(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム上でＧタンパク質のシステインヌースおよびヘパリン結合部位をコードする領域が欠失している、組換え体サブグループB呼吸器合胞体ウイルス。
【請求項２】
前記ゲノムが、
(ａ)配列番号１またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列;
(ｂ)配列番号１またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列に97.8%を超えて同一であるポリヌクレオチド配列;及び、
(ｃ)配列番号１またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列の全長とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、配列番号１３またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列の対応するポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする少なくとも２×信号対雑音比で、前記ストリンジェントな条件下で配列番号１またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列のポリヌクレオチド部分配列にハイブリダイズする、前記ポリヌクレオチド配列;
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のウイルス。
【請求項３】
前記Ｇタンパク質が配列番号１２で示される、請求項１または２に記載のウイルス。
【請求項４】
前記システインヌースおよびヘパリン結合部位が配列番号１２においてアミノ酸配列164〜197で示される、請求項１または２に記載のウイルス。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え体サブグループＢの呼吸器合胞体ウイルスを生成する方法であって、
(1) Ｇタンパク質のシステインヌースおよびヘパリン結合部位をコードする領域が欠失している組換え体サブグループＢ呼吸器合胞体ウイルスのゲノム核酸を含むベクターを含有する宿主細胞を、適当な培養培地で、前記核酸の発現を可能にする条件下で培養するステップと、
(2)  前記宿主細胞および/または培地から組換え体サブグループＢ呼吸器合胞体ウイルスを単離するステップと、
を含む方法。
【請求項６】
前記ゲノム核酸が
(ａ)配列番号１またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列;
(ｂ)配列番号１またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列に97.8%を超えて同一であるポリヌクレオチド配列;及び、
(ｃ)配列番号１またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列の全長と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、配列番号１３またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列の対応するポリヌクレオチド部分配列にハイブリダイズする少なくとも２×信号対雑音比で、前記ストリンジェントな条件下で配列番号１またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする、前記ポリヌクレオチド配列;
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｇタンパク質が配列番号１２で示される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記システインヌースおよびヘパリン結合部位が配列番号１２においてアミノ酸配列164〜197で示される、請求項５または６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
この出願は、以下の先行特許仮出願、すなわち、すべての目的に対してそれぞれが全体として参照により本明細書に組み込まれている、「Compositions and Methods Involving Respiratory Syncytial Virus Subgroup B Strain 9320」と題した、Xing Chengらによる、2003年3月28日出願の米国特許出願第60/458331号と、「Compositions and Methods Involving Respiratory Syncytial Virus Subgroup B Strain 9320」と題した、Xing Chengらによる、2003年10月3日出願の米国特許出願第60/508320号との優先権および特典を要求する非仮出願実用特許出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ウイルス学分野のものである。より詳細には、本発明は、ヒト呼吸器合胞体ウイルスに関し、これには、ヒトRSV感染の診断、治療、および予防が含まれる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ヒト呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は、世界中の乳児および幼い子供のウイルス性気道疾患(例えば、細気管支炎および肺炎)による入院の主要要因であり、同時に、免疫無防備状態の成人および高齢者の罹患率および死亡率の重大な源泉でもある(例えば、Shayら(1999年)、「Bronchiolitis-associated hospitalizations among US children,1980-1996」、JAMA、第282巻、1440〜1446頁、Falseyら(1995年)、「Respiratory syncytial virus and influenza A infections in the hospitalized elderly」、J Infect Dis、第172巻、389〜394頁、Falseyら(1992年)、「Viral respiratory infections in the institutionalized elderly:clinical and epidemiologic findings」、J Am Geriatr Soc、第40巻、115〜119頁、FalseyおよびWalsh(1998年)、「Relationship of serum antibody to risk of respiratory syncytial virus infection in elderly adults」、J Infect Dis、第177巻、463〜466頁、Hallら(1986年)、「Respiratory syncytial viral infection in children with compromised immune function」、N Engl J Med、第315巻、77〜81頁、および、Harringtonら(1992年)、「An outbreak of respiratory syncytial virus in a bone marrow transplant center」、J Infect Dis、第165巻、987〜993頁を参照)。現在まで、RSV感染に関連した疾患を予防できるいかなるワクチンも承認されていない。RSVは、一本鎖のマイナス鎖非分節性RNAゲノムを有するウイルスであり、Paramyxoviridae科のPneumovirus属に分類される(KnipeおよびHowley(編集)、「Fields Virology」、第1巻、Lippincott,Williams and Wilkins社、Philadelphia中の、Collinsら(2001年)、「Respiratory syncytial virus」、1443〜1485頁;および、KnipeおよびHowley(編集)、「Fields Virology」、第1巻、Lippincott、Williams and Wilkins社、Philadelphia中の、LambおよびKolakofsky(2001年)、「Paramyxoviridae:the viruses and their replication」、1305〜1340頁)。ヒトRSVは、抗原の多様性と、ヌクレオチド配列の相違とに基づいて、2つのサブグループ、すなわちサブグループAおよびBに分類される。例えば、接着タンパク質Gは、最も多岐にわたり、融合タンパク質Fは、2つのサブグループ間で比較的によく保存されている。
【０００４】
サブグループA RSVの分子生物学の理解に向けてかなりの進歩があったが、サブグループB RSVに関する利用可能な情報ははるかに少ない。これまでのほとんどの研究がサブグループA株に焦点を合わせたものであった。例えば、RSV株A2の配列決定がなされている。A2株RSVのゲノムは、長さが15222ntであり、11個のタンパク質(NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2-1、M2-2、およびL)をコードする10の転写単位を含有する。ゲノムにNタンパク質が密接に結合してヌクレオカプシドを形成し、これが、N、P、およびLタンパク質を含むウイルスRNAポリメラーゼのテンプレートとなる(Grosfeldら(1995年)、J.Virol.、第69巻、5677〜5686頁;Yuら(1995年)、J.Virol.、第69巻、2412〜2419頁)。各転写単位には、高度に保存されている10-ntの遺伝子スタート(GS)シグナルが隣接しており、mRNA合成がそこで開始し、また、各転写単位は、mRNAのポリアデニル化および放出を指示する準保存的な12から13-ntの遺伝子終結(GE)シグナルで終結する(Harmonら(2001年)、J.Virol.、第75巻、36〜44頁;Kuoら(1996年)、J.Virol.、第70巻、6892〜6901頁)。RSV遺伝子の転写は逐次的であり、転写減衰によって減少するmRNA合成の勾配が存在する(Barik(1992年)、J.Virol.、第66巻、6813〜6818頁;Dickensら(1984年)、J.Virol.、第52巻、364〜369頁)。ウイルスのRNAポリメラーゼは、下流mRNAの合成を開始するために、まず、上流メッセージの合成を終了させらなければならない。
【０００５】
ヌクレオカプシドタンパク質(N)、リンタンパク質(P)、および大きいポリメラーゼタンパク質(L)が、in vitroでウイルスRNAの複製および転写を行うための最小限の構成要素を構成する(Grosfieldら(1995年)、J.Virol.、第69巻、5677〜5686頁;Yuら(1995年)、J.Virol.、第69巻、2412〜2419頁)。Nタンパク質は、ゲノムRNAに結合してヌクレオカプシドを形成し、これがRNA合成用のテンプレートとして用いられる。Lタンパク質は、RNA依存性RNAポリメラーゼの触媒モチーフを含有する多機能タンパク質であり、おそらくウイルスmRNAのキャップ形成およびポリアデニル化も行っている。しかし、Lタンパク質のみでは、ポリメラーゼ機能に十分ではなく、Pタンパク質も必要である。RSV RNAの転写および複製は、ニューモウイルスに特有のM2-1、M2-2、NS1、およびNS2タンパク質によってモジュレートされる。M2-1は、連続的なRNA合成と、遺伝子接合部での転写リードスルーとに必要な抗転写終結(すなわち伸長)因子であり、RNA転写およびウイルス複製に必須である(Collinsら(1996年)、「Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus,a nonsegmented negative-strand RNA virus」、Proc Natl.Acad Sci USA、第93巻、81〜85頁;HardyおよびWertz(2000年)、「The Cys3-His1 motif of the respiratory syncytial virus M2-1 protein is essential for protein function」、J.Virol.、第74巻、5880〜5885頁;Tangら(2001年)、「Requirement of cysteines and length of the human respiratory syncytial virus M2-1 protein for protein function and virus viability」、J Virol、第75巻、11328〜11335頁;D.M.Knipeら(編集)、「Fields Virology」、第4版、Lippincott社、Philadelphia中の、Collinsら(2001年);Hardyら(1999年)、J.Virol.、第73巻、170〜176頁;および、HardyおよびWertz(1998年)、J.Virol.、第72巻、520〜526頁)。M2-2は、組織培養ではウイルス複製に必須でないが、ウイルスのRNA転写と複製との間の転換に関与している(BerminghamおよびCollins(1999年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第96巻、11259〜11264頁;Jinら(2000年)、J.Virol.、第74巻、74〜82頁)。NS1およびNS2は、ミニゲノム合成をin vitroで阻害することが示されている(Atreyaら(1998年)、J.Virol.、第72巻、1452〜1461頁)。
【０００６】
NS1、NS2、SH、M2-2、およびGは、ウイルスの生存率に影響を与えずにRSV A2株から欠失できるアクセサリータンパク質である(BerminghamおよびCollins(1999年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第96巻、11259〜11264頁;Jinら(2000年)、J.Virol.、第74巻、74〜82頁;Jinら(2000年)、「Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS 1,NS2,SH,and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo」、Virology、第273巻、210〜218頁;Bukreyevら(1997年)、「Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site- specific attenuation in the respiratory tract of the mouse」、J Virol、第71巻、8973〜8982頁;TengおよびCollins(1999年)、「Altered growth characteristics of recombinant respiratory syncytial viruses which do not produce NS2 protein」、J Virol、第73巻、466〜473頁;Tengら(2000年)、「Recombinant respiratory syncytial virus that does not express the NS1 or M2-2 protein is highly attenuated and immunogenic in chimpanzees」、J Virol、第74巻、9317〜9321頁;Karronら(1997年)、「Respiratory syncytial virus(RSV)SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro:clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged,attenuated RSV subgroup B mutant」、Proc Natl Acad Sci USA、第94巻、13961〜13966頁)。しかし、SH欠失突然変異体を除いて、これらの遺伝子欠失突然変異体の大部分は、組織培養または動物宿主で野生型RSVほど複製がよくない。
【０００７】
GおよびFタンパク質は、RSV感染および再感染に対する防御免疫を提供する抗RSV中和抗体を誘発する2つの主要な表面抗原である。循環抗体が高レベルであることは、RSV感染に対する防御、および疾患重度の低減と相関している(Crowe(1999年)、Microbiol.Immunol.、第236巻、191〜214頁)。記述したように、ウイルスの抗原および配列の相違に基づいて、2つの抗原性RSVサブグループ(AおよびB)が認識されている(Andersonら(1985年)、J.Infect.Dis、第151巻、626〜633頁;Mufsonら(1985年)、J.Gen.Virol.、第66巻、2111〜2124頁)。相互的な交差中和アッセイを用いることによって、Fタンパク質は、この2つのサブグループ間で50%の関連性を有し、また、Gタンパク質は、関連性が1〜7%しかないと判定されている(D.M.Knipeら(編集)、Fields Virology、1443〜1485頁、第1巻、Lippincott Williams & Wilkins社、Philadelphia中の、Collinsら(2001年)、「Respiratory syncytial virus」に総説がある)。この抗原多様性は、RSV感染が繰り返される原因の一部であるかもしれない。これら2つのRSVサブグループの抗原多様性によって、両方のサブグループのウイルスが共同体で同時に流行することが可能となっており、各サブグループの罹患率は、連続した何年かの間に交互となることもある。子供のRSV感染に関する流行研究は、自然に取得された感染が、相同のサブグループウイルスによって引き起こされた疾患に対して比較的高い防御を引き出すことを示唆した(D.M、Knipeら(編集)、第2版、「Virology」、1045〜1072頁、Raven Press社、New York中の、McIntoshおよびChanock(1990年)、「Respiratory syncytial virus」)。RSV感染によって誘導される免疫は一過性であり、後に再感染が起こりうる。しかし、通常、RSVの再感染は、重度の疾患を引き起こさない。したがって、RSVワクチンは、通常、RSVサブグループAおよびBウイルスによって引き起こされた重度の下気道疾患に対する防御の提供を標的とする。
【０００８】
安全かつ有効なRSVワクチンを生産しようとする試みは、精製されたウイルス抗原の投与、または鼻腔内投与用の弱毒生RSVの開発に焦点がしぼられてきた。例えば、ホルマリンで不活性化したウイルスワクチンは、RSV感染に対する防御を提供するのに失敗しただけではなく、乳児における野生型ウイルスによる後続の感染の間、症候を悪化させることが示された(Kapikianら(1969年)、Am.J.E idemiol.、第89巻、405〜421頁;Chinら(1969年)、Am.J.Epidemiol.、第89巻、449〜63頁)。より最近では、野生型RSVの化学突然変異誘発または低温継代による温度感受性の弱毒生突然変異体の開発に努力が向けられてきている(Croweら(1994年)、Vaccine、第12巻、691〜9頁)。ウイルス候補は、通常、過小弱毒化(underattenuated)または過剰弱毒化(overattenuated)されたものであったし(Kimら(1973年)、Pediatrics、第52巻、56〜63頁;Wrightら(1976年)、J.Pediatrics、第88巻、931〜6頁)、一部の候補は遺伝的に不安定であって、その結果、弱毒化表現型を喪失していた(Hodgesら(1974年)、Proc Soc.Exp.Bio.Med.、第145巻、1158〜64頁)。これまで、いかなる弱毒生ワクチンも、商品化に至っていない。
【０００９】
さらに多くのRSV株、特にサブグループB株の特性分析が、有効なワクチンの生産を補助するだろう(例えば、複数の株の間での相同または同一の領域は、突然変異誘発の標的となりうる機能的に保存されている領域を指示する場合がある)。様々なサブグループB株の短い領域が配列決定されているが(例えば、B9320タンパク質G、配列番号14、GenBankアクセッション番号M73544;B9320遺伝子間領域、配列番号15、GenBankアクセッション番号S75820;B9320 GおよびF遺伝子の開始および終結配列、配列番号16〜19、Jinら(1998年)、Virology、第251巻、206〜214頁、およびChengら(2001年)、Virology、第283巻、59〜68頁;ならびに、様々なB18537コード領域および遺伝子間領域、GenBankアクセッション番号D00334、D00392〜D00397、D00736、D01042、およびM17213)、その全体が配列決定されているのは、1株のサブグループB株、すなわち株B1のみである(配列番号13、GenBankアクセッション番号AF013254)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明は、ヒトRSVサブグループB株9320の完全なポリヌクレオチド配列を提供する。B9320ゲノムによってコードされているポリペプチド、および、開示を総覧することで明らかになるであろう他の恩恵も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
本発明は、ヒト呼吸器合胞体ウイルスサブグループB株9320の完全なポリヌクレオチド配列を提供する。B9320ゲノムによってコードされているタンパク質のアミノ酸配列も提供する。本発明は、新規のB9320配列を含む単離されたか、または組換え体の核酸およびポリペプチドを提供する。本発明の核酸およびポリペプチドを含む単離されたか、または組換え体のRSV(例えば、弱毒化された組換え体RSV)、ならびに、ワクチンとしての使用に適した、そのような核酸、ポリペプチド、およびRSVを含む免疫原性組成物も提供する。感染性の組換え体9320ウイルスの、cDNAからの回収についても記述する。
【００１２】
第1の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド配列を含む単離されたか、または組換え体の核酸を提供する。したがって、例えば、配列番号1のポリヌクレオチド配列、またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列を含む単離されたか、または組換え体の核酸は、本発明の好ましい実施形態である。別の好ましい実施形態は、配列番号1またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列の少なくとも1つの特有のポリヌクレオチド部分配列を、上記特有のポリヌクレオチド部分配列が配列番号14〜19またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列に含まれていない少なくとも1つの部分配列を含むという条件で含む、単離されたか、または組換え体の核酸である。上記特有のポリヌクレオチド部分配列は、例えば配列番号1またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列における連続した少なくとも10ヌクレオチド(例えば、連続した少なくとも20ヌクレオチド、連続した少なくとも50ヌクレオチド、連続した少なくとも100ヌクレオチド、連続した少なくとも500ヌクレオチド、または、場合によっては連続した少なくとも1000ヌクレオチド)を含みうる。一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチド部分配列が、配列番号1の少なくとも1つの完全なオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。
【００１３】
付随の配列表に明示的に提供する配列に加えて、構造的かつ/または機能的に強く関連したポリヌクレオチド配列(例えば、ハイブリダイゼーションおよび/または配列の同一性によって定義される)も、本発明のポリヌクレオチドである。例えば、デフォルトパラメータを用いたBLASTNによる判定で、配列番号1またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列に97.8%を超えて同一であるポリヌクレオチド配列も、本発明のポリヌクレオチドである。別の例として、配列番号1またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列における連続した少なくとも100ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド部分配列の実質的に全長と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、配列番号13またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列の対応するポリヌクレオチド部分配列にハイブリダイズする少なくとも2×信号対雑音比で、上記ストリンジェントな条件下で配列番号1のポリヌクレオチド部分配列またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列も、本発明のポリヌクレオチド配列である。同様に、本発明のポリヌクレオチド配列は、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、例えば、配列番号2〜11またはその人工の保存的変異からなる群から選択されたアミノ酸配列または特有の部分配列をコードするポリヌクレオチド配列も含む。
【００１４】
本発明の核酸は、任意選択で、人工的に突然変異された少なくとも1つのヌクレオチド(例えば、少なくとも1つの人工的に欠失、挿入、および/または置換されたヌクレオチド)を含む。特定の実施形態では、上記ポリヌクレオチド配列の突然変異によって、コードされているアミノ酸配列の改変がもたらされる。したがって、1クラスの実施形態では、上記核酸によってコードされている少なくとも1つのポリペプチドが、少なくとも1つの欠失、挿入、および/または、置換されたアミノ酸残基(例えば、少なくとも1つの保存的に、または非保存的に置換されたアミノ酸残基)を含む。例えば、突然変異されるヌクレオチドは、配列番号2〜12より選択されたポリペプチドをコードするORF中に位置しうる。
【００１５】
別のクラスの実施形態は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。さらに別のクラスの実施形態は、そのようなベクターが導入されている宿主細胞を提供する。別のクラスの実施形態は、組換え体の呼吸器合胞体ウイルスを生成する方法を提供する。これらの方法では、そのような宿主細胞が、適当な培地中で、核酸の発現を可能にする条件下で培養され、この宿主細胞および/または培地から、組換え体の呼吸器合胞体ウイルスが単離される。これらの方法に従って生成される組換え体RSVは、本発明の別の特色を形成し、また、本発明の核酸を含む組換え体RSVも同様である。関連したクラスの実施形態は、単離されたか、または組換え体のポリペプチドを生成する方法を提供する。これらの方法では、本発明の核酸を含有するベクターを含む宿主細胞が、適当な培地中で、核酸の発現を可能にする条件下で培養され、この宿主細胞および/または培地から、上記ポリペプチドが単離される。これらの方法に従って生成されたポリペプチドは、本発明の別の特色を形成し、また、本発明の核酸によってコードされているアミノ酸配列または部分配列を含むポリペプチドも同様である。
【００１６】
本発明の一態様は、本発明のアミノ酸配列を含む単離されたか、または組換え体のポリペプチドを提供する。したがって、例えば、配列番号2〜11からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む単離されたか、または組換え体のポリペプチドも、本発明の好ましい実施形態である。配列番号2〜11のいずれか1つにおける連続した少なくとも7(例えば、少なくとも8、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも50、またはこれより多数の)アミノ酸残基を含む特有のアミノ酸部分配列を含む単離されたか、または組換え体のポリペプチドも、別の好ましい実施形態である。本発明のアミノ酸配列または部分配列の人工の保存的変異も、本発明のアミノ酸配列であり、本発明のアミノ酸配列に実質的に同一なアミノ酸配列も同様である。例えば、デフォルトパラメータを用いたBLASTPによる判定で、配列番号2に99.3%を超えて同一なアミノ酸配列、配列番号3に98.4%を超えて同一なアミノ酸配列、配列番号4に99.7%を超えて同一なアミノ酸配列、配列番号5に98.3%を超えて同一なアミノ酸配列、配列番号6に99.6%を超えて同一なアミノ酸配列、配列番号7に97.0%を超えて同一なアミノ酸配列、配列番号8に99.3%を超えて同一なアミノ酸配列、配列番号9に99.5%を超えて同一なアミノ酸配列、配列番号10に96.4%を超えて同一なアミノ酸配列、または配列番号11に99.2%を超えて同一なアミノ酸配列も、本発明のアミノ酸配列である。同様に、配列番号1によってコードされるアミノ酸配列または部分配列に特異的に結合する抗体によって特異的に結合されるアミノ酸配列または部分配列であって、前記抗体が配列番号13または配列番号14によってコードされているアミノ酸配列または部分配列に特異的に結合しない、アミノ酸配列または部分配列も、本発明のアミノ酸配列である。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、任意選択で、人工的に改変された少なくとも1つのアミノ酸(例えば、少なくとも1つの欠失、挿入、および/または置換されたアミノ酸)を含む。例えば、1クラスの実施形態は、残基164〜197の欠失を有する配列番号12のアミノ酸配列またはその人工の保存的変異を含む単離されたか、または組換え体のポリペプチドを提供する。
【００１８】
免疫学的に有効な量の、本発明の組換え体の呼吸器合胞体ウイルス、ポリペプチド、および/または核酸を含む免疫原性組成物が本発明の別の態様を形成する。同様に、本発明の別の特色は、呼吸器合胞体ウイルスに対する防御免疫応答を生成するために個体の免疫系を刺激する方法を提供する。これらの方法では、生理的に許容される担体中の本発明の呼吸器合胞体ウイルス、ポリペプチド、および/または核酸の免疫学的に有効な量を個体に投与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が関係する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同一の意味を有する。以下の定義は、当技術分野における定義を補足するものであり、この出願を対象としており、いかなる関連または非関連の事例、例えば共有されているいかなる特許または出願にも帰属させるべきではない。本明細書に記載のものと同様または均等であるいかなる方法および物質も、本発明の試験の実施に用いることができるが、好ましい物質および方法は本明細書に記載のものである。したがって、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態の記述のみを目的とするものであって、限定的なものには意図されていない。
【００２０】
この明細書、および添付した特許請求の範囲で使用される場合、文脈によって別のことが明確に指示されない限り、単数形「a」、「an」、および「the」には、複数の指示対象も含まれる。したがって、例えば、「ウイルス(a virus)」に対する言及には、複数のウイルスが含まれており、「宿主細胞(a host cell)」に対する言及には、宿主細胞の混合物、および同様のものも含まれる。
【００２１】
「アミノ酸配列」は、文脈に応じて、アミノ酸残基の重合体(タンパク質、ポリペプチドなど)、またはアミノ酸重合体を表す文字列である。
【００２２】
「ポリヌクレオチド配列」または「ヌクレオチド配列」は、文脈に応じて、ヌクレオチドの重合体(オリゴヌクレオチド、DNA、核酸など)、またはヌクレオチド重合体を表す文字列である。指定されたいかなるポリヌクレオチド配列からも、所与の核酸配列または相補的なポリヌクレオチド配列(例えば、相補的な核酸)のいずれかを決定することができる。
【００２３】
「部分配列」は、完全配列を最大として、かつ、これを含めた、配列全体のいかなる部分でもある。通常、部分配列は完全長配列より短い配列を含む。「特有の部分配列」は、以前に決定されているいかなるRSVポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列にも見出されない部分配列である(例えば、本明細書で記載および/または参照されているA2、B1、およびB18537配列)。
【００２４】
「人工の突然変異」は、人間の介入によって、例えば実験室条件下で導入された突然変異である。したがって、「人工的に突然変異」されたヌクレオチドは、人間の介入の結果として突然変異されたヌクレオチドであり、「人工的に改変」されたアミノ酸残基は、人間の介入の結果として改変された残基であり、そして、「人工の保存的変異」は、人間の介入によって生成された保存的変異である。例えば、野生型ウイルス(例えば、ヒト宿主の間で自然に流行しているもの)、またはウイルスの他の親株を、組換えDNA技法を用いて「人工的に突然変異」することができ、それによってそのウイルスのゲノムが改変される(例えば、ウイルスゲノムは、in vitro突然変異誘発によって、または、化学物質、電離放射線、または同様のものにそれを曝露して、その後、ウイルスの温度感受性株、寒冷感受性株、または、他の方法で弱毒化された株を得るための、in vitroまたはin vivo選別を行うことによって改変することができる)。別の例として、野生型タンパク質は、そのタンパク質をコードする遺伝子を人工的に突然変異することによって、「人工的に改変」することができる。
【００２５】
ポリペプチドに関する「変異体」という用語は、参照配列と比較して、1つまたは複数のアミノ酸で改変されているアミノ酸配列を指す。変異体は、「保存的」な変化を有することがあり、その場合、置換されるアミノ酸は構造的または化学的に同様の特性を有し、例えば、ロイシンのイソロイシンとの置換が挙げられる。あるいは、変異体は、「非保存的」な変化、例えばグリシンのトリプトファンとの置換を有することもある。同様の小さい変異には、アミノ酸欠失、挿入、またはこれら両方も含まれることがある。生物学的または免疫学的な活性を消滅させずに、どのアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失できるか判定する際の教導を、当技術分野で周知のコンピュータプログラム、例えばDNASTARソフトウェアを用いて見出すことができる。保存的な置換の例を以下に記述する。
【００２６】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一連のヌクレオチドに相当しうる、単量体単位が物理的に一連になったものを包含し、これには、ヌクレオチドの重合体(例えば、典型的なDNAまたはRNA重合体)、PNA、修飾されたオリゴヌクレオチド(例えば、2'-O-メチル化されたオリゴヌクレオチドなど、溶液中の生物学的RNAまたはDNAでは典型的でない塩基を含むオリゴヌクレオチド)、および同様のものが含まれる。核酸は、例えば、一本鎖である場合も、また、二本鎖である場合もある。別段の指示がない限り、本発明の特定の核酸配列は、明示的に示された配列に加えて、相補配列も包含する。
【００２７】
「遺伝子」という用語は、広範に使用されて、生物学的機能に関連するいかなる核酸も意味する。したがって、遺伝子には、コード配列、および/または、それらの発現に必要な調節配列が含まれる。「遺伝子」という用語は、特定のゲノム配列に適用され、同様に、そのゲノム配列によってコードされるcDNAまたはmRNAにも適用される。遺伝子には、例えば他のタンパク質の認識配列を形成する、非発現性の核酸セグメントも含まれる。非発現性の調節配列には、「プロモーター」および「エンハンサー」が含まれ、これらに、転写因子などの調節タンパク質が結合して、隣接しているか、または近傍にある配列の転写をもたらす。
【００２８】
「遺伝子の発現」または「核酸の発現」は、文脈による指示に応じて、DNAのRNAへの転写(場合によっては、RNAの改変、例えばスプライシングも含まれる)、RNAのポリペプチドへの翻訳(場合によっては、それに続くポリペプチドの改変、例えば翻訳後修飾も含まれる)、または転写および翻訳の両方を意味する。
【００２９】
「ベクター」という用語は、生物、細胞、または細胞構成要素の間で、それによって核酸を伝播および/または転移できる媒体を意味する。ベクターには、自律的に複製するか、または宿主細胞の染色体への統合が可能な、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体、および同様のものが含まれる。ベクターは、自律的に複製しない裸のRNAポリヌクレオチド、裸のDNAポリヌクレオチド、同一鎖中にあるDNAおよびRNAの両方で構成されているポリヌクレオチド、ポリリジンが結合しているDNAもしくはRNA、ペプチドが結合しているDNAもしくはRNA、リポソームが結合しているDNA、または同様のものである場合もある。本発明のベクターは、最も一般的には、プラスミドである。
【００３０】
「発現ベクター」は、プラスミドなどのベクターであり、そこに組み込まれている核酸の複製だけでなく、発現も促進することができる。通常、発現される核酸は、プロモーターおよび/またはエンハンサーに「作用可能に連結」されており、かつ、プロモーターおよび/またはエンハンサーによる転写制御を受ける。
【００３１】
「宿主細胞」という用語は、ベクターなどの異種核酸を含有し、かつその核酸の複製および/または発現を補助する細胞を意味する。宿主細胞は、大腸菌(E.coli)などの原核細胞、または、ヒト細胞を含めた、酵母、昆虫、両生類、鳥類、または哺乳類の細胞などの真核細胞でありうる。本発明の文脈における例示的な宿主細胞には、HEp-2細胞およびベロ(Vero)細胞が含まれる。
【００３２】
異種核酸、または単離された核酸について述べる場合、「導入される」という用語は、そこで、核酸がその細胞のゲノム(例えば、染色体、プラスミド、色素体またはミトコンドリアDNA)に組み入れられるか、自律的レプリコンに変換されるか、または一時的に発現される(例えば、トランスフェクトされたmRNA)可能性のある真核細胞または原核細胞の中に、核酸が移行することを指す。この用語には、「感染」、「トランスフェクション」、「形質転換」、および「形質導入」などの方法が含まれる。本発明の文脈では、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、脂質媒介性のトランスフェクション(リポフェクション)などを含めた様々な方法を用いて、宿主細胞に核酸を導入することができる。
【００３３】
「オープンリーディングフレーム」または「ORF」は、DNAまたはRNA(例えば遺伝子)における可能な翻訳リーディングフレームであり、1つのポリペプチドに翻訳されるための要件を備えている。すなわち、リーディングフレームは終止コドンによって中断されていない。しかし、ORFという用語は、必ずしも、そのポリヌクレオチドが実際にポリペプチドに翻訳されることを指示するわけではないことに留意するべきである。
【００３４】
「ポリペプチド」は、2つ以上のアミノ酸残基を含む重合体である(例えば、ペプチドまたはタンパク質)。この重合体は、場合によって、グリコシル化または同様のものなどの改変を含むことがある。ポリペプチドのアミノ酸残基は、天然のものであることも、非天然のものであることもあり、かつ、非置換であることも、無修飾であることも、置換されていることも、また、修飾されていることもある。
【００３５】
「組換え体」という用語は、人間の介入によって、人工的に、もしくは合成的に(自然ではない方法で)改変された物質(例えば、ウイルス、核酸、またはタンパク質)を指す。この改変は、それの本来の環境または状態にある物質に対して施されることも、そこから取り出されている物質に対して施されることもある。例えば、「組換え体の核酸」は、例えばクローニング、DNAシャッフル、または他の操作の間に、あるいは、化学的突然変異誘発または他の突然変異誘発によって、核酸を再結合することによって作製されるものであり、「組換え体のポリペプチド」または「組換え体のタンパク質」は、組換え体の核酸の発現によって生成されるポリペプチドまたはタンパク質であり、そして、「組換え体のウイルス」、例えば組換え体の呼吸器合胞体ウイルスも、組換え体の核酸の発現によって生成される。
【００３６】
「単離された」という用語は、ウイルス、核酸、またはタンパク質などの生体物質であって、それが本来存在している環境でそれに付随しているか、あるいはそれと相互作用する成分を実質的に含まない生体物質のことをいう。単離されている物質は、場合によっては、その物質の本来の環境、例えば細胞では見出されない物質を含む。例えばその物質が、細胞など、それ本来の環境にある場合、その物質はその細胞中で、その環境で見出される物質が本来ある場所ではない場所(例えば、ゲノムまたは遺伝要素)に配置されている。例えば、天然に存在する核酸(例えば、コード配列、プロモーター、エンハンサーなど)は、ゲノムにおける、その核酸が本来ある場所ではない遺伝子座(例えば、プラスミドもしくはウイルスベクターなどのベクター、またはアンプリコン)に、自然には起こらない方法でそれを導入した場合、単離されていることになる。そのような核酸は、「異種」核酸とも呼ばれる。単離されたウイルスは、例えば、野生型ウイルスの本来の環境(例えば感染個体の鼻咽頭)ではない環境にある(例えば、細胞培養系にあるか、あるいは細胞培養から精製されている)。
【００３７】
ウイルスについて述べる場合、「キメラの」または「キメラ」という用語は、そのウイルスが、複数の親ウイルス株または供給源に由来する遺伝子構成要素および/またはポリペプチド構成要素を含有することを示す。同様に、ウイルスタンパク質について述べる場合、「キメラの」か「キメラ」という用語は、そのタンパク質が、複数の親ウイルス株または供給源に由来するポリペプチド構成要素(すなわちアミノ酸部分配列)を含んでいるのを示す。
【００３８】
「弱毒性の表現型を有する」RSV、すなわち「弱毒」RSVは、野生型ウイルス(例えば、ヒト宿主の間で自然に流行しているもの)と比較して、実質的に低い度合いの有毒性を示す。弱毒RSVは、通常、成長速度の低下、および/または複製レベルの減少を示す(例えば、細胞培養、感染の動物モデル、またはヒトワクチン受容者(vacinee)の鼻咽頭における、例えばピーク力価が、野生型RSVより、すなわち少なくとも約10倍、好ましくは少なくとも約100倍低い)。
【００３９】
RSVの「免疫学的に有効な量」は、その後における、RSVへの曝露に対する、個体(例えばヒト)自らの免疫応答を促進するのに十分な量である。誘導された免疫レベルは、例えば、プラーク中和アッセイ、補体結合アッセイ、酵素結合免疫吸着測定法、またはマイクロ中和試験によって、例えば、中和分泌型抗体および/または血清抗体量を測定することによってモニターすることができる。
【００４０】
RSVに対する「防御免疫応答」とは、後で個体が野生型RSVに曝露および/または感染した際に、個体(例えばヒト)が示す、重度の下気道疾患(例えば、肺炎および/または細気管支炎)に対して防御的な免疫応答を意味する。場合によっては、野生型(例えば、自然に流行している)RSVによって、なお感染が、特に上気道(例えば鼻炎)で、引き起こされることもあるが、それによって重度の感染が引き起こされることはない。通常は、防御免疫応答の結果として、同一の株および/またはサブグループのウイルスを(そしておそらく、異なった非ワクチン株および/またはサブグループのものも)、in vitroおよびin vivoで中和できる、検出可能なレベルの血清抗体および分泌型抗体が宿主によって生み出される。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって大部分または部分的にコードされた、1つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質である。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、これらが次に、免疫グロブリンクラス、IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEをそれぞれ定義する。免疫グロブリン(抗体)の典型的な構造単位は、四量体を含むものである。各四量体は、2対の同一なポリペプチド鎖対から構成され、その各対が、1本の「軽」鎖(約25kD)、および1本の「重」鎖(約50〜70kD)を有する。各鎖のN末端は、主として抗原認識を行う、約100から110、またはそれより多くのアミノ酸からなる可変領域を定義する。可変軽鎖(variable light chain)(VL)および可変重鎖(variable heavy chain)(VH)という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。抗体は、完全な免疫グロブリンとして、または、様々なペプチダーゼによる消化で生成される、詳細に特徴づけられた多数のフラグメントとして存在する。すなわち、例えばペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下で抗体を消化して、Fabの二量体であるF(ab)'2を生成するが、Fabそれ自体は、VH-CH1にジスルフィド結合によって連結された1本の軽鎖である。F(ab)'2を穏やかな条件下で還元して、ヒンジ領域でジスルフィド結合を切断し、それによって、(Fab')2二量体をFab'単量体に変換することができる。Fab'単量体は、本質的には、ヒンジ領域の一部を伴ったFabである(他の抗体フラグメントに関するより詳細な記述については、「Fundamental Immunology」、W.E.Paul編集、Raven Press社、N.Y.(1999)を参照のこと)。様々な抗体フラグメントは完全な抗体の消化によって定義されているが、化学的に、または組み換えDNA手法を用いることによって、そのようなFab'フラグメントをde novoに合成できることが、当業者には理解されよう。したがって、本明細書で使用する場合、抗体という用語には、抗体全体の修飾によって生成されたか、あるいは組み換えDNA手法を用いてde novoに合成された抗体または抗体フラグメントが含まれる。抗体には、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖Fv(sFvまたはscFv)抗体を含めた複数鎖または一本鎖抗体、およびヒト化またはキメラ抗体が含まれるが、一本鎖Fvでは、可変重鎖および可変軽鎖が相互に連結されて(直接的に、またはペプチドリンカーを介して)、連続的なポリペプチドを形成する。
【００４２】
「アンチゲノム」は、一本鎖ウイルス(例えばRSV)のゲノムに相補的(通常、完全に相補的)なポリヌクレオチドである。RSVは、マイナス鎖RNAウイルスであるので、そのゲノムは「アンチセンス」鎖であり、そして、「アンチゲノム」はmRNAに対応する「センス」鎖である。
【００４３】
追加される様々な用語は、本明細書中で定義するか、または別の方法で特徴づける。
【００４４】
詳細な説明
本発明は、ヒトRSVサブグループB株9320の完全なポリヌクレオチド配列を提供する。B9320アンチゲノムcDNAの配列を、配列番号1として記載する。自明であろうが、RSVゲノムは、配列番号1の配列に相補的なポリヌクレオチド配列を有するRNAである。
【００４５】
B9320ゲノムは、11個のタンパク質をコードする10の転写単位を含む。これらのタンパク質のアミノ酸配列も提供する。NS1は配列番号2として、NS2は配列番号3として、Nは配列番号4として、Pは配列番号5として、Mは配列番号6として、SHは配列番号7として、Gは配列番号12として、Fは配列番号8として、M2-1は配列番号9として、M2-2は配列番号10として、そしてLは配列番号11として記載する。
【００４６】
本発明は、新規のB9320配列を含む、単離されたか、または組換え体のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供する。これらの核酸および/またはポリペプチドを含む組換え体のRSV(例えば、弱毒生ウイルスワクチンでの使用に適した弱毒化された組換え体RSV)も提供する。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチド
本発明の一態様は、本発明のポリヌクレオチド配列を含む単離されたか、または組換え体の核酸を提供する。本発明のポリヌクレオチド配列には、配列番号1が表すポリヌクレオチド配列が含まれるが、これには、配列番号14〜19がRSV B9320の限られた部分配列を表し、以前に記載されている(例えば、GenBankアクセッション番号M73544およびS75820;Jinら(1998年)、Virology、第251巻、206〜214頁;ならびに、Chengら(2001年)、Virology、第283巻、59〜68頁)という補足説明が伴う。したがって、例えば、配列番号1のポリヌクレオチド配列、またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列を含む単離されたか、または組換え体の核酸は、本発明の好ましい実施形態である。配列番号1またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列の少なくとも1つのポリヌクレオチド部分配列(例えば、特有のコード部分配列)を含む単離されたか、または組換え体の核酸も、上記特有のポリヌクレオチド部分配列が、配列番号14〜19またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列に含まれていない少なくとも1つの部分配列を含むという条件で、別の好ましい実施形態である。特有のポリヌクレオチド部分配列は、例えば配列番号1またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列の連続した連続した少なくとも10ヌクレオチド(例えば、連続した少なくとも20ヌクレオチド、連続した少なくとも50ヌクレオチド、連続した少なくとも100ヌクレオチド、連続した少なくとも500ヌクレオチド、または、場合によっては、連続した少なくとも1000ヌクレオチド)を含むことができる。
【００４８】
付随の配列表に明示的に提供する配列に加えて、構造的かつ/または機能的に強く関連したポリヌクレオチド配列も、本発明のポリヌクレオチドである。したがって、本発明のポリヌクレオチド配列には、配列番号1のポリヌクレオチド配列(またはその相補配列)の実質的に全長と、ストリンジェントな条件下で、上記ポリヌクレオチド配列が配列番号13のポリヌクレオチド配列またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする少なくとも2×信号対雑音比(例えば、少なくとも5×、または少なくとも10×信号対雑音比)でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列が含まれる。本発明のポリヌクレオチド配列には、配列番号1またはその相補配列における連続した少なくとも100ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド部分配列(例えば、特有の部分配列)の実質的に全長と、ストリンジェントな条件下で、上記ポリヌクレオチド配列が配列番号13またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列の対応する部分配列(または、任意選択で、天然に存在する別の呼吸器合胞体ウイルスのゲノムにおける対応する部分配列もしくは相補的なポリヌクレオチド配列)にハイブリダイズする少なくとも2×信号対雑音比(例えば、少なくとも5×、または少なくとも10×信号対雑音比)でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列も含まれる。
【００４９】
同様に、本発明のポリヌクレオチド配列には、配列番号2〜11またはその人工の保存的変異からなる群から選択されたアミノ酸配列または特有の部分配列をコードするポリヌクレオチド配列も含まれる。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチド配列、例えば、配列番号1に記載のものに加えて、本発明のポリヌクレオチドに実質的に同一なポリヌクレオチド配列も、本発明の組成物および方法で用いることができる。実質的に同一であるか、または実質的に同様のポリヌクレオチド配列は、参照ポリヌクレオチド、例えば配列番号1より選択された参照ポリヌクレオチドの少なくとも部分配列とヌクレオチド対ヌクレオチドベースで同一なポリヌクレオチド配列と定義される。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、配列番号1に対する挿入、欠失、および置換を含みうる。例えば、デフォルトパラメータを用いたBLASTNによる判定で、配列番号1またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列に対して97.8%超の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列(または部分配列)を含む単離されたか、または組換え体の核酸は、上記ポリヌクレオチド配列が、配列番号14〜19より選択されたものではない少なくとも1つの部分配列を含むという条件において、本発明の好ましい実施形態である。例えば、上記ポリヌクレオチド配列(または部分配列)は、配列番号1またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列に少なくとも98.5%(例えば、少なくとも99.0%、少なくとも99.5%、またはさらに高い比率で)同一でありうる。
【００５１】
本発明の核酸は、例えば、一本鎖でも、二本鎖でもよく、また、DNA(例えばcDNA)でも、RNAでも、または人工的な核酸(例えばペプチド核酸)でもよい。配列番号1は、アンチゲノムB9320 cDNAのDNA配列を提供するものであるが、相補的なゲノムポリヌクレオチド配列も配列番号1から容易に決定できること、そして、RNA配列におけるUがDNA配列におけるTに対応することが理解されよう。
【００５２】
本発明の核酸には、本発明のポリペプチドをコードする核酸も含まれる。ある一般的なクラスの実施形態では、上記核酸が、配列番号1(またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列)における少なくとも1つの特有のポリヌクレオチド部分配列であって、配列番号2〜12のうち任意の1つにおける連続した少なくとも20アミノ酸残基(例えば、連続した少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、またはさらに多くのアミノ酸残基)をコードするポリヌクレオチド部分配列を含む。あるクラスの実施形態では、上記特有のポリヌクレオチド部分配列が、少なくとも1つの完全なORF、好ましくは、配列番号2〜12の中から選択されたポリペプチドをコードする少なくとも1つの完全なORFを含む。一部の実施形態では、上記核酸が複数の完全なオープンリーディングフレームを含む。
【００５３】
本発明の核酸は、任意選択で、少なくとも1つの人工的に突然変異されたヌクレオチド、例えば、少なくとも1つの人工的に欠失、挿入、および/または置換されたヌクレオチド(例えば、アンチゲノム配列の非コード領域内の、例えば、4番目の位置におけるCからGへの置換、および/またはコード領域内のもの)を含む。例えば、上記核酸は、人工的に突然変異された複数のヌクレオチドを含みうる。上記人工的に突然変異されたヌクレオチドは、部位特異的突然変異誘発、化学突然変異誘発、または同様の方法によって導入することができる。
【００５４】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチド配列の突然変異によって、コードされているアミノ酸配列の改変がもたらされる。したがって、1クラスの実施形態では、上記核酸によってコードされている少なくとも1つのポリペプチドが、欠失、挿入、および/または、置換された少なくとも1つのアミノ酸残基(例えば、保存的または非保存的に置換された少なくとも1つのアミノ酸残基)を含む。例えば、上記突然変異されたヌクレオチドは、配列番号2〜12より選択された1ポリペプチドをコードするORF中に位置しうる。したがって、1クラスの例示的実施形態では、上記少なくとも1つの人工的に突然変異されたヌクレオチドが、配列番号12のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中に位置する。上記人工的に突然変異されたヌクレオチドは、例えば欠失、例えば配列番号12によってコードされているGタンパク質からの1つまたは複数のアミノ酸残基の欠失(例えば残基164〜197の欠失)をもたらす欠失、またはGをコードするオープンリーディングフレーム中での欠失をもたらす欠失を含みうる。別のクラスの例示的実施形態では、上記少なくとも1つの人工的に突然変異されたヌクレオチドが、配列番号10のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中に位置する。上記人工的に突然変異されたヌクレオチドは、例えば欠失、例えば配列番号10によってコードされているM2-2タンパク質からの1つまたは複数のアミノ酸残基の欠失をもたらす欠失、またはM2-2をコードするオープンリーディングフレームの欠失をもたらす欠失を含みうる。別の例としては、M2-2におけるアミノ酸残基1、アミノ酸残基4、および/または、アミノ酸残基10をコードするヌクレオチドの少なくとも1つに突然変異すること(例えば、置換または欠失すること、例えば、第2および/または第3のスタートコドンの使用を強制して、M2-2のアミノ酸残基1〜3または1〜9の欠失をもたらすこと)ができる。
【００５５】
本発明の核酸には、キメラ核酸、例えば、配列番号1またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列の少なくとも1つの部分配列と、異なったウイルス株に由来する少なくとも1つのポリヌクレオチド部分配列とを含む核酸が含まれる。配列番号1の部分配列は、配列番号1またはその相補鎖における連続した少なくとも10ヌクレオチドを含む特有のポリヌクレオチド部分配列であって、配列番号14〜19またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列に含まれていない少なくとも1つの部分配列を含むポリヌクレオチド部分配列であることが好ましい。異なったウイルス株は、例えば、ヒトRSVの異なった株(例えば、A2、B1、または同様のもの)、または異なったウイルス種でありうる(例えば、別のパラミクソウイルス、例えば、マウス肺炎ウイルス、ウシRSV、またはメタニュウモウイルス)。そのようなキメラ核酸は、例えば、(例えば、RSVおよび/または別のウイルスの1つまたは複数の株に対する防御免疫応答を誘導するためのワクチン使用に供する)キメラタンパク質および/またはキメラウイルスをコードしうる。例えば、ある特定の実施形態では、上記核酸が、配列番号1の少なくとも1つの完全なオープンリーディングフレームと、異なったウイルス株の少なくとも1つの完全なオープンリーディングフレームとを含む。
【００５６】
別のクラスの実施形態は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。さらに別のクラスの実施形態は、そのようなベクターがその中に導入されている宿主細胞を提供する。
【００５７】
本発明のポリペプチド
本発明の一態様は、RSV B9320ポリペプチドおよびその変異体、例えば、本発明の核酸によってコードされているアミノ酸配列または部分配列を含むポリペプチドを、上記アミノ酸配列または部分配列が配列番号14によってコードされていないという条件で提供する。
【００５８】
ある一般的なクラスの実施形態は、本発明のアミノ酸配列を含む単離されたか、または組換え体のポリペプチドを提供する。したがって、例えば、配列番号2〜11からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む単離されたか、または組換え体のポリペプチドも、本発明の好ましい実施形態である。配列番号2〜11のうちの任意の1つにおける連続した少なくとも7(例えば、少なくとも8、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも50、またはさらに多くの)アミノ酸残基を含む特有のアミノ酸部分配列を含む単離されたか、または組換え体のポリペプチドも、別の好ましい実施形態である。本発明のアミノ酸配列または部分配列の人工の保存的変異も、本発明のアミノ酸配列である。そのようなポリペプチドは、場合によって免疫原性を有する。
【００５９】
本発明のアミノ酸配列、例えば、配列番号2〜11に記載のものに加えて、本発明のアミノ酸配列に実質的に同一なアミノ酸配列も、本発明の組成物および方法で用いることができる。実質的に同一であるか、または実質的に同様のポリペプチド配列は、参照ポリペプチド、例えば配列番号2〜11より選択された参照ポリペプチドの少なくとも部分配列とアミノ酸対アミノ酸ベースで同一なアミノ酸配列と定義される。そのようなアミノ酸配列は、例えば、配列番号2〜11に対する挿入、欠失、および置換を含みうる。例えば、デフォルトパラメータを用いたBLASTPによる判定で、配列番号2に99.3%を超えて同一なアミノ酸配列、配列番号3に98.4%を超えて同一なアミノ酸配列、配列番号4に99.7%を超えて同一なアミノ酸配列、配列番号5に98.3%を超えて同一なアミノ酸配列、配列番号6に99.6%を超えて同一なアミノ酸配列、配列番号7に97.0%を超えて同一なアミノ酸配列、配列番号8に99.3%を超えて同一なアミノ酸配列、配列番号9に99.5%を超えて同一なアミノ酸配列、配列番号10に96.4%を超えて同一なアミノ酸配列、または配列番号11に99.2%を超えて同一なアミノ酸配列を含む単離されたか、または組換え体のポリペプチドも本発明の好ましい実施形態である。例えば、上記単離されたか、または組換え体のポリペプチドは、デフォルトパラメータを用いたBLASTPによる判定で、配列番号2に少なくとも99.5%同一、配列番号3に少なくとも98.6%同一、配列番号4に少なくとも99.9%同一、配列番号5に少なくとも98.5%同一、配列番号6に少なくとも99.8%同一、配列番号7に少なくとも97.2%同一、配列番号8に少なくとも99.5%同一、配列番号9に少なくとも99.7%同一、配列番号10に少なくとも96.6%同一、または配列番号11に少なくとも99.4%同一であるアミノ酸配列(または部分配列)を含みうる。
【００６０】
本発明のポリペプチドは、場合によっては、人工的に改変された少なくとも1つのアミノ酸(例えば、欠失、挿入、および/または置換された少なくとも1つのアミノ酸)を含む。例えば、上記ポリペプチドは、人工的に改変された複数のアミノ酸を含みうる。
【００６１】
あるクラスの実施形態は、残基164〜197の欠失を有する配列番号12のアミノ酸配列を含む単離されたか、または組換え体のポリペプチド、あるいはその人工の保存的変異を提供する。
【００６２】
単離されたか、または組換え体のポリペプチドを生成する方法は本発明の別の態様を形成する。これらの方法では、本発明の核酸を含むベクター(例えば発現ベクター、例えば、1つまたは複数のORFを含む発現ベクター、あるいは、ウイルスゲノムまたはアンチゲノムの全体を含むベクター)がその中に導入される宿主細胞を、適当な培地中で、上記核酸の発現を可能にする条件下で培養する。その後、この宿主細胞および/または培地から、上記ポリペプチドを単離する。例えば、結果として得られる精製されたポリペプチドが、初期の状態と比較して少なくとも5×に濃縮されているように、上記ポリペプチドを宿主細胞および/または培地から精製することができる。本明細書に記載の方法に従って生成されるポリペプチドも、本発明の特色である。そのようなポリペプチドは、例えば、数アミノ酸(例えば、7以上、10以上、または20以上)から完全長タンパク質までの、配列番号2〜11の部分配列(例えば、特有の部分配列、免疫原性の部分配列など)を含みうる。
【００６３】
配列関連性の判定
配列番号1および配列番号13など、2つ以上の配列間にある関連性(例えば、同一性、類似性、および/または相同性)を判定する様々な方法が利用可能であり、また、当技術分野で周知である。これらの方法には、手操作によるアライメント、コンピュータ補助による配列アライメント、およびこれらの併用が含まれる。配列アライメントを行う多数のアルゴリズム(これらは通常、コンピュータで実施される)が広く利用可能であり、さもなくば、当業者が作成することもできる。これらの方法には、例えば、SmithおよびWaterman(1981年)、Adv.Appl.Math.、第2巻、482頁の局所的相同性アルゴリズム(local homology algorithm);NeedlemanおよびWunsch(1970年)、J.Mol.Biol.、第48巻、443頁の相同性アライメントアルゴリズム(homology alignment algorithm);PearsonおよびLipman(1988年)、Proc.Natl.Acad.Sci(USA)、第85巻、2444頁の類似性の探索法(search for similarity method);および/または、これらのアルゴリズムのコンピュータインプリメンテーション(例えば、ウィスコンシン遺伝学ソフトウェアパッケージリリース7.0(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0)におけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、Genetics Computer Group,575 Science Dr.、Madison、WI)が含まれる。
【００６４】
例えば、BLASTアルゴリズムを用いて配列同一性(および配列類似性)分析を行うソフトウェアが、Altschulら(1990年)、J.Mol.Biol.、第215巻、403〜410頁に記載されている。このソフトウェアは、例えば、ncbi.nlm.nih.govにおけるワールドワイドウェブで、全米バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)を介して一般に利用可能である。このアルゴリズムでは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードとのアライメントを行った際に、一致するか、または陽性の評価がなされる何らかの閾値スコアTを満たす、長さWのショートワードをクエリー配列中に同定することによって、高スコア配列対(HSP)を同定する。Tは、ネイバーフードワード(neighborhood word)スコア閾値と呼ばれる。これら初期のネイバーフードワードのヒットは、それらを含有するさらに長いHSPを見つけるための検索を開始する種子として働く。その後、これらワードヒットの伸長を、各配列に沿って両方向に、累積アライメントスコアが増加できなくなるまで行う。ヌクレオチド配列では、累積スコアは、パラメータM(一致した残基一対あたりに与える報酬スコア;常に>0)およびN(ミスマッチの残基に与えるペナルティスコア;常に<0)を用いて計算する。アミノ酸配列では、累積スコアを計算するのにスコアリングマトリクスが用いられる。各方向へのワードヒットの伸長が停止されるのは、累積アライメントスコアが、それまでに到達した最大値から量Xの差まで低下した場合;負のスコアを与える1つまたは複数の残基アライメントの蓄積によって累積スコアがゼロ以下になった場合;または、どちらかの配列の末端に達した場合である。BLASTアルゴリズムパラメータW、T、およびXによって、アライメントの感度および速度が決定される。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)では、デフォルトとして、ワード長(W)11、期待値(E)10、カットオフ値100、M=5、N=-4、および両鎖の比較が用いられる。アミノ酸配列用には、BLASTP(BLAST Protein)プログラムで、デフォルトとして、ワード長(W)3、期待値(E)10、およびBLOSUM62スコアリングマトリクスが用いられる(HenikoffおよびHenikoff(1989年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第89巻、10915頁参照)。
【００６５】
加えて、BLASTアルゴリズムは、2つの配列間にある類似性の統計分析を行う(例えば、KarlinおよびAltschul(1993年)、Proc Nat'l.Acad.Sci.USA、第90巻、5873〜5787頁を参照)。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の尺度の1つに、最少合計確率(smallest sum probability)(P(N))があるが、これは、2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間で、偶然によって一致が起こる確率の指標を提供する。例えば、ある核酸が参照配列に類似している(したがって、この文脈では、相同である)とみなされるのは、この試験核酸を参照核酸と比較した際の最少合計確率が約0.1未満、または約0.01未満、または場合によっては約0.001未満である場合である。
【００６６】
有用な配列アライメントアルゴリズムの別の例がPILEUPである。PILEUPは、関連した配列の一群から、漸進的な(progressive)ペアワイズアライメントを用いて複数の配列アライメントを生成する。PILEUPは、アライメントを生成するのに用いた、クラスター形成の関連性を示すツリーをプロットすることもできる。PILEUPは、FengおよびDoolittle(1987年)、J.Mel.Evol.、第35巻、351〜360頁の漸進的アライメント方法を簡素化したものを用いる。用いられる方法は、HigginsおよびSharp(1989年)、CABIOS、第5巻、151〜153頁に記載の方法と同様である。このプログラムは、例えば、最長5000文字の配列を300まで整列させることができる。多重アライメント操作は、最も類似した2つの配列のペアワイズアライメントを行って、2つの配列がアライメントされたクラスターを生成することによって開始される。次に、このクラスターと、2番目に最も関連性が高い配列またはアライメントされた配列のクラスターとのアライメントを行うことができる。2つの個別配列のペアワイズアライメントを単純に拡張することによって、2つの配列クラスターのアライメントを行うことができる。最終のアライメントは、一連の漸進的なペアワイズアライメントによって実現される。このプログラムは、クラスター形成の関連性を表すデンドグラム(dendogram)またはツリーをプロットするのに用いることもできる。このプログラムは、配列を比較する領域に特異的な配列と、それらのアミノ酸またはヌクレオチド座標とを指定することによって実行される。
【００６７】
複数のDNAまたはアミノ酸の配列アライメントに適したアルゴリズムのもう1つの例は、CLUSTALWプログラムである(Thompson、J.D.ら(1994年)、Nucl.Acids.Res.、第22巻、4673〜4680頁)。CLUSTALWは、配列グループ間で複数のペアワイズ比較を行い、それらを相同性に基づいた多重アライメントに組み合わせる。ギャップ生成ペナルティおよびギャップ伸長ペナルティは、例えば、それぞれ10および0.05とすることができる。アミノ酸アライメントでは、タンパク質のウエイトマトリクスとしてBLOSUMアルゴリズムを用いることができる。例えば、HenikoffおよびHenikoff(1992年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第89巻、10915〜10919頁を参照のこと。
【００６８】
核酸ハイブリダイゼーション
核酸間の類似性は、相補的であるか、部分的に相補的なポリヌクレオチド配列を有する一本鎖核酸(または核酸の一本鎖領域)相互の「ハイブリダイゼーション」で評価することもできる。ハイブリダイゼーションは、通常は溶液中、または、核酸鎖の一方が固形担体、例えば、膜、ビーズ、チップ、フィルターなどに固定されている状態にある核酸相互の物理的会合の尺度である。核酸ハイブリダイゼーションは、水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング、および同様のものなどの、詳細に特徴付けられている様々な物理化学力に基づいて起こる。核酸ハイブリダイゼーションに関する多数のプロトコールが当技術分野で周知である。核酸ハイブリダイゼーションのための詳細な指導が、Tijssen(1993年)、「Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes」、第I部、第2章、「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays」(Elsevier社、New York)に、そして、Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」(2003年を通して補足されている)、John Wiley & Sons社、New York(「Ausubel」);Sambrookら、「Molecular Cloning - A Laboratory Manual」(第3版)、第1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory社、Cold Spring Harbor、New York、2001年(「Sambrook」)ならびに、BergerおよびKimmel、「Guide to Molecular Cloning Techniques」、Methods in Enzymology、第152巻、Academic Press社、San Diego、CA(「Berger」)に見出される。HamesおよびHiggins(1995年)、「Gene Probes 1」、Oxford University Press社内IRL Press社、Oxford、英国(HamesおよびHiggins 1)、ならびに、HamesおよびHiggins(1995年)、「Gene Probes 2」、Oxford University Press社内IRL Press社、Oxford、英国(HamesおよびHiggins 2)は、オリゴヌクレオチドを含めたDNAおよびRNAの合成、標識化、検出、および定量に関する詳細な説明を提供する。
【００６９】
ディファレンシャルハイブリダイゼーションを含めたハイブリダイゼーションを得るのに適当な条件は、相補的な核酸、および部分的に相補的な核酸相互における理論上の融解温度(Tm)に応じて選択される。所与の1セットの条件、例えば、溶媒組成、イオン強度において、Tmは、ハイブリダイズしている核酸鎖相互の二本鎖分子が50%変性している温度である。すなわち、Tmは、へリックスからランダムコイルへの移行における中点に相当する温度に対応しており、これは、長い連続したヌクレオチドの長さ、ヌクレオチド組成およびイオン強度に依存する。
【００７０】
ハイブリダイゼーションの後で、ハイブリダイズしていない核酸を一連の洗浄によって除去することができ、その際のストリンジェンシーは、所望の結果に応じて調整することができる。低ストリンジェンシー条件での洗浄(例えば、より高い塩濃度と、より低い温度とを用いる)は感度を増大させるが、非特異的なハイブリダイゼーションシグナル、および高いバックグランドシグナルを生じる場合がある。より高ストリンジェンシーの条件(例えば、より低い塩濃度と、Tmにより近い、より高い温度を用いる)は、バックグランドシグナルを低下させ、主として通常、特異的なシグナルを残す。Rapley,RおよびWalker,J.M.編集、「Molecular Biomethods Handbook」(Humana Press社、1998年)も参照のこと。
【００７１】
サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」または「ストリンジェントな条件」は、配列依存的であり、また、異なった環境パラメータの下では相違する。核酸ハイブリダイゼーションのための詳細な指導は、Tijssen(1993年)、同上、ならびにHames and Higgins 1およびHames and Higgins 2、同上に見出される。
【００７２】
サザンまたはノーザンブロットで、100を超える相補的な残基を有する相補的な核酸の、フィルター上でのハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、42℃の2×SSC、50%ホルムアミドであり、この際、ハイブリダイゼーションが終夜(例えば約20時間)行われる。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、65℃における15分間の0.2×SSC洗浄である(SSC緩衝液の説明には、Sambrook、同上を参照のこと)。ストリンジェンシーを決定する洗浄の前に、低ストリンジェンシーの洗浄を行って、残留しているハイブリダイズしていないプローブによるシグナルを除去することも多い。低ストリンジェンシー洗浄の一例は、室温の2×SSC(例えば、20℃、15分間)である。
【００７３】
一般に、信号対雑音比が、特定のハイブリダイゼーションアッセイで、関係ないプローブで観測されるものの少なくとも2×(または、さらに高い比率、例えば、少なくとも5×、10×、20×、50×、100×、またはさらに高い比率)であると、特異的なハイブリダイゼーションの検出が示されたことになる。本発明の文脈において、2つの配列間で少なくともストリンジェントなハイブリダイゼーションが検出されることは、例えば本明細書の配列表に提供する本発明の核酸に対する、比較的強い構造的類似性を示すものである。
【００７４】
本発明に関する場合、「高度にストリンジェント」なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、通常、特定のイオンの強度およびpHにおける特定の配列の熱融点(Tm)より、約5℃以上低い条件に選択される(下記の通り、高度にストリンジェントな条件は、比較における意味で言及される場合もある)。注目しているヌクレオチド配列(例えば「プローブ」)に密接に関連しているか、または同一の標的配列は、ストリンジェントか、または高度にストリンジェントな条件下で同定することができる。より低ストリンジェンシーの条件は、それほど相補的でない配列に適している。
【００７５】
例えば、ストリンジェントまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件(または、さらになおストリンジェントなハイブリダイゼーション条件)および洗浄条件を決定するには、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を、選択されたセットの規準が満たされるまで徐々に増強する(例えば、温度の上昇、塩濃度の低下、界面活性剤濃度の増大、および/または、ハイブリダイゼーションまたは洗浄における、ホルムアミドなどの有機溶剤の濃度の増大によって)。例えば、必要に応じて、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を、本発明の1つまたは複数のポリヌクレオチド配列、例えば配列番号1より選択された配列もしくは特有の部分配列および/または相補的なポリヌクレオチド配列を含むプローブが、完全一致した相補的な標的(これも、配列番号1より選択された1つまたは複数の核酸配列もしくは部分配列、および/またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列を含む核酸)に、一致しない標的(例えば、配列番号13より選択された、1つまたは複数の対応する配列もしくは部分配列を含むポリヌクレオチド配列、および/またはそれに相補的なポリヌクレオチド配列)に対するそのプローブのハイブリダイゼーションで観測されるものの少なくとも2×(そして、任意選択で5×、10×、100×、またはさらに高い比率)の信号対雑音比で結合するまで、徐々に増強する。上記配列または部分配列は、配列番号14〜19に含まれない部分配列を少なくとも含む配列番号1の部分から選択されることが好ましい。
【００７６】
本発明のポリヌクレオチド、またはその部分配列を用いて、新規の標的核酸を得ることができ、そのような標的核酸も、本発明の特色である。例えば、そのような標的核酸には、本発明のポリヌクレオチドの任意のもの、例えば配列番号1に対応する特有のオリゴヌクレオチドプローブにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列が含まれる。
【００７７】
ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを増強することによって、約15×、20×、30×、50×、またはさらに高い比率など、より高い信号対雑音比を実現することができる。個別のシグナルは、適切なアッセイで使用される標識、例えば、蛍光標識、比色分析標識、放射性標識、または同様のものに応じて異なるであろう。
【００７８】
ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズしない核酸も、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合には、まだ実質的に同一である。これは、例えば、遺伝暗号によって許容される最大限のコドン縮重を用いて核酸のコピーを生成させた場合に起こる。
【００７９】
免疫反応性によるタンパク質の定義
本発明のポリペプチドは様々な新規のポリペプチド配列を提供するため、これらのポリペプチドは、例えば免疫学的アッセイによって認識することのできる新規の構造上の特色も提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体もしくは抗血清の産生、そのような抗体もしくは抗血清が結合するポリペプチド、およびこれらの抗体もしくは抗血清それら自体も、本発明の特色である。
【００８０】
したがって、本発明のタンパク質は、免疫反応性によって同定することもできる。例えば、本発明のポリペプチドは、配列番号1によってコードされるアミノ酸配列または部分配列に特異的に結合する抗体であって、配列番号13または配列番号14によってコードされるアミノ酸配列または部分配列に(または、任意選択で、天然に存在する別の呼吸器合胞体ウイルスのゲノムによってコードされるアミノ酸配列または部分配列に)、特異的に結合しない抗体に特異的に結合するアミノ酸配列または部分配列を含みうる。
【００８１】
抗体を産生する方法、イムノアッセイを行う方法、および同様のものは当技術分野で周知である。例えば、下記の「抗体」と題した節と、その中の参考文献を参照のこと。
【００８２】
典型的な1フォーマットでは、本発明のポリペプチドを同定するイムノアッセイは、1つまたは複数の本発明のRSV9320ポリペプチド(例えば、配列番号2〜11、または残基164〜197の欠失を有する配列番号12を含むポリペプチド)、または、その相当な部分配列(すなわち、提供されている完全長配列の少なくとも約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、またはさらに多く)に対して産生されたポリクローナル抗血清を用いる。1つまたは複数の本発明のRSV9320ポリペプチドに由来する潜在的なポリペプチド免疫原の完全なセットを、以下では、「免疫原性ポリペプチド」として集合的に言及する。結果として得られた抗血清は、任意選択で、対照RSV B1ポリペプチドおよび/または他の既知のRSVポリペプチド、例えば天然に存在するRSVポリペプチドに対する交差反応性が低いものを選択し、そのようないかなる交差反応性も、1つまたは複数のの対照RSVポリペプチドを用いた免疫吸着によって、イムノアッセイにおけるポリクローナル抗血清の使用の前に除去する。
【００８３】
イムノアッセイで使用するための抗血清を産生するために、1つまたは複数の免疫原性ポリペプチドを、本明細書の記載に従って生成し、そして精製する。例えば、哺乳類細胞系で組換え体のタンパク質を生成することができる。近交系のマウス(これらのマウスの遺伝子が事実上同一であることによって、結果がより再現可能であるので、このアッセイで使用される)を、フロインドアジュバントなどの標準的なアジュバントと組み合わせた免疫原性ポリペプチドと、標準的なマウス免疫プロトコールとを用いて免疫処置する(特異的な免疫反応性を測定するのに使用できる、抗体産生、免疫アッセイフォーマットおよび条件の標準的な記述に関しては、HarlowおよびLane(1988年)、「Antibodies,A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Press社、New Yorkを参照のこと)。別法では、本明細書に開示する配列に由来する1つまたは複数の合成または組換え体のポリペプチドを担体タンパク質に結合させ、免疫原として用いる。
【００８４】
ポリクローナル血清を収集し、免疫アッセイ、例えば、固形担体上に固定された1つまたは複数の免疫原性ポリペプチドを用いた固相免疫アッセイで、免疫原性ポリペプチドに対する力価を測定する。力価が106以上のポリクローナル抗血清を選択し、プールし、対照RSVポリペプチドによるサブストラクションを行って、サブストラクションされてプールされて力価決定されたポリクローナル抗血清を生成する。
【００８５】
このサブストラクションされてプールされて力価決定されたポリクローナル抗血清を、対照RSVポリペプチドに対する交差反応性がないかどうか試験する。免疫原性ポリペプチドが特異的に結合する抗体を同定するためには、少なくとも2つの免疫原性RSV9320ポリペプチドを、好ましくは少なくとも2つの対照RSVポリペプチドと共に、この測定で用いることが好ましい。
【００８６】
この比較アッセイでは、サブストラクションされて力価決定されたポリクローナル抗血清を識別するための結合条件が、この力価決定されたポリクローナル抗血清の、免疫原性RSV9320ポリペプチドに対する結合における信号対雑音比が、対照RSVポリペプチドに対する結合と比較して少なくとも約5〜10倍高くなるように決定される。すなわち、結合反応のストリンジェンシーの調整は、アルブミンまたは無脂肪ドライミルクなどの非特異的競合物質の添加によって、あるいは塩条件、温度、または同様のものを調整することによって行う。これらの結合条件は、プールされてサブストラクションされたポリクローナル抗血清が、試験ポリペプチドに特異的に結合するかどうかを判定する後続のアッセイで用いられる。詳細には、識別用の結合条件下で、対照ポリペプチドより少なくとも2〜5×高い信号対雑音比と、免疫原性ポリペプチドと比較して少なくとも約1/2の信号対雑音比とを示す試験ポリペプチドは、対照RSVポリペプチドと比較して、相当の構造的な類似性または相同性を免疫原性ポリペプチドと共有し、したがって、本発明のポリペプチドである。
【００８７】
別の例では、競合的結合フォーマットでの免疫アッセイが試験ポリペプチドの検出に用いられる。例えば、上述の通り、交差反応性の抗体は、対照RSVポリペプチドを用いた免疫吸着によって、プールされた抗血清混合物から除去される。次に、免疫原性ポリペプチドを固形担体に固定し、これを、サブストラクションされてプールされた抗血清に曝露する。試験タンパク質をこのアッセイに添加して、プールされてサブストラクションされた抗血清に対する結合を競合させる。プールされてサブストラクションされた抗血清に対する結合に関して、固定されたタンパク質と比較した、試験タンパク質が競合する能力を、結合に関して競合させるためにアッセイに添加された免疫原性ポリペプチド(この免疫原性ポリペプチドは、プールされた抗血清に対する結合に関して、固定された免疫原性ポリペプチドと効果的に競合する)の能力と比較する。試験タンパク質における交差反応性の比率を、標準的な計算を用いて計算する。
【００８８】
ある平行アッセイでは、プールされてサブストラクションされた抗血清に対する結合に関して、対照タンパク質が競合する能力を、この抗血清に対する結合に関して、免疫原性ポリペプチドが競合する能力と比較して測定する。ここでも、対照ポリペプチドにおける交差反応性の比率を、標準的な計算を用いて計算する。この試験ポリペプチドの交差反応性の比率が、少なくとも5〜10×高い場合に、この試験ポリペプチドは、プールされてサブストラクションされた抗血清に特異的に結合するものとみなされ、したがって、本発明のポリペプチドである。
【００８９】
一般に、免疫吸着されてプールされた抗血清は、いかなる試験ポリペプチドを免疫原性ポリペプチドと比較するのにも、本明細書に記載の競合的結合免疫アッセイで使用することができる。この比較を行うために、2つのポリペプチドを、それぞれ、広範囲の濃度で検査し、固定されたタンパク質に対する、サブストラクションされた抗血清の結合の50%を阻害するのに必要な各ポリペプチドの量を、標準的な技法を用いて測定する。必要な試験ポリペプチドの量が、必要な免疫原性ポリペプチドの量の2倍未満である場合には、その量が対照ポリペプチドの少なくとも約5〜10×であるという条件において、この試験ポリペプチドは、免疫原性ポリペプチドに対して産生された抗体に特異的に結合するものとみなす。
【００９０】
特異性の最終的な判定として、プールされた抗血清を免疫原性ポリペプチド(対照ポリペプチドではなく)で、任意選択で、完全に免疫吸着させる。この際、結果として得られる、免疫原性ポリペプチドでサブストラクションされてプールされた抗血清の、免疫吸着で用いられた免疫原性ポリペプチドに対する結合が、ほとんど、またはまったく検出されなくなるまで免疫吸着を行う。次に、この完全に免疫吸着された抗血清を、試験ポリペプチドに対する反応性について試験する。反応性がほとんど、またはまったく観測されない(すなわち、信号対雑音比が、完全に免疫吸着された抗血清の、免疫原性ポリペプチドに対する結合に関して観測されたものの2×以下である)場合には、この試験ポリペプチドは、免疫原性タンパク質によって産生された抗血清が特異的に結合するものである。
【００９１】
配列変異
サイレント変異
遺伝コード縮重のため、本発明のポリペプチドおよび/またはウイルスをコードする様々な核酸配列のうちいずれもが、任意選択で産生され、その中には、図中のRSV核酸配列またはポリペプチド配列に対して低レベルの配列同一性しかもたないものもある。以下に提供するのは、遺伝コードを指定する典型的なコドン表であり、生物学および生化学の多くの教科書にみられる。
【表１】
0004783726.tif 000002
【００９２】
コドン表は、多くのアミノ酸が複数のコドンによってコードされていることを示す。例えば、コドンAGA、AGG、CGA、CGC、CGG、およびCGUは、すべてが、アミノ酸のアルギニンをコードする。したがって、本発明の核酸において、あるコドンによってアルギニンが指定されているあらゆる位置で、コードされているポリペプチドを改変することなく、そのコドンを、対応する上記コドンのいずれにも改変することができる。RNA配列におけるUは、DNA配列におけるTに対応するものと理解されている。
【００９３】
一例として、アミノ酸配列FEV(配列番号12の残基164〜166)に対応する核酸配列はTTTGAAGTGである。この配列のサイレント変異には、TTCGAGGTA(これも、FEVをコードする)が含まれる。
【００９４】
このような「サイレント変異」は、以下に論じる「保存的に改変されている変異」の一種である。当業者ならば、核酸における各コドン(通常はメチオニンの唯一のコドンであるATGと、通常はトリプトファンの唯一のコドンであるTTGとを除いて)を、標準的な技法によって、機能的に同一なポリペプチドをコードするものに改変することができる。したがって、記載されているいずれの配列にも、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異が潜在的に含まれている。したがって、本発明は、可能なコドン選択に基づく組合せを選択することによって生成できるであろう、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列のありとあらゆる可能な変異を明示的に提供する。これらの組合せの生成は、標準的なトリプレット遺伝コード(例えば、表1に記載のもの、または当技術分野で一般的に利用可能なもの)に従って行われ、これは本発明のRSVポリペプチドをコードする核酸配列にも同様に適用される。本明細書におけるあらゆる核酸のそのようなすべての変異が明示的に提供されており、それらの配列を遺伝コードと併せて考慮することによって記載されている。当業者ならば、本明細書の方法を用いて、これらのサイレント置換を作製することが十分にできる。
【００９５】
保存的変異
「保存的に改変された変異」、または単に「保存的変異」は、特定の核酸配列またはポリペプチドの同一または本質的には同一なアミノ酸配列をコードするものである。当業者ならば、コードされている配列中の単一アミノ酸またはわずかな割合(典型的には5%未満、さらに典型的には4%、2%、または1%未満)のアミノ酸を、改変、付加、または欠失する個々の置換、欠失、または付加を、そのような改変によって、一アミノ酸の欠失、一アミノ酸の付加、または化学的に同様の一アミノ酸による一アミノ酸の置換がもたらされる場合に、「保存的に改変された変異」と認めるだろう。
【００９６】
機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当技術分野で周知である。表2は、相互に「保存的な置換」であるアミノ酸を含有する6つのグループを記載するものである。代替的な保存的置換表が当技術分野で利用可能であり、それらも同様に用いることができる。
【表２】
0004783726.tif 000003
【００９７】
したがって、本発明のポリペプチド配列の「保存的に置換された変異」には、それらのポリペプチド配列におけるわずかな割合、典型的には5%未満、より典型的には2%または1%未満のアミノ酸の、同じ保存的置換グループから選択された保存的アミノ酸による置換が含まれる。
【００９８】
例えば、配列番号9の、RSV B、株9320、M2-1ポリペプチドの保存的に置換された変異は、例えば、完全長ポリペプチドのうち約10残基(すなわち、約5%のアミノ酸)までに「保存的な置換」、例えば、上記に定義した6つのグループに記載のものを含有するだろう。
【００９９】
さらに別の例では、保存的な置換がRSV9320 M2-1のアミノ酸10〜12(EIR)に対応する領域に局在する場合、この領域における、保存的に置換された変異の例には、EIRの、DLKまたはDMR(あるいは、表2に従って作製できる他のいかなるものも)による保存的な置換も含まれる。
【０１００】
本明細書における一タンパク質配列の記載は、上記の置換表と併せて、すべての保存的に置換されたタンパク質の明示的な記載を提供する。
【０１０１】
最後に、非機能的配列、エピトープ標識、ポリヒスチジンタグ、GFP、または同様のものの付加または欠失など、核酸分子がコードしている活性を改変しない配列の付加または欠失も、元となる核酸またはポリペプチドの保存的な変異である。
【０１０２】
当業者ならば、開示されている核酸コンストラクトの多くの保存的な変異が、機能的に同一のコンストラクトを生ずることを理解するだろう。例えば、上記に論じたように、遺伝コード縮重のために、「サイレント置換」(すなわち、コードされているポリペプチドに改変をもたらさない核酸配列中の置換)は、アミノ酸をコードするあらゆる核酸配列の暗黙的な特色である。同様に、「保存的アミノ酸置換」では、アミノ酸配列中の1つまたはいくつかのアミノ酸が、極めて類似した特性を有する異なったアミノ酸によって置換されるが、これらも、開示されたコンストラクトに極めて類似したものとして容易に同定される。開示されているか、または特許請求の範囲に記載のウイルス、核酸またはタンパク質それぞれのそのような保存的な変異も本発明の特色である。そのような保存的(例えば、サイレント)変異は、例えばRSVの検出のため、またはRSVに対する免疫防御のための抗体を生成するのに用いることができる。
【０１０３】
ウイルス核酸の生成
本発明との関連においては、ウイルス(例えば、RSV)の核酸および/またはタンパク質の操作は、周知の分子生物学技術に従って行われる。増幅、クローニング、突然変異誘発、形質転換、および同様のものを含めた多数のそのような操作法に関する詳細なプロトコールは、例えば、Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」(2003年を通して補足されている)、John Wiley & Sons社、New York(「Ausubel」);Sambrookら、「Molecular Cloning - A Laboratory Manual」(第3版)、第1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory社、Cold Spring Harbor、New York、2001年(「Sambrook」)、ならびに、BergerおよびKimmel、「Guide to Molecular Cloning Techniques」、Methods in Enzymology、第152巻、Academic Press社、San Diego、CA(「Berger」)に記載されている。
【０１０４】
上記の参考文献に加えて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Qβレプリカーゼ増幅、および、RNAポリメラーゼに媒介された他の技法(例えば、NASBA)など、例えば、本発明のcDNAポリヌクレオチドを増幅するのに有用なin vitroの増幅技法のプロトコールは、Mullisら(1987年)、米国特許第4,683,202号;「PCR Protocols A Guide to Methods and Applications」(Innisら編集)、Academic Press社、San Diego、CA(1990年)(「Innis」);ArnheimおよびLevinson(1990年)、C&EN、第36巻;The Journal Of NIH Research(1991年)、第3巻、81頁;Kwohら(1989年)、Proc Natl Acad Sci USA、第86巻、1173頁;Guatelliら(1990年)、Proc Natl Acad.Sci USA、第87巻、1874頁;Lomellら(1989年)J Clin Chem、第35巻、1826頁;Landegrenら(1988年)、Science、第241巻、1077頁;Van Brunt(1990年)Biotechnology、第8巻、291頁;WuおよびWallace(1989年)、Gene、第4巻、560頁;Barringerら(1990年)、Gene、第89巻、117頁;ならびに、SooknananおよびMalek(1995年)、Biotechnology、第13巻、563頁に見出される。本発明との関連における核酸のクローニングに有用な他の方法には、Wallaceら、米国特許第5,426,039号が含まれる。PCRによって大きな核酸を増幅するための改良法は、Chengら(1994年)、Nature、第369巻、684頁と、その中の参考文献とに要約されている。
【０１０５】
本発明のある種のポリヌクレオチド(例えば、オリゴヌクレオチド)は、モノヌクレオチドベースおよび/またはトリヌクレオチドベースのホスホルアミダイト連結化学を含めた、様々な固相ストラテジーを利用して、合成することができる。例えば、核酸配列は、伸長しているポリヌクレオチド鎖に活性化単量体および/または三量体を逐次的に付加することによって合成することができる。例えば、Caruthers,M.H.ら(1992年)、Meth Enzymol、第211巻、3頁を参照のこと。
【０１０６】
所望の配列を合成する代わりに、本質的にはいかなる核酸も、The Midland Certified Reagent Company社(www.mcrc.com)、The Great American Gene Company社(www.genco.com)、ExpressGen社(www.expressgen.com)、QIAGEN社(http://oligos.qiagen.com)、およびその他多数などの様々な商業的供給源のうちの任意のものに特別注文して得ることができる。
【０１０７】
さらに、ウイルスポリペプチド中の選択されたアミノ酸残基の置換は、例えば、部位特異的突然変異誘発で行うことができる。例えば、望ましい表現型特性、例えば、弱毒性表現型、寒冷適応、および/または温度感受性と機能的に相関したアミノ酸置換を有するウイルスポリペプチドは、そのポリペプチドをコードするウイルス核酸セグメント(例えばcDNA)に特異的突然変異を導入することによって生成することができる。部位特異的突然変異誘発の方法は、当技術分野で周知であり、例えば、上記のAusubel、Sambrook、およびBergerに記載されている。部位特異的突然変異誘発を行うための多数のキット、例えば、ExSite(商標)およびChameleon(商標)部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene社、La Jolla)が購入可能であり、例えば、1つまたは複数のアミノ酸置換を特定する1つまたは複数のヌクレオチド置換をRSVポリヌクレオチドに導入にするために、製造業者の指示に従って用いることができる。
【０１０８】
本発明では、例えば、核酸、コードされているポリペプチド、および/またはウイルスを改変して、保存的または非保存的な変異体を生成するために、様々なタイプの突然変異誘発が任意選択で用いられる。利用可能ないかなる突然変異誘発操作法も用いることができる。そのような突然変異誘発操作法は、任意選択で、変異体の核酸およびポリペプチドを、1つまたは複数の注目している活性に関して選択することを含む。使用できる操作法には、部位特異的点突然変異誘発、ランダム点突然変異誘発、in vitroまたはin vivoの相同組換え(DNAシャッフリング)、ウラシル含有テンプレートを用いた突然変異誘発、オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾DNA突然変異誘発、ギャップを有する二重鎖DNAを用いた突然変異誘発、点ミスマッチ修復、修復欠失性の宿主株を用いた突然変異誘発、制限選択および制限精製、欠失突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、二本鎖切断修復、および、当業者に公知のその他多数が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、天然に存在する分子、または改変もしくは突然変異された天然に存在する分子に関する既知の情報、例えば、配列、配列比較、物理学的特性、結晶構造、または同様のものを、突然変異誘発のガイドとすることができる。別のクラスの実施形態では、改変が本質的にランダムである(例えば、古典的なDNAシャッフリングでそうであるように)。
【０１０９】
これらの操作法のいくつかは、SambrookおよびAusubel、そして本明細書に記載されている。これらの操作法に関する追加情報は、以下の刊行物、およびそれらに引用されている参考文献に見出される。すなわち、Arnold(1993年)、「Protein engineering for unusual environments」、Current Opinion in Biotechnology、第4巻、450〜455頁;Bassら(1988年)、「Mutant Tip repressors with new DNA-binding specificities」、Science、第242巻、240〜245頁;BotsteinおよびShortle(1985年)、「Strategies and applications of in vitro mutagenesis」、Science、第229巻、1193〜1201頁;Carterら(1985年)、「Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors」、Nucl.Acids Res.、第13巻、4431〜4443頁;Carter(1986年)、「Site-directed mutagenesis」、Biochem.J.、第237巻、1〜7頁;Carter(1987年)、「Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors」、Methods in Enzymol.、第154巻、382〜403頁;Daleら(1996年)、「Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method」、Methods Mol.Biol.、第57巻、369〜374頁;EghtedarzadehおよびHenikoff(1986年)、「Use of oligonucleotides to generate large deletions」、Nuci.Acids Res.、第14巻、5115頁;Fritzら(1988年)、「Oligonucleotide-directed construction o
f mutations:a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro」、Nucl.Acids Res.、第16巻、6987〜6999頁;Grundstromら(1985年)、「Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis」、Nucl.Acids Res.、第13巻、3305〜3316頁;Kunkel(1987年)、「The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis」、「Nucleic Acids and Molecular Biology」(Eckstein,F.およびLilley,D.M.J.編集、Springer Verlag社、Berlin);Kunkel(1985年)、「Rapid and efficient site-apecifc mutagenesis without phenotypic selection」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第82巻、488〜492頁;Kunkelら(1987年)、「Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection」、Methods in Enzymol.、第154巻、367〜382頁;Kramerら(1984年)、「The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction」、Nucl.Acids Res.、第12巻、9441〜9456頁;KramerおよびFritz(1987年)、「Oligonucleotidedirected construction of mutations via gapped duplex DNA」、Methods in Enzymol.154巻、350〜367頁;Kramerら(1984年)、「Point Mismatch Repair」、Cell、第38巻、879〜887頁;Kramerら(1988年)、「Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations」、Nuci.Acids Res.、第16巻、7207頁;Lingら(1997年)、「Approaches to DNA mutagenesis:an overview」、Anal Biochem.、第254(2)巻、157〜178頁;LorimerおよびPastan(1995年)、Nucleic Acids Res.、第23巻、3067〜8頁;Mandecki(1986年)、「Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli:a method for site-specific mutagenesis」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第83巻、7177〜7181頁;NakamayeおよびEckstein(1986年)、「Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis」、Nucl.Acids Res.、第14巻、9679〜9698頁;Nambiarら(1984年)、「Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein」、Science、第223巻、1299〜1301頁;SakamarおよびKhorana(1988年)、「Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein(transducin)」、Nucl.Acids Res.、第14巻、6361〜6372頁;Sayersら(1988年)、「Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis」、Nucl.Acids Res.、第16巻、791〜802頁;Sayersら(1988年)、「Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide」、Nucl.Acids Res.、第16巻、803〜814頁;Sieberら(2001年)、Nature Biotechnology、第19巻、456〜460頁;Smith(1985年)、「In vitro mutagenesis」、Ann.Rev.Genet.、第19巻、423〜462頁;Methods in Enzymol.、第100巻、468〜500(1983年):Methods in Enzymol.、第154巻、329〜350(1987年):Stemmer(1994年)、Nature、第370巻,389〜91頁;Taylorら(1985年)、「The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA」、Nucl.Acids Res.、第13巻、8749〜8764頁;Taylorら(1985年)、「The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA」、Nucl.Acids Res.、第13巻、8765〜8787頁;Wellsら(1986年)、「Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin」、Phil.Trans.R.Soc.Lond.A、第317巻、415〜423頁;Wellsら(1985年)、「Cassette mutagenesis:an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites」、Gene、第34巻、315〜323頁;ZollerおよびSmith(1982年)、「Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors:an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment」、Nucleic Acids Res.、第10巻、6487〜6500頁;ZollerおよびSmith(1983年)、「Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors」、Methods in Enzymol.、第100巻、468〜500頁;ならびに、ZollerおよびSmith(1987年)、「Oligonucleotide-directed mutagenesis:a simple method using two oigonucleotide primers and a single-stranded DNA template」、Methods in Enzymol.、第154巻、329〜350頁である。上記方法に関する多くの追加の説明を、Methods in Enzymology、第154巻に見出すことができるが、これには、様々な突然変異誘発方法に関するトラブルシューティング問題に有用な対照についても記載されている。
【０１１０】
ベクター、プロモーターおよび発現系
本発明は、上述した核酸配列の1つまたは複数を組み込んだ組換え体コンストラクトを含む。そのようなコンストラクトには、ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、バクテリア人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)などが含まれ、その中に、例えば、1つまたは複数の本発明のポリヌクレオチド配列、例えば、配列番号1から選択された少なくとも1つのORFを含む、例えば、配列番号1またはその部分配列が、順向または逆向の配向性で挿入されている。例えば、挿入される核酸は、本発明のポリヌクレオチド配列の少なくとも1つの全体または一部を含みうる。ベクターの選択は、通常、その特徴、例えば、選択されたポリヌクレオチド配列の大きさに基づいて、そして、意図されている使用、例えば、発現、増幅などに基づいて行われる。好ましい実施形態では、コンストラクトは、例えば、上記配列に作用可能に連結したプロモーターを含めた調節配列をさらに含む。多数の適当なベクターおよびプロモーターが、当業者に公知であり、また、購入可能である。
【０１１１】
本発明のポリヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスRNAを生成するのに、そして任意選択で、例えば配列番号2〜11から選択された、ポリペプチド(またはペプチド)発現産物を生成するのに適した様々なベクターの任意の1つに含ませることができる。そのようなベクターには、染色体、非染色体、および合成のDNA配列、例えば、SV40誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージDNAの組合せから得られたベクター、ワクチニア、アデノウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、仮性狂犬病、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、および、その他多数などのウイルスDNA、ならびに、ウイルスアンプリコンベクターが含まれる。細胞に遺伝物質を導入できるベクターであって、複製を行うことが望ましい場合に適切な宿主で複製を行うことができるベクターならいかなるものも用いることができる。
【０１１２】
発現ベクターでは、ポリヌクレオチド配列、通常は、例えば配列番号2〜11の中から選択されたポリペプチド(またはペプチド)(またはその変異体、例えばその保存的な変異)をコードするオープンリーディングフレームなどのオープンリーディングフレームを含む配列番号1の部分配列を、適切な転写調節配列(プロモーターおよび任意選択で1つまたは複数のエンハンサー)によってmRNA合成が指示されるように、その近傍に、そしてそのような方向に物理的に配置する。例えば配列番号1の部分配列、例えば、配列番号2〜11のうちの1つの部分配列から選択されたポリペプチドをコードする配列番号1の部分配列を、例えば診断または治療の目的で、抗体産生用の抗原性ペプチドを産生するために、発現ベクターに挿入することができる。すなわち、注目しているポリヌクレオチド配列は、適切な転写制御配列に作用可能に連結される。そのようなプロモーターの例には、LTRまたはSV40プロモーター、大腸菌(E.coli)lacまたはtrpプロモーター、ファージラムダPLプロモーター、および、原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子発現を制御することが知られている他のプロモーターが含まれる。発現ベクターは、通常、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写ターミネーターも含有する。上記ベクターは、任意選択で、発現を増幅するのに適した配列も含有する。さらに、発現ベクターは、任意選択で、真核細胞培養用のジヒドロ葉酸リダクターゼもしくはネオマイシン耐性など、または、大腸菌(E.coli)のテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性など、形質転換宿主細胞を選択するための表現型形質を提供する1つまたは複数の選択マーカー遺伝子を含む。
【０１１３】
本発明のポリヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされているポリペプチドの翻訳が望ましい場合、翻訳特異的な開始シグナルを追加することで、翻訳の効率を改善することができる。これらのシグナルには、例えば、ATG開始コドンと、それに隣接している配列とが含まれる場合がある。場合によっては、例えば、本発明のポリヌクレオチド配列、翻訳開始コドン、および、それに付随する配列エレメントが組み込まれている、コード配列を含有する完全長cDNA分子または染色体セグメントを、注目しているポリヌクレオチド配列と同時に、適切な発現ベクターに挿入する。そのような場合には、追加の翻訳調節シグナルは必要でない。しかし、ポリペプチドコード配列のみ、例えば、配列番号2〜11の中から選択されたアミノ酸配列またはその部分をコードする配列のみを挿入する場合、ATG開始コドンを含めた外来性の翻訳制御シグナルを、関連している配列の発現用に提供する。開始コドンは、注目しているポリヌクレオチド配列の転写が確実となるように、正しいリーディングフレームに配置する。外来性転写エレメントおよび開始コドンの出所は、様々でありえ、天然のものでも、合成のものでもありうる。発現の効率は、使用している細胞系に適したエンハンサーを含めることで促進することができる(Scharf Dら(1994年)、Results Probl Cell Differ、第20巻、125〜62;Bittnerら(1987年)、Methods in Enzymol、第153巻、516〜544頁)。
【０１１４】
ポリペプチドの産生および回収
本発明は、本発明のポリヌクレオチド(例えば配列番号1から選択された1つまたは複数のオープンリーディングフレームの全体または一部を含むポリヌクレオチド)を組み込んだベクターの、宿主細胞への導入、および、組換え技術による本発明のポリペプチド、例えば、配列番号2〜11より選択された1つまたは複数のポリペプチド、またはその部分配列(例えばそれの特有の部分配列)の産生に関する。本発明のポリヌクレオチドによってコードされている、組換え体および/または単離体のポリペプチド、例えば配列番号2〜11またはその部分配列(例えば特有の部分配列)は、例えば、動物またはヒト対象の抗体を産生する抗原として用いられる。下記の「抗体」と題した節でさらに記述するように、例えば、配列番号2〜11によって表されるポリペプチドの全体または一部に対応する抗原性ポリペプチド(またはペプチド)を、RSVの1つまたは複数の株に特異的な抗体を産生するために、実験動物に注射することができる。さらに、これらの抗原性ポリペプチドは、例えばワクチンとして、RSVの1つまたは複数の株に特異的な免疫応答を誘発するためにヒト対象に投与することができる。例えば、誘発されたそのような免疫応答は、防御免疫応答でありうる。
【０１１５】
本発明のポリペプチドを生成するために、宿主細胞は、本発明の発現ベクターなどのベクターで、遺伝的に組み換えられる(例えば、形質導入、形質転換、またはトランスフェクトされる)。上述のように、ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態でありうる。適切な発現宿主の例には、E.coli、Streptomyces、およびSalmonella typhimuriumなどの細菌細胞;Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、およびNeurospora crassaなどの真菌細胞;DrosophilaおよびSpodoptera frugiperdaなどの昆虫細胞;3T3、COS、CHO、BHK、HEK293、またはBowesメラノーマなどの哺乳類細胞;ならびに、植物細胞などが含まれる。
【０１１６】
構築された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体を選択、または挿入されたポリヌクレオチド配列の増幅のために必要に応じて改変された、従来の栄養物培地で培養することができる。温度、pH、および同様のものなどの培養条件は、通常、発現に関する選択がなされた宿主細胞で以前に用いられたものであり、当業者には明らかであろうし、また、例えば、Freshney(1994年)、「Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique」、第3版、Wiley-Liss社、New York、およびこれに引用されている参考文献を含めた、本明細書に引用されている参考文献でも明らかであろう。Sambrook、Berger、およびAusubelに加えて、細胞培養に関する詳細な説明は、Payneら(1992年)、「Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems」、John Wiley & Sons社、New York、NY;GamborgおよびPhillips(編集)(1995年)「Plant Cell,Tissue and Organ Culture:Fundamental Methods Springer Lab Manual」、Springer-Verlag社(Berlin、Heidelberg、New York);ならびに、AtlasおよびParks(編集)、「The Handbook of Microbiological Media」(1993年)、CRC Press社、Boca Raton、FLに見出すことができる。
【０１１７】
細菌システムでは、発現産物に意図されている使用に応じて、多数の発現ベクターを選択することができる。例えば、大量のポリペプチドまたはその断片が抗体産生に必要である場合、容易に精製される融合タンパク質の、高レベルでの発現を導くベクターを利用することが好ましい。そのようなベクターには、BLUESCRIPT(Stratagene社)、pINベクター(Van HeekeおよびSchuster(1989年)、J Biol Chem、第264巻、5503〜5509頁);pETベクター(Novagen社、Madison WI)、および、同様のものなど、大腸菌(E.coli)の多機能クローニングおよび発現ベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない。BLUESCRIPTでは、注目しているコード配列、例えば、上述した本発明のポリヌクレオチドを、アミノ末端翻訳を開始するメチオニン、およびそれに続くβ-ガラクトシダーゼの7残基の配列と共に、インフレームで、このベクター中に連結させて、触媒として活性のベータガラクトシダーゼ融合タンパク質を産生することができる。
【０１１８】
同様に、酵母Saccharomyces cerevisiaeでは、所望の発現産物を産生するのに、アルファ因子、アルコール酸化酵素、およびPGHなどの構成的プロモーターまたは誘導プロモーターを含有する多数のベクターを用いることができる。総説には、Berger、Ausubel、および、例えば、Grantら(1987年)、Methods in Enzymology、第153巻、516〜544頁を参照のこと。
【０１１９】
哺乳類細胞中での複製に適したベクターは当技術分野で公知である。例示的ベクターには、SV40、レトロウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、ワクシニアウイルス、他のヘルペスウイルス、およびアデノウイルスに由来するものが含まれる。そのような適当な哺乳類発現ベクターは、任意選択で、外来DNA配列の転写を媒介するプロモーターを、そして、任意選択でエンハンサーを含有する。適当なプロモーターは当技術分野で公知であり、これらには、SV40、サイトメガロウイルス(CMV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、アデノウイルス(ADV)、およびウシ乳頭腫ウイルス(BPV)に由来するものなどの、ウイルスプロモータが含まれる。
【０１２０】
上述したプロモーターと併せて、任意選択によるエンハンサーの存在は、通常、発現レベルを増強するだろう。エンハンサーは、内在性プロモーターまたは異種プロモーターに連結させた場合、転写を最大1000倍にまで刺激できる任意の調節DNA配列であって、この場合、合成は正常なmRNA開始部位で開始される。エンハンサーは、転写開始部位の上流に配置された場合でも、下流に配置された場合でも、また、通常の方向でも、反転した方向でも、また、プロモーターから1000ヌクレオチドを超える距離にあっても活性である。例えば、Maniatis(1987年)、Science、第236巻、1237頁、および、Alberts(1989年)、「Molecular Biology of the Cell」、第2版(またはそれ以降)を参照のこと。ウイルス由来のエンハンサーは、通常、宿主の範囲がより広範であるため、とりわけ有用でありうる。その例には、SV40初期遺伝子エンハンサー(Dijkema(1985年)、EMBO J、第4巻、761頁を参照)と、RSVの長末端反復(LTR)由来(Gorman(1982年)、Proc.Natl.Acad.Sci、第79巻、6777頁を参照)、および、ヒトサイトメガロウイルス由来(Boshart(1985年)、Cell、第41巻、521頁参照)のエンハンサー/プロモーターとが含まれる。さらに、一部のエンハンサーは、調節可能であり、ホルモンおよび金属イオンなどの誘導物質の存在下でのみ活性となる(Sassone-CorsiおよびBorelli(1986年)、Trends Genet.、第2巻、215頁を参照;Maniatis(1987年)、Science、第236巻、1237頁)。さらに、発現ベクターは、異種コード配列に作用可能に連結した終止配列およびポリ(A)付加配列を含むことができ、また、通常含むだろう。
【０１２１】
遺伝子の増幅を引き起こす配列も、発現ベクター、または、発現ベクターと同時翻訳される別のベクターに含まれるのが望ましい場合があり、また、選択マーカーをコードする配列も同様である。哺乳類細胞用の選択マーカーは、当技術分野で公知であり、これらには、例えば、チミジンキナーゼ、ジヒドロ葉酸リダクターゼ(メトトレキセートをDHFR増幅剤として伴う)、アミノグルコシドホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アスパラギンシンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、メタロチオネイン、および、ネオマイシンなどの抗生物質抵抗性遣伝子が含まれる。
【０１２２】
発現用の宿主として利用可能な哺乳類細胞系は、当技術分野で公知であり、これらには、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)によって利用可能な多数の不死化細胞系が含まれ、また、限定されるものではないが、ベロ、HEp-2、3T3、COS、CHO、HeLa、BHK、MDCK、293、WI38、Hep G2、MRC-5、およびその他多数を含めた初代培養細胞系および樹立細胞系が含まれる。
【０１２３】
上述したベクター(例えば発現ベクター)を含有する宿主細胞も、本発明の特色である。宿主細胞は、哺乳類細胞、酵母細胞、または植物細胞などの真核細胞でもよく、また、宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞でもよい。宿主細胞内へのコンストラクトの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチドの封入、核へのDNA直接マイクロインジェクション、または他の一般的な技法によって実施できる(例えば、Davis,L.、Dibner,M.、およびBattey,I.(1986年)、「Basic Methods in Molecular Biology」を参照)。
【０１２４】
宿主細胞株の選択は、任意選択で、それが有する挿入された配列の発現をモジュレートする能力、または、発現されたタンパク質のプロセシングを望ましい様式で行う能力によって行われる。タンパク質のそのような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。タンパク質の前駆体型を切断して、成熟型にする翻訳後プロセシングは、正しい挿入、折畳み構造、および/または機能に重要である場合がある。異なった宿主細胞は、そのような翻訳後活性のための専門の細胞機構と、特有の仕組みとを有し、導入された外来タンパク質の正しい修飾とプロセシングとを確実にするために選択することができる。
【０１２５】
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、任意選択で、コードされているタンパク質の発現と、細胞培養から回収に適した条件下で培養される。組換え体の細胞によって生成されたタンパク質または断片は、使用される配列および/またはベクターに応じて、分泌されることも、膜に結合することも、細胞内に含有されることもある。
【０１２６】
適当な宿主細胞系または細胞株に形質導入し、宿主細胞を適切な細胞密度まで成長させた後、必要に応じて、適切な方法(例えば温度シフトまたは化学的誘導)で選択されたプロモーターの誘導を行い、追加された時間、細胞を培養する。その後、分泌されたポリペプチド産物を培養液から回収する。別法として、細胞を遠心法によって採取し、物理的または化学的な方法で破砕し、その結果得られた粗抽出物をその後の精製用に保持することもできる。タンパク質発現に利用される真核細胞または微生物細胞は、凍結解凍サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用、または当業者に周知である他の方法を含めたいかなる好都合な方法で破砕してもよい。
【０１２７】
発現されたポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー(例えば、本明細書に記載のタグシステムのうち任意のものを用いる)、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含めた、当技術分野で周知の多数の方法のいずれかによって、組換え体の細胞培養物から回収および精製してもよい。成熟タンパク質の立体配位を完成するのに、必要に応じて、タンパク質の再折畳みステップを用いることもできる。最後に、最終精製ステップに高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を利用することもできる。上述した参照に加えて、様々な精製方法が当技術分野で知られており、これらには、例えば、Deutscher、「Methods in Enzymology」、第182巻、「Guide to Protein Purification」、Academic Press社、N.Y.(1990年);Sandana(1997年)、「Bioseparation of Proteins」、Academic Press社;Bollagら(1996年)、「Protein Methods」、第2版、Wiley-Liss社、NY;Walker(1996年)、「The Protein Protocols Handbook」、Humana Press社、NJ;HarrisおよびAngal(1990年)、「Protein Purification Applications:A Practical Approach」、IRL Press社、Oxford、U.K.;Scopes(1993年)、「Protein Purification:Principles and Practice」、第3版、Springer Verlag社、NY;JansonおよびRyden(1998年)、「Protein Purification:Principles,High Resolution Methods and Applications」、第2版、Wiley-VCH社、NY;および、Walker(1998年)、「Protein Protocols on CD-ROM」、Humana Press社、NJに記載のものが含まれる。
【０１２８】
別法として、本発明のポリヌクレオチドによってコードされているアミノ酸配列または部分配列を含むポリペプチドを生成するのに、無細胞転写/翻訳システムを利用することもできる。適切な多数のin vitro転写システムおよび翻訳システムが購入可能である。in vitro転写および翻訳のプロトコールに関する一般的な教導は、Tymms(1995年)、「In vitro Transcription and Translation Protocols:Methods in Molecular Biology」、第37巻、Garland Publishing社、NYに見出される。無細胞転写/翻訳システムは、ヒト対象に投与するためのタンパク質を含めたポリペプチドの生成にとりわけ有用である場合がある。
【０１２９】
さらに、ポリペプチドまたはその部分配列、例えば抗原性ペプチドを含む部分配列は、固相技法を用いた直接的ペプチド合成によって、手動で、または自動システムを用いることによって生成することもできる(例えば、Stewartら(1969年)、「Solid-Phase Peptide Synthesis」、WH Freeman社、San Francisco;Merrifield J(1963年)、J.Am.Chem.Soc.、第85巻、2149〜2154頁参照)。自動システムの例には、Applied Biosystems、431Aペプチド合成機(Perkin Elmer社、Foster City、CA)が含まれる。必要に応じて、部分配列を別々に化学的に合成し、完全長ポリペプチドを提供するために、化学的な方法を用いて結合させることもできる。
【０１３０】
修飾アミノ酸
発現される本発明のポリペプチドは、1つまたは複数の修飾アミノ酸を含有してもよい。修飾アミノ酸の存在は、例えば、(a)ポリペプチドの血清中半減期の延長、(b)ポリペプチドの免疫原性の低減、または(c)ポリペプチドの貯蔵安定性の増大に有利である場合がある。アミノ酸は、例えば、翻訳と同時にまたは翻訳後に、組換え体の生成中に修飾される(例えば、哺乳類細胞の発現中におけるN-X-S/TモチーフのN結合型グリコシル化)か、または、合成による方法(例えばPEG化を介して)で修飾される。
【０１３１】
修飾アミノ酸の非限定的な例には、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、プレニル化(例えば、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化)アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、PEG化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸、および同様のものが含まれ、さらに、例えば、脂質部分または他の有機的誘導体化試薬への結合によって修飾されたアミノ酸も含まれる。アミノ酸修飾における当業者を教導するのに適した参考文献は、諸々の文献中に豊富に存在する。プロトコールの例は、Walker(1998年)「Protein Protocols on CD-ROM」、Human Press社、Towata、NJに見出される。
【０１３２】
抗体
本発明のポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドによってコードされているアミノ酸配列または部分配列を含むポリペプチドに特異的な抗体を産生するのに用いることができる。例えば配列番号1によってコードされた抗原性ペプチド(例えば配列番号2〜11)、および関連した変異体ポリペプチドに特異的な抗体は、例えば標的ポリペプチドの活性、分布、および発現に関する、例えば診断および治療の目的に有用である。
【０１３３】
本発明のポリペプチドに特異的な抗体は、当技術分野で周知の方法によって産生することができる。そのような抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、単一鎖、Fabフラグメント、および、Fab発現ライブラリーによって生成されたフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３４】
ポリペプチドは、抗体産生のために生物学的活性を有する必要はない。しかし、上記ポリペプチドまたはオリゴペプチドは抗原性を有する。特異的な抗体を誘導するのに用いられるペプチドは、通常、少なくとも約5アミノ酸、そして、しばしば少なくとも10または20アミノ酸のアミノ酸配列を有する。配列番号1から選択された配列など、例えば本発明のポリヌクレオチドによってコードされている短いポリペプチドの連続(配列番号2〜11の中から選択されたポリペプチドなど)を、任意選択で、スカシガイヘモシアニン(KLH)などの別のタンパク質に融合することができ、融合タンパク質またはポリペプチドに対する抗体が産生される。
【０１３５】
ポリクローナルおよびモノクローナルの抗体を産生する多数の方法が、当業者に公知であり、本発明のポリペプチドまたはペプチドに特異的な抗体を産生するのに適用することができる。例えば、Coligan(1991年)、「Current Protocols in Immunology」、Wiley/Greene社、NY;ならびに、HarlowおよびLane(1989年)、「Antibodies:A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Press社、NY;Stitesら(編集)、「Basic and Clinical Immunology」(第4版)、Lange Medical Publications社、Los Altos、CA、およびこれに引用されている参考文献;Goding(1986年)、「Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(第2版)Academic Press社、New York、NY;「Fundamental Immunology」、例えば第4版(またはそれ以降)、W.E.Paul(編集)、Raven Press社、N.Y.(1998年);ならびに、KohlerおよびMilstein(1975年)、Nature、第256巻、495〜497頁を参照のこと。抗体調製に適した他の適当な技法には、ファージまたは同様のベクターにおける、組換え体抗体のライブラリーの選別が含まれる。Huseら(1989年)、Science、第246巻、1275〜1281頁;およびWardら(1989年)、Nature、第341巻、544〜546頁を参照のこと。特異的なモノクローナルおよびポリクローナルの抗体および抗血清の結合は、通常、KDが少なくとも約0.1μMであり、好ましくは少なくとも約0.01μMまたはそれより強い結合であり、そして最も典型的かつ好ましくは0.001μMまたはそれより強い結合である。
【０１３６】
ある特定の治療応用(例えば、RSV疾患を予防するか、またはその重篤度を軽減するために、RSVの1つまたは複数の株に特異的な抗体または抗血清を投与して、対象、例えばヒトに受動免疫を提供する場合)では、ヒト化された抗体が望ましい。ヒト化抗体を調製するための詳細な方法は、米国特許第5,482,856号に見出すことができる。ヒト化、ならびに他の抗体産生および操作技法に関するより詳細は、Borrebaeck(編集)(1995年)、「Antibody Engineering」、第2版、Freeman and Company社、NY(Borrebaeck);McCaffertyら(1996年)、「Antibody Engineering,A Practical Approach」、Oxford Press社内、IRL社、Oxford,England(McCafferty)、および、Paul(1995年)、「Antibody Engineering Protocols」、Humana Press社、Towata、NJ(Paul)に見出すことができる。特定の操作法に関するより詳細は、例えば、Ostbergら(1983年)、Hybridoma、第2巻、361〜367頁、Ostberg、米国特許第4,634,664号、および、Engelmanら、米国特許第4,634,666号に見出すことができる。
【０１３７】
診断アッセイ
本発明の新規核酸配列は、例えば配列番号1から選択された、化学合成または組換え体のRSV B9320ポリヌクレオチド断片を用いた、試料中のRSVを検出する診断アッセイ、RSV B9320様の配列を検出する診断アッセイ、およびRSVの臨床分離株における系統差異を検出する診断アッセイで用いることができる。例えば、少なくとも10から20ヌクレオチドを含む新規のB9320配列(配列番号1)の断片を、当技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法(例えば逆転写PCR法)を用いて核酸を増幅するためのプライマーとして、そして、臨床標本中のRSV RNAなど、標的遺伝物質を検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとして用いることができる。
【０１３８】
新規のRSV B9320ポリヌクレオチド配列は、当技術分野で公知のハイブリダイゼーション技法を使用するか、または、本明細書に論じられている方法の1つと併せて、細胞、組織、試料、および同様のものにおけるRNA配列または転写産物の存在を検出するために、その全体を用いるか、または断片として用いることができる。上記プローブは、ウイルスRNAの断片、クローニングされたDNAの単離された制限断片、cDNA、増幅産物、転写産物、およびオリゴヌクレオチドなど、DNA分子またはRNA分子のいずれであってもよく、短ければ長さ約10ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドから、1キロベースまたは数キロベースを超えるウイルスRNA断片またはcDNAまで、様々な長さのものでありうる。例えば、一部の実施形態では、本発明のプローブは、配列番号1から選択されたポリヌクレオチド配列もしくは部分配列(例えば特有の部分配列)、またはそれに相補的な配列を含む。このポリヌクレオチド配列(または部分配列)は、配列番号14〜19に含まれていない部分配列を少なくとも含む配列番号1の部分から選択されたものが好ましい。別法では、上記に指定された配列の1つの変異体であるポリヌクレオチド配列がプローブとして用いられる。最も典型的には、そのような変異体は、1つまたはいくつかのヌクレオチド変異を含むものである。例えば、オリゴヌクレオチド対(またはセット)を、その中の2つ(またはそれより多く)のポリヌクレオチド配列が、お互いの実質的に同一な変異体であり、一方のポリヌクレオチド配列またはセットが、第1のウイルス株(例えばB9320)に同一に対応し、(1つまたは複数の)他方の配列またはセットが別のウイルス株(例えば、B1、A2など)に同一に対応するように選択することができる。そのようなオリゴヌクレオチド対のプローブは、例えば診断またはモニタリングの目的で、例えば、RSVウイルスまたはウイルス核酸のアイデンティティを判定するためのアレル特異的なハイブリダイゼーション実験との関連においてとりわけ有用である。他の適用では、プローブの選択が多少多岐にわたり、すなわち、少なくとも約70%(または80%、90%、95%、98%、もしくは99%)同一なプローブが選択される。
【０１３９】
本発明のプローブは、例えば、配列番号1から選択された特有の部分配列を例とするが、当技術分野で日常的な操作法に従って、別の有用なポリヌクレオチド配列(別のRSV株に特徴的な配列など)を同定するのに用いることもできる。好ましい実施形態の1セットでは、配列番号1に同一な配列、またはこれに相当の配列同一性を有する配列を含むクローンを同定するために、発現産物、またはクローニングされたウイルス核酸のライブラリー(すなわち発現ライブラリーまたはゲノムライブラリー)をスクリーニングするのに、上述の1つまたは複数のプローブを利用する。同定されたこれらの各配列は、次に、プローブを作製するのに用いることができ、これらには、上述の変異体プローブ対またはセットも含まれる。ライブラリースクリーニングなどの物理的方法に加えて、コンピュータを補助にした生物情報学アプローチ、例えばBLASTおよび他の配列相同性アルゴリズム、ならびに同様のものも、関連しているポリヌクレオチド配列を同定するのに使用できることが理解されるよう。
【０１４０】
本発明のプローブは、細胞、組織、または他の生物試料(例えば鼻腔洗浄液または気管支洗浄液)におけるRSV核酸の存在の検出、およびアイデンティティの判定にとりわけ有用である。例えば、本発明のプローブは、対象(例えばヒト対象)またはモデル系(培養細胞試料など)などの生物試料がRSVに曝露されたかどうか、または感染しているかどうか判定するのに好都合に利用される。生物試料またはモデル系で生じた(例えば単離された)核酸に、選択されたプローブがハイブリダイズすることが検出された場合、これは、プローブのポリヌクレオチドが、それから選択されたウイルス(または関連したウイルス)に曝露されたか、または感染していることを示す。例えば、配列番号13の対応する部分配列(または、天然に存在する別のRSV株のゲノム)と比較して、配列番号1の部分配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列は、RSV B1(または別のRSV株)からRSV B9320を識別するのに用いることができる。
【０１４１】
プローブの設計は、意図されている適用によって影響されるものと理解されよう。例えば、いくつかのアレル特異的なプローブ-標的相互作用が、単一のアッセイで、例えば単一のDNAチップ上で、検出される場合、すべてのプローブが同様の融解温度を有することが望ましい。したがって、プローブの長さは、アレイ上のすべてのプローブの融解温度が極めて近接したものとなるように調整される(異なったプローブが異なったGC含量を有する場合、異なったプローブが特定のTmを実現するのに必要な長さは、異なっている場合があることが理解されよう)。プローブ設計では、融解温度が主要要件であるが、プライマー自己相補性に対する選択、および同様のものなど、他の因子も、さらにプローブ構築を調整するのに任意選択で用いられる。
【０１４２】
他の状況、例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを発現する細胞または生物の機能的な属性に関する場合には、ポリペプチド、ペプチド、または抗体であるプローブの利用が好ましい。例えば、本発明のポリヌクレオチド、例えば配列番号1によってコードされているか、または、それらにコードされている部分配列を有するポリペプチド、ポリペプチド断片、およびペプチドは、例えばファージディスプレイライブラリー、コンビナトリアルライブラリー、ポリクローナル血清、および同様のものから、抗体または他の結合タンパク質を同定して、単離するのに好都合に用いられる。
【０１４３】
配列番号1における任意の部分配列(例えば特有の部分配列)またはオープンリーディングフレームによってコードされているポリペプチド部分配列に特異的な抗体も、例えば細胞または組織からの発現産物を評価するプローブとして同様に貴重である。例えば、適切なポリペプチド配列は、配列番号2〜11によって表されるアミノ酸配列の中から選択される。抗体は、さらに、例えばRSVに感染しているか、または曝露された対象から得た試料中の、配列番号1によってコードされているアミノ酸部分配列(例えば配列番号2〜11)を含むタンパク質の発現を評価するのに適している。抗体は、以下に記述するように検出可能な試薬で直接標識することもできるし、また、特異的な抗体の重鎖定常領域(すなわちイソタイプ)に特異的な二次抗体の標識化によって間接的に検出することもできる。特異的な抗体の産生に関するより詳細は、上記の「抗体」と題した節に提供する。
【０１４４】
プローブの標識および検出
本発明の核酸およびポリペプチド(またはペプチドもしくは抗体)プローブの標識化および検出に利用可能な方法が多数ある。これらには、1)蛍光(例えば、フルオレセイン、Cy-5、ローダミン、または他の蛍光標識を使用する);2)アイソトープ法、例えば、放射性同位元素をプローブのポリヌクレオチド/オリゴヌクレオチドに組み入れるために、末端標識、ニックトランスレーション、ランダムプライミング、またはPCRを使用するもの;3)化学蛍光、例えば、アルカリ性ホスファターゼと、基質AttoPhos(Amersham社)、または蛍光生成物を生成する他の基質とを使用するもの;4)化学発光(例えば、分解生成物として光子を生成する基質と共に、ホースラディシュペルオキシダーゼおよび/またはアルカリ性ホスファターゼを使用するもの;試薬およびプロトコールを提供するキットは、Amersham社、Boehringer-Mannheim社、およびLife Technologies/Gibco BRL社などの商業的供給源から利用可能である);および、5)比色分析法(この方法でも、例えば、有色の沈殿を生成する基質と共に、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよび/またはアルカリ性ホスファターゼを使用する;キットはLife Technologies/Gibco BRL社、およびBoehringer-Mannheimから購入可能である)が含まれる。標識化および検出のための他の方法は、当業者には直ちに明らかであろう。
【０１４５】
より一般的には、プローブは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的、または他の利用可能な方法で検出可能ないかなる組成物でも標識することができる。本発明で有用な標識には、蛍光色素(例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、および同様のもの)などの分光標識、放射性標識(例えば、3H、125I、35S、14C、32P、33Pなど)、酵素(例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなど)、および、コロイド状金、または着色されたガラスビーズもしくはプラスチック(例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)ビーズなどの分光比色分析標識が含まれる。これらの標識は、当技術分野で周知の方法に従って、検出アッセイの構成要素(例えば、オリゴヌクレオチド、単離されたDNA、アンプリコン、制限断片、または同様のものなどのプローブ)に、直接的または間接的に結合することができる。上述のように、広範な標識が使用でき、標識の選択は、必要とされる感度、化合物との結合の容易さ、安定性要件、利用可能な機器、および廃棄規定に依存する。通常、プローブ-標的核酸ハイブリダイゼーションをモニタする検出器を、使用する特定の標識に適合させる。一般的な検出器には、分光光度計、光電管、フォトダイオード、顕微鏡、シンチレーションカウンター、カメラ、フィルム、および同様のもの、ならびに、これらの組合せが含まれる。適当な検出器の例は、当業者に公知の様々な商業的供給源から広範に購入可能である。通常は、特定のセットのプローブがアレイに結合している、核酸アレイを含む基質の視像を、後のコンピュータ解析用にデジタル化する。
【０１４６】
放射性同位元素標識されたヌクレオチドを核酸に取込ませるのは容易であるため、この検出は、好ましい標識化ストラテジーの1つとなっている。放射性標識を取込ませる例示的な技法には、キナーゼまたはホスファターゼ酵素を用いた末端標識、ニックトランスレーション、ポリメラーゼを用いた放射性ヌクレオチドの取込み、および、その他多数の周知のストラテジーが含まれる。
【０１４７】
蛍光標識は、取り扱いの際に必要とされる予防措置が他より少なく、かつ高処理の可視化技法が適用できるという利点を有し、望ましい。好ましい標識は、通常、次に挙げることの1つまたは複数を特徴とする。すなわち、高感度、高安定性、低バックグラウンド、低い環境感受性、および標識化の際の高特異性である。蛍光部分は一般に知られており、本発明の標識に組み入れられるものであるが、これらには、テキサスレッド、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンなどが含まれる。多数の蛍光標識が、SIGMA chemicals company社(Saint Louis、MO)、Molecular Probes社(Eugene、OR)、R&D systems社(Minneapolis、MN)、Pharmacia LKB Biotechnology社(Piscataway、NJ)、CLONTECH Laboratories社(Palo Alto、CA)、Chem Genes社,Aldrich Chemical Company社(Milwaukee、WI)、Glen Research社、GIBCO BRL Life Technologies社(Gaithersberg、MD)、Fluka Chemica-Biochenaika Analytika社(Fluka Chemie AG、Buchs、Switzerland)、およびApplied Biosystems社(Foster City、CA)、ならびに、当業者に公知の他の供給源から購入可能である。同様に、ジゴキシゲニンおよびビオチンなどの部分は、それら自体では蛍光を発しないが、標識化できる二次試薬、すなわち、抗ジゴキシゲニン抗体、アビジン(またはストレプトアビジン)との併用が容易であり、本発明のプローブとの関連においては、標識試薬として適している。
【０１４８】
標識は、当技術分野で周知の方法に従って、検出される分子(生成物、基質、酵素、または同様のもの)に直接的または間接的に結合される。上述のように、広範な標識が使用されており、標識の選択は、必要とされる感度、化合物の結合の容易さ、安定性要件、利用可能な機器、および廃棄規定に依存する。非放射性標識は、間接的な方法で結合されることが多い。通常、リガンド分子(例えばビオチン)は、共有結合によってプローブ、プライマー、アンプリコン、または同様のものなどの核酸に結合される。その後、リガンドは、本質的に検出可能であるか、または、検出可能な酵素、蛍光化合物、もしくは化学発光化合物などのシグナルシステムに共有結合によって結合している抗リガンド(例えばストレプトアビジン)分子に結合する。多数のリガンドおよび抗リガンドが使用できる。リガンドが天然の抗リガンドを有する場合、例えば、ビオチン、サイロキシン、およびコルチゾールの場合には、それを、標識された抗リガンドと組み合わせて用いることができる。別法として、いかなるハプテン化合物または抗原性化合物も、抗体と組み合わせて用いることができる。標識は、例えば、酵素、蛍光色素、または発色団と結合させることによって、シグナルを生成する化合物に直接的に結合することもできる。標識として興味深い酵素は、まず第1に加水分解酵素、とりわけ、ホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシドレダクターゼ、中でもペルオキシダーゼであろう。蛍光化合物には、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが含まれる。化学発光化合物には、ルシフェリンおよび2,3-ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールが含まれる。標識を検出する方法は当業者に周知である。すなわち、例えば、標識が放射性標識である場合、検出方法には、シンチレーションカウンター、または、オートラジオグラフィーの場合のように、写真フィルムが含まれる。標識が光学的に検出可能である場合、一般的な検出器には、顕微鏡、カメラ、光電管、フォトダイオード、およびその他多数の広範に利用可能な検出システムが含まれる。
【０１４９】
組換え体ウイルスの生成
マイナス鎖RNAウイルスは、遺伝子操作が可能であり、組換えリバースジェネティクスアプローチ(Paleseら、米国特許第5,166,057号)を用いて回収することができる。この方法は、元々、インフルエンザウイルスゲノムを操作するために適用された(Luytjesら(1989年)、Cell、第59巻、1107〜1113頁;Enamiら(1990年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第92巻、11563〜11567頁)が、広範な分節性および非分節性のマイナス鎖RNAウイルス、例えば、狂犬病ウイルス(Schnellら(1994年)、EMBO J.、第13巻、4195〜4203頁);VSV(Lawsonら(1995年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第92巻、4477〜4481頁);麻疹ウイルス(Radeckeら(1995年)、EMBO J.、第14巻、5773〜5784頁);牛疫ウイルス(BaronおよびBarrett(1997年)、J.Virol、第71巻、1265〜1271頁);ヒトパラインフルエンザウイルス(HoffmanおよびBanerjee(1997年)、J.Virol、第71巻、3272〜3277頁;Dubinら(1997年)、Virology、第235巻、323〜332頁);SV5(Heら(1997年)、Virology、第237巻、249〜260頁);イヌジステンパーウイルス(Gassenら(2000年)、J.Virol.、第74巻、10737〜44頁);センダイウイルス(Parkら(1991年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第88巻、5537〜5541頁;Katoら(1996年)、Genes to Cells、第1巻、569〜579頁)に成功裏に適用されている。
【０１５０】
近年、発明者らおよび共同研究者は、組換え体のサブグループA RSV(例えばワクチン生産に適した組換え体の減弱RSV)を生成するシステムを、「Recombinant RSV virus expression systems and vaccines」と題した、Jinらによる国際公開第02/44334号に記載した。この開示を、全体として本明細書に組み込む。サブグループA RSVのレスキュー(rescue)は、例えば、Jinら(1998年)、Virology、第251巻、206〜214頁、および、Collinsら(1995年)、Proc.Natl.Acad.Sci:USA、第92巻、11563〜11567頁にも記載されている。(例えば、Jinら(2000年)、J.Virol.、第74巻、74〜82頁;Jinら(2000年)、Virology、第273巻、210〜218頁;Chengら(2001年)、Virology、第283巻、59〜68頁;Tangら(2001年)、J.Virol.、第75巻、11328〜11335頁;「Functional mutations in respiratory syncytial virus」と題した、Jinらによる米国特許出願第60/444,287号(2003年1月31日に出願);および、「Functional mutations in respiratory syncytial virus.」と題したJinらによる、米国特許出願第10/672,302号(2003年9月26日に出願)も参照)。サブグループB RSVのレスキューについて、以下に簡潔に、そして本明細書の実施例に記述する。
【０１５１】
簡潔には、本発明の核酸を組み込んだ組換え体のRSVは、例えば、適当な細胞系(例えばベロ細胞またはHep-2細胞)で、それらの細胞にアンチゲノムcDNAでトランスフェクトすることによって生成する。通常、アンチゲノムcDNAは、T7RNAポリメラーゼプロモーターと、デルタ肝炎ウイルスリボザイムおよびT7転写ターミネーターとに挟まれている。ウイルスのN、P、およびLタンパク質を(そして任意選択でM2-1タンパク質も)発現するプラスミドも、細胞に導入し、通常、トランスフェクト細胞の中でT7RNAポリメラーゼを発現させる(例えば、T7RNAポリメラーゼを発現する改変ワクシニアウイルスAnkaraに細胞を感染させる)。組換え体RSVは、適当な細胞を、以前に単離された組換え体ウイルスに感染させることによっても生成することができる。RSVの伝播、宿主細胞の細胞構成要素からの分離、および/またはさらなる精製の技法は、当業者にとって周知である。
【０１５２】
組換え体のRSVを生成する方法も、本発明の特色である。これらの方法では、本発明の核酸を含むベクターがその中に導入される宿主細胞を、適当な培地中で、核酸の発現(例えば、RSV N、P、およびLの、そして任意選択でM2-1および/またはT7RNAポリメラーゼの共発現)を可能にする条件下で培養する。その後、この宿主細胞および/または培地から、組換え体の呼吸器合胞体ウイルスを単離する。通常、上記核酸は、RSVの全ゲノムまたはアンチゲノムを含む。別法として、上記核酸が、RSVゲノムまたはアンチゲノムの一部を含む場合もある(例えば、タンパク質をコードする1つまたは複数のオープンリーディングフレームを、別の供給源からのRSVゲノムと組み合わせて、組換え体ウイルスを形成する)。
【０１５３】
本明細書に記載の方法に従って生成された組換え体RSV(例えば組換え体の弱毒RSV)も、本発明の特色であり、本発明の1つまたは複数の核酸および/またはポリペプチドを含む組換え体のRSV(例えば組換え体の弱毒RSV)も同様である。
【０１５４】
細胞培養
通常、組換え体ウイルス(例えば組換え体のRSV)の伝播は、宿主細胞が通常その中で培養される培地組成物中で行われる。RSVの複製に適した宿主細胞には、例えばベロ細胞およびHEp-2細胞が含まれる。通常、細胞は、制御された湿度、および緩衝化された中性pH(例えばpHが7.0と7.2の間)を維持するのに適したCO2濃度の下に、血清(例えば10%ウシ胎仔血清)で補足されたダルベッコ改変イーグル培地、または無血清培地などの標準的な市販培地中で培養される。任意選択で、培地は、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなど、細菌増殖を防止する抗生物質、および/または、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸などの追加の栄養物、好ましい増殖特性を促進する追加のサプリメント、例えば、トリプシン、β-メルカプトエタノール、および同様のものを含有する。
【０１５５】
哺乳類細胞の培養を維持する操作法は、詳細に報告されており、当業者には公知である。一般的なプロトコールは、例えば、Freshney(1983年)、「Culture of Animal Cells:Manual of Basic Technique」、Alan R.Liss社、New York;Paul(1975年)、「Cell and Tissue Culture」、第5版、Livingston社、Edinburgh;Adams(1980年)、「Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists」、WorkおよびBurdon(編集)、Elsevier社、Amsterdamに提供されている。さらに、本発明に適合されたそのような操作の変法は、通常の実験によって容易に決定される。
【０１５６】
RSVの生成用の細胞は、血清含有培地でも、無血清培地でも培養することができる。場合によっては、例えば、純化ウイルスの調製には、無血清条件で宿主細胞を成長させることが望ましい。例えば、細胞を、血清含有培地で所望の密度まで成長させ、感染させて、その後、無血清培地中に維持することもできる。細胞を小規模で、例えば、25ml未満の培地で、培養試験管またはフラスコで、または大きいフラスコで撹拌しながら、回転ボトル中で、またはマイクロキャリアビーズ(例えば、Dormacell、Pfeifer & Langen社などのDEAE-デキストランマイクロキャリアビーズ;Superbead、Flow Laboratories社;Hillex、SoloHill、Ann Arborなどのスチレン共重合体トリメチルアミンビーズ)上で、フラスコ、ボトル、または反応器培養中で培養することもできる。マイクロキャリアビーズは、接着細胞が成長するための、細胞培養容積あたりの表面積が大きい小球(直径100〜200ミクロンの範囲)である。例えば、1リットルの培地は、2000万個を超えるマイクロキャリアビーズを含有することができ、8000平方センチメートルを超える成長表面を提供する。ウイルスの商業生産、例えばワクチン生産には、バイオリアクターまたは発酵槽で細胞を培養するのが望ましいことも多い。バイオリアクターは、容積が1リットル未満のものから、100リットルを超えるものまで、例えば、Cyto3バイオリアクター(Osmonics社、Minnetonka、MN);NBSバイオリアクター(New Brunswick Scientific社、Edison、NJ.);および、B.Braun Biotech International社製の実験規模および商業規模のバイオリアクター(B.Braun Biotech社、Melsungen、独国)が利用可能である。
【０１５７】
例えば、細胞の単離および培養(例えば後で核酸を単離するための、例えば組換え体の核酸を含有する細菌細胞の培養)に有用な他の参考文献には、Freshney(1994年)、「Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique」、第3版、Wiley-Liss社、New York、およびそれに引用されている参考文献;Payneら(1992年)、「Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems」、John Wiley & Sons社、New York、NY;GamborgおよびPhillips(編集)(1995年)、「Plant Cell,Tissue and Organ Culture;Fundamental Methods Springer Lab Manual」、Springer-Verlag社(Berlin Heidelberg New York)、ならびに、AtlasおよびParks(編集)、「The Handbook of Microbiological Media」、(1993年)、CRC Press社、Boca Raton、FLが含まれる。
【０１５８】
宿主細胞内へのベクターの導入
ベクター、例えば、RSVポリヌクレオチドが組み込まれているベクターは、当技術分野で周知の、真核細胞に異種核酸を導入する方法、例えば、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、および、ポリアミントランスフェクション試薬を利用したトランスフェクションによって、宿主細胞に導入する(例えばトランスフェクトする)。例えば、ベクター、例えばプラスミドは、メーカーの指示に従って、トランスフェクション試薬のLipofectACEまたはLipofectamine2000(Invitrogen社)を使用して、宿主細胞、例えばベロ細胞またはHep-2細胞にトランスフェクトすることができる。別法として、RSVゲノムセグメントが組み込まれているベクターを宿主細胞に導入するのに、エレクトロポレーションは利用することもできる。
【０１５９】
モデル系
弱毒RSV、例えば、配列番号1の全体もしくは一部、またはその変異を含む、本明細書に記載の弱毒RSVは、適切な弱毒化、遺伝的安定性、および/またはワクチン使用のための免疫原性を確認するために、in vitoおよびin vivoのモデルで試験することができる。in vitroアッセイ、例えば培養細胞における複製では、例えば、遺伝的安定性、ウイルス複製の温度感受性、および/または小プラーク表現型に関してウイルスを試験することができる。RSVは、さらに、感染の動物モデルで試験することもできる。様々な動物モデル、例えば、霊長類(例えば、チンパンジー、アフリカミドリザル)および齧歯動物(例えばコットンラット)が当技術分野で知られており、本明細書に簡潔に、そして、「Attenuated respiratory syncytial virus compositions」と題した、Murphyら(1999年7月13日)の米国特許第5,922,326号;米国特許第4,800,078号;Meignierら編集(1991年)、「Animal Models of Respiratory Syncytial Virus Infection」、Merieux Foundation Publication社;Princeら(1985年)、Virus Res.、第3巻、193〜206頁;Richardsonら(1978年)、J.Med.Virol.、第3巻、91〜100頁;Wrightら、Infect.Immun(1982年)、第37巻、397〜400頁;.および、Croweら(1993年)、Vaccine、第11巻、1395〜1404頁に記載されている。
【０１６０】
ワクチンの予防投与のための方法および組成物
本発明の一態様は、免疫学的に有効な量の本発明の組換え体RSV(例えば組換え体の弱毒生RSV)、免疫学的に有効な量の本発明のポリペプチド、および/または免疫学的に有効な量の本発明の核酸を含む免疫原性組成物(例えばワクチン)を提供する。
【０１６１】
本発明の関連した態様は、呼吸器合胞体ウイルスに対する防御免疫応答を生成するために、個体の免疫系を刺激する方法を提供する。この方法では、生理的に許容される担体中の、免疫学的に有効な量の本発明の組換え体RSV、免疫学的に有効な量の本発明のポリペプチド、および/または免疫学的に有効な量の本発明の核酸を個体に投与する。
【０１６２】
1つまたは複数のRSV株に特異的な免疫応答を刺激するために、適切な担体または賦形剤中の、本発明のRSV、ポリペプチド、および核酸を予防的に投与することができる。これらの担体または賦形剤は、通常、滅菌水、生理食塩水溶液、緩衝生理食塩水溶液、ブドウ糖水溶液、グリセリン水溶液溶液、エタノール、またはこれらの組合せなど、薬学的に許容される担体または賦形剤である。無菌、pH、等張、および安定性を保障するそのような溶液の調製は、当技術分野で確立しているプロトコールに従って実施される。通常、担体または賦形剤は、アレルギーおよび他の望ましくない効果を最小にするように、そして、例えば、皮下、筋肉内、鼻腔内、経口、局所など、特定の投与経路に適するように選択される。この結果得られる水溶液は、例えば、そのまま使用するために包装されるか、または凍結乾燥され、凍結乾燥された調製物は、投与前に無菌液と混合される。
【０１６３】
通常、本発明のRSV(またはRSV成分)は、1つまたは複数のRSV株に特異的な免疫応答を刺激するのに十分な量で投与する(例えば、免疫学的に有効な量のRSVまたはRSV成分を投与する)。RSVの投与は、防御免疫応答を誘発することが好ましい。防御的な抗ウイルス免疫応答を誘発し、かつRSVに対する防御免疫応答を生成するのに適用できる用量および方法は、当業者に公知である。例えば、米国特許第5,922,326号;Wrightら(1982年)、Infect.Immun.、第37巻、397〜400頁;Kimら(1973年)、Pediatrics、第52巻、56〜63頁;および、Wrightら(1976年)、J.Pediatr、第88 巻、931〜936頁を参照のこと。ウイルスは、例えば、投与される1用量あたり約103〜106pfu(プラーク形成単位)の範囲(例えば投与される1用量あたりの104〜105pfu)で提供することができる。通常、用量は、例えば、年齢、健康状態、体重、性別、食物、投与の様式および時間、ならびに他の臨床因子に基づいて調整する。予防ワクチン製剤は、例えば、注射針および注射器、または無針注射器具を用いた皮下または筋肉内注射によって、全身投与することができる。ワクチン製剤は、例えば、上気道への液滴、エアゾール(例えば、大粒子エアゾール(約10ミクロン超))、またはスプレーによって、鼻腔内投与することが好ましい。上記の送達経路はいずれも防御的な全身性免疫応答をもたらすが、鼻腔内投与は、ウイルスの進入部位における粘膜免疫を誘発するという別の恩恵も付与する。鼻腔内投与では、弱毒生ウイルスワクチン、例えば、弱毒、寒冷適応、および/または温度感受性の組換え体RSV、例えば組換え体キメラRSVが好ましい場合が多い。Walshら(1987年)、J.Infect.Dis.、第155巻、1198〜1204頁、および、Murphyら(1990年)、Vaccine、第8巻、497〜502頁で示唆されたように、弱毒生ウイルスワクチンに対する代替または追加として、不活化ウイルスワクチン、核酸ワクチン、および/またはポリペプチドサブユニットワクチンを、例えば、用いることもできる。
【０１６４】
通常、ワクチンに使用される本発明の組換え体弱毒RSVは、弱毒RSVで免疫処置(または別の方法で感染)された個体の大部分で、感染の症候、または少なくとも重症感染の症候が起こらないように十分に弱毒化されている。ウイルス成分(例えば本発明の核酸またはポリペプチド)をワクチン成分または免疫原性成分として使用する実施形態では、通常、重症感染が問題になることはない。場合によっては、弱毒RSV(または本発明のRSV成分)は、軽症疾患(例えば軽度の上部呼吸器系疾患)の症候を生成する能力、および/または、ワクチン接種されていない個体に伝搬する能力を、依然として保持していることもある。しかし、病原力は十分に抑制されており、そのため、ワクチン接種された宿主または偶発的な宿主では、通常、重度の下気道感染を発症することはない。
【０１６５】
単回投与によって防御免疫応答を刺激することが好ましいが、同一経路または異なった経路で追加の用量を投与して、望ましい予防効果を実現することもできる。例えば、新生児および乳児では、十分なレベルの免疫を誘発するのに、複数の投与が必要となる場合もある。野生型RSV感染に対する十分なレベルの防御を維持するために、間隔を置きながら幼児期全体にわたって投与を継続する必要がある場合もある。同様に、反復的または重度のRSV感染に特に罹りやすい成体、例えば、医療従事者、デイケア労働者、幼い子供の家族構成員、高齢者、および心肺機能に障害を有する個体は、防御免疫応答を確立および/または維持するために複数回の免疫処置を必要とする場合がある。誘発された免疫のレベルは、例えば、分泌性および血清中の中和抗体の量を測定することによって、モニタすることができ、望ましいレベルの防御を誘発し、維持するための必要性に従って、用量の調整、またはワクチンの反復接種を行う。
【０１６６】
別法として、樹状細胞をex vivoまたはin vivoでのウイルスの標的とすることによって、免疫応答を刺激することもできる。例えば、増殖中の樹状細胞を十分な量のウイルスに、十分な時間曝露し、樹状細胞によるRSV抗原の捕捉を可能にする。その後、標準的な静脈内移植法によって、ワクチン接種されるべき対象の体内に、これらの細胞を移行させる。
【０１６７】
任意選択で、RSVの予防投与用製剤は、RSV抗原に対する免疫応答を促進する1つまたは複数のアジュバントも含有する。適当なアジュバントには、例えば、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素エマルジョン、カルメット-ゲラン杆菌(BCG)、Corynebacterium parvum、および合成アジュバントQS-21が含まれる。
【０１６８】
必要に応じて、RSVの予防ワクチン投与を、1つまたは複数の免疫刺激分子の投与と併せて行うこともできる。免疫刺激分子には、インターロイキン(例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)など、免疫刺激、免疫強化、および炎症誘発性の活性を有する様々なサイトカイン、リンフォカイン、およびケモカイン;成長因子(例えば顆粒球マクロファージ(GM)-コロニー刺激因子(CSF));および、マクロファージ炎症因子、Flt3リガンド、B7.1、B7.2などの他の免疫刺激分子などが含まれる。免疫刺激分子類をRSVと同じように製剤で投与することができるか、または別々に投与することができる。免疫刺激効果を生成するためにタンパク質又はタンパク質をコードする発現ベクターを投与することができる。
【０１６９】
特定のサブグループにおける特定の株の弱毒RSVによる、個体のワクチン接種によって、異なった株および/またはサブグループのRSVに対する交差防御を誘導することができるが、交差防御は、必要に応じて、少なくとも2つの株、例えばそれぞれが異なったサブグループを代表する株に由来する弱毒RSVを個体にワクチン接種することによって、促進することができる。同様に、本発明の弱毒RSVワクチンは、任意選択で、他の感染性因子に対する防御免疫応答を誘導するワクチンと併用することもできる。
【０１７０】
キットおよび試薬
本発明は、任意選択で、キットとして使用者に提供される。例えば、本発明のキットは、本明細書に記載した1つまたは複数の核酸、ポリペプチド、抗体、または細胞系を含有する。ほとんどの場合、このキットは、診断用の核酸もしくはポリペプチド(例えば抗体またはプローブ、例えば適当な容器に包装されたcDNAマイクロアレイとして)、または1つもしくは複数の発現ベクターなどの他の核酸を含有する。このキットは、通常、例えば、基質、標識、プライマー、試験管および/または他の付属物、試料採集用の試薬、緩衝液、ハイブリダイゼーションチャンバー、カバーガラスなど、1つまたは複数の追加の試薬をさらに含む。このキットは、任意選択で、キット構成物の使用に適した方法を詳しく記述する指示セットまたは利用者マニュアルをさらに含む。
【０１７１】
デジタルシステム
本発明は、デジタルシステム、例えば、コンピュータと、コンピュータで読み込み可能な媒体と、本明細書のポリペプチドおよび核酸に関する、例えば本明細書に記載の配列ならびに様々なそれらのサイレント置換および保存的な置換を含めた、本明細書の配列情報に対応する文字列とを含む統合システムを提供する。統合システムは、例えば、上記文字列に対応する遺伝子を生成するための遺伝子合成設備および/またはポリペプチドを生成するためのペプチド合成設備をさらに含むことができる。
【０１７２】
当技術分野で公知の様々な方法を、異なった文字列相互の相同性または類似性を検出するのに用いることができ、または、出力ファイルを制御したり、配列および同様のものを含めた情報の提示を行う基礎を提供したり、他の望ましい機能を実施するのにも用いることができる。それらの例には、上記に論じたBLASTが含まれる。本発明のコンピュータシステムは、例えば、本明細書に記載の配列を含む1つまたは複数のデータファイルまたはデータベースに連動したそのようなプログラムを含むことができる。
【０１７３】
したがって、様々なストリンジェンシーおよび長さにおける、異なったタイプの相同性および類似性を、本明細書の統合システムで検出および認識することができる。例えば、多くの相同性判定法は、バイオポリマーの配列比較分析用に、文書処理におけるスペルチェック用に、そして、様々なデータベースからのデータ検索用に設計されている。天然のポリヌクレオチドにある4つの主要な核酸塩基相互における二重らせんのペアワイズ相補性相互作用に関する理解を用い、相補的な相同ポリヌクレオチド鎖のアニーリングをシミュレートするモデルを、典型的には、本明細書の配列に対応する文字列で行われる配列アラインメントまたは他の操作(例えば、文書処理操作、配列または部分配列の文字列、出力表を含む図の構築など)の基礎として用いることもできる。
【０１７４】
したがって、本発明の1つまたは複数のポリヌクレオチドおよびポリペプチド(核酸またはタンパク質のいずれか、あるいはこれら両方)に対応する文字列を入力することによって、ワープロ処理ソフトウェア(例えば、Microsoft Word(商標)、またはCorel WordPerfect(商標))、およびデータベースソフトウェア(例えば、Microsoft Excel(商標)もしくはCorel Quattro Pro(商標)などのスプレッドシートソフトウェア、またはMicrosoft Access(商標)もしくはParadox(商標)などのデータベースプログラム)などの標準的なデスクトップアプリケーションを、本発明に適合させることもできる。例えば、本発明のシステムは、本発明の配列に対応する文字列を操作するために、例えば、ユーザインターフェース(例えば、Windows（登録商標）、Macintosh、またはLINUXシステムなどの標準的なオペレーティングシステムにおけるGUI)と連動して用いられる、適切な文字列情報を有する上記のソフトウェアを含むこともできる。上述の通り、核酸またはタンパク質(または対応する文字列)のアライメント用に、BLASTなどの専門化されているアライメントプログラムを、本発明のシステムに組み入れることもできる。
【０１７５】
本発明におけるシステムは、通常、本発明の任意の配列を含むソフトウェアシステムに、データセットが入力されるデジタルコンピュータを含む。このコンピュータは、例えば、PC(Intel x86またはPentium（登録商標）チップ互換のDOS(商標)、OS2(商標)、WINDOWS（登録商標）、WINDOWS NT(商標)、WINDOWS95（商標）、WINDOWS98（商標）、LINUXベース機、MACINTOSH(商標)、Power PC、UNIX（登録商標）ベース(例えばSUN(商標)ワークステーション)機)でも、当業者に公知の他の市販コンピュータでもよい。配列のアラインメントまたは他の操作を行うソフトウェアは利用可能であり、また、当業者ならば、Visualbasic、Fortran、Basic、Java（登録商標）、または同様のものなどの標準的なプログラミング言語を用いて容易に構築することができる。
【０１７６】
制御装置またはコンピュータは、いかなるものでも、任意選択で、モニタを含み、これは、ブラウン管(「CRT」)ディスプレイ、フラットパネルディスプレイ(例えば、アクティブマトリクス液晶ディスプレイ、液晶ディスプレイ)、または他のものであることが多い。コンピュータ回路は、マイクロプロセッサ、メモリ、インターフェース回路、および他のものなど、多数の集積回路チップスを含む箱の中に配置されることが多い。この箱は、任意選択で、ハードディスクドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、リライタブルCD-ROMなどの高容量リムーバブルドライブ、および他の一般的な周辺エレメントも含む。キーボードまたはマウスなどの入力装置は、任意選択で、使用者による入力と、関連しているコンピュータシステムで比較されるか、または他の方法で操作されるべき配列の、使用者による選択とを提供する。
【０１７７】
上記コンピュータは、通常、例えばGUIにおける、セットパラメータフィールドへの使用者による入力の形態、または、例えば様々な異なった特定の操作をプリプログラムした、プリプログラムされた指示の形態で使用者の指示を受けるのに適したソフトウェアを含む。その後、ソフトウェアは、これらの指示を、例えば設備の操作、例えば遺伝子および/またはペプチド合成設備が所望の操作を実行するように指示する適当な言語に変換する。
【０１７８】
このソフトウェアは、(例えば、本明細書の配列、または配列アライメントに基づいて)核酸合成または他の操作を制御する出力エレメントを含むことができる。
【０１７９】
追加の態様では、本発明は、本明細書の方法、組成物、システム、および装置を具体化するシステムキットを提供する。本発明のシステムキットは、任意選択で、(1)本明細書に記載した装置、システム、システム構成要素、または装置構成要素;(2)本明細書に記載した方法を実施するため、および/または本明細書の装置または装置構成要素を操作するため、および/または本明細書の組成物を使用するための指示のうちの1つまたは複数を含む。さらに別の態様では、本発明は、本明細書の任意の装置、装置構成要素、組成物、またはキットの使用、本明細書の任意の方法またはアッセイの実施、および/または、本明細書の任意の方法またはアッセイを実施する任意の装置またはキットの使用を提供する。
【実施例】
【０１８０】
以下は、RSV B9320 cDNAの構築と、このcDNAからの組換え体RSVの回収とを示す一連の実験を説明する。ここに記述する実施例および実施形態は、例示的目的のみのものであり、その観点における様々な修正または改変を当業者に示唆するであろうが、それらもこの出願の趣旨および範囲と、添付された特許請求の範囲の範囲とに包含されるものと理解される。したがって、以下の実施例は、特許請求の発明を限定するものではなく、それを例示するために提供されている。
【０１８１】
材料および方法
細胞およびウイルス
HEp-2およびベロ細胞(アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection ATCC)から入手した)の単層培養は、5%のウシ胎仔血清を含有する最小必須培地(MEM)で維持した。RSV A2は、ATCCから入手し、Opti-MEM中のベロ細胞で増殖させた。RSVサブグループB株9320も、ATCCから入手して、Opti-MEM中のベロ細胞で増殖させた。RSVサブグループB株9320は、元来、1977年にマサチューセッツで単離されたものである(HierholzerおよびHirsch(1979年)、J.Infect.Dis.、第140巻、826〜828頁)。感染細胞は無血清のOpti-MEM培地で維持した。バクテリオファージT7RNAポリメラーゼを発現する改変ワクシニアウイルスAnkara(MVA-T7;Sutterら(1995年)、FEBS Lett.、第371巻、9〜12頁、および、Wyattら(1995年)、Virology、第210巻、202〜205頁)は、Bernard Moss博士によって提供されたものであり、CEK細胞中で増幅した。T7 RNAポリメラーゼを発現する組換え体鶏痘ウイルス(FPV-T7;Brittonら(1996年)、「Expression of bacteriophage T7 RNA polymerase in avian and mammalian cells by a recombinant fowlpox virus」、J Gen Virol、第77巻、963〜7頁)は、Michael Skinner博士から入手して、CEK細胞中で増殖させた。
【０１８２】
配列決定
RSV B9320をベロ細胞中で増殖させ、感染細胞の培養上清より超遠心分離によって精製されたウイルスから、ウイルスRNAを抽出した。9320のゲノム配列は、RT-PCRによって産生されたDNA断片の配列決定によって取得し、完全長のcDNAクローンも、比較のために配列決定した。すべての配列決定は、Sequetech社、Mountain View CA(www.sequetech.com)が行った。
【０１８３】
配列分析
配列分析は、Vector NTIバージョン6.0および8.0のContigExpressおよびAlignX(Informax社、www.informaxinc.com)を用いて行った。核酸またはポリペプチド配列のペアワイズアラインメントを、Vector NTIのAlignXで、供給業者によって設定されたデフォルトパラメータを用いて行った。
【０１８４】
RSVサブグループB株9320の完全長cDNAの構築、およびcDNAからの感染性呼吸器合胞体ウイルスの回収
RSV9320タンパク質発現プラスミドの構築
9320のN、P、およびLタンパク質コード領域を、それぞれT7 RNA ポリメラーゼプロモーターで制御されているpCITEベクター(Novagen社、Madison、WI)にクローニングして、発現プラスミドpB-N、pB-P、およびpB-Lを生成した。
【０１８５】
pB-N:超遠心分離によって精製されたウイルス粒子から抽出された9320 RNAから、プライマーXC19(5'-GATCCCATGGCTCTTAGCAAAGTCAAG-3'、Nco I部位を含有、配列番号20)およびXC020(5'-GTACGGATCCGTTGACTTATTTGCCCCGTAT-3'、Bam HI部位を含有、配列番号21)を用いてN遺伝子をRT-PCRによって増幅し、pCITE2a/3a(Novagen社)のNco I部位とBam HI部位との間に、T7プロモーター制御下となるようにクローニングした。このNタンパク質発現プラスミドを、AD740と名付けた。
【０１８６】
pB-P:プライマーXC17(5'-GATCCCATGGAGAAGTTTGCACCTG-3'、Nco I部位含有、配列番号22)およびXC018(5'-GTACGGATCCTGAGTGAGTTGATCACTG-3'、BamHI部位含有、配列番号23)を用いて、P遺伝子をRT-PCRによって増幅し、pCITE2a/3aのNco I部位とBam HI部位との間にクローニングした。このクローンはAD741と名付けた。
【０１８７】
pB-L:L遺伝子は、RT-PCRによって取得した3つのcDNAサブクローンからクローニングし、このクローンをAD778と名付けた。
【０１８８】
1サブクローンを得るために、プライマーXC003(5'-GCTTGGCCATAACGATTCTATATCATCC-3'、配列番号24)およびXC014(5-GGTAGTATAATGTTGTGCACTTTTAG-3'、配列番号25)を用いて、9320 Lのnt8511からnt11685までを増幅し、そして、このcDNAをT/Aベクター(Invitrogen社、pCR2.1)にクローニングして、サブクローンAD762を作製した。
【０１８９】
第2のサブクローンを得るために、プライマーXC011(5'-GGTCACGATTTACAAGATAAGCTCC-3'、配列番号26)およびXC007(5'-CAGATCCTTTTAACTTGCTACCTAGGCACA-3'、配列番号27)を用いて、nt11686からnt14495を増幅し、そして、Bam HIからAvr IIの断片をT/Aベクターにクローニングして、AD763とした。
【０１９０】
第3のサブクローンを得るために、プライマーXC009(5'-CTTACGTGTGCCTAGGTAGCAAG-3'、配列番号28)およびXC010(5'-ACGAGAAAAAAAGTGTCAAAAACTAATGTCTCG、配列番号29)を用いて、9320のnt14495〜15225を増幅して、第1のPCR産物を産生した。リボザイム切断配列(RBZ)およびT7ターミネーター配列(T7φ)を追加するために、XC015(5'-GTTTTTGACACTTTTTTTCTCGTGGCCGGCATGGTCCCAGCC-3'、配列番号30)およびXC016(5'-GATCTAGAGCTCCAAGCTTGCGGCCGCGTCGAC-3'、Kpn I部位含有、配列番号31)をプライマーとして、pRSV-A2の完全長アンチゲノムcDNA(Jinら(1998年)、Virology、第251巻、206〜214頁)をテンプレートとして用いて第2のPCR産物を得た。プライマーXC010およびXC015は、重複配列を含有しているので、これら2つのPCR産物は、XC009およびXC016をプライマーとして用いて、PCRによってアニーリング、伸長、および増幅させた。これらのcDNAは、T/Aベクターにクローニングして、AD764と名付けた。
【０１９１】
これら3つのサブクローンは、配列分析で確認を行った。3つのLサブクローンを一緒に連結するために、AD764からAvr IIおよびKpn Iの断片を取り出し、AD763にクローニングして、大きい方のクローンをAD767と名付けた。nt11685からT7ターミネーターの下流の配列までの、Bam HIからNot I制限断片をAD767から取り出し、T7プロモーターの制御下となるようにpCITE2a/3aベクターにクローニングし、このプラスミドをAD766と名付けた。nt8511からnt11685までのBam HI断片をクローンAD762から取り出して、AD766のBam HI部位に挿入した。次に、nt11685の位置にある第2のBam HI部位を部位特異的突然変異誘発によってノックアウトし、このクローンをpB-L(AD778)と名付けた。
【０１９２】
pB-N、pB-P、およびpB-L発現プラスミドの機能の検査は、RSVミニゲノムアッセイ(例えば、Tangら(2002年)、Virology、第302巻、207〜216頁に記載されている)によって行った。pB-N、pB-P、pB-L、およびpRSVCATミニゲノムでトランスフェクトされた細胞では、A2発現プラスミドのものと同様のCATレポータ遺伝子のレベルが検出されており、このことは、これら3つのプラスミドすべてが機能的であることを示している。
【０１９３】
RSV9320株の完全長アンチゲノムcDNAの組み立て
RSV9320の全ゲノムにまたがるアンチゲノムcDNAは、示されている特有の制限部位(図1)を用いて、RSV cDNA断片の逐次的連結によって組み立てた。簡潔には、6つのcDNA断片(B1〜B6)を、9320ウイルスRNAからpfuポリメラーゼ(Stratagene社、La Jolla、CA)を用いたRT-PCRによって生成し、RSV9320における単一制限酵素部位(Xma I、Avr II、Sac I、BamH I、およびBssH II)を含有する改変pETベクターにクローニングした。5'アンチゲノムセンスDNAの近傍にあるT7 RNAポリメラーゼプロモーターを含有するXma I-Avr II cDNA断片(B1)を、Avr II-Sac I cDNA断片(B2)に連結して、B7断片を形成した(下記の通り、Sac I部位を介して)。B7断片は、G、F、およびM2配列(B3)を含有する完全長RSV A2-B9320キメラの中の対応する領域を置換するのに用いた。この結果得られたpUC-B8のnt2310にあるSac I制限部位を、SH遺伝子のコード配列に影響を与えずに突然変異させた。L遺伝子フラグメント(B10)は、B4断片およびB9断片から組み立てた。デルタ肝炎ウイルスリボザイム(RBZ)およびT7RNA ポリメラーゼターミネータ配列は、RSV A2アンチゲノムcDNAから増幅し(Jinら(1998年)、「Recombinant human respiratory syncytial virus(RSV)from cDNA and construction of subgroup A and B chimeric RSV」、Virology、第251巻、206〜214頁)、PCRを介してトレーラー配列に連結させた(B6)。B5断片およびB6断片の連結は、Avr IIおよびNot I制限部位によって媒介された。nt11685の位置にあるBamH I部位を、タンパク質コード配列に影響を与えずに、突然変異誘発によって、B10 cDNAから除去した。L遺伝子(B10)は、9320 B8断片およびA2 Lを含有するキメラクローンにクローニングして、BamH IおよびNot I制限部位を介してA2-L配列を置換した。完全なRSV9320ゲノムをコードするアンチゲノムcDNAクローン(B11)を、pB9320C4と名付けた。さらに、リーダー配列の第4の位置に単一のCからGへの変化を含有するアンチゲノムcDNAクローンも突然変異誘発で取得し、pB9320G4と名付けた。以下に、cDNA構築をより詳細に記述する。
【０１９４】
完全長cDNAのクローニングに用いた様々なプライマーおよびサブクローンの位置を図1〜3に図示する。3'ゲノムは、RT-PCRによって、PFUポリメラーゼを使用し、プライマーV1964(5'-GGGTACCCCCGGGTAATACGACTCACTATAGGGACGGGAAAAAATG-3'、Xma I制限酵素、T7プロモーター、リーダー配列を含有、配列番号32)およびXC051(5'-GTTAACTTAGAGCTCTACATCATC-3'、9320ゲノムのnt2310の位置に存在するSac I制限部位を含有、配列番号33)を用いて増幅した。PCR断片は、改変されたpETベクター(pET21bをBspEIで切断し、pET21bをXmaI、SmaI、SacI、MscI、BamHI、SpeI、PmlI、およびBssHI制限部位を有するポリリンカーに連結して、改変pET-21bベクターを生成した)のXma IとSac I部位との間にクローニングし、AD803と名付けた。nt2106から4494までを含有した第2のPCR DNAは、RT-PCRによって、XC034(5'-GTGTGGTCCTAGGCAATGCAGCAG-3'、配列番号34)およびXC032(5'-GACACAGCATGATGGTAGAGCTCTATGTG-3'、配列番号35)をプライマーとして用いて取得し、配列分析用にpETベクターのSac I部位にクローニングした。このSacI断片は、その後、AD803のSac I部位を介して、AD803の中に移動させた(B7の生成)。NS1、NS2、N、P、M、およびSH遺伝子をコードしているcDNAを9320 cDNAの残部と連結するために、位置nt2310のSac I部位を突然変異誘発によって除去し、この結果得られたクローンをAD816と名付けた。AD816におけるXmaIからSacIまでの断片を切り離して、A2 G、およびF遺伝子の場所に9320のGおよびF遺伝子を有していたキメラcDNA AD379における、A2配列に対応する領域を置換した(pUC19バックボーン中、Chengら(2001年)、Virology、第283巻、59〜68頁)。このクローンをAD827と名付けた。
【０１９５】
9320株のG、F、およびM2遺伝子を含有するcDNAは、RT-PCRによって、XC063(5'-GCTAAGTGAACATAAAACATTCTGTAAC-3'、配列番号36)をRTプライマーとして、XC006(5'-CCATTAATAATGGGATCCATTTTGTC-3'、SacI部位、配列番号37)およびXC062(5'-CACATAGAGCTCTACCATCATGCTGTGTC-3'、BamH I部位を有する、配列番号38)をPCRプライマーとして用いて取得し、まず、配列分析用に、pETベクターにクローニングして、AD835とした。その後、AD835におけるSacIからBamH Iまでの断片を、AD827に移動させて、このクローンをAD848と名付けた。
【０１９６】
pB-L(nt10376およびnt14951の位置における2つのSac I部位がノックアウトされている9320 LをコードしているAD869)からのBamHIおよびNotIの断片を、交換によってAD848に挿入して、RSV9320の完全長アンチゲノムcDNAの組み立てを完了した。
【０１９７】
クローニングの過程中にPCRによって導入された3つの突然変異は、以下の通りに、それらのそれぞれのサブクローンで部位特異的突然変異誘発によって修正した。Lにおけるアミノ酸位置209のHisをAsnに変化させて戻すために、プライマーXCO81(5'-CATGGTTAATACACTGGTTCAATTTATATACA-3'、配列番号41)およびXC082(5'-TGTATATAAATTGAACCAGTGTATTAACCATG-3'、配列番号42)で、Hisを修正する部位特異的突然変異誘発を行った。Nにおけるアミノ酸位置194(nt1748)の、ArgからLysへの変化を修正するために、プライマーXC086(5'-GTCTTAAAAAACGAAATAAAACGCTACAAGGGCCTCATACC-3'、配列番号43)およびXC087(5'-GGTATGAGGCCCTTGTAGCGTTTTATTTCGTTTTTTAAGAC-3'、配列番号44)で、部位特異的突然変異誘発を行った。NS1におけるアミノ酸位置108の、SerからAsnへの変化は修正しなかった。
【０１９８】
組換え体の9320 cDNAは、以下のような、野生型9320年ウイルスとは異なる遺伝子タグを有する(在中の配列(配列番号1)は、野生型RSV9320株であり、組換え体のDNA配列を反映しない)。第1に、nt2310、10376、および14951のSac I部位が、以下のプライマーを用いて、タンパク質コード配列を変えずに除去された。すなわち、2310 ntのSacIに、XC049(5'-GATGATGTAGAGCTTTAAGTTAAC-3'、配列番号45)およびXCO50(5'-GTTAACTTAAAGCTCTACATCATC-3'、配列番号46);10376 ntのSacIに、XC088(5'-CTAACTGGTAAAGAAAGAGAGCTTAGTGTAGGTAGAATGTTTGC-3'、配列番号47)およびXC089(5'-GCAAACATTCTACCTACACTAAGCTCTCTTTCTTTACCAGTTAG-3'、配列番号48);そして、14951 ntのSacIに、XC090(5'-GTTTAACAACCAATGAGCTTAAAAAGCTGATTAAAATTAC-3'、配列番号49)およびXCO91(5'-GTAATTTTAATCAGCTTTTTAAGCTCATTGGTTGTTAAAC-3'、配列番号50)である。AD869を生成するための、AD864のLの遺伝子における位置nt 10376および14951の2箇所のSac I部位の除去は、Lのアミノ酸配列を改変しなかった。第2に、nt 11685のBamH I部位が、プライマーXC067(5'-CATTAATGAGGGACCCACAGGCTTTAG-3'、配列番号39)およびXC068(5'-CTAAAGCCTGTGGGTCCCTCATTAATG-3'、配列番号40)を用いて除去された。第3に、nt 4477のSac I部位が、XC032(5'-GACACAGCATGATGGTAGAGCTCTATGTG、配列番号35)を用いて付加された。
【０１９９】
RSV A2のリーダー領域における第4のヌクレオチド位置で、CをGに変えるとプロモーター強度が増強され、その結果、RSVミニゲノムの転写/複製の増大(Collinsら(1993年)、「Rescue of a 7502-nucleotide(49.3% of full-length)synthetic analog of respiratory syncytial virus genomic RNA」、Virology、第195巻、252〜256頁)と、より高いウイルス回収効率(Jinら(1998年)、Virology、第251巻、206〜214頁)とがもたらされたという報告が以前にされた。したがって、上述の通り、アンチゲノムセンスのリーダー配列における、C4からGへの変化を有する9320 cDNAを、プロモーター強度を増強するために作製し、この結果得られたクローンをAD897(pB9320G4)と名付けた。
【０２００】
G遺伝子欠失突然変異体の構築
例えば、組織培養および/または動物宿主におけるウイルスの複製に、RSV B9320株のG遺伝子が不必要であるかどうか判定するために、2つの突然変異体を構築した。1つの突然変異体では、G遺伝子の全オープンリーディングフレームが、9320 cDNAから除去された。もう1つの突然変異体では、Gにおけるシステインヌース(cysteine noose)およびヘパリン結合部位をコードする領域が、9320 cDNAから除去された。
【０２０１】
RSV A2株では、Gタンパク質がin vitroでのウイルス複製に必要でないことが示されている(Techaarpornkulら(2001年)、「Functional analysis of recombinant respiratory syncytial virus deletion mutants lacking the small hydrophobic and/or attachment glycoprotein gene」、J Viral、第75巻、6825〜34頁、および、Tengら(2001年)、「Contribution of the respiratory syncytial virus G glycoprotein and its secreted and membrane-bound forms to virus replication in vitro and in vivo」、Virology、第289巻、283〜96頁)。しかし、rA2ΔG(Gを欠失しているRSV A2)は、HEp-2細胞中で複製が貧弱であり、マウスの気道では、複製が減衰していた。寒冷適応したRSV B1株、cp-52で、SHおよびG遺伝子の両方が欠失されていることも以前に示された(Karronら(1997年)、Proc Natl Acad Sci USA、第94巻、13961〜13966頁)。しかし、この欠失突然変異体は、貧弱にしか複製せず、動物およびヒトで過剰に弱毒化されていた(over-attenuated)。Gタンパク質がin vitroでの9320の複製にも不必要であるかどうかを判定するために、遺伝子開始配列および遺伝子末端配列を含有するG遺伝子全体(957nt)がcDNAから欠失されており、新規のSH-F遺伝子間領域が75ntを含有するアンチゲノムcDNAを構築した。
【０２０２】
G遺伝子を欠失した9320アンチゲノムcDNAを構築するために、9320のG、F、およびM2遺伝子配列を含有するpET-S/B cDNAサブクローンで、Gのオープンリーディングフレームを対向した方向で挟み込む1対のPCRプライマー(5'-GATCCCATACTAATAATTCATCATTATG-3'、配列番号51、および、5'-AGCAGAGAACCGTGATCTATCAAGCAAG-3'、配列番号52)を用い、ExSite PCRベース部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene社、La Jolla、CA)を使用して欠失突然変異誘発を行った。欠失は、制限酵素による消化、およびヌクレオチド配列分析によって確認した。FおよびM2遺伝子のみを含有するSac I-BamH I断片をpB9320G4に導入し、このアンチゲノムcDNAをpB9320ΔGと名付けた。
【０２０３】
Gにおけるシステインヌースおよびヘパリン結合部位(アミノ酸164〜197)のみを欠失するために、プライマーXC079(5'-GTAATCATCTTTTGGTTTTTTTGGTGG-3'、配列番号53)およびXC080(5'-CCAACCATCAAACCCACAAACAAACCAACCGTC-3'、配列番号54)を用いて、nt 5179〜5280 ntの小さなcDNA断片を9320 G遺伝子から欠失した。所望の欠失を含有するcDNAを、その後、Sac IおよびBamH Iによる消化でサブクローンから取り出して、9320の完全長アンチゲノムcDNAに混合によって導入した。この結果得られたアンチゲノムcDNAをpB9320ΔHBSと名付けた。
【０２０４】
cDNAからの組換え体ウイルスの回収
リバースジェネティクス(rg)による9320ウイルス(rg9320C4、rg9320G4、rg9320ΔG、およびrg9320ΔHBS)の回収を、以前の記載(Jinら(1998年)、Virology、第251巻、206〜214頁)に従って行った。簡潔には、HEp-2細胞を、m.o.i.5.0でMVA-T7に感染させ、Lipofectamine(商標)2000(Invitrogen社、Carlsbad、CA)によって、0.4μgのpB-N(pN)、0.4μgのpB-P(pP)、0.2μgのpB-L(pL)、および0.8μgのpB9320C4、pB9320G4、pB9320ΔG、またはpB9320ΔHBSでトランスフェクトした。一部のトランスフェクション反応では、0.2μg pRSV-M2-1(RSV A2 M2-1タンパク質をコードする)も含まれていた。別法では、ベロ細胞をFPV-T7(Brittonら(1996年)、J Gen Virol、第77巻、963〜7頁)に、m.o.i.1.0で1時間感染させ、上記のDNAでトランスフェクトした。トランスフェクト細胞は35℃でインキュベートした。トランスフェクションの3日後に、培養上清を用いてベロ細胞を感染させ、回収したウイルスを増幅させた。感染の6日後に、培養上清を採取し、ポリクローナル抗RSV A2血清(Biogenesis社、Kingston、NH)を用いて、免疫染色によってウイルス感染細胞を同定した。培養上清からの組換え体ウイルスを、プラーク精製して、ベロ細胞中で増幅した。
【０２０５】
組織培養におけるrg9320C4、rg9320G4、rg9320ΔGの複製
ベロ細胞およびHEp-2細胞における野生型9320の複製を、rg9320C4、rg9320G4、およびrg9320ΔGの複製と比較した。6ウェルプレートにおけるベロ細胞またはHEp-2細胞の単層を、m.o.i.0.1で、各ウイルスにデュプリケートで感染させた。室温で1時間の吸着の後に、感染細胞をPBSで3回洗浄し、2mlのOptiMEMと共に35℃でインキュベートした。24時間間隔で、250μlアリコートの培養上清を採取し、ウイルス力価を測定する前に-80℃で保存した。採取した各アリコートは、同量の新しい培地で置換した。ベロ細胞におけるプラークアッセイを、1%メチルセルロースおよび1X MEM/L15(JRH Bioscience社、Lenexa、KS)からなり、2% FBSを含有するオーバレイを用いて行うことによって、ウイルス力価を測定した。35℃、6日間のインキュベーションの後に、単層をメタノールで固定し、免疫染色によってプラークを計数した。
【０２０６】
ウイルス感染細胞のウエスタンブロッティング分析
ベロ細胞またはHEp-2細胞を、m.o.i 5.0でウイルスに感染させ、Laemmliタンパク質試料緩衝液(Bio Rad社、Hercules、CA)で感染細胞を溶解させた。細胞溶解物は、0.1% SDSを含有する12%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行い、その後ナイロン膜上に転写させた。ブロットは、抗RSV A2ポリクローナル血清、またはGregory Storch博士から得たRSV B株のGタンパク質に対する4つのモノクローナル抗体(2434DB3、2218BD5、2218AE7、および2218DG7)(Storchら(1991年)、「Antigenic and genomic diversity within group A respiratory syncytial virus」、J Infect Dis、第163巻、858〜861頁)の混合物のいずれかとインキュベートした。ウイルスタンパク質の可視化は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体とのインキュベーションと、その後の化学発光検出(Amersham Biosciences社、Piscataway、NJ)によって行った。
【０２０７】
結果および考察
発明者らは、RSVサブグループB9320株に由来する完全長アンチゲノムcDNAの構築、およびcDNAからの感染性ウイルスの回収について記述した。アンチゲノム配列(野生型のRSV9320ゲノムに相補的であり、発明者らの組換え体RSVに導入された変化を含んでいない)を、配列番号1として記載する。この配列はGenBank(アクセッション番号AY353550)に登録されている。
【０２０８】
RSV9320ゲノムは、15225ヌクレオチドを含有し、RSV B1およびA2株と比較して、それぞれ97.8%および86%の同一性を共有する。上述の通り、A2ゲノムは15222ヌクレオチドを含有し;Blゲノムは15225ヌクレオチドを含有する(Karronら(1997年)、Proc Natl Acad Sci USA、第94巻、13961〜13966頁)。RSV A2株と同様に、9320は11個のタンパク質、すなわち順番にNS1/NS2/N/P/M/SH/G/F/M2-1/M2-2/Lをコードする10の転写単位を含有する。これらのタンパク質のアミノ酸配列も提供する。NS1は配列番号2として、NS2は配列番号3として、Nは配列番号4として、Pは配列番号5として、Mは配列番号6として、SHは配列番号7として、Gは配列番号12として、Fは配列番号8として、M2-1は配列番号9として、M2-2は配列番号10として、そしてLは配列番号11として記載する。
【０２０９】
9320、B1、およびA2株における11個のタンパク質それぞれの大きさを表3に記載する。
【表３】
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【０２１０】
RSVの上記3株における遺伝子間領域の長さを、表4に記載する。
【表４】
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【０２１１】
B9320株とB1株との間、9320株とA2株との間、そしてA2株とB1株との間における各タンパク質のアミノ酸配列同一性の割合を、表5に記載する。SH、G、およびM2-2タンパク質は、A2と9320との間で最も大きな相違を示し、一方、他のタンパク質は、86%を超えるアミノ酸同一性を有する。
【表５】
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【０２１２】
cDNAからの感染性9320の回収
サブグループA RSVのA2株におけるリバースジェネティクスシステムは数年前に確立された(Collinsら(1995年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第92巻、11563〜11567頁、および、Jinら(1998年)、Virology、第251巻、206〜214頁)。しかし、サブグループB RSVの回収システムは、以前には利用可能となっていなかった。本明細書において、発明者らは、RSVサブグループB9320に由来するアンチゲノムcDNAの構築、およびcDNAからの感染性RSVの回収を記述する。A2株と同様に、9320のレスキューはウイルスポリメラーゼタンパク質N、P、およびLの発現に依存している。M2-1発現プラスミドは、FPV T7に感染したベロ細胞でも、MVA-T7に感染したHEp-2細胞でも9320 RSV回収に必要でない。しかし、M2-1機能は、おそらく、トランスフェクトされた完全長アンチゲノムcDNAからの、M2-1タンパク質の潜在性の発現によって供給されたのである(Collinsら(1999年)、Virology、第259巻、251〜255頁)。9320株におけるリバースジェネティクスシステムの確立は、ウイルスタンパク質の構造、および多岐にわたるこのRSVサブグループの機能の研究を大いに補助するにちがいない。
【０２１３】
感染性RSVの回収は、N、P、およびLタンパク質をコードする最低3つのプラスミドの同時トランスフェクションを必要とする(Jinら(1998年)、Virology、第251巻、206〜214頁)。加えて、M2-1による伸長機能も、cDNAからのウイルスの回収に必要である(Collinsら(1999年)、「Support plasmids and support proteins required for recovery of recombinant respiratory syncytial virus」、Virology、第259巻、251〜255頁、および、Collinsら(1995年)、「Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第92巻、11563〜11567頁)。9320のN、P、およびLタンパク質をコードする発現プラスミドが構築されて、それらの機能は、RSV A2株に由来するリーダー配列およびトレーラー配列に挟まれたマイナスセンスCAT遺伝子を含有したpRSV/CATレプリコンを用いたRSVミニゲノムアッセイで検査された(Tangら(2001年)、J Virol、第75巻、11328〜11335頁)。このミニゲノムアッセイは、9320のN、P、およびL発現プラスミドが、RSV A2株のものと同様に機能したことを示した。
【０２１４】
RSV9320 cDNAからウイルスを回収するために、MVA-T7に感染したHEp-2細胞、またはFPV-T7に感染したベロ細胞の中に、pB9320C4またはpB9320G4を、9320のN、P、およびL発現プラスミドと共に、そして、RSV A2 M2-1プラスミドと共に、またはこのプラスミドなしでトランスフェクトした。トランスフェクトされた培養の上清でベロ細胞に接種を行った数日後に、シンシチウム形成が感染したベロ細胞に観測され、免疫染色によってウイルス感染を確認した。
【０２１５】
M2-1発現プラスミドの存在下または非存在下における組換え体RSVの回収効率を、表6に記載する。FPV-T7に感染したベロ細胞、またはMVA-T7に感染したHEp-2細胞を、トリプリケートウェル中で、N 、P、L発現プラスミドと共に、M2-1の存在下または非存在下に、p9320C4またはp9320G4でトランスフェクトした。トランスフェクションの3日後に、培養上清をベロ細胞で力価測定した。各ウェルのプラーク数をpfu/mlで示す。平均したプラーク数を括弧内に示す。
【表６】
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【０２１６】
表6に示されているように、rg9320G4は、FPV-T7に感染したベロ細胞と、MVA-T7に感染したHEp-2細胞との両方で、rg9320より効率的にレスキューされた。M2-1発現プラスミドを含めることによって、レスキュー効率が両方の細胞型でわずかに増大した。
【０２１７】
ワクチン生産では、通常、いかなる外在性の物質も含まない適格の細胞系からワクチンが生産される。感染性のRSV A2の回収に現在用いられているHEp-2細胞(例えば、Collinsら(1995年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第92巻、11563〜11567頁、および、Jinら(1998年)、Virology、第251巻、206〜214頁)は、ワクチン生産に適していない。したがって、9320ウイルスをcDNAから回収するための細胞基質としてベロ細胞の探査を行った。MVA-T7に感染したベロ細胞からウイルスを回収するのは、極めて困難なことであった。FPV-T7は、感染したベロ細胞中での細胞変性効果がより少なく、したがって、その結果、他のウイルスのウイルスレスキューをより効率的なものとすることが示されている(Brittonら(1996年)、J Gen Virol、第77巻、963〜7頁、および、Dasら(2000年)、「Improved technique for transient expression and negative strand virus rescue using fowlpox T7 recombinant virus in mammalian cells」、J Virol Meth、第89巻、119〜127頁)。同様に、本明細書に記載の組換え体RSVの回収も、FPV-T7に感染したベロ細胞からの方が、MVA-T7に感染した細胞からよりも効率的であった。このことは、臨床試験用のRSVワクチン候補株を回収するための道を開くものでありうる。
【０２１８】
rg9320C4およびrg9320G4のプラーク精製を行い、ベロ細胞で増幅させたところ、両方とも1×107pfu/mlの力価にまで達した。rg9320G4からG遺伝子が欠失されている組換え体ウイルスも得られ、このウイルスをrg9320ΔGと名付けた。
【０２１９】
cDNAから生成された組換え体ウイルスのアイデンティティは、導入されたマーカー部位、またはG欠失領域にまたがるプライマー対を用いて、それぞれのウイルスRNAのRT/PCRを行うことによって分析した。nt 2104からnt 3096までのRT/PCR DNA産物をSac I制限酵素で消化したところ、Sac I部位は、9320ウイルスには存在したが、組換え体ウイルスであるrg9320C4およびrg9320ΔGには存在しなかったことが示された。nt 11593からnt 11822までのRT/PCR産物をBamH Iで消化したところ、組換え体ウイルスのBamH I部位も除去されていることが確認された。G遺伝子にまたがる1対のプライマーを用いたRT/PCRによって、G遺伝子がrg9320ΔGから欠失されていることが確認された。これは、そのDNA産物がrg9320のものより約1kb短かったためである。G欠失の結合領域の配列決定を行ったところ、予測された欠失を有する配列が確認された。
【０２２０】
rg9320ΔGに感染した細胞におけるGタンパク質発現の不在は、サブグループB RSVのGタンパク質に対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析によって確認した(Storchら(1991年)、J Infect Dis、第163巻、858〜861頁)。rg9320ΔGに感染した細胞では、Gタンパク質が発現されていなかった。RSVに対するポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロットは、rg9320G4と比較して、同等のレベルの他のウイルスタンパク質(F、N、およびP)がrg9320ΔGによって合成されていることを明らかにした。
【０２２１】
組織培養におけるG欠失突然変異体の複製
組換え体9320、およびそのG欠失突然変異体の複製を、生物学的に派生した9320株の複製と比較した。ベロ細胞またはHEp-2細胞を、m.o.i.0.1で9320、rg9320C4、rg9320G4、またはrg9320ΔGに感染させ、培養上清中に放出されたウイルスの蓄積レベルを、毎日、ベロ細胞で力価測定した。図4のパネルAに示されているように、rg9320C4、rg9320G4、およびrg9320ΔGの成長動態は、感染後96時間で6.0log10pfu/mlのピーク力価に達するものであり、ベロ細胞における9320のものに極めて類似していた。HEp-2細胞(図4 パネルB)では、rg9320C4は、9320と同様に成長したが、rg9320G4は、成長がわずかに遅かった。rg9320ΔGの複製は、rg9320G4と比較して5倍減弱していた。
【０２２２】
rg9320ΔGのプラーク形態を、ベロ細胞およびHEp-2細胞におけるrg9320G4のものと比較した。液体培地中のベロ細胞およびHEp-2細胞におけるrg9320ΔGの伝搬は、rg9320G4のものと同様であった。rg9320ΔGは、ベロ細胞およびHEp-2細胞の両方で、同様の大きさのプラークを形成した。これらのデータによって、ベロ細胞およびHEp-2細胞でのウイルス複製には、9320からGを欠失したことによる有意な影響がないことが示された。
【０２２３】
本発明者らは、組織培養細胞におけるRSV9320複製には、Gタンパク質が必須でないことを実証した。しかし、RSV A2株からのGの欠失は、HEp-2細胞におけるウイルス複製に重大な影響を与えた。rA2ΔGは、3.0log10を超える減弱を有し、HEp-2細胞で明確なプラークを形成しなかった(Tengら(2001年)、Virology、第289巻、283〜96頁)。Techaarpornkulらによる研究(Techaarpornkulら(2001年)、J Virol、第75巻、6825〜34頁)では、rA2ΔGは、HEp-2細胞での力価が1〜2log低下しており、より小さいプラークをHEp-2細胞で形成したことが示された。Gタンパク質は、ウイルスの、標的細胞への結合を促進するが、ウイルスがいったん細胞に付着すれば、それはウイルス侵入に何の役割も持たない(Techaarpornkulら(2001年)、J Virol、第75巻、6825〜34頁)。ベロ細胞では、rA2ΔGもwt A2株と同様に複製し、これは、効率的なウイルスの進入に、Gタンパク質に依存しない別経路がベロ細胞に存在しているかもしれないことを示している(Tengら(2001年)、Virology、第289巻、283〜96頁)。rA2ΔGと同様に、rg9320ΔGもベロ細胞中で効率的に複製を行ったが、rA2ΔGとは対照的に、その複製はHEp-2細胞中でもわずかにしか減弱されていなかった。親株のrg9320G4ウイルスと比較して、HEp-2細胞におけるrg9320ΔGウイルスの減弱は5倍であって、HEp-2細胞におけるプラークの大きさの減少も、比較的目立たないものであった。したがって、9320は、HEp-2細胞における感染性が、RSV A2ほどGタンパク質に依存していないことが明らかになった。
【０２２４】
Gの部分的欠失(システインヌースおよびヘパリン結合部位)を有する組換え体9320ウイルスであるrg9320ΔHBSもcDNAから、上述の通りに回収した。rg9320ΔGと同様に、ベロ細胞におけるrg9320ΔHBSの複製は有意に損なわれていない。
【０２２５】
コットンラットでのウイルス複製
サブグループBのRSVは、通常、マウスよりコットンラットでよく複製する。したがって、組換え体ウイルスであるrg9320C4、rg9320G4、rg9320ΔG、およびrg9320ΔHBSの、in vivoでの複製をコットンラット(Sigmodon hispidus)で検査した。5匹ずつのグループのコットンラットに、106pfuの特定のウイルスを含有する種菌を、1動物あたり150μl鼻腔内接種した。動物は、接種の4日後に屠殺した。肺組織を、採取して、ホモジナイズし、ベロ細胞でのプラークアッセイによってウイルス力価を測定した。表7は、各組換え体ウイルスの平均ウイルス力価を記載する。rg9320C4およびrg9320G4は、コットンラットの肺でそれぞれ3.1および3.0log10pfu/gの力価まで複製を行った。両方のG欠失突然変異体(rg9320ΔGおよびrg9320ΔHBS)は貧弱にしか複製しなかった。これは、動物宿主でのRSV9320の複製が、Gの欠失に影響されることを示している。rg9320ΔGおよびrg9320ΔHBSは、したがって、弱毒生RSVワクチンの有力な候補である。
【表７】
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【０２２６】
組換え体9320およびワクチン
サブグループAおよびサブグループB RSV感染の双方は、共同体において同時に循環する傾向があり、RSVワクチンは、これらの両方に対する防御を提供することが好ましいであろう。過去に開発されたほとんどのRSVワクチンは、RSV A2株に基づいたものである。しかし、サブグループA株のみに基づいたRSVワクチンが両方のRSVサブグループに対して十分な免疫を提供することになるかどうかは、まだ判定するべきこととして残っている。サブグループB RSV抗原のA2株での発現が、組換技術を利用して行われており、これには、GおよびF遺伝子をB1の遺伝子で置換したもの(Whiteheadら(1999年)、「Replacement of the F and G proteins of respiratory syncytial virus(RSV)subgroup A with those of subgroup B generates chimeric live attenuated RSV subgroup B vaccine candidates」、J Viral、第73巻、9773〜9780頁)または9320の遺伝子で置換したもの(Chengら(2001年)、「Chimeric subgroup A respiratory syncytial virus with the glycoproteins substituted by those of subgroup B and RSV without the M2-2 gene are attenuated in African green monkeys」、Virology、第283巻、59〜68頁)、または、9320 G遺伝子をA2株に挿入したもの(Jinら(1998年)、Virology、第251巻、206〜214頁)が含まれるが、現在、サブグループB RSVワクチンの開発は、サブグループAワクチンの開発に比べて顕著に遅れている。本明細書に記載したサブグループB RSVのレスキューシステムの有効性によって、サブグループB RSVゲノムの操作を、例えば、ワクチン開発のために行うことが可能となる。例えば、任意選択で、サブグループA株の弱毒化に用いられた方法で、RSV B9320の弱毒化を行うことができる。RSVサブグループA RSVの弱毒化に用いられた方法には、例えば、ウイルス内部タンパク質の突然変異誘発(Luら(2002)、「Identification of temperature-sensitive mutations in the phosphoprotein of respiratory syncytial virus that are likely involved in its interaction with the nucleoprotein」、J Virol、第76巻、2871〜2880頁;Luら(2002)、「The major phosphorylation sites of the respiratory syncytial virus phosphoprotein are dispensable for virus replication in vitro」、J Virol、第76巻、10776〜10784頁;Tangら(2002年)、「Clustered charged-to-alanine mutagenesis of human respiratory syncytial virus L polymerase generated temperature-sensitive viruses」、Virology、第302巻(207〜216頁);および、Tangら(2001年)、「Requirement of cysteines and length of the human respiratory syncytial virus M2-1 protein for protein function and virus viability」、J Virol、第75巻、11328〜11335頁)、付属遺伝子(accessory gene)の欠失(BerminghamおよびCollins(1999年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第96巻、11259〜11264頁;Jinら(2000年)、J.Virol.、第74巻、74〜82頁;Jinら(2000年)、Virology、第273巻、210〜218頁;Bukreyevら(1997年)、J Virol、第71巻、8973〜8982頁;TengとCollins(1999年)、J Virol、第73巻、466〜473頁);および、ワクチン株の弱毒化レベルを微調整するための、異なる株に由来する弱毒化突然変異の導入(Firestoneら(1996年)、「Nucleotide sequence analysis of the respiratory syncytial virus subgroup A cold-passaged(cp)temperature sensitive(ts)cpts-248/404 live attenuated virus vaccine candidate」、Virology、第225巻、419〜422頁、および、Whiteheadら(1999年)、「Addition of a missense mutation present in the L gene of respiratory syncytial virus(RSV)cpts530/1030 to RSV vaccine candidate cpts248/404 increases its attenuation and temperature sensitivity」、J Virol、第73巻、871〜877頁)が含まれる。一例として、遺伝子欠失アプローチからは、rA2ΔM2-2が更なる臨床評価のために望ましい特徴をいくつか示すことが明らかになっており(Chengら(2001年)、Virology、第283巻、59〜68頁;Jinら(2003年)、「Evaluation of recombinant respiratory syncytial virus gene deletion mutants in African green monkeys for their potential as live attenuated vaccine candidates」、Vaccine、第21巻、3647〜3652頁;Tengら(2000年)、J Viral、第74巻、9317〜9321頁)、したがって、M2-2遺伝子の欠失を有する9320は、弱毒9320ワクチンの候補株である。同様に、A2 M2-2 mRNAにおける第2または第3の開始コドンの強制使用(第1の開始コドン、または3つの開始コドン全部の代わりに)は、M2-2活性の低下をもたらす(Jinら、2003年9月26日に出願された、「Functional mutations in respiratory syncytial virus」という題の米国特許出願第10/672,302号(代理人整理番号26-000320US))。したがって、M2-2の第1、第2、および/または第3の開始コドンに突然変異(例えば置換または欠失)を有する9320は、弱毒9320ワクチンの候補株である。
【０２２７】
上述の通り、G遺伝子の完全な欠失、または部分的な欠失を有する組換え体の9320ウイルス、例えば本明細書に記載のものは、弱毒9320ワクチンの候補株である。
【０２２８】
明快さと、理解とを目的として、以上の発明をある程度詳細に説明したが、この開示を読むことによって、本発明の本当の範囲から逸脱することなく、形式および詳細に様々な改変を行うことが可能であることが、当業者には明らかであろう。例えば、上述した組成および技法は、すべて様々な組合せで用いることができる。この出願で引用されたすべての刊行物、特許、特許出願、および/または他の書類は、それぞれの個々の刊行物、特許、特許出願、および/または他の書類が、すべての目的のために引用によって組み込まれるように個別に示された場合と同程度において、すべての目的のために、引用によって全体として組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２２９】
【図１】図１は、完全長アンチゲノムRSV9320cDNAの構築を模式的に図示する。完全長アンチゲノムcDNAを構築するのに用いられた様々なサブクローンの位置を示す。RT/PCRによって取得したcDNA断片は、示した制限酵素部位を用いて連結した。アンチゲノムセンスにおけるリーダー配列の第4の残基は、示した通りCまたはGのいずれかであった。
【図２】図２は、3つのサブクローンからのLコード領域の集合によるpB-Lのクローニングを模式的に図示する。pB-Lを構築するのに用いられた様々なサブクローンおよびプライマーの位置を示す。
【図３】図３は、RSV9320アンチゲノムの5'部分のクローニングを模式的に図示する。様々なサブクローンおよびプライマーの位置を示す。
【図４】図４は、ベロ細胞(パネルA)およびHEp-2細胞(パネルB)における野生型9320(ダイヤモンド)、rg9320C4(正方形)、rg9320G4(三角形)、およびrg9320ΔG(円)の成長を図示する線グラフである。ベロ細胞またはHEp-2細胞は、各ウイルスにm.o.i 0.1で感染させて、35℃で5日間、インキュベートした。それぞれの日に培養上清中に放出されたウイルスは、ベロ細胞でのプラークアッセイによって力価決定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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