(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療ペプチドと、酸化再生セルロース、中和酸化再生セルロース及びこれらの混合物からなる群から選択されるポリサッカライドとの複合体を含み、前記複合体は電離放射線で滅菌されている滅菌組成物。
【請求項２】
前記ペプチドが、成長因子、止血剤、抗微生物剤、抗バクテリア剤、抗付着剤及びコラーゲンフラグメントからなる群から選択される請求項１に記載の滅菌組成物。
【請求項３】
前記ペプチドが、ヒト分裂促進又は脈管形成活性を有する成長因子を含む請求項２に記載の滅菌組成物。
【請求項４】
前記成長因子が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β1 、ＴＧＦ−β2 ）、神経成長因子（ＮＧＦ−α、ＮＧＦ−β）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ又はＩＧＦ−ＩＩ）及びこれらの混合物からなる群から選択される請求項３に記載の滅菌組成物。
【請求項５】
前記組成物が、さらに、天然繊維状コラーゲン、ポリアニオン性ポリサッカライド及びこれらの混合物からなる群から選択される生体ポリマーを含む請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載の滅菌組成物。
【請求項６】
前記組成物が、天然繊維状コラーゲン及び酸化再生セルロースの混合物を含む請求項１乃至請求項５のいずれか一項に記載の滅菌組成物。
【請求項７】
前記治療ペプチドの前記ポリサッカライドに対する重量比が、１：１０6 乃至１：１０である請求項１乃至請求項６のいずれか一項に記載の滅菌組成物。
【請求項８】
前記重量比が、１：１０5 乃至１：１００である請求項７に記載の滅菌組成物。
【請求項９】
前記重量比が、１：１０4 乃至１：１０００である請求項８に記載の滅菌組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、凍結乾燥又は溶媒乾燥スポンジを含む請求項１乃至請求項９のいずれか一項に記載の滅菌組成物。
【請求項１１】
さらに、フリーラジカル捕集剤を含む請求項１０に記載の滅菌組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、ヒト又は動物の体に局所投与するための粘性液体又はゲルである請求項１乃至請求項１１のいずれか一項に記載の滅菌組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、ヒト又は動物の体に静脈内投与するための液体である請求項１乃至請求項１１のいずれか一項に記載の滅菌組成物。
【請求項１４】
前記治療ペプチドとポリサッカライドが、固体担体の面上にコートされている請求項１乃至請求項９のいずれか一項に記載の滅菌組成物。
【請求項１５】
前記固体担体が、傷面に適用するのに適した織布又は不織布、ポリマーフィルム又はウェブである請求項１４に記載の滅菌組成物。
【請求項１６】
前記固体担体が、生物学的に吸収可能である請求項１４又は請求項１５に記載の滅菌組成物。
【請求項１７】
前記固体担体が、織酸化再生セルロース布又は不織酸化再生セルロース布を含む請求項１６に記載の滅菌組成物。
【請求項１８】
前記滅菌組成物が滅菌パッケージされる請求項１乃至請求項１７のいずれか一項に記載の滅菌組成物。
【請求項１９】
治療ペプチドとポリサッカライドの複合体を準備し、
前記複合体を滅菌し、
次に、前記複合体を製薬的に許容可能な担体の中又は上に分散する工程を含み、
前記ポリサッカライドは、酸化再生セルロース、中和酸化再生セルロース及びこれらの混合物からなる群から選択される
滅菌治療組成物の製造方法。
【請求項２０】
前記準備工程が、前記治療ペプチドを前記ポリサッカライドと共に溶媒中で混合し、次に、前記溶媒を除いて前記複合体を残すことを含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶媒が水性溶媒である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記溶媒が、凍結乾燥又は溶媒乾燥により除かれる請求項２０又は請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記滅菌工程が、電離放射線又はガスプラズマ処理により実施される請求項１９乃至請求項２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記電離放射線がガンマ線である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記複合体が、前記滅菌工程の間、４重量％より少ない水を含む請求項１９乃至請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記分散工程が、前記滅菌工程の後に無菌条件下で実施される請求項１９乃至請求項２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１乃至請求項１８のいずれか一項に記載の滅菌組成物を製造するための請求項１９乃至請求項２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
治療ペプチドを準備し、
前記治療ペプチドとポリサッカライドの間に複合体を形成し、
前記複合体を滅菌し、
次に、無菌条件下で前記複合体から前記治療ペプチドを分離して、前記滅菌治療ペプチドを得る工程を含み、
前記ポリサッカライドは、酸化再生セルロース、中和酸化再生セルロース、キチン、キトサン、ガラクトマンナン及びこれらの混合物からなる群から選択される
滅菌治療ペプチドの製造方法。
【請求項２９】
前記分離工程が、水性溶媒を用いて前記複合体から前記治療ペプチドを抽出することを含む請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、１以上の治療ペプチドを含む滅菌組成物に関する。また、本発明は、このような組成物の製造方法及び滅菌治療ペプチドの製造方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
天然及び合成ペプチド化合物は、治療における活性剤として、その重要性が増大している。特に傷の治療のために、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、骨形態形成タンパク質、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）及びトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）等の成長因子を使用することに特別の関心が寄せられている。成長因子は組換ＤＮＡ合成技術により大量に利用できるようになり、このため、成長因子を投与するための滅菌製剤を必要とするようになった。
【０００３】
ペプチドに基づく医薬品の特徴は、ほとんどのペプチドは、消化管で破壊されてしまうので、腸内投与に適さないということである。従って、ほとんどのペプチド医薬品は、非経口的に、特に局所又は静脈内投与により、投与しなければならない。このような投与方法のためには、ペプチド組成物が滅菌されていることが必須である。即ち、組成物は、生存能力のある微生物、ウイルス及びＤＮＡフラグメントを実質的に含んではならない。
【０００４】
治療ペプチドを含む組成物を滅菌しようとすると、困難が生じる。オートクレーブでの加熱又はガンマ線照射等の従来の滅菌方法では、特に水の存在下で滅菌するときは、治療ペプチドの生物学的活性がしばしば低下する。化学的滅菌剤は、ペプチドの酸化剤に対する感度、ｐＨの変化、イオン強度の変化又は温度の変化により、やはり不適切である。エチレンオキシドによる滅菌も、エチレンオキシドと幾つかのペプチドとの反応性により、さらに、エチレンオキシドの残留が許容不可であること及び製品に含まれてしまうその有害な反応生成物により、不適切である。
【０００５】
過去において、ペプチドに基づく医薬品は無菌条件下で滅菌した出発材料から製剤していた。しかし、このような無菌製造はかなり高価で実施が難しい。ペプチドを含む溶液は限外ろ過で滅菌しているが、この方法は大分子を含む組成物又は固体又は半固体組成物には不適切である。
【０００６】
ＥＰ−Ａ−０２３８８３９は、トリプシン等の酵素を含浸させた吸収性セルロースシートを含む傷手当用品を示している。この傷手当用品は無菌条件下で製造して乾燥しているが、明らかに、その後に滅菌していない。
【０００７】
ＥＰ−Ａ−０３１２２０８は、ヒト分裂促進又は脈管形成活性を有するポリペプチド成長因子を含むゲル製剤を示している。このゲル製剤は傷に局所投与するのに適しており、セルロース誘導体を含んでいる。ポリペプチド成長因子を水溶液に保存すると通常生物学的活性が消失するが、セルロース誘導体はその消失が生じないようにポリペプチド成長因子を安定化できると記載されている。メチルセルロースとヒドロキシアルキルセルロース誘導体が好ましい。ペプチド成長因子を加える前にゲルを滅菌し、その後に、無菌条件下でペプチド成長因子を加える。従って、製剤した後では、組成物を滅菌していないと考えられる。同様の組成物がＥＰ−Ａ−０２６７０１５に記載されている。
【０００８】
ＥＰ−Ａ−０３０８２３８は、ポリペプチド成長因子を含む安定な凍結乾燥組成物を示している。凍結乾燥は、成長因子が水中で加水分解されて活性を失うのを防ぎ安定化する。凍結乾燥組成物は、水溶性又は水膨潤性ポリマー（例えば、セルロース誘導体）等の増量剤を含む。明細書には、滅菌された凍結乾燥製品を製造するために、成長因子以外の出発材料をオートクレーブで滅菌し成長因子は滅菌ろ過することが記載されている。この出願は、明らかに、最終凍結乾燥ペプチド組成物を滅菌することは意図していない。
【０００９】
ＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ９５／０２４１１号は、ポリペプチド成長因子を含む水性組成物を示しており、その成長因子は４℃で長期間生化学的に安定である。この成長因子は、組成物を２．８乃至３．８の低いｐＨにすることにより安定化される。しかし、成長因子を含む組成物を滅菌することは明細書に記載されていない。
【００１０】
ＥＰ−Ａ−０４３７０９５は、酢酸ナトリウム溶液等でＯＲＣを処理する、中和酸化セルロース生成物（ｎＯＲＣ）の製造方法を示している。この中和生成物を、スロンビン等の酸感受性止血剤で含浸させてその止血特性を高めてもよいし、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）等の酸感受性付着防止剤で含浸させてその付着防止特性を高めてもよい。他の実施形態では、この布を成長因子等の医薬品で含浸させている。
【００１１】
ＯＲＣとｎ−ＯＲＣは両方共ガンマ線照射で滅菌でき、ＥＰ−Ａ−０４３７０９５は、ヘパリン又はヘパリンフラグメントと複合するｎ−ＯＲＣもガンマ線照射で滅菌できることを示している。しかし、この文献は、ペプチドが結合しているＯＲＣ又はｎ−ＯＲＣを滅菌することは示していない。
【００１２】
ＥＰ−Ａ−０５６２８６４は、コラーゲンスポンジマトリックス、第二の生物学的吸収可能ポリマー（例えば、酸化再生セルロース（ＯＲＣ）の分散繊維）の基礎構造及び活性剤（例えば、ペプチド）を含む複合傷手当物質を示している。活性剤は、マトリックス又は基礎構造又は両方に存在できる。複合スポンジ物質をパッケージして滅菌できる。この文献に記載されている物質は本来的に不均質である。これらは、活性剤の相放出及び、好ましくは、指向性細胞内成長をもたらす繊維、フィルム又はフレークの基礎構造を含む。
【００１３】
ＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ９８／００１８０号は、慢性の傷の治療のためにＯＲＣとコラーゲンの複合体を使用することを示している。明細書には、ＯＲＣが細胞成長因子と安定な複合体を形成することが記載されている。
【００１４】
ＵＳ−Ａ−５７３０９３３は、生物学的に活性なペプチドをその生物学的活性を消失することなくガンマ線又は電子ビーム照射で滅菌する方法を示している。この方法は、生物学的に活性なペプチドとゼラチン等の外来タンパク質を含む混合物を形成し、この混合物を凍結又は凍結乾燥し、次にこの混合物を照射する工程を含む。外来タンパク質の存在がペプチドを安定化して生物学的活性の消失を防ぐと述べられている。この混合物には、さらに、フリーラジカル捕集剤（scavenger)を含ませて、照射安定性を一層高めてもよい。この文献は、ポリサッカライドが照射の際ペプチドを安定化できることは示唆していない。
【００１５】
【発明の開示】
本発明の目的は、滅菌した後もペプチドの生物学的活性が保持されるように生物学的に活性なペプチドを滅菌するための改善された方法を提供することである。
【００１６】
本発明は、滅菌前にペプチドを有効量の選択されたポリサッカライドと共に製剤するなら、電離放射線で滅菌しても、ペプチド治療剤（特に、成長ホルモン）の生物学的活性は消失しないで安定化するという驚くべき発見に基づいている。
【００１７】
第一の側面では、本発明は、治療ペプチドと、セルロース誘導体、キチン、キトサン、ガラクトマンナン及びこれらの混合物からなる群から選択されるポリサッカライドの複合体であって、電離放射線で滅菌された複合体を提供する。
【００１８】
ペプチドは任意の治療的に活性なペプチドでよく、例えば、ホルモン、抗体、抗体フラグメント、天然及び合成ペプチド抗原及び抗原フラグメントである。好適なペプチドの例には、オキシトシン、バソプレシン、コルチコトロピン、アプロチニン、カルシトニン、プロラクチン、インヒビチン、インターフェロン、ソマトスタチン、インシュリン、グルカゴン、心房性ナトリウム排泄因子（ＡＮＦ）、エンドルフィン、レニンインヒビター、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ペプチドＴ又はその合成相同体又は類似体がある。好ましくは、ペプチドは治療的に活性であって傷の治癒を促す。好適なペプチドには、トロンビン等の止血剤、ｔ−ＰＡ等の抗付着剤が含まれる。また、コラーゲンフラグメント等の天然プロティンの治療フラグメントも含まれる。本発明は水溶性及び非水溶性ペプチドの両方に適する。ペプチドはどのような分子量でもよいが、例えば１０００乃至１０００００であり、好ましくは４０００乃至６００００である。
【００１９】
好ましくは、ペプチドは、成長因子、より好ましくは、ヒト分裂促進又は脈管形成活性を有する成長因子である。より好ましくは、成長因子は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β1 、ＴＧＦ−β2 ）、神経成長因子（ＮＧＦ−α、ＮＧＦ−β）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ又はＩＧＦ−ＩＩ）及びこれらの混合物からなる群から選択される。
【００２０】
本出願人は、ポリサッカライドの特定のグループ（天然及び化学変性したものを含む）が電離放射線による滅菌に対してペプチドを安定化させるのに有効であることを見出した。特定された有効なポリサッカライドは、（ａ）セルロース誘導体、（ｂ）キチン及びキトサン、及び（ｃ）ガラクトマンナンである。ヒアルロン酸ナトリウム、ペクチン、β−グルカン又はアルギン酸カルシウム等の他のポリサッカライドは、これらは滅菌の際ペプチドの生物学的活性を保護しないため、又はこれらが体内で生物学的に活性なペプチドを解離しないと予想されるため、好適ではない。ペプチド複合体をこのように滅菌した結果得られる滅菌生成物は、高い生物学的活性と組成物内に存在する特徴的なイオン化破片により同定できる。
【００２１】
用語「セルロース誘導体」は全ての化学的に変性したセルロースを意味する。好ましくは、変性セルロースは各１００の糖残基に対し少なくとも１つのカルボキシレート基を有し、より好ましくは、カルボキシメチルセルロース、酸化セルロース又はこれらの塩を含む。
【００２２】
酸化セルロースは、セルロースにある−ＣＨ2 ＯＨ基の幾つかを二酸化窒素又は他の酸化剤で酸化して製造する。酸化セルロースは、簡単に組織面に適用できる生物学的に吸収可能な吸収性マトリックスを製造するのに使用できる。酸化再生セルロース（ＯＲＣ）布は、これらが再生セルロース布（例えば、レーヨンタイプ布）を酸化処理して製造できるので、特に好ましい。このようなＯＲＣの例を２つ挙げると、INTERCEED（ジョンソン・アンド・ジョンソン・メディカル・インクの登録商標）とSURGICEL（ジョンソン・アンド・ジョンソン・メディカル・インクの登録商標）である。INTERCEED布は手術のとき付着バリヤとして使用する。SURGICEL布は手術及び他の用途で止血剤用品として使用する。ＯＲＣは、特にインビボにおける生物学的再吸収性と止血特性において、非変性セルロースに比べて、大きな利点を有する。
【００２３】
好適なＯＲＣは、ＵＳ−Ａ−３１２２４７９の方法により、又は市販のINTERCEED（登録商標）又はSURGICEL（登録商標）布から、又はこのような布を粉砕して得た粉末又は繊維状形態で、製造できる。中和ＯＲＣはＥＰ−Ａ−０４３７０９５に記載されているように製造できる。低分子量ＯＲＣフラグメント（水溶性フラグメントを含む）はＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ９８／００４４６号に記載されているようにＯＲＣをアルカリ加水分解して製造できる。
【００２４】
キチン、キトサン及び一部が脱アシル化した全てのキトサン中間体も本発明に有効である。
【００２５】
ガラクトマンナン、即ち、ガラクトースとマンノース残基の両方を含むポリサッカライドも本発明に有効である。好ましいガラクトマンナンの例はグアーゴムとイナゴマメゴムである。
【００２６】
本発明に使用される治療的に活性なペプチドとポリサッカライドの複合体は、追加的に、他の天然又は半合成生体親和性ポリマーを上記のポリサッカライドと混合して含んでもよい。好適な追加的な生体ポリマーの例には、コラーゲン、フィブリン及びラミニン等の構造タンパク質、アテロコラーゲン又はペプシン可溶化コラーゲン等の変性構造タンパク質、セルロース、スターチ、アルギネート、変性スターチ又はムコポリサッカライド及びこれらの混合物等の他のポリサッカライドがある。好ましくは、追加的な生体ポリマーは、天然及び変性構造タンパク質及びポリアニオン性ポリサッカライドからなる群から選択される。用語「アニオン性ポリサッカライド」は、ヘパリン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸塩、コンドロイチン硫酸塩及びこれらのフラグメントと塩等のムコポリサッカライドを含む。
【００２７】
この明細書で使用する用語「構造タンパク質」は、コラーゲン及び他の構造タンパク質（例えば、フィブリン又はラミニン）を意味する。これらは、用語の普通の意味では治療的に活性なペプチドではない。このような構造タンパク質とアルギネートの複合体はＵＳ−Ａ−４６１４７９４に記載されている。このような構造タンパク質とＯＲＣの複合体はＧＢ−Ａ−２３１４８４２に記載されている。このような複合体は、傷治癒用途、特に慢性的傷の治療に効果を有する。好ましくは、構造タンパク質は、本質的に天然繊維状コラーゲンからなる。
【００２８】
本発明のこの側面による組成物は、好ましくは、意図する用途に対する治療有効量のペプチドを含む。典型的には、傷に局所投与するための組成物の場合、０．１重量ｐｐｍ乃至１０，０００重量ｐｐｍ、より好ましくは、１重量ｐｐｍ乃至１，０００重量ｐｐｍの範囲である。好ましくは、組成物における治療ペプチドのポリサッカライドに対する重量比は１：１０6 乃至１：１０、より好ましくは１：１０5 乃至１：１００、最も好ましくは１：１０4 乃至１：１０００である。
【００２９】
治療ペプチドはポリサッカライドと複合する。即ち、治療ペプチドの分子のかなりの部分がポリサッカライドの分子と共有結合、イオン結合、ファン・デル・ワールス結合で結合する。このことは、例えば、薄層を有孔性又は織物様ポリサッカライド基体上にコートすることにより、又は、ペプチドとポリサッカライドを密接に混合することにより達成できる。好ましくは、治療ペプチドはポリサッカライドと共有結合しない。
【００３０】
本発明に使用するポリサッカライドは、結合するペプチドが複合体から極めて容易に解離するというさらなる利点を有する。単に複合体を水又は血清に２０℃、２４時間浸漬するだけで、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも４０％のペプチド生物学的活性（結合前のペプチドの活性に基づく）を水性溶液に解離させることができる。
【００３１】
典型的には、例えば治療ペプチドとポリサッカライドを溶媒に共に分散させ次に溶媒を除いて、分子レベルで治療ペプチドとポリサッカライドを密接に混合させて複合体を製造する。
【００３２】
好ましくは、治療ペプチドとポリサッカライドの複合体は、製薬的に許容可能な担体に分散した固体又はコロイド状粒子の形態である。好ましくは、粒子の直径は、５０μｍより小さく、より好ましくは１０μｍより小さく、最も好ましくは２μｍより小さい。製薬的に許容可能な担体は固体面又は固体マトリックスでもよい。しかし、好ましくは、担体は、その中で治療ペプチドとポリサッカライドが分散する水性液体又はゲルである。特定の好ましい実施形態では、本発明による滅菌組成物は、好ましくは粘度が２０℃で少なくとも１００Ｎｓ／ｍである粘性液体又はゲルであり、ヒト又は動物の体、特に傷に局所投与するのに適する。
【００３３】
他の好ましい実施形態では、本発明による滅菌組成物は治療ペプチドとポリサッカライドを含む液体（例えば、緩衝塩水）であり、ヒト又は動物の体に静脈内投与するのに適する。
【００３４】
他の好ましい実施形態では、本発明の滅菌組成物は、治療ペプチドとポリサッカライドがその面にコートされている固体製薬的担体を含む。好ましくは、固体担体は織布又は不織布、ポリマーフィルム又はウェブであり、傷面へ適用するのに適する。特に好ましい固体担体は生物学的吸収性固体担体、特に織ＯＲＣ布又は不織ＯＲＣ布である。これらの実施形態は、例えば、治療ペプチドをポリサッカライドの固体担体（又はポリサッカライドでコートした固体担体）の上にコートし、乾燥して固体担体の面にペプチド／ポリサッカライド複合体を形成して、その後滅菌して製造する。
【００３５】
好ましくは、本発明による滅菌組成物を滅菌パッケージする。即ち、好ましくは、これらを滅菌した微生物不透過性容器にパッケージする。
【００３６】
第二の側面では、本発明は以下の工程を含む滅菌治療組成物の製造方法を提供する、即ち、治療ペプチドとポリサッカライドの複合体を準備し、この複合体を滅菌し、製薬的に許容可能な担体の中又は上に複合体を分散させる工程を含む。ここで、ポリサッカライドは、セルロース誘導体、キチン、キトサン、ガラクトマンナン及びこれらの混合物からなる群から選択される。
【００３７】
好ましい治療ペプチド、ポリサッカライド及び製薬的に許容可能な担体は、本発明の第一の側面として前記のように定義した通りである。
【００３８】
好ましくは、この複合体は、治療ペプチドとポリサッカライドを溶媒に分散させて、次に溶媒を除去して複合体を残留させることにより製造する。好ましくは、溶媒は水性溶媒であり、より好ましくは本質的に水からなる。好ましくは、溶媒は凍結乾燥又は溶媒乾燥により除去する。この結果、一般に、高度に孔の開いたポリサッカライドスポンジであってそこに治療ペプチドが接しているものが得られる。次に、この物質を粉砕した後、製薬的に許容可能な担体に分散させる。
【００３９】
他の好ましい方法では、ポリサッカライドは、織布又は不織布、ポリマーフィルム、ウェブ又はスポンジの形態であり、好ましくはポリサッカライドを治療ペプチドの溶液に少し浸して、治療ペプチドでコートする。次に、溶媒を蒸留して除くと、その面に治療ペプチド複合体を含むポリサッカライド担体が残る。
【００４０】
好ましくは、複合体の滅菌工程は、好ましくは１０重量％より少ない水を含む、より好ましくは４％より少ない水を含む、最も好ましくは実質的に無水の治療ペプチド／ポリサッカライド複合体において実施する。オートクレーブやエチレンオキシドによる処理等任意の従来方法により滅菌できる。好ましくは、ガスプラズマによる処理、例えばSTERAD（登録商標）機械で滅菌する。好ましくは、紫外光、電子ビーム又はガンマ線等の電離放射線で滅菌する。より好ましくは、電離放射線はガンマ線であり、最も好ましくは、滅菌用量が少なくとも１ｋＧｙ乃至５０ｋＧｙ（好ましくは、２０ｋＧｙ乃至３０ｋＧｙ）のコバルト６０照射である。即ち、約１ｍＲａｄ乃至３ｍＲａｄのガンマ線が好ましい。驚くべきことに、ペプチドはガンマ線照射により分解されやすいことが良く知られているにもかかわらず、選択されたポリサッカライドと複合している治療ペプチドを照射しても、治療ペプチドの活性は実質的に損なわれない。どのような理論にも結びつけることは望まないが、ポリサッカライドと複合した治療ペプチドの驚くべき安定性は、ポリサッカライドが照射により生じたフリーラジカルの捕獲剤（trap）として作用することによる可能性がある。
【００４１】
本発明に使用する生物学的に活性なペプチドとポリサッカライドの複合体は、さらに、フリーラジカル捕集剤（scavenger)を含んでもよい。使用するのに好適な捕集剤には、トコフェロール、クエン酸、ブチル化ヒドロキシアンソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ｔブチルヒドロキノン、没食子酸プロピル、アスコルビン酸誘導体等の抗酸化剤及び食品や医薬品に使用するのに安全であると一般に認められている他の抗酸化剤がある。好ましくは、複合体は、約０．０１重量％乃至１０重量％、より好ましくは０．１重量％乃至５重量％のフリーラジカル捕集剤を含む。
【００４２】
好ましくは、分散工程は滅菌工程の後で無菌条件下で実施する。治療ペプチドとポリサッカライドの乾燥複合体を滅菌して、次にこの滅菌した複合体を無菌条件下で液体、ゲル又は半固形担体に分散させて、滅菌治療組成物を製造することが特に有用である。
【００４３】
第三の側面では、本発明は以下の工程を含む滅菌治療ペプチドの製造方法を提供する、即ち、治療ペプチドを準備し、治療ペプチドとポリサッカライドの複合体を形成し、この複合体を滅菌し、次に無菌条件下で複合体から治療ペプチドを分離して滅菌治療ペプチドを得る工程を含む。ここで、ポリサッカライドはセルロース誘導体、キチン、キトサン、ガラクトマンナン及びこれらの混合物からなる群から選択される。
【００４４】
本発明のこの側面も、前述のように、標準滅菌条件下で治療ペプチドを分解しないように安定化するために、ポリサッカライドの注目すべき能力を利用する。好ましい治療ペプチド、ポリサッカライド及び滅菌方法は、本発明の第一の側面及び第二の側面として、上述した通りである。
【００４５】
好ましくは、単に抽出溶媒（好ましくは、水性溶媒）だけで滅菌複合体から治療ペプチドを分離する。例えば、可溶性治療ペプチドと非水溶性ポリサッカライドを含む複合体では、この複合体を単に水に分散又は懸濁して、ろ過又は精密ろ過することにより溶解した治療ペプチドをポリサッカライドから分離できる。ＯＲＣとキトサンは、水溶液中で結合ペプチドを容易に放出すると考えられるので特に好ましい。クロマトグラフィ等の他の従来の無菌分離方法ももちろん使用できる。滅菌治療ペプチドをクロマトグラフィ等によりさらに精製し、凍結乾燥で濃縮してもよい。好ましくは、滅菌治療ペプチドは実質的に純粋である。
【００４６】
要約すると、本発明は、治療ペプチドと選択されたポリサッカライドの間で複合体を形成することにより、標準滅菌条件下で、治療ペプチドが分解されないように安定化する。好ましくは、複合体は無水、例えば凍結乾燥複合体である。得られた滅菌複合体は、従来の局所又は非経口投与用治療製品に製剤できる。
【００４７】
従って、本発明は、セルロース誘導体、キチン、キトサン、ガラクトマンナン及びこれらの混合物からなる群から選択されるポリサッカライドの、生物学的活性の消失が少ない治療ペプチドの電離放射線による滅菌に使用する、治療ペプチドとの複合体を形成するための用途を提供する。ペプチドの最初の生物学的活性のうち、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも４０％が滅菌複合体から回復できる。
【００４８】
また、本発明は、ペプチドと、セルロース誘導体、キチン、キトサン、ガラクトマンナン及びこれらの混合物からなる群から選択されるポリサッカライドの間で複合体を形成し、電離放射線を用いてこの複合体を滅菌することを含む、生物学的活性の消失が少ない生物学的に活性なペプチドの滅菌方法を提供する。
【００４９】
以下、図面を参照して本発明の実施形態を説明する。
【００５０】
【実施例】
例１（比較のため）
以下の様に、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）と複合させた繊維状コラーゲンの固体スポンジを製造して滅菌した。
【００５１】
牛真皮から採取した酸膨潤天然コラーゲン繊維の水性スラリーを、ＵＳ−Ａ−４６１４７９４又はＵＳ−Ａ−４３２０２０１に記載されているように製造した（これらの文献の内容の全てをここに援用する）。スラリーの固体含有量は１重量％であった。スラリーを０．０５Ｍ酢酸で酸性にしてコラーゲン繊維を膨潤した。次に、ＰＤＧＦ（シグマ・ケミカル・コーポレーション）を、コラーゲンの重量に基づき、０重量％（対照）、０．１重量％、０．３３重量％及び１重量％の濃度で、スラリーサンプルに加えた。スラリーを脱気した。各スラリーサンプル３０ｇを１００ｃｍ2 ペトリ皿に注ぎ、急速冷凍し、その後一晩凍結乾燥した。
【００５２】
得られたコラーゲンスポンジを半分に切り、各スポンジの１方の半分を２．５ｋＧｙの60Ｃｏガンマ線照射で滅菌した。各スポンジの他方の半分は対照として滅菌しなかった。
【００５３】
これらのサンプルを、ＰＤＧＦの溶離と生物学的活性について、後述する方法１に従ってテストした。
【００５４】
典型的な結果を図２に示す。コラーゲンのみと複合したＰＤＧＦの活性は滅菌しても実質的に変化しないことが分かる。
【００５５】
精製した凍結乾燥ＰＤＧＦについて比較テストを実施した。図１に示す結果によれば、精製ＰＤＧＦ成長因子を滅菌するとＰＤＧＦ活性が大幅に減少した。
【００５６】
ＰＤＧＦを加えない、別のコラーゲン対照サンプルでは、滅菌前後に活性は無かった。
【００５７】
例２
例１と同様にして、ＰＤＧＦと複合させた繊維状コラーゲン／ＯＲＣの固体スポンジを製造した。ただし、ＰＤＧＦを加える前に、８０重量％（コラーゲンの重量に基づく）の粉砕SURGICEL（登録商標）ＯＲＣ繊維をコラーゲンスラリーに加えた。得られた生成物は、コラーゲンとＯＲＣを合わせた重量に基づき０（比較）、０．１重量％、０．３３重量％及び１．０重量％のＰＤＧＦを含むコラーゲン／ＯＲＣスポンジであった。
【００５８】
これらのサンプルを、ＰＤＧＦの溶離と生物学的活性について、後述する方法１に従ってテストした。
【００５９】
典型的な結果を図２に示す。コラーゲン／ＯＲＣだけと複合したＰＤＧＦの活性は滅菌しても実質的に変化しないことが分かる。驚くべきことに、生物学的に活性なＰＤＧＦの滅菌複合体からの溶離は、非滅菌複合体からの溶離よりも良好である。
【００６０】
例３
以下の様にして、ＰＤＧＦでコートしたＯＲＣの固体マトリックスを製造した。
【００６１】
SURGICEL（登録商標）ＯＲＣ布（２ｃｍ2 ）をＰＤＧＦの１％水溶液に少し浸し、室温で乾燥し、半分に切った。一方の半分を例１と同様にガンマ線照射により滅菌し、他方の半分を比較のためにとっておいた。
【００６２】
これらのサンプルを、ＰＤＧＦの溶離と生物学的活性について、後述する方法１に従ってテストした。
【００６３】
典型的な結果を図２に示す。ＯＲＣのみと複合したＰＤＧＦの生物学的活性は滅菌しても実質的に変化しないことが分かる。さらに、滅菌の前と後の両方において、ＰＤＧＦは、コラーゲン複合体よりもＯＲＣ複合体からの方がより容易に溶離する。
【００６４】
例４
例２と同様にして、アプロチニンと複合させたコラーゲン／ＯＲＣの固体スポンジを製造した。ただし、ＰＤＧＦは加えずに、牛肺アプロチニン（シグマ・ケミカル・コーポレーション）を、コラーゲンとＯＲＣを合わせた重量に基づき０重量％（対照）及び１０重量％の量で加えた。
【００６５】
これらの複合体を、アプロチニンの結合と活性について、方法２に従ってテストした。テスト結果は、アプロチニンがコラーゲン／ＯＲＣと複合しているときは、ガンマ線照射の後でも、大部分のアプロチニンが保存されていたことを示した。
【００６６】
驚くべきことに、この結果は、さらに、非照射コラーゲン／ＯＲＣマトリックスよりも照射コラーゲン／ＯＲＣマトリックスからの方が、アプロチニンがより速く解離したことを示した。
【００６７】
例５
以下の様にして、キトサンの、ペプチドと可逆的に結合する能力及び滅菌時に生物学的活性が消失しないようにペプチドを安定化させる能力について実験した。
【００６８】
例１および例２と同様にして、ＰＤＧＦと複合させたキトサン及び５５／４５コラーゲン／キトサンの固体スポンジを製造した。ただし、例１のコラーゲンをキトサンに代え、例２のＯＲＣを複合体の重量に基づき４５重量％の量のキトサンに代えた。
【００６９】
これらの複合体サンプルを、例１と同様にしてガンマ線照射により滅菌した。
【００７０】
これらのサンプルについて方法１を実施し、時間を関数として、血清溶液でサンプルから抽出した生物学的に活性なＰＤＧＦの量を評価した。滅菌サンプルと非滅菌サンプルの両方についてデータを集めた。
【００７１】
図３に示す結果によると、滅菌の前と後の両方で、元のＰＤＧＦの大部分が複合体から解離することが分かる。ＰＤＧＦは、コラーゲン／キトサン複合体よりもキトサンからの方が少しだけ容易に解離する。ＰＤＧＦの生物学的活性は、キトサン又はコラーゲン／キトサンの存在下では、滅菌により影響を受けない。
【００７２】
例６（比較のため）
例５と同様にして、ヒアルロン酸ナトリウムの、ペプチドと可逆的に結合する能力及び滅菌時に生物学的活性が消失しないようにペプチドを安定化させる能力について実験した。ただし、例５のキトサンをヒアルロン酸ナトリウムに代えた。
【００７３】
方法１による結果を図４に示す。滅菌の前と後の両方において、ＰＤＧＦが複合体から容易に解離することが分かる。しかし、ヒアルロン酸ナトリウムの存在下では、滅菌した後、抽出したＰＤＧＦの生物学的活性は顕著に減少する。例１に記載したようにコラーゲンはＰＤＧＦに安定化効果を及ぼすので、コラーゲン／ヒアルロン酸ナトリウム複合体についての生物学的活性の減少はそれほどでもない。ヒアルロン酸ナトリウムは滅菌時に生物学的活性が消失しないようにＰＤＧＦを安定化しないことが結論付けられる。
【００７４】
例７（比較のため）
例５と同様にして、ペクチンの、ペプチドと可逆的に結合する能力及び滅菌時に生物学的活性が消失しないようにペプチドを安定化させる能力について実験した。ただし、例５のキトサンをペクチンに代えた。
【００７５】
方法１による結果を図５に示す。滅菌の前と後の両方において、ＰＤＧＦが複合体から容易に解離することが分かる。しかし、ペクチンの存在下では、滅菌した後、抽出したＰＤＧＦの生物学的活性は顕著に減少する。例１に記載したようにコラーゲンはＰＤＧＦに安定化効果を及ぼすので、コラーゲン／ペクチン複合体についての生物学的活性の減少はそれほどでもない。ペクチンは滅菌時に生物学的活性が消失しないようにＰＤＧＦを安定化しないことが結論付けられる。
【００７６】
例８
例５と同様にして、イナゴマメゴムの、ペプチドと可逆的に結合する能力及び滅菌時に生物学的活性が消失しないようにペプチドを安定化させる能力について実験した。ただし、例５のキトサンをイナゴマメゴムに代えた。
【００７７】
方法１による結果を図６に示す。滅菌の前と後のいずれにおいても、ＰＤＧＦの生物学的活性はほとんど複合体から解離しないことがわかる。しかしイナゴマメゴムの存在下では、滅菌した後、抽出したＰＤＧＦの生物学的活性はほとんど減少しない。さらに、イナゴマメゴムが、複合体に存在するコラーゲンによる効果以上の安定化効果を付与することが分かる。イナゴマメゴムは滅菌時に生物学的活性が消失しないようにＰＤＧＦを安定化することが結論付けられる。
【００７８】
例９（比較のため）
例５と同様にして、ベータグルカンの、ペプチドと可逆的に結合する能力及び滅菌時に生物学的活性が消失しないようにペプチドを安定化させる能力について実験した。ただし、例５のキトサンをベータグルカンに代えた。
【００７９】
方法１による結果を図７に示す。滅菌の前と後の両方において、ＰＤＧＦが複合体からほとんど解離しないことが分かる。さらに、ベータグルカンの存在下では、滅菌した後、抽出したＰＤＧＦの生物学的活性は顕著に減少する。ベータグルカンは滅菌時に生物学的活性が消失しないようにＰＤＧＦを安定化しないことが結論付けられる。
【００８０】
例１０（比較のため）
例５と同様にして、アルギン酸ナトリウムの、ペプチドと可逆的に結合する能力及び滅菌時に生物学的活性が消失しないようにペプチドを安定化させる能力について実験した。ただし、例５のキトサンをアルギン酸ナトリウムに代えた。
【００８１】
方法１による結果を図８に示す。滅菌の前と後の両方において、ＰＤＧＦは複合体と強く結合していることが分かる。この結合が強いので、アルギン酸ナトリウムが滅菌時に生物学的活性が消失しないようにＰＤＧＦを安定化しているのか否かは、解離したＰＤＧＦから明らかにならない。アルギン酸ナトリウムは滅菌時に生物学的活性が消失しないようにＰＤＧＦを安定化させるのに有用ではないようだと結論付けられる。
【００８２】
例１１
傷の治癒を促す局所投与用滅菌医薬ゲルを以下の様に製剤した（重量％）。
カルボキシメチルセルロース                ２．４％
ヒドロキシエチルセルロース                ０．３％
塩化ナトリウム                            ０．２４％
プロピレングリコール                      ２０．２％
コラーゲン／ＯＲＣ／ＰＤＧＦ１重量％      ２．０％
水                                        残量
【００８３】
コラーゲン／ＯＲＣ／１重量％ＰＤＧＦを例２と同様に製造した。次に、約１μｍ乃至１０μｍの粒子サイズへ粉砕し、ガンマ線照射で滅菌し、その後、無菌条件下で他の成分と混合して、傷の治癒を促進させるために傷に適用するのに適した滅菌水性ゲルを得た。
【００８４】
例１２
滅菌した、実質的に純粋なＰＤＧＦを以下の様に製造した。
【００８５】
例１で製造した１％ＰＤＧＦ／コラーゲンスポンジを１０μｍより小さい粒子サイズまで粉砕し、次にガンマ線照射で滅菌した。この滅菌複合体を滅菌塩水（ｐＨ８）を用いて１時間３５℃で処理して、滅菌ＰＤＧＦを抽出し、続いて無菌条件下でろ過と凍結乾燥して、滅菌ＰＤＧＦを得た。
【００８６】
方法１
ＰＤＧＦの活性に及ぼす複合化と滅菌の効果を以下の様に評価した。
【００８７】
パンチ生検サンプル（直径６ｍｍ）を１ｍｌのダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）に設置して、湿環境細胞培養インキュベーターで３７℃５％ＣＯ2 で培養して、各サンプルの２４時間リリーサイトを製造した。各サンプルの溶離を２回テストした。
【００８８】
ＰＤＧＦの生物学的活性は、メチレンブルーアッセイを用いて細胞の数を測定して増殖により評価した。即ち、ＡＨＤＦ（ヒト大人皮膚繊維芽細胞）を９５％コンフルーエンシィまで成長させ、トリプシン処理し、カウントし、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭで３×１０4 細胞／ｍｌの細胞密度で９６穴マイクロタイタープレート（１００μｌ／穴−３０００細胞／穴）で再び培養した。細胞を、この培地で、湿環境細胞培養インキュベーターで３７℃５％ＣＯ2 で一晩付着、拡散させた。次に、培地を除き、細胞単層をＰＢＳで洗い、テストサンプル又は標準サンプルを１００μｌ／穴に加えた。各テストサンプルを×８テストし、シリンジフィルター（０．２μｍ）でろ過して滅菌した。各サンプルは、取り込んだＰＤＧＦの見積もり濃度に応じて希釈した。これは、線状範囲にわたってＰＤＧＦを定量できるようにするために必要であった。ヒト組換ＰＤＧＦ−ＢＢを標準サンプルとして使用し、ＳＦ−ＤＭＥＭで希釈し、５００ｎｇ／ｍｌ乃至１ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で用いた。刺激剤を細胞と共にさらに３日間３７℃、５％ＣＯ2 で培養し、その後、培地を除いて細胞単層をFORMOL（登録商標）塩水で固定した。次に、細胞をメチレンブルーで染色し、過剰染色を除いて、酸性エタノールを用いて細胞単層から色素を溶離した。溶解した色素を、マイクロタイタープレート分光光度計を用いて、６３０ｎｍで定量し、BIOLINX（登録商標）ソフトウェアを用いてデータを分析した。
【００８９】
各サンプルから解離したＰＤＧＦのトータルレベルをＥＬＩＳＡを用いて測定した。ＰＤＧＦ−ＢＢに対するモノクローナル獲得抗体を、０．５μｇ／ｍｌ、０．０２５Ｍ−ＮａＨＣＯ3 、０．０２５Ｍ−Ｎａ2 ＣＯ3 、０．０２５Ｍ−Ｎａ2 ＣＯ3 、ｐＨ９．７（１００μｌ／穴）で用いて、４℃で一晩培養した。残った結合部位を３％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間３７℃でブロックした後、テストサンプル及び標準サンプルを加えた。各サンプルを３回テストし、標準曲線は５００ｎｇ／ｍｌから１ｎｇ／ｍｌの範囲であった。濃度を正確に見積もるために、各サンプルを異なる希釈液でテストした。ＰＤＧＦ（１／１０００希釈）に対する第一のポリクローナル抗体及びペルオキシダーゼ接合体（１／５０００希釈）と共に第二の抗ウサギＩｇＧを用いて、テストサンプル中のＰＤＧＦレベルを定量した。次に、始めは青色だが１Ｍ硫酸を加えると黄色に変わる可溶性基質ＴＭＢを用いて、ペルオキシダーゼのレベルを定量した。色は４５０ｎｍで分光光度計でモニターした。
【００９０】
方法２
アプロニチンの活性に及ぼす複合化と滅菌の効果を以下の様に評価した。
【００９１】
３ｍｍパンチ生検サンプルを、コラーゲン／ＯＲＣ、アプロニチン含有コラーゲン／ＯＲＣ（照射済）及びアプロニチン含有コラーゲン／ＯＲＣから、２つづつ取った。各スポンジから取った２つのパンチ生検サンプルを、滅菌プラスチック容器内で１ｍｌのＤＭＥＭに加えた。３７℃培養における０時間から４８時間にわたる多数の時点の後、ＤＭＥＭを除いた。これらのリリーセイト（溶離液）は、アプロニチン活性の作用アッセイまで、２０℃で保存した。
【００９２】
アプロニチンの作用活性に及ぼす照射の効果は、アプロニチンが精製プラスミンサンプルを阻害する能力を測定することにより、テストした。４０μｌのプラスミン（４０ｎｇ）、１０μＭのプラスミン蛍光基質及び０．５％TRITON（登録商標）含有トリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．１）を含む総容量が１００μｌのアッセイ溶液に、１０μｌのリリーセイトを加えた。ポジィティブ対照はリリーセイト無しでアッセイした。
【００９３】
さらに、０．５ｎｇ／ｍｌ乃至１０ｎｇ／ｍｌのアプロチニンの様々な濃度についてプラスミン阻害の標準曲線を作成し、計算の基礎として使用した。
【００９４】
アッセイは３７℃で１時間モニターして、蛍光生成プレートリーダーを用いて蛍光量を検出した（４５５ｎｍで放出、３８３ｎｍで励起）。
本発明の具体的な実施態様は以下の通りである。
（１）治療ペプチドと、セルロース誘導体、キチン、キトサン、ガラクトマンナン及びこれらの混合物からなる群から選択されるポリサッカライドとの複合体を含み、前記複合体は電離放射線で滅菌されている滅菌組成物。
（２）前記ペプチドが、成長因子、止血剤、抗微生物剤、抗バクテリア剤、抗付着剤及びコラーゲンフラグメントからなる群から選択される実施態様（１）に記載の滅菌組成物。
（３）前記ペプチドが、ヒト分裂促進又は脈管形成活性を有する成長因子を含む実施態様（２）に記載の滅菌組成物。
（４）前記成長因子が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β1 、ＴＧＦ−β2 ）、神経成長因子（ＮＧＦ−α、ＮＧＦ−β）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ又はＩＧＦ−ＩＩ）及びこれらの混合物からなる群から選択される実施態様（３）に記載の滅菌組成物。
（５）前記組成物が、さらに、構造タンパク質、ポリアニオン性ポリサッカライド及びこれらの混合物からなる群から選択される生体ポリマーを含む実施態様（１）乃至実施態様（４）のいずれか一つに記載の滅菌組成物。
（６）前記構造タンパク質が、天然コラーゲンタイプ、アテロコラーゲン、ペプシン可溶化コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン及びラミニンからなる群から選択される実施態様（５）に記載の滅菌組成物。
（７）前記構造タンパク質が、本質的に天然繊維状コラーゲンからなる実施態様（６）に記載の滅菌組成物。
（８）前記ポリサッカライドが、酸化セルロース、キトサン及びこれらの混合物と塩からなる群から選択される実施態様（１）乃至実施態様（７）のいずれか一つに記載の滅菌組成物。
（９）前記ポリサッカライドが、酸化再生セルロース（以下「ＯＲＣ」という）及び中和酸化再生セルロース（以下「ｎＯＲＣ」という）からなる群から選択される実施態様（８）に記載の滅菌組成物。
（１０）前記組成物が、天然繊維状コラーゲン及びＯＲＣの混合物を含む実施態様（１）乃至実施態様（９）のいずれか一つに記載の滅菌組成物。
（１１）前記治療ペプチドの前記ポリサッカライドに対する重量比が、１：１０6 乃至１：１０である実施態様（１）乃至実施態様（１０）のいずれか一つに記載の滅菌組成物。
（１２）前記重量比が、１：１０5 乃至１：１００である実施態様（１１）に記載の滅菌組成物。
（１３）前記重量比が、１：１０4 乃至１：１０００である実施態様（１２）に記載の滅菌組成物。
（１４）前記組成物が、凍結乾燥又は溶媒乾燥スポンジを含む実施態様（１）乃至実施態様（１３）のいずれか一つに記載の滅菌組成物。
（１５）さらに、フリーラジカル捕集剤を含む実施態様（１４）に記載の滅菌組成物。
（１６）前記組成物が、ヒト又は動物の体に局所投与するための粘性液体又はゲルである実施態様（１）乃至実施態様（１５）のいずれか一つに記載の滅菌組成物。
（１７）前記組成物が、ヒト又は動物の体に静脈内投与するための液体である実施態様（１）乃至実施態様（１５）のいずれか一つに記載の滅菌組成物。
（１８）前記治療ペプチドとポリサッカライドが、固体担体の面上にコートされている実施態様（１）乃至実施態様（１３）のいずれか一つに記載の滅菌組成物。
（１９）前記固体担体が、傷面に適用するのに適した織布又は不織布、ポリマーフィルム又はウェブである実施態様（１８）に記載の滅菌組成物。
（２０）前記固体担体が、生物学的に吸収可能である実施態様（１８）又は実施態様（１９）に記載の滅菌組成物。
（２１）前記固体担体が、織ＯＲＣ布又は不織ＯＲＣ布を含む実施態様（２０）に記載の滅菌組成物。
（２２）前記滅菌組成物が滅菌パッケージされる実施態様（１）乃至実施態様（２１）のいずれか一つに記載の滅菌組成物。
（２３）治療ペプチドとポリサッカライドの複合体を準備し、
前記複合体を滅菌し、
次に、前記複合体を製薬的に許容可能な担体の中又は上に分散する工程を含み、
前記ポリサッカライドは、セルロース誘導体、キチン、キトサン、ガラクトマンナン及びこれらの混合物からなる群から選択される
滅菌治療組成物の製造方法。
（２４）前記準備工程が、前記治療ペプチドを前記ポリサッカライドと共に溶媒中で混合し、次に、前記溶媒を除いて前記複合体を残すことを含む実施態様（２３）に記載の方法。
（２５）前記溶媒が水性溶媒である実施態様（２４）に記載の方法。
（２６）前記溶媒が、凍結乾燥又は溶媒乾燥により除かれる実施態様（２４）又は実施態様（２５）に記載の方法。
（２７）前記滅菌工程が、電離放射線又はガスプラズマ処理により実施される実施態様（２３）乃至実施態様（２６）のいずれか一つに記載の方法。
（２８）前記電離放射線がガンマ線である実施態様（２７）に記載の方法。
（２９）前記複合体が、前記滅菌工程の間、４重量％より少ない水を含む実施態様（２３）乃至実施態様（２８）のいずれか一つに記載の方法。
（３０）前記分散工程が、前記滅菌工程の後に無菌条件下で実施される実施態様（２３）乃至実施態様（２９）のいずれか一つに記載の方法。
（３１）実施態様（１）乃至実施態様（２２）のいずれか一つに記載の滅菌組成物を製造するための実施態様（２３）乃至実施態様（３０）のいずれか一つに記載の方法。
（３２）治療ペプチドを準備し、
前記治療ペプチドとポリサッカライドの間に複合体を形成し、
前記複合体を滅菌し、
次に、無菌条件下で前記複合体から前記治療ペプチドを分離して、前記滅菌治療ペプチドを得る工程を含み、
前記ポリサッカライドは、セルロース誘導体、キチン、キトサン、ガラクトマンナン及びこれらの混合物からなる群から選択される
滅菌治療ペプチドの製造方法。
（３３）前記分離工程が、水性溶媒を用いて前記複合体から前記治療ペプチドを抽出することを含む実施態様（３２）に記載の方法。
【００９５】
上記の実施例は説明の目的だけで示されたものである。当業者には、特許請求の範囲内にある他の多くの本発明の実施形態が明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ガンマ線照射による滅菌の前と後における凍結乾燥ＰＤＧＦ（比較例）の活性を示すグラフ図である。
【図２】  ガンマ線照射による滅菌の前（非影線）と後（影線）における、（ｉ）コラーゲンのみ、（ｉｉ）ＯＲＣのみ及び（ｉｉｉ）コラーゲン／ＯＲＣ複合体と複合したＰＤＧＦの活性を示すグラフ図である。
【図３】  （ｉ）ガンマ線照射しないキトサンと複合したＰＤＧＦ、（ｉｉ）コラーゲン／キトサン５５：４５混合物と複合したＰＤＧＦ、（ｉｉｉ）ガンマ線照射滅菌したキトサンと複合したＰＤＧＦ、及び（ｉｖ）ガンマ線照射滅菌したコラーゲン／キトサン５５：４５混合物と複合したＰＤＧＦの複合体について、抽出時間に対して、測定した溶液中のＰＤＧＦ活性を示すグラフ図である。
【図４】  （ｉ）ガンマ線照射しないヒアルロン酸ナトリウム（ＮａＨＡ）と複合したＰＤＧＦ、（ｉｉ）コラーゲン／ＮａＨＡ５５：４５混合物と複合したＰＤＧＦ、（ｉｉｉ）ガンマ線照射滅菌したＮａＨＡと複合したＰＤＧＦ、及び（ｉｖ）ガンマ線照射滅菌したコラーゲン／ＮａＨＡ５５：４５混合物と複合したＰＤＧＦの複合体について、抽出時間に対して、測定した溶液中のＰＤＧＦ活性を示すグラフ図である。
【図５】  （ｉ）ガンマ線照射しないペクチンと複合したＰＤＧＦ、（ｉｉ）コラーゲン／ペクチン５５：４５混合物と複合したＰＤＧＦ、（ｉｉｉ）ガンマ線照射滅菌したペクチンと複合したＰＤＧＦ、及び（ｉｖ）ガンマ線照射滅菌したコラーゲン／ペクチン５５：４５混合物と複合したＰＤＧＦの複合体について、抽出時間に対して、測定した溶液中のＰＤＧＦ活性を示すグラフ図である。
【図６】  （ｉ）ガンマ線照射しないイナゴマメゴムと複合したＰＤＧＦ、（ｉｉ）コラーゲン／イナゴマメゴム５５：４５混合物と複合したＰＤＧＦ、（ｉｉｉ）ガンマ線照射滅菌したイナゴマメゴムと複合したＰＤＧＦ、及び（ｉｖ）ガンマ線照射滅菌したコラーゲン／イナゴマメゴム５５：４５混合物と複合したＰＤＧＦの複合体について、抽出時間に対して、測定した溶液中のＰＤＧＦ活性を示すグラフ図である。
【図７】  （ｉ）ガンマ線照射しないベータグルカンと複合したＰＤＧＦ、（ｉｉ）コラーゲン／ベータグルカン５５：４５混合物と複合したＰＤＧＦ、（ｉｉｉ）ガンマ線照射滅菌したベータグルカンと複合したＰＤＧＦ、及び（ｉｖ）ガンマ線照射滅菌したコラーゲン／ベータグルカン５５：４５混合物と複合したＰＤＧＦの複合体について、抽出時間に対して、測定した溶液中のＰＤＧＦ活性を示すグラフ図である。
【図８】  （ｉ）ガンマ線照射しないアルギネートと複合したＰＤＧＦ、（ｉｉ）コラーゲン／アルギネート５５：４５混合物と複合したＰＤＧＦ、（ｉｉｉ）ガンマ線照射滅菌したアルギネートと複合したＰＤＧＦ、及び（ｉｖ）ガンマ線照射滅菌したコラーゲン／アルギネート５５：４５混合物と複合したＰＤＧＦの複合体について、抽出時間に対して、測定した溶液中のＰＤＧＦ活性を示すグラフ図である。
【図１】
0004606587.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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