(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＩＩＩ）：
【化２】
0004658807.tif 000023
（式中、Ｒ１は水酸基の保護基、Ｘは脱離基を示す。）
で表される２−デオキシ−２−フルオロアラビノース誘導体を加水分解して式（ＩＶ）：
【化３】
0004658807.tif 000024
（式中、Ｒ１は前記定義のとおりである。）
で表されるα−１−ヒドロキシル体を立体選択的に得、式（ＩＶ）の化合物をリン酸化して式（Ｖ）：
【化４】
0004658807.tif 000025
（式中、Ｒ１は前記定義のとおりであり、Ｒ２は水素原子又はリン酸残基の保護基を示す。）
で表されるα−１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシド誘導体とし、次いで水酸基及び／又はリン酸残基の保護基を脱保護することを特徴とする、式（Ｉ）：
【化５】
0004658807.tif 000026
で表されるα−１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシドの立体選択的な製造法。
【請求項２】
式（ＩＩＩ）：
【化６】
0004658807.tif 000027
（式中、Ｒ１は水酸基の保護基、Ｘは脱離基を示す。）
で表される２−デオキシ−２−フルオロアラビノース誘導体を強酸塩存在下、リン酸化して、式（Ｖ）：
【化７】
0004658807.tif 000028
（式中、Ｒ１は前記定義のとおりであり、Ｒ２は水素原子又はリン酸残基の保護基を示す。）
で表される１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシド誘導体のαβ体混合物を得、次いで水酸基及び／又はリン酸残基の保護基を脱保護することを特徴とする、式（Ｖ’）：
【化８】
0004658807.tif 000029
で表される１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシドのαβ体混合物の製造法。
【請求項３】
ハロゲンイオン又は硝酸イオンを発生する強酸塩を使用する請求項２記載の製造法。
【請求項４】
請求項１記載の製造法により製造された式（Ｉ）：
【化９】
0004658807.tif 000030
で表されるα−１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシド又は請求項２記載の製造法により製造された式（Ｖ’）：
【化１０】
0004658807.tif 000031
で表される１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシドのαβ体混合物、及び塩基に、ヌクレオシドホスホリラーゼを作用させることを特徴とする、式（ＩＩ）：
【化１１】
0004658807.tif 000032
（式中、Ｂは塩基を示す。）
で表される２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオシドの製造法。
【請求項５】
塩基が、プリン塩基、又はハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノオキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基及びシアノ基から選ばれる置換基を有するプリン塩基である請求項４記載の製造法。
【請求項６】
ヌクレオシドホスホリラーゼがプリンヌクレオシドホスホリラーゼである請求項４又は５記載の製造法。
【請求項７】
請求項１記載の製造法により製造された式（Ｉ）：
【化１２】
0004658807.tif 000033
で表されるα−１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシド又は請求項２記載の製造法により製造された式（Ｖ’）
【化１３】
0004658807.tif 000034
で表される１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシドのαβ体混合物、及び２−アミノ−６−置換プリンに、ヌクレオシドホスホリラーゼを作用させ、式（ＶＩ）：
【化１４】
0004658807.tif 000035
（式中、Ｙは置換基を示す。）
で表される２−アミノ−６−置換−９−（２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノシル）プリンを得、これを加水分解酵素で処理することを特徴とする、式（ＶＩＩ）：
【化１５】
0004658807.tif 000036
で表される９−（２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノシル）グアニンの製造法。
【請求項８】
２−アミノ−６−置換プリンが２，６−ジアミノプリンである請求項７記載の製造法。
【請求項９】
加水分解酵素がデアミナーゼである請求項７又は８記載の製造法。
【請求項１０】
請求項１記載の製造法により製造された式（Ｉ）：
【化１６】
0004658807.tif 000037
で表されるα−１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシド又は請求項２記載の製造法により製造された式（Ｖ’）
【化１７】
0004658807.tif 000038
で表される１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシドのαβ体混合物、及びグアノシン５’−モノリン酸に、ヌクレオシドホスホリラーゼとヌクレオシダーゼを作用させることを特徴とする、式（ＶＩＩ）：
【化１８】
0004658807.tif 000039
で表される９−（２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノシル）グアニンの製造法。
【請求項１１】
ヌクレオシドホスホリラーゼがプリンヌクレオシドホスホリラーゼである請求項１０記載の製造法。
【請求項１２】
ヌクレオシダーゼがイノシン酸ヌクレオシダーゼである請求項１０又は１１記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、α−１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシド及びこれを鍵中間体とする２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオシドの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】  近年、２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオシド（２’Ｆ−ＡＮＡ）を構成成分とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、その生物的活性のために大いに注目されている（特許文献１及び非特許文献１、２）。【０００３】  ２’Ｆ−ＡＮＡは既知化合物であり、その化学的合成法も既に報告されている（特許文献２、非特許文献３、４）。具体的には、２’Ｆ−ＡＮＡを天然のヌクレオシドから誘導することは困難であるため、１−ハロゲン化糖誘導体と核酸塩基との置換反応（縮合反応）により合成されている。しかし、反応液中にはβ体の他にα体が混在し、高純度な２’Ｆ−ＡＮＡを得るには煩雑なカラムクロマトグラフィーなどの精製処理を必要とした。【０００４】  その中でも、２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノピリミジンヌクレオシドは、比較的容易に合成可能であるものの、２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノプリンヌクレオシドについては、反応液中に複雑な異性体（α体、β体、７位体、９位体など）が混在するため、効率的な合成法は未だ確立されていないのが現状である。【０００５】  上記化学合成法の欠点を克服する手段の１つとして、酵素合成法が提案されている。例えば、２−デオキシリボースの１位リン酸化糖の異性化反応の平衡を傾かせてα−１−リン酸化糖誘導体を合成し、引き続きヌクレオシドホスホリラーゼを用いて目的とするヌクレオシドを製造することができる（特許文献３）。【０００６】  しかしながら、本発明者らの知見によると、１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシドは比較的安定であり、α体とβ体の平衡を一方向へ傾けることは難しく、２’Ｆ−ＡＮＡの製造に上記酵素法を適用することは困難である。【０００７】  一方、２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノピリミジンヌクレオシドとプリン塩基からヌクレオシドホスホリラーゼを用いて２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノプリンヌクレオシドを酵素合成する方法も報告されている（特許文献４）。
【特許文献１】国際公開第９９／６７３７８号パンフレット
【特許文献２】特公平７−２３３９５号公報
【特許文献３】特開２００２−２０５９９６号公報
【特許文献４】特開昭６３−２５８８９１号公報
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１，３４５７（２００２）．
【非特許文献２】Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１２，２６５１，（２００２）．
【非特許文献３】Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５０，３６４４（１９８５）．
【非特許文献４】Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５３，８５（１９８８）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  しかしながら、上記酵素法は、（ｉ）化学的に合成した高価な２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノピリミジンヌクレオシドを原料として用いていること、（ｉｉ）目的物の２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノプリンヌクレオシドの合成収率が極めて悪いこと（対塩基収率は１５％未満）、（ｉｉｉ）２種類のヌクレオシドホスホリラーゼを使用する必要があることなど、必ずしも満足できる方法ではなかった。尚、上記方法の低収率の要因としては、ヌクレオシドホスホリラーゼを用いた２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノピリミジンヌクレオシドの加リン酸分解反応効率の低さが考えられる。
従って、本発明の目的は、高収率かつ立体選択的な合成が困難であった２’Ｆ−ＡＮＡ、特に２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノプリンヌクレオシドを簡便、かつ高立体選択的に高収率で製造する方法を提供することにある。とりわけ、本発明の目的は、従来合成が極めて困難であった９−（２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノシル）グアニンを工業的スケールで、簡便かつ高純度に製造できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  本発明者らは、かかる実情に鑑み鋭意検討を重ねた結果、（ｉ）１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシドは、意外にも水溶液中で安定であり、そのα体はヌクレオシドホスホリラーゼの基質として充分利用可能であること、（ｉｉ）式（ＩＩＩ）で表される２−デオキシ−２−フルオロアラビノース誘導体を加水分解、リン酸化することにより、α−１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシドが立体選択的に得られること、（ｉｉｉ）式（ＩＩＩ）で表される化合物を強塩基存在下にリン酸化することにより、ヌクレオシドホスホリラーゼの基質とならないβ−１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシドよりも基質となるα体の生成比率の高いαβ体混合物が得られること、（ｉｖ）原料として、２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノピリミジンヌクレオシドではなく、１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシド（α体又はαβ体混合物）を用いることにより、２種類のヌクレオシドホスホリラーゼを使用せずに、２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオシドが高収率で得られることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】  すなわち、本発明は、式（Ｉ）：【００１１】
【化１】
0004658807.tif 000002
【００１２】で表されるα−１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシド又はその塩を提供する。【００１３】  また本発明は、式（ＩＩＩ）：【００１４】
【化２】
0004658807.tif 000003
【００１５】（式中、Ｒ１は水酸基の保護基、Ｘは脱離基を示す。）
で表される２−デオキシ−２−フルオロアラビノース誘導体を加水分解して式（ＩＶ）：【００１６】
【化３】
0004658807.tif 000004
【００１７】（式中、Ｒ１は前記定義のとおりである。）
で表されるα−１−ヒドロキシル体を立体選択的に得、式（ＩＶ）の化合物をリン酸化して式（Ｖ）：【００１８】
【化４】
0004658807.tif 000005
【００１９】（式中、Ｒ１は前記定義のとおりであり、Ｒ２は水素原子又はリン酸残基の保護基を示す。）
で表されるα−１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシド誘導体とし、次いで水酸基及び／又はリン酸残基の保護基を脱保護することを特徴とする、式（Ｉ）：【００２０】
【化５】
0004658807.tif 000006
【００２１】で表されるα−１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシドの立体選択的な製造法を提供する。【００２２】  また本発明は、式（ＩＩＩ）：【００２３】
【化６】
0004658807.tif 000007
【００２４】（式中、Ｒ１は水酸基の保護基、Ｘは脱離基を示す。）
で表される２−デオキシ−２−フルオロアラビノース誘導体を強酸塩存在下、リン酸化して、式（Ｖ）：【００２５】
【化７】
0004658807.tif 000008
【００２６】（式中、Ｒ１は前記定義のとおりであり、Ｒ２は水素原子又はリン酸残基の保護基を示す。）
で表される１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシド誘導体のαβ体混合物を得、次いで水酸基及び／又はリン酸残基の保護基を脱保護することを特徴とする、式（Ｖ’）：【００２７】
【化８】
0004658807.tif 000009
【００２８】で表される１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシドのαβ体混合物の製造法を提供する。【００２９】  また本発明は、式（Ｉ）：【００３０】
【化９】
0004658807.tif 000010
【００３１】で表されるα−１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシド又は式（Ｖ’）：【００３２】
【化１０】
0004658807.tif 000011
【００３３】で表される１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシドのαβ体混合物、及び塩基に、ヌクレオシドホスホリラーゼを作用させることを特徴とする、式（ＩＩ）：【００３４】
【化１１】
0004658807.tif 000012
【００３５】（式中、Ｂは塩基を示す。）
で表される２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオシドの製造法を提供する。【００３６】  また本発明は、式（Ｉ）：【００３７】
【化１２】
0004658807.tif 000013
【００３８】で表されるα−１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシド又は式（Ｖ’）：【００３９】
【化１３】
0004658807.tif 000014
【００４０】で表される１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシドのαβ体混合物、及び２−アミノ−６−置換プリンに、ヌクレオシドホスホリラーゼを作用させ、式（ＶＩ）：【００４１】
【化１４】
0004658807.tif 000015
【００４２】（式中、Ｙは置換基を示す。）
で表される２−アミノ−６−置換−９−（２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノシル）プリンを得、これを加水分解酵素で処理することを特徴とする、式（ＶＩＩ）：【００４３】
【化１５】
0004658807.tif 000016
【００４４】で表される９−（２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノシル）グアニンの製造法を提供する。【００４５】  更に本発明は、式（Ｉ）：【００４６】
【化１６】
0004658807.tif 000017
【００４７】で表されるα−１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシド又は式（Ｖ’）：【００４８】
【化１７】
0004658807.tif 000018
【００４９】で表される１−リン酸化２−デオキシ−２−フルオロアラビノシドのαβ体混合物、及びグアノシン５’−モノリン酸に、ヌクレオシドホスホリラーゼとヌクレオシダーゼを作用させることを特徴とする、式（ＶＩＩ）：【００５０】
【化１８】
0004658807.tif 000019
【００５１】で表される９−（２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノシル）グアニンの製造法を提供する。
【発明の効果】
【００５２】  本発明によれば、従来高収率かつ立体選択的な合成が困難であった２’Ｆ−ＡＮＡ、特に２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノプリンヌクレオシドを簡便、かつ高立体選択的に高収率で製造できる。とりわけ、本発明によれば、従来合成が極めて困難であった９−（２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノシル）グアニンを工業的スケールで、簡便、かつ高立体選択的に高収率で製造できる。
従って、本発明のα−１−リン酸２−デオキシ−２−フルオロアラビノシド又はその塩、及びこれを鍵中間体とする本発明の製造法は、アンチセンス医薬の工業的製造に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】  式（Ｉ）で表される化合物、すなわち化合物（Ｉ）の塩としては、特に制限されるものでなく、例えばアルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）；アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等）；有機塩基塩（例えばトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩等）、アンモニウム塩等が挙げられ、ナトリウム塩が好ましい。【００５４】  以下に、化合物（Ｉ）の代表的な製造法を説明する。【００５５】合成法１（α体）：
化合物（ＩＩＩ）の１位を加水分解して化合物（ＩＶ）のα体を立体選択的に得、化合物（ＩＶ）の１位水酸基をリン酸化して化合物（Ｖ）とし、化合物（Ｖ）の水酸基及び／又はリン酸残基の保護基を脱保護する。【００５６】
【化１９】
0004658807.tif 000020
【００５７】（式中、Ｒ１は水酸基の保護基、Ｘは脱離基、Ｒ２は水素原子又はリン酸残基の保護基を示す。）【００５８】  式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）において、Ｒ１で示される水酸基の保護基としては、ホルミル基、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基などの炭素数１〜１０のアシル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基等の炭素数７〜２０のアラルキル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基等の炭素数１〜２０のアルキルシリル基が挙げられる。これらのうちで、炭素数１〜１０のアシル基が好ましく、特にベンゾイル基が好ましい。【００５９】  Ｘで示される脱離基としては、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子；メシル基、トシル基、トリフルオロメタンスルホニル基；ホルミル基、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基などの炭素数１〜１０のアシル基等が挙げられ、ハロゲン原子が好ましく、特に臭素原子が好ましい。【００６０】  Ｒ２で示されるリン酸残基の保護基としては、アリル基又は置換基を有していてもよいアルキル基が例示される。アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基等の炭素数１〜１０のアルキル基が挙げられる。アルキル基の置換基としては、例えばシアノ基、トリメチルシリル基、フェニル基等が挙げられる。置換アルキル基としては、例えば２−シアノエチル基、２−トリメチルシリルエチル基、ベンジル基等が挙げられる。【００６１】  化合物（ＩＩＩ）は、公知の方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５０，３６４４（１９８５）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５３，８５（１９８８）、特公平７−２３３９５号公報）に準じて合成できる。【００６２】  化合物（ＩＩＩ）の１位の加水分解反応は、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、メタノール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの有機溶媒中、トリブチルアミン、トリエチルアミンなどの塩基存在下、化合物（ＩＩＩ）１モルに対し、１モル以上の塩基と水を使用して行えばよい。反応温度は０〜１００℃が好ましく、反応時間は１〜２４時間程度が好ましい。必要により撹拌しながら反応させてもよい。【００６３】  このようにして得られた化合物（ＩＶ）は、必要により通常の糖の精製手段、例えば有機溶媒による分配、各種クロマトグラフィー処理により精製し、次のリン酸化反応に供すればよい。【００６４】  化合物（ＩＶ）の１位のリン酸化反応は、公知の方法に準じて行えばよい。例えば、五価のリン酸化剤を用いてリン酸化する方法、三価のリン酸剤を用いて亜リン酸化した後、酸化する方法が挙げられる。【００６５】  五価のリン酸化剤を用いる方法としては、具体的には、アセトニトリル、ＴＨＦ、ジクロロメタンなどの有機溶媒中、トリブチルアミン、トリエチルアミン、ピリジンなどの塩基存在下、オキシ塩化リン、モノアルキルホスホリルハライド、ジアルキルホスホリルハライドなどのリン酸化剤を化合物（ＩＶ）１モルに対して１〜１０モル使用すればよい。反応温度は−７８〜１２０℃が好ましく、反応時間は１〜２４時間程度が好ましい。【００６６】  三価のリン酸化剤を用いる方法としては、具体的には、アセトニトリル、ＴＨＦ、ジクロロメタン、１，４−ジオキサンなどの有機溶媒中、トリブチルアミン、トリエチルアミン、ピリジンなどの塩基存在下、三塩化リン、クロロホスホロジアミダイトなどの亜リン酸化剤を反応させ、次いで、シアノエタノール、アリルアルコールなどのアルコール類と反応させホスファイトとし、これを、ｍ−クロロ過安息香酸、ｔ−ブチルペルオキシド、過酸化水素等の酸化剤を用いて酸化すればよい。リン酸化剤、アルコール類及び酸化剤は化合物（ＩＶ）１モルに対して１〜１０モル使用すればよい。反応温度は−７８〜１２０℃が好ましく、反応時間は１〜２４時間程度が好ましい。【００６７】  このようにして得られた化合物（Ｖ）は、必要により通常の糖の精製手段、例えば有機溶媒による分配、各種クロマトグラフィー処理により精製し、次の脱保護反応に供する。【００６８】  化合物（Ｖ）の水酸基及び／又はリン酸残基の保護基の除去は、使用した保護基に応じて酸処理、アルカリ処理、接触還元、フッ化アンモニウム処理など通常使用する方法を適宜選択して行えばよい。【００６９】  上記の方法により得られた化合物（Ｉ）は、必要により通常の糖の精製手段、例えば有機溶媒による分配、各種クロマトグラフィー処理、結晶化などにより精製し、次の酵素反応に供する。【００７０】合成法２（αβ体混合物）：
化合物（ＩＩＩ）を強酸塩存在下、リン酸化剤で処理して保護体であるαβ体混合物（Ｖ）とすればよい。【００７１】  リン酸化反応は、アセトニトリル、ジクロロメタン、ＤＭＦ、メチルエチルケトンなどの有機溶媒中、トリブチルアミン、トリエチルアミンなどの塩基存在下、正リン酸、リン酸モノエステル、リン酸ジエステルなどのリン酸誘導体を化合物（ＩＩＩ）１モルに対して、１モル以上反応させればよい。反応温度は−７８〜１２０℃が好ましく、反応時間は１〜２４時間程度が好ましい。【００７２】  リン酸化の際、強酸塩、特に好ましくはハロゲンイオン又は硝酸イオンを発生する強酸塩を、化合物（ＩＩＩ）１モルに対して、０．１〜２０モル程度添加する。強酸塩の添加により、表１に示すようにβ体よりα体を優先的に合成することができる。【００７３】  ハロゲンイオン又は硝酸イオンを発生する強酸塩としては、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムヨージド、テトラエチルアンモニウムヨージド、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムブロミド、テトラエチルアンモニウムブロミド、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムクロリド、テトラエチルアンモニウムクロリドなどのハロゲンイオンのアンモニウム塩又は金属塩：硝酸テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムなどの硝酸イオンのアンモニウム塩又は金属塩）が挙げられる。これらのうちで、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムヨージド、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムブロミド、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムクロリド、テトラエチルアンモニウムクロリド、硝酸テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムが好ましい。【００７４】  得られた化合物（Ｖ）は、必要により通常の糖の精製手段、例えば有機溶媒による分配、各種クロマトグラフィー処理により精製し、次の脱保護反応に供する。【００７５】  化合物（Ｖ）の水酸基及び／又はリン酸残基の保護基を除去することにより、化合物（Ｉ）にそのβ体が混在したαβ体混合物（Ｖ’）【００７６】
【化２０】
0004658807.tif 000021
【００７７】が得られる。αβ体混合物（Ｖ’）のα／β比は１．９〜２．６である。保護基の除去の条件は、使用した保護基に応じて酸処理、アルカリ処理、接触還元、フッ化アンモニウム処理など、通常使用する方法を適宜選択して行えばよい。【００７８】  上記の方法により得られたαβ体混合物は、必要により通常の糖の精製手段、例えば有機溶媒による分配、各種クロマトグラフィー処理、結晶化などにより精製し、次の酵素反応に供する。【００７９】  次に、化合物（Ｉ）又はαβ体混合物（Ｖ’）と塩基（Ｂ）に、ヌクレオシドホスホリラーゼを作用させ、式（ＩＩ）で表される２’Ｆ−ＡＮＡを製造する方法について説明する。【００８０】  反応に用いるヌクレオシドホスホリラーゼとしては、化合物（ＩＩ）を合成できるものであれば特に制限されるものではないが、特にプリンヌクレオシドホスホリラーゼが好ましい。このようなヌクレオシドホスホリラーゼはその調製法も含め公知であり、当該公知の方法で容易に調製可能である。具体的に、ヌクレオシドホスホリラーゼは特定の由来のものに限定されず、動物由来、植物由来、微生物由来などすべての由来のものを使用することができる。調製の簡便性などの点から、微生物由来のヌクレオシドホスホリラーゼが好ましい。また、使用するヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子がクローン化されている場合には、そのクローン化されたヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子を用いて常法により大腸菌などを宿主として大量生産させ、当該組換え菌より当該酵素を調製することも可能である。【００８１】  このようなヌクレオシドホスホリラーゼは、当該活性を有する限りどのような形態であってもよい。具体的には、微生物の菌体、該菌体の処理物、該処理物から得られる酵素調製物などが挙げられる。【００８２】  微生物の菌体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集菌する方法により行うことができる。具体的には、バシラス属又は大腸菌類に属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）、２ｘＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、約３０〜５０℃で約１０〜５０時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体を集菌することによりヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物菌体を調製することができる。【００８３】  微生物の菌体処理物としては、上記微生物菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消火、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体の破壊物又は菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物が挙げられる。【００８４】  酵素調製物としては、上記菌体処理物からヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する画分を通常の酵素の精製手段、例えば塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理などを施して得られる粗酵素又は精製酵素を使用することができる。【００８５】  反応液に添加する塩基（Ｂ）は、合成目的に応じて市販されているもの、公知の方法で調製したもの等を使用すればよい。【００８６】  塩基（Ｂ）としては、プリン塩基又はその誘導体が好ましい。プリン塩基の誘導体としては、ハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノオキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基及びシアノ基から選ばれる置換基を有するものが挙げられる。置換基の数及び位置は特に制限されるものではない。【００８７】  ハロゲン原子としては、塩素、フッ素、ヨウ素、臭素が挙げられる。
アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基などの炭素数１〜６のアルキル基が挙げられる。
ハロアルキル基としては、フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、ブロモメチル基、ブロモエチル基などの上記ハロゲン原子で置換された上記炭素数１〜６のアルキル基が挙げられる。
アルケニル基としては、ビニル基、アリル基などの炭素数２〜７のアルケニル基が挙げられる。
ハロアルケニル基としては、ブロモビニル基、クロロビニル基などの上記ハロゲン原子で置換された炭素数２〜７のアルケニル基が挙げられる。
アルキニル基としては、エチニル基、プロピニル基などの炭素数２〜７のアルキニル基が挙げられる。
アルキルアミノ基としては、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジエチルアミノ基などの上記炭素数１〜６のアルキル基で置換されたアミノ基が挙げられる。【００８８】  アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基などの炭素数１〜７のアルコキシ基が挙げられる。
アルキルメルカプト基としては、メチルメルカプト基、エチルメルカプト基などの上記炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルメルカプト基が挙げられる。
アリール基としては、フェニル基；メチルフェニル基、エチルフェニル基などの上記炭素数１〜６のアルキル基で置換されたアルキルフェニル基；メトキシフェニル基、エトキシフェニル基などの上記炭素数１〜６のアルコキシ基で置換されたアルコキシフェニル基；ジメチルアミノフェニル基、ジエチルアミノフェニル基などの上記炭素数１〜６のアルキルアミノ基で置換されたアルキルアミノフェニル基；クロロフェニル基、ブロモフェニル基などのハロゲン原子で置換されたハロゲノフェニル基などが挙げられる。
アリールオキシ基としては、上記アリール基を有するものが挙げられる。例えば、フェノキシ基；メチルフェノキシ基、エチルフェノキシ基などの上記炭素数１〜６のアルキル基で置換されたアルキルフェノキシ基；メトキシフェノキシ基、エトキシフェノキシ基などの上記炭素数１〜６のアルコキシ基で置換されたアルコキシフェノキシ基；ジメチルアミノフェノキシ基、ジエチルアミノフェノキシ基などの上記炭素数１〜６のアルキルアミノで置換されたアルキルアミノフェノキシ基；クロロフェニル基、ブロモフェニル基などの上記ハロゲン原子で置換されたハロゲノフェノキシ基などが挙げられる。【００８９】  プリン塩基及びその誘導体としては、例えばプリン、６−アミノプリン（アデニン）、６−ヒドロキシプリン（ヒポキサンチン）、６−フルオロプリン、６−クロロプリン、６−メチルアミノプリン、６−ジメチルアミノプリン、６−トリフルオロメチルアミノプリン、６−ベンゾイルアミノプリン、６−アセチルアミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−アミノオキシプリン、６−メトキシプリン、６−アセトキシプリン、６−ベンゾイルオキシプリン、６−メチルプリン、６−エチルプリン、６−トリフルオロメチルプリン、６−フェニルプリン、６−メルカプトプリン、６−メチルメルカプトプリン、６−アミノプリン−１−オキシド、６−ヒドロキシプリン−１−オキシド、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン（グアニン）、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２−アミノ−６−ヨードプリン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−メルカプトプリン、２−アミノ−６−メチルメルカプトプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシアミノプリン、２−アミノ−６−メトキシプリン、２−アミノ−６−ベンゾイルオキシプリン、２−アミノ−６−アセトキシプリン、２−アミノ−６−メチルプリン、２−アミノ−６−シクロプロピルアミノメチルプリン、２−アミノ−６−フェニルプリン、２−アミノ−８−ブロモプリン、６−シアノプリン、６−アミノ−２−クロロプリン（２−クロロアデニン）、６−アミノ−２−フルオロプリン（２−フルオロアデニン）、６−アミノ−３−デアザプリン、６−アミノ−８−アザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−８−アザプリン、６−アミノ−７−デアザプリン、６−アミノ−１−デアザプリン、６−アミノ−２−アザプリンなどが挙げられる。【００９０】  ２’Ｆ−ＡＮＡは、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液中、化合物（Ｉ）又はそのαβ体混合物（Ｖ’）と上記塩基（Ｂ）に、ヌクレオシドホスホリラーゼを約５ユニット／ｍＬ以上、好ましくは約５０ユニット／ｍＬ以上添加することにより合成できる。化合物（Ｉ）又はそのαβ体混合物（Ｖ’）の使用量は、約１〜２００ｍＭが好ましく、特に１０〜１００ｍＭが好ましい。化合物（Ｉ）に対する塩基（Ｂ）の使用量は、１当量以上が好ましく、特に約２〜５モル倍当量程度が好ましい。反応時間は２０〜７０℃が好ましく、特に４０〜６０℃が好ましい。反応時間は約１〜１００時間程度が好ましい。必要により攪拌しながら反応させてもよい。【００９１】  次に、上記製造法を用いる９−（２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノシル）グアニン、すなわち化��物（ＶＩＩ）の製造を具体的に説明する。【００９２】  化合物（Ｉ）又はαβ体混合物（Ｖ’）と２−アミノ−６−置換プリンに、上記と同様のヌクレオシドホスホリラーゼを添加して化合物（ＶＩ）を得、これを加水分解酵素で処理すればよい。【００９３】  反応に使用する２−アミノ−６−置換プリンとしては、２−アミノ−６−置換プリンの置換基Ｙが加水分解可能な基であるプリン誘導体であれば特に制限されない。置換基Ｙとしては、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子、アミノ基、ヒドロキシ基、
メルカプト基、メチルメルカプト基、ヒドロキシアミノ基、メトキシ基、ベンゾイルオキシ基、アセトキシ基が挙げられる。２−アミノ−６−置換プリンの具体例としては、２−アミノ−６−ハロゲノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシプリンが挙げられ、２−アミノ−６−クロロプリン、２−アミノ−６−ヨードプリン、２−アミノ−６−メルカプトプリン、２−アミノ−６−メチルメルカプトプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシアミノプリン、２−アミノ−６−ベンゾイルプリン、２−アミノ−６−アセトキシプリンが挙げられ、特に２，６−ジアミノプリンが好ましい。【００９４】  加水分解酵素としては、２−アミノ−６−置換プリン又はそれを有するヌクレオシドの６位の置換基を加水分解することによって、２−アミノ−６−オキソプリン（グアニン）又はそれを有するヌクレオシドを生成できる活性を有するものであれば特に限定されない。このような加水分解酵素としては、デアミナーゼ等が挙げられ、特にアデノシンデアミナーゼが好ましい。【００９５】  加水分解酵素を用いた脱アミノ反応は、具体的には、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液中、加水分解酵素を約５ユニット／ｍＬ以上、好ましくは約３０ユニット／ｍＬ以上添加すればよい。反応温度は２０〜７０℃が好ましく、反応時間は約１〜１００時間程度が好ましい。必要により攪拌しながら反応させてもよい。
加水分解酵素を用いた脱アミノ反応は、上記ヌクレオシドホスホリラーゼを用いた反応に続けて又は同時並行的に行ってもよい。【００９６】  また、化合物（ＶＩＩ）は、化合物（Ｉ）又はαβ体混合物（Ｖ’）と５’−モノリン酸に、ヌクレオシドホスホリラーゼ及びヌクレオシダーゼを添加することによっても製造できる。反応は、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液中、ヌクレオシドホスホリラーゼとヌクレオシダーゼを各約５ユニット／ｍＬ以上添加し、２０〜７０℃で約１〜１００時間程度、必要により攪拌することにより実施できる。
反応に使用するヌクレオシダーゼとしては、ヌクレオチドを核酸塩基と糖リン酸に加水分解できる活性を有する酵素であればよく、具体的にはイノシン酸ヌクレオシダーゼ（Ｂｕｌｌ．Ａｇｒｉｃ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，２３，２８１−２８８（１９５９））が挙げられる。ヌクレオシドホスホリラーゼとしては上記と同様なものが使用できる。【００９７】  このようにして得られた化合物（ＶＩＩ）は、ヌクレオシドの通常の単離精製手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、結晶化などにより単離精製することができる。
【実施例】
【００９８】  以下に本発明を合成例により更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。【００９９】合成例１：３，５−Ｏ−ジベンゾイル−２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−ホスフェート［式Ｖ；Ｒ１＝Ｂｚ，Ｒ２＝Ｈ］
リン酸（５．０ｇ，５１ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ（３．６ｇ）をアセトニトリル（１８ｍＬ）に懸濁し、０℃でトリ−ｎ−ブチルアミン（２４．３ｍＬ，１０２ｍｍｏｌ）加え室温で１時間攪拌した。室温でテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムヨージド（１５．７ｇ，４２．５ｍｍｏｌ）を加え、さらに１０分後、３，５−Ｏ−ジベンゾイル−２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−ブロミド［式ＩＩＩ；Ｒ１＝Ｂｚ，Ｘ＝Ｂｒ］（３．５９ｇ，８．５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（３６ｍＬ）を滴下した。室温で２時間攪拌した後、不溶物をろ過して除いた。ろ液を減圧下で濃縮し、残渣を酢酸エチル（１５０ｍＬ）で抽出した。有機層を０．１Ｎ塩酸で３回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。【０１００】  標題化合物をＨＰＬＣ［ＵＶ：２３０ｎｍ，分析カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＮＨ２（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ），カラム温度：３０℃，移動相：６０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（５０％）−アセトニトリル（５０％），ｐＨ４．０（Ｈ３ＰＯ４），流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ］にて分析し、面積％より１−リン酸誘導体の生成率及びα／β比を算出した。６０．３％、α／β＝３．４。【０１０１】  残渣をメチルエチルケトン（９０ｍＬ）に溶解し、リン酸（１３．３ｇ）、モレキュラーシーブス４Ａ（３．６ｇ）を加え８０℃で２時間攪拌した。不溶物をろ過して除去した後、溶媒を留去した。残渣を酢酸エチル（１５０ｍＬ）で抽出した。有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を留去した。ＨＰＬＣ分析：６０．５％、α／β＝４．９。【０１０２】  さらに、残渣を逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（６００ｍＬ，５〜４０％アセトニトリル水）にて精製し、標題化合物をβ体との混合物（３１Ｐ−ＮＭＲ分析：α／β＝５．７）として２．９１ｇ（４１％）得た（ただし、標題化合物１モルに対し０．６モルのトリ−ｎ−ブチルアンモニウム及び０．１モルのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムを含有する）。【０１０３】１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）δ  ｐｐｍ：８．０７−８．０２（４Ｈ，ｍ），７．５１−７．３６（６Ｈ，ｍ），５．９９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．６，８．６Ｈｚ），５．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．３，２２．９Ｈｚ），５．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４９．１Ｈｚ），４．７４−４．５７（３Ｈ，ｍ）．【０１０４】合成例２：３，５−Ｏ−ジベンゾイル−２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−ホスフェート［式Ｖ；Ｒ１＝Ｂｚ，Ｒ２＝Ｈ］
１．０Ｍのリン酸／トリ−ｎ−ブチルアミンのアセトニトリル溶液（０．７５ｍＬ）にモレキュラーシーブス４Ａ（５０ｍｇ）、及び以下の表１に示す強酸塩（各０．６ｍｍｏｌ）を加え室温で４０分間攪拌した。これに３，５−Ｏ−ジベンゾイル−２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−ブロミド［式ＩＩＩ；Ｒ１＝Ｂｚ，Ｘ＝Ｂｒ］（５０ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．５ｍＬ）を滴下した。【０１０５】  ＨＰＬＣ分析：保持時間はα体が３．８分、β体が４．４分であった。【０１０６】  その結果を表１に示す。表１から明らかなように、強酸塩の添加により、α体の生成割合が高くなることが判明した。【０１０７】
【表１】
0004658807.tif 000022
【０１０８】合成例３：３，５−Ｏ−ジベンゾイル−２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノース［式ＩＶ；Ｒ１＝Ｂｚ］
３，５−Ｏ−ジベンゾイル−２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−ブロミド［式ＩＩＩ；Ｒ１＝Ｂｚ，Ｘ＝Ｂｒ］（２．４０ｇ，５．７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（４．８ｍＬ，３４．２ｍｍｏｌ）、水（３．１ｍＬ，１７１ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した。減圧下で溶媒を留去し、残渣を酢酸エチルで抽出し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄した。さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５０ｇ，０〜５％メタノール−クロロホルム）にて精製し、標題化合物１．８５ｇ（９０％）を得た。【０１０９】１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）δ  ｐｐｍ：８．０８−８．０１（４Ｈ，ｍ），７．６３−７．４１（６Ｈ，ｍ），５．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．６，１０．２Ｈｚ），５．５０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．３，２２．０Ｈｚ），５．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４９．１Ｈｚ），４．７７−４．６０（３Ｈ，ｍ），２．８９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝３．４Ｈｚ）．【０１１０】合成例４：３，５−Ｏ−ジベンゾイル−２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−（ビス−２−シアノエチル）ホスフェート［式Ｖ；Ｒ１＝Ｂｚ，Ｒ２＝ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ］
３，５−Ｏ−ジベンゾイル−２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノース［ＩＶ；Ｒ１＝Ｂｚ］（１．０１ｇ，２．８ｍｍｏｌ）をアセトニトリルで２回共沸脱水した後、アセトニトリル（２０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１．２ｍＬ，８．４ｍｍｏｌ）及びビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（１．６９ｇ，５．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。これに２−シアノエタノール（１．９ｍＬ，２８ｍｍｏｌ）及び１Ｈ−テトラゾール（０．９８ｇ，１４ｍｍｏｌ）を加え室温で１．５時間攪拌した。さらに７０％ｔ−ブチルヒドロペルオキシド溶液（２．５ｍＬ）を加え、室温で３０分間攪拌した。酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出し、有機層を水で２回、チオ硫酸ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水及び飽和食塩水でそれぞれ１回ずつ洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（７０ｇ，５０〜１００％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）にて精製し、標題化合物０．７８ｇ（５１％）を得た。【０１１１】１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）δ  ｐｐｍ：８．０７−８．０５（４Ｈ，ｍ），７．６５−７．４３（６Ｈ，ｍ），６．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．２，８．３Ｈｚ），５．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．９，２０．９Ｈｚ），５．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４８．４Ｈｚ），４．８２（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），４．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．５，１２．２Ｈｚ），４．６８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．６，１２．２Ｈｚ），４．３７−４．２７（４Ｈ，ｍ），２．７８−２．６８（４Ｈ，ｍ）．【０１１２】合成例５：３，５−Ｏ−ジベンゾイル−２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−ホスフェート［式Ｖ；Ｒ１＝Ｂｚ，Ｒ２＝Ｈ］
３，５−Ｏ−ジベンゾイル−２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−（ビス−２−シアノエチル）ホスフェート［式Ｖ；Ｒ１＝Ｂｚ，Ｒ２＝ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ］（８５ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３ｍＬ）に溶解し、ＤＢＵ（０．２５ｍＬ，１．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間攪拌した。これにクロロトリメチルシラン（０．１ｍＬ，０．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。反応液をクロロホルムで抽出し、有機層を０．１Ｎ塩酸で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。残渣を酢酸エチル（０．５ｍＬ）に溶解し、これにｎ−ヘキサン（５ｍＬ）を滴下して加えた。上澄液を除去し、残渣を真空乾燥して標題化合物を７１ｍｇ（８９％）得た（ただし、標題化合物１モルに対し、０．４モルのＤＢＵを含有する）。【０１１３】１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）δ  ｐｐｍ：８．０７−８．０２（４Ｈ，ｍ），７．５１−７．３６（６Ｈ，ｍ），５．９９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．６，８．６Ｈｚ），５．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．３，２２．９Ｈｚ），５．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４９．１Ｈｚ），４．７４−４．５７（３Ｈ，ｍ）．【０１１４】合成例６：２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−ホスフェート二ナトリウム塩［式Ｉ］
合成例４で合成した３，５−Ｏ−ジベンゾイル−２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−（ビス−２−シアノエチル）ホスフェート［式Ｖ；Ｒ１＝Ｂｚ，Ｒ２＝ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ］（５９０ｍｇ，１．０８ｍｍｏｌ）をメタノール−ＴＨＦ（１：１，６ｍＬ）に溶解し、２８％アンモニア水（６ｍＬ）を加え、室温で１時間攪拌した。溶媒を留去した後、２８％アンモニア水（１０ｍＬ）を加え、室温で一晩攪拌した。溶媒を留去し、残渣に水（２０ｍＬ）を加え、これを酢酸エチル（２０ｍＬ）で洗浄した。水層を回収し、１００ｍＬ水溶液とした。これをカチオン交換樹脂（三菱化学社製，ＰＫ２１６，Ｎａ型，３０ｍＬ）に通過させ、水を留去し、標題化合物を２７３ｍｇ（９９％）得た。【０１１５】１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）δ  ｐｐｍ：５．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．９，９．８Ｈｚ），５．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５０．５Ｈｚ），４．２６−４．１７（２Ｈ，ｍ），３．８７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．２，１２．４Ｈｚ），３．７４（１Ｈ，ｄｄ，５．３，１２．４Ｈｚ）．【０１１６】合成例７：２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−ホスフェート［式Ｉ］
合成例１で合成した３，５−Ｏ−ジベンゾイル−２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−ホスフェート［式Ｖ；Ｒ１＝Ｂｚ，Ｒ２＝Ｈ］（２．８ｇ，α体として３．３８ｍｍｏｌ）をメタノール（７０ｍＬ）に溶解し、２８％アンモニア水（７０ｍＬ）を加え、室温で１．５時間攪拌した。さらに２８％アンモニア水（７０ｍＬ）を加え、室温で一晩攪拌した。減圧下で溶媒を留去し、残渣を水（５０ｍＬ）に溶解した。これを酢酸エチル（１００ｍＬ）で２回洗浄し、水層を回収した。減圧下で水を濃縮し、メンブランフィルター（ＰＴＦＥ，０．４５μｍ）でろ過後、ろ液を濃縮した。残渣にアセトン（１０ｍＬ，２回）を加え、上澄液を除去した。残渣をエタノールで２回共沸し、減圧下、５０℃で２時間乾燥して標題化合物の粗体を１．３６ｇ得た。【０１１７】１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）δ  ｐｐｍ：５．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．９，９．９Ｈｚ），５．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５０．３Ｈｚ），４．２７−４．１８（２Ｈ，ｍ），３．８８−３．７１（２Ｈ，ｍ）．【０１１８】合成例８：９−（２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノシル）アデニン［式ＩＩ；Ｂ＝アデニン］
１．０Ｍリン酸／トリ−ｎ−ブチルアミンのアセトニトリル溶液（２．８ｍＬ，２．８ｍｍｏｌ）にモレキュラーシーブス４Ａ（１２６ｍｇ）及びトリ−ｎ−ブチルアミン（０．６７ｍＬ，２．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。室温でテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムヨージド（０．８７ｇ，２．４ｍｍｏｌ）を加え、さらに１０分後、３，５−Ｏ−ジベンゾイル−２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−ブロミド［式ＩＩＩ；Ｒ１＝Ｂｚ，Ｘ＝Ｂｒ］（０．２ｇ，０．４７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２ｍＬ）を滴下した。室温で２時間攪拌した後、不溶物をろ過して除いた。ろ液を減圧下で濃縮し、残渣を酢酸エチル（２０ｍＬ）で抽出した。有機層を０．１Ｎ塩酸で３回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。残渣をメチルエチルケトン（５ｍＬ）に溶解し、リン酸（０．７４ｇ）、モレキュラーシーブス４Ａ（０．２ｇ）を加え８０℃で３時間攪拌した。不溶物をろ過して除去した後、溶媒を留去した。残渣を酢酸エチル（２０ｍＬ）で抽出した。有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を留去して標題化合物の粗体を得た（ＨＰＬＣ分析：５６．４％，α／β＝７．３）。【０１１９】  これをメタノール（４ｍＬ）に溶解し、２８％アンモニア水（２ｍＬ）を加え、室温で１時間攪拌した。さらに２８％アンモニア水（２ｍＬ）を加え、室温で一晩攪拌した。減圧下で溶媒を留去し、残渣を水（２０ｍＬ）に溶解した。これを酢酸エチル（５０ｍＬ）で２回洗浄し、水層を回収した。減圧下で水を濃縮し、残渣を２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（２０ｍＬ，ｐＨ７．６）に溶解し、アデニン（５４ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（粗酵素、１７５０ユニット）を加え、５０℃で４日間静置した。反応液をメンブランフィルター（ＰＴＦＥ，０．４５μｍ）でろ過し、ろ液を４０ｍＬの水溶液に調整後、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（４０ｍＬ，０〜５％アセトニトリル−水）にて精製し、標題化合物を無色の結晶として５０ｍｇ（対アデニン収率４６％）得た。【０１２０】１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，５００ＭＨｚ）δ  ｐｐｍ：８．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），８．１７（１Ｈ，ｓ），７．３６（２Ｈ，ｂｒｓ），６．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．６，１４．１Ｈｚ），６．１５（１Ｈ，ｂｒ），５．２５（１Ｈ，ｂｒ），５．２２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．３，５２．７Ｈｚ），４．４７（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．５，１９．４Ｈｚ），３．８６−３．８４（１Ｈ，ｍ），３．６８−３．６３（２Ｈ，ｍ）．【０１２１】合成例９：９−（２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノシル）アデニン［式ＩＩ；Ｂ＝アデニン］
リン酸（２．８ｇ，２８．２ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ（２．０ｇ）をアセトニトリル（１０ｍＬ）に懸濁し、０℃でトリ−ｎ−ブチルアミン（１３．４ｍＬ，５６．４ｍｍｏｌ）加え室温で１時間攪拌した。室温でテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムヨージド（８．７ｇ，２３．５ｍｍｏｌ）を加え、さらに１０分後、３，５−Ｏ−ジベンゾイル−２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−ブロミド［式ＩＩＩ；Ｒ１＝Ｂｚ，Ｘ＝Ｂｒ］（２．０ｇ，４．７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２０ｍＬ）を滴下した。室温で２時間攪拌した後、不溶物をろ過して除いた。ろ液を減圧下で濃縮し、残渣を酢酸エチル（１５０ｍＬ）で抽出した。有機層を０．１Ｎ塩酸で３回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。残渣をメチルエチルケトン（５０ｍＬ）に溶解し、リン酸（７．４ｇ）、モレキュラーシーブス４Ａ（２．０ｇ）を加え８０℃で２時間攪拌した。不溶物をろ過して除去した後、溶媒を留去した。残渣を酢酸エチル（１５０ｍＬ）で抽出した。有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を留去した（ＨＰＬＣ分析：６７．４％，α／β＝３．１）。【０１２２】  これをメタノール（４０ｍＬ）に溶解し、２８％アンモニア水（２０ｍＬ）を加え、室温で１時間攪拌した。さらに２８％アンモニア水（２０ｍＬ）を加え、室温で一晩攪拌した。減圧下で溶媒を留去し、残渣を水（５０ｍＬ）に溶解した。これを酢酸エチル（２００ｍＬ）で２回洗浄し、水層を回収した。減圧下で水を濃縮し、標題化合物の粗体を得た。【０１２３】  この標題化合物の粗体の１／２量を２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（１００ｍＬ，ｐＨ７．６）に溶解し、アデニン（２７０ｍｇ，２．０ｍｍｏｌ）及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（粗酵素、２０００ユニット）を加え、５０℃で６日間静置した。反応液をメンブランフィルター（ＰＴＦＥ，０．４５μｍ）でろ過し、ろ液を１５０ｍＬの水溶液に調整後、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（２００ｍＬ，０〜５％アセトニトリル−水）にて精製し、標題化合物を無色の結晶として１８１ｍｇ（対アデニン収率３４％）得た。【０１２４】１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，５００ＭＨｚ）δ  ｐｐｍ：８．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），８．１７（１Ｈ，ｓ），７．３６（２Ｈ，ｂｒｓ），６．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．６，１４．１Ｈｚ），６．１５（１Ｈ，ｂｒ），５．２５（１Ｈ，ｂｒ），５．２２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．３，５２．７Ｈｚ），４．４７（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．５，１９．４Ｈｚ），３．８６−３．８４（１Ｈ，ｍ），３．６８−３．６３（２Ｈ，ｍ）．【０１２５】合成例１０：２，６−ジアミノ−９−（２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノシル）プリン［式ＩＩ；Ｂ＝２，６−ジアミノプリン］
合成例９で得た粗２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−ホスフェート［式Ｉ］の１／２量を２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（１００ｍＬ，ｐＨ７．６）に溶解し、２，６−ジアミノプリン（３００ｍｇ，２．０ｍｍｏｌ）及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（粗酵素、２０００ユニット）を加え、５０℃で６日間静置した。反応液をメンブランろ過し（ＰＴＦＥ，０．４５ｍｍ）、ろ液を１５０ｍＬの水溶液に調整後、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（２００ｍＬ，０〜３％アセトニトリル−水）にて精製し、標題化合物を無色の結晶として２２８ｍｇ（対２，６−ジアミノプリン収率４０％）得た。【０１２６】１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，５００ＭＨｚ）δ  ｐｐｍ：７．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），６．７９（２Ｈ，ｂｒｓ），６．１８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．２，１６．５Ｈｚ），５．８９（３Ｈ，ｂｒｓ），５．２０（１Ｈ，ｂｒ），５．１０（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝３．７，５２．６Ｈｚ），４．３９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．７，４．５，１８．２Ｈｚ），３．８２−３．８０（１Ｈ，ｍ），３．７９−３．６０（２Ｈ，ｍ）．【０１２７】合成例１１：９−（２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノシル）グアニン［式ＩＩ；Ｂ＝グアニン］
２，６−ジアミノ−９−（２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノシル）プリン（６１．２ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（２０ｍＬ，ｐＨ７．０）に溶解し、アデノシンデアミナーゼ（７１ユニット）を加え、室温で１．５時間攪拌した。反応液をメンブランフィルター（ＰＴＦＥ，０．５μｍ）でろ過し、６０ｍＬ水溶液に調整した。これを逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（８０ｍＬ，０〜２％アセトニトリル水）にて精製し、標題化合物を無色の結晶として６０．４ｍｇ（収率１００％）得た。【０１２８】１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，５００ＭＨｚ）δ  ｐｐｍ：１０．５０（１Ｈ，ｂｒｓ），７．８０（１Ｈ，ｓ），６．５４（２Ｈ，ｂｒｓ），６．１３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．２，１６．０Ｈｚ），５．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ），５．１１（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝３．８，５２．４Ｈｚ），５．０８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），４．３７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．９，１７．８Ｈｚ），３．８２−３．７９（１Ｈ，ｍ），３．６６−３．５７（２Ｈ，ｍ）．【０１２９】合成例１２：２−アミノ−６−クロロ−９−（２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノシル）プリン［式ＩＩ；Ｂ＝２−アミノ−６−クロロプリン］
実施例７で得た粗２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−ホスフェート［式Ｉ］（２００ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（１５０ｍＬ，ｐＨ７．５）に溶解し、２−アミノ−６−クロロプリン（１７０ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（粗酵素、３５１９ユニット）を加え、５０℃で１４日間静置した。反応液をメンブランフィルター（ＰＴＦＥ，０．４５μｍ）でろ過し、ろ液を１０ｍＬの水溶液に調整後、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（２０ｍＬ，０〜５％アセトニトリル水）にて精製し、標題化合物を得た。【０１３０】１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）δ  ｐｐｍ：８．２０（１Ｈ，ｓ），６．３１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．９，１７．４Ｈｚ），５．２４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝３．１，５１．２Ｈｚ），４．５６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝２．２，１８．２Ｈｚ），４．１０−４．０７（１Ｈ，ｍ），３．９２−３．８２（２Ｈ，ｍ）．【０１３１】合成例１３：２−アミノ−９−（２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノシル）プリン［式ＩＩ；Ｂ＝２−アミノプリン］
合成例７で得た粗２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−ホスフェート［式Ｉ］（２００ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＬ，ｐＨ７．５）に溶解し、２−アミノプリン（１３５ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（粗酵素、１５１７ユニット）を加え、５０℃で９日間静置した。反応液をメンブランフィルター（ＰＴＦＥ，０．４５μｍ）でろ過し、ろ液を６ｍＬの水溶液に調整後、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（４０ｍＬ，０〜５％アセトニトリル水）にて精製し、標題化合物を８７．３ｍｇ（対２−アミノプリン収率３２％）得た。【０１３２】１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，５００ＭＨｚ）δ  ｐｐｍ：８．６３（１Ｈ，ｓ），８．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），６．６４（２Ｈ，ｂｒｓ），６．５０（１Ｈ，ｂｒ），６．３１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．４，１５．２Ｈｚ），５．１９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．１，５２．６Ｈｚ），５．１５（１Ｈ，ｂｒ），４．４３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝４．０，４．９，１８．３Ｈｚ），３．８５（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），３．７０−３．６２（２Ｈ，ｍ）．【０１３３】合成例１４：２−フルオロ−９−（２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノシル）アデニン［式ＩＩ；Ｂ＝２−フルオロアデニン］
合成例７で得た粗２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−ホスフェート［式Ｉ］（７６ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）を５ｍＭトリス塩酸緩衝液（６０ｍＬ，ｐＨ７．５）に溶解し、２−フルオロアデニン（４４ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ）及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（粗酵素、７２２ユニット）を加え、５０℃で５日間静置した。反応液をメンブランフィルター（ＰＴＦＥ，０．４５μｍ）でろ過し、ろ液を３０ｍＬの水溶液に調整後、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（４０ｍＬ，０〜５％アセトニトリル水）にて精製し、標題化合物を３９．０ｍｇ（対２−フルオロアデニン収率４５％）得た。【０１３４】１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，５００ＭＨｚ）δ  ｐｐｍ：８．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ），８．００−７．８０（２Ｈ，ｍ），６．２９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．６，１３．８Ｈｚ），５．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），５．２２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．２，５２．６Ｈｚ），５．１０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），４．４３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝５．０，９．４，１８．９Ｈｚ），３．８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．９，９．６Ｈｚ），３．７１−３．６１（２Ｈ，ｍ）．【０１３５】合成例１５：９−（２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノシル）グアニン［式ＩＩ；Ｂ＝グアニン］
リン酸（４８．１ｇ，０．４９ｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ（３８ｇ）をアセトニトリル（１６０ｍＬ）に懸濁し、０℃でトリ−ｎ−ブチルアミン（２３３．９ｍＬ，０．９８ｍｏｌ）加え室温で１時間攪拌した。室温でテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムヨージド（１５１．０ｇ，０．４１ｍｏｌ）を加え、さらに１０分後、３，５−Ｏ−ジベンゾイル−２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−ブロミド［式ＩＩＩ；Ｒ１＝Ｂｚ，Ｘ＝Ｂｒ］（３４．６２ｇ，０．８２ｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２４０ｍＬ）を滴下した。室温で２時間攪拌した後、不溶物をろ過して除いた。ろ液を減圧下で濃縮し、残渣に水（２００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（６００ｍＬ）で２回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。残渣をメチルエチルケトン（８３０ｍＬ）に溶解し、リン酸（１１０．６ｇ）を加え８０℃で２時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣に水（１Ｌ）を加え、酢酸エチル（１Ｌ）で２回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を留去し、粗３，５−Ｏ−ジベンゾイル−２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−ホスフェート［式Ｖ；Ｒ１＝Ｂｚ，Ｒ２＝Ｈ］を得た。【０１３６】  これをメタノール（６００ｍＬ）に溶解し、２８％アンモニア水（３００ｍＬ）を加え、室温で１．５時間攪拌した。さらに２８％アンモニア水（３００ｍＬ）を加え、室温で一晩攪拌した。減圧下で溶媒を留去し、残渣を水（５００ｍＬ）に溶解した。これを酢酸エチル（８００ｍＬ）で２回洗浄し、水層を回収した。減圧下で水を濃縮し、メンブランフィルター（ＰＴＦＥ，０．４５μｍ）でろ過後、水を加え粗２−フルオロ−α−Ｄ−アラビノシル−１−ホスフェート［式Ｉ］水溶液（２．５Ｌ，ｐＨ７．５）を得た。【０１３７】  これに２，６−ジアミノプリン（１５．４ｇ，０．１ｍｏｌ）及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（粗酵素、１０８３００ユニット）を加え、５０℃で１０日間静置した。反応液を希塩酸でｐＨ４に調整し、セライトろ過で沈殿物を除去した。ろ液を吸着樹脂カラム（三菱化学社製，ＳＰ２０６，１．４Ｌ，０〜２０％エタノール水）にて精製し、濃縮して、２，６−ジアミノ−９−（２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノシル）プリン［式ＩＩ；Ｂ＝２，６−ジアミノプリン］水溶液（３．１Ｌ）を得た。【０１３８】  これにリン酸二水素カリウム（８．４ｇ）を加え、１Ｎ水酸化カリウムでｐＨ７．３に調整した後、アデノシンデアミナーゼ（２０００ユニット）を加え４０℃で３時間静置した。反応液を希塩酸でｐＨ４に調整し、吸着樹脂カラム（三菱化学社製，ＳＰ２０６，１．９Ｌ，０〜１５％エタノール水）にて精製し、標題化合物を無色の結晶として７．８ｇ（ＨＰＬＣ純度９９％、対２，６−ジアミノプリン収率２７％）得た。【０１３９】参考例１
（１）プリンヌクレオシドホスホリラーゼの調製
ペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、グルコース１ｇ／Ｌ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する栄養培地１００ｍＬに、特開平９−１１７２９８号公報に記載の方法に従い調製した組換えベクターｐＴｒｃ−Ｂ５６を保持する大腸菌ＪＭ１０９「ｐＴｒｃ−Ｂ５６」を植菌し、３７℃で振盪培養した。【０１４０】  ４×１０８個／ｍＬに達した時点で、培養液に終濃度１ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＩＰＴＧを添加し、更に３７℃で５時間振盪培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分間）により培養菌体を回収し、２０ｍＬの緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００含有）に懸濁した。菌体懸濁液に終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるようにリゾチームを加え、３７℃で１時間保温することで形質転換体を溶菌させ、更に遠心分離（１２，０００×ｇ、１０分間）により菌体残渣を除去した。このようにして得られた上清画分を酵素液とした。【０１４１】（２）アデノシンデアミナーゼの調製
ペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、グルコース１ｇ／Ｌ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する栄養培地１００ｍＬに、特開平５−２１９９７８号公報に記載の方法に従い調製した組換えベクターｐＤＲ−ａｄｄを保持する大腸菌形質転換体ＪＭ１０５［ｐＤＲ−ａｄｄ］を植菌し、３７℃で振盪培養した。【０１４２】  ４×１０８個／ｍＬに達した時点で、培養液に終濃度０．１ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＩＰＴＧを添加し、更に３７℃で３時間振盪培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分間）により培養菌体を回収し、１０ｍＬの緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ８．２）、１０％エチレングリコール）に懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕機にて処理して、更に遠心分離（２，０００×ｇ、１０分間）により菌体残渣を除去した。このようにして得られた上清画分を酵素液とした。