(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
耐熱性キトサナーゼ生産能力を有する好熱性キトサン分解細菌AK-1株（FERM P-18022）をキトサン存在下で培養し、培養物中からキトサンオリゴ糖を採取することを特徴とするキトサンオリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
キトサンオリゴ糖が、重合度２であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
キトサンオリゴ糖が、重合度３〜６であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
耐熱性キトサナーゼ生産能力を有する好熱性キトサン分解細菌AK-1株（FERM P-18022）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、好熱性キトサン分解細菌AK-1株をキトサン存在下で培養し、培養物中からキトサンオリゴ糖を採取することを特徴とするキトサンオリゴ糖の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、キトサンを加水分解することにより得られるキトサンオリゴ糖が、抗菌性、抗腫瘍活性、免疫賦活活性、植物生長促進作用等の生理活性を有することが明らかとなり、食品添加物、化粧品、医薬品、健康食品、植物活性化剤等への応用が試みられている。中でも、重合度５〜６のキトサンオリゴ糖は、特に高い抗菌性、抗腫瘍活性を有することが知られ、また、最近、重合度２のキトサンオリゴ糖が、リウマチに有効があることが報告されている。
【０００３】
ところで、キトサンオリゴ糖の製造法としては、塩酸による加水分解法、塩素や亜硝酸による酸化分解法、キトサナーゼによる酵素分解法等が知られている。
塩酸による加水分解法は、単糖が多量に副生し、また、塩素や亜硝酸による酸化分解法は、脱アミノ化物が生じ、いずれも純粋なキトサンオリゴ糖を高収率で得ることは困難である。一方、キトサナーゼによる酵素分解法は、キトサナーゼを生産菌から分離精製しなければならない等の操作上の煩雑性及び経時的な酵素の失活等の改善すべき点が存在する。そこで、より簡便且つ高収率のキトサンオリゴ糖製造方法が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、好熱性キトサン分解細菌AK-1株をキトサン存在下で培養し、培養物中からキトサンオリゴ糖を採取することを特徴とするキトサンオリゴ糖の製造方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、土壌から、高温下で効率よくキトサンを分解する好熱性細菌AK-1株をスクリーニングし、該菌株を用いて、キトサンから効率よくキトサンオリゴ糖を製造することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、耐熱性キトサナーゼ生産能力を有する好熱性キトサン分解細菌AK-1株（例えば、FERM P-18022菌株）をキトサン存在下で培養し、培養物中からキトサンオリゴ糖を採取することを特徴とするキトサンオリゴ糖の製造方法である。ここで、キトサンオリゴ糖としては、重合度２又は重合度３〜６のものが挙げられる。
【０００７】
さらに、本発明は、耐熱性キトサナーゼ生産能力を有する好熱性キトサン分解細菌AK-1株（例えば、FERM P-18022菌株）である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、耐熱性キトサナーゼ生産能力を有する好熱性キトサン分解細菌AK-1株を用いるキトサンオリゴ糖の製造方法である。前記好熱性キトサン分解細菌AK-1株は、以下のようにして、スクリーニングすることができ、キトサンオリゴ糖の製造に使用することができる。
【０００９】
１．耐熱性キトサナーゼを有する好熱性細菌のスクリーニング
キトサンを主要炭素源又は唯一の炭素源として生育することができる菌株は、通常、キトサンの資化過程において、まず、キトサンをまずキトサナーゼによって低分子化し代謝しやすい形態に変換する。そこで、耐熱性キトサナーゼを有する好熱性細菌は、高温下でキトサンを主要又は唯一の炭素源として生育可能な菌株をスクリーニングすることによって得ることができる。より具体的には、主要な又は唯一の炭素源として、キトサンを0.01〜10％の濃度で含有する液体培地又は固体培地に、自然界から採取した固体試料（例えば、天然土壌等）又は液体試料（例えば、天然温泉水等）を接種し、高温下（例えば、45〜70℃）で培養する。そして、生育してきた菌株を、キトサン含有寒天平板に接種し、同様に高温下で培養する。これを必要に応じて何度か反復することによって耐熱性キトサナーゼを保有する候補菌株を単一コロニーとして純粋分離することができる。なお、本発明においては、土壌試料として、キトサンを工業的に製造している千葉県山武郡芝山町の共和テクノス株式会社本社工場の敷地から採取したものを使用した。
【００１０】
純粋分離した菌株のキトサナーゼが耐熱性であることは、菌株から抽出又は精製したキトサナーゼを、高温に一定時間保持後の残存キトサナーゼ活性又は高温下でのキトサナーゼ活性を測定することによって調べることができる。ここで、キトサナーゼ活性は、キトサンを含有する溶液に、キトサナーゼを添加し、単位時間当たり生成する還元糖を定量することによって決定することがきる。本明細書中においてキトサナーゼ活性１単位とは、１分間に１マイクロモルのグルコサミンに相当する還元糖を生成する酵素量と定義した。
【００１１】
なお、本発明においてスクリーニングされた好熱性キトサン分解細菌は、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成12年９月５日付でFERM P-18022として寄託されている。
【００１２】
２．本発明の好熱性細菌を用いるキトサンオリゴ糖の醗酵生産
上記１において得られた好熱性細菌をキトサン存在下で液体培養することにより、キトサンオリゴ糖を醗酵生産することができる。培養は、キトサンを含有する液体培地に本発明の菌株を接種することにより行われるが、より増殖能の高い菌株を用いた方が、単位培養液及び単位時間当たりのオリゴ糖生産量が高くなるため、まず前培養によって菌体を活性化させ、これをキトサンオリゴ糖生産用の本培養の培地に接種して培養を行うことが好ましい。
【００１３】
なお、前培養及び本培養用培地中のキトサン含有量は、培地中の固形分換算で0.05〜5.0％、好ましくは0.1〜1.0％である。また、培地には、キトサン以外に、当該技術分野で通常用いられる窒素源、ビタミン類、無機塩類等を含有するものが挙げられる。具体的には、窒素源としては、酵母エキス、トリプトン、麦芽エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー等が挙げられる。また、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等のアンモニウム塩類や硝酸塩類等も使用可能である。また、培地に加える無機塩類としては、例えば、リン酸、マグネシウム、カリウム、カルシウム、鉄等の塩類が使用される。さらに、必要に応じて、生育に各種の有機物、無機物又は通常用いられる消泡剤等をさらに添加することができる。
【００１４】
本発明における培養は、培養液中の所望のキトサンオリゴ糖生成量が最高に達した時点で終了させることができるように、培養液中のキトサンオリゴ糖量を高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等の周知の方法により測定しながら行うことが望ましい。
【００１５】
培養液中に蓄積されたキトサンオリゴ糖は、培養終了後、常法によって培養液から精製される。すなわち、当該技術分野において通常使用されている周知の手段、例えば、ろ過、遠心分離、イオン交換又は吸着クロマトグラフィー、溶媒抽出等の操作が必要に応じて、適宜組み合わされて用いられる。具体的には、培養液から、ろ過、遠心分離等によって残存キトサン及び菌体を除去し、次いで、この液を活性炭で処理して着色物質等を除き、液を濃縮してキトサンオリゴ糖を含有するシロップとすることができる。さらに、イオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過で重合度別のオリゴ糖に分画すること、また、シロップを凍結乾燥法により粉末化することも可能である。
【００１６】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕  好熱性キトサン分解細菌のスクリーニング
以下のようにして、千葉県山武郡芝山町の共和テクノス株式会社本社工場（キトサン製造工場）の土壌より、50℃の温度下でキトサン分解活性を示す菌株を分離した。すなわち、キトサンを埋設した区域の地下２ｍから採取した土壌、キトサンを埋設した区域の地下0.6ｍから採取した土壌及びキトサンを埋設した区域の地表から採取した土壌を菌株分離源とした。これらの土壌試料１ｇを滅菌水10mlにそれぞれ懸濁し、その上澄み液１mlを普通ブイヨン培地（栄研化学株式会社製、pH7.0）100mlを含む500ml容の培養ビンに接種した。この培養ビンを50℃に設定した回転式振盪培養機で24時間培養した。この培養液１mlを表１に示すキトサン液体培地又はコロイド状キトサン培地100mlに接種し、同様に50℃で７日間振盪培養を行った。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
７日目の培養液の一部を採取して、薄層クロマトグラフィーでキトサンオリゴ糖の確認を行った。結果を表２に示す。キトサン源としてコロイド状キトサンを用いた培養液中にはキトサンオリゴ糖が確認されず、液状のキトサンを用いた培養液からはいずれもキトサンオリゴ糖が検出された。キトサン液体培地で７日間振盪培養した各培養液から平板分離法によって分離した好熱性キトサン分解細菌のうち、地下２ｍの土壌から分離した菌株をAK-1、地下0.6ｍの土壌から分離した菌株をAK-2、地表の土壌から分離した菌株をAK-3と命名した。
【００１９】
【表２】
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【００２０】
次いで、上記のAK-1、AK-2及びAK-3の３菌株をキトサン液体培地で、50℃、７日間培養して培養液中の還元糖量及びキトサナーゼ活性を測定した。結果を表３に示す。表２及び表３の結果より、高重合度のオリゴ糖を生産し、高いキトサナーゼ活性を有することから本発明の高熱性キトサン分解細菌としてAK-1株を選択して、以後の実験に供した。
【００２１】
【表３】
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【００２２】
〔実施例２〕  好熱性キトサン分解細菌AK-1株の特徴及び性質
実施例１において得られた好熱性キトサン分解細菌AK-1株の形態学的特徴及び生理学的特徴についてその一部を調べた。結果を表４に示した。
【００２３】
【表４】
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【００２４】
〔実施例３〕  好熱性キトサン分解細菌AK-1株によるキトサンオリゴ糖の生産
好熱性キトサン分解細菌AK-1株を普通ブイヨン培地で50℃、24時間振盪培養した培養液をキトサン濃度0.1％のキトサン液体培地に菌体濃度が8.8×105細胞/ml、8.8×106細胞/ml又は2.1×108細胞/mlとなるようにそれぞれ接種し、６日間振盪培養し、経時的に培養液をサンプリングして、キトサンオリゴ糖の重合度別の糖濃度を測定した。接種菌体濃度が8.8×105細胞/mlの場合の結果を図１に、接種菌体濃度が8.8×106細胞/mlの場合の結果を図２に、接種菌体濃度が2.1×108細胞/mlの場合の結果を図３に示す。
【００２５】
接種菌体濃度が8.8×105細胞/mlの場合には、培養２日目より二糖のみが選択的に増加し、６日目で二糖0.53mg/mlの蓄積が見られた。このときの二糖の収率は50％であり、全ての測定サンプル中で三糖から五糖の濃度はいずれも0.02mg/ml以下であった。
【００２６】
また、接種菌体濃度が8.8×106細胞/mlの場合には、二糖濃度は２日目に最大となり以後減少するが、三糖、四糖及び五糖は６日目までは増加傾向を示した。培養６日目の二糖、三糖、四糖及び五糖濃度はそれぞれ0.18mg/ml、0.08mg/ml、0.11mg/ml及び0.06mg/mlとなった。このときの全オリゴ糖収率は41％となった。
【００２７】
さらに、接種菌体濃度が2.1×108細胞/mlの場合には、２日目の二糖、三糖、四糖、五糖及び六糖濃度はそれぞれ0.06mg/ml、0.08mg/ml、0.18mg/ml、0.56mg/ml及び0.60mg/mlと重合度の高いオリゴ糖が蓄積量が多い結果となった。さらに、４日目はそれぞれ0.09mg/ml、0.03mg/ml、0.03mg/ml、0.05mg/ml及び0.62mg/mlと六糖が選択的に蓄積された。しかし、キトサン量から算出した２日目及び３日目の全オリゴ糖収率はそれぞれ14％及び８％であった。
【００２８】
以上のことより、AK-1株を用い、接種菌体濃度及び培養時間等を調節することによって、キトサンから所望の重合度のキトサンオリゴ糖を生成することができることがわかった。
【００２９】
【発明の効果】
本発明は、キトサンオリゴ糖のより効率的な工業生産に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】キトサン濃度が0.1％のキトサン液体培地にAK-1株を8.8×105細胞/mlとなるように接種したときの培養液の重合度別のキトサンオリゴ糖濃度を経日的に示した図である。
【図２】キトサン濃度が0.1％のキトサン液体培地にAK-1株を8.8×106細胞/mlとなるように接種したときの培養液の重合度別のキトサンオリゴ糖濃度を経日的に示した図である。
【図３】キトサン濃度が0.1％のキトサン液体培地にAK-1株を2.1×108細胞/mlとなるように接種したときの培養液の重合度別のキトサンオリゴ糖濃度を経日的に示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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