(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリネバクテリウム属細菌を、グルコースを構成糖として含有する二糖、オリゴ糖及び多糖から選ばれた一種以上及び１００〜５００ｍＭのリン酸類又はその塩を含有する培地中で培養し、培地中に生成蓄積されたグルコース−１−リン酸を採取するグルコース−１−リン酸の製造法。
【請求項２】
コリネバクテリウム属細菌が、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）及びコリネバクテリウム・ビタエルミニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｔａｅｒｕｍｉｎｉｓ）から選ばれる請求項１記載のグルコース−１−リン酸の製造法。
【請求項３】
コリネバクテリウム属細菌が、コリネバクテリウム・カルナエ  ＩＦＯ１５３５９株、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＪＣＭ１３２１株及びコリネバクテリウム・ビタエルミニス  ＪＣＭ１３２３株から選ばれる請求項２記載のグルコース−１−リン酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物を用いたグルコース−１−リン酸の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
グルコース−１−リン酸(以下、「Ｇ−１−Ｐ」と略称する)は、医薬品及び糖合成の基質として有用である。
Ｇ−１−Ｐは、主にマルトデキストリンホスホリラーゼ（ＭＤＰａｓｅ）によって、澱粉及びデキストリン類を加リン酸分解することによって得られるが、これまでに、馬鈴薯由来のＭＤＰａｓｅを利用する方法（特公平６−９５４９２号公報）や微生物由来のＭＤＰａｓｅを用いるいわゆる酵素法が報告されている。
【０００３】
微生物由来のＭＤＰａｓｅを用いる酵素法としては、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来の酵素を用いる方法(Enzyme Microb. Technol.,17,140-146(1995))、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）由来の酵素を用いる方法（J. Carbohydrate Chem., 14, 1017-1028(1995)）が報告され、さらに最近では、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）（特開平１０−１４５８０号公報）やサーマス・カルドフィルス（Thermus caldophilus）（J. Industrial Microbiol., 24, 89-93(2000)）等の中度好熱菌や高度好熱菌の熱安定性ＭＤＰａｓｅを利用してＧ−１−Ｐを製造する方法が報告されている。
【０００４】
しかしながら、これらのような酵素自体を用いる酵素法では、植物や菌体より酵素を抽出する工程や固定化酵素の作製等の複雑な工程が必要とされ、より簡便にＧ−１−Ｐを製造する方法の開発が望まれていた。
【０００５】
本発明は、煩雑な工程を要さず大量のＧ−１−Ｐを得ることができるＧ−１−Ｐの製造法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、培養により多量のＧ−１−Ｐを培地中に生産する菌を種々検討したところ、コリネバクテリウム属細菌を糖及び高濃度のリン酸類が存在する条件下で培養した場合に、高濃度のＧ−１−Ｐが直接培地中に生産され、Ｇ−１−Ｐの大量製造が可能であることを見出した。
【０００７】
すなわち本発明は、コリネバクテリウム属細菌を糖及び１ｍＭ以上のリン酸類又はその塩を含有する培地中で培養し、培地中に生成蓄積されたグルコース−１−リン酸を採取するグルコース−１−リン酸の製造法を提供するものである。
【発明の実施の形態】
【０００８】
本発明において用いられるコリネバクテリウム属細菌は、コリネバクテリウム属に属し、糖及び一定濃度のリン酸類又はその塩の存在下、培地中にグルコース−１−リン酸を産生するものであればよく、例えばコリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・ビタエルミニス（Corynebacterium vitaeruminis）、コリネバクテリウム・ピロスム（Corynebacterium pilosum）等が挙げられ、このうち、コリネバクテリウム・カルナエ、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・ビタエルミニスが好ましく、中でもコリネバクテリウム・カルナエ  ＩＦＯ１５３５９株、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＪＣＭ１３２１株、コリネバクテリウム・ビタエルミニス  ＪＣＭ１３２３株が好ましい。
【０００９】
培地に添加される糖としては、好ましくはグルコースを構成糖として含有する単糖、二糖、オリゴ糖及び多糖類が挙げられ、更に好ましくはα−１，４グルカンを含む糖質、例えばデンプン、アミロース、デキストリン、マルトース、マルトオリゴ糖、アミロペクチン、グリコーゲン等が挙げられる。このうち、安価なデンプン、デキストリン、マルトオリゴ糖が特に好ましい。
斯かる糖は、これらの２種以上を混合して用いてもよい。
【００１０】
培地に添加されるリン酸類又はその塩としては、例えばリン酸、メタリン酸、トリポリリン酸、ポリリン酸、二リン酸、ポリメタリン酸及びこれらの塩類が挙げられ、塩としてはナトリウム塩、カリウム塩が好ましい。特に好ましいリン酸類の塩としては、例えばリン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム等が挙げられる。本発明においては、リン酸類とその塩又は数種のリン酸類の塩を混合して用いることが好ましい。
培地中のリン酸類又はその塩の濃度は、効果の点から１ｍＭ以上であることが必要であるが、好ましくは１ｍＭ〜１Ｍの範囲、更に好ましくは５ｍＭ〜５００ｍＭ、特に１００ｍＭ〜５００ｍＭが望ましい。
【００１１】
本発明において用いられる培地は、コリネバクテリウム属細菌が生育できるものであればよく、上記の糖及びリン酸類又はその塩の他に、炭素源、窒素源、金属ミネラル類、ビタミン類等を含有する液体培地等が使用できる。
【００１２】
ここで、糖質以外の炭素源としては、例えば酢酸塩等の有機酸塩が挙げられ、窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機及び有機アンモニウム塩、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物等の窒素含有有機物、グリシン、グルタミン酸、アラニン、メチオニン等のアミノ酸等が挙げられ、
金属ミネラル類としては、例えば塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム等が挙げられ、これらを単独で又は必要に応じ混合して用いればよい。
【００１３】
培養は、好気的条件下で、微生物が十分に生育できる条件となるようｐＨ及び温度を適宜調整して行われるが、通常ｐＨ５〜ｐＨ８、温度２５℃〜４０℃で１２時間〜９６時間で行われることが好ましい。
また培養方法は、振とう培養、醗酵槽による培養の他、休止菌体反応及び固定化菌体反応も用いることができる。
【００１４】
培地中に生成蓄積したグルコース−１−リン酸を採取する方法は、公知の方法従って行えばよく、例えば、菌体を分離除去し、遠心分離、限外ろ過、イオン交換、逆浸透膜、電気透析、塩析、晶析等を組み合わせることにより行われる。
【００１５】
かくして、本発明の方法によれば、高濃度のＧ−１−Ｐを直接培地中に生産させることが可能であり、酵素を用いる酵素法と比較して煩雑な工程を行うことなく、大量のＧ−１−Ｐを製造することができる。斯かる効果は、後記実施例で示すように、コリネバクテリウム属細菌と同様に菌体中にＭＤＰａｓｅを含有し、その比活性もコリネバクテリウム属細菌由来ＭＤＰａｓｅ５．３unit/mg（J. Carbohydrate Chem., 14, 1017-1028(1995)）に対して４．２unit/mgと同等であるバチルス属細菌由来ＭＤＰａｓｅ（特開平１０−１４５８０号公報）においては殆ど認められず、コリネバクテリウム属細菌が有する特有の効果である。
【００１６】
【実施例】
＜Ｇ−１−Ｐの定量＞
培地中のＧ−１−Ｐの定量は、Weinhausle（Enzyme Microb. Technol., 17, 140-146(1995)）の方法を一部改変し行った。
すなわち、９６穴マイクロプレート上で適宜希釈したサンプル１００μLに酵素反応液（100mM Tris−酢酸緩衝液（pH６．８）、２mM EDTA、10mM 硫酸マグネシウム、２mM NAD、１０μMグルコース−１，６−二リン酸、１．２unit/mLホスホグルコムターゼ（ウサギ筋肉由来、ロシュダイアグノスティック社製）、１．２unit/mL グルコ−ス−６−リン酸脱水素酵素（Leuconostoc mesenteroides由来、ロシュダイイアグノスティック社製））を１００μL加え、３７℃で３０分間保温した後、３４０nmの吸光度を測定した。
【００１７】
実施例１
種培養は、培地（３．５％可溶性澱粉、３．０％ Lablemco Powder(OXOID社製）、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０４％リン酸一カリウム、０．１％リン酸二ナトリウム）にコリネバクテリウム・カルナエ（C. callunae）IFO15359、バチルス・ズブチリス（B. subtilis）IFO3037、バチルス・ズブチリス（B. subtilis）IFO1372、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）JGM2505を一白金耳接種し、３０℃で一晩振盪培養を行った。
主培養は、３．５％可溶性澱粉、３．０％ Lablemco Powder(OXOID社製)、０．０５％硫酸マグネシウムにリン酸濃度が１０mM、２０mM、４０mMとなるように添加した培地上に上記の種菌を１％植菌し、３０℃で５日間培養した。上清のＧ−１−Ｐ濃度を測定した。結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】
0004658417.tif 000002
【００１９】
実施例２
種培養は、培地（３．５％可溶性澱粉、３．０％ Lablemco Powder(OXOID社製）、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０４％リン酸一カリウム、０．１％リン酸二ナトリウム）にコリネバクテリウム・カルナエ（C. callunae）IFO15359、コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）JCM1321、コリネバクテリウム・ビタエルミニス（C. vitaeruminis）JCM1323、バチルス・ズブチリス（B. subtilis）IFO3037、バチルス・ズブチリス（B. subtilis）IFO1372、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）JGM2505を一白金耳接種し、３０℃で一晩振盪培養を行った。
主培養は、０．６７％ Yeast Nitrogen Base(Difco社製）、１０％デキストリン（ポテト、SIGMA社製）にリン酸カリウム緩衝液（pH７．０）濃度が１００mM、２００mM、４００mM、５００mMとなるように添加した培地に上記種菌を集菌後、ＯＤ600nm＝１０となるように植菌し、３０℃で５日間培養した。上清のＧ−１−Ｐ濃度を測定した。結果を表２に示す。
【００２０】
【表２】
0004658417.tif 000003
【００２１】
以上の結果、コリネバクテリウム属菌を用い、リン酸濃度を調製することにより濃度依存的にＧ−１−Ｐを効率良く生産させることができた。
【００２２】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、酵素法で必要とされる植物や菌体より酵素を抽出する工程や固定化酵素の作製等の複雑な工程を行うことなく、大量のＧ−１−Ｐを製造することができる。