(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブ固定担体と試料の反応場としての密閉可能な反応室を有する反応装置において、
前記反応室の温度を検知する温度検知手段と、
前記温度検知手段で検知した温度に基づいて前記反応室の温度を調節する温度調節手段と、
前記反応室の圧力を検知する手段と、
前記圧力検知手段で検知した圧力に基づいて前記反応室の圧力を調節する圧力調節手段と、
前記反応室内の気泡体積を算出する気泡体積算出手段と、
前記気泡体積算出手段で算出された気泡体積が所定値以下である場合に反応環境が良であると判定する、前記反応室の反応環境の良否を判定するための良否判定手段と、を有し、
前記気泡体積算出手段が、前記圧力調節手段により前記反応室内を所定圧に加圧するまでに必要とされる圧力に基づいて該反応室の気泡体積を算出することを特徴とする反応装置。
【請求項２】
前記圧力調節手段がシリンジポンプを有し、該シリンジポンプの有するシリンジの移動距離を利用して下記式（１）：
【数１】
0004732135.tif 000003
（上記式中、ｘはシリンジポンプと前記反応室内と連通する圧力検知部に残存する気体の体積［ｍｍ3］、Ｖは反応室内に含まれる気体の量［ｍｍ3］、ｐは所定の圧力［atm］、ｄはシリンジポンプの断面積［ｍｍ2］、Ｌはシリンジポンプのシリンジ移動距離［ｍｍ］を表す。）
により前記気体量を算出する請求項１に記載の反応装置。
【請求項３】
前記反応環境の良否の判定が以下の工程：
（Ａ）前記反応室内の気泡体積が予め設定された基準以下であれば、反応環境が「良」と判定する、
（Ｂ）前記反応室内の気泡体積が予め設定された基準を超える場合で、加圧により反応環境を改善できる場合に、「改善可」と判定する、
（Ｃ）前記反応室内の気泡体積が予め設定された基準を超える場合で、加圧によっても反応環境を改善できない場合に、「改善不可」と判定する、
のいずれかによって行われる請求項１〜２のいずれかに記載の反応装置。
【請求項４】
前記反応環境としての圧力が１気圧を超え、１０気圧以下に設定されている請求項３に記載の反応装置。
【請求項５】
前記試料中に前記プローブと結合する標的物質が存在する場合に、前記反応室内での前記プローブと反応した標的物質の有無あるいは量を検出する手段を更に備える請求項１〜４のいずれかに記載の反応装置。
【請求項６】
前記プローブと前記標的物質との反応を蛍光標識を利用して検出するための、蛍光標識を励起する手段と、蛍光を検出する手段と、を更に有する請求項１〜５のいずれかに記載の反応装置。
【請求項７】
前記プローブと標的物質との反応が、核酸間のハイブリダイゼーション反応である請求項１〜６のいずれかに記載の反応装置。
【請求項８】
前記プローブ固定担体が、多数のプローブを所定の配置で基板上に配列したプローブ固定担体である請求項１〜７のいずれかに記載の反応装置。
【請求項９】
反応室内に配置したプローブ固定担体に試料を反応させて、該試料中での標的物質の有無または含有量を測定する標的物質の測定方法において、請求項１〜８のいずれかに記載の反応装置を用いることを特徴とする標的物質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プローブ固定基板と標的物質とを反応させる自動ハイブリダイゼーション反応装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年マイクロアレイ、DNAチップ等の試験片を用いた遺伝子解析が行なわれている。
【０００３】
この方法で用いられる試験片は、スライドガラスやシリコン基板などからなる基板を用い、その表面に多数の生体分子が検出体としてマトリクス状に配置固定されたものである。この試験片上の検出体としては核酸プローブなどが利用される。核酸プローブを固定した試験片と蛍光標識を付した検体DNAを反応条件下におくと、検体に核酸プローブとハイブリダイズする核酸分子（標的物質）が含まれていれば、試験片に蛍光標識が標的物質を介して固定される。そして試験片上のどこに蛍光標識が存在するかを検出することにより、核酸プローブとハイブリダイズした検体ＤＮＡの種類を特定することができる（特許文献１参照）。
【０００４】
図４はDNAチップを用いた従来のハイブリダイゼーションの説明図である。DNAチップ１０８上に注入口１０４より検体DNAを含む液体が注入され、検体DNAはDNAチップ１０８上の各DNAスポット上に拡散する。その後ハイブリダイゼーションを行ない、図示しない手段により蛍光検出を行なっている。
【０００５】
ところが検体を含む液体を注入したときにＤＮＡ固定部分上に空気が残存したり、またハイブリダイゼーション中にかける温度などにより液体中に溶存している気体が気泡として発生したりすると、その部分はプローブと標的物質とが反応しない場合が起こりえる。このような場合、プローブと標的物質がハイブリダイゼーション反応できる状態にあったか否かを判断することができず、正しい検査を行なうことが出来ないという問題がある。
【０００６】
これに関して、特許文献２では、可撓カバーを備えた基板を使用して、多数のオリゴヌクレオチド結合部位を有する基板層上で核酸ハイブリダイゼーション反応を行なう装置が公開されている。
【０００７】
特許文献３は、密閉可能であり、その内部に被処理物を設置する処理部を備える処理槽と、処理部の温度調整手段と、処理槽内の圧力の検出手段と、処理槽内の湿度を保つための保湿液を供給する保湿液供給手段と、を有する被処理物の処理装置を開示している。この処理装置では、加温した時の内圧を測定することで、密閉性や処理部に残存する空気を検出したりしている。しかし、この方法では微少な気泡を検出することは精度的に困難であった。
【特許文献１】特開平１１−１８７９００号公報
【特許文献２】特表２００３−５２０９７２号公報
【特許文献３】特開２００３−０５７２５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、簡易な構造で、反応前にプローブ固定担体のプローブ部分への気泡の影響がなく、プローブと試料との信頼性の高い反応を行うことにより精度良い検査が可能となる反応装置を提供することにある。本発明の他の目的は、反応室内の気体量に基づいて反応環境の良否を判定できる反応装置を提供することにある。本発明の他の目的は、反応の際に必要となる温度によって溶液中の残存気体が気泡として発生し、反応に悪影響を及ぼす可能性をなくすことにある。本発明の他の目的は、これらの装置を用いた標的物質の測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の反応装置は、
プローブ固定担体と試料の反応場としての密閉可能な反応室を有する反応装置において、
前記反応室の温度を検知する温度検知手段と、
前記温度検知手段で検知した温度に基づいて前記反応室の温度を調節する温度調節手段と、
前記反応室の圧力を検知する手段と、
前記圧力検知手段で検知した圧力に基づいて前記反応室の圧力を調節する圧力調節手段と、
前記反応室内の気泡体積を算出する気泡体積算出手段と、
前記気泡体積算出手段で算出された気泡体積が所定値以下である場合に反応環境が良であると判定する、前記反応室の反応環境の良否を判定するための良否判定手段と、を有し、
前記気泡体積算出手段が、前記圧力調節手段により前記反応室内を所定圧に加圧するまでに必要とされる圧力に基づいて該反応室の気泡体積を算出することを特徴とする反応装置である。
【００１０】
本発明の標的物質の測定方法は、反応室内に配置したプローブ固定担体に試料を反応させて、該試料中での標的物質の有無または含有量を測定する標的物質の測定方法において、
上記構成の反応装置を用いることを特徴とする標的物質の測定方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る反応装置によれば、反応前にプローブ固定担体上に液体試料を注入した際のプローブ固定領域での反応への気泡の影響の有無を判定することができる。この判定に基づいて、プローブ固定領域と標的物質との反応を確実に行うことができ、精度の良い検査を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。本発明のプローブ固定担体としては、標的物質と特異的に結合可能なプローブが固定化されたプローブ固定担体であれば特に限定なく利用できる。なお、以下では特に断りのない限り、プローブとしてオリゴヌクレオチドが固定されたＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーション装置を例に挙げて説明する。本発明は、抗原と抗体の一方を標的物質とし、他方をプローブとする場合や、特異的に結合し得る２つの物質（例えばタンパク質）の一方を標的物質とし、他方をプローブとする場合等に適用でき、標的物質及びプローブともに核酸である場合に限定されない。
【００１３】
図１及び図２は本発明のハイブリダイゼーション装置の概略図を示している。ＤＮＡチップに代表されるプローブが固定された基板と標的物質の反応場（１０３）を形成する反応室にはシリンジポンプなどのような加圧装置（１０１）と圧力センサー（１０２）が接続され、反応場はヒーターやペルチェなどから構成される温調（１０６）によって温度調整されうる。加圧装置と圧力センサー、温調は制御部（１０５）に接続されている。反応場を含む反応室は密閉可能な構造を有する。液体試料は注入口（１０４）から反応場に注入され、反応室内に充填される。反応室の温度は温度センサーなどの温度検知手段（不図示）により検知され、そのデータに基づいて温度調節手段としての温調（１０６）により反応室内の温度を所定の温度（温度範囲）に調節する。反応室内の圧力は、圧力検知手段である圧力センサーで検知され、そのデータに基づいて加圧装置（１０１）による圧力の付加により調節できる。温度調節のためのヒータや冷却装置（不図示）は制御部（１０５）からの指示により動作可能に設けられ、また圧力調節も制御部（１０５）からの指示により行われる。
【００１４】
反応場は例えば、ＤＮＡチップの基板と、隔壁となるＯリング（１０７）、天板から構成することができる。天板には液体試料を注入する注入口、圧力センサー、加圧装置につながる流路、必要によって図示されていないハイブリダイゼーション反応終了後の洗浄液を注入する注入口（標的物質の注入口と兼ねてもよい）や、排出口を設けても良い。
【００１５】
ＤＮＡチップ（１０８）を本装置にセット後、ＤＮＡチップとＯリングとを確実に密着させ、液漏れがなくなるように、ＤＮＡチップと天井部とに圧力をかけ、加温することが好ましい。好ましくは５０℃乃至は７０℃に加温し、そのまま１乃至は５分程度放置する。なお、この操作の実行の有無、温度あるいは時間は特に限定されるものではない。
【００１６】
続いて、液体試料を注入口から注入し（図５フローチャートのS1）、注入口その他の部分を密閉する（図５フローチャートのS2）。測定対象の標的物質に二重らせんのＤＮＡが含まれる場合、これを解離させるために温度をかけ、ディネーチャーを行なうことが好ましい（図５フローチャートのS3）。好ましくは、融解温度（Ｔｍ）以上の温度、具体的には８０℃乃至は９５℃程度にし、１分乃至は１０分間放置、あるいは攪拌する。なお、ディネーチャーの実行の有無、温度あるいは時間は特に限定されるものではない。
【００１７】
次に後述するハイブリダイゼーション反応を行なう温度にする。プローブあるいは標的物質によって温度は異なるが、好ましくは３０℃乃至は６０℃が好ましい。また、ハイブリダイゼーション反応の時間は、プローブ、標的物質あるいはそれらの濃度などによっても異なるが、１０分乃至２４時間行なうことが好ましい。特に１塩基ミスマッチの検出には、温度を高めにし、ハイブリダイゼーション時間を長めにすることが好ましい。なお、ハイブリダイゼーション反応の条件は特に限定されるものではない。
【００１８】
上述したディネーチャーやハイブリダイゼーションの温度に昇温すると、標的物質を含む水性媒体に溶解されていた気体が気泡となって現れることがある。したがってディネーチャーを前記反応場以外で行なっておく事が好ましく、また予め真空脱気あるいは超音波脱気を行なってから反応場に注入することが好ましい。
【００１９】
しかし、これらの操作を行なっても反応場に現れる気泡を完全になくすことは難しい。また、反応場で現れる気泡の他に、液体試料を注入する際に、予め反応場に入っている空気が残ってしまうこともある。（以下、発生した気泡、残った気体を気泡と呼ぶ。）
この気泡（１１０）が、図３で示したようにプローブが固定されたエリア上に位置（１１０(a)）すると、ハイブリダイゼーション反応が正常に進行しない。しかも、このような気泡は少々の攪拌では移動しない。したがって、この気泡が発生したかを検査する必要がある。すなわち、反応場における反応環境の良否を判定する必要がある。
【００２０】
本発明では、反応場に圧力をかけ、いわゆるベイパーロック現象を利用してこの気泡の有無を検査し、その量が少ない場合にはそのまま圧力をかけて気泡を充分小さくした状態でハイブリダイゼーションを行なう。
【００２１】
具体的には、加圧装置にシリンジポンプを用いた場合、圧力センサーにて圧力を測定しながら加圧する。所定の圧力に達した時のシリンジポンプの移動量から、気体の量を算出する。
【００２２】
シリンジの断面積をｄ［ｍｍ2］、シリンジポンプと圧力センサーの部分に残る残存気体の体積をｘ［ｍｍ3］、所定の圧力をｐ［ａｔｍ］、シリンジの移動距離をＬ［ｍｍ］、気泡の体積をｖ［ｍｍ3］とする。これらより、シリンジを動かした時の気体の体積の変化量はｄＬ［ｍｍ3］となる。この時、残存気体の体積ｘ［ｍｍ3］と気泡の体積Ｖ［ｍｍ3］の和（総気体量）は、圧力ｐによって凝縮し、（ｘ＋Ｖ）／ｐ［ｍｍ3］となり、したがって体積の変化量は（ｐ−１）（ｘ＋Ｖ）／ｐ［ｍｍ3］となる。これらから以下の式（１）が成り立つ。
【００２３】
【数１】
0004732135.tif 000002
【００２４】
気泡の検出能はシリンジの移動量が大きいほど高くなる。したがって、Ｌの値を大きくすることができれば検出能が上がると言うことである。よって、シリンジの断面積が小さく、所定の圧力が高く、シリンジポンプと圧力センサーの部分に残る残存気体の体積が小さいほど、気泡の検出能が高くなる。
【００２５】
例えば、シリンジポンプと圧力センサーの部分に残る残存気体の体積が３９．２５ｍｍ3であって、断面積が７．８５ｍｍ2のシリンジを用いて、１０ａｔｍに達するシリンジの移動距離が、反応場に気泡が一切ない系では４．５ｍｍである。実際ハイブリダイゼーションを行なった際に測定すると、シリンジポンプが４．６ｍｍ移動した場合に圧力が１２．５ａｔｍとなった場合は、ほとんど気泡がないことを示す。そこでこのような場合には、反応環境を「良」として、反応を進行させるための温度や圧力にかかる条件を反応場に付与する（S7〜S8）。図５のＳ７の減圧は、好ましくはシリンジポンプを加圧前の初期位置に戻す操作により圧力をシリンジポンプでの加圧前の状態に戻すことによる減圧操作である。試料溶液の注入操作を大気圧下（例えば1気圧）で行った場合は、反応場の圧力は大気圧まで減圧される。そこで、図５のS８のハイブリダイゼーションを行うときの圧力は好ましくは試料液の注入時の大気圧（例えば、１気圧またはその周辺の圧力）である。
【００２６】
２つめの例として、１０ａｔｍに達するのにシリンジポンプが４．６ｍｍ移動した場合を例にとる。この場合は、０．８７ｍｍ3の気泡が残っていることになる。反応場の厚さ（高さ）が５００μｍであり、気泡が完全な円柱状であると仮定した場合、気泡の面積は１．７４ｍｍ2である（ただし、温度による体積あるいは圧力への影響を無視した場合）。
【００２７】
液体試料の物性（例えば、粘性や表面張力など）や、基板の物性（例えば濡れ性）、反応場のサイズ、ディネーチャーの温度、溶存気体量などにもよるが、直径が２０乃至４００μｍの気泡が、０．０１乃至１０個／１ｍｍ2程度発生する。
【００２８】
例えば反応場に４０個の気泡が発生した場合、上記の計算結果から総気体体積が０．８７ｍｍ3であるから、１個あたりの気泡の体積は平均０．０２１７５ｍｍ3となり、平均半径は、約１１８μｍとなる。
【００２９】
プローブを基板に付与する方法はインクジェット法、ピン法など公知の方法を用いることができるが、例えばピン法を用いた場合、一般には１００乃至２５０μｍのスポットが形成できる。したがって、スポット径が１００μｍである場合、気泡の大きさはスポット径を上回る。すなわち気泡がプローブ上に位置すると、ハイブリダイゼーション反応は不良であることになる。
【００３０】
このように、本発明を利用することで、ハイブリダイゼーション反応が不良になるかどうかの判定ができる（図５フローチャートのS6〜S12）。
【００３１】
具体的には、以下の判定を行うことができる。
（Ａ）前記反応室内の気体量が予め設定された基準以下であれば、反応環境が「良」と判定する。
（Ｂ）前記反応室内の気体量が予め設定された基準を超える場合で、加圧により反応環境を改善できる場合に、「改善可」と判定する。
（Ｃ）前記反応室内の気体量が予め設定された基準を超える場合で、加圧によっても反応環境を改善でききない場合に、「改善不可」と判定する。
【００３２】
この場合、上述した方法で１０ａｔｍまで反応室を加圧すると、反応室内の気泡体積は０．８７ｍｍ3から０．０８７ｍｍ3まで圧縮されると考えられる。ところが個々の気泡の基板上の面積を見ると、１／１０2/3とならずに、１／１０となる場合もある。前者は図４の１１０（ｄ）の場合であり、後者は１１０（ｃ）のような状態である。１１０（ｄ）の場合は、ハイブリダイゼーション反応に於いて、プローブと標的物質の反応を阻害しない。
【００３３】
一方、１１０（ｃ）の場合では気泡の径（基板の面方向）が大きいと、これまで述べてきたようにハイブリダイゼーション反応に影響が及ぶ。ところが上記の１０ａｔｍまでの加圧のように気泡体積が０．０８７ｍｍ3まで圧縮されおり、全ての気泡が１１０（ｃ）の状態だと仮定すると、気泡の半径は１／１０(1/2)乃ち、約３７．２μｍとなる。したがって、スポット径が１００μｍ上のスポット上に気泡が発生したとしてもハイブリダイゼーション反応への影響は軽微となる。このようにすることで、圧力をかけたままハイブリダイゼーション反応をすることで、気泡の影響を抑えることが可能かどうかの判断が可能となる（図５フローチャートのS9〜S11）。
【００３４】
加圧下でプローブ固定担体と試料とを反応させる際の圧力は、１気圧（atm）を超え１０気圧以下の範囲で気泡の影響を排除可能な値に設定されることが好ましい。
【００３５】
反応室を加圧しても反応環境の改善ができない、すなわち、加圧してもハイブリダイゼーション反応への気泡の影響を排除できないほどの量の気泡が反応場に存在していると判定された場合は、反応の進行を中止するための警告やエラー表示を行うことができる（図５のS12）。また、必要に応じて、反応の開始や反応の自動停止を行うようにしてもよい。
【００３６】
反応室内の気体量（またはシリンジの移動距離について予め設定した基準を設け、その基準を用いて図５の各工程S1〜S12を行うためのプログラムにより制御部１０５を作動させることで、反応を自動化することができる。このプログラムは、制御部１０５に用いるコンピュータに記憶させておいてもよいし、読み取り可能な媒体に記録して、利用時にコンピュータに読み取らせて利用してもよい。
【００３７】
また、本発明を用いれば、密閉度の検査も可能である。すなわち所定の圧力をかけ、ある一定時間後に内圧を再測定し、圧力が低下していれば密閉が保たれていないことになる。この場合、ハイブリダイゼーションを続行すれば、液体試料に含まれる媒体が蒸発し濃度が変わってしまったり、または媒体自体が反応場から漏れだしてしまう。この場合、ハイブリダイゼーション反応の不良として停止させることができる。
【００３８】
さらにハイブリダイゼーション反応終了後、自動的に結果を検出させる機能を反応装置に付与しておくことも好ましい。例えば、ハイブリダイゼーション終了後、緩衝溶液、水などで未反応の標的物質を洗い流し、乾燥させ、検出する。乾燥させやすくするため、メタノールやエタノールのような揮発しやすく、また水と任意の比率で混合される液体で洗浄液を置換してもよい。
【００３９】
検出は、プローブが固定されている面（表面）もしくは裏面から行なっても良い。標的物質に含まれる蛍光色素を検出する場合は、例えば図６に示したように、励起光となる波長のレーザーをレーザー光源（１１１）から出力し、これをビームエキスパンダー（１１２）でビーム径を拡張し、ダイクロイックミラー（１１４）で反射される。ダイクロイックミラーは、標識としての蛍光色素の種類によって適時好適な物を選ぶことができる。
【００４０】
また、ダイクロイックミラー（１１４）は、例えばガルバノによってDNAチップ上の読み取りたい位置に反射させることができる。そしてｆθレンズ（１１３）によって集光し、その部分に蛍光色素で標識された標的物質がある場合には、蛍光が発生する。この蛍光は、ｆθレンズ（１１３）を通り、ダイクロイックミラーは（１１４）を通過し、バンドパスフィルター（１１５）を通過し、集光レンズ（１１６）で集光されて光電子増倍管（１１７）に入る。光電増倍管で検出された信号は、不図示のマイクロコンピュータに集められ、位置情報と併せて、各スポットそれぞれの蛍光強度として処理される。
【００４１】
蛍光色素としては、例えばＤＮＡへの標識を例に挙げると、励起波長が５３２ｎｍのＣｙ３や、同じく６３３ｎｍのＣｙ５などが用いられる。
【００４２】
なお、ここで示した検出装置および蛍光色素は一例であり、これに限定される物ではない。また、上記の例では、プローブ及び標的物質ともにDNAであり、反応がハイブリダイゼーション反応である場合について説明したが、本発明はこれに限定されない。本発明の反応装置は、DNA−DNA以外の形態のハイブリダイゼーション反応や、抗原抗体反応、あるいは酵素活性反応を行うプローブと標的物質との反応のための反応装置としても利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ハイブリダイゼーション装置の概略図である。
【図２】ハイブリダイゼーション装置の反応場の構成を示す図である。
【図３】プローブ固定エリア上に気泡が発生した場合の模式図である。
【図４】気泡の断面図である。
【図５】ハイブリダイゼーションまでのフローチャートである。
【図６】蛍光標識を用いたハイブリッド体の検出に用いる検出系の一例を示す図である。
【符号の説明】
【００４４】
１０１  加圧装置
１０２  圧力センサー
１０３  反応場
１０４  標的物質注入口
１０５  制御装置
１０６  温調
１０７  Ｏリング
１０８  ＤＮＡチップ
１０９  プローブ
１１０  気泡（あるいは残存気体）
１１１  レーザー光源
１１２  ビームエキスパンダー
１１３  ｆθレンズ
１１４  ダイクロイックミラー
１１５  バンドパスフィルター
１１６  集光レンズ
１１７  光電子増倍管
【図１】
0004732135.tif 000004
【図２】
0004732135.tif 000005
【図３】
0004732135.tif 000006
【図４】
0004732135.tif 000007
【図５】
0004732135.tif 000008
【図６】
0004732135.tif 000009