(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
煮豆から納豆に至るまでの発酵過程における、別に添加したフィチン酸を含むフィチン酸の分解を抑制して、フィチン酸を高含有させたことにより、納豆の硬度を低下させたことを特徴とする食感の軟らかいフィチン酸高含有納豆。
【請求項２】
フィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子を欠損させた納豆菌株、又はフィチン酸分解酵素の活性が失活若しくは低下した納豆菌株を用いて納豆を製造することにより、納豆の発酵過程における、別に添加したフィチン酸を含むフィチン酸の分解を抑制して、フィチン酸を高含有させた、請求項１に記載の食感の軟らかいフィチン酸高含有納豆。
【請求項３】
上記フィチン酸が、原料大豆由来フィチン酸と、別に添加したフィチン酸から構成される、請求項１又は２に記載の食感の軟らかいフィチン酸高含有納豆。
【請求項４】
フィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子を欠損させた納豆菌株、又はフィチン酸分解酵素の活性が失活若しくは低下した納豆菌株を用いて納豆を製造することにより、納豆の発酵過程における原料大豆由来フィチン酸及び別に添加したフィチン酸の分解を抑制して、フィチン酸を高含有させることにより、発酵過程における豆の軟化率を高め、納豆製造における容器への煮豆充填適正の向上、発酵後の納豆加工適正の向上、及び軟らかい食感の付与を行うことを特徴とする食感の軟らかいフィチン酸高含有納豆の製造方法。
【請求項５】
フィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子を欠損させた納豆菌株を用いて納豆を製造する、請求項４に記載の食感の軟らかいフィチン酸高含有納豆の製造方法。
【請求項６】
フィチン酸分解酵素の活性が失活又は低下した納豆菌株を用いて納豆を製造する、請求項４に記載の食感の軟らかいフィチン酸高含有納豆の製造方法。
【請求項７】
上記フィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子を欠損させた納豆菌株が、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５４である、請求項４又は５に記載の食感の軟らかいフィチン酸高含有納豆の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、煮豆から納豆に至るまでの発酵過程において、豆の軟化率を高めると共に、食感が軟らかく、フィチン酸を高含有させた納豆の製造方法及びその製品に関するものであり、更に詳しくは、フィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子を欠損させた納豆菌株等を用いて、納豆の発酵過程におけるフィチン酸の分解を抑制し、フィチン酸を高含有させた納豆を製造する方法及びそのフィチン酸高含有納豆製品に関するものである。本発明は、納豆の発酵過程でフィチン酸を分解させないことにより、発酵時の豆の軟化率を向上させ、納豆製造における容器への煮豆充填適正の向上、発酵後の納豆加工適性の向上を可能とするフィチン酸高含有納豆の製造方法、及び、食感が軟らかく、フィチン酸の機能性が付与された納豆製品を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
日本で古来より食されてきた納豆は、近年、工場の機械化により、その製造工程の自動化が進んでいる。納豆製品は、一般に、清浄した原料大豆を水に浸漬した後、蒸煮し、これに納豆菌を接種した後、これを所定の容器に充填し、所定の発酵工程を経て製品化されている。
【０００３】
大豆は、浸漬・蒸煮・発酵の各工程において軟化し、最終的には快適に食することが可能なまでの硬さになる。その中でも、蒸煮工程における軟化率が最も高く、納豆の硬さを決めるのは、蒸煮に依るところが大きい。しかし、その一方、蒸煮した後の煮豆を容器に充填する際、より硬いものの方が充填適正が良く、蒸煮工程では軟らかくし過ぎず、発酵工程で軟らかくすることが納豆製造の効率化に繋がると考えられる。
【０００４】
しかし、蒸煮工程で軟化を抑制し、発酵工程で軟化を向上させる有効な方法は、今まで報告が無く、従来法では、発酵時間の延長、あるいは接種する納豆菌の量を増やすなど、発酵度合いを大きくすることで納豆製品を軟らかくする方法が試みられていた。
【０００５】
このように、発酵工程での豆の軟化率を向上させるために、発酵度合いを大きくするなどの方法が試みられているが、この種の方法では、発酵し過ぎになるため、納豆製品としては、品質が悪くなり、好まれるものではなかった。
【０００６】
従来、大豆を軟化、あるいはその硬度を調節する先行技術として、例えば、大豆を用いた納豆等の食品を製造する際、原料大豆をより柔らかくし、テクスチャーの異なった食品を提供するために、大豆を浸漬する際に、尿素もしくは、炭酸ナトリウム水溶液で１夜浸漬し、加圧蒸煮する大豆の軟化方法（特許文献１）、また、硬度を自由に制御できる納豆の製法として、浸漬大豆に予め浸漬等の処理を行った穀類を添加して、混合し、これを蒸煮した後、納豆菌を接種して発酵させる納豆の製造方法（特許文献２）、が提案されている。
【０００７】
また、フィチン酸に関するものとして、例えば、大豆蛋白にフィチン酸分解酵素を反応させることからなるフィチン酸が低減された大豆タンパク質の製造方法（特許文献３）、また、加熱処理された大豆蛋白溶液をフィチン酸分解酵素で処理する工程、及び処理した大豆蛋白溶液を凝固剤を用いることなく凝固させる工程からなる豆腐様食品素材の製造方法（特許文献４）、が提案されている。
【０００８】
更に、他の先行技術として、例えば、未変性あるいは低変性蛋白にフィチン酸分解酵素を反応させる大豆蛋白の製造方法（特許文献５）、大豆蛋白質にフィチン酸分解酵素を作用させて得られる低フィチン酸の大豆蛋白質（特許文献６）、ゴマのフィチン酸分解酵素処理物を含有する食品（特許文献７）、が提案されている。
【０００９】
このように、原料大豆に軟化剤や特定の成分を添加して製品を軟化させることは種々提案されており、また、原料にフィチン酸分解酵素を作用させて低フィチン酸食品を製造することも種々報告されているが、フィチン酸の分解を抑制して、豆の軟化率を向上させると共に、フィチン酸を高含有させた納豆製品は、未だその開発例は報告されていない。
【００１０】
【特許文献１】特開平７−１７７８６０号公報
【特許文献２】特開２００１−１２０２１２号公報
【特許文献３】特開２０００−３００１８５号公報
【特許文献４】特許第３６５４２４５号公報
【特許文献５】ＷＯ  ００／６２６２３
【特許文献６】特開２００２−２６２８３８号公報
【特許文献７】特開２００５−１５１９３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このような状況下にあって、本発明者らは、納豆製品とフィチン酸との関係について種々研究を進める中で、フィチン酸が納豆の硬度に影響を与えることを見出し、鋭意研究を積み重ねた結果、フィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子欠損納豆菌株等を用いて納豆を製造することにより、フィチン酸を増加させ、納豆の硬度を劇的に低下させることができるとの新規知見を見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。本発明は、煮豆から納豆に至るまでの発酵過程において、豆の軟化率を高めると共に、納豆製造における容器への煮豆充填適正の向上、発酵後の納豆加工適性の向上を可能とするフィチン酸高含有納豆の製造方法、該方法で使用するためのフィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子を欠損させた納豆菌株等の新規納豆菌株、及び食感が軟らかく、フィチン酸の機能性を付与したフィチン酸高含有納豆製品を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）煮豆から納豆に至るまでの発酵過程における、別に添加したフィチン酸を含むフィチン酸の分解を抑制して、フィチン酸を高含有させたことにより、納豆の硬度を低下させたことを特徴とする食感の軟らかいフィチン酸高含有納豆。
（２）フィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子を欠損させた納豆菌株、又はフィチン酸分解酵素の活性が失活若しくは低下した納豆菌株を用いて納豆を製造することにより、納豆の発酵過程における、別に添加したフィチン酸を含むフィチン酸の分解を抑制して、フィチン酸を高含有させた、前記（１）に記載の食感の軟らかいフィチン酸高含有納豆。
（３）上記フィチン酸が、原料大豆由来フィチン酸と、別に添加したフィチン酸から構成される、前記（１）又は（２）に記載の食感の軟らかいフィチン酸高含有納豆。
（４）フィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子を欠損させた納豆菌株、又はフィチン酸分解酵素の活性が失活若しくは低下した納豆菌株を用いて納豆を製造することにより、納豆の発酵過程における原料大豆由来フィチン酸及び別に添加したフィチン酸の分解を抑制して、フィチン酸を高含有させることにより、発酵過程における豆の軟化率を高め、納豆製造における容器への煮豆充填適正の向上、発酵後の納豆加工適正の向上、及び軟らかい食感の付与を行うことを特徴とする食感の軟らかいフィチン酸高含有納豆の製造方法。
（５）フィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子を欠損させた納豆菌株を用いて納豆を製造する、前記（４）に記載の食感の軟らかいフィチン酸高含有納豆の製造方法。
（６）フィチン酸分解酵素の活性が失活又は低下した納豆菌株を用いて納豆を製造する、前記（４）に記載の食感の軟らかいフィチン酸高含有納豆の製造方法。
（７）上記フィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子を欠損させた納豆菌株が、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５４である、前記（４）又は（５）に記載の食感の軟らかいフィチン酸高含有納豆の製造方法。
【００１３】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明のフィチン酸高含有納豆は、煮豆から納豆に至るまでの発酵過程において、原料大豆に由来するフィチン酸及び別に添加したフィチン酸の分解を抑制させ、フィチン酸を高含有させることにより、豆の軟化率を高め、納豆製造における容器への煮豆充填適正の向上、発酵後の納豆加工適性の向上を可能とし、更には食感が軟らかく、フィチン酸を高含有させてその機能性を高めたことを特徴とするものである。また、本発明のフィチン酸高含有納豆の製造方法は、フィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子欠損納豆菌株等を用いて納豆を製造することにより、納豆の発酵過程における原料大豆由来フィチン酸及び別に添加したフィチン酸の分解を抑制して、それらのフィチン酸を高含有させた納豆を製造することを特徴とするものである。
【００１４】
即ち、本発明は、洗浄した原料大豆を水に浸漬した後、これを蒸煮し、これに納豆菌を接種し、所定の容器に充填し、所定の発酵をさせる、通常の納豆の製造方法において、納豆菌として、フィターゼ酵素（ｐｈｙ）遺伝子欠損納豆菌株等を用いて納豆を製造することにより、納豆の発酵過程における、原料大豆に由来するフィチン酸及び別に添加したフィチン酸の分解を抑制して、フィチン酸を高含有する納豆を製造し、提供するものである。
【００１５】
ここで、フィチン酸分解酵素（Ｐｈｙ）について説明すると、フィチン酸分解酵素（３−ｐｈｙｔａｓｅ；Ｐｈｙ、別名：Ｐｈｙｔａｔｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）は、下記の反応式により、フィチン酸の３位のリン酸基を分離させる作用を有する。
（反応式）
phytic acid = myo-Inositol 1,2,4,5,6-pentakisphosphate + Phosphoric acid
【００１６】
フィチン酸は、高いキレート作用を有しており、主に、ナトリウム、カリウム結合塩（フィチン）として、ほとんどの植物体に含まれており、大豆中に０．１〜１．８％程度有することが分かっている。納豆の製造工程における原料大豆ないし納豆に含まれるフィチン酸の動向については、本発明者らが、納豆の発酵前後におけるフィチン酸量の変化を見たところ、発酵により、納豆のフィチン酸が減少する様子が確認されたが、納豆発酵後にもフィチン酸は残存している。
【００１７】
本発明では、フィチン酸は、基本的には、納豆の発酵過程でフィチン酸分解酵素により分解されるフィチン酸を意味するが、このフィチン酸を別に添加したものも包含される。本発明において、フィチン酸とは、原料大豆由来のフィチン酸及び別に添加したフィチン酸の両者を意味している。即ち、本発明のフィチン酸高含有納豆は、納豆の発酵過程における、原料大豆由来フィチン酸及び別に添加したフィチン酸の分解を抑制して、それらを高含有させた納豆を意味するものである。
【００１８】
次に、本発明で用いるフィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子欠損納豆菌株等について具体的に説明すると、本発明では、納豆菌として、（１）納豆菌ゲノム由来のフィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて破壊して作製したフィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子欠損納豆菌株、（２）遺伝子操作以外の人為的な手段により、フィチン酸分解酵素の活性を失活又は低下させた納豆菌株、又は（３）野生株からスクリーニングにより入手し、育種したフィチン酸分解酵素の活性が失活又は低下した納豆菌株、が用いられる。
【００１９】
即ち、本発明では、納豆菌として、例えば、遺伝子組換え手法でフィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子を欠損させた納豆菌株、遺伝子操作以外の手法で、フィチン酸分解酵素の活性を失活又は低下させた納豆菌株、又は、野生株からスクリーニングしたフィチン酸分解酵素の活性が失活又は低下した納豆菌株が用いられる。これらのうち、ｐｈｙ遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて破壊する方法を説明すると、好適には、例えば、納豆菌ゲノムから得られるｐｈｙ遺伝子の上流領域（約２ｋｂｐ）と、ｐＣＭのｃａｔ遺伝子を含む領域と、納豆菌ゲノムから得られるｐｈｙ遺伝子の下流領域（約２ｋｂｐ）とを、それぞれＰＣＲ増幅したものを、ＰＣＲ法により結合させ、ｐｈｙ上流−ｃａｔ−ｐｈｙ下流断片を作製し、次いで、これをＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏに導入して、形質転換させ、ｐｈｙ遺伝子破壊株を構築する方法が例示される。
【００２０】
遺伝子組換え手法は、ｐｈｙ遺伝子が破壊できれば、抗生物質耐性遺伝子等は、特に制限されるものではなく、適宜の手法を使用することができる。また、遺伝子組換え技術以外の手法でも、フィチン酸分解酵素の活性が失活又はその活性が低下した納豆菌株を、例えば、自然界から野生株をスクリーニングする方法や、紫外線やガンマ線、ニトロソグアニジン等の変異剤を用いる方法で入手ないし育種して使用することが可能である。このように、本発明では、上述のフィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子欠損納豆菌株等であれば、その入手ないし育種又は作製の過程の如何にかかわらず、使用することが可能である。
【００２１】
本発明では、納豆の製造方法において、納豆菌として、上記方法で構築したフィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子欠損納豆菌株等を用いて納豆を製造するが、納豆の製造方法及び条件は、上記納豆菌株を用いる他は、特に制限されるものではなく、適宜の方法及び条件を任意に使用することができる。本発明により、納豆の発酵過程において、原料大豆由来フィチン酸及び別に添加したフィチン酸の分解を抑制して、フィチン酸を高含有させた納豆を製造し、提供することができる。フィチン酸を納豆の発酵過程で分解させないことにより、発酵時の豆の軟化率を向上させ、納豆製造における容器への煮豆充填適正の向上、発酵時の納豆加工適正の向上を可能にすると共に、更に、食感の軟らかい、フィチン酸の機能性を付与した納豆製品を製造し、提供することを可能とすることができる。
【００２２】
また、フィチン酸の有する有用な生理活性として、例えば、フィチン酸は、腎結石の予防、歯垢形成の抑制等の作用を有することが知られているが、本発明のフィチン酸高含有納豆は、特に、原料大豆に由来するフィチン酸及び別に添加したフィチン酸の発酵過程における分解を抑制して、上記生理活性を有するフィチン酸を高含有させた機能性納豆製品を提供することを可能とするものである。すなわち、本発明は、フィチン酸を別に添加した場合でも、発酵過程におけるフィチン酸の分解を抑制して、フィチン酸を高含有する食感の軟らかい納豆製品を製造することが可能である。
【００２３】
フィチン酸は、そのキレート作用を始めとする機能性に優れており、また、製品自体の安定性も高いことから、例えば、その酸味、熱安定性、ビタミンＣの安定化、鉄結合能、抗酸化能、変色防止等の特性を利用して、各種食品の改質改善を目的として利用されている。しかし、従来、納豆の発酵過程において、フィチン酸の分解を抑制し、フィチン酸を高含有させた納豆を製造する方法及びその製品の開発例は知られて無い。本発明は、フィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子を欠損させた納豆菌株、遺伝子組換え以外の手法、例えば、自然界からのスクリーニングや、紫外線やガンマ線、ニトロソグアニジンなどの変異剤を用いてフィチン酸分解酵素の活性が失活又は低下した納豆菌を利用することで、上述のフィチン酸を高含有させた納豆を製造する方法及びその製品を提供することを実現したものである。
【発明の効果】
【００２４】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）原料大豆由来フィチン酸及び別に添加したフィチン酸を高含有する食感の軟らかいフィチン酸高含有納豆を製造することができる。
（２）フィチン酸の有する有用な生理活性を納豆に移行させてフィチン酸の機能性を付与した新規納豆製品を提供することができる。
（３）フィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子欠損納豆菌株及びその構築方法を提供することができる。
（４）納豆の発酵過程におけるフィチン酸の分解を抑制して、その生理活性及び機能の活用を図ることを可能とする新しい納豆の製造方法及びその製品を提供することができる。
（５）上記フィチン酸高含有納豆を摂取することで、有用な生理活性を有するフィチン酸を同時摂取することが可能となる。
（６）煮豆から納豆に至るまでの発酵過程において、フィチン酸の分解を抑制することで、豆の軟化率を高めると共に、食感の軟らかい、納豆製品を製造することが可能な納豆の製造方法を提供することができる。
（７）上記の納豆の発酵過程における豆の軟化率を高めることで、納豆製造において、容器への煮豆の充填適正を向上させることが可能である。
（８）納豆の発酵過程における豆の軟化率を高めることで、食感が軟らかい納豆製品を提供することができる。
（９）納豆の発酵過程における豆の軟化率を高めることで、発酵後に軟らかい納豆を得ることを可能とし、発酵後の納豆の加工適正を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
本実施例では、納豆菌ｐｈｙ遺伝子破壊株を作製した。
（１）ｐｈｙ遺伝子破壊株の作製方法
１）ｐｈｙ上流−ｃａｔ−ｐｈｙ下流断片の作製
納豆菌ゲノムから得られるｐｈｙ上流領域（約２ｋｂｐ）、ｐｈｙ下流領域（約２ｋｂｐ）、及びｐＣＭから得られるｃａｔ遺伝子（約１ｋｂｐ）を、それぞれＰＣＲ増幅して、アガロース電気泳動で確認した後、ＤＥＡＥペーパーを用いて、ゲルからＤＮＡ断片を回収し、それらのＤＮＡ断片をＰＣＲ法により結合させ、ｐｈｙ上流−ｃａｔ−ｐｈｙ下流断片を作製した。図１に、ｐｈｙ上流−ｃａｔ−ｐｈｙ下流断片の作製方法の概要の説明図を示す。
【００２７】
上記反応において、ＰＣＲに用いたｐｒｉｍｅｒは、以下を用いた。
（ｐｈｙ上流領域の増幅）
Primer1；  5’−gcctttttctcttgatgcaa
Primer2；  5’−cagctatttcagctgcgcttttttttccataaacctcagaaatat
（ｐｈｙ下流領域の増幅）
Primer3；  5’−aatgactggcttttataatatgagtgaccgtgcgacaggagatc
Primer4；  5’−gcctccctccgtcaaacataaa
（ｃａｔ領域の増幅）
Primer5；  5’−atatttctgaggtttatggaaaaaaaagcgcagctgaaatagctg
Primer6；  5’−gatctcctgtcgcacggtcactcatattataaaagccagtcatt
（ｐｈｙ上流−ｃａｔ−ｐｈｙ下流断片の増幅）
Primer1及びPrimer2
【００２８】
ｐｈｙ上流領域、ｐｈｙ下流領域、及びｃａｔ遺伝子のＰＣＲ増幅は、以下の条件で行った。
１×Ｅｘ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ
０．２ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ
２μＭ ｅａｃｈ ｐｒｉｍｅｒ
Ｔｅｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡ（１００ｎｇ）
Ｅｘ ｔａｑ（２．５ｕｎｉｔ）
Ｓｔｅｐ １；９４℃，５ｍｉｎ
Ｓｔｅｐ ２；Ｄｅｎａｔｕｒｅ；９６℃，４５ｓｅｃ
Ａｎｎｅａｌ    ；５８℃，４５ｓｅｃ
Ｅｘｔｅｎｄ    ；７２℃，４ｍｉｎ
２５ｃｙｃｌｅ
また、ｐｈｙ上流−ｃａｔ−ｐｈｙ下流断片の増幅には、上記条件のＥｘｔｅｎｄを６ｍｉｎとした。
【００２９】
２）ｐｈｙ遺伝子破壊株の構築
上記方法で作製したｐｈｙ上流−ｃａｔ−ｐｈｙ下流断片を用いて納豆菌を形質転換させて、納豆菌ｐｈｙ遺伝子破壊株を構築した。形質転換株の選択は、クロラムフェニコール濃度が５μｇ／ｍｌになるように添加したＬＢ培地で３７℃、１８時間培養することで行った。尚、納豆菌の形質転換は、枯草菌の相同組換え能を利用した２段階形質転換法（Molecular biological methods for Bacillus, p.27-74 (1990)）を改変した方法を用いた。
【００３０】
（２）結果
図１に示した遺伝子破壊法に従って、納豆菌のｐｈｙ遺伝子を破壊して、遺伝子破壊株を作製した。ｐｈｙ遺伝子が破壊されていることは、ｐｈｙ遺伝子の領域をＰＣＲで増殖することによって確認した。即ち、破壊株からゲノムＤＮＡを抽出し、そのＤＮＡのｐｈｙ上流−ｃａｔ−ｐｈｙ下流断片をＰＣＲ増幅した。増幅した断片を種々の制限酵素で処理して、ｐｈｙ遺伝子破壊前後の挙動の変化を比較した。図２に、ｃａｔ遺伝子を導入してｐｈｙ遺伝子を破壊することにより、断片が長くなる様子と、ＥｃｏＲＩサイドが欠失していることを示す。これは、ｐｈｙ遺伝子を破壊することにより、遺伝子周辺の長さが変わっていること、また、遺伝子破壊により任意の制限酵素で切断できなくなることを示すものである。上記方法で構築されたｐｈｙ遺伝子破壊株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５４として寄託された。
【実施例２】
【００３１】
本実施例では、フィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子欠損納豆菌株を用いて納豆を製造した。
（１）納豆の製造方法
吸水した原料大豆を高圧で蒸し、納豆菌を接種した煮豆を発酵させるという工程で納豆を製造した。即ち、１５〜２０℃で１８〜２４時間浸漬した浸漬大豆を、加圧釜に入れ、２０分前後で蒸煮した。菌の接種は、納豆菌ｐｈｙ遺伝子破壊株の細胞又は胞子を使用し、１０３〜１０４個／蒸煮大豆ｇになるように接種した。これを納豆用ＰＳＰ容器に充填した後、表面を有孔ポリエチレンフィルムで覆い、蓋をかぶせ、温度３８〜４２℃で１４〜２０時間発酵させ、納豆を製造した。
【００３２】
（２）結果
１）フィチン酸量
納豆菌ｐｈｙ遺伝子破壊株を用いて製造した納豆の品質は、市販納豆菌で試作した納豆品質と同様に良好であり、粘り、香り、外観について差は見られなかった。得られた納豆及び比較製品に含まれるフィチン酸の測定結果を表１に示す。これより、本発明のフィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子欠損納豆菌株を用いて製造した納豆は、比較製品に比べて、フィチン酸の含有量が高く、フィチン酸高含有納豆が得られることが分かった。図３に、煮豆、通常株で製造した納豆及び破壊株で製造した納豆におけるフィチン酸含有量の測定結果を示す。
【００３３】
【表１】
0004624278.tif 000002
【００３４】
２）納豆の硬度
３種類の原料大豆に関して、納豆菌ｐｈｙ遺伝子破壊株及び、市販納豆菌を用いて製造した納豆の硬度を、ＦＵＤＯＨ ＲＨＥＯ ＭＥＴＥＲ（ＲＨＥＯＴＥＣＨ）で測定した。その結果を表２に示す。これより、本発明のフィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子欠損納豆菌株を用いて製造した納豆は、比較製品に比べて、納豆の硬度が１４〜１６程度軟らかくなることが分かった。図４に、通常株及びフィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子欠損納豆菌株（破壊株）を用いて納豆を製造した際の納豆の硬度の変化を示す。
【００３５】
【表２】
0004624278.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００３６】
以上詳述したように、本発明は、フィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子欠損納豆菌株等を用いて納豆を製造する方法及びその製品等に関するものであり、本発明により、例えば、フィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子欠損納豆菌株の構築方法、及び該方法によって構築されたフィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）遺伝子欠損株、遺伝子組換え以外の手法、例えば、自然界からのスクリーニングや、紫外線やガンマ線、ニトロソグアニジンなどの変異剤を用いてフィチン酸分解酵素の活性が失活又は低下した納豆菌株を提供することができる。また、本発明により、上記納豆菌株を用いて、原料大豆由来フィチン酸及び別に添加したフィチン酸の発酵過程における分解を抑制して、その成分を高含有させた納豆を製造することができる。本発明は、フィチン酸を納豆の発酵過程で分解させないことにより、発酵時の豆の軟化率を向上させ、納豆製造における容器への煮豆充填適正の向上、発酵後の納豆加工適性の向上を可能とし、更には食感が軟らかく、フィチン酸の機能性を付与した納豆製品を実現する、食感の軟らかいフィチン酸高含有納豆に関する新技術・新製品を提供するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ｐｈｙ遺伝子の増幅（ＰＣＲ）と納豆菌への遺伝子導入による納豆菌ｐｈｙ遺伝子破壊株の構築方法の説明図である。
【図２】ｃａｔ遺伝子を導入してｐｈｙ遺伝子を破壊することにより、断片が長くなる様子と、ＥｃｏＲＩサイドが欠失していることを示す。
【図３】納豆の製造工程におけるフィチン酸成分の動向（煮豆、通常株で製造した納豆及び破壊株で製造した納豆におけるフィチン酸含有量の測定結果）を示す。
【図４】通常株及びフィチン酸分解酵素（ｐｈｙ）欠損納豆菌株（破壊株）を用いて納豆を製造した際の納豆の硬度の変化を示す。
【図１】
0004624278.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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