(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離精製した活性化血液凝固第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）及び血液凝固第Ｘ因子（ＦＸ）を単一容器内に混合して含有する溶液状止血用組成物に、さらにアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）を加えたことを特徴とする、薬剤学的に安定な溶液状止血用組成物。
【請求項２】
含有されるＦＶＩＩａ、ＦＸ及びＡＴ−ＩＩＩの濃度が各々１〜２０μＭ、５〜４００μＭ及び０．１〜５．０国際単位／ｍＬである、請求項１記載の溶液状止血用組成物。
【請求項３】
ｐＨが５．０を超える範囲である、請求項１または２記載の溶液状止血用組成物。
【請求項４】
ｐＨが５．０を超え、７．０未満の酸性領域にある、請求項３記載の溶液状止血用組成物。
【請求項５】
ｐＨが５．５以上、６．５以下の酸性領域にある、請求項３記載の溶液状止血用組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の溶液状止血用組成物を凍結乾燥してなる凍結乾燥止血用製剤。
【請求項７】
ＦＶＩＩａ及びＦＸを単一容器内に混合して含有する溶液状止血用組成物にＡＴ−ＩＩＩを加えることを特徴とする当該溶液状止血用組成物の安定化方法。
【請求項８】
該組成物のｐＨが５．０を超える範囲である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該組成物のｐＨが５．０を超え、７．０未満の酸性領域にある、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該組成物のｐＨが５．５以上、６．５以下の酸性領域にある、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は医療用医薬品の分野に関し、血漿蛋白質を含有する新たな止血用組成物及び製剤に関する。詳細には、活性化血液凝固第ＶＩＩ因子（以下、「ＦＶＩＩａ」と称することがある）及び血液凝固第Ｘ因子（以下、「ＦＸ」と称することがある）を単一容器内に混合して含有し、これにさらにアンチトロンビンＩＩＩ（以下、「ＡＴ−ＩＩＩ」と称することがある）を加えたことを特徴とする治療用薬剤に関する。さらに本発明は、ＦＶＩＩａ及びＦＸを同一容器内に混合して含有する溶液状止血用組成物にＡＴ−ＩＩＩを加えることを特徴とする当該溶液状止血用組成物の安定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  血友病インヒビター患者の止血管理には、活性型プロトロンビン複合体製剤（ＡＰＣＣ製剤）や遺伝子組換え活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤（ｒＦＶＩＩａ製剤）等が用いられている。しかしながら、前者は安全性において、後者は有効性において満足のいくものとはいえず、本発明者等はこれらの欠点を補った止血剤として、ＦＶＩＩａとＦＸを複合した医薬組成物の有用性を示した（特許文献１参照）。【０００３】  これら止血管理に用いる蛋白質を主要成分とする医薬組成物は、静脈内投与が最適であり、使用に適した形態でアンプル、注射器やバイアル等の容器に封入した剤型として供給される。より一般的には、蛋白質を凍結乾燥物として含有する容器と、その凍結乾燥物の溶解に適した溶液を含有する容器とからなるセットが用いられている。血液凝固因子に関連した蛋白質濃縮物は、血漿由来もしくは遺伝子組換え技術を用いて調製された薬剤が製剤化されているが、それらの殆どが上記のような凍結乾燥粉末と溶解液のセットとして供給されている。【０００４】  ＦＶＩＩａとＦＸを複合した製剤の剤型を考案する場合、２つの方策がある。１つはＦＶＩＩａとＦＸとを別々の容器に入れて用意する方策であり、もう１つはＦＶＩＩａとＦＸとを混合して単一の容器に入れて用意する方策である。後者は混合した溶液の凍結乾燥粉末と溶解液からなるセットとなり、１セット計２個の容器で足りるのに対し、前者はそれぞれの因子につき凍結乾燥粉末と溶解液のセットとなり、２セット計４個の容器が必要となる。加えて、前者は溶解液を凍結乾燥粉末の容器に移注する装置や操作を余分に必要とするため、利便性の観点からも好ましくない。このようにＦＶＩＩａとＦＸとを混合して調製し、単一の容器に封入することができれば、薬剤本来の薬力学的な有用性だけでなく、さらに製剤学的な利便性をも兼ね備えた製剤となり得る。【０００５】  図１に示すようにＦＶＩＩａとＦＸは酵素と基質の関係にあり、生理的条件下でＦＶＩＩａは、リン脂質やＣａ２＋存在下に、血管傷害部位に現れる組織因子と複合体を形成してＦＸを加水分解する。その結果生じたＦＸａは引き続き生じる酵素反応を惹起し、最終的には、不溶性のフィブリンを形成することで止血に至る。しかしながら、このＦＸａは、血管傷害部位のような出血局所にて産生される場合には、止血効果を示す有効な因子である一方で、全身循環で過剰に存在する場合には、全身的な過凝固を誘引することが報告されているだけでなく（非特許文献１参照）、血管内皮細胞や糸球体間質細胞の活性化を介した炎症の惹起にも寄与している（非特許文献２及び非特許文献３参照）という好ましくない一面が示唆されている。【０００６】  ＦＶＩＩａによるＦＸの加水分解は、両者が非生理的な高濃度で存在する場合にはＦＸａの産生はもはや制御することができず、その結果、大量のＦＸａ産生を生じる。また、それらにより生じるＦＸａは、ＦＶＩＩａを基質として分解不活化してしまうために（非特許文献４参照）、安定な溶液として存在することは困難である。このように、不安定な状態のままで製剤化することもできないし、ましてやそのような溶液を患者へ投与することはできない。【０００７】  これまで述べてきたように、精製分取された酵素と基質を混合して単一容器内に封入するような概念の既存製剤はなかったため、本発明者等はこれらの課題を克服する技術の１つを示した（特許文献２参照）。当該発明はＦＶＩＩａ及びＦＸの混合液状組成物並びに当該組成物の凍結乾燥製剤に関するものであり、ＦＶＩＩａをその至適ｐＨであるｐＨ６．５〜１０．０を外れた酸性領域下（ｐＨ５．０〜６．５）においてＦＸと混合することを特徴とするものである。すなわち、ＦＶＩＩａ自体の加水分解活性を制御することによってＦＸａの産生を低下せしめようとするものである。【０００８】
【特許文献１】特開２００１−１８１２０４号公報
【特許文献２】国際公開第０３／００６０５４号パンフレット
【非特許文献１】ガイルズ（Ｇｉｌｅｓ，Ａ．Ｒ．）ら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１９８８，６９：ｐ．４９１−４９７
【非特許文献２】カメラー（Ｃａｍｅｒｅｒ  Ｅ．）ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，２０００，９７：ｐ．５２５５−５２６０
【非特許文献３】モンノ（Ｍｏｎｎｏ  Ｒ．）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，２００１，１２：ｐ．８９１−８９９
【非特許文献４】バジャジ（Ｂａｊａｊ，Ｓ．Ｐ．）ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７３，２４８：ｐ．７７２９−７７４１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  一方、血友病という患者の特殊性から、しばしば血液凝固因子製剤の投与は患者自らもしくはその保護者による注射という方法が取られる。このような使用時の態様に配慮した製剤化を考慮すると、製剤の投与容量は少ないほうが好ましく、すなわち酵素ＦＶＩＩａ及び基質ＦＸを極めて高濃度にすることが望まれる。さらに、そのような場合であってもＦＸａ量の増加を極力抑制することが必要である。その意味においては、先述した国際公開第０３／００６０５４号パンフレットに開示された、ＦＶＩＩａ及びＦＸの混合溶液を酸性領域下（ｐＨ５．０〜６．５）におくことによりＦＸａの産生を抑制する方法には限界があり、極めて少量のＦＸａ量を高感度に測定すると、それら酸性領域の緩衝液においてさえも僅かではあるが経時的なＦＸａ量の増大が認められる。【００１０】  このように、極めて高濃度のＦＶＩＩａ及びＦＸからなる混合溶液中に存在し、増加するＦＸａ量を、薬剤の使用に際して必要な一定の時間、一定の濃度に制御する方法はなく、従来、この課題に対して克服する技術がなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  そこで、本発明者らは酵素であるＦＶＩＩａと基質であるＦＸとを極めて高濃度に混合して単一容器内へ封入し、さらに極めて安定な状態を保持し得る剤型を開発すべく鋭意研究した結果、驚くべきことに、ＦＶＩＩａとＦＸとの極めて高濃度の混合物にアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）を加えることによって産生されたＦＸａが特異的に阻害される結果、従来の活性型血液凝固因子製剤では試みられることのなかった酵素・基質の極めて安定な混合組成物及び当該混合組成物からなる止血用製剤が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】  すなわち、本発明は、ＦＶＩＩａ及びＦＸを単一容器内にて混合した溶液状止血用組成物にさらにＡＴ−ＩＩＩを混合してなる安定化された溶液状止血用組成物、及び当該組成物を凍結乾燥して得られる止血用の治療用薬剤を提供するものである。本発明は、ＦＶＩＩａとＦＸとの混合溶液状止血用組成物中に所要量のＡＴ−ＩＩＩを加えることにより、産生されたＦＸａを特異的に阻害させることによって、遊離ＦＸａ量を制御するものである。
【発明の効果】
【００１３】  本発明により、安全性及び有効性に優れ、かつ安定性と利便性が向上した新規な止血用製剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】内因系凝固と外因系凝固に関する二つの経路の血液凝固カスケードを示す図である。
【００１５】
【図２】ＦＶＩＩａ及びＦＸを混合してなる溶液状組成物に対し、所定のｐＨ条件下におけるＦＸａの生成状況を示す図である。
【００１６】
【図３】ＦＶＩＩａ及びＦＸを混合してなる溶液状組成物に対し、所定のｐＨ条件下にＡＴ−ＩＩＩを加えた場合の遊離ＦＸａの生成状況を示す図である。
【００１７】
【図４】ＦＶＩＩａ及びＦＸを混合してなる溶液状組成物に対し、異なる濃度のＡＴ−ＩＩＩを加えた場合の遊離ＦＸａの生成状況を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】  本発明に使用されるＦＶＩＩａ、ＦＸ及びＡＴ−ＩＩＩを製造する方法は特に限定されることはなく、例えばヒト血液より分離する方法あるいは遺伝子組換え技術により作製する方法などによって製造することができる。【００１９】  血液由来のＦＶＩＩａの製法としては、例えば、特開平３−１５５７９７号公報、特開平１０−０５９８６６号公報及び特開平１０−０５９８６７号公報に示される方法がある。また、新鮮凍結ヒト血漿を冷融解・遠心処理してクリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿から、陰イオン交換クロマトグラフィーにより粗精製後、抗ＦＶＩＩモノクローナル抗体固定化カラムを用いてのアフィニティークロマトグラフィーによってＦＶＩＩを精製した後、他の血漿蛋白質、例えば活性化血液凝固第ＸＩＩ因子、ＦＸａなどによりＦＶＩＩをＦＶＩＩａに活性化する方法がある。なお得られるＦＶＩＩａは、プロトロンビン、トロンビン、ＦＩＸ及びＦＩＸａを可能な限り伴なわない方が好ましい。【００２０】  血液由来のＦＸの製法としては、例えば、新鮮凍結ヒト血漿を冷融解・遠心処理してクリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿から、陰イオン交換クロマトグラフィーにより粗精製後、抗ＦＸモノクローナル抗体固定化カラムを用いてのアフィニティークロマトグラフィーによってＦＸを精製する方法がある。前記と同様、得られるＦＸは、プロトロンビン、トロンビン、ＦＩＸ及びＦＩＸａを可能な限り伴なわない方が好ましい。【００２１】  血液由来のＡＴ−ＩＩＩの製法としては、例えば、新鮮凍結ヒト血漿を冷融解・遠心処理してクリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿から、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより粗精製後、沈殿分画により製する方法がある。【００２２】  ＡＴ−ＩＩＩを添加する際の濃度は０．１〜５．０国際単位／ｍＬの範囲であることが好適であり、これより低濃度では十分なＦＸａ阻害効果を得ることができず、遊離のＦＸａ量は増加する。また、これより高濃度ではＦＸａ阻害効果を得るという目的に対し過剰量過ぎる。その意味で添加量は通常０．２〜２．０国際単位／ｍＬ、好ましくは０．５〜１．０国際単位／ｍＬが用いられ、その範囲ではＦＶＩＩａ及びＦＸ各々の成分の活性低下や遊離ＦＸａ量の増加は全く問題にならない。【００２３】  ＡＴ−ＩＩＩを添加する際の緩衝液のｐＨは、５．０を超える範囲、好ましくは５．０を超え、７．０未満の酸性領域、さらに好ましくは５．５以上、６．５以下の酸性領域であればよい。ｐＨ５．０以下の酸性領域では酵素であるＦＸａとその阻害剤であるＡＴＩＩＩの反応が起こらなくなり、ＦＸａ阻害効果を得ることができない。一方、ｐＨ７．０以上のｐＨ領域でもＡＴＩＩＩによる一応のＦＸａ阻害効果は得られるが、ＦＸａの増加水準が高いため実用的ではない。【００２４】  本発明のＡＴ−ＩＩＩを添加する溶液状組成物に使用される成分組成の、好適な含量は、ＦＶＩＩａ及びＦＸの濃度が各々１〜２０μＭ、５〜４００μＭであり、さらに、好ましい態様として、０．００１〜１重量％の非イオン性界面活性剤並びに０．０１重量％以上のアルブミン、糖類及びアミノ酸からなる群から選ばれた１種または２種以上の化合物の共存により、組成物の保存安定性のみならず、当該液状組成物を凍結乾燥した場合はその再構成時の溶解を容易にする。【００２５】  当該組成物もしくは止血用製剤の投与対象は、様々な止血障害を有し出血傾向にある患者であれば特に限定されることはない。【００２６】  以下、実施例に沿って本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００２７】ＡＴ−ＩＩＩ不在下での遊離ＦＸａの生成
ＦＶＩＩａ／ＦＸ混合物の緩衝溶液中の安定性を調べる目的で、所定のｐＨを有する各々の緩衝液（ＣａＣｌ２非存在下、クエン酸緩衝液：１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％グリシン、２％アルブミン、５０ｐｐｍツイーン８０）下に、ＦＶＩＩａ及びＦＸを終濃度０．６ｍｇ／ｍＬ（約１２μＭ）及び６．０ｍｇ／ｍＬ（約１００μＭ）になるよう混合し、室温で放置した。各放置時間後のサンプル中のＦＶＩＩａ活性、ＦＸ活性及びＦＸａ活性はそれぞれの因子が影響することのない系を用いて測定した。なお、ここで用いたＦＶＩＩａは、特開平３−１５５７９７号公報に記載の方法による血液由来の標品である。また、ここで用いたＦＸは、新鮮凍結ヒト血漿を冷融解・遠心処理してクリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿から、陰イオン交換クロマトグラフィーにより粗精製後、抗ＦＸモノクローナル抗体固定化カラムを用いてのアフィニティークロマトグラフィーによって製された血液由来の標品であった。【００２８】  その結果、ＦＶＩＩａ及びＦＸの両活性ともに、緩衝溶液中どのｐＨにおいても１８時間のインキュベーションにおいて９０％以上の活性を保持していた。ＦＸａ含量は、特異的な合成基質（Ｓ２７６５）水解活性から算出し、ＦＸとのモル比として図２に示した。その結果、図２に示すように高感度の測定系を用いてＦＸａ量を定量することにより、ｐＨ６．０及びｐＨ５．５の溶液中においても僅かではあるがＦＸａ量の増加が認められた。
【実施例２】
【００２９】ＡＴ−ＩＩＩ添加によるＦＸａ阻害効果
ＦＶＩＩａ／ＦＸ混合物の緩衝溶液中の安定性を高める目的で、実施例１に示した各ｐＨを有する各々の緩衝液下に、ＦＶＩＩａおよびＦＸを終濃度０．６ｍｇ／ｍＬ及び６．０ｍｇ／ｍＬになるよう混合し、さらにＡＴ−ＩＩＩを終濃度１．０国際単位／ｍＬになるよう添加し、室温で放置した。各放置時間後のサンプル中のＦＶＩＩａ活性、ＦＸ活性及びＦＸａ活性はそれぞれの因子が影響することのない系を用いて測定した。なお、ここで用いたＦＶＩＩａ、ＦＸは実施例１と同じく調製した。また、ここで用いたＡＴ−ＩＩＩは、新鮮凍結ヒト血漿を冷融解・遠心処理してクリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿から、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより粗精製後、沈殿分画により製された血液由来の標品であった。【００３０】  その結果、ＦＶＩＩａ及びＦＸの両活性ともに、緩衝溶液中どのｐＨにおいても１８時間のインキュベーションにおいて９０％以上の活性を保持していた。すなわち、活性化された凝固因子であるＦＶＩＩａはＡＴ−ＩＩＩ  １．０国際単位／ｍＬ存在下においても何ら影響されなかった。ＦＸａ含量は、特異的な合成基質（Ｓ２７６５）水解活性から算出し、ＦＸとのモル比として図３に示した。図３から明らかなように、ＡＴ−ＩＩＩ非存在下では著しいＦＸａ量の増加を示すｐＨ６．５の溶液中において、ＡＴ−ＩＩＩ存在下ではＦＸａ量の増加が顕著に抑制された。さらに、ＡＴ−ＩＩＩ非存在下では僅かながらもＦＸａ量の増加を示すｐＨ６．０及びｐＨ５．５の溶液中において、ＡＴ−ＩＩＩ存在下ではＦＸａ量の増加は殆ど認められなかった。一方、ｐＨ５．０の緩衝液では、ＡＴ−ＩＩＩによる当該阻害効果は認められなかった（データは示していない）。
【実施例３】
【００３１】各種濃度のＡＴ−ＩＩＩ添加によるＦＸａ阻害効果
ＦＶＩＩａ／ＦＸ混合物の緩衝溶液中の安定性を高めるために要するＡＴ−ＩＩＩの濃度を調べる目的で、実施例１に示した緩衝液組成のｐＨ５．７条件下に、ＦＶＩＩａおよびＦＸを終濃度０．６ｍｇ／ｍＬ及び６．０ｍｇ／ｍＬになるよう混合し、さらにＡＴ−ＩＩＩを終濃度０、０．１、０．２、０．５、１．０国際単位／ｍＬになるよう添加し、室温で放置した。各放置時間後のサンプル中のＦＶＩＩａ活性、ＦＸ活性及びＦＸａ活性については実施例１と同様の方法にて測定した。なお、ここで用いたＦＶＩＩａ、ＦＸは実施例１と同じく調製した。また、ここで用いたＡＴ−ＩＩＩは、実施例２と同じく調製した。【００３２】  その結果、ＦＶＩＩａ及びＦＸの両活性ともに、緩衝溶液中どのＡＴ−ＩＩＩ濃度においても１８時間のインキュベーションにおいて９０％以上の活性を保持していた。ＦＸａ含量は、特異的な合成基質（Ｓ２７６５）水解活性から算出し、ＦＸとのモル比として図４に示した。図４から明らかなように、用いたどの濃度のＡＴ−ＩＩＩ存在下においてもＦＸａ量の増加は殆ど認められなかった。また、そのときのＦＸａ量はＡＴ−ＩＩＩ濃度依存的に低下しており、その低下効果は０．５国際単位／ｍＬ以上ではほぼプラトーであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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