(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Tyr−Pro−Orn、Val-Pro-Orn、Gly−Pro−Orn−Gly、Val−Pro−Glu、Glu−Met−Pro、又はAsp−Met−Proであるトリペプチド又はテトラペプチド。
【請求項２】
調味料として使用する、請求項1に記載のトリペプチド又はテトラペプチド。
【請求項３】
食品において、Tyr−Pro−Orn、Val−Pro−Orn、Gly−Pro−Orn−Gly、Val−Pro−Glu、Glu−Met−Pro、及びAsp−Met−Proからなる群より選択される、少なくとも一つのトリペプチド又はテトラペプチドを、食塩と共に用いて、食品に甘味又は旨味を付与する方法。
【請求項４】
食品が、おでんつゆ、水産練製品、畜肉加工品、肉製品、漬物類、肉まん、餃子、シュウマイ、春巻き、焼きそば、焼きめし、ふりかけ、珍味、佃煮、せんべい、あられ、スナック菓子、ソース、インスタントラーメンスープ、カップ麺スープ、ブイヨン、ルー、麺類つゆ、又はたれである、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
請求項1に記載のトリペプチド又はテトラペプチドを1mg〜10g/100ml含む、調味料。
【請求項６】
調味料が、さらに魚介エキス、だし、畜肉エキス、ブイヨン、蛋白分解エキス、味噌、又は醤油を含む、請求項5に記載の調味料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、魚醤中に存在し、旨味を有するトリペプチドおよびテトラペプチド、及びそれらを旨味成分とする調味料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペプチドがいろいろな食物の味に好ましい作用を有するということは周知である。日本酒（sake）から単離されるＶａｌ−ＧｌｎおよびＩｌｅ−Ｇｌｎジペプチドは、合成酒の完全さを向上させる（Kirimura, J., Shimuzu, A., Kimizuka, A., Ninomiya, 1, and Katsuya, N. (1969) The contribution of peptides and amino acids to the taste of foodstuffs. J Agric. Food Chem., 17, 689〜695）。グルタチオン（γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ，ＧＳＨ）は、牛肉エキス中のこく味（kokumi flavor）（持続性、こくおよび厚み）を増加させると報告されている（Ueda, Y, Yonemitsu, M, Tsubuku, 1, Sakaguchi, M, and Miyajima, R. (1997) Flavor characteristics of glutathione in raw and cooked foodstuffs. Biosci. Biotech. Biochem., 61, 1977〜1980）。Ishii ら（Ishii, K, Tsuchida, M., Nishimura, 1, Okitani, A., Nakagawa, A., Hatae, K, and Shimada, A. (1995) Changes in the taste and taste components of beef during heating at a low temperature for a long time. J Home Econ. Jpn., 46, 229〜234）も、高ペプチド含量の牛肉エキスは、低ペプチド含量のものより柔らかい味を与えると報告している。Mojarro-Guerra ら（Mojarro-Guerra, S. H., Amado, R., Arrigoni, R, and Solms, J. (1991) Isolation of low-molecular-weight taste peptide from vacherin mont d'Or cheese. J Food Sci., 56, 943〜947）は、チーズから単離される７種類のペプチドが、チーズの味全体を増加させることを報告している。これら食物中のペプチドは、若干の風味特性または味全体を高めると考えられる。Fujimaki ら（Fujimaki, M., Arai, S., Yamashita, M., Kato, H., and Noguchi M. (1973) Taste peptide fractionation from a fish protein hydrolysate. Agric. Biol. Chem., 37, 2891〜2898）は、魚タンパク質加水分解物中において、酸性オリゴペプチド画分が、顕著なだし味および好ましい後味を与えることを報告している。αキモトリプシンを用いたダイズタンパク質加水分解物は、だし味と僅かな苦味を有している（Arai, S., Yamashita, M., and Fujimaki, M. (1972) Glutamy]. oligopeptides as factors responsible for tastes of a proteinase-modified soybean protein. Agric. Biol. Chem., 36, 1253〜1256）。
【０００３】
更に、いくつかのペプチドは、それら自体味を有すると報告されている。Ohyama ら（Ohyama, S., Ishibashi, N., Tamura, M., Nishizaki, H., and Okai, H. (1988) Synthesis of bitter peptides composed of aspartic acid and glutamic acid. Agric. Biol. Chem., 52, 871〜872）は、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ａｓｐ−ＬｅｕおよびＧｌｕ−Ｌｅｕのようないくつかのペプチドが旨味（umami taste）を示すことを報告している。Ｎ末端にグルタミン酸およびＣ末端にアスパラギン酸、グルタミン酸、セリンまたはトレオニンのような親水性アミノ酸を有する若干の合成ジペプチドも、旨味を有することが報告されている（Arai, S., Yamashita, M., Noguchi, M., and Fujimaki, M. (1973) Tastes of L-glutamyl oligopeptides in relation to their chromatographic properties. Agric. Biol. Chem., 37, 151〜156）。チロシン、フェニルアラニン、ロイシンまたはイソロイシンのような疎水性アミノ酸をＣ末端に有する同様のペプチドは、苦い味を有することも報告されている。
【０００４】
Kirimura ら（1969、前出）は、いろいろな食品中で見出される６０種類のオリゴペプチドの味を報告している。それらは、三群、すなわち、酸味、苦味およびほとんど味のない群に分類された。Ａｌａ−Ａｓｐ、γ−Ｇｌｕ−ＧｌｕおよびＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙのようなペプチドは、酸味があり、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ａｒｇ−ＰｒｏおよびＶａｌ−Ｖａｌのようなペプチドは苦く、Ｌｙｓ−Ｇｌｕ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙのようなペプチドはほとんど味がなかった。これらデータから、彼らは、酸味および苦味ジペプチドについての法則を発見した。彼らの法則によれば、酸味ジペプチドは、２個の酸性アミノ酸、酸性および中性のアミノ酸、または酸性および芳香族のアミノ酸から成った。もう一方で、苦味ジペプチドは、大きなアルキル基を持つ中性アミノ酸または大きいおよび小さいアルキル基の組合せを含む中性アミノ酸、中性および芳香族のアミノ酸、または中性および塩基性のアミノ酸の組合わせから成った。味のないジペプチドは、小さいアルキル基を含む２個のアミノ酸、酸性および塩基性アミノ酸、または２個の芳香族アミノ酸から構成された。彼らは、甘味アミノ酸から成るジペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−ＡｌａおよびＧｌｙ−Ｐｒｏ、およびＬｙｓ−ＧｌｕおよびＡｒｇ−Ｇｌｕのような酸性および塩基性のアミノ酸からなるものが、ほとんど味がないことを報告している。
【０００５】
Arai ら（1973、前出)は、Ｎ末端にグルタミル残基を含有する１２種類のジペプチドの味を、Ｃ末端アミノ酸に依って三群、すなわち、旨味群（Ｇｌｕ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）、無味群（Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ａｌａ、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ）および苦味群（Ｇｌｕ−Ｉｌｅ、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、Ｇｌｕ−Ｔｙｒ、Ｇｌｕ−Ｐｈｅ）に分類した。
この分類は、Ｃ末端アミノ酸の性状および疎水性に依る。
【０００６】
Ney（Ney, K. H. (1971) Prediction of bitterness of peptides from their amino acid composition. Z. Lebensm. Unters. Torsch., 147, 64〜68）によって報告された法則によれば、１．４ｋｃａｌ／ｍｏｌより高いＱ値を有するペプチドは味が苦く、１．３ｋｃａｌ／ｍｏｌより低いＱ値を有するものは苦くないと報告している。
【０００７】
一方、Wang ら（Wang, K, Maga, J. A, and Bechtel, P. J. (1996) Taste properties and synergisms of beefy meaty peptide. J Food Science, 61, 837〜839）は、牛肉から得られた美味ペプチド（ＢＭＰ、beefy meaty peptide）と、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）および／または塩との間の相乗作用を報告している。Konosu（Konosu, S. (1993) Fish paste products. Tech. Res. J, 18, 450〜462 (in Japanese)）も、塩がグリシン、アラニンおよびセリンの甘味を増加させたことを報告している。Arai ら（1973、前出）は、塩がペプチドＧｌｕ−ｇｌｙ−Ｓｅｒの旨味を増加させたことを示した。ペプチドの旨味は、ＭＳＧおよび／またはＩＭＰの添加によって更に増加することも報告されている。
【０００８】
これまでに、タンパク質加水分解物、またはチーズのような多数の発酵食品から、いろいろな苦味ペプチドが単離された（Shiba, T. and Nunami, K. (1974) Structure of a bitter peptide in casein hyrolyzate by bacterial proteinase. Tetrahedron letters, 6, 509〜512）。もう一方において、カゼイン加水分解物から単離されるジ−またはトリペプチドを含有するいくつかのグルタミン酸は、苦味を隠すことが報告された（Arai, S. (1981) Science of Taste, Asakura, Tokyo, pp. 185 (in Japanese)）。これら上述のデータは、いろいろな種類のペプチドが、タンパク質加水分解物または発酵食品に極めて複雑な呈味作用を与えるということを明示している。
【０００９】
一般に魚醤（フィッシュソース）と呼ばれている、魚介類を原料とした調味料は、東南アジアではニョクマム、ナン・プラー、パティス、日本ではいしる、しょっつる、いかなご醤油等が著名である。これらは、小魚やエビ等魚介類原料に食塩を２０〜３０％添加し樽に漬け込み、１〜２年間放置することにより、内臓に含まれる自己消化酵素によってタンパク質が分解され、液化したものを採取して製品としている。この方法によって作られる魚醤は、独特の旨みに富んでいる。
【００１０】
魚醤は、長い発酵期間中に生じた多量のペプチドを含有している。Miyazawa ら（Miyazawa, K, Le, C, Ito, K, and Matsumoto, R (1979) Studies on Fish Sauce. J Fac. Appl. Biol. Sci., Hiroshima Univ., 18, 55〜63）は、魚醤から３種類のペプチドを精製した。これらペプチドは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−ＧｌｙおよびＧｌｙ−Ｇｌｙであったが、それらの味は記載されておらず、魚醤の味に関与するペプチドについては解明されていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、魚醤の深い且つ複雑な味に関与しているペプチドを単離・同定し、それらを旨味成分とする、魚醤の旨味を有しかつ魚醤特有の臭気が改善された調味料を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため、魚醤中の旨味成分を詳細に検討した結果、特定のペプチドが魚醤の深い且つ複雑な味に関与していることを見いだした。また、それらのペプチドを調味料の旨味成分として利用しうることが見いだされ、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、魚醤中から単離される特定のトリペプチドおよびテトラペプチドからなる旨味成分を提供する。
魚醤中の旨味成分は、適当な分離カラムを用いて魚醤から分離することができる。魚醤試料を、塩酸溶液等を添加することにより希釈し、ｐＨ５以下の酸性溶液とし、イオン交換樹脂、例えばDowex ５０Ｗｘ４（２００〜４００メッシュ，Ｈ+型）のカラムに充填し、脱イオン水を用いて、流出液が中性域（ｐＨ６〜８）に達するまで洗浄する。魚醤中に存在する食塩および有機酸はカラムに吸着されず、アミノ酸およびペプチドと分離することができる。吸着したアミノ酸およびペプチドを、アルカリ溶液、例えば３Ｎ  ＮＨ4ＯＨを用いてカラムから溶離する。溶離液を、真空中で蒸発乾固させ、残留物を脱イオン水中に溶解させる。この溶液を、イオン交換樹脂、例えばDowex １ｘ８（１００〜２００メッシュ，酢酸型）カラム（５ｘ３０ｃｍ）に加え、脱イオン水を用いて洗浄する。水を用いて溶離した画分を、真空中で蒸発乾固させ、脱イオン水中に溶解させる。吸着した物質を、酸性溶液、例えば２Ｎ酢酸を用いて溶離させる。酢酸塩を除去するために、その溶離液を真空中で蒸発乾固させた後、脱イオン水に溶解させる。こららの操作により、アミノ酸およびペプチドからなる二つの画分を得ることができる。
【００１４】
更にそれぞれの画分を、限外濾過膜を用いて分子量により複数の画分に分けることができる。例えば、用いる限外濾過膜のカットオフ値を３００〜７００Ｄａとすれば、アミノ酸及びジペプチドを主に含む画分とトリペプチド以上を主に含む画分とに分離することができる。濾過に際しては、加圧下、例えば２〜５ｋｇ／ｃｍ2の条件下にて行うのが好ましい。
【００１５】
上記画分から更に、適当な分離カラム、例えばオクタデシルシリカ（ＯＤＳ）カラムを用いてペプチドおよびアミノ酸を単離することができる。ペプチドおよびアミノ酸の溶出は、ＵＶ検出器によって検出することができる。溶離されるピークをフラクション毎に集めることにより、目的とするペプチドを回収することができる。
【００１６】
精製されたペプチドのアミノ酸配列は、プロテインシークエンサー（例えば、４７６Ａ，Applied Biosystems Inc., フォスター）を用いて分析することができる。
【００１７】
分子質量測定は、質量分析計（例えば、ＪＥＯＬ  ＳＸ−１０２質量分析計（ＪＥＯＬ，Ltd.，東京））を用いて行うことができる。
得られたペプチドが本発明のペプチドであることを確認するために行う官能評価は、合成または分離されたペプチドを、脱イオン水（５ｍＭ）中に溶解させ、数滴の希ＮａＯＨまたはＨＣｌを用いて、ｐＨを５〜７に調整し、任意に選出したパネルメンバーによって行うことができる。また、評価は塩存在下および塩不存在下で味が異なることも考えられるため、塩存在下および塩不存在下で実施する。塩存在下の評価は、例えば、食塩 ０．１〜０．６％溶液中で行うのが好ましい。
【００１８】
本発明の特に好ましい旨味成分であるトリペプチドおよびテトラペプチドは、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ、及びＡｓｐ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏから選ばれる一種又は二種以上の混合物である。
【００１９】
一方、上記のようにして魚醤中の旨味成分として特定されたペプチドは、ペプチド合成機を用いた固相法、または液相法によって合成することができる。
合成されたペプチドの精製は、公知の方法、例えば液体クロマトグラフを用いて、カラム分離することにより行うことができる。
【００２０】
本発明の特徴の一つは、魚醤中に発見された旨味成分であるトリペプチドおよびテトラペプチドが、食塩が存在しないときは顕著な旨味を呈しないが、塩存在下で旨味性を有することである。そのような旨味成分は、上記６種以外にも種々存在すると思われる。
【００２１】
これらの旨味ペプチドを単離するために用いる魚醤原料としては、例えば、これらに限定するわけではないが、東南アジアではニョクマム、ナン・プラー、パティス、日本ではいしり、しょっつる、いかなご醤油等が使用できる。上記魚醤の他、いかなる魚醤であっても原料として用いることができるが、ペプチド含量の高い魚醤を用いるのが好ましい。
【００２２】
本発明における調味料とは、ニョクマム、ナン・プラー、パティス、いしる、しょっつる、又はいかなご醤油等の魚醤をはじめとする魚介エキス、だし、畜肉エキス、ブイヨン等の蛋白分解エキス、抽出エキス、みそ、醤油等であり、これらの調味料に旨味成分として本発明の旨味成分であるトリペプチドおよびテトラペプチドを添加することもできる。また、本発明の旨味成分であるトリペプチドおよびテトラペプチドを、グルタミン酸ナトリウムのように調味料として用いることもできる。
【００２３】
本発明において調味料とは、粉末状または液体状の何れであってもよい。
本発明の旨味成分であるトリペプチドおよびテトラペプチドを旨味成分として調味料中に添加する場合の添加濃度は、１ｍｇ〜１０ｇ／１００ｍｌの範囲が好ましい。具体的には、調味料を添加する食品を考慮して定められる。
【００２４】
本発明の旨味成分であるトリペプチドおよびテトラペプチドを旨味成分とする調味料を用いることができる食品は、特に制限されないが、おでんつゆの他、はんぺん、蒲鉾、ちくわ等の水産練製品；ハム、ソーセージ、ベーコンなど畜肉加工品；肉団子、ハンバーグ、ミートボールなどの肉製品；キムチ、浅漬け、らっきょう等の漬物類；肉まん、餃子、シュウマイ、春巻き、焼きそば、焼きめし、ふりかけ、珍味、佃煮、せんべい、あられ、スナック菓子、ソース、インスタントラーメンスープ、カップ麺スープ、ブイヨン、ルー、麺類つゆ、たれ等がある。
【００２５】
【実施例】
以下、本発明に関して、実施例を示して説明する。
実施例１
分画
分画スキームを図１に示す。ベトナム製魚醤試料（１００ｍＬ）を、９００ｍＬの０．５Ｍ  ＨＣｌを用いて希釈し、Dowex ５０Ｗｘ４（２００〜４００メッシュ，Ｈ+型）のカラム（５ｘ３０ｃｍ）に充填し、脱イオン水を用いて、流出液が中性のｐＨに達するまで洗浄した。吸着したアミノ酸およびペプチドを、３Ｎ  ＮＨ4ＯＨを用いて溶離した。溶離液を、アンモニアを除去するために真空中で蒸発乾固させ、残留物を脱イオン水中に溶解させた。この溶液を、Dowex １ｘ８（１００〜２００メッシュ，酢酸型）カラム（５ｘ３０ｃｍ）に加え、脱イオン水を用いて洗浄した。水を用いて溶離した画分を、真空中で蒸発乾固させ、脱イオン水中に溶解させて１００ｍＬとした（フラクションＢ，中・塩基性画分）。吸着した物質を、２Ｎ酢酸を用いて溶離させた。酢酸塩を除去するために、その溶離液を真空中で蒸発乾固させた後、脱イオン水を用いて元の容量（１００ｍＬ，フラクションＣ，酸性画分）にし、ｐＨ５．６２に調整した。
【００２６】
それぞれの画分（フラクションＢおよびＣ）を、図２に示されるように、限外濾過膜（ＹＣ０５，Amicon,Inc.，ビバリー）を用いて濾過した。用いられる膜の分子排除限界は、５００Ｄａであった。窒素圧を３．５ｋｇ／ｃｍ2で調節した。限外濾過後、４つの画分を得た。フラクションＢ（中・塩基性画分）から得られたのは、低分子（フラクションＢＬ）および高分子（フラクションＢＨ）重量画分であった。フラクションＣ（酸性画分）からの低分子（フラクションＣＬ）および高分子（フラクションＣＨ）重量画分も得られた。それら画分を全て、真空中で蒸発乾固させ、脱イオン水を用いて元の魚醤容量（１００ｍＬ）とし、希ＨＣｌまたはＮａＯＨを用いてそれらのｐＨを５．６２に調整後、官能評価に用いた。
【００２７】
各画分のアミノ酸分布
ベトナム製魚醤は、結合アミノ酸、特に、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、グリシン、リシンおよびヒスチジンが多かった。それら含量の合計は、全結合アミノ酸の７６％（４，２９６ｍｇ／１００ｍＬ）であった。表１は、５００Ｄａより小さい（フラクションＢＬ）および大きい（フラクションＢＨ）分子量を有する中・塩基性画分、および５００Ｄａより小さい（フラクションＣＬ）および大きい（フラクションＣＨ）分子量を有する酸性画分のそれぞれの加水分解前後のアミノ酸組成を示す。加水分解は常法に準じ、６Ｎ  ＨＣｌ、１１０℃１６時間の条件にて実施した。
【００２８】
加水分解前の高分子画分、フラクションＢＨおよびＣＨにおいて、残留する全アミノ酸は、加水分解前の低分子画分それぞれの場合の僅か１０％未満であり、限外濾過の結果として、アミノ酸がほぼ充分に分離されたことが示唆された。フラクションＢＨおよびＢＬの加水分解後、増加した全アミノ酸含量は、それぞれ７４０および５８６ｍｇ／１００ｍＬであった。酸性画分のフラクションＣＨおよびＣＬについて、その値はそれぞれ５１２および１９５ｍｇ／１００ｍＬであった。したがって、高分子画分、フラクションＢＨおよびＣＨは、低分子画分、フラクションＢＬおよびＣＬよりも多くのペプチドを含有していた。
【００２９】
【表１】
0004840837.tif 000002
【００３０】
図３および４は、高分子画分、フラクションＢＨおよびＣＨの加水分解前後の主な増加アミノ酸含量を示す。中・塩基性高分子画分（フラクションＢＨ）の場合、増加したアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシンおよびヒスチジンは、全増加アミノ酸の８０％であった。アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシンおよびヒスチジンの増加は、それぞれ、７２、１３６、８２、２２６および７０ｍｇ／１００ｍＬとなり、それぞれ、加水分解後の全増加アミノ酸の１０、１８、１１、３０および９％に相当した（図３）。
【００３１】
酸性高分子画分（フラクションＣＨ）の場合、増加したアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシンおよびヒスチジンは、全増加アミノ酸の７０％であった。アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシンおよびヒスチジンの増加は、それぞれ、１３１、１４８、４２および３８ｍｇ／１００ｍＬとなり、それぞれ、加水分解後の全増加アミノ酸の２６、２９、８および７％に相当した（図４）。
【００３２】
実施例２
ペプチド画分の官能評価
表２は、単純合成エキスの組成を示す。
【００３３】
単純合成エキスは、魚醤の呈味有効成分であると確認された１１種の化合物（グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、プロリン、トレオニン、バリン、ヒスチジン、チロシン、シスチン、メチオニン、およびピログルタミン酸）を魚醤中の濃度になるように混合したもので、魚醤の味を良く再現している。グルタミン酸含量が極めて高いため、高および低グルタミン酸合成エキスの両方について官能試験を行い、グルタミン酸含量の影響を見た。
【００３４】
表３は、単純合成エキスに加えられるペプチド画分の寄与に関する官能評価の結果を示す。中・塩基性高分子画分（フラクションＢＨ）および酸性高分子画分（フラクションＣＨ）を、低および高グルタミン酸１１成分単純合成エキスに加えた。数値は、味および風味特性それぞれの項目についてのｔ値である。それら値は、その値が０より大きいほど、味は強くなり、その値が０より小さいほど、味は弱くなることを意味している。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
【表３】
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【００３７】
低および高グルタミン酸単純合成エキスへの中・塩基性高分子画分（フラクションＢＨ）の添加は、甘味を大きく増加させたが、それは、低グルタミン酸エキスの場合、高グルタミン酸エキスの場合より大きかった。酸性高分子画分（フラクションＣＨ）の添加により、甘味は僅かに減少したが、酸味は、まろらかさの減少と共に著しく増加した。両方の画分とも、苦味、高グルタミン酸エキスのフラクションＣＨの場合を除く旨味、持続性、先味および後味を有意に増加させた。渋み、こくおよび伸びも、フラクションＣＨの添加によって増大した。これら結果から、高分子画分（フラクションＢＨおよびＣＨ）中のペプチドは、魚醤の味および風味特性に大きく貢献したということが明らかである。
【００３８】
実施例３
ペプチドの単離
実施例１の魚醤画分それぞれを、オクタデシルシリカ（ＯＤＳ）カラム（Inertsil ＯＤＳ−３，４．６ｘ２５０ｍｍ，ＧＬ Sciences Inc., 東京）クロマトグラフィーに付した。溶離は、０．０５％ＴＦＡ含有アセトニトリルで１５０分以内に０〜２０％の直線勾配によって０．７ｍＬ／分の流量で行った。ペプチドおよびアミノ酸を、ＵＶ検出器によって２１５ｎｍで検出した。溶離される主要ピークをフラクションコレクターによって集めた。注入量は２０μＬであったが、更に別の分析用に実質的な量を得るために、注入を５回繰り返した。これらプールされたピークを凍結乾燥させ、３００μＬの脱イオン水中に溶解させた。
【００３９】
３種類のペプチドを、図５に示される中・塩基性高分子画分（フラクションＢＨ）から単離した。これらペプチドは、プロテインシークエンサー（４７６Ａ，Applied Biosystems Inc., フォスター）によって、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯｒｎおよびＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−Ｇｌｙと確認された。オルニチンが、これらトリペプチドの共通成分であるということは興味深い。オルニチンは、タンパク質中には取り込まれないということは周知である。したがって、これらペプチドは、抗生物質のような細菌生産物に由来しうる。中・塩基性低分子画分（フラクションＢＬ）からは、一つのペプチドだけが単離され、プロテインシークエンサー（４７６Ａ，Applied Biosystems Inc., フォスター）によってＡｌａ−Ｐｒｏと確認された（図６）。図７に示される酸性高分子画分（フラクションＣＨ）から単離されたペプチドはなかったが、図８に示される酸性低分子画分（フラクションＣＬ）からは、１３種類のペプチドが単離された。これらピークからの１０種類のジペプチドは、プロテインシークエンサー（４７６Ａ，Applied Biosystems Inc., フォスター）によってＡｓｐ−Ｇｌｕ、Ａｓｐ−Ｐｒｏ、Ａｓｐ−Ｐｈｅ、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ、Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−ＰｒｏおよびＰｈｅ−Ｐｒｏと確認された。３種類のトリペプチドも、プロテインシークエンサー（４７６Ａ，Applied Biosystems Inc., フォスター）によってＡｓｐ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ、Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−ＰｒｏおよびＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕと確認された。
【００４０】
上記のように、魚醤画分から１７種類のペプチドが単離され且つ確認された。これらジペプチドの多くが、トリペプチドのＣ末端または中心にプロリンを含有していたことは興味深い。魚あるいは微生物由来のプロテイナーゼおよびペプチダーゼは、プロリンのＮ末端ペプチド結合をほとんど加水分解できないということが示唆されうる。
【００４１】
初期保持時間成分の検討
図５〜８に示されるクロマトグラムにおいて、より初期の保持時間の領域（先端ピーク）には、多数の小さいピークが存在した。したがって、他のペプチドの存在を確かめるために、その先端ピークを集め、加水分解前後のアミノ酸分析に用いた。図９は、加水分解前後の中・塩基性高分子画分（フラクションＢＨ）からの先端ピーク中の結合アミノ酸を示す。アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、グリシンおよびリシンの５種類のアミノ酸が、その画分の先端ピーク中の主要成分として確認された。アスパラギン酸およびグルタミン酸は、加水分解後に、それぞれ１３倍および１９倍まで増加した。グリシンおよびリシンも、加水分解後に、それぞれ１１倍および１５倍まで増加した。図１０は、中・塩基性低分子画分（フラクションＢＬ）からの先端ピークに関するデータを示す。この場合、プロリン、グリシン、アラニン、バリン、リシンおよびヒスチジンの多数のアミノ酸が、加水分解後に増加した。最大の増加は、プロリンおよびグリシンで見られ、それぞれ、３４倍および１４倍まで増加した。
【００４２】
図１１は、酸性高分子画分（フラクションＣＨ）からの先端ピークに関するデータを示す。加水分解後に増加したアミノ酸の量はかなり多く、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシンおよびヒスチジンは、加水分解後に多量に見出された。これらの結果から、これら画分中には、上述のように単離され且つ確認されたもの以外にも多数の他の種類のペプチドが存在するということが明らかである。
【００４３】
先端ピークの分析は、初めの１５分以内のピーク分離がほぼ充分であったので、酸性低分子画分（フラクションＣＬ）（図８）の場合は行わなかった。
【００４４】
実施例４
ペプチドの合成
試薬
ジペプチド、トリペプチドおよびテトラペプチドの合成には、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯtＢｕ）・Ｈ2Ｏ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（tＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−ＭｅｔおよびＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯtＢｕ）を、Peptide Institute,Inc., 大阪から購入した。Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｈ−Ｐｒｏ−ＯtＢｕ・ＨＣｌおよびＨ−Ｇｌｕ（ＯtＢｕ）−ＯtＢｕ・ＨＣｌは、Noba Biochem Co., シュヴァルバッハから入手した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸樹脂として、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ  Ｔｒｔ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）Ｆｍｏｃを、Fluka Chemika Co., ブフスから入手した。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＣＬＥＡＲ酸およびＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＣＬＥＡＲ酸樹脂は両方とも、Peptide Institute,Inc., 大阪から購入した。
【００４５】
カップリングおよび脱保護剤用の試薬として、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（ＨＢＴＵ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール・Ｈ2Ｏ（ＨＯＢｔ）およびベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＢＯＰ）は、Noba Biochem Co., シュヴァルバッハから入手した。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、ピペリジン、脱水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）は、Kanto Chemical Co.,Inc., 東京から購入した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Wako Pure Chemical Industries,Ltd., 大阪から購入した。他の試薬は、分析用等級のものであり、Wako から入手した。
【００４６】
固相法
ペプチドを、ペプチド合成機（ＰＳＳＭ−８システム，Shimadzu，京都）を用いた固相法によって合成した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸樹脂は、ＤＭＦを用いて予め洗浄した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸を、次のカップリングサイクルを用いて逐次的にカップリングさせた。１．ＤＭＦ洗浄（２ｘ２分）；２．３０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＤＭＦ洗浄（５分）；３．ＤＭＦ洗浄（５ｘ２分）；４．カップリング工程（３０分）；５．ＤＭＦ洗浄（２ｘ２分）。アミノ酸のカップリングには、Ｆｍｏｃ−アミノ酸それぞれをＤＭＦ中に溶解させた後、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔおよびＤＩＥＡの試薬混合物を用いて活性化させ、そして反応容器中に移した。カップリング反応は３０分間続けた。反応後ピペリジンを用いた末端Ｆｍｏｃの切断し、その樹脂を、ＤＭＦ（２回）、メタノール（５回）およびtert−ブチルメチルエーテル（２回）を用いて洗浄後、真空中で注意深く１時間乾燥させた。ペプチド樹脂を、９４％ＴＦＡ、５％アニソールおよび１％エタンジオールの混合物と一緒に３時間撹拌することによって、ペプチドを切断し且つ保護基をはずした。その混合物を濾過し、ＴＦＡを用いて樹脂を２回洗浄した。合わせた濾液を冷エーテルと直接混合した。ペプチドを−２０℃で２時間完全に沈澱させ、遠心分離によって集めた。その生成物を、冷エーテルを用いて２回洗浄し、遠心分離によって集めた後、真空中で充分に乾燥させた。
【００４７】
上記の方法により、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ（１９．５ｍｇ）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ（１６．７ｍｇ）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−Ｇｌｙ（２２．９ｍｇ）およびＧｌｕ−Ｐｈｅ（１３．０ｍｇ）を合成した。
【００４８】
液相法
下記の３種類のトリペプチドは、上記固相法では正しく合成されなかった。したがって、これらペプチドを液相法によって合成した。
【００４９】
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ．
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ（３３９ｍｇ）およびＰｒｏ−ＯtＢｕ・ＨＣｌ（１７１ｍｇ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、３種類の試薬ＢＯＰ（６６３ｍｇ）、ＨＯＢｔ（２００ｍｇ）およびＮＭＭ（０．１ｍＬ）を０℃で加え、その混合物を室温で２０時間撹拌した。溶媒を凍結乾燥によって除去後、その反応混合物を、ＥｔＯＡｃを用いて希釈し、１０％クエン酸、Ｈ2Ｏ、飽和ＮａＨＣＯ3、Ｈ2Ｏおよび飽和ＮａＣｌを用いて逐次的に洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、真空中で濃縮した。その残査をシリカゲルクロマトグラフィー（Kieselgel ６０，３．５ｘ１０ｃｍ，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ）に付して、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯtＢｕ（１９０ｍｇ；３７％収率）を得た。
【００５０】
このＦｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯtＢｕ（１００ｍｇ）を、ＴＦＡ（２ｍＬ）中に室温で溶解させ、１時間撹拌した。溶媒を凍結乾燥によって除去後、その反応混合物をシリカゲルクロマトグラフィー（Kieselgel ６０，３．５ｘ１０ｃｍ，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ，ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ）に付して、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ・ＯＨ（８８ｍｇ；９９％収率）を得た。
【００５１】
上のジペプチド（８８ｍｇ）およびＧｌｕ（ＯtＢｕ）ＯtＢｕ・ＨＣｌ（５１．８ｍｇ）のＤＭＦ（２ｍＬ）中溶液に、ＢＯＰ（１３３ｍｇ）、ＨＯＢｔ（４１ｍｇ）およびＮＭＭ（０．１ｍＬ）を０℃で加え、その混合物を上述のように反応させ且つ処理して、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＯtＢｕ）ＯtＢｕ（８２．８ｍｇ；５９％収率）を得た。
【００５２】
保護されたトリペプチドをＴＭＦ（２ｍＬ）中に室温で溶解させ、２時間撹拌した。溶媒を凍結乾燥によって除去後、残査をピペリジン（３ｍＬ）中に溶解させ、室温で３時間撹拌した。溶媒を凍結乾燥によって除去後、その反応混合物を逆相ＨＰＬＣに付して、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（３９．６ｍｇ；９５％収率）を得た。
【００５３】
Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ．
Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ（３７１ｍｇ）およびＰｒｏ−ＯtＢｕ・ＨＣｌ（１７１ｍｇ）のＤＭＦ（３ｍＬ）中溶液に、ＢＯＰ（６６３ｍｇ）、ＨＯＢｔ（２７０ｍｇ）およびＮＭＭ（０．１ｍＬ）を０℃で加え、その混合物を上のように反応させ且つ処理して、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−ＯtＢｕ（２３０ｍｇ；４４％収率）を生じた。このようにして得られたＦｍｏｃ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−ＯtＢｕ（１２０ｍｇ）を、ＤＭＦ（１ｍＬ）およびピペリジン（１ｍＬ）中に溶解させ、上のように反応させて、Ｈ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−ＯtＢｕ（６５ｍｇ；９４％収率）を生じた。上のジペプチド（６５ｍｇ）およびＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯtＢｕ）・ＯＨ（１９４ｍｇ）をＤＭＦ（２ｍＬ）中に溶解させ、上のように反応させて、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯtＢｕ）−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−ＯtＢｕ（１８１．９ｍｇ；７０％収率）を得た。
【００５４】
この保護されたトリペプチドを、ＴＦＡ（２．７ｍＬ）および０．３ｍＬの硫化エチルメチル（Guttmann & Boissonnas，1959年）中に溶解させ、上のように処理して、Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ（５７．６ｍｇ；６０％収率）を得た。
【００５５】
Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ．
上記のように合成されたＦｍｏｃ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−ＯtＢｕ（１１０ｍｇ）を、基本的に上述の記載手順にしたがって、Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ（２８．６ｍｇ；６５％収率）の合成に用いた。
【００５６】
実施例５
合成されたペプチドの精製
合成されたペプチドの精製は、Shimadzu ＬＣ−６ＡＤ液体クロマトグラフ（Shimadzu，京都）を用いて、Inertsil ＯＤＳ−３カラム（１０ｘ２５０ｍｍ，ＧＬ Sciences Inc., 東京）により、室温において、４０分間で０．０５％ＴＦＡ含有アセトニトリルの０〜２０％の直線勾配により２ｍＬ／分の流量で行った。ペプチドを２１５ｎｍで検出した。主要画分を集め、凍結乾燥させた。
【００５７】
分析用ＨＰＬＣに関して、用いられるシステムは、２個の Shimadzu ポンプ（ＬＣ−６ＡＤ）、ＵＶ分光光度計検出器（ＳＰＤ−６Ａ）およびシステムコントローラー（ＳＣＬ−６Ｂ）から成る。
【００５８】
実施例６
官能評価
合成されたペプチドを、脱イオン水（５ｍＭ）中に溶解させ、数滴の希ＮａＯＨまたはＨＣｌを用いて、ｐＨを６．０２に調整した。これらペプチドの官能評価は、女性２人、男性１人の３人のパネルメンバーによって行った。
【００５９】
単離された１７種類のペプチドの内、８種類のペプチドは商業的に入手可能であった。Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ａｓｐ−Ｇｌｕ、Ａｓｐ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−ＰｒｏおよびＰｈｅ−Ｐｒｏのような商業的に入手可能なジペプチドは、Bachem Co., ブベンドルフから入手し、官能評価に用いた。一つのジペプチドＧｌｕ−Ｐｈｅ、二つのトリペプチドおよび一つのテトラペプチドを、ペプチド合成機で合成した。３種類の他のトリペプチドは、液相法によって合成した。これら合成されたペプチド、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ（ＭＷ，３９２）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ（ＭＷ，３２８）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−Ｇｌｙ（ＭＷ，３４３）、Ｇｌｕ−Ｐｈｅ（ＭＷ，２９４）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＭＷ，３４３）、Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ（ＭＷ，３７５）およびＡｓｐ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ（ＭＷ，３６１）を、図１２〜１８に示される質量分析によって更に確認した。質量スペクトルはいずれも、これらペプチドの推定構造を充分に支持した。次に、これらペプチドを、食塩の存在下および非存在下において官能評価に用いた。
【００６０】
合成されたいくつかのペプチドは量が少なかったので、これらペプチドを５ｍＭ水溶液として調べた。Ａｓｐ−ＰｒｏおよびＧｌｕ−Ｐｒｏについての官能評価は、それらの得られた量が不充分なために行わなかった。
【００６１】
塩非存在下での評価
塩の非存在下において、苦味または酸味、旨味、またはほとんど無味を示した。魚醤中のプロリン含有ジペプチドの内、Ｐｈｅ−Ｐｒｏだけは苦味を与えた（表４）。プロリンを含有する５種類のトリペプチドの内、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−ＯｒｎおよびＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎは苦味を有した。
【００６２】
塩存在下での評価
これらペプチドの味への塩の作用は、０．３％食塩の存在下で決定した（表４）。ほとんど全てのペプチドが、先味に甘みを示し、そしてＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ、Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−ＰｒｏおよびＧｌｙ−Ｔｙｒを除いて、後味として旨味を有した。前者二つは先味に旨味を、後味に甘味を与えたが、最後の一つは、甘味だけを与えた。興味深いことに、塩の存在下におけるこれら甘味および旨味は、塩の非存在下の味とはほとんど無関係であった。つまり、食塩非存在下では甘みおよび旨味をほとんど示さなかったが、食塩存在下では甘みおよび旨味を示した。魚醤は高濃度の塩を含有しているので、これらペプチドは、魚醤の甘味および旨味の原因となっているといえる。これらデータは、ペプチド画分が合成エキスの甘味、旨味または酸味、更には、他の風味特性を増加させた前のデータ（表３）と充分に一致していた。
【００６３】
【表４】
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【００６４】
官能評価結果の考察
いくつかのペプチドについては、表４に示されるように、呈味作用が既に報告されている（Kirimuraら(1969、前出)； Araiら(1973、前出)； Noguchi, M., Arai, S., Yamashita, M., Kato, H., and Fujimaki M. (1975) Isolation and identification of acidic oligopeptides occurring in a flavor potentiating fraction from a fish protein hydrolysate. J Agric. Food Chem., 23, 49〜53.； Hessel, P. (1999) Amino acids, peptides, proteins. In Food Chemistry, (Belitz, H.-D. and Grosch, W, Ed.) 2nd ed. Springer, New York, pp. 8〜91）。これらペプチドの呈味特性は、食塩の非存在下において、酸味／旨味、旨味、無味（ほとんど味のない）、甘味および苦味に分類された。酸味ペプチドには、Ａｓｐ−Ｇｌｕ、Ｔｙｒ−ＰｒｏおよびＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕが含まれた。ほとんど無味なペプチドは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−Ｇｌｙ、Ａｓｐ−Ｐｈｅ、Ｇｌｕ−ＰｈｅおよびＧｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏであった。甘味を有するペプチドは、Ｖａｌ−Ｐｒｏだけであり、旨味を有するものにも、Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏだけが含まれた。苦味ペプチドには、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−ＴｙｒおよびＰｈｅ−Ｐｒｏが含まれた。
【００６５】
Ishibashi ら（Ishibashi, N., Kubo, M, Chino, M., Fukui, E, Shinoda, L, Kikuchi, E., Okai, R, and Fukui, S. (1988) Taste of proline-containing pepties. Agric. Biol. Chem., 52, 95〜98）は、プロリン含有ジペプチドが苦味を示したことを報告している。同じＱ値を有するＰｒｏ−ＧｌｙおよびＧｌｙ−Ｐｒｏの味は、互いに異なっていた。前者は無味であったが、後者は苦味を有していた。彼らは、ペプチドの苦さにおけるプロリン残基の最も有意の役割が、プロリン分子のピロリジン環のためにペプチド骨格を折りたたむことによるペプチド分子の立体配座変更に依存していると報告している。したがって、本発明のトリペプチドの苦さは、このαイミノ酸によるそれらの分子の立体配座に由来しうる。
【００６６】
若干のペプチドは、Ａｓｐ−Ｐｈｅ、Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、Ｖａｌ−ＰｒｏおよびＴｙｒ−Ｐｒｏの味に見られるように、報告された味とはかなり異なった味を示した（表４）。その違いは、ペプチドの濃度または試験液のｐＨの違いに由来しうる。本実施例において、ペプチド溶液のｐＨは、官能評価の前に６．０２に調整したが、報告されたジペプチド官能試験には、ｐＨに関する記載はなかった。Wangら（Wang, K, Maga, J. A, and Bechtel, P. J. (1996) Taste properties and synergisms of beefy meaty peptide. J Food Science, 61, 837〜839）は、牛肉ペプチド（ＢＭＰ）へのｐＨの作用を報告している。ｐＨ３．５での味は酸味であるが、ｐＨ６．５ではそれが旨味に変わり、そしてｐＨ９．５では、旨味と共に甘味および塩辛味が現れた。濃度の異なるペプチド溶液についての官能評価は、合成されたペプチドの量が不充分であったので、行うことができなかった。
【００６７】
Ney（1971、前出)によって報告された法則によれば、１．４ｋｃａｌ／ｍｏｌより高いＱ値を有するペプチドは味が苦く、１．３ｋｃａｌ／ｍｏｌより低いＱ値を有するものは苦くない。Ｑ値の計算を、表３に示されるペプチドについて行った場合、１．４ｋｃａｌ／ｍｏｌより高いＱ値を有するペプチドには、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ａｓｐ−Ｐｒｏ、Ａｓｐ−Ｐｈｅ、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ、Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ、Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ、Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−ＰｒｏおよびＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕが含まれた。これらのペプチドの内、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−ＴｙｒおよびＰｈｅ−Ｐｒｏだけが苦味を示した。したがって、上述のNeyによって報告された法則は、全てのペプチドに当てはまらないかもしれないが、呈味は、濃度依存性でありうる。
【００６８】
前出のKirimura ら（1969年）の法則に関しては、魚醤中で見出される若干のジペプチドは、この法則に従う。例えば、Ａｓｐ−Ｇｌｕは酸味を示し、Ｇｌｙ−ＰｈｅおよびＧｌｙ−Ｔｙｒは苦味を示した（表４）。
【００６９】
前出のArai ら（1973年）の分類に関しては、Ｇｌｕ−Ｐｈｅは苦味ジペプチドに分類されるが、それは、本評価ではほとんど味がないと判定されており（表４）、５ｍＭ濃度のＧｌｕ−Ｐｈｅは、このジペプチドの閾値未満であったことが示唆される。
【００７０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、魚醤の深い且つ複雑な味に関与しているペプチドを旨味成分とする、魚醤の旨味を有しかつ魚醤特有の臭気が改善された調味料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、Dowexイオン交換体による魚醤試料の分画フローを示す。
【図２】  図２は、限外濾過による魚醤画分の分別フローを示す。
【図３】  図３は、５００Ｄａより大きい分子量を有する中・塩基性画分（フラクションＢＨ）の加水分解前後のアミノ酸含量を示す。
【図４】  図４は、５００Ｄａより大きい分子量を有する酸性画分（フラクションＣＨ）の加水分解前後のアミノ酸含量を示す。
【図５】  図５は、５００Ｄａより大きい分子量を有する中・塩基性画分（ＢＨ）のＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図６】  図６は、５００Ｄａより小さい分子量を有する中・塩基性画分（ＢＬ）のＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図７】  図７は、５００Ｄａより大きい分子量を有する酸性画分（ＣＨ）のＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図８】  図８は、５００Ｄａより小さい分子量を有する酸性画分（ＣＬ）のＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図９】  図９は、中・塩基性高分子画分（フラクションＢＨ）からの先端ピークの加水分解前後のアミノ酸含量を示す。
【図１０】  図１０は、中・塩基性低分子画分（フラクションＢＬ）からの先端ピークの加水分解前後のアミノ酸含量を示す。
【図１１】  図１１は、酸性高分子画分（フラクションＣＨ）からの先端ピークの加水分解前後のアミノ酸含量を示す。
【図１２】  図１２は、合成されたＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎのポジティブマススペクトルを示す。
【図１３】  図１３は、合成されたＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎのポジティブマススペクトルを示す。
【図１４】  図１４は、合成されたＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−Ｇｌｙのポジティブマススペクトルを示す。
【図１５】  図１５は、合成されたＧｌｕ−Ｐｈｅのポジティブマススペクトルを示す。
【図１６】  図１６は、合成されたＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕのポジティブマススペクトルを示す。
【図１７】  図１７は、合成されたＧｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏのポジティブマススペクトルを示す。
【図１８】  図１８は、合成されたＡｓｐ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏのポジティブマススペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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