(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
原発性心筋症および続発性心筋症からなる群由来の心疾患の処置用医薬であって、
S100A1タンパク質をコードする核酸配列を有する核酸、
S100A1と少なくとも90％の相同性を有し、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する１以上の変異体をコードする核酸配列を有する核酸、
配列番号34または38で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列を有する核酸と、配列番号36または39で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列を有する核酸との２つの核酸の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の２つの核酸の組合せ、あるいは、
前記の２つの核酸の組合せに、配列番号32または37で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列を有する核酸をさらに含む３つの核酸の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の３つの核酸の組合せを含有し、
該核酸が医薬的に適合し得る助剤および／または支持体とともに製剤化されていてもよい、医薬。
【請求項２】
原発性心筋症および続発性心筋症からなる群由来の心疾患の処置用医薬であって、
S100A1タンパク質をコードする核酸配列、
S100A1と少なくとも90％の相同性を有し、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する１以上の変異体をコードする核酸配列、
配列番号34または38で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列と、配列番号36または39で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列との２つの核酸配列の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の２つの核酸配列の組合せ、あるいは、
前記の２つの核酸配列の組合せに、配列番号32または37で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列をさらに含む３つの核酸配列の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の３つの核酸配列の組合せを有する遺伝子導入ベクターを含有し、
該ベクターが医薬的に適合し得る助剤および／または支持体とともに製剤化されていてもよい、医薬。
【請求項３】
原発性心筋症が、遺伝性心筋症および自然突然変異による心筋症を包含する、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項４】
続発性心筋症が、動脈硬化による虚血性心筋症、心筋の感染症または中毒症による膨張性心筋症、肺動脈性および／または動脈性高血圧症による高血圧性心疾患、律動障害および心臓弁の障害による構造的心疾患を包含する、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項５】
S100A1タンパク質をコードする核酸配列を有する核酸、
S100A1と少なくとも90％の相同性を有し、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する１以上の変異体をコードする核酸配列を有する核酸、
配列番号34または38で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列を有する核酸と、配列番号36または39で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列を有する核酸との２つの核酸の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の２つの核酸の組合せ、あるいは、
前記の２つの核酸の組合せに、配列番号32または37で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列を有する核酸をさらに含む３つの核酸の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の３つの核酸の組合せを含有し、
該核酸が医薬的に適合し得る助剤および／または支持体とともに製剤化されていてもよい、心不全処置用医薬。
【請求項６】
S100A1タンパク質をコードする核酸配列、
S100A1と少なくとも90％の相同性を有し、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する１以上の変異体をコードする核酸配列、
配列番号34または38で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列と、配列番号36または39で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列との２つの核酸配列の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の２つの核酸配列の組合せ、あるいは、
前記の２つの核酸配列の組合せに、配列番号32または37で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列をさらに含む３つの核酸配列の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の３つの核酸配列の組合せを有する遺伝子導入ベクターを含有し、
該ベクターが医薬的に適合し得る助剤および／または支持体とともに製剤化されていてもよい、心不全処置用医薬。
【請求項７】
S100A1が、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有する、請求項１ないし６のいずれかに記載の医薬。
【請求項８】
該断片が、配列番号34で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片と、配列番号36で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片との２つの疎水性断片の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の２つの疎水性断片の組合せ、または、配列番号32で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片と、配列番号34で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片と、配列番号36で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片との３つの疎水性断片の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の３つの疎水性断片の組合せである、請求項１ないし６のいずれかに記載の医薬。
【請求項９】
S100A1をコードする配列番号1の核酸配列、またはこの配列を有する遺伝子導入ベクターを含有する、請求項１ないし６のいずれかに記載の医薬。
【請求項１０】
該断片をコードする核酸配列が、
配列番号33で示される核酸配列と、配列番号35で示される核酸配列との２つの核酸配列の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の２つの核酸配列の組合せ、
前記の２つの核酸配列の組合せに、配列番号31で示される核酸配列をさらに含む３つの核酸配列の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の３つの核酸配列の組合せ、
配列番号38で示される断片をコードする核酸配列と、配列番号39で示される断片をコードする核酸配列との２つの核酸配列の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の２つの核酸配列の組合せ、または
前記の２つの核酸配列の組合せに、配列番号37で示される断片をコードする核酸配列をさらに含む３つの核酸配列の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の３つの核酸配列の組合せであるか、あるいは、
これらの核酸配列の組合せを有する遺伝子導入ベクターの形態で含有される、請求項１ないし６のいずれかに記載の医薬。
【請求項１１】
経口、静脈、動脈または冠動脈適用用に製剤化されている、請求項１ないし１０のいずれかに記載の医薬。
【請求項１２】
原発性心筋症および続発性心筋症からなる群由来の心疾患の処置用医薬の製造のための、
S100A1タンパク質、
S100A1と少なくとも90％の相同性を有し、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する１以上の変異体、
配列番号34または38で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片と、配列番号36または39で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片との２つの疎水性断片の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の２つの疎水性断片の組合せ、あるいは、
前記の２つの疎水性断片の組合せに、配列番号32または37で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をさらに含む３つの疎水性断片の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の３つの疎水性断片の組合せの使用。
【請求項１３】
原発性心筋症および続発性心筋症からなる群由来の心疾患の処置用医薬製剤の製造のための、
S100A1タンパク質をコードする核酸配列を有する核酸、
S100A1と少なくとも90％の相同性を有し、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する１以上の変異体をコードする核酸配列を有する核酸、
配列番号34または38で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列を有する核酸と、配列番号36または39で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列を有する核酸との２つの核酸の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の２つの核酸の組合せ、あるいは、
前記の２つの核酸の組合せに、配列番号32または37で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列を有する核酸をさらに含む３つの核酸の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の３つの核酸の組合せの使用であって、
該核酸が医薬的に適合し得る助剤および／または支持体とともに製剤化されていてもよい、使用。
【請求項１４】
原発性心筋症および続発性心筋症からなる群由来の心疾患の処置用医薬製剤の製造のための、
S100A1タンパク質をコードする核酸配列、
S100A1と少なくとも90％の相同性を有し、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する１以上の変異体をコードする核酸配列、
配列番号34または38で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列と、配列番号36または39で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列との２つの核酸配列の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の２つの核酸配列の組合せ、あるいは、
前記の２つの核酸配列の組合せに、配列番号32または37で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列をさらに含む３つの核酸配列の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の３つの核酸配列の組合せを有する遺伝子導入ベクターの使用であって、
該ベクターが医薬的に適合し得る助剤および／または支持体とともに製剤化されていてもよい、使用。
【請求項１５】
原発性心筋症が、遺伝性心筋症および自然突然変異による心筋症を包含する、請求項１２ないし１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
続発性心筋症が、動脈硬化による虚血性心筋症、心筋の感染症または中毒症による膨張性心筋症、肺動脈性および／または動脈性高血圧症による高血圧性心疾患、律動障害および心臓弁の障害による構造的心疾患を包含する、請求項１２ないし１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
心不全処置用医薬製剤の製造のための、
S100A1タンパク質、
S100A1と少なくとも90％の相同性を有し、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する１以上の変異体、
配列番号34または38で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片と、配列番号36または39で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片との２つの疎水性断片の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の２つの疎水性断片の組合せ、あるいは、
前記の２つの疎水性断片の組合せに、配列番号32または37で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をさらに含む３つの疎水性断片の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の３つの疎水性断片の組合せの使用。
【請求項１８】
心不全処置用医薬製剤の製造のための、
S100A1タンパク質をコードする核酸配列を有する核酸、
S100A1と少なくとも90％の相同性を有し、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する１以上の変異体をコードする核酸配列を有する核酸、
配列番号34または38で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列を有する核酸と、配列番号36または39で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列を有する核酸との２つの核酸の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の２つの核酸の組合せ、あるいは、
前記の２つの核酸の組合せに、配列番号32または37で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列を有する核酸をさらに含む３つの核酸の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の３つの核酸の組合せの使用であって、
該核酸が医薬的に適合し得る助剤および／または支持体とともに製剤化されていてもよい、使用。
【請求項１９】
心不全処置用医薬製剤の製造のための、
S100A1タンパク質をコードする核酸配列、
S100A1と少なくとも90％の相同性を有し、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する１以上の変異体をコードする核酸配列、
配列番号34または38で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列と、配列番号36または39で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列との２つの核酸配列の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の２つの核酸配列の組合せ、あるいは、
前記の２つの核酸配列の組合せに、配列番号32または37で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片もしくはそれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列を有する疎水性断片をコードする核酸配列をさらに含む３つの核酸配列の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の３つの核酸配列の組合せを有する遺伝子導入ベクターの使用であって、
該ベクターが医薬的に適合し得る助剤および／または支持体とともに製剤化されていてもよい、使用。
【請求項２０】
S100A1が、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有する、請求項１７ないし１９のいずれかに記載の使用。
【請求項２１】
該断片が、
配列番号34で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片と、配列番号36で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片との２つの疎水性断片の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の２つの疎水性断片の組合せ、
または、配列番号32で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片と、配列番号34で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片と、配列番号36で示されるアミノ酸配列を有する疎水性断片との３つの疎水性断片の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の３つの疎水性断片の組合せである、請求項１７ないし１９のいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
配列番号1のS100A1をコードする核酸配列またはこの配列を有する遺伝子導入ベクターを用いる、請求項１３ないし１９のいずれかに記載の使用。
【請求項２３】
該断片をコードする核酸配列が、
配列番号33で示される核酸配列と、配列番号35で示される核酸配列との２つの核酸配列の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の２つの核酸配列の組合せ、
前記の２つの核酸配列の組合せに、配列番号31で示される核酸配列をさらに含む３つの核酸配列の組合せであって、かつ筋小胞体からのCa2+放出ならびに筋小胞体へのCa2+の再取込の促進および増大活性を有する前記の３つの核酸配列の組合せ、または、
これらの核酸配列の組合せを有する遺伝子導入ベクターである、請求項１４ないし１９のいずれかに記載の使用。
【請求項２４】
医薬が、経口、静脈、動脈または冠動脈適用用に製剤化されている、請求項１２ないし２３のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、治療的に有効量の１以上のS100タンパク質類、それらの１以上の変異体もしくは断片、またはこれらのアミノ酸配列をコードし、場合により１以上の遺伝子導入ベクター中に集積されている核酸配列を含有する心不全治療用医薬に関する。
【０００２】
細胞内のCa2+ホメオスタシスの変化は、心不全において分子レベルで病態生理学上中枢的な役割を果たす。Gwathmey らは初めて末期心不全患者の収縮心筋の組織標本中に延長された細胞内Ca2+動態(transients)を検出した(1)。高い心拡張期Ca2+レベルと低い心収縮期Ca2+ピーク群(2)のバックドロップに対し、この発見は、筋疾患心筋の収縮力−頻度関係の逆数として血流力学的レベルで相関する筋小胞体(sarcoplasmic reticulum、以下、略してSR)の機能不全の顕れであると解釈された(3)。
【０００３】
ここで中心となる重要なことは、Ca2+ATPアーゼ(1:10,000の濃度勾配に対してサイトソルからSR中へCa2+を汲み出すSRのCa2+ポンプ)による心拡張期のSR中へのCa2+の再取り込みが低下することである。これによって一方で心拡張期の心筋の弛緩が妨げられ、かつ、関連して心収縮期Ca2+放出が低下するので、心筋の収縮力が低下する。中でもこの観察は、不全心臓ではcAMPレベルが低い(4)という事実に基づいている。ホスホランバンのcAMP依存性のリン酸化が、SRのCa2+ATPアーゼの活性化の前提条件となる。
【０００４】
従って収縮性を向上させる既存の方法論の１つは、ホスホジエステラーゼ阻害剤の投与により細胞内cATPレベルを上昇させることを狙いとするものであった。この薬理学的アプローチにより短時間心臓の性能は向上するが、プラシーボに比べ、調べられた患者の死亡率が53%を超えるので、心不全の長期処置にはこの療法にも選択の余地が残る。
【０００５】
これまでに行われたさらなる方法論は、同じCa2+濃度に対して収縮器官の増強を可能にするCa2+増感剤で収縮器官を増感することで、心収縮期のCa2+供給の低下をより効果的に用いることからなる。しかしながらピモベンダンを用いてこれまでに行われた臨床試験は、プラシーボに比べて心機能が有意に向上するとは言えなかったので、十分なものではなかった(7)。不均一群についての新規Ca2+増感剤による臨床データはまだ得られていない。しかし、いくつかのCa2+増感剤を用いたこの療法アプローチでは、収縮器官のCa2+感受性の上昇によって弛緩が悪くなるので、心収縮期に強度が増すという治療上の利点が、心拡張の阻害という点で疑問になる(8)。
【０００６】
心不全の枠組み内でSRの機能を制限するさらなる分子レベルの原因が探索されたが、不全心臓の粗膜調製物(未精製膜)でCa2+ATPアーゼ活性が低いことが種々の動物モデル、またヒトで測定することができ、SRのタンパク質組成の変化がその原因であると思われた。しかし、SRタンパク質ホスホランバン、Ca2+ATPアーゼおよびリアノジンレセプターの遺伝子発現研究では様々な矛盾したデータが得られた。このように、種々の研究グループ(9、10、11)がホスホランバンおよびCa2+ATPアーゼをコードする遺伝子の発現、またタンパク質レベルでの有意な減少を見出したが、一方、Movsesianら(12)およびSchwingerら(13)は発現に有意な差はないと記載し、また、Araiら(14)は肥厚発達の過程で示差的発現を見出した。末期不全心臓の粗膜調製物では有意に低いCa2+ATPアーゼ活性が検出されたが(15)、この発見は筋小胞体の高度に精製された膜調製物については理解できるものではなかった(12)。これまでこれらの矛盾した結果は分析方法の違いに帰されていた(12)。
【０００７】
従って本発明の目的は、心不全の治療、特に心不全の枠組み内に限定される心臓のポンプ能の治療または向上のための医薬を提供することにある。これらの医薬は好ましくはさらに一般に心臓の力を高め、急性および慢性心不全の治療に好適であることを意図している。
【０００８】
この目的は通常、本発明に従ってS100タンパク質類を用いることで達成され、これらのタンパク質は、直接有効成分として用いてもよいし、あるいは遺伝子治療のアプローチにより果たされる心筋中でのS100タンパク質の過剰発現として用いてもよい。特にこの目的を達成するには、請求項１から３７のものが有用である。
【０００９】
S100タンパク質類は、カルモジュリンなどと同様に、EFハンドを有するCa2+結合タンパク質群に属し、その200以上にわたるCa2+結合モチーフが今日知られている。S100タンパク質ファミリー自体は19のメンバーからなり、それらのうち13は、染色体1q21上の狭い遺伝子クラスターにコードされている。これらのタンパク質は、機能上、細胞分化の調節、細胞周期の調節、シグナル変換、ならびにCa2+ホメオスタシスに組み入れられている(16)。遍在発現するカルモジュリンとは対照的に、S100タンパク質の発現パターンは、組織特異的である(17)。それらは従って、それらのEFハンドへCa2+を結合させた後、特異的標的タンパク質と相互作用することにより、Ca2+シグナルを翻訳して組織特異的に応答する(16)。S100タンパク質は、S100ファミリー内で高い相同性があるよく保存されたアミノ酸配列を有する。このアミノ酸配列およびcDNA配列は、配列番号1ないし30(コード番号＜210＞)として、配列プロトコールに示されている。
【００１０】
本発明では、S100タンパク質類とは、完全天然型タンパク質、S10タンパク質の変異体、S100タンパク質のペプチド(断片)またはペプチド変異体(相同性が少なくとも60%、好ましくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも95%である)、ならびに組換えによって作製したタンパク質もしくはペプチドもしくは変異体、または合成ペプチドもしくは変異体、を意味する。
【００１１】
本発明の特定の態様によれば、S100タンパク質類としては、S100β(S100B)、S100A1、S100A2、S100A4またはS100A6などがある(Schafer et al., Genomics 23 (1995) 638-643参照)。以下では、「S100タンパク質」または「タンパク質」の用語により、指定した変異体またはペプチドを意味することもあるものとする。本発明によれば、S100タンパク質が種全般で相同であるため、いずれの種の(例えば、ブタ、ウシなどの)タンパク質およびそれらをコードする配列を用いてもよいが、対応するヒト配列が最も好ましい。
【００１２】
従って本発明の主題は、いずれを原因とするものであっても(原発性または続発性心筋症)、収縮力の低下を伴う心疾患の治療用医薬(医薬製剤)であって、治療的に有効量の１以上(以下、１またはそれ以上を意味する)のS100タンパク質(好ましくはS100β、S100A1、S100A2、S100A3、S100A4またはS100A6)、それらの１以上の変異体または断片を含有し、所望により医薬的に適合し得る助剤および／または支持体とともに処方されている医薬である。
【００１３】
本発明のある好ましい態様によれば、S100タンパク質S100A1は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含有し、その好ましい断片は配列番号32、34および36で示されるアミノ酸配列を含有する。疎水性が優勢なペプチドは、C末端またはN末端において親水性アミノ酸で伸長させることにより溶解度を高めることができる。好ましくは本発明に従い、配列番号37、38および／または39の末端切断型および／または改変型断片を使用できる。
【００１４】
上記したタンパク質、変異体またはペプチドのいずれも各単独で有効成分として働くが、例えば配列番号32、34、36、37、38および39で示されるペプチドの少なくとも２種のペプチドなど、それらのどのような混合物も使用することができる。
【００１５】
本発明の枠組み内で、原発性心筋症とは、遺伝的心筋症および自然突然変異による心筋症を意味し、続発性心筋症とは、動脈硬化による虚血性心筋症、心筋の感染症または中毒症による膨張性心筋症、肺動脈性および／または動脈性高血圧症による高血圧性心疾患、律動障害および心臓弁の障害による構造的心疾患を意味し、これらの原発性および続発性筋疾患は心不全の原因となる。従って本願発明は、さらに心不全処置用医薬にも関する。
【００１６】
適用については、精製S100タンパク質(または変異体もしくはペプチド)の直接的な静脈、動脈もしくは冠動脈への注射、および／または組換えタンパク質または合成ペプチド類似体の長期にわたる経口投与も可能である。
【００１７】
本発明の枠組み内で、驚くべきことに、細胞培養モデルにおいて、S100タンパク質、特にS100A1タンパク質による処置の後、またS100遺伝子の付加(特にS100A1)の後、培養心筋細胞の短縮および再延長速度が増すことを特記されること、そしてそれはSRからの心収縮期Ca2+放出の上昇およびSRへのCa2+の再取り込みの促進という点で細胞内Ca2+動態の変化と相関していることが判明した(実施例参照)。これらの結果はまた、S100ファミリーの他のタンパク質でも確認することができた。
【００１８】
従って本発明はさらに、原発性および続発性心筋症ならびに心不全の処置用医薬に関しており、該医薬は、１以上のS100タンパク質またはそれらの１以上の変異体もしくは断片をコードする核酸配列を含有するものであり、該核酸は所望により医薬的に適合し得る助剤および／または支持体とともに処方されているものである。これらの核酸配列はまた、１以上の遺伝子導入ベクター中に含有されていてもよい。本発明に従って用いるS100タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号1ないし35に再現されており、配列番号１(S100A1 cDNA)が特に好ましい。本発明の好ましい態様によれば、配列番号32、24、36、37、38および39をコードする核酸配列(特に配列番号31、33、35の配列、ならびに配列番号37、38および39をコードする配列)の少なくとも２種の組合せ、が用いられる。遺伝子療法のアプローチにおいては、この組合せを含有する１以上の遺伝子導入ベクターが考えられ、すなわち指定の核酸配列群をいくつかのベクター中にクローニング(例えば、１種ずつ)してもよいし、それらのコード配列の組合せを単一のベクター中に含有させてもよい。
【００１９】
核酸または遺伝子導入ベクターは、所望により静脈、動脈、冠動脈または経口適用用に製剤化される。たとえトランスフェクション効率がより低くとも、リポソーム画分中でＤＮＡを使用すればさらなる適用の可能性が得られる。
【００２０】
従って本発明の主題はさらに、心筋中でのS100、好ましくはS100A1の過剰発現を可能にする構築物を使用することにもある。好ましいものは、S100タンパク質類、特にS100β、S100A1、S100A2、S100A4およびS100A6タンパク質、のDNAを含有し、かつ、それらが好ましくは冠動脈カテーテルを通じて冠動脈適用して、この適用の後に最高のトランスフェクション効率を示すウイルス性構築物である。
【００２１】
従って本発明はさらに、１以上のS100タンパク質または１以上のその変異体もしくは断片をコードする遺伝子導入ベクターの調製方法に関し、該方法では該タンパク質、変異体または断片をコードする核酸配列を遺伝子処置に適する１以上のベクター中にクローニングする。
【００２２】
このコード核酸配列は、好ましくは配列番号1ないし30で示される核酸配列群から選択されるものである。本発明の特に好ましい態様によれば、遺伝子導入ベクターの調製または直接適用のために、S100 DNA(配列番号１のS100A1をコードする配列)または配列番号32、34、36、37、38および／または39の断片をコードする核酸配列(特に配列番号31、33、35の配列、ならびに配列番号37、38および39をコードする配列)が使用される。
【００２３】
特にS100 DNAによる心臓組織のトランスフェクションを行うには、いくつかのウイルスベクター系が適している。最近のベクター系(G. Bilbao et al., FASEB J. 11 (1977) 624-634; A. Amalficano et al. J. Virol. 72 (1998) 926-933)では、公知のアデノウイルスベクターを用いる場合に比べて免疫学的副作用が最小となるので遺伝子治療の効率が向上する。遺伝子治療の効率は、例えばα-ミオシン重鎖プロモーターなどの強力な心臓特異的プロモーターを用いることでさらに最適化できる。
【００２４】
S100タンパク質の作用は、対応するセンスオリゴヌクレオチドを用いることでさらに高めることができるが、S100阻害物質のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用も考えられる。センスオリゴヌクレオチド(もしくは拮抗的に作用するタンパク質／ペプチドのアンチセンスオリゴヌクレオチド)、またはS100タンパク質は冠動脈の血管壁に直接導入することができる。バルーンシステムをオリゴヌクレオチドまたはタンパク質の担体物質としてのゲル面とともに使用すれば、バルーンの膨張に伴って血管の内皮層へのこれらの分子の導入が達成される。しかしながらこの適用法は、これによってS100タンパク質濃度の局部的上昇が達成できるに過ぎないので、内皮または平滑筋機能の向上という点では、血管の機能を向上させることによる心収縮性への影響に限られる。
【００２５】
S100A1 DNAによるトランスフェクションは、心臓組織中のS100A1タンパク質濃度を上昇させるので、心不全の枠組み内で起こるS100A1の不十分な発現は遺伝子療法によって原因上治療され、このタンパク質の機能が再び確実なものとなる。おそらくは心臓組織におけるS100A1の変力作用およびlusitropic作用を強調すべきである。培養心筋細胞、再構築された心臓組織(18)のS100A1遺伝子治療、ならびにS100A1を過剰発現させた後のウサギ心臓のin vivoモデルでは、少なくとも20%の有意な収縮速度上昇(変力作用陽性)および弛緩の促進(lusitropic作用陽性)が見られる。この作用は筋小胞体の機能の向上に基づくものであり、これはSRからのCa2+放出ならびにSRへのCa2+の再取り込みの促進および増大を特徴とする。このことは、生物発光による細胞内Ca2+動態の分析を用いるこれまでに公開されていないいくつかの試験に記載されている(実施例参照)。
【００２６】
本発明の利点は特に、心不全の病徴であるSRの機能不全が原因上治療されることにある。
【００２７】
従って本発明の枠組み内で、(慢性)心不全処置用医薬が得られるだけでなく、原発性心筋症(例えば、遺伝性心筋症、自然突然変異による心筋症)および続発性心筋症(例えば、動脈硬化による虚血性心筋症、心筋の感染症または中毒症状による膨張性心筋症、肺動脈性および／または動脈性高血圧症による高血圧性心疾患、律動障害および心臓弁の障害による構造的心疾患など)といった心不全の原因と理解される心疾患の処置用医薬が得られる。
【００２８】
本発明のさらなる利点は、S100、特にS100A1に関してさらに記載されるが、心不全を治療する遺伝子療法のアプローチを著しく拡大することができる。
【００２９】
Donatoによる、またGarbugliaら(19、20)による研究では、生化学再構築アッセイにおいてS100A1による微小管および中間フィラメントの重合の阻害が示されている。Schaperら(21)による免疫組織化学的分析では、NYHAクラスIV(New York Heart Association IV)の心不全患者の外植心臓において微小管ネットワークならびにランダムな中間フィラメントが著しく増加し、それにより不全心筋の粘性負荷が増し、ゆえに収縮速度が低下することが記載されている(22)。従ってS100A1の治療上の過剰発現により過剰な細胞骨格の架橋が妨げられ、粘性負荷を軽減することで収縮状態を改善することができる。
【００３０】
最後にBaudierら(23)からのデータでは、S100A1によるタンパク質キナーゼCの阻害が示されている。タンパク質キナーゼCの活性化は不全をもたらす高血圧症過程のシグナル変換カスケードにおいて鍵となる位置を占めるので、不全心筋における組織レベルS100A1の上昇によるタンパク質キナーゼCの阻害は、不全心臓のシグナル変換の正常化に対して治療上極めて重要であり得る。
【００３１】
以下の実施例、図面、および一連のプロトコールは本発明をさらに詳細に説明するものであって、本発明を限定するものではない。
【００３２】
実施例
実施例１
組換え体S100A1の精製
ヒト組換え体S100A1は、遺伝子操作した大腸菌(E. coli)で調製した。この目的で、S100A1のcDNAをpGEMEX発現ベクターにクローニングし、このベクターでコンピテント大腸菌を形質転換し、ベクター中に含まれるアンピシリン耐性によって選択した。この遺伝子操作細菌を使用まで-80℃にて50%グリセリン中で保存し、次いで以下の方法に従って混合した：100μg/mlアンピシリンを含有するLB培地3mlを保存容器からアイレットで播種し、37℃で一晩インキュベートした。その後一晩培養したものを100μg/mlアンピシリンおよび30μg/mlクロラムフェニコールを含有するLB培地250mlに加えた。光学濃度を30分毎に測定し、OD＞0.5で1M IPTG 120μlを加えた。さらに３〜４時間後、培地を遠心分離し、ペレットを３〜４回凍結・解凍して細菌を溶解した。
細菌ペレットを抽出バッファー(25mM tris-HCl、pH 7.5、50mM KCl、1mM PMSF、5mM EDTA)中で超音波によりホモジナイズした。上清を硫酸アンモニウム飽和溶液で最終濃度2Mとし、遠心分離した。硫酸アンモニウム沈殿の上清を、予めバッファーA(25mM tris-HCl、pH 7.5、2mM CaCl2)で平衡化したHiTrapオクチル-セファロースカラム(Phamacia, Freiburg)に適用した。カラムに結合したS100A1をバッファーB(25mM tris-HCl、pH 9.5、5mM EGTA)までの段階的勾配で溶出した。95%を上回る純度を達成するには、次ぎにS100溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーに付した。このサンプルを、予めバッファーA(25mM tris-HCl、pH 7.5)で平衡化したHiTrapQカラム(Pharmacia)上に付着させ、40%バッファーB(25mM tris-HCl、pH 7.5、1M NaCl)までの直線的勾配で溶出した。精製したS100A1を真空エバポレーターで濃縮し、10mM HEPES(pH 7.5)で透析し、その後-80℃で保存した。図１ａはHiTrapQカラムおよびSDSポリアクリルアミドゲルの溶出プロフィールを示し、図１ｂはS100A1精製の品質管理のために行われる関連のウエスタンブロットを示す。用いた精製法によって高純度のS100A1タンパク質が得られたことが明らかである。
【００３３】
実施例２
組換え体S100A1とともに培養した後の培養新生ラット心筋細胞における細胞内Ca2+動態の上昇
新生ラットの心臓は３日齢のラットから摘出し、心室を心房から分離し、ADSバッファー(6.8g NaCl、4.76g HEPES、0.12g NaH2PO4、1gグルコース、0.4g KCl、0.1g MgSO4および1000ml水)中、氷上に粗く砕いて保存した。次ぎに、バイオリアクター(Wheaton(登録商標)コンテナー)中で、コラゲナーゼ消化(108U/mg/mlコラゲナーゼ, Worthington, USA)によって組織塊から細胞を分離し、遊離した細胞を遠心分離により密度勾配(Percoll, Pharmacia(登録商標))で分離した。心筋細胞画分を細胞培養培地(DMEM＋10%新生ウシ血清)に再懸濁し、24ウェル細胞培養プレートで約100,000心筋細胞/ウェルの密度でプレーティングした。37℃、5%CO2で24時間培養した後、組換え体S100A1を1μM〜10μMの濃度で２日おきに細胞培養培地に加えた。７日後FuraPE3AM(登録商標)を用いて細胞を１時間ローディングした後、カルシウム動態の測定を行った。次ぎに細胞内Ca2+動態を検出し、倒立蛍光顕微鏡(Olympus OSP 3(登録商標))にて静止状態および電場刺激(PHYWE(登録商標)-生体電気測定装置;振動数30〜300bpm)の双方で定量した。図２は分析した対照細胞(2a)およびS100A1で処理した細胞(2b)の固有導関数を示している。統計学的評価では、心収縮期の単位時間当たりのCa2+濃度(+dc/dt)の上昇は対照細胞集団の３倍まで有意に高まる(p<0.0002)。心拡張期の単位時間当たりのCa2+濃度低下(-dc/dt)はS100A1刺激下では対照細胞集団の2.2倍に促進される。単位時間当たりのCa2+濃度の変化は、最大シグナルとシグナル振幅に達するまでの時間から指数として(+dc/dt)、あるいは半振幅とシグナル振幅が達成するまでの時間の指数(-dc/dt)として測定した。この試験アプローチでは、S100A1はパラ分泌因子としてSR機能の効率を向上させることが明らかである。
【００３４】
実施例３
S100A1を過剰発現するウイルス構築物の調製
S100A1を過剰発現するウイルス構築物を調製するために以下の方法を適用した：S100A1 DNAをアデノウイルス・シャトルベクターpAD TRACK(Tong-Chuan He et al. Proc Natl Acad Sci 95; 2509-2514)のCMVプロモーター後方のマルチクローニングサイトにクローニングした。得られたプラスミドをPME1で直鎖状にし、大腸菌BJ5183にてpEASY(Tong-Chuan He et al. Proc Natl Acad Sci 95; 2509-2514)と組み換えた。組換え構築物(pAD/S100A1)は、E1およびE3欠損5型アデノウイルスのウイルスDNA、S100A1 DNAおよびカナマイシン耐性を含有するプラスミドに相当する。このプラスミドpAD/S100A1サンプルは1999年3月26日に、ブタペスト条約の下、受託番号DSM 12755として、DSMZ- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH [German Collection of Microorganisms and Cell Cultures], Mascheroder Weg 1b, 38124 Brunswickに寄託した。次ぎにpAD/S100A1を大腸菌DH5∝に形質転換し、カナマイシン選択(50μg/mg)を伴って増殖させた。pAD/S100A1をPAC1で直鎖状にしてカナマイシン耐性を欠失させ、リポフェクタミン(Gibco, BRL)によってウイルス産生のためのHEK293細胞に組み込んだ。10日後、低力価でウイルスを回収し、再びHEK293を感染させた。回収・HEK293細胞の再感染を数回繰り返した後、最終的に高力価のウイルスが得られ、これは生物に導入する前に以下のように処理した：HEK293細胞を回収した後、細胞溶解し、遠心分離する(3400rpmｘ10分)。得られたHEK細胞ペレットをPBS(0.01M, Sigma, p-3813)で２回洗浄し、最後に0.01M TRIS-pH 8.1に取る。次ぎにウイルスを含有するHEK293細胞を４回凍結(液体窒素)・解凍(37℃)することで溶解し、ウイルスを放出させた。DNアーゼ消化(37℃にて30分間)によってHEK細胞のDNAを除去し、HEK細胞タンパク質を溶解物からフレオンで抽出した。ウイルスは塩化セシウム勾配による超遠心分離(12時間×127000g)で精製した。得られたウイルス画分を取り出し、２時間、３回透析し(0.01M PBS pH 7.4中、1容量%のサッカロース)、アリコートを-80℃で保存した。遺伝子治療については、心組織1g当たり109〜1012のウイルス粒子を用いる。
【００３５】
実施例４
ウサギ心臓の遺伝子治療：ウサギ心筋におけるCa2+結合性タンパク質S100A1のウイルスでの過剰発現の結果としての+dp/dtおよび心収縮期駆出圧の上昇
第４ICRにて、ニュージーランド白ウサギの右側の胸部を外側開胸術により切開した。大動脈を露出した後、心膜の切開および大動脈の連結を行った。左側の腔部への注入により、組換えS100A1ウイルス(n=6)、S100A1 cDNA を含まないウイルス(n=11)のウイルス粒子2ｘ1011、またはNaCl(n=11)で冠動脈潅流を行った。術後７日目にウサギに頸動脈を通じてカテーテルを挿管した。ウサギ心臓の収縮速度(dP/dt)および心収縮期駆出圧(SEP)は基底条件下ならびにイソプロテレノール刺激下(0.1、0.5および1.0μg/kg/分)で測定した。液体窒素中で急速冷凍したウサギ心筋から凍結切片を作製し、心筋のウイルス感染をGFP発現の蛍光顕微鏡観察により証明した(図３参照)。
【００３６】
S100A1 cDNAを含まないウイルス構築物を注入した結果、あらゆる上昇条件下で、NaClで処理した個体に比べてウサギ心臓の心収縮期駆出圧(SEP、mmHg)が平均9%低下した。基底条件下、個体がS100A1で処理された場合のSEPの挙動は両対照群とは統計学的に有意には異なっていない。S100A1を過剰発現する群のウサギのSEPは、すべてのイソプロテレノール刺激下で、S100A1 cDNAを含まないウイルス構築物で処理した群に比べて17%(0.1μg/kg/分; p<0.02)、10%(0.5μg/kg/分; p=0.06)および11%(1.0μg/kg/分; p<0.05)上昇する。イソプロテレノール刺激下、S100A1で処理した個体はNaCl群よりも4%高い(n.s.)SEPを有する(図４参照)。
【００３７】
心臓の収縮速度(dP/dt、mmHg/秒)は、発明者らが心筋炎の原因であるとするものである測定されたすべての条件下で、NaCl注入の場合に比べてS100A1 cDNAを含まないウイルス構築物を適用した際に平均10%まで低下する。S100A1を過剰発現する個体は、ウイルス対照群に比べ、基底条件下で有意なdp/dt偏差を示さなかった。これに対し、イソプロテレノール刺激下のS100A1群における心臓の収縮性は、ウイルス対照に比べて17%(0.1μg/kg/分; p<0.05)、14%(0.5μg/kg/分; p<0.03)および14%(1.0μg/kg/分; p<0.05)上昇した。組換え体S100A1ウイルスで処理した個体は心筋炎であるにもかかわらずNaCl群と比べて平均5%(n.s.)のdP/dt上昇を示した(図４ｂ参照)。
【００３８】
実施例５
組換え体S100A1およびこのタンパク質のペプチドによるラット骨格筋の除膜筋繊維調製物の収縮力動態の増強
Ca2+がS100A1に結合することでこのCa2+結合タンパク質の三次元構造が改変され、その結果、３つの疎水タンパク部分(1 アミノ酸2〜16[N末端]、配列番号32参照; 2 アミノ酸42〜54[ヒンジ領域]、配列番号34参照; 3 アミノ酸75〜85[C末端]、配列番号36参照)の狭い空間配置が生じるが、Trevesら(25)に示されるデータのようにRyR(リアノジンレセプターはSRのCa2+ATPアーゼの異名である)にともに結合している。従ってこの試験法の狙いは、SRからのCa2+放出の調節のための全タンパク質に比べ、合成ペプチドの形態にあるこの配列が機能上どんな重要性を持っているか調べることである。Ca2+放出は等尺性収縮力勾配にわたってラットのサポニン半透過性骨格筋繊維で直接測定した。S100A1ペプチド/タンパク質の添加前後の等尺性収縮力の測定値を対照とした。
【００３９】
個々のペプチドは作用を示さなかったが、「C末端」ペプチドと「ヒンジ領域」の組合せは等尺性収縮力をすでに15%±4%上昇させた。３つのペプチドの組合せ(図５ｂ)および組換えタンパク質(図５ａ)はいずれも等モル濃度(5〜10μM)で、収縮器官のCa2+感受性が変化していない対照に比べて、骨格遅筋系(ヒラメ筋)における最大収縮力を同様にそれぞれ49%±6%および52%±7%上昇させた。
【００４０】
これらの結果はS100A1の作用が疎水性タンパク部分によってシミュレートでき、天然タンパク質の完全な作用が３つすべてのペプチドの組合せによってはじめて誘発されることを示している。従ってそれらは、S100A1の疎水配列によるRyRのCa2+依存性配置調節の重要性を示している。
【００４１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  (a)HiTrapQの溶出プロフィール、220nmにおける吸収。(b)下記各精製段階のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後の銀染色：1：大腸菌からの抽出物、2：オクチル-セファロースに結合されなかったタンパク質、3：オクチル-セファロースのEGTA溶出物、4〜5：HiTrapQに結合されなかったタンパク質、6〜8：HiTrapQのS100A1ピーク画分。
【図２】  分析した対照細胞(図２ａ)、およびS100A1で処理した細胞(図２ｂ)の原図。
【図３】  急速冷凍したウサギ心筋の凍結切片におけるGFP発現の蛍光顕微鏡観察による心筋のウイルス感染の検出。
【図４】  S100A1で処理した動物群におけるイソプロテレノール刺激下の心収縮期駆出圧の対照群との比較(図４ａ)。S100A1で処理した動物群におけるイソプロテレノール刺激下の収縮速度の対照群との比較(図４ｂ)。
【図５】  等モル濃度(5〜10μM)の３種のS100A1ペプチド(N末端、ヒンジ領域、C末端；図５ｂ)の３つの組合せ、および組換え体S100A1タンパク質(図５ａ)による骨格遅筋系(ヒラメ筋)における最大収縮力増進の上昇。
【配列表】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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