(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エグジゴバクテリウム属であり、かつ、ＤＮＡ配列の少なくとも一部が、２００２年１２月５日に、第Ｉ−２９６２号のもとで、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ）（英語名：French national collection of microorganism cultures）に寄託された株のゲノムＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ配列を有し、これらの株は、４０〜５０℃程度の温度、５．４〜９．１５のｐＨで成育する熱抵抗性、糖分解性およびペプチド分解性であり、かつＬ（＋）ラクテートを生成することが可能であり、４０〜５０℃程度の温度、５．４〜９．１５のｐＨの生育特性を有し、４５℃の至適成育温度を有し、ＤＮＡにおけるグアニンおよびシトシンを合わせた含有率が約５０ｍｏｌ％であることを特徴とし、さらに、１６Ｓ  ｒＲＮＡについてのＤＮＡの配列番号１：
【化１】
0004720975.tif 000006
または配列番号１と９７％超の類似度を有する配列によって特徴付けられる細菌株。
【請求項２】
２００２年１２月５日に番号Ｉ−２９６２のもとでＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍに寄託された、請求項１に記載の細菌株。
【請求項３】
請求項１または２に記載の細菌株を培養する方法であって、
該方法は、通性嫌気性条件下に、３７℃で５．４〜９．１５のｐＨで、この株によってエネルギー源として用いられる糖を含む基本培地において行われることを特徴とする、方法。
【請求項４】
食物発酵処理における請求項１または２に記載の細菌株の使用。
【請求項５】
Ｌ（＋）ラクテート等の代謝物を生成する方法であって、
請求項１または２に記載の細菌株を、その成長および所望の代謝物の生成に適した条件下に培養する工程と、
生成された代謝物を回収し、所望の代謝物を単離し、そして、それを精製する工程と
を包含することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エグジゴバクテリウム属の新株に関する。
【０００２】
本発明はまた、これらの株を培養する方法およびそれらの工業的利用に関する。
【０００３】
本発明は、より詳細には、深海水熱系から生じたサンプルから単離されたような細菌株に関する。
【背景技術】
【０００４】
非特許文献１には、Drancourtらが、種々の供給源からの１７７の単離物の採集の研究およびｒＲＮＡに基礎としたそれらの同定の研究の結果を報告している。
しかしながら、この目録において与えられた種は、本発明の株とは全く異なっている。
非特許文献２において出版された論文には、Farrowらが、種々の種間の比較研究を記載する。エグジゴバクテリウム（Exiguobacterium）属が言及されているが、種に関しては特定化されていない。
非特許文献３におけるFruhlingらによる論文は、海水（pond water）から単離されたExiguobacterium undae sp.nov.およびExiguobacterium antarcticum sp.nov.の株を報告する。
与えられたExiguobacterium属のこれらの株および他の種は、本発明の株とははっきり区別される系統発生論的な位置を有する。
ＥＭＢＬデータベースドキュメントのアクセション番号Ｄ５５７３０号は、Exiguobacterium acetylicumクローンの１６Ｓ  ｒＲＮＡを与え、これもまた、本発明ものとは異なる種に対応する。
これらの文書はそれぞれExiguobacterium auriantiacum（ＮＤＣＤＯ）およびExiguobacterium undaeの１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列を報告する。データベースドキュメントに関連して上記に与えられた説明も利用する。
本発明者らによる得られたサンプルの研究によって、種々の工業分野において非常に興味深い性質を示すエグジゴバクテリウムの新種を単離するに至った。
【０００５】
【非特許文献１】ドランコート（Drancourt）ら著，「ジャーナル・オフ・クリニカル・ミクロバイオロジー（Journal of Clinical Microbiology）」，２０００年１０月，第３８巻，第１０号，ｐｐ３６２３−３０
【非特許文献２】ファロー（Farrow）ら著，「インターナショナル・ジャーナル・オフ・システマティック・バクテリオロジー（International Journal of Systematic Bacteriology）」，１９９４年，第４４巻，第１号，ｐｐ７４−８２
【非特許文献３】フリューリング（Fruhling）ら著，「インターナショナル・ジャーナル・オフ・システマティック・アンド・エボリューショナリー・ミクロバイオロジー（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology）」，２００２年７月，第５２巻，第４号，ｐｐ１１７１−１１７６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的はこの新種の株を提供することである。
【０００７】
本発明はまた、これらの株を培養し、かつ、細胞および／またはある種の代謝物、より詳細にはＬ（＋）ラクテートを好適に生成することを可能にする物理化学的条件および培養培地の組成を明記するプロトコールを提供することを目的とする。
【０００８】
別の局面によると、本発明は、種々の工業分野でのこれら株の直接的な使用、またはそれらの代謝物の使用を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の細菌株は、ＤＮＡ配列のうち少なくとも一部が２００年１２月５日に第Ｉ−２９６２号のもとにCollection Nationale de Culture de Nicroorganismes（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ）［英語名：Freench national collection of microorganism］,25 rue du Docteur Roux,75015 Parisに寄託された株のゲノムＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡとハイブリダイズしてもよいＤＮＡ配列を有することを特徴とする。
【００１０】
有利には、本発明の株のゲノムの少なくとも７０％が寄託された株のＤＮＡとハイブリダイズしてもよい。
【００１１】
本発明は、１６Ｓ  ｒＲＮＡの下記配列番号１または配列番号１と９７％を超える類似度を有する配列によって特徴付けられる上記の細菌株を特に目的とする。
【化１】
0004720975.tif 000002
【００１２】
別の局面によると、これらの株は熱抵抗性、糖分解性およびデンプン分解性であり、かつ／またはラクテートを生成可能であることを特徴とする。
【００１３】
なお、有利には、生成されたラクテートは９５％超がＬ（＋）ラクテートである。
【００１４】
「熱抵抗性」との表現は、細菌株が４０〜５０℃程度の温度、５．４〜９．１５のｐＨで、生育にとって至適には４５℃、約７のｐＨで生育できることを意味することが意図されている。
【００１５】
本発明はより詳細には、１６ＳリボゾームＲＮＡフラクションの配列の比較によって示されるようなエグジゴバクテリウム（Exiguobecterium）属の株を目的とする。
【００１６】
これらの株はまた、スルフェート、チオスルフェート、硫黄またはスルファイト（sulfite）を還元しないことを特徴とする。
【００１７】
本発明の細菌株はまた、グラム陽性であることを特徴とする。
【００１８】
さらに別の提供によると、本発明の細菌株のＤＮＡのグアニンとシトシンとを合わせた含有率は５０ｍｏｌ％程度である。
【００１９】
本発明は特に、２００２年１２月５日に第Ｉ−２９６２号のもとにＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍに寄託された細菌株を目的とする。
【００２０】
この株の識別参照は１０Ｃである。これを表すために用いられる分類名は、Exiguobacterium lactigenes sp.nov.であろう。
【００２１】
寄託された株のゲノムＤＮＡとハイブリダイズするための容量を少なくとも７０％維持するとすれば上記規定に対応する株の突然変異体も本発明の範囲内である。
【００２２】
本発明によると、上記規定の細菌株は、通性嫌気性条件下、５．４〜９．１５のｐＨ、３７℃で、下記に規定されるようなこれらの株によってエネルギー源として用いられ得る糖を含む基本培地（basic medium）中で培養することによって得られる。
【００２３】
本発明の細菌株は、有利には、食物発酵処理（food fermentation process）に用いられる。それらの発酵および酵素特性により、有利には、通常用いられる乳酸細菌に属するものに取って代わるおよび／またはそれを補足することが可能になる。
【００２４】
多種の糖、特に、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、マンニトール、Ｄ−リボース、Ｄ−スクロースおよびＤＬ−マルトース、およびデンプンを発酵させる本発明の株の能力は、かなりの利点を構成する。エネルギー基質として潜在的に用いられ得るこれら糖の一部（グルコース、フルクトース、スクロース）は、実際、大量に、特に、発酵糖ジュース中に入手可能である。
【００２５】
培地の物理化学パラーメータ（ｐＨ、糖／ペプチド比）を制御することによってこれらの株が代謝を行うことができれば、それらの用途領域は幅広いものとなる。このため、例えば、細胞および細胞代謝物、例えば酵素を生成するために直接発酵させることが可能である。
【００２６】
したがって、本発明はまた、代謝物、特にＬ（＋）ラクテートを生成する方法を目的とし、該方法は、
−その成長および所望の代謝物の生成に適した条件下に、上記規定の細菌株を培養する工程と、
−生成された代謝物を回収し、次いで、所望の代謝物を単離し、それを精製する工程と
を包含する。
【００２７】
９５％を超えるＬ（＋）ラクテートからなり、Ｄ（−）ラクテートが自然界において毒であるのに対してＬ（＋）ラクテートはより高等な生物によって吸収され得るので、本発明の株によって生成された乳酸は非常に有利である。
【００２８】
それは培養から分離され、例えば、乾固に適した場合には蒸発によって濃縮される。
【００２９】
濃縮または乾固生成物はそのままで用いられるか、または乳酸の所望の誘導体を形成するように処理される。
【００３０】
乳酸またはそれらのエステル体および他の誘導体の使用は多くの分野に関連する。
【００３１】
このため、乳酸は、これを飲料、ビール、乳製品（クリーム、チーズ、バターまたはアイスクリーム）またはジャム等に組み込むことによって農業食物工業において用いられる。
【００３２】
例えば、乳酸モノおよびジグリセライドまたは乳酸ステアリルナトリウムの形態で界面活性剤としてパン製造およびウィーンパン菓子製造（Viennese pastry-making）において有利に用いられるだろう。
【００３３】
医薬工業では、乳酸カリウムが、塩化ナトリウムの代用品を構成し得、高血圧の場合に特に貴重である。
【００３４】
欠乏症治療のために、その錯体形成特性、特に、鉄およびカルシウムとの錯体形成用にも用いられる。
【００３５】
最後に、化学工業における乳酸およびその塩および誘導体の使用の中で、プラスチック樹脂、接着剤、殺虫剤または織物原料の開発、または塗料、希釈剤および溶媒において、または金属の表面処理のためにその使用の言及がなされるだろう。
【００３６】
ポリラクチドおよび／または例えばポリアルケン酸化物、多価アルコール、グリコール酸、ヒドロキシカルボン酸、エチレンおよびプロピレンの共重合体、ブチルゴムまたは熱可塑性ポリウレタンエラストマーとの共重合体を製造するために用いられる場合には、重合体化学において乳酸の大きな利点が強調されるだろう。種々の物品がこれらの重合体および／または共重合体から、特に包帯を製造するための医療使用のための包装、薄膜または他の外科縫合糸用の被覆材料のために製造され得る。
【００３７】
本発明の他の特徴および利点が以下の説明中に説明され、実施例によって与えられる。実施例は、上記に言及され、第Ｉ−２９６２号のもとにＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍに寄託された株１０Ｃに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
（ａ．株１０Ｃを単離するためのプロトコール）
単離は深海水熱系のサンプルを用いて行われた。
【００３９】
・培地および方法
１ｇのＮＨ４Ｃｌ、０．３ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．３ｇのＫ２ＨＰＯ４、２５ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＣａＣｌ２、０．１ｇのＫＣｌ、３ｇのＭｇＣｌ２、０．５ｇのＣＨ３ＣＯＯＮａ、０．５ｇのシステイン−ＨＣｌ、０．１ｇの酵母菌抽出物（Difco Laboratories）、１０ｍｌのBalchミネラル溶液（１）および１ｍｇのレザズリンを（蒸留水１リットルあたりに）含む基本培地（basic medium）が用いられる。ｐＨは１０Ｍ  ＫＯＨを用いて７．３に調整され、培地は窒素流下に煮沸され、周囲温度に冷却される。
【００４０】
Ｂａｌｃｈミネラル溶液およびＢａｌｃｈ微量元素溶液の組成は以下の通りである。
【００４１】
Ｂａｌｃｈミネラル溶液
ＫＨ２ＰＯ４                       ６       ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                  ６       ｇ
ＮａＣｌ                        １２       ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ              ２．６    ｇ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ              ０．１６  ｇ
蒸留Ｈ２Ｏ十分量                  １０００ ｍｌ
Ｂａｌｃｈ微量元素溶液
ニトリロ酢酸                      １．５  ｇ
ＭｎＳＯ４・２Ｈ２Ｏ                ０．５  ｇ
ＭｇＳｏ４・７Ｈ２Ｏ                ３     ｇ
ＮａＣｌ                          １      ｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ               ０．１   ｇ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ               ０．１   ｇ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ               ０．１   ｇ
ＺｎＣｌ２                        ０．１   ｇ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ               ０．０１ ｇ
ＡｌＫ（ＳＯ４）２                 ０．０１ ｇ
Ｈ３ＢＯ３                         ０．０１ ｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４                     ０．０１ ｇ
蒸留Ｈ２Ｏ十分量                  １０００ｍｌ
培地のｐＨは１０Ｍ  ＫＯＨを用いて７．３に調整される。
【００４２】
続いて、培地は煮沸され、次いで、周囲温度に冷却され、そして、窒素流下にハンゲートチューブ（Hungate tubes）に１チューブあたり５ｍｌの割合で、窒素および二酸化炭素流（８０：２０；ｖ／ｖ）下に血清フラスコに２０ｍｌの割合で、分配される。
【００４３】
密封された容器をオートクレーブ内にて１１０℃で４５分間処理した後、Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＣＯ３およびグルコースが滅菌された溶液から加えられ、これにより、０．０４％、０．２％および２０ｍＭの濃度をそれぞれ与える。
【００４４】
培養の濃厚化を開始するために、培地の２０ｍｌサンプルが接種され、３７℃でインキュベートされる。培養は、寒天１ｌあたり１５ｇを含む凝固された培地によるハンゲートロールチューブ法を用いて精製される。
【００４５】
（ｂ．株の説明）
株１０Ｃは、非胞子形成性、通性嫌気性、グラム陽性の棹形態の細菌であり、４５℃、ｐＨ７および０〜２％のＮａＣｌで至適に生育する。
【００４６】
これは、糖を発酵させるために酵母菌抽出物を要求する従属栄養性株である。
【００４７】
株を生育させるための温度は、５．４〜９．１のｐＨ、０〜１２％のＮａＣｌの濃度で１２〜５０℃である。
【００４８】
至適な生育は、４５℃、ｐＨ７およびＮａＣｌ０〜２％で観察される。
【００４９】
生育を促進するために、ペプチド、例えば、酵母菌抽出物が、有利には、炭水化物、特にグルコースをエネルギー源として含む培地に加えられる。
【００５０】
（代謝特性）
糖の発酵は、Ｌ（＋）ラクテートを必然的に生成する（発酵されたグルコースのモルあたりラクテートの約２モル）。適切な生育条件下に、ホルメート（formate）、アセテートおよびエタノールの生成物が観察される。
【００５１】
（一般的な特徴）
株１０ＣはＤＮＡ中の（グアニン＋シトシン）含有率が５０．４ｍｏｌ％であることを特徴とする。
【００５２】
ＤＮＡの精製および抽出、１６Ｓ  ｒＲＮＡの増幅および配列決定は、（２）、（３）および（４）にしたがって行われた。Cashionらの方法（５）に従いヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィーによってＤＮＡは単離された。ＤＮＡ−ＤＮＡのハイブリダイゼーションは、De Leyら（６）により記載されたようにして、Hussら（７）およびEscaraおよびHutton（８）により記載されたように修飾しながら、２５２７−Ｒサーモプログラマ（thermoprogrammer）を備えたスペクトル光度計モデル２６００（Gilford Instrument Laboratories Inc., Oberlin, Ohio, USA）を用いて行われた。
【００５３】
１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列は、上記配列番号１に対応する。
【００５４】
（ｃ．株１０ＣとＥ．オーランティアカム（E. aurantiacum）との基質における相違の表）
【表１】
0004720975.tif 000003
【００５５】
（ｄ．培養方法および使用）
（１．糖の発酵によるバイオマスの生成）
方法は、非再生培地（non-renewed medium）で行われる。
【００５６】
発酵は、アルカリ性溶液（例えば水酸化ナトリウム）を用いてｐＨ７に、４５℃の温度に調節される。下記組成に対応する培地が用いられる。
【００５７】
グルコース                                                    計算値
酵母菌抽出物／プロテインヒドロリアーゼ（protein hydrolyzate）
計算値
ＮＨ４Ｃｌ                                                  １ｇ／ｌ
ＮａＣｌ                                                ０．５ｇ／ｌ
ＫＨ２ＰＯ４                                              ０．３ｇ／ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４                                              ０．３ｇ／ｌ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ                                      ０．２ｇ／ｌ
ＫＣｌ                                                  ０．１ｇ／ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ                                      ０．１ｇ／ｌ
糖および酵母菌抽出物の濃度は得ることが望まれる細胞の濃度に依存する。
【００５８】
糖は培地の他の部分とは別に高圧滅菌（autoclave）される。これは、ある種のミネラル塩が高圧滅菌の間に沈積物を形成するからである。続いて、それらは、培地の他の部分（酵母菌抽出物＋ミネラル（一緒に高圧滅菌された））に無菌で加えられ、次いで、最終容積が滅菌された蒸留水を用いて調節される。下記実施例は、培地を調製するプロトコールをより明瞭に理解することを可能にする。
【００５９】
４０ｇ／ｌのスクロースおよび３ｇ／ｌの酵母菌抽出物を含む培地１６リットルの調製の実施例：
１°）測量および高圧滅菌
【表２】
0004720975.tif 000004
【００６０】
注意：スクロースの加水分解を避けるために糖は小容量の液体中かつ２０分間のみ１１０℃で高圧滅菌される。マグネシウムおよびカルシウム塩は、あらゆる沈積を避けるために他の塩および酵母菌抽出物とは別に高圧滅菌される。
【００６１】
２°）アセンブリ：糖をベースとする溶液が酵母菌抽出物を含む培地１５リットルに移され、次いで、滅菌された蒸留水が加えられて１６リットルに増量される。全てのこれら移送は、滅菌して、ブンゼンバーナーのフレーム周囲で、液体を膨張させる（propel）ために空にされた建浴槽（vat）に適用される窒素過圧により行われる。
【００６２】
３°）均一化：窒素Ｎ２流が培地にバブリングされ、このため、要素全てを混合し、嫌気性を保証するために集められる。
【００６３】
（２．発酵方式）
複数のバッチを一緒に連結することによって連続して形成されたバッチ方式で研究が行われた。これは、「供給−採取（feed-harvest）」または「繰り返しバッチ（repeat batch）」システムであり、これは、発酵槽を新しい培地で充填する工程、次いで、細菌をバッチ培養する工程、次いで、発酵マスト（must）を空にして、次のバッチのインキュベーションのためにタンクを開始時の状態にし、再度充填等をする工程の３工程を一緒に連続的に連結することによって概略的に表され得る。
【００６４】
実際上の観点から、このシステムの利点は、２つのバッチ間の発酵槽の洗浄および滅菌を構成する工程が除かれるという事実、および処理が自動化される可能性にある。実際に、装置を調整することによってライン上で取得されたパラメータの値に従って空にするおよび充填する操作を誘引する自動化された装置をプログラムすることが可能である。
【００６５】
（ＩＩ．デンプンの発酵によるバイオマスの生成）
他の実験では、上記のデンプン基質および緩衝された培地（ただし、リットルあたり１０ｇのデンプンを有する）を用いて、９５％超のＬ（＋）ラクテートおよび痕跡量のホルメートを与えるデンプンの転換が得られる。
【００６６】
引用文献の参照
【化２】
0004720975.tif 000005
【配列表】
0004720975000001.app