(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応槽と、
前記反応槽に溶液が流入する流入流路と、
前記反応槽から前記溶液が流出する流出流路とを有し、
前記溶液中に含まれる第１の化学物質が前記反応槽内に固定された第２の化学物質に捕獲される捕獲量を測定するマイクロリアクターにおいて、
共振周波数を測定する共振周波数測定手段に接続される電極を表面と裏面に有する平板状の圧電振動子と、
前記流入流路から分岐して前記圧電振動子の前記表面に連通する第１の分岐路と、
前記流出流路から分岐して前記圧電振動子の前記裏面に連通する第２の分岐路とからなり、
前記圧電振動子の前記共振周波数を測定することにより、前記溶液が前記第１の分岐路を介して前記圧電振動子に与える圧力と前記第２の分岐路を介して前記圧電振動子に与える圧力との圧力差を検出する圧力検出手段と、
前記流入流路または前記流出流路に前記溶液を送液する送液手段と、
前記圧力検出手段による検出結果に基づいて、前記溶液の流速あるいは流量が一定になるように前記送液手段を駆動制御する制御回路部とを有することを特徴とするマイクロリアクター。
【請求項２】
前記圧電振動子が、水晶振動子であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロリアクター。
【請求項３】
前記第１の分岐路と第２の分岐路は前記流入流路または前記流出流路内の表面全体または一部に疎水領域を有することを特徴とする請求項１に記載のマイクロリアクター。
【請求項４】
前記送液手段は、前記マイクロリアクターの前記流入流路に接続され、前記マイクロリアクターに前記溶液を送液する加圧方式のポンプであることを特徴とする請求項１に記載のマイクロリアクター。
【請求項５】
前記送液手段は、前記マイクロリアクターの前記流出流路に接続され、前記マイクロリアクターから前記溶液を吸引する吸引方式のポンプであることを特徴とする請求項１に記載のマイクロリアクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学物質を固定化し、それに特異的に吸着あるいは結合する酵素、抗体、たんぱく質、ホルモン、糖鎖、化合物などの化学物質を測定するためのディスポーサブル型マイクロチップを備えて化学物質の測定を行うマイクロリアクター及びマイクロリアクターシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ、バイオマイクロチップ、あるいはマイクロリアクターなどと称される、バイオ検査用マイクロリアクター及びこれを備えたマイクロリアクターシステムの開発が盛んになってきている。これらのマイクロリアクターは、コンパクトで安価なため、例えば家庭内で人の健康状態を少量の検体で定期的に検査したりすることが可能である。また、ディスポーサブルが前提であるため、コンタミなどの心配もなく手軽に検査することが可能である。このマイクロリアクターに反応物質の質量を直接測定することのできるセンサとして、特許文献１に記載されているＱＣＭバイオセンサを組み込んだもの、非特許文献１及び２に記載されている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Surface Prasmon Resonance）現象を利用して検知するものなど、様々な方式が検討されている。
【０００３】
ＱＣＭバイオセンサを用いる場合、水晶振動子の電極上での反応物質の吸着・結合による質量変化を水晶振動子の発振周波数シフトを利用して測定することができる。ＱＣＭバイオセンサの一例として、例えば特開２００３−３０７４８１号公報（図６）に記載されているが、これを図６に示す。この図６に示すように、サンプル溶液１０３に含まれる分析対象のみを捕獲する感応膜を固定化した検出用チャネル１０１と、その近傍に配置した感応膜が無い補正用チャネル１０２とが複数形成されたＱＣＭバイオセンサ１００を設けることにより、両チャネル１０１、１０２の電気的特性の変化を利用して、サンプル溶液１０３の粘度及び密度に影響されずに反応の過程を逐次モニタできるといった方式が提案されている。
【０００４】
さらに、上述したＱＣＭバイオセンサをフローセル構造やマイクロリアクターに組み込んだ場合、シリンジポンプやロータリーポンプなどの送液手段を用いて、サンプル溶液をフローさせることによって、サンプル溶液をフローさせない従来の方式（ウェル型セル構造）よりも反応速度を速くすることができるため、一定量のサンプル溶液における反応全体のリアルタイム測定が短時間で可能である。このとき、フローさせるサンプル溶液の流速の変動をできるだけ抑えて反応を安定して測定するために、サンプル溶液の流れは、シリンジポンプやローラーポンプなどの送液手段を定速駆動させることによって、一定の流速に近い状態にしている。
【特許文献１】特開２００３−３０７４８１号公報
【非特許文献１】森本香織、「プラズモン共鳴分析タイプの分析装置」、臨床検査、株式会社医学書院、２００３年１０月、ｖｏｌ．４７，ｎｏ．１１，２００３年増刊号，ｐ．１３１９〜１３２７
【非特許文献２】永田和宏、半田宏、「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社、１９９８年１１月
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上述したようなＱＣＭバイオセンサをフローセル構造やマイクロリアクターに組み込む方式では、サンプル溶液の密度及び粘度の補正と短時間での測定とが可能であるが、サンプル溶液に含まれる反応物質の結合定数や解離定数などの反応速度に関するアフィニティー特性を正確に計測するために、フローさせるサンプル溶液の流速を一定にしなければならないという問題があった。
【０００６】
そこで本発明は、上記課題を解決するために、サンプル溶液の流速を一定にすることで、反応速度を一定にして、サンプル溶液に含まれる反応物質の結合定数や解離定数などの反応速度に関する測定を可能とするマイクロリアクター及びマイクロリアクターシステムを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のマイクロリアクターは、反応槽と、該反応槽に溶液が流入する流入流路と、前記反応槽から前記溶液が流出する流出流路とを有し、前記溶液中に含まれる第１の化学物質が前記反応槽内に固定された第２の化学物質に捕獲される捕獲量を測定するマイクロリアクターにおいて、共振周波数を測定する共振周波数測定手段に接続される電極を表面と裏面に有する平板状の圧電振動子と、前記流入流路から分岐して前記圧電振動子の前記表面に連通する第１の分岐路と、前記流出流路から分岐して前記圧電振動子の前記裏面に連通する第２の分岐路とからなり、前記圧電振動子の前記共振周波数を測定することにより、前記溶液が前記第１の分岐路を介して前記圧電振動子に与える圧力と前記第２の分岐路を介して前記圧電振動子に与える圧力との圧力差を検出する圧力検出手段を有することを特徴とするものである。
【０００８】
また、本発明のマイクロリアクターシステムは、前記マイクロリアクターと、前記流路に接続されて前記マイクロリアクターに前記溶液を送液する送液手段と、前記圧電振動子を介して前記共振周波数を測定することにより前記圧力差を測定し、測定した結果に基づいて、前記溶液の流速あるいは流量が一定になるように前記送液手段を駆動制御する制御回路部とを備えることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、圧電振動子からの共振周波数の変化から反応槽前後を流れる流体の圧力差を検知することにより、検出部回路がサンプル溶液の流速あるいは流量を測定し、送液手段にフィードバックすることで、計測中のサンプル溶液の流速あるいは流量を制御して、サンプル溶液に含まれる反応物質の反応速度を一定にすることができるため、様々なバイオ反応をリアルタイムで計測して、反応物質の結合定数や解離定数といったアフィニティー特性を容易に測定することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
(実施の形態の概要)
マイクロリアクター１内に形成された反応槽２の出入り口の圧力差を測定し、常に圧力差が一定となるように送液ポンプを制御する。圧力差を測定するための構造として、反応槽２の出入り口近傍から圧力を取り出すように第１の分岐路８と第２の分岐路９を接続し、これら分岐路の片端は圧電振動子１０の表裏に連通する形となっており、第１の分岐路８と第２の分岐路９の流路内圧差が圧電振動子１０に応力として作用し、この応力によって変化する共振周波数を測定することにより圧力差を測定する。
(実施の形態の詳細)
以下、本発明について図面を参照しつつ詳細に説明する。なお、以下の実施の形態により本発明が限定されるものではない。
（実施の形態１）
図１は、本発明のマイクロリアクター１の構成を説明する図であり、図１（ａ）はマイクロリアクター１の模式的平面図、図１（ｂ）はマイクロリアクター１の圧力検出手段１２の断面図（図１（ａ）中Ａ−Ａ'断面）である。
【００１１】
マイクロリアクター１の基部は樹脂基板７からなる。樹脂基板７は、シリコンゴムの一種であるＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）に凹部を形成し、これを積層して張り合わせた構造となっている。そして、図１（ａ）に示すように、圧力検出手段１２では凹部に挟み込まれるように圧電振動子１０が設置されている。圧電振動子１０は水晶振動子を用い、両面には発振用の電極１１が配置されている。この電極１１は圧電振動子１０の共振周波数を測定する共振周波数測定手段に接続されている。また、凹部は図１（ｂ）に示すような溶液供給口５、反応槽２への流入流路３、流出流路１４、溶液排出口４、第１の分岐路８及び第２の分岐路９を形成する。
【００１２】
一例として、溶液供給口５と溶液排出口４は直径約３ｍｍ、流入流路３と流出流路１４は幅約３００μｍ、深さ５０μｍに作製した。また、反応槽２は最大幅が６ｍｍとなるように作製した。そして、圧力検出手段１２に通じる第１の分岐路８及び第２の分岐路９は幅を５０μｍ以下に、圧力検出手段１２のサイズは最大３ｍｍ□に製作した。また、樹脂基板７の凹部は溶液を均一に流すために、表面を親水化処理コーティング処理を行った。ただし、圧力検出手段１２に接続された第１の分岐路８及び第２の分岐路９は流路内の表面に親水化処理コーティングを施さず疎水の状態を保持している。ここでは疎水性の材質をもつ樹脂を用いてマイクロリアクターを形成したために、第１の分岐路、第２の分岐路以外の流路に親水化処理を行ったが、親水性の素材(例えばガラス)を用いてマイクロリアクターを作る場合は、第１の分岐路、第２の分岐路に溶液が流れ込まないように、図１（ａ）に横線で示した分岐路の分岐部近傍に疎水化処理を施し、疎水領域５０を形成しても良い。
【００１３】
そして、反応槽２には生化学物質の吸着・結合反応を測定するために反応槽底面の一部にＱＣＭバイオセンサ６を配置している。ＱＣＭバイオセンサ６の電極や配線は図１（ａ）では省略している。本実施の形態１ではバイオセンサとしてＱＣＭバイオセンサを用いた。
【００１４】
本実施の形態１のマイクロリアクターシステムの構成について図２を参照して説明する。上述したマイクロリアクター１の溶液排出口４は、チューブ１５を介して廃液タンク１６及びポンプ１７（送液手段）に接続されている。また、そのポンプ１７の駆動制御を行うための制御回路部１８（制御手段）が、ポンプ１７と電気的に接続されている。制御回路部１８は、圧力検出手段１２内部にある圧電振動子１０に形成された電極１１からの電気信号（共振周波数信号１３）の変化に伴って変化する圧電振動子１０の共振周波数を測定する共振周波数測定手段を有しており、また、共振周波数測定手段からの出力を受けることによってポンプ１７の駆動電圧（制御信号１９）を制御する駆動回路などで構成されている。
【００１５】
ポンプ１７は、一般的なロータリーポンプやダイヤフラムポンプでよく、動力としては、電磁、圧電、静電など様々なアクチュエータなどで構成されている。例えば、電磁方式のＤＣモータであれば電圧を変動させることで送液に使用される圧力を可変することができるし、静電もまた同様に電圧により制御が可能である。また圧電アクチュエータの場合、制御パルスの周波数やその電圧を可変させ同様に圧力を変化させることができる。これらの駆動回路は、使用するポンプ１７に応じて構成すればよく、公知であるトランジスタやロジックＩＣで容易に構成することができる。また、ＱＣＭバイオセンサの駆動・検出用回路は図中では省略している。
【００１６】
次に圧力検出手段１２の検出原理について図３を用いて説明する。マイクロリアクター１の溶液供給口５から送液された溶液は、親水化処理された流路内を流れて溶液排水口４に到達する。このとき、溶液は流入流路３に形成された第１の分岐路８との分岐点及び、流出流路１４に形成された第２の分岐路９との分岐点を通過するが、これらの分岐路は疎水である上に流路終端が圧電振動子１０によって閉口されているため内部に溶液が入っていかない。従って、空気が残留した状態となる。マイクロリアクター１内の溶液位置を図３（ａ）斜線部に示す。そして、反応槽２に流れ込む直前の流水圧は、第１の分岐路８の空気を介して圧電振動子１０の表面に伝わる。さらに、反応槽２から流れ出た直後の流水圧は、第２の分岐路９の空気を介して圧電振動子１０の上記表面とは反対側の裏面に伝わる。
【００１７】
ここで、溶液が流れているため反応槽２の前後では圧力差が生じており、この圧力差は圧電振動子１０の表裏に伝わるため、圧電振動子１０に差圧分の微小な応力が加わる（図３（ｂ））。圧電振動子１０が共振しているときに応力が加わると共振周波数がシフトすることが知られており、本発明の圧力検出手段１２では、溶液の流れを発生させている圧力差を、圧電振動子１０の共振周波数変動として計測する原理である。
【００１８】
次に、本実施例のマイクロリアクターシステムを例えば抗原―抗体反応に応用する場合の動作について図面を参照しながら説明する。
【００１９】
まず、ＱＣＭバイオセンサ６の表面に、ＳＡＭ膜４１を介して抗体４２を修飾しておく（図４（ａ））。次に、リン酸などの緩衝液を溶液供給口５にピペットを用いて滴下し、ポンプ１７を動作させると、マイクロリアクター１内部は負圧となり、溶液供給口５に滴下した緩衝液は流入流路３を通り反応槽２へと送られる。そして、流出流路１４を経て溶液排出口４から廃液タンク１６に排出される。
【００２０】
この状態で、ポンプ１７の駆動速度（制御信号１９）を変えながら、緩衝液の流量をフローメーターなどによって測定する。例えば、ポンプ１７の動力として上述したＤＣモータを使用する場合、駆動電圧（制御信号１９）と流量との関係を求めることができる。
【００２１】
そして、流量によって圧力検出手段１２内部にある圧電振動子１０に形成された電極１１からの共振周波数信号１３が変化するので、この共振周波数信号１３の変動と流量変化との関係も測定しておく。これらの測定を行なった後、ポンプ１７を動作させた状態で、抗原４３を含むサンプル溶液を流体供給口５にピペットを用いて２０μＬ滴下した後、先に求めた駆動電圧（制御信号１９）と流量との関係を用いて、例えば、サンプル溶液の流量が１μＬ／ｍｉｎになるような駆動電圧（制御信号１９）でポンプ１７を動作させ、サンプル溶液の送液を行なう。
【００２２】
このとき、抗原４３を含むサンプル溶液の送液に流速や流量の変化が起こると、圧力検出手段１２内部にある圧電振動子１０に形成された電極１１からの共振周波数信号１３が変動する。この共振周波数信号１３は制御回路部１８に送られ、制御回路部１８は先に求めた共振周波数信号１３の変動と流量変化との関係を用いて、共振周波数信号１３が一定なるように、駆動電圧（制御信号１９）を可変させながらポンプ１７を動作させる。この結果、ポンプ１７は流量１μＬ／ｍｉｎを保持し続ける。そして、サンプル溶液中の抗原４３はＱＣＭバイオセンサ表面に固定化されている抗体４２と結合反応（抗原―抗体反応）を生じて捕獲される（図４（ｂ）参照）。
【００２３】
このように、本実施の形態１では、圧力検出手段１２内部にある圧電振動子１０に形成された電極１１からの共振周波数信号１３によってフィードバック制御を行い、容易に送液の流速・流量を高精度に制御することができる。したがって、一定濃度のサンプル溶液であれば、抗原―抗体反応をリアルタイムで計測でき、反応の定量化だけではなく結合定数や解離定数などの反応速度に関するアフィニティー特性をも計測することが可能となる。
【００２４】
例えば、ポンプ１７の圧力を制御せずに一定にした場合、抗原４３を含むサンプル溶液の送液中の残量によって、流入流路３、反応槽部２、流出流路１４内の流路抵抗が変化してしまい、サンプル溶液の送液開始時と終了時での流速は大きく変化してしまうが、上述したように圧力検出手段１２からの信号を受けてポンプ１７を制御してサンプル溶液の流速が一定になるような構成としているため、サンプル溶液の残量による影響を受けることなく計測が可能である。また、本実施の形態１では抗原―抗体反応に関して述べたが、ＤＮＡのハイブリダイゼーション反応、蛋白質の結合、酵素反応など様々な生化学反応に用いることができる。
【００２５】
また、本実施の形態１ではバイオセンサにＱＣＭバイオセンサを用いたが、光を利用したＳＰＲバイオセンサを用いても構わない。
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２のマイクロリアクターシステムの構成について、図５を参照して説明する。マイクロリアクター１は実施の形態１に使用したものと同様のものを用いている。マイクロリアクター１の溶液供給口５はチューブ２０を介してポンプ１７（送液手段）に接続され、マイクロリアクター１の溶液排出口４はチューブ２０を介して廃液タンク１６に接続されている。また、そのポンプ１７の駆動制御を行うための制御回路部１８（制御手段）が、ポンプ１７と電気的に接続されている。制御回路部１８は、圧力検出手段１２内部にある圧電振動子１０に形成された電極１１からの電気信号（共振周波数信号１３）の変化によってポンプ１７の駆動電圧（制御信号１９）を可変させて発生させるための駆動回路などで構成されている。
【００２６】
ポンプ１７は、一般的なロータリーポンプやダイヤフラムポンプでよく、動力としては、電磁、圧電、静電など様々なアクチュエータなどで構成されている。例えば、電磁方式のＤＣモータであれば電圧を変動させることで送液に使用される圧力を可変することができるし、静電もまた同様に電圧により制御が可能である。また圧電アクチュエータの場合、制御パルスの周波数やその電圧を可変させ同様に圧力を変化させることができる。これらの駆動回路は、使用するポンプ１７に応じて構成すればよく、公知であるトランジスタやロジックＩＣで容易に構成することができる。また、ＱＣＭバイオセンサの駆動・検出用回路は図中では省略している。
【００２７】
次に、実施形態２のマイクロリアクターシステムを、例えば抗原―抗体反応に応用する場合の動作について説明する。まず、実施の形態１と同様に、ＱＣＭバイオセンサ６の表面にＳＡＭ膜４１を介して抗体４２を修飾した後、抗原―抗体反応の測定前に緩衝液を用いてポンプ１７の駆動速度（制御信号１９）と流量の関係及び、圧力検出手段１２内部にある圧電振動子１０に形成された電極１１からの共振周波数信号１３と流量変化の関係を測定しておく。
【００２８】
その後、ポンプ１７を動作させた状態で、抗原４３を含むサンプル溶液をポンプ１７に接続されたチューブ２０に２０μＬ供給した後、先に求めた駆動電圧（制御信号１９）と流量との関係を用いて、サンプル溶液の流量が１μＬ／ｍｉｎになるような駆動電圧（制御信号１９）でポンプ１７を動作させ、サンプル溶液の送液を行なう。
【００２９】
このとき、抗原４３を含むサンプル溶液の送液に流速や流量の変化が起こると、圧力検出手段１２内部にある圧電振動子１０に形成された電極１１からの共振周波数信号１３が変動する。この共振周波数信号１３は制御回路部１８に送られ、制御回路部１８は先に求めた共振周波数信号１３の変動と流量変化との関係を用いて、共振周波数信号１３が一定なるように、駆動電圧（制御信号１９）を可変させながらポンプ１７を動作させる。この結果、ポンプ１７は流量１μＬ／ｍｉｎを保持し続ける。そして、サンプル溶液中の抗原４３はＱＣＭバイオセンサ表面に固定化されている抗体４２と結合反応（抗原―抗体反応）を生じて捕獲される。
【００３０】
このように、実施の形態２のマイクロリアクターシステムにおいても、一定濃度のサンプル溶液であれば、抗原―抗体反応をリアルタイムで計測でき、反応の定量化だけではなく結合定数や解離定数などの反応速度に関するアフィニティー特性をも計測可能である。
【００３１】
本実施の形態でも実施の形態１と同様に、例えば、ポンプ１７の圧力を制御せずに一定にした場合、抗原４３を含むサンプル溶液の送液中の残量によって、流入流路３、反応槽部２、流出流路１４内の流路抵抗が変化してしまい、サンプル溶液の送液開始時と終了時での流速は大きく変化してしまうが、上述したように圧力検出手段１２からの信号を受けてポンプ１７を制御してサンプル溶液の流速が一定になるような構成としているため、サンプル溶液の残量による影響を受けることなく計測が可能である。また、本実施の形態１では抗原―抗体反応に関して述べたが、ＤＮＡのハイブリダイゼーション反応、蛋白質の結合、酵素反応など様々な生化学反応に用いることができる。
【００３２】
また、本実施の形態ではバイオセンサにＱＣＭバイオセンサを用いたが、光をもちいたＳＰＲバイオセンサを用いても構わない。
【００３３】
本実施の形態と実施の形態１との違いはポンプ１７の配置が異なっている点にあり、本実施の形態では実施の形態１に示すような吸引方式ではなく加圧方式となっている。よってポンプ１７は、シリンジポンプなどの公知のものを使用することができる。実施の形態１の吸引方式が空気圧を利用するのに対して、本実施の形態の方式では、溶液その物を送り出す方式となるため、タイムラグが少なく、実施の形態１以上に、容易に送液の精度を高めることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明のマイクロリアクターの説明図であり、（ａ）は模式的平面図、（ｂ）は圧力検出手段のＡ−Ａ’断面図である。
【図２】本発明の実施の形態１のマイクロリアクターシステムのブロック構成図である。
【図３】本発明のマイクロリアクターの検出原理を説明する説明図であり、（ａ）は模式的平面図、（ｂ）は圧力検出手段のＡ−Ａ’断面図である。
【図４】本発明のマイクロリアクターの動作を示す説明図であり、（ａ）は抗体を固定した状態、（ｂ）は抗原を送液している状態である。
【図５】本発明の実施の形態２のマイクロリアクターシステムのブロック構成図である。
【図６】従来のＱＣＭバイオセンサの構造を示す説明図であり、（ａ）は上面図、（ｂ）はＢ−Ｂ´断面図である。
【符号の説明】
【００３５】
１      マイクロリアクター
２      反応槽
３      流入流路
４      溶液排出口
５      溶液供給口
６      ＱＣＭバイオセンサ
７      樹脂基板
８      第１の分岐路
９      第２の分岐路
１０    圧電振動子
１１    電極
１２    圧力検出手段
１３    共振周波数信号
１４    流出流路
１５    チューブ
１６    廃液タンク
１７    ポンプ
１８    制御回路部
１９    制御信号
２０    チューブ
４１    ＳＡＭ膜
４２    抗体
４３    抗原
５０    疎水領域
１００  ＱＣＭセンサ
１０１  検出用チャネル
１０２  補正用チャネル
１０３  サンプル溶液
【図１】
0004657867.tif 000002
【図２】
0004657867.tif 000003
【図３】
0004657867.tif 000004
【図４】
0004657867.tif 000005
【図５】
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【図６】
0004657867.tif 000007