(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ヒトα−シヌクレイン遺伝子が導入されており、該ヒトα−シヌクレイン遺伝子は、野生型ヒトα−シヌクレイン遺伝子のアミノ酸配列のＣ末端を１０アミノ酸残基欠損しており、
（ｂ）該ヒトα−シヌクレイン遺伝子が、野生型ヒトα−シヌクレイン遺伝子のアミノ酸配列において５３番目のアミノ酸残基であるＡｌａ残基がＴｈｒ残基に置換している変異体であり、
（ｃ）該ヒトα−シヌクレイン遺伝子がチロシンヒドロキシラーゼのプロモーターの制御下に組み込まれた組み換えＤＮＡとして導入されている、
ことを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
ヒトα−シヌクレイン遺伝子を脳の神経細胞で発現し、かつ脳の黒質におけるドーパミン産生神経細胞数が野生型動物と比較して４６％以下に減少していることを特徴とする、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
少なくとも５日齢で脳内ドーパミン量が野生型動物と比較して８５％以下まで減少している、請求項１又は２に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
チロシンヒドロキシラーゼの発現量が野生型動物と比較して８０％以下まで減少している、請求項１から３の何れか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
自発運動量が野生型動物と比較して６０％以下まで減少している、請求項１から４の何れか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項６】
非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項１から５の何れか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
請求項１から６の何れか１項に記載の非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とする、ドーパミン様作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
ドーパミン様作用を有する物質がパーキンソン病の治療剤又は予防剤である、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、α−シヌクレイン遺伝子が導入されているトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。より詳細には、本発明は、α−シヌクレイン遺伝子を脳で発現し、かつ脳の黒質におけるドーパミン産生神経細胞数が野生型動物と比較して有意に減少していることを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物、並びにその利用に関する。
【背景技術】  パーキンソン病は成人・高齢者にみられる神経変性疾患の一つである。パーキンソン病では一般に運動機能の障害が見られ、病変としては、中脳黒質のドーパミン産生神経細胞の変性・消失が認められる。この病変による中脳−基底核系における選択的なドーパミン量の低下は、ドーパミン前駆体であるＬドーパを経口投与することにより抑制することができ、これにより症状の改善がみられる。従って、パーキンソン病の治療薬としては、Ｌドーパおよびドーパミン受容体アゴニストが使用されている。しかしながら、ドーパミン前駆体の投与は対症療法に過ぎず、症状は次第に進行し、これらの薬効も衰弱するため、患者はやがて死に到ることが多い。
また、パーキンソン病の病理学的所見の一つとして、レビー小体の出現がある。レビー小体は、黒質、青斑核、迷走神経核などにおける残存ニューロンにおいて、細胞内に出現する特異的封入体である。さらに、脳幹病変に加え、大脳皮質にもレビー小体が出現する疾患として、レビー小体を伴う痴呆症（ＤＬＢ）が知られている。
パーキンソン病の多くは、孤発例であるが、稀に常染色体優性遺伝をとる家系が存在する。家族性パーキンソン病家系の連鎖解析から、パーキンソン病の原因遺伝子として染色体第４番長腕上のα−シヌクレイン遺伝子が同定され、ミスセンス変異（Ａ５３Ｔ、又はＡ３０Ｐ）が確認されている（Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ  ＭＨ，他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９７  Ｊｕｎ  ２７；２７６（５３２１）：２０４５−７；及び、Ｋｒｕｇｅｒ  Ｒ，他、Ａｌａ３０Ｐｒｏ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１９９８  Ｆｅｂ；１８（２）：１０６−８）。その後、抗α−シヌクレイン抗体を用いた生化学的検討や免疫組織学的検討によって孤発例のパーキンソン病やＤＬＢのレビー小体は、α−シヌクレインタンパク質が蓄積してできることが明らかになり、パーキンソン病の原因としてのα−シヌクレインタンパク質蓄積の重要性が明らかとなってきた。
これまでに、パーキンソン病のモデルマウスとして、α−シヌクレインタンパク質の野生型又は変異型を過剰発現するトランスジェニック動物が報告されているが（国際公報ＷＯ０１／６０７９４号公報、国際公報ＷＯ９８／５９０５０号公報など）、生後直ぐに脳内ドーパミン量が有意に減少しているトランスジェニック動物については未だ報吉されていない。また、中脳・黒質のドーパミン産生神経細胞の変性・消失が認められる、特にパーキンソン病の病理学的特徴である黒質緻密部のドーパミン産生神経細胞に変性・消失が認められるが、腹側被蓋野部分には変化が認められないトランスジェニック動物についての報告はない。
【発明の開示】
本発明は、α−シヌクレイン遺伝子が導入されたパーキンソン病モデル動物を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、上記モデル動物を用いてドーパミン様作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、導入遺伝子として、野生型ヒトα−シヌクレイン遺伝子のアミノ酸配列において５３番目のアミノ酸残基であるＡｌａ残基がＴｈｒ残基に置換され、かつ該アミノ酸配列のＣ末端を欠損させた変異体遺伝子を使用してトランスジェニックマウスを作製した。さらに本発明者らは、作製したトランスジェニックマウスにおける脳内ドーパミン量、チロシンヒドロキシラーゼ発現量、及び自発運動量などを解析した結果、パーキンソン病のモデル動物として有用性の高いマウスであることを確認した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  α−シヌクレイン遺伝子が導入されており、脳の神経細胞で該遺伝子を発現し、かつ脳の黒質におけるドーパミン産生神経細胞数が野生型動物と比較して有意に減少していることを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその一部。
（２）  α−シヌクレイン遺伝子がヒトα−シヌクレイン遺伝子又はその変異体である、（１）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその一部。
（３）  α−シヌクレイン遺伝子が、野生型ヒトα−シヌクレイン遺伝子のアミノ酸配列において５３番目のアミノ酸残基であるＡｌａ残基がＴｈｒ残基に置換している変異体である、（１）又は（２）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその一部。
（４）  α−シヌクレイン遺伝子が、野生型α−シヌクレイン遺伝子のアミノ酸配列のＣ末端を欠損させた遺伝子である、（１）から（３）の何れかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその一部。
（５）  α−シヌクレイン遺伝子をドーパミン産生神経細胞で発現させることができるプロモーターの制御下に組み込んだ組み換えＤＮＡが導入されている、（１）から（４）の何れかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその一部。
（６）  α−シヌクレイン遺伝子をドーパミン産生神経細胞で発現させることができるプロモーターが、チロシンヒドロキシラーゼのプロモーターである、（１）から（５）の何れかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその一部。
（７）  若年齢で脳内ドーパミン量が野生型動物と比較して有意に減少している、（１）から（６）の何れかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその一部。
（８）  若年齢で脳内ドーパミン量が野生型動物と比較して８５％以下まで減少している、（１）から（７）の何れかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその一部。
（９）  チロシンヒドロキシラーゼの発現量が野生型動物と比較して８０％以下まで減少している、（１）から（８）の何れかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその一部。
（１０）  自発運動量が野生型動物と比較して６０％以下まで減少している、（１）から（９）の何れかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその一部。
（１１）  非ヒト哺乳動物がマウスである、（１）から（１０）の何れかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその一部。
（１２）  （１）から（１１）の何れかに記載の非ヒト哺乳動物またはその一部を用いることを特徴とする、ドーパミン様作用を有する物質のスクリーニング方法。
（１３）  ドーパミン様作用を有する物質がパーキンソン病の治療剤又は予防剤である、（１２）に記載のスクリーニング方法。
（１４）  （１２）又は（１３）に記載のスクリーニング方法により得られる物質。
（１５）  （１２）又は（１３）に記載のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分として含有する、パーキンソン病の治療剤又は予防剤。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＰＣＲ法による変異型ヒトα−シヌクレインを発現するトランスジェニックマウスの選別を示す。２７９ｂｐのバンドと５９１ｂｐのバンドが両方とも検出できる個体が、所望のトランスジェニックマウスである
図２は、遺伝子発現解析の結果を示す。Ａ：染色体に組込まれた遺伝子のコピー数のサザンハイブリダイゼーションによる解析、Ｂ：脳における遺伝子発現のノーザンハイブリダイゼーションによる解析、Ｃ：変異型ヒトα−シヌクレイン蛋白のウエスタンブロッティングによる解析
図３は、線状体におけるチロシンヒドロキシラーゼ蛋白量のウエスタンブロッティングによる定量の結果を示す。
図４は、正向反射の結果を示す、
図５は、自発運動量の測定結果を示す。
図６は、生後８週齢及び１年齢の個体の中脳のモノアミン量の定量の結果を示す。ＤＡ：ドーパミン、ＨＶＡ：ホモバニリン酸、５−ＨＴ：セロトニン
図７は、生後８週齢及び１年齢の個体の線状体のモノアミン量の定量の結果を示す。ＤＡ：ドーパミン、ＨＶＡ：ホモバニリン酸、５−ＨＴ：セロトニン
図８は、生後５日齢の個体の全脳のモノアミン量の定量の結果を示す。ＤＡ：ドーパミン、ＨＶＡ：ホモバニリン酸、５−ＨＴ：セロトニン
図９は、生後１０日齢の個体の全脳のモノアミン量の定量の結果を示す。ＤＡ：ドーパミン、ＨＶＡ：ホモバニリン酸、５−ＨＴ：セロトニン
図１０は、生後８週齢の個体の脳のＬＢ５０９を用いた免疫組織染色を示す。
図１１は、生後８週齢の個体の中脳領域のチロシンヒドロキシラーゼ陽性神経細胞の定量の結果を示す。Ａ：細胞数の実測値、Ｂ：チロシンヒドロキシラーゼ陽性領域の画像解析による定量、薄い部分が黒質緻密部、濃い部分が腹側被蓋野
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の特徴
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、α−シヌクレイン遺伝子が導入されており、脳の神経細胞で該遺伝子を発現し、かつ脳の黒質におけるドーパミン産生神経細胞数が野生型動物と比較して有意に減少していることを特徴とする。特に好ましい態様によれば、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、以下の特徴の何れか１つ以上を有している。
（１）若年齢で脳内ドーパミン量が野生型動物と比較して有意に減少している。好ましくは生後８週齢で脳内ドーパミン量が野生型動物と比較して８５％以下、より好ましくは７０％以下、さらに好ましくは６０％以下まで減少している。
（２）黒質緻密部のドーパミン産生神経細胞数が野生型動物と比較して減少しているが、腹側被蓋野のドーパミン産生神経細胞数には変化がない。
（３）チロシンヒドロキシラーゼの発現量が野生型動物と比較して８０％以下、好ましくは７０％以下、より好ましくは６０％以下まで減少している。
（４）自発運動量が野生型動物と比較して６０％以下、好ましくは５０％以下まで減少している。
本明細書において「若年齢」とは、生後５日から１年齢程度の年齢を意味する。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物において、脳内ドーパミン量は、例えば、脳組織からドーパミン含有試料を調製し、ＨＰＬＣなどにより分析することにより測定することができる。また、黒質のドーパミン産生神経細胞数は、チロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞数を測定することにより測定することができる。また、チロシンヒドロキシラーゼの発現量は、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ又は免疫組織染色などにより測定することができる。さらに、運動機能及び自発運動量については、本願明細書の実施例１０及び１１に記載又はこれに準じた方法により測定することができる。
本明細書で言う「α−シヌクレイン遺伝子」は公知の遺伝子である。α−シヌクレイン遺伝子としては、ヒトなどの哺乳動物のα−シヌクレイン遺伝子、並びに、これらの遺伝子と同じ機能を有する変異体遺伝子の何れかを使用することができる。ヒトα−シヌクレイン遺伝子のアミノ酸配列を配列表の配列番号１６に記載する。
本発明では、α−シヌクレイン遺伝子の変異体遺伝子を使用することもできる。変異体遺伝子とは、α−シヌクレイン遺伝子のＤＮＡ配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたものを意味し、具体的には、該遺伝子中の塩基配列の一部が欠損した遺伝子、該遺伝子の塩基配列の一部が他の塩基配列で置換された遺伝子、該遺伝子の一部に他の塩基配列が挿入された遺伝子などを用いることができる。欠損、置換または付加される塩基の数は、特に限定されないが、一般的には１から５０個程度、好ましくは１から１５個程度、より好ましくは１から６個程度である。このような塩基配列の欠損、置換または付加によって、α−シヌクレインのアミノ酸配列において、好ましくは１ないし５個程度、より好ましくは１または２個程度のアミノ酸の欠損、置換または付加が生ずることになる。なお、これらの変異体遺伝子としては、野生型のα−シヌクレインと同等の機能を有するポリペプチドをコードしているものを使用することが好ましい。本明細書で言う「α−シヌクレイン遺伝子」とは、野生型のα−シヌクレイン遺伝子のみならず、上記したような変異体遺伝子の全てを包含する最も広い意味を有する。
本発明で用いるα−シヌクレイン遺伝子としては、野生型ヒトα−シヌクレイン遺伝子のアミノ酸配列（配列表の配列番号１６）におけるアミノ酸番号３０のアラニン残基が他のアミノ酸に置換した変異、及び／又は、アミノ酸番号５３のアラニン残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換し変異を有する、変異型のα−シヌクレイン遺伝子であることが好ましい。このような変異型のα−シヌクレイン遺伝子のＤＮＡは、例えば、公知のヒトα−シヌクレイン遺伝子をコードするＤＮＡを鋳型とし、α−シヌクレインタンパク質のアミノ酸番号３０、及び／又はアミノ酸番号５３のアラニン残基をコードするα−シヌクレイン遺伝子の塩基を他のアミノ酸をコードするように置換したミスセンス変異導入プライマーを用いたＰＣＲによって取得することができる。
本発明においては、配列番号１６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号３０のアラニン残基に相当するアミノ酸残基がプロリン残基に置換する変異、並びに配列番号１６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号５３のアラニン残基に相当するアミノ酸残基がスレオニン残基に置換する変異が好ましく、この中でも後者の変異が特に好ましい。さらに本発明では、上記アミノ酸配列のＣ末端（Ｃ末端の１〜２０アミノ酸残基、好ましくはＣ末端の５〜１５アミノ酸残基、例えば、Ｃ末端の１０アミノ酸残基など）を欠損させた遺伝子を使用することが好ましい。５３番目のアミノ酸残基であるアラニン残基がスレオニン残基に置換している変異体を使用することによりパーキンソン病の病態を再現することが可能になり、また、Ｃ末端を欠損させた遺伝子を使用することにより該遺伝子の発現量を向上させることが可能になる。
なお、ＰＣＲ、プライマーの作製、ゲノムＤＮＡの調製、クローニング、酵素処理等の方法は、当業者に周知の常法により行うことができる。
（２）本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法は特に限定されないが、例えば、α−シヌクレイン遺伝子をプロモーターの制御下に組み込んだ発現ベクターを受精卵などに導入することにより作製することができる。以下、α−シヌクレイン遺伝子の導入により該遺伝子を、特に脳の神経細胞で発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法について説明する。
トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製のために用いる導入遺伝子としては、上記したα−シヌクレイン遺伝子を適当な哺乳動物用プロモーターの下流に連結した組換え遺伝子を使用することが好ましい。当該α−シヌクレイン遺伝子の下流には、所望により、ポリＡシグナルを連結することができる。
導入遺伝子の構築に用いる哺乳動物用プロモーターの種類は特に制限されないが、α−シヌクレイン遺伝子を神経細胞（特に好ましくは、ドーパミン産生神経細胞）において発現させることができるプロモーターを用いることが好ましい。α−シヌクレイン遺伝子のドーパミン産生神経細胞での発現を駆動できるプロモーターの具体例としては、チロシンヒドロキシラーゼのプロモーターなどが挙げられる。その他、例えば、ウイルス（例、サイトメガロウィルス、モロニー白血病ウィルス、ＪＣウィルス、乳癌ウィルスなど）由来遺伝子プロモーター、各種哺乳動物（例、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（例、ニワトリなど）由来のプロモーターなどを適宜使用することもできる。
さらに、本発明で用いる組換え遺伝子には、α−シヌクレイン遺伝子の発現に必要なターミネーターを連結してもよい。該ターミネーターは、トランスジェニック動物において、目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（いわゆるポリＡ）として使用され、ウィルス由来、各種哺乳動物または鳥類由来の各遺伝子の配列が用いることができる。具体的には、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。その他、α−シヌクレイン遺伝子をさらに高発現させる目的で、既知の遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域を連結することができる。さらには、真核生物遺伝子のイントロンの一部をプロモーター領域の５’上流に、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも可能である。
上記導入遺伝子に組み込まれたα−シヌクレイン遺伝子は、受精卵等の細胞内で発現すると、細胞内にα−シヌクレインが産生されるようになる。
α−シヌクレイン遺伝子の導入によりα−シヌクレインを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、例えば、非ヒト哺乳動物の受精卵にα−シヌクレイン遺伝子を導入し、当該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物に移植し、当該非ヒト哺乳動物からα−シヌクレイン遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物を分娩させることにより作製することができる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類の他、ニワトリ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、サル等を使用することができるが、作製、育成及び使用の簡便さなどの観点から見て、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類が好ましく、そのなかでもマウスが最も好ましい。
本発明で用いるトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、胚芽細胞と、生殖細胞あるいは体細胞とが、非ヒト哺乳動物またはこの動物の先祖に胚発生の段階（好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）において外来性のα−シヌクレイン遺伝子を含む組み換え遺伝子を導入することによって作出される。α−シヌクレイン遺伝子を含む組み換え遺伝子の構築は上記した通りである。
受精卵細胞段階におけるα−シヌクレイン遺伝子の導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように維持されるように行う。遺伝子導入後の作出動物の胚芽細胞において、α−シヌクレイン遺伝子が存在することは、作出動物の後代がすべてその胚芽細胞および体細胞のすべてにα−シヌクレイン遺伝子が存在することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてにα−シヌクレイン遺伝子を有する。
本発明のトランスジェニック動物は、交配により遺伝子を安定に保持することを確認して、当該遺伝子保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することができる。導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該遺伝子を過剰に有するように繁殖継代することができる。α−シヌクレイン遺伝子の発現部位を同定するためにはα−シヌクレイン遺伝子の発現を個体、臓器、組織、細胞の各レベルで観察することができる。また、α−シヌクレインの抗体を用いた酵素免疫検定法によりその発現の程度を測定することも可能である。
以下、トランスジェニック非ヒト哺乳動物がトランスジェニックマウスの場合を例に挙げて具体的に説明する。α−シヌクレイン遺伝子をコードするｃＤＮＡをプロモーターの下流に含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の雄性前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、偽妊娠雌性マウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することによりトランスジェニックマウスを作製することができる。上記マウスの受精卵としては、例えば、１２９／ｓｖ、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ、ＳＪＬ／Ｗｔ等に由来するマウスの交配により得られるものなら任意のものを使用できる。
また、注入する導入遺伝子の数は受精卵１個当たり１００〜３０００分子が適当である。そしてまた、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等よりＤＮＡを抽出し、導入したα−シヌクレイン遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、α−シヌクレインを過剰発現することを特徴とするものであり、パーキンソン病の治療薬又は予防薬のスクリーニング試験に利用可能なモデルであり、またパーキンソン病の発生機構の解明などの研究分野においても有用である。
また、上記した本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の一部としては、非ヒト哺乳動物の細胞、細胞内小器官、組織および臓器のほか、頭部、指、手、足、腹部、尾などが挙げられ、これらも全て本発明の範囲内に属する。
（３）ドーパミン様作用を有する物質（例えば、パーキンソン病の治療剤及び／又は予防剤など）のスクリーニング
本発明によるドーパミン様作用を有する物質のスクリーニング方法は、α−シヌクレインを過剰発現する本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いて行うことができる。即ち、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えば、トランスジェニックマウスなど）に、被検物質を投与し、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物の生理学的データや運動能力などを評価・検討することにより、該被検物質のパーキンソン病に対する治療効果や予防効果を評価することができる。
あるいはまた、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、投与後におけるα−シヌクレインの発現状態や生体内における動態を分析することにより、該被検物質のパーキンソン病に対する治療効果や予防効果を評価することもできる。
すなわち、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を利用することにより、パーキンソン病の治療効果及び予防効果を評価することが可能であり、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、パーキンソン病の病態評価モデル動物として利用することができる。例えば、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いて、これらの病態回復および重篤程度を判定し、この疾患の治療方法の検討を行うことも可能である。
さらにまた、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることによって、α−シヌクレインの過剰発現と、上記疾病の進行度などを分析することにより、該疾患の発症・進行のメカニズムを解明することができる。
本発明のスクリーニング方法に供される被験物質としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。またペプチドライブラリーや化合物ライブラリーなど、多数の分子を含むライブラリーを被験物質として使用することもできる。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられる。また、被験物質の投与量は、投与方法、被験物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質は、上記した被験物質から選ばれた物質であり、パーキンソン病に対して予防・治療効果を有するので、パーキンソン病に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた物質から誘導される化合物も同様に医薬として用いることができる。該スクリーニング方法で得られた物質は塩を形成していてもよく、該物質の塩としては、生理学的に許容される酸（例えば、無機酸、有機酸）または塩基（例えば、アルカリ金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。
塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた物質は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。
例えば、該物質を生理学的に許容される担体、香味剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などと一緒に混和することによって製剤を製造することができる。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ，ゼラチン，アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖，乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント，アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなビヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを、溶解または懸濁させるなど常法に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水，ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール，塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ，ＨＣＯ−５０）などを併用することもできる。油性液としては、例えば、ゴマ油，大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル，ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
また、上記のパーキンソン病の治療剤及び／又は予防剤には、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン，ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール，フェノールなど）、酸化防止剤などを配合してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物に対して投与することができる。該物質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、経口投与する場合、一般的に成人においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、注射剤の形で通常成人に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜５０ｍｇ程度を静脈注射により投与する。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【実施例】［実施例１］ヒト型α−シヌクレイン遺伝子のクローニング
ヒト脳由来ｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型とし、配列−１のオリゴヌクレオチドと配列−２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ＰＣＲによりヒト型α−シヌクレイン遺伝子を増幅した。当該反応にはタカラバイオ社製のキット（ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２）を用い、タカラバイオ社製のＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用した。
反応組成液
ヒト脳由来ｃＤＮＡ                        １μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液                        ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                      ４μｌ
１０μＭ  オリゴヌクレオチド（配列−１）  ２μｌ
１０μＭ  オリゴヌクレオチド（配列−２）  ２μｌ
水                                  ３５．５μｌ
ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ            ０．５μｌ
総量                                    ５０μｌ
反応条件
９４℃で２分保持後、９４℃で３０秒間反応させ、６０℃まで冷却し、６０℃で１分保持し、更に７２℃で３分間保持した。これを３０回繰り返して、目的配列を増幅させた。
0004613824.tif 000002
増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）で分画し、常法に従ってヒトα−シヌクレイン遺伝子を含むバンド（１．２４ｋｂ）を切り出した。アガロースゲルからのＤＮＡ断片の抽出と精製はＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（バイオ  １０１社製）を用いて行った。この精製ＤＮＡ断片を以下の方法により塩基配列決定用ベクター、ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）に組み込んだ。ライゲーション溶液は、タカラバイオ社製のキット（ＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２）を用い、１６℃で１．５時間反応させた。
反応組成液
ＰＣＲ産物                                １μｌ（５０ｎｇ）
Ｔ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ          １μｌ（１７ｎｇ）
水                                        ３μｌ
ライゲーション溶液                        ５μｌ
総量                                    １０μｌ
上記反応溶液を用いて常法に従って大腸菌Ｋ１２株ＤＨ５の形質転換を行った。形質転換体をアンピシリン（Ａｍｐ）５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天培地にプレーティングし、３７℃で一晩培養した。コロニーを５０μｇ／ｍｌのＡｍｐを含むＬＢ液体培地１０ｍｌに接種して３７℃で一晩培養し、遠心分離によって菌体を集めた後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）で組換えＤＮＡを精製し、常法に従って全塩基配列を決定した。塩基配列はＧｅｎｂａｎｋに登録されている配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：Ｌ０８８５０）と同一であった。このようにして構築した組み換えＤＮＡをｐＴ７ＮＡＣＰ１４０と命名した。
［実施例２］変異型ヒトα−シヌクレイン遺伝子の調製
ｐＴ７ＮＡＣＰ１４０を鋳型とし、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて５３残基目のアラニン（コドン：ＧＣＡ）がスレオニン（コドン：ＡＣＡ）に変わるように点突然変異を導入した。
反応組成液
ｐＴ７ＮＡＣＰ１４０                              １μｌ（１ｎｇ）
１０μＭ  オリゴヌクレオチド（配列−３または５）  ２μｌ
１０μＭ  オリゴヌクレオチド（配列−４または６）  ２μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液                                ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                              ４μｌ
水                                          ３５．５μｌ
ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ                      ０．５μｌ
総量                                            ５０μｌ
反応条件
９４℃で２分保持後、９４℃で３０秒間反応させ、６０℃まで冷却し、６０℃で２分保持し、更に７２℃で３分間保持した。これを２５回繰り返して、目的配列を増幅させた。
0004613824.tif 000003
配列−３と配列−４を用いて得られたＰＣＲ産物と、配列−５と配列−６を用いて得られたＰＣＲ産物を等量混合し、９４℃で１０分間加熱後、６０分間かけて３７℃まで冷却し、３７℃で１５分間保持した。この反応溶液を鋳型としてＰＣＲ反応を実施し、目的とする点突然変異が導入されたＤＮＡを増幅した。
反応組成液
混合液                                          １μｌ
１０μＭ  オリゴヌクレオチド（配列−３）        ２μｌ
１０μＭ  オリゴヌクレオチド（配列−５）        ２μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液                              ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                            ４μｌ
水                                        ３５．５μｌ
ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ                    ０．５μｌ
総量                                          ５０μｌ
反応条件
９４℃で２分保持後、９４℃で３０秒間反応させ、６０℃まで冷却し、６０℃で２分保持し、更に７２℃で３分間保持した。これを２５回繰り返して、目的配列を増幅させた。
実施例１に記載したのと同様の方法を用いて増幅したＤＮＡ断片を精製し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）に組み込んだ。このようにして構築した組み換えＤＮＡをｐＴ７ＮＡＣＰ１４０ｍと命名した。常法に従ってヒトα−シヌクレイン遺伝子を含む領域の全塩基配列を決定し、当該遺伝子内に所望の点突然変異が導入されたことを確認した。
ｐＴ７ＮＡＣＰ１４０ｍを鋳型とし配列−１のオリゴヌクレオチドと配列−７のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ヒトα−シヌクレイン蛋白の開始コドンから１３０残基目のコドンまでを含む領域をＰＣＲにより増幅した。配列−７のオリゴヌクレオチドは１３０残基目のコドンの直後に終止コドンが来るように設計した。また当該ＰＣＲ反応にはＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）を用い、ＤＮＡ増幅中に新たな突然変異が入らないようにした。
反応組成液
ｐＴ７ＮＡＣＰ１４０ｍ                    １μｌ（１０ｎｇ）
１０×ＰＣＲ緩衝液                        ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                      ４μｌ
１０μＭ  オリゴヌクレオチド（配列−１）  ２μｌ
１０μＭ  オリゴヌクレオチド（配列−７）  ２μｌ
水                                  ３５．５μｌ
Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ            ０．５μｌ
総量                                    ５０μｌ
反応条件
９４℃で２分保持後、９４℃で３０秒間反応させ、６０℃まで冷却し、６０℃で１分保持し、更に７２℃で３分間保持した。これを３０回繰り返して、目的配列を増幅させた。
0004613824.tif 000004
得られたＤＮＡ断片を実施例１に記載したのと同様の方法を用いてｐＣＲＢｌｕｎｔ（インビトロジェン社製）に組み込んだ。このようにして構築した組み換えＤＮＡをｐＣＲＮＡＣＰ１３０ｍと命名した。常法に従って変異型ヒトα−シヌクレイン遺伝子を含む領域の全塩基配列を決定し、所望の配列を有することを確認した。
［実施例３］マイクロインジェクション用ＤＮＡ断片の調製
ｐＣＲＮＡＣＰ１３０ｍをＰｓｔＩとＳｐｅＩで切断してアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）で分画し常法に従って変異型ヒトα−シヌクレイン遺伝子を含むバンド（４１７ｂｐ）を切り出した。アガロースゲルからのＤＮＡ断片の抽出と精製は、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（バイオ１０１社製）を用いて行った。さらにＤＮＡ断片の両端を常法に従って平滑化した。次にラット・チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子のプロモーターを有する発現ベクター、ｐＴＨ／−９ｋｂ（Ｉｗａｗａｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２７４，５９０−５９５（２０００））をＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、プロモーターを有する断片をｐＢＳＴ−Ｎ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９，１６３１−１６３５（１９９２））に挿入してｐＲＴＨ−ＢｓｔＮを調製した。ｐＲＴＨ−ＢｓｔＮをＥｃｏＲＩで切断し、両端を常法に従って平滑化後、脱リン酸化した。当該ベクターと上述した変異型ヒトα−シヌクレイン遺伝子を含む断片を混合して実施例１に記載したのと同様の方法で結合して大腸菌Ｋ１２株ＤＨ５の形質転換を行い、形質転換体から組み換えＤＮＡを調製した。このようにして構築した組み換えＤＮＡをｐＲＴＨＮＡＣＰ１３０ｍと命名した。ｐＲＴＨＮＡＣＰ１３０ｍをＳａｌＩで切断した後アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）で分画し、常法に従って目的とするバンド（１１．４ｋｂ）を切り出した。アガロースゲルからのＤＮＡ断片の抽出と精製は、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（バイオ１０１社製）を用いて行った。精製したＤＮＡ断片をダルベッコ・リン酸緩衝溶液（インビトロジェン社製）に融解し（終濃度１２．６ｎｇ／μｌ（＝２０００コピー／２ｐｌ））、これをマイクロインジェクション用ＤＮＡ溶液とした。
［実施例４］変異型ヒトα−シヌクレイン・トランスジェニックマウスの作製
日本チャールスリバーが推奨する方法を用いて、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統の凍結前核期卵（日本チャールスリバーより購入）を融解した。すなわち凍結前核期卵が入ったクライオチューブ（直径１２ｍｍ、長さ４０ｍｍ、ナルジェヌンク社製）を液体窒素から取り出し、室温（２３℃）にて１分間放置した。３７℃に加温したマウス胚０．２５Ｍシュークロース液（ダイアヤトロン社製）９００μｌを添加し、ピペッティングにより素早く凍結塊を融解した。融解液を直径３５ｍｍのプラスチックシャーレに移し、胚操作用キャピラリーを用いて前核期卵を回収した。前核期卵をＰＢ１緩衝液で３回洗浄した後、マウス胚ｍＷ培地（三菱化学ヤトロン社製）で１時間培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。
ＰＢ１緩衝液
組成  ｇ／１００ｍｌ滅菌蒸留水
ＮａＣｌ              ０．８
ＫＣｌ                ０．０２
ＣａＣｌ２            ０．０１２
ＫＨ２ＰＯ４          ０．０２
ＭｇＣｌ・６Ｈ２Ｏ    ０．０１
Ｎａ２ＨＰＯ４        ０．１１５
ピルビン酸ナトリウム  ０．００３６
グルコース            ０．１
ペニシリンＧカリウム明治（明治製菓社製）      ０．００７５
アルブミンフラクションＶパウダー（シグマ社製）０．３
マイクロインジェクション装置（ノマルスキー微分干渉装置付き倒立顕微鏡ＴＥ３００（ニコン社製）にマイクロマニピュレーターＭＭＯ−２０４（ナリシゲ社製）、マイクロインジェクターＩＭ−５０Ａ／Ｂ（ナリシゲ社製）、マイクロシリンジ（ハミルトン社製）を取り付けたもの）を用いて、常法に従って前核期卵の雄性前核へ実施例３で調製したＤＮＡ溶液を２ｐｌ（２０００コピー）注入した。受精卵保持用マイクロキャピラリーとＤＮＡ注入用マイクロキャピラリーは、長さ１０ｃｍ、直径１．０ｍｍ、内径０．７５ｍｍのホウ珪酸塩ガラス管（サッター社製）を、プーラーＰ−９７／ＩＶＦ（サッター社製）及びマイクロフォージＭＦ−９００（ナリシゲ社製）で加工して作製した。ＤＮＡ注入操作用スライドガラスは、マイクロカバーグラス（マツナミガラス社製）にスウィンネクスガスケット０１５（ミリポア社製）を張り付けたものを使用した。
ＤＮＡ注入後の前核期卵をマウス胚ｍＷ培地（三菱化学ヤトロン社製）で一晩培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。翌朝２細胞期に発生した胚を常法に従ってレシピエントマウス（ＩＣＲ系統、雌、８週齢（日本ＳＬＣより購入）を同系統の精管結紮雄マウス（１０週齢、日本ＳＬＣより購入）と交配させ偽妊娠させたもの）の卵管膨大部へ移植した。移植１９日後にレシピエントマウスの帝王切開を行い、移植胚に由来する仔マウスを摘出した。仔マウスは離乳するまでフォスターマザー（出産１日後のＩＣＲ系統雌マウス（１２週齢、日本ＳＬＣより購入））に保育させ、帝王切開の２８日後に仔マウスを離乳させファウンダーマウスとした。
［実施例５］変異型ヒトα−シヌクレイン・トランスジェニックマウスの選別
離乳した仔マウスからジエチルエーテル麻酔下で尾の先端約５ｍｍを切断後、耳パンチ法により個体識別した。ＤＮＡ抽出緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＳＤＳ）４００μｌに対しプロテナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ：タカラバイオ社製）を２０μｌ添加した溶液中において、採取した尾を５５℃で一晩浸漬振盪した。この融解液１μｌを滅菌蒸留水で１００倍希釈し試料ＤＮＡとした。導入したＤＮＡの一部の配列を有する配列−８と配列−９、及び内部標準としてアセチルコリン受容体蛋白であるＲａｐｓｙｎの一部の配列を有する配列−１０と配列−１１のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを実施した。当該反応にはＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭ（タカラバイオ社製）を用い、アプライドバイオシステムズジャパン社製のＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００を使用した。
0004613824.tif 000005
0004613824.tif 000006
反応組成液
試料ＤＮＡ                                  １μｌ
１０μＭ  オリゴヌクレオチド（配列−８）    １μｌ
１０μＭ  オリゴヌクレオチド（配列−９）    １μｌ
１０μＭ  オリゴヌクレオチド（配列−１０）  １μｌ
１０μＭ  オリゴヌクレオチド（配列−１１）  １μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液                      ２．５μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                    １．５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                        ２μｌ
水                                  １３．７５μｌ
ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ              ０．２５μｌ
総量                                      ２５μｌ
ＰＣＲの反応条件として、９４℃で９分保持後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、更に７２℃で２分間反応させた。これを５回繰り返した後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間の反応を２８回繰り返し、目的の配列を増幅した。増幅したＤＮＡを、常法に従って２％ＴＡＥアガロース（Ｓｅａｋｅｍ  ＭＥ  Ａｇａｒｏｓｅ；タカラバイオ社製）ゲルで１００Ｖ、４０分間電気泳動した。ゲルをエチジウムブロマイド溶液（アマシャムバイオサイエンス社製）で染色した後、紫外光照射し配列−８と配列−９で増幅されたＤＮＡ断片（２７９ｂｐ）、及び配列−１０と配列−１１で増輻されたＤＮＡ断片（５９１ｂｐ）の両方を有する個体をＴｇ動物として選別した（図１）。
［実施例６］変異型ヒトα−シヌクレイン・トランスジェニックマウスの繁殖
実施例４で取得したファウンダーマウスを実施例５に記載した方法で解析することにより導入遺伝子陽性の個体を取得した。当該個体をＣ５７Ｂ６／Ｊ系統マウス（日本クレアより購入）と交配させ、Ｆ１世代を産生した。さらにＣ５７Ｂ６／Ｊ系統への戻し交配を繰り返してＮ２〜Ｎ６世代を産生した。実施例７に記載するサザンハイブリダイゼーション法でＦ１世代の遺伝子解析を行い、染色体中に組み込まれた遺伝子のコピー数を推定した。当該解析により染色体の複数箇所に導入遺伝子が挿入されていることが判明したファウンダーマウスは、Ｃ５７Ｂ６／Ｊ系統への戻し交配の過程で、各挿入部位について個別にラインを確立した。以上の方法により、計９匹のファウンダーマウスを作製し、ここから計１２ラインの変異型ヒトα−シヌクレイン・トランスジェニックマウスを確立した。
［実施例７］サザンハイブリダイゼーション解析
以下の方法により変異型ヒトα−シヌクレイン遺伝子に特異的なジゴキシゲニン標識プローブを調製した。まず変異型ヒトα−シヌクレイン遺伝子の一部と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド配列−１２及び配列−１３をプライマーとして用い、実施例３で調製したｐＲＴＨＮＡＣＰ１３０ｍを鋳型としてＰＣＲを行った。当該反応にはＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用い、タカラバイオ社製のＴａＫａＲａ  ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用した。
0004613824.tif 000007
反応組成液
ｐＲＴＨＮＡＣＰ１３０ｍ（１０ｐｇ／μｌ）                      １μｌ
１０×ＰＣＲバッファー（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）２．５μｌ
Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ                          １．５μｌ
（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）
１０μＭ  オリゴヌクレオチド（配列−１２）                      １μｌ
１０μＭ  オリゴヌクレオチド（配列−１３）                      １μｌ
滅菌蒸留水                                              １７．７５μｌ
Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ  ５Ｕ／μｌ                  ０．２５μｌ
（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）
総量                                                          ２５μｌ
反応条件
９４℃で９分保持後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、更に７２℃で２分間反応させた。これを５回繰り返した後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間の反応を２８回繰り返し、目的の配列を増幅した。
反応終了後の溶液を３μｌ採取し、常法に従って１．２％アガロースゲル電気泳動で分画し、泳動像を確認した。これにより２７９ｂｐの変異型ヒトα−シヌクレイン遺伝子の一部の配列を有するＤＮＡ断片が特異的に増幅されていることを確認した。次にＰＣＲ  ＤＩＧプローブ合成キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて、このＤＮＡ断片のジゴキシゲニン標識を行った。当該反応にはＴａＫａＲａ  ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用した。
反応組成液
上記ＰＣＲ反応溶液を滅菌蒸留水で１００倍希釈した溶液            １μｌ
ＭｇＣｌ２含ＰＣＲバッファー１０倍濃度                          ５μｌ
（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）
ＰＣＲ  ＤＩＧ  ミックス１０倍濃度                              ５μｌ
（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）
１０μＭ  オリゴヌクレオチド（配列−１２）                      １μｌ
１０μＭ  オリゴヌクレオチド（配列−１３）                      １μｌ
滅菌蒸留水                                              ３６．２５μｌ
エキスパンドＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ                    ０．７５μｌ
（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）
総量                                                          ５０μｌ
反応条件
９５℃で２分保持後、９５℃で１分間、６０℃で１分間、更に７２℃で２分間反応させた。これを１０回繰り返した後、９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間の反応を３５回繰り返した。これにより目的の配列を増幅させるとともに、ＤＩＧ−ｄＵＴＰをＰＣＲ産物に取り込ませることでジゴキシゲニン標識を行った。
反応終了後の溶液を３μｌ採取し、常法に従って１．２％アガロースゲル電気泳動で分画した。ジゴキシゲニンによる標識のため、本来のバンドサイズである２７９ｂｐよりも、バンドサイズが高分子側にシフトしていることを確認した。
次に尾組織由来ＤＮＡを以下の方法により調製した。尾組織（５ｍｍ）を２ｍｌのエッペンドルフチューブに入れ、バッファーＡＴＬ（キアゲン社製）４００μｌとプロテインネース  Ｋソリューション（キアゲン社製）２０μｌを添加し、５５℃で一晩浸漬振盪した。得られた融解液を１５０００×ｇ、１０分、室温（２３℃）で遠心し、上清と沈殿に分画した。上清を３００μｌ回収し、核酸自動分離装置ＰＴ−２００（クラボウ社製）を用いてＤＮＡを精製した後、分光光度計ＤＵ−６４０（ベックマン社製）を用いてＤＮＡ濃度を定量した。尾組織由来ＤＮＡ、１０μｇをＥｃｏＲＩで処理し、常法に従って１．２％アガロースゲル電気泳動で分画してナイロンメンブレンプラスチャージ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）に転写した。メンブレンをハイブリ・バック（コスモ・バイオ社製）に入れてＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）２０ｍｌを添加し、４２℃で３０分間浸漬振盪した。変異型ヒトα−シヌクレイン遺伝子特異的プローブ（１００℃で１０分加熱した後、直ちに氷上で急冷したもの）を２０ｍｌのＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂに希釈し（終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）、ハイブリ・バック内のＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂと交換した。これを４２℃で１２時間浸漬振盪した後、メンブレンを２×ＳＳＣ（０．１％  ＳＤＳ）で４２℃、１０分間処理し、０．１×ＳＳＣ（０．１％  ＳＤＳ）で６５℃、４０分間処理した。メンブレンと特異的に結合したジゴキシゲニン標識プローブの検出は、ＤＩＧ洗浄およびブロックバッファーセット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて行った。すなわち、メンブレンをマレイン酸バッファー（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）で２倍に希釈したブロッキング溶液（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）に浸し、室温（２３℃）で２時間振盪した。次にアルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニンＦａｂフラグメント（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をこの溶液で１００００倍希釈し、メンブレンを３０分間浸漬振盪した。さらにメンブレンを洗浄バッファー（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）で４０分間洗浄した後、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を検出バッファー（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）で１００倍希釈して、メンブレンを反応させた。シグナルの検出はルミ・イメージャーＦ１ワークステーション（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を使用した。
サザンハイブリダイゼーション解析の結果、トランスジェニックマウスでは導入遺伝子に由来する３４６ｂｐのバンドが検出されたが、野生型マウスでは検出されなかった（図２Ａ）。当該バンドのシグナル強度は各ラインで大きく異なっていた。シグナル強度から各ラインの挿入コピー数を推察したところ、最も高いコピー数を持つライン（１７０２ライン）は、約３０コピーの導入遺伝子が挿入されているものと考えられた。
なお、作製したトランスジェニックマウス（１７０２ライン）の受精卵（識別のための表示：ＴＨ／ｓｙｎ１３０ｍ１７０２）は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５４６として、２００３年（平成１５年）１０月２日付で、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１  中央第６）に寄託され、２００４年（平成１６年）９月１６日に、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１３１として国際寄託に移管されている。
この細胞に由来するマウスは、ドーパミン産生神経においてヒトα−シヌクレイン遺伝子の変異体を発現する。同様に、作製したトランスジェニックマウス（２４０２ライン）の受精卵（識別のための表示：ＴＨ／ｓｙｎ１３０ｍ  Ｔｇ２４０２）は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７３３として、２００４年（平成１６年）３月１２日付で、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１  中央第６）に寄託され、２００４年（平成１６年）９月１６日に、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１３２として国際寄託に移管されている。この細胞に由来するマウスは、ドーパミン産生神経においてヒトα−シヌクレイン遺伝子の変異体を発現する。
［実施例８］ノーザンハイブリダイゼーション解析
マウス脳組織を採材し、クライオチューブ（直径１２ｍｍ、長さ４０ｍｍ、ナルジェヌンク社製）に入れて速やかに液体窒素で凍結した。凍結した脳組織はＲＮＡを抽出するまでディープフリーザー（サンヨー社製）に入れて−８０℃で保存した。（株）日本ジーンが推奨する方法により、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社製）を用いてＴｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出を行った。すなわち、凍結した脳組織を液体窒素に浸しながらハンマーで叩き破砕した。破砕片を１００ｍｇ量り、２ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。ＩＳＯＧＥＮ１ｍｌを添加し、ホモジェナイザー（日立製作所社製）を用いて２０秒間破壊した。チューブを室温（２３℃）で５分間静置した後、クロロホルム２００μｌを加えて２分間激しく攪拌した。チューブを３分間静置した後、１２０００×ｇ、１５分、４℃で遠心し、上清６００μｌを回収した。これにイソプロパノール５００μｌを加えて１０分間静置した。１２０００×ｇ、１０分、４℃で遠心し、沈殿を７０％エタノールで洗浄した。洗浄した沈殿をジエチルピロカーボネート処理水３００μｌに融解し、分光光度計ＤＵ−６４０（ベックマン社製）を用いてＲＮＡ濃度を定量した。
ロシュ・ダイアグノスティックスが推奨する方法により、オリゴテックスｄＴ３０スーパー（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡよりポリ（Ａ）＋ＲＮＡの抽出を行った。すなわち２００μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡにＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＳＤＳ）を加え全量で２００μｌとした。オリゴテックスｄＴ３０スーパーを２００μｌを加え、６５℃で５分間加熱し、氷上で３分間急冷した。５Ｍ  ＮａＣｌを４０μｌを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。１５０００×ｇ、３分、４℃で遠心し、上清を除去した。沈殿をＷａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  ＳＤＳ）５００μｌに懸濁した。１５０００×ｇ、３分、４℃で遠心し、上清を除去した。沈殿をジエチルピロカーボネート処理水２００μｌに懸濁した後、６５℃で５分間加熱し、氷上で３分間急冷した。１５０００×ｇ、３分、４℃で遠心し、上清中のポリ（Ａ）＋ＲＮＡを回収した。
５μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを常法に従って１．０％変性アガロースゲル電気泳動で分画し、ナイロンメンブレンプラスチャージ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）に転写した。実施例７と同じ方法で導入遺伝子ｍＲＮＡの検出を行った。検出後、メンブレンを０．５％  ＳＤＳで１００℃、１０分加熱することによりプローブを除去した。次に各レーンにアプライしたポリ（Ａ）＋ＲＮＡ量を補正する目的で同じメンブレンを用いてジゴキシゲニン標識したβ−ａｃｔｉｎのｃＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの条件は上述した方法と同一である。またジゴキシゲニン標識β−ａｃｔｉｎｃＤＮＡ断片は、マウス脳由来ｃＤＮＡを鋳型とし、配列−１４及び配列−１５をプライマーとして上述したのと同様の方法を用いて作製した。
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ノーザンハイブリダイゼーションの結果、変異型ヒトα−シヌクレイン遺伝子特異的プローブにより外来性のヒトα−シヌクレイン遺伝子だけでなく内在性のマウスα−シヌクレイン遺伝子の発現も検出された。前者のｍＲＮＡは約１．０ｋｂのバンドとして検出され、後者のｍＲＮＡは約１．６ｋｂのバンドとして検出された。ヒトα−シヌクレイン遺伝子の発現量は各ライン間で大きく異なっており、サザンハイブリダイゼーションで推察された導入遺伝子の挿入コピー数と強く相関していた。すなわち、最も挿入コピー数が高い（約３０コピー）と推察された１７０２ラインでは発現量が最も高かった（図２Ｂ）。同様に２４０２ラインの発現量も高かった（図２Ｂ）。
［実施例９］ウエスタンブロッティング解析
マウス脳組織にそれぞれ２０倍量のＴＢＳバッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ  ＮａＣｌにｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製），１％  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｉ（シグマ社製）を溶解したもの）を添加し、ホモジェナイザー（日立製作所社製）で破壊した。さらに超音波破壊（タイテック社製）を行い、得られた融解液を２５００回転３分４℃で遠心した。上清を回収しさらに４５０００回転１時間４℃で遠心した。その上清についてｂｉｃｕｃｕｌｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＣＡ）ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（ピアス社製）を用いて蛋白濃度を測定した。
これらの蛋白をＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ（テフコ社製）で電気泳動して分画し、ＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（アマシャム社製）にセミドライ式で２ｍＡ／ｃｍ２、１２０分の条件で転写した。変異型ヒトα−シヌクレイン蛋白の検出には１６％のゲルを用い、チロシンヒドロキシラーゼ蛋白の検出には１０％のゲルを用いた。転写後のＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅは、５％スキムミルクを含むＴＢＳ溶液で一晩、４℃でブロッキングした。ヒト型およびマウス型α−シヌクレイン蛋白を検出するために、一次抗体としてα−シヌクレイン蛋白特異的抗体であるＮＡＣＰ−５（Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（Ｂｅｒｌ）９９，１４−２０（２０００））を使用した。ＮＡＣＰ−５は０．５％スキムミルクを含むＴＢＳで５０００倍希釈して使用した。チロシンヒドロキシラーゼ蛋白の検出には、抗チロシンヒドロキシラーゼポリクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）を同様に４００倍希釈して使用した。二次抗体はＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ（アマシャム社製）を同様に１０００倍希釈して使用した。検出は、ＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム社製）を基質に用いてＨｙｐｅｒ  ｆｉｌｍ  ＥＣＬ（アマシャム社製）に感光し、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ  ＩＤ  Ｅｌｕｔｅにてバンドの測定を行った。
Ｃ末側１０残基を欠損するヒト変異型α−シヌクレイン蛋白は、内在性マウス型α−シヌクレイン蛋白（電気泳動上の分子量約１９ｋＤａ）より低分子量側に約１８ｋＤａのバンドとして検出された。このため同一メンブレンを用いて外来性と内在性α−シヌクレイン蛋白の発現量を比較定量することが可能であった。最も遺伝子発現量が高い１７０２ラインでは、内在性α−シヌクレイン蛋白と比較して、線条体部位で約３倍、中脳部位で約２倍のヒトα−シヌクレイン蛋白が発現していることが確認された（図２Ｃ）。同様に、２４０２ラインにおいても、内在性α−シヌクレイン蛋白と比較して高い発現量でヒトα−シヌクレイン蛋白が発現していることが確認された（図２Ｃ）。
チロシンヒドロキシラーゼ蛋白は分子量約５６ｋＤａのバンドとして検出された。α−シヌクレインの発現量が最も高い１７０２ラインでは、生後８週齢及び１年齢の線条体において、チロシンヒドロキシラーゼ蛋白量が野生型マウスのそれぞれ４０％、６０％まで有意に低下していた（図３）。
［実施例１０］正向反射テスト
生後３日から１４日齢の仔マウスを対象として、濾紙上に被験体を仰向けに置き、正常位に戻るまでの時間を計測した。時間はストップウォッチ（Ｔｉｍｅ  Ｋｅｅｐｅｒ、セイコー社製）により０．１秒の単位まで測定した。観察限度時間は３０秒とし、観察限度時間内に反射が観察されない場合は、反射潜時３０秒とした。午後１時から午後２時の時間帯に毎日３試行実施し、その中央値を粗点とした。統計解析はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ  Ｕ検定を用いて行った。
１７０２ラインにおいて、生後１２日齢以前の成績に有意な反射潜時の延長が認められた。野生型マウスは、１０日齢以降ほとんどの個体が１秒以内に正向反射を成立させが、１７０２ラインのＴｇマウスでは、１０日齢以降でも１０秒以上仰向けの状態から起き上がれない個体が観察された（図４）。
［実施例１１］自発運動量の測定
生後８週齢及び１年齢の雄マウスを対象として、１日間の運動量を赤外線感知型運動量測定装置（ＡＢ−Ｓｙｓｔｅｍ、ニューロサイエンス社製）を用いて測定した。明暗周期は明期１２時間（午前７時から午後７時）、暗期１２時間（午後７時から午前７時）とした。測定前日の午後７時より被験体を、床敷を敷いた小型ポリカーボネート製透明ケージ（Ｌ×Ｗ×Ｈ＝２３×１７×１２ｃｍ）に入れて、十分に馴化を行った。測定日は同一ケージを用いて、午前１１時から翌日の午前１１時までの運動量を１時間ごとに２４時間測定した。運動量は２４時間の累積カウントとして表現した。統計解析はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔで有意差検定を行なった。
１７０２ラインにおいて、１日間の総自発運動量が有意に低下していた。これは主として活動期（暗期）の運動量が低下しているためであった（図５）。
［実施例１２］脳内モノアミン量測定
１７０２ラインの生後８週齢および１年齢マウスの脳より中脳黒質部および線条体を、また５日齢および１０日齢のマウスからは全脳を摘出し、それぞれ液体窒素で凍結した。凍結した組織を粉砕機で粉砕した後、重量を測定して組織１００ｍｇに対して０．５ｍｌの０．２Ｍ過塩素酸（１００μＭのエチレンジアミン四酢酸２ナトリウムと１０μＭのパージリンを含む）を加え、ミニコードレスグラインダー（ベルテックエンタープライズ社製）を用いてホモジナイズした。ホモジナイズ試料を氷中で３０分間静置した後、０℃、２万×ｇで２０分間遠心し、上清を回収した。採取した上清を１Ｍの酢酸ナトリウムにてｐＨ３付近に調整後、孔径０．２２μｍのマイクロコンフィルター（ミリポア社製）で濾過しモノアミン測定用サンプルとした。
モノアミン量は以下の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて測定した。まずモノアミン、７種（ドーパミン；ＤＡ、ホモバニリン酸；ＨＶＡ、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸；ＤＯＰＡＣ、Ｌ−３−メトキシチラミン；３−ＭＴ、ノルエピネフリン；ＮＥ、セロトニン；５−ＨＴ、５−ヒドロキシインドール酢酸；５−ＨＩＡＡ）の高濃度標品（各１ｍｇ／ｍＬ）を調製し、これらの溶液をすべて混合して０．１Ｍ酢酸（１ｍｇ／ｍＬのエチレンジアミン四酢酸２ナトリウム含有）で希釈し、最終濃度１０ｎｇ／μＬの７種混合の標準標品を作製した。当該標品は分解を避けるため使用時まで４℃で遮光保存した。
高濃度標品（１ｍｇ／ｍＬ）
標品調製には液体クロマトグラフィー用蒸留水（ナカライテスク社製）を使用
標品は全てシグマ社より購入
ＤＡ  ６．１９ｍｇ／５ｍＬ  ０．１Ｎ塩酸（１ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ含有）
ＨＶＡ  ５ｍｇ／５ｍＬ  ０．１Ｎ塩酸（１ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ含有）
ＤＯＰＡＣ  ５ｍｇ／５ｍＬ  ０．１Ｎ塩酸（１ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ含有）
３−ＭＴ  ６．０９ｍｇ／５ｍＬ  ０．１Ｎ塩酸（１ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ含有）
ＮＥ  ５ｍｇ／５ｍＬ  ０．１Ｎ塩酸（１ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ含有）
５−ＨＴ  ６．０４ｍｇ／５ｍＬ  ０．１Ｍ  酢酸（１ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ含有）
５−ＨＩＡＡ  ５ｍｇ／５ｍＬ  ０．１Ｍ  酢酸（１ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ含有）
次に標準標品をＨＰＬＣにて、以下に示す条件で分析した。
ＨＰＬＣ分析条件
カラム：ＥＩＣＯＭＰＡＣ  ＳＣ−５ＯＤＳ  φ３．０ｍｍ×１５０ｍｍ（エイコム社製）
プレカラム：ガードカートリッジ（資生堂社製）
流速：０．５ｍＬ／分
作用電極：グラッシーカーボン
加圧電圧：＋７００ｍＶ
設定温度：３０℃
測定時間：２５分間
測定装置：ＮＡＮＯＳＰＡＣＥ  ＳＩ−１シリーズ（資生堂社製）
電気化学検出器（ＳＩ−１／２００５）
ポンプ（ＳＩ−１／２００１）
脱気装置（ＳＩ−１／２００９）
データ解析装置（Ｓ−ＭｉｃｒｏＣｈｒｏｍ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１）
移動相組成
０．１Ｍ酢酸・クエン酸溶液（ｐＨ３．９）        ８２％
（０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液：０．１Ｍクエン酸溶液＝１０：７混合液でｐＨ３．９）
メタノール（液体クロマトグラフィー用）          １８％
１−オクタンスルホン酸ナトリウム                １９０ｍｇ／Ｌ
エチレンジアミン四酢酸２ナトリウム              ５ｍｇ／Ｌ
まず測定用移動相を調製し、電気化学検出器の測定値が安定するまでカラムを移動相で平衡化した。測定値の安定を確認した後、調製した７種混合標品を０．０２Ｍ酢酸（２００ｍＭエチレンジアミン四酢酸２ナトリウム含有）で更に２００倍希釈し、５００ｐｇ／１０μＬ液（用時調製）を調製してＨＰＬＣに１０μＬ注入した。標品はノルエピネフリン、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸、ドーパミン、５−ヒドロキシインドール酢酸、ホモバニリン酸、Ｌ−３−メトキシチラミン、セロトニンの順にピークが検出されることが知られており、各ピーク面積およびリテンションタイムにずれが生じないことを確認した。次に脳ホモジネートより抽出した試料の測定を行った。１検体に付き１０μＬ、２５分毎にオートサンプラーを用いて自動注入し測定した。測定までの間、試料は恒温槽で４℃に保冷した。モノアミン量は、各標品５００ｐｇ／１０μＬのピーク面積に対する試料のピーク面積の比例計算によって算出し、組織１ｍｇ（試料５μＬ分）に換算した。
算出法：
組織１ｍｇのモノアミン（ｐｇ）＝試料ピーク面積÷標品ピーク面積×５００（ｐｇ）÷２
その結果、１７０２ラインのトランスジェニックマウスでは野生型に比べて、生後８週齢および１年齢ともに中脳黒質部のドーパミン量が減少していた（図６）。特に、８週齢マウスで有意に減少しており野生型の約６０％だった。同様にドーパミンの分解産物のホモバニリン酸も８週齢のトランスジェニックマウスで有意に低下していた。しかし、セロトニン量は変化していなかった。次に線条体のドーパミン量は、８週齢、１年齢とも有意に減少しており、特に８週齢では野生型の約５０％まで低下していた（図７）。さらに若齢期マウスでも、成体同様ドーパミン量の有意な減少が確認された（図８、９）。特に１０日齢マウス（図９）のドーパミン量は野生型の約６０％で、既に生後１０日でドーパミン含量が顕著に減少している事が確認された。
［実施例１３］免疫組織染色
分離した１７０２ラインのトランスジェニックマウスの脳をマイルドホルム２０ＭＮ（和光社製）で室温で１日固定した後、メスを用いてブレグマから前脳側２ｍｍとブレグマ０ｍｍで冠状面に切り出し、これを線条体部とした。またブレグマから後方２．５ｍｍとラムダ０ｍｍで冠状面に切り出し、これを中脳とした。この後、常法に従いパラフィン包埋し、厚さ３ミクロンで薄切して切片を調製した。抗原賦活化のために切片を脱パラフィンした後１０ｍＭクエン酸緩衝溶液（ｐＨ６．０）中でマイクロウェーブ処理を施し、０．５％ブロッキングリェージェント／マレイン酸緩衝溶液（１００ｍＭマレイン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５）を用いてブロッキング処理した（３７℃、２０分）。免疫組織染色には１／１００希釈したウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体（フナコシ社製、ＶＮ−３１０９−００）または１／２０００希釈したマウス抗ヒト型α−シヌクレインモノクローナル抗体、ＬＢ５０９（コスモバイオ社製、ＺＹＭ１８０２１５）を一次抗体として用い、終濃度１０μｇ／ｍｌになるように希釈した。ビオチン化抗ウサギＩｇＧ（フナコシ社製、４１−０５１０−００）またはビオチン化抗マウスＩｇＧ（フナコシ社製、４１−０５２０−００）を二次抗体として用いた。免疫組織染色は自動免疫染色システム（ベンタナ・ジャパン社製）を用い、ベンタナ社推奨の方法に従った。またマイヤーのヘマトキシリン（和光社製、１３１−０９６６５）を用いて細胞核を同時に染色した。
その結果、１７０２ラインのトランスジェニックマウスの中脳にＬＢ５０９陽性細胞すなわちヒト型α−シヌクレインを発現する神経細胞を多数見出すことができた。また、これらＬＢ５０９陽性神経細胞は同時にチロシンヒドロキシラーゼに陽性であり、導入した遺伝子が所望の部位の所望の神経細胞で発現していることを確認できた（図１０）。
［実施例１４］チロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞数の定量
以下の要領で１７０２ラインのトランスジェニックマウスの中脳の半連続的切片を調製した。まず厚さ３ミクロンで切片を１枚とった後、９枚分の切片を取り除いた。この作業を繰り返すことにより、理論的に厚さ３０ミクロンの脳組織につき３ミクロンの切片を１枚得ることができる。このようにして得られた中脳領域のすべての切片について、実施例１３に記載したのと同様の方法で抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体を用いて免疫組織染色を行った。これらの切片を光学顕微鏡で観察することによりブレグマ後方２．８ｍｍから３．８ｍｍの範囲の切片を選び出した。当該切片の左側腹側被蓋野領域と黒質緻密部領域が視野に収まるように観察し、Ｐｈｏｔｏｇｒａｂ−２５００（富士フィルム社製）を用いて画像データをコンピューターに取り込んだ。次に画像データを印刷し細胞核を確認できる神経細胞のみを数えることにより、チロシンヒドロキシラーゼ陽性神経細胞数を計測した。また画像データをＩＰＬａｂソフト（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ社製）を用いて解析することによりチロシンヒドロキシラーゼ陽性領域の定量を行った。この目的のために画像中のチロシンヒドロキシラーゼ陽性領域が選択されるようにＣｏｌａｒ  ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓを  Ｒｓ  Ｉｎ  ９８−ｍａｘに設定し、Ｔｏｔａｌ  ａｒｅａと黒質緻密部領域を測定した。その結果、１７０２ラインのトランスジェニックマウスの黒質緻密部領域において、チロシンヒドロキシラーゼ陽性神経細胞が同週齢、同性の野生型マウスと比べて統計学的に有意に減少していることが確認できた（図１１Ａ、Ｂ）。
【産業上の利用可能性】  本発明により提供される、α−シヌクレイン遺伝子を脳の神経細胞で過剰発現し、かつ脳の黒質におけるドーパミン産生神経細胞数が野生型動物と比較して有意に減少していることを特徴とするトランジェニック非ヒト哺乳動物は、パーキンソン病モデル動物として、パーキンソン病の発症機構の解明、パーキンソン病の予防剤や治療剤のスクリーニングのために有用である。特に本発明のトランジェニック非ヒト哺乳動物は、生後８週齢で脳内ドーパミン量が有意に減少しているため、長期間飼育する必要がないという利点を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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