(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
超抗原と特異的にかつ直接結合するＣＤ２８分子内の超抗原結合部位であって、
配列番号３で示されるアミノ酸配列を含んでなる、超抗原結合部位。
【請求項２】
該部位での該ＣＤ２８分子と超抗原との直接結合がＢ７−２リガンドとＣＤ２８との結合を促進し、かつ、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ遺伝子発現の誘導により定義されているＴｈ１リンパ球の活性化に必要不可欠である、請求項１に記載のＣＤ２８内の超抗原結合部位。
【請求項３】
該部位での該ＣＤ２８分子と超抗原との直接結合がＢ７−２リガンドとＣＤ２８との結合を促進し、かつ、Ｂ７−２リガンドとＣＤ２８との該結合がＩＬ−４および／またはＩＬ−１０の誘導により定義されているＴｈ２リンパ球の活性化に必要不可欠ではない、請求項２に記載のＣＤ２８内の超抗原結合部位。
【請求項４】
発熱性外毒素の空間的に保存されているドメイン（このドメインはＭＨＣクラスII分子およびＴＣＲのいずれとの結合にも関係していない）と特異的にかつ直接結合する、請求項３に記載のＣＤ２８内の超抗原結合部位。
【請求項５】
該発熱性外毒素の空間的に保存されている該ドメインがその中にＳＥＢのドメイン番号に基づき、β鎖７内から始まり、β鎖７を、短いβ鎖８を介して、α−ヘリックス４へと連結し、α−ヘリックス４内で終わる中央ターンを形成する、請求項４に記載のＣＤ２８内の超抗原結合部位。
【請求項６】
超抗原関連疾患の治療のための医薬組成物の製造における、超抗原と請求項１に記載のＣＤ２８内の超抗原結合部位との特異的かつ直接的結合を阻害する、抗ＣＤ２８分子抗体（ＭＡＢ３４２）、Ｂ７−２分子の細胞外１〜２３９アミノ酸ドメインを含んでなる可溶性組換え型Ｂ７−２（ｓＢ７−２）ペプチド、および、配列番号３、配列番号４または配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むペプチドからなる群から選択される物質の使用。
【請求項７】
超抗原関連疾患の治療のための医薬組成物の製造における、超抗原と請求項１に記載のＣＤ２８内の超抗原結合部位との特異的かつ直接的結合を阻害する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の超抗原結合部位を含んでなる配列番号３、配列番号４、もしくは配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むペプチドの使用。
【請求項８】
超抗原関連疾患の治療のための医薬組成物の製造における、超抗原と請求項１に記載のＣＤ２８内の超抗原結合部位との特異的かつ直接的結合を阻害する、抗ＣＤ２８分子抗体としてのＭＡＢ３４２の使用。
【請求項９】
超抗原関連疾患の治療のための医薬組成物の製造における、超抗原と請求項１に記載のＣＤ２８内の超抗原結合部位との特異的かつ直接的結合を阻害する、可溶性Ｂ７−２分子の使用。
【請求項１０】
配列番号３、配列番号４および配列番号５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含んでなる、単離および精製されたペプチド。
【請求項１１】
ｐＴＡと呼ばれ、かつ、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
ＣＤ２８分子と該発熱性外毒素との直接相互作用を阻害する、請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１３】
Ｔリンパ球の毒素媒介性活性化のアンタゴニストであり、かつ、ある発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックから防御する、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
超抗原と請求項１に記載のＣＤ２８内の超抗原結合部位との直接相互作用を阻害する組成物であって、有効成分として、配列番号３、配列番号４および配列番号５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列またはそれらの混合物を含んでなる単離および精製されたペプチドを、該相互作用を阻害するのに有効な量で含んでなる、組成物。
【請求項１５】
Ｔリンパ球の発熱性外毒素媒介性活性化を阻害し、ある発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックから防御する組成物であって、有効成分として、配列番号３、配列番号４および配列番号５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列またはそれらの混合物を含んでなる単離および精製されたペプチドを、ＩＬ−２、ＩＮＦ−γおよび／またはＴＮＦ−β遺伝子によりコードされるＲＮＡの外毒素誘導性発現を阻害するのに有効な量で含んでなる、組成物。
【請求項１６】
単離および精製された該ペプチドが配列番号３、配列番号４および配列番号５のいずれか１つまたはその組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり、また、所望により、医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤さらに含んでなってもよい、請求項１４および１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
該ペプチドがｐＴＡと呼ばれ、かつ、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
哺乳類被験体における超抗原関連疾患の治療のための医薬組成物であって、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の単離および精製されたペプチドを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１４および１８のいずれか一項に記載の組成物の製造における、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項２０】
ＣＤ２８分子と特異的に結合し、Ｔｈ１リンパ球の発熱性外毒素媒介性活性化を拮抗し、また、所望により、ある発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を誘発し得る試験物質に関してスクリーニングする方法であって、
ａ．ＣＤ２８分子と結合する候補アンタゴニスト物質を得る工程、
ｂ．工程（ａ）で得られたＣＤ２８結合物質からＣＤ２８分子と該超抗原との直接相互作用を阻害する物質を選択する工程、および
ｃ．工程（ｂ）で得られた物質のＴｈ１リンパ球の超抗原媒介性活性化に対する拮抗効果を決定する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２１】
該候補アンタゴニスト物質が
ａ．ＣＤ２８分子またはその断片を含む混合物を準備する工程、
ｂ．該混合物を該結合に好適な条件下にて該試験物質と接触させる工程、および
ｃ．評価項目指標に対する試験物質の効果を判定する工程（ここで、該評価項目についての変化がＣＤ２８分子と該試験物質とが結合していることを示す）
により得られる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
評価項目指標が視覚的に検出可能なシグナルをもたらす抗ＣＤ２８抗体とＣＤ２８分子との結合である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＣＤ２８内の超抗原結合部位を介してＣＤ２８分子と特異的に結合し、それによりＣＤ２８分子と該超抗原との相互作用を阻止する該候補アンタゴニスト物質の、所望により、請求項２１に記載の方法により得てもよいＣＤ２８が結合する物質からの選択が
ａ．ＣＤ２８分子またはその断片を含む混合物を準備する工程、
ｂ．該混合物を、ＣＤ２８内の超抗原結合部位を介するＣＤ２８分子との特異的相互作用に好適な条件下にて該試験物質と接触させる工程、および
ｃ．評価項目指標に対する試験物質の効果を判定する工程（ここで、該評価項目についての変化が該超抗原結合部位を介してＣＤ２８分子と試験物質とが結合していることを示す）
により行われる、請求項２０に記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
該混合物が
ａ．ＣＤ２８分子またはその断片、
ｂ．ＣＤ２８分子と請求項１〜５のいずれか一項に記載のＣＤ２８内の超抗原結合部位にて特異的に結合する相互作用分子、および
ｃ．所望により、該相互作用分子とＣＤ２８分子との相互作用に、および該相互作用分子とＣＤ２８分子との相互作用に関する評価項目指標の検出に好適な条件を提供する溶液、バッファーおよび化合物
を含んでなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＣＤ２８の該断片が配列番号３で示されるアミノ酸配列を含んでなるＣＤ２８分子内の超抗原結合部位である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
該相互作用分子が抗ＣＤ２８モノクローナル抗体、配列番号１で示されるアンタゴニストペプチドｐ１２ 、配列番号２で示されるアンタゴニストペプチドｐ１４および発熱性外毒素またはその機能的断片のいずれか１つである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
評価項目指標が視覚的に検出可能なシグナルをもたらす該相互作用分子とＣＤ２８分子との結合である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
該評価項目における阻害が該試験物質と請求項１〜５のいずれか一項に記載のＣＤ２８内の超抗原結合部位とが直接結合していることを示し、その結合が相互作用分子と該部位との結合と競合する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該混合物が細胞混合物または細胞フリー混合物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
混合物が細胞フリー混合物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
該ＣＤ２８分子またはその断片が精製された組換えタンパク質、および該ＣＤ２８分子を発現する形質転換宿主細胞の細胞溶解物または膜調製物のいずれか１つとして提供される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
該混合物が細胞混合物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
該細胞混合物がトランスフェクト細胞培養物である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
該トランスフェクト細胞がＣＤ２８分子またはその断片をコードする核酸配列を含んでなる発現ベクターでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
該候補アンタゴニスト物質がタンパク質系物質、炭水化物系物質、脂質系物質、天然有機物系物質、合成有機物系物質、無機物系物質、およびペプチドミメティックス系物質からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
該物質がペプチドのコンビナトリアルライブラリー、環状ペプチドミメティックのライブラリー、およびランダムまたは特定ファージディスプレイライブラリーののポジショナルスキャニングのいずれかの産物である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
該候補アンタゴニスト物質がＴｈ１リンパ球の毒素媒介性活性化を拮抗する該物質の能力、および、所望により、ある発熱性外毒素またはこのような発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を誘発するその能力を決定する方法により評価され、その評価方法が
ａ．ＣＤ２８分子またはその断片を含んでなる試験系を準備する工程、
ｂ．該系を相互作用に好適な条件下で請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の方法により準備、選択された候補アンタゴニストと接触させる工程、および
ｃ．評価項目指標に対する該候補アンタゴニストの効果を対照との比較により決定する工程（ここで、該効果はＣＤ２８分子と発熱性外毒素との直接相互作用を阻害し、それによってＴｈ１リンパ球の毒素媒介性活性化の拮抗をもたらす該候補の可能性を示す）
を含んでなる、請求項２０に記載のスクリーニング方法。
【請求項３８】
該試験系が細胞フリー混合物、in-vitro／ex-vivo細胞培養物、およびin-vivo動物モデルのいずれか１つである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
該試験系が、所望により、Ｔ細胞の超抗原誘導性活性化に、および候補アンタゴニストの拮抗効果を決定する評価項目指標の検出に好適な条件を提供する内生および／または外生化合物をさらに含んでなってよい、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
該Ｔ細胞がＴｈ１リンパ球であり、かつ、該活性化がＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ遺伝子発現の誘導により決定される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
該試験系が可溶性ＣＤ２８分子（ｓＣＤ２８）および可溶性Ｂ７−２分子（ｓＢ７−２）を含んでなる細胞フリー系である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
評価項目指標が好適な手段により検出されるｓＣＤ２８分子とｓＢ７−２分子との結合である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
検出工程において、該候補アンタゴニストの存在下でのＣＤ２８分子とｓＢ７−２との相互作用の増大が、超抗原とＣＤ２８分子との相互作用を特異的に拮抗し、阻害する該候補の可能性を示す、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
該試験系が内生的に発現されるＣＤ２８分子を含んでなるin-vitro／ex-vivo細胞培養物である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
該細胞培養物が哺乳類供与体から単離されたＰＢＭＣ培養物である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
評価項目指標が視覚的に検出可能なシグナルをもたらすＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γの超抗原誘導性発現である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
該評価項目の阻害が、該超抗原とＣＤ２８分子との相互作用を特異的に拮抗し、阻害し、その阻害によってＴｈ１リンパ球の毒素媒介性活性化の拮抗をもたらす該候補の可能性を示す、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
該in-vivo試験系が動物モデルである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
該動物モデルが超抗原を投与したＤ−ガラクトサミン感作マウスである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
評価項目指標が該マウスの致死毒素性ショックからの防御および救済である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
決定工程において、該評価項目の増大が、超抗原とＣＤ２８分子との相互作用を特異的に拮抗し、阻害する、Ｔｈ１リンパ球の発熱性毒素媒介性活性化を拮抗する、毒素性ショックから防御する、また、所望により、ある発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を誘発する該候補物質の能力を示す、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
該動物モデルが発熱性外毒素を抗原投与したブタである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
評価項目指標が該ブタの毒素性ショックおよび無能力からの防御および救済である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
決定工程において、該評価項目の増大が、超抗原とＣＤ２８分子との相互作用を特異的に拮抗し、阻害する、Ｔｈ１リンパ球の発熱性外毒素媒介性活性化を拮抗する、毒素性ショックおよび無能力から防御する、また、所望により、ある発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を誘発する該候補物質の能力を示す、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
哺乳類被験体における超抗原関連疾患の治療のための治療用組成物の製造方法であって、
ａ．Ｔｈ１リンパ球の超抗原媒介性活性化を拮抗し、また、所望により、ある発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を誘発し得るアンタゴニスト物質を同定する工程、および
ｂ．該アンタゴニスト物質を少なくとも１つの医薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤および／または添加剤と混合する工程
を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、超抗原と特異的にかつ直接結合するＣＤ２８分子内の超抗原結合部位に関する。本発明はさらに、ＣＤ２８分子と特異的に結合し、Ｔｈ１リンパ球の発熱性外毒素媒介性活性化を拮抗し得る試験物質に関してスクリーニングする方法におけるＣＤ２８分子または該超抗原結合部位を含んでなるその断片の使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
本願を通じて、種々の公報を参照する。これらの公報および本明細書に記載の参考文献は、全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００３】
Ｔ細胞活性の調節は、Ｔ細胞表面受容体、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）により提供される抗原非依存性共刺激シグナルに依存している。ＣＤ２８の抗原提示細胞で発現されるＢ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）リガンドとの結合によりＴ細胞活性化に関する刺激シグナルが提供されるが、これらの同じリガンドとその後ＣＴＬＡ−４が結合することにより応答の減衰が起こる[Oosterwegel et al., Curr. Opin. Immunol. 11: 294-300, 1999; Lenschow et al., Annu. Rev. Immunol. 14: 233-258, 1996; Greenfield et al., Crit. Rev. Immunol. 18: 389-418, (1998)に概説されている]。これらの相互作用の変化は試験疾患モデルの免疫応答に大きな影響を与える。ＣＴＬＡ−４関連シグナル伝達経路およびＣＤ２８関連シグナル伝達経路は、自己免疫疾患、移植片対宿主病、移植片拒絶の予防および腫瘍免疫の増強に関する主要な治療標的である[Oosterwegel et al., (1999) 前掲; Ikemizu et al., Immunity 12: 51-60, (2000)に概説されている]。抗腫瘍免疫応答の増強は、Ｂ７−１をネズミ腫瘍にトランスフェクトするか、または抗ＣＴＬＡ−４抗体を用いてＣＴＬＡ−４のＢ７−１およびＢ７−２との相互作用を遮断することにより起こる。逆に、Ｂ７／ＣＤ２８相互作用を阻害すると、一般に免疫抑制が生じ、自己抗体産生が減少し、皮膚および心臓の同種移植臓器の生着率が高まる。そのため、ヒトＢ７相互作用の制御についてはかなり関心が寄せられ、すでにこのようなアプローチは効果を発揮している[Guinan et al., N. Engl. J. Med. 340: 1704-1714, (1999); Ikemizu et al., (2000) 前掲、に概説されている]。
【０００４】
Ｂ７−１およびＢ７−２は各々、単一Ｖ様およびＣ様免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメインからなる糖タンパク質である。それらのリガンド、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４はまた、構造的にも関係があり、単一Ｖ様ＩｇＳＦドメインのジスルフィド結合したホモ二量体として細胞表面で発現される。第３のＣＤ２８様分子、ＩＣＯＳは別のＢ７関連分子と相互作用するが、トランスジェニックマウスの解析により、Ｂ７−１およびＢ７−２がＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の唯一の機能的リガンドであることが示されている。これらの相互作用の親和性は実質的に異なっている：ヒトＣＴＬＡ−４は溶液Ｋｄ  ０．２〜０．４μＭにてＢ７−１と結合するが、ＣＤ２８のＢ７−２に対する親和性は４０〜１００倍低い（Ｂ７−１／ＣＤ２８およびＢ７−２／ＣＴＬＡ−４相互作用は各々、中間の親和性を有している[Ｋｄ＝４μＭ]）[Ikemizu et al., (2000) 前掲、に概説されている]。
【０００５】
Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の発現は厳重に調節されている：ＣＤ２８が静止期ヒトＴ細胞で構成的に発現される一方で、Ｂ７−２は免疫応答の初期に抗原提示細胞で迅速に誘導されるが、Ｂ７−１およびＣＴＬＡ−４の両方の発現はかなり遅れる[Lenschow et al., (1996) 前掲、に概説されている]。Ｂ７分子のＣＤ２８との相互作用により、Ｔ細胞受容体 (ＴＣＲ)シグナル伝達を増幅し、かつ、アネルギーを予防する共刺激シグナルが生じる一方で、ＣＴＬＡ−４との相互作用によりＴ細胞で強力な阻害シグナルが誘導される。ＣＤ２８依存性共刺激については不明のところが多いが、最近の研究では細胞表面分子およびキナーゼ豊富なラフトの受容体リン酸化およびシグナル伝達に有利なＴＣＲ結合部位への大量補充に関しても採り上げている。逆に、ＣＴＬＡ−４は、ＴＣＲおよびＲＡＳシグナル伝達経路構成要素の脱リン酸化を誘導することにより、およびＣＤ２８シグナル伝達経路の末端事象を妨害することによりシグナル変換を阻害する[Ikemizu et al., (2000) 前掲、に概説されている]。
【０００６】
ＣＤ２８とＣＴＬＡ−４との相対する作用については明らかであるが、Ｂ７−１とＢ７−２の個別機能についてはまだ明確にはなっていない。Ｔｈ０、Ｔｈ１、またはＴｈ２分化の役割が提示されている[Freeman et al., Immunity 2: 523- 532, (1995); Kuchroo et al., Cell 80: 707-718, (1995)]が、他の研究ではＢ７−１とＢ７−２がサブセット分化の結果よりも共刺激シグナルの大きさを左右することを示唆している。さらに、遺伝子破壊研究ではＢ７−１とＢ７−２の共刺激機能がかなり重複することが示されている。Ｂ７−１とＢ７−２との重要な機能の差は、異なるＣＤ２８依存性共刺激の役割を有することよりもむしろ、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４とのそれらの結合の強さおよび／または様式に関係していることが提示された[Ikemizu et al., (2000) 前掲、に概説されている]。さらに、すでに上述したＢ７−２とＢ７−１ならびにＣＤ２８とＣＴＬＡ−４の発現のタイミングの違いが細胞免疫応答期間の初期の事象において重大であると思われる[Lenschow et al., (1996) 前掲、に概説されている]。
【０００７】
Ｔ細胞の完全活性化には、抗原特異的とも、もう１つには、抗原非依存性とも呼ばれる共刺激シグナルが必要である。特異な抗原群は黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)および化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)により産生される、超抗原毒素としても知られる発熱性外毒素のファミリーからなっている。黄色ブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥ類）からなっている外毒素は、摂取後に嘔吐と下痢症状が現れる大多数のヒト食中毒の場合の原因となっている[Schlievert, J. Infect. Dis. 167: 997(1993)]。黄色ブドウ球菌は自然界で広く見られ、人間と関連している場合が多い。ＳＥのファミリーに属する主要な血清型（限定されるものではないが、ＳＥＡ〜ＳＥＥおよびＳＥＧが挙げられる）の中では、ＳＥＢが有名である[Marrack and Kappler, Science 248: 705 (1990)]。ＳＥＢはまた、手術創感染または外傷創感染、ならびに子供が特に引き起こしやすいインフルエンザ患者気道のウイルス感染に伴って起こり得る非月経時毒素性ショック症候群のヒト症例の主要な原因としても認識されている[Schlievert (1993) 前掲; Tseng et al., Infect. Immun. 63: 2880 (1995)]。毒素性ショック症候群のその最も重度な例ではショックおよび死を引き起こす[Murray et al., ASM News 61: 229 (1995); Schlievert (1993) 前掲]。より一般に、ＳＥＡ〜ＳＥＥおよび毒素性ショック症候群毒素１（ＴＳＳＴ−１）をはじめとするブドウ球菌の外毒素ファミリーのメンバーは、毒素性ショック症候群、アトピー性皮膚炎[Schlievert (1993) 前掲]および川崎症候群[Bohach et al., Crit. Rev. Microbiol. 17: 251 (1990)]に関係している。
【０００８】
エアゾール吸入後にヒトにおいて致死ショックが起こる可能性から、また、比較的容易に超抗原毒素が大量に産生され得ることから、懸念されるのはこれらの毒素が単独または組合せて生物兵器として使用され得ることである[Lowell et al., Infect. Immun. 64: 1706  (1996)]。ＳＥＢは、主にその致死能力から見て有力な生物兵器であると思われる。しかしながら、ブドウ球菌および連鎖球菌超抗原は、嘔吐と下痢を引き起こすそれらの強い能力から、戦闘部隊の実効性を一時的にでも大きく損なわせ、それにより通常の軍事的手段に対する脆弱性を強化する無能力化剤でもある。さらに、高い死亡率を伴う民間人の大量無能力化は、たとえ死亡率が低くとも深刻なバイオテロの脅威となり、言うまでもなく、ＳＥＢおよび超抗原外毒素ファミリーの他のメンバーの有害性には、軍事面に関してだけでなく一般に対処する必要がある。
【０００９】
超抗原は感染生物において逆説的な応答：一方では免疫系の莫大な刺激、他方では免疫応答により妨げられない感染細菌の増殖を可能にし得る重大な免疫抑制、を引き起こす毒性有糸分裂促進物質である[Hoffman, Science 248: 685 (1990); Smith and Johnson J. Immunol. 115: 575 (1975); Marrack et al., J. Exp. Med. 171: 455 (1990); Pinto et al., Transplantation 25: 320 (1978)]。細胞免疫応答期間、抗原または有糸分裂促進物質により、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）などのＴｈ１型サイトカインの遺伝子発現の活性化と、もう一方での、ＣＤ８細胞および他の細胞サブセットによる[Ketzinel et al., Scand. J. Immunol. 33: 593 (1991); Arad et al., Cell Immunol 160: 240 (1995)]、ならびにＴｈ２細胞由来の抑制性サイトカイン、ＩＬ−４およびＩＬ−１０による[Mosmann and Coffman, Annu. Rev. Immunol. 7: 145 (1989)]その細胞媒介性抑制との間の動的相互作用が誘導される。
【００１０】
細菌超抗原は普通の抗原よりも５〜５００００倍高い割合の齧歯動物またはヒトＴ細胞を刺激する外毒素である。例えば、ＳＥＢはあるマウスの全Ｔ細胞のうち３０〜４０％を活性化して、分裂させ、サイトカインを生成させる[Marrack and Kappler (1990) 前掲]。実際には、ＳＥＢの毒性にはＴ細胞が必要であり、Ｔ細胞またはＳＥＢ応答性Ｔ細胞を欠いたマウスはＳＥＢの投与による影響を受けない（正常な動物では体重減少および死を引き起こす）[Marrack et al. (1990) 前掲; Marrack and Kappler (1990) 前掲]。正規の抗原とは違い、超抗原はプロセシングおよび抗原提示を必要としない[Janeway et al., Immunol. Rev. 107: 61 (1989)]が、Ｔ細胞受容体のβ鎖可変部分（Ｖβ）にある特定部位にて結合することによりＴ細胞を活性化する[Choi et al., Nature 346: 471 (1990)]。Ｔ細胞受容体の毒素との相互作用で非常に重要な領域は、Ｖβドメインの外面、通常の抗原認識には関係していない領域にある[Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 8941 (1989)]。同時に、発熱性外毒素はＭＨＣクラスII分子と直接結合し[Scholl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 4210 (1989)]、そしてＣＤ４＋Ｔ細胞に最初に作用するが、ＣＤ８＋細胞もまた活性化される[Fleischer and Schrezenmeier, J. Exp. Med. 167: 1697 (1988); Fraser, Nature 339: 221 (1989); Misfeldt, Infect. Immun. 58: 2409 (1990)]。発熱性外毒素が抗原のクラスII  ＭＨＣおよびＴ細胞受容体との普通の相互作用を回避することで、それらがＴ細胞を効果的に活性化するというのが現在の一般見解である[Janeway, Cell 63: 659 (1990)]。
【００１１】
ＳＥＢおよび関連外毒素の毒性は、サイトカイン、特に、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ群）の迅速かつ過剰な産生を誘導するこれらの分子の能力に関係していると考えられる。ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−βは活性化されたＴヘルパー型１（Ｔｈ１）細胞から分泌され、ＴＮＦ−αはＴｈ１細胞、単球およびマクロファージにより分泌される。突然産生される高レベルのこれらのサイトカインは毒素に関連した毒性の主要な病原要因に関係があるとされており[Schad et al., EMBO J. 14: 3292 (1995)]、毒素性ショックを引き起こす血圧の急激な降下の原因と考えられている。
【００１２】
研究により、ＳＥ類によるＴ細胞の莫大な刺激に関するもっともらしい説明が付けられているが、これらの毒素もまた強い免疫抑制性を有することの理由はまだ明らかではない。それらは抗体産生およびプラーク形成細胞の生成をはじめとする一次Ｔ細胞応答およびＢ細胞応答の両方の低下を誘導する[Hoffman (1990) 前掲; Smith and Johnson (1975) 前掲; Marrack et al. (1990) 前掲; Pinto et al. (1978) 前掲; Ikejima et al., J. Clin. Invest. 73: 1312 (1984); Poindexter & Schlievert, J. Infect. Dis. 153: 772 (1986)]。
【００１３】
ヒトのブドウ球菌毒素に対する感受性はマウスを１００倍上回っている。例えば、毒素性ショック症候群毒素１、ＴＳＳＴ−１、黄色ブドウ球菌由来の別の発熱性外毒素は＜０．１ｐｇ／ｍｌにてヒトＴ細胞を刺激して主要なサイトカイン、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−βを発現させるが、ネズミ細胞では約１０ｐｇ／ｍｌを要する[Uchiyama et al., J. Immunol. 143: 3173 (1989)]。マウスは、それらのＴ細胞のレパートリーから最も高い反応性を有するＶ−β鎖を提示する細胞を取り除くことにより、またはこれらのＶ−β遺伝子を欠失させることにより毒性有糸分裂促進物質に対する相対耐性にし得る[Marrack and Kappler (1990) 前掲]。ヒトではこのような欠失は検出されず、はるかに影響を受けやすい。
【００１４】
ヒトにおけるＳＥＢ（および超抗原の同じファミリーに属する外毒素）の無能力化効果および潜在的致死効果から、民間人または軍人に関係なく、これらの毒素に対する予防および毒素に曝露した個体の治療の必要性が生じる。
【００１５】
細菌超抗原は最も致死性の高い毒素の１つであり、それらは兵器化されている。これらの極めて安定したタンパク質は煮沸に耐え、生産し、供給することが容易である。超抗原は通常の抗原の制限された提示を回避して、Ｔ細胞の最大５０％を活性化して、分裂させ、サイトカインを生成させ得る。例えば、超抗原は普通の抗原よりも少なくとも５，０００倍強く細胞免疫応答を活性化する。毒性はＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦなどのＴｈ１細胞由来のサイトカインの大量誘導によって生じる。死は２４〜４８時間以内に訪れ、致死濃度よりも数対数値低い濃度においてさえ、これらの毒素は重度に無能力化する。
【００１６】
一般的な黄色ブドウ球菌および化膿連鎖球菌（「人喰いバクテリア」）により産生される超抗原のファミリーを構成するメンバーは２０メンバーをはるかに上回り、ブドウ球菌エンテロトキシンＳＥＡ〜ＳＥＥ（その中では、ＳＥＢが最も有名である）および毒素性ショック症候群毒素１（ＴＳＳＴ−１）、ならびに連鎖球菌発熱性外毒素、とりわけ、ＳＰＥＡなどが挙げられる。超抗原のアミノ酸配列は極めて多様であり、軍事的問題を悪化させている。ＳＥＢおよびＳＥＡは２８％相同性を有しているが、ＴＳＳＴ−１はＳＥＢに対して６％配列相同性しか示さない。戦闘状況またはバイオテロ状況で直面する毒素または毒素混合物の性質は明確には予測できない。細菌戦争の最も起こりそうな筋書きには、１種類の精製された超抗原ではなく、むしろ細菌の培養により容易に得られる超抗原性毒素の天然混合物の使用が含まれている。この複雑性には広域スペクトルの防衛手段の開発が求められる。
【００１７】
本発明者らはこれまで、Ｔ細胞の活性化が起こる前に毒性カスケードの上部にある超抗原の作用をブロックする可能性を調査してきた。純粋に直観的なアプローチでは、広く異なる超抗原（ＳＥＢ、ＳＥＡ、ＴＳＳＴ−１およびＳＰＥＡ）によるヒトＴｈ１サイトカイン遺伝子発現誘導を阻害し、これらの毒素の致死効果からマウスを防御する一方で、毒素の攻撃に対する広域スペクトルの免疫性の迅速な付与を可能にし[Arad et al., Nature Medicine 6: 414-421 (2000); Arad et al., J. Leuk. Biol. 69: 921-927 (2001)]、および毒素性ショック初期にヒトで見られるような無能力症状からブタを守る[出願者の日本出願番号２００１−３７７６８２  ＪＰ、および出願者の米国出願１０／１７２，４２５]、１２または１４アミノ酸ペプチドアンタゴニスト[各々が配列番号１（ｄａＹＮＫＫＫＡＴＶＱＥＬＤｄａ）（”ｄａ”はＤ−アラニンを表す）および配列番号２（ｄａＶＱＹＮＫＫＫＡＴＶＱＥＬＤｄａ）でも示されるｐ１２Ａおよびｐ１４Ａ] の設計をなし得た。ブタはマウスよりも免疫系がヒトに近いことから、マウスとは違い、超抗原の毒性作用への前感作を必要としない。この発見は、適切な取り組みによりヒトにおける有効性の範囲に達し得るという予想を支持している。アンタゴニストペプチドの副作用はマウスまたはブタでは検出されなかった。アンタゴニストに対する抗体は見つけることができず、実際には、短いペプチド（１２〜１４アミノ酸）の小規模かつ比較的急速なクリアランスが治療上の利益となっている。アンタゴニストは、約１００倍モル過剰にて超抗原のヒトリンパ球様細胞に対する作用をブロックし（通常の抗原の作用はブロックしない）、約２０〜４０倍だけモル過剰にてマウスの致死ショックおよびブタの無能力を防止することから、それがその細胞標的としっかりと結合することおよびこの標的がＴ細胞の超抗原媒介性活性化に重要であることが示される。超抗原のアンタゴニストドメインは、調査した全ての超抗原では空間的にかつ順序正しく保存されているβ鎖／ヒンジ／β鎖／α−ヘリックスモチーフからなる。このことからアンタゴニストペプチドの広域スペクトル効力が分かる。
【００１８】
本発明者らは、超抗原はＴｈ１応答の過剰刺激を可能にするためにこのドメイン（「アンタゴニスト ドメイン」）を通じて、細胞受容体標的と結合するにちがいないと主張した。本発明者らはこの受容体がＣＤ２８受容体であると確認することに成功した。従って、Ｔｈ１リンパ球の活性化に必要不可欠であることが分かっているＣＤ２８と超抗原の驚くべき直接相互作用から、ＣＤ２８が致死毒素性ショック治療の第１の薬剤標的となった。アンタゴニスト剤とこの受容体との相互作用により超抗原毒素の作用がブロックできる。この受容体標的の性質およびアンタゴニストとのまたは超抗原とのその相互作用の性質を洞察して、さらに効果的なアンタゴニストを設計する新規なアプローチを提供する。
【００１９】
Ｔ細胞の完全活性化はＭＨＣクラスII分子、超抗原およびＴＣＲの相互作用だけによるものではない。ＴＣＲ結合を持続することはＴ細胞活性化に必要不可欠であるが、多くの障害に直面する。第一に、ＴＣＲ結合は小型のＴＣＲおよびＭＨＣ分子により阻止される。第二に、ＴＣＲの抗原に対する親和性が低い。第三に、抗原提示細胞とＴ細胞との抗原性複合体の数が極めて少ない。
【００２０】
最後に、Ｔ細胞の移動は抗原認識の持続に支障となる。超抗原はこれらの制約の克服においては普通の抗原よりはるかに優れ、多くのＴＣＲ  Ｖβ鎖と結合しながらＭＨＣ拘束を回避するが、それらはＴ細胞活性化に共刺激リガンド（抗原提示細胞ではＢ７ファミリーのものおよびＴ細胞ではＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４など）をなお必要とする。
【００２１】
数人の研究者が超抗原によるＴ細胞の活性化にＢ７−１およびＢ７−２が果たす役割を提示したが、それらの結果は矛盾していた。例えば、Muraille et al. [Int. Immunol. 7: 295-304, (1995)]は、ＣＤ２８またはＢ７−１でトランスフェクトした細胞を使用して、共刺激が細菌超抗原によるナイーブＴ細胞の活性化の閾値を低下させたことを報告した。その一方で、Muraille et al., [Cell. Immunol. 162: 315-320 (1995)]は、ネズミＢ７−１およびＢ７−２分子に対するモノクローナル抗体の組合せがナイーブＴ細胞のＳＥＡ、ＳＥＢ、およびＴＳＳＴ−１に対するin vitro応答を抑制すると主張した。Ｔ細胞応答の抑制にはＢ７−１およびＢ７−２の同時ブロッキングが必要であった。彼らはＢ７−１またはＢ７−２のいずれかが細菌外毒素に応答することで共刺激シグナルをナイーブＴ細胞に提供するに足ることを示した。Ｂ７関連分子に対する抗体によるＴ細胞活性化の阻害はＣＤ２８に対する抗体により克服されることから、ＣＤ２８媒介性シグナルが細菌超抗原によるＴ細胞活性化に関与しているという仮説が提起された[Muraille et al. (1995) 前掲]。しかしながら、同じグループによるさらにもう１つの研究では、抗Ｂ７−２抗体の単回投与でＴ細胞活性化を著しく阻害し、Ｄ−ガラクトサミン感作マウスにおいてＳＥＢの致死効果を低下させるが抗Ｂ７−１抗体ではそうならないという結論に達した[Muraille et al., Eur. J. Immunol. 25: 2111-2114, (1995)]。実際には、ＣＴＬＡ−４Ｉｇまたは抗Ｂ７−１抗体はナイーブＴ細胞の超抗原媒介性活性化に対してほとんどまたは全く効果がなかった[Muraille et al., (1995) 前掲、に概説されている]。これらの結果はその後、特異的なモノクローナル抗体によりＣＤ８０またはＣＤ８６誘導性シグナルをブロックすることで、ＳＥＢに応答してゆっくりした速度でＩＬ−２産生が誘導されるという同じグループからの報告により疑わしいものとなった[Muraille et al., Immunology 89: 245-249, (1996)]。Krummel et al., 
[Int. Immunol. 8: 519-523, (1996)]は同様に、Ｂ７−１／Ｂ７−２に対する抗体または抗ＣＤ２８抗体のＦａｂフラグメントが脾細胞のＳＥＢに対する応答を著しく抑制することを報告した。Mittrucker et al., [J. Exp. Med. 183: 2481-2488, (1996)]は、ＣＤ２８欠損マウスにおいてＳＥＢにより不応答およびＴ細胞の増殖障害が誘導されることを示した。ＣＤ２８−／−およびＣＤ２８＋／＋マウス両方由来のＶβ８＋Ｔ細胞がＳＥＢ注入後最初の２４時間以内に同じ表現型の変化を示し、細胞周期解析では同じ割合のＶβ８＋Ｔ細胞が増殖し始めたことが示されたことから、増殖の欠如はＳＥＢがＶβ８＋Ｔ細胞を活性化しないことが原因ではなかった。しかしながら、その後になってＶβ８＋Ｔ細胞の表現型および増殖状態は異なっていた。彼らは、ＣＤ２８共刺激がＳＥＢのＴ細胞媒介性毒性に決定的なものであるという結論に達した。ＣＤ２８欠損マウス（ＣＤ２８−／−）はＴＳＳＴ−１誘導性致死ＴＳＳに対して完全に耐性であるが、ＣＤ２８＋／−同腹マウスはＴＳＳＴ−１に対して部分的に耐性であることを報告したSaha et al. [J. Exp. Med. 183: 2675-2680, (1996)]によりＣＤ２８遺伝子の標的破壊による致死毒素性ショックに対する防御が示された。ＣＤ２８−／−マウスの耐性に関する機構は、ＴＳＳＴ−１の注入に応答して血清中のＴＮＦ−αの蓄積を完全に廃止し、ＩＦＮ−γ分泌をほぼ完全に（９０％）阻害することであった。その一方、ＩＬ−２の血清レベルはＣＤ２８発現の変化により適度にしか影響を受けなかった。ＣＤ２８野生型（ＣＤ２８＋／＋）、ＣＤ２８ヘテロ接合体（ＣＤ２８＋／−）およびＣＤ２８−／−マウス間のＴＳＳＴ−１耐性の階層は遺伝子量効果を示唆しており、Ｔ細胞表面のＣＤ２８発現レベルが超抗原媒介性共刺激を決定的に調節することがうかがえる。これらの結果はin vivoサイトカインカスケードの開始におけるＣＤ２８受容体の中心的で非冗長な役割を立証し、超抗原媒介性免疫病理学の治療的アプローチを示したが、具体的なアプローチを示していなかった。Wang et al. [J. Immunol. 158: 2856-2861, (1997)]は、ＣＤ２８の結合によりＩＬ−１０発現が誘導され、マウスの細菌毒素誘導性敗血性ショックが回避されると主張した。彼らは抗ＣＤ２８抗体を投与することでＳＥＢが媒介する敗血性ショック症候群および死を回避できることを観察した。彼らは、抗ＣＤ２８抗体による処置が脾細胞およびＴ細胞系両方でのＩＬ−１０の発現を刺激すると主張した。さらに、抗ＩＬ−１０の注入により敗血性ショックに対する抗ＣＤ２８の防御効果を無効にすることができた。Wang et al.（前掲）の結果は、本明細書に記載の研究成果に照らして、以下のように説明することができる：彼らの試験では、抗ＣＤ２８は、ＩＬ−１０を誘導するのではなく、彼らが主張したように、本発明者らが示している通り、ＳＥＢによるＴｈ１サイトカイン遺伝子発現の誘導（次には致死ショックを引き起こす）に不可欠であるＣＤ２８とＳＥＢの直接結合を、本発明者らが示している通り、ＣＤ２８結合とは無関係である超抗原によるＴｈ２サイトカインＩＬ−１０の誘導に干渉することなく、ブロックして、ＳＥＢの作用を阻害した。このように、ＳＥＢの作用は、Wang et al.（前掲）では防御的なＴｈ２応答の誘発においてのみ明らかであった。Wang et al.はＳＥＢとＣＤ２８との直接結合について示しておらず、示唆もしなかった。また、彼らはこのような結合がＴｈ１応答で選択的に必要とされ、Ｔｈ２応答では必要されないことについて示しておらず、示唆もなかった。実際には、Wang et al.はＳＥＢとＣＤ２８との直接結合、および本発明者らが示している通り、このような結合がＴｈ１応答で選択的に必要とされ、Ｔｈ２応答では必要されないという概念から離れて教示している。このことは、例えば、Wang et al.の題名「CD28 ligation prevents bacterial toxin-induced septic shock in mice by inducing IL-10 expression（ＣＤ２８の結合によりＩＬ−１０発現が誘導され、マウスの細菌毒素誘導性敗血性ショックが回避される）」および彼らの文「anti-CD28 Ab treatment stimulated the expression of IL-10, both in splenocytes and in T cell lines（抗ＣＤ２８抗体による処置が脾細胞およびＴ細胞系両方でのＩＬ−１０の発現を刺激した）」を見ても分かる。先行技術およびWang et al. [前掲]から見ても、本発明者らによって得られた新たな結果は驚くべきことである。本結果は、Wang et al.（前掲）の主張を実証するものではない。実際には、図１０にて示すように、抗ＣＤ２８ｍＡｂ（モノクローナル抗体）はヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）集団でのＩＬ−１０発現を誘導することはできない。さらに、アンタゴニストペプチドは超抗原によるＩＬ−１０の誘導を損なわない（図３）。
【００２２】
要するに、先行技術では次のことを示している：
１．Ｂ７−１およびＢ７−２はＴ細胞と結合するが、Ｔｈ１またはＴｈ２細胞の活性化という観点から各補助リガンドの役割はまだ議論の余地がある；
２．いずれかのＢ７リガンドが超抗原の作用を共刺激することを主張する報告書が存在する一方で、Ｂ７−２の役割を提言する報告書もあり、超抗原毒素によるＴ細胞活性化におけるＢ７−１およびＢ７−２の役割もまた、まだ議論の余地がある；
３．ＣＤ２８は、ＭＨＣクラスII分子により示される通常の抗原の場合と同じように、超抗原の共刺激リガンドとして作用する；
４．ＣＤ２８によるＢ７−１および／またはＢ７−２との超抗原媒介性Ｔ細胞応答の共刺激機構は分かっていないが、超抗原と通常の抗原は同じであると考えられる。さらに詳しく言えば、先行技術では超抗原の共刺激機構と通常の抗原の共刺激機構が異なるという概念から離れて教示している；
５．超抗原によるＴｈ１およびＴｈ２応答のＣＤ２８媒介性活性化におけるＢ７−１およびＢ７−２各々の特定の役割は分かっていない。
【００２３】
ＳＥＢはＭＨＣクラスIIα鎖と低い親和性（Ｋｄ，０．３４μＭ）で結合する[Papageorgiou, A. C. et al., EMBO J. 18: 9-21 (1999)]。超抗原は一層弱く、１〜１００μＭの範囲の親和性でＴＣＲと結合する[Leder L, Llera A, Lavoie PM, et al., J. Exp. Med. 187: 823-33 (1998); Andersen PS, et al., Biol. Chem. 276: 33452-7 (2001); Redpath S, et al., J. Immunol. 163: 6-10 (1999)]。
【００２４】
リガンド／受容体接触の平均時間を決定する低い親和性と高いオフレートがＴＣＲを介するシグナル伝達強度を決定すると思われる。実際には、ＴＣＲ  Ｖβ８．２ドメインに対する親和性が高い突然変異型ブドウ球菌超抗原ＳＥＣ３はＴ細胞に対して高い有糸分裂促進能力も示した[Andersen PS, et al., (2001) 前掲]。ＳＥＣ３変異体のＴＣＲに対する結合親和性とそれらが引き起こすＴ細胞応答の強さとの間には直接的な相関関係が認められた。この発見は超抗原をＴＣＲに対してより高い親和性を有するものへと発展させ得ることを示唆する。そういったものは自然界には存在せず、それどころか、ＳＥＡなどの強力な超抗原でさえもＴＣＲに対して低い親和性を保持している[Kieke MC, et al., J Mol Biol 307: 1305-15 (2001)]。表面プラズモン共鳴研究では、絶対的には、超抗原と個々のリガンド、ＭＨＣクラスII分子またはＴＣＲのいずれかとの相互作用が極めて弱いことが分かる[Redpath S, et al., (1999) 前掲; Seth A, et al., Nature 369: 324-7 (1994)]。
【００２５】
このことは、Ｔ細胞活性化を達成するために、超抗原はさらなるリガンド相互作用に依存する必要があり、また、本願に記載のアンタゴニストペプチドは超抗原のＣＤ２８受容体との相互作用、すなわち、有害なＴｈ１サイトカイン応答の超抗原媒介性活性化に重要である相互作用をブロックすることを示している。
【００２６】
超抗原上にＴＣＲ結合ドメインを占有させることが超抗原の作用をブロックするもう１つの戦略である。このアプローチを利用して、ＳＥＣ３と１０００倍強く（Ｋｄ，７ｎＭ）結合する可溶性突然変異型ＴＣＲ  Ｖβ８鎖を選択した[Kieke MC, et al., (2001) 前掲]。この突然変異型Ｖβ８タンパク質はＳＥＣ３媒介性特異的Ｔ細胞活性に拮抗作用を示した。本明細書に記載の短いアンタゴニストペプチドとは違い、可溶性Ｖβ８タンパク質は高分子量のものであり、そのため、送達はより困難である。異なる超抗原が広く多様な分子表面を有するＴＣＲと結合するという事実がさらに問題となっている。さらに、各超抗原はＶβ鎖レパートリーの限られた個々のサブセットとのみ優先的に結合する[Kieke MC, et al., (2001) 前掲; Kline JB, et al., Mol Microbiol. 24: 191-202 (1997); Li H, et al., Immunol Rev 163: 177-86 (1998)]。
【００２７】
実際には、異なる超抗原では、効率性の高いＴ細胞活性化がＴＣＲ結合の構造的に多様な戦略を通じて達成され得る[Sundberg EJ, et al., Structure (Camb) 10: 687-99 (2002)]。よって、可溶性突然変異型Ｖβ８タンパク質は超抗原に限定された特異性を示す。
【００２８】
実施例にて詳述する本発明の新規かつ予想外の結果は、問題となる先行技術に照らし、驚くべきことに、致死毒素性ショックを媒介するサイトカインを発現するＴｈ１細胞の活性化には、超抗原とＭＨＣクラスIIおよびＴＣＲリガンドとの相互作用が必要であるが、この相互作用単独では活性化には不十分であることを示している。一度結合すれば、超抗原はアンタゴニストドメインを介して作用して、Ｂ７−２／ＣＤ２８リガンド相互作用を可能にし、そのことがＴｈ１細胞活性化を推進する主要なシグナルであるこの本質的に弱い相互作用の強い促進作用となる。超抗原はこの相互作用が存在しないとＴｈ１細胞を活性化させることができない。このように、超抗原はＴｈ１細胞活性化のためのその必須の不可避的な経路としてＢ７−２／ＣＤ２８リガンド相互作用を利用する。それに対して、普通の抗原はＴＣＲのＭＨＣクラスIIポケット内に提示され、必須のリガンドよりもむしろ共刺激としてＢ７−２およびＣＤ２８分子を利用する。本発明者らは、アンタゴニストペプチドはＴｈ１細胞のＣＤ２８受容体内にある特異的な結合部位と直接結合し、それによりその活性化をブロックすることをさらに示した。さらに、本発明の結果は、Ｔｈ２細胞の活性化がＴｈ１細胞の活性化と対照的にＢ７−２／ＣＤ２８リガンド相互作用とは無関係であることを示している。このように、超抗原によるＴｈ１細胞の活性化は独自にＢ７−２／ＣＤ２８リガンド相互作用を必要とする。これらの結果から、超抗原アンタゴニストペプチドの標的、すなわち、本発明の新規な受容体がＣＤ２８であることが分かる。アンタゴニストペプチドはＣＤ２８分子と結合し、それによってこの受容体への超抗原の接近を妨害して、Ｔｈ１細胞活性化をブロックする。さらに、ＣＤ２８分子内の超抗原結合部位から誘導された新規なアンタゴニストペプチドは、超抗原との結合にて膜ＣＤ２８と競合することにより、Ｔｈ１細胞活性化を特異的にブロックする。そのため、アンタゴニストペプチドまたは他の小分子によろうが、他の手段によろうが、超抗原とＣＤ２８の細胞外ドメインとの複合体形成を阻害することにより、超抗原ファミリーに属する発熱性外毒素が媒介する致死毒素性ショックおよび無能力を予防する新規かつ驚くべき方法を提供する。
【００２９】
それゆえ、本発明の１つの目的は、毒素による敗血性ショック、毒素性ショックまたは無能力を問わない超抗原誘導性毒素性ショック症状の解毒剤の開発のための有力な新規標的としてＣＤ２８を使用することである。
本発明の前記ならびにその他の目的は次の説明により明らかになるであろう。
【発明の概要】
【００３０】
第１の態様において、本発明は、超抗原と特異的にかつ直接結合するＣＤ２８分子内の超抗原結合部位に関する。
【００３１】
特に好ましい実施形態によれば、この結合部位は抗ＣＤ２８モノクローナル抗体、ＭＡＢ３４２と呼ばれるマウス抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（R & D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota, USAのクローン  ３７４０７．１１１）により認識されるＣＤ２８分子内にあるエピトープと少なくとも一部が重複する。この抗体により認識される特定のエピトープは配列番号３で示されるアミノ酸配列（ＨＶＫＧＫＨＬＣＰ）を有している。そのため、ＣＤ２８分子内の超抗原結合部位は配列番号３で示されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含んでなる。配列番号３の一部についての限定されない例は、配列番号４で示されるＨＶＫＧＫＨモチーフによっても提供し得る。
【００３２】
本発明のＣＤ２８内の超抗原結合部位でのＣＤ２８分子と超抗原との直接結合がＢ７−２リガンドとＣＤ２８との結合を促進する。さらに詳しく言えば、この特異的な結合がＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ遺伝子発現の誘導により定義されているＴｈ１リンパ球の活性化に必要不可欠である。しかしながら、Ｂ７−２リガンドとＣＤ２８との結合はＩＬ−４および／またはＩＬ−１０の誘導により定義されているＴｈ２リンパ球の活性化に必要不可欠ではない。
【００３３】
好ましい実施形態によれば、新規なＣＤ２８内超抗原結合部位は発熱性外毒素の空間的に保存されているドメインと特異的にかつ直接結合する。好ましくは、この空間的に保存されているドメインはＭＨＣクラスII分子およびＴＣＲのいずれとの結合にも関係していない。最も好ましくは、発熱性外毒素の空間的に保存されている該ドメインはその中にＳＥＢのドメイン番号に基づき、β鎖７内から始まり、β鎖７を、短いβ鎖８を介して、α−ヘリックス４へと連結し、α−ヘリックス４内で終わる中央ターンを形成する。
【００３４】
第２の態様として、本発明は、超抗原関連疾患の治療を必要とする哺乳類被験体における超抗原関連疾患の治療のための方法に関する。本発明の方法はＣＤ２８分子と該超抗原との相互作用を阻害することを含んでなる。
【００３５】
特定の実施形態によれば、ＣＤ２８分子と該超抗原との直接結合の阻害は、該被験体に、ＣＤ２８分子と該超抗原との直接相互作用を阻害する物質または該物質を含んでなる組成物の治療上有効な量を投与することにより行われる。本発明の組成物は、所望により、医薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤および／または添加剤をさらに含んでなってもよい。さらに詳しく言えば、該物質は超抗原と本発明のＣＤ２８超抗原結合部位との結合を阻害する。
【００３６】
さらに詳しく言えば、ＣＤ２８分子と発熱性外毒素との直接相互作用を阻害することにより、Ｔｈ１リンパ球の外毒素媒介性活性化の阻害、毒素性ショックに対する防御をもたらし、また、所望により、ある発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫の直接誘発をもたらす。
【００３７】
さらにもう１つの好ましい実施形態では、超抗原が発熱性外毒素であり得、好ましくは、この発熱性外毒素が細菌外毒素であり得、最も好ましくは、この外毒素が黄色ブドウ球菌および化膿連鎖球菌のいずれか１つにより産生され得る。
【００３８】
本発明の方法により治療される超抗原関連疾患は、特定の実施形態によれば、ある発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される、毒素性ショック、無能力および死のいずれか１つであり得る。
【００３９】
本発明はさらに、このような治療を必要とする被験体においてＴｈ１リンパ球の発熱性外毒素媒介性活性化を阻害し、ある発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックから防御する方法を提供する。この方法は、被験体に、ＣＤ２８分子と該発熱性外毒素との直接相互作用を阻害する物質または該物質を含んでなる組成物の治療上有効な量を投与することを含んでなる。本発明の組成物は、所望により、医薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤および／または添加剤をさらに含んでなってもよい。
【００４０】
さらに、本発明は、このような治療を必要とする被験体においてある発熱性外毒素により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を誘発する方法を提供する。このような方法は、被験体に、ＣＤ２８分子と該発熱性外毒素との直接相互作用を阻害する物質または該物質を含んでなり、また、所望により、医薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤および／または添加剤をさらに含んでなってもよい組成物の治療上有効な量を投与することを含んでなる。この阻害物質は毒素性ショックをもたらす細胞免疫応答を誘導する毒素の能力をブロックすることにより、超抗原にそれ自身に対して向けられる活発な体液性免疫応答を誘導させ、それにより、間接的に防御免疫を誘発する可能性がある。
【００４１】
さらにもう１つの態様では、本発明は、超抗原と新規なＣＤ２８内超抗原結合部位との結合を阻害する物質に関する。具体的に言えば、該超抗原は発熱性外毒素であり得る。
【００４２】
好ましい実施形態によれば、本発明の物質により発熱性外毒素と該ＣＤ２８超抗原結合部位との結合を阻害することにより、Ｔｈ１リンパ球の毒素媒介性活性化の拮抗もたらし、それにより、間接的に、該発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫の誘発をもたらし得る。さらに詳しく言えば、この結合は新規なＣＤ２８内超抗原結合部位を介する。
【００４３】
もう１つの実施形態では、本発明の物質は超抗原関連疾患の治療における使用に向けられる。
【００４４】
本発明はさらに、超抗原関連疾患の治療のための医薬組成物の製造における本発明の物質の使用に関する。
【００４５】
第４の態様において、本発明は、超抗原関連疾患の治療および／または予防のための医薬組成物に関する。本発明の組成物は、有効成分として、ＣＤ２８分子と該発熱性外毒素との直接相互作用を阻害する物質の治療上有効な量を含んでなる。このような阻害により、Ｔｈ１リンパ球の毒素媒介性活性化の拮抗をもたらす。本発明のこの組成物は、所望により、少なくとも１つの医薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤および／または添加剤をさらに含んでなってもよい。
【００４６】
さらなる態様において、本発明は、ＣＤ２８分子内の超抗原結合部位内に含まれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する単離および精製されたペプチドに関する。
【００４７】
１つの好ましい実施形態では、本発明のペプチドは抗ＣＤ２８モノクローナル抗体により認識されるＣＤ２８分子内にあるエピトープを含んでなるアミノ酸配列を有する。さらに詳しく言えば、この抗ＣＤ２８モノクローナル抗体はＭＡＢ３４２と呼ばれるマウス抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（R & D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota, USAのクローン  ３７４０７．１１１）であり得る。
【００４８】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明のペプチドは配列番号３、４および５のいずれか１つで示される配列またはその機能的断片および誘導体を含んでなる。
【００４９】
特に好ましい実施形態によれば、本発明のペプチドはｐＴＡと呼ばれ、かつ、配列番号５のアミノ酸配列またはその機能的断片および誘導体を有する。
【００５０】
実施例により示すように、本発明のペプチドはＣＤ２８分子と該発熱性外毒素との直接相互作用を阻害する。
【００５１】
このペプチドはＴリンパ球の毒素媒介性活性化のアンタゴニストであり得、かつ、ある発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックから防御する。
【００５２】
さらにもう１つの態様では、本発明は、超抗原とＣＤ２８内の超抗原結合部位との直接相互作用を阻害する組成物に関する。この組成物は有効成分として、単離および精製されたペプチドを、該相互作用を阻害するのに有効な量で含んでなる。この実施形態によれば、このペプチドはＣＤ２８分子内の超抗原結合部位内に含まれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する。
【００５３】
さらに、本発明は、Ｔリンパ球の発熱性外毒素媒介性活性化を阻害し、ある発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックから防御する組成物に関する。この実施形態によれば、本発明の組成物は有効成分として、単離および精製されたペプチドを、ＩＬ−２、ＩＮＦ−γおよび／またはＴＮＦ−α遺伝子によりコードされるＲＮＡの外毒素誘導性発現を阻害するのに有効な量で含んでなる。このペプチドはＣＤ２８分子内の超抗原結合部位内に含まれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する。
【００５４】
好ましい実施形態では、本発明の組成物に含まれる単離および精製されたペプチドは配列番号３、配列番号４および配列番号５のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列またはその機能的断片を有する。注目すべきは、これらの組成物は本発明に記載されているペプチドの組み合わせを含んでなってよく、また、所望により、医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバントおよび／または 賦形剤をさらに含んでなってもよいことである。
【００５５】
特定の好ましい実施形態では、本発明の組成物に含まれるペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列またはその機能的断片および誘導体を有するｐＴＡと呼ばれるペプチドであり得る。
【００５６】
もう１つの実施形態では、本発明は、哺乳類被験体における超抗原関連疾患の治療のための医薬組成物に関する。この組成物は有効成分として本発明の単離および精製されたペプチドを含んでなる。
【００５７】
本発明はさらに、このような治療を必要とする患者においてＴリンパ球の発熱性外毒素媒介性活性化を阻害し、ある発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックから防御する方法を提供する。本発明の方法は、患者に、ＣＤ２８分子内の超抗原結合部位内に含まれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する単離および精製されたペプチドまたはそれを含んでなる組成物の阻害に有効な量を投与することを含んでなる。
【００５８】
この態様の好ましい実施形態では、本発明の方法に使用するペプチドは配列番号３、配列番号４および配列番号５のいずれか１つ 、好ましくは、配列番号５のアミノ酸配列を有するペプチドから選択され得る。
【００５９】
もう１つの実施形態では、本発明は、超抗原関連疾患を予防および／または治療する方法であって、このような治療を必要とする患者に、少なくとも１つの単離および精製されたペプチドまたはそれを含んでなる組成物の治療上有効な量を投与する工程を含んでなる方法に関する。よって、このペプチドは本発明に記載されているように、ＣＤ２８分子内の超抗原結合部位内に含まれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する。好ましくは、この方法に使用するペプチドはｐＴＡと呼ばれ、かつ、配列番号５のアミノ酸配列またはその機能的断片および誘導体を有する。
【００６０】
本発明はさらに、本発明に記載されている組成物の製造におけるこのペプチドの使用に関する。
【００６１】
さらなる態様において、本発明は、ＣＤ２８分子と特異的に結合し、Ｔｈ１リンパ球の発熱性外毒素媒介性活性化を拮抗し得る試験物質に関してスクリーニングする方法に関する。さらに、該試験物質は特異的かつ間接的に、ある発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を誘発し得る可能性がある。本発明のスクリーニング方法は
（ａ）ＣＤ２８分子と結合する候補アンタゴニスト物質を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたＣＤ２８結合物質からＣＤ２８分子と該超抗原との直接相互作用を阻害する物質を選択する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた物質のＴｈ１リンパ球の超抗原媒介性活性化に対する拮抗効果を決定する工程
を含んでなる。
【００６２】
好ましい実施形態では、本発明のスクリーニング方法に使用する候補アンタゴニスト物質は
（ａ）ＣＤ２８分子またはｓ−Ａｇ結合部位を含んでなるその断片を含む混合物を準備する工程、
（ｂ）（ａ）の混合物を該結合に好適な条件下にて試験物質と接触させる工程、および
（ｃ）評価項目指標（end point indication）に対する試験物質の効果を判定する工程（ここで、該評価項目についての変化がＣＤ２８分子と該試験物質とが結合していることを示す）
により得ることができる。
【００６３】
特定の実施形態によれば、評価項目指標は抗ＣＤ２８抗体とＣＤ２８分子との結合であり得る。この結合は視覚的に検出可能なシグナルをもたらす。
【００６４】
本発明のスクリーニング方法の第２の工程では、（好ましくは、上記のように得られた）ＣＤ２８と結合する候補アンタゴニスト物質を、ＣＤ２８分子と新規なＣＤ２８内超抗原結合部位にて特異的に結合するそれらの能力に関してさらに選択し得る。このように選択された物質は、望ましくは、ＣＤ２８分子と該超抗原との相互作用を阻止し得る。この実施形態によれば、このような物質の選択は
（ａ）ＣＤ２８分子またはｓ−Ａｇ結合部位を含んでなるその断片、例えば、配列番号３で示されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含んでなる断片を含む混合物を準備する工程、
（ｂ）該混合物を、ＣＤ２８内の超抗原結合部位によるＣＤ２８分子との特異的相互作用に好適な条件下にて該候補試験物質と接触させる工程、および
（ｃ）評価項目指標に対する試験物質の効果を判定する工程（ここで、該評価項目についての変化が該超抗原結合部位によりＣＤ２８分子と試験物質とが結合していることを示す）
により行われ得る。
特に好ましい実施形態によれば、選択プロセスに使用する混合物は
（ａ）ＣＤ２８分子またはその断片、もしくは、好ましくは、ｓ−Ａｇ結合部位を含んでなる断片、
（ｂ）ＣＤ２８と本発明のＣＤ２８内の超抗原結合部位にて特異的に結合する既知分子である相互作用分子、および
（ｃ）所望により、このような相互作用分子とＣＤ２８分子との相互作用に、および相互作用分子とＣＤ２８分子との相互作用に関する評価項目指標の検出に好適な条件を提供する溶液、バッファーおよび化合物
を含んでなる。
【００６５】
注目すべきは、ＣＤ２８断片の例として、配列番号３で示されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含んでなる超抗原結合部位を選択用混合物に使用し得ることである。 
特定の実施形態では、相互作用分子は、限定されるものではないが、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体、アンタゴニストペプチド（例えば、ｐ１２Ａおよびｐ１４Ａ（配列番号１（ｄａＹＮＫＫＫＡＴＶＱＥＬＤｄａ）でも示される）、ｐ１４Ａ（配列番号２（ｄａＶＱＹＮＫＫＫＡＴＶＱＥＬＤｄａ）でも示される）（”ｄａ”はＤ−アラニンを表す））、発熱性外毒素またはその機能的断片のいずれか１つであり得る。ペプチドｐ１２（配列ＹＮＫＫＫＡＴＶＱＥＬＤを有する）およびｐ１４（配列ＶＱＹＮＫＫＫＡＴＶＱＥＬＤを有する）は好適な超抗原アンタゴニストでもある。
【００６６】
評価項目指標は、１つの実施形態によれば、視覚的に検出可能なシグナルをもたらす相互作用分子とＣＤ２８分子との結合であってよい。この評価項目の阻害または減少が該試験物質とＣＤ２８内の超抗原結合部位とが直接結合していることを示す。例えば、このような結合は相互作用分子と該部位との結合と競合する。
【００６７】
本発明のスクリーニング方法で候補物質を準備、選択するのに使用する混合物は細胞混合物または細胞フリー混合物であり得る。
【００６８】
１つの別の実施形態によれば、本発明の方法で使用する混合物は細胞フリー混合物であってよい。このような混合物は、該ＣＤ２８分子またはその断片が精製された組換えタンパク質、融合タンパク質、および該ＣＤ２８分子を発現する形質転換された宿主細胞の細胞溶解物または膜調製物のいずれか１つとして提供され得る、ＣＤ２８分子またはｓ−Ａｇ結合部位を含んでなるその断片を含む。
【００６９】
あるいは、本発明の方法で使用する混合物は細胞混合物であってよい。好ましくは、細胞混合物がトランスフェクトされた細胞培養物である。
【００７０】
特定の好ましい実施形態では、トランスフェクト細胞がＣＤ２８分子またはその断片をコードする核酸配列を含んでなる発現ベクターでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞である。これらのトランスフェクト細胞は、好ましくは、ＣＤ２８分子と超抗原との相互作用に必要不可欠である内生的または外生的に発現される分子をさらに含む。
【００７１】
本発明のスクリーニング方法で準備、選択される候補物質は、タンパク質系物質、炭水化物系物質、脂質系物質、天然有機物系物質、合成有機物系物質、無機物系物質、およびペプチドミメティックス系物質のいずれか１つであり得る。
このような物質は、例えば、ペプチドのコンビナトリアルライブラリーのポジショナルスキャニング、環状ペプチドミメティックスのライブラリー、およびランダムまたは専用ファージディスプレイライブラリーの産物であってよい。
【００７２】
本発明のスクリーニング方法の第３の工程は選択された候補物質の評価である。この段階において、候補アンタゴニスト物質はＴｈ１リンパ球の毒素媒介性活性化を拮抗するその能力に関して評価され、また、ある発熱性外毒素またはこのような発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を誘発するその能力に関しても評価される。選択された物質（好ましくは、本発明の選択方法により得られたもの）の評価は
（ａ）ＣＤ２８分子またはその断片を含んでなる、好ましくは、ｓ−Ａｇ結合部位を含んでなる試験系を準備する工程、
（ｂ）該系を本発明の方法により準備、選択された候補アンタゴニストと接触させる（該接触は相互作用に好適な条件下で行われる）工程、および
（ｃ）評価項目指標に対する評価する候補アンタゴニストの効果を対照との比較により決定する工程
により行われ得る。
【００７３】
評価項目指標に対する候補アンタゴニストの効果はＣＤ２８分子と発熱性外毒素との直接相互作用を阻害し、それによってＴｈ１リンパ球の毒素媒介性活性化の拮抗をもたらす該候補の能力を示す。
【００７４】
本発明のスクリーニング方法による候補アンタゴニストの評価に使用する試験系は細胞フリー混合物、in-vitro／ex-vivo細胞培養物、またはin-vivo動物モデルであり得る。
【００７５】
このような試験系は、所望により、Ｔ細胞の超抗原誘導性活性化に、および候補アンタゴニストの拮抗効果を決定する評価項目指標の検出に好適な条件を提供する内生および／または外生化合物をさらに含んでなってよい。さらに詳しく言えば、Ｔ細胞がＴｈ１リンパ球であり、かつ、該活性化がＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ遺伝子発現の誘導により決定される。
【００７６】
特定の実施形態によれば、候補アンタゴニストの評価に使用する試験系は可溶性ＣＤ２８分子（ｓＣＤ２８）および可溶性Ｂ７−２分子（ｓＢ７−２）を含んでなる細胞フリー系であり得る。
【００７７】
特に好ましい実施形態では、このような細胞フリー系に関する評価項目指標は好適な手段により検出されるｓＣＤ２８分子とｓＢ７−２分子との結合であり得る。さらに詳しく言えば、該候補アンタゴニストの存在下でのＣＤ２８分子とｓＢ７−２との相互作用の増大が超抗原とＣＤ２８分子との相互作用を特異的に拮抗し、阻害する該候補の可能性を示す。 
【００７８】
あるいは、本発明のスクリーニング方法による評価に使用する試験系は内生的に発現されるＣＤ２８分子を含んでなるin-vitro／ex-vivo細胞培養物であり得る。
【００７９】
特定の例では、試験系として使用する細胞培養物は哺乳類供与体から単離されたＰＢＭＣ培養物であり得る。
【００８０】
よって、この特定の試験系での評価項目指標は視覚的に検出可能なシグナルをもたらすＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γの超抗原誘導性発現であり得る。そのため、該評価項目の阻害あるいは減少は超抗原とＣＤ２８分子との相互作用を特異的に拮抗し、阻害する該候補の可能性を示す。このような阻害によってＴｈ１リンパ球の毒素媒介性活性化の拮抗をもたらす。
【００８１】
さらにもう１つの別の例では、本発明のスクリーニング方法による候補アンタゴニストの評価に使用するin-vivo 試験系は動物モデルであり得る。
【００８２】
１つの特定の実施形態によれば、動物モデルは超抗原を投与したＤ−ガラクトサミン感作マウスであり得る。このような試験系に関する評価項目指標は該マウスの致死毒素性ショックからの防御および救済であり得る。該評価項目の増大が、超抗原とＣＤ２８分子との相互作用を特異的に拮抗し、阻害する、Ｔｈ１リンパ球の発熱性毒素媒介性活性化を拮抗する、毒素性ショックから防御する、また、所望により、ある発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を誘発する該候補物質の可能性を示す。
【００８３】
代替的動物モデルは発熱性外毒素を抗原投与したブタであり得る。このような方法では、評価項目指標は該ブタの毒素性ショックおよび無能力からの防御および救済であり得る。このような評価項目の増大は超抗原とＣＤ２８分子との相互作用を特異的に拮抗し、阻害する、Ｔｈ１リンパ球の発熱性外毒素媒介性活性化を拮抗する、毒素性ショックおよび無能力から防御する、また、所望により、ある発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を誘発する該候補物質の可能性を示す。
【００８４】
本発明はさらに、哺乳類被験体における超抗原関連疾患の治療のための治療用組成物の製造方法を提供する。この方法は
（ａ）Ｔｈ１リンパ球の超抗原媒介性活性化を拮抗し得、また、ある発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を誘発もし得るアンタゴニスト物質を同定する工程、および
（ｂ）該アンタゴニスト物質を少なくとも１つの医薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤および／または添加剤と混合する工程
を含んでなる。
【００８５】
治療用組成物の製造方法で使用するアンタゴニスト物質は、好ましくは、本発明に記載されているスクリーニング方法により同定され得る。
【００８６】
本発明はさらに、本発明の方法による超抗原関連疾患の治療のための医薬組成物の製造におけるＣＤ２８分子またはその断片、好ましくは、ｓ−Ａｇ結合部位を含んでなる断片の使用に関する。
【００８７】
後記の図面により本発明はさらに説明されるが、これらは単なる例示にすぎず、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものではない。
【発明の詳細な説明】
【００８８】
超抗原はほとんどのＭＨＣクラスII分子と直接結合し、抗原提示細胞によるプロセシングを必要としないでＴＣＲのβ鎖可変部分に特定のドメインを有する全てのＴ細胞を実質的に刺激する。ＴＣＲはそのＶβドメインの外面、普通の抗原認識には関係していない領域を介して超抗原と相互作用する。そのため、超抗原は通常の抗原の制限された提示を回避し、それらはＴ細胞の最大５０％のを活性化して、分裂させ、サイトカインを生成させ得る[Arad et al., (2000) 前掲]。
【００８９】
図１〜２７にて示した次の実施例の結果から、今やＴ細胞におけるＴｈ１サイトカインの発現を活性化するためには超抗原がＴ細胞でＣＤ２８受容体を拘束して、それと直接結合する必要があるという驚くべき概念が導かれている。超抗原とＣＤ２８との結合は、ｐ１２またはその誘導体、ｐ１４などのアンタゴニストペプチド（「アンタゴニストドメイン」）と少なくともある程度まで相同性を共有する超抗原ドメインを通じて起こる。驚くべきことに、短いアンタゴニストペプチド、１２〜１４  Ｌ−アミノ酸長は、Ｔ細胞の活性化に関する主要経路であるとこれまで考えられていた超抗原分子におけるＭＨＣクラスII分子またはＴＣＲとの結合部位を競合することによるのではなく、その代わりに超抗原とＣＤ２８との直接結合に干渉することにより、全長超抗原（ＳＥＢは２３８アミノ酸からなる）の作用をブロックする。本発明は最初に抗原とＣＤ２８受容体との結合を例示する。
【００９０】
現在まで、ＣＤ２８はＭＨＣクラスII分子により提示される抗原のＴＣＲへのシグナル伝達、同様に、超抗原によるシグナル伝達を手助けする共刺激リガンドとして作用すると考えられている。本発明者らはここでＣＤ２８が共刺激リガンドよりもむしろ超抗原の作用に必須のリガンドであることを示す。上に述べたように、超抗原はＣＤ２８と直接結合し、Ｔｈ１細胞活性化のためのその必須の不可避的な経路としてＢ７−２／ＣＤ２８リガンド相互作用を利用する。これは新しくかつ驚くべき結果である。図２２ではこの一連の共同結合作用を図式にまとめている。
【００９１】
よって、第１の態様において、本発明は、超抗原と特異的にかつ直接結合するＣＤ２８分子内の超抗原結合部位に関する。
【００９２】
次の実施例により示すように、ＣＤ２８内の超抗原結合部位は抗ＣＤ２８モノクローナル抗体、例えば、ＭＡＢ３４２と呼ばれるマウス抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（R & D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota, USAのクローン  ３７４０７．１１１）と結合するＣＤ２８分子内にあるエピトープと少なくとも一部が重複する。該抗ＣＤ２８モノクローナル抗体と結合するＣＤ２８分子内にあるエピトープは、実施例７で記載されているように、ＰｈＤ−１２コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーをパンニングすることにより同定された。固定化された抗ＣＤ２８  ｍＡｂと結合する能力およびｓＣＤ２８によって表示される能力に関してこのライブラリーをパンニングした。２２ファージから得られたペプチド配列ではヒトＣＤ２８の細胞外ドメインの１３４〜１４２位にあるＨＶＫＧＫＨＬＣＰモチーフ（配列番号３でも示される）と重複するコンセンサスアミノ酸配列が得られた。
【００９３】
そのため、特に好ましい実施形態では、ＣＤ２８内の超抗原結合部位は配列番号３で示されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含んでなる。
【００９４】
本明細書において「エピトープ」とは、抗体が結合でき、その抗体により認識されもする分子の一部を指すことが意図されている。エピトープまたは「抗原決定基」は通常、アミノ酸または糖側鎖などの化学的に活性な表面分子群で構成され、特定の三次元構造特性ならびに特定の電荷特性を有する。
【００９５】
次の実施例にて示すデータからは、超抗原によるＴｈ１細胞応答の活性化が弱い相互作用であることが分かっているＢ７−２／ＣＤ２８相互作用だけに依存しているという新規な概念が導かれる。ＣＤ２８はＢ７イソ型に対してＣＴＬＡ−４のものより１０〜１００倍低い親和性を示し[Ostrov et al., Science 290: 816-819, (2000)]、また、Ｂ７−２はＢ７−１よりも低い親和性でＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４と結合する[Greenfield et al., Crit. Rev. Immunol. 18: 389-418, (1998)]。図１〜２０のデータからは、超抗原がＴＣＲおよびＭＨＣクラスII分子との結合により所定の位置に保持され、その超抗原がＴｈ１細胞のＣＤ２８と一度直接結合すれば、有効なＢ７−２／ＣＤ２８相互作用が可能になるという新規な概念が導かれる。アンタゴニスト、特に、アンタゴニストペプチドによりブロックされるのはこの後者の結合工程である。それに対して、Ｔｈ２細胞はＢ７−２／ＣＤ２８相互作用を必要とせずに超抗原により活性化されるため、Ｔｈ２応答はアンタゴニストペプチドにより抑制されない。
【００９６】
超抗原およびアンタゴニストペプチド各々がＣＤ２８と直接結合する。これらの結果からは、超抗原がＴｈ１細胞活性化に必要なＣＤ２８とＢ７−２との機能的相互作用を促進するブリッジを提供するように作用することが示される。この機能はＴｈ２細胞活性化には必要ではない。
【００９７】
そのため、好ましい実施形態では、本発明のＣＤ２８内の超抗原結合部位でのＣＤ２８分子と超抗原の直接結合がＢ７−２リガンドとＣＤ２８との結合を促進する。さらに詳しく言えば、この特異的な結合がＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ遺伝子発現の誘導により定義されているＴｈ１リンパ球の活性化に必要不可欠である。しかしながら、以下で記載するように、Ｂ７−２リガンドとＣＤ２８との結合はＩＬ−４および／またはＩＬ−１０の誘導により定義されているＴｈ２リンパ球の活性化に必要不可欠ではない。
【００９８】
実施例１により示すように、ＣＤ２８受容体は本明細書においてＳＥＢによるＩＬ−１０の誘導に関して例示される超抗原によるＴｈ２応答の活性化には必要ではない。実際には、抗ＣＤ２８およびｓＢ７−２の両方ともがＴｈ２サイトカインＩＬ−１０の発現を誘導することができなかったが、それらは異なるＴｈ１応答を誘導した。超抗原に対するＴｈ１応答のＣＤ２８シグナル伝達へのこの独自の依存が新しくかつ驚くべきことであり、Ｂ７−２リガンドは超抗原に対するＴｈ１応答に独自に関与するがＢ７−１は関与しないという発見と同じである。
【００９９】
これらの発見はＴｈ１応答のブロッキングにおける超抗原アンタゴニストの選択的作用様式を説明するのに大いに役立つ。超抗原によるＴｈ２細胞の活性化はＣＤ２８を必要とせずにＴＣＲを通じて起こるが、Ｔｈ１細胞の活性化はＴＣＲだけでなく、単に共刺激リガンド経路として普通の抗原が利用するＣＤ２８／Ｂ７−２複合体も絶対要件である。結果として、超抗原によるＴｈ１細胞の活性化は超抗原とＣＤ２８との直接結合相互作用だけに依存している。この依存によりＴｈ１細胞の活性化は超抗原とＣＤ２８との相互作用をブロックするよう作用するアンタゴニストに対して選択的感受性を示すことになる。
【０１００】
超抗原に対する応答は、Ｂ細胞分化、その後に続く抗体応答をもたらすより持続的で長期にわたるＴｈ２サイトカインの発現とは対照的に、細胞免疫応答の最初の数時間以内にＴｈ１サイトカインの一時的発現を引き起こす。超抗原が活性化するためにはＭＨＣクラスII分子、ＴＣＲおよびＣＤ２８／Ｂ７−２と同時に相互作用しなければならないため、本明細書において明らかになったＴｈ１細胞の活性化における超抗原とＣＤ２８との結合およびＣＤ２８／Ｂ７−２相互作用を通じたシグナル伝達という選択要件によってこの応答が厳重に調節されている。これに対して、Ｔｈ２細胞の活性化はＣＤ２８／Ｂ７−２要件を回避していることからあまり厳しく制御されない。
【０１０１】
アンタゴニストペプチドはＴＣＲを通じてシグナル伝達する抗ＣＤ３によるＴｈ１応答またはＴｈ２応答の活性化いずれもをブロックしない。実際には、アンタゴニストペプチドはＴＣＲと接触する領域から十分に離れたところにある超抗原のドメインと相同である[Arad et al., (2000) 前掲]。アンタゴニストペプチドはＴｈ１応答が抑制される条件では超抗原媒介性Ｔｈ２応答をブロックしない。アンタゴニストペプチドは超抗原とＣＤ２８との結合をブロックし、それにより、Ｔｈ２応答には必要ないがＴｈ１応答に必要なＣＤ２８／Ｂ７−２シグナル伝達を妨害するという説がある。アンタゴニストペプチドはＴｈ１応答およびＴｈ２応答の両方に必要とされるＴＣＲを通じたシグナル伝達をブロックしない。
【０１０２】
よって、好ましい実施形態によれば、本発明のＣＤ２８内の超抗原結合部位は発熱性外毒素の空間的に保存されているドメインと特異的にかつ直接結合する。好ましくは、この空間的に保存されているドメインはＭＨＣクラスII分子およびＴＣＲのいずれとの結合にも関係していない。最も好ましくは、発熱性外毒素の空間的に保存されている該ドメインはその中にＳＥＢのドメイン番号に基づき、β鎖７内から始まり、β鎖７を、短いβ鎖８を介して、α−ヘリックス４へと連結し、α−ヘリックス４内で終わる中央ターンを形成する[Arad et al., (2000), (2001) 前掲]。
【０１０３】
実施例５（図１２、１７および２１）の結果をもとに、超抗原またはアンタゴニストペプチドがＢ７−２とＣＤ２８との結合を促進することが分かる。実際には、Ｔｈ１応答の抗ＣＤ２８媒介性活性化はアンタゴニストペプチドによる阻害に対して感受性であるため、抗体により認識されるＣＤ２８内のエピトープはアンタゴニストペプチド（および超抗原）に対する結合部位と少なくとも一部が重複するにちがいない。
【０１０４】
Ｔｈ１応答の抗ＣＤ２８媒介性活性化はｓＢ７−２による阻害に対しても感受性であり、抗体により認識されるＣＤ２８内のエピトープがＢ７−２に対する結合部位に近接してあるはずであることが分かる（図２４によっても示される）。このように、超抗原（またはアンタゴニストペプチド）およびｓＢ７−２に対する結合部位は折りたたまれたＣＤ２８タンパク質分子内に近接して存在する。よって、特に好ましい実施形態によれば、ＣＤ２８内の超抗原結合部位は折りたたまれたＣＤ２８分子内のＢ７−２結合部位に近接してある。
【０１０５】
第２の態様において、本発明は、超抗原関連疾患の治療を必要とする哺乳類被験体における超抗原関連疾患の治療のための方法に関する。本発明の方法はＣＤ２８分子と該超抗原との相互作用を阻害する工程を含んでなる。
【０１０６】
特定の実施形態によれば、ＣＤ２８分子と該超抗原との直接結合の阻害は、該被験体に、ＣＤ２８分子と該超抗原との直接相互作用を阻害する物質の治療上有効な量を投与することにより行われる。さらに詳しく言えば、該物質は超抗原と本発明のＣＤ２８超抗原結合部位との結合を阻害する。あるいは、それを必要とする該被験体に該物質を含んでなる組成物の治療上有効な量を投与してもよい。このような組成物は、所望により、医薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤および／または添加剤をさらに含んでなってもよい。
【０１０７】
さらに詳しく言えば、ＣＤ２８分子と発熱性外毒素との直接相互作用を阻害することにより、Ｔｈ１リンパ球の外毒素媒介性活性化の阻害、毒素性ショックに対する防御をもたらし、さらに、ある発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫の直接誘発もまたもたらし得る。
【０１０８】
本明細書において用いる治療上「有効な量」とは、当技術分野では公知であるような考慮すべき事柄により決定される量である。その量はＣＤ２８分子と発熱性外毒素との直接相互作用を阻害し、Ｔ細胞の毒素媒介性活性化を拮抗するのに十分である必要がある。
【０１０９】
本発明の方法により使用する医薬組成物は単位投与形に調製することができ、製薬業界で周知のいずれの方法によっても調製し得る。さらに、医薬組成物は医薬上許容される担体、賦形剤または安定剤などの医薬上許容される添加剤、および、所望により、他の治療成分をさらに含んでなってもよい。当然、許容される担体、賦形剤または安定剤は使用する用量および濃度においては受容者に対する毒性はない。
【０１１０】
本発明の組成物の治療量の大きさは、当然、患者群（年齢、性別など）、治療する状態の性質、および投与経路に応じて異なり、担当医師が判断する。
【０１１１】
本発明の方法は、特に、ヒトにおける超抗原関連疾患の治療を対象としているが、他の哺乳類も含まれる。限定されない例示として、哺乳類被験体としては、サル、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットなどの齧歯動物、ならびにブタが挙げられる。
【０１１２】
さらにもう１つの好ましい実施形態では、超抗原が発熱性外毒素であり得る。好ましくは、発熱性外毒素が細菌外毒素であり得、最も好ましくは、この外毒素が黄色ブドウ球菌および化膿連鎖球菌のいずれか１つにより産生され得る。本発明の方法により治療される超抗原関連疾患は、特定の実施形態によれば、ある発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される、毒素性ショック、無能力および死のいずれか１つであり得る。
【０１１３】
本発明はさらに、このような治療を必要とする被験体においてＴｈ１リンパ球の発熱性外毒素媒介性活性化を阻害し、ある発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックから防御する方法を提供する。この方法は、該被験体に、ＣＤ２８分子と該発熱性外毒素との直接相互作用を阻害する物質または該物質を含んでなる組成物の治療上有効な量を投与することを含んでなる。本発明の組成物は、所望により、医薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤および／または添加剤をさらに含んでなってもよい。
【０１１４】
さらに、本発明は、このような治療を必要とする被験体においてある発熱性外毒素により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を誘発する方法を提供する。このような方法は、被験体に、ＣＤ２８分子と該発熱性外毒素との直接相互作用を阻害する物質または該物質を含んでなり、所望により、医薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤および／または添加剤をさらに含んでなってもよい組成物の免疫学上有効な量を投与することを含んでなる。
【０１１５】
ＣＤ２８と超抗原との直接相互作用を阻害する物質が、例えば、低免疫原性と比較的急速なクリアランスを有するペプチド（例えば、ｐ１２Ａおよびｐ１４Ａ）である場合、このようなアンタゴニストペプチドに対する抗体は検出することができない。しかしながら、アンタゴニストペプチドは毒素性ショックをもたらす細胞免疫応答を誘導する毒素の能力をブロックすることにより、超抗原にそれ自身に対して向けられる活発な体液性免疫応答を誘導させる。これらの条件下で、超抗原はそれ自身のアジュバントとして作用する。そのため、超抗原に曝露されている間にアンタゴニストペプチドにより（ＣＤ２８−超抗原相互作用を阻害することにより）致死毒素性ショックを阻止する場合、治療した被験体は、異なる毒素によるものであってもさらなる毒素攻撃に対する防御免疫を獲得し、防御抗毒素抗体を生み出し得る。よって、ＣＤ２８分子と超抗原毒素との直接相互作用を阻害する物質を使用することにより、該発熱性外毒素により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を間接的に誘発し得る。
【０１１６】
「免疫学上有効な量」とは、発熱性外毒素により誘導されるＴ細胞活性化をブロックし、ある発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を与える抗体の産生を増強させるのに十分な量を意味する。
【０１１７】
さらにもう１つの態様では、本発明は、超抗原と本発明に記載のＣＤ２８内超抗原結合部位との結合を阻害する物質に関する。具体的に言えば、該超抗原は発熱性外毒素であり得る。
【０１１８】
本発明のこの態様の好ましい実施形態によれば、本発明の物質により該発熱性外毒素と該ＣＤ２８超抗原結合部位との結合を阻害することにより、Ｔｈ１リンパ球の毒素媒介性活性化の拮抗もたらし、さらに、該発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫の間接的な誘発ももたらし得る。さらに詳しく言えば、この結合は本発明に記載のＣＤ２８内超抗原結合部位を介する。
【０１１９】
本願を通じて用いる「毒素媒介性活性化」とは、１種類の発熱性外毒素またはこのような毒素の混合物により媒介されるＴ細胞の活性化を意味し得る。
もう１つの実施形態では、本発明の物質は超抗原関連疾患の治療における使用を対象としている。
【０１２０】
アンタゴニスト物質、好ましくは、アンタゴニストペプチドは、急性毒素性ショック、および発熱性外毒素により誘導される、例えば、食中毒事故が原因とされ得る悪影響いずれもの緊急治療に、ならびにこのような毒素性ショックに対する長期的な防御免疫の付与に用いることができる。
【０１２１】
本発明はさらに、超抗原関連疾患の治療のための医薬組成物の製造における本発明のアンタゴニスト物質の使用に関する。このような疾患はある発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される、毒素性ショック、無能力および死のいずれか１つであり得る。
【０１２２】
ヒトにおいて、例えば、発熱性外毒素への曝露によって起こる毒素性ショックは２つの異なる要素：（１）無能力および（２）死を有する。致死濃度よりも数対数値低い濃度においてさえ、発熱性外毒素は重度に無能力化し、高い死亡率の原因となる[USAMRIID Manual, (1998) Eitzen E, Pavlin J, Cieslak T, Christopher G, Culpepper R, eds. Medical Management of Biological Casualties Handbook. 3rd ed. Fort Detrick, Maryland: United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 1998]。例えば、集団中毒となり得る食中毒で認められる無能力応答は数多くの人々に影響を与える。さらに、無能力応答は 軍事的脅威および国家安全保障に対する脅威であり得る。
【０１２３】
第４の態様において、本発明は、超抗原関連疾患の治療および／または予防のための医薬組成物に関する。本発明の組成物は、有効成分として、ＣＤ２８分子と該発熱性外毒素との直接相互作用を阻害する物質の治療上有効な量を含んでなる。このような阻害により、Ｔｈ１リンパ球の毒素媒介性活性化の拮抗をもたらす。この組成物は、所望により、少なくとも１つの医薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤および／または添加剤をさらに含んでなってもよい。
【０１２４】
次の実施例により示すように、可溶性ＣＤ２８分子（ｓＣＤ２８）は超抗原（ＳＥＢ）と膜ＣＤ２８受容体分子内の超抗原結合部位との相互作用を阻害するアンタゴニスト物質としての機能を果たし得る。さらに詳しく言えば、図７および８から、ｓＣＤ２８分子はＴｈ１リンパ球のＳＥＢ媒介性活性化を特異的に阻害する（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）が、Ｔｈ２活性化を阻害しないことがはっきりと示されている（ＩＬ−１０）。よって、ｓＣＤ２８またはＣＤ２８の超抗原結合部位を含んでなるその断片は超抗原との結合に関してＣＤ２８トランスメンブラン型受容体と競合し得る。
【０１２５】
このように、ｓＣＤ２８、ならびにＣＤ２８分子の超抗原結合部位を含んでなる断片をＣＤ２８と超抗原との相互作用を阻害する物質として使用してもよい。
【０１２６】
よって、このような物質の特定の例は、ＣＤ２８分子内の超抗原結合部位内に含まれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する単離および精製されたペプチドに関する本発明のさらなる態様により提供される。
【０１２７】
本発明のペプチドとＣＤ２８分子内の相当する領域との相同性は、１０％〜１００％相同性、好ましくは、２０％〜９０％相同性、最も好ましくは、３０％〜８０％相同性に及ぶと思われる。
【０１２８】
１つの好ましい実施形態では、本発明のペプチドは抗ＣＤ２８モノクローナル抗体により認識されるＣＤ２８分子内にあるエピトープを含んでなるアミノ酸配列を有する。さらに詳しく言えば、この抗ＣＤ２８モノクローナル抗体はＭＡＢ３４２と呼ばれるマウス抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（R & D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota, USAのクローン  ３７４０７．１１１）であり得る。
【０１２９】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明のペプチドは配列番号３および５のいずれか１つで示される配列またはその機能的断片および誘導体を含んでなる。配列番号３の断片の特定の限定されない例は配列番号４のＨＶＫＧＫＨモチーフで提供される。
【０１３０】
特に好ましい実施形態によれば、本発明のペプチドはｐＴＡと呼ばれ、かつ、配列番号５のアミノ酸配列またはその機能的断片および誘導体を有する。
【０１３１】
実施例により示すように、本発明のペプチドはＣＤ２８分子と該発熱性外毒素との直接相互作用を阻害する。
【０１３２】
このペプチドはＴリンパ球の毒素媒介性活性化についてのアンタゴニストであり得、ある発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックから防御し、ある発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を間接的に誘発もし得る。アンタゴニストペプチドは毒素性ショックをもたらす細胞免疫応答を誘導する毒素の能力をブロックすることにより、超抗原にそれ自身に対して向けられる活発な体液性免疫応答を誘導させ得る。そのため、治療した被験体は、さらなる毒素攻撃に対する防御免疫を獲得し、防御抗毒素抗体を生み出し得る。
【０１３３】
よって、アンタゴニスト物質、好ましくは、アンタゴニストペプチドは、急性毒素性ショック、および発熱性外毒素により誘導される、例えば、食中毒事故が原因とされ得る悪影響いずれもの緊急治療、ならびにこのような毒素性ショックに対する長期的な防御免疫の付与に用いることができる。
【０１３４】
本明細書において用いる「誘導体および機能的誘導体」とは、ＣＤ２８と超抗原との相互作用を抑制する、外毒素により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を誘発する、および／またはＴ細胞の毒素媒介性活性化を拮抗するペプチドの能力に干渉しないペプチドへの挿入、欠失、置換および修飾を有する、配列番号３のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを意味する（以下、「誘導体」と呼ぶ）。誘導体は該超抗原結合部位に対して最小限の相同性（例えば、３０％未満でも）を維持すべきである。当然のことではあるが、本明細書において用いる「挿入」とは、本発明のペプチドへのアミノ酸残基（１〜５０アミノ酸残基、好ましくは、１〜２０アミノ酸残基、最も好ましくは、１〜１０アミノ酸残基）の付加を意味する。特定の例が配列番号５のｐＴＡアンタゴニストペプチドを創生する７アラニン残基のエピトープへの付加である。
【０１３５】
可能性ある立体構造のいくつかのものだけが活性であり得るため、直鎖ペプチドの構造の欠落はそれらをヒト血清中のプロテアーゼに対して弱くならしめ、標的部位に対するそれらの親和性が低下する。そのため、例えば、本発明の種々のペプチドの異なる誘導体を創生することにより、アンタゴニストペプチド構造を最適化することが望ましい。
【０１３６】
ペプチド構造を改良するため、本発明のペプチドをそれらのＮ末端を通じてラウリル−システイン（ＬＣ）残基と、および／またはそれらのＣ末端を通じてシステイン（Ｃ）残基と、または以下にさらに詳細に述べるように免疫化のためのペプチドのアジュバントへの連結に好適な他の残基と結合してもよい。
【０１３７】
本発明のペプチド、ならびにその誘導体は全てが正に帯電していてもよいし、負に帯電していてもよいし、または中性であってもよく、また、二量体、多量体形態であってもよいし、または制限のあるコンホメーションであってもよい。制限のあるコンホメーションは内部ブリッジ、近域環化、伸長または他の化学修飾により得ることができる。
【０１３８】
さらに、本発明のペプチドは同じまたは異なるアミノ酸残基各種を用いてそのＮ末端および／またはＣ末端にて伸長し得る。このような伸長の例として、ペプチドは同じまたは異なる疎水性アミノ酸残基（天然または合成アミノ酸残基であってよい）を用いてそのＮ末端および／またはＣ末端にて伸長してもよい。好ましい合成アミノ酸残基はＤ−アラニンである。
【０１３９】
このような伸長のさらなる例は、システイン残基を用いてそのＮ末端および／またはＣ末端の両方にて伸長されたペプチドにより与え得る。当然、このような伸長は、ジスルフィド結合の形成によって起こるＣｙｓ−Ｃｙｓ環化により制限のあるコンホメーションをもたらし得る。
【０１４０】
もう１つの例はＮ末端リシル−パルミトイルテール、リンカーとして働くリジンおよび疎水性アンカーとしてのパルミチン酸の組込みである。
【０１４１】
さらに、ペプチドは芳香族アミノ酸残基（天然または合成アミノ酸残基であってよい）により伸長し得る。好ましい芳香族アミノ酸残基はトリプトファンである。あるいは、ペプチドを天然に起こる発熱性外毒素のアミノ酸配列の相当する位置に存在するアミノ酸を用いてそのＮ末端および／またはＣ末端にて伸長してもよい。
【０１４２】
それでもなお、本発明によれば、本発明のペプチドは同じまたは異なる有機部分各種（天然または合成アミノ酸ではない）を用いてそのＮ末端および／またはＣ末端にて伸長し得る。このような伸長の例として、ペプチドはＮ−アセチル基を用いてそのＮ末端および／またはＣ末端にて伸長してもよい。
【０１４３】
本発明により使用し、本明細書において開示する１つ１つのペプチド配列に対し、本発明はペプチド鎖の方向が逆になっており、かつ、全てのアミノ酸がＤ型に属している対応するretro-inverso配列を包含する。
【０１４４】
当然のことではあるが、本発明はまた、配列番号３で示されるアミノ酸配列の一部または全てを含んでなる塩基性エピトープ配列、またはｐＴＡの塩基性ペプチド配列（配列番号５）が約２〜約１００回反復される長いペプチドも包含する。
【０１４５】
さらにもう１つの態様では、本発明は、超抗原とＣＤ２８内の超抗原結合部位との直接相互作用を阻害する組成物に関する。この組成物は有効成分として、単離および精製されたペプチドを、該相互作用を阻害するのに有効な量で含んでなる。この実施形態によれば、このペプチドはＣＤ２８分子内の超抗原結合部位内に含まれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する。
【０１４６】
さらに、本発明は、Ｔリンパ球の発熱性外毒素媒介性活性化を阻害し、ある発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックから防御する組成物に関する。この実施形態によれば、本発明の組成物は有効成分として、単離および精製されたペプチドを、ＩＬ−２、ＩＮＦ−γおよび／またはＴＮＦ−α遺伝子によりコードされるＲＮＡの外毒素誘導性発現を阻害するのに有効な量で含んでなる。このペプチドはＣＤ２８分子内の超抗原結合部位内に含まれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する。
【０１４７】
好ましい実施形態では、本発明の組成物に含まれる単離および精製されたペプチドは配列番号３、配列番号４および配列番号５のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列またはその機能的断片を有する。注目すべきは、これらの組成物は本発明に記載されているペプチドの組み合わせを含んでなってよく、また、所望により、医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバントおよび／または 賦形剤をさらに含んでなってもよいことである。
【０１４８】
特定の好ましい実施形態では、本発明の組成物に含まれるペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列またはその機能的断片および誘導体を有するｐＴＡと呼ばれるペプチドであり得る。 
【０１４９】
もう１つの実施形態では、本発明は、哺乳類被験体における超抗原関連疾患の治療のための医薬組成物に関する。この組成物は有効成分として本発明の単離および精製されたペプチドを含んでなる。
【０１５０】
本発明はさらに、このような治療を必要とする患者においてＴリンパ球の発熱性外毒素媒介性活性化を阻害し、ある発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックから防御する方法を提供する。本発明の方法は、患者に、ＣＤ２８分子内の超抗原結合部位内に含まれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する単離および精製されたペプチドまたはそれを含んでなる組成物の阻害に有効な量を投与することを含んでなる。
【０１５１】
この態様の好ましい実施形態では、本発明の方法に使用するペプチドは配列番号３、配列番号４および配列番号５のいずれか１つのアミノ酸配列またはその機能的断片および誘導体を有するペプチドから選択され得る。好ましくは、ペプチドは配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する。
【０１５２】
特定の実施形態では、この方法に使用するペプチドは配列番号５のアミノ酸配列またはその機能的断片および誘導体を有するｐＴＡと呼ばれるペプチドであり得る。 
【０１５３】
もう１つの実施形態では、本発明は、超抗原関連疾患を予防および／または治療する方法であって、このような治療を必要とする患者に、少なくとも１つの単離および精製されたペプチドまたはそれを含んでなる組成物の治療上有効な量を投与する工程を含んでなる方法に関する。よって、このペプチドは本発明に記載されているように、ＣＤ２８分子内の超抗原結合部位内に含まれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する。好ましくは、この方法に使用するペプチドはｐＴＡと呼ばれ、かつ、配列番号５のアミノ酸配列またはその機能的断片および誘導体を有する。
【０１５４】
本発明はさらに、本発明に記載されている組成物の製造におけるこのペプチドの使用を提供する。
【０１５５】
本発明の医薬組成物は良質の医療に従って投与することができるし、服用させることもできる。投与は静脈注射、筋肉注射または皮下注射をはじめとする種々の方法により実施し得る。しかしながら、経鼻投与などの他の投与方法もまた可能である。
【０１５６】
本発明の組成物は活性物質を自由な形態で含んでなってよく、治療する被験体にそのまま投与してもよい 。あるいは、活性分子の大きさに応じて、投与の前にそれを担体と複合体化することが望ましいと思われる。治療用の製剤は従来の剤形で投与し得る。製剤は、一般に、上記のような少なくとも１種の有効成分を１種以上のその許容される担体とともに含んでなる。
【０１５７】
各担体は他の成分と適合性があり、かつ、患者にとって有害ではないという意味で医薬上許容されるべきであり、また、生理学上許容されるべきである。製剤としては、経口、直腸、経鼻、または非経口（皮下、筋肉内、腹膜内（ＩＰ）、静脈内の（ＩＶ）および皮内を含む）投与に好適なものが挙げられる。製剤は便宜には、単位投与形で与えられ、製薬業界で周知の方法により製剤され得る。被験体に望ましい効果を与えるのに必要な有効量を含むそのような全ての化合物の性質、アベイラビリティーおよび供給元、ならびに投与については当技術分野では周知であり、本明細書においてはこれ以上述べる必要はない。
【０１５８】
さらに詳しく言えば、該アンタゴニスト物質またはそれを含んでなる組成物は、経口、静脈内、非経口、経皮、皮下、膣内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所および直腸投与ならびにその組合せから選択される経路により投与され得る。好ましくは、これらのアンタゴニストまたは組成物はＩＶまたはＩＰ注射される。
注入用に好適な剤形としては、滅菌水性溶液または分散液および滅菌注入用溶液または分散液の即時調合用滅菌粉末が挙げられる。いかなる場合でも、製剤は滅菌状態でなければならず、また、注射針を容易に通過し得る程度に流動性がなければならない。製造および保管条件下では安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から守らなければならない。
【０１５９】
微生物の作用は種々の抗菌薬および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより防止し得る。多くの場合、等張化剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含んでいることが好ましいであろう。注入用組成物において吸収を遅延する薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を使用することで組成物の長期吸収をなし得る。
【０１６０】
滅菌注入用溶液は、好適な溶媒に所要量の活性化合物と上記の様々な他の成分とを合せ、必要に応じて、その後、滅菌濾過することにより調製される。一般に、分散液は、種々の滅菌済み有効成分を、塩基性分散媒と上記のもののうち必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに合せることにより調製される。
【０１６１】
滅菌注入用溶液の調製用滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は有効成分にさらなる所望の成分を加えた予め滅菌濾過した溶液からその粉末を得る真空乾燥および凍結乾燥法である。
【０１６２】
本発明の医薬組成物は、一般に、緩衝剤、その浸透圧を調整する薬剤、および、所望により、当技術分野で公知の１種以上の医薬上許容される担体、賦形剤および／または添加剤を含む。また、組成物に追加有効成分を入れることもできる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であってよい。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散液の場合には必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。
【０１６３】
本明細書において用いる「医薬上許容される担体」としては、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬などが挙げられる。医薬活性物質に関するこのような媒質および薬剤の使用については当技術分野では周知である。従来の媒質または薬剤が有効成分と混合できない場合を除き、治療用組成物におけるその使用が意図される。
【０１６４】
本発明により示すように、超抗原アンタゴニストペプチドの細胞標的はＣＤ２８である。これは、毒素性ショックおよび細胞免疫応答（および特に、Ｔｈ１応答）の超抗原媒介性過剰刺激の他の結末、例えば、死、ならびに吐き気、嘔吐、および下痢症状が現れる毒素無能力を阻止するアンタゴニストの設計のために初めて細胞薬剤標的を提供する。最も重要なことだが、本発明によってようやく超抗原とＣＤ２８受容体との相互作用の新規なアンタゴニストの設計が、本明細書において例示するアンタゴニストペプチドによっても、小分子または酵素もしくはタンパク質によっても可能になった。本発明は、例えば、ランダムまたは特定の(dedicated)ペプチドライブラリーのファージディスプレイを通じて、ペプチドライブラリーのポジショナルスキャニングを通じて、または環状ペプチドミメティックスのライブラリーから、選択されたアンタゴニスト分子の結合のためのベイト（おとり）としてＣＤ２８（好ましくは、可溶型であるか、または自然発生的か、トランスフェクション後かに細胞で発現されるものである）を使用することによる毒素性ショックアンタゴニストを見つけるための新たな戦略を提供する。
【０１６５】
よって、さらなる態様において、本発明は、ＣＤ２８分子と特異的に結合し、Ｔｈ１リンパ球の発熱性外毒素媒介性活性化を拮抗し得る試験物質に関してスクリーニングする方法に関する。さらに、該物質はある発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を間接的に誘発し得る可能性がある。本発明のスクリーニング方法は
（ａ）ＣＤ２８分子と結合する候補アンタゴニスト物質を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたＣＤ２８結合物質からＣＤ２８分子と該超抗原との直接相互作用を阻害する物質を選択する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた物質のＴｈ１リンパ球の超抗原媒介性活性化に対する拮抗効果を決定する工程
を含んでなる。
【０１６６】
ポジショナルスキャニングおよび環化化学により生み出されるアンタゴニストペプチドの高親和性結合に関するハイスループットスクリーニングの適用への鍵が感度の良い便宜なスクリーニングアッセイの開発である。
【０１６７】
アンタゴニスト物質、好ましくは、アンタゴニストペプチドの、超抗原により認識されるドメインにあるＣＤ２８標的に対するそれらの親和性による強力なスクリーニングアッセイの開発が該スクリーニング方法における第一歩であろう。
【０１６８】
好ましい実施形態では、本発明のスクリーニング方法に使用する候補アンタゴニスト物質は
（ａ）ＣＤ２８分子またはその断片（具体的に言えば、好ましい断片は、例えば、本発明に記載の結合部位を含む可溶性細胞外ドメインまたはその一部、さらに具体的に言えば、配列番号３で示されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含んでなる断片であり得る）を含む混合物を準備する工程、
（ｂ）（ａ）の混合物を該結合に好適な条件下にて試験物質と接触させる工程（条件はＣＤ２８とアンタゴニストペプチド  ｐ１２およびｐ１４などの相互作用分子との相互作用に関して最適化する）、および
（ｃ）評価項目指標に対する試験物質の効果を判定する工程（ここで、該評価項目についての変化がＣＤ２８分子と該試験物質とが結合していることを示す）
により得られ得る。
【０１６９】
特定の実施形態によれば、評価項目指標は抗ＣＤ２８抗体とＣＤ２８分子との結合であり得る。この結合は視覚的に検出可能なシグナルをもたらす。このような場合には、この評価項目の増大が該試験物質とＣＤ２８分子とが結合していることを示す。
【０１７０】
さらに詳しく言えば、各候補物質、または、好ましくは、ペプチドをウェルに入れ、ｓＣＤ２８の直接結合を、好ましくは、ＣＤ２８に対する市販のタグ付きポリクローナル抗体により検出する。プレート上のｓＣＤ２８とアンタゴニストペプチドとを効率的に結合させる条件はアンタゴニストペプチドｐ１２およびｐ１４を用いて最初に最適化する。これにはｐＨ、塩およびバッファーの組成研究、ＢＳＡなどの担体タンパク質を必要とする。この強力なスクリーニングによりｓＣＤ２８と結合する物質、好ましくは、ペプチドが得られる。
【０１７１】
ｓＣＤ２８と結合する物質（特にペプチド）をプールした後、下記のようにアッセイする。
【０１７２】
本発明のスクリーニング方法の第１の工程に使用する抗ＣＤ２８抗体はポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれか１つであってよい。タンパク質に対するポリクローナル抗体の作製については、例えば、Current Protocols in Immunologyの第２章, Wiley and Sons Inc.に記述されている。
【０１７３】
モノクローナル抗体は免疫動物、特にラットまたはマウスの脾臓またはリンパ節から採取したＢ細胞から、ハイブリッド細胞の増殖に有利な条件下での不死化Ｂ細胞との融合により作製し得る。モノクローナル抗体の作製方法については、上記の、Current Protocols in Immunologyの第２章などの数多くの論文およびテキストで記述されている。
【０１７４】
「抗体」とは、抗原と結合し得る無傷分子ならびに例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２などのそのフラグメントを包含するよう意図される[Wahl et al., J. Nucl. Med. 24, 316-325, 1983]。
【０１７５】
当然のことではあるが、本発明において有用な抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに他のフラグメントは、無傷抗体分子に関して本明細書において開示する方法による結合したＣＤ２８分子の検出および定量に使用し得る。このようなフラグメントは、一般に、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生ずる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生ずる）などの酵素を用いるタンパク分解性切断により生ずる。
【０１７６】
本発明のスクリーニング方法の第２の工程では、（好ましくは、上記のように得られた）ＣＤ２８と結合する候補アンタゴニスト物質を、ＣＤ２８分子と本発明の新規なＣＤ２８内超抗原結合部位にて特異的に結合するそれらの能力に関してさらに選択し得る。このように選択された物質は、望ましくは、ＣＤ２８分子と該超抗原との相互作用を阻止し得る。この実施形態によれば、このような物質の選択は
（ａ）ＣＤ２８分子またはｓ−Ａｇ結合部位を含んでなるその断片を含む混合物を準備する工程、
（ｂ）該混合物を、ＣＤ２８内の超抗原結合部位によるＣＤ２８分子との特異的相互作用に好適な条件下にて該候補試験物質と接触させる工程、および
（ｃ）評価項目指標に対する試験物質の効果を判定する工程（ここで、該評価項目についての変化が該超抗原結合部位によりＣＤ２８分子と試験物質とが結合していることを示す）
により行われ得る。
【０１７７】
特に好ましい実施形態によれば、選択プロセスに使用する混合物は
（ａ）ＣＤ２８分子またはその断片（例えば、本発明の結合部位、好ましくは、配列番号３で示されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含んでなる結合部位を含む可溶性細胞外ドメインまたはその一部である）、
（ｂ）ＣＤ２８と本発明のＣＤ２８内の超抗原結合部位にて特異的に結合する既知分子である相互作用分子、および
（ｃ）所望により、このような相互作用分子とＣＤ２８分子との相互作用に、および相互作用分子とＣＤ２８分子との相互作用に関する評価項目指標の検出に好適な条件を提供する溶液、バッファーおよび化合物
を含んでなる。
【０１７８】
本明細書において用いる「断片および機能的断片」とは、超抗原結合部位を含み、かつ、超抗原と結合することができ、そして、Ｂ７−２分子の結合を促進し、それによりＴｈ１細胞の特異的活性化を誘導する、挿入、欠失、置換および修飾を有するＣＤ２８標的分子またはその断片を意味する（以下、「断片」と呼ぶ）。
【０１７９】
特定の実施形態では、相互作用分子は、限定されるものではないが、ＭＡＢ３４２と呼ばれるマウス抗ＣＤ２８抗体（R & D Systemsのクローン  ３７４０７．１１１）をはじめとする抗ＣＤ２８モノクローナル抗体、配列番号１で示されるアンタゴニストペプチドｐ１２、配列番号２で示されるアンタゴニストペプチドｐ１４および発熱性外毒素またはその機能的断片のいずれか１つであり得る。本発明により例示されるように、このような相互作用分子はＣＤ２８内の本発明の超抗原結合部位に対して特異的な親和性を提示する。
【０１８０】
本発明のスクリーニング方法に使用するアンタゴニストｐ１２およびｐ１４、ならびにその誘導体は全てが正に帯電していてもよいし、負に帯電していてもよいし、または中性であってもよく、また、二量体、多量体形態であってもよいし、または制限のあるコンホメーションであってもよい。制限のあるコンホメーションは内部ブリッジ、近域環化、伸長または他の化学修飾により得ることができる。
【０１８１】
評価項目指標は、１つの実施形態によれば、視覚的に検出可能なシグナルをもたらす相互作用分子とＣＤ２８分子との結合であってよい。この評価項目の阻害または減少が試験物質とＣＤ２８内の本発明の超抗原結合部位とが直接結合していることを示す。この結合は相互作用分子と該部位との結合と競合する。この競合アッセイを実施するために、相互作用分子を、例えば、ビオチン化によるか、またはフルオレセインの付加により直接標識してもよいし、あるいは、二次抗体により間接的に標識してもよい。
【０１８２】
本発明のスクリーニング方法で候補物質を準備、選択するのに使用する混合物は細胞混合物または細胞フリー混合物であり得る。
【０１８３】
１つの別の実施形態によれば、本発明の方法で使用する混合物は細胞フリー混合物であってよい。このような混合物は、精製された組換えタンパク質、融合タンパク質および該ＣＤ２８分子を発現する形質転換された宿主細胞の細胞溶解物または膜調製物のいずれか１つとして提供され得るＣＤ２８分子またはその機能的断片（好ましくは、ｓ−Ａｇ結合部位を含んでなる）を含んでなる。
【０１８４】
実施例９で記載されているように、本明細書において用いる精製された組換えＣＤ２８タンパク質の特定の限定されない例は、ＣＤ２８分子の細胞外ドメインを含んでなるキメラｓＣＤ２８／Ｆｃホモ二量体分子である。ｓＣＤ２８はR & D Systems(Minneapolis)提供のものであり、キメラｓＣＤ２８／Ｆｃホモ二量体（各単量体はグリコシル化前には４２．２ｋＤａのタンパク質であるが、実際に発現される高度にグリコシル化された形においては６０〜７０ｋＤａに達している）からなる。もう１つの特定の例が配列番号３の一部または全てを含んでなるアミノ酸配列を有するｓ−Ａｇ結合部位を含むＣＤ２８の断片であってよい。
【０１８５】
本発明のスクリーニング方法のこのような選択工程は、例えば、ｓＣＤ２８をマイクロプレートのウェル上に固定化して実施してもよい。アンタゴニストペプチドとプレート上のｓＣＤ２８とを効率的に結合させる条件はアンタゴニストペプチドｐ１２およびｐ１４を用いて最初に最適化する。次いで、各ウェルをアンタゴニスト物質、好ましくは、ペプチド（単独またはプール）の存在下で相互作用分子として限界量の抗ＣＤ２８  ｍＡｂとともにインキュベートする。各ウェルの上清を集める。上清中の結合していないｍＡｂを二次抗体ＥＬＩＳＡにより検出する。アンタゴニスト物質がｍＡｂにより認識されるドメイン内のｓＣＤ２８としっかりと結合すれば、それは抗ＣＤ２８とｓＣＤ２８との結合において競合し、自由なｍＡｂが放出される。このｍＡｂはゼロのバックグラウンドに対して検出され得るためにアッセイの感度が高まる。候補アンタゴニスト物質またはペプチドの、抗ＣＤ２８／ＣＤ２８相互作用に関与するドメインの外側での結合はこのアプローチにより排除される。本発明のデータは、本発明者らが使用したモノクローナル抗ＣＤ２８が超抗原の結合部位と重複しているエピトープを認識することを示している。図２４により示すように、このエピトープ（配列番号３で示されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含んでなる）はヒト、ネズミ、ラットおよびウサギＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４分子間ならびにＢ７−２リガンドの結合部位の一部を構成するヒトＣＴＬＡ−４で保存されるＭＹＰＰＰＹモチーフ（配列番号８でも示される）に近接してある[Schwartz et al., Nature 410: 604-608, (2001)]。このことから、ＣＤ２８での超抗原のアンタゴニストドメインの結合またはＣＤ２８での近接したＢ７−２結合部位の結合のいずれかをブロックする特定の物質またはペプチドを得てもよい。
【０１８６】
別のアプローチは、相互作用分子としてビオチン化したＳＥＢ(Toxin Technologies)を使用し、標識したＳＥＢをプレート上のｓＣＤ２８との結合から外すペプチドの能力に関してアッセイすることである。さらにもう１つの別のアプローチは、相互作用分子として標識したｐ１２を使用し、標識をプレート上のｓＣＤ２８との結合から外すペプチドの能力に関してアッセイすることである。システインタグ付きｐ１２を使用して、ビオチンまたはフルオレセインを連結してもよい。明確で一見便宜ではあるが、これらのワン工程スクリーニング方法は対照における１００％結合状態からの減少を測定するために感度が低いと思われる。
【０１８７】
あるいは、本発明の方法による選択工程に使用する混合物は細胞混合物であってよい。好ましくは、細胞混合物はトランスフェクトされた細胞培養物であり得る。
【０１８８】
特定の好ましい実施形態では、トランスフェクト細胞がＣＤ２８分子またはその断片（好ましくは、ｓ−Ａｇ結合部位を含んでなる断片）をコードする核酸配列を含んでなる発現ベクターでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞である。ＣＤ２８  ｃＤＮＡを本発明者らの研究室でトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞での一時的発現に通常使用されているベクターに、強力な骨髄増殖性肉腫ウイルスプロモーター下に、かつＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの上流にクローニングする[Ben-Asouli et al., Cell 106: 221-232 (2002)]。
【０１８９】
この特定の実施形態では、各候補アンタゴニスト、好ましくは、ペプチドをウェルに入れ、次いで、ウェルをＢＳＡまたはウシ胎児血清でブロックする。肉眼でまたは抗ＣＤ２８  ＥＬＩＳＡにより細胞表面でＣＤ２８を発現するＢＨＫ−２１細胞の結合にスコアをつける。あるいは、ＣＤ２８発現細胞から準備した細胞膜を使用してもよく、結合を抗ＣＤ２８抗体を用いて検出する。次いで、決定的な候補アンタゴニスト物質を競合相手として相互作用分子、例えば、ＳＥＢまたはｐ１４の存在下で再検討する。
【０１９０】
本明細書において用いる「ベクター」とは、宿主のゲノムにＤＮＡ断片を組み込むことが可能なプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡ断片および他のビヒクルを包含する。発現ベクターは、一般に、所望の遺伝子またはその断片を含むＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を自己複製するものであり、好適な宿主細胞で認識され、所望の遺伝子の発現をもたらす遺伝子制御エレメントに機能しうる形で連結される。これらの制御エレメントは好適な宿主内での発現を達成することができる。一般に、遺伝子制御エレメントとしては、原核生物プロモーター系または真核生物プロモーター発現制御系を挙げることができる。これは、一般に、転写プロモーター、転写開始を制御する任意のオペレーター、ＲＮＡ発現レベルを高める転写エンハンサー、好適なリボソーム結合部位をコードする配列、ＲＮＡスプライス部位、転写および翻訳を終結させる配列などを含む。発現ベクターは通常、宿主細胞とは無関係にベクターを複製させる複製起点を含む。
【０１９１】
ベクターはベクターを含む細胞の選択に好適な制限部位、抗生物質耐性または他のマーカーをさらに含んでいてもよい。プラスミドが最も一般に使用される種類のベクターであるが、同等の機能を果たし、かつ、当技術分野では公知であるか、または公知となる他の種類のベクターも本明細書における使用に好適である。例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Pouwels et al., Cloning Vectors: a Laboratory Manual (1985および追補版), Elsevier, N. Y.;およびRodriquez, et al. (eds.) Vectors: a Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses, Buttersworth, Boston, Mass (1988)を参照。
【０１９２】
本発明のスクリーニング方法で準備、選択される候補物質は、タンパク質系物質、炭水化物系物質、脂質系物質、天然有機物系物質、合成有機物系物質、無機物系物質、およびペプチドミメティックス系物質のいずれか１つであり得る。
【０１９３】
このような物質は、例えば、ペプチドのコンビナトリアルライブラリー、環状のペプチドミメティック（peptidomimetics）のライブラリー、およびランダムまたは特定(dedicated)ファージディスプレイライブラリーのポジショナルスキャニングの産物であってよい。
【０１９４】
特に好ましい実施形態では、本発明のスクリーニング方法で準備、選択される候補アンタゴニスト物質はペプチドであってよい。よって、ＣＤ２８受容体に対してナノモル以下の親和性を有する超抗原アンタゴニストペプチドに関してスクリーニングするためにはコンビナトリアルファージライブラリーを使用し得る。特定の限定されない例では、New England BiolabsのＰｈＤ−１２ライブラリーを使用し得る。
【０１９５】
パンニングは２段階で行われ、第１の段階では、結合したファージをｐＨ２．２での溶出によりマイクロプレートに結合したｓＣＤ２８から溶出する。これにより、超抗原との相互作用と関係のないＣＤ２８内のドメインとのバインダーをはじめとするＣＤ２８と結合する全ておよびファージを選択する。従って、第２の段階では、上記のように選択されたファージをｓＣＤ２８と結合させ、過剰の遊離ｐ１４またはＳＥＢを用いて特異的に溶出させる。結合したファージを溶出し、パンニングをさらに２〜３サイクル行う。次いで、ファージと固定化したｓＣＤ２８またはｓ−Ａｇ結合部位を含んでなるその断片との直接結合をファージＥＬＩＳＡにより検出し、プレート上のＭ１３に対してスコアをつけてもよい。線形ペプチドの合成前に決定的なファージクローンを増幅し、配列決定する。
【０１９６】
別法としてのパンニング戦略では、上記のようにトランスフェクトＢＨＫ−２１細胞で一時的に過剰発現されるＣＤ２８  ｃＤＮＡを使用してもよい。細胞をプレート上に固定化してもよい。ファージにディスプレイされたペプチドのパンニングをまずベクターでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞で行って非特異的なバインダーを排除した後、ＣＤ２８をそれらの細胞表面で過剰発現するＢＨＫ−２１細胞（またはｓ−Ａｇ結合部位を含んでなるＣＤ２８の断片を過剰発現する細胞）で行ってもよい。あるいは、全細胞膜調製物を細胞の代用にしてもよい。ＣＤ２８と結合したファージを過剰の遊離相互作用分子（例えば、ｐ１４またはＳＥＢ）で溶出させる。
【０１９７】
第２の段階では、Enshell-Seijffers et al. Nucleic Acids Res 29: E50-60 (2001)]により開発された有利なｆｄファージのｐＶＩＩＩを用いてディスプレイされたペプチドの数残基が一定に保持される特定(dedicated)ライブラリーを構築してもよい。このｆｄ ファージは２コピーのｐＶＩＩＩ遺伝子を有し、そのうちの一方が挿入用に設計されたオリゴヌクレオチドのカセットを保有するため、通常ｐＶＩＩＩの使用の際のヘルパーファージの必要をなくし、ラウンド間のファージ増幅を容易にする。次いで、以下で記述する本発明のスクリーニング方法の評価工程に従い、ランダムおよび特定(dedicated)ライブラリー各々から選択された２０ペプチドの小規模合成物をアンタゴニスト活性に関して評価し得る。
【０１９８】
特に好ましい実施形態では、本発明のスクリーニング方法で準備、選択された候補アンタゴニストペプチドをさらに、ポジショナルスキャニングニより解析し、改良してもよい。
【０１９９】
pepscanポジショナルスキャンでは、開始親和性は１０−３Ｍと低く、ペプチド長は難なく１５残基で可能である。リードペプチドは、特定のタンパク質配列由来のランダムコンビナトリアルライブラリーまたはペプチドライブラリーをはじめとするいかなるタイプのペプチドライブラリー由来であってもよい。音響信号対雑音比により特異的な低親和性相互作用の検出が可能である。それは固体支持体上で使用する場合もある[参照、Schroeijers et al., Cancer Res. 60: 1104-1110 (2000)]し、または支持体からペプチドを分離した後に使用する場合もあるし、さらにそれらを可溶性形態で使用する場合もある[Kast et al., Cell 59: 603-614 (1989); Kast et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88: 2283-2287 (1991); De Samblanx et al., Pept. Res. 9: 262-268 (1996); Oosterom et al., J. Biol. Chem. 274: 16853-16860 (1999)]。固定ポジショナルスキャニングでは、全ての候補ペプチドが非短縮型(non-reducable)ループとして合成される。それを用いてリードペプチドの親和性をさらに改良する。こうして、ペプチドを固体支持体と連結する（pepscan−Ｉ）か、または可溶性遊離ペプチドとしてアッセイする（pepscan−II）かしてリードペプチドの親和性を最適化する。スキャニングでのリードペプチドはｐ１２（ＹＮＫＫＫＡＴＶＱＥＬＤ）である。上記の本発明の方法により得られる他の候補ペプチドも同様にスキャンし得る。
【０２００】
候補アンタゴニストペプチドに対してアラニンスキャンを実施してもよい。このようなアッセイはｐ１２に対して行い、受容体との結合に、また、それとは別に、in vitroにおける超抗原アンタゴニスト活性に重要な残基を同定する。以下で記述する本発明のスクリーニング方法の評価工程に従い、in vitroにおけるアンタゴニスト活性を評価し得る。ペプチドはＮ末端アセチルおよびＣ末端−ＣＯＮＨ２を有する可溶型で合成され、評価工程としてのＰＢＭＣを用いたin vitroアッセイでのより高いプロテアーゼ耐性に関係するフランキングＤ−アラニンを保持する。同定されたリードペプチドに対してもう一度アラニンスキャンを実施してもよい。リジンは超抗原アンタゴニストドメインにおいて顕著であるため、同様に、ペプチドのリジンスキャンを実施してもよい。
【０２０１】
一度、アラニンスキャンによりアンタゴニスト活性に重要な残基が同定されれば、全２０アミノ酸（４００ペプチド）の完全に置換されたpepscanで２つのこのような位置が選択され、次いで、同様に、２つのさらなる位置がスキャンされる（４００ペプチド）。ペプチドは最初チップ上に保持するが、これは遊離可能な形態である。ｓＣＤ２８と各ペプチドとの結合にこの受容体に対する市販のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡによりスコアをつける。次ぎに、決定的なペプチドを解放し、スクリーニングアッセイ  ＥＬＩＳＡフォーマット（上記を参照）による受容体結合アッセイに向けて、さらに、ＰＢＭＣアッセイ（下記で詳述）によるin vitroにおけるアンタゴニスト活性に関するアッセイに向けてプール（グループ化）し、次いで、そのグループをデコンボルートする(deconvoluted)。段階的に、得られた改良リードに対してもう一度ポジショナルスキャニングを行う。合計４回のポジショナルスキャニングを実施し、受容体に対して最大の親和性を有するペプチドに対してもう一度固定ポジショナルスキャニングを実施する。
【０２０２】
環化スキャンでは、ｍ−マレインイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＭＢＳ）エステルなどのリンカーを用いて、その活性エステルを介して特定のペプチドのＮ末端と、また、そのマレインイミド基を介してシステインの遊離チオール基と反応させ得る。システインはペプチドの一部である。
【０２０３】
ループスキャンでは、各ペプチドのＮ末端をＭＢＳを用いてシステインの遊離ＳＨ基と連結し得る。このシステインは別々に同じウェルの底と連結している。このように、固定されたループが形成される。
【０２０４】
環状ペプチドミメティックスは個々に合成され、以下に記述するように、ＥＬＩＳＡおよびプラズモン共鳴アッセイにてＰＢＭＣにおけるアンタゴニスト活性およびｓＣＤ２８またはｓ−Ａｇ結合部位を含んでなるその断片に対する親和性に関して評価される。
【０２０５】
ポジショナルスキャン、ファージディスプレイまたは環状ペプチドミメティック合成により得られたバックアップは、相互作用分子としてのｐ１２およびｐ１４アンタゴニストペプチドと、標的受容体と結合するそれらの能力に関してプラズモン共鳴測定ならびにＥＬＩＳＡアッセイにより比較し得る。直接結合およびｓＣＤ２８に対してＳＥＢと競合する能力の両方がアッセイされる。ｓＣＤ２８と抗ＣＤ２８抗体との結合を阻止するアンタゴニストペプチドの能力もまた試験し得る。ｓＣＤ２８とＢ７−２との複合体形成を促進するアンタゴニストペプチドの能力もまた、以下に記述するような評価工程と同様に検討される。
【０２０６】
よって、本発明のスクリーニング方法の第３の工程は選択された候補物質の評価である。この段階では、候補アンタゴニスト物質がＴｈ１リンパ球の毒素媒介性活性化を拮抗するその可能性に関して評価され、ある発熱性外毒素またはそのような発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を誘発するその潜在的な可能性に関しても評価され得る。選択された物質（好ましくは、本発明の選択方法により得られたもの）の評価は
（ａ）ＣＤ２８分子または配列番号３で示されるアミノ酸配列の全てまたは一部を有するｓ−Ａｇ結合部位を含むその断片を含んでなる試験系を準備する工程、
（ｂ）該系を好ましくは、本発明の方法により準備、選択された候補アンタゴニストと接触させる（接触は相互作用に好適な条件下で行われる）工程、および
（ｃ）評価項目指標に対する評価する候補アンタゴニストの効果を対照との比較により決定する（効果はＣＤ２８分子と発熱性外毒素との直接相互作用を阻害し、それによってＴｈ１リンパ球の毒素媒介性活性化の拮抗をもたらす該候補の可能性を示す）工程
により行われ得る。
【０２０７】
本発明のスクリーニング方法による候補アンタゴニストの評価に使用する試験系は細胞フリー混合物、in-vitro／ex-vivo細胞培養物、またはin-vivo動物モデルであり得る。このような試験系は、所望により、Ｔ細胞の超抗原誘導性活性化に、および候補アンタゴニストの拮抗効果を決定する評価項目指標の検出に好適な条件を提供する内生および／または外生化合物をさらに含んでなってよい。さらに詳しく言えば、Ｔ細胞がＴｈ１リンパ球であり、かつ、該活性化がＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ遺伝子発現の誘導により決定される。
【０２０８】
実施例４により示すように、アンタゴニストペプチド単独ではヒトＰＢＭＣに対して超抗原アゴニストとして作用せず[Arad et al., (2000) 前掲]、それどころか、超抗原とＣＤ２８との結合に干渉する。しかしながら、アンタゴニストペプチドはｓＢ７−２によるシグナル伝達を刺激する超抗原の能力を共有している（実施例５）。超抗原によるＴ細胞の活性化は抗原提示細胞を必要とし、Ｔ細胞単独の存在下では起こらない[Marrack and Kappler, Science 248: 705-711, (1990)]。よって、事実上、超抗原の作用は抗原提示細胞上のＭＨＣクラスII分子とＴ細胞上のＴＣＲとの超抗原媒介性架橋により接近する、細胞に定着したＢ７−２およびＣＤ２８と主に関連している[Salomon and Bluestone, Annu. Rev. Immunol. 19: 225-252, (2001)を参照]。その意味で、アンタゴニストペプチドはＣＤ２８と結合する超抗原の能力をブロックし、それにより超抗原によるＢ７−２／ＣＤ２８媒介性シグナル伝達の促進を妨げる。Ｔｈ１細胞刺激が抗ＣＤ３によるものである場合のアンタゴニスト活性の欠落により示されるように、アンタゴニストはＴＣＲと相互作用しない。
【０２０９】
よって、特定の実施形態によれば、候補アンタゴニストの評価に使用する試験系は可溶性ＣＤ２８分子 （ｓＣＤ２８）またはｓ−Ａｇ結合部位を含んでなるその断片、および可溶性Ｂ７−２分子（ｓＢ７−２）を含んでなる細胞フリー系であり得る。
【０２１０】
特に好ましい実施形態では、このような細胞フリー系に関する評価項目指標は、好適な手段により、例えば、実施例５での直接結合の立証にも使用されたようにＥＬＩＳＡおよびプラズモン共鳴により検出されるｓＣＤ２８分子とｓＢ７−２分子との結合であり得る。さらに詳しく言えば、候補アンタゴニストの存在下でのＣＤ２８分子とｓＢ７−２との相互作用の増大が超抗原とＣＤ２８分子との相互作用を特異的に拮抗し、阻害する該候補の能力を示す。
【０２１１】
あるいは、本発明のスクリーニング方法による評価に使用する試験系は内生的に発現されるＣＤ２８分子を含んでなるin-vitro／ex-vivo細胞培養物であり得る。
【０２１２】
特定の例では、試験系として使用する細胞培養物は哺乳類供与体から単離されたＰＢＭＣ培養物であり得る。このような哺乳類は、好ましくは、ヒトおよびアカゲザルのいずれかであってよい。
【０２１３】
よって、この特定の試験系での評価項目指標は視覚的に検出可能なシグナルをもたらすＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γの超抗原誘導性発現であり得る。そのため、該評価項目の阻害あるいは減少は超抗原とＣＤ２８分子との相互作用を特異的に拮抗し、阻害する候補物質の能力を示す。このような阻害によってＴｈ１リンパ球の毒素媒介性活性化の拮抗がもたらされる。ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γの超抗原誘導性発現は、例えば、定量的ドットブロットハイブリダイゼーションおよびＲＮアーゼプロテクションアッセイにより検出し得る。
【０２１４】
次の実施例によって例示されるように、本発明者らは細胞免疫応答に関与する全ての細胞サブセットを含む新たに単離された全ヒトＰＢＭＣ集団におけるＴｈ１サイトカインｍＲＮＡの超抗原誘導性発現を阻害するアンタゴニストペプチドの能力に基づいた、超抗原アンタゴニスト活性に関しての強力なin vitroスクリーニングツールを開発した[Arad et al., (2000) 前掲]。本発明者らは、この系が種々の疾患におけるヒト免疫応答を厳密に反映し、この系によりその応答の異常調節が検知されることを示し[Gerez et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 58: 152-266 (1991); Gerez et al., Kidney International 40: 266-272 (1991); Gerez et al., Clin. Exp. Immunol. 109: 296-303 (1997); Kaempfer et al., J. Clin. Oncol. 14: 1778-1786 (1996)]、従って優れた代用マーカーを提供している。このＰＢＭＣアッセイがアンタゴニストペプチドｐ１２およびｐ１４の発見[Arad et al., (2000), (2001) 前掲]におよび毒素アゴニスト活性の欠落の提示[Arad et al., (2000) 前掲]に効果的であることが分かった。よって、この系は本発明のスクリーニング方法により得られた候補アンタゴニスト物質のアンタゴニスト活性の評価に効果的に使用し得る。
【０２１５】
本発明者らは、ヒトＰＢＭＣで誘導されるＩＬ−２およびＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現を測定し、少数の細胞のそれらの存在量の少ないｍＲＮＡ種を定量するための感度の良い定量方法を考案した。この方法は大量のサンプルの便宜なプロセシングを考慮に入れているため、そのようなものとして、可能性ある毒素アンタゴニストのスクリーニングに好適である。さらに、それは同時にいくつかの異なるヒト供与体由来のＰＢＭＣの応答の数多くのパラメーターに関する研究を可能にする。このことから、再現性ある形でアンタゴニスト活性を提示するのに効果的なツールがもたらされる。ｍＲＮＡは即座に発現され、正確にアッセイすることができるが、ＩＬ−２およびＩＦＮγタンパク質は誘導中、徐々にしか現れず、それらの細胞受容体との結合により抑えられることから、これらのタンパク質の測定はｍＲＮＡの測定よりも情報量が少ない。ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの測定は、免疫刺激の数時間後にはこれらの遺伝子の一次応答についての動的情報を与える。アッセイは広い範囲にわたって線形である。このような解析により得られた情報はＲＮアーゼプロテクション解析により確認される。
【０２１６】
所望のアンタゴニストペプチドの最も重要な特性は、それがＴｈ２応答を損なわないことである。このことはバックアップの必要条件でもあり、Ｔｈ１サイトカインｍＲＮＡの毒素誘導性発現がアンタゴニストペプチドにより阻害されるＰＢＭＣの培養培地を用いたＩＬ−１０に関するＥＬＩＳＡにより試験し得る。
さらにもう１つの別の例では、本発明のスクリーニング方法による候補アンタゴニストの評価に使用する試験系はin-vivo系、特に動物モデルであり得る。
【０２１７】
１つの特定の実施形態によれば、動物モデルは超抗原、好ましくは、発熱性外毒素を投与したＤ−ガラクトサミン感作マウスであり得る。このような試験系に関する評価項目指標は該マウスの致死毒素性ショックからの防御および救済であり得る。該評価項目の増大が、超抗原とＣＤ２８分子との相互作用を特異的に拮抗し、阻害する、Ｔｈ１リンパ球の発熱性毒素媒介性活性化を拮抗する、毒素性ショックから防御する該候補物質の能力を示し、また、ある発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を間接的に誘発する該候補の能力も示し得る。
【０２１８】
もう１つの動物モデルとしては、発熱性外毒素を抗原投与したブタであり得る。このような方法では、評価項目指標は該ブタの毒素性ショックおよび無能力からの防御および救済であり得る。このような評価項目の増大は超抗原とＣＤ２８分子との相互作用を特異的に拮抗し、阻害する、Ｔｈ１リンパ球の発熱性外毒素媒介性活性化を拮抗する、毒素性ショックおよび無能力から防御する、また、所望により、ある発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を誘発する該候補物質の可能性を示す。
【０２１９】
本発明はさらに、哺乳類被験体における超抗原関連疾患の治療のための治療用組成物の製造方法を提供する。この方法は
（ａ）Ｔｈ１リンパ球の超抗原媒介性活性化を拮抗し得、好ましくはさらにある発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒素性ショックに対する防御免疫を誘発し得るアンタゴニスト物質を同定する工程、および
（ｂ）該アンタゴニスト物質を少なくとも１つの医薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤および／または添加剤と混合する工程
を含んでなる。
【０２２０】
治療用組成物の製造方法で使用するアンタゴニスト物質は、好ましくは、本発明のスクリーニング方法により同定され得る。
【０２２１】
本発明はさらに、本発明の方法による超抗原関連疾患の治療のための医薬組成物の製造におけるＣＤ２８分子またはその断片、特に、最も好ましくは、配列番号３で示されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含んでなる超抗原結合部位を含む断片の使用に関する。
【０２２２】
当然のことではあるが、開示し、記述する本発明は本明細書において開示する特定の実施例、方法工程および組成物に限定されないため、そのようなものとして、方法工程および組成物は多少変更し得る。さらに当然のことではあるが、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ限定されるものであるため、本明細書において用いる専門用語は特定の実施形態を説明することを目的として使用しており、限定を意図したものではない。
【０２２３】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる単数形および「その」は、特に明示されない限り、複数の言及を包含することに留意しなければいけない。
【０２２４】
本明細書ならびに後に続く実施例および特許請求の範囲を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む」および「含んでなる」などの変形は、ある整数もしくは工程または整数群もしくは工程群を含めるが、その他の整数もしくは工程または整数群もしくは工程群を除外しないという意味を含むと解釈される。
【０２２５】
次の実施例は本発明の態様の実施において本発明者らが使用する技術の例示である。当然のことではあるが、これらの技術は本発明の実施のための好ましい実施形態の例示であり、当業者ならば、本開示内容に照らして、本発明の精神および意図された範囲を逸脱することなく数多くの修飾をなし得ることが分かるであろう。
【実施例】
【０２２６】
試験手順
細胞培養物およびヒトサイトカイン遺伝子発現の誘導
健常なヒト供与体由来のＰＢＭＣをFicoll Paque(Pharmacia)で分離し、５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、４×１０６／ｍｌの密度に再懸濁し、この培地に２％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１０ｍＭ  ＭＥＭ非特異的アミノ酸、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２、５×１０−５Ｍ  ２−メルカプト−エタノール、１００ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび５μｇ／ｍｌナイスタチンを添加して培養した。ＳＥＢ (ロット１４−３０、米国陸軍感染症研究所(U. S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases)毒物学部門より提供)、ＳＥＡまたはＴＳＳＴ−１(Sigma)を添加して１００ｎｇ／ｍｌにした。
【０２２７】
ＲＮアーゼプロテクション解析
トータルＲＮＡをグアニジンイソチオシアネートで抽出した[Chomezynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156 (1987)]。ｐＢＳ(Promega)に挿入されたＤＮＡからα−［３２Ｐ］ＵＴＰを用いてin vitro転写されたゲノムアンチセンスＲＮＡプローブを用いてＲＮアーゼプロテクション解析を行った[Arad et al. (1995) 前掲]。Ｔ７プロモーターから転写されたＩＬ−２プローブ（６００ヌクレオチド（ｎｔ））は、ＩＬ−２遺伝子の第３エクソンおよび第３イントロンの一部と相補的である；８Ｍ尿素−ポリアクリルアミドゲルでは、ＩＬ−２  ｍＲＮＡにより保護された１１７ｎｔのＲＮＡ断片が得られる。Ｔ３プロモーターから転写されたＩＦＮ−γプローブ（２７４ｎｔ）はＩＦＮ−γ遺伝子の第３エクソンおよび第３イントロンの一部と相補的であり、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡにより保護された１８３ｎｔのＲＮＡ断片が得られる。Ｔ３プロモーターから転写されたＴＮＦ−βプローブ（７００ｎｔ）はエクソン１の一部、エクソン２、エクソン３、ならびにイントロン３の一部およびエクソン４と相補的である；ＴＮＦ−β  ｍＲＮＡは２７４および２６３ｎｔの２断片を保護する。ハイブリダイゼーションにてセンスＲＮＡ転写物からは検出可能なシグナルが得られなかった。１８ＳｒＲＮＡ（９０ｎｔを保護する）またはβアクチン（４１５ｎｔを保護する）のアンチセンスＲＮＡプローブをローディング対照とした。
【０２２８】
ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ  ＲＮＡの定量的ドットブロットハイブリダイゼーション
１ｍｌ培養物由来のＰＢＭＣを回収し、７．５Ｍグアニジン−ＨＣｌで溶解した。−２０℃にて一晩エタノール沈殿したＲＮＡをホルムアルデヒドに溶かし、６０℃にて１５分間インキュベートした。１０×クエン酸ナトリウム生理食塩水で４連続２倍希釈したものを９６ウェルドットブロット装置を使用してニトロセルロースシートに適用した（二重試験）。真空炉で８０℃にて焼き付けた後、シートをヒトＩＬ−２およびＩＦＮ−γ各々の３２Ｐ標識したアンチセンスＲＮＡプローブとそれぞれハイブリダイズさせた。ＥＬＩＳＡリーダーにより６３０ｎｍにて、露光したオートラジオグラムをスキャンした。ＲＮＡレベルをＡ６３０を単位にして表す。与えられたＲＮＡサンプルの連続２倍希釈物では、各サンプルに存在する特異的なＲＮＡの濃度に比例する遺伝子発現の２００倍範囲の強度に対して線形光学密度応答を得る[Arad et al. (1995) 前掲; Gerez et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 58: 251 (1991); Kaempfer et al., J. Clin. Oncol. 14: 1778 (1996)]。
【０２２９】
ＳＥＢ関連ペプチドの合成
ペプチドは、一般に、引用することにより本明細書の一部とされるＷ０９８／２９４４４にて記載されているように合成した。
ｐ１２およびｐ１４（各々、配列番号１および２でも示される）はフルオロニル(fluoronyl)−メトキシカルボニル化学を利用して合成し、開裂させ、側鎖をトリフルオロ酢酸で脱保護した。培養培地中、トリフルオロ酢酸−ペプチドスラットは可溶性であった。同じ手順を用いてＤ−Ａｌａを連結した。
ペプチドはＨＰＬＣでは＞９５％純粋であった。
【０２３０】
表面プラズモン共鳴
タンパク質−タンパク質相互作用は表面プラズモン共鳴(BIAcore instrument, Pharmacia)により検出される（ここで、共鳴単位（ＲＵ）の増大が注入されたタンパク質と表面上に固定化されたタンパク質とが結合していることを示す）。Seth et al.[Nature 369: 324-327 (1994)]により報告されているような標準アミン化学により、固定化するタンパク質をデキストランマトリックスと結合させた。センサー表面を流れるＨＢＳ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｐＨ７．４）の流速を１０μｌ／分にて維持した。サンプルを１０μｌ／分にて、それらの量に応じて（２０または４０μｌ）２または４分間注入し、アンタゴニストペプチドに対してだけは４０μｌを使用した。各注入後は、５０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４により表面を再生した。固定化レベルは３，０００〜４，０００ＲＵであった。センサーグラムでは、注入前、応答のピーク時、注入中、および洗浄終了時の共鳴シグナルを示す。
【０２３１】
毒素性ショックからのマウスの防御
１０匹の１０〜１２週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス(Harlan, Jerusalem, Israel)群をＩＰ注射による毒素抗原投与に際して、２０ｍｇ  Ｄ−ガラクトサミン(Sigma)の腹膜内（ＩＰ）注射により感作させた。
【０２３２】
毒素性ショックからのブタの防御
各試験条件に対し、５日齢の雑種ブタ（主としてヨークシャー種；２．５ｋｇ）を６匹の子ブタからなる無作為化群（各群、雌ブタである）として、ＳＥＡ（２５ｇ）にＩＰ注射を施した。ＳＥＡ前ならびにＳＥＡ１、２、３、４および５時間後にアンタゴニストペプチドを３０分間ＩＰにて投与した。嘔吐と下痢について、８時間まで１時間おきに、その後、１２時間まで３時間おきに、さらに、２１および２４時間にスコアをつけた。
【０２３３】
実施例１
ＳＥＢなどの超抗原がＴｈ１サイトカイン、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの早期の同時発現、ならびにＴｈ２サイトカイン、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の早期の同時発現を誘導する
ＳＥＢはＴｈ２サイトカイン、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の早期発現を誘導する
超抗原はＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−βの発現を伴うＴｈ１応答の過剰刺激によりそれらの毒性作用を発揮すると考えられている。さらに、免疫抑制性サイトカイン、特にＩＬ−１０の発現を伴うＴｈ２応答は初期のＴｈ１応答を遮断しようとする以後の事象であると一般に考えられている。リンパ節[Litton et al., J. Immunol. Methods 175: 47-58, (1994)]またはＳＥＢ処置したマウスから新たに単離されたＣＤ４細胞[Cardell et al., Eur. J. Immunol. 23: 523-529, (1993); Nagelkerken et al., Eur. J. Immunol. 23: 2306-2310, (1993)]では、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γに関してｍＲＮＡの迅速な誘導があったが、ＩＬ−４およびＩＬ−１０に関してはなかった。ネズミＣＤ４細胞では、ＩＬ−２およびＩＬ−４の存在下でＳＥＢによるＩＬ−１０のかなりの誘導が見られたが、それらの不在下では見られなかった[Cardell et al., 前掲]。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）では、ＳＥＢおよびＳＥＡによりＩＬ−２およびＩＦＮ−γの発現は誘導されたが、ＩＬ−４またはＩＬ−１０の誘導は検出されなかった[Krakauer, J. Leukoc. Biol. 57: 450-454, (1995), Litton et al., 前掲]。これらの発見から、超抗原に対する一次応答時、Ｔｈ２サイトカインの発現はＴｈ１サイトカインの発現にかなり遅れを取るという知見が導かれた。
【０２３４】
本発明者らはヒトＰＢＭＣにおけるＴｈ２応答のＳＥＢ誘導性発現の動態を研究した。図１にて示すように、ＳＥＢは ２〜４時間以内に低いが有意なレベルのＩＬ−４を誘導し（図１Ａ）、同様にＩＬ−１０の産生を誘導もする（図１Ｂ）。誘導はＳＥＢ量とともに高まった。
【０２３５】
図１Ｃは長期にわたる誘導動態を示しており、ＳＥＢが８〜２０時間以内にこれらのＴｈ２サイトカインの最大レベルを誘導すること、また、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の発現が持続することがはっきりと示されている。しかしながら、ＩＬ−４およびＩＬ−１０のレベル(ｐｇ／ｍｌ）はＳＥＢ処置したマウスの血清に関して報告されたレベル（ｎｇ／ｍｌ）よりもはるかに低かった[Florquin et al., Autoimmun. 9: 609-615, (1996)を参照]；実際、他の研究では、ＳＥＢによるＩＬ−４またはＩＬ−１０のこのような初期誘導は検出されなかった[Cardell et al., 前掲; Litton et al., 前掲; Nagelkerken et al, 前掲; Krakauer, 前掲を参照]。
【０２３６】
ＩＬ−４およびＩＬ−１０の同時誘導によるＳＥＢ媒介性ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡ発現の阻害
新規な毒素受容体の検討において、本発明者らは次ぎに、観察されたＴｈ２型サイトカインの初期誘導が毒素性ショックをもたらすＴｈ１サイトカインの強力なＳＥＢ媒介性誘導に関与するかどうかを調査した。この調査結果から、ＳＥＢはＩＬ−２およびＩＦＮ−γ遺伝子発現の誘導と同時に、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の早期出現を低くともＩＬ−２およびＩＦＮ−γ遺伝子発現の誘導を著しく阻害するのに十分である、少なくとも１０〜２０倍低いレベルに誘導することが示された。ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡのＳＥＢ誘導性発現はＩＬ−４またはＩＬ−１０を中和する抗体（Ａｂｓ）の存在下で大いに高まる；これらのＡｂｓはＳＥＢの不在下では誘導効果がない（図２）。よって、ＳＥＢによる誘導の発生から、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ遺伝子の発現は同時に誘導されるＩＬ−４およびＩＬ−１０によりダウンレギュレートされる。これらのＴｈ２型サイトカインの誘導は一次応答であり、それらが誘導されるとすぐに、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ遺伝子の発現の調節が開始される（図２）。この本来備わっている抑制機構がなければ、それらの有害な誘導はさらに大きくなるであろう。
【０２３７】
ＩＬ−４およびＩＬ−１０のＳＥＢ媒介性誘導（図１）のＩＬ−２およびＩＦＮ−γ遺伝子のＳＥＢ誘導性発現に対する効果を評価するため、中和Ａｂｓ  αＩＬ−４またαＩＬ−１０を使用して、ＩＬ−４またはＩＬ−１０の作用をブロックした。ＩＬ−２  ｍＲＮＡの誘導波の振幅はαＩＬ−４またαＩＬ−１０いずれかの存在下でかなり増大した（図２Ａ）。イソ型の適合対照Ａｂ（ラット抗ヒトＩｇＧ）では効果はなかった。ＩＦＮ−γ遺伝子のＩＬ−４またはＩＬ−１０の枯渇に対する応答は一層大きかった。図２Ｃにて示すように、ＡｂｓによるＩＬ−４またはＩＬ−１０いずれかの枯渇は、誘導されるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡ波の振幅および継続時間を増大するだけでなく、はるかに早期の発現をもたらした。このように、中和Ａｂｓを使用することで、ＳＥＢによる誘導の発生から、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ遺伝子の発現はＩＬ−４およびＩＬ−１０の同時誘導により大きく減少する（２０倍）ことが分かった。これらの結果は、ＳＥＢなどの超抗原によるＴｈ１型サイトカイン遺伝子の過剰な活性化にもかかわらず、この応答は同時に誘導されるＩＬ−１０およびＩＬ−４により制限されるためにその最大の可能性をはるかに下回った状態のままであることを示している。これらのＴｈ２サイトカインの阻害量の早期発現は超抗原に対する一次応答の不可欠な要素である。
【０２３８】
アンタゴニストペプチドはＳＥＢ誘導性Ｔｈ１応答を阻害するが、ＳＥＢに対するＴｈ２応答はブロックしない
アンタゴニストペプチドにより、Ｔｈ１サイトカイン応答のブロッキングを通じて、致死毒素抗原投与から防御されたマウスは異なる毒素によるさらなる毒素抗原投与に対する防御免疫も迅速に発達させる[Arad et al., (2000) 前掲; Arad et al., (2001) 前掲]。防御抗体を必要とするこのような免疫[Arad et al., (2000) 前掲]は、致死Ｔｈ１応答がアンタゴニストペプチドによりブロックされる状況での超抗原によるＴｈ２サイトカインの活発な誘導を介していると思われる。実際には、アンタゴニストペプチドｐ１４ＡはＳＥＢによるＴｈ１サイトカイン遺伝子発現の誘導をブロックした（ＩＬ−２については図３Ａ、ＩＦＮ−γについては図３Ｂ）が、Ｔｈ２型サイトカインＩＬ−１０の誘導は損なわれなかった（図３Ｃ）。ＩＬ−１０のこの発現は同時に起こるＢ細胞へのヘルパー機能により免疫能力をフラグする。
【０２３９】
この結果では、超抗原の作用に必要不可欠であるアンタゴニストペプチド受容体の有望な担体としてＴｈ１細胞を指摘している。図２および３のデータは図４で示されるようなモデルを示唆する。超抗原毒素により誘導される過剰なＴｈ１応答が致死ショックを起こし、その場合にＩＦＮ−γがＴｈ２応答を抑制している。図２および３のデータを受けて、実際に認められるようにアンタゴニストペプチドは毒素によるＴｈ１細胞活性化の選択的ブロックを誘発する上、残留Ｔｈ１応答を抑制するだけでなく、防御免疫の急速な発達を促進する役割も果たすＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０）の活発な同時誘導には干渉しないという仮説を立てた[Arad et al., (2000), (2001) 前掲]。
【０２４０】
超抗原によるＴ細胞の活性化が主にＴｈ１応答であるという臨床的根拠がある。毒素により誘導されるＩＦＮ−γの大量放出により防御中和抗体の発達が妨げられる。例えば、月経時ブドウ球菌毒素性ショック症候群を発症している女性の８５％は回復後ＴＳＳＴ−１に対する抗体を発達させず、多くは再発する[Schlievert, Nature Medicine 6: 378-379. (2000)]。
【０２４１】
アンタゴニストの不在下（図４Ａ）では、毒素はＴｈ１サイトカイン、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦの大量産生を誘導し、それらが一方でＴｈ２応答を阻害するように作用し、もう一方で臓器不全および死をもたらす。しかしながら、アンタゴニストの存在下ではＴｈ１応答は阻害され、Ｔｈ２応答は弱まることなく進行する（図４Ｂ）。すぐに、高レベルのＩＬ−４およびＩＬ−１０が残留Ｔｈ１応答を抑制し、同時に防御免疫を誘導する。
【０２４２】
本発明者らの見解では、アンタゴニストペプチドは致死Ｔｈ１応答を防御Ｔｈ２応答へと転換するアジュバントとしての機能を果たす。理論にとらわれるものではないが、アンタゴニストがいかに毒素によるＴｈ１細胞活性化の選択的ブロックを引き起こすのかに関する魅力的な概念は、新規な毒素受容体がＴｈ１細胞の活性化に選択的に使用されるということである。本発明者らの研究仮説は、超抗原毒素がＴｈ１細胞を活性化するためには、Ｔ細胞受容体だけでなく、新規受容体も拘束しなければならないが、Ｔｈ２応答にこの受容体は必要ではないということであった（図５Ａ）。
【０２４３】
よって、アンタゴニストペプチドが新規受容体と結合することで毒素によるＴｈ１細胞活性化の選択的なブロックがなされ、それにより、生存が可能になる（図５Ｂ）。
【０２４４】
Ｔｈ１細胞の完全活性化はＭＨＣクラスII分子、超抗原およびＴＣＲの相互作用だけによるものではない。ＴＣＲ結合を持続することは、Ｔ細胞活性化に必要不可欠であるが、多くの障害に直面する。第一に、ＴＣＲ結合は小型のＴＣＲおよびＭＨＣ分子により阻止される。第二に、ＴＣＲの抗原性ＭＨＣペプチドに対する親和性が低い。第三に、抗原提示細胞での抗原性複合体の数が極めて少ない。最後に、Ｔ細胞の移動は抗原認識の持続に支障となる[Grakoui et al., Science 285: 221-227, (1999)]。超抗原はこれらの制約の克服においては普通の抗原よりはるかに優れ、ＭＨＣ拘束を回避するが、それらはＴ細胞活性化に共刺激リガンド（抗原提示細胞でのＢ７ファミリーのもの、遅れてＴ細胞でのＣＤ２８など）をなお必要とする[Lenschow et al., (1996) 前掲、に概説されている]。
【０２４５】
実施例２
Ｔｈ１細胞の超抗原活性化へのＢ７−２の特異的な関与／要件
抗Ｂ７−２はＳＥＢに対するＴｈ１応答をブロックするが、ＳＥＢに対するＴｈ２応答はブロックしないのに対し、抗Ｂ７−１はＴｈ１またはＴｈ２応答をブロックしない
本発明者らは、ヒトＰＢＭＣにおいてＢ７−２に対するｍＡｂがＳＥＢによるＩＬ−２およびＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの誘導をブロックするのに対し、Ｂ７−１に対するｍＡｂにそのような効果がないことを見出した（ＩＬ−２については図６ＡおよびＩＦＮ−γについては６Ｂ）。抗Ｂ７−１および抗Ｂ７−２抗体はいずれもＩＬ−１０産生に対する阻害効果を示さなかった（図６Ｃ）。一方でのアンタゴニストペプチドによるＩＬ−１０産生阻害の欠如と、もう一方での抗Ｂ７−２によるＩＬ−１０産生阻害の欠如とのこの相互関係はＴｈ１応答が阻害される状況での超抗原の作用様式へのＢ７−２共リガンドの関与を裏付けている。これらの結果に基づいて、本発明者らは、ＳＥＢがＢ７−２リガンドまたはこれらのＢ７リガンドを拘束するＣＤ２８共刺激受容体と結合するかどうか、また、このような結合がアンタゴニストペプチドによる阻害に対して敏感であるかどうかを調査した。
【０２４６】
理論にとらわれるものではないが、以下で詳述する結果は次の解釈を裏付けている。致死毒素性ショックを媒介するサイトカインを発現するＴｈ１細胞の活性化は超抗原のＭＨＣクラスIIおよびＴＣＲリガンドとの相互作用に完全依存しているが、この相互作用だけでは活性化に不十分である。一度結合すれば、超抗原はアンタゴニストドメインを介して作用して、Ｂ７−２／ＣＤ２８リガンド相互作用を可能にし、そのことがＴｈ１細胞活性化を推進する主要なシグナルであるこの本質的に弱い相互作用の強い促進作用となる。超抗原はこの相互作用が存在しないとＴｈ１細胞を活性化させることができない。重要なことは、超抗原はＣＤ２８と直接結合し、Ｂ７−２と後者との結合を促進するということである。また、超抗原はそれよりも弱くではあるがＢ７−２とも結合する。超抗原はＣＤ２８およびＢ７−２と三重複合体を形成することにより、Ｔｈ１細胞活性化のためのその必須の、実際には不可避的な経路としてＣＤ２８／Ｂ７−２リガンド相互作用を利用することに注目すべきである。このように、超抗原によるＣＤ２８およびＢ７−２の利用は、Ｂ７−２およびＣＤ２８を拘束できない代わりに これらのリガンドを間接的に、必須のリガンドよりもむしろ共刺激としてただ利用するように、ＴＣＲのＭＨＣクラスIIポケット内にプロセシングを受けたペプチドとして提示される通常の抗原の利用とは根本的に異なっている。
【０２４７】
以下の実施例３にて示すように、超抗原ＳＥＢはＴｈ１細胞のＣＤ２８受容体と直接結合する。これらの結果から、アンタゴニストペプチドの標的である新規受容体がＣＤ２８であることが分かる。アンタゴニストペプチドはＣＤ２８分子と結合し、それによってこの受容体への超抗原の接近を妨害して、Ｔｈ１細胞活性化をブロックする。さらに、本発明者らは、Ｔｈ２細胞の活性化がＴｈ１細胞の活性化と対照的にＢ７−２／ＣＤ２８リガンド相互作用とは無関係であることを示している。このように、超抗原によるＴｈ１細胞の活性化は独自にＢ７−２／ＣＤ２８リガンド相互作用を必要とする。
【０２４８】
実施例３
Ｔｈ１細胞の超抗原媒介性活性化はアンタゴニストの標的となるＣＤ２８受容体に依存するが、Ｔｈ２細胞の活性化は依存しない
可溶性ＣＤ２８受容体はＴｈ１サイトカイン遺伝子発現のＳＥＢ媒介性誘導をブロックするが、ＳＥＢに対するＴｈ２応答はブロックしない
以下の一連の観察により、ＣＤ２８受容体がアンタゴニストの標的であるという有力な証拠が示される。ヒトＰＢＭＣは種々のプロトコールにより誘導した。ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現をＴｈ１応答のデータとして、また、ＩＬ−１０タンパク質の発現をＴｈ２応答のデータとして用いた。
【０２４９】
組換え可溶性ＣＤ２８受容体（ｓＣＤ２８）はヒトＩｇＧ（R & D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota, USAのカタログ番号３４２−ＣＤ）のＣ末端ヒスチジン６タグ付きＦｃ領域と融合したヒトＣＤ２８分子の細胞外１〜１５２−アミノ酸ドメインからなるキメラ分子である。ＳＥＢによるＩＬ−２  ｍＲＮＡの誘導は単独ではこの遺伝子を誘導しないｓＣＤ２８により３．５倍阻害された（図７ＡおよびＢ）。これに対し、同じ細胞培養物におけるＳＥＢによるＩＬ−１０の誘導は本質的にｓＣＤ２８による影響を受けなかった（図７Ｃ）。ＳＥＢによるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの誘導は最大発現時の６時間の時点でｓＣＤ２８により約２０倍阻害された；ｓＣＤ２８は単独ではＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡを誘導しなかった（図７ＤおよびＥ）。これに対し、同じ細胞培養物におけるＳＥＢによるＩＬ−１０の誘導は本質的にｓＣＤ２８による影響を受けなかった（図７Ｆ）。
【０２５０】
ｓＣＤ２８はＩＬ−２  ｍＲＮＡのＳＥＢ媒介性誘導を用量依存的に阻害した（図８ＡおよびＢ）。これに対し、同じ細胞集団でのＩＬ−１０の誘導は使用したｓＣＤ２８の最高濃度においてさえも阻害されなかったが、その代わりにかなり刺激を受けた（図８Ｃ）。ＩＬ−２またはＩＦＮ−γ遺伝子の発現およびＩＬ−１０の発現各々により明らかになるＴｈ１およびＴｈ２サイトカイン産生細胞の異なる正反対の応答がこれらの試験を通じて繰り返し現れる主題である。
【０２５１】
別のスプライシングにより、ヒト血清で検出され、機能的共刺激分子であるように思われる、トランスメンブランドメインを欠いた天然可溶型Ｂ７−２リガンドが生じる[Jeannin et al., Immunity 13: 303-312, (2000)]。この可溶型Ｂ７−２の共刺激活性は抗ＣＤ３によるＴｈ１サイトカインの誘導を増強するその能力により示された[Jeannin et al., 前掲]。本発明者らは、本明細書において、ヒトＩｇＧ（R & D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota, USAのカタログ番号１４１−Ｂ２）のＣ末端ヒスチジン６タグ付きＦｃ領域と融合したＢ７−２分子の細胞外１〜２３９アミノ酸ドメインを含んでなる可溶性組換え型Ｂ７−２（ｓＢ７−２）を使用した。そして、ｓＢ７−２がＣＤ２８との相互作用を通じてＳＥＢの作用を阻害する可能性を調べた。図８Ｄおよび８Ｅにて示すように、ｓＢ７−２はＩＬ−２  ｍＲＮＡの誘導を強く阻害し、モル単位ではこの点においてｓＣＤ２８よりもはるかに効果的であった。これに対し、ＩＬ−１０の誘導はｓＣＤ２８およびｓＢ７−２のいずれによっても阻害されなかった（図８Ｆ）。
【０２５２】
抗ＣＤ２８およびｓＢ７−２は各々、強いＴｈ１サイトカイン遺伝子発現を誘導するが、Ｔｈ２サイトカイン遺伝子発現の有意な誘導はない
これまでは、ＳＥＢをＴｈ１およびＴｈ２応答のインデューサーとして使用した。ＣＤ２８およびその共リガンドＢ７−２の特別な役割を細かく調べるために、抗ＣＤ２８  ｍＡｂ（カタログ番号ＭＡＢ３４２、R & D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota, USAのクローン  ３７４０７．１１１）またはｓＢ７−２をこれらの応答の唯一のアクチベーターとして使用し、それらの誘導効果をＴＣＲを通じてシグナル伝達する抗ＣＤ３の効果と比較した。ＣＤ３はＴＣＲの不可欠な部分を形作り、抗ＣＤ３  ｍＡｂはＴ細胞を強く活性化する[Schlossman et al., Leukocyte Typing V: White cell differentiation antigens. Oxford University press, NY, (1995); Sancho et al., J. Biol. Chem. 267: 7871-7879, (1992)]。抗ＣＤ３はＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現を誘導した（図９Ａ）。抗ＣＤ２８およびｓＢ７−２は各々、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの活発な誘導を誘発し、これらの誘導は抗ＣＤ３よりも早期に起こった。
【０２５３】
より一般には、本発明者らは抗ＣＤ２８に対する応答と同じＰＢＭＣ集団でのｓＢ７−２に対する応答とに一貫した関係を認めた。すなわち、抗ＣＤ２８がＴｈ１応答を誘導する場合には、ｓＢ７−２もまたその応答を誘導する。図９Ｂにて例示するＰＢＭＣ集団では、抗ＣＤ２８またはsＢ７−２が各々、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの誘導をもたらしたが、抗ＣＤ２８とｓＢ７−２との組合せでは相互阻害が起こった。この結果から、ｓＢ７−２はＣＤ２８と相互作用して、Ｔｈ１細胞におけるＩＦＮ−γ遺伝子発現の誘導に関するシグナルを送達しているという概念が確立される。
【０２５４】
実施例４
ＣＤ２８とＢ７−２との相互作用を促進する超抗原とＣＤ２８との結合はアンタゴニストペプチドにより阻害される
抗ＣＤ２８誘導性Ｔｈ１応答はアンタゴニストペプチドにより阻害される
抗ＣＤ２８により誘導される、ＰＢＭＣにおけるＩＬ−２およびＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現はアンタゴニストペプチドｐ１４Ａによる阻害の影響を受けた（図１０Ａ、上の２列）。
【０２５５】
抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３誘導性Ｔｈ１応答はアンタゴニストペプチドにより阻害される
Ｔ細胞集団の活性化には抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の組合せによるＴ細胞の刺激が広く採用されている[例えば、Jeannin et al., 前掲]。図１０ＡではｍＡｂのこの組合せによるＩＬ−２  ｍＲＮＡの発現増幅が認められる。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８が媒介するＩＬ−２  ｍＲＮＡの誘導はアンタゴニストペプチドｐ１４Ａにより大幅に阻害され、同様の結果がＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡでも得られた（図１０Ａ）。抗ＣＤ２８単独ではＩＬ−１０を誘導しなかった（図１０Ｂ）。抗ＣＤ２８は抗ＣＤ３によるＩＬ−２  ｍＲＮＡの誘導を増強したが、抗ＣＤ３によるＩＬ−１０の誘導を増強しなかった（図１０Ｂ）。さらに、アンタゴニストペプチドがＩＬ−１０の誘導を低下することはなかった。よって、アンタゴニストペプチドは抗ＣＤ２８単独よる誘導か、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８の組合せによる誘導かにかかわらず、Ｔｈ１サイトカイン遺伝子発現の特異的な阻害剤である。
【０２５６】
抗ＣＤ３／ｓＢ７−２誘導性Ｔｈ１応答はアンタゴニストペプチドにより阻害されるが、Ｔｈ２応答は阻害されない
本発明者らは、抗ＣＤ３とｓＢ７−２との組合せによるＴ細胞の二重刺激が超抗原による刺激とよく似ていると仮定した。実際には、この組合せにより、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの強い初期誘導がもたらされ、この誘導はｐ１４Ａにより排除された（図１１Ａ）。これに対し、ｐ１４Ａは抗ＣＤ３単独によるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの誘導を阻害せず、ｓＢ７−２単独による誘導をより早期に移行させた。
【０２５７】
この結果は、アンタゴニストペプチドがＢ７−２ひいてはＴｈ１細胞でのその共リガンド、ＣＤ２８を必要するその阻害作用に特異的であることを示している。ｓＢ７−２単独では抗ＣＤ３よりも早期にＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの誘導をもたらした。これに対し、ｓＢ７−２単独では抗ＣＤ３で認められる誘導に匹敵するＩＬ−１０の誘導をもたらることはなく、また、ＣＤ３とｓＢ７−２との組合せによってもＣＤ３単独による誘導よりも大幅に増強された誘導はもたらされなかった（図１１Ｂ）。ｓＢ７−２／抗ＣＤ３によるＩＬ−１０の誘導がｐ１４Ａアンタゴニストペプチドによる阻害に大きな耐性を示すことが証明された（図１１Ｂ）。抗ＣＤ２８がＩＬ−１０を誘導することができず（図１０Ｂ）、また、ｓＢ７−２が抗ＣＤ３の存在下で得られるものに匹敵するレベルまでＩＬ−１０を誘導し得ない（図１１Ｂ）という発見は、図６のデータにより最初に提示したＢ７−２分子およびＣＤ２８のいずれもがＩＬ−１０誘導に関与しないという概念を裏付けている。
抗ＣＤ３／ｓＢ７−２による二重刺激は超抗原によるＴＣＲおよびＣＤ２８を介する刺激とよく似ており、本明細書においてはアンタゴニストペプチドにより阻害されることにおいて一致している（図１１ＡおよびＢ）。
【０２５８】
アンタゴニストペプチドはＴｈ１サイトカイン遺伝子発現のｓＢ７−２媒介性誘導を刺激する
図１２で使用したＰＢＭＣ集団では、ｓＢ７−２はＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの短い一時的な誘導しかもたらさなかった。この制限条件でｐ１４Ａを添加した場合には、図１１Ａの結果と一致してこの誘導を阻害し得ないだけでなく、アンタゴニストペプチドは誘導を強く刺激しさえした。
この結果は、超抗原とＣＤ２８との結合が共リガンド、Ｂ７−２とＣＤ２８との相互作用を促進し、また、ｐ１４Ａは超抗原の不在下ではこの点において超抗原によく似ているという概念を裏付けている。
【０２５９】
実施例５
超抗原とＣＤ２８標的受容体との直接結合
プラズモン共鳴による平衡結合研究によりＳＥＢと組換え可溶性ＣＤ２８との結合およびアンタゴニストペプチドと組換え可溶性ＣＤ２８との結合を示す
超抗原とＣＤ２８との相互作用およびアンタゴニストペプチドによるこの相互作用の阻害についてのこれまでの証拠はヒトＰＢＭＣにおけるＴｈ１サイトカイン遺伝子誘導の機能研究に基づいたものである。そのため、超抗原またはアンタゴニストペプチドとＣＤ２８標的受容体との直接結合を示す必要性がある。溶解状態にあるこれらの分子の結合を定量するために、プラズモン共鳴による測定を採用した。この方法は超抗原、ＭＨＣクラスII分子およびＴＣＲでの複合体形成を立証するのに用いられている[Seth et al., Nature 369: 324-327 (1994)]。図１３の試験では、ｓＣＤ２８をBiacore チップ上に固定化し、抗ＣＤ２８、ＳＥＢまたはｐ１４Ａを複合体形成に関する解析物として用いた（複合体形成は共鳴単位（ＲＵ）で測定される）。図１３Ａでは抗ＣＤ２８とｓＣＤ２８との結合がＲＵの上昇により観察される。ＳＥＢの結合を図１３Ｂで示し、ｐ１４Ａの結合を図１３Ｃで示している。ＳＥＢで予想されるこの結合は低親和性であり、Ｔ細胞アクチベーターとしてのその役割での複数のリガンド、ＭＨＣクラスII、ＴＣＲおよびＣＤ２８との結合に依存する。
【０２６０】
プラズモン共鳴は平衡条件下の結合をリアルタイムで測定するため、これらの結果はＳＥＢおよびｐ１４Ａ各々がＣＤ２８と直接結合することを立証している。
【０２６１】
Biacore プラズモン共鳴による平衡結合研究により抗ＣＤ２８とｓＣＤ２８との高親和性結合がＳＥＢにより阻害されることを示す
抗ＣＤ２８とｓＣＤ２８との結合に関するプラズモン共鳴シグナルを図１４で示す。この結合はＳＥＢによって、抗ＣＤ２８抗体と等モル比で存在するときでさえも減少した。モノクローナル抗体である抗ＣＤ２８がＣＤ２８に対するその高親和性で選択されるのに対し、超抗原がより低い親和性でｓＣＤ２８と結合する（参照、図１３Ａの抗ＣＤ２８は約２００ＲＵの増加、図１３ＢのＳＥＢは約３０ＲＵの増加）ことから、抗ＣＤ２８  ｍＡｂと競合するＳＥＢの能力は驚くべきものである。この結果は、ＳＥＢがｓＣＤ２８と直接相互作用することも示している。
【０２６２】
Biacore プラズモン共鳴による平衡結合研究により抗ＣＤ２８とｓＣＤ２８との高親和性結合がｐ１４Ａにより阻害されることを示す
抗ＣＤ２８とｓＣＤ２８との結合に関するプラズモン共鳴シグナルはアンタゴニストペプチドｐ１４Ａにより低下し、阻害の程度はＣＤ２８抗体濃度の低下に伴い漸増した（図１５）。ｍＡｂがそのリガンド、ｓＣＤ２８に対してアンタゴニストペプチドよりも高い親和性を有することから、抗ＣＤ２８  ｍＡｂと競合するアンタゴニストペプチドの能力は驚くべきものである（図１３Ａと図１３Ｃ）。この結果は、毒素アンタゴニストペプチドがｓＣＤ２８と直接相互作用することを示している。
【０２６３】
ＥＬＩＳＡ形式での結合研究により抗ＣＤ２８とｓＣＤ２８との高親和性結合がアンタゴニストペプチドにより阻害されることを示す
さらにもう１つのアッセイを考案してアンタゴニストペプチドとｓＣＤ２８との直接相互作用を示した。本発明者らは、ｓＣＤ２８をマイクロタイターＥＬＩＳＡプレートのウェルに固定化し、抗ＣＤ２８の結合をアルカリ性ホスファターゼを結合した二次抗体を用いて測定する酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）を開発した。図１６では、１，０００倍希釈した抗ＣＤ２８とプレートとの結合がたった０．１μｇ／ｍｌの濃度のｐ１４Ａによってさえも阻害されたことが分かる。ｐ１４Ａの量が高くなるほどもたらされる阻害のレベルが高くなることはなく、ある程度にしかそうならなかった。しかしながら、抗ＣＤ２８の濃度が２倍低くなると、ｐ１４ＡはｓＣＤ２８との結合に対して著しい阻害効果を示し、この阻害はｐ１４Ａ濃度に伴って漸増した。よって、アンタゴニストペプチドｐ１４Ａは抗ＣＤ２８とｓＣＤ２８との相互作用の強力な阻害剤である。このことは、図１３Ｃのデータに基づいた結論を強化して、ｐ１４ＡがｓＣＤ２８と直接結合することを示している。
【０２６４】
プラズモン共鳴による平衡結合研究によりＳＥＢのｓＣＤ２８との相互作用がｓＢ７−２との相互作用よりも弱いことを示す
抗ＳＥＢと固定化されたＳＥＢとの結合に関するプラズモン共鳴シグナルを図１７Ａに示す。図１７Ｂの試験では、この結合を漸増濃度のｓＣＤ２８の存在下で調べた。ｓＣＤ２８は抗ＳＥＢとＳＥＢとの相互作用を効果的に阻害し、結合が約５倍減少した。ｓＢ７−２も、それよりも弱くではあるがこの相互作用を阻害した。抗ＳＥＢはＳＥＢと十分に結合した（図１７ＡおよびＣ）が、ＣＤ２８とは結合し得なかった（図１７Ｃ）。よって、図１７Ｂの結果はＣＤ２８とＳＥＢとの直接相互作用を立証している。それらもまた、直接相互作用がｓＢ７−２とＳＥＢとの間に生じることを示している。
【０２６５】
ｓＢ７−２と固定化されたＣＤ２８との結合に関するプラズモン共鳴シグナルをＫｄ  １９ｎＭに従い、図１７Ｄに示す。Ｂ７−２／ＣＤ２８複合体がＳＥＢと結合することができるかどうかを解析するため、ｓＢ７−２およびｓＣＤ２８を等モル量で図１７Ａのアッセイ系に投入した。ｓＢ７−２単独では調べた濃度において阻害性はなかったが、それはｓＣＤ２８の阻害効果を高め、２種のリガンドが超抗原とのそれらの相互作用において協力することを示した（図１７Ｅ）。
【０２６６】
ｓＣＤ２８とＳＥＢとの結合をさらに研究するため、長時間のプラズモン共鳴解析を採用した（図１８）。解析物としての抗ＳＥＢとチップ上に固定化されているＳＥＢとの結合を漸増濃度のｓＣＤ２８により段階的に阻害した（図１８Ａ）。４ｎＭ抗ＳＥＢ  ＡｂとＳＥＢとの結合に対して１μＭ  ｓＣＤ２８により起こる８４％の阻害は漸増濃度の抗ＳＥＢ  Ａｂにより段階的に軽減される（図１８Ｂは結合率％を示す）。この結果は、抗ＳＥＢ  ＡｂとＳＥＢとの強い相互作用に関係なく、ｓＣＤ２８が競合し得ることを示している。これに対し、ｓＣＤ２８をチップ上に固定化した後、チップを抗ＳＥＢ  Ａｂに曝露した場合には観察できるシグナルはなかった（図１７Ｃ上記）。よって、ｓＣＤ２８は抗体を外すのに十分な親和性でＳＥＢと結合する。
【０２６７】
ｓＣＤ２８とＳＥＢとの相互作用に関する独立した証拠はＥＬＩＳＡにより与えられる。図１９の試験では、抗ＳＥＢ  ＡｂとＥＬＩＳＡプレート上に固定化されているＳＥＢとの結合をアッセイした。この結合に対して、漸増濃度のｓＣＤ２８が効果的に競合し得た、最大約７５％（図１９Ａおよび１９Ｂ）。アッセイの読み出しの最も早い時点でより強い阻害効果を示した（図１９Ａ）。図１８Ｂのプラズモン共鳴データに従い、抗体をより広く希釈するにつれて阻害の範囲が広がった（図１９Ｂ）。よって、ＥＬＩＳＡに基づいた試験的証拠もまた、ｓＣＤ２８が抗体を外すのに十分な親和性でＳＥＢと結合することを示している。
【０２６８】
これに対し、ｓＣＤ２８を用いてＥＬＩＳＡプレートをコーティングした後、プレートを抗ＳＥＢ抗体に曝露した場合には観察できるシグナルはなかった。よって、ｓＣＤ２８はＳＥＢと結合して、抗ＳＥＢとＳＥＢとの結合に干渉する。
【０２６９】
ＥＬＩＳＡ研究によりｐ１４ＡがＣＤ２８と相互作用することを示す
ｓＣＤ２８とｐ１４Ａとの相互作用に関する証拠は図２０のＥＬＩＳＡによりさらに与えられる。抗ｐ１４Ａ  ＡｂとＥＬＩＳＡプレート上に固定化されているｐ１４Ａとの結合をアッセイした。この結合に対して、漸増濃度のｓＣＤ２８が効果的に競合することができ、９０％を超える阻害をもたらした。抗体をより広く希釈するにつれて阻害の範囲が広がった。よって、ｓＣＤ２８は抗ｐ１４Ａ抗体を外すのに十分な親和性でｐ１４Ａと結合する。
【０２７０】
ｐ１４ＡがＳＥＢのドメインと相同であること、また、ｓＣＤ２８がｐ１４Ａと抗ｐ１４Ａ  Ａｂとの結合およびＳＥＢと抗ＳＥＢ  Ａｂとの結合の両方を阻害することから、当然ＳＥＢがｐ１４Ａとの相同性を有するドメインを介してｓＣＤ２８と相互作用するということになる。この結論は、ＳＥＢによるＴｈ１サイトカイン遺伝子発現の誘導を阻害するｓＣＤ２８の能力（図７および８ならびに図２５および２６下記）と抗ＣＤ２８  ｍＡｂによるＴｈ１サイトカイン遺伝子発現の誘導を阻害し（図１０Ａ）、また、抗ＣＤ２８  ｍＡｂとｓＣＤ２８との結合を阻害する（図１６）ｐ１４Ａの能力からの裏付けを受ける。
【０２７１】
プラズモン共鳴による平衡結合研究によりｓＣＤ２８とｓＢ７−２との結合がアンタゴニストペプチドにより増強されることを示す
ｓＣＤ２８とｓＢ７−２との結合に関するプラズモン共鳴シグナルはアンタゴニストペプチドｐ１４Ａによりかなり増強されたが、ｐＳＥＢ（４１−６１）、アンタゴニスト活性のないペプチドでは少ししか増強されなかった[Arad et al., (2000) 前掲]（図２１）。この結果より、アンタゴニストペプチドがｓＢ７−２によるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの初期誘導を増強し得るという観察結果（図１２）の説明がつく。
【０２７２】
よって、プラズモン共鳴により測定される結合とＰＢＭＣにおけるＴｈ１応答の誘導に関する機能アッセイとに直接的な相関関係が存在することが分かる。
する。
【０２７３】
つまり、図１〜２１でのデータから、超抗原によるＴｈ１細胞応答の活性化が非常に弱い相互作用として知られているＢ７−２／ＣＤ２８相互作用（Ｂ７−１／ＣＤ２８相互作用よりも２０倍弱く、また、Ｂ７−１／ＣＴＬＡ−４相互作用よりも１００倍弱い）に完全に依存しており、また、ＴＣＲおよびＭＨＣクラスII分子との結合により適所に保持される超抗原がひとたびＴｈ１細胞のＣＤ２８と直接結合すると有効なＢ７−２／ＣＤ２８相互作用が可能になるという新規な概念が導かれる。アンタゴニストペプチドによりブロックされるのがこの後者の結合工程である。これに対し、Ｔｈ２細胞の超抗原による活性化にはＢ７−２／ＣＤ２８相互作用の必要性がないために、Ｔｈ２応答はアンタゴニストペプチドにより阻害されない。
【０２７４】
実施例６
ＳＥＢは抗ＣＤ２８  ｍＡｂに対するエピトープを露出するＣＤ２８分子の一時的な変化を誘導する
マウス抗ヒトＣＤ２８  ｍＡｂ（R & D Systems, Minneapolis, MinnesotaのＭＡＢ３４２）およびＣＤ２８に対するヤギ抗ヒトポリクローナル抗体（ＣＤ２８  Ａｂ）を用いてＣＤ４を濃縮したヒトＰＢＭＣを染色した。ＣＤ４陽性細胞の濃縮は、製造業者の教示に従い、抗体カクテル(RosetteSep, StemCell Technologies, Vancouver, Canada)により行った。ＣＤ４細胞は濃縮前は全ＰＢＭＣの１８％、濃縮後は９０％を構成した。濃縮したＣＤ４細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＳＥＢにより誘導し、誘導０、６および２４時間後に抗ＣＤ２８  ｍＡｂまたは抗ＣＤ２８  Ａｂにより染色した。抗ＣＤ２８  Ａｂでは調べた全ての時点で細胞を染色することができたが、抗ＣＤ２８  ｍＡｂ染色はＳＥＢにより６時間誘導した細胞では検出されたが、０時間の静止期細胞およびＳＥＢにより２４時間誘導し続けた細胞では検出されなかった（図２３）。よって、ＣＤ２８受容体は抗ＣＤ２８  Ａｂによる染色で分かるように、全ての時点の細胞に存在するが、ｍＡｂにより認識されるのはＳＥＢによる細胞の誘導後だけであった。この結果は、ＳＥＢがＣＤ２８受容体の一時的変化を誘導し、そうすることでｍＡｂに接近しやすくするという解釈を裏付けている。
【０２７５】
実施例７
アンタゴニストペプチドにより認識されるＣＤ２８エピトープ
アンタゴニストペプチドは抗ＣＤ２８  ｍＡｂとｓＣＤ２８との結合を阻害する。本発明者らはこのｍＡｂの特異性をうまく利用して抗体により認識されるＣＤ２８エピトープをマッピングした。このエピトープは超抗原の、ひいてはアンタゴニストペプチドの結合部位と少なくとも一部が重複しているはずである。この目的に向けて、ＰｈＤ−１２コンビナトリアルファージディスプレイライブラリー(New England Biolabs)を用い、固定化された抗ＣＤ２８  ｍＡｂ  ＭＡＢ３４２上でのファージの反復パンニングおよびｓＣＤ２８による置き換え、続いて、最も容易に抗ＣＤ２８  ｍＡｂと結合するファージに関するスクリーニングによりエピトープマッピングを行った。このようにして選択された２２ファージから得られるペプチド配列をギャップを考慮せずにアラインすると、配列ＨＶＫＧＫＨ（配列番号４で示される）を含むヒトＣＤ２８の１９〜１５２アミノ酸細胞外ドメインの１３４〜１４２位にあるＨＶＫＧＫＨＬＣＰモチーフ（図２４で下線を引いた部分で、配列番号３でも示される）で重複する１つのコンセンサス配列がえられた。ＨＶＫＧＫＨモチーフの機能は分かっていないが、これは異なる種のＣＤ２８内に高度に保存されており、ヒトＣＴＬＡ−４二量体の界面の一部を構成する６アミノ酸モチーフＹＶＩＤＰＥ（配列番号６）を含むＣＴＬＡ−４の対応する領域とは著しく異なっている[Schwartz et al., Nature 410: 604-608 (2001)]。
【０２７６】
実施例８
ｐＴＡ、新規なアンタゴニストペプチドはＣＤ２８分子内の超抗原結合部位から誘導される
超抗原の作用におけるヒトＣＤ２８のＨＶＫＧＫＨＬＣＰ（配列番号３）モチーフの機能を評価するため、このモチーフを含み、かつ、配列ＡＡＡＡＡＡＡＨＶＫＧＫＨＬＣＰ（ｐＴＡ、配列番号５でも示される）を有する１６量体ペプチド（ｐ１４Ａと同じ長さのペプチドを作製するためだけにＮ末端アラニン残基を付加した）を合成した。
【０２７７】
抗ＣＤ２８  ｍＡｂ  ＭＡＢ３４２によりＰＢＭＣを誘導すると、２４時間の時点で顕著なＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現がもたらされた。この発現はｓＣＤ２８だけでなくｐＴＡによっても阻害された（図２５Ａ）。別のＰＢＭＣ集団での試験では、抗ＣＤ２８  ｍＡｂによるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの誘導はそれよりも早期に起こり、３時間までに顕著となり、その後は弱まった。この誘導は予想されるようにｓＣＤ２８によって阻害され、また、ｐＴＡによっても用量依存的に阻害された（図２５Ｂ）。よって、ｐＴＡは抗ＣＤ２８  ｍＡｂの機能的アンタゴニストである。
【０２７８】
ＰＢＭＣでの抗ＣＤ２８  ｍＡｂの作用はＣＤ２８ならびにｐＴＡ（配列番号５）によって排除される。抗ＣＤ２８による誘導においてＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現が早い（図２５Ｂなどの場合）、 遅い（図２５Ａなどの場合）に関係なく、ｐＴＡには阻害性がある。この結果は、可溶性ＣＤ２８受容体のように、ｐＴＡが抗ＣＤ２８  ｍＡｂとの結合において細胞ＣＤ２８受容体と競合し得ること、および、ｐＴＡのＣＤ２８配列モチーフがｍＡｂの機能的エピトープであることを示している。抗ＣＤ２８  ｍＡｂによるＴｈ１サイトカイン遺伝子誘導の解析によりエピトープマッピングの妥当性は高まる（図２４）。
【０２７９】
ＳＥＢによりＰＢＭＣの誘導を行った場合に、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現が３〜２４時間の時点ではっきりと認められた。この発現はｓＣＤ２８だけでなくｐＴＡによっても阻害された（図２６Ａ）。これに対し、ＳＥＢによるＩＬ−１０誘導はｓＣＤ２８およびｐＴＡのいずれによっても阻害されなかった（図２６Ｂ）。
【０２８０】
別の試験では、ＰＢＭＣにおけるＩＬ−２  ｍＲＮＡのＳＥＢ誘導性発現が６時間の時点で最も顕著であり、この発現はｓＣＤ２８だけでなくｐＴＡによっても阻害された（図２６Ｃ）、２４時間までにＩＬ−１０の蓄積の阻害はなかった（図２６Ｄ）。
【０２８１】
よって、ｍＡｂ  ＭＡＢ３４２により認識されるＣＤ２８のエピトープの少なくとも一部を有するペプチドｐＴＡ（配列番号５でも示される）がＳＥＢのアンタゴニストである。ＳＥＢが細胞ＣＤ２８受容体とこの受容体の全体または一部にあるＨＶＫＧＫＨＬＣＰモチーフ（配列番号３）を通じて結合するならば、また、この結合がＴｈ１サイトカイン応答の毒素媒介性活性化に必要不可欠であるならば、これは予測される結果である。このことから、ＣＤ２８が毒素性ショックをもたらし得る有害な細胞免疫応答の超抗原媒介性活性化に関する重要な標的であることが明確になる。
【０２８２】
ＣＤ２８のＳＥＢ結合部位は、ｐＴＡに存在する配列ＨＶＫＧＫＨＬＣＰの一部または全てを含んでなる。
【０２８３】
ｐＴＡがＳＥＢのアンタゴニストであり、抗ＣＤ２８  ｍＡｂのアンタゴニストもあるという発見は、ＳＥＢがＣＤ２８と直接相互作用してＴｈ１サイトカイン遺伝子発現を誘導するはずであり、また、この相互作用がＨＶＫＧＫＨＬＣＰモチーフの全てまたは一部を通じて起こるという概念の強い裏付けを与える。
【０２８４】
実際には、ｓＣＤ２８分子に別のモチーフを含むペプチドＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＭＹＰＰＰＹ（配列番号７で示される）を同様に試験した場合（図２４）、それはＳＥＢに対してアンタゴニスト活性を示さなかった。
【０２８５】
ｐＴＡおよびＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＭＹＰＰＰＹは単独ではいずれも、ヒトＰＢＭＣにおけるＴｈ１サイトカインｍＲＮＡ発現またはＩＬ−１０発現のインデューサーとして活性でなかった。
【０２８６】
ＣＤ２８の配列モチーフを有するペプチドが超抗原アンタゴニストとしての機能を果たし得るという発見により、ｐ１２Ａおよびｐ１４Ａなどの、超抗原ドメインに対して相同性を有するアンタゴニストペプチドに関する研究が拡張される。原則として、２つの異なる種類の超抗原アンタゴニストペプチドを作製することができる：１つはそのＣＤ２８標的受容体に対し超抗原と競合し（各々、配列番号１および２で示されるｐ１２Ａ、ｐ１４Ａなど）、もう１つのもの（配列番号５で示されるｐＴＡなど）は超抗原に対しＣＤ２８標的受容体と競合する（図２７）。
【０２８７】
実施例９
高親和性アンタゴニストに関するスクリーニングアッセイの開発
これまでのことを受け、超抗原アンタゴニストペプチドの細胞標的はＣＤ２８である。これは、毒素性ショックおよび細胞免疫応答（および特に、Ｔｈ１応答）の超抗原媒介性過剰刺激の他の結末、例えば、吐き気、嘔吐および下痢をはじめとする毒素無能力を阻止するアンタゴニストの設計のために初めて細胞薬剤標的を提供する。最も重要なことだが、本発明によってようやく超抗原とＣＤ２８受容体との相互作用の新規なアンタゴニストの設計が、本明細書において例示するアンタゴニストペプチドによっても、小分子、酵素またはタンパク質によっても可能になった。本発明は、例えば、ファージディスプレイまたはポジショナルスキャニングまたは環状ペプチドミメティックスにより、アンタゴニスト分子の結合のためのベイト（おとり）として可溶性組換えＣＤ２８またはｓ−Ａｇ結合部位（好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列の全てまたは一部を含んでなる）を含んでなるその断片を使用することによる毒素性ショックアンタゴニストを見つけるための新たな戦略を提供する。
【０２８８】
可溶性ＣＤ２８またはｓ−Ａｇ結合部位を含んでなるその断片の標的としての使用
各候補試験物質、より好ましくは、試験ペプチドをウェルに入れ、可溶性組換えＣＤ２８（ｓＣＤ２８）の直接結合をｓＣＤ２８に対するタグ付きＡｂにより検出する。プレート上でｓＣＤ２８と既知のアンタゴニストペプチド（例えば、ｐ１２およびｐ１４）とを効率的に結合させる条件を最初に最適化する（ｐＨ、塩およびバッファーの組成研究、ＢＳＡなどの担体タンパク質など）。このスクリーニングによりｓＣＤ２８と結合する全てのペプチドまたは物質が得られる。
【０２８９】
ＣＤ２８と超抗原結合部位で特異的に結合するペプチドまたは候補物質を選択するため、ｓＣＤ２８と結合するペプチドまたは物質をプールした後、下記のように異なる競合試験でアッセイする。ｓＣＤ２８またはｓ−Ａｇ結合部位（好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列の全てまたは一部を含んでなる）を含んでなるその断片をマイクロプレートのウェルに固定する。アンタゴニストペプチドとプレート上のｓＣＤ２８（またはｓ−Ａｇ結合部位を含んでなる断片）とを効率的に結合させる条件はｐ１２およびｐｌ４などの既知のアンタゴニストペプチドを用いて最初に最適化する。次いで、各ウェルを試験アンタゴニストペプチドまたは物質（単独またはプール）の存在下で限界量の抗ＣＤ２８  ｍＡｂとともにインキュベートする。各ウェルの上清を集める。上清中の結合していないｍＡｂを二次抗体ＥＬＩＳＡにより検出する。この選択により、ＣＤ２８にある超抗原のアンタゴニストドメイン結合部位または近接するＢ７−２結合部位のいずれかをブロックする特異的な候補物質、好ましくは、ペプチドが得られるはずである。次のラウンドではこれをアンタゴニストペプチドまたは超抗原との競合により分離する。また、ビオチン化したＳＥＢを、標識ＳＥＢをプレート上のｓＣＤ２８との結合から外すペプチドの能力に関するアッセイに使用してもよい。さらにもう１つの別の例では、ｐ１２およびｐｌ４などの標識した既知のアンタゴニストペプチドを使用し、また、標識をプレート上のｓＣＤ２８（またはｓ−Ａｇ結合部位を含んでなるその断片）との結合から外す試験ペプチドの能力に関してアッセイする。例えば、システインタグ付きｐ１２を使用して、ビオチンまたはフルオレセインを連結してもよい。
【０２９０】
ＣＤ２８を過剰発現する細胞の標的としての使用
ＣＤ２８  ｃＤＮＡを哺乳類細胞に好適な発現ベクターに、例えば、Ben-Asouli et al.[Cell 108: 221-232 (2002)]により記載されているように骨髄増殖性肉腫ウイルスプロモーター下に、かつＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの上流にクローニングする。各ペプチドをウェルに入れ、次いで、ウェルをＢＳＡまたはウシ胎児血清でブロックする。細胞表面でＣＤ２８を発現する細胞、例えば、ＢＨＫ−２１細胞の結合に肉眼でまたは抗ＣＤ２８  ＥＬＩＳＡによりスコアをつける。あるいは、ＣＤ２８発現細胞から準備した細胞膜を使用し、結合を抗ＣＤ２８を用いて検出する。次いで、決定的なペプチドを競合相手としてＳＥＢまたはｐ１２およびｐ１４などの既知のアンタゴニストペプチドの存在下で再検討する。
注目すべきは、ｓ−Ａｇ結合部位（好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列の全てまたは一部を含んでなる）を含んでなるＣＤ２８の断片を発現する細胞を上記のように使用し得ることである。
【０２９１】
ファージディスプレイ
ランダムライブラリー−ＣＤ２８受容体に対して高親和性（好ましくは、ナノモル以下）を有する超抗原アンタゴニストペプチドに関してスクリーニングするためにはコンビナトリアルファージライブラリーを使用する。具体的に言えば、New England BiolabsのＰｈＤライブラリーを最初に、一般には、約４〜６ラウンドのパニングに使用する。パニングは２段階で行われる。第１の段階では、結合したファージを低ｐＨ、好ましくは、pＨ２．２での溶出によりマイクロプレートに結合したｓＣＤ２８（またはｓ−Ａｇ結合部位を含んでなるその断片）から溶出する。第２の段階では、上記のように選択されたファージをｓＣＤ２８と結合させ、過剰の既知アンタゴニストペプチド（例えば、ｐ１２およびｐ１４）またはＳＥＢを用いて特異的に溶出させる。結合したファージを溶出し、これらに対して同様のパニングをさらに（２〜３サイクル）行う。次いで、個々のファージクローンと固定化したｓＣＤ２８との直接結合をファージＥＬＩＳＡにより検出し、この場合、プレート上のＭ１３ファージに対してスコアをつける。選択された線形ペプチドの合成およびＰＢＭＣにおけるアンタゴニスト活性に関するアッセイの前に合計、例えば、１，０００の決定的なファージクローンを増幅し、配列決定する。
【０２９２】
ｓＣＤ２８を固定標的として使用することが試験に値するという場合には代替パニング戦略を進める。ＣＤ２８  ｃＤＮＡをトランスフェクトされた細胞、例えば、ＢＨＫ−２１細胞で一時的に過剰発現させた後、これらの細胞をプレート上に固定化する。ファージにディスプレイされたペプチドのパニングをまずベクターでトランスフェクトされた細胞で行って非特異的なバインダーを排除した後、ＣＤ２８をそれらの細胞表面で過剰発現する細胞で行う。あるいは、全細胞膜画分を細胞の代用にしてもよい。ＣＤ２８と結合したファージを過剰の既知アンタゴニストペプチド（例えば、ｐ１２およびｐ１４）またはＳＥＢで溶出させる。
特定(dedicated)ライブラリー−第２の段階では、ディスプレイされたペプチドの数残基が一定に保持される専用ライブラリーを構築する。アンタゴニスト活性の評価に向けて、ランダムおよび専用ライブラリーから選択されたペプチドの小規模合成を行う。
【０２９３】
ファージディスプレイスクリーニングで単離されたか、ポジショナルスキャニングまたは環化化学により生み出された候補ペプチドに対して、上記のように、ＣＤ２８、ｓＣＤ２８または好ましくは、配列番号３で示されるアミノ酸配列の一部または全てを含んでなるＣＤ２８分子内のｓ−Ａｇ結合部位との高親和性結合に関するハイスループットスクリーニングを行う。
【０２９４】
アラニンスキャン
アラニンスキャンをまず、受容体との結合に重要な残基を同定するために既知アンタゴニストペプチド（例えば、ｐ１２またはｐ１４）で行うか、またはｓ−Ａｇとの結合に、また、それとは別に、in vitroにおける超抗原アンタゴニスト活性に重要な残基を同定するために本発明のアンタゴニストｐＴＡで行う。ペプチドはＮ末端アセチルおよびＣ末端ＣＯＮＨ２を有する可溶型で合成され、ＰＢＭＣを用いたin vitroアッセイでのより高いプロテアーゼ耐性に関係するフランキングＤ−アラニンを保持する。同定されたバックアップアンタゴニストペプチドに対してアラニンスキャンのさらなるラウンドを実施する。ペプチドのリジンスキャンを同様に実施する。同定されたバックアップペプチドに対してリジンスキャンのさらなるラウンドを実施する。
【０２９５】
ポジショナルスキャン
一度、アラニンスキャンによりアンタゴニスト活性に重要な残基が同定されれば、全２０アミノ酸（４００ペプチド）の完全に置換されたpepscanで２つのこのような位置が選択され、次いで、同様に、２つのさらなる位置がスキャンされる（４００ペプチド）。ペプチドは最初、解放可能な形態であるが、チップ上に保持される（Pepscan  Ｉ、下記を参照）。ｓＣＤ２８またはｓ−Ａｇ結合部位を含んでなるその断片と各ペプチドとの結合にこの受容体に対する市販のウサギポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡによりスコアをつける。次ぎに、決定的なペプチドを解放し(Pepscan  II、下記を参照)、上記の本発明のスクリーニング方法の選択工程に従うスクリーニングアッセイ  ＥＬＩＳＡフォーマットによる受容体結合アッセイに向けてプール（グループ化）し、さらに、ＰＢＭＣアッセイによるin vitroにおけるアンタゴニスト活性に関して評価した後、そのグループをデコンボルートする(deconvoluted)。段階的に、得られた改良リードに対してもう一度ポジショナルスキャニングを行う。好ましくは、合計４回のポジショナルスキャニングを実施し、受容体に対して最大の親和性を有するペプチドに対して２回の固定ポジショナルスキャニングを実施する。
【０２９６】
Pepscan−Ｉ：ペプチドはミニウェルの底に付着して残る
Pepscanライブラリーを合成し、共有結合したペプチドを含むポリエチレンカードを用いてスクリーニングする[例えば、Slootstra et al., Molecular Diversity 1: 87-96 (1995)により記載されている]。ペプチドをＮ末端がアセチル化され、Ｃ末端がミニウェルと連結された固相で合成してもよい。ｓＣＤ２８（またはｓ−Ａｇ結合部位を含んでなるその断片）と各ペプチドとの結合にこの受容体に対する市販のウサギポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡによりスコアをつける。カードを洗浄した後、それらをヤギ抗ウサギペルオキシダーゼとともにインキュベートし、次いで、洗浄後にペルオキシダーゼ基質２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸およびＨ２Ｏ２を添加する。着色を例えば、ＣＣＤカメラおよび画像処理ソフトウェアを使用して定量する。
【０２９７】
Pepscan−II：ペプチドはミニウェルの底から解放される
ペプチドとミニウェルの底との間に酸で不安定なリンカーを置くことを除き、上記のようにPepscanライブラリーを合成する。低ｐＨにてミニウェルの底からペプチドを解放し、９６ウェルマイクロタイタープレートに移す。このプレートを上記の方法により競合ＥＬＩＳＡフォーマットで使用する。２種類のフォーマット：ミニウェル（１μｇ／ウェル、≦１５残基）およびピン（１，０００μｇ／ピン、≦１５残基）を使用する。pepscan−IIフォーマットでは、ペプチドのセットをプールすることができる。例えば、１２量体ペプチドの完全シングルポジショナルスキャンにより１２の対照を含む２４０ペプチドが得られる。これらをアッセイに向けて、各々が１箇所異なる（対照ペプチドを除く）１２グループにプールすることができる。１２グループを、ＥＬＩＳＡフォーマットで受容体との結合に関して、さらに、in vitroにおけるアンタゴニスト活性に関してアッセイした後、デコンボルートする(deconvoluted)。
【０２９８】
環化スキャン（pepscan  Ｉ）
ＭＢＳ（ｍ−マレインイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル）などのリンカーを用いて、その活性エステル（スクシンイミド）を介して特定のペプチドのＮ末端と、また、そのマレインイミド基を介してシステインの遊離チオール基と反応させる[参照、Langeveld et al., J. Virol. 68: 4506-4513 (1994)]。システインはペプチドの一部である。（例えば、Ｃ末端に位置する）。この連結は還元剤に対して反応せず、ジスルフィド架橋と比べて有利な点である。
【０２９９】
ループスキャン（pepscan  Ｉ）
各ペプチドのＮ末端をＭＢＳなどの連結剤を用いてシステインの遊離ＳＨ基と連結する。このシステインは別々に同じウェルの底と連結している。このように、固定されたループが形成される。ペプチドの合成および同じウェルでのシステインの独立した連結は標準ＦＭＯＣ−およびＢＯＣ−ペプチド化学を併用して行われる（参照、Schnolzer et al. Int. J. Pept. Protein Res. 40: 180-193 (1992); Guy and Fields, Method Enzymol. 289: 67-83 (1997)]。ＦＭＯＣは２０％ピペリジンで切断され、ＢＯＣは１００％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で切断される；ピペリジンはＢＯＣを切断せず、ＴＦＡはＦＭＯＣを切断しない。よって、ペプチドはＦＭＯＣ−化学を用いて合成され、システインは独立にＢＯＣ−化学を用いて同じウェルに連結される。各連結後、ＦＭＯＣは選択的に除去され、別のアミノ酸が添加される。ＢＯＣはシステインから除去されないため、添加したアミノ酸はそれとは連結し得ない。ＦＭＯＣ合成終了時に、ペプチドが完成すると、ＢＯＣ−システインが脱保護される。その後、上記のようにペプチドのＮ末端を１つのシステインと連結することができる。
【０３００】
一度、上記のようにポジショナルスキャニングおよびファージディスプレイによりペプチドが選択されれば、短い種類を合成して最短のアンタゴニストペプチドを獲得することが可能である。本発明者らは１２量体ｐ１２を、２つのＮ末端アミノ酸を除去することにより１０量体にした。このことによってアンタゴニスト活性の低下が起こった[Arad et al., (2000) 前掲]が、かつて同定されたより強力なアンタゴニストは短縮を受けても活性を維持し得る。短縮はポジショナルスキャニングのデータに従って行われる。
【０３０１】
次いで、ＰＢＭＣにおける毒素アンタゴニスト活性の評価に向けて、選択されたペプチドの小規模合成を実施する。
【０３０２】
末端切断
一度、上記のようにポジショナルスキャニングおよびファージディスプレイによりペプチドが選択されれば（上記を参照）、短い種類が合成され、最短のアンタゴニストペプチドが得られる。
Ｄ−鏡像異性体of アンタゴニスト
【０３０３】
潜在的薬剤として高親和性Ｄ−ペプチドを得るため(Schumacher et al., Science, 271: 1854-1856 (1996); Miller et al., J. Molec. Struct. 423: 137-152 (1998); Eckhart et al., Cell 99: 103-115 (1999)の好ましい段階的なプログラムは：
（１）標的分子の鏡像を作製すること、すなわち、同じ配列を有するＤ−アミノ酸鏡像異性体を作製すること；
（２）Ｄ−鏡像異性体標的と結合するＬ−ペプチドアンタゴニストを（ファージディスプレイを利用して）選択すること；
（３）結合させるＬ−アンタゴニストリガンドのＤ−ペプチド鏡像異性体を合成することである。これは天然Ｌ−標的と結合する。
【０３０４】
Ｌ−ペプチドのReverse-inverso  Ｄ−類似体は、側鎖が略図では同じ角度をなして配置されているように見えるが鏡像（鏡像異性体）構造ではない。側鎖はもちろん主鎖も鏡像である必要がある。
【０３０５】
Ｄ−ペプチドは酸およびプロテアーゼに耐性であり、優れた、直接生物利用可能な経口薬剤候補と考えられる。サイクロスポリンは天然Ｄ−ペプチドである。Ｄ−ペプチドはＭＨＣ複合体に存在する形態に消化され得ない（Ｃ−α主鎖の方向の誤りにより結合が破壊される）ことから、それらはＢおよびＴ細胞活性化を誘発し得ないために、それらの免疫原性は低く、ほとんど存在しない[Dintzis et al., Proteins 16: 306-308 (1993)]。Ｄ−ペプチドの血清中半減期はＬ−ペプチドで見られるような数時間ではなく数日間であり[Dintzis et al., (1993) 前掲]、それらは腸から直接吸収され得る(Ptachcinski et al., Clin. Pharmacokinet. 11: 107-132 (1986); Pappenheimer, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 1942-1945 (1994)]。それらは動物モデルおよび細胞培養物では１００μＭ濃度においてさえもはっきりとした毒性は示さない。
【０３０６】
Ｄ−鏡像異性体タンパク質を効率的に生産するために、例えば、Gryphon Biosciences, San Francisco,により開発されたペプチドライゲーション技術を利用する。
【０３０７】
このアプローチの要件は、標的（可溶型のＣＤ２８受容体またはｓ−Ａｇ結合部位を含んでなるその断片）が入手可能であり、そのアミノ酸配列が検証されること、およびこの分子を可逆的に変性させて、その結合活性を取り戻すことができることである。この後者の要件は、Ｄ−鏡像異性体標的の合成により、高親和性Ｌ−アンタゴニストペプチドに関してスクリーニングする目的にそれを使用する前にその活性形へと自然に折りたたまれるべき鎖が得られるという事実に基づいている。そのため、Ｄ−アンタゴニストアプローチは、標的再生要件が満たされる場合のみに実現可能な選択肢である。これはｓＣＤ２８を用いて試験される。読み出しとしての既知のアンタゴニストペプチド（例えば、ｐ１２およびｐ１４）と結合する能力とともに一連の変性および再生プロトコールを用いる。
【０３０８】
環状ペプチドミメティックス
in vitroにおけるヒトＰＢＭＣに対するＳＥＢアンタゴニスト活性についてのアッセイでは、１５２位と１５９位との間に環を有するＳＥＢｌ５０−ｌ６ｌに基づく主鎖環状ペプチドが線形類似体よりも優れたＳＥＢアンタゴニストとして機能を果たすことおよび正電荷を有する残基、Ｌｙｓ１５３およびＬｙｓｌ５４がアンタゴニスト活性にとって重要である（その位置は上記のアラニンおよびリジンスキャンにより直接調べられる）ことが示された。
【０３０９】
最良の制限は設計および評価の一連のサイクルによってのみ得られる。ファージディスプレイまたはポジショナルスキャニングによりＣＤ２８受容体に対してｐ１２Ａまたはｐ１４Ａより高い親和性で選択されたアンタゴニストペプチド配列に対して同様の戦略を行う。
ペプチド合成．  ペプチドはフルオロニル(fluoronyl)−メトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）化学を利用して合成する[Arad et al., (2000) 前掲]。同じ手順を用いてＤ−Ａｌａを連結する。高速液体クロマトグラフィーによりペプチドが＞９５％純粋であることが示される[Arad et al., (2000) 前掲]。内部ブリッジを介した近域環化を有するペプチドミメティックスを合成する。非ペプチド結合を提供するアミノ酸のＮα−ω−官能基導入誘導体を用いる、内部ブリッジを介した近域環化[Toniolo, Int. J. Peptide Protein Res. 35: 287-300 (1990); Gilon et al., (1991); Chorev et al., Biopolymers 31: 725-733 (1991)]により、Ｐ物質[Bitan et al., J. Pept. Sci. 2: 261-269 (1996); Byk et al., J. Med. Chem. 39: 3174-3178 (1996)]、ＨＩＶ  Ｔａｔ  ＮＬＳ[Friedler et al., J. Biol. Chem. 275: 23783-23789 (2000)]、ＨＩＶマトリックスタンパク質ＮＬＳ[Friedler et al., Biochemistry 37: 5616-5622 (1998)]、および昆虫フェロモンアンタゴニスト[Altstein et al., J. Biol. Chem. 274: 17573-17579 (1999)]に対するペプチドミメティックスの活性の増強に成功した。ペプチドのごく少数の４〜８アミノ酸側鎖がしばしば受容体によるリガンドの認識に関与しているという事実が近域環化アプローチに有利であるということが分かる。そのような場合には、残りの分子フレームワークは活性基を特定の空間的配置に固定する働きをする。環状制限アプローチの別の利点は、より少数のアミノ酸を使用することで、より小さなアンタゴニスト分子を作製し得ることである。ペプチドミメティックスはＨＰＬＣにより精製し、質量分析により純度を評価する。
【０３１０】
新規受容体に対するアンタゴニストバックアップの親和性の評価
バックアップをＣＤ２８受容体と結合するそれらの能力に関してプラズモン共鳴測定ならびにＥＬＩＳＡアッセイによりｐ１２およびｐ１４ アンタゴニストペプチドと比較する。直接結合と可溶性組換えＣＤ２８（ｓＣＤ２８）またはｓ−Ａｇ結合部位を含んでなるその断片に対してＳＥＢと競合する能力の両方をアッセイする。また、ｓＣＤ２８（または配列番号３で示される配列の全てまたは一部を含んでなるアミノ酸配列を有するｓ−Ａｇ結合部位を含んでなるその断片）と抗ＣＤ２８抗体との結合に干渉するアンタゴニストペプチドの能力も試験する。注目すべきは、抗ＣＤ２８と配列番号３で示されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含んでなるそのエピトープとの相互作用に干渉する試験アンタゴニストペプチドの能力もまた試験し得ることである。ｓＣＤ２８とＢ７−２との複合体形成を促進するアンタゴニストペプチドの能力は実施例５で記載するように調べる。各リガンド組合せに最適な結合条件は、ｐ１２およびｐ１４を用い、ｐＨおよびバッファーを最初に変更して得た。
【０３１１】
よって、ＣＤ２８受容体に対する高親和性により準備、選択される候補アンタゴニストペプチドは、より高いプロテアーゼ耐性に関係するＤ−アラニン末端を有する線形のものとして[Arad et al., (2000) 前掲]、または環状ペプチドもしくはペプチドミメティックスとして合成した後、異なる健常な供与体由来のＰＢＭＣを用いて、新たに単離された全ヒトＰＢＭＣにおけるＴｈ１サイトカインｍＲＮＡの超抗原誘導性発現を阻害する能力に関して試験してもよい[Arad et al., (2000) 前掲]。
【０３１２】
要するに、健常なヒト供与体由来のＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍｌのＳＥＢ（ロット１４−３０、USAMRIIDの毒物学部門より提供）、ＳＰＥＡ(Toxin Technology, Sarasota, Florida)、ＳＥＡまたはＴＳＳＴ−１ (Toxin Technology; Sigma)により誘導する[Arad etcul., (2000) 前掲]。存在する場合には、アンタゴニストペプチドは、好ましくは、０．０１〜１０μｇ／ｍｌにて用いる。単一供与体由来のＰＢＭＣでのＴｈ１サイトカイン遺伝子発現の誘導は３〜４供与体由来の混合ＰＢＭＣでの誘導よりも低い傾向がある。混合ＰＢＭＣ集団でのこの応答の高さは、混合リンパ球応答により細胞表面受容体がより高密度に発現する（毒素作用には細胞表面受容体の発現が必要）ことによる可能性が高い。環状ペプチドもしくはペプチドミメティックス、またはＤ−アラニン末端を有する線形のものとして合成される候補バックアップを、１０の異なる健常な供与体由来のＰＢＭＣを用いてＴｈ１サイトカインｍＲＮＡの超抗原誘導性発現を阻害するそれらの能力に関して試験する。ＳＥＢに対して強いアンタゴニスト活性を示すペプチドをＳＥＢ、ＳＥＡ、ＴＳＳＴ−１およびＳＰＥＡに対して再試験する。単一供与体および混合供与体ＰＢＭＣの両方を評価アッセイに用いる。
【０３１３】
ＲＮＡの定量的ドットブロットハイブリダイゼーション
この方法は少量のＰＢＭＣしか必要としないため、ＲＮアーゼプロテクション解析による検証前の大量の候補バックアップの一次レベルのスクリーニングに好適である。ＲＮＡは１ｍｌ  ＰＢＭＣ培養物から、細胞を回収し、それらを７．５Ｍグアニジン−ＨＣｌに溶解することにより単離する。ＲＮＡを沈殿させ、連続２倍希釈物を９６ウェルドットブロット装置を使用してニトロセルロースシートに適用する（二重試験）。ヒトＴｈ１サイトカイン遺伝子の発現を検出するため、シートを３２Ｐ標識したアンチセンスＲＮＡプローブとハイブリダイズさせ、それに対してオートラジオグラフィーを行うか、またはホスホイメージャーで読み出す。ＲＮＡレベルを定量する。ハイブリダイゼーション強度はＲＮＡ量および細胞数に対して一次であり、２００倍範囲にわたり正確に定量できる。ノーザンブロッティングにより解析されるように、このように検出されたＩＬ−２およびＩＦＮ−γハイブリダイゼーションシグナルの８５％を超えるものが成熟ｍＲＮＡで構成されている[Arad et al., (2000) 前掲]。
【０３１４】
Ｔｈ１サイトカインｍＲＮＡのリボヌクレアーゼプロテクション解析
リボヌクレアーゼプロテクション解析は困難で費用がかかるが、スプライシングを受けたｍＲＮＡの最も直接的な定量的測度が得られる。グアニジンイソチオシアネートで３０ｍｌ  ＰＢＭＣ培養物から抽出したトータルＲＮＡに対して、ｐＢＳ(Promega)に挿入されたＤＮＡから［α−３２Ｐ］ＵＴＰを用いてin vitro転写されたアンチセンスＲＮＡプローブを用いてＲＮアーゼプロテクション解析を行う。Ｔ７プロモーターから転写されたＩＬ−２プローブ（６００ｎｔ）は第３エクソンおよび第３イントロンの一部と相補的である；８Ｍ尿素−ポリアクリルアミドゲルでは、ｍＲＮＡにより保護された１１７ｎｔのＲＮＡ断片が得られる。Ｔ３プロモーターから転写されたＩＦＮ−γプローブ（２７４ｎｔ）は第３エクソンおよび第３イントロンの一部と相補的であり、ｍＲＮＡにより保護された１８３ｎｔのＲＮＡ断片が得られる。Ｔ３プロモーターから転写されたＴＮＦ−βプローブ（７００ｎｔ）はエクソン１の一部、エクソン２、エクソン３、ならびにイントロン３の一部およびエクソン４と相補的である；ｍＲＮＡは２７４および２６３ｎｔの２断片を保護する。センスＲＮＡ転写物からは検出可能なハイブリダイゼーションシグナルは得られない。保護された９０ｎｔ断片を与える１８ＳｒＲＮＡのアンチセンスＲＮＡプローブに関する解析をローディング対照とする[Arad et al., (2000) 前掲]。ゲルをデンシトメトリーにより定量する。
Ｔｈ２応答についてのアッセイ
【０３１５】
現行のアンタゴニストペプチドの最も重要な特性は、それがＴｈ２応答を損なわないことである。このことは、Ｔｈ１サイトカインｍＲＮＡの毒素誘導性発現がアンタゴニストペプチドにより阻害される、ＰＢＭＣの培養培地を用いてＥＬＩＳＡによりＩＬ−１０に関して試験されるバックアップの必要条件でもある。本発明者らは、超抗原誘導性ＩＬ−４のレベルは入手可能なＥＬＩＳＡキットの感度より低い傾向があるが、ＩＬ−１０は確実に測定できることが分かった。
【０３１６】
霊長類ＰＢＭＣの機能アッセイによるアンタゴニスト効果
これまでの節で記載したアプローチはアカゲザル由来のＰＢＭＣを用いるアンタゴニスト活性についてのアッセイにも適用できる。これはin vivo効果研究に対してＦＤＡにより承認されているこの動物モデル由来の代用マーカー系でのアンタゴニストペプチドの効果とin vivoプロテクションのデータとの相関関係を確立するのに有用である。このような相関関係は、in vitro効果が現行のアンタゴニストリード、ｐ１２およびｐ１４ですでに証明されているヒトでは達成し得ない。
【０３１７】
アカゲザルは、ヘブライ大学にて、定量的ドットブロットハイブリダイゼーションアッセイ（上記を参照）によるアンタゴニスト活性についての解析に十分である１５ｍｌの血液サンプルの収集に対してＩＡＣＵＣにより承認された。アカゲザルおよびヒトＩＬ−２とＩＦＮ−γ  ｃＤＮＡは９５％ヌクレオチド配列相同性を示し、本発明者らはサル１Ｌ−２およびＩＦＮ−γ遺伝子の誘導がドットブロットアッセイにより（ヌクレアーゼの攻撃に対するプロテクションは測定しないが、単に細胞ｍＲＮＡとアニールする能力を測定する）ヒトリボプローブで容易に検出されることを示した。
【０３１８】
候補アンタゴニストの防御活性の評価に向けたin vivo試験モデル
致死的な抗原投与を行ったマウスに対する候補アンタゴニストの強力な防御活性：
Ｄ−ガラクトサミン感作マウス（超抗原の致死性研究に認められている動物モデル）を用いて、異なるアンタゴニスト候補の防御活性を調査する。アンタゴニスト候補は超抗原、好ましくは、ＳＥＢ、ＳＥＡ、ＴＳＳＴ−１またはＳＰＥＡでの致死的抗原投与の直前に投与し、マウスの生存を調べる。
【０３１９】
ブタにおけるＳＥＡ誘導性無能力からの候補アンタゴニストの防御活性：
ヒトＴ細胞はブドウ球菌の超抗原に対してネズミよりも少なくとも２桁感受性が高く、ヒトは毒素性ショック症候群の発生に対して感受性であり、マウスは耐性である。これは、ネズミＴ細胞のレパートリーから最も高い反応性を有するＴＣＲのＶβ鎖を提示する細胞を取り除くか、または関係のあるＶβ遺伝子を欠失させたことから明らかとなった[Arad et al., (2000), 前掲を参照]。マウスはこのように超抗原毒素に対する自然耐性を獲得し、それらが毒素性ショックを経験する前に感作したに違いない。さらに、マウスは重量および免疫系に関してはヒトとは遠い。よって、人間に近い動物モデルでアンタゴニストの効果を立証することも重要である。
【０３２０】
本発明者らは２つの問題：毒素無能力と高等動物モデルの使用、に取り組んだ。ブタはヒトと類似した免疫系を有する；よって、ショックを媒介するＴｈ１サイトカインＩＦＮ−γをコードするｍＲＮＡについてのブタとヒトとの間のヌクレオチド配列相同性は８５％のオーダーであるが、ヒトとマウスｍＲＮＡとの間では類似性は全く検出できない。
【０３２１】
ブタは感作に必要ではない急性超抗原曝露に対し感受性であり、ヒトで見られるものと類似した無能力症状が現れる。吐き気および嘔吐（神経応答）ならびに重度の下痢（腸管免疫応答）をはじめとする毒素性ショックの初期無能力症状を再現できるブタモデルを確立した。
【０３２２】
本発明者らによってこれまでに示されたように、各試験条件に対し、５日齢雑種ブタ（主としてヨークシャー種；２．５ｋｇ）を６匹の子ブタからなる無作為化群（各群、雌ブタである）として用い、ＳＥＡ（２５μｇ）によって、ＩＶ経路による施与またはＩＰ経路による施与に関係なく類似の動態および強度で２時間内に明らかになり、２４〜３６時間までに治まる重度の無能力を引き起こした。ブタにおける無能力研究にはＳＥＡのＩＰ投与を採用した（この経路は外傷を与えることが少ない上、ＩＶと同様に有効であるため）。この結果から、ブタがＳＥＡに対して特別感受性であることが確認される[Taylor et al., Infect. Immun. 36: 1263 (1982)]。この選択的感受性の理由は、ＳＥＡがそのβ-グラスプ(beta-grasp)を利用して独立した第２の部位にあるＭＨＣ  II分子とも結合して、それと一層強く結合し、また、ＭＨＣ  II分子間に架橋を生じさせることと考えられる[Hudson et al., J. Exp. Med. 182: 711 (1995); Schad et al., EMBO J. 14: 3292 (1995); Abrahmsen et al., EMBO J. 14: 2978 (1995)]。毒素アンタゴニストにより標的化されるドメインはＳＥＡのＭＨＣ  II結合部位からもＴＣＲ結合部位からも遠い。
【０３２３】
ブタにおける無能力の定量には以下の基準を採用する：嘔吐（スコア４）；軽度の下痢（スコア１）、通常の下痢（スコア２）、重度の下痢（スコア４）、および水様性の下痢（スコア６）（データは示していない）。
【図面の簡単な説明】
【０３２４】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、ＳＥＢによるＩＬ−４およびＩＬ−１０の初期誘導を示す。  ３×１０７ヒトＰＢＭＣのアリコートを０．１μｇ／ｍｌ（白丸）、１μｇ／ｍｌ（白三角）または１０μｇ／ｍｌ（黒四角）のＳＥＢとともにインキュベートした。示した時点で、培養培地中のＩＬ−４（Ａ）およびＩＬ−１０（Ｂ）をＥＬＩＳＡ(Amersham, UK)により定量した。別の試験（Ｃ）では、４×１０６ＰＢＭＣのアリコートを０．１μｇ／ｍｌのＳＥＢとともにインキュベートした。示した時点で、培養培地中のＩＬ−４（黒丸）およびＩＬ−１０（白丸）を定量した。略語：Ｔ（期間）、ｈ（時間）、ｐｇ（ピコグラム）、ｍｌ（ミリリットル）。
【０３２５】
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の同時誘導によるＳＥＢ誘導性ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡ発現の阻害を示す。（Ａ）ヒトＰＢＭＣを、Ａｂ不在（白丸）またはイソ型適合抗ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（黒丸）、ヒトＩＬ−４に対するラット中和Ａｂ(Genzyme, Cambridge, MA)（αＩＬ−４）（黒四角と白四角）もしくはＩＬ−１０に対するラット中和Ａｂ(PharMingen, San Diego, CA)（αＩＬ−１０）（黒三角と白三角）いずれかの存在下、ＳＥＢなしで（白四角、白三角）または０．１μｇ／ｍｌ  ＳＥＢとともにインキュベートした。抗体は１：１０４希釈し、ＳＥＢでの誘導２時間前に添加した。ＲＮＡを抽出し、連続２倍希釈物に対し、３２Ｐ標識したＩＬ−２アンチセンスＲＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーション解析を行い、フィルムの黒化度を６３０ｎｍで読み取った；（Ｂ）オートラジオグラムで８時間のデータを示す。（ｃ）別々の供与体由来のＰＢＭＣを、１：１０４希釈した上記αＩＬ−４またはαＩＬ−１０の存在下、ＳＥＢなしで（−）または４０μｇ／ｍｌ（Ｃ）もしくは０．１μｇ／ｍｌ（Ｄ）のＳＥＢとともにインキュベートした。ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡをＲＮアーゼプロテクション解析により定量した；ｒＲＮＡをローディング対照とした。略語：Ｔ（期間）、ｈ（時間）、μｇ（マイクログラム）、ｍｌ（ミリリットル）。
【０３２６】
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、アンタゴニストはＩＬ−２およびＩＦＮ−γ遺伝子のＳＥＢ媒介性誘導を阻害するが、ＩＬ−１０の誘導は阻害しないことを示す。（Ａ）ヒトＰＢＭＣを１０μｇ／ｍｌ  ｐ１４Ａの不在（白丸）または存在（黒丸）下、０．１μｇ／ｍｌ  ＳＥＢとともにインキュベートした。（Ａ，Ｂ）示した時点で、ＲＮＡを抽出し、連続２倍希釈物に対し、３２Ｐ標識したＩＬ−２またはＩＦＮ−γ  アンチセンスＲＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーション解析を行った（白丸のドットは左側４列のものであり、３時間を超えてからの黒丸のドットは右側３列を示す ）。（Ｃ）同じ細胞の培養培地でＩＬ−１０をＥＬＩＳＡによりアッセイした。略語：Ｔ（期間）、ｈ（時間）、ｐｇ（ピコグラム）、ｍｌ（ミリリットル）。
【０３２７】
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、超抗原アンタゴニストの作用様式のモデル。（Ａ）超抗原毒素により誘導される過剰なＴｈ１応答が致死ショックを起こし、ＩＦＮ−γがＴｈ２応答を抑制している。（Ｂ）図のように、アンタゴニストペプチドは毒素によるＴｈ１細胞活性化の選択的ブロックを引き起こす上、残留Ｔｈ１応答を抑制するだけでなく、防御免疫の急速な発達を促進する役割も果たすＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０）の活発な同時誘導には干渉しない[Arad et al., (2000), (2001) 前掲]。略語：ｓ−Ａｇ（超抗原）、Ｔｏｘ．（毒素）、Ｄｅａ．（死）、Ａｎｔａｇ．（アンタゴニスト）、Ｓｕｒｖ．（生存）、Ｐｒｏｔ．  Ｉｍｍ．（防御免疫）。
【０３２８】
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、新規受容体はＴｈ１細胞の活性化に関し、選択的に使用されることを示す。（Ａ）抗原提示細胞およびＭＨＣクラスII分子の役割については本明細書では省略する。本発明者らの研究仮説は、Ｔｈ１細胞を活性化するためには、超抗原毒素はＴ細胞受容体だけでなく、本明細書ではＴｈ１細胞で発現されることが分かっている、Ｔｈ２細胞の活性化には必要ではない新規受容体も拘束せねばならないというものである。（Ｂ）よって、アンタゴニストペプチドが新規受容体と結合することで毒素によるＴｈ１細胞活性化の選択的なブロックがなされ、それにより、生存ならびに防御免疫が可能になる。略語：ｓ−Ａｇ（超抗原）、Ｔｏｘ．（毒素）、Ｎｏｖ．  Ｒｅｃ．（新規受容体）、ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）、Ｄｅａ．（死）、Ａｎｔａｇ．（アンタゴニスト）、Ｓｕｒｖ．（生存）、Ｐｒｏｔ．  Ｉｍｍ．(防御免疫)。
【０３２９】
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡのＳＥＢ誘導性発現ならびにＩＬ−１０のＳＥＢ誘導性発現に対する抗Ｂ７  ｍＡｂの効果を示す。  ヒトＰＢＭＣを、ｍＡｂ不在（白丸）または１：１０４希釈した抗Ｂ７−１（白四角、黒四角）もしくは１：１０４希釈した抗Ｂ７−２（白三角、黒三角）いずれかの存在下、ＳＥＢなしで（白四角、白三角）または０．１μｇ／ｍｌ  ＳＥＢとともに（白丸、黒四角、黒三角）インキュベートした。図２Ｂの場合のように、ＩＬ−２  ＲＮＡ（Ａ）およびＩＦＮ−γ  ＲＮＡ（Ｂ）を定量的ドットブロットハイブリダイゼーションにより解析した（ドットは８時間の値を示す）。同じ細胞の培養培地でＩＬ−１０をＥＬＩＳＡによりアッセイした（Ｃ）。略語：Ｔ（期間）、ｈ（時間）、ｐｇ（ピコグラム）、ｍｌ（ミリリットル）。
【０３３０】
【図７】図７Ａ〜７Ｆは、ＳＥＢによるＩＬ−２およびＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの誘導ならびにＩＬ−１０の誘導に対する可溶性ＣＤ２８受容体の効果を示す。  （Ａ〜Ｃ）ヒトＰＢＭＣを混合し、１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＥＢ（白四角）、１μｇ／ｍｌ  ｓＣＤ２８（白三角）(R & D Systems)、またはその両方（黒丸）とともにインキュベートした。示した時点で、ＩＬ−２  ｍＲＮＡをＲＮアーゼプロテクション解析により確認した; アクチン  ｍＲＮＡをローディング対照とした（Ａ）。（Ｂ）はＮＩＨ  イメージ  １．６１  ソフトウェアを使用したＡでのデータの定量である。同じ細胞の培養培地でＩＬ−１０をＥＬＩＳＡによりアッセイした（Ｃ）。（Ｄ〜Ｆ）ＰＢＭＣを１０ｎｇ／ｍｌ  ＳＥＢ（白四角）、１０μｇ／ｍｌ  ｓＣＤ２８（白三角）、またはその両方（黒丸）とともにインキュベートしたことを除き、（Ａ〜Ｃ）と同様の試験。示した時点で、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡをＲＮアーゼプロテクション解析により解析した（Ｄ）；ＥはＤでのデータの定量である。同じ細胞の培養培地でＩＬ−１０をＥＬＩＳＡによりアッセイした（Ｆ）。アクチン  ｍＲＮＡをローディング対照とした（Ａ，  Ｄ）。略語：Ｔ（期間）、ｈ（時間）、ｐｇ（ピコグラム）、ｍｌ（ミリリットル）、Ｕｎ．（単位）。
【０３３１】
【図８】図８Ａ〜８Ｆは、ＳＥＢによるＩＬ−２  ｍＲＮＡおよびＩＬ−１０の誘導に対する可溶性ＣＤ２８受容体および可溶性Ｂ７−２の効果。  ヒトＰＢＭＣを１ｎｇ／ｍｌ  ＳＥＢ（白四角）、および０．１μｇ／ｍｌ  ｓＣＤ２８（黒丸）または１０μｇ／ｍｌ  ｓＣＤ２８（黒三角）とともにインキュベートした。 示した時点で、ＩＬ−２  ｍＲＮＡをＲＮアーゼプロテクション解析により確認し（Ａ）、定量した（Ｂ）; 同じ細胞の培養培地でＩＬ−１０をＥＬＩＳＡによりアッセイした（Ｃ）。（Ｄ〜Ｆ）はＰＢＭＣを１ｎｇ／ｍｌ  ＳＥＢ（白四角）、および１０μｇ／ｍｌ  ｓＣＤ２８（黒三角）または０．１μｇ／ｍｌ  ｓＢ７−２（黒四角）とともにインキュベートしたことを除き、（Ａ〜Ｃ）と同様の試験を示す。略語：Ｔ（期間）、ｈ（時間）、ｐｇ（ピコグラム）、ｍｌ（ミリリットル）、Ｕｎ．（単位）、μｇ（マイクログラム）、ｎｇ（ナノグラム）。
【０３３２】
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８またはｓＢ７−２によるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの誘導を示す。  ヒトＰＢＭＣを０．１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３、２．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８または１μｇ／ｍｌ  ｓＢ７−２(R & D Systems)とともにインキュベートした。；示した時点で、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡをＲＮアーゼプロテクション解析により定量した（Ａ）。（Ｂ）では、ヒトＰＢＭＣを２．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８または１μｇ／ｍｌ  ｓＢ７−２、単独またはその組合せとともにインキュベートした；示した時点で、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡをＲＮアーゼプロテクション解析により定量した。略語：ｈ（時間）。
【０３３３】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−２  ｍＲＮＡの誘導、ならびにこの誘導のｐ１４Ａアンタゴニストペプチドによる阻害を示す。  ヒトＰＢＭＣを１０μｇ／ｍｌ  ｐ１４Ａの不在（黒三角）または存在（黒丸）下、２．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８（白丸）または０．１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３単独（白四角）またはその両方とともにインキュベートした。示した時点で、ＩＬ−２  ｍＲＮＡ、別の試験ではＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡをＲＮアーゼプロテクション解析により定量した（Ａ）。ＩＬ−２  ｍＲＮＡの確認に用いた同じ細胞の培養培地でＩＬ−１０をＥＬＩＳＡによりアッセイした（Ｂ）。略語：Ｔ（期間）、ｈ（時間）、ｐｇ（ピコグラム）、ｍｌ（ミリリットル）。
【０３３４】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｂは、ｓＢ７−２と組み合わせた抗ＣＤ３によるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡおよびＩＬ−１０の誘導に対するｐ１４Ａアンタゴニストペプチドの効果を示す。  ヒトＰＢＭＣを１０μｇ／ｍｌ  ｐ１４Ａの不在（白の記号）または存在（黒の記号）下、０．１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３（四角）、１μｇ／ｍｌ  ｓＢ７−２（丸印）またはその両方（三角）とともにインキュベートした。示した時点で、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡをＲＮアーゼプロテクション解析により確認した（Ａ）。同じ細胞の培養培地でＩＬ−１０をＥＬＩＳＡによりアッセイした（Ｂ）。略語：Ｔ（期間）、ｈ（時間）、ｐｇ（ピコグラム）、ｍｌ（ミリリットル）。
【０３３５】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、ＩＦＮ−γ ｍＲＮＡのｓＢ７−２誘導性発現はアンタゴニストペプチドにより増強されることを示す。  ヒトＰＢＭＣを１μｇ／ｍｌ  ｓＢ７−２単独（白丸）または１０μｇ／ｍｌ  ｐ１４Ａ（黒丸）を合せて、ともにインキュベートした。示した時点で、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡをＲＮアーゼプロテクション解析により確認し（Ａ）、定量した（Ｂ）。アクチンｍＲＮＡをローディング対照とした。略語：Ｔ（期間）、ｈ（時間）、Ｕｎ．（単位）。
【０３３６】
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂは、ＳＥＢまたはアンタゴニストペプチドとｓＣＤ２８との結合のプラズモン共鳴の記録を示す。  １００μｇ量のｓＣＤ２８をBiacore チップ上に固定化した。ｓＣＤ２８チップとの結合を抗ＣＤ２８（２００ｎＭ）（Ａ）、ｐ１４Ａ（２μＭ）（Ｂ）、またはＳＥＢ（２００ｎＭ）（Ｃ）解析物に関して別々に記録した。この応答は共鳴単位（ＲＵ）として測定し、経時的（秒（ｓ））に解析物に対して応答する差（Ｒｅｓｐ．  Ｄｉｆｆ．）を示している。ベースラインは左側にあり、結合はベースラインに対するＲＵの増加により示される。ＢおよびＣでは、５０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４で解析物を洗浄して、ベースラインの更新を右側に示している。略語：Ｔ（期間）。
【０３３７】
【図１４】抗ＣＤ２８とｓＣＤ２８との高親和性結合はＳＥＢにより阻害される：プラズモン共鳴による解析。  １００μｇ量のｓＣＤ２８をBiacore チップ上に固定化し、図のように、プラズモン共鳴を２００ｎＭ抗ＣＤ２８の存在下、２００ｎＭ  ＳＥＢの不在または存在下で記録した。バーによりプラズモン共鳴シグナルの強度を示している。略語：ｂｏｕ．（結合）、α（抗）。
【０３３８】
【図１５】抗ＣＤ２８とｓＣＤ２８との高親和性結合はｐ１４Ａにより阻害される：プラズモン共鳴による解析。  １００μｇ量のｓＣＤ２８をBiacore チップ上に固定化し、図のように、プラズモン共鳴を示した濃度の抗ＣＤ２８の存在下、２μＭ  ｐ１４Ａの不在または存在下で記録した。バーによりプラズモン共鳴シグナルの強度を示している。略語：ｂｏｕ．（結合）、α（抗）。
【０３３９】
【図１６】抗ＣＤ２８とｓＣＤ２８との高親和性結合はアンタゴニストペプチドにより阻害される：ＥＬＩＳＡによる解析。  ２５０ｎｇ量のｓＣＤ２８をＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート上に固定化し、２種類の示した希釈（各々２５０および１２５ｎｇ／ｍｌに相当する）での抗ＣＤ２８の結合をアルカリ性ホスファターゼを結合した二次抗体を用いて測定し、４５０ｎｍでの吸光度を記録した。ｐ１４Ａは不在（対照）とするか、または示した濃度では存在させた。略語：ｂｉｎ．（結合）、Ｕｎ．（単位）、ｃｏｎｔ．（対照）、ｍｌ（ミリリットル）、μｇ（マイクログラム）、α（抗）。
【０３４０】
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｅは、抗ＳＥＢとＳＥＢとの結合に対するＣＤ２８またはｓＢ７−２の効果：プラズモン共鳴による解析を示す。  （Ａ，Ｂ）１００μｇ量のＳＥＢをBiacore チップ上に固定化し、プラズモン共鳴を１：１，０００倍希釈したポリクローナル抗ＳＥＢ抗体(Sigma)の存在下で記録した；（Ａ）はプラズモン共鳴シグナルの強度を示している。（ｂ）は漸増濃度のｓＣＤ２８またはｓＢ７−２リガンドの存在下で（Ａ）の場合に形成した抗ＳＥＢ／ＳＥＢ複合体の割合％を示している。（Ｃ）は抗ＳＥＢ解析物（ａＳＥＢ）と、各々が同じBiacore チップ上の異なるチャンネルに固定化されたＳＥＢまたはｓＣＤ２８との結合を示している。バーは複合体形成の比較を示している。（Ｄ）は漸増濃度のｓＢ７−２と、Biacore チップ上に固定化されたｓＣＤ２８との結合に関するプラズモン共鳴の記録を示し、曲線はＫｄ  １．９ｅ−８Ｍを用いている。（Ｅ）では、（Ａ）および（Ｂ）の１００μｇ量のＳＥＢが固定化されたBiacore チップを用いて、１：１，０００倍希釈したポリクローナル抗ＳＥＢ抗体の存在下、競合相手（ＣＴＲＬ）の不在下、または２５０ｎＭ  ｓＢ７−２、２５０ｎＭ  ｓＣＤ２８、またはその両方（同時に添加）の存在下、プラズモン共鳴を記録した；バーは抗ＳＥＢ/ＳＥＢ複合体形成の比較を示している。略語：Ｔ（期間）、ｓｅｃ．（秒）、Ｒｅｓｐ．（応答）、Ｄｉｆｆ．（差）、ｂｏｕ．（結合）、Ｌｉｇ．（リガンド）、α（抗）。
【０３４１】
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｂは、抗ＳＥＢとＳＥＢとの結合に対するＣＤ２８の効果：プラズモン共鳴による解析を示す。  （Ａ）１００μｇ量のＳＥＢをBiacore チップ上に固定化し、プラズモン共鳴を８ｎＭポリクローナルウサギ抗ＳＥＢ抗体(Sigma)単独（白三角）の存在下、または１２５ｎＭ（白丸）、２５０ｎＭ（白四角）、５００ｎＭ（黒丸）、１μＭ（黒三角）、または２μＭ（黒四角）の濃度のｓＣＤ２８の存在下で記録した。プラズモン共鳴シグナルの強度を示している（Ｒｅｓｐ．  Ｄｉｆｆ．，応答差；ＲＵ，応答単位）。（Ｂ）の別の試験では、１００μｇ量のＳＥＢをBiacore チップ上に固定化し、プラズモン共鳴を表の左欄にて示されるように漸増濃度のポリクローナル抗ＳＥＢ抗体（αＳＥＢ）の存在下で記録した。表ではαＳＥＢ単独の存在下、または一定濃度のｓＣＤ２８（１μＭ）の存在下でのＲＵおよび結合率％を示している。結合率％については、αＳＥＢ濃度の関数として表の上部に示している。略語：Ｔ（期間）、Ｓｅｃ．（秒）、ｂｉｎ．（結合）。
【０３４２】
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｂは、ＳＥＢと抗ＳＥＢとの結合およびｓＣＤ２８による干渉に関する酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）を示す。  ＥＬＩＳＡプレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中０．５μｇ  ＳＥＢ／ウェルで４℃にて一晩コーティングし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ中５％ウシ血清アルブミンにより２時間ブロックした。表にて示した濃度のｓＣＤ２８を５０，０００倍（Ａ；Ｂ，白四角）または５００，０００倍（Ｂ，黒四角）希釈したウサギ抗ＳＥＢ抗体とともに添加した。室温にて２時間インキュベートした後、プレートを２回洗浄し、抗ウサギＩｇＧ−ＡＰ（ＡＰ，アルカリ性ホスファターゼ）を１時間添加した。２回洗浄した後、基質ＰＮＰＰを添加し、１０分（丸印）または１５分（四角印）後、４０５ｎＭにて色を記録した。略語：ｂｉｎ．（結合）、ｃｏｎｃ．（濃度）。
【０３４３】
【図２０】ｐ１４Ａと抗ｐ１４Ａとの結合およびｓＣＤ２８による干渉に関する酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）。  ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中０．５μｇ  ｐ１４Ａ／ウェルで４℃にて一晩コーティングし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ中５％ウシ血清アルブミンにより２時間ブロックした。示した濃度のｓＣＤ２８を５０，０００倍（黒丸）または５００，０００倍（黒四角）希釈したウサギ抗ｐ１４Ａ抗体とともに添加した。室温にて２時間インキュベートした後、プレートを２回洗浄し、抗ウサギＩｇＧ−ＡＰ（ＡＰ，アルカリ性ホスファターゼ）を１時間添加した。２回洗浄した後、基質ＰＮＰＰを添加し、４０５ｎＭにて色を記録した。結合率％を示している（１００％，ｓＣＤ２８不在の場合）。略語：ｂｉｎ．（結合）、ｐｇ／ｍｌ（ピコグラム／ミリリットル）。
【０３４４】
【図２１】アンタゴニストペプチドはＣＤ２８とｓＢ７−２との結合を増強する：プラズモン共鳴による解析。  １００μｇ量のｓＢ７−２をBiacore チップ上に固定化し；ｓＣＤ２８（２００ｎＭ）が解析物（ＣＴＲＬ）であった。プラズモン共鳴を図のように２μＭ  ｐ１４Ａまたは２μＭ  ｐＳＥＢ（４１−６１）の不在または存在下で記録した。バーはプラズモン共鳴シグナルの強度の比較を示している。略語：Ｂｏｕ．（結合）。
【０３４５】
【図２２】ＳＥＢ、アンタゴニストペプチドとＢ７−２およびＣＤ２８リガンドとの相互作用を示す略図。ｓＡｇ，超抗原；ＡＰＣ，抗原提示細胞；Ｖ，ＴＣＲ  β鎖の可変領域。略語：ａｎｔａｇ．（アンタゴニスト）、ｐｅｐ．（ペプチド）、ｃｅ．（細胞）、ｓ−Ａｇ（超抗原）、ＡＰＣ（抗原提示細胞）。
【０３４６】
【図２３】ＳＥＢはヒトＣＤ４細胞においてＣＤ２８受容体の変化を誘導する。  ＰＢＭＣから、ＣＤ４細胞を９０％に濃縮し、４×１０６細胞／ｍｌにて１００ｎｇ／ｍｌのＳＥＢとともにインキュベートし、図のように、誘導０、６および２４時間後に抗ＣＤ２８  ｍＡｂ（二次抗体：ｃｙ−２，緑）または抗ＣＤ２８  Ａｂ（二次抗体：ｃｙ−３，赤）で染色した。共焦点蛍光顕微鏡検査データを示している。マージ、抗ＣＤ２８  ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８  Ａｂでの二重染色。略語：Ｍｅｒ．（マージ）、ｍＡｂ（モノクローナル抗体）。
【０３４７】
【図２４】ヒトおよびネズミＣＴＬＡ−４ならびにＣＤ２８のアミノ酸配列の一部のアラインメント。  示したアミノ酸配列はヒト（ｈ）およびネズミ（ｍ）ＣＴＬＡ−４ならびにＣＤ２８に関するものである。全４分子に保存されている残基を太字で表している。ペプチドのコンビナトリアルファージライブラリーを用いた抗ＣＤ２８  ｍＡｂのエピトープマッピングでは、ｈＣＤ２８内の下線を引いた配列を得、その中のＨＶＫＧＫＨモチーフを影付きにしている；ｍＣＤ２８の対応するモチーフもまた影付きにしている。
【０３４８】
【図２５】図２５Ａ〜２５Ｄは、抗ＣＤ２８  ｍＡｂによるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの誘導に対する可溶性ＣＤ２８受容体およびペプチドｐＴＡの効果を示す。  ヒトＰＢＭＣを２５０ｎｇ／ｍｌ  抗ＣＤ２８  ｍＡｂ単独とともにまたは０．１μｇ／ｍｌ  ｓＣＤ２８または１０μｇ／ｍｌのｐＴＡの存在下でインキュベートした。示した時点で、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡをＲＮアーゼプロテクション解析により確認した（Ａ）。（Ｂ）はＰＢＭＣを２５０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８  ｍＡｂ単独とともに、または１もしくは１０μｇ／ｍｌ  ｓＣＤ２８あるいは１もしくは１０μｇ／ｍｌ  ｐＴＡの存在下でインキュベートしたことを除き、（Ａ）と同様の試験を示す。アクチンをＲＮアーゼプロテクション解析のローディング対照とした。略語：ｈ（時間）、ｐｇ（ピコグラム）、ｍｌ（ミリリットル）、μｇ（マイクログラム）、ｎｇ（ナノグラム）。
【０３４９】
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｄは、ＳＥＢによるＩＦＮ−γおよびＩＬ−２  ｍＲＮＡの誘導ならびにＩＬ−１０の誘導に対する可溶性ＣＤ２８受容体およびペプチドｐＴＡの効果を示す。  ヒトＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＥＢ（白四角）単独とともに、または１μｇ／ｍｌ  ｓＣＤ２８（黒丸）もしくは１０μｇ／ｍｌ  ｐＴＡ（黒三角）の存在下でインキュベートした。示した時点で、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡをＲＮアーゼプロテクション解析により確認した（Ａ）；同じ細胞の培養培地でＩＬ−１０をＥＬＩＳＡによりアッセイした（Ｂ）。（Ｃ〜Ｄ）はＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＥＢ（白四角）単独とともにまたは０．１μｇ／ｍｌ  ｓＣＤ２８（黒丸）もしくは１０μｇ／ｍｌｐＴＡ（黒三角）の存在下でインキュベートしたことを除き、（Ａ〜Ｂ）と同様の試験を示す。アクチンをＲＮアーゼプロテクション解析のローディング対照とした。略語：Ｔ（期間）、ｈ（時間）、ｐｇ（ピコグラム）、ｍｌ（ミリリットル）、ｐｇ（マイクログラム）、ｎｇ（ナノグラム）。
【０３５０】
【図２７】ＳＥＢ、アンタゴニストペプチドおよびＣＤ２８標的の相互作用を示す略図。ｓ−Ａｇ（超抗原）、ＡＰＣ（抗原提示細胞）、Ｖ（ＴＣＲ  β鎖の可変領域）、ｔａｒｇｅｔ、ＣＤ２８，ａｎｔａｇ．（アンタゴニスト）、ｐｅｐ．（ペプチド）、ｃｅ．（細胞）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ−Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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