(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列において、
(1)  第597-636位配列のうち第618位Gluを欠失した39アミノ酸配列；
(2)  第597-638位配列のうち第618位Gluを欠失した41アミノ酸配列；または
(3)  第597-639位配列のうち第618位Gluを欠失した42アミノ酸配列、
のアミノ酸配列からなるヒト変異型アミロイドタンパク質。
【請求項２】
請求項１のヒト変異型アミロイドタンパク質の前駆体である変異アミロイド前駆体タンパク質をコードするヒト変異アミロイド前駆体タンパク質遺伝子。
【請求項３】
請求項２のヒト遺伝子の転写産物であるmRNA。
【請求項４】
請求項３のmRNAから合成されるcDNAであって、配列番号１における第1852-1854塩基が欠失した塩基配列を有するcDNA。
【請求項５】
請求項１のヒト変異型アミロイドタンパク質のオリゴマーを抗原として作成した抗体であって、オリゴマー状のアミロイドタンパク質を特異的に認識する抗体。
【請求項６】
請求項２のヒト遺伝子または請求項３のmRNAの存在を検出することを特徴とするアミロイド関連疾患の検査方法。
【請求項７】
請求項２のヒト変異アミロイド前駆体タンパク質遺伝子を発現する細胞。
【請求項８】
請求項１の変異型アミロイドタンパク質を体内に有する非ヒト動物およびこの非ヒト動物由来の組織ならびに細胞。
【請求項９】
アミロイド関連疾患の治療薬成分を探索する方法であって、請求項７の細胞または請求項８の非ヒト動物もしくはこの非ヒト動物由来の組織ないしは細胞に被験物質を接触させ、当該細胞または組織において、請求項３に記載の遺伝子の発現産物の量を測定し、この発現産物量を低減させる候補物質を治療薬成分として特定することを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、家族性アルツハイマー病患者に存在する変異型アミロイドタンパク質とその利用発明に関するものである。
【背景技術】  アミロイドタンパク質はアルツハイマー病、ダウン症ばかりでなく正常に老化した脳組織にあらわれる組織病変である。このアミロイドタンパク質は疎水性アミノ酸に富む４０個から４２個／４３個のアミノ酸からなり、その前駆体であるアミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、以下「ＡＰＰ」という。）から加水分解切断によって産生される。ＡＰＰは６９５個、７５１個あるいは７７０個のアミノ酸からなる、膜を１回通過するタイプ１型膜タンパク質であり、アミノ末端側が細胞外にある。アミノ酸数の違いは細胞外領域にあるキュニッツ型と呼ばれるプロテアーゼインヒビター活性部位の有無による。
神経細胞では６９５個のアミノ酸からなるＡＰＰ（以下「ＡＰＰ６９５」といい、そのアミノ酸配列を配列番号２に示す）が主成分になっている。一方、アミノ酸７７０個からなるＡＰＰ（以下「ＡＰＰ７７０」といい、そのｃＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号３に示す。）は、ＡＰＰ６９５分子種にないアミノ酸配列（配列番号３のＧｌｕから３６３番目のＬｙｓまでの７５個ののアミノ酸）を含む。この挿入アミノ酸配列以外はＡＰＰ６９５と全くアミノ酸配列をもつ分子種である。ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７７０以外にはＡＰＰ７５１というアイソフォームがあるが、これはＡＰＰ７７０の３４５番目のＭｅｔから３６３番目のＬｙｓの１９個のアミノ酸がなく、全部で７５１個のアミノ酸からなる。ＡＰＰ７５１とＡＰＰ７７０に共通して挿入されるアミノ酸配列（ＡＰＰ７７０のアミノ酸配列で示すと、２８９番目のＧｌｕから３４４番目のＡｌａまでの５６個のアミノ酸）はキュニッツ型プロテアーゼインヒビターの活性があり、神経細胞以外の細胞において発現されていると考えられている。
ＡＰＰ６９５は、主として神経細胞で発現しているアイソフォームであり、細胞膜を１回通過する膜通過ドメイン（６２５番目のグリシンから６４８番目のロイシンまでの２４個のアミノ酸）をもつタイプ１型膜タンパク質である。アミロイドタンパク質は、ＡＰＰ６９５（配列番号２）の細胞外部にある５９７番目のアスパラギン酸から細胞膜内の６３６番目のバリンまでのアミノ酸４０個の短いタンパク質分子種と、６３８番目のアラニンあるいは６３９番目のトレオニンまでのアミノ酸４２個あるいは４３個からなる長いタンパク質分子種からなる。
アミロイドタンパク質の生理活性については、その神経細胞毒性が実験的に証明され（非特許文献１、２）、アルツハイマー病発症の鍵分子と考えられている。アミロイド前駆体タンパク質からアミロイドタンパク質が産生されるためには２段階の重要な反応が必要である。第１段階では、βセクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質の切断によってアミロイドタンパク質のアミノ末端側が切り離される。第２段階では、γセクレターゼによる切断によって、アミロイドタンパク質のカルボキシル末端側が切断され、アミロイドタンパク質の遊離とＡＰＰの細胞質断片の解離を生じることになる。従来の知見では、第２段階の切断点がアミロイドタンパク質のカルボキシル末端であるガンマ（γ）部位（配列番号３のＡＰＰ７７０における７１１番目のＶａｌと７１２番目のＩｌｅの間、７１３番目のＡｌａと７１４番目のＴｈｒの間、あるいは７１４番目のＴｈｒと７１５番目のＶａｌの間）で生じていると考えられてきたが、最近の知見ではさらにアミノ酸残基５から１０個分下流（カルボキシル末端方向）の細胞質寄りのイプシロン（ε）部位（配列番号３のＡＰＰ７７０における７１９番目のＴｈｒと７２０番目のＬｅｕの間あるいは７２０番目のＬｅｕと７２１番目のＶａｌの間）で生じるとする報告がある。
アルツハイマー病の脳内神経病変は、臨床的な異常症状である失見当識、記憶低下、記憶喪失、判断力低下、行動異常などが生じる前に生じている。神経病変は、アミロイドタンパク質の沈着と神経原線維変化、細胞脱落変性であるが、この中でも、アミロイドタンパク質の沈着は最初期の病理反応である。
アルツハイマー病の進行には、アミロイドタンパク質の産生・沈着によって引き起こされているとするアミロイド仮説が重要であると考えられており、その根拠として家族性アルツハイマー病研究がある。
γセクレターゼは、早期発症型家族性アルツハイマー病の原因遺伝子として発見された、染色体１４にあるプレセニリン１（非特許文献３）とプレセニリン２（非特許文献４、５）の遺伝子産物であるとする考えが有力であるが、なお確定していない。
ＡＰＰもまた早期発症型家族性アルツハイマー病の原因遺伝子である（非特許文献６）ことから、１つのアルツハイマー病という痴呆症の病因に複数の因子が関連していることが示されている。
前述のように、アミロイドタンパク質は２つの構成成分を含む。１つはアスパラギン酸から始まり４０番目のバリンで終了する短いアミロイドタンパク質成分（以下「Ａβ１−４０」と記載する）と、この４０個のアミノ酸からなる成分と同じくアスパラギン酸から始まるが２残基分のアミノ酸もしくは３残基分のアミノ酸だけ長い４２番目のＡｌａあるいは４３番目のＴｈｒで終了する４２個あるいは４３個のアミノ酸からなる長いアミロイドタンパク質成分（以下、それぞれを「Ａβ１−４２」あるいは「Ａβ１−４３」と記載するが、両者をあわせて「Ａβ１−４２／４３」と記載する場合もある）である。後者の長い成分の内、Ａβ１−４２は疎水性が高くより難溶性である。この長い成分が核となりこれに短い成分が付加することによって、直径約５から６ｎｍの線維状のアミロイド線維が形成される。
プレセニリン１あるいはプレセニリン２に遺伝変異が存在すると、長いアミロイドタンパク質であるＡβ１−４２／４３の産生が増加することが示されている。この変異効果によって、アミロイドタンパク質重合の閾値を決定していると考えられている長いアミロイドタンパク質成分が多量に形成され、病因反応を加速すると考えられている。
ＡＰＰにも多くの遺伝変異が同定されているが、代表的な変異は、アミロイドタンパク質のアミノ末端の直前にあるスウェーデン変異（Ｍｅｔ６７０Ａｓｎ、Ｌｙｓ６７１Ｌｅｕ：ただしＡＰＰ７７０のアミノ酸番号に従う。以下、変異型について同じ。）、オランダ型変異（Ｇｌｕ６９３Ｇｌｎ）、ロンドン変異（Ｖａｌ７１７Ｉｌｅ）およびオーストラリア変異（Ｌｅｕ７２３Ｐｒｏ）に大別されている。スウェーデン変異では２つのアミロイドタンパク質成分の産生が増加するが、ロンドン変異やオーストラリア変異ではＡβ１−４２／４３のみの産生が増加する。オランダ型変異の意義についてはなお議論の途上であり、結論は得られていない。
アポリポタンパク質Ｅの危険因子アレルとしてＥ４がある。一方のみの染色体アレルがＥ４の場合で８年から１０年、両方の染色体アレルがＥ４／Ｅ４になった場合は１６年から２０年、アルツハイマー病の発症が早まることが統計学的に証明されている（非特許文献７）。
βセクレターゼおよびγセクレターゼの活性阻害はアミロイドタンパク質産生を抑制し、アルツハイマー病の進行を停止もしくは遅らせられる治療薬になると考えられる。ＡＰＰの加水分解の第１段階では、βセクレターゼ以外にもαセクレターゼ反応があるが、第２段階であるγセクレターゼ反応は両者の第１段階に共通して生じることからより広いスペクトル効果が期待される。
γセクレターゼの同定については未だ最終的な結論が得られていないが、プレセニリン１が重要な役割をもっていることは証明されている。このプレセニリン１の働きを無くした動物実験や培養細胞での実験によると、脳神経発生や脊柱形成異常あるいはリンパ球発生の異常が生じるという。つまりプレセニリン１はアミロイドタンパク質以外にも多様な作用があることが知られている。
γセクレターゼの非特異的な活性抑制は癌化誘導などの重篤な副作用を誘導する可能性があるということを考えなくてはならない（非特許文献８）。一方、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ：Ｎｏｎ  Ｓｔｅｒｏｉｄａｌ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇｓ）は、疫学的に抗痴呆作用があることが示唆されてきているが、Ａβ１−４２／４３産生を選択的に阻害し（非特許文献９、１０）、その作用機序がＲｈｏキナーゼであることも証明されてきた（非特許文献１１）ことから重要な抗痴呆薬候補となりつつあるが、使用濃度等においてなお検討を要する。
合成ペプチドＡβ１−４２を抗原とするワクチン療法（非特許文献１２）は、有望な治療法として検討されてきたが、重篤な脳炎を惹起する副作用が指摘されている（非特許文献１３）。このワクチン療法に関連して、抗アミロイド抗体を用いた間接ワクチン療法あるいは間接免疫療法（非特許文献１４）も注目されているが、臨床的にはさらなる検討を必要としている。ワクチン療法の副作用は、抗原とするアミロイドタンパク質の抗原部位をＡβ４−１０のアミノ末端側にすること、誘導される抗体がＩｇＧ２ｂ型イソタイプであること、経口投与による腸管免疫法などで副作用が減弱する可能性が指摘されているが、なお改良方法として確定するには至っていない。
文献リスト
【非特許文献１】Ｙａｎｋｎｅｒ，Ｂ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４５（４９１６）：４１７−２０
【非特許文献２】Ｙａｎｋｎｅｒ，Ｂ．Ａ．，Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｂｙ  ｔａｃｈｙｋｉｎｉｎ  ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９０  ２５０（４９７８）：２７９−８２
【非特許文献３】Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｂｅａｒｉｎｇ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ−ｏｎｓｅｔ  ｆａｍｉｌｉａｌ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ，３７５（６５３４），７５４−７６０
【非特許文献４】Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １  ｆａｍｉｌｉａｌ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｌｏｃｕｓ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９（５２２６），９７３−９７７
【非特許文献５】Ｒｏｇａｅｖ，Ｅ．Ｉ．ｅｔ−ａｌ．Ｆａｍｉｌｉａｌ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｋｉｎｄｒｅｄｓ  ｗｉｔｈ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｇｅｎｅ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｙｐｅ  ３  ｇｅｎｅ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７６（６５４３），７７５−７７８
【非特許文献６】Ｇｏａｔｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ  ｗｉｔｈ  ｆａｍｉｌｉａｌ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３４９（６３１１），７０４−６
【非特許文献７】Ｃｏｒｄｅｒ，Ｅ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｄｏｓｅ  ｏｆ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ｔｙｐｅ  ４  ａｌｌｅｌｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｌａｔｅ  ｏｎｓｅｔ  ｆａｍｉｌｉｅｓ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６１（５１２３）：９２１−３
【非特許文献８】Ｈａｒｄｙ，Ｊ．ａｎｄ  Ｉｓｒａｅｌ，Ａ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎ  ｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ．３９８（６７２７），４６６−７
【非特許文献９】Ｌｉｍ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｐｌａｑｕｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．（２０００）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２０：５７０９−１４
【非特許文献１０】Ｗｅｇｇｅｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ＮＳＡＩＤｓ  ｌｏｗｅｒ  ａｍｉｌｏｉｄｇｅｎｉｃ  Ａｂｅｔａ  ４２  ｉｎｄｉｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：２１２−６
【非特許文献１１】Ｚｈｏｕ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇｓ  ｃａｎ  ｌｏｗｅｒ  ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  Ａβ４２  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｒｈｏ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２：１２１５−７
【非特許文献１２】Ｓｃｈｅｎｋ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ−ｄｉｓｅａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＰＤＡＰＰ  ｍｏｕｓｅ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ．４００，１７３−６
【非特許文献１３】Ｎｉｃｏｌｌ，Ｊ．Ａ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｍｙｌｏｉｄ−  ｐｅｐｔｉｄｅ：ａ  ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：４４８−４５２
【非特許文献１４】ＤｅＭａｔｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９５：２２６４−７．；Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ  ａｆｔｅｒ  ｐａｓｓｉｖｅ  ａｎｔｉ−Ａβ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１３７９−）
【発明の開示】
本発明は、前記のとおりの従来技術の問題点に鑑みてなされたものであって、ワクチン療法を改良する抗原分子等として有用な新規アミロイドタンパク質（ヒト変異型アミロイドタンパク質）を提供することを課題としている。
また本発明は、前記の変異型アミロイドタンパク質およびこれをコードする遺伝子材料を用いて、アミロイド関連疾患の診断方法と、そのための材料を提供することを課題としている。
さらに本発明は、前記の変異型アミロイドタンパク質の産生機序に基づいて、アミロイド関連疾患に対する有効な治療薬成分をスクリーニングする方法を提供することを課題としている。
そしてさらに、本発明は、前記の変異型アミロイドタンパク質またはその遺伝子材料を利用した抗アミロイド関連疾患薬を提供することを課題としている。
そして本発明は、前記の課題を解決するものとして以下の発明を提供する。
第１の発明は、配列番号２のアミノ酸配列において、
（１）  第５９７−６３６位配列のうち第６１８位Ｇｌｕを欠失した３９アミノ酸配列；
（２）  第５９７−６３８位配列のうち第６１８位Ｇｌｕを欠失した４１アミノ酸配列；
（３）  第５９７−６３９位配列のうち第６１８位Ｇｌｕを欠失した４２アミノ酸配列；
（４）  第５９７−６３６位配列のうち第６１７位Ａｌａを欠失した３９アミノ酸配列；
（５）  第５９７−６３８位配列のうち第６１７位Ａｌａを欠失した４１アミノ酸配列；
（６）  第５９７−６３９位配列のうち第６１７位Ａｌａを欠失した４２アミノ酸配列；
（７）  第５９７−６３６位配列のうち第６１９位Ａｓｐを欠失した３９アミノ酸配列；
（８）  第５９７−６３８位配列のうち第６１９位Ａｓｐを欠失した４１アミノ酸配列；または
（９）  第５９７−６３９位配列のうち第６１９位Ａｓｐを欠失した４２アミノ酸配列、
のアミノ酸配列からなるヒト変異型アミロイドタンパク質である。
すなわち第１発明の変異型アミロイドタンパク質は、４０、４２または４３アミノ酸からなる正常型（野生型）アミロイドタンパク質（Ａβ１−４０、Ａβ１−４２、Ａβ１−４３）のそれぞれの第２２位Ｇｌｕ、第２１位Ａｌａまたは第２３位Ａｓｐを欠失したタンパク質である。以下の説明においては、前記（１）から（９）のアミノ酸配列からなる変異型アミロイドタンパク質を、それぞれ以下のとおりに記載することがある：（１）Ａβ１−４０（Δ２２Ｅ）、（２）Ａβ１−４２（Δ２２Ｅ）、（３）Ａβ１−４３（Δ２２Ｅ）（４）Ａβ１−４０（Δ２１Ａ）、（５）Ａβ１−４２（Δ２１Ａ）、（６）Ａβ１−４３（Δ２１Ａ）、（７）Ａβ１−４０（Δ２３Ｄ）、（８）Ａβ１−４２（Δ２３Ｄ）、（９）Ａβ１−４３（Δ２３Ｄ）。
なお、前記（１）、（２）および（３）のそれぞれのアミノ酸配列からなる変異型アミロイドタンパク質（Ａβ１−４０（Δ２２Ｅ）、Ａβ１−４２（Δ２２Ｅ）、Ａβ１−４３（Δ２２Ｅ）は、本発明者らが家族性アルツハイマー患者から単離同定した欠失変異型のアミロイドタンパク質である。一方、前記（４）から（９）のそれぞれのアミノ酸配列からなる変異型アミロイドタンパク質は、当該技術分野における周知の知見と手段によって、前記（１）から（３）のアミノ酸配列からなる変異型アミロイドタンパク質と同等の機能を有することが、高い蓋然性をもって推定される変異型アミロイドタンパク質である。すなわち、既存のタンパク質構造予測プログラム（例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ  ２ｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ：ＧＥＮＥＴＸＹ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ８．１．８［ＧＥＮＥＴＸＹ  Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ］に含まれているタンパク質２次構造予測プログラム）を用いて正常型または野性型アミロイドタンパク質の構造を解析すると、１〜２５番目までのアミノ酸配列中に、７番目あたりでの不規則コイル構造によって分断された２つのα螺旋が存在し、３０番目からカルボキシル末端までにβ構造が存在することが確認される。すなわち正常または野性型アミロイドタンパク質の構造は「α螺旋−α螺旋−β構造」である。一方、公知の変異型アミロイドタンパク質であるオランダ型変異（Ｇｌｕ６９３Ｇｌｎ）および前記（１）〜（３）のアミノ酸配列からなる本発明の変異型アミロイドタンパク質Ａβ１−４０（Δ２２Ｅ）、Ａβ１−４２（Δ２２Ｅ）、Ａβ１−４３（Δ２２Ｅ）を同様に解析すると、その構造は「α螺旋−β構造−β構造」である。従って、本発明の変異型アミロイドタンパク質は、その構造が「α螺旋−β構造−β構造」であることによって特徴づけられるが、前記第２２位Ｇｌｕの前後いずれかのアミノ酸残基（ＡｌａまたはＡｓｐ）を欠失した変異型アミロイドタンパク質（Δ２１２ＡまたはΔ２３Ｄ）の構造も「α螺旋−β構造−β構造」である。このことは、第２２位Ｇｌｕから前後２つめのアミノ酸（ＰｈｅおよびＶａｌ）が欠失した変異型アミロイドタンパク質の構造が正常（野性型）アミロイドタンパク質と同一の「α螺旋−α螺旋−β構造」であることとは明らかに相違する。
なお、第１発明の変異型アミロイドタンパク質には、その特徴的な活性（例えば野性型アミロイドタンパク質に比べて低い毒性や凝集性など）を消失しない範囲で、Ｎ末端および／またはＣ末端の１または複数個のアミノ酸残基が欠失したタンパク質も含まれる。
以上のとおり、第１発明の変異型アミロイドタンパク質には、家族性アルツハイマー病患者に存在する「天然」の変異型アミロイドタンパク質Ａβ１−４０（Δ２２Ｅ）、Ａβ１−４２（Δ２２Ｅ）、Ａβ１−４３（Δ２２Ｅ）と、これらの天然タンパク質と同一の機能を有する「非天然」の変異型アミロイドタンパク質Ａβ１−４０（Δ２１Ａ）、Ａβ１−４２（Δ２１Ａ）、Ａβ１−４３（Δ２１Ａ）、Ａβ１−４０（Δ２３Ｄ）、Ａβ１−４２（Δ２３Ｄ）およびＡβ１−４３（Δ２３Ｄ）が含まれる。なお、この場合の「非天然」という表現は、現時点において患者から単離同定されていないという意味であり、多くの患者等を対象として探索すれば、第２１位Ａｌａまたは第２３位Ａｓｐを欠失した変異型アミロイドタンパク質が天然に存在する可能性が存在する。
第２の発明は、前記第１発明のヒト変異型アミロイドタンパク質の一部分であって、配列番号２における欠失アミノ酸残基の前後のアミノ酸残基を含む５〜２８個のアミノ酸配列からなるペプチドである。
第３発明は、前記第１発明のヒト変異型アミロイドタンパク質の前駆体である変異アミロイド前駆体タンパク質をコードするヒト変異アミロイド前駆体タンパク質遺伝子（以下「変異ＡＰＰ遺伝子」または「欠失変異型ＡＰＰ遺伝子」と記載することがある）である。
第４発明は、前記第３発明のヒト遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡである。
第５発明は、前記第４発明のｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡであって、配列番号１における第１８５２−１８５４塩基が欠失した塩基配列を有するｃＤＮＡである。
第６発明は、前記第１発明のヒト変異型アミロイドタンパク質を特異的に認識する抗体である。
さらに第７発明は、前記発明１のヒト変異型アミロイドタンパク質のオリゴマーを抗原として作成した抗体であって、オリゴマー状のアミロイドタンパク質を特異的に認識する抗体。
第８発明は、前記第１発明のヒト変異型アミロイドタンパク質の存在を検出することを特徴とするアミロイド関連疾患の診断方法である。
第９発明は、前記第３発明のヒト遺伝子または前記第４発明のｍＲＮＡの存在を検出することを特徴とするアミロイド関連疾患の診断方法である。
第１０発明は、前記第３発明のヒト変異アミロイド前駆体タンパク質遺伝子を発現する細胞である。
第１１発明は、前記第１発明の変異型アミロイドタンパク質を体内に有する非ヒト動物およびこの非ヒト動物由来の組織ならびに細胞である。
第１２発明は、アミロイド関連疾患の治療薬成分を探索する方法であって、前記第１０発明の細胞または前記第１１発明の非ヒト動物もしくはこの非ヒト動物由来の組織ないしは細胞に被験物質を接触させ、当該細胞または組織におけるヒト変異型アミロイドタンパク質の挙動および活性を測定することを特徴とするスクリーニング方法である。
第１３発明は、前記第１発明の変異型アミロイドタンパク質を含有する抗アミロイド関連疾患薬である。
第１４発明は、前記第２発明のペプチドを含有する抗アミロイド関連疾患薬である。
第１５発明は、前記第５発明のｃＤＮＡを含有する抗アミロイド関連疾患薬である。
第１６発明は、前記第６発明または第７発明の抗体を含有する抗アミロイド関連疾患薬である。
本発明において、欠失変異型ＡＰＰ遺伝子およびその断片を従来の野生型ＡＰＰあるいは既報の家族性変異型ＡＰＰと比較検証することが可能となる。その結果、アミロイドタンパク質の代謝解明に、新らたな分子機構、作用、効果が病態解明に寄与すると期待される。
また本発明において、欠失変異型ＡＰＰ遺伝子およびその断片を用いた新規の細胞、動物は新しい薬剤と化合物のスクリーニングに使用できる。
また本発明において、欠失変異型全長アミロイドタンパク質Ａβ１−４０（Δ２２Ｅ）、Ａβ１−４０（Δ２１Ａ）またはＡβ１−４０（Δ２３Ｄ）からなるアミノ酸３９個、欠失変異型全長アミロイドタンパク質Ａβ１−４２（Δ２２Ｅ）、Ａβ１−４２（Δ２１Ａ）またはＡβ１−４２（Δ２３Ｄ）からなるアミノ酸４１個、或いは欠失変異型全長アミロイドタンパク質Ａβ１−４３（Δ２２Ｅ）、Ａβ１−４３（Δ２１Ａ）またはＡβ１−４３（Δ２３Ｄ）からなるアミノ酸４２個を使用することは、その欠失変異作用を既報の野生型アミロイドタンパク質の情報と比較利用できる点で有利である。
また本発明において、その変異は家族性アルツハイマー病患者において同定されたことから痴呆症病態を誘導することが期待されるが、その変異効果を強調するためにアミロイドタンパク質の細胞膜内部分Ａβ２９−４０あるいはＡβ２９−４２／４３を除く部分配列をもつｃＤＮＡあるいはペプチドが使用されることが想定される。また、脳血管関門あるいは分子安定性向上のために解離基修飾により親水性の変化を誘導した修飾体が考えられる。
本発明の変異型アミロイドタンパク質またはその修飾体は、欠失型変異ＡＰＰからの分解物であり、その性質は従来知られていなかったタンパク質凝集能の著しく低下した活性が確認された。
なお、本発明において「タンパク質」および「ペプチド」とは、ペプチド結合によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。
さらに、本発明において「アミロイド関連疾患」とは、例えばアルツハイマー病やダウン症をはじめとする、アミロイドタンパク質が直接・間接に病因として関与することが知られ、またはその可能性が疑われている疾患、およびアミロイドタンパク質が神経病変中に認められる疾患を意味する。「診断」とは、被験者がアミロイド関連疾患に羅患しているか否かの判定、将来的にアミロイド関連疾患に羅患する危険性が存在するか否かの判定、および治療後にアミロイド関連疾患を再発する危険性が存在するか否かの判定を意味する。また、診断には、アミロイド関連疾患の羅患やその危険性がどの程度であるか測定することも含まれる。
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，”ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．１  ｔｏ  ４，（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、東京化学同人（１９９２）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．６８（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｂ）＆  １０１（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｃ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５３（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｄ），１５４（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｅ）＆  １５５（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｆ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また本発明の医薬の調製はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０などに記載の方法、あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、変異アミロイド前駆体タンパク質から分泌された変異型アミロイドタンパク質の質量分析の結果である。
図２は、変異型アミロイドタンパクの抗原性を検定するためのドットテストの結果である。
図３は、変異型アミロイドタンパク質と野生型アミロイドタンパク質に対する変異型アミロイドタンパク質の抗原性を検定するためのドットテストの結果である。
図４は、抗変異型アミロイドタンパク抗体の特異性を検定するための免疫沈降テストの結果である。
図５は、抗変異型アミロイドタンパク質抗体の組織染色性を検討した結果である。
図６は、抗変異型アミロイドタンパク質抗体を用いた変異型アミロイドタンパク質と神経免疫反応の関係を検討するために行った蛍光免疫組織２重染色の結果である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の変異型アミロイドタンパク質は、天然のタンパク質Ａβ１−４０（Δ２２Ｅ）、Ａβ１−４２（Δ２２Ｅ）、Ａβ１−４３（Δ２２Ｅ）として、例えば家族性アルツハイマー患者の細胞から単離生成することができる。また非天然の変異型アミロイドタンパク質Ａβ１−４０（Δ２１Ａ）、Ａβ１−４２（Δ２１Ａ）、Ａβ１−４３（Δ２１Ａ）Ａβ１−４０（Δ２３Ｄ）、Ａβ１−４２（Δ２３Ｄ）およびＡβ１−４３（Δ２３Ｄ）は公知のペプチド合成法によっても得ることができる。合成するための素材および合成の各ステップにおいて用いる方法は、周知であるから、当業者は合成、単離、精製等を適宜行なって目的とする変異型アミロイドタンパク質を適宜製造することができる。また大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞の自体公知の宿主を利用した遺伝子組み換え技術によって、本発明の変異型アミロイドタンパク質を製造することも可能である。化学合成としては、例えば、後述の実施例に準じて行なうことができるが、目的とする遺伝子およびペプチドあるいはその化合物が得られる限り、いかなる方法を用いてもよい。例えば周知の方法であるＢｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）化反応、ＤＭＳＯ酸化、アルカリ反応、酸性反応、エポキシ化反応、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、アルキル化反応、ケン化反応、加熱反応、脱炭酸反応、縮合反応、逆相高速液体クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて行なうことができる。また例えば、変異型アミロイドタンパク質を構成するアミノ酸残基を順次反応させ、効率と反応物純度の検定を適宜実施する方法をとる。さらに、合成されたペプチドを様々な時間だけ常温、高温、凍結融解処理等により変化させてもよい。具体的には、例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．Ｊ．Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉ．Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ．Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９−２１５４，１９６３；Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｃ．ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，Ｐ．Ｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００に準じて行うことができる。
本発明の変異型アミロイドタンパク質は、合成や精製を促進するための修飾、物理・化学的安定化を促進するための修飾、生体内の代謝に対する安定性と不安定性、条件付けの等の活性化修飾、更には、脳血管関門通過を含む臓器搬送効率の高進と低下をもたらす制御修飾を含むものであってよい。ここにいう制御修飾としては、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号４）の１１個のアミノ酸よりなる配列（Ｓｃｈｗａｒｚｅ，Ｓ．Ｒ．，Ｈｏ，Ａ．，Ｖｏｃｅｒｏ−Ａｋｂａｎｉ，Ａ．＆  Ｄｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５６９−１５７２）を例示することができる。Ｎ末端側にペプチド結合で連結されたこの制御配列を含むことにより、変異型アミロイドタンパク質は、血液脳関門の通過が容易化され、脳内の目標部位によりよい効率で到達することが可能となる。
本発明の変異型アミロイドタンパク質のその他の修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合、脱メチル化、交差架橋共有結合形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、脂質結合、硫酸化、セレノイル化、アルギニル化のようなトランスファーＲＮＡ媒介のタンパクへのアミノ酸の添加、ならびにユビキチネーション等がある。
さらに、本発明の変異型アミロイドタンパク質またはこれを免疫原として調製された抗体の検出もしくは精製を容易にするために、または別の機能を付加するために、構造の付加、変更、置換することは技術的に容易であり、これらの生成物も本発明の範囲に包含される。なお、修飾付加にはＦＬＡＧ−ｔａｇ、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片やＧＦＰ等の遺伝子工学手法による生成物も本発明の範囲に包含される。
第６発明の抗体は、本発明の変異型アミロイドタンパク質またはその修飾体、あるいはその分解物（部分ペプチド等）を選別し、これらを抗原として用いて作成することができる。部分ペプチドは、例えば２０個以下のアミノ酸残基、好ましくはそれ以下の少ない５以上のアミノ酸残基から構成される。抗体作成には、それらの抗原を組み合わせて用いてもよい。抗原としては必ずしも本発明の変異型アミロイドタンパク質またはその修飾体、あるいはその分解物そのものでなくとも、変異ＡＰＰの当該欠失変異部位近傍の一次配列を立体構造上外部へ露出して有するタンパク質であってもよい。
また、本発明の変異型アミロイドタンパク質に対する免疫特異的な抗体を作製するためには、上記した当該欠失変異近傍の構造のアミノ酸配列を含んだ化合物を抗原として用いることが好ましい。これらの抗体は、当該部位に免疫学的に結合またはこれを認識する限り、種類および量は特に限定されない。抗体の結合または認識の有無は、公知の抗原抗体反応によって決定される。「免疫特異的」とは、先行技術の他の関連タンパク質あるいは化合物よりも、当該化合物に対する親和性が実質的に大きいことを意味する。
抗体の生産は、本発明の変異型アミロイドタンパク質またはその修飾体、あるいはその分解物を抗原として、アジュバントの存在または非存在下に、単独または担体に結合あるいは同居した状態で、抗原に対する体液性応答および／または細胞性応答の免疫誘導を行うことによって実施される。
また第７発明の抗体は、例えば、変異型アミロイドタンパクを有機合成したペプチドよりオリゴマーを作成し、このオリゴマー状変異型アミロイドタンパク質を抗原とする抗体を作成することができる。この抗体は、実施例に示したとおり、老人班を構成する繊維状アミロイドタンパク質のようなモノマー形状のアミロイドタンパク質は野性型であっても、変異型であっても認識せず、オリゴマー状の野性型および変異型アミロイドタンパク質を特異的に認識するという新規がつ有用な特性を有している。
抗体の作成は、より具体的には、上記アミロイドタンパク質のＦｒｅｕｎｄ完全アジュバンドの懸濁液をマウスに免疫注射し、さらに１ヶ月後にＦｒｅｕｎｄ不完全アジュバンドに変えた懸濁液を免疫し、７日後に同じ免疫操作を繰り返して実施して得ることができる。あるいは培養条件下でリンパ球もしくはその前駆細胞を免疫刺激することによっても免疫誘導することができる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用をおこさなければ、特に限定されず例えばセルロース、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、重合アミノ酸、アルブミンおよびそれらの混合物等が例示されるがこれに限らない。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ウシ等が好適に用いられる。ポリクローナル抗体は、自体公知の方法により血清として、また血清からの抗体回収法によって取得される。好ましい手段としては、免疫アフィニティークロマトグラフィー法が挙げられる。
モノクローナル抗体の生産は、上記の免疫誘導した動物から抗体活性を含む組織（例えば脾臓またはリンパ節）あるいは培養細胞を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８株等のミエローマ株）への形質転換手段を導入することによって行われる。例えば、上記抗体産生細胞と永久増殖細胞とから作製されたハイブリドーマをクローン化し、本発明に係る変異型アミロイドタンパク質を特異的に認識する抗体を産生しているハイブリドーマを選別し、このハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。実例としては、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７）、トリオーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）、およびＥＢＶ法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８５）：７７−９６）に記載されるような種々の技法がある。
上記抗体は、本発明の変異型アミロイドタンパク質の同定、検出、定量、あるいはアフィニティークロマトグラフィー等による変異型アミロイドタンパク質の調製と精製に用いることができる。上記抗体はヒト型抗体へと、自体公知の手法を用いて改変することができる。
具体的には、本発明の変異型アミロイドタンパク質に対する特異的抗体で、本発明の変異型アミロイドタンパク質の活性を増加させる活性を持つものは、アミロイドタンパク質生成阻害薬のスクリーニングに付される化合物の標準物として、またスクリーニング手段として有用である。本発明の変異型アミロイドタンパク質に対する抗体を用いたアッセイ法としては、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、高速液体クロマトグラフィー、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイ等ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。
第８発明および第９発明は、それぞれ第１本発明のヒト変異型アミロイドタンパク質遺伝子の発現産物を測定することを特徴とするアミロイド関連疾患の診断方法である。すなわち、本発明の変異型アミロイドタンパク質は家族性アルツハイマー患者から単離同定された原因タンパク質であり、その存在量を測定することによって、アルツハイマー病等のアミロイド関連疾患を診断することがきる。さらに本発明の変異型アミロイドタンパク質が外来性に投与された場合にも、その存在量を測定することができる。
発現産物としてｍＲＮＡを対象とする場合には、例えば、定量的なプローブハイブリダイゼーションやマイクロアレイを用いて行うことができる。標識ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法としては、具体的には、例えばＡｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅ法、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法等の公知の方法を採用することができる。あるいはまた、被験者から単離したｍＲＮＡを鋳型とし、定量的ＲＴ−ＰＣＲによってもｍＲＮＡ量を測定することができる。
さらに、遺伝子発現産物として変異型アミロイドタンパク質を対象とする場合には、第６発明の抗体を用いる方法が好ましい。特に標識化抗体を用いることによって、簡便かつ高精度の検出が可能となる。標識は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｎｕｍｂｅｒが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のＥＩＡに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、１２５Ｉや３Ｈ等の通常のＲＩＡで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射性同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。また、フローサイトメーターを用いて測定することもできる。さらに、１次抗体と標識化２次抗体を用いたサンドイッチ法（標識として酵素を用いた場合には「ＥＬＩＳＡ法」）も好ましく用いることができる。
次に、第１０発明の細胞および第１１発明の動物について説明する。この動物または細胞は、例えば、動物に変異型アミロイドタンパク質溶液を注射する方法、金属コロイドと変異型アミロイドタンパク質を結合させて動物に投与する方法、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療の方法に準じて動物や細胞に第２発明の変異ＡＰＰ遺伝子またはそのｃＤＮＡを導入する方法、リン酸カルシウム法、リポソームや赤血球ゴーストを使用する方法、エレクトロポーレーション法、ガラスピペットを用いた微量注入法等によって細胞に変異型アミロイドタンパク質またがそのペプチドを導入する方法等によって作成することができる。
さらに、これらの動物や細胞は、公知のトランスジェニック動物作成法（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｌ．ＵＳＡ  ７７；７３８０−７３８４，１９８０）に従って作成することができる。すなわち、第２発明の変異ＡＰＰ遺伝子を非ヒト動物（好ましくはマウスまたはラット）の分化全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に変異ＡＰＰ遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって目的とするトランスジェニック動物を作成することができる。分化全能性細胞への遺伝子導入法としては、トランスジェニック動物個体の産出効率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、外来遺伝子ＤＮＡの物理的注入（マイクロインジェクション）法が最適である。遺伝子を注入した受精卵は、次に仮親の卵管に移植され、個体まで発生し出生した動物を里親につけて飼育させたのち、体の一部（尾部先端等）からＤＮＡを抽出し、サザンブロット解析やＰＣＲアッセイにより導入した外来遺伝子の存在を確認することによって、２倍体染色体の一方に外来遺伝子が導入された初代のヘテロ接合体動物が得られ、このヘテロ接合体同士を交配することによってホモ接合体動物が獲られる。この発明のトランスジェニック動物には、初代ヘテロ接合体動物、ヘテロ接合体同士を交配して得られるホモ接合体動物、それらの子孫動物、またはそれらの胎児が含まれる。
第１２発明は、前記の細胞や動物を対象として、アミロイド関連疾患の治療薬成分を探索する方法である。具体的には、例えば、動物や細胞に候補物質を接触させ、細胞で動物組織（中枢神経系組織）で発現している変異ＡＰＰ遺伝子の発現産物（ｍＲＮＡや変異型アミロイドタンパク質）の量を、前記第８、９発明の診断方法と同一の方法で測定する。そして、この発現産物量を低減させる候補物質が、治療薬成分となる。また、細胞や動物組織で発現している変異型アミロイドタンパク質の活性に影響を与える物質を治療薬成分として決定する。
また、このスクリーニング方法に使用する候補物質には、例えば、有機または無機の化合物（特に低分子量の化合物）、タンパク質、ペプチド等が含まれる。これらの物質は、機能や構造が公知のものであって未知のものであってもよい。あるいは「コンビナトリアルケミカルライブラリー」は、目的物質を効率的に特定するための候補物質群として有効な手段である。コンビナトリアルケミカルライブラリーは、化学合成または生物学的合成により、試薬などの多くの化学的「ビルディングブロック」を結びつけることにより生成される種々の化学組成物のコレクションである。例えば、ペプチドライブラリーなどの直線的なコンビナトリアルケミカルライブラリーは、ビルディングブロック（アミノ酸）のセットを、所与の化合物の長さ（すなわちペプチドのサイズ）について可能なすべての方法で結びつけることにより形成される。化学的なビルディングブロックについてのこのようなコンビナトリアルミキシングを通して、多数の化学組成物を合成することが可能である。例えば、１００の可換的な化学的ビルディングブロックについての系統的なコンビナトリアルミキシングは、結果として１億個の４量体化合物または１００億個の５量体化合物を生じる（例えば、Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）３７（９）：１２３３−１２５０参照）。コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，００４，６１７号；５，９８５，３６５号を参照）。また各種の市販ライブラリーを使用することもできる。
第１３〜１６の発明は、それぞれ本発明の変異型アミロイドタンパク質、ペプチド、ｃＤＮＡ、抗体を含有する抗アミロイド関連疾患薬である。この薬剤は、アルツハイマー病等のアミロイド関連疾患に対し、アミロイドタンパク質産生量あるいはその脳内蓄積量を制御し、それによりそれらの疾患の予防、治療、および症状を改善するのため用いられる。すなわち、第６発明および第７発明の抗体は、従来の間接免疫療法における副作用の問題を解決するものとして提供される。また変異型アミロイドタンパク質やペプチド、あるいはｃＤＮＡは、生体内において、野性型アミロイドタンパク質の重合を阻害または抑制するための有効な抗体を産生するための抗原分子として機能する。
前記の各成分は、公知の方法・手段によって、生体あるいは細胞内に導入可能な形態として製剤化される。薬剤形態としては、例えばｃＤＮＡの場合には、ｃＤＮＡを組込んだ発現ベクターを、例えば生体認識分子を提示した中空ナノ粒子、または公知のウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等）に組み込むようにすればよい。このような薬剤を遺伝子治療の手法により生体内に導入することによって、生体細胞内で変異型アミロイドタンパク質を発現させることができる。ｃＤＮＡ溶液を筋肉に注射するような遺伝子治療法を適用することもできる。また、変異型アミロイドタンパク質、ペプチドまたは抗体を生体内に導入可能な形態とするためには、例えば、それらの構造や機能を変更することなく、かつ薬理学的に許容される担体溶液に変異型アミロイドタンパク質、ペプチドまたは抗体を混合して製剤化することができる。生体の組織あるいは細胞を一旦体外に取り出し、インビトロでこれらのタンパク質あるいはペプチドで処理し所望の形質を誘導した後に生体に戻す方法もある。また、生体より取り出した組織あるいは細胞にｃＤＮＡ発現ベクターを導入した後に生体に戻すことも治療のひとつの形態として可能である。そのような場合は、例えばマイクロインジェクション法により細胞内に導入することができる。あるいは脂質による細胞内導入法（ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）、Ｃｈａｒｉｏｔ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社、米国）等）を採用することもできる。また、本発明の抗アミロイド関連疾患薬は、その脳組織への輸送効率を高める適切な製剤化を施してよい。
さらに、有効成分である変異型アミロイドタンパク質やそのペプチド、ｃＤＮＡまたは抗体は単独で使用しても、あるいはその修飾体や分解物を組み合わせて使用してもよい。さらには、治療上有利となる他の化合物と併用してもよい。本発明の医薬の全身投与の好ましい形態は、注射であり、とりわけ静脈注射である。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注射経路を用いることもできる。全身投与のための別の手段は、胆汁酸塩またはフクジン酸または他の界面活性剤のような浸透剤を用いる経粘膜または経皮投与である。さらに、腸溶処方またはカプセル処方がうまく処方されるならば、経口投与も可能である。これらの医薬品組成物の投与は局所的なものであってもよく、膏薬、パスタ、ゲル等の形態であってもよい。
【実施例】  以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
実施例１
欠失変異型ＡＰＰ塩基配列の決定
家族性アルツハイマー病患者の血液からゲノムＤＮＡ抽出し、得られたＤＮＡを鋳型として、現在既知原因遺伝子であるプレセニリン１（ＰＳＥＮ１）、プレセニリン２（ＰＳＥＮ２）、ＡＰＰについてそのｃＤＮＡをコードする全塩基配列をＰＣＲ増幅した後に、ＡＢＩ社ＰＲＩＳＭモデル３１０シークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ）によって解析した。その結果、野生型ＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡのアミロイドタンパク質コード領域（配列番号１）に１箇所の変異が見出された（配列番号１の第１８５２−１８５４位の３塩基ｇａａの欠失）。
実施例２
欠失変異型ＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡから合成されるアミロイドタンパク質の構造決定
実施例１で得られた変異ＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡは、アミロイドタンパク質の内部に変異があることから、βセクレターゼあるいはγセクレターゼ切断部位が検討された。そこで、ＡＰＰを発現し、アミロイドタンパク質を産生、分泌することが知られているヒト培養細胞ＨＥＫ細胞に、変異ＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡの発現ベクターを導入した。発現を２日間行わせ、培養上清を得、抗アミロイドタンパク質抗体を用いて免疫沈降した画分を島津社ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲにて質量分析した。結果を図１に示す。
図１に明らかなように、ヒト培養細胞ＨＥＫ細胞で発現する変異ＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡから分泌されるアミロイドタンパク質であるＡβ１−４０（ΔＥ）の分子量として得られた実験観察値は、４２００．５１であった。これは、Ａβ１−４０の２２番目のＧｌｕを欠失した分子量の理論計算値４２００．６９とほぼ一致した。つまり、この欠失変異型ＡＰＰは従来と同じβセクレターゼとγセクレターゼ切断部位が保持された状態で欠失変異型アミロイドタンパク質が産生・分泌されていることが示された。すなわち変異型アミロイドタンパク質のアミノ末端はＡｓｐではじまり、Ｖａｌで終わるＡβ１−４０であり、ただし２２番目のＧｌｕを含まない変異型アミロイドタンパク質であることが示された。
実施例３
欠失変異型ＡＰＰから合成されるアミロイドタンパク質の定量
ヒト培養細胞ＨＥＫ細胞で発現する欠失変異型ＡＰＰは、表１にあるようにほぼ野生型ＡＰＰと同様の２つの変異型アミロイドタンパク質を産生・分泌していることが示された。
【表１】
0004776544.tif 000002
なお表１でいうコントロールとは、生理食塩水に溶解した空の発現ベクターを使用している。また、Ａβ４２はＡβ１−４２およびＡβ１−４３あるいはＡβ１−４２（ΔＥ）およびＡβ１−４３（ΔＥ）を示し、Ａβ４０はＡβ１−４０あるいはＡβ１−４０（ΔＥ）を示す。
実施例４
変異型アミロイドタンパク質の毒性
本実施例に用いた変異型アミロイドタンパク質は、有機合成したペプチドであり、アミノ酸配列および質量分析によって、細胞から分泌される変異型アミロイドタンパク質と同じアミノ酸配列、質量を持つ。この合成ペプチドを用いて、神経細胞毒性を検討したところ、従来の野生型アミロイドタンパク質より低い毒性をもつことが示された。この結果を表２に示す。
【表２】
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表２でいう野生型Ａβあるいは変異型Ａβとは、Ａβ１−４０、あるいはＡβ１−４０（ΔＥ）のことを示し、コントロールとは、野生型Ａβ１−４０のアミノ酸配列の逆アミノ酸配列をもつＡβ４０−１のことを示す。
実施例５
変異型アミロイドタンパク質の凝集性
本実施例に用いた変異型アミロイドタンパク質は、有機合成したペプチドであり、アミノ酸配列および質量分析によって、生細胞から分泌される変異型アミロイドタンパク質と同じアミノ酸配列、質量を持つ。これらのペプチドを用いて、チオフラビンＴ結合能によって、タンパク質凝集能を検討したところ、本発明の変異型アミロイドタンパク質の凝集活性は従来の野生型アミロイドタンパク質よりはるかに低いことが示された。この結果を表３に示す。
【表３】
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表３でいう野生型ＡβとはＡβ１−４２、変異型ＡβとはＡβ１−４２（ΔＥ）を示す。１００マイクログラム／ｍｌ（ＰＢＳ）の条件で、３７℃、２４時間での野生型Ａβ１−４２の凝集能活性を１００％とした。
実施例６：
変異型アミロイドタンパクの抗原性
本実施例に用いた変異型アミロイドタンパクを有機合成したペプチドを用いて、３７℃、２４時間加温処理し、オリゴマーを作成した。オリゴマーの同定には、ウェスタンブロットで２量体、３量体以上の大きなアミロイド複合体が検出されること、電子顕微鏡観察でアミロイド繊維が観察されないこと、チオフラビン結合反応の陰性であることで確認した。
このオリゴマー状変異型アミロイドタンパクを抗原とする抗体を作成した。この目的のために、ＰＢＳに溶解したペプチドとＦｒｅｕｎｄ完全アジュバンドの懸濁液をマウスに免疫注射した。１ヶ月後に、Ｆｒｅｕｎｄ不完全アジュバンドに変えた懸濁液を免疫し、７日後に同じ免疫操作を繰り返して実施した。採血はマウス尾静脈から１００マイクロリットル採取し、その反応性を確認した。
抗原ペプチドをスポットしたＰＶＤＦ膜ストリップを複数用意し、乾燥後に２０％牛血清を含むＰＢＳにてブロッキングさせた後、各膜ストリップを個別に小さな反応箱中にて、１５０倍希釈したマウス血清（Ｎｏ．１から８）を反応させた（図２）。膜ストリップは、その後ビオチン化標識抗マウスＩｇＧやギ抗体を２次抗体として使用し、その後にアビジン・ビオチン複合体を反応させた。検出は、ＤＡＢ発色にて抗体力価をみた。一番左の膜ストリップは、Ｎ末断端を認識するウサギ抗体をコントロールとして反応させた例を示している。
図２において、ドットテストでしめす各膜ストリップは、横の膜ストリップと区別するために上下に少しずらせてスポットした。各膜ストリップには、上から１０ｎｇ、１ｎｇ、０．１ｎｇ、０．０１ｎｇ、ＰＢＳ、アルブミンをドットしてある。１５０倍希釈した抗血清は、少なくとも１ｎｇの抗原量が必要であり、それ以下の抗原量では検出されないことがわかる。しかも牛アルブミン（ＢＳＡ）には反応していない。重要なことは、テストされた８匹の例外なくすべてのマウス血清で、オリゴマーペプチドを認識する抗体が同定されたことであり、オリゴマー状変異型アミロイドタンパク質の高い、そして再現性のある抗原性が認められた。
さらに、変異型アミロイドタンパク質を抗原として作成された抗変異型アミロイドタンパク質抗体は、変異型アミロイドタンパク質だけでなく野生型アミロイドタンパク質とも反応することが確認された（図３）。図３は、変異型アミロイドタンパク質の代わりに野生型アミロイドタンパク質を用いた以外は同じ操作によってテストした。膜ストリップには、上から１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇの野生型アミロイドタンパク質、さらにＰＢＳ、アルブミンをドットしてある。
実施例７
抗変異型アミロイドタンパク抗体の特異性
抗変異型アミロイドタンパク抗体の特異性は、得られた抗血清で変異型アミロイドタンパクオリゴマーを免疫沈降させた後、ウェスタンブロットで他の通常アミロイド抗体にて検出することで確認した。
図４に示した免疫沈降テストの一番左の膜ストリップは、Ｎ末断端を認識するウサギ抗体をコントロールとして反応させ、同じ抗体で検出した例を示している。矢印はアミロイドタンパクの電気泳動パターンをしめし、一番下から順に上へ、単量体（分子量４ｋＤａ）、２量体（分子量８ＫＤａ）、３量体（分子量１２ｋＤａ）、４量体（分子量１６ｋＤａ）、５量体以上（分子量２０ｋＤａ以上）を示している。ここで検討されたマウス血清（Ｎｏ．２、３、および４）は、２量体以上のオリゴマーだけを認識結合していることがわかる。通常のアミロイド抗体は単量体も認識するが、抗変異型アミロイドタンパク抗体は単量体を認識していない。
次に、抗変異型アミロイドタンパク抗体のオリゴマー抗体活性を定量的に測定した（表４）。この測定においては、９６穴プラスチックプレートに、変異型アミロイドタンパクオリゴマーを１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、あるいはＰＢＳ、牛アルブミン（ＢＳＡ）を結合させてから、２０％牛血清ＰＢＳにてブロックさせて、各４５０倍希釈したマウス血清（Ｎｏ．２，３、４）をテストした。２次抗体はペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧやギ抗体を使用した。
【表４】
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表４より、抗変異型アミロイドタンパク質オリゴマー抗体は、ＢＳＡやモノマー状アミロイドタンパク質には反応しないで、オリゴマーにのみ特異的に反応することが明らかとなった。
実施例８
抗変異型アミロイドタンパク質抗体の組織染色性
実施例６で作成した抗変異型アミロイドタンパク質抗体の特異性を、ホルマリン固定したアルツハイマー病脳組織切片を用いて蛍光抗体染色によって検討した（図５）。一次抗体として抗変異型アミロイドタンパク質抗体を４℃で一晩反応させ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳにて脳組織切片を洗浄し、二次抗体としてＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識した抗マウスＩｇＧ抗体を２時間反応させて、再度洗浄後に抗蛍光退色剤を含む封入剤にて包埋した。観察は、共焦点レーザー顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １００；Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にて実施した。
結果は図５に示したとおりであり、その染色性はニューロンでのドット状分布が観察され、オリゴマー状アミロイドタンパク質の既報文献（非特許文献８；Ｒ．Ｈ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｃ．Ｇ．Ａｌｍｅｉｄａ，Ｐ．Ｆ．Ｋｅａｒｅｙ，Ｆ．Ｙｕ，Ｍ．Ｔ．Ｌｉｎ，Ｔ．Ａ．Ｍｉｌｎｅｒ，Ｇ．Ｋ．Ｇｏｕｒａｓ，Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｈａｍｙｌｏｉｄ  ｗｉｔｈｉｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  ｓｙｎａｐｓｅｓ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ｂｒａｉｎ，（２００４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：３５９２−３５９９．；Ｒ．Ｋａｙｅｄ，Ｅ．Ｈｅａｄ，Ｊ．Ｌ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｔ．Ｍ．Ｍｃｌｎｔｉｒｅ，Ｓ．Ｃ．Ｍｉｌｔｏｎ，Ｃ．Ｗ．Ｃｏｔｍａｎ，Ｃ．Ｇ．Ｇｌａｂｅ，Ｃｏｍｍｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｉｍｐｌｉｅｓ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：４８６−４８９．）と一致する。
すなわち、オリゴマー状アミロイドタンパク質を抗原として作成した抗変異型アミロイドタンパク質抗体はオリゴマー状アミロイドタンパク質を認識するが、繊維状アミロイドタンパク質が形成する老人斑を認識しないことが確認された。
実施例９
抗変異型アミロイドタンパク質抗体と神経免疫反応
従来のワクチン治療（Ｄ．Ｓｃｈｅｎｋ，Ｒ．Ｂａｒｂｏｕｒ，Ｗ．Ｄｕｎｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ−ｄｉｓｅａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＰＤＡＰＰ  ｍｏｕｓｅ，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４００：１７３−１７７．）で誘導される抗体は、野生型アミロイドタンパク質（Ａｂｅｔａ１−４２）を抗原としたもので、老人斑が染色された（Ｃ．Ｈｏｃｋ，Ｕ．Ｋｏｎｉｅｔｚｋｏ，Ａ．Ｐａｐａｓｓｏｔｉｒｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｙ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｄｉｓｅａｓｅ，（２００２）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８：１２７０−１２７５．）。しかもこの抗体によって脳炎反応の副作用が生じたことが報告されている（Ｊ．Ａ．Ｎｉｃｏｌｌ，Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｃ．Ｈｏｌｍｅｓ，Ｐ．Ｓｔｅａｒｔ，Ｈ．Ｍａｒｋｈａｍ，Ｒ．Ｏ．Ｗｅｌｌｅｒ，Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  ｐｅｐｔｉｄｅ：ａ  ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔ，（２００３）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９：４４８−４５２．；Ｊ．−Ｍ．Ｏｒｇｏｇｏｚｏ，Ｓ．Ｇｉｌｍａｎ，Ｊ．−Ｆ．Ｄａｒｔｉｇｕｅｓ，Ｂ．Ｌａｕｒｅｎｔ，Ｍ．Ｐｕｅｌ，Ｌ．Ｃ．Ｋｉｒｂｙ，Ｐ．Ｊｏｕａｎｎｙ，Ｂ．Ｄｕｂｏｉｓ，Ｌ．Ｅｉｓｎｅｒ，Ｓ．Ｆｌｉｔｍａｎ，Ｂ．Ｆ．Ｍｉｃｈｅｌ，Ｍ．Ｂｏａｄａ，Ａ．Ｆｒａｎｋ，＆  Ｃ．Ｈｏｃｋ，Ｓｕｂａｃｕｔｅ  ｍｅｎｉｎｇｏｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＡＤ  ａｆｔｅｒ  Ａｂｅｔａ４２  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ，（２００３）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ６１：４６−５４．）。
炎症反応のマーカーとして活性化された補体分子（Ｃ３ｄ）と抗変異型アミロイドタンパク質抗体の染色を比較するために一次抗体として抗変異型アミロイドタンパク質マウス抗体と抗Ｃ３ｄウサギ抗体を混合し４℃で一晩反応性させ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳにて脳組織切片を洗浄し、二次抗体としてＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識した抗マウスＩｇＧ抗体とＦＩＴＣ標識した抗ウサギＩｇＧ抗体の混合液を２時間反応させて、再度洗浄後に抗蛍光退色剤を含む封入剤にて包埋した。観察は、共焦点レーザー顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １００；Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にて実施した。
結果は図６に示したとおりである。図６は同一切片での２重染色像を示す。図６（ａ）は抗変異型アミロイドタンパク質マウス抗体染色像、図６（ｂ）は抗Ｃ３ｄウサギ抗体染色像を別々の蛍光像で検出した。従来の報告（Ｐ．Ｅｉｋｅｌｅｎｂｏｏｍ，Ｆ．Ｃ．Ｓｔａｍ，Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｓｅｎｉｌｅ  ｐｌａｑｕｅｓ，（１９８２）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  ５７：２３９−２４２．；Ｐ．Ｅｉｋｅｌｅｎｂｏｏｍ，Ｃ．Ｅ．Ｈａｃｋ，Ｊ．Ｍ．Ｒｏｚｅｍｕｌｌｅｒ，Ｆ．Ｃ．Ｓｔａｍ，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｌａｑｕｅｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｅｍｅｎｔｉａ，（１９８９）Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ  ５６：２５９−２６２．；Ｐ．Ｅｉｋｅｌｅｎｂｏｏｍ，Ｊ．Ｍ．Ｒｏｚｅｍｕｌｌｅｒ，Ｆ．Ｌ．ｖａｎ  Ｍｕｉｓｗｉｎｋｅｌ，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，（１９９８）Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １５４：８９−９８．；Ｐ．Ｌ．ＭｃＧｅｅｒ，Ｅ．Ｇ．ＭｃＧｅｅｒ，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｕｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ，（２００１）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ  ２２：７９９−８０９．；Ｐ．Ｅｉｋｅｌｅｎｂｏｏｍ，Ａ．Ｊ．Ｍ．Ｒｏｚｅｍｕｌｌｅｒ，Ｊ．Ｊ．Ｍ．Ｈｏｏｚｅｍａｎｓ，Ｒ．Ｖｅｅｒｈｕｉｓ，＆  Ｗ．Ａ．ｖａｎ  Ｇｏｏｌ，Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＆  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，（２０００）１４，Ｓｕｐｐｌ．１：Ｓ５４−Ｓ６１）と一致して、活性化された神経免疫補体反応マーカーであるＣ３ｄは老人斑と一致した分布を観察することができた。しかしながら、Ｃ３ｄのアルツハイマー病脳組織局在は、抗変異型アミロイドタンパク質抗体染色像であるオリゴマー状アミロイドタンパク質局在とは一致しなかった。
【産業上の利用可能性】  本発明はアルツハイマー病等のアミロイド関連疾患の病態に関する新規な変異型アミロイドタンパク質とその遺伝子を提供するものであり、この特性を利用した新規医薬組成物、診断手段の提供は本発明物が関与する疾患、特にアルツハイマー病等のアミロイド関連疾患の臨床、基礎研究領域において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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