(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４又は６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
請求項１記載の遺伝子を有する発現ベクター。
【請求項３】
請求項１記載の遺伝子を導入してなる形質転換体。
【請求項４】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするニンジン由来Δ４−パルミトイルACPデサチュラーゼ遺伝子を導入したことを特徴とする請求項３記載の形質転換体。
【請求項５】
請求項１記載の遺伝子及び配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするニンジン由来Δ４−パルミトイルACPデサチュラーゼ遺伝子を導入したことを特徴とするペトロセリン酸生産能を有する形質転換植物細胞もしくは形質転換植物個体。
【請求項６】
請求項１記載の遺伝子を導入したことを特徴とする飽和脂肪酸増産能を有する形質転換植物細胞もしくは形質転換植物個体。
【請求項７】
請求項１記載の遺伝子を植物細胞に導入し、形質転換植物を作製する工程と、
上記形質転換植物から採取した組織から飽和脂肪酸を抽出する工程とを備える、飽和脂肪酸の製造方法。
【請求項８】
形質転換植物は配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするニンジン由来Δ４−パルミトイルACPデサチュラーゼ遺伝子をさらに導入したものであることを特徴とする請求項７記載の飽和脂肪酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペトロセリン酸生合成に関与する新規遺伝子、特に、ニンジン由来のΔ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子、及び植物由来のペトロセリノイル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子に関し、これら新規遺伝子を用いたペトロセリン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、樹脂材料においても、脱石油資源、循環型社会の構築の観点から、バイオマス由来の樹脂を生産する技術開発が進められている。
エンジニアリングプラスチックの一種であるナイロンは、原料としてアミノカルボン酸、またはジアミンとジカルボン酸を重合することにより合成されているが、原料モノマーのほとんどは、化学工業的に化石資源から生産されている。バイオマス由来のナイロン原料としては、セバシン酸（１，１０−Ｄｅｃａｎｅｄｉｏｉｃ  Ａｃｉｄ）が用いられており、これは、ヒマから抽出したヒマシ油を苛性アルカリにより開裂して製造され、ナイロン６，１０の原料となる。しかしながら、ナイロン６，１０の用途は限定されており、樹脂材料としては広範に利用されていない。
不飽和脂肪酸を酸化分解することにより、ジカルボン酸を製造できることが既に知られており、これまでにナイロン６，６の原料モノマーであるアジピン酸（ｈｅｘａｎｅｄｉｏｉｃ  ａｃｉｄ）の原料となるペトロセリン酸（ｃｉｓ−６−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）の製造技術が検討されてきた。（非特許文献１〜８）。
セリ科植物のコリアンダーやニンジンなどは、種子の油脂成分中に８０％以上のペトロセリン酸を含むが、種子の収量が低いためにペトロセリン酸の生産には適していない。植物の脂肪酸はプラスチド（葉緑体）中で新規合成される。ペトロセリン酸の合成は、前駆体であるパルミトイルＡＣＰがΔ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（以下、４ＤＥＳと称す）によりｃｉｓ−４−ｈｅｘａｄｅｃｅｎｏｉｌ  ＡＣＰへ変換された後に、原核型脂肪酸シンターゼ複合体によって鎖長が伸長され、ペトロセリノイル−ＡＣＰとなる。さらにこれが、ペトロセリノイル−ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、ＰＴＥと称す）により遊離のペトロセリン酸が合成されて細胞質へ移行する。ペトロセリン酸を合成する植物にはペトロセリン酸合成に特異的な一連の生合成系酵素とその遺伝子が存在すると考えられており、これらのうちコリアンダー由来のΔ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼの遺伝子がクローニングされ、元来、ペトロセリン酸を生産しない植物であるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）に遺伝子を導入した形質転換植物が作製されたが、ペトロセリン酸の蓄積は確認できたものの、その蓄積量は種子油脂中のわずか１％程度であった。
また、ＰＴＥについては、酵素活性の存在は示されているが（非特許文献８）、その遺伝子は、未だにクローニングされていない。
植物の油脂生産とその構成脂肪酸組成は、プラスチド中の脂肪酸生合成系だけでなく、細胞質内での脂肪酸誘導体の輸送、小胞体膜中でのトリアシルグリセロール合成系が関与しており、遺伝子組換え技術を用いてペトロセリン酸生産を行うためには、多くの課題を解決しなければならないと考えられる。
【特許文献１】Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  ５，４３０，１３４
【特許文献２】国際公開公報第９４／０１５６５
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１１１８４−１１１８８，１９９２
【非特許文献２】Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１７（６），６７９−６８８，１９９９
【非特許文献３】Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，３３（１／２），１５５−１６３，１９９４
【非特許文献４】Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２４，６８１−６９２，２０００
【非特許文献５】Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７，５０７−５１８，２００１
【非特許文献６】Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，４，１２−２１，２００２
【非特許文献７】Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１２１２，１３４−１３６，１９９４
【非特許文献８】Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０４，８３９−８４４，１９９４
【非特許文献９】Ｐｌａｎｔａ  ２１５：５８４−５９５  ２００２．
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、上述した実状に鑑み、ペトロセリン酸の蓄積を促進することができる新規な遺伝子、及び当該遺伝子を用いたペトロセリン酸の製造方法を提供することを目的としている。
上述した目的を達成するため本発明者が鋭意検討した結果、セリ科に属するニンジン（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ）由来のΔ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼがコリアンダー由来のΔ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼと比較してペトロセリン酸合成能に優れているといった新たな知見が得られた。また、本発明者は、ペトロセリノイル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を新規に単離することに成功し、当該遺伝子をΔ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子と併用した場合にペトロセリン酸の合成能を約２倍にさせる技術を発明した。
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、Δ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、Δ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ活性を有するタンパク質
ここで、上記（ｂ）及び（ｃ）において、Δ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ活性を有するタンパク質とは、植物培養細胞もしくは植物個体中で発現することによりｃｉｓ−４−ヘキサデセン酸（ｃｉｓ−４−Ｈｅｘａｄｅｃｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）又はペトロセリン酸（ｃｉｓ−６−オクタデセン酸（ｃｉｓ−６−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ））又はｃｉｓ−８−イコセン酸（ｃｉｓ−８−ｉｃｏｓｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）の蓄積量を増加することが可能なタンパク質と言い換えることができる。
（２）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号４又は６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号４又は６に示すアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、ペトロセリノイル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号３又は５に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、ペトロセリノイル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
ここで、上記（ｂ）及び（ｃ）において、ペトロセリノイル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質とは、植物培養細胞もしくは植物個体中でΔ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ活性を有するタンパク質と同時に発現することにより、Δ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ活性を有するタンパク質単独で発現した時より、ｃｉｓ−４−ヘキサデセン酸（ｃｉｓ−４−Ｈｅｘａｄｅｃｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）又はペトロセリン酸（ｃｉｓ−６−オクタデセン酸（ｃｉｓ−６−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ））又はｃｉｓ−８−イコセン酸（ｃｉｓ−８−ｉｃｏｓｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）量を増加することが可能なタンパク質と言い換えることができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−１９１７７５号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、各種ペトロセリノイル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列の相同性（％）を比較した図である。なお図中、ＤｃＰＴＥはニンジン（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ）由来のペトロセリノイル−ＡＣＰチオエステラーゼを意味し、ＣｓＰＴＥはコリアンダー（Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）由来のペトロセリノイル−ＡＣＰチオエステラーゼを意味し、ＡｇＰＴＥはディル（Ａｎｅｔｈｕｍ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）由来のペトロセリノイル−ＡＣＰチオエステラーゼを意味し、ＣｓＯＴＥはコリアンダー（Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）由来のオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼを意味し、ＤｃＯＴＥはニンジン（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ）由来のオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼを意味する。
図２−１は、各種ペトロセリノイル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列のアライメントを示す図である。
図２−２は、各種ペトロセリノイル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列のアライメントを示す図である。
図３は、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ）由来のΔ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（Ｄｃ４ＤＥＳと称す）のアミノ酸配列とコリアンダー（Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）由来のΔ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（Ｃｓ４ＤＥＳと称す）のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。
図４は、精製した、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ）由来のペトロセリノイル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＤｃＰＴＥと称す）、コリアンダー（Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）由来のオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＣｓＯＴＥと称す）及びニンジン（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ）由来のオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＤｃＯＴＥと称す）の大腸菌からのヒスチジン標識タンパク質溶出液について１画分づつＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す写真である。
図５は、精製したＤｃＰＴＥ、ＤｃＯＴＥのヒスチジン標識タンパク質溶出液でアシルＡＣＰを基質として反応させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す写真である。
図６は、図５に示した写真に含まれるバンドを画像解析ソフトを用いて定量化した結果を示す特性図である。
図７は、実施例で作製した常時全身発現用ベクターを模式的に示す構成図である。
図８は、実施例で作製した種子特異的発現用ベクターを模式的に示す構成図である。
図９は、形質転換植物の種子での脂肪酸組成分析結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明に係る新規遺伝子及びペトロセリン酸の製造方法を、図面を参照して詳細に説明する。
１．ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ）由来Δ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子（Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子）の取得
Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質（Ｄｃ４ＤＥＳ）をコードしている。Ｄｃ４ＤＥＳは、炭素数１６の飽和脂肪酸であるパルミトイル−ＡＣＰ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ａｃｙｌ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）におけるΔ４位を不飽和化する活性を有するタンパク質である。Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子の一例として、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を配列番号１に示す。
また、本発明においてＤｃ４ＤＥＳ遺伝子は、配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、Δ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものであっても良い。ここで、「複数のアミノ酸」とは、２〜１５０個、好ましくは２〜８０個、より好ましくは２〜４０個を意味する。欠失、置換又は付加する領域は、特に限定されないが、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列における１〜９９番目もしくは２７０〜３８６番目の領域、好ましくは１〜９９番目もしくは３０１〜３８６番目の領域、より好ましくは１〜５３番目もしくは３８１〜３８６番目の領域である。
さらにまた、本発明においてＤｃ４ＤＥＳ遺伝子は、配列番号２に表すアミノ酸配列において、５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から構成され、且つ、Δ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であっても良い。ここで、上記相同性の数値は、配列解析ソフトウェアであるＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて、例えば、マキシムマッチング法のコマンドを実行することにより求められる。その際のパラメータは、デフォルトの設定（初期設定）とする。
さらに、本発明においてＤｃ４ＤＥＳ遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、Δ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ及び５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリタイズのシグナルが観察されることを表す。
Δ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ活性とは、パルミトイル−ＡＣＰにおけるΔ４位を不飽和化する活性を意味する。当該活性の有無は、検定対象タンパク質をコードするＤＮＡ断片をタバコやシロイヌナズナ等のｃｉｓ−４−ヘキサデセン酸、ペトロセリン酸、ｃｉｓ−８−イコセン酸を蓄積しない宿主植物細胞に機能しうる形で導入し、導入した植物体の脂質中のｃｉｓ−４−ヘキサデセン酸、ペトロセリン酸、ｃｉｓ−８−イコセン酸の有無を測定することによって検定できる。例えば、Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子を恒常的発現プロモーター或いは特異的発現プロモーターの下流に、すなわち、当該プロモーターにより制御可能な位置に配してなる発現ベクターを用いて、タバコやシロイヌナズナ等のｃｉｓ−４−ヘキサデセン酸、ペトロセリン酸、ｃｉｓ−８−イコセン酸を蓄積しない植物細胞を形質転換する。作製した形質転換植物細胞もしくはこれより再生した植物体の種子の脂質を抽出する。抽出した脂質をメタノール塩酸等で処理することにより脂肪酸メチルエステルとし、これに含まれるペトロセリン酸メチルエステル量、ｃｉｓ−４−ヘキサデセン酸脂肪酸メチルエステル量、ｃｉｓ−８−イコセン酸脂肪酸メチルエステル量をガスクロマトグラフィー等で測定する。これらの脂肪酸メチルエステルが検出できれば、検定対象タンパク質はΔ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ活性を有し、これらの脂肪酸メチルエステルが検出できなければΔ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ活性を持たないといえる。
Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子は、宿主植物細胞に機能しうる形で導入することによって、当該細胞内におけるペトロセリン酸合成を促進する機能を有している。例えば、Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子を恒常的発現プロモーター或いは特異的発現プロモーターの下流に、すなわち、当該プロモーターにより制御可能な位置に配してなる発現ベクターを用いて、植物細胞を形質転換する。得られた形質転換植物を育成して植物体とすることによって、当該植物体におけるペトロセリン酸合成を促進することができる。特異的発現プロモーターとしては、種子特異的発現プロモーターを使用することが好ましい。種子特異的発現プロモーターを使用することによって、ペトロセリン酸を種子に蓄積することができる。
ペトロセリン酸は、例えば、形質転換植物を育成して植物体とした後、種子等の組織を粉砕し、塩酸−メタノール溶液と混合することによって当該組織に含まれるペトロセリン酸をメチルエステル化し、ヘキサン抽出し、ヘキサン抽出物をガスクロマトグラフ−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）装置により検出することができる。ＧＣ−ＭＳ装置による検出の結果から、ペトロセリン酸の合成促進能を解析することができる。
２．ペトロセリノイル−ＡＣＰチオエステラーゼ酵素遺伝子（ＰＴＥ遺伝子）
ＰＴＥ遺伝子は、コリアンダー（Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）において、その存在が指摘されていたものの単離及びクローニングされていなかったところ、本発明において新規に単離・クローニングされた遺伝子である。ＰＴＥ遺伝子は、ペトロセリノイル−ＡＣＰ等のΔ６位に二重結合を有するアシルＡＣＰ（ａｃｙｌ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に特異性が高いチオエステラーゼ（ＰＴＥ）をコードする遺伝子である。ＰＴＥは、遊離のペトロセリン酸の生成に関与している。
ＰＴＥ遺伝子としては、配列番号４又は６に示すアミノ酸配列を含むニンジン由来のＰＴＥをコードする遺伝子を挙げることができる。なお、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を配列番号３に示し、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を配列番号５に示す。なお、ニンジン由来のＰＴＥ遺伝子及びＰＴＥを、それぞれＤｃＰＴＥ遺伝子及びＤｃＰＴＥと称する。
本発明においてＤｃＰＴＥ遺伝子は、配列番号４又は６に示すアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、活性を有するタンパク質をコードするものであっても良い。ここで、「複数のアミノ酸」とは、２〜１８８個、好ましくは２〜６４個、より好ましくは２〜４４個を意味する。欠失、置換又は付加する領域は、特に限定されないが、例えば配列番号４に示すアミノ酸配列における１〜７０番目もしくは３１１〜３７５番目の領域、好ましくは１〜５７番目もしくは３６８〜３７５番目の領域、より好ましくは１〜３２番目の領域である。
なお、配列番号４又は６に示すアミノ酸配列に対して置換、欠失及び挿入を導入したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＰＴＥ遺伝子は、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用して、配列番号３又は５に示す塩基配列に所望の変異を導入することで取得することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて変異の導入が行われる。
さらにまた、本発明においてＤｃＰＴＥ遺伝子は、配列番号４又は６に表すアミノ酸配列において、５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から構成され、且つ、ペトロセリノイル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であっても良い。ここで、上記相同性の数値は、配列解析ソフトウェアであるＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて、例えば、マキシムマッチング法のコマンドを実行することにより求められる。その際のパラメータは、デフォルトの設定（初期設定）とする。
さらに、本発明においてＤｃＰＴＥ遺伝子は、配列番号３又は５に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、ペトロセリノイル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ及び５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリタイズのシグナルが観察されることを表す。
ペトロセリノイル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性とは、ペトロセリノイル−ＡＣＰをペトロセリン酸とＡＣＰに分解する活性を意味する。当該活性は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＤＴＴ、ペトロセリノイル−ＡＣＰと水を混合後、２５℃で５分間のプレ・インキュベーションを施し、１５μｇの検定対象タンパク質を加えた反応液１００μｌを２５℃で３０分間反応させる。反応液後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより未反応のペトロセリノイル−ＡＣＰおよび反応生成物である遊離ＡＣＰを分離する。電気泳動後のゲルをＣＢＢ染色後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより反応生成物である遊離ＡＣＰ量をデンシトメーターにより定量化することにより、添加した検定対象タンパク質のチオエステラーゼ活性を測定する。もしくは２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＤＴＴ、トリチウムでペトロセリノイル基をラベルしたペトロセリノイル−ＡＣＰと水を混合後、２５℃で５分間のプレ・インキュベーションを施し、検定対象タンパク質を加えた反応液１００μｌを２５℃で３０分間反応させる。反応後５０μｌのイソプロパノールを加え反応を停止し，その後酵素反応により生じたペトロセリン酸を薄層クロマトグラフィーで分離し、シンチレーションカウンターで生じたペトロセリン酸量を定量することにより添加した検定対象タンパク質のチオエステラーゼ活性を測定する。
また、本発明においてＰＴＥ遺伝子は、ニンジン由来のＰＴＥをコードする遺伝子に限定されず、ペトロセリン酸を生合成する植物由来のＰＴＥ遺伝子を含む意味である。ペトロセリン酸を生合成する植物として、ニンジン以外には、コリアンダー（Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ  ｓａｔｉｖｉｕｍ）、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）、ディル（Ａｎｅｔｈｕｍ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）等のセリ科植物、キヅタ（Ｈｅｄｅｒａｈｅｌｉｘ）、タラノキ（Ａｒａｌｉａｅｌａｔａ）等のウコギ科植物等を挙げることができる。
ニンジン以外の植物から、ＰＴＥ遺伝子を取得する際には、配列番号３又は５に示すＤｃＰＴＥ遺伝子の塩基配列における、例えば１８７〜１１２８番目の領域の全部または一部をプローブとして使用することができる。プローブとして長い核酸配列（＞１００ｂｐ）を使用する場合には、８０％以上の相同的配列である標的サンプルからシグナルを得るために、中高度のストリンジェンシーによってもスクリーニングすることができる。また、プローブは相当短くてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドを使用してもよいが、少なくとも約１０、好ましくは少なくとも約１５、より好ましくは２０のヌクレオチドとすべきである。短い領域をプローブに使用する場合には、より長いプローブの場合よりも高度の配列同一性が要求される。
すなわち、当該プローブ及びニンジン以外の植物から抽出したゲノムＤＮＡを用いたサザンハイブリダイゼーションを実行することによって、当該植物のゲノムＤＮＡからＰＴＥ遺伝子を単離・同定することができる。なお、ゲノムＤＮＡに代えて、当該植物から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを用いても当該植物のＰＴＥ遺伝子を単離・同定することができる。
配列番号３又は５に示すＤｃＰＴＥ遺伝子の塩基配列に基づいて、コリアンダー（Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ  ｓａｔｉｖｉｕｍ）及びディル（Ａｎｅｔｈｕｍ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）より単離したＤｃＰＴＥ相同遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号７及び９に示す。なお、配列番号７に示すコリアンダー由来のＰＴＥ遺伝子から推定されるアミノ酸配列（ＣｓＰＴＥ）を配列番号８に示し、配列番号９に示すディル由来のＰＴＥ遺伝子から推定されるアミノ酸配列（ＡｇＰＴＥ）を配列番号１０に示す。また、各種植物のチオエステラーゼにおける各タンパク質間のアミノ酸相同性（％）を、図１に示す。
図１に示すように、ＤｃＰＴＥ、ＣｓＰＴＥ及びＡｇＰＴＥを含むＰＴＥ群内においては高い相同性を示している。また、ＤｃＯＴＥ及びＣｓＯＴＥ間も高い相同性を示している。これに対して、ＰＴＥ群とＯＴＥ群の間は比較的に低い相同性を示している。従って、これらＰＴＥ群に含まれるＰＴＥタンパク質とのアミノ酸相同性が８０％を超えるような新規タンパク質は、ＰＴＥ群に含まれる蓋然性が非常に高いと言える。すなわち、本発明に係るＰＴＥ遺伝子には、配列番号４、６又は８、１０に示すアミノ酸配列との相同性が８０％を超えるようなアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡも含まれることとなる。
また、ＤｃＰＴＥ、ＣｓＰＴＥ、ＡｇＰＴＥ、ＤｃＯＴＥ、ＣｓＯＴＥのアミノ酸配列の整列図を図２に示す。ＯＴＥとＰＴＥとの間に、約３０％のアミノ酸の相違がある。その中で、ＰＴＥ群と比較してＯＴＥ群において、いくつかのアミノ酸の極性が異なっていることが示される。以下の説明において「共通配列第Ｘ（Ｘは自然数）」とは、図２におけるアライメントの上部に付した番号を意味する。ＰＴＥ群において、共通配列第１２０、１２５、３７３のアミノ酸が非極性であり、一方ＯＴＥ群においては、上記アミノ酸は極性である。また、ＰＴＥ群において、共通配列第１４０、１９５のアミノ酸が極性であり、一方ＯＴＥ群においては、上記アミノ酸は非極性である。
さらに、ＰＴＥ群に比較してＯＴＥ群において、いくつかの荷電アミノ酸が異なっていることが示される。ＰＴＥ群において、共通配列第１４９、２４６のアミノ酸が荷電を持たないアミノ酸であり、一方ＯＴＥ群においては、上記アミノ酸は陽性荷電である。また、ＰＴＥ群において、共通配列第２４４のアミノ酸が陰性荷電しており、一方、ＯＴＥ群においては、上記アミノ酸は荷電を持たないアミノ酸である。また、ＰＴＥ群において、共通配列第２７０のアミノ酸が陽性荷電しており、一方ＯＴＥ群においては、上記アミノ酸は荷電を持たないアミノ酸である。
これらの位置におけるアミノ酸の極性の有無及び荷電の変化が基質選択性の変化を導くと考えられる。さらに、基質結合部位のアミノ酸の側鎖構造の違いが基質選択性の変化を導くことが知られている。ＰＴＥ群において、共通配列第８９、１４７、１６１、１７７、１９２、１９６、２１４、２１７、２２３、２３８、２７０、２８７、３３８のアミノ酸とＯＴＥのアミノ酸では、アミノ酸の側鎖構造の違いがある。ＯＴＥ群とＰＴＥ群との間で相違するこれらのアミノ酸を置換することによりアシルＡＣＰに対する基質特異性を改変できる可能性がある。
ＰＴＥ遺伝子は、Δ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子とともに宿主植物細胞に機能しうる形で導入することによって、当該細胞内におけるペトロセリン酸合成を大幅に促進する機能を有している。
例えば、ＰＴＥ遺伝子を恒常的発現プロモーター或いは特異的発現プロモーターの下流に、すなわち、当該プロモーターにより制御可能な位置に配してなる発現ベクターを構築する。当該発現ベクターを用いて、Δ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子を形質転換してなる植物細胞（上述１．参照）に形質転換する。或いは、ＰＴＥ遺伝子及びΔ４−パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子を恒常的発現プロモーター或いは特異的発現プロモーターの下流に配してなる発現ベクターを用いて、植物細胞を形質転換しても良い。いずれの場合であっても、得られた形質転換植物を育成して植物体とすることによって、当該植物体におけるペトロセリン酸合成を促進することができる。
ペトロセリン酸は、例えば、形質転換植物を育成して植物体とした後、種子等の組織を粉砕し、塩酸−メタノール溶液と混合することによって当該組織に含まれるペトロセリン酸をメチルエステル化し、ヘキサン抽出し、ヘキサン抽出物をガスクロマトグラフ−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）装置により検出することができる。ＧＣ−ＭＳ装置による検出の結果から、ペトロセリン酸の合成促進能を解析することができる。
発現ベクター
本発明において、発現ベクターは、上記１．及び２．で説明したＤｃ４ＤＥＳ遺伝子及び／又はＰＴＥ遺伝子を有するものである。発現ベクターは、プラスミド型ベクター、又は宿主生物中のゲノムに組み込み可能な染色体導入型ベクターであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡ（ＹＡＣ：ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）などが挙げられる。
プラスミドＤＮＡとしては、例えばｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１４、ｐＲＳ４１５、ｐＲＳ４１６、ＹＣｐ５０、ｐＡＵＲ１１２又はｐＡＵＲ１２３などのＹＣｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、ｐＹＥＳ２又はＹＥｐ１３などのＹＥｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＡＵＲ１０１又はｐＡＵＲ１３５などのＹＩｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９６又はｐＴｒｃ９９ＡなどのＣｏ１Ｅ系プラスミド、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＡＣＹＣ１８４などのｐ１５Ａ系プラスミド、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ２１８又はｐＭＷ２１９などのｐＳＣ１０１系プラスミド等）、アグロバクテリウム由来のプラスミド（例えばｐＢＩ１０１等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ）、φＸ１７４、Ｍ１３ｍｐ１８又はＭ１３ｍｐ１９などが挙げられる。レトロトランスポゾンとしては、Ｔｙ因子などが挙げられる。ＹＡＣ用ベクターとしてはｐＹＡＣＣ２などが挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
発現ベクターにおいて、Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子及び／又はＰＴＥ遺伝子は、それぞれ発現可能な状態でベクターに組み込まれることが必要である。発現可能な状態とは、Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子及び／又はＰＴＥ遺伝子が導入される宿主生物において所定のプロモーターの制御下に発現されるように、これらＤｃ４ＤＥＳ遺伝子及び／又はＰＴＥ遺伝子とプロモーターとを連結してベクターに組み込むことを意味する。そこで、ベクターには、Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子及び／又はＰＴＥ遺伝子のほか、プロモーター及びターミネータ、所望によりエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子やカナマイシン耐性遺伝子やハイグロマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子などの除草剤耐性遺伝子などが挙げられる。
本発明において発現ベクターに含まれるプロモーターとしては、特に限定されないが、恒常的発現プロモーター、組織特異的発現プロモーター及び刺激誘導性プロモーター等を挙げることができる。中でも、合成されたペトロセリン酸を種子内で蓄積することを目的とする場合、種子特異的発現プロモーターを使用することが好ましい。種子特異的発現プロモーターとしては、ナタネ由来のナピンＡプロモーター、シロイヌナズナ由来のＦＡＥ１プロモーター、オレオシンプロモーター、ダイズ由来のグルテリンＢ１プロモーター、アマのステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）プロモーター等を使用することができる。
形質転換体
上述した発現ベクターを用いて形質転換体を作製することができる。すなわち、形質転換体は、上述した発現ベクターを、当該ベクターに含まれるＤｃ４ＤＥＳ遺伝子及び／又はＰＴＥ遺伝子が発現しうるように宿主に導入することによって作製することができる。宿主としては、特に限定されるものではない。例えば、セリ科、ナス科、アブラナ科、イネ科、マメ科、バラ科、キク科、ユリ科、ナデシコ科、ウリ科、ヒルガオ科、アカザ科等に属する植物が挙げられる。特にセリ科やアブラナ科の植物を宿主とすることが望ましい。
宿主が植物である場合は、形質転換植物は以下のようにして得ることができる。本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。
発現ベクターは、通常の形質転換方法、例えば、減圧浸潤法（アグロバクテリウム法）、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等によって植物中に導入することができる。
例えば、減圧浸潤法は、公知の手法（秀潤社、モデル植物の実験プロトコル、２００１、１０９−１１３ｐｐ．）に従って行うことができる。アグロバクテリウムを用いる場合は、発現ベクターを適当なアグロバクテリウム、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４株に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著，植物遺伝子操作マニュアル，１９９０，２７−３１ｐｐ，講談社サイエンティフィック，東京）等に従って宿主（例えばタバコ）の無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることもできる。
また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、３〜１２ｃｍ程度の距離で行う。
形質転換の結果として得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。
遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。
一方、宿主としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の酵母が挙げられ、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞が挙げられ、あるいはＳｆ９等の昆虫細胞が挙げられる。
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５α、Ｙ１０９０などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法［Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）］、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法［Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７５：１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｉｔｏｈ，Ｈ．：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３：１６３（１９８３）］等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
ペトロセリン酸の製造方法
上述した形質転換植物においては、導入したＤｃ４ＤＥＳ遺伝子及び／又はＰＴＥ遺伝子の機能によりペトロセリン酸合成を促進することができる。形質転換植物において合成され蓄積されたペトロセリン酸は、従来公知の手法を用いて抽出することができる。
油生産型植物の種子や果実などの植物組織から油脂を搾油する方法は圧搾法と抽出法の二つに大別される。例えばナタネの種子などの油脂含量が多い組織より油脂を得る方法は組織をロールミルなどで粗砕・圧扁して７５−８５℃に加熱した後、エキスペラーなどの圧搾機で圧搾し油脂を取り出す（圧搾法）。一方、大豆などの低油脂含量の原料に対しては、ヘキサンなどの溶媒を用いて組織より抽出する（抽出法）。これらの工程により製造される油脂は、脂肪酸（ペトロセリン酸を含む）とグリセリン等のエステルの混合物であり、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、リン脂質等が含まれている。次にこれらの油脂を加水分解することにより脂肪酸を得ることができる。得られた脂肪酸混合物を分離精製することにより純度の高いペトロセリン酸を得ることが可能である。また、油脂にメタノール等のアルコールを添加、反応することにより、ペトロセリン酸メチルエステル等のアルコールエステルを得ることができる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例によって限定的に解釈されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子のクローニング
植物試料
本実施例では、実験試料としてニンジン（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ  Ｌ．）夏播き鮮紅五寸（Ｆ１品種）を使用した。遺伝子クローニング源としては相同遺伝子の配列が同一である固定種が望ましいが、実験の都合上（早期に開花した試料が準備できた）、Ｆ１品種を使用した。ニンジン種子は太田種苗から購入した。種子を人工気象器（コイトトロン、小糸製作所社製）中で２５℃、日照１６時間、湿度６０％の条件下で栽培したニンジン植物体を試料とした。
ニンジンＲＮＡの調製
ニンジン植物体から、種子発達段階の異なる未熟種子約１００ｍｇと葉約１００ｍｇを採取し、液体窒素凍結下でそれぞれ粉砕した。得られた粉砕物から、ＱＩＡＧＥＮ製ＲＮｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔを用いてキット添付のプロトコルに従ってＲＮＡを調製した。
ＤＮＡ断片増幅用ＰＣＲプライマーの設計及びＲＴ−ＰＣＲ
ＮＣＢＩサイト内のＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）にてコリアンダー（Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ  Ｌ．）のΔ４  ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ＡＣＰ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ（Ｃｓ４ＤＥＳ）の相同遺伝子を探索して収集した後、得られたＣｓ４ＤＥＳ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ９３１１５）と、Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ上に登録されている各種植物のΔ９  ｓｔｅａｒｏｙｌ−ＡＣＰ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列をＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ  Ｖｅｒ．４．０／ＡＴＧＣ  ｖｅｒ．２．０（ソフトウェア開発社製）でマルチプルアライメント解析した。解析の結果、得られた保存性の高い領域に相当するＤＮＡ断片を増幅するために、下記のＰＣＲプライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅプライマー）を設計し、ＲＴ−ＰＣＲに使用した。
ＰＦ１：５′  ＣＡＮ  ＧＡＲ  ＧＡＲ  ＧＣＮ  ＣＴＢ  ＣＣＮ  ＣＡＮ  ＴＡ  ３′  （配列番号１１）
ＰＲ１：５′  ＴＣＶ  ＲＶＤ  ＡＧＹ  ＴＴＹ  ＴＣＮ  ＡＣＤ  ＡＴＹ  ＴＴ  ３′  （配列番号１２）
ＰＲ２：５′  ＧＣＮ  ＧＹＹ  ＫＣＲ  ＴＧＮ  ＣＫＹ  ＴＴＹ  ＴＣＲ  ＴＣ  ３′  （配列番号１３）
ＮＦ０：５′  ＧＡＮ  ＭＴＢ  ＣＣＮ  ＧＡＴ  ＧＡＮ  ＴＡＹ  ＴＴＨ  ＲＴＴ  Ｇ  ３′  （配列番号１４）
ＮＲ１：５′  ＣＣＹ  ＴＣＮ  ＳＣＮ  ＳＷＭ  ＡＧＨ  ＣＣＮ  ＧＴ  ３′  （配列番号１５）
ＮＲ２：５′  ＧＧＣ  ＡＴＮ  ＤＶＤ  ＡＹＹ  ＴＴＢ  ＷＴＹ  ＹＴＣ  ＡＴＣ  ＡＴ  ３′  （配列番号１６）
なお、これら塩基配列は、以下の各国共通混合塩基配列（ＩＵＢ）の表記法で記載している。すなわち、ＲはＡ又はＧを示し；ＹはＣ又はＴを示し；ＭはＡ又はＣを示し；ＫはＧ又はＴを示し；ＳはＧ又はＣを示し；ＷはＡ又はＴを示し；ＨはＡ又はＴ又はＣを示し；ＢはＧ又はＴ又はＣを示し；ＶはＧ又はＡ又はＣを示し；ＤはＧ又はＡ又はＴを示し；ＮはＡ又はＣ又はＧ又はＴを示す。
ＲＴ−ＰＣＲは、表１に示したＰＣＲプライマー対を用いて行った。ＲＴ−ＰＣＲにはＱＩＡＧＥＮ製Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔを使用した。反応液組成はキット添付のプロトコルに従い、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製サーマルサイクラー（マスターサイクラー・グラディエント）を用いて実施した。アニーリング温度は５０℃から７０℃（５℃毎に５段階）で行った。ＲＴ−ＰＣＲの条件は５０℃で３０分、９４℃で１５分処理した後、９４℃で１分、５０−７０℃で１分及び７２℃で１分３０秒のサイクルを４０サイクル処理し、その後、７２℃で１５分処理した。反応後は４℃を維持した。
【表１】
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ＰＣＲ後の反応液を、アガロースゲルを用いてＴＡＥバッファで電気泳動した。電気泳動後のアガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色し、目的断片を確認した。目的断片部分をゲルごとメスで切出し、ＱＩＡＧＥＮ製ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いてゲルより溶出・精製した。精製したＰＣＲ産物の塩基配列は、ＡＢＩ製ＤＮＡシークエンサー（３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて確認した。シークエンス反応は、ＡＢＩ製ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＦＳキット（ｖｅｒ．３．０）を用いた。実験手順はＡＢＩ製のマニュアルにしたがって実施した。なお塩基配列の決定には、表１記載のプライマーを用いた。
５′及び３′ＲＡＣＥ法及びＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の配列情報に基づき下記のプライマーを設計し、５′及び３′ＲＡＣＥ法に使用した。
〔５′ＲＡＣＥ用プライマー〕
Ｄ２−Ｒ２：５′  ＧＣＧ  ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＧＴ  Ｃ  ３′  （配列番号１７）
Ｄ２−Ｒ３：５′  ＧＴＴ  ＧＧＣ  ＡＴＧ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＴＧ  ３′  （配列番号１８）
〔３′ＲＡＣＥ用プライマー〕
Ｄ２−Ｆ４：５′  ＣＡＡ  ＡＴＧ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＣＡＴ  ＧＣＡ  ＡＴＧ  ３′  （配列番号１９）
Ｄ２−Ｆ５：５′  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＡＴＴ  ＧＧＡ  ＧＴＣ  ＴＡＣ  ＴＣ  ３′  （配列番号２０）
５′ＲＡＣＥ法及び３′ＲＡＣＥ法は、Ｒｏｃｈｅ製５′／３′  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔを用いて行った。また、ＰＣＲはタカラバイオ製Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎを使用して行った。反応液組成はキット添付のプロトコルに従った。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製サーマルサイクラー（マスターサイクラー・グラディエント）を使用した。アニーリング温度は５０℃から７０℃（５℃毎に５段階）で行った。ＰＣＲ条件は９４℃で１５分処理した後、９４℃で１分、５０−７０℃で１分及び７２℃で１分３０秒のサイクルを３０サイクル処理し、その後、７２℃で１５分処理した。反応後は４℃を維持した。
ＰＣＲ産物の精製及び塩基配列の決定は、上述した方法と同様に行った。
ポリペプチドコード領域増幅用ＰＣＲプライマーの設計
ＲＡＣＥ法で決定した配列情報に基づきポリペプチドコード全領域を増幅およびクローニングするために下記のプライマーを設計した。ポリペプチドコード領域増幅用ＰＣＲプライマーには植物用発現ベクターｐＢＩ１２１へ導入するための制限酵素サイト（ＢａｍＨ  ＩおよびＳａｃ  Ｉ）を付加した下記のプライマーも作成した。
４ＤＳ−Ｆ−ＯＲ１：５′  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＴＴＧ  ＡＡＣ  ＧＣＣ  ３′  （配列番号２１）
Ｂａｍ−４ＤＳ−Ｆ−ＯＲ１：５′  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＴＴＧ  ＡＡＣ  ＧＣＣ  ３′  （配列番号２２）
４ＤＳ−Ｒ−ＯＲ：５′  ＴＣＡ  ＴＡＴ  ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＧＴＴ  Ｇ  ３′  （配列番号２３）
Ｓａｃ−４ＤＳ−Ｒ−ＯＲ１：５′  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＣＧＡ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＴＣＴ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＴＧ  ３′  （配列番号２４）
これらプライマーを用いてＰＣＲを行い、ポリペプチドコード全領域を増幅した。次に、タカラバイオ製ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて、ポリペプチドコード領域のＤＮＡ断片とＴＡ−Ｃｌｏｎｉｎｇ用（ＰＣＲ産物のクローニング用）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ製ｐＳＴＢｌｕｅ１）のライゲーション（１６℃、一晩反応）を行った。ＴＯＹＯＢＯ製コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α）を付属プロトコルに従って形質転換し、ＩＰＴＧ、Ｘ−ｇａｌ、および５０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、形質転換体を選抜した。出現したコロニーを釣菌して５０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＬＢ培地で液体培養して得た菌体から、ＱＩＡＧＥＮ社製Ｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔを用いてプラスミドＤＮＡを調製した。ゲル電気泳動による挿入断片の確認を行い、目的断片がサブクローニングされたと予想されるプラスミドＤＮＡを得た。
シークエンシング用プライマーはｐＳＴＢｌｕｅ１ベクターのクローニングサイトの両端に存在するＴ７配列およびＭ１３配列を標的としたプライマー（タカラバイオ製ＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｔ７；５´  ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧ  ３´  （配列番号２５）およびＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４；５´ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＡＣＧ  ＡＣ  ３´  （配列番号２６））を使用した。本実施例で単離したＤｃ４ＤＥＳ遺伝子の塩基配列及びＤｃ４ＤＥＳのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び２に示す。
得られた塩基配列はＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ  Ｖｅｒ．４．０／ＡＴＧＣ  ｖｅｒ．２（ソフトウェア開発社製）を用いて解析・編集した。
Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子と既報のコリアンダー由来遺伝子（Ｃｓ４ＤＥＳ）との塩基配列の相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）はポリペプチドコード領域（推定）配列（Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子１１６１ｂｐ、Ｃｓ４ＤＥＳ遺伝子１１５８ｂｐ）において８８．０％であった。また、アミノ酸配列の相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）はポリペプチドコード領域推定アミノ酸配列（Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子３８６ａａ、Ｃｓ４ＤＥＳ遺伝子３８５ａａ）において９０．２％であった。Ｄｃ４ＤＥＳアミノ酸配列とＣｓ４ＤＥＳアミノ酸配列のアライメントを図３に示す。図３において、上段がＤｃ４ＤＥＳアミノ酸配列であり下段がＣｓ４ＤＥＳアミノ酸配列である。
【実施例２】
【０００７】
ＰＴＥ遺伝子の同定及びクローニング
植物試料
実施例２では、実験試料としてニンジン（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ  Ｌ．）のＦ１品種である夏播き鮮紅五寸、陽州五寸、および固定種である新黒田五寸を使用した。ニンジン種子は太田種苗から購入した。遺伝子クローニング源としては相同遺伝子の配列が同一である固定種が望ましいが、実験の都合上（早期に開花した試料が準備できた）、Ｆ１品種も使用した。また同じセリ科植物であるコリアンダー（Ｃｏｒｉａｎｌｒｕｍ  ｓａｔｉｖｉｕｍ）、ディル（Ａｎｅｔｈｕｍ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ  ｃｖ．ｍａｍｍｏｔｈ）も栽培し使用した。
人工気象器（コイトトロン；小糸製作所）中で２５℃、日照１６時間、湿度５０％で栽培した植物体を試料とした。
ＲＮＡの調製
ニンジンの葉、未熟種子、完熟種子を各１００ｍｇ程度ずつ採取し、実施例１の方法に準じてＲＮＡを調製した。
ＲＴ−ＰＣＲ増幅
ニンジンと同じセリ科植物であるコリアンダーに由来するＯＴＥ様遺伝子（ＣｓＯＴＥ）の部分ｃＤＮＡ配列（アクセッション・ナンバー，Ｌ２０９７８）についてＢＬＡＳＴサーチ（ｂｌａｓｔｎおよびｂｌａｓｔｘ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）を行い、相同性の高い遺伝子としてヒットした１７種の類似遺伝子をリスト・アップした。その推定アミノ酸配列について、さらにマルチプルアライメント解析を行い、保存性の高い領域を選んだ。さらに同じ遺伝子のＤＮＡ配列について同様にマルチプルアライメント解析を行い、アミノ酸レベルで保存性の高かった領域について近縁種のＤＮＡでのコドン使用頻度を考慮してｄｅｇｅｎｅｒａｔｅプライマーを設計しＲＴ−ＰＣＲ法に使用した。以下にその配列を示す。なお、括弧内はシロイヌナズナのｏｌｅｏｙｌ−ＡＣＰ  ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ（ＡｔＯＴＥ）を基準に相当する塩基番号を示した。
ＴＥ−ＰＦ３（５１５−５３６）：５´−ＲＴＧ  ＧＮＡ  ＣＮＭ  ＧＲＧ  ＫＲＲ  ＡＴＴ  ＧＧＡ  Ｔ−３´  （配列番号２７）
ＴＥ−ＰＦ２（４１５−４３８）：５´−ＣＴＢ  ＡＴＷ  ＴＧＧ  ＧＴＢ  ＡＣＤ  ＤＭＮ  ＭＧＮ  ＡＴＧ−３´  （配列番号２８）
ＴＥ−ＰＦ１（２３５−２５７）：５´−ＧＡＲ  ＲＡＹ  ＧＧＮ  ＹＷＮ  ＴＣＢ  ＴＡＹ  ＡＭＲ  ＧＡ−３´  （配列番号２９）
ＴＥ−ＰＲ１（８８６−９１５）：５´−ＴＧＲ  ＣＡＹ  ＴＣＮ  ＣＫＹ  ＣＫＲ  ＴＡＲ  ＴＣ−３´  （配列番号３０）
ＴＥ−ＰＲ２（７８７−８０９）：５´−ＡＣＲ  ＴＴＲ  ＴＴＮ  ＡＣＲ  ＴＧＹ  ＴＫＲ  ＴＴＣ  ＡＴ−３´  （配列番号３１）
ＴＥ−ＰＲ０（１０４１−１０６１）：５´−ＧＴＤ  ＳＫＮ  ＣＭＶ  ＣＫＲ  ＴＴＫ  ＡＫＹ  ＴＣ−３´  （配列番号３２）
具体的には、ＱＩＡＧＥＮ社製Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔを使用して上記プライマーの組み合わせ対を用いてＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。反応液組成はキット添付の標準プロトコルに従い、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製サーマルサイクラー（マスターサイクラー・グラディエント）を用いて実施した。本装置はヒートブロック上に任意の（最大１２段階の）温度勾配を設定して反応を行う事ができるので、増幅効率と特異性に重要なアニーリング温度は５０℃から７０℃（５℃毎に５段階）で行った。ＰＣＲ条件は５０℃で３０分、９４℃で１５分処理した後、９４℃で１分、５０−７０℃で１分及び７２℃で１分３０秒のサイクルを４０サイクル処理し、その後、７２℃で１５分処理した。反応後は４℃を維持した。
ＲＴ−ＰＣＲの結果、ＴＥ−ＰＦ２とＴＥ−ＰＲ１の組み合わせで特異的な増幅産物（約５００ｂｐ）が得られた。この増幅産物の塩基配列を解読し、部分配列を用いて分子系統樹解析したところ、ＯＴＥクラスターに属することが判明した。
５′及び３′ＲＡＣＥ法及びＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲの結果として得られた部分配列について再度データベースを検索し、相同性の高い遺伝子を再抽出した。その推定アミノ酸配列について、同様にマルチプルアライメント解析を行い、アミノ酸レベルで保存性の低い領域を選び出した。次にその領域についてＤＮＡでのコドン使用頻度を考慮して、目的の遺伝子の特異的増幅が可能なプライマーを設計しＲＡＣＥ法に使用した。
〔３´−ＲＡＣＥ用〕
ＴＥ−Ｄ１Ｆ：５´−ＴＡＧ  ＣＡＡ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＧＡＴ  ＧＡＴ−３´  （配列番号３３）
ＴＥ−Ｄ３Ｆ：５´−ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＡＣＡ  ＣＣ−３´  （配列番号３４）
〔５´−ＲＡＣＥ用〕
ＴＥ−Ｄ２Ｒ：５´−ＴＡＴ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＣＧＡ  ＡＣＡ  ＴＣＡ  Ｔ−３´  （配列番号３５）
ＴＥ−Ｄ１Ｒ：５´−ＡＴＣ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＴＴＧ  ＣＴＡ−３´  （配列番号３６）
ＲＡＣＥ法の結果、増幅において２種の異なる遺伝子断片が得られた。両者とも不飽和アシルＡＣＰに特異性を持つＴＥ群から成るＦａｔ  Ａクラスターに属していたが、一方は分子系統樹上において既知のＯＴＥと同じサブクラスターに属していたのに対し、もう一方は新規なサブクラスターを形成した。
なお、実施例２において塩基配列の決定および得られた塩基配列の解析・編集は実施例１と同様に行った。さらに分子系統樹解析は、国立遺伝学研究所  日本ＤＮＡデータバンクの遺伝子解析サービス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）を利用して、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラム（塩基配列・アミノ酸配列の多重整列と系統樹作成プログラム）により行った。
ＲＡＣＥ法の結果として２種の異なる遺伝子断片が得られたので、その両者の特異的増幅用プライマーも設計した。すなわち、ＲＡＣＥ法で決定した配列情報に基づきｃＤＮＡおよびポリペプチドコード領域の全長を再増幅およびクローニングするために下記のＯＴＥ遺伝子特異的増幅用プライマーおよびＰＴＥ遺伝子特異的増幅用プライマーを設計した。
〔ＯＴＥ遺伝子特異的増幅用プライマー〕
＜３´−ＲＡＣＥ用＞
ＯＴＥ−２Ｆ：５´−ＧＣＡ  ＴＴＣ  ＴＡＧ  ＧＣＴ  ＡＧＧ  ＡＴＴ  ＧＴ−３´  （配列番号３７）
ＯＴＥ−３Ｆ：５´−ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＧＴＣ  ＣＴＴ  ＴＡＴ  ＡＣＧ−３´  （配列番号３８）
＜５´−ＲＡＣＥ用＞
ＯＴＥ−ｍ１Ｒ：５´−ＧＧＣ  ＧＡＡ  ＴＣＧ  ＡＧＡ  ＴＣＧ  ＡＡＴ  ＣＴ−３´  （配列番号３９）
ＯＴＥ−ｍ２Ｒ：５´−ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＡＴＴ  ＣＡＣ  ＣＣＣ  ＡＴＴ−３´  （配列番号４０）
ＯＴＥ−ｍ３Ｒ：５´−ＣＴＣ  ＡＡＴ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴ−３´  （配列番号４１）
〔ＰＴＥ遺伝子特異的増幅用プライマー〕
＜３´−ＲＡＣＥ用＞
ＰＴＥ−２Ｆ：５´−ＣＴＴ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＧＧ  ＧＣＴ  ＴＧ−３´  （配列番号４２）
＜５´−ＲＡＣＥ用＞
ＰＴＥ−４Ｒ：５´−ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＡＡＣ  ＴＣＡ  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＣＴ  ＧＴ−３´  （配列番号４３）
ＰＴＥ−２Ｒ：５´−ＣＡＡ  ＧＣＣ  ＣＧＡ  ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＡＧ−３´  （配列番号４４）
また、ポリペプチドコード増幅用のプライマーには、植物用発現ベクターｐＢＩ１２１へ導入するための制限酵素サイト（ＢａｍＨ１およびＳａｃＩ）を付加したプライマーも作成した。
〔推定ポリペプチドコード領域用〕
ＸｂａＢａｍ−ＤｃＰＴＥ−ＯＦ：５´−ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＴＴＡ  ＴＴＧ  ＡＣＡ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＡＣ−３´  （配列番号４５）
ＤｃＰＴＥ−ＯＦ：５´−ＡＴＧ  ＴＴＡ  ＴＴＧ  ＡＣＡ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＡＣ−３´  （配列番号４６）
Ｓａｃ−ＤｃＰＴＥ−６Ｒ：５´−ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＣＧＡ  ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＡＧＴ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＡＧＴ  ＡＣＡ  ＣＴＧ−３´  （配列番号４７）
ＤｃＰＴＥ−６Ｒ：５´−ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＴＡＡ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＣＡＣ  ＴＧ−３´  （配列番号４８）
これらプライマーを用いてニンジンＲＮＡを鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲを行い、ポリペプチドコード全領域を増幅した。次に、タカラバイオ製ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて、ＰＣＲ増幅断片とＴＡ−Ｃｌｏｎｉｎｇ用（ＰＣＲ産物のクローニング用）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ製ｐＳＴＢｌｕｅ１）のライゲーション（１６℃、一晩反応）を行った。ＴＯＹＯＢＯ製コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α）を付属プロトコルに従って形質転換し、ＩＰＴＧ、Ｘ−ｇａｌ、および５０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、形質転換体を選抜した。出現したコロニーを釣菌して５０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＬＢ培地で液体培養して得た菌体から、ＱＩＡＧＥＮ社製Ｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔを用いてプラスミドＤＮＡを調製した。ゲル電気泳動による挿入断片の確認を行い、目的断片がサブクローニングされたと予想されるプラスミドＤＮＡを得た。本実施例では２種類のＤｃ４ＰＴＥ遺伝子を単離した。単離した２種類のＤｃ４ＰＴＥ遺伝子をＤｃ４ＰＴＥａ、Ｄｃ４ＰＴＥｂと名づけ、それらの塩基配列をそれぞれ配列番号３及び５に示し、２種類のＤｃ４ＰＴＥのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４及び６に示す。
以上のようにしてＤｃＰＴＥ遺伝子をクローニングした。ＤｃＰＴＥ遺伝子のクローニングと同様に、コリアンダーとディルについてもＰＴＥ遺伝子のクローニングを試みたところ、コリアンダー由来のペトロセリノイル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子（ＣｓＰＴＥ遺伝子）、ディル由来のペトロセリノイル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子（ＡｇＰＴＥ遺伝子）を単離した。それらの塩基配列をそれぞれ配列番号７及び９に示し、２種類のＤｃ４ＰＴＥのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号８及び１０に示す。次に、ＤｃＰＴＥ遺伝子によってコードされる酵素のペトロセリノイル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を検討した。具体的には、以下に示すように、大腸菌を用いてヒスチジン標識組換えタンパク質を調製し、その酵素活性の解析を行った
ヒスチジン標識タンパク質の発現コンストラクトの作製
既知のベニバナ由来ｏｌｅｏｙｌ−ＡＣＰ  ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅの知見（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１００，１７５１−１７５８，１９９４）に基づき、各遺伝子のｍａｔｕｒｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅを推定し、ｍａｔｕｒｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ発現用ＤＮＡコンストラクト中のコード領域のＮ末端として設定した。また、Ｃ末端側は停止コドンまでとした。ＤｃＰＴＥａ遺伝子については、ｍａｔｕｒｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅとして３２番目のアミノ酸をコードする塩基配列と３３番目のアミノ酸をコードする塩基配列の間を推定した。ＤｃＯＴＥ遺伝子とＣｓＯＴＥ遺伝子については、ｍａｔｕｒｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅとして５１番目のアミノ酸をコードする塩基配列と５２番目のアミノ酸をコードする塩基配列の間を推定した。
その領域をｐＳＴ  Ｂｌｕｅ１（Ｎｏｖａｇｅｎ製クローニングベクター）にクローニングしたＤｃＰＴＥａ、ＤｃＯＴＥ、ＣｓＯＴＥ  ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で増幅した。その産物をヒスチジン標識タンパク質用発現ベクターｐＱＥ−３０ＵＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）と混合し、等量のＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を加えて１６℃で３０分間ライゲーション反応を行いサブクローニングした。このベクターにサブクローニングすると、Ｎ末端に６ＸＨｉｓが付加された組換えタンパク質を大腸菌で調製できる。反応液の全量を５０μｌの大腸菌コンピテントセル（ｌａｃＩｑ変異を持つＪＭ１０９株、タカラバイオ社製）に添加し、メーカー指定のプロトコルに従って形質転換操作を行った。得られた形質転換体（５０μｇ／ｍｌアンピシリン入りＬＢ寒天培地で生育）からプラスミドを調製した。
大腸菌によるヒスチジン標識タンパク質の発現及び精製
作製したヒスチジン標識タンパク質発現ＤＮＡコンストラクトを大腸菌（ＪＭ１０９株）に形質転換し（もしくはプラスミド調製前に保存したグリセロール・ストックを利用し）、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １（メルク）と５０μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＬＢ培地で終夜培養し、発現誘導を行った。
次に、発現コンストラクトにより形質転換された大腸菌２０ｍＬを集菌し、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４ｍＬ（５０ｍＭ  リン酸水素ナトリウム、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール）と１０ｍｇ／ｍｌのリゾヂームを加えて混合、３０分氷中に静置した後、超音波破砕装置（ＴＯＭＹ社製ＵＤ−２０１）を使用し１０秒×６回の超音波処理により破砕した。
１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間の遠心分離後、あらかじめ平衡化しておいたＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に上清をシリンジで注入し、ペリスタ・ポンプ（Ｐ−１、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を使用して、キットに付属のＢｕｆｆｅｒで洗浄、溶出した。溶出は、１ｍＬづつ全量４ｍＬで分画した。
精製したＤｃＰＴＥａ、ＤｃＯＴＥ、ＣｓＯＴＥのヒスチジン標識タンパク質溶出液について１画分ずつＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリドアミド・ゲル電気泳動）を行ったところ、目的のタンパク質が精製されていることを確認した。結果を図４に示す。
図４に示した電気泳動結果から高濃度のタンパク質が溶出されている画分を選定し、それらについてＬｏｗｒｙ法（ＲＣＤＣプロテインアッセイ・キット，ＢＩＯ−ＲＡＤ）によるタンパク質濃度測定を行ったところ、それぞれ約２００μｇの組換えタンパク質が調製できた。
アシルＡＣＰの調製
基質として使用するアシルＡＣＰは以下のように調製した。先ず、脂肪酸（オレイン酸、ペトロセリン酸）のヘキサン溶液（１００ｍＭ）を調製し、６．２μｌを１０ｍｌガラス試験管に入れ、窒素ガスにより乾固した。その後、以下の表２の反応液を加え、ヒートブロック上で３７℃にて６０分間反応させた。
【表２】
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反応後、水を１２ｍｌ加えた後、酢酸でｐＨ６．０に調整した。反応液に含まれるアシルＡＣＰは以下の（Ａ）〜（Ｍ）に示す手順で精製した。
（Ａ）ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｃ（ＴＯＳＯＨ社）１．８ｍｌをポリプロピレン製  空カラム（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）に充填（１ｍｌ  ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅとする）
（Ｂ）ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．０（Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂとする）を（Ａ）の１０倍量程加え平衡化する。
（Ｃ）アシルＡＣＰ溶液（ｐＨ６．０）をカラムに添加
（Ｄ）Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ  ３ｍＬで洗浄
（Ｅ）８０％（ｗ／ｗ）Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ  ｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ  ３ｍＬで未反応の脂肪酸を洗い流す。
※ＩｓｏｐｒｏｐａｎｏｌとＢｕｆｆｅｒ  Ｂは、個々に超音波洗浄機で脱気したものを混合して使用
（Ｆ）Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ  ３ｍＬで洗浄
（Ｇ）０．６Ｍ  ＬｉＣｌ  ｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ  ５ｍｌで溶出
（Ｈ）別の空カラムにＯｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）４．５ｍｌを入れる（ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ約３ｍｌとする）
（Ｉ）（Ｈ）の１０倍量のＢｕｆｆｅｒ  Ｂで平衡化
（Ｈ，Ｉの操作は事前に行っておく）
（Ｊ）（Ｇ）の溶出液を（Ｉ）に直接溶出しアプライする
（Ｋ）１０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ６．０（Ｂｕｆｆｅｒ  Ｃとする）５ｍｌで洗浄
（Ｌ）３５％（ｗ／ｗ）Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ  ｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｃ  ６ｍＬで溶出
※ＩｓｏｐｒｏｐａｎｏｌとＢｕｆｆｅｒＣは、個々に超音波洗浄機で脱気したものを混合して使用
（Ｍ）減圧遠心濃縮機を使用し、イソプロパノールを揮発させる
精製酵素のチオエステラーゼ活性の検出
上記の操作により精製したヒスチジン標識タンパク質について、アシルＡＣＰ（オレオイルＡＣＰ、ペトロセリノイル−ＡＣＰ）を基質として使用してチオエステラーゼ活性を測定した。反応前にＬｏｗｒｙ法（ＲＣＤＣプロテインアッセイ・キット、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により両溶液のタンパク質濃度の測定を行った。
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＤＴＴ、アシルＡＣＰと水を混合後、２５℃で５分間のプレ・インキュベーション（使用するバッファ類を反応温度に馴化）を施し、１２μｇのＤｃＰＴＥ、ＤｃＯＴＥのヒスチジン標識タンパク質、対照区としてγ−グロブリンをそれぞれ加えて、反応液全量が１００μｌになるようにし、２５℃で３０分間反応させた。反応液の１０分１量（１０μｌ）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより未反応のアシルＡＣＰおよび反応生成物である遊離ＡＣＰを検出する事により、チオエステラーゼ活性を測定した。その結果を電気泳動写真として図５に示す。
また、電気泳動後のゲルをＣＢＢ染色後、高性能スキャナー（Ｐｉｃｔｒｏｓｔａｔ  ｄｉｇｉｔａｌ  ４００、富士写真工業）を用いてデジタル画像データ化し、画像解析ソフトＩｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｖｅｒ．３．０（日立製作所）でアシルＡＣＰおよび遊離ＡＣＰのバンドの濃度を定量化した。その結果を図６に示す。図６に示すように、ペトロセリノイル−ＡＣＰを基質とした場合（図６（Ｂ））にはＤｃＯＴＥよりもＤｃＰＴＥの方が明らかに高い反応性を有する事が判明した。逆に、オレオイル−ＡＣＰを基質にした場合（図６（Ａ））にはＤｃＯＴＥの反応性の方が高かった。従って、ＤｃＰＴＥはペトロセリン酸に対して特異性を持つチオエステラーゼであると結論付けることができた。
【実施例３】
【０００８】
次に、実施例１でクローニングしたＤｃ４ＤＥＳ遺伝子及び実施例２でクローニングしたＤｃＰＴＥ遺伝子を導入した形質転換植物を作製し、当該形質転換植物におけるペトロセリン酸の合成能を検討した。すなわち、Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子を単独で導入した形質転換植物、ＤｃＰＴＥ遺伝子を単独で導入した形質転換植物、並びにＤｃ４ＤＥＳ遺伝子及びＤｃＰＴＥ遺伝子を共に導入した形質転換植物を作製した。
常時全身発現用ＤＮＡコンストラクトの作成
形質転換に使用したベクターのうち、常時全身常時全身発現用ベクターを図７に示す。図７中、“Ｐｎｏｓ”はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のノパリン合成酵素プロモーターを意味し、“Ｔｎｏｓ”はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のノパリン合成酵素ターミネータを意味し、“Ｐ３５Ｓ”はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを意味し、“ＮＰＴ  ＩＩ”はネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子を意味する。
具体的には、植物用発現ベクターｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に含まれるＧＵＳ遺伝子を、Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子のｃＤＮＡ配列で置換した。
Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子のＯＲＦ領域をコードするＤＮＡ断片は、５’末端側にＢａｍＨＩ、３’末端側にＳａｃ  Ｉ配列を付加するように設計したプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅した。このＰＣＲ産物をｐＳＴＢｌｕｅ１（Ｎｏｖａｇｅｎ製クローニングベクター）と混合し、等量のＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を加えて１６℃で３０分ライゲーション反応を行った。反応液の全量を５０μｌのコンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α、ＴＯＹＯＢＯ社製）に添加し、メーカー指定のプロトコルに従って形質転換操作を行った。得られた形質転換体（５０μｇ／ｍｌカナマイシン入りＬＢ寒天培地で生育）からプラスミドを調製した。得られたプラスミドを制限酵素（Ｂａｍ  ＨＩおよびＳａｃ  Ｉ）で処理した。次にｐＢＩ１２１内のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流に連結されたＧＵＳ遺伝子を切出すために、同様に制限酵素処理（Ｂａｍ  ＨＩとＳａｃ  Ｉ）を行った。これらの制限酵素消化産物について０．８％アガロースゲル電気泳動を行いＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔおよびＧｅｎｅｃｌｅａｎ  ＩＩ（ＢＩＯ  １０１）を用いて、Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片およびｐＢＩ１２１のバックボーン（ＧＵＳ遺伝子を除去した部分）をそれぞれ分取・精製した。
ｐＢＩ１２１のバックボーン断片と挿入対象のＤＮＡ断片（Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子）との比が１：１０になる様に混合し、等量のＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて１６℃で３０分ライゲーション反応を行った。反応液の全量を１００μｌのコンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  ＤＨ５α，ＴＯＹＯＢＯ）に添加し、メーカー指定のプロトコルに従って形質転換操作を行った。５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、一晩培養した。
一方、Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子とＤｃＰＴＥ遺伝子とを共発現するためのベクター（図６（Ｄ））は、図６（Ａ）に示したＤｃ４ＤＥＳ発現用の発現ベクター中のＴ−ＤＮＡのＬＢ付近にあるユニークなＥｃｏ  ＲＩサイトおよびＤｒａ  ＩＩＩサイト間に、ＤｃＰＴＥ遺伝子の発現ユニット（プロモーター及びターミネータを含むＤＮＡ断片）を挿入することで作製した。ＤｃＰＴＥ遺伝子の発現ユニットは、両端にＥｃｏ  ＲＩサイトおよびＤｒａ  ＩＩＩサイトを付加するように設計したプライマーを用いたＰＣＲ法で増幅した。
種子特異的発現用コンストラクトの作製
形質転換に使用したベクターのうち、種子特異的発現用ベクターを図８（Ａ）〜（Ｄ）に示す。図８（Ａ）〜（Ｄ）中、“Ｐｎａｐ”はナタネ（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｃｖ．Ｋｉｚａｋｉｎｏｎａｔａｎｅ）由来ナピンＡプロモーターを意味する。当該プロモーターは、モンサント社がナタネ油脂含量の制御に用いていることで知られる。
具体的には、図７に示したベクターにおけるＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを、ナタネ由来のナピンＡプロモーターで置換することによって種子特異的発現用ベクターを作製した。また、ＧＵＳ遺伝子を、Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子、ＤｃＰＴＥ遺伝子又はＣｓ４ＤＥＳのｃＤＮＡ配列で置換した。
一方、Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子とＤｃＰＴＥ遺伝子とを共発現するためのベクター（図８（Ｄ））は、図８（Ａ）に示したＤｃ４ＤＥＳ発現用の発現ベクター中のＴ−ＤＮＡのＬＢ付近にあるユニークなＥｃｏ  ＲＩサイトおよびＤｒａ  ＩＩＩサイト間に、ＤｃＰＴＥ遺伝子の発現ユニット（プロモーター及びターミネータを含むＤＮＡ断片）を挿入することで作製した。ＤｃＰＴＥ遺伝子の発現ユニットは、両端にＥｃｏ  ＲＩサイトおよびＤｒａ  ＩＩＩサイトを付加するように設計したプライマーを用いたＰＣＲ法で増幅した。
エレクトロポレーション法によるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの遺伝子導入
作製したプラスミドを用いてアグロバクテリウムのエレクトロポレーション（電気穿孔）法による形質転換を行った。常法により調製されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＬＢＡ４４０４株）のコンピテントセル４０μｌを溶かし、ＤＮＡ溶液を５μｌ（２５μｇ）添加し、氷上で１〜２分間静置した。続いて、氷冷したＢＩＯ−ＲＡＤ社製キュベット（０．２ｃｍ）に入れ、島津製作所製遺伝子導入装置を用いて１．２５ｋＶ、１０μＦのパルス電流を印加した。直ちに冷却したＳＯＣ培地を４６０μｌ加え、２８℃で１時間培養した。５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび５０μｇ／ｍｌリファンピシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、一晩培養して形質転換体を選抜した。出現した形質転換コロニーについてｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎを行った後に、コロニーを複数個釣菌し、ＰＣＲ法により目的のプラスミドＤＮＡの存在を確認した。
減圧浸潤法によるシロイヌナズナ形質転換体の作製
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｅｔ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ）を、減圧浸潤法によって形質転換した。減圧浸潤法は、秀潤社、モデル植物の実験プロトコル、２００１、１０９−１１３ｐｐ．に従って実行した。
次に、減圧浸潤を行ったシロイヌナズナを栽培し、採取した種子を形質転換第一世代種子（Ｔ１種子）とした。ただし、これらは便宜上、形質転換世代種子として扱うが、本種子集団のすべての種子が形質転換されている訳ではない。
次に、形質転換第一世代種子をカナマイシン入り培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ基本培地に、０．５ｇ／Ｌ  ＭＥＳ、１０ｇ／Ｌ  ｓｕｃｒｏｓｅ、８ｇ／Ｌ  Ａｇａｒ、１００ｍｇ／Ｌ  ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、５０ｍｇ／Ｌ  ｋａｎａｍｙｃｉｎを添加したもの）に播種し、明条件で発芽させた。１〜２週間程度育成し、形質転換された個体（カナマイシン耐性を有しており正常に生育）を選抜した。本葉が正常に展開した個体を再度同じ培地に移植し、１〜２週間程度育成して再選抜を行った。得られた系統を形質転換第一世代植物体（Ｔ１植物）とした。カナマイシン耐性系統を滅菌していないバーミキュライトに移植し、非滅菌環境へ馴化させて栽培を行った。
次に、形質転換第一世代植物体より約１００ｍｇのロゼット葉を採取し、液体窒素凍結下で粉砕した。ＱＩＡＧＥＮ製ＤＮＡ調製キット（ＤＮｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ）を用いてキット添付の標準プロトコルに従ってＤＮＡを調製した。Ｔ−ＤＮＡ内の薬剤耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）および導入した脂肪酸合成系の遺伝子を標的としたＰＣＲプライマーを用いてタカラバイオ製Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用してＰＣＲ増幅を行った。
得られたＰＣＲ増幅産物断片について、０．８％アガロースゲルを用いてＴＡＥバッファで電気泳動後、エチジウムブロマイド染色を行い、目的断片の増幅を確認した。増幅の有無によって遺伝子導入の有無を判定した。
次に、前述したＴ−ＤＮＡ導入が確認された系統を引き続き栽培し、採取した種子を形質転換第二世代種子（Ｔ２種子）とした。各コンストラクトにつき１５系統以上のＴ２種子を収穫し、以下の脂肪酸組成解析に用いた。
シロイヌナズナ種子用脂肪酸組成分析プロトコル
種子中の脂肪酸組成の分析を行うために、種子脂肪酸を塩酸−メタノールでメチル・エステル化し、そのｎ−ヘキサン抽出物をＧＣ−ＭＳで解析した。なお、試料の酸化防止剤としてＢＨＴ（Ｂｕｔｙｌａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅ）を添加した。また内部標準として植物油中に含まれないｐｅｎｔａｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（Ｃ１５：０）のメチルエステル（ＳＩＧＭＡ）のメタノール溶液を秤量後の種子に直接添加し、分析用試料調製時の実験誤差の補正に使用した。
抽出に用いるｎ−ヘキサンはフタル酸エステル分析用グレードのｎ−ヘキサン（東京化成）を使用した。これにより、ＧＣ解析中に脂肪酸と同様の挙動を示すフタル酸エステルの影響を排除することができる。
定性分析用のプロトコルを表３に、定量分析用のプロトコルを表４に示す。
【表３】
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【表４】
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上記プロトコルに従った処理によって得られたスペクトルは、表５の条件で解析した。この条件は、二重結合位置による位置異性体であるオレイン酸（Ｃ１８：１，Δ９）およびペトロセリン酸（Ｃ１８：１，Δ６）をＧＣで分離して解析できる条件である。
【表５】
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ＧＣ−ＭＳシステムの質量検出器のＴｏｔａｌ  Ｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍにおける各ピークの積分値を内部標準および分子量で割算した値を算出し、その和を全脂肪酸料として、全脂肪酸中のモル分率（ｍｏｌ−％）で各脂肪酸の組成を示した。なお、質量分析器で検出されるフラグメント強度は物質によって異なり、分子量を単純に反映しない事が知られているが、同一条件で分析した際の再現性・定量性は非常に高く、相対的な比較は十分に可能である。
解析結果１
本発明で取得したＤｃ４ＤＥＳ遺伝子のペトロセリン酸生産に対する効果を調べるために、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にＤｃ４ＤＥＳ遺伝子を発現するｐＢ−４ＤＥＳコンストラクトを用いて常時全身発現型の形質転換植物を作製した。この形質転換植物から葉を採取し、油脂成分を抽出して上述の方法により脂肪酸組成分析をおこなった。なお、脂肪酸成分としては、ペトロセリン酸および、ペトロセリン酸の前駆体であるｃｉｓ−４−ヘキサデセン酸（１６：１Δ４）について解析を行った。これらモノエン不飽和脂肪酸の分析結果を表６に示す。
【表６】
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その結果、野生型のシロイヌナズナでは合成されないペトロセリン酸がｐＢ−Ｄｃ４ＤＥＳを導入した形質転換体の葉中では全脂肪酸の７．６７ｗｔ％が蓄積していた。すなわち、ニンジン由来のＤｃ４ＤＥＳ遺伝子を用いることにより植物細胞中で効率的にペトロセリン酸を生産することが可能であることが示された（表６）。また、既に報告されているタバコの培養細胞にコリアンダー由来のＣｓ４ＤＥＳ遺伝子を導入した場合のペトロセリン酸含量が２．７ｗｔ％であることから（特許文献１）、ペトロセリン酸の合成・蓄積において、コリアンダー由来のＣｓ４ＤＥＳ遺伝子よりもニンジン由来のＤｃ４ＤＥＳ遺伝子の機能が優れていることが判明した。
解析結果２
種子特異的に発現するナタネのナピンプロモーターを用いて種子特異的にＤｃ４ＤＥＳ遺伝子、Ｃｓ４ＤＥＳ遺伝子、ＤｃＰＴＥ遺伝子を発現する形質転換植物を作製し、これらの種子から油脂成分を抽出して上述の方法により脂肪酸組成分析をおこなった。モノエン不飽和脂肪酸の分析結果を表７に示す。なお、表７中“ＮＴ”はｎｏｔ  ｔｅｓｔｅｄの略である。
【表７】
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その結果、ｐＮ−Ｃｓ４ＤＥＳを導入した形質転換体の種子において０．８１ｍｏｌ％のペトロセリン酸が蓄積していた。これに対し、ｐＮ−Ｄｃ４ＤＥＳを導入した形質転換体の種子に蓄積しているペトロセリン酸は０．８９ｍｏｌ％であり、種子中でのペトロセリン酸の合成・蓄積においてもコリアンダー由来のＣｓ４ＤＥＳ遺伝子よりもニンジン由来のＤｃ４ＤＥＳ遺伝子の機能が優れていた。
ｐＮ−Ｄｃ４ＤＥＳ−ＤｃＰＴＥを導入した形質転換体の場合は、１．８３ｍｏｌ％のペトロセリン酸が蓄積していた。すなわち、Ｃｓ４ＤＥＳ遺伝子のみを導入した場合と比較して、ペトロセリン酸の蓄積量が２２６％に増加しており、ペトロセリノイル−ＡＣＰに高い基質特異性を持つＤｃＰＴＥを導入することによりペトロセリン酸の生産が促進された。すなわち、Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子とＤｃＰＴＥ遺伝子とを共発現することにより、Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子を単独で発現させた場合に比較して遥かに高いペトロセリン酸蓄積量を示す効果がある事が判明した。また、従来技術であるコリアンダー由来Ｃｓ４ＤＥＳ遺伝子を単独で用いた場合と比較すると、２倍以上に近い値が得られた。これまでに４ＤＥＳ遺伝子と共発現させることによってペトロセリン酸蓄積量を高めることを可能にするペトロセリン酸生合成系遺伝子は全く知られておらず、これは世界初の発見である。
また、表６に示すように、Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子を発現で発現させるか、もしくはＤｃ４ＤＥＳ遺伝子及びＤｃＰＴＥ遺伝子を共発現させることにより、ペトロセリン酸のみならず、ｃｉｓ−８−イコセン酸の生産が可能であることを発見した。また、Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子及びＤｃＰＴＥ遺伝子を共発現させた場合には、Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子を単独で発現させた場合と比較してｃｉｓ−８−イコセン酸の生産量を増加できることが確認できた。なお、ｃｉｓ−８−イコセン酸はこれまでに植物での生産例はない。
解析結果３
さらに、Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子またはＤｃＰＴＥ遺伝子を単独で発現させた形質転換植物と、Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子及びＤｃＰＴＥ遺伝子を共発現させた形質転換植物における、飽和脂肪酸を含む各脂肪酸組成の分析をおこなった。
その結果、野生株とＣｓ４ＤＥＳ遺伝子、Ｄｃ４ＤＥＳ遺伝子導入形質転換植物に対して、ＤｃＰＴＥ遺伝子を単独で、あるいはＤｃＰＴＥ遺伝子とＤｃ４ＤＥＳ遺伝子を共発現させた形質転換体では種子中の飽和脂肪酸含量が有意に増加している事が判明した（図９）。ＤｃＰＴＥ遺伝子を導入した植物種子中のステアリン酸（Ｃ１８：０）、イコサン酸（Ｃ２０：０）、ドコサン酸（Ｃ２２：０）の含量は、ＤｃＰＴＥ遺伝子を導入していない植物種子中含量の２倍近くに達していた。ＤｃＰＴＥ遺伝子は、推定アミノ酸配列に基づく分子系統樹解析から、不飽和脂肪酸−ＡＣＰに特異性を有するＦａｔ  Ａと呼ばれる群のチオエステラーゼ遺伝子として分類されている。また、実施例２に示すようにペテロセリノイルＡＣＰに基質特異性を示すとの結果から、不飽和脂肪酸含量を高める効果は予期できるものの、飽和脂肪酸の増産効果は予想し難いことから、ＤｃＰＴＥ遺伝子は当業者の予測できない格別顕著な効果を有する遺伝子であることが判明した。
植物由来脂肪酸を酸化分解することによってナイロン原料（ジカルボン酸）を製造する場合に、ＤｃＰＴＥ遺伝子の持つ「ペトロセリン酸蓄積促進効果に加えてＣ１８以上の飽和脂肪酸含量を高める効果」は非常に有利な性質となると考えられる。すなわち、飽和脂肪酸含量を増加により、相対的にペトロセリン酸以外の不飽和脂肪酸（酸化分解されるので不純物生成の原因となる）含量を下げることとなる。また、この効果はＤｃ４ＤＥＳ遺伝子等の他の遺伝子と併用しなくても単独で得られるので、樹脂原料製造を目的としたペトロセリン酸蓄積以外の用途（飽和脂肪酸生産等）へも応用することができる。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明によれば、ペトロセリン酸の製造においてその合成量を増加させるために用いる新規遺伝子を提供することができ、当該遺伝子を用いた新規なペトロセリン酸の製造方法を提供することができる。本発明に係るペトロセリン酸の製造に関与する遺伝子を用いれば、例えば植物種子内に多量にペトロセリン酸を蓄積することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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