(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のペプチドもしくはポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の上流に位置する配列番号６または配列番号８から選択されるヌクレオチド配列からなることを特徴とする、組換えヌクレオチド分子。
【請求項２】
目的のペプチドまたはポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が、
−  治療目的のペプチド、もしくは農業および食品工業に用い得るペプチドをコードしている配列、または
−  α−グルカンと相互作用する酵素をコードしている配列
から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の組換えヌクレオチド分子。
【請求項３】
α−グルカンと相互作用する酵素が、様々な加水分解酵素、ホスホリラーゼ、α−１，４−グルカノトランスフェラーゼ、分枝酵素、またはアミラーゼから選択される、請求項２記載の組換えヌクレオチド分子。
【請求項４】
α−グルカンと相互作用する酵素が、好極限性細菌から得られる耐熱性加水分解酵素から選択される、請求項２記載の組換えヌクレオチド分子。
【請求項５】
配列番号７または配列番号９のアミノ酸配列からなるデンプン合成酵素をコードしているヌクレオチド配列と、目的のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列との間に位置し、切断部位をコードしているヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えヌクレオチド分子。
【請求項６】
デンプンを産生することができる、植物、藻類または微藻類の細胞から選ばれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えヌクレオチド分子を、そのゲノムに組み込まれてか、またはその細胞質に安定的な方式で維持されて有するトランスジェニック植物細胞。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えヌクレオチド分子を、それを構成する細胞の、ゲノムに組み込まれてか、または細胞質に安定的な方式で維持されて有するトランスジェニック植物、藻類もしくは微藻類、またはこれらの植物、藻類もしくは微藻類の部分。
【請求項８】
部分が、トランスジェニック植物、藻類もしくは微藻類の花、果実、葉、茎、根、種子、もしくは断片から選択される少なくとも１つである、請求項７記載のトランスジェニック植物、藻類もしくは微藻類の部分。
【請求項９】
Ｎ末端位に、配列番号７または配列番号９のアミノ酸配列からなるデンプン合成酵素、かつ
Ｃ末端位に、目的のペプチドまたはポリペプチド
を含むことを特徴とする、融合ポリペプチド。
【請求項１０】
一方ではデンプン合成酵素と、他方では目的のポリペプチドとの間に位置する切断部位を有することを特徴とする請求項９記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項９または１０に定義された１種類以上の融合ポリペプチドを含むことを特徴とするデンプン顆粒。
【請求項１２】
生理学的に許容され得るビヒクルと組み合わせて、請求項１１記載のデンプン顆粒を含有し、該顆粒が、請求項９または１０に定義されたとおりの１種類以上の融合ポリペプチドを含み、該融合ポリペプチド中の目的のペプチドが、定義された治療効果を保有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
非経口的に投与できる形態をなすか、または経口的に投与できる形態をなし、デンプン顆粒の直径が、約０．１〜数１０μmであり、これらの顆粒中の融合ポリペプチドの重量割合が、約０．１〜１％であることを特徴とする、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
非経口的投与が、静脈内投与である、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
生理学的に許容され得るビヒクルと組み合わせて、請求項９または１０に定義されたとおりの１種類以上の融合ポリペプチドを含有し、該融合ポリペプチド中の目的のペプチドが、定義された治療効果を保有することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１１記載のデンプン顆粒を含有し、該顆粒が、請求項９または１０に定義されたとおりの１種類以上の融合ポリペプチドを含有し、該融合ポリペプチド中の目的のペプチドが、食品加工の分野で使用可能であることを特徴とする、食品組成物。
【請求項１７】
請求項１１記載のデンプン顆粒を製造する方法であって、下記の工程：
−  請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えヌクレオチド分子を含む組換えベクターによって形質転換された、細胞性宿主による植物細胞の形質転換、
−  上記の形質転換された植物細胞のin vitroでの培養によって、そのゲノムが、請求項１〜５のいずれか一項に記載の１種類以上のヌクレオチド分子を有するようにして形質転換された植物、藻類または微藻類を得ること、
−  形質転換された植物、藻類または微藻類からか、またはこれらの植物、藻類もしくは微藻類の部分からの、沈降によるデンプン顆粒の抽出
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
細胞性宿主が、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）である、請求項１７記載のデンプン顆粒を製造する方法。
【請求項１９】
組換えベクターが、プラスミド、コスミドまたはファージ型から選択される、請求項１７または１８記載のデンプン顆粒を製造する方法。
【請求項２０】
形質転換された植物、藻類または微藻類の部分が、これら植物、藻類または微藻類の花、果実、葉、茎、根、またはフラグメントから選択されるすくなくとも１つである、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のデンプン顆粒を製造する方法。
【請求項２１】
請求項９または１０に記載の融合ポリペプチドを製造する方法であって、請求項１７〜２０のいずれか一項記載の方法の実施を包含し、該方法が、デンプン顆粒からの融合ポリペプチドの回収を含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
目的のペプチドを製造する方法であって、請求項１７〜２１のいずれか一項記載の方法の実施を包含し、該方法が、請求項５記載のヌクレオチド分子による植物細胞の形質転換によって実施され、得られた融合ポリペプチドの適当な試薬による切断の追加的工程を包含することを特徴とする方法。
【請求項２３】
デンプン顆粒を生体形質転換する方法であって、下記の工程：
−  デンプンを形質転換することができる酵素をコードしている請求項２記載の組換えヌクレオチド分子を含む組換えベクターによって形質転換された、細胞性宿主による植物細胞の形質転換、
−  上記の形質転換された植物細胞のin  vitroでの培養によって、そのゲノムが、上記の１種類以上のヌクレオチド配列を有するようにして形質転換された植物、藻類または微藻類を得ること、
−  形質転換された植物、藻類または微藻類からか、またはこれら植物、藻類または微藻類の部分からの、沈降によるデンプン顆粒の抽出、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
細胞性宿主が、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）である、請求項２３記載のデンプン顆粒を生体形質転換する方法。
【請求項２５】
組換えベクターが、プラスミド、コスミドまたはファージ型から選択される、請求項２３または２４記載のデンプン顆粒を生体形質転換する方法。
【請求項２６】
形質転換された植物、藻類または微藻類の部分が、これらの植物、藻類または微藻類の花、果実、葉、茎、根、またはフラグメントから選択される少なくとも１つである、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載のデンプン顆粒を生体形質転換する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、目的の組換えポリペプチドを含有するデンプン顆粒、それを得る方法はもとより、その用途、特に医薬組成物におけるそれに関する。
【０００２】
デンプンは、世界で最も重要な多糖類源の一つであって、特に植物（トウモロコシ、バレイショ、コムギ、コメ、オオムギ等々）、藻類、微藻類等々に産する。デンプンは、水に不溶である顆粒の形態で出現し、その大きさは、その起源（植物、藻類または微藻類）、さらには目的の植物の遺伝子型に応じて、直径０．１μmから数１０μmまで変動し得る。したがって、これらの顆粒の大きさは、直径０．１μmから直径５０μmを越えるまでに変動する。さらに、これらの顆粒の結晶化度は、０％（アミロースに富む顆粒について）から３０％を越えるまでの範囲にある。３または４種類の結晶型（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｖ）が存在する。顆粒は、デンプン顆粒の中心から始まり、交互に無定形層および半結晶質層の敷設によって成長する。
【０００３】
デンプンは、α−１，４で結合し、α−１，６で分枝するグルカンで構成される、いくつかの別個の多糖類画分を含有する。より詳しくは、デンプンは、２種類のグルコース重合体、すなわち一方でのアミロース、すなわち低分子量で、僅かにのみ分枝している（＜１％のα−１，６結合）、顆粒の少数画分（約２０〜３０重量％）と、他方でのアミロペクチン、すなわち高分子量で、高度に分枝している（５％のα−１，６結合）、顆粒の主要画分（７０〜８０重量％）からなる。アミロースは、デンプン顆粒の結晶化度の発達には必要でなく；デンプン顆粒の結晶化度の原因となるのはアミロペクチンであることが、現在では知られている。
【０００４】
生物学的用語においては、厳密に言えば、デンプンは、植物界にのみ、より特定的には真核植物細胞の葉緑体、または非光合成顆粒に出現するにすぎない。２種類のデンプンが、植物によって合成される：すなわち、一時的または光合成デンプン（その合成は、葉緑体のレベルで行われる）、および貯蔵デンプン（その合成は、アミロプラストのレベルで行われる）である。
【０００５】
植物におけるデンプンの合成は、前駆体ＡＤＰ−グルコースの生合成に参加する一揃い酵素の全体、アミロースおよびアミロペクチン分子の組立、最後にデンプン顆粒の分解を伴う。
【０００６】
デンプンの生合成の第１段階は、２種類の酵素、すなわちホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）およびＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰアーゼ）が関与する、前駆体ＡＤＰ−グルコースの生成である。
【０００７】
デンプン顆粒の生合成の第２段階も、アミロースおよびアミロペクチンの合成に主として参加する、２種類の酵素：すなわちデンプン合成酵素（すなわちアデノシン二リン酸グルコースα−１，４−グルカンα−４−グルコシルトランスフェラーゼ）および分枝酵素（すなわちα−１，４−グルカン−６−グルコシルトランスフェラーゼ）が関与する。デンプン合成酵素は、ＡＤＰ−グルコースからグルカンの成長する鎖への、α−１，４型のＯ−グリコシド結合の形成によるグルコース残基の転移を触媒する。次いで、分枝酵素が、伸長するグルカンのα−１，４結合を加水分解し、次いでこうして遊離された断片を、α−１，６結合によってグルカンの残余に結合する。
【０００８】
デンプンの分解に関しては、分解酵素の二つの主要な群：すなわち一方では、加水分解性の酵素（加水分解酵素）、たとえばα−アミラーゼ（エンドミラーゼ）、β−アミラーゼ（エキソミラーゼ）、γ−アミラーゼ（アミログルコシダーゼ）、Ｄ−酵素（グルコシルトランスフェラーゼ）、Ｒ−酵素（脱分枝酵素）、α−グルコシダーゼ（マルターゼ）、他方では、加リン酸分解酵素（またはデンプンホスホリラーゼ）が存在する。
【０００９】
高等植物では、デンプン合成酵素のいくつかのイソ型が一緒に出現する。これらのイソ型の間の主な相違は、その溶解度（すなわち、植物の色素体の基質に溶解する）、またはデンプン顆粒に結合するという事実に関係する。
【００１０】
デンプン顆粒に結合したデンプン合成酵素（またはＧＢＳＳ：顆粒結合デンプン合成酵素）は、デンプンと密接に結びついて出現する。ＧＢＳＳのいくつかのイソ型は、トウモロコシ、エンドウマメ、バレイショまたはコムギで単離されている〔MacDonald & Preiss, 1985；Smith, 1990；Dry et al., 1992；Denyer et al., 1995〕。すべての事例で、ＧＢＳＳＩは、主要なイソ型であって；このイソ型がデンプン顆粒の生合成で果たす役割は、アミロースの形成である〔Tsai, 1974；Hovenkamp-Hermelink et al., 1987；Delrue et al., 1992；Denyer et al., 1995〕。穀類のWX、バレイショのAMF、およびエンドウマメのLAMという遺伝子座での突然変異は、ＧＢＳＳＩの消滅を、デンプンのアミロース画分の完全な崩壊と結び付ける。「ろう状タンパク質」（言語の誤用から、用語「ろう状タンパク質」は、植物におけるＧＢＳＳＩを指し、こうして、それを他のＧＢＳＳから区別するのに用いられている）に対応するｃＤＮＡが、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、コメ、バレイショおよびエンドウマメで単離されている。タンパク質の相対配列の比較から、異なる種間で相当の相同性が存在することが示されている〔Ainsworth et al., 1993〕。
【００１１】
ＧＢＳＳＩは、デンプン顆粒に結合した唯一のデンプン合成酵素ではない。他のイソ型も、エンドウマメ、バレイショ、トウモロコシまたはコムギではデンプン顆粒に結合されるのが見出されている〔Smith, 1990；Dry et al., 1992；Mu et al., 1994；Denyer et al., 1995〕。しかし、これらの様々なイソ型の役割は、未だ明らかではない。さらに、それらのほとんどは、可溶相でも見出される。
【００１２】
可溶性デンプン合成酵素（ＳＳ）は、デンプン顆粒には結合せずに、植物の色素体基質で可溶形態で見出される。結合形態と同様に、いくつかの形態の可溶性デンプン合成酵素が、高等植物で出現する。たとえば、可溶性デンプン合成酵素の三つのイソ型（ＳＳＩ、ＳＳIIおよびＳＳIII）がバレイショの塊茎で検出されている。
【００１３】
様々な形態の可溶性デンプン合成酵素に対応するｃＤＮＡが、高等植物でクローニングされている〔Baba et al., 1993；Dry et al., 1992；Edwards et al., 1995；Abel et al., 1996；Marshall et al., 1996；Gao et al., 1998〕。これから導き出される配列比較から、単一の種内であれ、高等植物の種間であれ、イソ型にわたって高度に保存された３領域の存在が明瞭に示されている。
【００１４】
本発明者らによる最近の研究は、クラミドモナス・ラインハルティイ（Chlamydomonas reinhardtii）からの可溶性デンプン合成酵素II（ＳＳII）が、アミロペクチン分枝の結晶の形成に主として関与することを確定するのを可能にした。
【００１５】
一方、ＧＢＳＳＩは、アミロペクチンの結晶の構築には参加しない。ＧＢＳＳＩ活性は、可溶相では検出されたことがない。ＧＢＳＳＩは、デンプン顆粒と密接に関連する。しかし、アミラーゼとは対照的に、デンプンの単位結合は、これまで記載されたＧＢＳＳＩ配列に見出されている。したがって、デンプン顆粒とのＧＢＳＳＩの結合を制御する機序は、未知である。
【００１６】
デンプン合成酵素は、これらの酵素が、目的の組換えペプチドを、デンプン顆粒の生合成が行われる色素体へと輸送するのを可能にしている可能性があるという点で、特に関心が持たれる。そのため、デンプン合成酵素と目的のペプチドとの間の融合ペプチドをコードしている配列による、植物の形質転換は、デンプン顆粒を大量に獲得し、そこから該目的のペプチドが回収できることを可能にすると思われる。
【００１７】
国際公開特許第WO98/14601号公報（Exseed Genetics）の著者らが、可溶性デンプン合成酵素Ｉ、IIおよびIII（ＳＳＩ、ＳＳII、ＳＳIII）、顆粒結合デンプン合成酵素（ＧＢＳＳ）、分枝酵素Ｉ、IIａおよびIIＢｂ、ならびにグルコアミラーゼを含む群から選ばれるデンプン合成酵素のアミノ末端に目的のポリペプチドが結合された、融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を記載したのは、これを目的としてであった。しかし、この出願に記載された配列を用いて植物を形質転換し、したがってまた該配列によって形質転換されたデンプン顆粒を得る方法の詳細は、全く例示されていない。
【００１８】
本発明は、目的のポリペプチドがデンプン合成酵素のカルボキシル末端に結合した、融合ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列による植物の形質転換のみが、該目的のポリペプチドを含有するデンプン顆粒を得るのを可能にすることの本発明者らによる立証から生じた。
【００１９】
本発明の目的の一つは、目的のペプチドを、（藻類または微藻類の細胞を包含する）植物細胞におけるデンプン顆粒の生合成の部位へと輸送できる融合タンパク質をコードしている、新規なヌクレオチド配列を提供することである。
【００２０】
本発明のもう一つの目的は、上記のヌクレオチド配列を用いて形質転換された、目的のポリペプチドを含有するデンプンを産生する植物を提供することである。
【００２１】
本発明のもう一つの目的は、目的のポリペプチドを含有するデンプン顆粒を提供することである。
【００２２】
本発明のもう一つの目的は、これらのデンプン顆粒を製造する方法を提供することである。
【００２３】
本発明のもう一つの目的は、これらのデンプン顆粒から始めて、目的の組換えポリペプチドを製造する方法を提供することである。
【００２４】
本発明のもう一つの目的は、上記のデンプン顆粒を含有する組成物、特に製剤または食料のためのそれを提供することである。
【００２５】
本発明のもう一つの目的は、用いられる該目的のペプチドがデンプンを形質転換できるときに、デンプン顆粒を生体形質転換する方法を提供することである。
【００２６】
以下、本発明を、図面を援用して解説する。
【００２７】
本発明は、アデノシン二リン酸グルコースα−１，４−グルカンα−４−グルコシルトランスフェラーゼ、またはデンプン合成酵素（ＥＣ２．４．１．２１）、もしくはこの酵素から、特に一つ以上のアミノ酸の抑制、付加もしくは置換によって誘導されるタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を、５′→３′の方向に含み、該デンプン合成酵素、または誘導されるタンパク質が、植物細胞内でのデンプン顆粒の生合成、またはデンプン顆粒への付着の部位へと移動する特性を有し、該酵素または上記タンパク質をコードしている該ヌクレオチド配列が、目的のペプチドもしくはポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の上流に位置することを特徴とする、いかなる組換えヌクレオチド配列にも関する。
【００２８】
上記または下記において、デンプン合成酵素とは、上記の組換えヌクレオチド配列がコードしている、該デンプン合成酵素と該目的のポリペプチドとの融合ポリペプチド内に、その酵素活性をそれが保存していると否とにかかわらず、植物細胞内でのデンプン顆粒の生合成、またはデンプン顆粒への付着の部位へと移動する特性を有するいかなるタンパク質も意味するものとする。
【００２９】
好ましくは、デンプン合成酵素、または上記に定義されたとおりの誘導されたタンパク質をコードしているヌクレオチド配列は、特に植物、藻類もしくは微藻類に産するデンプン顆粒ＧＢＳＳに結合しているデンプン合成酵素、はるかに好都合には、上記に定義されたとおりのイソ型ＧＢＳＳＩ、またはこのＧＢＳＳもしくはＧＢＳＳＩから誘導されるタンパク質をコードしているものから選ばれる。
【００３０】
本発明は、より詳しくは、デンプン合成酵素、より詳しくはＧＢＳＳ、特にＧＢＳＳＩをコードしているヌクレオチド配列が、この酵素を有すると思われる細胞、特に植物、藻類または微藻類の細胞から調製されたｃＤＮＡライブラリーを、該ライブラリー内の１種類以上のｃＤＮＡがコードしている該デンプン合成酵素を特異的に認識する抗体を含む抗血清を用いて、該デンプン合成酵素が適切なクローニングベクターによって発現されたときに、スクリーニングすることによって得られるようなそれであり、該抗血清が、動物、たとえばウサギを上記細胞から抽出されたデンプンで免疫化することによって得られことを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる組換ヌクレオチド配列にも関する。
【００３１】
本発明は、より詳しくは、デンプン合成酵素、または誘導されるタンパク質をコードしているヌクレオチド配列が、
【００３２】
−そのうちの３′末端の１，６９６塩基対が図１に示される、約２，９００〜３，１００塩基対のｃＤＮＡのヌクレオチド配列であって、
【００３３】
・そのアミノ末端が、アミノ酸の下記の系列：ＡＬＤＩＶＭＶＡＡＥＶＡＰＧＧＫＴＧＧＬＧＤＶ、またはＡＬＤＩＶＭＶＡＡＥＶＡＰＷＳＫＴＧＧＬＧＤＶに相当し、そのカルボキシル末端が、図１に示されるアミノ酸の系列に相当する、約６４０〜６８０アミノ酸、特に約６６０アミノ酸からなるクラミドモナス・ラインハルティイChlamydomonas reinhardtiiのＧＢＳＳＩをコードしており、
【００３４】
・クラミドモナス・ラインハルティイの細胞から調製されたｃＤＮＡライブラリーを、クラミドモナス・ラインハルティイの上記の細胞から抽出したデンプンでウサギを免疫化することによって得られた抗血清を用いて、スクリーニングすることによって得られるヌクレオチド配列、または
【００３５】
−クラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩのペプチドフラグメントであって、該ＧＢＳＳＩのアミノ末端部分の全体を含み、図１に示されるアミノ酸配列の第２５〜２３８位のうち一つ、もしくは第１１８〜２３８位のうち一つに位置するアミノ酸によってそのカルボキシル末端が画定されているペプチドフラグメントをコードしている、上記ｃＤＮＡのヌクレオチドフラグメント、または
【００３６】
−上記ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、もしくはその上記のヌクレオチド配列フラグメントの遺伝子コードの縮重によって誘導され、上記のクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩ、もしくはその上記のペプチドフラグメントをコードしているヌクレオチド配列、または
【００３７】
−上記のヌクレオチド配列もしくはフラグメントから、特に一つ以上のヌクレオチドの置換、抑制もしくは付加によって誘導され、上記のクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩ、もしくはその上記のペプチドフラグメントから誘導されるペプチド配列をコードし、デンプン顆粒に付着する特性を有するヌクレオチド配列であって、好ましくは、上記のヌクレオチド配列もしくはフラグメントとの約５０％以上、好ましくは約７０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列、または
【００３８】
−上記ヌクレオチド配列もしくはフラグメントの一つと、特に下記に定義するハイブリダイゼーションの厳格な条件下で、ハイブリダイズできるヌクレオチド配列
から選ばれ：
【００３９】
デンプン合成酵素、または上記に定義されたとおりのフラグメント、もしくはそれから誘導されるタンパク質が保有する特性が、デンプン顆粒に付着できることであって、それは、下記の手法：たとえば下記に詳述する方法による、デンプン顆粒からのタンパク質の抽出、および該デンプン合成酵素、または上記に定義されたとおりのフラグメント、もしくはそれから誘導されるタンパク質の存在の、特に下記に詳述する手法によるポリアクリルアミドゲル電気泳動による検出によって測定できることを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなるヌクレオチド配列にも関する。
【００４０】
本発明は、より詳しくは、デンプン合成酵素、または誘導されるタンパク質をコードしている上記のヌクレオチド配列が、より詳しくは、
【００４１】
−別途与えられる配列表の配列番号１に相当する、クラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩをコードしている、図２に示されるｃＤＮＡのヌクレオチド配列、
【００４２】
−図２に示されるヌクレオチド配列である配列番号１の上記に定義されたとおりのいかなるフラグメント、より詳しくは、その５′末端のヌクレオチドが、配列番号１の第１〜１８６位のうち一つに位置するものに相当し、その３′ 末端のヌクレオチドが、配列番号１の第１，４９９〜３，１１７位のうち一つに位置するものに相当するいかなる配列、特に：
【００４３】
・図２に示されるペプチド配列の第１および７０８位に位置するアミノ酸によって画定される、７０８アミノ酸のプレタンパク質（配列番号３）の形態のクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩをコードしている、配列番号１の第１５〜２，１３８位に位置するヌクレオチドによって画定される配列である配列番号２、
【００４４】
・図２に示されるペプチド配列の第５８および７０８位に位置するアミノ酸によって画定される、６５１アミノ酸の成熟タンパク質（配列番号５）の形態のクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩをコードしている、配列番号１の第１８６〜２，１３８位に位置するヌクレオチドによって画定される配列である配列番号４、
【００４５】
・図２に示されるクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩのペプチド配列の第５８および４９５位に位置するアミノ酸によって画定される、４３８アミノ酸のフラグメント（配列番号７）をコードしている、配列番号１の第１８６〜１，４９９位に位置するヌクレオチドによって画定される配列である配列番号６、
【００４６】
・図２に示されるクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩのペプチド配列の第５８および５８８位に位置するアミノ酸によって画定される、５３１アミノ酸のフラグメント（配列番号９）をコードしている、配列番号１の第１８６〜１，７７８位に位置するヌクレオチドによって画定される配列である配列番号８、または
【００４７】
−上記ヌクレオチド配列の遺伝コードの縮重によって誘導され、クラミドモナス・ラインハルティイの上記ＧＢＳＳＩ、もしくはその上記ペプチドフラグメントをコードしているヌクレオチド配列、または
【００４８】
−上記のヌクレオチド配列もしくはフラグメントから、特に一つ以上のヌクレオチドの置換、抑制もしくは付加によって誘導され、クラミドモナス・ラインハルティイの上記ＧＢＳＳＩから誘導されるか、またはその上記ペプチドフラグメントから誘導されるペプチド配列をコードしており、デンプン顆粒に付着する特性を有するヌクレオチド配列であって、好ましくは、上記ヌクレオチド配列もしくはフラグメントとの約５０％以上、好ましくは約７０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列、または
【００４９】
−上記ヌクレオチド配列もしくはフラグメントの一つと、特に上記に定義されたとおりのハイブリダイゼーションの厳格な条件下で、ハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列
から選ばれることを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなるヌクレオチド配列にも関する。
【００５０】
本発明は、より詳しくは、目的のペプチドまたはポリペプチドをコードしている組換えヌクレオチド配列が、生物学的活性であるペプチド、特に治療目的のか、もしくは農業および食品工業に用い得るペプチドをコードしているものから選ばれることを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる組換えヌクレオチド配列にも関する。
【００５１】
本発明は、目的のペプチドまたはポリペプチドをコードしている組換えヌクレオチド配列が、様々な加水分解酵素、ホスホリラーゼ、α−１，４−グルカノトランスフェラーゼ、分枝酵素、アミラーゼ、および特に４０℃を越える温度で活性である古細菌のような好極限性細菌から得られる耐熱性加水分解酵素を包含する、デンプンを形質転換できる酵素、たとえば、α−グルカンと相互作用する酵素コードしているものから選ばれることを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる組換えヌクレオチド配列にも関する。
【００５２】
本発明は、デンプン合成酵素、またはそれから誘導されるタンパク質をコードしているヌクレオチド配列と、目的のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列との間に位置し、切断部位をコードしているヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる組換えヌクレオチド配列にも関する。
【００５３】
例示として、切断部位をコードしているヌクレオチド配列は、酸性のpHで非常に不安定である、アスパルチル−プロリン型のペプチド配列、またはプロテアーゼが特異的に認識する小さいペプチド配列、たとえばトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、コラゲナーゼ、トロンビン、アラズブチリシン、もしくは臭化シアンのような化学的化合物が認識するそれをコードしている配列から選ばれる。
【００５４】
本発明は、デンプン合成酵素、またはそれから誘導されるタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の上流に位置するプロモーターはもとより、目的のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の下流に位置する転写終結シグナルをコードしている配列も含むことを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる組換えヌクレオチド配列にも関する。
【００５５】
本発明の範囲内で用いるのに適する転写プロモーターのうちでは、
−原核生物のプロモーターのためには、LacまたはＴ７プロモーターを、
−高等植物型の真核生物のプロモーターのためには、プロモーター３５ＳCaMV、または植物起源のいかなる種類のプロモーターも列挙することができ、
−微藻類の形質転換の場合は、用い得るプロモーターは、アルギノコハク酸リアーゼをコードしているARG7遺伝子のそれ、または硝酸還元酵素をコードしているNIT1遺伝子のプロモーターである。
【００５６】
本発明は、その複製に不可欠ではない部位に挿入された、上記に定義されたとおりの本発明による組換えヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、いかなる組換えベクター、特にプラスミド、コスミドまたはファージ型のそれにも関する。
【００５７】
本発明は、上記に定義されたとおりの組換えベクターによって形質転換され、本発明による少なくとも一つの組換えヌクレオチド配列を含む、いかなる細胞性宿主、特にアグロバクテリウム・ツメファシエンスAgrobacterium tumefaciensのようないかなる細菌にも関する。
【００５８】
本発明は、
【００５９】
−Ｎ末端位に、植物細胞内のデンプン顆粒の生合成の部位へと移動し、該デンプン顆粒に付着する特性を有する、デンプン合成酵素、または該酵素から、特に一つ以上のアミノ酸の抑制、付加もしくは置換によって誘導されるタンパク質を、また
【００６０】
−Ｃ末端位に、目的のペプチドまたはポリペプチドを
含み、こうして、
該デンプン合成酵素、または誘導されるタンパク質のアミノ酸配列のＣ末端部分が、目的のペプチド配列のＮ末端部分に結合されていて、該融合ポリペプチドが、本発明による上記に定義されたとおりの組換えヌクレオチド配列によってコードされていることを特徴とする、いかなる融合ポリペプチドにも関する。
【００６１】
本発明は、より詳しくは、Ｎ末端位に、特に植物、藻類または微藻類に産するＧＢＳＳ、より詳しくはイソ型ＧＢＳＳＩ、または上記に定義されたとおりのそれから誘導されるタンパク質を含むことを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる融合ポリペプチドにも関する。
【００６２】
本発明は、より詳しくは、デンプン合成酵素が、
【００６３】
−そのアミノ末端が、アミノ酸の下記の系列：ＡＬＤＩＶＭＶＡＡＥＶＡＰＧＧＫＴＧＧＬＧＤＶ、またはＡＬＤＩＶＭＶＡＡＥＶＡＰＷＳＫＴＧＧＬＧＤＶに相当し、そのカルボキシル末端が、図１に示されるアミノ酸の系列に相当する、約６４０〜６８０アミノ酸からなるクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩであって、該ＧＢＳＳＩが、クラミドモナス・ラインハルティイの細胞から調製したｃＤＮＡライブラリーを、クラミドモナス・ラインハルティイの上記の細胞から抽出したデンプンでウサギを免疫化することによって得た抗血清を用いて、スクリーニングすることによって得られる、ヌクレオチド配列によってコードされているＧＢＳＳＩ、または
【００６４】
−クラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩのペプチドフラグメントであって、該ペプチドフラグメントが、該ＧＢＳＳＩのアミノ末端部分全体を含み、そのカルボキシル末端としては、図１に示されるアミノ酸配列の、第２５〜２３８位のうち一つ、または第１１８〜２３８位のうち一つに位置するアミノ酸によって画定されるペプチドフラグメント、または
【００６５】
−上記のペプチド配列またはフラグメントから、特に一つ以上のアミノ酸の置換、抑制もしくは付加によって誘導され、デンプン顆粒に付着する特性を有し、好ましくは、上記のペプチド配列もしくはフラグメントとの約６０％以上、好都合には約８０％以上の相同性を有するペプチド配列
から選ばれ、
【００６６】
クラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩ、またはフラグメント、もしくはそれから誘導される、上記に定義されたとおりのタンパク質が保有する特性が、デンプン顆粒に付着できること、上記の手法によって測定できることであることを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる融合ポリペプチドにも関する。
【００６７】
本発明は、より詳しくは、上記に定義されたとおりのデンプン合成酵素が、より詳しくは、下記のもの、すなわち
【００６８】
−図２の第１〜７０８位に位置するアミノ酸によって画定され、７０８アミノ酸のプレタンパク質の形態のクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩに相当するペプチド配列である配列番号３、
【００６９】
−図２に示されたペプチド配列である配列番号３からの、上記に定義されたとおりのいかなるフラグメント、より詳しくは、そのアミノ末端のアミノ酸が、配列番号３の第１〜５８位のうち一つに位置するものに相当し、そのカルボキシル末端のアミノ酸が、配列番号３の第４９５〜７０８位のうち一つに位置するものに相当するいかなる配列、特に：
【００７０】
・６５１アミノ酸の成熟タンパク質の形態のクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩに相当する、配列番号３の第５８〜７０８位に位置するアミノ酸によって画定される配列である配列番号５、
【００７１】
・図２に示されるクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩのペプチド配列の４３８アミノ酸のフラグメントに相当する、配列番号３の第５８〜４９５位に位置するアミノ酸によって画定される配列である配列番号７
【００７２】
・図２に示されるクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩのペプチド配列の５３１アミノ酸のフラグメントに相当する、配列番号３の第５８〜５８８位に位置するアミノ酸によって画定される配列である配列番号９、または
【００７３】
−上記のペプチド配列もしくはフラグメントから、特に一つ以上のアミノ酸の置換、抑制もしくは付加によって誘導され、デンプン顆粒に付着する特性を有するペプチド配列であって、好ましくは、上記のペプチド配列もしくはフラグメントとの好ましくは約６０％以上、好都合には約８０％以上の相同性を有するペプチド配列
から選ばれ、
【００７４】
クラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩ、またはフラグメント、もしくは上記に定義されたとおりの、それから誘導されるタンパク質が保有する特性が、デンプン顆粒に付着できること、および上記の手法によって測定できることを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる融合ポリペプチドにも関する。
【００７５】
本発明は、より詳しくは、目的のポリペプチドが、生物学的活性であるペプチド、特に治療目的のペプチド、もしくは農業および食品工業に用い得るペプチドをコードしているものから選ばれることを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる融合ポリペプチドにも関する。
【００７６】
本発明は、目的のポリペプチドが、様々な加水分解酵素、ホスホリラーゼ、α−１，４−グルカノトランスフェラーゼ、分枝酵素、アミラーゼ、および特に４０℃を越える温度で活性である古細菌のような好極限性細菌から得られる耐熱性加水分解酵素を包含する、デンプンを形質転換できる酵素、たとえば、α−グルカンと相互作用する酵素から選ばれることを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる融合ポリペプチドにも関する。
【００７７】
本発明は、一方でのデンプン合成酵素、またはそれから誘導されるタンパク質と、他方での目的のポリペプチドとの間に位置する、上記のとおりの切断部位を含むことを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる融合ポリペプチドにも関する。
【００７８】
本発明は、上記のとおりの一つ以上の組換えヌクレオチド配列を、そのゲノムに組み込まれてか、またはその細胞質に安定的な方式で維持されて含む、デンプンを産生できる植物、藻類または微藻類から選ばれ、遺伝的に形質転換された植物細胞にも関する。
【００７９】
本発明は、その細胞内に含まれるデンプン顆粒中に、上記に定義された１種類以上の融合ポリペプチドを含有する、上記に定義されたとおりのトランスジェニック植物細胞にも関する。
【００８０】
本発明は、より詳しくは、そのうちの３′末端の１，６９６塩基対が図１に示される、約２，９００〜３，１００塩基対のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を含む、上記のクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩをコードしているか、または上記のｃＤＮＡからの上記の通りのフラグメント、もしくは誘導された配列を含む、組換えヌクレオチド配列で形質転換された、上記のトランスジェニック植物細胞に関する。
【００８１】
本発明は、はるかに詳しくは、
【００８２】
−クラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩをコードしている、図２に示されるｃＤＮＡヌクレオチド配列、
【００８３】
−図２に示されるヌクレオチド配列の、上記に定義されたとおりのいかなるフラグメント、または
【００８４】
−上記のヌクレオチドはれからの、上記に定義されたとおりの誘導されたヌクレオチド配列、もしくは
【００８５】
−上記のヌクレオチド配列もしくはフラグメントの一つと、特に上記に定義されたハイブリダイゼーションの厳格な条件下で、ハイブリダイズできるヌクレオチド配列
で形質転換された、上記のトランスジェニック植物細胞に関する。
【００８６】
本発明は、上記に定義されたとおりの少なくとも一つの組換えヌクレオチド配列を、それを構成する細胞の、ゲノムに組み込まれてか、または細胞質に安定的な方式で維持されて有する、遺伝的に形質転換された植物、藻類もしくは微藻類、またはこれらの植物、藻類もしくは微藻類の部分、特に花、果実、葉、茎、根、種子、もしくは断片にも関する。
【００８７】
本発明は、上記の通りの一つ以上の融合ポリペプチドを、それを構成する植物細胞に含まれたデンプン顆粒中に有する、遺伝的に形質転換された植物、藻類もしくは微藻類、またはこれらの植物、藻類もしくは微藻類の上記に定義されたとおりの部分もしくは断片にも関する。
【００８８】
本発明の範囲内で形質転換された植物、藻類または微藻類のうちでも、主として、コムギ、トウモロコシ、バレイショ、コメ、オオムギ、アマランス、クラミドモナス属の藻類、特にクラミドモナス・ラインハルティイ、クロレラ属の藻類、特にクロレラ・ブルガリスChlorella vulgaris、またはドゥナリエラ属の単細胞藻類〔論文「Dunaliella: Physiology, Biochemistry, and Biotechnology (1992), Mordhay Avron and Ami Ben-Amotz Publishers, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida、米国」に記載されたとおり〕が列挙され得る。
【００８９】
本発明は、より詳しくは、そのうちの３′末端の１，６９６塩基対が図１に示される、約２，９００〜３，１００塩基対のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を含む、上記のクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩをコードしているか、または上記のｃＤＮＡの上記されたようなフラグメント、もしくは誘導された配列を含む、組換えヌクレオチド配列で形質転換された、上記のトランスジェニックな植物、藻類もしくは微藻類に関する。
【００９０】
本発明は、はるかに詳しくは、
【００９１】
−クラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩをコードしている、図２に示されるｃＤＮＡヌクレオチド配列、
【００９２】
−図２に示されるヌクレオチド配列の、上記に定義されたとおりのいかなるフラグメント、または
【００９３】
−上記のヌクレオチド配列の、上記に定義されたとおりの誘導されたヌクレオチド配列、または
【００９４】
−上記のヌクレオチド配列もしくはフラグメントの一つと、特に上記に定義されたハイブリダイゼーションの厳格な条件下で、ハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列
で形質転換された、上記のトランスジェニックな植物、藻類もしくは微藻類に関する。
【００９５】
本発明は、上記に定義された一つ以上の融合ポリペプチドを含み、表現「形質転換されたデンプン顆粒」または「グルコソーム」によってさらに示される、デンプン顆粒にも関する。
【００９６】
本発明は、より詳しくは、上記の約６４０〜６８０アミノ酸のクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩを含み、そのアミノ末端が、アミノ酸の下記の系列：ＡＬＤＩＶＭＶＡＡＥＶＡＰＧＧＫＴＧＧＬＧＤＶ、またはＡＬＤＩＶＭＶＡＡＥＶＡＰＷＳＫＴＧＧＬＧＤＶに相当し、そのカルボキシル末端が、図１に示されるアミノ酸の系列に相当する、上記に定義された融合ポリペプチド、またはクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩの上記のようなフラグメント、もしくは誘導されるポリペプチドを含む、上記のデンプン顆粒に関する。
【００９７】
本発明は、より詳しくは、図２の第１〜７０８位に位置するアミノ酸によって画定され、７０８アミノ酸のプレタンパク質の形態のクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩをコードしている配列を有する、上記に定義された融合ポリペプチド、または図２に示されるペプチド配列の上記に定義されたとおりのいかなるフラグメント、特にアミノ末端のアミノ酸が、図２の第１〜５８位のうちの一つに位置するものに相当し、カルボキシル末端のアミノ酸が、図２の第４９５〜７０８位のうちの一つに位置するものに相当するいかなる配列、たとえば上記のフラグメントも含む、上記のデンプン顆粒に関する。
【００９８】
好都合には、上記のデンプン顆粒は、約０．１μm〜数１０μmの直径を有し、これらの顆粒中の融合ポリペプチドの重量割合が、約０．１〜１％であることを特徴とする。
【００９９】
本発明は、必要ならば、生理学的に許容され得る担体と組み合わせて、上記に定義されたとおりの形質転換されたデンプン顆粒を含有し、該顆粒が、上記に定義されたとおりの１種類以上の融合ポリペプチドを含み、該融合ポリペプチド中の目的のペプチドが、定義された治療効果を保有することを特徴とするいかなる医薬組成物にも関する。
【０１００】
好都合には、本発明の上記の医薬組成物は、非経口的に、特に静脈内に投与できる形態をなすか、または経口的に投与できる形態をなす。
【０１０１】
好ましくは、非経口的に投与できる上記の医薬組成物は、デンプン顆粒の直径が、約０．１〜数１０μm、特に約０．１〜１０μmであり、これらの顆粒中の融合ポリペプチドの重量割合が、約０．１〜１％であることを特徴とする。
【０１０２】
融合ポリペプチドの重量割合が約０．１〜１％である、約０．１〜約１０μmの小さい直径を有する上記の通りのデンプン顆粒は、好都合には、
【０１０３】
−本発明の範囲内で形質転換され、上記のデンプン顆粒を天然に産生する特性について選別された、特にコメおよびアマランスから選ばれる植物、もしくは植物の細胞、または
【０１０４】
−本発明の範囲内で形質転換された植物の、上記のデンプン顆粒を天然に産生する部分、たとえば植物の葉、または
【０１０５】
−本発明の範囲内で形質転換され、上記のとおりの小さい直径のデンプン顆粒を産生するような突然変異を有する植物、特にBuleon, A. et al., 1998に記載された突然変異植物から選別された植物、もしくは植物の細胞、または
【０１０６】
−本発明の範囲内で形質転換され、植物細胞でのＡＤＰ−グルコースの合成に必要とされるＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼをコードしている遺伝子の全部もしくは一部のアンチセンスヌクレオチド配列を援用して形質転換された植物から、特にMueller-Roeber, B. et al., 1992による論文に記載された形質転換植物から選ばれた植物、もしくは植物の細胞
から得られる。
【０１０７】
好都合には、非経口的に投与することができる、上記の医薬組成物の場合、デンプン顆粒は、好ましくは、それが患者の血中で含有する融合ポリペプチドの急速な放出を得ようと望む場合は、無定形構造のものから選ぶか、逆に融合ポリペプチドを血中に漸進的に放出しようと望む場合は、結晶質構造のものから選ぶ。
【０１０８】
例示するならば、無定形デンプン顆粒は、発芽期に本発明に従って形質転換された種子からか、またはShannon, J. & Garwood, D., 1984に記載されたような特定の突然変異植物から、特にトウモロコシの「アミロース増量体」のような突然変異栽培品種、または実際は、そのデンプンがアミロースに富むようにした植物、藻類もしくは微藻類のすべての突然変異栽培品種から得ることができる。
【０１０９】
本発明による結晶質構造のデンプン顆粒は、好都合には、約３０〜３５％の結晶を有し、成熟に際して収穫したばかりの穀類か、もしくはShannon, J. & Garwood, D., 1984に記載されたような突然変異植物から、特にトウモロコシの「ワキシー」のような突然変異栽培品種、または実際には、そのデンプンがアミロースを欠く植物、藻類もしくは微藻類のすべての突然変異栽培品種から得ることができる。
【０１１０】
本発明は、必要ならば、生理学的に許容され得る担体と組み合わせて、１種類以上の上記に定義されたとおりの融合ポリペプチドを含むことを特徴とし、該融合ポリペプチド中の目的のペプチドが、定義された治療効果を保有する。
【０１１１】
本発明は、上記に定義されたとおりの形質転換されたデンプン顆粒を含有し、該顆粒が、上記に定義されたとおりの１種類以上の融合ポリペプチドを含有し、該融合ポリペプチド中の目的のペプチドが、食品加工の分野で使用可能であることを特徴とする、上記のいかなる食品組成物にも関する。
【０１１２】
本発明は、上記に定義されたとおりの１種類以上の融合ポリペプチド中を含有し、該融合ポリペプチド中の目的のペプチドが、食品加工分野で使用可能であることを特徴とする、上記の通りのいかなる食品組成物にも関する。
【０１１３】
本発明は、植物細胞を（植物、藻類および微藻類から）、かつ必要ならば、上記に定義されたとおりの少なくとも１種類のヌクレオチドによって形質転換された、全植物、藻類または微藻類から得る方法であって、
【０１１４】
−植物細胞を、本発明による一つもしくはそれ以上の組換えヌクレオチド配列を、これらの細胞のゲノムに組み込むか、またはその細胞質中に安定的な方式で維持するようにして形質転換し、これらの形質転換された細胞をin vitroで栽培すること、
【０１１５】
必要ならば、上記の形質転換された細胞から、形質転換された植物を生産すること
を含むことを特徴とするいかなる方法にも関する。
【０１１６】
本発明の上記の方法の一実施態様によれば、植物細胞の形質転換は、葉緑体中の本発明の組換えヌクレオチド配列の、特にKrens et al., 1982による論文に記載された方法による２価の陽イオン（Ｃａ2+）の存在下で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の溶液中で温置した後の、転移によって実施することができる。
【０１１７】
植物細胞の形質転換は、特にFromm et al., 1986による論文に記載された方法による、電気穿孔によっても実施することができる。
【０１１８】
植物細胞の形質転換は、遺伝子銃を用い、本発明による組換えヌクレオチド配列で被覆した金属粒子を、それによって高速度で推進し、こうして遺伝子を、特にSanford, 1988による論文に記載された手法に従って細胞核の内部に送達しても、実施することができる。
【０１１９】
植物細胞の形質転換のもう一つの方法は、De La Penna et al., 1987による論文に記載されたとおり、細胞質または核の微量注入の方法である。
【０１２０】
本発明の上記の方法の特に好適な実施態様によれば、植物細胞を、上記のとおり、本発明によるベクターで形質転換した細胞性宿主の存在下に置き、該細胞性宿主が、該植物細胞に感染して、上記ベクターのゲノム中に当初含まれた、本発明の組換えヌクレオチド配列を、そのゲノムに組み込むか、またはその細胞質中に安定的な方式で維持できることによって形質転換する。
【０１２１】
好都合には、用いられる上記の細胞性宿主は、特にBevan, 1984およびAn et al., 1986の論文に記載された方法による、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）であるか、または特にJouanin et al., 1987による論文に記載された方法による、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）である。
【０１２２】
本発明の範囲内で形質転換することができる植物細胞のうちでも、主として、コムギ、トウモロコシ、バレイショ、コメ、オオムギ、アマランス、クラミドモナス・ラインハルティイ、クロレラ・ブルガリスを列挙し得る。
【０１２３】
本発明の上記の方法の一実施態様によれば、本発明に従って形質転換された植物細胞は、特にBrodelius, 1988による論文に記載された方法によるバイオリアクター内で、液体媒体中でか、またはBrodelius et al., 1979による論文に記載された方法に従って、固定化された形態でか、またはDeno et al., 1987による論文に記載された方法に従って、in vitroで形質転換された根の培養によって、in vitroで栽培する。
【０１２４】
本発明の上記の方法の好適実施態様によれば、植物細胞の形質転換の後、該形質転換された細胞を適する培地中で培養し、必要ならば、先行する段階で得た植物を受精させ、種子を回収、これらの種子を栽培して、次世代の植物を得ることによって、形質転換された植物を得る段階を実施する。
【０１２５】
本発明に従って形質転換された種子は、上記の形質転換された植物から収穫されるが、これらの植物は、Ｔ０世代のもの、すなわち、適する培地上での本発明の形質転換された細胞の培養から得られるもの、または好都合には先行世代の植物の自家受精によって得られ、本発明の組換えヌクレオチド配列が、メンデルの法則、もしくは染色体外遺伝の法則に従って複製された、次世代（Ｔ１、Ｔ２等々）のもののいずれかである。
【０１２６】
本発明は、上記のとおり形質転換されたデンプン顆粒を製造する方法であって、形質転換された植物細胞もしくは植物、またはその部分、特に花、果実、葉、茎、根、もしくは上記のとおり形質転換されたこれらの植物の断片からの、デンプン顆粒の、特に後述する条件での沈降による、抽出の段階を含むことを特徴とする方法にも関する。
【０１２７】
好ましくは、本発明によるデンプン顆粒は、上記の形質転換された植物、藻類もしくは微藻類からか、またはこれらの植物、藻類もしくは微藻類の、上記に定義されたとおりの部分もしくは断片からの、特に以下に記載する条件での沈降による抽出によって得たものである。
【０１２８】
デンプン顆粒を回収するのに用いられる形質転換された植物は、Ｔ０世代のもの、または好都合には上記の次世代（Ｔ１、Ｔ２等々）のものである。
【０１２９】
本発明は、上記に定義されたとおりの融合ポリペプチドを製造する方法であって、上記の形質転換されたデンプン顆粒からの融合ポリペプチドを、特に後述する条件で回収し、必要ならば精製する段階を含むことを特徴とする方法にも関する。
【０１３０】
本発明は、目的のペプチドを製造する方法であって、上記のとおりの切断部位を有する融合ポリペプチドをコードしている上記ヌクレオチド配列で植物細胞を形質転換することによって実施される、本発明による植物の細胞、または形質転換された植物を得るための、上記のとおりの方法を実施する段階を含み、該融合ポリペプチドを、適切な試薬を用いて切断し、次いで必要ならば、目的のポリペプチドを精製する段階をさらに含むことを特徴とする方法にも関する。
【０１３１】
本発明は、デンプン顆粒の生体形質転換の方法であって、
【０１３２】
−上記のとおりのデンプンを形質転換できる酵素をコードしている、１種類以上のヌクレオチド配列を含む上記の宿主細胞を援用して、上記に定義されたとおり植物細胞を形質転換し、
【０１３３】
−そのゲノムが上記の１種類以上のヌクレオチド配列を含むようにして、上記の形質転換された植物細胞のin vitroでの培養によって、形質転換された植物、藻類または微藻類を生産し、
【０１３４】
−必要ならば、先行する段階で得た植物を受精させ、その種子を回収し、これらの種子を培養して、次世代の植物を入手し、
【０１３５】
−上記の形質転換された植物、藻類もしくは微藻類、またはその部分、特に花、果実、葉、茎、根、もしくはこれらの植物、藻類もしくは微藻類の断片から、特に後述する条件での沈降によって、デンプン顆粒を抽出し、
【０１３６】
−必要ならば、該デンプン顆粒を、上記の融合ポリペプチドの目的のペプチドが活性であることができる温度まで加熱する
段階を含むことを特徴とする方法にも関する。
【０１３７】
好ましくは、上記の方法を、植物細胞の形質転換によって実施するときは、これらを、約２，９００〜３，１００塩基対のｃＤＮＡヌクレオチド配列を含み、そのうちの３′末端の１，６９６塩基対が図１に示される、上記のクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩをコードしている上記の組換え配列、より詳しくは、図２に示されるヌクレオチド配列、または図２に示されるヌクレオチド配列の上記のとおりのフラグメント、もしくは誘導された配列を含む、上記の組換え配列で形質転換する。
【０１３８】
本発明は、与えられた植物、藻類または微藻類に結合したデンプン合成酵素を特異的に認識する抗体を、該植物、藻類または微藻類から得られたデンプンによる、動物、特にウサギの免疫化によって製造する方法にも関する。
【０１３９】
従って、本発明は、より詳しくは、与えられた植物、藻類または微藻類の、ＧＢＳＳＩを特異的に認識する抗体を、該植物、藻類または微藻類から得られたデンプンによる、動物、特にウサギの免疫化によって製造する方法に関する。
【０１４０】
本発明は、より詳しくは、与えられた植物、藻類または微藻類からのＧＢＳＳＩ以外のＧＢＳＳのイソ型を特異的に認識する抗体を、ＧＢＳＳＩの発現が抑制されるような突然変異、たとえば、下記：すなわちクラミドモナス・ラインハルティイにおけるsta2-29::ARG7〔上記のDelrue et al., 1992が記載〕、バレイショにおけるamf〔上記のHovenkamp-Hermelink et al., 1987が記載〕、トウモロコシ、コメおよびコムギにおけるwx〔上記のTsai, 1974が記載〕、エンドウマメにおけるtam〔上記のDenyer et al., 1995が記載〕から選ばれる突然変異を有する、該植物、藻類または微藻類から得られたデンプンによる、動物、特にウサギの免疫化によって製造する方法にも関する。
【０１４１】
本発明は、デンプン合成酵素、たとえばＧＢＳＳ、より詳しくはイソ型のＧＢＳＳＩを、与えられた植物、藻類または微藻類から、この酵素を含有できる該与えられた植物、藻類または微藻類の細胞から調製したｃＤＮＡライブラリーを、該ライブラリーからの１種類以上のｃＤＮＡがコードしている該酵素を、該酵素が適切なクローニングベクターによって発現されたときに特異的に認識する抗体を含有する、上記の方法に従って得られる抗血清を用いて、スクリーニングすることによって得る方法にも関する。
【０１４２】
本発明は、下記のもの、すなわち
【０１４３】
−別途与えられる配列表中の配列番号１に相当する、クラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩをコードしている、図２に示されるｃＤＮＡヌクレオチド配列、
【０１４４】
−図２に示されるヌクレオチド配列である配列番号１の上記に定義されたとおりのいかなるフラグメント、より詳しくは、その５′末端のヌクレオチドが、配列番号１の第１〜１８６位のうち一つに位置するものに相当し、その３′末端のヌクレオチドが、配列番号１の第１，４９９〜３，１１７位のうち一つに位置するものに相当するいかなる配列、特に
【０１４５】
・図２に示されるペプチド配列の第１および７０８位に位置するアミノ酸によって画定される、７０８アミノ酸のプレタンパク質（配列番号３）の形態のクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩをコードしている、配列番号１の第１５〜２，１３８位に位置するヌクレオチドによって画定される配列である配列番号２、
【０１４６】
・図２に示されるペプチド配列の第５８および７０８位に位置するアミノ酸によって画定される、６５１アミノ酸の成熟タンパク質（配列番号５）の形態のクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩをコードしている、配列番号１の第１８６〜２，１３８位に位置するヌクレオチドによって画定される配列である配列番号４、
【０１４７】
・図２に示されるクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩのペプチド配列の第５８および４９５位に位置するアミノ酸によって画定される、４３８アミノ酸のフラグメント（配列番号７）をコードしている、配列番号１の第１８６〜１，４９９位に位置するヌクレオチドによって画定される配列である配列番号６、
【０１４８】
・図２に示されるクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩのペプチド配列の第５８および５８８位に位置するアミノ酸によって画定される、５３１アミノ酸のフラグメント（配列番号９）をコードしている、配列番号１の第１８６〜１，７７８位に位置するヌクレオチドによって画定される配列である配列番号８、または
【０１４９】
−上記ヌクレオチド配列の遺伝コードの縮重によって誘導され、クラミドモナス・ラインハルティイの上記ＧＢＳＳＩ、もしくはその上記ペプチドフラグメントをコードしているヌクレオチド配列、または
【０１５０】
−上記のヌクレオチド配列もしくはフラグメントから、特に一つ以上のヌクレオチドの置換、抑制もしくは付加によって誘導され、クラミドモナス・ラインハルティイの上記ＧＢＳＳＩから誘導されるか、またはその上記ペプチドフラグメントから誘導されるペプチド配列をコードしており、デンプン顆粒に付着する特性を有するヌクレオチド配列であって、好ましくは、上記ヌクレオチド配列もしくはフラグメントとの約５０％以上、好ましくは約７０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列、または
【０１５１】
−上記ヌクレオチド配列もしくはフラグメントの一つと、特に上記に定義されたとおりのハイブリダイゼーションの厳格な条件下で、ハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列
から選ばれる、デンプン合成酵素、または誘導されたタンパク質をコードしているヌクレオチド配列にも関する。
【０１５２】
本発明は、下記のもの、すなわち
【０１５３】
−図２の第１〜７０８位に位置するアミノ酸によって画定され、７０８アミノ酸のプレタンパク質の形態のクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩに相当するペプチド配列である配列番号３、
【０１５４】
−図２に示されるペプチド配列である配列番号３の上記に定義されたとおりのいかなるフラグメント、より詳しくは、そのアミノ末端のアミノ酸が、配列番号３の第１〜５８位のうち一つに位置するものに相当し、そのカルボキシル末端のアミノ酸が、配列番号３の第４９５〜７０８位のうち一つに位置するものに相当するいかなる配列、特に：
【０１５５】
・６５１アミノ酸の成熟タンパク質の形態のクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩに相当する、配列番号３の第５８〜７０８位に位置するアミノ酸によって画定される配列である配列番号５、
【０１５６】
・図２に示されるクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩのペプチド配列の４３８アミノ酸のフラグメントに相当する、配列番号３の第５８〜４９５位に位置するアミノ酸によって画定される配列である配列番号７
【０１５７】
・図２に示されるクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩのペプチド配列の５３１アミノ酸のフラグメントに相当する、配列番号３の第５８〜５８８位に位置するアミノ酸によって画定される配列である配列番号９、または
【０１５８】
−上記の配列もしくはペプチドフラグメントから、特に一つ以上のアミノ酸の置換、抑制もしくは付加によって誘導され、デンプン顆粒に付着する特性を有するペプチド配列であって、好ましくは、上記のペプチド配列もしくはフラグメントとの好ましくは約６０％以上、好都合には約８０％以上の相同性を有するペプチド配列
から選ばれ、
【０１５９】
クラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩ、またはフラグメント、もしくは上記に定義されたとおりの、それから誘導されるタンパク質が保有する特性が、デンプン顆粒に付着できること、および上記の方法によって測定できることであるポリペプチドにも関する。
【０１６０】
本発明は、上記ポリペプチドに対して導かれた、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体にも関する。
【０１６１】
本発明を、クラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩをコードしている遺伝子のクローニング、および該ＧＢＳＳＩとの融合ポリペプチドを含む形質転換されたデンプン顆粒の入手の下記の詳細な説明によって、またクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩをコードしている、ＣＤ１４２クローンのｃＤＮＡ挿入断片から推測されるヌクレオチド配列およびタンパク質配列（下線を施した配列は、すべてのデンプンおよびグリコーゲン合成にわたって高度に保存された３領域のうちの一つに相当し、おそらく、ＡＤＰ−グルコースという基質の固定に関与する）を示す図１によって、さらに例示することにする。
【０１６２】
（Ｉ）クラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩの構造遺伝子に相当する、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）およびｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）のクローニング
（Ａ）ｃＤＮＡのクローニング
クラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩの構造遺伝子に相当するｃＤＮＡをクローニングするために開発された戦略は、ポリクローナル抗血清を用いた、発現ライブラリーのスクリーニングを利用する。抗血清は、適当なクローニングベクターから発現されるｃＤＮＡがコードしている、ポリペプチド配列を認識することができる。
【０１６３】
（ａ）抗血清の製造
ＧＢＳＳＩまたはクラミドモナス・ラインハルティイを特異的に認識することができる抗血清を製造するために野生型株（１３７Ｃ）から得たデンプンを、アルビノNew Zealand系雑種のウサギに３回にわたって注射した。同様の実験で、STA2およびSTA3の遺伝子座での二重突然変異株（ＩＪ２）からの残余のデンプンを、同じ条件でウサギに注射した。
【０１６４】
詳細なプロトコル
−クラミドモナス・ラインハルティイの株の遺伝子型：
１３７Ｃ：mt-nitl nit2
ＩＪ２：mt-nitl nit2 sta2-29::ARG7 sta3-1
１３７Ｃ株は、クラミドモナス・ラインハルティイで実施されたデンプン代謝のすべての研究のための参照株である。ＩＪ２株は、1994年にMaddeleinらが完全に記載した。このSTA2およびSTA3の遺伝子座での二重突然変異株では、ＧＢＳＳＩおよびＳＳIIの活性が、同時に不在である。STA2座での突然変異は、pARG7というプラスミド〔Meggelein, et al., 1994〕を用いた遺伝子遮断によって形成し、デンプン顆粒からのＧＢＳＳＩの完全な消滅へと導くのに対して、STA3 遺伝子の突然変異対立遺伝子は、Ｘ線による突然変異形成によって形成した〔Fontaine et al., 1993〕。
【０１６５】
−培養、デンプンの抽出および精製条件
５ｘ１０4細胞／mlからの接種材料からの細胞を、ＴＡＰ培地で３日間、連続的に照明（３，０００ルクス）しつつ培養した。細胞濃度が、約２ｘ１０6細胞／mlに達したとき、主培養を停止した。
【０１６６】
ＴＡＰ培地の組成（培地１リットルに対する値）
【０１６７】
【表１】
0004767420.tif 000002
【０１６８】
ＴＡＰ−Ｎ培地は、同じ組成を有したが、この培地は、塩化アンモニウムの形態で供給される窒素の不在が第一のものとは異なり、これを同じ濃度での塩化ナトリウムで置き換えたが；細胞が、ＴＡＰ培地で培養された細胞のそれの２０倍まで表す量のデンプンを蓄積するのは、これらの条件においてである。この場合、培養は、５ｘ１０5細胞／mlで接種した培養体から出発して、連続光で５日間実施した。
【０１６９】
次いで、細胞を、遠心分離によって２〜４ｘ１０8細胞／mlまで濃縮し（トリス／酢酸緩衝液、pH７．５、５０mM；ＥＤＴＡ１０mM；ＤＴＴ２．５mM）、次いで約７０３kg/cm2（10,000psi）でのフレンチプレスの作用に付した。圧力の解除で得られた抽出物を、４℃、５，０００Gで１５分間遠心分離した。デンプンを含有する堆積物を、水１容に再懸濁させ、Percoll（Pharmacia, Uppsala、スウェーデン国）９容をこれに加えてから、４℃、100,000Gで３０分間遠心分離した。Percollは、遠心分離の間に密度勾配を形成する。高い密度（１．３〜１．５）を有するデンプンは、遠沈管の底に沈澱するが、低密度の脂質その他の細胞砕片は、Percoll勾配の表面に「キャップ」を形成する。次いで、デンプンの沈澱を、脱イオン水で３回洗浄し、次いで、洗浄からの最後の上清をそれから除去した後、４℃で貯蔵した。
【０１７０】
−ウサギの免疫化の条件、抗血清の採取および調製
この実験に用いたウサギは、アルビノNew Zealand系雑種のウサギである。精製したデンプンを水５００μlに懸濁させて、３回の注射を３週間の間隔で連続して実施した。標準フロインドアジュバント５００μlを、この懸濁液に加えた。最後の注射の３週後に、ウサギから血液サンプルを採取した。４℃での凝集の２４時間後の血液の一回の遠心分離によって、血清を調製した。１３７ＣおよびＩＪ２株のデンプンの注射によって生成した抗血清は、下記では、それぞれ、「抗血清ＳＡ１３７Ｃ」および「抗血清ＳＡＩＪ２」という指定によって特定される。
【０１７１】
（ｂ）ｃＤＮＡライブラリーの調製およびスクリーニング
ｃＤＮＡライブラリーは、クラミドモナス・ラインハルティイの野生株から精製したｍＲＮＡから生成した。λＺＡＰ発現ベクターを用いた。
【０１７２】
詳細なプロトコル
−クラミドモナス・ラインハルティイの完全なＲＮＡの調製
この方法は、シロイヌナズナArabidopsis thalianaの葉からＲＮＡを抽出するのに用いた方法の適応である。１〜２ｘ１０6細胞／mlの培養体の細胞を、３，５００G、４℃で１５分間の遠心分離によって収穫した。次いで、細胞を約２００μlの体積を有するアリコートに分割した。この段階で、細胞は、液体窒素中に凍結し、−８０℃で数ヶ月貯蔵することができる。下記の組成の「Ｚ６」緩衝液４００μlを、凍結した細胞２００μlに加えた：
【０１７３】
0004767420.tif 000003
【０１７４】
混合物を、数分間非常にはげしく攪拌し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合物（２５v／２４v／１v）４００μlを加え、混合物を再び数分間はげしく攪拌した。全体を、13,000G、４℃で１０分間遠心分離した。回収し、上清の体積を測定した後、酢酸１／２０容を１Mで、１００％エタノール０．７容とともに加えた。核酸は、この時点で加えて、−２０℃で少なくとも３０分間沈澱させた。13,000G、４℃で１５分間遠心分離した後、ペレットを、３Mの酢酸ナトリウム（pH５．６）４００μlに再懸濁させ、次いで13,000G、４℃で１０分間遠心分離した。次いで、ペレットを、７０％エタノールで２回洗浄し、乾燥し、最後に、ＤＥＰＣで処理した水５０μlに溶解した。核酸の量は、分光光度計で２６０nmで決定した（ＯＤ260＝１は、約４０μg/mlの核酸と等価である）。
【０１７５】
λＺＡＰベクター中でのｃＤＮＡライブラリーの構築
ポリＡのテイルを有するＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）を、Promega（Madison, WI、米国）が市販するキットである「ポリＡ牽引ｍＲＮＡ単離システム」を用いて、総ＲＮＡ調製物から単離した。ｃＤＮＡの合成、λＺＡＰベクター中での結合、およびキャプシド内でのパッケージングは、Stratagene（La Jolla, CA、米国）が市販するキットである「ｃＤＮＡ合成キット、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット、およびＺＡＰ−ｃＤＮＡギガパックIIゴールドクローニングキット」を用いて実施した。従った手順は、該キットとともに供給された指示説明書に対応した。
【０１７６】
発現ベクター中でのｃＤＮＡライブラリーの免疫学的スクリーニング
クラミドモナス・ラインハルティイからのλＺＡＰのｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングは、以前に得られた（上記を参照されたい）抗血清を用いて実施した。約100,000の溶菌プレートを、細菌増殖培地、および適応させた抗生物質を含有する数個のペトリ皿に、Top-寒天の手法によって展開した。３７℃で３時間の温置の後、あらかじめＩＰＴＧ１０mMの溶液に浸積し、乾燥しておいた、ニトロセルロースフィルター（Protan BA85, Schleicher & Schnell, Dassel、ドイツ国）をTop-寒天の表面に貼付した。ペトリ皿を、再び３７℃で３時間温置してから、４℃で３０分間貯蔵した。次いで、ニトロセルロースフィルターを、寒天表面から注意深く除去した。λＺＡＰライブラリーのスクリーニングの際は、大腸菌XL1-blue株を用いた。そうして、フィルター展開のためのプロトコルは、ウエスタンブロット分析に用いたのと同じである（ウエスタンブロット分析を扱うセクションを参照されたい）。
【０１７７】
その陽性の性質を確認かつ精製するために、陽性の溶菌領域を、同じ抗血清による一連のスクリーニングに２回連続して付した。３回のスクリーニングの終了時に、溶菌領域が陽性であると判明したとき、目的の挿入断片を含むプラスミドpBluescript SK+の配列を、λファージからin vivoで切り出した。λＺＡＰファージによるＳＯＬＲ株の同時トランスフェクションに用いたのは、「ExAssistヘルパーファージ」である。このようにして、本発明者らは、ファージミドを入手し、これを、目的のｃＤＮＡを有する二本鎖プラスミドのpBluescript SK+の回復へと導く株XL1-Blue MRF′を感染するのに用いた。
【０１７８】
ＳＡ１３７Ｃ抗血清で実施されたこの種のスクリーニングは、３回のスクリーニングの後に、単一陽性クローンの生成へと導いた。本発明者らは、このクローンを「ＣＤ１４２」と指定した。ＣＤ１４２の挿入断片は、１，６９６bpという大きさを有する（図１で配列を参照されたい）。
【０１７９】
（ｃ）ＣＤ１４２の挿入断片の配列分析
タンパク質配列ライブラリーを、ｃＤＮＡクローンの「ＣＤ１４２」から誘導される配列で調べたとき、高等植物のＧＢＳＳＩで、最高の類似性が得られた。このｃＤＮＡの起源の最初の表示は、高等植物の主要ＧＢＳＳＩに対比される、コーディング配列のカルボキシル末端での、１１９アミノ酸の伸長（約１４kDa）の存在によって補強される。実際、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定された、クラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩの分子量は、植物中の対応するタンパク質のそれより、平均して１０〜１５kDa大きい。１１９アミノ酸の伸長は、ことなる起源のＧＢＳＳＩ間の分子量におけるこの差を説明する可能性がある。これとは別に、コーディング配列のこの伸長は、他の公知の種類のポリペプチド配列とはいかなる類似性も共有しない。
【０１８０】
第７１７位におけるＵＡＡという停止コドンの存在は、９４６bpの非常に長い非コーディング領域の出発の前触れとなる。３′末端位におけるこれらの非コーディング領域は、クラミドモナスの核遺伝子にはしばしば出現するが、特にメッセンジャーを安定化することが意図されていると思われる。
【０１８１】
（Ｂ）ｇＤＮＡのクローニング
ＣＤ１４２クローンに関連するｇＤＮＡを、コスミドにおける索引付きｇＤＮＡライブラリーをスクリーニングした後に単離した〔Zhang et al., 1994〕。ｃ２ＲＢから誘導されたコスミドベクターに構築された、このｇＤＮＡライブラリーを、１２０枚の９６穴微量滴定プレートに収容した。各ウェル（プレートの方向付けを容易にするため、２ウェルを隔てた）は、単一のコスミドを輸送する細菌クローンを含んだ。したがって、ライブラリー全体は、挿入断片の平均した大きさが約３８kbである、11,280のクローンを表す。そのため、クラミドモナス・ラインハルティイの核ゲノムは、統計的には約４倍してここに表される。
【０１８２】
ＣＤ１４２クローンに対応するプローブによるこのライブラリーのスクリーニングは、１８Ｂ１と指定されるゲノムＤＮＡクローンの単離へと導いた。この単一コスミドに存在する挿入断片を、より詳しく解析した。NotIによる制限、次いでＣＤ１４２プローブによるハイブリダイゼーションの後、約９kbのバンドのみが陽性のままであったにすぎず、ＣＤ１４２クローンに相当するすべての情報が、このフラグメントに存在することを示した。ＣＤ１４２クローンに相当するゲノム配列を、下記に提示する。
【０１８３】
詳細なプロトコル：
−スクリーニング用ナイロンフィルターの調製：
ナイロンフィルター（Hybond N, Amersham Buchler, Braunschweig、ドイツ国）を、適切な抗生物質（本事例ではアンピシリン）で強化した富裕細菌増殖培地を含む、ペトリ皿上に注意深く置いた。次いで、ライブラリーに含まれる各大腸菌クローンを、複写装置を用いて、ナイロンフィルターに直接複写し、こうして調製されたペトリ皿を、３７℃で終夜温置した。次いで、フィルターを寒天表面から取り外し、下記の処理に付した：
【０１８４】
（１）変性用溶液（ＮａＯＨ、０．５M；ＮａＣｌ、１．５M）で２分間、
（２）中和溶液（トリス／ＨＣｌ、pH７．０、０．５M；ＮａＣｌ、１．５M）で２分間、
（３）洗浄溶液（緩衝液２ｘＳＳＣ）で２分間。
最後に、フィルターを、乾燥キャビネット内で８０℃で２時間温置した。
【０１８５】
−フィルターの前ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション：
前ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション緩衝液中、４２℃で少なくとも４時間実施した。ハイブリダイゼーションは、32Ｐで標識したヌクレオチドプローブの存在下で、４２℃で終夜実施した。膜を、洗浄溶液中、６０℃で洗浄し、適用したい厳密度まで調整した。洗浄浴の交換の時間および頻度は、厳密度、膜で検出された放射能に応じて変化する。一般的には、浴は、１０分ごとに更新し、洗浄は、低厳密度の洗浄緩衝液で開始し、より高い厳密度の緩衝液で終了する。陽性クローンを検出するために、KodakのX-OMAT ARフィルムを、最後に、−８０℃でフィルターに露光させた。
【０１８６】
溶液および緩衝液の組成：
緩衝液ＳＳＣｘ２０：水８００mlにＮａＣｌ１７５．３gおよびクエン酸ナトリウム８８．２gを溶解する。ＮａＯＨの１０Nの溶液数滴でpHを７．０に調整する。水で１リットルにする。
【０１８７】
ハイブリダイゼーション緩衝液：
ホルムアミド                  ５０％
デンハート溶液                  ｘ５
ＳＤＳ                        ０．５％
リン酸Ｎａ緩衝液、pH７．０    ５０mM
サケ精子のＤＮＡ              １００μg/ml
ウシ血清アルブミン            ０．５％
【０１８８】
デンハート試薬ｘ１００（水中５００mlのための量）：
フィコール４００                      １０g
ポリビニルピロリドン４０（ＰＶ４０）  １０g
ＢＳＡ                                １０g
【０１８９】
１Mでのリン酸緩衝液、pH７．０（緩衝液１００mlのための量）：
Ｎａ2ＨＰＯ4、１M                    ５７．７ml
ＮａＨ2ＰＯ4、１M                    ４２．３ml
【０１９０】
洗浄緩衝液：
低厳密度        ＳＳＣｘ２；ＳＤＳ０．２％
中厳密度        ＳＳＣｘ１；ＳＤＳ０．５％
高厳密度        ＳＳＣｘ０．５；ＳＤＳ０．５％
ＳＳＣｘ０．１；ＳＤＳ０．５％
【０１９１】
−32Ｐによるヌクレオチドプローブの調製および標識化：
ヌクレオチドプローブとして役立てるフラグメントは、一般的には、細菌プラスミドの多重クローニング部位に挿入する。そのため、初めに、適切な制限エンドヌクレアーゼでそれを消化し、次いでプラスミドの残余から目的のフラグメントを、ＴＡＥ緩衝液ｘ１で緩衝化した１％アガロースゲルでの電気泳動によって分離した。次いで、目的のフラグメントに相当するバンドを、ゲルから切り出し、BIO 101 Inc.（La Jolla, CA、米国）が市販するキットの「GENECLEAN IIキット」を用いて、ＤＮＡ抽出を実施した。初めに、アガロースの小片を、６Mのヨウ化ナトリウム溶液に溶解した。溶液が完成したならば、ＤＮＡ分子を、「ガラスミルク」と名付けたシリカマトリックスで捕獲した。ＤＮＡ分子は、ＮａＩというカオトロピックな薬剤の存在下では、シリカビーズに特異的に吸着される。塩、および溶解したアガロースを除去した後、ＤＮＡ分子を、滅菌水の存在下でシリカビーズから溶離させた。
【０１９２】
32Ｐによるヌクレオチドプローブの標識化は、Boehringer（Mannheim、ドイツ国）からの「ランダムプライムＤＮＡ標識化キット」を用いて達成した。その原理は、配列の可能な組合せのすべてを表すヘキサヌクレオチドの混合物を用いた、クレノウＤＮＡポリメラーゼによる延長反応のランダムプライミングである。放射性元素は、〔α−32Ｐ〕−ｄＣＴＰ（３，０００Ci/mmol）から出発して組み込み、その５０μCiを各標識化反応に用いた。最後に、放射能標識化したプローブを、９５℃で４時間変性させた後に、ハイブリダイゼーション溶液に加えた。
【０１９３】
（Ｃ）クラミドモナス・ラインハルティイのSTA2遺伝子座は、ＧＢＳＳＩの構造遺伝子を表す
下記の分析は、クラミドモナス・ラインハルティイのSTA2遺伝子が、ＧＢＳＳＩの構造遺伝子に相当し、ＣＤ１４２クローンが、この遺伝子座から生じるｃＤＮＡを表すことを正式に立証した。実際、BamHIというエンドヌクレアーゼによって消化したゲノムＤＮＡの制限解析は、遺伝子遮断〔Delrue et al., 1992〕によって生成された、STA2遺伝子座での突然変異ＢＡＦＲ１株における制限像の顕著な変化を明らかにした。同じ変化は、Maddeleinらが、ＢＡＦＲ１株をｓｔａ３−１という突然変異株と交雑させることによって生成した、STA2およびSTA3遺伝子座での二重突然変異ＩＪ２株でも観察された。
【０１９４】
さらに、クラミドモナス・スミティイC. Smithiの「ＣＳ９」株と融合させた、ＩＪ２株の減数分裂子孫における、制限像のこの変化は、下記の交雑で追跡することができた。
【０１９５】
【表２】
0004767420.tif 000004
【０１９６】
この交雑の結果得られた３５２の分離体を精製し、増幅し、それらのデンプン蓄積の表現型を解析した。５４の減数分裂組換え体に、制限分析を実施した：遺伝子型がsta2-29::Arg7/+のもの２１、遺伝子型が+/sta3-1のもの１９、および野生型１４であった。遺伝子型がsta2-29::Arg7/+の２１分離体に関しては、BamHIによる消化によって得られ、ＣＤ１４２プローブとハイブリダイズさせたその制限像は、依然として、親株ＩＪ２と同じ変化を有した。このことから、本発明者らは、STA2遺伝子とＣＤ１４２プローブとが、遺伝的に非常に強く関連すると推論する。ＣＤ１４２クローンの性質については、もはやいかなる疑いもなく、それは、ＧＢＳＳＩの構造遺伝子（STA2遺伝子座）を表している。
【０１９７】
詳細なプロトコル
交雑の実施：
反対の性的極性を有する細胞の融合を実施する前に、融合に好都合である状態にそれらを置くことが必要である。そのため、最初に、細胞を配偶子へと分化させてから、直接接触させなければならない。配偶子形成は、クラミドモナス属では、強い光源（５，０００ルクス）の存在下で、細胞を窒素欠乏に付すことによって誘導される。このためには、富裕寒天培地で培養した新鮮な細胞（５日未満の培養）を、ＴＡＰ−Ｎ培地２ml中に懸濁させ、強い光の中に少なくとも１２時間、攪拌なしに放置した。細胞の状態を、光学顕微鏡で検査してから、接触させた。配偶子への分化の後、細胞は、非欠乏培養の場合より小さく、特にはるかに活性に富んだ。それぞれの性的極性の細胞の同等量を、混合した。融合は、常に強い光の中で実施した。接触１時間後に、細胞融合は、既に光学顕微鏡で可視的であった。減数分裂分離体の分析は、細胞融合の産物を富裕培地に４％寒天で沈積させることからなると思われる。こうして得られた皿を、散乱光の中で１５時間温置し、次いで、全暗中に少なくとも１週間貯蔵した。これによって、接合子の成熟、および４％寒天中でのそれらの「被嚢形成」が可能になる。暗中でのこの温置期間の後、皿を、明所に戻し、その後の段階を可及的速やかに実施した。可能な限り最大数の融合しなかった栄養細胞を除去するため、寒天の表面を、剃刀の刃で非常に軽く削り取った。双眼拡大鏡で観察して、約５０の接合子を含む領域を区別し、これらを富裕培地の新鮮な皿に寒天１．５％で移転した。残留栄養細胞の消滅を確実に完了させるため、皿を、クロロホルム蒸気に４５秒〜１分間付した（他の細胞とは対照的に、接合子は、クロロホルム蒸気とのこの程々の時間の接触に耐えられる）。光の存在は、接合子の減数分裂の開始を不可逆的に誘発することになる。その発芽（１．５％寒天を含有する培地の、より高い含水量によって促進される）の際に、接合子は、４個の一倍体の娘細胞（四分子）を放出し、これが、有糸分裂によって増殖し、皿内にコロニーを形成することになる。減数分裂産物の分析は、二通りの方法で実施することができる。第一は、交雑の結果生じる少なくとも２００の分離体の無作為調査からなる。分離体の精製の後、その性質を、異なる選択培地での複写によって調べることができる。
【０１９８】
ゲノムＤＮＡの抽出の手法：
総ＤＮＡの抽出のために採用したプロトコルは、Rochaixら（1991）が記載したものであり、ここに詳細を示す：
【０１９９】
（１）細胞培養体１０mlを、１５ml入りのボトル内で３，５００Gで１０分間、３〜５ｘ１０6細胞／mlまで遠心分離した。
【０２００】
（２）次いで、細胞のペレットを、下記の緩衝液３５０μlに再懸濁させた：
トリス／ＨＣｌ、pH８．０      ２０mM
ＥＤＴＡ                      ５０mM
ＮａＣｌ                    １００mM
【０２０１】
（３）２mg/mlの原液からのプロテイナーゼＫ５０μlを加えた（利用できるならば、プロナーゼを１０mg/mlで用いることができる）。
【０２０２】
（４）２０％のＳＤＳ２５μlを加え、５５℃で２時間温置した。
【０２０３】
（５）ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）２μlを加え、７０℃で１５分間温置した。
【０２０４】
（６）管を氷中で短時間冷却し、酢酸カリウム５Mの溶液５０μlを加えた。
【０２０５】
（７）管を適正に振盪することによって混合し、氷上に少なくとも３０分間放置した（管を冷蔵室内で氷中に放置するならば、この時点で抽出を停止し、翌日再開することができる）。
【０２０６】
（８）１．５ml入りエッペンドルフ管に移し、ミニ遠心機内で（約13,000Gで）１５分間遠心分離した。
【０２０７】
（９）上清を回収して、新たなエッペンドルフ管に移した。
【０２０８】
（１０）上清を、下記の混合物１容で抽出した：
フェノール（ＴＥ：トリス／ＨＣｌ、pH８．０、１０mM、ＥＤＴＡ、１mMで飽和）                      ２５容
クロロホルム            ２４容
イソアミルアルコール      １容
【０２０９】
（１１）抽出後、１００％エタノール１mlを室温にて加えた。抽出が上首尾ならば、沈澱が、「エンジェルヘアー」の形態で出現するのが認められるはずである。この時点から、ＤＮＡ分子が破損しないよう、操作は、注意深く、静かでなければならない。
【０２１０】
（１２）ミニ遠心機内で（約13,000Gで）５分間遠心分離した。
【０２１１】
（１３）ペレットを７０％エタノールで洗浄し、ミニ遠心機内で３分間遠心分離した。
【０２１２】
（１４）（１３）の操作を一回または二回反復して、塩を適正に除去した。
【０２１３】
（１５）ペレットを、３７℃で５分間乾燥し、次いで、ウシ膵臓ＲＮアーゼを１μg/mlで含有するＴＥ５０μlに溶解した。
【０２１４】
分子ハイブリダイゼーションおよびサザンブロット分析：
ＤＮＡ２５μgを、適切な制限エンドヌクレアーゼで完全に消化した。次いで、制限産物を、０．８％アガロースゲル、ＴＢＥｘ１中での電気泳動によって分離した。次いで、ゲルを、脱プリン溶液中で１５分間、変性溶液中で３０分間連続して温置した。次いで、変性したＤＮＡを、ＳＳＣ緩衝液ｘ２０を有する毛細管によって「Porablot NYplus」というナイロン膜（Macherey-Nagel GmbH, Duren、ドイツ国）に移した。移転後、膜を、空気の不在下、８０℃で２時間温置して、ＤＮＡフラグメントをナイロン膜の表面に固着させた。前ハイブリダイゼーションを、ハイブリダイゼーション緩衝液中、４２℃で少なくとも４時間実施した。ハイブリダイゼーションを、あらかじめ調製した標識化されたプローブの存在下、４２℃でまる一晩で達成した。膜を、洗浄に適用すべき厳密度まで調整した、洗浄緩衝液中で６０℃で洗浄した。洗浄浴の交換の時間および頻度は、厳密度、および膜に存在する放射能のレベルに応じて変動する。一般的には、洗浄浴は、１０分ごとに更新し、洗浄は、低厳密度の洗浄緩衝液で開始して、より高い厳密度の緩衝液で終了する。最後に、KodakのX-OMAT ARフィルムを、−８０℃で膜に接触させて、ハイブリダイゼーション領域を明らかにさせた。
【０２１５】
（II）デンプン顆粒とのＧＢＳＳＩの結合の研究
（Ａ）sta2-1突然変異対立遺伝子の分析
クラミドモナス・ラインハルティイのSTA2遺伝子座に発生したすべての突然変異対立遺伝子のうち、一つだけが、７６kDaの野生型単に代えて５８kDaの断端ＧＢＳＳＩの産生へと導く。これが１８Ｂ株のsta2-1対立遺伝子である。Delrueら（1992）は、ポリアクリルアミドゲルから抽出したＧＢＳＳＩの微細配列決定によって、野生株（１３７Ｃ）のタンパク質のアミノ末端ペプチド配列と、突然変異株（１８Ｂ）のそれとが同一であることを立証することができた。
【０２１６】
アミノ末端配列：
＠１３７Ｃ株のＧＢＳＳＩ：  ALDIVMVAAEVAPGGKTGGLGDV
＠１８Ｂ株のＧＢＳＳＩ：    ALDIVMVAAEVAPGGKTGGLGDV
【０２１７】
したがって、sta2-1突然変異対立遺伝子が産生するタンパク質は、カルボキシル末端の位置で断端されており、ＡＤＰ−グルコースについてのＫmは、６倍ほど増大される。しかし、このカルボキシル末端配列の不在は、図１に示されるとおり、顆粒でのタンパク質固定の特性を変化させない。
【０２１８】
詳細なプロトコル
デンプン顆粒からのタンパク質の抽出およびＳＤＳ−ＰＡＧＥの手法：
デンプン０．３〜１mgから、タンパク質を、抽出緩衝液６０μl；β−メルカプトエタノール５体積％；ＳＤＳ２体積％により１００℃で５分間抽出した。13,000Gで１０分間の遠心分離の後、上清を回収し、ペレットについて操作を１回反復した。二つの上清を併せ、サンプルを、１０μlの下記の装荷緩衝液：トリス５０mM、グリシン３８４mM、２０％グリセリン、ＳＤＳ０．１％、ブロモフェノールブルー０．００１％を再び加えた後、ゲルのウェルに装荷することができる。移動を、室温で、１５０Vで１．５時間（ブロモフェノールブルーがゲルを離れるまで）実施した。タンパク質は、クーマシーブルーによる染色、または免疫検出（下記のウエスタンブロット分析に関するセクションを参照されたい）によって顕示した。クーマシーブルーによる染色の際は、ゲルを、下記の溶液中で３０分間温置した：２gのクーマシーブリリアントブルーＲ２５０、０．５gのクーマシーブリリアントブルーＧ２５０、エタノール４２５ml、酢酸１００ml、１，０００mlに充分な水。次いで、ゲルを、下記の溶液を用いて、脱色した：
【０２１９】
・脱色機Ｉに１５〜３０分：エタノール４５０ml、酢酸５０ml、水で１，０００mlにする。
【０２２０】
・脱色機IIに一晩：酢酸８０ml、メタノール５０ml、水で１，０００mlにする；この脱色機IIは、ゲルの非特異的な着色を除去する。
【０２２１】
・脱色機III（酢酸２４０ml、メタノール２００ml、水で１，０００mlにする）は、必要ならば、ゲルの完全な脱色を許す。
【０２２２】
（Ｂ）顆粒に結合したタンパク質の量の決定
デンプン顆粒に結合したタンパク質の量を、異なる培養条件で、様々な遺伝子ライブラリー内で決定した。そのためには、細胞を、デンプンの大量蓄積の条件（窒素欠乏培地）、または混合栄養増殖の条件（窒素の存在）に置いた。次いで、顆粒から抽出したタンパク質を、変性条件（ＳＤＳの存在）下でポリアクリルアミドゲルに沈積させた。移動の後、タンパク質を、クーマシーブルーで染色することによって顕示させた。この実験の際は、STA1遺伝子座での突然変異株である、Ｉ７株を用いた。この突然変異は、Van den Koornhuyseら（1996）によって、その後Van de Walら（1998）によって詳しく記載された。STA1遺伝子座は、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼの大調節サブユニットの構造遺伝子に相当する。Ｘ線突然変異形成の際に生成される、sta1-1突然変異は、３−ホスホグリセリン酸、すなわちそのアロステリックな活性剤に対するこの酵素の不感受性へと導いた。その結果、Ｉ７株は、デンプンの正常量の５％未満を蓄積した。顆粒に結合したＧＢＳＳＩの量の推定は、１３７Ｃおよび１８Ｂ株に対する窒素欠乏の条件下での、デンプンの重量の約０．１％であった。この値は、混合栄養の条件下では１％に達した。Ｉ７株の場合、培養条件にかかわらず、ＧＢＳＳＩは、デンプン顆粒の重量の１％より多くを占めた。この分析に用いた手法は、先行段落に記載したものと同じであった。
【０２２３】
（Ｃ）ウエスタンブロット分析での免疫応答の分析
ウサギであらかじめ得られたＳＡ１３７ＣおよびＳＡＩＪ２抗血清の抗原性を試験するため、様々な培養条件下で培養した異なる株から得られた、新鮮なデンプン１００μgから抽出したタンパク質を、免疫移転の手法（ウエスタンブロット分析）による分析に付した。野生株（１３７Ｃ）からのデンプンの注入の際に、ＧＢＳＳＩに関して生成された免疫応答は、sta2-1突然変異株での断端タンパク質の場合でさえ、非常に特異的かつ強力であることが判明した（タンパク質は、わずか１００μgの新鮮なデンプンから抽出されている）。デンプン顆粒に結合したタンパク質の量は、ＳＡ１３７Ｃ抗血清によって示されたＧＢＳＳＩより多い、大量バンドの存在が示すとおり、窒素欠乏培養の際のＩ７突然変異株では、より多いものと思われた。このことは、ＳＡＩＪ２抗血清で実施したウエスタンブロット分析によって確認され、窒素欠乏で培養されたＩ７株のデンプンから抽出されたタンパク質により、最強の免疫応答が検出された。
【０２２４】
対照の目的で、本発明者らは、Abelら（1995）によって得られたＰＡ５５という抗血清を用いて、同じ形式の実験を実施した。ウサギで産生されたこの抗血清は、その共通配列が、高等植物の、可溶性であれ、デンプン顆粒に結合してであれ、すべてのデンプン合成において強く保存されたカルボキシル末端の領域に相当する、ペプチドに対して導いたものである。この抗血清は、顆粒に存在するときの、クラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩを特異的に認識する。さらに、ＰＡ５５抗血清は、１８Ｂという突然変異株（sta2-1）が産生する断端タンパク質も認識する。したがって、カルボキシル末端の位置で高度に保存された配列は、断端タンパク質に依然として存在すると思われる。
【０２２５】
詳細なプロトコル
デンプン顆粒からのタンパク質の抽出およびＳＤＳ−ＰＡＧＥの手法：
これらの手法は、クーマシーブルーによる染色（本事例では省かれている）は別として、先行セクションに記載されたのと同じである。
【０２２６】
移転、および抗血清による検出の手法：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での移動が終了したとき、ゲルを、メタノールを２０％含有する「ウエスタン」緩衝液ｘ１中で３０分間温置した。次いで、タンパク質を、電気移転装置（Multiphor II, LKB-Pharmacia, Bromma、スウェーデン国）を用い、下記の条件下、すなわち前に用いた緩衝液により２５０mAで４５分間で、４℃でニトロセルロース膜（Protan BA 85, Schleicher & Schuell, Dassel、ドイツ国）に電気移転した。ニトロセルロース膜へのタンパク質の移転のこの段階の後、膜を、３％のＢＳＡを含有するＴＢＳＴ緩衝液中、室温で１時間温置した。次いで、膜を、ＴＢＳＴ緩衝液中で３回洗浄してから、ＴＢＳ緩衝液で希釈した、ウサギの一次抗血清中、４℃で終夜温置した。膜を、再び、ＴＢＳＴ緩衝液で３回洗浄し、次いで、ウサギ抗血清に対して導かれた、ＴＢＳ中に１／５００に希釈したビオチニル化された二次抗体とともに、室温で１時間温置した。ＴＢＳＴ緩衝液でさらに３回洗浄した後、膜を、ＴＢＳ緩衝液中１／３，０００の希釈でのストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ複合体とともに、室温で３０分間温置した。最後に、ＴＢＳＴ緩衝液中で３回の洗浄の後、膜を、アルカリ性ホスファターゼの基質：すなわちＮＢＴおよびＢＣＩＰを含有するジエタノールアミン緩衝液中での温置によって顕色した（温置時間は、反応の強さに応じて変化した）。用いた検出キットは、Amersham Buchler（Braunschweig、ドイツ国）が提供したもの：すなわち「ウサギ抗体用ブロット検出キット」であった。
【０２２７】
0004767420.tif 000005
【０２２８】
（III）デンプン顆粒中の融合タンパク質のターゲッティング
クラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩの特異的なカルボキシル末端の伸長は、前の実験で本発明者らが立証できたとおり、デンプン顆粒へのタンパク質のin vivoでのターゲッティングには必要とされない。約１６kDaの伸長は、目的のペプチド配列と置き換えることができ、こうして、それがデンプン顆粒のまさに核心を標的とするのを可能にする。
【０２２９】
この方法を高等植物に適用するために構築できる、様々な種類のベクターは、下記のものからなった：
【０２３０】
−プラスミドを適当な細菌株内で増幅できるための、細菌セレクター遺伝子、および細菌の複製起点、
【０２３１】
−形質転換体の植物の容易な選別を許すと思われるセレクター遺伝子、
【０２３２】
−ＧＢＳＳＩのコーディング配列と目的のポリペプチド配列との間の翻訳上の融合。二つの主要な種類の翻訳融合を考慮することができ：第一の場合は、目的の配列と融合したＧＢＳＳＩからの５８kDaの断端配列であり、第二の場合は、ＧＢＳＳＩの完全な配列を用いる。
【０２３３】
−融合は、強力な構成的植物プロモーター、または誘導できる植物プロモーター、次いで直ちに、葉緑体への融合タンパク質の輸送を促進する、適切な通過ペプチドの制御下に置くことができる。
【０２３４】
（IV）顆粒結合デンプン合成酵素の活性を決定するためのプロトコル
下記の反応混合物１００μlにデンプン２０μgを加える：
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【０２３５】
反応は、３０℃で１５分間実施し、次いで、７０％エタノール３mlの添加によって停止した。得られた沈澱を、「ワットマンガラス繊維」フィルター（Whatman, Maidstone、英国）によって減圧下で濾過し、７０％エタノール４ｘ５mlで洗浄した。フィルターを、シンチレーション液３．５mlを含むカウント用バイアルに入れた後、ベックマンカウンターを用いて、放射能をカウントした。
【０２３６】
（Ｖ）デンプンの抽出および精製の方法は、下記のとおり：
−クラミドモナス・ラインハルティイのような単細胞緑藻類の場合（上記の方法を参照されたい）
【０２３７】
−高等植物の種子、塊茎その他のあらゆる器官の場合：
植物から採取した器官または形式を、（摩砕後に）適正に均質化した。こうして得られた微粉化した材料を、（Miracloth： Calbiochem, La Jolla, CA、米国のような）フィルター布越しに水洗した。次いで、濾液を、２時間立て掛けておき、デンプン顆粒を沈澱させた。沈澱を、初めに、水数容で、次いで０．１MのＮａＣｌ溶液数容で洗浄した。沈澱をもう一度濾過し、次いで、エタノールで２回洗浄してから、乾燥した。
【０２３８】
【表３】
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【０２３９】
【表４】
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【０２４０】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  クラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩのカルボキシル末端をコードしているｃＤＮＡを示す図である。
【図２】  クラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩをコードしているｃＤＮＡ、およびクラミドモナス・ラインハルティイのＧＢＳＳＩのペプチド配列を示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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