(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶの選択された改変体の改変されたＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドは、ＨＸＢ−２（配列番号１）に対して残基４２０〜４３６に対応する領域において、該選択された改変体の野生型Ｅｎｖポリペプチドに対して少なくとも１つのアミノ酸が欠失されており、ＣＤ４結合ドメインが露出されている、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
ＨＸＢ−２に対して残基１２４〜１９８に対応する前記領域が欠失されており、そして少なくとも１つのアミノ酸が、ＨＸＢ−２（配列番号１）に対して残基１１９〜１２３および残基１９９〜２１０に対応する領域において欠失または置換されている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ＨＸＢ−２（配列番号１）に対して残基４２７〜４２９に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸が、欠失または置換されている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記改変されたＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドの前記アミノ酸配列が、ＳＦ１６２株に基づいている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＨＩＶの選択された改変体の免疫原性の改変されたＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ＨＸＢ−２（配列番号１）に対して残基４２０〜４３６に対応する領域において、該選択された改変体の野生型Ｅｎｖポリペプチドに対して少なくとも１つのアミノ酸が欠失されており、ＣＤ４結合ドメインが露出されている、免疫原性の改変されたＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチド。
【請求項６】
ＨＸＢ−２（配列番号１）に対して残基４２０〜４３６に対応する領域において１つのアミノ酸が欠失している、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
１つ以上のアミノ酸が、ＨＸＢ−２（配列番号１）に対して残基４２０〜４３６に対応する領域において欠失している、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドのＶ１領域およびＶ２領域が短縮されている、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記改変されたＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドのアミノ酸配列が、ＳＦ１６２株に基づいている、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
図６（配列番号３）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項１１】
図７（配列番号４）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項１２】
図８（配列番号５）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項１３】
図９（配列番号６）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項１４】
図１０（配列番号７）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項１５】
図１１（配列番号８）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項１６】
図１２（配列番号９）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項１７】
図１３（配列番号１０）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項１８】
図１４（配列番号１１）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項１９】
図１５（配列番号１２）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項２０】
図１６（配列番号１３）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項２１】
図１７（配列番号１４）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項２２】
図１８（配列番号１５）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項２３】
図１９（配列番号１６）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項２４】
図２０（配列番号１７）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項２５】
図２１（配列番号１８）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項２６】
図２２（配列番号１９）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項２７】
図２３（配列番号２０）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項２８】
図２４（配列番号２１）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項２９】
図２５（配列番号２２）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項３０】
図２６（配列番号２３）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項３１】
図２７（配列番号２４）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項３２】
図２８（配列番号２５）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項３３】
図２９（配列番号２６）に示されるヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項３４】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の改変されたＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ワクチン組成物。
【請求項３５】
請求項１０〜３３のいずれか１項に記載の改変されたＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物を含む、ワクチン組成物。
【請求項３６】
請求項５〜９のいずれか１項に記載の改変されたＥｎｖポリペプチドを含む、ワクチン組成物。
【請求項３７】
アジュバントをさらに含む、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項３８】
被験体において免疫応答を誘導するのに使用するための医薬の製造において使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項３９】
被験体において免疫応答を誘導するのに使用するための医薬の製造において使用するための、請求項１０〜３３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物の使用。
【請求項４０】
被験体において免疫応答を誘導するのに使用するための医薬の製造において使用するための、請求項５〜９のいずれか１項に記載の改変されたＥｎｖポリペプチドを含む組成物の使用。
【請求項４１】
前記医薬がアジュバントをさらに含む、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４２】
被験体において免疫応答を誘導するために、ブースタとして請求項５〜９のいずれか１項に記載の改変されたＥｎｖポリペプチドを含む第２の組成物とともにプライマーとして使用するための医薬の製造において使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む第１の組成物の使用。
【請求項４３】
被験体において免疫応答を誘導するために、プライマーとして請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む第１の組成物とともにブースタとして使用するための医薬の製造において使用するための、請求項５〜９のいずれか１項に記載の改変されたＥｎｖポリペプチドを含む第２の組成物の使用。
【請求項４４】
前記第１の組成物または第２の組成物がアジュバントをさらに含む、請求項４２または４３に記載の使用。
【請求項４５】
前記第１の組成物および第２の組成物がアジュバントをさらに含む、請求項４２または４３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、概して改変されたＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）ポリペプチドに関する。このポリペプチドは、被験体における免疫応答（例えば、細胞性免疫応答または保護的免疫応答）を生成するための免疫薬剤として有用である。より詳細には、本発明は、Ｅｎｖポリペプチド（例えば、ｇｐｌ２０、ｇｐｌ４０またはｇｐｌ６０）に関し、ここで、ネイティブβシート立体配置の少なくとも１つが改変されている。本発明はまた、これらのポリペプチドを用いて、広汎なＨＩＶサブタイプにたいする免疫応答を惹起する方法に関する。
（発明の背景）
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）（ＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも呼ばれる）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および関連する障害の病因因子である。（例えば、Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ、ら、（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：８６８−８７１；Ｇａｌｌｏら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：５００−５０３；Ｌｅｖｙら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２５：８４０−８４２；Ｓｉｅｇａｌら、（１９８１）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０５：１４３９−１４４４を参照のこと）。ＡＩＤＳ患者は、通常、長期の無症状期間を有し、続いて、免疫系および中枢神経系の進行的退縮が起こる。このウイルスの複製は、高度に制御されており、そしてそのＣＤ４陽性ヘルパーサブセットのＴリンパ球の潜伏性感染および溶解性感染の両方が、組織培養物において生じる（Ｚａｇｕｒｙら、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１：８５０−８５３）。ＨＩＶ−１の分子研究によって、このウイルスは多数の遺伝子をコードすることが示されている（Ｒａｔｎｅｒら、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：２７７−２８４；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：４８４〜４９２）。これには、３つの構造遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）が含まれ、これらは、すべてのレトロウイルスに共通している。他のレトロウイルス（特に、ＨＩＶ−２およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）（以前にはＳＴＬＶ−ＩＩＩと称された））のウイルスゲノムからのヌクレオチド配列もまた、これらの構造遺伝子を含む（Ｇｕｙａｄｅｒら、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２６：６６２−６６９；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ）。
【０００２】
ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶのエンベロープタンパク質は、約１６０ｋｄの糖タンパク質である（ｇｐｌ６０）。この宿主のウイルス感染の間、ｇｐｌ６０は、宿主細胞のプロテアーゼによって切断されて、ｇｐ１２０および膜内在性タンパク質であるｇｐ４１を形成する。このｇｐ４１の部分は、ビリオンの二層膜に固定されるが、他方で、ｇｐ１２０セグメントは、まわりの環境へと突出する。ｇｐｌ２０およびｇｐ４１は、より共有結合的に会合しており、そして遊離のｇｐ１２０は、ビリオンおよび感染した細胞の表面から遊離され得る。
【０００３】
図１に示すように、ｇｐ１２０コアポリペプチドの結晶学的研究によって、このポリペプチドが特定の発散性の構造を有する主要な構造へと折り畳まれる（フォールリングされる）ことが示された。内側のドメイン（Ｎ末端およびＣ末端に対して内側）は、２つのヘリックス、二鎖の束（小さな５鎖のβサンドウィッチを末端〜近位末端において、および突出部を遠位末端において有する）によって特徴付けられ、この遠位末端からは、Ｖ１／Ｖ２ステムが発散する。外側のドメインは、固定された（ｓｔａｋｅｄ）二重のバレルであり、これは、内側ドメインの側面に沿って存在し、その結果、外側のバレルおよび内側の束の軸は、ほぼ並行である。遠位内側ドメインと遠位外側ドメインとの間には、４鎖のブリッジングシートが存在し、これは、内側ドメイン、外側ドメインおよびＶ１／Ｖ２ドメインと接触しているがそれらとは異なる独特のミニドメインを有する。このブリッジングシートは、４つのβ鎖構造（β１、β２、β２１、β２０、図１に示す）から構成される。このブリッジング領域は、図１において、内側ドメインにわたって主に広がっているように見受けられ得るが、その外側のドメインのいくらかの表面残基（例えば、Ｐｈｅ３８２）は、ブリッジングシートに達して、その疎水性コアの部分を形成する。
【０００４】
ブリッジング領域のβシート立体配座の基本ユニットは、β鎖である。このβ鎖は、１ターンあたり２．０残基で、あまり厳密ではないコイルドヘリックスとして存在する。β鎖立体配座は、βシートに組み込まれたときのみに安定である。ここで、最適な幾何的条件に近い水素結合が隣接するβ鎖上のペプチド基の間で形成される場合に、その鎖の双極子モーメントもまた、好ましく整列される。同じ鎖の隣接する残基からの側鎖は、そのシートの反対側の側面から突出し、そして互いに相互作用はしないが、その骨格および隣接する鎖の側鎖とは有意な相互作用を有する。βシートについての一般的な説明については、例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏｍｐａｎｙ、１９９３）；およびＡ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ．、１９７５を参照のこと）。
【０００５】
ｇｐ１２０ポリペプチドは、宿主細胞への侵入を媒介する際の装置である。最近の研究によって、ｇｐ１２０へのＣＤ４の結合が、共同レセプター（例えば、ケモカインレセプター）に結合することおよびその細胞へのそのウイルスの続いての侵入を可能にするＥｎｖにおける立体配座変化を誘導することが示された（Ｗｙａｔｔ、Ｒ．、ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：７０５−７１１；Ｋｗｏｎｇ、Ｐ．、ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：６４８−６５９）。図１を再び参照すると、ＣＤ４は、ｇｐ１２０の外側ドメイン、内側ドメインおよびブリッジングシートの界面において形成される窪みに結合している。
【０００６】
ｇｐ１２０ポリペプチドの免疫原性もまた、研究された。例えば、ＨＩＶ−１に感染した個体は、通常、インビトロアッセイにおいてそのウイルスを中和し得る抗体を発生させ、そしてこの応答は、ｇｐ１２０糖タンパク質の第三の可変ループにおける線状の中和性決定基に対しておもに指向される（Ｊａｖａｈｅｒｉａｎ、Ｋ．、ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：６７８６−６７７２；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ、Ｍ．、ら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２１０７−２１４４；Ｐｕｔｎｅｙ、Ｓ．ら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３９２−１３９５；Ｒｕｓｈｅ、Ｊ．Ｒ．、ら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３１９８−３２０２．）。しかし、これらの抗体は、概して、ＨＩＶ−１の限定され多数の株のみを中和する能力を示す（Ｍａｔｔｈｅｗｓ、Ｔ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８３：９７０９９７１３；Ｎａｒａ、Ｐ．Ｌ．ら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２６２２−２６２８；Ｐａｌｋｅｒ、Ｔ．Ｊ．、ら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：１９３２−１９３６）。ヒトにおけるＨＩＶ感染の経過の後期において、より広い範囲のＨＩＶ−１単離体を中和し得る抗体が出現する（Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ、Ｆ．ら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：８６８−８７１；Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ、Ｍ．、ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１６：７２−７４；Ｗｅｉｓ、Ｒ．、ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１６：６９−７２；Ｗｅｉｓ、Ｒ．、ら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２４：５７２−５７５）。
【０００７】
Ｓｔａｍａｔａｔｏｓら（１９９８）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １４  （１３）：１１２９−３９によって最近行われた研究によって、以下が示されている：ＣＣＲ−５共同レセプターを利用してウイルス侵入をするＨＩＶ−１SF162ウイルスからの可変領域２の欠失によって、そのウイルスは、血清によって媒介される中和に対して高度に感受性になった。このＶ２欠失ウイルスはまた、クレードＢ  ＨＩＶ−１単離体に感染した患者のみならず、クレードＡ、Ｃ、ＤおよびＦのＨＩＶ−１単離体に感染した患者から得られる血清によっても中和された。しかし、可変領域１の欠失は、効果がなかった。ＬＡＩ単離体ＨＩＶ−１IIIBからの可変領域１および２の欠失もまた、モノクローナル抗体による中和に対する感受性を増したことを示した。この抗体のエピトープは、Ｖ３ループ、ＣＤ４結合部位および保存されたｇｐ１２０領域内に存在する（Ｗｙａｔｔ、Ｒ．、ら（１９９５）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６９：５７２３−５７３３）。ＬＡＩ株からのＶ１／Ｖ２およびＶ３の領域における欠失を有するＨＩＶ−１ウイルス（これは、ウイルス侵入についてＣＸＣＲ４共同レセプターを使用する）を使用したウサギの免疫原性研究は、Ｅｎｖが抗体の中和を惹起する能力の改善を示さなかった（Ｌｅｕら（１９９８）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．１４：１５１−１５５）。
【０００８】
さらに、ほとんどの感染した個体において見出される、あるサブセットの広汎に反応性の抗体は、ｇｐ１２０とＣＤ４との結合を妨害する（Ｋａｎｇ、Ｃ．−Ｙ．、ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８８：６１７１−６１７５；ＭｃＤｏｕｇａｌ、Ｊ．Ｓ．、ら（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：２９３７〜２９４４）。他の抗体は、Ｅｎｖに対してＣＤ４が結合した後に、そのケモカインレセプター結合領域に結合すると考えられている（Ｔｈａｌｉ  ら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３９７８−３９８８）。ＨＩＶ感染の経過の間に生成される中和抗体が恒常的な抗ウイルス効果を提供しないという事実は、部分的に、「中和逃避」ウイルス変異体の発生、および病因を伴う宿主の免疫系における一般的現象に起因し得る。対照的に、初期のＨＩＶ−１曝露に対する既存の中和抗体の存在は、保護的効果を有するようである。
【０００９】
成功するワクチンが、多様なＨＩＶ−１株に対して強力で、広汎な中和抗体応答を誘導し得るべきであると広汎に考えられている。（ＭｏｎｔｅｆｉｏｒｉおよびＥｖａｎｓ（１９９９）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔ．１５（８）：６８９−６９８；Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ、Ｄ．、Ｐ．、ら（１９９４）Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．８：６０３−６１１；Ｈａｙｎｅｓ、Ｂ．、Ｆ．、ら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ；２７１：３２４−３２８．）。中和抗体は、侵入するビリオンに付着することによって、標的細胞に対するその感染性を減少または妨害さえし得、そして組織培養物の細胞間のウイルスの蔓延を妨害し得る（Ｈｕ  ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：４５６〜４５９；Ｂｕｒｔｏｎ、Ｄ．、ＲおよびＭｏｎｔｅｆｉｏｒｉ、Ｄ．（１９９７）ＡＩＤＳ  １１（補遺Ａ）：５８７−５９８）。しかし、上記のように、ｇｐ１２０に対して指向される抗体は、一般に、異なるＨＩＶ株に対する広汎な抗体応答を示す。
【００１０】
現在、ワクチン開発の焦点は、体液性免疫の観点から、ウイルス侵入に重要であると考えられているＣＣＲ５ケモカイン共同レセプターを利用する初代単離物の中和に向けられている（Ｚｈｕ、Ｔ．、ら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１１７９〜１１８１；Ｆｉｏｒｅ、Ｊ．、ら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２０４：２９７−３０３）。これらのウイルスは、一般に、ＣＸＣＲ４共同レセプターを使用するＴ細胞株に適合された株よりも、抗体中和についてはるかにより耐性であるが、両方とも、特定の広汎かつ強力に作用するモノクローナル抗体（例えば、ＩｇＧｌｂｌ２，２Ｇ１２および２Ｆ５）によってインビトロで中和され得る（Ｔｒｋｏｌａ、Ａ．ら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：６６０９−６６１７；Ｄ’Ｓｏｕｓａ  ＰＭ．ら（１９９７）Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７５：１０６２−１０７５）。これらのモノクローナル抗体は、それぞれＣＤ結合部位、グリコシル化部位、およびｇｐ４１融合ドメインに指向される。しかし、ワクチン接種によって適切な特異性の抗体を誘発する方法が知られていないという問題が残存する。所定の単離物からのｇｐ１２０糖タンパク質によって惹起された抗体（Ａｂ）は、一般に、類似の（通常は同じの）ＨＩＶ−１サブタイプからの密接に関連するウイルスのみを中和し得る。
【００１１】
上記アプローチにもかかわらず、例えば、ワクチンとして投与されるときに、複数のＨＩＶ株およびサブタイプに対して、被験体において免疫学的応答（例えば、中和抗体および／または保護抗体）を惹起し得るＥｎｖ抗原についての必要性が残存する。本発明は、これらおよび他の問題を、改変されたＥｎｖポリペプチド（例えば、ｇｐ１２０）を提供して、ＣＤ４結合部位内またはその付近にエピトープを曝露させることによって解決する。
【００１２】
（発明の要旨）
本発明に従って、改変されたＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドが提供される。特に、欠失および／または変異は、、ＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドにおいて１つ以上の４−β反平行ブリッジングシートにおいて作製される。このようにして、十分な構造が残されて、例えば、ｇｐ１２０のポリペプチドの正確な折り畳みを可能にし、なおも、充分なそのブリッジングシートが除去されてＣＤ溝が曝露され、それによって、免疫応答がＥｎｖポリペプチド（例えば、ｇｐ１２０）のＣＤ結合部位内またはその付近におけるエピトープに対して生成することを可能にする。
【００１３】
１つの局面において、本発明は、改変されたＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含し、ここで、このポリペプチドは、少なくとも１つの改変された（例えば、欠失または置換された）アミノ酸残基が、ＨＸＢ−２についての残基４２１〜４３６に対応する領域（例えば、図６〜２９（配列番号３〜２６）において示される構造）において欠失されている。特定の実施形態において、そのポリヌクレオチドはまた、ポリペプチドＨＸＢ−２（例えば、Ｖ１／Ｖ２）の残基１２４〜１９８に対応する領域を欠失しているか、またはＨＸＢ−２に対して、残基１１９〜１２３、および１９９〜２１０に対応する領域において少なくとも１つのアミノ酸が欠失もしくは置換されている。他の実施形態において、これらのポリヌクレオチドは、ブリッジングシートの小ループの少なくとも１つのアミノ酸（例えば、ＨＸＢ−２についてのアミノ酸残基４２７−４２９）が欠失もしくは置換されたＥｎｖポリペプチドをコードする。本発明のポリヌクレオチドによってコードされる改変されたポリペプチドのアミノ酸配列は、任意のＨＩＶ改変体（例えば、ＳＦ１６２）に基づき得る。
【００１４】
別の局面において、本発明は、ＨＸＢ−２に関して４２１〜４３６に対応する領域において欠失した、少なくとも１つの改変された（例えば、欠失または置換された）アミノ酸残基（例えば、小さなループ領域（例えば、ＨＸＢ−２に対して、アミノ酸残基４２７−４２９）において１つのアミノ酸の欠失または置換）を有する、免疫学的に改変されたＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドは、ＨＸＢ−２に対してほぼアミノ酸残基４２０とアミノ酸残基４３６との間の少なくとも１つのアミノ酸の改変（例えば、欠失または置換）を有し得、そして必要に応じて、Ｖ１および／またはＶ２領域の欠失または短縮を有し得る。本発明の、この免疫原性の改変されたポリペプチドは、任意のＨＩＶ改変体（例えば、ＳＦ１６２）に基づき得る。
【００１５】
別の局面において、本発明は、上記の改変されたＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのいずれかを含むワクチン組成物を包含する。改変されたＥｎｖポリペプチドおよび必要に応じてアジュバントを含む、ワクチン組成物もまた、本発明に包含される。
【００１６】
さらに別の局面において、本発明は、被験体において、免疫応答を誘発する方法を包含する。この方法は、１以上の上記のポリヌクレオチドまたは構築物を、その被験体において免疫応答を誘導するに充分な量で投与する工程を包含する。特定の実施形態において、この方法はさらに、その被験体にアジュバントを投与する工程を包含する。
【００１７】
別の局面において、本発明は、免疫応答を、被験体において誘導する方法を包含する。この方法は、上記の任意の改変されたＥｎｖポリペプチドおよびアジュバントを含む組成物を被験体に投与する工程を包含する。その組成物は、その被験体において免疫応答を誘発するに充分な量で投与される。
【００１８】
別の局面において、本発明は、被験体において免疫応答を誘発する方法を包含する。この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）プライム刺激工程において上記のポリヌクレオチドのいずれかを含む第一の組成物を投与する工程、および
（ｂ）ブースタとして、上記の改変されたＥｎｖポリペプチドのいずれかを含む第二の組成物を、その被験体において免疫応答を誘導するに充分な量で投与する工程。特定の実施形態において、その第一の組成物、その第二の組成物、またはその第一およびその第二の組成物の両方は、さらに、アジュバントを含む。
【００１９】
本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書の開示に照らし、当業者には容易に明らかである。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、そうでないと示さない限り、当該分野の技術範囲内の、タンパク質化学、ウイルス免疫学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。そのような技術は、文献に充分説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９３）；Ｎｅｌｓｏｎ  Ｌ．Ｍ．ａｎｄ  Ｊｅｒｏｍｅ  Ｈ．Ｋ．ＨＩＶ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ．１７，１９９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９）；Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ａｎｄ  ＬｉｐｋｏｗｉｔｚおよびＢｏｙｄ、Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌｕｍｅｓ  １−ｐｒｅｓｅｎｔ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９）を参照のこと。
【００２１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合に、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、そうでないとその内容が明らかに示さない限りは、複数形も包含することに留意しなければならない。従って、例えば、「ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」との言及は、２つ以上のポリペプチドの混合物を含む、等々である。
【００２２】
（定義）
本発明の記載において、以下の用語が用いられ、そして以下に示されるように定義されることが意図される。
【００２３】
用語「ポリペプチド」、および「タンパク質」が、本明細書中に交換可能に使用され、アミノ酸残基の任意のポリマーを示す。この用語は、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などを含む。このようなポリペプチドは、天然の供給源に由来され得るか、または合成され得るか、または組換え的に産生され得る。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）を含む。
【００２４】
本明細書中で定義されるようなペプチドは、一般に、２０個の天然アミノ酸（Ａｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、およびＶａｌ（Ｖ））からなり、そして任意のいくつかの公知のアミノ酸アナログ（天然に存在するアナログおよび合成されるアナログの両方）（例えば、ホモイソロイシン、アサロイシン、２−（メチレンシクロプロピル）グリシン、Ｓ−メチルシステイン、Ｓ−（プロップ−１−エニル（ｐｒｏｐ−１−ｅｎｙｌ））システイン、ホモセリン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ホモアルギニン、３−（３−カルボキシフェニル）アラニン、シクロヘキシルアラニン、ミモシン、ピペコリン酸、４−メチルグルタミン酸、カナバニン、２，３−ジアミノプロピオン酸などであるが、これらに限定されない）もまた含み得る。本発明における使用を見出すポリペプチド因子のさらなる例は、以下に示される。
【００２５】
ポリペプチドまたはタンパク質の「幾何」または「三次構造」により、タンパク質の全体の３−Ｄ立体配置が意味される。本明細書中に記載されるように、幾何は、例えば、結晶学研究により、または一次構造および二次構造を成すアミノ酸間の相互作用に基づく幾何を予測する種々のプログラムまたはアルゴリズムを使用することにより決定され得る。
【００２６】
「野生型」ポリペプチド、ポリペプチド因子またはポリペプチド薬物により、天然に存在するポリペプチド配列、およびその対応する二次構造が意味される。「単離された」または「精製された」タンパク質またはポリペプチドは、そのタンパク質が通常天然において関連する生物体全体から、分離および解離されるタンパク質である。この用語は、種々のレベルの純度のタンパク質を示すことが明らかである。代表的に、精製されたタンパク質を含む組成物は、その組成物中の総タンパク質の少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約４０〜５０％、より好ましくは少なくとも約７５〜８５％、および最も好ましくは少なくとも約９０％またはそれ以上が、問題のタンパク質であるものである。
【００２７】
「Ｅｎｖポリペプチド」により、エンベロープタンパク質に由来する分子が意味され、好ましくはＨＩＶ  Ｅｎｖに由来する分子を意味される。ＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質は、約１６０ｋｄの糖タンパク質である（ｇｐ１６０）。宿主細胞のウイルス感染の間、ｇｐ１６０は、宿主細胞プロテアーゼにより切断され、ｇｐ１２０および内在性膜タンパク質（ｇｐ４１）を形成する。このｇｐ４１部分は、ビリオンの膜二重層に固定され（そしてそれを架橋（ブリッジ）する）、一方ｇｐ１２０セグメントは、周囲の環境へ突出する。ｇｐ１２０とｇｐ４１との間には共有結合はないので、遊離ｇｐ１２０が、ビリオンおよび感染された細胞の表面から放出される。Ｅｎｖポリペプチドはまた、ｇｐ１４０ポリペプチドを含み得る。Ｅｎｖポリペプチドは、単量体、二量体または多量体として存在し得る。
【００２８】
「ｇｐ１２０ポリペプチド」により、Ｅｎｖポリペプチドのｇｐ１２０領域に由来する分子が意味される。好ましくは、ｇｐ１２０ポリペプチドは、ＨＩＶ  Ｅｎｖに由来する。ｇｐ１２０の一次アミノ酸配列は、およそ５１１個のアミノ酸であり、約６０，０００ダルトンのポリペプチド中心（ｃｏｒｅ）を有する。このポリペプチドは、Ｎ結合型グリコシル化により広範に改変され、１２０，０００ダルトンまでその分子の見かけ上の分子量を増加する。ｇｐ１２０のアミノ酸配列は、５個の超可変領域ドメインが点在する５個の比較的保存されたドメインを含む。ＨＩＶ−１HXB-2（これから先「ＨＸＢ−２」）系統のｇｐ１２０一次配列における１８個のシステイン残基の位置およびｇｐ１２０配列におけるおよそ２４個のＮ結合型グリコシル化部位のうちの１３個のＮ結合型グリコシル化部位の位置は、全てではないがほとんどのｇｐ１２０配列にとって共通である。超可変領域ドメインは、広範なアミノ酸置換、挿入および欠失を含む。このバリエーションに関わらず、全てではないがほとんどのｇｐ１２０配列は、ウイルス性レセプターＣＤ４に結合するそのウイルスの能力を保存する。「ｇｐ１２０ポリペプチド」は、１つのサブユニットまたは多量体の両方を含む。
【００２９】
Ｅｎｖポリペプチド（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０およびｇｐ１６０）は、βシートを形成する４つの逆平行β鎖（β−２、β−３、β−２０およびβ−２１）からなる「ブリッジングシート（ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ｓｈｅｅｔ）」を含む。２つのループ（Ｖ１およびＶ２）が、１対のβ鎖（β−２およびβ−３）から突出する。このβ−２シートは、ＨＸＢ−２に関して、ほぼアミノ酸残基１１９（Ｃｙｓ）〜アミノ酸残基１２３（Ｔｈｒ）で生じ、一方β−３は、ほぼアミノ酸残基１９９（Ｓｅｒ）〜アミノ酸残基２０１（Ｉｌｅ）で生じる。「Ｖ１／Ｖ２領域」は、ＨＸＢ−２に関して、ほぼアミノ酸１２６位（Ｃｙｓ）〜残基１９６（Ｃｙｓ）で生じる（例えば、Ｗｙａｔｔら、（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：５７２３−５７３３；Ｓｔａｍａｔａｔｏｓら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７８４０−７８４５を参照のこと）。「小さいループ」構造が、第２対のβ鎖（β−２０およびβ−２１）から突出し、これはまた、本明細書中で「ブリッジングシートの小さいループ」といわれる。ＨＸＢ−２において、β−２０は、約アミノ酸残基４２２（Ｇｌｎ）からアミノ酸残基４２６（Ｍｅｔ）にのび、一方β−２１は、約アミノ酸残基４３０（Ｖａｌ）からアミノ酸残基４３５（Ｔｙｒ）にのびる。改変体ＳＦ１６２において、Ｍｅｔ−４２６は、Ａｒｇ（Ｒ）残基である。「小さいループ」は、ＨＸＢ−２に関して、約アミノ酸残基４２７（Ｔｒｐ）からアミノ酸残基４２９（Ｌｙｓ）にのびる。ブリッジングシート、小さいループ、およびＶ１／Ｖ２を示すｇｐ１２０の代表的な図が、図１において示される。さらに、選択された改変体のＥｎｖポリペプチドｇｐ１６０のアミノ酸配列のアライメントは、ＨＸＢ−２に関して、図２Ａ〜Ｃにおいて示される。
【００３０】
さらに、本明細書中に定義されるような「Ｅｎｖ  ポリペプチド」または「ｇｐ１２０ポリペプチド」は、本明細書中に記載される正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際、ＨＩＶゲノムは、絶えず変化する（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｆｌｕｘ）状態であり、そして単離物間で比較的高い程度の可変性を示すいくつかの可変ドメインを含む。この用語は、同定されたＨＩＶ単離物、ならびに新しく同定された単離物、およびこれらの単離物のサブタイプのいずれか由来のＥｎｖ（例えば、ｇｐ１２０）ポリペプチドを含むことは、容易に明らかである。構造特徴の説明は、ＨＸＢ−２に関して本明細書中に与えられる。本開示および本技術の教示を考慮して、当業者は、例えば、配列比較プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴおよび本明細書中に記載の他のプログラム）または構造特徴の同定およびアライメント（例えば、β−シート領域を同定し得る本明細書中に記載の「ＡＬＢ」プログラムのようなプログラム）を使用して、他のＨＩＶ改変体（例えば、単離物ＨＩＶIIIb、ＨＩＶSF2、ＨＩＶ−１SF162、ＨＩＶ−１sf170、ＨＩＶLAV、ＨＩＶLA1、ＨＩＶMN、ＨＩＶ−１CM235、ＨＩＶ−１US4）、多様なサブタイプ（例えば、サブタイプ、Ａ〜Ｂ、およびＯ）に由来する他のＨＩＶ−１系統、ＨＩＶ−２系統および多様なサブタイプ（例えば、ＨＩＶ−２UC1およびＨＩＶ−２UC2）、ならびにサル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）（例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編  １９９８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編  １９９１）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｆｉｅｌｄｓ、ＢＮ、ＤＭ  Ｋｎｉｐｅ、ＰＭ  Ｈｏｗｌｅｙ、編集者、１９９６、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｐｈｉａ、ＰＡ；（これらのウイルスおよび他の関連ウイルスの説明のために）を参照のこと）における対応する領域を決定し得る。改変されたＥｎｖポリペプチドの実際のアミノ酸配列は、任意のＨＩＶ改変体に基づき得る。
【００３１】
さらに、用語「Ｅｎｖ  ポリペプチド」（例えば、「ｇｐ１２０ポリペプチド」）は、ネイティブな配列に対するさらなる改変（例えば、さらなる内部欠失、付加および置換）を含むタンパク質を含む。これらの改変は、部位特異的変異誘発を介するように、意図的（ｄｅｌｉｂｅｒａｔｅ）であり得るか、または自然に生じる変異事象を介するように、偶発的であり得る。従って、例えば、Ｅｎｖポリペプチドが、ワクチン組成物において使用される場合、その改変は、免疫学的活性（すなわち、そのポリペプチドに対する抗体応答を誘発する能力）が失われるようでなければならない。同様に、ポリペプチドが診断的目的のために使用される場合、そのような能力は保持されなければならない。
【００３２】
従って、「改変Ｅｎｖポリペプチド」は、これはブリッジングシート部分の全てまたは一部、および必要に応じて可変領域（Ｖ１ならびにＶ２）を、欠失もしくは置換するように操作されている、Ｅｎｖポリペプチド（例えば、上で規定されるようなｇｐ１２０）である。一般に、改変されたＥｎｖ（例えば、ｇｐ１２０）ポリペプチドは、ＣＤ４結合部位を露出するために十分なブリッジングシートを除去されるが、正確な折りたたみ（例えば、正確な幾何）を可能にするのに十分な構造を残す。従って、β−２０領域およびβ−２１領域（ＨＸＢ−２に関して、約アミノ酸残基４２０と約アミノ酸残基４３５との間）に対する改変が、好ましい。さらに、β−２領域およびβ−３領域（約アミノ酸残基１１９（Ｃｙｓ）と約アミノ酸残基２０１（Ｉｌｅ）との間）に対する改変およびＶ１ループ領域およびＶ２ループ領域に対する改変（例えば、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ））がまた、作製され得る。全ての可能なβ−シートおよびＶ１／Ｖ２の改変が本明細書で例示されるわけではないが、他の破壊的（ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ）改変体もまた、本明細書により包含されることが理解されるべきである。
【００３３】
通常、このような改変されたポリペプチドは、タンパク質を発現する生物が培養される、増殖培地中への分泌を可能にする。しかし、本発明の目的のために、このよなポリペプチドはまた、細胞内で回収される。増殖培地への分泌は、多くの検出技術（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などを含む）、およびウェスタンブロットおよび免疫沈降アッセイのような免疫学的技術（例えば、１９９６年２月１５日に公開された国際公開番号ＷＯ  ９６／０４３０１において記載されるような）を使用して、容易に決定される。
【００３４】
ｇｐ１２０または他のＥｎｖポリペプチドは、小胞体（ＥＲ）またはゴルジ体と関連するように細胞の成分と関連して、細胞内で見出される場合、あるいは可溶性細胞画分に存在する場合のいずれかで、「細胞内に」産生される。本発明のｇｐ１２０および他のＥｎｖポリペプチドはまた、十分な量のポリペプチドが細胞内に存在する場合に限り、増殖培地に分泌され得、それらは本明細書中に記載される技術を用いて、細胞溶解物から精製され得る。
【００３５】
「免疫原性」ｇｐ１２０または他のＥｎｖタンパク質は、少なくとも１つのエピトープを含む分子であり、その結果、この分子は、このタンパク質が投与される個体において、免疫学的反応を惹起し得るか、または診断の状況において、問題のＨＩＶに対する抗体と反応し得る。
【００３６】
「エピトープ」により、特異的Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位が意味され、このようなエピトープを含む分子を、免疫学的反応を惹起し得るようにするか、または生物学的サンプルに存在するＨＩＶ抗体と反応し得るようにする。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用され得る。エピトープは、そのエピトープに特有の空間的構造で、３以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、そしてより通常には、少なくとも８〜１０のこのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的な構造を決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶構造解析、および２次元核磁気共鳴が挙げられる。さらに、所定のタンパク質中のエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して（例えば、疎水性研究の使用および部位指向的血清学により）、容易に達成される。Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１：３９９８−４００２（迅速にペプチドを合成し、所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定するための手順および化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６）２３：７０９−７１５（所定の抗体に高い親和性を有するペプチドを同定する技術）もまた参照のこと。同じエピトープを認識する抗体は、１つの抗体が別の抗体の標的抗体への結合をブロックする能力を示す単純な免疫アッセイで、同定され得る。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「免疫学的応答」または「免疫応答」は、Ｅｎｖ（例えば、ｇｐ１２０）ポリペプチドがワクチン組成物中に存在する場合の、このＥｎｖポリぺプチドに対する体液性および／または細胞性の免疫応答の、被験体における発生である。これらの抗体はまた、伝染性を中和し、そして／または抗体−補体もしくは抗体依存性細胞の細胞障害性を媒介し、免疫宿主に保護を提供する。免疫学的反応性は、当該分野で周知の標準的な免疫アッセイ（例えば、競合アッセイ）で決定され得る。
【００３８】
アミノ酸配列「類似性」を決定するための技術は、当該分野で周知である。一般的に、「類似性」は、適切な位置における２つ以上のポリぺプチドの正確なアミノ酸対アミノ酸の比較を意味し、ここでアミノ酸は、同一であるか、または類似の化学的特性および／または物理的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する。次いで、いわゆる「同一性パーセント」が、比較されるポリぺプチド配列の間で決定される。核酸配列およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術はまた、当該分野で周知であり、そしてその遺伝子（通常ｃＤＮＡ中間体を介する）のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する工程およびそれらによりコードされるアミノ酸配列を決定する工程、ならびにこれを第２のアミノ酸配列と比較する工程を包含する。一般に、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列またはポリぺプチド配列の、それぞれ正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の一致をいう。
【００３９】
２つ以上のポリヌクレオチド配列を、それらの「同一性パーセント」を決定することにより比較し得る。２つ以上のアミノ酸配列を、同様にそれらの「同一性パーセント」を決定することにより比較し得る。２つの配列（核酸配列またはペプチド配列のいずれでも）の同一性パーセントは、一般に、２つの整列した配列の間の正確なマッチの数をより短い配列の長さで割り、そして１００を掛けた数として記述される。核酸配列の近似の整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより与えられる。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編）、（第５補遺）３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡにより開発され、そしてＧｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）により標準化されたスコアリングマトリックスを使用して拡張され、ペプチド配列と使用し得る。核酸配列およびペプチド配列のためのこのアルゴリズムの手段は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により、ＢｅｓｔＦｉｔユーティリティーを適用して、提供される。この方法のためのデフォルトのパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能）に記載される。配列間の同一性パーセントおよび類似性パーセントを計算するための他の同程度に適切なプログラムは、一般的に当該分野で公知である。
【００４０】
例えば、特定のヌクレオチド配列の参照配列に対する同一性パーセントは、６つのヌクレオチド位置のデフォルトのスコアリング表およびギャップペナルティを用いる、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの同一性アルゴリズムを使用して、決定され得る。本発明に関連する同一性パーセントを確立するための他の方法は、エディンバラ大学が著作権を有し、Ｊｏｈｎ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により配給される、プログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージの使用である。この一組のパッケージ（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム）は、スコアリング表（例えば、１２のギャップ開放ペナルティー、１のギャップ伸長ペナルティー、および６のギャップ）に使用されるデフォルトパラメーターに使用され得る。作製されたデータから、「マッチ」値は、「配列同一性」を反映する。配列間の同一性パーセントおよびパーセント類似性を計算するための他の適切なプログラムは、一般に当該分野で公知である（例えば、整列プログラムＢＬＡＳＴ、これはまた、デフォルトのパラメーターを用いて使用され得る）。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターを用いて使用され得る：ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ  ｂｙ＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００４１】
当業者は、正確な検索パラメーターを容易に決定し、上記のプログラムで所定の配列に使用し得る。例えば、この検索パラメーターは、問題の配列のサイズに基づいて変化し得る。従って、例えば、本発明の代表的な実施形態は、Ｘ個の連続するヌクレオチドを有する単離されたポリヌクレオチドを含み、ここで（ｉ）Ｘ個の連続するヌクレオチドは、本明細書中に記載される任意の配列由来のＹ個の連続するヌクレオチドと、少なくとも約５０％の同一性を有し；（ｉｉ）ＸはＹに等しく、そして（ｉｉｉ）Ｘは、６ヌクレオチド以上５０００ヌクレオチドまで、好ましくは８ヌクレオチド以上５０００ヌクレオチドまで、より好ましくは、１０〜１２ヌクレオチド以上および５０００ヌクレオチドまで、ならびになおより好ましくは１５〜２０ヌクレオチド以上、本明細書中に記載される全長配列に存在するヌクレオチドの数（例えば、配列表および特許請求の範囲を参照のこと）までであり、上記の範囲内に含まれる全ての整数値を含む。
【００４２】
本発明の合成発現カセット（および精製したポリヌクレオチド）は、本発明の配列が問合せ（ｑｕｅｒｙ）配列として使用される場合、本明細書中に記載される合成発現カセット配列（例えば、請求項に係る配列または本発明の他の配列）に対して、約８０％〜１００％、８０〜８５％よりも高い、好ましくは９０〜９２％より高い、より好ましくは９５％より高い、そして最も好ましくは９８％より高い配列（これらの記載される範囲に含まれる全ての整数値を含む）同一性を有する、関連するポリヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
コンピュータープログラムはまた、特定のポリぺプチドがβシートのような構造を形成する可能性を決定するために有用である。本明細書中に記載されるこのようなプログラムの１つは、タンパク質およびポリぺプチドの二次構造の計算および推測のための「ＡＬＢ」プログラムである。さらに、タンパク質の二次構造は、一次アミノ酸配列から、例えば、タンパク質結晶構造および結晶構造に関するタンパク質配列の整列（例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｐ．Ｑ．，Ｃａｎａｄａから入手可能なＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ）プログラムを使用する）を使用して、推測され得る。二次構造を推測する他の方法が、例えば、Ｇａｒｎｉｅｒら、（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：５４０−５５３；Ｇｅｏｕｒｊｏｎら、（１９９５）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：６８１−６８４；Ｌｅｖｉｎ（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０：７７１−７７６；およびＲｏｓｔら、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２３２：５８４−５９９に、記載される。
【００４４】
相同性はまた、相同な領域間の安定な二重鎖を形成する条件下のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続く一本鎖特異的ヌクレアーゼを用いる消化、および消化されたフラグメントのサイズ決定により決定され得る。２つのＤＮＡ配列、または２つのポリぺプチド配列は、これらの配列が、上記の方法を使用して決定されたように、分子の規定された長さにわたって、少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列同一性を示す場合に、互いに「実質的に相同」である。本明細書中で使用される場合、実質的に相同とはまた、特定のＤＮＡ配列またはポリぺプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、特定の系に規定されるストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の規定は、当該技術に含まれる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，前出を参照のこと。
【００４５】
「コード配列」または選択されたタンパク質を「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、インビトロまたはインビボでポリぺプチドに転写され（ＤＮＡの場合）そして翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンにより決定される。コード配列は、ウイルスのヌクレオチド配列由来のｃＤＮＡならびに合成ＤＮＡ配列および半合成ＤＮＡ配列ならびに塩基アナログを含む配列を含み得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列に対して３’側に配置され得る。
【００４６】
「制御エレメント」とは、集合的に、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、エンハンサーなどをいい、これらは集合的に、宿主細胞におけるコード配列の転写および翻訳を提供する。所望の遺伝子が、転写され得、そして翻訳され得る限り、これらの制御エレメントの全てが、常に存在するとは限らない。
【００４７】
ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、そしてコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いでこれがコード配列にコードされるポリぺプチドに翻訳される場合、制御エレメントは、細胞においてコード配列の「転写を指向する」。
【００４８】
「作動可能に連結される」とは、そのように記載された構成要素が、それらの通常の機能を実行するように構成される、エレメントの配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結される制御エレメントは、ＲＮＡポリメラーゼが存在する場合に、コード配列の発現に影響し得る。制御エレメントは、コード配列の発現を指向するように機能する限り、コード配列と連続的である必要はない。従って、例えば非翻訳で転写されない配列の介入が、例えば、プロモーター配列とコード配列の間に存在し得、そしてプロモーター配列は、なおコード配列に「作動可能に連結される」と考えられ得る。
【００４９】
核酸分子を記述するために本明細書中で使用される場合、「組換え」とは、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、半合成起源、または合成起源のポリヌクレオチドを意味し、これは、その起源または操作により：（１）天然では結合されるポリヌクレオチドの全てまたは一部と結合されず；そして／または（２）天然では連結されるポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結される。タンパク質またはポリぺプチドに関して使用される場合、用語「組換え」は、組換えポリヌクレオチドの発現により産生されるポリぺプチドを意味する。原核微生物または単細胞体として培養された真核生物細胞株を示す、「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」および他のこのような用語は、交換可能に使用され、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用され得る細胞、または使用されてきた細胞をいい、そしてトランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、偶然または故意の変異に起因して、元の親と形態学的に、またはゲノムもしくは全ＤＮＡ補体において、必ずしも完全に同一であり得るわけではない。関連する特性（例えば、所望のポリぺプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）により特徴付けられる親と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれ、そして上記の用語に包含される。
【００５０】
「脊椎動物被験体」は、脊索動物亜門の任意のメンバーを意味し、このメンバーとしては、ヒトおよび他の霊長類（チンパンジーのような非ヒト霊長類および他の類人猿およびサルの種を含む）；畜牛、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマのような家畜；イヌおよびネコのような飼いならされた動物；マウス、ラットおよびハムスターのような齧歯類を含む研究用動物；ニワトリ、七面鳥およびアヒル、ガチョウなどの他のキジ類のトリのような飼いならされたトリ、野鳥および猟鳥を含むトリが挙げられるが、これらに限定されない。この用語は特定の世代を意味しない。従って、成体および新生の個体が包含されるように意図される。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」は、個体から単離された組織または流体のサンプルをいい、これらとしては、例えば、血液、血漿、血清、糞物、尿、骨髄、胆汁、骨髄液、リンパ液、皮膚のサンプル、（皮膚、気道、腸管、および尿生殖器管の）外分泌物、胃上皮および胃粘膜由来のサンプル、涙、唾液、乳、血球、器官、生検材料、ならびにインビトロの細胞培養構築物のサンプルもまた挙げられるが、これらに限定されない。インビトロの細胞培養構築物（例えば、組換え細胞、および細胞構成成分）としては、培養培地における細胞および組織の増殖から生じた馴化培地が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
用語「標識」および「検出可能な標識」とは、検出し得る分子をいい、これらとしては、放射性同位体、蛍光体、化学発光体（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチンまたはハプテン）などが挙げられるが、これらに限定されない。用語「蛍光体」とは、検出可能な範囲で蛍光を示し得る物質またはその部分をいう。本発明を用いて使用され得る標識の特定の例としては、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、アクラジマム（ａｃｒａｄｉｍｕｍ）エステル、ＮＡＤＰＨ、α−β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびウレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
（概観）
本発明は、改変Ｅｎｖポリぺプチド分子（例えば、糖タンパク質（「ｇｐ」）１２０）に関する。特定の理論に制限されることなく、ＣＤ４結合部位が、外部ドメインと内部ドメインとＶ１／Ｖ２ドメインとの間で変化するために、Ｅｎｖに対する免疫学的応答を生じることが、困難であったことは、明らかである。従って、Ｖ１／Ｖ２ドメインの欠失は、ウイルスを、ＣＤ４部位に指向されるモノクローナル抗体による中和に対して敏感にさせ得るが、ＣＤ４結合ドメインの大部分を覆う架橋（ブリッジング）シートは、抗体の応答を妨げ得る。従って、本発明は、それらの大体の全体的な構造を維持するが、ＣＤ４結合ドメインを露出する、Ｅｎｖポリぺプチドを提供する。これにより、ＣＤ４結合部位またはその近傍のエピトープに対する免疫応答（例えば、抗体応答）の生成を可能にする。
【００５４】
本明細書中に記載される、本発明の異なる実施形態の種々の形態は、組合せられ得る。
【００５５】
（βシートのコンフォメーション）
本発明において、βシート構造の位置は、ＨＸＢ−２結晶化Ｅｎｖタンパク質の３−Ｄ（結晶）構造（実施例１Ａを参照のこと）と比較して同定された。この構造に基づいて、全ジオメトリーを維持する置換基および／または切り出しを有し、一方でＣＤ４結合部位を露出するポリペプチドをコードする構築物を設計した。特に、ＨＸＢ−２の結晶構造は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｄａｔａｂａｓｅからダウンロードされた。Ｓｙｂｙｌ分子モデルパッケージの生体分子モジュールのＬｏｏｐ  Ｓｅａｒｃｈ特性のデフォルトパラメータを使用して、全体の３級構造をさらに維持するβ鎖間のネイティブなループを置換し得るアミノ酸の相同性および適合が決定された。次いで、改変されたＥｎｖポリペプチドをコードする構築物を設計した（実施例１．Ｂ）。
【００５６】
従って、改変されたＥｎｖポリペプチドは、代表的に、ＣＤ４溝を露出するように除去された十分の架橋（ブリッジング）シートを有するが、Ｅｎｖ糖タンパク質の正しい折り畳みを可能にするのに十分な構造を有する。例示的な構造が、以下に記載される。
【００５７】
（ポリペプチドの産生）
本発明のポリペプチドは、当該分野で周知の任意の数の方法で産生され得る。
【００５８】
１実施形態において、ポリペプチドは、当該分野で周知の組換え技術を使用して産生される。このことに関連して、オリゴヌクレオチドプローブは、Ｅｎｖ（例えば、ｇｐ１２０）ポリペプチドゲノムの公知の配列に基づいて発明され得、そしてＥｎｖ遺伝子のためのプローブ遺伝子ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーに使用され得る。次いで、この遺伝子は、標準技術を使用してさらに単離され得、そして例えば、制限酵素を利用して、全長配列の所望の部分で遺伝子を切断する。同様に、このＥｎｖ遺伝子は、フェノール抽出のような公知の技術を使用してこの遺伝子を含む細胞および組織から直接単離され得、さらに配列を操作して、所望の切断を生じる。ＤＮＡを得るため、および単離するために使用する技術の説明について、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。
【００５９】
改変された（例えば、切断および／または置換された）ポリペプチドをコードする遺伝子は、公知の配列に基づいて、合成的に産生され得る。このヌクレオチド配列は、所望の特定アミノ酸配列のための適切なコドンで設計され得る。完全配列は、一般に、標準方法によって調製される重複オリゴヌクレオチドから構築され、そして完全コード配列に構築される。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２３：１２９９；Ｊａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１；Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９５）Ｇｅｎｅ１６４：４９−５３を参照のこと。
【００６０】
組換え技術を手軽に使用して、Ｅｎｖポリペプチド遺伝子をコードする遺伝子をクローン化して、次いで、この遺伝子は、適切な塩基対の置換によってインビトロで変異誘発され得、その結果、所望のアミノ酸のためのコドンを得る。このような変化は、１塩基対ほどの小さな変化を含み、単一のアミノ酸の変化に影響を与え得るか、またはいくつかの塩基対の変化を含み得る。あるいは、不適性な二重鎖の溶融温度より低い温度で、親のヌクレオチド配列（一般に、ＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡ）にハイブリダイズする不適性なプライマーを使用する際に、この変異は、影響され得る。比較的狭い制限内でプライマー長および塩基組成を維持することによって、そして中心に配置された変異塩基を維持することによって、このプライマーは、特異的に作製され得る。例えば、Ｉｎｎｉｓら（１９９０）ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８３）１００：４６８を参照のこと。プライマーの伸長は、使用するＤＮＡポリメラーゼ、クローン化された産物、変異ＤＮＡを含むクローンに影響され、これらは、選択されるプライマー伸長鎖の分離によって誘導される。選択は、変異プライマーをハイブリダイゼーションプローブとして使用して達成され得る。この技術は、多発生点変異を発生するために適用可能であり得る。例えば、Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８２）７９：６４０９を参照のこと。
【００６１】
所望のタンパク質のコード配列が、一旦、単離されるかまたは合成されると、この配列は、発現のために任意の適切なベクターまたはリプリコンにクローン化され得る。本明細書中の教示から明らかであるように、改変されたポリメラーゼをコードする広範の種々のベクターは、種々の組み合わせで、失欠または変異を有するＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結する発現構築物を作製することによって産生され得る。従って、特定の失欠したＶ１／Ｖ２領域をコードするポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現のために宿主細胞中に導入される小さなループ領域および構築物中に失欠または置換基を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結され得る。このような組み合わせの非制限例は、実施例に記載される。
【００６２】
多数のクローンベクターは、当業者に公知であり、そして適切なクローンベクターの選択は、重要な選択である。クローニングのための組換えＤＮＡベクターおよび形質転換しえる宿主細胞の例には、以下が挙げられる：バクテリオファージλ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性バクテリア）、ｐＧＶ１１０６（グラム陰性バクテリア）、ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性バクテリア）、ｐＭＥ２９０（非−Ｅ．ｃｏｌｉグラム陰性バクテリア）、ｐＨＶ１４（Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ｐＢＤ９（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ｐＩＪ６１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ｐＵＣ６（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ＹＩｐ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ＹＣｐ１９（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ならびにウシパピローマウイルス（哺乳動物の細胞）。一般にＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：第Ｉ巻および第ＩＩ巻、前出；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、前出を参照のこと。
【００６３】
バキュロウイルス系のような昆虫細胞発現系がまた使用され得、当業者に公知であり、そして例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ第１５５５号（１９８７）に記載される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための物質および方法は、特にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ（「ＭａｘＢａｃ」キット）のキット形態で市販されている。
【００６４】
植物発現系をまた使用して、改変されたＥｎｖタンパク質を産生し得る。一般に、このような系は、植物細胞を異種遺伝子でトランスフェクトするためにウイルスベースのベクターを使用する。このような系の記載について、例えば、Ｐｏｒｔａら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９６）５：２０９−２２１；およびＨａｃｋｌａｎｄら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）１３９：１−２２を参照のこと。
【００６５】
ワクシニアベースの感染／トランスフェクション系のようなウイルス系（Ｔｏｍｅｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：４０１７−４０２６およびＳｅｌｂｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ（１９９３）７４：１１０３−１１１３に記載される）はまた、本発明での使用を見出す。この系において、細胞が、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換えワクシニアウイルス組換えでインビトロでまずトランスフェクトされる。このポリメラーゼは、Ｔ７プロモーターを有するテンプレートを転写する場合でのみ優れた特異性を示す。感染後、細胞は、Ｔ７プロモーターで駆動される目的のＤＮＡでトランスフェクトされる。組換えワクシニアウイルスから細胞質内で発現されるポリメラーゼは、トランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、次いで、ＲＮＡは、宿主翻訳機によってタンパク質に翻訳される。この方法は、高レベルで一過性の大量のＲＮＡの細胞質産物、およびその翻訳産物を提供する。
【００６６】
この遺伝子は、プロモータ、リボソーム結合部位（バクテリアの発現のため）、および必要に応じてオペレータ（まとめて、「制御」エレメントと本明細書では呼ぶ）の制御下に置かれ得、所望のＥｎｖポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、この発現構築物を含むベクターによって形質転換される宿主細胞においてＲＮＡに転写される。このコード配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでいても、含まなくてもよい。本発明において、天然に由来のシグナルペプチドまたは異種配列の両方が、使用され得る。リーダー配列は、翻訳処理後、宿主によって除去され得る。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号；同第４、４２５，４３７号；同４，３３８，３９７号を参照のこと。このような配列には、ＴＰＡリーダーおよびミツバチメリチンシグナル配列が挙げられるが、これに限定されない。
【００６７】
他の調節塩基配列はまた、宿主細胞の成長に関連するタンパク質配列の発現の調節を可能にすることが所望される。このような調節塩基配列は、当業者に公知であり、例としては、化学的な刺激または物理学的な刺激に応答して、遺伝子の発現をオンまたはオフにする調節塩基配列が挙げられ、これらは、調節化合物の存在を含む。調節エレメントの他の型はまた、ベクター（例えば、エンハンサー配列）中に存在し得る。
【００６８】
コントロール配列および他の調節配列はまた、ベクターへの挿入の前にコード配列に結合され得る。あるいは、このコード配列は、発現ベクターに直接クローン化され得、このベクターは、既にコントロール配列および適切な制限部位を含む。
【００６９】
いくつかの場合において、コード配列を改変することが必要であり得、この結果、適切な配向でコントロール配列に結合；すなわち適切なリーディングフレームを維持し得る。変異体またはアナログは、タンパク質をコードする配列の一部の失欠によって、配列の挿入によって、および／または配列内の１以上のヌクレオチドの置換によって調製され得る。部位指向性変異誘発のようなヌクレオチド配列を改変するための技術は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、前出を参照のこと。
【００７０】
次いで、発現ベクターを使用して、適切な宿主細胞を形質転換する。多数の哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、以下のようなＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から市販の不死化された細胞株が挙げられるが、これらに限定されない：Ｃｈｉｎｉｓｅハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスターの腎（ＢＨＫ）細胞、サルの腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ｖｅｒｏ２９３細胞、ならびに他の細胞。同様に、細菌宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）は、現在の発現構築での使用を見出す。本発明において有用である酵母宿主としては、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターでの使用ための昆虫細胞としては、特に、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉが挙げられる。
【００７１】
発現系および選択される宿主に依存して、本発明のタンパク質は、目的のタンパク質が発現される条件下で、上記の発現ベクターによって形質転換される宿主細胞を増殖させることによって産生される。適切な増殖条件の選択は、当該分野の技術内である。
【００７２】
１実施形態において、形質転換された細胞は、ポリペプチド産物を周囲の媒体に分泌する。特定の調節塩基配列は、例えば、組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダー配列、γ−インターフェロンシグナル配列または公知の分泌タンパク質由来の他のシグナルペプチド配列を使用して、タンパク質産物の分泌を増強するためにベクター中に含まれ得る。次いで、この分泌されたポリペプチド産物は、例えば、標準精製技術（例えば、ヒドロキシアパタイト樹脂、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動、ＨＰＬＣ、免疫吸着技術、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降など（これらに限定されない））を使用して、本明細書中に記載される種々の技術により単離され得る。
【００７３】
あるいは、形質転換された細胞を、化学的、物理的、または機械的手段を使用して破壊させ、さらに細胞を溶解させ、Ｅｎｖポリペプチドを実質的にインタクトで保持する。細胞内タンパク質がまた、例えば、界面活性剤または有機溶媒の使用によって、成分を細胞壁または細胞膜から取り除くことによって得られ得、これにより、Ｅｎｖポリペプチドの漏出が生じる。このような方法は、当業者に公知であり、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｌ．Ｖ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ａｎｇａｌ編、１９９０）に記載される。
【００７４】
例えば、本発明での使用のために細胞を破壊する方法としては、超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎまたはｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）；攪拌；液体抽出または固体抽出；熱処理；凍結融解；乾燥；爆発的減圧；浸透圧衝撃；トリプシン、ノイラミニダーゼおよびリゾチームのようなプロテアーゼを含む溶解酵素での処理；アルカリ処理；胆汁酸塩、ドデシルスルフェートナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ４０およびＣＨＡＰＳのような界面活性剤および溶媒の使用が挙げられるが、これらに限定されない。細胞を破壊するために使用される特定の技術は、主に選択の方法であり、ポリペプチドが発現される細胞型、培養条件、使用される任意の前処理に依存する。
【００７５】
この細胞の破壊後、細胞の細片を一般に遠心分離で除去し、そして標準的な精製技術（カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動、ＨＰＬＣ、免疫吸着技術、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降など（これらに限定されない））を使用して、細胞内で産生されるＥｎｖポリペプチドをさらに精製する。
【００７６】
例えば、本発明の細胞内Ｅｎｖポリペプチドを得るための１方法は、抗−Ｅｎｖ特異的抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーまたはレクチンアフィニティークロマトグラフィーによるようなアフィニティー精製を含む。特に、好ましいレクチン樹脂は、以下から誘導される樹脂（これらに限定されない）のようなマンノース部分を認識する樹脂である；Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＧＮＡ）、Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＬＣＡまたはレンチルレクチン）、Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＳＡまたはペアレクチン）、Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＮＰＡ）およびＡｌｌｉｕｍ  ｕｒｓｉｎｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＡＵＡ）。適切なアフィニティー樹脂の選択は、当該技術分野内である。アフィニティー精製後、このＥｎｖポリペプチドは、例えば、上記の任意の技術によるような当該分野で周知の従来の技術を使用してさらに精製され得る。
【００７７】
Ｅｎｖ（例えば、ｇｐ１２０）複合体を、それ自体または他のタンパク質のいずれかを用いて産生することが、所望され得る。このような複合体は、例えば、Ｅｎｖ（例えば、ｇｐ１２０）および／または所望の複合体の他のポリペプチドをコードする構築物で同時トランスフェクトする宿主細胞によって、容易に産生される。同時トランスフェクションは、トランスまたはシスのいずれかで、すなわち分離ベクターを使用することによってか、またはＥｎｖおよび他の遺伝子の両方を有する単一のベクターを使用することによって達成され得る。単一のベクターを使用して実施した場合、両方の遺伝子は、単一のセットのコントロールエレメントによって駆動され得るか、あるいは、遺伝子は、個々のコントロールエレメントによって駆動される個々の発現カセットのベクター上に存在し得る。発現後、タンパク質は、同時に結合する。あるいは、複合体は、精製形態または準精製形態のいずれかで別個に産生された個々のタンパク質を共に混合することによってか、あるいはさらにタンパク質を発現する宿主細胞が培養された培養培地を混合することによって形成され得る。このような複合体の記載について、国際出願番号ＷＯ９６／０４３０１（１９９６年２月１５日刊行）を参照のこと。
【００７８】
比較的小さなポリペプチド（すなわち、約５０アミノ酸長まで）は、例えば、ペプチドの分野の当業者に公知である任意のいくつかの技術によって化学的に都合良く合成され得る。一般に、これらの方法は、成長するペプチド鎖に対して、１以上のアミノ酸の配列付加を使用する。通常、１級アミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかは、適切な保護基によって保護される。次いで、保護されたアミノ酸または誘導体化されたアミノ酸は、アミド結合の形成を可能にする条件下で、不活性固体支持体に付着され得るか、または適切に保護された相補的な（アミノまたはカルボキシ）基を有する配列中で次のアミノ酸を付加することによって溶液中で利用され得るかのいずれかである。次いで、保護基は、新しく付加されたアミノ酸残基から除去され、次いで、次の（適切に保護された）アミノ酸を付加する。所望のアミノ酸を適切な配列中に連結した後、任意の残りの保護基（および任意の固体支持体（固相合成技術を使用した場合））を、経時的または同時的に除去し、最終のポリペプチドを提供する。この一般的な手順の単純な改良によって、１以上のアミノ酸を、例えば、（キラル中心をラセミ化しない条件下で）保護されたトリペプチドを適切に保護したジペプチドと連結し、脱保護後ペンタペプチドを形成することにより、一度に成長鎖に付加することが可能である。。例えば、Ｊ．Ｍ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ  １９８４）およびＧ．ＢａｒａｎｙおよびＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，編者Ｅ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，第２巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）３〜２５４頁（固相ペプチド合成技術）；ならびにＭ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ  １９８４）およびＥ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻（古典的な溶液合成）を参照のこと。
【００７９】
代表的な保護基としては、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）；ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｘ）；２，４−ジニトロフェニル；ベンジル（Ｂｚｌ）；ビフェニルイソプロピルオキシカルボキシ−カルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、シクロヘキシル、イソプロピル、アセチル、ｏ−ニトロフェニルスルホニルなどが挙げられる。
【００８０】
代表的な固体支持体は、架橋重合体支持体である。これらは、ジビニルベンゼン架橋スチレンベースの重合体（例えば、ジビニルベンゼン−ヒドロキシメチルスチレン共重合体、ジビニルベンゼン−クロロメチルスチレン共重合体およびジビニルベンゼン−ベンズヒドリルアミノポリスチレン共重合体）を含み得る。
【００８１】
本発明のポリペプチドアナログはまた、他の方法（例えば、同時多数ペプチド合成の方法により）により化学的に調製され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：５１３１−５１３５；米国特許第４，６３１，２１１号を参照のこと。
【００８２】
（診断およびワクチンの適用）
細胞内で産生された本発明のＥｎｖポリペプチド、その複合体、またはこれをコードするポリヌクレオチドは、多くの診断および治療の目的のために用いられ得る。例えば、このタンパク質およびポリヌクレオチドまたはこのタンパク質に対して生成された抗体を、種々のアッセイに用いて、ＨＩＶの感染もしくは疾患の状態の診断において、または免疫化に対する応答の尺度として助けとなる生物学的サンプル中の反応性抗体および／またはＥｎｖタンパク質の存在を決定し得る。
【００８３】
Ｅｎｖ（例えば、ｇｐ１２０）ポリペプチドと反応性である抗体の存在、および逆に、Ｅｎｖポリペプチドに対して惹起された抗体と反応性である抗原は、標準的な電気泳動技術および免疫アッセイ（例えば、競合アッセイ、直接反応アッセイ、またはサンドイッチ型アッセイ）を含む免疫診断技術を用いて検出され得る。このようなアッセイとしては、以下を含むがこれらに限定されない：ウエスタンブロット；凝集試験；酵素標識免疫アッセイおよび酵素媒介免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）；ビオチン／アビジン型アッセイ；放射免疫アッセイ；免疫電気泳動；免疫沈降など。この反応は、一般的に顕示標識（例えば、蛍光、化学発光、放射活性、または酵素標識もしくは色素分子、あるいは抗原と抗体との間の複合体の形成または抗原と反応した抗体を検出するための方法）を含む。
【００８４】
固体支持体（例えば、ニトロセルロース）は、膜またはマイクロタイターウェル形態でのアッセイにおいて用いられ得る；ポリ塩化ビニル（シートまたはマイクロタイターウェルにおいて）；ポリスチレンラテックス（ビーズまたはマイクロタイタープレートにおいて）；フッ化ポリビニリデン；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性化ビーズなど。
【００８５】
代表的に、固体支持体はまず、生物学的サンプル（またはｇｐ１２０タンパク質）と反応し、洗浄され、次いで抗体（または抗体が含まれていると推測されるサンプル）が添加される。洗浄して任意の非結合リガンドを除去した後、二次結合体部分が、適切な結合条件下で添加される。その結果、二次結合体は、この結合リガンドと選択的に会合し得る。次いで、二次結合体の存在は、当該分野で周知の技術を用いて検出され得る。代表的に、二次結合体は、この抗体リガンドに対して惹起された抗体を含む。多くの抗ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）分子は、当該分野で公知である（例えば、市販のヤギ抗ヒトＩｇまたはウサギ抗ヒトＩｇ）。本明細書中での使用のためのＩｇ分子は、好ましくは、ＩｇＧ型またはＩｇＡ型であるが、ＩｇＭもまた、いくつかの例において適切であり得る。このＩｇ分子は、当業者に公知の方法により検出可能な酵素標識（例えば、特に西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびウレアーゼ）に容易に結合し得る。次いで、適切な酵素の基質を用いて、検出可能なシグナルを生じる。
【００８６】
あるいは、「二抗体サンドイッチ」アッセイを用いて、本発明のタンパク質を検出し得る。この技術において、固体支持体をまず、Ｅｎｖ（例えば、ｇｐ１２０）に対して惹起された１つ以上の抗体と反応させ、洗浄し、次いで試験サンプルに曝露させる。抗体を再度、添加して、そしてこの反応を、直接呈色反応かまたは標識二次抗体（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはウレアーゼで標識された抗免疫グロブリン）のいずれかを用いて可視化される。
【００８７】
アッセイはまた、溶液中で行われ、その結果このウイルスタンパク質およびこれに対する抗体は、沈降条件下で複合体を形成する。次いで、この沈降した複合体は、例えば、遠心分離によりこの試験サンプルから分離され得る。この反応混合物を多くの標準的な方法（例えば、上記した免疫診断方法）のいずれかを用いて分析して、抗体抗原複合体の存在または非存在を決定し得る。
【００８８】
上記のように産生された改変されたＥｎｖタンパク質、またはこのタンパク質に対する抗体は、上記のような免疫アッセイを行うために、適切な説明書および他の必須の試薬とともにキットに提供され得る。このキットはまた、用いられる特定の免疫アッセイに依存する、適切な標識および他のパッケージされた試薬および材料（すなわち、洗浄緩衝液など）を含み得る。標準的な免疫アッセイ（例えば、上記のアッセイ）は、これらのキットを用いて、行われ得る。
【００８９】
Ｅｎｖポリペプチド、およびこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、ワクチン組成物（例えば、予防ワクチン（すなわち、感染を予防するため）または治療ワクチン（感染後のＨＩＶを処置するため））において、個々にまたは組み合わせて用いられ得る。このワクチンは、１つ以上の改変されたＥｎｖタンパク質（またはこのタンパク質をコードするヌクレオチド配列）（例えば、１つよりも多いウイルス単離物由来のＥｎｖ（例えば、ｇｐ１２０）タンパク質）の混合物を含み得る。このワクチンはまた、他の抗原および免疫調節試薬（例えば、免疫グロブリン、サイトカイン、リンホカイン、およびケモカイン（ＩＬ−２、改変ＩＬ−２（ｃｙｓ１２５→ｓｅｒ１２５）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、γ−インターフェロン、ＩＰ−１０、ＭＩＰ１βおよびＲＡＮＴＥＳを含むが、これらに限定されない）と併せて投与され得る。このワクチンは、ポリペプチドとしてか、あるいは代替的にウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター）または非ウイルスベクター（例えば、リポソーム、核酸またはタンパク質で被覆された粒子）を用いて裸の核酸ワクチン（例えば、ＤＮＡ）として投与され得る。このワクチンはまた、タンパク質および核酸の混合物を含み、次いで、これは同様のビヒクルまたは異なるビヒクルを用いて送達され得る。このワクチンは、所望の効果を達成するために１回よりも多く投与され得る（例えば、「プライム（初期）」投与に続いて１回以上の「ブースト」）。同様の組成物が、プライム投与および１回以上のブースト投与として投与され得る。あるいは、異なる組成物が、プライム投与およびブースト投与のために用いられ得る。
【００９０】
このワクチンは、一般的に例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどの１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」を含む。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤）、ｐＨ緩衝物質などが、このようなビヒクル中に存在し得る。
【００９１】
キャリアは、必要に応じて存在し、これは、この組成物を受け入れる個体に対して有害な抗体の産生をキャリア自体が誘発しない分子である。適切なキャリアは、代表的には、大きな、ゆっくり代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ酪酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体、脂質凝集体（例えば、油溶滴またはリポソーム）、および不活化ウイルス粒子）である。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、Ｅｎｖポリペプチドは、細菌トキソイド（例えば、ジフテリア、テタノス、コレラなど由来のトキソイド）と結合体化され得る。
【００９２】
アジュバンドをまた用いて、ワクチンの有効性を増強し得る。このようなアジュバンドとしては、以下を含むがこれらに限定されない：（１）アルミニウム塩（明礬）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）水中油型乳濁液処方物（他の特定の免疫刺激薬因子（例えば、ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分）を伴うかまたは伴わない）を包含する。例えば、（ａ）５％  スクアレン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％  Ｓｐａｎ８５（必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含有するが、必要ではない）を含み、Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙ微小流体化器（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）のような微小流体化器を用いてμｍ未満の粒子へと処方されたＭＦ５９（国際出願  ＷＯ９０／１４８３７）；（ｂ）μｍ未満のエマルジョンへと微小流体化されたか、またはボルテックスして、より大きな粒子径エマルジョンを生成したかのいずれかである、１０％  スクアレン、０．４％  Ｔｗｅｅｎ８０、５％  プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含有するＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％  スクアレン、０．２％  Ｔｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘTM）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉTMアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）；（３）サポニンアジュバント（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎTM）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）を使用し得るか、またはそれから粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体））を生成し得る；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２など）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；（６）コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）（詳細には、ＬＴ−Ｋ６３（リシンが、６３位の野生型アミノ酸に対して置換されている）、ＬＴ−Ｒ７２（アルギニンが、７２位の野生型アミノ酸に対して置換されている）、ＣＴ−Ｓ１０９（セリンが、１０９位の野生型アミノ酸に対して置換されている）、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（リシンが、９位の野生型アミノ酸に対して置換されており、そしてグリシンが、１２９位で置換されている））のような細菌ＡＤＰ−リボース化毒素の無毒化変異体（例えば、国際出願  ＷＯ９３／１３３０２および同  ＷＯ９２／１９２６５を参照のこと）；ならびに（７）その組成物の有効性を増強するための免疫刺激因子として作用する他の物質。
【００９３】
ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などを含むが、これらに限定されない。
【００９４】
代表的に、ワクチン組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかとして、注射可能なように調製され；注射前に液体ビヒクルにおける溶液または懸濁物として適切な固体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、上記に議論されたように、アジュバント効果の増強のために乳化され得るかまたはリポソーム中にカプセル化され得る。
【００９５】
このワクチンは、改変されたＥｎｖタンパク質、もしくはこのタンパク質の複合物、またはこのタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および必要な場合、任意の他の上記の成分の治療的有効量を含む。「治療的有効量」とは、このワクチンが投与される非感染個体、感染個体または曝露されていない個体において保護性免疫学的応答を誘導する改変されたＥｎｖ（例えば、ｇｐ１２０）タンパク質の量を意味する。このような応答は、一般的に、被験体の分泌免疫応答、ワクチンに対する細胞媒介免疫応答および／または抗体媒介免疫応答における発達を生じる。通常、このような応答としては、１つ以上の以下の効果が含まれるが、これらに限定されない：免疫学的クラス（例えば、免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭ）のいずれかからの抗体の産生；Ｂリンパ球およびＴリンパ球の増殖；免疫学的細胞への活性化シグナル、増殖シグナルおよび分化シグナルの供給；ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞の拡大。
【００９６】
好ましくは、有効量は、疾患の症状の処置または予防をもたらすのに十分である。この正確な必要量は、数ある因子のなかでもとりわけ、処置する患者；処置される個体の年齢および一般的な状態；抗体を合成する個体の免疫系の能力；所望される保護の程度；処置される状態の危篤度；選択される特定のＥｎｖポリペプチドならびにこの投与形態に依存して変化する。適切な有効量は、当業者により容易に決定され得る。「治療的有効量」は、慣用的な試みを通して決定され得る比較的広い範囲内にある。
【００９７】
一旦処方された核酸ワクチンは、上記されたように、ウイルスベクターを伴ってかまたは伴わないで、従来の注射器かまたは遺伝子銃（例えば、Ａｃｃｅｌｌ（登録商標）遺伝子送達系（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ））のいずれかを用いる注入により達成され得る。表皮の細胞へのＤＮＡの送達が、特に好ましい。なぜなら、投与のこの様式は、皮膚関連リンパ細胞へのアクセスを提供し、そしてレシピエントにおけるＤＮＡの一次的な存在に備えるからである。核酸および／またはペプチドの両方は、皮下、表皮、真皮、粘膜内（例えば、鼻、直腸および膣）、腹腔内、静脈内、経口的または筋肉内のいずれかに注入し得る。投与の他の様式は、経口的投与および肺投与、坐薬、針なし注入、経皮的塗布および経皮的塗布（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を含む。投薬量の取り扱いは、単一な投薬計画かまたは複合的な投薬計画であり得る。核酸の投与はまた、ペプチドまたは他の物質の投与と併用され得る。
【００９８】
本発明は、その好ましい特定の実施形態とともに記載されているが、この説明ならびに以下の実施例は、例示であることを意図し、そして本発明の範囲を制限しないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の他の局面、利点および改善は、本発明に関連する当業者には明らかである。
【００９９】
（実験）
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の実施例である。これらの実施例は、例示の目的のみのために示され、そして、いずれにしても本発明の請求の範囲を制限することを意図しない。
【０１００】
使用される数字（例えば、量、温度など）に関する精度を保証する試みがなされたが、幾分かの実験誤差および偏差は、もちろん許容されべきである。
【０１０１】
（実施例１）
（Ａ．１．Ｂｅｓｔ−Ｆｉｔおよび相同性検索）
ＨＸＢ−２  ｇｐ  １２０の結晶構造を、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎデータベース（ＣＯＭＰＬＥＸ（ＨＩＶ  ＥＮＶＥＬＯＰＥ  ＰＲＯＴＥＩＮ／ＣＤ４／ＦＡＢ）１５−ＪＵＮ−９８  １ＧＣ１  ＴＩＴＬＥ：ＨＩＶ−１  ＧＰ１２０  ＣＯＲＥ  ＣＯＭＰＬＥＸＥＤ  ＷＩＴＨ  ＣＤ４  ＡＮＤ  Ａ  ＮＥＵＴＲＡＬＩＺＩＮＧ  ＨＵＭＡＮ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ）からダウンロードした。ｇｐ  １２０のβ鎖３、２、２１および２０は、ＣＤ４結合部位付近にシートを形成する。鎖β−３およびβ−２は、Ｖ１／Ｖ２ループによって連結される。鎖β−２１およびβ−２０は、別の小ループによって連結される。鎖β−２とβ−２１との間の界面におけるＨ結合は、タンパク質の「下」半分のドメイン間の連結（へリックスα１をＣＤ４結合部位に結合する）にすぎない。このβシートおよびこれらのループは、ＣＤ４結合の間にただ暴露されるいくつかの抗原（例えば、中和抗体を生成し得る抗原）をマスクする。
【０１０２】
ＣＤ４結合部位において十分なβシートを除去して、抗原を暴露するが、十分なタンパク質を残して、正しい折り畳みを可能にする構築物を設計した。小ループに対する改変およびＶ１／Ｖ２ループの任意の欠失を特に標的にした。以下の３つのタイプの構築物を設計した：（１）４−鎖βシート全体を作製する数の残基をインタクトのままにするが、１つ以上の残基を置換する、ポリペプチドをコードする構築物；（２）切除された少なくとも１つのβ鎖の少なくとも１つの残基を有するポリペプチドをコードする構築物；または（３）切除された少なくとも１つのβ鎖の少なくとも２つの残基を有するポリペプチドをコードする構築物。従って、合計６個の異なるターンが、これらの鎖の末端を再結合するために必要であった。
【０１０３】
最初に、小ループ中の残基（残基４２７〜４３０、ＨＸＢ−２に関する）および連結したβ鎖（β−２０およびβ−２１）を、ＧｌｙおよびＰｒｏ（βターンで共通）を含むように改変した。次いで、これらの配列を、標的として使用して、各検索で整合した。その標的の構造は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋの既知のタンパク質と一致した。特に、５残基のターン（Ｎ末端の重複単一残基、２残基の標的ターン、およびＣ末端の２つの重複残基）は、このデータベースで検索した。言い換えると、これらの改変ループは、野生型タンパク質のβシート構造を維持する構造を支持できなければならない２残基のターンを付加する。Ｓｙｂｙ１分子モデリングパッケージのＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒモジュールのＬｏｏｐ  Ｓｅａｒｃｈフィーチャで、デフォルトパラメーターを使用して、計算を行った。各場合において、構造のみに基づく２５のベストフィットを評価し、それらのいくつかを相同性について選択し、そしてフィットさせた。
【０１０４】
さらに、どの改変が行われて、ほとんどのＶ１／Ｖ２ループ（残基１２４−１９８、ＨＸＢ−２に関して）を除去し、タンパク質の構造をインタクトにしたままにするかも決定した。小ループの場合と同様に、１つ以上の残基を、β−２鎖（ＨＸＢ−２の残基１１９〜１２３）、β−３鎖（ＨＸＢ−２の残基１９９〜２０１）またはβ−２およびβ−３の両方から切除する構築物をまた設計した。これらの構築物について、既知のループを検索して、ペンタマー（Ｎ末端側由来の２つの残りの残基、２残基のターンおよびＣ末端残基を含む）の構造を整合した。これらの検索について、Ｇｌｙ−Ｇｌｙが、少なくとも１つのＣ末端置換を伴う挿入として好ましかった。
【０１０５】
（Ａ．２．小ループ置換）
１つの局面において、ネイティブ配列を、ＣＤ４結合部位を暴露するが、タンパク質の構造全体を比較的変えないままにする残基で置換した。小ループ置換について、一致する標的は、ＡＳＮ４２５−ＭＥＴ４２６−ＧＬＹ４２７−ＧＬＹ４２８−ＧＬＹ４３１であった。この検索結果を、表１にまとめる。
【０１０６】
表１：小ループの検索（Ａｓｎ４２５〜Ｇｌｙ４３１）
【０１０７】
【表１】
0004776075.tif 000002
これらの結果に基づいて、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（＃７）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（＃１２）またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（＃７）をコードする構築物が推奨された。
【０１０８】
Ｖ１／Ｖ２ならびにβ−２およびβ−３の１つ以上の残基がまた、必要に応じて、本発明の改変ポリペプチドにおいて欠失されるため、Ｖ１／Ｖ２ループの構造と一致する既知のループもまた検索した。一致する標的のＶ１／Ｖ２ループは、Ｌｙｓ１２１−Ｌｅｕ−１２２−Ｇｌｙ１２３−Ｇｌｙ１２４−Ｓｅｒ１９９であった。いくつかの著しく一致したものを表２に示す。
【０１０９】
表２：Ｖ１／Ｖ２ループの検索（Ｌｙｓ１２１〜Ｓｅｒ１９９）
【０１１０】
【表２】
0004776075.tif 000003
これらの検索に基づいて、Ｖ１／Ｖ２の代わりにＧｌｙ−Ａｓｎをコードする構築物が推奨された。
【０１１１】
（Ａ．３．１つのさらなる残基の切除）
わずかに切り取られた小ループについて、もう１つの残基を、各β鎖から切り取り、βシートをわずかに短くした。一致する標的は、ＩＬＥ４２４−ＡＳＮ４２５−ＧＬＹ４２６−ＧＬＹ４２７−ＬＹＳ４３２であった。結果を表３に示す。
【０１１２】
表３：１残基だけ短縮したβシートの検索（Ｉｌｅ４２４〜Ｌｙｓ４３２）
【０１１３】
【表３】
0004776075.tif 000004
これらの検索は、以前の切除より大きな変化および劣った適合を示し、Ｐｒｏ−ＶａｌまたはＰｒｏ−Ｌｅｕコード構築物は非常に類似していた。従って、Ａｌａ−Ｐｒｏコード構築物が推奨された。
【０１１４】
欠失したＶ１／Ｖ２および切除されたβ−２またはβ−３からのさらなる残基を有するｇｐ１２０ポリペプチドをコードする配列をまた検索した。Ｖ１／Ｖ２ループの、一致した標的は、ＶＡＬ１２０−ＬＹＳ１２１−ＧＬＹ１２２−ＧＬＹ１２３−ＶＡＬ２００であった。いくつかの著しく一致したものを表４に示す。
【０１１５】
表４：Ｖ１／Ｖ２ループの検索（Ｖａｌ１２０〜Ｖａｌ２００）
【０１１６】
【表４】
0004776075.tif 000005
Ａｌａ−Ｐｒｏ（例えば、＃７）をコードする構築物が推奨された。
【０１１７】
（Ａ．４．さらなる切除）
なおさらなる切除において、さらなる残基を、β−２０およびβ−２１鎖から切り取り、βシートをさらに短くした。一致した標的は、ＩＬＥ４２３−ＩＬＥ４２４−ＧＬＹ４２５−ＧＬＹ４２６−ＡＬＡ４３３であった。著しく一致したものを表５に示す。
【０１１８】
表５：２つの残基だけ短縮されたβシートの検索（Ｉｌｅ４２３〜Ａｌａ４３３）
【０１１９】
【表５】
0004776075.tif 000006
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（例えば、＃３）（これは、１００％相同性を有する）が推奨された。
【０１２０】
欠失したＶ１／Ｖ２領域、ならびにβ−２、β−３から切除された少なくとも２つの残基、またはβ−２およびβ−３から切除された少なくとも１つの残基をコードする配列をもまた、検索した。一致すべき標的は、ＣＹＳ１１９−ＶＡＬ１２０−ＧＬＹ１２１−ＧＬＹ１２２−ＩＬＥ２０１であった。著しい一致を表６に示す。
【０１２１】
【表６】
0004776075.tif 000007
両方の構築物が使用され得ることが、決定された。
【０１２２】
（Ｂ．１．改変されたＥｎｖポリペプチドをコードする構築物）
上記のように、４−β逆平行鎖から突出しているネイティブなループを切除し、そして１〜３残基の屈曲で置き換えた。このループを、全体のβ鎖を放出するために置き換えるか、または連結された鎖の各末端から１つ以上のアミノ酸をトリミングすることにより切除した。Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋを検索することにより決定する場合、同じ骨格の相対位置を維持する屈曲（例えば、β−２０およびβ−２１の三次構造）で、鎖の末端を再結合した。
【０１２３】
表７Ａは、上記の実施例１．Ａ．において決定される場合、この研究に対して推奨される可変領域１および２の短縮型の要約である。
【０１２４】
【表７Ａ】
0004776075.tif 000008
以前に記したように、本発明の構築物によりコードされるポリペプチドは、ＨＸＢ−２に関して番号付けられるが、これらの例示的な構築物によりコードされるポリペプチドの特定のアミノ酸残基は、ＳＦ−１６２に基づく。従って、例えば、ＨＸＢ−２中のアミノ酸残基１９５は、セリン（Ｓ）であるが、野生型ＳＦ１６２配列を有するポリペプチドをコードしている構築物の場合は、この位置でアスパラギン（Ｎ）を有する。表７Ｂは、株ＨＸＢ−２と株ＳＦ１６２との間のアミノ酸配列における、ちょうど３つのバリエーションを示す。残基およびアミノ酸番号における差異を含む、ＨＸＢ−２およびＳＦ１６２の全体の配列を、図２（配列番号１および２）のアラインメントにおいて示す。
【０１２５】
【表７Ｂ】
0004776075.tif 000009
β−２０鎖、β−２１鎖および小ループにおける欠失を含む構築物をまた、構築した。これらの領域の短縮型をコードする構築物を、表８に示す。表８における構築物は、ＨＸＢ−２に相対して番号付けられるが、非改変アミノ酸配列は、ＳＦ１６２に基づく。従って、この構築物は、ＨＸＢ−２に関して４２６と番号付けられたアミノ酸の位置で、ＳＦ１６２において見出されるような、アルギニン（Ａｒｇ）をコードする（表７Ｂをまた、参照のこと）。
野生型（ＳＦ１６２）からの変化を、表８Ｂ中の太字で示す。
【０１２６】
【表８】
0004776075.tif 000010
β鎖の１つおよびそれらの組み合わせの各々ついて、表７および表８において示される欠失構築物を構築する。これらの欠失を、サブタイプＢ株（例えば、ＳＦ１６２、ＵＳ４、ＳＦ２）、サブタイプＥ株（例えば、ＣＭ２３５）およびサブタイプＣ株（例えば、ＡＦ１１０９６８またはＡＦ１１０９７５）のような異なるＨＩＶ株由来のＥｎｖ形態（ｇｐ１２０、ｇｐ１４０およびｇｐ１６０）において試験する。ＳＦ１６２に関する例示的な構築物を図に示し、そして表９に要約する。上の図２および表７Ｂに記されるように、結合シート領域において、ＨＸＢ−２のＭｅｔ４２６がＳＦ１６２ではＡｒｇであるので、ＳＦ１６２のアミノ酸配列は、ＨＢＸ−２とは異なる。表９において、Ｖ１／Ｖ２は、Ｖ１／Ｖ２領域における欠失をいい、＃ｂｓｍは、架橋シートの小ループにおける改変をいう。
【０１２７】
【表９】
0004776075.tif 000011
0004776075.tif 000012
表９に具体的に示される改変に加え、Ｖ１／Ｖ２の欠失の組み合わせおよび架橋シートの小ループの改変はまた、本発明の範囲に含まれる。本明細書に記載される、本発明の異なる実施形態の種々の形態はまた、組み合わせられ得る。
【０１２８】
最初のスクリーニングを、ＣＯＳ−７細胞、ＲＤ細胞および／または２９３細胞中の一過性の発現後に行う。発現されるタンパク質を、イムノブロット、ＥＬＩＳＡにより分析し、そしてＣＤ４結合部位および構造の統合性を決定するために、ｇｐ１２０上の他の重要なエピトープに対するｍＡｂへの結合について分析する。これらをまた、ＣＤ４結合アッセイにおいて、そしてさらに、例えば、患者の血清またはｍＡｂ４４８Ｄ（Ｇｌｕ３７０およびＴｙｒ３８４に方向付けられる欠失により変更されないＣＤ４結合の溝の領域）を用いて、中和抗体の結合について試験する。
【０１２９】
これらの新規なＥｎｖ糖タンパク質の免疫原性を、げっ歯類および霊長類において試験する。この構造物は、ＤＮＡワクチンもしくはアジュバントタンパク質ワクチンとして、または組み合わされた様式で投与される。これらのワクチン接種の目的は、広範に反応性の中和抗体応答をアーカイブ（ａｒｃｈｉｖｅ）することである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、結晶学的研究によって決定されるところの、ＨＩＶ−１HXB-2Ｅｎｖ  ｇｐ１２０ポリペプチドの三次構造の模式図である。
【図２】  図２Ａ〜Ｃは、ＨＩＶ改変体ＳＦ１６２のアミノ酸配列（「１６２」で示す）（配列番号２）、ＳＦ２、ＣＭ２３６およびＵＳ４との、野生型ＨＩＶ−１HXB2のＥｎｖ  ｇｐ１６０ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）の整列を示す。矢印は、この領域が、改変されたポリペプチドにおいて欠失または置換されている領域を示す。黒点は、保存されたシステイン残基を示す。星印は、ｇｐ１２０における最後のアミノ酸の位置を示す。
【図３】  図３Ａ〜Ｊは、Ｖ１／Ｖ２欠失を有する改変されたＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の整列を示す。これらの配列によってコードされる改変されていないアミノ酸残基は、野生型ＳＦ１６２残基に対応するが、ＨＸＢ−２に関連付けられて番号付けている。
【図４】  図４Ａ〜Ｍは、小ループにおいて欠失もしくは置換を有する改変されたＥｎｖポリペプチドをコードするポリペプチドのヌクレオチド配列の整列を示す。これらの配列によってコードされる改変されていないアミノ酸残基は、野生型ＳＦ１６２残基に対応するが、ＨＸＢ−２に対して番号付けている。
【図５】  図５Ａ〜Ｎは、Ｖ１／Ｖ２欠失およびさらに小ループにおける欠失もしくは置換の両方を有する改変されたＥｎｖポリペプチドをコードするポリペプチドのヌクレオチド配列の整列を示す。これらの配列によってコードされる改変されていないアミノ酸残基は、野生型ＳＦ１６２残基に対応するが、ＨＸＢ−２に対して番号付けている。
【図６】  図６は、Ｖａｌ２０−Ａｌａ２０４と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号３）。
【図７】  図７は、ＶａＩ１２０−Ｉｌｅ２０１と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号４）。
【図８】  図８は、Ｖａｌｌ２０−Ｉｌｅ２０１Ｂと称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号５）。
【図９】  図９は、Ｌｙｓｌ２１−Ｖａｌ２００と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号６）。
【図１０】  図１０は、Ｌｅｕｌ２２−Ｓｅｒｌ９９と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号７）。
【図１１】  図１１は、Ｖａｌｌ２０−Ｔｈｒ２０２と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号８）。
【図１２】  図１２は、Ｔｒｐ４２７−Ｇｌｙ４３１と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号９）。
【図１３】  図１３は、Ａｒｇ４２６−Ｇｌｙ４３１と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号１０）。
【図１４】  図１４は、Ａｒｇ４２６−Ｇｌｙ４３１Ｂと称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号１１）。
【図１５】  図１５は、Ａｒｇ４２６−Ｌｙｓ４３２と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号１２）。
【図１６】  図１６は、Ａｒｇ４２５−Ｌｙｓ４３２と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号１３）。
【図１７】  図１７は、Ｉｌｅ４２４−Ａｌａ４３３と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号１４）。
【図１８】  図１８は、Ｉｌｅ４２３−Ｍｅｔ４３４と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号１５）。
【図１９】  図１９は、Ｇｌｎ４２２−Ｔｙｒ４３５と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号１６）。
【図２０】  図２０は、Ｇｌｎ４２２−Ｔｙｒ４３５Ｂと称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号１７）。
【図２１】  図２１は、Ｌｅｕ１２２−Ｓｅｒ１９９；Ａｒｇ４２６−Ｇｌｙ４３１と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号１８）。
【図２２】  図２２は、Ｌｅｕｌ２２−Ｓｅｒｌ９９；Ａｒｇ４２６−Ｌｙｓ４３２と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号１９）。
【図２３】  図２３は、Ｌｅｕｌ２２−Ｓｅｒｌ９９；Ｔｒｐ４２７−Ｇｌｙ４３１と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号２０）。
【図２４】  図２４は、Ｌｙｓｌ２１−Ｖａｌ２００；Ａｓｎ４２５−Ｌｙｓ４３２と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号２１）。
【図２５】  図２５は、Ｖａｌｌ２０−Ｉｌｅ２０１；Ｉｌｅ４２４−Ａｌａ４３３と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号２２）。
【図２６】  図２６は、Ｖａｌｌ２０−Ｉｌｅ２０１Ｂ；Ｉｌｅ４２４−Ａｌａ４３３と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号２３）。
【図２７】  図２７は、Ｖａ１１２０−Ｔｈｒ２０２；Ｉｌｅ４２４−Ａｌａ４３３と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号２４）。
【図２８】  図２８は、Ｖａ１１２７−Ａｓｎｌ９５と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号２５）。
【図２９】  図２９は、Ｖａｌｌ２７−Ａｓｎｌ９５；Ａｒｇ４２６−Ｇｌｙ４３１と称する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号２６）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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