(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
主要ヌクレオキャプシド（N）タンパク質、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（P）、大きなポリメラーゼタンパク質（L）、及びヒトパラパラインフルエンザウィルス３（HPIV3）ゲノム又はアンチゲノムであってHPIV3ヌクレオキャプシドリンタンパク質（P）遺伝子を有するもの、を含んで成る単離された感染性キメラパラミキソインフルエンザウィルス（PIV）において、前記HPIV3 P遺伝子の前又は後にHPIV3以外のヒトパラインフルエンザウイルスのHNタンパク質をコードする１又は複数の異種遺伝子（HN遺伝子）が挿入されていることを特徴とする前記単離された感染性キメラパラミキソインフルエンザウィルス（PIV）。
【請求項２】
前記挿入されたHN遺伝子が、ヒトパラミキソウイルス１（HPIV1）からのものである、請求項１に記載の単離された感染性キメラPIV。
【請求項３】
前記HN遺伝子が、HPIV3 P遺伝子の前に挿入される、請求項２に記載の単離された感染性キメラPIV。
【請求項４】
前記HN遺伝子が、HPIV3 P遺伝子の後に挿入される、請求項２に記載の単離された感染性キメラPIV。
【請求項５】
前記挿入されたHN遺伝子が、ヒトパラミキソウイルス２（HPIV2）からのものである、請求項１に記載の単離された感染性キメラPIV。
【請求項６】
前記HN遺伝子が、HPIV3 P遺伝子の前に挿入される、請求項５に記載の単離された感染性キメラPIV。
【請求項７】
前記HN遺伝子が、HPIV3 P遺伝子の後に挿入される、請求項５に記載の単離された感染性キメラPIV。
【請求項８】
HPIV2からのHN遺伝子であって、HPIV3 P遺伝子の後に挿入されたものを更に含んで成る、請求項３に記載の単離された感染性キメラPIV。
【請求項９】
生理的に許容されるキャリヤー中に免疫原的に十分な量の請求項１に記載のキメラPIVを含んで成る、PIVに対する免疫応答を誘発するための免疫原組成物。
【請求項１０】
103〜107 PFUの量で配合されている、請求項９に記載の免疫原組成物。
【請求項１１】
液滴又はエアロゾルにより上部気道に投与するために配合されている請求項９に記載の免疫原組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の感染性キメラPIVをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
１又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子から感染性弱毒化キメラPIV粒子を製造する方法において、細胞又は無細胞溶解物中で、請求項12に記載の単離されたポリヌクレオチド並びにPIV  Ｎ、Ｐ及びＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んで成る発現ベクターを発現させて、請求項１に記載の感染性キメラPIVを生成せしめる、ことを含んで成る方法。
【請求項１４】
１又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子から感染性弱毒化キメラPIV粒子を製造する方法において、細胞又は無細胞溶解物中で、請求項12に記載の単離されたポリヌクレオチド並びにPIV  Ｎ、Ｐ及びＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドを２又はそれより多くの異なる発現ベクターにより発現させて、請求項１に記載の感染性キメラPIVを生成せしめる、ことを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景：
ヒトパラインフルエンザウィルスタイプ３（HPIV3）は、年齢１歳以下の乳児及び子供における重度の低部気道感染の一般的な原因である。それは、この年齢グループにおけるウィルス低部気道疾患のための入院の主な原因としてRSウィルス（RSV）の次である（Collinsなど., p.1205-1243. In B. N. Fields (Knipe など., eds.), Field Virology, 3rd ed., Vol. 1. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996; Croweなど., Vaccine 13:415-421, 1995; Marxなど., J. Infect. Dis. 176: 1423-1427, 1997）。このウィルスによる感染は、３歳以下の子供において実質的な病的状態をもたらす。
【０００２】
HPIV1及びHPIV2は、喉頭気管支炎（クループ）の主要病因物質であり、そしてまた、重度の肺炎及び気管支炎も引き起こす（Collinsなど., 3rd ed. In “Fiekds Virology,” B.N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, R.M. Chanock, J. L. Melnick, T. P. Monath, B. Roizman, 及びS.E. Straus, Eds., Vol. 1, pp. 1205-1243. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996）。20年以上もの長い研究において、HPIV1, HPIV2及びHPIV3は、全体的に入院の18％である気道患者に関する入院のそれぞれ6.0, 3.2及び11.5％の病因物質として同定され、そしてこの理由のために、効果的なワクチンの必要性が存在する（Murphy など., Virus Res. 11:1-15, 1988）。
【０００３】
パラインフルエンザウィルスはまた、中耳炎を有する子供におけるウィルス誘発された中耳滲出の患者において有意な割合で同定されている（Heikkinenなど., N. Engl. J. Med. 340:260-4, 1999）。従って、重度の低部気道疾患及びそれらのHPIV感染を付随する中耳炎を妨げることができる、それらのウィルスに対するワクチンを生成する必要性がある。HPIV1, HPIV2及びHPIV3は、有意な交差−保護免疫性を誘発しない明白な血清型である。
【０００４】
HPIPに対する効果的なワクチン治療を開発するためへの相当の努力にもかかわらず、いずれのHPIV血清型のための又はHPIV関連疾病を改善するための許容できるワクチン剤もまだ得られていない。今日まで、わずか２種の弱毒化された生存PIVワクチン候補体が特定の注目を受けて来た。それらの候補体の１つには、HPIV3に抗原的に関連し、そしてHPIV3に対して動物を保護することが示されているウシPIV（BPIV3）株である。BPIV3は、弱毒化され、遺伝的に安定性であり、そしてヒト乳児及び子供において免疫原性である（Karronなど., J. Inf. Dis. 171:1107-14, 1995a; Karron など., J. Inf. Dis. 172:1445-1450, 1995b）。第２のPIV3ワクチン候補体、すなわちJS cp45は、HPIV3のJS野生型（wt）株の低温−適合された変異体である（Karrnなど., J. Inf. Dis. 172: 1445-1450, 1995b; Belshe など., J. Med. Virol. 10: 235-42, 1982）。
【０００５】
この生存性の弱毒化された、低温継代された（cp）PIV3ワクチン候補体は、インビボでのウィルス複製の後、安定性である、感温性（ts）、低温適合性（ca）、及び弱毒化（att）表現型を示す。cp45ウィルスは、実験動物においてヒトPIV3攻撃に対して保護性であり、そして弱毒化され、遺伝的に安定性であり、そして血清陰性ヒト乳児及び子供において免疫原性である（Hallなど., Virus Res. 22: 173-184, 1992; Karronなど., J. Inf. Dis. 172: 1445-1450, 1995b）。今日までの最も著名な見込みは、弱毒化された生存ウィルスであり、なぜならば、それらは受動的にトランスファーされた抗体の存在下でさえ、非ヒト霊長類において効果的であることが示されているからであり、それに類似する実験情況は、母親から得られた抗体を有する非常に若い乳児において存在する（Crowe など., Vaccine 13:847-855, 1995; Durbin など., J. Infect. Dis. 179: 1345-1351, 1999）。
【０００６】
２種の弱毒化された生存PIV3ワクチン候補体、すなわち野生型PIV3 JS株の感温性（ts）誘導体（PIV3 cp45と称する）及びウシPIV3（BPIV3）株が、臨床学的評価を受けている（Karron など., Pediatr. Infect. Dis. J. 15: 650-654, 1996; Karron など., J. Infect. Dis. 171: 1107-1114, 1995a; Karron など., J. Infect. Dis. 172; 1445-14450, 1995b）。弱毒化された生存PIV3cp45ワクチン候補体は、低温での細胞培養における連続的な継代を通して、HPIV3のJS株から誘導され、そして実験動物においてHPIV3攻撃に対して保護性であり、そして満足して弱毒化され、遺伝的に安定し、そして血清陰性ヒト乳児及び子供において免疫原性であることが見出されている
【０００７】
(Belshe など, J. Med. Virol. 10:235-242, 1982; Belshe など, Infect. Immun. 37:160-5, 1982; Clements など., J. Clin. Microbiol. 29: 1175-82, 1991; Crookshanks など., J. Med. Virol. 13:243-9, 1984; Hall など., Virus Res. 22: 173-184, 1992; Karron など., J. Infect.Dis. 172:1445-1450, 1995b)。それらのPIV3候補体ワクチンウィルスは生物学的に誘導されるので、弱毒化のレベルを調節するための証明された方法が存在せず、従って、この方法は進行する臨床学的試験から必要であることが見出されるべきである。
【０００８】
PIVワクチン候補体の進行を促進するために、組換えDNA技法が最近、cDNAから感染性の陰性鎖RNAの回収を可能にしている（Conzelmann, J. Gen. Virol. 77: 381-89, 1996; Palese など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 11354-58, 1996）。この情況においては、組換え救援が、必要ウィルスタンパク質の存在下でcDNA−コードされたアンチゲノムDNAからの感染性RSウィルス（RSV）、狂犬病ウィルス（RaV）、シミアンウィルス５（SV5）、牛疫ウィルス、ニューカッスル病ウィルス（NDV）、水疱性口内炎ウィルス（VSV）、はしかウィルス（MeV）及びセンダイウィルス（SeV）について報告されている
【０００９】
(例えば、Garcin など., EMBO J. 14:6087-6094, 1995; Lawson など., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:4477-81, 1995; Radecke など., EMBO J. 14:5773-5784, 1995; Schnell など., EMBO J. 13:4195-203, 1994; Whelan など., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 92:8388-92, Hoffman など., J. Virol. 71. 4272-4277, 1997; Kato など., Genes to Cells 1:569-579, 1996, Roberts など., Virology 247:1-6, 1998; Baron など., J. Virol. 71:1265-1271, 1997; 国際公開番号WO97/06270; Collins など., Proc, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:11563-11567, 1995; 1997年７月15日に出願されたアメリカ特許第08/892,403号（公開された国際出願番号WO98/02530, 及び次の仮の優先権アメリカ出願第60/047,634号（1997年５月23日に出願された）、第60/046, 141号（1997年５月９日に出願された）及び第60/021,773号（1996年７月15日に出願された）；
【００１０】
1999年４月13日に出願されたアメリカ特許出願第09/291,894号：2000年４月12日に出願された国際出願番号PCT/US00/09695号（1999年４月13日に出願された仮のアメリカ特許出願第6.0/129,006号の優先権を主張する）；2000年６月23日に出願された国際出願番号PCT/US00/17755号（1999年７月９日に、Bucholz などにより出願された仮のアメリカ特許出願第60/143,132号の優先権を主張する）；Juhasz など., J. Virol, 71:5814-5819, 1997; He など., Virology 237:249-260, 1997; Peters など., J. Virol. 23:5001-5009, 1999; Baron など., J. Virol. 71:1265-1271, 1997; Whitehead など., Virology 247:232-9, 1998a; Whitchead など., J. Virol. 72:4467-4471, 1998b; Jin など., Virology 251:206-214, 1998; Bucholz など., J. Virol. 73:251-259, 1999; 及びWhitehead など., J. Virol. 73:3438-3442, 1999, それぞれは、引用により本明細書にくみこまれる）。
【００１１】
本発明に関しては、cDNAからのwt表現型を有するHPIVを生成するための方法が最近、感染性組換えHPIV3 JS株の回収のために開発された（例えば、Durbinなど., Viroogy 235: 323-332, 1997; 1998年５月22日に出願されたアメリカ特許出願第09/083,793号（1997年９月19日に出願された仮のアメリカ特許出願第60/059,385号に対応する）；及び1997年５月23日に出願された仮のアメリカ特許出願第60/047,575号（国際特許公開番号WO98/53078号に対応する）；それぞれは、引用により本明細書に組み込まれる）。さらに、それらの開示は、例えばHPIV3  cp45ウィルスにおける突然変異がそのts, ca 及びatt表現型を特定し、そしてBPIV3の遺伝子又はゲノムセグメントがその弱毒化表現型を特定する、生物学的突然変異における表現型変化の遺伝的基礎を決定するためのウィルスcDNAコーンの遺伝子操作を可能にする。
【００１２】
さらに、それらの及び関連する開示は、広範囲の異なった突然変異を有する新規PIVワクチン候補体の構成、及び弱毒化、免疫原性及び表現型安定性のそれらのレベルの評価を実施可能にする（2000年６月１日に出願されたアメリカ特許出願第09/586,479号（1999年７月９日に出願された仮のアメリカ特許出願第60/143,134号に対応する）；及び1999年７月９日に、Durbinなどにより出願されたアメリカ特許出願第09/350,821号；それぞれは、引用により本明細書に組み込まれる）。
【００１３】
従って、感染性野生型組換えPIV3、（ｒ）PIV3、及び多くのts誘導体が、cDNAから回収されており、そして逆遺伝子システムが、定義された弱毒化突然変異を担持する感染性ウィルスを生成し、そして存在するワクチンウィルスの弱毒性化の遺伝子基礎を研究するために使用されて来た。例えば、単独で又は組合して、cp45のL遺伝子に見出される３個のアミノ酸置換が、ts及び弱毒化表現型を特定することが見出された。追加のts及び弱毒化突然変異が、PIV3 cp45の他の領域に存在する。さらに、キメラPIV1ワクチン候補体が、Lに3個の弱毒化突然変異を含む十分な長さのPIV3 cDNAにおけるPIV1のオープンリーディングフレーム（ORF）によりPIV3 HN及びFオープンリーディングフレームを置換することによって、PIV3 cDNA救援システムを用いて生成された。
【００１４】
このcDNAに由来する組換えキメラウィルスは、ｒPIV3−１、cp45Lとして命名されている（Skiadopoulos など., J. Virol. 72: 1762-8, 1998; Tao など., J. Virol. 72: 2955-2961, 1998; Taoなど., Vaccine 17: 1100-1108, 1999; それらは引用により本明細書に組み込まれる）。rPIV3-1, cp45Lはハムスターにおいて弱毒化され、そしてPIV1による攻撃に対して高レベルの耐性を誘発された。12の15cp45突然変異を含む、すなわちHN及びFにおいて存在する突然変異を排除するrPIV3, cp45と称する、さらにもう１つの組換えキメラウィルスが生成された。この組換えワクチン候補体は、ハムスターの上部及び下部気道において非常に弱毒化され、そしてHPIV１感染に対して高レベルの保護を誘発する（Skiadopoulosなど., Vaccine 18: 503-510, 1999）。
【００１５】
最近、多くの研究が、他のワクチンが好結果をもたらさないことがわかっている病原体に対するワクチンの開発のために外来性抗原を発現するためへのウィルスベクターの可能な使用に集中されて来た。この場合、多くの報告は、外来性遺伝子が、種々の効果を伴なって、組換え陰性鎖RNAウィルスゲノム又はアンチゲノム中に都合良く挿入され得ることを示唆している（Bukreyev など., J. Virol. 70: 6634-41, 1996: Bukreyev など., Proc, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:2367-72, 1999; Finke など., J. Virol. 71:7281-8, 1997; Hasan など., J. Gen. Virol. 78:2813-20, 1997; He など., Virology 237:249-60, 1997; Jin など., Virology 251:206-14, 1998; Johnson など., J. Virol. 71: 5060-8, 1997; Kahn など., Virology 254:81-91, 1999; Kretzschmar など., J. Vorol. 71:5982-9, 1997;
【００１６】
Mebatsion など., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93:7310-4, 1996; Moriya など., FEBS Lett. 425: 105-11, 1998; Roberts など., J. Virol. 73:3723-32, 1999; Roberts など., J. Virol. 72:4704-11, 1998; Roberts など., Virology 247:1-6, 1998; Sakai など., FEBS Lett 456:221-226, 1999; Schnell など., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:11359-65, 1996a; Schnell など., J. Virol. 70:2318-23, 1996b; Schnell など., Cell 90:849-57, 1997; Singh など., J. Gen. Virol. 80:101-6, 1999; Singh など., J. Virol. 73: 4823-8, 1999; Spielhofer など., J. Virol. 72:2150-9, 1998, Yu など., Genes to Cells 2:457-66など., 1999; 2000年７月12日に出願されたアメリカ特許出願第09/614,285号（1999年７月13日に出願された仮のアメリカ特許出願第60/143,425号に対応する）；
【００１７】
それぞれは、引用により本明細書に組み込まれる）。ウィルス転写遺伝子−開始及び遺伝子−終結のシグナルの制御下でウィルスゲノム中に挿入される場合、その外来性遺伝子は、別のmRNAとして転写され得、そして有意なタンパク質発現を生成する。驚くべきことには、多くの場合、外来性配列は、安定し、そしてインビトロでの多くの継代の間、機能的タンパク質を発現できることが報告されている。
【００１８】
しかしながら、ワクチン使用のためのベクターを都合良く開発するためには、高く安定したレベルのタンパク質発現を単純に示すことは不十分である。例えば、これは、1980年代初期〜中間以来、組換えワクチンウィルス及びアデノウィルスにより可能にされ、そしてさらに、それらのベクターはヒト使用のためのワクチンの開発において期待はずれであることがわかっている。同様に、ベクターとして開発されて来た、ほとんどのセグメント化されていない陰性鎖ウィルスは、ヒトに使用できる性質又は免疫化手段を有さない。
【００１９】
この場合の例は、小胞性胃炎ウィルス、すなわち少数の実験的事故を除いて、ヒトへの投与の歴史を有さない有蹄類病原体；センダイウィルス、すなわちヒトへの投与の歴史を有さないマウス病原体；シミアンウィルス５、すなわちヒトへの投与の歴史を有さないイヌ病原体；及び全身投与されるべきであり、そして母性抗体及び商業化されたワクチンの広い使用のためにほぼすべてのヒトに存在するはしか−特異的抗体により中和されるはしかウィルスの弱毒化された株を包含する。
【００２０】
さらに、それらの従来のベクター候補体のいくつかは、ベクターとしてのそれらの使用と直接的に一致しない逆の効果、例えば免疫制御を有する。従って、増殖特徴、向性及び他の生物学的性質がヒト使用のためのベクターとしてそれらを適切にするベクターを同定すべきである。生存可能な免疫接種方法、例えば投与の免疫原性及び効果的経路を開発することがさらに必要である。
【００２１】
ワクチンベクターとして現在、考慮される３種のヒトモノネガウィルス、すなわちはしか、流行性耳下腺炎及び狂犬病ウィルスが、ベクターとしての追加の開発のためにそれらを弱い候補体にするために結合する追加の制限を有する。例えば、はしかウィルスは、B型肝炎ウィルスの保護抗原のためのベクターとして見なされて来た（Singh など., J. Virol. 73:4823-8, 1999）。しかしながら、この組合されたはしかウィルス−B型肝炎ウィルスワクチン、例えば商業的使用のはしかウィルスワクチンは、生後９ヶ月後のみ与えられるが、ところが現在のB型肝炎ウィルスワクチンは、それよりも早い時期の乳児への使用のために推薦されている。
【００２２】
これは、現在の商業的使用のはしかウィルスワクチンは、非経口投与され、そして母性抗体による中和及び免疫抑制に対して非常に敏感であり、そして従って、生後９〜15ヶ月前で投与される場合、効果的ではない。従って、それは、初期乳児において疾病を引き起こすベクター抗原に使用され得ず、そして従って、ウィルス、例えばRSV及びHPIVのためには使用され得ない。はしかウィルス感染のもう1つの良く知られている特徴的な効果は、数ヶ月間、持続することができるウィルス介在性免疫抑制である。免疫抑制は、ベクターのための所望する特徴ではない。
【００２３】
弱毒化されたはしかウィルスワクチンは、高い用量で投与される場合、少なくとも一部、ウィルス誘発された免疫抑制のためである、変更された免疫応答及び過度の死亡率に関連し、そしてこのことは、弱毒化されたはしかウィルスさえ、ベクターとして適切でないことを示唆する。さらに、ベクターとしてのはしかウィルスの使用は、この病原体を根絶するための全体的な効果と一致しない。事実、それらの理由のために、生存はしかウィルスの使用を終結しし、そして本明細書に記載されるように、はしかウィルス保護抗原を発現するPIVベクターにより、現在のはしかウィルスワクチンを置換することが所望される。
【００２４】
狂犬病ウィルス、すなわちヒトの感染のまれな原因ウィルスは、ベクターとしての使用のために考慮されて来たが（Mebatsionなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 7310-4, 1996）、しかしヒトに対して100％致命的であるベクターが、特に、偏在性ヒト病原体でない狂犬病ウィルスに対する免疫性は、一般的な集団のためには必要とされないので、生存性の弱毒化されたウィルスベクターとしての使用のために開発され得るとは思われない。流行性耳下腺炎及びはしかウィルスは低い病原性であるが、それらのウィルスによる感染は所望しない特徴を包含する。流行性耳下腺炎ウィルスは、耳下腺を感染し、そして精巣まで広がり、時々、生殖不能をもたらす。はしかウィルスは、ウィルス血症を確立し、そしてその感染の拡張する特徴は関連する広がった発疹により例示される。耳下腺炎及びはしか感染の間の軽い脳炎は、まれではない。
【００２５】
はしかウィルスはまた、亜急性硬化性脳炎として呼ばれるまれな進行性致死性神経疾患にも関連している。対照的に、正常な個人におけるPIV感染及び疾病は、気道、すなわち非経口路よりも免疫化のためにより好都合である部位に制限される。ウィルス血症及び第２の部位への広がりが、重度に免疫無防備状態にされた実験動物及びヒトにおいて生じるが、しかしこれは典型的なPIV感染の特徴ではない。急性気道疾病は、PIVに関連する唯一の疾病である。従って、ベクターとしてのPIVの使用は、それらの生物学的特徴に基づいて、合併症、例えば免疫抑制を導く、末梢リンパ球とウィルスとの相互作用、又は二次器官、例えば他の合併症を導く、精巣又は中枢神経系の感染を回避するであろう。
【００２６】
ベクターに基づくワクチンアプローチが所望されるヒト病原体の宿主がはしかウィルスである。弱毒化された生存ワクチンは、30年以上の間、利用されており、そしてアメリカ合衆国においては、はしか疾病を根絶することにおいて非常に好結果を生んで来た。しかしながら、World Health Organization は、４千５百万人以上のはしか患者が、特に発展途上国において、毎年、発生しており、そしてそのはしかウィルスが毎日、約百万人の死に寄与していると推定している。
【００２７】
はしかウィルスは、パラミキソビリダエ（Paramyxoviridae）科のモルビリビラス（Morbillivirus）属のメンバーである（Griffinなど., In “Fields Virology”, B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, R. M. Chanock, J. L. Melnick, T. P. Monath, B. Roizman, 及びS. E. Straus, Eds., Vol. 1, p. 1267-1312, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996）。それは、ヒトに対して知られている最も感染性の感染物質の１つであり、そして呼吸路を通して人から人に伝達される（Griffinなど., In “Fields Virology”, B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, R. M. Chanock, J. L. Melnick, T. P. Monath, B. Roizman, 及びS. E. Straus, Eds., Vol. 1, p. 1267-1312, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996）。
【００２８】
はしかウィルスは、気道及び種々の全身性部位の両者における複製を包含する複雑な病因を有する（Griffinなど., In “Fields Virology”, B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, R. M. Chanock, J. L. Melnick, T. P. Monath, B. Roizman, 及びS. E. Straus, Eds., Vol. 1, p. 1267-1312, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996）。
【００２９】
粘膜IgA及び血清IgGはしかウィルス−特異的抗体は、はしかウィルスの制御に参加することができるが、母から得られたはしかウィルス−特異的抗体を有する非常に若い乳児におけるはしかウィルス疾病の不在は、疾病の耐性の主要メディエイターとして血清抗体を同定する（Griffinなど., In “Fields Virology”, B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, R. M. Chanock, J. L. Melnick, T. P. Monath, B. Roizman, 及びS. E. Straus, Eds., Vol. 1, p. 1267-1312, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996）。
【００３０】
２種のはしかウィルス糖タンパク質、すなわち赤血球凝集素（HA）及び融合（F）タンパク質は、主要中和及び保護抗原である（Griffinなど., In “Fields Virology”, B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, R. M. Chanock, J. L. Melnick, T. P. Monath, B. Roizman, 及びS. E. Straus, Eds., Vol. 1, p. 1267-1312, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996）。
【００３１】
現在入手できる弱毒化された生存はしかワクチンは非経口路により投与される（Griffinなど., In “Fields Virology”, B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, R. M. Chanock, J. L. Melnick, T. P. Monath, B. Roizman, 及びS. E. Straus, Eds., Vol. 1, p. 1267-1312, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996）。野生型はしかウィルス及びワクチンウィルスの両者は、抗体により非常に容易に中和され、そしてはしかウィルスワクチンは、非常に低レベルの母から得られたはしかウィルス−特異的中和抗体により非感染性にされる（Halseyなど., N. Engl. J. Med. 313:544-9, 1985; Osterhaus など., Vaccine 16:1479-81, 1998）。従って、ワクチンウィルスは、受動的に得られた母性抗体が検出できないレベルに低められるまで、与えられない。
【００３２】
アメリカ合衆国においては、はしかウィルスワクチンは、生後12〜15ヶ月まで、すなわちほとんどすべての子供がはしかウィルスワクチンにより容易に感染される時まで、与えられない。発展途上国においては、はしかウィルスは、特に、生後６〜12ヶ月以内の子供において、高い死亡率を有し続けている（Gellin など., J. Infect. Dis. 170:S 3-14, 1994; Taylor など., Am. J. Epidemiol127:788-94, 1988）。これは、それらの地域において高く流行するはしかウィルスが、母から得られたはしかウィルス−特異的抗体レベルが非保護レベルに低められている幼児を感染できるので、生じる。
【００３３】
従って、生後６ヶ月以内に発生するはしかウィルス疾病を根絶するために、はしかウィルス中和抗体の存在下でさえ、保護免疫応答を誘発できるはしかウィルスワクチンの必要性がある。生後６〜12ヶ月の幼児をはしかウィルスに対して保護するための免疫化手段を開発する多くの試みが存在して来たが、しかし今日まで効果的であるそれらの方法は存在しない。
【００３４】
初期はしかワクチンを開発するための第１の手段は、次の２つの方法の1つにより、生後、約6ヶ月の幼児への商業的な弱毒化された生存はしかウィルスワクチンの投与を包含した（Cutts など., Biologicals 25:323-38, 1997）。1つの一般的なプロトコールにおいては、弱毒化された生存はしかウィルスは、気道の感染を開始するために、液滴により鼻腔内に（Black など., New Eng. J. Med. 263: 165-169, 1960; Kokなど., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77:171-6, 1983; Simasathien など., Vaccine 15:329-34, 1997）、又はエアロゾルにより低部気道中に（Sabinなど., J. Infect. Dis. 152:1231-7, 1985）、投与された。第２のプロトコールにおいては、はしかウィルスは、現在のワクチンのために使用される用量よりも高い用量で非経口投与された。
【００３５】
粘膜表面上で複製できるワクチンの投与は、弱毒化された生存ポリオウィルス及びロタウィルスワクチンに関して、初期幼児において都合良く達成されて来た（Melnickなど., In “Fields Virology”, B. N. Knipe, P. M. Howley, R. M. Chanock, J. L. Melnick, T.P. Monath, B. Roizman, 及びS.E. Straus, Eds., Vol. 1, p.655-712. 2vols. Lippencott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996; Perez-Schael など., N. Engl. J. Med. 337:1181-7, 1997）。たぶん、これは、受動的に得られたIgG抗体がウィルス複製の全身性部位よりも粘膜表面に接近するからである。この場合、弱毒化された生存ポリウィルスワクチンウィルスは、母性抗体を有する幼児の胃腸管又は気道の粘膜表面を感染することができ、保護免疫応答の誘発をもたらす。
【００３６】
従って、適切な方法は、弱毒化された生存はしかウィルスワクチンにより幼児の気道を通して免疫化することであり、なぜならば、これははしかウィルスによる感染の天然路であるからである。しかしながら、非経口路により感染する弱毒化された生存はしかウィルスは、鼻腔内経路により一貫して感染せず（Blackなど., New Eng. J. Med. 263:165-169, 1960; Cutts など., Biologicals 25: 323-38, 1997; Kokなど., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77:171-16, 1983; Simasathien など., Vaccine 15:329-34, 1997）、そしてこの低められた感染性は特に、現在のワクチン株であるはしかウィルスワクチンのSchwarts株のために特に明らかであった。
【００３７】
たぶん、鳥類起源の組織培養細胞における継代によるこのウィルスの弱毒化の間、ウィルスはヒトの上部気道のために有意な量の感染性を失う。事実、はしかウィルス生物学の顕著な特徴は、インビトロで増殖する場合、ウィルスが生物学的性質の急速な変化を受けることである。この免疫化の比較的単純な経路は好結果をもたらさなかったので、低部気道中へのエアロゾルによる生存ウィルスワクチンの投与を包含する第２のアプローチが試みられた（Cuttsなど., Biologicals 25:323-38, 1997; Sabinなど., J. Infect. Dis. 152:1231-7, 1985）。
【００３８】
はしかウィルスワクチンのエアロゾル投与による幼児の感染は、高く抑制された実験研究において達成されたが、しかし非協力的な幼児へのエアロゾルによる弱毒化された生存はしかウィルスワクチンを再生的に供給することは不可能であった（Cuttsなど., Biologicals 25:323-38, 1997）。生後６ヶ月の幼児を免疫化するためのもう１つの試みにおいては、はしかウィルスワクチンが10〜100倍に高められた用量で非経口投与された（Markowitzなど., N. Engl. J. Med. 322:580-7, 1990）。高い力価の生存はしかワクチン接種は生後４〜６ヶ月の幼児において血清転換を改良したが、後での高い力価のワクチン受容体において、関連する死亡率の上昇が存在し（Gellin など., J. Infect. Dis. 170:S3-14, 1994; Holtなど., J. Infect. Dis. 168:1087-96, 1993; Markowitzなど., N. Engl. J. Med. 322:580-7, 1990）、そしてこの免疫化アプローチは断念された。
【００３９】
はしかウィルスワクチンのためにこれまで研究された第２の手段は、不活性化されたはしかウィルス、特にはしかウィルスから調製されたホルマリン不活性化された完全はしかウィルス又はサブユニットウィルスワクチンの使用であった（Griffinなど., In “Fields Virology”, B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, R. M. Chanock, J. L. Melnick, T. P. Monath, B. Roizman, 及びS. E. Straus, Eds., Vol. 1, p. 1267-1312, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996）。しかしながら、1960年代におけるワクチンの臨床学的使用は、非常に重度の合併症を表し、すなわち不活性化されたウィルスワクチンは、疾病を妨げるよりもむしろその疾病を増強した（Fulginitiなど., JAMA 202:1075-80, 1967）。これは、ホルマリン不活性化されたはしかウィルスワクチンに関して最初に観察された（Fulginitiなど., JAMA 202:1075-80, 1967）。
【００４０】
最初に、このワクチンは、はしかを妨げたが、しかし数年後、ワクチンは感染に対するそれらの耐性を失った。天然において循環するはしかウィルスにより続いて感染される場合、ワクチンは悪化された全身性徴候及び肺炎を伴なっての非典型的な疾病を進行せしめた（Fulginitiなど., JAMA 202:1075-80, 1967; Naderなど., J. Pediatr. 72:22-8, 1968; Rauh など., Am. J. Dis. Child 109: 232-7, 1965）。過去を振り返っての分析は、ホルマリン不活性化が溶血−阻害抗体を誘発するはしか融合（F）タンパク質の能力を破壊したが、しかしそれは、中和抗体を誘発するHA（赤血球凝集素又は結合）タンパク質の能力は破壊しなかったことを示した（Norrbyなど., J. Infect. Dis. 132: 262-9,1975; Norrbyなど., Infect. Immun. 11: 231-9, 1975）。
【００４１】
HAタンパク質により誘発される免疫性が野生型はしかウィルスによる多量の感染を可能にするために十分に弱い場合、変更され、そして時々、より重度の疾病がはしかウィルス複製の部位で見られた（Bellanti, Pediatrics 48:715-29, 1971; Buser, N. Engl. J. Med, 277:250-1, 1967）。この非典型的な疾病は、Th−２細胞が、ウィルス複製の部位で強化された疾病表示を導くよう選択的に誘発されている、変更された細胞介在性免疫応答により一部、介在されていると思われる（Polackなど., Nat. Med. 5:629-34, 1999）。非生存性はしかウィルスワクチンによるこの実験のために、及びまた、そのような非経口投与されたワクチンの免疫原性が受動的に感染された抗体により低められ得るので、ヒト幼児においてそのようなワクチンを評価するためには相当の不本意なことが存在した。疾病悪化が殺されたワクチンとのみ関連するように思えることは注目されるべきである。
【００４２】
幼児への使用のための、はしかに対するワクチンを開発するために研究されて来たさらにもう１つの手段は、はしかウィルスの保護抗原を発現するためへのウィルスベクターの使用である（Drillienなど. Proc. Natl: Acad. Sci. USA85: 1252-6, 1988; Fooksなど., J. Gen. Virol. 79: 1027-31, 1998, Schnellなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11359-65, 1996a; Taylorなど., Virology 187:321-8, 1992; Wild など., Vaccine 8: 441-2, 1990; Wild など., J. Gen. Virol. 73: 359-67, 1992）。
【００４３】
種々のベクター、例えばポックスウィルス、例えば複製能力を有するワクシニアウィルス又は複製−欠損性の修飾されたワクシニアウィルスAnkara（MVA）株が研究されて来た。はしかウィルスのF又はHA糖タンパク質を発現する、複製能力を有するワクシニア組換え体は、免疫学的に純粋なワクチンにおいて効果があった。しかしながら、それらがはしかウィルスに対する受動的抗体の生存下で非経口投与される場合、それらの免疫原性及び保護効能は非常に低められた（Gallettiなど., Vaccine 13:197-201, 1995; Osterhaus など., Vaccine 16:1479-81, 1998; Siegristなど., Vaccine 16:1409-14, 1998; Siegristなど., Dev. Biol. Stand. 95: 133-9, 1998）。
【００４４】
RSVの保護抗原を発現する複製能力を有するワクシア組換え体はまた、受動的抗体の存在下で非経口される場合、保護免疫応答の誘発においては無効果であることが示されているが（Murphy など., J. Virol. 62:3907-10, 1988a）、しかしそれらは、鼻腔内投与される場合、そのような宿主を容易に保護した。不運なことには、複製能力を有するワクシニアウィルス組換え体は、免疫無防備状態の宿主、例えばヒト免疫欠損ウィルス（HIV）感染を有する個人への使用のために効果的に弱毒化されず（Fennerなど., World Health Organization, Geneva, 1988; Redfieldなど., N. Engl. J. Med. 316:673-676, 1987）、そして免疫能力を有する個人への鼻腔内投与は問題がある。従って、それらは、それらのいく人かはHIVにより感染されるヒト幼児への使用のためのベクターとして追跡されない。
【００４５】
ヒヨコ胚細胞で500より多い継代により得られたMVAベクター（Mayr et al., Infection 3:6-14, 1975; Meyer et al., J. Gen. Virol. 72:1031-1038, 1991）は、いくつかのパラミクソウイルスの防御抗原のための考え得るワクチンベクターとしても評価されてきた（Durbin et al., J. Infect. Dis. 179:1345-51, 1999a; Wyatt et al., Vaccine 14:1451-1458, 1996）。
【００４６】
MVAは、鳥細胞中で良好に複製するが、しかしほとんどの哺乳類細胞、例えばサルおよびヒトから得られる細胞中では複製しない高弱毒化宿主範囲突然変異体である（Blanchard et al., J. Gen. Virol. 79:1159-1167, 1998; Carroll et al., Virology 238:198-211, 1997; Drexier et al., J. Gen. Virol. 79:347-352, 1998; Sutter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10847-10851, 1992）。
【００４７】
MVAと同様の宿主範囲制限を有する鳥痘ワクチンベクターも、麻疹ウイルス防御抗原を発現するよう構築された（Taylor et al., Virology 187:321-8, 1992）。MVAは免疫無防備状態宿主中で非病原性であり、付随的出来事を伴わずに多数のヒトに投与されてきた（Mayer et al., Zentralbl. Bakteriol.[B]）167:375-90, 1978; Stickle et al., Dtsch. Med. Wochenschr. 99:2386-92, 1974; Werner et al., Archives of Virology 64:247-256, 1980）。
【００４８】
残念ながら、パラミクソウイルス防御抗原を発現するMVAの免疫原性および効力は、非経口的経路により送達されるかまたは局所経路によるかにかかわらず、受動的免疫感作化アカゲザルにおいて阻害された（Durbin et al., Virology 235:323-332, 1999）。非経口的に送達された麻疹ウイルス防御抗原を発現するDNAワクチンの免疫原性も、受動免疫感作化宿主中で低減された（Siegrist et al., Dev. Biol. Stand. 95:133-9, 1998）。麻疹ウイルス防御抗原を発現する複製欠陥ベクター、例えばアデノウイルス−麻疹ウイルスHA組換え体が、目下、評価されつつある（Fooks et al., J. Gen. Virol. 79:1027-31, 1998）。
【００４９】
この情況においては、パラインフルエンザウイルス抗原を発現するMVA組換え体は、複製コンピテントワクシニアウイルス組換え体と異なり、受動的に獲得された抗体を有する動物に粘膜経路で投与される場合、防御効力を欠き、それらまたは同様の鳥痘ベクターは、母親から獲得した麻疹ウイルス抗体を有する乳児に用いられ得る。
【００５０】
前記に要約した報告に基づいて、麻疹ウイルス防御抗原を発現する複製コンピテントまたは複製欠陥ポックスウイルス、またはDNAワクチンは、受動的に獲得された母親からの麻疹ウイルス特異的抗体を保有する乳児において申し分なく免疫原性または有効であるとは思われない。
【００５１】
近年開発された動物宿主の気道中で複製する麻疹ウイルスHAを発現する複製コンピテントウイルスベクターは、即ち、天然では畜牛に感染するが、ヒトには感染しないラブドウルスである水疱性口内炎ウイルス（VSV）を発症した（Roberts et al., J. Virol. 73:3723-32, 1999; Schnell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11359-65, 1996a）。VSVはヒトにおいて疾患を引き起こし得る動物ウイルスであるため、ヒトで用いるためのこの組換え体の開発は、ヒト乳児において申し分なく弱毒化されるVSV主鎖が先ず同定されることが必要である（Roberts et al., J. Virol. 73:3723-32, 1999）が、しかし臨床試験は開始されてはいない。
【００５２】
PIVおよびその他の病原体、例えば麻疹に対する有効なワクチン剤の開発に向けての多くの進歩が認められるが、しかし、特に幼い乳児間のこれらの病原体のためである重篤な健康問題を緩和するための安全且つ有効なワクチンを工学処理するための付加的道具および方法は、当業界では明らかに依然として必要とされている。
【００５３】
この情況における残りの挑戦は、１つ又はそれ以上の病原体に対する多様な臨床的設定において用いるための適切に弱毒化された免疫原性および遺伝的安定なワクチン候補を生成する付加的道具の必要性である。これらの目標を容易にするために、組換え体ワクチン株中に弱毒突然変異を同定し、組み入れるための、そしてベクターベースのワクチンおよび免疫感作方法を開発するための既存の方法が拡張されねばならない。意外にも、本発明はこれらの必要性を満たし、本明細書中で後述するような付加的利点を提供する。
【００５４】
発明の要約
本発明は、ヒトおよびその他の哺乳類において感染性であり、１つ又はそれ以上のPIVに対して、あるいはそれからの感染が疑われる宿主中のPIVおよび１つ又はそれ以上の付加的病原体に対して所望の免疫応答を生じるための種々の組成物に有用であるキメラパラインフルエンザウイルス（PIV）を提供する。好ましい局面において、本発明は、PIVおよび１つ又はそれ以上の付加的病原体による感染および関連疾患症状を予防および／または治療するためのワクチン剤として有用である弱毒化キメラPIVを設計し、製造するための新規の方法を提供する。
【００５５】
本発明のこれらの局面内に含まれるのは、１つの異種病原体のまたは多数の異種病原体の単一または多重抗原決定基をコードする１つ又はそれ以上の異種遺伝子またはゲノムセグメントと併合されるかまたは一体化される部分的または完全PIVベクターゲノムまたはアンチゲノムを含めたキメラPIVゲノムまたはアンチゲノムを包含するこのような分子を組み入れる新規の単離ポリヌクレオチド分子およびベクターである。さらに本発明内で提供されるのは、選定PIVおよび１つ又はそれ以上の異種病原体、例えば異種PIVまたは非PIV病原体、例えば麻疹ウイルスによる感染の予防および治療のためのキメラPIVを組み入れる方法および組成物である。
【００５６】
したがって本発明は、パラインフルエンザウイルスあるいは異種病原体（１または複数）の１つ又はそれ以上の抗原決定基を組み入れるよう組換え的に修飾される亜ウイルス粒子を用いるキメラを基礎にした生ワクチン候補を開発するための方法および組成物を包含する。本発明のキメラPIVは、cDNAベースのウイルス回収系により構築される。cDNAから作製される組換えキメラPIVは、別々に複製し、生物学的に得られるウイルスと同様の様式で増殖される。
【００５７】
組換え体ウイルスは、ベクター（即ち「レシピエント」または「バックグラウンド」）PIVゲノムまたはアンチゲノム、および異なるPIVまたは異種病原体の１つ又はそれ以上の抗原決定基をコードする１つ又はそれ以上の異種「ドナー」配列の両方からのヌクレオチド配列を組み入れて、感染性キメラウイルスまたは亜ウイルス粒子を生成するよう工学処理される。この様式で、候補ワクチンウイルスは組換え的に工学処理されて、それからの感染が疑われる哺乳類宿主における１つ又はそれ以上のPIVに対する免疫応答、あるいは選定PIVおよび非PIV病原体に対する多重特異的応答を引き出す。
【００５８】
好ましくは、抗原決定基（１または複数）をコードする異種配列が得られるPIVおよび／または非PIV病原体（１または複数）はヒト病原体であり、宿主はヒト宿主である。さらに好ましくは、ベクターPIVはヒトPIVであるが、しかし非ヒトPIV、例えばウシPIV（BPIV）は、ヒトPIVおよびその他のヒト病原体の抗原決定基を組み入れるためのベクターとして用いられ得る。本発明のキメラPIVは、特定のPIV、例えばHPIV1、HPIV2、HPIV3に対する免疫応答、あるいは多重PIV、例えばHPIV1およびHPIV2に対する多重特異的免疫応答を引き出し得る。あるいは、本発明のキメラPIVは、１つ又はそれ以上のPIVおよび非PIV病原体、例えば麻疹ウイルスに対する多重特異的免疫応答を引き出し得る。
【００５９】
本発明の好例キメラPIVは、前記のようなキメラPIVゲノムまたはアンチゲノム、ならびに主要ヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（Ｐ）および大型ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）を組み入れる。付加的PIVタンパク質が、種々の組合せで含まれて、完全ウイルス粒子までの一連の感染性亜ウイルス粒子を、あるいは余分のタンパク質、抗原決定基またはその他の付加的構成成分を含有するウイルス粒子を提供し得る。
【００６０】
本発明のキメラPIVは、キメラPIVゲノムまたはアンチゲノムを生成するために異なるPIVまたはその他の病原体の１つ又はそれ以上の異種遺伝子（１または複数）またはゲノムセグメント（１または複数）と併合されたヒトPIVまたは非ヒトPIVから得られるかまたはその後にパターン化される部分または完全「ベクター」PIVゲノムまたはアンチゲノムを含む。本発明の好ましい局面では、キメラPIVは、二次ヒトPIVまたは非PIV病原体、例えば麻疹ウイルスからの１つ又はそれ以上の異種遺伝子（１または複数）またはゲノムセグメント（１または複数）と併合された部分または完全ヒトPIVベクターゲノムまたはアンチゲノムを組み入れる。
【００６１】
PIV「ベクター」ゲノムまたはアンチゲノムは、典型的には、異種病原体の１つ又はそれ以上の「ドナー」遺伝子またはゲノムセグメントを付加されるかまたは組み入れられるレシピエントまたは担体として作用する。典型的には、異種病原体の１つ又はそれ以上の抗原決定基をコードするポリヌクレオチドは、ベクターゲノムまたはアンチゲノムに付加されるかまたはその中で置換されて、キメラPIVを産生し、したがってこれは、異種病原体に対して選択された宿主中での免疫応答を引き出す能力を獲得する。さらに、キメラウイルスは、ベクターPIVおよび異種病原体の一方または両方と比較して、その他の新規の表現型特性を示し得る。
【００６２】
例えば、ベクターPIV株内の異種遺伝子またはゲノムセグメントの付加または置換は、非修飾化ベクターウイルスおよび／またはドナーの対応する表現型と比較した場合、弱毒化の増大、増殖変化またはその他の所望の表現型変化を付加的にまたは別々に生じる。本発明の一局面では、キメラPIVは、挿入物のサイズによって結果的に生じるキメラウイルスにおける弱毒化のレベルを特定する大型ポリヌクレオチド挿入物を組み入れることにより、ワクチン候補としてのより大きい効力のために弱毒化される。
【００６３】
本発明の好ましいキメラPIVワクチン候補は、ヒトPIVの、例えばHPIV1、HPIV2またはHPIV3の１つ又はそれ以上の主要抗原決定基を保有し、したがってヒト宿主中の選定PIVに対する有効免疫応答を引き出す。選定ヒトPIVに特異的である抗原決定基はベクターゲノムまたはアンチゲノムによりコードされ得るし、あるいは異なるPIVからの異種ポリヌクレオチド配列としてPIVベクターゲノムまたはアンチゲノム内に挿入されるかまたはそれに連結され得る。ヒトPIVの主要防御抗原はそれらのHNおよびＦ糖タンパク質であるが、しかしその他のタンパク質も防御または治療免疫応答に関与し得る。
【００６４】
この情況においては、体液性および細胞媒介性免疫応答はともに、本発明内の代表的ワクチン候補により有益に引き出される。したがって、ベクターゲノムまたはアンチゲノム内に存在するか、あるいは異種遺伝子またｈ上げの無セグメントとしてそれと一体化される得る抗原決定基をコードするポリヌクレオチドは、ヒトPIVからの１つ又はそれ以上のPIV N、Ｐ、Ｃ、Ｄ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、HNおよび／またはＬタンパク質（１または複数）あるいはそれらの選定免疫原性断片（１または複数）またはエピトープ（１または複数）をコードし得る。
【００６５】
選定されたヒトPIVの１つ又はそれ以上の主要抗原決定基を有する他に、本発明の好ましいキメラPIVワクチンウイルスは、二次ヒトPIVの、または非PIV病原体の１つ又はそれ以上の主要抗原決定基を保有する。好例局面では、キメラPIVは、部分または完全ヒトPIV（HPIV）ゲノムまたはアンチゲノム、例えばHPIV3のゲノムまたはアンチゲノムであるベクターゲノムまたはアンチゲノムを含み、そしてさらに、少なくとも１つの異種PIV、例えばHPIV1および／またはHPIV2の抗原決定基をコードする１つ又はそれ以上の異種遺伝子（１または複数）またはゲノムセグメント（１または複数）を含む。
【００６６】
好ましくは、ベクターゲノムまたはアンチゲノムは、部分的または完全HPIV3ゲノムであり、そして抗原決定基（１または複数）をコードする異種遺伝子（１または複数）またはゲノムセグメント（１または複数）は、１つ又はそれ以上の異種HPIV（１または複数）のものである。代替的実施態様では、HPIV1の１つ又はそれ以上の抗原決定基をコードする１つ又はそれ以上の遺伝子またはゲノムセグメントは、部分的または完全HPIV3ゲノムまたはアンチゲノムに付加されるかまたはその中で置換され得る。
【００６７】
好ましくは、HPIV1の抗原決定基（１または複数）は、HPIV1 HNおよびＦ糖タンパク質から選択され、１つ又はそれ以上の抗原ドメイン、HNおよび／またはＦ糖タンパク質の断片またはエピトープを含む。種々の好例実施態様では、HNおよびＦ糖タンパク質をコードするHPIV1遺伝子はともに、HPIV3ベクターゲノムまたはアンチゲノム中の対部分HPIV3 HNおよびＦ遺伝子に代えて置換される。これらの構築物は、HPIV3および／またはHPIV1に対するヒトにおける単一または多重特異的免疫応答を引き出すキメラPIVを生じる。
【００６８】
付加的実施態様では、HPIV2の１つ又はそれ以上の抗原決定基をコードする１つ又はそれ以上の遺伝子またはゲノムセグメントは、部分または完全HPIV3ゲノムまたはアンチゲノムに付加されるかまたはその中に組み入れられて、HPIV2単独に対する、またはHPIV3およびHPIV2に対する結果的に生じるキメラの新規のまたは付加的免疫特異性を生成する。さらに詳細な局面では、１つ又はそれ以上のHNおよび／またはＦ糖タンパク質をコードする１つ又はそれ以上のHPIV2遺伝子またはゲノムセグメント、あるいはそれらの抗原ドメイン、断片またはエピトープは、部分または完全HPIV3ベクターゲノムまたはアンチゲノムに付加されるか、あるいはその中に組み入れられる。
【００６９】
本発明のさらに別の局面では、多重異種PIVの抗原決定基をコードする多重異種遺伝子またはゲノムセグメントは、部分または完全PIVベクターゲノムまたはアンチゲノム、好ましくはHPIVベクターゲノムまたはアンチゲノムに付加されるかまたはその中に組み入れられる。好ましい一実施態様では、HPIV1およびHPIV2の両方からの抗原決定基をコードする異種遺伝子またはゲノムセグメントが、部分または完全HPIV3ベクターゲノムまたはアンチゲノムに付加されるかまたはその中に組み入れられる。
【００７０】
さらに詳細な局面では、１つ又はそれ以上のHNおよび／またはＦ糖タンパク質をコードする１つ又はそれ以上のHPIV1遺伝子またはゲノムセグメント（あるいはそれらの抗原ドメイン、断片またはエピトープ）、ならびにHNおよび／またはＦ糖タンパク質をコードする１つ又はそれ以上のHPIV2遺伝子またはゲノムセグメント、それらの抗原ドメイン、断片またはエピトープが、部分または完全HPIV3ベクターゲノムまたはアンチゲノムに付加されるかまたはその中に組み入れられる。
【００７１】
一例では、HNおよびＦ糖タンパク質をコードするHPIV1遺伝子は、対部分HPIV3 HNおよびＦ遺伝子に代えて置換されて、キメラHPIV3-1ベクターゲノムまたはアンチゲノムを形成し、これはさらに、HPIV2の単一または多重抗原決定基をコードする１つ又はそれ以上の遺伝子または遺伝子セグメントの付加または組み入れにより修飾される。これは、例えばキメラHPIV3-1ベクターゲノムまたはアンチゲノム内のHPIV2 HNの開放読取枠（ORF）を包含する転写単位を付加または置換することにより、本発明内で容易に達成される。この方法にしたがって、本明細書中で後述するワクチン候補rPIV3-1.2HNおよびrPIV3-1cp45.2HNにより例示されるような、HPIV1およびHPIV2の抗原決定基を有するキメラPIVを生成する本発明を例示する特定の構築物が提供される。
【００７２】
本発明の他の局面では、本発明のキメラPIVは、非PIV病原体からの主要抗原決定基の組み入れのためのレシピエントとして用いられるヒトPIVベクターゲノムまたはアンチゲノムを基礎にしている。１つ又はそれ以上の抗原決定基がキメラPIVワクチン候補に適合され得る病原体としては、麻疹ウイルス、亜群Ａおよび亜群ＢのRSウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、１型および２型ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、フィロウイルス、ブンヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルスおよびインフルエンザウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
本発明の方法によりこのようにワクチン開発のために標的化され得る病原体のこの集団は例であるにすぎず、抗原決定基を保有するためのPIVの使用は、付加的病原体の大型宿主に広範に拡大する、と当業者は理解する。
【００７４】
すなわち、本発明の種々の代替的局面において、ヒトPIVゲノムまたはアンチゲノムは、広範囲の非PIV病原体からの１つ又はそれ以上の主要抗原決定基の組み入れのためのベクターとして用いられ得る。本発明のキメラPIV内に組み入れられ得る代表的主要抗原としては、麻疹ウイルスHAおよびＦタンパク質、亜群Ａおよび亜群ＢのRSウイルスのＦ、Ｇ、SHおよびM2タンパク質、流行性耳下腺炎ウイルスHNおよびＦタンパク質、ヒトパピローマウイルスL1タンパク質、１型および２型ヒト免疫不全ウイルスgp160タンパク質、単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスのgB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gLおよびgMタンパク質、狂犬病ウイルスＧタンパク質、エプスタイン−バーウイルスgp350タンパク質、フィロウイルスＧタンパク質、ブンヤウイルスＧタンパク質、フラビウイルスＥおよびNS1タンパク質、ならびにアルファウイルスＥタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
種々のヒトPIVベクターは、キメラワクチンウイルスにより保有される抗原決定基（１または複数）に対する１つ又はそれ以上の特異的体液性または細胞媒介性免疫応答を引き出し、それゆえ感受性の強い宿主中の野生型「ドナー」病原体に対する有効免疫応答を引き出すための非PIV病原体の異種抗原決定基を保有するために用いられ得る。好ましい実施態様では、ドナー病原体からの１つ又はそれ以上の異種遺伝子またはゲノムセグメントは、部分または完全HPIV3ゲノムまたはアンチゲノムに連結されるかまたはその中に挿入される。
【００７６】
あるいは、異種遺伝子またはゲノムセグメントは、キメラHPIVベクターゲノムまたはアンチゲノム、例えば、異種PIVの１つ又はそれ以上の遺伝子またはゲノムセグメントを保有する部分または完全HPIV3ゲノムまたはアンチゲノム内に組み入れられ得る。例えば、非PIV病原体の抗原決定基（１または複数）をコードする遺伝子（１または複数）またはゲノムセグメント（１または複数）は、対部分HPIV3HNおよびＦ遺伝子に代えて置換されるHNおよびＦ糖タンパク質をコードするHPIV1遺伝子の一方または両方を有する例えば前記のような部分または完全キメラHPIV3-1ベクターゲノムまたはアンチゲノムと併合され得る。
【００７７】
あるいは、非PIV病原体の抗原決定基（１または複数）をコードする遺伝子（１または複数）またはゲノムセグメント（１または複数）は、前記のようにHPIV1またはHPIV3ベクターゲノムまたはアンチゲノム、あるいはキメラHPIV3-1ベクターゲノムまたはアンチゲノム内にHPIV2の単一または多重抗原決定基、例えばHPIV2HN遺伝子を組み入れる部分または完全キメラゲノムまたはアンチゲノムと併合され得る。１つ又はそれ以上の麻疹抗原決定基（１または複数）をコードする異種遺伝子（１または複数）またはゲノムセグメント（１または複数）は、本明細書中に開示されたPIVベクターまたはキメラPIVベクターのいずれかと併合され得る。
【００７８】
本明細書中に提供される実施例では、ベクターゲノムまたはアンチゲノムは、部分または完全HPIV3ゲノムまたはアンチゲノム、あるいはそこに付加されるかまたは組み入れられる異種HPIVの抗原決定基（１または複数）をコードする１つ又はそれ以上の遺伝子またはゲノムセグメントを有する部分または完全HPIV3ゲノムまたはアンチゲノムを含むキメラHPIVゲノムまたはアンチゲノムである。このような一キメラ構築物においては、麻疹ウイルスHA遺伝子の開放読取枠（ORF）を含む転写単位は、種々の一でHPIV3ベクターゲノムまたはアンチゲノムに付加されて、好例のキメラPIV／麻疹ワクチン候補rPIV3（HA HN-L）、rPIV3（HA N-P）、rcp45L（HA N-P）、rPIV3（HA P-M）またはrcp45L（HA P-M）を生じる。
【００７９】
付加的実施態様では、PIVベクターゲノムまたはアンチゲノムは、そこに付加されるかまたは組み入れられるHPIVの１つ又はそれ以上の抗原決定基（１または複数）をコードする１つ又はそれ以上の遺伝子（１または複数）またはゲノムセグメント（１または複数）を有する部分または完全HPIV3ゲノムまたはアンチゲノムを含むキメラHPIVゲノムまたはアンチゲノムである。この構築物は、例えば麻疹ウイルスのためのベクターとして用いられ得るが、この場合、異種抗原決定基（１または複数）は、麻疹ウイルスHAおよびＦタンパク質ならびにそれらの抗原ドメイン、断片およびエピトープから選択される。
【００８０】
一例では、麻疹ウイルスHA遺伝子の開放読取枠（ORF）を含む転写単位は、HPIV1のHNおよびF ORFにより置換されるHPIV3HNおよびF ORFの両方を有するHPIV3-1ベクターゲノムまたはアンチゲノムに付加されるかまたはその中に組み入れられる。この範疇の組換え体は、rPIV3-1HAP-MまたはrPIV3-1HAP-Mcp45Lとして以下の本明細書中で同定されるワクチン候補である。
【００８１】
本発明のその他の詳細な実施態様では、部分または完全PIVベクターゲノムまたはアンチゲノムは、１つ又はそれ以上の「余分の」（即ち、野生型ベクター中に存在するか突然変異体、例えばキメラベクター主鎖中に存在するかにかかわらず、遺伝子の完全補足体に付加的な）異種遺伝子（１または複数）またはゲノムセグメント（１または複数）と併合されて、キメラPIVゲノムまたはアンチゲノムを形成する。ベクターゲノムまたはアンチゲノムは、しばしば、完全HPIV3またはHPIV3-1キメラゲノムまたはアンチゲノムであり、余分の異種遺伝子（１または複数）またはゲノムセグメント（１または複数）は、HPIV1HN、HPIV1F、HPIV2HN、HPIV2F、麻疹HAおよび／または翻訳的に無症候性の合成遺伝子単位から選択される。
【００８２】
ある実施態様では、HPIV1HNおよび／またはHPIV2HN ORF（１または複数）の一方または両方が、それぞれHPIV3ベクターゲノムまたはアンチゲノム内に挿入される。さらに詳細な実施態様では、HPIV1HN、HPIV2HNおよび麻疹ウイルスHA ORFが、それぞれＮ／Ｐ、Ｐ／ＭおよびHN／Ｌ遺伝子間に挿入される。あるいは、HPIV1HNおよび／またはHPIV2HN遺伝子は、それぞれＮ／ＰおよびＰ／Ｍ遺伝子間に挿入され、3918-ntGU挿入物がHNおよびＬ遺伝子間に付加される。
【００８３】
この範疇の組換え体は、rPIV3 1HNN-P、rHPIV3 1HNP-M、rHPIV3 2HNN-P、rHPIV3 2HNP-M、rHPIV3 1HNN-P 2HNP-M、rHPIV3 1HNN-P 2HNP-M HAHN-LおよびrHPIV3 1HNN-P 2HNP-M3918GUHN-Lとして以下の本明細書中で同定されるワクチン候補である。
【００８４】
したがって、本発明の意図され、構築されたキメラPIVは、１、２、３、４またはそれ以上の異なる病原体からの防御抗原をを含有し得る。例えば、HPIV3、HPIV1、HPIV2および麻疹ウイルスから選択される１〜４つの病原体からの防御抗原を含有するワクチン候補が提供される。このような多重特異的ワクチン候補を構築するために、30％〜50％またはそれ以上大きい（例えば、15,462ntの野生型HPIV3ゲノム長と比較して）余分の外来配列の全長を組換え体ゲノムまたはアンチゲノムに付加し得る１つ又はそれ以上の余分の異種遺伝子（１または複数）またはゲノムセグメント（１または複数）が付加され得る。
【００８５】
この情況における１つ又はそれ以上の余分の異種遺伝子（１または複数）またはゲノムセグメント（１または複数）の付加は、しばしば、上および／または下気道における複製の、少なくとも10〜 100分の１、しばしば100〜1,000分の１、そして1,000〜10,000分の１までまたはそれ以下の低減を示す弱毒表現型のキメラPIVを特定する。
【００８６】
本発明のキメラPIVクローンを構築するためには、ドナーPIVまたは非PIV病原体の異種遺伝子またはゲノムセグメントが、ベクターゲノムまたはアンチゲノム中の任意の操作可能位置に付加されるかまたはそこで置換される。しばしば、遺伝子または遺伝子セグメント置換の位置は、部分または完全PIVベクターゲノムまたはアンチゲノム内の対部分遺伝子またはゲノムセグメントの野生型遺伝子オーダー位置に対応する。その他の実施態様では、異種遺伝子またはゲノムセグメントは、バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム内の対部分遺伝子またはゲノムセグメントの野生型遺伝子オーダー位置と比較してよりプロモーターに近位またはプロモーター遠位である位置に付加されるかまたは置換されて、異種遺伝子またはゲノムセグメントの発現をそれぞれ増強または低減する。
【００８７】
本発明のさらに詳細な局面では、異種ゲノムセグメント、例えば異種PIVまたは非PIV病原体の免疫原性エクトドメインをコードするゲノムセグメントは、PIVベクターゲノムまたはアンチゲノム中の対部分遺伝子中の対応するゲノムセグメントに代えて置換されて、キメラタンパク質、例えば別のPIVまたは非PIV病原体のエクトドメインに融合された一PIVの細胞質尾および／または膜貫通ドメインを有する融合タンパク質をコードする構築物を生じる。代替的実施態様では、キメラPIVゲノムまたはアンチゲノムは、２つの異なる病原体からの免疫原性糖タンパク質ドメインまたはエピトープを有する組換え体ウイルスまたは亜ウイルス粒子中の多重特異的キメラ糖タンパク質をコードするよう工学処理され得る。
【００８８】
さらに別の実施態様では、一PIVまたは非PIV病原体からの異種遺伝子またはゲノムセグメントは、PIVベクターゲノムまたはアンチゲノム内に付加されて（即ち、置換を伴わない）、結果的に生じるクローン内に新規の免疫原性特性を生じ得る。これらの場合、異種遺伝子またはゲノムセグメントは、任意に結果的に生じるキメラウイルスを弱毒化するという付加的目的のために、完全PIVベクターゲノムまたはアンチゲノムと組合せて、余分の遺伝子またはゲノムセグメントとして付加され得る。あるいは、異種遺伝子またはゲノムセグメントは、ベクターゲノムまたはアンチゲノム中の選定遺伝子またはゲノムセグメントの欠失とともに付加され得る。
【００８９】
本発明の好ましい実施態様では、異種遺伝子またはゲノムセグメントは、部分または完全PIVベクターゲノムまたはアンチゲノム内の遺伝子間位置で付加される。あるいは、遺伝子またはゲノムセグメントは、ゲノムのその他の非コード領域内、例えば５‘または３’非コード領域内、あるいは非コードヌクレオチドがベクターゲノムまたはアンチゲノム内に生じるその他の位置に挿入され得る。いくつかの場合には、ベクターゲノムまたはアンチゲノム内の、例えば効率的複製、転写および／または翻訳に必要な配列内のシス−作用調節配列に対応するか重複する非コード部位に異種遺伝子またはゲノムセグメントを挿入するのが望ましい。ベクターゲノムまたはアンチゲノムのこれらの領域は、異種遺伝子またはゲノムセグメントの導入に関連した調節機能の崩壊または修正のための標的部位を表す。
【００９０】
臨床使用のための候補ワクチンウイルスを構築するという好ましい目的のためには、組換え体ウイルスにおける弱毒化のレベルを増大または低減する付加的突然変異を導入することにより本発明のキメラPI部位の弱毒化表現型を調整するのがしばしば望ましい。したがって、本発明の付加的局面では、結果的に生じるウイルスまたは亜ウイルス粒子中の弱毒性表現型を特定する１つ又はそれ以上の弱毒性突然変異を導入することによりキメラゲノムまたはアンチゲノムがさらに修飾される弱毒化キメラPIVが生成される。これらの弱毒化突然変異はde novoで生成され、周知の合理的設計突然変異誘発戦略したがって弱毒作用に関して試験される。あるいは、弱毒化突然変異は、既存の生物学的に得られる突然変異体PIVまたはその他のウイルス中で同定され、したがって、本発明のキメラPIV中に組み入れられ得る。
【００９１】
後者の状況に置ける好ましい弱毒化突然変異は、ベクターゲノムまたはアンチゲノム内に突然変異を挿入することにより、あるいは弱毒化突然変異を含入するためにベクターゲノムまたはアンチゲノムをクローニングするかまたは突然変異化することによって、キメラPIV中に容易に同定され、組み入れられる。好ましくは、弱毒化突然変異は、ベクターゲノムまたはアンチゲノム内で工学処理され、そして生物学的に得られる弱毒化PIV突然変異体から移入されるかまたは複写される。
【００９２】
これらは、例えば、冷継代（cp）、冷適応（ca）、宿主範囲制限（hr）、小プラーク（sp）および／または温度感受性（ts）PIV突然変異体を含むと認識される。好例実施態様では、十分に特性化されたJS HPIV3cp45突然変異体株中に存在する１つ又はそれ以上の弱毒化突然変異は、JSのTyr942、Leu992またはThr1558に対応する位置で、好ましくはポリメラーゼＬタンパク質中に同定された１つ又はそれ以上の突然変異を含めて、本発明のキメラPIV内に組み入れられる。代替的にはまたは付加的には、JS HPIV3cp45突然変異体株中に存在する弱毒か突然変異は、例えば、JSの残基Val96またはSer389に対応する位置でのアミノ酸置換（１または複数）をコードするキメラPIVクローンのＮタンパク質中に導入される。
【００９３】
さらに別の有用な弱毒化突然変異は、例えばJSのIle96に対応する位置のＣタンパク質中の、ならびに、例えばPro199に対応する位置（例えばPro199-Thr突然変異）のＭタンパク質におけるアミノ酸置換（１または複数）をコードする。本発明のキメラPIVの弱毒化を調整するために適合され得るPIV3JScp45中で同定されたその他の突然変異は、例えば、JSのIle420またはAla450に対応する位置のＦタンパク質中に、ならびに、例えばJSの残基Val384に対応する位置のHNタンパク質中に見出される。
【００９４】
本発明のキメラPIV中への組み入れのために生物学的に得られるPIV突然変異体からの弱毒化突然変異は、例えば、３‘リーダー配列中のPIVゲノムまたはアンチゲノムの非コード部分における突然変異も含む。この情況において好例突然変異は、JScp45のヌクレオチド23、24、28または45に対応する位置の組換え体ウイルスの３’リーダー中の位置で工学処理され得る。さらに別の好例突然変異は、例えばJScp45のヌクレオチド62に対応する位置で、例えばＮ遺伝子開始配列中の１つ又はそれ以上のヌクレオチドを変えることにより、Ｎ遺伝子開始配列中で工学処理され得る。
【００９５】
PIV3JScp45およびその他の生物学的に得られるPIV突然変異体から、大型「メニュー」の弱毒化突然変異が提供され、その各々の突然変異は、本発明のキメラPIVワクチン候補における弱毒化のレベルを微調整するために任意のその他の突然変異（１または複数）と併合され得る。好例実施態様では、１つ又はそれ以上の、好ましくは２つまたはそれ以上のJScp45の突然変異を含むキメラPIVが構築される。
【００９６】
したがって、ワクチン使用のために選定される本発明のキメラPIVは、しばしば、生物学的に得られるPIV突然変異体または同様のモデル供給源からの２つの、時としては３つまたはそれ以上の弱毒化突然変異を有して、広範な臨床使用のための申し分ないレベルの弱毒化を達成する。好ましくは、本発明の組換え体キメラPIV突然変異体内に組み入れられるこれらの弱毒化突然変異は、突然変異を特定するコドン中の多重ヌクレオチド置換により安定化される。
【００９７】
キメラウシ−ヒトPVIベクターを含めた選定PIVベクター中への弱毒化およびその他の所望の表現型特定突然変異の導入は、突然変異を含有する異種遺伝子またはゲノムセグメント、例えば突然変異体Ｌタンパク質をコードする遺伝子またはその一部をPIVベクターゲノムまたはアンチゲノム中に移すことにより、成し遂げられ得る。あるいは、突然変異は選定ベクターゲノムまたはアンチゲノム中に存在し、導入異種遺伝子またはゲノムセグメントは突然変異を保有しないか、または１つ又はそれ以上の付加的な異なる突然変異を保有し得る。
【００９８】
ある種の実施例では、ベクターゲノムまたはアンチゲノムは、異種「ドナー」ウイルス（例えば、異種ウシまたはヒトPIVまたは非PIVネガティブ鎖RNAウイルス）中の突然変異の部位に対応する１つ又はそれ以上の部位で修飾されて、ドナーウイルスで同定された突然変異と同一のまたは保存的に関連する突然変異（例えば、保存的アミノ酸置換）を含有するかまたはコードする（PCT/US00/09695（2000年4月12日提出）およびその優先権米国特許仮出願60/129,006号（1999年4月13日提出）参照（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる))。一好例実施態様では、PIVベクターゲノムまたはアンチゲノムは、前記で列挙したようなHPIV3JScp45中の突然変異の部位に対応する１つ又はそれ以上の部位で修飾される。
【００９９】
本発明のPIVベクター中に弱毒化突然変異を同定し、組み入れるための好ましい突然変異体PIV株としては、冷継代（cp）、冷適応（ca）、宿主範囲制限（hr）、小プラーク（sp）および／または温度感受性（ts）突然変異体、例えばJSHPIV委cp45突然変異体株が挙げられる。本発明のヒト−ウシキメラPIV中への組み入れのための生物学的に得られるPIV突然変異体からの弱毒化突然変異は、例えば、３‘リーダー配列中のPIVゲノムまたはアンチゲノムの非コード部分中の突然変異も含む。
【０１００】
この情況における好例突然変異は、JScp45のヌクレオチド23、24、28または45に対応する位置の組換え体ウイルスの３’リーダー中の位置で工学処理され得る。さらに別の好例突然変異は、例えばJScp45のヌクレオチド62に対応する位置で、例えばＮ遺伝子開始配列中の１つ又はそれ以上のヌクレオチドを変えることにより、Ｎ遺伝子開始配列中で工学処理され得る。
【０１０１】
本発明のPIVベクターに採用されるかまたは移され得る付加的突然変異は、非PIV非セグメント化ネガティブ鎖RNAウイルス中で同定され、本発明のPIV突然変異体中に組み入れられる。これは、異種ネガティブ鎖RNAウイルス中で同定される突然変異をレシピエントPIVゲノムまたはアンチゲノム中の対応する同種部位にマッピングし、レシピエント中の既存の配列を突然変異化遺伝子型に突然変異化する（同一または保存的突然変異により）ことにより、容易に成し遂げられる（PCT/US00/09695（2000年4月12日提出）およびその優先権米国特許仮出願60/129,006号（1999年4月13日提出）参照（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる))。
【０１０２】
この開示にしたがって、付加的弱毒化突然変異は、その他のウイルス、特にその他の非セグメント化ネガティブ鎖RNAウイルス中に同定される本発明のキメラPIV内に容易に採用されるかまたは工学処理され得る。
【０１０３】
本発明のさらに別の局面では、キメラPIVは、生物学的に得られた弱毒化突然変異体ウイルスの後に形作られた弱毒化突然変異を有しても有さなくても、所望の表現型、構造または機能的変化を生じるよう付加的ヌクレオチド修飾（１または複数）を有する。典型的には、選定ヌクレオチド修飾は、部分または完全PIVベクターゲノム内で作られるが、しかしこのような修飾は、キメラクローンに関与する任意の異種遺伝子またはゲノムセグメント内で十分にさらに作られ得る。これらの修飾は、好ましくは所望の表現型変化、例えば増殖特性、弱毒化、温度感受性、冷適応、プラークサイズ、宿主範囲限定または免疫原性の変化を特定する。この情況における構造的変化は、操作および同定を容易にするためのPIVコードcDNA中への制限Ｖの導入または削除を含む。
【０１０４】
好ましい実施態様では、キメラPIVのゲノムまたはアンチゲノム内のヌクレオチド変化は、遺伝子の部分または完全欠失、あるいはその発現の低減または削除（ノックアウト）によるウイルス遺伝子の修飾を含む。この情況における突然変異のための標的遺伝子としては、PIV遺伝子のいずれか、例えばヌクレオキャプシドタンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ、大型ポリメラーゼサブユニットＬ、マトリックスタンパク質Ｍ、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼタンパク質HN、融合タンパク質Ｆ、ならびにＣ、ＤおよびＶ開放読取枠（ORF）の生成物が挙げられる。
【０１０５】
組換え体ウイルスが生育可能且つ感染性である程度に、これらのタンパク質の各々は、全体でまたは一部分、単独でまたはその他の所望の修飾と組合せて、選択的に欠失され、置換され、または再配列されて、新規の欠失またはノックアウト突然変異体を達成し得る。例えば、１つ又はそれ以上のＣ、Ｄおよび／またはＶ遺伝子は、全体でまたは一部分、欠失され、アルはその発現が低減または削除され得る（例えば、停止コドンの導入により、RNA編集部位の突然変異により、開始コドンにより特定されるアミノ酸を変える突然変異により、あるいは標的化ORF（１または複数）におけるフレームシフト突然変異による）。
【０１０６】
一実施態様では、突然変異は、編集を妨げ、そのmRNAがRNA編集により生成されるタンパク質の発現を削除する編集部位でなされ得る（Kato et al., EMBO 16:578-587, 1997およびSchneider et al., Virology 227:314-322,1997)(これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。あるいは、１つ又はそれ以上のＣ、Ｄおよび／またはV ORF（１または複数）は、全体でまたは一部分欠失されて、結果的に生じる組換え体クローンの表現型を変え、増殖、弱毒化、免疫原性またはその他の所望の表現型特性を改善し得る（米国特許出願第09/350,821号（Durbin等、1999年7月9日提出）参照)(この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。
【０１０７】
本発明のキメラPIV中の代替的ヌクレオチド修飾としては、組換え体ゲノムまたはアンチゲノム中の選定遺伝子に関するシス作用調節配列の欠失、挿入、付加または再配列が挙げられる。一例では、一PIV遺伝子のシス作用調節配列は、異なるPIV中の同一遺伝子の対部分シス作用調節配列または異なるPIV遺伝子のシス作用調節配列である異種調節配列に対応するよう変えられる。例えば、遺伝子末端シグナルは、同一PIV株中の異なる遺伝子の遺伝子末端シグナルへの変換または置換により修飾され得る。その他の実施態様では、ヌクレオチド修飾は、例えば、選定形態のタンパク質に代えて代替的翻訳開始部位を削除するための、組換え体ゲノムまたはアンチゲノム内の翻訳開始部位の挿入、欠失、置換または再配列を含み得る。
【０１０８】
さらに、種々のその他の遺伝子変化が、キメラPI部位ゲノムまたはアンチゲノム中で、単独であるいは生物学的に得られる突然変異体PI部位から採用される１つ又はそれ以上の弱毒化突然変異とともに、生成され得る。例えば、非PIV供給源からの遺伝子またはゲノムセグメントは、全体でまたは一部分が挿入され得る。このような一局面において、本発明は、例えば非ヒトPIVからの１つ又はそれ以上の遺伝子（１または複数）またはゲノムセグメント（１または複数）のヒトPIVベクターベースのキメラウイルス中への導入による宿主範囲作用を基礎にしたキメラPIVワクチン候補の弱毒化のための方法を提供する。
【０１０９】
例えば、宿主範囲弱毒化は、ウシPIV（BPIV）からのヌクレオチド配列の導入によりHPIV−ベクターベースのキメラ構築物に付与され得る（例えば、米国特許仮出願60/143,134号（1999年7月9日提出）に対応する米国特許出願第09/586,479号（2000年6月1日提出）参照)(これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。これらの作用は、ベクターおよびドナーウイルス間の構造的および機能的相違のためであり、弱毒化のための安定基礎を提供する。
【０１１０】
例えば、HPIV3およびBPIV3間では、Ｎタンパク質の各々に関するアミノ酸同一性％は86％であり、Ｐに関しては65％、Ｆに関しては83％、HNに関しては77％、そしてＬに関しては91％である。したがって、これらのタンパク質はすべて、復帰突然変異により容易に変更され得ない弱毒化キメラウイルスを生成するためにHPIVベクター中に導入するための候補である。好例実施態様では、ベクターゲノムまたはアンチゲノムはHPIV3ゲノムまたはアンチゲノムであり、異種遺伝子またはゲノムセグメントは、選定BPIV3株から得られるN ORFである。
【０１１１】
したがって、ヒト−ウシキメラPIVゲノムまたはアンチゲノムであるベクターゲノムまたはアンチゲノムを基礎にして本発明の範囲内で、キメラPIVが提供される。ある種の実施態様では、ヒト−ウシキメラベクターゲノムまたはアンチゲノムは、麻疹ウイルス、亜群Ａおよび亜群ＢのRSウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、１型および２型ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、フィロウイルス、ブンヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルスおよびインフルエンザウイルスから選択される異種病原体の１つ又はそれ以上の抗原決定基（１または複数）をコードする１つ又はそれ以上の異種遺伝子（１または複数）またはゲノムセグメント（１または複数）と併合される。
【０１１２】
本発明の代替的局面では、ヒト−ウシキメラベクターゲノムまたはアンチゲノムは、BPIVからの１つ又はそれ以上の異種遺伝子（１または複数）またはゲノムセグメント（１または複数）と併合された部分または完全HPIVゲノムまたはアンチゲノムを含む。一好例実施態様では、BPIV3N ORFの開放読取枠（ORF）を含む転写単位は、HPIV3ベクターゲノムの対応するN ORFに代えてベクターゲノムまたはアンチゲノム中で置換される。この構築物および類似の構築物を用いて、ベクターゲノムまたはアンチゲノムは、rHPIV3-NB HAP-Mのような以下で同定されるワクチン候補により例示されるように、余分の遺伝子挿入物として、麻疹ウイルスHA遺伝子と、または別の病原体の選定抗原決定基と併合される。
【０１１３】
本発明のその他の局面では、ヒト−ウシキメラベクターゲノムまたはアンチゲノムは、BPIVからの１つ又はそれ以上の異種遺伝子（１または複数）またはゲノムセグメント（１または複数）と併合された部分または完全HPIVゲノムまたはアンチゲノムを含む。例えば、HNおよび／またはＦ糖タンパク質あるいは１つ又はそれ以上の免疫原性ドメイン（１または複数）、その断片（１または複数）またはエピトープ（１または複数）をコードする１つ又はそれ以上のHPIV遺伝子（１または複数）またはゲノムセグメント（１または複数）は、部分または完全ウシゲノムまたはアンチゲノムに付加されるか、あるいはその中に組み入れられて、ベクターゲノムまたはアンチゲノムを生成する。
【０１１４】
ある種の実施態様では、HNおよびＦ糖タンパク質をコードするHPIV3はともに、体宇するBPIV3HNおよびＦ遺伝子に代えて置換されて、ベクターゲノムまたはアンチゲノムを生成する。このおよび類似の構築物を用いて、ベクターゲノムまたはアンチゲノムは、rBPIV3-G1またはrB/HPIV3-F1のような以下で同定されるワクチン候補により例示されるように、余分の遺伝子挿入物として、RSV Fおよび／またはＧ遺伝子と、または別の病原体の選定抗原決定基と併合される。
【０１１５】
さらに詳細な実施態様では、キメラヒト−ウシベクターは、１つ又はそれ以上の免疫原性ドメイン（１または複数）、その断片（１または複数）またはエピトープ（１または複数）をコードする１つ又はそれ以上のHPIV1 HNおよび／またはＦ遺伝子（１または複数）またはゲノムセグメント（１または複数）を組み入れ、ベクターはさらに、１つ又はそれ以上の免疫原性ドメイン（１または複数）、その断片（１または複数）またはエピトープ（１または複数）をコードする１つ又はそれ以上のHPIV2 HNおよび／またはＦ遺伝子（１または複数）またはゲノムセグメント（１または複数）を組み入れて、HPIV1およびHPIV2の両方からの防御抗原（１または複数）を発現するキメラゲノムまたはアンチゲノムを形成することにより修飾される。この範疇のキメラPIVは、rB/HPIV3.1-2F、rB/HPIV3.1-2HNまたはrB/HPIV3.1-2F、2HNのような以下で同定される種々のワクチン候補により例示される。
【０１１６】
本発明のさらに追加の側面で、遺伝子のオーダーを変えて、弱毒化を起こさせるかまたは特定の遺伝子の発現を低下させるかまたは高めることができる。あるいは、PIV ゲノムプロモーターをそのアンチゲノムカウンターパートで置換して、追加の望ましい表現型変化を得ることができる。組換えゲノムまたは組換えアンチゲノムの異なる修飾または追加の修飾を行って、各種の遺伝子間領域または他の場所に独特の制限部位を挿入するなどの操作を容易にすることができる。翻訳されない遺伝子配列を、取り除いて、異種配列を挿入する容量を増やすことができる。
【０１１７】
さらに追加の側面で、キメラPIV のゲノムまたはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子またはベクターを修飾して、非PIV 配列、例えばサイトカイン、Ｔヘルパーエピトープ、制限部位マーカー、または目標とする宿主の保護免疫応答を誘導することができる微生物病原体（例えばウイルス、細菌もしくは真菌）のタンパク質もしくは免疫性エピトープをコードさせることができる。このような実施態様の一つで、サイトカインをコードする遺伝子を取りこむキメラPIV を構築して、得られたキメラに新規な表現型の免疫原性作用が得られる。
【０１１８】
本発明は、ワクチンの用途にキメラPIV を提供する上に、PIV ベクターのゲノムまたはアンチゲノム、および一種以上の非相同の抗原決定基をコードする単一もしくは複数の非相同ポリヌクレオチドを取り込む、関連するcDNAクローンとベクターを提供するものであり、それらクローンとベクターは、上記のような一つ以上の弱毒変異体または他の表現型の変化を特定する突然変異と関連修飾を任意に取り込む。
【０１１９】
抗原決定基をコードしおよび／または所望の表現型変化を特定する非相同配列が、選択された組合せで、例えば、組換えcDNAのベクターのゲノムまたはアンチゲノムである単離されたポリヌクレオチド中に導入されて、本願に記載の方法にしたがって、適切に弱毒化された感染性ウイルスまたはサブウイルス粒子を産生する。これらの方法は、日常の表現型評価と組み合わせて、弱毒化、温度感受性、変化した免疫原性、低温適応性、小プラークの大きさ、宿主域の制限、遺伝的安定性などの望ましい特性を有するキメラPIV の大きな集合体を提供する。これら候補の中の好ましいワクチンウイルスは、弱毒化され、しかも予防接種された哺乳類宿主に保護免疫応答を誘発するのに十分に免疫原性である。
【０１２０】
本発明の関連する側面で、単離された感染性キメラPIV を産生させるための組成物（例えば、キメラPIV をコードするcDNAを取りこんでいる単離されたポリヌクレオチドとベクター）および方法が提供される。本発明のこれらの側面には、キメラPIV のゲノムまたはアンチゲノムを含有する分子を取りこんでいる、新規な単離されたポリヌクレオチド分子とベクターが含まれている。また、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質をコードする一種以上の単離されたポリヌクレオチド分子を含有する同じかまたは異なる発現ベクターも提供される。
【０１２１】
これらのタンパク質は、代わりに、前記ゲノムまたはアンチゲノムのcDNAから直接発現させることができる。前記の一種もしくは複数種のベクターは、好ましくは、細胞内または細胞なしのライゼート中で発現されるかまたは同時発現（coexpress ）されて、感染性キメラパラインフルエンザウイルス粒子またはサブウイルス粒子を産生する。
【０１２２】
キメラPIV を製造する上記の方法と組成物は、感染性のウイルス粒子もしくはサブウイルス粒子またはその誘導体を産生する。感染性ウイルスは、基準PIV 粒子に類似していて、そのまゝで感染性である。感染性ウイルスは、新鮮な細胞に直接感染する。感染性サブウイルス粒子は、一般に、適当な条件下で感染を開始できるウイルス粒子のサブコンポーネントである。
【０１２３】
例えば、ゲノムのもしくはアンチゲノムのＲＮＡならびにＮタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質を含有するヌクレオキャプシドが、細胞の細胞質中に導入された場合に感染を開始することができるサブウイルス粒子の例である。本発明によって提供されるサブウイルス粒子としては、感染力のために不可欠ではない一種以上のタンパク質、タンパク質セグメントなどのウイルスコンポーネントを欠いたウイルス粒子がある。
【０１２４】
他の実施態様で、本発明は、上記のキメラPIV のゲノムもしくはアンチゲノムを含有する分離されたポリヌクレオチド分子を有する発現ベクター、およびPIV のＮタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質をコードする一種以上の分離されたポリヌクレオチド分子を含有する発現ベクター（同じかまたは異なるベクター）を含む細胞または細胞なしのライゼートを提供するものである。また、これらタンパク質の一種以上は、前記ゲノムもしくはアンチゲノムのcDNAから発現させることができる。前記ゲノムもしくはアンチゲノムならびにＮタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質は、発現すると結合して、感染性のキメラパラインフルエンザウイルスまたはサブウイルス粒子を産生する。
【０１２５】
本発明の他の実施態様で、キメラPIV をコードする分離されたポリヌクレオチド分子を含有する発現ベクター、およびPIV のＮタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質をコードする一種以上の分離されたポリヌクレオチド分子を含有する発現ベクターを取りこんでいる細胞もしくは無細胞の発現系が提供される。発現すると、前記ゲノムもしくはアンチゲノムおよびＮタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質は、ウイルス粒子またはサブウイルス粒子のような感染性PIV 粒子を産生する。
【０１２６】
本発明のキメラPIV 類は、一種以上のPIV またはPIV と非PIV の病原体に対する望ましい免疫応答を、これら病原体に感染しやすい宿主に生成させるための各種組成物に有用である。キメラPIV 組換え体は、感染した哺乳類宿主にモノ−もしくはポリ−特異性保護免疫応答を誘発することができ、しかも免疫化された宿主に、疾患の許容できない症状を起こさないよう十分に弱毒化されている。その弱毒化されたウイルスまたはサブウイルス粒子は細胞培養液の上澄み液中に存在し、その培養物から単離されるかまたは部分的にもしくは完全に精製される。またそのウイルスは凍結乾燥され、そして貯蔵するかまたは必要時に宿主に送達するため各種の他の成分と組み合わせてもよい。
【０１２７】
さらに、本発明は、生理的に許容可能な担体および／またはアジュバント、ならびに上記の単離された弱毒化キメラパラインフルエンザウイルスまたはサブウイルス粒子を含有する新規なワクチンを提供するものである。好ましい実施態様で、本発明のワクチンは、弱毒化と免疫原性の適切なバランスを特定する、少なくとも一種のおよび好ましくは二種以上の追加の突然変異体または他のヌクレオチド修飾体を有するキメラPIV で構成されている。
【０１２８】
本発明のワクチンは、弱毒化ウイルスを、103〜107 PFUの投与量で配合することができる。本発明のワクチンは、単一株のPIV または多種株もしくは多種群のPIV に対して免疫応答を誘発する弱毒化キメラPIV を含有していてもよい。この点については、キメラPIV は、ワクチン配合物中に、他のPIV ワクチン株または他のウイルスワクチンのウイルス例えばRSV を組み合わせてもよい。
【０１２９】
関連する側面で、本発明は、個体の免疫系を刺激して、哺乳類の被検体に、一種以上のPIV またはPIV と非PIV の病原体に対して免疫応答を誘発する方法を提供するものである。この方法では、生理的に許容可能な担体および／またはアジュバント中に、免疫的に十分な量のキメラPIV を含有する配合物が投与される。一実施態様で、本発明の免疫原性組成物は、上記のような所望の表現型および／または弱毒化のレベルを特定する少なくとも一種のおよび好ましくは二種以上の弱毒化突然変異体または他のヌクレオチド修飾体を有するキメラPIV を含有するワクチンである。
【０１３０】
本発明のワクチンには、103 〜107PFUの投与量の弱毒化ウイルスを配合できる。本発明のワクチンは、単一のPIV 、複数種のPIV 例えばHPIV1 およびHPIV3 、または一種以上のPIV および非PIV の病原体例えばはしかもしくはRSV に対して免疫応答を誘発する弱毒化キメラPIV を含有していてもよい。このことに関連して、キメラPIV 類は、複数種のPIV 、または一種以上のPIV と非PIV の病原体に対して、モノ特異性免疫応答またはポリ特異性免疫応答を誘発することができる。
【０１３１】
あるいは、異なる免疫原性の特性を有するキメラPIV は、ワクチン混合物に混合するかまたはコーディネーテッド治療法のプロトコル（coordinated treatment protocol）にしたがって別個に投与して、単一のPIV 、複数種のPIV 、または一種以上のPIV とはしかもしくはRSV のような非PIV 病原体に対してより有効な保護作用を誘発することができる。本発明の免疫原性組成物は、好ましくは、上気道に、例えばスプレー、液滴またはエアゾールによって投与される。本発明の免疫原性組成物は、好ましくは上気道に、例えばスプレー、液滴またはエアゾールで投与される。
【０１３２】
また、本発明は、複数種のPIV および／またはPIV と非PIV の病原体を含む複数の病原体に対する新規な組合わせワクチン類（combinatorial vaccines）とコーディネート予防接種法のプロトコルを提供するものである。例えば、これらの組成物による早期予防接種の選択された標的には、RSV とPIV3が含まれているが、これらは各々、出生後、最初の４ヶ月間内に重篤な疾病を起こし、一方PIV1とPIV2が起こす疾病は大部分、６ヶ月の年齢の後に起こる（米国フィラデルフィア，Lippincott-Raven Publishers 1996年発行の「Fields Virology 」１巻1205〜1243頁のCollins らの報告；Reedら、J.Infect.Dis., 175巻807〜813頁1997年）。
【０１３３】
弱毒化RSV とPIV の生ワクチンを利用する好ましい免疫化の手順は、１ヶ月年齢という早期に（例えば１ヶ月と２ヶ月の年齢時に）投与し、続いて４ヶ月と６ヶ月の年齢時に、PIV1とPIV2の二価ワクチンを投与する手順である。したがって、一種以上のキメラPIV ワクチンを含む複数のPIV ワクチンを、定義された時間系列で（例えば毎日または一週間毎に）、混合物でまたは別個に、協調して、例えば同時に投与する本発明の方法を利用ることが好ましく、そして、各ワクチンのウイルスは異なる非相同の保護抗原を発現することが好ましい。このような協調／逐次的（coordinate/sequential ）免疫化法は、多数のウイルス気道病原体に対する二次抗体応答を誘発することができ、早期乳児の前記三種のPIV ウイルスおよび他の病原体の各々に対する免疫化に対する必要度によって決まる非常に強力で極度に順応性の免疫化方法を提供する。
【０１３４】
重要なことであるが、多数のPIV 血清型が存在し、PIV1とPIV2より若い年齢で起こるPIV3の疾患に対するそれら血清型の独特の疫学的性質によって、はしかウイルスHAのような同じ非相同抗原決定基を各々発現する異なるPIV ベクターで乳児を逐次免疫化することが望ましくなる。この逐次免疫化法によって、非相同タンパク質に対する抗体を高力価で誘発することができ、これは二次抗体応答の特徴である。一次実施態様で、早期乳児（例えば２〜４ヶ月年齢の乳児）は、本発明の弱毒化キメラウイルス、例えばはしかウイルスのHAタンパク質を発現するキメラHPIV3 で免疫されそして適応して、rcp45L (HA P-M) などのHIPV3 に対して免疫応答を誘発する。
【０１３５】
続いて、例えば４ヶ月齢で、乳児は再び免疫化されるが、異なる二次ベクター構造体、例えばはしかウイルスのHA遺伝子を発現する、PIV3 〜1 cp45Lウイルスおよび前記ベクターの機能性の絶対的糖タンパク質としてのHPIV1 抗原決定基で再び免疫化される。第一予防接種によって、そのワクチン注射を受けた者は、PIV3HNとＦタンパク質の両者およびはしかウイルスHAタンパク質に対する一次抗体応答を誘発するが、PIV1HAとＦタンパク質に対する一次抗体応答を誘発しない。
【０１３６】
はしかウイルスHAを発現するrPIV3-1cp45Lで二次免疫化が行われると、そのワクチン注射を受けた者は、PIV1HNとＦタンパク質に対する抗体がないので、そのワクチンに容易に感染して、PIV1HNとＦ防御抗原に対する一次抗体応答と、非相同のはしかウイルスHAタンパク質に対する高力価の二次抗体応答の両方を起こす。本願に開示されているキメラワクチンウイルスの一種以上を用いて、はしかまたは他の非PIV 病原体に対する初期のおよび二次の高力価防御応答の刺激を同時に行い、免疫を、HPIV3 に対し次にHPIV2 に対し逐次誘発する類似の逐次免疫化法を行うことができる。
【０１３７】
一次と二次のベクターとして好ましくは異なる血清型のPIV を利用するこの逐次免疫化法は、一次ベクターに誘発される免疫、すなわち血清型を一つだけ有するベクターの有用性を結局制限する因子を有効に回避する。先に述べたようなrPIV3 とrPIV3-1 ウイルスのワクチン候補による逐次免疫化が成功したことが立証されている（Tao ら、Vaccine 117巻1100〜1108頁1999年）。
【０１３８】
特定の実施態様の記載
本発明は、新規なキメラパラインフルエンザウィルス(PIV)および関連ワクチンの製造および使用のための方法および組成物を提供する。本発明のキメラウィルスはヒトおよび他の動物において感染性かつ免疫源性であり、１つ以上のPIVに対して、例えば１つ以上のヒトPIV(HPIV)に対して免疫応答を生じさせるのに有用である。あるいは、選ばれたPIVおよび１つ以上のさらなる病原体に対する、例えばHPIVおよび麻疹ウィルスの両方に対する免疫応答を誘発するキメラPIVが提供される。誘発された免疫応答は、体液および／または細胞が仲介する応答のどちらかまたは両方を含むことができる。好ましくは、本発明のキメラPIVは弱毒化されて、ワクチン用途のために所望の弱毒化バランスおよび免疫源性を与える。
【０１３９】
本発明はかくして、PIVおよび他の病原体による感染および関連疾患の症状を防御および／または治療するためのワクチン剤として有用な、弱毒化されたキメラPIVを設計し、製造するための新規な方法を提供する。本発明の方法によれば、キメラパラインフルエンザウィルスまたはサブウィルス粒子(subviral particle)が、組換えにより修飾されて非相同の病原体の１つ以上の抗原決定基を組み込んだ、PIV「ベクター」のゲノムまたはアンチゲノムを用いて構築される。ベクターのゲノムまたはアンチゲノムは、一部または全部のPIVゲノムもしくはアンチゲノムからなり、これは、それ自体ヌクレオチド修飾、例えば弱毒化変異を組み込むことができる。
【０１４０】
ベクターのゲノムまたはアンチゲノムは、非相同の遺伝子またはゲノムセグメントの組み込みによってキメラ構造を形成するように修飾される。より詳細には、本発明のキメラPIVは、cDNAに基づくウィルス回収系によって構築され、これは、非相同の抗原決定基をコードする１つ以上の「ドナー」ヌクレオチド配列と結合された、一部または全部のベクターまたは「バックグラウンド」PIVゲノムもしくはアンチゲノムを組み込む組換えウィルスを生じる。
【０１４１】
好ましくは、PIVベクターは、HPIVゲノムもしくはアンチゲノムを含むが、非ヒトPIV、例えばウシPIV(BPIV)は、ヒトPIVおよび他のヒト病原体の抗原決定基を組み込むためにベクターとして使用することができる。本明細書に記載された典型的な実施態様においては、ヒトPIV3(HPIV3) ベクターのゲノムまたはアンチゲノムは、１つ以上の非相同PIV（例えばHPIV1および／またはHPIV2）、および／または非PIV病原体（例えば麻疹ウィルス）の抗原決定基をコードする１つ以上の遺伝子またはゲノムセグメントを組み込むように修飾される。
【０１４２】
かくして構築された本発明のキメラPIVは、特定のPIV、例えばHPIV1、HPIV2および／またはHPIV3に対して、または非PIV病原体に対しての免疫応答を誘発することができる。あるいは、多重PIV、例えばHPIV1およびHPIV3に対する、または１つ以上のHPIVおよび非PIV病原体、例えば麻疹ウィルスに対する多特異的免疫応答を誘発するための組成物および方法が提供される。
【０１４３】
例示的な本発明のキメラPIVは、上記したように、キメラPIVゲノムもしくはアンチゲノムならびに、主要ヌクレオカプシド(N)タンパク質、ヌクレオカプシドリンタンパク質(P)および大きいポリメラーゼタンパク質(L)を組み込む。さらなるPIVタンパク質が、種々の組合せに含まれて、完全なウィルス粒子または余分のタンパク質、抗原決定基または他のさらなる成分を含むウィルス粒子までの、ある範囲の感染性サブウィルス粒子(subviral particle)を提供することができる。さらなるPIVタンパク質が、種々の組合せに含まれて、完全なウィルス粒子または余分のタンパク質、抗原決定基または他のさらなる成分を含むウィルス粒子までの、ある範囲の感染性サブウィルス粒子(subviral particle)を提供することができる。
【０１４４】
本発明の好ましい態様においては、キメラPIVは、第２のヒトPIVまたは非PIV病原体、例えば麻疹ウィルスからの１つ以上の非相同遺伝子またはゲノムセグメントと結合した、一部または全部のヒトPIVベクターのゲノムもしくはアンチゲノムを組み込む。PIV「ベクター」ゲノムもしくはアンチゲノムは典型的には、非相同病原体の１つ以上の「ドナー」遺伝子またはゲノムセグメントが加えられまたは組み込まれる、受容体もしくは担体としてふるまう。
【０１４５】
典型的には、非相同病原体の１つ以上の抗原決定基をコードするポリヌクレオチドが、ベクターのゲノムもしくはアンチゲノム内で加えられ、または置換されて、選ばれた宿主において非相同病原体に対する免疫応答を誘発する能力をかくして獲得するキメラPIVを生じる。さらには、キメラウィルスは、ベクターPIVおよび非相同病原体の一方または両方と比べて、他の新規な表現型特性を示すことができる。
【０１４６】
一部または全部のベクターのゲノムもしくはアンチゲノムは一般に、異なる病原体の非相同遺伝子またはゲノムセグメントが組み込まれる主鎖としてふるまう。しばしば、非相同病原体は、１つ以上の遺伝子またはゲノムセグメントが、ベクターのゲノムもしくはアンチゲノムを有する、それと結合される、またはその中で置換される、異なるPIVである。
【０１４７】
新規な免疫源特性を提供することの他に、ベクターPIV株中での非相同遺伝子またはゲノムセグメントの添加または置換は、未修飾のベクターおよびドナーウィルスの対応する表現型と比べて、弱毒化、増殖変化または他の所望の表現型変化に増加または減少を与えることができる。本発明のキメラPIV中での挿入物または添加物として選択され得る他のPIVからの非相同遺伝子およびゲノムセグメントとしては、PIV N、P、C、D、V、M、F、HNおよび／もしくはLタンパク質または、１つ以上のその抗原決定基をコードする遺伝子もしくはゲノムセグメントを包含する。
【０１４８】
１つのPIVの非相同遺伝子またはゲノムセグメントは、余分のゲノム要素として、異なるPIVの、一部または全部のゲノムもしくはアンチゲノムに添加され得る。あるいは、１つのPIVの１つ以上の非相同遺伝子またはゲノムセグメントは、PIVベクターのゲノムもしくはアンチゲノム内で欠失される、対遺伝子またはゲノムセグメントの野生型遺伝子オーダー位置(order position)に対応する位置で置換され得る。なおさらなる実施態様においては、非相同遺伝子またはゲノムセグメントは、ベクターのゲノムもしくはアンチゲノム内の対遺伝子またはゲノムセグメントの野生型遺伝子オーダー位置に比べてよりプロモーター-近位またはプロモーター-遠位である位置で、添加または置換されて、非相同遺伝子またはゲノムセグメントの発現をそれぞれ増進または減少させる。
【０１４９】
キメラPIVを製造するために非相同免疫源性タンパク質、タンパク質ドメインおよび免疫源性エピトープを導入することは、免疫された宿主において新規な免疫応答を生じさせるのに特に有用である。受容体PIVベクターゲノムまたはアンチゲノム内での、１つのドナー病原体からの免疫源性の遺伝子またはゲノムセグメントの添加または置換は、ドナー病原体、PIVベクターに対する、またはドナー病原体およびベクターの両方に対する免疫応答を生じさせることができる。
【０１５０】
この目的を達成するために、キメラタンパク質、例えば異なるPIVまたは非PIV病原体の非相同エクトドメインに融合されたベクターに特異的な細胞質テール(tail)および／または経膜ドメインを有する免疫源性の糖タンパク質を発現するキメラPIVを構築して、非相同の病原体に対する免疫応答を誘発する融合タンパク質を提供することができる。例えば、ヒトPIV1 HNまたはF糖タンパク質からの糖タンパク質エクトドメインをコードする非相同ゲノムセグメントは、対応するHPIV3 HNまたはF糖タンパク質の細胞質および経膜ドメインをコードするゲノムセグメントと結合されて、HPIV1に対する免疫応答を誘発するHPIV3-1キメラ糖タンパク質を形成することができる。
【０１５１】
簡単には、キメラ糖タンパク質を発現する本発明のPIVは、主要なヌクレオカプシド(N)タンパク質、ヌクレオカプシドリンタンパク質(P)、大きいポリメラーゼタンパク質(L)および、キメラ糖タンパク質をコードするように修飾されたHPIVベクターゲノムまたはアンチゲノムを含む。キメラ糖タンパク質は、第２の抗原的に別個のHPIVの１つ以上の非相同の抗原ドメイン、断片またはエピトープを組み込む。好ましくは、これは、１つ以上の抗原ドメイン、断片またはエピトープをコードする第２のHPIV の1つ以上の非相同ゲノムセグメントのHPIVベクターゲノムまたはアンチゲノム内の置換によって達成され、それによって、ゲノムまたはアンチゲノムは、親のベクターウィルスとは抗原的に別個のキメラ糖タンパク質をコードする。
【０１５２】
より詳細な態様においては、非相同のゲノムセグメントは好ましくは、糖タンパク質エクトドメインまたは免疫源性タンパク質またはそのエピトープをコードし、任意的に非相同または「ドナー」糖タンパク質の他の部分、例えば、ベクターのゲノムまたはアンチゲノムにおいて対の糖タンパク質のエクト-および経膜ドメインの代わりに使用される、エクトドメインおよび経膜領域の両方を含む。本発明において好ましいキメラ糖タンパク質は、HPIV HNおよび／またはF糖タンパク質から選択することができ、ベクターのゲノムまたはアンチゲノムは、多重キメラ糖タンパク質をコードするように修飾され得る。
【０１５３】
好ましい実施態様においては、HPIVベクターのゲノムまたはアンチゲノムは、部分的HPIV3ゲノムまたはアンチゲノムであり、第２の抗原的に別個のHPIVはHPIV1またはHPIV2である。以下に記載する１つの典型的な実施態様においては、HPIV2 HNおよびF糖タンパク質の両方の糖タンパク質エクトドメインが、HPIV3ベクターのゲノムまたはアンチゲノムにおける対応するHNおよびF糖タンパク質エクトドメインの代わりに使用される。別の典型的な実施態様においては、一方または両方のHNおよび／またはF糖タンパク質のPIV2エクトドメインおよび経膜領域が、１つ以上の対応するPIV3細胞質テール領域に融合されて、キメラ糖タンパク質を形成する。
【０１５４】
本発明のこれらの態様に関するさらなる詳細は、キメラ糖タンパク質を発現する組換えパラインフルエンザウィルスの構築および使用（CONSTRUCTION AND USE OF RECOMBINANT PARAINFLUENZA VIRUSES EXPRESSING A CHIMERIC GLYCOPROTEIN）という題の、1999年12月10日にタオ(Tao)らにより出願され、代理人の事件番号No.17634-000340により確認される米国特許出願（参照することによって本明細書に組入れられる）に与えられている。
【０１５５】
非PIV病原体の非相同抗原決定基を有する本発明のキメラPIVを構築するために、ドナー病原体の非相同遺伝子またはゲノムセグメントが、ベクターゲノムまたはアンチゲノムにおける任意の機能し得る位置で添加または置換されることができる。１つの実施態様においては、非PIV病原体からの非相同遺伝子またはゲノムセグメントがPIVベクターゲノムまたはアンチゲノム内に添加されて（すなわち、置換はない）、得られるクローン内に新規な免疫源特性を作ることができる。
【０１５６】
これらの場合には、非相同遺伝子またはゲノムセグメントが、余分の遺伝子またはゲノムセグメントとして、任意的に、得られるキメラウィルスを弱毒化するさらなる目的のために、完全なPIVベクターゲノムまたはアンチゲノムと組合せて添加され得る。あるいは、非相同遺伝子またはゲノムセグメントは、ベクターゲノムまたはアンチゲノムにおける選ばれた遺伝子またはゲノムセグメントの欠失と関連して添加され得る。
【０１５７】
本発明の好ましい実施態様においては、非相同の遺伝子またはゲノムセグメントが、一部または全部のPIVベクターゲノムまたはアンチゲノム内の遺伝子間位置に加えられる。あるいは、遺伝子またはゲノムセグメントは、ゲノムの他の非コード領域内、例えば5'または3'非コード領域内に、または非コードヌクレオチドがベクターゲノムまたはアンチゲノム内に生じる他の位置に、挿入することができる。１つの態様においては、非相同の遺伝子またはゲノムセグメントが、ベクターゲノムまたはアンチゲノム内、例えば有効な複製、転写および／または翻訳のために必要とされる配列内のシス−作用調節配列を重複する非コード部位に挿入される。ベクターゲノムまたはアンチゲノムのこれらの領域は、非相同の遺伝子またはゲノムセグメントの導入に関連する調節機能の破壊または修飾のための標的部位を示す。
【０１５８】
本明細書の中で用いられる用語「遺伝子」は、一般にmRNAをコード化する主題のゲノムの一部分、例えばPIVゲノムを意味し、遺伝子出発（GS）シグナルを備えた上流末端で始まり、遺伝子末端（GE）シグナルを備えた下流末端で終わる。遺伝子という用語はまた、特にPIVのＣタンパク質などのタンパク質がユニークmRNAからでなく付加ORFから発現する場合、用語「翻訳のオープン読み枠」すなわちORFと互換可能である。HPIV3の典型例においてゲノムは、長さが一本鎖のネガティブセンスRNAの15462個のヌクレオチド（nt）である（Galinski等の論文、Virology 165:499〜510,1988;Stokes等の論文、Virus Res.25:91〜103,1992）。
【０１５９】
少なくとも８個のタンパク質がHPIV3ゲノムによりコード化される。すなわち、ヌクレオキャプシドタンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ，機能の知られていないＣおよびＤタンパク質、マトリックスタンパク質Ｍ、融合糖タンパク質Ｆ、赤血球凝集素ノイラミニダーゼ糖タンパク質HN、および大ポリメラーゼタンパク質Ｌである（Collins等の論文、3rd ed.,「Fields Virology」,B.N.Fields,D.M.、Knipe,P.M.、Howley,R.M.、Chanock,J.L.、Melnick,T.P.、Monath,B.Roizman、およびS.E.Straus共編、Vol.1,pp.1205〜1243,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996）。
【０１６０】
全PIVのウィルスのゲノムもまた、非コード領域および遺伝子間領域だけでなく、ウィルスの複製および転写にとって必要なプロモーターの全体または一部を持った遺伝子外リーダーおよびトレーラー領域を含有する。したがってPIVの遺伝子マップは、３′リーダー−Ｎ−Ｐ／Ｃ／Ｄ／Ｖ−Ｍ−Ｆ−HN−Ｌ−５′トレーラーとして表される。転写は３′末端で開始し、遺伝子の境界に見られる短い保存モチーフにより導かれる連続した開始−停止機構により進む。各遺伝子の上流末端は、そのそれぞれのmRNAの開始を指示する遺伝子出発（GS）シグナルを含有している。各遺伝子の下流末端は、ポリアデニル化および終結を指示する遺伝子末端（GE）モチーフを含有している。
【０１６１】
典型的な遺伝子配列は、ヒトPIV3の株JS（GenBankの受入れ番号Z11575、これは参照により本明細書に合体される）およびWashington（Galinski M.S.の論文、Kingsbury,D.W.編の「The Paramyxoviruses」,pp.537〜568,Plenum Press,New York,1991、これは参照により本明細書に合体される）に対して、またウシのPIV3株910N（GenBankの受入れ番号D80487、これは参照により本明細書に合体される）に対して記述されている。
【０１６２】
本発明のキメラPIVを構築するために、１もしくは複数のPIV遺伝子またはゲノムセグメントが全体的または部分的に欠失し、挿入され、または置換されてもよい。これは、部分的または完全な欠失、挿入、および置換にはオープン読み枠および／または任意の１もしくは複数のPIV遺伝子またはゲノムセグメントのシス作用調節配列が含まれることを意味する。「ゲノムセグメント」とは、PIVゲノム由来の任意の長さの連続ヌクレオチドを意味し、ORFの一部、遺伝子、または遺伝子外領域、あるいはその組み合わせであってもよい。
【０１６３】
主題のゲノムセグメントが抗原決定基をコード化する場合、ゲノムセグメントは哺乳類の宿主中で体液または細胞が仲介する免疫応答を誘発することが可能な少なくとも１つの免疫原性エピトープをコード化する。ゲノムセグメントはまた、免疫原性断片またはタンパク質のドメインをコード化することもできる。別の実施態様においてドナーのゲノムセグメントは、多重、反復、もしくは異なる免疫原性ドメインまたはエピトープを含む、組換えにより合成された配列を含む多重免疫原性ドメインまたはエピトープをコード化することができる。
【０１６４】
本発明の別のキメラPIVは、HPIV1、HPIV2、および／またはHPIV3の防御抗原決定基を含有する。これは好ましくは、ベクターPIVによる１もしくは複数のHNおよび／またはＦの遺伝子もしくはゲノムセグメントの発現により、あるいは異種のドナー病原体由来の余分の遺伝子または置換遺伝子として達成される。ある実施形態において、HPIV3-1またはHPIV3-2のキメラウィルスをワクチンまたはベクターの株として用いるために構築することができ、そこではHPIV1またはHPIV2のHNおよび／またはＦ遺伝子がそれらPIV3の対の片方に取って代わる（Skiadopoulos等の論文、Vaccine,18:503〜510,1999;Tao等の論文、Vaccine,17:1100〜1108,1999;1998年5月22日出願の米国特許出願第09/083,793号（および対応する国際公開第98/53078号として公開されている国際出願）；1999年12月10日出願の米国特許出願第09/458,813号、1999年12月10日出願の米国特許出願第09/459,062号、これらは各々参照により本明細書に合体される）。
【０１６５】
この文脈においてキメラPIV1ワクチンの候補は、PIV3のcDNAレスキューシステムを用いて、Ｌ中に３つの弱毒化突然変異を含有するPIV3の標準長さのcDNA中のPIV3のHNおよびＦオープン読み枠（ORF）を、PIV1のものと置き換えることにより生成した。このcDNAから誘導された組換えキメラウィルスはrPIV3-1.cp45Lと呼ばれる（Skiadopoulos等の論文、J.Virol.72:1762〜8,1998;Tao等の論文、J.Virol.72:2955〜2961,1998;Tao等の論文、Vaccine 17:1100〜1108、1999、これらは参照により本明細書に合体される）。
【０１６６】
rPIV3-1.cp45Lはハムスター中で弱毒化され、PIV1と対抗するために高レベルの耐性が誘発される。また、15のcp45L突然変異のうちの12を含有する、すなわちHNおよびＦ中に突然変異を含有しないrPIV3-1.cp45Lと呼ばれる組換えキメラウィルスを生産し、ハムスターの上部および下部気道中で高度に弱毒化する（Skiadopoulos等の論文、Vaccine 18:503〜510、1999、これは参照により本明細書に合体される）。
【０１６７】
本発明の好ましい実施形態においてキメラPIVは、ヒトPIVの１もしくは複数の主要な抗原決定基を運ぶか、またはHPIV1、HPIV2、またはHPIV3を含む多重のヒトPIVに対抗する。これらの好ましいワクチン候補は、１もしくは複数の選択されたHPIVに対するヒトの有効な免疫応答を誘発する。上記で言及したようにHPIVに対する免疫応答を誘発する抗原決定基は、ベクターのゲノムまたはアンチゲノムによりコード化することができ、あるいは非相同の遺伝子または遺伝子セグメントとしてPIVベクターのゲノムまたはアンチゲノムに挿入するかまたは接合することができる。ヒトのPIVの主要な防御抗原は、それらのHNおよびＦ糖タンパク質である。しかしながら、全てのPIV遺伝子、例えばCTLエピトープのような決定基をコード化することができる内部タンパク質遺伝子を含むPIV遺伝子が問題の抗原決定基をコード化するための候補である。
【０１６８】
本発明の好ましいキメラPIVワクチンのウィルスは、１もしくは複数の主要な抗原決定基を複数のそれぞれHPIVから、またはHPIVおよび非PIV病原体から移す。こうして構築されたキメラPIVには、例えばHPIV3の部分的または完全なHPIVゲノムまたはアンチゲノムと、非相同のPIV、例えばHPIV1またはHPIV2の抗原決定基をコード化する１もしくは複数の非相同の遺伝子またはゲノムセグメントとが含まれる。別の実施形態において、HPIV1またはHPIV2の１もしくは複数の抗原決定基をコード化する１もしくは複数の遺伝子またはゲノムセグメントを、部分的または完全なHPIV3のゲノムまたはアンチゲノムに付加するかまたはその中で置き換えることができる。
【０１６９】
下記に記載のさまざまな典型的な実施形態において、HNおよびＦ糖タンパク質をコード化する両HPIV1遺伝子は、キメラPIVワクチン候補中の対の片方のHPIV3のHNおよびＦ遺伝子と置き換えられる。これらのならびにその他の構築物は、ヒトの中で１もしくは複数のHPIVに対する単一または多特異的免疫応答のいずれかを誘発するキメラPIVを産生する。本発明のさらに詳細な実施態様は、1999年12月10日に出願され、弁理士整理番号17634-000340により確認されているTao他の「CONSTRUCTION AND USE OF RECOMBINANT PARAINFLUENZA VIRUSES EXPRESSING A CHIMERIC GLYCOPROTEIN」という名称の米国特許出願、および1999年12月10日に出願され、弁理士整理番号17634-000330により確認されているMurphy他の「USE OF RECOMBINANT PARAINFLUENZA VIRUS(PIV)AS A VECTOR TO PROTECT AGAINST DISEASE CAUSED BY PIV AND RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS（RSV）」という名称の米国特許出願の中で提供されており、これらは各々参照により本明細書に合体される。
【０１７０】
本発明の典型的な実施態様において、HPIV1およびHPIV2の両者由来の抗原決定基をコード化する非相同の遺伝子またはゲノムセグメントは、部分的または完全なHPIV3ベクターのゲノムまたはアンチゲノムに付加されるかまたはその中に取り込まれる。例えば、HNおよび／またはＦ糖タンパク質あるいはその抗原決定基をコード化する１もしくは複数のHPIV1遺伝子またはゲノムセグメントと、HNおよび／またはＦ糖タンパク質あるいは抗原決定基をコード化する１もしくは複数のHPIV2遺伝子またはゲノムセグメントとは、部分的または完全なHPIV3ベクターのゲノムまたはアンチゲノムに付加されるかまたはその中に取り込まれる。
【０１７１】
下記に記載の一実施例において、HNおよび／またはＦ糖タンパク質をコード化する両HPIV1遺伝子は、対の片方のHPIV3のHNおよびＦ遺伝子と置き換えられてキメラHPIV3-1ベクターのゲノムまたはアンチゲノムを形成する。このベクター構築物はさらに、HPIV2の抗原決定基をコード化する１もしくは複数の遺伝子またはゲノムセグメントの付加または取り込みにより修飾することができる。こうして、本明細書の下記に記載されるワクチン候補rPIV3-1.2HNおよびrPIV3-1cp45.2HNにより例示されるようにHPIV1とHPIV2の両者の抗原決定基を有するキメラPIVを産生する、本発明を例示する特異的構築物が提供される。
【０１７２】
本発明の別の好ましい実施態様においてキメラPIVは、非PIV病原体、例えば麻疹ウィルスの１もしくは複数の主要な抗原決定基を発現するように修飾されたHPIVベクターのゲノムまたはアンチゲノムを取り込む。本発明の方法は一般に、キメラPIVワクチンの候補の中に広範囲の追加の病原体由来の抗原決定基を取り込むのに応用できる。この点に関して本発明はまた、その他の病原体のなかでも呼吸合胞体層ウィルス（RSV）サブグループＡおよびサブグループＢ、おたふくがぜウィルス、ヒト乳頭腫ウィルス属、ヒト免疫不全ウィルス属１型および２型、単純ヘルペスウィルス属、サイトメガロウィルス、狂犬病ウィルス、エプスタイン・バーウィルス、フィロウィルス属、ブニャウィルス、フラビウィルス属、アルファウィルス属、およびインフルエンザウィルス属に対するワクチン候補の開発の手だてとなる。
【０１７３】
この点に関して、本発明の方法によるワクチン開発のための標的となる可能性のある病原体には、ウィルス性および細菌性病原体、ならびに原生動物および多細胞病原体が含まれる。この文脈においては多くの重要なヒトの病原体由来の有用な抗原決定基が知られており、本発明のキメラPIVの中に取り込むためにすでに同定されている。
【０１７４】
こうして主要な抗原は、麻疹ウィルスのHAおよびＦタンパク質、RSVのＦ、Ｇ、SH、およびM2タンパク質、おたふくかぜウィルスのHNおよびＦタンパク質、ヒト乳頭腫ウィルスのL1タンパク質、ヒト免疫不全ウィルス１型および２型のgp160タンパク質、単純ヘルペスウィルスおよびサイトメガロウィルスのgB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、およびgMタンパク質、狂犬病ウィルスのＧタンパク質、エプスタイン・バーウィルスのgp350タンパク質、フィロウィルスのＧタンパク質、ブニャウィルスのＧタンパク質、フラビウィルスのＥおよびNS1タンパク質、およびアルファウィルスのＥタンパク質を含む上記の典型的な病原体について同定されている。
【０１７５】
これらの主要な抗原、ならびに列挙された病原体およびその他の病原体に対する当業界で知られているその他の抗原は、標準長さのタンパク質およびそれらの構成要素の抗原ドメイン、断片、およびエピトープを含むこれらの抗原決定基の多くが、それらそれぞれの免疫原性作用について同定され、マッピングされ、特徴が調べられるほどまでに十分な特徴づけがなされている。
【０１７６】
本発明において使用するさまざまな病原体の主要な抗原を同定し特徴づける多くの典型的なマッピングの研究には、HPIV3の赤血球凝集ノイラミニダーゼ（HN）遺伝子に向けられたエピトープのマッピング研究がある（van Wyke Coelingh等の論文、J.Virol.61:1473〜1477,1987、これは参照により本明細書に合体される）。この報告書は、ノイラミニダーゼ、赤血球凝集、または両者の作用を阻害するHNタンパク質に対して、単クローン抗体（MAbs）を用いて選定したHPIV3変異体の16種類の抗原型に関する詳細な抗原の構造分析を提供している。各変異体はHN遺伝子中にただ一点の突然変異を持ち、HNタンパク質中のたった一つのアミノ酸の置換をコード化する。
【０１７７】
HNタンパク質の実用化された位置関係地図は、置換の相対位置とよい相関関係がある。HNタンパク質のコンピュータ援用分析の結果、主としてランダムな親水性のらせん構造によって相互に結合した疎水性のβシートからなる二次構造が予想された。HNエピトープは予想されるらせん領域に位置した。ウィルスのノイラミニダーゼ活性を阻害するMAbsにより認識されたエピトープは、パラミクソウィルスの幾つかのHNタンパク質の中に構造的に保存されているようにみえる領域で、かつHN分子のシアル酸結合部位を表している可能性のある領域に位置した。
【０１７８】
通常の抗原マッピング法を使用するこの典型的な研究により、HNエピトープの完全性にとって重要なたった一つのアミノ酸が同定された。これらエピトープの大部分は分子の片方のＣ末端に位置しており、タンパク質で予想されるようにそのＮ末端に固定されている（Elango等の論文、J.Virol.57:481〜489,1986）。以前に出版されたPIV3のHNの実用化された位置関係地図は、使用したMAbsが、第三の部位（Ｃ）により部分的にブリッジされた２つの位置的に離れた部位（ＡおよびＢ）の中に組織されたエピトープの６つの別個の群（ＩからVI）を認識したことを示した。
【０１７９】
エピトープのこれらの群は、本発明のキメラPIVの中に単独またはさまざまな組み合わせで取り込むことができる抗原決定基用の有用な候補の代表例である（各々参照により本明細書に合体されるCoelingh等の論文、Virology 143:569〜582,1985;Coelingh等の論文、Virology 162:137〜143,1988;Ray等の論文、Virology 148:232〜236,1986;Rydbeck等の論文、J.Gen.Virol.67:1531〜1542,1986もまた参照されたい）。
【０１８０】
Wyke Coelingh等による追加の研究（J.Virol.63:375〜382,1989）は、本発明中で使用されるPIV抗原決定基の選定に関係する更なる情報を提供している。この研究においては26の単クローン抗体（MAbs)(14は中和性、12は非中和性）が、HPIV3の融合（Ｆ）糖タンパク質の抗体構造、生物学的特性、および自然変異を試験するために用いられた。
【０１８１】
実験室で選定した抗原変異体の分析およびPIV3の臨床用分離株の分析の結果、MAbsのパネルが少なくとも20のエピトープを認識し、その14が中和と関係することを示した。競合結合アッセイにより、14の中和エピトープが３つのオーバーラップしない主抗原領域（Ａ、Ｂ、およびＣ）および１つのブリッジ部位（AB）に組織され、６つの非中和エピトープが４つの部位（Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ）を形成することを確認した。中和MAbsの大部分が非相互競合結合反応と関係しており、それらが別の中和エピトープ中で配座変化を誘発することを示唆している。
【０１８２】
本発明において使用される別の抗原決定基を、呼吸合胞体層ウィルス（RSV）について同定し、特徴を調べた。例えば、参照により本明細書に合体されるBeeler等の論文、J.Virol.63:2941〜2950,1989は、RSVの中和および融合と関係したエピトープの詳細な位置関係の実用化された地図を構築するために、RSVのA2株の融合糖タンパク質に対して特異的な18の中和単クローン抗体（MAbs）を使用した。競合結合アッセイにより、３つのオーバーラップしない抗原領域（Ａ、Ｂ、およびＣ）および１つのブリッジ部位（AB）が同定された。13のMAb耐性突然変異体（MARM）を選定し、MARMまたはRSV臨床用株のいずれかを有するMAbsの中和パターンを少なくとも16のエピトープについて同定した。
【０１８３】
部位ＡおよびABの６つのエピトープに対する抗体により選定されたMARMは、小さなプラークの表現型を示し、Ｆ分子の生物学的に活性な領域における変化と一致している。MARMの分析はまた、これらの中和エピトープが独特の生物学的および免疫学的特性を有する、位置的には別個だが配座的には自由な領域を占めることを示した。次いでエピトープＦ中の抗原の変異を、23の臨床用分離株（サブグループＡが18、サブグループＢが５）を用いて18の抗ＦのMAbsとの交差中和アッセイにより試験した。この分析は分子の不変、可変、また超可変領域を同定し、RSVのＦ糖タンパク質の中和エピトープ中の抗原の変異が非累積性の遺伝子の不均一性の結果であることを示した。
【０１８４】
16のエピトープのうち８つが、23のサブグループＡもしくはサブグループＢの臨床用分離株の全てまたは１つを除く全ての上に保存された。標準長さのタンパク質およびそれらの構成要素の抗原ドメイン、断片、およびエピトープを含むこれら抗原決定基は全て、上記に記載した新奇な免疫応答を誘発するために、本発明のキメラPIVの中に組み込むための有用な候補の代表例である（各々参照により本明細書に合体されるAnderson等の論文、J.Infect.Dis.151:626〜633,1985;Coelingh等の論文、J.Virol.63:375〜382,1989;Fennerらの論文、Scand.J.Immunol.24:335〜340,1986;Fernie等の論文、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.171:266〜271,1982;Satoらの論文、J.Gen.Virol.66:1397〜1409,1985;Walsh等の論文、J.Gen.Virol.67:505〜513,1986;Olmsted等の論文、J.Virol.63:411〜420,1989もまた参照されたい）。
【０１８５】
非相同のPIVおよび非PIV病原体の抗原決定基を発現するために本発明は、ウシのPIV（BPIV）ベクターを含む多くのヒトまたは非ヒトPIVベクターを提供する。これらのベクターは、非相同の抗原決定基を運ぶために、また非相同の病原体およびPIVベクターに抗する、体液または細胞が仲介する１もしくは複数の特異的免疫応答を誘発するために本明細書に記載した組換え法により容易に修飾される。典型的な実施形態においては、ドナーの病原体由来の１もしくは複数の非相同の遺伝子またはゲノムセグメントを、HPIV3ベクターのゲノムまたはアンチゲノムと組み合わせる。
【０１８６】
別の典型的な実施形態においては、非相同の遺伝子またはゲノムセグメントを、キメラHPIVベクターのゲノムまたはアンチゲノム、例えばそれらの対の片方のHPIV3のHNおよび／またはＦ遺伝子で置換したHNおよびＦ糖タンパク質をコード化する一方または両方のHPIV1遺伝子を有するキメラHPIV3-1ベクターのゲノムまたはアンチゲノムの中に取り込む。より詳細な実施形態においては、麻疹ウィルスのHA遺伝子のオープン読み枠（ORF）を含む転写単位を、さまざまな位置でHPIV3ベクターのゲノムまたはアンチゲノムに付加し、典型的なキメラPIV／麻疹ワクチンの候補のrPIV3（HA HN-L）、rPIV3（HA N-P）、rcp45L（HA N-P）、rPIV3（HA P-M）、またはrcp45L（HA P-M）が産生する。別法では、ワクチンに使用するためのキメラPIVは、HPIV2の１もしくは複数の抗原決定基、例えばHPIV2のHN遺伝子をキメラHPIV3-1ベクターのゲノムまたはアンチゲノムの中に取り込むことができる。
【０１８７】
本発明の別の詳細な実施形態においては、感染性の弱毒化したワクチンの候補を製造するために呼吸合胞体層ウィルス（RSV）由来の防御抗原をコード化する非相同のヌクレオチド配列を取り込むキメラPIVを設計する。RSVのcDNAのクローニングおよびその他の開示は下記資料中で提供される。1995年９月27日出願の米国特許仮出願第60/007,083号；1996年９月27日出願の米国特許出願第08/720,132号；1996年７月15日出願の米国特許仮出願第60/021,773号；1997年５月９日出願の米国特許仮出願第60/046,141号；1997年５月23出願の米国特許仮出願第60/047,634号；1997年７月15日出願の米国特許出願第08/892,403号（国際公開第98/02530号に対応）；1999年４月13日出願の米国特許出願第09/291,894号；2000年４月12日出願の国際公開第PCT/US00/09696号（1999年４月13出願の米国特許仮出願第60/129,006号に対応）；
【０１８８】
collins等の論文、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.92:11563〜11567,1995;Bukreyev等の論文、J.Virol.70:6634〜41,1996;Juhasz等の論文、J.Virol.71:5814〜5819,1997;Durbin等の論文、Virology 235:323〜332,1997;He等の論文、Virology 237:249〜260,1997;Baron等の論文、J.Virol.71:1265〜1271,1997;Whitehead等の論文、Virology 247:232〜9,1998a;Whitehead等の論文、J.Virol.72:4467〜4471,1998b;Jin等の論文、Virology 251:206〜214,1998;Whitehead等の論文、J.Virol.73:3438〜3442,1999;Bukreyev等の論文、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.96:2367〜72,1999（この各々はあらゆる目的のためにその全文が参照により本明細書に合体される）。本明細書中に組み込まれ、または述べられたその他の報告書および考察は、本発明の中で有用なRSVの抗原決定基を同定し特徴づけている。
【０１８９】
1つまたは複数のRSV抗原決定基を取り込んでいるPIVキメラは、好ましくは、抗原性RSV糖タンパク、タンパクドメイン（例えば、糖タンパク・エクトドメイン（ectodomain))あるいは1つまたは複数の免疫原性エピトープをコードする異種遺伝子またはゲノムセグメントを有するヒトPIV（例えば、HPIV1、HPIV2、HPIV3）ベクターゲノムまたはアンチゲノムを含んでなる。ある実施様態において、RSV Fおよび／またはＧ遺伝子から得た1つまたは複数の遺伝子またはゲノムセグメントは、前記ベクターゲノムまたはアンチゲノムと組み合わされて、キメラPIVワクチン候補物を形成する。これらのコンストラクトのあるものは、キメラタンパク質、例えばRSVのエクトドメインと融合した細胞質テールおよび／または膜内外ドメインを有する融合タンパクを発現し、PIVとRSVの両方に多価免疫反応を引き出す新規の弱毒ウイルスを生ずる。
【０１９０】
上述のとおり、弱毒化を増減する追加の突然変異を導入することによりワクチン用のキメラPIVの表現型を調整するか、もしくはキメラウイルスの表現型を変えるのが望ましいことが多い。cDNAから組み換え型PIVを作るための材料および方法ならびに本発明の補足的な態様として本願に示したさまざまな突然変異体およびヌクレオチド修飾を作り試験するための材料および方法の詳細な記載は、例えば、Dubrin et al.,Virology,235:323-332,1997;1998年５月22日に出願された米国特許出願番号第09/083,793号；1999年12月10日に出願された米国特許出願番号第09/458,813号；1999年12月10日に出願された米国特許出願番号第09/459,062号；1997年５月23日に出願された米国仮特許出願番号第60/047,575号（国際公開WO98/53078に相当する）；および1997年９月19日に出願された米国仮特許出願番号第60/059,385号に提供されており、これらのそれぞれは参照により本願に組み込まれる。
【０１９１】
特にこれらの文書は、弱毒化突然変異株（例えば、温度敏感（ts）、低温継代（cp）、低温適応（ad）、小プラーク（sp）および宿主範囲制限（hr）突然変異株）を得るためにPIVに突然変異を起こし、単離し、特徴を調べる方法および手順を記載しており、弱毒表現型を規定する遺伝子的変化を決定する方法および手順も記載している。これらの方法と関連して、上記の文書は、ネズミおよび非ヒト霊長類モデルシステムを含む許容されたモデルシステム中で、生物学的に誘導され組み換え技術により作られた弱毒ヒトPIVの複製、免疫原性、遺伝的安定性および保護効能を決定するための手順を詳述している。
【０１９２】
さらに、これらの文書は、PIV感染を予防し治療するための一価および二価ワクチンを含む免疫原性組成物を開発し試験するための一般的方法を記載している。必須なPIVタンパク質とともに発現されたPIVゲノムまたはアンチゲノムをコードするcDNAの構築および発現により、感染性組み換え型PIVを作る方法も上記に組み込まれた文書に記載されており、それらは感染性PIVクローンを作るために利用できる以下の例示的なプラスミド：p3/7（131)(ATCC97990）；p3/7（131）2G（ATCC97889）；およびp218（131)(ATCC97991）の記載を含んでいるが、これらはそれぞれブタペスト条約の条項に従い米国バージニア州20110-2209、マナッサス、ブルヴァール大学10801のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託されたものであり上記の確認済み受託番号が与えられた。
【０１９３】
上記で組み込まれた参考文献には、生物学的に誘導されたPIV突然変異体、例えば低温継代（cp）、低温適応（ad）、宿主範囲制限（hr）、小プラーク（sp）および／または温度敏感（ts）突然変異株、例えばJS HPIV3 cp45突然変異株において確認された表現型に特異な突然変異を取り入れるために修飾された感染性組み換え型PIVを構築し評価するための方法も開示されている。これらの突然変異体に確認された突然変異は、本発明のキメラPIVに容易に取り込むことができる。
【０１９４】
例示的な実施様態において、1つまたは複数の弱毒化突然変異はポリメラーゼＬプロテイン、例えばJS cp45のTyr942、Leu992またはThr1558に対応する位置で起こる。これらの突然変異は、生物学的突然変異体に確認されたのと同一のまたは保存的なアミノ酸置換により本発明のキメラPIVに取り込まれるのが好ましい。より詳細な態様において、ワクチン用のキメラPIVは、Tyr942がHisに、Leu992がPheに、および／またはThr1558がIleに置換された突然変異を1つまたは複数取り込んでいる。
【０１９５】
これらのアミノ酸置換に保存的な置換は、キメラワクチン候補物において望ましい弱毒化を達成するのに有用でもある。HPIV3 JS cp45株は、ブタペスト条約の条項に従い特許寄託指定PTA-2419の米国バージニア州20110-2209、マナッサス、ブルヴァール大学10801のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託されている。
【０１９６】
生物学的に誘導されたPIV突然変異体から得たキメラPIVに採用できる他の例示的な突然変異には、JS cp45の残基Val96またはSer389に対応する位置での特定の突然変異を含む、Ｎタンパク中の1つまたは複数の突然変異がある。より詳細な態様において、これらの突然変異は、Val96からAlaへまたはSer389からAlaへあるいはこれらに保存的な置換として示される。本発明のキメラPIVでやはり有用であるのが、Ｃタンパク中のアミノ酸置換、例えば、JS cp45のIle96に対応する位置での突然変異であり、好ましくはIle96からThrへの同一または保存的置換により表される。
【０１９７】
生物学的に誘導されたPIV突然変異体から採用できるさらなる例示的突然変異としては、JS cp45の残基Ile420またはAla450に対応する位置でのJS cp45から採用される突然変異を含む、Ｆタンパク中での1つまたは複数の突然変異があり、好ましくは、Ile420からValへのまたはAla450からThrへのアミノ酸置換あるいはそれと保存的な置換により示される。あるいはまたはさらには、本発明のキメラPIVは、JS cp45の残基Val384に対応する位置での突然変異を例とする、NHタンパク中のアミノ酸置換を1つまたは複数採用でき、好ましくはVal384からAlaへの置換により示される。
【０１９８】
本発明のさらに追加的な実施様態は、弱毒化などの望ましい表現型の変化を規定する、PIVゲノムまたはアンチゲノムの暗号とならない部分、例えば３’リーダー配列における1つまたは複数の突然変異を取り込むキメラPIVを含む。この意味での例示的な突然変異は、JS cp45のヌクレオチド23、24、28または45に対応する位置でのキメラウイルスの３’リーダー中の位置で実行することができる。
【０１９９】
さらに追加の例示的な突然変異は、Ｎ遺伝子開始配列において、例えばJS cp45のヌクレオチド62に対応する位置で、例えばＮ遺伝子開始配列中の1つまたは複数のヌクレオチドを変更することにより実行することができる。より詳細な態様において、キメラPIVは、ヌクレオチド23でのＴからＣへの変化、ヌクレオチド24でのＣからＴへの変化、ヌクレオチド28でのＧからＴへの変化および／またはヌクレオチド45でのＴからＡへの変化を取り込んでいる。遺伝子外配列における追加の突然変異は、JSのヌクレオチド62に対応する位置でのＮ遺伝子開始配列におけるＡからＴへの変化により例示される。
【０２００】
本発明のキメラPIVに実行できる上記の例示的な突然変異は、rcp45、rcp45L、rcp45F、rcp45M、rcp45HN、rcp45C、rcp45F、rcp45 3’N、rcp3’NLおよびrcp45 3’NCMFHNと称される組み換え型PIVクローン（Dubrin et al.,Virology,235:323-332,1997;Skiadopoulos et al.,J.Virol.72:1762-1768,1998;Skiadopoulos et al.,J.Virol.73:1374-1381,1999;1998年５月22日に出願された米国特許出願番号第09/083,793号；1999年12月10日に出願された米国特許出願番号第09/458,813号；1999年12月10日に出願された米国特許出願番号第09/459,062号；1997年５月23日に出願された米国仮特許出願番号第60/047,575号（国際公開WO98/53078に相当する）；および1997年９月19日に出願された米国仮特許出願番号第60/059,385号、これらはそれぞれ参照により本願に組み込まれている）により示されるとおり、組み換え型PIV中にうまく実行され回復されてきた。
【０２０１】
さらに、上記に組み込まれた参考文献は、例えばHPIV1のHNおよびＦ遺伝子が部分的なHPIV3バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中に置換され、HPIV3 JS cp45に確認された弱毒化突然変異を1つまたは複数持つようにさらに修飾されているキメラPIV組み換え型の構築を記載している。そのようなキメラ組み換え体の1つは、cp45のＬ遺伝子に確認された弱毒化突然変異を全て取り入れている。異種（HPIV1）HNおよびＦ遺伝子の外側のcp45突然変異は全てHPIV3-1組み換え体に取り込まれ、弱毒化キメラワクチン候補物を与えられることが示された。
【０２０２】
JS cp45および生物学的に誘導された他のPIV突然変異体から、弱毒化突然変異の膨大な「メニュー」が提供され、そのそれぞれは本発明のキメラPIVにおける弱毒化、免疫原性および遺伝的安定性のレベルを調整するために他のいかなる突然変異とも組み合わせることができる。この意味で多くのキメラPIVは、生物学的に誘導されたPIV突然変異体からの突然変異、例えばJS cp45に確認された突然変異のいずれかまたはそれらの組合せからの突然変異を1つまたは複数、好ましくは２つ以上含む。本発明の中の好ましいキメラPIVは、JS cp45または生物学的に誘導されたPIV突然変異株に存在する突然変異を複数または全数取り込む。これらの突然変異は、各突然変異を規定するコドン中の多重ヌクレオチド置換によりキメラPIV中の復帰突然変異に対して安定化されている。
【０２０３】
本発明のキメラPIVに取り入れることができるさらに追加的な突然変異は、例えば、異種PIVまたは他の非区分負鎖RNAウイルスに確認される弱毒化突然変異などの突然変異である。特にある負鎖RNAウイルス中に確認される弱毒化および他の望ましい突然変異は「転移」、例えば、キメラPIVのゲノムまたはアンチゲノム内の対応する位置にコピーされることがある。簡単にいうと、ある異種負鎖RNAウイルス中の望ましい突然変異は、キメラPIVレシピエント（ベクターゲノムまたはアンチゲノム中あるいは異種ドナーゲノムまたはゲノムセグメント中）に転移される。
【０２０４】
これは、参照により本願に組み込まれた1999年４月13日に出願された米国仮特許出願番号第60/129,006号に相当する2000年４月12日に出願された国際出願番号PCT/US00/09695に記載のとおり、異種突然変異ウイルス中の突然変異をマッピングし、通常の配列アラインメントによりレシピエントPIV中の対応するサイトを特定し、PIVレシピエント中の天然配列を（同一または保存的突然変異により）突然変異遺伝子型に変化させるものである。
【０２０５】
この開示が教示するとおり、レシピエントキメラPIVゲノムまたはアンチゲノムを修飾して、異種突然変異ウイルスに確認された変更と保存的に対応する突然変異の問題サイトでの変更をコードすることが好ましい。例えば、アミノ酸置換が、対応する野生型配列と比較して突然変異体ウイルス中で突然変異サイトをマークする場合、類似の置換が組み換え型ウイルス中の対応する残基で実行されることもある。置換が、突然変異ウイルスタンパク中に存在する置換残基に同一または保存的であるアミノ酸を規定することが好ましい。
【０２０６】
しかし、突然変異体タンパク中の置換残基に対して（他のアミノ酸を用いて野生型残基の機能を混乱または損なうことにより）突然変異のサイトで非保存的に天然アミノ酸残基を変更することも可能である。例示的突然変異が確認され本発明の組み換え型PIVに転移する元の負鎖RNAウイルスには、とりわけ、他のPIV（例えばHPIV1、HPIV2、HPIV3、BPIVおよびMPIV）、RSV、センダイウイルス（SeV）、ニューカッスル病ウイルス（NDV）、シミアンウイルス５（SV5）、麻疹ウイルス（MeV）、牛疫ウイルス、イヌジステンパーウイルス（CDV）、狂犬病ウイルス（RaV）および水疱性口内炎ウイルス（VSV）がある。
【０２０７】
HPIV3 Lタンパクの位置456におけるフェニルアラニン（または保存的に関連するアミノ酸）の置換に対応しそのためそれに転移可能なRSV Lタンパクの位置521におけるフェニルアラニンのアミノ酸置換を含むが、これに限定されないさまざまな例示的突然変異が開示される。欠失または挿入によりマークされる突然変異の場合、これらは対応する欠失または挿入として組み換え型ウイルスに導入されることができるが、欠失または挿入されたタンパクフラグメントの大きさおよびアミノ酸配列は異なることがある。
【０２０８】
本発明のキメラPIV内に取り込むための生物学的に誘導されたPIVおよび他の非区分負鎖RNAウイルスにおける弱毒化突然変異は自然に起こることもあるが、公知の突然変異誘発方法により野生型PIV株に導入することもできる。例えば、上記に組み込まれた参考文献に記載のとおり、成長制限突然変異を導入するために最適状態に及ばない温度で継代したウイルスを選択することにより、または細胞培養中に小さなプラーク（sp）を作る突然変異ウイルスを選択することにより、不完全に弱毒化された親PIV株を、化学的突然変異誘発物質が添加された細胞培養中でウイルス成長の間化学的突然変異誘発により作ることができる。
【０２０９】
「生物学的に誘導されたPIV」とは、組み換え手段により作られたのではない、いかなるPIVをも意味する。したがって、生物学的に誘導されたPIVは、例えば野生型ゲノム配列を有する天然にみられるPIVおよび基準野生型PIV配列からの対立または突然変異ゲノム変化を有するPIV、例えば弱毒化表現型を規定する突然変異を有するPIVをはじめとする、天然にみられる全てのPIVを含む。同様に、生物学的に誘導されたPIVは、親PIVから、とりわけ人工突然変異誘発および選抜法により誘導されたPIV突然変異体を含む。
【０２１０】
上述のとおり、十分に弱毒化された生物学的に誘導されたPIV突然変異体の製造は、いくつかの公知の方法により達成できる。そのような方法の1つは、部分的に弱毒化されたウイルスを段々に低くなる温度において細胞培養中で継代するものである。例えば、部分的に弱毒化された突然変異体は最適状態に及ばない温度において細胞培養中で継代により製造される。したがって、cp突然変異体または他の部分的に弱毒化されたPIV株は、培養中での継代により、より低温での効率的な成長に適応している。低温継代中の突然変異体PIVのこの選択は、部分的に弱毒化された親に比較して派生的な株における残存毒性を著しく低減する。
【０２１１】
あるいは、部分的に弱毒化された親ウイルスを化学的突然変異誘発物質に曝して、例えばts突然変異を導入し、また既にtsであるウイルスの場合弱毒化派生物のts表現型の増加した弱毒性および／または安定性を与えるに十分な追加のts突然変異を導入することで、生物学的に誘導されたPIVに特定の突然変異を導入することができる。PIVへのts突然変異の導入手段には、一般的に知られている手順による５−フルオロウリジンなどの突然変異誘発物質の存在下におけるウイルスの複製がある。
【０２１２】
他の化学的突然変異誘発物質を用いてもよい。弱毒化はほとんど全てのPIV遺伝子中のts突然変異に起因するが、この目的のために特に影響を受けやすい目標がポリメラーゼ（Ｌ）遺伝子であると分かっている。本発明の中で用いるための例示的な弱毒化PIVにおいて複製の温度に対する感受性のレベルは、任意の温度での複製をいくつかの制限的な温度での複製と比較することにより決定される。任意の温度での複製に比較し、ウイルスの複製が100分の１またはそれ以下に減少する最低温度をシャットオフ温度という。実験動物およびヒトにおいて、PIVの複製および毒性は、突然変異体のシャットオフ温度に相関関係がある。
【０２１３】
JS cp45 HPIV3突然変異体は、遺伝的に比較的安定であり、免疫原性が高く、満足のいく程度まで弱毒化されると分かっている。この生物学的に誘導されたウイルスおよびそれに見出されるさまざまな突然変異を、個別または組合わせて取り入れた組み換え型ウイルスのヌクレオチド配列分析により、増加した弱毒化の各レベルが、特定のヌクレオチドおよびアミノ酸置換に関連することが示されている。上記の組み込まれた参考文献は、突然変異を別々にまたはさまざまな組合せで感染性PIVクローンのゲノムまたはアンチゲノム中に導入することにより、偶然の沈黙突然変異と表現型の違いの元となる突然変異との区別を定型的に行う方法も開示している。
【０２１４】
親および派生ウイルスの表現型特性の評価と組み合わせたこの方法は、弱毒化、温度感受性、低温適応、小プラークサイズ、宿主範囲制限などの望ましい特性の元となる突然変異を特定する。
このように特定された突然変異は「メニュー」中に編集され、希望どおりに単独でまたは組み合わせて導入され、本発明のキメラPIVを、適切なレベルの弱毒化、免疫原性、弱毒化表現型からの復帰突然変異に対する遺伝的耐性に希望どおりに調整する。上記の記述に従い、cDNAから感染性PIVを製造する能力により、キメラPIV中で実行された特定の変化が導入される。
【０２１５】
特に、感染性組み換え型PIVは、生物学的に誘導された弱毒化PIV株における特定の突然変異、例えばts、ca、attおよび他の表現型を規定する突然変異を確認するのに用いられる。望ましい突然変異は、このように確認されキメラPIVワクチン株に導入される。cDNAからウイルスを製造する能力により、これらの突然変異を個別またはさまざまな選択された組合せで全長cDNAクローンに定型的に取り入れることができ、その後導入された突然変異を含む救出された組み換え型ウイルスの表現型が容易に決定できる。
【０２１６】
望ましい表現型、例えばcpまたはts表現型に関連する特定の突然変異を規定し感染性キメラPIVクローン中に取り入れることにより、本発明は、特定された突然変異に、またはそれに極めて接近して他のサイト特異性修飾を提供する。生物学的に誘導されたPIV中に作られた弱毒化突然変異のほとんどは単一のヌクレオチド変化であるが、他の「サイト特異性」突然変異も組み換え技術によりキメラPIVに取り込むことができる。本願で用いるサイト特異性突然変異には、１から３の、約５〜15またはそれ以上の（例えば野生型PIV配列から、選択されたPIV突然変異株から、または突然変異誘発物質に曝された親組み換えPIVクローンから）変化したヌクレオチドの挿入、置換、欠失または再配列が含まれる。
【０２１７】
そのようなサイト特異性突然変異は、選択された生物学的に誘導された点突然変異で、またはその領域内で取り込まれることがある。あるいは、突然変異はPIVクローン内の他のさまざまな状況で、例えばタンパク活性部位、結合部位、免疫原性エピトープなどをコードするシス作用性調節配列またはヌクレオチド配列で、またはその近くで導入されうる。サイト特異性PIV突然変異体は所望の弱毒化表現型を有するのが典型的であるが、弱毒化と関係のない変化した表現型特性、例えば向上または広範囲になった免疫原性および／または改善された成長をさらに示すこともある。
【０２１８】
望ましいサイト特異性突然変異体のさらなる例は、弱毒化点突然変異を規定するコドン中で追加の安定化ヌクレオチド突然変異を取り込むように設計された組み換え型PIVである。可能な場合、２つ以上のヌクレオチド置換が、親突然変異体または組み換え型PIVクローン中で弱毒化アミノ酸変化を規定するコドンにおいて導入され、弱毒化表現型からの復帰突然変異に対する遺伝的耐性が強くなったPIVを生じる。他の実施様態において、サイト特異性ヌクレオチド置換、追加、欠失または再配列は、上流（Ｎ末端方向）または下流（Ｃ末端方向）で、例えば標的ヌクレオチド位置に対して１〜３、５〜10および15ヌクレオチドまたはそれ以上５’または３’で導入され、例えば既存のシス作用性調節要素を構築または除去する。
【０２１９】
１または多数の点突然変異およびサイト特異性突然変異に加え、本願で開示されるキメラPIVへの変化は、1つまたは複数の遺伝子またはゲノムセグメントの欠失、挿入、置換または再配列を含む。1つまたは複数の遺伝子またはゲノムセグメントが関連する欠失が特に有用であり、そのような欠失が追加の望ましい表現型効果を生み出すことが示されてきた。
【０２２０】
したがって、参照により本願に組み込まれる1999年７月９日にDurbinらにより出願された米国特許出願番号第09/350,821号は、PIVゲノムまたはアンチゲノムを修飾して開始コドンのコード指定を変更する突然変異または1つまたは複数の終止コドンを導入する突然変異を取り入れることにより、1つまたは複数のHPIV遺伝子、例えば1つまたは複数のＣ，Ｄおよび／またはV ORFの発現が低減または除去される方法および組成物を記載している。あるいは、1つまたは複数のＣ，Ｄおよび／またはV ORFを完全または部分的に消して、対応するタンパクを部分的または完全に機能しないようにするか、タンパク発現を完全に阻害することもできる。
【０２２１】
Ｃ，Ｄおよび／またはＶあるいは他の必須でない遺伝子にそのような突然変異を有するキメラPIVは、ワクチン開発に極めて望ましい表現型特性を有する。例えば、これらの修飾は、（ｉ）細胞培養での変化した成長特性、（ii）哺乳類の上部および／または下部気道での弱毒化、（iii）ウイルスプラークサイズの変化、（iv）細胞変性効果の変化および（ｖ）免疫原性の変化を含む1つまたは複数の望ましい表現型変化を規定する。γC-KOと称される、C ORF発現を欠く例示的な「ノックアウト」突然変異体PIVは、その有益な弱毒化表現型にも関わらず、非ヒト霊長類モデルにおいて野生型HPIV3の攻撃に対して保護免疫反応を引き起こすことができた。
【０２２２】
したがって、本発明のより詳細な態様において、キメラPIVはＣ，Ｄおよび／またはV ORFあるいは選択された遺伝子またはゲノムセグメントの発現を変化または除去する他の必須でない遺伝子に欠失またはノックアウト突然変異を取り入れている。これは、例えば、選択された暗号配列中にフレームシフト突然変異または終止コドンを導入し、翻訳開始サイトを変化させ、遺伝子の位置を変更しまたは上流開始コドンを導入して発現の速度を変化させ、GSおよび／またはGE転写シグナルを変えて表現型を変更し、RNA編集サイト（例えば、成長、転写に対する温度制限など）を修飾することにより達成できる。
【０２２３】
本発明のより詳細な態様において、例えば、翻訳オープンリーディングフレーム（ORF）中に多重翻訳終止コドンを導入し、開始コドンを変更し、または編集サイトを修飾することにより、遺伝子またはそのセグメントの欠失なしに、1つまたは複数の遺伝子、例えばＣ，Ｄおよび／またはV ORFの発現が翻訳または転写レベルで除去されているキメラPIVが提供される。ノックアウトウイルスのこのような形態は、細胞培養において低減された成長速度および小さいプラークサイズを示すことが多い。
【０２２４】
したがって、これらの方法は、主なウイルス感染防御抗原の1つではないウイルス遺伝子の発現を除去する、追加の新規タイプの弱毒化突然変異を提供する。この意味で、遺伝子またはゲノムセグメントの欠失なしに作られたノックアウトウイルス表現型は、別法としては、欠失突然変異誘発により、上述のとおり標的タンパクの合成を回復する可能性がある修正突然変異を効果的に排除することにより作ることができる。他のいくつかのＣ，Ｄおよび／またはV ORF欠失の遺伝子ノックアウトおよびノックアウト突然変異体は、当業界に公知の他のデザインおよび方法を用いて作ることができる（上述のとおり、例えば、Kretschmer et al.,Virology,216:309-316,1996;Radecke et al.,Virology,217:418-421,1996;Kato et al.,EMBO J.16:578-587,1987;and Schneider et al.,Virology,277:314-322,1996、それぞれ参照により本願に組み込まれる）。
【０２２５】
本発明のキメラPIVコンストラクトに導入されるヌクレオチド修飾は、ベクターゲノムまたはアンチゲノムあるいは異種ドナー遺伝子またはゲノムセグメント中で、変化の性質に応じて（すなわち免疫原性エピトープを挿入または除去しあるいは小さなゲノムセグメントを変化させるのには少数の塩基が変化するのに対し、遺伝子または大きなゲノムセグメントが加わり、置換、欠失、再配列されるとき、大きなブロックの塩基が関与する）、少数の塩基（例えば、15〜30塩基、35〜50塩基までまたはそれ以上）、大きなブロックのヌクレオチド（例えば50〜100、100〜300、300〜500、500〜1,000塩基）またはほとんど完全なまたは完全な遺伝子（例えば1,000〜1,500ヌクレオチド、1,500〜2,500ヌクレオチド、2,500〜5,000ヌクレオチド、5,00〜6,5000ヌクレオチドまたはそれ以上）を変更することがある。
【０２２６】
関連した態様において、本発明は、さらに修飾されたPIVクローン中の同じまたは異なる遺伝子が関与する突然変異の追加タイプとともに、生物学的に誘導されたPIVからキメラPIVクローン中に採用された突然変異、例えばcpおよびts突然変異の補足を提供する。PIV遺伝子のそれぞれは、完全にまたは部分的に、単独または他の望ましい修飾と組み合わされて、発現レベルの点で選択的に変化され、加えられ、欠失、置換または再配列されて、新規ワクチン特性を示すキメラPIVを生じることができる。したがって、生物学的に誘導されたPIV突然変異体から採用される弱毒化突然変異に加えてまたはそれと組み合わせて、本発明は、感染性PIVクローンの組み換え技術に基づいて、キメラPIVの表現型を弱毒化または修飾するためのある範囲の追加方法も提供する。
【０２２７】
感染性クローン中に取り入れるためのキメラPIVゲノムまたはアンチゲノム中のドナーまたはレシピエント遺伝子またはゲノムセグメントを含む、標的遺伝子またはゲノムセグメントをコードする孤立したポリヌクレオチド配列中にさまざまな変更を作ることができる。より詳細には、組み換え型PIV中に望ましい構造的および表現型の変化を達成するために、親ゲノムまたはアンチゲノムから選択されたヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を削除、置換、導入または再配列する突然変異の導入ならびにキメラPIVクローン中の全遺伝子またはゲノムセグメントを削除、置換、導入または再配列する突然変異の導入を本発明は考慮している。
【０２２８】
したがって、例えば、選択されたPIV暗号配列中に終止コドンを導入または翻訳開始サイトまたはRNA編集サイトを変更し、操作可能に結合しているプロモーターに対しPIV遺伝子の位置を変化させ、上流開始コドンを導入して発現の速度を変更し、GSおよび／またはGE転写シグナルを修飾して（位置を変え、既存の配列を変更し、既存の配列を異種配列と置換することにより）表現型（例えば、成長、転写に対する温度制限など）およびウイルス複製、選択された遺伝子の転写または選択されたタンパクの翻訳における定量的または定性的変化を規定するさまざまな他の欠失、置換、追加および再配列を変更することにより、選択された遺伝子の発現を単に変更または除去する本発明のキメラPIVにおける修飾が提供される。
【０２２９】
この点で、成長に必須ではないPIV遺伝子またはゲノムセグメントはいかなるものでも、除去または組み換え型PIV中で修飾され、毒性、病原性、免疫原性および他の表現型特性に望ましい影響を生じさせることができる。暗号配列に関しては、暗号とならない、リーダー、トレイラーおよび遺伝子間領域は同様に欠失、置換または修飾され、それらの表現型効果は例えばミニレプリコンおよび組み換え型PIVの使用により容易に分析される。
【０２３０】
さらに、さまざまな他の遺伝的変更が、単独または生物学的に誘導された突然変異体PIVから採用された1つまたは複数の弱毒化突然変異とともに、例えば成長、弱毒化、免疫原性、遺伝的安定性を調整し他の有利な構造的および／または表現型効果を提供するために、キメラPIVに取り込むためのPIVゲノムまたはアンチゲノム中に作られる。これらの突然変異の追加タイプは、上記に組み込まれた参考文献中に開示されており、本発明のキメラPIV中に容易に実行することができる。例えば、制限サイトマーカーをキメラPIV中に定型的に導入して、cDNA構築および操作を用意にすることができる。
【０２３１】
これらの変化に加え、キメラPIVコンストラクト中の遺伝子の順序を変更でき、PIVゲノムプロモーターがそのアンチゲノム対応物と置換され、遺伝子の一部が除去または置換され、遺伝子全体が除去されている。配列中の異なるまたは追加の修飾が作られて、さまざまな遺伝子間領域または他の場所における独特の制限サイトの挿入などの操作を容易にできる。翻訳されない遺伝子配列は、外来の配列を挿入するためのキャパシティーを増すために除かれる。
【０２３２】
本発明のキメラPIV構成体中に取り込む他の突然変異には、例えば、PIVミニゲノムの突然変異分析により容易に識別することができるシス動作信号を目指す突然変異が含まれる。例えば、初端部および終端部および側面部配列の挿入および欠失分析は、ウイルス性プロモーターおよび転写信号を識別し、RNA複製または転写の減数分裂の異なる段階に関係する一連の突然変異をもたらす。
【０２３３】
これらのシス動作信号の飽和突然変異誘発（それにより、各位置が順にヌクレオチド代替のそれに変性される）も、RNA複製または転写に影響を及ぼす多くの突然変異を識別してきた。これらのあらゆる突然変異は、本明細書に記載されるように、キメラPIVアンチゲノムまたはゲノム中に挿入することができる。完全なアンチゲノムcDNAを用いるトランス動作蛋白質およびシス動作RNA配列の評価および調節は、上述の参考文献中に記載されているように、PIVミニゲノムの使用により支援される。
【０２３４】
本発明のキメラPIVs内での添加突然変異は、RNAの複製および転写の変化に関係するゲノム３’末端の、アンチゲノムからのその同等物との置換をも含むことが可能である。一つの代表的な実施形態において、保護HNおよび／またはＦ抗原などの特定PIV蛋白質発現のレベルは、本来の配列を、合成的に作成され効率の良い翻訳に合致するように設計されてきた配列に置換することにより増大しうる。これに関連して、コドン使用は、哺乳動物のウイルス性蛋白質翻訳のレベルにおいて、主要な要因でありえることが示されてきた（Haas et al.,Current Biol.6:315〜324,1996、本明細書に参考として包含する）。PIVのHNおよびＦ蛋白質を符号化するmRNAsのコドン使用の組替え型手法による最適化は、これら遺伝子に対して改善された発現をもたらす。
【０２３５】
別の代表的な実施形態において、選択されたPIV遺伝子の翻訳の出発部位（好ましくは−３位のヌクレオチドを含む）を取り巻く配列は、単独か、または上流の出発コドンの導入と組み合わせて変成されて、翻訳の上への、または下への調節を指定することにより、PIV遺伝子発現を調整する。あるいは、または本明細書において開示された他の組替え型の変成と組み合わせて、ウイルスのあらゆる選択された遺伝子の転写のGSまたはGE信号を変更することにより、キメラPIVの遺伝子発現を調整することが可能である。
【０２３６】
代わりの実施形態において、キメラPIVワクチン候補中の遺伝子発現のレベルは、転写のレベルで変更される。一つの態様において、PIV遺伝地図の中で選択された遺伝子の位置は、さらにプロモーター基部か、またはプロモーター末端位置に変えることが可能であり、それにより、遺伝子は、それぞれ多少は効率良く発現される。
【０２３７】
この態様によれば、特定の遺伝子に対する発現の調整を行って、多くの場合相反する位置にある置換遺伝子に対して対応する発現レベルの減少を伴う野性型のレベルに較べて、２倍、さらに一般的に４倍、10倍まで、またはそれ以上の、遺伝子発現の減少または増加を生み出すことが可能である。これらの、および他の転移変化は、例えば、RNA複製に組み込まれる選択されたウイルス性蛋白質の減少した発現による弱毒化された表現型を有するか、または増大した抗原発現などの他の望ましい特性を有する新規のキメラPIVベクターを生み出す。
【０２３８】
他の実施形態において、ワクチン配合物に有用なキメラPIVsは、好都合に変成されて、循環ウイルスの中で抗原流を供給することができる。一般に、変成はHNおよび／またはＦ蛋白質において存在する。一つのPIV系統またはグループから、それらの特定の免疫性領域を符号化する全体HNまたはＦ遺伝子、またはゲノムセグメントは、異なるPIV系統またはグループの受容体クローン中の対応領域の置き換えにより、または多抗原形態が表現されるように１個以上の遺伝子の複製を添加することにより、キメラPIVゲノムまたはアンチゲノムcDNA中に取り込まれる。その後、変成PIVクローンから生成された子孫ウイルスは、新生するPIV系統に対するワクチン予防接種プロトコルに用いることが可能である。
【０２３９】
ヒトPIV符号化配列または非符号化配列（例えば、プロモーター、遺伝子末端、遺伝子出発端、遺伝子間または他のシス動作要素）の、異種同等物との置換は、多種の可能な弱毒化および他の表現型効果を有するキメラPIVを生み出す。例えば、生物学的に双方向のヒトPIV配列または蛋白質（すなわち、通常ウイルスの転写、翻訳、組立てなどのために置換された、配列または蛋白質と協力する配列または蛋白質）との、異種配列または蛋白質の不適合からヒト細胞中において、またはさらに一般に、許容性および許容性の小さい宿主の間で異なる細胞蛋白質、またはいくつかの他の細胞環境の態様を持つ宿主範囲限定において、ウシまたはネズミの遺伝子が効率的に機能しない、ヒトPIVバックグラウンド内に移入された、ウシPIV（BPIV）またはネズミPIV（MPIV）の蛋白質、蛋白質領域、遺伝子またはゲノムセグメントを置換することにより、特に、宿主範囲および他の望ましい効果は生じる。
【０２４０】
代表的な実施形態において、ウシPIV配列は、ウシおよびヒトPIV構造および機能の知られた態様に基づき、ヒトPIV中への導入に対して選択される。
【０２４１】
さらに詳細な態様において、本発明は、HPIVおよび非ヒトPIV、例えば、HPIV3およびBPIV3（例えば、Schmidtらによる2000年６月１日付、米国特許出願第09/586,479号、SchmidtらのJ.Virol.74:8922〜9、2000に開示されているように、それぞれは本明細書において参考として包含した）間のさらなる詳細なキメラの構造に基づき、キメラPIVワクチン候補を弱毒化するための方法を提供する。この弱毒化の方法は、非ヒトPIVの１個以上の遺伝子またはゲノムセグメントを、ヒトPIVベクターベースのキメラウイルス中に導入することによる宿主範囲効果に基づいている。
【０２４２】
例えば、宿主範囲の相違に現れるBPIVおよびHPIVs間には多数のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の違いがある。HPIV3およびBPIV3間で、それぞれ以下の蛋白質に対するアミノ酸％同一性は：Ｎ（86％）、Ｐ（65％）、Ｍ（93％）、Ｆ（83％）、HN（77％）、およびＬ（91％）である。宿主範囲の相違は、アカゲザル中のHPIV3の高度に許容できる成長を、同じ動物中のBPIV3二つの異なる系統の限定された複製と比較することによって代表される（van Wyke Coelingh et al.,J.Infect.Dis.157:655〜662,1988、本明細書に参考として包含する）。HPIV3およびBPIV3間の宿主範囲相違の基盤は決められようとして残っているが、恐らく、それらは１個より多い遺伝子および多数のアミノ酸の相違を含むであろう。
【０２４３】
それぞれ多アミノ酸またはヌクレオチドの相違を含む、多遺伝子およびできる限りシス動作を調節する配列の組み込みは、容易には復帰突然変異により変更されえない、弱毒化に対する非常に広い基盤を与える。これは、１点または数点の突然変異により弱毒化される他の生きている弱毒化HPIV3ウイルスによる状況とは異なっている。この場合に、あらゆる個々の突然変異の復帰は、有意な毒性の再獲得を生じ、または単独の残基のみが弱毒化を決める場合には、完全な毒性の再獲得を生じることが可能である。
【０２４４】
本発明の代表的な実施形態において、ベクターゲノムまたはアンチゲノムは、HPIV3ゲノムまたはアンチゲノムであり、異種の遺伝子またはゲノムセグメントは、あるいは、BPIV3のKaまたはSF系統（99％アミノ酸配列に関係している）から誘導されたNORFである。HPIV3バックグラウンドアンチゲノムのNORFは、新規の組替え型キメラPIVクローンを生み出す、同等物のBPIV3NORFにより置換される。
【０２４５】
HPIV3のHPIV3NORFの、BPIV3KaまたはSFのそれとの置換は、HPIV3Nのそれとは約70のアミノ酸の相違（組み込まれた系統に応じて決まる）を持つ蛋白質をもたらす。Ｎは一層保存された蛋白質の一つであり、Ｐなどの他蛋白質の、単独または組み合わせての置換は、より多くのアミノ酸の相違をもたらすであろう。それぞれ多アミノ酸またはヌクレオチドの相違を与える、多遺伝子およびゲノムセグメントの組み込みは、復帰突然変異に対して高度に安定である、弱毒化に対する広い基盤をもたらす。
弱毒化のこのモードは、個別の突然変異の復帰が有意な、または完全な毒性の再獲得を生じうる１点以上の突然変異により弱毒化されるHPIVワクチン候補に対して、鋭く対照をなす。加えて、HPIV中の数点の知られた弱毒化突然変異は、一般に、温度感受性表現型を生じる。温度感受性に関係する弱毒化に伴う一つの問題は、ウイルスが、上部呼吸気道において弱毒化されている一方で、下部呼吸気道において複製に対して過度に限定されうることである。これは、温度が下部呼吸気道においてより高い（およびより限定的な）、および上部呼吸気道においてより低い（より限定的でなく）温度で、呼吸気道内の温度勾配があることによる。
【０２４６】
上部呼吸気道において複製する弱毒化ウイルスの能力は、うっ血、鼻炎、熱および中膜耳炎を含む合併症をもたらしうる。よって、温度感受性突然変異により単独に達成される弱毒化は、理想的ではありえない場合がある。対照的に、本発明のキメラPIVに存在する宿主範囲突然変異は、殆どの場合に温度感受性を与えない。従って、これら種類の変更により提供されるPIV弱毒化の新規方法は、他の知られたPIVワクチン候補に較べ、遺伝子的におよび表現型的により安定であり、且つ上部呼吸気道において残留毒性との関係は殆どありそうもない。
【０２４７】
上に含めた参考文献は、KaおよびSF両方のHPIV3/BPIV3キメラ組替え体が生育可能であり、キメラ組替え体が試験管中の複製を限定する遺伝子不適合性を示さないことを表す、HPIV3の親またはBPIV3の親いずれかと同じように細胞培養において効率的に複製することを、開示している。試験管中のこの効率的な複製の特性は、それがこの生物学的製剤の効率的な製造を可能とするので、重要である。また、唯一のウシの遺伝子を含有する、KaおよびSFのHPIV3/BPIV3キメラ組替え体（cKaおよびcSFと呼ばれる）は、アカゲザルの呼吸気道中において、宿主範囲限定の程度は、それらのBPIV3親と殆ど同等である。
【０２４８】
特に、cKaおよびcSFウイルスは、アカゲザルの上部呼吸気道中における複製において、HPIV3の複製に較べて、それぞれ、約60倍または30倍の減少を示す。この発見に基づき、他のBPIV3遺伝子も、本発明のキメラPIV内で、宿主範囲限定の望ましいレベルを与えることが期待される。よって、本明細書の方法により、弱毒化決定基の一覧表は、BPIVおよび適切に組み合わせてワクチン使用のために選択されたキメラPIVに関する宿主範囲限定および免疫抗原性の望ましいレベルを与える他の非ヒトPIVsの異種遺伝子、およびゲノムセグメントに容易に識別される。
【０２４９】
本発明内のベクターとしての使用に対するキメラのヒト−ウシPIVは、ヒト−ウシキメラPIVゲノムまたはアンチゲノムを形成するために、異なるPIV系統またはサブグループウイルスの１個以上の異種遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わせた、ヒトまたはウシのPIV系統またはサブグループウイルスから誘導された、またはそれにならって作成された部分的な、または完全な「バックグラウンド」のPIVゲノムまたはアンチゲノムを含む。本発明の好ましい態様において、キメラPIVは、ウシPIVからの１個以上の異種遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わせた、部分的な、または完全なヒトPIVバックグラウンドのゲノムまたはアンチゲノムを組み込む。
【０２５０】
部分的な、または完全なバックグラウンドのゲノムまたはアンチゲノムは、一般に、同等物、ヒトまたはウシPIVの異種遺伝子またはゲノムセグメントが中に移入される、受容体バックボーンまたはベクターとして機能する。同等物、ヒトまたはウシPIVからの異種遺伝子またはゲノムセグメントは、バックグラウンドのゲノムまたはアンチゲノムと組み合わされるか、またはその内に置換されて、一つまたは両方の寄与しているPIVsに較べて、新規の表現型の特徴を示すヒト−ウシキメラPIVを生じる、「供与体」遺伝子またはポリヌクレオチドを示す。
【０２５１】
例えば、選択された受容体PIV系統内の異種遺伝子またはゲノムセグメントの添加または置換は、未変成受容体および／または供与体の対応表現型（複数を含む）に較べて、弱毒化の増減、成長の変化、変更された免疫抗原性、または他の望ましい表現型の変化をもたらすことが可能である（Schmidtらによる2000年６月１日付、米国特許出願第09/586,479号、SchmidtらのJ.Virol.74:8922〜9、2000に開示されているように、それぞれは本明細書に参考として包含する）。
【０２５２】
ヒト−ウシキメラPIVベクター内に異種置換または添加としての使用のために選択することが可能である遺伝子およびゲノムセグメントは、PIVN、Ｐ、Ｃ、Ｄ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、SH（適切な所で）、HNおよび／またはＬ蛋白質（複数を含む）またはそれらの部分（複数を含む）を符号化する遺伝子またはゲノムセグメントを含む。加えて、非−PIV蛋白質、例えば、流行性耳下腺炎およびSV5ウイルスにおいて発見されたようなSH蛋白質を符号化する遺伝子およびゲノムセグメントは、本発明のヒト−ウシPIV内に組み込むことが可能である。遺伝子外３’初端部または５’終端部領域、および遺伝子出発、遺伝子末端、遺伝子内領域、または３’または５’非符号化領域などの調節領域も、異種の置換または添加として有用である。
【０２５３】
本発明内で使用のためのあるヒト−ウシキメラPIVベクターは、１個以上のBPIV3遺伝子またはゲノムセグメントの置換または添加により弱毒化される、バックグラウンド中HPIV3の１個以上の主要抗原決定基を含有する。他の蛋白質も保護免疫反応に寄与することは可能であるけれども、PIVsの主要保護抗原は、それらのHNおよびＦ糖蛋白質である。ある実施形態において、バックグラウンドのゲノムまたはアンチゲノムは、HPIVゲノムまたはアンチゲノム、例えば、好ましくはBPIV3から、１個以上のBPIV遺伝子またはゲノムセグメントが中に添加されるか、または中で置換される、HPIV3、HPIV2、またはHPIV1のバックグラウンドのゲノムまたはアンチゲノムである。
【０２５４】
以下に説明される一つの代表的な実施形態において、BPIV3のＮ遺伝子のORFは、HPIVのそれに対して置換される。あるいは、バックグラウンドのゲノムまたはアンチゲノムは、HPIV3、HPIV2、またはHPIV1糖蛋白質、糖蛋白質領域または他の抗原決定基を符号化する１個以上の遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わせたBPIVのゲノムまたはアンチゲノムでありえる。
【０２５５】
本発明の方法により、あらゆるBPIV遺伝子またはゲノムセグメントは、単独に、または１個以上の他のBPIV遺伝子と組み合わせて、ヒト−ウシキメラPIVワクチン候補を、HPIV配列と組み合わされて引き起こすことが可能である。特定のHPIV血清型、例えば、HPIV3の異なる系統を含むあらゆるHPIVは、BPIV遺伝子（複数を含む）を弱毒化するための合理的な受容体である。一般に、ヒトPIVに対するワクチンとしての使用のためのヒト−ウシキメラPIV中の細胞含有物に選択されるHPIV3の遺伝子（複数を含む）またはゲノムセグメント（複数を含む）は、HNまたはＦ糖蛋白質などの１個以上のHPIV防護抗原を含む。
【０２５６】
本発明の代表的な態様において、１個以上のウシの遺伝子またはゲノムセグメントを含有するヒト−ウシキメラPIVは、例えば、非ヒト霊長類などのヒトPIV感染の哺乳類モデルの呼吸気道において、宿主範囲限定の高い程度を示す。
【０２５７】
代表的な実施形態において、ヒトPIVは、１個以上のウシの遺伝子、またはゲノムセグメントの部分的な、または完全なヒトの、例えば、HPIV3、PIVバックグラウンドのゲノムまたはアンチゲノムに対する添加または置換により弱毒化される。一つの実施例において、HPIV3N遺伝子がBPIV3N遺伝子により置換されて、新規のヒト−ウシキメラPIVベクターを生じ、このベクター内で、はしかのＨＡ遺伝子が置換されて、以下に説明される組替え型rHPIV3-NBHAF-Mにより代表されるような多価のHPIV／はしかワクチン候補を生じる。
【０２５８】
好ましくは、本発明のワクチン候補を発生させるためのヒト−ウシキメラPIVベクターにより示される宿主範囲限定の程度は、それぞれのBPIVの親または「供与体」系統により示される宿主範囲限定の程度に匹敵する。好ましくは、限定は、真の宿主範囲表現型を有するべきである、すなわち、それは問題の宿主に対して特有であるべきであり、適する細胞系において試験管中での複製およびワクチン作成を限定するべきでない。加えて、１個以上のウシの遺伝子またはゲノムセグメントを含有するヒト−ウシキメラPIVベクターは、PIV感染に感染し易い宿主において、高レベルの耐性を引き出す。従って、本発明は、宿主範囲効果に基づき、PIVおよび他の病原菌に対するワクチンを発生させるための生きたウイルスベクターを弱毒化するための新しい基盤を提供する。
【０２５９】
本発明の関連する態様において、ヒト−ウシキメラPIVベクターは、HPIVHNおよび／またはＦ糖蛋白質（複数を含む）を符号化する１個以上の異種遺伝子を組み込む、BPIV受容体またはバックボーンウイルスを含む。あるいは、キメラPIVは、HPIVHNおよび／またはＦ糖蛋白質（複数を含む）の外部領域（および、代わりに細胞質領域および／または膜を通しての領域）、または免疫抗原決定基を符号化する１個以上のゲノムセグメントを組み込むことが可能である。これらの免疫抗原性蛋白質、領域および決定基は、それらが免疫性宿主の中で新規の免疫反応を生み出すので、ヒト−ウシキメラPIV内で特に有用である。特に、その中のHNおよびＦ蛋白質、および免疫抗原性領域および決定基は、主要保護抗原をもたらす。
【０２６０】
本発明のある実施形態において、ヒトPIVサブグループまたは系統からの１個以上の免疫抗原性遺伝子またはゲノムセグメントを、ウシのバックグラウンド、または受容体、ゲノムまたはアンチゲノムに対して、またはそれらの内で、添加するか、または置換することは、１個以上の特定のヒトPIVサブグループまたは系統を含むヒト供与体ウイルスに対抗して免疫反応を起こすことが可能な、組替え型の、キメラウイルスまたはウイルス粒子より小さい高分子粒子を生じ、一方でウシのバックボーンは弱毒化表現型を与えて、キメラをワクチン発生のための有用な候補になす。
【０２６１】
一つの代表的な実施形態において、１個以上のヒトPIV糖蛋白質遺伝子、例えば、HNおよび／またはＦは、部分的または完全なウシゲノムまたはアンチゲノムに添加されるか、またはそれらの内で置換されて、感染し易い宿主の中で抗−ヒトPIV免疫反応を引き出す、弱毒化された、感染性のヒト−ウシキメラを生じる。こうした一つの代表的なベクター（BPIV3バックグラウンド中にHPIV3JSHNおよびＦ糖蛋白質遺伝子を運ぶ）内で、RSVA糖蛋白質遺伝子ＧおよびＦが添加異種ORFとして効果的に挿入されて、以下に説明する組替え型ウイルスrB/HPIV3-G1およびrB/HPIV3-F1により代表される、多価、HPIV/RSVワクチン候補を生成した。
【０２６２】
別の実施態様では、ヒト−ウシ・キメラPIVベクターは、複数のヒトPIV株に由来する免疫原タンパク質、タンパク質ドメインまたはエピトープ（たとえばHPIV1またはHPIV2などのような異なるHPIVにそれぞれ由来する2つのHNまたはFタンパク質またはその免疫原部分）をコードする遺伝子またはゲノム分節を付加的に組み込む。あるいは、1つの糖タンパク質または免疫原決定基を第1 HPIVから、2つ目の糖タンパク質または免疫原決定基を第2 HPIVから、それぞれ置換により、追加の糖タンパク質または決定基コード化ポリヌクレオチドをゲノムまたはアンチゲノムに付加することなく、供給してもよい。
【０２６３】
HPIV糖タンパク質または抗原決定基の付加または置換は、組み換えウィルスまたはサブウィルス粒子内にキメラ糖タンパク質をコードするゲノムまたはアンチゲノムを構築することによって、たとえば第1 HPIVの免疫原エピトープ、抗原領域または完全エクトドメインを異種HPIVの細胞質ドメインへと融合させて実現してもよい。たとえば、HPIV1またはHPIV2のHNまたはF糖タンパク質に由来する糖タンパク質エクトドメインをコードする異種ゲノム分節を、バックグラウンドのゲノムまたはアンチゲノム内で、HPIV3 HNまたはF糖タンパク質の細胞質ドメイン／エンドドメインをコードするゲノム分節に結合してもよい。
【０２６４】
別の実施態様ではヒト−ウシ・キメラPIVベクターのゲノムまたはアンチゲノムは、組み換えウィルスまたはサブウィルス粒子にあって置換、付加またはキメラ型の糖タンパク質またはその抗原決定基をコードして、ヒト、ウシ両方の糖パク質、糖タンパク質ドメインまたは免疫原エピトープをもつウィルス組み換え体を生み出すようになろう。
【０２６５】
たとえばバックグラウンドのゲノムまたはアンチゲノム内で、ヒトPIV HNまたはF糖タンパク質に由来する糖タンパク質エクトドメインをコードする異種ゲノム分節を、対応するウシHNまたはF糖タンパク質の細胞質ドメイン／エンドドメインをコードするゲノム分節に結合してもよい。あるいは、ヒトPIV HNまたはF糖タンパク質またはその部分を、別のPIV株または血清型に由来するHNまたはF糖タンパク質またはその部分をコードするゲノム分節に結合してもよい。
【０２６６】
本発明のヒト−ウシ・キメラPIVにもたらされる宿主域表現型効果と組み合わせて、キメラウィルスの弱毒化を強めるまたは弱めるような追加の突然変異を導入することにより弱毒化表現型を調整するのがしばしば望ましい。こうして、本発明の追加態様においては弱毒化されたヒト−ウシ・キメラPIVベクターが作製されるが、そこではキメラのゲノムまたはアンチゲノムが、結果として得られるウィルスまたはサブウィルス粒子に弱毒化表現型を指定する1つ以上の弱毒化突然変異を導入することによりさらに変更される。
【０２６７】
これらの突然変異はRNA調節配列またはコードされるタンパク質の突然変異を含みうる。こうした弱毒化突然変異は合理的な設計突然変異戦略に沿って新規に生成し、その弱毒化効果を調べてもよい。あるいは、生物学的に誘導された既存突然変異PIVの中に弱毒化突然変異を特定し、それを本発明のヒト−ウシ・キメラPIVに組み込んでもよい。
【０２６８】
本発明の好ましいキメラワクチン候補においては、許容動物モデルたとえばハムスターやアカゲザルなどの上／下気道での複製によって記録される、ヒトでのPIV複製のための弱毒化を（たとえば感染後3〜8日の間に測定して）全体で、対応する野生型または変異型の親PIV株の増殖と比較して少なくとも約2倍も、より頻繁には約5倍または20倍も、そして好ましくは50〜100倍から1,000倍以上も進行させることができる。
【０２６９】
また、本発明の感染性キメラPIVベクタークローンを本書で開示する方法と組成物に依拠して作製し、免疫原性の強化と野生型の親（すなわちベクターまたは異種宿主）PIVまたは非PIV病原体による感染でもたらされるよりも高レベルの感染防御の誘発とをはかるようにすることもできる。たとえば、異種PIV株または型に由来する、または麻疹ウィルスやRSVなどのような非PIV病原体に由来する1種以上の追加的な免疫原エピトープ、タンパク質ドメインまたはタンパク質をキメラPIVに付加するには、キメラのゲノムまたはアンチゲノムの適当なヌクレオチドを改変すればよい。
【０２７０】
あるいは、本発明のキメラPIVを作製して、望ましいまたは望ましくない免疫反応に関連する免疫原タンパク質、タンパク質ドメイン、または特異的タンパク質を（たとえばアミノ酸の挿入、置換または削除により）付加または除去することもできる。
【０２７１】
本発明の方法の範囲内で、追加の遺伝子またはゲノム分節をキメラPIVベクターのゲノムまたはアンチゲノム内あるいはその近くに挿入することができる。これらの遺伝子は受容体遺伝子と共通の制御を、または独立した転写シグナルセットの制御を受けよう。これとの関連で重要な遺伝子には、抗原決定基をコードする遺伝子やゲノム分節に加えて、サイトカイン類、たとえばインターロイキン［インターロイキン2 (IL-2)、インターロイキン4 (IL-4)、インターロイキン5 (IL-5)、インターロイキン6 (IL-6)、インターロイキン18 (IL-18)など］や主要壊死因子アルファ（TNFα）、インターフェロンガンマ（IFNγ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（CM-CSF）、それにIL-2〜IL-18特にIL-2やIL-6、IL-12、IL-18およびγインターフェロンなどをコードする遺伝子が含まれる（1999年7月13日出願の米国仮出願第60/143,425号に対応する2000年7月12日出願の米国出願第09/614,285号を参照。これは参照指示により本書に組み込まれる）。これらの追加タンパク質の同時出現は、本発明のキメラPIVに対する免疫反応を質的にも量的にも改変する能力をもたらす。
【０２７２】
本発明のキメラPIV内の全ウィルス遺伝子またはゲノム分節の変化を伴う削除や挿入、置換、その他の突然変異からは、免疫不全者には特に重要であるきわめて安定なワクチン候補が生成される。これらの変化は、結果として得られるワクチン株の弱毒化につながるものも多いであろうし、種々の望ましい表現型の改変を指定するものもあろう。たとえばアクセサリー（すなわち、in vitro増殖には必須でない）遺伝子は、宿主の免疫を特異的に妨げるタンパク質をコードするための有力候補である（たとえば、Kato et al., EMBO.J.16:578-87, 1997を参照。これは参照指示により本書に組み込まれる）。ワクチンウィルス中のかかる遺伝子の除去は毒性と病原性の低減や免疫原性の改善につながると期待される。
【０２７３】
前記定義済み変異の感染性キメラPIVクローンへの導入は種々の周知の方法により実現することができる。「感染性クローン」はDNA関連では、感染性ウィルスまたはサブウィルス粒子のゲノムを複製するための鋳型として機能しうるゲノムまたはアンチゲノムRNAへの転写が可能なcDNAまたはその産物を、合成、天然の区別なく意味する。したがって、定義済み変異は通常の手法（部位指定突然変異誘発など）によりゲノムまたはアンチゲノムのcDNAコピーへと導入することができる。
【０２７４】
本書で述べるようなアンチゲノムまたはゲノムcDNA小断片の使用による完全なアンチゲノムまたはゲノムcDNAの集成には、個々の領域を別々に操作し（より小さいcDNAのほうが大きいものよりも操作しやすい）、次いで簡単な集成により完全なcDNAにすることが可能になるという利点がある。こうして、完全なアンチゲノムまたはゲノムcDNAまたはその任意の小断片をオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発の鋳型として使用することができる。
【０２７５】
突然変異誘発は一本鎖ファスミドという形態の中間体を介して、たとえばBio-Rad Laboratories社（カリフォルニア州リッチモンド）のMuta-gene（商標）キットを用いて、またはStratagene社（カリフォルニア州ラホーヤ）のChameleon突然変異誘発キットなどのような二本鎖プラスミドを鋳型として直接使用する方法を用いて、または目的の突然変異を組み込んだオリゴヌクレオチドのプライマーまたは鋳型を採用するPCRにより、実現することができる。
【０２７６】
次いで、変異小断片を集成すれば完全なアンチゲノムまたはゲノムcDNAができあがる。他にもさまざまな突然変異誘発手法が周知であり、PIVアンチゲノムまたはゲノムcDNAに目的の突然変異を誘発するのに使用できる。突然変異は単一ヌクレオチドの変化から1個以上の遺伝子またはゲノム領域を収めた大きなcDNA断片の入れ替えまで多岐にわたる可能性がある。
【０２７７】
したがって一実施例ではBio-Rad社のMuta-geneファスミドin vitro突然変異誘発キットの使用によって突然変異が導入される。要するに、PIVゲノムまたはアンチゲノムの一部分をコードするcDNAを、プラスミドpTZ18Uを使用してクローニングし、それを使用してCJ236細胞（Life Technologies社、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を形質転換させる。ファスミドの調製はメーカーの説明書に従って行う。ゲノムまたはアンチゲノムの所望位置に改変ヌクレオチドを導入することにより、突然変異誘発用のオリゴヌクレオチドを用意する。この遺伝子改変ゲノムまたはアンチゲノム小断片を収めたプラスミドを増幅し、次いで変異断片を完全長ゲノムまたはアンチゲノムへと再導入する。
【０２７８】
本発明はまた、1個以上の単離ポリヌクレオチド、たとえば1個以上のcDNAから感染性キメラPIVを作製するための方法を提供する。本発明では、PIVゲノムまたはアンチゲノムをコードするcDNAを感染性PIVの作製に必要なウィルスタンパク質との細胞内またはin vitro同時発現用に作製する。「PIVアンチゲノム」は、結果としてのPIVゲノムを合成するための鋳型として機能する単離型ポジティブセンスポリヌクレオチド分子を意味する。
【０２７９】
好ましくは、複製中間RNAすなわちアンチゲノムに対応するPIVゲノムのポジティブセンス版であるcDNAを作製して、転写・複製用ヌクレオキャプシドの生成に必要となるタンパク質をコードする相補配列、すなわちN、PおよびLタンパク質をコードする配列のポジティブセンス転写物とハイブリダイズする可能性を極力抑えるようにする。
【０２８０】
本発明の目的のためには、本発明の組み換えPIVのゲノムまたはアンチゲノムは、それによってコードされるウィルスまたはサブウィルス粒子を感染性にするうえで必要な遺伝子またはその一部分を含むだけで十分である。さらに、この遺伝子またはその一部分は1個以上のポリヌクレオチド分子により供給してもよい。すなわちある遺伝子を別個のヌクレオチド分子から相補などによって供給してもよいし、またはゲノムまたはアンチゲノムcDNAから直接発現させることもできる。
【０２８１】
組み換えPIVはPIVまたはPIV様ウィルスまたはサブウィルス粒子であって、組み換え発現系から直接または間接に誘導されるもの、または発現系から生み出されるウィルスまたはサブウィルス粒子から増やされるものを意味する。この組み換え発現系は組み換え発現ベクターを使用することになろうが、そのベクターには、少なくともPIV遺伝子発現の調節機能を担う単数または複数の遺伝子要素（たとえばプロモーターやPIV RNAへと転写される構造配列またはコード配列、適当な転写開始および終結配列など）からなる集成体を含む作動可能に連結された転写単位が収めてある。
【０２８２】
cDNA発現ゲノムまたはアンチゲノムから感染性PIVを生成するには、ゲノムまたはアンチゲノムを、(i)RNA複写能をもつヌクレオキャプシドを生成し、(ii)結果として生成したヌクレオキャプシドをRNAの複写と転写の両方に適したものにするうえで必要となるPIVタンパク質と同時発現させる。ゲノムヌクレオキャプシドによる転写は他PIVタンパク質をもたらし、また増殖性感染を開始させる。あるいは、同時発現によって増殖性感染に必要となる追加PIVタンパク質を供給することができる。
【０２８３】
本発明の感染性PIVは、PIVゲノムまたはアンチゲノムRNAをコードする1個以上の単離ポリヌクレオチド分子の、転写・複製用ヌクレオキャプシドの生成に必要となるウィルスタンパク質をコードする1個以上のポリヌクレオチドとの、細胞内または無細胞同時発現によって生成される。感染性PIVを生成するための同時発現に有効なウィルスタンパク質には、主要ヌクレオキャプシド(N)タンパク質、ヌクレオキャプシドリン(P)タンパク質、大ポリメラーゼ(L)タンパク質、融合(F)タンパク質、赤血球凝集素−ノイラミダーゼ(HN)糖タンパク質、基質(M)タンパク質などがある。これとの関連ではPIVのC、DおよびV ORFsの産物もまた有効である。
【０２８４】
PIVゲノムまたはアンチゲノムをコードするcDNAを、感染性PIVの作製に必要なウィルスタンパク質との細胞内またはin vitro同時発現用に作製する。「PIVアンチゲノム」は、結果としてのPIVゲノムを合成するための鋳型として機能する単離型ポジティブセンスポリヌクレオチド分子を意味する。好ましくは、複製中間RNAすなわちアンチゲノムに対応するPIVゲノムのポジティブセンス版であるcDNAを作製して、転写・複製用ヌクレオキャプシドの生成に必要となるタンパク質をコードする相補配列のポジティブセンス転写物とハイブリダイズする可能性を極力抑えるようにする。
【０２８５】
本発明のいくつかの実施態様では、組み換えPIV（rPIV）のゲノムまたはアンチゲノムは、それによってコードされるウィルスまたはサブウィルス粒子を感染性にするうえで必要となる遺伝子またはその一部分を含むだけでよい。この遺伝子またはその一部分は1個以上のポリヌクレオチド分子により供給してもよい。すなわち、ある遺伝子を別個のヌクレオチド分子から相補などにより供給してもよい。他の実施態様ではPIVゲノムまたはアンチゲノムは、ヘルパーウィルスの参加またはプラスミドまたはヘルパー細胞株によって提供されるウィルス機能を伴わないウィルスの増殖や複製、感染に必要な諸々の機能をコードする。
【０２８６】
「組み換えPIV」はPIVまたはPIV様ウィルスまたはサブウィルス粒子であって、組み換え発現系から直接または間接に誘導されるもの、または発現系から生み出されるウィルスまたはサブウィルス粒子から増やされるものを意味する。この組み換え発現系は組み換え発現ベクターを使用することになろうが、そのベクターには、少なくともPIV遺伝子発現の調節機能を担う単数または複数の遺伝子要素（たとえばプロモーターやPIV RNAへと転写される構造配列またはコード配列、適当な転写開始および終結配列など）からなる集成体を含む作動可能に連結された転写単位が収めてある。
【０２８７】
cDNA発現ゲノムまたはアンチゲノムから感染性PIVを生成するには、ゲノムまたはアンチゲノムを、(i)RNA複写能をもつヌクレオキャプシドを生成し、(ii)結果として生成したヌクレオキャプシドをRNAの複写と転写の両方に適したものにするうえで必要となるPIV N、PおよびLタンパク質と同時発現させる。ゲノムヌクレオキャプシドによる転写は他PIVタンパク質をもたらし、また増殖性感染を開始させる。あるいは、同時発現によって増殖性感染に必要となる追加PIVタンパク質を供給することができる。
【０２８８】
前記ウィルスタンパク質によるPIVアンチゲノムまたはゲノムの合成はin vitro（無細胞）でも、たとえば結合型の転写−翻訳反応とそれに続く細胞への導入を用いて実現することができる。あるいは、アンチゲノムまたはゲノムRNAをin vitroで合成し、PIV発現細胞に導入することもできる。
【０２８９】
本発明のある種の実施態様では、転写・複製用PIVヌクレオキャプシドの生成に必要なタンパク質をコードする相補的配列が1個以上のヘルパーウィルスによって供給される。その種のヘルパーウィルスは野生型でも変異型でもよい。ヘルパーウィルスはPIV cDNAによってコードされるウィルスから表現型的に識別しうるのが好ましい。たとえば、PIV cDNAによってコードされるウィルスには免疫反応を起こさないがヘルパーウィルスには免疫反応を起こすようなモノクローナル抗体をもたらすのが望ましい。
【０２９０】
その種の抗体は中和抗体でもよい。実施態様によっては、アフィニティークロマトグラフィーで抗体を使用して組み換えウィルスからヘルパーウィルスを分離することができる。そうした抗体を調達しやすくするために、PIV cDNAに突然変異を導入して、ヘルパーウィルスからHNまたはF糖タンパク質遺伝子に見られるような抗原多様性をもたらすようにすることが可能である。
【０２９１】
本発明の別の実施態様では、N、P、Lおよび他の所望PIVタンパク質を1個以上の非ウィルス発現ベクターによりコードするが、それはゲノムまたはアンチゲノムをコードするベクターと同じでも別でもよい。必要に応じて追加タンパク質を含めることもできるが各追加タンパク質をコードするのは独自のベクターでも、1以上のN、P、Lおよび他の所望PIVタンパク質を、あるいは完全ゲノムまたはアンチゲノムをコードするベクターでもよい。導入されたプラスミドからのゲノムまたはアンチゲノム、およびタンパク質の発現は、たとえばT7 RNAポリメラーゼプロモーターのコントロールを受ける各cDNAによって実現することができる。
【０２９２】
T7 RNAポリメラーゼのほうはT7 RNAポリメラーゼ発現系、たとえばT7 RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウィルスMVA株組み換え体による感染、トランスフェクションまたは形質導入によって供給される（Wyatt et al., Virology 210: 202-205, 1995。これは参照指示によりその全体が本書に組み込まれる）。ウィルスタンパク質および／またはT7 RNAポリメラーゼはまた、形質転換した哺乳類細胞により、またはあらかじめ形成しておいたmRNAまたはタンパク質のトランスフェクションにより供給することもできる。
【０２９３】
本発明に用いるためのPIVアンチゲノムは、たとえば総体として完全なアンチゲノムを構成するクローンcDNAの諸断片を集成することにより、PIV mRNAまたはゲノムRNAの逆転写コピーのPCR（PCR：たとえば米国特許第4,683,195号および第4,683,202号とPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, San Diego, 1990などで説明されている。これらはいずれも参照指示によりその全体が本書に組み込まれる）等により作製されよう。
【０２９４】
たとえば最初の構成体は、アンチゲノムの左手端を収め適当なプロモーター（たとえばT7 RNAポリメラーゼプロモーター）を発端とし適当な発現ベクター、たとえばプラスミド、コスミド、ファージ、またはDNAウィルスベクターなどの中に集成されているcDNAsを含むものとして生成される。ベクターは突然変異誘発により、および／または集成を容易にするために設計された固有の制限部位を備える合成ポリリンカーの挿入により、変更してもよい。作製を楽にするために、N、P、Lおよび他の所望PIVタンパク質を1個または複数の別個のベクターの中に集成することができる。
【０２９５】
アンチゲノムプラスミドの右手端は必要に応じて追加配列を、たとえばフランキングリボザイムやタンデムT7転写終結因子などを含んでもよい。このリボザイムは、単一の非ウィルスヌクレオチドを含む3’末端を生み出すようなハンマーヘッド型（たとえばGrosfeld et al., J. Virol. 69: 5677-5686, 1995を参照）でも、他の任意の適当なリボザイムたとえば非PIVヌクレオチドを伴わない3’末端を生み出すようなデルタ肝炎ウィルスのリボザイム（Perrotta et al., Nature 350: 434-436, 1991。これは参照指示によりその全体が本書に組み込まれる）などでもよい。
【０２９６】
PIVゲノムまたはアンチゲノムにはcDNA作製中または作製後に種々のヌクレオチド挿入、削除および再配列を行うことができる。たとえば、特定の所望ヌクレオチド配列を合成し、都合のよい制限酵素認識部位を使用してcDNAの適当な領域に挿入することができる。あるいは、技術上周知の部位指定突然変異誘発、アラニンスキャニング、PCR突然変異誘発などの手法を使用してcDNAに突然変異を導入することができる。
【０２９７】
ゲノムまたはアンチゲノムをコードするcDNAを作製するための代替手段には、改良PCR条件を採用してサブユニットcDNAコンポーネント数をわずか1〜2個に減らすようにした逆転写PCR法（たとえば、参照指示により本書に組み込まれるCheng et al., Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A. 91: 5695-5699, 1994に説明されているものなど）が含まれる。他の実施態様では、異なるプロモーター（たとえばT3、SP6など）または異なるリボザイム（デルタ肝炎ウィルスのそれなど）を使用することができる。異なるDNAベクター（コスミドなど）を増殖に使用すれば、より大きなサイズのゲノムまたはアンチゲノムを受け入れやすくすることができる。
【０２９８】
ゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離型ポリヌクレオチド（cDNAなど）はトランスフェクション、エレクトロポレーション、機械的挿入、形質転換などにより適当な宿主細胞に、増殖性PIV感染サポート機能をもつ細胞たとえばHEp-2、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5およびVero細胞などに挿入することができる。
【０２９９】
単離型ポリヌクレオチド配列のトランスフェクションによる培養細胞への導入には、たとえばリン酸カルシウム法（Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973）、エレクトロポレーション（Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982）、DEAE-デキストラン法（Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987）、陽イオン脂質法（Hawley-Nelson et al., Focus 15:73-79, 1993）、またはLipofectACE（商標）（Life Technologies社）のような市販のトランスフェクション試薬などを用いることができる（以上の参考文献はそれぞれ、参照指示によりその全体が本書に組み込まれる）。
【０３００】
前述のように、本発明のいつくかの実施態様ではN、P、Lおよび他の所望PIVタンパク質は、ゲノムまたはアンチゲノムをコードするウィルスから表現型的に識別しうる1個以上のヘルパーウィルスによってコードされる。N、P、Lおよび他の所望PIVタンパク質はまた、ゲノムまたはアンチゲノムをコードするベクターと同一でも別個でもよい1個以上の発現ベクター、およびそのさまざまな組み合わせによってコードされる場合もある。必要に応じて追加タンパク質を含めてもよいが、これは独自のベクターによって、または1個以上のN、P、Lおよび他の所望PIVタンパク質あるいは完全なゲノムまたはアンチゲノムをコードするベクターによってコードされる。
【０３０１】
本発明は、感染性PIVクローンを提供することにより、PIVゲノム（またはアンチゲノム）内に広範囲の変更を組み換えによって生み出し、もって所望の表現型変化を指定する定義済みの突然変異をもたらすことができる。「感染性クローン」は、感染性ウィルスまたはサブウィルス粒子のゲノムを複製するための鋳型として機能しうるゲノムまたはアンチゲノムRNAへの転写が可能な感染性ビリオンへと直接組み込むことができるcDNAまたはその産物RNAを、合成、天然の区別なく意味する。前述のように、定義済み変異はさまざまな通常の手法（部位指定突然変異誘発など）によりゲノムまたはアンチゲノムのcDNAコピーへと導入することができる。
【０３０２】
本書で述べるようなアンチゲノムまたはゲノムcDNA小断片の使用による完全なアンチゲノムまたはゲノムcDNAの集成には、個々の領域を別々に操作し（対象としては、より小さいcDNAのほうが大きいものよりも操作しやすい）、次いで簡単な集成により完全なcDNAにすることが可能になるという利点がある。こうして、完全なアンチゲノムまたはゲノムcDNAまたはその任意の小断片をオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発の鋳型として使用することができる。
【０３０３】
突然変異誘発は一本鎖ファスミドという形態の中間体を介して、たとえばBio-Rad Laboratories社（カリフォルニア州リッチモンド）のMUTA-gene（商標）キットを用いて、またはStratagene社（カリフォルニア州ラホーヤ）のChameleon（商標）突然変異誘発キットなどのような二本鎖プラスミドを鋳型として直接使用する方法を用いて、または目的の突然変異を組み込んだオリゴヌクレオチドのプライマーまたは鋳型を採用するPCRにより、実現することができる。次いで、変異小断片を集成すれば完全なアンチゲノムまたはゲノムcDNAができあがる。他にもさまざまな突然変異誘発手法が周知であり、本発明のPIVアンチゲノムまたはゲノムcDNAに目的とする突然変異を誘発するいう用途に合わせてごく普通に適合させることができる。
【０３０４】
したがって、一実施例ではBio-Rad社のMUTA-gene（商標）ファスミドin vitro突然変異誘発キットの使用によって突然変異が導入される。要するに、PIVゲノムまたはアンチゲノムをコードするcDNAを、プラスミドpTZ18Uを使用してクローニングし、それを使用してCJ236細胞（Life Technologies社）を形質転換させる。ファスミドの作製はメーカーの説明書に従って行う。ゲノムまたはアンチゲノムの所望位置に改変ヌクレオチドを導入することにより、突然変異誘発用のオリゴヌクレオチドを用意する。次いで、この遺伝子改変ゲノムまたはアンチゲノムを収めたプラスミドを増幅する。
【０３０５】
突然変異は単一ヌクレオチドの変化から1個以上の遺伝子またはゲノム分節を収めた大きなcDNA分節の導入、削除または入れ替えまで多岐にわたる可能性がある。ゲノム分節は構造および／または機能ドメイン、たとえばタンパク質の細胞質ドメイン、膜貫通ドメインまたはエクトドメイン、異なるタンパク質との結合または他の生化学的相互作用を仲介する部位などのような活性部位、エピトープ部位、たとえば抗体結合および／または体液性または細胞仲介性免疫反応を刺激する部位などに対応する可能性がある。この意味での有用ゲノム分節の大きさは、タンパク質の小機能ドメイン、たとえばエピトープ部位をコードするゲノム分節の場合の約15〜35ヌクレオチドから約50、75、100、200〜500および500〜1,500以上のヌクレオチドにまでわたる。
【０３０６】
こうした定義済み変異を感染性PIVに導入しうる能力はPIV病原および免疫原機構の操作を含めて数多くの用途をもつ。たとえばN、P、M、F、HNおよびLタンパク質やC、DおよびV ORF産物を含めたPIVタンパク質の機能は、タンパク質発現レベルを低減させるような、または変異タンパク質を産生するような突然変異の導入によって操作することができる。
【０３０７】
ゲノムRNAの種々の構造上の特色、たとえばプロモーターや遺伝子間領域、転写シグナルもまた本発明の方法と組成物の範囲内でごく普通に適合させることができる。トランス作用タンパク質とシス作用RNA配列の効果はたとえばPIVミニゲノムを用いる平行検定に完全アンチゲノムcDNAを使用することにより、すぐに測定することができる（Dimock et al., J. Virol. 67:2722-8, 1993。これは参照指示によりその全体が本書に組み込まれる）。そのレスキュー依存状態は複製と無関係の感染性ウィルス中に取り込むにはあまりに抑制的すぎる突然変異体を特性記述するうえで有用である。
【０３０８】
本発明の組み換えPIV内での遺伝子またはゲノム分節のある種の置換、挿入、削除または再配列［特定のタンパク質またはタンパク質領域(たとえば細胞質テール、膜貫通ドメインまたはエクトドメイン、エピトープ部位または領域、結合部位または領域、活性部位または活性部位を含む領域など)をコードするゲノム分節の置換など］は、同じまたは異なるPIVあるいは他ソースに由来する既存の「カウンターパート」遺伝子またはゲノム分節に対する構造的または機能的関係において行われる。
【０３０９】
この種の変更は、野生型または親PIVあるいは他ウィルス株と比べて所望の表現型変化を引き起こしている新規組み換え体を生み出す。たとえば、この種の組み換え体にはあるPIVの細胞質テールおよび／または膜貫通ドメインを別のPIVのエクトドメインに融合させたキメラタンパク質を発現するものがあろう。また、二重タンパク質領域、たとえば二重免疫原領域を発現するものもあろう。
【０３１０】
「カウンターパート」遺伝子、ゲノム分節、タンパク質またはタンパク質領域はここでは一般に異種ソースに由来する（たとえば異なるPIV遺伝子に由来する、または異なるPIV型または株の中の同じ(すなわち相同または対立)遺伝子またはゲノム分節を表す）。これとの関連で選択される代表的なカウンターパートは構造上の特色をそっくり共有する。たとえば、各カウンターパートは類似のタンパク質またはタンパク質構造ドメイン（細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、エクトドメイン、結合部位または領域、エピトープ部位または領域など）をコードしよう。カウンターパートドメインとそれをコードするゲノム分節は、ドメインまたはゲノム分節変異体に共通の生物活性によって規定される範囲のサイズおよび配列変動をもつ諸種の集合を包含する。
【０３１１】
カウンターパート遺伝子およびゲノム分節、それに本発明の範囲内での組み換え型PIV生成用に本書で開示される他ポリヌクレオチドはしばしば特定ポリヌクレオチドの「基準配列」たとえば他の特定カウンターパート配列と、実質的配列同一性を共有する。ここで用いる「基準配列」とは、配列比較の基準として使用される定義済み配列、たとえば完全長cDNAまたは遺伝子、あるいは完全cDNAまたは遺伝子配列をいう。一般に、基準配列は長さが20ヌクレオチド以上、しばしば25ヌクレオチド以上、またしばしば50ヌクレオチド以上である。
【０３１２】
2つのポリヌクレオチドはそれぞれ(1)両ポリヌクレオチド間で互いに類似する配列（すなわち完全ポリヌクレオチド配列の一部分）を含み、また(2)両ポリヌクレオチド間で互いに異なる配列をさらに含むため、2つ（以上）のポリヌクレオチドの配列比較は一般に「比較窓」越しに2ポリヌクレオチドの配列を比較して配列が類似する局所領域を特定し比較するという方法で行われる。ここで用いる「比較窓」とは、20以上の隣接ヌクレオチド部分からなる概念的分節をいい、その中でポリヌクレオチド配列が20以上の隣接ヌクレオチド部分からなる基準配列と比較され、また両配列の最適アラインメントを実現するために比較窓の中のポリヌクレオチド配列部分は（追加または欠失のない）基準配列と比べた場合の追加または欠失（すなわちギャップ）を20%以下にする。
【０３１３】
比較窓を合わせるための最適配列アラインメントはSmith & Waterman社の局所相同アルゴリズムにより（Adv. Appl. Math. 2:482, 1981）、Needleman & Wunsch社の相同アラインメント・アルゴリズムにより（J. Mol. Biol. 48:443, 1970）、Pearson & Lipman社の類似性探索法により（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988）（以上の各文献は参照指示により本書に組み込まれる）、これらのアルゴリズムをコンピュータで実行する方法（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0に収めてあるGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA。Genetics Computer Group, 575 Science Dr. Madison, WI。引用により本書に組み込まれる）により、または検査により、行われ、種々の方法で生成される最良のアラインメント（すなわち比較窓越しの配列同一性率が最高になるアラインメント）が選択される。
【０３１４】
「配列同一性」は2つのポリヌクレオチド配列が比較窓越しに比較して同一である（すなわち、個別ヌクレオチド単位で一致する）ことを意味する。「配列同一性率」は、最適配列アラインメントで2つの配列を比較窓越しに比較し、両配列で核酸塩基（A、T、C、G、UまたはI）が一致する位置の数を求めて一致位置数とし、その一致位置数を比較窓枠内の総位置数（すなわち窓の大きさ）で割り、その商に100を掛けるという方法で計算する。
【０３１５】
ここで用いる「実質的同一性」は、ポリヌクレオチド配列の一特性を指し、そのポリヌクレオチドが長さ20ヌクレオチド以上の比較窓越しに、しばしば長さ25〜50ヌクレオチド以上の比較窓越しに基準配列と比較して85%以上の、好ましくは90〜95%以上の配列同一性を有する配列を備えることを意味し、この場合の配列同一性率は基準配列を、比較窓越しに比較して基準配列の合計20%以下の欠失または追加を含むようなヌクレオチド配列と比較して計算する。基準配列はより大きな配列の部分集合でもよい。
【０３１６】
これらのポリヌクレオチド配列関係に加えて、組み換え型PIVによってコードされるタンパク質およびタンパク質領域は特定の基準ポリペプチドと保存的関係をもつように、すなわち実質的配列同一性または配列類似性をもつようにも選択される。「配列同一性」はポリペプチドに適用される場合には、ペプチドが対応する位置で同一のアミノ酸を共有することを意味する。「配列類似性」はペプチドが対応する位置で同一の、または類似するアミノ酸を共有することを意味する。
【０３１７】
「実質的配列同一性」は2つのペプチド配列が、デフォールト・ギャップウェイトを使用するGAPまたはBESTFITプログラムなどによる最適配列アラインメントで、80%以上の配列同一性を、好ましくは90%以上の配列同一性を、もっと好ましくは95%以上の（たとえば99%の）配列同一性を共有することを意味する。「実質的配列類似性」は2つのペプチド配列が相応の配列類似性率を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換が異なる。
【０３１８】
保存的アミノ酸置換とは類似の側鎖をもつ残基の互換性をいう。たとえば、脂肪族側鎖をもつアミノ酸群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖をもつアミノ酸群はセリンとトレオニンであり、アミド含有側鎖をもつアミノ酸群はアスパラギンとグルタミンであり、芳香族側鎖をもつアミノ酸群はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基性側鎖をもつアミノ酸群はリシン、アルギニンおよびヒスチジンであり、含イオウ側鎖をもつアミノ酸群はシステインとメチオニンである。
【０３１９】
好ましい保存的アミノ酸置換群はバリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。本書で使用する20種の天然アミノ酸の略号は慣用に従う（Immunology - A Synthesis, 2nd ed., E.S. Golub & D.R. Gren, eds., Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1991。これは参照指示により本書に組み込まれる）。
【０３２０】
20種の通常型アミノ酸の立体異性体（D型アミノ酸など）、非天然型アミノ酸（α,α-二置換型アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸およびその他の非通常型アミノ酸）もまた本発明のポリペプチドの適当な成分である。非通常型アミノ酸の例は4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシルグルタメート、ε-N,N,N-トリメチルリシン、ε-N-アセチルリシン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリシン、ω-N-メチルアルギニンおよび他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（4-ヒドロキシプロリンなど）である。さらにアミノ酸はグリコシル化、リン酸化などによって変性させてもよい。
【０３２１】
本発明に基づく候補ワクチンを選定するために、周知の方法により生存力や弱毒化、免疫原性についての選定基準を定める。本発明のワクチンに最も望ましいウィルスは生存力を維持し、安定した弱毒化表現型をもち、免疫性を与えられた宿主内で（低レベルながらも）複製を示し、かつ野生型ウィルスからの将来の感染に起因する重病に対する感染防御を与えるに足る免疫反応をワクチンで効果的に引き出さなければならない。
【０３２２】
本発明の組み換え型PIVは生存力があり、以前のワクチン候補よりももっと適正に弱毒化されているだけでなく、生体内で遺伝的により安定でもある。しかも、感染防御免疫反応を刺激し、場合によっては多数の改変によってもたらされる感染防御を、または異なる免疫基盤、たとえば分泌性対血清免疫グロブリン、細胞性免疫などによる感染防御を拡大（たとえば種々のウィルス株または下位群に対する感染防御を誘発）する能力を保持する。
【０３２３】
本発明の組み換え型PIVはさまざまな周知の、一般に認められているin vivoおよびin vitroモデルで試験して、適正な弱毒化、表現型復帰への抵抗性、およびワクチン用免疫原性を確認することができる。in vitro検定では、変異ウィルス（たとえば格段に弱毒化された、生物学的に誘導された、または組み換え型のPIV）についてウィルス複製の温度感受性すなちわちts表現型や、小プラークまたは他の所望表現型を調べる。
【０３２４】
変異ウィルスはさらに、PIV感染動物モデルでも検査する。種々の動物モデルが記述されてきたし本書に組み込まれる種々の参考文献に要約されてもいる。PIVワクチン候補の弱毒化と免疫原活性を評価するためのPIVモデル系は齧歯類や非ヒト霊長類を含めて、技術上広く受け入れられており、そこから得られるデータはヒトでのPIV感染、弱毒化および免疫原性と十分相関する。
【０３２５】
前記の説明のとおり、本発明はまたワクチン用の単離型の感染性組み換え型PIV組成物を提供する。ワクチン成分である弱毒ウィルスは単離型の、一般に精製された形態をとる。単離型とは野生型の自然環境以外に存在するPIVをいう。もっと一般的には、単離型とは細胞培養または他の合成培地の成分としての弱毒ウィルスを含むことを意味し、そこでは弱毒ウィルスを管理された環境の下で増殖させ、特性記述することができる。たとえば、本発明の弱毒PIVは感染細胞培養で生成させ、培地から分離し、安定剤に加えてもよい。
【０３２６】
ワクチン用には、本発明に従って生成される組み換え型PIVをワクチン製剤に直接使用することが、または必要に応じて技術上周知の凍結乾燥プロトコールにより凍結乾燥させることができる。凍結乾燥ウィルスは一般に約4℃に維持されよう。凍結乾燥ウィルスは使用準備が整ったら、安定液（たとえば食塩水またはSPG、Mg++およびHEPESを含む溶液）中で、アジュバントを加えて、または加えずに、後述の要領で還元する。
【０３２７】
本発明のPIVワクチンは活性成分として、本書で述べる要領で生成されたPIVの免疫学的有効量を含む。この変異ウィルスは宿主に、生理学的に許容しうる担体および／またはアジュバントと共に導入する。有効な担体は技術上周知であり、たとえば水、緩衝液、0.4%食塩水、0.3%グリシン、ヒアルロン酸などが含まれる。得られた水溶液は容器に詰めてそのまま使用するようにしてもよいし凍結乾燥させてもよい。凍結乾燥製剤は前述のように滅菌溶液と混ぜてから投与する。
【０３２８】
この製剤組成物には生理的条件に近似させるために必要に応じて製薬上許容しうる補助物質を加えてもよい。補助物質はpH調整剤や緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤など（たとえば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなど）である。許容しうるアジュバントにはフロイント不完全アジュバント、MPLTM（3-o-デアクリレーテド-モノホスホリル脂質A；RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT）、IL-12（Genetics Institute, Cambridge, MA）など、技術上周知のものが多数ある。
【０３２９】
本書に述べる要領でPIV組成物によるワクチン投与を受けると宿主の免疫系はそのワクチンに対し、PIVタンパク質、たとえばFおよびHN糖タンパク質に対して特異的な抗体を産生することにより反応する。本書に述べる要領で生成されるPIVの有効量をワクチンとして投与すると、結果的に宿主はPIV感染に対し少なくとも部分的に、または完全に免疫になり、特に下気道の中度または重度PIV感染に対し抵抗力をもつ。
【０３３０】
ワクチン投与を受ける宿主は、PIVまたは近縁ウィルスによる感染を受けやすい、または種痘株の抗原に対する感染防御免疫反応を生成することができる任意の哺乳動物とする。したがって、本発明は種々のヒトおよび動物用のワクチンを創り出すための方法を提供する。
【０３３１】
本発明のPIVを混ぜたワクチン組成物は、PIV感染を受けやすい、またはPIV感染の危険にさらされている宿主に投与して、宿主自身の免疫反応機能を強化する。そのための必要量は「免疫学的有効量」という。この用法では、PIVの厳密な投与量は宿主の健康状態や体重、投与形態、組成物の性質などに左右されるが、一般的には宿主当たり約103〜104プラーク形成単位（PFU）のウィルスであり、もっと一般的には宿主当たり約104〜106プラーク形成単位（PFU）のウィルスであろう。いずれにしても、ワクチン製剤は患者となる宿主を重い、または生命を脅かすようなPIV感染から効果的に防御するに足る量の本発明の変異PIVを提供する必要がある。
【０３３２】
本発明に従って生成されるPIVは、複数のPIV血清型または株に対する感染防御を実現するために他PIV血清型または株のウィルスと混ぜることができる。あるいは、複数のPIV血清型または株に対する感染防御は、本書に述べる要領で複数の血清型または株の防御エピトープを1種のウィルスにまとめて組み込むことにより、実現することができる。一般に種々のウィルスを投与するときは、それを混和して同時に投与することになろうが、別々に投与してもよい。ある株による免疫が同じまたは異なる血清型の、異なる株に対する感染防御をもたらす場合もある。
【０３３３】
場合によっては、本発明のPIVワクチンを、他作用物資、特に他小児ウィルスに対する感染防御反応を誘発するワクチンと混ぜるのが望ましいであろう。本発明の別の態様では、PIVをRSウィルス（RSV）または麻疹ウィルスなどのような他病原体の防御抗原のためのベクターとして使用して、これらの防御抗原をコードする配列を、本書で述べる要領で、感染性PIVの生成に使用されるPIVゲノムまたはアンチゲノムへと組み込むことができる。
【０３３４】
いずれの被検体についても、正確な量の組換え体PIVワクチンが投与され、投与のタイミング及び繰り返しは患者の健康状態、体重、投与形式、製剤の特徴等に基づき決定された。投与量は一般に患者当たり約107プラーク形成単位（PFU)又はそれ以上のウイルス、より一般的には約104ないし約106PFUウイルス／患者であろう。
【０３３５】
いずれの場合も、ワクチン製剤は、例えば補体結合、ラーク中和反応、及び／又は酵素結合免疫吸着アッセイ、及びその他方法により決定できる様な抗PIV免疫反応を効果的に促進又は誘導するのに十分な量の弱毒化PIVを提供しなければならない。この点に関し、各個体は上部呼吸器疾患の徴候及び症状についてもモニターされる。チンパンジーに投与した場合、ワクチンの弱毒化ウイルスは、ワクチン接種被検体の鼻咽頭に於いて野生型ウイルスの約10倍又はそれ以上低いレベル、又は不完全な弱毒化PIVのレベルに比べ約10倍またはそれ以上低いレベルで増殖する。
【０３３６】
新生児及び乳児の場合、十分なレベルの免疫の惹起には複数回の投与が必要とされる。投与は出産１ヶ月以内に開始し、小児期の間２ヶ月、６ヶ月、１年及び２年といった間隔で投与し、未変性（野生型）PIV感染に対し十分なレベルの防御を維持すべきである。同様に、例えば医療従事者、デイケア職員、低年齢小児の家族、老齢者、心臓肺機能に障害を持つ者の様な、反復性あるいは重症性のPIV感染に特に感受性である成人の場合には、防御免疫反応を確立し、及び／又は維持するためには複数回の投与が必要である。
【０３３７】
誘導される免疫のレベルは、分泌型及び血清型後退を中和する量を測定することでモニターでき、必要に応じ投与量を調整し、ワクチン投与を繰り返すことで所望の防御レベルを維持することができる。更に、サイトカイン又はT細胞エピトープに富む追加蛋白質を発現する様に遺伝子的に加工されたPIV株は、乳児よりは特に成人に関し有益であろう。
【０３３８】
本発明に従い作製されたPIVワクチンをPIVの別サブグループ又は株の抗原を発現するウイルスと組合せ、複数のPIVサブグループ又は株に対する防御を確立することができる。或いはワクチンウイルスはここに記載される様に、PIVの１クローン内に遺伝子工学により作られた複数のPIV株又はサブグループの防御エピトープを取り込んでもよい。
【０３３９】
発明のPIVワクチンは、引き続き個体が野生型PIVに感染した場合に肺炎や気管支炎の様な重症下部気道疾患に対する防御となる免疫反応の発生を誘発する。自然に循環しているウイルスはまだ感染の可能性、特に上部気道に対する感染の可能性を有しているが、ワクチン接種及びその後起こるであろう野生型ウイルスによる感染による耐性の促進の結果、鼻炎にかかる可能性は非常に大きく低下する。ワクチン投与により、インビトロ及びインビボに於いて相同的（同一サブグループの）野生型ウイルスを中和することができる、宿主由来の血清及び分泌型抗体が検出可能なレベル存在するようになる。多くの例では、宿主抗体はまた異なる、非ワクチンサブグループの野生型ウイルスも中和するだろう。
【０３４０】
好ましい発明のPIVワクチン候補は、ヒト体内を自然に循環している野生型ウイルスに比べ毒性の非常に大きな低下を示す。ウイルスは十分に弱毒化されており、免疫化された多くの個体では感染症状は出現しないだろう。一部の例に於いては、弱毒化ウイルスはまだ未ワクチン接種個体に対し播種能力を持っているだろう。しかし毒性は十分に減弱化されていることから、ワクチン接種された、又は偶発的に感染した宿主についても重症下部気道感染は起こらないだろう。
【０３４１】
PIVワクチン候補の弱毒化のレベルは、例えば免疫化された宿主の気道に存在するウイルス量を定量化すること、及び野生型PIVまたは候補ワクチン株として評価されるその他の弱毒化PIVにより産生される量と比較することで決定できるだろう。例えば、発明の弱毒化ウイルスは、高度に感受性である宿主、例えばチンパンジーに於いて、野生型ウイルスの複製レベルに比べ複製の制限がより強く、例えば10ないし1000倍少ない。上部気道でのウイルス複製と関連する鼻炎の発生をさらに少なくするためには、理想的なワクチン候補ウイルスは上部及び下部気道両方で複製が制限されなければならない。しかし、発明の弱毒化ウイルスは個体をワクチン接種した個体に対し防御を付与するのに十分な程度にヒトに対し感染性であり且つ免疫原性である。
【０３４２】
発明のワクチンにより誘導される免疫のレベルもまた分泌型及び血清抗体を中和する量を測定することでモニターできる。これら測定値に基づき、必要に応じワクチン投与量を調整でき、又はワクチン投与を繰り返し所望の防御レベルを維持することができる。更に、異なるレシピエントグループに関しては異なるワクチンウイルスも有益であろう。例えば、T細胞エピトープに豊富な追加蛋白質を発現している遺伝子工学PIV下部は特に、乳児よりも成人にとって有益であろう。
【０３４３】
発明の更に別の観点では、PIVは気道の一過性遺伝子治療のためのベクターとして利用される。本発明によれば、組換え体PIVゲノム又はアンチゲノムは所望する遺伝子産物をコードすることができる配列を取り込む。所望遺伝子産物は、PIV発現をコントロールするものと同一又は別種のプロモーターの制御下にある。組換え体PIVゲノム又はアンチゲノムをN、P、L及びその他所望PIV蛋白質とを共発現することで産生され、且つ所望の遺伝子産物をコードしている配列を含んでいる感染性PIVが患者に投与される。
【０３４４】
投与は典型的にはエアゾール、噴霧器又はその他局所適用方により治療を受ける患者の気道に行われる。組換え体PIVは治療又は予防レベルの所望遺伝子産物の発現をもたらすのに十分な量投与される。この方法により投与される代表的遺伝子産物は好ましくは一過性の発現に好適であり、例えばインターロイキン−２、インターロイキン−４、ガンマ−インターフェロン、GM-CSF、G-CSF、エリスロポイエチン及びその他サイトカイン、グルコセレブロシダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンス制御因子（CFTR）、ヒポキサンチン−グアニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ、サイトトキシン、腫瘍抑制遺伝子、アンチセンスRNAｓ及びワクチン抗原が含まれる。
【０３４５】
以下実施例は例示、非限定的に提供される。これら実施例は上記方法による非相同的抗原性決定基を１またはそれ以上有する代表的なキメラPIVsの構築体を描写する。実施例の一つでは麻疹ウイルスのHA遺伝子が、JS野生型又はHPIV3弱毒化ウイルスの３遺伝子の接続部の１つ、即ちN/P、P/M又はHN/L接続部の１つに外部遺伝子として挿入され、組換え体キメラウイルスが回収される。
【０３４６】
HPIV3遺伝子中の３カ所の位置への麻疹HA遺伝子の挿入は、外部病原性からの抗原決定基をPIVベクター内に移動するの有用な構築体の範囲を例示する。更に、異種遺伝子発現の近接修飾を考慮すると、より3’リーダーに近い挿入遺伝子単位は、より遠位に位置する同一遺伝子単位に比べより高いレベルで転写され、発現されるだろう（Collinsら、第３版、In”Fields Virology”, B.N.Fields, D.M.Kinpe, P.M. HOwley, R.M.Chanock, J.L. Melnick, T.P. Monath, B. Roizman, 及びS.E.Staus, 編集、Vol.1、pp.1205-1243、Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996）。
【０３４７】
野生型のrHPIV3をバックグランドとする麻疹ウイルスHA挿入を持つキメラrHPIVはインビトロでは効率的に複製したが、ハムスター体内ではそれが由来したrHPIV3ウイルスに比べ複製は制限された。同様に減弱かrHPIV3をバックグランドとした麻疹ウイルスHA挿入体を持つ組換え体キメラHPIV3もインビトロでは複製するが、ハムスター体内ではそれが由来する弱毒化rHPIVcp45L変異体ウイルスに比べるとそのレベルは若干低かった。
【０３４８】
N/P又はP/M接続部に麻疹ウイルスHA挿入体を持つ弱毒化rHPIV3麻疹ウイルスHA組換え体に感染した細胞により発現されるHA蛋白質の量は極めて多く、未変性麻疹ウイルスに感染した細胞に見られるものより遙かに多い。ハムスター上気道では、N/P又はP/M接続部に麻疹ウイルスHA挿入体を持つrHPIV3cp45Lの複製レベルはrHPIV3-cp45L親ウイルスに比べ10倍低いことから、遺伝子挿入が予想外にHPIV3ベクターの弱毒化に寄与できることが示唆された。特異的宿主域を特定するこれら結果は予想外のものであった。
【０３４９】
試験した各組換え体キメラウイルスはいずれも、高いレベルのHPIV3及び麻疹ウイルスに対する抗体を誘導したことは重要である。HA挿入を持つ弱毒化組換え体キメラHPIV3で免疫された動物は、HPIV3攻撃ウイルスの複製に対し極めて耐性であった。野生型麻疹ウイルスはハムスター内では効率的に複製せず、従って攻撃に利用できないが、弱毒化組換え体キメラワクチンの予防効率は高いレベルの中和抗体の誘導より容易に見て取れる。これらレベルはヒトでの麻疹に対する高いレベルの抵抗性に関係している（Chenら、I.Infect.Dis.162.1036-42,1990）。
【０３５０】
更に、HPIV3のバックボーンと１またはそれ以上のHPIV1の抗原性決定基を組み合わせ持つ弱毒化キメラ組換え体HPIVベクターは追加の外来抗原（例えばHPIV2又は非PIVウイルス）を発現させるベクターとしても利用できる。発明のこの観点は、HPIV3バックボーンの効率的増殖及び優れた弱毒化特性の利点を利用し、HPIV1及びHPIV2により例示される様な複数の病原体の抗原決定基を持たせる。
【０３５１】
rPIV3-1（HPIV1の主要抗原を持つ非減弱化組換え体）又はrPIV3-1cp45（HPIV1主要抗原を持つ減弱化組換え体）をコードしているcDNAを、HPIV1のF及びHNのORFを含む遺伝子単位の間にHPIV2のORFを含む遺伝子単位を挿入し修飾した。rPIV3-2HN及びrPIV3-1cp45.2HNと命名された組換え体キメラウイルスは容易に回収され、組織培養中に効率的に複製した。各ウイルスは、そのrPIV3-1又はrPIV3-1cp45親ウイルスと同レベルのインビトロに於ける複製の温度感受性を示した。
【０３５２】
PIV2HNの挿入は、ハムスターではrPIV3-1及びrPIV-cp45ウイルスのいずれについても弱毒化したが、この所見は麻疹ウイルスHAをrJS内及びrPIV3cp45内に挿入した時のものに似ていた。これらPIV2HN遺伝子挿入体を持つ抗原性rPIV3-1組換え体でハムスターを感染させると、HPIV1及びHPIV2の両方に対し反応する血清抗体反応を誘導した。
【０３５３】
即ち、弱毒化rHPIV3又はrHPIV3-1ワクチン候補は感受性宿主の上気道に感染し、それにより外部遺伝子単位から発現された外来性防御抗原及びHPIVベクター自体に対する強力な抗体反応を誘導するベクターとして利用できる可能性がある。HPIVには有意な交叉防御を提供しない３種類の抗原血清型が存在していることから、それぞれが同一または各種異種抗原決定基、例えば防御抗原、麻疹ウイルス又は１あるいはそれ以上の異なるウイルス、あるいいは細菌病原体の抗原性ドメインあるいはエピトープを持つHPIVの抗原性的に異なる変異体を利用することで、より効率的且つ連続的にヒト乳児を免疫することができる。
【０３５４】
連続免疫感作により外来蛋白質に対する一次免疫反応の発生が可能となり、この反応は１またはそれ以上の異種抗原決定基、例えば麻疹ウイルス、又は１あるいはそれ以上の異なるウイルス、あるいは細菌病原体の防御抗原、抗原性ドメイン又はエピトープを持つ二次的な、抗原的に異なるHPIVに引き続き感染することでさらに促進される。この様にして、１種類のHPIVベクターに対し誘導された免疫は、抗原的に異なるHPIVベクターによる追加免疫により迂回することができる。
【０３５５】
この意味に於いてPIV3に対し免疫される動物の免疫感作は、弱毒化PIV3-1ワクチン候補により成功裏に達成され、例えこれらPIVがHNやF以外の蛋白質を共有している場合でも、血清学的に異なるPIVウイルスにより連続免疫感作できることが確認された（Taoら、Vaccine 17: 1100-8, 1999）。本研究では、PIV1攻撃に対するrPIV3-1.cp45Lの免疫原性及び有効性は、PIV3による事前免疫有り無しのハムスターにて検証された。rPIV1-1.cp45Lは野生型又は弱毒化PIV3に事前感染したハムスターには効率的に感染したが、PIV3免疫動物ではrPIV3-1.cp45Lウイルスの複製は約５倍低下した。
【０３５６】
しかしPIV3-免疫動物をrPIV3-1.cp45Lにて免疫感作すると、PIV1に対し反応する各種血清抗体が誘導され、PIV1攻撃ウイルスの複製は下部気道では1000倍、上部気道では200倍低下した。これらの結果は、組換え体キメラrPIV3-1.cp45L候補ワクチンがPIV3に対し免疫された動物においてさえもPIV1に対する免疫を誘導できることを示している。これにより生弱毒化PIV3ワクチンに続いて組換え体キメラrPIV3-1.cp45L又はその他PIVワクチンウイルスが投与される、連続免疫スケジュールを利用することの実効性が確立された。
【０３５７】
rPIV3-1.cp45Lは容易にそれ自体に対する防御免疫を誘導したことから、それはそれ自身保有しているその他のベクター化防御抗原に対しても効果的な免疫反応を誘導するだろう。また、PIVs及びRSVは気道に再感染できるという珍しい特性を持っているが、一般的に再感染は重症の病気と関係しない。即ち発明のワクチン構築体をベースとしたベクターは、同一HPIVベクターの第２、第３又は第４投与、あるいは異なるベクターの連続利用により免疫反応を促進するのに有用である。
【０３５８】
発明の好適な連続ワクチン接種法では、乳児をそれぞれが麻疹ウイルスHAの様な同一の異種抗原決定基を発現している各種PIVベクターで連続的に免疫されることが望ましい。この連続免疫により、二次抗体反応の特徴である異種蛋白質に対する高い力価の抗体が誘導できる。実施態様の一つでは、初期乳児（例えば2-4月齢乳児）は異種抗原決定基、例えば麻疹ウイルスHA蛋白質を発現している弱毒化キメラHPIV3で免疫され、そして同時にHPIV3に対する免疫反応の誘導に適応する。この目的に有用なワクチン候補の１例は、rcp45L(HA P-M)組換え体である。
【０３５９】
続いて、例えば４ヶ月齢時に乳児に再度、初回とは抗原性が異なる別種の二次PIVベクター構築体により免疫を行う。この目的でのワクチン候補例は麻疹ウイルスHA遺伝子及びHPIV1抗原決定基をベクターの機能的、真性糖タンパク質として発現しているrPIV3-1cp45Lウイルスである。初回ワクチン接種後、ワクチンはPIV3 HN及びF蛋白質の両方及び麻疹HA蛋白質に対する一次抗体反応を惹起するが、PIV1 HN及びF蛋白質に対する反応は惹起しない。PIV1 HN及びF蛋白質に対する抗体が無いためワクチン接種者は麻疹ウイルスHAを発現しているrPIV3-1cp45Lによる二次免疫感作により容易に感染し、PIV1 HN及びF防御抗原に対する一次抗体反応と異種麻疹ウイルスHA蛋白質に対する高力価の二次抗体反応の両方を誘導する。
【０３６０】
１又はそれ以上のここに記載のキメラワクチンウイルスにより免疫がHPIV3、続いてHPIV2に対し惹起される、同時に麻疹又はその他非PIV病原体に対する一次、続いて二次の高力価防御反応をシュミレーションする連続免疫スケジュールも開発できる。好ましくは一次及び二次ベクターとして別の血清型PIVを使用するこの連続免疫法は、１血清型のみを持つベクターの有効性を究極的に限定する因子である一次ベクターに対し誘導される免疫を効果的に迂回する。
【０３６１】
更に発明のこの観点によれば、典型的協調型ワクチン接種プロトコールは、同時に投与される２、３、４及び６種類またはそれ以上の独立したキメラHPIVワクチンを一次ワクチン接種段階、例えば１、２又は４ヶ月齢に取り込むだろう（例えば、多特異的ワクチン混合体）。例えば、RSVサブグループAのG蛋白質、RSVサブグループAのF蛋白質、RSVサブグループBのG蛋白質、RSVサブグループBのF蛋白質、麻疹ウイルスのHA蛋白質、及び／又は麻疹ウイルスのF蛋白質より選択された１またはそれ以上の抗原決定基（即ち、全抗原、免疫原性ドメイン、又はエピトープ）を別々に発現している２またはそれ以上及び全パネルのHPIVを部０巣としたワクチンウイルスが投与できる。
【０３６２】
これら同一のPIV3-をベースとしたワクチン構築体の協調ブースター投与は２月齢時にも繰り返すことができる。続いて、例えば４月齢時に2-6あるいはそれ以上の抗原性が異なる（ベクター抗原特異性を参照し）生弱毒化HPIVベースワクチンウイルスの別パネルを二次ワクチン接種段階にて投与することができる。例えば、二次ワクチン接種はサブグループＡ由来のRSV G、サブグループＡ由来のRSV F、サブグループB由来のRSV F、サブグループB由来のRSV G、麻疹ウイルスHA及び／又は麻疹ウイルスF、あるいはこれら蛋白質のいずれかの組み合せに由来する抗原決定基を集合的に発現する、複数のHPIV3-1ワクチン構築体を含む混合体、または複数の製剤の同時投与が含まれるだろう。
【０３６３】
この二次免疫感作は、異種RSVのそれぞれ及び麻疹ウイルス蛋白質、又はその抗原決定基に対する免疫に対するブーストを提供する。６ヶ月齢時にはサブグループＡ由来のRSV G、サブグループＡ由来のRSV F、サブグループB由来のRSV G、サブグループB由来のRSV F、麻疹ウイルスHA及び／又は麻疹ウイルスF、あるいはそれらの抗原決定基を別々または集合的に発現する、1-6種類またはそれ以上の異なる生弱毒化PIV3-2ベクターベースワクチン組換え体を投与することを含む第３ワクチン接種段階を協調的に投与することができる。
【０３６４】
随意、ワクチンプロトコールのこの段階ではrPIV3及びrPIV3-1ワクチンはブースター製剤の形で投与してもよい。この様にして最初の乳児期６ヶ月間に、PIV1、PIV2、PIV3、RSV A、RSV B及び麻疹ウイルスに対する二次抗体全てに強力な免疫特性が誘導され、これらは複数のウイルス性呼吸器病原体に対する二次抗体反応を誘導でき、初期乳児期に於ける３種類の各PIVウイルス及びその他病原体に対する免疫化に必要とされる非常に強力であり、かつ極めて柔軟性に富む免疫感作法を提供する。
【０３６５】
発明の別の観点では、異種ヌクレオチド配列がHPIVワクチン候補に挿入され、候補ワクチン組換え体の弱毒化のレベルを、例えば上部気道に関し別々に変化させる。即ち、rHPIV内に外来蛋白質の発現と動物宿主でのウイルスの弱毒化の両方を行うヌクレオチド配列を挿入するか、又はヌクレオチド挿入を別々に利用し候補ワクチンウイルスを弱毒化することができる。弱毒化に関する遺伝子挿入の効果を支配する規則の幾つかを規定するために、様々な長さの遺伝子単位を野生型HPIV3バックボーンに挿入し、遺伝子単位の長さの弱毒化に及ぼす作用を調べた。これら新規の遺伝子単位の挿入はその遺伝子の発現蛋白質の効果とは独立して遺伝子単位の長さの効果を評価できる様に、有意なORFを含まない様に工夫されている。
【０３６６】
これら異種配列はHN及びL遺伝子の間に、169ntから3918ntの大きさの外部遺伝子として挿入された。更に同様の大きさの挿入体がHN遺伝子の3’非コーディング域に挿入され、従って外部遺伝子の付加を含まないコントロールcDNA構築体及びウイルスが作られた。これらウイルスを作り、弱毒化への遺伝子長及び遺伝子数が増すことの影響を調べた。外部陰電子単位の挿入は、挿入部位の下流にある遺伝子の転写を低下させると考えられ、さらにこれは発現蛋白質の全体量及び割合の両方に影響するだろう。
【０３６７】
ここに示す様に、約3000nts長以上の挿入体又は延長体は、ハムスターの上部及び下部気道に関し生型ウイルスを弱毒化した。長さ約2000ntsの遺伝子挿入は更に上部気道に関しrHPIV3cp45Lワクチン候補を弱毒化した。まとめると、遺伝子挿入は候補ワクチンウイルスの弱毒化及び二次ウイルスに対する防御効果の誘導の両方に関する二重作用を有することができる。追加蛋白質を発現できない遺伝子の3’-非翻訳域の遺伝子延長もまたその内部及びそれ自体を弱毒化する。発明のこれら方法では、遺伝子挿入の長さは弱毒化の決定因子である。
【０３６８】
発明の組換え体PIV内のGU及びNCR挿入は、インビトロでの効率的複製とインビボでの複製低下を特徴とする表現形の弱毒化をもたらすが、この表現形は他のパラミクソウイルス挿入について従来報告されたことはない。GU素入の結果もたらされる弱毒化のメカニズムは、以下のインビボで主に作用する１またはそれ以上の因子の結果であろう。プロモーターから離れている遺伝子に比べ、プロモーターにより近い遺伝子の方が高率に転写される転写勾配が存在することから、外部遺伝子単位を付加することはは下流遺伝子の転写レベルを下げるだろう。下流遺伝子の発現低下はそれらのmRNAs量の減少によるものであり、その結果それら遺伝子産物が制限されるか又は効率的複製に必要とされる遺伝子産物の特異的比率が変化して、弱毒化が起こるのだろ。
【０３６９】
転写勾配は転写中及び遺伝子接合部を越えた移動中に於ける転写複合体の脱落の結果でると考えられている。あるいは、転写されたゲノム及び外部mRNAsの全長が増加した結果生成されたウイルス二重鎖RNAのレベルが増し、それによりインターフェロンシステムの抗ウイルス活性レベルはより高くなるだろ。最後に、ゲノム複製の全体レベルは、ゲノム長及びアンチゲノム長の増加によって減少するだろう。これはゲノムRNA又はアンチゲノムRNA複製中に鋳型からレプリカーゼ複合体が脱落スル結果と考えられる。ビリオン中にパッケージングできるゲノム量が減少すると、ウイルスの収率が低下し、その結果弱毒化がもたらされるのだろう。
【０３７０】
NCR素入の結果起こる弱毒化のメカニズムは、以下の要素の１つ又はそれ以上の結果であろう。NCR挿入の結果NHmRNAの3’末端に余分な長さが生じたことでmRNAが不安定化し、これによりHN蛋白質の発現が低下するだろう。又は、HNmRNAのゲノム全長が増したこと、及び余分な長さにより生成されるウイルス二重鎖RNAのレベルが増し、これがインターフェロンシステムの抗ウイルス活性を増加させるかもしれない。
【０３７１】
あるいはまたはこれらに加え、ゲノム複製の全体レベルがゲノム及びアンチゲノムの長さが増したことで低下するかもしれない。その結果、ゲノムRNA又はアンチゲノムRNA複製中に以外からレプリカーゼ複合体の脱落が起こるかもしれない。ビリオン内にパッケージングできるゲノム量が減少した結果、ウイルス収量も低下し、その結果弱毒化する可能性がある。最後に、HNゲノムの3’末端への余分なヌクレオチドの付加は、HN遺伝子の3’末端にある余分なヌクレオチドを転写している間に転写複合体が以外から脱落する可能性があるために、下流遺伝子の転写レベルが下がる可能性がある。
【０３７２】
PIV3へのGU及びNCR挿入のインビトロ及びインビボ増殖特性は、上記引用の１本差型マイナス−センスRNAウイルスに関する従来所見とは異なっている。これまで試験された挿入について発現蛋白質を検証した結果、インビボでのウイルス増殖に対する挿入長の独立効果は決定できなかった。最近の所見は、3kb以上の大きさのGU及びNCR挿入は、発現蛋白質とは無関係に減弱表現形を規定することが示されている。例えば約2kbより大きな挿入の様なより短い挿入は、部分的に弱化されたレシピエントでの更なる弱毒化を規定する。
【０３７３】
同様に予想外にもGU及びNCRの挿入は、インビトロでの複製を制限することなくインビボでの複製の制限している。更にインビボでの弱毒化表現形は、挿入がGU又はNCR挿入のいずれかの形にある場合に見られた−他の報告挿入例はGU型のみである。即ち、蛋白質をコードしないGU又はNCRの挿入により明示されるインビボでの複製低下は、インビボでのモノネガウイルスのメンバーを減弱する独特の方法を表す。
【０３７４】
実施例１
キメラHPIV3/麻疹ウイルス-HAアンチゲノムをコードするcDNAクローンの構築及び感染性ウイルスの回収
JSPIV3wtウイルスの15462ヌクレオチドアンチゲノムをコードしている完全長cDNAクローン、p3/7(131)2G+、及びPIV3のL ORF中に３種類のcp45-特異的温度感受性変異を含んでいるJSwt誘導体のアンチゲノムをコードしているpFLCcp45Lは既に記述されている（Durbinら、Virology 235:323-332, 1997a; Skiadopoulosら、J. Virol.72:1762-8, 1998、共に参照されここに取り込まれている）。
【０３７５】
これらクローンは麻疹ウイルスのHA遺伝子の挿入に適したベクターとして利用され、野生型及びHA蛋白質を代表とする麻疹ウイルスの異種抗原決定基を発現している弱毒型HPIV3キメラ構築体が作製された。麻疹のHA遺伝子を含む各挿入体の大きさは６の倍数であり、cDNAから回収されたキメラウイルスは６の規則に従っていた（Durbinら、Virology 234:74-83, 1997b、参照されここに取り込まれている）。
【０３７６】
N/P又はP/M接合部に麻疹ウイルスのHA蛋白質をコードしている完全長キメラHPIV3cDNAsの構築
p3/7(131)2G+（PIV3アンチゲノムのnt1215-3903）のPmlIからBamHI断片を、マルチクローニング領域内にPmlI部位を含む様に改良されたプラスミドpUC119｛pUC119(PmlI-BamHI)｝内にサブクローニングした。クンケル法を用い（Kunkelら、Methods Enzymol. 154:367-382, 1987、参照されここに取り込まれている）pUC119に対し２つの独立した単鎖型変異誘導反応を実施した；最初の反応はアンチゲノムのnts1677-1682にあるCTAAAT配列をCTTAG(pAFlIIM-P)に変異することでN遺伝子の3’（下流）-非コーディング域内にAflII部位を導入した、そして第２の別反応は、アンチゲノムのnts3693-3698にあるTCAATC配列をCTTAAG(pAflIIP-M)に変異することでP遺伝子の3’（下流）-非コーディング域内にAflII部位を導入した。
【０３７７】
麻疹ウイルスエドモンストン（Edmonston)株のHA ORFを逆転写ポリメラーゼチェインリアクション）（RT-PCR）を使い、エドモンストン野生型ウイルスから増幅した。エドモンストン野生型HAのオープンリーディングフレーム（ORF)のnt配列はジーンバンク登録番号U03669であり、参照されここに取り込まれている（本配列は上流の3nts又は停止コドンのみ含まないORFであることに注意）。麻疹ウイルスRNAはTRIzol-LS（ライフテクノロジー、ガイサーブルグ、MD）をメーカー推奨方法に従い用いて、清浄培地から精製された。RT-PCRはAdvantageRT-for-PCR及びAdvantage-HF PCRキット（クローンテック、パロアルト、CA)を推奨プロトコール通りに使い、実施した。
【０３７８】
プライマーを利用し、PIV3非コーディング配列及びAflII制限酵素部位に接続した麻疹ウイルスHA遺伝子の全ORFをカバーするPCR断片を生成した。正方向プラマー5’-TTAATCTTAAGAATATACAAATAAGAAAAACTTAGGATTAAAGAGCGATGTCACCACAACGAGACCGGATAAATGCCTTCTAC-3’（配列番号13）は、GE、IG及びGS配列（図1A）及びプライマー内に明示された３種類の非HPIV3、非麻疹ウイルスntsが先行する麻疹HA ORF（太字）の開始部分を含み、N/P遺伝子接合nts3699-3731（下線部）由来のPIV3非コーディング域の下流にAflII部位（イタリック）をコードしている。
【０３７９】
逆向きプライマー5’-ATTATTGCTTAAGGTTTGTTCGGTGTCGTTTCTTTGTTGGATCCTATCTGCGATTGGTTCCATCTTC-3’（配列番号14）はnt3594-3623のP遺伝子（下線）に由来するPIV3非コーディング配列の下流にAflII部位（イタリック）を、そして麻疹HAのORF（太字）をコードしている。得られたPCR断片は次にAflIIで消化され、p(AflII N-P）及びp(AflII P-M）内にクローン化され、それぞれpUC119(HAN-P)及びpUC119(HAP-M)が作製された。
【０３８０】
pUC119(HA N-P)及びpUC119(HA P-M)はdローダミンターネーターサイクルシークエンシングレディー反応（dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction)(ABIプリズム、PEアプライドバイオシステムス、フォスターシティー、CA）を用い全AflII挿入体について配列決定され、配列が正しいことが確認された。
【０３８１】
PUC119（HA N-P）及びｐUC119(HA P-M)のPmlIからBamHIの断片は、既報の如くに完全長アンチゲノムcDNAプラスミドp3/7(131)2G+内に別々に挿入され（Durbinら、Virology 235:323-332, 1997a、参照されここに取り込まれている）、pFLC(HA N-P)及びpFLC(HA P-M)（図１）を生成した。次にPFLCcp45LのXhoI-NgoMI断片（nt7437-15929）をpFLC(HA N-P)及びpFLC(HA P-M)Xho-I-NgoMI両方のウインドウにクローン化してpFLCcp45(HA N-P)及び(pFLCcp45L(HA P-M)を作成した。PCLCcp45LはPIV3cp45のL遺伝子内にあり温度感受性の大部分及びcp45ワクチン候補ウイルスの弱毒化を付与している（Skiadopoulosら、J.Virol.72:1762-8、1998、参照されここに取り込まれている）３アミノ酸の変化（アミノ酸位置、942、992及び1558）、及びこれら変異が移入されたXhoI-NgoMI断片の転移体をコードしている。
【０３８２】
HN/L接合部に麻疹のHAタンパク質をコードしている完全長HPIV3キメラcDNAの構築
HPIV3キメラcDNAは、麻疹ウイルスの異種抗原決定基をコードする麻疹ウイルスHA遺伝子により例示される異種ポリヌクレオチド配列を、転写シグナル及びHPIV3NH遺伝子の非コーディング域に並ぶようにPCRを用い構築された。このcDNAは次のHN遺伝子に続き外部遺伝子としてrPIV3ベクターと組み合わされる様に設計された。まずKunkelの突然変異誘導法（Kunkelら、Methods Enzymol. 154:367-382, 1987、参照されここに取り込まれる）を利用し、アンチゲノムのnt8598-8603にあるAGACAA配列に突然変異を誘導し、StuI部位をHN遺伝子の3’-非コーディング域内に導入してプラスミドp3/7(131)2G-Stu（図1B）を得た。
【０３８３】
HPIV3配列に並列して麻疹HAのORFを含むcDNA（図1B参照）を次にPCRを利用して３片に分け構築した。第１PCRは遺伝子の左手、上流部を合成した。正方向プライマー5’-GACAATAGGCCTAAAAGGGAAATATAAAAAACTTAGGAGTAAAGTTACGCAATCC-3’（配列番号15）はHN遺伝子の下流末端、遺伝子間領域、及び遺伝子開始シグナルを含む（HPIV3nts8602-8620）HPIV3配列（下線）が続くStuI部位（イタリック）及びHN遺伝子（HPIV3nt6733-6753）の上流末端に由来する配列を含む。
【０３８４】
逆向きプライマー5’-GTAGAACGCGTTTATCCGGTCTCGTTGTGGTGACATCTCGAATTTGGATTTGTCTATTGGGTCCTTCC-3’（配列番号16）は、上流のHN非コーディング域の一部であるHPIV3nts6744-6805に対する相補配列（下線）が続いている、麻疹HA ORF（太字）の開始部の下流にMluI部位（イタリック）を含んでいる。導入された麻疹ウイルスORF内にあるMluI部位はnt27をT（野生型エドモンストンHA遺伝子）からCに、そして30をCからGに変化させることで作成された。
【０３８５】
これら変化はいずれも麻疹ウイルスORF内の非コーディングである。PCRはp3/7(131)2G-Stuを鋳型に用いて実施された。PCR断片１と命名された産物は5’末端にStuI部位を、3’末端にはMluI部位が並列しており、HPIV3HN遺伝子に由来する非コーディング配列の下流にある麻疹HAのORFの先頭36ntを含む。
【０３８６】
第２PCR反応は、HN遺伝子の右手を合成した。正方向プライマーGTAGAACGCGTTTATCCGGTCTCGTTGTGGTGACATCTCGAATTTGGATTTGTCTATTGGGTCCTTCC-3’（配列番号16）はXmaI（イタリック）及び麻疹HAのORFの末端（太字）を含み、更にこれにHN遺伝子の下流非翻訳領域の一部を表すHPIV3nts8525-8566（下線）が続く。逆向きプライマー5’-CCATGTAATTGAATCCCCCAACACTAGC-3’（配列番号17）はL遺伝子内にあるHPIV3nts11475をカバーしている。
【０３８７】
PCRの鋳型はp3/7（131）2G-Stuであった。本反応より得られたPCR断片２は麻疹HAのORFの末端35nt及びPIV3のL ORFの約2800ntを含み、XmaI部位とSphI部位がそれにつながっている（これらは天然にはHPIV位置11317に生じる）。第３PCR反応はATCCが供与された麻疹ウイルスのエドモンストン株のHA ORFを含むプラスミドである鋳型cDNApTM-7より麻疹HA ORF中もっとも大きな中部分を増幅した。このプラスミドの配列分析は、N-P及びM-P接合部内への挿入に使用したPTM-7に含まれている麻疹ウイルスのHA ORFが、エドモンストン野生型HA配列のpTM-7と異なる２アミノ酸を含むこと、そしてこれらがアミノ酸位置46（FからSへ）及び位置481（YからN）にあることを示した。
【０３８８】
正方向プライマー5’-CGGATAAACGCGTTCTACAAAGATAACC-3’（配列番号18）（MluI部位イタリック）及び逆向きプライマー5’-CGGATAAACGCGTTCTACAAAGATAACC-3’（配列番号18）（XmaI部位イタリック）は麻疹HA ORFのnts19-1838を含むPCR断片３を増幅した。
【０３８９】
この断片を組み立てるために、PCR断片１をStuI及びMluIで消化し、PCR断片３をMluI及びXmaIで消化した。次にこれら２消化断片を３重連結によりそのマルチクローニング領域内にStuI部位を持つように修飾されたpUC118のStuI-XmaIウィンドウ内にクローン化した。得られたプラスミドpUC118（HA1+3）はStu1及びXmaIで消化し、一方PCR断片２はXmaI及びSphIで消化した。
【０３９０】
２種類の消化産物を次にp3/7(131)2G-StuのStuI-SphIウインドウ内にクローン化し、プラスミドpFLC(HA HN-L)を得た。全麻疹HA ORFを含むStuI-SphI断片を次にｄローダミンターミネーターシークエンシングレディー反応（dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction）（ABIプリズム、PEアプライドバイオシステム、フォスターシティー、CA）を使い配列改正した。キメラ構築体の配列を確認した。この様にして、HPIV3転写シグナルに並列する麻疹ウイルスのHA ORFを外部遺伝子として、野生型HPIV3を含むアンチゲノムcDNAベクターのN/P、P/MまたはHN/L接合部内、または弱毒化HPIV3を含むアンチゲノミックcDNAベクターのN/PまたはP/M接続部内に挿入した。
【０３９１】
キメラrPIV3野生型及び麻疹ウイルスのHA蛋白質を発現しているrcp45Lの回収
独立遺伝子として麻疹HA ORFを持つ５種類の完全長ベクターcDNAを別々に、６ウエルプレート（コースター、ケンブリッジ、MA）上にてサポートプラスミド｛pTM(N)、pTM(P no C)及びpTM(L)｝及びリポフェクトA（LifofectA）（ライフテクノロジーズ）と共にHep-2細胞内にトランスフェクションし、そして既報の如く（Durbinら、Virology 235:323-332, 1997；Durbinら、Virology 234:74-83, 1997、それぞれ参照されここに取り込まれる）細胞にバクテリオファージT7ポリメラーゼ蛋白質をコードしている複製欠損ワクシニアウイルス組換え体であるMVA-T7で同時感染させた。
【０３９２】
PTM(P no C)はC開始コドンの変異によりC ORFの発現が沈黙しているpTM(P)の誘導体である（Durbinら、Virology 261:319-330,1999）。32℃にて３日間インキュベーションした後、トランスフェクションハーベストをT25フラスコ中の新規単層Vero細胞に継代し、さらに32℃にて５日間インキュベーションした（継代１とする）。継代１中のHPIV3の存在は、既報に従い（Durbinら、Virology 235:323-332, 1997、参照されここに取り込まれている）HPIV3 HN-特異的、及び麻疹HA特異的モノクローナル抗体を使った免疫パーオキシダーゼを利用してLC-MK2単層培養体のプラーク力価測定を行い決定した。
【０３９３】
適当な継代１ハーベスト上清中に存在しているｒPIV3(HA HN-L)ウイルスは、既報の如く（Hallら、Virus Res. 22:173-184, 1992、参照されここに取り込まれている）LLC-MK2細胞上でプラーク精製を３回繰り返し生物学的にクローン化した。RPIV3(HA N-P)、rcp45L（HA N-P）, rPIV3(HA P-M)及びrcp45L(HA P-M)はVero細胞単層の96ウエル型プレート（希釈あたり12ウエル）での連続２倍希釈を利用した最終希釈により、それぞれの継代１ハーベストから生物学的にクローン化された。
【０３９４】
次にプラーク精製を３ヵ回繰り返し、あるいは最終希釈を２回または３回繰り返し得た生物学的にクローン化された組換え体ウイルスを32℃にてLLC-MK2細胞｛rPIV3(HA HN-L)またはVero細胞｛rPIV3(HA N-P), rcp45L(HA N-P), rPIV3(HA P-M), rcp45L(HA P-M)｝内で２回増幅し、その後の解析用のウイルスを作成した。麻疹ウイルスのHA糖蛋白質を発現している組換え体キメラPIV3sを確認し、解析する第１段階として、核継代１ハーベストを３種類の異なるプライマーペア：HA ORF挿入体それぞれの位置について１ペアを使ったRT-PCRで分析した。第１プライマーペアはN/P挿入部位を含む完全長HPIV3ゲノムのヌクレオチド1596-1968をカバーするPIV3の断片を増幅した。
【０３９５】
この断片の大きさは、N及びP遺伝子の間に挿入されたHA ORFのため2298ヌクレオチドに増加した。第２プライマーはP/M挿入部位を含む完全長HPIV3ゲノムのヌクレオチド3438-3866をカバーするPIV3の断片を増幅した。P及びMの間に挿入された麻疹HA ORFによって、この断片の大きさは2352ヌクレオチドに増加した。第３プライマーペアは、完全長アンチゲノムのヌクレオチド8466-8649をカバーするPIV3断片を増幅した。HN及びL遺伝子の間に挿入された麻疹HA ORFにより、この断片の大きさはHN/L挿入部位を含む2211ヌクレオチドに増加していた。回収された５ウイルスは全て適当な部位に適当な大きさの挿入体を含んでいた。各PCR産物の生成は逆転写酵素を含むことに依存しており、それぞれがRNAに由来するものであり、汚染cDNAに由来するものでないことを示唆していた。
【０３９６】
T25フラスコ内のLLC-MK2細胞の単層をrcp45L(HA N-P) ,rcp45L(HA P-M) ,RJSにより多重度(MOI)５により感染させるか、模擬感染させた。T25フラスコ内のVero細胞の単層は、MOI５で麻疹ウイルスのエドモンストン野生型株により感染させられた。麻疹ウイルスはLLC-MK2細胞ないでは良好に増殖しないことから、麻疹エドモンストンウイルス感染についてVero細胞単層を選別した。感染24時間後、単層をメチオニン抜きDMEM（ライフテクノロジーズ）により洗浄した。35SメチオニンをDMEM抜き培地に10uCi/mlの濃度で加え、各フラスコに1ml添加し、続いて32℃にて６時間インキュベーションした。細胞を集めPBSにて３回洗浄した。
【０３９７】
細胞の沈殿を1mlのRIPA緩衝液｛１％(w/v)ナトリウムでオキシコール酸、1%(v/v)TritonX-100（シグマ）、0.2%(w/v)SDS,150mM NaCl、50mM Tris-HCl, pH7.4｝に再懸濁し、凍結融解し、５分間6500Xにて遠心分離して清明にした。細胞抽出物を新しいエッペンドルフチューブに移し、麻疹ウイルスのＨＡ糖蛋白質を認識する（79-XV-V17、80-III-B2、81-1-366）（Hummelら、J．Virol．69；1913-6，1995；Sheshbcradaranら、Arch,Virol.83;251-68, 1985, それぞれ参照されここに取り込まれる）またはPIV3のHN蛋白質を認識する（101/1、402/7、166/11）（van Wyke Coelinghら、Virology 160:465-72, 1987、引用によりここに取り込まれる）モノクローナル抗体の混合液を各サンプルに加え、４℃にて２時間一定に混合しながらインキュベーションした。
【０３９８】
免疫複合体は蛋白質Aセファローズビーズ（シグマ、セントルイス、MO）の10%懸濁液を各サンプルに200μl加えることで沈殿させ、続いて一晩４℃にて一定に混合した。各サンプルを90μlの1Xローディング緩衝液中に懸濁し、10μlの還元剤を加えた。70℃にて10分間加熱した後、各サンプル20μlを4-12%ポリアクリルアミドゲル（NuPAGE、ノベックス、サンジェゴ、CA）にメーカー推奨法に従いかけた。ゲルを乾燥させ、オートラジオグラフにかけた（図２）。Rcp45L（HA P-M）及びrcp45L（HA N-P）は、正当な麻疹HA蛋白質と同一サイズである、抗麻疹HAモノクローナル抗体により沈殿した蛋白質をコードしていた。
【０３９９】
rcp45L(HA P-M)及びrcp45L（HA N-P）は麻疹ウイルスHA蛋白質を麻疹ウイルスのエドモンストン野生株に比べ大量に発現しており、これら構築体が効率よく弱毒株のN/P及びP/M接合部より麻疹ウイルスHAを発現していることが示された。rcp45L（HA N-P）及びrcp45L(HA P-M)は、PIV3抗HNモノクローナル抗体とのそれらの反応性から、HPIV3をベースとしていることが確認された。
【０４００】
インビトロに於けるRPIV3親ウイルス及びrPIV(HA)キメラウイルス複製の温度感受性
麻疹ウイルスHA挿入体を有するキメラrPIV3sの複製の温度感受性レベルを調べ、HA挿入獲得が各種温度に於ける親のベクターウイルスに比べキメラウイルスでの複製レベルを変化させているか検討した（第１表）。Rcp45L、rcp45L(N-P)、rcp45L(HA P-M)及びrPIV3(HA HN-L)、rPIV3（HA P-M）またはrJSを、96ウエルプレート中のLLC-MK2細胞単層上にて、5%FBS、4mMグルタミン、及び50μg/mlの源太邁進を添加したL-15中にて連続10倍希釈し、32、36、37、38、39または40℃にて６日間インキュベーションした。
【０４０１】
ウイルスは赤血球吸着により検出し、log10TCID50/mlとして報告した。興味深いことに、麻疹ウイルスHA遺伝子、rPIV3（HA HN-L）及びrPIV(HA P-M)を有する両野生型ベクターウイルスのキメラ誘導体は、40℃にて複製が若干制限された（第１表）。rcp45L(N-P)、rcp45L(HA P-M)を有する２種の弱毒化rPIV3は、親rcp45Lとほぼ同様の温度感受性レベルを示したが、rcp45L(HA P-M)はその親に比べ若干高い温度感受性を示した。
【０４０２】
即ち挿入体を持つウイルスは、組織培養体中ではそれが由来する親ベクターrPIV3と同等に複製し、温度感受性の上昇はわずかであった。これら結果は、rPIV3がインビトロでの複製に大きな変化をもたらすことなくHA挿入を各種部位に順応させるベクターとして容易に利用できることを示しており、またrPIV3(HA)キメラウイルスが１またはそれ以上の弱毒変異の更なる付加にも容易に順応できることを示している。
【０４０３】
【表１】
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【０４０４】
実施例II
ハムスターに於いて効率的に麻疹ウイルスを複製し、HPIV3及び麻疹の両方に対し高抗体力価を誘導する抗原決定基を持つキメラrPIV3s
ハムスターに於けるrPIV3(HA)ウイルスの複製及び免疫原性のレベルの決定
麻疹ウイルスの抗原決定基を持つキメラrPIV3sの複製レベルをそれらの親rPIV3sのものと比較し、HA挿入体により例示される決定基の獲得がインビボに於けるそれらの複製能力及び免疫反応誘導能力を大きく変えるか決定した。２種類の実験にて、６又は7-8週齢のゴールデンシリアンハムスターのグループに106.9PFUのrJS、rcp45L, rcp45L(HA P-M), rcp45L(HA N-P), rPIV3(HA HN-L)又はrPIV3(HA P-M)を含むEMEM（ライフテクノロジーズ）0.1mlを鼻内接種した(第２表及び３）。
【０４０５】
接種４日後、ハムスターを屠殺し、肺及び鼻甲介を集めた。鼻甲介及び肺は10%又は20%w/vのL-15の懸濁液中にてそれぞれホモジェナイズされ（クオリティーバイオロジカルス、ガイサーブルグ、MD）、サンプルは急速凍結された。サンプル中に存在するウイルスはLCC-MK2細胞単層の96ウエルプレート上にて力価測定され、32℃にて７日間インキュベーションされた。ウイルスは血球吸収により検出され、各ハムスターグループについて平均log10TCID50/gを計算した。HA遺伝子の野生型rJSへの挿入（第２表）は、上部気道での複製を４ないし20倍制限し、下部気道での複製を５倍まで制限したことから、HA遺伝子の獲得のハムスターに於ける野生型rJSウイルスの複製に対する効果は極僅かであることが示唆された。
【０４０６】
２種類のrcp45(HA)抗原性キメラのそれぞれの複製は、L蛋白質内に３種類の弱毒化ts変異を持つrcp45Lに比べると上部気道において10倍低かった（第３表）が、下部気道に関してはrec45Lに同じであった。即ち、２種類のrcp45(HA)抗原性キメラのそれぞれについて、ハムスターの上部気道では僅かではあるが統計有意な複製低下が認められ、rcp45LによるHA遺伝子の獲得により上部気道での弱毒化が増強されるが、下部気道ではこれが見られないことが示された。即ち、HA遺伝子挿入の野生型又は弱毒化PIV3の複製に及ぼす作用は、上部気道に関しては同等であった。
【０４０７】
【表２】
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【０４０８】
【表３】
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【０４０９】
次にキメラrHPIV3(HA)ウイルスのHPIV3及び麻疹ウイルスに対する免疫反応誘導能を調べた。6-24匹のゴールデンシリアンハムスター（4-6週齢）のグループに上記同様んして106.0PFUのrJS、rPIV3(HA P-M)、rcp45L, rcp45L(HA P-M)又は rcp45L(HA N-P)を０日目に感染させた（第４表）。血清は接種後−１日目、及び25日目に各ハムスターより集められた。HPIV3に対する血清反応は、既報（van Wyke Coelinghら、Virology 143:569-582,1985, 参照されここに取り込まれる）の如くにして、血球凝集阻害(HAI)アッセイにより評価され、そして麻疹ウイルスに対する血清抗体反応は既報同様（Goatesら、Am. J. Epidemiol. 83:299-313,1996,  参照されここに取り込む）にして60%プラーク減少アッセイにより評価された。
【０４１０】
これら結果は、10.5.0の生弱毒化麻疹ウイルス（モラタン（Moraten）株）を０日目に筋肉内投与されたコトンラットの追加コントロールグループの結果と比較された。麻疹ウイルスはハムスターに対し弱くしか感染しないことから、ハムスターではなくコトンラットを使用した。第４表に見られる様に、各PIV3(HA)キメラウイルスは麻疹ウイルスに対する大きな血清中和抗体反応を誘導できた。弱毒化誘導体rcp45L(HA P-M)及び野生型を背景とする相当体、rPIV3（HA P-M)により惹起された血清中和抗体量の間に有意差は認められなかった。更に、rPIV3(HA)組換え体により誘導された麻疹ウイルス中和血清抗体のレベルは平均して生弱毒化麻疹ウイルスワクチンで筋肉内免疫感作された場合の平均レベルに比べ５倍高かった。
【０４１１】
更に、全てのキメラウイルスにより産生されたHPIV3に対する血清抗体反応はもまた比較的大きく、野生型rJSによる感染により産生される反応に匹敵した。
【０４１２】
【表４】
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【０４１３】
25日目に、各グループ及び同様にRSVを感染させられたコントロールグループからの６匹のハムスターに生物学的に誘導されたHPIV3野生型ウイルス106.0pfuを0.1mlの接種液として鼻内投与された。４日目に肺及び鼻甲介が集められ、上記同様に処理された。サンプル中に存在するウイルスはLLC-MK2細胞単層の96ウエルプレート上で力価測定され、７日間32℃にてインキュベーションされた。ウイルスは赤血球吸収により検出され、各ハムスター群についてlog10TCID50/mlが計算された。第５表に示す通り、キメラウイルスが投与されたこれらハムスターは、弱毒化又は野生型のバックボーンであるかにかかわらず上部及び下部気道に於いて接種された野生型HPIV3の複製に対し高度に保護されていた。
【０４１４】
即ち、麻疹HA遺伝子獲得のrep45(HA)キメラウイルスの複製に及ぼす弱毒化作用は軽微であるが、rcp45L(HA P-M)又はrcp45L(HA N-P)いずれかの感染は、ハムスターの上部及び下部気道に於けるその複製を約1000倍低下させることで示される様にHPIV3に対し高いレベルの防御を誘導した。野生型麻疹ウイルスはハムスターでは効率的に複製しないため、これを利用しこの宿主を攻撃することはできない。しかし、高いレベルの中和抗体、即ち1:5000より大きな平均力価が誘導されることから、弱毒化キメラrcp45L(HA)ワクチン候補は麻疹ウイルスに対し極めて効果的であることが期待される。ハムスターでは、麻疹ウイルス抗体の同等レベルには麻疹ウイルス疾患に対し強力な耐性が付随する（Chenら、J.Infect.Dis.162:1036-42, 1990,参照されここに取り込まれる）。
【０４１５】
【表５】
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【０４１６】
実施例III
F及びHN遺伝子間に挿入外部転写／翻訳単位としてHPIV2HN遺伝子を持つキメラHPIV3-1ベクターをコードするアンチゲノムcDNAの構築、及び感染ウイルスの回収
rPIV3-1ｈHN及びF遺伝子がHPIVIのものに弛緩されている組換え体キメラHPIV3である（Skiadopoulosら、Vaccine 18:503-510, 1999; Taoら、Vaccine 17:1100-1108, 1999;米国特許出願連続番号09/083,793、1998年5月22日出願；米国特許出願連続番号09/458,813、1999年12月10日出願；米国特許出願連続番号09/459,062、1999年12月10日出願参照、それぞれ参照されここに取り込まれている）。
【０４１７】
本実施例でHPIV2のHN遺伝子は、キメラ誘導ウイルスを生ずるベクターとして機能し、HPIV2由来の導入異種抗原決定基を持ち、HPIV1及びHPIV2の両方を予防できるrPIV3-1キメラウイルス内に挿入された。HPIV2HN遺伝子はまたrPIV3-1cp45と名付けられた、15種類あるcp45変異、即ちrPIV3バックボーン内に挿入されたHN及びF以外の遺伝子にある変異のうち12種類を含むrPIV3-1の弱毒化誘導体の中にも挿入された（Skiadopoulosら、Vaccine 18:503-510, 1999）。HPIV2野生型ウイルスの源は自然HPIV2感染小児より1994年に得た鼻洗浄液より分離されたVero細胞である野生型株V9412-6（PIV2/V94と命名された）である（Taoら、Vaccine 17:1100-1108, 1999)。
【０４１８】
HPIV2/V94はFBSを含まないOptiMEM組織培養培地を利用しVero細胞での２回目の増幅を行う前に、Vero細胞上にて３回プラーク精製された。PIV2/V94のHN遺伝子のcDNAクローンは、ランダムヘキサマー及びスーパースクリプトプレアンプリフィケーション（Superscript Preamplification)システムを使用した逆転写(RT)、それに続くアドバンテージcDNA合成キット（クローンテック、パロアルト、ＣＡ）及びHN cDNAに並列しNcoI-HindIII部位を導入する合成プライマーを利用したPCRによってビリオンRNAより作製された（図3A)。
【０４１９】
これらプライマーの配列は：（大文字表示でHPIV特異的配列、下線を付した制限酵素、小文字表示で非HPIVであるか又はwtから変更されたnts、及び太字で表された開始及び停止コドン）、上流HPIV2HN5’-gggccATGGAAGATTACAGCAAT-3’（配列番号19）；下流HPIV HN5’-caataagcTTAAAGCATTAGTTCCC-3’（配列番号20）。HNのPCR断片はNcoI-HindIIIにより消化され、pLit.PIV31HNhc内にクローン化され、pLit.32HNhcが作られた（図3B)。pLit.32HNhc内のHPIV2HN異種遺伝子挿入体はThermoSequenaseキット及び32P-標識ターミネーター（ファルマシアアマシャム、ピスキャタウェイ、NJ）を使用し完全に配列決定し、正当なPIV2/94HNコーディング域の配列を含むことを確認した。
【０４２０】
pLit.32GNhe内のHPIV2HN遺伝子は更にPCR及びディープベント（Deep Vent)熱安定型DNAポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラブ、バーバリー、MA)により修飾され、p38’△PIV31hc内にある特異的PpuMI部位内にクローニングすることを目的としてPpuMI部位が導入された、図3C（Skiadopoulosら、Vaccine 18:503-510, 1999）。これらプライマーの配列は（HPIV特異配列は大文字で、関連制限部位には下線を付し、非HPIVnt又はwtから変化したntは小文字で表した）：上流HPIVHN5’-gcgatggcccGAGGAAGGACCCAATAGACA-3’（配列番号21）下流HPIV2HN5’-cccgggtcctgATTTCCCGAGCACGCTTTG-3’（配列番号22）。
【０４２１】
HPIV2 HN ORFを持つ修飾cDNAは（左から右に）5’末端にPpuMI部位を含むHPIV3 HNの一部5’-非翻訳領域（5’-UTR）、HPIV2 HN ORF、HPIV3 HNの3’-UTR、その配列がHPIV3 HN及びL遺伝子接合部の配列に適合しているHPIV3転写シグナルの完全セット（即ち、遺伝子開始、遺伝子内領域及び遺伝子終止配列）、HPIV3 Lの一部5’-UTR及び3’末端に加えられたPpuMI部位より構成される（図3C)。この断片はPpuMIにより消化され、PpuMIで消化されたp38’△PIV31hc.2HN内に挿入されp38’△PIV31hc.2HNが生成された（図3D)。
【０４２２】
挿入されたPpuMIカセットは完全に配列決定され、設計通りであることが判明した。p38’△PIV31hc.2HN由来の挿入体は8.5kbのBspEI-SphI断片として分離され、pFLC.2C+.hc又はpFLCcp45のBspEI-SphIウインドウ内に導入され、それぞれpFLC.31hc.2HN又はpFLC.31hc.cp45.2HNが生成された（図３、E及びF）。pFLC.2G+.hc及びpFLCcp45は既報の如く、それぞれwtのrPIV3-1及びrPIV3cp45を含む完全長の抗原性クローンである（Skiadopoulosら、J. Virol. 73: 1374-81, 1999; Taoら、J. Virol. 72: 2955-2961, 1998、それぞれ参照されここに取り込まれている）。
【０４２３】
融合性HEp-2細胞を、pFLC.31hc.2HN又はpFLC.3-1hc.cp45.2HNにpTM(N)、pTM(P no C)及びpTM(L)サポートプラスミドを加えたもので、既報の如くにMVA-T7存在下にトランスフェクションした（Durbinら、Virology 235: 325-332, 1997, 参照されここに取り込まれている）。トランスフェクションより回収された組換え体キメラウイルスhaTPCKトリプシン（カタログ番号3741、ウォーリントンバイオケミカルコーポ、フリーホールド、NJ)を加え活性化し、全て継代し、既報に従いHPIV1HN及びF糖蛋白質を持つウイルスについて力価検定を行った（Taoら、J. Virol. 72: 2955-2961, 1998、参照されここに取り込まれている）。回収されたキメラ組換え体ウイルスrPIV3-1.2HN及びrPIV3-1cp45.2HNは既報に従い、アガロースで覆われたLLC-MK2単層上でのプラーク−プラーク−プラーク継代により精製された（Taoら、Vaccine. 17: 1100-1108, 1999、参照されここに取り込まれている）。
【０４２４】
rPIV3-1.2HN及びrPIV3-1cp45.2HN組換え体が異種HPIV2HN遺伝子を含むか決定するために、回収された各組換え体キメラウイルスより回収されたウイルスRNAをLLC-MK2細胞上にて増幅し、ポリエチレングリコール(PEG)沈殿で濃縮した（Mbiguinoら、J. Virol. Methods 31:161-170, 1991、参照されここに取り込まれている）。ビリオンRNA(vRNA)はTrizol（ライフテクノロジーズ）にて抽出され、鋳型として利用しスーパースクリプトプレアンプリフィケーションシステム（ライフテクノロジーズ、カイサーブルグ、MD）及びランダムヘキサマーを上記の如く利用し第１鎖cDNAを合成した。
【０４２５】
合成されたcDNAはアドバンテージｃDNA合成キット（クローンテック、パロアルト、CA）とHPIV1F及びHPIV1HNコーディング域（IPIV1Fについては5’-AGTGGCTAATTGCATTGCATCCACAT-3（配列番号23）及びHPIV1HNについては5’-GCCGTCTGCATGGTGAATAGCAAT-3’）（配列番号24）に特異的なプライマーを使ったPCRにより増幅された。PIV1F及びNFプライマーの相対位置は図３及び４の中矢印により示されている。増幅されたDNA断片は消化され、アガロースゲル上にて分析された（図４）。rPIV3-1cp45.2HNに関するデータは示されていないが同様であり、また構造中に確認された。rPIV3-1.2HN及びrPIV3-1cp45.2HNはそれぞれ期待通りの大きさを持つ挿入体を含んでおり、複数の制限酵素による消化パターンにより挿入体の同一性及び真正性が確認された。rPIV3-1cp45.2HN内のcp45変異の存在も確認された。
【０４２６】
rPIV3-1cp45.2HNキメラウイルスによるHPIV1HN発現を確認するため、T25フラスコ内のLLC-MK2単層を、0.5μg/mlのTPCKトリプシンを含む無血清OptiMEM5mlの中、MOI５のPIV2/94、rPIV3-1、又はｒPIV3-1.2NHに感染させた。18時間、32℃でインキュベーションした後、フラスコを5mlのメチオニン及びシステイン欠損DMEM（バイオウイッタッカー、ウォーカービル、MD）で３回洗浄した。次に細胞に120μCiのProMix35S-メチオニン及び35S-システイン混合体が添加されたメチオニンとシステイン欠失DMEM（ファルマシアアマシャム、ピスキャタウェイ、NJ)1mlを加え、32℃にて18時間インキュベーションした。細胞を培地より剥がし取り、微量遠心装置にて短時間遠心分離して沈殿させ、冷PBSにて３回洗浄した。
【０４２７】
各細胞沈査を250単位/mlのベンゾナーゼ（シグマ）を含む1mlのRIPA緩衝液（1%ナトリウムデオキシコール酸、1%(v/v)TritonX-100（シグマ）、0.2%(w/v)SDS,150mM NaCl、50mM Tris-HCl, pH7.4｝に再懸濁し、凍結融解し、微量遠心分離装置で５分間12,000Xにて遠心分離して清明にした。清明化した上清を清浄なマイクロフュージチューブに移し、50μlの抗HPIV2HNモノクローナル抗体（mAb)150S1（Tsurudomeら、Virology 171:38-48, 1989, 参照されここに取り込まれている）と混合、４℃にて３時間混合しながらインキュベーションした。
【０４２８】
各チューブに0.2mlの10%プロテインAセファローズ懸濁液（RIPA緩衝液）を加えモノクローナル抗体を沈殿させ、18時間、４℃にて混合しながらインキュベーションした。ビーズをRIPA緩衝液で３回洗浄し、微量遠心装置で短時間遠心分離して沈殿させた。各サンプルを90μlの1Xのローディング緩衝液中に懸濁し、10μlを4-12％SDSポリアクリルアミドゲル（PAGE；NOVEX、サンジェゴ、CA)にて解析した。PIV2HNに特異的なmAbはrPIV3-1.2HN及びPIV2/V94感染LLC-MK2細胞の両方からHPIV2の86kDHN蛋白質に期待される大きさを持つ蛋白を沈殿させたが、rPIV3-1感染細胞からは沈殿を生じなかった（Rydbeckら、J. Gen. Virol. 69:931-5, 1988、参照されここに取り込まれている）。
【０４２９】
実施例IV
HPIV2抗原決定基を持つrPIV3-1ウイルスはそれらの親ベクターウイルスど同様の温度感受性表現形を示す
LLC-MK2細胞内に於けるrPIV3-1.2HN及びrPIV3-1.cp45.2HN複製の温度感受性レベルを評価し、rPIV3-1野生型又はベクターとして使用した弱毒化ウイルスがHPIV2のHNORFを獲得することで、生じたHPIV2の異種抗原決定基を持つキメラ誘導体がそれらの親ベクターウイルスに比べ複製に関する温度感受性が変化するか決定した（第６表）。rPIV3-1.2HN及びrPIV3-1cp45.2HNをコントロールウイルスと共に、0.5μg/mlTPCKトリプシンが添加された1XL15の中に1:10の割合で連続希釈し、これを用いて96ウエルプレート中４重測定にてLLC-MK2単層を感染した。
【０４３０】
感染させたプレートは、0.2%のモルモット赤血球（1XPBS中）を用いた赤血球吸収によりウイルス力価を決定する前に各種温度に７日間置いた。ウイルス力価はlog10TCI50±標準誤差（S.E.)で表された。第６表に示す様に、rPIV3-1.2HN及びrPIV3-1cp45.2HNはそれらの親ベクターウイルス、即ちそれぞれHPIV2挿入体を欠いているrPIV3-1及びrPIV3-1cp45と同様の温度感受性レベルを示した。このことは、rPIV3-1.2HN及びrPIV3-1cp45.2HN内に１つ余分の転写／翻訳単位が導入されてもインビトロに於ける複製の温度感受性レベルを大きく変えないことを示している。
【０４３１】
【表６】
0004795597.tif 000007
【０４３２】
実施例Ｖ
動物内でのrHPIV3-1.2HNキメラウイルスの複製と免疫原性
インビボでのキメラウイルスの複製レベルを決定するために、ゴールデンシリアンハムスター６匹づつのグループに、105.3TCID50（又は106pfu）のウイルスを含む1×L-15培地0.1mlを鼻内接種した（第７表）。接種４日後、ハムスターを屠殺し、それらの肺及び鼻甲介を集めた。平均log10TCID50/組織ｇとして表されるウイルス力価を決定した（第７表）。PIVHN遺伝子を発現しているrPIV-1.2HNと命名されたrPIV3-1は、その親であるrPIV3-1に比べ複製がより制限され、ハムスターの上部及び下部気道でのウイルス力価は30倍低下していた。
【０４３３】
即ち、PIVHN蛋白質を発現している転写／翻訳単位をrPIV3-1内に挿入すると、ハムスターに関しウイルスは弱毒化される。rPIV3-1内へのPIV2HN ORFをに含む転写／翻訳単位の挿入の弱毒化作用は、麻疹HA ORFを含む同様の単位を野生型PIV3の組換え体JS株に挿入した場合に観察されるものに比べ若干高い程度であった。pRIV3-1cp45.2HNウイルスは親であるrPIV3-1cp45に比べ複製は1000倍以上制限されたことから、PIV2HN挿入及びcp45変異の弱毒化作用は相加的であることが示された。必要に応じてrPIV3-1.cp45.2HN内に存在する12の変異より少ないcp45変異を加えることで、弱毒化のレベルを調製することができるだろう。
【０４３４】
【表７】
0004795597.tif 000008
【０４３５】
単一のrPIV3-1.2HNウイルスはPIV1（F及びHN糖蛋白質）及びPIV2（HN糖蛋白質のみ）の防御抗原を発現することから、このウイルスによる感染はPIV1又はPIV2野生型ウイルスいずれかの感染に対し耐性を誘導するだろう。このことを確認するために、12匹のグループのゴールデンハムスターを105.3TCID50の上記ウイルスで鼻内免疫した。半数のハムスターは29日目にPIV2の感染を受け、残りの半数は32日目にPIV1の感染を受けた。ハムスターの肺と鼻甲介組織を感染４日後に集め、感染ウイルスの力価を上記同様にして決定した（第８表）。免疫感作前及び28日後に血清を得て、PIV1及びPIV2に対する中和抗体力価について試験した。
【０４３６】
【表８】
0004795597.tif 000009
【０４３７】
予想通りPIV3はPIV1又はPIV2のいずれについても耐性をもたらさなかった（Tao, Vaccine 17: 1100-1108, 1999）が、PIV2野生型ウイルス及びrPIV3-1による事前感染はPIV2及びPIV1感染ウイルスの複製に対し完全耐性を誘導した。１種類のウイルスに対する防御を提供するこれらウイルスとは対照的に、rPIV3-1.2HNはPIV1及びPIV2両方に対する抗体を誘導し、rPIV3-1.2HN免疫感作ハムスターの上部及び下部気道では各ウイルスの複製を1,000-ないし10,000-倍低下することから示される様にPIV1とPIV2の両方に対し強力な耐性を含んだ。
【０４３８】
このことは単一の組換え体キメラPIVが２種類のヒトウイルス病原体に対する耐性を誘導できることを示している。しかしcp45変異を有するrPIV3-1.2HNの誘導体は野生型PIV1又はPIV2感染ウイルスの複製に対し有意な耐性を誘導できなかったことから、この特別な組換え体キメラウイルスはハムスターでは過剰に弱毒化されていることが示唆された。12種類の変異全てではなく１または複数の選択されたcp45変異をrPIV3-1.2HN内に導入することでrPIV3-1.2HNの弱毒化レベルを適切なレベルに調節することができる。
【０４３９】
実施例VI
ヌクレオチド挿入物を含有するrHPIV3ウイルスをコードするcDNAの構築
先に討議したように、減弱（弱化）ベクター・ウイルスrPIV3cp45LのＮ／Ｐ又はＰ／Ｍ遺伝子境界間、並びに野生型PIV3のＮ／Ｐ，Ｐ／Ｍ、及びHN／Ｌ境界における麻疹HA ORFの挿入は、ハムスターの上気管内のその複製をさらに制限した。このことは、HPIV3ゲノム内のいずれかの位置における追加の遺伝子の挿入が候補ワクチン・ウイルスの減弱を強化することができるということを示している。本発明の上記の例示的な局面においては、その遺伝子挿入物は比較的大きなものであった（約1900nts ）。
【０４４０】
上記挿入物のサイズが、得られた組換えウイルスの減弱の選択的レベルを特定するということを示すさらなる例が本明細書中に提供される。これは、HPIV3 HNとL ORFsの間の１遺伝子単位（GUs ）として、RSV A2株により例示されるように、異種ウイルスから得られたさまざまな長さの配列を導入することにより評価された。上記挿入物は、いずれかの意味のあるORF を欠くように特別に設計され、それにより、観察されるいずれの効果も、発現されたタンパク質の可能性のある寄与により複雑化されることはないであろう。
【０４４１】
伸ばされたゲノムの長さに因子効果と追加のmRNAの発現の間を区別するために、第２シリーズの構築物であって、同様のサイズをもの挿入物がHN遺伝子の下流の非コーディング領域（NCR ）内に導入されているものを作製した。従って、伸された長さをもつ挿入物を含む２シリーズのrPIV3sを作成し：GUシリーズにおいては、余分のmRNAをコードする余分の遺伝子として上記挿入物が添加され、一方、NCR シリーズにおいては、上記挿入物は、その遺伝子番号が変わらないように作製された。
【０４４２】
GUと３′-NCR挿入物を含むrHPIV3ウイルスをコードするcDNAs の構築物
挿入突然変異体を、全長HPIV3クローニングp3/7 (131) 2G-StuをもつXhoI〜SphI断片（HPIV3nts 7437〜11317）を含む、pUC ベースのプラスミド、pUC118-Stu内に構築した。２つの別個のプラスミドを、GUとHN遺伝子の３′-NCR伸長物の挿入のための受容プラミスドとして構築した（図６）。各々において、多クローニング部位を含む合成オリゴヌクレオチド２本鎖を、ユニークStuI部位内に挿入した。上記GU挿入プラスミドのための挿入された配列は、HN遺伝子−末端（GE）シグナル配列、保存された遺伝子間（IG）トリヌクレオチド配列、及びＬ遺伝子−開始（GS）シグナル配列、それぞれ、HN遺伝子転写終了と上記挿入された配列の転写開始を指令するシス作用性配列を含んでいた（図６）。
【０４４３】
追加のユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位は、その後のスクリーニングとサブクローニングを容易にするための多クローニング領域内に含まれていた。３′-NCR伸長アクセプター・プラスミドを、同様に設計し、そして構築したが、それは、その５′末端においてシス作用性のGE, IG、及びGS配列を欠いていた（図６Ｂ、第９表）。RSV 抗ゲノム・プラスミドd53RSV、及びサブゲノム・プラスミドpUC118FM2 部位を、適当な制限酵素で消化し、そして所望のサイズの断片を、アガロース・ゲル上の電気泳動により単離し、そしてGU又はHN遺伝子３′-NCR伸長アクセプター・プラスミドのユニークHpaI部位内に別々にライゲートした（図６；第９表）。
【０４４４】
クローンを、RSV 制限断片が逆方向、すなわち、全てのリーディング・フレームが多終止コドンを含んでいるような方向において挿入されているところのクローンを同定するためにスクリーニングした（図７）。また、13〜17ヌクレオチドのサイズ範囲にある短い合成オリゴヌクレオチド２本鎖を、GU又は３′-NCRアクセプター・プラスミド内に必要に応じて挿入して、“rule of six ”に合うようにその遺伝子の長さを変えた（第９表）。特定のRSV 配列と添加した短い合成オリゴヌクレオチドのサイズを第９表中に要約する。
【０４４５】
クラスミド・クローンを、サブクローニングのために使用した全制限酵素部位を通して配列決定し、そしてGU又はHN遺伝子NCR 伸長物のいずれかとして、rule of six に合う挿入突然変異を含むXhoI-SphI 断片を、全長PIV3 cDNA プラスミドp3/7 (131) 2G+にクローニングした。1908GU挿入物を含む１の挿入物をも、cp45の３つのＬ突然変異を担持するアンチゲノムcDNA内に入れた。
【０４４６】
【表９】
0004795597.tif 000010
【０４４７】
挿入突然変異物を担持する組換えPIV3s の回収
上記挿入突然変異物を担持する全長アンチゲノムcDNA誘導体と３つの支持プラスミドpTM (N), pTM (PnoC) 、及びpTM (L)(Durbin et al., Virology 235: 323-332, 1997; Durbin et al., Virology 261: 319-330, 1999、それぞれ本明細書中に援用する）を、Lipofect ACE (Life Technologies, MD)を用いて６ウェル・プレート（Coster, MA）内のHEp-2 単層にトランスフェクトし、そしてこの単層を、先に記載したようにMVA-T7で感染させた（Durbin et al., Virology 235: 323-332, 1997; Skiadopoulos et al., J.Virol. 72: 1762-8, 1998、それぞれ本明細書中に援用する）。４日間32℃でインキュベートした後、トランスフェクション収穫物を、T-25フラスコ内でLLC-MK2 細胞上で継代し、これを４〜８日間32℃でインキュベートした。
【０４４８】
清澄化した培地上清を先に記載されたようにLLC-MK2 細胞上でのプラーク精製に供した（Durbin et al., Virology 235: 323-332, 1987; Hall et al., Virus Res, 22: 173-184, 1992; Skiadopoulous et al., J. Virol. 72: 1762-8, 1998 、それぞれ本明細書中に援用する）。各生物学的にクローン化された組換えウイルスを32℃でLLC-MK2 細胞内で２回増幅して、さらなる特徴付けのためのウイルスを作った。ウイルスをポリエチレン・グリコール沈降（Mbiguino et al., J.Virol.Methods 31: 161-170, 1991、本明細中に援用する）により清澄化された培地から濃縮し、そしてウイルスRNA (vRNA)をTrizol試験（Life Technologies)を用いて抽出した。
【０４４９】
逆転写を、ランダム・ヘキサマー・プライマーを用いたSuperscript II Preamplification System (Life Technologies)を使用してvRNAに対して行った。Avdantage cDNA PCRキット（Clontech, CA）、及びセンス（PIV3 nt 7108〜7137）、及びアンチセンス・プライマー（PIV3 nt 10605〜10576）を、制限エンドヌクレアーゼ消化又は配列分析のための断片を増幅するために使用した。PCR 断片を、アガロース・ゲル電気泳動（図８）及びシークエンシングにより分析した。回収されたrPIV3 挿入突然変異体のそれぞれが、意図されたサイズの挿入物を含んでおり、そしてそれらは、それらの生物学的特性について評価された。
【０４５０】
実施例VII
動物内、及び組織培養におけるGU又はNCR 挿入物を含むrHPIV3ウイルスの複製
多段階増殖曲線
rPIVGUとNCR 挿入突然変異体の増殖曲線を、rPIV3 wtとrcp45Lとインビトロにおいて比較した。図９中に示すように、GU又はNCR 挿入物のいずれかを含むrPIV3 のそれぞれの複製速度及びピーク・ウイルス力価は、rPIV3 wtのものとは区別できなかった。このことは、長さ少なくとも3918nts の配列の挿入はインビトロにおけるウイルス複製に影響を及ぼさないということを示している。
【０４５１】
GU挿入物を含むrPIVsのハムスター内での複製
ハムスターを、106.0TCID50 rPIV3wt, rcp45L、又はGU挿入物を担持する上記突然変異体rPIV3sの中の１で鼻内接種した（第10表）。肺及び鼻甲介を感染から４日目に収獲し、そして各ウイルスの複製レベルを測定した。サイズ168nt 〜1908ntの範囲のGUs の挿入は、ハムスターの気管内でウイルス複製を有意に低下させなかった。しかしながら、野生型PIV3のHNとL ORF の間の3918nt遺伝子単位の挿入は、それぞれ、鼻甲介と肺におけるウイルス複製の５〜25倍の低下をもたらした。このことは、このサイズの遺伝子単位挿入が野生型ウイルスをための減弱しており、一方、より短いサイズ、例えば、約2000ntは、ハムスターの気管内の野生型ウイルスの複製に対してほとんど効果がないということを示している。従って、GU長は、PIV ワクチン・ウイルスにおける所望の減弱レベルを決定するために変更されることができる。
【０４５２】
【表１０】
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【０４５３】
上記のように、rJS 野生型及び減弱cp45L ウイルス内への麻疹ウイルスのHA遺伝子の挿入は、ハムスターについての各ウイルスをさらに弱化した。麻疹ウイルスのHA遺伝子は長さ1936であるので、我々は、rcp45Lの複製についての同様のサイズの遺伝子挿入（1908nt）の効果を調べた。1908遺伝子挿入は、それが大きなポリペプチドを合成することができないという点で、麻疹ウイルスHA遺伝子挿入と相違する。1908 nt GU挿入がcp45Lポリメラーゼ・アミノ酸置換（第10表中のr1908 nt GU挿入／cp45L ）と組み合されるとき、気管上部内で約20倍弱化が強化される。
【０４５４】
これを考え合わせると、これらの発見は、長さ約3918nts のGU挿入は、ハムスターについての野生型PIV3ウイルスを弱化することができること、そしてこのサイズの約半分のGU挿入が、弱化されたPIV3ワクチン候補をさらに弱化することができることを示している。従って、GU挿入は、組換えワクチンの設計において２重の役割をもつことができる。第１の役割は、病因の保護抗原をコードすることであり、そして第２の役割は減弱表現型付与することである。
【０４５５】
HN遺伝子３′-NCR挿入物を含むrPIVsのハムスター内での複製
ハムスターに、HN遺伝子３′-NCRの長さまで延びた挿入突然変異を担持するウイルス又はrPIV3 対照ウイルスを鼻内接種した（第11表）。肺と鼻甲介を接種後４日目に収獲し、そして各組織内でのウイルス複製のレベルを先に記載されたように測定した。長さ258nt 〜1404ntの範囲のHN遺伝子NCR 挿入は、ハムスターの気管内でウイルス複製を有意に低下させなかった（第３表）。しかしながら、3126ntの挿入は、感染したハムスターの気管上部と下部内でウイルス力価において16倍低下させ、そして3894nt HN 遺伝子NCR 挿入は、気管上部及び下部内でのウイルス複製の12倍の低下をもたらした。このことは、そのゲノム長の増加もウイルス複製に対する減弱効果を付与することを示唆している。
【０４５６】
【表１１】
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【０４５７】
GUとNCR 挿入物の温度感受性レベルの評価
rPIVs の許容及び非許容温度におけるプラーキング率（efficiency of plaquing (EOP)) を、先に記載されたようにLLC-MK2 単層上で測定した（第12表）。32℃において、サイズ168nt 〜3918ntの範囲のGU挿入物、及びサイズ258nt 〜3894ntの範囲のNCR 挿入物を担持するウイルスは、rPIV3 wtのものに類似のプラーク形態を有していた。しかしながら、39℃及びより高い温度においては、挿入突然変異を担持する上記ウイルスの全てが、小さなプラーク表現型を有していた（第12表）。サイズ996nt 〜3918ntの範囲のGU挿入物は、40℃においてtsでないウイルスを作り出した。
【０４５８】
しかしながら、1404nts 又はそれより大きなHN遺伝子NCR 挿入を担持するウイルスは、その挿入のサイズに正比例する温度感受性の勾配をもって、40℃において僅かにtsであるウイルスを作り出した。cp45L 骨格への1908nt GU 挿入の付加は、rcp45Lに比較して38℃においてほぼ100 倍以上tsであるウイルスを作り出した。このことは、1908nt GU 挿入及びＬ遺伝子ts突然変異により特定されるts表現型が付加的であることを示している。
【０４５９】
【表１２】
0004795597.tif 000013
【０４６０】
r3918nt GU突然変異体並びにr3126及びr3894nt NCR挿入突然変異体はインビトロにおいて効率的に複製したがハムスターの気管内で複製が制限されたので、これらの組換え体は新規の、宿主レンジの弱化表現型を示している。
【０４６１】
これまでの例に基づき、組換えHPIV3 (rHPIV3)は、麻疹ウイルスヘマグルチニン（HA）糖タンパク質遺伝子により例示されるような、追記の過剰遺伝子として発現される外来ウイルス保護抗原のための有効なベクターを提供することが証明される。他の態様においては、rHPIV3-1抗原性キメラ・ウイルス、PIV3 FとHN遺伝子がそれらのHPIV1 対応物により置換されているところの組換えHPIV3 は、HPIV2 ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（HN）糖タンパク質のための有効なベクターを提供する。
【０４６２】
各場合において、上記外来コーディング配列を設計し、そしてHPIV3 遺伝子の開始と遺伝子終結転写シグナルのセットの制御下にあるように構築し、追加の過剰遺伝子としてベクター・ゲノム内に挿入し、そしてHPIV3 ポリメラーゼにより別個のmRNAとして発現させる。
【０４６３】
上記rHPIV3又はrHPIV3-1ベクターによる過剰遺伝子挿入物からの麻疹ウイルスHA又はHPIV2 HN糖タンパク質の発現は、多ラウンドの複製の間、安定していることが測定された。麻疹ウイルスHAを発現するrHPIV3ベクター又はHPIV2 HN糖タンパク質を発現するrHPIV3-1ベクターに感染したハムスターは、それぞれ、HPIV3と麻疹ウイルス、又はHPIV1 とHPIV2 に対する保護免疫応答を誘導した。従って、麻疹ウイルスの保護抗原を発現する１のrHPIV3ベクターは、２つのヒト病原体、すなわち、ベクター骨格中に存在する糖タンパク質に対する免疫応答を介してのHPIV3 、及びrHPIV3内に挿入された余分な遺伝子から発現されるHA保護抗原を介しての麻疹ウイルス、に対する１の保護免疫応答を誘導した。
【０４６４】
麻疹ウイルス糖タンパク質は、感染性HPIV3 ベクター・ウイルス内に取り込まれず、そしてこれ故、その発現は上記ベクターの向性を変化させることが期待されないばかりかそれを麻疹ウイルス特異的抗体により中和され易くすることもないであろう。同様に、HPIV2 の保護HN抗原を発現する１のrHPIV3-1ベクターは、２つのヒト病原体、すなわち、ベクター骨格中に存在する糖タンパク質に対する免疫応答を介してのHPIV1 、及びrHPIV3-1内に挿入された余分な遺伝子から発現されたHN保護抗原を介してのHPIV2 、に対する１の保護免疫応答を誘導した。
【０４６５】
実施例VIII
３つまでの過剰外来ウイルス糖タンパク質を発現する単一rHPIV3は３つまでのウイルスに対する保護抗体を誘導する
多病原体に対して免疫を誘導するための単一組換えワクチン・ウイルスの修飾は、いくつかの利点をもつ。各病原体に対して別個の弱化ワクチンを開発するよりも、多病原体に対する抗原を発現する単１の弱化骨格を開発するほうがより実行可能性が高く、かつ、好都合である。各病原体は、操作、弱化、並びに安全性及び効果の証明に関して異なる仕事を提供し、そして一連の病原体の各々の弱化バージョンを開発する試みはやっかいな仕事であるであろう。いくつかの異なる弱化ウイルスを用いて上記活動を企てるよりも、単一のワクチンウイルスを調製し、取扱い、そして投与するほうがより簡単であり、かつ、容易でもある。
【０４６６】
ワクチン・ウイルスの数を減少させることは、小児免疫の混雑したスケジュールを単純化することをも助けるであろう。いくつかの弱化ウイルスは、混合物として投与されることができるが、これはワクチン開発を複雑にする。なぜなら、各成分が別々に安全であることが示されなければならず、そして次に混合物として安全かつ効果があることも示されなければならないからである。ウイルスの混合物の投与に伴う１の特別な問題は、混合物中のウイルスの中の１以上が他の成分の中の１以上の複製を妨害するという、一般的なウイルス干渉の現象である。
【０４６７】
これは、１以上の成分について減少された複製及び免疫原性をもたらすことができる。この一般的な問題は、単一のベクター骨格の使用により回避される。また、いくつかのウイルス、例えば麻疹ウイルスは特別な安全性の心配があるので、その各々が別々に開発されかつ証明されなければならないところの、別々に弱化されたウイルスの混合物とは対照的に、多過剰抗原を担持するベクターとして単一の、比較的良性のウイルス、例えばPIV を使用することがより安全であろう。
【０４６８】
本実施例において、組換えHPIVs が構築され、そしてワクチン・ウイルスの開発のための、複製及び免疫原性の満足できる特徴をもつ２以上の過剰遺伝子のためのベクターとして役立つことが示された。特に、本実施例は、以下のリストからの１，２又は３の過剰遺伝子を発現するrHPIV3s の設計、構築、回収、及び特徴付けを記載する：（ｉ）HPIV1 (Washington/20993/1964株）のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（HN）；（ii）HPIV2 (V9412株）のHN；（iii ）麻疹ウイルスの野生型Edmonston 株のヘマグルチニン（HA）；及び（iv）遺伝子単位（GU）と呼ばれる3918ntの翻訳的にサイレントな合成遺伝子（上記参照）。
【０４６９】
上記の付加された遺伝子を、核タンパク質（Ｎ）遺伝子とリンタンパク質（Ｐ）遺伝子の間に、上記Ｐ遺伝子と膜タンパク質（Ｍ）遺伝子の間に、又は上記HN遺伝子と大きなポリメラーゼ（Ｌ）遺伝子の間に、挿入した。従って、本開示は、例えば、ベクター自体、及び１又は２の追加の病原体に対して、多価免疫を誘導することができる、２価、３価、又は４価ワクチン組換え体に修飾されたHPIV3 ベクターの首尾よい使用を証明するものである。
【０４７０】
上記Ｎ／Ｐ遺伝子間とＰ／Ｍ遺伝子間のHPIV1 HN遺伝子とHPIV2 HN遺伝子の挿入を以下のように行った：プラミスドpUC119 (AflII N-P)、HPIV3 アンチゲノムcDNAのサブクローン（Durbin, J.Virol. 74: 6821-31, 2000、本明細書中に援用する）を、部位指定突然変異誘発により修飾して、ユニークAflII 部位を、（ｉ）HPIV3 N 遺伝子の下流の非コーディング領域（CTAAAT〜CTTAAG, HPIV3 nts 1677〜1682）、又は（ii）HPIV3 P 遺伝子の下流の非コーディング領域（TCAATC〜CTTAAG, HPIV3 nts 3693〜3698）に挿入した。
【０４７１】
次に各AflII 部位を、オリゴヌクレオチド２本鎖の挿入により修飾して、それぞれ、中間体プラスミドpUC (GE/GS-N-H)N-P とpUC (GE/GS-N-H)P-Mを作製した。この挿入された２本鎖は、HPIV3 遺伝子終結（GE）配列、保存された遺伝子間（IG）トリヌクレオチド配列、及びHPIV3 遺伝子−開始（GS）配列であって、それぞれ転写終結及び開始を指令するシス作用性シグナルであるものを含んでいた（図10）。
【０４７２】
追加のユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位を上記多クローニング領域内に含ませて、その後のサブクローニング及びスクリーニングを容易にした。この領域は、HPIV1 とHPIV2 HN ORFs の付加のためのNcoIとHindIII 部位を含んでいた。従って、上記多クローニング部位内に挿入された外来ORF は、１セットのHPIV3 転写シグナルの制御下にあり、そしてHPIV3 ポリメラーゼにより別個のmRNAとして発現されるであろう。この多クローニング部位も、挿入された配列の全体がrule of six に合うようにするため必要に応じて長さの違うオリゴヌクレオチドを挿入するためのMluI部位を含んでいた（Calain et al., J.Virol. 67: 4822-30, 1993; Durbin et al., Virology 234: 74-83, 1997b; 1999a Skiadopoulos et al., Virology 272: 225-34, 2000 ）。
【０４７３】
p38′Δ31hc #6のNcoI〜HindIII 制限断片として入手可能なHPIV1 HN ORF (Tao et al., J.Virol. 72: 2955-2961, 1998）を、pUC (GE/GS-N-H)N-PとpUC (GE/GS-N-H)P-MのNcoI〜HindIII 部位内に挿入して、それぞれ、pUC 1HNN-PとpUC 1HNP-Mを作製した。短いオリゴヌクレオチド２本鎖を、上記のユニークなMluI制限部位内に挿入して、その配列がrule of six に合うように調整した。次にこれらのキメラ・サブゲノムcDNAを、本明細書中pFLC HPIV3 wt という全長HPIV3 アンチゲノムcDNA p3/7 (131) 2G+ 内にクローニングして、それぞれ、pFLC HPIV3とpFLC HPIV3 1HNP-M を作製した（図11、上からの２及び３番目の組換えウイルスがそれから単離されたところのプラスミド）。
【０４７４】
p32Hnhc #3 31hc のNcoI〜HindIII 制限断片内に入手可能なHPIV2 HN ORF (Tao et al., J.Virol. 72: 2955〜2961, 1998 、本明細書中に援用する）を、pUC (GE/GS-H-N)N-PとpUC (GE/GS-H-N)P-MのNcoI〜HindIII 部位内に挿入して、それぞれpUC 2HNN-PとpUC 2HNP-Mを作製した。短いオリゴヌクレオチド２本鎖をユニークなMluI制限部位内に挿入してその配列がrule of six に従うように調整した。不注意にも、挿入されたオリゴヌクレオチドは、回収されるウイルスのゲノムがrule of six に従うであろうということを特定するために要求されるものよりも１ヌクレオチド短かかった。それ故、HIV2 HN 遺伝子挿入物を担持するcDNAの全てがrule of six に従っていなかった。しかしながら、ウイルスは、上記cDNAのそれぞれから回収された。
これらのキメラ・サブゲノムcDNAを、全長PIV3アンチゲノムcDNA pFLC HPIV3 wt内にクローニングして、それぞれ、pFLC PIV3 2HN(N-P)とpFLC PIV3 2HN(P-M)を作製した（図11、上から４と５番目の組換えウイルスがそれから単離されたところのプラスミド）。
【０４７５】
HPIV3 骨格内にさまざまな組合せ及び位置において３つまでの過剰外来遺伝子を含む追加の組換えHPIV3 アンチゲノムcDNAをアセンブルした（図11）。これらのアンチゲノムcDNAを、その中で、HPIV1 又はHPIV2 のHNが、Ｎ遺伝子とＰ遺伝子の間又はＰ遺伝子とＭ遺伝子の間に挿入されているところの上記のサブゲノムcDNAからアセンブルした。アセンブリーのために使用された他のサブクローンは、上記のようなＰ／Ｍ遺伝子間又はHN／Ｌ遺伝子間に麻疹ウイルスHA遺伝子を含んでいた。アセンブリーのために使用された他のサブクローンは、上記のように、HN遺伝子とＬ遺伝子の間に3918nt GU を含んでいた。
【０４７６】
２又は３の過剰挿入物を含む組換え体は以下のようなものであった：rHPIV3 1HNN-P 2HNP-M（図11、上から６番目の組換え体）は、それぞれＮ／Ｐ遺伝子間とＰ／Ｍ遺伝子間にHPIV1 HN遺伝子とHPIV2 HN遺伝子を含んでいた；rHPIV3 1HNN-P 2HNP-M HAHN-L （図11、７番目の組換え体）は、それぞれ、Ｎ／Ｐ遺伝子、Ｐ／Ｍ遺伝子、及びHN／Ｌ遺伝子間にHPIV1 HN, HPIV2 HN、及び麻疹ウイルスHAを含んでいた；rPIV3 1HNN-P 2HNP-M 3918GUHN-L（図11、下）は、それぞれ、Ｎ／Ｐ遺伝子、及びＰ／Ｍ遺伝子間にHPIV1 HN遺伝子、及びHPIV2 HN遺伝子を含んでいた、そしてさらに、HN遺伝子とＬ遺伝子の間に3918nt GU 挿入物を含んでいた。
【０４７７】
上記構築物の下から２番目、rHPIV3 1HNN-P 2HNP-M HAHN-L （図11、上から７番目の構築物）が、４つの病原体：HPIV3 (NHとＦ), HPIV1 (HN), HPIV2 (HN)、と麻疹ウイルス（HA）のための保護抗原を含んでいたということは注目に値する。この組換え体内に挿入された外来配列の合計長は、約5.5kb であり、これは、15,462ntをもつHPIV3 ゲノム全長の36％である。最後の組換え体、rHPIV3-1HNN-P 2HNP-M GUHN-L （図11、下）は長さ約23kbであった。これは、野生型HPIV3 よりも50％短く、そして先に記載された生物学的に得られ又は組換え体パラミクソウイルスのいずれよりも長かった。
【０４７８】
１，２、又は３つの過剰遺伝子挿入物を担持する組換えrHPIV3のインビトロにおける回収及び複製
異移パラミクソウイルス保護抗原の単一又は多過剰遺伝子を担持する全長HPIV3 アンチゲノムcDNAを、支持プラスミドpTM (N), pTM (PnoC) 、及びpTM (L) 、及びLipofect ACE (Life Technologies, Gaithersburg, MD ）とともに６ウェル・プレート（Costar, Cambridge, MA ）上でHEp-2 単層培養に別々に移し、そしてこれらの細胞を、先に記載された技術（Durbin et al., Virology 235: 323-332, 1997a; Skiadopoulos et al., Virology 272: 225-34, 2000、それぞれ本明細書中に援用する）を使用して、バクテリオファージT7ポリメラーゼ・タンパク質をコードする複製欠陥ワクシニア・ウイルス組換え体であるMVA-T7で同時に感染させた。４日までの間32℃でインキュベートした後、そのトランスフェクション収獲物を25cm2 フラスコ内のLLC-MK2 単層培養物上に継代し、そして上記細胞を32℃で５日間インキュベートした。
【０４７９】
上記細胞上清から回収したウイルスをさらに32℃においてLLC-MK2 細胞上に継代して、上記ウイルスを増幅した。１つ又は多数の外来遺伝子挿入物を担持するrHPIV3を、先に記載したようにLLC-MK2 細胞上でのプラーク精製により生物学的にクローニングした（Skiadopoulos et al., J.Virol. 73: 1374-81, 1999a、本明細書中に援用する）。生物学的にクローン化されたウイルスから得られたウイルス懸濁液をLLC-MK2 細胞上で増幅し、そして、wt rHPIV3 について典型的に得られる力価の範囲に類似する、107 と109TCID50 ／ml最終力価を得た。組換えウイルスを、39℃において増殖するそれらの能力についてアッセイした。驚ろくべきことに、１又は多数の外来遺伝子挿入物を担持するいくつかのrHPIV3s (rHPIV3 1HNN-P, rHPIV3 1HNN-P 2HNP-M HAHN-L 、及びrHPIV3 1HNN-P 2HNP-M 3918 GUHN-L）は、その許容温度における複製に比較して39℃において複製に関して100 〜1000倍制限された。
【０４８０】
ウイルスRNA (vRNA)を、先に記載されたように生物学的にクローン化された組換えキメラ・ウイルスから単離した（Skiadopoulos et al., J.Virol. 73: 1374-81, 1999a 、本明細書中に援用する、をも参照のこと）。これを、挿入部位に境界を接する特異的プライマーを用いた、逆転写及びポリメラーゼ・チェイン・リアクション（RT-PCR）のためのテンプレートとして使用した。増幅された生成物を、制限エンドヌクレアーゼ消化、及び接合領域の部分的DNA 配列決定により分析して、各外来挿入物の存在及び同一性を確認した。全ての場合において、予想された、正しい配列を確認した。
【０４８１】
１，２又は３つの過剰の外来保護抗原を発現するrHPIV3s のハムスターの気管内での複製
１つの過剰のウイルス保護抗原遺伝子を発現するrHPIV3又はrHPIV3-1ウイルスがインビボ及びインビトロにおいて効率的に複製し、そしてそのベクター・ウイルス、及びその過剰抗原遺伝子により提示されるウイルスの両者に対する保護免疫応答を誘導したことが先に示されていた。しかしながら、rHPIVが２以上の過剰遺伝子に適応し、そしてインビトロ及びインビボにおいて効率的に複製し、かつ上記ベクター及び上記発現された過剰抗原の両者に対する保護免疫応答を誘導する能力を保持することができるかどうかは知られていなかった。本実施例は、これが実際に可能であることを示すものである。
【０４８２】
８群のハムスターに、１又は多数の過剰外来遺伝子挿入物を担持する106TCID50 の各rHPIV3を、又は対照ウイルスを鼻内接種した（第13表）。鼻甲介と肺を感染から４日後に収獲し、そして組織ホモジェネート中に存在するウイルスを先に記載されたように32℃でLLC-MK2 単層培養物上での逐次的希釈により定量した（Skiadopoulos et al., J.Virol. 73: 1374-81, 1999aをも参照のこと）。ウイルスをモルモット・ブタ赤血球により血球吸着により検出し、そして各群についての平均ウイルス力価を、log10 TCID50（50％組織培養感染性投与量／グラム組織±SE）として表す。
【０４８３】
【表１３】
0004795597.tif 000014
【０４８４】
HPIV3 HN遺伝子とＬ遺伝子間、Ｎ遺伝子とＰ遺伝子間、又はＰ遺伝子とＭ遺伝子間の過剰遺伝子挿入物からの麻疹ウイルスHAを発現するrHPIV3は、中程度に（約10〜20倍）、ハムスターの気管上部及び下部内で複製を制限した。これは、本実験において確認された。ここで、Ｎ／Ｐ遺伝子、Ｐ／Ｍ遺伝子、又はHN／Ｌ遺伝子間の単一の過剰遺伝子として麻疹ウイルスHAを含むrHPIV3は10倍まで弱化された（第13表、群５，６、及び７）。同様に、HPIV3 N 遺伝子とＰ遺伝子間、又はＰ遺伝子とＭ遺伝子間へのHPIV2 HN遺伝子の挿入も、ハムスターの気管内での中程度（約10〜20倍）の複製を示した。反対に、Ｐ遺伝子とＭ遺伝子の間、又はＮ遺伝子とＰ遺伝子の間へのHPIV1 HN遺伝子の挿入は、ハムスターの気管上部及び下部内での約100 倍の複製低下をもたらした（第13表、群１と２）。
【０４８５】
HPIV1 HN, HPIV2 HN、及び麻疹ウイルスHA遺伝子挿入物は全てほぼ同じサイズをもっていたので（それぞれ、1794nt, 1781nt 、及び1926nt ）、これは、挿入物の長さに因るものではないようであった。それ故、HPIV1 HN遺伝子の導入により与えられたこのより大きな弱化レベルは、HPIV3 ベクターの複製に対する、HPIV1 HNタンパク質の発現に特異的な追加の弱化効果に因るようである。従って、いくつかの場合、例えばHPIV1 HNを用いて、過剰の抗原は、追加の遺伝子に因り上記中程度の弱化を超えてハムスターに関してrHPIV3を弱化することができる。
【０４８６】
第13表中のデータを見ると、挿入の部位も、ハムスターの気管内でのキメラrHPIV3の複製の制限レベルに役割を演じていることが判かる。rHPIV3 N遺伝子とＰ遺伝子間の麻疹ウイルスHA遺伝子又はHPIV2 HN遺伝子の挿入は、Ｐ遺伝子とＭ遺伝子の間に挿入がそうであるよりも大きな複製減少をハムスターの気管上部及び下部でもたらした（第13表、群３と４、そして群５と６を比較のこと）。HPIV3 ベクターの複製に対するこの部位特異的弱化効果は、HPIV1 HN遺伝子の挿入に関しては明らかでなかった。これはおそらく、それがHPIV1 HNに特異的なより実質的な減弱（弱化）効果により覆い隠されているからであろう。
【０４８７】
上記rHPIV3キメラ組換えウイルスは、過剰遺伝子挿入物の数の関数である弱化の勾配を示した。３つの追加の遺伝子を担持するウイルスは、最高の効果を示し、そして感染ハムスターの気管上部及び下部内で約10,000〜108,000 倍複製を低下させた（第13表、群９と10）。２つの遺伝子挿入物を担持するrHPIV3キメラ組換えウイルスは、中程度の弱化レベルを示し、そして約12〜80倍減少させた（第13表、群８）。
【０４８８】
（HPIV1 NH遺伝子を担持するものを除き）１つの過剰遺伝子を担持するrHPIV3キメラ組換えウイルスは、ほんの約10〜25倍だけ減少させた（第13表中  群３〜７）。重要なことは、１，２、又は３つの過剰遺伝子挿入物を担持するrHPIV3キメラ組換えウイルスが全ての動物内で複製されたということである。これらのウイルスの中で最も弱化されたもの、すなわち、３つの過剰遺伝子を担持するものは、気管上部及び下部内での複製に関してrcp45 （群11）よりも実質的に弱化されていた。
【０４８９】
１，２、又は３つの過剰外来保護抗原を発現するrHPIV3s のハムスターにおける免疫原性
ハムスターを、先に記載したように、１，２、又は３つの過剰遺伝子挿入物を担持するHPIV1 wt, HPIV2 wt, rHPIV3 wt 、又はrHPIV3s で感染させた。血清サンプルを免疫感作の３日前、及び免疫感作から28日後に採取し、そしてHPIV1 又は麻疹ウイルスのいずれかに特異的なウイルス中和アッセイにより、又はHPIV3 又はHPIV2 HN−特異的抗体についての血液凝集阻害（HAI ）アッセイにより、HPIV1, HPIV2, HPIV3 又は麻疹ウイルス特異的抗体についてアッセイした（第14表）。rHPIV3ウイルスの全てが、HPIV3 骨格に対して強い免疫応答を顕出した。但し、３つの過剰遺伝子挿入物を担持するウイルスを除く。rHPIV3 1HNN-P 2HNN-P HAHN-L 又はrHPIV3 1HNN-P 2HNN-P 3918 GUHN-Lのいずれかに感染したハムスターにおける低下した又は不存在の免疫応答は、これらのウイルスがハムスターにおける複製について過剰に弱化されている結果であるようであった。
【０４９０】
同様に、３つの外来遺伝子を担持するウイルス内の運ばれた抗原に対する免疫応答も低いか又は検出されることができないものであった。反応に、１又は２つの外来遺伝子挿入物を担持するウイルスは、これら追加の抗原のそれぞれに対する免疫応答を誘導した。このことは、運ばれた（vectored）外来遺伝子がハムスター内で免疫原性であり、そしてrHPIV3 1HNN-P 2HNN-Pの例におけるように（第14表；群11）、３つの異なるウイルス：HPIV1, HPIV2、とHPIV3 に対する強い免疫応答を誘導するために使用されることができるということを証明している。
【０４９１】
【表１４】
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【０４９２】
実施例IX
麻疹ウイルスHAタンパク質のための弱毒化ベクターとしてのrHPIV3-NB の使用
抗原的に関連するヒトのものに対するワクチンとしての宿主範囲の制限によりヒトにおいて弱毒化された動物ウイルスの使用は、ワクチン開発へのジェンナーのアプローチに基づく。ウシパラインフルエンザウイルス３型（BPIV3 ）のKansas (Ka) 株は、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（HPIV3 ）と比べてアカゲザルにおいて複製の100 〜1000倍の制限であることが見い出され、ヒトにおいて弱毒化されることも示された（各々が引用により本明細書に組み込まれる、Coelingh et al., J.Infect.Dis. 157: 655〜62, 1988; Karron et al., J.Infect.Dis. 171: 1107〜14, 1995b）。
【０４９３】
生存できるキメラ組換えヒトパラインフルエンザウイルス３型（HPIV3 ）は、HPIV3 N ORF の場所にBPIV3 Kaからのヌクレオプロテイン（Ｎ）オープン読み枠（ORF ）を含むものが以前に作られた。このキメラ組換え体は、以前、cKa-N と呼ばれ（引用により本明細書に組み込まれるBailly et al., J.Virol. 74: 3188〜3195, 2000a ）、ここではrHPIV3-NB と呼ぶ。この先の研究は、N ORF の交換から始まった。なぜならPIV3タンパク質の中で、BPIV3 及びHPIV3 N タンパク質が中間レベルのアミノ酸配列同一性（85％）を有し（引用により本明細書に組み込まれるBailly et al., Virus Genes 20: 173〜82, 2000b ）、このようなBPIV3/HPIV3 N 組換え体は生存できることが示された（引用により本明細書に組み込まれるBailly et al., J.Virol. 74: 188〜3195, 2000a）からである。
【０４９４】
これは、“改変型ジェンナー”アプローチを表し、ここでは、ワクチンウイルス中の遺伝子のサブセットが動物のものから得られる。rHPIV3-NB は、LLC-MK2 サル腎臓及びMadin Darby ウシ腎臓細胞中に存在するrHPIV3及びBPIV3 のものに匹敵するタイターまで生長した（Bailly et al., J.Virol. 74: 3188〜3195, 2000a ）。これにより、Ｎタンパク質の異種の性質は、試験管内で、rHPIV3-Na の複製を妨げなかった。しかしながら、rHPIV3-NB はそのBPIV3 親ウイルスと同様の程度までアカゲザル内で複製が制限された（Bailly et al., J.Virol. 74: 3188〜3195, 2000a ）。これは、霊長類の中でのBPIV3 の複製の宿主範囲制限の決定要因としてBPIV3 N タンパク質を同定した。
【０４９５】
これにより、rHPIV3-NB キメラウイルスはHPIV3 の抗原決定基を、BPIV9 の宿主範囲制限及び弱毒化表現型と組み合わせる。HPIV3 及びBPIV3 のＮタンパク質の間には全部で515 アミノ酸のうち79の差がある（Bailly et al., Virus Genes 20: 173〜82, 2000b ）。これら79アミノ酸の差の多くはrHPIV3-NB の宿主範囲弱毒化表現型に寄与するようである。宿主範囲制限は多数のアミノ酸の差に基づくと予想されるので、rHPIV3-NB の弱毒化表現型は、生体内の長期の複製の後でさえ遺伝的に安定であろうと予想される、アカゲザルにおけるその制限された複製にかかわらず、rHPIV3-NB は、野生型（wt) HPIV3 でのそのサルの攻撃に対して高レベルの耐性を誘導し、この耐性のレベルは、wt HPIV3での免疫化により与えられるものと区別できなかった。rHPIV3-NB の感染性、弱毒化、及び免疫原性は、この新規キメラウイルスがHPIV3 ワクチンとしての優れた候補であることを示唆する（Baillyら、J.Virol. 74: 3188〜3195, 2000a）。
【０４９６】
更に、後述の通り、このようなキメラワクチンは、過剰保護抗原、例えば麻疹ウイルスのHAの発現のための弱毒化ベクターとして機能する優れた候補であることが本明細書で示される。得られたキメラウイルスのベクター成分はHPIV3 に対して免疫応答を誘導し、その添加された過剰な遺伝子は、それらの各々の異種病原に対する免疫応答を誘導する。この特定の実施形態において、HPIV3 及び麻疹ウイルスに対して免疫応答を同時に誘導する二価弱毒化ワクチンウイルスが作られる。
【０４９７】
rHPIV3は麻疹ウイルスヘマグルチニン（HA）タンパク質の発現のためのベクターとして用いることができる。２つの例、rcp45L HA (N-P) 及びrcp45 HA (HN-L) において、麻疹ウイルスHA遺伝子を発現する弱毒化ベクターはそのベクター骨格内に３つの弱毒化アミノ酸点変異を有することが先に示される。本発明のrHPIV3-NB ベクターは、３アミノ酸点変異に基づく弱毒化表現型を有するベクターより更にいっそうより安定であろう。上述したように、過剰な遺伝子としてのHAのrHPIV3への挿入は、ハムスターについてHPIV3 及び弱毒化HPIV3 cp45L の両方の複製をいくらか減衰させた。更に、1908-nt 遺伝子のHPIV3 への挿入は野生型骨格を減衰させたが、ハムスターにおいて複製のためのcp45L 変異を有する骨格の減衰のレベルを増加させた。
【０４９８】
それゆえ、麻疹ウイルスHA遺伝子の宿主範囲制限化rHPIV3-NB ウイルスへの挿入は、試験管内及び／又は生体内でのその増殖を更に減衰させるよう計画された。試験管内又は生体内で複製に影響を与える挿入物は、rHPIV3-NB のような特定のワクチンの開発のために問題となり得る。特に、試験管内で複製が高度に制限された候補ウイルスは、製造するのが困難であろうし、生体内で複製が高度に制限されたものは過剰に弱毒化されてワクチンとして有用でないであろう。HAを発現するHPIV3 での全ての以前の研究はげっ歯動物モデルで行われたので、rHPIV3-NB HA(P-M)で示す麻疹ウイルスHAグリコプロテインを発現するrHPIV3-NB キメラウイルスがHPIV3 及び麻疹ウイルスの両方に対して霊長類において満足いく免疫原性を有するであろうか否かも知られていなかった。
【０４９９】
逆遺伝子技術を用いてrHPIV3-NB HA(P-M)の生成を詳述する本例は、驚くことに、HA遺伝子のrHPIV3-NB への挿入はアカゲザルにおいてその複製を更に制限しないことを示す。おそらく挿入の弱毒化効果は、霊長類において複製の宿主範囲制限を特定するＮB 遺伝子中に存在する遺伝要素によりマスクされる。むしろ、rHPIV3-NB HA(P-M) は、アカゲザルにおいて満足いくほど弱毒化された。rHPIV3-NB HA(P-M) でのアカゲザルの免疫化は、wt HPIV3 チャレンジウイルスの複製に対する耐性を誘導し、麻疹ウイルスに対する中和性抗体の高いレベル、ヒトにおいて保護的であることが知られているレベルを刺激した（引用により本明細書に組み込まれるChen et al., J.Infect.Dis. 162: 1036〜42, 1990）。
【０５００】
rHPIV3 N 遺伝子ORF のかわりのBPIV3 N 遺伝子ORF 並びにrHPIV3 P 及びＭ遺伝子の間に挿入された過剰遺伝子としての麻疹ウイルスのHA遺伝子をコードするキメラウシ／ヒトPIV3抗原cDNAであるpFLC HPIV3-NB HA(P-M) の作製
全長抗原性cDNAプラスミドpFLC HPIV3-NB HA(P-M) （図12）を２つのステップで作製した。最初に、先に作製したpLeft-NBプラスミドは、BPIV3 のものにより置きかえられたHPIV3 N ORF を伴い、HPIV3 抗原性cDNAの３′半分（HPIV3nts 1-7437、後方の位置はHN遺伝子内のXhoI部位である）を含む（引用により本明細書に組み込まれるBailly et al., J.Vriol. 74: 3188〜3195, 2000a ）。このプラスミドからPshAI-NgoMIVフラグメントを切り出した。
【０５０１】
PshAI 部位はHPIV3 アンチゲノム配列内の位置2147にあり（図12を参照）、NgoMIV部位はベクター配列内にあり、従ってこれはPshAI 部位の下流のHPIV3 配列の全てを除去することに注意のこと。このフラグメントを、先に作製したプラスミドpLeft HA(P-M) からのPshAI-NgoMIVフラグメントにより置換し、それは、HPIV3 転写シグナルの制御下にあり、HPIV3 N 及びＰ遺伝子の間に挿入された麻疹ウイルスHA ORFを含む（引用により本明細書に組み込まれるDurbin, J.Virol. 74: 6821 〜31, 2000）。
【０５０２】
これは、pLeft-NB HAP-Mを作り出す。次に、BPIV3 N 遺伝子ORF 及び麻疹ウイルスHA遺伝子挿入物を含むHPIV3 アンチゲノムcDNAの３′半分を含む、pLeft NB HAP-Mの11899nt NgoMIVからのXhoIのフラグメントを、HPIV3 アンチゲノムcDNAの５′半分（PIV3nts 7462-15462）をコードするプラスミドであるpRightのNgo MIV からXhoIの窓にクローン化した（Durbin et al, Virology 235: 323-332, 1997a）。これは、HPIV3 N ORF の場所にBPIV3 を含み、HPIV3 のＰ及びＭ遺伝子の間に挿入された過剰遺伝子として麻疹ウイルスHA遺伝子を含むHPIV3 の全長アンチゲノムcDNAを有するプラスミド、pFLC HPIV3-NB HAP-M を作り出した。
【０５０３】
ウシＮ遺伝子及び麻疹ウイルスHA遺伝子を発現するキメラrHPIV3の回収
rHPIV3-NB HAP-M を、pFLC HPIV3-NB HAP-M をトランスフェクトしたHEp-2 細胞から回収した。これを行うために、pFLC HPIV3-NB HAP-M を、サポートプラスミドpTM (N), pTM (PnoC) 、及びpTM (L) 及びLipofectACE (Life Technologies, Gaithersburg, MD）と一緒に６−ウェルプレート（Costar, Cambridge, MA ）上のHEp-2 細胞にトランスフェクトし、その細胞に、上述のように、バクテリオファージT7ポリメラーゼタンパク質をコードする複製欠損のワクシニアウイルス組換え体であるMVA-T7を同時に感染させた。
【０５０４】
32℃で４日のインキュベーションの後、そのトランスフェクション収集物を25cm2 フラスコ内のLLC-MK2 細胞に植え継ぎ、その細胞を５日間、32℃でインキュベートした。その細胞上清から回収したウイルスを、32℃で、LLC-MK2 細胞上の更なる継代により増幅した。rHPIV3-NB HAP-M を上述のようにLLC-MK2 単層培養物上でのプラーク精製により生物学的にクローン化した。生物学的にクローン化したウイルス由来のウイルス上清を32℃でLLC-MK2 単層培養上で増幅した。ウイルスRNA (vRNA)を上述の通り生物学的にクローン化した組換えキメラウイルスから単離した。RT-PCRを、BPIV3 N ORF 又は麻疹ウイルスHA遺伝子を貫く特定のオリゴヌクレオチドプライマー対を用いて行い、その増幅したcDNAを上述の通り制限エンドヌクレアーゼ消化及び部分的DNA 配列決定により分析した。これは、BPIV3 N ORF 置換及び麻疹ウイルスHA過剰遺伝子挿入物の存在を確認した。
【０５０５】
麻疹ウイルスHAタンパク質の発現は、先に記載のように（引用により本明細書に組み込まれるDurbin, J.Viol. 74: 6821-31, 2000 ）、麻疹ウイルスHAタンパク質に特異的なマウスモノクローナル抗体及びヤギ抗マウスペルオキシダーゼ接合抗体を用いてrHPIV3-NB HAP-M を感染させたLLC-MK2 単層培養物上で形成された免疫染色プラークにより最初に確認した。
【０５０６】
rHPIV3-NB HAP-M はアカゲザルの気道においてrHPIV3-NB と同じレベルまで複製する。
麻疹ウイルスHA挿入物の獲得は、過剰遺伝子をウシキメラ構成物を欠如する弱毒化HPIV3 骨格に挿入した時に観察されるように、上部及び下部気道においてrHPIV3-NB の複製を有意に減少させるか否かを次に決定した。rHPIV3-NB HAP-M がHPIV3 及び麻疹ウイルスの両方に対する免疫応答を生体内で誘導するのに十分に複製するか否かも決定した。アカゲザルの上部及び下部気道におけるrHPIV3-NB HAP-M の複製を、そのrHPIV3-NB 親並びにwt HPIV3及びwt HPIV3のものと比較した（第15表）。
【０５０７】
HPIV3 及び麻疹ウイルスの両方について血清陰性であるアカゲザルに、鼻内（IN）及び気管内（IT）経路により、先に記載（Bailly et al., J.Vriol. 74: 3188〜3195, 2000a ）されるように、105TCID50 のウイルス懸濁液を含むL15 培地を部位当り１ミリリッターで接種した。鼻咽腔（NP）拭きとりサンプルを感染後１〜10日目に収集し、気管洗浄（TL）サンプルを感染後２，４，６，８及び10日に収集した。NP及びTL試料中に存在するウイルスを、32℃でLLC-MK2 細胞単層上に連続希釈により定量し、そして得られたタイターをlog10TLID50 ／mLとして表した（第15表）。
【０５０８】
この比較は、rHPIV3-NB NA(P-M) キメラウイルスがアカゲザルの上部及び下部気道においてそのrHPIV3-NB 親ウイルスと同じレベルまで複製することを示した。この複製のレベルは、BPIV3 ウイルス親のものにも匹敵し、このことは、rHPIV3-NB HA(P-M) がrHPIV3-NB 及びBPIV3 の弱毒化表現を保持すること、並びに予期せぬことに、麻疹ウイルスHA遺伝子のrHPIV3-NB ゲノムへの挿入がアカゲザルの気道内での複製についてこのウイルスを弱毒化させないことを証明する。
【０５０９】
【表１５】
0004795597.tif 000016
【０５１０】
ａ．本研究は、rHPIV3-NB HA(P-M) を与えた４匹のサル、及びrHPIV3 wt, rHPIV3-NB、又はBPIV3 Kaを与えた各々のグループ２匹のサルを含む。rHPIV3-NB HA(P-M) を与えたグループを除き、データは、Bailey et al., J.Virol 74: 3188 〜3195, 2000、及びSchmidt et al., J.Virol. 74: 8922 〜8929, 2000に報告される研究からの歴史的データを含む。
ｂ．Schmidt et al., J.Virol. 74: 8922 〜8929, 2000からの歴史的データ。
【０５１１】
ｃ．サルに、各々の部位に１mLの接種物中105TCID50 のウイルスを鼻内及び気道内に接種した。鼻咽腔（NP）スワブサンプルは感染後１〜10日目に収集した。気管洗浄（TL）サンプルは、感染後２，４，６，８及び10日に収集した。そのグループ内の各々の動物についてのピークウイルスタイターの平均はサンプル採取日と関係ない。S.E.＝標準誤差。ウイルス滴定は、32℃でLLC-MK2 細胞で行った。ウイルスタイターの限界は10TCD50 ／mLであった。
【０５１２】
ｄ．本研究において、血清は免疫化後31日目にサルから収集し、次に動物をHPIV3 で攻撃した。２つの先の研究において、サルのサンプルをとり、免疫化後28日目に攻撃した。
ｅ．本研究のために収集した及び先の２つの研究からの血清を同時にアッセイした。血清HAI タイターは、平均逆数log2±標準誤差SEとして表す。
ｆ．動物を、非経口的に投与した麻疹ウイルスMoraten ワクチン（IM）106pfuで59日目に免疫化した。血清はその後28日目（即ち最初の免疫化後87日目）に収集した。データは、本研究の動物からのみ収集した。wt麻疹ウイルスに対する平均中和抗体タイターは平均逆数log2標準誤差として表す。PRN ＝プラーク削減中和。
【０５１３】
ｇ．免疫化後28又は31日目に、サルに、各々の部位に１mL接種物中の106TCID50 のwt HPIV3を鼻内及び気管内に接種した。NP及びTLサンプルは、攻撃後０，２，４，６及び８日目に収集した。０日目にNP及びTLサンプルについて得られたタイターは2.0log10TCID50／mL未満であった。
ｈ．グループ５を除き、データは本研究からのものである。
【０５１４】
rHPIV3-NB HA(P-M) でのアカゲザルの免疫化はHPIV3 及び麻疹ウイルスの両方に対する高タイターの抗体を誘導し、HPIV3 での攻撃からサルを保護する
rHPIV3-NB HAP-M で免疫化したアカゲザルはHPIV3 及び麻疹ウイルスの両方に対する高レベルの血清抗体を発達させた（第15表）。血清HPIV3 抗体は、先に記載（引用により本明細書に組み込まれるDurbin, J.Virol. 74: 6821 〜31, 2000）されるように、モルモット赤血球を用いて赤血球凝集抑制試験（HAI ）により定量し、そのタイターは平均逆数log2±SEで表した。
【０５１５】
HPIV3 に対する高レベルの血清HAI 抗体が、rHPIV3-NB HAP-M 及びrHPIV3-NB の両方により誘導され、このことはこれらの弱毒化組換え体はHPIV3 ベクターの骨格抗原に対する強力な免疫応答を誘導することができることを示す。rHPIV3-NB HAP-M で免疫化したアカゲザルは免疫化後31日に高レベルの血清麻疹ウイルス中和抗体を発達させ、そのレベルは麻疹ウイルスでの感染に対してヒトを保護するのに必要とされる過剰なものであることも見い出された（引用により本明細書に組み込まれるChen et al., J.Infect.Dis. 162: 1036〜42, 1990）。野生型麻疹ウイルスに対する血清中和抗体タイターを先に記載（Durbin, J.Virol. 74: 6821 〜31, 2000）のように定量し、そのタイターを逆数平均log2±SEとして表した（第15表）。
【０５１６】
wt HPIV3に対する保護する、生きている弱毒化rHPIV3-NB HAP-M 及びrHPIV3-NB ウイルスでの感染の能力を比較するために、サルを、最初の感染後31日目に、106TCID50 のwt HPIV3でIN及びITで攻撃した（第15表）。鼻咽腔スワグ及び気管洗浄サンプルを攻撃後２，４，６及び８日目に収集した。その試料中に存在するウイルスを、上述のようにLLC-MK2 単層培養物上での連続希釈により定量した。rHPIV3-NB HAP-M 及びrHPIV3-NB は、免疫化サルの気道中のwt HPIV3複製における100 〜1000倍の削減により示されるように、wt HPIV3での攻撃に対して相対物に高レベルの保護を与えた、これは、麻疹ウイルスHA遺伝子のキメラウシ／ヒトPIV3への挿入は、弱毒化ウイルスベクターの骨格に存在するHPIV3 グリコプロテインにより誘導される保護のレベルを減少させないことを示した。
【０５１７】
次に、rHPIV3-NB HAP-M の免疫原性を、PIV3及び麻疹ウイルスの両方が有効に複製する種であるアカゲザルにおいて、生きている弱毒化ウイルスワクチンの認可されたMoraten 株のものと比較した。先にrHPIV3ウイルス又はrHPIV3-NB HAP-M を感染させたアカゲザルを、59日目に、生きている弱毒化された麻疹ウイルスワクチンのMoraten 株106pfuで非経口的（IM）に免疫化し、87日目に血清サンプルをとり、麻疹ウイルスに対する中和抗体について分析した（第15表）。
【０５１８】
Moraten ワクチンを与える前に麻疹ウイルスについて未処置である動物（第15表、グループ１及び２）において、Moraten ワクチンにより誘導される麻疹特異的抗体のタイターは、rHPIV3-NB HAP-M 免疫化動物（第15表、グループ２）で見られるのとほぼ同じであった。これにより、HAグリコプロテイン麻疹ウイルスを発現するrHPIV3-NB HAP-M ベクターは、この霊長類モデルにおいて、ウイルス中和抗体を誘導する能力においてMoraten ワクチンと等価であった。
【０５１９】
Moraten ワクチンに優る麻疹ウイルスのワクチンとしてのrHPIV3-NB HAP-M の重要な利点は、そのPIV ベクターは鼻内経路により投与することができるが、生きている弱毒化麻疹ウイルスワクチンは、おそらく細胞培養へのそれらの減衰及び適合の結果として、この経路により一定して感染性ではないことである。これは、母の抗体の中和及び免疫抑制効果のため、Moraten 株のような現在生きている弱毒化麻疹ウイルスワクチンで免疫化することができない年齢グループである早期乳児期においてrHPIV3-NB HAP-M で免疫化することを可能にする（引用により本明細書に組み込まれるDurbin, J.Virol. 74: 6821 〜31, 2000）。他の利点は、上述のように、細胞培養におけるPIV ベクターの優れた増殖及びビリオン内の麻疹ウイルスHAの組込みの欠如があり、それは、PIV ベクターの向性の変化を排除し、麻疹ウイルス誘導化免疫抑制を排除するはずである。
【０５２０】
麻疹ウイルス感染に対する有効なワクチン接種の欠如は、世界で毎日2700を超える子供の死を引きおこす。rHPIV3-NB HA(P-M) 候補ワクチンは、激しい小児の疾患の２つの主要な原因、即ちHPIV3 及び麻疹ウイルスに対して免疫化する特有の機会を与える。現在、認可されている麻疹ウイルスワクチンと異なり、我々は、麻疹ウイルス又は他の異種病原体の主要抗原決定基を発現するキメラrHPIV3-NB HA(P-M) 及び他のヒト−ウシキメラベクターが、幼児及び６ヶ月の年令り若い子供において、例えば麻疹ウイルスに対する強力な免疫応答を誘導するのに用いることができると予想する。幼児及び子供のための有効な免疫化ストラテージは、2010年までに麻疹を撲滅するための世界保健機構の目的に合致するために必要とされよう。特に、感染性麻疹ウイルスに関連しない麻疹ウイルスワクチンを用いることが撲滅のために有効であろう。
【０５２１】
実施例Ｘ
RSV グリコプロテイン過剰遺伝子のためのベクターとしての組換えウシ−ヒトパラインフルエンザウイルス３型（rB/HPIV3）の使用
本発明に用いるために、BPIV3 F 及びHN遺伝子をHPIV3 のもので置きかえた組換えキメラヒト−ウシPIV を作製した。この組換えキメラウシ−ヒトウイルスrB/HPIV3は、細胞培養における複製について十分にコンピテントであることが示されたが、アカゲザルにおいて、それは、BPIV3 の宿主範囲制限化弱毒化表現型特性を示し、高度に免疫原性かつ保護的であった（各々が引用により本明細書に組み込まれる、2000年６月１日に出願された米国特許出願通し番号09/586,479；Schmidt et al., J.Virol. 74: 8922〜9, 2000）。これは、本発明の組成物及び方法において有用である“改良型ジェンナー”アプローチの別の例であるが、この場合、ウイルスの“内部”遺伝子の全体のセットはBPIV3 から得られ、抗原決定基のみがHPIV3 から得られる。
【０５２２】
上述の通り、各々が別個に弱毒化され、確認されなければならず、予測できない方法で相互作用することができる異なるウイルスの結合混合物と反対に、単一PIV3骨格に基づくワクチンを好む多数の実用的かつ安全性の考慮がある。更に、BPIV3 の宿主範囲制限は極めて高度に安全であるべき弱毒化表現型を与える。本例において、組換えキメラヒト−ウシPIV3 (rB/HPIV3) をデザインし、レスキューし、そして主要RSV 中和及び保護抗原である呼吸系発疹ウイルス（RSV ）をコードするものとしてキャラクタライズした。この例は、rB/HPIV3は試験管内又は生体内でのその複製効率の有意な減少なく、外来RSV 遺伝子を直ちに受け入れこれにより有望な候補ワクチン及びベクターであることを示す。このベクターは、試験管内での乏しい増殖の問題及びRSV の他の特徴である不安定性がないであろう。
【０５２３】
更なる過剰遺伝子としてRSV サブグループAG又はF ORF を有する組換えキメラrB/HPIV3ウイルスをコードする抗原性cDNAの作製
BPIV3 Kansas株の全長cDNAを、ウシウイルスのＦ及びHNグリコプロテイン遺伝子がHPIV3 JS株（rB/HPIV3）の対応する遺伝子で置換されるように作製した（各々が引用により本明細書に組み込まれるSchmidt et al.の2000年６月１日に出願された米国特許出願通し番号09/586,479；Schmidt et al., J.Virol 74: 8922-9, 2000）。本発明に用いるために、このcDNAを、３つの更なるユニーク制限酵素認識部位を含むように改変した。
【０５２４】
詳しくは、BlpI部位はN ORF （ヌクレオチド（nt）103-109 ）の前に導入し、AscI部位は、Ｎ遺伝子末端配列の前に導入し、そしてNotI部位はＰ遺伝子端配列の前に導入した。これらの制限酵素認識部位は、外来の過剰遺伝子をキメラB/HPIV3 ウイルスゲノムのゲノムへの挿入を容易にするために導入した。それらの部位は、それらがBPIV3 複製及び転写シス作用因子のいずれも破壊しないようにデザインした。この特定の例は、BlaI部位への挿入を記述するであろう（図13）。
【０５２５】
先に記述されるRSV サブグループＡグリコプロテイン遺伝子Ｇ及びＦ（GenBank accession no. M74568）を、B/HPIV3 のプロモーター近傍BlpI部位への挿入のために改変した（図13）。そのストラテジーは、更なる別個のmRNAとして各々の異種ORF を発現することであり、従って、それがBPIV3 遺伝子開始シグナルの後にあり、次にBPIV3 遺伝子終了シグナルがあるように、それをrB/HPIV3ゲノムに導入することが重要であった。BlpI挿入部位はＮ遺伝子の遺伝子開始シグナルの後にあった（図13）。従って、この部位への挿入のため、RSV ORF はその上流でのBlpI部位の挿入、並びにその下流端でのBPIV3 遺伝子終了シグナル、遺伝子間領域、遺伝子開始シグナル、及びBlpI部位の付加により改変されることが必要であった。
【０５２６】
RSV A G ORF のため、用いた正PCR プライマーは（５′→３′）AATTCGCTTAGCGATGTCCAAAAACAAGGACCAACGCACCGC（配列番号：30）であり、逆プライマーは（５′→３′）AAAAAGCTAAGCGCTAGCCTTTAATCCTAAGTTTTTCTTACTTTTTTTACTACTGGCGTGGTGTGTTGGGTGGAGATGAAGGTTGTGATGGG（配列番号：31)(BlpI部位を下線、ORF 翻訳開始及び終了トリプレットを太線）であった。RSV A F ORF について、用いた正PCR プライマーは（５′→３′）AAAGGCCTGCTTAGCAAAAAGCTAGCACAATGGAGTTGCTAATCCTCAAAGCAAATGCAATTACC（配列番号：32）であり、逆プライマーは（５′→３′）AAAAGCTAAGCGCTAGCTTCTTTAATCCTAAGTTTTTCTTACTTTTATTAGTTACTAAATGCAATATTATTTATACCACTCAGTTGATC（配列番号：33)(BlpI部位を下線、ORF 翻訳開始及び終了トリプレットをボールド）であった。
【０５２７】
そのPCR 産物をBlpIで消化し、標準的分子クローニング技術を用いて改変全長cDNAクローンにクローン化した。RSV A G ORF を含む得られた全長cDNAをpB/HPIV3-GA1と呼び、F ORF を含むプラスミドをpB/HPIV3-FA1と呼んだ。各々の挿入された遺伝子のヌクレオチド配列を、制限酵素消化及び自動化配列決定により確認した。最終的なゲノムヌクレオチド長が、有効なRNA 複製のための必要条件であることが示されている６の倍数になるように、全構成物をデザインした（引用により本明細書に組み込まれるCalain et al., J.Virol. 67: 4822〜30, 1993）。
【０５２８】
cDNAからのrB/HPIV3-G1 及びrB/HPIV3-F1 キメラウイルスの回収
rB/HPIV3-G1 及びrB/HPIV3-F1 ウイルスを、各々のcDNA, rB/HPIV3-GA1及びrB/HPIV3-FA1から回収した。これは、HEp-2 細胞にBPIV3 N, P及びＬサポートプラスミドと一緒に各々のアンチゲノムcDNAをトランスフェクトする先に記載される方法により行った。それらの細胞に、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルス株MVA を同時に感染させた。
【０５２９】
その回収した組換えウイルスをVero細胞において連続的終点希釈により生物学的にクローン化た。各々の回収された組換え体ウイルスの骨格中の挿入されたRSV G 又はＦ遺伝子の存在は、感染した細胞から単離されたウイルスRNA のRT-PCR、次の制限酵素消化及びDNA 配列決定により確認した。その回収された組換え体ウイルス中の挿入された遺伝子及び隣接領域の配列は、出発アンチゲノムcDNAのものと同一であった。
【０５３０】
rB/HPIV3-G1 及びrB/HPIV3-F1 ウイルス又は細胞培養において有効に複製する
LLC-MK2 細胞中のrB/HPIV3-G1 及びrB/HPIV3-F1 のマルチサイクル増殖速度を、LLC-MK2 細胞単層に、３回重複で、0.01の感染の多重度（MOI ）で感染させ、先に記載（引用により本明細書に組み込まれるBailly et al., J.Virol. 74: 3188-3195, 2000a ）のように、７日間にわたり、24時間間隔でサンプルを収集することにより決定した。これらの２つのウイルスを、BPIV3 Ka, HPIV3 JS, rBIV3 Ka、及びrB/HPIV3と比較した（図14）。HPIV3 グリコプロテインを有する２つの親ウイルス、即ちHPIV3 及びrB/HPIV3は、他のものよりいくらか迅速に複製するようであった。しかしながら、６つのウイルスの各々について達成された最終的なタイターは、１つを除いて同様であった：rB/HPIV3-F1 は、他のウイルスと比べてその複製能力において約８倍、少かった（図14）。
【０５３１】
これは、プロモーター近傍位置においてこの大きな遺伝子を有する効果であるか、又は第２の融合原タンパク質の発現の効果か、又はその両方であり得る。この後者の可能性は、rB/HPIV3-F1 は野生型RSV 感染とで観察されるのに匹敵し、rB/HPIV3又は他の親ウイルスで観察されるより大きな大規模シンシチウムを誘導するという観察結果により示唆された。比較において、rB/HPIV3-G1 は、LLC-MK2 細胞において、rB/HPIV3に匹敵する少い細胞毒性効果及び少いシンシチウムを導入した。しかしながら、rB/HPIV3-F1 及びrB/HPIV3-G1 はLLC-MK2 細胞及びVero細胞において少くとも107TCID50 ／mLの最終タイターまで増殖した。これは、各々のウイルスが、コスト効率のいいワクチン製造を許容するであろう増殖についての十分な許容性を有することを示す。
【０５３２】
rB/HPIV3-G1 及びrB/HPIV3-F1 ウイルスはハムスターの気道内で有効に複製する。
rB/HPIV3-G1 及びrB/HPIV3-F1 を、ハムスターの上部及び下部気道内で複製する能力について評価した。rB/HPIV3親ウイルス、並びにBPIV3 及びHPIV3 生物学的誘導化ウイルスを、コントロールとして平行して比較した（第16表）。各々のウイルスを106TCID50 の投与量で鼻内に投与し、１つのグループに、rB/HPIV3-G1 及びrB/HPIV3-F1 の両方を与えた。
【０５３３】
各々のグループからの動物を感染後４及び５日目に殺し、鼻甲介及び肺の中のウイルスタイターを、連続希釈により決定した。気道中のrB/HPIV3-G1 の複製のレベルは、HPIV3 JS及びBPIV3 Kaのものと極めて似ており、統計的に区別できなかった。rB/HPIV3-F1 の複製は、他のものに対して、４日及び５日目にいくらか減少したが、この差は、先の霊長類及び臨床研究が十分に複製して保護的免疫応答を誘導した生物学的BPIVウイルスと比べて、統計的に有意でなかった（各々が引用により本明細書に組み込まれる、Coelinghら、Virology 162: 137〜143, 1988: Karron et al, Pediatr-Infect.Dis.J. 15: 650〜654, 1996）。
【０５３４】
また、rB/HPIV3-G1 及びrB/HPIV3-F1 の混合感染からのウイルスのタイターは、４日目において下部気道においていくらか減少するようであったが、これは統計的に有意でなかった。コントロールウイルスBPIV3 Kaの１つの複製は、５日目に下部気道においていくらか減少した：これも統計的に有意でなく、これらの小さな差は重要でないようである。これにより、rB/HPIV3-G1 及びrB/HPIV3-F1 ウイルスは、プロモーターに隣接した0.9kb G 又は1.8kb F 過剰遺伝子の存在にかかわらず、生体内での複製について十分にコンピテントであるようであった。
【０５３５】
【表１６】
0004795597.tif 000017
【０５３６】
rB/HPIV3-G1 及びrB/HPIV3-F1 ウイルスは、HPIV3 及びRSV の両方に対する血清抗体を誘導する。
ハムスターにrB/HPIV3-G1, rB/HPIV3-F1、又はrB/HPIV3を上述のように感染させた。更なるグループにrB/HPIV3-G1 及びrB/HPIV3-F1 の両者を与え、そして別のグループにRSV を鼻内に感染させた。血清サンプルを感染後５日に収集し、RSV F タンパク質又はRSV G タンパク質に特異的なELISA テストによりRSV 特異的抗体について（第17表）、及び赤血球凝集抑制（HAI ）抗体アッセイによりHPIV3 HN特異的抗体について（第18表）アッセイした。
【０５３７】
各々rB/HPIV3-F1 又はrB/HPIV3-G1 ウイルスにより誘導されるＦ−特異的又はＧ−特異的抗体のタイターは、野生型RSV により誘導されるのより２〜４倍高かった。rB/HPIV3-F1 及びrB/HPIV3-G1 の両方を接種した動物もＦ−特異的及びＧ−特異的抗体の高いタイターを有した。RSV G 及びＦに対する高いELISA タイターに加えて、rB/HPIV3-G1 及びrB/HPIV3-F1 も、wt RSVにより誘導されるより高いRSV 中和血清抗体タイターを誘導した（第18表）。各々のウイルスはそれらの親ウイルスrB/HPIV3のものから区別できないPIV3−特異的抗体のタイターを誘導した（第18表）。これにより、RSV のＦ又はＧ遺伝子を有するrB/HPIV3ベクターは、RSV 挿入物及びPIV ベクターの両方に対して強力な免疫応答を誘導した。
【０５３８】
【表１７】
0004795597.tif 000018
【０５３９】
【表１８】
0004795597.tif 000019
【０５４０】
rB/HPIV3-G1 及びrB/HPIV3-F1 ウイルスはHPIV3 及びRSV チャレンジウイルスの複製に対する耐性を誘導する。
rB/HPIV3, rB/HPIV3-G1, rB/HPIV3-F1、又はrB/HPIV3-G1+rB/HPIV3-F1 ワクチン候補で免疫化したハムスターを、28日後に、106TCID50 のHPIV3 又は106PFUのRSV の鼻内接種により攻撃した。動物を５日後に殺し、鼻甲介及び肺を収集し、ウイルスタイターを測定した（第19表）。親rB/HPIV3ウイルス又はG1及びF1誘導体を与えた動物は、HPIV3 チャレンジウイルスの複製に対する高レベルの耐性を示し、実験グループ間に有意な差はなかった。
【０５４１】
rB/HPIV3-G1 もしくはrB/HPIV3-F1 、又は両方のウイルスを与えた動物は、RSV チャレンジウイルスの複製に対する高レベルの耐性を示した。RSV 攻撃に対するrB/HPIV3-F1 ウイルスの保護効能のレベルは、rB/HPIV3-G1 ウイルス又はRSV コントロールのものよりわずかに少いようであった。しかしながら、この差は有意に異ならなかった。これにより、RSV のＦ又はＧ遺伝子のいずれかを有するrB/HPIV3ベクターは、完全な感染性RSV のものに匹敵する保護効能のレベルを誘導した。
【０５４２】
【表１９】
0004795597.tif 000020
【０５４３】
実施例XI
PIV2のヘムアグルチニンHN及びＦタンパク質のためのベクターとしてのrB/HPIV3.1の利用
HPIV3 HN及びＦ遺伝子がそのHPIV1 対応物で置き換えられているHPIV3 骨格を有するキメラrHPIV3-1ウイルスは過剰遺伝子として、HPIV2 HNタンパク質のための有用なベクターを担う。このキメラベクターrHPIV3-1.2HNはハムスターにおいてHPIV1 及びHPIV2 の双方の複製に対する耐性を誘導することがここで実証された。これらの発見は、PIV 発現系の驚くべき多様性を示す。例えば、rHPIV3-1.2HN組換ウイルスは顕著な疾患を惹起するHPIVの３つの血清型各々に由来する要素、即ち、血清型１のHN及びＦ糖タンパク質遺伝子と組合さった血清型３の内部遺伝子、並びに過剰遺伝子としての血清型２のHN防御抗原、を含む。
【０５４４】
本実施例はPIV1及びPIV2の双方に対する防御のためのPIV 系ベクターワクチンを誘導する更なる別のアプローチを提供する。この実施例において、rB/HPIV3はヒトPIV3 HN 及びＦタンパク質のHPIV1 のそれらによる置換により修飾した。rB/HPIV3.1と命名されたこのウイルスは、HPIV1 に対する中和抗体及び免疫力を誘導するつもりで、ベクター骨格の一部としてPIV1 HN 及びＦ糖タンパク質を含む。このウイルスは本実施例において、HPIV2 のHN及びＦタンパク質を単独で又は一緒に過剰遺伝子として発現させるベクターとして使用する。３種のウイルスを回収し、そして完全に生きていることが示された。rB/HPIV3.1-2F; rB/HPIV3.1-2HN ；又はrB/HPIV3.1-2F, 2HN。各々はPIV2F 及び／又はHN遺伝子を１又は複数の過剰遺伝子として発現する。
【０５４５】
従って、２つの過剰遺伝子からPIV2F 及び／又はHNタンパク質を発現させ、且つベクター骨格からPIV1 F及びHN遺伝子を発現させるrB/HPIV3.1-2F, 2HNは、単独のウイルス由来のPIV1及びPIV2の双方の主要防御抗原、即ち、Ｆ及びHN糖タンパク質を発現する。このアプローチはワクチンの防御効能の最適化を図り、且つこの増強された免疫原性がたった１個のウイルスを利用して達成されるため、製造費を最小限にする。また、複数のウイルスの混合物と比べ、単独の多価ウイルスで幼児及び小児を免疫することは簡単、安全、且つより有効であろう。
【０５４６】
追加の過剰遺伝子としてHPIV2 F 及びHN遺伝子を担持する組換キメラrB/HPIV3.1ウイルスをコードするアンチゲノムcDNAの構築
ウシウイルスのＦ及びHN糖タンパク質遺伝子がHPIV3 JS株の対応の遺伝子（rB/HPIV3）に置き換えられたBPIV3 カンサス株の全長cDNAを既に発表されている通りにして構築して（本明細書に組入れる、Schmidt ら、J.Virol. 74: 8922-9, 2000 ）。このDNA を３つの更なる固有制限酵素認識部位を含むように修飾した（図15）。詳しくは、BlpI部位をN ORF （ヌクレオチド（nt）103-109 ）の前に導入し、AscI部位（nt 1676-83）をＮ遺伝子末端配列の前に導入し、そしてNotI部位（nt 3674-3681）をＰ遺伝子末端配列の前に導入した。
【０５４７】
次に、rB/HPIV3のＦ及びHN糖タンパク質遺伝子をHPIV1 の対応の遺伝子で置換した。これを成し遂げるため、既に発表されているrHPIV3-1全長cDNAのサブクローン3.1hcR6 （引用することで本明細書に組入れるTao ら、J.Virol. 72: 2955 〜2961, 1998)(これはHPIV3 転写シグナルのコントロール下でHPIV1 のＦ及びHN糖タンパク質遺伝子のORF を含む）をPCR 突然変異誘発により修飾して、rB/HPIV3（Schmidt ら、J.Virol. 74: 8922-9, 2000）に予め導入されているSgrAI 及びBsiWI 部位の位置と似たようにして、SgrAI 制限酵素認識部位をＦ遺伝子の前に、そしてBsiWI 部位をHN遺伝子の前にくるように構築した。
【０５４８】
SgrAI 部位を構築するために用いた突然変異誘発フォワードプライマーは（５′から３′にかけて）CGGCCGTGACGCGTCTCCGCACCGGTGTATTAAGCCGAAGCAAA (SEQ ID NO.34) (SgrAI部位に下線）、そして突然変異誘発リバースプライマーは（５′から３′にかけて）CCCGAGCACGCTTTGCTCCTAAGTTTTTTATATTTCCCGTACGTCTATTGTCTGATTGC (SEQ ID NO.35)(BsiWI部位に下線）とした。rB/HPIV3内のHPIV3 F 及びHN遺伝子を修飾3.1hcR6 プラスミド由来のHPIV1 F 及びHN遺伝子で置き換えるため、SgrAI 及びBsiWI 部位を一本鎖DNA フラグメントとして用いた。これはBPIV3 に由来するバックグランドの中でHPIV3 転写シグナルのコントロール下にあるHPIV1 F 及びHNオープンリーディングフレームから成る全長アンチゲノムcDNA pB/HPIV3.1 をもたらす。
【０５４９】
以下の工程において、既に発表されているHPIV2 F 及びHNオープンリーディングフレーム（GenBank 受託番号AF213351及びAF213352）をpB/HPIV3.1（図15）のNtoI及びAscI部位それぞれへの挿入のために修飾した。この戦略はPIV2 F及びHN ORFの各々を追加の独立mRNAとして実現させるためのものであり、従ってそれがrB/HPIV3ゲノムの中に導入され、PIV3遺伝子開始シグナルが先行し、且つPIV3遺伝子末端シグナルが後続するようになることが重要である。NotI挿入部位はＰ遺伝子の遺伝子末端シグナルを先行する（図15）。従って、この部位での挿入のため、HPIV2 F ORF はNotI部位の挿入、その上流でのBPIV3 遺伝子末端シグナル、遺伝子間領域及び遺伝子開始シグナルの追加、並びにその下流末端でのNotI部位の追加による修飾を必要とする。
【０５５０】
HPIV2 F ORF の場合、使用したフォワードPCR プライマーは（５′から３′にかけて）AAAATATAGCGGCCGCAAGTAAGAAAAACTTAGGATTAAAGGCGGATGGATCACCTGCATCCAATGATAGTATGCATTTTTGTTATGTACACTGG (配列番号：36)とし、そしてリバースプライマーは（５′から３′にかけて）AAAATATAGCGGCCGCTTTTACTAAGATATCCCATATATGTTTCCATGATTGTTCTTGGAAAAGACGGCAGG (配列番号：37) とした（NotI部位に下線：ORF 翻訳開始及び終止トリプレットは太字）。
【０５５１】
HPIV2 HN ORFの場合、HPIV2 F について上述したのと同じcis 作用要素を加えたが、NotIの代わりに、AscI部位をインサートのいずれかの側に加え、Ｎ−Ｐ遺伝子ジャンクションへのクローニングを促進させた。使用したフォワードPCR プライマーは（５′から３′にかけて）GGAAAGGCGCGCCAAAGTAAGAAAAACTTAGGATTAAAGGCGGATGGAAGATTACAGCAATCTATCTCTTAAATCAATTCC (配列番号：38)とし、リバースプライマーは（５′から３′にかけて）GGAAAGGCGCGCCAAAATTAAAGCATTAGTTCCCTTAAAAATGGTATTATTTGG (配列番号：39）とした。
【０５５２】
PCR 生成物をNotI（HPIV2 F インサート）又はAsc1 (HPIV 2 HN インサート）で消化し、そして標準の分子クローニング技術を利用して修飾全長cDNAクローンにクローニングした。HPIV2 ORF を含む得られる全長cDMAをpB/HPIV3.1-2F と命名し、HPIV2 HN ORFを含む全長cDNAをpB/HPIV3.1-2HNと命名し、そしてＦ及びHNインサートの双方を含むプラスミドをpB/HPIV3.1-2F,2HN と命名した。各挿入遺伝子のヌクレオチド配列を制限酵素、消化及び自動配列決定により確認した。構築体は全て、最終ゲノムヌクレオチド長が、効率的なRNA 複製のために必要であると示されている６倍の長さとなるように設計した（引用することで本明細書に組入れるCalainら、J.Virol. 67: 4822-30, 1993）。回収したキメラウイルスのゲノムヌクレオチド長は下記の通りであった：pB/HPIV3.1: 15492; pB/HPIV3.1-2HN: 17250; pB/HPIV3.1-2F: 17190; pB/HPIV3.1-2HN,2F: 18948。
【０５５３】
cDNAからのrB/HPIV3.1, rB/HPIV3.1-2F, rB/HPIV3.1-2HN及びrB/HPIV3.1-2F,2HNの回収
rB/HPIV3.1, rB/HPIV3.1-2F, rB/HPIV3.1-2HN及びrB/HPIV3.1-2F,2HNのキメラウイルスを各々cDNAs pB/HPIV3.1, pB/HPIV3.1-2F, pB/HPIV3.1-2HN及びpB/HPIV3.1-2F,2HNから回収した。これは、HEp-2細胞を対応のアンチゲノムcDNAで、BPIV3 N, P 及びＬサポートプラスミドと共にトランスフェクションする既に発表された方法で行った。細胞を同時にT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を発現する組換ワクシニアウイルス、MVA 株で感染させた。既に発表されている通りにして（Tao ら、J.Virol. 72: 2955-2961, 1998）、ブタトリプシンを細胞培養培地に加え、HPIV1 F タンパク質を活性化させた。回収した組換ウイルスをVero細胞での連続終点希釈により生物学的にクローニングした。
【０５５４】
組換ウイルスは全て効率的に複製し、５日以内にVero細胞内でCPE を誘導し、そして細胞単層をヘム吸着に対して陽性にした。回収した組換ウイルス各々の骨格内の挿入HPIV2 F 及びHN遺伝子の存在は、感染細胞から単離したウイルスRNA のRT-PCR、その後の制限酵素消化及びDNA 配列決定により確認した。回収した組換ウイルス内の挿入遺伝子及び隣接領域の配列は出発アンチゲノムcDNAのそれと同じであった。
【０５５５】
実施例XII
麻疹ウイルスヘムアグルチニン（HA）タンパク質のベクターとしてのrHPIV3-1 cp45Lの利用：連続免疫化戦略
HPIV3 HN及びＦ遺伝子がそのHPIV1 対応物に置き換えられているHPIV3 骨格を有するキメラrHPIV3-1ウイルスは上述の通り過剰遺伝子としてHPIV2 HNタンパク質の有効なベクターを担う。このキメラベクターrHPIV3-1.2HNはハムスターにおいてHPIV1 及びHPIV2 の双方の複製に対する耐性を誘導することができる。この発見はPIV 発現系の驚くべき多様性を示す。例えば、この特定のウイルスrHPIV3-1.2HNはHPIVの３つの血清型各々に由来する要素、即ち、血清型１のHN及びＦ糖タンパク質と組合さった血清型３の内部遺伝子、並びに過剰遺伝子としての血清型２のHN防御タンパク質を含む。更なる誘導体、rHPIV3-1.2HN cp45Lも、cp45 HPIV3ワクチン候補由来の弱毒突然変異を含むようにした。
【０５５６】
従って、PIV ベクターは３つの成分、即ち、所望するなら弱毒突然変異を含みうる内部ベクター骨格遺伝子；同一又は異種の血清型でありうるベクター糖タンパク質遺伝子；及び別の病原体に対する防御抗原をコードする１又は複数の過剰遺伝子を含んで成るものとして提供されうる。ほとんどの場合、これらの過剰抗原はビリオンには組込まれず、それ故ウイルスの中和又は向性特性を変えてしまわない。かくして、各PIV ベクターは二価又は多価ワクチンであり、それにおいてはベクター自体が重要なヒト病原体に対する免疫力を誘導し、そして各過剰抗原は別の病原体に対する免疫力を誘導する。
【０５５７】
本実施例において、PIV ベクター系の多様性はrHPIV3-1ウイルス、及びその弱毒rHPIV3-1 cp45L誘導体を、麻疹ウイルスHAを過剰遺伝子として発現するベクターとして用いることにより更に実証される。これはHPIV1 及び麻疹ウイルスの新たな二価ワクチン候補を供する。かくして、麻疹ウイルスHAは血清型３抗原決定基を担持するrHPIV3及びその弱毒誘導体により搬送されるか、又は血清型１抗原決定基を担持するrHPIV3-1及びその弱毒誘導体により搬送されうる。
【０５５８】
HPIVの３つの血清型（１，２及び３）が有意な交差防御を供せず、各々がワクチンを必要とする顕著なヒト病原体を提示することは注目すべきである。このことは、３つの血清型が幼児をPIV と、異種病原体に対する搬送された防御抗原とに対して連続免疫させるのに利用できうる蓋然性を高める。詳しくは、一の血清型の抗原決定基を含むPIV ベクターによる免疫は、異種血清型の抗原決定基を含む１又は複数のベクターによる事前免疫によりほとんど又は全く影響されるべきである。このことは、過剰抗原に対して、及び遺伝子がベクター骨格の中から又は過剰遺伝子として発現されうる３つのHPIV血清型に対する連続免疫及び増強（好ましくは、４〜６週間又はそれより長い間隔をあけて）を実行する機会を供する。
【０５５９】
本実施例は、麻疹ウイルス及びHPIV1 の双方に対する免疫応答を誘導するように幼児及び小児において利用するための、過剰遺伝子として主要麻疹ウイルス防御抗原、HA糖タンパク質（Durbin, J.Virol. 74: 6821-31, 2000; 引用することで本明細書に組入れる）を発現する生きた弱毒HPVI1 候補ワクチン、rHPIV3-1 HAP-M cp45Lの開発のための逆方向遺伝学技術の利用を詳細する。
【０５６０】
また、連続免疫スケジュールを開発し、それにおいては弱毒rHPIV3 HAP-M cp45L候補ワクチン（血清型３抗原決定基を担持）により免疫し、その後rHPIV3-1 HNP-M cp45L候補ワクチン（血清型１抗原決定基を担持）により免疫を行う。これらのウイルスで免疫したハムスターはベクターの骨格の中に存在するHPIV3 及びHPIV1 抗原に対する抗体を作り、そしてHPIV3 及びHPIV1 候補ワクチンウイルスの双方由来の過剰抗原として発現される搬送された抗原、麻疹ウイルスHAに対する抗体の高力価を維持した。
【０５６１】
過剰遺伝子として麻疹ウイルスHAを発現するrHPIV3-1 HA(P-M)及びrHPIV3-1 HA(P-M) cp45L, rHPIV3-1の野生型及び弱毒バージョンの構築
上記の通りにして２つの全長プラスミドpFLC HPIV3-1 HA(P-M)及びpFLC HPIV3-1 HA(P-M) cp45L （図16）を構築した（Durbin, J.Virol. 74: 6821-31, 2000; Skiadopoulos et al., J.Virol. 72: 1762-8, 1998; Tao et al., J.Virol. 72: 2955-2961, 1998を参照のこと。各々引用することで本明細書に組入れる）。pFLC HPIV3-1 HA(P-M)は上記のpFLC HPIV3 HA(P-M)を用いて構築し、それにおいては野生型麻疹ウイルスEdmonston 株HA遺伝子ORF をrHPIV3のＰ及びＭ遺伝子の間に過剰遺伝子として挿入した。
【０５６２】
pFLC HPIV3 HA(P-M)をBspEI 〜SphIで消化し、そして6487bpのBspEI 〜SphI配列を欠くcDNAフラグメントを単離した。次に、HPIV3 の代わりにPIN1 のＦ及びHN ORFを担持するpFLC 2G+.hc 全長アンチゲノムcDNAプラスミド（Tao ら、J.Virol. 72: 2955-2961, 1998）をBspEI 及びSphIで消化し、そしてHPIV3 骨格内にHPIV1 糖タンパク質遺伝子を含む6541bpのフラグメント（プラスミドnts 4830-11371 ）をpFLC HPIV3 HAP-MのBspEI 〜SphIウィンドウに挿入し、pFLC HPIV3-1 HAP-M（図15）を得た。
【０５６３】
Ｌ遺伝子ORF 内に存在するcp45L 突然変異体（Ser-942 →His , Leu-992→Phe、及びThr-1558→Ile へのアミノ酸置換をコードする点突然変異）がHPIV3 cp45候補ワクチンの主要ts及びatt 決定因子であり（Skiadopoulosら、J.Virol. 72: 1762-8, 1998 ）、そしてハムスターの気管内にrHPIV3-1 cp45Lに対する複製の減衰を供することが予め示されている（Tao ら、Vaccine 17: 1100-8, 1999）。
【０５６４】
次にpFLC HPIV3-1 HAP-Mを修飾してこれら３つのts突然変異をコードさせ、pFLC HPIV3-1 HAP-M cp45Lを供した（図16）。これはpFLC HPIV3 cp45LのSphI〜NgoMIVの制限エンドヌクレアーゼフラグメント（プラスミドnts 11317-15929)(Skiadopoulos ら、J.Virol. 72: 1762-8, 1998 ）のpFLC HPIV3-1 HAP-MのSphI〜NgoMIVウィンドウへの挿入により成し遂げた。
【０５６５】
rHPIV3-1 HA(P-M)及びrHPIV3-1 HA(P-M) cp45Lの回収
pFLC HPIV3-1 HA(P-M)又はpFLC HPIV3-1 HA(P-M) cp45Lを６穴プレート（Costar, Cambridge, MA）上のHEp-2 細胞に別々に、サポートプラスミドpTM (N), pTM (PnoC)及びpTM (L) 並びにLipofect ACE (Life Techonologies, Gaithersburg, MD）と一緒にトランスフェクションし、そしてこれらの細胞を既に発表の通りにして（Skiadopoulosら、Vaccine 18: 503-10, 1999b 、引用することで本明細書に組入れる）バクテリオファージT7ポリメラーゼタンパク質をコードする複製欠陥ワクシニアウイルスMVA-T7で同時に感染させた。トリプシンを含む培他の中で４日間32℃でインキュベーションした後、トランスフェクション回収物を25cm2 フラスコ内のLLC-MK2 細胞に継代し、そして細胞を32℃で５日間インキュベーションした。
【０５６６】
細胞上清液から回収したウイルスを更に32℃でトリプシンを伴ってLLC-MK2 単層培養物に継代し、ウイルスを増幅させた。rPIV3-1 HAP-M 及びrPIV3-1 HAP-M cp45L を既に発表されている通りにして（Skiadopoulosら、Vaccine 18: 503-10, 1999b ）32℃にてLLC-MK2 単層培養物上で終点希釈により生物学的にクローニングした。生物学的にクローニングしたウイルス由来のウイルス懸濁物をLLC-MK2 単層培養物上で増幅させた。
【０５６７】
ウイルスRNA (vRNA)を上記の通りにして生物学的にクローニングして組換キメラウイルスから単離した。RT-PCRを、鋳型としてのrHPIV3-1 HAP-M又はrHPIV3-1 HAP-M cp45L vRNA 、HA遺伝子インサート又はＬ遺伝子内のcp45突然変異をまたぐ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを利用して実施した。RT-PCR生成物を上記の通りにして制限エンドヌクレアーゼ消化及びPCR 生成物の部分DNA 配列決定により分析した。このことは、rHPIV3-1のＰ及びＭ遺伝子の間に挿入された麻疹ウイルスHA遺伝子の存在並びにcp45L遺伝子のその弱毒誘導体における存在を確証した。
【０５６８】
ハムスターにおけるrHPIV3-1 HA(P-M) cp45L の弱毒表現型の実証
６つのグループのGolden Syrian ハムスターに106TCID50のrHPIV3-1, rHPIV3-1 HAP-M, rHPIV3-1 cp45L 又はrHPIV3-1 HAP-M cp45Lを鼻内接種した。接種の４日後、肺及び鼻甲介を取り出し、そしてウイルスの力価を既に発表されている通りにして決定した（Skiadopoulosら、Vaccine 18: 503-10, 1999b ）。その力価を平均log10TCID50 ／グラム組織として示す（第20表）。
【０５６９】
組換rHPIV3-1 HAP-M及びその親rHPIV3-1 wt は同等のレベルへと複製し、HA遺伝子ORF をコードする更なる転写ユニットの挿入がこのウイルスをハムスターに対して更に弱毒化しないことを示唆する。rHPIV3-1 HAP-M cp45L及びそのrHPIV3-1 cp45L親株は上気管及び下気管において似かよったレベルにまで複製し、rHPIV3-1 HAP-M cp45Lがハムスターにおける複製について十分に弱毒化され、そして麻疹ウイルスHA遺伝子ORF の挿入がキメラrHPIV3-1 cp45L親ウイルスを更に弱毒化しないことを示唆する。
【０５７０】
【表２０】
0004795597.tif 000021
【０５７１】
弱毒rHPIV3 HAP-M cp45Lキメラワクチン候補、それに続く弱毒rHPIV3-1 HAP-M cp45Lワクチン候補による免疫を採用する連続免疫スケジュールはベクター骨格のHPIV3 及びHPIV1 抗原に対する抗体を誘導し、且つ分配して搬送された抗原、麻疹ウイルスHAに対する抗体の高力価を維持する
rHPIV3-1 HAP-M cp45Lによるハムスターのグループの免疫はHPIV1 及び麻疹ウイルスの双方に対する強い免疫反応を誘導し（第21表、グループ６）、rHPIV-3 がrHPIV3 と同様に、麻疹ウイルスHAのための有効なベクターでありうることを示唆する。
【０５７２】
次に、rHPIV3 HAP-M cp45L及びrHPIV3-1 HAP-M cp45Lによるハムスターの連続免疫の可能性を調べた。ハムスターのグループを106TCID50 のrHPIV3 HAP-M cp45L（第21表、グループ１，２及び３）、rHPIV3 cp45L（グループ４）又はL15 培地コントロール（グループ５）で免疫した（第５表）。第１回目の免疫の59日後、ハムスターのグループを106TCID50 のrHPIV3-1 HAP-M cp45L（グループ１及び４）、rHPIV3-1 cp45L（グループ２及び５）、又はL15 培地グループ（グループ３）で免疫した。血液サンプルを、第１回目の免疫の前、第１回目の免疫から58日後、及び第２回目の免疫から35日後に集めた。rHPIV3 cp45Lにより免疫した動物（第21表、グループ４）はHPIV3 に対する強い抗体応答を示し、そしてrHPIV3 HAP-M cp45Lにより免疫した動物（グループ１，２及び３）はHPIV3 及び麻疹ウイルスの双方に対して強い抗体応答を示した。
【０５７３】
rHPIV3 cp45Lで予め免疫しておいたグループ４の動物を次に59日目にrHPIV3-1 HAP-M cp45Lで免疫した。94日目にアッセイすると、これらの動物はHPIV3 及び麻疹ウイルスに対して高い抗体力価を有し、且つHPIV1 に対する低乃至中程度の抗体力価を有していた。このことは、HPIV3-1 キメラワクチンウイルスが、HPIV3 に対する免疫力の存在下でさえもベクターのHPIV1 抗原及び搬送されたHAタンパク質の双方に対する免疫応答を誘導できるが、HPIV3 に対する動物免疫力におけるその免疫原性に多少の低下があったことを示す。rHPIV3-1 HAP-M cp45Lワクチンはグループ４におけるハムスターの応答により示される通り、HPIV3 に対して予め免疫された動物において明らかに免疫原性であった。
【０５７４】
０日目にrHPIV3 cp45Lにより免疫した動物は、59日目にrHPIV3-1 HAP-M cp45Lで免疫してから35日後の94日目に麻疹に対するやや高い中和抗体力価を示した。有意義なことに、rHPIV3 HAP-M cp45Lでまず免疫し、次いでrHPIV3-1 HAP-M cp45L（グループ１、第21表）で免疫したハムスターは94日目に、rHPIV3 HAP-M cp45Lのみで免疫したハムスターのグループ（グループ３）よりも高い麻疹ウイルス血清中和抗体力価を達成し、rHPIV3-1 HAP-M cp45LがrHPIV3 HAP-M cp45Lによる免疫の後に麻疹に対する高い血清中和抗体力価を維持するために利用できることを示唆する。グループ１のハムスターはrHPIV3 HAP-M cp45Lによる１回目の免疫の後に麻疹ウイルスHAに対するかかる高い抗体力価を示すため、rHPIV3-1 HAP-M cp45Lによる免疫の後にこれらの力価の４倍以上の上昇を検出することはできなかった。
【０５７５】
ヒトでは、HPIV3 ワクチン、例えばrHPIV3 HAP-M cp45Lは生後４ヶ月以内に与えられ、２ヶ月後にHPIV1 ワクチン、例えばrHPIV3-1 HAP-M cp45Lが与えられているようである（Skiadopoulosら、Vaccine 18: 503-10, 1999b 、引用することで本明細書に組入れる）。げっ歯類とは対照的に、ヒト幼児は生後６ヶ月以内に投与されたウイルス糖タンパク質抗原に対しては、免疫学的未熟、母体抗体による免疫抑制及びその他の要因に基づき、低い抗体力価を特徴的に示す（Karronら、Pediatr.Infect.Dis.J. 14: 10-6, 1995a; Karron ら、J.Infect.Dis. 172: 1445-1450, 1995b; Murphy ら、J.Clin.Microbiol. 24: 894-8, 1986 、各々引用することで本明細書に組入れる）。
【０５７６】
従って、麻疹ウイルスHAに対する抗体力価へのrPIV3-1 HAP-M cp45L の増強効果が必要とされる傾向が極めて高く、そして生後６ヶ月以内にrPIV3 HAP-M cp45L で免疫した幼児において容易に観察されるであろう。本実施例は、各々が麻疹ウイルスHAを発現する２種類の血清学的に相違する生きた弱毒PIV ワクチンにより動物を連続免疫して、ベクター骨格のHPIV3 及びHPIV1 抗原に対する抗体を生起させ、且つ搬送された抗原、麻疹ウイルスHAに対する高い抗体力価の維持が可能であることを示唆する。
【０５７７】
【表２１】
0004795597.tif 000022
【０５７８】
実施例XIII
キメラ糖タンパク質を発現するキメラHPIV3-2 ワクチン組換体の構築及び特性決定
本実施例は逆方向遺伝子学技術を利用する、幼児及び小児において利用するための生きた弱毒PIV2候補ワクチンウイルスの開発を詳細する。HPIV3-1 キメラ抗体について上記した通りの野生型PIV3骨格内に全長PIV2糖タンパク質を担持する組換キメラPIV3-PIV2 ウイルスの回収の事前の試みでは感染性ウイルスは得られていなかった。しかしながら、全長PIV2 ORFではなく、キメラHN及びＦのORF を全長cDNAの構築に用いると生きたPIV2-PIV3 キメラウイルスが回収された。
【０５７９】
PIV2エクトドメイン及びトランスメンブランドメインがPIV3細胞質ドメインに融合したrPIV3-2CT と命名した回収ウイルス、並びにPIV2エクトドメインがPIV3トランスメンブラン及び細胞質テールドメインに融合したrPIV3-2TM は、同一ではないが、似かよったin vitro及びin vivo 表現型を有した。かくして、PIV3のHF又はＦ糖タンパク質の細胞質テールだけがPIV2-PIV3 キメラウイルスの回収の成功のために必要なようである。
【０５８０】
rPIV3-2 組換キメラウイルスは強い宿主域表現型を示し、即ち、それらはin vitroで効率的に複製するが、in vivo では複製が強く制限される。in vivo でのこの弱毒化はcp45からの任意の追加の突然変異の不在下で起こる。rPIV3-2CT 及びrPIV3-2TM はin vitroで効率的に複製するが、それらはハムスター及びアフリカミドリザル（AGM ）の上気管及び下気管の双方で極めて弱毒化し、PIV2及びPIV3のHN及びＦタンパク質のキメラ化自体がin vivo 弱毒表現型を特定することが示唆される。
【０５８１】
in vitroでの効率的な複製及びin vivo での高度に抑制された増幅を含む表現型がワクチン候補に極めて所望される。この弱毒化にかかわらず、これらは両方の種においてPIV2野生型ウイルスによる負荷に対して高度に免疫原性且つ防御性であった。rPIV3-2CT 及びrPIV3-2TM をHN及びＦコード配列の外側に配置した12 PIV3 cp45突然変異の導入により更に修飾し、rPIV3-2CTcp45 及びrPIV3-2TMcp45 を誘導した。これらの誘導体はin vitroでは効率的に複製したが、ハムスター及びAGM では更に減衰し、糖タンパク質のキメラ化及びcp45突然変異により特定されるこの弱毒化が加算的であることを示唆する。これらの発見はrPIV3-2CT 及びrPIV3-2TM 組換体を生きた弱毒PIV2ワクチンにおいて利用するための好適な候補として特定する。
【０５８２】
ウイルス及び細胞
この研究において利用した野生型PIV1株、PIV1/Washington/20993/1964 (PIV1/Wash64)(Murphy ら、Infect.Immun. 12: 62-68, 1975 、引用することで本明細書に組入れる）を既に発表されている通りにして（Tao ら、J.Virol. 72: 2955-2961, 1998、引用することで本明細書に組入れる）LLC-MK2 細胞（ATCC CCL 7.1）の中で増殖させた。PIV2/V94と命名したPIV 野生型ウイルス、株V9412-6は、1994年において病気にかかった子供の鼻洗浄液由来の検定済みVero細胞において単離された。PIV2/V94をVero細胞で３回プラーク精製し、それからFBS 抜きのOptiMEM を利用してVero細胞で２回増幅した。
【０５８３】
野生型cDNA誘導組換PIV3/JS 株（rPIV3/JS ）を既に発表されている通りにして（Durbinら、Virology 235: 323-332, 1997 、引用することで本明細書に組入れる）増殖させた。バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼを発現する修飾ワクシニアAnkaraウイルス（MVA ）組換体はDrs. L.Wyatt and B.Moss の好意により贈呈された（Wyatt ら、Virology 210: 202-205, 1995 、引用することで本明細書に組入れる）。
【０５８４】
HEp-2 細胞（ATCC CCL 23 ）を10％の胎児牛血清、50μｇ／mlの硫酸ゲンタマイシン及び２mMのグルタミンの入ったMEM (Life Technologies, Gaithersburg, MD ）の中に維持した。150 の継代に未たないVero細胞を50μｇ／mlの硫酸ゲンタマイシン及び２mMのグルタミンの入った無血清培地VP-SFM (Formula No.96-0353 SA, Life Technologies）に維持した。
【０５８５】
ビリオンRNA の単離、ウイルス遺伝子の逆転写及びPCR 増幅、並びに自動配列決定
ウイルス遺伝子をクローニングするため又は組換キメラウイルスの遺伝子マーカーを確認するため、既に発表されている通りにして（Mbiguinoら、J,Virol.Methods 31: 161-170, 1991 、引用することで本明細書に組入れる）ウイルスを培養細胞上で増殖させ、そしてポリエチレングリコール沈殿により濃縮した。ビリオンRNA をトリゾール試薬（Life Technologies ）を用いてウイルスペレットから抽出し、そしてSuperscript Preamplification system (Life Technologies）による逆転写（RT）のための鋳型として用いた。
【０５８６】
このcDNAをAdvantage cDNAキット（Clontech, Palo Alto, CA ）を利用して更にPCR 増幅させた。クローニング又は配列決定の目的のため、RT-PCR増幅DNA をNA45 DEAE 膜を用い、製造者の提案（Schleicher & Schuell, Keene, NH ）に従いアガロースゲルから精製した。配列決定はdRhodamine色素ターミネーターサイクリングシーケシングキット（Perkin Elmer, Forster City, CA ）及びABI 310 Gene Analyzer (Perkin Elmer, Forster City, CA ）により実施した。
【０５８７】
PIV2誘導エクトドメイン及びPIV3誘導細胞質テールドメインを含む完全PIV2 F及びHNタンパク質又はキメラＦ及びHNタンパク質をコードするキメラPIV3-PIV2 アンチゲノムcDNAの構築
PIV3 F及びHN ORFがそのPIV2対応物で置き換えられた全長PIV3アンチゲノムRNA をコードするDNA をPIV3-PIV1 について既に発表された戦略（Tao ら、J.Virol. 72: 2955-2961, 1998）に従って構築した。
【０５８８】
この構築の詳細を図17に示す。Vero細胞内で増殖させたPIV2/V94を濃縮し、そしてビリオンRNA (vRNA)をトリゾール試薬を用いてウイルスペレットから抽出した。PIV2/V94のＦ及びHNのORF をランダムヘキサマープライマー及びSuper Script Preamplification Systemを用いてvRNAから逆転写させ、それからcDNA Advantageキット並びにPIV2 F及びHN遺伝子のそれぞれに特異的なプライマーペアー（１，２及び３，４；第22表）を利用するPCR により増幅させた。
【０５８９】
PIV2 FのORF の増幅cDNAフラグメントをNcoIとBamHI とで消化し、そしてpLit.PIV31.FhcのNcoI-BamHIウィンドウ（Tao ら、J.Virol. 72: 2955-2961, 1998、引用することで本明細書に組入れる）の中にライゲーションし、pLit.PIV32Fhc を作り上げた。PIV3全長cDNA内のBspEI 部位は固有であり、そして我々はcDNA間のセグメントの交換にそれを用いる計画を立てた（図17〜19参照のこと）。従って、PIV2 F ORF内で見つかったBspEI 部位はアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく部位特異的突然変異誘発により除去した。PIV2 HN ORF のcDNAフラグメントをNcoIとHindIII とで消化し、そしてpLit.PIV31.HNhc のNcoI-HindIIIウィンドウ（Tao ら、J.Virol. 72: 2955-2961, 1998）にライゲーションし、pLit.PIV32HNhcを作り上げた。
【０５９０】
pLit.PIV32Fhc 及びpLit.PIV32HNhc内のPIV2 ORFを配列決定し、そしてその配列はデザイン通りであることがわかった。PIV2 F及びHN ORFのヌクレオチド配列はGenBank に提出した。pLit.PIV32Fhc 及びpLit.PIV32HNhcをそれぞれPpuMI とSpeIとで消化し、そして集成してpLit.PIV32hcを作り上げた。pLit.PIV32hcの４kbのBspEI-SpeIフラグメントをp38′ΔPIV31hcのBspEI-SpeIウィンドウ（Skiadopoulosら、Vaccine 18: 503-510, 1999 、引用することで本明細書に組入れる）に導入し、p38′ΔPIV32hcを作り上げた。p38′ΔPIV32hcのBspEI及びSphI消化により作り上げたPIV2全長Ｆ及びHNのORF を含む6.5kb のフラグメントをpFLC.2G+.hc のBspEI-SphIウィンドウ（Tao ら、J.Virol. 72: 2955-2961, 1998）に導入し、pFLC.PIV32hc（図17；第23表：配列番号：60）を作り上げた。
【０５９１】
【表２２】
0004795597.tif 000023
【０５９２】
【表２３】
0004795597.tif 000024
【０５９３】
【表２４】
0004795597.tif 000025
【０５９４】
【表２５】
0004795597.tif 000026
【０５９５】
【表２６】
0004795597.tif 000027
【０５９６】
【表２７】
0004795597.tif 000028
【０５９７】
【表２８】
0004795597.tif 000029
【０５９８】
【表２９】
0004795597.tif 000030
【０５９９】
【表３０】
0004795597.tif 000031
【０６００】
【表３１】
0004795597.tif 000032
【０６０１】
【表３２】
0004795597.tif 000033
【０６０２】
第２の戦略においては（図18）、完全ORF 交換ではなく、キメラPIV3-PIV2 F 及びHN ORFを構築した。それにおいては、エクトドメインをコードするPIV2 F及びHN ORFの領域をpLit.PIV32Fhc 及びpLit.PIV32HNhcのそれぞれから、PCR, Vent DNA ポリメラーゼ（NEB, Beverly, MA）、並びにPIV2 Fに特異的なプライマーペアー（第22表の５，６）及びHNに特異的なプライマーペアー（第22表の７，８）を利用して増幅させた。平行して、エクトドメインをコードするPIV3 F及びHNのORF の領域をそのcDNAサブクローンpLit.PIV3.F3a及びpLit.PIV3.HN4 (Taoら、J.Virol. 72: 2955-2961, 1988 、引用することで本明細書に組入れる）のそれぞれから、PCR, Vent DNA ポリメラーゼ、並びにPIV3 Fに特異的なプライマーペアー（第22表の９，10）及びHNに特異的なプライマーペアー（第22表の11, 12）を利用して除去した。
【０６０３】
PIV2及びPIV3の増幅Ｆ及びHN cDNA フラグメントをアガロースゲルから精製し、そしてライゲーションさせてpLit.PIV32FTM 及びpLit.PIV32HNTMのそれぞれを作り上げた。このキメラＦ及びHN構築体をPpuMI とSpeIとで消化し、そして集成してpLit.PIV32TMを作り上げた。次にそれをdRhodamine色素ターミネーターシーケシングキットにより、そのPIV 特異的領域全域にわたって配列決定し、そしてデザイン通りであることがわかった。
【０６０４】
pLit.PIV32TM由来の４kbのBspEI-SpeIフラグメントを次にp38′ΔPIV31hcのBspEI-SpeIウィンドウに導入し、p38′ΔPIV32TMを作り上げた。PIV3-PIV2 キメラＦ及びHN遺伝子を含むp38′ΔPIV32TM由来の6.5kb のBspEI-SphIフラグメントをpFLC.2G+.hc 及びpFLCcp45のBspEI-SphIウィンドウ（Skiadopoulosら、J.Virol. 73: 1374-81, 1999、引用することで本明細書に組入れる）に導入し、pFLC.PIV32TM（第24表、配列番号：61）及びpFLC.PIV32TMcp45のそれぞれを作り上げた。キメラPIV3-PIV2 F 及びHN遺伝子を含むBspEI-SpeIフラグメントのヌクレオチド配列はGenBank に提出した。
【０６０５】
【表３３】
0004795597.tif 000034
【０６０６】
【表３４】
0004795597.tif 000035
【０６０７】
【表３５】
0004795597.tif 000036
【０６０８】
【表３６】
0004795597.tif 000037
【０６０９】
【表３７】
0004795597.tif 000038
【０６１０】
【表３８】
0004795597.tif 000039
【０６１１】
【表３９】
0004795597.tif 000040
【０６１２】
【表４０】
0004795597.tif 000041
【０６１３】
【表４１】
0004795597.tif 000042
【０６１４】
第３の戦略においては（図19）、キメラPIV3-PIV2 F 及びHN遺伝子を構築した。それにおいては、エクトドメイン及びトランスメンブランドメインをコードするPIV2 F及びHNのORF の領域をpLit.PIV32Fhc 及びpLit.PIV32HNhcのそれぞれから、PCR, Vent DNA ポリメラーゼ、並びにPIV2 Fに特異的なプライマー（第22表の13, 14）並びにPIV2 HN に特異的なプライマー（第22表の15, 16）から増幅させた。平行して、エクトドメイン及びトランスメンブランドメインをコードするPIV3 F及びHN遺伝子の部分ORF をそのcDNAサブクローンpLit,PIV3.F3a 及びpLit.PIV3.HN4 (Taoら、J.Virol. 72: 2955-2961, 1988、引用することで本明細書に組入れる）それぞれに、PCR, Vent DNA ポリメラーゼ、並びにPIV3 Fに対して特異的なプライマー（第22表の17, 18）及びPIV3 HN に対して特異的なプライマー（第22表の19, 20）を用いて欠失させた。
【０６１５】
PIV2及びPIV3のＦ及びHN cDNA フラグメントをゲル精製し、そしてライゲーションしてpLit.PIV32FCT 及びpLit.PIV32HNCTのそれぞれを作り上げた。このキメラＦ及びHN構築体をPpuMI とSpeIとで消化し、そして集成してpLit.PIV32CTを作り上げた。これをPIV 特異的領域全域にわたって配列決定し、そしてテザイン通りであることがわかった。pLit.PIV32CT由来の４kbのBspEI-SpeIフラグメントをp38′ΔPIV31hcのBspEI-SpeIウィンドウに導入して、p38′ΔPIV32CTを作り上げた。PIV3-PIV2 F 及びHNキメラ遺伝子を含むp38′ΔPIV32CT由来の6.5kb のBspEI-SphIフラグメントをpFLC.2G+.hc 及びpFLCcp45のBspEI-SphIウィンドウに導入して、pFLC.PIV32CT（第25表、SEQ ID NO.62）及びpFLC.PIV32CTcp45のそれぞれを作り上げた。このBspEI-SpeIフラグメントのヌクレオチド配列をGenBank に提出した。
【０６１６】
【表４２】
0004795597.tif 000043
【０６１７】
【表４３】
0004795597.tif 000044
【０６１８】
【表４４】
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【０６１９】
【表４５】
0004795597.tif 000046
【０６２０】
【表４６】
0004795597.tif 000047
【０６２１】
【表４７】
0004795597.tif 000048
【０６２２】
【表４８】
0004795597.tif 000049
【０６２３】
【表４９】
0004795597.tif 000050
【０６２４】
【表５０】
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【０６２５】
cDNA操作を、最終PIV3-2アンチゲノムが第６法則に合うようにデザインした（Calainら、J.Virol. 67: 4822-30, 1993; Durbinら、Virology 234: 74-83, 1997 、各々引用することで本明細書に組入れる）。pFLC.PIV32TM内のPIV3-2インサートは長さ15498nt であり、そしてpFLC.PIV32CT内のインサートは長さ15474nt である。これらの全長はT7プロモーターにより寄与される２つの５′末端Ｇ残基は含まず、なぜならそれらは回収の間に除去されたと推定されるからである。
組換キメラPIV3-PIV2 ウイルスのトランスフェクション及び回収
【０６２６】
HEp-2 細胞単層を６穴プレート内で集密となるまで増殖させ、そしてトランスフェクションを本質的に発表の通り（Tao ら、72: 2955-2961, 1988 、引用することで本明細書に組入れる）にして実施した。一の穴の中のHEp-2 単層を５μｇのPIV3-PIV2 アンチゲノムcDNA、並びに３つのサポートプラスミド、0.2 μｇのpTM (N) 、0.2 μｇのpTM (PnoC)、0.1 μｇのpTM (L) で、12μｌのLipofect ACE (Life Technologies)を含む0.2ml のMEM の中でトランスフェクションした。これらの細胞を同時に、50μｇ／mlのゲンタマイシン及び２mMのグルタミンを含む0.8ml の無血清MEM の中で感染多重度（MOI ）３にてMVA-T7により感染させた。キメラアンチゲノムcDNA pFLC.2G+.hc (Taoら、J.Virol. 72: 2955-2961, 1998 ）を平行して陽性コントロールとしてトランスフェクションした。
【０６２７】
32℃で12時間インキュベーション後、トランスフェクション培地を50μｇ／mlのゲンタマイシン及び２mMのグルタミンの入った1.5ml の新鮮な無血清MEM と交換した。トランスフェクションした細胞を更に２日間32℃でインキュベーションした。ガンマー照射ブタトリプシン（ｐ−トリプシン；T1311, Sigma, St.Louis, MO）をトランスフェクションの３日後に0.5 μｇ／mlの最終濃度となるように加えた。細胞培養上清液を回収し、そしてT25 フラスコ内で新鮮なVero細胞単層に継代した（継代１と称する）。一夜の吸着の後、トランスフェクション回収物を0.5 μｇ／mlのｐ−トリプシンの入った新鮮なVP-SFMと交換した。
【０６２８】
継代１由来の培養物を32℃で４日間インキュベーションし、そして増幅ウイルスを回収し、そして0.5 μｇ／mlのｐ−トリプシンの存在下で32℃で更に４日間Vero細胞に更に継代した（継代２と称する）。継代２培養物内のウイルスの存在は0.2 ％のモルモット赤血球（RBC ）とのヘム吸着により測定した。ウイルスを更に２mMのグルタミン、50μｇ／mlのゲンタマイシン及び0.5 μｇ／mlのｐ−トリプシンの入ったVP-SFMの中に維持したVero細胞を用いて実施する３連続終点希釈により精製した。３回目の終点希釈の後、ウイルスをVero細胞で更に３回増幅し、そしてこのウイルス懸濁物をin vitro及びin vivo での更なる特性決定のために使用した。
【０６２９】
シークエンシング及びPCR産物の制限分析を用いたvRNAのキメラ特性の確認
vRNAsの遺伝子構造の分析のために、リコンビナントPIVsをLLC-MK2細胞中に増幅し、そして濃縮した。ウイルスのペレットからvRNAsを抽出し、そしてスーパースクリプト・プレアンプリフィケーション・システムを用いて逆転写した。RT-PCRをアドバンテージcDNA合成キット及びPIV2又はPIV3に特異的なプライマー対（第22表中の21、22又は23、24）を用いて行った。RT-PCR産物を制限的な消化又はゲル精製のいずれかにより分析し、さらにシークエンシングにより分析した。
【０６３０】
LLC-MK2細胞中のPIVsの複製
組織培養中のPIVウイルスの増殖を、感染効率0.01において3連で6ウェル・プレート上のコンフルエントな単層LLC-MK2細胞に感染させることにより評価した。種菌を32℃1時間の吸収の後に除去した。細胞を血清を含まないOptiMEMＩにより3回洗浄し50μg/ml ゲンタマイシン及び0.5μg/ml p-トリプシンを追加した、2ml/ウェルのOptiMEMＩを与えて、そして32℃でインキュベートした。
【０６３１】
24時間おきに、培地の0.5mlアリコートをそれぞれのウェルから採取して急速冷凍した、そしてp-トリプシンを含む0.5mlの新たな培地を培養に添加した。アリコート中の前記ウイルスを32℃の単層LLC-MK2細胞において前記液体オーバーレイを用いて滴定し（Tao et al., J.Virol. 72:2955-2961,1998,本明細書中に援用する）、そして滴定の終末点を血球吸着によって決定した。前記力価はlog10TCID50/mlで表される。
【０６３２】
各種温度における組換えキメラPIV3-PIV2ウイルスの複製
ウイルスを2mM グルタミン及び0.5μg/ml p-トリプシンを追加した1倍L15中に連続的に希釈した。希釈したウイルスを96ウェル・プレート中の単層LLC-MK2細胞に感染させるために用いた。記載と同様に感染させたプレートを種々温度において7日間インキュベートした（Skiadopouls et al., Vaccine 18:503-510,1999,本明細書中に援用する）。ウイルスの力価を前記と同様に決定した。
【０６３３】
ハムスターの気管内での組換えキメラPIV3-PIV2ウイルスの複製、免疫原性、及び保護効果
群中の6匹のゴールデン・シリアン・ハムスターに105.3TCID50の組換えウイルス又は生物学に由来したウイルスを鼻腔内接種した。接種の4日後、ハムスターを屠殺し、そしてそれらの肺と鼻甲介を採取しウイルスの量を計測する準備をした（Skiadopoulos et al., Vaccine 18:503-510,1999,本明細書中援用する）。前記力価は各群の6匹のハムスターの平均log10TCID50/組織のグラム数で表される。
【０６３４】
0日目に郡中の12匹のハムスターに105.3TCID50のウイルスを鼻腔内に感染させ、そして4週間後にそれぞれの群の6匹のハムスターを106TCID50のPIV1又は106TCID50のPIV2で接種した。攻撃の4日後、ハムスターを屠殺し、そしてそれらの肺と鼻甲介を採取した。前記採取した組織中の攻撃ウイルスの力価を前記と同様に決定した（Tao et al., J.Virol. 72:2955-2961,1998,本明細書中に援用する）。前記ウイルスの力価はそれぞれの群の6匹のハムスターの平均log10TCID50/組織のグラム数として表される。血清サンプルを接種3日前及び28日目に回収し、そしてPIV1、PIV2、及びPIV3に対する血液凝集阻害抗体（HAI）の力価を前記と同様に決定した（van Wyke Coelingh et al., Virology 143:569-582,1985,本明細書中に援用する）。前記力価は平均log2の逆数で表される。
【０６３５】
アフリカミドリザル（AGMs）における組換えキメラPIV3-PIV2ウイルスの複製、免疫原性、及び保護効果
0日目に郡中の4匹のAGMsに105TCID50のウイルスを鼻腔内及び気管内のぞれぞれに感染させた。鼻／咽頭（NT）のスワブ検体及び気管洗浄液を、それぞれ12日間及び5日間、前記と同様に回収した（van Wyke Coelingh et al., Virology 143:569-582,1985）。29日目に、免疫化したAGMsを105TCID50のPIV2/V94にて鼻腔内及び気管内のぞれぞれに接種した。
【０６３６】
NTのスワブ検体及び気管洗浄液を、それぞれ10日間及び5日間回収した。免疫化前、免疫化後、及び攻撃後の血清サンプルをそれぞれ-3、28、及び60日目に回収した。前記NTのスワブ検体及び気管洗浄液中のウイルス力価を前記と同様に決定した（Tao et al., J.Virol. 72:2955-2961,1998,）。力価はlog10TCID50/mlで表される。PIV1及びPIV2に対する血清中和抗体の力価を前記と同様に決定した（van Wyke Coelingh et al., Virology 143:569-582,1985）。そして前記力価は平均log2の逆数で表される。
【０６３７】
チンパンジーにおける組換えキメラPIV3-PIV2ウイルスの複製及び免疫原性の有効性
0日目に郡中の4匹のチンパンジーに105TCID50のPIV2/V94又はrPIV3-2TMを鼻腔内及び気管内に前記と同様に感染させた（Whitehead et al., J.Virol. 72:4467-4471,1998,本明細書中に援用する）。NTのスワブ検体を12日間毎日回収し、そして気管洗浄液を2、4、6、8、及び10日目に得た。前記検体中のウイルス力価を前記と同様に決定した（Tao et al., J.Virol. 72:2955-2961,1998,本明細書中に援用する）。ウイルス力価のピークはlog10TCID50/mlで表される。免疫化前及び免疫化後の血清サンプルをそれぞれ-3及び28日目に回収した。PIV1及びPIV2に対する血清中和抗体の力価を前記と同様に決定した（van Wyke Coelingh et al., Virology 143:569-582,1985）。そして前記力価は平均log2の逆数で表される。
【０６３８】
完全なPIV2F及びHNタンパク質をコードするPIV3-PIV2キメラcDNAから回復しなかった生存可能な組換えキメラ・ウイルス
JS野生株PIV3のF及びHN翻訳領域をPIV2/V94のF及びHN翻訳領域によって入れ替えたところのPIV3-PIV2キメラcDNAの構造は先に記載され、そして図17中に要約されている。最終プラスミド構成体であるpFLC.PIV32hc（図17）は、15492ntのPIV3-PIV2キメラ・アンチゲノミック（antigenomic）RNAをコード化し、6つの規則に従う。
【０６３９】
単層HEp-2細胞に3種類の担体プラスミドpTM（N）、pTM（PnoC）、及びpTM（L）を伴ったpFLC.PIV32hcによりリポフェクトエース（LipofectACE）を用いて形質移入し、そして前記細胞にMVA-T7によって前記と同様に同時に感染させた（Tao et al., J.Virol. 72:2955-2961,1998,本明細書中に援用する）。ウイルスは、pFLC.PIV32hcを用いたそれぞれの最初の形質移入から回復しなかった。一方、キメラ・ウイルスが対照プラスミドpFLC.2G+.hcを用いた全ての形質移入から回復しなかった。
【０６４０】
これらの結果は、このcDNAクローンによって形質移入した細胞からのrPIV3-2ウイルスの回復を妨げた、突然変異がpFLC.PIV32hcの4kbのBspEＩ-SpeＩセグメントの外側に起こった可能性と一致する。この可能性を検討するために、p38’ΛPIV31hcとp38’ΛPIV32hcのBspEＩ-SpeＩ断片を交換した。再生したp38’ΛPIV31hc及びp38’ΛPIV32hcは、PIV3L遺伝子配列を含むSpeＩ-SphＩ断片を交換したことを除いて図17中のそれらと完全に一致した。
【０６４１】
それら2つの再生したcDNAsのBspEＩ-SphＩ断片を、PIV3の全長クローンp3/7-(131)2G+のBspEＩ-SphＩ開口部に、それぞれ10種類のpFLC.2G+.hcクローン及びpFLC.PIV32hcクローン（2つのクローンはそれぞれのライゲーションから選ばれた）を与える5つの別々の独立したラーゲーションにて導入した（p3/7-(131)2G+、pFLC.2G+.hc、及びpFLC.PIV32hcのBspEＩ-SphＩ開口部の外側のPIV3配列が完全に一致することに注意）。したがって、これは、機能的であることが知られる配列に誤った突然変異を受けうるPIV3基幹配列に置き換わるであろう。さらには、前記基幹の機能性を同時に再評価した。10種類のpFLC.PIV32hc cDNAクローンは生存可能なウイルスを全くもたらさなかったが、しかし10種類のpFLC.2G+.hc cDNAクローンは生存可能なウイルスをそれぞれにもたらした。
【０６４２】
ウイルスは、回復に成功した時に用いた大きな欠失をもったPIV3Cノック・アウト・リコンビナント（Durbin et al., Virology 261:319-30,1999,参考文献として本明細書中に組み入れた）と一応は同種の形質移入産物を培養しているにもかかわらずpFLC.PIV32hcから回復しなかった。pFLC.PIV32hc製造に用いたそれぞれの独特な成分を、F及びHNの細胞質のテール・ドメインを除いて、他の組換えウイルスの成功した製造に用いた。このケースにおいては組換えウイルスをもたらさない主な原因となるcDNA中のエラーが大いに疑わしい。むしろ、好ましい解釈は、PIV2F及びHN糖タンパク質の全長はウイルス増殖に必要な1つ以上のPIV3タンパク質と両立しないというものである。
【０６４３】
キメラPIV3-PIV2F及びHNタンパク質をコード化しているPIV3-PIV2キメラcDNAからのキメラ・ウイルスの回復
2つの異なる理論を用いて、PIV3F及びHN糖タンパク質の外部ドメイン又は外部ドメイン及び膜透過ドメインをそれらのPIV2の相当物によって置き換えたところの新たなキメラPIV3-PIV2アンチゲノミックcDNAsを構築した。4つの全長cDNAsの構成物、言い換えればpFLC.PIV32TM、pFLC.PIV32TMcp45、pFLC.PIV32CT、及びpFLC.PIV32CTcp45は先に記載され、そして図18、19、及び20に要約されている。最終プラスミドpFLC.PIV32TM及びpFLC.PIV32CT中の前記PIV3-2挿入物は、それぞれ15498nt及び15474ntの長さであって、そして6つの規則に従った（Calain et al., J.Virol. 67:4822-30,1993; Durbin et al., Virology 234:74-83,1997,それぞれ本明細書に援用する）。それら4つの構成物の確実性をBspEＩ-SphＩリージョンのシークエンシング及び制限分析により裏付けた。
【０６４４】
組換えキメラ・ウイルスを全長クローンpFLC.PIV32TM、pFLC.PIV32CT、pFLC.PIV32TMcp45、又はpFLC.PIV32CTcp45から回復し、そしてそれぞれrPIV3-2TM、rPIV3-2CT、rPIV3-2TMcp45、及びrPIV3-2CTcp45と呼んだ。それらのウイルスをベロ（Vero）細胞に3連続した最後にくる希釈液によって生物学的にクローン化し、そしてその後ベロ細胞中で3回増幅した。
【０６４５】
組換えキメラPIV3-PIV2ウイルスの遺伝学的特徴づけ
生物学的にクローン化されたキメラPIV3-PIV2ウイルス、rPIV3-2TM、rPIV3-2CT、rPIV3-2TMcp45、及びrPIV3-2CTcp45をLLC-MK2細胞に増殖させ、そしてその後濃縮した。ウイルス・ペレットから抽出したウイルスRNAsをPIV2又はPIV3特異的なプライマー・ペア（第22表中の21、22又は23、24）を用いた特異的遺伝子セグメントのRT-PCR増幅に用いた。rPIV3-2TM、rPIV3-2CT、rPIV3-2TMcp45、及びrPIV3-2CTcp45からPIV2特異的なプライマー対によって増幅されたRT-PCR産物の制限酵素消化パターンはPIV2/V94から得られたものとそれぞれ異なり、そしてEcoRＩ、MfeＩ、NcoＩ、又はPpuMＩを用いたそれらのパターンは設計したcDNAからそれらに期待されたものであった。
【０６４６】
rPIV3-2TM及びrPIV3-2CTのF及びHN遺伝子中の8つの異なったPIV3-PIV2ジャンクションのヌクレオチド配列は図20中に与えられる。また、3’リーダー・リージョン及びNPの最初の遺伝子中のcp45標識を除く、rPIV3-2TMcp45及びrPIV3-2CTcp45中に与えられるcp45標識を前記と同様のRT-PCR及び制限酵素による消化によって確認した（Skiadopoulos et al., J.Virol. 73:1374-81,1999,本明細書に援用する）。それらの結果は導入したcp45突然変異の存在と同様に回復したPIV3-PIV2ウイルスのキメラ特性を確認した。
【０６４７】
インビトロでのLLC-MK2細胞におけるPIV3-PIV2組換えキメラ・ウイルスの効率的な複製
PIV3-PIV2組換えキメラ・ウイルスのインビトロでの複製の反応速度論及び規模をLLC-MK2細胞のマルチサイクル型の複製により評価した（図21）。6ウェル・プレート中の単層培養LLC-MK2細胞に3連でrPIV3-2TM、rPIV3-2CT、rPIV3-2TMcp45、又はrPIV3-2CTcp45を感染効率0.01においてp-トリプシン（0.5μg/ml）存在下で感染させた。サンプルを6日間24時間おきに培養の上清から採取した。
【０６４８】
rPIV3-2CTcp45（クローン2A1）を除く、それぞれの組換えキメラ・ウイルスは同じ割合で複製し、そしてF及びHNタンパク質のPIV3-PIV2キメラ化が組換えキメラ・ウイルスの増殖の割合を変更しなかったことを示すそれらのPIV2/V94親ウイルスに似たレベルで複製した、そして全てのウイルスが107TCID50/ml以上の力価に達した。2つの実験のそれぞれにおいて前記rPIV3-2CTcp45だけがわずかに速く増殖し、そしてPIV2/V94より速くその最大力価に達した。姉妹クローンがこの増殖パターンを示さないことから、この促進された増殖パターンはこのクローンの特定できない突然変異の結果と思われた。rPIV3-2CTcp45クローン2A1を以下に記載の試験に用いた。
【０６４９】
rPIV3-2 キメラウイルス及びそのcp45誘導体の温度感受性のレベル
PIV3-PVI2 組換キメラウイルスの複製の温度感受性のレベルを検査して、rPIV3-2TM 及びrPVI3-2CT ウイルスがts表現型を示すかどうかを決定し、そして前記ウイルスによる12個のcp45変異の獲得が、それらの12個のPIV3cp45変異を有するcp45誘導体に特徴的である温度感受性レベルを示したかどうかを決定した（Skiadopoulos et al., J.Virol. 73: 1374-81, 1999 ）。当該ウイルスの温度感受性レベルを、前記通りに単層のLLC-MK2 細胞において決定した（Skiadopoulos et al., Vaccine 18: 503-510, 1999)(第26表）。
【０６５０】
rPIV3-2TM 及びrPVI3-2CT の力価は、許容温度（32℃）、そして検査した種々の制限温度ではかなり一定であった。このことはこれらの組換え体がts+ であったことを示す。対照的に、それらのcp45誘導体であるrPIV3-2TMcp45 及びrPIV3-2CTcp45 はtsであり、その温度感受性レベルはrPIV3-1cp45 のレベルと似ていた。rPIV3-1cp45 は、PIV3-PIV1 キメラウイルスであり、完全なPIV1F 及びHN糖タンパク質及び12個のcp45変異の同一セットを有する。従ってrPIV3-2TM 及びrPVI3-1CT ウイルス、並びにそれらのcp45誘導体のインビトロでの特性は、各々rPIV3-1 並びにrPIV3-1 cp45と類似しており、このことは、rPIV3-2 及びrPIV3-1 ウイルスのインビボでの特性もまた類似するだろうことを示唆するが、驚くことにこのことは当てはまらなかった。
【０６５１】
【表５１】
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【０６５２】
rPIV3-2TM 及びrPVI3-2CT はハムスター内で減弱化され、免疫原性を示し、そして高度に保護的であり、そしてcp45変異の導入により前記ウイルスは非常に減弱化され、かつ低保護的となる。
６匹から成る群で、ハムスターに、鼻内に105.3TCID50 のrPIV3-2TM, rPIV3-2CT, rPIV3-2TMcp45, rPIV3-2CTcp45又はコントロールウイルスを接種した。以前に、rPIV3-1 ウイルスが、その親のPIV3及びPIV1の場合と同様に、ハムスターの上気道及び下気道で複製することが認められた（Skiadopoulos et al., Vaccine 18: 503-510, 1999; Tao et al., J.Virol. 72: 2955-2961, 1998）。
【０６５３】
PIV2ウイルスはハムスター内で効率よく複製するが、rPIV3-2TM 及びrPIV3-2CT ウイルスは各々、上気管では、親のPIV3及びPIV2よりも50〜100 倍低く、そして下気道では、320 〜2000倍低く複製した（第27表）。このことはキメラのPIV3-PIV2F及びHN糖タンパク質が、ハムスターにおいて予期せぬ減弱表現型を示すことを意味する。cp45変異を有する誘導体rPIV3-2TMcp45 及びrPIV3-2CTcp45 は、その親のrPIV3-2 よりも50〜100 倍減弱化され、鼻甲介ではほとんど、そして肺では全く複製が検出されなかった。これらのrPIV3-2cp45 ウイルスは、rPIV3-1cp45 よりも明かに減弱化され、鼻甲介では更に50倍低い複製を示した。従ってＦ及びHN糖タンパク質のキメラ化による減弱化効果を、cp45変異による減弱化効果とは相加的である。
【０６５４】
【表５２】
0004795597.tif 000053
【０６５５】
PIV3-PIV2 キメラウイルスの免疫原性及び保護効果を決定するために、12匹かになる群で、ハムスターに、105.3TCID50 のrPIV3-2TM, rPIV3-2CT, rPIV3-2TMcp45, rPIV3-2CTcp45又はコントロールウイルスを０日目に免疫接種した。各群６匹のハムスターに、29日目に106TCID50 のPIV1を攻撃的に投与し、残りの６匹のハムスターに32日目にPIV2を攻撃的に投与した。その攻撃的な接種の４日後にハムスターから肺及び鼻甲介を取り出した。血清試料を−３日目及び28日目に採取し、そしてPIV1, PIV2、及びPIV3に対するHAI 抗体の力価を決定した。
【０６５６】
第28表に示す通り、ハムスター内での減弱化された増殖にも関わらず、rPIV3-2TM 又はrPIV3-2CT による免疫接種により、PIV2に対する血清中のHAI 抗体が、野生型PIV2/V94の感染により誘導されたレベルに匹敵するレベルで誘導された。rPIV3-2TM 及びrPIV3-2CT によるハムスターの免疫接種により、攻撃的に投与されたPIV2ウイルスの複製は完全に制限された。rPIV3-2TMcp45 及びrPIV3-2CTcp45 は、検出できるほどの血清抗体応答を誘導できなかった。そしてこれらの２つのウイルスのいずれかによるハムスターの免疫接種により、下気道において、攻撃的に投与されたPIV2ウイルスの複製はほんの10〜100 倍だけ低下した。
【０６５７】
【表５３】
0004795597.tif 000054
【０６５８】
rPIV3-2TM 及びrPIV3-2CT は、AGM において減弱化され、免疫原性を示し、そして高度に保護的であり、一方cp45変異の導入により、前記ウイルスは高度に減弱化され、そして低保護的となる。
ある種の組換えPIV3及びRSV ウイルスは、ゲッシ類及び霊長類において異なったレベルの減弱化を示し得る（Skiadopoulos et al., Vaccine 18: 503-510, 1999; Skiadopoulos et al., J.Virol. 73: 1374-81, 1999a; Skiadopoulos et al., Virology 272: 225-34, 2000; Whitehead et al., J.Virol. 73: 9773-9780, 1999 ）。このことは、減弱化はいくらか種特異的であり得ることを意味する。従って、rPIV3-2 ウイルスを、AGM （アフリカミドリザル）における複製及び免疫原性のレベルに関して評価する。
【０６５９】
４匹から成る群でAGM に、０日目に部位あたり105TCID50 のrPIV3-2TM, rPIV3-2CT, rPIV3-2TMcp45, rPIV3-2CTcp45, PIV2/V94 、又はrPIV3-1 を鼻内及び気管内投与した。鼻甲介（NT）の綿棒標本（１〜12日目に採取）及び気管洗浄標本（２，４，５，８，10日目に採取）内のウイルスの力価を、従来通りに決定した（van Wyke Coelingh et al., Virology 143: 569〜582, 1985）。第29表に示す通り、rPIV3-2TM 及びrPIV3-2CT は、上気道及び下気道の両方で、放出されたウイルスのピーク力価が親のPIV2/V94ウイルスより低下することから示される様に、AGM の気管において明らかに減弱化された。
【０６６０】
cp45変異を有する誘導体rPIV3-2TMcp45 及びrPIV3-2CTcp45 は、NTの綿棒標本及び気管洗浄標本において、あったとしても非常に低いレベルで検出された。このことは、Ｆ及びHN糖タンパク質のキメラ化による減弱化効果と、cp45変異による効果とが、ハムスターと同様にAGM でも相加的であることを示唆する。
【０６６１】
PIV3-PIV2 キメラウイルスによるAGM の免疫接種により、PIV2の攻撃に対して保護化されるかどうかを決定するために、予めrPIV3-2 ウイルスを感染させたAGM を、28日目に105TCID50 のPIV2により攻撃した（第29表）。NTの綿棒標本（29〜38日目に採取した）及び気管洗浄液（30, 32, 34, 36, 38日目に採取した）中に存在するウイルスの力価を、従来通りに決定した（Durbin et al., Virology 261: 319-30, 1999 ）。第29表に示す通り、rPIV3-2TM 及びrPIV3-2CT による免疫接種により、攻撃的に投与されたPIV2/V94ウイルスの複製は高レベルで制限された。
【０６６２】
対照的に、rPIV3-2TMcp45 及びrPIV3-2CTcp45 によるAGM の免疫接種では、攻撃的に投与されたPIV2/V94ウイルスの複製は制限されなかった。そしてそれらの動物は、PIV2に対する中和抗体の攻撃前の血清中の非常に低レベルで維持された。rPIV3-2CT により免疫化されたAGM における、攻撃的に投与されたPIV2/V94の複製の完全な制限は、不完全な保護を与える、rPIV3-2TM により免疫化されたAGM の場合と比べて、PIV2に対する中和抗体の攻撃前の血清中レベルの2.5 培のレベルを伴なった。
【０６６３】
【表５４】
0004795597.tif 000055
【０６６４】
rPIV3-2TM は、チンパンジーの気管において、その複製に関して減弱化された。
４匹から成る群でチンパンジーに、105TCID50 のrPIV3-2TM 又はrPIV2/V94 を、０日目に鼻内及び気管内接種した。NTの綿棒標本（１〜12日目）及び気管洗浄標本（２，４，６，８，10日目）を集めた。ウイルスの力価を、従前通りに決定し（Durbin et al., Virology 261: 319-30, 1990）、そしてその結果をlog10TCID50／mlとして表した。第30表に示す通り、rPIV3-2TM は、その親の野生型PIV2/V94に比べてより低いピーク力価を有し、更に有意により短い期間放出された。このことはrPIV3-2TM がチンパンジーにおいて減弱化されることを示す。PIV2/94 野生型ウイルスは、チンパンジーにおいて、ハムスター及びAFG に比べて低いレベルで複製する。一方rPIV3-2TM ウイルスは、これらのモデル宿主の各々において減弱化された。
【０６６５】
【表５５】
0004795597.tif 000056
【０６６６】
前記の通り、PIV に対する主な保護的な抗原はHN及びＦ糖タンパク質である。従って、本発明の典型的な態様では、幼児及び若い小児に用いるための減弱化された生ワクチンウイルス候補には、基幹となるPIV3ゲノム又はアンチゲノム中に完全長のPIV1及び部分的なPIV2糖タンパク質を各々有するHPIV3-1 及びHPIV3-2 キメラウイルスが含くまれる。後者の場合、その完全長cDNAを構築するために、完全長のPIV2よりもむしろキメラのHN及びＦのORF を用いる。回収されたウイルスは、PIV2の膜外ドメイン及び膜貫通ドメインがPIV3の細胞質ドメインに融合されたrPIV3-2CT と、PIV2の膜外ドメインがPIV3の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部ドメインに融合されたrPIV3-2TM であり、これらはインビトロ及びインビボでの類似した表現型を有した。
【０６６７】
特に、rPIV3-2 組換えキメラウイルスは、宿主域の表現型を示す。すなわちそれらはインビトロでは効率よく複製するが、インビボでは複製が制限される。このインビボの減弱化は、cp45に由来する追加変異が無くても起きる。このことは、予期しない宿主域効果であり、部分的には、その表現型が、野生型に復帰し得る点変異によっていないということからも、ワクチン目的のために非常に望ましい効果である。同時に、インビトロでの、制限のない増殖は、効率よくワクチンを製造するために非常に有利である。
【０６６８】
rPIV3-2CT 及びrPIV3-2TM はインビトロで効率よく複製するが、ハムスター及びアフリカミドリザルの上気道および下気道の両方において非常に減弱化される。このことは、PIV2及びPIV3のHNタンパク質及びＦタンパク質のキメラ化により、インビボでの減弱化の表現型が規定されることを示す。この減弱化にも関わらず、それらは、両種において、高い免疫原性を示し、そして野生型ウイルスPIV2の攻撃に対して保護性を示す。rPIV3-2CT 及びrPIV3-2TM は更に、HN及びＦのコード配列の外側に存在する12個のPIV3のcp45変異の導入によって修飾されて、rPIV3-2CTcp45 及びrPIV3-2TMcp45 が形成された。これらは、インビトロで効率よく複製したが、ハムスター及びAGM において更に一層減弱化された。このことは、前記糖タンパク質による減弱化とcp45変異による減弱化とは相加的であることを示す。
【０６６９】
一方のウイルスの保護的な抗原、及び他方のウイルスの減弱性変異を有する抗原的キメラウイルスの開発は、インフルエンザウイルス（Belshe et al., N.Engl.J.Med. 338: 1405-1, 1998; Murphy et al., Infections Diseases in Clinical Practice 2: 174-181, 1993）及びロタウイルス（Pevez-Schael et al., N.Engl.J.Med. 337: 1181-7, 1997）において、他者から既に報告されている。減弱化された抗原性キメラワクチンは、セグメント化されたゲノムを有するこれらのウイルスにおいてはより容易に作製される。なぜならゲノムのセグメントの再配置化は、同時感染中に高頻度で発生するからである。
【０６７０】
減弱化された生インフルエンザウイルスワクチン候補は、減弱された供与ウイルスのHA及びNA遺伝子を、新しく局部的又は世界的に流行しているウイルスのものによって置換することによって、毎年、抗原性に関して更新される。フラビウイルス及びパラミクソウイルスにおける減弱化された抗原キメラウイルス生ワクチンを作製するために、組換DNA 技術も積極的に用いられている。フラビウイルスの場合、減弱化された黄熱ウイルス（YFV ）の膜前領域（prM ）及びエンペロープ領域（Ｅ）を、日本脳炎ウイルス（JEV ）の減弱化株に由来するものによって置換することによって、日本脳炎ウイルスのための減弱化された生ウイルスワクチン候補が作製された（Guirakhoo et al., Virology 257: 363-72, 1999）。
【０６７１】
このJEV-YFV 抗原キメラ組換えワクチン候補はインビボで減弱化され、そして免疫原性を示した（Guirakhoo et al., Virology 257: 363-72, 1999）。このキメラウイルスの構造タンパク質及び非構造タンパク質は両方とも、減弱化された生ワクチンウイルスに由来した。また、天然で減弱化されたダニ媒介フラビウイルス（Langatウイルス）と、野生型の蚊媒介デング４ウイルスとの間で、抗原性キメラワクチンも作製された。この生成した組換体は、親のダニ媒介ウイルスよりも有意に大きく減弱化されていた（Pletnev et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 95: 1746-51, 1998）が、このキメラウイルスは、インビトロでのVero細胞内での複製が非常に制限されていた。
【０６７２】
これは、Langatウイルスにより規定された進化的に分岐した構造タンパク質と、デングウイルスの非構造タンパク質との間の部分的な不適合性に由来する減弱化効果の例である。四価のデングウイルスの製造のために、第三の方策が追求されている。その場合、３′側の非コード領域中の減弱性の欠失変異を含有するデング４ウイルスの基幹を用いて、デング１，２又はウイルスの保護性抗原を含有する抗原キメラウイルスを構築する（Bray et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88: 10342-6, 1991; J.Virol. 70: 3930-7, 1996 ）。
【０６７３】
抗原性キメラウイルスも、一本鎖のネガティブセンスRNA ウイルスのために産生した。例えば、抗原性キメラPIV1ワクチンの候補は、本発明細に開示した方法に従い、パラインフルエンザウイルス１型の完全長のHN及びＦタンパク質を、弱毒化PIV3ワクチン候補におけるPIV3のそれらの代わりに用いることによって構築することができ、そしてこの組換え体は弱毒化され、そして実験動物のPIV1の誘発に対して保護性がある。同様に、例示的な抗原性キメラ呼吸器合胞体ウイルス（RSV ）ワクチン候補は、１又は複数のRSV F 及びＧ感染防御抗原、又はサブグループＢウイルスの、その抗原決定基は、弱毒化RSV サブグループＢワクチン候補を生成する弱毒化RSV サブグループＡウイルスにおけるそれらのために交換される
【０６７４】
（国際公開番号WO97/06270; Callins et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92: 11563-11567 (1995); 1997年７月15日に提出された米国特許出願番号08/892,403（公開国際出願番号WO98/02530並びに優先権米国仮特許出願、1997年５月23日に提出された60/047,634号、1997年５月９日に提出された60/046,141号、及び1996年７月15日に提出された60/021,773号に相当する）；1993年４月13日にCollins 等によって提出された米国特許出願番号09/291,894；1993年４月13日に提出された米国仮特許出願番号60/129,006；1999年７月９日にBucholz 等によって提出された米国仮特許出願番号60/143,132；及びWhitehead et al., J.Virol. 73: 9773-9780, 1999も参照のこと。
【０６７５】
これらはそれぞれが引用によって本明細書に組み入れられる）。PIV1とPIV3ウイルスとの間の、並びにRSV サブグループＡとRSV サブグループＢウイルスとの間の糖タンパク質の交換が野生型ウイルスの背景で行われた場合、抗原性キメラウイルスは、in vitro及びin vivo で野生型ウイルスのレベルに複製された。これらの発見は、高レベルな互変性が、レシピエントとドナーウイルスとの間に存在し、そしてあったとしても、非常にわずかな弱毒化が、キメラ化の過程の結果として得られたことを示している。PIV1とPIV3、並びにRSV A とＢ糖タンパク質との交換についてのこれらの発見を、本明細書で開示したPIV2とPIV3との間の交換について、様々な方法で厳密に対比させる。
【０６７６】
本開示において、完全長のPIV2 HN 又はＦタンパク質がPIV3のそれらを交換するのに使用された生存可能な組換えウイルスは、cDNAの構築の間に導入された同一の変異に明らかに起因しうるこの例において回収されず、一方、これはPIV-1-PIV3の糖タンパク質交換のために首尾よく達成された。これは、PIV2 HN 又はＦ糖タンパク質が、前記cDNAでコードされる１又は複数のPIV3タンパク質とほとんど互換性がないことを示している。２つの生存可能なPIV2-PIV3 キメラウイルスは、完全長のPIV2のORF よりもむしろ、キメラHF及びＦのORF が完全長のcDNAの構築に使用された場合に得られた。
【０６７７】
これらのキメラウイルスのうちの一方は、PIV2の外部ドメインがPIV3の膜貫通及び細胞質の尾の領域に融合されたキメラHN及びＦの糖タンパク質を含み、そして他方は、PIV2の外部ドメイン及び膜貫通領域がPIV3の細胞質の尾の領域に融合されたキメラHN及びＦの糖タンパク質を含んだ。両方のrPIV3-2 組換え体が、類似であるが同一でない。in vitro及びin vivo の表現型を有していた。従って、PIV3のHN又はＦの糖タンパク質の細胞質側の尾のみが、PIV2-PIV3 キメラウイルスの回収の成功に必要であることが明らかとなった。
【０６７８】
タンパク質の構造−機能解析についての以前の研究において、キメラHN又はＦの糖タンパク質は構築され、そしてin vitroで発現し、そして前記タンパク質の様々な機能的ドメインをマッピングするために使用されていた（Bousse et al., Virology 204: 506-14, 1994; Deng et al., Arch.Virol.Suppl. 13: 115-30, 1997; Deng et al., Virology 253: 43-54, 1999; Deng et al., Virology 209: 457-69, 1995; Mebatsion et al., J.Virol. 69: 1444-1451; Takimoto et al., J.Virol. 72: 9747-540, 1998; Tanabayashi et al., J.Virol. 70: 6112-6118, 1996; Tsurudome et al., J.Gen.Virol. 79: 279-87, 1998; Tsurudome et al., Virology 213: 190-203, 1995; Yao et al., J.Virol. 69: 704005-53, 1995 ）。
【０６７９】
１つの報告において、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質の膜貫通及び外部ドメインに融合した麻疹ウイルスＦの細胞質側の尾から成るキメラタンパク質は、麻疹ウイルスＦ及びHNウイルスの糖タンパク質の代わりに麻疹ウイルス感染クローンに挿入された（Spielhofer et al., J.Virol. 72: 2150-9, 1998）。複製適格性のあるキメラウイルスが得られたが、in vitroでの高い弱毒化の程度を示す、遅れた増殖及び低いウイルスの収率によって示される様に、in vitroでの複製に高度に限定された。この発見は、キメラ糖タンパク質を発現している本発明の組換えPIV 、例えばin vitroで効率的に複製するPIV2-PIV3 キメラによって示される表現型と明らかに異なる。
【０６８０】
本発明のrPIV3-2 及び他のキメラPIV ウイルスの、in vitroでの効率的な複製は、大規模なワクチンの製造に必要な弱毒化生ワクチンの候補にとって重要な特性である。rPIV3-2CT 及びrPIV3-2TM と対照的に、rPIV3-1 はin vivo で弱毒化されない。従って、PIV2及びPIV3自身のHN及びＦタンパク質のキメラ化は、in vivo での複製の減弱という、一本鎖のネガティブセンスRNA ウイルスについての新規の発見をもたらした。
【０６８１】
このin vivo での複製の宿主範囲の限定の機構は知られていない。重要なことに、これらの弱毒化rPIV3-2CT 及びrPIV3-2TM ワクチン候補による感染は、PIV2による誘発に対する高レベルな耐性を誘導し、これはキメラ糖タンパク質の抗原性構造が大きく又は完全に無傷であることを示す。従って、弱毒化生PIV2の候補としてのrPIV3-2CT 及びrPIV3-2TM の機能は、AGM 及びハムスターの両方において弱毒化と免疫原性との間の所望の平衡を示す。
【０６８２】
Ｆ及びHN糖タンパク質のPIV3-PIV2 のキメラ化の弱毒化効果は、cp45変異によって特定されるものが加えられる。cp45変異を含むrPIV3-2 組換え体は、in vivo で高度に弱毒化され、そしてPIV2による誘発に対するハムスターの不完全な防御及びAGM におけるわずかな防御が提供される。これは、in vivo で十分に弱毒化され、そしてPIV1による誘発に対して動物が防御されたというrPIV3-1cp45 による発見と対照的である。
【０６８３】
PIV3-PIV2 糖タンパク質のキメラ化及び12cp45変異の追加の弱毒化効果は、in vivo での弱毒化も明らかにした。明らかに、rPIV3-2CT 及びrPIV3-2TM ワクチンの候補がヒトで十分に弱毒化されないことがわかったら、cp45の弱毒化変異は、ヒトでの使用のための弱毒化生PIV2ワクチンに必要な弱毒化と免疫原性との間の所望の平衡を達成するために、12個の組み合わせよりむしろ追加的に加えられるだろう。
【０６８４】
従って、本明細書で提示した発見はパラミキソウイルスを弱毒化するための新規な手段を同定し、そしてヒトにおける、これらのPIV3-PIV2 キメラ弱毒化生PIV2ワクチンの候補の評価基準を提供する。重要なことに、rPIV3-2CT 又はrPIV3-2TM ウイルスも、他のPIV 抗原又は他のウイルス性防御抗原、例えば麻疹ウイルスのHAタンパク質又はその免疫原性部分のためのベクターとして使用されうる。
【０６８５】
前記の記述及び例を簡単に要約すると、異種ウイルス遺伝子又はゲノムセグメントを有するベクターとして構築した組換えキメラPIV が作製され、そしてcDNAに基づいたウイルス回収システムを用いて特徴づけられた。cDNAから生成した組換えウイルスは独立して複製し、そしてまるでそれらが生物学的に派生したウイルスであるかの様に増殖しうる。好ましい態様において、組換えキメラヒトPIV (HPIV)ワクチンの候補は、好ましくは１又は複数のヌクレオチドの修飾によって弱毒化されているという背景のある、１又は複数のHPIVの主要な抗原決定基を有する。
【０６８６】
好ましくは、本発明のキメラPIV も、別の病原、例えば微生物性病原の１又は複数の防御抗原を発現する。これらの場合において、HPIVは弱毒化ウイルスベクターとして働き、そして１又は複数のHPIVに対する、並びに前記の外来の防御抗原が由来する病原に対する防御的免疫応答を誘導する２つの目的のために使用される。上述した様に、PIV の主要な防御抗原はそれらのHN及びＦ糖タンパク質である。
【０６８７】
他の外被ウイルス、例えばヒトの気道に感染し、遺伝子単位として言及される、１又は複数の外部の転写単位由来のHPIVベクターによって発現しうるウイルスの主要な防御抗原は、それらの付着タンパク質であり、例えばRSV のＧタンパク質、麻疹ウイルスのHAタンパク質、おたふく風邪ウイルスのHNタンパク質、又はそれらの融合（Ｆ）タンパク質、例えばRSV 、麻疹ウイルス若しくはおたふく風邪ウイルスのＦタンパク質である。
【０６８８】
外被の無いウイルスの防御抗原、例えば感染した宿主においてウイルス様粒子を形成しうるヒトパピローマウイルスのL1タンパク質を発現することも可能である（Roden et al., J.Virol. 70: 5875-83, 1996）。これらの技術に従い、多様な病原に由来する巨大な配列の防御抗原及びそれらの構成的抗原決定基は、新規な、有効な免疫応答を生成するために、本発明のキメラPIV 内に組込まれうる。
【０６８９】
本発明は、ベクターに基がいたワクチンの開発に対する以前のアプローチにおける、固有な困難性に打ち勝つ、そして様々なヒトの病原に対する人生の最初の１年間の乳児の免疫化の独特な免疫化を提供する。弱毒化生PIV ワクチンを開発する以前の研究は、思いがけなく、rPIV及びそれらの弱毒化キメラ誘導体が、様々なヒトの病原に対するワクチンとしての外来タンパク質を発現するためのベクターとして、断片化していないネガティブ鎖のRNA ウイルスの中でそれらをそれぞれ最適化する特性を有する。
【０６９０】
当業者は、断片化されていないネガティブ鎖のウイルス型ほど実質的に増殖しない傾向があり、そして分子の研究に関して典型的に表わされていないヒトPIV を予言し、ベクターとして高度に望ましい特性を有することを証明するだろう。これらのワクチンの投与の鼻腔内経路が、前記ベクター及び発現した異種抗原、その両方に対する強力な局所かつ全身性の免疫応答を刺激するのに非常に有効な手段であることを証明したのも驚くことである。更に、この経路は、気道又は他の場所に感染する異種病原に対する免疫化にとって追加の利益を提供する。
【０６９１】
PIV ベクターの特性は、（ｉ）野生型及び弱毒化されている背景の別々の遺伝子として発現した麻疹ウイルスの主要な中和抗原又は（ii）更にHPIV2の主要な中和抗原を発現するPIV3の中和抗原の代わりの、HPIV1 の主要な中和抗原を生むrPIV3 ベクターの例を用いて上述した。これらのrPIVベクターは野生型及び弱毒化される背景を用いて構築した。更に、本明細書の記載は、PIV ベクターの弱毒化レベルを容易に向上される能力を証明する。これらの方法のうちの１つに従い、本発明のキメラPIV におけるゲノムインサートの長さの変更は、非常に長いインサートを用いて野生型誘導体においてのみ明らかな弱毒化表現型の調節を許容する。
【０６９２】
本発明は、麻疹ウイルス又は他の微生物病原に対する幼い乳児を免疫化するためのこれまでの試みを超える６つの主要な利点を提供する。最初に、前記防御抗原又は麻疹ウイルス若しくは他の微生物病原の抗原が挿入されるPIV 組換えベクターは、非常に幼いヒトの乳児の気道のために、ウイルスを弱毒化することが知られている１又は複数の弱毒化遺伝的因子を有する弱毒化rPIVである（Karron et al., Pediatr.Infect.Dis.J. 15: 650-654, 1996; Karron et al., J.Infect.Dis. 171, 1107-1114, 1995a; Karron et al., J.Infect.Dis. 172: 1445-1450, 1995b）。以前の臨床的評価及び実施のこの広範にわたる歴史は、非常に幼いヒトの乳児における外来防御抗原を生むこれらの組換え体の誘導体の評価を非常に容易にする。
【０６９３】
第２の利点は、麻疹HA又は別のヒト病原の他の防御抗原を有するrPIV主鎖が、（１）上述したワクチンについての強制的な独立した必要性のあるPIV 、及び（２）防御抗原がベクターによって発現する異種ウイルス又は他の微生物病原、に対する２つの防御的免疫応答を誘導することである。これを、１つのヒトの病原のみ、すなわち麻疹ウイルスに対する免疫性を誘導し、そしてベクター自身に対する免疫応答が最高でも不適切であるか又は潜在的に不利である、上述したVSV 麻疹ウイルスHA組換え体と比較する。
【０６９４】
モノネガウイルス（Mononegavirales ）目の様々なメンバーのウイルスに挿入された外来遺伝子のコード配列は、組織培養細胞における複数の複製周期の後、多くの組換えウイルスのゲノムにおいて無傷なままであり、これはこのウイルス群の一員が、ベクターとしての使用のための優れた候補であることを示している（Bukreyer et al., J.Virol. 70: 6634-41, 1996; Schnell et al., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 93: 11359-65, 1996a; Singth et al., J.Gen.Virol. 80: 101-6; Yu et al., Genes Cells 2: 457-66, 1997 ）。
【０６９５】
本発明によって提供される別の利点は、ワクチンにとって必要な、ヒト病原のバックボーンの使用が、既に混雑している幼少期初期の免疫化計画への、その様な弱毒化生ウイルスベクターの導入を好むことである。更に、気道の粘膜表面を介しての免疫化が様々な利点を提供する。弱毒化生PIV3は、アカゲザルの気道において複製し、そして母系的に獲得される大量のPIV3抗体の存在下で、それ自身に対する防御的免疫応答を誘導することを示した。
【０６９６】
母系的に獲得される抗体を有する非常に幼い乳児の上気道において感染し、そして効率的に複製する２つのPIV3ワクチンの候補の能力も証明された（Karron et al., Pediatr.Infect.Dis.J. 15: 650-654, 1996; Karron et al., J.Infect.Dis. 171: 1107-1114, 1995a; Karron et al., J.Infect.Dis. 172: 1445-1450, 1995b）。
【０６９７】
このことは、ヒトの上気道に投与された場合にほとんど感染せず、そして幼い子供に非経口投与された場合に高度に中和感受性である、現在認可されている麻疹ウイルスワクチンと対照的である（Black et al., New Eng.J.Med. 263: 165-169, 1960; Kok et al., Trars.R.Soc.Trop.Med.Hyg. 77: 171-6, 1983; Simasathien et al., Vaccine 15: 329-34, 1997）。
気道におけるHPIVベクターの複製は、粘膜IgA 並びにHPIVベクター及び発現した外来抗原に対する全身性の免疫性の両方の生成を刺激するだろう。野生型ウイルス、例えば麻疹ウイルスに対するその次の天然の暴露により、ワクチン誘導型局所及び全身性免疫の存在は、その進入口、すなわち気道、及び複製の全身性部位、その両方でその複製を限定する役割を果たすはずである。
【０６９８】
本発明の更に別の利点は、異種の配列を生むキメラHPIVがin vitroで効率的に複製し、ワクチンの大規模製造の可能性を示すことである。このことは、外来遺伝子の挿入によってin vitroで阻害されうる複数の一本鎖のネガティブセンスRNA ウイルスの複製と対照的である（Bukreyev et al., J.Virol. 70: 6634-41, 1996 ）。
【０６９９】
また、HPIVの３つの抗原性血清型は、それぞれがヒトにおいて重大な疾患を引き起こし、そしてそれ故にベクター及びワクチンとして同時に役割を果たすことがあり、これらは、それぞれが同一の外来タンパク質を生む、抗原的に異なるHPIV変異体を用いて経時的に免疫化する独特の機会を提示する。この様に、経時的な免疫化は、同一又は異なる１又は複数のタンパク質、すなわち麻疹ウイルス又は別の微生物病原の防御抗原も生む抗原と抗原的に異なるHPIVによるその次の感染の間に追加免疫されうる外来タンパク質に対する一次免疫応答の発生を許容するだろう。
【０７００】
相同性HPIVベクターの再投与は、HPIV及び外来抗原、その両方の応答も増大させるのは、ヒトにおける複数の再感染を起こす能力は通常と異なるが、特性はHPIVに起因するためであるだろう（Collins et al., In“Fields Virology”, B.N.Fields, D.M.Knipe, P.M.Homley, R.M.Chanock, J.L.Melnick, T.P.Monath, B.Roizman, and S.E.Strans, Eds., Vol.1, pp.1205-1243. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996 ）。
【０７０１】
更に別の利点は、PIV ベクターへの遺伝子単位の導入が、予期できないが高度に所望な複数の効果を弱毒化ウイルスの産生について有することである。最初に、例えば麻疹ウイルスのHA又はPIV2のHNを発現する遺伝子単位の挿入は、これまでに認識されていなかったPIV ベクターに対する宿主範囲の表現型を特定することができ、すなわち生じたPIV ベクターはin vitroで効率的に複製するが、in vivo では上気道及び下気道に限定される。これらの発見は、PIV ベクターのための弱毒化因子としてウイルス防御抗原を発現する遺伝子単位の挿入、本発明の弱毒化ウイルス生ワクチンの所望の特性を同定する。
【０７０２】
PIV ベクター系は、モノネガウイルス目の一本鎖のルガティブセンスウイルスの他の全てのメンバーに及ぶ独特な利点を有する。はじめに、ベクターとして使用されてきた多くの他のモノネガウイルスはヒトの病原に由来しない（例えば、マウスHPIV1 （センダイウイルス)(Sakai et al, FEBS Lett. 456: 221-6, 1999）、ウシの病原である水疱性口内炎ウイルス（VSV)(Roberts et al., J.Virol. 72: 4704-11, 1998 ）、及びイヌPIV2 (SVS)(He et al., Virology 217: 249-60, 1997))。
【０７０３】
これらの非ヒトウイルスにとって、弱い又は微弱な免疫性は、ベクターの主鎖に存在する抗原によってヒトウイルスのいずれかに対して与えられるだろう。従って、ヒトの病原にとって過剰な遺伝子を発現する非ヒトウイルスベクターは、単一のヒト病原に対してのみ、耐性を誘導するだろう。更に、ウイルス、例えばVSV, SVS、狂犬病ウイルス又はセンダイウイルスのベクターとしての使用は、それらが生涯を通じて他に遭遇しないであろうウイルスにワクチンを暴露するだろう。その様な非ヒトウイルスによる感染、及びそれに対する免疫応答があまり利益がなく、そして安全性の問題を主張するのは、ヒトにおいてこれらのウイルスによる感染の経験がわずかであるためである。
【０７０４】
PIV ベクター系の重要かつ具体的な利点は、天然の感染を真似た、その好ましい鼻腔内経路が、粘膜及び全身性免疫、その両方を誘導し、そして乳児に存在する母系由来の血清IgG の中和及び免疫抑制効果を低下させることである。同時に、これらの同一な利点はベクターとしてのRSV の使用が理論的に可能であり、例えば、我々はRSV の複製が約500bp 以上のインサートによって強力に阻害されることを見出した（Bukreyev et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 96: 2167-72, 1999）。対照的に、本明細書に記載した様に、HPIV3 は複数の大きな遺伝子のインサートを容易に収容しうる。組換えRSV が大きなインサートの生成に不適当であるか、組換えPIV は高度に適しているという発見は、予期していない結果を表わす。
【０７０５】
他のウイルスベクターのいくつかは、PIV ベクターについて示されたのと同様の利益を得るために鼻腔内に投与されうることが提案されるが、これは今のところ成功していない。例えば、HPIV3 の防御抗原を発現するワクチンウイルスのMVA 菌株は、HPIV3 に対する弱毒化鼻腔内生ワクチンとして評価された。このベクターは細胞培養における非常に効率的な発現系であると思われるが、不可解なことに霊長類の上気道において耐性を誘導するのに不十分であり
【０７０６】
（Durbin et al., Vaccine 16: 1324-30, 1998）、そして不可解なことに受動血清抗体の存在下で防御的な応答を誘導するのに不十分であった（Durbin et al., J.Infect.Dis. 179: 1345-51, 1999 ）。対照的に、PIV3及びRSV ワクチンの候補は、受動血清抗体の存在下であっても、非ヒトの霊長類の上気道及び下気道において防御的であることが明らかになった（Crowe et al., Vaccine 13: 847-855, 1995; Durbin et al., J.Infect.Dis. 179: 1345-51, 1999）。
【０７０７】
特にベクターとしてのPIV3の使用は、更に追加の利点を提供する。例えば、RSV 及び麻疹ウイルスの様なウイルスで達成されうるものより10〜1000倍大きい、マイクロキャリヤー培養におけるPIV3の高い力価を得るために、条件が確立されてきた。また、RSV の感染力は不安定であり、これは増殖、輸送、保存及び取り扱いを複雑にする。これらの問題は、PIV ベクター化RSV ワクチンの開発によって除かれるだろう。
【０７０８】
重要なことに、２種類のPIV3は、鼻腔内に投入される候補ワクチン、すなわちBPIV3 及び弱毒化HPIV3 cp45菌株として広範な臨床的評価を受けてきた。それぞれ、子供及び乳児において安全であり、免疫原性があり、かつ表現型的に安定であることが明らかとなった。他の候補の操作されたベクターは、子供及び乳児において評価されておらず、そして特に他の入手可能なベクターはこの年齢群における鼻腔内投与について評価されてこなかった。
【０７０９】
PIV ベクター系の別の利点は、モデルとしてHPIV3 を用いての多くの弱毒化変異が同定され、これが所望の弱毒化の程度を得るために、ベクターの主鎖に単一及び複数に導入されうるということである。例えば、HPIV3 cp45に弱毒化表現型を与える具体的な変異は、直接的な配列解析及び野生型の組換えウイルスへの導入によって同定されてきた。追加の弱毒化変異は、センダイウイルス及びRSV から弱毒化点変異を「輸入」することによって発展してきた。
【０７１０】
いくつかの場合において、野生型への復帰に対する変異を安定化する、１つではなく２つのヌクレオチドの変化を用いて、組換えウイルスに、ある点変異を導入することが可能であった。Ｃ，Ｄ及びV ORF の発現の消失は、前記ウイルスを弱毒化するために示された。更に、HPIV3 及びウシ（Ｂ）PIV3のキメラウイルスは、弱毒化の手段として、霊長類におけるBPIV3 の天然の宿主範囲の制限を使用するために開発された。ある配列の組み合わせは、例えばHPIV3 HN及びＦの外部ドメインの、それらのHPIV2 由来の対応物による置換を弱めることも明らかとなった。その結果、所望の様にベクターの主鎖を弱毒化しうる、PIV 弱毒化変異の巨大な一覧表が存在する。
【０７１１】
この様に、本明細書で開示した本発明の観点は、過剰な遺伝子として異種病原の１又は複数の防御抗原を発現するためのベクターとして、選択される組換えPIV を用いる方法に関する。本明細書に記載の異種病原は、異種PIV 、麻疹ウイルス、及びRSV を含む。上述の例において、rHIPV3は異なるウイルス防御抗原をそれぞれが発現する、最大３つの別々な、過剰な遺伝子のインサートを発現するためのベクターとして操作された。
【０７１２】
更に、rHIPV3は、野生型ゲノムのうちの少なくとも50％の長さの全てが集合したインサートに容易に収容された。コンストアクトは、複数の異なるPIV ベクターの主鎖、すなわち：野生型HPIV3 ；N ORF がBPIV3 のそれと置換されたHPIV3 の弱毒化版；HPIV3 のHN及びF ORF がHPIV1 由来のそれらの対応物によって置換されたHPIV3-1 キメラウイルス；１遺伝子における３つの独立した弱毒化cp45点変異の存在によって弱毒化されたHPIV3-1 ；並びにHN及びＦ遺伝子がHPIV3 由来のそれらの対応物によって置換されたBPIV3 を用いて生成した。
【０７１３】
１又は複数の過剰な遺伝子を有する３つのベクターはin vitroで効率的に複製し、これはそれらの商業的発展の可能性を示し、そしてそれらは複製し、そして前記ベクター及びインサート、その両方に対するin vivo での強い免疫応答を誘導した。この様に、少なくとも４つの病原に対して免疫応答を誘導することができる、単一な組換えPIV に基づいたウイルス、すなわちPIV ベクター自身及び過剰な遺伝子を意味する病原を構築することができる。
【０７１４】
本発明の第２の観点は、RSV に対するワクチン及びベクターとしてのPIV の優れた特性を使用することである。RSV はPIV ほど増殖しない病原であり、不安定であり、そして完全に解明されていない理由によりほとんど防御的でない免疫応答を誘導する傾向がある。弱毒化RSV 生ワクチンの開発は、35年以上かかっており、これはこのヒト病原について、免疫原性と弱毒化との間の適当な平衡を達成することが難しいことを示している。この様に、感染性RSV に基づかない、弱毒化RSV 生ワクチンを開発するための避けようのない理由が存在している。RSV の主要な防御Ｆ及びＧ抗原は、PIV ベクター由来の過剰な遺伝子として発現し、この場合、BPIV3 は、感染性RSV に基づく弱毒化性生ワクチンを生成するために必要なことが明らかである。
【０７１５】
本明細書に記載の第３の観点は、異なるPIV の血清型の抗原決定基を有するPIV を基にしたベクターを開発することであった。血清型の間で本質的に交差防御が存在しないので、このことが、防御抗原決定基を変化させている一般的なPIV ベクターによる経時的な免疫化のための方法を開発することを可能にしている。この様に、例えばrHPIV3に由来する、上述した過剰な遺伝子を有する単一な弱毒化PIV ベクターは、最初の免疫化に使用されうる。好ましくは１回目から４〜６週又はそれ以上後の次の免疫化は、糖タンパク質遺伝子が異種PIV の血清型のもの、例えばrHPIV3-1で置換された同一のPIV ベクターを用いて達成されうる。
【０７１６】
このベクターは、続いて過剰な抗原に対する追加免疫を提供する、同一の過剰な遺伝子を含みうり、又は異なる組み合わせを含みうる。第２免疫化が異種PIV の血清型の糖タンパク質を含むベクターで行われるので、最初の免疫化によって誘導されるベクター特異的免疫性による複数の干渉が存在する。あるいは、第２免疫化は、全てのベクター遺伝子が異なる血清型のもの、例えばHPIV1 又はHPUV2 であるPIV ベクターで行われうる。
【０７１７】
しかし、内部遺伝子、例えばHPIV3 に基づくrPIV3 及びrPIV3-1 にある一般的な組み合わせを用いる利点は、弱毒化変異の単一の組み合わせが各コンストラクトで適用でき、そしてそれぞれのPIV 血清型のために別々に弱毒化した菌株を開発する必要がないということである。重要なことに、経時的免疫化は多価の戦略に従う：それぞれの免疫化において、ベクター自身が重要なヒト病原に対する免疫性を誘導し、そしてそれぞれの過剰なインサートが追加の病原に対する免疫性を誘導する。
【０７１８】
前記発明は理解の明確化のために例によって詳細に記載したが、ある変更及び修飾が特許請求の範囲において実施され、これが限定していない例示によって表されていることは当業者にとって明らかであろう。本文において、様々な刊行物及び他の参考文献は、記述の省略のために前記開示内に引用されている。これらの参考文献のそれぞれが、全ての目的のためにその全体が引用によって本明細書に組み入れられる。
【０７１９】
生物学的材料の寄託
以下の材料は、ブダペスト条約の合意のもとに、American Type Culture Collection (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 ）に寄託されている。
ウイルス 寄託番号 寄託日
p3/7 (131) 2G             （ATCC 97989）             1997年４月18日
p3/7 (131)                （ATCC 97990）             1997年４月18日
p218 (131)                （ATCC 97991）             1997年４月18日
HPIV3 JS cp45             （ATCC PTA-2419）          2000年８月24日
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図１Ａは、はしかウイルスのHA遺伝子のHPIV3 ゲノムへの挿入を示す（注：本願に記載の図および関連する説明はすべて、HPIV3, 5′-3′のポジティブセンスのアンチゲノム（positive-sense antigenome）に当てはまる）。
図１Ａは、はしかウイルスHAを、エキストラ転写ユニットから発現するよう加工されたはしかウイルスのエドモンストン（Edmonston ）野生型株の赤血球凝集素（HA）遺伝子の完全オープンリーディングルームを含有する1926ntの挿入物の線図〔頂部；比例尺に合わしていない（not to scale）〕を示す。その挿入物は、５′から３′へ順に、AflII 部位；Ｐ遺伝子、その遺伝子末端シグナル、その遺伝子間領域およびＭ遺伝子の出発シグナルの下流非コーディング配列を含むＰ／Ｍ遺伝子ジャンクションを有するHPIV3 アンチゲノムからの3699〜3731ntの部分；三つの追加のnt (GCG)；完全はしかウイルスHA ORF；Ｐ遺伝子の下流の非コーディング領域からの3594〜3623ntのHPIV3 ；および第二AflII 部位を含有している。図１Ａのパネル１は、はしかHA ORFを挿入する前（上部）と挿入後（下部）のＮ遺伝子の３′−非コーディング領域内に導入されたAflII 部位を有するHPIV3 のJS野生型株（1PIV3 ）の完全アンチゲノムを示す。図１Ａのパネル２は、はしかHA ORFを挿入する前（上部）と挿入後（下部）のＰ遺伝子の３′−非コーディング領域内に導入されたAflII 部位を有するHPIV3 のJS野生型株（rPIV3 ）の完全アンチゲノムを示す。配列番号：１と配列番号：２を図１Ａに示す。
【図１Ｂ】  図１Ｂは、はしかウイルスのHA遺伝子のHPIV3 ゲノムへの挿入を示す（注：本願に記載の図および関連する説明はすべて、HPIV3, 5′-3′のポジティブセンスのアンチゲノム（positive-sense antigenome）に当てはまる）。
図１Ｂは、はしかウイルスのHA遺伝子の完全ORF を含有する2028ntの挿入物の線図（頂部；比例尺に合わしていない）である。その挿入物は、５′から３′へ順に、StuI部位；HN遺伝子から下流の非コーディング配列とその遺伝子末端のシグナルからなるHPIV3 アンチゲノムからの8602〜8620ntの部分；HPIV3 の遺伝子間保存トリヌクレオチド；HPIV3 アンチゲノム由来の6733〜6808ntの部分（HN遺伝子の出発および上流の非コーディング領域を含有している）；はしかウイルスのHA ORF；HN遺伝子由来の下流の非コーディング配列であるHPIV3 のnt8525〜8597；および第二StuI部位を含有している。その構造は、挿入時に、StuI部位を含有するHPIV3 HN遺伝子を再生しそして、はしかウイルスORF を、それに転写シグナルおよびHPIV3 HN遺伝子の非コーディング領域が隣接した後、直接配置によるように設計される。HN遺伝子の３′−非コーディング領域のnt位置8600に導入されたStuI部位を有するHPIV3 JS野生型（rPIV3 ）の完全アンチゲノムを次の（中央の）線図に示す。下に示すのは、StuI部位に挿入されたはしかHAタンパク質を発現するHPIV3 のアンチゲノムである。この挿入に使用されるHA cDNA は、既存のプラスミド由来のものであり、Ｎ／Ｐ領域とＰ／Ｍ領域への挿入に使用したエドモンストン野性型はしかウイルス由来のものではない。このcDNAは、図１Ａで挿入されたHAタンパク質とは二つのアミノ酸が異なっており、そしてはしかウイルスのHA遺伝子中のそれらアミノ酸の位置は図１Ｂに星印で示してある。配列番号：３と４を図１Ｂに示す。
【図２】  図２は、LLC-MK2 細胞内におけるrHPIV3はしかウイルスHAのキメラウイルスによるはしかウイルスのHAタンパク質の発現を示す。この図は、はしかHAタンパク質が、組換えキメラウイルスのrcp45L (HA P-L) とrcp45L (HA N-P) およびはしかウイルスのエドモンストン野性型株のはしかウイルス（はしか）によって発現されるが、rJS の野生型HPIV3 (rJS) によっては発現されないことを実証する放射線免疫沈降検定法（RIPA）の測定結果を示す。レーンＡ--35Ｓ標識感染細胞ライゼートを、HPIV3 HNタンパク質に対して特異的な三種のモノクローナル抗体の混合物によって免疫沈降させた。HNタンパク質に対応する64KDのバンド（白矢印）が、前記三種のHPIV3 に感染した細胞ライゼート（レーン３，５および７）の各々に存在しているがはしかウイルスに感染した細胞ライゼート（レーン９）には存在していない。これはrcp45L (HA P-M) とrcp45L (HA N-P) のキメラが実際にHPIV3 であり、類似レベルのHAタンパク質を発現することを確証している。レーン（ｂ）--35Ｓ標識感染細胞ライゼートを、はしかウイルスのHA糖タンパク質を認識するモノクローナル抗体類（79-XV-V17, 80-III-B2, 81-1-366）の混合物によって免疫沈降させた（Hummelら、J.Virol. 69巻1913〜1916頁1995年；Sheshberadaran ら、Arch.Virol. 83巻251〜268頁1985年、これら文献は各々本願に援用するものである）。HAタンパク質に対応する76KDのバンド（黒矢印）が、rep45L (HA) キメラウイルスに感染した細胞由来のライゼート（レーン６，８）とはしかウイルスに感染した細胞由来のライゼート（レーン10）には存在しているが、rJS に感染した細胞由来のライゼート（レーン４）、はしかウイルスHA遺伝子をコードしていないHPIV3 野生型ウイルス由来のライゼートには存在していない。
【図３】  図３は、HPIV2 HN遺伝子の、エキストラ転写／翻訳ユニットとしての、rPIV3-1 キメラウイルスまたはrPIV3-1 cp45キメラウイルスをコードするアンチゲノムcDNAへの挿入を示す（注：rPIV3-1 はHN遺伝子とＦ遺伝子がHPIV1 のそれらで置換されているrPIV3 であり、そしてrPIV3-1 cp45は、さらにcp45弱毒化ウイルス由来の12種の変異体を含有する変形である）。HPIV2 HN遺伝子は、HPIV2 HN遺伝子特異的プライマーによるRT-PCRを利用して、HPIV2 のvRNAから増幅した（パネルＡ）。５′末端にプライマーで導入されたNcoI部位を保有し、その３′末端にHindIII 部位を保有する増幅されたcDNAを、NcoI-HindIIIで消化し、次にNcoI-HindIIIで消化したpLit.PIV31HNhcに連結して、pLit.PIV32HNhcを生成させた（パネルＢ）。前記pLit.PIV32Hhc プラスミドを鋳型として使用し、その５′末端にPpuMI 部位を有しかつ３′末端に導入されたPpuMI 部位を有する修飾PIV2 HN カセットを製造した（パネルＣ）。このカセットは、左から右へ順に、５′末端のPpuMI 部位、PIV3 HN の部分的５′−非翻訳領域（VTR ）、PIV2 HN ORF, PIV3 HN Nの３′-VTR, PIV3 HN とＬ遺伝子のジャンクションに存在する遺伝子末端、遺伝子間、遺伝子開始配列、PIV3 Lの５′非翻訳領域の部分、および３′末端に導入されたPpuMI 部位を含有していた。このcDNAカセットをPpuMI で消化し次いでPpuMI で消化したp38′ΔPIV31hcに連結してp38′ΔPIV31hc.2HNを生成させた（パネルＤ）。8.5kb のBspEI-SphIフラグメントを、pFLC.2G+.hc またはpFLCcp45のそれぞれのBspEI-SphIウインドー中にアセンブルして、最終の全長アンチゲノムcDNA、pFLC.3-1hc.2HN（パネルＥ）またはpFLC.3-1hc.cp45.2HN （パネルＦ）を生成させた。pFLC.2G+.hc とpFLCcp45はそれぞれ、先に述べた野生型rPIV3-1 とrPIV3cp45 をコードする全長アンチゲノムクローンである（Skiadopoulosら、J.Virol. 73 巻1374〜1381頁1999年ａ；Tao ら、J.Virol. 72 巻2955〜2961頁1998年、これらの文献は本願に援用するものである）。
【図４】  図４は、PIV1F 遺伝子とHN遺伝子の間にPIV2 HN ORF を挿入されて保有するrPIV3-1.2NH キメラウイルスの構築を詳述して実証する。パネルＡは、rPIV3-1 、およびrPIV3-1 のPIV1F とHN ORFの間にPIV2 HN ORF 挿入物を含有するrPIV3-1.2HN の構造の差を示す。矢印はパネルＢ−Ｄで分析されたフラグメントを増幅するため使用するRT-PCRプライマーの近似位置を示す。パネルＢとＣは、rPIV3-1 とrPIV3-1.2HN から増幅して得たRT-PCR産物から、PpuMI もしくはNcoIの制限エンドヌクレアーゼを用いて産生させた制限酵素消化フラグメントの予想サイズを、塩基対のフラグメントの大きさ（bp）とともに示し、そしてその結果をパネルＤに示した。rPIV3-1.2HN またはrPIV3-1 に感染したLLC-MK2 細胞から収獲したウイルスから抽出したvRNAを、逆転写酵素（RT）の存在下および非存在下、鋳型として使用して、cDNAフラグメントを、パネルＡで示したプライマーを使用するPCR で増幅した。PCR フラグメントはRTを欠いたRT-PCR反応には存在しなかった。これはDNA フラグメントの増幅に利用した鋳型がRNA であり汚染cDNAでないことを示す（パネルＤのレーンＡとＣ）。RTステップが含まれた場合、rPIV3-1.2HN vRNA（レーンＢ）は、２KDの挿入物が存在していることを示すそのrPIV3-1 ペアレントより約２KD大きいフラグメント（レーンＤ）を生成した。さらに、この３kbのフラグメントを、いくつもの異なる制限エンドヌクレアーゼで消化した結果、rPIV3-1.2HN 由来のRT-PCRフラグメント（奇数番号のレーン）が、各被検制限エンドヌクレアーゼに対するrPIV3-1 ペアレント（偶数番号のレーン）のパターンとは異なるパターンを有していることを示した。各消化によって得られた部位の数とフラグメントの大きさは、rPIV3-1 とrPIV3-1.2HN のRT-PCR産物の予想配列と完全に一致した。代表的な実施例を提供する。第一に、rPIV3-1.2HN からのRT-PCR産物をPpuMI で消化した結果（レーン１）、二つのPpuMI 部位が存在していることを示す予想サイズの三つのバンドを産生し、そしてrPIV3-1 からのRT-PCR産物をPpuMI で消化した結果、PpuMI 部位が一つだけ存在することを示す、rPIV3-1 について予想される大きさの二つのバンドを生成した（レーン２）。第二に、rPIV3-1.2HN からのRT-PCR産物をNcoIで消化した結果（レーン５）、HPIV2 HN 遺伝子を示す0.5kb のフラグメントを含む四つのバンドを生成し、そしてrPIV3-1 からのRT-PCR産物をNcoIで消化した結果（レーン６）、予想された二つのフラグメントを生成した。Ｍは、ヌクレオチド（nt）のサイズマーカーとして使用した１kb DNAのラダー（Lite Technology ）を含有するレーンを示す。類似の結果が得られ、rPIV3-1cp45.2HN中にHPIV2 HN 挿入物が存在していることが確認された。
【図５】  図５は、rPIV3-1.HNがHPIV2 HNタンパク質を発現することを実証する。LLC-MK2 の単層を、MOI5で、rPIV3-1, rPIV3-1.2HNまたはPIP2/V94野生型ウイルスに感染させた。感染された単層は、感染後18〜36hr, 35S-metおよび35S-cysの混合物で標識をつけた。細胞を収穫して溶解し、そのタンパク質を抗HPIV2 HN mAb 150S1で免疫沈降させた（Durbinら、Virology、261巻 319〜330頁1999年；Tsurudome ら、Virology、171巻 38〜48頁1989年；これらの文献は本願に援用するものである。免疫沈降させた試料を変性して、４〜12％のSDS PAGEゲル上で分離してオートラジオグラフィーにかけた（レーン１：rPIV3-1 ；レーン２：rPIV3-1.2HN 、レーン３：PIV2/V9412-6）。HPIV2 HNに対して特異的な前記mAb は、rPIV3-1.2HN およびPIV2/V94に感染したLLC-MK2 細胞由来のタンパク質を沈降させたが、rPIV3-1 に感染した細胞由来のタンパク質を沈降させなかった。HPIV2 のHNタンパク質の予想サイズは86KDである（Rydbeck ら、J.Gen,Virol. 69巻931-935頁1988年、この文献は本願に援用するものである）。
【図６】  図６は、遺伝子ユニット（GU）の挿入物またはHN遺伝子の３′−非コーディング領域（NCR ）のエクステンション（extension ）の位置と構成を示す。GUとNCR それぞれの挿入部位のヌクレオチド配列と独特の制限酵素クローニング部位を、パネルＡとＢに示す。シス作用転写シグナル配列すなわち遺伝子末端（GE）、遺伝子間（IG）および遺伝子開始（GS）のシグナル配列を示す。図６のパネルＡには、導入されたStuI制限部位（下線をつけたヌクレオチド）に挿入されたHNのGE, IGおよびGSのシグナル配列および独特の制限酵素認識配列を特定するオリゴヌクレオチドデュプレックスを示す（導入されたStuI部位の位置については図１Ｂと実施例Ｉ参照）。RSV アンチゲノムプラスミド由来の制限フラグメントをHpaI部位にクローン化した。必要に応じて、短いオリゴヌクレオチドデュプレックスを、マルチプルクローン化部位のMluI部位に挿入したが、その結果、その挿入物の全長は、６のルールに当てはまるであろう。図６のパネルＢでは、図６パネルＡに記載したStuI制限部位にクローン化した、図に示す32ntのマルチプルクローン化部位のHpaI部位中に、HN遺伝子の３′-NCR挿入物をクローン化した。挿入された配列は、短いオリゴヌクレオチドデュプレックスをマルチプルクローン化部位のMluI部位中に挿入することによって６のルールに当てはまるようにつくった。配列番号５と６を図６に示す。
【図７】  図７は、3079bpのRSV 挿入物内のオープンリーディングフレーム（ORF ）を示す。3079bpのRSV フラグメント中６個の可能なリーディングフレームを示す（各オリエンテーションに三個ずつ；３，２，１，−１，−２，−３）。短いバーは翻訳出発コドンを示す。長いバーは翻訳停止コドンを示す。前記3079bpのフラグメントは、PIV3翻訳機構（trans lation machinery）に出合ったリーディングフレームが図中の−３，−２および−１に対応するオリエンテーションで、HN 3′NCR (NCRins ）中にまたはHN遺伝子とＬ遺伝子の間に遺伝子ユニット（GUins ）として挿入した。これらのリーディングフレームは、配列の全長にわたって多数の停止コドンを含有しているので、機能性タンパク質を産生しない。
【図８】  図８は、rPIV3 挿入物とエクステンション変異体が適当な大きさの挿入物を含有していることを示す。前記挿入部位に隣接するPIV3特異的プライマー対を使用してRT-PCRを実施し、次いでRT-PCRの産物をアガロースゲル電気泳動法で分離した。rPIV3wt (rJSとも呼称される）に対するRT-PCRフラグメントの予想サイズは3497bpであり、他のrPIV3のGUまたはNCR 変異体各々の予想サイズは、長さが挿入物の大きさによって増大する。パネルＡは、GU挿入物（ins ）の変異体：1. rPIV3wt; 2. r168ntGUins; 2. r678ntGUins; 3. r996ntGUins; 4. r1428ntGUins; 5. r1908ntGUins; 6. r3918ntGUins を示す。ＭはλファージDNA のHindIII 制限酵素による消化産物を示す。関連するサイズマーカーの大きさを示してある。パネルＢは、NCR 挿入変異体：1. rPIV3wt; 2. r258ntNCRins; 3. r972ntNCRins; 4. r1404ntNCRins; 5. r3126ntNCRins; 6. r3894ntNCRinsを示す。Ｍは、λファージDNA のHindIII 制限酵素による消化産物を示す。関連するサイズマーカーの大きさを示してある。
【図９Ａ】  図９Ａは、rHPIV3wtおよびrcp45Lと比べたGUおよびNCR の挿入変異体のマルチステップ増殖曲線を示す。６ウェルプレート中のLLC-MK2 単層を、各HPIV3 に、３回すづ、感染多重度（m.o.i ）0.01で感染させ、次いでウイルスの上澄み液を除いた後、４回洗浄した。感染後０hrの時点と24hr間隔で、６日間、各ウェルから0.5ml のウイルス培地を収獲し、次いで各ウェルに新鮮な培地0.5ml を添加した。収獲した試料を−80℃で貯蔵した。これら試料中に存在するウイルスを、32℃でインキュベートした96ウェルプレート中のLLC-MK2 単層を滴定することによって定量した。ウイルスの力価を、TCID50／mlで表わしてある。実験から得た３個の独立した感染物の平均値を示してある。検出の下限は0.7log10TCID50／mlである。図９ＡはGU挿入変異体を示す。
【図９Ｂ】  図９Ｂは図９Ａと同じであるが、NCR 挿入変異体を示す。
【図９Ｃ】  図９Ｃは図９Ａと同じであるが、cp45L/GU挿入変異体を示す。
【図１０】  図10は、rHPIV3のP遺伝子とM遺伝子との間に余分の遺伝子挿入断片を置くための方法を説明する。rHPIV3のP遺伝子の下流(3')NCRが、アンチゲノム(antigenomic)配列位置3693-3698にAflII制限部位を含むように修飾された（ダービン(Durbin), J. Virol. 74: 6821-31, 2000、参照することによって本明細書に組入れられる）。この部位は次に、HPIV3シス-作用転写シグナル配列、すなわち遺伝子末端(GE)、遺伝子間(IG)および遺伝子開始(GS)モチーフ(motif)を含むオリゴヌクレオチド二本鎖（上部に示す）を挿入するために使用された。二本鎖はまた、外来ORFの挿入のために利用可能な一連の制限酵素認識配列を含む。HPIV1およびHPIV2 HN ORFの場合には、クローニング部位は、NcoIおよびHindIIIであった。外来ORFの多重クローニング部位への挿入は、それを１組のHPIV3転写シグナルの制御下に置き、それによって、最終の組換えウィルスにおいて、遺伝子が、HPIV3ポリメラーゼにより別のmRNAへ転写される。必要なときは、短いオリゴヌクレオチド二本鎖が、多重クローニング部位のMluI部位へ挿入されて、ゲノムの最終長さが６の倍数でさえあるように調節され、これは、有効なRNA複製のための必要条件であることが示された（カライン(Calain)ら、J. Virol. 67: 4822-30, 1993；ダービン(Durbin)ら,Virology 234: 74-83, 1997b）。位置1677-1682 9に、導入されたAflII制限部位を用いてrHPIV3のN遺伝子とP遺伝子との間にHPIV1およびHPIV2遺伝子挿入断片を置くために、同様の方法を使用した(SEQ ID NO.7)。
【図１１】  図11は、そのそれぞれがPIV1、PIV2または麻疹ウィルスの防御抗原をコードする、１つ、２つまたは３つの余分な遺伝子挿入断片を含む一連のキメラrHPIV3のゲノムの（スケール通りでない）図である。rHPIV3の概略図（スケール通りでない）は、rHPIV3主鎖（  ）に挿入されたHPIV1（  ）もしくはHPIV2（  ）のHN（ヘマグルチニン-ニューラミニダーゼ）糖タンパク質または麻疹ウィルス（  ）のHA（ヘマグルチニン）糖タンパク質をコードする、加えられた挿入断片の相対的位置を示している。下部に図示されたrHPIV3構築物は、3918-nt挿入断片(GU)を含み、これは、タンパク質（  ）をコードしない（スキアドポウロス (Skiadopoulos) ら、Virology 272:225-34, 2000、参照することによって本明細書に組入れられる）。各外来挿入断片は、１組のHPIV3遺伝子開始および遺伝子末端転写シグナルの制御下にあり、別々のmRNAとして発現される。ａ．６ウェルのプレート（コスター(Costar)）上のLLC-MK2単層が、示されたウィルスのそれぞれを用いて、0.01のm.o.i.で３重にて別々に感染された。上清が５日、６日および７日に採取され、ウィルスは、前記したように定量された（スキアドポウロス (Skiadopoulos) ら、Virology 272:225-34, 2000）。各ウィルスについて得られた平均ピーク力価は、log10TCID50／mlで示される。ｂ．２つの実験の平均。連続希釈したウィルスを32℃および39℃にて、LLC-MK2単層培養で７日間インキュベートし、ウィルスの存在を、モルモットの赤血球を用いて血球吸着により決定した。39℃における平均の力価減少を、32℃と比較して示す。
【図１２】  図12は、余分の遺伝子挿入断片のrHPIV3主鎖、rHPIV3-NBへの挿入を説明する図（スケール通りでない）を提供し（ここでHPIV3 N ORFは、そのBPIV3対応物で置き換えられている）、これは、宿主域制限による弱毒化表現型を与えている（ベイリー(Bailly)ら、J. Virol. 74: 3188-3195, 2000a、参照することによって本明細書に組入れられる）。rHPIV3（一番上）および生物学的に誘導されたBPIV3（一番下）の概略の説明が示されている。PIV3主鎖中のBPIV3のカンザス(Kansas)株から誘導されたN ORF配列（  ）および麻疹ウィルスヘマグルチニン遺伝子（  ）の相対的位置が示されている。各場合に、外来の配列は、一組のHPIV3転写シグナルの制御下にある。NgoMIV部位を含むプラスミドベクターの一部が示されている（  ）。アンチゲノムcDNAクローン（左）およびそれらのコードされた組換えウィルス（右）について名称が与えられている。
【図１３】  図13は、プロモーター-近位位置におけるさらなる余分の遺伝子としてのRSV GまたはFのrB/HPIV3のゲノムへの挿入を説明する。rB/HPIV3は、BPIV3 FおよびHN遺伝子がそれらのHPIV3相対物（それぞれFHおよびHNH）で置き換えられたBPIV3の組換えバージョンである。BlpI部位が、N ORFのATG開始コドンの直ぐ上流のB/HPIV3主鎖中に作られた。RSV GまたはFオープンリーディングフレーム(ORF)が、このBlpI部位へ挿入された。両方のRSV挿入断片の下流末端が、遺伝子間配列CTTによって分離されたPIV3遺伝子末端(GE)および遺伝子開始(GS)配列（ポジティブセンスで、それぞれAAGTAAGAAAAA(SEQ ID NO.8)およびAGGATTAAAG）を含むように設計された。各挿入断片はまた、さらなる余分の遺伝子のための挿入部位として役立つことができるNheI部位を含んでいた。AGGATTAAAGAACTTTACCGAAAGGTAAGGGGAAAGAAATCCTAAGAGCTTAGCGATG（配列番号：９）。GCTTAGCGATG（配列番号：10）。AAGCTAGCGCTTAGC（配列番号：11）。GCTTAGCAAAAAGCTAGCACAATG（配列番号：12）。
【図１４】  図14は、サルLLC-MK2細胞におけるrB/HPIV3-G1、rB/HPIV3-F1ならびにそれらの組換えおよび生物学的親ウィルスの多周期(multicycle)複製を説明する。３重の単層培養物を、rB/HPIV3-G1、rB/HPIV3-F1または次の対照ウィルス：rBPIV3 Ka（BPIV3 株Kaの組換えバージョン）；rB/HPIV3（BPIV3 FおよびHN糖タンパク質遺伝子がそれらのHPIV3対応物で置き換えられたrBPIV3のバージョン）；HPIV3 JS（生物学的に誘導されたHPIV3株JS）；およびBPIV3 Ka（BPIV3 株Kaの生物学的に誘導されたバージョン）を用いて、細胞当たり0.01 TCID50の入力MOIにて感染させた。ウィルス力価は、３重試料の平均log10TCID50／mlで示される。このアッセイの検出下限は101.45 TCID50／mlである。
【図１５】  図15は、rBPIV3(#1)および一連のキメラrB/HPIV3(#2〜6)のゲノムの図（スケール通りでない）であり、HPIV3(#2)またはHPIV1(#3〜6)の遺伝子によるBPIV3 FおよびHN遺伝子の置換物を含み、１つまたは２つの余分の遺伝子挿入断片は、HPIV2(#4〜6)のFおよび／またはHN ORFをコードする。rB/HPIV3.1キメラウィルス（スケール通りでない）の概略説明は、HPIV2のFまたはHN糖タンパク質をコードする余分の遺伝子（それぞれF2およびHN2）の相対的位置を示している。それぞれの外来挿入断片は、１組のHPIV3遺伝子開始および遺伝子末端の転写シグナルの制御下にあり、別々のmRNAとして発現されるように設計される。
【図１６】  図16は、麻疹ウィルスHAコード配列の幾つかの異なるrPIV3主鎖への挿入を説明する図（スケール通りでない）を提供する。３本の主鎖が描かれている：野生型rHPIV3（一番上の構築物）；HPIV3 FおよびHN糖タンパク質遺伝子がHPIV1の遺伝子で置き換えられている、野生型rHPIV3-1（上から２番目の構築物）（タオ(Tao)ら、J. Virol. 72: 2955-2961, 1998、参照することによって本明細書に組入れられる）；ならびに、cp45ワクチン株から誘導されたL遺伝子に３つの弱毒化アミノ酸点変異を含む、野生型rHPIV3-1の誘導体である、rHPIV3-1cp45L（第３の構築物）（スキアドポウロス (Skiadopoulos) ら、J. Virol. 72: 1762-8, 1998、参照することによって本明細書に組入れられる）。rPIV3主鎖（  ）における、HPIV1 FおよびHN ORF配列（  ）ならびに麻疹ウィルスHA遺伝子（  ）の相対的位置が示されている。各場合に、それぞれの外来ORFは、１組のHPIV3転写シグナルの制御下にある。L遺伝子における３つのcp45 Lアミノ酸点変異の相対的配置が示されている（*）。ユニークNgoMIV部位を含むプラスミドベクターの一部が示されている（  ）。
【図１７】  図17は、全長のPIV2 HNおよびFタンパク質をコードするPIV3-PIV2キメラアンチゲノムcDNA pFLC.PIV32hcの構築物を示す。示された制限部位(A1)により隣接された(flanked)全長のPIV2 F ORFを含むcDNA断片が、RT-PCRおよびPIV2 F特異的プライマー対を用いてPIV2/V94 vRNAから増幅された（第22表の1、2）。この断片は、NcolおよびBamHI(C1)で消化され、pLitPIV31.fhc(B1)のNcol-BamHIウィンドウに結合されて、pLit.PIV32Fhc(D1)を生じた。並行して、示された制限部位(A2)により隣接された(flanked)全長のPIV2 HJN ORFを含むcDNA断片が、RT-PCRおよびPIV2  HN特異的プライマー対を用いてPIV2/V94 vRNAから増幅された（第22表の3、4）。この断片は、NcolおよびHindIII(C2)で消化され、pLitPIV31.HNhc(B2)のNcol- HindIIIウィンドウに結合されて、pLit.PIV32HNhc(D2)を生じた。pLit.PIV32FhcおよびpLit.PIV32HNhcは、PpuMIおよびSpeIで消化され、一緒に組立てられてpLit.PIV32hc(E)を生じた。pLit.PIV32hcはさらに、BspEIおよびSpeIで消化され、p38'ΔPIV31hc(F)のBspEI-SpeIウィンドウへと導入されて、p38'ΔPIC32hc(G)を生じた。キメラPIV3-PIV2構築物が、pFLC.2G+hcのBspEI-Sphlウィンドウへ導入されて、pFLC.PIC32hc(H)を生じた。
【図１８】  図18は、全長PIV3-PIV2キメラアンチゲノムcDNA pFLC.PIV32TMおよびpFLC.PIV32TMcp45の構築物を示し、これらは、PIV2-誘導エクトドメイン(ectodomain)ならびにPIV3-誘導経膜および細胞質ドメインを含む、FおよびHNタンパク質をコードする。エクトドメインをコードする、pLit.PIV3.F3a(A1)における PIV3 F ORFの領域は、PIV3 F特異的プライマー対を用いたPCRにより欠失された(C1)（第22表の9、10）。エクトドメインをコードするPIV2 F ORFの領域は、PCRおよびPIV2 F特異的プライマー対を用いてpLit.PIV32Fhc(B1)から増幅された（第22表の5、6）。２つの得られた断片（C1およびD1）は結合されて、pLit.PIV32FTM(E1)を生じた。並行して、エクトドメインをコードする、pLit.PIV3.HN4(A2)における PIV3 HN ORFの領域が、PIV3 HN特異的プライマー対を用いたPCRにより欠失された(C2)（第22表の11、12）。エクトドメインをコードするPIV2 HN ORFの領域は、PCRおよびPIV2 HN特異的プライマー対によってpLit.PIV32HNhc(B2)から増幅された（第22表の8、9）。これら２つのDNA断片（C2およびD2）は一緒に結合されて、pLit.PIV32HNTM(E2)を生じた。pLit.PIV32FTM およびpLit.PIV32HNTMはPpuMIおよびSpeIで消化され、組立てられてpLit.PIV32TM(F)を生じた。pLit.PIV32TM からのBspEI-SpeI断片は、p38'_PIV31hc(G)のBspEI-SpeIウィンドウに結合されて、p38'_PIV32TM(H)を生じた。キメラPIV3-PIV2 FおよびHNを含む挿入断片は、6.5kbのBspEI-SphI断片としてpFLC.2G+hcおよびpFLCcp45のBspEI-SphIウィンドウへ導入されて、それぞれpFLC.PIV32TMおよびpFLC.PIV32TMcp45(I)を生じた。
【図１９】  図19は、PIV2-誘導エクトドメイン、PIV2-誘導経膜ドメインおよびPIV3-誘導細胞質ドメインを含む、FおよびHNタンパク質をコードする、全長PIV3-PIV2キメラアンチゲノムcDNA pFLC.PIV32CTおよびpFLC.PIV32Ctcp45の構築を示す。エクトドメインおよび経膜ドメインをコードする、pLit.PIV3.F3a(A1)における PIV3 F ORFの領域は、PIV3 F特異的プライマー対を用いたPCRにより欠失された(C1)（第22表の17、18）。エクトドメインおよび経膜ドメインをコードするPIV2 F ORFの領域は、PCRおよびPIV2 F特異的プライマー対を用いてpLit.PIV32Fhc(B1)から増幅された（第22表の13、14）。２つの得られた断片（C1およびD1）は結合されて、pLit.PIV32FCT(E1)を生じた。並行して、エクトドメインおよび経膜ドメインをコードするpLit.PIV3.HN4(A2)における PIV3 HN ORFの領域が、PIV3 HN特異的プライマー対を用いたPCRにより欠失された(C2)（第22表の19、20）。エクトドメインおよび経膜ドメインをコードするPIV2 HN ORFの領域が、PIV2 HN特異的プライマー対を用いたPCRによりpLit.PIV32HNhc(B2)から増幅された（第22表の15、16）。これら２つのDNA断片（C2およびD2）は結合されて、pLit.PIV32HNCT(E2)を生じた。pLit.PIV32FCTおよびpLit.PIV32HNCTはPpuMIおよびSpeIで消化され、組立てられてpLit.PIV32CT(F)を生じた。pLit.PIV32CTからのBspEI-SpeI断片は、p38'_PIV31hc(G)のBspEI-SpeIウィンドウに結合されて、p38'_PIV32CT(H)を生じた。キメラPIV3-PIV2 FおよびHNを含む挿入断片は、6.5kbのBspEI-SphI断片としてpFLC.2G+.hcおよびpFLC.cp45のBspEI-SphIウィンドウへ導入されて、それぞれpFLC.PIV32CTおよびpFLC.PIV32CTcp45(I)を生じた。
【図２０】  図20は、PIV3-PIV2キメラウィルスの遺伝子構造およびrPIV3-2CTおよびrPIV3-2TMについての遺伝子結合部配列を詳述する。パネルAは、rPIV3-2キメラウィルス（中間の３つの図）の遺伝子構造を、rPIV3（上部図）およびrPIV3-1（下部図）ウィルスのものと比較して示す。cp45誘導体が、cp45変異の相対的位置を示す矢印で記されて示されている。cp45誘導体については、すべてPIV3からの、残りの遺伝子が同じままで、FおよびHN遺伝子のみが異なる。上から下まで、３つのキメラPIV3-PIV2ウィルスは、PIV3糖タンパク質遺伝子の量が減少している。完全なPIV2 HNおよびF ORFを有するrPIV3-2は回収可能でなかったことに注意せよ。パネルBは、タンパク質の翻訳と共に与えられた、rPIV3-2TMについてのキメラFおよびHN糖タンパク質遺伝子の結合部のヌクレオチド配列を提供する。影をつけられた部分は、PIV2からの配列を示す。アミノ酸は、対応する野生型糖タンパク質におけるそれらの位置に関して番号を付けられている。３つの余分のヌクレオチドが、示されているように、PIV3-PIV2 HN TMに挿入されて、構築物を６の規則に従うようにした。パネルCは、タンパク質の翻訳と共に与えられた、rPIV3-2CTについてのキメラFおよびHN糖タンパク質遺伝子の結合部のヌクレオチド配列を示す。影をつけられた部分は、PIV2からの配列を示す。アミノ酸は、対応する野生型糖タンパク質におけるそれらの位置に関して番号を付けられている。GE=遺伝子末端；I=遺伝子間；GS=遺伝子開始；ORF=オープンリーディングフレーム；TM=経膜ドメイン；CT=細胞質ドメイン；*=終止コドン。
【図２１】  図21は、rPIV3/JSおよびPIV2/V94野生型親ウィルスのものと比較したrPIV3-2キメラウィルスの多周期複製を詳述する。パネルA‐rPIV3-2TMおよびrPIV3-2TMcp45ウィルスが、rPIV3/JSおよびPIV2/V94 wt親ウィルスと共に、６ウェルのプレート中で、それぞれ３重で、0.01のMOIにてLLC-MK2細胞を感染するのに使用された。すべての培養物は、32℃でインキュベートされた。１時間の吸着時間後、接種物を除去し、細胞を血清を含まないOptiMEMで３回洗浄した。培養物は、ウェル当たり2mlの同じ培地で表面を覆った。rPIV3-2TMおよびrPIV3-2TMcp45感染プレートについては、0.5mg/mlのp-トリプシンを各ウェルに加えた。24時間間隔で６日間、0.5mlの分量を各ウェルから採取し、ドライアイスで急速凍結し、−80℃で貯蔵した。先に示したように、各一定分量を、p-トリプシンを含むかまたは含まない新しい培地0.5mlで置き換えた。一定分量中に存在するウィルスを、32℃にて７日間、液体で覆ったLLC-MK2プレートで力価測定し、終点を血球吸着を用いて確認した。パネルB‐rPIV3-2CTおよびrPIV3-2CTcp45が、rPIV3/JSおよびPIV2/V94 wt親ウィルスと共に、パネルAで記載したように、６ウェルのプレート中で、それぞれ３重で、LLC-MK2を感染するのに使用された。一定分量を採取し、パネルAで記載したのと同じやり方で処理した。ウィルス力価は、パネルAおよびBに示された両方の実験について、log10TCID50／ml±標準誤差で表されている。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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