末を実施例１に係る免疫活性増強剤とし、fraction ２に係る乾燥粉末を実施例２に係る免疫活性増強剤とする。
【００２２】
実験例１  マウス脾臓リンパ球幼若化に対する作用
C3H/HeNマウスより脾臓を無菌的に摘出後、細胞培養用培地（５％ウシ胎児血清、  ３％ glutamine、penicillin-streptomycin混液を含むＲＰＭＩ １６４０培地）中でフロストスライドガラス上（すりガラス部分）で軽く圧迫することにより、細胞を取り出した。pipettingにより細胞を分散させた後、遠心分離（５００×ｇ、５分間、４ ℃）した。赤血球を溶血除去した後、沈殿物を細胞培養用培地にて２回洗浄し、脾臓リンパ球とした。得られた脾臓リンパ球を細胞培養用培地（５％ウシ胎児血清、３％ glutamine、１００Ｕ／ｍｌ penicillin、０．１ｍｇ／ｍｌstreptomycin混液を含むＲＰＭＩ １６４０培地）に懸濁した後、自動血球計数器（ＭＥＫ−４３００、日本光電）を用いて細胞数を測定し、２×１０５／４０ μｌになるよう前出の培地にて希釈し、脾臓リンパ球懸濁液とした。平底９６穴マイクロプレートのウエルに細胞培養用培地０．０４５ ｍｌ、１ｍＭ2-mercaptoethanol ０．００５ ｍｌ、脾臓リンパ球懸濁液０．０４ ｍｌ（細胞数２×１０５）並びに実施例１に係る免疫活性増強剤が含まれた被験薬液あるいは実施例２に係る免疫活性増強剤が含まれた被験薬液０．０１ ｍｌを加えて５％ＣＯ２、３７℃にて４８時間培養した。培養終了4時間前に、各ウエルにcell proliferation assay kit (Cell Titer 96AQueous、Promega)溶液を添加し、tetrazolium塩の生細胞への取り込みの結果、細胞内のNADH生成性脱水素酵素により生成するformazan色素の４９２ ｎｍにおける吸光度を、マイクロプレートリーダーにより測定した。その結果を図１に示す。
【００２３】
図１に示すように実施例１に係る免疫活性増強剤及び実施例２に係る免疫活性増強剤は、マウス脾臓リンパ球幼若化反応を濃度依存的に促進させた。また、 concancvalin A結合カラム精製により、その作用が増強することから、センソに含まれるリンパ球幼若化反応促進物質の多くが、concanavalin Aに結合することが確認できた。
【００２４】
実験例２  リンパ球培養液上清サイトカイン濃度に対する作用  
実験例1記載の方法にて脾臓リンパ球を調製し、これに実施例２に係る免疫活性増強剤、又は比較としてconcanavalin Aを添加し、５％ＣＯ２、３７ ℃にて４８時間培養した。培養液を集め、遠心分離（１，５００ｒｐｍ、５分間）した上清につき、含まれるサイトカイン（インターロイキン２、インターロイキン４、およびインターロイキン１２）量をＥＬＩＳＡキット（BioSourse International）により測定した。免疫活性増強剤やconcanavalin Aを添加しない培養液をＣｏｎｔｒｏｌとして同様に測定を行った。これらの結果を表１に示す。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
表１に示すように、実施例２に係る免疫活性増強剤の添加により、培養液中インターロイキン２とインターロイキン１２濃度の有意な上昇と、インターロイキン４濃度の有意な低下が認められた。
【００２７】
実験例３  マウス脾臓細胞ナチュラルキラー活性に対する作用
１ｍｇ／ｋｇの実施例２に係る免疫活性増強剤、又は比較例として１０ｍｌ／ｋｇの滅菌生理食塩水を、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスに１日１回、３日間腹腔内投与した。投与開始４日目に脾臓を摘出し、リンパ球分画をナイロンカラムに通して精製してeffector細胞を得た。別にマウスリンパ種由来YAC-1細胞を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０倍値にて継代培養し、前日に培地を取り換えて培養したものをtarget細胞とし、以下の手順により細胞障害試験を行い、ＮＫ活性とした。すなわち１×１０４／μｌのeffector細胞０．２ ｍｌに２×１０２ ／μｌ のtarget細胞０．２ ｍｌを加え（effector細胞：target細胞＝50：1）、細胞同士の接触を促進するため遠心分離（１，５００ ｒｐｍ、５分間、２０ ℃）した後、３７ ℃、５％ ＣＯ２にて４時間培養した。終了後、遠心分離（１，５００ ｒｐｍ、５分間、２０ ℃）し、上清０．０５ ｍｌを平底マイクロプレートのウエルに取り、細胞障害の結果漏出する乳酸脱水素酵素の活性（A）をキット（Cytotox 96、Promega）にて測定した。YAC-1細胞０．２ ｍｌの代わりに培養培地0.2 ml を加えたものを（B）とし、effector細胞０．２ ｍｌの代わりに培養培地０．２ ｍｌ を加えたものを（C）とし、培養培地0.4 ml のみ加えたものを（Ｄ）とし、（Ｃ）と（Ｄ）に１０％ Triton X-100 ０．０５ ｍｌを加えたものをそれぞれ（Ｅ）と（Ｆ）とし、細胞障害性を数１により算出した。その結果を図２に示す。
【００２８】
【数１】
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【００２９】
図２に示すように、実施例２に係る免疫活性増強剤を投与されたマウスの脾臓細胞ナチュラルキラー活性は、比較例に係る滅菌生理食塩水を投与されたマウスのそれに比較して有意に高値となった。
【００３０】
実験例４  電気泳動による実施例１に係る免疫活性増強剤の分析と活性成分の推定
常法に従いpolyacrylamide gel（縦６０ ｍｍ、横８０ ｍｍ、厚さ１ ｍｍの１５％分離用ゲルの上に縦２０ ｍｍ、横８０ ｍｍ、厚さ１ ｍｍの４％試料濃縮用ゲルを重層したもの）を調製し、濃縮ゲルの上端に作成した試料添加用ウエルに染色済みの分子量マーカー５μｌおよび実施例１に係る免疫活性増強剤２００μｇを添加した。このゲルをスラブゲル電気泳動装置に取り付け、０．０５ Ｍ Tris（ヒドロキシメチルアミノメタン）, ０．３８４ Ｍ glycine， ０．１％ ＳＤＳ混液中で４０ ｍＡ，約６０分（試料溶液中のbromophenolblue色素がゲル下端から溶出されるまで）通電し、電気泳動（SDS-PAGE）を行った。なお、実施例１に係る免疫活性増強剤は、試料溶解液（１％  ＳＤＳ， １０％ sucrose, ０．５Ｖ／Ｖ％ 2-mercaptoethanol, ０．０２５％ bromophenolblueを含む０．０３ Ｍ Tris-HCl 緩衝液、ｐＨ ６．８に溶解し、沸騰水浴中で３分間加熱後、室温まで冷却し、添加した。
【００３１】
SDS-PAGEにより実施例１に係る免疫活性増強剤を分離し、ゲルを切りだして抽出し、実検例1の方法に準拠してリンパ球幼若化作用を検討した。その結果を図３に示す。
【００３２】
図３に示すように分子量１１８，０００〜２１４，０００および６，８００〜２０，８００の分画で比較的強いリンパ球幼若化活性が認められている。
【００３３】
実験例５  電気泳動およびレクチンブロッティングによる実施例２に係る免疫活性増強剤の分析と活性成分の推定
実施例１に係る免疫活性増強剤の作用が、レクチンであるconcanvalin A結合カラム精製により増強することから、その活性成分の推定のため、実施例２に係る免疫活性増強剤に含まれる成分を電気泳動にて分離し、PVDF膜に転写後酵素標識したconcanavalin Aと反応させて結合性成分を検出した。すなわち実験例４と同様に調製したpolyacrylamide gelに染色済みの分子量マーカー５μlおよび実施例２に係る免疫増強剤（実験例４と同様の試料溶解液にて溶解）２５μgを添加し、実験例４と同様の条件にてSDS-PAGEにより泳動させた。ゲルを取り出し、転写装置にてPVDF膜に電気的に転写（２００ ｍＡ，４時間，１４ ℃）した。転写後PVDF膜をTris-buffered saline（TBS）にて洗浄し、3 % 牛血清アルブミン含有TBSにて４ ℃，１６時間浸けてblockingを行った。その後０．０５％Tween ２０含有ＴＢＳ（ＴＴＢＳ）にて洗い、５ μｇ／ｍｌ concanavalin A-alkaline phosphatase conjugateのＴＴＢＳ溶液に浸け、４℃、１時間反応させた。膜をＴＴＢＳにて３回、次いでＴＢＳにて１回洗浄した後、alkaline phosphatase基質溶液（nitroblue tetrazolium と 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphateの混液）を加えて室温で反応させた。その結果を図４に示す。
【００３４】
図４に示すように実施例２に係る免疫増強剤から分子量１８，０００前後および１３，０００前後のconcanavalin A結合成分が確認される。
【００３５】
Concanavalin Aは D-glucoseおよびD-mannoseに親和性を有するレクチンであり、実験例４の結果から、センソ抽出物の免疫活性増強成分の少なくとも一つは、これらの糖鎖を含む分子量１８，０００前後または１３，０００前後の糖タンパクまたは多糖類である可能性が考えられる。  
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】実施例１及び実施例２に係る免疫活性増強剤のマウス脾臓リンパ球幼若化反応に対する作用を示すグラフである。
【図２】実施例２に係る免疫活性増強剤のマウス脾臓ＮＫ細胞活性に対する作用を示すグラフである。縦軸はＮＫ細胞活性（細胞障害性）を標準誤差とともに表している
【図３】ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による実施例１に係る免疫活性増強剤の分離と、そのリンパ球幼若化作用との関係を示す。
【図４】実施例２に係る免疫活性増強剤の酵素標識concanavalin Aによるレクチンブロット結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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