(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドの混合物中における標的ポリヌクレオチド配列に沿ったオリゴヌクレオチドプライマーの選択的伸長方法であって、その方法が、
（ａ）前記混合物、修飾を有するオリゴヌクレオチドプライマー、およびその修飾に対する抗体を組合せて用意し、ここで抗体はオリゴヌクレオチドに結合して、オリゴヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイズを阻害することで、標的ポリヌクレオチド配列に沿ったオリゴヌクレオチドの伸長を抑制するものであり、そして
（ｂ）前記組合せの温度を、抗体を不可逆的に変性して、特定の標的ポリヌクレオチド配列に沿ってオリゴヌクレオチドプライマーを選択的に伸長させるのに十分なレベルに調整することからなる方法。
【請求項２】
鋳型ポリヌクレオチドに沿ったオリゴヌクレオチドの伸長を制御する方法であって、その方法が、
（ａ）媒体中にて(ｉ)鋳型ポリヌクレオチド、(ii)その鋳型ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、そのオリゴヌクレオチドは修飾部分を含むもの、(iii)鋳型ポリヌクレオチドに沿ったオリゴヌクレオチドの伸長に必要な全ての試薬、および（iv）前記修飾部分に対する抗体であって、該抗体が修飾部分に結合して、オリゴヌクレオチドと鋳型ポリヌクレオチドとのハイブリダイズを阻害することで、鋳型ポリヌクレオチドに沿ったオリゴヌクレオチドの伸長を抑制するもの、を組合せて用意し、そして
（ｂ）その組合せの温度を上昇させてオリゴヌクレオチドから抗体を不可逆的に解離させ、鋳型ポリヌクレオチドに沿ってオリゴヌクレオチドを伸長させることからなる方法。
【請求項３】
修飾部分が修飾ヌクレオチドである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
修飾ヌクレオチドが、非天然のヌクレオチドであるか、または鎖の伸長ができないように修飾を導入した３’−ヒドロキシル基を有する天然のヌクレオチドであって、該３’−ヒドロキシル基に導入された修飾は、鋳型ポリヌクレオチドに沿ってオリゴヌクレオチドを伸長させる前に除去される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
３’−ヒドロキシル基に導入された修飾が、エステル、アミド、スルフェートまたはグリコシドを形成する修飾である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
鋳型ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡである請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ポリメラーゼ連鎖反応、単一プライマー増幅または転写をベースにした核酸増幅からなる群から選択される核酸増幅方法の一部である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）(ｉ)標的ポリヌクレオチド配列を含有すると推測される媒体、(ii)その標的ポリヌクレオチド配列の増幅を実施するために必要な全ての試薬を組合せて用意し、ここでその試薬はヌクレオチドポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸および標的ポリヌクレオチド配列に沿って伸長可能な少なくとも１つのプライマーを含むものであり、そして
（ｂ）前記組合せを標的ポリヌクレオチド配列の増幅条件に付することからなり、
前記プライマーが修飾部分を含み、そして抗体が修飾部分に結合して、プライマーと標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイズを阻害することで、標的ポリヌクレオチド配列に沿ったプライマーの伸長を抑制しうるものであり、温度サイクル過程中における温度上昇により抗体をプライマーから不可逆的に放出して、これによりプライマーを標的ポリヌクレオチド配列と結合させ、これに沿って伸長させることを特徴とする、標的ポリヌクレオチド配列の増幅方法。
【請求項９】
修飾部分が修飾ヌクレオチドである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
修飾ヌクレオチドが、非天然のヌクレオチドであるか、または鎖の伸長ができないように修飾を導入した３’−ヒドロキシル基を有する天然のヌクレオチドであって、該３’−ヒドロキシル基に導入された修飾は、プライマーを伸長させる前に除去される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
３’−ヒドロキシル基に導入された修飾が、エステル、アミド、スルフェートまたはグリコシドを形成する修飾である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
標的ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡである請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
唯一つのプライマーを使用し、且つ、標的配列が、該プライマーがハイブリダイズするその３′末端の配列とハイブリダイズしうる少なくとも１０塩基配列をその５′末端に含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
第１および第２プライマーを用いて、伸長した第１プライマーが第２プライマーの鋳型であり、伸長した第２プライマーが第１プライマーの鋳型であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
標的ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列（標的配列）の増幅方法であって、その方法が
（ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（第１プライマー）を標的配列の３′末端とハイブリダイズさせ、
（ｂ）ポリメラーゼおよびヌクレオチド三リン酸の存在下にて第１プライマーを少なくとも標的配列に沿って伸長させて、伸長した第１プライマーを形成させ、ここで第１プライマーが（１）伸長した第１プライマーまたは（２）伸長した第２オリゴヌクレオチドプライマー（第２プライマー）とハイブリダイズして、これに沿って伸長しうるものであり、伸長した第２プライマーが標的配列と相補的なポリヌクレオチド（相補的ポリヌクレオチド）とハイブリダイズしてこれに沿って伸長しうる第２プライマーの伸長の結果として生じたものであり、
（ｃ）伸長した第１プライマーを標的配列から解離させ、
（ｄ）第１プライマーまたは第２プライマーを伸長した第１プライマーの３′末端とハイブリダイズさせ、
（ｅ）第１プライマーまたは第２プライマーを伸長した第１プライマーに沿って伸長させ、
（ｆ）伸長した第１プライマーまたは伸長した第２プライマーを伸長した第１プライマーから解離させ、
（ｇ）第１プライマーを伸長した第１プライマーまたは伸長した第２プライマーの３′末端とハイブリダイズさせ、そして
（ｈ）工程（ｅ）〜（ｇ）を反復温度サイクルにより繰り返すことからなり、
第１プライマーおよび第２プライマーの少なくとも１つが、標的ポリヌクレオチドと結合する部分に修飾ヌクレオチドを含み、その修飾ヌクレオチドに対する抗体を前記組合せ中に包含させ、その抗体は修飾ヌクレオチドに結合して、プライマーと標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイズを阻害することで、標的配列に沿って前記プライマーの少なくとも１つが伸長するのを抑制しうるものであり、且つ抗体を前記温度サイクル過程中における温度上昇によりプライマーの少なくとも１つから不可逆的に放出させ、これによりプライマーの少なくとも１つを標的ポリヌクレオチド配列と結合させてこれに沿って伸長させることを特徴とする方法。
【請求項１６】
修飾ヌクレオチドが、非天然のヌクレオチドであるか、または鎖の伸長ができないように修飾を導入した３’−ヒドロキシル基を有する天然のヌクレオチドであって、該３’−ヒドロキシル基に導入された修飾は、プライマーを伸長させる前に除去される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
３’−ヒドロキシル基に導入された修飾が、エステル、アミド、スルフェートまたはグリコシドを形成する修飾である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
標的ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡである請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
第１プライマーのみを用いて、標的配列がその５′末端において、そのプライマーとハイブリダイズする標的配列の３′末端の配列とハイブリダイズしうる少なくとも１０塩基配列を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
第１プライマーおよび第２プライマーが異なり、伸長した第１プライマーが第２プライマーの鋳型であり、そして伸長した第２プライマーが第１プライマーの鋳型であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドプライマーの３′末端部分にある請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
標的ポリヌクレオチドの標的配列の検出方法であって、その方法が（ａ）(ｉ) 第１オリゴヌクレオチドプライマー（第１プライマー）を標的配列の３′末端とハイブリダイズさせ、
(ii) ポリメラーゼおよびヌクレオチド三リン酸の存在下にて第１プライマーを少なくとも標的配列に沿って伸長させて、伸長した第１プライマーを形成させ、第１プライマーが（１）伸長した第１プライマーまたは（２）伸長した第２オリゴヌクレオチドプライマー（第２プライマー）とハイブリダイズして、これに沿って伸長しうるものであり、伸長した第２プライマーが標的配列と相補的なポリヌクレオチド（相補的ポリヌクレオチド）とハイブリダイズしてこれに沿って伸長しうる第２プライマーの伸長の結果として生じたものであり、
(iii) 伸長した第１プライマーを標的配列から解離させ、
(iv) 第１プライマーまたは第２プライマーを伸長した第１プライマーの３′末端とハイブリダイズさせ、
(ｖ) 第１プライマーまたは第２プライマーを伸長した第１プライマーに沿って伸長させ、
(vi) その伸長した第１プライマーまたは伸長した第２プライマーを伸長した第１プライマーから解離させ、
(vii) 第１プライマーを伸長した第１プライマーまたは伸長した第２プライマーの３′末端とハイブリダイズさせ、そして
(viii) 工程（ｖ）〜（vii）を繰り返すことからなる方法により標的配列を増幅させ、次いで
（ｂ）伸長した第１プライマーおよび／または伸長した第２プライマーを検出することからなり、
第１プライマーおよび第２プライマーの少なくとも１つが、標的ポリヌクレオチドと結合する部分に修飾ヌクレオチドを含み、その修飾ヌクレオチドに対する抗体を前記組合せ
中に包含させ、その抗体は修飾ヌクレオチドに結合して、プライマーと標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイズを阻害することで、標的配列に沿って前記プライマーの少なくとも１つが伸長するのを抑制しうるものであり、且つ抗体を前記温度サイクル過程中における温度上昇により前記プライマーの少なくとも１つから不可逆的に放出させ、これにより前記プライマーの少なくとも１つを標的ポリヌクレオチド配列と結合させてこれに沿って伸長させることを特徴とする方法。
【請求項２３】
工程(ｖ)〜(vii)の繰り返しが反復温度サイクルにより実施される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
標的ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡである請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
第１プライマーのみを用いて、標的配列がその５′末端において、その第１プライマーとハイブリダイズする標的配列の３′末端の配列とハイブリダイズしうる少なくとも１０塩基配列を含むことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
第１プライマーおよび第２プライマーが異なり、伸長した第１プライマーが第２プライマーの鋳型であり、そして伸長した第２プライマーが第１プライマーの鋳型であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
1.本発明の技術分野
著しく高い疾病率および死亡率は、感染症と関連する。より早く正確な診断方法が、疾病のより優れたモニタリングおよび治療に必要とされている。ＤＮＡプローブ、核酸ハイブリダイゼーションおよびインビトロでの増幅技術を用いた分子的手法は、患者の診断に使われているある慣用法に利点をもたらす将来有望な方法である。
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法として知られたＤＮＡの特異的断片の酵素学的増幅方法は、今までに記述されている。このインビトロにおける増幅方法は、変性，オリゴヌクレオチドプライマーのアニ−リング、および好熱菌のポリメラーゼによるプライマー伸長の繰り返しサイクルをベースとし、その結果、隣接領域のコピー数が急激に増加することになる。ＤＮＡの反対のストランドにアニ−ルしている、異なったＰＣＲプライマーは、ポリメラーゼが触媒する１個のプライマーの伸長産物が、もう一方の鎖の鋳型として役立ち、不連続断片を蓄積させ、その断片の長さはオリゴヌクレオチドプライマーの各５‘-末端の間の距離により決定され得るように、位置している。
【０００３】
核酸シークエンスを増幅させるための他の方法も記述されている。この方法はシングルプライマー増幅と称される。この方法は、標的シークエンスが比較的短い相補的シークエンスの隣接に位置するステムループまたは逆リピート構造を有する標的シークエンスの増幅を提供する。ポリヌクレオチド検体の存在をに関して、このような標的シークエンスを作成するいろいろな方法もまた記述されてきた。
【０００４】
上記の増幅法は、一つの特異的なヌクレオチドシークエンスをもつと推測されるサンプルを、約９５℃に熱し、次いで、1、2℃低い温度と約95℃の間で、繰り返し熱的に循環させることを必要とする。より高い温度では二重螺旋が変性し、そしてより低い温度ではプライマーのハイブリダイゼーションおよび鎖伸長ができる。
【０００５】
上記の方法は、ごく少量の標的DNA分子を、高感度で検出する非常に強力な技術である。最初の標的DNA分子の数と特異的に増幅された産物の数との間の相関関係は、多くの可変因子により影響を受ける。緩衝液または温度条件における小さな差異は、反応から反応への増幅効率に多大な影響を与えることができる。さらに、ＤＮＡ標的の臨床サンプルは、酵素的増幅を抑制することができる阻害因子を含み得る。その上、このような臨床的なサンプルもまた、無関係なＤＮＡを含み、そしてそれらは標的ＤＮＡ分子に対して大過剰に存在することができる。
【０００６】
上記の増幅方法は、無関係なＤＮＡ、すなわち標的ＤＮＡではないＤＮＡ、およびプライマーが非特異的または非選択的に結合するＤＮＡの、このように増幅に使用されるプライマ−のランダムな部分的ハイブリダイゼーションにより、妨害されてしまう。このように、この酵素とプライマーに対する、標的ＤＮＡおよび無関係なＤＮＡとの競合が、創出される。 その結果、標的ＤＮＡ分子の増幅の効率が減少する。いくらよく見ても、これでは増幅した標的ＤＮＡと増幅した無関係のＤＮＡを識別するのは困難なことになる。標的ＤＮＡの検出を完全に阻害するために、無関係なＤＮＡを実質的な程度まで増幅することで、標的ＤＮＡの特異的な増幅を妨害できる。
【０００７】
この問題に対するひとつのアプローチは、ポリメラーゼを活性化するために必要である重要な試薬、例えばポリメラーゼ酵素またはマグネシウムを添加する前に、９５℃に反応混合物を加熱することにより、低温で非特異的にハイブリダイズしたプライマーの鎖伸長を回避することである。これは、高温に至るまで、いろいろな反応成分を分離するワックスの一層を用いることにより、達成され得る。あるいはまた、ポリメラーゼに対する阻害抗体を、低温で添加することができる。その抗体は高温で変性し、そして酵素を再活性化させる。他の方法では、ＰＣＲ反応におけるポリメラーゼとしてAmpliTaq Gold酵素を使用することが挙げられる。一つのオリゴヌクレオチドプライマーの鎖伸長を含む他の方法は、核酸の違いを検出する方法で、短く言えば、分岐点移動法は、二つの相対する核酸シークエンスの違いを検出する。その方法では、もし、二つの相対する核酸シークエンス間で違いがみられるならば、二重螺旋形での核酸シークエンスの両方から成る安定な4分子複合体が形成される。通常は、その複合体は一つのホリデイ連結を構成する。その複合体中の少なくとも１対の非相補的ストランドの両方が、標識されている。複合体の部分としての標識の会合は、二つの相対したシークエンス間での違いの存在の表示として測定される。この方法は標的核酸シークエンスにおける変異の存在を検出するのに用いることができる。
【０００８】
二つの相対したＤＮＡシークエンス間の違いを検出する上記の方法において、非特異的プライミングは、ＤＮＡ分岐点移動の阻害により変異を検出する問題になりうる。全ての増幅産物は、テイル・プライマーの“テイル”シークエンスを取込み、そしてそれ故に、両方の特異的ＰＣＲ産物およびお互いとで、４ストランドDNA複合体との形成に参加することができる。連結の両端のシークエンスは、お互い完全に異なっているので、このような複合体は、分岐点移動により、ストランドは決して分離せず、したがって非特異的なシグナルを生むことは決してない。この問題を多少とも解決するための方法のひとつは、2段階ＰＣＲ法またはネステッドＰＣＲの使用である。しかし、1セットのプライマーのみを用いたシングルＰＣＲ反応を使った上記の方法を行うことが大変望ましい。
上記の問題を回避するために、上記に述べた方法よりも安価でより制御しやすい方法が望まれている。
【０００９】
2.関連する技術の記載
米国特許No. 5,338,671 (Scalice, et  al.)は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびポリメラーゼを阻害する抗体とを用いてＤＮＡの増幅について論述している。
ポリメラーゼ連鎖反応試薬の貯蔵中におけるプライマーのダイマー化を阻害する組成物と方法については、米国特許No.5,565,339 (Bloch, et al) (Bloch I)に開示されている。
ポリメラーゼ連鎖反応におけるグリースまたはワックスの使用は、米国特許No, 5,411,876 (Bloch, et al.) (Bloch II)に記述されている。
米国特許No. 5,599,660 (Ramanujam, et al.)は、ワックスに埋め込まれた、不活性な生物学的試薬および化学的試薬のシークエンシャルデリバリーのための方法と調製を開示している。
【００１０】
ＤＮＡ増幅における非特異的プライミングを減らすための方法が、米国特許 No. 5,348,853 (Wang, et al.)に開示されている。
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを直接中和するモノクローナル抗体により促進され、ホットスタートＰＣＲにおいて使用するＴａｑＳｔａｒｔ  ＡｎｔｉｂｏｄｙTMは、Kellogg,  et al., BioTechnigues (1994) 16(6). 1134-1137に記述されている。
反応組成物およびテスト・キットおよびそれに有用なテスト・デバイスに減量剤を入れた、標的核酸の共増幅は、米国特許No. 5,705,366 (Backus)において論述されている。
親和性固定化されたTaq DNA ポリメラーゼの熱による活性化はNilsson, eｔ al , in BioTechniques (1997) 22(4): 744-751に記述されている。
Dang, et al., J. Mol. Biol. (1996) 264:268-278では、PCRによる低コピー数の標的を検出するのを促進するTaqポリメラ−ゼのオリゴヌクレオチド阻害剤について論述している。
【００１１】
PCRの特異性を増強する簡単な操作は、 Weighardt,et al., PCR Methods and Applications (1993) 3:77-80に記述されている。
Birch, et al.. Nature (1996) 381:445-446に、AmpliTaq Gold enzymeを用いた簡便なホットスタートＰＣＲが論述されている。
Chou, et al., NucleicAcids Research (1992) 20:1717-1723により、ワックス・ビーズを用いたホットスタート法が開示されている。
W. B. Barnesは、Proc Nat. Acad. Sci. USA(1994)91:2216-2220に、λ-バクテリオファージ・テンプレートから高い忠実度および高収量で35ｋｂまでのＰＣＲ増幅ができることについて論述されている。
ＰＣＴ出願WO 96/03526A1 (Niveleau)では修飾したヌクレオチドを用いた核酸の増幅方法、および抗体を使用した増幅産物の検出を論述している。
Backman等は、米国特許No.5,792.607においてポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応の両方に適用できる標的核酸増幅のための方法およびキットを開示している。
【００１２】
核酸シーケンスの増幅、検出および/またはクローニングのプロセスは、米国特許  No. 4,683,195.に開示されている。
米国特許 No. 5,508,178 (Rose, et at.)では、一つのポリヌクレオチド・プライマーを用いた核酸の増幅について記述している。
プライマーとしてランダムシークエンスのオリゴヌクレオチドを用いる核酸シーケンスの増幅は米国特許  No.5,043,272(Hartley)に記述されている。
Nickel, etal., J. Biol. Chem. (1992) 267:848-854 では、細胞のＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡプライマーゼと、アジドチミジン  トリホスフェートとの相互作用について記述している。
EP 0439182 (Beckman, et a/.) は、ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応の両方に適用できる標的核酸を増幅する方法を論述している。
【００１３】
【発明の概要】
最も広範な特徴において、本発明は、ポリヌクレオチドの混合物中で、特異的な標的ポリヌクレオチドシークエンスに沿ったオリゴヌクレオチドプライマーを選択的に伸長する方法に関する。上記混合物、一つの修飾を有するオリゴヌクレオチドプライマー、およびその修飾のための結合物質からなる一つの組み合わせが提供され、そこではその結合物質がそのオリゴヌクレオチドに結合し、標的のポリヌクレオチドシークエンスに沿ったオリゴヌクレオチドの伸長を阻害している。その組合わせの温度は、その結合物質を不可逆的に変性させるのにそして特異的な標的ポリヌクレオチドシークエンスに沿ってオリゴヌクレオチドプライマーの伸長を可能にする十分な程度まで、連続的または循環的に調節される。
【００１４】
本発明の他の特徴は、鋳型であるポリヌクレオチドに沿って、オリゴヌクレオチドの伸長を制御する方法である。一つの組合わせは一つのメジウムで提供される。 その組み合わせは、（ｉ）鋳型ポリヌクレオチド（ii）少なくとも一部が修飾された部分から成るオリゴヌクレオチドである鋳型ポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド(iii)鋳型ポリヌクレオチドに沿ったオリゴヌクレオチドの伸長に必要とされる全ての試薬、および（iv）修飾された部分に対する結合物質からなる。その結合物質は、修飾された部分に結合するすることができ、そしてオリゴヌクレオチドの鋳型ポリヌクレオチドに沿った伸長を阻害することができる。その組合わせは、結合物質をオリゴヌクレオチドから不可逆的にリリースし、そしてオリゴヌクレオチドの、鋳型ポリヌクレオチドに沿う伸長ができる条件に付される。
【００１５】
本発明の他の特徴は、標的ポリヌクレオチドシークエンスの増幅方法である。 (i)標的ポリヌクレオチドシークエンスを含むと推測されるメジウム (ii)標的ポリヌクレオチドシークエンスの増幅を行う必要がある全ての試薬、すなわちヌクレオチドポリメラーゼから成る試薬、ヌクレオチドトリフォスフェートおよび標的ポリヌクレオチドシークエンスに沿って伸長することのできる少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプライマーからなる試薬からなる一つの組み合わせが提供される。そのオリゴヌクレオチドプライマーは修飾された部分からなる。その修飾された部分に対する結合物質は，その組合わせに含まれる。その結合物質は修飾された部分に結合し、そしてプライマーの標的シークエンスに沿った伸長を阻害することができる。その組合わせは、標的ポリヌクレオチドシークエンスを増幅するための条件に付される。このような条件下では、結合物質は、温度サイクルの間に、 不可逆的にプライマーからリリースされ、その結果、プライマーが結合され、標的ポリヌクレオチドシークエンスに沿って延びることができる。
【００１６】
本発明の他の特徴は、標的ポリヌクレオチドのポリヌクレオチドシーケンス (“標的シーケンス")を増幅する方法である。最初のオリゴヌクレオチドプライマー(“第1プライマー")は、標的シーケンスの３’末端にハイブリダイズする。第一プライマーは、ポリメラーゼおよびヌクレオチドトリフォスフェートの存在下で、少なくとも、第1プライマーが伸長できる標的シーケンスに沿って伸長する。第一プライマーは、ハイブリダイズして(1)伸長された第1プライマーまたは(2)伸長した第2オリゴヌクレオチドプライマー("第2プライマー")に沿って伸長することができる。伸長した第2プライマーは、第2プライマーの伸長物が、ハイブリダイズし、標的シーケンスに相補的であるポリヌクレオチド(相補的ポリヌクレオチド)に沿って伸長することができる。伸長した第1プライマーは標的シークエンスから分離する。第1または第2のプライマーは、伸長した第一プライマーの３’末端にハイブリダイズし、そして第1プライマーまたは第2プライマーは、伸長した第1プライマーに沿って伸長する。伸長した第１プライマーまたは伸長した第2のプライマーは、伸長した第一プライマーから解離する。第1プライマーは伸長した第1プライマーまたは伸長した第2プライマーの３’末端にハイブリダイズする。温度サイクルの繰り返しにより、第１および/または第２プライマーと伸長したプライマーを含むハイブリダイゼーション段階が、繰り返される。そのプライマーは、一部が標的ポリヌクレオチドに結合する修飾されたヌクレオチドを含む。修飾されたヌクレオチドに対する抗体はその組み合わせに含まれる。抗体は修飾したヌクレオチドに結合することができ、そしてプライマーが標的シークエンスに沿って伸長することを妨げる。抗体は、温度サイクルの間、プライマーから不可逆的にリリースされ、それによりプライマーが標的ポリヌクレオチドシークエンスに結合し、それに沿って伸長させることができる。
【００１７】
本発明の他の特徴は、 標的ポリヌクレオチドの標的シークエンス (“標的シークエンス") を検出する方法である。標的シーケンスは、上記のシークエンスに似た方法に従属する。伸長した第一のプライマーおよび／または伸長した第2プライマーが検出される。そのプライマーは、その一部が標的ポリヌクレオチドに結合する、修飾されたヌクレオチドを含有する。修飾されたヌクレオチドの抗体は、その組み合わせに含まれる。抗体は，修飾されたヌクレオチドに結合することができ、そしてプライマーが標的シークエンスに沿って伸長されるのを防ぐ。抗体は、温度サイクルの間、プライマーから不可逆的にリリースされ、その結果、プライマーの結合および標的のポリヌクレオチドシークエンスに沿った伸長を妨害する。
【００１８】
本発明のもうひとつの特徴は、(a)少なくとも一部分が鋳型ポリヌクレオチドの一部分にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、修飾した部分を含有するオリゴヌクレオチド、(b)鋳型ポリヌクレオチドに沿ったオリゴヌクレオチドの伸長のための試薬および(c)修飾した部分に対する抗体からなる包装した組み合わせでのキットである。抗体は、修飾した部分に結合することができ、そしてオリゴヌクレオチドが鋳型ポリヌクレオチドに沿って伸長するのを妨げる。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明では、オリゴヌクレオチドプライマーの未熟なハイブリダイゼーションおよび伸長が、易熱性結合物質（例えば蛋白質）によるオリゴヌクレオチドプライマーとの特異的結合によって抑制される。本オリゴヌクレオチドプライマーは、通常は（必然的ではないが）鋳型のポリヌクレオチドと結合するオリゴヌクレオチドプライマーの部分に修飾部分を含む。前記結合部分は本修飾部分に特異的で、オリゴヌクレオチドプライマーと結合し、それによってポリメラーゼの嵌合およびオリゴヌクレオチドの早すぎる活性化および／またはそれに続く伸長を防止する。プライマーの活性化およびハイブリダイズしたプライマーの伸長は結合物質（これは易熱性である）の結合によって阻止される。反応媒体の温度の上昇はこの結合物質を不活化させる。結合物質の不活化は、結合物質とオリゴヌクレオチドプライマーの複合体の解離、オリゴヌクレオチドプライマーの遊離、特異的なプライマー−鋳型ポリヌクレオチドハイブリッドの形成、オリゴヌクレオチドプライマーの３’終末部の活性化および鋳型ポリヌクレオチドに対応するプライマーの伸長をもたらす。
【００２０】
本発明は、増幅プロセスの開始前に増幅に必要なすべての試薬を１つの反応混合物に加えることを可能にする。検出のための増幅生成物の分析、配列分析などが本方法によって極めて簡略化される。結合物質は高い温度で不可逆的に不活性になるので、結合物質によって増幅反応の後の分析は干渉されない。したがって本発明は、非特異的な増幅生成物の主たる原因である低温での非特異的プライミングを排除する。本方法は、一般に使用するポリメラーゼに左右されない。しかしながら下記で説明するように、ある環境下ではエキソヌクレアーゼが必要であろう。
【００２１】
本発明は、一本鎖ＤＮＡと特異的に結合する抗体を使用するよりも利点を提供する。サンプル調製時にサンプルＤＮＡの一本鎖種を生成することは一般的である。これはＤＮＡ抗体の結合に競合し、したがって非特異的プライマー伸長を起こす活性なプライマーの早すぎる遊離を生じる可能性がある。本発明のまた別の利点は、オリゴヌクレオチドプライマー内に修飾部分を作ることが必要とされるだけであるということである。この修飾部分は、鋳型ポリヌクレオチドの対応する部分と結合するオリゴヌクレオチドの部分内に存在するか、またはこの修飾部分はその３′終末部、３′末端または５’末端に存在するであろう。本方法は、増幅反応混合物の低温での混合を可能にし、したがって増幅工程を簡略化させる。
【００２２】
本発明の方法は単独で用いて上記の利点を達成できる。しかしながら、本方法を他の“ホットスタート”法と併用して実施することも本発明の範囲内である。例えば、本方法をワックスビーズと一緒に用いてもよい。
【００２３】
本発明では、標的ポリヌクレオチド配列の増幅は、修飾部分を有するオリゴヌクレオチドおよび結合物質（前記修飾部分に特異的に結合する）を用いて実施される。結合物質とオリゴヌクレオチドプライマーとの複合体の形成は、オリゴヌクレオチドプライマーが鋳型ポリヌクレオチドに沿って伸長される能力を抑制する。増幅試薬のすべてをサンプルと一緒に混合したとき、混合物中に存在する任意の鋳型ポリヌクレオチドに対応するプライマーの伸長は、前記結合物質とオリゴヌクレオチドプライマーとの複合体の存在のために抑制される。温度が上昇するにつれ、結合物質はプライマーとの複合体から解離する。オリゴヌクレオチドプライマー（その前に未結合であれば）は鋳型ポリヌクレオチドと結合し、鎖が伸長される。無関係のＤＮＡから生じるバックグラウンド生成物は極めて減少する。なぜならば鎖の伸長は高い温度でのみ惹起され、この高い温度では結合は比較的選択的であるからである。
【００２４】
反応媒体は、結合物質がオリゴヌクレオチドプライマーとの複合体から解離する制御条件に付され、それによって、オリゴヌクレオチドプライマーはポリヌクレオチド鋳型に沿って伸長するために制御された態様で遊離される。
【００２５】
本方法は、オリゴヌクレオチドの鎖の伸長が鋳型に対応して惹起される多数の方法に利用される。そのような方法の１つは、標的ポリヌクレオチド配列の増幅、例えば温度サイクリングを用いて実施される増幅である。本方法の使用によって、有意義な結果を提供するために十分に低いバックグラウンドを増幅方法が提供するためにこれまで必要とされていたネスティッド（nested）プライマーまたは他の手段を使用する必要がなくなった。
本発明の個々の実施態様をさらに説明する前に、多数の用語を定義する。
【００２６】
オリゴヌクレオチドの鎖の伸長：鋳型ポリヌクレオチド（ヌクレオチドの鎖）に沿ったオリゴヌクレオチドの伸長で、鋳型ポリヌクレオチドの相補物である鎖の伸長生成物を生じる。前記ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部分とハイブリダイズし、前記の部分に沿って伸長されるので鋳型である。一般に、プライマーの伸長反応では、プライマーは、ポリヌクレオチド内の少なくとも鋳型配列とハイブリダイズし、前記鋳型配列に沿って伸長（鎖が伸長）される。伸長されたプライマーは”鎖の伸長生成物”である。鋳型ポリヌクレオチドに対応するオリゴヌクレオチドプライマーの鎖の伸長を実施するための試薬には、ヌクレオチドポリメラーゼおよびヌクレオシド三リン酸が含まれる。鎖の伸長工程は、例えばポリヌクレオチドの増幅、ある遺伝子またはそのフラグメントのクローニングを目的とするｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡの生成のような工程で利用される。
【００２７】
増幅という場合には、鎖の伸長は温度サイクリング、すなわち反応混合物の温度を上昇させてハイブリダイズしたポリヌクレオチド配列を変性させ、反応混合物の温度を低下させてオリゴヌクレオチドプライマーをその対応する標的ポリヌクレオチド配列と結合させ、さらに続いて標的ポリヌクレオチド配列に沿って伸長させ、上記のサイクルを繰り返す。しかしながら、標的ポリヌクレオチドは温度サイクリングを実施せずに増幅させてもよい。
【００２８】
オリゴヌクレオチドプライマーの鎖の伸長を利用する重要な方法の１つは、核酸またはポリヌクレオチド（例えば標的ポリヌクレオチド配列）を増幅させるための方法である。そのような方法は、一般に１つまたは２つ以上の核酸もしくはポリヌクレオチド分子のコピーの生成、または核酸もしくはポリヌクレオチド分子（通常は媒体中に存在する標的ポリヌクレオチド配列）の相補物の１つまたは２つ以上のコピーの生成をもたらす。
【００２９】
個々の二本鎖ＤＮＡ配列の酵素的増幅を目的とするそのような方法の１つは、上記で説明したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）として知られている。このin vitro増幅方法は、変性、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、および耐熱性の鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼによるプライマーの伸長、すなわちそのようなプライマーの“鎖の伸長”の反復サイクルを基にしており、これによって指数関数的なコピー増加、すなわち前記プライマーに接する標的ポリヌクレオチド配列の“上記プライマーの鎖の伸長生成物”を生じる。２つの異なるＰＣＲプライマー（これらはＤＮＡの対抗する鎖とアニールする）は、一方のプライマーのポリメラーゼ触媒伸長生成物が他方の鋳型鎖として機能できるように配置され、オリゴヌクレオチドプライマーの５′末端間の距離によってその長さが規定される別個の二本鎖フラグメントの蓄積をもたらす。
【００３０】
増幅のための別の方法は上記で述べたが、シングルポリヌクレオチドプライマーを用いる一本鎖ポリヌクレオチドの増幅を含む。増幅されるべき一本鎖ポリヌクレオチドは互いに相補的な２つの非連続配列を含み、したがって一緒にハイブリダイズしてステム−ループ構造を形成することができる。この一本鎖ポリヌクレオチドは既に標的ポリヌクレオチド配列の部分であるか、または標的ポリヌクレオチド配列の存在の結果として生成される。
【００３１】
オリゴヌクレオチドプライマーの鎖の伸長を含むまた別の方法は、核酸中の違いを検出する方法である。一般に、この方法では２つの関連する核酸配列を含むと思われる媒体は、２つの部分的二重体を提供するために以下のように処理される。この二重体の各々は、一方の端に非相補的な末端部分を有する完全に適合した二重体を含む。この部分的二重体は、その異なる部分を除いて、前記二重体の一方の二重体の鎖の一方（Ｓ１）が二重体の他方の鎖の一方（Ｓ１′)と相補的で、さらに二重体の一方の二重体の鎖の他方（Ｓ２）が二重体の他方の鎖の他方（Ｓ２′) と相補的であるという点で関連性を有する。Ｓ１とＳ１’が結合し、Ｓ２とＳ２′がそれぞれ結合できる条件に前記媒体を曝す。この関連核酸配列間に違いが存在する場合、Ｓ１、Ｓ１′、Ｓ２およびＳ２′を含む安定な複合体が形成される。安定な複合体が形成されたか否かが決定されるが、安定な複合体の存在は、この関連核酸配列間に相違が存在することを示唆する。
【００３２】
修飾部分─修飾を含む部分であって、前記修飾によって、そのような修飾を含まない部分とそのような修飾を含む部分とが区別される。
ヌクレオチド─塩基・糖・リン酸の結合体、例えば核酸ポリマー（すなわちＤＮＡおよびＲＮＡ）のノマーユニット。
天然のヌクレオチド─天然に一般に見出されるヌクレオチド。そのような天然のヌクレオチドはアデニン、ウリジン、シチジン、チミジン、グアニンなどの塩基を含む。
【００３３】
非天然ヌクレオチド─いくつかの修飾によって天然のヌクレオチドと異なる修飾ヌクレオチド中のユニット。本発明の目的のための非天然ヌクレオチドの特性は、修飾オリゴヌクレオチドの定義で下記に詳細に説明されている。結合物質が結合していないときは、非天然ヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチド鋳型ポリヌクレオチドとハイブリダイズする能力、鋳型ポリヌクレオチドに沿って伸長する能力に顕著な程度には影響を与えないかまたは全く影響しないであろう。非天然ヌクレオチドが前記の能力に影響を与える事例では、前記非天然ヌクレオチドはプライマーの３’末端から遠位に存在するか、または伸長前にプライマーから除去されるべきである。前記の非天然ヌクレオチドの例はエテノ−ｄＡである。
【００３４】
ヌクレオシド─塩基・糖結合体すなわちリン酸部分を欠くヌクレオチド。
標的ヌクレオチドの標的配列−特定されるべきヌクレオチドの配列で、通常ポリヌクレオチド分析物の一部分（標的ポリヌクレオチド）または全体の中に存在する。前記ポリヌクレオチド分析物がどのようなものであるかは、標的ポリヌクレオチド内に含まれる標的配列を増幅するために必要な種々のプライマーおよび他の分子の調製が十分に実施できる程度に既知である。一般に、プライマーの伸長では、増幅プライマーは標的ポリヌクレオチド内の少なくとも標的配列とハイブリダイズし、これに沿って伸長（鎖が伸長）し、したがって標的配列は鋳型として機能する。伸長したプライマーは鎖の“伸長生成物”である。標的配列は通常は２つの規定配列の間に存在するが、必ずしもその必要があるわけではない。一般に、プライマーは、規定配列または前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部分（通常はその３′末端の少なくとも１０ヌクレオチドセグメント、好ましくは１５、より好ましくは２０〜５０ヌクレオチドセグメント）とハイブリダイズする。標的配列は、通常は約３０〜５０００またはそれ以上のヌクレオチド、好ましくは５０〜１０００ヌクレオチドを含む。標的ポリヌクレオチドは、一般に大きな分子の一部分であるか、または実質的に完全な分子（ポリヌクレオチド分析物）であろう。標的ポリヌクレオチド配列内の最少ヌクレオチド数が、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在がサンプル中のポリヌクレオチド分析物の存在の特異的指標であることを担保できるように選択される。非常に大ざっぱに言えば、配列の長さは通常は１.６ｌｏｇＬヌクレオチドより大で、ここでＬは、サンプルの生物学的供給源のゲノムにおける塩基対数である。標的ポリヌクレオチドの最大ヌクレオチド数は、通常はポリヌクレオチド分析物の長さ、並びに単離時の剪断または他のプロセスおよびアッセイのためにサンプルを調製するために必要な他の一切の処理による破壊され易さ、並びに前記配列の検出および／または増幅の効率によって決定される。
【００３５】
オリゴヌクレオチド─一本鎖ポリヌクレオチドで通常は合成ポリヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、通常は長さが約５から約１５０またはそれ以上のヌクレオチド、好ましくは約１０〜約１００ヌクレオチド、より好ましくは約１５から約５０ヌクレオチドを含む。多様な周知の技術をオリゴヌクレオチドの調製に用いることができる。そのような配列は、生物学的合成または化学的合成によって得ることができる。短い配列（約１００ヌクレオチドまで）のためには、生物学的合成に比べて化学的合成がしばしば経済的である。より長い配列のためには、分子生物学で利用される標準的複製方法が用いられ、例えば文献に記載されたように（J. Messing, Methods Enzymol. 101：20-78(1983))、一本鎖ＤＮＡのためにはＭ１３が使用される。
【００３６】
標準的なクローニング技術の他に、in vitro酵素法、例えばポリメラーゼ触媒反応を用いることができる。ＲＮＡの調製には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよび適当なＤＮＡ鋳型が用いられる。ＤＮＡの場合には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびシングルプライマー増幅が便利である。
【００３７】
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド合成の他の化学的方法には、ホスホトリエステリおよびホスホジエステル法（Narang, et al., Meth. Enzymol. 68:90（1979)）および支持体上での合成（Beaucage, et al., Tetrahedron Letters 22:1859-1862（1981)）がホスホルアミデート法（M.H. Caruthers, et al., Methods in Enzymology, 154：287-314(1988); in "Synthesis and Applications of DNA and RNA", S.A. Narang, editor, Academic Press, New York,(1987）およびその中に含まれる文献）と同様に含まれる。
【００３８】
オリゴヌクレオチドの終末部─本明細書で用いられるように、この用語は、オリゴヌクレオチドの３’または５′末端の終末ヌクレオチドを指す。
オリゴヌクレオチドプライマー─例えば核酸の増幅において鋳型ポリヌクレオチドを基にする鎖の伸長で通常用いられるオリゴヌクレオチド。オリゴヌクレオチドプライマーは通常は合成デオキシヌクレオチドで、一本鎖であり、標的ポリヌクレオチドの規定配列とハイブリダイズできる配列をその３′末端に含んでいる。通常は、オリゴヌクレオチドプライマー（特にその３’末端）は、前記規定配列に対して好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、もっとも好ましくは１００％相補的である。標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイズ可能な配列中のヌクレオチド数は、オリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせるために用いられるストリンジェンシー条件が過剰な非特異的ランダムハイブリダイゼーションを防止することができるようなものでなければならない。オリゴヌクレオチドプライマー中のヌクレオチド数は、前記プライマーが結合する標的オリゴヌクレオチドの規定配列と同じ、すなわち少なくとも１２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド、一般には約１２から約５０ヌクレオチド、好ましくは約１５から約３０ヌクレオチドであろう。
【００３９】
修飾オリゴヌクレオチド─修飾を含むオリゴヌクレオチド。すなわち、非修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドと比較したとき、１つまたは２つ以上の（ｉ）４種の一般的に認識されているヌクレオチドとは異なる天然のヌクレオチドを有し、したがってそのようなヌクレオチドに関して修飾されているか、または本明細書では時に“ヌクレオチド類似体”と称する（ｉｉ）化学的な修飾を有する非天然のヌクレオチド（修飾ヌクレオチド）を有するオリゴヌクレオチド。修飾を含む天然または非天然ヌクレオチドが結合物質と結合するとき、オリゴヌクレオチドプライマーは、それが結合するポリヌクレオチドに沿って伸長することができない。したがって、結合物質とオリゴヌクレオチドプライマーとの複合体が解離し、結合物質が不可逆的に変性するまで、鎖の伸長は実質的レベルでは発生しない。
【００４０】
修飾オリゴヌクレオチドのための修飾ヌクレオチドは、結合物質と十分に結合してオリゴヌクレオチドが実質的なレベルで鋳型ポリヌクレオチドに沿って伸長できないように選択される。結合物質は、修飾ヌクレオチドに対して少なくとも約１０-8、通常は約１０-9から約１０-11の結合親和性をもたねばならない。
【００４１】
修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、好ましくは約１から約３の修飾ヌクレオチドを好ましくは連続配列内に有する。修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプライマーが鋳型ポリヌクレオチドの対応する部分と結合する前記プライマーの部分内に存在するか、または修飾ヌクレオチドは３′終末部、３′末端または５′末端に存在するであろう。修飾ヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドと結合するオリゴヌクレオチドの部分内に存在する場合、前記修飾ヌクレオチドはオリゴヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに干渉するものであってはならない。修飾ヌクレオチドがそのようなハイブリダイゼーションに干渉する場合は、一般に前記修飾ヌクレオチドは、一切の伸長反応の前にオリゴヌクレオチドから除去される。いくつかの実施態様では、修飾ヌクレオチドは、３′末端から少なくとも１〜２０ヌクレオチド、より通常は約１から２ヌクレオチド離れている。しかしながら、下記でさらに詳述するように、修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３′終末部または終末部近くに位置し、そのような修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに干渉する場合には、ハイブリダイゼーションの前に修飾ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドから切断するために酵素が反応混合物に添加される。
本発明の目的を達成するためのいずれの修飾も利用できる。前記修飾は、結合物質を調製または入手するためのものであろう。修飾は、結合物質が修飾オリゴヌクレオチドに結合することを可能にするものでなければならない。
【００４２】
ある実施態様では、修飾ヌクレオチドは、例えばエステル、アミド、スルフェートまたはグリコシドの形成によって修飾された３’ヒドロキシル規定配列をもち、したがって鎖の伸長ができない天然のヌクレオチドである。好ましくは、そのような修飾ヌクレオチドは易熱性または光感受性で、したがって、事例に応じて反応媒体の温度を高めたとき、または媒体を照射したときに修飾ヌクレオチドは除去できる。別の実施態様では、そのような修飾ヌクレオチドは酵素によって除去できる。そのような修飾ヌクレオチドの他の除去方法も当業者には上記の開示から考えられるであろう。例えば修飾がエステルである場合は、除去は、熱耐性エステラーゼ酵素を使用して本発明にしたがって達成できる。また別には、３’ヒドロキシル基のグリコシドが用いられる場合は、前記グリコシド結合は熱耐性グリコシダーゼによって切断される。例えば、β−ガラクトシル基が修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に結合され、耐熱性β−ガラクトシダーゼを反応媒体中で用いることができる。
【００４３】
また別の実施態様では、修飾オリゴヌクレオチドが結合物質と結合していないとき、または鋳型ポリヌクレオチドと結合していないときに、修飾ヌクレオチドが３’エキソヌクレアーゼ活性をもつ酵素によって除去できるように修飾が選択される。この方法での修飾ヌクレオチドの選択の因子の１つは、増幅に用いられるポリメラーゼの特異性である。このアプローチでは、修飾オリゴヌクレオチドは、通常はその３′末端に１つまたは２つ以上の修飾ヌクレオチドを含むものである。結合物質と修飾オリゴヌクレオチドとの複合体の解離に続いて、修飾オリゴヌクレオチドは３′エキソヌクレアーゼ活性をもつ酵素とともに加熱することによって分解される。ホスホロチオエートを用いて修飾オリゴヌクレオチドの一部分をホスホロチオエート基を過ぎたところで分解に対して抵抗性を付与してもよい。
【００４４】
通常でないヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを生成するための天然ヌクレオチドの化学的修飾は、限定的ではない例示として下記に記載されている。エテノアデノシンは、６−アミノ基と１位の環内窒素との間にエチレン架橋を有し、これは一切の可能な水素結合を阻止する。他の修飾には、グアニンの６−酸素、チミンの４−酸素、プリンの５位の環内窒素、またはピリミジンの３位の環内窒素におけるアルキル化、またはグアニンの２−アミノ基もしくはシトシンの４−アミノ基の除去が含まれる。プリンまたはピリミジン以外の複素環基もまた用いることができる。それに関しては、修飾オリゴヌクレオチドの固形相合成に便利な形態で、通常はホスホルイミデートとして購入できる誘導体を使用するのが好ましい。他の複素環には、例えばトリアジン、非置換ピリミジン、ピリジン、デアザプリン、ピリドピロールなどが含まれる。修飾オリゴヌクレオチドの個々の構造は、前記修飾オリゴヌクレオチドがハイブリダイズしていないとき、または前記修飾オリゴヌクレオチドが鎖の伸長を維持できないときに酵素がそれを除去できるかぎり重要な問題ではない。
【００４５】
本発明のまた別の適当な修飾は、ある規定部分が天然のヌクレオチドへ取り込まれたことによる修飾をもつ天然のヌクレオチドである。そのような規定部分の１つは小さな有機分子である。本方法で特に有用なそのような小分子の典型的な例には、例示すればフルオレセイン、ジギトキシン、ビオチンなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。そのような修飾オリゴヌクレオチドは当分野で周知の方法によって調製できる。例えば以下を参照されたい：“PCR Primer, A Laboratory Manual". C.W. Dueksler(Ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press(1995)。
【００４６】
適当な修飾のまた別の例は（ただしこれらに限定されない）、リボースで修飾されているヌクレオチドである。リボヌクレオチドで終わるオリゴヌクレオチドはほとんどのポリメラーゼで伸長されないので、リボヌクレオチドは候補物質である。リボヌクレオチドを用いる場合には、修飾オリゴヌクレオチドが相補鎖とハイブリダイズしていないときには外側から分解して修飾オリゴヌクレオチドからリボヌクレオチドを除去できるが、プライマーがハイブリダイズしていないときに容易にリボヌクレオチドを除去できない酵素を加える必要がある。リボースの修飾の他の例には、３′−ヒドロキシが水素以外の官能基（例えばアジド基）によって置換されているものを含む３’−デオキシ誘導体が含まれる。
【００４７】
多くの修飾ヌクレオチドおよびそのような修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは一般に入手可能であり、または文献に記載されている。例えば、エテノ−デオキシＡ、Ｏ−６−メチルデオキシＧおよびＯ−４−メチルデオキシＴが市販されている（Oligos Etc., Wilsonville, Oregon)。非水素結合ヌクレオシドが文献に報告されており（Moran et al., Nucleic Acids Research 24(11)：2044-2052(1996))、４−メチルインドールβ−ヌクレオシド、α−ナフタレンヌクレオシド、α−ピレンヌクレオシドなどが含まれる。Ｎ３−（β−Ｄ−リボフラノシド）誘導体（例えば４アミノ−１−（２′−デオキシ−β−リボフラノシル）−２（１Ｈ）−ピリジノン）およびそのような修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが報告されている（Charcruk et al., Helv. Chim. Acta 70(3):717-725(1987))。Huang et al.は、アラビノシルシトシン５′−トリホスフェートおよび他の修飾ヌクレオシドを考察している（Cancer Res. 51:6110-6117(1991))。Solomon et al.は、２−ヒドロキシピリジンおよび２−ヒドロキシキノリンのＣ−連結デオキシリボシドを報告した（Tetrahedron Letters 32(28)：3297-3300(1991)、さらにSolomon et al.の文献も 参照されたい：J. Org. Chem. 58:2232-2243(1993))。他の修飾ヌクレオシドおよび修飾オリゴヌクレオチドは周知の合成技術を用いて合成できる。
【００４８】
一般にオリゴヌクレオチドの製造のために上記で述べたような多様な周知の技術によって、化学的な修飾を修飾されるべきオリゴヌクレオチドに導入することができる。生物学的合成または化学的合成のいずれも用いることができる。あるアプローチでは、ホスホトリエステルおよびホスホジエステル法（Narang et al.,上掲書）が用いられ、さらに、支持体上での合成（Beaucage et al.,上掲書）がホスホルアミド法（M.H. Caruthers et al.,上掲書）が、 文献（“Synthesis and Applications of DNA and RNA", S.A. Narang(Ed.), Academic Press, New York,(1967) およびその中で引用された文献）に記載された他の方法と同様に用いられる。修飾ヌクレオシドをその表面に結合させた制御ポアガラスが、ホスホルアミド法を用いる固相ＤＮＡ合成のために利用可能である。したがって、自動および手動合成の両合成を実施できる。２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む修飾オリゴヌクレオチドは、３′−ヒドロキシル（これに別の修飾ヌクレオチドを付加することができる）をもつ修飾ヌクレオチドを付加し、これを繰り返すことによって同様な態様で製造できる。
【００４９】
標準的なクローニング技術の他に、in vitro酵素法（例えばポリメラーゼ触媒反応）を用いることができる。ＲＮＡの調製には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよび適当なＤＮＡ鋳型が用いられる。ＤＮＡの場合には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびシングルプライマー増幅が便利である。
別のアプローチでは、液相にただ１つの修飾ヌクレオチドを添加することによって天然のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を誘導できる。
【００５０】
本発明で用いることができる修飾ヌクレオチドを開示している上記に引用した文献のいくつかは、修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの合成もまた開示している。例えば以下を参照されたい：Solomon et al., J. Org. Chem. 58:2232-2243およびCharczuk et al., Helv. Chim. Acta 70(3):717-725(1987)。
【００５１】
結合物質−本発明では、結合物質とは、修飾オリゴヌクレオチド、より具体的には修飾オリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオチドに特異的に結合することができる物質である。本結合物質は、通常は蛋白質、通常は抗体、特異的結合蛋白質、特異的レセプターなどである。結合物質は、修飾オリゴヌクレオチドから温度に応じて解離することができるものである。通常は、結合物質は、高温（すなわち結合物質が熱変性を受ける温度）でそのような複合体から不可逆的に解離する。好ましくは、結合物質は修飾オリゴヌクレオチドとの複合体から約４５℃から約９０℃、より好ましくは約４５℃から約６０℃の温度で解離する。好ましくは、この温度は結合物質を変性させるために十分である。
【００５２】
抗体−別の分子の固有の空間的および極性構造と特異的に結合し、したがって前記構造に相補的と定義される免疫グロブリン。前記抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに前記抗体は、当分野で周知の技術、例えばホストの免疫および血清の採集（ポリクローナル）により、または持続的なハイブリッド細胞株の調製および分泌蛋白質の採集（モノクローナル）により、または天然の抗体の少なくとも特異的結合に必要なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列もしくはその変異型のクローニングおよび発現によって製造できる。抗体は完全な免疫グロブリンまたはそのフラグメントを含むことができる。前記免疫グロブリンには、種々のクラスおよびアイソタイプ、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭなどが含まれる。そのフラグメントには、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ′)2、Ｆａｂ′など、およびその単鎖類似体が含まれる。さらに、凝集物および免疫グロブリン共役物またはそのフラグメントも、特定の分子に対する結合親和性が維持されるかぎり適切な場合には使用できる。
【００５３】
一般にモノクローナル抗体の調製では、免疫原がマウスに注射され、十分な時間が経過したときマウスを屠殺し、脾細胞を採取する。所望の免疫グロブリンをコードする脾細胞の染色体を、脾細胞とミエローマ細胞またはリンパ球を一般にはポリエチレングリコールの存在下で融合させることによって不朽化させる。得られた細胞（これは融合ハイブリドーマを含む）を選別培養液（例えばＨＡＴ−培養液）で増殖させ、生存細胞を限定希釈条件を用いて前記の培養液で増殖させる。細胞を適当な容器（例えばマイクロタイターのウェル）で増殖させ、上清を所望の特異性をもつモノクローナル抗体についてスクリーニングする。
【００５４】
モノクローナル抗体の収量を高めるために種々の方法が存在する。例えばハイブリドーマ細胞を前記細胞を受容する哺乳類ホストの腹腔へ注入し、腹水を採集する。腹水のモノクローナル抗体採集量が不十分な場合、抗体はホストの血液から採集される。モノクローナル抗体の単離および精製のために種々の一般的な方法があり、モノクローナル抗体が他の蛋白質および他の夾雑物から分離される（例えば上掲書（Kohler and Milstein) を参照されたい）。
【００５５】
ホスホロチオエート─少なくとも１つのホスフェートの酸素が硫黄によって置換されたヌクレオチド一リン酸である。１つから５つのホスフェートの酸素が硫黄によって置換され、好ましくは１つから２つのホスフェートの酸素が置換される。これらの硫黄含有修飾オリゴヌクレオチドは既知の技術にしたがって調製できる。例えば以下を参照されたい：WO 9008838号、 WO 8911486号、 米国特許4910300号、 EP 318245号（これらの文献は参照により本明細書に含まれる）。
【００５６】
ヌクレオシド三リン酸─５′三リン酸置換基をもつヌクレオシド。このヌクレオシドは、プリンまたはピリミジン誘導体の窒素塩基のペントース糖誘導体である。窒素塩基はペントース糖（通常はデオキシリボースまたはリボース）の１′−炭素に共有結合されている。プリン塩基はアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、イノシン並びにその誘導体および類似体を含む。ピリミジン塩基はシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、並びにその誘導体および類似体を含む。ヌクレオシド三リン酸は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）およびリボヌクレオシド三リン酸（例えばｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰおよびｒＵＴＰ）を含む。“ヌクレオシド三リン酸”という用語はまたその誘導体および類似体を含み、これら誘導体および類似体は、その未誘導ヌクレオシド三リン酸と同様な態様で認識され重合される誘導体によって例示される。そのような誘導体または類似体の例は、例えばレポーター基で修飾された（例えばビオチン化、アミン修飾、放射能標識、アルキル化など）もので（ただしこれらに限定されない）、それらはまたホスホロチオエート誘導体、ホスファイト誘導体、環原子修飾誘導体などを含む。レポーター基は、蛍光基（例えばフルオレセイン）、化学発光基（例えばルミノール）、テルビウムキレーター（例えばＮ−（ヒドロキシエチル）エチレンジアミントリ酢酸で、これは遅発性蛍光によって検出できる）などであろう。“ヌクレオシド三リン酸”という用語はその誘導体および類似体を含む。
【００５７】
ヌクレオチドポリメラーゼ─ＤＮＡの鋳型に沿ってヌクレオチドの伸長物を形成するための触媒（通常は蛋白質酵素）であり、この場合、伸長物は鋳型に対して相補的である。ヌクレオチドポリメラーゼは、鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼで、オリゴヌクレオチドの３′末端を伸長させるために構築ブロックとしてヌクレオシド三リン酸を利用し、ポリヌクレオチドの一本鎖部分（これとオリゴヌクレオチドはハイブリダイズして二重体を形成する）と相補的な配列を提供する。
【００５８】
本発明で有用なヌクレオチドポリメラーゼは本方法で用いられる条件下で安定でなければならず、通常は耐熱性ヌクレオチドポリメラーゼである。そのような酵素は任意の供給源、例えば細胞、細菌（例えば大腸菌（E.coli))、植物、動物、ウイルス、好熱菌などから得られ、ここで、前記ポリメラーゼを化学的または遺伝子工学によって修飾して熱安定性および／または活性の増加を提供することが可能である。
【００５９】
通常はこの触媒は酵素（例えばＤＮＡポリメラーゼ）である。そのような酵素には、ｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（天然およびリコンビナント）（Stratagene, La Jolla. CA)、ＵｌｔｍａＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer, Foster City, CA)、 ｒＢＳＴＤＮＡポリメラーゼ（Epicentre Technologies, Madison,WI)、ＶＥＮＴＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA)、ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ（Promega Corp., Madison, WI)、およびＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer Manheim, Indianapolis, IN)などが含まれる。さらに文献（"PCR Primer", 上掲書、 ４〜５ページ）で詳述されている酵素もまた参照されたい（これらには以下が含まれている：ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、  ＴｆｌＤＮＡポリメラーゼ、 ＴｂｒＤＮＡポリメラーゼ、 Ｈot ＴubＤＮＡポリメラーゼなど）。さらにまた本発明の範囲内に含まれるものは、上記の酵素の２つまたは３つ以上の組み合わせ、例えばＴａｑおよびＰｆｕ（１００：１）などである。
【００６０】
３′から５′方向のエキソヌクレアーゼ─本発明の目的のための酵素は、３′から５’方向のエキソヌクレアーゼであるか、または３′から５′方向のエキソヌクレアーゼ活性を有するべきであると考えられる。この場合、本発明で意図される反応条件下では、前記酵素は、修飾オリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズしていないときは、前記修飾ヌクレオチドの３’末端からヌクレオチドの除去または切断を触媒し、さらにまたヌクレオチドポリメラーゼとしても機能できる（後者の意味ではこの酵素は３′から５′方向のエキソヌクレアーゼを含むポリメラーゼと考えられる）。この酵素は、修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチドを少なくとも修飾ヌクレオチドまで切断する。そのような意味では、分解された修飾オリゴヌクレオチドはその３′終末部で伸長可能で、標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズしたとき、オリゴヌクレオチドプライマーとして機能することができる。上記で述べたヌクレオチドポリメラーゼのいくつかはまた３′から５′方向のエキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００６１】
ポリヌクレオチド分析物─アッセイで測定されるべき化合物または組成物、すなわち重合ヌクレオチドで、無傷の天然の状態では、これは２０〜５０００００またはそれ以上のヌクレオチドを含み、単離された状態では、約３０〜５００００またはそれ以上のヌクレオチド、通常は約１００〜２００００ヌクレオチド、より好ましくは５００〜１００００ヌクレオチドを有する。したがって、天然の状態から分析物を単離することはしばしばフラグメント化をもたらすことが明らかである。ポリヌクレオチド分析物には、精製または未精製形の任意の供給源に由来する以下を含む核酸が含まれる：ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ）、ｃＤＮＡおよび他の合成ＤＮＡ、およびＲＮＡ（ｔ−ＲＮＡ、ｍ−ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡを含む）、ミトコンドリアＤＮＡおよびＲＮＡ、染色体、プラスミド生物学的材料由来の（例えば微生物（例えば細菌、酵母、ウイルス、ウイロイド、粘菌、カビ）、植物、動物、ヒト）のゲノムおよびそのフラグメントなど。ポリヌクレオチド分析物は、複合混合物（例えば生物学的サンプル）中のマイナーな部分であってもよい。分析物は、多様な生物学的材料から当分野で周知の方法によって得ることができる。そのような生物学的材料のいくつかを例示すれば、米国特許5508178号（Rose et al.)に開示されたようなものであるが、ただしこれに限定されない（この文献は参照により本明細書に含まれる）。
【００６２】
完全にまたは部分的に連続して−本発明で用いられる試薬が同時ではなく混合されるときは、１つまたは２つ以上の試薬が残りの試薬の１つまたは２つ以上とともに混合され、サブコンビネーションを作ることができる。続いて各サブコンビネーションを本方法の１つまたは２つ以上の工程に付すことができる。したがって、サブコンビネーションの各々を１つまたは２つ以上の所望の結果を達成する条件下で保温することができる。
【００６３】
ハイブリダイゼーション（ハイブリダイズする）−ヌクレオチド配列の場合には、これらの用語は本明細書では互換的に用いられる。２つのヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズする能力は、２つのヌクレオチド配列の相補性の程度に依存し、これは順次適合する相補的なヌクレオチド対に依存する。もう一方の配列と相補的なヌクレオチドがある配列で多ければ多いほど、ハイブリダイゼーションのための条件はよりストリンジェントになり、２つの配列の結合はより特異的になるであろう。高いストリンジェンシーは、温度の上昇、補助溶媒の増加、塩濃度の低下などによって達成される。
【００６４】
相同または実質的に同一─一般に、同一であるかまたは各々が同じポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる２つのポリヌクレオチド配列は相同である。２つの配列が各々少なくとも９０％、好ましくは１００％の同じまたは類似の塩基配列を有するとき（この場合チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）を同じと考える）、この２つの配列は相同または実質的に同一である。したがって、リボヌクレオチドＡ、Ｕ、ＣおよびＧは、デオキシヌクレオチドｄＡ、ｄＴ、ｄＣおよびｄＧにそれぞれ類似と考えられる。相同な配列はともにＤＮＡであるか、または一方がＤＮＡで他方がＲＮＡであろう。
【００６５】
相補的─一方の配列が他方の配列と反対方向で結合できるときは２つの配列は相補的である。この場合、各配列の３′末端は他方の配列の５′末端と結合し、一方の配列の各Ａ、Ｔ（Ｕ）、ＧおよびＣは、他方の配列のＴ（Ｕ）、Ａ、ＣおよびＧとそれぞれ結合する。
配列のコピー−ある配列から派生した、一本鎖ポリヌクレオチドの完全なコピーで、前記一本鎖ポリヌクレオチドと相補的である配列。
【００６６】
特異的結合対のメンバー（“ｓｂｐメンバー”）─２つの異なる分子の一方の分子であって、特異的に他方の分子と結合し、それにより他方の分子の固有の空間的および極性構造と相補的であると定義される、表面または空洞内の領域を有するもの。この特異的結合対の両メンバーはリガンドとレセプター（アンチリガンド）と称される。これらは免疫学的ペア（例えば抗原−抗体）のメンバーでもよく、またはオペレーター−リプレッサー、ヌクレアーゼ−ヌクレオチド、ビオチン−ストレプトアビジン、ホルモン−ホルモンレセプター、核酸二重体、ＩｇＧ−蛋白Ａ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡなどでもよい。
【００６７】
リガンド─そのためのレセプターが天然に存在するか、または調製できる任意の化合物。
レセプター（“アンチリガンド”）─分子の固有の空間的および極性構造、例えばエピトープ部位または決定基部位を認識することができる任意の化合物または組成物。レセプターを例示すれば、天然に存在するレセプター（例えばタイロキシン結合グロブリン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、レクチン、核酸、リプレッサー、保護酵素、蛋白Ａ、補体成分Ｃ１ｑ、ＤＮＡ結合蛋白質またはリガンドなどが含まれる。
【００６８】
小さな有機分子─分子量が１５００未満、好ましくは１００〜１０００、より好ましくは３００〜６００の化合物で、例えばビオチン、フルオレセイン、ローダミンおよび他の染料、テトラサイクリンおよび他の蛋白質結合分子およびハプテンなどである。この小さな有機分子はヌクレオチド配列を標識または支持体に結合させるための手段を提供することができる。
【００６９】
支持体または表面−多孔性または非多孔性の水不溶性材料。支持体は親水性または親水性にすることが可能であり、無機粉末たとえばシリカ、硫酸マグネシウムおよびアルミナ；天然のポリマー材料とくにセルロース性材料およびセルロースから誘導される材料、たとえば繊維を含む紙、たとえばろ紙、クロマトグラフィー用の紙等；合成もしくは改良した天然に存在するポリマーたとえばニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ(4-メチルブテン)、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、ポリビニルブチレート等が包含され、それら単独でまたは他の材料たとえばバイオガラスとして市販されているガラス、セラミックス、金属等と接合して使用される。天然または合成アッセンブリーたとえばリポソーム、リン脂質ベジクルおよび細胞も使用することができる。
【００７０】
sbp メンバーの支持体または表面への結合は、文献中に一般に利用できるよく知られた技術により達成することができる。たとえば，"Immobilized Enzymes" Ichiro Chibata, Halsted Press, New York, 1978 および Cuatrecasas, J.Biol.Chem. 245: 3059, 1970 を参照されたい。表面は多くの形状の任意の一つ、たとえばストリップ、ロッド、ビーズを含めた粒子等とすることができる。
【００７１】
標識またはレポーターグループもしくはレポーター分子−シグナル産生システムのメンバー。通常、標識またはレポーターグループもしくは分子はポリヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーに接合または結合されて、直接検出できるかまたは検出可能なシグナルを産生する特異的結合反応を介して検出可能である。標識には、増幅もしくはリゲーションの鋳型を提供できるか、またはレプレッサータンパク質のようなリガンドとして働くことができるポリヌクレオチドプライマーまたは特異的なポリヌクレオチド配列が包含される。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは標識を有するかまたは標識をもつことができる。一般に検出可能な任意の標識が使用できる。標識は同位元素でも非同位元素でもよく、通常は非同位元素であり、また触媒たとえば酵素、触媒をコードするポリヌクレオチド、プロモーター、染料、蛍光分子、化学ルミネッサー、補酵素、酵素物質、放射能基、小さな有機分子、増幅可能なポリヌクレオチド配列、粒子たとえばラテックスまたは炭素粒子、金属ゾル、クリスタライト、リポソーム、細胞等とすることが可能であり、これらはさらに、染料、触媒または他の検出可能なグループ等によって標識されてもよい。標識はシグナル産生システムのメンバーであり、それ単独でまたはシグナル産生システムの他のメンバーとともに検出可能なシグナルを発生することができる。標識は直接ヌクレオチド配列に結合してもよくまたヌクレオチド配列に結合する sbp メンバーに相補性な sbp メンバーに結合することによってそれに結合できるようになってもよい。
【００７２】
シグナル産生システム−シグナル産生システムは１または２以上の成分を有し、少なくとも１つの成分は標識またはレポーターグループである。シグナル産生システムはサンプル中の標的ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドアナライトの存在または量に関連するシグナルを発生する。シグナル産生システムには測定可能なシグナルを産生するのに要求される試薬すべてを包含する。標識がヌクレオチド配列に接合していない場合は、通常、ヌクレオチド配列に結合するかまたはその一部である sbp メンバーに相補性の sbp メンバーに結合する。シグナル産生システムの他の成分はデベロッパー溶液中に包含され、物質、エンハンサー、アクティベーター、化学ルミネセンス化合物、補因子、インヒビター、スカベンジャー、金属イオン、シグナル発生物質の結合に要求される特異的結合物質等が包含される。シグナル産生システムの他の成分には、補酵素、酵素産物、他の酵素および触媒と反応する物質等であってもよい。触媒産生システムは外部手段により、電磁照射線の使用により、望ましくは肉眼検査によって検出可能なシグナルを提供する。シグナル産生システムについては、さらに詳細に米国特許第 5,508,178 号（Roseら）に記載されている。この関連する開示は引用により本明細書に導入される。
【００７３】
補助材料−本発明により実施される方法およびアッセイには様々な補助材料が頻繁に使用される。たとえば、緩衝剤は通常、アッセイメジウムおよびアッセイ成分の安定剤とともに、アッセイメジウム中に存在させる。これらの添加物に加えて多くの場合、タンパク質たとえばアルブミン、有機溶媒たとえばホルムアミド、四級アンモニウム塩、ポリカチオンたとえばデキストラン硫酸、界面活性剤とくに非イオン界面活性剤、結合エンハンサーたとえばポリアルキレングリコール等が包含される。
【００７４】
上述のように、本発明の方法はその最も広い態様において、ポリヌクレオチドの混合物中、標的ポリヌクレオチド配列に沿ってオリゴヌクレオチドプライマーの選択的な伸長を提供する。この方法の特定の適用は核酸の増幅においてであり、修飾からなる部分を有し、その核酸にハイブリダイズ可能な修飾オリゴヌクレオチドが用いられる。修飾は結合物質によって結合され、増幅に使用されるポリメラーゼによって伸長され得ない修飾オリゴヌクレオチドになる。
【００７５】
この方法においては、オリゴヌクレオチドプライマーは、ポリヌクレオチドの混合物中で標的ポリヌクレオチド配列に沿って制御可能および選択的に伸長する。混合物は非天然ヌクレオチドと非天然ヌクレオチドに特異的な結合物質からなる修飾オリゴヌクレオチドとの組み合わせで提供される。修飾オリゴヌクレオチドプライマーの制御された放出は、修飾オリゴヌクレオチドプライマーとの複合体から結合物質の不可逆的放出に十分なレベルに、混合物の温度を調整することによって達成される。オリゴヌクレオチドプライマーンはインシトゥで放出され、オリゴヌクレオチドプライマーは選択的に標的配列に結合し、それに沿って伸長される。オリゴヌクレオチドプライマーの無関係なポリヌクレオチドへの結合は実質的に低下する。したがって、通常複合体からプライマーの放出に必要な温度より低い温度で起こる反応混合物中の標的オリゴヌクレオチド配列以外の任意のポリヌクレオチドに沿ったオリゴヌクレオチドプライマーの伸長は回避される。
【００７６】
本発明の一実施態様を図１に掲げる。この実施態様においては、ＰＣＲ増幅による標的ポリヌクレオチド配列（ＴＰＳ）の増幅は一例として選択され限定ではない。ＴＰＳは適当な緩衝水性メジウム中で、ＴＰＳの二重鎖の一方または他方にハイブリダイズできる修飾オリゴヌクレオチドＯＰ１およびオリゴヌクレオチドプライマーＯＰ２と混合される。ＯＰ１は修飾ヌクレオチドＭＮ１含有する。また、反応混合物中にはタンパク性結合物質（ＢＳ）、たとえばＭＮ１に対する抗体が包含される。ＢＳはＭＮ１に結合し、ＭＯ１がＴＰＳに沿って伸長されるのを防止する。したがってＯＰ１は、ＢＳによって結合された場合は、ＴＰＳに沿って伸長することはできないし、またそれがハイブリダイズする可能性がある無関係なすべてのＤＮＡに沿って伸長することができない。メジウム中にはまた、ヌクレオシドトリホスフェート（ＮＴＰ）およびヌクレオチドポリメラーゼＮＰも包含される。メジウムの温度は比較的低く、たとえば約20℃〜45℃である。反応メジウムの温度が上昇すると、結合物質ＢＳはＯＰ１から解離し、変性する。したがって、温度を上昇させるにつれて（Δで表示）、ＢＳのＯＰ１との複合体は解離し、ＢＳは変性して遊離のオリゴヌクレオチドプライマーＯＰ１および変性した結合物質ＤＢＳを与える。次のサイクル時に温度が約50℃〜80℃に下降されると、ヌクレオシドトリホスフェートおよびヌクレオチドポリメラーゼの存在下には、ＯＰ１はＴＰＳ鎖にハイブリダイズし、それに沿って伸長し、それは選択的にＴＰＳ鎖にハイブリダイズし、伸長したＯＰ１（ＥＯＰ１）を産生する。高温では、ヌクレオチド配列の互いの結合はさらに選択的で、比較的低濃度で存在するＯＰ１はＴＰＳに選択的に結合し、無関係なＤＮＡに結合する量は実質的にきわめて低下する。その結果、バックグランド産物は著しく減少する。ＯＰ２もまたＴＰＳ鎖に沿って伸長され、それはＴＰＳにハイブリダイズして伸長したＯＰ２（ＥＯＰ２）を産生する。熱サイクリングにより、ＴＰＳの多重コピーの産生を生じる。したがって、温度の制御は、ＢＳとＴＰＳの間の複合体の制御された変性によりＴＰＳに沿った優先的なＯＰ１の伸長を生じる。本発明の適用によるＰＣＲにおいて達成される効果を増強させるために、ＯＰ２もまた修飾され、修飾ヌクレオチドＭＮ２を含有する。
【００７７】
図２を参照すると、ＴＰＳは適当な緩衝水性メジウム中で２つの異なるオリゴヌクレオチドプライマー、それぞれ二重鎖ＴＰＳの一つの鎖にハイブリダイズすることができる修飾オリゴヌクレオチドプライマーＯＰ１および修飾オリゴヌクレオチドプライマーＯＰ２と混合する。反応混合物中にはまた、結合物質ＢＳ１とともに結合物質ＢＳ２も存在させる。結合物質は、ＯＰ１における修飾ヌクレオチドがＯＰ２中の修飾ヌクレオチドと同一であるかまたは異なるかに依存して、同種または異種である。ＢＳ１はＭＮ１に結合し、ＯＰ１がＴＰＳに沿って伸長するのを防止し、ＢＳ２はＭＮ２に結合し、ＯＰ２がＴＰＳに沿って伸長するのを防止する。したがって、ＯＰ１はＢＳ１によって結合された場合、ＴＰＳに沿って伸長できないし、またそれがハイブリダイズする可能性がある無関係な任意のＤＮＡに沿って伸長することもできない。同様に、ＯＰ２もＢＳ２により結合された場合、ＴＰＳに沿って伸長することはできないし、またそれがハイブリダイズする可能性がある無関係な任意のＤＮＡに沿って伸長することもできない。またメジウム中にはヌクレオシドトリホスフェート（ＮＴＰ）およびヌクレオチドポリメラーゼＮＰも包含される。メジウムの温度は、たとえば約20℃〜45℃と比較的低い。結合物質ＢＳ１およびＢＳ２は、反応メジウムの温度が上昇するに従い、それぞれＯＰ１およびＯＰ２から解離し、変性する。したがって、温度が上昇すると（Δで表示）、ＢＳ１とＯＰ１およびＢＳ２とＯＰ２の複合体は解離し、ＢＳ１およびＢＳ２は変性して遊離のオリゴヌクレオチドプライマーＯＰ１およびＯＰ２ならびに変性した結合物質ＤＢＳ１およびＤＢＳ２を与える。次のサイクル時に温度が約50℃〜80℃に下降すると、ヌクレオシドトリホスフェートおよびヌクレオチドポリメラーゼの存在下には、ＯＰ１はＴＰＳ鎖にハイブリダイズし、それに沿って伸長し、伸長したＯＰ１（ＥＰＯ１）を産生し、ＯＰ２もＴＰＳ鎖にハイブリダイズしして伸長したＯＰ２（ＥＯＰ２）を産生する。図１の実施態様として上述したように、連続的な熱サイクルはこのようにしてＴＰＳの多重コピーの産生を招来する。
【００７８】
本発明を核酸のＰＣＲ増幅に適用する場合、一般的に反応メジウムは２ないし３種の温度の間を循環させる。本発明における一般原理は標的ポリヌクレオチド配列上でのオリゴヌクレオチドプライマーの伸長は結合が比較的に選択的である場合、高温でのみ起こることである。すなわち、無関係なポリヌクレオチド配列に沿ったオリゴヌクレオチドプライマーの伸長は最小限になる。したがって反応混合物の温度は、修飾オリゴヌクレオチドプライマーから結合物質が解離するのに十分なレベルに調整される。一般に、温度は約40℃〜約100℃、好ましくは50℃〜約90℃に上昇させる。この解離工程の時間は通常、約２〜約300秒、さらに通常には約30〜約240秒である。この工程ののち、本発明の方法を実施するには、メジウムを２ないし３種の温度の間で循環させる。この方法の温度は、一般的に約10℃〜約105℃、さらに通常には約40℃〜約99℃、好ましくは50℃〜約98℃である。正確な温度は塩濃度、ｐＨ、使用された溶媒、標的ポリヌクレオチド配列およびプライマー長および組成に依存して変動させることができる。解離工程は増幅反応における初期サイクルの部分であることは本発明の範囲内にある。
【００７９】
伸長工程には約30℃〜約75℃の比較的低い温度を使用することが可能であり、一方、変性およびハイブリダイゼーションは約50℃〜約105℃の温度で実施することができる。上述のように反応メジウムは初期には約20℃〜約45℃、好ましくは約25℃〜約35℃である。約50℃〜約80℃、好ましくは50℃〜約70℃の比較的に低い温度がハイブリダイゼーションまたはアニーリング工程には使用され、一方変性は、約80℃〜約100℃、好ましくは90℃〜約95℃の温度で実施され、伸長は約70℃〜約80℃、通常は約72℃〜約74℃の温度で行われる。
【００８０】
増幅は所望のコピー数を達成するのに十分な時間行われる。一般に、この方法を行うための時間は１サイクルあたり約10秒から約10分であり、１回から約60回またはそれ以上の任意の数のサイクルを使用できるが、通常は10〜約50回、多くの場合約20〜約45回である。便宜上、サイクルの時間および回数を最小限にすることが通常望ましい。一般的に与えられた程度の増幅のための時間は、たとえばポリヌクレオチドポリメラーゼを飽和させるのに十分なヌクレオシドトリホスフェートの濃度を選択することにより、ポリヌクレオチドポリメラーゼおよびポリヌクレオチドプライマーの濃度を増大させることにより、および迅速な熱平衡が達せられる反応容器を使用することにより最小限にすることができる。本発明の方法における増幅を実施するための時間は一般的に約５〜約200分である。便宜上、この時間は通常最小限にすることが望ましい。
【００８１】
増幅を含めて本発明による方法を実施するには水性のメジウムが使用される。他の極性補溶媒、通常１〜６個さらに通常には１〜４個の炭素原子を有する酸化有機溶媒たとえばアルコール、エーテル等も使用できる。これらの補溶媒を使用する場合、通常約70重量％未満さらに通常には約30重量％未満を存在させる。
【００８２】
メジウムのｐＨは、通常約 4.5〜約 9.5 の範囲、さらに通常には約 5.5〜約 8.5 の範囲、好ましくは約６〜約８の範囲である。ｐＨおよび温度はそれぞれの場合により、結合物質と修飾オリゴヌクレオチドプライマーおよび内部でハイブリダイズした任意の配列の解離、オリゴヌクレオチドプライマーの標的ポリヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーション、標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーの 3'-末端の分解、プライマー（単数または複数）の伸長、ならびに伸長プライマー（単数または複数）の解離が、同時にまたは順次起こるように選択され変動される。場合によっては、上記工程が順次または同時に実施されることを所望するか否かに依存して、これらの工程の速度、効率および特異性の至適化に矛盾を生じることがある。測定時の所望のｐＨの達成およびそのｐＨの維持には、様々な緩衝剤を使用することができる。緩衝剤の例にはホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタール等が包含される。使用する特定の緩衝剤は本発明の必須事項ではないが個々の方法においてある緩衝剤が他に比べて好ましいことはある。
【００８３】
ヌクレオチドポリメラーゼの濃度は連鎖の伸長の達成に十分なように選択される。ポリメラーゼの濃度は通常、経験的に決定される。好ましくはさらに濃度を５倍以上、好ましくは２倍に上昇させても増幅に要する時間は低下しないような十分の濃度が使用される。主要な律速因子は一般に試薬の価格である。
【００８４】
本発明の一態様によれば、上に説明したように、3'から 5'へのエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が必要である。この環境下において、このような酵素の濃度は、修飾ヌクレオチド（単数または複数）を含有するオリゴヌクレオチドプライマーの分解の要求レベルが実現するのに十分でなければならないが、プライマーの前以ての分解が起こる濃度であってはならない。この濃度は通常反応容量100μl あたり約 0.1〜約10単位、好ましくは、反応容量100μl あたり１〜約５単位である。
【００８５】
コピーされる標的ポリヌクレオチド配列の量は、サンプル中１または２分子のような低量でもよいが、一般的にはサンプル中約10〜約1010、さらに好ましくは約10〜約108分子、好ましくはサンプル中少なくとも約10-21Ｍであり、10-10〜約10-19Ｍ，さらに通常は10-14〜10-19Ｍである。
【００８６】
修飾オリゴヌクレオチドの量は特定の増幅または本発明が適用される他の反応に必要なオリゴヌクレオチドプライマーの量によって支配される。オリゴヌクレオチドプライマー（単数または複数）の量は、少なくとも所望のコピー数と同じであり、通常約 1×10-10〜約 1×10-6モル/サンプルである（式中、サンプルは約１〜約1,000μL）。通常、プライマー（単数または複数）は少なくとも約 0.1μＭ、好ましくは約 0.5×Ｍ存在させる。好ましくはオリゴヌクレオチドプライマー（単数または複数）の濃度は標的ポリヌクレオチド配列の濃度よりも実質的に過剰であり、好ましくは少なくとも約 1×1014倍以上とする。
【００８７】
結合物質の量は修飾オリゴヌクレオチドプライマーの量によって支配される。一般的に、結合物質は少なくとも修飾オリゴヌクレオチドプライマーの量に関し当量存在させ、実質的にすべての修飾オリゴヌクレオチドプライマーが結合物質によって結合されるように修飾オリゴヌクレオチドプライマーの量に対して過剰に存在させることができる。結合物質の量は好ましくは修飾オリゴヌクレオチドプライマーの濃度より少なくとも１〜２倍多くする。
【００８８】
メジウム中のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの濃度は広範囲に変動させることができるが、好ましくはこれらの試薬は過剰量存在させる。デオキシヌクレオシドトリホスフェートは通常約10-6〜約10-2Ｍ，好ましくは約10-5〜10-3Ｍ存在させる。
【００８９】
混合物を形成させるための様々な試薬の混合順序は様々である。一般的には、標的ポリヌクレオチドは、このようなポリヌクレオチドを得るために予め処理したこのようなポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナライトを含むサンプルから得られる。一般的に、オリゴヌクレオチドプライマーはデオキシヌクレオシドトリホスフェートおよび結合物質と混合される。次に、ヌクレオチドポリメラーゼを加え、ついで標的ポリヌクレオチドを添加する。しかしながら、上述のすべてを同時に添加する方法、ならびに他の段階的または連続順序による添加も使用することができる。
【００９０】
この方法の試薬の濃度および添加順序ならびに条件は一般的に、伸長したプライマー（単数または複数）のコピー数およびこのようなコピーが形成される速度ならびに複製の忠実度を最大限にしようとする希望によって支配される。一般的に、伸長したプライマーのコピー数を少なくとも約102のファクター、好ましくは約104のファクター、さらに好ましくは約106のファクターで増大させることが望ましい。
【００９１】
ポリヌクレオチドアナライトの検出に適用して本発明の方法を実施する場合、メジウム、ｐＨ、温度および時間に関して考慮すべき点は上述の通りである。
【００９２】
様々な試薬の濃度は一般的に、興味のあるポリヌクレオチドアナライトの濃度範囲によって決定されるが、多くの試薬の最終的な濃度は通常、興味ある範囲にわたってアッセイの感度を至適にするように経験的に決定される。アッセイ中における他の試薬の濃度は一般的に上に掲げたのと同じ原理に従って決定される。主要な考慮事項は伸長されたプライマー（単数または複数）の十分なコピー数がポリヌクレオチドアナライト配列に関して産生され、このようなコピーが容易に検出可能であり、標的ヌクレオチド配列の正確な測定値を提供することである。
【００９３】
伸長されたプライマー（単数または複数）のコピー数は、多くの方法によって検出することができる。たとえば本発明の方法においては、オリゴヌクレオチドプライマー分子は、レポーター分子たとえばリガンド、小さな有機分子、ポリヌクレオチド配列、タンパク質、支持体、オペレーター／レプレッサーペアのメンバー、インターカレーション染料等で標識することができる。核酸配列を特異的に検出する任意の標準方法を使用することができる。連鎖の伸長を検出するためにはゲル電気泳動を使用してもよい。
【００９４】
核酸を検出する一つの方法は核酸プローブを使用する方法である。プローブを利用する一つの方法は米国特許第 4,868,104 号に記載されている。この開示は引用により本明細書に導入される。
【００９５】
他のアッセイホーマットおよび検出ホーマットは、米国特許第 5,508,178号および米国特許第 5,439,998 号に開示されている。これらは引用により本明細書に導入される。
【００９６】
特定の標識またはレポーター分子およびそれらの検出の例については米国特許第 5,439,998 号に見いだされる。この関連する開示は引用によって本明細書に導入される。
【００９７】
シグナルの検出は、使用されるシグナル産生システムの本質に依存する。標識またはレポーターグループが酵素である場合には、システム産生システムの付加的なメンバーには酵素物質等が包含される。酵素反応の産物は好ましくは、分光光度測定法によって検出することができるルミネセンス産物、蛍光産物もしくは非蛍光染料または他の分光光度測定法または電気測定法により検出できる産物である。標識が蛍光分子である場合には、メジウムを照射して蛍光を測定することができる。標識が放射性グループである場合には、メジウムをカウントし、放射能カウントを測定することができる。
【００９８】
本発明の方法は標的ポリヌクレオチド配列がＤＮＡまたはＲＮＡである場合に適用を有する。
【００９９】
本発明の一態様においては、１種または２種以上の試薬たとえば修飾オリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドプライマーはラベル（レポーター分子）で標識される。レポーター分子はたとえば検出可能なグループまたはバインダーたとえばビオチンまたは標的配列にハイブリダイズする配列以外のヌクレオチド配列である。伸長されたプライマー（単数または複数）はプローブに共有結合によって結合するレポーター分子により検出することができる。プローブはプライマーが結合する配列以外の標的ヌクレオチド配列の部分に対して相同性であるかまたは相補性であるヌクレオチド配列を有する。
【０１００】
本発明はまた、米国特許第 5,508,178 号に記載されたような単一オリゴヌクレオチドプライマーを用いる増幅ならびに転写ベースの増幅（たとえばＮＡＳＢＡのような）または転写仲介増幅（ＴＭＡ）への適用を有する。
【０１０１】
本発明はまた、関連した核酸配列における差異を検出する方法への適用を有する。この方法はオリゴヌクレオチドプライマーの連鎖伸長を包含する。略述すれば、同じ反応メジウム中で試薬の組み合わせを形成させてＰＣＲに付す。組み合わせは（ｉ）突然変異を有する可能性がある標的核酸配列を含有するサンプル、（ii）サンプル中における存在が知られていない場合には別個に添加してもよく、突然変異を欠く標的核酸に相当し、野生型核酸であってもよい参照核酸配列、（iii）ヌクレオチドポリメラーゼ、（iv）ヌクレオシドトリホスフェート、および（ｖ）その１種は異なる標識でラベルされている３種のオリゴヌクレオチドプライマーからなる。上述のように、メジウムは参照核酸配列ならびに標的核酸配列を含んでいてよい。また別法として上記それぞれのＰＣＲ反応、すなわち標的核酸配列および参照核酸配列のＰＣＲは別個におこなってもよい。すなわち、上記試薬の組み合わせにおいて、ＰＣＲ反応混合物は標的核酸配列または参照核酸配列の一方または他方を含有することになる。個々の配列のＰＣＲに続いて、反応混合物を混合する。ＰＣＲにおいて、メジウムを加熱および冷却の多重温度サイクルに付し、同時にすべての増幅反応を達成する。この実施態様においては好ましくは各サイクルはメジウムの約90℃〜約100℃への約２秒〜約３分の加熱、メジウムの約60℃〜約70℃への約５秒〜約３分の冷却、およびメジウムの約70℃〜約75℃への約10秒〜約３分の加熱を包含するが、プライマー配列の長さにより異なる温度が要求されることもある。上記からの反応メジウム、またはＰＣＲ反応を別個に行った場合は合わせたＰＣＲ反応混合物を、二重鎖分子の変性に十分な時間、好ましくは約90℃〜約99℃に約10秒〜約２分加熱し、ついで約40℃〜約80℃、好ましくは約60℃〜約70℃に冷却し、この温度に少なくとも１分、好ましくは約20分〜２時間保持する。
【０１０２】
メジウムの冷却後（図３参照）に１）参照または突然変異配列ならびに 5'-末端、Ａ２およびＢ２の任意の組み合わせを有する単一鎖、および２）参照または突然変異配列および 5'-末端、Ａ１またはＢ１の任意の組み合わせを有する単一鎖から形成されるすべての可能な部分および完全二重鎖が形成される。この場合、鎖はさらにＬ１またはＬ２（Ｌ１およびＬ２が異なる場合）のいずれかによって標識されていてもよい。形成される部分二重鎖中にテーリングされた部分二重鎖Ａ'およびＢ'があり、これらは互いに結合して複合体Ｃを形成することができる。これは突然変異が存在する場合は二重鎖ＤおよびＥに解離しない。ついで、このような複合体の存在の決定により、標的核酸配列における突然変異の存在が確立される。
【０１０３】
図３には同時に起こる上記反応を段階的な様式で記述する。本発明のこの適用における実施態様では、３種の修飾オリゴヌクレオチドが使用され、それぞれ、ＯＰ４，ＯＰ５およびＯＰ６と命名される。図３に示した実施態様においては、限定ではなく例示のために、２セットの修飾オリゴヌクレオチドＯＰ５を使用し、１つのセットはＬ１で標識し、他方のセットはＬ２で標識する。テーリングされた標的部分二重鎖Ａ'は、突然変異Ｍを有する標的核酸二重鎖Ａから産生され、テーリングされた参照部分二重鎖Ｂ'は参照核酸二重鎖Ｂ'から産生される。
【０１０４】
図４の実施態様においては、標的核酸Ａおよび参照核酸Ｂを適当な緩衝水性メジウム中で修飾オリゴヌクレオチド、ＯＰ４，ＯＰ５-Ｌ１およびＯＰ５-Ｌ２，ならびにＯＰ６と混合する。本発明によれば、ＯＰ４は修飾ヌクレオチドＭＮ４を含有し、ＯＰ５-Ｌ１は修飾ヌクレオチドＭＮ５を含有する。同様に、ＯＰ６は修飾ヌクレオチドＭＮ６を含有し、ＯＰ５-Ｌ２は修飾ヌクレオチドＭＮ５を含有する。反応メジウムはまた、それぞれの修飾ヌクレオチドＭＮ４，ＭＮ５およびＭＮ６に対する結合物質ＢＳ４，ＢＳ５およびＢＳ６を含有する。結合物質はＭＮ４，ＭＮ５およびＭＮ６が同種または異種であるかに依存して同種または異種である。ＢＳ４はＭＮ４に結合し、ＯＰ４がＡに沿って伸長するのを防止し、ＢＳ５はＭＮ５に結合し、ＯＰ５-Ｌ１がＡに沿って伸長するのを防止する。したがって、ＯＰ４はＢＳ４によって結合された場合、Ａに沿って、またはそれがハイブリダイズする無関係なＤＮＡに沿って伸長することができない。同様に、ＯＰ５-Ｌ１はＢＳ５によって結合された場合、Ａに沿ってまたはそれがハイブリダイズする無関係なＤＮＡに沿って伸長することができない。ＢＳ６はＭＮ６に結合し、ＯＰ６がＢに沿って伸長するのを防止し、ＢＳ５はＭＮ５に結合し、ＯＰ５-Ｌ２がＢに沿って伸長するのを防止する。したがって、ＯＰ４はＢＳ４に結合された場合、Ｂに沿って、またそれがハイブリダイズする無関係なＤＮＡに沿って伸長することができない。同様に、ＯＰ５-Ｌ２はＢＳ５によって結合された場合、Ｂに沿って、またそれがハイブリダイズする無関係なＤＮＡに沿って伸長することができない。また、メジウムにはヌクレオシドトリホスフェート（ＮＴＰ）およびヌクレオチドポリメラーゼＮＰが包含される。メジウムの温度は、たとえば約20℃〜約45℃であり比較的低い。結合物質ＢＳ４，ＢＳ５およびＢＳ６はそれぞれＯＰ４，ＯＰ５-Ｌ１，ＯＰ５-Ｌ２およびＯＰ６から解離し、反応メジウムの温度の上昇に従い変性する。したがって、温度が上昇するにつれて（Δで表示）、ＢＳ４のＯＰ４との複合体、ＢＳ５のＯＰ５-Ｌ１およびＯＰ５-Ｌ２との複合体、ならびにＢＳ６のＯＰ６との複合体は解離して、ＢＳ４，ＢＳ５およびＢＳ６は変性して、遊離のオリゴヌクレオチドプライマーＯＰ４，ＯＰ５-Ｌ１，ＯＰ５-Ｌ２およびＯＰ６、ならびに変性した結合物質ＤＢＳ４，ＤＢＳ５およびＤＢＳ６を与える。
【０１０５】
温度が約50℃〜80℃に下降すると、ＯＰ４，ＯＰ５およびＯＰ６はＡおよびＢ上のそれぞれの結合部位に結合する。ヌクレオシドトリホスフェートおよびヌクレオチドポリメラーゼの存在下には、ＯＰ４，ＯＰ５およびＯＰ６は、それぞれがハイブリダイズする各ＡまたはＢ鎖に沿って伸長する。高温ではヌクレオチド配列の互いの結合はさらに選択的であるので、比較的低濃度で存在するＯＰ４，ＯＰ５およびＯＰ６はそれらの各ＡまたはＢ鎖に選択的に結合し、ＯＰ４，ＯＰ５およびＯＰ６が無関係なＤＮＡに結合するレベルは実質的に低下する。すなわち、本発明では一貫してバックグランド産物は大幅に減少する。
【０１０６】
図３に示すように、ＡはプライマーＯＰ４およびＯＰ５を用いるポリメラーゼ連鎖反応により増幅され、アンプリコンＡＡを産生する。プライマーＯＰ５は標識Ｌ１を含有し、プライマーＯＰ４は標的配列とハイブリダイズできる 3'-末端部分Ｐａおよび標的配列とハイブリダイズできない 5'-末端部分Ｂ１からなる。増幅はヌクレオチドポリメラーゼおよびヌクレオシドトリホスフェートの存在下に温度サイクリングを用いて実施される。アンプリコンＡＡは２本の鎖、プライマーＯＰ５に由来する標識鎖およびプライマーＯＰ４に由来する非標識鎖を有する。非標識鎖はプライマーＯＰ４の 5'-末端部分Ｂ１を有し、標識鎖はＢ１に相補性の相当する 3'-末端部分Ａ２を有する。再び図３を参照すると、アンプリコンＡＡの標識鎖に沿ったプライマーＯＰ６の連鎖伸長が起こり、テーリングされた標的部分二重鎖Ａ'が生成する。
【０１０７】
プライマーＯＰ６は、3'-末端部分Ｐａからなり、これはプライマーＯＰ４のＰａと同一であり、ＡＡの標識鎖に結合する。ＯＰ６は、5'-末端部分Ａ１を有し、これはアンプリコンＡＡと相補性ではない。図３の実施態様においては重要な鎖は標識鎖の相補性鎖であり、そのコピーではない。テーリングされた標的部分二重鎖Ａ'の相補性非標識鎖は 5'-末端部分Ａ１を有し、これはＡ'の標識鎖の3'-末端部分Ａ２に相補性ではない。
【０１０８】
上述のように、このＰＣＲ増幅は、参照核酸配列Ｂの増幅とは別個に行うことができる。別法として、ＰＣＲ増幅は標的核酸配列Ａおよび参照核酸配列Ｂの両者の存在下に実施してもよい。
【０１０９】
図３を再び参照すれば、参照核酸配列Ｂは突然変異Ｍを除いてＡと同一な配列からなる。プライマーＯＰ５はＬ１とは異なる標識Ｌ２を含有する。アンプリコンＢＢは２本の鎖、プライマーＯＰ５-Ｌ２の伸長に由来する標識鎖およびプライマーＯＰ６の伸長に由来する非標識鎖を有する。非標識鎖はプライマーＯＰ６の末端部分Ａ１を、標識鎖はＡ１に相補性の相当する末端部分Ｂ２を有す。
【０１１０】
アンプリコンＢＢの標識鎖に沿ったプライマーＯＰ４の連鎖伸長はテーリングされた参照部分二重鎖Ｂ'を産生する。上述のように、プライマーＯＰ４は部分Ｐａからなり、これは、ＢＢの標識鎖、およびアンプリコンＢＢには結合しない部分Ｂ１に結合する。プライマーＯＰ４の伸長産物は 5'-末端部分Ｂ１を有し、これはＢ'の標識鎖の末端部分Ｂ２に相補性でない。明らかなように、Ａ'およびＢ'はそれらの標識鎖のそれぞれが突然変異Ｍを除いて他方の非標識鎖に相補性である点で類似している。
【０１１１】
部分二重鎖Ａ'およびＢ'は、たとえば約30℃〜約75℃、好ましくは約60℃〜約70℃の温度の条件下に少なくとも約１分好ましくは約15〜約120分置くと、結合し、分岐遊走行を受け、この場合、複合体Ｃを形成する。Ａ'のオリゴヌクレオチドテールＡ１は相当するＢ'のオリゴヌクレオチドテールＢ２にハイブリダイズし、同様に、Ａ'のオリゴヌクレオチドテールＡ２はＢ'のオリゴヌクレオチドテールＢ１にハイブリダイズする。
【０１１２】
複合体Ｃ内の分岐遊走は上述の温度条件下に続き、突然変異Ｍが存在しなければ複合体Ｃは二重鎖ＤおよびＥに分離し、その場合、分岐遊走および鎖の解離は阻害される。ついで複合体Ｃを検出すれば、その存在は突然変異Ｍの存在に直接関係する。
【０１１３】
図３に示す実施態様においては、標識Ｌ１およびＬ２は複合体Ｃからなる部分二重鎖に導入され、複合体Ｃの検出手段を提供する。これは例示であり限定ではなく、複合体Ｃを検出する他の便利な方法、たとえばその複合体の受容体の利用も使用することができる。このアプローチでは、sbp メンバーまたはレポーター分子からなる唯１個の標識Ｌ１またはＬ２が要求される。sbp メンバーの受容体ならびにＬ１およびＬ２以外の特性によって複合体Ｃに結合することができる受容体はいずれも複合体Ｃに結合することが可能で、検出手段を提供する。
【０１１４】
本発明が使用される核酸における差異の検出を実施するための条件は、上述の増幅の場合に類似する。一般的に、メジウムを約90℃〜約100℃の温度に約２〜約500秒の間加熱し、ついで約20℃〜約80℃に約５〜約2000秒冷却し、これに続いて約40℃〜約85℃に約５〜約2000秒間加熱する。好ましくは、メジウムは約90℃〜約100℃の加熱に約10秒〜約３分の期間、約50℃〜約65℃の冷却に約10秒〜約２分の期間、および約70℃〜約80℃の加熱に約30秒〜約５分の期間付す。
【０１１５】
便宜上、本発明で使用される試薬の予め定められた量をパッケージした組み合わせとしたキットで提供することができる。キットは、１種または２種以上の修飾オリゴヌクレオチドプライマー、修飾オリゴヌクレオチドプライマーのための１種または２種以上の結合物質、ヌクレオチドトリホスフェートおよびヌクレオチドポリメラーゼをパッケージした組み合わせからなる。一実施態様においては、ヌクレオチド類縁体は化学修飾を有する天然のヌクレオチドである。キットにヌクレオチドポリメラーゼが包含され、ヌクレオチドポリメラーゼが 3'→5'エキソヌクレアーゼ活性をもたない場合には、キットにはさらに 3'→5'エキソヌクレアーゼ活性のみを有する酵素を包含させる。この場合、１種または２種以上の修飾ヌクレオチドを修飾オリゴヌクレオチドプライマーの 3'-末端において除去することが重要である。
【０１１６】
標的ポリヌクレオチド配列の増幅用キットには上記品目に加えてＰＣＲを実施するために、両者とも修飾された２つのオリゴヌクレオチドプライマーを包含させる。オリゴヌクレオチドプライマーは、上記標的配列に沿った一方の伸長産物が他方の伸長の鋳型として働く点で類似する。
【０１１７】
サンプル中のポリヌクレオチドアナライトのアッセイにおいては本発明の方法に有用なキットには、上述の他の試薬に、ポリヌクレオチドアナライトから標的ポリヌクレオチド配列を形成するための試薬をパッケージした組み合わせを包含させることができる。さらに、オリゴヌクレオチドプライマーは標識できるか、またはその配列を標識するかもしくは支持体に結合させるグループとともに提供することができる。キットにはさらに、増幅された標的ポリヌクレオチド配列に結合できる標識ポリヌクレオチドプローブを包含させることができる。キットにはさらにシグナル産生システムのメンバー、および各種の緩衝化されたメジウムを包含させることができる。一部のメジウムに１種または２種以上の上記試薬を含有させてもよい。
【０１１８】
キット中の各種試薬の相対量は、本発明の方法の間に起こる必要がある反応を実質的に至適化し、さらに、アッセイの感度を実質的に至適化する試薬の濃度を提供するように広範囲に変動させることができる。
【０１１９】
適当な環境下には、キット中の１種または２種以上の試薬は乾燥粉末として、通常は賦形剤を含めて凍結乾燥し、溶解時に本発明による方法またはアッセイを実施するのに適当な濃度を有する試薬溶液を提供する粉末として提供することができる。それぞれの試薬は別個の容器に充填し、また一部の試薬は交差反応性と保存寿命が許容されるならば１つの容器に混合することもできる。キットには、さらに上述のような本発明による方法の説明書を包含させることができる。
【０１２０】
【実施例】
下記の実施例により本発明をさらに説明する。
特に明記しない限り、温度は摂氏（℃）であり、部および割合は重量部および重量％である。
本明細書において次の定義および略語を用いる。
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ  −  トリス(ヒドロキシメチル)アミノエタン−HCl（１Ｍのストック溶液）、BioWhittaker, Walkersville, MDから入手
ＤＴＴ  −  1,4−ジチオスレイトール、Sigma Chemical Company, St. Louis, MOから入手
ＨＰＬＣ  −  高速液体クロマトグラフィー
ＤＰＰ  −  4,7−ジフェニルフェナンストロリン、Aldrich Chemical Company, Milwaukee Wlから入手
ＢＳＡ  −  ウシ血清アルブミン、Sigma Chemical Company, St. Louis MOから入手
ＥＬＩＳＡ  −  “Enzyme-Immunoassay,”Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida (1980)に記載されるエンザイム結合イムノアッセイ
ｂｐ  −  塩基対
ｗｔ（ＷＴ）  −  野生型
ｄｄｃ  −  ジデオキシシチジン
ｇ  −  グラム
ｍｍｏｌ  −  ミリモル
ｎｍｏｌ  −  ナノモル
ｍＭ  −  ミリモル濃度
ｎＭ  −  ナノモル濃度
ＤＭＦ  −  ジメチルホルムアミド
ＴＨＦ  −  テトラヒドロフラン
ＬＳＩＭＳ  −  液体二次イオン化質量分析法
ＮＭＲ  −  核磁気共鳴法
ＴＭＳＣＩ  −  テトラメチルシリルクロリド
ＥＤＡＣ  −  １−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸
ＭＥＳ  −  ２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸
ＳＰＤＰ  −   Ｎ−スクシンイミジル ３−(２−ピリジルチオ)−プロピオン酸塩
スルホ−ＳＭＣＣ  −  スルホスクシンイミジル−４−(Ｎ−マレインイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボン酸塩
ＴＣＥＰ  −  トリス-カルボキシエチルホスフィン
Ｓａｖ  −  ストレプトアビジン
ｄｄ  −  二重蒸留
ＭＯＰＳ  −  ３−(Ｎ−モルホリノ)プロパンスルホン酸
ＳＡＴＡ  −  Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート
ＥＤＴＡ  −  エチレンジアミンテトラ酢酸
Ｒ.Ｂ.  −  丸底
ＲＬＵ  −  相対発光値
【０１２１】
試薬の調製
ビーズ：
Acc-AbDig  −  抗Ｄｉｇ抗体と共役したアクセプタービーズ（ＭＡＤ）（１ビーズ当たり３７７抗体分子を有する）を次のように調製した：
機械攪拌機と滴下漏斗を取り付けた３口丸底フラスコ中にてデキストランＴ−５００（Pharmacia, Uppsala, Sweden）（５０ｇ）をＨ2Ｏ  １５０ｍｌ中に溶解することによりヒドロキシプロピルアミノデキストラン（１ＮＨ2/７グルコース）を調製した。上述の溶液にＺｎ(ＢＦ4)2  １８.８ｇを添加し、温水槽を用いて温度を８７℃にした。温度を８７〜８８℃に維持しながら、エピクロロヒドリン（３５０ｍＬ）を約３０分間にわたり攪拌しながら滴下して添加した。温度を８０℃〜９５℃の範囲に維持しながら混合物を４時間攪拌し、次いで混合物を室温まで冷却した。クロロデキストラン生成物は、穏やかに攪拌しながらエタノール３Ｌをゆっくり注ぐことにより沈殿させ、濾過により回収し、そして真空オーブン中で一晩乾燥した。
【０１２２】
クロロデキストラン生成物は水２００Ｌ中に溶解し、濃アンモニア水（３６％）２Ｌに添加した。この溶液を室温で４日間攪拌し、次いでロータリーエバポレーター上で約１９０ｍＬまで濃縮した。濃縮物は二つのバッチに等分し、各バッチは急速に攪拌したメタノール２Ｌ中にゆっくり注ぐことにより沈殿させた。最終生成物を濾過により回収し、真空下で乾燥した。
上述のように調製したヒドロキシプロピルアミノデキストラン（１ＮＨ2/７グルコース）は、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７.２中に１２.５ｍｇ／ｍＬにて溶解した。溶液を室温で８時間攪拌し、冷却下で保存し、そして使用する直前にSorval RC-5B遠心分離機において１５,０００ｒｐｍにて４５分間遠心して微量の固体物質を除去した。この溶液１０ｍＬに水１ｍＬ中のスルホ-SMCC  ２３.１ｍｇを添加した。この混合物を室温で１時間インキュベートし、さらに精製せずに用いた。
【０１２３】
Ｃ−２８チオキセンを次のように調製した：
乾燥ＤＭＦ（２００ｍＬ）中の4-ブロモアニリン（３０ｇ，１７４ｍｍｏｌ）溶液に、1-ブロモテトラデカン（８９.３ｍＬ，３６６ｍｍｏｌ）およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（６２.２ｍＬ，３５７ｍｍｏｌ）を添加した。反応溶液はアルゴン下で９０℃にて１６時間加熱し、その後室温まで冷却した。この反応溶液に、再度 1-ブロモテトラデカン（４５ｍＬ，１８４ｍｍｏｌ）およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（３１ｍＬ，１７８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を９０℃にて１５時間加熱した。冷却後、反応溶液を真空下で濃縮し、残留物をＣＨ2Ｃｌ2（４００ｍＬ）で希釈した。ＣＨ2Ｃｌ2溶液は、１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液（２回）、Ｈ2Ｏそしてブラインで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、次いで真空下で濃縮して、暗褐色の油（約１１０ｇ）を得た。ヘキサンで溶出するWaters 500 Prep LCシステムによるシリカゲル上の調製カラムクロマトグラフィーにより黄色の油を得て、これは主に生成物（4-ブロモ-N,N-ジ-(Ｃ14Ｈ29)-アニリン）と微量成分の1-ブロモテトラデカンを含有していた。後者の成分は、減圧蒸留（沸点１０５〜１１０℃，０.６ｍｍ）により混合物から除去し、褐色の油として生成物５０.２ｇ（５１％）が残った。乾ＴＨＦ（３０ｍＬ）中のマグネシウムターニング（９.６０ｇ，３９５ｍｍｏｌ）の混合物に、アルゴン下でＴＨＦ（２５０ｍＬ）中の上述の置換アニリン生成物（４４.７ｇ，７９ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。ヨウ素の結晶２〜３個を添加して、Grignard試薬の生成を開始させた。反応混合物が暖まり、そして環流し始めたら、添加速度を調節して、穏やかな環流を維持した。添加完了後、混合物は環流にてさらに１時間加熱した。冷却した上清溶液は、カニューラを介して別の漏斗に移し、アルゴン下で−３０℃にてＴＨＦ（３００ｍＬ）中のフェニルグリオキサール（１１.７ｇ，８７ｍｍｏｌ）溶液に滴下して添加した（２.５時間以上）。反応混合物を１時間にわたり徐々に０℃まで暖め、さらに３０分間攪拌した。生じた混合物は、氷水（８００ｍＬ）と酢酸エチル（２５０ｍＬ）の混合物に注いだ。有機相を分離して、水相を酢酸エチルで抽出した（３回）。合わせた有機相をＨ2Ｏ（２回）、次いでブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥した。溶媒を蒸発させ、濃緑色の油状液体として粗製生成物４８.８ｇを得た。この液体のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン，酢酸エチル：ヘキサン  １.５：９８.５，３：９７，５：９５を用いた勾配溶出）はベンゾイン生成物２４.７ｇ（５０％）（MS (C42H69NO2); [M-H+] 618.6, 1NMR (250 MHz, CDCl3)を与え、これは期待されるベンゾイン生成物と一致していた。乾トルエン（５００ｍＬ）中の上述のベンゾイン生成物（２４.７ｇ，４０ｍｍｏｌ）に、2-メルカプトエタノール（２５ｇ，３２０ｍｍｏｌ）およびＴＭＳＣＩ（１００ｍＬ，７８８ｍｍｏｌ）を連続的に添加した。反応溶液をアルゴン下で環流にて２３時間加熱し、次いで室温まで冷却した。これに、追加的にＴＭＳＣＩ（５０ｍＬ，３９４ｍｍｏｌ）を添加し；反応溶液を環流にてさらに３時間加熱した。生じた溶液を冷却し、２.５Ｎ  ＮａＯＨ冷水溶液を用いて塩基性にして、次いでＣＨ2Ｃｌ2で抽出した（３回）。合わせた有機相を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（２回）とブライン���洗浄し、真空下で濃縮して、褐色の油状液体を得た。Waters 500 Prep LCシステムを使用したシリカゲル上の調製カラムクロマトグラフィー（ヘキサン，酢酸エチル：ヘキサン  １.５：９８.５，３：９７，５：９５を用いた勾配溶出）は橙黄色の油としてＣ−２８チオキセン  １５.５％（６０％）（MS (C44H71NOS): [M-H+] 661.6, 1NMR (250 MHz, CDCl3)を与え、これは期待されるＣ−２８チオキセン生成物である2-(4-(N,N-ジ-(C14H29)-アニリノ)-3-フェニルチオキセンと一致していた。
【０１２４】
カルボキシル化学発光体（アクセプター）ビーズ（ＴＡＲビーズ）：
次の色素組成物を用いた：２０％  Ｃ−２８チオキセン（上述のように調製）、１.６％  1-クロロ-9,10-ビス(フェニルエチニル)アントラセン（１−Ｃｌ−ＢＰＥＡ）（から入手）および２.７％ブルレン（Aldrich Chemical Companyから入手）。粒子はラテックス粒子である（Seradyn Particle Technology, Indianapolis IN）。色素組成物（２４０〜２５０ｍＭ  Ｃ−２８チオキセン，８〜１６ｍＭ  １−Ｃｌ−ＢＰＥＡおよび２０〜３０ｍＭ  ルブレン）は、1994年8月23日に特許された米国特許第5,340,716号（第'716特許）第４８欄第２４〜４５行（本明細書にて引用することにより組み入れる）に記載されるのと同様な方法でラテックス粒子に組込まれた。着色法は、ラテックスビーズ（１０％固体）をエチレングリコール（６５.４％），2-エトキシエタノール（３２.２％）および０.１Ｎ  ＮａＯＨ（２.３％）の混合物中に添加すること包含する。ビーズを混合し、連続的に攪拌しながら９５℃で４０分間加熱した。ビーズを攪拌しながら、３つの化学発光色素を連続的に攪拌しながら９５℃まで３０分間加熱して2-エトキシエタノール中に溶解した。両方のインキュベーションの終了時に、色素溶液をビーズ懸濁物中に注ぎ、生じた混合物を連続的に攪拌しながらさらに２０分間インキュベートした。２０分間インキュベートした後、ビーズを油浴槽から取り出し、４０℃±１０℃まで冷却した。次いでビーズは、４３ミクロンメッシュポリエステルフィルターに通して、洗浄した。着色粒子は、Microgon（Microgon Inc., Laguna Hills, CA）を使用して、エチレングリコールおよび２−エトシキエタノール（７０％／３０％）から構成される溶媒混合物で洗浄した。ビーズは、ビーズグラム当たり溶媒混合物５００ｍｌで洗浄した。これは次に、１０％  エタノール水（ｐＨ１０〜１１）により洗浄した。洗浄容量はビーズグラム当たり４００ｍＬである。次いで、ビーズを収集し、％固体、色素含量、粒径、シグナルおよびバックグラウンド発生について試験した。
【０１２５】
上述のように調製したカルボキシルアクセプタービーズ（水４.５ｍＬ中９９ｍｇ）を攪拌しながら徐々に上述のＭＡＤアミノデキストラン５.５ｍＬに添加し、次いで１ｍＬ  ｏｆ  ５０ｍＭ  ＭＥＳ，ｐＨ６中の２００ｍｇ／ｍＬ  ＮＨＳを１ｍＬ，水中の２００ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＡＣを１ｍＬおよび４５０μＬを添加し、最終的にｐＨ６にした。混合物は暗室中にて室温で一晩インキュベートし、次いでＤＭＳＯ  ０.５ｍＬ中の無水コハク酸２００ｍｇと室温で３０分間反応させた。新たに開封したSurfact-Amps Tween-20（Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois）を添加し、ビーズをSorvall RC-5B遠心分離機にて１５,０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、３部の５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，５０ｍＭ  ＥＤＴＡ，０.１％Surfact-Amps Tween-20（Pierce Chemical Company），ｐＨ７.２  １０ｍＬを用いて遠心分離により洗浄し、同じ溶液３ｍＬに再懸濁した。
【０１２６】
モノクローナル抗ジゴキシンＡｂ（上述のように調製）は、ＡＢｘ樹脂（Baker Chemical Company, Phillipsburg, NJ）により精製し、０.１５Ｍ  ＮａＣＩ，５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰ０4，ｐＨ７.４中で透析した。抗ジゴキシンＡｂは、ＳＡＴＡ（エタノール中１．２５ｍｇ／ｍＬ，２当量）１０.２μＬを含む６２２μＬ（４.２８ｍｇ）と混合し、室温で１時間インキュベートし、そして冷却した２Ｌの１５０ｍＭ  ＮａＣＩ，１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰ０４，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７に対して２回透析することによりチオール化した。チオアセチル化抗体は、ヒドロキシルアミン  ６２.２μＬ（１Ｍ  Ｈ2ＮＯＨ，５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７）を添加し、アルゴンを用いて泡立て、そして室温で１時間インキュベートして脱アセチル化した。生成物はPharmacia PD-10カラム（G-25）に適用して、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，５０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７.２を用いて溶出し、アルゴンを用いて泡立てた。先に溶出した２.５ｍＬ画分と３つの１ｍＬ画分を集めて合わせた。抗体の回収は、Ａ280により３.６６ｍｇまたは８６％であった。Surfact-Amps Tween-20（１０％）を添加して、最終濃度０.２％にした。
【０１２７】
上述のチオール化抗体（１.７１ｍｇ抗体）のアリコート１.４ｍＬは、上述のように調製したレインイミド化ビーズ３００μＬ（１０ｍｇ）に十分な１０％  Ｔｗｅｅｎ−２０を足したものに即座に添加して、最終濃度０.２％の混合物にした。試験管をアルゴンでパージして、暗室中にて室温で一晩インキュベートした。上述のものに、水中の１Ｍ  ＨＳＣＨ2ＣＯＯＨ  ３.４μＬを添加した。室温にて３０分後、ＩＣＨ2ＣＯＯＨ（水中，１Ｍ）６.８μＬを添加した。３０分後、０.１７Ｍ  グリシン，０.１Ｍ  ＮａＣｌ，０.１％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ−２０，１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ，ｐＨ９.２  ３.５ｍＬを添加し、ビーズを遠心分離（１５,０００ｒｐｍにて３０分間）し、同じ緩衝液５ｍＬ中で３時間インキュベートし、遠心分離し、３部の緩衝液Ｃ  ５ｍＬを用いて遠心分離して洗浄し、緩衝液Ｃ  ５ｍＬ中に再懸濁し、冷蔵下にて保存した。緩衝液Ｃ中で測定したビーズのサイズは３０１+/-５６ｎｍであった。結合能は、125Ｉ−ジゴキシンを用いて測定したところ、ビーズ当たり３７７抗体分子に相当していた。
【０１２８】
シリコンテトラ−ｔ−ブチルフタロシアニンは次のように調製した：
新たに切断した金属ナトリウム（５.０ｇ，２０８ｍｍｏｌ）は、磁気攪拌機、還流コンデンサ、乾燥管およびガス泡立て器を取り付けた２リットルの３口フラスコ中の無水エーテル３００ｍＬに添加した。ナトリウムが完全に溶解した後、漏斗を用いて 4-t-ブチル-1,2-ジシアノベンゼン（３８.６４ｇ，２１０ｍｍｏｌ，TCI Chemicals, Portland ORから入手）を添加した。混合物が透明になり、温度が約５０℃まで上昇した。この時点で、無水アンモニア気体流を連続的にガラス泡立て器を通じて反応混合物に１時間導入した。次いでアンモニア気体の流れを持続させながら、反応混合物を還流下で４時間加熱した。反応過程中において、固体として沈殿しはじめた。生じた懸濁物を蒸発させて乾燥させ（ハウスバキューム）、残留物を水（４００ｍＬ）中に懸濁して濾過した。固体を乾燥した（６０℃，ハウスバキューム，Ｐ2Ｏ5）。生成物（1,3−ジイミノイソインドリン，４２.２ｇ）のおおよその収率を定量した。この物質はさらに精製せずに次の工程にて用いた。コンデンサおよび乾燥管を取り付けた１リットルの３口フラスコに、上述の生成物（１８ｇ，８９ｍｍｏｌ）およびキノリン（２００ｍＬ，Aldrich Chemical Company, St. Louis MOから入手）を添加した。注射器を用いて四塩化ケイ素（１１ｍＬ，９５ｍｍｏｌ，Aldrich Chemical Company）を、攪拌溶液に１０分間にわたり添加した。添加終了後、反応混合物は油浴槽槽中にて１８０〜１８５℃まで１時間加熱した。反応は室温まで冷却し、濃塩酸を注意して添加して、反応混合物を酸性（ｐＨ５〜６）にした。暗褐色の反応混合物を冷却し、濾過した。固体を水１００ｍＬで洗浄し、乾燥した（ハウスバキューム，６０℃，Ｐ2Ｏ5）。固体物質を１リットルの丸底フラスコに入れ、濃硫酸（５００ｍＬ）を攪拌しながら添加した。混合物を６０℃にて４時間攪拌し、次いで砕いた氷（２０００ｇ）で注意して希釈した。生じた混合物を濾過して、固体を水１００ｍＬで洗浄し、そして乾燥した。紺青色の固体を１リットルの丸底フラスコに移し、濃アンモニア（５００ｍＬ）を添加し、混合物を加熱し、そして還流下で２時間攪拌し、室温まで冷却して、次いで濾過した。固体を水５０ｍＬで洗浄し、真空下で乾燥し（ハウスバキューム，６０℃，Ｐ2Ｏ5）、紺青色の固体として生成物、シリコンテトラ-t-フタロシアニン１２ｇを得た。3-ピコリン（１２ｇ，Aldrich Chemical Companyから入手）、トリ−ｎ−ブチルアミン（無水，４０ｍＬ）およびトリ-n-ヘキシルクロロシラン（１１.５ｇ）は、磁気攪拌機及び還流コンデンサを取り付けた１リットルの３口フラスコ中の上述の生成物１２ｇに添加した。混合物を還流下で１.５時間加熱し、次いで室温まで冷却した。ピコリンを高真空下（オイルポンプ，約１ｍｍＨｇ）にて留去して、乾燥させた。残留物をＣＨ2Ｃｌ2中に溶解して、シリカゲルカラム（ヘキサン）を用いて精製し、紺青色の固体として純粋な生成物、ジ−(トリ−ｎ−ヘキシルシリル)-シリコンテトラ-t-ブチルフタロシアニン１０ｇを得た。（MS: [M-H]+ 1364.2, 吸収スペクトル: メタノール: 674nm (( 180,000): トルエン678nm, 1NMR (250 MHz, CDCl3): (: -2.4(m, 12H), -1.3(m, 12H), 0.2-0.9 (m, 54H), 1.8(s, 36H), 8.3(d, 4H) および9.6 (m, 8H)）は上記の期待される生成物と一致していた。
【０１２９】
Sens-Sav  -  ストレプトアビジンと共役した感光剤ビーズ（2300 SAv/ビーズ）
感光剤ビーズは、機械攪拌機、１つの口に取り付けた温度計を備えたガラス栓および反対側の口に漏斗を備えた３口丸底フラスコにカルボン酸修飾ビーズ６００ｍＬを入れて調製した。フラスコを油浴槽に浸して、９４+/-１℃に維持した。ビーズは、口漏斗を通じてフラスコに添加し、ビーズコンテナをエトキシエタノール８３０ｍＬ、エチレングリコール１７００ｍＬおよび０.１Ｎ  ＮａＯＨ  ６０ｍＬですすぎ、洗浄液を炉とを通じてフラスコに添加した。ビーズを９４+/-１℃の温度で４０分間、７６５ｒｐｍにて攪拌した。
【０１３０】
シリコンテトラ−ｔ−ブチルフタロシアニン（１０.０ｇ）をベンジルアルコール３００ｍＬ中に６０+/-５℃にて溶解し、８５ｍＬを１２０+/-１０℃まで加熱した注射器によりセプタムを通じて毎分３ｍＬの速度で上述の丸底フラスコに添加した。フタロシアニン溶液の残りの８５ｍＬを次いで上述のように添加した。最初からフタロシアニンを含んでいるシリンジおよびフラスコは、ベンジルアルコール４０ｍＬですすぎ、丸底フラスコに移した。１５分後、脱イオン水９００ｍＬおよび０.１Ｎ  ＮａＯＨ  ７５ｍＬを４０分間にわたり滴下して添加した。油浴槽の温度を４０+/-１０℃まで徐々に下げ、攪拌を中断した。次いでビーズは４３ミクロンポリエステルフィルターを通して濾過し、エタノール：水が１００：０から１０：９０を用いる接線流濾過装置（Microgon Inc., Laguna Hills, CA）に供し、次いで４３ミクロンポリエステルフィルターで濾過した。
【０１３１】
スルホ−SMCC（１１.５５ｍｇ）を蒸留水０.５ｍＬ中に溶解した。１０秒間にゆっくりと上述の溶液を攪拌アミノデキストラン（Molecular Probes, Eugene, Oregon Molecular Probes, Eugene, Oregon）溶液（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７.２中、１２.５ｍｇ／ｍＬ）に添加した。混合物を室温で１時間インキュベートした。
【０１３２】
上記攪拌溶液に、上述のように調製した蒸留水中の感光剤ビーズの２０ｍｇ／ｍＬを５ｍＬ（１００ｍｇ）添加した。次いで、２００ｍｇ／ｍＬ  ＮＨＳを１ｍＬ（６Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを６.０に調節した５０ｍＭ  ＭＯＰＳ中にて新たに調製）。２００ｍｇのＥＤＡＧは、蒸留水１ｍＬ中に溶解し、この溶液を攪拌しながらゆっくりと感光剤ビーズに添加した。ｐＨは、１Ｎ  ＨＣｌ  ４５０μＬを添加することにより６.０に調整し、混合物を暗室中で一晩インキュベートした。ＤＭＳＯ  ０.５ｍＬ中の無水コハク酸１００ｍｇの溶液を感光剤ビーズに添加し、混合物を暗室中にて室温で３０分間インキュベートした。この溶液に、１０％  Ｔｗｅｅｎ−２０を０.１３ｍＬ添加して、Ｔｗｅｅｎ−２０の最終濃度を０.１％にした。ビーズは、上述のように１５,０００ｒｐｍにて４５分間遠心分離した。上清は捨て、ビーズは緩衝液（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，５０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０，ｐＨ７.２）１０ｍＬ中に再懸濁した。混合物を超音波処理してビーズを拡散させた。ビーズを上述のように３０分間遠心分離し、上清を捨て、そしてビーズを再懸濁した。この手法を総計３回繰り返した。次いで、ビーズを上述の緩衝液２.５ｍＬ中に４０ｍｇ／ｍＬにて再懸濁し、アルゴンで飽和させ、Ｔｗｅｅｎ−２０を添加して濃度０.１％にした。ビーズは４℃にて保存した。
【０１３３】
ビーズ１００ｍｇに対してストレプトアビジン２５ｍｇを用いて、ストレプトアビジンを上記ビーズに結合させた。ストレプトアビジン２５ｍｇ（５０ｍｇ  Aaston固体、Aaston, Wellesley, MAから入手）を１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７.５
１ｍＬ中に溶解し、エタノール中の２.５ｍｇ／ｍＬ  ７７μＬをこれに添加した。混合物を室温で３０分間インキュベートした。脱アセチル化溶液は、１Ｍ
ヒドロキシアミン−ＨＣｌ，５０ｍＭ  Ｎａ2ＰＯ4，２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７.０含有するよう調製した。この脱アセチル化溶液０.１ｍＬを上述の溶液に添加し、室温で１時間インキュベートした。生じたチオール化ストレプトアビジンは、Pharmacia PD10カラム上で精製し、そして５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，５０ｍＭ
ＥＤＴＡ，ｐＨ７.２を含有する緩衝液で洗浄した。試料の体積は、上記カラム緩衝液１.５ｍＬを添加して２.５ｍＬにした。試料をカラムに詰め、カラム緩衝液３.５ｍＬを用いて溶出した。チオール化ストレプトアビジンは、５０ｍＭ
ＭＯＰＳ，５０ｍＭ  ＥＤＴＡ，０.１％  Ｔｗｅｅｎ−２０，ｐＨ７.２を１.５ｍＬ添加することにより５ｍＬにした。チオール化ストレプトアビジン溶液５ｍＬをアルゴン下にて感光剤ビーズ５ｍＬに添加して、よく混合した。ビーズはアルゴンで１分間覆い、管を密封し、そして反応混合物を暗室下にて室温で一晩インキュベートした。
【０１３４】
上記ビーズに、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，５０ｍＭ  ＥＤＴＡ，０.１％  Ｔｗｅｅｎ−２０，ｐＨ７.２を７.５ｍＬ添加し、ビーズを１ｍｇ／ｍＬにした。残留したマレインイミドは、最終濃度２ｍＭにてメルカプト酢酸を添加してキャッピングした。混合物は暗室下にて室温で３０分間インキュベートした。残留したチオールは、最終濃度１０ｍＭにてヨード酢酸を添加してキャッピングし、混合物は暗室下にて室温で３０分間インキュベートした。ビーズは上述のように総計３回、１５,０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離した。
【０１３５】
実施例１
ヒトＢＲＣＡ１遺伝子エキソン１１の多型部位の検出
ＢＲＣＡ１遺伝子のエキソン１１の長さ４５０塩基対の配列の増幅は二段階で実行された。第１のＰＣＲ増幅は、２個の５′末端付加プライマーを用いて実施した。プライマーは標的遺伝子配列に相補的である３′部分と、標的遺伝子配列に無関係の配列からなる５′部分（以下で下線付）から構成されている。２個のプライマーは示される通り、その３′末端において、天然のヌクレオチドを蛍光修飾したｄＴに置換することによって修飾された。プライマーはOligosなど入手した。
【０１３６】
第１のＰＣＲ増幅に続いて、第２の増幅はプライマーを用いて実施した。前方プライマーは第１前方プライマーの５′末端の配列に相補的な配列からなり、ビオチンまたはデゴキシゲニン（ディグ）で５′標識された。後方プライマーは、第１ＰＣＲ後方プライマーの５′末端に相補的な３′配列と、標的遺伝子にも第１ＰＣＲプライマーにも相補的でない配列からなる５‘末端から構成された。２個の後方プライマーの５′末端はお互いに無関係で、変更された配列の検出に用いられる４本鎖ＤＮＡ構造を形成しうる増幅産物が形成されるよう設計された。  プライマーの配列は以下の通りである。
【０１３７】
第１ＰＣＲ前方プライマー：
5'-GTTTTCCCAGTCACGACGAGGCTTTAAGTATCCATNG-3' (SEQ ID NO:1)
第１ＰＣＲ後方プライマー：
5'-AGGAAACAGCTATGACCATCAAAACCTAGACCTCCTTNG-3' (SEQ ID NO:2)
上記配列の下線部分は、“末端” 配列を表す。下線のない部分は、標的遺伝子に相補的である。NはC6 dTフルオレセインを表す。
【０１３８】
第２ＰＣＲ前方プライマー：
5'-ビオチン-GTTTTCCCAGTCACGACG-3' (SEQ ID NO:3)
5'-ディグ- GTTTTCCCAGTCACGACG-3' (SEQ ID NO:4)
第２ＰＣＲ後方プライマー：
5'-ACCATGCTCGAGATTACGAGAGGAAACAGCTATGACCAT-3' (SEQ ID NO:5)
5'-GATCCTAGGCCTCACGTATTAGGAAACAGCTATGACCAT-3' (SEQ ID NO:6)
上記配列の各々の下線部分は、“末端” 配列を表す。下線のない部分は、第１PCR反応の増幅産物に相補的である。
【０１３９】
ＰＣＲワックスジェムを用いたホットスタート法によるＰＣＲ増幅は、次のように設計した：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８.３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１.５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０.２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０.２５  ｍＭ  各ｄＮＴＰ、０.５  μＭの各プライマーを含む部分反応混合液のアリコート２
５μｌを、ＰＣＲジェム(Perkin-Elmer社より; カタログ番号N-808-0150)を含
むＰＣＲチューブに移した。チューブはワックスを融解させるため、８５℃で２分間インキュベートし、ワックスバリアーを形成するために室温まで冷却した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１.５ｍＭ  ＭｇＣｌ2，５ユニットのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene; カタログ番号600159-81)またはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ (Stratagene, La Jolla, CA)を含む第２反応混合液２０μｌを各チューブに添加した。標的核酸を含むと推測される試料５μｌがチューブを添加し、反応チューブは温度サイクル(Trio thermoblock, Biometra Inc., Tampa, FL,カタログ番号050090005)に供せられた。
【０１４０】
本発明の方法を用いて実施した反応は、以下のように設計された。すなわち、試料５μｌが、すなわち、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.３、５０ｍＭ  ＫＣｌ，１.５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０.２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，０.２５ｍＭ  各ｄＮＴＰ、０.５μＭ  各プライマー，２.５ユニットのＰｆｕポリメラーゼまたはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含有し、１２.５μＭの抗蛍光モノクロ
ーナル抗体（抗デゴキシン抗体に関して上述した方法と同様の既知の方法によって調製された）を含むまたは含まない反応混合液に加えられた。。反応混合液（全量２５μｌ）は上記のように温度サイクルに供された。第１ＰＣＲ増幅反応のための温度サイクリングは、以下の通りであった。すなわち、９４℃４分間；９４℃３０秒間、６４℃１分間、７２℃１分間を３５サイクル。第１増幅反応の反応混合液の一部は、第２増幅反応に用いられた。第２ＰＣＲ増幅のための温度サイクリングは、以下の通りであった。すなわち、９４℃４分間、次に９４℃３０秒間、６４℃１分間、７２℃１分間を２０サイクル。
【０１４１】
２個のゲノムＤＮＡ試料(Myriad Genetics, Salt Lake City, UT)が解析に用いられた。すなわち、多型部位に関してヘテロ接合体の細胞と、ホモ接合体の細胞から精製されたゲノムＤＮＡである。ＤＮＡ試料は２倍体細胞由来であり、分析の目的は試験した配列がホモ接合体かヘテロ接合体かを調べることであったため、本実施例では対照ＤＮＡ増幅産物を付加せずに実施した。
【０１４２】
増幅に続いて、２μＬのテスト増幅反応混合液は４μＬ緩衝液と混合された。その混合液は以下のインキュベーション条件に供せられた。すなわち、増幅産物を変性させるための９５℃２分間、続いて、アニールし、４本鎖ＤＮＡ構造を形成し、分枝点移動するための６５℃３０分間である。５０μｌの粒子混合物（固定化ストレプトアビジンを含む感光剤粒子２.５μＬおよび固定化抗デゴキシン抗体を含む化学発光剤粒子１.２５μＬ）が各反応チューブに加えられた。チューブはシグナルを読みとるためにリーダーに移され、３７℃で３０分間インキュベートし、シグナルを読んだ（１秒照射、１秒読み取りを３サイクル）。その結果を、表１および２に示す。
【０１４３】
【表１】
0004657454.tif 000002
【０１４４】
【表２】
0004657454.tif 000003
【０１４５】
上記の結果は、増幅前にプライマーに結合している抗体（本例では抗蛍光抗体）が、標的遺伝子依存的または非依存的に、非特異的増幅の顕著な減少を引き起こしたことを示している。本実施例は、本発明の方法が特定の熱安定ＤＮＡポリメラーゼに限定されないことを示している。
【０１４６】
実施例２  ヒト嚢胞性繊維症遺伝子のエキソン１０
８試料のヒトゲノムＤＮＡ（４つの野生型ホモ接合体と、１つの野生型アリルと３塩基の欠失を持つアリル、ΔＦ５０８を持つ４つのヘテロ接合体）は、２２０塩基長の生成物を生じるために、後述するプライマーを用いて増幅された。ゲノムＤＮＡ試料はMayo Foudation（Rochester, MN）から入手した。
前方プライマー配列:
5'-CTCAGTTTTCCTGGATTATGCCNNA-3' (SEQ ID NO: 7)
N=エテノ-dA
等モルの混合物（それぞれ１２５μＭ）の５′ビオチン化および５′ジゴキシゲニン標識前方プライマーをＰＣＲに用いている。
第１後方プライマー配列:
5'-ACCATGCTCGAGATTACGAGCTAACCGATTGAATATGGAGCCNNG-3' (SEQ ID NO: 8)
第２後方プライマー配列:
5'-GATCCTAGGCCTCACGTATTCTAACCGATTGAATATGGAGCCNNG-3' (SEQ ID NO: 9)
上記において、末端（tail）配列は下線で示した：N=エテノ-dA
【０１４７】
等モルの混合物（それぞれ１２５μＭ）の２つの後方プライマーをＰＣＲに用いている。２０μｌ  ＰＣＲ反応溶液は２００μＭのそれぞれのデオキシＮＴＰ、１０ｎｇゲノムＤＮＡおよび１ＵのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む。緩衝液は１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８.３）、５０ｍＭ  塩化カリウム、４ｍＭ  塩化マグネシウムおよび２００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（緩衝液Ａ）を含む。２セットのＰＣＲ反応液は室温で用意された。それらのセットの一方は抗エテノ・モノクローナル抗体（Ｐ．Ｌｏｒｅｎｚ博士、ドイツより供与）を２５０ｎＭ含む。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは、反応溶液に最後に加えられる成分である。反応は温度サイクルを始める前に３０分室温で予めインキュベートした。バイオトラ  トリオ（Biotra Trio）温度サイクラーにおいて、最初に９４℃でのゲノムＤＮＡの変性を４分間行い、９４℃における変性段階３０秒、６４℃のアニール段階１分および７２℃の伸長段階１分からなる合計４０サイクルを実施した。
【０１４８】
ＰＣＲ増幅の直後に、全ての反応液を分枝点移動させた。分枝点移動のプロトコールは９４℃にて変性工程を２分間、６５℃にて再アニール／ストランド伸長工程３０分間からなる。
各分枝点移動の反応液のアリコート２μｌ〔試料の一部〕は、感光剤−ストレプトアビジンビーズ２.５μｌ（５μｇ）と化学発光剤−抗ジゴキシゲニン抗体ビーズ１.２５μｌ（２.５ｐｇ）含有するの緩衝液Ａ  ５０μｌに添加され、３７℃にて３０分インキュベートした。次いでシグナルはシグナルリーダーを用いて読み取った。結果を表３に示す。
【０１４９】
【表３】
0004657454.tif 000004
【０１５０】
結果として抗エテノ抗体の存在がより高く、より画一的なポジティブシグナルが生じた。この効果は酵素とプライマーに対する所望のアンプリコンと通常競合する非特異的ＰＣＲ生成物の量を減少したためであると推測される。
【０１５１】
実施例３  ヒト嚢胞性繊維症遺伝子のエキソン１１
１６試料のヒトゲノムＤＮＡ（６つの野生型ホモ接合体と、８つの野生型アリルとG542X、G551D、R553XまたはR560Tの点突然変異を保持するアリルを含む８つのヘテロ接合体および２つの二重変異体）は、３３３塩基長の生成物を生じるために、後述するプライマーを用いて増幅した。ゲノムＤＮＡ試料はMayo Foudation（Rochester, MN）から入手した。
前方プライマー配列:
5'-GCCTTTCAAATTCAGATTGAGCNNA-3' (SEQ ID NO: 10)
式中、N=エテノ-dA
等モルの混合物（それぞれ１２５ｎＭ）の５′ビオチン化および５′ジゴキシゲニン標識化前方プライマーをＰＣＲに用いた。
第１後方プライマー配列：
5'-ACCATGCTCGAGATTACGAGGACATTTACAGCAAATGCTTGCNNA-3' (SEQ ID NO: 11)
第２後方プライマー配列:
5'-GATCCTAGGCCTCACGTATTGACATTTACAGCAAATGCTTGCNNA-3' (SEQ  ID NO: 9)
上記において、“末端（tail）”配列に下線を施し、N=エテノ-dA
全ての実験条件はエキソン１０の実施例２に示されたものと厳密に同じである。結果を表４に示す。
【０１５２】
【表４】
0004657454.tif 000005
【０１５３】
抗エテノ抗体が存在する場合、ヘテロ接合体でのシグナルにおける重要な増加が再び観察された。野生型試料のバックグラウンドのシグナルはやや低下した。
【０１５４】
実施例４  修飾型前方および後方プライマーと、修飾型前方プライマーおよび非修飾型後方プライマーの比較
下記の２つの実験は、全ての分枝点移動プライマーが修飾され、使用した対応する抗体と結合し得る場合に、本発明の利点が達成されたことを示している。下記の実施例において、前方および後方"分枝点移動"ＰＣＲプライマーは修飾され、それ故に抗体と結合することが可能である。特異性において改善が得られた。
ヒト嚢胞性繊維症遺伝子のエキソン１０の増幅における実験条件は実施例２に示されたものと厳密に同じである。
７試料のヒトゲノムＤＮＡは３つの野生型ホモ接合体（３）、３つの(F508（３）、および１つの(I507のヘテロ接合子（突然変異体は共に３塩基欠失である）を包含する。抗エテノモノクローナル抗体は、全ての反応液中に存在する。
表５は、２セットのＰＣＲプライマーの比較実験を示す。一方のセット（左欄）において、前方および後方プライマーは実施例２に示されているように３′末端にてエテノ基で修飾されており、もう一方のセット（右欄）は前方標識プライマーのみが３′末端にてエテノ基で修飾されており、５′後方プライマーは修飾されていない（これらの３′−末端にはＮＮＡが存在しない）。
【０１５５】
【表５】
0004657454.tif 000006
【０１５６】
上記の実験は、修飾型前方プライマーと非修飾型後方プライマーを使用した場合と比較して、本発明の方法が修飾型前方および後方プライマーを使用して、より良好な結果を達成したことを示す。
【０１５７】
実施例５  従来法と比較した本発明の方法
本発明の方法の使用は、他の方法と共に、エテノ修飾プライマーセットEx11-f2e/r1eを用い、抗エテノアデニンモノクローナル抗体（MAb）の存在下または非存在下にて、両者ともワックスジェム非存在下で実施した。また、２つの他のコントロールは、対応する非エテノ化プライマーセットEx11-f2/r1を使用し、ホットスタート法を用いず、またはワックスジェムを用いて実施した。f2/r1プライマーセットはCFTR エキソン１１配列の１７３塩基部位に位置し、その結果、エキソン１１の２１７塩基および後方プライマーの２０塩基を含め、計２３７塩基の増幅産物を生成する。
用いたEx11-f2e/r1eプライマーは下記の通りである:
前方プライマー (エテノ修飾):
5'-ビオチン-TAGAAGGAAGATGTGCCTTTCANNA (SEQ ID NO: 12)
5'-ジゴキシゲニン-TAGAAGGAAGATGTGCCTTTCANNA(SEQ ID NO:13)
式中、N = エテノ dA
後方プライマー (エテノ修飾):
5'-GATCCTAGGCCTCACGTATTGACATTTACAGCAAATGCTTGCNNA-3' (SEQ ID N0: 9)
5'-ACCATGCTCGAGATTACGAGGACATTTACAGCAAATGCTTGCNNA-3'(SEQ ID NO: 11)
式中、N = etheno dA
非エテノプライマーは、ＮＮＡ−３′末端が欠損している以外はエテノプライマーと同じである。
１つの野性型およびヘテロ(R553D/(F508の混合)はそれぞれ5条件（つまり、非エテノ化／ワックスなし、エテノ／ワックスなし、およびエテノ／MAbホットスタート、非エテノ／ワックスあり、およびエテノ／ワックスありにおいて３回アッセイした。加えて、水ブランクおよびヘテロ(G551 D/WT)のポジティブコントロールを各反応セットに包含させた。
【０１５８】
試薬の調製：
１０×緩衝液Ｄ：  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ８.３，ＲＴにて，５００ｍＭ  ＫＣｌ，４０ｍＭ  ＭｇＣｌ2，２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
１×ｄＮＴＰ混合物：ｄｄＨ2Ｏ  ２.５ｍＭ  各々ＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ，＆ＴＴＰ
１×プライマーセット：  ｄｄＨ2Ｏ中  ６.２５μＭ  前方プライマー混合
物／６.２５μＭ  後方プライマー混合物
標的ＤＮＡ：  １×−ＴＥ緩衝液中  １０ｎｇ／μｌ
１×−ＴＥ緩衝液＝１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ  ｐＨ７.４，１ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ
【０１５９】
反応プロトコル
下記の表は、２ストリップの反応チューブ（８チューブ／ストリップ）に対するコントロール混合物（ＮＭ＝ホットスタートなし）およびＭＡｂ混合物（ＭＭ＝ＭＡｂ添加）溶液を調製するための試薬の体積を示している。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは最後に添加した。水、緩衝液、ヌクレオチド、およびＭＡｂ*を含むまたは含まないプライマーとを混合し、室温にて１０分間インキュベートした。このインキュベーションの間に、ワックスジェム混合物（ＷＭ＝ワックスジェム、ホットスタート）の下層（ＢＬ）および上層（ＴＬ、Ｐｆｕポリメラーゼなし）を調製した。インキュベーション完了後、それぞれの適当なストリップチューブを配置する直前に、各混合物に（即ち、ＮＭ，ＭＭおよびＷＭのＴＬ）にＰｆｕポリメラーゼを添加した。
*ＭＡｂとプライマーの容積比１：１（即ち、８.４ピコモル  ＭＡｂ／２０μｌチューブ，〜０.４２μＭ  ＭＡｂ）は抗体の結合部位とエテノアデニンダイマーを有するプライマー末端の比率を１：２にした。即ち、等量のＭＡｂはエテノアデニンを有するプライマー全量の５０％の力価に相当する。
【０１６０】
0004657454.tif 000007
【０１６１】
ＷＭ−ＢＬのアリコート１８μｌを３ストリップのうちの１つの各チューブに添加した。ストリップを密封し、温度サイクラーに移した。ワックスビーズは８５℃  ２分のインキュベーションにより融解し、次いで室温まで冷却することによりワックスバリアを形成させた。ＷＭ−ＴＬ  １４.４μｌをＷＭストリップ中の各相当するチューブに添加した。試験ＤＮＡ試料（詳しくは下記参照）、３.６μｌをこのストリップチューブに添加し、穏やかに攪拌して混合した。
試験ＤＮＡ試料、２μｌ（詳しくは下記参照）を各ストリップの１つのチューブに添加した。
ＮＭまたはＭＭのアリコート１８μｌをこれらの２つのストリップの各チューブに添加し（気泡を防ぐ）、穏やかに攪拌して混合した。
【０１６２】
0004657454.tif 000008
【０１６３】
他の方法は、Biometra trio温度サイクラーで下記の順にて実施した：
９５℃  ４分；９４℃  ３０秒；６４℃  １分；７２℃  １分を４０サイクル；次いで９５℃  ２分にて増幅産物を変性させ、引き続いて６５℃  ３０分にて再度アニーリングさせ、４重鎖構造の形成および分枝点移動させた。
各分枝点移動反応のアリコート２μｌを、感光剤−Ｓａｖビーズ２.３３μｇおよび化学発光体−抗ＤＩＧ抗体ビーズ１.１６μｇを含む緩衝液Ａ  ５０μｌと合わせて３７℃にて３０分インキュベートした。次いで、シグナルは、シグナルリーダー（照射１秒、読み取り１秒を３サイクル）を用いて読み取った。
嚢胞性繊維症遺伝子エクソン１１の結果を表６に示す。
【０１６４】
【表６】
0004657454.tif 000009
【０１６５】
【表７】
0004657454.tif 000010
【０１６６】
【表８】
0004657454.tif 000011
【０１６７】
結論：
非ホットスタート法を用いた場合には、野性型とポジティブ試料の間に顕著な違いが表れなかった（Ｓ／Ｂ＝１.８±０.７）。エテノ修飾プライマーまたはワックスジェム単独のいずれかの使用は、陰性試料のバックグラウンドレベルの顕著な低下、および陽性試料のシグナルのわずかな増強の両方のために、中程度の識別の結果となった（それぞれＳ／Ｂ＝１５.７±２.０または１１.３±３.１）。エテノ修飾プライマーとワックスジェムまたはモノクローナル抗体のいずれかを組み合わせることは、陽性試料のシグナルに顕著な増強を提供し、その結果として相当のＳ／Ｂ比が得られた（６０.９±１６．６または６３.２±３.１）。エテノ修飾プライマーとＭＡｂを使用した場合、高いＳ／Ｂ比および最も低いＣＶ（５.０％、残りの４種の手法；１３〜４０％と比較）が得られた。
【０１６８】
要約すると、抗エテノアデニンモノクローナル抗体を用いた結果、低バックグラウンド、陽性試料の高いシグナルおよび高いＳ／Ｂ比が得られ、誤りが少なくなったが、これはモノクローナル抗体の非存在下にてワックスジェムを含むエテノ修飾プライマーを用いて観察されたものと少なくとも同程度であった。さらに、エテノ修飾プライマーとモノクローナル抗体を使用することは、作業の簡略化、必要とされるより少ない反応容量および増幅産物の回収の容易さの点において、ワックスジェムの使用と比較してより簡便なホットスタート法であることが示された。
【０１６９】
本明細書にて引用されている全ての刊行物および特許出願明細書は、それぞれ各刊行物または特許出願明細書が特定的に、且つ別個に引用されることにより組み入れられることが示されているかのように、引用することにより本明細書に組み入れられる。本明細書の開示の一部は、著作権保護の対象となりうる題材を含むものである。
本著作権者は、米国特許庁の特許ファイルまたは記録において出される特許文献または特許の開示いずれかのファクシミリ複製には異議を唱えないが、すべての著作権は保留するものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の実施態様を示す模式図である。
【図２】  本発明のまた別の実施態様を示す模式図である。
【図３】  本発明のまた別の実施態様を示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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