(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質を含有する、ｐＨ４．０以下で用いるためのセルロース分解剤。
【請求項２】
以下の（ａ）及び（ｂ）のいずれかにアミノ酸配列を含み、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を含有する、ｐＨ４．０以下で用いるためのセルロース分解剤。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加であるアミノ酸変異を有するアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【請求項３】
前記タンパク質は、ｐＨ２以上４以下のいずれかのｐＨにおいて、配列番号２６で表されるアミノ酸配列又は配列番号２８で表されるアミノ酸配列からなるTrichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼよりも高いエンドグルカナーゼ活性を有する、請求項２に記載のセルロース分解剤。
【請求項４】
前記タンパク質は、ｐＨ２以上３以下のｐＨにおいて、前記Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼよりも高いエンドグルカナーゼ活性を有する、請求項３に記載のセルロース分解剤。
【請求項５】
前記タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１０７位、１７１位、１９２位及び２０１位からなる群から選択される１又は２以上の位置において疎水性アミノ酸残基へ置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項２〜４のいずれかに記載のセルロース分解剤。
【請求項６】
前記タンパク質は、少なくとも以下の（１）又は（２）の位置に疎水性アミノ酸残基を有するタンパク質である、請求項５に記載セルロース分解剤。
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列の１０７位及び２０１位
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列の１９２位及び２０１位
【請求項７】
前記タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、Ｋ１０５Ｅ、Ｑ１０７Ｐ、Ｇ１２６Ｓ、Ｓ１５２Ｇ、Ｒ１７１Ｍ、Ｓ１９２Ｌ及びＶ２０１Ａのアミノ酸変異から選択される１又は２以上のアミノ酸変異を有する、請求項２〜４のいずれかに記載のセルロース分解剤。
【請求項８】
前記タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において少なくともＱ１０７Ｐ、Ｇ１２６Ｓ及びＶ２０１Ａのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項２〜４のいずれかに記載のセルロース分解剤。
【請求項９】
前記タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくともＳ１５２Ｇ、Ｓ１９２Ｌ及びＶ２０１Ａのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項２〜４のいずれかに記載のセルロース分解剤。
【請求項１０】
前記タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくともＳ１９２Ｌのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項２〜４のいずれかに記載のセルロース分解剤。
【請求項１１】
前記タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくともＫ１０５Ｅのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項２〜４のいずれかに記載のセルロース分解剤。
【請求項１２】
前記タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくともＲ１７１Ｍのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項２〜４のいずれかに記載のセルロース分解剤。
【請求項１３】
前記タンパク質は、Phanerochaete属菌のエンドグルカナーゼ又はその改変体である、請求項２〜４のいずれかに記載のセルロース分解剤。
【請求項１４】
請求項７〜１２のいずれかに記載のセルロース分解剤の前記タンパク質のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加であるアミノ酸変異を有する被験タンパク質のライブラリを準備する工程と、
前記ライブラリの前記被験タンパク質についてｐＨ４．０以下の酸性条件下でのエンドグルカナーゼ活性を評価する工程と、
を備える、ｐＨ４．０以下で用いるためのセルロース分解剤のスクリーニング方法。
【請求項１５】
前記エンドグルカナーゼは、Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼである、請求項１４に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
前記酸性条件はｐＨ２以上３以下である、請求項１４又は１５に記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記セルロース分解能を前記被験タンパク質が供給されたセルロースを含有する固体培地におけるセルロース分解量を検出することによって評価する、請求項１４〜１６のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項７〜１２のいずれかに記載のセルロース分解剤の前記タンパク質をコードするＤＮＡを含む、ｐＨ４．０以下で用いるためのセルロース糖化発酵用酵母の発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれかに記載のセルロース分解剤の前記タンパク質を細胞表層に保持する酵母を含む、ｐＨ４．０以下で用いるためのセルロース糖化発酵用材料。
【請求項２０】
エンドグルカナーゼ以外の他種のセルラーゼを細胞表層に保持する、請求項１９に記載のセルロース糖化発酵用材料。
【請求項２１】
セルロースの分解産物の生産方法であって、
セルロースを、請求項１〜１３のいずれかに記載のセルロース分解剤を用いてｐＨ４．０以下で分解する工程、を備える生産方法。
【請求項２２】
有用物質の生産方法であって、
セルロースの存在下、請求項１９又は２０に記載のセルロース糖化発酵用材料を用いてｐＨ４．０以下で有用物質を発酵生産する工程、を備える生産方法。
【請求項２３】
前記発酵生産工程は、ｐＨ２以上ｐＨ３．５以下で発酵を行う、請求項２２に記載の生産方法。
【請求項２４】
前記発酵生産工程は、ｐＨ２以上ｐＨ２．５以下で発酵を行う、請求項２３に記載の生産方法。
【請求項２５】
前記有用物質はエタノールである、請求項２２〜２４のいずれかに記載の生産方法。
【請求項２６】
前記セルロース糖化発酵用材料に含まれる前記表層提示酵母は有機酸生産酵母であり、前記有用物質は有機酸である、請求項２２〜２４のいずれかに記載の生産方法。
【請求項２７】
以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１０個以下の複数個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加であるアミノ酸変異を有するアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列であって、かつ以下の(i)〜（v）：
(i)配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくともＱ１０７Ｐ、Ｇ１２６Ｓ及びＶ２０１Ａのアミノ酸変異
（ii）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくともＳ１５２Ｇ、Ｓ１９２Ｌ及びＶ２０１Ａのアミノ酸変異
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくともＳ１９２Ｌのアミノ酸変異
（iv）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくともＫ１０５Ｅのアミノ酸変異
（v）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくともＲ１７１Ｍのアミノ酸変異
のいずれかのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含み、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐酸性エンドグルカナーゼ及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、有限である石油資源を代替するものとして、植物の光合成作用に由来するバイオマスへの期待が高まってきており、バイオマスをエネルギーや各種材料に利用するための各種の試みがなされている。バイオマスを、エネルギー源やその他の原料として有効利用するためには、バイオマスを動物や微生物が容易に利用可能な炭素源に糖化することが必要である。
【０００３】
典型的なバイオマスであるセルロースを利用するには、セルロースをエンドグルカナーゼなどのセルラーゼにより分解してグルコースに糖化することが好ましいとされている。このため、セルロースを効率的に分解できるセルラーゼやその改変が種々試みられている。なかでも、Trichoderma属などの糸状菌の産生するエンドグルカナーゼについては種々の検討がされている（特許文献１、２及び３）。また、セルラーゼを酵母の表層に提示させることで、セルラーゼをグルコースに分解しつつ、そのグルコースを炭素源として利用してエタノールを生産することも検討されている（特許文献４）。
【０００４】
【特許文献１】米国特許第7094588号明細書
【特許文献２】米国特許第6268328号明細書
【特許文献３】米国特許第6623949号明細書
【特許文献４】国際公開ＷＯ０１／０７９４８３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
典型的なバイオマスであるセルロースを利用して乳酸などの有機酸を発酵生産する方法として、セルロースを分解しグルコースを生成させると同時にそのグルコースを炭素源として利用して有機酸発酵することが考えられる。しかしながら、セルロースから有機酸発酵する場合には、培地が生産物である有機酸により酸性化する傾向がある。したがって、酸性下で高いセルロース分解活性を発揮できるセルラーゼがないとセルロースを実質的に利用することができない。また、発酵条件により培地が酸性化する場合以外であっても、培地を酸性化することで雑菌のコンタミネーションを効果的に防止できることがある。
【０００６】
さらに、バイオマスの糖化に際しての前処理は、酸による前処理が一般的であり、前処理されたバイオマス由来の原料液の液性は酸性であることが多い。したがって、酸性下で高いセルロース分解活性を有する酵素がなければ、この前処理液を中和する必要が生じる。
【０００７】
しかしながら、現状において、上述のような酸性条件で有効に機能する耐酸性セルラーゼが酸性下で高いセルラーゼ活性を有する酵素が供給されているわけではない。また、Phanerochaete属に由来するエンドグルカナーゼについても特に検討されてはいない。
【０００８】
そこで、本発明は、耐酸性エンドグルカナーゼ、すなわち、酸性条件下でも作用するエンドグルカナーゼ活性を呈するタンパク質を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、酸性条件下でも作用するエンドグルカナーゼ活性を呈するタンパク質の有効な用途を提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記した課題を解決するべく、エンドグルカナーゼを探索したところ、低ｐＨ下において高いエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を見出した。また、このエンドグルカナーゼを改変することで酸性条件下でより高いエンドグルカナーゼ活性を呈する改変タンパク質を見出した。さらに、こうしたエンドグルカナーゼを異種の細胞である酵母の細胞表層に提示したとき、酸性条件下において、エンドグルカナーゼ活性が安定化できることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づき以下の発明を完成した。
【００１０】
本発明によれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が提供される。また、本発明によれば、以下の各種態様のセルロース分解剤も提供される。
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質を含有する、ｐＨ４．０以下で用いるためのセルロース分解剤
（２）以下の（ａ）及び（ｂ）のいずれかにアミノ酸配列を含み、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を含有する、ｐＨ４．０以下で用いるためのセルロース分解剤。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加であるアミノ酸変異を有するアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００１１】
本発明によれば、以下の（ａ）及び及び（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつエンドグルカナーゼ活性を有する、タンパク質も提供される。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
【００１２】
本発明のタンパク質は、さらに以下の各種態様を採ることができる。すなわち、エンドグルカナーゼ活性は、ｐＨ２以上４以下のいずれかのｐＨにおいて、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼよりも高いエンドグルカナーゼ活性であってもよいし、エンドグルカナーゼ活性は、ｐＨ２以上３以下のｐＨにおいて、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼよりも高いエンドグルカナーゼ活性であってもよい。
【００１３】
また、本発明のタンパク質のエンドグルカナーゼ活性は、ｐＨ２以上４以下のいずれかのｐＨにおいて、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと同等又はより高いエンドグルカナーゼ活性であってもよいし、ｐＨ２以上３以下において、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと同等又はより高いエンドグルカナーゼ活性であってもよい。好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼよりも高いエンドグルカナーゼ活性である。
【００１４】
本発明のタンパク質の有するアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列における１０７位、１７１位、１９２位及び２０１位又はこれらに相当する位置のいずれかに疎水性アミノ酸残基を有していてもよい。また、少なくとも以下の（１）又は（２）のいずれかの位置にに疎水性アミノ酸残基を有するものであってもよい。
（１）配列番号２で表されるのアミノ酸配列の１０７位及び２０１位若しくはこれらに相当する位置
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１９２位及び２０１位若しくはこれらに相当する位置
【００１５】
また、本発明のタンパク質の有するアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるＫ１０５Ｅ、Ｑ１０７Ｐ、Ｇ１２６Ｓ、Ｓ１５２Ｇ、Ｒ１７１Ｍ、Ｓ１９２Ｌ及びＶ２０１Ａのアミノ酸変異から選択されるいずれか又はこれらに相当するアミノ酸変異のいずれかを有していてもよい。また、前記アミノ酸配列は、少なくともＱ１０７Ｐ、Ｓ１９２Ｌ及びＶ２０１Ａのうちのいずれかを有するものであってもよい。さらに、前記アミノ酸配列は、少なくともＱ１０７Ｐ、Ｇ１２６Ｓ及びＶ２０１Ａのアミノ酸変異を有するものであってもよい。さらにまた、前記（ａ）のアミノ酸配列は、少なくともＳ１５２Ｇ、Ｓ１９２Ｌ及びＶ２０１Ａのアミノ酸変異を有していてもよい。また、前記アミノ酸配列は、配列番号４又は５で表されるアミノ酸配列であってもよい。
本発明によれば、以下の実施形態も提供される。
以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１０個以下の複数個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加であるアミノ酸変異を有するアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列であって、かつ以下の(i)〜（v）：
(i)配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくともＱ１０７Ｐ、Ｇ１２６Ｓ及びＶ２０１Ａのアミノ酸変異
（ii）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくともＳ１５２Ｇ、Ｓ１９２Ｌ及びＶ２０１Ａのアミノ酸変異
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくともＳ１９２Ｌのアミノ酸変異
（iv）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくともＫ１０５Ｅのアミノ酸変異
（v）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくともＲ１７１Ｍのアミノ酸変異
のいずれかのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含み、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質。
【００１６】
本発明のタンパク質は、Phanerochaete属菌のエンドグルカナーゼの改変体であってもよい。また、本発明のタンパク質の有するアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列であってもよい。
【００１７】
本発明の他の一つの実施形態によれば、Phanerochaete属由来のエンドグルカナーゼ又はその改変体において１又は複数個のアミノ酸変異を導入した被験タンパク質のライブラリを準備する工程と、前記ライブラリの前記被験タンパク質について酸性条件下でのエンドグルカナーゼ活性を評価する工程と、を備える、エンドグルカナーゼ改変体のスクリーニング方法が提供される。このスクリーニング方法によれば、効率的に酸性条件下で優れたエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を見出すことができる。
また、本発明によれば、以下（１）〜（４）の実施形態も提供される。
（１）上記セルロース分解剤の前記タンパク質のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加であるアミノ酸変異を有する被験タンパク質のライブラリを準備する工程と、
前記ライブラリの前記被験タンパク質についてｐＨ４．０以下の酸性条件下でのエンドグルカナーゼ活性を評価する工程と、
を備える、ｐＨ４．０以下の酸性条件下のセルロース分解剤のスクリーニング方法。
（２）前記エンドグルカナーゼは、Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼである、（１）のスクリーニング方法。
（３）前記酸性条件はｐＨ２以上３以下である、（１）又は（２）のスクリーニング方法。
（４）前記セルロース分解能を前記被験タンパク質が供給されたセルロースを含有する固体培地におけるセルロース分解量を検出することによって評価する、（１）〜（３）のいずれかのスクリーニング方法。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法において、前記エンドグルカナーゼは、Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼであってもよい。また、前記酸性条件はｐＨ２以上４以下であってもよい。また、前記セルロース分解能を前記被験タンパク質が供給されたセルロースを含有する固体培地におけるセルロース分解量を検出することによって評価するものであってもよい。
【００１９】
本発明の他の一つの実施形態によれば、上記いずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡを含む、ＤＮＡ構築物が提供される。本発明のＤＮＡ構築物は、ベクターであってもよい。また、本発明の他の一つの実施形態によれば、上記ＤＮＡ構築物によって形質転換された形質転換体も提供される。
また、本発明によれば、以下の（１）〜（３）の実施形態も提供される。
（１）上記いずれかのセルロース分解剤の前記タンパク質をコードするＤＮＡを含む、ｐＨ４．０以下でのセルロース糖化発酵用酵母の発現ベクター。
（２）上記いずれかに記載のセルロース分解剤の前記タンパク質を細胞表層に保持する酵母を含む、ｐＨ４．０以下でのセルロース糖化発酵用材料。
（３）  エンドグルカナーゼ以外の他種のセルラーゼを細胞表層に保持する、（２）のセルロース糖化発酵用材料。
【００２０】
本発明の他の一つの実施形態によれば、上記いずれかのエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を細胞表層に保持する酵母が提供される。こうした酵母においては、上記タンパク質は安定化されており、酸性条件下において高いエンドグルカナーゼ活性を呈することができる。この酵母においては、エンドグルカナーゼ以外の他種のセルラーゼを細胞表層に保持していてもよい。また、特に、ｐＨ２以上４以下のいずれかのｐＨでの発酵工程を有する発酵用としてもよい。本発明の酵母は、ｐＨ２以上４以下での培養条件で使用されるものであってもよい。また、有機酸発酵用であってもよいし、エタノール発酵用であってもよい。
【００２１】
本発明の他の一つの実施形態によれば、エンドグルカナーゼ表層提示酵母による有用物質の生産方法であって、セルロースの存在下、上記いずれかの表層提示酵母を用いて有用物質を発酵生産する工程、を備える生産方法が提供される。前記有用物質はエタノールであってもよい。また、前記表層提示酵母は有機酸生産酵母であり、前記有用物質は有機酸であってもよい。
また、本発明によれば、以下の（１）〜（４）の実施形態も提供される。
（１）セルロースの分解産物の生産方法であって、
セルロースを、上記いずれかに記載のセルロース分解剤を用いてｐＨ４．０以下で分解する工程、を備える生産方法。
（２）有用物質の生産方法であって、
セルロースの存在下、請求項１９又は２０に記載のセルロース糖化発酵用材料を用いてｐＨ４．０以下で有用物質を発酵生産する工程、を備える生産方法。
（３）前記発酵生産工程は、ｐＨ２以上ｐＨ３．５以下で発酵を行う、（２）に記載の生産方法。
（４）前記発酵生産工程は、ｐＨ２以上ｐＨ２．５以下で発酵を行う、（３）に記載の生産方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、エンドグルカナーゼ活性を有する新規タンパク質、その改変体、エンドグルカナーゼのスクリーニング方法、ＤＮＡ構築物、形質転換体、エンドグルカナーゼ表層提示酵母及び当該酵母による有用物質の生産方法等に関する。本発明の新規タンパク質及びその改変体は、酸性条件下でも作用するエンドグルカナーゼ活性を呈することができる。このため、例えば、セルロースを炭素源として用いて有機酸発酵する場合において、産生される乳酸によって培地中のｐＨが低下しても、セルロースの糖化能の低下が抑制又は回避され、酸性条件でもセルロースを有効に糖化し有機酸発酵に利用できる。また、酸性条件でセルロースを分解できるため、セルロース分解液における雑菌の繁殖を抑制できる。このため、セルロースを炭素源として利用して発酵を行う際に、雑菌の繁殖を効果的に抑制しつつ発酵を行うことができる。さらに、酸によって前処理したセルロース含有バイオマスを炭素源として利用するときであっても、残留する酸による糖化率の低下を抑制又は回避して、効率的にセルロースを糖化することができる。
【００２３】
本発明は、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質、特には、酸性条件下で優れたエンドグルカナーゼ活性を呈するタンパク質及びその用途に関しており、この発明の実施形態として、エンドグルカナーゼ活性を呈するタンパク質、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ構築物及び形質転換体及びエンドグルカナーゼ表層提示酵母、エンドグルカナーゼ改変体のスクリーニング方法、に関する。以下、これらの各種実施形態について詳細に説明する。
【００２４】
(エンドグルカナーゼ活性を呈するタンパク質)
本発明のタンパク質は、
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
及び
以下の（ａ）及び（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつエンドグルカナーゼ活性を有する、タンパク質も提供される。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
【００２５】
（アミノ酸配列）
配列番号２で表されるアミノ酸配列は、Phanerochaete chrysosporiumから単離ししたタンパク質の成熟タンパク質のアミノ酸配列である。本発明者らがクローニングしたＤＮＡ断片の塩基配列につき、成熟タンパク質領域を予測できるSignalP 3.0 server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/PCR）によって解析したところ、このＤＮＡ断片がコードするポリペプチド配列の所定位置イソロイシン以降が成熟タンパク質として予測された。このタンパク質につき、エンドグルカナーゼ活性を認めることができため、エンドグルカナーゼ活性を有する成熟タンパク質として特定した。
【００２６】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質はグリコシドハイドロラーゼファミリー１２に分類され、pfamのホームページ（http://pfam.sanger.ac.uk/）においてpfam familyアクセッション番号：pf01670にてアラインメントされるドメインを有している。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列と他のエンドグルカナーゼとのアラインメントによれば、このアミノ酸配列は、第５９位から７６位までの１８アミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号３）のモチーフ領域をPhanerochaete chrysosporiumのGenBankのアクセッション番号AY 682744に記載のmature proteinは有していない。また、AY682744に記載のmature proteinについては活性が報告されていない。これらのことから、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、Phanerochaete属から初めてクローニングされたファミリー１２タイプのエンドグルカナーゼであるといえる。
【００２７】
本発明のタンパク質は、Phanerochaete属菌のエンドグルカナーゼである。従来、エンドグルカナーゼなどセルラーゼの糖化のための酵素は、Trichoderma reeseiなどのトリコデルマ属（Trichoderma）菌、フザリウム属（Fusarium）菌、トレメテス属（Tremetes）菌、ペニシリウム属（Penicillium）菌、フミコーラ属（Humicola）菌、アクレモニウム属（Acremonium）菌、アスペルギルス属（Aspergillus）菌等の糸状菌の他に、クロストリジウム属（Clostridium）菌、シュードモナス属（Pseudomonas）菌、セルロモナス属（Cellulomonas）菌、ルミノコッカス属（Ruminococcus）菌、バチルス属（Bacillus）菌等の細菌、スルフォロバス属（Sulfolobus）菌等の始原菌、さらにストレプトマイセス属（Streptomyces）菌、サーモアクチノマイセス属（Thermoactinomyces）菌の放射菌について検討されている。また、洗剤用途を考慮して耐アルカリ性のエンドグルカナーゼについては検討が試みられている。しかし、既存のエンドグルカナーゼは、弱酸性からアルカリ性にかけての反応pHを持つものがほとんどであり、酸性条件下でも高いエンドグルカナーゼ活性を示すものは知られていない。また、Phanerochaete chrysosporiumなどのPhanerochaete 属のエンドグルカナーゼについては、そのエンドグルカナーゼ活性についての詳細な検討は全くなされていない。
【００２８】
本発明のタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に基づいて取得及び改変されたものであってもよい。すなわち、上記した（ａ）及び（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつエンドグルカナーゼ活性を有する、タンパク質であってもよい。
【００２９】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の他には、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列にタンパク質合成のためにメチオニンをＮ末端に付加されていてもよいし、成熟タンパク質となる前のシグナルペプチドなどのアミノ酸配列がＮ末端に付加されたものであってもよい。
【００３０】
本発明のタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列(以下、この配列を相同性アミノ酸配列という。)を有していてもよく、また当該相同性アミノ酸配列からなっていてもよい。
【００３１】
相同性アミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対してより好ましくは８０％以上の相同性、さらに好ましくは８５％以上の相同性、一層好ましくは９０％以上の相同性を有し、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する。特定のアミノ酸配列に対する相同性は、NCBIのホームページ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）において利用可能なblastp, psi-blast, phi-blastを用いたprotein blastやblastxなどのプログラムを利用して取得することができる。
【００３２】
相同性アミノ酸配列は、また、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号１で表される塩基配列）の全体又はその一部をプローブとして用いるとき、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるものであってもよい。本明細書で言う「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０MのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 3nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第３版と略す）又は、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００３３】
本発明のタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列及び相同性アミノ酸配列のいずれかにおいて、１又は数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有していてもよく、また当該アミノ酸配列からなっていてもよい。アミノ酸変異の個数は特に限定されないが、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。また、アミノ酸変異は、置換、欠失及び付加のいずれであってもよく、２種類以上の変異態様を同時に含んでいてもよい。
【００３４】
アミノ酸変異は、後述するエンドグルカナーゼ活性が得られればどのような態様であってもよいが、例えば、少なくとも、配列番号２で表されるアミノ酸配列における１０７位、１７１位、１９２位及び２０１位又はそれに相当する位置のいずれかに疎水性アミノ酸残基を有する態様が好ましい。なかでも、１０７位、１９２位及び２０１位のいずれか又は２つ以上に疎水性アミノ酸残基を有する態様が好ましい。疎水性アミノ酸残基によるアミノ酸変異の具体例としては、以下の４つの態様が挙げられる。
（１）１０７位及び２０１位若しくはこれらに相当する位置にする疎水性アミノ酸残基を有する態様
（２）１９２位及び２０１位若しくはこれらに相当する位置に疎水性アミノ酸残基を有する態様
（３）１９２位又はこれに相当する位置に疎水性アミノ酸残基を有する態様
（４）１７１位もしくはこれに相当する位置に疎水性アミノ酸残基を有する態様
【００３５】
疎水性アミノ酸残基としては、グリシン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン及びプロリンが挙げられる。これらは１種又は２種以上を組み合わせられてもよい。疎水性アミノ酸残基は、好ましくは、プロリン、ロイシン、メチオニン、アラニン及びバリンである。特に、上記（１）の態様においては、１０７位又はこれに相当する位置がプロリンであり、２０１位又はこれに相当する位置がアラニンであることが好ましい。また、上記（２）の態様においては、１９２位又はこれに相当する位置がロイシンであり、２０１位又はこれに相当する位置がアラニンであることが好ましい。上記（３）の態様においては、１９２位又はこれに相当する位置がロイシンであることが好ましい。上記（４）の態様では、１７１位又はこれに相当する位置がメチオニンであることが好ましい。
【００３６】
本発明のタンパク質が有するアミノ酸配列は、さらに具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるＫ１０５Ｅ、Ｑ１０７Ｐ、Ｇ１２６Ｓ、Ｓ１５２Ｇ、Ｒ１７１Ｍ、Ｓ１９２Ｌ及びＶ２０１Ａのアミノ酸変異から選択されるいずれか又はこれらに相当するアミノ酸変異のいずれかを有することができる。なかでも、少なくともＱ１０７Ｐ、Ｓ１９２Ｌ及びＶ２０１Ａのうちのいずれかを有することが好ましい。また、少なくともＱ１０７Ｐ、Ｇ１２６Ｓ及びＶ２０１Ａのアミノ酸変異を有することが好ましく、少なくともＳ１５２Ｇ、Ｓ１９２Ｌ及びＶ２０１Ａのアミノ酸変異を有することが好ましい。
【００３７】
アミノ酸変異は、各種の手法にて導入することができる。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列や相同性配列をコードするＤＮＡ等の遺伝子情報を改変する方法を用いることができる。ＤＮＡに変異を導入して遺伝子情報を改変して本発明のタンパク質を得るには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて変異の導入が行われる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えばエラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャフリングやカセットＰＣＲ等の分子進化工学的手法は、例えば、Kurtzman,A.L.,Govindarajan, S., Vahle, K., Jones, J. T., Heinrichs, V., Patten P. A.,Advances in directed protein evolution by recursive genetic recombination: applications to therapeutic proteins. Curr. Opinion Biotechnol.,12, 361-370, 2001、及び、Okuta, A., Ohnishi, A. and Harayama, S., PCR isolation of catechol 2,3-dioxygenase gene fragments from environmental samples and their assembly into functional genes. Gene, 212, 221-228, 1998を参照することができる。なかでも、エラープローンＰＣＲ等によりランダム変異を導入する分子進化的手法を利用する無細胞タンパク質合成系を採用することが好ましい。エラープローンＰＣＲに適用する無細胞タンパク質合成系としては、公知のあるいは本出願人が出願した特開２００６−６１０８０号公報及び特開２００３−１１６５９０号公報に記載のタンパク質合成系を用いることができる。本出願人によるこれらの無細胞タンパク質合成系を用いることで活性型の酵素を容易に得ることができる。このため、これらのタンパク質合成系が適用されたエラープローンＰＣＲは、本発明のタンパク質を取得する手法として好ましく用いることができる。
【００３８】
本発明のタンパク質のうち、特に配列番号２で表されるアミノ酸配列と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列や配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有するタンパク質は、Phanerochaete属に由来することができる。Phanerochaete chrysosporiumをはじめとするhanerochaete属由来のエンドグルカナーゼが酸性条件下で高いエンドグルカナーゼ活性を呈することはこれまで全く知られておらず、本発明者らが初めて見出した。こうしたエンドグルカナーゼを酸性条件下でのセルロース分解用に用いることで、従来よりも酸性条件下で効率的にセルロースを分解することができるようになる。「Phanerochaete属に由来するタンパク質」とは、Phanerochaete属に分類される微生物（野生株であっても変異株であってもよい）が生産するタンパク質又は当該微生物の生産するタンパク質をコードする遺伝子を利用して遺伝子工学的手法によって得られたタンパク質をいう。したがって、Phanerochaete 属から取得したタンパク質をコードする遺伝子（又はその改変遺伝子）を導入した形質転換体によって生産された組換体タンパク質も、Phanerochaete由来のタンパク質に該当する。
【００３９】
Phanerochaete属に属する菌としては以下の表に示すものが挙げられる。なお、Phanerochaete chryososporiumはSporotrichum pruinosum のteleomorph（有性生活環）にあるものを意味している。
【００４０】
【表１】
0004665989.tif 000002
【００４１】
本発明のタンパク質は、上述のようにタンパク質の無細胞合成系による遺伝子工学的手法によって取得することができるほか、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡで適当な宿主細胞を形質転換し、当該形質転換体において本発明のタンパク質を生産させる遺伝子工学的手法により取得することができる。形質転換体を用いた遺伝子工学的なタンパク質の生産方法は、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００４２】
本発明のタンパク質がPhanerochaete属が産生するタンパク質であるときには、Phanerochaete chrysosporium等のPhanerochaete属菌を培養してその培地の培養上清を取得し、この培養上清からPhanerochaete属エンドグルカナーゼを分離し、精製すればよい。分離や精製には公知のタンパク質の分離・精製法を適用すればよい。なお、Phanerochaete属エンドグルカナーゼを培養上清から分離精製することは必ずしも必要ではない。Phanerochaete属エンドグルカナーゼとして、培養上清をそのまま用いてもよい。なお、Phanerochaete属エンドグルカナーゼを培養上清から分離精製することは必ずしも必要ではない。Phanerochaete属エンドグルカナーゼとして、培養上清をそのまま用いてもよい。
【００４３】
本発明のタンパク質としては、例えば、配列番号４〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。これらのアミノ酸配列からなるタンパク質はいずれも酸性条件下において好ましいエンドグルカナーゼ活性を呈することができる。これらは、いずれも配列番号２で表されるアミノ酸配列においてアミノ酸変異を導入し改変したものである。これらのアミノ酸配列における配列番号２で表されるアミノ酸配列に対するアミノ酸変異（部位及び置換アミノ酸残基）は以下の通りである。本発明のタンパク質としては、好ましくは配列番号４〜８で表されるアミノ酸配列を有しあるいは当該アミノ酸配列からなる。
配列番号４：Ｑ１０７Ｐ、Ｇ１２６Ｓ、Ｖ２０１Ａ
配列番号５：Ｓ１５２Ｇ、Ｓ１９２Ｌ、Ｖ２０１Ａ
配列番号６：Ｓ１９２Ｌ
配列番号７：Ｋ１０５Ｅ
配列番号８：Ｒ１７１Ｍ
【００４４】
なかでも、酸性条件下でのエンドグルカナーゼ活性の向上程度の観点から、配列番号４又は５で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質であることが好ましい。
【００４５】
（エンドグルカナーゼ活性）
本発明のタンパク質は、さらに、酸性条件下でも作用するエンドグルカナーゼ活性を呈することができる。エンドグルカナーゼは、グルコースがβ-1,4-グルコシド結合（β-1,4結合）により高度に重合した高分子セルロースを、エンド型の作用様式で（すなわち分子鎖内部で）を加水分解し、セロオリゴ糖、セロビオース、及びグルコースを生産するエンド型のセルラーゼ（EC 3.2.1.4）である。エンドグルカナーゼは、カルボキシメチルセルラーゼ、エンド1,4-βグルカナーゼ、エンドセルラーゼなどとも呼称されている。
【００４６】
セルロースは、天然では植物細胞壁の主たる構成成分として存在し、多糖としては地球上で最も多く生産されている。植物細胞壁において、セルロースは、結晶性セルロース領域と非晶質セルロース領域とを形成している。結晶性セルロース領域は、分子間水素結合等により強固な結晶構造を形成しており、グルコースなどの単糖にまで人工的に分解するには非常に過酷な条件を必要とする。自然では、セルロースは、糸状菌などの微生物により分解されているが、各種のセルラーゼによる相乗作用によりグルコースにまで分解されることが知られている。なお、セルラーゼは、一般に、セルロース をグルコースにまで加水分解するのに作用する酵素の総称である。セルラーゼの種類としては、他に、グルカン1,4-βグルコシダーゼ（EC 3.2.1.74）、セルロース 1,4-βセロビオシダーゼ（EC 3.2.1.91）、βグルコシダーゼ（EC 3.2.1.21）が挙げられる。
【００４７】
酸性条件とは、ｐＨ２以上４以下のいずれかのｐＨとすることができる。好ましくは、ｐＨ２．５以上４以下のいずれかのｐＨである。なお、ｐＨ２以上４以下のいずれかのｐＨというとき、少なくとも、このｐＨ範囲のいずれかのｐＨにおいて向上したエンドグルカナーゼ活性を有していればよく、このｐＨ範囲内の他のｐＨあるいはこのｐＨ範囲外において向上したエンドグルカナーゼ活性を呈するものでなくてもよい。また、このｐＨ範囲外においても向上したエンドグルカナーゼ活性を呈するものであってもよい。
【００４８】
また、酸性条件とは、より好ましくはｐＨ２以上３以下の範囲である。すなわち、少なくともｐＨ２以上３以下の全ての範囲で向上したエンドグルカナーゼ活性を呈することが好ましい。当該ｐＨ範囲外におけるエンドグルカナーゼ活性の有無は特に問わない。また、酸性条件とは、ｐＨ２以上２．５以下の全範囲又はｐＨ２．５以上３以下の全範囲とすることができる。
【００４９】
「向上したエンドグルカナーゼ活性を呈する」の一つの態様は、このような酸性条件下でTrichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼよりも高いエンドグルカナーゼ活性を呈する態様である。Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼは、従来汎用されているエンドグルカナーゼである。酸性条件下でこのエンドグルカナーゼよりも高い活性を呈するタンパク質であれば、酸性条件下で従来に比して効率的にセルロースを糖化することができる。この態様における酸性条件は、ｐＨ２以上４以下のいずれかのｐＨとすることができ、好ましくはｐＨ２．５以上４以下のいずれかのｐＨとすることができる。また、ｐＨ２以上３以下の全範囲、ｐＨ２以上２．５以下の全範囲又はｐＨ２．５以上３以下の全範囲とすることができる。
【００５０】
エンドグルカナーゼ活性の比較対象であるTrichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼとしては、例えば、Trichoderma reesei EGII(例えば、GenBankアクセッション番号：M19373)やTrichoderma reesei EGIII(例えば、GenBankアクセッション番号：AB003694)が挙げられる。このうち、Trichoderma reesei EGIIよりもエンドグルカナーゼ活性が向上していることがより好ましい。
【００５１】
「向上したエンドグルカナーゼ活性を呈する」の他の一つの態様は、酸性条件下で、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと同等又はより高いエンドグルカナーゼ活性を呈する態様である。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼは、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼなど汎用のエンドグルカナーゼよりも酸性条件下で向上したエンドグルカナーゼ活性を呈する。したがって、酸性条件下で配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと同等又はより高いエンドグルカナーゼ活性を備えることで、従来に比して酸性条件下で効率的にセルロースを分解することができる。この態様における酸性条件は、ｐＨ２以上４以下のいずれかのｐＨとすることができ、好ましくはｐＨ２．５以上４以下のいずれかのｐＨとすることができる。また、ｐＨ２以上３以下の全範囲、ｐＨ２以上２．５以下の全範囲又はｐＨ２．５以上３以下の全範囲とすることができる。
【００５２】
エンドグルカナーゼ活性が向上しているか否か、すなわち、エンドグルカナーゼ活性の評価は、特に限定しないで公知の方法によりカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等の基質と反応させ、基質の分解によって生じる還元糖の量等を測定することにより、本発明のタンパク質はエンドグルカナーゼ活性を示すか否かを判定することができる。なお、他のエンドグルカナーゼとの相対活性の評価にあたっては、相対活性の比較対象となるエンドグルカナーゼのエンドグルカナーゼ活性を被験体のタンパク質と同一条件（好ましくは同時アッセイ）で実施することが好ましい。
【００５３】
なお、エンドグルカナーゼ活性の評価にあたって使用するセルロースは、結晶性セルロースとして、アビセル（商品名）などを用いることができ、非晶質セルロースとしては、リン酸膨潤したアビセルなどを用いることができる。水溶性セルロースとしては、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などを用いることができる。本発明のエンドグルカナーゼ活性は、ＣＭＣを基質として用いるのが好ましい。なお、多種のセルラーゼを組み合わせて協同作用によるセルロース分解活性を通じてエンドグルカナーゼ活性を評価する場合などにおいては、結晶性セルロースやリン酸膨潤セルロースなどを用いることもできる。
【００５４】
なお、本発明のタンパク質とＣＭＣ等の基質との反応をさせるときの温度条件は、特に限定しないが、好ましくは、２０℃〜６０℃におけるいずれかの温度とする。一般的なエンドグルカナーゼの至適温度の観点からは、５０℃程度とすることが好ましい。また、後述するように酵母に表層提示させて本タンパク質のエンドグルカナーゼ活性を測定する場合にも、５０℃程度とすることが好ましい。エンドグルカナーゼの至適温度近傍であることのほか、酵母によるセルロースの糖化物の利用を抑制する必要があるからである。一方、酵母における表層提示のためのタンパク質のエンドグルカナーゼ活性の評価にあたっては、２５℃以上３５℃以下、おおよそ３０℃程度と反応させることが好ましい。酵母が生存できる温度で高活性を呈するエンドグルカナーゼが好ましいからである。また、反応時間も特に限定しないが、数時間から十数時間とすることができる。なお、反応時間は、反応温度や用いる基質等の種類に応じて適切に設定することが好ましい。
【００５５】
酵素反応の結果生じる還元糖量の定量法としてはSomogyi法、Tauber-Kleiner法、Hanes法（滴定法）、Park-Johnson法、3,5-ジニトロサリチル酸（DNS）法、ＴＺ法（Journal of Biochemical Methods, 11(1985)109-115）などの多数の定量法が挙げられる。なかでも、糖による銅イオンの還元を利用するSomogyi-Nelson法を用いることができる（福井作蔵 著「生物化学実験法１ 還元糖の定量法 第２版」学会出版センター １９９０年）。Somogyi-Nelson法のプロトコールの一例は、まず酵素反応液を100℃で10分加熱処理して反応を停止させ、その反応液と等量のSomogyi銅液（和光純薬社製など）を加えて混合し、100℃で10分加熱処理してから急速に冷却し、冷却後、等量のNelson試薬（和光純薬社製など）を加えて還元銅沈殿を溶解して発色させ、30分静置し、660nmでの吸光度を測定し、その測定値から、グルコースを標準糖として還元糖量を算出する。
【００５６】
エンドグルカナーゼ活性は、カルボキシルメチルセルロースなどのセルロースを含有する固相体からなる評価領域に本発明としての可能性のある被験タンパク質を供給し、当該領域の固相体中のセルロースを分解させて、固相体中でセルロースが分解されて消失した領域（ハロー：固相体においてバイオマスの分解により淡色化又は無色化する領域）の大きさでエンドグルカナーゼ活性を評価することもできる。ハローの大きさはエンドグルカナーゼ活性によるセルロース分解量に対応しているからである。
【００５７】
固相体におけるセルロース消失に基づくハローは、通常、周囲よりも透明性の高い部分として形成され、そのままでも、目視等により視認することができる。ハロー検出時にコンゴーレッドなどで、セルロースを染色することで明瞭にハローを検出することができる。また、バイオマスとして色素結合セルロース（例えば、Cellulose Azure、Sigma社製など）を用いた場合、セルロースの分解により色素が固相体中に拡散しハローを形成するため、容易にセルロース分解活性を検出することができる。同様に蛍光色素を結合したセルロースもバイオマスとして利用することでハローを容易に検出することができる。さらに、酸処理セルロースなどをバイオマスとして用いた場合にもセルロースの分解により透明なハローを形成するため、セルロース分解活性を容易に検出することができる。ハローを検出するには、カルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）を用いてもよい。また、基質としてＣＭＣ等を用いて、ＤＮＳ法やソモギ−ネルソン法により、セルロースの分解によって生じる還元糖を検出してもよい。
【００５８】
セルロースの分解にあたって、エンドグルカナーゼ活性のみでは十分にセルロース分解活性を呈しない場合には、セロビオヒドロラーゼ等を併用して相乗作用によるセルロース分解活性を利用してエンドグルカナーゼ活性を評価してもよい。
【００５９】
ハロー形成用の固相体は、例えば、バイオマスを担持するゲルやフィルムが挙げられる。ゲルやフィルムの構成材料は特に限定しないで、天然又は人工の高分子材料を好ましく用いることができる。このような高分子材料としては、アガロース（寒天）を好ましく用いることができる。固相体は、例えば、ある程度精製されたバイオマスとしてのセルロースをアガロース溶液に懸濁又は溶解させた後、所定条件で固化することにより得ることができる。また、未精製のバイオマスを乾燥粉砕して得られた粉体をアガロース溶液に懸濁した後、固化することによっても得ることができる。固相体の形態及び固相体に含まれるセルロース量は、エンドグルカナーゼ活性を検出できる程度であればよい。
【００６０】
また、こうした固相体を用いた評価を行う場合には、エンドグルカナーゼ活性は、本発明のタンパク質それ自体を用いて評価してもよいが、本発明のタンパク質を細胞表層に提示させた酵母などの細胞を用いて評価してもよい。タンパク質の細胞表層提示については後段にて説明する。
【００６１】
エンドグルカナーゼ活性の評価にあたっては、上記した手法を適宜組み合わせて実施できるが、例えば、以下の方法を採用することができる。以下のいずれかの方法によってエンドグルカナーゼ活性の向上が検出されればよい。なお、各法における反応生成物の検出方法は例示である。
（１）被験体となるタンパク質の所定量の溶液（例えば、１μｌ程度）を、所定のｐＨ（上記酸性条件等）となるようにそれぞれ調整した０．５％のＣＭＣなどの基質及び１％乳酸を含有する溶液５００μｌに添加して３０℃で１６時間程度反応させる。
反応後、ＴＺ法（Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11（1985）、109-115）で還元糖量を定量することができる。
（２）被験体となるタンパク質の所定量の溶液（例えば、１μｌ程度）を、所定のｐＨ(例えば上記酸性条件等)となるように調整した０．１％のＣＭＣなどの基質及び１％乳酸を含む１％寒天培地上に滴下して、３０℃で１６〜１８時間反応させる。
反応後、形成されたハローの大きさを測定することができる。
（３）被験体となるタンパク質の所定量を、所定のｐＨになるように酢酸ナトリウム緩衝液で調整した基質溶液（例えば、基質として０．５％ＣＭＣやβグルカンのほか１％乳酸を含有する）に添加し、５０℃で４時間程度反応させる。
反応により生じたβグルカンの還元糖末端量を例えば、ソモギ−ネルソン法で測定する。
【００６２】
（酵母の細胞表提示時のエンドグルカナーゼ活性）
本発明のタンパク質を酵母の細胞表層に提示したとき、酸性条件下において安定化される傾向がある。本発明者らによれば、意外にも、本発明のタンパク質が酵母細胞表層に提示されるとき、酸性条件でエンドグルカナーゼ活性が相対的に向上する傾向があることがわかった。すなわち、本発明のタンパク質は、ｐＨ３程度の領域よりもｐＨ５程度の弱酸性領域において活性が高い傾向にあるが、酵母細胞表層提示には、ｐＨ５程度の弱酸性領域よりも低いｐＨ領域（典型的には、ｐＨ２以上４以下のいずれかのｐＨ、好ましくはｐＨ２．５以上４以下のいずれかのｐＨ、より好ましくはｐＨ２以上３以下の全範囲又はｐＨ２以上２．５以下の全範囲又はｐＨ２．５以上３以下の全範囲）において、より高いエンドグルカナーゼ活性を呈する傾向がある。こうした傾向は、配列番号２で表されるタンパク質やその改変体においても見出されている。したがって、本発明のタンパク質に共通する特性であると考えられる。
【００６３】
以上のことから、本発明のタンパク質は、酸性条件下でのセルロースの分解、糖化利用に有用である。また、本発明のタンパク質は、細胞表層提示用として有用である。すなわち、本発明のタンパク質は、酵母の細胞表層に提示したときには、酵母に本タンパク質を生産させながら培養でき、さらに生産したタンパク質は酸性条件下でエンドグルカナーゼ活性が安定化されることになる。このため、長時間反応時であってエンドグルカナーゼを追加して添加する必要性が低くなるとともに、当該表層提示酵母を繰り返し利用できるようになる。
【００６４】
酵母の細胞表層に提示されたときのタンパク質のエンドグルカナーゼ活性についても、既に説明した本発明のタンパク質についてのエンドグルカナーゼ活性の評価手法を適用することができる。
【００６５】
（エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の利用）
本発明によれば、セルロースを本発明のタンパク質で分解して、セルロース分解物を生産する方法が提供される。
【００６６】
本発明のセルロース分解物の生産方法によれば、酸性条件下でもセルロースを効率的に分解できるため、セルロース含有バイオマスの酸による前処理物の利用の容易性（中和操作の低減又は回避）を得ることができる。
【００６７】
セルロースとしては、グルコースがβ-1,4-グルコシド結合により重合した重合体及びその誘導体が挙げられる。グルコースの重合度は特に限定しない。また、誘導体としては、カルボキシメチル化、アルデヒド化、若しくはエステル化などの誘導体が挙げられる。また、セルロースは、その部分分解物である、セロオリゴ糖、セロビオースであってもよい。さらに、セルロースは、配糖体であるβグルコシド、リグニン及び／又はヘミセルロースとの複合体であるリグノセルロース、さらにペクチンなどとの複合体であってもよい。セルロース は、結晶性セルロースであってもよいし、非結晶性セルロースであってもよい。さらに、セルロース は、天然由来のものでも、人為的に合成したものでもよい。セルロースの由来も特に限定しない。植物由来のものでも、真菌由来のものでも、細菌由来のものであってもよい。
【００６８】
また、セルロースは、上記したセルロースを含むセルロース含有材料であってもよい。セルロース含有材料は、綿や麻などの天然繊維品、レーヨン、キュプラ、アセテート、リヨセルなどの再生繊維品、稲ワラ、籾殻、木材チップなどの農産廃棄物などが挙げられる。
【００６９】
本発明方法で得られるセルロース分解産物は、グルコースのほか、セロビオース及びセロオリゴ糖が挙げられる。セルロースからグルコースを効率的に得るには、β−グルコシダーゼやセロビオシダーゼ等の他種のセルラーゼを同時に作用させることが好ましい。
【００７０】
本発明方法における反応条件は、本発明のタンパク質がセルロースに作用してセルロース分解物を生成可能な条件であれば足りる。ｐＨ条件は、特に限定しないが、好ましくは、ｐＨ４．５以下、より好ましくは、ｐＨ２以上４．５以下であり、さらに好ましくはｐＨ２以上３以下である。本発明のタンパク質は、酸性条件下においても優れたエンドグルカナーゼ活性を呈するため、こうした酸性条件下で、雑菌の繁殖を抑制しつつセルロースを分解できる。また、酸処理されたセルロースであってもその酸性度を緩和するための中和操作等を軽減又は省略した状態で分解することができる。こうして得られるセルロース分解産物は、通常のグルコースと同様、有用物質の発酵原料等に利用できる。
【００７１】
（本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド）
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。こうしたポリヌクレオチドの塩基配列としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする配列番号１で表される塩基配列が挙げられる。また、配列番号１で表される塩基配列の全体又はその一部を配列からなるプローブを用いるとき、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列有し、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列が挙げられる。なお、ストリンジェントな条件は既に説明した。さらに、配列番号１で表される塩基配列に対して１から複数の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列が挙げられる。
【００７２】
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成法や各種ＰＣＲ法等により取得することができる。なお、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（二重鎖及び一重鎖のいずれであってもよい）、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリット等、いずれの形態であってもよい。
【００７３】
（ＤＮＡ構築物）
本発明のＤＮＡ構築物は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含んでいる。ＤＮＡ構築物は、主として適当な宿主細胞の形質転換を意図した発現ベクターとしての形態を採ることができる。形質転換の手法や宿主細胞における当該ポリヌクレオチドの保持形態（染色体に導入する形態や染色体外に保持する形態等）に応じて、上記コード領域以外の構成要素が適宜決定される。また、ＤＮＡ構築物の形態は、使用形態に応じて様々な形態を採ることができる。例えば、ＤＮＡ断片の形態を採ることができるほか、プラスミドやコスミドなどの適当なベクターの形態を採ることもできる。
【００７４】
（形質転換体）
本発明の形質転換体は、上記したＤＮＡ構築物で適当な宿主細胞を形質転換することによって得ることができる。形質転換にあたり、従来公知の各種方法、例えば、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法等を用いることができる。遺伝子導入の宿主となる細胞は特に限定しないが、後述する有機酸発酵やエタノール発酵等を考慮すると、Saccharomyces cerevisiae等のSaccharomyces属の酵母、Schizosaccharomyces pombe,等のSchizosaccharomyces属の酵母、Candida shehatae等のCandida属の酵母、Pichia stipitis等のPichia属の酵母、Hansenula属の酵母、Trichosporon属の酵母、Brettanomyces属の酵母、Pachysolen属の酵母、Yamadazyma属の酵母、Kluyveromyces marxianus, Kluveromyces lactis等のKluveromyces属の酵母が挙げられる。
【００７５】
なお、上記した本発明のポリヌクレオチド、ＤＮＡ構築物及び形質転換体の作製方法は、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００７６】
（エンドグルカナーゼ表層提示酵母）
本発明のエンドグルカナーゼ表層提示酵母は、本発明のタンパク質を細胞表層に保持する酵母である。エンドグルカナーゼが酵母表層において保持されて酵母表層近傍にてセルロースを分解することで、酵母は速やかにセルロース由来のグルコースを利用できる。
【００７７】
本発明のタンパク質は酵母に対して外来性のタンパク質であるため、本発明の酵母は、本発明の形質転換体の一態様とすることができる。本発明のタンパク質を酵母細胞表層に提示して保持する形態は特に問わない。酵母の細胞表層に直接的であっても間接的であっても保持されていればよい。
【００７８】
タンパク質を細胞表層提示する一つの方法として、細胞表層提示のためのタンパク質や分泌用タンパク質を本発明のタンパク質に連結した融合タンパク質を発現するように酵母を形質転換する方法が挙げられる。表層提示酵母の宿主となる酵母としては、特に限定しないが、「形質転換体」の項において開示した酵母が同様に好ましく用いることができる。また、表層提示によりセルロースを直接糖化して利用できるため、表層提示酵母の宿主は、有用物質を生産するように形質転換された形質転換体又は変異体であることが好ましい。こうした形質転換体等としては、特に限定しないが、例えば、乳酸発酵用としては、特開２００３−２５９８７８、特開２００４−１８７６３、特開２００５−１３７３０６、特開２００６−６２７１、特開２００６−２０６０２、特開２００６−４２７１９、特開２００６−２８３１８、特開２００６−２９６３７７、特開２００７−８９４６６、特開２００７−１７５０２９等に開示されている乳酸生産酵母等が挙げられる。なお、本発明の表層提示酵母において有用物質を生産させるためには、宿主としてこうした形質転換体を用いることに限定するものではない。作製した表層提示酵母に対して別途形質転換を施して所望の有用物質を生産させるようにしてもよい。
【００７９】
本発明の表層提示酵母を取得するためのＤＮＡ構築物は、本発明のタンパク質のコード領域のほか、酵母における細胞表層提示用タンパク質をコードする領域あるいは分泌用タンパク質をコードする領域を備えていることが好ましい。細胞表層提示用タンパク質としては、凝集性タンパク質あるいはその一部が挙げられ、例えば、性凝集素タンパク質であるα−アグルチニンをコードするSAG1遺伝子の５’領域の３２０アミノ酸残基からなるペプチドがある。所望のタンパク質を細胞表層に提示するためのポリペプチドや手法は、ＷＯ０１／７９４８３号公報や、特開２００３−２３５５７９号公報、ＷＯ２００２／０４２４８３号パンフレット、ＷＯ２００３／０１６５２５号パンフレット、特開２００６−１３６２２３号公報、藤田らの文献（藤田ら，2004. Appl Environ Microbiol 70:1207-1212および藤田ら, 2002. Appl Environ Microbiol 68:5136-5141.）、村井ら, 1998. Appl Environ Microbiol 64:4857-4861.に開示されており、当業者であればこれらの記載に基づいて本発明のタンパク質を酵母の細胞表層に提示させることができる。
【００８０】
本発明のタンパク質の細胞表層提示にあたり、細胞表層提示用のタンパク質に加えて分泌タンパク質も融合させることで本タンパク質の細胞表層提示量を増加させることができる場合がある。分泌タンパク質としては、例えば、Rhizopus oryzaeのグルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナルなどが挙げられる。なお、本発明のタンパク質を細胞外に分泌させることで本発明のタンパク質を細胞表層提示できる場合もある。この場合には、必要に応じて本発明のタンパク質に分泌タンパク質を融合した融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を作製して、このＤＮＡ構築物により酵母を形質転換する。
【００８１】
本発明の酵母は、酸性条件下において相対的に優れるエンドグルカナーゼ活性を呈することができる。本発明のタンパク質について既に説明したように、本発明のタンパク質が酵母細胞表層に提示されるとき、酸性条件でエンドグルカナーゼ活性が相対的に向上する傾向があるからである。また、本発明の酵母は、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ（配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる）を同じ酵母の細胞表層に提示したときに得られるエンドグルカナーゼ活性よりも高いエンドグルカナーゼ活性を呈することができる。したがって、本発明の酵母は、酸性条件下（特には、ｐＨ２以上４以下）でのセルロースの分解、糖化利用に適した酵母であるということができる。
【００８２】
本発明の酵母の細胞表層には、さらにβ１，４−グルカングルコシダーゼ、β−グルコシダーゼやセロビオシダーゼ等の他種のセルラーゼを他種のセルラーゼを提示させることができる。こうすることで、特に、結晶性セルロースを含む場合などにおいてセルロースを効率的に糖化利用できるようになる。こうした他種セルラーゼは、Trichoderma reeseiやPhanerochaete chrysosporiumなど各種の糸状菌や細菌等において公知であり、これらから適宜選択できる。なお、他のエンドグルカナーゼを提示してもよい。こうした各種セルラーゼの細胞表層提示にあたっては、本発明のタンパク質の細胞表層提示と同様の手法を採用できる。
【００８３】
（細胞表層提示酵母の利用）
本発明の酵母は、酸性条件下でのセルロースを分解・糖化して利用する発酵に適している。発酵形態は、特に問わない。糖化利用する場合において発酵生産する物質の種類も問わない。酵母を利用した有用物質の発酵であれば、本発明の酵母を有効利用できる。いずれの発酵用途であっても、酸性条件下での発酵でもセルロースを効率的に利用できる。また、酸で前処理されたリグノセルロースなどのバイオマス由来のセルロース原料を用いる場合でも、その原料の酸性度を緩和することを抑制又は回避することができる。また、酸性条件下での発酵により、雑菌の増殖を効果的に抑制できる。
【００８４】
発酵用途としては、例えば、酵母本来のエタノール発酵用途、乳酸などの有機酸生産酵母による有機酸発酵用途が挙げられる。本発明の酵母をエタノール発酵用途に用いるとき、セルロースを炭素源として直接利用して発酵によりエタノールを生産することができる。有機酸発酵用途に用いるとき、セルロースを炭素源として直接利用して有機酸を生産することができる。また、有機酸発酵に産生される有機酸によって培地のｐＨが低下しても、セルロースを効率的に利用し続けることができるため、セルロース糖化のためにｐＨ調整するという操作負担を抑制又は回避できる。
【００８５】
なお、本明細書において、「有機酸」とは、酸性を示す有機化合物であって、遊離の酸あるいはその塩である。「有機酸」が備える酸性基としては、カルボン酸基であることが好ましい。このような「有機酸」としては、乳酸、酪酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、マロン酸、プロピオン酸、アスコルビン酸、アジピン酸などが挙げられる。これらの「有機酸」は、Ｄ体、Ｌ体のほか、ＤＬ体であってもよい。「有機酸」は好ましくは、乳酸である。
【００８６】
本発明によれば、エンドグルカナーゼ表層提示酵母による有用物質の生産方法であって、セルロースの存在下、本発明のエンドグルカナーゼ表層提示酵母を用いて培養して有用物質を生産する工程、を備える生産方法が提供される。本発明の有用物質生産方法において酵母が利用するセルロースは、セルロース分解産物の生産方法において説明したセルロースと同義である。セルロースとしては、グルコースがβ-1,4-グルコシド結合により重合した重合体及びその誘導体が挙げられる。グルコースの重合度は特に限定しない。また、誘導体としては、カルボキシメチル化、アルデヒド化、若しくはエステル化などの誘導体が挙げられる。また、セルロースは、その部分分解物である、セロオリゴ糖、セロビオースであってもよい。さらに、セルロースは、配糖体であるβグルコシド、リグニン及び／又はヘミセルロースとの複合体であるリグノセルロース、さらにペクチンなどとの複合体であってもよい。セルロース は、結晶性セルロースであってもよいし、非結晶性セルロースであってもよい。さらに、セルロース は、天然由来のものでも、人為的に合成したものでもよい。セルロースの由来も特に限定しない。植物由来のものでも、真菌由来のものでも、細菌由来のものであってもよい。
【００８７】
セルロースの存在下とは、セルロースが培地中に存在していれば足り、セルロースの形態は上記したセルロースの他、綿や麻などの天然繊維品、レーヨン、キュプラ、アセテート、リヨセルなどの再生繊維品、稲ワラ、籾殻、木材チップなどの農産廃棄物などが挙げられる。
【００８８】
これらの態様において用いる培養培地としては、セルロースを炭素源として本発明の細胞表層提示酵母が利用でき、増殖できるものであればよい。酵母を培養するための培地の組成は、当業者であれば適宜決定することができる。培地のｐＨは、特に限定しない。一般に酵母の培養に用いられるｐＨ４．５〜６．５程度であってもよい。セルロースを効率的に分解する観点からは、本発明のタンパク質のエンドグルカナーゼ活性の至適ｐＨ近傍で培養することが好ましい。一方、雑菌増殖の観点からは、好ましくはｐＨ４．５以下、より好ましくは４以下、さらに好ましく３以下であり、一層好ましくはｐＨ２．５以下である。ｐＨが低いほど雑菌抑制効果が高いが、特にｐＨ２．５以下であると顕著に雑菌を抑制できるようになる。なお、培養開始時においては、ｐＨ４．５〜６．５程度とし、その後、酸性側にシフトさせることが好ましい。なお、酵母が有機酸生産酵母であるときには、当該酵母が生産する有機酸によってｐＨが低下し、上記酸性条件に到達することになり、特にｐＨを酸性化しなくても雑菌増殖抑制効果を得ることができる。培養温度及び酸素条件は、細胞表層提示酵母の生育可能範囲内の温度であればよい。また、培養時間は、当業者であれば任意に設定することができるが、少なくとも24時間培養を継続することが好ましい。
【００８９】
こうしてセルロースの存在下、本発明の細胞表層提示酵母を培養することで、セルロースが分解され、酵母が増殖するとともにエタノールや有機酸（前記細胞表層提示酵母が有機酸生産酵母のとき）などの有用物質が生産される。この方法によると、枯渇する石油資源や食料資源を利用することなく、セルロース系のバイオマスを炭素源としてエタノールや有機酸などの有用物質を効率的に生産することができる。
【００９０】
（スクリーニング方法）
本発明のエンドグルカナーゼ改変体のスクリーニング方法は、Phanerochaete属由来のエンドグルカナーゼ又はその改変体において１又は複数個のアミノ酸変異を導入した被験タンパク質のライブラリを準備する工程と、前記ライブラリの前記被験タンパク質について酸性条件下でのエンドグルカナーゼ活性を評価する工程と、を備えることができる。本発明のスクリーニング方法によれば、Phanerochaete属由来のエンドグルカナーゼ及びその改変体をもとに新たな改変体のライブラリを準備し、このライブラリから酸性条件下でのエンドグルカナーゼ活性を評価することで、効率的に酸性条件下で優れたエンドグルカナーゼ活性を呈する改変体を取得することができる。
【００９１】
（ライブラリの準備）
改変体を得る起源タンパク質としては、本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質以外の他のPhanerochaete属由来のエンドグルカナーゼとすることができる。Phanerochaete属由来のエンドグルカナーゼとしては、好ましくは、Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼ又はその改変体である。Phanerochaete chrysosporium由来エンドグルカナーゼは、既に酸性条件下で優れたエンドグルカナーゼ活性を呈しているため、より高いエンドグルカナーゼ活性のエンドグルカナーゼをより効率的にスクリーニングできる。
【００９２】
ライブラリは、天然界から探索された天然の起源タンパク質及び／又はこうした起源タンパク質に新たな改変を導入して得られる改変体（人工的な起源タンパク質）から構成される。改変体を得る手法は特に限定しない。多様な改変体を得る手法としては分子進化的手法を利用することができる。ライブラリを構成する被験タンパク質は、起源タンパク質において１又は複数個のアミノ酸変異を有することができる。アミノ酸変異の個数は特に限定されないが、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。また、アミノ酸変異は、置換、欠失及び付加のいずれであってもよく、２種類以上の変異態様を同時に含んでいてもよい。
【００９３】
各種の改変体は、分子進化技術に基づいて以下の方法で作製することができる。まず、エラープローンＰＣＲ等を用いて起源タンパク質のＤＮＡから変異ＤＮＡライブラリを構築し、これら各変異ＤＮＡを用いて、例えば、無細胞タンパク質合成を行い変異体タンパク質（改変体）のライブラリを得る。これらの変異体タンパク質を、本スクリーニング方法におけるライブラリの被験タンパク質の少なくとも一部として用いる。なお、無細胞タンパク質合成系としては、公知のあるいは本出願人が出願している特開２００６−６１０８０号公報及び特開２００３−１１６５９０号公報に記載のタンパク質合成系を用いることができる。なお、こうして構築したライブラリから有用であるとしてスクリーニングされた被験タンパク質を新たな起源タンパク質として新たなライブラリを構築し、さらなるスクリーニングを行うことで、より有用なエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をスクリーニングできる。
【００９４】
被験タンパク質の少なくとも一部は、被験タンパク質を細胞外部（特には細胞表層）に提示する微生物（典型的には酵母）としてもよい。Phanerochaete属由来のエンドグルカナーゼやその改変体は、酵母の細胞表層に提示したとき安定化され、高いエンドグルカナーゼ活性を呈することができる。このため、細胞表層提示時におけるエンドグルカナーゼ活性を評価することを意図するときには、被験タンパク質を細胞表層に提示する酵母を、被験タンパク質単体とともにあるいは被験タンパク質単体に替えて用いることで、ライブラリを構成してもよい。
【００９５】
（エンドグルカナーゼ活性の評価）
被験タンパク質について酸性条件下でのエンドグルカナーゼ活性を評価するには公知の各種の方法から１種あるいは２種以上を採用することができる。例えば、すでに説明した本発明のタンパク質のエンドグルカナーゼ活性の評価方法から適宜選択して採用できる。
【００９６】
効率的なスクリーニングあるいは一次スクリーニングには、エンドグルカナーゼを含む固相体において被験タンパク質の作用によりセルロースが分解してセルロースの分解量（消失量）に応じて得られるハローを検出するのが好ましい。この方法によれば、ハローの大きさにより、エンドグルカナーゼ活性を容易に検出しかつ比較することができる。
【００９７】
エンドグルカナーゼ活性評価用のセルロース含有固相体の形態は特に限定しない。例えば、多数の被験タンパク質を同時に評価するのに十分な評価領域を形成可能なプレート状であることが好ましい。こうしたプレート状の固相体に対して、アレイ状に被験タンパク質含有液等をスポットとして供給すると、被験タンパク質がエンドグルカナーゼ活性を有する場合には、当該スポットを中心にハローが形成されることになる。
【００９８】
エンドグルカナーゼ活性の評価は少なくとも酸性条件下で実施することが好ましい。評価にあたって適用する酸性条件は、本発明のタンパク質についての酸性条件と同義である。すなわち、もっとも広義にはｐＨ２以上４以下の範囲のいずれかのｐＨである。なお、エンドグルカナーゼ活性の評価にあたって、ｐＨ以外の被験タンパク質の作用によってセルロースを分解できる各種反応条件を付与する。具体的には、被験タンパク質がエンドグルカナーゼとして機能する温度、水分、塩濃度及び時間等についての個々の条件を付与する。このような条件は、当業者であれば容易に取得することができる。
【００９９】
エンドグルカナーゼ活性の評価は、上記酸性条件以外で実施してもよい。例えば、ｐＨ５以上の弱酸性領域から中性領域にかけてのｐＨ条件下でのエンドグルカナーゼ活性の評価を組み合わせてもよい。こうすることで、被験タンパク質のエンドグルカナーゼ活性の至適ｐＨなどのｐＨプロファイルを取得して、より確実及び有効なスクリーニングが可能となる。
【０１００】
被験タンパク質以外に、エンドグルカナーゼ及び他種のセルラーゼを組み合わせて、これらの相乗作用によるセルロース分解能を通じてエンドグルカナーゼ活性を評価してもよい。セルロースの分解又は糖化利用にあたり、各種のセルラーゼを組み合わせることが有効である。したがって、こうすることで、複数のセルラーゼを組み合わせて用いるのに適したエンドグルカナーゼを容易にスクリーニングすることができる。
【０１０１】
このような相乗作用によるスクリーニングは、被験タンパク質単体のエンドグルカナーゼ活性の評価に替えて実施してもよいし、単体のエンドグルカナーゼ活性評価に組み合わせて実施してもよい。
【０１０２】
なお、相乗作用によるスクリーニングは、上記のような組み合わせ利用を意図しない場合でも実施することができる。例えば、セルロースの種類等に起因して被験タンパク質のみでは十分にセルロースを分解しない場合にも利用することができる。また、相乗作用によるスクリーニングにおいては、好ましくはエンドグルカナーゼ以外の他種のセルラーゼを組み合わせることが有効である。
【０１０３】
エンドグルカナーゼ活性の評価は、酵母等の微生物の細胞表層に提示された状態で実施することができる。こうすることで、細胞表層提示時のエンドグルカナーゼ活性に基づくスクリーニングが可能である。本発明者らによれば、本発明のタンパク質は、酵母等の細胞表層に提示されたとき、安定化されて高いエンドグルカナーゼ活性を呈することがわかっている。また、エンドグルカナーゼを酵母等の細胞表層に提示させる使用形態は、セルロースを糖化利用して有用物質を発酵生産するときのもっとも有効な形態の一つである。したがって、細胞表層提示形態での被験タンパク質のスクリーニングは、極めて有効である。このような形態のスクリーニングは、被験タンパク質単体のエンドグルカナーゼ活性の評価に替えて実施してもよいし、被験タンパク質単体のエンドグルカナーゼ活性評価に組み合わせて実施してもよい。
【０１０４】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下に述べる遺伝子組換え操作はMolecular Cloning： A Laboratory Manual (T. Maniatis, et al., Cold Spring Harbor Laboratory) に従い行った。
【実施例１】
【０１０５】
（Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼ遺伝子のクローニング）
P. chrysosporiumの遺伝子はGC含量が高いためにPCR産物が増幅されにくい事が予想されたので、GCリッチなテンプレートに最適化されたTaKaRa LA Taq with GC Buffer（宝酒造）を用いることにした。得られたPCR増幅産物はTOPO TA Cloning Kit（Invitrogen）を用いてpCR2.1-TOPO vectorにクローニングした。
【実施例２】
【０１０６】
（遺伝子組換え操作）
大腸菌へのプラスミドDNAの導入はZ-Competent E. coli Transformation Kit（ZYMO RESEARCH）またはECOS Competent E.coli DH5α（ニッポンジーン）を用いた。大腸菌からのプラスミドの抽出にはQIA Prep Spin Miniprepkit(50) (QIAGEN)を用いた。遺伝子断片の精製は、1％アガロースゲルで電気泳動後、Zymoclean Gel DNA Recovery Kit（ZYMO RESEARCH）を用いてゲルから回収・精製した。ライゲーション反応にはLigaFast Rapid DNA Ligation System（Promega）を用いた。制限酵素は宝酒造社製のものを用いた。
【実施例３】
【０１０７】
（P. chrysosporiumのcDNAライブラリーの作製）
P. chrysosporium（ATCC64314）の菌体を、500ml容の三角フラスコに入れた50 mlのmodified Vogel's medium9) （0.01 M dimethyl succinate buffer (pH 4.5), 0.23 g/L NH4H2PO4, 0.068 g/L veratryl alcohol, 0.2% (wt/vol) Avicel (microcrystalline cellulose:アビセル PH-101, 旭化成)）に接種し、30℃で4日間の静置培養を行った。生育した菌体を遠心分離により集菌し、液体窒素により急凍した。凍結した菌体（湿重量120mg）を乳鉢に入れ、液体窒素を注いで凍結状態を保ちながら乳棒を用いて約10分間菌体破砕を行った。RNeasy Plant Mini Kit（キアゲン）をもちいて、破砕した菌体からtotal RNAを抽出した。RNA抽出時に、DNase処理を行わなかった場合は、ゲノムDNAが混入し、次のPCR反応でイントロンの入ったゲノムDNAが増幅されてしまった。この問題はオプション・プロトコルであるオンカラムでのDNase処理を行ったのちにカラムから溶出したtotal RNAを用いることで解決できた。得られたtotal RNAを鋳型としてTaqMan Reverse Transcription Reagentsキット（アプライド・バイオシステムズ）の逆転写酵素を用いてcDNAを合成した。
【実施例４】
【０１０８】
（Pccel12A遺伝子のサブクローニング）
PccelPccel12Aの分泌シグナル配列をPSORT II Predictionプログラムを用いて予想し、N末端の22アミノ酸を除く成熟タンパクをコードするDNA配列をPCR増幅することにした。
使用したPCRプライマーの配列は以下のとおりとした。
Sac-Pccel12A-F（配列番号９）：CCGCGGagatcacaggacagtacgactgcattcctgc
Xho-Pccel12A-R（配列番号１０）：CTCGAGccaacgttgactgcgactgcgaaactctctg
（大文字部分がそれぞれSacII, XhoI認識配列、下線部分がPccel12A遺伝子の相同配列、その間の２塩基は読み枠を合わせるための挿入配列）
【０１０９】
合成したcDNAを鋳型としてPccel12A遺伝子断片（0.64kb）を増幅し、pCR2.1-TOPOベクターにサブクローニングした。得られたクローンのうち、３クローンについて全長の塩基配列を決定したところPccel12A（AY682744）と相同な配列であった。しかし、3クローンに共通してAY682744には無い８アミノ酸の挿入が見られ、さらに挿入配列に続く10アミノ酸の配列が置換されていた（図１に示すクローニングされたPccel12Aとデータベースの配列との比較を参照）。この挿入・置換配列は3クローンに共通していたことから、これは今回用いたATCC64314株特有の配列であると判断し、そのまま用いることにした。また、取得したｃＤＮＡを元にPccel 12A （AY682744）も作製した。
【実施例５】
【０１１０】
（Pccel12A遺伝子配列の修正）
クローニングされたPccel12A遺伝子は、ＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩで切り出してインテグレーションベクターに挿入する予定であったが、上記挿入配列中にＸｈｏＩ配列が含まれていたため、図２に示すスキームでアミノ酸配列は変えずにＸｈｏＩ配列を除去した。
【０１１１】
２組のプライマーセット（Sac-Pccel12A-FとPccel12A+200R、Pccel12A+171FとXho-Pccel12A-R）を用い、KOD plus DNA polymeraseにてXhoI配列の削除された２つのＤＮＡ断片を増幅し、アガロースゲル電気泳動で精製した。使用したプライマーのＤＮＡ配列は以下のとおりであった。
Pccel12A+200R（配列番号１１）：gagctacgcgaacctagagcacaacaccgc
Pccel12A+171F（配列番号１２）：gcggtgttgtgctctaggttcgcgtagctc
（下線部分の配列をそれぞれcをa, aをtに変えることにより、アミノ酸配列を変えずにXhoI配列を除去した。）
【０１１２】
２つのＤＮＡ断片をテンプレートとし、プライマーSac-Pccel12A-FとXho-Pccel12A-R用いてKOD plus DNA polymeraseによりオーバーラップPCRを行い、全長のPccel12Aを合成した。得られた増幅断片をZero Blunt TOPO PCR Cloning Kitを用いてpCR -Blunt II TOPOベクターにサブクローニングし、DNAシーケンスで配列を確認したところ、計画通りに内部のXhoI配列が削除されていることが確認できた。
【実施例６】
【０１１３】
（エンドグルカナーゼ遺伝子のプラスミド（pET23b）へのサブクローニング）
エンドグルカナーゼ遺伝子としては、実施例１で新規に取得したP.chrysosporium由来のPccel 12A  ATCC64314遺伝子、Pccel 12A  AY682744及びT. reesei由来のTrEGII（アクセッション番号：M19373）TrEGIII（アクセッション番号：AB 003694）の４種の遺伝子を用いた。各遺伝子の成熟タンパク質部分のｃＤＮＡの５’末端にＮｄｅｌ制限酵素サイトを、３’末端にＸｈｏｌ制限酵素サイトを付加した表１に示すプライマー（配列番号１３〜１８）を用いて、ＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅した。反応液の組成は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）０．２μｌ、１０×反応バッファー５μｌ、２５ｍＭｄＮＴＰ ４μｌ、１００ｐｍｏｌ／μｌプライマーＦ０．２５μｌ、１００ｐｍｏｌ／μｌプライマーＲ０．２５μｌテンプレートＤＮＡ２０ｎｇに滅菌蒸留水を加えて５０μｌにした。反応サイクルは、９４℃で５分の後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃２分を３０サイクル後、７２℃を７分間行った。得られたＰＣＲ増幅産物をＧＦＸＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス）を用いて説明書記載の方法で精製した。精製後、制限酵素ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで末端配列を切断し、同じくＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで切断したｐＥＴ２３ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（宝酒造）を用いてライゲーション反応を行い、大腸菌ＤＨ５αへ導入した。得られた形質転換大腸菌より、それぞれプラスミドＤＮＡを抽出後塩基配列の解析を行い、各ＥＧ遺伝子が正しくサブクローニングされていることを確認した。
【０１１４】
【表２】
0004665989.tif 000003
【実施例７】
【０１１５】
（Pc-cel 12 ATCC64314の相同性検索）
Pccel12A(Pc-cel12A ATCC64314aa(TOKU).gpt)のBLASTサーチの結果最も相同性が高いタンパク質は、AY682744がコードするタンパク質（Pccel12A genebank mature AA.gpt）で92%の相同性であった。次に相同性の高いタンパク質がPolyporus arcularius EG（アミスタケ）のdbj BAD98315.1で、70％であり、次いで、Fomitopsis palustris EG(オオウズラタケ）のdbj BAF49602.1で同60％であった。アライメントの結果を図３に示す。
【０１１６】
図３に示すように、T. reesei由来のEGIII（TrEGIII）との相同性は３７％、AnCMCI（アクセッション番号：CAA03652）、Aspergillus nigar hypo（アクセッション番号：XP＿001390433）との相同性は４２％、Aspergillus orizae EG（アクセッション番号:BAE58022）との相同性は４２％、Aspergillus aculeatus XG（アクセッション番号：ＡＡＯ20340）との相同性は４３％であった。
【０１１７】
今回取得したエンドグルカナーゼのアミノ酸配列（配列番号２、Pccel 12A  ATCC64314aa(TOKU)）は、すでに知られているPhanerochaete chrysosporiumのPccel 12A のアミノ酸配列（アクセッション番号：AY 682744）とは、図３における囲み部分（１８アミノ酸残基(配列番号３)）において全く相違する。一方、この既知アミノ酸配列以外の相同タンパク質につき、囲み部分について比較すると、アミスタケやオオウズラタケ等の相同タンパク質と相同性が認められる。また、Pccel 12A として既知のアミノ酸配列は、クローン化されたタンパク質の活性が未知である。以上のことから、今回取得したタンパク質は、Phanerochaete chrysosporiumからクローニングされた初めてのファミリー１２Aタイプのエンドグルカナーゼであることがわかった。また、クローン化されたタンパク質の活性が既に調べられているTrEGIIIやAnCMCIとはアミノ酸配列の相同性が４０％程度しかなく、異種のタンパク質であると考えられる。
【実施例８】
【０１１８】
（エンドグルカナーゼ遺伝子の無細胞タンパク質合成用鋳型DNAの増幅）
各エンドグルカナーゼ遺伝子を発現ベクターpET23bに挿入したものを鋳型として用いて、無細胞タンパク質合成用に用いるDNA断片の増幅を行った。すなわち、実施例６で作製した各プラスミドを鋳型として、F1 primer (ATCTCGATCC CGCGAAATTA ATACGA)（配列番号１９）からR1 primer (TCCGGATATA  GTTCCTCCTT  TCAG)（配列番号２０）までの配列をPCRにより増幅し、アガロースゲル電気泳動後に目的のバンドを切り出し、エタノール沈殿したものを、転写翻訳反応の鋳型とした。PCR反応液の組成はLA Taq(宝酒造) 0.5μl、10×反応バッファー 5μl、2.5mM dNTP mix 4μl、25 mM MgCl2 4μl、100pmol/μlプライマーF 0.5μl、100pmol/μlプライマーR 0.5μl テンプレートDNA 50ngに滅菌蒸留水を加えて50μlにした。反応サイクルは、94℃ 5minの後94℃ 30sec、60℃ 30sec、72℃ 2minを30サイクル後、72℃を７min行った。増幅したDNA断片は全て、5'側に、T7プロモーター配列（AATACGACTCACTATA：配列番号２１）、リボソーム結合サイト（AAGGAG）を持ち、NdeIサイトのATGから翻訳が開始し、各種エンドグルカナーゼ成熟タンパク質に相当するｃDNA配列が続き、終始コドンの後にXhoIサイトが入る。さらに3’側にT7ターミネーター配列（CTAGCATAAC CCCTTGGGGC CTCTAAACGG GTCTTGAGGG GTTTTTTG）（配列番号２２）配列を持つように設計されている。増幅した領域の塩基配列（Pccel 12A  ATCC64314、Tr EGII、Tr EGIII及びPccel 12A  AY682744）（配列番号２３、２５、２７及び２９）を図４〜図７に示した。
【実施例９】
【０１１９】
（各種のセルラーゼタンパク質の無細胞合成と活性測定）
Ｔ７プロモーター配列の下流にPccel 12A  ATCC64314、Pc-cel 12A AY682744、TrEGII及びTrEGIIIを結合したＰＣＲ産物各２μｌを鋳型として以下に示す組成の無細胞タンパク質合成反応液８μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ 大腸菌ｓ３０抽出液、５６．４ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸 ｐＨ７．４、１．２ｍＭ ＡＴＰ、１．２ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ＵＴＰ、４０ｍＭ クレアチンリン酸、ｐＨ７．４、０．７ｍＭ ２０アミノ酸ミックス、４．１％（ｗ／ｗ）ポリエチレングリコール６０００、３５μｇ／ｍｌ フォリン酸、０．２ｍｇ／ｍｌ 大腸菌ｔＲＮＡ、３６ｍＭ 酢酸アンモニウム、０．１５ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１０μｇ／ｍｌリファンピシリン、７．７μｇ／ｍｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）に加え、転写・翻訳共役反応を行った。
【０１２０】
各合成産物各１μｌ及び対照ウェルにおいて得られた合成産物各１μｌを、ｐＨ２．０、ｐＨ２．５、ｐＨ３．０、ｐＨ４．０、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０及びｐＨ７．０となるようにそれぞれ調整した０．５％ＣＭＣ、１％乳酸溶液５００μｌに添加して、３０℃で１６時間反応させた。反応後、ＴＺ法（Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11（1985）にて還元糖量を定量した。その後、各タンパク質毎に最も活性の高かったｐＨでの還元糖量を１００％として相対活性を求めた。結果を図８に示す。
【０１２１】
図８に示すように、Pccel 12A  ATCC64314は、TrEGII、TrEGIIIに対して高い耐酸性を示し、Pc-cel 12A AY682744は全ｐＨにわたり還元糖の生成が認められなかった。
【実施例１０】
【０１２２】
さらに、実施例９で得られた各合成産物につき、ｐＨ２．０、ｐＨ２．５、ｐＨ３．０、ｐＨ４．０及びｐＨ５．０となるようにそれぞれ調整した０．１％ＣＭＣ、１％乳酸を含む１％寒天培地上に滴下重層し、３０℃で１６時間〜１８時間反応させた。反応後染色液（１％コンゴーレッド、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ９．０)）を寒天上に滴下重層し、３０分間染色反応させた。その後、染色液を取り除き、１Ｍ ＮａＣｌを滴下重層し、エンドグルカナーゼ反応部分が脱色されハローが形成されるまで脱色反応を行った。ハローが形成されたプレートの画像をデジタルカメラにより撮影して、取得した画像を画像処理ソフトを用いて２値化し、白黒反転を行った。得られた画像によりハロー部分をデンシトメーター分析（ＮＩＨ Image １．６）により数値化した。Pccel 12A  ATCC64314のｐＨ２．０でのハローのデンシドメーター分析数値を１として、各ハローのデンシトメーター分析結果を換算し相対活性を求めた。結果を図９に示す。
【０１２３】
図９に示すように、Pccel 12A  ATCC64314はｐＨ２〜５の全域において最も高い活性を示した。一方、Pc-cel 12A AY682744は全くハローが形成されなかった。以上のことから、Pc-cel 12A AY682744がコードするタンパク質はセルラーゼ活性を有していないことが明らかとなった。また、今回取得したPccel 12A  ATCC64314がコードするタンパク質は、公知のセルラーゼタンパク質として比較して高いエンドグルカナーゼ活性と高い酸安定性を有する新規セルラーゼであることが明らかとなった。また、アミノ酸配列の比較で最も相同性の高いアミスタケ（Poyporous arcularius）の エンドグルカナーゼ（dbj BAD98315.1）で７０％であるから、アミノ酸配列上も報告のない新規のエンドグルカナーゼである。
【実施例１１】
【０１２４】
（Pccel 12A  ATCC64314遺伝子の変異体ＤＮＡライブラリの作製）
Pccel 12A  ATCC64314遺伝子を発現ベクターpET23bに挿入したものを鋳型として用いて、無細胞タンパク質合成用に用いるDNA断片の増幅を行った。すなわち、実施例６で作製したプラスミドを鋳型として、F1 primer (ATCTCGATCC CGCGAAATTA ATACGA)（配列番号１９）からR1 primer (TCCGGATATA GTTCCTCCTT TCAG)（配列番号２０）までの配列をエラープローンPCR（１０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０５０ｍＭ、ＫＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，５−１０ｍＭ、ＭｇＣｌ2、０．５〜２．０ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰ、１〜１００ｎｇ／μｌ ＭｎＰ、０．３μＭ プライマー、２５ｍＵ／μｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）により増幅し、１００塩基あたり平均０．５個の変異（エラー率０．５％）をランダムに導入した変異ＤＮＡライブラリを作製した。
【実施例１２】
【０１２５】
Pccel 12A  ATCC64314遺伝子の変異体ライブラリから変異体タンパク質の無細胞合成
実施例１０で作製した変異体ライブラリのウェルにつき、平均２分子／ウェルまで希釈後に、ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼを用いて、９４℃で２分の後、９６℃で１０秒、（Ｔｍ−５)℃で５秒、７２℃で１分を６５サイクル行い、７２℃で７分 ＲＣＲを行った。ＰＣＲ産物各２μｌを鋳型として、以下に示す組成の無細胞タンパク質合成反応液８μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ 大腸菌ｓ３０抽出液、５６．４ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸 ｐＨ７．４、１．２ｍＭ ＡＴＰ、１．２ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ＵＴＰ、４０ｍＭ クレアチンリン酸、ｐＨ７．４、０．７ｍＭ ２０アミノ酸ミックス、４．１％（ｗ／ｗ）ポリエチレングリコール６０００、３５μｇ／ｍｌ フォリン酸、０．２ｍｇ／ｍｌ 大腸菌ｔＲＮＡ、３６ｍＭ 酢酸アンモニウム、０．１５ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１０μｇ／ｍｌリファンピシリン、７．７μｇ／ｍｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）に加え、転写・翻訳共役反応を行い、変異体タンパク質のライブラリを作製した。
【実施例１３】
【０１２６】
（Pccel 12A  ATCC64314遺伝子の高活性変異体のスクリーニングその１）
実施例１１の各ウェルにおいて得られた合成産物各１μｌをｐＨ２．０、２．５となるようにそれぞれ調整した０．１％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）及び１％乳酸を含む１％寒天培地上に滴下して、３０℃で１６〜１８時間反応させた。反応後染色液（１％コンゴーレッド、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ９．０)）を寒天上に滴下重層し、３０分間染色反応させた。その後、染色液を取り除き、１Ｍ ＮａＣｌを滴下重層した。形成したハローの大きさから相対活性を求め、エンドグルカナーゼ活性を評価した（一次スクリーニング）。なお、ハローの大きさに基づく相対活性は、実施例１０と同様に行った。
【０１２７】
実施例１２で作製したサンプル９２１６個についてエンドグルカナーゼ活性を評価したところ、高活性変異体として、変異体３、４、５、１９及び９３を取得した。
【実施例１４】
【０１２８】
（Pccel 12A  ATCC64314遺伝子の高活性変異体のスクリーニングその２）
実施例１２で取得した変異体について、ｐＨ２．０、ｐＨ２．５、ｐＨ３．０、ｐＨ４．０及びｐＨ５．０となるようにそれぞれ調整した０．１％ＣＭＣ、１％乳酸を含む１％寒天培地上に滴下して、実施例１２と同様にしてハローの大きさから相対活性を求め、エンドグルカナーゼ活性を評価した(二次スクリーニング)。なお、同時に、Pccel 12A  ATCC6431、TrEGII、TrEGIIIについても無細胞合成タンパク質合成を行い、エンドグルカナーゼ活性を評価した。結果を図１０及び１１に示す。
【０１２９】
図１０及び図１１に示すように、各変異体は、変異前(Pccel 12A  ATCC64314）に比較してそれぞれエンドグルカナーゼの相対活性が、上昇した。すなわち、これら変異体は、変異前のPccel 12A  ATCC64314に比較して、ｐＨ４以下、特にｐＨ３以下、さらにｐＨ２．５以下において相対活性の上昇が明らかであった。変異体１１については、ｐＨ２．０で４．４倍、ｐＨ２．５で２倍、ｐＨ３．０で２倍、ｐＨ４．０で１．５倍に上昇していることがわかった。また、変異体１２は、ｐＨ２．０のとき、２．８倍に上昇し、変異体１４は、ｐＨ２．０のとき、２．３倍に上昇した。変異体１９はｐＨ２．０のとき１．４倍に上昇した。変異体９３はｐＨ２．０で２．２倍、ｐＨ２．５で１．６倍に上昇した。
【０１３０】
図１及び図２から明らかなように、これらの変異体は、Trichoderma reesei由来のEGII及びEGIIIに対しても、ｐＨ４以下、特にｐＨ３以下、さらにはｐＨ２．５以下で高い相対活性を有していることがわかった。
【０１３１】
これらの変異体１１，１２，１４，１９及び９３についてのアミノ酸配列を解析したところ、配列番号４〜８に示すとおりであった。各変異体における変異箇所を図１２に示す。
【実施例１５】
【０１３２】
（Phanerochaete chrysosporium由来エンドグルカナーゼ及びその改変体の酵母表層への提示）
本実施例では、Pccel 12A  ATCC64314の酵母の表層提示用のプラスミドを作製し、酵母を形質転換し、酵母表層でのPccel 12A  ATCC64314のエンドグルカナーゼ活性を評価した。表層提示用プラスミドは以下のようにして作製した。すなわち、サブクローニングされたPccel 12A  ATCC64314断片を、S. cerevisiaenoのＨＯＲ７プロモーターをコードするＤＮＡの下流に、Pccel 12A  ATCC64314断片又は実施例１で得られた変異体１１遺伝子断片をコードするＤＮＡを結合し、さらに下流にサッカロマイセス・セレビジエのＳＡＧ１遺伝子の３’側及びＳＡＧ１ターミネーターをコードするＤＮＡを備えるようにプラスミドを作製した。作製したプラスミドＤＮＡ（ｐＸｂＧ−ＨＯＲ７ｐ−Pccel 12A ）を図１３に示す。
【０１３３】
作製したプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｓｓｅ ８３８７Ｉで切断して得られたＤＮＡを、ＢＧＬ株（特願２００２−３６２８９１号に記載の酵母Ｔ１６５株（Ｌ−乳酸合成酵素を発現するように形質転換されている）にPhanerochaete chrysosporium由来のβグルコシダーゼ遺伝子を表層提示した株）のブレオマイシン耐性遺伝子領域にインテグレーションすることによりPccel 12A  ATCC64314及びその変異体１１タンパク質をそれぞれ細胞表層に提示する株（Pccel 12A 株及びPccel 12A -M11株）を作製した。遺伝子が導入された株は、Ｇ４１８により選抜した。
【０１３４】
作製したPccel 12A 株及びPccel 12A −Ｍ１１株をＹＰＤ培地で２日間培養を行った。培養液から遠心分離により酵母菌体を回収後、菌体を滅菌水で３回洗浄した。菌体をＯＤ１０となるように基質溶液１（０．５％βグルカン、１％乳酸、２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ２．９））又は基質溶液２（０．５％βグルカン、２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．１））に菌体を添加した。菌体添加後、５０℃酵素反応を行い、４時間後に反応により生じたβグルカンの還元糖末端量をソモギ−ネルソン法で、セルラーゼ活性(βグルコシダーゼ及びエンドグルカナーゼ活性)を測定した。なお、ＢＧＬ株についても同様に培養してセルラーゼ活性を測定した。結果を図１４に示す。なお、図１４において、１Ｕは、菌体１ｇ、１時間あたりに１ｍｇの還元糖(グルコース当量)が生成する単位を示す。なお、本実施例で用いたβグルカンは、大麦のβグルカン（barley β-glucan (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)）であり、可溶性の直鎖状多糖で、平均１２００個のグルコースで構成され、結合はβ１−４結合を７０％、β１−３結合を３０％含んでいる。
【０１３５】
図１４に示すように、基質溶液１（ｐＨ２．９）を用いたとき、Pccel 12A −Ｍ１１株は、Pccel 12A  株に比較して高い活性を示した。また、Pccel 12A −Ｍ１１株は、基質溶液１（ｐＨ２．９）を用いたとき、基質溶液２（ｐＨ５．１）に比べて高い活性を示すことが明らかとなった。すなわち、酵母表層に提示されたＭ１１変異体タンパク質は、実施例１３及び後述する実施例１６において示すＭ１１変異体タンパク質単独でのエンドグルカナーゼ活性のｐＨプロファイルとは異なる傾向を示している。また、Pccel 12A 株は基質溶液１及び基質溶液２のセルラーゼ活性はほぼ同等であった。以上のことから、Ｍ１１変異体タンパク質は、酵母表層に提示されることにより、酸性条件下においてより安定化され、高いエンドグルカナーゼ活性を呈し、βグルコシダーゼと協同することにより高いセルラーゼ活性を呈することがわかった。また、このようなｐＨプロファイルの変化は、Pccel12A株においても同様に観察された。これらのことから、酵母の細胞表層提示時におけるｐＨプロファイルの変化、すなわち、耐酸性の向上は、Pccel 12A 及びその変異体に共通する特徴であると考えられた。
【実施例１６】
【０１３６】
（改変酵素のセルラーゼ活性）
Ｔ７プロモーター配列の下流にPccel 12A 、Pccel 12A 変異体１１遺伝子、Trichoderma reesei由来ＥＧＩＩ及びTrichoderma reesei由来ＥＧＩＩＩのそれぞれを結合した各ＰＣＲ産物２μｌを鋳型として以下に示す組成の無細胞タンパク質合成反応液８μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ 大腸菌ｓ３０抽出液、５６．４ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸 ｐＨ７．４、１．２ｍＭ ＡＴＰ、１．２ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ＵＴＰ、４０ｍＭ クレアチンリン酸、ｐＨ７．４、０．７ｍＭ ２０アミノ酸ミックス、４．１％（ｗ／ｗ）ポリエチレングリコール６０００、３５μｇ／ｍｌ フォリン酸、０．２ｍｇ／ｍｌ 大腸菌ｔＲＮＡ、３６ｍＭ 酢酸アンモニウム、０．１５ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１０μｇ／ｍｌリファンピシリン、７．７μｇ／ｍｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）に加えて、転写・翻訳共役反応を行い、各種タンパク質を合成した。合成産物各１μｌを、ｐＨ２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、６．０及び７．０となるようにそれぞれ調整した０．５％ＣＭＣ、１％乳酸溶液５００μｌに添加して３０℃で１６時間反応させた。反応後、ＴＺ法（Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11（1985）、109-115）で還元糖量を定量した。結果を図１５に示す。
【０１３７】
図１５に示すように、実施例１４におけるハロアッセイの結果と同様に、Pccel 12A 変異体１１は、Pccel 12A に対して、ｐＨ２以上７以下の全範囲において高いエンドグルカナーゼ活性を示した。特に、ｐＨ２以上であって、ｐＨ４以下において、より顕著にはｐＨ３以下、さらに顕著にはｐＨ２．５以下において高いエンドグルカナーゼ活性を示した。
【０１３８】
以上の実施例１３〜１６から、Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼの改変体、特に変異体１１は、Pccel 12A 及びTrichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼよりも高いエンドグルカナーゼ活性を有することがわかった。また、Pccel 12A 変異体は、酵母の細胞表層に提示することで、酸性条件下でより安定化され、酸性条件下でより高いエンドグルカナーゼ活性を呈するとともに、βグルコシダーゼ等の他種のセルラーゼと協同してより高いセルラーゼ活性を呈することがわかった。
【０１３９】
また、変異体１１等についての解析結果から、配列番号２における１０７位、１２６位及び２０１位等が酸性条件下でのエンドグルカナーゼ活性の向上に寄与していることが認められた。なかでも、Ｑ１０７Ｐ及びＶ２０１Ａ等の１０７位及び２０１位における疎水性アミノ酸残基へ置換ないし配置が重要な要素であることが推定された。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】クローニングされたPccel 12A のアミノ酸配列とデータベース上において公開されているPhanerochaete chrysosporiumのアミノ酸配列（GenBankアクセッション番号AY682744）との対比を示す図である。
【図２】Pccel 12A  遺伝子配列のスキームを示す図である。
【図３】取得したPccel 12A  ATCC64314由来のタンパク質と他のエンドグルカナーゼのアミノ酸配列アラインメント結果を示す図である。
【図４】無細胞タンパク質合成系に用いるPccel 12A  ATCC64314の鋳型ＤＮＡの塩基配列を示す図である。
【図５】無細胞タンパク質合成系に用いるTr EGIIの鋳型ＤＮＡの塩基配列を示す図である。
【図６】無細胞タンパク質合成系に用いるTr EGIIIの鋳型ＤＮＡの塩基配列を示す図である。
【図７Ａ】無細胞タンパク質合成系に用いるPc-cel 12A AY682744の鋳型ＤＮＡの塩基配列の５’側を示す図である。
【図７Ｂ】無細胞タンパク質合成系に用いるPc-cel 12A AY682744の鋳型ＤＮＡの塩基配列の３’側を示す図である。
【図８】無細胞タンパク質合成産物についての各ｐＨでの還元糖量に基づく相対活性を示す図である。
【図９】無細胞タンパク質合成産物についての各ｐＨでのハローアッセイに基づく相対活性を示す図である。
【図１０】一次スクリーニングされた変異体のハローアッセイによる二次スクリーニング結果を示すグラフ図である。
【図１１】一次スクリーニングされた変異体のハローアッセイによる二次スクリーニング結果を示す表である。
【図１２】一次スクリーニングされた変異体における配列番号１のアミノ酸配列に対する変異を示す図である。
【図１３】変異体１１を酵母の表層に提示するために用いた染色体組み込み型ベクターの構造を示す図である。
【図１４】作製した表層提示酵母によるセルラーゼ活性の測定結果を示す図である。
【図１５】無細胞合成系で合成した各種タンパク質についてのＴＺ法によるエンドグルカナーゼ活性の測定結果を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１４１】
配列番号４〜８：Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼの改変体タンパク質
配列番号９〜２０：合成プライマー
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図３】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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