(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリスルホンとポリビニルピロリドンのブレンド体からなる支持体にジエチルアミノエチルデキストランが放射線照射により不溶化して付与されていることを特徴とする酸化低密度リポ蛋白吸着用吸着材。
【請求項２】
支持体表面積１ｍ２あたりの血漿量が３．３×１０２ｍｌ／ｍ２である条件で支持体と血漿を相互作用させたときに、該血漿中に含まれている初期濃度２μｇ／ｍｌの酸化低密度リポ蛋白の吸着除去率が６０％以上であることを特徴とする請求項１に記載の酸化低密度リポ蛋白吸着用吸着材。
【請求項３】
請求項２記載の条件で低密度リポ蛋白の吸着除去率が２０％未満であることを特徴とする請求項１に記載の酸化低密度リポ蛋白吸着用吸着材。
【請求項４】
請求項２記載の条件で高密度リポ蛋白の吸着除去率が１５％未満であることを特徴とする請求項１に記載の酸化低密度リポ蛋白吸着用吸着材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酸化低密度リポ蛋白質（以下酸化ＬＤＬという）の吸着材に関するものである。さらに詳しくは体液中より酸化ＬＤＬを選択的に除去し、動脈硬化症の諸症状の軽減または進展を抑えるための吸着材に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
動脈硬化症とは、動脈壁の肥厚を示し、かつ弾力を失い硬化をきたした病変の総称であり、そのなかでも、頻度がずば抜けて高く、かつ重要な疾患が粥状動脈硬化症であり、一般的にも動脈硬化症といえば粥状動脈硬化症を意味することが多い。粥状動脈硬化巣の形成に重要な役割を果たしているのが、過酸化脂質である。その中でも、特に酸化ＬＤＬは様々な生物作用をもっており、内皮細胞から一酸化窒素（ＮＯ）産生を抑制するなどの作用以外にも、単球を内皮下に遊送、集積させ、そのものをマクロファージとさせ、酸化ＬＤＬそれ自身を取り込み泡沫細胞とさせ、動脈壁のプラーク形成を促進するほか、内皮細胞や平滑筋細胞傷害を促進するなど、動脈硬化の発症、進展に重要な役割を果たしている。従って、血中から過酸化脂質、特に酸化ＬＤＬを除去することが望ましい。
【０００３】
これまで、動脈硬化症を治療する方法としては外科的に狭窄した血管を押し広げたり、薬剤を用いてＬＤＬ（以下ＬＤＬという）の代謝を阻害したりするものしかなかった。前者は、侵襲度が高く、また動脈硬化症の進展予防はできない。後者はＬＤＬの代謝異常のない動脈硬化症患者には有効ではないという問題点があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題を解決するために体液中の有効成分をほとんど失うことなく選択的に酸化ＬＤＬを吸着しうる吸着材を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため、本発明は次の構成を有する。「支持体にジアルキルアミノアルキルデキストランが付与されていることを特徴とする過酸化脂質吸着材。」
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【０００７】
本発明の吸着材は、支持体に酸化ＬＤＬと選択的親和性をもつジアルキルアミノアルキルデキストランを付与することを特徴とする。また、ジアルキルアミノアルキルデキストランを構成するモノマー単位からなる共重合体であってもよい。また、入手のしやすさから、ジエチルアミノエチルデキストランが好んで用いられる。また、ジエチルアミノエチルデキストランは、医薬品に用いられた実績がある（F.Kazuya et al.,U.S.pat.3,851,057(1974 to Meito Sangyo)）ので、安全性の面からも好ましい。
【０００８】
高脂血症の患者の場合には血中のＬＤＬ量が多いため、ＬＤＬを除去してやることにより動脈硬化の進展予防などに有効であるが、透析患者や心疾患を有する患者の場合は、血中のＬＤＬ濃度は健常者と同レベルであることが多い。また、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）は動脈硬化防御因子としての機能を有するため、透析患者や心疾患を有する患者の血中のＨＤＬ濃度を下げてはいけない。このように、透析患者や心疾患を有する患者からは、過酸化脂質、特に酸化ＬＤＬを選択的に除去することが望ましい。本発明においては、支持体表面積１ｍ2あたりの血漿量が３．３×１０2ｍｌ／ｍ2である条件で吸着材と血漿を相互作用させたときに、該血漿中に含まれている初期濃度２μｇ／ｍｌの酸化低密度リポ蛋白の吸着除去率が６０％以上、低密度リポ蛋白の吸着除去率が２０％未満、高密度リポ蛋白の吸着除去率が１５％未満であることを、その選択性の指標とすることができる。
【０００９】
また、本発明でいう支持体とは、ジアルキルアミノアルキルデキストランを固定化するための水に溶解しない性質をもつ物質のことを指す。本発明に用いる支持体は有機性、無機性いずれであってもよい。支持体の材料の具体例としては、ポリスチレンで代表される芳香族ポリビニル化合物、ポリスルホン、ポリエーテルイミド、ポリアミド、ポリイミド、ポリエーテル、ポリフェニレンサルファイドなどがあげられるが、目的とする酸化ＬＤＬ以外の体液成分が吸着しにくいポリスルホンが好ましい。ここでいう体液とは、血液、腹水、リンパ液、関節内液、その他の生体由来の液性成分および、これらから得られた分画成分のことを指す。
【００１０】
本発明の吸着材は、支持体にジアルキルアミノアルキルデキストランを付与することを特徴とするものである。付与する方法としては、物理吸着による方法、イオン結合による方法、共有結合による方法などを用いることができる。具体的には、支持体の成形前の原液にジアルキルアミノアルキルデキストランを混和しておいて成形する方法や、反応性を有する官能基を導入した素材を支持体に混和しておいて支持体を成形後、ジアルキルアミノアルキルデキストランを官能基に対して表面反応により固定化する方法、通常の支持体をジアルキルアミノアルキルデキストランの溶液に浸漬し、放射線照射、熱処理などによりジアルキルアミノアルキルデキストランを不溶化する方法、支持体にジアルキルアミノアルキルデキストランをコーティングし、吸着固定化する方法、さらに吸着固定化後、放射線照射、熱処理などにより不溶化する方法などが挙げられる。
【００１１】
支持体の形状は、平膜、中空糸膜、繊維状、粒状などどういう形状であってもよい。
【００１２】
また、ジアルキルアミノアルキルデキストランを支持体に付与するには膜内表面だけに固定化してもよいし、孔を有する膜全面に付与してもよい。
【００１３】
支持体の材料が高分子化合物の場合、その分子量は、通常５０００以上、１００万以下、とりわけ１万以上、２０万以下のものが好ましく用いられる。
【００１４】
特に支持体の材料がポリスルホンである場合は、主鎖に芳香環、スルフォニル基およびエーテル基を持つもの、例えば、次式の化学式で示されるポリスルホンが好適に使用されるが、本発明ではこれらに限定されない。式中のｎは、５０〜８０の整数である。
【００１５】
【化１】
0004783971.tif 000002
【００１６】
ポリスルホンの具体例としては、”ユーデル”Ｐ−１７００、Ｐ−３５００（テイジンアモコ社製）、”ウルトラソン”Ｓ３０１０、Ｓ６０１０（ＢＡＳＦ社製）、”ビクトレックス”（住友化学）、”レーデル”Ａ（テイジンアモコ社製）、”ウルトラソン”Ｅ（ＢＡＳＦ社製）等のポリスルホンが挙げられる。また、本発明で用いられるポリスルホンは上記式（１）および／または（２）で表される繰り返し単位のみからなるポリマーが好適ではあるが、本発明の効果を妨げない範囲で他のモノマーと共重合していても良い。他の共重合モノマーは１０重量％以下であることが好ましい。
【００１７】
本発明においては、支持体の血液適合性を向上させるために、親水性高分子をブレンドすることが好ましい。親水性高分子としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン等が、血液適合性の点で好ましい。また、親水性高分子については、カチオン性ポリマーと放射線架橋できるものであるとより好ましい。ポリスルホンとの相溶性から、特にポリビニルピロリドンが好ましい。ポリビニルピロリドンは、支持体となる素材と積層されていても良いが、混合ないしは相溶されている方が好ましい。
【００１８】
ポリビニルピロリドンとしては、市販されている重量平均分子量３６万、１６万、４万、１万のものが好適に用いられるが、もちろんそれ以外の分子量のものを使用してもかまわない。ポリビニルピロリドンの重量平均分子量は２０００〜２００００００が好ましく、１００００〜１５０００００がより好ましい。なお、前記分子量は原料段階での分子量であり、最終製品においては、放射線架橋などにより分子量は前記値より遙かに大きなものとなっている場合もある。また、本発明で用いられるポリビニルピロリドンは、支持体となる素材とブレンドして用いる場合、ホモポリマーが好適ではあるが、本発明の効果を妨げない範囲で他のモノマーと共重合していても良い。他の共重合モノマーは１０重量％以下であることが好ましい。
【００１９】
なお、前記以外のポリマーなどが、本発明の効果を妨げない範囲で混合されていても良いが、そのようなその他の素材は、支持体全重量中、１０重量％以下であることが好ましい。
【００２０】
本発明の吸着材は、体外循環カラム等に充填し、体外循環治療に用いることができる。すなわち、中空糸膜状、繊維状、ビーズ状などにして用いることができる。特に人工腎臓用の中空糸膜に過酸化脂質と選択的に相互作用するようなリガンドを付与させてやれば、尿毒素や水分などの除去という従来の機能に加え、ＬＤＬや高密度リポ蛋白（以下ＨＤＬという）などをほとんど損なわずに、体液中の酸化ＬＤＬ除去するという新たな機能を付加させることもできる。とりわけ、長期に血液透析を行っている患者の中には、血中抗酸化作用の低下や過酸化脂質が高値であることが確認されており、これに起因すると思われる長期透析患者の動脈硬化性疾患等が増加しているため、透析患者の体液中の酸化ＬＤＬを除去する目的で本発明の吸着材を用いることは好ましい。一方、血漿分離膜の場合には、ＬＤＬやＨＤＬは濾過されるが、膜全体に過酸化脂質と選択的に相互作用するジアルキルアミノアルキルデキストランを付与させてやれば、膜全体の面積を有効に使えるため過酸化脂質を効率よく除去するには有効である。ただし、濾過されたＬＤＬやＨＤＬは体内に戻すか、新たに新鮮血漿を補充することが好ましい。
【００２１】
以下、本発明の膜型吸着器の性能測定条件を記載する。
（１）抗酸化ＬＤＬ抗体の作製
板部らが作製したものを用いた（Ｈ．Ｉｔａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５２７４、１９９４）。すなわち、ヒト粥状硬化病巣ホモジェネートをマウスに注射して免疫、そのマウスの脾臓からハイブリドーマを作製し、硫酸銅処理ＬＤＬと反応するものを選別した。抗体クラスは、マウスＩｇＭで、未処理ＬＤＬ、アセチルＬＤＬ、マロンジアルデヒドＬＤＬとは反応しない。フォスファチジルコリンのアルデヒド誘導体やヒドロペルオキシドを含めていくつかのフォスファチジルコリン過酸化反応生成物と反応する。１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解したものを用いた（蛋白濃度０．６０ｍｇ／ｍｌ）。
（２）酸化ＬＤＬの調製
市販のＬＤＬ（フナコシ製）を脱塩した後、０．２ｍｇ／ｍｌとなるようにリン酸緩衝液（以下ＰＢＳという）で希釈後、０．５ｍＭ硫酸銅水溶液を１ｗｔ％添加し、３７℃で１６時間反応させた。２５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（以下ＥＤＴＡという）を１ｗｔ％、１０ｗｔ％アジ化ナトリウムを０．０２ｗｔ％となるように添加したものを酸化ＬＤＬ標品とした。
（３）吸着実験操作
健常者血漿（日本人、３０歳、ＬＤＬ（βリポ蛋白）濃度２７５ｍｇ／ｄｌ，ＨＤＬ−コレステロール濃度７０ｍｇ／ｄｌ）に上記酸化ＬＤＬを２μｇ／ｍｌとなるように添加した。
【００２２】
表面積９ｃｍ2の支持体を上記血漿０．３ｍｌ中に３７℃、４時間静置した。（支持体表面積１ｍ2あたりの血漿量は３．３×１０2ｍｌ／ｍ2）。
【００２３】
膜と相互作用前後の血漿中の酸化ＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ濃度を定量することにより、それぞれの吸着除去率を下記式により算出した。
【００２４】
それぞれの吸着除去率（％）＝１００×（相互作用前の濃度−相互作用後の濃度）／相互作用前の濃度
（４）酸化ＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ濃度の測定
抗酸化ＬＤＬ抗体をＰＢＳで５μｇ／ｍｌに希釈し、９６穴のプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で２時間震盪した後、４℃にて一晩以上壁に吸着させた。
【００２５】
ウェル中の抗体溶液を捨て、１ｗｔ％Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｍｉｎ（ＢＳＡ、”フラクションＶ”、生化学工業）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を２００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で２時間震盪して壁をブロッキングした後、ウェル中のＢＳＡ溶液を捨て、酸化ＬＤＬを含んだ血漿および検量線作成用のスタンダード（０〜２μｇ／ｍｌの酸化ＬＤＬを含むＰＢＳ緩衝液）を１００μｌ／ウェルずつ分注した。その後、室温で３０分震盪した後、４℃で一晩放置した。
【００２６】
室温に戻し、ウェル中の溶液を捨て、０．０５ｗｔ％”トゥイーン−２０”（片山化学）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でウェルを３回洗浄した。洗浄したウェルにＰＢＳで２０００倍に希釈したヒツジ抗アポＢ抗体（ＴＨＥ  ＢＩＮＤＩＮＧ  ＳＩＴＥ）を１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で２時間震盪した後、ウェル中の抗アポＢ抗体を捨て、０．０５ｗｔ％”トゥイーン−２０”を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でウェルを３回洗浄した。洗浄したウェルに２ｗｔ％”ブロックエース”（大日本製薬）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２０００倍に希釈したアルカリ性フォスファターゼ標識ロバ抗ヒツジＩｇＧ抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）を１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で２時間震盪した。その後、ウェル中の標識抗体を捨て、０．０５ｗｔ％”トゥイーン−２０”を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でウェルを３回洗浄し、さらにトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。続いて、ｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ）の１ｍｇ／ｍｌ溶液（０．０００５Ｍ  ＭｇＣｌ2、１Ｍジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８）を１００μｌ／ウェルずつ分注し、適当な時間室温で反応させた後、４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。スタンダードの結果から検量線を引き、酸化ＬＤＬ濃度を決定した。
【００２７】
ＬＤＬの定量はβ−リポ測定キット（和光純薬）を用いて行った。
【００２８】
ＨＤＬの定量はＨＤＬ−Ｃ測定キット（和光純薬）を用いて行った。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこのような実施例に限定されるものではない。
（１）支持体の作成
ポリスルホン（テイジンアモコ社製”ユーデル”Ｐ−３５００）１８重量部、ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製Ｋ９０）６重量部、ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製Ｋ３０）３重量部、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド７２重量部、水１重量部の溶液を調製した。その後、この溶液を０．１ｍｍスペーサー付きのガラス板に塗布し、ドクターブレードにて膜になるよう引き延ばした後すぐに、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド５２重量部、水４８重量部に調製した溶液に、ガラス板を浸漬し、膜を凝固させた。一連の操作の操作はすべて５０℃で行った。
（２）ジエチルアミノエチルデキストランの支持体への固定化
１ｗｔ％のジエチルアミノエチルデキストラン（ＳＩＧＭＡ社製分子量５０万）水溶液を調製した。（１）で作成したポリビニルピロリドンブレンドポリスルホン平膜をエチルアミノエチルデキストラン水溶液に浸漬した状態で、２５ｋＧｙのγ線を照射することでジエチルアミノエチルデキストランを固定化した。その後、５０℃温水中で１晩放置することで、膜に固定化されていないジエチルアミノエチルデキストランを抽出、洗浄した。
【００３０】
実験結果は、表１に示した。
比較例１
実施例と同様にしてポリスルホン／ポリビニルピロリドン平膜を作成し、１ｗｔ％のジエチルアミノエチルデキストラン水溶液の代わりに水を充填して、２５ｋＧｙのγ線を照射したものを作成した。
比較例２
実施例と同様にしてデキストラン（ＳＩＧＭＡ社製分子量５０万）を固定化したポリスルホン／ポリビニルピロリドン平膜を作成した。
【００３１】
実施例および比較例１、２における酸化ＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬの吸着除去率の結果を表１に示した。
【００３２】
【表１】
0004783971.tif 000003
【００３３】
【発明の効果】
本発明により、膜型血液浄化器などの用途に用いられ、特に透析患者において動脈硬化の進展を予防したり、その発症を未然に防ぐような場合に好適に用いられる吸着材を提供することができる。