(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
細胞を、ＵＶ照射、二クロム酸塩、過酸化水素、５−アザ−シチジン、カドミウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択されるストレス因子で処理する工程；
該細胞を溶解して、細胞溶解産物を得る工程；
酸化および／または脱メチル化した膜ＤＮＡ（ｍＤＮＡ）を、該細胞溶解産物から精製する工程
を包含するプロセスによって得られた酸化および／または脱メチル化したｍＤＮＡを含む、診断剤。
【請求項２】
以下の工程：
細胞を、ＵＶ照射、二クロム酸塩、過酸化水素、５−アザ−シチジン、カドミウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択されるストレス因子で処理する工程；
該細胞を溶解して、細胞溶解産物を得る工程；
酸化および／または脱メチル化した膜ＤＮＡ（ｍＤＮＡ）を、該細胞溶解産物から精製する工程
を包含するプロセスによって得られた酸化および／または脱メチル化したｍＤＮＡのフラグメントを含む、診断剤。
【請求項３】
以下の工程：
細胞を、ＵＶ照射、二クロム酸塩、過酸化水素、５−アザ−シチジン、カドミウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択されるストレス因子で処理する工程であって、該ストレス因子での処理は、該細胞内で、酸化されたｍＤＮＡの量を増加させ、そして／または、ｍＤＮＡの脱メチル化を増加させる、工程；
を包含するプロセスによって得られた細胞を含む、診断剤。
【請求項４】
前記細胞が、二クロム酸塩、過酸化水素およびカドミウムイオンの組み合わせを含むストレス因子で処理される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の診断剤。
【請求項５】
前記細胞が固体支持体に結合されている、請求項３に記載の診断剤。
【請求項６】
前記細胞がリンパ球である、請求項３または５のいずれか１項に記載の診断剤。
【請求項７】
前記酸化および／または脱メチル化したｍＤＮＡが、ＤＮＡ結合タンパク質と会合している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の診断剤。
【請求項８】
前記ＤＮＡ結合タンパク質がヒストンである、請求項７に記載の診断剤。
【請求項９】
前記ＤＮＡ結合タンパク質が、過少アセチル化もしくは過剰アセチル化、および／または過少リン酸化もしくは過剰リン酸化、および／または過少メチル化もしくは過剰メチル化、および／または過少ユビキチン化もしくは過剰ユビキチン化、および／または過少（ポリ−ＡＤＰ−リボシル化）もしくは過剰（ポリ−ＡＤＰ−リボシル化）、および／または過少グリコシル化もしくは過剰グリコシル化されているか、あるいはこれらの組み合わせである、請求項７に記載の診断剤。
【請求項１０】
疾患のインビトロ検出のためのプロセスであって、以下の工程：
動物の抗体含有生物学的流体を、請求項１〜９のいずれか１項に記載の診断剤と接触させる工程、
該診断剤との該抗体の結合を測定する工程
を包含し、ここで、結合が、該動物の疾患を示す、プロセス。
【請求項１１】
前記診断剤が細胞であり、該細胞が、固体支持体に結合されている、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
疾患のインビトロ検出のためのプロセスであって、以下の工程：
動物の細胞含有生物学的サンプルを、以下の工程：
細胞を、ＵＶ照射、二クロム酸塩、過酸化水素、５−アザ−シチジン、カドミウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択されるストレス因子で処理する工程；
該細胞を溶解して、細胞溶解産物を得る工程；
酸化および／または脱メチル化した膜ＤＮＡ（ｍＤＮＡ）を、該細胞溶解産物から精製する工程
を包含するプロセスによって得られた酸化および／または脱メチル化されたｍＤＮＡに対する抗体またはＤＮＡ結合タンパク質と接触させる工程、
該細胞との該抗体またはＤＮＡ結合タンパク質の結合を測定する工程
を包含し、ここで、結合が、該動物の疾患を示す、プロセス。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ結合タンパク質がホルムアミドピリミジンＤＮＡ−グリコシラーゼである、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記疾患が、自己免疫疾患である、請求項１０または１２に記載のプロセス。
【請求項１５】
ｍＤＮＡとの抗体の結合を検出するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の診断剤の使用。
【請求項１６】
動物由来の抗体の結合が、該動物の自己免疫疾患を示す、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
薬物をスクリーニングするための方法であって、薬物の存在下で、以下：
（ｉ）以下の工程：
細胞を、ＵＶ照射、二クロム酸塩、過酸化水素、５−アザ−シチジン、カドミウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択されるストレス因子で処理する工程；
該細胞を溶解して、細胞溶解産物を得る工程；
酸化および／または脱メチル化した膜ＤＮＡ（ｍＤＮＡ）を、該細胞溶解産物から精製する工程
を包含するプロセスによって得られたｍＤＮＡ；あるいは
（ｉｉ）以下の工程：
細胞を、ＵＶ照射、二クロム酸塩、過酸化水素、５−アザ−シチジン、カドミウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択されるストレス因子で処理する工程であって、該ストレス因子での処理は、該細胞内で、酸化されたｍＤＮＡの量を増加させ、そして／または、ｍＤＮＡの脱メチル化を増加させる、工程；
を包含するプロセスによって得られた細胞
との抗体の結合を測定することによる、方法。
【請求項１８】
前記ｍＤＮＡが脱メチル化されたｍＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の診断剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、酸化および／または脱メチル化された細胞質膜会合ＤＮＡ（ｃｍＤＮＡ）または膜ＤＮＡ（ｍＤＮＡ）または酸化および／または脱メチル化されたｍＤＮＡの調製のためのプロセスに関する。
【０００２】
本発明はさらに、酸化および／または脱メチル化された膜ＤＮＡを含む細胞、ならびに酸化および／または脱メチル化された膜ＤＮＡならびにこのようなｍＤＮＡを含む細胞の診断的使用および薬学的使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
参考として援用される米国特許第６，０５７，０９７号は、自己免疫反応を含む病理的状態についてのマーカー、および炎症性疾患についてのマーカーを開示した。
【０００４】
この文献に開示される通り、自己免疫反応および炎症性疾患を含めた多数の病理的状態が、病因が不確かであるかまたは未知であり、そして多因子起源を有し得る。
【０００５】
これらの疾患のいくつかの診断は、困難であるかまたは不確かである。この文献において特に言及される１つの疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。
【０００６】
米国特許第６，０５７，０９７号の前には、充分な特異的抗原構造体を提供して、言及した病理的状態（特に、ＳＬＥ）について特異性および感度の両方において信頼性のある診断を得ることは可能ではなかった。
【０００７】
米国特許第６，０５７，０９７号は、細胞質膜会合ＤＮＡ（ｃｍＤＮＡ）または膜ＤＮＡ（ｍＤＮＡ）という名称の抗原性構造体を提供することによってこの課題を解決する。
【０００８】
この抗原は、言及した疾患を理解している被験体の生物学的流体中に存在する抗体によって認識される。この抗原構造体は、細胞（特に、Ｂリンパ球（例えば、Ｗｉｌ−２細胞））から調製される。
【特許文献１】米国特許第６，０５７，０９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、改善された抗原構造体を提供し、それによって、特異性および感度の向上した、改善された診断ツールを提供することである。
【００１０】
さらなる目的は、自己免疫疾患および／または炎症の処置において有用な薬学的物質についてのスクリーニング方法を提供することである。
【００１１】
さらなる目的は、薬学的組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明によれば、抗原性構造体が、酸化および／または脱メチル化された状態にある膜ＤＮＡの調製のためのプロセスによって調製される。
【００１３】
このプロセスは、以下の工程を包含する：
・細胞を、ＵＶ照射、酸化試薬、重金属塩、薬物、ヌクレオシドアナログおよびヌクレオチドアナログ、酵素インヒビター、酵素アクチベーターならびにｐＨシフトからなる群より選択されるストレス因子で処理する工程、
・この細胞を溶解して、細胞溶解産物を得る工程、
・酸化および／または脱メチル化したｍＤＮＡを、この細胞溶解産物から精製する工程。
【００１４】
ストレス因子での処理は、酸化された膜ＤＮＡの量を増加させ、そして／または細胞中の膜ＤＮＡの脱メチル化を増加させると考えられる。その後、このｍＤＮＡは、米国特許第６，０５７，０９７号によって以前から公知の様式と類似の様式で単離される。
【００１５】
「酸化および／または脱メチル化されたｍＤＮＡ」は、酸化もしくは脱メチル化またはその両方のいずれかがされたｍＤＮＡである。
【００１６】
「酸化された膜ＤＮＡ」は、ストレス因子で処理していない細胞由来のｍＤＮＡと比較してより多くの酸化されたヌクレオチドを含む、膜ＤＮＡである。この酸化されたヌクレオチドは、例えば、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシウリジン、および／またはチミジングリコール、および／または７，８−ジヒドロキシ−８−オキソアデノシンおよび／または８−オキソ−７，８−ジヒドロ−２’−デオキシグアノシンのいずれかであり得る。
【００１７】
最も豊富な酸化されたヌクレオチドは、８−オキソ−７，８−ジヒドロ−２−デオキシグアノシン（８−オキソ−ｄＧ）である。この酸化されたｍＤＮＡは、全グアノシンのうち、好ましくは０．５％よりも多く、より好ましくは１％よりも多く、最も好ましくは３％よりも多くを酸化形態で含み得る。
【００１８】
「脱メチル化されたｍＤＮＡ」は、ストレス因子で処理されていない細胞から調製されたｍＤＮＡよりも少なくメチル化されたヌクレオチドを含むｍＤＮＡである。
【００１９】
このメチル化されたヌクレオチドは、通常、シトシンである。このようなメチル化は、大部分が、脊椎動物においてはＣｐＧジヌクレオチドの状況で生じ、そしてしばしば、転写抑制と関連する。
【００２０】
５−メチル化されたシトシンの好ましい量は、未処理のｍＤＮＡの９０％未満であり、より好ましくは５０％以下であり、そしてより好ましくは３０％以下である。
【００２１】
ストレス因子（例えば、酸化的ストレスであるがこれに限定されない）での処理が、細胞中の膜ＤＮＡの配列においてトランスバージョンまたは変異（例えば、Ｇ→Ｔであるがこれに限定されない）を生じ得ることもまた考えられる。それ故、「酸化および／または脱メチル化されたｍＤＮＡ」は、ストレス因子で処理されていない細胞由来のｍＤＮＡと比較して、少なくとも同じ量であるが異なるヌクレオチド配列を有する、酸化および／またはメチル化されたヌクレオチドを含む膜ＤＮＡであり得る。
【００２２】
適切なストレス因子は、例えば、以下である：二クロム酸塩、過酸化水素、過マンガン酸塩、キニジン、Ｄ−ペニシラミン（Ｄ−ｐｅｎｃｉｌｌａｍｉｎｅ）、ヒドララジン、プロカインアミド、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ代謝産物、ヌクレオシドアナログおよびヌクレオチドアナログ（例えば、５−アザ−シチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン）、ＤＮＡメチラーゼのインヒビター、ヒストンデアセチラーゼのインヒビター（例えば、酪酸塩またはトリコスタチンＡ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼのインヒビター、ヒストンアルギニンメチルトランスフェラーゼインヒビターおよびヒストンリジンメチルトランスフェラーゼインヒビター、プロテインキナーゼのインヒビター（例えば、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）またはカルホスチンＣ（ｃａｌｐｈｏｓｔｉｎ  Ｃ）またはＫ−２５２ａまたはＨ−８９）、プロテインキナーゼのアクチベーター（例えば、ホルボールエステルまたはブリオスタチン１（ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ  １））、プロテインホスファターゼのインヒビター（例えば、カリキュリンＡ（ｃａｌｙｃｕｌｉｎ  Ａ）またはオカダ酸（ｏｋａｄａｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼのインヒビター（例えば、３−アミノベンズアミドまたはｍ−ヨードベンジルグアニジンヘミスルフェート）、ユビキチン結合体化酵素のインヒビター（例えば、メチル化ユビキチン）、ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼのインヒビター（例えば、ユビキチンアルデヒド）、複製の誤りおよび／または自然ＤＮＡ損傷の修復に関与する酵素のインヒビター（例えば、カドミウムイオン）、Ｎ−グリコシル化のインヒビター（例えば、ツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ））、２０Ｓプロテアソームまたは２６Ｓプロテアソームのインヒビター（例えば、ラクタシスチン（ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ））、ファルネシル化のインヒビター（例えば、α−ヒドロキシ−ファルネシルホスホン酸（ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｆａｒｎｅｓｙｌｐｈｏｐｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））、ゲラニルゲラニル化のインヒビター、タンパク質メチル化のインヒビター（例えば、エベルラクトンＢ（ｅｂｅｌａｃｔｏｎｅ  Ｂ））、カタラーゼのインヒビター、スーパーオキシドジスムターゼのインヒビター、グルタチオンペルオキシダーゼのインヒビター、ＤＮＡ過剰メチル化のインデューサー、リン脂質メチル化のインデューサー、リン脂質メチル化のインヒビター（例えば、３−デアザアデノシンまたは３−デアザ−（±）−アリステロマイシン、またはそれらの組み合わせ。
【００２３】
さらなる適切なストレス因子は、ｐＨシフトである。ｐＨシフトは、少なくとも０．２ｐＨ単位、好ましくの０．４ｐＨ単位の環境ｐＨの変化である。
【００２４】
さらなる適切なストレス因子は、例えば、ＵＶ照射である。ＵＶ照射は、好ましくは、酸化試薬と組み合わされる。
【００２５】
適切な酸化試薬は、例えば、Ｈ２Ｏ２または分子酸素である。
【００２６】
分子酸素からは、活性種（例えば、スーパーオキシドラジカル（Ｏ２−・）およびヒドロキシルラジカル（ＨＯ・）が取得され得る。例えば、「ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、１９９９、２４６〜２５２を参照のこと。
【００２７】
適切な重金属塩は、カドミウム塩、クロム塩またはそれらの組み合わせである。これらは、単独で、または酸化試薬（例えば、Ｏ２またはＨ２Ｏ２）と組み合わせて用いられ得る。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の方法に従って入手され得る、酸化および／または脱メチル化された膜ＤＮＡ（ｍＤＮＡ）である。
【００２９】
このような酸化および／もしくは脱メチル化された膜ＤＮＡまたはそれらのフラグメントは、自己免疫疾患の診断試験において、抗原性構造体として有用である。ｍＤＮＡのフラグメントまたは酸化および／もしくは脱メチル化されたｍＤＮＡのフラグメントは、当該分野で公知の方法（例えば、超音波処理、ヌクレアーゼおよび／または制限酵素を用いた酵素的消化であるがこれらに限定されない）によって入手され得る。
【００３０】
さらなる実施形態では、酸化および／もしくは脱メチル化されたｍＤＮＡまたはそれらのフラグメントは、ＤＮＡ結合タンパク質（最も好ましくはヒストン）とさらに会合されている。
【００３１】
これらのＤＮＡ結合タンパク質は、過少アセチル化もしくは過剰アセチル化、過少リン酸化もしくは過剰リン酸化、過少メチル化もしくは過剰メチル化、過小ユビキチン化もしくは過剰ユビキチン化、過少（ポリ−ＡＤＰ−リボシル化）もしくは過剰（ポリ−ＡＤＰ−リボシル化）、または過少グリコシル化もしくは過剰グリコシル化、またはこれらの組み合わせがなされ得る。
【００３２】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の膜ＤＮＡを含む細胞である。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、この細胞は、白血球（特に、好中球、および／またはＢリンパ球および／またはリンパ芽球様細胞および／または単球）の群より選択されるか、または細胞は、微生物（例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａおよびＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓであるがこれらに限定されない）の群より選択される。
【００３４】
このような細胞は、細胞を、ＵＶ照射、酸化試薬、重金属塩、薬物、ヌクレオシドアナログおよびヌクレオチドアナログ、酵素インヒビター、酵素アクチベーターならびにｐＨシフトからなる群より選択されるストレス因子で処理する工程を包含するプロセスによって入手され得る。
【００３５】
適切なストレス因子は、上記に開示される。
【００３６】
本発明のさらなる実施形態は、酸化および／もしくは脱メチル化された膜ＤＮＡ、このｍＤＮＡのフラグメント、または酸化および／もしくは脱メチル化された膜ＤＮＡ含有細胞を含む、診断剤である。
【００３７】
この診断剤は、異なる診断試験において用いられ得る。
【００３８】
１つの実施形態では、それゆえ、本発明は、以下の工程を包含する自己免疫疾患の検出のためのプロセスを包含する：
・動物の抗体含有生物学的流体を、本発明の診断剤と接触させる工程、
・この診断剤とのこの抗体の結合を測定する工程。
ここで、結合は、この動物の自己免疫疾患を示す。
【００３９】
好ましい実施形態では、この診断剤は細胞の形態にあり、そしてこの細胞は、この生物学的流体をこの診断薬剤と接触させる前に、固体支持体に付着されているかまたは固体支持体に付着され得る。このような付着は、リガンド／レセプターもしくはリガンド／タンパク質相互作用またはビオチン化細胞／（ストレプト）アビジン、レクチン／抗レクチンを通して、あるいは活性化固体支持体とアミノ基、酸性基もしくはスルフヒドリル基または細胞表面の糖質もしくは酸化された糖質との間の共有結合を通してのいずれかによる、共有結合によるものであっても非共有結合的なものであってもよい。
【００４０】
第２の実施形態では、本発明は、以下の工程を包含する、自己免疫疾患のインビトロ検出のためのプロセスを包含する：
・動物の細胞含有生物学的サンプルを、請求項４に記載の酸化および／もしくは脱メチル化されたｍＤＮＡ、またはそれらのフラグメントに対する抗体と接触させる工程、
・この細胞とのこの抗体の結合を測定する工程。ここで、結合は、この動物の自己免疫疾患を示す。
【００４１】
好ましくは、これらの診断試験は、インビトロで行われる。
【００４２】
このような診断試験はまた、ストレス因子で細胞を処理することによって（生）化学的に改変された他の抗原についても有用である。
【００４３】
適切な試験では、この細胞は、生物学的流体（特に、血液または血清）由来の抗体の、細胞に対する結合を同定するために用いられ得る。
【００４４】
あるいは、この酸化および／もしくは脱メチル化されたｍＤＮＡ、またはそれらのフラグメントは、結合を同定するために、試験系（例えば、ＥＬＩＳＡまたはゲルシフトアッセイ）において用いられ得る。
【００４５】
本発明のさらなる実施形態は、この診断剤を用いて、膜ＤＮＡとの結合を検出することである。このような結合は、動物の自己免疫疾患を示す。
【００４６】
さらなる実施形態では、本発明は、スクリーニング方法によって薬物を同定するための方法を提供する。このスクリーニング方法は、酸化および／もしくは脱メチル化されたｍＤＮＡ、またはそれらのフラグメント、あるいは酸化および／もしくは脱メチル化されたｍＤＮＡ含有細胞との抗体の結合を測定する工程を包含する。この抗体の結合に対する潜在的物質の影響は、このような物質が有用な薬学的組成物であるか否かを示す。
【００４７】
本発明のなお別の実施形態は、酸化および／もしくは脱メチル化されたｍＤＮＡまたはそれらのフラグメントあるいは酸化および／または脱メチル化されたＤＮＡ含有細胞を含む、薬学的処方物である。このような薬学的組成物は、患者の構造体から患者の自己免疫抗体を減少させ、それにより、この疾患を軽減または治癒するために用いられ得る。
【００４８】
この薬学的処方物はまた、ワクチンの形態で用いられ得る。
【００４９】
それゆえ、動物における自己免疫疾患を処置するための薬学的処方物の使用もまた、本発明の一部である。
【００５０】
本発明は、以下の非限定的な実施形態によってさらに説明される。
【実施例】
【００５１】
（細胞培養）
ＩＣＮ  Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ  ９０１１２１２１）から入手したヒトリンパ芽球性Ｂの細胞株（Ｗｉｌ２  ＮＳ）を、１０％ウシ胎児血清（熱不活化され、そしてマイコプラスマが存在しないことについて試験された）、Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０中で、加湿オーブン中で、３７℃および５％  ＣＯ２において維持する。
【００５２】
（血清）
血清を、自己免疫反応を有するいくつかの炎症疾患または病理状態に罹患している患者、および正常個体から入手する。これらの血清を、遠心分離した凝固血から入手し、そして使用するまで−２０℃において保持する。
【００５３】
下記の全ての実験では、米国特許第６，０５７，９７号による試験において陽性であるＳＬＥ患者の血清は、細胞処理がどのようなものであれ、常に陽性である。
【００５４】
ＬＥＤ  ０とは、１／３０に希釈した血清が米国特許第６，０５７，９７号の試験において陽性パターンを与えない、ＳＬＥＤＡＩ基準のうちの少なくとも４つを有するＳＬＥ患者を意味する。
【００５５】
ＲＦは、「いくつかの炎症性疾患または病理的状態に罹患しているが、ＳＬＥに罹患していない患者由来の血清」について用いられる。
【００５６】
（ｍＤＮＡのインビトロ酸化）
Ｗｉｌ２  ＮＳ細胞をハンクス溶液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で３回洗浄し、そして０．２５×１０６細胞／ｍＬにおいてＨＢＳＳ中に再懸濁し、続いて２０μＬ／ウェルに分けたスライドガラス上にスポットする。オーブンにおいて２時間の間３７℃にて乾燥した後、この細胞をメタノール中で３分間固定する。次いで、細胞を、３０μＬのＰＢＳ中に１／３５に希釈したヤギ抗ヒトアルブミン血清（Ｄｉａ−Ｓｏｒｉｎ）の存在下で室温において３０分間インキュベートする。
【００５７】
これらのスライドをＰＢＳ中の１％過酸化水素に曝露し、そしてこれらのＵＶＢを、１時間の間、ＵＶ−ＣＡＭＡＧランプ下において２５４ｎｍにおいて直ちに照射した。照射を、室温において暗所で、１３ｃｍのスライドにて実施した。
【００５８】
これらのスライドを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％（細胞培養グレード）中に２０μｌにおいて１／１０希釈した異なる患者血清の存在下で３０分間インキュベートし、そしてＰＢＳで再度洗浄する。Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｓｅｒ  １０，０００  ＭＷＣＯ（Ｐｉｅｒｃｅ）中で４℃において一晩透析し、次いでＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＭＹ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて３回遠心分離した３０μＬのフルオレセイン結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｉｎｏｖａ）の存在下で、暗所において３０分間、これらのスライドをさらにインキュベートする。これらのスライドの最終洗浄を、ＰＢＳ単独で実施し、次いで対比染料としてエバンスブルーを含むＰＢＳによって実施する。最後に、スライドをグリセリン・ＰＢＳ（１：１）（ｐＨ８．４）中にマウントし、そしてＵＶ液浸（Ｎｉｋｏｎ）によって可視化する。
【００５９】
（結果）
Ｈ２Ｏ２＋ＵＶ２５４ｎｍを用いてインビトロ酸化を実施し、そして４５人の血清（５人の健常被験体、１０人の自己免疫、および３０人の慢性関節リウマチ）を試験した。
【００６０】
【表１】
0004776376.tif 000002
明らかに、ｍＤＮＡのインビトロ酸化は、この試験の特異性および感度を向上させ、そしてより多くのＳＬＥ患者を同定することを可能にする。
【００６１】
（ｍＤＮＡのインビボ酸化）
酢酸カドミウム（Ｃｄ）、二クロム酸ナトリウム（Ｃｒ）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）のプールを、対数増殖期にある細胞の取り出しの１７時間３０分前に、（それぞれ、１０μＭ、１０μＭおよび２０μＭの最終濃度において）この培養物に添加した。この調製物を、１．０〜１．５×１０６細胞／ｍＬの密度において、この実験の前および終了時に、トリパンブルー排除によって生存率について評価した。生存率は、９５％より高くなければならない。
【００６２】
Ｗｉｌ２  ＮＳ細胞を、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水、１０ｍＭ、ｐＨ７．４）中で１回洗浄し、次いで５００μＭの濃度でＡＴＰを補充したＰＢＳ中で１回洗浄する。その後、これらを、ＰＢＳ中に１／３５で希釈したヤギ抗ヒトアルブミン（Ｄｉａ−Ｓｏｒｉｎ）の存在下で室温において３０分間インキュベートする。次いで、細胞を遠心分離によって収集し、そして０．２６×１０６細胞／ｍＬにおいて再懸濁し、続いて２０μＬ／ウェルに分けたスライドガラス上にスポットする。
【００６３】
オーブン中で３７℃において２時間の間乾燥した後、これらの細胞をメタノール中で３分間固定し、そしてＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水、１０ｍＭ、ｐＨ７．４）中で１回洗浄する。
【００６４】
これらを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％（細胞培養グレード）中に２０μＬ／ウェルに１／２０希釈した異なる患者血清の存在下で３０分間インキュベートし、そしてＰＢＳで再度洗浄する。これらのスライドを、フルオレセイン結合体化ヤギＦ（ａｂ２）’抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、１／６０希釈）およびフルオレセイン結合体化ヤギＩｇＧ抗ヒトＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ、１／７０希釈）の混合物（３０μＬ）の存在下で、暗所にて３０分間、さらにインキュベートする。スライドの最終洗浄は、ＰＢＳ単独、次いで対比染料としてエバンスブルーを含むＰＢＳを用いて実施される。最終的に、スライドをグリセリン／ＰＢＳ（１：１）（ｐＨ８．４）中にマウントし、そしてＵＶ液浸顕微鏡法（Ｎｉｋｏｎ）によって解像度４０倍で可視化する。
【００６５】
（結果）
１０％  ＦＢＳおよび種々の生成物を補充したＲＰＭＩ  １６４０中で細胞増殖が生じる場合、いくつかの炎症性疾患または病理状態に罹患しているがＳＬＥには罹患していない患者由来の３２７のうちの１０の血清のみが陽性のパターンを生じ、そして「ＬＥＤ  ０」として参照された３１のうちの１５の血清が、陽性パターンを生じた。この試験は、９７％の特異性および８２％の感度を有する。
【００６６】
細胞増殖が、無血清培地（ＡＩＭＶ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び種々の生成物中で生じた場合、いくつかの炎症性疾患または病理状態に罹患しているがＳＬＥに罹患していない患者由来の３４７のうちのほんの６つの血清は陽性パターンを生じ、そして「ＬＥＤ  ０」と言及される３１のうちの１８の血清は、陽性結果を生じる。この試験は、９８．３％の特異性および８４％の感度を有する。
【００６７】
（ＤＮＡメチラーゼのインビボでの阻害）
５−アザ−シチジンを、１．０μＭの最終濃度において、対数増殖期における細胞の取り出しの１７時間３０分前に培養物に添加した。この調製物を、１．５〜１．８〜２．０×１０６細胞／ｍｌの密度において、トリパンブルー排除による実験の前および終了後での両方で、生存率について評価した。生存率は、９５％よりも高くなければならない。
【００６８】
これらのスライドを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％（細胞培養グレード）中に１／２０希釈した異なる患者血清の存在下で３０分間インキュベートし、そしてＰＢＳで再度洗浄する。
【００６９】
これらのスライドを、フルオレセイン結合体化ヤギＦ（ａｂ２）’抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、１／６０希釈）およびフルオレセイン結合体化ヤギＩｇＧ抗ヒトＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ、１／７０希釈）の混合物（３０μｌ）の存在下で、暗所にて３０分間さらにインキュベートする。
【００７０】
（結果）
【００７１】
【表２】
0004776376.tif 000003
脱メチル化されたｍＤＮＡはまた、良好な抗原であり、ＳＬＥ患者の抗ｍＤＮＡ抗体によって良好に認識される。特異性は、感度と同様に向上する。なぜなら、血清は、１／３０の代わりに１／１０で希釈され得るからである。
【００７２】
ここで、７つのうちの６つのＲＦ血清が、上記の実験において陽性であって血清であることに留意すべきである。
【００７３】
（ヒストン脱アセチル化のインビボ阻害）
酪酸ナトリウムを、対数増殖期での細胞の取り出しの１７時間３０分前に、培養培地（無血清培地ＡＩＭＶ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１．０ｍＭの最終濃度において添加した。この調製物を、１．５〜１．８×１０６細胞／ｍｌの密度において、トリパンブルー排除による実験前および実験終了時の両方で、生存率について評価した。生存率は、９５％より高くなければならない。
【００７４】
これらのスライドを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％（細胞培養グレード）中に２０μＬ／ウェルにおいて１／２０希釈した異なる患者血清の存在下で３０分間インキュベートし、そしてＰＢＳで再度洗浄する。
【００７５】
これらのスライドを、フルオレセイン結合体化ヤギＦ（ａｂ２）’抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、１／６０希釈）およびヤギＩｇＧ抗ヒトＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ、１／７０希釈）の混合物（３０μｌ）の存在下で、暗所にてさらに３０分間インキュベートする。
【００７６】
（結果）
【００７７】
【表３】
0004776376.tif 000004
ヒストン過剰アセチル化を制御することが、この試験の選択性を改善するようである。それ故、膜ＤＮＡは、細胞表面の過剰アセチル化ヒストンと会合し得る（ヌクレオソーム様構造体）。
【００７８】
（薬物の使用）
ヒドララジンまたはプロカインアミドを、対数増殖期にある細胞の取り出しの１７時間３０分前に、１０−５Ｍの最終濃度において培養培地（無血清培地ＡＩＭＶ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に添加した。この調製物を、１．５〜１．８×１０６細胞／ｍｌの密度において、トリパンブルー排除による実験前および実験終了時の両方で、生存率について評価した。生存率は、９５％より高くなければならない。
【００７９】
これらのスライドを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％（細胞培養グレード）中に２０μＬ／ウェルにおいて１／２０希釈した異なる患者血清の存在下で３０分間インキュベートし、そしてＰＢＳで再度洗浄する。
【００８０】
これらのスライドを、フルオレセイン結合体化ヤギＦ（ａｂ２）’抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、１／６０希釈）およびヤギＩｇＧ抗ヒトＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ、１／７０希釈）の混合物（３０μｌ）の存在下で、暗所にてさらに３０分間インキュベートする。
【００８１】
（結果）
【００８２】
【表４】
0004776376.tif 000005
細胞を、狼瘡を誘導することが周知の薬物のうちの１つで処理した後、ｍＤＮＡはまた、良好な抗原であり、ＳＬＥ患者血清の抗ｍＤＮＡ抗体によって良好に認識される。特異性は、感度と同様に向上する。なぜなら、血清は、１／３０または１／４０の代わりに１／２０希釈され得るからである。
【００８３】
（８−オキソ−２’−デオキシグアノシンの存在）
Ｈ２Ｏ２−ＵＶ照射スライド、またはＣｄ＋Ｃｒ＋Ｈ２Ｏ２もしくは５−アザシチジンのいずれかの存在下で増殖させた細胞を有して製造されたスライド、または酪酸ナトリウムを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％ウシ胎児血清中に１／１００希釈した３０μｌの抗８−オキソ−ｄＧマウスモノクローナル抗体（Ｇｅｎｔａｕｒ）の存在下で、４℃にて一晩インキュベートする。これらのスライドをＰＢＳ中で１回洗浄し、次いでＰＢＳ中０．１μｇ／１×１０６細胞の濃度に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体（ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ）の存在下で４０分間インキュベートする。
【００８４】
これらのスライドの最終洗浄をＰＢＳ中で実施し、そしてこれらのスライドをグリセリン／ＰＢＳ（ｐＨ８．４）中にマウントし、その後、ＵＶ液浸顕微鏡法により可視化する。
【００８５】
（結果）
陽性パターン５は、細胞膜の緑色の断続的パターンによって表された。８−オキソ−ｄＧは、ｍＤＮＡの酸化を上記の方法に従ってインビボ（Ｃｄ＋Ｃｒ＋Ｈ２Ｏ２）またはインビトロ（Ｈ２Ｏ２＋ＵＶ）のいずれかで実施した場合に細胞表面に存在することが示される。
【００８６】
細胞を５−アザ−シチジンの存在下で増殖させた場合も陽性パターンが示されるが、酪酸ナトリウムの存在下で増殖させた場合には示されない。
【００８７】
（５−メチルシトシンの存在）
Ｃｄ＋Ｃｒ＋Ｈ２Ｏ２もしくは５−アザシチジンのいずれか、または酪酸ナトリウムの存在下で増殖させた細胞を有して製造されたスライドを、ＰＢＳ中に１／１００希釈した３０μｌの抗５−メチルシトシンヒツジ抗体（Ａｂｃａｍ，Ａｂ１８８４）の存在下で４℃にて一晩インキュベートする。これらのスライドをＰＢＳ中で１回洗浄し、次いで３０μｌのＮａＯＨ（７×１０−５Ｎ）の存在下で１５秒間インキュベートする。ＰＢＳで洗浄した後、これらのスライドを、ＰＢＳ中の０．１μｇ／１×１０６細胞の濃度に希釈したロバ抗ヒツジＩｇＧ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ）の存在下で３０分間、最終的にインキュベートする。
【００８８】
これらのスライドの最終洗浄をＰＢＳ中で実施し、そしてスライドをグリセリン／ＰＢＳ（ｐＨ８．４）中にマウントし、その後、ＵＶ液浸顕微鏡法によって可視化する。
【００８９】
（結果）
この細胞内での５−メチルシトシンを同定するための陽性パターンを、細胞内緑色蛍光により表す。
【００９０】
ＤＮＡの強力な全体的メチル化は、Ｃｄ＋Ｃｒ＋Ｈ２Ｏ２または酪酸ナトリウムのいずれかの存在下で増殖させた細胞について生じたが、酪酸ナトリウムによって処理した細胞の細胞内緑色蛍光が、最初の場合と同程度に強い場合でさえ、５−アザ−シチジンの存在下では生じなかった。