(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターと、
下記（1）〜（4）のいずれかのDNA分子：
（1）配列番号１記載のDNA分子；
（2）配列番号２及び／又は３記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（3）配列番号１記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシリンガ酸に対してディメチラーゼ活性を有する2本のポリペプチドをコードするDNA分子；又は
（4）配列番号２及び／又は３記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつシリンガ酸に対してディメチラーゼ活性を有する2本のポリペプチドのいずれか一方又は両方をコードするDNA分子と、
ターミネーターとが、この順に、適切な宿主において機能可能に接続された組換え体DNAであって、
さらに、組換え体DNAは、プロモーターとDNA分子との間にVanAの安定化に寄与し、VanAの酵素機能を阻害しないポリペプチドをコードするDNA分子を有し、
VanAの安定化に寄与し、VanAの酵素機能を阻害しないポリペプチドがLacZのαフラグメントに含まれる16アミノ酸からなるオリゴペプチドであって、配列：MTMITPSLHACRSESLで表されるオリゴペプチド又はヒスチジン6個を含む30アミノ酸からなるオリゴペプチドであって、発現ベクターpQE32上の制限酵素SmaIによる切断部位から上流の57塩基の配列がコードするポリペプチドに配列SLHACRSESLMで表されるポリペプチドを連結して得られるオリゴペプチドであり、
さらに、プロモーターとターミネーターとの間に下記DNA分子群を有し、
ここで、前記DNA分子群はDNA分子（ligA遺伝子）、DNA分子（ligB遺伝子）、DNA分子（ligC遺伝子）及びその組み合わせからなる群より選ばれ、
DNA分子（ligA遺伝子）は下記のいずれかのDNA分子であり、
（5）配列番号１４記載のDNA分子；
（6）配列番号１５記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（7）配列番号１４記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリペプチド（ligB）と会合してプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；又は
（8）配列番号１５記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリペプチド（ligB ）と会合してプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；
DNA分子（ligB遺伝子）は下記のいずれかのDNA分子であり、
（9）配列番号１６記載のDNA分子；
（10）配列番号１７記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（11）配列番号１６記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリペプチド（ligA）と会合してプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；又は
（12）配列番号１７記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリペプチド（ligA）と会合してプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；
DNA分子（ligC遺伝子）は下記のいずれかのDNA分子であり、
（13）配列番号１８記載のDNA分子；
（14）配列番号１９記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（15）配列番号１８記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；又は
（16）配列番号１８記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；
前記ポリペプチド（ligA）は、配列番号１５記載のアミノ酸配列又は配列番号１５記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、
前記ポリペプチド（ligB）は、配列番号１７記載のアミノ酸配列又は配列番号１７記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、
さらに、プロモーターとターミネーターとの間に下記（17）〜（20）のいずれかのDNA分子を有する、組換え体DNA：
（17）配列番号２１記載のDNA分子；
（18）配列番号２２記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（19）配列番号２１記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；又は
（20）配列番号２２記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は追加したアミノ酸配列からなり、かつベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA分子。
【請求項２】
組換え体DNAが、大腸菌XL1-Blue株が保持するプラスミドである、請求項１記載の組換え体DNA。
【請求項３】
請求項２記載の組換え体DNAを含む宿主生物。
【請求項４】
請求項３記載の宿主生物を培養することを含む2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物成分あるは石油成分由来、あるいは化学的に合成されたバニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を発酵生産するための多段反応プロセスを構成する4種類の酵素（ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ディメチラーゼ、プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ、4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）をコードした遺伝子配列、前記多段反応プロセスの制御遺伝子、前記遺伝子を含む組換えベクター、前記遺伝子を保有する形質転換細胞及びそれを用いたの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物主要成分であるリグニンは、芳香族高分子化合物として植物細胞壁に普遍的に含まれており、樹木では30％、イネやトウモロコシ稈の15％を占めるバイオマス資源である。その他にも植物は多様な芳香族化合物を構成成分として含んでいる。しかしリグニンを主成分とする植物由来の芳香族成分は化学構造が多様な成分で構成されている事や複雑な高分子構造を持つため有効な利用技術が開発されていない。従来の利用技術として挙げられるのは、リグニンを主成分とする植物由来の芳香族成分をアルカリ分解などの化学分解で生成する低分子芳香族分解物から、香料原料であるバニリンを分離製造する実用化技術がある。しかし、化学分解で生成するバニリン以外の多量の低分子芳香族物質の有効な利用方法はないのが現状である。そのため製紙工程で大量に生成するリグニンは有効利用される事無く重油の代替え品として燃焼されている。
今日の石油化学工業の発展を支えたのは、多様な化学成分の混合物である原油を触媒分解と分溜によってベンゼンやエチレンなどの単一な中間物質に一旦変換し、それらを原料に多様な機能性プラスチックスを製造するという原理である。この石油化学工業の発展を支えた基本原理は、化学構造の多様さや複雑な高分子構造を持つリグニンなど植物芳香族成分の利用技術においても適用可能な普遍的原理である。リグニンを主成分とする植物由来の芳香族成分利用の技術を開発する上で、石油化学の触媒分解に相当するプロセスとして、リグニンなど植物芳香族成分の加水分解や酸化分解、可溶媒分解などの化学的分解法や、超臨界水や超臨界有機溶媒による物理化学的分解法など多くの低分子化技術が既に数多く研究され開発されている。しかしもう一つの技術である、各種分解法により生成する植物成分由来低分子混合物から、様々な機能性プラスチックス原料や化学製品の原料と成りうる有用な単一の中間物質（石油化学においてはエチレンやベンゼン）への変換分離技術は開発されていなかった。この技術が開発されれば、リグニンを主成分とする植物由来の芳香族成分利用が、石油化学に匹敵する技術として発展する可能性がある。
このような状況の下で、バニリン酸をNADHの存在下でプロトカテク酸に変換するディメチラーゼ反応は、既にPseudomonas putida WCS358、Pseudomonas sp. HR199等の微生物において研究が行われ、配列番号５及び８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（VanA）と、配列番号６及び９に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（VanB）、さらにこれらのポリペプチドをコードする配列番号４及び７で示される塩基配列を有する遺伝子が示されている（例えば非特許文献１から３参照）。
【０００３】
【非特許文献１】Priefert H., Rabnehorst J., Steinbuchel A., (1997) J.Bacteriol. 179, 2595-2607
【非特許文献２】Venturi V., Zennaro F., Degrassi G., (1998) Microbiology 144, 965-973
【非特許文献３】Brunel F., Davison J., (1988) J.Bacteriol. 170, 4924-4930
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、化学構造の多様さや複雑な高分子構造を持つリグニンなど植物芳香族成分の加水分解や酸化分解、可溶媒分解などの化学的分解法や、超臨界水や超臨界有機溶媒による物理化学的分解法などの低分子化技術で生成するバニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸を含む植物成分由来低分子混合物から多段階の酵素反応を介して、単一の中間物質2-ピロン-4,6-ジカルボン酸（PDC）に高収率で変換する新しい発酵生産技術を組換えDNA技術により設計し構築することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記低分子混合物の主用成分であるバニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸及びプロトカテク酸が微生物Sphingomonas paucimobilis SYK-6によって完全に分解代謝され二酸化炭素と水に至ること、さらにこの代謝経路においてこれら5種類の化合物が単一の中間物質2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を経由して分解されることを発見した。
本発明者は、さらにこれら5種類の化合物が単一の中間物質2-ピロン-4,6-ジカルボン酸に変換される多段階の反応とそれを触媒する酵素機能、及びそれらをコードする遺伝子の単離と塩基配列の決定に関して鋭意研究を行った結果、前記低分子混合物から直接、単一の中間物質2-ピロン-4,6-ジカルボン酸に変換する発酵生産プロセスに必要な全ての遺伝子取得に成功した。
本発明者は、これらの研究成果に基づき、発酵生産プロセスに関与する各種遺伝子の改変と各遺伝子配置の設計を行い、前記低分子混合物から、発酵法によって2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の生産に至る多段酵素反応を同調的に高発現する発酵生産プロセス制御遺伝子の構築し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
従って、本発明は、下記のいずれかのDNA分子（vanAB遺伝子）を提供する：
（1）配列番号１記載のDNA分子、
（2）配列番号２及び／又は３記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子、
（3）配列番号１記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシリンガ酸に対してディメチラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA分子、又は
（4）配列番号２及び／又は３記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつシリンガ酸に対してディメチラーゼ活性を有する2本のポリペプチドのいずれか一方又は両方をコードするDNA分子。
また、本発明は、VanAの安定化に寄与し、VanAの酵素機能を阻害しないポリペプチドをVanAのN末端に付加したポリペプチドを提供する。
【０００７】
また、本発明は、プロモーターとターミネーターとの間に、以下のDNA分子とを有し、かつ適切な宿主において機能可能に接続された組換え体DNAを提供する：
VanAの安定化に寄与し、かつVanAの酵素機能を阻害しないポリペプチドをコードするDNA分子；
vanAB遺伝子；
下記のいずれかのDNA分子（ligA遺伝子）；
（5）配列番号１４記載のDNA分子、
（6）配列番号１５記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子、
（7）配列番号１４記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリペプチド（ligB）と会合してプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子、又は
（8）配列番号１５記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリペプチド（ligB）と会合してプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子、
下記のいずれかのDNA分子（ligB遺伝子）；
（9）配列番号１６記載のDNA分子、
（10）配列番号１７記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子、
（11）配列番号１６記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリペプチド（ligA）と会合してプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子、又は
（12）配列番号１７記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリペプチド（ligA）と会合してプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子、
下記のいずれかのDNA分子（ligC遺伝子）；
（13）配列番号１８記載のDNA分子、
（14）配列番号１９記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子、
（15）配列番号１８記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子、又は
（16）配列番号１８記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子、
下記のいずれかのDNA分子（ligV遺伝子）；
（17）配列番号２１記載のDNA分子、
（18）配列番号２２記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子、
（19）配列番号２１記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子、又は
（20）配列番号２２記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は追加したアミノ酸配列からなり、かつベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA分子。ここで、前記ポリペプチド（ligA）は、配列番号１５記載のアミノ酸配列又は配列番号１５記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、前記ポリペプチド（ligB）は、配列番号１７記載のアミノ酸配列又は配列番号１７記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる。
【０００８】
また、本発明は、大腸菌XL1-Blue株が保持するプラスミドである前記組換え体DNAを提供する。
また、本発明は、前記組換え体DNAを含む宿主生物を提供する。
また、本発明は、前記宿主生物を培養することを含む2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、バニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸を含む植物成分由来低分子混合物から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸に高収率で変換する新しい発酵生産技術が提供され、リグニンを主成分とする植物由来の芳香族成分利用が、石油化学に匹敵する技術として発展することが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において構築した2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の発酵生産プロセス制御遺伝子は、配列番号２及び３で示されるアミノ酸配列を有する2種類のポリペプチド（vanA及びvanB）会合により、ディメチラーゼ活性を有する2本のポリペプチドをコードする領域を一部に含む、配列番号１記載のDNA分子（vanAB遺伝子）を有する。vanAB遺伝子(図１)を含有する組換えベクターを保有する形質転換細胞は、NADHの存在下でバニリン酸及びシリンガ酸のメチルエーテル結合を切断するディメチラーゼ反応によってプロトカテク酸及び3メチルガリック酸に変換する。ここで、vanAB遺伝子は、配列番号１記載のDNA分子に代えて、配列番号２及び／又は３記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子、配列番号１記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシリンガ酸に対してディメチラーゼ活性を有する2本のポリペプチドをコードするDNA分子、又は配列番号２及び／又は３記載のアミノ酸配列の一部のアミノ酸が欠失、置換及び／又は追加してなり、かつシリンガ酸に対してディメチラーゼ活性を有する2本のポリペプチドのいずれか一方又は両方をコードするDNA分子であってもよい。
【００１１】
本発明者らは、Pseudomonas putida PpY101株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーAS（5'-GGAGAGCCTCATGTACCCGAGAAACACTTCC-3'：配列番号１０）及びプライマーBO（5'-AATGCCACCTTGCGTTATGC-3'：配列番号１１）を用いてPCR法により増幅したDNA断片を解析した結果、NADHの存在下でバニリン酸のメチルエーテル結合を切断する配列番号４及び７で示される既知のディメチラーゼ遺伝子とは異なる配列番号１で示される塩基配列を有する新たなディメチラーゼ遺伝子として単離した。この遺伝子は、NADHの存在下でバニリン酸及びシリンガ酸のメチルエーテル結合を切断するディメチラーゼをコードする酵素遺伝子である。
配列番号１で示される塩基配列を持つDNA断片を、大腸菌プラスミドpUC119のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素Hinc II切断部位に連結し、ハイブリドプラスミドpvanABを作成した（図２）。ハイブリドプラスミドpvanABを大腸菌XL1-Blue株（STRATEGENE, CA, USAより購入）に導入した形質転換体は、バニリン酸に対する強力なディメチラーゼ活性を示した。さらに前記形質転換体は、Pseudomonas putida WCS358及びPseudomonas sp. HR199の既知ディメチラーゼでは示されていないシリンガ酸に対する強力なディメチラーゼ活性を示した。
次に、配列番号１示される塩基配列を持つDNA断片を、大腸菌プラスミドpUC18のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素SmaI切断部位に連結したハイブリドプラスミドpvnnABを作成した（図３）。ハイブリドプラスミドpvnnABを大腸菌XL1-Blue株 (STRATEGENE, CA, USAより購入)に導入した形質転換体は、予想に反してバニリン酸及びシリンガ酸に対するディメチラーゼ活性を全く示さなかった。
【００１２】
ハイブリッドプラスミドpvanABは、大腸菌プラスミドpUC119のLacZプロモーターの下流に存在するLacZのαフラグメントをコードする遺伝子内に存在するマルチクローニングサイトのうち、制限酵素HincIIによって切断される部位に、配列番号１の塩基配列を持つDNA断片を連結して作成される。ハイブリッドプラスミドpvanABを導入した大腸菌XL1-Blue株の形質転換体においては、LacZプロモーターの制御下配列番号２で示されるアミノ酸配列を持つ本来のディメチラーゼ酵素蛋白質として生産されず、LacZのαフラグメントに由来する16アミノ酸からなるオリゴペプチドを配列番号２に示されるディメチラーゼ酵素のサブユニットのN末端に付加した融合蛋白質として生産される（図４）。
他方、ハイブリドプラスミドpvnnABを導入した大腸菌XL1-Blue株の形質転換体においては、LacZプロモーターの制御下配列番号２で示されるアミノ酸配列を持つ本来のディメチラーゼ酵素蛋白質として生産される（図４）。
ハイブリドプラスミドpvanABを導入した大腸菌XL1-Blue株の形質転換体は強力で安定なディメチラーゼ活性を示すが、ハイブリドプラスミドpvnnABを導入した大腸菌XL1-Blue株の形質転換体はディメチラーゼ活性を全く示さない事実は、2つの形質転換体において共に生成すると考えられる配列番号２で示されるアミノ酸配列を持つ本来のディメチラーゼ酵素蛋白質が、極めて不安定な酵素蛋白質として生成し速やかに分解され、一方ハイブリドプラスミドpvanABを導入した大腸菌XL1-Blue株の形質転換体が生成するLacZのαフラグメントに由来する16アミノ酸からなるオリゴペプチドをN末端に付加したディメチラーゼ酵素蛋白質は、N末端にLacZのαフラグメントに由来する16アミノ酸からなるオリゴペプチドを付加することで分解を免れ、ディメチラーゼ活性を持つ安定な融合蛋白質として生産されていることが考えられる。
【００１３】
この可能性をさらに確認するために、ハイブリッドプラスミドpvanAB及びpvnnABより制限酵素HindIII及びSmaIで切断される得られる配列番号１を含むDNA断片を、ヒスチジンの6アミノ酸を付加した蛋白質生産用に市販されている発現ベクターpQE32上の制限酵素SmaIによる切断部位に、平滑化することにより読み枠を一致させて連結したハイブリドプラスミドpQvABを作成した（図５）。このハイブリドプラスミドpQvABを導入した大腸菌の形質転換体は、LacZプロモーターの制御下で配列番号１で示されるポリペプチドのN末端に、pvanABの場合のようなLacZのαフラグメントに由来する16個のアミノ酸から構成されるオリゴペプチドとは異なる、ヒスチジンの6アミノ酸を含む30アミノ酸からなるオリゴペプチドを配列番号２で示されるポリペプチドのN末端に付加した融合蛋白質を生産する。
新たに作成したハイブリドプラスミドpQvABを大腸菌XL1-Blue株に導入して作成した形質転換細胞は、バニリン酸及びシリンガ酸を基質とする強力で安定な酵素活性を生み出した。
なお、大腸菌XL1-Blue株に導入して強力なディメチラーゼ活性を示す形質転換体においては、配列番号２に示されるポリペプチドに比べて分子量が増大した融合蛋白質が大量に生産されるが、ハイブリドプラスミドpvnnABを導入した大腸菌XL1-Blue株の形質転換体では、配列Aで示されるアミノ酸配列から計算される本来のディメチラーゼ酵素蛋白質の蓄積は認められない（図８）。
【００１４】
バニリン酸ディメチラーゼ（VanA及びVanB）は、微生物細胞内で本来半減期の短い不安定ポリペプチドとして生成されている。これは、バニリン酸ディメチラーゼを生成する野生の微生物細胞を破砕して得られる粗酵素液を用いたこれまでの数多くの研究において極めて微弱な酵素活性としてしか検出されない事実や、多くの文献（Priefert H., Rabnehorst J., Steinbuchel A., (1997) J.Bacteriol. 179, 2595-2607, Venturi V., Zennaro F., Degrassi G., (1998) Microbiology 144, 965-973）による、単離されたディメチラーゼ遺伝子をもつハイブリドプラスミドを大腸菌に導入して作成した形質転換体では、本発明で達成した酵素活性の3000分の1という極めて微弱なヂメチラーゼ活性を検出したにすぎないと言う報告は、本発明の重要性を良く説明する。従って、本発明は、シュードモナス属などの微生物が有するバニリン酸をプロトカテク酸に変換するディメチラーゼの機能を、遺伝子組換え技術を用いて大腸菌を含む多様な宿主細胞内で強力に安定に実現する新しい方法に関するものである。LacZのαフラグメントに含まれる16アミノ酸からなるオリゴペプチド、或いはヒスチジン6個を含む30アミノ酸からなるオリゴペプチドを一例とする、VanAの安定化に寄与し、かつVanAの酵素機能を妨害しない様々なポリペプチドをVanAのN 末端に付加することによりバニリン酸ディメチラーゼを安定化することができる。N末端に付加する融合ペプチドの構造は、本発明で用いたアミノ酸配列に限定される必要はなく、バニリン酸ディメチラーゼ（VanA及びVanB）の安定化に寄与するものであればよい。
【００１５】
大腸菌XL1-Blue株で強力なディメチラーゼ活性を生成する、ハイブリドプラスミドpvanAB上に保持され、本発明で単離され配列番号１で示されるPseudomonas putida PpY101株由来の新たなディメチラーゼ遺伝子が、Pseudomonas putida のディメチラーゼ欠損変異株（PpY1100株）において大腸菌XL1-Blue株における場合より強力に発現し、安定な酵素活性を維持する事が期待される。
Pseudomonas putida において複製して維持可能な広宿主域プラスミド pKT230Mc（図７）の制限酵素EcoRIによる切断後平滑化したDNA断片に、大腸菌の形質転換体細胞において安定で強力なバニリン酸ディメチラーゼ（VanA及びVanB）の生産を実現したハイブリドプラスミドpvanABの、制限酵素PvuIIによる切断によって得られるlacZプロモーター領域、LacZのαフラグメント領域、配列番号１で示されるディメチラーゼをコードする領域を含むDNA断片を連結した広宿主域ハイブリドプラスミドpDVZ1を作成した（図８）。ハイブリドプラスミドpDVZ1上のディメチラーゼ遺伝子は、広宿主域プラスミドpKT230Mc（図７）が持つ大腸菌由来のβ-ラクタマーゼ遺伝子プロモーター下流に存在しており、β-ラクタマーゼ遺伝子プロモーターが大腸菌だけでなくPseudomonas属を含む多様な微生物で機能する事から、ハイブリドプラスミドpDVZ1 を導入された大腸菌XL1-Blue株やPseudomonas putidaのディメチラーゼ欠損変異株（PpY1100株）形質転換体は、ディメチラーゼ遺伝子を強力に発現し安定な酵素活性を生成することが期待できる。
ハイブリドプラスミドpDVZ1を導入した大腸菌XL1-Blue株及びPseudomonas putidaのディメチラーゼ欠損変異株（PpY1100株）の形質転換体は、両者とも強力なバニリン酸及びシリンガ酸に対するディメチラーゼ活性を示した。
【００１６】
大腸菌XL1-Blue株の形質転換体において、配列番号２及び３に示されるバニリン酸ディメチラーゼ（VanA及びVanB）は本来半減期の短い不安定ポリペプチドとして生成され、VanAポリペプチドのN末端に安定化に寄与するポリペプチドを付加する事でポリペプチド鎖の不安定性を低減し、安定なディメチラーゼ活性を生み出していると判断された。この現象が大腸菌に限らずPseudomonas putidaの形質転換体においても認められる普遍的性質である可能性について調査した。
広宿主域プラスミドpKT230MC（図７）の制限酵素EcoRIによる切断部位に、大腸菌ハイブリドプラスミドpvanABから制限酵素EcoRI及びHindIIIで切断して得られる配列番号１で示される塩基配列を含むDNA断片を連結し新たなハイブリドプラスミドpDV01を作成した（図９）。ハイブリドプラスミドpDV01上のディメチラーゼ遺伝子は、pKT230MCが持つ大腸菌由来のβ-ラクタマーゼ遺伝子プロモーター下流に存在しており、ハイブリドプラスミドpDV01を導入された大腸菌XL1-Blue株やPseudomonas putidaのディメチラーゼ欠損変異株（PpY1100株）形質転換体は、ディメチラーゼ遺伝子を強力に発現し、配列番号２及び３で示されるアミノ酸配列を持つ本来のディメチラーゼ酵素蛋白質を生産することができる。予想通りハイブリドプラスミドpDV01を導入された大腸菌XL1-Blue株やPseudomonas putida PpY1100株の形質転換体は、ディメチラーゼ活性を示さなかった。
ハイブリドプラスミドpDV01 を導入された大腸菌XL1-Blue株及びPseudomonas putida PpY1100株の形質転換体においてディメチラーゼが生産されない原因として、配列番号１で示されるディメチラーゼ遺伝子の上流域に翻訳に必要なシャインダルガノ配列（SD配列）を持たないことが考えられる。
シュードモナス属細菌で有効に機能することが判明している2種類のシャインダルガノ配列（SD配列）を配列番号１に付加するため、図１０に示す2種類のPCRプライマー配列（AS-LIGA（配列番号１２）及びAS-GAP（配列番号１３））を新たに作成し、プライマーBO（5'-AATGCCACCTTGCGTTATGC-3'：配列番号１１）を下流側のプライマーとして、大腸菌のハイブリドプラスミドpvanABを鋳型としてPCR法により増幅した。配列番号１の5'側にSD配列を新たに導入したDNA断片を、大腸菌プラスミドpUC18のマルチクローニングサイトの制限酵素SmaIによる切断部位に連結することにより、新たな大腸菌ハイブリドプラスミドpvLAB（PCRプライマー配列（AS-LIGA）を含むもの）、及びハイブリドプラスミドpVGAB（PCRプライマー配列（AS-GAP）を含むもの）を作成した（図１２）。これらのハイブリドプラスミドpvLAB又はpVGAB導入した大腸菌XL1-Blue株の形質転換体は予想したとおりディメチラーゼを生成しなかった。
また、大腸菌のハイブリドプラスミドpvLAB及びpVGABから、制限酵素EcoRI及びHindIIIで切断して得られるSD配列を付加したディメチラーゼ遺伝子を持つDNA断片を、広宿主域プラスミド pKT230MC（図７）の制限酵素EcoRIによる切断部位に連結しハイブリドプラスミドpDVL1及びpDVG1を作成した（図１１）。これらのハイブリドプラスミドを導入されたPseudomonas putida PpY1100株の形質転換体は全くディメチラーゼ活性を示さなかった。
ハイブリドプラスミドpDVZ1は、それを保持する大腸菌及びPseudomonas putidaの形質転換体において、LacZプロモーターの制御下、LacZのαフラグメントに由来する16アミノ酸からなるオリゴペプチドを配列番号２に示されるディメチラーゼ酵素のVanAサブユニットのN末端に付加した融合蛋白質として生産して、強力で安定な酵素活性を生み出すことができる。このことから、ディメチラーゼが本来的にPseudomonas putida PpY101株で半減期の短い不安定ポリペプチドとして生成されており、配列番号２で示されるポリペプチドのN末端に安定化に寄与するポリペプチドを付加することにより、配列番号２及び３のアミノ酸配列で示されるディメチラーゼポリペプチド鎖の安定化と強力なディメチラーゼ活性を得ることができる。
【００１７】
さらに、本発明において構築した2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の発酵生産プロセス制御遺伝子は、配列番号１５及び１７で示されるアミノ酸配列を有する2種類のポリペプチド（ligA及びligB）の会合により、プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ活性を有する2種類のポリペプチドをコードする塩基配列（それぞれ配列番号１４及び１６）をその一部として有し、さらにその下流領域に配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有する4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（ligC）をコードする塩基配列領域（配列番号１８）を一部に含む、配列番号２０で示される塩基配列を有する。配列番号２０で示される塩基配列には、4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする領域の終止コドン配列から約24塩基下流に、逆向き相補配列（インバーティドリピート）が存在しその直後に6個のチミンが連続したρ非依存性の転写のターミネーター構造が配置され（位置2688〜2706）、このρ非依存性の転写のターミネーター構造を2-ピロン-4,6-ジカルボン酸発酵生産プロセス制御遺伝子の最下流に配置することにより、多種類の酵素遺伝子で構成される2-ピロン-4,6-ジカルボン酸発酵生産プロセス制御遺伝子全体の効率的な転写が可能になる。
【００１８】
配列番号２０で示される塩基配列は、配列番号１４及び１６で示される塩基配列がコードするプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼの酵素活性によってプロトカテク酸から生成する、不安定な中間生成物4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドを速やかに安定な2-ピロン-4,6-ジカルボン酸に変換するため、配列番号１４及び１６で示される塩基配列がコードする2種類のポリペプチドのうち下流の小サブユニットをコードする遺伝子領域に、配列番号１８で示される4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター配列を重複した構造を持つ。このことにより、該遺伝子を含むDNA断片を大腸菌プラスミドやシュードモナスを宿主とする広宿主域プラスミドpKT230MC（図７）が持つ大腸菌由来のβ-ラクタマーゼ遺伝子プロモーター下流に連結して作成されるハイブリドプラスミドは、β-ラクタマーゼ遺伝子プロモーターが大腸菌だけでなくPseudomonas属を含む多様な微生物で機能することから、当該ハイブリドプラスミドを導入した形質転換体はプロトカテク酸の4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドへの変換酵素プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ及び4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドの2-ピロン-4,6-ジカルボン酸への変換酵素である4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの2種類の酵素を同調的に生成して、プロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の発酵生産プロセスの安定な進行が可能になる。
【００１９】
配列番号２０で示されるプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ及び4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有する微生物Sphingomonas paucimobilis SYK-6のゲノムDNAより、制限酵素XbaI切断によって得られる配列番号２０を有するDNA断片（図１２）を、大腸菌プラスミドpUC119のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素XbaIによる切断部位に連結することによりハイブリドプラスミドpULABC（図１３）を作成する。本ハイブリドプラスミドを導入した大腸菌XL1-Blue株の形質転換体は、プロトカテク酸を2-ピロン-4,6-ジカルボン酸に高収率変換することが出来る。
【００２０】
大腸菌XL1-Blue株で強力なディメチラーゼ活性を生成する、ハイブリドプラスミドpvanAB（図２）の制限酵素Xba1による切断部位に、図１３で示されるハイブリドプラスミドpULABCから制限酵素XbaIの切断によって得られる、配列番号２０で示される塩基配列を有するプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ及び4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするDNA 断片を連結した大腸菌ハイブリドプラスミド：pUVLABC（図１４）を作成した。本ハイブリドプラスミドを導入した大腸菌XL1-Blue株の形質転換体は、LacZプロモーターの制御下３種類の酵素、ディメチラーゼ、プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ及び4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードした遺伝子配列を同調的に発現して、植物成分あるは石油成分由来、あるいは化学的に合成されたバニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を発酵生産することができた。
【００２１】
Pseudomonas putidaにおいて複製して維持可能な広宿主域プラスミド pKT230MC（図７）に、大腸菌の形質転換体細胞において安定で強力なバニリン酸ディメチラーゼ（VanA,B）の生産を実現したハイブリドプラスミドpvanAB（図２）の制限酵素PvuIIによる切断によって得られる DNA断片を連結した広宿主域ハイブリドプラスミドpDVZ1（図８）は、それを導入した大腸菌XL1-Blue株やPseudomonas putidaの形質転換体で、ディメチラーゼ遺伝子を強力に発現し安定な酵素活性生産する。このハイブリドプラスミドpDVZ1（図８）の制限酵素Xba1による切断部位に、図１３で示されるハイブリドプラスミドpULABCから制限酵素XbaIの切断によって得られる、配列番号２０で示される塩基配列を有するプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ及び4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするDNA 断片を連結した広宿主域ハイブリドプラスミド：pKTVLABC (図１５)を作成した。本ハイブリドプラスミドを導入したPseudomonas putida PpY1100株及び大腸菌XL1-Blue株の形質転換体は、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸の混合物をことごとく、或いは各々を2-ピロン-4,6-ジカルボン酸に高収率変換することができた。
広宿主域組換えプラスミドpKTVLABC (図１５)は、シュードモナス属細菌をはじめとして広い宿主域を持ち、当該組換プラスミドを導入された形質転換細胞において、3種類の酵素ディメチラーゼ、プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ、4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードした遺伝子配列を同調的に発現して、植物成分あるいは石油成分由来、あるいは化学的に合成されたバニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を生産することができるが、2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の高生産のためには、植物成分由来、化学合成もしくは石油由来のバニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸のいずれかから2-ピロン-4,6-ジカルボン酸への分解代謝酵素機能、及び2-ピロン-4,6-ジカルボン酸に対する分解酵素機能を消失せしめた微生物を宿主とした形質転換体を用いる必要がある。
【００２２】
バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を発酵生産する大腸菌ハイブリドプラスミドpUVLABC（図１４）、及び広宿主域ハイブリドプラスミド：pKTVLABC (図１５)に対し、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有するベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（ligV）をコードする領域を一部に含む、配列番号２１で示される塩基配列をさらに連結するとこにより作成されるハイブリドプラスミドは、NADの存在下でバニリン及びシリンガアルデヒドをバニリン酸及びシリンガ酸に酸化し、さらにはベンズアルデヒド及びP-ヒドロキシベンズアルデヒドを安息香酸及びP-ヒドロキシ安息香酸に酸化する。従って、植物成分由来低分子混合物に含まれるバニリン、シリンガアルデヒドを酸化してバニリン酸、シリンガ酸に変換する機能が新たに付加される。
【００２３】
配列番号２１で示されるベンズアルデヒドデヒドロゲナーをコードする遺伝子を、大腸菌プラスミドpUC119のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素SmaIによる切断部位に連結することによりハイブリドプラスミドpULV（図１６）を作成する。本ハイブリドプラスミドを導入した大腸菌XL1-Blue株の形質転換体は、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーを生産することができる。さらに配列番号２１で示されるベンズアルデヒドデヒドロゲナーをコードする遺伝子を、Pseudomonas putidaにおいて複製して維持可能な広宿主域プラスミドpKT230MC（図７）の制限酵素SmaIによる切断部位に連結することによりハイブリドプラスミドpKTLV（図１６）を作成する。本ハイブリドプラスミドを導入したPseudomonas putida PpY1100株の形質転換体は、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーを生産することができる。
【００２４】
配列番号２１を保持する大腸菌ハイブリドプラスミドpULV（図１６）の制限酵素SmaIの切断によって得られるDNA断片を、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を発酵生産するための多段反応プロセスを構成する3種類の酵素（ディメチラーゼ、プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ及び4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）をコードした遺伝子配列とそれらの発現制御に関与する遺伝子領域持つ大腸菌ハイブリドプラスミドpUVLABC（図１４）の制限酵素XbaIによる部分切断後、末端処理によって得られたDNA断片と公知のDNAリガーゼにより結合させることによって、大腸菌組み換えプラスミドpUVDLABC（図１７）を作成する。
作成された大腸菌組み換えプラスミドpUVDLABC（図１７）は、大腸菌に導入されLacZプロモーターの制御下、4種類の酵素ディメチラーゼ、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ及び4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードした遺伝子配列を同調的に発現して、植物成分あるは石油成分由来、あるいは化学的に合成されたバニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸から２−ピロンー４，６−ジカルボン酸を発酵生産することができる。
【００２５】
配列番号２１を保持する大腸菌ハイブリドプラスミドpULV（図１６）の制限酵素SmaIの切断によって得られるDNA断片を、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を発酵生産するための多段反応プロセスを構成する3種類の酵素（ディメチラーゼ、プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ及び4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）をコードした遺伝子配列とそれらの発現制御に関与する遺伝子領域持つ広宿主域ハイブリドプラスミドpKTVLABC（図１５）の制限酵素XbaIによる部分切断後、末端処理によって得られたDNA断片と公知のDNAリガーゼにより結合させることによって、広宿主域組み換えプラスミドpKTVDLABC（図１８）を作成する。
作成された広宿主域組換えプラスミドpKTVDLABC（図１８）は、シュードモナス属細菌をはじめとして広い宿主域を持ち、当該組換プラスミドを導入された形質転換細胞において、4種類の酵素ディメチラーゼ、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ及び4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードした遺伝子配列を同調的に発現して、植物成分あるは石油成分由来、あるいは化学的に合成されたバニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を生産することができる。2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の高生産のための宿主として用いる微生物は、広宿主域組換えプラスミドpKTVDLABC（図１８）を複製し、2-ピロン-4,6-ジカルボン酸生産に関与する酵素遺伝子を発現できるものであれば制限されないが、植物成分由来、化学合成もしくは石油由来のバニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸のいずれかから2-ピロン-4,6-ジカルボン酸への分解代謝酵素機能、及び2-ピロン-4,6-ジカルボン酸に対する分解酵素機能を消失せしめた微生物を宿主とした形質転換体を用いる必要がある。
【００２６】
（バニリン酸ディメチラーゼ遺伝子（vanAB遺伝子）の取得）
本発明の2-ピロン-4,6-ジカルボン酸に高収率変換する発酵生産のために設計構築された多段反応プロセス制御遺伝子の作成には、先ずNADHの存在下でバニリン酸及びシリンガ酸のメチルエーテル結合を切断することによってプロトカテク酸及び3メチルガリック酸に変換するバニリン酸ディメチラーゼ遺伝子（vanAB遺伝子）の分離が必要である。本遺伝子の分離手段は特に制限されないが、例えば微生物の宿主ベクター系を用いることができる。ディメチラーゼ遺伝子（vanAB遺伝子）は、例えば組換えDNA技術を利用して次の如くして製造される。すなわちDNA供与体としてバニリン酸及びシリンガ酸のメチルエーテルをNADHの存在下で切断するディメチラーゼを生産する能力を有する微生物を用い、該微生物からゲノムDNAを抽出し、制限酵素などにより切断しDNA断片とする。一方、ファージ、プラスミド等のベクターDNAを制限酵素等を用いて、ゲノムDNAを制限酵素等を用いて、ゲノム断片が挿入可能な制限酵素末端を作成する。これらゲノムDNA断片と直鎖状にしたベクターDNAをDNAリガーゼを用いて結合させ組換えベクターを得る。該組換えベクターを宿主細胞に移入し、目的の組換えベクターを保持する形質転換体細胞を選択し、該形質転換体細胞より目的の組換えベクターを分離することにより製造される。
該遺伝子の分離のDNA供与体としては、バニリン酸及びシリンガ酸のメチルエーテルをNADHの存在下で切断するディメチラーゼを生産する能力を有する微生物であれば特に制限されない。例えばPseudomonas putida PpY101株などが好ましい。
【００２７】
該微生物からのゲノムDNAの抽出は、該微生物の培養菌体を集菌し、例えばプロテアーゼKにて菌体を溶菌した後、フェノール抽出による除タンパク質処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコールによるゲノムDNAの沈殿、遠心分離などの方法を適宜組み合わせて行うのが好ましい。分離されたゲノムDNAを断片化するには、例えば該ゲノムDNAの制限酵素の消化により行われる。
ベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖しうるファージ又はプラスミドから組換えベクターを目的として構築されたものを用いるのが好ましい。プラスミドとしては、例えば大腸菌を宿主とするpUC18、pUC19、pUC118、pUC119、ブルースクリプト、pKT230MC（図７）等が好ましい。これらのベクターは、例えば制限酵素を用いてDNA断片が挿入可能な制限酵素末端を作成し、必要に応じてその末端を脱リン酸処理した後に用いられる。ゲノムDNA断片とベクターDNA断片の結合は、公知のDNAリガーゼ、例えばT4DNAリガーゼ等を用いて行うのが好ましい。
【００２８】
得られた組換えベクターを導入させる宿主微生物としては、該組換えベクターが安定にかつ自律的に複製可能で、かつ外来性遺伝子の形質が安定的に発現するものであれば良いが、たとえば大腸菌や Pseudomonas putida を用いることができる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば接合法、エレクトロポレーション法、コンピテントセル法等の何れの方法も用いることができる。
形質転換体の選択は、用いたベクターの選択マーカー、例えば形質転換体のDNA組換えにより獲得する薬剤耐性を指標にすることができる。これらの形質転換体の中から目的の組換えベクターを含有する形質転換体の選択は、例えば遺伝子の部分的なDNA断片をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法により行うのが好ましい。このプローブの標識としては、例えば放射性同位元素、ジゴキシゲニン、酵素等のいずれも用いることができる。
【００２９】
このようにして選択された形質転換体細胞から組換えベクターを抽出するには、常法により抽出すれば良く、例えばアルカリ溶菌法（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Molecular Cloning Second Edition (1989)）を用いることができる。抽出される組換えベクターは、必要に応じて再びDNA技術を利用して組換えることができる。得られる組換えベクターから、本発明遺伝子に含まれるNADHの存在下でバニリン酸及びシリンガ酸のメチルエーテル結合を切断することによってプロトカテク酸及び3メチルガリック酸に変換するバニリン酸ディメチラーゼ遺伝子（vanAB遺伝子）を切り出すには、制限酵素などを用いることができる。
かくして得られる、本発明遺伝子に含まれるバニリン酸ディメチラーゼ遺伝子の塩基配列は、例えばダイデオキシ法で解読し、決定することができる。配列番号１に、本発明遺伝子に含まれるバニリン酸ディメチラーゼ遺伝子を含む領域の塩基配列を、配列番号２及び３に当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示す。
【００３０】
(プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子（ligAB遺伝子）の取得)
本発明の、2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の発酵生産のために設計構築された多段反応プロセス制御遺伝子の作成には、第二の遺伝子としてプロトカテク酸及び3メチルガリック酸の芳香環を開環する酵素プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子（ligAB遺伝子）の分離が必要である。本遺伝子の分離手段は特に制限されないが、例えば微生物の宿主ベクター系を用いる事ができる。プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子は、例えば組換えDNA技術を利用して次の如くして製造される。すなわちDNA供与体としてプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼを生産する能力を有する微生物を用い、該微生物からゲノムDNAを抽出し、制限酵素などにより切断しDNA断片とする。一方、ファージ、プラスミド等のベクターDNAを制限酵素等を用いて、ゲノムDNAを制限酵素等を用いて、ゲノム断片が挿入可能な制限酵素末端を作成する。これらゲノムDNA断片と直鎖状にしたベクターDNAをDNAリガーゼを用いて結合させ組換えベクターを得る。該組換えベクターを宿主細胞に移入し、目的の組換えベクターを保持する形質転換体細胞を選択し、該形質転換体細胞より目的の組換えベクターを分離することにより製造される。
該遺伝子の分離のDNA供与体としては、プロトカテク酸及び3メチルガリック酸の芳香環を開環するプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼを生産する能力を有する微生物であれば特に制限されない。例えばSphingomonas paucimobilis SYK-6株などが好ましい。
【００３１】
該微生物からのゲノムDNAの抽出及び、該ゲノムDNA断片化、ベクター及び組ベクターの作成、得られた組換えベクターを導入させる宿主微生物とその導入法、目的の組換えベクターを含有する形質転換体の選択、選択された形質転換体細胞から組換えベクターの抽出法は、上記（バニリン酸ディメチラーゼ遺伝子（vanAB遺伝子）の取得）の記載内容と同じである。得られる組換えベクターから、本発明遺伝子に含まれるプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子（ligAB遺伝子）を切り出すには、制限酵素などを用いることができる。
かくして得られる、本発明遺伝子に含まれるプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子（ligAB遺伝子）の塩基配列は、例えばダイデオキシ法で解読し、決定することができる。配列番号１４及び１６（それらを含む配列番号２０）に、本発明遺伝子の作成のために微生物のゲノムDNAより単離されたプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子（ligAB遺伝子）を含む領域の塩基配列を、配列番号１５及び１７に当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示す。
【００３２】
（4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ligC遺伝子））
本発明の、2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の発酵生産のために設計構築された多段反応プロセス制御遺伝子の作成には、第3の酵素遺伝子として4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドを2-ピロン-4,6-ジカルボン酸に変換する4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ligC遺伝子）の分離が必要である。本遺伝子の分離手段は特に制限されないが、例えば微生物の宿主ベクター系を用いることができる。4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ligC遺伝子）は、例えば組換えDNA技術を利用して次の如くして製造される。すなわちDNA供与体として4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ligC）を生産する能力を有する微生物を用い、該微生物からゲノムDNAを抽出し、制限酵素などにより切断しDNA断片とする。一方、ファージ、プラスミド等のベクターDNAを制限酵素等を用いて、ゲノムDNAを制限酵素等を用いて、ゲノム断片が挿入可能な制限酵素末端を作成する。これらゲノムDNA断片と直鎖状にしたベクターDNAをDNAリガーゼを用いて結合させ組換えベクターを得る。該組換えベクターを宿主細胞に移入し、目的の組換えベクターを保持する形質転換体細胞を選択し、該形質転換体細胞より目的の組換えベクターを分離することにより製造される。
該遺伝子の分離のDNA供与体としては、4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドを2-ピロン-4,6-ジカルボン酸に変換する4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ligC）を生産する能力を有する微生物であれば特に制限されない。例えばSphingomonas paucimobilis SYK-6株が好ましい。
【００３３】
該微生物からのゲノムDNAの抽出及び、該ゲノムDNA断片化、ベクター及び組ベクターの作成、得られた組換えベクターを導入させる宿主微生物とその導入法、目的の組換えベクターを含有する形質転換体の選択、選択された形質転換体細胞から組換えベクターの抽出法は、上記（バニリン酸ディメチラーゼ遺伝子（vanAB遺伝子）の取得）の記載内容と同じである。得られる組換えベクターから、本発明遺伝子に含まれる4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ligC遺伝子）を切り出すには、制限酵素などを用いることができる。
かくして得られる、本発明遺伝子に含まれる4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ligC遺伝子）の塩基配列は、例えばダイデオキシ法で解読し、決定することができる。配列番号２０に、本発明遺伝子の作成のために微生物Sphingomonas paucimobilis SYK-6株のゲノムDNAより単離された4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ligC遺伝子）を含む領域の塩基配列を、配列番号１８に4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ligC遺伝子）領域の塩基配列を、配列番号１９に塩基配列から推定される当該酵素蛋白質のアミノ酸配列を示す。
【００３４】
（各遺伝子の配置設計と代謝系遺伝子の構築）
かくして得られた3種類の酵素（バニリン酸ディメチラーゼ（VanA及びVanB）、プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ（ligA及びligB）及び4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ligC））をコードした遺伝子配列とそれらの発現制御に関与する遺伝子領域を含むDNA断片として、各々の組換えプラスミドより制限酵素によって切り出し、設計した遺伝子配置に基づきDNAリガーゼで連結して3種類の酵素遺伝子を含む制限酵素切断DNA断片を相互に連結する。バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を速やかに大量に発酵生産する多段反応プロセスの制御遺伝子の新規2本鎖DNA分子を作成することができる。
【００３５】
（各遺伝子の配置設計と代謝系遺伝子の構築１：ディメチラーゼの大腸菌発現プラスミドpvanABの作成）
本発明では、配列番号１に示す遺伝子配列をその一部に持つDNA断片を保持する形質転換プラスミドから、制限酵素HincIIにより切り出される配列番号１の塩基配列を持つDNA断片を、大腸菌プラスミドpUC119のコードするLacZαフラグメント遺伝子中に存在する制限酵素HincIIの切断部位で切断して作成したDNA断片に、公知のDNAリガーゼにより結合させることによって新たな大腸菌発現プラスミドpvanABを作成する（図２）。大腸菌発現プラスミドpvanABはエレクトロポレーション法やコンピテントセル法を用いて大腸菌などに導入されると、その形質転換体細胞でLacプロモーター下流に存在するαフラグメントポリペプチドと配列番号２及び３で示されるディメチラーゼのポリペプチドとの融合ポリぺプチドとして生産される。
配列番号１は、大腸菌プラスミドpUC119のコードするLacZαフラグメント遺伝子に連結し、配列番号２及び３で示されるポリペプチドのN末端にαフラグメント遺伝子に由来するディメチラーゼ酵素の安定化に寄与するオリゴペプチドを付加した融合ペプチドとして、大腸菌などの形質転換体細胞内で生産させることにより、安定で、高いディメチラーゼ酵活性を得ることができる。しかし、図２−２に示した大腸菌発現プラスミドpvnnABの如く、配列番号１のディメチラーゼ遺伝子を直接プロモーター配列の下流に連結して、配列番号２及び３に示されるアミノ酸配列を持つポリペプチドとして生成させた場合、形質転換体細胞内で不安定なポリペプチドとして生成されるためディメチラーゼ活性は得られない。また、ディメチラーゼの安定な生産のために配列番号２及び３に付加する安定化に寄与するオリゴペプチドは、LacZαフラグメント由来のオリゴペプチドだけでなく、図５のpQvABの如くヒスチジンの6アミノ酸を含む30アミノ酸から構成されるオリゴペプチドでも良く、配列番号２及び３の安定化に寄与するものであれば良い。
【００３６】
（各遺伝子の配置設計と代謝系遺伝子の構築２：ディメチラーゼの広宿主域プラスミドpDVZ1（図８）の作成）
大腸菌組換えプラスミドpvanAB（図２）から、制限酵素PuvIIにより切り出されるLacプロモーター配列、その下流に存在するαフラグメントの16アミノ酸をコードする遺伝子、さらにそれに融合した配列番号１を含むDNA断片を、Pseudomonas putida において複製して維持可能な広宿主域プラスミドpKT230MC（図７）の制限酵素EcoRIによる切断によって得られるDNA断片の両末端を平滑化して得られるDNA分子に、公知のDNAリガーゼにより結合させることによって新たな広宿主域プラスミドpDVZ1（図８）を作成する。広宿主域プラスミドpDVZ1（図８）はエレクトロポレーション法やコンピテントセル法を用いてPseudomonas putidaなどに導入されると、その形質転換体細胞でLacプロモーター下流に存在するαフラグメントポリペプチドと配列番号２及び３で示されるディメチラーゼのポリペプチドとの融合ポリぺプチドとして生産され、強力で安定なディメチラーゼを生産することができる。
【００３７】
（各遺伝子の配置設計と代謝系遺伝子の構築３：プロトカテク酸からPDCへの大腸菌プラスミドpULABC（図１３）の作成）
配列番号２０で示される塩基配列を含む大腸菌プラスミドから、制限酵素XbaIにより切り出される配列番号２０の塩基配列を持つDNA断片を、大腸菌プラスミドpUC119のコードするLacZαフラグメント遺伝子中に存在する制限酵素XbaIの切断部位で切断して作成したDNA断片に、公知のDNAリガーゼにより結合させることによって新たな大腸菌プラスミドpULABC（図１３）を作成する。大腸菌プラスミドpULABC（図１３）は、エレクトロポレーション法やコンピテントセル法を用いて大腸菌などに導入されると、その形質転換体細胞でプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ酵素遺伝子（ligAB遺伝子）及び、4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素遺伝子（ligC遺伝子）が同調して発現し2種類の酵素生産を行うことができる。
【００３８】
（各遺伝子の配置設計と代謝系遺伝子の構築４：バニリン酸及びシリンガ酸からPDCへの大腸菌の組換えプラスミドpUVLABC（図１４））
図２に示す大腸菌プラスミドpvanABの制限酵素XbaI切断によって得られるDNA断片に、図１３に示す大腸菌プラスミドpULABCの制限酵素XbaIの切断によって得られる配列番号２０を含むDNA断片に、公知のDNAリガーゼにより結合させることによって、バニリン酸、シリンガ酸、及びプロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を発酵生産するための多段反応プロセスを構成する3種類の酵素（バニリン酸ディメチラーゼ、プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ及び4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒド）をコードした遺伝子配列とそれらの発現制御に関与する遺伝子領域を連結した新規2本鎖DNA分子を含む、2-ピロン-4,6-ジカルボン酸発酵生産大腸菌組換えプラスミドpUVLABC（図１４）を作成する。大腸菌組換えプラスミドpUVLABC（図１４）は、エレクトロポレーション法やコンピテントセル法を用いて大腸菌などに導入されると、その形質転換体細胞は植物成分あるは石油成分由来、あるいは化学的に合成されたバニリン酸、シリンガ酸、及びプロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を発酵生産することができる。
【００３９】
（各遺伝子の配置設計と代謝系遺伝子の構築５：バニリン酸及びシリンガ酸からPDCを生産する広宿主域組換プラスミドpKTVLABC（図１５））
大腸菌組換えプラスミドpULABC（図１３）の制限酵素XbaIの切断によって得られる配列番号２０を有するDNA断片を、ディメチラーゼを生産可能な広宿主域プラスミドpDVZ1（図８）の制限酵素XbaIの切断によって得られるDNA断片と公知のDNAリガーゼにより結合させることによって、様々な宿主域を持つ2-ピロン-4,6-ジカルボン酸発酵生産広宿主域組換プラスミドpKTVLABC（図１５）を製造することができる。様々な宿主域を持つ2-ピロン-4,6-ジカルボン酸発酵生産組換えプラスミドpKTVLABC（図１５）には、バニリン酸、シリンガ酸、及びプロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を発酵生産するための多段反応プロセスを構成する3種類の酵素（ディメチラーゼ、プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ及び4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）をコードした遺伝子配列とそれらの発現制御に関与する遺伝子領域を連結した新規2本鎖DNA分子が含まれる。広宿主域組換プラスミドpKTVLABC（図１５）は、宿主となる微生物細胞にエレクトロポレーション法やコンピテントセル法を用いて導入されると、その形質転換体細胞は植物成分あるは石油成分由来、あるいは化学的に合成されたバニリン酸、シリンガ酸、及びプロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を発酵生産することができる。
様々な宿主域を持つ2-ピロン-4,6-ジカルボン酸発酵生産組換えプラスミドpKTVLABC（図１５）は、βラクタマーゼ遺伝子プロモーター下流にバニリン酸、シリンガ酸、及びプロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を発酵生産するための多段反応プロセスを構成する3種類の酵素をコードした遺伝子配列を含み、シュードモナス属細菌をはじめとして広い宿主域を持ち、エレクトロポレーション法やコンピテントセル法を用いて当該組換プラスミドを導入された形質転換細胞において、3種類の酵素ディメチラーゼ、プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ、及び4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードした遺伝子配列を同調的に発現して、植物成分あるは石油成分由来、あるいは化学的に合成されたバニリン酸、シリンガ酸、及びプロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を生産することができるが、2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の高生産のためには、植物成分由来、化学合成もしくは石油由来のバニリン酸、シリンガ酸、及びプロトカテク酸のいずれかから2-ピロン-4,6-ジカルボン酸への分解代謝酵素機能、及び2-ピロン-4,6-ジカルボン酸に対する分解酵素機能を消失せしめた微生物 を宿主とした形質転換体を用いる必要がある。
【００４０】
（ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ligV遺伝子））
植物成分あるは石油成分由来、あるいは化学的に合成されたバニリン、及びシリンガアルデヒドからバニリン酸、シリンガ酸、及びプロトカテク酸を経由して2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を発酵生産するための多段反応プロセスを構成する4種類の酵素（ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ディメチラーゼ、プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ、4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）をコードした遺伝子配列とそれらの発現制御に関与する遺伝子領域を、遺伝子工学的方法により設計配置して連結した新規2本鎖DNA分子を作成し、それを保持する形質転換細胞内で4種類の酵素遺伝子が同調的に高発現して、植物成分あるは石油成分由来、あるいは化学的に合成されたバニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、及びプロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を速やかに大量に発酵生産する多段反応プロセスの制御遺伝子を構築するためには、新たにバニリンのバニリン酸への酸化及びシリンガアルデヒドのシリンガ酸への酸化活性を有するベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ligV遺伝子）の分離が必要である。本遺伝子の分離手段は特に制限されないが、例えば微生物の宿主ベクター系を用いることができる。ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ligV遺伝子）は、例えば組換えDNA技術を利用して次の如くして製造される。すなわちDNA供与体としてバニリン及びシリンガアルデヒドを酸化することができるベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼを生産する能力を有する微生物を用い、該微生物からゲノムDNAを抽出し、制限酵素などにより切断しDNA断片とする。一方、ファージ、プラスミド等のベクターDNAを制限酵素等を用いて、ゲノムDNAを制限酵素等を用いて、ゲノム断片が挿入可能な制限酵素末端を作成する。これらゲノムDNA断片と直鎖状にしたベクターDNAをDNAリガーゼを用いて結合させ組換えベクターを得る。該組換えベクターを宿主細胞に移入し、目的の組換えベクターを保持する形質転換体細胞を選択し、該形質転換体細胞より目的の組換えベクターを分離することにより製造される。
該遺伝子の分離のDNA供与体としては、バニリン及びシリンガアルデヒドを酸化することができるベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼを生産する能力を有する微生物であれば特に制限されない。例えばSphingomonas paucimobilis SYK-6などが好ましい。
【００４１】
該微生物からのゲノムDNAの抽出及び、該ゲノムDNA断片化、ベクター及び組ベクターの作成、得られた組換えベクターを導入させる宿主微生物とその導入法、目的の組換えベクターを含有する形質転換体の選択、選択された形質転換体細胞から組換えベクターの抽出法は、上記（バニリン酸ディメチラーゼ遺伝子（vanAB遺伝子）の取得）の記載内容と同じである。得られる組換えベクターから、本発明遺伝子に含まれるバニリンのバニリン酸への酸化及びシリンガアルデヒドのシリンガ酸への酸化活性を有するベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ligV遺伝子）を切り出すには、制限酵素などを用いることができる。
かくして得られる、本発明遺伝子に含まれるベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ligV遺伝子）の塩基配列は、例えばダイデオキシ法で解読し、決定することができる。配列番号２１に、本発明遺伝子に含まれるベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ligV遺伝子）を含む領域の塩基配列を、配列番号２２に当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示す。
【００４２】
（各遺伝子の配置設計と代謝系遺伝子の構築６：バニリン、及びシリンガアルデヒドからPDCへの大腸菌の組換えプラスミドpUVDLABC（図１７））
かくして得られたベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ligV遺伝子）を含む大腸菌組み換えプラスミドpULV（図１６）から、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ligV遺伝子）をコードした遺伝子配列を含むDNA断片として、制限酵素SmaIによって切り出し、既に構築したバニリン酸、シリンガ酸、及びプロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を速やかに大量に発酵生産する大腸菌プラスミドpUVLABC（図１４）の制限酵素XbaIで部分切断して得られるDNA断片をDNAリガーゼで連結して4種類の酵素遺伝子を含み、バニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、及びプロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を速やかに大量に発酵生産する多段反応プロセスにを触媒する2種類の酵素遺伝子をコードして、発現する新規2本鎖DNA分子を有する大腸菌の組換えプラスミドpUVDLABC（図１７）を作成することができる。
大腸菌の組換えプラスミドpUVDLABC（図１７）は、エレクトロポレーション法やコンピテントセル法を用いて大腸菌などに導入されると、その形質転換体細胞は植物成分あるは石油成分由来、あるいは化学的に合成されたバニリン、及びシリンガアルデヒドからバニリン酸、シリンガ酸、及びプロトカテク酸を経由して2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を発酵生産するための多段反応プロセスを構成する4種類の酵素（ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、バニリン酸ディメチラーゼ、プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ、及び4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）遺伝子を同調的に発現し、2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を発酵生産することができる。
【００４３】
（各遺伝子の配置設計と代謝系遺伝子の構築７：バニリン、及びシリンガアルデヒドからPDCへの広宿主域組換えプラスミドpKTVDLABC（図１８））
ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ligV遺伝子）を含む大腸菌組み換えプラスミドpULV（図１６）から、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ligV遺伝子）をコードした遺伝子配列を含むDNA断片として、制限酵素SmaＩによって切り出し、既に構築したバニリン酸、シリンガ酸、及びプロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を速やかに大量に発酵生産する広宿主域プラスミドpKTVLABC（図１５）の制限酵素XbaIで部分切断して得られるDNA断片をDNAリガーゼで連結して4種類の酵素遺伝子を含み、バニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、及びプロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を速やかに大量に発酵生産する多段反応プロセスにを触媒する4種類の酵素遺伝子をコードして、発現する新規2本鎖DNA分子を有する広宿主域組換えプラスミドpKTVDLABC（図１８））を作成することができる。
広宿主域組換えプラスミドpKTVDLABC（図１８）は、シュードモナス属細菌をはじめとして広い宿主域を持ち、エレクトロポレーション法やコンピテントセル法を用いて当該組換プラスミドを導入された形質転換細胞において、4種類の酵素、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、バニリン酸ディメチラーゼ、プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ、及び4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードした遺伝子配列を同調的に発現して、植物成分あるは石油成分由来、あるいは化学的に合成されたバニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、及びプロトカテク酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を生産することができるが、2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の高生産のためには、植物成分由来、化学合成もしくは石油由来のバニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、及びプロトカテク酸のいずれかから2-ピロン-4,6-ジカルボン酸への分解代謝酵素機能、及び2-ピロン-4,6-ジカルボン酸に対する分解酵素機能を消失せしめた微生物を宿主とした形質転換体を用いる必要がある。
【００４４】
また、本発明は、上述のプラスミドを含む宿主生物を培養することを含む、植物成分由来、化学合成もしくは石油由来のバニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸のいずれか、又はいくつか、或いは全てを含む混合物から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を発酵生産する方法に関するものである。
【実施例】
【００４５】
（実施例１）
シュードモナス属細菌（Pseudomonas putida PpY1100）に2-ピロン-4,6-ジカルボン酸
の発酵生産プラスミドpKTVLABC（図１５）を導入した形質転換細胞によるバニリン酸、シリンガ酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の製造に関する実施例
（１）2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の発酵生産するための多段反応プロセスの酵素遺伝子を含む組み換えプラスミドpKTVLABC（図１５）を大腸菌HB101株に形質転換し、25mg/Lのアンピシリンを含むLB培地（100ml）で、37℃で18時間振とう培養し、増殖した培養細胞から組み換えプラスミドpKTVLABC（図１５）を抽出した。
（２）植物成分由来、化学合成もしくは石油由来のバニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸のいずれかから2-ピロン-4,6-ジカルボン酸への分解代謝酵素機能、及び2-ピロン-4,6-ジカルボン酸に対する分解酵素機能を消失せしめた微生物であるシュードモナス属細菌（Pseudomonas putida PpY1100）を、LB液体培地500mlで、28℃23時間培養し氷中で30分冷却した。4℃10分10000rpmで遠心集菌し、500mlの0℃蒸留水で温和に洗浄後再び遠心集菌した。続いて250mlの0℃蒸留水で温和に洗浄後、遠心集菌した。さらに125mlの0℃蒸留水で温和に洗浄後、遠心集菌した。集菌した微生物細胞を、10％グリセロールを含む蒸留水に懸濁し0℃にて保持した。
（３）（１）のプラスミドpKTVLABC（図１５）DNA約0.05μgを含む蒸留水4μlを0.2cmのキュベットに入れ、（２）の10％グリセロールを含む蒸留水に懸濁した細胞液40μlを加え、（25μF、2500V、12msec）の条件でエレクトロポレーションにかけた。
（４）上記処理した細胞全量を10mlのLB液体培地に接種し、28℃で6時間培養した。培養後遠心によって菌体を集め25mg/Lのカナマイシンを含むLB平板に展開し28℃で48時間培養し、プラスミドpKTVLABC（図１５）を保持するカナマイシン耐性を示す形質転換株を得た。本菌をPseudomonas putida PpY1100（pKTVLABC）株と名づけた。
（５）Pseudomonas putida PpY1100（pKTVLABC）株を、200mlのLB液体培地（25mg/Lのカナマイシンを含む）に接種し28℃で16時間培養し前培養菌体懸濁液とした。8LのLB液体培地及び消泡剤（Antiform A）3mlを10L容量のジャーファーメンター（発酵槽）を用いて調製し、そこに培養したPseudomonas putida PpY1100（pKTVLABC）株の前培養菌体懸濁液200mlを混合し、28℃500rpm/minの通気攪拌下、OD660＝13〜14まで培養した（10時間〜12時間）。培養に伴う増殖曲線を図１９に示す。
（６）10L容量のジャーファーメンター（発酵槽）を用いた培養で、OD660＝13〜14に達した時点で、発酵槽から500mlの培養液を三角フラスコに抜き取り、氷上で保存した。
（７）OD660＝13〜14に達した発酵槽の培養液に、基質であるバニリン酸（40g）、シリンガ酸（40g）を含む0.1NのNAOH溶液（pH8.5に調整）500mlを、ペリスタポンプを用いて5〜7時間かけて添加した。反応の進行に伴う2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の生成により、培養液のpHが低下する。それを防ぐためpHセンサーに連結したペリスタポンプで0.1NのNAOH溶液を添加して培養液のpHを維持した。
反応の進行はTin Layer Chromatography（TLC）によって確認した。図２０〜２２に示す様に、添加したバニリン酸、シリンガ酸がTLC分析で殆ど消失が確認される16時間後、（５）で調製した氷冷菌体懸濁500mlを発酵槽の培養液に加えて12時間培養を続けた。
（８）反応終了後、発酵槽の培地をプラスチック容器（バケツ）に移し塩酸を加えてpH3として反応を停止させた。培養液から遠心分離（6000rpm、20℃）により菌体成分を沈殿除去し、得られた上清に塩酸を加えることによりpH1.0に低下させ低温で保存することにより2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を沈殿として分離した。生成した2-ピロン-4,6-ジカルボン酸は約65gに達し、添加した基質比90％程度の収率で生産された。製造した2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を活性炭処理等によりさらに純度を上げた精製物のNRMスペクトルとMSスペクトルを図２３〜２５に示す。
（実施例２）
シュードモナス属細菌（Pseudomonas putida PpY1100）にバニリン、シリンガアルデヒドから、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸を経由して2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を生産する遺伝子機能を持った広宿主域プラスミドpKTVDLABC（図１８）を導入した形質転換細胞によるバニリン、シリンガアルデヒドから2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の製造に関する実施例
（９）本発明が作成した、2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の発酵生産するための多段反応プロセスの酵素遺伝子を含む組み換えプラスミドpKTVDLABC（図１８）を大腸菌HB101株に形質転換し、25mg/Lのアンピシリンを含むLB培地（100ml）で、37℃で18時間振とう培養し、増殖した培養細胞から組み換えプラスミドpKTVDLABC（図１８）を抽出した。
（１０）植物成分由来、化学合成もしくは石油由来のバニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸のいずれかから2-ピロン-4,6-ジカルボン酸への分解代謝酵素機能、及び2-ピロン-4,6-ジカルボン酸に対する分解酵素機能を消失せしめた微生物であるシュードモナス属細菌（Pseudomonas putida PpY1100）を、LB液体培地500mlで、28℃23時間培養し、氷中で30分冷却した。4℃10分10000rpmで遠心集菌し、500mlの0℃蒸留水で温和に洗浄後再び遠心集菌した。続いて250mlの0℃蒸留水で温和に洗浄後、遠心集菌した。さらに125mlの0℃蒸留水で温和に洗浄後、遠心集菌した。集菌した微生物細胞を、10％グリセロールを含む蒸留水に懸濁し0℃にて保持した。
（１１）（９）のプラスミドpKTVDLABC（図１８）DNA約0.05μgを含む蒸留水4μlを0.2cmのキュベットに入れ、（２）の10％グリセロールを含む蒸留水に懸濁した細胞液40μlを加え、（25μF、2500V、12msec）の条件でエレクトロポレーションにかけた。
（１２）上記処理した細胞全量を10mlのLB液体培地に接種し、28℃で6時間培養した。培養後遠心によって菌体を集め25mg/Lのカナマイシンを含むLB平板に展開し28℃で48時間培養し、プラスミドpKTVDLABC（図１８）を保持するカナマイシン耐性を示す形質転換株を得た。本菌をPseudomonas putida PpY1100（pKTVDLABC）株と名づけた。
（１３）Pseudomonas putida PpY1100（pKTVDLABC）株を、200mlのLB液体培地（25mg/Lのカナマイシンを含む）に接種し28℃で16時間培養し、前培養菌体懸濁液とした。8LのLB液体培地及び消泡剤（Antiform A）3mlを10L容量のジャーファーメンター（発酵槽）を用いて調製し、そこに培養したPseudomonas putida PpY1100（pKTVDLABC）株の前培養菌体懸濁液200mlを混合し、28℃500rpm/minの通気攪拌下、OD660＝13〜14まで培養した（10時間〜12時間）。
（１４）10L容量のジャーファーメンター（発酵槽）を用いた培養で、OD660＝13〜14に達した時点で、発酵槽から500mlの培養液を三角フラスコに抜き取り、氷上で保存した。
（１５）OD660＝13〜14に達した発酵槽の培養液に、基質としてバニリン（40g）、シリンガアルデヒド（40g）を添加して（７）の如く培養を続行った。反応の進行はTin Layer Chromatography（TLC）によって確認した。添加したバニリン、シリンガアルデヒドがTLC分析で殆ど消失が確認される20時間後、（１４）で調製した氷冷菌体懸濁500mlを発酵槽の培養液に加えて12時間培養を続けた。その後（８）の如く2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を沈殿として分離した。生成した2-ピロン-4,6-ジカルボン酸は添加した基質比90％程度の収率で生産された。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】P. putida PpY101由来のvanA及びvanB遺伝子の構造図である。
【図２】pvanABの構造図である。
【図３】pvnnABの構造図である。
【図４】pvanAB及びpvnnABから生産されるタンパクのアミノ酸配列である。
【図５】pQvABの構造図である。
【図６】各組み換え体におけるタンパク分析を示す。
【図７】pKT230MCの構造図である。
【図８】pDVZ1の構築を示す。
【図９】活性のない広宿主域プラスミドpDV01の構築である。
【図１０】S. paucimobilis SYK-6由来のligA及びP.aeruginosa GAPDH由来のＳＤ配列の導入を示す。
【図１１】S. paucimobilis SYK-6由来のligA及びP.aeruginosa GAPDH由来のＳＤ配列を含む広宿主プラスミドの構築を示す。
【図１２】S. paucimobilis SYK-6由来のLigA、LigB及びLigC遺伝子の構造図である。
【図１３】pULABCの構築を示す。
【図１４】pUVLABCの構築を示す。
【図１５】pKTVLABCの構築を示す。
【図１６】pULV及びpKTLVの作成を示す。
【図１７】pUVDLABCの作成を示す。
【図１８】pKTVDLABCの作成を示す。
【図１９】P. putida PpY1100（pKTVLABC）の増殖曲線を示すグラフである。
【図２０】Tin Layer Chromatography（TLC）結果を示す図である。
【図２１】Tin Layer Chromatography（TLC）結果を示す図である。
【図２２】Tin Layer Chromatography（TLC）結果を示す図である。
【図２３】2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の1H-NRMスペクトルである。
【図２４】2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の13C-NRMスペクトルである。
【図２５】2-ピロン-4,6-ジカルボン酸のMSスペクトルである。
【図２６】Pseudomonas putida PpY101由来のvanAB遺伝子を示す（配列番号１）。
【図２７】Pseudomonas putida. WCS358由来のvanAB遺伝子を示す（配列番号４）。
【図２８】Pseudomonas sp. HR199由来のvanAB遺伝子を示す（配列番号７）。
【図２９】S. paucimobilis SYK-6由来のligABC遺伝子を示す（配列番号２０）。
【図３０】S. paucimobilis SYK-6由来のligV遺伝子を示す（配列番号２１）。
【図１】
0004658244.tif 000002
【図２】
0004658244.tif 000003
【図３】
0004658244.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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