(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイズの異なるポアーが混在する多孔質体を内部に充填形成したキャピラリーの先端部をエッチング処理により先鋭化して前記多孔質体を露出させ、
前記キャピラリーに導電性の第１のコーティング膜を形成し、且つ当該第１のコーティング膜をアースし、
前記露出した多孔質体をＦＩＢ（Focusing Ion Beam）加工により先鋭化し、
当該先鋭化部に、前記多孔質体が露出する位置に開口を備え、エレクトロスプレイイオン源の電圧を印加する電極として使用する導電性の第２のコーティング膜を施すことを特徴とするエレクトロスプレイ用カラム一体型チップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフ／質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ）に関し、特に、ペプチド，蛋白などのサンプルを含む溶液をマイクロからナノフロー流量(ｎｌ／min）レベルで分析を行うＬＣ／ＭＳに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、質量分析装置を用いてプロテオーム分析などを行う場合に、毎分マイクロリッター(μｌ／min）〜ナノリッター(ｎｌ／min）レベルの極流量で分析を行うことが行われている。
【０００３】
このような分析の場合、液体クロマトグラフで試料を分離した後、質量分析装置のエレクトロスプレイイオン源（ＥＳＩ）でイオン化して分析を行うことが行われるが、極低流量で分析を行う場合には、液体クロマトグラフから質量分析装置間の移送経路のデッドボリュームによって、試料が拡散してしまうことが問題となる。そこで、このデッドボリュームを可能な限り少なくするために、液体クロマトグラフの分離カラムとＥＳＩのノズルを一体化した一体化チップを用いることが考えられている。このような例としては、例えば、以下のものが報告されている。
【０００４】
特開２００３−１５１４８６号公報（特許文献１）に、石英ガラス製のカラムの先端を尖頭形にし、０.５μｍ 以下の開口を設け、このカラム内に０.５μｍ 〜５μｍの粒径を持つ化学結合型シリカゲルを充填剤として充填した例が記載されている。
【０００５】
しかし、液体クロマトグラフのカラムとして、上記特許文献１に示されているような球状粒子を充填剤として用いる場合には、流体の流れに対する抵抗が大きく、圧力損失が大きいため、溶液を流すために高圧が必要になるという課題が従来より知られている。この問題を解決するための例として、例えば特開平６−２６５５３４号公報（特許文献２）や特開２００３−７５４２０号公報（特許文献３）に、無機質多孔質体を用いたカラム（モノリス型カラム）が示されている。
【０００６】
モノリス型カラムは、サイズの異なるポアー（マクロポアーとメゾポアー）が混在する棒状の多孔質体である。マクロポアーは約２ミクロン（μｍ）であるのに対し、メゾポアーは数１０ｎｍである。マクロポアーは、溶液の流れを容易にし、従って、カラムとして使用した場合、圧力は球状の充填剤を詰めた通常のカラムに比べて、圧力損失が数分の一であるので、高流量でも使用可能といった特長がある。一方、メゾポアーは数１０ｎｍなので、カラム分離性能に重要な比表面積の増大に役立つ。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−１５１４８６号公報
【特許文献２】特開平６−２６５５３４号公報
【特許文献３】特開２００３−７５４２０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ナノフローレベルの分析を行うＬＣ／ＭＳに用いる分離カラムとＥＳＩのノズルを一体化した一体化チップとしては、粒状の充填剤を用いた一般的なものでは、上記のような圧力損失の問題以外に、充填剤が漏れ出てしまうことや、充填剤の１粒子がチップの開口を塞いでしまう可能性もある。
【０００９】
また、上記のモノリス型のカラムを一体化チップに適用する場合、先端部分が数マイクロメートルのものを寸法精度を確保して再現性良く作製することは大変難しい。さらに、先端部の寸法や形状によりイオン化効率、すなわち信号強度や感度が大きく影響を受ける可能性がある。
【００１０】
本発明は、目詰まりを起こしにくく、かつ、マイクロ〜ナノフロー流量での分析において感度向上及び再現性向上を行うことの出来る一体化チップ、及びこれを用いた液体クロマトグラフ質量分析計を提供すること目的としたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するための本発明の特徴は、サイズの異なるポアーが混在する多孔質体を内部に充填形成したキャピラリーの先端部をエッチング処理により先鋭化して前記多孔質体を露出させ、前記キャピラリーに導電性の第１のコーティング膜を形成し、且つ当該第１のコーティング膜をアースし、前記露出した多孔質体をＦＩＢ（Focusing Ion Beam）加工により先鋭化し、当該先鋭化部に、前記多孔質体が露出する位置に開口を備え、エレクトロスプレイイオン源の電圧を印加する電極として使用する導電性の第２のコーティング膜を施すことを特徴とするエレクトロスプレイ用カラム一体型チップの製造方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ナノエレクトロスプレイ（ＥＳＩ）質量分析計においてしばしば発生するＥＳＩチップの先端部での目詰まりの可能性を激減し、サブミクロンスケールの帯電液滴を容易に作り出すことにより、液体クロマトグラフ−質量分析計での感度向上及び再現性の確保を計ることが可能になる。
【００１３】
また、分離カラムとＥＳＩチップを一体化することにより、ＥＳＩ部でのカラム分離度低下を最小化できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施例を説明する。
【００１５】
図１は、本発明のカラム一体型チップの第１の実施例である。
【００１６】
図１が示すように、無機質多孔質体であるモノリスカラム１は、フューズドシリカキャピラリー２内にゾルーゲル化反応させて充填される。従って、フューズドシリカキャピラリー２と一体化している。フューズドシリカキャピラリー２の内径は、５０〜２００μｍのものが選択される。これは、モノリスカラム１を充填するために必要な径であり、これ以上小さい径のものは作成が難しいためである。
【００１７】
しかし、このままの内径サイズでは、ナノフローＥＳＩの感度向上に必要なサブミクロンレベルの電荷を帯びた液滴（帯電液滴）を、カラム先端で作り出すことが困難である。ナノフローレベルのＥＳＩにおいては、先端開口径が小さいほど高感度化が図れる。
【００１８】
そこで本実施例では、数マイクロメートルの先端部分を作り出すために、図２に示す手順により、カラム一体化チップを製作する。
【００１９】
まず、内径５０〜２００μｍのフューズドシリカキャピラリー２の先端を先鋭化し、カラム部分の露出を行う。ただし、先鋭化する際に、加熱されるような加工方法では、フューズドシリカキャピラリー２が溶けてカラム部分を覆ってしまうこともある。そこで本実施例では、カラム部分の露出には、フューズドシリカキャピラリー２の先端部分、例えば、数mm程をフッ化水素でエッチング処理し、フューズドシリカキャピラリー２の外径をモノリスカラム１が露出するまで、或いは、露出直前までに細める。
【００２０】
その後、フューズドシリカキャピラリー２に導電性樹脂を塗布してコーティング膜を施すか、メッキ加工によって金属のコーティング膜を施す。そして、このコーティング膜をアースする。これは、この後のＦＩＢ(Focusing Ion Beam）加工のためである。ＦＩＢは、イオンをビーム状に細くし、加速することで、原子衝撃によりミクロンメートル以下で加工出来るものである。この時、加工対象物の電位が変動してはイオンが上手く衝突しないため、導電性のコーティングをし、更にアースをすることが必要となる。
【００２１】
ＦＩＢでは、電子顕微鏡で位置を観察しながら精度良い加工が可能である。また、原子衝撃により加工するため、レーザのように部材に熱が加わらず、部材に熱的変性を生じないため、材質の違うフューズドシリカキャピラリー２とモノリカラム１の同時加工が可能である。さらに、ＦＩＢでは、ＮＣ(Numerical Control）により再現性良く自動加工が可能である。
【００２２】
そして本実施例では、コーティング膜を形成した後、ＦＩＢによって、図１に示したような形状（たとえば、円錐状，ピラミッド型，三角錐状など）に加工する。
【００２３】
充分に先端を細めた後、最先端部を除いて改めてコーティング膜３を形成する。コーティングの材質は、例えば金などの金属や、導電性を保つためにカーボンを混入したプラスチック樹脂，ポリアニリンなどの導電性高分子膜が適用される。形成方法は、金属の場合はメッキ加工、導電性樹脂の場合はその樹脂を塗布する。蒸着する方法は、モノリスカラム１が多孔性であるため使用できない。コーティング膜３は、コーティングされない部分の内径が数μｍ程度となるようにする。また、一旦、先端部全体をコーティングした後、内径が数μｍ程度となるように最先端部の金属コーティングをＦＩＢ加工によって取り除いても良い。
【００２４】
本実施例では、既存の内径５０〜２００μｍのモノリスカラムキャピラリーであってもナノフローレベルの流量に最適な数μｍの開口を備えたカラム一体型チップを実現することが出来る。
【００２５】
図３〜図６に本発明の第２の実施例を示す。図３〜図５は、製作過程の一体型チップを示す図、図６は製作工程のフローチャートである。
【００２６】
本実施例では、まず図３に示すように、モノリスカラム１が内部に充填された内径５０〜２００μｍのフューズドシリカキャピラリー２に導電性のコーティング膜及びこのコーティング膜のアースを施し、ＦＩＢ加工によってハス状に切断する。次に図４に示すように、先端部分の少なくとも断面部をモノリスカラム１の漏れ防止として、メッキ加工や樹脂の塗布によってコーティング膜３を形成する。その後、図５に示すように、ハス状の切断面の先端部分のＡの部分をＦＩＢ加工によって切断する。この時の切断位置は、切断によって現れるモノリスカラム１の断面の径が数μｍ程度となるようにする。
【００２７】
本実施例では、第１の実施例に比べて、チップ先端の先鋭化が直線的な切断のみ済むため、加工が容易に行える。
【００２８】
図７及び図８に、本発明の第３の実施例である。
【００２９】
本実施例は、予めモノリスカラム１が充填された内径５０〜２００μｍのフューズドシリカキャピラリー２の先鋭化処理を行わず、そのまま用いるものである。
【００３０】
図７の例では、先ず、フューズドシリカキャピラリー２の先端端面をモノリスカラム１の漏れ防止を兼ねて導電性の樹脂を塗布してコーティング膜３を施し、コーティング膜３をアースし、その後、ＦＩＢ加工により、径が数μｍのピンホール５を開けたものである。本実施例では、まず端面に導電性の樹脂によってコーティング膜３を形成しているため、多孔質体であるモノリスカラム１上にもコーティング膜３を形成することが出来、且つ、コーティング膜３をＥＳＩの電圧を印加する電極として使用することが出来る。
【００３１】
尚、図７は、コーティング膜３上に開けるピンオール５は１つである例を示しているが、ピンホール５は、モノリスカラム１上であれば複数形成しても良い。複数のピンホールを形成した場合は、より効率よく試料を噴霧することができ、且つ、ピンホールの目づまりに対しても回避することができるようになる。
【００３２】
図８の例では、フューズドシリカキャピラリー２の先端部に、モノリスカラム１の部分に開口を設けた導電性樹脂から成るコーティング膜３を施し、その開口部にポーラス
（porous）な材質から成る先端チップ４をモノリスカラム１の先端に埋め込むものである。モノリスカラム１から溶出した試料は、先端チップ４を伝わって大気中に噴霧されるようになるため、より効率良く試料を噴霧することが出来る。
【００３３】
本実施例では、フューズドシリカキャピラリー２の先鋭化の処理が不用となり、カラム一体型チップの製作が容易になる。
【００３４】
図９は、本発明の第４の実施例である。
【００３５】
本実施例は、従来型のポリマーまたはシリカゲルのカラム充填剤６を詰め込んだカラムと、図１で示したカラム一体型チップを結合させたものである。製造方法としては、以下の二通りの方法がある。
（１）フューズドシリカキャピラリー２の先端部にモノリスカラム１を形成・充填させ、その後、上記カラム充填剤６を高圧ポンプを用いてフューズドシリカキャピラリー２内に充填する。その後、実施例１と同様の先端加工を施す。
（２）先端未加工状態のモノリスカラム１を充填したフューズドシリカキャピラリー２を接続ユニオン７を用いて中身が空のフューズドシリカキャピラリー２に接続し、上記カラム充填剤６を高圧ポンプを用いてフューズドシリカキャピラリー２内に充填する。その後、実施例１と同様の先端加工を施す。
【００３６】
本実施例は、モノリスカラム１の上流側に従来のカラム充填剤を後から詰めたものであるが、モノリスカラムは背圧が小さいため、上記（１），（２）に示した充填は容易に行うことが出来る。また、先端部にモノリスカラム１を充填していることで、後段のカラム充填剤６の漏れを防止することが出来る。
【００３７】
本実施例によれば、既存の充填剤とモノリスカラムの２種類のカラムが結合したカラムを提供することが出来る。これにより、二次元ＬＣ，多次元ＬＣが１チップの部材でデッドボリューム無しで実現可能となる。例えば、前段でイオン交換カラム、後段で逆相カラムとして用いることができる。よって、多次元ＬＣの専用分析用のカラムが安価に作製可能となり、モノリスカラムとも組み合わせているため低流量でハイスループットな分析を行うことが出来る。
【００３８】
図１０は、本発明のカラム一体型チップの典型的な利用例としての液体クロマトグラフ／質量分析装置を示している。
【００３９】
溶離液９，１０は、グラジエント機能付きポンプ８で、その組成比を時間と共に変化させながらカラム一体型チップ１２に送られる。サンプルは、サンプルインジェクター１１により流路に導入され、カラム一体型チップ１２で分離された後、微小な帯電液滴１３となって噴霧される。帯電液滴１３は、カラム一体型チップ１２とイオン取り込みオリフィス１５間に高電圧電源１４によって印加された電圧により、イオン化される。イオン化された帯電液滴１３は、イオン取り込みオリフィス１５から、質量分析部１６内に入り、質量分析され、質量／電荷比（ｍ／ｚ）として検出される。
【００４０】
検出感度は、カラム一体型チップ１２の最先端で作られる帯電液滴１３のサイズ（サブミクロン）に大きく左右される。上記の各実施例で示したチップをカラム一体型チップ
１２として用いることにより、最適なサイズの帯電液滴１３を形成することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】カラム一体型チップの第１の実施例を示す図である。
【図２】第１の実施例のカラム一体型チップの製作工程を示すフローチャートである。
【図３】カラム一体型チップの第２の実施例を示す図である。
【図４】カラム一体型チップの第２の実施例を示す図である。
【図５】カラム一体型チップの第２の実施例を示す図である。
【図６】第２の実施例のカラム一体型チップの製作工程を示すフローチャートである。
【図７】カラム一体型チップの第３の実施例を示す図である。
【図８】カラム一体型チップの第３の実施例を示す図である。
【図９】カラム一体型チップの第４の実施例を示す図である。
【図１０】本発明のカラム一体型チップを適用したＬＣ／ＭＳの構成例を示す図である。
【符号の説明】
【００４２】
１…モノリスカラム、２…フューズドシリカキャピラリー、３…コーティング膜、４…先端チップ、５…ピンホール、６…カラム充填剤、７…接続ユニオン、８…グラジエントポンプ、９，１０…溶離液、１１…サンプルインジェクター、１２…カラム一体型チップ、１３…帯電液滴、１４…高電圧電源、１５…イオン取り込みオリフィス、１６…質量分析部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004613002.tif 000008
【図８】
0004613002.tif 000009
【図９】
0004613002.tif 000010
【図１０】
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