(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コア、キャップおよび親水性結合基を含む、水溶性発光半導体量子ドットであって、前記親水性結合基がメルカプト酢酸またはチオールアルコールである、水溶性発光半導体量子ドット。
【請求項２】
前記親水性結合基がメルカプト酢酸である、請求項１に記載の水溶性発光半導体量子ドット。
【請求項３】
前記量子ドットのコアが、ＩＩＢ−ＶＩＢ半導体、ＩＩＩＢ−ＶＢ半導体、およびＩＶＢ−ＩＶＢ半導体からなる群より選ばれ、該コアのサイズが約１ｎｍから約１０ｎｍまでである、請求項１または２に記載の水溶性発光半導体量子ドット。
【請求項４】
前記量子ドットのコアがＩＩＢ−ＶＩＢ半導体からなる群より選ばれ、該コアのサイズが約２ｎｍから約５ｎｍまでである、請求項１〜３のいずれかに記載の水溶性発光半導体量子ドット。
【請求項５】
前記量子ドットのコアがＣｄＳまたはＣｄＳｅである、請求項１〜４のいずれかに記載の水溶性発光半導体量子ドット。
【請求項６】
前記量子ドットのコアがＣｄＳｅである、請求項１〜５のいずれかに記載の水溶性発光半導体量子ドット。
【請求項７】
前記コアのサイズが約４．２ｎｍである、請求項１〜６のいずれかに記載の水溶性発光半導体量子ドット。
【請求項８】
前記キャップが高いバンドギャップのＩＩＢ−ＶＩＢ半導体からなる群より選ばれる、請求項１〜７のいずれかに記載の水溶性発光半導体量子ドット。
【請求項９】
前記キャップがＺｎＳである、請求項１〜８のいずれかに記載の水溶性発光半導体量子ドット。
【請求項１０】
前記キャップがＣｄＳである、請求項１〜８のいずれかに記載の水溶性発光半導体量子ドット。
【請求項１１】
ＣｄＳｅコア、ＺｎＳキャップおよびメルカプト酢酸結合基を含む、水溶性発光半導体量子ドット。
【請求項１２】
前記ＣｄＳｅコアが約４．２ｎｍであり、前記ＺｎＳキャップが約１ｎｍである、請求項１１記載の水溶性発光半導体量子ドット。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の水溶性発光半導体量子ドットと水性担体とを含む組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載の水溶性発光半導体量子ドットと生体分子（ここで、該生体分子は前記親水性結合基を介して該量子ドットに結合されている）とを含むコンジュゲート。
【請求項１５】
前記生体分子がタンパク質またはそのフラグメントである、請求項１４記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
前記タンパク質またはそのフラグメントが抗体またはその抗原反応性フラグメントである、請求項１５記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
前記生体分子が核酸である、請求項１４記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
前記生体分子がリンカーを介して前記親水性結合基に結合されている、請求項１４〜１７のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
前記リンカーが一級アミンである、請求項１８記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
前記リンカーがストレプトアビジンである、請求項１８記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
前記生体分子がステム・アンド・ループ構造を含む一本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記親水性結合基が該一本鎖オリゴヌクレオチドの一端に結合されており、クエンチング部分が該一本鎖オリゴヌクレオチドの他端に結合されており、該クエンチング部分が該発光半導体量子ドットをクエンチする、請求項１４記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
請求項１４〜２１のいずれかに記載のコンジュゲートと水性担体とを含む組成物。
【請求項２３】
（ａ）非極性有機溶媒中の発光半導体量子ドットを、親水性結合基を含む第１の水溶液と反応させる工程（ここで、該親水性結合基はメルカプト酢酸またはチオールアルコールである）と、
（ｂ）ほぼ中性のｐＨの第２の水溶液を加え、混合する工程と、
（ｃ）水層を抽出することによって、水溶性発光半導体量子ドットを得る工程
とを含む、請求項１記載の水溶性発光半導体量子ドットを得る方法。
【請求項２４】
前記非極性有機溶媒がクロロホルムであり、前記親水性結合基がメルカプト酢酸である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）請求項１〜１２のいずれかに記載の水溶性発光半導体量子ドットと、該水溶性発光半導体量子ドットのキャップ上の親水性結合基に直接結合し得る生体分子とを接触させる工程と
（ｂ）コンジュゲートを単離する工程
とを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の水溶性発光半導体量子ドットと生体分子とを含むコンジュゲートを作製する方法。
【請求項２６】
前記生体分子がタンパク質もしくはそのフラグメント、または核酸である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記親水性結合基がメルカプト酢酸である、請求項２５または２６記載の方法。
【請求項２８】
触媒的クロスリンカーの存在下で、前記水溶性発光半導体量子ドットと前記生体分子とを接触させる、請求項２５〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
（ａ）請求項１〜１２のいずれかに記載の水溶性発光半導体量子ドットと、（ｉ）リンカー、媒介クロスリンカーまたは２官能分子とを接触させ、次いで（ｉｉ）該水溶性発光半導体量子ドットのキャップ上の親水性結合基と間接的に結合し得る生体分子とを接触させる工程と、
（ｂ）コンジュゲートを単離する工程
とを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の水溶性発光半導体量子ドットと生体分子とを含むコンジュゲートを作製する方法。
【請求項３０】
（ａ）コア、キャップおよび親水性結合基を含む、水溶性発光半導体量子ドットと、（ｉ）リンカー、媒介クロスリンカーまたは２官能分子とを接触させ、次いで（ｉｉ）該水溶性発光半導体量子ドットのキャップ上の親水性結合基と間接的に結合し得る生体分子とを接触させる工程と、
（ｂ）コンジュゲートを単離する工程
とを含む、コア、キャップおよび親水性結合基を含む、水溶性発光半導体量子ドットと生体分子とを含むコンジュゲートを作製する方法。
【請求項３１】
前記生体分子がタンパク質もしくはそのフラグメント、または核酸である、請求項２９または３０記載の方法。
【請求項３２】
前記親水性結合基がメルカプト酢酸である、請求項２９〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記リンカーがストレプトアビジンである、請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
（ａ）生体分子と、（ｉ）リンカー、媒介クロスリンカーまたは２官能分子とを接触させ、次いで（ｉｉ）請求項１〜１２のいずれかに記載の水溶性発光半導体量子ドットとを接触させる工程と、
（ｂ）コンジュゲートを単離する工程
とを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の水溶性発光半導体量子ドットと生体分子とを含むコンジュゲートを作製する方法。
【請求項３５】
（ａ）生体分子と、（ｉ）リンカー、媒介クロスリンカーまたは２官能分子とを接触させ、次いで（ｉｉ）コア、キャップおよび親水性結合基を含む、水溶性発光半導体量子ドットとを接触させる工程と、
（ｂ）コンジュゲートを単離する工程
とを含む、コア、キャップおよび親水性結合基を含む、水溶性発光半導体量子ドットと生体分子とを含むコンジュゲートを作製する方法。
【請求項３６】
前記生体分子がタンパク質もしくはそのフラグメント、または核酸である、請求項３４または３５記載の方法。
【請求項３７】
前記親水性結合基がメルカプト酢酸である、請求項３４〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記リンカーがストレプトアビジンである、請求項３４〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
サンプル中のタンパク質を検出する方法であって、
（ａ）該サンプルと請求項１４記載のコンジュゲートとを接触させる工程であって、該コンジュゲートの生体分子が該タンパク質に特異的に結合する工程と、（ｂ）発光を検出する工程であって、発光の検出が、該コンジュゲートが該サンプル中の該タンパク質に結合したことを示す工程
とを含む方法。
【請求項４０】
前記コンジュゲートの生体分子がタンパク質またはそのフラグメントである、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記コンジュゲートの生体分子が抗体またはその抗原反応性フラグメントであり、前記サンプル中のタンパク質が、該抗体または該その抗原反応性フラグメントに結合される抗原またはそのエピトープである、請求項３９または４０記載の方法。
【請求項４２】
前記抗原または前記そのエピトープがウイルスまたは細菌のものである、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記コンジュゲートの生体分子が抗原またはそのエピトープであり、前記サンプル中のタンパク質が、該抗原またはそのエピトープに結合する抗体またはその抗原反応性フラグメントである、請求項３９または４０記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体または前記その抗原反応性フラグメントが、ウイルス、細菌、ウイルスの一部、または細菌の一部に特異的である、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記コンジュゲートの生体分子が核酸である、請求項３９記載の方法。
【請求項４６】
サンプル中の核酸を検出する方法であって、
（ａ）該サンプルと請求項１４記載のコンジュゲートとを接触させる工程であって、該コンジュゲートの生体分子が該核酸に特異的に結合する工程と、
（ｂ）発光を検出する工程であって、発光の検出が、該コンジュゲートが該サンプル中の該核酸に結合したことを示す工程
とを含む方法。
【請求項４７】
前記生体分子が核酸である、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記生体分子がタンパク質またはそのフラグメントである、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
サンプル中の核酸を検出する方法であって、
（ａ）該サンプルと請求項２１記載のコンジュゲートとを接触させる工程であって、前記ループがプローブ配列を含み、該プローブ配列が該核酸中の標的配列に結合すると、前記ステムを開かせる構造変化を該コンジュゲートが受けることによって、前記量子ドット部分と前記クエンチング部分とが分離する工程と、
（ｂ）発光を検出する工程であって、発光の検出が、該コンジュゲートが該サンプル中の該核酸に結合したことを示す工程、
とを含む方法。
【請求項５０】
サンプル中の核酸を検出する方法であって、
（ａ）第１の一本鎖核酸を含むサンプルと、該第１の一本鎖核酸に結合し得る第２の一本鎖核酸が結合した固相支持体とを接触させる工程と、
（ｂ）該固相支持体と、請求項１７記載のコンジュゲート（ここで、前記生体分子は、該第２の一本鎖核酸が結合する領域以外の領域で該第１の一本鎖核酸に特異的に結合する第３の一本鎖核酸である）とを接触させる工程と、
（ｃ）発光を検出する工程であって、発光の検出が、該コンジュゲートの該第３の一本鎖核酸が該サンプル中の該第１の一本鎖核酸に結合したことを示す工程
とを含む方法。
【請求項５１】
サンプル中の核酸を検出する方法であって、
（ａ）核酸捕捉プローブ（ここで、該核酸捕捉プローブは該サンプル中の該核酸に結合する配列を含む）を固相支持体に結合させる工程と、
（ｂ）結合した核酸捕捉プローブと該サンプルとを接触させることによって、該核酸を該固相支持体上に固定化する工程と、
（ｃ）該固定化した核酸と請求項１７記載のコンジュゲート（ここで、該コンジュゲートの生体分子は該核酸に特異的に結合する）とを接触させる工程と、
（ｄ）発光を検出する工程であって、発光の検出が該コンジュゲートが該サンプル中の該核酸に結合したことを示す工程
とを含む方法。
【請求項５２】
サンプル中の２つ以上の異なる分子および／または所定の分子の２つ以上の領域、のいずれかを同時検出する方法であって、
（ａ）該サンプルと請求項１４〜２１のいずれかに記載の２つ以上のコンジュゲート（ここで、該２つ以上のコンジュゲートのそれぞれが、異なるサイズおよび組成の量子ドットと、該サンプル中の異なる分子または所定の分子の異なる領域に特異的に結合する生体分子とを含む）とを接触させる工程と、
（ｂ）発光を検出する工程であって、所定の色の発光の検出が、該サンプル中の分子にコンジュゲートが結合したことを示す工程
とを含む方法。
【請求項５３】
前記サンプルが２つ以上の異なるタンパク質またはそのフラグメントを含む、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
前記サンプルが２つ以上の異なる核酸を含む、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
前記サンプルが少なくとも１つの核酸と少なくとも１つのタンパク質またはそのフラグメントとを含む、請求項５２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００３】
（発明の技術分野）
本発明は、水溶性発光量子ドット（water-soluble luminescent quantum dot）、その生体分子コンジュゲート（biomolecular conjugate）、およびそのような量子ドットまたはコンジュゲートを含む組成物に関する。さらに、本発明は、発光量子ドットを得る方法、その生体分子コンジュゲートを作製する方法、ならびに生体分子コンジュゲートをインビトロおよびインビボでの超高感度非同位体検出に使用する方法に関する。
【０００４】
（発明の背景）
生物学的アッセイに使用する高感度非同位体検出システムの開発は、ＤＮＡ配列決定、臨床的診断アッセイ、および基礎的な細胞および分子生物学のプロトコール等の多くの研究および診断領域に重大な影響を与えてきた。現在の非同位体検出法は、酵素が関連した色変化を受けるか、または蛍光性、発光性、もしくは電気活性な有機レポーター分子に主に基づいている（Kricka編、Nonisotopic Probing, Blotting, and Sequencing, Academic Press, New York, 1995；Issac編、Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes, Humana, Totowa, NJ, 1994；ならびにDiamandisおよびChristopoulos編、Immunoassay, Academic Press, New York, 1996）。これらの非同位体システムは放射性同位体検出に付随する問題（例えば、放射性同位体の短い半減期、健康被害および放射性廃棄物の費用のかかる除去）を解決するが、それらは、発光半導体量子ドットを利用する非同位体検出システムほど高感度または安定ではない。例えば、ＺｎＳキャッピングしたＣｄＳｅ量子ドット等の高発光半導体量子ドットは、蛍光ローダミン等の有機染料よりも２０倍明るく、光退色に対して１００倍安定であり、そしてスペクトル線幅が３倍狭い。
【０００５】
過去１０年間にわたって、多種多様の半導体量子ドットの合成および特徴付けにおいて、多くの進歩があった。最近の前進は、比較的単分散の量子ドットの大規模調製を導いた（Murrayら、J. Am. Chem. Soc.,115, 8706-15 (1993)；Bowen Katariら、J. Phys. Chem., 98, 4109-17 (1994)；およびHinesら、J. Phys. Chem., 100, 468-71 (1996)）。他の前進は、量子ドット格子構造の特徴付けを導き（Henglein, Chem. Rev., 89, 1861-73 (1989)；およびWellerら、Chem. Int. Ed. Engl. 32, 41-53(1993)）、そしてまた、量子−ドットアレイの製作（Murrayら、Science, 270, 1335-38 (1995);Andresら、Science, 273, 1690-93 (1996);Heathら、J. Phys. Chem., 100, 3144-49 (1996)；Collierら、Science, 277, 1978-81 (1997)；Mirkinら、Nature, 382, 607-09 (1996)；およびAlivisatosら、Nature, 382, 609-11 (1996)）、ならびに発光ダイオードの製作（Colvinら、Nature, 370, 354-57 (1994);およびDabbousiら、Appl. Phys. Let., 66, 1316-18 (1995)）も導いた。特に、ＩＩＢ−ＶＩＢ半導体が多くの関心の焦点であり、これにより前例のない程度の単分散性および結晶秩序を有するＣｄＳｅ量子ドットの開発が導かれた（Murray (1993)，前述）。
【０００６】
発光量子ドット技術におけるさらなる前進により、量子ドットの蛍光収率および安定性の劇的な増大が得られた。量子ドットの注目すべき発光特性は、量子サイズ束縛(quantum-size confinement)（これは、金属と半導体のコア粒子がそれらの励起ボーア半径（約１〜５ｎｍ）よりも小さい場合に起こる）から生じる（Alivisatos、Science, 271, 933-37 (1996)；Alivisatos、J. Phys. Chem., 100, 13226-39 (1996)；Brus, Appl. Phys., A 53, 465-74 (1991)；Wilsonら、Science, 262, 1242-46 (1993)；Henglein (1989)，前述；およびWeller (1993)，前述）。最近の研究により、改良された発光がサイズを整調することができる低いバンドギャップのコア粒子を、高いバンドギャップのシェルでキャッピングすることによって得ることができること示された。例えば、ＺｎＳ層で不動態化されたＣｄＳｅ量子ドットは室温で強力に発光性であり（３５〜５０％量子収率）、そしてその発光波長は、粒子サイズを変えることによって、青から赤まで調整できる。さらに、ＺｎＳキャッピングはコア表面を保護し、量子ドットのより大きな安定性を導く（Hines (1996)，前述；およびDabbousiら、J. Phys. Chem. B 101, 9463-75 (1997)）。
【０００７】
発光量子ドット技術における著しい前進にもかかわらず、キャッピングした発光量子ドットは、それらが水溶性でないため、生物学的用途には適していない。さらに、生体分子の生物活性を保つような方法で、生体分子に量子ドットを結合することはできなかった。しかし、発光量子ドットは、現在利用可能な非同位体検出システムを超える重大な前進を提供するので、生物学的アッセイにおける検出目的に使用し得る発光量子ドットへの実現されていない要求が依然存在している。このため、本発明の目的は、生物学的用途に適した発光量子ドットを提供することである。本発明の別の目的は、生物学的用途に適した発光量子ドットの生体分子コンジュゲートを提供することにある。特に、本発明は、発光量子ドットの生体分子コンジュゲート（ここで、生体分子はその生物学的活性を保持したままであり、得られるコンジュゲートは生物学的用途に適している）を提供しようとしている。従って、本発明のさらに別の目的は、そのような発光量子ドットを作製する方法およびその生体分子コンジュゲートを作製する方法を提供することである。本発明のなおさらに別の目的は、そのような量子ドットまたはその生体分子コンジュゲートを含む組成物を提供することである。本発明のさらなる目的は、生体分子コンジュゲートを、インビトロおよびインビボでの超高感度非同位体検出に使用する方法を提供することである。本発明のこれらおよび他の目的および利点ならびにさらなる発明的特徴は、本明細書中に提供する詳細な説明を読めば、当業者に明らかとなるだろう。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、コア、キャップおよび親水性結合基を含む、水溶性発光量子ドットを提供する。水溶性発光量子ドットおよび水性担体を含む組成物もまた提供する。本発明は、水溶性発光量子ドットおよび生体分子を含むコンジュゲート（ここで、生体分子は親水性結合基に直接または間接的に結合されている）をさらに提供する。このコンジュゲートおよび水性担体を含む組成物もまた提供する。
【０００９】
水溶性発光量子ドットを得る方法およびその生体分子コンジュゲートを作製する方法を本発明によってさらに提供する。本発明によって提供される他の方法には、インビトロおよびインビボで生体分子を検出する方法が含まれる。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、インビトロおよびインビボでの生体分子の超高感度非同位体検出の手段および方法を提供する。本発明は、キャッピングした発光量子ドットが、親水性結合基を量子ドットのキャップに結合することによって水溶性にされ得るという、そしてこれらの量子ドットがその発光特性を保持するという驚くべき予期せぬ有利な発見を前提としている。本発明はまた、様々な生体分子が量子ドットのキャップ上の親水性結合基に直接および間接的に結合され得るという、そしてこれらの生体分子がその生物活性を保持し得るという発見を前提としている。
【００１１】
上記の点から、本発明は、一実施態様において、コア、キャップおよび親水性結合基を含む水溶性発光半導体量子ドットを提供する。「コア」とは、ナノ粒子サイズの半導体である。ＩＩＢ−ＶＩＢ半導体、ＩＩＩＢ−ＶＢ半導体またはＩＶＢ−ＩＶＢ半導体のいずれのコアも本発明において使用できるが、コアはキャップと組み合わせた場合、発光量子ドットを生じるようなものでなくてはならない。ＩＩＢ−ＶＩＢ半導体は、周期表のＩＩＢ族からの少なくとも１つの元素と、ＶＩＢ族からの少なくとも１つの元素とを含む化合物等である。好ましくは、コアは、約１ｎｍから約１０ｎｍまでのサイズ範囲の、ＩＩＢ−ＶＩＢ半導体、ＩＩＩＢ−ＶＢ半導体またはＩＶＢ−ＩＶＢ半導体である。コアは、より好ましくは、ＩＩＢ−ＶＩＢ半導体であり、約２ｎｍから約５ｎｍまでのサイズ範囲である。最も好ましくは、コアはＣｄＳまたはＣｄＳｅである。この点で、ＣｄＳｅはコアとして特に好ましい（特に約４．２ｎｍのサイズのもの）。
【００１２】
「キャップ」とは、コアの半導体とは異なり、コアに結合することによってコア上に表面層を形成する半導体である。キャップは、所定の半導体コアと組み合わせた場合、発光量子ドットを生じるようなものでなくてはならない。キャップは、コアよりも高いバンドギャップを有することによってコアを不動態化すべきである。この点で、キャップは、好ましくは、高いバンドギャップのＩＩＢ−ＶＩＢ半導体である。より好ましくは、キャップはＺｎＳまたはＣｄＳである。最も好ましくは、キャップはＺｎＳである。特に、コアがＣｄＳｅまたはＣｄＳである場合、キャップは好ましくはＺｎＳであり、コアがＣｄＳｅである場合、キャップは好ましくはＣｄＳである。
【００１３】
「結合基」とは、その語を本明細書中で使用する場合、（例えば、任意の安定な物理的または化学的結合によって）発光半導体量子ドットのキャップ表面に結合され得、かつ量子ドットをもはや発光性でないようにすることなく量子ドットを水溶性にし得る任意の有機基を示す。従って、結合基は親水性部分を含む。好ましくは、結合基は、親水性量子ドットが少なくとも約１時間溶解状態のままであることを可能にする。より好ましくは、結合基は、親水性量子ドットが少なくとも約１日溶解状態のままであることを可能にする。さらにより好ましくは、結合基は、親水性量子ドットが少なくとも約１週間、最も好ましくは少なくとも約１ヶ月間、溶解状態のままであることを可能にする。望ましくは、結合基は、共有結合によってキャップに結合され、そして親水性部分を露出するようにしてキャップに結合される。好ましくは、親水性結合基は、イオウ原子を介して量子ドットに結合される。より好ましくは、親水性結合基は、イオウ原子と少なくとも１つの親水性結合基とを含む有機基である。適当な親水性結合基としては、例えば、カルボン酸またはその塩、スルホン酸またはその塩、スルファミン酸またはその塩、アミノ置換基、四級アンモニウム塩、および水酸基が挙げられる。本発明の親水性結合基の有機基は、好ましくはＣ1〜Ｃ6アルキル基またはアリール基であり、より好ましくはＣ1〜Ｃ6アルキル基であり、さらにより好ましくはＣ1〜Ｃ3アルキル基である。従って、好ましい実施態様では、本発明の結合基は、チオールカルボン酸またはチオールアルコールである。より好ましくは、結合基はチオールカルボン酸である。最も好ましくは、結合基はメルカプト酢酸である。
【００１４】
従って、水溶性発光半導体量子ドットの好ましい実施態様は、約４．２ｎｍのサイズのＣｄＳｅコア、ＺｎＳキャップおよび結合基を含むものである。水溶性発光半導体量子ドットの別の好ましい実施態様は、ＣｄＳｅコア、ＺｎＳキャップおよび結合基メルカプト酢酸を含むものである。特に好ましい水溶性発光半導体量子ドットは、約４．２ｎｍのＣｄＳｅコア、約１ｎｍのＺｎＳキャップ、およびメルカプト酢酸結合基を含む。
【００１５】
別の実施態様では、本発明はまた、上記水溶性発光半導体量子ドットおよび水性担体を含む組成物を提供する。任意の適当な水性担体がこの組成物において使用できる。望ましくは、担体は組成物を所望の温度（例えば、室温）にて安定にするものであり、ほぼ中性ｐＨのものである。適当な水性担体の例は、当業者に公知であり、生理食塩水溶液およびリン酸緩衝化生理食塩水溶液（ＰＢＳ）が挙げられる。
【００１６】
さらに別の実施態様では、本発明は、上記水溶性発光半導体量子ドットおよび生体分子を含むコンジュゲート（ここで、生体分子は親水性結合基を介して量子ドットに結合されている）を提供する。生体分子は、量子ドットを水不溶性にすべきではない。好ましくは、生体分子はタンパク質、タンパク質のフラグメント、または核酸である。句「タンパク質またはそのフラグメント」の使用は、（天然から単離されたものであろうとなかろうと）ウイルス、細菌、植物または動物（例えば、ヒト等の哺乳動物）起源の、または合成の、タンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、ペプチド等を包含することを意図する。本発明のコンジュゲートにおいて生体分子として使用するのに好ましいタンパク質またはそのフラグメントは、抗原、抗原のエピトープ、抗体、または抗体の抗原反応性フラグメント（antigenically reactive fragment）である。句「核酸」の使用は、（天然から単離されたものであろうとなかろうと）ウイルス、細菌、植物または動物（例えば、ヒト等の哺乳動物）起源の、合成の、一本鎖の、二本鎖の、天然もしくは非天然ヌクレオチドを含む、または化学的に修飾された、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含することを意図する。好ましい核酸は、ステム・アンド・ループ構造（stem and loop structure）を含む一本鎖オリゴヌクレオチドであり、親水性結合基は該一本鎖オリゴヌクレオチドの一端に結合され、クエンチング部分は該一本鎖オリゴヌクレオチドの他端に結合され、該クエンチング部分は発光半導体量子ドットをクエンチする。
【００１７】
生体分子は、（例えば、任意の安定な物理的または化学的結合によって）水溶性発光量子ドットの親水性結合基に任意の適当な手段により直接または間接的に結合できる。望ましくは、生体分子は１つ以上の共有結合を介して直接または間接的に結合基に結合される。生体分子が親水性結合基に間接的に結合される場合、その結合は好ましくは「リンカー」による。語「リンカー」の使用は、生体分子を水溶性発光量子ドットの結合基に連結するのに使用することができる任意の適当な手段を包含することを意図する。リンカーは水溶性発光量子ドットを水不溶性にすべきでなく、量子ドットの発光に悪影響を与えるべきでない。また、リンカーは結合した生体分子の機能に悪影響を与えるべきでない。コンジュゲートがインビボで使用される場合、望ましくは、リンカーは生体適合性である。
【００１８】
例えば、結合基がメルカプト酢酸であり核酸生体分子が結合基に結合している場合、リンカーは好ましくは、一級アミン、チオール、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ビオチン、または類似の分子である。結合基がメルカプト酢酸でありタンパク質生体分子またはそのフラグメントが結合基に結合されている場合、リンカーは好ましくは、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ビオチン、または類似の分子である。本発明によれば、リンカーは、結合したタンパク質の機能または活性に不可欠なアミノ酸において、タンパク質生体分子またはそのフラグメントと結合すべきではない。クロスリンカー（例えば、媒介クロスリンカー（intermediate crosslinker））が、生体分子を水溶性発光量子ドットの結合基に結合するのに使用できる。エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）は媒介クロスリンカーの一例である。本発明で使用する媒介クロスリンカーの他の例は、当該分野で公知である。例えば、Bioconjugate Techniques (Academic Press, New York, (1996))を参照のこと。
【００１９】
触媒的クロスリンカー（catalytic crosslinker）もまた、生体分子を水溶性発光量子ドットの結合基に結合するのに使用できる。触媒的クロスリンカーは、結合基への生体分子の直接結合をもたらす。触媒的クロスリンカーの例もまた当該分野で公知である。例えば、Bioconjugate Techniques (1996)（前述）を参照のこと。
【００２０】
水溶性発光量子ドットの結合基への生体分子の結合はまた、当該分野で公知であるような２官能性化合物によって達成され得る。例えば、Bioconjugate Techniques (1996)（前述）を参照のこと。
【００２１】
短いリンカーが立体障害の問題を引き起こし得るか、またはそうでなければ、生体分子の機能に影響を与え得る場合には、リンカーの長さを、当該分野で周知の手順を用いて、例えば、約１０〜約２０原子のスペーサーを付加することによって、増加させることができる（例えば、Bioconjugate Techniques (1996)（前述）を参照のこと）。１つの可能なリンカーは、親水性であり標識化オリゴヌクレオチドを調製するときに広く使用されている活性化ポリエチレングリコールである。
【００２２】
従って、好ましい本発明のコンジュゲートは、約４．２ｎｍのＣｄＳｅコア、ＺｎＳキャップ、親水性結合基、および生体分子を含むコンジュゲートである。別の好ましい本発明のコンジュゲートは、ＣｄＳｅコア、ＺｎＳキャップ、メルカプト酢酸結合基、および生体分子を含むコンジュゲートである。特に好ましいコンジュゲートは、約４．２ｎｍのＣｄＳｅコア、約１ｎｍのＺｎＳコーティング、メルカプト酢酸結合基、および生体分子を含む。
【００２３】
他の好ましい本発明のコンジュゲートは、生体分子がステムとループとを含む一本鎖オリゴヌクレオチドである、本質的に上述したようなコンジュゲートである。親水性結合基は一本鎖オリゴヌクレオチドの一端に結合され、クエンチング部分は一本鎖オリゴヌクレオチドの他端に結合される。クエンチング部分は発光半導体量子ドットをクエンチする。
【００２４】
量子ドットの発光をクエンチする任意の適当なクエンチング部分を、上記他の好ましいコンジュゲートにおいて使用することができる。好ましくは、他の好ましいコンジュゲートは、３’末端に一級アミン基、５’末端にビオチン基を含む。クエンチング部分は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの３’アミノ基に共有結合された非蛍光有機発色団である。より好ましくは、クエンチング部分は、４−［４’−ジメチルアミノフェニルアゾ］安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）である。好ましくは、バイオコンジュゲート（bioconjugate）の発光量子ドットは、周知の架橋法によってまずストレプトアビジンを用いて誘導体化され、次いで、好ましくは１：１のモル比で、５’ビオチン基に結合される。
【００２５】
従って、別の実施態様では、本発明はまた、上述したようなコンジュゲートと水性担体とを含む組成物を提供する。任意の適当な水性担体がこの組成物において使用できる。望ましくは、担体は組成物を所望の温度（例えば、室温）にて安定にするものであり、そしてほぼ中性のｐＨのものである。適当な水性担体の例は、当業者に公知であり、生理食塩水およびＰＢＳが挙げられる。
【００２６】
上記の点から、本発明はさらに、記載したような水溶性発光半導体量子ドットを得る方法を提供する。本方法は、（ａ）非極性有機溶媒中の上記したような発光半導体量子ドットと、結合基を含む第１の水溶液とを反応させる工程と、（ｂ）ほぼ中性ｐＨの第２の水溶液を添加し、混合する工程と、（ｃ）水層を抽出することによって、水溶性発光半導体量子ドットを得る工程とを含む。好ましくは、非極性有機溶媒はクロロホルムであり、結合基はメルカプト酢酸である。
【００２７】
本発明はまた、上述したような水溶性発光半導体量子ドットおよび生体分子を含むコンジュゲートを作製する方法を提供する。生体分子が量子ドットの結合基に直接結合される場合、本方法は、（ａ）上記したような水溶性発光半導体量子ドットと、水溶性発光半導体量子ドットのキャップ上の結合基に直接結合し得る生体分子とを接触させる工程と、（ｂ）コンジュゲートを単離する工程とを含む。好ましくは、生体分子はタンパク質またはそのフラグメントあるいは核酸である。生体分子を結合基に直接結合させる方法の一実施態様において、結合基はメルカプト酢酸であり、生体分子はタンパク質である。直接結合法の別の実施態様においては、量子ドットおよび生体分子を、触媒的クロスリンカーの存在下で接触させる。
【００２８】
生体分子が水溶性発光半導体量子ドットの結合基に間接的に結合される場合、本発明は、（ａ）上記したような水溶性半導体発光量子ドットと、結合基および生体分子に結合し得るリンカーとを接触させる工程と、（ｂ）リンカーが結合した水溶性発光半導体量子ドットを単離する工程と、（ｃ）リンカーが結合した水溶性発光半導体量子ドットを生体分子と接触させる工程と、（ｄ）コンジュゲートを単離する工程とを含む方法を提供する。
【００２９】
あるいは、本方法は、（ａ）生体分子と、結合基および生体分子に結合し得るリンカーとを接触させる工程と、（ｂ）リンカーが結合した生体分子を単離する工程と、（ｃ）リンカーが結合した生体分子と水溶性発光量子ドットとを接触させる工程と、（ｄ）コンジュゲートを単離する工程とを含む。生体分子を結合基に間接的に結合させる方法の一実施態様において、リンカーは一級アミンまたはストレプトアビジンであり、結合基はメルカプト酢酸であり、生体分子は核酸である。
【００３０】
生体分子を結合基に間接的に結合させる方法の別の実施態様において、本方法は、（ａ）水溶性発光量子ドットと、媒介クロスリンカーまたは２官能分子（これらのいずれか一つが結合基および生体分子に結合し得る）とを接触させる工程、（ｂ）媒介クロスリンカーまたは２官能分子が結合した水溶性発光量子ドットを単離する工程と、（ｃ）媒介クロスリンカーまたは２官能分子が結合した水溶性発光量子ドットと生体分子とを接触させる工程と、（ｄ）コンジュゲートを単離する工程とを含む。
【００３１】
あるいは、本方法は、（ａ）生体分子と、媒介クロスリンカーまたは２官能分子（これらのいずれか一つが結合基および生体分子に結合し得る）とを接触させる工程と、（ｂ）媒介クロスリンカーまたは２官能分子が結合した生体分子を単離する工程と、（ｃ）媒介クロスリンカーまたは２官能分子が結合した生体分子を水溶性発光量子ドットと接触させる工程と、（ｄ）コンジュゲートを単離する工程とを含む。そのような実施態様の例には、結合基としてメルカプト酢酸、生体分子としてタンパク質またはそのフラグメント、および媒介クロスリンカーとしてＥＤＡＣを用いる方法がある。
【００３２】
サンプル中のタンパク質を検出する方法もまた本発明によって提供される。本方法は、（ａ）サンプルと上記したようなコンジュゲートとを接触させる工程であって、該コンジュゲートの生体分子が該タンパク質に特異的に結合する工程と、（ｂ）発光を検出する工程であって、発光の検出が、該コンジュゲートがサンプル中の該タンパク質に結合したことを示す工程とを含む。
【００３３】
好ましくは、タンパク質検出の方法において、コンジュゲートの生体分子はタンパク質またはそのフラグメント（例えば、抗体またはその抗原反応性フラグメント）であり、サンプル中のタンパク質は、該抗体またはその抗原反応性フラグメントにより結合される抗原またはそのエピトープである。該抗原またはそのエピトープは、好ましくは、ウイルスまたは細菌の一部である。あるいは、また好ましくは、コンジュゲートの生体分子は抗原またはそのエピトープであり、サンプル中のタンパク質は、該抗原またはそのエピトープに結合する抗体またはその抗原反応性フラグメントである。該抗体またはその抗原反応性フラグメントは、好ましくは、ウイルス、細菌、またはウイルスもしくは細菌の一部に特異的である。さらに別の他のそして好ましい実施態様においては、コンジュゲートの生体分子は核酸であり、サンプル中のタンパク質は核酸結合タンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質）である。
【００３４】
本発明により提供される別の方法は、サンプル中の核酸を検出する方法である。本方法は、（ａ）サンプルと上記したようなコンジュゲートとを接触させる工程であって、該コンジュゲートの生体分子が該核酸に特異的に結合する工程と、（ｂ）発光を検出する工程であって、発光の検出が、該コンジュゲートが該サンプル中の該核酸に結合したことを示す工程とを含む。好ましくは、コンジュゲートの生体分子は核酸である。あるいはそして好ましくは、コンジュゲートの生体分子は核酸に結合するタンパク質またはそのフラグメント（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質）である。
【００３５】
図１に示すように、本発明はまた、サンプル中の核酸を検出する別の方法を提供する。この方法は、ステム・アンド・ループ構造を有する一本鎖オリゴヌクレオチド、量子ドット部分、およびクエンチング部分を含む、バイオコンジュゲートを使用することを含む。オリゴヌクレオチドのループは、サンプル中で検出されるべき核酸中の標的配列に相補的なプローブ配列を含む。望ましくは、ループはそれが標的配列と接触した際に容易に開くような、しかし、それが容易に剪断されるほど大きくはない、十分なサイズのものである。好ましくは、ループは、約１０ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドまで、より好ましくは約１５ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドまでである。プローブ配列は、ループのすべてまたはそれ未満を含み得る。好ましくは、プローブ配列は、少なくとも約１５ヌクレオチド長である。ステムは、一本鎖オリゴヌクレオチドの２つの末端のまたはその付近の相補配列をアニーリングすることによって形成される。発光量子ドット部分は一本鎖オリゴヌクレオチドの一端に共有結合され、クエンチング部分は一本鎖オリゴヌクレオチドの他端に共有結合される。ステムは、一本鎖オリゴヌクレオチドが標的配列に結合していない場合に量子ドットの発光がクエンチされるように、発光量子ドットおよびクエンチング部分を互いに非常に近傍に維持する。この点で、ステムを構成する相補配列は、発光量子ドットのクエンチングを達成するように、オリゴヌクレオチドの両端に十分に近くなくてはならない。プローブ配列がサンプル中の検出すべき核酸中の標的配列に遭遇する場合、それは標的配列に結合（すなわちハイブリダイズ）することによって、ステムハイブリッドよりも長く安定なプローブ−標的ハイブリッドを形成する。プローブ−標的ハイブリッドの長さおよび剛性によって、ステムハイブリッドの同時形成が防止される。結果として、該構造がステムを開かせる自発的構造変化を受けることによって、量子ドット部分とクエンチング部分とが分離し、発光が回復する。
【００３６】
従って、本方法は、（ａ）サンプルとコンジュゲート（ここで、生体分子はステム・アンド・ループ構造を含む一本鎖オリゴヌクレオチドであり、親水性結合基が該一本鎖オリゴヌクレオチドの一端に結合されており、クエンチング部分が該一本鎖オリゴヌクレオチドの他端に結合されている）とを接触させ、その結果、クエンチング部分が発光半導体量子ドットをクエンチする工程を含む（すべて上述されるとおり）。ループは、サンプル中の核酸中の標的配列に結合するプローブ配列を含む。結合時、コンジュゲートがステムを開かせる構造変化を受けることによって、量子ドットとクエンチング部分とが分離される。本方法はさらに、（ｂ）発光を検出する工程を含む。発光の検出は、コンジュゲートがサンプル中の核酸に結合したことを示す。
【００３７】
図２に示すように、本発明は、固相支持体（例えば、メンブレン、ガラスビーズ、透明ポリマー等）へ結合させることによって、サンプル中の一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、または変性二本鎖ＤＮＡを検出するさらに別の方法を提供する。本方法は、（ａ）第１の一本鎖核酸を含むサンプルと、該第１の一本鎖核酸に結合し得る第２の一本鎖核酸が結合した固相支持体とを接触させる工程と、（ｂ）固相支持体と上記したようなコンジュゲート（ここで、該生体分子は、該第２の一本鎖核酸により結合されている領域以外の領域で該第１の一本鎖核酸に特異的に結合する第３の一本鎖核酸である）とを接触させる工程と、（ｃ）発光を検出する工程であって、発光の検出が、コンジュゲートの第３の一本鎖核酸がサンプル中の第１の一本鎖核酸に結合したことを示す工程とを含む。
【００３８】
好ましくは、第２の一本鎖核酸はオリゴヌクレオチド捕捉プローブ（例えば、合成チミン（ポリ−Ｔ）またはアデノシン（ポリ−Ａ）オリゴヌクレオチド）である。好ましくは、第２の一本鎖核酸は当該分野で公知の方法に従う標準的な架橋手順によって、固相支持体に結合される（例えば、Joosら、Anal. Biochem., 247, 96-101 (1997)；Runningら、BioTechniques, 8, 276-277 (1990)を参照のこと）。第２の一本鎖核酸は、安定かつ効率的に第１の一本鎖核酸と結合するように、固相支持体上で十分な長さと密度を有するべきである。好ましくは、捕捉プローブは、少なくとも約３５塩基長である。
【００３９】
さらに広くは、本発明はサンプル中の核酸を検出する方法を提供する。本方法は、核酸捕捉プローブを固相支持体に結合する工程を含む。核酸捕捉プローブは、サンプル中の該核酸に結合する配列を含む。次いで、結合した核酸捕捉プローブはサンプルと接触させられることによって、該核酸を固相支持体上に固定化する。本方法はさらに、該固定化された核酸と、水溶性発光半導体量子ドットおよび生体分子を含むコンジュゲートとを接触させる工程を含む。コンジュゲートの生体分子は、該核酸に特異的に結合する。次いで、本方法は、発光を検出する工程を含む。発光の検出は、コンジュゲートがサンプル中の該核酸に結合したことを示す。
【００４０】
本発明はまた、２つ以上の異なる分子および／または所定の分子上の２つ以上の領域をサンプル中で同時検出し得る方法を提供する。本方法は、１セットの上述したようなコンジュゲート（ここで、セット中の各コンジュゲートは、サンプル中の異なる分子または所定の分子上の異なる領域に特異的に結合する生体分子に結合した、異なるサイズの量子ドットまたは異なる組成の量子ドットを有する）を使用することを含む。好ましくは、コンジュゲートの量子ドットは１ｎｍから１０ｎｍまでのサイズ範囲であり、このサイズは、青〜赤の範囲の発光の放射を可能にする。特定の色の発光に対応する量子ドットサイズは当該分野で周知である。このサイズ範囲内において、異なるサイズの量子ドットが単一波長で励起され得、かつ異なるサイズの量子ドット間の発光の差異が検出され得る限り、量子ドットの任意のサイズバリエーションを用いることができる。望ましくは、異なるサイズの量子ドットは、狭く対称的な発光ピークを有するキャッピング層を有する。好ましくは、異なるサイズの量子ドットは、コアの構造に適合する無機キャッピング層を有する。より好ましくは、異なるサイズの量子ドットは、ＺｎＳまたはＣｄＳｅキャッピング層を有する。同様に、異なる組成または構成の量子ドットは、特定の色の発光に関して変化するだろう。組成が異なる量子ドットが単一波長で励起され得、かつ異なる組成の量子ドット間の発光の差異が検出され得る限り、量子ドット間の組成の任意のバリエーションを用いることができる。サンプル中の異なる標的分子の検出は、コンジュゲートのセットを構成する組成の異なる量子ドットまたは異なるサイズの量子ドットによって生じる多色発光の放射から生じる。この方法はまた、単一タンパク質の異なる機能ドメインを、例えば区別することを可能にする。
【００４１】
従って、本発明は、サンプル中の２つ以上の異なる分子および／または所定の分子の２つ以上の領域を同時検出する方法を提供する。本方法は、サンプルと、水溶性発光半導体量子ドットおよび生体分子の２つ以上のコンジュゲートとを接触させる工程を含み、ここで該２つ以上のコンジュゲートのそれぞれが、異なるサイズまたは組成の量子ドットと、サンプル中の異なる分子または所定の分子の異なる領域に特異的に結合する生体分子とを含む。本方法はさらに、発光を検出する工程であって、所定の色の発光の検出がサンプル中の分子へのコンジュゲートの結合を示す工程を含む。
【００４２】
本発明によれば、２つ以上のタンパク質またはそのフラグメントをサンプル中で同時検出できる。あるいは、２つ以上の核酸が同時検出できる。この点で、サンプルは核酸およびタンパク質（またはそれらのフラグメント）の混合物を含むことができる。
【００４３】
好ましくは、２つ以上のタンパク質またはそのフラグメントを検出する方法において、各コンジュゲートの生体分子はタンパク質またはそのフラグメント（例えば、抗体またはその抗原反応性フラグメント）であり、サンプル中のタンパク質またはそのフラグメントは該抗体またはその抗原反応性フラグメントにより結合される抗原またはそのエピトープである。あるいはそしてまた好ましくは、各コンジュゲートの生体分子は抗原またはそのエピトープであり、サンプル中のタンパク質またはそのフラグメントは、該抗原またはそのエピトープに結合する抗体またはその抗原反応性フラグメントである。また好ましくは、各コンジュゲートの生体分子は核酸であり、サンプル中のタンパク質またはそのフラグメントは核酸結合タンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質）である。
【００４４】
また、本発明によれば、２つ以上の核酸がサンプル中で同時検出できる。サンプル中の核酸を検出する上記方法のいずれもが、該核酸に結合し得る生体分子に結合した異なるサイズの量子ドットを含む２つ以上のコンジュゲートとともに用いられ得る。従って、サンプル中の２つ以上の核酸を同時検出する１つの方法は、（ａ）サンプルと、２つ以上のコンジュゲート（ここで、各コンジュゲートは、サンプル中の標的核酸に特異的に結合する生体分子（好ましくは、核酸（特に一本鎖核酸）またはタンパク質もしくはそのフラグメント（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質））に結合した異なるサイズの量子ドットを含む）とを接触させる工程と、（ｂ）発光を検出する工程であって、所定の色の発光の検出が、コンジュゲートがサンプル中のその標的核酸に結合したことを示す工程とを含む。
【００４５】
サンプル中の２つ以上の核酸を同時検出する別の方法は、２つ以上のコンジュゲート（これらの各々は異なる上記ステム・アンド・ループ構造を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを含む）を、上述したようなコンジュゲートを使用する方法に従って、使用することを含む。サンプル中の２つ以上の核酸を同時検出するさらに別の方法は、上記方法（ここで、検出すべき核酸は上記した種類の固相支持体に結合される）を、記載したサンプル中の核酸を結合する方法および記載した上述したような該核酸を検出する方法に従って使用することを含む。この方法の一実施態様を図２に記載する。
【００４６】
サンプル中の２つ以上の分子を同時検出する本発明の方法の別の実施態様では、サンプルは、少なくとも１つの核酸と少なくとも１つのタンパク質またはそのフラグメントとを含む。サンプル中の核酸およびタンパク質またはそのフラグメントの同時検出は、記載したサンプル中のタンパク質またはそのフラグメントを検出する方法、および記載した上述したサンプル中の核酸を検出する方法に従って、上記したような方法を使用して達成できる。
【００４７】
上記コンジュゲートおよび方法は、生体分子の検出を達成する非常に多くの他の方法および生物学的システムにおける使用に適合され得る。このような方法としては、例えば、インサイチュハイブリダイゼーション等が挙げられる。本発明はまた、量子ドットの増大した光安定性によって、生細胞における細胞メカニズム（例えば、リガンド−レセプター相互作用および分子輸送）をリアルタイムで観察するための広範な用途を有する。
【００４８】
本発明は、様々な診断アッセイにおける用途を有する。これらには、ウイルス感染、ガン、心疾患、肝疾患、遺伝子疾患および免疫疾患の検出が含まれるが、それらに限定されない。本発明は、ＨＩＶおよび肝炎等の特定のウイルスを、例えば、（ａ）試験すべきサンプルを患者から取り出し、（ｂ）該サンプルと水溶性発光量子ドット生体分子コンジュゲート（ここで、生体分子は、該ウイルスに結合する抗体またはその抗原反応性フラグメントである）とを接触させ、（ｃ）発光を検出する（ここで、発光の検出が該ウイルスがサンプル中に存在することを示す）ことによって、検出する診断アッセイに使用できる。患者のサンプルは、唾液、涙液、血液、血清または尿等の体液であり得る。例えば、ＨＩＶ  ｇｐ１２０に対する抗体が、サンプル中のＨＩＶの存在を検出するために使用され得る。あるいは、ＨＩＶ  ｇｐ１２０が、サンプル中の、ＨＩＶに対する抗体の存在を検出するために使用され得る。
【００４９】
本発明はまた、ウイルス核酸を検出することによって、特定のウイルス（例えば、ＨＩＶおよび肝炎）の超低レベルのウイルス負荷を決定する診断アッセイに使用できる。患者のウイルス負荷の決定は、ウイルス粒子数が現在の技術の検出限界未満である場合に有用である。例えば、この技術は、高度な薬物治療（例えば、三剤療法(triple drug therapy)）中のＡＩＤＳ患者（ここで、該患者のウイルス負荷は非常に減少している）の超低ＨＩＶレベルを追跡するのに特に有用であり得る。ウイルス核酸の検出は、例えば、（ａ）試験すべきサンプルを患者から取り出し、（ｂ）該サンプルを処理して、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを遊離させ、（ｃ）該サンプルと、水溶性発光量子ドット生体分子コンジュゲート（ここで、該生体分子は該ウイルスの核酸に結合する）とを接触させ、（ｄ）発光を検出する（ここで、発光の検出は該ウイルスがサンプル中に存在することを示す）ことによって、達成され得る。
【００５０】
本発明の方法の一実施態様を図３に示す。この方法を用いて、ウイルス核酸の検出は、（ａ）試験すべきサンプルを患者から取り出し、（ｂ）該サンプルを処理して、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを遊離させ、（ｃ）捕捉プローブを固相支持体に結合させ（ここで、捕捉プローブはサンプル中の該ウイルス核酸に結合する配列を含む）、（ｄ）結合した捕捉プローブとウイルス核酸とを接触させることによって、ウイルス核酸を固相支持体上に固定し、（ｅ）固定化したウイルス核酸と発光量子ドットコンジュゲート（ここで、コンジュゲートの生体分子は該ウイルス核酸に特異的に結合する）とを接触させ、（ｆ）発光を検出する（ここで、発光の検出は、コンジュゲートがサンプル中のウイルス核酸に結合したことを示す）ことによって、達成される。
【００５１】
好ましくは、固相支持体は、捕捉プローブが結合し得る、ガラス表面、透明ポリマー表面、メンブレン等である。捕捉プローブは、固相支持体表面への結合および標的ウイルス核酸との結合の両方が可能な任意の分子であり得る。好ましくは、捕捉プローブは、固相支持体に結合した相補配列に結合する第１の核酸配列と、ウイルスゲノム中の第３の核酸配列に結合する第２の核酸配列とを含む一本鎖オリゴヌクレオチドである。第１および第２の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドは、約２０〜５０塩基の長さを有し得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約３０塩基の長さを有する。望ましくは、ウイルスゲノム中の第３の核酸配列は保存配列である。
【００５２】
発光量子ドットコンジュゲートは、捕捉プローブ配列の第２の配列によって結合される領域以外の領域で標的ウイルス核酸の第３の配列に特異的に結合する生体分子に結合した発光量子ドットを含む。生体分子は、標的ウイルス核酸に結合し得る任意の分子であり得る。好ましくは、生体分子は、標的ウイルスゲノム中の第３の配列に相補的な第４の配列を含むオリゴヌクレオチドである。あるいは、生体分子は標的ウイルス核酸に特異的に結合するＤＮＡ結合タンパク質であり得る。
【００５３】
単一ウイルスの検出に加えて、本発明は、異なる種のウイルス核酸を検出することによって、様々なタイプのウイルスのウイルス負荷または単一ウイルスの様々なサブタイプのウイルス負荷を同時検出するために使用することができる。サンプル中の複数のウイルス核酸を同時検出する１つの方法は、（ａ）サンプルと、１セットのコンジュゲート（ここで、該セットの各コンジュゲートは、サンプル中の標的ウイルス核酸と特異的に結合するプローブ生体分子に結合した異なるサイズの量子ドットを含む）を接触させる工程と、（ｂ）多色発光を検出する工程であって、多色発光の検出が、異なるコンジュゲートのそれぞれがサンプル中のその標的ウイルス核酸に結合したことを示す工程とを含む。サンプル中の２つ以上の核酸を同時検出するさらに別の方法は上記方法を用いることを含み、これもまた図３に記載する。
【００５４】
本発明は、例えば、ガン、心疾患または肝疾患等の特定の疾患状態を、（ａ）試験すべきサンプルを患者から取り出し、（ｂ）該サンプルと、水溶性発光量子ドット生体分子コンジュゲート（ここで、生体分子は所定の疾患状態と関連するタンパク質に結合する抗体またはその抗原反応性フラグメントであり、該疾患は、例えば、ガン、心疾患または肝疾患である）とを接触させ、（ｃ）発光を検出する（ここで、発光の検出は、所定の疾患状態の存在を示す）ことによって検出するのと類似の様式で使用できる。これらの場合、サンプルは、細胞もしくは組織生検材料または体液（例えば、血液、血清または尿）であり得る。タンパク質は、所定の疾患に関連するマーカーまたは酵素であり得、それらの検出は、所定の疾患状態の存在を示す。疾患状態の検出は、タンパク質の産生過剰または産生不足の検出のように定量的なものであるか、あるいは非野生型（変異したものまたは切断したもの）形態のタンパク質の検出のように定性的なものであるかのいずれかであり得る。定量的測定に関して、好ましくは、量子ドットコンジュゲート−標的タンパク質複合体の発光を、適当なセットの標準と比較する。適当なセットの標準は、例えば、様々な所定濃度の検出されている標的と接触している本発明の発光量子ドットコンジュゲートを含む。当業者は、例えばサンプル中のタンパク質の量の概算が、サンプルの発光と適当な標準の発光とを比較することによって決定され得ることを理解するだろう。
【００５５】
本発明はまた、遺伝子疾患またはガン等の疾患状態を、（ａ）試験すべきサンプルを患者から取り出し、（ｂ）該サンプルと水溶性発光量子ドット生体分子コンジュゲート（ここで、生体分子は、目的の核酸と特異的にハイブリダイズする核酸である）とを接触させ、（ｃ）発光を検出する（ここで、発光の検出は所定の疾患状態の存在を示す）ことによって、検出するのに使用できる。これらの場合、サンプルは、細胞、組織または体液に由来するものであり得る。目的の遺伝子は、疾患状態のマーカー（例えば、乳ガンの存在を示し得るＢＲＣＡ1）であり得る。
【００５６】
上記方法はまた、動物におけるインビボ試験に適合させることができる。コンジュゲートは、生物学的に許容し得る担体中で、動物に投与すべきである。投与経路は、該コンジュゲートとアッセイすべき生体分子（例えば、タンパク質または核酸）との間の接触を達成するものであるべきである。インビボ投与は、発光を検出することによってのみ制限される。言い換えれば、コンジュゲートとアッセイすべき生体分子との間の接触部位は、発光検出手段がアクセス可能でなくてはならない。この点で、光ファイバが使用され得る。光ファイバにより、本発明の方法で必要な光の放出および検出が可能となる。
【００５７】
【実施例】
本発明を以下の実施例においてさらに記載する。これらの実施例は本発明をさらに例示するために提供され、本発明の範囲を制限することを意図しない。
【００５８】
（実施例１）
本実施例は、一端が発光量子ドットのキャップに結合し得、かつ他端が親水性部分を含む結合基を結合することによって、水溶性発光量子ドットを得る方法を示す。
【００５９】
４．２ｎｍのＣｄＳｅコアおよびＺｎＳキャップを含む量子ドットを、HinesおよびGuyot-Sionnest（J. Phys. Chem., 100, 468-71 (1996)）により開発された手順に従って調製した。量子ドットをクロロホルムに溶解し、ゆっくりと攪拌しながら、１．０Ｍの氷メルカプト酢酸(glacial mercapto-acetic acid)と室温で２時間反応させた。引き続いて、等量のＰＢＳ水溶液（ｐＨ  ７．４）を、３０分間激しく振盪しながら反応混合物に加えた。クロロホルム層と水層との自然分離時に、メルカプトコーティングされた量子ドットを含む水層を抽出した。次いで、水層を遠心分離して、メルカプトコーティングされた量子ドットをペレットにし、少なくとも４回抽出して過剰のメルカプト酢酸を取り除いた。最終ペレットを１０ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）に再懸濁し、室温で用時まで保存した。メルカプトコーティングされた量子ドットは少なくとも１ヶ月間可溶性のままであった。水溶性量子ドットの調製は、Chanら、Science, 281, 2016-2018 (1998)にさらに論ぜられる。
【００６０】
（比較例１ａ）
本実施例は、水溶性でない量子ドットの調製を示す。
【００６１】
その表面上にメルカプト安息香酸基を有する量子ドットを構築した。メルカプト安息香酸を、５０％ＤＭＳＯ／５０％メタノールの溶液に溶解した。テトラメチルアンモニウムヒドロキシドを添加することによって、溶液のｐＨを１１に調節した。メルカプト安息香酸の終濃度は５ｍＭであった。
【００６２】
メルカプト安息香酸溶液の１ｍｌアリコートをおよそ１ｍｇの実施例１に記載のＺｎＳキャッピングした量子ドットに加え、７０℃で加熱した。メルカプト安息香酸が結合した量子ドットは一時的に可溶化するが、メルカプト安息香酸量子ドットはおよそ１時間後急速に凝集し始めた。溶液からの量子ドットの凝集は、不安定性の表れである。次いで、メルカプト安息香酸量子ドットをアセトンを用いて精製し、引き続いて、ＰＢＳ中に置いた。再び、量子ドットは不安定であり、数時間後に溶液から沈殿した。
【００６３】
（実施例２）
本実施例は、架橋剤によって、タンパク質性生体分子（例えば、リガンド）を発光量子ドットのキャップ上の結合基に結合する方法を示す。
【００６４】
１ｍｌの実施例１の精製したメルカプト−量子ドットの溶液を、２ｍｇのトランスフェリン(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)および１ｍｇの架橋試薬ＥＤＡＣ(Sigma Chemical Co.)と、ボルテックスしつつ、室温で一晩反応させた。次いで、この溶液を５０，０００ＲＰＭで１時間遠心分離して、量子ドット−トランスフェリンバイオコンジュゲートをペレットにし、上清を取り除いた。この遠心分離工程をさらに２回繰り返した。精製したトランスフェリンバイオコンジュゲートをＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）に溶解し、室温で保存した。
【００６５】
（実施例３）
本実施例は、架橋剤によって、タンパク質性生体分子（例えば、抗体）を発光量子ドットのキャップ上の結合基に結合する方法を示す。
【００６６】
１ｍｌの実施例１の精製したメルカプト−量子ドットの溶液を、２ｍｇの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）(Sigma Chemical Co.)および１ｍｇのＥＤＡＣと、ボルテックスしつつ、室温で一晩反応させた。次いで、この溶液を５０，０００ＲＰＭで１時間遠心分離して、量子ドット−免疫グロブリンバイオコンジュゲートをペレットにし、上清を取り除いた。この遠心分離工程をさらに２回繰り返した。精製した免疫グロブリンバイオコンジュゲートをＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）に溶解し、室温で保存した。
【００６７】
（実施例４）
本実施例は、リンカー（例えば、遊離アミン基）によって、核酸を発光量子ドットのキャップ上の結合基に結合する方法を示す。
【００６８】
１ｍｌの実施例１の精製したメルカプト−量子ドットの溶液を、３’−または５’−アミン修飾オリゴヌクレオチド(Midland Certified Reagents, Midland, TX)および１ｍｇのＥＤＡＣと、ボルテックスしつつ、室温で一晩反応させる。次いで、この溶液を５０，０００ＲＰＭで１時間遠心分離して、量子ドット−オリゴヌクレオチドバイオコンジュゲートをペレットにし、上清を取り除く。この遠心分離工程をさらに２回繰り返す。精製したオリゴヌクレオチドバイオコンジュゲートをＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）に溶解し、室温で保存する。このアプローチを用いて、直接結合が、量子ドット上のカルボン酸基と核酸上のアミン基との間に形成される。
【００６９】
（実施例５）
本実施例は、リンカー（例えば、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジン）によって、発光量子ドットのキャップ上の結合基に核酸生体分子を結合する方法を示す。
【００７０】
実施例２および３に示した手順に従って、ストレプトアビジン(Sigma Chemical Co.)をメルカプト−量子ドットに共有結合する。量子ドットをストレプトアビジンでコーティングした後、ビオチン化オリゴヌクレオチド(Midland Certified Reagents)を、ストレプトアビジンコーティングした量子ドットと、ボルテックスしつつ、室温で一晩インキュベートする。量子ドット−ストレプトアビジン−ビオチン化−オリゴヌクレオチドを、５０，０００ＲＰＭで１時間遠心分離することによって精製する。上清を捨て、ペレットをＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）に再び溶解する。遠心分離工程をさらに２回繰り返す。精製した量子ドット−ストレプトアビジン−ビオチン化−オリゴヌクレオチドをＰＢＳに溶解し保存する。ストレプトアビジンをニュートラアビジンに代えて、同じ方法が使用できる。
【００７１】
（実施例６）
本実施例は、インビトロで抗体を検出するために抗体バイオコンジュゲートを使用する方法（ここで、この方法は免疫凝集アッセイである）を示す。
【００７２】
免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ）に結合した水溶性発光量子ドットを含む精製した免疫グロブリンバイオコンジュゲートを、実施例３に示した手順によって調製した。発光量子ドット−免疫グロブリンバイオコンジュゲートを、０．５μｇ／ｍｌの抗Ｆａｂ抗体（これはＩｇＧ分子に結合する）と反応させた。反応混合物を室温で１時間インキュベートした。該抗Ｆａｂ抗体は発光量子ドット−免疫グロブリンバイオコンジュゲートのＩｇＧ分子に結合し、これにより、発光バイオコンジュゲートが凝集した。高解像度ＣＣＤカメラ（１４０万画素，Photometrix, Tuscon, AZ）および１００Ｗ水銀励起ランプを備え付けた落射蛍光顕微鏡を用いて、発光を検出することによって、凝集を測定した。
【００７３】
（実施例７）
本実施例は、インビトロで抗体を検出するためにタンパク質バイオコンジュゲートを使用する方法（ここで、この方法は免疫凝集アッセイである）を示す。
【００７４】
水溶性発光量子ドットとタンパク質性生体分子（例えば、抗原）とを含む精製したタンパク質バイオコンジュゲートを、実施例２および３の手順に従って調製する。精製した細胞溶解物を、細胞を溶解し、サンプルを遠心分離して細胞の破片をペレットにし、次いで、精製した細胞溶解物を含む上清を抽出することによって、血液サンプルから調製する。精製した細胞溶解物を発光量子ドット−抗原バイオコンジュゲートとともにインキュベートする。目的の抗体が細胞溶解物サンプル中に存在する場合、発光量子ドット−抗原コンジュゲートに結合した抗原を認識し、それに結合して、これにより、発光量子ドットが凝集する。従って、発光量子ドットコンジュゲートの凝集は、細胞溶解物サンプル中にその抗体が存在することを示す。凝集は、実施例６に示した手順に従って発光によって決定される。所望であるならば、全く同じ方法が、サンプルとコントロールとを比較するために行われ得る。適当なコントロールとしては、標的抗体を含まない生理学的に等価な組成物に発光量子ドット−バイオコンジュゲートを加えることが挙げられる。
【００７５】
（実施例８）
本実施例は、インビトロでタンパク質を検出するために抗体バイオコンジュゲートを使用する方法（ここで、この方法は免疫凝集アッセイである）を示す。
【００７６】
水溶性発光量子ドットと抗体とを含む精製した抗体コンジュゲートを、実施例３の手順に従って調製する。精製した細胞溶解物を、実施例７に示した手順に従って、血液または組織サンプルから調製する。精製した細胞溶解物を、発光量子ドット−抗体コンジュゲートとともにインキュベートする。目的のタンパク質が細胞溶解物サンプル中に存在する場合、発光量子ドット−抗体コンジュゲートに結合した抗体分子は、サンプル中の該タンパク質を認識し、それに結合し、これによって発光量子ドットが凝集する。従って、凝集は該タンパク質がサンプル中に存在することを示す。凝集の程度は、細胞溶解物サンプル中に存在するタンパク質の濃度を示す。凝集の程度は、実施例６に示した手順に従って発光によって決定される。もちろん、サンプル中のタンパク質濃度を概算するため、量子ドット−コンジュゲート−タンパク質複合体の発光を、所定濃度の標的タンパク質と接触している本発明の発光量子ドット−バイオコンジュゲートを含む一連の標準と比較する。
【００７７】
（実施例９）
本実施例は、抗体をインビトロで検出するためにタンパク質バイオコンジュゲートを使用する方法（ここで、この方法は直接免疫アッセイである）を示す。
【００７８】
精製した細胞溶解物を、実施例７に示した手順に従って血液サンプルから調製する。水溶性発光量子ドットとタンパク質性生体分子（例えば、抗原）とを含む精製したタンパク質バイオコンジュゲートを、実施例２の手順に従って調製する。選択されて結合される抗原は、目的の抗体によって特異的に認識されるものである。精製した細胞溶解物のサンプルをポリスチレン表面上にピペッティングし、２時間室温でインキュベートする。サンプルを取り除き、ポリスチレン表面を蒸留水で洗浄する。非特異的結合を防ぐために、ＰＢＳ中１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）(Sigma Chemical Co.)溶液をポリスチレン表面上にピペッティングし、１時間室温でインキュベートする。ＢＳＡを取り除きポリスチレン表面を蒸留水で洗浄した後、水溶性発光量子ドット−抗原バイオコンジュゲートをポリスチレン表面上にピペッティングし、インキュベートする。目的の抗体が細胞溶解物サンプル中に存在する場合、それは発光量子ドット−抗原バイオコンジュゲートに結合した抗原を認識し、それに結合する。量子ドット−抗原バイオコンジュゲートの発光を、５１４ｎｍのＡｒ+／Ｋｒ+レーザーを用いてサンプルを励起することによって検出する。
【００７９】
（実施例１０）
本実施例は、インビトロでタンパク質を検出するために抗体バイオコンジュゲートを使用する方法（ここで、この方法はサンドイッチ免疫アッセイである）を示す。
【００８０】
精製した細胞溶解物を、実施例７に示す手順に従って、血液または組織サンプルから調製する。水溶性発光量子ドットと抗体とを含む抗体バイオコンジュゲートを、実施例３に示す手順に従って調製する。選択されて結合される抗体は、目的のタンパク質を特異的に認識するものである。まず、目的のタンパク質を認識する「捕捉」抗体をポリスチレン表面上にピペッティングし、室温で２時間インキュベートする。抗体を取り除き、ポリスチレン表面を蒸留水で洗浄する。非特異的抗体結合を防ぐため、ＰＢＳ中１％のＢＳＡ溶液をポリスチレン表面上にピペッティングし、室温で１時間インキュベートする。ＢＳＡを取り除きポリスチレン表面を蒸留水で洗浄した後、精製した細胞溶解物をポリスチレン表面上にピペッティングし、室温で２時間インキュベートする。目的のタンパク質が細胞溶解物サンプル中に存在する場合、「捕捉」抗体はそのタンパク質に結合する。ポリスチレン表面を蒸留水で洗浄して、結合していないタンパク質を取り除く。最後に、発光量子ドット−抗体バイオコンジュゲートを加えて、室温で２時間インキュベートする。目的のタンパク質が存在する場合、発光量子ドット−抗体バイオコンジュゲートに結合した抗体がそれに結合する。量子ドット−抗体バイオコンジュゲートの発光を、５１４ｎｍのＡｒ+／Ｋｒ+レーザーを用いてサンプルを励起することによって検出する。
【００８１】
（実施例１１）
本実施例は、インビトロで核酸を検出するために核酸バイオコンジュゲートを使用する方法を示す。
【００８２】
精製したｍＲＮＡサンプルを、当該分野で周知の方法に従って細胞または組織から調製する。特定の目的のｍＲＮＡは、該ｍＲＮＡを単離するのに、どの方法およびどの細胞または組織を使用するかを指定するだろう。水溶性発光量子ドットと核酸とを含む核酸バイオコンジュゲートを、実施例４、５または１４に示した手順に従って調製する。結合される核酸は、目的の核酸配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列から構成される。１００μｌの０．１μＭアミン修飾ポリチミジン(Midland Certified Reagents)、一片のＢｉｏｄｙｎｅ  Ｃメンブレン(Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, MI)（０．５ｃｍ×０．５ｃｍ）、および１ｍｇのＥＤＡＣを遠心管中に加え、この混合物を室温で一晩インキュベートすることによって、アミン修飾ポリチミジンをＢｉｏｄｙｎｅ  Ｃメンブレンに共有結合する。次の日、Ｂｉｏｄｙｎｅ  Ｃメンブレンを蒸留水で３〜４回リンスする。精製したｍＲＮＡサンプルを、アミン修飾ポリチミジンを結合したＢｉｏｄｙｎｅ  Ｃメンブレンに加え、室温で２時間インキュベートする。ｍＲＮＡ分子のポリＡテールは結合したポリチミジンとハイブリダイズし、ｍＲＮＡがＢｉｏｄｙｎｅ  Ｃメンブレンに結合されるのを可能にする。Ｂｉｏｄｙｎｅ  Ｃメンブレンを蒸留水で数回洗浄し、ハイブリダイズしていないｍＲＮＡを取り除く。次に、水溶性発光量子ドットと、目的のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとを含むオリゴヌクレオチドバイオコンジュゲートを、アミン修飾ポリチミジンおよびｍＲＮＡを結合したＢｉｏｄｙｎｅ  Ｃメンブレンと反応させ、室温で一晩インキュベートする。目的のｍＲＮＡが存在する場合、発光量子ドット−オリゴヌクレオチドバイオコンジュゲートはそれにハイブリダイズする。Ｂｉｏｄｙｎｅ  Ｃメンブレンを蒸留水で数回洗浄して、過剰のハイブリダイズしていない発光量子ドット−オリゴヌクレオチドバイオコンジュゲートを取り除く。量子ドット−オリゴヌクレオチドバイオコンジュゲートの発光を、５１４ｎｍのＡｒ+／Ｋｒ+レーザーでサンプルを励起することによって検出する。
【００８３】
（実施例１２）
本実施例は、レセプター媒介エンドサイトーシスをインビボで検出するためにタンパク質バイオコンジュゲートを使用する方法を示す。
【００８４】
水溶性発光量子ドットとトランスフェリンとを含む生体分子コンジュゲートを、実施例２に示した手順に従って調製した。１０％のウシ胎仔血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、およびファンギゾンを含む最小必須培地（ＭＥＭ）で、ＨｅＬａ細胞を増殖させた。培養細胞を、発光量子ドット−トランスフェリンバイオコンジュゲートとともに、３７℃で一晩インキュベートした。洗浄を繰り返して過剰のバイオコンジュゲートを取り除いた後、細胞をペトリ皿からトリプシン処理によって取り出し、実施例６に記載の高解像度ＣＣＤカメラ（１４０万画素，Photometrix）および１００Ｗ水銀励起ランプを備え付けた落射蛍光顕微鏡を用いた画像化のために、ガラスカバースリップ上に置いた。ＨｅＬａ細胞の内部発光は、コンジュゲートのトランスフェリンが依然生物学的に活性であり、ＨｅＬａ細胞表面上のトランスフェリンレセプターによって認識されることを示した。実施例１の水溶性発光量子ドットとともにインキュベートしたＨｅＬａ細胞は発光しなかった。経時の内部発光量の測定により、エンドサイトーシス速度の測定が可能となる。
【００８５】
（実施例１３）
本実施例は、タンパク質性生体分子（例えば、リガンド）を、リンカー（例えば、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジン）によって、発光量子ドットのキャップ上の結合基に結合する方法を示す。
【００８６】
ストレプトアビジン(Sigma Chemical Co.)を、実施例２に示した手順に従って、メルカプト−量子ドットに共有結合する。タンパク質（例えば、トランスフェリン）を、ＥＤＡＣ架橋法を用いて、ビオチンに結合する。ビオチンへの結合は、タンパク質活性にほとんど変化がないように誘導体化することができるアミノ酸において起こらなくてはならない。精製したストレプトアビジンコーティングした量子ドットの溶液を、ビオチン化したトランスフェリンと、ボルテックスしつつ、室温で一晩反応させる。ビオチン化したトランスフェリンおよびストレプトアビジンコーティングした量子ドットを、所望する１量子ドットあたりのタンパク質分子数を生じるように特定のモル比（例えば、１：１、１：２等）で反応させることができる。次いで、溶液を５０，０００ＲＰＭで１時間遠心分離して、量子ドット−トランスフェリンバイオコンジュゲートをペレットにし、上清を取り除く。この遠心分離工程をさらに２回繰り返す。精製したトランスフェリンバイオコンジュゲートをＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）に溶解し、室温で保存する。
【００８７】
（実施例１４）
本実施例は、リンカー（例えば、チオール基）によって、発光量子ドットのキャップ上の結合基に核酸を結合する方法を示す。
【００８８】
４．２ｎｍのＣｄＳｅコアおよびＺｎＳキャップを含む量子ドットを、HinesおよびGuyot-Sionnest(1996)（前述）によって開発された手順に従って調製する。チオール修飾したオリゴヌクレオチドを購入するかまたは標準的な合成手順を用いて調製する。１ｍｌのＣｄＳｅ（ＺｎＳ）量子ドット溶液をチオール修飾したオリゴヌクレオチドと反応させる。量子ドットのＺｎＳコーティングは、修飾オリゴヌクレオチドのチオール基が結合し得る未反応のＺｎ分子を含む。次いで、溶液を５０，０００ＲＰＭで１時間遠心分離して、量子ドット−オリゴヌクレオチドバイオコンジュゲートをペレットにし、上清を取り除く。この遠心分離工程をさらに２回繰り返す。精製したオリゴヌクレオチドバイオコンジュゲートをＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）に溶解し、室温で保存する。
【００８９】
（実施例１５）
本実施例は、インビトロで核酸を検出するために特別設計された、クエンチャーをさらに含む核酸バイオコンジュゲートを作製する方法を示す。
【００９０】
特別設計された核酸バイオコンジュゲートは、ステム・アンド・ループ構造を有する一本鎖オリゴヌクレオチド、量子ドット部分、およびクエンチング部分を含む。一級アミン基を３’末端に有するようにオリゴヌクレオチドを修飾する（このアミン修飾オリゴヌクレオチドはMidland Certified Reagentsから入手可能である）。標準的な架橋手順を用いて、ビオチン基を５’末端に有するように、オリゴヌクレオチドをさらに修飾する。アミノ反応性誘導体ＤＡＢＣＹＬ（Molecular Probes, Eugene, ORから入手可能である）を用いることによって、非蛍光有機発色団（４−［４’−ジメチルアミノフェニルアゾ］安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ））を３’アミノ基に共有結合する。量子ドットをまず、実施例２に記載の方法に従ってストレプトアビジンを用いて誘導体化し、次いで、５’ビオチン基に１：１のモル比で結合させる。オリゴヌクレオチドバイオコンジュゲートを、ゲル濾過カラムおよびＨＰＬＣを用いて精製する。
【００９１】
（実施例１６）
本実施例は、メルカプトコハク酸結合基を発光量子ドットのキャップに結合することによって、水溶性発光量子ドットを得る方法を示す。本実施例はさらに、リンカー（例えば、遊離チオール基）によって、核酸をメルカプトコハク酸結合基に結合する方法を示す。
【００９２】
４．２ｎｍのＣｄＳｅコアおよびＺｎＳキャップを含む量子ドットを、前述したように調製した。量子ドットをメルカプトコハク酸（０．５ｇ／ｍｌ、ｐＨ  ９．０）に溶解し、１５〜３０分間室温で混合した。３０％アセトン／７０％量子ドットの濃度での一連のアセトン沈殿を、親水性発光量子ドットを十分に精製するために行った。得られたメルカプトコハク酸−量子ドットをｐＨ  ６．０の１５ｍＭ  ＥＤＡＣ溶液に懸濁した。
【００９３】
１ｍｌの精製したメルカプトコハク酸コーティングした発光量子ドットの溶液を、３’−または５’−チオール−末端のいずれかの１５マーオリゴヌクレオチド(Midland Certified Reagents)と、１量子ドットあたりおよそ１００オリゴヌクレオチドの相対濃度で反応させた。混合しつつ、３０〜６０分間反応を続けた。発光量子ドット−ＤＮＡコンジュゲートを、アセトン沈殿（３０％アセトン／７０％コンジュゲート）によって数回精製した。引き続いて、発光量子ドット−ＤＮＡコンジュゲートをハイブリダイゼーション緩衝液（０．４Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．０）中に保存した。
【００９４】
（実施例１７）
本実施例は、インビトロで核酸を検出するために核酸バイオコンジュゲートを使用する方法を示す。
【００９５】
実施例１６に記載のように生成した３’−および５’−チオール末端オリゴヌクレオチド−発光量子ドットコンジュゲートの等量のアリコートを、ハイブリダイゼーション緩衝液（０．４  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．０）に懸濁した。相補的３０マーリンカーを、２つの発光量子ドットコンジュゲート毎にほぼ１リンカーの相対濃度で、ハイブリダイゼーション緩衝液に加えた。３０マーリンカーは、発光量子ドットコンジュゲートのチオール末端１５マーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするよう特別設計した。従って、発光量子ドットコンジュゲートのオリゴヌクレオチドがその生物学的活性を保持している場合、図４に示すように、２つの量子ドットが、リンカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、引き続いて凝集するだろう。ハイブリダイゼーションを１〜１２時間モニターし、バイオコンジュゲートの凝集を観察した。逆広領域Ｈｇランプ(inverted wide-field Hg lamp)励起および高感度ＣＣＤ検出を用いて、凝集を画像化した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ステム・アンド・ループ構造を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを含むバイオコンジュゲート、および標的核酸に結合した該バイオコンジュゲートの概略図である。
【図２】  図２は、本発明によるサンプル中の複数の核酸を検出する方法の概略図である。
【図３】  図３は、本発明によるサンプル中のウイルス核酸を検出する方法の概略図である。
【図４】  図４は、発光半導体量子ドットおよびオリゴヌクレオチドを含むバイオコンジュゲートならびにＤＮＡリンカーによって結合された該バイオコンジュゲートの概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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