(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）〜（ｆ）のいずれかから選択される、蛋白質を有効成分として含有する、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤：
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ耐糖能改善活性を有する蛋白質、
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における第２２番目のアミノ酸から第４１４番目のアミノ酸で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ耐糖能改善活性を有する蛋白質、
（ｆ）配列番号１で示される塩基配列における第２２４番目のヌクレオチドから第１４６５番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｇ）配列番号１で示される塩基配列における第２２４番目のヌクレオチドから第１４６５番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつ耐糖能改善活性を有する蛋白質、
（ｈ）配列番号１で示される塩基配列における第２２４番目のヌクレオチドから第１４６５番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされアミノ酸配列からなり、かつ耐糖能改善活性を有する蛋白質。
【請求項２】
請求項１の（ａ）〜（ｈ）のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子を有効成分として含有する、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤。
【請求項３】
インスリン応答性促進活性を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の治療剤又は予防剤。
【請求項４】
被験物質が、請求項１の（ａ）〜（ｈ）のいずれかに記載の蛋白質又は該蛋白質をコードする遺伝子の発現を促進するか否かを指標とする、被験物質の耐糖能改善活性の検定方法。
【請求項５】
下記の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、請求項４に記載の耐糖能改善活性の検定方法：
（１） 被験物質と、請求項１の（ａ）〜（ｈ）のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる第一工程、
（２） 被験物質を接触させた細胞における、前記遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞における前記遺伝子の発現量と比較する第二工程、及び
（３） 前記第二工程の比較結果に基づいて、被験物質が前記遺伝子の発現量を増加させるか否かを指標として被験物質の耐糖能改善活性を評価する第三工程。
【請求項６】
下記の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、請求項４に記載の耐糖能改善活性の検定方法：
（１）被験物質と、請求項１の（ａ）〜（ｈ）のいずれかに記載の蛋白質を発現可能な細胞とを接触させる第一工程、
（２）被験物質を接触させた細胞における、前記蛋白質の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞における前記蛋白質の発現量と比較する第二工程、及び
（３）前記第二工程の比較結果に基づいて、被験物質が前記蛋白質の発現量を増加させるか否かを指標として被験物質の耐糖能改善活性を評価する第三工程。
【請求項７】
下記の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、請求項４に記載の耐糖能改善活性の検定方法：
（１） 被験物質と、請求項１の（ａ）〜（ｈ）のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞とを接触させる第一工程、
（２） 被験物質を接触させた細胞における、前記レポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞における前記遺伝子の発現量と比較する第二工程、及び
(３） 前記第二工程の比較結果に基づいて、前記レポーター遺伝子の発現量を増加させるか否かを指標として被験物質の耐糖能改善活性を評価する第三工程。
【請求項８】
耐糖能改善活性が、インスリン応答性促進活性である、請求項４〜７のいずれかに記載の検定方法。
【請求項９】
請求項４〜７のいずれかに記載の検定方法により測定された、被験物質の耐糖能改善活性を指標として、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤の候補物質を選別することを特徴とする、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤の探索方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤、詳しくは、耐糖能改善活性やインスリン応答性促進活性を有する蛋白質等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体における糖代謝（糖の新生及びクリアランス）の恒常性が破綻した状態、特に高血糖状態が持続した病態が糖尿病である。糖尿病の病態の背景には、血糖調節ホルモンであるインスリンの分泌不全や作用不全があり、インスリン作用を是正あるいは代替することにより、糖代謝に密接に関連する疾患（糖代謝関連疾患）の治療または予防が可能となる。これまでに、糖代謝機能を改善する生体内物質（ホルモン）としてはインスリンが知られており、インスリン製剤が糖代謝機能の改善に用いられているが、更に優れた薬剤が求められている。
一方、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質は、肥満動物の内臓脂肪組織に特異的に発現する蛋白質であることが知られている（非特許文献１を参照）。しかしながら、前記蛋白質の生体内での機能は不明であり、糖代謝関連疾患の関係についても全く知られていなかった。
【非特許文献１】Hida K et al, J. Lipid Research, 41, p 1615 - p1622 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明が解決すべき課題は、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤、詳しくは、耐糖能改善活性やインスリン応答性促進活性を有する蛋白質等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、かかる状況のもと鋭意検討した結果、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質が、耐糖能改善活性やインスリン応答性促進活性を有し、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤となり得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
即ち、本発明は、
〔１〕  下記のいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質（以下、本明細書において、本蛋白質と称する場合がある。）又はそのフラグメントを有効成分として含有する、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤：
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入もしくは置換されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における第２２番目のアミノ酸から第４１４番目のアミノ酸で示されるアミノ酸配列、
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号１で示される塩基配列における第２２４番目のヌクレオチドから第１４６５番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号１で示される塩基配列における第２２４番目のヌクレオチドから第１４６５番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされ、かつ糖代謝亢進活性を有するアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号１で示される塩基配列における第１番目のヌクレオチドから第１２４２番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ糖代謝亢進活性を有するアミノ酸配列；
〔２〕  〔１〕に記載のアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子を有効成分として含有する、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤；
〔３〕  耐糖能改善活性を有することを特徴とする、〔１〕又は〔２〕に記載の治療剤又は予防剤；
〔４〕  耐糖能改善活性が、インスリン応答性促進活性である、〔３〕に記載の治療剤又は予防剤；
〔５〕  被験物質が、〔１〕に記載のアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列からなる蛋白質又は該蛋白質をコードする遺伝子の発現を促進するか否かを指標とする、被験物質の耐糖能改善活性の検定方法；
〔６〕  下記の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、〔５〕に記載の耐糖能改善活性の検定方法：
（１）  被験物質と、〔１〕に記載のアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる第一工程、
（２）  被験物質を接触させた細胞における、前記遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞における前記遺伝子の発現量と比較する第二工程、及び
（３）  前記第二工程の比較結果に基づいて、被験物質が前記遺伝子の発現量を増加させるか否かを指標として被験物質の耐糖能改善活性を評価する第三工程；
〔７〕  下記の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、〔５〕に記載の耐糖能改善活性の検定方法：
（１）被験物質と、〔１〕に記載のアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列からなる蛋白質を発現可能な細胞とを接触させる第一工程、
（２）被験物質を接触させた細胞における、前記蛋白質の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞における前記蛋白質の発現量と比較する第二工程、及び
（３）前記第二工程の比較結果に基づいて、被験物質が前記蛋白質の発現量を増加させるか否かを指標として被験物質の耐糖能改善活性を評価する第三工程；
〔８〕  下記の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、〔５〕に記載の耐糖能改善活性の検定方法：
（１）  被験物質と、〔１〕に記載のアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞とを接触させる第一工程、
（２）  被験物質を接触させた細胞における、前記レポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞における前記遺伝子の発現量と比較する第二工程、及び
(３)  前記第二工程の比較結果に基づいて、前記レポーター遺伝子の発現量を増加させるか否かを指標として被験物質の耐糖能改善活性を評価する第三工程；
〔９〕  耐糖能改善活性が、インスリン応答性促進活性である、〔５〕〜〔８〕のいずれかに記載の検定方法；
〔１０〕  〔５〕〜〔８〕のいずれかに記載の検定方法により測定された、被験物質の耐糖能改善活性を指標として、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤の候補物質を選別することを特徴とする、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤の探索方法；
〔１１〕  〔１０〕に記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分して含有する、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤；
〔１２〕  〔１〕に記載のアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列からなる蛋白質の発現誘導物質、又は機能促進物質を有効成分として含有する、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤；
に関するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、耐糖能改善活性やインスリン応答性促進活性を有することを特徴とする糖代謝関連疾患の治療剤もしくは予防剤、耐糖能改善活性の検定方法、及び当該検定方法を用いる糖代謝関連疾患の治療剤もしくは予防剤の探索方法等を提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明を詳細に説明する。
（I）治療剤又は予防剤
本発明の第一の態様は、前記本蛋白質又はそのフラグメントを有効成分として含有する糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤に関する。
本明細書において、「下記のいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質」（本蛋白質）とは、（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列、（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入もしくは置換されたアミノ酸配列、（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における第２２番目のアミノ酸から第４１４番目のアミノ酸で示されるアミノ酸配列、（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列、（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、（ｆ）配列番号１で示される塩基配列における第２８７番目のヌクレオチドから第１４６５番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、（ｇ）配列番号１で示される塩基配列における第２８７番目のヌクレオチドから第１４６５番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、及び（ｈ）配列番号１で示される塩基配列における第２８７番目のヌクレオチドから第１４６５番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつ糖代謝亢進活性を有する蛋白質である。
【０００８】
ここで、前記（ｂ）における「アミノ酸の欠失、付加、挿入もしくは置換」や前記（ｅ）及び（ｇ）にある「８０％以上の配列同一性」には、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が細胞内で受けるプロセシング、該蛋白質が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。
前記（ｂ）における「アミノ酸の欠失、付加もしくは置換」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res., 12,9441-9456(1984)）、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には1若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、当該蛋白質の糖代謝亢進活性を見出すことのできる範囲であれば良い。
また前記欠失、付加又は置換のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、i)グリシン、アラニン；ii)バリン、イソロイシン、ロイシン；iii)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、iv)セリン、スレオニン；v)リジン、アルギニン；vi)フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
【０００９】
前記（ｃ）における、「配列番号２で示されるアミノ酸配列における第２２番目のアミノ酸から第４１４番目のアミノ酸で示されるアミノ酸配列」とは、分泌蛋白質である配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、シグナルペプチド部分に相当する第１番目のアミノ酸から第２１番目のアミノ酸で示される部分アミノ酸配列を除いたアミノ酸配列に相当する。
【００１０】
本発明において「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
本発明における配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。
【００１１】
前記（ｈ）における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×SSC（１．５M  NaCl、０．１５M  クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×SSCとする）、50％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、2×SSCで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×SSCで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×SSCで５０℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
【００１２】
上述の本蛋白質の具体例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるヒト型蛋白質の他、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるラット型ホモログや、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるマウス型ホモログを挙げることができる。
【００１３】
本明細書において、本蛋白質のフラグメントとは、前記本蛋白質の１５〜１００残基、好ましくは１５〜５０残基のアミノ酸部分配列からなるペプチドフラグメントを表し、本蛋白質の糖代謝亢進活性が保持されている限り特に限定はない。
【００１４】
本蛋白質の調製方法について以下に説明する。
まず、本蛋白質をコードする遺伝子（本遺伝子）、例えば、（I）配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、（II）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、（III）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２１個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列をコードする塩基配列（即ち、配列番号２で示されるアミノ酸配列における第２２番目から第４１４番目までのアミノ酸で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列）、（IV）前記（III）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、（V）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、（VI）配列番号１で示される塩基配列、（VII）配列番号１で示される塩基配列における第２８７番目のヌクレオチドから第１４６５番目までのヌクレオチドで示される塩基配列、（VIII）配列番号１で示される塩基配列における第２８７番目のヌクレオチドから第１４６５番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するDNAと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は（IX）配列番号１で示される塩基配列における第２８７番目のヌクレオチドから第１４６５番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するDNAに対し相補性を有するDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAの塩基配列等の塩基配列を有する遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法（例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載されている方法）に準じて取得する。次いで、得られた本遺伝子を用いることにより、通常の遺伝子工学的方法に準じて本蛋白質を製造・取得する。このようにして本蛋白質を調製することができる。
【００１５】
例えば、本遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドを作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、さらに形質転換された宿主細胞（形質転換体）を培養することで得られる培養物から本蛋白質を取得すればよい。上記プラスミドとしては、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主細胞からの単離・精製が容易であり、宿主細胞中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマーカーをもつ発現ベクターに、本蛋白質をコードする遺伝子が導入されたものを好ましく挙げることができる。尚、発現ベクターとしては、各種のものが市販されている。例えば、大腸菌での発現に使用される発現ベクターは、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃなどのプロモーターを含む発現ベクターであって、これらはファルマシア社、宝酒造等から市販されている。当該発現ベクターに本蛋白質をコードする遺伝子を導入するために用いられる制限酵素も宝酒造等から市販されている。さらなる高発現を導くことが必要な場合には、本蛋白質をコードする遺伝子の上流にリボゾーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボゾーム結合領域としては、Guarente L.ら（Cell 20, p543）や谷口ら（Genetics of Industrial Microorganisms, p202, 講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。
【００１６】
哺乳動物細胞での発現に使用されるベクターは、ＳＶ４０ウイルスプロモーター、サイトメガロウィルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、Raus Sarcoma Virusプロモーター（ＲＳＶプロモーター）、βアクチン遺伝子プロモーター、ａＰ２遺伝子プロモーター等のプロモーターを含む発現ベクターであって、これらは、東洋紡社、宝酒造社等から市販されている。
【００１７】
宿主細胞としては、原核生物もしくは真核生物である微生物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞等を挙げることができる。例えば、本蛋白質の大量調製が容易になるという観点では、大腸菌等を好ましく挙げることができる。
前記のようにして得られたプラスミドは、通常の遺伝子工学的方法により前記宿主細胞に導入することができる。
【００１８】
形質転換体の培養は、微生物培養、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。例えば大腸菌の場合、適当な炭素源、窒素源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
【００１９】
本蛋白質の取得は、一般の蛋白質の単離・精製に通常使用される方法を組み合わせて実施すればよい。例えば、前記の培養により得られた形質転換体を遠心分離等で集め、該形質転換体を破砕または溶解せしめ、必要であれば蛋白質の可溶化を行い、イオン交換、疎水、ゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた工程を単独で、若しくは組み合わせることにより精製すればよい。精製された蛋白質の高次構造を復元する操作をさらに行ってもよい。また、例えば、前記の培養により得られた形質転換体を遠心分離などで除去し、培養上清から本蛋白質を前記と同様にして精製してもよい。
【００２０】
本明細書において、糖代謝関連疾患としては、生体における糖代謝機能の異常を伴う疾患が挙げられ、具体的には、糖尿病、耐糖能異常、高血糖の持続に伴う動脈硬化症等の疾患が挙げられる。すなわち、糖代謝関連疾患は、インスリンの機能低下または機能不全によって生ずる種々の病態を有する疾患であれば特に限定は無い。本発明の糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤を適用可能な疾患として、好ましくは、糖尿病などの血糖の恒常性が破綻した病態をあげることができる。本発明の糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤は、耐糖能亢進活性やインスリン応答性促進活性、すなわち耐糖能改善活性を有することを特徴とするものである。
【００２１】
本明細書において「耐糖能亢進活性」とは、ＯＧＴＴ（糖負荷試験：マウスに一定量の糖を負荷した後の血糖値やインスリン値の変動を測定する試験）を実施することによって測定することができ、ＯＧＴＴにおいて糖負荷後の血糖値の低下が亢進されていることを表す。具体的には、本明細書実施例９及び１０に記載の方法でＯＧＴＴを実施することができる。
本明細書において、「インスリン応答性」とは、ＩＴＴ（インスリン負荷試験：マウスに一定量のインスリンを負荷した後の血糖値やインスリン値の変動を測定する）を実施することによって測定することができ、ＩＴＴにおいてインスリン負荷後の血糖値の低下が亢進されていることを表す。具体的には、本明細書実施例９及び１０に記載の方法でＩＴＴを実施することができる。
前記OGTT及びITTにおいて、測定対象のタンパク質が、本発明実施例９及び１０で用いられる本タンパク質と同程度の血糖値を示す場合に、測定対象のタンパク質は「耐糖能亢進活性」や「インスリン応答性」を示すということができる。
【００２２】
（II）検定方法
本発明の第二の態様は、被験物質が本蛋白質又は本蛋白質をコードする遺伝子（本遺伝子）の発現を促進するか否かを指標とする、被験物質の耐糖能改善活性の検定方法に関する。
（II-1）本蛋白質をコードする遺伝子の発現量を指標とする方法
すなわち、下記の工程（１）〜（３）：
（１）  被験物質と、本蛋白質をコードする遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる第一工程、
（２）  被験物質を接触させた細胞における、前記遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における前記遺伝子の発現量と比較する第二工程、及び
（３）  前記第二工程の比較結果に基づいて、被験物質が前記遺伝子の発現量を増加させるか否かを指標として被験物質の耐糖能改善活性を評価する第三工程、
を有する。
【００２３】
前記第一工程において用いられる「本蛋白質をコードする遺伝子（以下、本遺伝子と称する場合がある）」としては、本遺伝子を発現している細胞であれば特に限定は無く、使用する細胞の内在性の本遺伝子、外来遺伝子として細胞に導入された本遺伝子のいずれでも良いが、使用する細胞の内在性の本遺伝子が好ましい。外来遺伝子として導入する場合、本遺伝子は用いられる細胞の由来動物種の本遺伝子であることが好ましい。
具体的には、脂肪組織由来細胞、本遺伝子発現ベクターを導入されてなる形質転換細胞等が挙げられる。由来動物種としては、ラット、マウス、モルモット等のげっ歯類哺乳動物、イヌ、サル、ヒト等が挙げられる。
【００２４】
前記細胞としては、動物の組織や臓器から分離された細胞や、同一の機能・形態を持つ集団を形成している細胞（組織）等も含まれ、いかなる分化過程にある細胞であってもよい。
【００２５】
被験物質として用いられる化合物には特に限定は無く、蛋白質、ペプチド、核酸、無機化合物、天然もしくは合成化学的に調製された有機化合物等が挙げられる。被験物質として、具体的には、アミノ酸３〜５０残基、好ましくは５〜２０残基のペプチドライブラリーや、当業者に公知のコンビナトリアルケミストリーの技術を用いて調製された分子量１００〜２０００、好ましくは２００〜８００の低分子有機化合物ライブラリーを挙げることができる。
【００２６】
前記の第二工程における「対照細胞」とは前記第一工程で用いられる本遺伝子を発現可能な細胞において、被験物質を接触させない場合の当該細胞を表す。「被験物質を接触させない場合」には、被験物質の代わりに被験物質と同量の溶媒（ブランク）を添加する場合や、本遺伝子の発現に影響を与えないネガティブコントロール物質を添加する場合も含まれる。
【００２７】
また、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死なないように、その培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を大きく変化させない条件を採用することが好ましい。
【００２８】
本蛋白質をコードする遺伝子を発現可能な細胞と接触させる被験物質の濃度としては、特に限定は無く、通常約０．１μＭ〜約１００μＭであればよく、好ましくは１μＭ〜５０μＭであればよい。筋肉細胞もしくは肝細胞と被験物質とを接触させる時間は、通常５分間〜３０分間程度あり、好ましくは１０分間〜２０分間程度である。被験物質は適宜、水、リン酸バッファーもしくはトリスバッファー等のバッファー、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキシドもしくはこれらの混合物などの溶媒に溶解又は懸濁して用いることができる。
【００２９】
「被験物質を接触させない対照細胞」としては、第一工程で用いられる本遺伝子を発現可能な細胞において、被験物質を接触させない場合の当該細胞を表す。「被験物質を接触させない場合」には、被験物質の代わりに被験物質と同量の溶媒（ブランク）を添加する場合や、本遺伝子の発現に影響を与えないネガティブコントロール物質を添加する場合も含まれる。
また、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死なないように、その培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を大きく変化させない条件を採用することが好ましい。
【００３０】
本遺伝子の発現レベルの検出及び定量は、前記細胞から調製したRNA又はそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを用いて、ノーザンブロット法、RT-PCR法など公知の方法で実施できる。具体的には、本遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチドをプライマーまたはプローブとして用いることによって、RNA中の本遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。そのようなプローブもしくはプライマーは、本遺伝子の塩基配列をもとに、例えばprimer 3（ HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi）あるいはベクターNTI（Infomax社製）を利用して設計することができる。
【００３１】
ノーザンブロット法を利用する場合、前記プライマーもしくはプローブを放射性同位元素（32P、33Pなど：RI）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした細胞由来のRNAとハイブリダイズさせた後、形成された前記プライマーもしくはプローブ（DNAまたはRNA）とRNAとの二重鎖を、前記プライマーもしくはプローブの標識物（RI若しくは蛍光物質）に由来するシグナルとして放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham PharamciaBiotech社製)を用いて、該プロトコールに従って前記プローブを標識し、細胞由来のRNAとハイブリダイズさせた後、前記プローブの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
【００３２】
RT-PCR法を利用する場合は、細胞由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、これを鋳型として標的の本遺伝子の領域が増幅できるように、本遺伝子の配列に基づき調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、上記ＰＣＲを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した前記プライマーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRIME 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
【００３３】
被験物質を添加した細胞における本遺伝子の発現が被験物質を添加しない対照細胞での発現量と比較して1.5倍以上、好ましくは2倍以上、更に好ましくは３倍以上であれば、該被験物質は本遺伝子の発現誘導物質として選択することができる。
【００３４】
II-2）本蛋白質の発現量を指標として用いる検定方法
本発明は、下記の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、耐糖能促進活性の検定方法を提供する。すなわち：
（１）被験物質と、本蛋白質を発現可能な細胞とを接触させる第一工程、
（２）被験物質を接触させた細胞における、前記蛋白質の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞における前記蛋白質の発現量と比較する第二工程、及び
（３）前記第二工程の比較結果に基づいて、被験物質が前記蛋白質の発現量を増加させるか否かを指標として被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程。
ここで、被験物質としては前記と同じものが挙げられる。また、「本蛋白質を発現可能な細胞」としては、前記１）における「本蛋白質をコードする遺伝子（本遺伝子）を発現可能な細胞」と同じものが挙げられる。
【００３５】
本蛋白質の発現レベルの検出及び定量は、本蛋白質を認識する抗体を用いたウェスタンブロット法等の公知方法に従って定量できる。ウェスタンブロット法は、一次抗体として本蛋白質を認識する抗体を用いた後、二次抗体として125Iなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）等の酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器（BAI-1800II：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで測定することによって実施できる。また、一次抗体として本蛋白質を認識する抗体を用いた後、ECL Plus Western Blotting Detection System（アマシャム  ファルマシアバイオテク社製）を利用して該プロトコールに従って検出し、マルチバイオメージャーSTORM860（アマシャム  ファルマシアバイオテク社製）で測定することもできる。
【００３６】
抗体は、その形態に特に制限はなく、前記本蛋白質を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよく、さらには本蛋白質を構成するアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
【００３７】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13）。
【００３８】
II-3）本遺伝子の発現制御領域を用いたレポーター遺伝子アッセイを用いる検定方法
本発明は、下記の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、耐糖能促進活性の検定方法を提供する。すなわち：
（１）  被験物質と、本蛋白質をコードする遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞とを接触させる第一工程、
（２）  被験物質を接触させた細胞における、前記レポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞における前記遺伝子の発現量と比較する第二工程、及び
（３）  前記第二工程の比較結果に基づいて、前記レポーター遺伝子の発現量を増加させるか否かを指標として被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程。
ここで、被験物質は、前記と同じものが挙げられる。
「本蛋白質をコードする遺伝子（本遺伝子）の発現制御領域」とは、通常、当該染色体遺伝子の上流数ｋｂから数十ｋｂの範囲を指し、例えば、（i）５’-レース法（5'-RACE法）(例えば、５’full Race Core Kit（宝酒造社製）等を用いて実施されうる)、オリゴキャップ法、S1プライマーマッピング等の通常の方法により、５’末端を決定するステップ；（ii）Genome Walker Kit(クローンテック社製)等を用いて５’-上流領域を取得し、得られた上流領域について、プロモーター活性を測定するステップ；、を含む手法等により同定することが出来る。
【００３９】
本遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子は、当業者に公知の方法で調製すればよい。すなわち、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols In Molecular Biology」(1987),John Wiley & Sons,Inc.等に記載される通常の遺伝子工学的手法に従って切り出された本遺伝子の発現調節領域を、レポーター遺伝子を含むプラスミド上に組み込むことができる。
【００４０】
レポーター遺伝子としては、グルクロニダーゼ（GUS）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（CAT）、β-ガラクトシダーゼ及びグリーン蛍光タンパク質（GFP）等が挙げられる。
調製した本遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を、通常の遺伝子工学的手法を用いて、当該レポーター遺伝子を導入する細胞において使用可能なベクターに挿入し、プラスミドを作製し、適当な宿主細胞へ導入することができる。レポーター遺伝子に応じた選抜条件の培地で培養することにより、形質転換細胞を得ることができる。
【００４１】
また、レポーター遺伝子の発現量を測定する方法としては、個々のレポーター遺伝子に応じた方法を利用すればよい。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合には、前記形質転換細胞を数日間培養後、当該細胞の抽出物を得、次いで当該抽出物をルシフェリンおよびＡＴＰと反応させて化学発光させ、その発光強度を測定することによりプロモーター活性を検出することができる。この際、ピッカジーンデュアルキット（登録商標；東洋インキ製）等の市販のルシフェラーゼ反応検出キットを用いることができる。
【００４２】
上記II-１）〜II-３）において、「本蛋白質をコードする遺伝子を発現可能な細胞」、「本蛋白質を発現可能な細胞」又は「本遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞」と、被験物質との接触は、当該細胞が成育可能な条件で培養しながら行えばよく、例えば、哺乳動物細胞を宿主とする本発明形質転換細胞の場合、適宜ウシ胎児血清等の哺乳動物由来の血清を添加したＤ−ＭＥＭ、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ製）等の市販の培地中で培養できる。
【００４３】
上記II-１）〜II-３）において、「被験物質に接触させない対照細胞」とは、各第一工程で用いられる「本蛋白質をコードする遺伝子を発現可能な細胞」、「本蛋白質を発現可能な細胞」又は「本遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞」において、被験物質を接触させない場合の当該細胞を表す。「被験物質を接触させない場合」には、被験物質の代わりに被験物質と同量の溶媒（ブランク）を添加する場合や、本遺伝子、本蛋白質もしくはレポーター遺伝子の発現に影響を与えないネガティブコントロール物質を添加する場合も含まれる。
【００４４】
上記II-１）〜II-３）において、各第一工程及び第二工程で測定した本遺伝子、本蛋白質又はレポーター遺伝子の発現レベルに基づき、本遺伝子もしくは本蛋白質の発現誘導活性を有する被験物質を選択することができる。すなわち、被験物質を添加した細胞における本遺伝子、本蛋白質又はレポーター遺伝子の発現が被験物質を添加しない対照細胞での発現量と比較して１．２倍以上、好ましくは１．５倍以上、更に好ましくは２倍以上であれば、該被験物質は本遺伝子もしくは本蛋白質の発現誘導物質（発現促進物質）として選択することができる。
上記のように選択される本遺伝子もしくは本蛋白質の発現誘導物質もまた、耐糖能促進活性、即ち耐糖能を改善する活性、詳しくはインスリン応答性促進活性を有する本発明の糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤の候補物質である。
【００４５】
本蛋白質及びそのフラグメント、あるいは本発明探索方法で見出される化合物は、これらを医薬品として用いるにあたり、そのままもしくは公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、希釈剤、増量剤、結合剤、滑沢剤、流動助剤、崩壊剤、界面活性剤等などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、懸濁液などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて、全身的にまたは局所的に、経口投与または非経口投与することができる。非経口投与する場合には、静脈投与、皮内投与、皮下投与、直腸投与、経皮投与すること等が可能である。
【００４６】
前記の適当な投与剤型は許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等に有効成分（本蛋白質、又は本発明探索方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩等）を配合することにより製造することができる。また注射剤型で用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、通常、経口の場合には成人で１日あたり有効成分量として、数ｍｇ〜２ｇ程度、好ましくは５ｍｇ〜数十ｍｇ程度を、１日１〜数回にわけて投与することができる。注射の場合には成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよく、１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
【００４７】
上記有効成分物質として、本遺伝子そのものを挙げることができる。この場合は、本遺伝子を遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。これらの場合も、遺伝子治療用組成物の投与量、投与方法は患者の体重、年齢、症状などにより変動し、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【００４８】
上記遺伝子治療につき詳述すれば、該遺伝子治療は、通常のこの種の遺伝子治療と同様にして、例えば本遺伝子またはそれらの化学的修飾体を直接糖代謝関連疾患に罹患した哺乳動物（患者）の体内に投与することにより目的遺伝子の発現を制御する方法、もしくはこれらの遺伝子を患者の標的細胞に導入することにより該細胞による目的遺伝子の発現を制御する方法により実施できる。
【００４９】
ここで前記化学修飾体としては、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート、アルキルホスホアミデートなどの、細胞内への移行性または細胞内での安定性を高め得る誘導体（"Antisense RNA and DNA" WILEY-LISS刊、1992年、pp.1-50、J. Med. Chem. 36:1923-1937, 1993）  が含まれる。これらは常法に従い合成することができる。
本遺伝子は、その投与に当たり、通常慣用される安定化剤、緩衝液、溶媒などを用いて製剤化され得る。
【００５０】
本遺伝子を患者の標的細胞に導入する方法において、用いられるポリヌクレオチドは、好ましくは100塩基以上、より好ましくは300塩基以上、さらに好ましくは500塩基以上の長さを有するものとすればよい。また、この方法は、生体内の細胞に遺伝子を導入するin vivo法および一旦体外に取り出した細胞に遺伝子を導入し、該細胞を体内に戻すex vivo法を包含する(日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36 (1), 23-48 (1994)、実験医学増刊, 12 (15), 全頁 (1994)など参照）。この内ではin vivo法が好ましく、これには、ウイルス的導入法(組換えウイルスを用いる方法)と非ウイルス的導入法がある（前記各文献参照)。
【００５１】
上記組換えウイルスを用いる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルスなどのウイルスゲノムに本遺伝子のポリヌクレオチドを組込んで生体内に導入する方法が挙げられる。この中では、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスなどを用いる方法が特に好ましい。非ウイルス的導入法としては、リポソーム法、リポフェクチン法などが挙げられ、特にリポソーム法が好ましい。他の非ウイルス的導入法としては、例えばマイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法なども挙げられる。
【００５２】
遺伝子治療用製剤組成物は、本遺伝子又はこれらを含む組換えウイルスおよびこれらウイルスが導入された感染細胞などを有効成分とするものである。該組成物の患者への投与形態、投与経路などは、治療目的とする疾患、症状などに応じて適宜決定できる。例えば注射剤などの適当な投与形態で、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができ、また患者の疾患対象部位に直接投与、導入することもできる。in vivo法を採用する場合、遺伝子治療用組成物は、本遺伝子を含む注射剤などの投与形態の他に、例えば本遺伝子を含有するウイルスベクターをリポソームまたは膜融合リポソームに包埋した形態(センダイウイルス(HVJ)-リポソームなど)とすることができる。これらのリポソーム製剤形態には、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などが含まれる。また、遺伝子治療用組成物は、本遺伝子を含有するベクターを導入されたウイルスで感染された細胞培養液の形態とすることもできる。これら各種形態の製剤中の有効成分の投与量は、治療目的である疾患の程度、患者の年齢、体重などにより適宜調節することができる。通常、患者成人1人当たり約0.0001-100mg、好ましくは約0.001-10mgが数日ないし数カ月に1回投与される量とすればよい。本遺伝子を含むレトロウイルスベクターの場合は、レトロウイルス力価として、1日患者体重1kg当たり約1ｘ103pfu-1ｘ1015pfuとなる量範囲から選ぶことができる。本遺伝子を導入した細胞の場合は、1ｘ104細胞/body-1ｘ1015細胞/body程度を投与すればよい。
【００５３】
以下に本発明を実施例で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５４】
（ラット由来の本遺伝子のクローニング）
Rat Adipose cDNA   Marathon-Ready cDNA (CLONTECH社) 1μL、配列番号７で示された塩基配列からなるプライマー1 20pmol、配列番号８で示される塩基配列からなるプライマー2 20pmol、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ（宝酒造社）2U、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のバッファー 5μL及びTaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のdNTP mixture（2.5mM）4μLを含む50μLの反応液を調製した。ＰＣＲは、まず94℃で30秒間、次いで60℃で30秒間、更に72℃で1分間からなる保温サイクルを50回繰り返し、最後に72℃で5分間保温する条件にて行われた。ＰＣＲ後、アガロース電気泳動で約1.５Ｋｂｐを示すPCR産物を回収した。次いで回収されたＰＣＲ産物をpT7-Blue vector(Novagen社)にサブクローニングした後、当該プラスミドでE.coliJM109株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換した。形質転換された細胞を50μg/mLアンピシリン含有LB培地100mLで培養することにより得られる培養菌体からQIAGEN Plasmid Maxi kit(QIAGEN社)を用いて分離・精製することにより、ラット由来の本遺伝子（rMO64）を含むプラスミドを得た。
【実施例２】
【００５５】
（ラット由来の本遺伝子（ｒＭＯ６４）の塩基配列の決定）
実施例１で得られたPCR産物（約１．５Ｋｂｐ）を含むプラスミドを鋳型として、Thermo Sequenase IIダイ・ターミネーターキット（Amersham Pharmacia Biotech社）及びABI373DNA配列読み取り装置（PE Applied Biosystems社）を用いて、サンガーの方法〔F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson著、Proceedings of National Academy of Science U.S.A.(1977), 74, 5463-5467〕により、配列番号３で示される塩基配列からなるラット由来の本遺伝子の塩基配列を決定した。
【実施例３】
【００５６】
（マウス由来の本遺伝子のクローニング）
Mouse Normal Adipose cDNA (BioChain社)1μL、配列番号９で示される塩基配列からなるプライマー３ 20pmol、配列番号１０で示される塩基配列からなるプライマー４ 20pmol、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ（宝酒造社）2U、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のバッファー 5μL及びTaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のdNTP mixture（2.5mM）4μLを含む50μLの反応液を調製した。PCRは、まず94℃で30秒間、次いで65℃で30秒間、更に72℃で2分間からなる保温サイクルを50回繰り返し、最後に72℃で5分間保温する条件にて行われた。ＰＣＲ後、アガロース電気泳動で約1.2kbpを示すPCR産物を回収した。回収されたPCR産物をpT7-Blue vector(Novagen社)にサブクローニングした後、当該プラスミドでE.coliJM109株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換した。形質転換された細胞を50μg/mLアンピシリン含有LB培地100mLで培養することにより得られる培養菌体からQIAGEN Plasmid Maxi kit(QIAGEN社)を用いて分離・精製することにより、マウス由来の本遺伝子（ｍＭＯ６４）の塩基配列を含むプラスミドを得た。
【実施例４】
【００５７】
（マウス由来の本遺伝子の塩基配列の決定）
実施例３で得られたPCR産物（約１．５Kbp）を含むプラスミドを鋳型として、Thermo Sequenase IIダイ・ターミネーターキット（Amersham Pharmacia Biotech社）及びABI373DNA配列読み取り装置（PE Applied Biosystems社）を用いて、サンガーの方法〔F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson著、Proceedings of National Academy of Science U.S.A.(1977), 74, 5463-5467〕により、配列番号５で示される塩基配列からなるマウス由来の本遺伝子（mＭＯ６４）の塩基配列を決定した。
【実施例５】
【００５８】
（ヒト由来の本遺伝子のクローニング）
Human Adipocyte Marathon-Ready cDNA (CLONTECH社)1μL、配列番号１１で示される塩基配列からなるプライマー5 20pmol、配列番号１２で示される塩基配列からなるプライマー6 20pmol、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ（宝酒造社）2U、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のバッファー 5μL及びTaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のdNTP mixture（2.5mM）4μLを含む50μLの反応液を調製した。PCRは、まず94℃で30秒間、次いで65℃で30秒間、更に72℃で2分間からなる保温サイクルを50回繰り返し、最後に72℃で5分間保温する条件にて行われた。ＰＣＲ後、アガロース電気泳動で約1.2kbpを示すPCR産物を回収した。回収されたPCR産物をpT7-Blue vector(Novagen社)にサブクローニングした後、当該プラスミドでE.coliJM109株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換した。形質転換された細胞を50μg/mLアンピシリン含有LB培地100mLで培養することにより得られる培養菌体からQIAGEN Plasmid Maxi kit(QIAGEN社)を用いて分離・精製することにより、ヒト由来の本遺伝子（hＭＯ６４）の塩基配列を含むプラスミドを得た。
【実施例６】
【００５９】
（ヒト由来の本遺伝子の塩基配列の決定）
実施例５で得られたPCR産物（約１．５Ｋbp）を含むプラスミドを鋳型として、Thermo Sequenase IIダイ・ターミネーターキット（Amersham Pharmacia Biotech社）及びABI373DNA配列読み取り装置（PE Applied Biosystems社）を用いて、サンガーの方法〔F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson著、Proceedings of National Academy of Science U.S.A.(1977), 74, 5463-5467〕により、配列番号１で示される塩基配列からなるヒト由来の本遺伝子の塩基配列を決定した。
【実施例７】
【００６０】
（ヒト由来の本遺伝子の大腸菌発現用ベクター構築）
実施例６で得られたヒト由来の本遺伝子を含むプラスミド0.1μg、配列番号１３で示される塩基配列からなるプライマー７ 20pmol、配列番号１４で示される塩基配列からなるプライマー８ 20pmol、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ（宝酒造社）2U、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のバッファー 5μL及びTaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のdNTP mixture（2.5mM）4μLを含む50μLの反応液を調製した。PCRは、まず94℃で30秒間、次いで65℃で30秒間、更に72℃で2分間からなる保温サイクルを50回繰り返し、最後に72℃で5分間保温する条件にて行われた。PCR産物を制限酵素NdeIとBamHIにて消化し、アガロース電気泳動で約1.2kbpを示すPCR産物を回収した。回収されたPCR産物をpET16ｂ（Novagen社製）へクローニングしたのち、通常の方法に従って、大腸菌BL21(DE3)plysS（Novagen社製）に形質転換した。
【実施例８】
【００６１】
（ヒト由来の本タンパクの精製）
実施例７で作成した組換え体大腸菌（hMO64-pET16b/BL21）をアンピシリン50ug/mlを含むLB培地（トリプトン1w/v%、酵母エキス0.5w/v%、NaCl 0.5w/v%）30mLに接種後、37℃で一晩振とう培養した。培養後の培養液15mLをアンピシリン50ug/mlを含むLB培地（トリプトン1w/v%、酵母エキス0.5w/v%、NaCl 0.5w/v%）500mLに接種後、37℃で2時間培養後、IPTG（イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド）を終濃度0.5mMになるように添加し、37℃でさらに4時間培養した。遠心分離（８０００ｘｇ，５分間 ,４℃）により菌体を回収し、菌体を超音波破砕した後、遠心分離（１２０００ｘｇ，１５分間 ,４℃）を行いその上清を得た。得られた上清10mLをニッケルを結合させたアフィニティ担体1mL（Ni-NTA 、QIAGEN社製）を充填したカラムに通した。25mMイミダゾールを含む洗浄液（25mMイミダゾール、50mM Tris pH8.0）でカラムを洗浄した後、400mMイミダゾールを含む溶出液（400mMイミダゾール、50mM Tris pH8.0）で溶出させ、アフィニティ精製MO64タンパクを得た。アフィニティ精製タンパクMO64を20mM  Tris  pH7.0溶液にバッファー置換後、陽イオン交換クロマトカラム（S-Sepharose、アマシャムファルマシア社製）に吸着させ、20mM  Tris  pH7.0、  1M  NaClにより塩濃度勾配を上げることにより溶出させ、最終精製hMO64タンパクを得た。
【実施例９】
【００６２】
（ＤＩＯ（食餌性肥満誘導）マウスの作成）
ICRマウス個体について、それぞれを体重平均値が同程度になるように普通食群（Std食群）と高脂肪・高蔗糖食群（ＨＨ食群）に分け、約１０週齢以降からは８週間、普通食（D12328(Research Diets社製)）もしくは、高脂肪食（D12331(Research Diets社製)）を自由に摂取させた。飼育する際の環境条件は室温20〜26℃、湿度40〜70%、明暗各12時間（照明：午前6時〜午後6時）、換気回数12回／時に維持された飼育室にてステンレス製六連ケージ（W：750×D：100×H：100mm）内での個別飼育を実施した。
【実施例１０】
【００６３】
（ヒト由来本タンパクの肥満動物への投与実験−１）
実施例９に記載される方法により構築されたDIO（食餌性肥満誘導）マウス（雄性）１０匹を１群とした。これに、実施例８で調製されたヒト由来本タンパクのPBS緩衝溶液を、被験物質純分で１ｍｇ／ｋｇ−体重ｘ２回／日になるように、２週間腹腔内投与した。投与２週間後に耐糖能試験およびインスリン応答性試験を実施した。
耐糖能試験およびインスリン応答性試験については以下の方法で行った。
（１）糖負荷試験（OGTT）：実施例９に示した長期間食餌負荷を実施した後、前日から摂水下で18〜24時間絶食した動物にグルコース溶液（1g/kg、10mL/kg）を経口投与（ディスポーザブル金属性ゾンデを装着したポリプロピレン製ディスポーザブル注射筒）した。グルコース投与前、グルコース投与後20、60および120分後に動物の眼窩静脈叢からヘパリン加キャピラリーを用いて、約50μL血液を採取し、アントセンスII（ダイキン工業株式会社）を用いて酸素電極法にて全血の血糖値を測定した。
（2）インスリン負荷試験（ipITT）：上記OGTTを実施後、2週間程度間隔をおいて実施した。前日から摂水下で18〜24時間絶食した動物にインスリン溶液（0.35U/kg、10mL/kg）を腹腔内投与（注射針を装着したポリプロピレン製ディスポーザブル注射筒）した。インスリン負荷直前、30、60および120分後に上記（1）の方法にて血糖値を測定した。
（結果）
糖負荷試験ではヒト由来の本タンパクの投与マウス群はりん酸緩衝液投与群に比して、グルコース投与120分後に有意な血糖降下作用が認められた（表１）。また、インスリン負荷試験を実施し同様に比較したところ、ヒト由来の本タンパクの投与マウス群はりん酸緩衝液投与群に比して、グルコース投与６０分および９０分後に有意な血糖降下作用が認められた（表２）。これらの結果から、肥満マウス群（食餌性肥満誘導マウス）に対して、本蛋白質の投与により耐糖能およびインスリン応答性が改善することが示された。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
【表２】
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【実施例１１】
【００６６】
（肥満動物への本遺伝子の投与実験）
肥満動物への本遺伝子の投与はアデノウイルスにより行うことができる。アデノウイルスの作製はAdenovirus  Expression  Kit（宝酒造社）により行う。
ｉ）  コスミドベクターへの本遺伝子の挿入
実施例４で調製されたマウスMO６４遺伝子のセンス鎖をコスミドベクターpAxCAwt（宝酒造社）のSwaI部位に挿入し、pAxCAwt-ｍMO64を得る。得られたpAxCAwt-ｍMO64をλパッケージングキットGigapackXL（Stratagene社）を用いてインビトロパッケージングを行い大腸菌DH5αに感染させる。感染させた大腸菌を、50ml  50μg/mlアンピシリン含有LB培地で培養し、Lambda  DNA  purification  Kit(東洋紡社)によりコスミドDNAを大量調製する。
ｉｉ）  組換えアデノウイルスの作製
293細胞（宝酒造社）を10%FCS添加D-MEM培地（宝酒造社）で37℃、5%二酸化炭素下で培養する。ｉ）で調製されたpAxCAwt-ｍMO64  8μｇと制限酵素処理済みDNA-TPC（宝酒造）5μｌとを混合し、当該混合物を用いてリン酸カルシウム法にて293細胞にコトランスフェクションを行う。当該細胞をそのまま18時間培養後、培地を10%FCS添加D-MEM培地（宝酒造社）と交換し、さらに12時間培養する。培養終了後、後細胞をディッシュから剥がすことにより、回収された細胞懸濁液と293細胞を混ぜてさらに10%FCS添加D-MEM培地（宝酒造社）にて培養をつづけ、293細胞が完全に死滅した時点で培養液をドライアイスにて急凍する。凍結融解6回後、5000rpm  5分間遠心することにより得られた上清を1次組換えアデノウイルス液（AxCAwt-ｍMO64）として保存する。
ｉｉｉ）  組換えアデノウイルスの確認および力価測定
293細胞（宝酒造社）に前項で調製された1次組換えウイルス液を１０μl加え、これに5%FCS添加D-MEM培地（宝酒造社）を加えた後、当該混合物を37℃、5%二酸化炭素下で1時間培養する。さらに当該混合物に5%FCS添加D-MEM培地（宝酒造社）を加えた後、これを37℃、5%二酸化炭素下で培養する。3日間培養後、ウイルス感染させた293細胞（宝酒造社）の培養液を回収し、これをドライアイスにて急凍する。凍結融解6回後、5000rpm  5分間遠心することにより得られた上清を２次組換えアデノウイルス液として保存する。一方、前記操作により同時に得られた沈殿（細胞）も回収し、ドライアイスにて急凍する。回収された細胞に10ｘTNE（500mM  トリスー塩酸（pH=7.5）、1M  NaCl、100mM  EDTA）40μl及びproteinaseK(20mg/ml)4μl、滅菌蒸留水356μlを加え、当該混合液をVoltexでよく懸濁した。得られた懸濁物に、10%SDS  4μlを加え、これを50℃で1時間保温する。その後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ニッポンジーン社）処理後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡペレットを風乾させた後、20μg/ml  RNaseA（ニッポンジーン社）を含む滅菌蒸留水50μlに溶解することにより、組換えアデノウイルスDNA溶液を得る。得られた組換えアデノウイルスDNA溶液をXhoI  5U(宝酒造社)にて切断し、目的の断片（0.48Kbp）を確認する。続いてこの組換えアデノウイルスDNAを前記操作を繰り返すことにより継代培養する。このようにしてし、高力価組換えウィルスを作製する。力価の測定は既存の方法（特開平7-298877）により測定する。
ｉｖ）肥満動物への本遺伝子の投与
肥満動物である10週齢の雄性のＫＫＡｙマウス（日本クレア）に対して、アデノウイルス投与量1x1010PFU（1群10匹）の割合になるように、前項により作製された組換えアデノウイルスを生理食塩水で希釈することにより調製する。本水溶剤を実施例９で作成したＤＩＯ（食餌性肥満誘導）マウスに、マウス1匹当たり0.2mlずつシリンジを用いて腹腔内に投与する。投与２週間後に被験肥満動物であるDIOマウスに対して耐糖能試験およびインスリン応答性試験を実施する。
【実施例１２】
【００６７】
（形質転換非ヒト動物の作製：形質転換マウスの作製）
ｉ）導入遺伝子断片の調製
実施例４で調製されたマウスMO６４遺伝子を、マウスａＰ２プロモーター領域（約５．４ｋｂ）を有するプラスミド（Shimomura, I. et al., Genes & Developmemt, 12, 3182（1998））に挿入することにより、プラスミドｐＢｌｕｅＳＫ／ｍａＰ２ｐｒｏ／ｍＭＯ６４／ｐｏｌｙＡを得る。
得られたｐＢｌｕｅＳＫ／ｍａＰ２ｐｒｏ／ｍMO64／ｐｏｌｙＡをＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化することにより、マウスａＰ２プロモーター領域、マウス由来の本遺伝子及びＳＶ４０ＥポリＡを含む断片（約７．１ｋｂ）を約５μｇ取得する（以下、本導入遺伝子と記す。）。本導入遺伝子を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ（ｐＨ８．５）で０．１μｇ／μｌとなるように調製することで本導入遺伝子調製液を得る。
ｉｉ）受精卵の採取
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系の雌性及び雄性のマウス（８週齢以上）を用い、５単位の妊馬血清性ゴナドトロピンとヒト繊毛性ゴナドトロピンとの両者の腹腔内投与により過剰排卵を惹起し、体外受精によって前核期受精卵を得る。該受精卵は、卵丘細胞などを除去するために、ｍＷＭ培地（５．１４ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．３６ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、０．１６ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、０．５３ｇ／Ｌ  乳酸Ｃａ・５Ｈ2Ｏ、０．２９ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4／７Ｈ2Ｏ、０．１９ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ3、３７ｍｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ／２Ｎａ、１ｇ／Ｌ  グルコース、３．７ｍｌ／Ｌ  乳酸Ｎａ、３５ｍｇ／Ｌ  ピルビン酸Ｎａ、３ｇ／Ｌ  ウシ血清アルブミン、８０ｍｇ／Ｌ  ペニシリン、５０ｍｇ／Ｌ  ストレプトマイシン、５ｍｇ／Ｌ  フェノールレッド）で洗浄する。
ｉｉｉ）受精卵への本導入遺伝子の注入
マイクロインジェクションシステムは、マイクロマニピュレーター装置（ライカ製）とホフマン倒立型顕微鏡（ツァイス製）から構成される。前項に記載される本導入遺伝子調製液を約５００〜約１０００コピー／μｌに調製し、１３，０００ｒｐｍ×３分間遠心分離することにより得られた上清を導入本遺伝子溶液とする。マイクロマニピュレーターのインジェクションチャンバー内で、前項ｉｉ）に記載される受精卵を支持ピペットで固定し、注入用ピペットに入れた前記の本導入遺伝子調製液を雄性前核に約２μｌ注入する。注入後、ｍＷＭ培地で５％ＣＯ2存在下、３７℃で１２〜１６時間培養する。２細胞期に発生した胚を仮親の卵管に移植する。
ｉｖ）受精卵の仮親への移植
前項ｉｉｉ）に記載される胚を、予め、移植用に準備した同系の偽妊娠状態の雌性マウスの左右の卵管に１匹あたり２０〜２５個注入する。
ｖ）形質転換マウスの選抜
受精卵を移植した雌マウスから、約３週間後に仔を得る。仔が６週齢程度になったら尾の一部を切り取って染色体ＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡ中に本導入遺伝子由来の断片が存在するかについてＰＣＲ法により調べる。染色体ＤＮＡは通常の方法（例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載されている方法）により抽出する。得られた染色体ＤＮＡ５ｎｇを鋳型として、配列番号１５と配列番号１６に示される塩基配列からなるＤＮＡ各１０ｐｍｏｌをプライマーとして、ＥｘＴａｑポリメラーゼ２．５ユニット（宝酒造製）を用いて、９４℃で２分間、５８℃で２分間、７２℃で２分間の保温を１サイクルとしてこれを１サイクル、次に９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で１分間の保温を1サイクルとしてこれを５５サイクル、最後に７２℃で５分間保温の条件でＰＣＲ反応を行う。当該反応により得られるＰＣＲ反応産物をアガロースゲル電気泳動に供する。目的断片が確認された個体を、染色体中に本導入遺伝子が挿入された形質転換マウス（以下、本形質転換マウスと記す。）であると判断する。
ｖｉ）本導入遺伝子コピー数の解析
次に、本形質転換マウスにおける本導入遺伝子のコピー数について、通常のサザンブロッティング法（例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載されている方法）により調べる。前項で得られたプラスミドｐＢｌｕｅＳＫ／ｍａＰ２ｐｒｏ／ｍＭＯ６４／ｐｏｌｙＡを  ＢａｍＨＩで消化する。得られる約０．７Ｋｂの断片を市販の放射能標識キット（Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ、ベーリンガーマンハイム製）を用いて添付のプロトコールに従って32Ｐ標識し、検出プローブとして使用する（以下、本検出プローブと記す。）。本検出プローブは１００℃で１０分加熱した後に急冷して使用する。前項に記載される方法に従って抽出した染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩなどの制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動する。電気泳動後のゲルを１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１５Ｍ  クエン酸三ナトリウムを含む溶液（以下、１０×ＳＳＣと記す。）で洗浄した後、市販のナイロンメンブランＨｙｂｏｎｄ−Ｎ（アマシャムファルマシア製）にキャピラリー法でブロッティングする。該メンブランをポリエチレン袋に入れ、変性サケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌとなるように添加したＤＩＧ  ＥＡＳＹ  Ｈｙｂ溶液（ベーリンガーマンハイム製）を加えて、５０℃で２時間保温する。袋内の溶液を除去し、新たに、変性サケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌとなるように添加したＤＩＧ  ＥＡＳＹ  Ｈｙｂ溶液２〜３ｍｌを注入する。さらに、本検出プローブ１ｍｌ以下を添加し、５０℃で約１５時間保温する。保温後、メンブランを取り出して、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと記す。）を含む、１０×ＳＳＣを５倍に希釈した溶液中で室温下１５分間保温する。メンブランを取り出し、新たな１０×ＳＳＣを５倍に希釈した溶液中で保温する操作をさらに１〜２回繰り返す。さらに、０．１％ＳＤＳを含む、１０×ＳＳＣを１００倍に希釈した溶液中で、５０〜６８℃、３０分間保温する。メンブランを取り出し、余分な水分を除去した後、イメージングプレート（ＢＡＳ３−２０４０。富士フィルム製）を露光させる。露光後のイメージングプレートをイメージアナライザー（フジフィルム製）で分析し、メンブラン上のシグナルを検出する。
本導入遺伝子を導入しないマウス（以下、本野生型マウスと記す。）の染色体ＤＮＡを用いること以外は前記と同様にサザンブロッティング法を行い、メンブレン上のシグナルを検出する。本形質転換マウスと本野生型マウスのシグナルを比較し、本形質転換マウスにのみ検出されるシグナルの強度から、本遺伝子の導入コピー数の多少を評価する。
【配列表フリーテキスト】
【００６８】
配列番号７：PCR用プライマー
配列番号８：PCR用プライマー
配列番号９：PCR用プライマー
配列番号１０：PCR用プライマー
配列番号１１：PCR用プライマー
配列番号１２：PCR用プライマー
配列番号１３：PCR用プライマー
配列番号１４：PCR用プライマー
【配列表】
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