(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の表Ｉ：
0004657108.tif 000007
に示される組成を有することを特徴とする、ＥＳ細胞培養用培地を調製するための基礎培地。
【請求項２】
以下の表ＩＩ：
0004657108.tif 000008
に示される組成を有することを特徴とする、ＥＳ細胞培養用培地を調製するための基礎培地。
【請求項３】
以下の表ＩＩＩ：
0004657108.tif 000009
に示される組成を有することを特徴とする、ＥＳ細胞培養用培地を調製するための基礎培地。
【請求項４】
２．５〜４．５ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ、および所望のｐＨに調節するために必要な量のＮａＨＣＯ３をさらに含む、請求項１−３のいずれかに記載の基礎培地。
【請求項５】
請求項１−４のいずれかに記載の基礎培地に、インスリン，トランスフェリン，２−メルカプトエタノール，２−エタノールアミン，亜セレン酸ナトリウム，及び無脂肪酸ウシ血清アルブミンと複合体化したオレイン酸を含む、ＥＳ細胞培養用培地。
【請求項６】
さらに、ＬＩＦ（白血病抑制因子）を含む、請求項５記載のＥＳ細胞培養用培地。
【請求項７】
請求項５又は６記載のＥＳ細胞培養用培地を用いることを特徴とする、ＥＳ細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は哺乳動物のＥＳ細胞を培養するための培地を調製するための基礎培地に関する。
【背景技術】  胚性幹（ＥＳ）細胞は未分化性を示し，生物の発生過程においてインビトロであらゆるタイプの分化した細胞を発生させる能力を有する。ＥＳ細胞の自己複製能および未分化性は，ウシ胎児血清を補充した培養用培地を用いて，フィーダー細胞またはＬＩＦの存在下で維持しうることが知られている（Ｚａｎｄｓｔｒａ，Ｐ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ６９，６０７−１７（２０００））。しかし，現在広く用いられているこのような培養条件においては，ＥＳ細胞の分化を解析する際にフィーダー細胞を確実に除去することが困難であり，分化誘導因子の添加による影響を正確に解析することができない。また，フィーダー細胞なしで培養しうるＥＳ細胞株も知られているが，例えば，マウスＥＳ細胞株の１つであるＥＳ−Ｄ３は，フィーダー層なしの培養条件下では自発的に分化する傾向にある。
さらに，血清は，アクチビンおよび線維芽細胞成長因子や未知の分化誘導因子の，その量が変動する成分を含む。これらの成分は，種々の物質を外から加えてＥＳ細胞の細胞成長および分化を解析する際に，分析結果に影響を与える可能性がある。また，血清の使用はウイルス，プリオンや未知の因子などの感染の危険性があり，再生医療への応用の際にはリスクを伴う。また，ＥＳ細胞の無血清培養条件についての報告もあるが，数代継代すると神経などに分化し，未分化性が維持できない場合がある。
【発明の開示】
本発明は，フィーダー細胞なしで，未分化性を維持したままＥＳ細胞を長期に培養しうる無血清培養用の培地，およびこのような培地を製造するための基礎培地を提供することを目的とする。
本発明者らは，特定の組成を有する培地を用いることにより，フィーダー細胞および血清なしで，未分化性を維持したままＥＳ細胞を培養しうることを見いだした。すなわち，本発明は，以下の表Ｉ：
0004657108.tif 000002
に示される組成を有することを特徴とする，ＥＳ細胞培養用培地を調製するための基礎培地を提供する。
別の態様においては，本発明は，以下の表ＩＩ：
0004657108.tif 000003
に示される組成を有することを特徴とする，ＥＳ細胞培養用培地を調製するための基礎培地を提供する。
また別の態様においては，本発明は，以下の表ＩＩＩ：
0004657108.tif 000004
に示される組成を有することを特徴とする，ＥＳ細胞培養用培地を調製するための基礎培地を提供する。
別の態様においては，本発明の基礎培地は，２．５〜４．５ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ，および所望のｐＨに調節するために必要な量のＮａＨＣＯ３をさらに含む。
さらに別の態様においては，本発明は，本発明のＥＳ細胞培養用培地を用いることを特徴とするＥＳ細胞の培養方法を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は，各種培地で培養したＥＳ−Ｄ３細胞におけるＯｃｔ３／４発現のフローサイトメトリ分析を示す。
図２は，ＥＳ−Ｄ３細胞の成長に及ぼすＬＩＦ濃度の影響を示す。
図３は，ＥＳＦ７培地およびＣＥＭ培地で培養したＥＳ−Ｄ３細胞の増殖を示す。
発明の詳細な説明
本発明においては，フィーダー細胞の非存在下で未分化マウスＥＳ細胞を成長させるための無血清合成培地を調製するための基礎培地が提供される。本発明の基礎培地（以下，ＥＳＦ培地と称する）は，水に，上の表に示される各成分を所定の濃度となるように加え，さらに２．５〜４．５ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ，および所望のｐＨに調節するために必要な量のＮａＨＣＯ３を加えた後，当該技術分野においてよく知られる方法を用いて滅菌することにより，容易に製造することができる。塩基性アミノ酸等の塩基性成分は，遊離塩基の形で加えても，ＨＣｌ塩等の塩の形で加えてもよい。本発明の基礎培地に，６因子（６Ｆ；インスリン，トランスフェリン，２−ＭＥ，２−エタノールアミン，亜セレン酸ナトリウム，無脂肪酸ウシ血清アルブミンと複合体化したオレイン酸）およびＬＩＦ（白血病抑制因子）を補充して，本発明のＥＳ細胞培養用培地（以下，ＥＳＦ７培地と称する）を製造する。これらの６因子およびＬＩＦは市販されている。このＥＳＦ７培地を用いることにより，ＥＳ細胞をタイプＩコラーゲン被覆フラスコで無血清条件下で維持することができる。あるいは，本発明のＥＳ細胞培養用培地は，市販の培地を適宜混合することにより製造してもよい。例えば，市販のＲＰＭＩ，ＤＭＥＭおよびＦ１２を１：２：１の割合で混合し，ＨＥＰＥＳ，ＮａＨＣＯ３，ピルビン酸，亜セレン酸ナトリウムを添加して作成することにより簡便に製造することができるが，Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ−Ｈ２Ｏの代わりに，Ｌ−ヒスチジンを計２３．１６５ｇ／Ｌ添加して使用する方が好ましい。
後述の実施例に示されるように，本発明にしたがってＥＳＦ７培地でマウスＥＳ細胞を培養すると，ＥＳ細胞は，転写因子Ｏｃｔ３／４，幹細胞マーカーＳＳＥＡ−１，およびアルカリホスファターゼの発現により表されるように，未分化の表現型を維持した。また，このようにして維持した未分化細胞に，骨形成因子４（ＢＭＰ４）を加えると上皮様細胞への分化が誘導された。また，アクチビンＡを加えると，ＥＳ細胞の線維芽細胞様細胞および棘状細胞への分化が促進された。すなわち，本発明にしたがってＥＳＦ７培地で培養したＥＳ細胞は，分化誘導因子の刺激により特定の細胞に分化する能力を維持していた。
本発明の基礎培地においては，Ｌ−アラニンの濃度は，１．７８ｍｇ／Ｌ〜２．６７ｍｇ／Ｌ，好ましくは２．００２５ｍｇ／Ｌ〜２．４４７５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは２．１１３７５ｍｇ／Ｌ〜２．３３６２５ｍｇ／Ｌである。Ｌ−アルギニンの濃度は，４０ｍｇ／Ｌ〜６０ｍｇ／Ｌ，好ましくは４５ｍｇ／Ｌ〜５５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは４７．５ｍｇ／Ｌ〜５２．５ｍｇ／Ｌである。Ｌ−アルギニンＨＣｌの濃度は，７５．８ｍｇ／Ｌ〜１１３．７ｍｇ／Ｌ，好ましくは８５．２７５ｍｇ／Ｌ〜１０４．２２５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは９０．０１２５ｍｇ／Ｌ〜９９．４８７５ｍｇ／Ｌである。Ｌ−アスパラギンＨ２Ｏの濃度は，１３．００２ｍｇ／Ｌ〜１９．５０３ｍｇ／Ｌ，好ましくは１４．６２７２５ｍｇ／Ｌ〜１７．８７７７５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは１５．４３９８８ｍｇ／Ｌ〜１７．０６５１３ｍｇ／Ｌである。Ｌ−アスパラギン酸の濃度は，６．６６ｍｇ／Ｌ〜９．９９ｍｇ／Ｌ，好ましくは７．４９２５ｍｇ／Ｌ〜９．１５７５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは７．９０８７５ｍｇ／Ｌ〜８．７４１２５ｍｇ／Ｌである。Ｌ−システインＨＣｌ・Ｈ２Ｏの濃度は，７．０２４ｍｇ／Ｌ〜１０．５３６ｍｇ／Ｌ，好ましくは７．９０２ｍｇ／Ｌ〜９．６５８ｍｇ／Ｌ，より好ましくは８．３４１ｍｇ／Ｌ〜９．２１９ｍｇ／Ｌである。Ｌ−シスチン２ＨＣｌの濃度は，３８．０５８ｍｇ／Ｌ〜５７．０８７ｍｇ／Ｌ，好ましくは４２．８１５２５ｍｇ／Ｌ〜５２．３２９７５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは４５．１９３８８ｍｇ／Ｌ〜４９．９５１１３ｍｇ／Ｌである。Ｌ−グルタミン酸の濃度は，６．９４ｍｇ／Ｌ〜１０．４１ｍｇ／Ｌ，好ましくは７．８０７５ｍｇ／Ｌ〜９．５４２５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは８．２４１２５ｍｇ／Ｌ〜９．１０８７５ｍｇ／Ｌである。Ｌ−グルタミンの濃度は，４３９．７２ｍｇ／Ｌ〜６５９．５８ｍｇ／Ｌ，好ましくは４９４．６８５ｍｇ／Ｌ〜６０４．６１５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは５２２．１６７５ｍｇ／Ｌ〜５７７．１３２５ｍｇ／Ｌである。グリシンの濃度は，１５．５ｍｇ／Ｌ〜２３．２５ｍｇ／Ｌ，好ましくは１７．４３７５ｍｇ／Ｌ〜２１．３１２５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは１８．４０６２５ｍｇ／Ｌ〜２０．３４３７５ｍｇ／Ｌである。Ｌ−ヒスチジンの濃度は，３ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ，好ましくは２０．８４８５ｍｇ／Ｌ〜２５．４８１５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは２２．００６７５ｍｇ／Ｌ〜２４．３２３２５ｍｇ／Ｌである。Ｌ−ヒドロキシプロリンの濃度は，４ｍｇ／Ｌ〜６ｍｇ／Ｌ，好ましくは４．５ｍｇ／Ｌ〜５．５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは４．７５ｍｇ／Ｌ〜５．２５ｍｇ／Ｌである。Ｌ−イソロイシンの濃度は，５２．７４８ｍｇ／Ｌ〜７９．１２２ｍｇ／Ｌ，好ましくは５９．３４１５ｍｇ／Ｌ〜７２．５２８５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは６２．６３８２５ｍｇ／Ｌ〜６９．２３１７５ｍｇ／Ｌである。Ｌ−ロイシンの濃度は，５４．５８ｍｇ／Ｌ〜８１．８７ｍｇ／Ｌ，好ましくは６１．４０２５ｍｇ／Ｌ〜７５．０４１５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは６４．８１３７５ｍｇ／Ｌ〜７１．６３６２５ｍｇ／Ｌである。Ｌ−リジンＨＣｌの濃度は，７３．７４ｍｇ／Ｌ〜１１０．６１ｍｇ／Ｌ，好ましくは８２．９５７５ｍｇ／Ｌ〜１０１．３９２５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは８７．５６６２５ｍｇ／Ｌ〜９６．７８３７５ｍｇ／Ｌである。Ｌ−メチオニンの濃度は，１５．８９６ｍｇ／Ｌ〜２３．８４４ｍｇ／Ｌ，好ましくは１７．８８３ｍｇ／Ｌ〜２１．８５７ｍｇ／Ｌ，より好ましくは１８．８７６５ｍｇ／Ｌ〜２０．８６３５ｍｇ／Ｌである。Ｌ−フェニルアラニンの濃度は，３０．３９２ｍｇ／Ｌ〜４５．５８８ｍｇ／Ｌ，好ましくは３４．１９１ｍｇ／Ｌ〜４１．７８９ｍｇ／Ｌ，より好ましくは３６．０９０５ｍｇ／Ｌ〜３９．８８９５ｍｇ／Ｌである。Ｌ−プロリンの濃度は，１０．９ｍｇ／Ｌ〜１６．３５ｍｇ／Ｌ，好ましくは１２．２６２５ｍｇ／Ｌ〜１４．９８７５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは１２．９４３７５ｍｇ／Ｌ〜１４．３０６２５ｍｇ／Ｌである。Ｌ−セリンの濃度は，２４．９ｍｇ／Ｌ〜３７．３５ｍｇ／Ｌ，好ましくは２８．０１２５ｍｇ／Ｌ〜３４．２３７５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは２９．５６８７５ｍｇ／Ｌ〜３２．６８１２５ｍｇ／Ｌである。Ｌ−スレオニンの濃度は，４４．４２ｍｇ／Ｌ〜６６．６３ｍｇ／Ｌ，好ましくは４９．９７２５ｍｇ／Ｌ〜６１．０７７５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは５２．７４８７５ｍｇ／Ｌ〜５８．３０１２５ｍｇ／Ｌである。Ｌ−トリプトファンの濃度は，７．８０８ｍｇ／Ｌ〜１１．７１２ｍｇ／Ｌ，好ましくは８．７８４ｍｇ／Ｌ〜１０．７３６ｍｇ／Ｌ，より好ましくは９．２７２ｍｇ／Ｌ〜１０．２４８ｍｇ／Ｌである。Ｌ−チロシンの濃度は，３３．８８８ｍｇ／Ｌ〜５０．８３２ｍｇ／Ｌ，好ましくは３８．１２４ｍｇ／Ｌ〜４６．５９６ｍｇ／Ｌ，より好ましくは４０．２４２ｍｇ／Ｌ〜４４．４７８ｍｇ／Ｌである。Ｌ−バリンの濃度は，４３．８６ｍｇ／Ｌ〜６５．７９ｍｇ／Ｌ，好ましくは４９．３４２５ｍｇ／Ｌ〜６０．３０７５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは５２．０８３７５ｍｇ／Ｌ〜５７．５６６２５ｍｇ／Ｌである。
グルタチオンの濃度は，０．２ｍｇ／Ｌ〜０．３ｍｇ／Ｌ，好ましくは０．２２５ｍｇ／Ｌ〜０．２７５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは０．２３７５ｍｇ／Ｌ〜０．２６２５ｍｇ／Ｌである。パラアミノ安息香酸の濃度は，０．２ｍｇ／Ｌ〜０．３ｍｇ／Ｌ，好ましくは０．２２５ｍｇ／Ｌ〜０．２７５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは０．２３７５ｍｇ／Ｌ〜０．２６２５ｍｇ／Ｌである。ビオチンの濃度は，０．０４１４８ｍｇ／Ｌ〜０．０６２２２ｍｇ／Ｌ，好ましくは０．０４６６６５ｍｇ／Ｌ〜０．０５７０３５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは０．０４９２５８ｍｇ／Ｌ〜０．０５４４４３ｍｇ／Ｌである。パントテン酸カルシウムの濃度は，１．７４６ｍｇ／Ｌ〜２．６１９ｍｇ／Ｌ，好ましくは１．９６４２５ｍｇ／Ｌ〜２．４００７５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは２．０７３３７５ｍｇ／Ｌ〜２．２９１６２５ｍｇ／Ｌである。塩化コリンの濃度は，４．９９２ｍｇ／Ｌ〜７．４８８ｍｇ／Ｌ，好ましくは５．６１６ｍｇ／Ｌ〜６．８６４ｍｇ／Ｌ，より好ましくは５．９２８ｍｇ／Ｌ〜６．５５２ｍｇ／Ｌである。葉酸の濃度は，２．０６ｍｇ／Ｌ〜３．０９ｍｇ／Ｌ，好ましくは２．３１７５ｍｇ／Ｌ〜２．８３２５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは２．４４６２５ｍｇ／Ｌ〜２．７０３７５ｍｇ／Ｌである。イノシトールの濃度は，１３．４８ｍｇ／Ｌ〜２０．２２ｍｇ／Ｌ，好ましくは１５．１６５ｍｇ／Ｌ〜１８．５３５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは１６．００７５ｍｇ／Ｌ〜１７．６９２５ｍｇ／Ｌである。ニコチン酸アミドの濃度は，１．８０７４ｍｇ／Ｌ〜２．７１１１ｍｇ／Ｌ，好ましくは２．０３３３２５ｍｇ／Ｌ〜２．４８５１７５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは２．１４６２８８ｍｇ／Ｌ〜２．３７２２１３ｍｇ／Ｌである。ピリドキサールＨＣｌの濃度は，１．６ｍｇ／Ｌ〜２．４ｍｇ／Ｌ，好ましくは１．８ｍｇ／Ｌ〜２．２ｍｇ／Ｌ，より好ましくは１．９ｍｇ／Ｌ〜２．１ｍｇ／Ｌである。ピリドキシンＨＣｌの濃度は，０．２１２４ｍｇ／Ｌ〜０．３１８６ｍｇ／Ｌ，好ましくは０．２３８９５ｍｇ／Ｌ〜０．２９２０５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは０．２５２２２５ｍｇ／Ｌ〜０．２７８７７５ｍｇ／Ｌである。リボフラビンの濃度は，０．２０７６ｍｇ／Ｌ〜０．３１１４ｍｇ／Ｌ，好ましくは０．２３３５５ｍｇ／Ｌ〜０．２８５４５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは０．２４６５２５ｍｇ／Ｌ〜０．２７２４７５ｍｇ／Ｌである。チアミンＨＣｌの濃度は，１．８６８ｍｇ／Ｌ〜２．８０２ｍｇ／Ｌ，好ましくは２．１０１５ｍｇ／Ｌ〜２．５６８５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは２．２１８２５ｍｇ／Ｌ〜２．４５１７５ｍｇ／Ｌである。ビタミンＢ１２の濃度は，０．２７３ｍｇ／Ｌ〜０．４０９５ｍｇ／Ｌ，好ましくは０．３０７１２５ｍｇ／Ｌ〜０．３７５３７５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは０．３２４１８８ｍｇ／Ｌ〜０．３５８３１３ｍｇ／Ｌである。ヒポキサンチンの濃度は，０．８１６ｍｇ／Ｌ〜１．２２４ｍｇ／Ｌ，好ましくは０．９１８ｍｇ／Ｌ〜１．１２２ｍｇ／Ｌ，より好ましくは０．９６９ｍｇ／Ｌ〜１．０７１ｍｇ／Ｌである。リノール酸の濃度は，０．０１６８ｍｇ／Ｌ〜０．０２５２ｍｇ／Ｌ，好ましくは０．０１８９ｍｇ／Ｌ〜０．０２３１ｍｇ／Ｌ，より好ましくは０．０１９９５ｍｇ／Ｌ〜０．０２２０５ｍｇ／Ｌである。リポ酸（チオクト酸）の濃度は，０．０４２ｍｇ／Ｌ〜０．０６３ｍｇ／Ｌ，好ましくは０．０４７２５ｍｇ／Ｌ〜０．０５７７５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは０．０４９８７５ｍｇ／Ｌ〜０．０５５１２５ｍｇ／Ｌである。プロレッシン二塩酸塩の濃度は，０．０３２２ｍｇ／Ｌ〜０．０４８３ｍｇ／Ｌ，好ましくは０．０３６２２５ｍｇ／Ｌ〜０．０４４２７５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは０．０３８２３８ｍｇ／Ｌ〜０．０４２２６３ｍｇ／Ｌである。チミジンの濃度は，０．１４６ｍｇ／Ｌ〜０．２１９ｍｇ／Ｌ，好ましくは０．１６４２５ｍｇ／Ｌ〜０．２００７５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは０．１７３３７５ｍｇ／Ｌ〜０．１９１６２５ｍｇ／Ｌである。
塩化ナトリウムの濃度は，５２７９．８ｍｇ／Ｌ〜７９１９．７ｍｇ／Ｌ，好ましくは５９３９．７７５ｍｇ／Ｌ〜７２５９．７２５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは６２６９．７６３ｍｇ／Ｌ〜６９２９．７３８ｍｇ／Ｌである。塩化カリウムの濃度は，２８４．７２ｍｇ／Ｌ〜４２７．０８ｍｇ／Ｌ，好ましくは３２０．３１ｍｇ／Ｌ〜３９１．４９ｍｇ／Ｌ，より好ましくは３３８．１０５ｍｇ／Ｌ〜３７３．６９５ｍｇ／Ｌである。塩化カルシウム（無水）の濃度は，８６．６４４ｍｇ／Ｌ〜１２９．９６６ｍｇ／Ｌ，好ましくは９７．４７４５ｍｇ／Ｌ〜１１９．１３５５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは１０２．８８９８ｍｇ／Ｌ〜１１３．７２０３ｍｇ／Ｌである。硝酸カルシウム４Ｈ２Ｏの濃度は，２０ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ，好ましくは２２．５ｍｇ／Ｌ〜２７．５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは２３．７５ｍｇ／Ｌ〜２６．２５ｍｇ／Ｌである。塩化マグネシウム（無水）の濃度は，１１．４４４ｍｇ／Ｌ〜１７．１６６ｍｇ／Ｌ，好ましくは１２．８７４５ｍｇ／Ｌ〜１５．７３５５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは１３．５８９７５ｍｇ／Ｌ〜１５．０２０２５ｍｇ／Ｌである。硫酸マグネシウム（無水）の濃度は，４８．８４４ｍｇ／Ｌ〜７３．２６６ｍｇ／Ｌ，好ましくは５４．９４９５ｍｇ／Ｌ〜６７．１６０５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは５８．００２２５ｍｇ／Ｌ〜６４．１０７７５ｍｇ／Ｌである。リン酸二水素ナトリウム（無水）の濃度は，４３．４８ｍｇ／Ｌ〜６５．２２ｍｇ／Ｌ，好ましくは４８．９１５ｍｇ／Ｌ〜５９．７８５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは５１．６３２５ｍｇ／Ｌ〜５７．０６７５ｍｇ／Ｌである。リン酸一水素二ナトリウム（無水）の濃度は，１８８．４０８ｍｇ／Ｌ〜２８２．６１２ｍｇ／Ｌ，好ましくは２１１．９５９ｍｇ／Ｌ〜２５９．０６１ｍｇ／Ｌ，より好ましくは２２３．７３４５ｍｇ／Ｌ〜２４７．２８５５ｍｇ／Ｌである。ブドウ糖（無水）の濃度は，１８６０．４ｍｇ／Ｌ〜２７９０．６ｍｇ／Ｌ，好ましくは２０９２．９５ｍｇ／Ｌ〜２５５８．０５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは２２０９．２２５ｍｇ／Ｌ〜２４４１．７７５ｍｇ／Ｌである。ピルビン酸ナトリウムの濃度は，０．００１ｍｇ／Ｌ〜２２０ｍｇ／Ｌ，好ましくは５０ｍｇ／Ｌ〜１７０ｍｇ／Ｌ，より好ましくは１００ｍｇ／Ｌ〜１２０ｍｇ／Ｌである。ピルビン酸ナトリウムは，基本培地中に含めず，後に添加してもよい。硝酸第二鉄９Ｈ２Ｏの濃度は，０．０４ｍｇ／Ｌ〜０．０６ｍｇ／Ｌ，好ましくは０．０４５ｍｇ／Ｌ〜０．０５５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは０．０４７５ｍｇ／Ｌ〜０．０５２５ｍｇ／Ｌである。硫酸銅５Ｈ２Ｏの濃度は，０．０００５ｍｇ／Ｌ〜０．０００７５ｍｇ／Ｌ，好ましくは０．０００５６３ｍｇ／Ｌ〜０．０００６８８ｍｇ／Ｌ，より好ましくは０．０００５９４ｍｇ／Ｌ〜０．０００６５６ｍｇ／Ｌである。硫酸第一鉄７Ｈ２Ｏの濃度は，０．１６６８ｍｇ／Ｌ〜０．２５０２ｍｇ／Ｌ，好ましくは０．１８７６５ｍｇ／Ｌ〜０．２２９３５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは０．１９８０７５ｍｇ／Ｌ〜０．２１８９２５ｍｇ／Ｌである。硫酸亜鉛７Ｈ２Ｏの濃度は，０．１７２８ｍｇ／Ｌ〜０．２５９２ｍｇ／Ｌ，好ましくは０．１９４４ｍｇ／Ｌ〜０．２３７６ｍｇ／Ｌ，より好ましくは０．２０５２ｍｇ／Ｌ〜０．２２６８ｍｇ／Ｌである。亜セレン酸ナトリウムの濃度は，０．０００６９２ｍｇ／Ｌ〜０．００３４８ｍｇ／Ｌ，好ましくは０．０００７７９ｍｇ／Ｌ〜０．００２９１ｍｇ／Ｌ，より好ましくは０．０００８２２ｍｇ／Ｌ〜０．００２６３ｍｇ／Ｌである。亜セレン酸ナトリウムは，基本培地中に含めず，後に添加してもよい。フェノールレッドの濃度は，５．２４８ｍｇ／Ｌ〜７．８７２ｍｇ／Ｌ，好ましくは５．９０４ｍｇ／Ｌ〜７．２１６ｍｇ／Ｌ，より好ましくは６．２３２ｍｇ／Ｌ〜６．８８８ｍｇ／Ｌである。
本発明の基礎培地に加えるＨＥＰＥＳの濃度は，２８５９．６ｍｇ／Ｌ〜４２８９．４ｍｇ／Ｌ，好ましくは３２１７．０５ｍｇ／Ｌ〜３９３１．９５ｍｇ／Ｌ，より好ましくは３３９５．７７５ｍｇ／Ｌ〜３７５３．２２５ｍｇ／Ｌである。ＮａＨＣＯ３の濃度は，１６００ｍｇ／Ｌ〜２４００ｍｇ／Ｌ，好ましくは１８００ｍｇ／Ｌ〜２２００ｍｇ／Ｌ，より好ましくは１９００ｍｇ／Ｌ〜２１００ｍｇ／Ｌである。
本発明のＥＳ細胞培養用培地を用いることにより，フィーダー細胞を用いることなく，ＥＳ細胞を未分化性を維持したまま成長させることができる。このため，種々の因子がＥＳ細胞の分化に及ぼす影響を再現性をもって調べることができる。また，ＥＳ細胞からの特定の細胞や臓器への分化条件を確立することがより容易になり，予め規定された経路に沿って試験菅内（あるいは生体外で）で分化させるようＥＳ細胞を誘導することが可能となる。したがって，本発明のＥＳ細胞培養用培地は，再生医療への応用に向けたＥＳ細胞の研究に有用である。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００３−４３４０３５号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】  以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
［実施例１］
基礎培地の調製
以下の表に示される組成の基礎培地（ＥＳＦ培地と称する）を作成し，定法にしたがって滅菌した。
0004657108.tif 000005
［実施例２］
ＥＳ細胞の培養および成長
ＥＳ細胞株としては，ＥＳ−Ｄ３（ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）を用いた。この細胞は，フィーダー細胞なしで培養することができるが，その場合には分化傾向を示すと言われている。ＥＳ−Ｄ３細胞は，最初は，０．１％ゼラチン被覆プレート（（Ｃｅｌｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｂｕｒｇ，ＮＪ）で，１５％ウシ胎児血清，Ｌ−グルタミン，０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール，ヌクレオシド，非必須アミノ酸，およびＬＩＦを補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＳ  ｍｅｄｉｕｍ；以下ＣＥＭと称する，Ｃｅｌｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｂｕｒｇ，ＮＪ）で維持した。ＣＥＭ培地の組成を以下に示す。
0004657108.tif 000006
７５ｃｍ２コーニング社プラスチックフラスコに０．１５ｍｇ／ｍｌのコラーゲンタイプＩ溶液を１０ｍｌ入れ，乾燥させないように１２時間処理し，細胞播種直前に溶液を吸引除去した。ＥＳＦ培地に６因子（１０μｇ／ｍｌウシインスリン，５μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン，１０μＭ  ２−メルカプトエタノール，１０μＭ  ２−アミノエタノール，１０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム，４μｇ／ｍｌ無脂肪酸ウシ血清アルブミンと複合体化したオレイン酸）ならびに３００ユニット／ｍｌのＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ（登録商標），Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）を添加した無血清培地（ＥＳＦ７培地）を調製した。継代時は，ダルベッコ氏リン酸緩衝液にて洗浄後，０．００１％トリプシン・０．０１％ＥＤＴＡにて細胞を１０秒から３０秒処理後，ピペッティングにて細胞を分散後，ＭＣＤＢ１５３溶液に溶解した０．１％トリプシンインヒビターにてトリプシンを中和し，ＥＳＦ培地で細胞を集めて，遠心後，細胞をＥＳＦ培地で分散，再度，遠心後，ＥＳＦ７培地に細胞を分散させた。コラーゲン被覆フラスコに，ＥＳＦ７培地中でＥＳ−Ｄ３細胞を５−７ｘ１０３／ｍｌの細胞密度で播種し，数日間培養したところ，接着性の弱い小型で境界が不明瞭でアルカリフォスファター活性陽性の細胞群がコロニーを形成して増殖した。
未分化表現型の判定は以下のようにして行った。細胞のアルカリホスファターゼ活性を検出するために，細胞を４．５ｍＭクエン酸，２．２５ｍＭクエン酸ナトリウム，３ｍＭ塩化ナトリウム，６５％メタノールおよび４％パラホルムアルデヒドで５分間固定し，洗浄し，次にＦａｓｔＲｅｄ基質キット（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ  Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて製造元の指針にしたがって，アルカリホスファターゼを可視化した。
ＯＣＴ３／４蛋白質発現を検出するためには，細胞をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で４℃で１６時間固定した。抗体とのインキュベートの前に，０．００２％トリプシンを室温にて５分処理して細胞の透過性を増加させ，切片をメタノール中３％Ｈ２Ｏ２で３０分間インキュベートすることにより内在性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。切片をマウス抗Ｏｃｔ３／４（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ）で免疫染色し，ペルオキシダーゼコンジュゲート化ＳｉｍｐｌｅＳｔａｉｎ  ＭＡＸＰＯ（登録商標）ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＮＩＣＨＩＲＥＩ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）および３−アミノ−９−エチルカルバゾールで可視化した。
Ｏｃｔ３／４発現のフローサイトメトリ分析を行うためには，ＥＳ細胞を，コラーゲンタイプＩで被覆した９０ｍｍプラスチックプレートでＥＳＦ７中で，およびＲＤ＋２ＭＥ＋ＦＢＳ中で，およびゼラチン被覆プラスチックプレートでＣＥＭ中で，３ｘ１０５細胞を播種した。培養第６日に，細胞をＰＢＳ中トリプシン／ＥＤＴＡでトリプシン処理し，次に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中１％パラホルムアルデヒドで１時間固定した。細胞をＰＢＳ中１％サポニン（Ｓｉｇｍａ）中で室温で１０分間処理して透過性を増加させた後，細胞を１ｍｌの１０％ヤギ血清（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ）中に３０分間懸濁し，遠心分離し，次に抗Ｏｃｔ３／４マウス抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｌａｒｔｏｒｉｅｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ）とともに１時間インキュベートした。細胞を１％ヤギ血清を含有するＰＢＳで３回洗浄し，次にフルオレセイン（ＦＩＴＣ）−コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）と３０分間反応させた。細胞を１％ヤギ血清を含有するＰＢＳで３回洗浄した。再懸濁した細胞をＥｐｉｃｓＡｌｔｒａ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏ．，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）で分析した。
コラーゲン被覆フラスコでＥＳＦ７培地中で５日間培養したＥＳ−Ｄ３細胞と，０．１％ゼラチン被覆フラスコでＣＥＭ中で５日間培養したＥＳ−Ｄ３細胞について，その細胞の形態を観察することにより表現型を比較した。ＥＳＦ７培地中で成長したほとんどのＥＳ細胞は未分化のままであった。しかし，ＣＥＭ中の培養物は，未分化細胞，線維芽細胞様細胞，上皮細胞様細胞および神経様細胞の混合物を含んでいた。ＥＳ細胞の未分化の性質は，通常は，幹細胞マーカー／Ｏｃｔ３／４に対する抗体で染色された細胞の比率を決定することにより確認される。免疫組織化学的染色により，ＥＳＦ７培地中のほとんどのＥＳ−Ｄ３細胞はＯｃｔ３／４蛋白質を発現していたが，ＣＥＭ中ではより少ない細胞がＯｃｔ３／４を発現していた。フローサイトメトリを用いて調べたところ，ＥＳＦ７培地中の９５％以上の細胞がＯｃｔ３／４蛋白質を発現していたが，ＣＥＭ中では８５％未満の細胞がＯｃｔ３／４を発現していた（図１）。１５％ＦＢＳおよび２−メルカプトエタノールを添加したＲＤ栄養培地中では，Ｏｃｔ３／４ポジティブ細胞のパーセンテージは６０％未満であった。
［実施例３］
ＬＩＦ濃度の影響
ＬＩＦがＥＳ−Ｄ３細胞の増殖に及ぼす影響を調べた。ＥＳ−Ｄ３細胞をタイプＩコラーゲンで被覆した２４−ウエルプレートでＥＳＦ６（ＥＳＦ＋６因子）で，およびＲＤ＋６Ｆ中で，およびゼラチンで被覆した２４−ウエルプレートでＤＭＥＭ＋１５％ＦＢＳ＋２−メルカプトエタノール中で，５ｘ１０３細胞／ウエルで播種した。ＬＩＦを各ウエルに０，１，１０，１００，５００，１０００ユニット／ｍｌで加えた。６日間培養した後に細胞をコールターカウンターで計数した。
ＬＩＦはＥＳ細胞の自己複製能および未分化性を維持するが，細胞の増殖には影響を及ぼさないことが知られている。しかしながら，図２に示されるように，ＥＳＦ６培地（黒丸）においては，ＬＩＦは明らかに濃度依存的様式でＥＳ細胞増殖を刺激した。一方，１５％ＦＢＳおよび２−メルカプトエタノールを補充したＤＭＥＭ（黒三角）中では，ＬＩＦは細胞増殖にはほとんど影響を及ぼさなかった。すなわち，本発明の化学合成無血清ＥＳＦ６培地を用いることにより，ＬＩＦのマウスＥＳ細胞に対するこれまでに知られていない活性を識別することが可能となった。
ＥＳＦ７培地からＬＩＦを除いた場合にも，ＥＳ−Ｄ３細胞の自発的分化は認められなかった。ＬＩＦの非存在下でＦＢＳを培地に加えると，ＥＳ−Ｄ３細胞は線維芽細胞様細胞，上皮様細胞，および神経様細胞に分化した。このことは，ＥＳ−Ｄ３細胞がＥＳＦ６培地中で未分化性を維持していたことを示す。
［実施例４］
ＥＳ細胞の細胞増殖
ＥＳ−Ｄ３細胞を，タイプＩコラーゲンで被覆した２４−ウエルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）にＥＳＦ７中で，およびゼラチンで被覆した２４ウエルプレートにＣＥＭ中で，１ｘ１０４細胞／ウエルで播種し，細胞増殖を比較した（図３）。ＥＳ−Ｄ３細胞はＣＥＭ中でよく増殖した（黒三角；Ｔｄ＝９時間）。ＥＳ−Ｄ３細胞はＥＳＦ７培地中ではＣＥＭ中よりゆっくりと増殖したが（黒丸；Ｔｄ＝１１．８時間），第６日における細胞密度はいずれの培地についてもほとんど同じであった。ＥＳ−Ｄ３細胞をＥＳＦ７培地中で１年以上継続して培養しても，細胞はその形態を変化させず，アルカリホスファターゼ活性，Ｏｃｔ３／４およびＳＳＥＡ−１を発現し続けた。
［実施例５］
ＥＳ  １２９Ｓｖ細胞の培養
ＥＳＦ７培地がＥＳ  １２９Ｓｖ細胞の培養に及ぼす影響を調べた。１０代継代目の凍結１２９／ＳＶＥＳ細胞（Ｃｅｌｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｂｕｒｇ，ＮＪ）を購入し，これをフィーダー細胞上でＣＭＥ中で維持した。１２９／ＳＶＥＳ細胞をタイプＩコラゲナーゼを含むＰＢＳ中でピペッティングし，ＥＳＦ７培地（２０００ユニットのＬＩＦ／ｍｌ）でフィーダー細胞なしでコラーゲン被覆フラスコに接種した。ＥＳ  １２９Ｓｖ細胞はゆっくり増殖し，神経様細胞も出現した。しかし，アルカリホスファターゼ活性およびＯｃｔ３／４抗体を用いる免疫組織学的発現の測定からＥＳ  １２９Ｓｖ細胞がＥＳＦ７培地中で分化することなく増殖したことがわかった。すなわち，本発明のＥＳ細胞培養用培地を用いることにより，通常はフィーダー細胞上で増殖するＥＳ細胞もフィーダー細胞なしで増殖することが示された。ただし，継代時は，トリプシンＥＤＴＡではなく，０．３ユニット／ｍｌのコラゲナーゼタイプＩＡ−Ｓを用いて，細胞を分散させた。
［実施例６］
ＢＭＰ４，アクチビンＡならびにＦＧＦ−２による分化誘導
ＥＳ−Ｄ３細胞を，ＥＳＦ７中でラミニン被覆プラスチックプレートに接種し，２日間培養した。次に，培地をＲＤ＋５Ｆ培地（５因子を補充したＲＤ）に交換した。ＲＤ培地は非ＥＳ細胞タイプについて一般に用いられている無血清合成培地用の基本培地である。ＢＭＰ４の添加のためには，ＲＤ＋５Ｆ培地にｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｆｒｅｅ−ＢＳＡを補充した。
アクチビンＡをＲＤ＋５Ｆに加えると，ＥＳ−Ｄ３細胞の線維芽細胞様細胞への分化が誘導された。ＢＭＰ４をｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｆｒｅｅ−ＢＳＡ（無脂肪酸ウシ血清アルブミン）を補充したＲＤ＋５Ｆに加えると，ＥＳ細胞は上皮様細胞に分化した。これらの結果は，ＥＳ−Ｄ３細胞が成長因子に応答して，特定の経路に沿って分化するよう誘導されうることを示す。ＥＳ−Ｄ３細胞を，ＥＳＦ７中でラミニン被覆プラスチックプレートに接種し，２日間培養した。次に，培地をＥＳＦ５に交換した。ＢＭＰ４の添加のためには，ＥＳＦ５にｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｆｒｅｅ−ＢＳＡ（無脂肪酸ウシ血清アルブミン）を補充した。あるいは，ＥＳ−Ｄ３細胞を，培地をＥＳＦ５を用いて，ラミニン被覆プラスチックプレートに接種し，ＢＭＰ４ならびにｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｆｒｅｅ−ＢＳＡを添加して培養を行う。培地は２日毎に交換した。あるいは，ＥＳ−Ｄ３細胞を，培地をＥＳＦ５を用いて，ラミニン被覆プラスチックプレートに接種し，ＦＧＦ−２ならびにヘパリン，あるいは，ＦＧＦ−２とヘパリンとＮＧＦ，あるいは，ＦＧＦ−２とヘパリンとＰＤＧＦ−ＡＡを添加し，１日培養後，それぞれ漕辱因子のみ添加し，さらに培養２日目に培地をＥＳＦ５に培地交換し，培養を行った。培地は２日毎に交換した。
アクチビンＡをＥＳＦ５に加えると，ＥＳ−Ｄ３細胞の線維芽細胞様細胞への分化が誘導された。ＢＭＰ４をｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｆｒｅｅ−ＢＳＡ（無脂肪酸ウシ血清アルブミン）を補充したＥＳＦ５に加えると，ＥＳ細胞は上皮様細胞に分化した。ＦＧＦ−２とヘパリン，あるいはさらにＮＧＦ，あるいはＰＤＧＦ−ＡＡをＥＳＦ５に加えると，神経様細胞に分化した。これらの結果は，ＥＳ−Ｄ３細胞が成長因子に応答して，特定の経路に沿って分化するよう誘導されうることを示す。
［実施例７］
ＥＳ  Ｃ５７／ＢＬ６Ｊ  ＥＳ細胞の培養
ＥＳＦ７培地が  Ｃ５７／ＢＬ６Ｊ  ＥＳ細胞の培養に及ぼす影響を調べた。１０代継代の凍結Ｃ５７／ＢＬ６Ｊ  ＥＳ細胞（Ｃｅｌｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｂｕｒｇ，ＮＪ）を購入し，これをフィーダー細胞上でＣＭＥ中で維持した。  Ｃ５７／ＢＬ６Ｊ  ＥＳ細胞をＰＢＳのみにて，あるいはタイプＩコラゲナーゼを含むＰＢＳ中でピペッティングし，ＥＳＦ７培地（３０００ユニットのＬＩＦ／ｍｌ）でフィーダー細胞なしでコラーゲン被覆フラスコに接種した。Ｃ５７／ＢＬ６Ｊ  ＥＳ細胞は未分化なコロニーを作り，ゆっくり増殖した。すなわち，本発明のＥＳ細胞培養用培地を用いることにより，通常はフィーダー細胞上で増殖するＥＳ細胞もフィーダー細胞なしで増殖することが示された。
産業上の利用性
本発明にしたがう培地を用いることにより，フィーダー細胞なしで，未分化性を維持したままＥＳ細胞を長期に無血清培養することができるため，ＥＳ細胞の成長および分化誘導に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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