(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列のタンパク質、配列番号46のタンパク質および配列番号１または配列番号46の全体配列と少なくとも90％の同一性を有する配列で表され、かつ細胞内での過剰発現が該細胞の細胞分裂をブロックするタンパク質からなる群より選択される中心体結合(ASAP)タンパク質の活性を活性化または阻害することができる物質をスクリーニングする、
−  第一工程において、前記ASAPタンパク質を発現する生体試料の細胞を、試験される物質と接触させ、
−  第二工程において、該物質の、有糸分裂紡錘体機構または異常な有糸分裂および有糸分裂の頓挫の誘導に対する影響を、いずれの適切な手段により測定し、かつ
−  第三工程において、該活性を活性化または阻害することができる物質を選択する
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
ａ)配列番号１の配列のタンパク質、配列番号46のタンパク質および配列番号１または配列番号46の全配列と少なくとも90％の同一性を有する配列で表され、かつ細胞内での過剰発現が該細胞の細胞分裂をブロックするタンパク質からなる群より選択される中心体結合(ASAP)タンパク質、または
ｂ)ａ)で規定されるタンパク質の少なくとも10個連続するアミノ酸のペプチドを特異的に認識することができるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含むことを特徴とする、ASAPタンパク質の過剰発現に関連する有糸分裂紡錘体機構における妨害および／または異常な有糸分裂および有糸分裂の頓挫の誘導を示す細胞を検出および／または選択するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な中心体結合タンパク質(centrosome-associated protein)、該タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド、ならびに該タンパク質および該ポリヌクレオチドの適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞分裂(cell division)のプロセスは、核分裂(有糸分裂)と、それに続く細胞質の分割(細胞質分裂)からなる。有糸分裂は、2種のファミリーの微小管：極微小管(polar microtubles)およびキネトコア微小管からなる非常に組織化された極紡錘体(有糸分裂紡錘体)の形成により支配される。微小管は、α-およびβ-チューブリンサブユニットからつくられるポリマーである。これらの成長は、中心体の周辺領域において、同類のタンパク質であるγ-チューブリンを主に含有する複合体により開始される。極微小管は、一連の微小管と、紡錘体の両側(opposite)の極に位置する中心小体と随伴する2つの有糸分裂中心により適所に配置される結合タンパク質(星状体)とからつくられる。それぞれの複製染色体は、互いにセントロメアを介して連結されている2つの姉妹染色分体からなる。キネトコア微小管は、複製染色体に、セントロメアの2つの面のそれぞれの上に前期の間に形成されるキネトコアとよばれる特別の構造により結合している。染色体は、前期の間に縮合(condense)してキネトコア微小管を形成し、これが、前中期の間で核膜の破壊の後に紡錘体の極微小管と相互作用を開始する。キネトコア微小管を引っ張る極に向かう正反対の力による張力の影響の下で、染色体は中期の間に紡錘体の赤道領域に整列する。後期には、有糸分裂紡錘体の中で続けて発生する力の影響の下に、姉妹染色分体は離れ、反対の極の方へ引っ張られる。同時に、2つの細胞質の極(cellular poles)は離れる。終期の間に、核膜は染色体の各群の表面において再び形成される。
【０００３】
細胞分裂は、細胞質の内容物が、細胞質分裂のプロセスによって分割されるときに終わりを迎える。有糸分裂紡錘体は、細胞質分裂において、細胞分割の組立てを調整する(fix)ことにより重要な役割を演じる。分裂溝は、赤道板の平面に、有糸分裂紡錘体の軸に垂直に必ず現れる。
【０００４】
上記のプロセスは、リン酸化反応と脱リン酸化反応の間の平衡により、精巧に調節されている。細胞が有糸分裂に入るとき、タンパク質のリン酸化に重要な変化が起こる。中心体と有糸分裂紡錘体は、リン酸化部位に特に富んでいる。多くのプロテインキナーゼ、特にセリン-スレオニンキナーゼは、これらのリン酸化プロセスに関係していると記載されている(これに関して、R. GietおよびC. Prigent、J. Cell Science、112、3591〜3601、1999を参照)。これらのうち、中心体の水平面(level)に位置するものを挙げることができ、これらのうち、中心体の分離および有糸分裂紡錘体の組立てに必要なオーロラ型キナーゼ、二極紡錘体(bipolar spindle)の成熟および形成に関係するポロ型キナーゼ、および中心体分離を調節するNIMA型キナーゼを挙げることができる。
【０００５】
哺乳動物は、少なくとも３種のオーロラ型プロテインキナーゼを有する。ヒトにおいては、これら3種のプロテインキナーゼは、染色体異常のため、癌に関連する病理において過剰発現している。よって、これらのタンパク質は、倍数性の制御において重要な役割を演じているとみられる。例えば、これらのキナーゼの2種の不活性化または過剰発現は、多倍数性をもたらす。オーロラAキナーゼの阻害は、単極紡錘体の形成をもたらす。オーロラBキナーゼの阻害は、細胞質分裂の喪失により多核細胞の形成をもたらす。これらの染色体異常は、有糸紡錘体形成における妨害に関連があると見られる。
【０００６】
これらのプロテインキナーゼのパートナーおよび基質は、まだ比較的知られていない。例えば、ツメガエルでは、オーロラAは、微小管動態に関係するキネシンと相互作用する。ヒトにおいては、これは多くの癌細胞株においても過剰発現するHsTACC-3タンパク質をリン酸化する。ショウジョウバエにおいては、オーロラAは、D-TACCタンパク質をリン酸化し、中心体でのその局在化に、星状体の微小管を調節するために必要である。D-TACCは、インビトロで微小管の成長を刺激し、かつインビボでセントロメアに濃縮されるXMAO215/ch-TOC/Mspsタンパク質のファミリーの一部である微小管結合タンパク質(MAP) Mspと相互作用する。D-TACCとMspとは、中心体を安定化するために相互作用する。「MAP」の用語は、微小管と相互作用するそれらの能力を基に規定される種々のタンパク質の集合(collection)を含む。MAPは、オーロラまたはポロのような中心体のキナーゼのパートナー／基質であると見られる。
【０００７】
正しい細胞分裂は、有糸分裂紡錘体による染色体の隔離(segregation)と、細胞質分裂機構による細胞分割との間の調整を必要とする。有糸分裂紡錘体の微小管は、両方のプロセスにおいて必須の役割を演じる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、細胞分裂について行われた全ての研究にもかかわらず、有糸分裂紡錘体を正しく組立てることに関係するか、および／または逆にその組立ておよび／または構造を妨害し、それにより上記のような結果を導く因子については、まだ知られていない。
【０００９】
このような知見は、まず、有糸分裂の機構をよりよく理解し、次いで細胞分裂異常およびそれによる結果の抑制に努める手段を開発可能にすることを可能にするであろう。
本発明は、この分野にある。
【００１０】
具体的には、驚くべきことに、そして予期せぬことに、本発明者らは、新規な中心体結合ヒトタンパク質を証明している。これは、免疫蛍光により、有糸分裂紡錘体の微小管のα-チューブリン、特に星状体との共局在化(colocalization)として検出される。このタンパク質は、本発明者らにより、星状体結合タンパク質(Aster Associated Protein)として、ASAPと名付けられた。
【００１１】
本発明によるタンパク質の過剰発現は、有糸分裂紡錘体の機構を妨害し、異常および頓挫性有糸分裂(多核細胞、単極または多極紡錘体)を誘導する。この過剰発現は、細胞分裂、およびその結果として細胞増殖をブロックする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
よって本発明の主題は、
a) 添付の配列表において配列番号1の番号で表される配列に対応するタンパク質；
b) 配列番号1のタンパク質と、その全配列にわたって、少なくとも80%の同一性(identity)または少なくとも90%の類似性(similarity)、好ましくは少なくとも90%の同一性または少なくとも95%の類似性を示すタンパク質
からなる群より選択されることを特徴とする、ASAPとよばれる単離タンパク質である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明によるタンパク質は、次の特性により特徴付けられる。
- 60〜100 kDaの間、好ましくは65〜80 kDaの間の分子量を有する；
- 中心体に結合する；
- 免疫蛍光により、有糸分裂紡錘体の微小管のα-チューブリンと共局在化する；
- MAP1Aタンパク質(微小管結合タンパク質(Microtubule Associated Protein) 1A)と弱い同一性を示す(23%)；
- そのC-末端部分に実質的に含まれる高次コイルドメインを、まずアミノ酸297〜327の間、次にアミノ酸477〜628の間に有し、このことはタンパク質がオリゴマー化するか、または他のタンパク質と相互作用することを示す；
【００１４】
- アミノ酸300〜600の間で、pfam00769 (NCBI、ドメイン、 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cgi?uid-=pfam00769)を参照とするカルデスモン型ドメイン(N.B. Gusev、Biochemistry、10：1112〜1121、2000)と、およびアミノ酸480〜630の間で、pfam02029 (NCBI, domains,  HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cgi?uid-=pfam02029)を参照とするERM型のドメイン(エズリン/ラディキシン/モエシン(ezrin/radixin/moesin)；S. Louvet Vallet、Biol. Cell、274：305〜316、2000)と、弱い同一性を示す(20％)。カルデスモンおよびERMタンパク質もMAPであると考えられている；
【００１５】
- 位置65〜303の間に、BRCTドメイン(乳癌カルボキシ末端ドメイン(Breast Cancer Carboxy-Terminal domain)；P. Borkら、FASEB J.、11、68〜76 (1997))も有し、このことはタンパク質が細胞周期調節に関係していることを示す；
- そのC-末端部分、特にアミノ酸420〜620の間の領域においてα-ヘリックスに非常に富み、ここはほとんどα-ヘリックスのみでつくられている。
これらの要素は、ASAPタンパク質を新規なMAPであるとみなすことを可能にする。
【００１６】
本発明によるタンパク質は、ASAPタンパク質を含むかまたはこれからなる、いずれの原核または真核生物、特に哺乳動物のいずれのタンパク質(天然、合成、半合成または組換え)も含む。好ましくは、該タンパク質は機能的ASAPタンパク質である。
「機能的」なる用語は、通常の生物活性を有する、すなわち有糸分裂紡錘体機構および細胞分裂に関係し得るタンパク質を意味することを意図する。このタンパク質は、その活性にいずれの本質的な変化も誘導せず、いずれの表現型の変更も生み出さないサイレント突然変異を含み得る。
【００１７】
本発明によるタンパク質は、ヒトASAP (配列番号1)およびマウスASAP (配列番号46)タンパク質により特に表される。
【００１８】
b)で規定される本発明によるタンパク質に含まれるものは、配列番号1および46の配列の異型(variant)であるタンパク質、配列番号1および46の配列に比べて、少なくとも1つのアミノ酸の特に短縮(truncation)、欠失、置換および／または付加に対応する少なくとも1つの突然変異を有するアミノ酸配列のタンパク質である。
好ましくは、異型タンパク質は、該タンパク質、他の遺伝子もしくはタンパク質、または一般に細胞の機能不全(活性化または阻害)をもたらす突然変異を有する。
【００１９】
本発明の別の有利な実施形態によると、該タンパク質は、哺乳動物タンパク質、好ましくはヒト起源のタンパク質である。
【００２０】
本発明の目的のために、次の定義を適用する。
参照配列としての配列番号1の配列に対する配列の同一性は、2つの配列を、これらの間で最大限の一致が得られるように整列させたときに、同一であるアミノ酸残基のパーセンテージにより評価する。
パーセンテージ同一性は、当業者により、例えばBLASTシリーズ(Altschulら、NAR、1997、25、3389〜3402)のもののような配列比較のためのコンピュータプログラムを用いて算出できる。
BLASTプログラムは、参照配列として示される配列番号1全体からなる比較のウィンドウ(window of comparison)にわたって実行される。
【００２１】
参照配列と少なくともX%の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質は、本発明において、その配列が、参照配列の100個のアミノ酸当たり100-X個までの変更を含み得るが、同時に該参照タンパク質の機能的特性を保存しているタンパク質として規定される。本発明の目的のために、「変更(alteration)」の用語は、参照配列における連続もしくは分散したアミノ酸の欠失、置換または挿入を含む。
【００２２】
参照配列に対する配列の類似性は、2つの配列を、これらの間で最大限の一致を得るように整列させたときに、一致するかまたは保存的置換により異なるアミノ酸残基のパーセンテージにより評価される。本発明の目的のために、「保存的置換」の用語は、アミノ酸の、類似の化学的または物理的特性(サイズ、電荷または極性)を有し、通常はタンパク質の機能的特性を修飾しない別のアミノ酸での置換を意味することを意図する。
参照配列と少なくともX%の類似性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質は、本発明において、参照配列の100個のアミノ酸当たり100-X個までの非保存的変化(non-conservative alterations)を含み得る配列のタンパク質として規定される。本発明の目的のために、「非保存的変化」の用語は、参照配列における連続もしくは分散したアミノ酸の非保存的置換または挿入を含む。
【００２３】
本明細書における「当業者に公知の技術または方法」の表現は、当業者により通常用いられ、特にMolecular Cloning. A Laboratory Manual (Sambrook J, Russell DW. (2000) Cold Spring Harbor Laboratory Press)と題するもののような多くの著作で開示されている技術または方法のことをいうことを意図する。
【００２４】
本発明によるタンパク質は、細胞から、または化学合成もしくは遺伝子組換えのいずれかにより得られる。
化学合成により、タンパク質は、多くの既知のペプチド合成経路の一つ、例えば固相を用いる技術または部分固相(partial solid phase)を用いる技術によるか、断片の縮合によるか、あるいは通常の溶液での合成により得ることができる。この場合、タンパク質の配列は、特に水性溶媒でのその溶解性を向上するために修飾することができる。このような修飾は、当業者に公知であり、例えば疎水性ドメインの欠失または疎水性アミノ酸の親水性アミノ酸での置換である。
【００２５】
本発明によるタンパク質は、一連の13個のペプチドからなり、これは対応する遺伝子が含有する14個のエキソンの最初のエキソンが翻訳されない13個の翻訳産物に対応する(以下を参照)。
より明確には、該ペプチドは、次の配列に対応する(与えられた位置は、配列番号1の配列の番号付けに関する)：
- ペプチド1：位置1〜25に相当する25アミノ酸を含む(配列番号2)；
- ペプチド2：位置26〜53に相当する28アミノ酸を含む(配列番号3)；
- ペプチド3：位置54〜160に相当する107アミノ酸を含む(配列番号4)；
- ペプチド4：位置161〜236に相当する76アミノ酸を含む(配列番号5)；
- ペプチド5：位置237〜267に相当する31アミノ酸を含む(配列番号6)；
- ペプチド6：位置268〜350に相当する83アミノ酸を含む(配列番号7)；
- ペプチド7：位置351〜374に相当する24アミノ酸を含む(配列番号8)；
【００２６】
- ペプチド8：位置375〜428に相当する54アミノ酸を含む(配列番号9)；
- ペプチド9：位置429〜460に相当する32アミノ酸を含む(配列番号10)；
- ペプチド10：位置461〜514に相当する54アミノ酸を含む(配列番号11)；
- ペプチド11：位置515〜563に相当する49アミノ酸を含む(配列番号12)；
- ペプチド12：位置564〜606に相当する43アミノ酸を含む(配列番号13)；
- ペプチド13：位置607〜647に相当する41アミノ酸を含む(配列番号14)。
【００２７】
本発明の主題は、上記のa)またはb)で規定されるタンパク質の少なくとも10個連続するアミノ酸の断片からなるペプチド、特に：
- 上記のペプチド1〜13に相当する、すなわち配列番号2〜配列番号14の配列から選択される配列、および
- BRCT ドメインを含むN-末端部分(Ndel1：残基304〜647 (配列番号48)；Ndel2：残基411〜647 (配列番号49)；Ndel3：残基478〜647 (配列番号50))、またはMAPドメインを含むC-末端部分(Cdel1：残基1〜477 (配列番号51)；Cdel2：残基1〜418 (配列番号52)；Cdel3：残基1〜303 (配列番号53)；残基1〜421 (配列番号47))の欠失があるhASAPタンパク質の突然変異体に対応する配列番号47〜53の配列
から選択されるペプチドでもある。
【００２８】
本発明の有利な実施形態によると、該ペプチドは上記で規定されるタンパク質を特異的に認識する、好ましくは配列番号1または配列番号46の配列のASAPタンパク質を認識する抗体の産生に有用である。
【００２９】
よって本発明の主題は、本発明によるタンパク質を特異的に認識し得ることを特徴とするモノクローナルまたはポリクローナル抗体でもある。
本発明によると、好ましくは、該抗体は、MAPのうちで、配列番号1または配列番号46の配列のASAPタンパク質を単一かつ特異的に認識する。
【００３０】
本発明による抗体は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはFabもしくはF(ab’)2フラグメントである。これらは、検出可能および／または定量可能なシグナルを得るためにイムノコンジュゲート、または標識化された抗体の形であることもできる。
該抗体は、ヒト血清から、または本発明によるタンパク質もしくはペプチドで免疫された動物の血清から直接得ることができる。
特異的ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、当業者に公知の技術により得ることができる。
【００３１】
本発明の主題は、本発明による抗体の、本発明によるタンパク質を検出および／または精製するための使用でもある。
一般に、本発明による抗体は、本発明による通常または変異タンパク質の存在を検出するために有利に用いることができる。
特に、モノクローナル抗体は、生体試料中のこれらのタンパク質を検出するために用い得る。よってこれらは本発明によるタンパク質、特に配列番号1の配列のタンパク質の、組織切片上での発現の免疫化学的または免疫組織学的分析の手段を構成する。このような分析について一般には、用いられる抗体は、検出可能とするために、例えば免疫蛍光化合物により、金標識により、または酵素イムノコンジュゲートの形において標識される。
【００３２】
これらは、生体組織または試料において、これらのタンパク質の異常発現を証明することを特に可能とすることができ、よって本発明によるタンパク質の過剰発現に関連する、有糸分裂紡錘体機構における妨害および／または異常および頓挫性有糸分裂の誘導(多核細胞、単極または多極紡錘体)を示す細胞の検出を許容する。
【００３３】
本発明の主題は、細胞を、細胞内の媒体(intracellular medium)を接触可能にするためのいずれの適切な手段により適切に処理することにある第一工程、得られた細胞内の媒体を、本発明による抗体と接触させることにある第二工程、およびいずれの適切な手段により、形成されたASAPタンパク質-抗体複合体を証明することにある第三工程を含む、生体試料において本発明によるタンパク質、とくにASAPタンパク質を検出する方法でもある。
この方法は、本発明によるタンパク質の細胞内、特に癌細胞内での発現レベルの測定も可能にする。ASAPタンパク質の発現(過剰発現または過少発現)の研究は、癌細胞の増殖能または攻撃性(予後が乏しい癌に対して進行する能力)を評価するための要素である。
【００３４】
本発明の主題は、細胞を、細胞内の媒体を接触可能にするためのいずれの適切な手段により適切に処理することにある第一工程、得られた細胞内の媒体を、本発明による抗体と接触させることにある第二工程、いずれの適切な手段により、形成されたASAPタンパク質-抗体複合体を証明および／または測定することにある第三工程、ならびに遺伝子の転写レベルを、形成されたASAPタンパク質-抗体複合体のレベルの、予め選択した対照の生体試料のレベルとの比較により評価することにある第四工程を含むことを特徴とする、インビトロで、生体試料中に含まれる癌細胞の増殖能または攻撃性を評価する方法でもある。該対照は、例えば通常または変更されたレベルのタンパク質を有する細胞を含有する生体試料からなることができ、これに対して該方法が同じ条件下で適用される。
【００３５】
本発明の主題は、上記の方法のいずれか1つを行うための：
a) 少なくとも1つの本発明によるモノクローナルまたはポリクローナル抗体；
b) 免疫反応の間に産生されたASAPタンパク質-抗体複合体を検出するための試薬
を含むキットでもある。
【００３６】
本発明の具体的な実施形態によると、該キットは、細胞内の媒体を接触可能にするために必要な試薬を任意に含み得る。
「細胞内の媒体を接触可能にするための手段」の表現は、当業者に公知のいずれの手段、例えば酵素学的もしくは化学的プロセス、または超音波処理、膜透過、熱ショックによる細胞溶解を意味することを意図する。
【００３７】
本発明の主題は、その配列が：
- 上記で規定されるタンパク質またはペプチドをエンコードする配列、および
- 該配列に相補的な、センスまたはアンチセンスであり得る配列
からなる群より選択されることを特徴とする単離ポリヌクレオチド(cDNAまたはゲノムDNA断片)でもある。
本発明は、いずれの哺乳動物に由来するasap遺伝子の対立遺伝子、およびASAP タンパク質、特に上記で規定されるような機能的ASAPタンパク質をエンコードするasap遺伝子の天然または人工の突然変異体のポリヌクレオチドを包含する。
【００３８】
本発明の有利な実施形態によると、ASAPタンパク質をエンコードする該ポリヌクレオチドは：
- ヒトASAPタンパク質(hASAP)をエンコードするmRNAの2575ヌクレオチドの相補的DNAに対応する配列番号15の配列；
- マウスASAPタンパク質(mASAP)をエンコードするmRNAの2767ヌクレオチドの相補的DNAに対応する配列番号45の配列；
- 14個のエキソン(そのうちの13個だけが翻訳され、最初のエキソンは翻訳されない)を含むヒトasap遺伝子に対応する、添付の配列表において配列番号16の番号の下で表される配列に対応する29750ヌクレオチドのゲノムDNA断片であって、contig AC097467 (長さ178204塩基対)の115117〜143828塩基の間 (version v.7.29a3 NCBI/Ensembl of July 12, 2002,http://www.ensembl.org)に含まれ、染色体4q32.1上に、無名のマーカー(anonymous markers) D4S1053およびD4S571の間 (161.25メガベース(Mb)〜161.28 Mbの領域)に位置する断片
からなる群より選択される配列に対応する。
【００３９】
配列番号16の配列は、BACクローンRP11-27G13 (K. Osoegawaら、(2001) A Bacterial Artificial Chromosome Library for Sequencing the Complete Human Genome、Genome Research、Vol. 11、No. 3、483〜496、March 2001)に含まれる。contig AC097467およびBACクローンRP11-27G13に含まれる配列は、ヒトゲノム配列決定プログラムの関係において得られ、現在まで、それらにいずれの機能を割り当てることを可能にするいずれの正確な認識または特徴付けの対象ではなかった。本発明者らにより単離されたポリヌクレオチドの断片に対応する2つの核酸は、GenBankデータベースにおいて、受理番号
【００４０】
【表１】
0004660200.tif 000002
【００４１】
BF343454、AW262441、AW237952の下で記載されるESTとともに、受理番号AK024730およびAK024812の下で記載される。ヒト相補DNAライブラリの大量配列決定(mass sequencing)プログラムの関係において得られるこれらの配列は、不完全であり、認識または特徴づけのいずれもされたことがなかった。実際、本発明者らにより単離されたポリヌクレオチドは、長いデオキシアデノシン鎖(ポリ-dA)を示し、このことは、本発明者らが、全長(complete) cDNAを通常のオリゴデオキシチミジン(オリゴ-dT)プライマー(ポリ-dA鎖と無作為にハイブリダイズする)を用いて得るときに遭遇した困難を示す。本発明者らは、3'ラピッドアンプリフィケーションcDNAエンド(rapid amplification cDNA end または3'RACE)技術を繰返し用いることにより、全長mRNAに対応するポリヌクレオチドを単離することに成功した。
【００４２】
配列番号15の配列のポリヌクレオチドに対応するmRNAは、精巣において約2.9キロベース長のポリヌクレオチドの形で、および脳において約9キロベース長のポリヌクレオチドの形(これはプレメッセンジャーまたは高分子量のイソ型のいずれかに対応し得る)で特異的に発現される。
【００４３】
より明確には、該エキソンは、次のようにして該ゲノム配列上に分布している(配列番号16の配列の番号付けに関する)：
- エキソン1：位置101〜300に対応する200塩基対を含む(配列番号17)；
- エキソン2：位置1157〜1295に対応する139塩基対を含む(配列番号18)；
- エキソン3：位置2050〜2134に対応する85塩基対を含む(配列番号19)；
- エキソン4：位置3615〜3935に対応する321塩基対を含む(配列番号20)；
- エキソン5：位置8259〜8485に対応する227塩基対を含む(配列番号21)；
- エキソン6：位置14930〜15023に対応する94塩基対を含む(配列番号22)；
- エキソン7：位置16715〜16962に対応する248塩基対を含む(配列番号23)；
【００４４】
- エキソン8：位置19552〜19622に対応する71塩基対を含む(配列番号24)；
- エキソン9：位置21187〜21355に対応する169塩基対を含む(配列番号25)；
- エキソン10：位置21911〜22000に対応する90塩基対を含む(配列番号26)；
- エキソン11：位置23731〜23892に対応する162塩基対を含む(配列番号27)；
- エキソン12：位置24014〜24159に対応する146塩基対を含む(配列番号28)；
- エキソン13：位置24343〜24475に対応する133塩基対を含む(配列番号29)；
- エキソン14：位置29166〜29650に対応する485塩基対を含む(配列番号30)。
【００４５】
本発明の主題は、
- GenBankデータベースにおいて、受理番号AK024730およびAK024812の下で記載される配列、ならびに受理番号BU198882、BM693711、
【００４６】
【表２】
0004660200.tif 000003
【００４７】
BF889835、AU164011、AV656025、BF343454、AW262441、AW237952の下で記載されるESTを除く、少なくとも15〜1500個連続するヌクレオチドのいずれか1つの本発明によるポリヌクレオチドの断片、特にエキソンに対応する配列から選択される、すなわち配列番号16〜配列番号30の配列から選択される断片；
【００４８】
- 本発明によるポリヌクレオチドの1つと少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%のパーセンテージ同一性を示す核酸
でもある。
タンパク質についての上記の配列の同一性の定義を、核酸分子に対して類推により適用する。
【００４９】
本発明による少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%のパーセンテージ同一性を示すポリヌクレオチドには、配列番号15および45の配列の異型であるポリヌクレオチド、すなわち対立遺伝子変異体、すなわち配列番号15および45の配列の個別の異型に対応する全てのポリヌクレオチドが含まれる。これらの天然の異型配列は、哺乳動物、特にヒトに存在する多型、および特に病理の発生をもたらす多型に対応する。
「異型ポリヌクレオチド」の用語は、突然変異および／またはその相補DNAが、配列番号15または配列番号45の配列のポリヌクレオチドであるmRNAを有するゲノム配列のスプライス部位の変異に起因するいずれのRNAまたはcDNAを意味することを意図する。
【００５０】
好ましくは、本発明は、配列番号15および45の配列の異型であるポリヌクレオチドまたは断片、特に突然変異が配列番号1および配列番号46の配列のタンパク質のアミノ酸配列の修飾をもたらすものに関する。
【００５１】
本発明によるポリヌクレオチドは、細胞から、特に精巣もしくは脳の細胞から、または細胞性DNAライブラリから単離され得る。これらは、細胞の全DNAについて行われるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるか、または細胞の全RNAについて行われるRT-PCRによるか、または化学合成により得ることもできる。
【００５２】
本発明によるポリヌクレオチド、特にいずれの1つの本発明によるポリヌクレオチドの断片、ならびにGenBankデータベースにおいて、受理番号AK024730およびAK024812の下で記載される配列、および受理番号BU198882、BM693711、
【００５３】
【表３】
0004660200.tif 000004
【００５４】
BF889835、AU164011、AV656025、BF343454、AW262441、AW237952の下で記載されるESTまたはこれらの断片は、本発明によるポリヌクレオチドに対応するポリヌクレオチド(RNAまたはゲノムDNA)の、他の生物における検出および／または増幅のためのプローブまたはプライマーとして特に用い得る。
【００５５】
asap遺伝子の転写産物は、例えば、配列番号15、配列番号45および配列番号17〜配列番号44の配列からなる群より選択されるプローブを用いるかまたは上記で規定されるESTを用いて証明されるか、あるいは配列番号31〜43の配列からなる群より選択されるプライマーを用いるRT-PCRにより増幅されるのが好ましい。
【００５６】
本発明によるポリヌクレオチドは、病理の状態またはasap遺伝子の機能不全を含む遺伝子疾患の診断、および該遺伝子の転写を調節(活性化または阻害)し得る物質のスクリーニングを可能にすることができる。
【００５７】
本発明の主題は、本発明によるプライマーを用いる増幅により得ることができるポリヌクレオチドでもある。
本発明によるプローブおよびプライマーは、検出可能および／または定量可能なシグナルを得るために、放射活性または非放射活性化合物を用いて、当業者に公知の方法により直接または間接的に標識することができる。
【００５８】
本発明によるプローブの標識化は、放射活性元素または非放射活性分子を用いて行われる。用いられる放射活性同位体のうち、32P、33P、35S、3Hまたは125Iを挙げることができる。非放射活性物質は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはジゴキシゲニンのようなリガンド、ハプテン、色素および放射線発光、化学発光、生物発光、蛍光またはリン光の剤のような発光剤から選択される。
【００５９】
よって本発明によるポリヌクレオチドは、プライマーおよび／またはプローブとして、特にPCR (ポリメラーゼ連鎖反応)技術 (米国特許第4,683,202号)を用いる方法において用いることができる。標的核酸を増幅するその他の技術を、PCRの代わりに有利に用いることができる。この増幅を許容する多数の方法、例えばSDA (ストランドディスプレースメントアンプリフィケーション(strand displacement amplification))法、TAS (トランスクリプションベースドアンプリフィケーションシステム(transcription-based amplification system))法、3SR (セルフサステインドシークエンスレプリケーション(self-sustained sequence replication))法、NASBA (ヌクレイックアシッドシークエンスベースドアンプリフィケーション(nucleic acid sequence based amplification))法、TMA (トランスクリプションメディエーテッドアンプリフィケーション(transcription mediated amplification))法、LCR (リガーゼ連鎖反応(ligase chain reaction))法、RCR (リペアチェインリアクション(repair chain reaction))法、CPR (サイクリングプローブリアクション(cycling probe reaction))法、またはQ-ベータ-レプリカーゼ増幅法が現在、存在する。点突然変異を検出可能とするPCR-SSCPも挙げることができる。
これらの技術は、もちろん当業者に完全に知られている。
【００６０】
プローブまたはプライマーとして、本発明による種々のポリヌクレオチドは、対応するasap遺伝子の転写プロフィールもしくは生体試料中のこのプロフィールのいずれの可能な変更を測定する(determine)か、あるいは他の生物での対応する遺伝子、この遺伝子の対立遺伝子変異体、または該遺伝子の少なくとも1つのエキソン中の1つ以上のヌクレオチドの突然変異(挿入、欠失または置換)に起因する、この遺伝子のいずれの可能な機能的変更(該遺伝子によりエンコードされるタンパク質の活性における実質的な変化)を証明するかのいずれかを可能にする。このような突然変異は、特にタンパク質の生物活性に必須なドメイン中に位置するアミノ酸残基に対応するコドン中の欠失、挿入または非保存的置換を含む。
【００６１】
よって、本発明の主題は、いずれの適切な手段により、生体試料から全RNAを得ることにある第一工程、該RNAを、予め標識された本発明によるプローブと、該RNAとプローブとの間のハイブリダイゼーションのための通常の条件下に接触させることにある第二工程、およびいずれの適切な手段により、形成されたハイブリッドを明らかにすることにある第三工程を含む、生体試料中において、本発明によるポリヌクレオチドに対応する遺伝子の転写プロフィール、または該プロフィールの変更を測定する方法である。
「ハイブリダイゼーションのための通常の条件」の表現は、J. Sambrook、D.W. Russell (2000) Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載のものを意味することを意図する。
【００６２】
該方法のある実施形態によると、第二工程は、上記のようなプライマー対を用いて行われる逆転写および転写産物の増幅からなる工程であることができ、第三工程は、いずれの適切な手段により、形成された増幅核酸を明らかにする工程であり得る。
遺伝子の転写プロフィールを測定する上記の方法は、遺伝子の転写レベルを、予め選択された対照試料との比較により評価することにある工程も含み得る。該対照は、例えば本発明によるポリヌクレオチドに対応する遺伝子の正常または変更された転写を示す生体試料からなることができ、これに対して遺伝子の転写プロフィールを測定する該方法を同じ条件下で適用する。
【００６３】
本発明の主題は、いずれの適切な手段により、生体試料の細胞からDNAを得ることにある第一工程、該DNAを、予め標識された本発明によるプローブと、該DNAとプローブとの間のハイブリダイゼーションのための通常の条件下で接触させることにある第二工程、およびいずれの適切な手段により、形成されたハイブリッドを明らかにすることにある第三工程を含む、他の種において、本発明によるポリヌクレオチドに対応する遺伝子もしくは該遺伝子の対立遺伝子変異体、またはこの遺伝子の機能的変更を生体試料中において証明する方法でもある。
【００６４】
該方法のある実施形態によると、第二工程は、上記のようなプライマーの対を用いて行われる増幅工程であることができ、第三工程は、いずれの適切な手段により、形成された増幅核酸を明らかにすることにある工程であり得る。該方法は、証明された核酸を単離して配列決定することにある第四工程を任意に含み得る。
【００６５】
本発明の主題は、
a) 少なくとも1つの本発明によるプローブまたは1つのプライマー対；
b) 該プローブまたはプライマーと生体試料の核酸との間の通常のハイブリダイゼーションを行うのに必要な試薬；
c) 増幅反応を行うのに必要な試薬；
d) プローブと生体試料の核酸との間に形成されたハイブリッド、または形成された増幅核酸を検出および／またはアッセイするのに必要な試薬
を含む、上記の方法を行うための試薬キットでもある。
このようなキットは、得られる結果の質を確実にするために、陽性または陰性の対照も含み得る。生体試料から核酸を精製するのに必要な試薬も含むことができる。
【００６６】
本発明のポリヌクレオチドまたはその断片の1つ、および上記のESTまたはそれらの断片は、Si RNA法(小型干渉RNA(small interfering RNA)；M. McManusおよびP. Sharp、Nature Reviews Genetics、3、737〜747、2002；V. Brondani、F. Kolb、E. Billy、M/S、6-7、665〜667、2002)により、これらの配列に由来するオリゴヌクレオチドを用いてASAP遺伝子をノックアウトすることにより、ASAPタンパク質を発現しない細胞または動物モデルを開発するのに用いることができる。
【００６７】
本発明の主題は、その中に本発明によるポリヌクレオチドが挿入されたクローニングおよび／または発現ベクターでもある。
このようなベクターは、発現、および任意に宿主細胞におけるタンパク質の分泌に必要な要素を含み得る。
該ベクターは、好ましくはプロモーター、転写開始および終結シグナル、ならびに転写調節に適切な領域を含む。これらは細胞内で安定に保持されることが可能であるべきであり、翻訳されたタンパク質の分泌を明示する特異的シグナルをエンコードする配列、例えば強力な普遍的プロモーター、または特定の細胞および／または組織の種類に選択的なプロモーターを任意に含み得る。これらの種々の調節配列は、用いられる細胞宿主により選択される。
【００６８】
本発明によるポリヌクレオチドは、選択された宿主内で自律複製するベクター、または選択された宿主に組み込み可能なベクターに挿入することができる。
自律複製系のうち、宿主細胞により、プラスミドまたはウイルスタイプの系を用いるのが好ましい。ウイルスベクターは、特にアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルスまたはヘルペスウイルスであり得る。当業者は、これらの系のそれぞれに用い得る技法を知っている。
配列を宿主細胞の染色体に組み込むことが望まれる場合、例えばプラスミドまたはウイルスタイプの系を用いることができる。このようなウイルスは、例えばレトロウイルスまたはアデノ随伴ウイルス(AAV)である。
【００６９】
非ウイルスベクターのうち、裸のDNAまたは裸のRNAのような裸のポリヌクレオチド、細菌人工染色体(BAC)、酵母内での発現のための酵母人工染色体(YAC)、マウス細胞での発現のためのマウス人工染色体(MAC)、および好ましくはヒト細胞での発現のためのヒト人工染色体(HAC)が好ましい。
このようなベクターは、当業者により通常用いられる方法により調製され、それから得られる組換えベクターは、適切な宿主に、標準的な方法、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、熱ショック、化学的膜透過化後の形質転換、細胞融合により導入することができる。
【００７０】
本発明の主題は、その中に少なくとも1つの本発明によるポリヌクレオチドもしくは1つの断片、または少なくとも1つの本発明によるベクターが導入されている形質転換された宿主細胞、特に真核および原核細胞である。
本発明の目的のために用い得る細胞のうち、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、特に哺乳動物細胞、または植物細胞を挙げることができる。例えばバキュロウイルスを用いる方法を用い得る昆虫細胞も挙げることができる。
【００７１】
本発明の主題は、その全てまたはいくつかの細胞が、本発明によるポリヌクレオチド、または本発明によるベクターを、遊離もしくは組み込まれた形で含むトランスジェニック動物または植物のようなヒト以外のトランスジェニック生物でもある。
本発明によると、好ましくは、ヒト以外のトランスジェニック生物は、機能的でないか、または突然変異を有する本発明によるポリヌクレオチドを含む細胞を有するものである。
本発明によると、トランスジェニック動物は、好ましくはヒト以外の哺乳動物、より好ましくはげっ歯動物、特にマウスまたはラットである。
【００７２】
トランスジェニック動物は、当業者に公知のいずれの通常の方法、例えば胚性幹細胞での相同的組換え、これらの幹細胞の胚への移送、生殖株で生育するキメラの選択および該キメラの生育により得ることができる。
よって本発明による形質転換された宿主細胞、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物は、本発明によるタンパク質をエンコードする遺伝子、またはそれらの相同遺伝子を発現するかもしくは過剰発現するか、あるいは突然変異が導入された該遺伝子を発現することができる。
【００７３】
本発明による精巣もしくは脳の細胞、形質転換された宿主細胞、またはトランスジェニック生物は、本発明によるタンパク質を製造するために用いることができる。
本発明によるタンパク質、特に天然のASAPタンパク質は、当業者に公知の技法により精製することができる。つまり、タンパク質は、細胞溶解産物および抽出物、または培養上清から、分画、クロマトグラフィー法、特に親和性クロマトグラフィー法、特異的モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いる免疫親和性技術などのような個別にまたは組み合わせで用いる方法により精製することができる。
【００７４】
本発明の主題は、タンパク質を発現する細胞もしくは本発明による形質転換細胞、特に哺乳動物細胞、または本発明によるトランスジェニック生物の細胞を、該タンパク質の発現を許容する条件下で培養すること、および該タンパク質を精製することを特徴とするASAPタンパク質を製造する方法である。
精製技術としては、例えばJ Sambrook & DW Russell (2000、Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載のようなグルタチオン-セファロース(またはアガロース)上での親和性クロマトグラフィーを挙げることができる。
【００７５】
本発明の主題は、上記の製造方法のいずれか1つにより得ることができることを特徴とするタンパク質でもある。
【００７６】
本発明の主題は、
- 第一工程において、試験される物質と、本発明によるポリヌクレオチドまたはタンパク質とを接触させ、そして
- 第二工程において、該物質と本発明によるポリヌクレオチドまたはタンパク質との間に形成された複合体を、いずれの適切な方法により検出する
ことを特徴とする、本発明によるポリヌクレオチドまたはタンパク質と、直接または間接的に、インビトロで相互作用可能な物質のスクリーニング方法でもある。
【００７７】
本発明の主題は、ASAPタンパク質の活性を調節(活性化または阻害)し得る物質のスクリーニング方法でもあり、
- 第一工程において、ASAPタンパク質を発現する生体試料の細胞を、試験される物質と接触させ、
- 第二工程において、該ASAPタンパク質の活性に対する該物質の影響を、いずれの適切な手段により測定し、そして
- 第三工程において、該活性を調節可能な物質を選択する
ことを特徴とする。
本発明の目的のために、「ASAPタンパク質の活性」の用語は、ASAPタンパク質または対応する転写産物(mRNA) の発現と、該ASAPタンパク質の生物活性、例えば有糸分裂紡錘体の機構、または異常もしくは頓挫性有糸分裂の誘導に対するその影響との両方を意味することを意図する。
【００７８】
該物質と、ポリヌクレオチドもしくはタンパク質との間に形成される複合体の検出、または該物質の、該ASAPタンパク質の活性に対する影響の測定は、それ自体で知られているmRNAまたはタンパク質分析の通常の技術により行うことができる。限定しない例として、次の技術を挙げることができる：RT-PCR、ノザンブロッティング、ウェスタンブロッティング、RIA、ELISA、免疫沈降、免疫細胞化学または免疫組織学的分析技術。
該測定は、上記で規定されるプローブ、プライマーまたは抗体を用いて行われるのが有利である。
このような物質は、例えば核酸、脂質、糖、タンパク質、ペプチド、タンパク質-脂質、タンパク質-糖、ペプチド-脂質もしくはペプチド-糖ハイブリッド化合物、化学的ブランチが付加されたタンパク質もしくはペプチドのような生体高分子、または化学分子であり得る。
【００７９】
本発明の主題は、本発明によるポリヌクレオチド、タンパク質、抗体、ベクターまたは形質転換細胞の、医薬品としての使用である。
上記のように、本発明によるタンパク質の過剰発現は、細胞分裂、結果として細胞増殖をブロックする。このことにより、これは、例えば癌に関連する病理の治療において用い得る有糸分裂抑制剤としての使用のための優れた候補となる。
【００８０】
よって、本発明の主題は、本発明によるポリヌクレオチド、ベクターまたはタンパク質の、有糸分裂抑制医薬品の製造における使用でもある。
同様に、上記のように、本発明によるタンパク質の過剰発現は、有糸分裂紡錘体の機構を妨げ、かつ異常および頓挫性有糸分裂を誘導する(多核細胞、単極または多極紡錘体)。
【００８１】
よって、本発明の主題は、本発明によるアンチセンスポリヌクレオチドもしくはアンチセンス断片、抗体、または本発明によるポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現を阻害し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するベクターの、本発明によるタンパク質の過剰発現に関連する有糸分裂紡錘体機構の妨害および／または異常もしくは頓挫性有糸分裂の誘導(多核細胞、単極または多極紡錘体)に関連する病理の治療を意図する医薬品の製造における使用でもある。
【００８２】
上記の規定に加えて、本発明は、本発明の実施例および添付の図面に言及する次の記載から明らかになるその他の規定も含む。ここで、
- 図1は、ヒトasap遺伝子の染色体局在化および構造を表す。
- 図2は、種々のヒト組織について、hASAPプローブとのハイブリダイゼーション後のノザンブロッティングにより得られるシグナルを表す。
- 図3は：
(A) 配列番号15のポリヌクレオチドのオルトログ(ortholog)であるマウスポリヌクレオチドに対応するプライマーで、種々のマウス組織を用いて得られたRT-PCR産物のアガロースゲル電気泳動により；
(B) 電気泳動後、メンブレン上へのゲルのトランスファーおよび内部mASAPプローブとのハイブリダイゼーションの後に
得られた結果を表す。
【００８３】
- 図4は、3'の位置で緑色蛍光タンパク質(GFP)と結合したか、または5'の位置で黄色蛍光タンパク質(YFP)と結合したか、あるいはN-末端側でMYCタグと結合した(融合欄)hASAPタンパク質の細胞性局在化を表す。
核は、ヨウ化プロピジウムまたはヘキスト(Hoechst) 33286 (4A：63×対物レンズ；4B、4Cおよび4D：100×対物レンズ)で染色される。
- 図5は、α-チューブリンとのヒトASAPタンパク質の共局在化を示す。図5A：α-チューブリンの細胞性局在化、図5B：ASAPタンパク質の局在化、図5C：2種のタンパク質の共局在化を示す2つの画像の重ね合わせ。
【実施例】
【００８４】
以下の実施例は、本発明を説明するが、決して限定しない。
実施例1：全長ASAPコーディング配列の構築
ASAPタンパク質のcDNAの全長配列を、2つのオーバーラップ断片：
- PCRにより、クローンAI885274から、プライマー
constFIS-1F (5'-ATGTCTGATGAAGTTTTTAGCACC-3') (配列番号31)および
constFIS-2R (5'-AGGCCTCAAATGATGCTAATGC-3' (配列番号32);
を用いて増幅される断片A：
- クローンAI671785から、プライマー：
constFIS-2F (5'-ATCATTTGAGGCCTGGAAGGC-3') (配列番号33)および
constFIS-1R (5'-AAACACTTTTGCGAACACAGTTC-3') (配列番号34)
を用いて増幅される断片B
から増幅する。
【００８５】
次に、ASAPタンパク質のcDNAの全長配列に対応する、機能的実験に用い得る単一PCR産物を得るために、2つのPCR反応の各々の産物(断片AおよびB) 0.5μlを、一緒に25℃でハイブリダイズさせ、次いでプライマーconstFIS-1FおよびconstFIS-2Fを用いて増幅させる。このPCR産物を、製造者(Invitrogen)の推奨に従ってベクターPCR4にサブクローニングし、配列決定により確かめる。
インシリコ(in silico)での全長ASAPコーディング配列の決定、およびインビトロでのその再構築が、遭遇した主要な困難であった。特に、プライマーおよび3'領域の種々のPCRの選択は、配列がポリAに富むので注意を要した。
【００８６】
実施例2：バイオインフォマティクス的分析
図1は、ヒトasap遺伝子の染色体局在化および構造を示す。
asap遺伝子の完全な構成およびその染色体局在化を、実施例1で得られたcDNAの配列を、ヒトゲノムの配列とWellcome Trust Sanger Instituteプログラム(http://www.ensembl.oriz/genome/central/)およびより特異的にはBLASTサーチプログラム(http://genome.cse.ucsc.edu/)を用いて比較することにより得た。
【００８７】
ヒトasap遺伝子は、14個のエキソンを含む29750ヌクレオチドからなり、その13個だけが翻訳され、最初のエキソンは翻訳されない。エキソンのサイズは、71〜321塩基対の範囲である。遺伝子の配列は、塩基115117〜143828の間のcontig AC097467 (長さ178204塩基対)に含まれ(version v.7.29a3 NCBI/Ensembl of July 12, 2002,http://www.ensembl.org)、さらに無名のマーカーD4S1053とD4S571 (領域161.25メガベース(Mb)〜161.28 Mb)との間の染色体4q32.1上に位置する。遺伝子の配列は、物質的にBACクローンRP11-27G13に含まれる。
【００８８】
本発明者らにより単離されたポリヌクレオチドの断片に対応する2つの核酸は、GenBankデータベースにおいて、受理番号BU198882、BM693711、AW372449、BM021380、BU928828、AL707573、AI885274、A1671785、AA805679、BU619959、BM021126、AL598336、AW976973、BU629726、AI433877、AV751613、BQ372751、AI827535、AI866257、AA843565、R96130、
【００８９】
【表４】
0004660200.tif 000005
【００９０】
BF889835、AU164011、AV656025、BF343454、AW262441、AW237952の下で記載されるESTと共に、受理番号AK024730およびAK024812の下で記載される。ヒト相補DNAライブラリの大量配列決定プログラムの関係において得られるこれらの配列は、不完全であり、認識も特徴づけのいずれもされたことがなかった。
【００９１】
タンパク質配列を、NCBIのPSI-BLASTおよびPHI-BLASTプログラム(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sitemap/)を用いてデータバンクの配列と比較した。共通タンパク質モチーフは、NCBIのDARTプログラム、およびExPASy-ToolsのSMARTプログラム(http://www.expasy.ch/tools/#similariw)を用いて(これらのパラメータは、弱い相同性のモチーフを検出可能である)探索した。ASAPタンパク質は、C-末端の3分の1(C-terminal third)にわたって、微小管結合タンパク質(microtubule-associated protein 1AからMAP 1A)と23％の配列同一性を示す。さらに、保存モチーフについてのサーチ(DARTまたはSMART)により、カルデスモン型(N.B. Gusev、Biochemistry、10 1112〜1121、2000)およびERM型(エズリン/ラディキシン/モエシン) (Louvet-Vallet, S.、Biol. Cell. 274：305〜316、2000)のドメインが明らかになり、これらは約20％の同一性でMAPと考えられているタンパク質である。これはまた、BRCTドメイン(乳癌カルボキシ末端ドメイン(breast cancer carboxy-terminal domain)；P. Borkら、J. FASEB、11、68〜76 (1997))を位置65〜303の間に有する。
【００９２】
ASAPタンパク質は、実質的にそのC-末端部分に含まれる高次コイルドメインを、まずアミノ酸297〜327の間、次にアミノ酸477〜628の間に有し、このことはタンパク質がオリゴマー化するか、またはこれが他のタンパク質と相互作用するかのいずれかを示す。
インターネットサイト(http://npsa-bil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa#automat.pl?page=/NPSA/npsa#secons.html)上でアクセス可能なプログラムを用いるタンパク質のコンピュータ分析により、これがβ-シートを欠損し、特にアミノ酸420〜620の間の領域でα-ヘリックスに富む(ここはほぼα-ヘリックスのみでつくられる)ことが明らかになる。
これらの要素は、ASAPタンパク質が新規なMAPであるとみなすことを可能にする。
【００９３】
実施例3：組織発現
a) ノザンブロッティングによる分析
放射活性プローブの調製：
放射性標識されることとなるDNAを、低融点(LMP)ゲル上で、S. Rouquierら(Genomics、17、330〜340、(1993))により記載される方法に従って単離する。このようにして単離された約100 ngのDNAを、ランダムプライミングにより(Klenowフラグメント、Promega)、[α32P dCTP] (Amersham)の存在下に、A.P. FeinbergおよびB. Vogelstein (Anal. Biochem.、132、6〜13、(1983))により記載された技術に従って標識する。これらのプローブを、Sephadex G-50カラム上でJ SambrookおよびDW Russell (2000、Cold Spring Harbor Laboratory Press)により記載された技術に従って精製する。ハイブリダイゼーションを、変性放射活性プローブ2・106 Cpm/mlの存在下に一晩行う。
【００９４】
a.1) ハイブリダイゼーション
種々の組織からのヒトmRNAを含有するClontech社からの2枚のノザンブロッティングメンブレン(Human MTN BlotおよびHuman MTN Blot II、Ref. 7760-1および7759-1)を、上記のようにして標識した全長hASAP cDNAとハイブリダイズさせた。メンブレンを、ホルムアミドの存在下に42℃でClontech社のプロトコルに従ってハイブリダイズさせた。メンブレンハイブリダイゼーションコントロールは、アクチンプローブにより行った。メンブレンを0.1×SSC/0.1% SDS中に42℃の温度で15分間、2回、高ストリンジェントで洗浄した。次いでメンブレンを、オートラジオグラフィーによるか、またはPhosphorImager上で分析した。
試験した組織は、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、血液白血球、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓であった。
【００９５】
a.2) 結果
図2は、これらの結果を示す。
2つのシグナルが検出された：
- 前立腺において、約2.6 kbにシグナルがあり、これはmRNAのサイズに対応する；
- 脳において、しかしながら高い分子量(9 kb)にシグナルがあり、これはプレメッセンジャーまたは高分子量のイソ型に対応する。
【００９６】
b) RT-PCRによる分析
分析を、種々のマウスの組織、つまり脳、心臓、結腸、肝臓、小腸、骨格筋、膵臓、肺、腎臓、脾臓および精巣からの全RNAについて行った。
b.1) マウスのオートロガスcDNAの取得
種々のマウスの組織の細胞からの全RNAを、Sigma社の「mammalian total RNA kit」を用いて抽出した。RNAを、Invitrogen社からのSuperscript IIキットを用いて、供給業者が推奨する条件に従って、オリゴdTプライマーを用いて逆転写した。得られた産物を、1%アガロースゲル電気泳動により確かめた。続いて、このようにして得られた各試料1μlを、PCR (反応液25μl、30サイクル(94℃で15秒、55℃で30秒、72℃で30秒))により、マウスasap遺伝子に特異的なプライマー(mFIS-1F、5'-ACA ACG AAT AAC AGA GTG TCC-3' (配列番号35)およびmFIS-2R、5'-ACT CCT GAT AAA CAG CTG CC-3' (配列番号36))を用いて増幅させた。
【００９７】
得られた増幅産物を、エチジウムブロマイドで染色する1%アガロースゲル上での電気泳動により分析し、それらのサイズを平行してゲルにのせたサイズマーカーと比較した。
電気泳動後、得られた増幅産物を、毛細管現象により、電荷を帯びたナイロンメンブレンに、1.5 M NaCl/0.5 M NaOHバッファー中に、サザン法(アルカリトランスファー)に従ってトランスファーした。次いでメンブレンを、データバンク(GenBank) (http://expression.gnf.org/promoter/tissue/images/41739#s#at.png)においてヒトASAP配列との比較の後に選択したマウスクローンAW06131中に含まれる配列を増幅することによりつくった放射性標識したmASAPプローブ(配列番号44)とハイブリダイズさせた。
【００９８】
増幅は、PCR (上記の条件、ここで反応容量は50μlであり、冷dCTPは10μMの濃度で、50μCiのα-P32-dCTPを3000 Ci/mmoleで補った)により、プライマーmFIS-1F (配列番号35)およびmFis-2R (配列番号36)を用いて行った。ハイブリダイゼーションを65℃で行った(6×SSCバッファー/0.5% SDS/5×Denhardt's溶液中)。メンブレンを高ストリンジェント(0.1×SSC/0.1% SDS)でリンスし、次いでオートラジオグラフィーによるか、またはPhosphorImager上で分析した。
【００９９】
b.2) 結果
図3は、これらの結果を示す。
主要なシグナルが精巣および脳で得られ、これはゲル上において明確に見えることが記載される(図3A)。
ゲルのトランスファーおよび内部プローブとのハイブリダイゼーション後に、非常に弱いシグナルが他の組織において検出されることが記載される(図3B)。
結果として、mASAPタンパク質をエンコードするmRNAは、精巣および脳で主に発現される。マウス精巣RNAからRT-PCRにより増幅されるマウス全長cDNAは、配列番号45の配列に対応し、対応タンパク質(mASAP)は、配列番号46の配列に対応する。
【０１００】
実施例4：細胞性局在化
a) 真核発現ベクターでのhASAP cDNAのサブクローニング
実施例1で得られたhASAP cDNAを、3種の発現ベクターに挿入した：
1- C-末端の位置に融合された緑色蛍光タンパク質(GFP)を有する状態のpEAK10-EGFP中へ(ベクター1) (pEAK10、Edge Biosystemsからのベクター (フランスのQ.BIOgene、Illkirchにより流通)、この中にはEGFPタンパク質(増強緑色蛍光タンパク質(enhanced green fluorescent protein))が、参考文献I.：Gaillardら、Eur. J. Neurosci、15 409〜418、2002に従って導入されている)；
【０１０１】
2- N-末端側に融合された黄色蛍光タンパク質(YFP)を有する状態のpEYFP-C1中へ(ベクター2) (BD Biosciences Clontechにより流通)；
3- N-末端側にMYC タグを含むGLOMYC3-1の中へ(ベクター3)、該ベクターは、ベクターpcDNA3.1 (Invitrogen)に由来し、この中には、HindIII-BamHI 部位において5'非翻訳領域(5'UTR)とMYCタグが挿入され、XbaI部位でグロブリンの3'UTR領域(SpeI-XbaI断片)が挿入されている。
【０１０２】
hASAP cDNAは、その最初のクローニングベクター(pCR4-TOPO)から、PCRにより、忠実度の高いpfu Turboポリメラーゼを用いて、最初のメチオニンと最後のアミノ酸との間のcDNAを増幅するプライマーを用いて増幅させた。得られた増幅産物を、3種のベクターにサブクローニングした。
【０１０３】
- PEAK-GFP中にクローニング。DNA挿入断片を、PCRにより[94℃で2分；(94℃で15秒；58℃で30秒；72℃で1分30秒) 30サイクル；72℃で3分]、プライマー：
hFIS-Exp1F (5'-GCCACCATGTCTGATGAAGTTTTTAGCAC-3) (配列番号37)および
hFIS-Exp1R (5'-GAAACACTTTTGCGAACACAGTTC-3') (配列番号38)
を用いて調製。
このベクターを、EcoRVで開裂し、脱リン酸化した。ベクター10 ngを、DNA挿入断片とのライゲーションに用いた。PCR産物をリン酸化し、high PURE PCR kit (Roche)で精製した。挿入断片100 ngを、ライゲーション[最終容量10μl (Biolabsリガーゼ)中に16℃で12時間、標準的な条件(SambrookおよびRussell)に従う]に用いた。
【０１０４】
- Glomyc中にクローニング：DNA挿入断片を、PCRにより[94℃で2分；(94℃で15秒；60℃で30秒；72℃で1分30秒) 30サイクル；72℃で3分]、プライマー：
Glomyc-FIS1F：(5'-TAATGTCTGATGAAGTTTTTAGCACC-3') (配列番号39)および
Glomyc-FIS1R：(5'-TCAAAACACTTTTGCGAACACAGTTC-3') (配列番号40)
を用いて調製。
クローニング条件は、PEAK-GFPへのクローニングについて記載したものと同じである。
【０１０５】
- YFP中にクローニング：DNA挿入断片の調製：Glomycについてと同じ条件、プライマー：
YFP-FIS1F (5'-AATGTCTGATGAAGTTTTTAGCACC-3') (配列番号41)および
Glomyc-FIS1R (配列番号40) (上記を参照)
を用いる。
クローニング条件は、PEAK-GFPへのクローニングについて記載したものと同じであり、ベクターは予めSma1で切断しておく。
【０１０６】
組換え体を、PCRにより、ベクターについてのプライマーおよび内部プライマーを用いて分析した。
PEAK-GFP：58℃でアニーリング、72℃で45秒の伸長、および残りについて標準的な条件。プライマー：constFIS-2F (配列番号33)およびGFP-1R (5'-TCAGCTTGCCGTAGGTGGC-3') (配列番号42)。
YFP：55℃で1分間のアニーリング：プライマー：YFP-2F (5'-ATGGTCCTGCTGGAGTTCG-3') (配列番号43)およびhFIS-Exp1R (配列番号38)。
Glomyc：44℃でアニーリング、72℃で45秒の伸長。プライマー：constFIS-2F (配列番号33)およびSP6。組換え体を、販売先で調整した自動配列決定によりPCR製品(Genome Express、Meylan)を用いて配列決定した。
【０１０７】
b) 原核生物発現ベクターにおけるhASAP cDNAのサブクローニング
上記の段落a)で用いたのと類似のストラテジーを用いて、標準的なプロトコルに従って精製可能なGSTとの融合タンパク質を産生するように、hASAP cDNAをベクターpGEX-4T2 (AMERSHAM)中にクローニングした。
【０１０８】
c) 原核生物または真核生物発現ベクターにおけるmASAP cDNAのサブクローニング
上記の段落a)で用いたのと類似のストラテジーを用いて、mASAP cDNAを、次のベクターにクローニングした：
- pGEX-4T2 (AMERSHAM)、標準的なプロトコルに従って精製可能なGSTとの融合タンパク質を産生するように。
- pEYFP-C1、直接の免疫蛍光により検出可能な黄色蛍光タンパク質(YFP)との融合タンパク質(N-末端融合)を産生するように。
【０１０９】
d) トランスフェクション、免疫蛍光および顕微鏡観察
d.1) 材料および方法
得られたベクターを、リン酸カルシウム法によるか、またはより日常的には、jetPEI法(GDSP10101、Qbiogene)を製造者の推奨に従って用いて、次の細胞株にトランスフェクションした：
- PEAK (参照番号37937、Edge Biosystems (フランスのQ.BIOgene、Illkirchにより流通))、ヒトASAP構築物についてのみ、
- HEK-293 (ATCC (American Tissue Culture Collection) 参照番号CRL-1573；p 53 -/- 同期化不能(non-synchronizable))、ヒトおよびマウスASAP構築物について、
- 形質転換していないNIH3T3 (マウスASAP構築物)、および
- U-2 OS (ATCC HTB-96; p 53 +/-、同期化可能)。
【０１１０】
ベクター1)および2) (ヒトおよびマウスASAP構築物)について、局在化をGFPまたはYFPの蛍光を24時間、48時間および72時間で、パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、核をヨウ化プロピジウムまたはヘキスト33286のいずれかで染色した後に検出することにより直接測定した。
ベクター3)について、MYCタグを、TEBU (9 E10、カタログ番号SC-40、Santa Cruz Biotechnology、CA)により流通している抗-MYC一次抗体、およびフルオロクロムで標識した抗マウスIgGヤギ二次抗体Alexa-594 (Molecular Probes、参照番号A-11032、フランスにおいてInterchim, Montluconにより流通)を用いて、細胞を固定化し、そしてこれを0.1% Triton X 100で透過可能にした後で検出した。スライドを分析し、画像をZeiss Axiophot顕微鏡で収集した。
【０１１１】
d.2) 結果：ASAPタンパク質のα-チューブリンとの細胞性局在化と共局在化
- 細胞性局在化
図4は、HEK-293株で過剰発現させたhASAPタンパク質の細胞性局在化を示す(PI = ヨウ化プロピジウム)。
ベクター1)、2)および3)での種々のトランスフェクションに対応するスライドの蛍光顕微鏡下の観察は、同じタイプのプロフィールを示す。hASAPおよびmASAPタンパク質の局在化は、細胞質性であり、その線維性のプロフィールは、チューブリンフィラメントのそれを思い起こさせる。
【０１１２】
さらに、トランスフェクションされた細胞が分裂障害を示すことが明らかである。なぜなら、核が常にトランスフェクションされていない細胞よりも大きいからである(図4Aおよび4B)。これに加えて、トランスフェクションされた細胞のいくつかは、多核であるようである(図4B)。このことは、トランスフェクションされた細胞の異常な分裂を示唆する。
最後に、トランスフェクションされた細胞の有糸分裂は、染色体機構および有糸分裂紡錘体のレベルでのhASAPおよびmASAPタンパク質の局在化プロフィールの両方の観点において、異常であるようである。hASAPおよびmASAPタンパク質の星型の局在化プロフィールは、中心体の周りの星状体の微小管の核形成の特徴である(図4Cおよび4D)。
【０１１３】
類似のASAPタンパク質局在化プロフィールが、hASAPを過剰発現するU-2 OS株(p 53 +/-)、およびmASAPを過剰発現する形質転換されていないNIH 3T3株において検出される。有糸分裂において単極細胞の蓄積が観察される。
さらに、U-2 OS細胞の同期化および周期中の種々の時間での細胞抽出物の回収により、ASAPタンパク質が細胞周期の全ての段階(間期、S、G2/M)で実際に存在することが確認された。
【０１１４】
- ASAPタンパク質のα-チューブリンとの共局在化
図5は、ヒトASAPタンパク質のα-チューブリンとの共局在化を示す。同様に、マウスASAPタンパク質は、α-チューブリンと共局在化する。
図5Aは、抗-チューブリン抗体(Alexa-594、Molecular Probe)を用いる免疫蛍光により検出されるα-チューブリンの細胞性局在化を示す。
図5Bは、YFP (黄色蛍光タンパク質)で標識したASAPタンパク質の局在化を示す。
図5Cは、2つの画像の重ねあわせを示し、2つのタンパク質の共局在化を証明する。
【０１１５】
実施例5：抗-hASAPおよび抗-mASAPポリクローナル抗体の製造
a) 抗体製造
次のASAPタンパク質構築物を、原核生物発現ベクターpGEX 4T-2 (AMERSHAM)に、実施例4に記載されるようにしてクローニングした：
- 全ヒトASAPタンパク質(配列番号1)、
- 可能性がある(potential) MAPドメインを含むC-末端部分(残基1〜421、配列番号47)を欠失させたヒトタンパク質、
- 全マウスタンパク質(配列番号46)。
タンパク質をイー・コリ(E. coli)内で発現させ、標準的なプロトコルにより精製した。次いでウサギを精製ASAPタンパク質で標準的なプロトコルに従って免疫し、免疫された血清を回収した。
【０１１６】
b) ポリクローナル血清の、内因性ASAPタンパク質に対する反応性の分析
全hASAPタンパク質または可能性があるMAPドメインを含むC-末端部分を欠失させたhASAPタンパク質に指向された単一特異的ポリクローナル血清を、HEK-293およびU-2 OS細胞について標準的なプロトコルに従って、ウェスタンブロッティングおよび免疫蛍光により試験した。
ウェスタンブロッティングにより、全hASAPタンパク質に指向された単一特異的ポリクローナル血清は、内因性ASAPタンパク質に対応する約110 kDaの見かけの分子量を有するタンパク質を、HEK-293細胞およびU-2 OS細胞の両方において検出した。これらの条件下で、抗-FLAG抗体は、等しい分子量を有するタンパク質を、FLAG タグと融合されたhASAPタンパク質を発現するためのベクターでトランスフェクションされた対照のHEK-293またはU-2 OS細胞で検出した。
【０１１７】
免疫蛍光により、全hASAPタンパク質に指向された単一特異的ポリクローナル血清は、間期のHEK-293細胞の微小管、有糸分裂の細胞の星状体、および終期の終わりの残体の微小管を標識した。
可能性があるMAPドメインを含むC-末端部分を欠失させたhASAPタンパク質に指向された単一特異的ポリクローナル血清は、免疫蛍光により同じプロフィールを示し、ウェスタンブロッティングにより約110 kDaのタンパク質を検出した。
mASAPタンパク質に指向された単一特異的ポリクローナル血清は、どの細胞のタイプがASAPを発現したか、および細胞周期のどの段階でそれが発現されたかを、マウスの精巣切片についての免疫蛍光により検出するために用いた。
【０１１８】
実施例6：BRCTドメインを含むN-末端部分または可能性のあるMAPドメインを含むC-末端領域を欠失させた突然変異体を用いるhASAPタンパク質の機能分析
BRCTドメインを含むN-末端部分を欠失させた(Ndel1：残基304〜647 (配列番号48)；Ndel2：残基411〜647 (配列番号49)；Ndel3：残基478〜647 (配列番号50))か、またはMAPドメインを含むC-末端部分を欠失させた(Cdel1：残基1〜477 (配列番号51)；Cdel2：残基1〜418 (配列番号52)；Cdel3：残基1〜303 (配列番号53)) hASAPタンパク質をエンコードするcDNAの断片を、適切なプライマーを用いるPCRにより増幅させ、発現ベクターpEAK10-EGFP (GFPとのC-末端融合)、およびpEYFP-C1 (YFPとのN-末端融合)に、実施例4に記載したのと類似のプロトコルに従ってクローニングした。
【０１１９】
種々の構築物を、HEK-293およびU-2 OS株にトランスフェクションし、次いでhASAPタンパク質の種々の突然変異体の細胞性局在化を、実施例4に記載のようにして分析した。
同じ欠失について、N-末端部分にYFPを含むか、またはC-末端部分にGFPを含む構築物を用いて、類似のプロフィールが得られたことが記載される。
【０１２０】
全hASAPタンパク質と比べると、C-末端部分を欠失させた3つの構築物は、もはや間期においてチューブリンと共局在化せず、線維性の外観も有さない。これらの結果は、欠失がMAPドメインを含むことを示す。これに加えて、MAPドメインを含むC-末端部分を欠失させた突然変異体を過剰発現する細胞において、有糸分裂においてブロックする単極細胞が観察されない。
【０１２１】
全hASAPタンパク質と比べると、BRCTドメインを含むN-末端部分を欠失させた3つの構築物は、遺伝子座の形で核局在化を示したが、チューブリンと共局在化するいくらかの線維が細胞質に残っている。
hASAPタンパク質の機能分析は、干渉RNA (iRNA)を用いる遺伝子の発現不活性化からなる実験により完了する。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図1は、ヒトasap遺伝子の染色体局在化および構造を表す。
【図２】図2は、種々のヒト組織について、hASAPプローブとのハイブリダイゼーション後のノザンブロッティングにより得られるシグナルを表す。
【図３】図3は：(A) 配列番号15のポリヌクレオチドのオルトログ(ortholog)であるマウスポリヌクレオチドに対応するプライマーで、種々のマウス組織を用いて得られたRT-PCR産物のアガロースゲル電気泳動により；(B) 電気泳動後、メンブレン上へのゲルのトランスファーおよび内部mASAPプローブとのハイブリダイゼーションの後に得られた結果を表す。
【図４】図4は、3'の位置で緑色蛍光タンパク質(GFP)と結合したか、または5'の位置で黄色蛍光タンパク質(YFP)と結合したか、あるいはN-末端側でMYCタグと結合した(融合欄)hASAPタンパク質の細胞性局在化を表す。
【図５】図5は、α-チューブリンとのヒトASAPタンパク質の共局在化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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