(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）導電性基板上に複数の均一な穴が形成される耐膨張高分子樹脂シートを用意し、
（ｂ）該耐膨張高分子樹脂シート上に脂質溶液を塗布し、
（ｃ）前記耐膨張高分子樹脂シートを前記基板から剥がすことにより、該基板上に均一な形のパターン化された脂質フィルムを形成し、
（ｄ）前記均一な形のパターン化された脂質フィルムを有する導電性基板を底部電極とし、絶縁性スペーサを介して上部に導電性基板からなる上部電極を配置したチャンバー内を水溶液で満たし、
（ｅ）前記上部電極と底部電極との間に電界を印加し、
（ｆ）均一な形のリポソームを形成することを特徴とする脂質パターンを用いたリポソームの製造方法。
【請求項２】
請求項１記載の脂質パターンを用いたリポソームの製造方法において、前記耐膨張高分子樹脂シートがパリレン樹脂シートであることを特徴とする脂質パターンを用いたリポソームの製造方法。
【請求項３】
請求項１記載の脂質パターンを用いたリポソームの製造方法において、前記導電性基板がＩＴＯ基板であることを特徴とする脂質パターンを用いたリポソームの製造方法。
【請求項４】
請求項１記載の脂質パターンを用いたリポソームの製造方法において、前記絶縁性スペーサがシリコーンであることを特徴とする脂質パターンを用いたリポソームの製造方法。
【請求項５】
請求項１記載の脂質パターンを用いたリポソームの製造方法において、前記均一な形のリポソームが１０−１００μｍの直径を有する巨大リポソームであることを特徴とする脂質パターンを用いたリポソームの製造方法。
【請求項６】
請求項１記載の脂質パターンを用いたリポソームの製造方法において、前記電界を印加をするために、前記上部電極と底部電極との間に１０Ｈｚで０．５−２．５Ｖppの交流を印加することを特徴とする脂質パターンを用いたリポソームの製造方法。
【請求項７】
請求項１記載の脂質パターンを用いたリポソームの製造方法において、前記リポソームのサイズの偏差係数が１〜１５％であることを特徴とする脂質パターンを用いたリポソームの製造方法。
【請求項８】
請求項１記載の脂質パターンを用いたリポソームの製造方法において、前記耐膨張高分子樹脂シートにリソグラフィーによって複数の均一な穴を形成することを特徴とする脂質パターンを用いたリポソームの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質パターンを用いたリポソームの製造方法に係り、特に、リピート脂質パターンを用いた単分散巨大リポソームの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リポソームとは、図６に示すように、リン脂質を主体に形成される二重膜からなる水溶液を包含した球形の小胞であり、細胞膜と同様の構造を持っている。図６において、リポソーム１００は、脂質二重膜１０１からなり、その二重膜１０１は親水性のヘッド１０２と疎水性のテール１０３からなっている。
【０００３】
このような構造のリポソームの中でも近年、直径が十から百ミクロンと大きい“ジャイアント（巨大）”リポソームの応用が注目されている（非特許文献１参照）。巨大リポソームは、その大きさから、直接顕微鏡下で観察できることが一番の利点であり（非特許文献２参照）、また、細胞と同様のサイズであり人工細胞のモデルとして用いることができる（非特許文献３参照）。さらに、リポソーム内には、薬剤やＤＮＡを包み込むことができ、マイクロサイズの容器として用いることもできる（非特許文献４参照）。
【０００４】
図７はタンパク質を膜に組み込んだリポソームを示す図、図８はその薬品の輸送効率を示す図である。
【０００５】
図７に示すように、リポソーム膜に膜タンパク質１０４を導入することで、各種の膜タンパク質の挙動を個別に解析するデバイスを実現することができると考えられる。例えば、膜タンパクの含まれるリポソームに外部から薬品をかけ、内部に取り込まれた量をリポソーム内の濃度変化として蛍光強度で計測することで、薬剤の輸送効率を解明することができる。
【非特許文献１】Ｌｉｉｓｉ，Ｐ．Ｌ．，Ｇｉａｎｔ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，ｐｐ．３−９（２０００）
【非特許文献２】Ａｎｇｅｌｏｖａ，Ｍ．Ｉ．，Ｇｉａｎｔ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，ｐｐ．２７−３６（２０００）
【非特許文献３】Ｙ．Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３６６，ｐｐ．３０５−３１０（２００２）
【非特許文献４】Ｇ．Ｔｒｅｓｓｅ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）
【非特許文献５】Ｂ．Ｉｌｉｃ  ａｎｄ  Ｈ．Ｇ．Ｃｒａｉｇｈｅａｄ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，ｐｐ３１７−３２２，２０００
【非特許文献６】Ｒ．Ｎ．Ｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｖｏｌ．８５，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００３．３０６６−３０７３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来法で用意されたリポソームは、図８（ａ）に示すように大きさが多様であり、内容積が異なれば、単位時間当たりの濃度変化も異なるため（大きいものほど濃度変化は少ない＝蛍光輝度が低い）、結果として、薬品の取り込みは分散の大きい、あいまいなデータを取り扱うしかないのが現状である。
【０００７】
このような状況から当該分野では、体積の揃った（直径の揃った）均一な形のリポソーム〔図８（ｂ）〕を効率的に製造する方法が渇望されている。
【０００８】
また、従来法で用意されたリポソームは、図８（ａ）に示すように大きさが多様であり、フィルターを通過させて粒径をそろえるなど後処理を行わなければ、均一径のリポソームは得られない。また、これまで、Ｔａｙｌｏｒら（Ｐ．Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＣＰ，ｐｐ４９１８−４９２２，２００３）により、シリコーンゴム製ＰＤＭＳ（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）でできたスタンプを利用し、リン脂質フィルムをパターニングする技術とエレクトロフォーミングを利用して、均一なリポソームを製造する試みがなされているが、ＰＤＭＳのスタンプは有機溶媒をつけると膨張し、スタンプが押される際に歪んでしまい、得たいサイズのリポソームが作れないという欠点が指摘されている（上記非特許文献５参照）。
【０００９】
また、ＰＤＭＳのスタンプに代わってパリレン樹脂シートを用いるようにしたものが開示されている（下記非特許文献６）が、これを用いて脂質溶液からエレクトロフォーメーションによりリポソームを作製することについては何ら示されてはいない。
【００１０】
本発明は、上記状況に鑑みて、エレクトロフォーメーションにより均一な形のパターン化された脂質フィルムから均一な形のリポソームを効率的に形成することができる脂質パターンを用いたリポソームの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕脂質パターンを用いたリポソームの製造方法において、導電性基板上に複数の均一な穴が形成される耐膨張高分子樹脂シートを用意し、この耐膨張高分子樹脂シート上に脂質溶液を塗布し、前記耐膨張高分子樹脂シートを前記基板から剥がすことにより、この基板上に均一な形のパターン化された脂質フィルムを形成し、前記均一な形のパターン化された脂質フィルムを有する導電性基板を底部電極とし、絶縁性スペーサを介して上部に導電性基板からなる上部電極を配置したチャンバー内を水溶液で満たし、前記上部電極と底部電極との間に電界を印加し、均一な形のリポソームを形成することを特徴とする。
【００１２】
〔２〕上記〔１〕記載の脂質パターンを用いたリポソームの製造方法において、前記耐膨張高分子樹脂シートがパリレン樹脂シートであることを特徴とする。
【００１３】
〔３〕上記〔１〕記載の脂質パターンを用いたリポソームの製造方法において、前記導電性基板がＩＴＯ基板であることを特徴とする。
【００１４】
〔４〕上記〔１〕記載の脂質パターンを用いたリポソームの製造方法において、前記絶縁性スペーサがシリコーンであることを特徴とする。
【００１５】
〔５〕上記〔１〕記載の脂質パターンを用いたリポソームの製造方法において、前記均一な形のリポソームが１０−１００μｍの直径を有する巨大リポソームであることを特徴とする。
【００１６】
〔６〕上記〔１〕記載の脂質パターンを用いたリポソームの製造方法において、前記電界を印加をするために、前記上部電極と底部電極との間に１０Ｈｚで０．５−２．５Ｖppの交流を印加することを特徴とする。
【００１７】
〔７〕上記〔１〕記載の脂質パターンを用いたリポソームの製造方法において、前記リポソームのサイズの偏差係数が１〜１５％であることを特徴とする。
【００１８】
〔８〕上記〔１〕記載の脂質パターンを用いたリポソームの製造方法において、前記耐膨張高分子樹脂シートにリソグラフィーによって複数の均一な穴を形成することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、以下のような効果を奏することができる。
【００２０】
（１）エレクトロフォーメーションにより均一な形のパターン化された脂質フィルムから均一な形のリポソームを効率的に形成することができる。
【００２１】
（２）均一で、かつ１０−１００μｍの直径を有する巨大リポソームを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の脂質パターンを用いたリポソームの製造方法は、導電性基板上に複数の均一な穴が形成される耐膨張高分子樹脂シートを用意し、この耐膨張高分子樹脂シート上に脂質溶液を塗布し、前記耐膨張高分子樹脂シートを前記基板から剥がし、均一な形のパターン化された脂質フィルムを形成し、前記均一な形のパターン化された脂質フィルムを有する導電性基板を底部電極とし、絶縁性スペーサを介して上部に導電性基板からなる上部電極を配置したチャンバー内を水溶液で満たし、前記上部電極と底部電極との間に電界を印加し、均一な形のリポソームを形成する。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００２４】
図１は本発明の実施例を示す脂質パターンを用いたリポソームの製造装置の模式図、図２はそれを用いた均一サイズのリポソームの製造工程を示す図であり、ここではパリレン樹脂シートパターンの形成方法について説明する。
【００２５】
図１は、均一直径リポソーム作成用デバイスを示している。この図において、２枚のＩＴＯガラス板１，８が電極として用いられており、シリコーンスペーサー７により隔てられチャンバー９が形成されている。チャンバー９内は脱気水（ｄｅｇｇａｓｓｅｄ  ｗａｔｅｒ）（だだし、通常の水溶液であってもよい）で満たされている。また、２枚のＩＴＯガラス板１，８を介して電源１０からＡＣ電圧をチャンバー９内に印加して、均一サイズの巨大リポソーム（１０−１００μｍ）を形成する。
【００２６】
（１）まず、図２（ａ）に示すように、ＩＴＯガラス板１上に耐膨張高分子樹脂シートとしてのパリレン樹脂を蒸着し、パリレン樹脂シート２を積層する。
【００２７】
（２）次いで、図２（ｂ）に示すように、ＩＴＯガラス板１上のパリレン樹脂シート２をＯ2 プラズマによりパターン化し、穴あきシート３を作製する。その際、穴あきシート３の穴４が正確に所定の面積となるようにする。
【００２８】
（３）次に、図２（ｃ）に示すように、その所定の面積の穴４が形成された穴あきシート３上にリン脂質とクロロホルムとメタノールを混ぜた溶液からなる脂質溶液５を塗布し、真空中で乾燥させる。
【００２９】
（４）次に、図２（ｄ）に示すように、所定の面積の穴４が形成された穴あきシート３を剥がすと、ＩＴＯガラス板１には所定の面積の脂質パターン６が転写されて残る。このＩＴＯガラス板１が下部に配置され、シリコーンスペーサー７を介して上部にＩＴＯガラス板８が配置される。
【００３０】
（５）次に、図２（ｅ）に示すように、リポソーム製造のためのチャンバー９内に脱気水１１を導入し、エレクトロフォーメーションにより、ＩＴＯガラス板８，９に電界を印加すると、チャンバー９内で単一サイズの巨大リポソーム１２が製造される。
【００３１】
上記したように、エレクトロフォーメーションにより均一な形のパターン化された脂質フィルムから均一な形のリポソームを効率的に形成することができる。
【００３２】
図３（ａ）には２０μｍ□のリポソームの蛍光イメージが示されている。図３（ｂ）は脂質パターンのＡ−Ｂ線に沿った強度分布を示す図であり、このパターンの強度プロファイルからＩＴＯガラス板上のパターン化された脂質フィルムの明確なエッジが確認できる。
【００３３】
図４には実験における工程を示している。
【００３４】
図４（ａ）には５０×５０μｍ□のパターン化された脂質フィルムが示されており、図４（ｂ）には電界が印加されて膨張したパターン化された脂質フィルム、図４（ｃ）には巨大リポソームが形成された状態が示されている。比較例として図４（ｄ）には２０×２０μｍ□のパターン化された脂質フィルムから形成された小さなリポソームが示されている。
【００３５】
図５は本発明と従来の方法により形成されたリポソームのサイズ分布を示す図である。図５（ａ）はパターン化された脂質フィルムを用いずにリポソームを形成した場合のリポソームのサイズ分布を示しており、ここでは、リポソームのサイズは広範囲に分布しておりその偏差係数は７０％と高い。これに比べて、本発明のパターン化された脂質フィルムを用いた場合には、その偏差係数は１５％であり、大幅に低い偏差係数となっている。さらに、開発を進めた結果、偏差係数は１％レベルまで向上させることができた。これにより、本発明により形成されたリポソームのサイズがほぼ均一であることが分かる。
【００３６】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づき種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明の脂質パターンを用いたリポソームの製造方法は、細胞膜と同様の構造を持っている巨大リポソームの製造に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の実施例を示す脂質パターンを用いたリポソームの製造装置の模式図である。
【図２】本発明の実施例を示す脂質パターンを用いたリポソームの製造装置を用いた均一サイズのリポソームの製造工程を示す図である。
【図３】本発明にかかる２０μｍ□のリポソームの蛍光イメージが示す図である。
【図４】本発明の実験における工程を示す図である。
【図５】本発明と従来の方法により形成されたリポソームのサイズの分布を示す図である。
【図６】二重膜を持つリポソームの模式図である。
【図７】二重膜を持つリポソームへの膜タンパク質の組み込み状態を示す図である。
【図８】薬剤を取り込むリポソームの模式図である。
【符号の説明】
【００３９】
１，８    ＩＴＯガラス板
２    パリレン樹脂シート
３    穴あきシート
４    穴
５    脂質溶液
６    所定の面積の脂質パターン
７    シリコーンスペーサー
９    チャンバー
１０    電源
１１    脱気水
１２    単一サイズの巨大リポソーム
【図１】
0004840906.tif 000002
【図２】
0004840906.tif 000003
【図５】
0004840906.tif 000004
【図６】
0004840906.tif 000005
【図７】
0004840906.tif 000006
【図８】
0004840906.tif 000007
【図３】
0004840906.tif 000008
【図４】
0004840906.tif 000009