(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド配列：
ｘ１ｃｃｃｃｘ６ｘ７ｘ８
（式中、ｘ１は、ｔ、ｇ、またはａを表し、ｘ６は、ｇ、ａ、またはｃを表し、ｘ７は、ｃ、ａ、またはｔを表し、ｘ８は、ｃ、ａ、またはｔを表す）
またはこの配列に相補的なヌクレオチド配列よりなる軽度低温転写制御エレメント。
【請求項２】
ヌクレオチド配列が  tccccgcc  （配列番号２）である請求項１に記載の軽度低温転写制御エレメント。
【請求項３】
ヌクレオチド配列が  gccccgcc  （配列番号９）である請求項１に記載の軽度低温転写制御エレメント。
【請求項４】
ヌクレオチド配列が  accccgcc  （配列番号１０）である請求項１に記載の軽度低温転写制御エレメント。
【請求項５】
ヌクレオチド配列が  tccccgtc  （配列番号１１）である請求項１に記載の軽度低温転写制御エレメント。
【請求項６】
ヌクレオチド配列が  tccccgct  （配列番号１２）である請求項１に記載の軽度低温転写制御エレメント。
【請求項７】
ヌクレオチド配列が  tccccgaa  （配列番号２１）である請求の範囲第１項に記載の、軽度低温転写制御エレメント。
【請求項８】
ヌクレオチド配列が  ggcgggga  （配列番号２２）である請求項１に記載の軽度低温転写制御エレメント。
【請求項９】
ヌクレオチド配列が  ggggggga  （配列番号７）である請求項１に記載の、軽度低温転写制御エレメント。
【請求項１０】
同一または異なる、請求項１に記載の軽度低温転写制御エレメントが連結されている軽度低温転写制御エンハンサー。
【請求項１１】
同一または異なる、請求項１に記載の軽度低温転写制御エレメントが他のヌクレオチド残基を介して結合されている軽度低温転写制御エンハンサー。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載の軽度低温転写制御エレメントまたは請求項１０または１１に記載の軽度低温転写制御エンハンサーを含むベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターで形質転換された哺乳動物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は軽度の低温において遺伝子の転写および翻訳を促進させる軽度低温応答因子に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体、成長因子、凝固因子など多くの医薬品や検査試薬がバイオテクノロジーにより産生されるようになってきた。
一般に１０−１５℃という低温においては、リコンビナントタンパク質の正しいフォールディングが促進され、そのタンパク質分解酵素による分解も抑制されることから(Baneyx, F., In vivo folding of recombinant proteins in Escherichia coli. In Manual of industrial microbiology and biotechnology, 2nd ed. (Demain, A.L., Davies, J.E., Altas, R.M., et al., eds.), ASM Press, Washingtonm D.C., pp.551-565, 1999)、組換えタンパク質をバクテリアに産生させる場合には、３７℃ではなく２０℃以下の低温での培養が利用されている。この際、低温ではタンパク質合成が一般に低下するために、目的タンパク質の収量が悪くなる可能性がある。そこで、目的タンパク質の発現プロモーターとして低温ショックタンパク質ＣｓｐＡのプロモーターと５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を利用し、この問題を解決している。（Baneyx, F. and Mujacic, M., Cold-inducible promoters for heterologous protein expression. Methods in Molecular Biology, 205, 1-18, 2001.）
しかし、バクテリアと哺乳動物細胞では、タンパク質の翻訳後修飾に大きな違いがあり、特に医薬品の場合にはグリコシル化の状態が治療効果に重要である。そこで、組換えタンパク質医薬品の産生には、哺乳動物細胞（特にチャイニーズハムスターの細胞株）が利用されている。この細胞培養を利用した製造のコストを減らすためには、タンパク質の収量を上げる必要がある。３７℃で通常の培養を行った場合、細胞は急激に増殖した後死滅するために、細胞が生存して目的タンパク質を生産する期間が短いという欠点がある。そこで、細胞増殖を抑制し、長期間細胞を生存させることが、細胞増殖阻害剤添加、増殖阻害遺伝子ｐ２７の発現、軽い低温（３０−３２℃）での培養、その他の方法により試みられている。（Schatz SM et al, Biotechnol Bioeng 2003 Nov 20;84(4):433-438参照）
なかでも軽い低温での培養では、１）培養温度が３７℃の場合よりも細胞が長い期間生存してタンパク質合成を行う。２）タンパク質分解酵素の活性が低下して目的タンパク質の分解が減少する。３）タンパク質のグリコシル化 や異性体の産生は３７℃培養の時と同程度である。また、シアル酸付加はかえって３７℃でよりも良好である。４）バクテリアでの場合と同様に目的タンパク質の正しいフォールディングが起きやすい可能性があるという特徴がある(Kaufmann H, Mazur X, Marone R, Bailey JE, Fussenegger M. Biotechnol Bioeng. 2001 Mar 20;72(6):592-602；Yoon SK, Song JY, Lee GM., Biotechnol Bioeng. 2003 May 5;82(3):289-98)。
肝心のリコンビナントタンパク質収量に関しては、細胞の生存期間が延びるために総収量が増える場合が多い。しかし、細胞あたりの単位時間でのタンパク質産生量（specific productivity）をみた場合には、ばらつき（細胞の種類や目的タンパク質の種類によるのか、未知の要因による）があり、３７℃でのspecific productivityよりもかえって低下する例が多く問題点となっている（(Kaufmann H, Mazur X, Marone R, Bailey JE, Fussenegger M. Biotechnol Bioeng. 2001 Mar 20;72(6):592-602；Yoon SK, Song JY, Lee GM., Biotechnol Bioeng. 2003 May 5;82(3):289-98）。なお、遺伝子発現制御機構が異なるために、バクテリアの低温ショックタンパク質ＣｓｐＡのプロモーターと５‘非翻訳領域 （ＵＴＲ）を哺乳動物に利用することはできない。
【非特許文献１】Kaufmann H, Mazur X, Marone R, Bailey JE, Fussenegger M. Biotechnol. Bioeng. 2001 Mar 20;72(6):592-602
【非特許文献２】Yoon SK, Song JY, Lee GM., Biotechnol. Bioeng. 2003 May 5;82(3):289-98
【非特許文献３】Fujita J., J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 1999 Nov;1(2):243-55
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は低温において細胞あたりの単位時間でのタンパク質産生量を高め、総収量を上げる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は軽度低温により発現の亢進する哺乳動物の低温ショックタンパク質Ｃｉｒｐ（cold inducible RNA-binding protein)（そのゲノムＤＮＡ配列を配列番号１に示す）およびＲｂｍ３(RNA-binding motif protein 3)を発見し先に報告した(Fujita J. Cold shock response in mammalian cells.  J Mol Microbiol Biotechnol. 1999 Nov;1(2):243-55.)。このたびこれらのタンパク質遺伝子のプロモーターの５’側に、軽い低温温度下において転写を促進させる遺伝子発現制御配列を発見したことに基いて本発明を完成させた。【０００５】
即ち、本発明は、ヌクレオチド配列：
ｘ１ｃｃｃｃｘ６ｘ７ｘ８
（式中、ｘ１は、ｔ、ｇ、またはａを表し、ｘ６は、ｇ、ａ，またはｃを表し、ｘ７は、ｃ、ａ，またはｔを表し、ｘ８は、ｃ、ａ，またはｔを表す）
またはこの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む軽度低温転写制御エレメントに関する。【０００６】
本明細書において、「軽度低温」とは１５〜３６℃、好ましくは３０〜３４℃、特に好ましくは３２℃の温度をいう。「軽度低温転写制御エレメント」とは軽度低温において特異的に遺伝子の転写を促進させるヌクレオチド配列をいう。本発明の軽度低温転写制御エレメントは遺伝子の転写に軽度低温特異的なエンハンサーとして作用する。【０００７】
本発明の軽度低温転写制御エレメントは単独で用いてもその機能を発揮し得るが、同一または異なる該配列を２〜５０個、好ましくは２〜１０個結合して用いるのが好ましい。結合させて用いる場合、同一または異なる該ヌクレオチド配列を相互に直接連結してもよいが、該配列間に任意の種類および数のヌクレオチド残基を介在させて結合させてもよい。軽度低温転写制御エレメントを結合させたものを本明細書では「軽度低温転写制御エンハンサー」と呼ぶ。本発明の軽度低温転写制御エレメントおよび軽度低温転写制御エンハンサーはプロモーターからの距離には無関係である。【０００８】
本発明は、上に記載の軽度低温転写制御エレメントまたは軽度低温転写制御エンハンサーを含むベクターにも関する。【０００９】
本発明は該ベクターで形質転換された哺乳動物細胞にも関する。【００１０】
本発明は、軽度低温転写制御エレメントのスクリーニング方法であって、以下の工程：
１）軽度低温、特に好ましくは３２℃の培養温度で転写の亢進する遺伝子を提供し、
２）該遺伝子の転写開始点の５’上流１．５キロべースから第一エキソンの範囲をクローニングし、
３）クローニングしたヌクレオチド配列を、適当なプロモーターとともに、レポーター遺伝子を発現するベクターに組み込み、
４）該ベクターで哺乳動物細胞を形質転換し、
５）培養細胞を軽度低温および３７℃でそれぞれ培養し、レポーター遺伝子を発現させ、軽度低温においてレポーター遺伝子の転写を促進させるポリヌクレオチド配列を得、
６）軽度低温においてレポーター遺伝子の転写を促進させるポリヌクレオチド配列について、ベクターに組み込むヌクレオチド配列を短くしていき、軽度低温においてレポーター遺伝子の転写を促進させるに必要なヌクレオチド配列を同定する、
ことを含む方法に関する。【００１１】
本発明は、軽度低温転写制御エレメントの改良方法であって、以下の工程：
１）軽度低温転写制御エレメントのうち１又は２塩基を他の塩基に置換した変異ヌクレオチドを合成し、
２）適当なプロモーターとともに、レポーター遺伝子を発現するベクターに組み込み、
３）該ベクターで哺乳動物細胞を形質転換し、
４）培養細胞を軽度低温および３７℃でそれぞれ培養し、レポーター遺伝子を発現させ、軽度低温においてレポーター遺伝子の転写を促進させるヌクレオチド配列を同定する、
ことを含む方法に関する。【００１２】
本発明者はさらにＣｉｒｐ遺伝子ｍＲＮＡの５’側の非翻訳領域（Untranslated Region (UTR)）に、軽度低温下において翻訳を促進させる遺伝子発現制御配列を発見した。
即ち本発明は、コード配列の５’側でプロモーターの３’側に配置される、ヌクレオチド配列：
actcgcgcct taggaagctt gggtgtgtgt ggcgcgctgt cttcccgctc gcgtcaggga
cctgcccgac tcagcggctg cc  （配列番号２３）
を含む軽度低温翻訳制御エレメントに関する。【００１３】
本明細書において、「軽度低温翻訳制御エレメント」とは軽度低温において特異的に、転写されたｍＲＮＡの翻訳を促進させる因子をいう。この軽度低温翻訳制御エレメントは転写された場合、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を形成する。
また「軽度低温応答因子」と言う場合は軽度低温転写制御エレメントおよび／または軽度低温翻訳制御エレメントを意味する
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、軽度低温において遺伝子の転写と翻訳を促進させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ｐＣＡＴ３ベーシックベクターを表わす模式図である。ＭＣＳはマルチクローニングサイトを表わし、ＣＡＴはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのコード配列を表わし、ＰＡはＳＶ４０ウイルス由来のポリアデニル化シグナルを表わし、Ａｍｐｒはアンピシリン耐性遺伝子を表わす。
【００１６】
【図２】ｐＣＡＴ３プロモーターベクターを表わす模式図である。ＭＣＳはマルチクローニングサイトを表わし、ＳＶ４０プロモーターはＳＶ４０ウイルス由来のプロモーターを表わし、ＣＡＴはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのコード配列を表わし、ＰＡはＳＶ４０ウイルス由来のポリアデニル化シグナルを表わし、Ａｍｐｒはアンピシリン耐性遺伝子を表わす。
【００１７】
【図３】ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロジェン社）を表わす模式図である。ＭＣＳはマルチクローニングサイトを表わす。このマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＶとＸｂａＩの間にホタルルシフェラーゼのコード配列を挿入し、マルチクローニングサイトＫｐｎＩとＢａｍＨＩの間にＣｉｒｐ  ｍＲＮＡの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を組み込んだ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
軽度低温転写制御エレメントの例は、限定するものではないが、tccccgcc（配列番号２）、gccccgcc（配列番号９）、accccgcc（配列番号１０）、tccccgtc（配列番号１１、tccccgct（配列番号１２）、tccccgaa（配列番号２１）、ggcgggga（配列番号２２）、ggggggga（配列番号７）がある。【００１９】
（ｉ）軽度低温応答エレメントの製造
軽度低温転写制御エレメント、軽度低温転写制御エンハンサー及び軽度低温翻訳制御エレメントは保護基のついた４種類のデオキシリボヌクレオチドを用いホスホロアミダイドを用いる固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法などで得ることができる（例えば, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, 35-81,83-115 (1984); J. Org. Chem., 49,2139 (1984); Tetrahedron Lett., 27,469 (1986); Tetrahedron Lett.,22,1859-1862; Tetrahedron Lett.,21,719-722(1980); J. Am. Chem. Soc.,103,3185-3191(1981) を参照）。今日では市販のＤＮＡ合成装置（例えばApplied Biosystem社製など）によって容易に合成できる。【００２０】
（ｉｉ）使用するプロモーター
プロモーターとしては、原核生物、真核生物、ウイルスのプロモーターを使用できる。好ましくは哺乳動物プロモーター、およびウイルスプロモーターである。好ましいプロモーターの例は、限定されるものではないがマウスチミジンキナーゼ（ＴＫ），サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＳＶ４０のプロモーターを含む。【００２１】
（ｉｉｉ）コード配列
発現させるべき遺伝子には制限がなくいずれのタンパク質をコードする配列も用いることができる。【００２２】
（ｉｖ）使用するベクター
本発明の軽度低温応答エレメントまたは軽度低温応答エンハンサー、プロモーターおよび、発現させるべきタンパク質をコードするコード配列を連結してベクターに挿入する。ベクターとしては原核細胞及び真核細胞発現用ベクターである。好ましいベクターの例は、限定されるものではないがｐＣＭＶ（インビトロジェン社）、ｐＣＡＴ３プロモーターベクター（プロメガ社）、ｐＳＶ２−ネオベクターを含む。【００２３】
(ｖ）使用する宿主細胞
該ベクターで宿主細胞をトランスフェクトする。宿主細胞としては哺乳動物細胞を用いるのが好ましい。好ましい哺乳動物細胞株の例はヒト細胞株２９３、２９３Ｔ，Ｕ−２ ＯＳ，Ｈｕｈ−７、ＨｅLａ等、サル細胞株ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ等、マウス細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３，Ｂａｌｂ／３Ｔ３，Ｂ−６，Ｈｅｐａｌ−６、チャイニーズハムスター細胞株ＣＨＯ等である。
トランスフェクションの方法としてはリン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロウイルス法、電気穿孔法等がある。例えば、リン酸カルシウム法では、リン酸溶液にＤＮＡ（ベクター）を含む塩化カルシウム溶液を攪拌しながら１滴ずつ加える。ＤＮＡ−リン酸カルシウムの微細な沈殿ができ、この溶液を宿主細胞に加えるとＤＮＡ−リン酸カルシウムの沈殿が宿主細胞に食作用により取りこまれる結果、ＤＮＡが細胞内に取りこまれることになる。【００２４】
（ｖｉ）培養条件
宿主細胞は軽度低温において培養する。培地は特別のものを使用する必要はなく、哺乳動物細胞培養用の培地を使用できる。典型的な培地の例は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加のダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（インビトロジェン社）である。【００２５】
本発明は、軽度低温転写制御エレメントのスクリーニング方法であって、以下の工程：
１）軽度低温、特に好ましくは３２℃の培養温度で転写の亢進する遺伝子を提供し、
２）該遺伝子の転写開始点の５’上流１．５キロべースから第一エキソンの範囲をクローニングし、
３）クローニングしたヌクレオチド配列を、適当なプロモーターとともに、レポーター遺伝子を発現するベクターに組み込み、
４）該ベクターで哺乳動物細胞を形質転換し、
５）培養細胞を軽度低温および３７℃でそれぞれ培養し、レポーター遺伝子を発現させ、軽度低温においてレポーター遺伝子の転写を促進させるポリヌクレオチドを得、
６）軽度低温においてレポーター遺伝子の転写を促進させるポリヌクレオチドについて、ベクターに組み込むヌクレオチド配列を短くしていき、軽度低温においてレポーター遺伝子の転写を促進させるに必要なヌクレオチド配列を同定する、
ことを含む方法に関する。【００２６】
３２℃の培養温度で転写の亢進する遺伝子は、哺乳動物細胞を３７℃及び軽度低温、特に好ましくは３２℃、で培養し、それぞれから抽出したRNAに対して、DNAチップ（マイクロアレー）、cDNAサブトラクション法など（例えば、Moody, D.E. Genomic techniques:An overview of methods for the study of gene expression. J. Anim. Sci. 79(E. Suppl.):E128-E135, 2001を参照）を応用することで得ることができる。
使用するプロモーターとしては原核生物、真核生物、ウイルスのプロモーターを使用できる。好ましくは哺乳動物プロモーター、およびウイルスプロモーターである。好ましいプロモーターの例は、限定されるものではないがマウスチミジンキナーゼ（ＴＫ），サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＳＶ４０のプロモーターを含む【００２７】
レポーター遺伝子としては、検出が容易なタンパク質をコードしているものであり、限定されるものではないがルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。ベクターとしては原核細胞及び真核細胞発現用ベクターである。好ましいベクターの例は、限定されるものではないがｐＣＭＶ（インビトロジェン社）、ｐＣＡＴ３プロモーターベクター（プロメガ社）、ｐＳＶ２−ネオベクターを含む。
使用する該ベクターで宿主細胞をトランスフェクトする。宿主細胞としては哺乳動物細胞を用いるのが好ましい。好ましい哺乳動物細胞株の例はヒト細胞株２９３、２９３Ｔ，Ｕ−２ ＯＳ，Ｈｕｈ−７、ＨｅLａ等、サル細胞株ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ等、マウス細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３，Ｂａｌｂ／３Ｔ３，Ｂ−６，Ｈｅｐａｌ−６、チャイニーズハムスター細胞株ＣＨＯ等である。トランスフェクションの方法としてはリン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロウイルス法、電気穿孔法等がある。例えば、リン酸カルシウム法では、リン酸溶液にＤＮＡ（ベクター）を含む塩化カルシウム溶液を攪拌しながら１滴ずつ加える。ＤＮＡ−リン酸カルシウムの微細な沈殿ができ、この溶液を宿主細胞に加えるとＤＮＡ−リン酸カルシウムの沈殿が宿主細胞に食作用により取りこまれる結果、ＤＮＡが細胞内に取りこまれることになる。
培地は特別のものを使用する必要はなく、哺乳動物細胞培養用の培地を使用できる。典型的な培地の例は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加のダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（インビトロジェン社）である。
軽度低温、好ましくは３２℃でのレポーター遺伝子の発現量の、３７℃でのレポーター遺伝子の発現量に対する比が１以上であれば軽度低温において特異的に遺伝子の転写を促進させるエンハンサーであり得る。軽度低温において遺伝子の転写を促進させるヌクレオチド配列について、組み込まれている配列を短くしていき、軽度低温転写制御エレメントを得る。エンハンサーであることは該軽度低温転写制御エレメントの配列に相補的なヌクレオチド配列も、軽度低温において遺伝子の転写を促進させることを確認することにより確認できる。【００２８】
本発明は、軽度低温転写制御エレメントの改良方法であって、以下の工程：
１）軽度低温転写制御エレメントのうち１又は２塩基を他の塩基に置換した変異ヌクレオチドを合成し、
２）適当なプロモーターとともに、レポーター遺伝子を発現するベクターに組み込み、
３）該ベクターで哺乳動物細胞を形質転換し、
４）培養細胞を軽度低温および３７℃でそれぞれ培養し、レポーター遺伝子を発現させ、軽度低温においてレポーター遺伝子の転写を促進させるヌクレオチド配列を同定する、
ことを含む方法にも関する。【００２９】
軽度低温転写制御エレメントのうち１又は２塩基を他の塩基に置換した変異ヌクレオチドを合成は前記のように行う。使用するプロモーターとしては原核生物、真核生物、ウイルスのプロモーターを使用できる。好ましくは哺乳動物プロモーター、およびウイルスプロモーターである。好ましいプロモーターの例は、限定されるものではないがマウスチミジンキナーゼ（ＴＫ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＳＶ４０のプロモーターを含む。
レポーター遺伝子としては、検出が容易なタンパク質をコードしているものであり、限定されるものではないがルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。ベクターとしては原核細胞及び真核細胞発現用ベクターである。好ましいベクターの例は、限定されるものではないがｐＣＭＶ（インビトロジェン社）、ｐＣＡＴ３プロモーターベクター（プロメガ社）、ｐＳＶ２−ネオベクターを含む。
使用する該ベクターで宿主細胞をトランスフェクトする。宿主細胞としては哺乳動物細胞を用いるのが好ましい。好ましい哺乳動物細胞株の例はヒト細胞株２９３、２９３Ｔ，Ｕ−２  ＯＳ，Ｈｕｈ−７、ＨｅＬａ等、サル細胞株ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ等、マウス細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、Ｂ−６、Ｈｅｐａｌ−６、チャイニーズハムスター細胞株ＣＨＯ等である。トランスフェクションの方法としてはリン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロウイルス法、電気穿孔法等がある。例えば、リン酸カルシウム法では、リン酸溶液にＤＮＡ（ベクター）を含む塩化カルシウム溶液を攪拌しながら１滴ずつ加える。ＤＮＡ−リン酸カルシウムの微細な沈殿ができ、この溶液を宿主細胞に加えるとＤＮＡ−リン酸カルシウムの沈殿が宿主細胞に食作用により取りこまれる結果、ＤＮＡが細胞内に取りこまれることになる。
培地は特別のものを使用する必要はなく、哺乳動物細胞培養用の培地を使用できる。典型的な培地の例は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加のダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（インビトロジェン社）である。
軽度低温、好ましくは３２℃でのレポーター遺伝子の発現量の、３７℃でのレポーター遺伝子の発現量に対する比が１以上であれば軽度低温において特異的に遺伝子の転写を促進させるエンハンサーであり得る。エンハンサーであることは該軽度低温転写制御エレメントの配列に相補的なヌクレオチド配列も、軽度低温において遺伝子の転写を促進させることを確認することにより確認できる。【００３０】
本発明はまた、コード配列の５’側でプロモーターの３’側に配置される、ヌクレオチド配列：
actcgcgcct taggaagctt gggtgtgtgt ggcgcgctgt cttcccgctc gcgtcaggga
cctgcccgac tcagcggctg cc  （配列番号２３）
を含む軽度低温翻訳制御エレメントに関する。【００３１】
使用するプロモーターとしては原核生物、真核生物、ウイルスのプロモーターを使用できる。好ましくは哺乳動物プロモーター、およびウイルスプロモーターである。好ましいプロモーターの例は、限定されるものではないがマウスチミジンキナーゼ（ＴＫ），サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＳＶ４０のプロモーターを含む。    また、軽度低温転写制御エレメントまたは軽度低温転写制御エンハンサーを軽度低温翻訳制御エレメントと同時に使用することもできる。【００３２】
ベクターとしては原核細胞及び真核細胞発現用ベクターである。好ましいベクターの例は、限定されるものではないがｐcDNA3.1(+)ベクター（インビトロジェン社）、pSV2-ネオベクターを含む。【００３３】
使用する該ベクターで宿主細胞をトランスフェクトする。宿主細胞としては哺乳動物細胞を用いるのが好ましい。好ましい哺乳動物細胞株の例はヒト細胞株２９３、２９３Ｔ，Ｕ−２ ＯＳ，Ｈｕｈ−７、ＨｅLａ等、サル細胞株ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ等、マウス細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３，Ｂａｌｂ／３Ｔ３，Ｂ−６，Ｈｅｐａｌ−６、チャイニーズハムスター細胞株ＣＨＯ等である。トランスフェクションの方法としてはリン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロウイルス法、電気穿孔法等がある。例えば、リン酸カルシウム法では、リン酸溶液にＤＮＡ（ベクター）を含む塩化カルシウム溶液を攪拌しながら１滴ずつ加える。ＤＮＡ−リン酸カルシウムの微細な沈殿ができ、この溶液を宿主細胞に加えるとＤＮＡ−リン酸カルシウムの沈殿が宿主細胞に食作用により取りこまれる結果、ＤＮＡが細胞内に取りこまれることになる。
培地は特別のものを使用する必要はなく、哺乳動物細胞培養用の培地を使用できる。典型的な培地の例は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加のダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（インビトロジェン社）である。
【実施例】
【００３４】
実施例１
マウスのＣｉｒｐの転写開始点のａｃｔｃｇｃ---のａを＋１として、５’側に９７０塩基（−９７０）から第１エクソン５６塩基（＋５６）までのＣｉｒｐゲノム遺伝子、およびその５’側を欠失させた断片(表１）をｐＣＡＴ３−ベーシックベクター（プロメガ社）のマルチクローニングサイトに組み込んだ(図１）。このベクターはレポータータンパク質としてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を有する。
次いで、これらのプラスミド各２．５〜５．０μｇ／３５ｍｍディッシュを、ＣＤＭ８−ＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ発現ベクターであり、各トランスフェクションの効率を補正するために使用した。ＡＴＣＣ社）０．５〜１．０μｇ／３５ｍｍディッシュとともに、３７℃で１日培養したヒト細胞株２９３にコトランスフェクションした。
トランスフェクションした細胞を２つに分け、１方を３２℃で、他方を３７℃でそれぞれ培養した。培地は１０％ＦＣＳ添加Ｄ−ＭＥＭである。
３６時間後、遠心分離によって細胞を回収し、全細胞溶解液を作成した。それぞれの温度で生成したクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）タンパク質の量をＣＡＴ  ＥＬＩＳＡキット（ロシュ・ダイアグノステック社）を用いて測定し、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）活性をβ−ガラクトシダーゼアッセイキット（ストラタジーン社）を用いて測定した。各断片の転写促進活性を表１に示す。転写活性としてはＣＡＴタンパク質量をβ−ガラクトシダーゼ活性で割った値を示した。【００３５】
【表１】
0004613160.tif 000002
２４時間後のデータも同様の結果であった。
これらの結果から、ゲノム遺伝子の−２２０〜０に遺伝子転写の基本的プロモーターが存在し、−３４０〜−２２０に３２℃に応答して転写を促進するエンハンサーが存在する可能性が考えられる。【００３６】
実施例２
実施例１において、宿主細胞としてヒト２９３細胞に代えて、ヒト細胞株２９３Ｔ，Ｕ−２ ＯＳ，Ｈｕｈ−７、サル細胞株ＣＯＳ−７、マウス細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３，Ｂａｌｂ／３Ｔ３、Ｂ−６，Ｈｅｐａｌ−６を使用して同様の実験を行って同様の結果を得た。【００３７】
実施例３
Ｃｉｒｐゲノム遺伝子−３４０〜−２２０のいろいろな欠失変異体を作製し、ｐＣＡＴ３プロモーターベクター（プロメガ社）のマルチクローニングサイトに組み込んだ（図２）。このベクターはＳＶ４０のプロモーターを有する。実施例１と同様に、ヒト２９３細胞を用いて、リン酸カルシウム法を用いたＤＮＡトランスフェクションによる遺伝子導入後、３２℃での転写促進活性を調べた。陰性コントロールとしてなにもいれていないｐＣＡＴ３プロモーターベクター（ｍｏｃｋ）を用いた。
３６時間でのデータを示す。転写活性としてはＣＡＴタンパク質量をβ−ガラクトシダーゼ活性で割った値を示した（表２）。【００３８】
【表２】
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この結果より、ゲノム遺伝子−３１０〜−２９０および−２６０〜−２２０の２箇所に３２℃に応答して転写を促進するエンハンサーが存在することが考えられる。この２箇所の塩基配列を比較することによりｔｃｃｃｃｇｃｃ（配列番号２）という共通する塩基配列を見出した。【００３９】
実施例４
上で見出したtccccgccを含む１０塩基を直列に３個つないで連続させたもの（ttccccgccgttccccgccgttccccgccg）（配列番号３）を実施例３と同様にｐＣＡＴ３プロモーターベクター（プロメガ社）のマルチクローニングサイトに組み込んだ。陰性コントロールとしてなにもいれていないｐＣＡＴ３プロモーターベクター（ｍｏｃｋ）を、陽性コントロールとしてはＣｉｒｐゲノム−３４０〜−２２０を組み込んだもの、およびＳＶ４０エンハンサーを組み込んだものを用いた。２９３細胞にトランスフェクション２４時間後の結果を表３に示す。【００４０】
【表３】
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実施例５【００４１】
さらに、エンハンサーであれば反対向きでも有効であるはずなので、5’-tccccgcc-3’を含む１０塩基を反対向き（つまり5’-cggcggggaa-3’）（配列番号４）に３個連結させた配列（cggcggggaacggcggggaacggcggggaa）（配列番号５）をｐＣＡＴ３プロモーターベクターのマルチクローニングサイトに組み込んで実施例4と同様の実験を行った。
この場合も３２℃／３７℃の比の値は３．８３であり軽度低温転写制御のエンハンサーであることが確認された。【００４２】
実施例６
マウスＣｉｒｐゲノムで見出した８塩基tccccgcc（配列番号２）のみを２個連結させたもの（tccccgcctccccgcc)（配列番号６）をｐＣＡＴ３プロモーターベクターのマルチクローニングサイトに組み込んで実施例４と同様の実験をおこなった。
この場合も３２℃／３７℃の比の値は２．５１であり軽度低温転写制御のエンハンサーであることが確認された。【００４３】
実施例７
ヒトＲＢＭ３ゲノム（GenBank NT_011568)の転写開始点の約２６０塩基、５’上流に存在する８塩基ggggggga（配列番号７）のみを３個連結させたもの（gggggggagggggggaggggggga）（配列番号８）をｐＣＡＴ３プロモーターベクターのマルチクローニングサイトに組み込んで実施例４と同様の実験をおこなった。
この場合も３２℃／３７℃の比の値は２．５２であり軽度低温転写制御のエンハンサーであることが確認された。【００４４】
実施例８
上で見出した配列ｔｃｃｃｃｇｃｃ（配列番号２）の１または２塩基を変異させた変異体（下表）を含む１０塩基を直列に３個つないで連続させたものを実施例４と同様のベクターに組み込み、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。２４時間後にＣＡＴ／ＬａｃＺを測定して、コントロールとしてなにもいれていないｐＣＡＴ３プロモーターベクターを用いときの３２℃／３７℃の比を１として、それぞれの変異体の低温転写促進(エンハサー)活性を下表に示す。【００４５】
【表４】
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【００４６】
【表５】
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【００４７】
１番目の塩基のＧまたはＡへの変異、７番目の塩基のＴへの変異、８番目の塩基のＴへの変異は野生型と同様の低温転写促進活性を示す。６番目の塩基のＡまたはＣへの変異で低温転写促進活性は野生型に比べ低下するものの、有意な活性が認められる。変異体７8にみられるように、７番目８番目の２塩基のＡＡへの変異は、野生型と同程度の低温転写促進活性を示す。
よってtccccgccが低温転写促進活性を示す配列であるが、
ｔ（又はｇ，ａ）ｃｃｃｃｇ（又はａ，ｃ）ｃ（又はａ，ｔ）ｃ（又はａ，ｔ）
でも良いことがわかる。
また、エンハンサーであることからこれらの相補的な配列（例えばtccccgcc(配列番号２)に対する相補的な配列はggcgggga（配列番号２２））を用いても良い。【００４８】
実施例９
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを持つｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロジェン社）（図３）のマルチクローニングサイト（ＥｃｏＲＶとＸｂａＩの間）に、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃプラズミド（プロメガ社）から切り出したホタルルシフェラーゼｃＤＮＡを組み込んだ。次いで、マウスＣｉｒｐ転写産物（ｍＲＮＡ）のａｃｔ−−−のａを１として、３’側に８２塩基：
actcgcgcct taggaagctt gggtgtgtgt ggcgcgctgt cttcccgctc gcgtcaggga
cctgcccgac tcagcggctg cc    （配列番号２３）
をｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社）のマルチクローニングサイト（ＫｐｎＩとＢａｍＨＩの間）に組み込んだ。コントロールはＫｐｎＩとＢａｍＨＩの間に何も組み込んでいないプラズミドである。
次いで、これらのプラスミド各２．５〜５．０μｇ／３５ｍｍディッシュを、ｐＲＬＴＫプラズミド（ｒｅｎｉｌａルシフェラーゼ発現ベクターであり、各トランスフェクションの効率を補正するために使用した。プロメガ社）０．５〜１．０μｇ／３５ｍｍディッシュとともに、３７℃で１日培養したヒト細胞株２９３Ｔにコトランスフェクションした。
トランスフェクションした細胞を２つに分け、１方を３２℃で、他方を３７℃でそれぞれ培養した。培地は１０％ＦＣＳ＋Ｄ−ＭＥＭである。
３６時間後、遠心分離によって細胞を回収し、全細胞溶解液を作成した。それぞれの温度で生成したホタルとｒｅｎｉｌａのルシフェラーゼ活性を、Dual-Luciferase Reporter Assayキット（プロメガ社）を用いて測定した。各断片の翻訳促進活性を表６に示す。翻訳活性としてはホタルルシフェラーゼ活性をｒｅｎｉｌａルシフェラーゼ活性で割った値を示した。【００４９】
【表６】
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この結果、３２℃でのタンパク質産生量は、Ｃｉｒｐ  ｍＲＮＡの５’ＵＴＲが付いた場合は付いていない場合の１．７倍に増加し、Ｃｉｒｐ  ｍＲＮＡの５’ＵＴＲが付いていない通常のプラズミドをトランスフェクションして３７℃で培養した場合と同等の目的タンパク質産生が得られることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明はタンパク質の生産に広く用いることができる
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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