(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の活性を低減させるための製剤組成物を提供するための抗菌剤の使用であって、
アミノ酸配列がそれぞれＶＰＫＣＣＫＰＶ、ＭＥＨＦＲＷＧ、ＨＦＲＷＧＫＰＶ及びＫＰＶであるペプチドからなる群より選択されるペプチドを一種類又はそれ以上含有する抗菌剤の使用。
【請求項２】
前記抗菌剤は、Ｎ−アセチル化及びＣ−アミド化されている、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記抗菌剤の濃度は、少なくとも１０-12モル濃度である、請求項１記載の使用。
【請求項４】
前記抗菌剤の濃度は、少なくとも１０-6モル濃度である、請求項３記載の使用。
【請求項５】
前記微生物は、Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓあるいはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓを含む、請求項１記載の使用。
【請求項６】
酵母の発芽を低減させるための製剤組成物を提供するための抗菌剤の使用であって、
アミノ酸配列がそれぞれＶＰＫＣＣＫＰＶ、ＨＦＲＷＧＫＰＶ及びＫＰＶであるペプチドからなる群より選択されるペプチドを一種類又はそれ以上含有する抗菌剤の使用。
【請求項７】
前記抗菌剤は、Ｎ−アセチル化及びＣ−アミド化されている、請求項６記載の使用。
【請求項８】
前記抗菌剤の濃度は、少なくとも１０-12モル濃度である、請求項６記載の使用。
【請求項９】
前記抗菌剤の濃度は、少なくとも１０-6モル濃度である、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
前記酵母は、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓを含む、請求項６記載の使用。
【請求項１１】
微生物感染による炎症を低減させるための製剤組成物を提供するための抗菌剤の使用であって、
アミノ酸配列がそれぞれＶＰＫＣＣＫＰＶ、ＭＥＨＦＲＷＧ、ＨＦＲＷＧＫＰＶ及びＫＰＶであるペプチドからなる群より選択されるペプチドを一種類又はそれ以上含有する抗菌剤の使用。
【請求項１２】
前記抗菌剤は、Ｎ−アセチル化及びＣ−アミド化されている、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
前記抗菌剤の濃度は、少なくとも１０-12モル濃度である、請求項１１記載の使用。
【請求項１４】
前記抗菌剤の濃度は、少なくとも１０-6モル濃度である、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
前記微生物は、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓを含む、請求項１１記載の使用。
【請求項１６】
微生物におけるｃＡＭＰの蓄積を増大させるための製剤組成物を提供するための抗菌剤の使用であって、
アミノ酸配列がそれぞれＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ及びＫＰＶであるペプチドからなる群より選択されるペプチドを一種類又はそれ以上含有する抗菌剤の使用。
【請求項１７】
前記抗菌剤は、Ｎ−アセチル化及びＣ−アミド化されている、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
前記抗菌剤の濃度は、少なくとも１０-12モル濃度である、請求項１６記載の使用。
【請求項１９】
前記抗菌剤の濃度は、少なくとも１０-6モル濃度である、請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
前記微生物は、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓを含む、請求項１６記載の使用。
【請求項２１】
アミノ酸配列がそれぞれＶＰＫＣＣＫＰＶ、ＭＥＨＦＲＷＧ、ＨＦＲＷＧＫＰＶ及びＫＰＶであるペプチドからなる群より選択されるペプチドを一種類又はそれ以上含有する抗菌剤。
【請求項２２】
前記抗菌剤は、Ｎ−アセチル化及びＣ−アミド化されている、請求項２１記載の抗菌剤。
【請求項２３】
前記抗菌剤の濃度は、少なくとも１０-12モル濃度である、請求項２１記載の抗菌剤。
【請求項２４】
前記抗菌剤の濃度は、少なくとも１０-6モル濃度である、請求項２３記載の抗菌剤。
【請求項２５】
前記抗菌剤は、Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓあるいはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓを含む微生物に対して有効である、請求項２１記載の抗菌剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
（発明の技術分野）
本発明は、例えば、微生物の活性を低減し、酵母の発芽を低減し、ヒト好中球による微生物の死滅の低減を伴うことなく微生物を死滅することにおける使用、微生物の死滅の低減を伴うことなく微生物感染における炎症の治療のための使用、及び微生物におけるｃＡＭＰの蓄積の増大のための使用、を含む、抗菌剤として有用な新規な製剤組成物に関する。特に、この発明は、アルファ−メラノサイト−刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）由来のアミノ酸配列及びその生物学的機能同等物を含む抗菌剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（発明の背景）
粘膜性の分泌や、食細胞やそのほかの非特異的な（本来的な）宿主防御システムは、時間を要する適応免疫が開始されるのに先だって、微生物の侵入に応答して開始する。適応免疫を有していない、植物や非脊椎動物の生存は、そのような本来的なメカニズムに基づく宿主防御システムの有効性を例証するものである。
【０００３】
内在性の抗菌性ペプチドは、環境上の攻撃に対するバリアであり、病原体に対して第一のデフェンスラインを提供する表皮において重要である。食細胞による天然の抗菌性ペプチドの合成は、長い間知られている。これらの天然の抗菌性ペプチドは、一般的に、細菌、真菌、及びウイルスに対して広い抗菌スペクトラムを有している。  Martin, E., Ganz, T., Lehrer, R.I., Defensins and Other Endogenous Peptide Antibiotics of Vertebrates, J. Leukoc. Biol. 58, 128-136 (1995); Ganz, T., Weiss, J., Antimicrobial Peptides of Phagocytes and Epithelia, Sem. Hematol. 34, 343-354 (1997).
【０００４】
抗菌性ペプチドの探索は、非常に困難でしかも遅々たるものであった。たぐいまれでしかも困難な発見が、重症の髄膜炎菌性敗血症の子供を治療するために成功裏に使用されてきている細菌性／透過性−増大タンパク質（Bacterial/permeability-increasing protein("BPI")であった。Giroir, B.P., Quint, P.A., Barton, P., Kirsh, E.A., Kitchen, L., Goldstein, B., Nelson, B.J., Wedel, N.I., Carrol, S.F., Scannon, P.J., Preliminary Evaluation of Recombinant Amino-terminal Fragment of Human Bactericidal/Permeability-increasing Protein in Children with Severe Meningococcal Sepsis, Lancet 350,1439-1443 (1997).
【０００５】
広い抗菌性スペクトラムのための最も活性のあるアミノ酸配列を同定することは、科学における重要な発展であり、また、新規な予防的あるいは治療的な抗菌性処置に有用である。
【０００６】
本発明のアプローチによれば、脊椎動物の抗菌性ペプチドの相同体が非脊椎動物に存在することが、そのようなペプチドが、宿主防御システムの古くからの成分であることを示唆する。これらのペプチドのいくつかは、あるいは、その合成相同体は、微生物を制御するための治療用剤としての使用を示唆するであろう。
【０００７】
アルファ−メラノサイト−刺激ホルモン（”α−ＭＳＨ”）は、古来からの１３個のアミノ酸ペプチドであり、より大きな前駆体分子であるプロピオメラノコルチンの翻訳後修飾によって生成され、その１〜１３のアミノ酸の配列を、アドレノコルチコトロピックホルモン（”ＡＣＴＨ”）と共有している。Eberle, A. N., The Melanotropins, Karger, Basel, Switzerland (1988).
α−ＭＳＨは、下垂体細胞、単核細胞、メラニン生成細胞、及びケラチン生成細胞を含む多くの細胞タイプによって分泌されていることが知られている。Lipton, J. M., Catania, A., Anti-inflammatory Influence of the Neuroimmunomodulator a-MSH, Immunol. Today 18, 140-145 (1997)
α−ＭＳＨは、ラットの肌及びヒトの表皮において発現している。Thody, A.J., Ridley, K., Penny, R.J., Chalmers, R., Fisher, C., Shuster, S., MSH Peptides Are Present in Mammalian Skin, Peptides 4, 813-816 (1983)
また、α−ＭＳＨは、無傷の消化管や下垂体を除去した粘膜性バリアにも見いだされている。Fox, J.A.E.T., Kraicer, J., Immunoreactive a-Melanocyte Stimulating Hormone, its Distribution in the Gastrointestinal Tract of Intact and Hypophysectomized Rats, Life. Sci. 28, 2127-2132 (1981)
【０００８】
我々は、最近、ヒト十二指腸細胞が、その細胞培養においてα−ＭＳＨを生成することを見いだした。Catania et al.,（未発行）
この古来からのペプチド、すなわち、約３００年以上にわたって、アミノ酸配列において比較的不変であるペプチドの、バリア性の器官における存在は、それが、非特異的な（本来的な）宿主防御システムにおいて役割を担っていることを示唆している。
【０００９】
α−メラノサイト−刺激ホルモンは、強力な解熱及び抗炎症特性を有していることが知られている。参照によりその全体が本明細書に一体化される、米国特許第５，０２８，５９２号（１９９１年７月２日発行、Ｌｉｐｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．に対して、解熱及び抗炎症性Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｖａｌ組成物及びその使用として付与されている）；参照によりその全体が本明細書に一体化される、米国特許第５，１５７，０２３号（１９９２年１０月２０日発行、Ｌｉｐｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．に対して、解熱及び抗炎症性Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｖａｌ組成物及びその使用として付与されている）；Catania, A., Lipton, J. M., a-Melanocyte Stimulating Hormone in the Modulation of Host Reactions, Endocr. Rev. 14, 564-576 (1993); Lipton, J. M., Catania, A., Anti-inflammatory Influence of the Neuroimmunomodulator a-MSH, Immunol. Today 18, 140-145 (1997)
【００１０】
α−ＭＳＨは、インビトロで宿主による前炎症性の媒介物の生成を低減させる。Rajora, N., Ceriani, G., Catania, A., Star, R.A., Murphy, M. T., Lipton, J. M., a-MSH Production, Receptors, and Influence on Neopterin, in a Human Monocyte/macrophage Cell Line, J. Leukoc. Biol.  59, 248-253 (1996); Star, R.A, Rajora, N., Huang, J., Stock, R.C., Catania, A., Lipton, J. M., Evidence of Autocrine Modulation of Macrophage Nitric Oxide Synthase by a-MSH, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92, 8016-8020 (1995)
α−ＭＳＨは、また、炎症動物モデルにおける局所的あるいは全身的反応を低減させる。Lipton, J. M., Ceriani, G., Macaluso, A., McCoy, D., Carnes, K., Biltz, J., Catania, A., Anti-inflammatory Effects of the Neuropeptide aMSH in Acute, Chronic, and Systemic Inflammation, Ann. N. Y. Acad. Sci. 741, 137-148 (1994); Rajora, N., Boccoli, G., Burns, D., Sharma, S., Catania, A., Lipton, J.M., a-MSH Modulates Local and Circulating Tumor Necrosis Factor A in Experimental Brain Inflammation, J. Neurosci. 17, 2181-2186 (1997)
【００１１】
α−ＭＳＨ配列のコア配列（４−１０）は、学習的及び記憶的な作用を有しているが、ほとんど解熱及び抗炎症活性を有していない。Lipton, J. M., Catania, A., Anti-inflammatory Influence of the Neuroimmunomodulator a-MSH, Immunol. Today 18, 140-145 (1997)
解熱及び抗炎症活性のための活性伝達配列（ａｃｔｉｖｅ ｍｅｓｓａｇｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、α−ＭＳＨのＣ末端配列、すなわち、リジン−プロリン−バリン（”Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ”、あるいは”ＫＰＶ”）にある。このトリペプチドは、インビトロ及びインビボで、その親分子と同等の活性を有している。Richards, D.B., Lipton, J.M., Effect of a-MSH (11-13) (Lysine-proline-valine) on Fever in the Rabbit, Peptides 5, 815-817 (1984); Hiltz, M. E., Lipton, J.M., Anti-inflammatory Activity of a COOH-terminal Fragment of the Neuropeptide a-MSH, FASEB J. 3, 2282-2284 (1989)
これらのペプチドは、非常に低い毒性であることが知られている。Lipton, J.M., Catania, A., Anti-inflammatory Influence of the Neuroimmunomodulator a-MSH, Immunol. Today 18, 140-145 (1997)
【００１２】
α−ＭＳＨ、ＡＣＴＨ、及びα−ＭＳＨあるいはＡＣＴＨに由来する他のアミノ酸配列を含むメラノコルチンペプチドが、強力な抗菌活性を有することは今まで研究されていないし、メラノコルチンペプチドがそのような活性を有する示唆もなかった。
【００１３】
本発明によれば、α−ＭＳＨ及びα−ＭＳＨに由来するある種の他のアミノ酸配列が、例えば、微生物活性の低減、酵母の発芽の低減、ヒト好中球細胞による微生物死滅の低減を伴わない微生物の死滅、微生物死滅の低減を伴わない微生物感染に伴う炎症の治療、微生物におけるｃＡＭＰの蓄積の増加、を含む、有意な抗菌性用途、を有していることが確認された。
本発明の広いアスペクトによれば、抗菌剤は、α−ＭＳＨのＣ末端配列アミノ酸配列、ＫＰＶ配列を含む一またはそれ以上のペプチド、アミノ酸配列ＭＥＨＦＲＷＧを含む一またはそれ以上のペプチド、あるいはこれらのいずれかのペプチドの生物学的機能同等物からなる群から選択される。
【００１４】
本発明の一つのアスペクトによれば、抗菌剤は、α−ＭＳＨのＣ末端配列アミノ酸配列、すなわち、ＫＰＶ配列を含む、一またはそれ以上のペプチド、あるいはこれらのいずれかのペプチドの生物学的機能同等物からなる群から選択される。ＫＰＶ配列は、α−ＭＳＨ（１１−１３）のアミノ酸配列である。このタイプの抗菌剤は、ＶＰＫＣＣＫＰＶのような、アミノ酸配列ＫＰＶの二量体を包含する。
【００１５】
本発明の別のアスペクトによれば、抗菌剤は、アミノ酸配列ＨＦＲＷＧＫＰＶを含む一またはそれ以上のペプチド、あるいはこれらのいずれかのペプチドの生物学的機能同等物からなる群から選択される。アミノ酸配列ＨＦＲＷＧＫＰＶは、α−ＭＳＨ（６−１３）のアミノ酸配列である。
【００１６】
本発明の更に別のアスペクトによれば、抗菌剤は、アミノ酸配列ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶを含む一またはそれ以上のペプチド、あるいはこれらのいずれかのペプチドの生物学的機能同等物からなる群から選択される。アミノ酸配列ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶは、α−ＭＳＨ（１−１３）のアミノ酸配列である。
【００１７】
本発明の別のアスペクトによれば、抗菌剤は、アミノ酸配列ＭＥＨＦＲＷＧを含む一またはそれ以上のペプチド、あるいはこれらのいずれかのペプチドの生物学的機能同等物からなる群から選択される。アミノ酸配列ＭＥＨＦＲＷＧは、時に、α−ＭＳＨアミノ酸配列のコアとも称される、α−ＭＳＨ（４−１０）である。
【００１８】
本発明のこれらのアスペクトについて、より短いアミノ酸配列が、より有効である傾向があるとされている。好ましくは、さらに、抗菌剤は、アミノ酸鎖長が１３までの一またはそれ以上のペプチドからなる群から選択される。さらに好ましくは、抗菌剤は、アミノ酸鎖長が８までの一またはそれ以上のペプチドからなる群から選択される。これまで得られている実験結果に基づけば、ＫＰＶが最も有効である。
【００１９】
この発明によれば、本抗菌剤の有効濃度は、少なくとも１０-12モル濃度であり、好ましくは、少なくとも１０-6モル濃度である。
これらの非常に毒性の低いペプチドが、副作用を伴うことなく、動物及びヒトに有効であることが充分に期待される。
以下の実験的証拠及び考察を読むことにより、本発明のこれらのアスペクト及び他のアスペクトは、当該分野の当業者に明らかになるであろう。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
Ｉ．材料及び方法
（ペプチド）
この研究で使用するペプチドは、α−ＭＳＨ（１−１３）、（４−１０）、（６−１３），及び（１１−１３）、これらのＮ−アセチル化及びＣ−アミド化されたすべての配列、及びＡＣＴＨ（１−３９）と（１８−３９）（ＣＬＩＰ）を含む。この研究における他のペプチドは、アミノ酸配列ＫＰＶの二量体、特に、Ｎアセチル化あるいはＣアミド化されたアミノ酸配列ＶＰＫＣＣＫＰＶ（”ＫＰＶ二量体”）を含んでいる。このＫＰＶ二量体は、ＮＨ2−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＡｃＣｙｓ−ＣｙｓＡｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ＮＨ2として化学的に表示されうる。これらのペプチドは、固相ペプチド合成法により調製され、Ｄｒ．Ｒｅｎａｔｏ Ｌｏｎｇｈｉ，ＣＮＲ，Ｍｉｌａｎｏによって提供された逆相高性能液体クロマトグラフィーによって精製された。
【００２１】
（微生物及び培養条件）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２９２１３）及び臨床的に分離されたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓとが、Ｏｓｐｅｄａｌｅ Ｍａｇｇｉｏｒｅ ｄｉ Ｍｉｌａｎｏの細菌部門のコレクションから得られた。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの培養は、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ’ｓ アガースラントにおいて維持され、定期的にＳａｂｏｕｒａｕｄ’ｓ アガー平板上に移されて、２８℃で４８時間培養された。定常増殖期の酵母を調製するために、アガー平板からコロニーを採取し、３０ｍｌのＳａｂｏｕｒａｕｄ−デキストロース ブロスに移して、３２℃で７２時間培養した。細胞は、１０分間１０００×ｇで遠心され、そのペレットが蒸留水で２回洗浄された。細胞が計数され、所望の濃度にハンクスバランスド塩溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁された。０．０１％のメチレンブルー除去によって決定される生菌活性は、９８％を超えて維持されていた。
【００２２】
（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ活性に対するメラノコルチンペプチドの試験）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（１×１０6／ｍｌ、ＨＢＳＳ中、）が、濃度範囲が１０-15〜１０-4Ｍのα−ＭＳＨ（１−１３）、α−ＭＳＨ（１１−１３）あるいは”ＫＰＶ二量体”の存在下あるいは非存在下において３７℃で２時間培養された。細胞は、その後、冷たい蒸留水で洗浄され、ＨＢＳＳで１００細菌／ｍｌにまで希釈された。その１ｍｌが、血液寒天プレートに付与され、３７℃で２４時間培養された。細菌の活性は、形成されたコロニーから評価された。
【００２３】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓについての実験で、我々は、ウロキナーゼ誘導性の増殖増強についてのα−ＭＳＨの影響を確認した。Hart, D.A., Loule, T., Krulikl, W., Reno, C., Staphylococcus Aureus Strains Differ in Their in Vitro Responsiveness to Human Urokinase: Evidence That Methicillin-resistant Strains Are Predominantly Nonresponsive to the Growth-enhancing Effects of Urokinase, Can. J. Microbiol. 42, 1024-31 (1966)
１０-6Ｍのα−ＭＳＨ（１−１３）及びα−ＭＳＨ（１１−１３）の存在下あるいは非存在下のもと、組換えヒトウロキナーゼ（Ｌｅｐｅｔｉｔ，Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）５００単位とともに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（１０6／１００ｍｌ）が、振とう水浴中で、３７℃で４時間培養された。
【００２４】
（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの活性に対するメラノコルチンペプチドの試験）
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（ＨＢＳＳ中、１×１０6／ｍｌ）が、１０-15〜１０-4Ｍの濃度範囲のα−ＭＳＨ（１−１３）、α−ＭＳＨ（１１−１３）及び”ＫＰＶ二量体”の存在下あるいは非存在下のもと、３７℃で２時間培養された。細胞は、その後、冷たい蒸留水で洗浄され、ＨＢＳＳで１００菌／ｍｌに希釈された。その後、１ｍｌが、血液寒天平板に付与され、３７℃で４８時間培養された。菌の活性は、形成されたコロニー数で評価された。
【００２５】
同様の方法を用いて次の実験では、我々は、公知の抗真菌剤であるフルコナゾール（ｆｌｕｃｏｎａｚｏｌｅ）と、α−ＭＳＨ（４−１０）、（６−１３）、（１１−１３）、ＡＣＴＨ（１−３９）、（１８−３９）の活性とを対比した。メラノコルチンペプチドとフルコナゾールは、１０-6〜１０-4Ｍの濃度範囲で試験された。少なくとも、各濃度のペプチドにつき、繰り返し数を少なくとも６とされた。
【００２６】
（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの発芽に対するα−ＭＳＨペプチドの試験）
定常期培養からのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓは、蒸留水で２回洗浄され、ＨＢＳＳに懸濁されて２×１０6／ｍｌの最終濃度とされた。菌糸の成長は、１０％の不活性化されたウマ血清（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、ペイズリー、グレイト ブリテイン）を、継続的に振盪しながら３７℃で４５分間培養した酵母菌に添加することによって誘導された。ウマ血清は、その後、ＨＢＳＳで２回洗浄して除去され、さらに、１０-6Ｍ濃度のα−ＭＳＨ（１−１３）、（６−１３）、あるいは（１１−１３）の存在のもとに、さらに６０分間の培養が、３７℃で振盪しながら継続された。糸状体細胞の数は、ヘモサイトメータを利用して、光学顕微鏡下で測定された。実験は、繰り返し数３回で行われ、少なくとも２００細胞が計数された。顕微鏡写真が、Ａｘｉｏｓｋｏｐ Ｚｅｉｓｓ顕微鏡に装着したＭＣ１００カメラで撮影された。
【００２７】
（ヒト好中球細胞によるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの死滅に対するα−ＭＳＨペプチドの試験）
健康なボランティアからの静脈血（２０ｍｌ）が、ヘパリンで抗凝集化された。好中球細胞は、デキストラン沈降分離と、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ., セントルイス、ミズーリ、ＵＳＡ）による遠心分離を用いて分離された。赤血球が、低浸透圧ショックで溶菌されて、細胞懸濁液の少なくとも９７％を好中球とする液が得られた。トリパンブルー除去により評価される細胞の活性は、９８％を超えていた。好中球は、ＨＢＳＳ中に最終濃度にまで再懸濁された。
【００２８】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（１×１０6）は、３７℃で、３０分間振盪水浴中でヒトＡＢ血清でオプソニンを作用された。微生物は、次いで、好中球とともに、培地のみ、あるいは培地と１０-15〜１０-4Ｍの濃度範囲のα−ＭＳＨ（１−１３）あるいは（１１−１３）の存在下で、３７℃、２時間振盪水浴中で培養された。培養後、増殖を停止させるために、氷上に培養チューブを載置し、菌体外有機体は、４℃で１０００×ｇの遠心分離を２回することにより洗浄された。２．５％のデオキシコール酸ナトリウム溶液が、その懸濁液に添加され、そのチューブは５分間振盪された。冷たい蒸留水が、その後、添加されて、１０6細胞／ｍｌの懸濁液が得られた。ＨＢＳＳによる二回の一連の１００分の１希釈が、１００細胞／ｍｌの最終懸濁液を得るのに行われた。１ｍｌがその後、血液寒天平板に付与され、３７℃で４８時間培養された。コロニー形成単位（”ＣＦＵ”）は、培養期間の最後に計数された。実験は、繰り返し数を３として行われ、５人の異なるドナーを用いて繰り返された。
【００２９】
（ｃＡＭＰの蓄積に対するα−ＭＳＨペプチドの試験）
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（１０6／ｍｌ）、トルエン／エタノールで膜透過性とされ、３７℃で１０-6Ｍのα−ＭＳＨ（１−１３）、（１１−１３）あるいは、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）（細胞内ｃＡＭＰを増大させるさせる薬剤として知られている）の存在下、あるいは培地のみで、連続振盪培養された。氷冷したエタノールを添加することにより、３分後に反応を停止させた。ｃＡＭＰは、商業的に入手可能な酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ユナイテッドキングダム）を用いて、製造者の指示書に従い、液相法による抽出後に、繰り返し数を２として測定された。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対するフォルスコリン（１０-6Ｍ）の効果は、α−ＭＳＨペプチドと同様の方法で測定された。
【００３０】
（統計的解析）
分散値の一方向性分析、及びスチューデントテストが、データ解析に使用された。確率値（Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｖａｌｕｅ）が０．０５より小さいときに有意であるとした。
【００３１】
II．結果
（α−ＭＳＨペプチドはＳ．ａｕｒｅｕｓのコロニー形成を阻害した）
α−ＭＳＨ（１−１３）及び（１１−１３）は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのコロニー形成を阻害した（図１）。アミノ酸配列ＰＫＶの二量体、特に、ＮＨ2−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＡｃＣｙｓ−ＣｙｓＡｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ＮＨ2（”ＫＰＶ二量体”）も、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのコロニー形成を阻害した（図１）。阻害効果は、広い濃度範囲にわたって生じており、１０-12〜１０-4Ｍのペプチド濃度の範囲で有意（ｐ＜０．０１）であった。
ウロキナーゼ処理は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのコロニー形成を増大させ、１０-6Ｍの濃度のα−ＭＳＨ（１−１３）あるいは（１１−１３）は、ウロキナーゼによる成長促進効果の増強を有意に阻害している（図２）。
【００３２】
（α−ＭＳＨペプチドは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのコロニー形成を阻害した）
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのコロニー形成単位（”ＣＦＵ”）は、α−ＭＳＨ（１−１３）及びα−ＭＳＨ（１１−１３）によって著しく低減された。アミノ酸配列ＫＰＶの二量体、特に、ＫＰＶＣＶＰＫ（”ＫＰＶ二量体”）もお、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのコロニー形成を阻害した（図３）。全ての３種のペプチドについて、１０-12〜１０-4Ｍの濃度範囲において、ＣＦＵに対して有意な阻害効果を有していた（ｐ＜０．０１ ｖｓ コントロール）。
【００３３】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの活性を低減させることにおける、１０-6Ｍのメラノコルチンペプチドの相対的力価を比較する実験においては、α−ＭＳＨ（１１−１３）、（６−１３）及び（１−１３）が、最も有効であった（図４）。それらの阻害活性は、等モル濃度のフルコナゾールに近似していた。行動的な作用（ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ）があるもののほとんど抗炎症活性を有していないα−ＭＳＨのコア配列（４−１０）は、ＣＦＵのおおよそ５０％阻害を示した。かかる阻害効果は、実質的なものではあるが（ｐ＜０．０１ｖｓ コントロール）、ＫＰＶシグナル配列を備えるα−ＭＳＨ断片、すなわち、α−ＭＳＨ（６−１３）、及び（１１−１３）（ｐ＜０．０１）もしくは、その親分子であるα−ＭＳＨ（１−１３）（ｐ＜０．０５）よりは、有意に小さかった。
ＡＣＴＨ（１−３９）とそのＡＣＴＨ断片（１８−３９）が、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの生菌活性を低減させなかった（図４）。１０-4Ｍまでの高濃度のこれらのＡＣＴＨペプチドにおいてさえ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＣＦＵを低減させるのに同様に有効でなかった（図示せず）。
【００３４】
（α−ＭＳＨペプチドはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの発芽を低減した）
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓとα−ＭＳＨ（１−１３）あるいは（１１−１３）とを同時に培養することにより、ウマ血清により誘導される芽管形成を阻害した（図５Ａ〜Ｄ）。α−ＭＳＨ（１−１３）が糸状体細胞の数を２８〜３２％低減させる一方、前記トリペプチドは、発芽を５４〜５８％低減させた。オクタペプチドであるα−ＭＳＨ（６−１３）も、同様の活性（約５０％の阻害）を有していた（図示せず）。
【００３５】
（α−ＭＳＨペプチドは、ヒト好中球細胞によるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの死滅を増強した）
α−ＭＳＨ（１−１３）及び（１１−１３）が、１０-12〜１０-4Ｍの濃度範囲で投与された際、好中球細胞によるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの死滅を増強した（ｐ＜０．０１）（図６）。それゆえ、かかる死滅の増強は、ヒト血漿中に見いだされるα−ＭＳＨの濃度に等しいピコモル濃度を含む広い濃度範囲にわたって生じていた。Catania, A., Airaghi, L., Garofalo, L., Cutuli, M., Lipton, J.M., The Neuropeptide a-MSH in AIDS and Other Conditions in Humans, Ann. N. Y. Acad. Sci. 840, 848-856 (1998)
【００３６】
（α−ＭＳＨペプチドは、ｃＡＭＰの蓄積を増大させた）
α−ＭＳＨの多くの作用が、ｃＡＭＰによる誘導に媒介されることが知られていることから、我々は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓにおけるｃＡＭＰの蓄積に対するα−ＭＳＨペプチドの作用を測定した。
α−ＭＳＨ（１−１３）及び（１１−１３）が、その酵母におけるｃＡＭＰ含有量を増大させた（図７）。この増大は、等モル濃度の、ｃＡＭＰの活性化剤であるフォルスコリンによって誘導されるのと同じオーダーの強度であった（図７）。ｃＡＭＰの増加が、ＣＦＵの低減の原因であるかどうかを確認するために、我々は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの生菌活性に対するフォルスコリンの効果を試験した。結果は、１０-6Ｍのフォルスコリンが、コントロールに対して、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＣＦＵを顕著に阻害すること（ｐ＜０．０１）を示した。この阻害効果は、α−ＭＳＨペプチドによって発揮される効果と同様であった（図８）。
【００３７】
III．考察
（微生物の活性に対抗する抗菌剤）
これらの結果は、α−ＭＳＨ（１−１３）、そのＣ末端のトリペプチド配列α−ＭＳＨ（１１−１３）及び他のα−ＭＳＨは、少なくとも二つの主要な病原体であるＳ．ａｕｒｅｕｓ及びＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに対して、有意な抗菌性作用を有することを示す。これらのα−ＭＳＨのうち、最も有効なものは、α−ＭＳＨ配列のうちのＣ末端のアミノ酸配列ＫＰＶを含むものであった。すなわち、α−ＭＳＨ（１−１３）、（６−１３）及び（１１−１３）であった。アミノ酸配列ＫＰＶの二量体、特に、ＶＰＫＣＣＫＰＶ（ここに”ＫＰＶ二量体”と称される。）も、また微生物に対して、少なくとも、α−ＭＳＨ（１−１３）と同程度に有効であることが示された。学習及び記憶に作用があると知られているが、ほとんど解熱性及び抗炎症作用を有していない、α−ＭＳＨのコア配列（４−１０）は、有効であったが、それほどではなかった。ＡＣＴＨペプチド（１−３９）及び（１８−３９）は、有意なＣａｎｄｉｄａ死滅作用を有していなかった。これらの観察は、抗菌活性は、すべてのメラノコルチンペプチドに共通するものではないが、それは、むしろ、α−ＭＳＨアミノ酸配列に特異的であり、特に、α−ＭＳＨのＣ末端アミノ酸配列に特異であることを示している。
【００３８】
これらのα−ＭＳＨペプチドの抗菌作用は、ヒト血清中において通常生じているピコモル濃度を含む非常に広い濃度範囲で生じていた。Catania, A., Airaghi, L., Garofalo, L., Cutuli, M., Lipton, J.M., The Neuropeptide a-MSH in AIDS and Other Conditions in Humans, Ann. N. Y. Acad. Sci. 840, 848-856 (1998)
このことは、内在性のα−ＭＳＨが、本来的な免疫において生理的な役割を担っていることを示している。
【００３９】
それゆえに、これらのα−ＭＳＨペプチドは、微生物感染に対する広範囲な予防剤として、及び、微生物の侵入の結果生じるヒトあるいは脊椎動物の疾患の治療に有用であると期待される。さらに、抗炎症活性も有するこれらのペプチドは、炎症と微生物侵入とが同時に存するような治療ケースや、それらの共存あるいは発症を予防することを目的とするケースに使用される。
【００４０】
（酵母の発芽に対抗する抗菌剤）
酵母は、主要な病原体となりうる。例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは、未熟児、糖尿病患者、外科患者、ヒト免疫不全ウイルス感染症あるいは他の免疫抑制状態にある患者においては、真菌の侵入による疾患の主たる原因である。適切な治療にもかかわらず、免疫抑制状態の患者におけるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの全身的な感染による死亡は、現実にある。Wenzel, R.P., Pfaller, M.A., Candida Species: Emerging Hospital Bloodstream Pathogens, Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 12, 523-4 (1991); Cartledge, J.D.,  Midgley, J., Gazzard, B.G., Clinically Significant Azole Cross-resistance in Candida Isolates from HIV-Positive Patients with Oral Candidosis, AIDS 11, 1839-44 (1997)
【００４１】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの感染による病因は、宿主の外皮及び内皮細胞への粘着、及び、楕円状の出芽胞子から、芽管、擬菌糸、及び菌糸等の各種糸状体形態への酵母細胞の変態とを伴う。Gow, N.A., Germ Tube Growth of Candida Albicans, Curr. Topics Med. Mycol. 8, 43-55 (1997)
それゆえ、α−ＭＳＨ（１−１３）及びそのＣ末端トリペプチド（１１−１３）が酵母の生菌活性を低減させるだけでなく、酵母の発芽を低減させることが重要である。
【００４２】
（ヒト好中球細胞による死滅の低減を伴わない抗菌性及び抗炎症性作用）
病原体の死滅の低減は、コルチコステロイド類及び他の非ステロイド系抗炎症剤を感染期間中に用いる治療の悲惨な結果である。Stevens, D.L., Could Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs (NSAIDs) Enhance Progression of Bacterial Infections to Toxic Shock Syndrome?, Clin. Infect. Dis. 21, 977-80 (1997); Capsoni, F., Meroni, P.L., Zocchi, M.R., Plebani, A.M., Vezio, M., Effect of Corticosteroids on Neutrophil Function: Inhibition of Antibody-dependent Cell-mediated Cytotoxicity (ADCC), J. Immunopharmacol.  5, 217-30 (1983)
このような作用は、免疫傷害のある宿主において非常に危険となりうる。
【００４３】
α−ＭＳＨは、強力な抗炎症作用を急性、慢性及び全身性炎症モデルにおいて有している。その広い活性スペクトラムと低い毒性とは、α−ＭＳＨが、ヒト及び脊椎動物の疾患における炎症の治療に有用であることを示唆している。それゆえ、α−ＭＳＨペプチドの、食細胞によるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの死滅に対する効果を研究することは重要である。Catania, A., Rajora N., Capsoni, F., Minonzio, F., Star, R.A., Lipton, J.M., The Neuropeptide a-MSH Has Specific Receptors on Neutrophils and Reduces Chemotaxis in Vitro, Peptides 17, 675-679 (1996)
試験が実施されていない状況下では、その直接的な抗菌効果にもかかわらず、ヒト好中球細胞による死滅の低減が予想されていた。本研究の結果は、α−ＭＳＨペプチドは、死滅を低減させないというよりもむしろ、その直接的なＣａｎｄｉｄａ死滅効果の帰結であるかのように、死滅作用を増強することを示唆している。それゆえ、抗菌作用を有するα−ＭＳＨペプチドのような抗炎症剤は、臨床上実務において非常に有用であることが期待される。
【００４４】
（統計的解析とｃＡＭＰの蓄積）
重大な疑問が、いかにα−ＭＳＨペプチドがその抗菌性効果を発揮し、それらが、他の天然の抗菌剤のように機能するかどうかにかかわる。α−ＭＳＨは、ディフィンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ）やカティリシディン（ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎｓ）といくつかの類似性を共有している。
１）それらが、ヒトでも適応免疫を欠く原始的な生物において合成されている。Eberle, A. N., The Melanotropins. Karger, Basel, Switzerland (1988)    ２）公知の抗菌性ペプチドのように、その前駆体分子であるプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）が、食細胞及び外皮細胞で発現され、活性なα−ＭＳＨに変換させるのに、翻訳後のタンパク質分解修飾が必要とされる。Rajora, N., Ceriani, G., Catania, A., Star, R.A., Murphy, M. T., Lipton, J. M., a-MSH Production, Receptors, and Influence on Neopterin, in a Human Monocyte/macrophage Cell Line, J. Leukoc. Biol. 59, 248-253 (1996); Luger, T.A., Schauer, E., Trautinger, F., Krutmann, J., Ansel, J., Schwarz, A., Schwartz, T., Production of Immunosuppressing Melanotropins by Human Keratinocytes, Ann. N.Y. Acad. Sci.  680, 567-570 (1993)
３）カチオン性ペプチドである。
４）少なくとも二つの異なる病原体、酵母と細菌に対して抗菌活性を有する。加えて、α−ＭＳＨは、ＨＩＶ−１の急性感染あるいは慢性感染した単核細胞における複製を阻害する。Barcellini, W., La Maestra, L., Clerici, G., Lipton, J. M., Catania, A., Inhibitory Influences of a-MSH Peptides on Hiv-1 Expression in Monocytic Cells, 12th World AIDS Conference, Geneva, June 28-July 3, 1998
これらの発見は、α−ＭＳＨが、他の生来の抗菌性物質の有する広い活性スペクトラムを備えていることを示している。
【００４５】
天然の抗菌剤の活性メカニズムは、部分的にしか理解されていない。ディフェンシンを含む、これらのペプチドの多くは、膜透過性を変化させ、生物体の内部ホメオスタシスを損なわせる。最初の接触は、そのペプチドのカチオン性基と標的となる膜の負に荷電した先端部との間で行われる。その後、その３次元構造が、そのペプチドの膜への挿入形態を決定し、そこで、ペプチドはセルの構造を破壊するイオンチャンネルや孔部を形成する。ｃＡＭＰ増強剤が、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓにおけるｍＲＮＡ及びタンパク質の合成を阻害することが知られている。Bhattacharya, A., Datta, A., Effect of Cyclic AMP on RNA and Protein Synthesis in Candida Albicans, Biochem. Biophys. Res. Commun. 77:1483-44 (1977)
【００４６】
本実験においては、α−ＭＳＨが、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓにおけるｃＡＭＰの蓄積を誘導すること、及び、ｃＡＭＰ誘導剤であるフォルスコリンが、コロニー形成を阻害することも開示される。かかる理論的な説明によって制限されることなく、抗菌性効果がこの媒介物の増強によって引き起こされたとすることができる。
【００４７】
（生物学的機能同等性）
ここに用いられるように、生物学的機能同等性とは、生物学的な活性の意味において機能的に同等であるアミノ酸配列として定義される。
ここに記載される特定のアミノ酸配列は有効であるが、このペプチドの有効性を変えることなく、アミノ酸が置換され削除されうることは、当業者によく知られている。さらに、α−ＭＳＨ配列の安定化は、顕著にそのペプチドの活性を増大させること、及びＤ−アミノ酸をＬ−アミノ酸に置換することは、そのペプチドの有効性を改善しあるいは減少させることが知られている。たとえば、安定したα−ＭＳＨの類似体である、[ＮＬｅ4，Ｄ−Ｐｈｅ7]−α−ＭＳＨ（この類似体は、メラニン生成細胞及びメラノーマ細胞に対して顕著な生物学的活性を有している）は、熱を低減させることにおいては、親ペプチドによりもおおよそ１０倍強力である。Holdeman, M., and Lipton, J.M., Antipyretic Activity of a Potent a-MSH Analog, Peptides 6, 273-5 (1985)
【００４８】
さらに、α−ＭＳＨ（１１−１３）配列のＣ末端にアミノ酸を付加することにより、解熱作用を低減させあるいは増強することができる。Deeter, L.B., Martin, L.W., Lipton, J.M., Antipyretic Properties of Centrally Administered a-MSH Fragments in the Rabbit, Peptides 9,1285-8 (1989)
１０−１３配列を形成するように、グリシンを付加することにより、やや作用は低減し、その９−１３配列は、ほとんど活性を排除する一方、その８−１３配列は、１１−１３配列よりも強力である。Ａｃ−[Ｄ−Ｋ11]−α−ＭＳＨ−ＮＨ2は、トリペプチドα−ＭＳＨ（１１−１３）のＬ型と同じ通常の力価を有していることが知られている。Hiltz, M.E., Catania, A., Lipton, J.M., Anti-inflammatory Activity of a-MSH (11-13) Analogs: Influences of Alterations in Stereochemistry, Peptides 12, 767-71, (1991)
【００４９】
しかしながら、Ｄ−プロリンでそのトリペプチドの１２番を置換することは、トリペプチドを不活性化する。その１３番をＤ−バリンで置換すること、あるいは、１３番をＤ−バリンで置換することに加えて、１１番をＤ−リジンで置換することは、Ｌ型のトリペプチドよりも顕著な抗炎症活性が得られることになる。これらの例は、ペプチドのアミノ酸の特性を変化することが、その操作の性質によっては、ペプチドの活性に影響を与えたり、あるいは、ほとんど影響を及ぼさなかったりすることを示している。
【００５０】
生物学的機能同等性は、類似したハイドロパティック値（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｖａｌｕｅ）を有するアミノ酸で置換することよっても得られるとされている。したがって、例えば、ハイドロパティック値がそれぞれ＋４．５及び＋３．８であるイソロイシンとロイシンは、ハイドロパティック値が＋４．２であるバリンと置換されうるし、また、同じような生物学的活性を有するタンパク質を得ることができる。また、その尺度の反対側においては、リジン（−３．９）は、アルギニン（−４．５）などと置換されうる。一般的に、置換されるアミノ酸と約＋／−１の範囲内のハイドロパティック値を有しているアミノ酸であれば、アミノ酸がうまく置換されうるとされている。
【図面の簡単な説明】
添付する図面は、この明細書に一体化され、本発明の実施例を提供し、そして、本発明の基本概念を説明する本明細書の一部となる。図面は、どのように本発明がなされあるいは使用されるかを説明するための好ましくかつ可変の具体的態様を説明するための目的のためだけにある。もちろん、図面、本発明の概念を代表し説明することが意図されていることが理解されるべきである。図面は、説明され記載された実施例にのみ本発明を限定するものとして解釈されるものではない。本発明の各種の利点や特徴は、記載された明細書及び付随する図面を考慮することによって明白になるであろう。
【図１】  図１は、S. aureusのコロニー形成単位（ＣＦＵ）に対するα−ＭＳＨ（１−１３）、α−ＭＳＨ（１１−１３）及び”ＫＰＶ二量体”の効果をコントロールと対比して示す。３種のペプチドは、すべて、広い範囲のペプチド濃度にわたって有意にＳ．ａｕｒｅｕｓのコロニー形成単位を低減させた。
【図２】  図２は、ウロキナーゼ処理が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのコロニー形成を増大させるが、α−ＭＳＨ（１−１３）あるいはα−ＭＳＨ（１１−１３）の添加が、有意に、このウロキナーゼが増強する効果を阻害したことを示す。*Ｐ＜０．００１ ｖｓ ウロキナーゼ単独
【図３】  図３は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのコロニー形成単位（ＣＦＵ）に対するα−ＭＳＨ（１−１３）、α−ＭＳＨ（１１−１３）及び”ＫＰＶ二量体”の効果をコントロールと対比して示す。これらの３種の分子は、すべて、広い範囲のペプチド濃度にわたって有意にＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのコロニー形成単位を低減させた。
【図４】  図４は、ある種のメラノコルチンペプチドとフルコナゾール（すべて１０-6Ｍ）とのＣａｎｄｉｄａ死滅活性の対比を示す。最も有効なメラノコルチンペプチドは、α−ＭＳＨのＣ末端配列を備えるペプチドであり、例えば、α−ＭＳＨ（１−１３）、α−ＭＳＨ（６−１３）及びα−ＭＳＨ（１１−１３）であった。
【図５】  図５（Ａ）は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの未処理の発芽、すなわち、出芽胞子の状態を示す。図５（Ｂ）は、ウマ血清により誘導されたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの発芽を示す。図５（Ｃ）は、α−ＭＳＨ（１−１３）処理のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの発芽に対する効果を示す。図５（Ｄ）は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの発芽に対するα−ＭＳＨ（１１−１３）の効果を示す。
【図６】  図６は、ヒト好中球細胞によるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの死滅に対するα−ＭＳＨ（１−１３）及びα−ＭＳＨ（１１−１３）の効果を示す。数値は、培地単独の場合に対する死滅％の増加として示されている。評価は、平均値±ＳＥＭである。
【図７】  図７は、α−ＭＳＨ（１−１３）、α−ＭＳＨ（１１−１３）及びフォルスコリンのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのｃＡＭＰ含有量に対する効果を示す。
【図８】  図８は、α−ＭＳＨ（１−１３）、α−ＭＳＨ（１１−１３）及びフォルスコリンのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのコロニー形成単位に対する阻害効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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