(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖化タンパク質または糖化ペプチドから、α−アミノ基が糖化されたアミノ酸を遊離させる酵素であって、スフィンゴモナス  パラポウシモビリス  KDK1004（Sphingomonas  parapaucimobilis  KDK1004）（FERM  BP−7041）の菌体由来であり、下記（ａ）及び（ｂ）の理化学的性質を有する新規酵素。
（ａ）分子量：４０，０００〜６０，０００
（ｂ）至適温度：３７℃付近
【請求項２】
遊離される糖化アミノ酸が、α−アミノ基が糖化されたバリンである請求項１記載の酵素。
【請求項３】
糖化タンパク質または糖化ペプチドを酵素で分解した後、この分解物とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとを反応させ、この酸化還元反応を測定することにより、前記糖化タンパク質または糖化ペプチドの量を測定する方法であって、前記酵素として請求項１又は２に記載の酵素を使用する測定方法。
【請求項４】
測定対象物である糖化タンパク質が、糖化ヘモグロビンである請求項３記載の測定方法。
【請求項５】
プロテアーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびこれとの反応により酸化される基質を備える糖化タンパク質または糖化ペプチドの測定キットであり、前記プロテアーゼが、請求項１又は２に記載の酵素を含む測定キット。
【請求項６】
スフィンゴモナス属（Sphingomonas）の菌体であって、糖化タンパク質または糖化ペプチドから、α−アミノ基が糖化されたアミノ酸を遊離させる酵素であって、下記（ａ）及び（ｂ）の理化学的性質を有する酵素を産生するスフィンゴモナス  パラポウシモビリス  KDK1004（Sphingomonas  parapaucimobilis  KDK1004）（FERM  BP−7041）。
（ａ）分子量：４０，０００〜６０，０００
（ｂ）至適温度：３７℃付近
【請求項７】
遊離される糖化アミノ酸が、α−アミノ基が糖化されたバリンである請求項６記載の菌体。
【請求項８】
スフィンゴモナス  パラポウシモビリス  KDK1004（Sphingomonas  parapaucimobilis  KDK1004）（FERM  BP−7041）を培養する工程を含む、請求項１又は２に記載の酵素を製造する方法。
【請求項９】
さらに、下記（ａ）〜（ｃ）の少なくとも一つの精製工程を含む、請求項８記載の製造方法。
（ａ）  培養液から菌体を除去して、上清を調製する工程。
（ｂ）  前記上清中のタンパク質をエタノール沈殿する工程。
（ｃ）  前記タンパク質をクロマトグラフィーにより分離する工程。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規酵素に関し、詳しくは、α−アミノ基が糖化されたアミノ酸を遊離させる新規酵素に関する。
背景技術
プロテアーゼは、様々な産業分野において利用されている。例えば、糖尿病の診断および治療等における重要な指標である血清中の糖化アルブミン等の糖化タンパク質を測定する際にも、前記プロテアーゼが使用されている。
このプロテアーゼを利用した糖化タンパク質の測定方法は、例えば、以下に示すようにして行うことができる。例えば、糖化タンパク質をプロテアーゼで分解し、この分解物とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）とを反応させ、生成する過酸化水素量または消費される酸素量を測定することにより、前記糖化タンパク質の量を知ることができる。前記プロテアーゼとしては、特開平５−１９２１９３号公報、特開平７−２８９２５３号公報等に開示されているものが使用されている。
このように、糖化タンパク質を予めプロテアーゼで処理するのは、前記ＦＡＯＤ等は、糖化アミノ酸や糖化ペプチドに作用し易く、糖化タンパク質自身には作用し難いからである。特に、糖化ヘモグロビン（以下、「ＨｂＡ１ｃ」という）は、その糖化部分がβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基であるため、この部分にＦＡＯＤが作用しやすいように、ＨｂＡ１ｃを処理できるプロテアーゼが求められていた。発明の開示
そこで、本発明の目的は、糖化タンパク質や糖化ペプチド等に対してＦＡＯＤが作用しやすいように、前記糖化タンパク質等を処理できる新規酵素の提供である。
本発明者らは、まず、各種ＦＡＯＤの中でも、糖がα−アミノ基に結合した糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸等に作用するＦＡＯＤについて、その作用機構を検討した。その結果、前記ＦＡＯＤは、例えば、α−アミノ基に糖が結合した糖化アミノ酸には良く作用するが、前記糖化タンパク質や糖化ペプチドには作用しがたいことがわかった。そこで、本発明者らは、この知見に基づいて、自然界の様々な菌を分離培養し、それらが産生する酵素を検討した結果、糖がα−アミノ基（Ｎ末端アミノ基）に結合した糖化タンパク質または糖化ペプチドから、α−アミノ基が糖化されたアミノ酸（α−Ｇｌｙｃａｔｅｄ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ：以下、「α−ＧＡ」という）を遊離する新規酵素を産生する菌を分離することに成功し、本発明に至った。本発明の新規酵素（α−Ｇｌｙｃａｔｅｄ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ：以下、「α−ＧＡＲＥ」という）によれば、例えば、前記糖化タンパク質や糖化ペプチドからα−ＧＡを遊離できるため、α−ＧＡに良く作用する前記ＦＡＯＤを用いたＨｂＡ１ｃの測定を臨床検査等で実用化することができる。また、ＨｂＡ１ｃの測定の他に、他の糖化タンパク質の測定等の様々な分野で使用することもできる。なお、本発明のα−ＧＡＲＥは、α−ＧＡを遊離させる触媒機能のほかに、他の触媒機能、例えば、他のペプチド結合を切断する機能等を備えていても良い。本発明者らが分離した新菌体としては、スフィンゴバクテリウム属（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）、ムコー属（Ｍｕｃｏｒ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）等の菌体がある。なお、本発明のα−ＧＡＲＥは、これらの菌体由来に制限されない。
本発明のα−ＧＡＲＥにおいて、遊離される糖化アミノ酸は、そのα−アミノ基が糖化されていれば特に制限されないが、前述のように、ＨｂＡ１ｃはＮ末端バリン残基が糖化されていることから、前記遊離されるα−ＧＡは、糖化バリン（以下、「α−ＧＶ」という）であることが好ましい。
本発明のα−ＧＡＲＥとしては、例えば、以下に示す、五種類のα−ＧＡＲＥがある。
まず、一つめのα−ＧＡＲＥは、スフィンゴバクテリウム属（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の菌体由来であり、特に好ましくは、スフィンゴバクテリウム  ミズタエ  ＫＤＫ１００３（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｚｕｔａｅ  ＫＤＫ１００３）由来である。このスフィンゴバクテリウム  ミズタエ  ＫＤＫ１００３（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｚｕｔａｅ  ＫＤＫ１００３）は、本発明者らが土壌中より新規に単離した菌体であり、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）（日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１−３）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４８（寄託日：平成１１年３月２９日）で寄託されている。本菌体の菌学的特性は、下記に示すとおりである。
（形態的特性）
本菌体の形状は、その大きさが０．５×１．２μｍの桿菌であり、非運動性である。
（培養的性質）
本菌体を常法の寒天培地に生育させた場合、そのコロニー形態は、低い凸状の全縁がなめらかな円形であり、前記コロニーの色は、黄色である。
0004613282.tif 000002
つぎに、二つ目のα−ＧＡＲＥは、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）の菌体由来であり、特に好ましくは、スフィンゴモナス  パラポウシモビリス  ＫＤＫ１００４（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＫＤＫ１００４）由来である。前記スフィンゴモナス  パラポウシモビリス  ＫＤＫ１００４（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＫＤＫ１００４）も、本発明者らが土壌中より新規に単離した菌体であり、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）（日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１−３）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４７（原寄託日：平成１１年３月２９日）で寄託され、国際寄託当局である前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０４１（移管受領日：平成１２年２月２１日）で原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託へ移管されている。本菌体の菌学的特性は、下記に示すとおりである。
（形態的特性）
本菌体の形状は、その大きさが０．８×２．０μｍの桿菌であり、運動性を有する。
（培養的性質）
本菌体を常法の寒天培地に生育させた場合、そのコロニー形態は、低い凸状の全縁がなめらかな円形である。前記コロニーの色は、透明から淡黄色に変化する。マックコンケイ（Ｍａｃ  Ｃｏｎｋｅｙ）培地で生育は認められない。また、培養温度４２℃でも弱いながら生育は認められる。
0004613282.tif 000003
つぎに、三つ目のα−ＧＡＲＥは、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）の菌体由来であり、特に好ましくは、コマモナス  アシドボランス  ＫＤＫ１００５（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ  ＫＤＫ１００５）由来である。前記コマモナス  アシドボランス  ＫＤＫ１００５（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ  ＫＤＫ１００５）も、本発明者らが土壌中より新規に単離した菌体であり、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）（日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１−３）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４６（寄託日：平成１１年３月２９日）で寄託されている。本菌体の菌学的特性は、下記に示すとおりである。
（形態的特性）
本菌体の形状は、その大きさが０．６×１．５μｍの桿菌であり、運動性を有する。
（培養的性質）
本菌体を常法の寒天培地に生育させた場合、そのコロニー形態は、凸状の円形で、根足を有する。前記コロニーの色は、黄色で光沢がある。
0004613282.tif 000004
つぎに、四つ目のα−ＧＡＲＥは、ムコー属（Ｍｕｃｏｒ）の菌体由来であり、特に好ましくは、ムコー  サーシネロイデス  エフ  ジャンセッニ  ＫＤＫ３００４（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ ｆ．ｊａｎｓｓｅｎｉｉ  ＫＤＫ３００４）由来である。前記ムコー  サーシネロイデス  エフ  ジャンセッニ  ＫＤＫ３００４（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ ｆ．ｊａｎｓｓｅｎｉｉ  ＫＤＫ３００４）も、本発明者らが土壌中より新規に単離した菌体であり、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）（日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１−３）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４５（寄託日：平成１１年３月２９日）で寄託されている。本菌体の菌学的特性は、下記に示すとおりである。
（形態的特性）
亜球形の胞子嚢胞子を形成し、その径は４〜６μｍとなる。胞子嚢は直径７０μｍ程度で黒色を呈し、基底部にカラレットが観察される。菌糸幅は１０〜１２μｍで仮根の形成は見られない。
（培養的性質）
本菌体を常法の寒天培地に生育させた場合、配偶子嚢の接合によってのみ接合胞子を形成する。気菌子は綿毛状で白色を呈し、漸次灰色と色調を変える。コロニー裏面は白色を呈する。また、３７℃での生育は不良で、４０℃では生育しない。
つぎに、五つ目のα−ＧＡＲＥは、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の菌体由来であり、特に好ましくは、ペニシリウム  ワクスマニ  ＫＤＫ３００５（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗａｋｓｍａｎｉｉ  ＫＤＫ３００５）由来である。前記ペニシリウム  ワクスマニ  ＫＤＫ３００５（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗａｋｓｍａｎｉｉ  ＫＤＫ３００５）も、本発明者らが土壌中より新規に単離した菌体であり、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）（日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１−３）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４４（寄託日：平成１１年３月２９日）で寄託されている。本菌体の菌学的特性は、下記に示すとおりである。
（形態的特性）
基層から立ち上がる分子柄は薄い細胞壁で覆われ、平滑であり、頂嚢は形成しない。分子柄は非分岐である。メツラは輪生で２〜５個生じる。メツラの先端に９μｍの単一のフィアライドを形成する。フィアライドの形状は短く、先細りの首を持つフラスコ型である。分生子は直径３μのほぼ球状を呈し、平滑な細胞壁で覆われ、連鎖状をなす。
（培養的性質）
本菌体を常法の寒天培地に生育させた場合、生育速度は２５℃、７日間で直径３０ｍｍとなる。コロニーの表面はフェルト状で緑色を呈する。菌糸は呈色しない。コロニー裏面は淡青色となる。浸出液は産生しない。３７℃での生育は陰性である。
つぎに、本発明の糖化タンパク質または糖化ペプチドの測定方法は、糖化タンパク質または糖化ペプチドを酵素で分解した後、この分解物とＦＡＯＤとを反応させ、この酸化還元反応を測定することにより、前記糖化タンパク質または糖化ペプチドを測定する方法であって、前記酵素として本発明の新規酵素（α−ＧＡＲＥ）を使用することを特徴とする。本発明の測定方法において使用するα−ＧＡＲＥは、測定する糖化タンパク質や糖化ペプチドの種類、それらの濃度等により適宜決定されるが、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。また、前記α−ＧＡＲＥがより作用しやすいように、予め、糖化タンパク質等を別の酵素（例えば、プロテアーゼ等）で分解させてもよい。
本発明の測定方法において、前記酸化還元反応の測定は、前記酸化還元反応によって生じる過酸化水素量の測定または消費される酸素量の測定であることが好ましく、前記過酸化水素量を測定する場合、ペルオキシダーゼと酸化により発色する基質（以下、「発色性基質」という）とを用いた測定であることが好ましい。なお、前記過酸化水素量は、前記ペルオキシダーゼ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的手法等により測定することもできる。
前記発色性基質としては、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（例えば、商品名ＤＡ−６４：和光純薬社製等）、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとを組み合わせた基質等があげられる。前記トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、アフチルアミン誘導体等があげられる。また、前記アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。これらの発色性基質の中でも、特に好ましくは、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである。
本発明の測定方法において、前述のように、血球中のＨｂＡ１ｃを測定することは糖尿病の診断に有用であることから、測定対象試料は、血球であることが好ましい。しかし、糖化タンパク質は、例えば、前記血球以外の血液成分（全血、血漿、血清等）、尿や髄液等の生体試料、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食料等にも含まれるため、測定対象試料は前記血球には限定されない。また、測定対象物も、前記ＨｂＡ１ｃには制限されず、この他にも、ゼラチン、カゼイン等の糖化タンパク質や糖化ペプチド等があげられる。
つぎに、本発明の糖化タンパク質または糖化ペプチドの測定キットは、プロテアーゼ、ＦＡＯＤ、ペルオキシダーゼおよびペルオキシダーゼとの反応により酸化される基質を備える測定キットであり、前記プロテアーゼが本発明のα−ＧＡＲＥを含むことを特徴とする。この測定キットによれば、本発明の測定方法を迅速かつ簡便に行うことができる。なお、前述と同様に、前記α−ＧＡＲＥは一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
本発明の測定キットにおいて、前記酸化される基質としては、前述のような発色性基質が好ましく、測定対象物および測定対象試料も前述と同様である。
つぎに、本発明のα−ＧＡＲＥの製造方法は、本発明の新菌体を培養する工程を含む方法である。これにより、本発明のα−ＧＡＲＥを容易に製造することができる。
本発明のα−ＧＡＲＥの製造方法は、さらに、以下の（ａ）〜（ｃ）に示す精製工程を含むことが好ましい。
（ａ）  培養液から菌体を除去して、上清を調製する工程。
（ｂ）  前記上清中のタンパク質をエタノール沈殿する工程。
（ｃ）  前記タンパク質をクロマトグラフィーにより分離する工程。
前記精製工程は特に制限されず、その他の精製工程を組合わせてもよい。また、例えば、（ａ）工程だけでもよいし、２以上の工程を行ってもく、さらに同じ工程を繰り返し行ってもよい。
前述のような菌体培養によって得られる本発明のα−ＧＡＲＥは、培養液中に含有された状態でも、精製された状態であってもよく、糖化タンパク質等からα−ＧＡを遊離させる限り、その精製度に拘わらず使用できる。しかし、精製すれば、培養液中のα−ＧＡＲＥ以外の成分が除去されるため、前記α−ＧＡＲＥの比活性が向上する。これにより、実際に使用する際に、その使用量が少量でよく、取り扱いが簡便になる。また、各種反応に用いる場合に、α−ＧＡＲＥ以外の成分による影響も回避できる。
つぎに、以上のような精製工程により精製されたα−ＧＡＲＥについて、そのアミノ酸配列の決定および遺伝子配列の決定を行い、本発明のα−ＧＡＲＥをコードする遺伝子を調製することが好ましい。なお、この遺伝子は、前記α−ＧＡＲＥが発現するために必要である遺伝子には限定されず、例えば、プローブやプライマーとして使用するＤＮＡ断片やＲＮＡ等、また、α−ＧＡＲＥの遺伝子配列をもとに作製した化学合成の断片等も含む。このような遺伝子を用いて、例えば、組換え体等を作製し、これによりα−ＧＡＲＥを製造してもよい。本発明のα−ＧＡＲＥの遺伝子は、例えば、以下に示すようにして得ることができる。
まず、本発明のα−ＧＡＲＥを、例えば、後述する精製工程等により精製して、エドマン分解等の常法によりアミノ酸配列の決定を行ない、これをもとにその遺伝子配列を推測する。そして、これに基づいて常法の化学合成等によりＤＮＡ断片やＲＮＡ断片等を作製し、これをプライマーやプローブ等として使用して、本発明の新規菌体からα−ＧＡＲＥをコードする遺伝子をクローニングすれば、本発明のα−ＧＡＲＥの遺伝子が得られる。
発明を実施するための最良の形態
本発明のα−ＧＡＲＥを産生する菌体のスクリーニングは、例えば、以下に示すように、土壌中の菌体を分離培養し、その培養液を用いて糖化ペプチドの分解反応を行い、得られる分解物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分析することによって行うことができる。なお、以下のスクリーニング方法は、α−ＧＡＲＥ産生菌を分離するために、本発明者らが詳細な検討を重ねた結果、見出したものである。このスクリーニング方法の確立によって、本発明のα−ＧＡＲＥ産生菌の分離が成功したといっても過言ではない。
（１）培養方法
以下に示す栄養液体培地を、予め、オートクレーブにより、１２１℃で２０分間滅菌する。そして、土壌サンプルを滅菌水に懸濁し、これを前記滅菌済みの栄養液体培地に添加して、３０℃で４８時間振とう培養（１１１ｒｐｍ）を行う。得られた培養液を遠心分離（１２，０００Ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）して、その上清を回収する。
（栄養液体培地）
麦芽エキス（商品名Ｍａｌｔ  ｅｘｔｒａｃｔ：ＤＩＦＣＯ社製）  ２．０ｇ
Ｄ−グルコース（ナカライテスク社製）                          ２．０ｇ
ペプトン（商品名Ｂａｃｔｏ  ｐｅｐｔｏｎｅ：ＤＩＦＣＯ社製）  ０．１ｇ
蒸留水                                                        １００ｍｌ
（２）糖化ペプチドの分解反応
（糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸の製造方法）
そのアミノ酸配列が、ＨｂＡ１ｃβ鎖におけるＮ末端側アミノ酸配列と同様であるα−アミノ基糖化ペプチドおよびα−フルクトシルバリン（以下、「ＦＶ」という）を、以下のペプチドおよびバリンと、グルコースとを用いて、常法により作製する。
（ペプチド）
Ｖａｌ−Ｈｉｓ（ペプチド研究所社製：以下、これの糖化物を「Ｆ２Ｐ」という）
Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（ペプチド研究所社製：以下、これの糖化物を「Ｆ３Ｐ」という）
Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（バイオリンク社製：以下、これの糖化物を「Ｆ４Ｐ」という）
Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ（ＳＩＧＭＡ社製：以下、これの糖化物を「Ｆ５Ｐ」という）
Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ（バイオリンク社製：以下、これの糖化物を「Ｆ９Ｐ」という）
（Ｌ−アミノ酸）
Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＨｉｓ（和光純薬工業社製）
（分解方法）
予め、前記各糖化ペプチドを０．０１Ｍの濃度になるように蒸留水に溶解し、糖化ペプチド水溶液をそれぞれ調製する。そして、前記各糖化ペプチド水溶液５０μｌと前記培養液上清１００μｌとをそれぞれ混合し、３７℃で一晩反応させた後、これらの反応液を凍結乾燥する。
（３）ＴＬＣ分析
前記糖化ペプチドの分解物をＴＬＣにより分析し、前記糖化ペプチドから遊離されるα−ＧＡの存在を確認し、α−ＧＡＲＥ活性の有無を調べる。なお、使用する試薬および方法を以下に示す。
（薄層プレート）
商品名Ｐｒｅ−Ｃｏａｔｅｄ  ＴＬＣ  ｐｌａｔｅ  ＳＩＬＩＣＡ  ＧＥＬ  ６０    （メルク社製）
（検出試薬）
ニンヒドリン（フナコシ社製）を０．５体積％の濃度になるように、７５体積％エタノールで溶解する。
（展開溶媒）
ブタノール（ナカライデスク社製）、酢酸（ナカライデスク社製）および蒸留水を、２：１：１の体積割合になるように混合する。
（分析方法）
展開距離が８ｃｍになるように前記薄層プレートを準備し、前記プレート下端から１ｃｍの位置をサンプルスポットの原線とする。そして、ＴＬＣ分析の直前に、前記凍結乾燥した各反応液を５０体積％エタノール１５μｌにそれぞれ溶解し、これらをシリンジ（容量２５μｌ）により前記原線上にスポットする。なお、コントロールとして、前記ＦＶおよび各種アミノ酸も同様にスポットする。そして、前記展開溶媒で予め飽和された展開槽にこのプレートをいれ、前記原線から約８ｃｍの距離まで前記展開溶媒を上昇させる。なお、前記展開溶媒は、前記プレートがその下端から約０．５ｃｍまで浸かるように入れておく。
前記展開後、ドラフト内で完全に風乾させた前記プレートに前記検出試薬（ニンヒドリン溶液）を噴霧してから、熱しておいたホットスターラー（１００℃）により加熱して発色試験を行う。その結果、コントロールのＦＶと同じ移動度を示すサンプルがα−ＧＡＲＥ活性陽性であり、その培養液の菌体がα−ＧＡＲＥ産生菌体である。
前記ＴＬＣ分析は、前述のようなニンヒドリン検出には限定されず、例えば、この他にもフルオレスカミン、エチレンジアミン硫酸塩等の試薬を用いた蛍光検出法も採用できる。
また、前記コントロールとしては、例えば、基質である糖化タンパク質または糖化ペプチドのα−ＧＡを使用することが好ましい。
このようなスクリーニング方法により、発明者らが単離した新菌体としては、例えば、前記スフィンゴバクテリウム  ミズタエ  ＫＤＫ１００３（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｚｕｔａｅ  ＫＤＫ１００３）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４８）、スフィンゴモナス  パラポウシモビリス  ＫＤＫ１００４（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＫＤＫ１００４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０４１）、コマモナス  アシドボランス  ＫＤＫ１００５（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ  ＫＤＫ１００５）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４６）、ムコー  サーシネロイデス  エフ  ジャンセッニ  ＫＤＫ３００４（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｃｓ ｆ．ｊａｎｓｓｅｎｉｉ  ＫＤＫ３００４）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４５）およびペニシリウム  ワクスマニ  ＫＤＫ３００５（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗａｋｓｍａｎｉｉ  ＫＤＫ３００５）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４４）等がある。
本発明のα−ＧＡＲＥの検出および活性測定に使用できる基質としては、前述の糖化ペプチド等には制限されず、例えば、Ｎ末端のα−アミノ基が糖化されている糖化タンパク質および糖化ペプチド等があげられる。このような基質を用いる場合、例えば、遊離されたα−ＧＡに対して、後述するＦＡＯＤを用いた酸化還元反応（例えば、発色反応等）を行うことにより、α−ＧＡＲＥを検出・測定することができる。
前記糖化タンパク質としては、例えば、ＨｂＡ１ｃ、糖化グロビン等があげられる。このような糖化タンパク質は、例えば、天然のものでもよいし、糖とタンパク質とのアマドリ転位反応により合成したものでもよい。前記糖化グロビンは、例えば、ＨＰＬＣ等を用いて精製したＨｂＡ１ｃを、テールの方法（Ｔｅａｌｅ，Ｆ．Ｗ．Ｊ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ａｃｔａ，３５，５４３，１９５９）によりグロビン化することによって調製できる。合成により各種タンパク質を糖化する場合、使用する糖は特に制限されず、例えば、グルコース等のアルドースや、ケトース等があげられる。
前記糖化ペプチドは、例えば、前述のような糖化タンパク質をプロテアーゼ分解することにより調製したり、糖と合成ペプチドとのアマドリ転位により合成できる。糖化ペプチドの長さは、特に制限されないが、例えば、アミノ酸残基数２〜２０の範囲であり、好ましくは２〜８の範囲である。
糖とのアマドリ転位反応を行う前記ペプチドは、例えば、天然のものでもよいし合成ペプチドでもよい。また、そのアミノ酸組成は特に制限されないが、アルギニンやリジンを含まないペプチドであることが好ましい。このようなペプチドを糖化すれば、ペプチドのα−アミノ基のみが糖化された糖化ペプチドを調製できるため、この糖化ペプチドを用いることによってα−ＧＡＲＥ活性のみを検出できる。
具体的に、α−ＧＡＲＥをＨｂＡ１ｃ測定に利用することを目的とする場合、前記糖化ペプチドは、例えば、ＨｂＡ１ｃβ鎖におけるＮ末端側アミノ酸配列と同様の糖化ペプチドであることが好ましく、例えば、前記「糖化ペプチドの分解反応」において記載したＮ末端Ｖａｌのα−アミノ基が糖化された糖化ペプチド等があげられる。また、例えば、ＨｂＡ１ｃをトリプシンで分解すれば、Ｎ末端バリンのα−アミノ基が糖化されているアミノ酸残基数８個の糖化ペプチドを得ることができる。
また、α−ＧＡＲＥの基質として、Ｎ末端のα−アミノ基が糖化されている糖化ペプチド等を用いる場合、遊離されたα−ＧＡを検出してもよいが、α−ＧＡ遊離後の残存ペプチドの検出により、α−ＧＡＲＥを検出・測定することもできる。
このような糖化ペプチドは、特に制限されないが、例えば、ＦＶ−Ｌｅｕ（以下、「ＦＶＬ」）、ＦＶ−Ｇｌｎ（以下、「ＦＶＱ」）、ＦＶ−Ａｌａ（以下、「ＦＶＡ」）、ＦＶ−Ａｓｎ（以下、「ＦＶＮ」）等のジペプチドがあげられる。これらは、α−ＧＡＲＥによりＦＶが遊離し、同時にＬｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ａｓｎがそれぞれ生成される。この生成されたＬｅｕをロイシンデヒドロゲナーゼ、Ｇｌｎをグルタメートデヒドロゲナーゼ、Ａｌａをアラニンアミントランスフェラーゼとα−ケトグルタル酸とラクテートデヒドロゲナーゼ、Ａｓｎをアスパラギンアミノトランスフェラーゼとα−ケトグルタル酸とマレートデヒドロゲナーゼ等とそれぞれ反応させ、ＮＡＤＨ生成またはＮＡＤ生成を吸光度測定（波長３４０ｎｍ）することによって検出できる。
また、糖化トリペプチドとしては、例えば、ＦＶ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（以下、「ＦＶＬＳ」）等があげられる。ＦＶＬＳは、α−ＧＡＲＥによりＦＶが遊離し、同時にＬｅｕ−Ｓｅｒが生成される。これを例えば、アミノペプチダーゼ、キモトリプシン、プロテナーゼＫ等の加水分解酵素で分解し、これにより生成したロイシンを前述と同様にして測定することができる。なお、前記ペプチドの長さは、特に制限されない。
さらに、α−ＧＡＲＥの基質として、アミノ酸と検出基とを含み、前記アミノ酸のα−アミノ基が糖化され、かつ、前記検出基が前記アミノ酸のα−カルボキシル基にアミド結合またはエステル結合し、前記検出基が、結合状態では検出不可能であり、遊離すると検出可能となる基質を用いることもできる。
α−ＧＡＲＥは、前記基質と反応させれば、α−ＧＡと前記検出基とのアミド結合またはエステル結合を切断して、α−ＧＡと検出基とを遊離する。この切断によって遊離した前記検出基は、例えば、発色・発光するため、これによりα−ＧＡＲＥを検出・測定できる。
前記検出基は、特に制限されないが、例えば、前述のように、発色や蛍光により検出できるものが好ましい。前記発色により検出できる検出基としては、パラニトロアニリド（以下、「ｐ−ＮＡ」という）、パラニトロフェノール、インドール、β−ナフチルアミド、４−メトキシ−β−ナフチルアミド（４ＭβＮＡ）等があげられ、前記蛍光により検出できる検出基としては、例えば、４−メチル−クマリル−７−アミド等があげられる。具体的に、ｐ−ＮＡやパラニトロフェノールは、例えば、波長４０５〜４１０ｎｍ付近の吸光度を分光光度計等により測定すればよく、４−メチル−クマリル−７−アミドは、波長３８０ｎｍで励起して波長４６０ｎｍで測定すればよい。
なお、前記検出基とα−カルボキシル基との結合が、アミド結合であってもエステル結合であっても、α−ＧＡＲＥがα−ＧＡを遊離できるのは、α−ＧＡＲＥがα−アミノ基の糖化部分を認識してα−ＧＡを遊離させるためと推測される。
このようにα−カルボキシル基に検出基を結合させたα−ＧＡＲＥの基質は、例えば、市販の検出基が結合したアミノ酸と糖とを用いて常法により調製できる。
つぎに、本発明のα−ＧＡＲＥは、例えば、前述の培養方法に準じた方法により、本発明のα−ＧＡＲＥ産生菌体を培養することによって製造できる。スフィンゴバクテリウム  ミズタエ  ＫＤＫ１００３（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｚｕｔａｅ  ＫＤＫ１００３）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４８）は、例えば、培養温度２０〜３７℃の範囲、培養時間１２〜１２０時間の範囲、培地のｐＨ６．０〜９．５の範囲であり、スフィンゴモナス  パラポウシモビリス  ＫＤＫ１００４（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＫＤＫ１００４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０４１）は、例えば、培養温度２０〜３７℃の範囲、培養時間１２〜１２０時間の範囲、培地のｐＨ６．０〜９．５の範囲である。コマモナス  アシドボランス  ＫＤＫ１００５（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ  ＫＤＫ１００５）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４６）、ムコー  サーシネロイデス  エフ  ジャンセッニ  ＫＤＫ３００４（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ ｆ．ｊａｎｓｓｅｎｉｉ  ＫＤＫ３００４）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４５）およびペニシリウム  ワクスマニ  ＫＤＫ３００５（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗａｋｓｍａｎｉｉ  ＫＤＫ３００５）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４４）は、例えば、培養温度２０〜３７℃の範囲、培養時間１２〜１２０時間の範囲、培地のｐＨ５．０〜９．０の範囲である。
また、前記培養液に含有されるα−ＧＡＲＥを、常法により分離精製することによって、α−ＧＡＲＥの酵素標品を得ることができる。α−ＧＡＲＥの精製は、例えば、既知の方法である、硫安等による塩析法、等電点沈殿法、エタノール沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等の組み合わせにより行うことができる。以下に、スフィンゴバクテリウム  ミズタエ  ＫＤＫ１００３（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｚｕｔａｅ  ＫＤＫ１００３）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４８）由来α−ＧＡＲＥの精製方法の一例を示す。
まず、前記培養液を遠心分離（１２，０００Ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）して菌体を除去し、上清を得る。そして、前記上清を限外ろ過膜（商品名  ＭＩＣＲＯＺＡ、分画分子量サイズ３ｋＤａ：旭化成社製）により、４０倍（体積）に濃縮する。前記濃縮液に対して、１／３倍体積量の陰イオン交換樹脂（商品名  ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ：ファルマシア社製）を加えて、バッチ法によりα−ＧＡＲＥの吸着および溶出を行う。まず、１０ｍＭリン酸二カリウム水溶液、続いて０．０５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸二カリウム水溶液で洗浄することにより非吸着タンパク質を除去してから、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸二カリウム水溶液によりα−ＧＡＲＥを溶出させ、α−ＧＡＲＥ活性画分を回収する。
次に、前記活性画分を、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した陰イオン交換樹脂（商品名  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ：ファルマシア社製）カラムに供してα−ＧＡＲＥを吸着させ、前記緩衝液により洗浄を行う。そして、ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、ＮａＣｌ濃度０．２Ｍ−０．２６Ｍのステップワイズ法によりα−ＧＡＲＥを溶出させる。この場合、α−ＧＡＲＥは、０．２６Ｍ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液により溶出される。
例えば、以上のような精製方法によって、部分精製された本発明のα−ＧＡＲＥ酵素溶液を得ることができる。なお、本発明のその他の新菌体由来のα−ＧＡＲＥも同様にして精製できる。
また、本発明の新規菌体の培養に使用する培地は、前記栄養液体培地には制限されず、この他に、例えば、以下に示すヘモグロビン（Ｈｂ）培地を使用することもできる。なお、Ｈｂ溶液は、例えば、以下に示す方法により調製できる。
（Ｈｂ培地：ｐＨ６．０）
Ｈｂ溶液                          ０．２重量％
Ｋ２ＨＰＯ４                      ０．２重量％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ            ０．０２重量％
微量金属塩溶液                    １．０重量％
微量ビタミン類溶液                ０．２重量％
（Ｈｂ溶液）
新鮮血液を遠心分離（２，０００Ｇ、１０分間、室温）して赤血球を回収し、これに等量（体積）の蒸留水を添加して溶血させる。この溶血液を遠心分離（２，０００Ｇ、１５分間、室温）し、赤血球膜等を除去した溶液をＨｂ溶液とする。
（微量金属塩溶液）
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ              ２００ｍｇ
Ｈ３ＢＯ３                          ５０ｍｇ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                ２０ｍｇ
ＫＩ                                ５０ｍｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ              １００ｍｇ
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ              ２００ｍｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ              ２００ｍｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ            ５０ｍｇ
残分                                水（全量  ５００ｍｌ）
（微量ビタミン類溶液）
Ｃａ−パントテン酸                  ４０ｍｇ
イノシトール                        ２０ｍｇ
ナイアシン                          ４０ｍｇ
ρ−アミノ安息香酸                  ２０ｍｇ
ピリドキシン塩酸塩                  ４０ｍｇ
チアミン塩酸塩                      ４０ｍｇ
ビオチン                              ０．２ｍｇ
ビタミンＢ１２                        ０．０５ｍｇ
残分                              水（全量１００ｍｌ）
つぎに、本発明の糖化タンパク質または糖化ペプチドの測定方法について、血球を試料とし、前記血球中の糖化タンパク質（例えば、ＨｂＡ１ｃ）を、α−ＧＡＲＥおよびＦＡＯＤを用いて測定する例をあげて説明する。
まず、全血から遠心分離等の常法により血球画分を分離し、これを溶血させる。この溶血方法は特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法等が使用できる。この中でも、操作の簡便性等の理由から、界面活性剤を用いる方法が好ましい。
前記界面活性剤としては、例えば、商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００等のポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル類、商品名Ｔｗｅｅｎ−２０等のポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル類、商品名Ｂｒｉｊ３５等のポリ（オキシエチレン）アルキルエーテル類等が使用できる。前記界面活性剤による処理条件は、例えば、処理溶液中の血球濃度が１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．１〜１重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で、５秒〜１分程度攪拌すればよい。
つぎに、前記溶血試料に対し、本発明のα−ＧＡＲＥによる酵素処理を行う。これにより、前記溶血試料中の糖化タンパク質からα−ＧＡを遊離させる。前記α−ＧＡＲＥによる酵素処理は、例えば、緩衝液中で行われ、その処理条件は、使用するα−ＧＡＲＥの種類（例えば、由来等の違い）や、糖化タンパク質や糖化ペプチドの種類およびそれらの濃度等により適宜決定される。
例えば、測定対象物がＨｂＡ１ｃであり、スフィンゴモナス  パラポウシモビリス  ＫＤＫ１００４（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＫＤＫ１００４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０４１）由来のα−ＧＡＲＥを使用する場合、その処理条件は、例えば、反応液中のα−ＧＡＲＥ濃度０．０１Ｕ〜１ＫＵ／リットル、温度１５〜６０℃、反応時間３分〜６時間、ｐＨ５．０〜１０．０の範囲である。また、好ましくは、それぞれ、温度３０〜３７℃、反応時間５〜６０分、ｐＨ６〜８の範囲である。この場合、前記緩衝液としては、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、グッド緩衝液（ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等）等が使用できる。なお、本発明のその他の新菌体由来のα−ＧＡＲＥも同様にして使用できる。
つぎに、前記α−ＧＡＲＥ処理によって得られた分解物（α−ＧＡ）をＦＡＯＤで処理する。このＦＡＯＤが触媒する、α−ＧＡの分解反応を、下記式（１）に示す。
（式１）
Ｒ１−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２  ＋  Ｈ２Ｏ  ＋  Ｏ２
→  Ｒ１−ＣＯ−ＣＨＯ  ＋  ＮＨ２−Ｒ２  ＋  Ｈ２Ｏ２
前記式（１）に示すように、前記α−ＧＡＲＥ処理による分解物（α−ＧＡ  ：  Ｒ１−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２）をＦＡＯＤ処理することにより、糖（Ｒ１−ＣＯ−ＣＨＯ）、アミノ酸（ＮＨ２−Ｒ２）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が生成する。
前記式（１）において、Ｒ１は、糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を意味する。前記糖残基（Ｒ１）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ１）はグルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ１）は、例えば、  −［ＣＨ（ＯＨ）］ｎ−ＣＨ２ＯＨで示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
また、前記式（１）において、Ｒ２は、α−アミノ基が糖化されているアミノ酸残基であり、下記式（２）で示すことができる。下記式（２）において、Ｒ３はアミノ酸側鎖基を示す。
（式２）
−ＣＨＲ３−ＣＯ−ＯＨ
前記ＦＡＯＤは、前記反応を触媒するものであれば、特に制限されず、例えば、さらに他の触媒機能を有してもよい。このＦＡＯＤ処理は、前記α−ＧＡＲＥによる酵素処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましい。前記緩衝液は特に制限されず、例えば、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等が使用できる。
前記ＦＡＯＤの処理条件は、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度０．１〜１０ＫＵ／リットル、温度１５〜５０℃、反応時間１〜６０分、ｐＨ６〜９の範囲であり、好ましくは、それぞれ、ＦＡＯＤ濃度０．５〜２ＫＵ／リットル、温度３０〜３７℃、反応時間５〜２０分、ｐＨ７〜８の範囲である。
つぎに、前記ＦＡＯＤ処理で生じた過酸化水素を、前記ＰＯＤおよび酸化により発色する基質を用いて、酸化還元反応を利用して測定する。
前記酸化還元反応は、通常、緩衝液中で行われ、その条件は、反応液中の過酸化水素濃度等により適宜決定される。例えば、反応液中のＰＯＤ濃度１０Ｕ〜４００ＫＵ／リットル、反応温度１５〜４０℃、反応時間０．１〜５分、ｐＨ５〜１０であり、より好ましくは、ＰＯＤ濃度５０Ｕ〜２０ＫＵ／リットル、反応温度３０〜３７℃、反応時間０．１〜１分、ｐＨ５〜８である。また、前記緩衝液は、特に制限されず、前記ＦＡＯＤ処理と同様の緩衝液等が使用できる。
前記基質として前記発色性基質を用いた場合は、その発色（反応液の吸光度）を分光光度計で測定することにより、過酸化水素の濃度を測定でき、これから試料中の糖化タンパク質濃度を知ることができる。
この測定において、各処理工程は前述のように別々に行ってもよいが、場合によりいくつかの工程を同時に行ってもよいし、全てを同時に行ってもよい。例えば、試料にα−ＧＡＲＥとＦＡＯＤとを同時に添加して反応させることにより、α−ＧＡＲＥ処理工程とＦＡＯＤ処理工程とを同時に行うことができる。また、α−ＧＡＲＥ分解物に、ＦＡＯＤとＰＯＤと発色性基質とを同時に添加して反応させることにより、ＦＡＯＤ処理工程とＰＯＤを用いた発色工程とを同時に行うこともできる。この他に、前記界面活性剤による溶血処理工程と、α−ＧＡＲＥ処理工程とを同時に行うことも可能である。
（実施例）
（実施例１）
この実施例は、本発明のα−ＧＡＲＥを産生する新菌体の培養液上清と、α−ＧＡを有する糖化ペプチドとを反応させて、前記糖化ペプチドからα−ＧＡを遊離させた例である。なお、特に示さない限り、前記スクリーニング方法と同様にして、菌の培養、糖化ペプチドの分解およびＴＬＣ分析を行った。
まず、以下に示す本発明の各新規菌体を、それぞれ前記栄養液体培地（ｐＨ８．０）５ｍｌに植菌して、３０℃で４８時間振とう培養を行った。得られた各培養液を、遠心分離して菌体を除去し、その上清を粗酵素液とした。
（使用菌体）
スフィンゴバクテリウム  ミズタエ  ＫＤＫ１００３（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｚｕｔａｅ  ＫＤＫ１００３）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４８）
スフィンゴモナス  パラポウシモビリス  ＫＤＫ１００４（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＫＤＫ１００４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０４１）
コマモナス  アシドボランス  ＫＤＫ１００５（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ  ＫＤＫ１００５）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４６）
ムコー  サーシネロイデス  エフ  ジャンセッニ  ＫＤＫ３００４（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ ｆ．ｊａｎｓｓｅｎｉｉ  ＫＤＫ３００４）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４５）
ペニシリウム  ワクスマニ  ＫＤＫ３００５（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗａｋｓｍａｎｉｉ  ＫＤＫ３００５）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４４）
前記粗酵素液１００μｌと、前記各０．０１Ｍ糖化ペプチド（Ｆ２Ｐ、Ｆ３Ｐ）水溶液５０μｌとをそれぞれ混合し、３０℃で一晩反応させた後、これらの反応液をＴＬＣにより分析した。これらのＴＬＣ分析の結果を図１〜図５に示す。図１〜図５は、それぞれ、スフィンゴバクテリウム  ミズタエ  ＫＤＫ１００３（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｚｕｔａｅ  ＫＤＫ１００３）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４８）、スフィンゴモナス  パラポウシモビリス  ＫＤＫ１００４（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＫＤＫ１００４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０４１）、コマモナス  アシドボランス  ＫＤＫ１００５（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ  ＫＤＫ１００５）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４６）、ムコー  サーシネロイデス  エフ  ジャンセッニ  ＫＤＫ３００４（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ ｆ．ｊａｎｓｓｅｎｉｉ  ＫＤＫ３００４）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４５）、ペニシリウム  ワクスマニ  ＫＤＫ３００５（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗａｋｓｍａｎｉｉ  ＫＤＫ３００５）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４４）についてのＴＬＣのクロマトグラムである。図１〜図５において、レーンＮｏ．１はコントロール（ＦＶ）、レーンＮｏ．２はコントロール（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ）であり、図１および図２において、レーンＮｏ．３はＦ３Ｐ分解物、図３〜図５において、レーンＮｏ．３はＦ２Ｐ分解物、レーンＮｏ．４はＦ３Ｐ分解物である。また、各図中において矢印が示すスポットの移動度を、下記表１に示す。
0004613282.tif 000005
図１〜図５および前記表１に示すように、前記各粗酵素液により処理した糖化ペプチド分解物において、コントロールＦＶと同じ移動度でスポットが確認できた（矢印で示すスポット）。以上のことから、本発明のα−ＧＡＲＥにより、糖化ペプチドからα−ＧＡが遊離することがわかった。さらに、前記分解物のスポットが、Ｖａｌの移動度とは異なることから、α−ＧＡＲＥにより遊離されたＦＶから糖が乖離されていないこともわかった。また、図３〜図５に示すように、Ｆ２Ｐ分解物では、ＦＶとＨｉｓのスポットが見られた。Ｆ３Ｐ分解物において、ＦＶ以外の分解物（ジペプチド）のスポットが見られないのは、このＴＬＣの方法では検出されにくいためと推測できる。
（実施例２）
この実施例は、本発明の新規菌体由来の粗酵素により糖化ペプチドを処理し、α−ＧＡ（ＦＶ）の遊離を確認した例である。
スフィンゴモナス  パラポウシモビリス  ＫＤＫ１００４（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＫＤＫ１００４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０４１）を、前述のＨｂ培地（ｐＨ６．０）で２８℃、５日間、往復振とう培養した。そして、培養液を遠心分離（１２，０００Ｇ、１５分間、４℃）し、得られた上清を粗酵素液とした。
０．０１Ｍ  Ｆ４Ｐ水溶液５０μｌに、前記粗酵素液１００μｌおよび０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）５０μｌを混合し、３７℃で一晩反応させた。この反応液を、限外ろ過膜（分画分子量サイズ５ｋＤａ：商品名ウルトラフリーＭＣフィルター：ミリポア社製、以下同じ）に供してタンパク質等の高分子量物質を除去し、得られた溶液を凍結乾燥した。
前記各凍結乾燥品を下記溶離液Ａ２０μｌに溶解し、この溶液を下記条件で逆相クロマトグラフィーに供し、分析開始から１５秒ごと（２５０μｌ／１フラクション）に分画した。また、コントロールとしてＦＶを同条件で溶出させ、その溶出時間も確認した。
（逆相クロマトグラフィー）
カラム  ；  商品名  Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ（ジーエルサイエンス社製）
サイズ  ；  １００ｍｍ×４．６ｍｍ
ループ  ；  １０００μｌ
溶離液Ａ  ；  トリフルオロ酢酸：蒸留水＝０．１：１００（体積比）
溶離液Ｂ  ；  トリフルオロ酢酸：蒸留水：アセトニトリル
＝０．１：８０：２０（体積比）
グラジェント条件  ；  ０分〜２５分  ：  ０−２０体積％溶離液Ｂ
２５分以降    ：  ２０体積％溶離液Ｂ
流速  ；  １ｍｌ／分
カラム温度  ；  ３７℃
検出波長  ；  ２１０ｎｍ、２３０ｎｍ
そして、前記逆相クロマトグラフィーにより得られた各分離フラクションについて、以下に示す方法によりＦＶの検出を行った。
（ＦＶの検出方法）
各分離フラクション溶液２０μｌに、１０μｍｏｌ／リットル過酸化水素水溶液２０μｌ添加した後、下記酸化還元反応液Ａ  ６０μｌを添加して３７℃で１５分間反応させた。なお、前記反応は、生化学自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製、以下同じ）により行い、その検出は、主波長６９４ｎｍおよび副波長８８４ｎｍにおける前記反応液の吸光度の測定により行った。
（酸化還元反応液Ａの組成）
商品名  ＤＡ６４                              ３３μｍｏｌ／リットル
（和光純薬工業社製、以下同じ）
ＰＯＤ（ＴｙｐｅＩＩＩ：東洋紡績社製、以下同じ）  ３３ＫＵ／リットル
ＦＡＯＤ（旭化成社製）                          ３．３ＫＵ／リットル
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）          ０．１７ｍｏｌ／リットル
この結果、逆相クロマトグラフィーにおける溶出時間５〜６分の分離フラクションにおいて、発色が確認された。この溶出時間は、コントロールＦＶの溶出時間と一致し、Ｆ４Ｐの分解物にＦＶが存在することが示唆された。
（実施例３）
この実施例は、α−ＧＡＲＥ濃度を変化させて、各濃度におけるα−ＧＡＲＥ活性を確認した例である。
（１）部分精製酵素の調製
スフィンゴモナス  パラポウシモビリス  ＫＤＫ１００４（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＫＤＫ１００４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０４１）を前記実施例２と同様にしてそれぞれ培養し、その培養液から上清を回収して粗酵素液とした。この粗酵素液５０ｍｌを、前記限外ろ過膜（分画分子量サイズ５ｋＤａ）を用いて５ｍｌに濃縮した後、以下に示す条件のゲルクロマトグラフィーに供して部分精製した。
（ゲルカラムクロマトグラフィー）
カラム  ：  商品名  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ
（ファルマシア社製）
カラムサイズ  ：  内径２６０ｍｍ、長さ６００ｍｍ
流速  ：  ５．２ｍｌ／分
検出波長  ：  ２８０ｎｍ、２３０ｎｍ
溶離液  ：  ２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
１フラクション  ：  ７ｍｌ
（２）α−ＧＡＲＥ活性の測定
（分解方法）
１０ｍＭ  Ｆ３Ｐ水溶液５０μｌに対して、所定量（２５、５０、７５、１００、１２５μｌ）の前記部分精製α−ＧＡＲＥおよび１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して３７℃で一晩反応させた。なお、前記反応溶液は全量２００μｌとし、前記緩衝液の最終濃度が５０ｍＭとなるようにした。
（測定方法）
前記反応溶液を蒸留水で３倍希釈（体積）し、この希釈液２５μｌに、１０μＭ過酸化水素溶液１５μｌと下記酸化還元反応液Ｂ７０ｍｌとをこの順序で添加し、３７℃で１５分間反応させた。そして、実施例２と同様にして吸光度を測定した。そして、α−ＧＡＲＥ無添加の場合をブランクとし、５分間当たりの吸光度増加量をα−ＧＡＲＥ活性として求めた。この結果を図６に示す。図６は、スフィンゴモナス  パラポウシモビリス  ＫＤＫ１００４（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＫＤＫ１００４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０４１）由来α−ＧＡＲＥの酵素量と発色量（吸光度）との関係を表すグラフである。
（酸化還元反応液Ｂの組成）
ＤＡ６４                                  ３１μｍｏｌ／リットル
ＰＯＤ                                        ３１ＫＵ／リットル
ＦＡＯＤ                                    ０．８ＫＵ／リットル
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）      ０．１６ｍｏｌ／リットル
図６に示すように、前記α−ＧＡＲＥは、酵素量約２０〜１００μｌの範囲で酵素量に依存して活性が増加した。
（実施例４）
この実施例は、本発明のα−ＧＡＲＥについて熱安定性を確認した例である。
前記実施例３において調製した、スフィンゴモナス  パラポウシモビリス  ＫＤＫ１００４（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＫＤＫ１００４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０４１）由来α−ＧＡＲＥの部分精製酵素を、予め、各温度（３０、３７、５０、６０、７０℃）で２０分間インキュベートした。そして、実施例３と同様のＦ３Ｐ水溶液５０μｌに、前記熱処理後の部分精製酵素１００μｌおよび５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）５０μｌを混合して、３７℃で１８時間反応させた。この反応溶液２０μｌについて前記実施例３と同様にしてＦＡＯＤを用いた酸化還元反応を行い、吸光度を測定した。そして、５分間当たりの吸光度の増加量をα−ＧＡＲＥ活性とし、未処理のα−ＧＡＲＥの活性を１００％とした場合の残存活性（％）を求めた。この結果を図７に示す。図７は、スフィンゴモナス  パラポウシモビリス  ＫＤＫ１００４（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＫＤＫ１００４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０４１）由来α−ＧＡＲＥの熱安定性を示すグラフである。
図７に示すように、前記α−ＧＡＲＥは、３０〜５０℃の熱処理によって１００％の残存活性を示したが、７０℃での熱処理によって、完全に失活した。
（実施例５）
この実施例は、本発明のα−ＧＡＲＥについて至適温度を確認した例である。
前記実施例３において調製したスフィンゴモナス  パラポウシモビリス  ＫＤＫ１００４（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＫＤＫ１００４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０４１）由来α−ＧＡＲＥの部分精製酵素１００μｌおよび２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０μｌを、実施例３と同様のＦ３Ｐ水溶液５０μｌに混合し、各温度（１０、３０、３７、５０、６０、７０℃）で８時間反応させた。この反応溶液を蒸留水で３倍希釈（体積）した希釈液２５μｌについて、前記実施例３と同様にしてＦＡＯＤを用いた酸化還元反応を行い、吸光度を測定した。そして、５分間当たりの吸光度の増加量をα−ＧＡＲＥ活性とした。この結果を図８に示す。図８は、スフィンゴモナス  パラポウシモビリス  ＫＤＫ１００４（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＫＤＫ１００４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０４１）由来α−ＧＡＲＥの至適温度を示すグラフである。
図示のように、前記α−ＧＡＲＥの至適温度は、約３７℃付近であることがわかった。
（実施例７）
この実施例は、本発明のα−ＧＡＲＥの分子量を確認した例である。
前記実施例３と同様にして、スフィンゴモナス  パラポウシモビリス  ＫＤＫ１００４（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＫＤＫ１００４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０４１）の培養液上清を、同様の条件のゲルクロマトグラフィーに供して分離を行った。そして、各フラクションについて前記実施例３と同様にしてＦＡＯＤを用いた酸化還元反応を行い、α−ＧＡＲＥ活性を測定した。他方、分子量マーカー（商品名  ＭＷマーカー（ＨＰＬＣ）：オリエンタル酵母社製）を同様の条件で前記ゲルカラムクロマトグラフィーに供した。その結果から得られた分子量の検量線と、α−ＧＡＲＥの溶出結果とから、スフィンゴモナス  パラポウシモビリス  ＫＤＫ１００４（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＫＤＫ１００４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０４１）由来α−ＧＡＲＥの分子量は、約４０，０００〜６０，０００と推定される。
産業上の利用可能性
このように本発明の新規酵素であるα−ＧＡＲＥは、糖化タンパク質等から、α−アミノ基が糖化されたアミノ酸残基を遊離させることができる。したがって、例えば、前記α−ＧＡＲＥを、ＦＡＯＤを用いた糖化タンパク質等の測定方法に使用すれば、糖尿病診断の指標となるＨｂＡ１ｃの測定を正確かつ簡便に行うことができるため、ＨｂＡ１ｃの測定を臨床検査等において実用化することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の一実施例において、スフィンゴバクテリウム属の菌体の培養液上清を用いて、糖化ペプチドを分解し、その分解物をＴＬＣにより分析したクロマトグラムである。
図２は、前記一実施例において、スフィンゴモナス属の菌体の培養液上清を用いて、糖化ペプチドを分解し、その分解物をＴＬＣにより分析したその他のクロマトグラムである。
図３は、本発明のその他の実施例において、コマモナス属の菌体の培養液上清を用いて、糖化ペプチドを分解し、その分解物をＴＬＣにより分析したクロマトグラムである。
図４は、前記一実施例において、ムコー属の菌体の培養液上清を用いて、糖化ペプチドを分解し、その分解物をＴＬＣにより分析したその他のクロマトグラムである。
図５は、本発明のその他の実施例において、ペニシリウム属の菌体の培養液上清を用いて、糖化ペプチドを分解し、その分解物をＴＬＣにより分析したクロマトグラムである。
図６は、本発明のさらにその他の実施例において、スフィンゴモナス属の菌体由来のα−ＧＡＲＥ量と吸光度との関係を表すグラフである。
図７は、本発明のさらにその他の実施例において、スフィンゴモナス属の菌体由来のα−ＧＡＲＥの熱安定性を表すグラフである。
図８は、本発明のさらにその他の実施例において、スフィンゴモナス属の菌体由来のα−ＧＡＲＥの至適温度を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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