(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性高分子が濃度勾配をつけてマイクロチップ上のマイクロチャンネル内に泳動液として充填されていることを特徴とするマイクロチップ電気泳動用装置。
【請求項２】
泳動液がさらに緩衝液を含有することを特徴とする請求項１記載のマイクロチップ電気泳動用装置。
【請求項３】
水溶性高分子が非架橋水溶性高分子であることを特徴とする請求項１または２記載のマイクロチップ電気泳動用装置。
【請求項４】
非架橋水溶性高分子の種類が２種以上であることを特徴とする請求項３記載のマイクロチップ電気泳動用装置。
【請求項５】
非架橋水溶性高分子が、ヒドロキシメチルセルロースおよび／またはメチルセルロースであることを特徴とする請求項３または４記載のマイクロチップ電気泳動用装置。
【請求項６】
泳動液全体に対するヒドロキシメチルセルロースの濃度が０．０１〜２．０％（ｗ／ｗ）、ヒドロキシメチルセルロースの濃度が０．２〜２．０％（ｗ／ｗ）であって、両者の体積比が０．１〜１０：０．１〜１０であることを特徴とする請求項５記載のマイクロチップ電気泳動用装置。
【請求項７】
泳動液全体に対するメチルセルロースの濃度が０．０１〜０．５％（ｗ／ｗ）、メチルセルロースの濃度が０．６〜２．０％（ｗ／ｗ）であって、両者の体積比が０．１〜５：０．２〜１０であることを特徴とする請求項５記載のマイクロチップ電気泳動用装置。
【請求項８】
泳動液全体に対するメチルセルロースの濃度が０．０１〜２．０％（ｗ／ｗ）、ヒドロキシメチルセルロースの濃度が０．０１〜０．６０、およびヒドロキシメチルセルロースの濃度が０．６１〜２．０％（ｗ／ｗ）で、三者の体積比が０．１〜５：０．１〜１０：０．１〜１０であることを特徴とする請求項５記載のマイクロチップ電気泳動用装置。
【請求項９】
水溶性高分子が濃度勾配をつけてマイクロチップ上のマイクロチャンネル内に泳動液として充填されているマイクロチップ電気泳動装置を用いることを特徴とするマイクロチップ電気泳動方法。
【請求項１０】
水溶性高分子の濃度が異なる泳動液を１種類ずつ順番にマイクロチャンネル内に充填することを特徴とする請求項９に記載のマイクロチップ電気泳動方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マイクロチップ電気泳動用装置に関する。さらに詳細には、電気泳動用マイクロチップの微細流路（以下マイクロチャンネルと略す）内に泳動液が充填されており、水溶性高分子が泳動液の成分であって、しかもマイクロチップ内で水溶性高分子が段階的な濃度勾配を有することを特徴とする、マイクロチップ電気泳動用装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
キャピラリー電気泳動（Capillary Electrophoresis；以下ＣＥと略す）は核酸の分離に広く用いられており、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）産物の分析、制限酵素断片の分離およびＤＮＡのシークエンスなどにおいて有効であることが明らかとなっている（例えばCohen,A.S.;Najarian,D.;Smith,J,A.;Karger,B.L.J.Chromatogr.1988,458,323-333、Kheterpal,I.;Mathies,R.A.Anal.Chem.1999,31A-37A、Heller,C.Electrophoresis,2001,22,629-643など）。そのため、キャピラリー電気泳動は、ヒトゲノム計画（Human Genome Project ; ＨＧＰ）において重要な役割をはたしている。
しかしながら、近年、マイクロ素子の製造技術およびエレクトロニクス産業の発展によって分析機器の小型化が可能となったことから、取り扱いが煩雑なガラスキャピラリーに代わって、分析の高速化、装置の小型化、薬品およびサンプルの消費量の減少などが期待できる形態として、D.J.Harrison et al./Science 261(1993)895-897やAnal.Chim.Acta283(1993)361-366に示されているように、２枚の基板を接合して形成されたチップ（特に、マイクロチップ）が提案されている。
【０００３】
従来のマイクロチップ電気泳動においては、一般にＤＮＡサンプルは固定された濃度で１種類のマトリックスによって分離されている。そのため、サンプルＤＮＡが様々なｂｐ（ベースペア）の断片から構成されている複合ＤＮＡである場合、小さい断片と大きい断片との分離能は必ずしも満足するものではなく、従って小さい断片と大きい断片を同時に分離して採取することは困難であった。同じ問題がＣＥでもみられ、それを解決するために、例えば緩衝液中に数種の高分子を混合する方法（例えばLiang,D.H.;Chu,B.Electrophoresis,1998,19,2447-2453、Liang,D.H.;Song,L.G.;Zhou,S.Q.;Zaitsev,V.S.;Chu,B.Macromolecules,1999,20,6326-6332など）や電場勾配を用いる方法（例えばLuckey,J.A.;Smith,L.M.Anal.Chem.1993,65,2841-2850、Endo,Y.;Yoshida,C.;Baba,Y.J.Biochem.Biophys.Methods 1999,41,133-141など）などが提案されている。しかし、ＣＥにおける高分子溶液の段階的な濃度勾配は電気浸透流（electroosmotic flow；ＥＯＦ）の存在下のみで可能なものであった（例えばChen H-S.;Chang H-T.J.Chromatogr.A,1999,853,337-347、Chen H-S.;Chang H-T.J.Chromatogr.A,1999,853,337-347など）。
キャピラリーの内表面がマイナスに荷電している場合、プラス荷電のイオンや粒子がキャピラリー内壁面付近に集まるため、電場がかけられるとキャピラリー内表面付近ではイオンや粒子のマイナス電極側への流れが生じてしまう。ＥＯＦは、その流れを是正するためにキャピラリー中央部で生じる逆方向の流れのことである。
【０００４】
ＥＯＦによってサンプルが運ばれる速度は、数μｍ／ミリ秒程度であるが、高電圧の切り替えの遅れによってサンプル領域（サンプルプラグともいう）は数μｍから数十μｍも動いてしまう。一般にサンプルプラグの大きさは数十μｍであることから、高電圧の切り替えの遅れによるサンプルプラグの移動が原因で、サンプルプラグの広がりや分析精度の低下など好ましくない現象が誘起されるという問題があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記課題に鑑み、水溶性高分子マトリックスの段階的な濃度勾配を容易に電気泳動用マイクロチップで形成させることで、ＥＯＦの存在なしにサンプルの分離能と分析精度を改善することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、水溶性高分子が濃度勾配をつけてマイクロチップ上のマイクロチャンネル内に充填されていることを特徴とするマイクロチップ電気泳動用装置の製作に成功し、それを用いることによってＥＯＦの存在なしでもサンプルの分離能が改善され、かつ検出精度がよくなることを知見し、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）  水溶性高分子が濃度勾配をつけてマイクロチップ上のマイクロチャンネル内に泳動液として充填されていることを特徴とするマイクロチップ電気泳動用装置、
（２）  泳動液がさらに緩衝液を含有することを特徴とする上記（１）記載のマイクロチップ電気泳動用装置、
（３）  水溶性高分子が非架橋水溶性高分子であることを特徴とする上記（１）または（２）記載のマイクロチップ電気泳動用装置、
（４）  非架橋水溶性高分子の種類が２種以上であることを特徴とする上記（３）記載のマイクロチップ電気泳動用装置、
（５）  非架橋水溶性高分子が、ヒドロキシメチルセルロースおよび／またはメチルセルロースであることを特徴とする上記（３）または（４）記載のマイクロチップ電気泳動用装置、
（６）  泳動液全体に対するヒドロキシメチルセルロースの濃度が０．０１〜２．０％（ｗ／ｗ）、ヒドロキシメチルセルロースの濃度が０．２〜２．０％（ｗ／ｗ）であって、両者の体積比が０．１〜１０：０．１〜１０であることを特徴とする上記（５）記載のマイクロチップ電気泳動用装置、
（７）  泳動液全体に対するメチルセルロースの濃度が０．０１〜０．５％（ｗ／ｗ）、メチルセルロースの濃度が０．６〜２．０％（ｗ／ｗ）であって、両者の体積比が０．１〜５：０．２〜１０であることを特徴とする上記（５）記載のマイクロチップ電気泳動用装置、
（８）  泳動液全体に対するメチルセルロースの濃度が０．０１〜２．０％（ｗ／ｗ）、ヒドロキシメチルセルロースの濃度が０．０１〜０．６０、およびヒドロキシメチルセルロースの濃度が０．６１〜２．０％（ｗ／ｗ）で、三者の体積比が０．１〜５：０．１〜１０：０．１〜１０であることを特徴とする上記（５）記載のマイクロチップ電気泳動用装置、
（９）  水溶性高分子が濃度勾配をつけてマイクロチップ上のマイクロチャンネル内に泳動液として充填されているマイクロチップ電気泳動装置を用いることを特徴とするマイクロチップ電気泳動方法、
（１０）  水溶性高分子の濃度が異なる泳動液を１種類ずつ順番にマイクロチャンネル内に充填することを特徴とする上記（９）に記載のマイクロチップ電気泳動方法、
に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
マイクロチップ電気泳動は、例えばエレクトロニクスの分野で広く用いられているマイクロチップに形成した幅および深さが例えば数〜１００μｍ程度の溝内で電気泳動を行うことによって、特にＤＮＡを分離するのに有効な手法である。分離に用いる分離流路の長さは数ｃｍであることが多いことから、泳動時間は通常、短時間（数秒から数十秒）で行われる。マイクロチップは回路設計に自由度が高く、複数の流路を同一のチップに並べて形成することによるマルチキャピラリー化が容易であることから、処理能力を高めることが容易であるという利点を有する。
【０００９】
本発明におけるマイクロチップ電気泳動装置は、自体公知のものを用いてよい。また、市販の装置を用いることもでき、例えばＨＩＴＡＣＨＩ  ＬＥＤ検出器付きＳＶ１１００マイクロチップ電気泳動装置（日立エレクトロニクスエンジニアリング社製）などが挙げられる。より具体的に、装置の一態様を図１を用いて以下に説明する。
電気泳動用マイクロチップ１は、ガラス板、石英板などから成る一対の基板２、３から構成される（図１（Ａ））。下側の基板２の上表面には、それぞれ試料導入流路４と分離流路５とが交差する（これを「交差部７」とする）ように形成され（図１（Ｃ））、上側の基板（以下、カバー体と略す）３にはその両溝４，５の各端部に対応する位置にそれぞれ貫通孔６が穿孔されている（図１（Ｂ））。溝４、５は、基板２の表面にエッチングにより形成されている。
【００１０】
電気泳動用マイクロチップ１は、上述の一対の基板２、３が溝４、５を内側にして貼りあわされることにより、貫通孔６により形成される第１および第２リザーバＲ１、Ｒ２でもって外部と連通する試料導入流路４と、第３および第４リザーバＲ３、Ｒ４でもって外部と連通する分離流路５とが内部に形成されている。各リザーバＲ１〜Ｒ４は、図１に示すように、外部より泳動液などの液体を導入するためのキャピラリ（毛細管）を受け入れるようになっており、また、そこに貯留している泳動液に電圧を印加するための電極（図示しない）がそれぞれ設けられている。
【００１１】
本発明に用いられる電気泳動用マイクロチップは、例えばレーザー加工、イオンエッチング加工、光リソグラフィーなどを利用することで約１０〜１００μｍ程度の幅、深さ約５〜５０μｍ程度のマイクロチャンネルが形成された、例えばガラスやアクリルからなる一対の基板で構成されている。上記基板としては、マイクロチャンネルの形成加工が可能であって、耐薬剤性に優れ、適度な剛性をも備えたものから選択することが考慮され、例えばガラス、石英、セラミックス、シリコンあるいは金属、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）などの高分子材料などの材料であってよい。カバー体についても同様である。ただし、光分析の適用などを考慮する場合には、透明性の高いものが好ましい。
【００１２】
基板は単一あるいは多層積層体であってもよい。また、基板とカバー体とは、熱処理接合により、あるいは接着などの手段により積層一体化することができる。またこの積層時には、基板の補強のために、カバー体と反対の側に支持体を積層一体化してもよい。
【００１３】
試料注入用小穴、排出用小穴、さらには作用剤注入用小穴がカバー体に配置される場合には、これらは、その径が数ｍｍ以下であることが例えば例示される。ここで、作用剤としては各種のものであってよいことが留意され、例えば溶媒抽出用の溶媒、反応用試薬、あるいは希釈剤などである。これらの小穴の加工は、化学的に、機械的に、あるいはレーザー加工やイオンエッチング加工などの各種の手段によって可能とされる。
【００１４】
マイクロチャンネルは、たとえばレーザー加工、イオンエッチング加工などの手段によって形成することができる。マイクロチャンネルの長さは特に限定されるものではなく、必要に応じて任意に設定することができるものであるが、好ましくは約１５〜３０ｍｍ程度の長さに設定される。マイクロチャンネルの幅および深さは特に限定されるものではないが、好ましくは幅は約１０〜１００μｍ程度、深さは約５〜１０μｍ程度である。マイクロチャンネルの形としては、例えば十字型のものが挙げられるが、その他の形のものを用いてもよい。
【００１５】
マイクロチャンネルは、試料注入用小穴などのカバー体に設けた小穴でのみ外界と通じた状態になる。このため、マイクロチャンネル内に流通される流体は外部条件に左右されることが少なく、より安定した微細流となる。マイクロチャンネル内への通液は、例えばキャピラリーやゴムチューブなどの導管を通じて可能とされる。キャピラリーやゴムチューブなどの導管を通しての通液は、該導管の一端は試料注入用小穴、排出用小穴、さらには作用剤注入用小穴に挿入されているため、溶液は導管の多端にマイクロシリンジなどを取り付け、シリンジを押圧などすることによって可能となる。その他にマイクロポンプなどの機械的手段や電気振とう手段などによって、あるいは排出用小穴での吸引などによって可能となる。
【００１６】
本発明においては、分離流路内に水溶性高分子を含有する泳動液を充填して電気泳動する方法が好ましい。本発明における泳動液は、水溶性高分子および緩衝液を含有することによって、泳動液中の高分子の絡み合いによる網目構造や、該水溶性高分子とＤＮＡとの相互作用により、特定の高次構造をもつＤＮＡを分離することができる。この方法を用いることにより、該水溶性高分子の種類または濃度を変えるだけで、異なった選択性の分離を行うことができる。
【００１７】
上記水溶性高分子としては、好ましくは非架橋水溶性高分子が用いられ、具体的には例えばアガロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（以下、ＨＰＭＣと略す）、ヒドロキシセルロース、メチルセルロース（以下、ＭＣと略す）などのセルロース誘導体、プルラン、デキストランなどの多糖類、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリグリセリンなどのポリオール類などが挙げられる。好ましくは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）およびメチルセルロース（ＭＣ）である。
【００１８】
上記水溶性高分子と混合させる緩衝液としては、例えばトリス緩衝液、フタル酸緩衝液、ホウ酸−トリス緩衝液などを用いることができ、市販されているものを用いてもよい。そのような市販品としては、例えばホウ酸−トリス緩衝液（関東化学（株）社製）などが挙げられる。
水溶性高分子と緩衝液を混合して泳動液を調整する方法としては、濃度が異なる水溶性高分子を２種以上用意し緩衝液と混合させたものを、好ましくは均等な体積比で１種類ずつ充填していくのが望ましい。泳動液を充填する順番としては、濃度の高いものから順にいれてもよいし、また濃度の低いものから順にいれてもよい。緩衝液と水溶性高分子の混合物は、水溶性高分子の濃度が高いものほど粘性が高くなり、粘性によって抵抗が生じるためマイクロチャンネル内に段階的な勾配が形成される。
充填された水溶性高分子の濃度の高い泳動液と、その後に充填された水溶性高分子の濃度がより低い泳動液は、マイクロチャンネル内で境界をもって接しているが、マイクロチャンネルの径が極小であるため、両者が拡散してまじりあうことがない。異なる泳動液の境界線は目視できる。
【００１９】
上記水溶性高分子を含有する泳動液には、当業界で知られている他の成分が含有されていてもよい。そのような他の成分としては、例えばＤＮＡにインターカレーションする成分が挙げられる。これにより電気泳動の分離能が改善するため、本発明においては該成分を含有させるのが好ましい。ＤＮＡにインターカレーションする成分とは、通常、例えばアクリジン色素のような２本鎖ＤＮＡに挿入される平面状分子を意味するが、本発明においては高次構造を有する一本鎖に挿入される分子をも含む概念である。
ＤＮＡにインターカレーションする成分としては、例えばエチジウムブロマイド（以下、ＥｔＢｒと略すことがある）、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎなどが挙げられる。本発明においては、好ましくはＥｔＢｒが約０．３〜３．０μｇ／ｍｌ程度、好ましくは約０．５〜１．０μｇ／ｍｌ程度用いられる。
【００２０】
前記キャピラリーなどの導管を用いることによって、マイクロチャンネル内に泳動液が導入される。水溶性高分子含有泳動液は、好ましくは粘性の高いものから順にマイクロチャンネル内に導入される。導管としては、例えば約１００μｍ程度の内径を有するシリカキャピラリーチューブ、ゴムキャピラリーチューブなどが挙げられ、市販されている電気泳動用チップキットに含まれているキャピラリーを用いてもよい。
【００２１】
本発明の電気泳動に用いることのできる試料は、例えば様々なサイズのＤＮＡ断片をはじめとする核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質などの有機分子、金属イオンなどが挙げられる。また、遺伝子の一部をＰＣＲ法により増幅し、得られた二本鎖ＤＮＡ（以下、ＰＣＲ産物という）を熱処理などにより一本鎖ＤＮＡに解離したものも用いることができる。
ＤＮＡは例えばDnase-free水、Rnase-free水などによって希釈して用いるのが好ましい。
【００２２】
試料小穴への試料の注入方法としては、特に問わないが、具体的には注射器を用いた注入法や、加圧法または電気泳動法などが挙げられる。注射器を用いた方法としては、上記泳動液をマイクロチャンネル内に充填する方法と同じ方法である。加圧法とは、窒素ガスなどにより試料貯槽Ｒ４に圧力を加えて試料の注入を行う方法である。電気泳動法とは、短い高圧電パルスをマイクロチャンネルを横切って印加することにより、試料を注入する方法である。本発明においては、注射器を用いる方法が好ましい。
【００２３】
電気泳動の泳動パターンを観察するために、ＰＣＲ産物などには蛍光物質などで標識しておき、該標識物質を目印に観察する方法と、ＰＣＲ産物を標識しないで電気泳動パターンを観察する方法とがある。前者のほうは、高感度で検出できるという利点がある。一方、後者は標識するためにＰＣＲを２回行う必要がないという利点がある。特に、ＤＮＡの紫外線吸収を測定する方法は、電気泳動後の泳動パターンを染色する必要もなく、最も簡便で迅速な方法である。染色方法は自体公知の方法を用いてよいが、具体的にはエチジウムブロマイド染色などが挙げられる。
エチジウムブロマイド染色は自体公知の方法に従って行えばよい（Ｍａｎｉｔｉｓらの１９８２年編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ）。
【００２４】
電気泳動の条件は、自体公知の条件に従ってよいが、例えば試料用注入用小穴にサンプルを注入した後、それぞれ電極を差し込むか、または予め各リザーバに形成された電極を用いて、試料導入流路の一端に所定時間だけ約３００Ｖ程度の高電圧を印加し他端をＧＮＤ電圧（接地）することによりサンプルを交差部に導く。次に分離流路の一端に約４００〜８００Ｖ程度、より好ましくは約５００〜７５０程度の電圧を印加し、他端を接地すると電位差によって、交差部に存在する試料が分離流路に導入され、泳動することで分離される。電気泳動時間は、用いる試料の塩基配列または温度などにより異なるため一概にはいえないが、数秒から数十秒程度である。また交差部でのサンプルの拡散を防ぐために、サンプルを交差部に導くときには分離流路に、またサンプルを分離するときには試料導入流路に弱い電圧をかけてもよい。
【００２５】
サンプルの検出は検出位置において行われ、例えばサンプルの成分と発光試薬との接触によって生じる発光を光電子増倍管で受光し、その発光強度に応じた電気信号が光電子増倍管から取り出せることにより測定する方法が挙げられる。あるいはＵＶオンカラム検出器、ダイオードアレイ検出器、フォトダイオード検出器、またはその吸収スペクトルを測定するフォトダイオードアレイ検出器を用いることもできる。
【００２６】
より詳しくは、上記マイクロチップ電気泳動装置を用いて、例えば以下のような手順で操作する。マイクロチップ電気泳動装置の両基板２、３を重ね、いずれかのリザーバ（複数でもよい）から緩衝液および水溶性高分子から成る泳動液を、各リザーバに設置されている外部より液体を導入するためのキャピラリの多端から例えば予防接種用注射器などを用いることで注入し、試料導入流路４および分離流路５に水溶性高分子を含有する泳動液を充填する。次に、第１リザーバ（試料注入点）Ｒ１へ所定量の微量のサンプルを注入するとともに、第３および第４リザーバ（作用剤注入点）Ｒ３、Ｒ４へ泳動液（例えば０．１Ｍトリス−ホウ酸緩衝液）を注入する。サンプルおよび泳動液の注入は、泳動液を充填した方法と同様にして行われる。
【００２７】
サンプル、泳動液および水溶性高分子を上記のように注入したのち、各リザーバにそれぞれ電極を差し込むか、または予め各リザーバに形成された電極を用いて、試料導入流路４の一端に所定時間だけ所定の高電圧を印加し（例えば３００Ｖを６０秒間）、他端をＧＮＤ電位（接地）にする。また、分離流路５の両端に低い電圧を印加して分離流路へのサンプルの拡散を抑制する（以後、分離流路では、泳動方向の基端側を一端、進行方向の端部を他端とする）。これによりサンプルは試料導入流路４を移動して、所定の電圧印加時間経過後、交差部７に導かれる。
【００２８】
次に、分離流路５の一端を約５５０〜７５０Ｖ程度の電圧を印加し、他端をＧＮＤ電位に切り替え、電荷、サイズなどの違いによりサンプルを分離する。このとき試料導入流路４の両端には例えば約１３０Ｖ程度の電圧を印加することで分離流路へのサンプルの拡散を抑制する。
【００２９】
上記の手順によってサンプルを分離流路５で分離したのち、分離流路５の他端側の検出位置で検出器により検出する。例えば分離流路５内を泳動する際にサンプルに含まれる成分は分離され、時間的にずれて第４リザーバＲ４に到達する。第３リザーバから入力される発光試料と接触し、分離流路５内で化学反応を生じて発光する。生じた発光を、光電子増倍管で受光し、その発光強度に応じた電気信号が光電子増倍管から取り出せることにより測定する方法が挙げられる。その他に、サンプルが紫外線を吸収する性質を利用して、約２００〜３００ｎｍの波長の吸収度変化をみるフォトダイオード検出器、またはその吸収スペクトルを測定するフォトダイオードアレイ検出器を用いることもできる。
また、ＤＮＡに蛍光標識をした場合には、蛍光放射検出を行うことができる。これにより、高感度の検出が可能になる。蛍光放射検出は、用いた蛍光物質によって異なるが、好ましくは約２４０〜６００ｎｍ程度の励起波長で行われる。電気泳動ピークを記録するため、検出器を積分器に連結する。
【００３０】
【実施例】
〔試験例１〕  ２０ｂｐのＤＮＡの分離に対するＭＣ濃度の効果
サンプルとしては、２０ｂｐＤＮＡ（ゲンスラ（GenSura）ラボラトリーズ社より購入）２μｇ／ｍｌをDNAase-free水（ＩＣＮ  バイオメディカルズ社製）で希釈したものを用いた。泳動液全体に対する濃度が０．１％（ｗ／ｗ）、０．３％（ｗ／ｗ）、０．５％（ｗ／ｗ）および０．７％（ｗ／ｗ）となるようＭＣ（２０℃で粘度２％の水溶液、シグマ化学（株）製）をそれぞれ５０ｍＭのホウ酸−トリス緩衝液（関東化学（株）製）に１００℃で加え、溶液が室温で均一かつ透明になるまで攪拌して、４種類の溶液を得た。得られた溶液におそれぞれ０．５μｇ／ｍｌＥｔＢｒ（日本遺伝子社製）を添加して、４種類の泳動液を作成した。
【００３１】
泳動は、ＨＩＴＡＣＨＩ ＬＥＤ検出器付きのＳＶ１１００マイクロチップ電気泳動装置（日立エレクトロクスエンジニアリング社製）を用いて行った。上記の方法で調製された４種類の泳動液を、ＨＩＴＡＣＨＩ電気泳動用チップキットのチューブを用いてチップ上のマイクロチャンネルに導入した。
サンプルは３００Ｖで６０秒間印加した。分離ボルト数は、サンプル、サンプルの排出用リザーバおよび陰極の緩衝液用リザーバは１３０Ｖにセットし、陽極は７５０Ｖで行った。
図２は、上記４種類の泳動液を用いて分離した２０ｂｐＤＮＡの電気泳動図（エレクトロフェログラム）を示している。
泳動液中のＭＣ濃度は小さすぎると適切な分離ができないが、ＭＣ濃度が大きくなるにつれて５００ｂｐまでの断片をよりよく篩い分けることができる。
【００３２】
〔試験例２〕  ＤＮＡの分離に対するＭＣ濃度および分離ボルト数の効果
サンプルとしては、０．５μｇ／ｍｌで最も高いピークを示す濃度のＤＮＡをDNAase-free水（ＩＣＮ  バイオメディカルズ社製）で希釈したものを用いた。泳動液全体に対する濃度が０．３％（ｗ／ｗ）、０．５％（ｗ／ｗ）、０．７％（ｗ／ｗ）および１．０％（ｗ／ｗ）となるようにＭＣ（２０℃で粘度２％の水溶液、シグマ化学（株）製）を５０ｍＭのホウ酸−トリス緩衝液（関東化学（株）製）に１００℃で加え、溶液が室温で均一かつ透明になるまで攪拌して、４種類の溶液を得た。得られた溶液に０．５μｇ／ｍｌＥｔＢｒ（日本遺伝子社製）を添加し、４種類の泳動液を得た。
【００３３】
泳動は、ＨＩＴＡＣＨＩ ＬＥＤ検出器（付きのＳＶ１１００マイクロチップ電気泳動装置日立エレクトロクスエンジニアリング社製）を用いて行った。上記の方法で調製された泳動液を、ＨＩＴＡＣＨＩ電気泳動用チップキットのチューブを用いてチップ上のマイクロチャンネルに導入した。
サンプルは３００Ｖで６０秒間印加した。分離ボルト数は、サンプル、サンプルの排出用リザーバおよび陰極の泳動液用リザーバは１３０Ｖにセットし、陽極は、最も低い場合にのみ５５０Ｖで泳動し、その他は７５０Ｖで泳動を行った。
図３は、ＭＣ濃度および分離ボルト数を変化させて分離したＤＮＡの電気泳動図（エレクトロフェログラム）を示している。
低濃度のＭＣ泳動液は大きいＤＮＡ断片の分離に適しており、高濃度のＭＣ泳動液は小さいＤＮＡ断片に適していることがわかる。従って、ＤＮＡサンプルの構成成分が広範囲のサイズのベースペアを有している場合には、低濃度および高濃度の泳動液を共存させて用いるのがよいことが分かる。
【００３４】
〔実施例１〕  無勾配条件下および勾配条件下での５０ｂｐＤＮＡの電気泳動
サンプルとしては、５０ｂｐＤＮＡ（ライフテクノロジーズ社より購入）をDNAase-free水（ＩＣＮ  バイオメディカルズ社製）で希釈したものを用いた。ＨＰＭＣをそれぞれ５０ｍＭのホウ酸−トリス緩衝液（関東化学（株）製）に１００℃で加え、溶液が室温で均一かつ透明になるまで攪拌し、得られた泳動液に、０．５μｇ／ｍｌＥｔＢｒ（日本遺伝子社製）を添加して、全体に対して０．３％（ｗ／ｗ）のＨＰＭＣを含む泳動液Ａと、０．７％（ｗ／ｗ）のＨＰＭＣを含む泳動液Ｂを得た。
泳動液Ａのみをマイクロチャンネルに充填した場合と、泳動液Ｂのみをマイクロチャンネルに充填した場合と、１／３重量部の泳動液Ａをマイクロチャンネルに充填し、その後に２／３重量部の泳動液Ｂをマイクロチャンネルに充填した場合とに分けて実験した。
【００３５】
泳動は、ＨＩＴＡＣＨＩ ＬＥＤ検出器のＳＶ１１００マイクロチップ電気泳動装置（日立エレクトロクスエンジニアリング社製）付きを用いて行った。上記の方法で調製された泳動液を、ＨＩＴＡＣＨＩ電気泳動用チップキットのチューブを用いてチップ上の分離チャンネルに導入した。
サンプルは３００Ｖで６０秒間印加した。分離ボルト数は、サンプル、サンプルの排出用バイアルおよび陰極の泳動液用バイアルは１３０Ｖにセットし、陽極は、５５０Ｖで泳動を行った。
図４は、無勾配条件下および勾配条件下で分離した小ＤＮＡの電気泳動図（エレクトロフェログラム）を示している。
図４から、０．７％ＨＰＭＣ泳動液では大きい断片の分離は乏しく、０．３％ＨＰＭＣ泳動液では小さい断片の分離が乏しかった。従って、小さい断片から大きい断片まで広範囲の大きさのＤＮＡ断片を分離するには、１：２の割合（ｗ／ｗ）の濃度勾配を有する０．７％および０．３％ＨＰＭＣ混合泳動液を用いるのがよいことがわかる。
【００３６】
〔実施例２〕  無勾配および勾配条件下でのφｘ１７４−ＨｉｎｄIII酵素切断断片の電気泳動
サンプルとしては、φｘ１７４−ＨｉｎｄIII酵素（宝酒造より購入）切断断片をDNAase-free水（ＩＣＮ  バイオメディカルズ社製）で希釈したものを用いた。ＭＣをそれぞれ５０ｍＭのホウ酸−トリス緩衝液（関東化学（株）製）に１００℃で加え、溶液が室温で均一かつ透明になるまで攪拌し、得られた泳動液に、０．５μｇ／ｍｌＥｔＢｒ（日本遺伝子社製）を添加して、全体に対して０．３％（ｗ／ｗ）のＭＣを含む泳動液Ａと、１．０％（ｗ／ｗ）のＭＣを含む泳動液Ｂを得た。
泳動液Ａのみをマイクロチャンネルに充填した場合と、泳動液Ｂのみをマイクロチャンネルに充填した場合と、１／２重量部の泳動液Ａをマイクロチャンネルに充填し、その後に１／２重量部の泳動液Ｂをマイクロチャンネルに充填した場合とに分けて実験した。
【００３７】
泳動は、ＨＩＴＡＣＨＩ ＬＥＤ検出器付きのＳＶ１１００マイクロチップ電気泳動装置（日立エレクトロクスエンジニアリング社製）を用いて行った。上記の方法で調製された泳動液を、ＨＩＴＡＣＨＩ電気泳動用チップキットのチューブを用いてチップ上のマイクロチャンネルに導入した。
サンプルは３００Ｖで６０秒間印加した。分離ボルト数は、サンプル、サンプルの排出用バイアルおよび陰極の泳動液用バイアルは１３０Ｖにセットし、陽極は、５５０Ｖで泳動を行った。
図５は、無勾配および勾配条件下でのφｘ１７４−ＨｉｎｄIII酵素切断断片のエレクトロフェログラムを示す。
ベースライン分離は０．３％ＭＣのみおよび１．０％ＭＣのみでは不十分であったことから、小さい断片と大きい断片の両方の分離を得るためには、勾配条件が必要があることがわかった。
さらに、１．０％ＭＣおよび０．３％ＭＣを１：２の比率で共存させると、271/281ｂｐの分離が改善され、1078/1353bpのベースライン分離も得られたが、１．０％ＭＣの添加量をさらに増加させると小さい断片の分離が改善され続ける一方で大きい断片は失われ始めた。
これらの結果から、勾配条件下の泳動液においては、最適な結果を得るためには異なるマトリックスの比をサンプルによって調節される必要があることが分かる。
【００３８】
〔実施例３〕  無勾配および３段階の勾配条件下での１００ｂｐＤＮＡの電気泳動
サンプルとしては、１００ｂｐＤＮＡ（ゲンスラ（GenSura）ラボラトリーズ社から購入）をDNAase-free水（ＩＣＮ  バイオメディカルズ社製）で希釈したものを用いた。ＨＰＭＣをそれぞれ５０ｍＭのホウ酸−トリス緩衝液（関東化学（株）製）に１００℃で加え、溶液が室温で均一かつ透明になるまで攪拌し、得られた泳動液に、０．５μｇ／ｍｌＥｔＢｒ（日本遺伝子社製）を添加して、全体に対して０．３％（ｗ／ｗ）のＨＰＭＣを含む泳動液Ａと、０．５％（ｗ／ｗ）のＨＰＭＣを含む泳動液Ｂおよび０．７％（ｗ／ｗ）のＨＰＭＣを含む泳動液Ｃを得た。
泳動液Ａのみをマイクロチャンネルに充填した場合と、泳動液Ｂのみをマイクロチャンネルに充填した場合と、泳動液Ｃのみをマイクロチャンネルに充填した場合と、１／３重量部の泳動液Ａを充填し、次に１／３重量部の泳動液Ｂを充填し、最後に１／３重量部の泳動液Ｃをマイクロチャンネルに充填した場合とにわけて実験した。
【００３９】
泳動は、ＨＩＴＡＣＨＩ ＬＥＤ検出器付きのＳＶ１１００マイクロチップ電気泳動装置（日立エレクトロクスエンジニアリング社製）を用いて行った。上記の方法で調製された泳動液を、ＨＩＴＡＣＨＩ電気泳動用チップキットのチューブを用いてチップ上のマイクロチャンネルに導入した。
サンプルは３００Ｖで６０秒間印加した。分離ボルト数は、サンプル、サンプルの排出用バイアルおよび陰極の泳動液用バイアルは１３０Ｖにセットし、陽極は、５５０Ｖで泳動を行った。
図６は、無勾配および三段階の勾配条件下での１００ｂｐＤＮＡのエレクトロフェログラムを示す。
図６から、０．３％ＭＣ、０．５％ＨＰＭＣおよび０．７％ＨＰＭＣの三段階の勾配では、それぞれ単独で用いた無勾配マトリックスと比べて、３分以内に全てのＤＮＡ断片のベースライン分離がよりよく得られた。
【００４０】
〔試験例３〕  三段階の勾配条件下における１００ｂｐＤＮＡ断片の泳動時間の再現性
１００ｂｐ〜１０００ｂｐのＤＮＡ断片について、実施例３と同様に三段階の勾配条件を設定し、６回連続でサンプルの注入を行い泳動時間を測定した。結果を表１に示す。泳動時間の比較標準偏差（relative standard derivation:RSD）は、０．５３％より小さく、この方法の再現性がよいことを証明している。
【００４１】
【表１】
0004657524.tif 000002
【００４２】
【発明の効果】
本発明を用いて電気泳動用マイクロチップ上のマイクロチャンネル内に水溶性マトリックスの段階的な濃度勾配を簡便に形成させることにより、無勾配な方法と比べて、様々なｂｐサイズからなる複合ＤＮＡサンプルの分離性能を向上させることができる。また、本発明は段階的な濃度勾配の形成にＥＯＦを必要としないことから、分析の精度を向上させることができる。さらに、本発明は再現性が高いことから、ＤＮＡおよび制限酵素断片の分析に優れている。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、マイクロチップを示す図である。
（Ａ）はマイクロチップの正面図である。
（Ｂ）はマイクロチップを構成する上側の基板３の平面図である。
（Ｃ）はマイクロチップを構成する下側の基板２の平面図である。
【図２】図２は、上記４種類の泳動液を用いて分離した２０ｂｐＤＮＡの電気泳動図（エレクトロフェログラム）を示している。
【図３】図３は、ＭＣ濃度および分離ボルト数を変化させて分離した小ＤＮＡの電気泳動図（エレクトロフェログラム）を示している。
【図４】図４は、無勾配条件下および勾配条件下で分離したＤＮＡの電気泳動図（エレクトロフェログラム）を示している。
【図５】図５は、無勾配および勾配条件下でのφｘ１７４−ＨｉｎｄIII酵素切断断片のエレクトロフェログラムを示す。
【図６】図６は、無勾配および三段階の勾配条件下での１００ｂｐＤＮＡのエレクトロフェログラムを示す。
【符号の説明】
Ｒ１〜Ｒ４        リザーバ
１          マイクロチップの全体
２          下側の基板
３          上側の基板
４          試料導入溝
５          分離溝
６          貫通孔
７          交差部
【図１】
0004657524.tif 000003
【図２】
0004657524.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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