(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を抽出分離する方法であって、（１）抽出分離しようとする一本鎖の標的核酸と、該標的核酸に相補的な配列を含む核酸に疎水基が結合したプローブ剤とがハイブリダイズした二本鎖核酸構造体を含有する水相を形成する工程、（２）界面活性剤と有機溶媒とを含み逆ミセル形成能を有する有機相に、前記水相を接触させる工程、（３）前記有機相中に前記二本鎖核酸構造体を抽出する工程、（４）前記二本鎖核酸構造体を抽出した有機相に、新たな水相を接触させる工程、および（５）前記新たな水相中に、前記標的核酸を抽出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の配列の核酸を選択的に分離するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のバイオテクノロジーの発展に伴い、細胞や人工合成物から特定の配列の核酸を選択的に分離する技術の重要性が高まっている。例えば、個体の識別、遺伝子診断などを目的とする遺伝子解析においては、一般に、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）反応により、目的の遺伝子（核酸）を増幅するが、不純物が存在するとＰＣＲ反応を阻害するおそれがあるので、試料から特定の核酸を分離することは重要な基本技術となる。また単鎖核酸に様々な生理機能が見いだされる中、目的核酸配列のみを分離精製する技術が求められている。
【０００３】
従来より核酸の分離には、アビジンカラムゲル濾過クロマトグラフィーなど各種のクロマトグラフィーがこれらの分離には用いられてきたが（例えば、非特許文献１および非特許文献２参照）、その分離条件の選定がむずかしいこと、大量処理が不可能であること、カラム充填剤が高価であることなどの問題点を抱えていた。
【非特許文献１】Sequence-SpecificAffinity Precipitation of Oligonucleotide UsingPoly(N-Isopropylacrylamide)-Oligonucleotide Conjugate" BIOTECHNOLOGY ANDBIOENGINEERING, Vol. 72, NO. 3, 2001
【非特許文献２】"Sequence-SpecificOligonucleotide Purification Using Peptide Nucleic Acid Amphiphiles inHydrophobic Interactgion Chromatography" Biotechnol. Prog., Vol. 20, No.6, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、核酸の配列選択的分離に適用され、簡便で大量の核酸を処理することもできる新しい技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、研究を重ねた結果、特殊構造のプローブ（プローブ剤）を開発し、これと溶媒抽出を組み合わせることにより、如上の目的が達成されることを見出し本発明を導き出した。
【０００６】
かくして、本発明は、次の工程を含むことを特徴とする核酸の抽出分離方法を提供するものである。
（１）抽出分離しようとする一本鎖の標的核酸と、該標的核酸に相補的な配列を含む核酸に疎水基が結合したプローブ剤とがハイブリダイズした二本鎖核酸構造体を含有する水相を形成する工程、
（２）界面活性剤と有機溶媒とを含み逆ミセル形成能を有する有機相に、前記水相を接触させる工程、
（３）前記有機相中に前記二本鎖核酸構造体を抽出する工程、
（４）前記二本鎖核酸構造体を抽出した有機相に、新たな水相を接触させる工程、および
（５）前記新たな水相中に、前記標的核酸を抽出する工程。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、溶媒抽出に基づいているので大量処理が可能であり、従来法におけるような単位時間当りの核酸サンプルの分離・精製量の制限の問題は実質的になくなる。本発明の方法は、必要な試薬を混ぜて、分相するだけであり、専門的な知識や熟練された技術を必要とせず、誰が実施してもほぼ同じ結果が得られる簡便な核酸分離法である。また、液体クロマトグラフなどの特化された分離精製機器を必要としない点からも、多分野の研究施設や生産現場に適応しうる分離精製技術である。さらに、本発明の方法においては、有機媒体中に物質を抽出するため菌類によるサンプルの汚染を防止できることなどの利点もある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
図１は、本発明の実施の形態とともに本発明の原理を模式的に示すものである。
本発明を実施するに際しては、先ず、抽出分離しようとする一本鎖の標的核酸と、その標的核酸に相補的な配列を含む核酸に疎水基が結合したプローブ剤とがハイブリダイズした二本鎖核酸構造体を含有する水相を形成する。図１では、Ｘとして水相を示している。実際の分析に当たっては、このような水相は、一般に、標的核酸を含有する細胞や人工合成物由来の水性溶液にプローブ剤を添加することにより調製される。これによって標的核酸（図１では（Ｉ）の部分拡大図にａとして示している）とプローブ剤（図１ではｂ）とがハイブリダイズした二本鎖核酸構造体（図１ではｃ）が形成される。
【０００９】
このような二本鎖核酸構造体を含有する水相を、次に、有機相と接触させる。この有機相は、界面活性剤と有機溶媒とを含み逆ミセル形成能を有するものである。図１では有機相はＹで表わされ、逆ミセルはｄで示されている。具体的には、如上の水相の上に、界面活性剤を含む有機溶媒を添加し、これによって、水−有機二相が形成される（図１の（Ｉ）参照）。
【００１０】
以上のようにして、水相と有機相とを接触させることにより、上述の二本鎖核酸構造体が有機相中に抽出される。抽出を促進するためには、水−有機二相を軽く振盪する。振盪時間（抽出時間）は、一般に、１〜５時間、例えば、３時間である。この操作により、プローブ剤が標的核酸のみとハイブリダイズして形成された二本鎖核酸構造体が有機相に抽出されるが、これはその核酸構造体が有機相の逆ミセル内に取り込まれるためと理解される（図１の（II）の一部拡大図参照）。本発明では、この抽出を正抽出と呼ぶ。
【００１１】
上記の正抽出により、標的核酸とプローブ剤とがハイブリダイズした二本鎖核酸構造体を抽出した有機相は、次に、新たな水相と接触させられる。具体的には、図１の（III）に示されるように、当該有機相を採取し新たな水相（Ｚ）の入った容器内に添加する。なお、この新たな水相は、適当な緩衝剤により緩衝液を構成している。
【００１２】
このようにして、最後に、新たな水相中に標的核酸を抽出する工程が実施される。この抽出を促進するには、軽く振盪しながら、水相（新たな水相）／有機相系を加熱するか、および／または変性剤を加える。これによって二本鎖核酸構造体から標的核酸が解離する。それと同時に有機相に解浮化剤を添加し、逆ミセル（マイクロエマルション）を破壊する。このような操作により、水相（緩衝液）中に、標的核酸が選択的に抽出される（図１の（IV）の部分拡大図参照）。本発明では、この抽出を逆抽出と呼ぶ。
【００１３】
以上の説明から明らかなように、本発明に従えば、標的核酸を含有する水相から有機相への標的核酸の抽出（正抽出）、およびその有機相から別の水相への標的核酸の抽出（逆抽出）という２段階の溶媒抽出操作により簡単に配列選択的な核酸分離を行うことができる。次に、本発明の核酸抽出分離方法の各工程において用いられる素材等について詳述する。
【００１４】
有機溶媒／界面活性剤
本発明において用いられる有機相は、界面活性剤と有機溶媒とを含み、且つ、逆ミセル形成能を有するものである。
ここで、逆ミセルとは、よく知られているように、有機媒体中で高秩序に自己形成される分子集合体であり、具体的には、界面活性剤分子が、有機溶媒中で、その親水部（親水性の官能基または原子団）を内側にし、疎水部を外側（有機溶媒側）にして形成されるほぼ球状の分子集合体である。逆ミセルは、マイクロエマルションの１種である。
【００１５】
本発明において用いられる有機溶媒および界面活性剤は、逆ミセルを形成し得るものであれば特に制限されるものではないが、本発明において使用可能な有機溶媒として、脂肪族炭化水素（イソオクタン、ヘキサン、ヘプタン等）芳香族系溶媒（ベンゼン、トルエン等）ハロゲン化系溶媒（クロロホルム、四塩化水素、塩化メチレン等）を挙げることができ、また、本発明において使用可能な界面活性剤として、リン脂質類、ＡＯＴ（ジ−２−エチルヘキシルスルホコハク酸ナトリウム）、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）系界面活性剤類、ＴＯＭＡＣ（メチルトリオクチルアンモニウムクロライド）、シュガーエステル類、ポリオキシエチレン系界面活性剤などを挙げることができる。逆ミセルの形成を促進または助長するためには、脂肪族アルコール類、ポリエチレングリコール類、脂肪酸などの補界面活性剤を添加することが好ましい。例えば、リン脂質であるＤＬＰＣ（ジラウロイルホスファチジルコリン）は、これだけでは逆ミセルを形成しないが、数ｖｏｌ％のｎ−ヘキサノールを添加することにより容易に逆ミセルを形成することができる。
【００１６】
プローブ剤
本発明の更なる特徴の一つは、特定構造のプローブ剤、すなわち、標的核酸に相補的な配列を含む核酸に疎水基が結合したプローブ剤を開発してこれを標的核酸の選択的なピックアップに利用していることである。標的核酸とプローブ剤は互いに相補的な配列を介して水素結合して二本鎖核酸構造体を形成する。
【００１７】
この二本鎖核酸構造体が有機相中に選択的に且つ安定的に抽出されるのは、有機相中の逆ミセルに取り込まれ、その親水部分（標的核酸と相補的結合している部分）を内側にして、その疎水基が界面活性剤の疎水部と並んで配置されるためと理解される。すなわち、本発明で用いられるプローブ剤は、それ自身も界面活性剤として機能して逆ミセルの構成の一部を成し、したがって、核酸界面活性剤またはＤＮＡ界面活性剤とでも称することができるものである。
【００１８】
本発明のプローブ剤（核酸界面活性剤、ＤＮＡ界面活性剤）は、各種の反応を応用して合成することができる。すなわち、ＤＮＡに代表される核酸の末端あるいは反応性核酸塩基に共有結合的に疎水鎖を導入する。疎水鎖としてはオレイル基、ラウリル基、コレステロール基、リン脂質等がある。導入方法としては、ＤＮＡなどの核酸鎖末端のアミノ基に対しアミド結合を形成させる方法や、ＤＮＡなどの核酸鎖末端のＳＨ基（チオール基）にジスルフィド結合を形成させる方法やマレイミドを反応させて結合させる方法がある。また共有結合以外にも、タンパク質−糖質相互作用（分子認識）や、金属キレート形成を利用してＤＮＡ鎖末端に疎水鎖を導入する方法もある。
【００１９】
逆抽出
標的核酸を含む二本鎖核酸構造体を抽出した有機相に別の水相（緩衝液）を接触させ、該水相に標的核酸を逆抽出するには、軽く加熱を行い、および／または変性剤を添加し、さらに、逆ミセルを破壊するための解乳化剤を添加する。
加熱は、用いた有機溶媒／界面活性剤にもよるが、一般に、５０〜９０℃程度の温度で行う。なお、既述の正抽出は室温（常温）で行う。変性剤としては、例えば、尿素、ホルムアミド、アセトン、アセトニトリルなどが挙げられる。また、解乳化剤としては、例えば、ｎ−ブタノール、アセトン、アルコール類などが挙げられる。
【００２０】
標的核酸
本発明は、ＤＮＡに限らず、ＲＮＡやペプチド核酸などあらゆる種類の核酸を対象とする。また、本発明の方法は、合成によるもの、および天然または生物由来のもののいずれの核酸類にも適用することができる。採用する有機溶媒／界面活性剤に応じて形成され得る逆ミセルの大きさにも依るが、本発明の方法は、一般に、100mer以下、好ましくは10〜50mer程度の長さの核酸を分離するのに適している。
以下に、本発明の特徴をさらに具体的に明らかにするため実施例を示すが、本発明は、この実施例によって制限されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
プローブ剤（ＤＮＡ界面活性剤）の調製
図２に示す反応スキームに従って、以下のように、ＤＮＡ界面活性剤を調製した：
オレイン酸2.82g（10mmol）とＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）1.15g（10mmol）をＤＭＦ10mlに溶解し、縮合剤ＤＣＣ（ジシクロヘキシシルカルボジイミド）2.26gを加えて、氷冷下で20h撹拌した。ＤＣウレアを吸引ろ過で除去した後、溶媒を減圧留去してＮ−ヒドロキシスクシイミド化オレイン酸を得た。ｐＨ8.0、100mMのＨＥＰＥＳ緩衝液に10μlに、５’末端アミノ化ＤＮＡ5nmolを溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシイミド化オレイン酸溶液20μgを溶解したＤＭＳＯを50μl加え、37℃で24時間撹拌した。その後凍結乾燥し、ＤＮＡの５’末端にオレイル基の結合したオレイル化ＤＮＡ（ＤＮＡ−オレイン酸複合体）を得た。なお、用いたＤＮＡの配列は下記の通りである。
3’-CCAATACCACATCATCCATA-5’（配列番号１）
【実施例２】
【００２２】
ＤＮＡ混在系から標的ＤＮＡの選択的抽出
＜正抽出＞
以下に示すような配列の異なる３種類の22merのＤＮＡを水相（緩衝液）に溶解させ、これに実施例１で調製したＤＮＡ界面活性剤を添加した（水相の具体的な組成は表１に示す）。なお、各ＤＮＡは、蛍光分析ができるように、その５’末端を蛍光基ＦＩＴＣ（フルオレセインインチオシアネート）、TAMRA（カルボキシテトラメチルローダミン）、ローダミンでそれぞれ蛍光修飾した。
ＤＮＡ１：5’-GGTTATGGTGTAGTAGGTATAT-3’（配列番号２）
ＤＮＡ２：5’-GGTATTGTATGCCATTAGAATT-3’（配列番号３）
ＤＮＡ３：5’-AGAGTACAACTTAGACACATTT-3’（配列番号４）
ＤＮＡ１〜ＤＮＡ３のうち、ＤＮＡ１が実施例１で調製したＤＮＡ界面活性剤のＤＮＡ（20mer）と相補的な配列を有する。
【００２３】
上記のようにして得られた、ＤＮＡ１〜ＤＮＡ３を含有する水相に、界面活性剤としてリン脂質（ＤＬＰＣ）とアルコールを含むイソオクタンを添加し、水−有機二相を形成させた（有機相の具体的組成も表１に示す）。なお、ＤＬＰＣは親水部が電気的に中性であり、ＤＮＡの非特異的吸着を防ぐことができる点から特に好ましい界面活性剤の１種である。３時間振盪撹拌の後、有機相中に抽出されたＤＮＡを蛍光測定により定量した。その結果、ＤＮＡ１のみが選択的に抽出され、その抽出率は約74%だった。逆に非相補的な配列であるＤＮＡ２と３はほとんど抽出されなかった（図３）。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
＜逆抽出＞
以上のようにして得られた抽出操作後の有機相を10mMのＴＥ−緩衝液と接触させ、ここに２−ブタノールを添加した。80℃で約1時間おいた後、水相のＤＮＡ量を蛍光測定により定量したところ、抽出されたＤＮＡ１の約６割が緩衝液中に逆抽出された。
このように、本発明に従えば、一連の正抽出・逆抽出操作により、複数種のＤＮＡを含む溶液から特定のＤＮＡのみを選択的に分離することができる。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸は遺伝情報以外の機能を有することが見出され、核酸医薬あるいは分子認識化合物として、医療や分析などの分野でその有効利用が期待されている。本発明は、合成した機能性核酸あるいは生物由来の核酸類を選択的に分離する技術であり、これまでの遺伝子解析のみならず機能性核酸や核酸薬生産プロセスなど産業の各種分野において大いに役立つものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の実施の形態とともに本発明の原理を模式的に示す。
【図２】本発明で用いられるプローブ剤（ＤＮＡ界面活性剤）の１例を合成するための反応スキームである。
【図３】本発明に従い特定の配列のＤＮＡが選択的に抽出されることを例示する。
【図１】
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【図２】
0004795818.tif 000004
【図３】
0004795818.tif 000005
【配列表】
0004795818000001.app