(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソマルチフロレノールシンターゼ活性を有し、かつ配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
請求項１記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNA。
【請求項４】
請求項２記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるDNA。
【請求項５】
配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなるDNA。
【請求項６】
配列表の配列番号１の１３０〜２４０９番目のヌクレオチド配列からなるDNA。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか一項に記載のDNAを含むベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項９】
請求項８記載の細胞を用いて、イソマルチフロレノールシンターゼの酵素活性を有するポリペプチドを製造する方法。
【請求項１０】
請求項８記載の細胞を用いてブリオノール酸を製造する方法。
【請求項１１】
前記ブリオノール酸がイソマルチフロレノールから生合成されるテルペノイドである請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はイソマルチフロレノールの生合成酵素であるイソマルチフロレノールシンターゼ、該酵素をコードするDNAおよびイソマルチフロレノールおよび／またはこのイソマルチフロレノールから生合成される各種テルペノイドを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ブリオノール酸は、トリテルペノイドに分類される植物二次代謝産物の一種で、ウリ科ヘチマ属植物のヘチマ(Luffa cylindrica Roem.)、カラスウリ属植物のキカラスウリ(Trichosanthes kirilowii var. japonica)、スイカ属植物のスイカ(Citrullus lanatus)、ブリオニア属植物のブリオニア・ディオイカ(Bryonia dioica)などウリ科植物の根に含有されていることが明らかになっている。ブリオノール酸およびその誘導体は他の植物由来のトリテルペノイドとは異なった構造を有しており、他にはない生理活性を持つことが期待されるとともに、医薬用の原料としても注目されている。
【０００３】
しかしながら、ブリオノール酸およびその誘導体を製造する場合、植物体を原料として用いる場合は、栽培に多額のコストがかかるとともに、その生産性は極めて低いものとならざるを得ない。そのため、ヘチマの細胞培養によるトリテルペノイドの生産に関する研究がなされ、ヘチマのカルスがブリオノール酸およびその誘導体を生産することを報告している[Plant and Cell Physiology 25,1571-1574(1984); Organic Magnetic Resonance 22,93-100(1984)]。
また、ブリオノール酸の生合成経路についても幾つか研究がなされており、メバロン酸経路により生成した２，３−オキシドスクワレンが環化することにより生成したイソマルチフロレノールが生合成前駆体と考えられ、生成したイソマルチフロレノールが酸化されることでブリオノール酸が生成するものと考えられる。天然には90以上の異なったタイプのトリテルペン骨格が存在すると言われており、２，３−オキシドスクワレンを環化するβ―アミリンシンターゼ、ルペオールシンターゼなど幾つかのトリテルペン合成酵素が知られている[Eur. J. Biochem. 256 ,238-244 (1998) ; Eur. J. Biochem. 266 ,302-307 (1999)]。しかし、２，３−オキシドスクワレンからブリオノール酸の前駆体であるイソマルチフロレノールの生成を触媒するイソマルチフロレノールシンターゼに関する研究はなされていなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、イソマルチフロレノールシンターゼをコードするDNAをクローン化し、その塩基配列を決定し、更にクローン化した組換えDNAを発現させた細胞を用いてイソマルチフロレノールシンターゼ、該酵素をコードするDNAおよびイソマルチフロレノールおよび／またはこのイソマルチフロレノールから生合成される各種テルペノイドを製造することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、カンゾウのβ―アミリンシンターゼcDNAをプローブとしてヘチマ培養細胞のcDNAをスクリーニングし、１種類のオキシドスクワレン環化酵素cDNAをクローニングした。本cDNAの全長のORFを酵母発現ベクターに組込み、ラノステロールシンターゼを欠く酵母に形質転換して機能解析をした結果、該酵母において本来生合成されないイソマルチフロレノールの生産が認められたことから、本cDNAがイソマルチフロレノールシンターゼをコードしていることを確認した。
【０００６】
すなわち、本発明の第１の態様は、イソマルチフロレノールシンターゼの酵素活性を有するポリペプチドおよび／または配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、第２の態様は、イソマルチフロレノールシンターゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNAおよび／または配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNAであり、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むDNAが挙げられる。本発明の第３の様態は、第１の様態に記載のDNAを含むベクターである。本発明の第４の様態は、上記ベクターで形質転換された細胞である。また、本発明の第５の様態は、上記形質転換細胞を用いて、植物二次代謝産物を製造する方法である。この植物二次代謝産物はイソマルチフロレノールから生合成されるテルペノイドであってもよい。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、ブリオノール酸の生産性が高いヘチマ培養細胞よりcDNAライブラリーを作成し、カンゾウのβ―アミリンシンターゼ(GgbAS1) cDNAをプローブとしてスクリーニングを行い、１種類のオキシドスクワレン環化酵素cDNAをクローニングした。得られたcDNAの全長ORFを酵母発現ベクター(pYES2)に組み込み、ラノステロールシンターゼを欠く酵母(GIL77)に形質転換して機能解析をした結果、本cDNAがイソマルチフロレノールシンターゼをコードしていることが確認された。新規に得られたイソマルチフロレノールシンターゼのアミノ酸配列はプローブとして用いたカンゾウのβ―アミリンシンターゼとは67％の相同性があったが、既知のクローンの中にこれ以上高い相同性のものは認められなかった。
【０００８】
本発明に係るイソマルチフロレノールシンターゼとは、２，３−オキシドスクワレンからイソマルチフロレノールを生成する反応を触媒する酵素を指しており、その起源は特に限定されないが、好ましくは植物由来であり、そのようなものとしてたとえば以下の実施例に記載のものを挙げることが出来る。
【０００９】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１  ヘチマ培養細胞株の作成および培養
ヘチマ(Luffa cylindrica)の種子を無菌処理し、無菌発芽させた実生から子葉および茎の切片を切り取り、これを2,4-Dを10-6Mとなるように添加したリンスマイヤー・スクーグ（LS）の寒天培地に移植し、27℃暗所下で培養した。5-7週間後に得られたヘチマのカルスを2,4-Dを10-7Mになるように添加したLSの液体培地に移植し、27℃、暗所にて振盪培養を行い、3年間以上継代培養を行った後、この細胞を2,4-DをNAAに変更したLSの液体培地、27℃、暗所下で継代培養を行った。
【００１０】
実施例２  cDNAライブラリーの作成
このようにして得られた培養10日目のヘチマ細胞から、グアニジンチオシアネート／ホットフェノール法により全RNAを抽出し、更にｍRNA精製キット（Pharmacia製）を用い、製造者の説明書に従ってPoly(A)+RNAを精製した。精製したPoly(A)+RNAを用い、ZAP-cDNA合成キット（Stratagene製）を用いて製造者の説明書に従ってヘチマcDNAライブラリーを作成した。
【００１１】
実施例３  プローブの作成
イソマルチフロレノールシンターゼのクローニングに用いるプローブにはG.glabra由来のGgbAS1β-アミリンシンターゼのアミノ酸残基353-729に相当する1227-bpジオキシゲニン（DIG）ラベルDNAプローブを用いた。本プローブは、GgbAS1をテンプレートとし、配列番号２および配列番号３に示す２種のプライマー、Taq DNAポリメラーゼ、DIG-dNTPミクスチャーを用いて製造者の説明書に従い、PCR法により調製した。
【００１２】
実施例４  cDNAライブラリーのスクリーニング
このようにして調製したDIGラベルプローブを用いてヘチマcDNAライブラリーを低ストリンジェンシー条件下でスクリーニングした結果、cDNAライブラリーの200,000プラークから陽性クローンを１種取得し、pBluescript SK(-)ベクターにサブクローニングした。このクローンを両ストランド共にシークエンスした結果、本クローンは2277塩基からなるオープンリーディングフレーム(ORF)を含む2551塩基からなり、分子量87.7kDの759アミノ酸からなる翻訳産物ポリペプチドが想定された。cDNA配列中には、既知のオキシドスクワレン環化酵素配列中に繰り返し認められるQWモチーフ[Trends Biochem. Sci. 19 ,157-158 (1994)]やオキシドスクワレン環化酵素の活性部位であることが指摘されているDCTAEモチーフ[J. Biol. Chem. 269 ,802-804 (1994)]が存在した。
【００１３】
実施例５  機能確認
実施例４で得られたcDNAの機能を明らかにするため、得たcDNAのORFをPCRにより増幅し、酵母での発現プラスミドpYES2(Invitrogen社)に組込んだ。PCRは得られたcDNAを鋳型とし、配列番号４と配列番号５で示される塩基配列のプライマーを用い、94℃で40秒間のディネーチャー、50℃で40秒間のアニール、72℃で２分間の伸長反応を1サイクルとし、25サイクル反応させた。得られたPCR産物は制限酵素KpnIとXbaIで処理し、発現プラスミドpYES2のKpnIとXbaIサイトに組込み、これをpYES2-LcOSC3とした。これによりLcOSC3はGAL1プロモーターの下流にセンス方向に導入される。更に得られたpYES2-LcOSC3プラスミドをラノステロール合成酵素欠損株である酵母変異株GIL77に酢酸リチウム法により導入した。培養条件、がラクトースによる発現誘導、トリテルペンモノアルコール画分の調整方法はKushiro,T. et al.文献に記載されている方法と同様に行った[Eur. J. Biochem. 256, 238-244(1998)]。ガラクトースによる発現誘導後、形質転換酵母から生成物を抽出し、TLCにより精製後、トリテルペンモノアルコール画分をLC-MS/MSにより分析した。LC-MS/MＳは以下に示すHPLC条件下、LCQ(Thermo Quest)で測定した。
（HPLC条件）
Column: SUPER-ODS(diameter: 4.6mm, length: 200mm; Tosoh製)
Solvent system: 95% CH3CN aq.、Flow rate: 1ml/min、Column temp.: 40℃、Detection: UV205nm、Retention time for isomultiflorenol: 23.9min.
標準品イソマルチフロレノールのMS/MSフラグメントパターンとの比較から、LC-MS/MSにより同定したトリテルペンモノアルコール画分から得られたピークはイソマルチフロレノールであり、本画分から得られた化合物はイソマルチフロレノールのみであった（図１）。尚、イソマルチフロレノールのMSおよびMS/MS分析の結果、MS m/z 409[M+H-H2O]+、MS/MS (precursor ion at m/z 409) 353(10%), 313(22%), 299(57%), 245(65%), 231(91%), 217(100%), 191(71%)の結果を得た。よって本cDNAは、高等植物から得られたオキシドスクワレン環化酵素の１つに位置づけられるイソマルチフロレノールシンターゼ（IMS1）をコードしているものと結論づけた。
【００１４】
ヘチマ由来の３種オキシドスクワレン環化酵素、シクロアルテノールシンターゼ（CAS1）[Plant Physiol. 121,1384 (1999)]、機能不明であるオキシドスクワレン環化酵素（OSC2）[Plant Physiol. 122,1457 (2000)]、イソマルチフロレノールシンターゼ（IMS1）のアミノ酸配列を比較した結果、IMS1のアミノ酸配列はCAS1と51％、OSC2と50％の相同性を示した（図２）。更にIMS1のアミノ酸配列と高等植物からクローン化されたオキシドスクワレン環化酵素のアミノ酸配列から系統樹を作成した（図３）。IMS1はβ−アミリンシンターゼと67-66％の相同性、ルペオールシンターゼと61-57％の相同性を示した。IMS1のアミノ酸配列は他のトリテルペンシンターゼと67-57％の低相同性であったことから、イソマルチフロレノールシンターゼはウリ科植物に認められる新しいクラスのトリテルペンシンターゼに分類される。
【００１５】
実施例６  ノーザンブロット分析
DIGラベルRNAプローブはBamHI処理CAS1、EcoRI処理OSC2、BamHI処理IMS1からT7RNAポリメラーゼおよびDIG RNA Labeling Mix (Roche Diagnostic製)を用いて製造者の説明書に従って調製した。全RNAはExtract-A-PlantTM RNA Isolation Kit (Clontech製)を用いて抽出した。レーン当たり５μgの全RNAをホルムアルデヒド含有１％アガロースゲルで分離し、正電荷ナイロンメンブラン（Roche Diagnostic製）にブロットした。メンブラン上のRNAを、50mM Na-Pi buffer(pH7.0)、50% ホルムアミド、0.1% N-ラウリルサルコシン、7% SDS、5xSSC、1mg/ml tRNA(yeast)、blocking reagentを含むハイブリダイゼーションバッファー中50℃で、DIGラベルRNAプローブを用いてハイブリダイズし、DIG Nucleic Acid Detection Kit Mix (Roche Diagnostic製)を用いて製造者の説明書に従って検出した（図４）。
【００１６】
実施例７  細胞増殖およびブリオノール酸生産のタイムコース
培養開始日後4、8、12、16、20、24日目の細胞増殖およびブリオノール酸の生産の経時変化を示した（図５）。ブリオノール酸の定性分析は以下の方法で行った。培養終了後の細胞を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥細胞50mgから酢酸エチル2mlを用いて60℃、１時間の撹拌抽出を2回行った。得られた抽出液に内部標準としてコレステロール1mgを添加し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を流去した後、乾燥サンプルをピリジン20(l、N,O-ビストリメチルシリルアセトアミド20(lからなる混合溶媒に再溶解し、50℃、１時間インキュベートした。反応後の液1(lを以下に示す条件下、ガスクロマトグラフィーにより分析し、ブリオノール酸の定量を行った。ブリオノール酸の定量は内部標準のTMSi誘導体のピーク面積から算出した。
（ガスクロマトグラフィー分析条件）
Column: Ultra Alloy+-17 capillary column (15m x 0.5mm i.d., film thickness: 1(l, Frontier Lab Ltd.製)、Column temp.: 295℃(isothermal)、 injector and detector temp.: 320℃、Carrier gas: He 3.5ml/min。
ヘチマ培養細胞によるブリオノール酸の生産は対数増殖期の後期から立ち上がる。ブリオノール酸生産のタイムコースとIMS1のmRNAレベル、CAS1のmRNAレベル、OSC2のmRNAレベルを比較した結果、ヘチマ細胞内で３種のオキシドスクワレン環化酵素のmRNAレベルは異なった制御を受けていた（図６）。イソマルチフロレノールシンターゼmRNAレベルは培養16日目、20日目で最も高く、この時点でブリオノール酸合成活性は非常に高い。ところが4、8、24日目ではイソマルチフロレノールシンターゼmRNAレベルは低く、この時点ではブリオノール酸生産はさほど顕著には認められない。一方、シクロアルテノールシンターゼmRNAレベルは4、8日目で高く、この時点では細胞の増殖が顕著に認められる。そして対数増殖期の後期ではmRNAレベルはより低いレベルとなっている。また、オキシドスクワレン環化酵素と推定されるOSC2のmRNAレベルは20、24日目で高く、この時点では細胞は既に安定期に入っている。
【００１７】
【発明の効果】
以上記載の如く、イソマルチフロレノールシンターゼをコードするDNAのクローン化に初めて成功し、更にクローン化した組換えDNAを発現させた細胞を用いてイソマルチフロレノールシンターゼ、該酵素をコードするDNAおよびイソマルチフロレノールおよび／またはこのイソマルチフロレノールから生合成される各種テルペノイドを製造することが可能である。
【００１８】
【配列表】
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0004606604.tif 000003
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【図面の簡単な説明】
【図１】標準品イソマルチフロレノールとpYES2-OSC3形質転換酵母抽出物のHPLCクロマトグラムおよびLC-MS/MSフラグメントを比較した図である。
【図２】CAS1、OSC2、IMS1のアミノ酸配列の比較した図である。相同なアミノ酸を白文字反転で示した。
【図３】高等植物由来オキシドスクワレン環化酵素のアミノ酸配列から作成した系統樹である。方法：UPGMA (Genetyx software）。bAS,β-アミリンシンターゼ；LUS,ルペオールシンターゼ；IMS,イソマルチフロレノールシンターゼ；CAS,シクロアルテノールシンターゼ；CDS,ククルビタジエノールシンターゼ；OSC,オキシドスクワレン環化酵素。
【図４】CAS1,OSC2,IMS1の制限酵素サイトおよびDIGラベルRNAプローブ部位を示す図である。
【図５】細胞増殖およびブリオノール酸生産のタイムコースを示す図である。
【図６】ヘチマ細胞培養時のIMS1 mRNA、CAS1 mRNA、OSC2 mRNA量の変化を示した電気泳動図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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