(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステビア・レバウディアナ・ベルトニー品種間の交配により得られる植物体から、ステビオサイド１重量部に対してレバウデイオサイドＡを３重量部以上含む植物体を選択し、次いで配列番号１および２に示される塩基配列を有するプライマーミックスを用いるＲＡＰＤ法によりＤＮＡ鑑定を実施することを特徴とする、同植物体の選別方法。
【請求項２】
植物体の選別にあたり、セプトリア菌およびアルタナリア菌に対する耐病性に優れた植物体の選別をさらに行う、請求項１に記載の選別方法。
【請求項３】
最初に請求項１または２に記載の方法を実施し、次いで、当該方法により選別されたステビア・レバウディアナ・ベルトニー品種の植物体またはその乾燥葉を水または含水溶媒で抽出することを特徴とする、ステビオサイド１重量部に対してレバウデイオサイドＡを３重量部以上含む甘味料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
ＲＡＰＤ法(Random Amplified Polymorphic DNA method)によるステビオサイドに対してレバウディオサイドＡの比率の高いステビア・レバウディアナ・ベルトニーの品種の識別方法、識別された植物体またはその乾燥葉、その抽出物を含む甘味料およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
ステビアは南米パラグアイを原産地とする菊科多年生植物で、学名をステビア・レバウディアナ・ベルトニー(Ｓtevia  Ｒebaudiana  Ｂertoni)という。ステビアは砂糖の３００倍以上の甘味を持つ甘味成分を含むので、この甘味成分を抽出して天然甘味料として用いる為に栽培されている。
【０００３】
ステビアの甘味成分としては、ステビオサイド(Ｃ３８Ｈ６０Ｏ１８、分子量８０４)、レバウディオサイドＡ(Ｃ４４Ｈ７０Ｏ２３、分子量９６６)、レバウディオサイドＣ、Ｄ、Ｅ、ズルコサイドＡ等が知られている。一般に栽培されているステビア品種では上記甘味成分の内ステビオサイド(ＳＴ)が主成分でレバウディオサイドＡ(ＲＡ)の含有量はステビオサイドの１０分の３〜４程度、レバウディオサイドＣの含量はそれよりやや少ないが、品種によってはレバウディオサイドＡ、及びＣを含まないもの、更にレバウディオサイドＣを主成分とするものなど種々である。
【０００４】
渋み、辛み等の舌で知覚される味の中でも甘みの質は非常に微妙である。ステビオサイドは砂糖の３００倍の甘味度を有するので天然甘味料として食品工業界で用いられている。その甘味は比較的砂糖に似ているが、苦み等の不快味が後味に残るという欠点がある。それゆえステビオサイドを多量に含むことは甘味料として好ましいことではない。これに対して、レバウディオサイドＡは良質の甘味質とステビオサイドの１.３倍〜１.５倍の甘味度を有する。
【０００５】
生産コストの削減と安定した収穫量を保ち、甘味料原料として甘味質の優れたレバウディオサイドＡを高含有したステビア品種を開発し、同時に、それらを継続維持し、それらを基に優れた甘味料を製造する必要がある。
【０００６】
本発明者らは従来品種から交配選抜を繰り返し品種改良を行い、ステビオサイド(ＳＴ)に対してレバウディオサイドＡ(ＲＡ)が高い含有比率を示すステビア品種を得、これらの植物から甘味成分を抽出しステビオサイドに対してレバウディオサイドＡの含有比の高い優れた甘味料を製造してきた(特開昭５９−０４５８４８号、特開昭６０−１６０８２３号、特開昭６１−２０２６６７号など)。
【０００７】
一方、ステビア植物を特定する問題点である改良品種の識別方法として、草丈、葉形等による識別が考えられるが、ステビアは自家不和合性であり雑種になりやすい。
【０００８】
また、ステビア特有の病原菌による耐病性による比較特定もあるが、ステビア特有に発現する枯葉、黒斑点病はセプトリア菌、アルタナリア菌に起因して発生するが、それらの菌は土壌に生息する菌であり、これらの症状のみによる品種の特定は日本のみならず世界的に発生することからこれら特性のみで品種を特定するには不十分である。
【０００９】
甘味成分の含有量が高くステビオサイドに対してレバウディオサイドＡの含有比率の高い改良品種にいたっては、生育期間の気象条件、収穫時期等により甘味成分比率が変動するのは避けられないから、常に同じというわけにはいかない。従って、甘味成分の含有量および比率を測定する方法しかないが、識別の対象となる甘味成分は化学構造式が類似しているため不十分であった。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１は、ステビオサイド１重量部に対してレバウデイオサイドＡ３重量部以上を含むステビア・レバウディアナ・ベルトニー品種の識別方法であって、配列番号１および２に示される塩基配列を有するプライマーミックスを用いるＲＡＰＤ法によって、ＤＮＡ鑑定により識別を行うことを特徴とする方法である。
【００１１】
上記の方法によって、ステビオサイド１重量部に対してレバウデイオサイドＡ３重量部以上を含むステビア・レバウディアナ・ベルトニー品種に属する植物体またはその乾燥葉を識別することができる。
【００１２】
本発明の第２は、本発明の方法によって識別された植物体またはその乾燥葉を水、または含水溶媒で抽出して得られるステビオサイド１重量部に対してレバウデイオサイドＡ３重量部以上を含む甘味料である。
【００１３】
本発明の第３は、ステビオサイド１重量部に対してレバウデイオサイドＡ３重量部以上を含む甘味料の製造方法であって、本発明の植物体またはその乾燥葉を水、または含水溶媒で抽出することを特徴とする方法である。
【００１４】
本発明の識別に用いられるＲＡＰＤ法(Random Amplified Polymorphic DNA method)はＤＮＡの解析手法の１つであり、複数のプライマーを用いてPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)を行うと、用いたプライマーと同一または類似の配列に挟まれたＤＮＡの領域が増幅され、その増幅されたＤＮＡのパターンを電気泳動で解析する方法である。また、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(ＣＴＡＢ：Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)は長鎖アルキル基をもつ第４級アンモニウム塩基であり、核酸のようなポリアニオンと不溶性の複合体を形成するために核酸の単離に利用することができる。
【００１５】
【発明の実施の態様】
本発明は甘味成分含量、甘味成分含有比の優れた品種を創造し、その特徴を維持するためにＲＡＰＤ法で遺伝子を識別することにより他系統、他品種のステビア植物と区別し、それらより甘味質の優れた甘味料を得ることである。
【００１６】
ＤＮＡ塩基配列を特定する手段はＣＴＡＢにより植物体からゲノムＤＮＡを単離し、リボ核酸(ＲＮＡ)を除去し、プライマーミックスを用いてＰＣＲ法により得られたＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動法によって得られるＤＮＡフィンガープリントの違いにより区別する。
【００１７】
選択的に沈殿させたゲノムＤＮＡを雛型とし、プライマーとしてＡ０６(塩基配列；ＡＣＴＧＧＣＣＧＡＧＧＧ) とＡ４８(塩基配列；ＣＣＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡ)のセットおよび rＴａｑ(ＴＡＫＡＲＡ)を用いて９４度(３０秒)、５５度(３０秒)、７２度(６０秒)で３５サイクル反応を行った後、７２度で１０分間反応させる。その後、ＰＣＲ増幅産物をアガロース電気泳動法によって確認し、特定のＤＮＡバンドを確認した植物体、またはその乾燥葉から水、または含水有機溶媒にて抽出し、次いで抽出液をそのまま濃縮するか、または必要に応じて陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂でイオン性不純物を除去し、吸着樹脂に甘味成分を吸着させ親水性溶媒でして溶離液を濃縮、乾燥して甘味料が得られる。甘味料の製造方法はその他脱色等の慣用精製手段を適宣施すことが出来る。得られた甘味料は他の甘味料、希釈剤等を加える事が出来、さらに再結晶により高純度レバウデイオサイドＡおよび酵素処理ステビア甘味料の原料とすることも出来る。
【００１８】
レバウディオサイドＡを比較的高含有する品種の育種過程
育種はレバウディオサイドＡを比較的高含有する品種のかけ合わせ選抜にて行い、まず、レバウディオサイドＡを高含有するＳＦ５−１、ＳＦ５−２(特願平９−１６５３１号記載)を人工的に交配し、得られた種子の苗を耐病性をも調査すべくセプトリア菌、アルタナリア菌の発生が顕著な圃場に移植する。セプトリア菌、アルタナリア菌に抵抗性を有する品種を選抜し、その甘味成分を分析し、ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡを３倍以上含み、甘味含有量が高く、比較的耐病性に優れた品種ＴＤ−１を選抜した。さらに、甘味成分含量、甘味成分比率、生育状況を再度確認し、ＴＤ−１の遺伝子を検索した。
【００１９】
【実施例】
以下に、育種過程およびその特性等を具体的に記載する。本発明は本育種過程、栽培方法に限定されるものでない。
実施例１
レバウディオサイドＡを比較的高含有する品種のかけ合わせで得られた種子より、１９９５年にレバウディオサイドＡを含有するＳＦ−１、ＳＦ５−２品種(特願平９−１６５３１号記載)を新見工場内ビニールハウス内で人工的にかけ合わせ、得られた種子を９６年３月に新見工場内のビニールハウスに播種、発芽した苗を育苗ポットに移植し、５月上旬に苗丈８cm程度以上の苗６００本を長年ステビア栽培を行いセプトリア菌、アルタナリア菌の発生が顕著な工場内圃場に１０アール当たり窒素、燐、カリの肥料成分各２０kgを施肥し２週間に移植した。
７月上旬に追肥として１０アール当たり窒素、燐、カリの肥料成分各１０kgを追肥した。
【００２０】
上記の病原菌に対する抵抗性を目視により９月上旬に調査し、生育が良く耐病性を有する株を選抜し、その甘味成分を分析し、ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡを３倍以上含み、その含有量が多い株を選抜し、電照下で各５０本挿し木した。９７年４月中旬にそれらより萌芽した芽を２００本挿し木した。５月上旬に同様に工場内圃場に植え付け７月末に耐病性、生育を再度調査し、甘味成分比、含量が優れている事を確認しＴＤ−１品種とした。
【００２１】
ＴＤ−１、ＳＴおよびＳＮの比較試験１
比較のために、９７年４月中旬にステビオサイドを主甘味成分とするステビア品種(ＳＴ)、ステビオサイドを主甘味成分とし、レバウデイオサイドＡを副甘味成分とするステビア品種(ＳＮ)各４０本も同様に挿し木し、同様に工場内圃場に植え付けた。
【００２２】
上記の５月上旬に圃場に移植した挿し木により増殖させた品種ＴＤ―１の苗２００本と、品種ＳＴ、ＳＮ苗各４０本のうち、６月下旬に任意に選んだ各品種１０本中での発病の有無を調査した後、ＴＤ−１を地上から１５ｃｍで刈り取り、ＳＴ、ＳＮの各品種は２０本を地上部から刈り取り後、葉部を分離し、乾燥後分析試料とした。
【００２３】
分析結果は次のとおりであった。
【表１】
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【００２４】
ＴＤ−１、ＳＴおよびＳＮの比較試験２
７月上旬に追肥を行い、９月上旬に各品種１区画２０株を選択しセプトリア菌、アルタナリア菌の発病状況を調査した後、各品種を地上部から刈り取った後、葉部を分離し、乾燥後分析試料とした。
【００２５】
分析結果次のとおりであった。
【表２】
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【００２６】
品種ＴＤ−１は枯れ葉の発病割合は比較的低く、甘味成分含量、乾燥葉収量も他品種より優れていた。品種ＳＴはセプトリア菌により下葉の４節までの部分で既に葉の１／２程度がセプトリア菌により発病した葉が多数あり黄色く変色しており、最下部の葉は枯葉になっていた。品種ＳＮはセプトリア菌により下葉の３節までの部分で既に葉の１／２程度がセプトリア菌による黄変が見られ、地上より１節の葉は枯れ葉となっていた。
【００２７】
９８年３月にＴＤ−１から萌芽した穂先を２００本挿し木し、４月下旬に圃場に移植し、５月末、６月末、７月末、８月末、９月末、１０月末に地上部を刈り取り、葉のみを分離した後、乾燥し、甘味成分含量を測定した。
甘味成分の測定は高速液体クロマトグラフィ−により行った。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
ＴＤ一１は生育期間により甘味成分含量、甘味成分比が異なり、生育期間が長くなるにつれて甘味成分含量が増え、一方、ステビオサイド含量が減少する傾向が見られた。開花時期の１０月末には甘味成分含量の減少がみられる。
【００３０】
遺伝子塩基配列の特定
甘味成分含量、甘味成分比、収量からＴＤ−１が最も優れていたことから、ＴＤ−１を識別すべくそのＤＮＡ塩基配列を決定した。
【００３１】
乾熱滅菌した乳鉢にＴＤ−１の葉を約１グラム入れ、液体窒素を加えて完全にすりつぶし、１５ｍｌのチューブに粉砕した植物組織を移した。５ｍｌの２％ＣＴＡＢ溶液(２％ＣＴＡＢ溶液(５０ｍｌ)：組成１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２.５ｍｌ、０.５Ｍ  ＥＤＴＡ  １.０ｍｌ、２％  ＣＴＡＢ  ０.５ｇ、４Ｍ  ＮａＣｌ  ４.１ｇ)を加え、転倒混和した後、３０分間６５℃でウォターバスにて加温し、５ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコール(２４:１)を加え、５分間穏やかに攪拌する。８０００ｒｐｍで３０分遠心した後、２層に分かれた内容物の上層の水層を新しいチューブに移す。
【００３２】
加温後の上記操作をもう一度繰り返し、水層を新しいチューブに移す。７ｍｌの１％ＣＴＡＢ溶液(１％ＣＴＡＢ溶液(５０ｍｌ)：組成１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２.５ｍｌ、０.５Ｍ  ＥＤＴＡ  １.０ｍｌ、１％  ＣＴＡＢ  ０.５ｇ)を加え、転倒混和後、１時間室温で静置し、８０００ｒｐｍで１５分間遠心を行う。
【００３３】
上清を捨てて、１ｍｌの１ＭＣｓＣＬ(１Ｍ  ＣｓＣｌ溶液(５０ｍｌ)：組成ＣｓＣｌ  ８.４ｇ)を加え、沈殿を完全に溶かす。２.５倍量の１００％エタノールを加え、転倒混和後、−２０℃で２０分以上静置し、エタノール沈殿を行う。上清を捨て、沈殿を真空乾燥機で風乾し、１００ｍｌの超純水に溶解する。溶液をアガロースゲル電気泳動でＤＮＡが単離されていることを確認した。
【００３４】
ＲＮＡを除去する為にＲＮａｓｅ溶液５００μｌ(組成：上記ＤＮＡ単離溶液１００μl、ＲＮａｓｅ(５ｇ／ｍｌ)  ５μｌ)で３７℃にて１時間反応させ、反応液にＰＣＩ溶液(組成：フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、２５：２４：１を穏やかに混合した後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、水層を分離した溶液)を等量加える。蓋をして穏やかに混合した後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心した。
【００３５】
水層(上層)を新しいマイクロチューブに移し、室温で保存していたＣＩＡ溶液(組成：クロロホルム／イソアミルアルコール、容量比２４：１)を等量加え、穏やかに混合した後、１５０００ｒｐｍで３分間遠心し、水層を新しいマイクロチューブに移し、もう一度ＣＩＡ処理を行い、得られた上清の１／１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２.５倍量の１００％エタノールを加え、よく混ぜた後、−２０゜Ｃで３０分間冷却し、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心し、ＤＮＡをペレットにし、上清を捨て、ペレットに冷却しておいた７０％エタノールを１ｍｌを加えた後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を捨て、もう一度冷却した７０％エタノールを１ｍｌ加えた後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を捨て、減圧デシケーターを用いて５分間乾燥させた。
【００３６】
得られたゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ用組成物(表４)にて、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃６０秒を３５サイクル反応を行った後、７２℃で１０分間反応させる。反応後、４℃に保ちＰＣＲ増幅産物を得た。ＰＣＲ増幅産物を１％アガロースゲル電気でＤＮＡバンドを確認すると、図１の▲４▼が示すように、およそ２３００および９００ｂｐに特徴的なＤＮＡ断片が確認できた。
【００３７】
【表４】
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【００３８】
比較遺伝子塩基配列の特定
同様にステビオサイドを主成分とする品種(ＳＴ)、ステビオサイドを主成分としレバウディオサイドＡを副成分とする品種(ＳＮ)を上記と同様に処理したＤＮＡバンドを図１の▲２▼、▲３▼に示す。
【００３９】
ＴＤ―１はおよそ２３００、および９００ｂｐに特徴的な塩基配列を有するＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で検出することによって、他の品種と容易に区別することが出来る。
【００４０】
実施例２
甘味料の製造
９月末にＴＤ−１の乾燥葉２０ｇを２０倍量の水で甘味が感じられなくなるまで数回抽出し、抽出液を陽イオン交換樹脂(アンバーライトＩＲ−１２０Ｂ)２０mlを充填したカラムおよび陰イオン交換樹脂(デュオライトＡ−４)２０mlを充填したカラムに通液し、通過液を吸着樹脂(ダイヤイオンＨＰ−２０)１００mlを充填したカラムに通して甘味成分を吸着させ、十分水洗後メタノール３００mlで溶離する。溶離液を減圧下に濃縮し、乾燥して淡黄白色の粉末を得た。比較のためにＳＮからも同様の処理をして甘味成分を得、これを分析した。
【００４１】
分析方法        高速液体クロマトグラフィー法
使用カラム      リクロソルブＮＨ２  ５μ  ４mm(直径)×２５０mm
流速            １.５ml／分
展開溶媒        アセトニトリル：水＝８２：１８
測定波長        ２１０ｎｍ
【００４２】
表５に抽出精製物の分析結果を示す。表中のＳＴはステビオサイド、ＲＡはレバウディオサイドＡである。
【表５】
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【００４３】
官能試験
実施例２で得られた淡黄色の粉末の各０.１％溶液を調製し、ステビア甘味料の味質に精通したパネラ−１０人により苦み、渋み、甘味質を比較した。
苦み    ＴＤ−１＜ＳＮ
渋み    ＴＤ−１＜ＳＮ
甘味質  ＴＤ−１＞ＳＮ
各試料においてＴＤ−１は苦み、渋みが他の試料より改善されており、甘味質において優れていた。
【００４４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ＴＤ−１、ＳＴおよびＳＮのＤＮＡ塩基配列の電気泳動図である。
【符号の説明】
▲１▼・・１００bpＤＮＡLadderマーカー  ▲２▼・・ＳＴ品種  ▲３▼・・ＳＮ品種
▲４▼・・ＴＤ−１品種  ▲５▼・・λ−Ｈind III digestマーカー
【図１】
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