(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＥＲ−２タンパク質に対する免疫応答を刺激するための組成物であって、該組成物は、キメラペプチドであり、そしてＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープ、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープ、および該ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープを該Ｔｈエピトープに連結するためのリンカーを含み、該ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープは以下：
【化１−１】
0004658423.tif 000009
によって示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
【化１−２】
0004658423.tif 000010
によって示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；および
【化１−３】
0004658423.tif 000011
によって示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み；
ここで、該Ｔｈエピトープは、
【化１−４】
0004658423.tif 000012
によって示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み；そして
ここで、該リンカーは、配列ＧＰＳＬ、配列番号２０を含む、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記Ｔｈエピトープは、乱交雑Ｔｈエピトープである、組成物。
【請求項３】
被験体における免疫応答を刺激するための組成物であって、該組成物は、請求項１に記載のキメラペプチドを含む、組成物。
【請求項４】
被験体における癌を処置するための組成物であって、該組成物は、
請求項１に記載の組成物；および
薬学的に受容可能なビヒクル、
を含む、組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の組成物であって、前記被験体がヒトであり、そして乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、および結腸癌の癌のうちの１つを有するか、または上記の癌のうちの１つに対する素因を有する、組成物。
【請求項６】
請求項４に記載の組成物であって、前記ビヒクルが、生分解性であり、そして薬学的に受容可能な油／水エマルジョンを含むエマルジョン、およびポリラクチド−ポリグリコール酸ポリマーを含む生分解性ミクロスフェアまたはナノスフェアからなる群より選択される、組成物。
【請求項７】
前記油がスクアレンまたはスクアランである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ミクロスフェアが、直径０．１〜５０ｎｍであり、ポリ（Ｄ，ｌラクチド−コ−グリコリド）を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
癌の被験体を処置するための組成物であって、キメラペプチドの混合物を含み、該混合物は、２つ以上のキメラペプチドを含み、該２つ以上のキメラペプチドの各々は、ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープ、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープ、および該ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープを該Ｔｈエピトープに結合するリンカーを含み；該２つ以上のキメラペプチドの該ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープは異なり、そして以下：
【化１−１】
0004658423.tif 000013
によって示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
【化１−２】
0004658423.tif 000014
によって示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；および
【化１−３】
0004658423.tif 000015
によって示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み；
ここで、該Ｔｈエピトープは、
【化１−４】
0004658423.tif 000016
によって示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み；そして
ここで、該リンカーは、配列ＧＰＳＬ、配列番号２０を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の引用）
米国特許法１１９条（ｅ）項（１）に基づいて、本出願は、先願の米国仮特許出願６０／１４６，８６９号（１９９９年８月３日出願）の優先権を主張する。
【０００２】
本出願に記載される研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからの助成金ＰＨＳ／ＮＩＨ  Ｐ３０  ＣＡ−１６０５８およびＮＩＨ／ＮＣＩ  ＲＯ１  ＣＡ  ８４３５６−０１Ａ１により少なくとも一部後援された。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
（背景）
現在、乳癌を処置する最も一般的な形態は、外科手術、化学的介入、および／または放射線療法を含む。癌が規定された領域に限定されなければ、外科手術のみでは、癌を排除することができない。従って、手術部位近辺にあり、手術から逃れた癌細胞を破壊するために、術後、放射線処置がしばしば行われる。このような処置の副作用としては、皮膚過敏（ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）またはかゆみ、免疫系の妨害、ときおり吐き気、および稀に肺の影響を受けた部分が繊維性になる放射線維症（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）が挙げられる。化学療法はまた、外科手術後に用いられ得る。化学療法は、癌細胞に毒性の薬物を利用する。これは、完全には選択的系ではないので、正常細胞もまた影響を受ける。ネガティブな副作用としては、悪心、疲労、食欲喪失、脱毛および下痢が挙げられる。
【０００４】
現在の治療の欠点を鑑みて、乳癌を処置するためのさらなるアプローチを見出す試みが行われてきた。１つのこのようなアプローチは、免疫療法である。免疫療法的アプローチのための標的の１つは、ＨＥＲ−２タンパク質である。ＨＥＲ−２タンパク質（ＨＥＲ−２癌遺伝子の産物）は、種々の癌において過剰発現されている。インサイチュで腺管癌のうちの５０〜６０％、および全ての乳癌のうちの２０〜４０％、ならびに卵巣、前立腺、結腸および肺で生じる腺癌の実質的な割合において見出される。ＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現は、ヒトにおける悪性形質転換に関する。ＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現はまた、悪性疾患の攻撃性と密接に関連し、これは、全ての侵襲性乳癌のうちの１／４において見出される。ＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現は、乳癌および卵巣癌の両方において予後があまりよくないことと相関する。
【０００５】
最近の研究において、ＨＥＲ−２の細胞外結合ドメイン（ＥＣＤ）に対する抗体は、インビトロおよび動物モデルで腫瘍増殖に対する阻害効果を付与することを示した（Ｈｕｄｚｉａｋ，Ｒ．Ｍ.ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：１１−６５−７２，１９８９；Ｔａｇｌｉａｂｕｅ，Ｅ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７：９３３−７，１９９１；Ｄｒｅｂｉｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９１２９−３３，１９８６；Ｄｒｅｂｉｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２：２７３−７，１９８８；Ｄｒｅｂｉｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２：３８７−９４，１９８８およびＫａｔｕｍａｔａ，Ｍ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：６４４−８．１９９５）。さらに組換えヒト化抗ＨＥＲ−２モノクローナル抗体（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）の転移性ＨＥＲ−２過剰発現乳癌を有する患者における第ＩＩ相および第ＩＩＩ相の臨床試験は、単一の薬剤として１５％の全体応答割合を生じた。Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂはまた、細胞傷害性化学療法剤と組み合わせた場合に、生存性を改善することが示された（Ｂｅｓｅｌｇａ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４：７３７−４４，１９９６；Ｐｅｇｒａｍ，Ｍ．Ｄ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１６：２６５９−７１，１９８８）。組換えＨＥＲ−２タンパク質、ＨＥＲ−２  ＥＣＤ、またはラットｎｅｕ（これは、ＨＥＲ−２のラットホモログである）のＥＣＤを標的とする多くのワクチンアプローチが評価されてきた。例えば、ラットｎｅｕのＥＣＤを発現する組換えワクシニアウイルスで免疫したＮＦＳ系統マウスは、ｎｅｕ形質転換ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞でのその後のチャレンジに対して防御性抗体応答を発生させた（Ｂｅｒｎａｒｄｓ，Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６８５４−８，１９８７）。しかし、ＢＤＩＸラットの同じ免疫原での免疫は、抗体応答も生じず、同系のｎｅｕ発現Ｂ  １０４神経芽腫細胞の増殖を阻害もしなかった。このことは、このストラテジーがラットにおいて免疫応答を誘導するには不充分であったことを示唆する。ポリサッカリド−癌タンパク質複合体ワクチン（コレステリル基保有マンナンおよびプルランと複合体化したＨＥＲ−２  ＥＣＤの１４７のアミノ末端アミノ酸からなる）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＨＥＲ−２発現肉腫の拒絶を媒介した細胞性免疫応答および体液性免疫応答を誘導した（Ｇｕ，Ｘ．Ｇ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８：３３８５−９０，１９９８）。精製ラットｎｅｕ  ＥＣＤ（Ｅｓｓｅｒｍａｎ，Ｌ．Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４７：３３７−４２，１９９９）またはｎｅｕトランスフェクト同種異系マウス線維芽細胞（Ｃｅｆａｉ，Ｄ．，ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：３９３−４００，１９９９）のいずれかで免疫することにより乳腺腫瘍を発症させるようにしたラットｎｅｕトランスジェニックマウスにおいて、部分的な防御が示された。
【０００６】
上記研究の結果にも拘わらず、ヒトにおいてＨＥＲ−２またはＨＥＲ−２  ＥＣＤ（ＨＥＲ−２が変異していない）「自己」抗原を標的化する細胞ベースまたはタンパク質ベースのワクチンストラテジーを用いて、有効な免疫応答が生成され得るか否かは、未だに不確かなままである。従って、ＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現が関連している乳癌および他の悪性疾患を処置または予防するためのさらなる免疫療法的アプローチを行うことが望ましい。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、免疫系を刺激し、そしてＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現に関連する悪性疾患を処置するための新たな化合物および組成物を提供する。この化合物は、ＨＥＲ−２タンパク質の免疫原性エピトープおよびこのようなエピトープを含むキメラペプチドおよび多価ペプチドである。
【０００８】
第１の群の化合物は、本明細書中以降まとめて「ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープ」とよばれる。ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープは、約１５〜約５０アミノ酸、より好ましくは１７〜４０アミノ酸、最も好ましくは１８〜３５アミノ酸を含む。好ましくは、ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープは、以下の群またはその機能的等価物から選択される配列を含む：
【０００９】
【化５】
0004658423.tif 000002
上記に列挙されたＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープおよびそれらの機能的等価物は、ＨＥＲ−２タンパク質の細胞外ドメインと免疫反応性の抗体の生成を誘導する能力を有する。
【００１０】
本発明はまた、本発明のＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープまたはその機能的等価物の少なくとも１つを含むキメラペプチド（本明細書中以降「キメラＨＥＲ−２  Ｂ細胞ペプチド」といわれる）を提供する。好ましくは、このキメラＨＥＲ−２  Ｂ細胞ペプチドは、約３５〜約１５０アミノ酸長、より好ましくは約３５〜約７０アミノ酸長である。このキメラＨＥＲ−２  Ｂ細胞ペプチドは、３つのユニットを含む。第１のユニットは、ＨＥＲ−２Ｂ細胞エピトープまたはその機能的等価物を含む。第２のユニットは、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞エピトープ、好ましくは、乱交雑Ｔｈ細胞エピトープである。本明細書中で使用される場合、「乱交雑」Ｔｈ細胞エピトープは、ＭＨＣ拘束の迂回を補助するサイトカインの放出を促進するエピトープである。第２のユニットは、約１４〜約２２アミノ酸長、より好ましくは約１５〜２１アミノ酸長、最も好ましくは１６アミノ酸長である。好ましくは、このＴｈ細胞エピトープは、以下のアミノ酸配列のうちの１つを有する：
【００１１】
【化６】
0004658423.tif 000003
第３のユニットは、第１および第２のペプチドユニットを結合する。第３のユニットは、アミノ酸、すなわち、好ましくは約２〜約１５アミノ酸長、より好ましくは約２〜約１０アミノ酸長、最も好ましくは約２〜約６アミノ酸長のペプチドである。最も好ましいリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（配列番号２０）を含む。
【００１２】
本発明はまた、複数の（すなわち、少なくとも２つの）本発明のＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープまたはその機能的等価物およびＴｈ細胞エピトープを含む多価ＨＥＲ−２  Ｂ細胞ペプチドを提供する。ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープおよびＴｈ細胞エピトープは、コアβシート鋳型に結合されている。好ましくはこの鋳型は、ロイシン残基とリジン残基とが交互になっている２つの鎖を含み、これらは、リンカーにより結合される。このリンカーはアミノ酸であり、すなわち、好ましくは約２〜約１５アミノ酸長、より好ましくは約２〜約１０アミノ酸長、最も好ましくは約２〜約６アミノ酸長のペプチドである。最も好ましいリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（配列番号２０）を含む。
【００１３】
本発明はまた、キメラＨＥＲ−２  Ｂ細胞ペプチドまたは多価ＨＥＲ−２  Ｂ細胞ペプチドおよび薬理学的に受容可能なキャリアを含む免疫原性組成物に関する。好ましいキャリアは、生分解性ミクロスフェアである。このような免疫原性組成物は、ＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現が関連している悪性疾患を処置または予防するために有用である。
【００１４】
本発明はまた、上記のＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドに関する。このようなポリヌクレオチドは、組換え技術によりエピトープを生成するために有用である。本発明はまた、本発明のキメラＨＥＲ−２  Ｂ細胞ペプチドをコードする配列を有する単離されたポリヌクレオチドに関する。このようなポリヌクレオチドは、キメラＨＥＲ−２  Ｂ細胞ペプチドを調製するために有用である。このようなポリヌクレオチドはまた、ＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現が関連している悪性疾患を処置または予防するための免疫原性組成物（例えば、ＤＮＡワクチン）において有用である。好ましくは、このような免疫原性組成物は、筋肉内に投与される。
【００１５】
本発明はまた、細胞傷害性（Ｔｃ）細胞を活性化し得るＨＥＲ−２エピトープ（本明細書中以降「ＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープ」といわれる）を提供する。このＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープは、約８〜約１２アミノ酸、より好ましくは９〜１１アミノ酸を含む。好ましくは、このＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープは、以下の配列のうちの１つを含む：
【００１６】
【化７】
0004658423.tif 000004
本願ＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープはまた、上記に示されるＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープの機能的等価物であるペプチドを包含する。機能的等価物であるペプチドは、上記に示される配列の１つに少なくとも９０％同一である配列を有する。機能的に等価であるペプチドはまた、Ｔｃ細胞を活性化する能力を有する。
【００１７】
本発明はまた、キメラペプチドを提供し、これは、ＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープまたはその機能的等価物を含むキメラＨＥＲ−２  ＣＴＬペプチドとして下に言及される。キメラＨＥＲ−２  ＣＴＬペプチドは、３つのユニットを含む。第１のユニットは、ＣＴＬエピトープを含む。第２のユニットは、好ましくは、乱交雑（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）Ｔヘルパー細胞エピトープである。第３のユニットは、リンカーアミノ酸または第１ペプチドユニットおよび第２ペプチドユニットを結合するペプチドユニットである。
【００１８】
本発明はまた、複数の、すなわち、本願ＨＥＲ  ２  ＣＴＬエピトープの少なくとも２つまたはその機能的等価物およびＴｈ細胞エピトープを含む多価ＨＥＲ  ２  ＣＴＬペプチドを提供する。ＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープおよびＴｈ細胞エピトープは、コアβシートテンプレートに連結される。好ましくは、テンプレートが、ロイシン残基とリシン残基とが交互になっている２つの鎖を含み、これは、リンカーにより連結される。
【００１９】
キメラＨＥＲ−２  ＣＴＬペプチドおよび多価ＨＥＲ−２  ＣＴＬペプチドは、Ｔｃ細胞を活性化するために有用な免疫原である。このような活性化は、ＩＬ−２レセプターおよび少ない範囲でＩＬ−２、の発現を開始するようＴｃ細胞を誘導し、重要なサイトカインは、増殖およびエピトープを提示する標的細胞に対するサイトカイン活性を保有する機能的細胞傷害性リンパ球への、活性化されたＴｃ細胞の分化に必要とされる。本発明はまた、キメラＨＥＲ−２  ＣＴＬペプチドまたは多価ＨＥＲ−２  ＣＴＬペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む免疫原性組成物に関する。本発明はまた、このような動物に免疫原性組成物を投与することによる、哺乳動物にＴｃ細胞を活性化する方法に関する。
【００２０】
本発明はまた、上記の１つ以上のＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。このようなポリヌクレオチドは、組換え技術によりエピトープを産生するのに有用である。本発明はまた、キメラＨＥＲ−２  ＣＴＬペプチドをコードする配列を有する単離されたポリヌクレオチドを含む。このようなポリヌクレオチドは、キメラＣＴＬ細胞エピトープペプチドを調製するために有用である。このようなポリヌクレオチドはまた、ＨＥＲ−２オンコジーンが関連する悪性腫瘍を処置または予防するための免疫原性組成物（例えば、ＤＮＡワクチン）において有用である。
【００２１】
本発明はまた、多価のＢ／ＣＴＬペプチドに関し、これは、１つ以上のＴヘルパー細胞エピトープに連結される１つ以上のＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープに連結される、１つ以上のＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープを含む。このエピトープは、コアβシートテンプレートに連結される。本発明はまた、多価のＢ／ＣＴＬペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびこのようなポリヌクレオチドを含むＤＮＡベクターに関する。本発明はまた、Ｂ／ＣＴＬエピトープペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む免疫原性組成物に関する。
【００２２】
本発明はまた、ＨＥＲ−２タンパク質に対する被験体における免疫応答を刺激する方法に関する。このような方法は、被験体に対する本発明のキメラペプチドまたは多価ペプチドを投与することを含む。このような方法は、ＨＥＲ−２タンパク質の発現と関連する疾患状態に対する被験体の免疫の増強を生じる。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＨＥＲ−２タンパク質の免疫原性エピトープであるペプチドを提供し、これは、以下でＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープおよびＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープとして以下で言及される。
【００２４】
ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープは、ＨＥＲ−２タンパク質の細胞外ドメインと免疫活性である抗体の産生を生じる体液反応を引き起こすことが可能である。ＨＥＲ−２タンパク質およびそのラットホモログｎｅｕは、長さが約１２５５個のアミノ酸（ａａ）である１８５ｋｄの相対的分子量を有する膜貫通タンパク質である。ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質は、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）に４０％の相同性を有する、約６４５  ａａの細胞外結合ドメイン（ＥＣＤ）、高い疎水性膜貫通アンカードメイン（ＴＭＤ）、およびＥＧＦＲに対して８０％の相同性を有する約５８０ａａのカルボキシ末端の細胞質ドメイン（ＣＤ）を有する。ＨＥＲ−２タンパク質のアミノ酸配列およびこのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１１７３０に示される。
【００２５】
ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープは、配列の１つを有するペプチドを包含し、これは、以下の表Ｉに示される「参照配列」として以下に言及する。この参照配列は、抗原性の６つの相互関係を使用して、コンピューターで補助される分析を用いて選択され、そしてスコアされた：（ａ）個々の配列の鎖の柔軟性および可動性のプロフィールが、ＫａｒｐｌｕｓおよびＳｃｈｕｌｔｚ、Ｎａｔｕｒｗｉｓｓ  ７２：２１２−２１３、１９８５に従って算出された；（ｂ）水治療法プロフィールが、７つの残基範囲セッティング（ｒｅｓｉｄｕｅ  ｓｐａｎ  ｓｅｔｔｉｎｇ）に対して作製され、そして最終的にＫｙｔｅ  およびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｉ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２，１９８２の尺度を使用して３つの残基範囲と共に洗練された；（ｃ）水治療法プロフィールはＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３８２４−３８２８，１９８１のプログラムを使用して６残基のウィンドウに対して作製された；（ｄ）１．４Ａプローブを使用して水へのアミノ酸残基の曝露の分析が、Ｒｏｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８３４−８３８，１９８５の溶媒曝露アルゴリズムにより実行された；（ｅ）溶媒中へ接近そして突出するタンパク質の部分を予測する突出指数が、Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：４０９−４１３，１９８６の方法により算出された；（ｆ）５つの残基配列が抗原性である可能性は、Ｗｅｌｌｉｎｇ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １８８：２１５−２１８，１９８５の方法により決定された。基本的な前提は、予測に使用されるアルゴリズムが、タンパク質上の表面に曝露される領域に常に位置し、従って、多分抗体結合に関与している。配列が、それらのそれぞれの指数値に基づいて１〜６のスコアで与えられ、そしてランクされて：もっも高いランキング配列は、調べられた分析物（６／６）について最も高い個々のスコアを有し、そして連続的な候補は、次に高いスコア（５／６）などを有した。最もよい、スコアしたエピトープは、２次構造の特性と関連することによりさらにランク付けされ、例えば、両親媒性αへリックス配列またはβターンループ領域が、ランダムコイルフラグメントについて好まれる。ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ｓｕｂｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：４５−１４８，１９７８によるコンピュータープログラムが、２次構造（αへリックス、βストランド／シート、３ターン／ループ、ランダムコイル）およびへリックス両親媒性モーメントを予測するために使用された。静電気的イオン対およびへリックスセグメントにおけるへリックス双極子相互作用もまた、考えられる（例えば、疎水性／親水性バランス）。好ましくは、親水性／疎水性バランスは、２／２〜４／１である。
【００２６】
本明細書中に記載されるように、ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープはまた、以下の表Ｉに示されるペプチドの機能的な等価物であるペプチドを含む。このような機能的等価物が、対応する参照配列における１つ以上のアミノ酸が置換されるか、または１つ以上のアミノ酸が対応する参照配列から欠失されるかまたは付加された、変更した配列を有する。例えば、システイン残基は、欠失されるかまたは他のアミノ酸と置換され、復元において不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止し得る。必要に応じて、ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープが、グリコシル化される。
【００２７】
非保存的アミノ酸置換を有することが可能であるが、システインを交換するために行われる置換を除き、この置換は保存的アミノ酸置換であり、ここで、置換されるアミノ酸は、参照配列において対応するアミノ酸と、類似の構造的または化学的特性を有する。例として、保存的アミノ酸置換は、１つの脂肪族アミノ酸または疎水性アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）の、別のアミノ酸との置換；水酸基を含む１つのアミノ酸（例えば、セリンおよびスレオニン）の、別のアミノ酸との置換；１つの酸性残基（例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸）の、別のアミノ酸との置換；アミドを含む１つの残基（例えば、アスパラギンおよびグルタミン）の、別の残基との置換；１つの芳香族残基（例えば、フェニルアラニンおよびチロシン）の、別の残基との置換；１つの塩基性残基（例えば、リシン、アルギニンおよびヒスチジン）の、別の残基との置換；および１つの小アミノ酸（例えば、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン、およびグリシン）の、別の残基との置換、を含む。
【００２８】
好ましくは、欠失および付加は、上記で示される配列の１つの、アミノ末端、カルボキシ末端、または両方に位置する。変更の結果として、ＨＥＲ２  Ｂ細胞エピトープ等価物は、対応する参照配列に少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する。少なくとも９０％同一である配列は、１つの変更しか有さない（すなわち、参照配列の１０個のアミノ酸あたり、欠失、付加または置換、の任意の組み合わせ）。百分率の同一性が、ＤＮＡ  ＳＴＡＲプログラムにおけるＭＥＧＡＬＩＧＮプロジェクトを使用して、参照配列を有する改変体のアミノ酸配列を比較することにより、決定される。
【００２９】
対応する参照配列より長い機能的な等価物について、この機能的等価物は、参照配列および野生型ＨＥＲ２タンパク質における参照配列に隣接する配列と少なくとも９０％同一である配列を有する。
【００３０】
（表１．アミノ酸残基数によるランクの順に列挙した強化ヒトｐ１８５  ＨＥＲ−２予想Ｂ細胞エピトープ。アスパラギン（Ｎ）−結合グリコシル化部位は太字で下線を付す）
【００３１】
【表１】
0004658423.tif 000005
本発明はまた、「キメラＨＥＲ−２  Ｂ細胞ペプチド」として本明細書中以下に言及されるキメラペプチドを提供する。これは、ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープ、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞エピトープ、好ましくは、乱交雑Ｔｈ細胞エピトープおよびリンカーを含む。用いられる乱交雑Ｔｈ細胞エピトープに依存して、ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープを、Ｔｈ細胞エピトープのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに連結する。Ｔｈ細胞エピトープの位置および選択は、Ｂ細胞エピトープの構造特性（αヘリックスまたはβターンもしくは鎖のいずれか）に依存する。適切なＴｈ細胞エピトープを選択する方法は、Ｋａｕｍａｙａら、「ＤＥＮＯＶＯ」  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＯＦ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＩＣ  ＡＮＤ  ＡＮＴＩＧＥＮＩＣ  ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴＳ  ＡＳ  ＰＯＴＥＮＴＩＡＬ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ（１９９４），１３３−１６４頁、これは本明細書中で参考として援用される。Ｂ細胞エピトープキメラを含む種々の乱交雑Ｔ−ヘルパー細胞エピトープを惹起する免疫応答の要旨は、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｄｒｅａｍ  ｏｒ  Ｒｅａｌｉｔｙ」Ｋｕｍａｙａら、と題する総説において示され、そしてＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．（１９９６）において公開されている。
【００３２】
キメラＨＥＲ−２  Ｂ細胞ペプチドは、ＨＥＲ−２タンパク質の細胞外ドメインと相互作用し、かつこれに結合する抗体の産生を誘導するための有用な免疫源である。キメラＢペプチドはまた、患者の血清におけるＨＥＲ−２タンパク質に対する抗体を検出するための研究用ツールとして有用である。本発明に従って、キメラＢ細胞ペプチドＭＶＦ-ＨＥＲ-２（６２８-６４７）、ＨＥＲ-２（３７６-３９５）-ＭＶＦ、およびＨＥＲ-２（４１０-４２９）-ＭＶＦが、ウサギにおける抗体応答を惹起し、そしてこのような抗体が、（ａ）ＨＥＲ−２タンパク質を免疫沈降し、（ｂ）培養物中の細胞を過剰発現するＥＲ−２上のインタクトなＨＥＲ−２レセプターに結合し、そして（ｃ）インビトロでおよび異種移植マウスモデルで細胞を過剰発現するＨＥＲ−２の増殖を減少させることが測定されている。トランスジェニックマウスのキメラペプチドＭＶＦ-ＨＥＲ-２（６２８-６４７）での免疫は、このようなマウスにおける、コントロールマウスが腫瘍を発症した時点の少なくとも９ヶ月後に腫瘍発症を遅らせることもまた測定されている。
【００３３】
本発明は、ＨＥＲ−２タンパク質に対する細胞媒介応答を惹起する能力を有する、ＨＥＲ−２ＣＴＬエピトープを提供する。本明細書中で用いられる場合、用語ＨＥＲ−２ＣＴＬエピトープとは、以下の表２に示される配列の１つを有するペプチド、またはその機能的等価物を含む。この機能的等価物は、以下の表２に示される「参照配列」と呼ばれる、配列の１つに少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する。機能的等価物のＨＥＲ−２タンパク質、またはＨＥＲ−２タンパク質の細胞外結合ドメインに対する細胞媒介応答を惹起する能力は、対応する参照配列と同じか、またはこれよりも高い。
【００３４】
【表２】
0004658423.tif 000006
本発明はまた、キメラＨＥＲ−２ＣＴＬペプチドとして本明細書中以下で言及されるキメラペプチドを提供する。これは、上記のＨＥＲ−２ＣＴＬエピトープの１つ、またはその機能的等価物を含む。キメラＨＥＲ−２  ＣＴＬペプチドは、３つの単位を含む。第１の単位は、キメラＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープまたはその機能的等価物を含む。第２の単位は、乱交雑Ｔヘルパー細胞エピトープを含む。この第２の単位は、好ましくは、約１４〜約２２、より好ましくは、約１５〜２１、最も好ましくは、１６のアミノ酸の長さである。第３の単位は、第１の単位と第２の単位とを結合するリンカーである。このリンカーは、アミノ酸であるか、または好ましくは約２〜約１５のアミノ酸、より好ましくは、約２〜約１０のアミノ酸、最も好ましくは、約５〜約６のアミノ酸の長さであるペプチドである。最も好ましいリンカーは、配列：Ｇｌｙ−Ｐｒｏ-Ｓｅｒ-Ｌｅｕ（配列番号２０）を含む。
【００３５】
本発明はまた、複数のＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープを含む共リンカーキメラペプチドを含む。複数のＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープは、１〜５のアミノ酸の長さであるリンカーによりお互いに連結される。必要に応じて、このリンカーは、タンパク質分解部位を含む。１つの実施形態では、このリンカーは隣接する塩基性アミノ酸残基を含む。好ましくは、共リンカーキメラペプチドは、クラスＨＬＡ−Ａ３由来のＨＥＲ−２ＣＴＬエピトープ、クラスＨＬＡ−Ｂ７由来のＨＥＲ−２ＣＴＬエピトープ、クラスＨＬＡ−Ａ２由来のＨＥＲ−２ＣＴＬエピトープ、およびクラスＨＬＡ−Ｂ２７由来のＨＥＲ−２ＣＴＬエピトープを含む。この共リンカーキメラペプチドは、１４〜２２のアミノ酸の長さの乱交雑Ｔｈエピトープである第２の単位をさらに含む。この第２の単位は、リンカーにより第１の単位のアミノ末端またはカルボキシ末端に連結される。
【００３６】
（Ａ．エピトープおよび共リンカーキメラペプチドの調製）
ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープ、ＣＴＬエピトープ、キメラ、および多価ペプチドは、好ましくは、市販のペプチド合成機を用いて合成される。好ましくは、Ｋａｕｍａｙａら、「ＤＥＮＯＶＯ」  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＯＦ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＩＣ  ＡＮＤ  ＡＮＴＩＧＥＮＩＣ  ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴＳ  ＡＳ  ＰＯＴＥＮＴＩＡＬ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ（１９９４），１３３−１６４頁、これは本明細書中で参考として援用されるに記載される化学法が用いられる。
【００３７】
ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープ、ＨＥＲ−２ＣＴＬエピトープ、およびキメラペプチドはまた、無細胞翻訳系、ならびにエピトープおよびペプチドをコードするＤＮＡ構築物由来のＲＮＡ分子を用いて生成され得る。あるいは、エピトープまたはキメラペプチドは、それぞれのエピトープまたはキメラペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む、発現ベクターを用いて宿主細胞をトランスフェクトすることにより作製され、次いで、宿主細胞においてポリヌクレオチドの発現を誘導する。組換え産生について、エピトープ、キメラペプチド、またはその改変体をコードする１つ以上の配列を含む組換え構築物は、カルシウムリン酸トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレイプレイディング（ｓｃｒａｐｅ  ｌａｄｉｎｇ）、ボリスティックイントロダクション（ｂｏｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、またはインフェクションのような、従来の方法により宿主細胞へと導入される。
【００３８】
ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープ、ＣＴＲエピトープおよびキメラペプチドは、適切な宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母、細菌、昆虫細胞または他の細胞）中で、従来の技術を使用して適切なプロモーターの制御下で発現され得る。適切な宿主には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃｏｓ細胞および２９３ＨＥＫ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。適切な宿主菌株の形質転換および適切な細胞密度への宿主菌株の増殖に続いて、細胞を遠心分離により採取し、物理的または化学的手段により破壊し、そして得られた粗製の抽出物がエピトープまたはキメラペプチドのさらなる精製のために保持される。
【００３９】
形質転換された宿主細胞から組換えタンパク質を単離するための従来の手順（例えば、細胞ペレットまたは細胞培養培地からの最初の抽出、続いて塩析、そして水性イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー工程、および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ならびにアフィニティークロマトグラフィーを含む１つ以上のクロマトグラフィー工程による単離）を使用して組換えペプチドを単離し得る。グリコシル化エピトープおよびキメラペプチドを作製するために、組換え技術を使用することが好ましい。同じものを含むグリコシル化エピトープおよびキメラペプチドを作製するために、哺乳動物細胞（例えば、Ｃｏｓ−７およびＨｅｐ−Ｇ２細胞）を組換え技術において使用するのが好ましい。
【００４０】
上の表１および表２に示されるＨＥＲ−２  ＢエピトープおよびＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープの天然に存在する改変体がまた、例えば、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を用いて適切なｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。
【００４１】
（Ｂ．多価ＨＥＲ−２  Ｂ細胞ペプチド、多価ＣＴＬペプチド、および多価Ｂ／ＣＴＬペプチドの調製）
ＨＥＲ−２多価ペプチドを調製するための好ましい合成アプローチは、コンビナトリアルＦｍｏｃ／ｔブチル、Ｆｍｏｃ／ベンジルおよびＢｏｃベンジルストラテジーならびに第４レベルの差示的保護基（Ｎｐｙｓ）ストラテジーを利用する。このようなアプローチの詳細は、Ｌａｒｉｍｏｒｅら（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６９：６０７７−６０８９に示され、これは本明細書中で参考として具体的に援用される。
【００４２】
（Ｃ．表１に示されるＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープの機能的等価体の同定）
上にしめされるＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープの機能的等価体は、一般的に、エピトープの配列を改変し、次いで免疫応答（例えば、抗体の産生）を刺激する能力についてアッセイすることによって同定され得る。例えば、このようなアッセイは、一般的に、改変されたポリペプチドおよび乱交雑Ｔｈ細胞エピトープを含むキメラペプチドを調製し、キメラペプチドを試験動物に注射し、そして抗体をアッセイすることによって実行され得る。このような抗体は、血清および腹水を含む種々の体液において見出され得る。手短には、体液サンプルは、温血動物（例えばヒト）から単離される。このため、ＨＥＲ−２／ｎｅｕポリペプチドに特異的な抗体が存在するか否かを決定することが望ましい。体液を、免疫複合体がポリペプチドとこのタンパク質に特異的な抗体との間に形成し得るのに十分な条件および時間で、ＨＥＲ−２／ｎｅｕポリペプチドとともにインキュベートし、次いで、好ましくは、ＥＬＩＳＡ技術を使用してアッセイする。このような技術において、比色の変化を４９０ｎｍにて測定する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に対して１０，０００以上の力価を示す抗体の産生を誘導するエピトープが好ましい。本明細書中で使用されるように、１０，０００の力価は、バックグラウンドより上の０．２の吸収値を示す。
【００４３】
（Ｄ．表２に示されるＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープの機能的等価体を同定する方法）
表２に示されるＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープの機能的等価体を、配列を改変し、次いで得られたポリペプチドを免疫応答（例えば、Ｔｃ細胞の活性化）を刺激する能力についてアッセイすることによって同定する。ＣＴＬエピトープとの最初に遭遇において、少数の免疫Ｔ細胞がリンホカインを分泌し、エフェクターおよびメモリーＴ細胞に増殖および分化する。一次免疫反応はインビボで生じるが、インビトロで検出するのは難しい。メモリーＴ細胞による同じＨＥＲ−２抗原（すなわち、ＣＴＬエピトープ）との後の遭遇は、より早くより強力な免疫応答を導く。二次応答は、インビボまたはインビトロのいずれかで生じる。従って、インビトロ応答は、増殖の程度、サイトカイン産生の程度、またはＨＥＲ−２抗原に対して再曝露されるＴ細胞集団の細胞質溶解性活性の生成を測定することによって容易に評価される。Ｔ細胞の増殖の検出は、種々の公知の技術によって達成され得る。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成の速度を測定することによって検出され得る。増殖するように刺激されたＴ細胞は、ＤＮＡ合成の増加速度を示す。ＤＮＡ合成の速度を測定するための代表的な方法は、例えば、トリチウム化されたチミジン、新たに合成されたＤＮＡに組み込まれるヌクレオシド前駆体を用いてＴ細胞をパルス標識することによる。トリチウム化されたチミジンの量は、液体シンチレーション分光光度計を使用して決定され得る。Ｔ細胞増殖を検出するための他の方法には、インターロイキン−２（ＩＬ−２）産生、Ｃａ2+フラックス、または色素取り込み（例えば、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）の増加を測定することが挙げられる。あるいは、リンホカイン（例えば、インターフェロン−γ）の合成が測定され得るか、またはインタクトなＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に応答し得るＴ細胞の相対的な数が定量化され得る。
【００４４】
（ポリヌクレオチド）
本発明はまた、Ｂ細胞エピトープ、ＣＴＬエピトープ、および本発明のキメラペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドはまた、ストリンジェントな条件下、好ましくは高ストリンジェントな条件下で、ヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る配列を有するポリヌクレオチドを含む。ハイブリダイゼーション条件は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（１９８７）Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ  １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載されるように、核酸結合複合体、またはプローブの融解温度TMに基づく。本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、約Ｔｍ−５（プローブの融解温度の５℃下）〜Ｔｍの約２０℃下の範囲内で生じる「ストリンジェンシー」である。本明細書中で使用される場合、「高ストリンジェント」条件は、少なくとも０．２×ＳＳＣ緩衝液および少なくとも６５℃を使用する。当該分野で認識されるように、ストリンジェンシー条件は、変化する多くの要因（例えば、プローブの長さおよび性質（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）；標的配列の長さおよび性質、ハイブリダイゼーション溶液の塩および他の成分（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、およびポリエチレングリコール）の濃度）によって達成され得る。これらの要因の全ては、上記に列挙される条件と等価なストリンジェンシーの条件を生成するために変更され得る。
【００４５】
ＨＥＲ−２Ｂ細胞エピトープ、ＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープまたは本発明のキメラペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドは、全体的または一部に化学的方法、または好ましくは、当該分野で公知の組換え方法を使用して合成され得る。ＨＥＲ−２Ｂ細胞エピトープまたはＣＴＬエピトープをコードするポリヌクレオチドは、このようなポリヌクレオチドを含むクローンを同定するために、それぞれＨＥＲ−２タンパク質またはＣＴＬタンパク質に対して免疫特異的な抗体を用いて、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。
【００４６】
このポリヌクレオチドは、ＨＥＲ−２Ｂ細胞エピトープ、ＣＴＬエピトープまたはキメラペプチドを産生するために有用である。例えば、多価キメラペプチドをコードするＲＮＡ分子は、このようなポリペプチドを調製するための、細胞を含まない翻訳系において使用される。あるいは、ＨＥＲ−２Ｂ細胞エピトープ、ＣＴＬエピトープまたはキメラペプチドをコードするＤＮＡ分子は、発現ベクター中に導入され、そして細胞を形質転換するために使用される。適切な発現ベクターとしては、例えば、染色体、非染色体および合成のＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０、細菌プラスミド、ファージＤＮＡの誘導体；酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡとの組合わせ由来のベクター、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、禽痘ウイルス、仮性狂犬病、バキュロウイルス、およびレトロウイルス））が挙げられる。ＤＮＡ配列は、従来の手順によって発現ベクターに導入される。
【００４７】
従って、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド配列のうち１つ以上を含む組換え構築物に関する。適切な構築物としては、例えば、ベクター（例えば、プラスミド、ファージミド、またはウイルスベクター）が挙げられ、この中に、ＨＥＲ−２Ｂ細胞エピトープ、ＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープまたはキメラペプチドをコードする配列が挿入される。この発現ベクターにおいて、エピトープまたはキメラペプチドをコードするＤＮＡ配列は、発現制御配列（すなわち、プロモーター）に作動可能に連結され、これはｍＲＮＡ合成を指向する。このようなプロモーターの代表例としては、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージλＰＬプロモーター、および原核生物細胞または真核生物細胞あるいはウイルスにおける遺伝子の発現を制御することが公知の他のプロモーターが挙げられる。この発現ベクターはまた、好ましくは、翻訳開始および転写ターミネーターのためのリボソーム結合部位を含む。好ましくは、組換え発現ベクターはまた、形質転換された細胞（すなわち、異種ＤＮＡ配列を発現する細胞）の選択を可能にするために、複製起源および選択マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子）を含む。ＨＥＲ−Ｂ細胞エピトープ、ＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープまたはキメラペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、翻訳開始および終結配列を用いて、インフレームでベクターに組み込まれる。好ましくは、このポリヌクレオチドは、ＨＥＲ−２Ｂ細胞エピトープ、ＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープ、またはキメラペプチドのアミノ末端に作動可能に連結されたシグナル配列をさらにコードする。
【００４８】
ＨＥＲ−２Ｂ細胞エピトープ、ＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープまたはこのようなエピトープを含むキメラペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当該分野で周知の技術を使用して、組換えペプチドを発現するために使用され得る。このような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹに記載される。ＨＥＲ−２Ｂ細胞エピトープ、ＨＥＲ−２  ＣＴＬエピトープまたはこのようなエピトープを含むキメラペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、動物を免疫するために使用される。
【００４９】
（薬学的組成物）
キメラＨＥＲ−２Ｂ細胞ペプチドおよび多価ＨＥＲ−２Ｂ細胞ペプチド、ＨＥＲ−２ＣＴＬペプチド、およびそれらをコードするＨＥＲ−２Ｂ／ＣＴＬペプチドまたはポリヌクレオチドを含む薬学的組成物は、好ましくは、薬学的組成物（例えば、免疫原性組成物またはワクチン）としての使用のために処方される。このような組成物は、一般に、１つ以上のＨＥＲ−２キメラペプチドまたは多価ペプチド、または薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤と組み合わせてそれらをコードするポリヌクレオチドを含む。このようなキャリアは、使用される容量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。
【００５０】
エピトープに加えて、多価のペプチド、およびキメラペプチド（抗原として機能する）またはそれをコードするポリヌクレオチド、他の成分（例えば、抗原送達のためのビヒクルおよびタンパク質の免疫原性を改善するように設計された免疫刺激物質）は、好ましくは、薬学的組成物に含まれる。抗原送達のためのビヒクルの例として、アルミニウム塩、油中水エマルジョン、生分解性油ビヒクル、水中油エマルジョン、生分解性マイクロカプセル、およびリポソームが挙げられる。キメラペプチドを含むワクチンに対して、抗原送達のための好ましいビヒクルは、生分解性ミクロスフィアであり、これは、好ましくは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）から構成される。
【００５１】
当業者に公知の任意の適切なキャリアが本発明の薬学的組成物に使用され得る場合、キャリアの型は、投与の形態および実質的放出が所望されるかどうかに依存して変化する。非経口的投与（例えば、皮下注射）の場合、キャリアは、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、または緩衝液を含み得る。生分解性ミクロスフィア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド）はまた、本発明の薬学的組成物のためのキャリアとして使用され得る。必要に応じて、薬学的組成物は、アジュバントを含む。
【００５２】
ＨＥＲ−２キメラペプチドおよび多価ペプチドならびにそれらをコードするポリヌクレオチドは、被験体または細胞株において、体液性応答、好ましくは細胞性免疫応答（例えば、抗原特異的細胞溶解性Ｔ細胞の発生）を改善または誘発するのに有用である。本明細書中で使用されるように、用語「被験体」は、任意の温血動物、好ましくはヒトをいう。被験体は、癌（例えば、乳癌）に羅患されていてもよいし、または正常（すなわち、検出可能な疾患および感染を有しない）であってもよい。薬学的組成物は、特に、乳癌の家族履歴を有するか、または乳腫瘍が除去された女性を処置するのに有用である。
【００５３】
（処置の方法）
本発明はまた、ＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現に関連した癌を処置する方法を提供する。「処置」は、腫瘍の増殖を阻害または遅延または抑制することを意味する。このような癌として、乳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌および前立腺癌が挙げられる。この方法は、本発明の１つ以上のキメラペプチドまたは多価ペプチドを含む薬学的組成物を被験体に投与する工程を包含する。好ましい多価ペプチドは、以下のエピトープの１つ以上を含むものである：ＨＥＲ−２（６２８−６４７）、ＨＥＲ−２（３１６−３３９）、およびＨＥＲ−２（４８５−５０３）。好ましくは、３週間おきの複数回の筋肉内注射が、薬学的組成物を投与するために使用される。
【００５４】
（実施例）
例示の方法は、以下に記載されるが、本明細書中に記載されるものと同様または等価の方法および材料は、本発明のペプチド、組成物および方法の実施または試験に使用され得る。本明細書中で言及される全ての公報および他の引用文献は、それらの全体を通して、参考として援用される。材料、方法、および実施例は、例示するのみにすぎず、限定することを意図しない。
【００５５】
（ペプチド合成およびＨＰＬＣ精製）
ペプチドは、以前に記載されるように合成した（Ｋａｕｍａｙａ  １９９４）。簡潔に言えば、ペプチドは、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ９６００ペプチド合成機で、固体支持体として４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂を使用して合成した（置換０．５４ｍｍ／ｇ）。リンカーとして４−（ヒドロキシメチル）フェノキシ酢酸を使用するＦｍｏｃ／ｔ−ブチル合成法を使用した。最終脱保護工程後、保護基およびペプチド樹脂結合を、９０％ＴＦＡ、５％アニソール、３％チオアニソール、２％エタンジチオールで切断した。粗ペプチドを、３２．５℃で、Ｖｙｄａｃ  Ｃ４（１０ｍｍ×２５ｃｍ）カラムを使用するセミ分取（ｓｅｍｉｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＨＰＬＣによって精製した。緩衝液は、Ｈ2Ｏ中０．１％ＴＦＡおよびアセトニトリル中０．１％ＴＦＡであった。ペプチドは、「乱交雑な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）」Ｔ細胞エピトープＭＶＦ２８８−３０２（Ｋａｕｍａｙａ１９９４）：ＤＷ１ＭＶＦ（ＨＥＲ−２  ３７６−３９５）、ＭＶＦＤＷ４（６２８−６４７）、ＤＷ５ＭＶＦ（１１５−１３６）、ＤＷ６ＭＶＦ（４１０−４２９）を組み込む。
【００５６】
（ゲル濾過）
２０ｍｇ／ｍｌの酸性化ペプチド溶液（ＤＴＴ中０．１ｍｇ／ｍｌ）をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム上に充填し、そして５ｍｌの画分を０．１Ｍ  ＨＯＡｃで溶出した。ペプチドサンプルを分光学的に２３５ｎｍで測定し、吸光度の値を時間に対してプロットした。０．１を超える吸光度の値を有し、ＤＴＴの前に溶出するサンプルをプールし、凍結乾燥した。この反応をＥｌｌｍａｎ試薬による完了について、４１０ｎｍにて、モニターした。
【００５７】
（キャピラリーゾーン電気泳動）
ＣＺＥを、ＩＢＭコンピューターとインターフェースしたＢｅｃｋｍａｎ  Ｐ／ＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２１００で行った。サンプルを、１００ｍＭホウ酸化ナトリウム中で、５０ｃｍキャピラリーを使用して、２０分間以上電圧分離した（１５ｋＶ）。溶出物を２１４ｎｍでモニターした。
【００５８】
（円二色性および質量分析）
測定を、ＩＢＭコンピューターとインターフェースしたＪＡＳＣＯ  Ｊ−５００分光偏光計で行った。機器を、アンモニウム−ｄ−１０−カンファースルホネートの０．０６％（ｗ／ｖ）溶液中で較正した。ペプチド（水中のペプチドストックの希釈により、６２．５〜２５０μＭ）ＣＤスペクトルを、０．１ｃｍ光路長の円柱状石英キュベット（Ｈｅｌｌｍａ）中で周囲の温度で測定した。平均残余楕円率（ｍｄｅｇ）を、関係［θ］＝１００θ／ｃｎｌを使用して計算し、ここで、θは楕円率であり、ｃはペプチド濃度（ｍＭ）であり、ｎはペプチド中のアミノ酸の数であり、そしてｌは光路長（ｃｍ）である。高速原子衝撃（ｆａｓｔ  ａｔｏｍ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（ＦＡＢ）質量分析測定を、ｉｎｎｅｇａｎＭａｔ−９００機器で行った。
【００５９】
（酢酸水銀）
ペプチドを少量の水中に溶解し、１００ｍｇ／ｍｍのＳ−ｔＢｕ溶液（２〜１０倍過剰）を加えた。ペプチドを真空下に置き、撹拌下、５５℃の水浴中で２−メルカプトエタノールによって沈殿させた。湿らせたＣｅｌｉｔｅに通して濾過した後、濾液をロータリーエバポレーターにかけ、水中０．１％ＴＦＡで酸性化し、凍結乾燥した。
【００６０】
（生物学的手順）
（免疫および動物）
雌性ニュージーランド白ウサギを、Ｍｏｈｉｃａｎ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｒａｂｂｉｔｒｙ（Ｌｏｕｄｅｎｖｉｌｌｅ，ＯＨ）から得た。ウサギを、皮下の複数の箇所にて、ＣＦＡ中で乳化した１ｍｇのペプチドの全てを用いて免疫化した。後のブースター注射（ＰＢＳ中の１ｍｇおよび５００μｇ）を最初の免疫化の３週間後および６週間後に与えた。血清を回収し、３０分間、５６℃までの加熱によって補足的に不活性化した。血清アリコートを−５℃〜−１５℃で保存した。抗体を硫酸アンモニウム沈殿によって精製した：飽和硫酸アンモニウム溶液（ＳＡＳ）のストック溶液を調製し、高圧滅菌し、そして４℃まで冷却した。抗体を、冷却室中の撹拌下でＳＡＳを３５％ｖ／ｖまでゆっくり加えることによって沈殿させた。サンプルを１４，０００×ｇで２０分間遠心分離し、この上清（ｓｕｐｅｍａｔｅ）を−２０℃で保存した。ペレットを元の容量の半分で０．１Ｍ  ＰＢＳで溶解した。次いで、画分をＳｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒカセット（Ｐｉｅｒｃｅ）中に置き、２００容量を越えるｐＨ８、０．１５ＭのＮａＣｌの頻繁な変化に対して透析した。この生理食塩水を数滴の０．１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ８にした。ＩｇＧ濃度を、放射免疫拡散（ＲＩＤ）（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ，ＵＫ）によって決定した。モノクローナル抗体をＯｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅから購入した。
【００６１】
（直接ＥＬＩＳＡ）  Ｕ字底のポリ塩化ビニルプラスチックアッセイプレートを、１００μｌのＰＢＳ中２μｇ／ｍｌの抗原で、４℃で一晩コートした。非特異的結合部位を、２００μｌのＰＢＳ−１％  ＢＳＡで１時間ブロックし、そしてプレートをＰＢＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０および１％ウマ血清を含む、リン酸緩衝化生理食塩水）で洗浄した。ＰＢＴ中１／５００のウサギ抗血清または１／５０のマウス抗血清を、抗原コートプレートに添加し、ＰＢＴ中１：２に段階希釈し、そして２時間室温でインキュベートした。プレートの洗浄後、５０μｌの１／５００  西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧまたはヤギ抗マウスＩｇＧを、各ウェルに添加した。過剰の抗体結合体を除去し、そして結合した抗体を、０．５ｍｇ／ｍｌの２，２’−アミノビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）を発色団として含有する、２４ｍＭ  クエン酸、５ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．２）中の０．１５％Ｈ2Ｏ2  ５０μｌを使用して検出した。発色を１０分間進行させ、そして反応を、２５μｌの１％ドデシル硫酸ナトリウムで停止した。吸光度を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＭＲ７００  ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４１０ｎｍで測定した。結果を、バックグラウンドを差し引いた後の二連のウェルの平均吸光度として表す。
【００６２】
（細胞培養）  保存培養物を、５％  ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で維持した。全ての培養培地、ＦＣＳおよび補助剤を、ＧＥＢＣＯ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入した。ヒト乳腺癌細胞株ＳＫＢＲ−３およびＭＣＦ−７を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得て、そして１０％  ＦＣＳおよびＬ−グルタミンを補充したＭｃＣｏｙ  ５ＡまたはＤＭＥＭ中で継代培養した。Ｃａｖ−１を、１０％  ＦＣＳおよびＬ−グルタミンを含む、ＲＰＭＩ  １６４０中で維持した。Ｃａｖ−１は、冷凍保存しそしてその後培養した、新鮮な結腸腫瘍検体から誘導し；これは、検出可能なレベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現しない。ＳＫＢＲ３は、ＨＥＲ−２タンパク質を過剰発現する乳房腫瘍細胞株であり、ＭＣＦ−７は、通常の濃度のこのタンパク質を発現する。
【００６３】
（免疫沈降およびウエスタンブロッティング）  ０日目に、１．０×１０7のＳＫＢＲ３細胞を、７５ｃｍ3細胞培養フラスコ中にプレートし、一晩接着させた。抗ペプチド抗体を、４時間添加した（１００μｇ／ｍｌ）。この反応を、培地を吸引しそして直ぐに氷冷０．１Ｍリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を添加することによって停止した。細胞をトリプシン処理し、冷却したハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄した。３ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4、１０μｇ／ｍｌのアプロチニンおよびロイペプチンの各々を含有する、冷却した溶解緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８；１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭ  フッ化ナトリウム；１％  ＮＰ−４０、０．１％  ＳＤＳ）を、１００μｌのＨＢＳＳ中に再懸濁した細胞に添加した。４℃で２０分間の緩やかな回旋によって、溶解を達成した。遠心分離（１４，０００×ｇ、２０分）して細胞細片を除去した後、溶解物を、３〜５μｇの抗体および３０μｌのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）と共に一晩インキュベートした。ビーズを、遠心分離（１４，０００×ｇ、３０秒）によってペレット化し、１ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4を含む溶解緩衝液中で２回洗浄し、そしてＳＤＳサンプル緩衝液中で５分間煮沸した。
【００６４】
タンパク質を、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースに転写し、そして抗体をプローブした。タンパク質の移動を、前染色した分子量スタンダード（ＢｉｏＲａｄ）でモニターした。免疫反応性のバンドを、増強化学ルミネセンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンを使用して検出した。
【００６５】
（間接的結合アッセイ）  ＳＫＢＲ３細胞またはＭＣＦ−７細胞を、Ｖ字底プレート（Ｌｉｎｂｒｏ、ＭｃＬｅａｎ  ＶＡ）中、５，０００細胞／ウェルでプレーとした。細胞を、種々の濃度の抗体と共にインキュベートした。ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄した後、細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合体化ヤギ抗ウサギ抗体またはヤギ抗マウス抗体と共に１時間インキュベートし、そしてホルマリンで固定した。マウスモノクローナルＡｂ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｎｅｃｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を、ポジティブコントロールとして用い、抗ＣＤ３  Ａｂを、ネガティブコントロールとして用いた。細胞を、４８８ｎｍでの励起のためのアルゴンレーザーおよびＦＩＴＣ蛍光に対する５２５ランのバンドパスフィルターを有するＣｏｕｌｔｅｒ  ＥＬＩＴＥフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）によって分析し、５．０×１０3細胞を、各サンプルについて計数し、最終処理を行った。細片、細胞クラスターおよび死細胞を、光散乱評価によってゲートアウトし、その後、単一パラメーターのヒストグラムを作成した。
【００６６】
（細胞増殖に対するＡｂの効果）  ＳＫＢＲ３、ＭＣＦ７およびＣＡＶＩ細胞を、０日目に、種々の濃度のＡｂと共に、Ｖ字底プレート中に５，０００細胞／ウェルでプレートした。３日目に、［3Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）を細胞にパルスし、この時、これらの細胞を、１時間、−２０℃のフリーザー中に配置した。室温で解凍した後、細胞を、ＰＨＤ細胞回収機（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）で回収した。サンプルを、５ｍｌのＲｅａｄｙ  Ｓａｆｅ液体シンチレーション混液（Ｂｅｃｋｍａｎ）中でインキュベートし、放射活性を、βカウンターで測定した。結果を、平均ＣＰＭ＋／−標準偏差（ＳＤ）として表す。
【００６７】
（ＣＴＬアッセイ：インビトロ刺激）  鼡径部および大動脈周囲のリンパ節（ＬＮ）を、免疫後７〜１０日で取り出す。次いで、１時間、１μＭの適切なＣＴＬペプチドを前パルスした１．５×１０5の照射（１０，０００ラド）Ｐ８１５細胞と共に共培養することによって、ＬＮ細胞（４×１０6〜５×１０6）をインビトロで刺激した。使用した培養培地は、ｃＤＭＥＭ（１０％  ＦＣＳを補充したＤＥＭＥ）である。上清は３０Ｕ／ｍｌ（最終）のＩＬ−２、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓおよび５×１０5Ｍ  ２−メルカプトエタノールを含む。
【００６８】
インビトロ刺激７日後、ＣＴＬ活性を、標準的なクロム放出アッセイにおいて試験する。Ｐ８１５細胞（１０6）を、適切なペプチド（１μＭ）の存在下または非存在下で、３７℃で１時間、１５０μＣｉのクロム酸ナトリウム［51Ｃｒ］で標識し、そして３回洗浄した。標識した標的（２×１０3）を、Ｖ字底の９６ウェルプレート中に２００μｌ容量で、予め決定した比の刺激したＬＮ細胞と共に同時インキュベートした。３７℃で４時間のインキュベーション後、上清（１００μｌ）を、γ計数のために回収する。特異的溶解％を、１００×［（実験での放出−自然放出）／（全体−自然放出）］として計算する（Ｖａｌｍｏｒｉら、１９９４）。
【００６９】
（インビボでの抗体の効果）  ＨＥＲ２細胞（３×１０6）を、２５０μＬ  ＰＢＳ中に懸濁し、氷上で２５０μｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）と混合し、そしてマウスに皮下注射した。ポリクローナル抗体を、２ｍｇ／マウスの全濃度で、９日目および１１日目にｉ．ｐ．注射した。腫瘍体積を、カリパスで１週間に２回測定し、そして式（長さ×幅×高さ）によって計算した。
【００７０】
（実施例１−ペプチドＤＷＩ  ＭＶＦ；ＨＥＲ−２（３７６−３９５）ＭＶＦ）
ＤＷ１と名付けたエピトープは、乱混雑なＴｈ細胞エピトープＭＶＦに連結した、ＨＥＲ−２タンパク質のアミノ酸３７６〜２９１を含む。ＤＷ１は、わずかにターン傾向を有する、α−ヘリックスであると予測される。
【００７１】
（合成）：２０アミノ酸のＨＥＲ−２配列を、４アミノ酸連結配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（配列番号２０）によってＭＶＦ２８８〜３０２のＮ末端に連結させた。この得られたペプチドを、ＤＷ１ＭＶＦと名付け、これは、Ｎ末端側でのＤＷ１の配置を示し、対して、ＭＶＦＤＷ１は、Ｃ末端側の配置を表す。最初のアミノ酸を手動で連結し、そしてＫａｉｓｅｒニンヒドリン試験によって完了をモニターした。その後のカップリングを、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ９６００ペプチド合成機上で行った。最後の脱保護後、ペプチドを、試薬ＰＵで樹脂から切断した。このペプチドは、Ａｒｇ−２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（ＰＭＣ）およびＨｉｓを含むので、長い切断時間が必要である（ヒスチジンが存在する場合、黄色の切断溶液が観察される）。
【００７２】
（精製および特徴付け）：ペプチドを回転エバポレート（ｒｏｔａｒｙ  ｅｖａｐｏｔａｔｅ）して、ＴＦＡを除去し、冷エーテルで沈殿させ、そして水／エーテル抽出した。抽出はかなり容易であり、そしてゲル濾過し、凍結乾燥したペプチドのＨＰＬＣ分析により、２〜３の欠失ペプチドが示された。このペプチドは、ＤＴＴの前に２つのピークとして溶出した。これらをプールし、そして分析ＨＰＬＣに供した。
【００７３】
半調製（ｓｅｍｉｐｒｅｐ）精製ＤＷ１ＭＶＦの分析ＢＰＬＣにより、１つの大きいピークを同定したが、ＣＺＥは、異なる電荷の３つの種を同定した。完全なペプチドは、中性のｐＨで、６つの負に荷電した種および４つの正に荷電した種を含む。質量分析の結果、大きいピークは、分子量４４７２の目的のエピトープであることが確認された。稀酢酸液中のペプチドのＣＤスペクトルは、わずかなランダムコイルを示す。ＴＦＥ中では、構成は、わずかなαらせんに偏向し、これは１９０〜１９５ｎｍの範囲で最大強度、そして２０８ｎｍおよび２２２ｎｍで最小強度であった。ペプチドの螺旋構造［θ222，−５，０００］を、１００％螺旋θ222についてのポリスチレンの平均楕円率＝−３３，０００として、Ｃｈｅｎの式を用いて算出した。
【００７４】
（実施例２−ペプチドＭＦＶＤＷ４；ＨＥＲ−２（６２８−６４７）ＭＶＦ）
ＭＶＦＤＷ４は、ＨＥＲ−２タンパク質の６２８〜６４７のアミノ酸から伸長するペプチドの変化した配列を含む。ネイティブ配列は、３つのシステイン残基を含む。この残基のジスルフィド結合対は未知である。６３４位および６４２位のシステインは、架橋を形成する能力を有するので、Ｃｙｓ６３０をＧｌｙで置換した。システインのグリシン置換は、その位置でのＲ基の相対サイズを保存するための１つの方法である。リンカーに結合したＤＷ４（６２８〜６４７）ペプチドをまず作成することにより合成が進行し、次いで、ＮＷＦ（２８８〜３０２）ヘルパーＴ細胞配列の付加によってＮ末端に配列が伸長する。これにより、ＭＶＦＤＷ４ペプチドを産生した。
【００７５】
ジスルフィド結合を生成するため、ｔＢｕｔ保護基を切断して、遊離のチオール形態を得た。酢酸水銀／２−メルカプトエタノール手順によって、ジスルフィド結合したマルチマーの生成を減じる。粗産物およびサンプルの分析ＨＰＬＣを比較した。粗サンプルにおいて、２つの先鋭なピークの直後に広い不明瞭な肩が続く。処理サンプルによって、最初のピーク（ｌｅａｄｉｎｇ  ｐｅａｋ）およびより広がった第２のピークのサイズの減少が示された。正しい画分を、質量分析によって後に同定した。この分析によってこのペプチドの分子量が４６１２と確認された。
【００７６】
新しいピークの同定を行うため、過酸化水素またはジチオスレイトール（ＤＴＴ）を粗サンプルに添加した。過酸化水素の添加は、酸化を生じた。
【００７７】
２ＲＳＨ＋Ｈ2Ｏ2→Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ＋Ｈ2Ｏ
この反応により、１１．５分で溶出する単一の大きいピークが得られた。これは、粗サンプルの最初のピーク（ｌｅａｄｉｎｇ  ｐｅａｋ）に対応する。ＤＴＴ処理は、以下の反応スキームによる還元を生じる。
【００７８】
Ｒ−ＣＨ2−Ｓ−Ｓ−ＣＨ2＋ＤＴＴ→Ｒ−ＣＨ2−ＳＨ＋ＨＳ−ＣＨ2−Ｒ
ＤＴＴ処理産物のプロフィールは、出発物質に似ていた。これらのプロフィールは、出発物質が還元ペプチドおよび酸化ペプチドの混合物であることを示す。
酢酸水銀処理により、還元種に適した濃度に偏向する。
【００７９】
（実施例３−ペプチドＤＷ５ＭＶＦ；ＨＥＲ−２（１１５〜１３６）ＭＶＦ）
（合成）：ＭＶＦ２８８〜３０２および４残基アミノ酸リンカーを、上記実施例１に記載のように、樹脂に連結し、この配列にＨＥＲ−２タンパク質の１１５〜１３６のアミノ酸を続けた。これによりペプチドＤＷ５ＭＶＦを生成した。この配列は、高い凝集能を有するβターンであると予測される。これは、二重カップリング重要残基Ａｌｌ５、Ｖ１１６、Ｔ１２７、Ｖ１２９およびＳ１３３を必要とした。
【００８０】
（精製および特徴付け）：ＤＷ５ＭＶＦを切断し、そしてエーテルおよび水で抽出した。抽出は、ペプチド形態高密度ではかなり困難で、粘着性に凝集し、酢酸の添加によってほとんど可溶にならなかった。粗サンプルの分析ＨＰＬＣにより、１つの顕著なピークがわずかな二重物であることが示された。半調製的ＨＰＬＣを用いて、この二重物を分離した。凍結乾燥サンプルを、分析ＨＰＬＣ用に、稀酢酸中で容易に溶解した。サンプルを飛行時間質量分析に供し、そして正確な分子量４４３１を得た。ペプチドは、単一のピークとして１５．５分で溶出する。
【００８１】
（実施例４−ペプチドＤＷ６ＭＶＦ；ＨＥＲ−２（４１０−４２９）ＭＶＦ）
ＨＥＲ−２の残基４１０〜４２９（ＤＷ６と名付けられた）は、ＤＷ１ＭＶＦと同じ領域由来の可能性のある免疫原性エピトープを示す。ＤＷ１ＭＶＦの成功によって、初期のＦＡＣＳ実験では、本発明者らは、この領域に対してさらなる抗体が惹起されることを望んだ。残基４１０〜４２９を、以前に記載のとおり、ＭＶＦ／４−残基−リンカー配列へのＮ末端付加によって合成した。最終産物は、ＤＷ６ＭＶＦであった。そのＣ末端で中度〜高度凝集能を有するβ−ターンであることが期待される。
【００８２】
（合成）：ＤＷ６配列は、ＦＭＯＣ化学を用いてＭＶＦ配列に連結したＣ末端に結合された。コンピューターアルゴリズムは、高い凝集能を予想し、従って、カップリング時間の延長および／または２倍のカップリングを用いて、凝集を最小限にすることを試みた。
【００８３】
（精製および特徴付け）：ＴＦＡ切断によって、ＤＷ６ＭＶＦペプチドを得て、これをエーテル／水抽出した。このワークアップは、高い程度の凝集によって、困難であることをなお証明した。ＨＰＬＣによって示されるように、有意な濃度の欠失ペプチドが存在した。半調製ＢＰＬＣで、大きいピークを分離し、これを１３〜１４．５分で溶出した。分析ＢＰＬＣにより、１７分で溶出する単一のピークが示された。半調製ＨＰＬＣおよび分析ＨＰＬＣに関する保持時間の差異は、サンプル注入の時間の３分の違いによる。アミノ酸分析によって、それが目的のペプチドと同一であることを確認した。誘導体化アミノ酸を、そのフェニルチオヒダントイン誘導体として分析した（実測値（理論値））：Ａｓｐ（２．９９（３））、Ｇｌｕ（４．３２（４））、Ｓｅｒ（４．７７（５））、Ｇｌｙ（３．５３（４））、Ｈｉｓ（１．６２（２））、Ａｒｇ（１．０８（１））、Ｔｈｒ（０．０２（０））、Ａｌａ（０．９７（１）、Ｐｒｏ（３．０２（３））、Ｔｙｒ（０．９５（１））、Ｖａｌ（３．８６（４））、Ｍｅｔ（０．０９（０））、Ｃｙｓ（０（０））、Ｉｌｅ（２．８７（３））、Ｌｅｕ（９．３４（９））、Ｐｈｅ（０．９３（１））、Ｌｙｓ（２．２８（２））およびＴｒｐ（０（０））。
【００８４】
（実施例５および６−ＤＷ２（３９１〜３９９）およびＤＷ３（３７６〜３９９）
ＤＷ２は、ＨＥＲ−２タンパク質のアミノ酸３９１〜３９９を含む。ＤＷ３は、ＨＥＲ−２タンパク質のアミノ酸３７６〜３９９を含む。
【００８５】
（合成）：残基３９１〜３９４を樹脂に結合する。残基３７６〜３９０の付加により、残りを用いて、合成を続けた。これにより、３７６〜３９９の最終ペプチド（ＤＷ３）を得た。
【００８６】
（精製および特徴付け）：半調製ＨＰＬＣにより、ＤＷ２から３つの主なピーク（１１分で溶出する）を分離した。ＤＷ３は、混合組成物の２つの主要なピークを得た。質量分析によって、ＤＷ２の１１分で溶出する画分は、１０５２の分子量を有する正しいペプチドであることを確認した。ＤＷ３についてはさらなる特徴付けは行わなかった。
【００８７】
（実施例１〜６のキメラペプチドの免疫原性）
上記実施例１〜６において記載されたように調製したキメラペプチドは、免疫後３週程度の初期での高い抗体力価によって証明されるように、非常に高い免疫原性である。ペプチド配列を認識し、そしてペプチド配列に結合する能力におついて、毎週得た血清をアッセイした。ＤＷ５ＭＶＦは、抗体力価の定常的な上昇を示した。ＤＷ５ＭＶＦについての力価は、一方のウサギでは、他方よりも高かった。ウサギ１は、ペプチド免疫原に対する即時の強力な応答を示したが、ウサギ２は、抗体力価の緩徐だが安定した上昇を示した。ＭＶＦＤＷ４は、最も即時的かつ強力な応答を生じた。これらの際立って高い力価は、第３回目のブースト後、４週間にわたって最大レベルのままであった。ペプチドＤＷ６ＭＶＦは、４つの抗体の最低力価であったが、応答は安定しておりそしてウサギ間で比較可能であった。ポリクローナルＩｇＧ血清は、ＭＶＦ  Ｔ細胞配列と交差反応しなかった。全ての結果は、非近交系で得ており、このことはウサギでの、このペプチドの広い免疫原性を示す。
【００８８】
（ＨＥＲ−２に対するペプチド抗体の特異性）
ＦＡＣＳおよび免疫沈降：フローサイトメトリー分析により、ＤＷ１ＭＶＦ抗ペプチド抗体が、ＨＥＲ−２レセプターを直接標的化することを決定した（図  を参照のこと）。市販のマウスＭａｂ〜ＨＥＲ−２／ｎｅｕを、ＳＫＢＲ３細胞におけるコントロールとして使用した。陰性コントロール血清は、レセプターに対する結合を示なかったが、蛍光の増加が免疫血清を用いて見られた。ポリクローナル抗ペプチド血清の蛍光強度は、モノクローナル抗体に匹敵した。従って、ポリクローナル血清は、モノクローナル抗体の特異性および親和性を模倣し得る。
【００８９】
免疫血清を、Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔｓ  溶液で希釈し、そして平均細胞蛍光を決定した。「三次＋３週」血液由来の血清は、１２１．４の蛍光値を示し（１：３２０希釈）、一方ＭＡｂは１３２の値を示した。以下は、様々な血清希釈における平均細胞蛍光値のリストである。
【００９０】
希釈                      平均細胞蛍光（ＤＷＬＭＶＦ）
コントロール              ０．６４７
１：８０                  ３９．３
１：１６０                ８３．５
１：３２０                １２１．４
１：６４０                ６９．４
１：１２８０              ３４．４
１：２５６０              １７．４
しかし、ペプチド抗体ＭＲＦＤＷ４、ＤＷ５ＭＶＦ、およびＤＷ６ＭＶＦは、ＤＷ１ＭＶＦと同じ傾向強度を示さなかった。従って、免疫沈降法を、ＨＥＲ−２に対する特異性を検証するために使用した。ＳＫＢＲ３細胞を、タンパク質Ａ／Ｇ精製抗ペプチド抗体を用いて免疫沈降した。抗体は、ＨＥＲ−２反応性ｖ,であることが示された。同一のバンドは、Ｍａｂサンプルおよび抗ペプチド抗体においてはっきり現れる。
【００９１】
（抗ペプチド抗体の生物学的効果の同定）
（インビボにおける増殖）
一旦、ＨＥＲ−２に対する特異性を確認すると、次の工程は生物学的活性を決定することであり、この場合、この活性は、ＨＥＲ−２過剰発現細胞と共にＭＡｂをインキュベーションすることによって生成する腫瘍増殖の減少であった。抗体または腫瘍細胞のインビトロ効果を、標準トリチウム化チミジン増殖アッセイによって決定した。抗体のＤＷ１ＭＶＦ、ＭＶＦＤＷ４、およびＤＷ５ＭＶＦは、ＳＫＢＲ３細胞のインビトロにおける増殖を減少し得た。正常な量のレセプターを発現するＭＣＦ−７細胞は、この抗体によって阻害されなかった。逆に、市販のチロシンリン酸化を減少させるモノクローナル抗体、およびインビトロにおけるリン酸化もまた減少させるＤＷ６ＭＶＦは、ＳＫＢＲ３細胞における細胞増殖を刺激した。これらの結果は、ポリクローナル抗体が、生物学的活性が認識されたエピトープに依存するという点でモノクローナルのように挙動し得ることを示す。さらに、阻害抗体は、正常な量のＨＥＲ−２（ＭＣＦ７）を発現する細胞に対してごくわずかな効果を有したことに注目することは興味深い。これはまた、いくつかのモノクローナルについても報告され、そして正常細胞の最小毒性が所望される乳癌の治療のために有利である。
【００９２】
（インビボにおける増殖）
４つの抗ペプチド抗体のうちの３つは、たとえ異なる程度ではあっても、ヌードマウスモデルにおける腫瘍増殖の抑制において成功した。全ての場合の腫瘍の減少は、自己リン酸化の減少の結果ではなかった。この結果の要約は、いくつかの抗体（ＭＶＦＤＷ４およびＤＷ５ＭＶＦ）は、最大腫瘍抑制のための宿主エフェクター細胞を必要とし得ることを示唆する。腫瘍の進行対時間のプロットは、抗体ＤＷ１ＭＶＦ、ＭＶＦＤＷ４およびＤＷ５ＭＶＦを用いて、腫瘍容積が減少することを示す。ＤＷ６ＭＶＦは、増殖に対してほんのわずかな効果しか有さないようであった。
【００９３】
（細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープの同定）
（ＣＴＬアッセイ）
ペプチドＤＷ１ＭＶＦ（３７６−３９５）は、オーバーラップＴ細胞エピトープ３９１−３９９を有する。本発明者らは、ＨＥＲ−２ワクチンに組み込むためのこのエピトープの有効性を試験することを所望した。結果は、特定のＣＴＬ応答が、ＨＥＲ−２誘導性エピトープを生じ得ることを示した。ＨＥＲ−２  ３９１−３９９で刺激された細胞毒性Ｔ細胞は、用量依存様式で、自己標的を特異的に溶解し得た。しかし、２つのインビトロ再刺激物は、この結果を生じるために必要であった。この研究において、ＩＬ−２を培養培地に添加した。Ｔヘルパーおよび細胞毒性Ｔ細胞配列の両方を含むペプチドを用いる免疫は、結果を上げることが予測される。
【００９４】
（ラットｎｅｕトランスジェニックマウスにおけるＭＶＦ−ＨＥＲ−２ペプチド構築物の効果）
ヒト乳癌細胞と同様の乳房腫瘍を発現するトランスフェニックマウスモデル（Ｎ２０２と称される）（Ｍｕｌｌｅｒら、Ｇｕｙ，Ｃ．Ｔ．ら、Ｐｒｏ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０５７８−８２，１９９２によって開発された）を用いて、キメラペプチドの抗腫瘍効果をインビボで試験した。限局性乳房腫瘍は、マウス乳房腫瘍ウイルスの３’長末端反復配列下のラットｎｅｕ遺伝子の過剰発現に起因して、約２８週齢の雌性トランスフェニックマウスの少なくとも５０％で生じた。ＨＥＲ−２ペプチド配列のうち３つ（３７６−３９５、４１０−４２９、および６２８−６４７）は、ラットｎｅｕにおける類似性領域に対して８０％より大きい相同性を有する。本発明者らは、初めに、２０％のアミノ酸配列が相違している場合、ＨＥＲ−２ペプチドを生じる抗体が、ラットｎｅｕレセプターを認識し得るか否かを試験した。結果は、ＨＥＲ−２配列（１１５−１３６）、（４１０−４２９）および（６２８−６４７）を用いて誘導された抗体は、ｎｅｕ遺伝子過剰発現ＤＨＦＲ−Ｃ８線維芽細胞株からラットｎｅｕレセプターを免疫沈降し得ることを示した。
【００９５】
これらの結果に基づいて、雌のトランスジェニックマウスを、ＨＥＲ−２配列１１５−１３６、４１０−４２９および６２８−６４７のＭＶＦ構築物ならびにＭＶＦ単独で別々に免疫した。ＭＶＦ  ＨＥＲ−２（６２８−６４７）は、２度目のブーストの２週間後に早くも、免疫原に対する５００００を超える高力価の抗体応答を誘発し、この抗体力価は、３度目のブースト後２５００００を越えた。ＭＶＦ  ＨＥＲ  ２（６２８−６４７）に対する抗体はまた、１００００を超える力価で組換えＨＥＲ−２  ＥＣＤならびにインタクトなＨＥＲ−２および細胞のラットｎｅｕレセプターと反応した。
トランスジェニックマウスは、ＨＥＲ−２免疫原、１１５−１３６  ＭＶＦおよび４１０−４２９  ＭＶＦに対する明らかな抗体応答をマウントしなかった。
【００９６】
４８週齢まで、全てのトランスジェニックマウスをＭＶＦエマルジョンで免疫し、ＨＥＲ−２（１１５−１３６）ＭＶＦおよびＨＥＲ−２（４１０−４２９）ＭＶＦは、少なくとも１０ミリメートルの大きさの腫瘍を発生した。最も顕著には、腫瘍細胞増殖のインビトロ阻害に相関して、ＭＶＦ  ＨＥＲ−２（６２８−６４７）で免疫したトランスジェニックマウスの８３％（６匹中５匹）では、完全に腫瘍がなかった。ＭＶＦ  ＨＥＲ−２（６２８−６４７）でワクチン接種したマウスは、ＭＶＦエマルジョンで免疫したマウスと比較して、長い腫瘍のない期間を顕著に示した（ｐ＝０．００２５）。他の群と比較してＭＶＦ  ＨＥＲ−２（６２８−６４７）で免疫したマウスにおいて腫瘍の徴候における遅延があるものの、これらが生じた後は腫瘍増殖の反応速度論における顕著な差異はなかった。
【００９７】
（乳房腫瘍細胞株の抗体媒介細胞傷害性）
本発明者らは、ＭＶＦ  ＨＥＲ−２（６２８−６４７）によって誘発されたトランスジェニックマウス血清において、ＩｇＧ１（５８％）およびＩｇＧ２（３５％）が主要なアイソタイプであることを見出した。本発明者らは、末梢血の単核細胞を集めＨＥＲ−２を過剰発現する乳房腫瘍細胞株を融解する能力をＡＤＣＣアッセイにおいて試験した。トランスジェニックマウスにおいてＨＥＲ−２（６２８−６４７）によって誘発されたペプチド抗体は、異なる２つのヒト乳房腫瘍細胞抗体（そのいくつかは変性タンパク質を認識する）の溶解を引き起こした。
【００９８】
（実施例７：ＨＥＲ−２（２７−４５））
ＨＥＲ−２タンパク質のアミノ酸２７−４５、Ｎ末端に麻疹ウイルス融合タンパク質由来の乱交雑ヘルパーＴ細胞エピトープ（アミノ酸２８８−３０２）、およびＧＰＳＬリンカー（ＭＶＦＤＮ１）を含むキメラペプチドを、実施例１で上述したような手順を使用して合成した。
【００９９】
（実施例８：ＨＥＲ−２（３１６−３３９））
ＨＥＲ−２タンパク質の改変した配列３１６−３３９、Ｎ末端に麻疹ウイルス融合タンパク質由来の乱交雑（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ヘルパーＴ細胞エピトープ（アミノ酸２８８−３０２）、およびＧＰＳＬリンカー（ＭＶＦＤＮ２）を含むキメラペプチドを、上記の実施例１で記載したような手順を使用して合成した。ＨＥＲ−２配列３１９−３３９は、３つのシステインを３３１位、３３４位および３３８位に含む。分子モデル化ソフトウェア（Ｈｙｐｅｒｃｈｅｍ，Ｈｙｐｅｒｃｕｂｅ  Ｉｎｃ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、本発明者らは、残基３３４および３３８が最も安定なシステイン−システイン結合対を強く形成することを決定した。一方、合成中に、本発明者らは、システイン３３１をアラニンに置換して２次構造形成および合成後凝集に対する干渉を防いだ。
【０１００】
【表３】
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ＨＥＲ−２（３１６−３３９）エピトープを、破傷風トキソイドの配列５８０−５８９および９４７−９６７（それぞれＴＴおよびＴＴ３と表される）ならびに麻疹融合タンパク質の配列２８８−３０２（ＭＶＦと表される）を含むＴｈエピトープに連結し、異なる３つのＨＥＲ−２  Ｂ細胞ペプチドを提供した。
【０１０１】
（実施例９：ＨＥＲ−２（４８５−５０３）
ＨＥＲ−２タンパク質の改変した配列４９５−５０８、Ｎ末端に麻疹ウイルス融合タンパク質由来の乱交雑ヘルパーＴ細胞エピトープ（アミノ酸２８８−３０２）、およびＧＰＳＬリンカー（ＭＶＦＤＮ３）を含むキメラペプチドを、上記の実施例１で記載したような手順を使用して合成した。ＨＥＲ−２配列４９５−５０８は、７５０オングストローム2にわたる抗体の抗原結合部位の約１７−１８残基の最適なＢ細胞エピトープより４残基短い。一方、抗原結合ポケットにより適合するようにこの配列を伸長するために、本発明者らは、抗原性エピトープを形成する確率について近接配列に割り当てられたスコアを調べた。配列４８５−４９９は、Ｗｅｌｌｉｎｇの抗原性スケールで、ＨＥＲ−２細胞外ドメインにおいて分析した全ての配列で最高のスコアを割り当てられた。このスケールは、５残基配列が抗原性エピトープを形成する確率を示す。この配列はまた、規定されたβターン（残基４８８−４９１）およびαヘリックス（残基４９１−４９５）を保有する。従って、本発明者らは、当所示されたエピトープ４９５−５０８を伸長して４８５−４９９を含んだ。さらに、本発明者らは、配列４９５−５０８をＣ末端で５残基短縮して、ペプチドの凝集を導き得かつ精製および特徴付けを困難にし得る５０４位の単一のシステインを除外した。システインに続く４残基は、規定された二次構造のいずれをも形成しない。このエピトープを、Ｃ末端で乱交雑Ｔヘルパー細胞エピトープＴＴと連結した（表４を参照のこと）。
【０１０２】
【表４】
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（実施例１０：ＨＥＲ−２（６０５−６２２）
ＨＥＲ−２タンパク質のアミノ酸６０５−６２２、Ｎ末端に麻疹ウイルス融合タンパク質由来の乱交雑ヘルパーＴ細胞エピトープ（アミノ酸２８８−３０２）、およびＧＰＳＬリンカー（ＭＶＦＤＮ４）を含むキメラペプチドを、実施例１で上述したような手順を使用して合成した。
【０１０３】
（実施例７−１０のペプチドの免疫原性）
実施例７−１０のキメラＨＥＲ−２ペプチドは、免疫した対の繁殖後のウサギにおいて可変性の抗体応答を誘発した。最も瞬時でかつ高力価の抗体を、ＭＶＦ  ＨＥＲ−２（３１６−３３９）によって誘発した。低い抗体応答を、他の３つのペプチド構築物に対してマウントした。抗体力価における相対的差異にもかかわらず、キメラペプチドのそれぞれでの免疫に応答して産生した抗体は、フローサイトメトリーおよび免疫沈降の両方によってＨＥＲ−２レセプターを認識し得た。
【０１０４】
繁殖後のウサギでの抗体産生におけるキメラペプチドの組合せの効果をまた、決定した。これらの結果は、対の繁殖後のウサギにおける単一の免疫原としてかまたはこれらの組合せのいずれかで投与した場合に、Ｂ細胞エピトープ構築物ＭＷＦＮＤ２、ＭＷＦＮＤ３およびＭＷＦＤＷ４が５００００を超える高力価の抗体応答を誘発したことを示した。これらのウサギを、まず個々のエピトープで免疫し、そして４回目のブーストの２週間後に同一のウサギを、まず３つのエピトープの１つで、そして後に３つ全てのエピトープで交差免疫した。交差免疫に対する抗体応答は、良好であるか、または単一の免疫原として投与した場合よりも良好であった。
【０１０５】
（乳房腫瘍細胞株における実施例７−１０のキメラペプチドの抗増殖性効果）
高順位であるＨＥＲ−２ペプチド配列３１６−３３９およびＨＥＲ−２の４８５−５０３に対して誘発された抗体は、２つのヒト乳房腫瘍細胞株（ＳＫＢＲ−３およびＢＴ−４７４）の増殖を阻害した。ＭＶＦ  ＨＥＲ−２（３１６−３３９）抗体は、ＳＫＢＲ−３およびＢＴ−４７４の細胞株の増殖を、未処理またはアイソタイプ抗体で処理した細胞に比べて約３５％および１５％だけ阻害した。ＭＶＦ  ＨＥＲ−２（４８５−５０３）抗体は、ＳＫＢＲ−３細胞の増殖を２２％およびＢＴ−４７４細胞の増殖を１１％だけ阻害した。ＨＥＲ−２ペプチド２７−４５および６０５−６２２に対して惹起された抗体は、腫瘍細胞株の増殖に対する極わずかな効果を有し、そしてアイソタイプコントロール抗体と同様にＢＴ−４７４細胞の増殖を増加することが示された。実施例７−１０のキメラペプチドに対して惹起されたどの抗体のいずれも、別のヒト乳房腫瘍細胞株ＭＣＦ−７（ＨＥＲ−２の標準レベルだけ発現する）の増殖を阻害しなかった。
【０１０６】
乳房腫瘍細胞株ＳＫ−ＢＲ３の細胞をまた、種々のＨＥＲ−２ペプチド抗体の混合物を用いて、それぞれ０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で処理した。複数の抗体での処理によって、単一の抗体での阻害効果より優れたさらなる増殖阻害効果が生じた。異なる３つの増殖阻害ペプチド抗体の混合物は、未処理細胞に比べてＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖を９０％を超えて防止した。乳房腫瘍細胞株ＢＴ４７４の細胞をまた、種々のＨＥＲ−２ペプチド抗体の混合物を用いて、２６６μｇ／ｍｌ、５２８μｇ／ｍｌおよび７９２μｇ／ｍｌの濃度で処理した。
【０１０７】
（実施例１１：ＭＶＦＤＷ４−ミクロスフェア）
実施例で上述したように調製されたＭＶＦＤＷ４を、下記のようにミクロスフェア内にロードした。
【０１０８】
（ミクロスフェア調製）
ミクロスフェアの調製を、Ｇｌａｓ−ｃｏｌ／Ｇ．Ｋ．Ｈｅｌｌｅｒ  ＨＳＴ１０Ｎ  Ｓｔｉｒ−Ｔｅｓｔｅｒを用いて、制御された温度の被膜された（ｊａｃｋｅｔｅｄ）ビーカー内で実施した。ミクロスフェア調製は、０．５８ｄＬ／ｇの固有の粘度を有する７５／２５ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）を１２０ｍｇ／ｍｌで利用した。ペプチド／ポリマー溶液を、Ｓｐａｎ８５（ソルビタントリオレート）を乳化剤として用いて、４０℃にて鉱油／綿実油中で乳化した。７５０ｒｐｍで一時間攪拌後、油エマルジョン中の油（ｏｉｌ−ｉｎ−ｏｉｌ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）を、０．４５μｍ膜を通して濾過し、そして石油エーテルで数回洗浄した。このフィルターをコニカルチューブ内に置き、液体窒素で凍結し、そして少なくとも３日間凍結乾燥した。ペプチドローディングをアミノ酸分析によって決定した。
【０１０９】
ミクロスフェアの形態学、表面の特徴、およびサイズを、Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ＸＬ−３０  ＦＥＧ走査型電子顕微鏡を使用して観察した。乾燥サンプルを、スパッターコートした炭素帯電性タブ化標本マウント（ピンの直径３．２ｍｍ、台座の直径１２．７ｍｍ）上にて、アルゴン雰囲気下で１１０秒間スプレーした。画像を、１０ｍｍの作動距離で、二次電子検出器および５ｋＶの加速（ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ）電位を使用して得た。各々の調製物について少なくとも１００粒子を、Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ＸＬ−３０  Ｆｉｅｌｄ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｇｕｎ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して得た電子顕微鏡写真より分けた。
【０１１０】
酢酸エチルを使用してミクロスフェアからペプチドを抽出することにより、ペプチドローディングを決定した。ミクロスフェアを、過剰の酢酸エチル中に浸漬し、そして強くボルテックスした。溶解しないポリマーおよび放出したペプチドを、５分間の遠心分離によってスピンダウンした。上清を回収し、そしてこのプロセスをさらに３回反復した。過剰の酢酸エチルを、蒸発して除いた。サンプルを、２％酢酸中で再構成し、そして酢酸分析に供した。ペプチドを、６Ｎ  ＨＣｌで加水分解し、そして引き続き、アミノ酸をＷａｔｅｒｓ  ＰｉｃｏＴａｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用してフェニルチオヒダントインとして誘導体化し、かつ分析した。
【０１１１】
（ペプチド免疫）
ＰＢＳ中１００μｇのペプチドおよび１００μｇのｎｏｒ  ＭＤＰを、４：１のスクアレン：アルラセル（Ａｒｌａｃｅｌ）中で乳化し、そして１ペプチド当たり５匹のマウスの複数の部位に皮下注射する。３週間後、マウスを同一のプロトコルを使用してブーストする。２度目の免疫の２週間後、脾臓を外科的に回収する。
【０１１２】
（ミクロスフェアカプセル化ペプチド免疫）
ＭＶＦＤＷ４ペプチドおよびＮｏｒ−ＭＤＰアジュバントを、ミクロスフェア中に個別にカプセル化した（５．２％ロード（ＭＶＦＤＷ４）および５％ロード（Ｎｏｒ−ＭＤＰ））。１マウス当たり１００μｇのペプチドおよび１００μｇのＮｏｒ−ＭＤＰを含むミクロスフェアを、２００μｌの４：１のスクアレン：アルラセルＡと混合し、そしてマウスに皮下注射した。
【０１１３】
（ＣＴＬ活性の検出）
最後の注射の２週間後、脾臓細胞を各マウスから取り出した。単一の細胞の懸濁液を調製し、その一部をＥｌｉｓｐｏｔによるＩＮＦ−γ検出に、残りをクロム放出アッセイに使用した。
【０１１４】
（ｉ）Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ
４日間のＥｌｉｓｐｏｔプロトコルを使用して、脾臓細胞のＩＮＦ−γ産生を検出した。１日目、Ｅｌｉｓｐｏｔプレート（ＰｏｌｙＦｉｌｔｒｏｎｉｃｓ）を、アジ化物（ａｚｉｄｅ）を含まない滅菌ＰＢＳで希釈した抗マウスＩＮＦ−γ（クローンＲ４−６Ａ２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を４μｇ／ｍｌで用いてコートした。次いで、プレートを湿潤チャンバー内で４℃で一晩インキュベートした。２日目、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、次いで、ＤＭＥＭ中１％のＢＳＡ（添加物なし）をウェルあたり２００μｌで、室温にて１時間ブロックした。ＢＳＡを除去した後、１％  Ｌ−グルタミンを含むＨＬ−１培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中に回収した新鮮な脾臓細胞を、特定の濃度でウェル中に添加した。次いで、湿潤インキュベーターにて３７℃で５％  ＣＯ2にて、プレートを２４時間インキュベートした。３日目、細胞を回収し、そしてプレートをＰＢＳで１回洗浄した後、このプレートをさらに、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０（２０００：１）で４回洗浄した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０／１％  ＢＳＡで２μｇ／ｍｌに希釈したビオチン化抗ＩＮＦ−γ（クローンＸＭＧ  １．２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、ウェル当たり１００μｌでウェルに添加した。プレートを湿潤チャンバーにて４℃で一晩インキュベートした。４日目、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０でプレートを４回洗浄した後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０／１％  ＢＳＡで１：１０００に希釈したヤギ抗ビオチン／アルカリホスファターゼ結合物（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を、ウェル当たり１００μｌ添加した。プレートを、室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳで４回洗浄した。ＢＣＩＰ／ＮＢＴアルカリホスファターゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を、室温でのインキュベートのためにウェル当たり２００μｌ添加した。スポットがプレート上で可視化したときに、反応を、流れる水道水でクエンチした。プレートを風乾しこのスポットを読んだ。
【０１１５】
（ｉｉ）細胞傷害性溶解アッセイ
単一細胞懸濁液の同一のバッチより得た同系の脾臓細胞刺激因子を使用して、インビトロでの再刺激を実施し、そしてｐ６３合成ペプチドで１時間パルスした。反応させる（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）細胞：刺激する（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）細胞（３：１）を２４ウェルプレート中で混合し、そして３７度で１週間インキュベートし、次いで、これらの反応させる脾臓細胞を以下のＣＴＬアッセイにて効果（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）細胞として使用した。標準クロム放出アッセイを使用して、ＣＴＬアッセイを実施した。簡単には、ＳＶＢａｌｂ細胞（Ｈ−２d）またはＭＣＳ７細胞（Ｈ−２b、コントロールとして）を１０μｇ／ｍｌのペプチドｐ６３および５００μＣｉ／ｍｌの51Ｃｒ塩化クロム酸を伴うかまたは伴わないで、３７℃で１時間インキュベートすることによって、ペプチドでパルスした標的を調製した。標識化標的細胞（ウェル当たり１０4細胞）および種々の数の効果細胞を、９６ウェルプレートに最終容積０．２ｍｌにてプレートした。３７℃で５時間後、５０μｌの上清を各ウェルから回収し、そして特異的溶解％を、以下の式に従って決定した：［（試験したサンプルのｃｐｍ−自然発生51Ｃｒ放出のｃｐｍ）／（最大51Ｃｒ放出のｃｐｍ−自然発生51Ｃｒ放出のｃｐｍ）］×１００。
【０１１６】
（実施例１２）
ＨＥＲ−２を、細胞外ドメインにのみ存在する７つの潜在部位にて広範囲にわたってグリコシル化する。本発明者らは、これらのＮ連結グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｘ）を保有するＢ細胞エピトープを、分析に用いたコンピューターによって同定した。安定に配列をコードするＢ細胞エピトープを含む３つの構築物を、変異してグリコシル化を改善し、そしてこれらの野生型対照物ＨＥＲ−２（１１５−１３６）；（１８２−２１６）；および（６３０−６５０）ならびにＴヘルパー細胞エピトープを、バキュロウイルス哺乳動物シャトル発現ベクターにサブクローン化した。このベクターは、哺乳動物細胞への目的の遺伝子の容易なバキュロウイルス媒介トランスフェクションを可能にするが、効率よい発現およびエピトープのグリコシル化が可能な細胞において複製し得ない。発現したキメラグリコシル化エピトープを、糖の型およびグリコシル化効率についてキャピラリー電気泳動によって特徴付ける。効率よくグリコシル化したエピトープで、ウサギを免疫し、そしてペプチド抗体を作成する。
【０１１７】
ここで、本発明は、十分に記載され、添付の特許請求の範囲の精神および範囲を逸脱することなく多くの変化および改変がなされ得ることは、当業者には明白である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、キメラＨＥＲ２−Ｂ細胞ペプチドの模式図である。
【図２】  図２は、多価ＨＥＲ２−２Ｂ／ＣＴＬペプチドの模式図である。
【図３】  図３は、キメラＨＥＲ−２  Ｂ細胞ペプチドＤＷ１ＭＶＦに対して惹起される抗体の、ＨＥＲ−２過剰発現ＳＫＢ３細胞への結合を示す。ＤＷ１ＭＶＦに対して惹起される抗体は、市販のモノクローナル抗体に匹敵する親和性を有して、ＨＥＲ−２レセプターを特異的に結合した。ＳＫＢＲ３細胞が、抗体とインキュベートされ、洗浄され、そしてＦＩＴＣ結合体化２次抗体が添加された。ホルマリン中に固定された後、細胞が、励起のために４８８ｎｍでＣｏｕｌｔｅｒ  ＥＬＩＴＥフローサイトメトリーにより分析された。５．０×１０6個の細胞が、各サンプルについて計測された。
【図４】  図４は、複数のキメラＨＥＲ−２  Ｂ細胞ペプチドを注射された非近交系のウサギにおける免疫原性を示す。
【図５】  図５は、ＨＥＲ−２過剰発現ＳＫ−ＢＲ−３ヒト乳癌細胞におけるヘルセプチン（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）および単一および複数の、ＨＥＲ−２  Ｂ細胞キメラペプチドＭＶＦＤＮ１（ＨＥＲ−２（２７−４５））、ＭＶＦＤＮ２（ＨＥＲ−２（３１６−３３７））、ＭＶＦＤＮ３（ＨＥＲ−２（４８５−５０３））およびＭＶＦＤＷ４（ＤＷ４）に対して生成されるペプチド抗体の抗増殖効果を示す。結果は、全く同じ３つのサンプルの平均である。
【図６】  図６は、ＨＥＲ−２過剰発現ＢＴ４７４ヒト乳癌細胞におけるヘルセプチンＨＥＲ−２  Ｂ細胞キメラペプチドＭＶＦＤＮ１（ＮＤ１）ＭＶＦＤＮ２（Ｎ２）、ＭＶＦＤＮ３（Ｎ３）およびＭＶＦＤＷ４（ＤＷ４）に対して生成されるペプチド抗体の抗増殖効果を示す。結果は、全く同じ３つのサンプルの平均である。
【図７】  図７は、ＨＥＲ−２過剰発現ＢＴ４７４ヒト乳癌細胞における単一および複数のＨＥＲ−２  Ｂ細胞キメラペプチドＭＶＦＤＮ２（Ｎ２）、ＭＶＦＤＮ３（Ｎ３）およびＭＶＦＤＷ４（ＤＷ４）に対して生成されるペプチド抗体の増殖効果を示す。結果は、全く同じ３つのサンプルの平均である。
【図８】  図８は、自発的な乳房腫瘍発症におけるＨＥＲ−２  Ｂ細胞ペプチドを用いた予防接種の効果を示す。６個体のマウスの群が、約４週齢で、１００μｇのペプチド（およびスクアレンアルラセル（ａｒｌａｃｅｌ）Ａにおいて乳化されたアジュバントとしてのＭＤＰ）を接種され、そして４、８、１６、および２４週後にブーストした。腫瘍が、長さ×幅2／２として算出された。腫瘍発症までの時間が、個々の曲線の対数ランクの比較と共にＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析を使用して分析された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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