(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱脂後の紅花種子を５〜４５℃の水で洗浄し、固形分と洗浄液分に分離して得られた洗浄処理固形物から、炭素数１〜４のアルコールからなる群より選ばれるアルコールを含む有機溶媒で抽出して得られた紅花種子抽出組成物。
【請求項２】
脱脂後の紅花種子を５〜４５℃の水で洗浄し、固形分と洗浄液分に分離して得られた洗浄処理固形物から、炭素数１〜４のアルコールからなる群より選ばれるアルコールを含む有機溶媒で抽出して得られた抽出物を濃縮、乾燥して得られたものである紅花種子抽出組成物。
【請求項３】
ｐ−クマロイルセロトニン、フェルロイルセロトニン、ｐ−クマロイルセロトニン配糖体及びフェルロイルセロトニン配糖体の含有量の総量と、２−ハイドロキシアークチインの含有量との重量比が、１：０．０１〜０．２である、請求項１または２に記載の紅花種子抽出組成物。
【請求項４】
アルコールが、エタノールである請求項１、２または３に記載の組成物。
【請求項５】
請求項３または４に記載の組成物を含有する食品または飼料。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の組成物を含有する医薬組成物。
【請求項７】
動脈硬化または動脈硬化に起因する疾患の予防用である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
動脈硬化に起因する疾患が狭心症、心筋梗塞、間歇性跛行または脳梗塞である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
脱脂後の紅花種子を５〜４５℃の水で洗浄し、固形分と洗浄液分に分離して得られた洗浄処理固形物から、炭素数１〜４のアルコールからなる群より選ばれるアルコールを含む有機溶媒で抽出する工程を含む紅花種子抽出組成物の製造方法。
【請求項１０】
脱脂後の紅花種子を５〜４５℃の水で洗浄し、固形分と洗浄液分に分離して得られた洗浄処理固形物から、炭素数１〜４のアルコールからなる群より選ばれるアルコールを含む有機溶媒で抽出して得られた抽出物を濃縮、乾燥する工程を含む紅花種子抽出組成物の製造方法。
【請求項１１】
アルコールが、エタノールである請求項９または１０記載の製造方法。
【請求項１２】
請求項１または２に記載の組成物を食品または飼料に含有させる工程を含む、紅花種子抽出組成物含有食品または飼料の製造方法。
【請求項１３】
紅花種子抽出組成物がエタノールを含む有機溶媒で抽出されたものである、請求項１２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、動脈硬化の予防等に用いることができる新規な植物種子抽出組成物、該植物種子抽出組成物を含有する食品、飼料及び医薬組成物、並びに該植物種子抽出組成物の製造方法に関する。
【背景技術】  近年のライフスタイルの欧米化に伴い、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞などといった動脈硬化性疾患が、ガンとならんで日本人の死因のトップを形成するようになった。動脈硬化巣形成の初期にはＬＤＬ（低比重リポタンパク）の酸化が重要な役割を果たしている事はほぼコンセンサスが得られていることから、血中コレステロールレベルを適切な領域に管理するだけでなく、酸化ＬＤＬの生成を制御することの重要性が最近指摘されるようになってきた。
食品、特に植物由来のものの中には豊富に抗酸化物質が含まれていることが分かっており、緑茶や赤ワインに含まれる抗酸化物質がＬＤＬに取り込まれて（あるいはその近傍で）ラジカルを消去することにより酸化ＬＤＬの生成を防ぐのではないかと考えられている（Ｆｕｈｒｍａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６１：ｐｐ５４９−５４，１９９５）。これらの食品の積極的な摂取がガンや心臓病を抑制するとの疫学的研究もある（Ｒｅｎａｕｄら、Ｌａｎｃｅｔ，３３９：ｐｐ１５２３−２６，１９９２）。
ところで、ゴマ種子リグナン、ブドウ種子ポリフェノールなどの特定の植物種子由来の特定成分が実験動物に対して抗動脈硬化作用を示すとの報告はある（Ｋａｎｇら、Ｊ．Ｎｕｔｒ．，１２９：ｐｐ１８８５−９０，１９９９；Ｙａｍａｋｏｓｈｉら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１４２：ｐｐ１３９−４９，１９９９）。しかしながら、このように植物種子の成分が動物実験レベルで抗動脈硬化性が明らかにされた例はまだわずかであって、多くの研究は試験管レベルにとどまっているのが実情である。例えば、特開平８−３３７５３６号公報には、植物種子を焙煎し、発酵処理したものから抽出した抗活性酸素作用剤が開示されている。この技術では、原料として植物種子を利用しているものの、焙煎、発酵処理などの操作を必要としているため汎用性が低く、実用的な方法ではない。また、動脈硬化抑止に効果を奏することは明確には示されていない。また、Ｚｈａｎｇら（Ｚｈａｎｇら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４５：ｐｐ１９１０−１４，１９９７）は、紅花の油粕から各種溶媒の分配操作により抽出した化合物群の構造を示し、それらの中にはインビトロで抗酸化活性を有するものがあることを示している。しかしながら、これらの抗酸化活性を有する化合物が動脈硬化予防に有効であることは現状では明らかではない。インビトロの抗酸化活性がインビボにおける抗動脈硬化活性と必ずしも相関しないことが知られている（Ｆｒｕｅｂｉｓら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，３８：ｐｐ２４５５−６４，１９９７；Ｆｒｕｅｂｉｓら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１１７：ｐｐ２１７−２４，１９９５；Ｍｕｎｄａｙら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，１８：ｐｐ１１４−１９，１９９８）ことを考慮すると、植物種子中の抗酸化物質が抗動脈硬化性を有するか否かは、少なくとも実験動物レベルで確認される必要があるものと思われる。Ｍｏｏｎらは紅花種子の粉末、エタノール抽出物あるいは熱水抽出物にコレステロール負荷食を与えたラットの血中コレステロール上昇を抑制する作用を見出している（Ｍｏｏｎら、Ｎｕｔｒ．Ｒｅｓ．，２１：ｐｐ８９５−９０４，２００１）が、このラットへのコレステロール負荷実験結果はコレステロール吸収抑制を評価しているものであり、動脈硬化抑制を評価しているものではない。
一方、紅花種子にはインビトロで抗酸化活性、抗炎症活性が知られているセロトニン誘導体が含まれていることが知られている（Ｚｈａｎｇら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４４：ｐｐ８７４−８７６，１９９６；Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．，１８：ｐｐ４２３−４２８，１９９８）。また、紅花種子中には配糖体であるセロトニン誘導体が含まれていることが知られている（Ｚｈａｎｇら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４５：ｐｐ１９１０−１４，１９９７）。さらに、紅花種子にはセロトニン誘導体と下痢誘起性物質としてフェノール性配糖体である２−ハイドロキシアークチイン（２−ｈｙｄｒｏｘｙａｒｃｔｉｉｎ）が含まれていることが報告されている（Ｐａｌｔｅｒ．Ｒ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１：ｐｐ２８７１−２８７４，１９７２）。この２−ハイドロキシアークチインはｐＨ５の水で抽出されることが報告されているが、セロトニン誘導体の挙動については調べられていない（Ｌｙｏｎ．Ｃ．Ｋ．ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，５６：ｐｐ５６０−５６４，１９７９）。
【発明の開示】
本発明の課題は、インビボで活性を有する有効成分を多く含み、且つ、副作用の低減された新規な植物種子抽出組成物、該植物種子抽出組成物を含有する食品、飼料、医薬組成物を提供すること、及び該植物種子抽出組成物の製造方法であって食品、飼料、医薬組成物の製造に適した方法を提供することにある。
本発明者らのうち小山らは脱脂後の植物種子、なかでも紅花種子や菜種種子の有機溶媒抽出物（脱脂種子の含水エタノール抽出液をヘキサンにて洗浄後、酢酸エチルにより抽出された抽出物）がインビトロでヒト血漿中のＬＤＬの酸化を抑制する作用を有することを見出し、さらにインビボで、脱脂後の植物種子の有機溶媒抽出物がマウスの血管内壁に形成する粥状斑（プラーク）の形成を抑制する作用を有し、実験動物で動脈硬化予防に有効であるという知見を得た（ＰＣＴ／ＪＰ０３／０４６０７）。また、本発明者らのうち小山らはセロトニン誘導体（ｐ−クマロイルセロトニンとフェルロイルセロトニン）の混合物が実験動物で動脈硬化予防に有効であるという知見を得た（ＰＣＴ／ＪＰ０３／０４６０７）。この知見から、これらのセロトニン誘導体と同様に、紅花種子中に含まれていることが知られている配糖体であるセロトニン誘導体がインビボで活性を有し動脈硬化予防に有効であることは容易に類推できる。
ところで動脈硬化予防にとって下痢は有害なものである。そこで本発明者らは、上記の実情及び知見に鑑み、インビボで活性を有し動脈硬化予防に有効であるセロトニン誘導体の含有量が多く、且つ、下痢誘起性物質である２−ハイドロキシアークチインの含有量が少ない植物種子抽出組成物を得ること、且つ、かかる組成物を得るための抽出方法の開発に着目した。
本発明者らは、上記課題を解決するためにさらに鋭意研究した結果、脱脂後の植物種子を水で洗浄し、得られた洗浄処理物から有機溶媒で抽出することで、セロトニン誘導体の含有量が多く、且つ、２−ハイドロキシアークチインの含有量が少ない組成物が得られることを初めて見出して本発明を完成するに至った。本発明の方法は、食品、飼料、医薬組成物の製造に通常使用可能な製造用剤を用いて行うことができるので、食品、飼料、医薬組成物の製造に適している。本発明は以下の項目を包含する。
（１）脱脂後の植物種子を水で洗浄し、得られた洗浄処理物から有機溶媒で抽出して得られた植物種子抽出組成物。
（２）脱脂後の植物種子を水で洗浄し、得られた洗浄処理物から有機溶媒で抽出して得られた抽出物を濃縮、乾燥して得られたものである植物種子抽出組成物。
（３）植物種子が、紅花の種子である上記（１）または（２）に記載の組成物。
（４）ｐ−クマロイルセロトニン、フェルロイルセロトニン、ｐ−クマロイルセロトニン配糖体及びフェルロイルセロトニン配糖体の含有量の総量と、２−ハイドロキシアークチインの含有量との重量比が、１：０．０１〜０．２である紅花種子抽出組成物。
（５）脱脂後の紅花の種子を水で洗浄し、得られた洗浄処理物から有機溶媒で抽出して得られたものである上記（４）に記載の組成物。
（６）脱脂後の紅花の種子を水で洗浄し、得られた洗浄処理物から有機溶媒で抽出して得られた抽出物を濃縮、乾燥して得られたものである上記（４）に記載の組成物。
（７）有機溶媒が、低級アルコールである上記（１）、（２）、（３）、（５）または（６）に記載の組成物。
（８）低級アルコールが、エタノールである上記（７）に記載の組成物。
（９）上記（１）〜（８）のいずれかに記載の組成物を含有する食品。
（１０）上記（１）〜（８）のいずれかに記載の組成物を含有する飼料。
（１１）上記（１）〜（８）のいずれかに記載の組成物を含有する医薬組成物。
（１２）脱脂後の植物種子を水で洗浄し、得られた洗浄処理物から有機溶媒で抽出する工程を含む植物種子抽出組成物の製造方法。
（１３）脱脂後の植物種子を水で洗浄し、得られた洗浄処理物から有機溶媒で抽出して得られた抽出物を濃縮、乾燥する工程を含む植物種子抽出組成物の製造方法。
（１４）植物種子が、紅花の種子である上記（１２）または（１３）に記載の製造方法。
（１５）有機溶媒が、低級アルコールである上記（１２）、（１３）または（１４）のいずれかに記載の製造方法。
（１６）低級アルコールが、エタノールである上記（１５）記載の製造方法。
本発明の植物種子抽出組成物は、有効成分であるセロトニン誘導体の含有量が多く、且つ、下痢誘起性化合物である２−ハイドロキシアークチインの含有量が少ない新規な組成物である。本発明の方法によれば上記植物種子抽出組成物を好適に製造することができ、また、本発明の方法は、一般に食品、飼料等の用途に資するためには製造用剤として用いることが好ましくない酢酸エチルを用いなくても製造することができるので、食品、飼料等の製造に適している。
【図面の簡単な説明】  図１は、参考例１における、各試料のＬＤＬの被酸化性に及ぼす効果を示すグラフである。
図２は、参考例２において、紅花ミール抽出組成物、菜種ミール抽出組成物がａｐｏＥ（−／−）マウス〔動脈硬化モデルマウス〕（投与５週目、１４週齢）の大動脈での動脈硬化を抑制する効果を有することを示す写真の概略図であり、（ａ−１）は対照群を（ｂ−１）は紅花群を（ｃ−１）は菜種群を示す。写真は、本来カラー写真であり、赤く染色されている部分が粥状斑である。図２は、該赤く染色されている部分を明確にするために該写真を作図し、赤く染色されている部分を黒く塗りつぶして示した概略図である。
図３は、参考例３における、各試料投与１５週目のａｐｏＥノックアウトマウス（２１週齢、オス）の大動脈起始部病変面積を示すグラフである。図中、ＳＦＭは紅花ミール抽出組成物を、ＣＳはｐ−クマロイルセロトニンを、ＦＳはフェルロイルセロトニンを示す。
発明の詳細な説明
本発明で用いる植物種子は、どの植物の種子でも良く、例えば紅花、菜種、大豆等の種子が挙げられるが、好ましくは紅花の種子である。本発明において植物種子とは、植物種子を構成する全体、あるいはその一部、例えば、種皮、胚乳、胚芽等をとりだしたものでもよく、また、それらの混合物であってもよい。
本発明では脱脂後の植物種子、即ち脱脂物（ミール）を原料として用いる。植物種子の脱脂物は、自体公知の方法により植物種子を脱脂して得ることができるが、例えば種子を圧搾抽出するか又は種子の破砕物にｎ−ヘキサン等を加えて抽出した後、抽出系から固形分を取り出し、該固形分を乾燥して得ることができる。脱脂程度は通常６０重量％以上、好ましくは８０重量％以上である。
本発明は、後述の有機溶媒抽出の前に、原料である脱脂後の植物種子を水で洗浄することを特徴とする。
水は、特に限定されず、例えば蒸留水、水道水、工業用水及びこれらの混合水等のいずれも用いることができる。水には、本発明の効果が得られる限り、他の物質、例えば無機塩（例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等）、酸（例えば塩化水素、酢酸、炭酸、過酸化水素、リン酸等）、アルカリ（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム等）等を含んでいてもよい。洗浄の際のｐＨは通常２〜９であり、好ましくは５〜７である。
水の使用量は、総量として、原料である脱脂後の植物種子に対して、通常２〜１００倍量（水容量／脱脂後の植物種子重量、以下同様）、好ましくは１０〜４０倍量である。
洗浄は、自体公知の方法で、原料である脱脂後の植物種子と水とを接触させて行うことができる。例えば、脱脂後の植物種子を水に懸濁後、濾過して固形の洗浄処理物を回収する方法等が挙げられる。洗浄は、上記の量の水を、脱脂後の植物種子に一度に又は複数回に分けて、又は連続的に接触させて行ってもよい。接触させる際の温度は通常５〜４５℃、好ましくは２５〜３５℃である。接触させる時間は通常１０〜２４０分であり、好ましくは１５〜６０分である。
本発明は、上記のようにして得られた脱脂後の植物種子の洗浄処理物から有機溶媒で抽出して植物種子抽出組成物を得ることを特徴とする。
有機溶媒として、例えば、低級アルコール、アセトン及びそれらの混合溶媒等が挙げられるが、それらに限定されない。有機溶媒は、水を含んでいてもよく、無水物であってもよい。有機溶媒の濃度は、通常２０〜９５重量％、好ましくは５０〜９０重量％である。有機溶媒は抽出後の抽出物の濃縮、乾燥及び食品製造の点からは低級アルコールが好ましい。低級アルコールとして、例えば炭素数１〜４のアルコールが挙げられ、具体的には例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等が挙げられるが、これらに限定されない。低級アルコールは、食品製造の点からは、エタノールが好ましい。エタノールは、エタノール分を５０重量％以上含む含水エタノールあるいは無水エタノールが好ましい。
有機溶媒の使用量は、原料である脱脂後の植物種子の通常２〜４０倍量（有機溶媒容量／脱脂後の植物種子重量、以下同様）、好ましくは２〜１０倍量である。抽出温度は通常２０〜７５℃、好ましくは５０〜７０℃である。抽出時間は通常１０〜２４０分、好ましくは６０〜１２０分である。
抽出後、懸濁液より濾過等により固形分を分離して得られた抽出液は、そのまま、又は必要により濃縮、乾燥して本発明の植物種子抽出組成物として用いることができる。濃縮、乾燥は抽出液そのままを濃縮、乾燥してもよく、賦型剤（例えば乳糖、ショ糖、デンプン、サイクロデキストリン等）を添加して実施してもよい。上記の溶媒で抽出された組成物は、その純度で、本発明の植物種子抽出組成物として有用であるが、更に自体公知の方法により精製しても良い。
上記の方法により得られた本発明の植物種子抽出組成物を食品、飼料、医薬組成物（動脈硬化予防剤等）として用いるときは、組成物が生理的に有害な溶媒中に存在する場合には、乾燥させたものか、又はその乾燥物を生理的に許容できる溶媒中に溶解、懸濁又は乳化させた物を用いる。組成物の形態として、水性液などの液状物や、減圧濃縮し乾固させた固体、凍結乾燥品などの固形物を含む。
上記の方法により得られた本発明の植物種子抽出組成物は、セロトニン誘導体（例えばｐ−クマロイルセロトニン、フェルロイルセロトニン、ｐ−クマロイルセロトニン配糖体及びフェルロイルセロトニン配糖体等）の含有量が総量として多く、且つ、２−ハイドロキシアークチインの含有量が少ないことを特徴とする。ここで含有量とは、賦形剤を添加した場合には、添加した賦形剤を除いて求めた含有量を意味する。上記の方法により得られた本発明の植物種子抽出組成物のうち例えば紅花種子抽出組成物は、組成物の純度等によっても異なるが、ｐ−クマロイルセロトニン、フェルロイルセロトニン、ｐ−クマロイルセロトニン配糖体及びフェルロイルセロトニン配糖体を総量として、植物種子抽出組成物総量に対して、通常１０〜７０重量％、好ましくは２０〜５０重量％で含み、２−ハイドロキシアークチインの含有量が、植物種子抽出組成物総量に対して、通常２０重量％以下、好ましくは５重量％以下である。また、上記の方法により得られた本発明の植物種子抽出組成物のうち例えば紅花種子抽出組成物は、ｐ−クマロイルセロトニン、フェルロイルセロトニン、ｐ−クマロイルセロトニン配糖体及びフェルロイルセロトニン配糖体の含有量の総量と、２−ハイドロキシアークチインの含有量との重量比が、通常１：０．０５〜０．２であり、好ましくは１：０．０１〜０．２である。
本発明は、また、ｐ−クマロイルセロトニン、フェルロイルセロトニン、ｐ−クマロイルセロトニン配糖体及びフェルロイルセロトニン配糖体の含有量の総量と、２−ハイドロキシアークチインの含有量との重量比が、１：０．０５〜０．２であり、好ましくは１：０．０１〜０．２である新規な紅花種子抽出組成物に関する。本発明の新規な紅花種子抽出組成物は、上記した本発明の方法により好適に製造することができる。
本発明において、セロトニン誘導体の含有量は、高速液体クロマトグラフィを用いて、資生堂社製Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８カラムで含水アセトニトリルをリニアグラジエントで展開溶剤として、ＵＶ２９０ｎｍをモニターし、標準試料と比較を行い測定した値をいう。本発明において、２−ハイドロキシアークチインの含有量は、高速液体クロマトグラフィを用いて資生堂社製Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８カラムで含水アセトニトリルをリニアグラジエントで展開溶剤としてＵＶ２７９ｎｍをモニターし、標準試料と比較を行い測定した値をいう。
本発明の植物種子抽出組成物、特に紅花種子抽出組成物は、セロトニン誘導体の含有量が多いので、セロトニン誘導体の投与若しくは摂取、又は予防的な投与若しくは摂取が有効な疾患の治療又は予防、例えば動脈硬化の予防等に用いることができる。加えて、本発明の植物種子抽出組成物、特に紅花種子抽出組成物は、下痢誘起性物質である２−ハイドロキシアークチインの含有量が少ないので副作用が少ない。従って、本発明の植物種子抽出組成物、特に紅花種子抽出組成物は、動脈硬化予防剤等の医薬組成物、動脈硬化予防用等の食品、動脈硬化予防用等の飼料として極めて有用である。
本発明の植物種子抽出組成物、特に紅花種子抽出組成物は、動脈硬化を予防する結果、動脈硬化に起因する疾患、例えば狭心症、心筋梗塞、間歇性跛行、脳梗塞等の予防に有用である。
本発明の植物種子抽出組成物は、ヒト、ヒト以外の動物（例えば、ヒト以外の哺乳類（ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ等の家畜）、鳥類（シチメンチョウ、ニワトリ等の家禽）等）等に適用することが有用である。
本発明の「食品」は、食品全般を意味するが、いわゆる健康食品を含む一般食品の他、厚生労働省の保健機能食品制度に規定される特定保健用食品や栄養機能食品をも含むものであり、さらにサプリメントも包含される。
食品、飼料、医薬組成物として、本発明の植物種子抽出組成物そのものを用いることができる。また、本発明の植物種子抽出組成物を、様々な食品、例えば、ドレッシング、マヨネーズ等の一般食品（いわゆる健康食品を含む）に含有させて用いることもできる。更に、本発明の植物種子抽出組成物を、賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、デンプン等）、場合によっては、香料、色素等と共に、錠剤、丸剤、顆粒、細粒、粉末、ペレット、カプセル、溶液、乳液、懸濁液、シロップ及びトローチ等に製剤化して、特定保健用食品や栄養機能食品等の保健機能食品、サプリメント、医薬製剤（医薬組成物）（主に経口用）として用いることができる。また、本発明の植物種子抽出組成物は、飼料用途にも適用することができ、家禽や家畜等には、通常の飼料に添加して摂取又は投与することができる。
特に、医薬組成物の場合、医薬として許容できる担体（添加剤も含む）と共に製剤化することができる。医薬として許容できる担体として、当業者公知のように、例えば、賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、デンプン、Ｄ−マンニトール等）、結合剤（例えば、セルロース、ショ糖、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム等）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）、溶剤（例えば、水、食塩水、大豆油等）、保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル等）などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の植物種子抽出組成物の摂取量又は投与量は、組成物の純度、対象人の年齢、体重、健康状態、疾患の種類等によって異なるが、例えば動脈硬化予防用として、通常、成人１日当たり１０ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは、１００ｍｇ〜１０ｇを１日１回から数回にわけて摂取又は服用するのが好ましい。
本発明の方法により製造した植物種子抽出組成物は、従来から食用等として用いられてきた植物種子、特に食用油の原料の紅花の種子を用い、且つ、下痢誘起性物質の含有量が少ないため、毒性は極めて低く、副作用は殆ど認められない。
【実施例】  以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に例示するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
脱脂後の紅花種子（紅花ミール）０．１ｋｇを攪拌機付き容器にとり、水０．５Ｌを加え、温度３０℃で３０分間攪拌し、次いで内容物を室温下、遠心濾過機（２００ｇ）にかけて固形分と洗浄液分とに分離した。固形分に水０．５Ｌを加える洗浄を４回繰り返した。次いでこの洗浄済みミール０．１７ｋｇに含水エタノール（水：エタノール＝１：９重量比）溶液０．５Ｌを加え、６０℃で１時間攪拌し、内容物を遠心濾過機（２００ｇ）にかけて固形分と抽出液分とに分離し、０．５Ｌの抽出液を得た。この抽出液０．５Ｌを減圧濃縮後、真空乾燥を行い、紅花ミール抽出物２．７ｇを得た。
［実施例２］
脱脂後の紅花種子（紅花ミール）０．１ｋｇを攪拌機付き容器にとり、水０．５Ｌを加え、温度３０℃で３０分間攪拌し、次いで内容物を室温下、遠心濾過機（２００ｇ）にかけて固形分と洗浄液分とに分離した。固形分に水０．５Ｌを加える洗浄を４回繰り返した。洗浄済みミール０．１７ｋｇに含水エタノール（水：エタノール＝５：５重量比）溶液０．５Ｌを加え、６０℃で１時間攪拌し、内容物を遠心濾過機（２００ｇ）にかけて固形分と抽出液分とに分離し、０．５Ｌの抽出液を得た。この抽出液０．５Ｌを減圧濃縮後、真空乾燥を行い、紅花ミール抽出物２．４ｇを得た。
［実施例３］
脱脂後の紅花種子（紅花ミール）０．１ｋｇを攪拌機付き容器にとり、水２Ｌを加え、温度３０℃で３０分間攪拌し、次いで内容物を室温下、遠心濾過機（２００ｇ）にかけて固形分と洗浄液分とに分離した。洗浄済みミール０．１７ｋｇに含水エタノール（水：エタノール＝１：９重量比）溶液０．５Ｌを加え、６０℃で１時間攪拌し、内容物を遠心濾過機（２００ｇ）にかけて固形分と抽出液分とに分離し、０．５Ｌの抽出液を得た。この抽出液０．５Ｌを減圧濃縮後、真空乾燥を行い、紅花ミール抽出物２．４ｇを得た。
比較例１
脱脂後の紅花種子（紅花ミール）０．１ｋｇに含水エタノール（水：エタノール＝１：９重量比）溶液０．５Ｌを加え、６０℃で３時間攪拌し、内容物を吸引濾過にかけて固形分と抽出液分とに分離し、０．５Ｌの抽出液を得た。第２工程として、この抽出液０．５Ｌを減圧濃縮後、水０．１Ｌに溶解した。この水溶液０．１Ｌをヘキサン０．１Ｌを添加、洗浄した後、酢酸エチル０．１Ｌを添加し、混合後、分配を実施し、酢酸エチル層を得た。この酢酸エチル抽出液を減圧濃縮、真空乾燥を行い紅花ミール抽出物１．２ｇを得た。
［実施例４］  紅花ミール抽出物の分析及び評価
製造した各例の紅花ミール抽出物について、紅花ミール抽出物の分析を下記の方法により行い、ｐ−クマロイルセロトニン（ＣＳ）、フェルロイルセロトニン（ＦＳ）、ｐ−クマロイルセロトニン配糖体（ＣＳ−Ｇｌｃ）、フェルロイルセロトニン配糖体（ＦＳ−Ｇｌｃ）、及び、２−ハイドロキシアークチインを分析した。結果を表１〜３に示した。
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セロトニン誘導体の分析
紅花ミール抽出物５ｍｇをエタノール５０ｍｌに溶解分散した。この分散物を分析試料とした。この分析試料を下記の条件で高速液体クロマトグラフィに供して、セロトニン誘導体を分析した。尚、標準試料としてのｐ−クマロイルセロトニン、フェルロイルセロトニンはセロトニンとｔｒａｎｓ−４−クマル酸或いはｔｒａｎｓ−４−フェルラ酸との縮合で得たものを使用した。ｐ−クマロイルセロトニン配糖体、フェルロイルセロトニン配糖体はＣｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ４５巻  １９１０−１９１４（１９９７）に記載の方法で得たものを使用した。
高速液体クロマトグラフィの条件
固定相：資生堂Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８  ５μｍ
カラム径：４．６ｍｍ、カラム長：２５０ｍｍ
展開溶剤：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−４０％アセトニトリル水溶液まで、４０分間のリニアグラジエント
展開溶剤流量：１ｍｌ／分
検出器：ＵＶ（２９０ｎｍ）
２−ハイドロキシアークチインの分析
各例の紅花ミール抽出物５ｍｇをエタノール５０ｍｌに溶解分散した。この分散物を分析試料とした。この分析試料を下記の条件で高速液体クロマトグラフィに供して、２−ハイドロキシアークチインを分析した。尚、標準試料としての２−ハイドロキシアークチインはＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｏｉｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｓ’  ｓｏｃｉｅｔｙ  ３５巻５６０−５６４（１９７８）に記載の方法で得たものを使用した。
高速液体クロマトグラフィの条件
固定相：資生堂Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８  ５μｍ
カラム径：４．６ｍｍ、カラム長：２５０ｍｍ
展開溶剤：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−４０％アセトニトリル水溶液まで、４０分間のリニアグラジエント
展開溶剤流量：１ｍｌ／分
検出器：ＵＶ（２７９ｎｍ）
［実施例５］
ラット（ＳＤ（ＩＧＳ）、オス、７週齢）に紅花ミール抽出物（表１組成物、および表３組成物）を単回経口投与（０．５％カルボキシメチルセルロースに懸濁）し、投与後２４時間までの下痢、軟便の有無を糞皿上で直接確認した。結果を表４に示した。
表４から明らかなように、比較例１の水洗未実施サンプル（表３組成物）を経口投与したラットにおいては１，０００ｍｇ／ｋｇで全例に下痢が認められたが、実施例１（本発明）の水洗後抽出サンプル（表１組成物）を経口投与したラットでは、２００ｍｇ／ｋｇでは無作用、１，０００ｍｇ／ｋｇの高用量区でも下痢は２／７例にとどまり、瀉下性に改善が認められた。
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参考例１  （インビトロの抗酸化性データ）
搾油後の紅花ミール１００ｇに５００ｍｌの９０容量％エタノール水を加え、６０℃の湯浴中で３時間、加温、攪拌した後、ろ過した。ろ過後の固形分に対して同様の操作を１回行い、得られたろ過液を合一し減圧濃縮にて６０ｍｌの濃縮液を得た。濃縮液に水を加え２００ｍｌとし、内容物を懸濁した後、１２０ｍｌのｎ−ヘキサンにて２回洗浄し、洗浄後の水層を酢酸エチル１００ｍｌで２回抽出した。酢酸エチル抽出液を飽和食塩水で洗浄後、酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後減圧濃縮して固形物１．１６ｇを得た。同時に、それぞれ搾油後の、菜種ミール、大豆ミール、大豆胚芽ミール、大豆種皮についても同様な処理を加えたものを調製し、１／１０量の抽出物に１ｍｌのＤＭＳＯを加え溶解したものを試料とした。
ヒトボランティアから得た血漿（ＫＢｒにて比重＝１．２１（ｇ／ｍｌ）に調整）を不連続密度勾配遠心（４１７，０００ｘｇ，４０ｍｉｎ，４℃）（ＯｐｔｉｍａＴＬＸ；ベックマンコールター）にかけ、ＬＤＬのバンドをシリンジで採取した。ＬＤＬ画分のタンパク含量を測定し（ＢＣＡプロテインアッセイキット；ピアース）、終濃度１００μｇタンパク／ｍｌとなるようにリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で希釈したものに上記試料を１／１００量添加した後、ラジカル開始剤（Ｖ７０；２，２’−ａｚｏｂｉｓ（４−ｍｅｔｈｏｘｙ−２，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌｖａｌｅｒｏｎｉｔｒｉｌｅ））を終濃度１ｍＭ添加し、直ちに過酸化脂質中の共役ジエン構造に基づく２３４ｎｍの吸収を５時間にわたってモニターした（ＤＵ６４０；ベックマンコールター）。得られた過酸化脂質生成曲線から、近藤ら（Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．，４３：ｐｐ４３５−４４，１９９７）の方法に従ってラグタイムを計算し、コントロール（対照）区（溶媒のみ添加）の値を１００とした相対値で各試料がＬＤＬの被酸化性に及ぼす影響を評価した（図１）。いずれの試料もＬＤＬの被酸化性を多かれ少なかれ抑制（すなわち、ラグタイムを延長）する傾向が見られたが、菜種ミールと紅花ミールはとりわけ強くＬＤＬの酸化を抑制した。上記の試験で、希釈されたヒトＬＤＬと混ぜる前の段階での各試料の希釈倍率は、菜種ミール、紅花ミールは２００倍希釈、他は５０倍希釈である。
参考例２  （インビボの動脈硬化予防効果）
菜種ミール、および紅花ミールの抽出物の調製は以下のようにして行った。
搾油後の菜種ミール６００ｇに３０００ｍｌの９０容量％エタノール水を加え、６０℃の湯浴中で３時間、加温、攪拌した後、ろ過した。ろ過後の固形分に対して同様の操作を１回行い、得られたろ過液を合一し減圧濃縮にて５００ｍｌの濃縮液を得た。濃縮液に水を加え１０００ｍｌとし、内容物を懸濁した後、５００ｍｌのｎ−ヘキサンにて２回洗浄し、洗浄後の水層を酢酸エチル５００ｍｌで２回抽出した。酢酸エチル抽出液を無水硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後減圧濃縮して抽出物１２．５ｇを得た。
搾油後の紅花ミール６００ｇに対して上記と同様の操作を実施、１０．１ｇの抽出物を得た。
９週齢の雄性ａｐｏＥノックアウトマウス（ａｐｏＥ（−／−）；ジャクソンラボラトリーより購入）を１群９匹として対照／菜種（菜種ミール抽出物投与群）／紅花（紅花ミール抽出物投与群）の３群に分け、各群ごとにそれぞれ表５に示すような組成の餌を５週間自由摂取させた。２週目（ｎ＝６）と５週目（ｎ＝３）にマウスを屠殺し、大動脈起始部より大腿動脈分岐部までの大動脈を摘出し、Ｓｕｄａｎ  ＩＶで染色される血管内壁部分に形成された粥状斑（プラーク）の面積を対照群のそれと比較した。２週間の投与で菜種群、紅花群では対照群に比べてプラーク形成が抑制される傾向を示した。その後３週間延長投与された群同士の比較において上記の傾向は更に強まり（プラーク面積：紅花＜菜種＜対照）、これらの油糧植物ミール抽出物に動脈硬化の初期病変形成を抑制する効果があることが示された（図２）。
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参考例３
６〜７週齢の雄性ａｐｏＥノックアウトマウス（ジャクソンラボラトリーより購入）を１群７〜１０匹として、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）／セロトニン誘導体０．２重量％投与群（ｐ−クマロイルセロトニン（ＣＳ）、フェルロイルセロトニン（ＦＳ）各０．１％）（ＣＳ＋ＦＳ、０．２％）／セロトニン誘導体０．４重量％投与群（ｐ−クマロイルセロトニン（ＣＳ）、フェルロイルセロトニン（ＦＳ）各０．２％）（ＣＳ＋ＦＳ、０．４％）／フェルロイルセロトニン（ＦＳ）０．４重量％投与群（ＦＳ、０．４％）／紅花ミール抽出物（ＳＦＭ）１重量％投与群（ＳＦＭ、１％）の計５群に分け、各群ごとにそれぞれ表６に示すような組成の餌を１５週間自由摂取させた。なお、本参考例で使用した紅花ミール抽出物（ＳＦＭ）は、参考例２に示した方法に従い調製されたものである。投与期間終了後、マウスを屠殺し、大動脈起始部の切片を作製して脂質沈着部位（動脈硬化病変）をオイルレッド０で染色した。１個体につき３枚の切片を作製し、そのうち最も大動脈弁が明瞭に認められる標本について画像解析（ＷｉｎＲＯＯＦ（三谷商事）使用）を行い、Ｒａｊｅｎｄｒａらの方法（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，３６：ｐｐ２３２０−２３２８，１９９５）に基づいて病変面積を測定した。得られた病変面積については各群間で分散分析を行い、有意差が認められた場合にＳｃｈｅｆｆｅ検定で群間の平均値を比較した。インビトロでの抗酸化活性、抗炎症性が知られている紅花ミール中の主要なフェノール性物質であるセロトニン誘導体（Ｚｈａｎｇら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４４：ｐｐ８７４−８７６，１９９６、Ｋａｗａｓｈｉｍａら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．，１８：ｐｐ４２３−４２８，１９９８）はａｐｏＥノックアウトマウスの病変形成を部分的に抑制したが、紅花ミール抽出物（ＳＦＭ、セロトニン誘導体を１０〜３０重量％含有）はそれ以上に強く抑制することが判明した（図３）。
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【産業上の利用可能性】  以上述べたことから、本発明により提供される植物種子抽出組成物は、動脈硬化の予防に顕著に有効であることが明らかである。また、本発明の植物種子抽出組成物は天然由来の素材であることから、安全性が高く、副作用がほとんど無いので、本発明の食品、飼料、医薬組成物は、使用上の問題が無く有利である。さらに、本発明の方法は、有効成分の含有量が多く下痢誘起性物質の含有量が少ない本発明の植物種子抽出組成物を得るために有効である。
以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示された特定の態様には、本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲で様々な修正と変更をなすことは可能である。従って、そのような修正および変更も、すべて後記の請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。
本出願は、日本で出願された特願２００３−３５２８２９を基礎としており、それらの内容は本出願にすべて包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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