(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
９〜１０．５のｐＨおよび少なくとも３５℃で、かつ６０℃以下の温度を有する閉鎖冷却システムにおける水を、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンを含む組成物を添加することによって処理する方法であって、前記組成物は金属イオンと、非水系溶媒と、揮発性有機化合物と、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン以外のすべての殺生物剤とを実質的に含まず、金属イオンと、非水系溶媒と、揮発性有機化合物と、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン以外のすべての殺生物剤とが前記水に別に添加されることはなく、並びに２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンは水中で１５ｐｐｍから５００ｐｐｍの２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン濃度を生成するのに十分な量で存在する、方法。
【請求項２】
２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの濃度が２５ｐｐｍから３００ｐｐｍである請求項１記載の方法。
【請求項３】
２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの濃度が３０ｐｐｍから２００ｐｐｍである請求項２記載の方法。
【請求項４】
金属イオンと、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン以外のすべての殺生物剤とを実質的に含まない５０〜３００ｐｐｍの２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンを、８〜１２のｐＨを有し２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン以外のすべての殺生物剤を実質的に含まない金属加工用流体に添加することを含む、
金属加工用流体におけるマイコバクテリアの成長を制御する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は閉鎖冷却水システムにおける水を殺生物剤組成物で処理するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソチアゾロン殺生物剤の公知の用途の１つは、米国特許第３，７６１，４８８号に開示されるような水冷システムの処理である。しかしながら、市販の水冷システムにおいて最も頻繁に用いられるイソチアゾロン殺生物剤は、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンそれぞれの３：１混合物である。この混合物は、高ｐＨおよび高温での５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの相対的な不安定性を含む、幾つかの不都合を有する。冷却水システムにおいて用いられる他の殺生物剤配合物は、同じ理由で、並びに殺生物剤配合物中の非水系溶媒、塩および揮発性有機化合物の存在のため、不都合である。
【特許文献１】米国特許第３，７６１，４８８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明が取り組む問題は、上で論じられる不都合を被ることのない、閉鎖冷却システムにおける水の処理方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、少なくとも７のｐＨおよび少なくとも２５℃の温度を有する閉鎖冷却システムにおける水を２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンを含む組成物を添加することによって処理する方法であって、該組成物は非水系溶媒、揮発性有機化合物およびハロゲン化殺生物剤を実質的に含まず、並びに２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンは水中に１５ｐｐｍから５００ｐｐｍの２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン濃度を生じるのに十分な量で存在する方法に関する。
【０００５】
本発明は、さらに、使用中の金属加工用流体系におけるマイコバクテリア（グラム陽性、抗酸性菌）をＭＩを添加することによって制御するための方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
「ＭＩ」もしくは「ＭＩＴ」は２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、別名２−メチル−３−イソチアゾロンである。「ＣＭＩ」は５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、別名５−クロロ−２−メチル−３−イソチアゾロンである。
ここで用いられる場合、以下の用語は、その文脈が他を明瞭に示さない限り、指定された定義を有する。「殺微生物剤」という用語は所定の位置での微生物の成長を阻害もしくは成長を制御することが可能な化合物を指す。殺微生物剤には殺バクテリア剤、殺真菌剤および殺藻剤が含まれる。「微生物」という用語は、例えば、真菌（例えば、酵母およびカビ）、細菌および藻類を含む。「位置」という用語は微生物による汚染を受ける産業システムもしくは製品を指す。「閉鎖冷却システム」という用語は、蒸発に対して開放されておらず、かつ水の損失が再循環率の５％未満である、産業冷却用途に用いられる水を含むシステムを指す。以下の略語が本明細書を通して用いられる。ｐｐｍ＝重量基準での１００万分率（重量／重量）、ｍＬ＝ミリリットル、ＡＩ＝活性成分、すなわち、イソチアゾロンの総量。他に指定されない限り、温度は摂氏度（℃）であり、パーセンテージへの言及は重量基準である。
【０００７】
本発明に用いられる組成物は、好ましくは、２０％から９５％の水および５％から８０％のＭＩを含むが、非水系溶媒を実質的に含まず、すなわち、含まれるそのような溶媒は２％未満、あるいは１％未満、あるいは０．５％未満、あるいは０．１％未満である。この組成物は、ＥＰＡ規定による定義で、実質的に揮発性有機化合物を含まず、すなわち、含まれるそのような化合物は２％未満、あるいは１％未満、あるは０．５％未満、あるいは０．１％未満である。この組成物はハロゲン化殺生物剤を実質的に含まず、すなわち、含まれるそのような殺生物剤は０．５％未満、あるいは０．１％未満、あるいは１００ｐｐｍ未満、あるいは５０ｐｐｍ未満である。ハロゲン化殺生物剤には、例えば、市販の殺生物剤においてしばしばＭＩと共に存在するＣＭＩ、２−ブロモ−２−ニトロ−ｌ−プロパン−ｌ，３−ジオール（ＢＮＰＤ）、および２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミド（ＤＢＮＰＡ）が含まれる。本発明の一実施形態においては、この組成物はＭＩ以外のすべての殺生物剤を実質的に含まない。一実施形態においては、この組成物は金属を実質的に含まず、すなわち、含まれる金属イオンは０．４％未満、あるいは０．２％未満、あるいは０．１％未満である。本発明の一実施形態においては、この組成物が特定の成分を実質的に含まないものとして説明されるとき、冷却水はこれらの成分を実質的に含まず、すなわち、それらが冷却水に別に添加されることはない。
【０００８】
この組成物は腐食抑制剤と共に用いることができ、これには、例えば、亜硝酸塩、クロム酸塩、モリブデン酸塩、リン酸塩、亜鉛塩、アゾールおよびホスホン酸塩が含まれ、これらは別に冷却水に添加することができる。腐食抑制剤中に存在する金属は、本発明の組成物中のあらゆる痕跡金属によって生じるものを上回る量で冷却水中に存在することができる。
【０００９】
この組成物はスケール抑制剤と共に用いることもでき、これには、例えば、ポリカルボン酸、例えば、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸、およびポリアスパラギン酸、またはリン酸塩もしくはホスホン酸塩が含まれる。スケール抑制剤は冷却水に１ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、もしくは１００ｐｐｍ未満の使用レベルで別に添加することができる。スケール抑制剤中に存在する金属も本発明の組成物によってもたらされる量を上回ることができる。
【００１０】
本発明の一実施形態において、冷却水中のＭＩ濃度は少なくとも２０ｐｐｍ、あるいは少なくとも２５ｐｐｍ、あるいは少なくとも３０ｐｐｍ、あるいは少なくとも４０ｐｐｍ、あるいは少なくとも５０ｐｐｍ、あるいは少なくとも６０ｐｐｍであり、好ましくは、ＭＩ濃度は３００ｐｐｍ以下、あるいは２５０ｐｐｍ以下、あるいは２００ｐｐｍ以下、あるいは１５０ｐｐｍ以下、あるいは１２５ｐｐｍ以下である。
【００１１】
本発明の一実施形態において、冷却水のｐＨは少なくとも７．５、あるいは少なくとも８、あるいは少なくとも８．５、あるいは少なくとも９であり、好ましくは、ｐＨは１２以下、あるいは１１．５以下、あるいは１１以下、あるいは１０．５以下である。一実施形態において、冷却水温度は少なくとも３０℃、あるいは少なくとも３５℃、あるいは少なくとも４０℃であり、好ましくは、冷却水温度は７０℃以下、あるいは６０℃以下である。
【００１２】
「金属加工用流体におけるマイコバクテリアの成長の制御に対する、メチルイソチアゾロン殺生物剤の使用」
以下の例は、近年同定され、かつ使用中の金属加工用流体系から回収されるマイコバクテリア（グラム陽性、抗酸性菌）の制御に２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（ＭＩＴ）殺生物剤を使用する概念を支持するデータを提供する。研究室および現場試料を用いる研究の結果は、ＭＩＴ殺生物剤が汚染された金属加工用流体系において遭遇するマイコバクテリアの成長の制御において、特には公知の金属加工用流体殺生物剤と比較して、驚くべき効力を示すことを示している。加えて、ＭＩＴの使用は、ホルムアルデヒドを含まないか、もしくは放出せず、かつ重金属、溶媒および臭気のない、１パック高ｐＨ安定殺生物剤処理を提供する。
【００１３】
概要
金属加工用流体産業において通常用いられる幾つかの殺生物剤を、標準微生物学的効力手順；最小阻止濃度（ＭＩＣ）および最小殺生物濃度（ＭＢＣ）試験を用いたときの、マイコバクテリアの純粋培養物に対するそれらの有効性の基本レベルについて試験した。これらの試験において、すべての市販殺生物剤が、それらの典型的な最大使用率を下回るレベルで、評価されたマイコバクテリアの２つの株を阻害もしくは殺生する効力を示した。これらの研究室効力試験に基づき、これらの殺生物剤のすべてが、現場からの汚染された試料中のこれらの生物を殺すことにおいてそれらの典型的な使用率で良好な効力を示すものと期待された。
【００１４】
しかしながら、６つの使用中の、かつ汚染された金属加工用流体系からのすべての試料における天然のマイコバクテリアの混合集団の成長の制御において、ＭＩＴは予想外の結果をもたらした。ＭＩＴは、それらの最大推奨適用量（３種類のイソチアゾロン物質、クロロフェノールおよびホルムアルデヒド放出性トリアジン殺生物剤を含む）で用いられるとき、現場から回収される汚染流体の６つの試料すべてにおける最小程度の効力（＞９０％殺生物）をもたらす上で、他の市販金属加工用流体殺生物剤のすべてを凌いでいた。
【００１５】
背景
金属加工用流体、別名、金属機械加工用流体もしくは金属切削用流体は、金属加工用途において冷却および潤滑性のために用いられる。水系金属加工用流体は、それらの流体が開放環境で再循環されるため、様々なタイプの細菌および真菌による微生物汚染を受けやすい。様々なタイプのグラム陰性およびグラム陽性細菌、酵母、およびカビに遭遇する。近年同定され、かつこれらの流体中で回収されている具体的なグラム陽性菌のタイプの１つはマイコバクテリウム属のメンバー、別名、マイコバクテリアである。
マイコバクテリアは、ミコール酸をそれらの細胞壁に含み、標準細菌学的手順を用いる抗酸性染色に陽性に応答する、グラム陽性である細菌の属の１つを構成する。これらの生物は、近年、「過敏性肺炎」（ＨＰ）として知られる特定の健康問題の発生にも関連付けられており、これは、これらの細菌を含むエアロゾルが存在し得る金属機械加工もしくは金属加工環境において作業する個人が遭遇し得るものである（Ｓｈｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｅｍｅｒｇ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ５：  ２７０−２７３；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  ＡＩＨＪ  ６２：  ２０５−２１３；Ｋｒｅｉｓｓ  ａｎｄ  Ｃｏｘ−Ｇａｎｓｅｒ，  １９９７，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｉｎｄ．  Ｍｅｄ．  ３２：  ４２３−４３２）。
【００１６】
マイコバクテリウム・イムノゲヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｕｍ）がＨＰの発生に関連付けられる金属加工用流体中のマイコバクテリアの新たな種として近年同定されており（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｅｖｏｌ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５１：  １７５１−１７６４）、ＨＰ問題を経験するさらなる流体系で回収され続けている（Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６８：  ５５８０−５５８４；  Ｖｅｉｌｌｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ａｎｎ．  Ｏｃｃ．  Ｈｙｇ．  ４８：  ５４１−５４６）。マイコバクテリウム・イムノゲヌムＡＴＣＣ７００５０５およびＡＴＣＣ７００５０６株が、近年、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に寄託された。金属加工用流体を殺生物剤で処理したにもかかわらずＨＰの報告が継続するとなると、金属加工用流体中のマイコバクテリウム・イムノゲヌムおよびマイコバクテリウムの他の株の成長を制御する改善された方法に対する必要性が存在することは明かである。
【００１７】
現在、多くの殺生物剤もしくは防腐剤が金属加工用流体系中の細菌および真菌の制御に用いられる。これらには、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（ＣＭＩＴ）に加えて２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（ＭＩＴ）殺生物剤の３：１混合物（ＣＭＩＴ／ＭＩＴ）、ＣＭＩＴ／ＭＩＴに加えてクエン酸モノ銅（ＭＣＣ）、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（ＭＩＴ）、ホルムアルデヒド放出性トリアジン（ヘキサヒドロ−１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）−ｓ−トリアジン）およびオキサゾリジン（４，４−ジメチルオキサゾリジン）、パラクロロメタクレゾール（ＰＣＭＣ）、並びに１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン（ＢＩＴ）が挙げられる。
複数の流体中の、制御された条件下での並列試験における、金属加工用流体中の特定のマイコバクテリアの制御に対するこれらの殺生物剤の相対効力に関しては、限られたデータしか存在しない。最近の論文の１つは、ＰＣＭＣが現場における汚染された系のマイコバクテリアの制御において非常に有効であり、それに対して、トリアジンおよびイソチアゾロン殺生物剤は有効ではないものと報告した（Ｒｏｓｓｍｏｏｒｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｌｕｂｅｓ  ″Ｎ  Ｇｒｅａｓｅｓ，  Ａｐｒｉｌ，  ２０〜２７）。金属加工用流体においてＰＣＭＣを使用する欠点の１つは、適用する際のその強力なフェノール臭である。金属加工用流体の混合集合においてＭ．イヌノゲヌムを用いる別の最近の研究は、等しい生成物濃度で迅速に殺すことに対して、イソチアゾロン殺生物剤（ＣＭＴ／ＭＩＴ）がトリアジン、ＰＣＭＣ、およびオキサゾリジン殺生物剤に対して、より有効であったことを示した（Ｓｅｌｖａｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ７１：５４２〜５４６）。
【００１８】
イソチアゾロンおよびクエン酸モノ銅の組み合わせ（ＣＭＩＴ／ＭＩＴ／ＭＣＣ）を用いる金属加工用流体中の微生物の成長を制御するための改善された方法が、最近の特許において、Ｒｏｓｓｍｏｏｒｅによって記述された（米国特許第４，６０８，１８３号）。ＣＭＩＴ化合物の相乗効果および改善された安定性が金属加工用流体中での改善された効力および性能をもたらした。
【００１９】
ＣＭＩＴ／ＭＩＴ生成物の投与とＭＣＣとの組み合わせを用いて、ＨＰと関連付けられるマイコバクテリア、特には、Ｍ．イムノゲヌムの成長を制御する方法がＲｏｓｓｍｏｏｒｅによって近年開示されている（米故国特許第６，９５１，６１８号）。高濃度のクエン酸銅（５００ｐｐｍ）が、ＣＭＩＴ／ＭＩＴ混合物において最も活性のイソチアゾロンであるが、求核性化合物による急速分解を受ける塩素化イソチアゾロン（ＣＭＩＴ）の安定性を改善することが示された。しかしながら、金属加工用流体における高濃度の銅の使用は、最終用途流体の変色、使用済み流体の処分および廃棄物処理の経費の増加、並びに潜在的な腐食および金属染色の問題のため、常に望ましいものとは限らない。マイコバクテリアを制御するための単一生成物処理としてのＭＩＴ単独の使用はこの特許においてはＲｏｓｓｍｏｏｒｅによって示されていない。したがって、改善された安定性を有し、高レベルの追加金属の添加もしくは二重生成物投与を用いることのない、金属加工用流体系中のマイコバクテリア、特には、Ｍ．イヌノゲヌムの制御をもたらす殺生物剤に対する必要性が存在する。
【実施例】
【００２０】
実施例１：ｐＨ９バッファ溶液中、７０℃での、ＢＩＴおよびＢＮＰＤ殺生物剤に対するＭＩの改善された安定性
【００２１】
概要
高ｐＨおよび高温条件下でのＭＩ（２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン）、ＢＩＴ（１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン）およびＢＮＰＤ（２−ブロモ−２−ニトロ−プロパン−１，３−ジオール）の安定性を決定する研究を行った。ＭＩは、ｐＨ９バッファ中、７０℃で５６日の保存の後、優れた安定性を示した。この時間にわたってＭＩの損失はなかった。ＢＩＴは５６日の研究にわたって安定性の減少を示し、第５６日での活性成分の損失は３２％であった。ＢＮＰＤは、ｐＨ９および７０℃で、５時間で完全に分解した。
【００２２】
方法
０．０６９Ｍホウ酸、０．０１７Ｍクエン酸、０．０６６Ｍリン酸ナトリウムを含むｐＨ９バッファを蒸留水中で調製した。殺生物剤をこのｐＨ９バッファ溶液に添加し、加熱ブロック内に７０℃で保存した。これらの試料を、５時間、並びに１、３、７、２３、３０、３５および５６日後の時点での活性成分濃度について試験した。初期殺生物剤用量は１６６ｐｐｍ  ＭＩ、１９９ｐｐｍ  ＢＩＴおよび１５０ｐｐｍ  ＢＮＰＤであった。
【００２３】
これらの試料を活性成分濃度について高速液体クロマトグラフィーによって評価した。試料を加熱ブロックから採取し、室温に３０分間冷却した。次に、それらの試料を、２５ｍｌガラス試料バイアルにおいて９．５ｍｌの脱イオン水を０．５グラムの試料に添加することにより、脱イオン水で１：２０に希釈した。試料を１５秒間混合し、分析のためＨＰＬＣ試料バイアルに移した。このＨＰＬＣ法の分析変動は±１０％である。
【００２４】
結果
７０℃で５６日にわたって保存したとき、ＭＩの損失はなかった。ＢＩＴは安定性に劣り、７０℃で３２％分解した。ＢＮＰＤの安定性は乏しく、５時間後にほぼ即時の全体的な分解が観察された。
【００２５】
【表１】
0004840934.tif 000002
【００２６】
実施例２：様々な酸化および還元剤を伴う、ｐＨ７およびｐＨ９での、ＢＩＴに対するＭＩの改善された安定性
【００２７】
概要
ＭＩおよびＢＩＴの安定性を様々なレドックス剤の存在下、ｐＨ７．０および９．０バッファにおいて、第２および第８日に評価した。それらの結果は、様々なレドックス条件下および高ｐＨでのＢＩＴに対するＭＩのより高い安定性を示した。両殺生物剤はｐＨ９で亜硫酸水素ナトリウムでの僅かな分解を示したが、ｐＨ７．０で有意に分解した。亜硫酸水素塩は、特には低ｐＨ値での、イソチアゾロンの公知の不活性化剤である。
【００２８】
方法
酸化剤（２ｍＭ）は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、６８ｐｐｍ）、ｔ−ブチルヒドロゲンペルオキシド（ｔ−ｂｕｔｙｌ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ）（ｔ−ＢＨＰ、１８０ｐｐｍ）、および過硫酸カリウム（Ｋ２Ｏ８Ｓ２、５４０ｐｐｍ）を含んでいた。還元剤（２ｍＭ）はイソ−アスコルビン酸（ＩＡＡ、３５２ｐｐｍ）および亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＳＯ３、２０８ｐｐｍ）を含んでいた。殺生物剤は１ｍＭ濃度で試験し、これは１１５ｐｐｍ  ＭＩおよび１６６ｐｐｍ  ＢＩＴを表す。
【００２９】
ｐＨ７．０バッファは０．００４２６％リン酸一カリウムに加えて０．０１９％塩化マグネシウム六水和物を含んでいた。ｐＨ９．０バッファは０．００４６Ｍ塩酸に加えて０．０１３Ｍホウ砂を含んでいた。レドックス剤のストック溶液を調製し、各バッファのアリコートに添加して２ｍＭ濃度を得た。次に、殺生物剤を添加して１ｍＭ濃度を得た。これらの試料を２５℃で保存し、殺生物剤濃度をＨＰＬＣによって第０、第２および第８日に分析した。
【００３０】
結果
これらの結果は、様々なレドックス条件下および高ｐＨでのＢＩＴに対するＭＩのより高い安定性を示した。ＭＩは試験した酸化剤のすべてでＢＩＴより安定であり、過酸化水素で第８日に唯一の最小ｐＨ効果が見られた。８日後に、すべての酸化剤、ｐＨ９で残留するＢＩＴは、存在するとしても、非常に少量であった。ＢＩＴは、特には過酸化水素で、ｐＨ７に対してより高いｐＨでのより多くの分解も示した。ＭＩは、ＢＩＴに対して、アスコルビン酸還元剤に対するより良好な安定性を示し、ｐＨによる影響はなかった。両殺生物剤は亜硫酸水素ナトリウム、ｐＨ９で僅かな分解を示したが、ｐＨ７．０では２日以内に有意に分解した（イソチアゾロンの公知の不活性化剤）。
【００３１】
【表２】
0004840934.tif 000003
【００３２】
実施例３：緩衝水中で様々なｐＨおよび温度での、ＣＭＩおよびＢＩＴイソチアゾロンに対するＭＩの改善された安定性
概要
３種類のイソチアゾロンに対して、緩衝脱イオン水中、２種類の異なる温度（２２℃および５０℃）で安定性研究を行った。ＭＩは最も安定であることが示され、５０℃およびｐＨ１２で９０日後に活性の僅かな損失が伴うのみであった。ＢＩＴは、両温度で、ｐＨ１０までは良好な安定性を示した。ＣＭＩは試験したイソチアゾロンのうちで最も安定性が低く、上昇する温度の影響を最も受けた。
【００３３】
方法
殺生物剤をバッファ溶液に添加し、２２℃および５０℃で、ＨＰＬＣを用いて０時間、２１日、４３日、および８８〜９０日での殺生物剤濃度を測定して安定性を試験した。殺生物剤の安定性は以下のバッファ溶液中で決定した。ｐＨ２、０．０１Ｍ  ＨＣ１；ｐＨ６、０．１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ８、０．０２５Ｍホウ酸塩；ｐＨ１０，０．０２５Ｍホウ酸塩；ｐＨ１２、０．０５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４。試験した殺生物剤濃度は１００ｐｐｍ  ＭＩ、２００ｐｐｍ  ＢＩＴ、４４ｐｐｍ  ＣＭＩであった。
【００３４】
結果
３種類のイソチアゾロンに対して、緩衝水中、２種類の異なる温度（２２°および５０℃）で安定性研究を行った。ＭＩが最も安定な試験された殺生物剤であり、ＢＩＴがそれに続き、ＣＭＩが条件の全範囲にわたって最も安定性が低かった。ＭＩは室温でｐＨ１２まで優れた安定性を示した。５０℃で、ＭＩの安定性は、ｐＨ１２のみではあるが、僅かに低下した。ＢＩＴは室温および５０℃でｐＨ１０まで優れた安定性を示した。ｐＨ１２では、両温度で僅かな分解が生じた。ＣＭＩはｐＨ１０〜１２、室温（２２℃）での急速かつ完全な分解、およびｐＨ６〜１２、より高温での安定性の低さを示した。
【００３５】
【表３】
0004840934.tif 000004
【００３６】
【表４】
0004840934.tif 000005
【００３７】
実施例４：細菌および真菌に対するＭＩの有効濃度
【００３８】
概要
細菌および真菌を用いる最小阻止濃度（ＭＩＣ）研究は、３：１比ＣＭＩ＋ＭＩ組み合わせ製品中に存在するＭＩと比較して、ＭＩ単独が効力を示すのに有意に高い濃度を必要とすることを示した。ＣＭＩ＋ＭＩ組み合わせにおいて、抗微生物活性のレベルは単に塩素化イソチアゾロン（ＣＭＩ）によるものであり、存在するＭＩの濃度は有効性に必要なＭＩ単独の濃度よりも有意に低い。
【００３９】
方法
最小阻止濃度（ＭＩＣ）研究を行い、細菌および真菌の成長を阻害するのに必要な殺生物剤の最低濃度を決定した。試験は９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて行った。殺生物剤をプレート内の成長培地に添加し、連続的に希釈して一連の濃度を得た。細菌試験は、トリプチカーゼ大豆ブロス（ＴＳＢ、ｐＨ７）において、ｍｌあたり１０６コロニー形成単位で添加された一晩接種材料を用いて行った。試料を２５℃で２日間インキュベートし、ＭＩＣ値を成長・非成長基準で視覚的に決定した。真菌試験は、麦芽抽出物ブロス（ＭＥＢ、ｐＨ４．７）において、ｍｌあたり１０４コロニー形成単位で添加された５〜７日接種材料を用いて行った。試料を２５℃で７日間インキュベートし、上述のようにＭＩＣ値を決定した。
【００４０】
結果
これらのＭＩＣ研究は、細菌および真菌の両者の制御について、効力を示すのに必要なＭＩの濃度が、３：１比ＣＭＩ：ＭＩ組み合わせ製品中に存在するＭＩ濃度よりも有意に（１０−１００×）高いことを示す。細菌および真菌に対するＭＩ単独の平均ＭＩＣ値は、それぞれ、２４および６３ｐｐｍ  ＭＩ単独であり、それに対して、３：１組み合わせにおいては、ＭＩは、それぞれ、０．５６および０．３４ｐｐｍで存在するのみであった。したがって、組み合わせ殺生物剤中に存在するＭＩはＭＩ単独で必要とされるものよりも有意に少なく、配合イソチアゾロンのＣＭＩ成分が単独で観察される効力の原因であった。
【００４１】
【表５】
0004840934.tif 000006
【００４２】
【表６】
0004840934.tif 000007
【００４３】
実施例５：高ｐＨ値での、細菌および真菌に対する、ＢＩＴに対して改善されたＭＩの効力
【００４４】
概要
細菌および真菌を用いる最小阻止濃度（ＭＩＣ）研究は、増加するｐＨ（ｐＨ９対ｐＨ７）によって、ＭＩの効力が有意に影響されることがなく、それに対して、よりアルカリ性の条件下（ｐＨ９）で、ＢＩＴは微生物成長の制御に対する有効性に劣ることを示した。これらの知見に基づき、ＭＩは高ｐＨ条件下での微生物の有効な制御により望ましい殺生物剤であった。
【００４５】
方法
最小阻止濃度（ＭＩＣ）研究を行い、細菌および真菌の成長を阻害するのに必要な殺生物剤の最小濃度を決定した。試験は９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて行った。殺生物剤をプレート内の成長培地に添加し、連続的に希釈して一連の濃度を得た。試験は１／２強度トリプチカーゼ大豆ブロス（ＴＳＢ、ｐＨ７．１もしくはｐＨ９．０に調整）中で行った。細菌および真菌を試料にｍｌあたり１０６コロニー形成単位で添加し、３０℃で３日間インキュベートした。ＭＩＣ値は成長・非成長基準で視覚的に決定した。
【００４６】
結果
細菌および真菌を用いる最小阻止濃度（ＭＩＣ）研究は、増加するｐＨ（ｐＨ９対ｐＨ７）によって、ＭＩの効力が有意に影響されることがなく、それに対して、よりアルカリ性の条件下（ｐＨ９）で、ＢＩＴは微生物成長の制御に対する有効性に劣ることを示した。
ＭＩのＭＩＣ値は、ｐＨ９．０対ｐＨ７．１で、抗微生物活性に大きな差は示さなかった。両ｐＨ値での結果は一般に同一であったか、もしくはＭＩＣ試験の決定限界であるマイクロタイタープレート内の１ウェル（２×差に等しい）以内であった。ＭＩで試験した生物のいずれも、ｐＨの関数としての効力に２×を上回る変化を示したものはなかった。
【００４７】
ＢＩＴは、比較により、試験した細菌および真菌のほとんどについて、ｐＨ７．１に対してｐＨ９．０で有意に高いＭＩＣ値を示した。９つの生物のうちの８つがＢＩＴでのｐＨ有効性を示し、ＭＩＣ値はｐＨ７．１に対してｐＨ９．０で４から３０×高かった。
これらの結果は、高ｐＨ条件を伴う用途における使用に非常に有効な殺生物剤として、ＭＩを示す。
【００４８】
【表７】
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【００４９】
実施例６
標準実験培地中のマイコバクテリアの純粋培養物に対する、市販殺生物剤を用いる最小阻止濃度（ＭＩＣ）および最小殺生物濃度（ＭＢＣ）研究
【００５０】
ＭＩＣおよびＭＢＣ研究を行い、２種類の株のマイコバクテリアの阻害および殺生に対する、金属加工用流体において典型的に用いられる数種類の市販殺生物剤の基本有効性を、標準培地および実験手順を用いて決定した。結果は、すべての市販殺生物剤がそれらの最大推奨使用濃度を下回る濃度で両株の（阻害および殺生の両者）の効力を示すことを示した。これは、これらの殺生物剤が、他の細菌が存在しない状態で試験し、かつ標準実験培地を用いるとき、マイコバクテリアの株に対する固有の抗微生物効力を有することを示す。
【００５１】
細菌の阻害に必要な殺微生物剤の最小濃度は高分解能ＭＩＣ試験によって決定した。様々な量の各殺微生物剤を９６ウェルマイクロタイタープレート内の培地に添加した。ＭＩＣ試験に用いた培地は１０％トリプチカーゼ大豆ブロス（１／１０Ｘ  ＴＳＢ）であった。１０倍連続希釈をＢｉｏｍｅｋ  ２０００  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎで行い、殺微生物剤の一連の間隔の狭い濃度を得た。各ウェルにおいて１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬの細菌をもたらすように調整された静止期微生物の細胞懸濁液をマイクロタイタープレートに添加した。それらのマイクロタイタープレートを、マイコバクテリウム・イムノゲヌムについては３０℃で、マイコバクテリウム・ケロナエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｅｌｏｎａｅ）については３７℃で、２４時間インキュベートした。６５０ｎｍの吸光度に設定されたＴｈｅｒｍｏｍａｘマイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの濁度を測定することにより、微生物の成長の有無を決定した。成長が観察されなかった化合物の最小濃度をその殺微生物剤のＭＩＣ値とみなした。各殺微生物剤のＭＩＣ値を細菌に対する４回の決定の平均から決定した。
【００５２】
試験した細菌株には、マイコバクテリウム・ケロナエ（ＡＴＣＣ１４４７２）およびマイコバクテリウム・イムノゲヌム（ＡＴＣＣ７００５０５）が含まれていた。マイコバクテリア培養物は３０℃（Ｍ．イムノゲヌム）もしくは３７℃（Ｍ．ケロナエ）で、回転浸透浴において、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ富化のＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０  Ａｇａｒ中で一晩培養した。一晩培養物の１：２０希釈物を適切な試験培地で作製し、接種して１０６から１０７ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度を得た。
【００５３】
ＭＢＣ試験は、ＭＩＣ試験試料からの試料を新鮮な培地に移し、培養物の成長を観察することによって行った。成長は上述のように決定した。Ｂｉｏｍｅｋ  ２０００  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いるこの試験においては、９６ウェルＭＩＣプレートから採取した１０μｌの試料を１９０ｍｌの新鮮な成長培地に入れ、同じ殺生物剤濃度の勾配に対する生存生物の数を決定した。これらのプレートはＭＩＣプレートと同じ方式でインキュベートおよび読み取りを行った。新鮮な培地に移した２日後に、生存を示さなかったＭＩＣプレートからの殺生物剤の最小濃度をＭＢＣとみなした。
【００５４】
表１に示される結果は、すべての市販殺生物剤がそれらの最大推奨使用濃度を下回る濃度で両株の（阻害および殺生の両者）の効力を示すことを示した。これらのデータに基づき、これらの殺生物剤が現場からの実際の金属加工用流体試料において遭遇する類似の生物に対してすべて有効であるはずであると期待された。
【００５５】
【表８】
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【００５６】
実施例７
使用中のシステムからの金属加工用流体の汚染試料におけるマイコバクテリアの根絶および制御に対する最大推奨投与濃度での殺生物有効性の比較
【００５７】
６種類の使用中の金属加工用流体からのマイコバクテリウムの天然常在集団に対して６種類の金属加工用流体殺生物剤を評価する比較試験を行った。ＣＭＩＴ／ＭＩＴ、ＣＭＩＴ／ＭＩＴ／ＭＣＣ、ＭＩＴ、ＢＩＴ、トリアジン、およびＰＣＭＣ殺微生物剤を制御された実験条件下で試験し、製造者の最大推奨添加率でのそれらの効力を決定した（表２）。金属加工用流体は、殺生物剤を添加する前は、高濃度のマイコバクテリアを含むことが公知である。次に、試料に殺生物剤を添加して攪拌しながら室温でインキュベートし、４８時間後に、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０培地に、望ましくない微生物の成長を抑制するために、Ｔｗｅｅｎ  ８０、グリセリン、シクロヘキサミド、クロラムフェニコール、およびゲンタマイシンと共にプレートすることによって生存しているマイコバクテリアの数を決定した。
【００５８】
１００％の製造者最大推奨処理率で添加された様々な殺生物剤の比較効力（ｌｏｇ殺生）を表３に示す。ＭＩＴが６種類の金属加工用流体の各々において少なくとも１対数減少（９０％殺生）をもたらす唯一の殺生物剤であった（表４）。ＭＩＴは試験した６種類の流体のうちの５種類において少なくとも２対数減少（９９％殺生）をもたらす唯一の殺生物剤でもあった。ＰＣＭＣは試験した５種類の流体において少なくとも９０％殺生で、および４種類の流体において最小で９９％殺生で有効であった。ＣＭＩＴ／ＭＩＴおよびＣＭＩＴ／ＭＩＴ／ＭＣＣは試験した６種類の流体のうちの４種類においてこれらの殺生率でのみ有効であった。トリアジンおよびＢＩＴ殺生物剤は試験した流体のいずれにおいても効力を示さなかった。
【００５９】
これらの結果は、特にはこれらの殺生物剤のすべてがこれらの生物の純粋培養物に対する効力を実験室の研究においてより低い濃度で従来示していたため、天然に汚染された金属加工用流体におけるマイコバクテリアの成長の制御に対して最大推奨添加濃度で驚くほど有効であるものとしてＭＩＴを示した。ＭＩＴは、Ｒｏｓｓｍｏｏｒｅによって（米国特許第６，９５１，６１８号）マイコバクテリアに対する非常に有効な殺生物剤として従来報告されるＣＭＩＴ／ＭＩＴ／ＭＣＣを含めて、他のすべての殺生物剤を有意に凌いでいた。しかしながら、ＭＩＴ処理法は２種類の生成物の使用を必要とせず、並びに、流体に色を加え、かつ潜在的な腐食、金属染色および廃棄物処理の問題を有する、高濃度の銅塩を必要としない。
【００６０】
【表９】
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【００６１】
【表１０】
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【００６２】
【表１１】
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【００６３】
実施例８
使用中のシステムからの金属加工用流体の汚染試料におけるマイコバクテリアの根絶および制御についての、最大推奨添加濃度の５０％での殺生物剤有効性の比較
【００６４】
実施例７からのマイコバクテリアを含有する６種類の金属加工用流体試料を、同じ殺生物剤を製造者の最大推奨率の５０％の添加（表２）で用いて同じ条件下でも試験した。これらの金属加工用流体は殺生物剤を添加する前は高濃度のマイコバクテリアを含むことが公知である。次に、試料に殺生物剤を添加して攪拌しながら室温でインキュベートし、４８時間後に、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０培地に望ましくない微生物の成長を抑制するための、Ｔｗｅｅｎ  ８０、グリセリン、シクロヘキサミド、クロラムフェニコール、およびゲンタマイシンと共にプレーティングすることによって生きているマイコバクテリアの数を決定した。
【００６５】
最大処理率の５０％での投与の効力（ｌｏｇ殺生）データを表５に示す。ＭＩＴおよびＣＭＩＴ／ＭＩＴ／ＭＣＣが６種類の流体のうちの４種類において少なくとも１対数減少（９０％殺生）をもたらし、かつ試験した６種類の流体のうちの３種類において少なくとも２対数減少（９９％殺生）をもたらす唯一の殺生物剤であった（表６）。ＣＭＩＴ／ＭＩＴは３種類の流体においてのみ最小で９０％から９９％の殺生を達成した。ＰＣＭＣは３種類の流体において９０％以上の殺生をもたらし、２種類の流体のみにおいて９９％以上の殺生を達成した。トリアジンおよびＢＩＴ殺生物剤は試験した６種類の流体のいずれにおいても効力を示さなかった。
【００６６】
これらの結果は、特にはこれらの殺生物剤のすべてがこれらの生物の純粋培養物に対する効力を実験室の研究において低濃度で従来示していたので、天然に汚染された金属加工用流体におけるマイコバクテリアの成長の制御に対して最大推奨処理濃度の５０％で添加されたときでさえ驚くほど有効であるものとしてＭＩＴを示した。推奨使用率の１／２で、ＭＩＴは、Ｒｏｓｓｍｏｏｒｅ（米国特許第６，９５１，６１８号）によってマイコバクテリアに対する非常に有効な殺生物剤として従来報告されるＣＭＩＴ／ＭＩＴ／ＭＣＣ殺生物剤と比較して類似の効力をもたらした。しかしながら、ＭＩＴ処理法は２種類の生成物の使用を必要とせず、並びに、流体に色を加え、かつ潜在的な腐食、金属染色および廃棄物処理の問題を有する、高濃度の銅塩を必要としない。
【００６７】
【表１２】
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【００６８】
【表１３】
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【００６９】
実施例９
侵襲性金属加工用流体中でのＣＭＩＴ（ＭＣＣ含有および非含有）に対するＭＩＴの安定性の比較
【００７０】
３種類の高ｐＨ金属加工用流体使用時希釈物中で安定性試験を行い、ＭＩＴ殺生物剤の持続性を、単独で、もしくはＭＣＣとの組み合わせで試験したＣＭＩＴ殺生物剤に対して比較した。使用時希釈流体のアリコートに１７．５ｐｐｍ活性ＣＭＩＴ／ＭＩＴおよびＣＭＩＴ／ＭＩＴ／ＭＣＣを添加し、２５℃で保存した。殺生物剤濃度を、時間ゼロで、および毎週、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を用いて決定した。
【００７１】
結果は、ＭＩＴ単独が３〜４週間後に３種類の高ｐＨ使用時希釈流体のすべてにおいて殺生物剤活性の９０％超を保持することを示した（表７）。対照的に、ＣＭＩＴ単独は３種類の流体中で急速に分解し、３〜４週間後には何も残らなかった。３００ｐｐｍ  ＭＣＣの添加はＣＭＩＴの安定性を中程度に改善したが、３〜４週間後に１６％を上回る殺生物剤が残留する流体はなかった。
【００７２】
これらの結果は、典型的な（高ｐＨ）金属加工用流体使用時希釈物中での、ＣＭＩＴに加えてＭＣＣの組み合わせに対するＭＩＴ殺生物剤の優れた安定性を明瞭に示す。Ｒｏｓｓｍｏｏｒｅ（米国特許第６，９５１，６１８号）は、侵襲性流体中でのＣＭＩＴの分解を防止するのに有効な安定化剤として、ＭＣＣを従来報告していた。しかしながら、この効果は、ここで試験した流体においては、永続もしくは長期間高度に有効であるものとは観察されなかった。したがって、ＭＩＴは、金属加工用流体におけるマイコバクテリアの制御に最も有効な殺生物剤であることが示されただけではなく、侵襲性流体における微生物制御に対して長期間持続する最も安定なイソチアゾロン殺生物剤であることも示された。
【００７３】
【表１４】
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【００７４】
本発明は、多量の金属塩（例えば、５００ｐｐｍクエン酸モノ銅）の添加の必要がなく、かつ金属加工用流体中での安定性が制限されることが公知である塩素化イソチアゾロン、例えば、ＣＭＩＴを用いることのない、金属加工用流体中のマイコバクテリア、特には、Ｍ．イムノゲヌムの成長の（添加後、少なくとも４８時間の）制御のための、ＭＩＴの低臭気、高安定性、持続性１パック殺生物剤処理としての使用を含む。この処理は、望ましくないヒト健康効果を生じる潜在能力を有する生物、例えば、マイコバクテリア、特には、Ｍ．イムノゲヌムの濃度を制御する改善された方法を提供する。
【００７５】
使用方法の鍵となる部分。
１．金属加工用流体中の過敏性肺炎（ＨＰ）に関連するマイコバクテリア、特には、Ｍ．イムノゲヌムの成長を制御する方法であって、臭気が少なく、ホルムアルデヒドを放出もしくは含有せず、金属塩（特には、銅）を含まず、塩素化イソチアゾロン、特には、クロロメチルイソチアゾロ（ＣＭＩＴ）を含まず、かつアルカリ性金属加工用流体（ｐＨ＞７）中で非常に安定であるＭＩＴ殺生物剤を１パック処理として用いる方法。
ａ．５０から３００ｐｐｍでのＭＩＴでの処理が好ましく、１００−２００ｐｐｍがより好ましく、１２５〜１５０ｐｐｍが最も好ましい。
ｂ．マイコバクテリアの制御は最小で添加後４８時間で達成される。
ｃ．マイコバクテリアの濃度を現場で監視し、マイコバクテリアの成長が処理後に抑制されていることを確認する。