(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３５の配列またはその相補鎖からなる精製または単離された核酸。
【請求項２】
請求項１の核酸を含むベクター。
【請求項３】
請求項１の核酸を含む細胞。
【請求項４】
免疫原製剤の製造方法であって、
リバビリンを提供すること、
配列番号３５の核酸を提供すること、および
前記免疫原製剤を調合するために前記リバビリンおよび前記核酸を混合すること
を包含する方法。
【請求項５】
免疫原製剤の製造方法であって、
リバビリンを提供すること、
配列番号３５の核酸を含む核酸を提供すること、および
前記免疫原製剤を調合するために前記リバビリンおよび前記核酸を混合すること
を包含する方法。
【請求項６】
改良型Ｃ型肝炎ウイルス免疫原製剤であって、配列番号３５の配列からなる核酸を包含する免疫原製剤。
【請求項７】
抗ＨＣＶウイルス組成物を調製するための請求項１の核酸の使用。
【請求項８】
請求項１の核酸を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明の態様は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化された新規のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ３／４Ａ遺伝子の作製に関する。実施形態は、コドン最適化ＮＳ３／４Ａ遺伝子、上記核酸によりコードされるＨＣＶペプチド、上記ＨＣＶペプチドをコードする核酸、上記ペプチドに対する抗体、上記核酸およびペプチドを含有する組成物、ならびに上記組成物の製造および使用方法、例えばＨＣＶ感染の治療および予防のための診断および薬剤（これらに限定されない）を包含する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスは、複製および増殖のために宿主細胞の生化学的機構を必要とする細胞内寄生体である。ウイルス粒子は全て、ウイルス構造タンパク質および酵素をコードする何らかの遺伝情報を含有する。遺伝物質は、二本鎖または一本鎖形態のＤＮＡまたはＲＮＡであり得る（Virology, Fields ed., third edition, Lippencott-Raven publishers, pp 72-83 (1996)）。ウイルス核酸は、キャプシドと呼ばれるタンパク質の被膜に取り囲まれる（同上）。いくつかのウイルスでは、キャプシドは、エンベロープと呼ばれる脂質膜から成る付加的層により取り囲まれる（同上、８３〜９５）。
【０００３】
典型的ウイルス生活環は、細胞表面受容体へのウイルス粒子の付着およびウイルスキャプシドのインターナリゼーションによる宿主細胞の感染に伴って開始する（同上、１０３）。したがって、ウイルスの宿主域は適切な細胞表面レセプターを発現する細胞に制限される。一旦インターナライズされると、ウイルス粒子はばらばらにされ、その核酸は転写され、翻訳され、または複製される（同上）。この時点で、ウイルスは溶菌的複製を受け得るが、この場合、新しいウイルス粒子が生成され、感染細胞から放出される（同上、１０５〜１１）。インフルエンザウイルスは、宿主細胞の感染時に直ちに溶菌的複製を受けるウイルスの典型的例である（同上、１３６９〜８５）。
【０００４】
あるいはウイルスは、溶原期として言及される潜伏期に入り得るが、ここでは、ゲノムは複製されるが、しかしウイルスタンパク質は実質的に殆ど発現せず、また、ウイルス粒子は形成されない（同上、２１９〜２９）。ヘルペスウイルス、例えばエプスタイン・バーウイルスは、宿主細胞中で潜伏感染を確立するウイルスの典型的例である（同上、２２９〜３４）。結局、ウイルスが伝播するためには、それは溶原期を抜け出して、溶解期に入らねばならない。溶解期中に放出されるウイルス粒子は、同一個体の他の細胞に感染するか、あるいは別の個体に伝染され得るが、この場合は新規の感染が確立される。
【０００５】
ウイルス生活環は細胞内および細胞外期の両方を含むため、ウイルス感染と闘うためには、体液性および細胞媒介性免疫防御系の両方が重要である（同上、４６７〜７３）。ウイルスタンパク質に対する抗体は、細胞受容体とのウイルス粒子の相互作用を遮断するか、そうでなければ、インターナリゼーションまたは放出プロセスを妨害し得る（同上、４７１）。ウイルス生活環を妨害し得る抗体は、中和抗体と呼ばれる。
【０００６】
細胞内複製中に、宿主細胞に対して異物であるウイルスタンパク質が産生され、これらのタンパク質のあるものは、感染細胞の表面に提示される主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子とのカップリング後に細胞プロテアーゼにより消化される（同上、３５０〜５８）。したがって感染細胞は、Ｔリンパ球、マクロファージまたはＮＫ細胞により認識され、ウイルスが複製し、隣接細胞に伝播する前に抹殺される（同上、４６８〜７０）。さらに、特に二本鎖ＲＮＡとしてのウイルス核酸の存在は、感染細胞の翻訳機構を止め、そしてイ
ンターフェロンとして既知である抗ウイルスシグナル伝達分子の産生を誘発する（同上、３７６〜７９）。
【０００７】
しかしながらウイルスは、宿主の免疫防御系をすり抜ける種々の手段を進化させてきた。例えば潜伏期（すなわち溶原期）を確立することにより、ウイルスは溶解期に入らず、体液性免疫防御系を回避する（同上、２２４）。潜伏期中、ウイルスタンパク質はほとんど産生されず、感染細胞は、それらの感染状態の形跡を周囲リンパ球およびマクロファージに示すことは殆どできない（同上、２２５〜２６）。さらにいくつかのウイルスタンパク質、最も顕著には潜伏期中に産生されるものは、細胞媒介性免疫防御系に効率的に提示され得ないポリペプチド配列を進化させている（Levitskaya et al., Nature 375: 685-88 (1995)）。最後に、いくつかのウイルスは、例えばＭＨＣ分子の表面発現を防止することにより（Fruh et al., J. Mol. Med. 75: 18-27 (1997)）、あるいはインターフェロンシグナル伝達を撹乱することにより（Fortunato et al., Trends Microbiol. 8: 111-19 (2000)）、感染宿主の免疫応答を積極的に妨げ得る。
【０００８】
特に回避的なのは、一科としては分類されていないが、肝臓の細胞に感染する能力に基づいて分類される肝炎ウイルスである。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、フラビウイルス科の一本鎖ＲＮＡウイルスに属する（Virology, 上記、pp 945-51）。ＨＣＶゲノムは約９．６ｋｂ長であり、少なくとも１０のポリペプチドをコードする（Kato, Microb. Comp. Genomics, 5: 129-151 (2000)）。ゲノムＲＮＡはある単一ポリタンパク質に翻訳され、これはその後、ウイルスおよび細胞プロテアーゼにより切断されて、機能性ポリペプチドを産生する（同上）。ポリタンパク質は、３つの構造タンパク質（コアタンパク質、Ｅ１およびＥ２）に、未知の機能を有するｐ７に、そして６つの非構造（ＮＳ）タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ／Ｂ、ＮＳ５Ａ／Ｂ）に切断される（同上）。ＮＳ３は、ウイルス成熟に必要とされるタンパク質分解事象のいくつかに関与するセリンプロテアーゼをコードし（Kwong et al., Antiviral Res., 41: 67-84 (1999)）、そしてＮＳ４ＡはＮＳ３プロテアーゼに関するコファクターとして作用する（同上）。ＮＳ３はさらにＮＴＰアーゼ活性を示し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡヘリカーゼ活性を保有する（Kwong, et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 242: 171-96 (2000)）。
【０００９】
ＨＣＶ感染は、典型的には急性期から慢性期に進行する（Virology、上記、pp 1041-47）。急性感染は、肝臓組織および末梢血中での高ウイルス複製および高ウイルス量により特徴付けられる（同上、1041-42）。急性感染は、感染個体の約１５％において患者の免疫防御系により取り除かれ、他の８５％では、ウイルスは慢性持続性感染を確立する（Lawrence, Adv. Intern. Med., 45: 65-105 (2000)）。慢性期中、複製は肝臓で起こり、そしていくつかのウイルスは末梢血中で検出され得る（Virology、上記、pp 1042）。
【００１０】
持続性感染の確立に不可欠であるのは、宿主の免疫防御系をすり抜けるための戦略の進化である。一本鎖ＲＮＡウイルスとしてのＨＣＶは、そのゲノムの複製および転写において高突然変異率を示す（同上、1046）。したがって溶解期中に産生される抗体は慢性感染中に産生されるウイルス株をめったに不活化しない、ということが注目された（同上）。ＨＣＶはＭＨＣ−１分子における抗原のプロセシングおよび提示を妨害していないと思われるが、しかしウイルスＮＳ５Ａタンパク質はＰＫＲプロテインキナーゼの抑制によりインターフェロンシグナル伝達の抑制に関与し得る（Tan et al., Virology, 284: 1-12 (2001)）。
【００１１】
感染宿主は、ＨＣＶウイルスに対する体液性および細胞性免疫応答の両方を備えるが、しかしほとんどの場合、応答は慢性疾患の確立を防止できない。急性期後、感染患者は抗ウイルス抗体、例えばエンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２に対する中和抗体を産生する（同上、1045）。この抗体応答は、慢性感染中、持続される（同上）。慢性感染患者で
は、肝臓もＣＤ８＋およびＣＤ４＋リンパ球の両方に浸潤される（同上、1044-45）。さらに感染患者は、ウイルス感染に対する早期応答としてインターフェロンを産生する（同上、1045）。感染に対する初期免疫応答の活力が、ウイルスが除去されるか否か、あるいは感染が慢性期に進行するか否かを決定する、と思われる（Pape et al., J. Viral. Hepat., 6 Supp. 1: 36-40 (1999)）。その他の努力にもかかわらず、ＨＣＶ感染の予防および治療のための効果的な免疫原および薬剤に対する必要性は明白である。
【発明の開示】
【００１２】
新規のＨＣＶ単離物が発見された。ＨＣＶゲノムの新規ＮＳ３／４Ａ断片が、ＨＣＶに感染した患者からクローニングされ、シーケンシングされた（配列番号１）。この配列は、最も密接に関連するＨＣＶ配列と９３％相同であるに過ぎないことが判明した。実施形態は、このペプチド（配列番号２）またはその断片であって配列番号２のうちの少なくとも３〜５０の間の任意数の連続したアミノ酸（例えば３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個連続したアミノ酸）を含有する断片、これらの分子をコードする核酸、上記核酸を有するベクター、ならびに上記ベクター、核酸またはペプチドを有する細胞を含み、それらから成り、または本質的にそれらから成る。ＮＳ３／４Ａ核酸、その断片および対応するペプチドは、免疫原性であることが判明した。したがって、好ましい実施形態は、配列番号２のＨＣＶペプチド、またはその断片であって配列番号２のうちの少なくとも３〜５０の間の任意数の連続したアミノ酸（例えば３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個連続したアミノ酸）を含有する断片（例えば配列番号１４および１５）、あるいは上記ペプチドまたは断片をコードする核酸を含み、それらから成り、または本質的にそれらから成るワクチン組成物および免疫原製剤を包含する。
【００１３】
ＮＳ３／４Ａペプチドの突然変異体も作製され、そして免疫原性であることが判明した。いくつかの突然変異体は、ＮＳ３／４Ａペプチドの短縮（truncated）バージョンであり（例えば配列番号１２および１３）、そして他のものはタンパク質分解性開裂部位を欠く（例えば配列番号３〜１１）。これらのペプチド（例えば配列番号３〜１３）およびその断片であって配列番号３〜１３のいずれか１つのうちの少なくとも３〜５０の間の任意数の連続したアミノ酸（例えば３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個連続したアミノ酸）を含有する断片（例えば配列番号１５〜２６）、これらの分子をコードする核酸、上記核酸を有するベクター、ならびに上記ベクター、核酸またはペプチドを有する細胞は、本発明の実施形態である。特に好ましい実施形態は、配列番号３〜１１のうち少なくとも１つのＨＣＶペプチド、またはその断片であって配列番号３〜１１のいずれか１つのうちの少なくとも３〜５０の間の任意数の連続したアミノ酸（例えば３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個連続したアミノ酸）を含有する断片（例えば配列番号１６〜２６）、あるいは上記ペプチドまたは断片をコードする核酸を含み、それらから成り、または本質的にそれらから成るワクチン組成物または免疫原製剤である。
【００１４】
付加的実施形態としては、ヒトにおいて最も頻繁に用いられるコドンに関して最適化された配列を含むＮＳ３／４Ａコード核酸または対応するペプチドが挙げられる。コドン最適化ＮＳ３／４Ａ（ｃｏＮＳ３／４Ａ）核酸配列の核酸配列は、配列番号３５で提供されるが、一方、上記核酸配列によりコードされるペプチドは配列番号３６で提供される。この核酸および対応するＮＳ３／４Ａペプチドは、いかなる既知のＨＣＶ配列またはゲノムとも対応しない。コドン最適化ＮＳ３／４Ａコード核酸は、ヌクレオチド位置３４１７〜５４７５の領域内で、ＨＣＶ−１と７９％相同であるに過ぎないことが判明し、総計４３３の異なるヌクレオチドを含有した。コドン最適化核酸配列によりコードされるＮＳ３／４Ａペプチドは、ＨＣＶ−１と９８％相同であるに過ぎず、総計１５の異なるアミノ酸を含有した。コドン最適化核酸は、体液性および細胞性応答に関して、ネイティブＮＳ３／
４Ａ遺伝子と比較して、より高い発現レベルのＮＳ３を生成することが判明し、そしてより免疫原性であることが判明した。
【００１５】
ヒトＨｅｐＧ２細胞の一過性トランスフェクションは、ｃｏＮＳ３／４Ａ遺伝子が、ＣＭＶプロモーターを用いる場合、ｗｔＮＳ３／４Ａ遺伝子と比較して１１倍高いレベルのＮＳ３を生じる、ということを示した。ＮＳ４Ａの存在はセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）による発現を増強する、ということも示された。ＳＦＶ構築物を含有する野生型ＮＳ３／４Ａは、ＳｐｅＩ−ＢＳｔＢ１断片としてポリメラーゼ連鎖反応によりｗｔＮＳ３／４Ａ遺伝子を単離し、キャプシドの３４アミノ酸長翻訳エンハンサー配列とその後のＦＭＤＶ２ａ切断ペプチドを含有するｐＳＦＶ１０ＥｎｈのＳｐｅＩ−ＢＳｔＢ１部位に挿入することにより作製された。ｒＳＦＶ粒子中への組換えＲＮＡのパッケージングは、２−ヘルパーＲＮＡ系を用いて実行された。コドン最適化およびＳＦＶレプリカーゼにより媒介されるｍＲＮＡ増幅はともに、より高レベルのＮＳ３特異的抗体により立証されるような免疫原性改良を生じた。この免疫原性改良は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のより迅速なプライミング（priming）も生じた。ＨＣＶは非細胞溶解性ウイルスであるため、プライミングされたＣＴＬ応答の機能性は、ＮＳ３／４Ａ発現同系腫瘍細胞を用いたｉｎ  ｖｉｖｏチャレンジ（challenge）により評価した。腫瘍防御免疫のプライミングは免疫原およびＣＤ８＋ＣＴＬの内因性産生を要したが、しかしＢおよびＣＤ４＋Ｔ細胞とは無関係であった。このモデルは、コドン最適化およびｍＲＮＡ増幅によるＮＳ３／４Ａ特異的腫瘍抑制免疫性のより迅速なｉｎ  ｖｉｖｏ活性化を確証した。最後に、腫瘍注入後６〜１２日目の、遺伝子銃を用いたｃｏＮＳ３／４Ａ遺伝子による治療的ワクチン接種は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖を有意に低減した。コドン最適化およびｍＲＮＡ増幅は、ＮＳ３／４Ａの全体的な免疫原性を有効に増強する。したがってこれらのアプローチのいずれかまたは両方が、ＮＳ３／４ＡベースのＨＣＶ遺伝子ワクチンにおいて選択される。
【００１６】
したがって、本発明の態様は、配列番号３５の配列により提供される核酸配列、および／または配列番号３６の配列により提供されるペプチド配列を含み、それらから成り、または本質的にそれらから成る組成物を包含する。例えば好ましい実施形態としては、配列番号３５のうちの少なくとも１２〜２１１２の間の任意数の連続したヌクレオチドまたはその相補鎖（例えば１２〜１５、１５〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜５００、５００〜１０００、１０００〜１５００、１５００〜２０７９または１５００〜２１１２個連続したヌクレオチド）を含み、それらから成り、または本質的にそれらから成る組成物が挙げられる。好ましい実施形態としては、配列番号３５のうちの少なくとも１２〜２１１２の間の任意数の連続したヌクレオチドまたはその相補鎖（例えば配列番号３５のうちの少なくとも３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個連続したアミノ酸）を含み、それらから成り、または本質的にそれらから成る組成物も挙げられる。付加的実施形態としては、配列番号３６またはその断片をコードする配列、即ち配列番号３６のうちの少なくとも３〜５０の間の任意数の連続したアミノ酸（例えば３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個連続したアミノ酸）を含み、それらから成り、または本質的にそれらから成る核酸が挙げられる。さらなる実施形態としては、配列番号３６の配列またはその断片、即ち配列番号３６のうちの少なくとも３〜５０の間の任意数の連続したアミノ酸（例えば３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個連続したアミノ酸）を含み、それらから成り、または本質的にそれらから成るペプチドが挙げられる。
【００１７】
本明細書中に記載された組成物の製造および使用方法も提供される。具体化された核酸およびペプチドの製造方法のほかに、他の実施形態としては、ＨＣＶ感染を治療または予防するために用いられ得る免疫原および／またはワクチン組成物の製造方法が挙げられる。いくつかの方法は、例えば単一組成物(例えばワクチン組成物)を処方するために、アジ
ュバントを上記のようなペプチドまたは核酸抗原（例えばＨＣＶペプチドまたはＨＣＶ核酸）と混合することにより実行される。好ましい方法は、リバビリンを、本明細書中に開示されたＨＣＶ遺伝子または抗原と混合することを包含する。
【００１８】
本明細書中に記載された組成物の好ましい使用方法は、ＨＣＶに対する免疫応答を必要とする動物に、本明細書中に記載された十分量の１つまたは複数の核酸またはペプチド実施形態を提供することを包含する。例えば一アプローチにより、ＨＣＶに対する免疫応答を必要とする動物（例えばＨＣＶに感染する危険があるかまたはすでに感染した動物、例えばヒト）が同定され、そして上記の動物は、肝炎ウイルス抗原に対する免疫応答を増強または促進するのに有効である量のＮＳ３／４Ａ（配列番号２または配列番号３６）、突然変異体ＮＳ３／４Ａ（配列番号３〜１３）、それらの断片（例えば配列番号１４〜２６）または上記分子をコードする核酸を提供される。付加的方法は、ＨＣＶに対する強力な免疫応答を必要とする動物を同定し、そして配列番号２〜２７または配列番号３６上に存在する抗原またはエピトープを含むペプチドまたは上記ペプチドをコードする核酸を含む組成物を上記動物に提供することにより実施される。特に好ましい方法は、ＨＣＶに対する免疫応答を必要とする動物を同定し、そして上記抗原に対する免疫応答を増強するかまたは促進するに十分な量のＨＣＶ抗原（例えばＮＳ３／４Ａ（配列番号２または配列番号３６））、突然変異体ＮＳ３／４Ａ（配列番号３〜１３）、その断片であって配列番号２または配列番号３６のうちの少なくとも３〜５０の間の任意数の連続したアミノ酸（例えば３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、４５または５０個連続したアミノ酸）を含有する断片（例えば配列番号１４〜２６）または１または複数のこれらの分子をコードする核酸を含む組成物を上記動物に提供することを包含する。いくつかの実施形態では、上記の組成物は、アジュバント作用を提供する量のリバビリンも含有する。
【００１９】
さらなる実施形態では、例えば遺伝子銃を用いて、本明細書中に記載されたＨＣＶ核酸（例えば上記のような配列番号３５またはその断片）を、ＨＣＶに対する免疫応答を必要とする哺乳類に投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子銃による送達の前に、ある量のリバビリンがＤＮＡ免疫原と混合される。他の実施形態では、ＤＮＡ免疫原は、ＤＮＡ接種の同一部位またはその付近でのリバビリンの投与の直前または後に、遺伝子銃により提供される。
【００２０】
［発明の詳細な説明］
ＨＣＶのＮＳ３／４Ａドメインに対応する新規の核酸およびタンパク質は、ＨＣＶに感染した患者からクローニングした（配列番号１）。クローン配列はＨＣＶ配列との最大相同性を有するが、しかし最も近いＨＣＶ類縁体（寄託番号ＡＪ  ２７８８３０）とは９３％相同であるに過ぎない、ということをGenBank検索は明示した。この新規のペプチド（配列番号２）、その断片であって少なくとも３〜５０の間の任意数の連続したアミノ酸（例えば３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個連続したアミノ酸）である断片（例えば配列番号１４および１５）、これらの分子をコードする核酸、上記核酸を有するベクター、ならびに上記ベクター、核酸またはペプチドを有する細胞は、本発明の実施形態である。ＮＳ３／４Ａ遺伝子（配列番号１）および対応するペプチド（例えば配列番号２）がともにｉｎ  ｖｉｖｏで免疫原性である、ということも発見された。
【００２１】
新規ＮＳ３／４Ａペプチドの突然変異体が作製された。短縮型突然変異体（例えば配列番号１２および１３）ならびにタンパク質分解性開裂部位を欠く突然変異体（配列番号３〜１１）がｉｎ  ｖｉｖｏで免疫原性である、ということも発見された。これらの新規ペプチド（配列番号３〜１３）およびその断片であって少なくとも３〜５０の間の任意数の連続したアミノ酸（例えば３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５
、４０、４５または５０個連続したアミノ酸）である断片（例えば配列番号１６〜２６）、これらの分子をコードする核酸、上記核酸を有するベクター、ならびに上記ベクター、核酸またはペプチドを有する細胞も、本発明の実施形態である。
【００２２】
ＮＳ３／４Ａをコードするコドン最適化核酸も作製され、免疫原性であることが判明した。配列番号１の核酸はコドン使用頻度に関して分析され、そしてその配列を、ヒト細胞において最も一般的に用いられるコドンと比較した。ＨＣＶはヒト病原体であるため、ウイルスが、ヒトタンパク質をコードすることが最も高頻度で見出されるコドン（例えば最適ヒトコドン）を用いるよう未だ進化していなかった、ということを発見することは予期されなかった。総計４３５ヌクレオチドを置換して、コドン最適化合成ＮＳ３／４Ａ核酸を生成した。コドン最適化核酸配列によりコードされたＮＳ３／４Ａペプチド（配列番号３６）は、ＨＣＶ−１と９８％相同であり、総計１５の異なるアミノ酸を含有した。
【００２３】
コドン最適化核酸（ＭＳＬＦ１またはｃｏＮＳ３／４Ａ）（配列番号３５）は、ネイティブＮＳ３／４Ａよりｉｎ  ｖｉｔｒｏで効率的に翻訳されることが、そしてＭＳＬＦ１含有構築物で免疫されたマウスは野生型ＮＳ３／４Ａ含有構築物で免疫されたマウスより有意に多いＮＳ３／４Ａ特異的抗体を生成することが判明した。さらに、ＭＳＬＦ１含有構築物で免疫されたマウスは、野生型ＮＳ３／４Ａ含有構築物で免疫されたマウスより有効にＮＳ３特異的ＣＴＬをプライミングし、そしてより良好なｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍抑制免疫応答を示す、ということが判明した。
【００２４】
上記のペプチドおよび核酸は免疫原として有用であり、これらは単独でまたはアジュバントと一緒に投与され得る。好ましい実施形態は、１つまたは複数の上記の核酸および／またはペプチドを、アジュバントとともにまたはアジュバントを伴わずに含む組成物を包含する。即ち、本明細書中に記載された組成物のいくつかはアジュバントを用いてまたは用いずに調製され、そしてＮＳ３／４Ａペプチド（配列番号２または配列番号３６）、またはその断片であって少なくとも３〜５０の間の任意数の連続したアミノ酸（例えば３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個連続したアミノ酸）である断片（例えば配列番号１４および１５）、あるいは１または複数のこれらの分子をコードする核酸（例えば配列番号３５、またはその断片であって少なくとも１２〜２１１２の間の任意数の連続したヌクレオチド（例えば１２〜１５、１５〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜５００、５００〜１０００、１０００〜１５００、１５００〜２０７９または１５００〜２１１２個連続したヌクレオチド）である断片）を含み、それらから成り、または本質的にそれらから成る。付加的組成物は、アジュバントを用いてまたは用いずに調製され、そしてＮＳ３／４Ａ突然変異体ペプチド（配列番号３〜１３）およびその断片であって少なくとも３〜５０の間の任意数の連続したアミノ酸（例えば３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個連続したアミノ酸）である断片を含み、それらから成り、または本質的にそれらから成る。
【００２５】
リバビリンおよび抗原（例えば１または複数の上記ＨＣＶペプチドまたは核酸）を含む組成物は、抗原に対する動物の免疫応答を増強するかまたは促進する、ということも発見された。即ち、リバビリンは、本開示の目的のために、特定の抗原に対する免疫応答を増強するかまたは促進する能力を有する物質として言及される非常に有効な「アジュバント」である、ということが発見された。リバビリンのアジュバント活性は、抗原に対する免疫媒介性防御の有意の増大、抗原に対して作られた抗体の力価の増大、ならびに増殖性Ｔ細胞応答の増大により明示された。
【００２６】
したがってリバビリンおよび本明細書中に記載された１または複数のペプチドまたは核酸を含む組成物（例えばワクチンおよびその他の薬剤）は、本発明の実施形態である。こ
れらの組成物は、リバビリンの量、リバビリンの形態、ならびにＨＣＶ核酸またはペプチドの配列によって変わり得る。
【００２７】
本発明の実施形態は、上記の組成物の製造および使用方法も包含する。いくつかの方法は、ＮＳ３／４Ａ、コドン最適化ＮＳ３／４Ａ、突然変異体ＮＳ３／４Ａ、その断片であって少なくとも９〜１００の間の任意数の連続したヌクレオチド（例えば９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、５０、６０、７５、８０、９０または１００個連続したヌクレオチド）である断片をコードする核酸、該核酸に対応するペプチド、該核酸を含む構築物、ならびに上記組成物を含有する細胞の製造方法を包含する。しかしながら好ましい方法は、新しく発見されたＮＳ３／４Ａ断片、コドン最適化ＮＳ３／４Ａ、またはＮＳ３／４Ａ突然変異体（例えば短縮型突然変異体またはタンパク質分解性開裂部位を欠く突然変異）またはその断片、あるいは上記のような１つまたは複数のこれらの分子をコードする核酸を含み、それらから成り、または本質的にそれらから成るワクチン組成物または免疫原製剤の製造に関する。本明細書中に記載された方法とともに用いるための好ましい断片としては、配列番号１２〜２７、ならびに少なくとも３０個連続したヌクレオチドを含有する配列番号３５の断片が挙げられる。上記の組成物は、アジュバント（例えばリバビリン）を提供し、ＨＣＶ抗原（例えば（配列番号２〜１１または３６）のようなＨＣＶ抗原を含むペプチド、または配列番号１２〜２６のようなそれらの断片、あるいは１または複数の上記ペプチドをコードする核酸）を提供し、そして上記アジュバントおよび上記抗原を混合して、上記抗原に対する被験体における免疫応答を増強するかまたは促進するために用いられ得る組成物を処方することにより製造され得る。
【００２８】
抗原に対する動物、例えばヒトにおける免疫応答を増強するかまたは促進する方法も、提供される。このような方法は、例えばＨＣＶに対する免疫応答を必要とする動物を同定し、そして１または複数の上記の核酸またはペプチドならびに抗原／エピトープに対する免疫応答を増強するかまたは促進するのに有効な量のアジュバントを含む組成物を上記動物に提供することにより実施され得る。いくつかの実施形態では、抗原およびアジュバントは、単一の混合物としてではなく、別々に投与される。好ましくはこの場合、アジュバントは抗原投与の直前にまたは直後に投与される。好ましい方法は、リバビリンおよびＮＳ３／４Ａ（例えば配列番号２）、コドン最適化ＮＳ３／４Ａ（例えば配列番号３６）、突然変異体ＮＳ３／４Ａ（例えば配列番号３〜１３）、その断片であって少なくとも３〜５０の間の任意数の連続したアミノ酸（例えば３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個連続したアミノ酸）を含有する断片（例えば配列番号１４〜２６）、あるいは上記分子のいずれか１または複数をコードする核酸を必要とする動物に提供することを包含する。
【００２９】
その他の実施形態は、ＨＣＶ感染を治療し、予防する方法に関する。一アプローチにより、ＨＣＶ感染の治療および／または予防のための薬剤を調製するために、本明細書中に記載された１または複数のＨＣＶ核酸またはペプチドを含む免疫原が用いられる。別のアプローチにより、ＨＣＶ感染を予防および／または治療する薬剤を必要とする個体が同定され、そして上記個体は、リバビリンおよびＨＣＶ抗原、例えばＮＳ３／４Ａ（例えば配列番号２）、コドン最適化ＮＳ３／４Ａ（例えば配列番号３６）または突然変異体ＮＳ３／４Ａ（例えば配列番号３〜１３）、その断片であって少なくとも３〜５０の間の任意数の連続したアミノ酸（例えば３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個連続したアミノ酸）を含有する断片（例えば配列番号１４〜２６）、あるいはこれらの分子のいずれか１つまたは複数をコードする核酸を含む薬剤を提供される。
【００３０】
以下の節は、新規のＮＳ３／４Ａ遺伝子の発見、コドン最適化ＮＳ３／４Ａ遺伝子、ＮＳ３／４Ａ突然変異体の作製、ならびにそれらに対応する核酸およびペプチドの特性を考
察する。
【００３１】
ＮＳ３／４Ａ、ＮＳ３／４Ａ突然変異体およびコドン最適化ＮＳ３／４Ａ
ＨＣＶのＮＳ３／４Ａドメインに対応する新規の核酸およびタンパク質は、ＨＣＶに感染した患者からクローニングした（配列番号１および２）。クローン配列はＨＣＶ配列との最大相同性を有するが、しかし最も近いＨＣＶ類縁体（寄託番号ＡＪ  ２７８８３０）とは９３％相同であるに過ぎない、ということをGenBank検索は明示した。この新規のＮＳ３／４Ａペプチドの短縮型突然変異体、およびタンパク質分解性開裂部位を欠くＮＳ３／４Ａ突然変異体、（ならびに対応する核酸）も作製された。さらに、ヒトコドン最適化ＮＳ３／４Ａ核酸およびペプチドが作製された。これらの新規ペプチドおよび上記ペプチドをコードする核酸は、ＨＣＶに対する免疫応答を提供するようレシピエントを誘導する組成物を製造するためにアジュバントと混合され得る強力な免疫原である、ということが発見された。新規のＮＳ３／４Ａ遺伝子のクローニング、ならびに種々のＮＳ３／４Ａ突然変異体およびコドン最適化ＮＳ３／４Ａ遺伝子の作製を、以下の実施例に記載する。
【実施例１】
【００３２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ＨＣＶ感染患者（ＨＣＶ遺伝子型１ａ）の血清からＮＳ３／４Ａ配列を増幅した。総ＲＮＡを血清から抽出し、そしてｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを標準プロトコルに従って実施した（Chen M et al., J. Med. Virol. 43: 223-226 (1995)）。アンチセンスプライマー「ＮＳ４ＫＲ」（５’−ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＴＴＣ  ＡＴＣ−３’（配列番号２８））を用いて、ｃＤＮＡ合成を開始した。このｃＤＮＡから、ＮＳ３およびＮＳ４Ａ遺伝子を包含する、アミノ酸１００７〜１７１１に対応するＨＣＶの２０７９塩基対ＤＮＡ断片を増幅した。高忠実性ポリメラーゼ（Expand High Fidelity PCR, Boehringer-Mannheim, Mannheim, Germany）を、「ＮＳ３ＫＦ」プライマー（５’−ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ
ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＣＣＴ  ＡＴＣ  ＡＣＧ  ＧＣＣ  ＴＡＴ−３’（配列番号２９））およびＮＳ４ＫＲプライマーとともに用いた。ＮＳ３ＫＦプライマーはＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位および開始コドンを含有し、そしてプライマーＮＳ４ＫＲはＸｂａＩ制限酵素切断部位および停止コドンを含有した。
【００３３】
次に増幅断片をシーケンシングした（配列番号１）。配列比較分析は、遺伝子断片が遺伝子型１ａのウイルス株から増幅される、ということを明示した。ＮＣＢＩウエブサイトを用いたGenBankデータベースに対するコンピュータによるＢＬＡＳＴ検索は、最も近いＨＣＶホモログがヌクレオチド配列において９３％同一である、ということを明示した。
【００３４】
次に増幅ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、同一酵素で消化されたｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓプラスミド（Invitrogen）中にインサートした。次にＮＳ３／４Ａ−ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、インサートをＱｉａＱｕｉｃｋキット（Qiagen, Hamburg, Germany）を用いて精製し、そしてＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸプラスミドを生成するために、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ消化ｐＶＡＸベクター（Invitrogen）にライゲーションした。
【００３５】
ＮＳ３／４Ａ  ＤＮＡからＮＳ４Ａ配列を欠失することにより、ｒＮＳ３短縮型突然変異体を得た。したがってそれぞれＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位を含有するプライマーＮＳ３ＫＦおよび３’ＮｏｔＩ（５’−ＣＣＡ  ＣＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＣＴＡ  ＣＡＧ−３’（配列番号３０））を用いて、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸのＮＳ３遺伝子配列をＰＣＲ増幅した。次にＮＳ３断片（１８５０ｂｐ）をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ消化ｐＶＡＸプラスミドにライゲーションして、ＮＳ３−ｐＶＡＸベクターを生成した。プラスミドをＢＬ２１大腸菌細胞中で増殖させた。プラスミドをシーケンシングし、制限酵素切断により立証し、結果は、本来の配列に基づいて予測されたとおりであっ
た。
【００３６】
表１は、ＮＳ３およびＮＳ４Ａ間の切断点として言及されるＮＳ３／４Ａのタンパク質分解性開裂部位の配列を記載する。いくつかの異なるＮＳ３／４Ａ切断点突然変異体を生成するために、この野生型切断点配列を多数の異なる方法で突然変異化した。表１は、これらの突然変異体切断点配列も同定する。表１に列挙した断片は、ＨＣＶに対する上記動物における免疫応答を誘導するために、動物への投与のための組成物中に、アジュバント（例えばリバビリン）とともにまたはアジュバントを伴わずに組入れられ得る好ましい免疫原である。
【００３７】
【表１】
0004660195.tif 000002
【００３８】
ＮＳ３およびＮＳ４Ａ間のタンパク質分解性切断部位を変更するために、メーカーの推奨に従って、ＱＵＩＣＫＣＨＡＮＧＥ（商標）突然変異誘発キット（Stratagene）を用いて、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸプラスミドを突然変異化した。例えば「ＴＰＴ」突然変異を生成するために、プライマー５’−ＣＴＧＧＡＧＧＴＣＧＴＣＡＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣＧＴＴ−３’（配列番号３１）および５’−ＡＣＣＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＡＣＧＡＣＣＴＣＣＡＧ−３’（配列番号３２）を用いてプラスミドを増幅して、ＮＳ３／４Ａ−ＴＰＴ−ｐＶＡＸを生じた。例えば「ＲＧＴ」突然変異を生成するために、プライマー５’−ＣＴＧＧＡＧＧＴＣＧＴＣＣＧＣＧＧＴＡＣＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣＧＴＴ−３’（配列番号３３）および５’−ＡＣＣＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＴＡＣＣ−ＧＣＧＧＡＣＧＡＣＣＴＣＣＡＧ−３’（配列番号３４）を用いてプラスミドを増幅して、ＮＳ３／４Ａ−ＲＧＴ−ｐＶＡＸを生じた。全ての突然変異化構築物をシーケンシングして、突然変異が正しく作製されていたことを立証した。コンピテントＢＬ２１大腸菌中で、プラスミドを増殖させた。
【００３９】
ヒト細胞中で最も一般的に用いられるコドンに関して、予め単離され、シーケンシングされた固有のＮＳ３／４Ａ遺伝子の配列（配列番号１）のコドン使用頻度を分析した。総
計４３５ヌクレオチドを置換して、コドン使用頻度をヒト細胞に最適化した。配列をRetrogen Inc. （6645 Nancy Ridge Drive, San Diego, CA92121）に送リ、彼等に、全長合成コドン最適化ＮＳ３／４Ａ遺伝子を生成するための説明書を提供した。コドン最適化ＮＳ３／４Ａ遺伝子は、ＨＣＶ−１参考株のヌクレオチド位置３４１７〜５４７５間の領域内に７９％の配列相同性を有した。総計４３３ヌクレオチドが異なった。アミノ酸レベルでは、ＨＣＶ−１株との相同は９８％であり、総計１５アミノ酸が異なった。
【００４０】
高忠実性ポリメラーゼ（Expand High Fidelity PCR, Boehringer-Mannheim, Mannheim,
Germany）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＮＳ３およびＮＳ４Ａ、ＮＳ３／４Ａ遺伝子断片を包含するアミノ酸１００７〜１７１１に対応するＨＣＶの２．１ｋｂ  ＤＮＡ断片を増幅した。次に、ＭＳＬＦ１−ｐＶＡＸ（ｃｏＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ）プラスミドを生成するＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによって消化されたｐＶＡＸベクター（Invitrogen, San Diego）中にアンプリコンを挿入した。全発現構築物をシーケンシングした。プラスミドを、コンピテントＢＬ２１大腸菌中で増殖させた。ｉｎ  ｖｉｖｏ注入のために用いられるプラスミドＤＮＡを、メーカーの使用説明書（Qiagen GmbH, Hilden, FRG）に従って、QiagenＤＮＡ精製カラムを用いて精製した。その結果生じたプラスミドＤＮＡの濃度を分光光度的に確定し（Dynaquant, Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）、そして精製ＤＮＡを１ｍｇ／ｍｌの濃度で滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解した。
【００４１】
ｗｔＮＳ３／４Ａ（野生型ＮＳ３／４Ａ）およびｃｏＮＳ３／４ＡプラスミドからのＮＳ３およびＮＳ３／４Ａタンパク質の発現を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および翻訳検定により分析した。検定は、タンパク質がプラスミドから正確に翻訳され、そしてｃｏＮＳ３／４ＡプラスミドはｗｔＮＳ３／４Ａプラスミドと比較した場合、より高いプラスミド希釈で検出可能なＮＳ３およびＮＳ３／４Ａバンドを生じる、ということを示した。この結果は、ｃｏＮＳ３／４Ａプラスミドからのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳がｗｔＮＳ３／４Ａより効率的である、という強力な証拠を提供した。発現レベルをより精確に比較するために、ＨｅｐＧ２細胞をｗｔＮＳ３／４ＡおよびｃｏＮＳ３／４Ａプラスミドで一過的にトランスフェクトした。これらの実験は、濃度測定および組換えＮＳ３の標準曲線により確定されるように、ｃｏＮＳ３／４Ａプラスミドが、ｗｔＮＳ３／４Ａプラスミドと比較して、１１倍高いＮＳ３タンパク質の発現レベルを生じる、ということを明示した。ｗｔＮＳ３／４ＡおよびｃｏＮＳ３／４Ａプラスミドはサイズが同一であるため、プラスミド間のトランスフェクション効率に任意の大きな差があるとは考えられない。トランスフェクトされ、ＳＦＶ感染されたｃｏＮＳ３／４Ａプラスミドの染色により、ＢＨＫ細胞は前に観察されたような類似したＮＳ３の核周囲および細胞質分布を明示し、このことは、細胞内局在化不変を確証した。
【００４２】
いくつかの核酸実施形態は、本明細書中に記載されたＨＣＶペプチドをコードするヌクレオチド(配列番号２〜１１または配列番号３６)またはその断片であって少なくとも３〜５０の間の任意数の連続したアミノ酸（例えば３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個連続したアミノ酸）を含有する断片（例えば配列番号１４および１５）を包含する。例えばいくつかの実施形態としては、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびこれらのＨＣＶペプチドをコードするｃＤＮＡが挙げられる。ＨＣＶヌクレオチド実施形態は、配列表に示されたＤＮＡ配列(例えば配列番号１または配列番号３５)を包含するだけでなく、配列表に示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば配列番号２〜１１または配列番号３６）、ならびにストリンジェントな条件下（例えば０．５ＭのＮａＨＰＯ4、７．０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ中で５０℃でフィルター結合ＤＮＡとのハイブリダイゼーション、ならびに５０℃で０．２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中での洗浄）、およびより低ストリンジェントな条件下（例えば０．５ＭのＮａＨＰＯ4、７．０％のドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ中で３７℃でのハイブリダイゼーション、ならびに３７℃で０．２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中での洗浄）において配列表に提供されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列（配列番号２〜１１または配列番号３６）とハイブリダイズする任意のヌクレオチド配列も包含する。
【００４３】
本発明の核酸実施形態としては、上記の配列の断片、修飾体、誘導体および変異体も挙げられる。例えば所望の実施形態としては、新規のＨＣＶ配列またはそれと相補的な配列の１つのうちの少なくとも２５個連続した塩基を有する核酸が挙げられ、そして好ましい断片は、配列番号２または配列番号３６のＮＳ３／４Ａ分子、または配列番号３〜１３の突然変異体ＮＳ３／４Ａ分子をコードする核酸、あるいはそれと相補的な配列のうちの少なくとも２５個連続した塩基を含む。
【００４４】
この点では、本明細書中に記載された核酸実施形態は、配列番号１または配列番号３５のうちの約１２〜約２１１２の間の任意数の連続したヌクレオチドを有し得る。例えばいくつかのＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号３５のうちの少なくとも１２〜１５、１５〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜５００、５００〜１０００、１０００〜１５００、１５００〜２０７９または１５００〜２１１２個連続したヌクレオチド、あるいはその相補鎖を有する核酸を包含する。これらの核酸実施形態は、変更がＨＣＶ核酸の構造または機能（例えば免疫原として役立つ能力）に有意に影響を及ぼさない限り、置換、付加または欠失によっても変更され得る。例えばヌクレオチドコード配列の縮重のため、配列番号２〜１３または配列番号３６で示されるような同一ＨＣＶアミノ酸配列を実質的にコードする他のＤＮＡ配列が、いくつかの実施形態で用いられ得る。これらの例としては、ＨＣＶペプチドの全部または一部をコードする核酸配列（配列番号２〜１３）、あるいは配列内の機能的に等価のアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換により変更され、したがってサイレント変化が生じるか、または配列内の機能的に等価でないアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換により変更され、したがって検出可能な変化を生じる配列の全部または一部を相補する核酸が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本発明の核酸実施形態は、上記の修飾の点から見て、配列番号２〜２７または配列番号３６のいずれか１つをコードする核酸を含み、それらから成りまたは本質的にそれらから成ると言える。
【００４５】
上記の核酸配列を用いることにより、これらの分子を相補するプローブが設計され、オリゴヌクレオチド合成により製造され得る。望ましいプローブは、このＨＣＶ単離体に固有である配列番号１の核酸配列を含む。そのいくつかがそれ自体新規のＨＣＶ配列であり得るＨＣＶの天然供給源を単離するために、これらのプローブを用いて患者からのｃＤＮＡをスクリーニングし得る。スクリーニングは、フィルターハイブリダイゼーションによる、または例えばＰＣＲによるものであり得る。フィルターハイブリダイゼーションでは、標識化プローブは好ましくは、このＮＳ３／４Ａペプチドに固有である配列番号１の核酸配列の少なくとも１５〜３０塩基対を含有する。用いられるハイブリダイゼーション洗浄条件は、好ましくは中〜高ストリンジェントのものである。ハイブリダイゼーションは、０．５ＭのＮａＨＰＯ4、７．０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ中で４２℃で一晩実施され、そして洗浄は、０．２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中で４２℃で実施され得る。このような条件に関する手引きとしては、例えばSambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, N.Y.；およびAusubel et aｌ．、 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.を参照されたい。
【００４６】
ＨＣＶ核酸は、本明細書中に記載された核酸を用いて、ＨＣＶに感染した患者からも単離され得る（実施例１も参照）。したがってＨＣＶ感染患者から得られるＲＮＡが逆転写され、その結果生じたｃＤＮＡはＰＣＲまたは別の増幅技法を用いて増幅される。プライ
マーは、好ましくはＮＳ３／４Ａ配列（配列番号１）から得られる。
【００４７】
ＰＣＲ技法の再検討のためには、Molecular Cloning to Genetic Engineering White, B.A. Ed. In Methods in Molecular Biology 67: Humana Press, Totowa (1997)ならびに「PCR Methods and Applications」という表題の出版物（1991, Cold Spring Harbor Laboratory Press）を参照されたい。ｍＲＮＡの増幅のためには、ｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡとし、その後ＰＣＲ処理する（ＲＴ−ＰＣＲ）こと、あるいは米国特許第５，３２２，７７０号に記載されているように、両過程のために単一酵素を用いることは本発明の範囲内である。別の技法は、Marshall R.L. et al. (PCR Methods and Applications 4: 80-84, 1994）に記載されているように、逆転写酵素不斉ギャップリガーゼ連鎖反応(Reverse Transciptase Asymmetric Gap Ligase Chain Reaction (ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）)の使用を包含する。
【００４８】
要するに、ＲＮＡは標準手法に従って単離される。逆転写反応は、一次鎖合成のプライマーとして増幅断片のほとんどの５’末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＲＮＡ上で実施される。その結果生じるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは次に、標準ターミナルトランスフェラーゼ反応を用いてグアニンテールが付加（tailed）される。次にハイブリッドはRNase Hで消化され、そして二次鎖合成がポリＣプライマーでプライミングされる。したがって増幅断片の下流のｃＤＮＡ配列は、容易に単離される。用いられ得るクローニング戦略の再検討に関しては、例えばSambrook et al., 1989（上記）を参照されたい。
【００４９】
これらの増幅手法の各々において、増幅されるべき配列のいずれかの側のプライマーが、ｄＮＴＰおよび熱安定性ポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼ、ＰｆｕポリメラーゼまたはＶｅｎｔポリメラーゼと一緒に、適切に調製された核酸試料に付加される。試料中の核酸は変性され、そしてプライマーは、試料中の相補的核酸配列と特異的にハイブリダイズされる。次にハイブリダイズ化プライマーが延長される。その後、変性、ハイブリダイゼーションおよび延長の別のサイクルが開始される。サイクルは多数回反復されて、プライマー部位間の核酸配列を含有する増幅断片を生成する。ＰＣＲはさらに、いくつかの特許、例えば米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，９６５，１８８号に記載されている。
【００５０】
プライマーは、このＮＳ３／４Ａ分子に固有である（配列番号１）の核酸配列の一部と実質的に相補的であり、それによりプライマー間の配列を増幅させるよう選択される。好ましくはプライマーは、少なくとも１６〜２０、２０〜２５または２５〜３０ヌクレオチド長の間の任意数であり得る。安定なハイブリッドの形成は、ＤＮＡの溶融温度（Ｔｍ）に依っている。Ｔｍは、プライマーの長さ、溶液のイオン強度およびＧ＋Ｃ含量に依っている。Ｇ：Ｃ対は３つのＨ結合により保持され、一方、Ａ：Ｔ対は２つのみを有するため、プライマーのＧ＋Ｃ含量が高いほど、溶融温度は高い。本明細書中に記載された増幅プライマーのＧ＋Ｃ含量は、好ましくは１０％〜７５％、さらに好ましくは３５％〜６０％、最も好ましくは４０％〜５５％の範囲である。特定組の検定条件下でのプライマーに関する適切な長さは、当業者により経験的に確定され得る。
【００５１】
プライマーのスペーシングは、増幅されるべきセグメントの長さに関連づけられる。本明細書中に記載された実施形態の情況では、ＨＣＶペプチドをコードする核酸配列を保有する増幅セグメントは、少なくとも約２５ｂｐからＨＣＶゲノムの全長までのサイズ範囲であり得る。２５〜１０００ｂｐの増幅断片が典型的であり、５０〜１０００ｂｐの断片が好ましく、そして１００〜６００ｂｐの断片が非常に好ましい。増幅プライマーは、ＮＳ３／４Ａ領域の特異的増幅を可能にする任意の配列を有し、そして例えばクローニングを促すための制限酵素認識部位のような修飾を包含し得る、と理解される。
【００５２】
ＰＣＲ産物は、増幅配列がＨＣＶペプチドの配列を表すことを保証するようサブクローニングされ、シーケンシングされ得る。次にＰＣＲ断片を用いて、種々の方法により全長ｃＤＮＡクローンを単離し得る。例えば増幅断片は標識され、ｃＤＮＡライブラリー、例えばバクテリオファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いられ得る。あるいは標識化断片を用いて、ゲノムライブラリーのスクリーニングによりゲノムクローンを単離し得る。さらに発現ライブラリーは、例えば感染患者から単離されるＲＮＡから合成されるｃＤＮＡを利用して構築し得る。このようにして、標準抗体スクリーニング技法をＨＣＶ遺伝子産物に対して作られた抗体とともに用いて、ＨＣＶ遺伝子産物を単離し得る（スクリーニング技法に関しては、例えばHarlow, E. and Lane, eds., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harborを参照されたい）。
【００５３】
本発明の実施形態は、（ａ）上記核酸配列および／またはそれらの相補体（即ちアンチセンス）のいずれかを含有するＤＮＡベクター；（ｂ）核酸の発現を司る調節要素と有効に結合する上記核酸配列のいずれかを含有するＤＮＡ発現ベクター；ならびに（ｃ）宿主細胞中でのコード配列の発現を司る調節要素と有効に結合する上記核酸配列のいずれかを含有する遺伝子工学処理宿主細胞も包含する。これらの組換え構築物は、宿主細胞中で自律的に複製し得る。あるいは組換え構築物は、宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に組入れられるようになり得る。このような組換えポリヌクレオチドは典型的には、人為操作による半合成または合成起源のＨＣＶゲノムまたはｃＤＮＡポリヌクレオチドを含む。したがって天然に生じないこれらの配列およびその相補体を含む組換え核酸が提供される。
【００５４】
ＨＣＶペプチドをコードする核酸、あるいはそれらが現実に出現するようにＨＣＶ遺伝子を相補する配列を有する核酸が用いられ得るが、しかしそれらはしばしば、例えば欠失、置換または挿入により変更され、そしてヒトに存在しない配列を伴い得る。本明細書中で用いる場合、調節要素としては、誘導性および非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーターならびに発現を誘導し調節する当業者に既知のその他の要素が挙げられるが、これらに限定されない。このような調節要素としては、サイトメガロウイルスｈＣＭＶ即時性遺伝子、ＳＶ４０アデノウイルスの早期または後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージＡの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄ外被タンパク質の制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーターおよび酵母接合因子のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
さらに、組換えＨＣＶペプチドコード核酸配列およびそれらの相補的配列は、それらのプロセシングまたは発現を修飾するよう、設計され得る。例えば本明細書中に記載されたＨＣＶ核酸は、プロモーター配列および／またはリボソーム結合部位と併合され得るし、あるいはシグナル配列は、ペプチドの分泌を可能にし、それにより収穫または生物利用能を促進するために、ＨＣＶペプチドコード配列の上流に挿入され得るが、これらに限定されない。さらに所定のＨＣＶ核酸は、翻訳、開始および／または終止配列を作製しおよび／または破壊するために、あるいはコード領域に変異を作製しおよび／または新規制限部位を形成するかまたは先在するものを破壊するために、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏ修飾をさらに促進するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで突然変異処理され得る（実施例１参照）。当該技術分野で既知の突然変異誘発のための任意の技法が用いられ、例としてはｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発（Hutchinson et al., J. Biol. Chem., 253: 6551 (1978)）が挙げられるが、これらに限定されない。上記のＨＣＶペプチドをコードする核酸は、ＨＣＶペプチドを発現する組換え構築物を作製するために、分子生物学における慣用的技法を用いて操作され得る。
【００５６】
さらに、その他のタンパク質またはその他のタンパク質のドメインをコードする核酸は、融合タンパク質を作製するために、ＨＣＶペプチドをコードする核酸と連結され得る。融合タンパク質をコードするヌクレオチドとしては、全長ＮＳ３／４Ａ配列（配列番号２または配列番号３６）、突然変異体ＮＳ３／４Ａ配列(例えば配列番号３〜１１)、または非関連タンパク質またはペプチドと融合したＮＳ３／４Ａ配列のペプチド断片、例えば下記のようなポリヒスチジン、ヘマグルチニン、酵素、蛍光タンパク質または発光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
構築物「ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ」は、構築物「ＮＳ３−ｐＶＡＸ」よりｉｎ  ｖｉｖｏで有意に免疫原性である、ということが発見された。意外にも、コドン最適化ＮＳ３／４Ａ含有構築物（「ＭＳＬＦ１−ｐＶＡＸ」）はＮＳ３／４ＡｐＶＡＸよりｉｎ  ｖｉｖｏでより免疫原性である、ということも発見された。以下の実施例は、これらの実験を記載する。
【実施例２】
【００５８】
体液性免疫応答がＮＳ３−ｐＶＡＸおよびＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸベクターにより引き出されたか否かを判定するために、メーカーの使用説明書に従ってQiagenＤＮＡ精製系を用いて、実施例１に記載した発現構築物を精製し、そして精製ＤＮＡベクターを用いて４〜１０匹のＢａｌｂ／ｃマウスの群を免疫した。以前に記載されたように（Davis et al., Human Gene Therapy 4(6): 733 (1993)）、再生中の前脛骨（ＴＡ）筋に直接プラスミドを注入した。要するに、０．９％滅菌ＮａＣｌ中の０．０１ｍＭの心臓毒（Latoxan, Rosans, France）５０μｌ／ＴＡをマウスに筋注した。５日後、各ＴＡ筋に、ｒＮＳ３またはＤＮＡを含有するＰＢＳ  ５０μｌを注入した。
【００５９】
近交マウス系統Ｃ５７／ＢＬ６（Ｈ−２ｂ）、Ｂａｌｂ／Ｃ（Ｈ−２ｄ）およびＣＢＡ（Ｈ−２ｋ）を、Mollegard Denmark, Charles River Uppsala, SwedenまたはB&K Sollentuna Swedenの繁殖施設から入手した。全マウスが雌であり、４〜８週齢で用いた。体液性応答をモニタリングするために、全マウスに５０μｌ／ＴＡのプラスミドＤＮＡを４週間毎に追加抗原注射した。さらに数匹のマウスには、本明細書中に記載したように精製した組換えＮＳ３（ｒＮＳ３）タンパク質を投与した。ｒＮＳ３摂取マウスには、２回より多く免疫することはなかった。全マウスを、月に２回採血した。
【００６０】
酵素免疫測定法（Enzyme immunosorbent assays）（ＥＩＡ）を用いて、マウスＮＳ３特異的抗体の存在を検出した。これらの検定を、本質的には記載どおりに実施した（Chen
et al., Hepatology 28 (1): 219 (1998)）。要するに、ｒＮＳ３を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中に１μｇ／ｍｌで、９６ウエルマイクロタイタープレート（Nunc, Copenhagen, Denmark）に４℃で一晩、受動的に吸着させた。次に、ＰＢＳ、２％ヤギ血清および１％ウシ血清アルブミンを含有する希釈緩衝液中で３７℃で１時間インキュベーションすることにより、プレートをブロックした。次に１：６０から開始するマウス血清の連続希釈液を、プレート上で１時間インキュベートした。アルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Sigma Cell Products, Saint Louis, MO）と、その後の基質ｐＮＰＰ（１錠／５ｍｌの１Ｍジエタノールアミン緩衝液＋０．５ｍＭのＭｇＣｌ2）の付加により、結合マウス血清抗体を検出した。１ＭのＮａＯＨの付加により反応を停止して、吸光度を４０５ｎｍで読取った。
【００６１】
４週間後、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸで免疫したマウス５匹のうち４匹が、ＮＳ３抗体を産生していたが、一方、ＮＳ３−ｐＶＡＸで免疫した５匹のうち１匹が、抗体を産生した（図１）。６週間後、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸで免疫したマウス５匹のうち４匹は高レベル（＞１０4）のＮＳ３抗体（平均レベル１０８００±４８３０）を産生し、そして１匹は２１６０の力価を有した。ＮＳ３−ｐＶＡＸで免疫したマウスは全てＮＳ３抗体を産生
したが、しかしそれらのうち、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ構築物により産生されたような高レベルを発現したものはなかった（平均レベル１８００±８０５）。ＮＳ３／４Ａ融合構築物により誘導される抗体レベルは、６週目でＮＳ３−ｐＶＡＸにより誘導されるものより有意に高かった（平均順位７．６対３．４、ｐ＜０．０５、Mann-Whitney順位和検定、およびｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定）。したがってＮＳ３−ｐＶＡＸまたはＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸによる免疫は、ＮＳ３特異的抗体の産生を生じたが、ＮＳ３／４Ａ含有構築物はより強力な免疫原であった。
【００６２】
同様の実験を実行して、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸおよびＭＳＬＦ１−ｐＶＡＸ構築物の免疫原性を比較した。しかしながらヒトにおける将来的ワクチン接種計画をより良好になぞらえるために、遺伝子銃を用いて１０匹のマウスの群にプラスミドを送達した。要するに、製造者（Bio−Rad Laboratories, Hercules, CA）により供給されたプロトコルに従って、プラスミドＤＮＡを金粒子と連結した。免疫前に注射域を剃毛し、メーカーのプロトコルに従って免疫した。各注入用量は、４μｇのプラスミドＤＮＡを含有した。０、４および８週目に、免疫した。
【００６３】
ＮＳ３特異的抗体は、二次および三次免疫感作後２週間目にＭＳＬＦ１−ｐＶＡＸ構築物で免疫したマウスにおいて有意に高かったため、ＭＳＬＦ１遺伝子は、ネイティブＮＳ３／４Ａ遺伝子より免疫原性である、ということが判明した（表２）。これらの結果は、コドン最適化ＭＳＬＦ１−ｐＶＡＸがＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸより強力なＢ細胞免疫原である、ということを確証した。
【００６４】
【表２】
0004660195.tif 000003
【００６５】
以下の実施例は、ＭＳＬＦ−１（ｃｏＮＳ３／４ａ）が強力な体液性応答を生じるというさらなる証拠を提供する。
＜実施例２Ａ＞
【００６６】
異なるＮＳ３遺伝子の内因性の免疫原性を試験するために、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）マウスの群を以下のベクターで免疫した：ｗｔＮＳ３／４Ａ（野生型ＮＳ３／４Ａ）、ｃｏＮＳ３／４Ａ（コドン最適化ＮＳ３／４ＡまたはＭＳＬＦ−１）またはｗｔＮＳ３／４Ａ−ＳＦＶ（ＳＦＶ発現から得られる野生型ＮＳ３／４Ａ）。４μｇＤＮＡを遺伝子銃を用いて投与し、そして１０7用量のＳＦＶ粒子を皮下注射（ｓ．ｃ．）した。４週間後に、マウスに追加免疫した。ｗｔＮＳ３／４Ａ−ＳＦＶで免疫したマウスは最初の注射後にすでに抗体を発現したが、これは、強力な免疫原性を示唆する（図１０）。２回目の免疫後２週間目に、ｃｏＮＳ３／４ＡまたはｗｔＮＳ３／４Ａ−ＳＦＶベクターで免疫されたほとんどのマウスは１０3以上の平均抗体レベルを発現した（図１０）。これに反して、ｗｔＮＳ３／４Ａプラスミドで免疫したマウスで、６週間目に検出可能なＮＳ３特異的抗体を発現していたものはなかった（図１０）。したがってコドン最適化およびＳＦＶによるｍＲＮＡ増幅はともに、ＮＳ３／４Ａ遺伝子のＢ細胞免疫原性増大を生じる。
【００６７】
ｗｔＮＳ３／４Ａ、ｃｏＮＳ３／４ＡおよびｗｔＮＳ３／４Ａ−ＳＦＶ免疫によりプライミングしたＴ細胞応答のＴヘルパー１（Ｔｈ１）およびＴｈ２−非対称性（skewing）を間接的に比較するために、ＮＳ３特異的ＩｇＧ１（Ｔｈ２）およびＩｇＧ２ａ（Ｔｈ１）抗体のレベルを分析した（図１０）。アジュバントを用いてまたは用いずにｒＮＳ３で免疫したＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比は、マウスハプロタイプにかかわらず、常に＜１であり、Ｔｈ２優勢応答を示していた。対照的に、ｗｔＮＳ３（野生型ＮＳ３）、ｗｔＮＳ３／４ＡまたはｃｏＮＳ３／４Ａ含有プラスミドで筋内免疫したマウスは、＞１であるＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比により立証されるＴｈ１に傾いたＴｈ細胞応答を有した（図１０）。したがってコドン最適化は、ＩｇＧサブクラス分布を変えなかった。遺伝子銃を用いてＮＳ３／４ＡでＢＡＬＢ／ｃマウスを遺伝子免疫した場合、サブクラス比は混合型のＴｈ１／Ｔｈ２応答を示唆した（図１０）。ネイティブプラスミドと比較して、コドン最適化プラスミドはＢ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激能力増大を示さなかったが、これは何らの主要免疫刺激モチーフも失われておらず、導入もされていないことを示唆する、ということに留意すべきである。
【００６８】
ＳＦＶを用いた免疫は、Ｔｈ１−または混合Ｔｈ１／Ｔｈ２−様アイソタイプ分布をプライミングした。ｗｔＮＳ３／４Ａ−ＳＦＶ免疫後の抗ＮＳ３  ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比は、異なる実験間で２．４〜２０の範囲であったが、これはＴｈ１様応答の証拠を提示する。これは、Ｔｈ−１に傾いたＩｇＧサブクラス分布が観察されたＳＦＶベクターを用いた以前の経験と類似する。
【００６９】
以下の実施例は、タンパク質分解性開裂部位を欠く突然変異体ＮＳ３／４ＡペプチドがＮＳ３に対する免疫応答を引き出すか否かを判定するために実施した実験を記載する。
【実施例３】
【００７０】
ＮＳ３／４Ａの免疫原性増強が専らＮＳ４Ａの存在に起因するか否か、あるいはＮＳ３／４Ａ融合タンパク質がさらにＮＳ３／４Ａ接合部で切断される必要があるか否かを試験するために、別の組の実験を実施した。第一の実験では、ＮＳ３−ｐＶＡＸ、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸおよび突然変異体ＮＳ３／４Ａ構築物の免疫原性を、Ｂａｌｂ／ｃマウスで比較した。マウスを上記のように０週目に免疫し、２週間後、全マウスを採血して、１：６０の血清希釈液でのＮＳ３に対する抗体の存在を判断した（表３）。４週目にマウスを再び採血した。表３に示したように、全構築物が免疫応答を誘導した；例えば突然変異体構築物ＮＳ３／４Ａ−ＴＧＴ−ｐＶＡＸベクターは、ＮＳ３−ｐＶＡＸベクターに匹敵した（４／１０対０／１０；ＮＳ、フィッシャーの正確確率検定）。しかしながらＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸベクターは突然変異体構築物より強力であった。
【００７１】
【表３】
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【００７２】
感染の慢性期中、ＨＣＶは肝細胞中で複製し、そして肝臓内に広がる。慢性および持続性ウイルス感染と闘う場合の主要因子は、細胞媒介性免疫防御系である。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球はＨＣＶ感染の慢性期中に肝臓に浸潤するが、しかしそれらはウイルスを除去することまたは肝臓損傷を予防することができない。さらに持続性ＨＣＶ感染は、肝細胞癌（ＨＣＣ）の開始に関連づけられる。以下の実施例は、ＮＳ３、ＮＳ３／４ＡおよびＭＳＬＦ１構築物がＮＳ３に対するＴ細胞媒介性免疫応答を引き出し得るか否かを判定するために実施した実験を記載する。
【実施例４】
【００７３】
上記の構築物がＮＳ３に対する細胞媒介性応答を誘導し得るか否かを試験するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖検定を実施した。この目的のために、ＮＳ３／４Ａ遺伝子で安定的にトランスフェクトされたＳＰ２／０腫瘍細胞株（ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞株（Ｈ−２d））を作製した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Sigma Chemicals, St Louis, MO）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１ｍＭの非必須アミノ酸、５０μＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム(GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)を補足したＤＭＥＭ培地中に、ＳＰ２／０細胞を保持した。ＮＳ３／４Ａ遺伝子を含有するｐｃＤＮＡ３．１プラスミドを、ＢｇｌＩＩ消化により線状化した。総計５μｇの線状化プラスミドＤＮＡを６０μｇのトランスフェクション試薬（Superfect, Qiagen, Germany）と混合し、混合物を３５ｍｍ皿中のＳＰ２／０細胞の５０％集密的細胞単層（confluent layer）に付加した。メーカーのプロトコルに従って、トランスフェクション手法を実施した。
【００７４】
希釈を制限することによりトランスフェクトされた細胞をクローニングし、１４日後、８００μｇのジェネテシン（Ｇ４１８）／ｍｌ完全ＤＭＥＭ培地の付加により選抜した。ＰＣＲおよびＲＴＰＣＲにより、および／またはＮＳ３に対するモノクローナル抗体を用いた捕捉ＥＩＡにより、安定的なＮＳ３／４Ａ発現ＳＰ２／０クローンを同定した。マウスＮＳ３抗体の検出のための全ＥＩＡを、本質的には以下のように実施した：要するに、ｒＮＳ３（大腸菌中で産生され、ＰＢＳに対して一晩透析され、滅菌濾過された組換えＮＳ３タンパク質）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中に１μｇ／ｍｌで、９６ウエルマイクロタイタープレート（Nunc, Copenhagen, Denmark）に４℃で一晩、受動的に吸着させた。次に、＋３７℃で１時間、ＰＢＳ、２％ヤギ血清および１％ウシ血清アルブミンを含有する希釈緩衝液を用いたインキュベーションにより、プレートをブロックした。次に１：６０から始まるマウス血清の連続希釈液を、プレート上で１時間インキュベートした。アルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Sigma cellproducts, Saint Louis, Missouri USA）と、その後の基質ｐＮＰＰ（１錠／５ｍｌの１Ｍジエタノールアミン緩衝液＋０．５ｍＭのＭｇＣｌ2）の付加により、結合マウス血清抗体を検出した。１ＭのＮａＯＨの付加により反応を停止した。次に吸光度を４０５ｎmで読取った。
【００７５】
次にＳＰ２／０およびＮＳ３／４Ａ−ＳＰ２／０細胞株のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖動態を、Ｂａｌｂ／ｃマウスで評価した。マウスの右脇腹に２×１０6個の腫瘍細胞を皮下注射した。毎日、皮膚を通して腫瘍のサイズを測定した。２つの細胞株の増殖動態は類似していた。平均腫瘍サイズは、例えば任意の時点での２つの細胞株間で異ならなかった（表４参照）。
【００７６】
【表４】
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【００７７】
以下の実施例は、ＮＳ３／４Ａ構築物で免疫したマウスがＮＳ３に対するＴ細胞応答を発現したか否かを判定するために実施した実験を記載する。
【実施例５】
【００７８】
Ｔ細胞応答がＮＳ３／４Ａ免疫により誘導されるか否かを調べるために、ＮＳ３発現腫瘍細胞株を攻撃する免疫マウスの免疫防御系の能力を検定した。Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＳＰ２／０骨髄腫細胞株の腫瘍増殖のｉｎ  ｖｉｖｏ抑制に関して試験するためのプロトコルは、以前に詳細に記載されている（Encke et al., J Immunol, 161: 4917-4923 (1998)）。このモデルにおける腫瘍増殖の抑制は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のプライミングに依っている。第一組の実験では、１０匹のマウスの群を、１００μｇのＮＳ３−ｐＶＡＸまたは１００μｇのＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸを用いて、月１回の間隔で５回、筋内免疫した。最終免疫の２週間後、２×１０6個のＳＰ２／０またはＮＳ３／４Ａ−ＳＰ２／０細胞を各マウスの右脇腹に注入した。２週間後、マウスを屠殺し、最大腫瘍サイズを測定した。ＮＳ３−ｐＶＡＸ免疫マウスにおける平均ＳＰ２／０およびＮＳ３／４Ａ−ＳＰ２／０腫瘍サイズ間に差は認められなかった（表５参照）。
【００７９】
【表５】
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【００８０】
異なるＮＳ３含有組成物の投与が細胞媒介性免疫応答の誘発に影響を及ぼすか否かを分析するために、マウスをＰＢＳ、ｒＮＳ３、対照ＤＮＡまたはＮＳ３／４Ａ構築物で免疫し、上記のように腫瘍サイズを測定した。ＮＳ３／４Ａ構築物は、腫瘍サイズの統計学的に有意の低減を引き起こすのに十分なＴ細胞応答を誘導し得た（表６参照）。
【００８１】
【表６】
0004660195.tif 000007
【００８２】
以下の実施例は、腫瘍サイズの低減がＮＳ３特異的Ｔリンパ球の生成に起因し得るか否かを判定するために実施したさらなる実験を記載する。
【実施例６】
【００８３】
次の組の実験では、ＳＰ２／０またはＮＳ３／４Ａ−ＳＰ２／０腫瘍増殖の抑制もまた、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ免疫Ｂａｌｂ／ｃマウスで評価した。ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸプラスミドで免疫したマウスにおいて、ＮＳ３／４Ａ−ＳＰ２／０腫瘍細胞の増殖は、非トランスフェクト化ＳＰ２／０細胞の増殖と比較して、有意に抑制された（表７参照）。したがって、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ免疫は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＮＳ３／４Ａを発現する細胞の増殖を抑制するＣＴＬを誘導する。
【００８４】
【表７】
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【００８５】
別の組の実験では、ＮＳ３／４Ａ発現ＳＰ２／０腫瘍増殖の抑制を、ＭＳＬＦ１−ｐＶＡＸ免疫Ｂａｌｂ／ｃマウスで評価した。要するに、マウスの群を、０、４、８、１２および１６週目に、遺伝子銃を用いて異なる免疫原（４μｇのプラスミド）で免疫した。最終免疫後２週間目に、約２×１０6個のＮＳ３／４Ａ発現ＳＰ２／０細胞をマウスの右脇腹に皮下注射した。次に７、１１および１３日目に、皮膚を通して腫瘍サイズを測定することにより、腫瘍増殖の動態を観察した。平均腫瘍サイズを算定し、群をマン−ホイットニーノンパラメトリック検定を用いて比較した。１４日目に、全マウスを屠殺した。
【００８６】
１回だけの免疫後、腫瘍抑制応答を観察した（図２および表８参照）。２回免疫後、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸおよびＭＳＬＦ１−ｐＶＡＸプラスミドはともに、腫瘍抑制応答をプライミングした（図３および表９参照）。しかしながらネイティブＮＳ３／４Ａ遺伝子と比較して、ＭＳＬＦ１遺伝子で免疫したマウスにおいては、腫瘍は有意に小さかった。３回注射後、両プラスミドは、匹敵する腫瘍抑制応答を有効にプライミングした（図４および表１０参照）。これらの実験は、ＭＳＬＦ−１遺伝子が、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸと比較してｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍抑制免疫応答をより効率的に活性化するという証拠を提供した。
【００８７】
【表８】
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【００８８】
【表９】
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【００８９】
【表１０】
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【００９０】
以下の実施例は、ＮＳ３に対する細胞媒介性応答を誘導するに際しての種々のＮＳ３含有組成物の効率を分析するために実施した実験を記載する。
【実施例７】
【００９１】
ＮＳ３特異的Ｔ細胞がＮＳ３／４Ａ免疫により引き出されるか否かを判定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞溶解検定を用いた。検定は、以前に詳細に記載されている（Sallberg et al., J. Virol. 71: 5295 (1997)）。第一組の実験では、５匹のＢａｌｂ／ｃマウスからなるグループに対して、１００μｇのＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸを用いて３回、筋内免疫した。最終注射の２週間後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を収穫した。３×１０6個の脾臓細胞および３×１０6個のＮＳ３／４Ａ−ＳＰ２／０細胞による再刺激培養を設定した。５日後、標的としてＮＳ３／４Ａ−ＳＰ２／０またはＳＰ２／０細胞を用いて、標準51Ｃｒ放出検定を実施した。本発明の特異的溶解を、ＮＳ３／４Ａ−ＳＰ２／０細胞の溶解およびＳＰ２／０細胞の溶解間の比として算定した。ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸで免疫したマウスは、２０：１のエフェクター対標的比を用いた際には、５匹の試験したマウスのうちの４匹において１０％を上回る特異的溶解を示した（図５Ａおよび図５Ｂ参照）。
【００９２】
次の組の実験では、ＭＳＬＦ１−ｐＶＡＸおよびＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸに対するＴ細胞応答を比較した。Ｈ−２ｂ制限ＮＳ３エピトープは以前にマッピングされていたため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出可能ＣＴＬをプライミングする２つのプラスミドの能力をＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて評価した。マウスの群を２つのプラスミドで免疫し、ペプチド被覆Ｈ−２ｂ発現ＲＭＡ−Ｓ細胞またはＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞を用いて、ＣＴＬをｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出した。要するに、５Ｕ／ｍｌの組換えマウスＩＬ−２（ｍＩＬ−２；R&D Systems, Minneapolis, MN）を最終容積１２ｍｌで含有する２５ｍｌフラスコ中で５日間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を実行した。再刺激培養は、総計４０×１０6個の免疫脾臓細胞およびＮＳ３／４Ａタンパク質を発現する２×１０6個の放射線照射（１０，０００ｒａｄ）同系のＳＰ２／０細胞を含有した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の５日後、標準51Ｃｒ放出検定を実施した。エフェクターを収穫し、総容積２００μｌ中で、９６ウエルＵ底プレート中で４時間51Ｃｒ検定を実施した。総計１×１０6個の標的細胞を２０μｌの51Ｃｒ（５ｍＣｉ／ｍｌ）で１時間標識し、次にＰＢＳ中で３回洗浄した。５×１０3個の51Ｃｒ標識標的細胞／ウエルを用いて、４０：１、２０：１および１０：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で、細胞傷害性活性を測定した。
【００９３】
あるいはペプチド免疫後１２日目にＣ５７ＢＬ／６マウスから脾臓細胞を採取し、１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１ｍＭの非必須アミノ酸、５０μＭのβ−メルカプトエタノールおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補足したＲＰＭＩ  １６４０培地中に再懸濁した。２５×１０6脾臓細胞および２×１０6照射（２０００  ｒａｄ）同系脾細胞を含入する総容量１２ｍｌで、２５ｍｌフラスコ中にて５日間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を実行した。０．０５μＭのＮＳ３／４Ａ Ｈ−２Ｄb結合ペプチド（配列ＧＡＶＱＮＥＶＴＬ、配列番号３７）または対照ペプチド Ｈ−２Ｄbペプチド（配列ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ、配列番号３８）の存在下で、再刺激を実施した。５日後、51Ｃｒ放出検定を実施した。ＲＭＡ−Ｓ標的細胞を、51Ｃｒ標識前に＋３７℃で１．５時間、５０μＭのペプチドでパルス処理し、次にＰＢＳ中で３回洗浄した。エフェクター細胞を収穫し、４時間51Ｃｒ検定を上記と同様に実施した。５×１０3個の51Ｃｒ標識標的細胞／ウエルを用いて、６０：１、２０：１および７：１のＥ：Ｔ比で、細胞傷害性活性を確定した。これらの検定により、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸベクターと比較して、ＭＳＬＦ１遺伝子はより高レベルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ溶解活性をプライミングすることが明らかになった（図６Ａ〜図６Ｌ参照）。ペプチド被覆Ｈ−２ｂ発現ＲＭＡ−Ｓ細胞およびＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞の両方を用いて、同様の結果を得た。
【００９４】
フローサイトメトリーを用いて、コドン最適化ＭＳＬＦ１遺伝子がＮＳ３特異的ＣＴＬをネイティブＮＳ３／４Ａ遺伝子より有効にプライミングする、という付加的証拠を得た。組換え可溶性二量体マウスＨ−２Ｄb：Ｉｇ融合タンパク質を用いたＮＳ３／４Ａ  ＤＮＡ免疫マウスからの脾臓細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ染色により、ＮＳ３／４Ａ−ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を分析した。本明細書中に記載したモノクローナル抗体およびＭＨＣ：Ｉｇ融合タンパク質の多くは、BDB Pharmingen（San Diego, CA）から購入した；抗ＣＤ１６／ＣＤ３２（Ｆｃ−ブロック（商標）、クローン２．４Ｇ２）、ＦＩＴＣ接合抗ＣＤ８（クローン５３−６．７）、ＦＩＴＣ接合抗Ｈ−２Ｋb（クローンＡＦ６−８８．５）、ＦＩＴＣ接合抗Ｈ−２Ｄb（クローンＫＨ９５）、組換え可溶性二量体マウスＨ−２Ｄb：Ｉｇ、ＰＥ接合ラット−αマウスＩｇＧ１（クローンＸ５６）。
【００９５】
１００μｌのＰＢＳ／１％ＦＣＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中に再懸濁した約２×１０6個の脾臓細胞を、１μｇ／１０6細胞のＦｃ遮断抗体とともに氷上で１５分間インキュベートした。次にそれらの細胞を、過剰量の６４０ｎＭ ＮＳ３／４Ａ由来ペプチドで＋４℃で４８時間前負荷した２μｇ／１０6細胞のＨ−２Ｄb：Ｉｇ（配列ＧＡＶＱＮＥＶＴＬ、配
列番号３７）、または２μｇ／１０6細胞の非負荷Ｈ−２Ｄb：Ｉｇ融合タンパク質とともに、氷上で１．５時間インキュベートした。次に細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、１０μｌ／１００μｌのＰＥ接合ラット−αマウスＩｇＧ１二次抗体を含有するＦＡＣＳ緩衝液１００μｌ中に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。次に細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、１μｇ／１０6細胞のＦＩＴＣ接合α−マウスＣＤ８抗体とともに３０分間インキュベートした。次に細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、０．５μｇ／ｍｌのＰＩを含有するＦＡＣＳ緩衝液０．５ｍｌ中に再懸濁した。各試料からの約２００，０００事象をＦＡＣＳCalibur（BDB）で獲得し、死細胞（ＰＩ陽性細胞）を分析から排除した。
【００９６】
ＦＡＣＳ分析により特異的ＣＴＬを定量することの利点は、それが、分析に先だってＣＴＬのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖の考え得る欠点を回避する、という点である。ＮＳ３−ペプチド負荷二価Ｈ−２Ｄb：Ｉｇ融合タンパク質分子を用いたＮＳ３特異的ＣＴＬの直接的ｅｘ−ｖｉｖｏ定量により、コドン最適化ＭＳＬＦ−１遺伝子は２回の免疫後すでに有効にプライミングされたＮＳ３特異的ＣＴＬをプライミングするが、一方、本来のＮＳ３／４Ａ遺伝子はプライミングしないということが明らかとなった（表）。したがって最適化ＭＳＬＦ−１遺伝子は、本来のＮＳ３／４Ａ遺伝子と比較した場合、試験した全てのパラメーターにおいてより高い頻度およびより良好な機能性を有するＮＳ３特異的ＣＴＬを有効にプライミングする。以下の実施例は、コドン最適化ＮＳ３／４ＡがＮＳ３特異的細胞傷害性Ｔ細胞を効率的にプライミングするというさらなる証拠を提供する。
＜実施例７Ａ＞
【００９７】
最初に、ｗｔＮＳ３、ｗｔＮＳ３／４ＡおよびｃｏＮＳ３／４Ａ発現プラスミドを用いて、遺伝子銃免疫によりプライミングされ得るＮＳ３特異的ＣＴＬの頻度を測定した。ｃｏＮＳ３／４Ａプラスミドは、ｗｔＮＳ３遺伝子と比較して、ＮＳ３特異的ＣＴＬ前駆体をより高い頻度でプライミングしたが、これはＮＳ４Ａの重要性を強く示すものである（図１１）。ＣＴＬ前駆体頻度の統計学的差は、ｅｘ  ｖｉｖｏで直接的に分析した場合、ｗｔＮＳ３／４ＡおよびｃｏＮＳ３／４Ａ発現プラスミド間には認められなかった（図１１）。ｃｏＮＳ３／４ＡプラスミドまたはｗｔＮＳ３／４Ａ−ＳＦＶによる１回の免疫は、免疫から２週間以内にペプチド特異的ＣＴＬの約１％をプライミングした（図１１）。ＮＳ３特異的ＣＴＬの検出の特異性を、ＮＳ３−ペプチドを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで５日間の再刺激により確証したが、これにより、ｃｏＮＳ３／４Ａ遺伝子による免疫後に高頻度で前駆体が観察された（図１１）。
【００９８】
異なるベクターによりプライミングされたＮＳ３特異的ＣＴＬのｉｎ  ｖｉｔｒｏ溶解活性を直接比較するために、標準51Ｃｒ放出検定を１回または２回免疫後に実施した。ｉｎ  ｖｉｖｏでプライミングされたＣＴＬの溶解活性を、ＮＳ３−ペプチド負荷Ｈ−２Ｄb発現ＲＭＡ−Ｓ細胞およびＮＳ３／４Ａを安定的に発現するＥＬ−４細胞の両方で検定した。１回投与後、ｃｏＮＳ３／４ＡプラスミドおよびｗｔＮＳ３／４Ａ−ＳＦＶベクターは、ＮＳ３−ペプチド被覆標的細胞を溶解したＣＴＬのプライミングに際して、ｗｔＮＳ３／４Ａプラスミドより明らかに効率的であった（図１２）。このように、ＣＴＬプライミング事象は、ＮＳ３／４Ａ遺伝子のコドン最適化またはｍＲＮＡ増幅により増大した。おそらく、この検定は感受性が低いため、ＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞を用いた場合の差はさほど明白ではなかった（図１２）。２回の免疫後、全てのＮＳ３／４Ａベクターは同様の効率でＮＳ３特異的ＣＴＬをプライミングするように思われた（図１２）。しかしながらＮＳ３／４Ａ含有ベクターのいずれかによる２回の免疫は、ｗｔＮＳ３遺伝子のみを含有するプラスミドと比較して、ＮＳ３特異的ＣＴＬをプライミングするに際して明らかにより効率的であり（図１２）、これは、ＣＴＬ前駆体分析および以前の観察と完全に一致する。このようにＮＳ３／４Ａ遺伝子のコドン最適化またはｍＲＮＡ増幅は、ＮＳ３特異的ＣＴＬをより迅速にプライミングする。
【００９９】
ＳＰ２／０骨髄腫細胞を用いたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、あるいはＨＣＶウイルス抗原を発現するＥＬ−４リンパ腫細胞を用いたＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖の抑制の分析は、ｉｎ  ｖｉｖｏ機能性ＨＣＶ特異的免疫応答を意味することが、当業者により認識されている（Encke J et al., J Immunol 161: 4917-4923 (1998)参照）。ＮＳ３／４Ａを安定に発現するＳＰ２／０細胞株は、以前に記載されており（Frelin L et al., Gene Ther 10: 686-699 (2003)参照）、ＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞株は、下記のように特徴付けされた。
【０１００】
ＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞株を用いた腫瘍増殖の抑制がＮＳ３／４Ａ特異的免疫応答に完全に依存している、ということを確証するために、対照実験を実施した。１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群を、非免疫のままか、またはｃｏＮＳ３／４Ａプラスミドで２回免疫した。最終免疫の２週間後、１０6個のネイティブＥＬ−４またはＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞（ＮＳ３／４Ａ−ＥＬ−４）を、皮下注射によってマウスにチャレンジした。ＮＳ３／４Ａ−ＥＬ−４細胞株の増殖に対して免疫マウスのみが保護されたことから、ＮＳ３／４Ａ特異的免疫応答は保護のために必要であった（図１３）。したがってこのＨ−２b制限モデルは、ＳＰ２／０  Ｈ−２b制限モデルと同様に振舞う。
【０１０１】
組換えＮＳ３タンパク質による免疫は、ＮＳ３／４Ａ特異的Ｂ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方が腫瘍増殖に対する防御においてきわめて重要であるというわけではない、という証拠を提供した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系でのｃｏＮＳ３／４Ａプラスミド免疫Ｈ−２bマウスからの脾臓細胞のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が51Ｃｒ放出検定における主要エフェクター細胞である、という証拠を提供した。ｉｎ  ｖｉｖｏ機能性抗腫瘍エフェクター細胞集団を明らかにするために、ＮＳ３／４Ａ−ＥＬ−４腫瘍細胞株チャレンジの１週間前および最中にｃｏＮＳ３／４Ａプラスミドで免疫したマウスにおいて、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に枯渇させた。フローサイトメトリーによる分析は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の８５％がそれぞれ枯渇していた、ということを明示した。この実験は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇は腫瘍免疫性に有意の作用を及ぼさない、ということを明示した（図１３）。対照的に、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇は、腫瘍免疫性を有意に低下させた（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ；図１３）。したがって予測どおり、ＮＳ３／４Ａ特異的ＣＤ８＋ＣＴＬは、腫瘍増殖の抑制に関するｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおけるエフェクター段階での主要防御細胞であると思われる。
【０１０２】
次に、腫瘍チャレンジモデルを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＳ３／４Ａ−ＥＬ−４腫瘍細胞の増殖に対する防御免疫をプライミングするに際して異なる免疫原がいかに有効であるかを評価した。プライミング事象の有効性が試験されたことを保証するために、全てのマウスを１回だけ免疫した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＴＬデータと完全に一致して、空のｐＶＡＸプラスミドで免疫した場合と比較して、ＮＳ３／４Ａを含有するベクターのみが防御的免疫応答を迅速にプライミングし得る、ということをわれわれは見出した（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ；図１４）。しかしながらこれは、ＮＳ４Ａに依存していたが、しかしコドン最適化またはｍＲＮＡ増幅とは無関係であり、このことは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスが遺伝子免疫を用いて腫瘍増殖から全く容易に保護される、ということを示唆する。
【０１０３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ防御的ＣＤ８＋ＣＴＬ応答のプライミングのための必要前提条件をさらに明らかにするために、さらなる実験を実施した。まず、ＮＳ３由来ＣＴＬペプチドで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスは、ＮＳ３／４Ａ−ＥＬ−４腫瘍の増殖に対して防御されなかった（図１４）。第二に、アジュバント中の組換えＮＳ３による免疫は、腫瘍増殖を防御しなかった（図１４）。ＮＳ３由来ＣＴＬペプチドはＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣＴＬを有効にプライミングし、アジュバント中のｒＮＳ３は高レベルのＮＳ３特異的Ｔヘ
ルパー細胞をプライミングする。したがってＮＳ３／４Ａの内因性産生は、ｉｎ  ｖｉｖｏで防御的ＣＴＬをプライミングするために必要であると思われる。プライミング事象をさらに特徴付けするために、Ｂ細胞の群（μＭＴ）またはＣＤ４欠損Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、遺伝子銃を用いてｃｏＮＳ３／４Ａ遺伝子で１回免疫し、２週間後にチャレンジした（図１４）。両系列はともに腫瘍増殖から保護されたため、Ｂ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ機能性ＮＳ３／４Ａ特異的ＣＴＬのプライミングにとって必要がなかった、と結論づけた（図１４）。要するに、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍防御性ＮＳ３／４Ａ特異的ＣＴＬのプライミングには、ＮＳ４Ａ、ならびに免疫原の内因性発現が必要である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、プライミングは、遺伝子送達経路または補助細胞、例えばＢ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞にあまり依存しない。ｃｏＮＳ３／４Ａ  ＤＮＡプラスミドによるｉｎ  ｖｉｖｏ機能性ＣＴＬのプライミングはＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞に無関係であったという事実は、プライミングが生じた速度を説明するのに役立ち得る。
【０１０４】
ＮＳ３／４Ａ−ＥＬ−４細胞株を用いたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける反復実験は、腫瘍増殖に対する防御は、コドン最適化またはｍＲＮＡ増幅とは無関係に、ＮＳ３／４Ａ遺伝子による最初の免疫後すでに得られる、ということを示した。さらにまた２回注入後、ＮＳ３／４Ａ−ＥＬ−４腫瘍増殖に対する免疫性はさらに増強されたが、しかしＮＳ４Ａが存在した場合のみであった。したがってこのモデルは、異なる免疫原の内在性免疫原性における微妙な差を明示するのに十分なほど高感度であるというわけではない。
【０１０５】
ｗｔＮＳ３／４ＡおよびｃｏＮＳ３／４Ａ  ＤＮＡプラスミドの免疫原性をより良好に比較するために、Ｈ−２bマウスにおいてさらなる実験を実施したが、この場合、少なくとも２回の免疫が、腫瘍防御免疫のために必要であると思われた。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＮＳ３／４Ａ遺伝子を用いた遺伝子銃免疫後に得られるＩｇＧサブクラス分布は混合型Ｔｈ１／Ｔｈ２様応答を示した、ということを思い起こすことは重要である。したがって、Ｔｈ２傾向ＢＡＬＢ／ｃマウス株におけるＴｈ２様免疫経路（遺伝子銃）は、ｉｎ
ｖｉｖｏにおいて、有効なＣＴＬ応答をプライミングする能力を弱める可能性があった。
【０１０６】
１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、遺伝子銃を用いて４μｇのそれぞれのＤＮＡプラスミドで、１回、２回または３回免疫した（図１５）。最終注入後２週間目に、マウスにチャレンジを行った。したがって、これらの実験は、ｃｏＮＳ３／４Ａプラスミドが、野生型プラスミドより迅速にｉｎ  ｖｉｖｏ機能性ＮＳ３／４Ａ特異的腫瘍抑制免疫をプライミングする、というさらなる証拠を提供した（図１５）。ｃｏＮＳ３／４Ａの２回投与は、ｗｔＮＳ３／４Ａプラスミドと比較して、有意により良好にＮＳ３／４Ａ特異的腫瘍抑制免疫をプライミングした（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ；図１５）。３回投与後、腫瘍抑制免疫は同一であった。したがって上記のデータは、ＮＳ３／４Ａ遺伝子のコドン最適化がＮＳ３特異的ＣＴＬをより迅速にプライミングする、ということを立証した。
【０１０７】
本明細書中に記載したように、ＮＳ３／４Ａ遺伝子は、ワクチンとして用いられ得る。ＮＳ３／４Ａはｉｎ  ｖｉｖｏで機能性ＣＴＬを迅速にプライミングすることが確定されたが、しかし腫瘍細胞の注入後の治療的免疫の効果を次に分析した。１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群に１０6個のＮＳ３／４Ａ−ＥＬ−４腫瘍細胞をチャレンジした。１群を腫瘍チャレンジ後６日目に４μｇのｃｏＮＳ３／４Ａで経皮的に免疫感作し、別の群を１２日目に免疫感作した。治療的ワクチン接種後、両群は、非免疫対照群と比較して、有意に小さい腫瘍を有した（それぞれｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ；図１６）。これは、ワクチンがＣＴＬを迅速にプライミングし、ＣＴＬがＮＳ３／４Ａ発現腫瘍に向かって進み、そして浸潤し得る、ということを確証する。したがってｃｏＮＳ３／４Ａプラスミドを用いた遺伝子銃免疫は、治療用ワクチンとしても機能する。即ち、ＮＳ３／４Ａ発現腫瘍細胞
の接種後６〜１２日目のｃｏＮＳ３／４Ａ遺伝子を用いた遺伝子銃免疫は、腫瘍増殖を有意に抑制した。全体的に見て、ｉｎ  ｖｉｖｏで機能的であるＨＣＶ  ＮＳ３特異的免疫応答の迅速なプライミングは、コドン最適化遺伝子を用いたＤＮＡベースの免疫により、またはＳＦＶレプリコンによるｍＲＮＡ増幅によりもたらされる。これらのアプローチを用いることにより、慢性ＨＣＶ感染の治療および予防のための非常に有効なワクチンを調製し得る。次の実施例では、本明細書中に記載した実験に用いられる材料および方法のいくつかをより詳細に記載した。
＜実施例７Ｂ＞
【０１０８】
マウス
近交系ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）およびＣ５７／ＢＬ６（Ｈ−２b）マウスは、営利業者（Mollegard, Denmark）から入手した。Ｂ細胞（μＭＴ）欠損マウスは、カリン・サンドステッド（Karin Sandstedt）博士（カロリンスカ研究所（Karolinska Institutet）、Sweden）の懇意により提供された。ＣＤ４欠損Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、カロリンスカ研究所、微生物学および腫瘍生物学センター（Microbiology and Tumorbiology Centre）の繁殖施設から入手した。全マウスが雌であり、実験開始時に４〜８週齢で用いた。
【０１０９】
組換えＮＳ３  ＡＴＰアーゼ／ヘリカーゼドメインタンパク質
組換えＮＳ３（ｒＮＳ３）タンパク質は、ダレル・Ｌ．ピーターソン氏（Darrell L., Peterson）（Department of Biochemistry, Commonwealth University, VA）の懇意により提供された。大腸菌中での組換えＮＳ３タンパク質（ＮＳ４Ａを含まない）の産生は、当該技術分野で記載されている。使用前に、ｒＮＳ３タンパク質をＰＢＳに対して一晩透析し、滅菌濾過した。
【０１１０】
合成コドン最適化（ｃｏ）ＮＳ３／４Ａ遺伝子の生成
前に単離され、シーケンシングされた固有のｗｔＮＳ３／４Ａ遺伝子の配列について、ヒト細胞において最も一般的に用いられるコドンに関してコドン使用頻度を分析した。総計４３５ヌクレオチドを置き換えて、ヒト細胞のためのコドン使用頻度を最適化した。全長合成ｃｏＮＳ３／４Ａ遺伝子の生成のために、配列をRetrogen Inc（San Diego, CA）に送付した。ｃｏＮＳ３／４Ａ遺伝子は、ＨＣＶ−１参考株のヌクレオチド位置３４１７〜５４７５の領域と７９％の配列相同性を有した。総計４３３ヌクレオチドが異なった。アミノ酸レベルでは、ＨＣＶ−１株との相同性は９８％であった（１５アミノ酸が異なった）。
【０１１１】
全長コドンは、ＮＳ３およびＮＳ４Ａを包含するアミノ酸１００７〜１７１１に対応するＨＣＶゲノム型１ｂの２．１ｋｂ  ＤＮＡ断片を最適化した。ＮＳ３／ＮＳ４Ａ遺伝子断片をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ消化ｐＶＡＸベクター（Invitrogen, San Diego）中に挿入して、ｃｏＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸプラスミドを得た。発現構築物をシーケンシングして、正確な配列およびリーディングフレームを保証した。タンパク質発現をｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および翻訳検定により分析した。プラスミドを、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌（Invitrogen）中で増殖させた。メーカーの使用説明書（Qiagen GmbH, Hilden, FRG）に従って、QiagenＤＮＡ精製カラムを用いることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏ注入用に用いたプラスミドＤＮＡを精製した。その結果生じたプラスミドＤＮＡの濃度を分光光度的に確定した（Dynaquant, Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）。精製ＤＮＡを１ｍｇ／ｍｌの濃度で滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解した。
【０１１２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳検定
ｗｔＮＳ３／４ＡおよびｃｏＮＳ３／４Ａ遺伝子が無傷であり、そして翻訳され得る、ということを保証するために、原核生物Ｔ７結合網状赤血球溶解物系を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写検定（ＴＮＴ；Promega, Madison, WI）を実施した。２つのプラスミドからの
翻訳効率を比較するために、ＴＮＴ検定への付加の前に、投入ＤＮＡ量を連続希釈（６ｎｇ〜１ｎｇ）で希釈した。
【０１１３】
一過性トランスフェクション
標準プロトコルにより、ＨｅｐＧ２細胞を一過的にトランスフェクトした。要するに、ＨｅｐＧ２細胞を、トランスフェクト前日にＤＭＥＭ倍地中の２．５ｃｍ2ウエル中に入れた（０．５×１０6）。Ｆｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬（Roche）を用いてＨｅｐＧ２細胞中に、各プラスミドＤＮＡ構築物（ｗｔＮＳ３／４ＡおよびｃｏＮＳ３／４Ａ）２μｇをトランスフェクトした。トランスフェクション後、ＨｅｐＧ２細胞を２４〜４８時間インキュベートした。
【０１１４】
タンパク質試料の調製および分析
免疫沈降とその後のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、細胞溶解物を分析した。要するに、一過的にトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞をＲＩＰＡ緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス、１％トリトン−Ｘ１００、１％デオキシコール酸ナトリウムおよび１％ＳＤＳ）中で溶解した。細胞溶解物をプロテインＡセファロースおよび抗ＮＳ３ポリクローナル抗体とともに４℃で一晩免疫沈降させた。洗浄ペレットをＳＤＳ試料緩衝液中に再懸濁して、１００℃で５分間加熱した後、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Invitrogen）上でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析し、そしてニトロセルロース膜上にエレクトロトランスファーした。
【０１１５】
ＮＳ３タンパク質発現の分析
化学発光結合ウエスタンブロットキット（WesternBreeze; Invitrogen）を用いることにより、メーカーのプロトコルに従って、ＮＳ３タンパク質の検出を実行した。ＮＳ３特異的ポリクローナル抗体を用いて、化学発光シグナルとしてＮＳ３タンパク質発現を検出し、定量した。GeneGnome（Syngene, Cambridge, UK）を用いて、化学発光シグナルを検出した。化学発光ウエスタンブロットの定量をGeneGnomeで実施し、各タンパク質バンドからの強度の単位を算定し、ｒＮＳ３の標準曲線と比較した。
【０１１６】
セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）ベクター
仔ハムスター腎（ＢＨＫ）−２１細胞を、５％ＦＣＳ、１０％トリプトースリン酸ブロス、２ｍＭのグルタミン、２０ｍＭのＨｅｐｅｓおよび抗生物質（ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌおよびペニシリン１００  ＩＵ／ｍｌ）を補足した完全ＢＨＫ培地中にて維持した。
【０１１７】
ｗｔＮＳ３／４Ａ遺伝子を、ＰＣＲによりＳｐｅ１−ＢＳｔＢ１断片として単離し、キャプシドの３４アミノ酸長翻訳エンハンサー配列およびその後に続くＦＭＤＶ２ａ切断ペプチドを含有するｐＳＦＶ１０ＥｎｈのＳｐｅ１−ＢｓｔＢ１部位に挿入した。２−ヘルパーＲＮＡ系を用いて、ｒＳＦＶ粒子中への組換えＲＮＡのパッケージングを実行した。感染ＢＨＫ細胞の間接的免疫蛍光を実施して、組換えウイルスストックの力価を確定した。
【０１１８】
免疫蛍光
ＢＨＫ細胞を、リポフェクトアミンプラス試薬（Invitrogen）を用いて標準技法に従ってｃｏＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１で一過性トランスフェクトするか、またはｒＳＦＶにより感染させた。間接的免疫蛍光法により、ＮＳ３タンパク質を検出した。
【０１１９】
免疫法プロトコル
雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）またはＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２b）マウス、４〜８週齢の群（５〜１０匹のマウス／群）を、個々のまたは多数のＨＣＶタンパク質をコードするプラ
スミドＤＮＡ１００μｇの注射針注入により、免疫した。ＰＢＳ中のプラスミドＤＮＡを、前脛骨（ＴＡ）筋に筋肉内（ｉ．ｍ．）投与した。本文中に示す場合、０．９％滅菌食塩水ＮａＣｌ中の０．０１ｍＭの心臓毒（Latoxan, Rosans, France）５０μｌ／ＴＡをマウスに筋注し、５日後、ＤＮＡを免疫した。４週間間隔で、マウスに追加免疫した。
【０１２０】
遺伝子銃ベースの免疫法に関しては、メーカー（Bio−Rad Laboratories, Hercules, CA）により供給されたプロトコルに従って、プラスミドＤＮＡを金粒子（１μｍ）と連結した。免疫前に、腹部注射域を剃毛して、５００ｐｓｉのヘリウム放出圧で、メーカーのプロトコルに従って免疫した。各回につき４μｇのプラスミドＤＮＡを注入した。１ヶ月間隔で、同一用量をマウスに追加免疫した。
【０１２１】
ｒＳＦＶ粒子での免疫に関しては、１００μｌの最終容積で、ＰＢＳ中に希釈した１×１０7個のウイルス粒子（ｗｔＮＳ３／４Ａ−ＳＦＶ）を用いて、尾の基部でマウスを皮下免疫した。完全フロイントアジュバント中に１：１で混合したペプチド１００μｇを用いて、尾の基部に皮下免疫することにより、ペプチド免疫を実施した。
【０１２２】
マウス抗ＨＣＶ  ＮＳ３抗体の検出のためのＥＬＩＳＡ
抗体検出およびアイソタイピングのための血清を、イソフルオラン麻酔したマウスの眼窩後方採血により初回免疫後２週間または４週間毎に回収した。前に記載したように、酵素免疫検定を実施した。
【０１２３】
細胞株
１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Sigma Chemicals, St Louis, MO）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１ｍＭの非必須アミノ酸、５０μＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム(GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)を補足したＤＭＥＭ培地中で、ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞株（Ｈ−２d）を維持した。ＮＳ３／４Ａの安定な発現を示すＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞を、８００μｇのゲネチシン（Ｇ４１８）／完全ＤＭＥＭ培地１ｍｌ中にて維持した。
【０１２４】
ＥＬ−４リンパ腫（Ｈ−２b）細胞を、１０％ＦＣＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１ｍＭの非必須アミノ酸、５０μＭのβ−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（GIBCO-BRL）を補足したＲＰＭＩ １６４０培地中にて培養した。SuperFect（Qiagen GmbH, Hilden, FRG）トランスフェクション試薬を用いた線状化ＮＳ３／４Ａ−ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドによるＥＬ−４細胞のトランスフェクションにより、ＮＳ３／４Ａの安定的な発現を示すＥＬ−４細胞を作出した。メーカーのプロトコルに従ってトランスフェクション手法を実施した。トランスフェクトされた細胞を限界希釈法によりクローニングし、８００μｇのゲネチシン（Ｇ４１８）／完全ＲＰＭＩ １６４０培地１ｍｌの付加により選択した。
【０１２５】
ＲＭＡ−Ｓ細胞（Klas Karre教授（カロリンスカ研究所、Sweden）の懇意による）を、５％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。全細胞を、加湿された３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター中で増殖させた。
【０１２６】
Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ枯渇
精製ハイブリドーマ上清の腹腔内注射により、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞亜集団をｉｎ  ｖｉｖｏで枯渇させた。総計０．４ｍｇ／マウス／注射の抗ＣＤ４（クローンＧＫ１．５）または抗ＣＤ８（クローン５３−６．７）を、腫瘍チャレンジの３日前、２日前お
よび１日前、ならびにチャレンジ後３、６、１０および１３日目に注射した。０、３、６、１０および１３日目の末梢血単核球細胞集団のフローサイトメトリー分析は、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の８５％より多くが枯渇したことを実証した。
【０１２７】
ＮＳ３／４Ａ発現腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｖｏチャレンジ
上記のEncke等により記載された方法に従って、免疫マウスに対するＮＳ３／４Ａ発現ＳＰ２／０骨髄腫またはＥＬ−４リンパ腫細胞株のｉｎ  ｖｉｖｏチャレンジを実施した。要するに、上記のように０、４および８週目に、異なる免疫原でＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６マウスの群を免疫した。最終免疫後２週間目に、１×１０6個のＮＳ３／４Ａ発現ＳＰ２／０またはＥＬ−４細胞を右脇腹に皮下注射した。６〜２０日目に皮膚を通して腫瘍のサイズを測定することにより、腫瘍増殖の動態を判定した。２群のマウスにおける動的腫瘍進展を、曲線下面積（ＡＵＣ）を用いて比較した。分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定を用いて平均腫瘍サイズを比較した。２０日目に、全マウスを屠殺した。
【０１２８】
ワクチンの治療効果を試験するために、上記のようにマウスの群に腫瘍細胞を接種した。６または１２日後、マウスを１回免疫した。６日目から２０日目まで、腫瘍増殖をモニタリングした。
【０１２９】
抗体およびＭＨＣ：Ｉｇ融合タンパク質
モノクローナル抗体およびＭＨＣ：Ｉｇ融合タンパク質は全て、BDB Pharmingen（San Diego, CA）から購入した；抗ＣＤ１６／ＣＤ３２（Ｆｃ−ブロック（商標）、クローン２．４Ｇ２）、ＦＩＴＣ接合抗ＣＤ８（クローン５３−６．７）、Ｃｙ−クロム接合抗ＣＤ４（クローンＲＭ４−５）、ＦＩＴＣ接合抗Ｈ−２Ｄb（クローンＫＨ９５）、組換え可溶性二量体マウスＨ−２Ｄb：Ｉｇ、ＰＥ接合ラット−αマウスＩｇＧ１（クローンＸ５６）。
【０１３０】
ＮＳ３／４Ａ特異的ＣＴＬ活性の検出
ＤＮＡまたはｒＳＦＶ免疫Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓細胞を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１ｍＭの非必須アミノ酸、５０μＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補足した完全ＲＰＭＩ １６４０培地中に再懸濁した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激は、２５ｍｌフラスコ中で、５Ｕ／ｍｌの組換えマウスＩＬ−２（ｍＩＬ−２；R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）を含有する最終容積１２ｍｌで５日間行った。再刺激培養は、総計２５×１０6個の免疫脾臓細胞、およびＮＳ３／４Ａタンパク質を発現する２．５×１０6個の放射線照射（１０，０００ｒａｄ）同系ＥＬ−４細胞を含有した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の５日後、標準51Ｃｒ放出検定を実施した。エフェクター細胞を収穫し、総容積２００μｌ中で、９６ウエルＵ底プレート中で４時間51Ｃｒ検定を実施した。総計１×１０6個の標的細胞（ＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞）を２０μｌの51Ｃｒ（５ｍＣｉ／ｍｌ）で＋３７℃で１時間標識し、次にＰＢＳ中で３回洗浄した。異なる数のエフェクターおよび51Ｃｒ標識標的細胞（５×１０3個の細胞／ウエル）を、６０：１、２０：１および７：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で、ウエルに付加した。＋３７℃で４時間のエフェクターおよび標的のインキュベーション後、細胞溶解性活性のレベルを測定した。１００μｌの上清を回収し、γ−計数器で放射能を測定した。
【０１３１】
ＤＮＡまたはｒＳＦＶ免疫マウスからの脾細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから採取し、前述の完全ＲＰＭＩ １６４０培地中に再懸濁した。要するに、２５×１０6個の脾臓細胞および２５×１０6個の放射線照射（２，０００ｒａｄ）同系脾細胞を混合することにより、５日間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を実行した。再刺激培養は、０．０５μＭのＮＳ３／４Ａ  Ｈ−２Ｄb結合ペプチド（配列ＧＡＶＱＮＥＶＴＬ（配列番号３７））の存在下で
実施した。再刺激後、51Ｃｒ標識化ペプチドパルス処理ＲＭＡ−Ｓ細胞を標的として用いて、４時間51Ｃｒ放出検定を実施した。細胞傷害性活性を、６０：１、２０：１および７：１のＥ：Ｔ比で測定した。
【０１３２】
次式に従って、結果を表した：特異的溶解％＝（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）。実験的放出は、エフェクター細胞の存在下で標的細胞により放出された平均数／分である。最大放出は、１０％トリトンＸ−１００による標的細胞の溶解後に放出された放射能である。自発的放出は、培地中への標的細胞の放射能の漏出である。
【０１３３】
４℃で３０分間、抗ＣＤ４または抗ＣＤ８、モノクローナル抗体含有ハイブリドーマ上清（クローンＲＬ１７２．４；抗ＣＤ４またはクローン３１Ｍ；抗ＣＤ８）とともにエフェクター細胞をインキュベーションすることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞枯渇実験を実行した。次に細胞を洗浄し、補体（低毒性ウサギ補体の１／２０希釈液；Saxon, UK）とともに３７℃で１時間インキュベーションした後、上記のＣＴＬ検定を実施した。
【０１３４】
フローサイトメトリーによるＮＳ３／４Ａ特異的ＣＴＬの定量
ＤＮＡまたはｒＳＦＶ免疫マウスからの脾臓細胞を前述のように組換え可溶性二量体マウスＨ−２Ｄb：Ｉｇ融合タンパク質を用いてｅｘ  ｖｉｖｏ染色することにより、ＮＳ３−ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を分析した。要するに、脾臓細胞をＰＢＳ／１％ＦＣＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中に再懸濁し、Ｆｃ遮断抗体とともにインキュベーションした。次に細胞を洗浄し、ＮＳ３／４Ａ由来ペプチドで前負荷したＨ−２Ｄb：Ｉｇとともにインキュベーションした。その後、細胞を洗浄し、ＰＥ接合ラット−αマウスＩｇＧ１抗体、ＦＩＴＣ接合α−マウスＣＤ８抗体およびＣｙ−クロムα−マウスＣＤ４抗体とともにインキュベーションした。洗浄後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有するＦＡＣＳ緩衝液中で細胞を希釈した。各試料からの約２００，０００の総事象をＦＡＣＳCalibur（BDB）で獲得し、死細胞（ＰＩ陽性細胞）を分析から除外した。
【０１３５】
統計学的分析
頻度分析のためにフィッシャーの正確確率検定を用い、２つの群からの値を比較するためにはマン−ホイットニーＵ検定を用いた。マウスの２つの群における動的腫瘍進展を、曲線下面積（ＡＵＣ）を用いて比較した。ＡＵＣ値を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて比較した。StatViewソフトウェアのマッキントッシュバージョン（バージョン５．０）を用いて、算定を行なった。
【０１３６】
次の節は、本発明のペプチド実施形態のいくつかを記載する。
【０１３７】
ＨＣＶペプチド
具体化されたＨＣＶペプチドまたはその誘導体としては、実質的には配列表に示されるような全てのアミノ酸配列のうちの主要アミノ酸配列（配列番号２〜１１および配列番号３６）、ならびに少なくとも４アミノ酸長である配列番号２〜１１および配列番号３６の断片（例えば配列番号１４〜１６）、例えば機能的に等価のアミノ酸残基が配列内の残基を置換して、サイレント変化を生じる配列変更を含有するものが挙げられるが、これらに限定されない。配列番号２〜１１および配列番号３６の配列の好ましい断片は少なくとも４つのアミノ酸であり、発見されたＮＳ３／４Ａペプチドまたはその突然変異体に固有のアミノ酸配列、例えば機能的に等価のアミノ酸残基が配列内の残基を置換して、サイレント変化を生じる配列変更を含む。ＨＣＶペプチドは、例えば少なくとも１２〜７０４アミノ酸長（例えば１２〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２５０、２５０〜５００または５００〜７０４アミノ酸長間の任意の数）であり得る。
【０１３８】
実施形態としては、上記のものと実質的に同一であるＨＣＶペプチドも挙げられる。即ち、配列番号２〜１１および配列番号３６ならびにその断片内の１つまたは複数のアミノ酸残基を有するＨＣＶペプチドは、機能的等価物として作用する同様の極性を有する別のアミノ酸により置換されて、サイレント変化を生じる。さらに、ＨＣＶペプチドは、融合によりＨＣＶペプチドの構造または機能（例えば免疫原特性）に有意な変更が生じない限り、配列番号２〜１１および配列番号３６またはその断片に融合された１または複数のアミノ酸残基を有し得る。配列内のアミノ酸残基の置換基は、アミノ酸が属するクラスの他の成員から選択され得る。例えば非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。中性極性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正荷電（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられる。負荷電（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが挙げられる。したがって、本発明のペプチド実施形態は、上記の修飾の点から見て、本質的に配列番号２〜２７および配列番号３６から成ると言える。
【０１３９】
本明細書中に記載されたＨＣＶペプチドは、当該技術分野で既知の技法、例えばMerrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1964), Houghten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 51: 32 (1985)、Stewart and Young (Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem Co., Rockford, IL (1984)およびCreighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y.により記載された技法を用いて、化学合成方法（例えば固相ペプチド合成）により調製され得る。このようなポリペプチドは、アミノ末端にメチオニンを伴ってまたは伴わずに合成され得る。化学合成ＨＣＶペプチドは、これらの参照文献中に記載された方法を用いて酸化されて、ジスルフィド架橋を形成し得る。
【０１４０】
本明細書中に記載されたＨＣＶペプチドは化学的に合成され得るが、一方、組換えＤＮＡ技法によりこれらのポリペプチドを産生することはより有効であり得る。このような方法は、例えば上記のＨＣＶヌクレオチド配列、ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するために用いられ得る。これらの方法としては、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えが挙げられる。あるいはＨＣＶヌクレオチド配列をコードし得るＲＮＡは、例えば合成機を用いて化学的に合成され得る（例えばOligonucleotide Synthesis, 1984, Gait, M.J. ed.,
IRL Press, Oxfordに記載された技法を参照）。したがって、いくつかの実施形態は、体現されたＨＣＶペプチドを発現するよう人工的に作出された細胞株に関する。例えばいくつかの細胞は、配列番号２〜１１および配列番号３６のＨＣＶペプチドまたはこれらの分子の断片（例えば配列番号１４〜２６）を発現するよう作製される。
【０１４１】
種々の宿主発現ベクター系は、体現されたＨＣＶペプチドを発現させるのに利用され得る。適切な発現系としては、ＨＣＶヌクレオチド配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された微生物、例えば細菌（例えば大腸菌または枯草菌）；ＨＣＶヌクレオチド配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えばサッカロミセス、ピキア）；ＨＣＶ配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ＨＣＶ配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、または組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳類細胞のゲノム由来（例えばメタロチオネインプロモーター）の、または哺乳類ウイルス由来（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ
ー）のプロモーターを含有する組換え発現構築物を保有する哺乳類細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
細菌系では、多数の発現ベクターは、発現されているＨＣＶ遺伝子産物に対して意図される用途に応じて有利に選択され得る。例えばこのようなタンパク質が大量に産生されるべき場合、例えばＨＣＶペプチドの薬学的組成物の生成のために、またはＨＣＶペプチドに対する抗体の産生のために、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指図するベクターが所望され得る。このようなベクターとしては、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al., EMBO J., 2: 1791 (1983)）、この場合、融合タンパク質が産生されるよう、ＨＣＶコード配列は、ｌａｃＺコード領域を有するフレーム内でベクターに個別にライゲーションできる；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res., 13: 3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem., 264: 5503-5509 (1989)）等が挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するためにも用いられ得る。概して、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着と、その後の遊離グルタチオンの存在下での溶離により、溶解細胞から精製され得る。ＰＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るよう、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０１４３】
昆虫系では、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして用いられる。ウイルスは、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞中で増殖する。ＨＣＶコード配列は、ウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）中に独立してクローニングされ、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれ得る。ＨＣＶ遺伝子コード配列の上首尾の挿入は、ポリヘドリン遺伝子の不活性化および非閉塞性組換えウイルス（即ちポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク質様被膜を欠くウイルス）の産生を生じる。次にこれらの組換えウイルスは、挿入遺伝子を発現させるSpodoptera frugiperda細胞に感染するために用いられる（例えばSmith et al., J. Virol. 46: 584 (1983)；および米国特許第４，２１５，０５１号（Smith）参照）。
【０１４４】
哺乳類宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、当該ＨＣＶヌクレオチド配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三連リーダー配列にライゲーションされ得る。このキメラ遺伝子は次に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによりアデノウイルスゲノム中に挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ１またはＥ３）中への挿入は、実行可能な、そして感染宿主中でＨＣＶ遺伝子産物を発現し得る組換えウイルスを生じる（例えばLogan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659 (1984)参照）。挿入ＨＣＶヌクレオチド配列の効率的翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を包含する。
【０１４５】
しかしながらＨＣＶコード配列の一部分のみが挿入される場合、外因性翻訳制御シグナル、例えばおそらくはＡＴＧ開始コドンが提供され得る。さらに開始コドンは、全挿入物の翻訳を保証するための所望のコード配列のリーディングフレームと一致し得る。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の種々の起源のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等の含入により増強され得る（Bittner et al., Methods in Enzymol., 153: 516-544 (1987)参照）。
【０１４６】
さらに、挿入配列の発現を調節し、あるいは所望の特定の方式で遺伝子産物を修飾し、
プロセシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物のこのような修飾（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば切断）は、タンパク質の機能にとって重要である。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に関する特徴的および特異的メカニズムを有する。適切な細胞株または宿主系は、発現する外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを保証するために選択され得る。この目的のために、一次転写産物の適正なプロセシング、グリコシル化および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を保有する真核生物宿主細胞が用いられ得る。このような哺乳類宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３およびＷＩ３８が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４７】
組換えタンパク質の長期高収率産生のためには、安定的な発現が好ましい。例えば上記のＨＣＶペプチドを安定的に発現する細胞株が人工的に作出され得る。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを用いるというよりむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えばプロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）および選択可能マーカーにより制御されるＤＮＡで形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入後、組換え細胞は強化培地中で１〜２日間増殖され、次に選択培地に切り替えられる。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞の染色体中にプラスミドを安定的に組入れさせ、そして増殖させて病巣を形成させ、これは次にクローニングされ、細胞株中に拡げられる。この方法は、ＨＣＶ遺伝子産物を発現する細胞株を人工的に作出するために有益に用いられる。
【０１４８】
多数の選択系が用いられ、例としては単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler, et al., Cell 11: 223 (1977)）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026 (1962)）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy, et al., Cell 22: 817 (1980)）遺伝子がそれぞれｔｋ-、ｈｇｐｒｔ-またはａｐｒｔ-細胞で用いられ得るが、これらに限定されない。さらにまた抗代謝産物耐性が、以下の遺伝子に関する選択の基礎として用いられ得る：ｄｈｆｒ（メトトレキセートに対する耐性を付与する）（Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567 (1980)；O'Hare, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527 (1981)）；ｇｐｔ（ミコフェノール酸に対する耐性を付与する）（Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072 (1981)）；ｎｅｏ（アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する）（Colberre-Garapin, et al., J. Mol. Biol. 150: 1 (1981)）；およびｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシンに対する耐性を付与する）（Santerre, et al., Gene 30: 147 (1984)）。
【０１４９】
あるいは、発現している融合タンパク質に特異的な抗体を利用することにより、任意の融合タンパク質が容易に精製され得る。例えばJanknecht等により記載された系は、ヒト細胞株中で発現される非変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする（Janknecht, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972-8976 (1991)）。この系では、遺伝子のオープンリーディングフレームが６つのヒスチジン残基から成るアミノ末端タグに翻訳的に融合されるよう、当該遺伝子はワクシニア組換えプラスミド中にサブクローニングされる。組換えワクシニアウイルスに感染した細胞からの抽出物は、Ｎｉ2+ニトリロ酢酸−アガロースカラム上に載せられ、ヒスチジンタグ化タンパク質はイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶離される。以下の実施例は、具体化された核酸によりコードされるＨＣＶペプチドを発現するために用いられた方法を記載する。
【実施例８】
【０１５０】
実施例１に記載されたＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ、ＭＳＬＦ１−ｐＶＡＸおよびＮＳ３／４Ａ突然変異体構築物を特徴付けするために、プラスミドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写および翻訳して、その結果生じたポリペプチドを、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により可視化した。メーカーの使用説明書に従ってＴ７結合網状赤血球溶解物系（Promega, Madison, WI）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および翻訳を実施した。発現構築物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳反応は全て、35Ｓ標識化メチオニン（Amersham、 International, Plc, Buckinghamshire, UK）を用いて、３０℃で実行した。１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより標識化タンパク質を分離し、Ｘ線フィルム（Hyper Film-MP, Amersham）に６〜１８時間曝露することにより可視化した。
【０１５１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析は、全てのタンパク質がそれらのそれぞれの発現構築物から多量に発現する、ということを明示した。ｒＮＳ３構築物（ＮＳ３−ｐＶＡＸベクター）は約６１ｋＤａの単一ペプチドを生成し、一方、突然変異体構築物（例えばＴＧＴ構築物（ＮＳ３／４Ａ−ＴＧＴ−ｐＶＡＸ）およびＲＧＴ構築物（ＮＳ３／４Ａ−ＲＧＴ−ｐＶＡＸ））は、約６７ｋＤａの単一ポリペプチドを生成したが、これはＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ構築物から生成される非切断ＮＳ３／４Ａペプチドの分子量と同一である。発現ＮＳ３／４Ａペプチドから生成された切断生産物は、約６１ｋＤａであり、これはＮＳ３−ｐＶＡＸベクターから生成されたｒＮＳ３と同じサイズだった。これらの結果は、発現構築物が機能的であり、ＮＳ３／４Ａ構築物が酵素的に活性であり、ｒＮＳ３が予測サイズのペプチドを生成し、そして切断点突然変異がＮＳ３−ＮＳ４Ａ接合部での切断を完全に無効にする、ということを実証した。
【０１５２】
ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸおよびＭＳＬＦ１−ｐＶＡＸプラスミドからの翻訳効率を比較するために、検定への付加の前に、投入ＤＮＡ量を連続的に希釈した。プラスミドの連続希釈は、高希釈プラスミドにおいてＭＳＬＦ１プラスミドが野生型ＮＳ３／４Ａプラスミドより強力なバンドを示すということを明示し、これは、転写および翻訳はＭＳＬＦ１プラスミドからの方がより効率的である、という証拠を提供した。次に一過的にトランスフェクトされたＨｅｐ−Ｇ２細胞を用い、タンパク質発現に関してＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸおよびＭＳＬＦ１プラスミドを分析した。ＭＳＬＦ−１遺伝子がネイティブＮＳ３／４Ａ遺伝子より効率的なＮＳ３の発現を提供するという、同様の結果を得た。
【０１５３】
具体的なＨＣＶ核酸およびペプチドを含む配列、構築物、ベクター、クローンおよびその他の物質は、濃縮または単離形態であり得る。本明細書中で用いる場合、「濃縮」とは、物質の濃度がその天然濃度の多数倍、例えばその天然濃度の少なくとも約２、５、１０、１００または１０００倍であり、有益には０．０１重量％、好ましくは少なくとも約０．１重量％であるということを意味する。約０．５重量％またはそれ以上、例えば１重量％、５重量％、１０重量％および２０重量％からの濃縮調製物も意図される。「単離された」という用語は、物質がその本来の環境（例えばそれが天然のものである場合には、天然環境）から移動させられることを必要とする。例えば生きている動物中に存在する天然ポリヌクレオチドは単離されていないが、しかし天然系中の共存物質のいくつかまたは全てから分離される同一ポリヌクレオチドは、単離されている。配列が精製された形態である、ということも好都合である。「精製された」という用語は絶対的純粋を必要としない。むしろそれは、相対的定義として意図される。単離タンパク質は慣用的には、例えばクマシー染色による電気泳動的均質にまで精製される。出発物質または天然物質の少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、さらに好ましくは４または５桁の純度への精製が、明確に意図される。
【０１５４】
本明細書中に記載されたＨＣＶ遺伝子産物は、遺伝子導入生物を作製するために、植物、昆虫および動物中でも発現され得る。ＨＣＶペプチドを有する望ましいトランスジェニック植物系としては、シロイヌナズナ、トウモロコシおよびクラミドモナスが挙げられる。ＨＣＶペプチドを有する望ましい昆虫系としてはキイロショウジョウバエおよび線虫が挙げられるが、これらに限定されない。任意の種の動物、例えば両生類、爬虫類、鳥類、マウス、ハムスター、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギ、イヌ、ネコ
および非ヒト霊長類、例えばヒヒ、サルおよびチンパンジー（これらに限定されない）が、具体的なＨＣＶ分子を有するトランスジェニック動物を作製するために用いられ得る。これらのトランスジェニック生物は、望ましくは本明細書中に記載されたＨＣＶペプチドの生殖系列移入を示す。
【０１５５】
当該技術分野で既知の任意の技法は、好ましくは動物にＨＣＶ導入遺伝子を導入して、トランスジェニック動物の始祖系列を生成し、あるいは既存のＨＣＶ遺伝子を破壊するかまたは置き換えるために用いられる。このような技法としては、前核マイクロインジェクション（Hoppe, P. C. Wagner, T. E., 1989、米国特許第４，８７３，１９１号）；生殖系列中へのレトロウイルス媒介性遺伝子移入（Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6148-6152 (1985)）；胚幹細胞における遺伝子ターゲッティング（Thompson et al., Cell 56: 313-321 (1989)）；胚の電気穿孔（Lo, Mol Cell. Biol. 3: 1803-1814 (1983)）；ならびに精子媒介性遺伝子移入（Lavitrano et al., Cell 57: 717-723 (1989)）が挙げられるが、これらに限定されない（Gordon, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115: 171-229 (1989)も参照）。
【０１５６】
ＨＣＶペプチドの合成または発現および単離または精製後、単離または精製ペプチドを用いて抗体を生成し得る。状況によって、「抗体」という用語は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂ断片およびＦａｂ発現ライブラリにより生成される断片を包含し得る。ＨＣＶペプチドを認識する抗体は多数の用途を有し、例えばバイオテクノロジー用途、治療的／予防的用途および診断用途が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５７】
抗体産生のため、ＨＣＶペプチドの注入により、種々の宿主、例えばヤギ、ウサギ、ラット、マウスおよびヒト等を免疫し得る。宿主種によって、種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を増大し得る。このようなアジュバントとしては、リバビリン、フロイント、無機ゲル、例えば水酸化アルミニウム、および界面活性剤、例えばリソレシチン、プルロニック  ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルション、カギアナカサガイ（keyhole limpet）ヘモシアニンおよびジニトロフェノールが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＣＧ（Bacillus Calmette-Guerin）およびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）も潜在的に有用なアジュバントである。
【０１５８】
特異的抗体を誘導するために用いられるペプチドは、少なくとも４つのアミノ酸、好ましくは少なくとも１０〜１５のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有し得る。一アプローチにより、キメラ分子に対して抗体が産生されるよう、ＮＳ３／４Ａの断片をコードするアミノ酸の短鎖を別のタンパク質、例えばカギアナカサガイヘモシアニンのものと融合する。さらに、リバビリンおよびＨＣＶペプチド（配列番号２〜１１および配列番号３６）、その断片であって少なくとも３〜５０の間の任意数の連続したアミノ酸（例えば３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個連続したアミノ酸）を含有する断片（例えば配列番号４〜２６）、あるいは１または複数のこれらの分子をコードする核酸を含む組成物を、動物、好ましくは哺乳類、例えばヒトに投与する。ＨＣＶペプチドに対応する合成３−ｍｅｒ、１０−ｍｅｒおよび１５−ｍｅｒペプチドをマウスに注入することによりＨＣＶを特異的に認識し得る抗体を生成し得るが、一方、上記のように調製される組換えＨＣＶペプチドを用いることにより、より多様な抗体組を生成し得る。
【０１５９】
ＨＣＶペプチドに対する抗体を生成するために、実質的に純粋なペプチドをトランスフェクトあるいは形質転換された細胞から単離する。例えばAmiconフィルター装置上での濃度で数μｇ／ｍｌのレベルになるよう、最終調製物中のペプチドの濃度を調整する。次に当該ペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を、以下のように調製し
得る：
【０１６０】
培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技法を用いて、ＨＣＶペプチドに対するモノクローナル抗体を調製し得る。これらの例としては、Koehler and Milstein（Nature 256: 495-497 (1975)）により最初に記載されたハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kosbor et al. Immunol Today 4: 72 (1983); Cote et al Proc Natl Acad Sci 80: 2026-2030 (1983)）；ならびにＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc, New York N.Y., pp 77-96 (1985)）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、「キメラ抗体」の産生のために開発された技法である、適切な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためのヒト抗体遺伝子とのマウス抗体遺伝子のスプライシングを用い得る（Morrison et al. Proc Natl Acad Sci 81: 6851-6855 (1984)；Neuberger et al. Nature 312: 604-608 (1984); Takeda et al. Nature 314: 452-454 (1985)）。あるいは、一本鎖抗体の産生に関して記載された技法（米国特許第４，９４６，７７８号）を、ＨＣＶ特異的一本鎖抗体を産生するために適合させ得る。Orlandi et al., Proc Natl Acad Sci 86:
3833-3837 (1989)およびWinter G. and Milstein C; Nature 349: 293-299 (1991)に開示されているように、リンパ球集団中でのｉｎ  ｖｉｖｏ産生を誘導することにより、あるいは高特異的結合試薬の組換え免疫グロブリンライブラリーまたはパネルをスクリーニングすることによっても、抗体を産生し得る。
【０１６１】
ＨＣＶペプチドに対する特異的結合部位を含有する抗体断片も生成し得る。例えばこのような断片としては、Ｆ（ａｂ’）2、抗体分子のペプシン消化により産生され得る断片、ならびにＦ（ａｂ’）2断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成され得るＦａｂ断片が挙げられるが、これらに限定されない。あるいはＦａｂ発現ライブラリーを構築して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速且つ容易な同定を可能にし得る（Huse W.D. et al. Science 256: 1275-1281 (1989)）。
【０１６２】
一アプローチにより、ＨＣＶペプチドに対するモノクローナル抗体を以下のように作製する。要するに、数週間の期間に亘って、数μｇの選定タンパク質またはそれらに由来するペプチドをマウスに反復接種する。次にマウスを屠殺し、脾臓の抗体産生細胞を単離する。脾臓細胞をポリエチレングリコールの存在下でマウス骨髄腫と融合させて、アミノプテリンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）上での系の増殖により、余分量の非融合細胞を破壊する。首尾よく融合した細胞を希釈し、希釈液のアリコート（aliquots）をマイクロタイタープレートのウエル中に入れて、ここで培養物の増殖を継続させる。Engvall, E., Meth. Enzymol. 70: 419 (1980)により最初に記載されたＥＬＩＳＡのような免疫検定手法により、そしてその派生的方法により、ウエルの上清液中の抗体の検出により、抗体産生クローンを同定する。選定陽性クローンを増殖させて、それらのモノクローナル抗体産物を回収して用いる。モノクローナル抗体産生に関する詳細な手法は、Davis, L. et al. Basic Methods in Molecular Biology Elsevier, New York. Section 21-2に記載されている。
【０１６３】
免疫原性を増強するために修飾されることもされないこともあり得る上記の発現タンパク質またはそれに由来するペプチドで適切な動物を免疫することにより、単一タンパク質の異種エピトープに対する抗体を含有するポリクローナル抗血清を調製し得る。抗原および宿主種の両方に関連した多数の因子により、有効なポリクローナル抗体産生が影響を及ぼされる。例えば小分子は、他のものより低免疫原性の傾向があり、担体およびアジュバントの使用を要する可能性がある。さらにまた宿主動物は、接種部位および用量に応答して変わり、不適切なまたは過剰な用量の抗原は低力価抗血清を生じる。多数の皮膚内部位で投与される少用量（ｎｇレベル）の抗原が、最も信頼できると思われる。ウサギに関する有効な免疫プロトコルは、Vaitukaitis, J. et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:
988-991 (1971)に見出され得る。
【０１６４】
追加免疫注入を一定間隔で行い、例えば既知の濃度の抗原に対する寒天中の二重免疫拡散によって半定量的に測定して、その抗体力価が下がり始めたら、抗血清を採取する（例えばOuchterlony, O. et al., Chap. 19 in: Handbook of Experimental Immunology D. Wier (ed) Blackwell (1973)参照）。抗体のプラトー濃度は、通常は０．１〜０．２ｍｇ／血清１ｍｌ（約１２μＭ）の範囲である。例えばFisher, D., Chap. 42 in: Manual of
Clinical Immunology, 2d Ed. (Rose and Friedman, Eds.) Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D.C. (1980)により記載されたような競合的結合曲線を調製することにより、抗原に対する抗血清の親和性を確定する。いずれかのプロトコルに従って調製された抗体調製物は、生物学的試料中の抗原保有物質の濃度を確定する定量的免疫検定に有用である；それらは、半定量的または定性的にも用い得る（例えば生物学的試料中のＨＣＶの存在を同定する診断的実施形態において）。次の節は、上記の新規の核酸およびペプチドのいくつかを診断において用い得る方法を記載する。
【０１６５】
診断的実施形態
具体的な診断は、一般に、核酸ベースの検定が用いられるかまたはタンパク質ベースの検定が用いられるかによって分類される。いくつかの診断検定は患者から得られた試料中の具体的なＨＣＶ核酸配列の存在または非存在を検出するが、一方、他の検定は、具体的なＨＣＶペプチドが患者から得られた生物学的試料中に存在するか否かを同定しようと試みる。さらに、本明細書中に記載された試薬および方法を組入れ、ＨＣＶの迅速な検定および同定を可能にするキットの製造も具体化される。これらの診断キットとしては、例えばＨＣＶを特異的に検出する具体的な核酸プローブまたは抗体が挙げられる。これらのキットの検出構成成分は、典型的には１または複数の以下の試薬と組合せて供給される。ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質を吸収するかまたは別の方法で結合し得る支持体が、しばしば供給される。利用可能な支持体としては、正荷電置換基のアレイを保有することにより特徴付けされ得るニトロセルロース、ナイロンまたは誘導体化ナイロンの膜が挙げられる。１または複数の制限酵素、制御試薬、緩衝液、増幅酵素および仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡのような非ヒトポリヌクレオチドがこれらのキット中に供給され得る。
【０１６６】
有用な核酸ベースの診断としては、直接ＤＮＡシーケンシング、サザンブロット分析、ドットブロット分析、核酸増幅、ならびにこれらのアプローチの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。これらの分析の出発点は、ＨＣＶの罹患が疑われる患者またはＨＣＶに罹患する恐れのある患者から得られた生物学的試料からの単離または精製された核酸である。核酸を試料から抽出し、そして具体的なＨＣＶ核酸配列（例えばＮＳ３／４Ａ（配列番号１））と隣接する領域に対応するプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ増幅により増幅し得る。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶ配列と特異的にハイブリダイズする核酸プローブは整列アレイで支持体に結合されるが、この場合、核酸プローブは互いに重複しない支持体の異なる領域に結合される。好ましくはこのような整列アレイは、「アドレッサブル（addressable）」であるよう設計され、この場合、プローブの異なる位置が記録され、検定手法の一部としてアクセスされ得る。これらのプローブは、異なる既知の位置で支持体に連結される。各核酸プローブの正確な位置についての知識は、結合検定においてこれらの「アドレッサブル」アレイを特に有用にする。次にいくつかの生物学的試料の調製物からの核酸は、慣用的アプローチ（例えば放射能または蛍光）により標識され、そして標識試料は、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でアレイに適用される。
【０１６８】
試料中の核酸がアレイ上のプローブとハイブリダイズする場合には、シグナルは、ハイブリッドの位置に対応する支持体上の一位置で検出される。各標識試料の特性は既知であ
り、標識試料が適用される支持体の領域は既知であるため、多型変異体の存在は迅速に同定され得る。これらのアプローチは、ハイスループット診断または検出分析の技術分野の当業者に既知の技法を用いて、容易に自動化される。
【０１６９】
さらに、上に提示したものと逆のアプローチを用い得る。アドレッサブルアレイを作製するために、生物学的試料中に存在する核酸を支持体上に配置し得る。好ましくは試料を、重複しない既知の位置で支持体上に配置する。生物学的試料が配置された位置に対応するアレイ上の場所に、ＨＣＶペプチドをコードする核酸を相補する標識核酸プローブを適用することにより、各試料中のＨＣＶ核酸の存在を判断する。生物学的試料の特性およびアレイ上でのその位置は既知であるため、ＨＣＶに感染している患者が迅速に同定され得る。これらのアプローチも、ハイスループット診断分析の当業者に既知の技法を用いて、容易に自動化される。
【０１７０】
当該技術分野で既知の任意のアドレッサブルアレイ技法を用い得る。ポリヌクレオチドアレイの特定の一実施形態はGenechips（商標）として既知であり、米国特許第５，１４３，８５４号、ＰＣＴ公告ＷＯ  ９０／１５０７０および９２／１００９２に一般的に記載されている。これらのアレイは一般に、機械的合成法または光照射化学合成法（フォトリソグラフ法および固相オリゴヌクレオチド合成の組合せを組入れる）を用いて生成される（Fodor et al., Science, 251: 767-777, (1991)）。固体支持体上でのオリゴヌクレオチドのアレイの固定化は、「非常に大規模な固定化ポリマー合成」（ＶＬＳＰＩＳ（商標））として一般に同定される技術の開発により可能にされてきたが、この場合、典型的にはプローブはチップの固体表面の高密度アレイで固定化される。ＶＬＳＰＩＳ（商標）技術の例は、米国特許第５，１４３，８５４号および第５，４１２，０８７号に、ならびにＰＣＴ公告ＷＯ  ９０／１５０７０、ＷＯ  ９２／１００９２およびＷＯ  ９５／１１９９５に提示されており、これらは、光照射化学合成技法のような技法によるオリゴヌクレオチドアレイの生成方法を記載する。固体支持体上で固定化されるヌクレオチドのアレイを提供することに向けられる設計戦略では、ハイブリダイゼーションパターンおよび診断情報を最大にするための試みにおいて、チップ上にオリゴヌクレオチドアレイを並べ、そして表示するために、さらなる提示戦略が開発された。このような提示戦略の例は、ＰＣＴ公告ＷＯ  ９４／１２３０５、ＷＯ  ９４／１１５３０、ＷＯ  ９７／２９２１２およびＷＯ  ９７／３１２５６に開示されている。
【０１７１】
広範な種々の標識および接合技法が当業者に既知であり、種々の核酸検定に用いられ得る。ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲのために標識核酸を生成するためのいくつかの方法が存在し、例としてはオリゴラベリング、ニックトランスレーション、末端ラベリングまたは標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅が挙げられるが、これらに限定されない。あるいはＨＣＶペプチドをコードする核酸は、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクター中にクローニングされ得る。このようなベクターは当該技術分野で既知であり、市販されており、そして適切なＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｔ３又はＳＰ６および標識ヌクレオチドの付加によりｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。多数の会社、例えばPharmacia Biotech（Piscataway N.J.）、Promega （Madison, Wis）、およびU.S. Biochemical Corp（Cleveland Ohio）が商業用キットおよびこれらの手法のためのプロトコルを供給する。適切なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光物質、化学発光物質または発色剤、ならびに基質、補因子、阻害剤、磁性粒子等が挙げられる。
【０１７２】
患者から得られるタンパク質試料中のＨＣＶペプチドの存在も、慣用的検定および本明細書中に記載された実施形態により検出され得る。例えば開示されたＨＣＶペプチドと免疫反応性である抗体を用いて、ＨＣＶ感染の存在に関して生物学的試料をスクリーニングし得る。好ましい実施形態では、具体化されたＨＣＶペプチドに対して反応性である抗体
を用いて、生物学的試料からの開示ＨＣＶペプチドを免疫沈降するか、あるいはそれらを用いて、ウエスタンブロットまたはイムノブロット上で生物学的試料から得られるタンパク質と反応させる。好ましい診断実施形態としては、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射分析法（ＩＲＭＡ）および免疫酵素検定（ＩＥＭＡ）、例えば開示ＨＣＶペプチドに特異的なモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を用いたサンドイッチ検定も挙げられる。サンドイッチ検定の例は、David等により米国特許第４，３７６，１１０号および第４，４８６，５３０号に記載されている。その他の実施形態は、米国特許第５，２９０，６７８号、第５，６０４，１０５号、第５，７１０，００８号、第５，７４４，３５８号および第５，７４７，２７４号に開示された免疫ストリップ（immune-strip）技法の態様を用いる。
【０１７３】
別の好ましいタンパク質ベースの診断では、本明細書中に記載された抗体は整列アレイで支持体に結合されるが、この場合、複数の抗体が、互いに重複しない支持体の異なる領域に結合される。核酸ベースの検定を用いた場合と同様に、タンパク質ベースの検定は、異なる位置が記録され、検定手法の一部としてアクセスされ得るように、「アドレッサブル」であるよう設計される整列アレイである。これらのプローブは、異なる既知の位置で支持体に連結される。各プローブの正確な位置についての知識は、結合検定においてこれらの「アドレッサブル」アレイを特に有用にする。例えばアドレッサブルアレイは、生物学的試料中に存在するＨＣＶペプチドを特異的に認識し、本明細書中で同定されたＨＣＶアイソタイプを区別する複数の抗体プローブを連結するいくつかの領域を有する支持体を含み得る。
【０１７４】
一アプローチにより、生物学的試料からタンパク質を得て、次に慣用的アプローチ（例えば放射能、比色測定的にまたは蛍光的に）により標識する。次に結合を可能にする条件下で標識試料をアレイに適用する。試料中のタンパク質がアレイ上で抗体プローブと結合する場合には、抗体−タンパク質複合体の位置に対応する支持体上の位置でシグナルが検出される。各標識試料の同一性は既知であり、標識試料が適用された支持体上の領域は既知であるため、存在、濃度および／または発現レベルは迅速に検証され得る。即ち、ＨＣＶペプチドの既知の濃度の標識化標準を用いることにより、研究者は試験試料中の特定のペプチドのタンパク質濃度を精確に確定し得るし、そしてＨＣＶペプチドの発現レベルを査定することもできる。濃度測定における慣用的方法を用いて、ＨＣＶペプチドの濃度または発現レベルをより精確に確定することも可能である。これらのアプローチは、ハイスループット診断分析の当業者に既知の技法を用いて容易に自動化される。
【０１７５】
別の実施形態では、上に提示したものと逆のアプローチを用い得る。アドレッサブルアレイを作製するために、生物学的試料中に存在するタンパク質を支持体上に配置し得る。好ましくはタンパク質試料を、重複しない既知の位置で支持体上に配置する。次に、ＨＣＶペプチドに特異的なエピトープを認識する標識化抗体プローブを適用することにより、各試料中のＨＣＶペプチドの存在を確定する。生物学的試料の特性およびアレイ上のその位置は既知であるため、ＨＣＶペプチドの存在、濃度および／または発現レベルは迅速に検証され得る。
【０１７６】
即ち、濃度既知のＨＣＶペプチドの標識化標準を用いることにより、研究者は試料中のペプチドの濃度を精確に確定し得るし、そしてこの情報から、ペプチドの発現レベルを査定し得る。濃度測定における慣用的方法を用いて、ＨＣＶペプチドの濃度または発現レベルをより精確に確定することも可能である。これらのアプローチも、ハイスループット診断分析の当業者に既知の技法を用いて容易に自動化される。上で詳述したように、当該技術分野で既知の任意のアドレッサブルアレイ技術を用い得る。次の節は、本明細書中に記載されたＨＣＶ核酸および／またはＨＣＶペプチドを含むさらなる組成物を記載する。
【０１７７】
ＨＣＶ核酸またはペプチドを含む組成物
本発明の実施形態は、ＮＳ３／４Ａ融合タンパク質またはこれらの分子をコードする核酸も包含する。例えば組換えタンパク質の産生および精製は、「タグ」を形成するための補助アミノ酸の付加により促され得る。このようなタグとしては、Ｈｉｓ−６、Ｆｌａｇ、ＭｙｃおよびＧＳＴが挙げられるが、これらに限定されない。タグは、Ｃ末端、Ｎ末端またはＮＳ３／４Ａアミノ酸配列内に付加され得る。さらなる実施形態は、アミノまたはカルボキシ末端の欠損あるいは内部欠失を有するか、あるいはアミノまたはカルボキシ末端に付加されるかまたは内部的に付加された付加的ポリペプチド配列を有するＮＳ３／４Ａ融合タンパク質を包含する。その他の実施形態としては、ＮＳ３／４Ａ融合タンパク質、あるいはその短縮型または突然変異化バージョンが挙げられるが、この場合、ＮＳ３／４Ａタンパク質分解性切断部位の残基は置換されている。このような置換としては、Ｐ１’部位がＳｅｒ、ＧｌｙまたはＰｒｏであるか、あるいはＰ１位置がＡｒｇである配列、あるいは、Ｐ８〜Ｐ４’配列がＳｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ（配列番号１５）である配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７８】
さらなる実施形態は、ＮＳ３に対する免疫応答増強を引き出し得るＮＳ３／４Ａ融合タンパク質またはその短縮、突然変異または修飾バージョンを含む免疫原に関する。免疫原は、実質的に精製された形態で提供され得るが、これは、免疫原がそれと天然に会合する他のタンパク質、脂質、炭水化物またはその他の化合物を実質的に含有しないことを意味する。
【０１７９】
いくつかの実施形態は、支持体に連結された少なくとも１つのＨＣＶ核酸またはＨＣＶペプチド（例えば配列番号１〜２７、３５または３６）を含有する。好ましくはこれらの支持体は、多量体の薬剤を作製するよう製造される。これらの多量体薬剤は、分子に対する十分な親和性が達成されるような形態で、または方法で、ＨＣＶペプチドまたは核酸を提供する。ＨＣＶ核酸またはペプチドを有する多量体薬剤は、所望の分子を高分子支持体に連結することにより得られる。「支持体」は、担体、タンパク質、樹脂、細胞膜、キャプシドまたはそれらの部分、あるいはこのような分子を連結するかまたは固定するために用いられる任意の高分子構造と呼ばれるものであり得る。固体支持体としては、反応トレーのウエルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルロースストリップ、膜、例えばラテックス粒子などの微小粒子、動物細胞、デュラサイト（商標）、人工細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＣＶ核酸またはペプチドは、例えばヒドロキシ、カルボキシまたはアミノ基および担体上の反応基を介した共有結合により、無機担体、例えば酸化ケイ素物質（例えばシリカゲル、ゼオライト、珪藻土またはアミン化ガラス）に連結され得る。
【０１８０】
いくつかの多量体薬剤では、高分子支持体は、疎水性非共有的相互作用によりＨＣＶ核酸またはペプチドの一部と相互作用する疎水性表面を有する。いくつかの場合、支持体の疎水性表面は、疎水性基が連結された可塑性または任意の他のポリマー、例えばポリスチレン、ポリエチレンまたはポリビニルのようなポリマーである。さらに、ＨＣＶ核酸またはペプチドは、担体、例えばタンパク質およびオリゴ／多糖（例えばセルロース、デンプン、グリコーゲン、キトサンまたはアミン化セファロース）に共有的に結合され得る。これら後者の多量体薬剤では、分子上のヒドロキシまたはアミノ基のような反応基が、担体上の反応基に連結して共有結合を作製するために用いられる。さらなる多量体薬剤は、ＨＣＶ核酸またはペプチドを結合するよう、化学的に活性化される他の反応基を有する支持体を含む。例えば臭化シアン活性化マトリックス、エポキシ活性化マトリックス、チオおよびチオプロピルゲル、ニトロフェニルクロロ蟻酸およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドクロロ蟻酸結合、あるいはオキシランアクリル支持体が用いられる（Sigma）。
【０１８１】
身体中に用いるため（即ち予防的または治療的用途）の担体は、望ましくは生理学的、非毒性および好ましくは非免疫応答性である。身体に用いるための適切な担体としては、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ、Ｌ−アラニン、リポソーム、所望のＨＣＶペプチドまたは核酸を表示するキャプシド、およびクロモソルブ（商標）（Johns-Manville Products, Denver Co.）が挙げられる。リガンド接合クロモソルブ（商標）（Synsorb-Pk）は、溶血尿毒性症候群の予防のためにヒトで試験されており、副作用を示さないと報告された（Armstrong et al. J. Infectious Diseases 171: 1042-1045 (1995)）。いくつかの実施形態では、生物の身体中でＨＣＶ核酸またはペプチドを結合する能力を有する「裸の」担体（即ち結合ＨＣＶ核酸またはペプチドを欠く）が投与される。このアプローチにより、裸の担体がＨＣＶ核酸またはペプチドとは別に投与され、ひとたび両者が生物の身体中に存在すれば、担体およびＨＣＶ核酸またはペプチドが集合して多量体複合体を形成する、「プロドラッグ型」療法が意図される。
【０１８２】
ＨＣＶペプチド、ハイブリッドまたは結合相手のより大きな柔軟性を助長し、それを通じて支持体による任意の立体障害を克服するために、ＨＣＶ核酸またはペプチドと支持体との間の適切な長さのリンカー（例えばλファージの可動領域に類似するよう設計された「λリンカー」）の挿入も意図される。最適な細胞応答を可能にするかまたはそれを欠くリンカーの適切な長さの決定は、本発明の開示に詳述した検定において種々のリンカーを用いて、ＨＣＶ核酸またはペプチドをスクリーニングすることにより確定され得る。
【０１８３】
１より多い型のＨＣＶ核酸またはペプチドを含む複合支持体も意図される。「複合支持体」は、２またはそれ以上の異なるＨＣＶ核酸またはペプチドを結合するかまたは固定するために用いられる担体、樹脂または任意の高分子構造であり得る。上記のように、分子中のより大きな柔軟性を促し、生じ得る任意の立体障害を克服するために、ＨＣＶ核酸またはペプチドと支持体との間の適切な長さのリンカー、例えばλリンカーの挿入も意図される。最適細胞応答を可能にするかまたはそれを欠くリンカーの適切な長さの確定は、本発明の開示に詳述した検定において種々のリンカーを用いて、ＨＣＶ核酸またはペプチドをスクリーニングすることにより確定され得る。
【０１８４】
別の実施形態では、それぞれ「多量体化多量体支持体」および「多量体化複合支持体」を作製するために、上記の多量体および複合支持体が多量体化ＨＣＶ核酸またはペプチドを結合し得る。多量体化リガンドは、例えば分子生物学における慣用的技法を用いて、直列に２またはそれ以上のＨＣＶ核酸またはペプチドを結合することにより得られる。多量体化形態のＨＣＶ核酸またはペプチドは、例えばより高い親和性を有する薬剤を生成する能力のため、多数の用途のために有益であり得る。多量体化薬剤を作り上げる個々のドメイン間のリンカーまたはスペーサー、例えば柔軟性λリンカーの組入れも、いくつかの実施形態のために有益であり得る。例えばタンパク質結合ドメイン間の適切な長さのλリンカーの挿入は、分子におけるより大きな柔軟性を助長し、立体障害を克服し得る。同様に多量体化ＨＣＶ核酸またはペプチドおよび支持体間のリンカーの挿入は、より大きな柔軟性を促し、支持体により提示される立体障害を限定し得る。リンカーの適切な長さの決定は、本発明の開示に詳述した検定においてＨＣＶ核酸またはペプチドをスクリーニングすることによってなされ得る。
【０１８５】
実施形態は、ＮＳ３／４Ａ融合タンパク質あるいはその短縮化または突然変異化バージョンを、そして任意にアジュバントを含むワクチン組成物および免疫原製剤も包含する。次の節は、これらの組成物のいくつかをより詳細に説明する。
【０１８６】
ワクチン組成物および免疫原製剤
具体化されたＨＣＶ核酸またはＨＣＶペプチドまたはその両方（例えば任意の１または複数の配列番号１〜２７、３５または３６）を含むか、それらから成るか、または本質的
にそれらから成るワクチン組成物および免疫原製剤が意図される。これらの組成物は通常はアジュバントを含有するが、しかし、アジュバントを必ずしも必要とするわけではない。即ち本明細書中に記載された核酸およびペプチドの多くは、そのままで投与された場合にも、免疫原として機能する。本明細書中に記載された組成物（例えばリバビリンのようなアジュバントを含有するＨＣＶ免疫原およびワクチン組成物）は、製剤調製学の慣用的方法に従って製造されて、動物、例えばヒトを含めた哺乳類への投与のための薬剤を生成し得る。
【０１８７】
種々の核酸ベースのワクチンが既知であり、これらの組成物および免疫療法へのアプローチは、リバビリンを用いた組成変更により増大され得る、ということが意図される（例えば米国特許第５，５８９，４６６号および第６，２３５，８８８号参照）。一アプローチにより、例えば本明細書中に記載されたＨＣＶペプチド（例えば配列番号１または配列番号３５）のうちの１つをコードする遺伝子が、被験体に導入されるとポリペプチドを発現し得る発現ベクター中にクローニングされる。発現構築物は、アジュバント（例えばリバビリン）の混合物中で、あるいはアジュバント（例えばリバビリン）と一緒に、被験体に導入される。例えばアジュバント（例えばリバビリン）は、発現構築物の直後に、同一部位に投与される。あるいは当該ＨＣＶポリペプチド抗原をコードするＲＮＡが、リバビリンとの混合物中で、またはアジュバント（例えばリバビリン）と一緒に被験体に提供される。
【０１８８】
抗原がＤＮＡであるべき場合（例えばＤＮＡワクチン組成物の調製物）、適切なプロモーターとしては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、例えばＨＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルス、ＡＬＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、例えばＣＭＶ極初期（immediate early）プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられ、ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインのようなヒト遺伝子からのプロモーターが用いられ得る。いくつかの実施形態に関して、特にヒトのための遺伝子ワクチンの生成において有用なポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。特に、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルとして言及されるｐＣＥＰ４プラスミド（Invitrogen, San Diego, Calif.）中に存在するＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが用いられる。
【０１８９】
遺伝子発現に必要とされる調節要素のほかに、その他の要素も遺伝子構築物中に含まれ得る。このような付加的要素としては、エンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ならびにウイルスエンハンサー、例えばＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶからのものから成る群から選択され得るが、これらに限定されない。構築物を染色体外に保持し、そして細胞中に構築物の多数のコピーを生成するために、遺伝子構築物は、哺乳類複製起点を与えられ得る。Invitrogen （San Diego, CA）からのプラスミドｐＣＥＰ４およびｐＲＥＰ４は、エプスタイン・バーウイルス複製起点および核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含有し、これは、取り込みを伴わずに高コピーエピソーム複製を生成する。複製しても、複製しなくても、ゲノム中に取り込まれるようにはならない、そして発現可能である全形態のＤＮＡが用いられ得る。好ましくは遺伝子ワクチンは、リバビリン、ならびにＮＳ３／４Ａ、ＮＳ３またはそれらの断片または突然変異体をコードする核酸（配列番号２〜２６および３６）を含む。以下の実施例は、ヒトに用いるのに適した遺伝子ワクチンの作製を記載する。
【実施例９】
【０１９０】
ＨＣＶ発現プラスミドは、ＮＳ３／４Ａペプチド（配列番号２または配列番号３６）を
発現するよう設計される。ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸまたはＭＳＬＦ１−ｐＶＡＸのＮＳ３／４Ａコード配列を酵素的に取り出し、それがＣＭＶプロモーターおよびＲＳＶエンハンサー要素の転写制御下にあるよう、単離断片をプラスミドＡ中に挿入する（米国特許第６，２３５，８８８号（Pachuk等）参照）。プラスミド主鎖Ａは３９６９塩基対からなる；それは、大腸菌Escherichia coli中での複製のためのＰＢＲ複製起点、およびカナマイシン耐性遺伝子を含有する。ＮＳ３／４Ａまたはコドン最適化ＮＳ３／４Ａのようなインサートをポリリンカー領域にクローニングするが、該インサートはポリリンカー領域中でプロモーターとポリアデニル化シグナルとの間に機能的に連結されている。クローンインサートの転写は、ＣＭＶプロモーターおよびＲＳＶエンハンサー要素の制御下にある。ポリアデニル化シグナルは、ちょうどクローニング部位の３’に位置するＳＶ４０ポリＡシグナルの存在により提供される。次に、約０．５〜５００ｍｇ、例えば０．５〜１μｇ、１〜２μｇ、２〜５μｇ、５〜１０μｇ、１０〜２０μｇ、２０〜５０μｇ、５０〜７５μｇ、７５〜１００μｇ、１００〜２５０μｇ、２５０〜５００μｇの任意量の構築物を、約０．１〜１０ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜０．５ｍｇ、０．５ｍｇ〜１ｍｇ、１ｍｇ〜２ｍｇ、２ｍｇ〜５ｍｇまたは５ｍｇ〜１０ｍｇの任意量のリバビリンと混合することにより、ＮＳ３／４Ａ含有ワクチン組成物または免疫原製剤が作られる。
【０１９１】
上記のワクチン組成物を用いて、哺乳類（例えばマウスまたはウサギ）において抗体を産生し得るし、あるいは抗体を産生するよう、ヒトに、好ましくはＨＣＶウイルスに慢性的に感染しているヒトに筋肉内注射され得る。レシピエントは、好ましくは同様に、４週間間隔で混合物の追加免疫を３回施される。３回目の追加免疫により、ＨＣＶに特異的な抗体の力価は有意に増大される。さらにこの時点で、上記被験体は、ＥＩＡにより検出されるようなＮＳ３特異的抗体の画分増大により立証されるように、ＮＳ３に対する抗体およびＴ細胞媒介性免疫応答の増強、ならびにＲＴ−ＰＣＲにより検出されるようなウイルス量の低減を経験する。
【０１９２】
本明細書中に記載された１または複数のＨＣＶペプチドを含むワクチン組成物も意図される。好ましくは具体化されたペプチドワクチンは、リバビリンおよびＮＳ３／４Ａ、ＮＳ３あるいはそれらの断片または突然変異体（例えば配列番号２〜２６および３６）を含む。以下の実施例は、ＮＳ３／４Ａ融合タンパク質およびアジュバントを含むワクチン組成物を作製するためのアプローチを記載する。
【実施例１０】
【０１９３】
タグ化ＮＳ３／４Ａ構築物を生成するために、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸまたはＭＳＬＦ１−ｐＶＡＸのＮＳ３／４Ａコード配列を酵素的に取り出し、単離断片をＸｐｒｅｓｓベクター（Invitrogen）中に挿入する。Ｘｐｒｅｓｓベクターは、二価陽イオンに対する高親和性を有する短いＮ末端リーダーペプチドを有する組換え融合タンパク質の産生を可能にする。ニッケルキレート樹脂（Invitrogen）を用いて、組換えタンパク質を一工程で精製し、エンテロキナーゼを用いた切断によりリーダーを実質的に除去し得る。好ましいベクターは、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２  Ｘｐｒｅｓｓである。ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２
Ｘｐｒｅｓｓベクターは、多数のクローニング部位、アンピシリン耐性遺伝子およびｌａｃ  ｚ遺伝子を含有するバキュロウイルス発現ベクターである。したがって消化された増幅断片をｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２  Ｘｐｒｅｓｓベクター中でクローニングし、そしてＳＦ９細胞を感染させる。次に、メーカーの使用説明書に従って、発現タンパク質を単離または精製する。次に、約０．１〜５００ｍｇ、例えば１〜５μｇ、５〜１０μｇ、１０〜２０μｇ、２０〜３０μｇ、３０〜５０μｇ、５０〜１００μｇ、１００〜２５０μｇまたは２５０〜５００μｇの任意量のｒＮＳ３／４Ａを、約０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜０．５ｍｇ、０．５ｍｇ〜１ｍｇ、１ｍｇ〜２ｍｇ、２ｍｇ〜５ｍｇまたは５ｍｇ〜１０ｍｇの任意量のリバビリンと混合することにより、ＮＳ３／４Ａ含有ワクチン組成物が作られる。
【０１９４】
上記のワクチン組成物を用いて、哺乳類（例えばマウスまたはウサギ）において抗体を産生し得るし、あるいは抗体を産生するよう、ヒトに、好ましくはＨＣＶウイルスに慢性的に感染しているヒトに筋肉内注射し得る。レシピエントは、好ましくは４週間間隔で混合物の追加免疫を３回施される。３回目の追加免疫により、ＨＣＶに特異的な抗体の力価は有意に増大される。さらにこの時点で、上記被験体は、ＥＩＡにより検出されるようなＮＳ３特異的抗体の画分増大により立証されるように、ＮＳ３に対する抗体およびＴ細胞媒介性免疫応答の増強、ならびにＲＴ−ＰＣＲにより検出されるようなウイルス量の低減を経験する。
【０１９５】
１または複数の具体化されたＨＣＶ核酸またはペプチドを含む組成物は、他の成分、例えばアジュバント、結合剤、賦形剤、例えば安定剤（長期保存を促すため）、乳化剤、増粘剤、塩、防腐剤、溶媒、分散媒質、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等（これらに限定されない）を含有し得る。これらの組成物は、疾患または症状を回避するための予防手段として、あるいは疾患または症状にすでに悩まされている動物を治療するための療法として、動物の治療に適している。
【０１９６】
多数のその他の成分が存在してもよい。例えばアジュバントおよび抗原は、慣用的賦形剤（例えばアジュバントおよび／または抗原と有害に反応しない非経口的、経腸的（例えば経口）、または局所的適用に適している薬学的に許容可能な有機または無機担体物質）と混合して用いられ得る。薬学的に許容可能な適切な担体としては、水、塩溶液、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、例えばラクトース等の炭水化物、アミロースまたはデンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられるが、これらに限定されない。多数のさらに適切な担体が、Remmington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, Easton:Mack Publishing Company, pages 1405-1412 and 1461-1487 (1975)ならびにThe National Formulary XIV, 14th Edition, Washington, American Pharmaceutical Association (1975)に記載されている。
【０１９７】
本明細書中に記載した遺伝子構築物は特に、同一遺伝子ワクチンがこのような薬剤の非存在下で投与される場合に生じる細胞による遺伝子構築物の取込みおよび／または発現と比較して、細胞による遺伝子構築物の取込みおよび／または発現を増大させる薬剤とともに処方されるかまたは投与され得る。このような薬剤ならびにそれらを遺伝子構築物と一緒に投与するためのプロトコルは、ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９（１９９４年１月２６日提出）に記載されている。このような薬剤の例としては、以下のものが挙げられる：ＣａＰＯ4、ＤＥＡＥデキストラン、陰イオン性脂質；細胞外マトリックス活性酵素；サポニン；レクチン；エストロゲン様化合物およびステロイドホルモン；ヒドロキシル化低級アルキル；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；尿素；および安息香酸エステルアニリド、アミジン、ウレタンおよびその塩酸塩、例えば局所麻酔薬のファミリーのもの。さらに、遺伝子構築物は、脂質／ポリカチオン複合体内に封入され／それらとともに投与され得る。
【０１９８】
本明細書中に記載した組成物は、滅菌され、そして所望により、アジュバントまたは抗原と有害に反応しない助剤、例えば滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色剤、風味および／または芳香物質等と混合され得る。
【０１９９】
特定の処方物の有効用量および投与方法は、個々の患者ならびに疾患の型および段階、ならびに当業者に既知のその他の因子に基づいて変わり得る。ワクチンの治療効力および毒性は、細胞培養または実験動物における標準薬学手法により、例えばＥＤ50（集団の５
０％に治療的に有効な用量）により確定され得る。細胞培養検定および動物試験から得られるデータは、ヒト使用のための一連の投与量を処方するために用いられ得る。ワクチンの投与量は、好ましくは毒性を伴わないＥＤ50を含む一連の血中濃度範囲内である。投与量は、アジュバント誘導体およびＨＣＶ抗原の型、用いられる剤形、患者の感受性ならびに投与経路によって、この範囲内で変化する。
【０２００】
数年の間に多数のアジュバント、例えばリバビリンが市場に出回ったため、多数の剤形および投与経路が既知である。既知の剤形および投与経路は全て、本明細書中に記載した実施形態の情況内に提供され得る。好ましくは動物における抗原に対する免疫応答を増強するのに有効であるアジュバントの量は、動物において約０．２５〜１２．５μｇ／ｍｌ、好ましくは約２．５μｇ／ｍｌの抗原の血中血清レベルを達成するのに十分な任意量であると考えられ得る。いくつかの実施形態では、アジュバントの量は、ワクチンを投与される動物の体重によって確定される。したがって特定の処方物中のアジュバント量は、約０．１〜６．０ｍｇ／体重１ｋｇの任意量であり得る。即ちいくつかの実施形態は、約０．１〜１．０ｍｇ／動物の体重１ｋｇ、１．１〜２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１〜３．０ｍｇ／ｋｇ、３．１〜４．０ｍｇ／ｋｇ、４．１〜５．０ｍｇ／ｋｇおよび５．１〜６．０ｍｇ／ｋｇの任意量に対応するアジュバントの量を有する。より慣用的には、本明細書中に記載された組成物のいくつかは、約０．２５ｍｇ〜２０００ｍｇの間の任意量のアジュバントを含有する。即ち、いくつかの実施形態は、約２５０μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ、８５０ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、１．１ｇ、１．２ｇ、１．３ｇ、１．４ｇ、１．５ｇ、１．６ｇ、１．７ｇ、１．８ｇ、１．９ｇおよび２ｇのアジュバントを有する。
【０２０１】
当業者が理解するように、ワクチン中の抗原または免疫原製剤の量は、抗原の型およびその免疫原性によって変わり得る。それに応じてワクチン中の抗原の量は変化し得る。それでもなお、一般的指針として、本明細書中に記載された組成物は、約０．２５〜２０００ｍｇの間の任意量の本明細書中で考察されたＨＣＶ抗原を有し得る。例えば抗原の量は、約０．２５ｍｇ〜５ｍｇ、５〜１０ｍｇ、１０〜１００ｍｇ、１００〜５００ｍｇおよび２０００ｍｇより上の量の間であり得る。好ましくはＨＣＶ抗原の量は、上記抗原が核酸である場合、０．１μｇ〜１ｍｇ、望ましくは１μｇ〜１００μｇ、好ましくは５μｇ〜５０μｇ、最も好ましくは７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１１μｇ〜２０μｇであり、そして上記抗原がペプチドである場合、１μｇ〜１００ｍｇ、望ましくは１０μｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１００μｇ〜１ｍｇ、最も好ましくは２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇまたは７００μｇ〜１ｍｇである。
【０２０２】
本明細書中に記載したいくつかのアプローチでは、アジュバントおよび／またはＨＣＶ抗原の的確な量は、治療される患者を考慮して、個々の医師により選定される。さらにアジュバントの量は、同一のまたは等価の量の抗原と組合せて、あるいはそれらとは別個に付加され得るし、そしてこれらの量は、患者特異的または抗原特異的考察の点から見て十分なレベルを提供するために、個々のワクチン接種プロトコルの間に調整することができる。この趣旨で、考慮され得る患者特異的および抗原特異的因子としては、患者の疾患状態の重症度、患者の年齢および体重、食生活、投与の時間および頻度、薬剤組合せ（単数または複数）、反応感受性、ならびに療法に対する耐容／応答が挙げられるが、これらに限定されない。次の節は、アジュバントとしてのリバビリンの使用をより詳細に記載する。
【０２０３】
リバビリン
ヌクレオシド類似体は、ウイルス複製を低減する能力のため、抗ウイルス療法に広範に
用いられてきた（Hosoya et al., J. Inf. Dis., 168: 641-646 (1993)）。リバビリン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）は、ＲＮＡおよびＤＮＡウイルス複製を阻害するために用いられてきた合成グアノシン類似体である（Huffman et al., Antimicrob. Agents. Chemother., 3: 235 (1973); Sidwell et al., Science, 177: 705 (1972)）。リバビリンは、ＩＭＰをＩＭＸ（これは次にＧＭＰに転化される）に転化するイノシトールモノホスフェート（ＩＭＰ）デヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）の競合的阻害剤であることが示されている（De Clercq, Anti viral Agents: characteristic activity spectrum depending on the molecular target with which they interact, Academic press, Inc., New York N.Y., pp. 1-55 (1993)）。ＧＴＰの細胞内プールは、長期リバビリン治療の結果として枯渇するようになる。
【０２０４】
抗ウイルス活性のほかに、いくつかのグアノシン類似体が免疫系にある作用を及ぼす、ということを研究者等は観察した（米国特許第６，０６３，７７２号および第４，９５０，６４７号）。リバビリンは、機能的体液性免疫応答（Peavy et al., J. Immunol., 126: 861-864 (1981); Powers et al., Antimicrob. Agents. Chemother., 22: 108-114 (1982)）および肥満細胞分泌のＩｇＥ媒介性変調（Marquardt et al., J. Pharmacol. Exp. Therapeutics, 240: 145-149 (1987)）を抑制することが示されている。数人の研究者等は、リバビリンの１日経口療法がヒトおよびマウスに及ぼす免疫変調作用を有する、と報告している（Hultgren et al., J. Gen. Virol., 79: 2381-2391 (1998)およびCramp et al., Gastron. Enterol., 118: 346-355 (2000)）。それにもかかわらず、免疫系に及ぼすリバビリンの作用についての一般的理解は、初期段階にある。以下に開示されるように、リバビリンは強力なアジュバントであることが判明した。
【実施例１１】
【０２０５】
第一組の実験では、３〜５匹のＢａｌｂ／ｃマウスの群（BK Universal, Uppsala, Sweden）を、１０μｇまたは１００μｇの組換えＣ型肝炎ウイルス非構造３（ｒＮＳ３）タンパク質で腹腔内または皮下（例えば尾の基部）免疫した。ｒＮＳ３をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）単独または１ｍｇのリバビリン（ICN, Costa Mesa, CAから入手）を含有するＰＢＳ中に溶解した。マウスには、一度の注入につき総量１００μｌを注入した。
【０２０６】
腹腔内免疫後２および４週目に、眼窩後方サンプリングにより全マウスを採血した。血清試料を収集し、ｒＮＳ３に対する抗体の存在に関して分析した。抗体力価を確定するために、酵素免疫検定（ＥＩＡ）を実施した（例えばHultgren et al., J. Gen. Virol. 79: 2381-2391 (1998)およびHultgren et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4: 630-632 (1997)参照）。非免疫マウスの２倍より大きい４０５ｎｍでの光学的濃度を示す最高血清希釈として、抗体レベルを記録した。
【０２０７】
ＰＢＳ中で１ｍｇのリバビリンと混合された１０μｇまたは１００μｇのｒＮＳ３を摂取したマウスは、一貫して高レベルのＮＳ３抗体を示した。免疫後２週間目にＥＩＡにより検出された抗体力価を、図７に示す。１ｍｇのリバビリンおよび１０μｇまたは１００μｇのｒＮＳ３を有するワクチン処方物は、ｒＮＳ３のみから成るワクチン処方物より有意に大きい抗体力価を誘導した。
【０２０８】
第二組の実験では、０ｍｇ、１ｍｇ、３ｍｇまたは１０ｍｇのリバビリン（Sigma）を含有するリン酸緩衝生理食塩水１００μｌ中の１０または５０μｇのｒＮＳ３を用いて、８匹のＢａｌｂ／ｃマウスの群を腹腔内免疫した。４、６および８週間目に、マウスを採血し、血清を分離して、凍結させた。試験完了後、上記のように組換えＮＳ３に対する抗体のレベルに関して血清を試験した。ｒＮＳ３に対する平均抗体レベルを、スチューデントｔ検定（パラメトリック分析）またはマン−ホイットニー（ノンパラメトリック分析）およびソフトウェアパッケージStatView４．５（Abacus Concepts, Berkely, CA）を用い
て、群間で比較した。１０μｇのｒＮＳ３に対し３つの用量で添加した場合のリバビリンのアジュバント作用を、表１１に示す。５０μｇのｒＮＳ３に３つの用量で添加した場合のリバビリンのアジュバント作用を、表１１に示す。異なる１０μｇまたは５０μｇのｒＮＳ３、ならびに異なる用量のリバビリンを摂取しているマウスにおける平均ｒＮＳ３抗体力価のパラメトリック比較をそれぞれ表１２および１３に示す。異なる１０μｇまたは５０μｇのｒＮＳ３および異なる用量のリバビリンを摂取しているマウスにおける平均ＮＳ３抗体力価のノンパラメトリック比較を、それぞれ表１４〜１６に示す。示された値は、組換えｒＮＳ３に対する終点力価を表す。
【０２０９】
【表１１】
0004660195.tif 000012
【０２１０】
【表１２】
0004660195.tif 000013
【０２１１】
【表１３】
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【０２１２】
【表１４】
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【０２１３】
【表１５】
0004660195.tif 000016
【０２１４】
【表１６】
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【０２１５】
上記のデータは、リバビリンがＨＣＶ抗原またはＨＣＶエピトープに対する免疫応答を促進するかまたは増強する、ということを実証する。１ｍｇのリバビリンおよび１０μｇのｒＮＳ３抗原という少量を含むワクチン組成物による免疫後に、ｒＮＳ３に対する強力な免疫応答が誘導された。上記のデータは、抗原に対する免疫応答を促すのに十分であるリバビリンの量は２５〜３０ｇのＢａｌｂ／ｃマウスに関して１〜３ｍｇ／注入である、という証拠も提供する。しかしながらこれらの量は指針としてのみ意図されると理解されるべきであり、いかなる点でも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。それでもやはり、約１〜３ｍｇ用量のリバビリンを含むワクチン組成物は、リバビリンの非存在下で誘導される免疫応答の１２倍以上高い免疫応答を誘導する、ということをデータは示す。このようにリバビリンは動物の体液性免疫応答に及ぼす有意のアジュバント作用を有
し、それにより抗原に対する免疫応答を増強するかまたは促進する。以下の実施例では、抗原に対する免疫応答を増強するかまたは促進するために必要とされるリバビリンの量をより良好に理解するために実行した実験を説明する。
【実施例１２】
【０２１６】
アジュバント作用を提供するのに十分なリバビリンの用量を確定するために、以下の実験を実施した。第一組の実験では、マウスの群（３匹／群）を２０μｇのｒＮＳ３単独または２０μｇのｒＮＳ３と０．１ｍｇ、１ｍｇまたは１０ｍｇのリバビリンの混合物を用いて免疫した。次にＥＩＡにより、抗原に対する抗体のレベルを確定した。１および３週目の平均終点力価をプロットし、図８に示す。リバビリンにより提供されるアジュバント作用は、提供されるリバビリンの用量によって異なる動態を有する、ということを発見した。例えば低用量（＜１ｍｇ）のリバビリンでも、３週目でなく１週目に抗体レベルを増強することが見出されたが、一方、高用量（１〜１０ｍｇ）は、３週目に抗体レベルを増強することが判明した。
【０２１７】
第二組の実験も実施した。これらの実験では、マウスの群に、種々の量のリバビリンおよびｒＮＳ３を含むワクチン組成物を注入し、これらの動物におけるＩｇＧ応答をモニタリングした。ワクチン組成物は、約１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水および２０μｇのｒＮＳ３から成り、０．１ｍｇ、１．０ｍｇまたは１０ｍｇのリバビリン（Sigma）を含有する場合としない場合があった。６週目にマウスを採血し、上記のようにＥＩＡによりｒＮＳ３特異的ＩｇＧレベルを確定した。表１７に示すように、持続性抗体レベルに及ぼすアジュバントの作用は、２５〜３０ｇのマウスに対する１〜１０ｍｇ／注入の用量範囲で最も明白であった。
【０２１８】
【表１７】
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【０２１９】
第三組の実験では、初回および追加抗原注射後のリバビリンのアジュバント作用を調べた。これらの実験では、１０μｇのｒＮＳ３を、リバビリンとともにまたはリバビリンを伴わずに含むワクチン組成物の２回の腹腔内注射をマウスに施し、上記と同様に、抗原に対するＩｇＧサブクラス応答をモニタリングした。１０μｇの組換えＮＳ３単独、０．１または１．０ｍｇのリバビリン（Sigma）とともにまたはリバビリンを伴わずに含有する
１００μｌのリン酸緩衝液で、０および４週目にマウスを免疫した。６週目にマウスを採血し、上記のようにＥＩＡによりＮＳ３特異的ＩｇＧサブクラスを確定した。表１８に示したように、注射前の免疫原へのリバビリンの付加は、ＮＳ３特異的免疫応答においてＩｇＧサブクラス応答を変えなかった。したがってリバビリンおよび抗原を含むワクチン組成物のアジュバント作用は、Ｔｈ１／Ｔｈ２平衡の移行により説明され得ない。別のメカニズムがリバビリンのアジュバント作用に関与し得ると思われる。
【０２２０】
【表１８】
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【０２２１】
本実施例で提示したデータは、リバビリンがアジュバントとして投与できることを立証し、そしてリバビリンの用量がアジュバント作用の動態を調節し得る、ということをさらに立証する。以下の実施例には、抗原に対する免疫応答を増強または促進するリバビリンの能力を評価するために実施した別の検定を記載する。
【実施例１３】
【０２２２】
この検定は、特定のワクチン処方物が細胞性免疫応答を調節する程度を確定するために、任意のリバビリン誘導体またはリバビリン誘導体の組合せとともに用い得る。リバビリン含有ワクチンに対するＣＤ４+Ｔ細胞応答を判定するために、ＰＢＳ中の１００μｇのｒＮＳ３またはＰＢＳ中の１００μｇのｒＮＳ３および１ｍｇのリバビリンを用いてマウスの群を皮下免疫した。免疫後１０日目にマウスを屠殺し、それらのリンパ節を採取して液を抜いた。次にｉｎ  ｖｉｔｒｏリコール (recall) 検定を実施した（例えばHultgren
et al., J. Gen. Virol., 79: 2381-91 (1998)およびHultgren et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4: 630-632 (1997)参照）。［3Ｈ］チミジンの混入による培養９６時間目に、ＣＤ４+Ｔ細胞増殖の量を確定した。
【０２２３】
図９に示すように、１ｍｇのリバビリンと混合した１００μｇのｒＮＳ３で免疫したマウスは、ＰＢＳ中の１００μｇのｒＮＳ３で免疫したマウスより非常に大きいＴ細胞増殖応答を示した。このデータは、リバビリンが細胞性免疫応答を増強または促進する（例えばＴ細胞の有効なプライミングを促進することにより）、というさらなる証拠を提供する。
【０２２４】
付加的実験を実行して、リバビリンが市販ワクチン製剤に対する免疫応答を増強する、ということを立証した。以下の実施例は、市販のＨＢＶワクチン製剤を伴うリバビリンの使用を記載する。
【実施例１４】
【０２２５】
ＨＢｓＡｇおよびミョウバンを含有する２用量の市販ワクチン（Engerix, SKB）と混合した場合の、リバビリンのアジュバント作用を試験した。約０．２μｇまたは２μｇのEngerixワクチンを、ＰＢＳまたはＰＢＳ中の１ｍｇのリバビリンと混合し、混合物をマウスの群（３匹／群）に腹腔内注射した。同一混合物を含有する追加免疫を４週目に投与し、６週目に全マウスを採血した。血清試料を１：６０〜１：３７５００に希釈し、希釈液を上記と同様にＥＩＡにより試験したが、但し、精製ヒトＨＢｓＡｇを固相抗原として用いた。表１９に示すように、リバビリンを有するワクチン処方物は、ワクチンがすでにミョウバンを含有しているという事実にもかかわらず、２μｇの現存ワクチンに対する応答を増強した。即ち、準最適ワクチン用量（即ち、単独では検出可能な抗体を誘導しない用量）にリバビリンを付加することにより、抗体は検出可能になり、リバビリンの付加が免疫応答を弱めることなくワクチン処方物中のより低い抗原量の使用を可能にする、という証拠を提供した。
【０２２６】
【表１９】
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【０２２７】
上記の実験に用いたリバビリンは、商業的供給元（例えばSigmaおよびICN）から入手した。本明細書中に記載した実施形態とともに用いられ得るリバビリンも商業的供給元から入手するか、あるいは合成し得る。リバビリンおよび／または抗原は、修飾を伴って、ならびに伴わずに処方し得る。例えばリバビリンを修飾するかまたは誘導体化して、より安定な分子および／またはより強力なアジュバントを作製し得る。一アプローチにより、支持体、例えば親水性ポリマー（例えばポリエチレングリコール）にリバビリン分子をカップリングすることにより、リバビリンの安定性を増強し得る。
【０２２８】
理論的薬剤設計およびコンビナトリアルケミストリーにおける慣用的技法を用いて、多数のさらなるリバビリン誘導体を生成し得る。例えばMolecular Simulations Inc. (ＭＳＩ)、ならびに多数のその他の供給元は、有機分子の組合せライブラリを当業者に構築させるソフトウエアを提供する。例えばＣ２．アナログビルダー（Analog Builder）プログラムは、Cerius２分子多様性ソフトウエアのＭＳＩセットとともに組み込まれて、本明細書中に記載した実施形態とともに用い得るリバビリン誘導体のライブラリを発現させ得る（例えばhttp://msi.com/life/products/cerius2/index.html参照）。
【０２２９】
一アプローチにより、リバビリンの化学構造をコンピューター読取可能媒体に記録し、１つまたは複数のモデリングソフトウエア適用プログラムによりアクセスする。Ｃ２．アナログビルダープログラムをＣ２多様性プログラムと一緒に用いると、例えば各置換基位置に関するＲ基の多様性に基づいて非常に大きなバーチャルライブラリをユーザーは生成し得る。次に、バーチャルライブラリ中に作製したモデル化リバビリン誘導体と同一構造を有する化合物は、慣用的化学を用いて製造するか、あるいは商業的供給基から入手し得る。
【０２３０】
次に新規製作リバビリン誘導体を、分子のアジュバント活性の程度および／または免疫
応答を調節するその能力の程度を確定する検定でスクリーニングし得る。いくつかの検定は、バーチャル薬剤スクリーニングソフトウエア、例えばＣ２．Ｌｕｄｉを包含し得る。Ｃ２．Ｌｕｄｉは、当該タンパク質（例えばＲＡＣ２または別のＧＴＰ結合タンパク質）の活性部位と相互作用するそれらの能力に関して分子（例えばリバビリン誘導体）のデータベースをユーザーに調査させるソフトウエアプログラムである。バーチャル薬剤スクリーニングソフトウエアを用いて発見された予測相互作用に基づいて、リバビリン誘導体に対するさらなる特徴付けを、ある分子のアジュバント活性および／または免疫応答を調節する程度を確定する慣用的検定によって優先的に行うことができる。以下の節は、本明細書中に記載した組成物の使用方法に関するさらなる説明を提供する。
【０２３１】
ワクチン組成物および免疫原製剤の使用方法
本明細書中に記載した実施形態の投与経路としては、経皮、非経口、胃腸、経気管支および経肺胞が挙げられるが、これらに限定されない。経皮投与は、アジュバントおよびＨＣＶ抗原を皮膚に浸透させ得るクリーム、リンス、ゲルなどの適用により成し遂げられ得る。非経口的投与経路としては、電気的または直接注入、例えば中心静脈への直接注入、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮膚内または皮下注入が挙げられるが、これらに限定されない。胃腸投与経路としては、摂取および直腸的経路が挙げられるが、これらに限定されない。経気管支および経肺胞投与経路としては、口を介したまたは鼻腔内の吸入が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３２】
経皮投与に適したアジュバントおよびＨＣＶ抗原を有する組成物としては、皮膚に直接適用されるかまたは経皮デバイス（「経皮パッチ」）のような保護担体中に組入れられる薬学的に許容可能な懸濁液、油、クリームおよび軟膏が挙げられるが、これらに限定されない。適切なクリーム、軟膏等の例は、例えばPhysician's Desk Referenceに見出され得る。適切な経皮デバイスの例は、例えば米国特許第４，８１８，５４０号（Chinen等、１９８９年４月４日発行）に記載されている。
【０２３３】
非経口投与に適したアジュバントおよびＨＣＶ抗原を有する組成物としては、薬学的に許容可能な滅菌等張溶液が挙げられるが、これらに限定されない。このような溶液としては、中心静脈への注入、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮膚内または皮下注入のための生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水および油調製物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３４】
経気管支および経肺胞投与に適したアジュバントおよびＨＣＶ抗原を有する組成物としては、吸入用の種々の型のエアロゾルが挙げられるが、これらに限定されない。これらの経気管支および経肺胞投与に適した用具も実施形態である。このような用具としては、噴霧器および気化器が挙げられるが、これらに限定されない。多数の形態の一般的に利用可能な噴霧器および気化器が、リバビリンおよび抗原を有するワクチンを送達するために容易に適合可能である。
【０２３５】
胃腸投与に適したアジュバントおよびＨＣＶ抗原を有する組成物としては、摂取用の薬学的に許容可能な粉末、ピルまたは液体、ならびに直腸投与のための座薬が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３６】
特に本明細書中に記載した遺伝子構築物は、例えば旧来の注射器、無針注入用具または「微粒子衝撃遺伝子銃（microprojectile bombardment gene guns）」といった手段により投与され得るが、これらに限定されない。あるいは遺伝子ワクチンは、種々の手段により、個体から取り出された細胞中に導入され得る。このような手段としては、例えばｅｘ
ｖｉｖｏトランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクションおよび微粒子銃が挙げられる。遺伝子構築物が細胞に組み込まれた後、それらを個体に再移植する。さもなければ、細胞中に組入れられた遺伝子構築物を有する非免疫原性の細胞を、たとえその
ワクチンされた細胞が元々別の個体から採取された場合であっても、個体中に移植し得ることを意図している。
【０２３７】
いくつかの実施形態によれば、無針注入用具を用いて個体に遺伝子構築物を投与し得る。いくつかの実施形態によれば、無針注入用具を用いて、皮内、皮下および筋肉内に、遺伝子構築物を個体に同時投与する。無針注射用具は既知であり、広範に利用可能である。当業者は、本明細書中の教示にしたがって、個体の細胞に遺伝物質を送達するために無針注入用具を使用する。無針注入用具は、全ての組織に遺伝物質を送達するのによく適している。それらは特に、皮膚および筋肉細胞に遺伝物質を送達するのに有用である。いくつかの実施形態では、無針注入用具を用いて、個体の皮膚表面に向けてＤＮＡ分子を含有する液体を噴射し得る。皮膚との衝突時に、液体が皮膚の表面に浸透し、その下の皮膚および筋肉組織に透過するよう、十分な速度で液体を噴射する。したがって遺伝物質は、皮内、皮下および筋肉内に同時に投与される。いくつかの実施形態では、その器官の細胞に核酸分子を導入するために、無針注入用具を用いて他の器官の組織に遺伝物質を送達し得る。
【０２３８】
好ましい実施形態は、ＨＣＶ感染の治療または予防方法に関する。これらの実施形態では、処置を要する動物に、ＨＣＶ抗原（例えば本明細書中に記載したようなペプチド抗原または核酸ベースの抗原（配列番号１〜２７および３５〜３６））ならびに上記動物においてアジュバント活性を示すのに十分な量のアジュバントを提供する。したがって、一般に利用可能な診断試験または臨床評価を用いて、処置を要する動物を同定し得る。アジュバントおよび抗原は、別々にあるいは組合せて提供し得るし、そして他のアジュバント（例えば油、ミョウバンまたは免疫応答を増強するその他の薬剤）も処置を要する動物に提供し得る。
【０２３９】
本発明の他の実施形態は、上記免疫応答を増強するのに有効な量のアジュバント（例えばリバビリン）および１または複数の配列番号１〜１１および３５〜３６、またはその断片、好ましくは配列番号１２〜２７を、必要とする動物に提供することによるＨＣＶ抗原に対する免疫応答の増強方法を包含する。これらの実施形態では、一般的に利用可能な診断試験または臨床評価を用いて、抗原に対する免疫応答増強を必要とする動物を同定する。例えば一アプローチにより、上記個体がＨＣＶに感染するのを防御するために、ＮＳ３に対する細胞性および体液性免疫応答を引き出すのに十分な量で上記のワクチン組成物を非感染個体に提供する。別の実施形態では、ＨＣＶ感染個体を同定し、ＨＣＶ感染を低減するかまたは排除するために、ＮＳ３に対する細胞性および体液性免疫応答を増強するのに十分な量でリバビリンおよびＮＳ３を含むワクチン組成物を提供する。このような個体は、感染の慢性期または急性期にあり得る。さらに別の実施形態では、ＨＣＣに罹患しているＨＣＶ感染個体に、ＮＳ３発現腫瘍細胞に対する細胞性および体液性免疫応答を引き出すのに十分な量でアジュバントおよびＮＳ３／４Ａ融合遺伝子を含む組成物を提供する。
【０２４０】
実施形態および実施例を参照しながら本発明を説明してきたが、本発明の精神から逸脱しない限り、種々の修正が成され得る、と理解されるべきである。したがって本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０２４１】
【図１】Ｈ−２dマウスにおけるＮＳ３に対する抗体力価を初回筋肉内免疫後の時間の関数として示したグラフである。菱形はＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸで免疫したマウスにおける抗体力価を意味し、そして正方形はＮＳ３−ｐＶＡＸで免疫したマウスにおける抗体力価を意味する。
【図２】ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１（４μｇ）またはＭＳＬＦ１−ｐＶＡＸ１（４μｇ）の１回遺伝子銃免疫により付与されるｉｎ  ｖｉｖｏ防御を示す。マウスをそれぞれのプラスミドで免疫し、１４日後、該マウスにＮＳ３／４Ａ発現ＳＰ２／０細胞株をチャレンジした（約１０6細胞／マウス）。次に、チャレンジ後６日目以後、毎日皮膚を通して腫瘍サイズを測定し、データをプロットした。
【図３】ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１（４μｇ）またはＭＳＬＦ１−ｐＶＡＸ１（４μｇ）の２回遺伝子銃免疫により付与されるｉｎ  ｖｉｖｏ防御を示す。マウスをそれぞれのプラスミドで０週目および４週目に免疫し、そして最終免疫の１４日後、該マウスにＮＳ３／４Ａ発現ＳＰ２／０細胞株をチャレンジした（約１０6細胞／マウス）。次に、チャレンジ後６日目以後、毎日皮膚を通して腫瘍サイズを測定し、データをプロットした。
【図４】ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１（４μｇ）またはＭＳＬＦ１−ｐＶＡＸ１（４μｇ）の３回遺伝子銃免疫により付与されるｉｎ  ｖｉｖｏ防御を示す。マウスをそれぞれのプラスミドで０週目、４週目および８週目に免疫し、そして最終免疫の１４日後、該マウスにＮＳ３／４Ａ発現ＳＰ２／０細胞株をチャレンジした（約１０6細胞／マウス）。次に、チャレンジ後６日目以後、毎日皮膚を通して腫瘍サイズを測定し、データをプロットした。
【図５Ａ】エフェクター対標的比の関数としてＳＰ２／０標的細胞の特異的ＣＴＬ媒介性溶解パーセンテージを示したグラフである。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を対照免疫原として用いた。
【図５Ｂ】エフェクター対標的比の関数としてＳＰ２／０標的細胞の特異的ＣＴＬ媒介性溶解パーセンテージを示したグラフである。プラスミドＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸを免疫原として用いた。
【図６Ａ】ペプチド被覆ＲＭＡ−Ｓ細胞で刺激したナイーブ脾臓Ｔ細胞の応答を示すグラフである。Ｃ５７／ＢＬ６マウスからナイーブ脾臓Ｔ細胞を得た。
【図６Ｂ】ペプチド被覆ＲＭＡ−Ｓ細胞で再刺激した脾臓Ｔ細胞の応答を示すグラフである。４μｇのＭＳＬＦ１−ｐＶＡＸ１を１回投与したＣ５７／ＢＬ６マウスから脾臓Ｔ細胞を得た。
【図６Ｃ】ペプチド被覆ＲＭＡ−Ｓ細胞で再刺激した脾臓Ｔ細胞の応答を示すグラフである。４μｇのＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１を１回投与したＣ５７／ＢＬ６マウスから脾臓Ｔ細胞を得た。
【図６Ｄ】ペプチド被覆ＲＭＡ−Ｓ細胞で刺激したナイーブ脾臓Ｔ細胞の応答を示すグラフである。Ｃ５７／ＢＬ６マウスからナイーブ脾臓Ｔ細胞を得た。
【図６Ｅ】ペプチド被覆ＲＭＡ−Ｓ細胞で再刺激した脾臓Ｔ細胞の応答を示すグラフである。４μｇのＭＳＬＦ１−ｐＶＡＸ１を２回投与したＣ５７／ＢＬ６マウスから脾臓Ｔ細胞を得た。
【図６Ｆ】ペプチド被覆ＲＭＡ−Ｓ細胞で再刺激した脾臓Ｔ細胞の応答を示すグラフである。４μｇのＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１を２回投与したＣ５７／ＢＬ６マウスから脾臓Ｔ細胞を得た。
【図６Ｇ】ＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞で刺激したナイーブ脾臓Ｔ細胞の応答を示すグラフである。Ｃ５７／ＢＬ６マウスからナイーブ脾臓Ｔ細胞を得た。
【図６Ｈ】ＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞で再刺激した脾臓Ｔ細胞の応答を示すグラフである。４μｇのＭＳＬＦ１−ｐＶＡＸ１を１回投与したＣ５７／ＢＬ６マウスから脾臓Ｔ細胞を得た。
【図６Ｉ】ＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞で再刺激した脾臓Ｔ細胞の応答を示すグラフである。４μｇのＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１を１回投与したＣ５７／ＢＬ６マウスから脾臓Ｔ細胞を得た。
【図６Ｊ】ＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞で刺激したナイーブ脾臓Ｔ細胞の応答を示すグラフである。Ｃ５７／ＢＬ６マウスからナイーブ脾臓Ｔ細胞を得た。
【図６Ｋ】ＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞で再刺激した脾臓Ｔ細胞の応答を示すグラフである。４μｇのＭＳＬＦ１−ｐＶＡＸ１を２回投与したＣ５７／ＢＬ６マウスから脾臓Ｔ細胞を得た。
【図６Ｌ】ＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞で再刺激した脾臓Ｔ細胞の応答を示すグラフである。４μｇのＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１を２回投与したＣ５７／ＢＬ６マウスから脾臓Ｔ細胞を得た。
【図７】１ｍｇのリバビリンを１回同時に投与した場合の、平均終点力価により確定される、１０および１００μｇの組換えＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造３タンパク質（ＮＳ３）に対する体液性応答を示すグラフである。
【図８】０．１、１．０または１０ｍｇのリバビリンを１回同時に投与した場合の、平均終点力価により確定される、２０μｇの組換えＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造３タンパク質（ＮＳ３）に対する体液性応答を示すグラフである。
【図９】ｉｎ  ｖｉｔｒｏリコール応答により確定されるような、ＮＳ３特異的リンパ節増殖性応答に及ぼす１ｍｇのリバビリンの１回投与の作用を示すグラフである。
【図１０】１０匹のＨ−２dマウスの群における、４μｇのｗｔＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１およびｃｏＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１を用いた遺伝子銃免疫により、または１０7のｗｔＮＳ３／４Ａ−ＳＦＶ粒子の皮下注射によりプライミングされた平均ＮＳ３特異的抗体応答を示す（ａ）。０週目および４週目に、全マウスを免疫した。値は、平均終点抗体力価（±ＳＤ）として示されている。ｗｔＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１筋注、ｃｏＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１筋注または遺伝子銃（ｇｇ）、ならびにｗｔＮＳ３／４Ａ−ＳＦＶ皮下投与により２回免疫した５匹のマウスの群からのＩｇＧサブクラスパターンも示す（ｂ）。値は、平均終点抗体力価（±ＳＤ）として示されている。「**」印は、ｐ＜０．０１の統計学的差を示し、「*」印は、ｐ＜０．０５の差を示し、そしてＮＳ（有意でない）は統計学的差が認められないことを示す（Mann-Whitney）。ＮＳ３に対するＩｇＧ２ａ抗体の平均終点力価をＮＳ３に対するＩｇＧ１抗体の平均終点力価で割ることにより得られる力価比も示す。高比率（＞３）はＴｈ１様応答を示し、そして低比率（＜０．３）はＴｈ２様応答を示すが、一方、１から３倍以内の差の値（０．３〜３）は混合型Ｔｈ１／Ｔｈ２応答を示す。
【図１１】ペプチド負荷Ｈ−２Ｄb：Ｉｇ融合タンパク質を用いたＮＳ３／４Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の前駆体頻度のフローサイトメトリー定量を示す。ａ)では、遺伝子銃を用いてｗｔＮＳ３−ｐＶＡＸ１、ｗｔＮＳ３／４ＡｐＶＡＸ１またはｃｏＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１で２回免疫した５匹のマウスの群からのＮＳ３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均％を示す。「*」印は、ｐ＜０．０５の差を示し、そしてＮＳ（有意でない）は統計学的差が認められないことを示す（Mann-Whitney）。上記の群を代表する個々のマウス（ｅ、ｆおよびｈ）からの、ならびにｃｏＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１（ｂ）またはｗｔＮＳ３／４Ａ−ＳＦＶ（ｃ）で１回免疫した個々のマウスからの生データも示す。（ｄ）および（ｇ）には、異なる実験からの非免疫対照マウスを示した。（ｉ）および（ｊ）では、分析前にＮＳ３−ペプチドを用いて５日間、脾細胞を再刺激した。総計１５０，０００〜２００，０００データ点を収集し、Ｈ−２Ｄb：Ｉｇに対して染色されたＣＤ８＋細胞のパーセンテージを各ドットプロットについて挿入的に示す。
【図１２】ｗｔＮＳ３−ｐＶＡＸ１、ｗｔＮＳ３／４ＡおよびｃｏＮＳ３／４Ａプラスミドの遺伝子癌免疫、あるいはｗｔＮＳ３／４Ａ−ＳＦＶ粒子の皮下注入による、Ｈ−２bマウスにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出可能ＣＴＬのプライミングを示す。５〜１０匹のＨ−２bマウスの群を、１回（ａ）または２回（ｂ）免疫した。特異的溶解％は、ＮＳ３−ペプチド被覆ＲＭＡ−Ｓ細胞（（ａ）および（ｂ）の上パネル）またはＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞（ａおよびｂの下パネル）を用いて得られた溶解％から非負荷または非トランスフェクトＥＬ−４細胞を用いて得られた溶解％を引いた値に相当する。値は、６０：１、２０：１および７：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比について示されている。各線は、個々のマウスを示す。
【図１３】遺伝子銃免疫によりプライミングされた腫瘍抑制免疫応答の特異性を示す（パネル（ａ））。１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群を、未処理のままか、あるいは４μｇのｃｏＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１で１ヶ月毎に２回免疫した。最終免疫の２週間後に、マウスにＥＬ−４親細胞株または１０6のＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞を皮下注射した。腫瘍注射後６、７、１０、１１、１２および１４日目に皮膚を通して腫瘍サイズを測定した。（ｂ）では、遺伝子銃を用いてｃｏＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１プラスミドで２回免疫した１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群において、ｉｎ  ｖｉｖｏ機能性エフェクター細胞集団を決定した。２つの群では、ＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞株チャレンジの１週間前または最中に、モノクローナル抗体の投与によりＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかを枯渇させた。腫瘍注射後５、６、８、１１、１３、１４および１５日目に皮膚を通して腫瘍サイズを測定した。値は、平均腫瘍サイズ±標準誤差として示した。「**」印は、ｐ＜０．０１の統計学的差を示し、「*」印は、ｐ＜０．０５の差を示し、そしてＮＳ（有意でない）は統計学的差が認められないことを示す（曲線下面積の値を、ＡＮＯＶＡにより比較）。
【図１４】種々の免疫原が１回免疫後にＨＣＶ  ＮＳ３／４Ａ特異的腫瘍抑制応答をプライミングする能力の評価を示す。１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群を、未処理のままか、あるいは指示免疫原を用いて１回免疫した（（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｇ）および（ｈ）では遺伝子銃を用いて４μｇのＤＮＡ；（ｄ）では１０7 ＳＦＶ粒子皮下投与；（ｅ）ではＣＦＡ中の１００μｇのペプチドを皮下投与；ならびに（ｆ）ではＣＦＡ中の２０μｇのｒＮＳ３を皮下投与）。最終免疫後２週間目に、マウスに１０6 ＮＳ３／４Ａ発現ＥＬ−４細胞を皮下注射した。腫瘍注射後６〜１９日目に皮膚を通して腫瘍サイズを測定した。値は、平均腫瘍サイズ±標準誤差として示した。（ａ）〜（ｅ）では、陰性対照として、遺伝子銃により空のｐＶＡＸプラスミドを用いて免疫した群からの平均データを、各グラフにプロットした。（ｆ）〜（ｈ）では、陰性対照は非免疫マウスであった。曲線下面積およびＡＮＯＶＡを用いた対照と各曲線との統計学的比較から得られたｐ値も示す。
【図１５】遺伝子銃送達ｗｔＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１およびｃｏＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ１プラスミドの、腫瘍抑制免疫応答をプライミングする効率の比較を示す。１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、未処理のままか、あるいは４μｇのプラスミドで１ヶ月毎に１、２または３回免疫した。最終免疫の２週間後に、マウスに１０6 ＮＳ３／４Ａ発現ＳＰ２／０細胞を皮下注射した。腫瘍注射後６、８、１０、１１、１２、１３および１４日目に皮膚を通して腫瘍サイズを測定した。値は、平均腫瘍サイズ±標準誤差として示した。「**」印は、ｐ＜０．０１の統計学的差を示し、「*」印は、ｐ＜０．０５の差を示し、そしてＮＳ（有意でない）は統計学的差が認められないことを示す（曲線下面積の値を、ＡＮＯＶＡにより比較）。
【図１６】遺伝子銃を用いたｃｏＮＳ３／４Ａプラスミドによる治療的ワクチン接種の効果を示す。１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群に、１０6 ＮＳ３／４Ａ−ＥＬ４細胞を接種した。１群は、チャレンジの２週間前に遺伝子銃を用いて４μｇのｃｏＮＳ３／４Ａ  ＤＮＡで１回免疫し（陽性対照）、１群は、腫瘍接種後６日目に同一方法で免疫し、そして１群は、腫瘍接種後１２日目に免疫した。１群は、免疫しなかった（陰性対照）。腫瘍注射後６、１０、１１、１２、１３、１４、１８、１９および２０日目に皮膚を通して腫瘍サイズを測定した。値は、平均腫瘍サイズ±標準誤差として示した。「**」印は、ｐ＜０．０１の統計学的差を示し、「*」印は、ｐ＜０．０５の差を示し、そしてＮＳ（有意でない）は統計学的差が認められないことを示す（曲線下面積の値を、ＡＮＯＶＡにより比較）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図６Ｌ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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