(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
小腸膜の粘膜下組織由来の機械的及び化学的に清浄化された処理済み腸コラーゲン層であって、無細胞性テロペプチドコラーゲン約９３乾燥重量％、糖タンパク、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、脂質、非−コラーゲンタンパク、及びＤＡＮ及びＲＮＡのような核酸約５乾燥重量％以下で、細胞及び細胞破片を含んでいない処理済み組織材料からできた層が２層以上に重ねられ、該層が化学的に結合されてなる生物工学的移植補綴であって、哺乳動物患者に移植された場合に、適当な生きている細胞置換を引き起こして、制御された生物分解を行い元の移植補綴が、患者の生きている細胞によって改造作用を受けることを特徴とする生物工学的移植補綴の調製方法であって、
（ａ）処理済み組織層を水和処理した上で２層以上積層し；
（ｂ）次いで、前記組織層を脱水し、層を一緒に粘着させ；
（ｃ）次いで、前記組織層を再水和した後、架橋剤を使って架橋させ、層を一緒に結合させ；
（ｄ）この後、前記組織層を洗浄して、架橋剤を除去する；
ことを特徴とする該方法。
【請求項２】
架橋剤が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩であることを特徴とする請求項１記載の生物工学的移植補綴の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、組織工学の分野に属する。この発明は、動物由来の清浄な組織物質から調整した生物工学的移植補綴に関する。この発明の生物工学的移植補綴は、細胞の和合性、強度、及び処理を施した組織基質の細胞学的再改造作用  を保存する方法を使って調整されている。生物工学的移植補綴は、インプラント、修復に用いられ、もしくは哺乳動物宿主に用いられるものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
組織工学の分野は、工学の手法を生命科学の原理に合体させて、正常及び異常な哺乳動物組織における構造と機能の関係を理解するものである。組織工学の目指すところは、組織機能の修復、維持、改善のために生物物質の開発と最終的な使用を行うことである。
【０００３】
コラーゲンは、体の基本的な構造タンパクで、体タンパク全体の約１／３を占めている。それは、皮膚、腱、骨、及び歯の有機物質の殆どを構成し、その他の体構造の繊維性包含物として存在している。コラーゲンの特徴のいくつかに、その高い張力強度：その低い抗原性、これは螺旋構造によってタンパクの抗原決定因子をマスキングするせいである：そしてその低い伸長性、半浸透性、及び溶解性が挙げられる。さらに、コラーゲンは細胞癒着のための天然物質である。これらの特徴及びその他の特徴は、コラーゲンをして組織工学に用いる適当な材料、及び移植用生物物質や生物再改造用  補綴の製造に用いる適当な材料となさしめている。
【０００４】
外移植された哺乳動物組織からコラーゲン組織、及び組織構造物を得る方法、組織から補綴を改造作用する工程は、外科的修復、もしくは組織や器官の置換に用いるために広く研究がなされてきている。成功裏に哺乳動物の組織の置換もしくは修復に用いる事ができる補綴を開発することは、研究者のとどまる事のない目標である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
腸粘膜下組織のような生物由来コラーゲン材料は、組織修復もしくは置換に用いるために多くの研究者達によって提唱されてきている。生物補綴物に用いるラミナートを形成するのに用いる事ができる腸コラーゲン（ＩＣＬ）の単一、無細胞層を生み出す、近似のブタ空腸の機械的かつ化学的処理の方法は、開示されている。天然コラーゲン構造を維持しながら、処理は細胞と細胞破片を除去する。結果得られた処理済み組織基質のシートは、望ましい特異性を有する多層ラミネート改造作用物の製造に用いられている。血管移植体としてチューブ状にしたＩＣＬを用いるのと同様に、我々は柔組織修復に用いるラミネート状パッチの効果を研究している。この材料は、最小限の癒着を生み出す一方で必要とされる物理的支持体を提供し、周りを取囲む天然の組織の中に融和し、宿主の細胞に浸透していくことができる。生体内において、再改造作用は機械的な完全無欠さを妥協することはない。弾力、縫合保持、及びＵＴＳのようなインプラントの本質的かつ機能的特性は、重要なパラメータである。そのパラメータは、ＩＣＬ層の数や架橋条件を変化させる事によって、特異な要求に対する処理を施される。
【０００６】
【発明の実施の形態】
この発明は、哺乳動物宿主へ移植された場合に、機能修復、増大、もしくは体の部位や組織構造物の置換として作用する事ができ、それに相伴って宿主の細胞による再改造作用を引き起こして生物退化を制御する事になる組織工学的補綴を目的としている。この発明の補綴は、組織置換として用いた場合には二つの特性を有する；一つには、体の一部の代用物として機能し、二つ目には、体の一部の代用物として機能しながら宿主細胞の内に成長するためのテンプレートを再改造作用するものとして作用する。このことを行うために、この発明の補綴材料は、それ自体もしくは他の処理済み組織基質と結合して患者に移植する補綴を形成できる、コラーゲン性組織から開発した、哺乳動物由来の処置済み組織基質である。
【０００７】
この発明は、清浄な組織材料から組織工学的な処置を施された補綴を作る方法を目的とするもので、その方法は、補綴の生物改造作用性を維持しながら、層を結合させるのに、粘着剤、縫合、もしくはステーブルを必要としないのである。
【０００８】
”処置を施された（処理済み）組織基質”及び”処置を施された（処理済み）材料”とは、動物、好ましくは哺乳動物、由来で、機械的に付属組織をきれいにし、細胞、細胞性破片を化学的にきれいにし、非−コラーゲン性細胞外基質成分を含んでいない天然の清浄な細胞性組織を意味する。処理済み組織基質は、非−コラーゲン性成分を含んではいないが、天然の基質構造、強度、形状の多くを維持している。生物工学的処置を施されたこの発明の移植片を調製するのに用いる好ましい組成物は、コラーゲンからなる動物組織である。コラーゲン性組織基質からなる、腸、靭帯、心嚢、硬膜、及び他の平面もしくは平らな構造をした組織を（これらに限定されるものではない）、コラーゲン性組織源は含んでいる。これらの組織基質の構造故に、この発明の生物工学的移植片を調整するという点において、これら組織基質を容易にきれいにし、操作し、そして組み立てることができるのである。同様の平面構造と基質組成を有するその他の適当な資源は、この発明にしたがって、その他の動物資源を使って、その分野の通常の知識を有する者によって、検証され、調達され、処置される場合がある。
【０００９】
この発明の生物工学的移植片を調製するのに用いるさらに好ましい組成物は、小腸膜の粘膜下組織由来の腸コラーゲン層である。小腸の適当な資源は、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ヤギ、ウマのような哺乳動物の器官であり、ブタの小腸が好ましい資源である。
【００１０】
この発明の補綴を調製するのにもっとも好ましい組成物は、ブタ小腸膜の粘膜下組織由来の処理済み腸コラーゲン層である。処理済みＩＣＬを得るには、ブタの小腸を採取し、付属腸間膜組織を大まかに腸から切開する。粘膜下組織を好ましくは小腸のその他の層から、相対するローラーの間で腸の原材料を機械的に圧搾することによって取り分け、もしくは薄く剥がし、筋肉層（筋層）と粘膜（粘膜）を除去する。小腸の粘膜下組織は、それを取り囲む組織よりも堅く、硬直しているので、ローラーは、粘膜下組織からより柔らかい成分を圧搾することになる。以下の例では、ブタ小腸からＢｉｔｔｅｒｌｉｎｇ  腸清浄マシーンを用いて粘膜下組織を機械的に採取し、次に化学的にきれいにしてきれいな組織基質を得ることになる。この機械的、化学的にきれいになった腸コラーゲン層をここでは、”ＩＣＬ”とする。
【００１１】
処理済みＩＣＬは、本質的には無細胞性テロペプチドコラーゲン約９３乾燥重量％、糖タンパク、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、脂質、非−コラーゲンタンパク、及びＤＡＮ及びＲＮＡのような核酸約５乾燥重量％以下で、細胞及び細胞破片を含んでいないものである。処理済みＩＣＬは、その基質構造及びその強度の殆どを保持している。重要なことは、コラーゲンの生物改造性に悪影響を及ぼす洗剤残滓と結合することのない清浄化工程によって、組織の生物改造作用性を幾分か残しているということである。それに加えて、コラーゲン分子は、組織が酵素を使った処理を清浄化工程の間に受けていないので、そのテロペプチド領域を残している。
【００１２】
補綴装置の処理済み組織層は、ＩＣＬの２層以上の層のような同様のコラーゲン材料由来である場合、もしくは一層以上のＩＣＬ層と一層以上の大腿筋膜層のような相異なるコラーゲン材料から作られる場合がある。
【００１３】
処理済み組織基質は、生物工学的移植片補綴を製造するのに先立って、物理的および化学的に処置もしくは改質される場合がある。整形、伸張と緩和によるコンディショニング、清浄化済み組織基質の目打ちのような物理的改質が、成長因子、選択された細胞外基質成分、遺伝物質、及び処置を施され、修復され、もしくは置換される体の部分の生物改造作用性と修復に影響を及ぼすことになるその他の薬剤との結合のような化学的改質が同様に実施される場合がある。
【００１４】
ＩＣＬが、この発明の生物工学的移植片補綴の製造に用いる好ましい出発物質であるので、以下に述べる方法は、ＩＣＬからなる生物工学的移植片補綴を製造するのに用いる好ましい方法である。
【００１５】
もっとも好ましい具体例では、ブタ小腸の粘膜下組織をこの発明の生物学的移植片補綴に用いる出発物質として使用する。ブタの小腸を採取し、その付属組織を除去し、次に脂肪、筋肉、粘膜層を粘膜下組織から、機械作用と水を使う洗浄の組み合わせによって強制的に除去する腸清浄マシーンを使って機械的にきれいにする。機械的作用を、ローラーの間を元のままの腸が通る際に、圧縮し、かつ粘膜下組織から連続する層を剥ぎ取る一連のローラーとして記述することができる。小腸の粘膜下組織は、それを取り囲む組織よりも比較的堅く、硬直しているので、ローラーは粘膜下組織からより柔らかい成分を圧搾する。機械的清浄化の結果、腸の粘膜下組織層だけが残るのである。
【００１６】
機械的清浄化の後、好ましくは室温で無菌条件下で化学的清浄化処置を行い、細胞及び基質成分を除去する。小腸を内腔に沿って縦方向に切り、次に長さ約１５ｃｍの断片に切る。材料を計量し、腸材料に対し１００：１（ｖ／ｖ）の溶液の割合で容器の中に入れる。国際ＰＣＴ出願  ＷＯ９８／４９９６９で開示されている方法のような、もっとも好ましい化学的清浄化処置においては、その開示はここに組み込まれているが、コラーゲン組織をアルカリ性条件下、好ましくは水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加して、エチレンジアミンテトラ酢酸テトラナトリウム塩（ＥＤＴＡ）のようなキレート剤に接触させ、次に塩を含有する酸、好ましくは塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含有する塩酸（ＨＣｌ）、に接触させる。さらに、１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）／１０ｍＭリン酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）のような緩衝化塩溶液に接触させ、最終的に水で洗浄する。
【００１７】
各々の処置段階を、回転もしくは振トウ台を使って遂行するのが好ましい。洗浄後，ＩＣＬを各容器から取り出して、ＩＣＬをゆっくりと過剰な水を使って圧搾する。この時点で、ＩＣＬはを−８０℃で凍結保存する場合があり、４℃で殺菌リン酸塩緩衝液の中で、もしくは補綴の製造に用いるまで乾燥して保存する場合がある。乾燥して保存する場合には、ＩＣＬのシートを平らな皿のような表面、好ましくは多孔性皿もしくはポリカーボネイト性膜のような膜の上に平らにし、材料の外内腔側面（ａｂｌｕｍｉｎａｌ）からリンパ管のたれはしをメスを用いて除去し、室温と通常の湿度でＩＣＬシートを層流フードの中で乾燥させる。
【００１８】
ＩＣＬは、その意図される用途による形状を有する補綴として用いることになる様々な構築物の型を製造するのに用いられる平らなシート構造物である。この発明の補綴を作るためには、処理済み基質材料の生物改造作用性を残すだけではなく、置換組織として取り扱われた際にその強度と構造特性を維持もできるという方法を用い、シートを製造しなければならない。処理済み組織基質シートを層状にして、その他のシートに接触させる。接触面積は、層が接触する結合面積である。結合面積は、移植の間、初期治癒相の間、臨床で取り扱われている間に、患者の細胞が密になり、補綴を生物改造して新しい組織を形成するまで体の置換部分として機能しながら、縫合と伸張に逆らうことができなければならない。
【００１９】
好ましい具体例において、この発明の補綴装置は、一緒に結合する二つ以上の重なったコラーゲン層を有している。ここで用いる”結合コラーゲン層”は、同一もしくは合い異なった二層以上のコラーゲン材料からなったものを意味し、そのコラーゲン材料は、層を互いに重ね、自己−積層と化学的結合によって十分に一緒にするような方法で処置を施されている。
【００２０】
例えば、ＩＣＬの多層構築物を用いて、体壁構造物を修復する。また、例えば心膜パッチ、血管パッチ、膀胱壁パッチ、もしくはヘルニア修復装置として用いられる場合、過度に動き得る、もしくは下垂した器官を支持するつるし装置として用いられる場合もある。さらに、組織膨張と増加に用いるために、平ら、巻いた、もしくは折りたたんだ状態でインプラントされる場合もある。たくさんのＩＣＬ層が、大きさもしくは強度の指標に用いる構築物に組み込まれる場合がある。移植の前に、層をさらに処理して、もしくはコラーゲン、または他の細胞外基質成分、ヒアルロン酸、ヘパリン、成長因子、ペプチド、もしくは培養した細胞を使って被膜を施す場合もある。
【００２１】
この発明の好ましい具体例は、患者の細胞が生物改造作用を行いうる移植可能生物材料として使用する、結合及び架橋した二層以上のＩＣＬ層からなる平板なシート状補綴、及び平板なシート状補綴の製造法と使用法を目的とする。ＩＣＬの平板なシート状構造の故に、補綴は容易に層のいかなる数からもなるものを、好ましくは２〜１０層、さらに好ましくは２〜６層、構築物の最終的に意図する用途に必要な強度と大きさに従う層の数で製造できる。ＩＣＬは特定ではない同じ方向に走る構造基質繊維を有している。層状にした場合、処理済み組織層における一般的な組織繊維の方向の影響で、層の方向を換える場合がある。シートは、繊維方向が平行もしくは別々の角度にあるように層状にされる場合がある。また、層は重ねられて、補綴の表面を横切って連続する層を有する構築物を作る場合がある。それとは別に、重ねられた配置の究極の大きさが、腸という境界線でもって限られているので、層を切り絵のように互い違いにして配置して、出発物質の直径よりも大きな表面積を有するが補綴の表面を横切る連続的な層がないシート状構築物を作る場合もある。複合体の特徴を導入して、例えば、導管、層の間を走るもしくは層を横断する導管もしくは溝のネットワークを作る場合がある。
【００２２】
ＩＣＬからなる多層構築物の製造において、殺菌ＩＣＬ材料を使って出発する場合には構築物の殺菌性を維持するために、無菌環境と殺菌機器を用いるのが好ましい。ＩＣＬの多層構築物を作るには、ポリカーボネイトの硬いシートのような堅固な第一殺菌支持体を、層流キャビネットの殺菌面に敷く。ＩＣＬシートが、機械的及び化学的清浄化工程からまだ水和段階にない場合には、水もしくはリン酸緩衝塩水のような水溶液を使って水和する。ＩＣｌシートを殺菌吸収性布を使って水を吸い取り、材料から過剰な水分を除去する。今だ終了していない場合には、ＩＣＬ材料は、漿膜表面上にあるリンパ管の垂れ下がりを外内腔側面から整えられる。整えられたＩＣＬの第一シートを、ポリカーボネイト製シートの上に敷き、手でポリカーボネイト製シートに撫で付け、空気の泡立ちや折り目及びヒダを取り除く。第二の整えられたＩＣＬシートを第一のシートの上に敷き、再度、手で空気の泡立ち、折り目、及びヒダを取り除く。特別な使用に呈する望ましい層の数が得られるまで、好ましくは２〜１０層、これを繰り返す。
【００２３】
ＩＣＬは、その本来の管という状態に由来する面を持つという特性を有している：本来の状態では腸の内腔に面した粘膜表面と外内腔（ａｂｌｕｍｅｎ）に面した反対側の外部漿膜表面である。これらの表面が、補綴の手術後の成果に影響を与えるが、装置の成果を強める力を与えることができる。現状では合成装置の使用で、癒着形成は装置を取り囲む組織からの癒着を解除するために再度の手術の必要が不可欠である場合がある。二層のＩＣＬを有する、心膜パッチもしくはヘルニア修復補綴の形成においては、粘膜表面が移植後の手術後癒着を食い止める能力を有することを示しているので、二層の結合表面が漿膜表面の間にあるのが望ましい。その他の具体例においては、ＩＣＬパッチの一つの表面が非−癒着性で、もう一つの表面が宿主組織へ癒着する親和性を有するということが望ましい。この場合には、補綴は粘膜表面一つとその他に漿膜表面を有することになる。もう一つの具体例では、相対する表面が癒着を生み出すことができ、共にどちらかの側で表面と接触する組織を増殖させるので、補綴が構築物の両側上に漿膜表面を有するということが望ましい。移植した場合に、二つの外部シートが潜在的に他の体の構造物と接触するので、構築物が二つ以上からなる場合は、内部の層の方向は、手術後の癒着形成の一因とはなりそうにないので、重要性が少ない。
【００２４】
望む数のＩＣＬシートを層状にした後、脱水を行ってＩＣＬシートを一緒に結合させる。理論に拘束されるのを望みはしないが、脱水は、基質の繊維の間から水分が除去された場合に、層の中にあるコラーゲン繊維のような細胞外基質成分を一緒にするのである。層は、第一指示体の上で、もしくは第一支持体とポリカーボネイト製の第二シートのような第二支持体との間で何も覆いをしないで脱水される場合がある。その第二支持体は、乾燥前にＩＣＬの頂上部層の上に置かれ、第一支持体に留められて、少しの圧力をかけて、もしくは圧力をかけないで、全ての層を平板で平らな配置にしておく。脱水を促進するために、支持体は多孔性のものである場合があり、空気と水分が脱水されている層を通りぬける。層は、大気下、真空下、もしくはアセトン、もしくはエチルアルコールやイソプロピルアルコールのようなアルコールによって化学的に脱水される場合がある。脱水は、約１０〜２０％Ｒｈ、もしくはそれ以下の室内湿度：もしくは約１０〜２０％、もしくはそれ以下の湿気にまで脱水される。脱水は、ポリカーボネイト製シートを支えるフレームを折り曲げ、ＩＣＬ層を空気乾燥器の噴出し口に、室内温度約２０℃の常態湿度下において１〜２４時間さらすことによって容易になされる。
【００２５】
これまでに求めた望ましい具体化方法では、必要とはされていないが、脱水したＩＣＬ層を互いに結合する前に脱水する。脱水したＩＣＬ層は、多孔性支持体を剥がし、再水和の薬剤、望ましくは水で再水和する。この場合、脱水したＩＣＬ層を、分離や積層剥離が起こらないように再水和するために再水和薬剤を含む容器の中に、温度４〜２０℃で少なくとも１０〜１５分間浸す方法を採る。
【００２６】
再水和し結合しているＩＣＬ層は、架橋薬剤、望ましくはＩＣＬ基質の生物改造作用性を保持できる化学架橋薬剤に接触させて、相互架橋を施す。上記に述べたように、脱水によりＩＣＬ層に付随する細胞外基質成分は共に結合する結果となる。そして、これらのＩＣＬ層を架橋させると、細胞外基質成分を化学的に結合し、ＩＣＬ層を結合させることにつながる。結合した補綴を架橋すると、強度及び耐久性も増加し、操作性（取り扱い性）が向上する。架橋に使用される薬剤については、学会では様々なタイプのものが知られている。例えば、リボースや他の糖類、酸化剤や脱水温熱法（ＤＨＴ）等が使用される場合がある。望ましい架橋用薬剤に、１−エチル−３（３−ジメチルアミノピロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）がある。もう一つの望ましい方法として、上記のＥＤＣ架橋剤にスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドを添加する方法がある。これは、Ｓｔａｒｏｓ  Ｊ．Ｖ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１、３９５０−３９５５、１９８２に記述されている。化学的架橋剤以外には、フィブリンをベースとした接着剤、もしくはポリウレタン、ビニルアセテート、ポリエポキシのような医療用接着剤によって結合できる場合がある。もっとも望ましい方法においては、ＥＤＣを約０．１〜１００ｍＭ、さらに好ましくは約１．０〜１０ｍＭ、もっとも好ましくは約１．０ｍＭ水に溶解する。水に加えて、リン酸緩衝塩水もしくは（２−［Ｎ−モルフォリノ］エタンズルホン酸）（ＭＥＳ）を使って、ＥＤＣを溶解する場合がある。他の薬剤が添加される場合もある。例えば、アセトン、もしくはアルコールを９９％ｖ／ｖまで、ごく普通には５０％ｖ／ｖ水に加えて、架橋をより均質かつ効率的にしている。これらの薬剤は、ＩＣＬ層から水を除去し、基質繊維を結合させて、繊維間の架橋を増進させる。架橋に使用される薬剤の水分中濃度は、架橋を制御するために使用される。ＥＤＣを、架橋のために溶解する場合には、使用直前に添加される。なぜならば、ＥＤＣは、一定の時間を経過すると活性がなくなるからである。架橋薬剤ＩＣＬに加えるには、まず脱水し、結合したＩＣＬを浅い皿状の容器に移し、架橋薬剤を静かにその容器に注入する。このとき、ＩＣＬ層が両面ともに薬剤に浸って、自由に浮いた常態であること、またＩＣＬ構築物の層の中、もしくは下部に空気泡が入っていないことを確実にすることが必要である。この容器はフタをされ、ＩＣＬ層は、約４〜２４時間、より好ましくは約８〜１６時間かけて、温度約４〜２０℃の状態で架橋されていく。架橋は温度により制御できる。温度が低ければ、架橋は効率的に行われる。なぜならば、ＥＤＣの反作用が鈍いからである。温度が高くなると、ＥＤＣが安定性を失うので、架橋の効率性は低下する。
【００２７】
架橋の後、架橋に用いた薬剤を静かに抜き取り、処分する。そして、構築物は容器中で残留架橋薬剤を除去するために、洗浄剤を用いて容器の中で洗浄する。望ましい洗浄剤は、水であり、もしくは他の水性溶液である。望ましくは、十分な洗浄とは、化学的に結合された構築物を、一回の洗浄につき５分間、同量の殺菌した水を使用して３回行うことによって達成される。メスと定規を使用して、構築物を必要とされる大きさに調整する。有用な大きさは、６インチ四方の正方形（約１５．２×１５．２ｃｍ）である。しかしながら、患者に移植するためには、どのような大きさにして使用しても差し支えない。
【００２８】
構築物は、医療機器による殺菌という分野でよく知られている方法で、最終的に無菌化される。無菌化の方法で望ましいものは、構築物を十分な量の１０Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を使って中和した０．１％の無菌過酢酸（ＰＡ）に接触させることである。この方法は、米国特許第５，４６０，９６２号によるものであり、その内容はパテント中に公開されている。汚染除去は、１Ｌ  Ｎａｌｇｅ容器のような容器を振トウ器の台の上に載せ、その中で約１８±２時間かけて行われる。その次に、構築物は、殺菌水を使って、一回あたり１０分間計３回接触により洗浄される。
【００２９】
他に薦められる無菌化方法は、ガンマ線照射によるものである。構築物は、ガンマ線照射用素材から作られたバッグに詰められて、真空計数装置を使用して密封される。次に、これを２５．０から３５．０ｋＧｙのガンマ線照射のための密封バッグに入れる。ガンマ線照射は、顕著に、しかし害することなく、ヤングの弾性率、弾性極度値、収縮温度を低下させる。構築物の機能上の特性は、ガンマ線照射後も、その利用上何ら問題なく十分である。ガンマ線照射は、移植用医療物分野で広く利用されていることから、殺菌のための望ましい方法である。
【００３０】
他の望ましい具体化例の中では、ＩＣＬが細胞質修復や置換のための構造物に作りかえられた後、ＩＣＬ結合層及び培養細胞からなる細胞質を移植する場合がある。細胞構築物は、それが修復したり置換しようとする器官に似せて形成されることができる。
【００３１】
細胞培養は、哺乳動物の細胞を分離したもの、もしくは移植用に取り出したものを元にして成立する。初期の培養がなされると、それらはマスター・セル・バンクに凍結保存される。そこから解凍し、培養し、二次培養して細胞数を拡大する。細胞を含まないＩＣＬ構築物に細胞を植え付けるために、ＩＣＬ構築物を培養皿もしくはフラスコに入れ、懸濁細胞を含む培地に浸す。コラーゲンは、細胞を結合するための天然物質であるから、細胞はＩＣＬ構築物に結合し、構築物に中に増殖していく。
【００３２】
この発明で使用される望ましい細胞のタイプは、生物の間充組織から得られる。より望ましい細胞のタイプは、線維芽細胞、間質細胞や他の細胞を支える結合組織細胞、もしくはヒトの皮膚の線維芽細胞である。ヒト線維芽細胞種は異化の多くの組織から得られる。それには、新生児男子の包皮、真皮、腱、肺、ヘソの緒、軟骨組織、尿道角膜基質、口腔粘膜、及び腸があるが、これらに限られるわけではない。ヒト細胞には、以下のものがあるが、それらに限られるわけではない、すなわち、線維芽細胞、平滑筋細胞、軟骨、及び他の間充組織から由来する結合組織細胞である。細胞構築物の生産で使用する基質生産細胞は、この発明による培養方法の適用によりその細胞が似たり真似たりできる細胞を起源とする細胞とすべきであることは、望ましいことであるが、必ずしも必要ではない。例えば、多層シート構築物は、線維芽細胞と共に培養され、生きた結合組織構築物を形成する。同様に、筋芽細胞は、骨格筋構築物を形成する。一つのＩＣＬ構築物に移植できる細胞のタイプは複数ある。例えば、尿細管ＩＣＬ構築物は、最初に平滑筋細胞を培養し、次に構築物の内腔は管内皮細胞を第二のタイプの細胞として培養し、形成され、細胞からなる尿細管代替物となるのである。同様に、膀胱壁パッチ補綴は、平滑筋細胞を第一の細胞として、そして膀胱細胞を第二の細胞タイプとして用いたＩＣＬ多層シート構築物の上に形成される。細胞ドナーは、発育状況及び年齢によって異なる。胚、新生児組織、もしくは年をとった成人から細胞を採取できる。間葉幹細胞のような胚の先祖細胞をこの発明に用いたり、望ましい組織へと発育するように分化を誘発させるのに用いたりする場合がある。
【００３３】
この発明でヒトの細胞を使用するのが好ましいのであるが、この発明の方法で使用される細胞はヒト由来の細胞に限定されるものではない。ウマ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びマウスを含む、これらに限られるものではないが、他の哺乳動物由来の細胞を用いる場合がある。加えて、自然な、化学的な、もしくはウィルスのトランスフェクションによって遺伝子工学的に操作された細胞もまた、この発明で用いる場合がある。一つ以上の細胞型、正常な及び遺伝子を改質した、もしくはトランスフェクションされた細胞の混合物を組み入れた、これらの具体例を用いる場合があり、２種以上の細胞もしくは組織資源の混合物を用いる場合もあり、その両方を用いる場合もある。
【００３４】
組換え体もしくは遺伝子工学的に操作された細胞を、細胞基質構築物の製造に用いて、天然細胞生成物のレベルを上げたり、治療を用いる処置を必要としている患者に用いる薬剤送達移植片として作用する組織構築物を作り出す場合がある。細胞は、移植片組換え体細胞生成物を通して、患者に連続する時間、もしくは患者に存在する病状のせいで生物学的に、化学的に、もしくは熱にシグナルがでた場合に必要とされる時間、成長因子、ホルモン、ペプチド、もしくはタンパクを生産し、患者に送達する場合がある。細胞は、遺伝子工学的に操作され、細胞外基質成分の異型もしくはタンパクを発現する場合がある。それらは”正常”であるが、高レベルで発現、もしくは細胞がい基質からなる移植片装置、及び傷の癒しの改善に有用な生きている細胞、もしくは新生血管形成を促進もまたは目的とする生きている細胞を作るように改質されている。これらの工程は、通常その分野では知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）に記述されており、ここでは参照に組み入れられている。上述の細胞型全てを、結合ＩＣＬ層から作られた無細胞性構築物に由来する細胞性組織構築物の製造に用いるこの発明で使用する場合がある。
【００３５】
体の一部の代用物として機能する、この発明の補綴は、平板、管状、もしくは複雑な幾何学的なものである場合がある。形作られた補綴の形状は、その意図される用途によって決められることになる。このように、この発明の補綴の結合層を作る場合に、ヒナ型もしくはプレート支持体は、希望する形状にあうように作られる。平板な多層補綴はインプラントされて、病気にかかったもしくは損傷を受けた、腹壁、心嚢、ヘルニアのような器官、及び他の様々な器官、そして骨、骨膜、軟骨膜、椎骨間盤、関節軟骨、真皮、腸、靭帯、及び腱を含む構造物、これらに限定されることはないが、の修復、増量、もしくは置換を行うことができる。加えて、平板な多層補綴を、血管もしくは心臓内パッチとして、もしくは心臓弁の置換物として用いることができる。
【００３６】
平板なシートを、例えば器官支持体として用い、下垂もしくは動き回る器官を、膀胱や子宮のような器官に用いる吊り具としてシートを用いることによって支持する場合もある。管状補綴を、例えば脈管構造、食道、気管、腸、及びＦａｌｌｏｐｉａｎ管のような管状器官断面の置換に用いる場合がある。これらの器官は、外部表面と内部表面と有する基本的な管形状をしている。加えて、平板なシートと管状構造物を一緒にして、心臓や静脈の弁を置換もしくは増大させる複雑な構造物を作ることもできる。
【００３７】
この発明の生物工学的操作を加えられた移植片補綴を用いて、損傷を受けた、もしくは宿主組織の中ではずれた体構造物を修復、もしくは置換する場合がある。体の一部の置換物もしくは支持物として機能するが、補綴は宿主細胞の内部に成長するものに用いる生物改造作用性基質骨格として機能する。”生物改造作用性”は、ここでは宿主細胞及び酵素の力で、インプラントされた補綴の基質成分の置換、再形成が、生分解とほぼ同等の速度で宿主細胞の内部成長によって行われて、構造コラーゲン、血管新生、及び細胞の再集団化を生み出すことを意味している。移植片補綴は、宿主によって全て、あるいは、ほぼ全部の、宿主組織へと改造作用を施されるが、その構造特性を保持し、組織の類似物として機能し、修復もしくは置換を行う。
【００３８】
ＹｏｕｎｇのＭｏｄｕｌｕｓ（ＭＰａ）を、緊迫と緊張の間の直線状比例定数として定義している。Ｕｌｔｉｍａｔｅ  Ｔｅｎｓｉｌｅ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ（Ｎ／ｍｍ）は、補綴を横切る強度の測定値である。これらの特性双方は、補綴におけるＩＣＬ層の数の関数である。負荷を生み出す、もしくは支持装置として用いる場合、当初の治癒相と全体の改造作用の間、物理的活性の厳密さに逆らうことができなければならない。
【００３９】
結合面積の積層板強度を、ピール検査を使って測定する。インプラント手術の直後、物理的緊迫条件下で層の積層が壊れないことが重要である。動物実験では、移植された材料に、何も積層が壊れた事実はなかった。インプラントの前、１ｍＭ  ＥＤＣ架橋多層構築物の二つの相対する層の間の粘着強度は約８．１±２．１Ｎ／ｍｍであった。
【００４０】
Ｓｈｉｎｋ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）は、基質の架橋程度の指標である。Ｓｈｒｉｎｋ温度が高くなれば、材料の架橋は多くなる。非−架橋、ガンマ線照射ＩＣＬは、約６０．５±１．０のＳｈｒｉｎｋ温度を有している。好ましい具体例では、５０％アセトンに溶かした１〜約１００ｍＭ  ＥＤＣ中で架橋された装置に用いるＥＤＣ架橋補綴は、それぞれ約６４．０±０．２〜７２．５±１．１℃のＳｈｒｉｎｋ温度を有するのが好ましい。
【００４１】
機械的特性には機械的完全性が含まれ、補綴は生物改造作用の間に起きるヒズミに抵抗を示し、それに加えて柔軟かつ縫い合わせ可能なものである。”柔軟”という単語は、臨床で使用する際に求められる簡便さのための優れた取り扱い特性ということを意味している。
【００４２】
”縫い合わせ可能”という単語は、層の機械的特性が、天然の組織の一部に補綴を縫合した際に、針と縫合材を補綴材料に通らせることができる縫合保留力を含んでいるということを意味している。縫合の間、補綴は、縫合によって補綴に加えられる張力の結果として剥がれることがあってはならず、また縫合が終了した際に剥がれることがあってもならない。補綴の縫合性、即ち縫合の間における剥がれへの耐性能力、は補綴材料本来の機械的強度、移植片の厚さ、縫合にかかる緊張、結び目を引っ張って閉じる速さに関係している。１００ｍＭ  ＥＤＣと５０％アセトンの中で高度に架橋した平らな６層補綴の縫合保持は、約６．７±１．６Ｎである。水に溶かした１ｍＭ  ＥＤＣの中で架橋した２層補綴の縫合保持は、約３．７±０．５Ｎである。縫合時の外科医師の力が約１．８Ｎであるので、架橋平板２層補綴の好ましい低縫合保持強度は、約２Ｎである。
【００４３】
ここで用いる、”非−ヒズミ”という単語は、補綴の生物機械的特性が耐久性を与え、それで補綴がインプラント後に通常の限界を超えて、伸びたり、広がったり、もしくは膨張したりしないということを意味している。以下に記述するように、この発明のインプラント補綴の全伸張は、受容でき得る限界内に収まっている。この発明の補綴は、インプラント後の細胞性生物改造作用の機能として伸張に対する耐性を獲得する。生分解と改造作用からのインプラント材料の機械的強度の減少よりも早い速度で宿主細胞が構造コラーゲンを置換するのである。
【００４４】
本発明の処理済み組織材料は、層状にされ、結合されてあるとしても、”半−浸透性”である。半−浸透性は、改造作用のため、もしくは薬剤や生物改造作用性、細胞内部増殖、癒着阻止もしくは促進、または血流に影響を及ぼす成分の移し変えのために、宿主細胞の内部への成長を可能にする。補綴の”非−多孔性”特徴は、補綴移植によって保持するように意図される液体の通過を阻止する。逆にいえば、孔もしくはミシン目を入れることが補綴の使用の際に求められる場合には、補綴に孔を作る場合がある。
【００４５】
この発明の補綴の機械的完全性は、積層を損なうことなく、もしくは構築物の端をほつれさせることなく、きれいな端を得るのに補綴を切ったり、整えたりできるのと同様に、それにヒダを取ったり、それを折りたたんだりできるということでもある。
【００４６】
以下の例は、本発明の実施をよく説明するもので、本発明の範囲をどのような方法でも限定することを了解するものではない。その組成、形状、及び厚さに関する装置デザインは、構築物の最終的な指示にしたがって選択されることになるということを、認識することになる。この分野の通常の知識を有する者は、ここに記述された方法に対して、本発明の真意と範囲を逸脱することなく、様々な改質を行うことができるということを認識することになる。
【００４７】
【実施例】
実施例Ｉ：機械的に清浄化を施したブタ小腸の化学的清浄化
ブタの小腸を採取し、機械の作用と水を使うことの組み合わせで強制的に脂肪、筋肉、粘膜層を粘膜下組織から除去するＢｉｔｔｅｒｌｉｎｇ  腸清浄マシーン（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）を使って、機械的に剥ぐ。機械的作用は、元の腸がローラーの間を通る際に、圧搾し、粘膜下組織から連続する層を剥ぎ取る一連のローラーとして記述することができる。小腸の粘膜下組織は、それを取り囲んでいる組織よりも比較的硬く、堅固であるので、ローラーは粘膜下組織から柔らかい成分を圧搾する。機械による清浄化の結果、腸の粘膜下層だけが残ることになる。
【００４８】
この工程の残り、Ａｂｒａｈａｍ等への国際ＰＣＴ出願  ＷＯ  ９８／４９９６９に従った化学的清浄化、を無菌条件下、室温で行う。化学溶液は、全て室温で用いる。腸を内腔に沿って縦に切り、１５ｃｍの断片に切る。材料を計量し、腸材料に対し溶液約１００：１ｖ／ｖの割合で容器の中に入れる。
【００４９】
Ａ．  腸を入れた各容器に、０．２２μｍ（ミクロン）のフィルターで殺菌した１００ｍＭエチレンジアミン４酢酸４ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）／１０ｍＭ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液、約１Ｌを添加する。次に、容器を約２００ｒｐｍで約１８時間振トウテーブルに置く。振トウ後、ＥＤＴＡ／ＮａＯＨ溶液を各容器から除去する。
【００５０】
Ｂ．  各容器に、０．２２μｍフィルター殺菌１Ｍ塩酸（ＨＣｌ）／１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）塩の溶液約１Ｌを添加する。容器を振トウテーブルに置き、約６〜８時間約２００ｒｐｍで振トウする。振トウ後、ＨＣｌ／ＮａＣｌ溶液を、各容器から除去する。
【００５１】
Ｃ．  各容器に、０．２２μｍフィルター殺菌１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）／１０ｍＭリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）溶液約１Ｌを添加する。容器を振トウテーブルに置き、２００ｒｐｍで約１８時間振トウする。振トウ後、ＮａＣｌ／ＰＢＳ溶液を各容器から除去する。
【００５２】
Ｄ．  各容器に、０．２２μｍフィルター殺菌１０ｍＭ  ＰＢＳ約１Ｌを添加する。容器を振トウテーブルに置き、２００ｒｐｍで約２時間振トウする。振トウ後，リン酸緩衝塩水を各容器から除去する。
【００５３】
Ｅ．  最後に、各容器に０．２２μｍフィルター殺菌水約１Ｌを添加する。容器を振トウテーブルに置き、２００ｒｐｍで約１時間振トウする。振トウ後、水を各容器から除去する。
【００５４】
処理済みＩＣＬ試料を切断し、組織学的分析に用いるのに固定する。ヘモトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）とＭａｓｓｏｎのトリクロム染色を、コントロールと処理済み組織双方の断面と側面試料双方に行う。処理済みＩＣＬ試料は、未処理コントロール試料が通常、期待どうりに非常に細胞性であると見えるのに対し、細胞と細胞破片がなくなったかに見える。
【００５５】
実施例２：コラーゲン組織の他の清浄化処理の比較研究
コラーゲン生組織を消毒及び殺菌するのに用いる他の方法は、Ｋｅｍｐへの米国特許第５，４６０，９６２号に記述されており、それを国際ＰＣＴ出願  ＷＯ９８／２２１５８にＣｏｏｋ等によって記述された類似方法と比較した。Ｋｅｍｐから、非−緩衝過酢酸法に加えて例１，２及び３が行われた。
【００５６】
小腸を、４匹の大きなブタから採取した。腸を調達し、外部の腸間膜層を剥ぎ、腸に水をほとばしりさせる。
【００５７】
研究では、７種類の条件を用いた：条件Ａは、Ｃｏｏｋ等、国際ＰＣＴ出願  ＷＯ  ９８／２２１５８の例１の開示に従って行った。条件ＢはＡのバリーションで、開示された化学的処理を行う前に、腸材料を機械的に洗浄する。条件Ｃ，Ｄ及びＥは、Ｋｅｍｐへの米国特許第５，４６０，９６２の例１，２及び３の方法に従って行われる。全ての条件では、材料に対して１０対１の割合の溶液を用いる、これは組織材料１００ｇを溶液１Ｌで処理するということである。
【００５８】
Ａ．４種の腸各々に由来する材料を、５％エタノールに溶かした０．２％過酢酸溶液（ｐＨ２．５６）１Ｌを加えた別々のビン（ｎ＝５）に入れ、振トウ台上で攪拌する。２時間の攪拌の後、条件Ａは、Ｂｉｔｔｅｒｌｉｎｇ  腸清浄マシーンで機械的にきれいにした。
【００５９】
他の６種の条件ＢからＧでは、化学的処理に先立ってＢｉｔｔｅｒｌｉｎｇ  腸清浄マシーンを使って腸をきれいにした。機械できれいにした後、４種の腸に由来する典型的な断片を、化学処理に用いる溶液を入れたビンの中に入れる。ビンを台の上で１８±２時間振トウする。残りの６種の条件、ＢからＧは以下の通りである：
Ｂ．５％エタノールに溶かした０．２％過酢酸溶液１Ｌ（ｐＨ２．５６）（ｎ＝５）
Ｃ．リン酸緩衝塩水に溶かした０．１％過酢酸溶液１Ｌ（ｐＨ７．２）（ｎ＝３）
Ｄ．１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）と０．１％過酢酸溶液１Ｌ（ｐＨ７．２）（ｎ＝３）
Ｅ．０．１過酢酸と１Ｍ  ＮａＣｌの溶液１Ｌ（ｐＨ２．９）（ｎ＝３）
Ｆ．上記実施例１に記述した”化学清浄化”溶液１Ｌ（ｎ＝４）
Ｇ．脱ウオン水に溶かし、ｐＨ７．０に緩衝化した０．１％過酢酸溶液１Ｌ（ｎ＝２）
化学的及び機械的処理の後、全ての条件を濾過殺菌精製水で４回洗浄する。機械的及び化学的に処理を施された材料を、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンを使って大まかに染色し、細胞破片を検証する。形態学的評価には、ヘマトキシリン及びエオシン、Ｍａｓｓｏｎのトリクローム、及びアリザリンレッド  染色技法がある。様々な処理から得られた形態学的結果は、化学的処理の後Ｂｉｔｔｅｒｌｉｎｇ上で粘膜層を除去することが難しい条件Ａの方法が、材料を生み出すということを示している。材料は、Ｂｉｔｔｅｒｌｉｎｇを余計に約１０〜１２回通っていかなければならなかった。材料は一見して非常に膨潤し、材料の表面上及び血管系においてかなり大量の細胞夾雑物を有した。条件Ｂの方法も、非常に膨れており、材料の表面上及び脈管構造の中に著しく多量の細胞破片を見せた。条件ＣとＤの方法は、脈管構造中に最少の細胞破片を有する膨れていない材料を生み出した。条件Ｅは、僅かに膨らんで、脈管構造中に最少の細胞破片を含んだ材料を生み出した。
【００６０】
ＤＮＡ／ＲＮＡ単離キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、清浄化済み組織に含まれる残留ＤＮＡ／ＲＮＡを定量した。その結果を、表１にまとめる。
【００６１】
【表１】
0004606583.tif 000002
【００６２】
形態学的分析は、ＤＮＡ／ＲＮＡの定量に相関し、条件ＡとＢの清浄化法が、高度に細胞性のままで、結果として残留ＤＮＡを含有しているコラーゲン性組織基質となったということを示している。Ｋｅｍｐの清浄化法は、コラーゲン組織基質から細胞と細胞破片を除去するのに、さらにもっと有効である。最後に、Ａｂｒａｈａｍ等への国際ＰＣＴ出願  ＷＯ  ９８／４９９６９の中で記述され、上記実施例１で概略した、条件Ｆの化学的清浄化法は、全ての細胞と細胞破片及びそのＤＮＡ／ＲＮＡをこれらの方法で検出できないレベルにまで除去する。
【００６３】
実施例３：多層ＩＣＬ構築物の製造方法
実施例１に従って処理を施されたＩＣＬを用いて、２層のＩＣＬを有する多層構築物を作る。多孔性ポリカーボネイトシート（孔の大きさ、生産者）を層流キャビネットの殺菌面に敷く。殺菌ＴＥＸＷＩＰＥＳ（ＬＹＭ−ＴＥＣＨ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃｈｉｃｏｐｅｃ  ＭＡ）を使って、材料のＩＣＬの水分を吸い取る。ＩＣＬ材料を整えて、リンパ管の垂れ下がりを外内腔（ａｂｌｕｍｉｎａｌ）側面からとり、長さ約６インチ（約１５．２ｃｍ）の断片にする。整えたＩＣＬの第一シートを、ポリカーボネイト製シートの上に粘膜側を下にして載せ、手を使って空気の泡、折り目、及びヒダを取り除く。整えたＩＣＬの第二シートを、第二シートの外内腔側面を第一シートの外内腔側面に接触させて、第一シートの頂上部に面してもしくは外内腔側面に面して載せ、再度手を使って空気の泡、折り目、及びヒダを取り除く。ＩＣＬ層を載せたポリカーボネイトシートの角度を上げて、ＩＣＬ層を層流キャビネットの噴出し気流と向かい合わせにする。層を、キャビネット中で約１８±２時間、約２０℃の室温で乾燥させる。次に、層を分離もしくは剥離することなく、乾燥させたＩＣＬ層からポリカーボネイトシートを剥がしとり、室温の水浴に移し、約１５分間層を水和させる。
【００６４】
時間と共にＥＤＣがその活性をなくすので，１００ｍＭ  ＥＤＣ／５０％アセトンからなる化学架橋溶液を、架橋直前に調製する。次に、水和した層を浅い皿に移し、層が覆われ、かつ自由に浮いているのを確認、気泡が構築物の下もしくは内部に存在しないことを確認ながら架橋剤を静かに皿に入れる。皿を覆い、約１８±２時間煙霧となって発散する状況（ｆｕｍｅ  ｈｏｏｄ）にしておく。架橋溶液を捨て、処理する。構築物を、皿の中で殺菌水で３回、各々約５分間洗浄する。メスと定規を用いて、望ましい大きさに整える。
【００６５】
米国特許第５，４６０，９６２号に従って、構築物を、水酸化ナトリウム１０Ｎ  ＮａＯＨで中和した殺菌０．１％過酢酸（ＰＡ）処理で汚染除去を行う。その開示は、ここに組み込まれている。振トウ台の上に載せた１Ｌ  Ｎａｌｇｅ容器のなかで、構築物に約１８±２時間汚染除去を行う。次に、構築物を３倍量の殺菌水で１０分間洗浄し、ＰＡ活性をＭｉｎｎｃａｒｅ  ｓｔｒｉｐ検査でモニターして、構築物からＰＡが除去されていることを確認する。
【００６６】
次に、構築物を真空密封装置を使ってプラスティック製バッグに包装する。このプラスティック製バッグを、２５．０から３５．０ｋＧｙのガンマ線照射に用いる密封バッグの中に順次入れていく。
【００６７】
実施例４：多層ＩＣＬ構築物を用いるインプラント研究
ニュージーランド白ウサギを用いて生体内分析を行った。全ての工程はＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＡＣＵＣ）のガイドラインに従って行った。約２インチの全厚の欠損を、各動物の直腸部腹筋に作り、次に６層パッチ補綴を用いて修復を行った。パッチを、インプラント後３０，６６，９９，及び１８０日で取り除いた。各時点で３匹のウサギをト殺し、ヘルニア、腫れ、幹線もしくは癒着の有無を検証した。外植したパッチをホルマリンで固定し、ヘマトキシリンとエオシン、アリザリンレッドで染色して、細胞浸潤、炎症反応、及びカルシウム沈着の形態学的評価を行った。いくつかのケースでは、単軸ＭＴＳ分析を使って固定していないパッチを評価して、機械的特徴にインプラントの影響を見た。
【００６８】
全ての動物は、腹壁の修復部位に、腫れ、ヘルニアもしくは炎症をおこさないで、穏やかな手術後経過を経ていた。外植の時点で、パッチの内部表面を、体壁腹膜につながっているように見えるぎらつく組織層で覆う。外植３０日後の一匹の動物に、外植された腹部の内臓へのグレード１の癒着がみられ、それは、インプラントそれ自体よりもぬしろ縫合線に関連しているように見えた。パッチの腹膜表面の新生血管形成は、どの時点でも観察された。
【００６９】
３０日以内に、パッチの腹部表面は中皮で覆われた。異体の反応の典型である炎症細胞は、外植片に存在したが、パッチの周辺部ではもっと行き渡っていた。炎症細胞は、主にマクロファージと多核巨大細胞、それより少ないリンパ細胞、異好性及び線維芽細胞からなる。インプラント６６日後、その形態は類似していたが、炎症細胞は少なくなっていた。加えて、パッチは天然の腹壁細胞の中に組み込まれ始めていた。９９及び１８０日目、宿主線維芽細胞の浸透が、ヘマトキシリンとエオシン染色とＭａｓｓｏｎ  トリクロム染色によって明らかになった。カルシウムに用いるアリザリンレッド染色は、パッチ剤にカルシウム沈着が見られないことを明らかにした。カルシウム沈着の小さな点面積が、縫合剤に関係してあった。
【００７０】
機械的検査を外植時に行い、構築物の最終的な緊張強度（ＵＴＳ）を決めた。短くいえば、組織を構築物の端から周辺組織約１インチを残して切り取る。次に、構築物の反対側末端にある周辺組織をつかんで、ＴｅｓｔＳｔａｒ−ＳＸソフトウェアを装備した自動水力ＭＴＳ検査システムを用いて、単軸に伸張させて０．０１３ｓ-1の恒常的引張り速度で切れるまで引っ張った。次に、ＵＴＳはをピークの力から算出した。検査標本の組織領域内に引き起こされた切れ全ては、構築物が周辺組織と同じ、もしくはそれより強い位であると示しており、周辺組織の中によく吸収され、ヘルニア修復パッチとしてのその役目に充分な強度を維持しているということを示していた。
【００７１】
機械的特性と宿主組織への優れた吸収性の可能性との組み合わせは、ＩＣＬをして柔組織修復に用いる有望な材料となさしめている。これらの研究は、癒着の形成が最少で、パッチにカルシウム沈着の兆候がなかったということを示している。機械的特性に関する予備的分析は、このコラーゲン構築物が周辺組織への改造作用と吸収の間に必要とされる強度を維持することができるということを示している。改造作用を行うというパッチのこの効能は、周辺組織への吸収がよくなされない補綴材料に好都合である。
【００７２】
実施例５：機械的検査法及び足そうＩＣＬ補綴の特長
ガンマ線照射を用いる実施例３の方法によって作られた多層ＩＣＬパッチ構築物の好ましい具体例を検証した。５０％アセトンに溶かした１００ｍＭ  ＥＤＣ（１００／５０）を使って架橋したＩＣＬの２，４及び６層からなる構築物、及び水に溶かした７ｍＭ  ＥＤＣ／９０％アセトンｖ／ｖ（７／９０）と水に溶かした１ｍＭ  ＥＤＣ（１／０）を使って架橋した６層構築物を、多くの測定法に沿って評価した。その結果を表２にまとめる。
【００７３】
引張りに対する切れの検査は、ＴｅｓｔＳｔａｒ−ＳＸソフトウェアを装備した自動水力ＭＴＳ検査システムを用いて行った。幅１．２５ｃｍの細片を、０．０１３ｓ−１の恒常的引張り速度で単軸方向に切れるまで引張った。直線領域の傾斜（ＥＹ）と最終的引張り強度（ＵＴＳ）を、組織引っ張り曲線から算出した。
【００７４】
粘着剤を検査するのに用いる標準的な技法（ＡＳＴＭ  Ｄ１８７６−９５）を使って、層の間の粘着強度を検査した。粘着強度は、積層したＩＣＬの２層を、０．５ｃｍ／秒の恒常的速度で剥がし分けるのに必要とされる平均的な力のことである。
【００７５】
別のスキャンカロリー計を用いて、熱を制御した条件下で、試料から、及び試料への熱の流れを測定した。収縮温度を、温度−エネルギープロットにおける変性ピークの開始温度として求めた。縫合保持は、１００ｍＭ  ＥＤＣと５０％アセトンの中で架橋した２もしくは４層構築物に関しては行わなかった。というのは、１ｍＭ  ＥＤＣとアセトンなしの中で架橋した（架橋が少ない）２層構築物の縫合保持（３．７Ｎ±０．５Ｎ）が、２Ｎ  最少規格を大幅に越えているからである。ＩＣＬ層間の積層強度と収縮温度は、構築物における層の数というよりもむしろ、架橋密度、アセトンの添加に依存している。
【００７６】
【表２】
0004606583.tif 000003
【００７７】
前述の発明は、理解と明確化のために図と実施例という方法によって詳しく記述されてきているが、この分野の通常の知識を有する者にとっては、ある種の改質及び変更が添付クレームの範囲内で行う場合があるということは明らかである。