(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３、４、５に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する２つの重鎖可変領域および配列番号：６、７、８に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する２つの軽鎖可変領域を含むsc(Fv)2であって、ヒト白血球抗原(HLA)への結合活性を有するsc(Fv)2。
【請求項２】
配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域および配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域を含むsc(Fv)2であって、ヒト白血球抗原(HLA)への結合活性を有するsc(Fv)2。
【請求項３】
配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を有するsc(Fv)を２つ有するsc(Fv)2であって、ヒト白血球抗原(HLA)への結合活性を有するsc(Fv)2。
【請求項４】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するsc(Fv)2であって、ヒト白血球抗原(HLA)への結合活性を有するsc(Fv)2。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
請求項５に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６に記載のベクターを保持する宿主細胞。
【請求項８】
以下の工程を含む請求項１〜４のいずれかに記載の抗体を作製する方法。
(a)  HLAを認識する抗体を調製する工程
(b)  (a)で調製した抗体の配列を基に、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを作製する工程
(c)  (b)のポリヌクレオチドを含むベクターを作製する工程
(d)  (c)のベクターを宿主細胞に導入する工程
(e)  (d)の宿主細胞を培養する工程
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、細胞死誘導剤。
【請求項１０】
B細胞又はT細胞に対する細胞死誘導であることを特徴とする、請求項９に記載の細胞死誘導剤。
【請求項１１】
B細胞又はT細胞が、活性化B細胞又は活性化T細胞である、請求項１０に記載の細胞死誘導剤。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、細胞増殖抑制剤。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、抗腫瘍剤。
【請求項１４】
腫瘍が血液腫瘍である請求項１３に記載の抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ＨＬＡを認識する抗体のｓｃ（Ｆｖ）２に関する。
【背景技術】
【０００２】  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ抗原は、３つのドメイン（α１、α２、α３）からなる４５ＫＤのα鎖と、１２ＫＤのβ２ミクログロブリンのヘテロダイマーによって形成される。ＨＬＡ分子の主な役割は、細胞の中で作られる８〜１０程度のアミノ酸でできた抗原ペプチドをＣＤ８＋Ｔ細胞に提示することであり、これによって誘導される免疫応答や免疫寛容に非常に重要な役割を担っている。【０００３】  また、ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＡ抗原の抗体によるライゲーションで、細胞増殖抑制や細胞死誘導効果がリンパ球細胞において観察されており、ＨＬＡ分子のシグナル伝達分子としての可能性も示唆されている。【０００４】  すなわち、例えばヒトＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＡのα１ドメインに対する抗体Ｂ９．１２．１、α２ドメインに対する抗体Ｗ６／３２、α３ドメインに対する抗体ＴＰ２５．９９，Ａ１．４は、活性化リンパ球に対して細胞増殖を抑制するとの報告がある（非特許文献１，２）。また、α１ドメインに対する二種類の抗体ＭｏＡｂ９０，ＹＴＨ８６２は、活性化リンパ球に対してアポトーシスを誘導することが報告されている（非特許文献２，３，４）。この２つの抗体によって誘導されるアポトーシスはカスパーゼを介した反応であることが明らかにされており（非特許文献４）、このことからリンパ細胞で発現するＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＡ抗原は、アポトーシスの信号伝達にも関与していると推測されている。【０００５】
さらに、ヒトHLA class IAのα3ドメインに対する抗体 5H7（非特許文献５）、マウス MHC classIのα2ドメインに対する抗体RE2（非特許文献６）も、活性化リンパ球などに細胞死を誘導することが報告されている。しかしながら前出のアポトーシス誘導抗体MoAb90やYTH862とは違い、これらの抗体によって誘導される細胞死は、いずれもカスパーゼを介さないことが示されている。このことから、5H7やRE2による細胞死は、従来知られているアポトーシスの機構とはまったく異なるタイプの細胞死であると推測されている。
【０００６】  以上のように、抗ＨＬＡ抗体による細胞増殖抑制、細胞死誘導作用に関する報告はこれまで複数なされている。ただし、ここで利用されている抗体の分子形態はいずれもＩｇＧ抗体、もしくはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂであり、またＦ（ａｂ’）２やＦａｂのように抗体を低分子化することで、細胞死誘導活性が上昇したとの知見は今のところない。【０００７】  一方２Ｄ７抗体は、ヒトミエローマ細胞をＢａｌｂ／ｃマウスに免疫して得たマウスモノクローナル抗体である（非特許文献７）。これまで２Ｄ７抗体が、種々のリンパ系腫瘍細胞の細胞表面に高い特性を持って結合することは確認されていたが、２Ｄ７抗体が認識する抗原については同定されてはいなかった。【０００８】  なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Ｆａｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：１３４７−１３５８（１９９８）
【非特許文献２】Ｇｅｎｅｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９０：３６２９−３６３９（１９９７）
【非特許文献３】Ｇｅｎｅｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９０：７２６−７３５（１９９７）
【非特許文献４】Ｇｅｎｅｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：５０６０−５０６６（１９９８）
【非特許文献５】Ｗｏｏｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：２１５６−２１６４（１９９７）
【非特許文献６】Ｍａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：２００７−２０１５（１９９５）
【非特許文献７】Ｇｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ８４：１９２２（１９９４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的は、ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＡを認識し、高い細胞死誘導活性及び優れた血中安定性を有する抗体を提供することにある。詳しくは、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域を含み、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）への結合活性を有する一本鎖ポリペプチドであることを特徴とする抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行なった。2D7抗体は、徳島大学第一内科のグループにより患者由来leukemiaを免疫することにより得られたマウス抗体である。本発明者らは、2D7抗体が種々のリンパ系腫瘍細胞の細胞表面に高い特性を持って結合すること、また、2D7抗体がHLA-Aを認識することを見出し、特許出願を行った（WO2004/033499）。また、抗HLA抗体をDiabodyなどの低分子化抗体にすると細胞死誘導活性が上昇することも見出した（WO2004/033499）。本発明者らは、抗体の活性を上昇させる為、さらに鋭意研究した結果、sc(Fv)2にすることにより非常に優れた活性を維持しながら、高い血中安定性を有することを見出した。具体的には、2D7抗体の重鎖可変領域配列 (VH) と軽鎖可変領域配列 (VL) が、VH-VL-VH-VLの並びになるように、それぞれを15merのリンカーで接続した2D7sc(Fv)2をコードするDNA発現ベクターを構築し、該ベクターをCHO細胞に導入して2D7sc(Fv)2産生発現細胞株を樹立した。該細胞株で発現させた2D7sc(Fv)2を精製し、細胞死誘導実験を行なったところ、2D7sc(Fv)2は濃度依存的に細胞死を誘導する非常に優れた活性を有することが明らかになった。さらに2D7sc(Fv)2の血中安定性を調べるため、マウスでの血中濃度推移を解析した結果、2D7diabodyに比べて顕著に血中消失時間が延長されることが分かった。このことから、2D7sc(Fv)2は、高い細胞死誘導活性および細胞増殖抑制能を有し、血中安定性面でも優れた低分子抗体であることが明らかとなった。
【００１１】  即ち、本発明は、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域を含み、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）への結合活性を有する一本鎖ポリペプチドであることを特徴とする抗体に関し、以下の〔１〕〜〔２８〕を提供するものである。
〔１〕２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域を含み、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）への結合活性を有する一本鎖ポリペプチドであることを特徴とする抗体。
〔２〕２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域が、一本鎖ポリペプチドのＮ末端側を基点として重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖可変領域の順に並んでいることを特徴とする、〔１〕に記載の抗体。
〔３〕２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域がリンカーで結合されていることを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載の抗体。
〔４〕リンカーが１５アミノ酸であることを特徴とする、〔３〕に記載の抗体。
〔５〕ＨＬＡがＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉである、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の抗体。
〔６〕ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩがＨＬＡ−Ａである、〔５〕に記載の抗体。
〔７〕ｓｃ（Ｆｖ）２である〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の抗体。
〔８〕配列番号：３、４、５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域を含むｓｃ（Ｆｖ）２。
〔９〕配列番号：６、７、８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含むｓｃ（Ｆｖ）２。
〔１０〕配列番号：３、４、５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域および配列番号：６、７、８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含むｓｃ（Ｆｖ）２。
〔１１〕配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むｓｃ（Ｆｖ）２。
〔１２〕配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むｓｃ（Ｆｖ）２。
〔１３〕配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むｓｃ（Ｆｖ）２。
〔１４〕配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を有するｓｃ（Ｆｖ）２。
〔１５〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するｓｃ（Ｆｖ）２。
〔１６〕〔８〕〜〔１５〕のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入され、かつ〔８〕〜〔１５〕のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有するｓｃ（Ｆｖ）２。
〔１７〕〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
〔１８〕〔１７〕に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体をコードするポリヌクレオチド。
〔１９〕〔１７〕または〔１８〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔２０〕〔１７〕または〔１８〕に記載のポリヌクレオチドまたは〔１９〕に記載のベクターを保持する宿主細胞。
〔２１〕以下の工程を含む〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の抗体を作製する方法。
（ａ）ＨＬＡを認識する抗体を調製する工程
（ｂ）（ａ）で調製した抗体の配列を基に、〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを作製する工程
（ｃ）（ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクターを作製する工程
（ｄ）（ｃ）のベクターを宿主細胞に導入する工程
（ｅ）（ｄ）の宿主細胞を培養する工程
〔２２〕〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、細胞死誘導剤。
〔２３〕Ｂ細胞又はＴ細胞に対する細胞死誘導であることを特徴とする、〔２２〕に記載の細胞死誘導剤。
〔２４〕Ｂ細胞又はＴ細胞が、活性化Ｂ細胞又は活性化Ｔ細胞である、〔２３〕に記載の細胞死誘導剤。
〔２５〕〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、細胞増殖抑制剤。
〔２６〕〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、抗腫瘍剤。
〔２７〕腫瘍が血液腫瘍である〔２６〕に記載の抗腫瘍剤。
〔２８〕〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、自己免疫疾患治療剤。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】2D7低分子抗体の構造を示す図である。図１Ａは2D7diabodyを示し、diabody(HL5)は、5merのリンカーで接続された重鎖可変領域（VH）と軽鎖可変領域（VL）が、非共有結合により二量体化することで形成される。図１Ｂはsc(Fv)2型を示し、sc(Fv)2は、２対のVHとVLを15merのリンカーで１本鎖に接続することで、内部で折りたたまれ、Bのような構造を形成する。
【図２】2D7sc(Fv)2の塩基配列とアミノ酸配列を示す図である。イタリック太字は重鎖可変領域のシグナル配列、下線で示した配列はリンカー領域（15mer）、C末太字はFlagタグ領域を示す。枠で囲った塩基配列は5’側から制限酵素EcoRI, BamHI, NotIの切断部位を示す。
【図３】2D7 diabodyと2D7 sc(Fv)2のゲルろ過クロマトグラフィー精製時のチャート比較を示す図である。(1)は 2D7 sc(Fv)2のクロマトグラム溶出チャート、(2)は 2D7 diabodyのクロマトグラム溶出チャートを示す。
【図４】in vitroにおける2D7 diabodyと2D7 sc(Fv)2の細胞死誘導活性の比較を示す図である。
【図５】2D7 diabodyと2D7 sc(Fv)2の細胞増殖抑制活性の比較を示す図である。
【図６】マウスに放射性標識2D7sc(Fv)2および放射性標識2D7diabody(HL5)単回静脈内投与後の血漿中TCA沈殿画分放射能より算出された2D7sc(Fv)2濃度および2D7diabody濃度の推移を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】  本発明は、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域を含み、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）への結合活性を有する一本鎖ポリペプチドであることを特徴とする抗体を提供する。本発明における抗体は、活性が上昇している点で有用である。ここで、活性とは、抗体が抗原に結合することにより生じる生物学的作用をいう。具体的な例としては、細胞死誘導作用、アポトーシス誘導作用、細胞増殖抑制作用、細胞分化抑制作用、細胞分裂抑制作用、細胞増殖誘導作用、細胞分化誘導作用、細胞分裂誘導作用、細胞周期調節作用などを挙げることができるが、好ましくは細胞死誘導作用、細胞増殖抑制作用である。【００１４】  細胞死誘導作用、細胞増殖抑制作用などの上記作用の対象となる細胞は特に限定されないが、血球系細胞や浮遊細胞が好ましい。血球系細胞の具体的な例としては、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞）、好中球、好酸球、好塩基球、単球（好ましくは活性化した末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ））、ミエローマ細胞などを挙げることができるが、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞）、ミエローマ細胞が好ましく、Ｔ細胞又はＢ細胞（特に活性化したＢ細胞又は活性化したＴ細胞）が最も好ましい。浮遊細胞は、細胞を培養した際、細胞がガラスやプラスチックなどの培養器の表面に付着することなく、浮遊状で増殖する細胞である。これに対し、接着細胞（付着細胞）とは、細胞を培養した際、ガラスやプラスチックなどの培養器の表面に付着する細胞である。【００１５】  一般的に、全長抗ＨＬＡ抗体では細胞死誘導活性を示す為には抗ＩｇＧ抗体などでクロスリンクする必要があるが、本発明の抗体では抗ＩｇＧ抗体でのクロスリンクがなくても細胞死誘導活性を示すことが可能である。【００１６】  本発明の抗体が浮遊細胞に対して細胞死を誘導するか否かは、Ｊｕｒｋａｔ細胞又はＡＲＨ７７細胞に対して細胞死を誘導するか否かにより判定することができ、抗体が接着細胞に対して細胞死を誘導するか否かは、ＨｅＬａ細胞に対して細胞死を誘導するか否かにより判定することができる（ＷＯ２００４／０３３４９９）。【００１７】  本発明においては、上記、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域を含み、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）への結合活性を有する一本鎖ポリペプチドであることを特徴とする抗体を投与することにより、例えば、血液腫瘍（造血器腫瘍）などの腫瘍（具体的な例として、白血病、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、形質細胞異常症（骨髄腫、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症）、骨髄増殖性疾患（真性赤血球増加症、本態性血小板血症、特発性骨髄線維症）など）や自己免疫疾患（具体的な例として、リウマチ、自己免疫性肝炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性水疱症、自己免疫性副腎皮質炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性レセプター病、自己免疫不妊、クローン病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、バセドウ病、若年性糖尿病、アジソン病、重症筋無力症、水晶体性ブドウ膜炎、乾癬、ベーチェット病、など）のような疾��の治療、予防などをおこなうことが可能である。また、本発明の抗体は生体内での安定性に優れていると考えられる為、生体に投与する際には特に有効であると考えられる。【００１８】  本発明において、ＨＬＡとは、ヒト白血球抗原を意味する。ＨＬＡ分子はｃｌａｓｓＩとｃｌａｓｓＩＩに分類され、ｃｌａｓｓＩとしてはＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊなどが知られており、ｃｌａｓｓＩＩとしてはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、ＤＰなどが知られている。本発明の抗体が認識する抗原はＨＬＡ分子であれば特に制限されないが、好ましくはｃｌａｓｓＩに分類される分子であり、より好ましくはＨＬＡ−Ａである。【００１９】  本発明の抗体としては、好ましくは、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域が、一本鎖ポリペプチドのＮ末端側を基点として重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖可変領域の順に並んでいることを特徴とする抗体であり、より好ましくは、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域がリンカーで結合されていることを特徴とする抗体であり、このような抗体としてはｓｃ（Ｆｖ）２が例示できる。【００２０】  ｓｃ（Ｆｖ）２は、２つの重鎖可変領域（［ＶＨ］）及び２つの軽鎖可変領域（［ＶＬ］）をリンカー等で結合して一本鎖ポリペプチドにした抗体である（Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９９；２３１：１７７−１８９）。ｓｃ（Ｆｖ）２は、例えば、２つのｓｃＦｖ（シングルチェインＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３、Ｐｌｉｃｋｔｈｕｎ「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｖｏｌ．１１３，Ｒｅｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５，（１９９４））をリンカー等で結合することにより作製することが可能である。結合される２つの重鎖可変領域と２つの軽鎖可変領域の順序は特に限定されず、どのような順序で並べられていてもよく、例えば、以下のような配置を挙げることができる。
［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］
［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］
［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］
［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］
［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］
［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］
本発明においては、好ましくは、［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］の配置を有するｓｃ（Ｆｖ）２である。【００２１】  重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。さらに、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を会合させた場合に、抗原結合活性を有する限り、一部を欠損させてもよいし、他のポリペプチドを付加してもよい。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。【００２２】  本発明において、抗体の可変領域を結合するリンカーは、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９（３），２９９−３０５，１９９６に開示されるリンカーを用いることができる。【００２３】  本発明において好ましいリンカーはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通常、１〜１００アミノ酸、好ましくは３〜５０アミノ酸、更に好ましくは５〜３０アミノ酸、特に好ましくは１２〜１８アミノ酸（例えば、１５アミノ酸）である。【００２４】  ペプチドリンカーのアミノ酸配列としては、例えば、以下のような配列を挙げることができる。
Ｓｅｒ
Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
（Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ）ｎ
（Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ）ｎ
［ｎは１以上の整数である］等を挙げることができる。【００２５】  合成化学物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＧＳ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−ＤＳＴ）、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビス［２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）などであり、これらの架橋剤は市販されている。【００２６】  ４つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、３つのリンカーが必要となるが、全て同じリンカーを用いてもよいし、異なるリンカーを用いてもよい。【００２７】  本発明において、好ましいｓｃ（ＦＶ）２の例としては、以下の（ａ）〜（ｉ）のいずれかに記載の抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（ａ）配列番号：３、４、５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域を含むｓｃ（Ｆｖ）２。
（ｂ）配列番号：６、７、８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含むｓｃ（Ｆｖ）２。
（ｃ）配列番号：３、４、５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域および配列番号：６、７、８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含むｓｃ（Ｆｖ）２。
（ｄ）配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むｓｃ（Ｆｖ）２。
（ｅ）配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むｓｃ（Ｆｖ）２。
（ｆ）配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むｓｃ（Ｆｖ）２。
（ｇ）配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を有するｓｃ（Ｆｖ）２。
（ｈ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するｓｃ（Ｆｖ）２。
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入され、かつ本発明の抗体と同等の活性を有するｓｃ（Ｆｖ）２。【００２８】  なお、配列番号：９、１０はそれぞれ２Ｄ７重鎖可変領域の塩基配列、アミノ酸配列を示し、当該領域における、５０番目〜５４番目がＣＤＲ１（配列番号：３）、６９番目〜８５番目がＣＤＲ２（配列番号：４）、１１８番目〜１２３番目がＣＤＲ３（配列番号：５）に相当する。また、配列番号：１１、１２はそれぞれ２Ｄ７軽鎖可変領域の塩基配列、アミノ酸配列を示し、当該領域における、４６番目〜５５番目がＣＤＲ１（配列番号：６）、７１番目〜７７番目がＣＤＲ２（配列番号：７）、１１０番目〜１１８番目がＣＤＲ３（配列番号：８）に相当する。また、上記重鎖可変領域と軽鎖可変領域をリンカーでつないだｓｃＦＶをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号：１３に、ｓｃＦＶのアミノ酸配列を配列番号：１４に示し、本発明のｓｃ（ＦＶ）２をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号：１に、ｓｃ（ＦＶ）２のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。【００２９】  また、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するｓｃ（Ｆｖ）２または、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ（又は可変領域）を有するｓｃ（Ｆｖ）２を、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的としてヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）化してもよい。これらの人為的に改変した抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。【００３０】  ここで「機能的に同等」とは、対象となる抗体が、配列番号：２に記載の配列を有するｓｃ（ＦＶ）２、または配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ（又は可変領域）を有するｓｃ（ＦＶ）２と同等の活性（例えば、ＨＬＡ−Ａへの結合活性、細胞死誘導活性、など）を有することを意味する。【００３１】  あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪ，ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ，ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ  ＨＪ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８２，４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発明の抗体のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該抗体と機能的に同等な抗体もまた本発���の抗体に含まれる。【００３２】  変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内）であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。【００３３】  本発明の抗体には、本発明の抗体のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加された抗体も含まれる。また、これら抗体と他のペプチド又はタンパク質とが融合した融合タンパク質も含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の抗体との融合に付される他のペプチド又はポリペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６，１２０４−１２１０）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ  ｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の抗体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたはポリペプ��ドをコードするポリヌクレオチドを、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと融合させ、これにより調製された融合ポリヌクレオチドを発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。【００３４】  本発明の抗体は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた抗体が、本発明の抗体と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明の抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加される。本発明の抗体はこのような抗体も包含する。【００３５】  本発明の抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている（例えば、ＵＳ５０５７３１３、ＵＳ５１５６８４０）。本発明における「抗体」にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。【００３６】  また本発明は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明の抗体と同等の活性を有する抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコードする限り、特に限定されず、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等の塩基または塩基対からなる重合体である。本発明のポリヌクレオチドは天然以外の塩基を含んでいてよい。本発明のポリヌクレオチドは、抗体を遺伝子工学的な手法により発現させる際に使用することができる。また本発明の抗体と同等な機能を有する抗体をスクリーニングする際に、プローブとして用いることもできる。即ち本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、またはその一部をプローブとして用い、ハイブリダイゼーション、遺伝子増幅技術（例えばＰＣＲ）等の技術により、該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明の抗体と同等の活性を有する抗体をコードするＤＮＡを得ることができる。このようなＤＮＡも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）は当業者によく知られた技術である。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するポリ���クレオチドが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。【００３７】  これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により得られるポリヌクレオチドがコードする、本発明の抗体と機能的に同等な抗体は、通常、これら抗体とアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明の抗体には、本発明の抗体と機能的に同等であり、かつ該抗体のアミノ酸配列と高い相同性を有する抗体も含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも５０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を指す。ポリペプチドの相同性を決定するには、文献（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。【００３８】  本発明のｓｃ（Ｆｖ）２は当業者に公知の方法により作製することができる。例えば、ＨＬＡを認識する抗体の配列を基に、当業者に公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することが可能である。具体的には、ＨＬＡを認識する抗体の配列を基にｓｃ（Ｆｖ）２をコードするポリヌクレオチドを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。【００３９】  ＨＬＡを認識する抗体の配列は、既に公知の抗体の配列を用いることが可能であり、又、ＨＬＡを抗原として、当業者に公知の方法により抗ＨＬＡ抗体を作製し、その抗体の配列を取得して用いることも可能である。具体的には、例えば、以下のようにして行うことができる。ＨＬＡタンパク質若しくはその断片を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングする。抗原の調製は公知の方法、例えばバキュロウイルスを用いた方法（ＷＯ９８／４６７７７など）等に準じて行うことができる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．��１９８１）７３：３−４６）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。その後、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡの配列を公知の方法により解読すればよい。【００４０】  ＨＬＡを認識する抗体は、ＨＬＡと結合する限り特に制限はなく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。又、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体なども使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。【００４１】  キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体等であり、マウス抗体の可変領域をコードするポリヌクレオチドをヒト抗体の定常領域をコードするポリヌクレオチドと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。【００４２】  ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９６／０２５７６参照）。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したポリヌクレオチド配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する（国際特許出願公開番号ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法を参照）。得られたポリヌクレオチドをヒト抗体定常領域をコードするポリヌクレオチドと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。これらキメラ抗体やヒト化抗体などについては、ｓｃ（Ｆｖ）２にした後にキメラ化やヒト化等を行ってもよいし、キメラ化やヒト化等を行った後にｓｃ（Ｆｖ）２にしてもよい。【００４３】  また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗��で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／１２２２７，ＷＯ  ９２／０３９１８，ＷＯ  ９４／０２６０２，ＷＯ  ９４／２５５８５，ＷＯ  ９６／３４０９６，ＷＯ  ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのポリヌクレオチド配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ  ９２／０１０４７，ＷＯ  ９２／２０７９１，ＷＯ  ９３／０６２１３，ＷＯ  ９３／１１２３６，ＷＯ  ９３／１９１７２，ＷＯ  ９５／０１４３８，ＷＯ  ９５／１５３８８を参考にすることができる。【００４４】  本発明の抗体は当業者に公知の方法により製造することができる。具体的には、目的とする抗体のＤＮＡを発現ベクターへ組み込む。その際、発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。その際には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。【００４５】  ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。本発明の抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。【００４６】  また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌ���ｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。【００４７】  大腸菌以外にも、例えば、本発明のポリペプチドを製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。【００４８】  ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。【００４９】  さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０  Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。【００５０】  一方、動物の生体内で本発明のポリヌクレオチドを発現させる方法としては��本発明のポリヌクレオチドを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のポリヌクレオチドの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，５．６１−５．６３）。生体内への投与は、ｅｘ  ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ  ｖｉｖｏ法であってもよい。【００５１】  また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明の抗体の製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。【００５２】  真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ  Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。【００５３】  植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞がポリペプチド生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）が知られている。【００５４】  原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏ���ｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。【００５５】  これらの細胞を目的とするポリヌクレオチドにより形質転換し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。【００５６】  一方、ｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするポリヌクレオチドを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。【００５７】  動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。【００５８】  例えば、目的とするポリヌクレオチドを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むポリヌクレオチド断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的の抗体を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。【００５９】  また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のポリヌクレオチドを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のポリペプチドを得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。【００６０】  さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的のポリヌクレオチドを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ  ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ  Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。【００６１】  こ��により得られた本発明の抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常の抗体の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば抗体を分離、精製することができる。【００６２】  クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製された抗体も包含する。【００６３】  本発明において、調製された抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。【００６４】  本発明者らは、本発明の抗体が細胞死を誘導することを見出した。この知見に基づき、本発明の抗体を有効成分として含有する、細胞死誘導剤または細胞増殖抑制剤を提供する。また、既に本発明者らは、抗ＨＬＡ抗体を低分子化したＤｉａｂｏｄｙが、ヒト骨髄腫モデル動物に対して、抗腫瘍効果を有することを見出している（ＷＯ２００４／０３３４９９）。さらに、本発明の抗体の細胞死誘導活性は、活性化されたＴ細胞又はＢ細胞で特に効果が大きいと考えられる。従って、本発明の抗体は、Ｄｉａｂｏｄｙと同様に癌などの腫瘍（特に血液腫瘍）や自己免疫疾患の治療や予防に特に有効であると考えられる。本発明は、本発明の抗体を有効成分として含有する、抗腫瘍剤または自己免疫疾患治療剤もまた提供するものである。【００６５】  本発明の抗体は、直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物として投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的��、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。【００６６】  錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。【００６７】  注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。【００６８】  油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。【００６９】  患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がポリヌクレオチドによりコードされうるものであれば、該ポリヌクレオチドを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。【００７０】  本発明の抗体の投与量は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１０００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。【００７１】  非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異な��が、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。
さらに本発明は、本発明の抗体を用いることにより、細胞の細胞死を誘導する方法に関する。具体的には、本発明の抗体を細胞に接触させることにより、該細胞に細胞死を誘導する方法に関する。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００７２】  以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。
〔実施例１〕２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２型ＤＩＡＢＯＤＹ発現ベクターの作製
ＷＯ２００４／０３３４９９に記載した通り、ＨＬＡクラスＩに対する抗体２Ｄ７モノクローナル抗体を、重鎖および軽鎖可変領域を５ｍｅｒのリンカーで接続した低分子抗体（２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙ）（図１Ａ）に改変することにより、ミエローマ細胞に対する細胞死誘導活性が劇的に上昇したことを既に示した。そこで、この２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙを、構造的により安定であると考えられるｓｃ（Ｆｖ）２型（図１Ｂ）に改変し、細胞死誘導活性を従来型ｄｉａｂｏｄｙ（ＨＬ５）と比較検討した。【００７３】  まず、２Ｄ７抗体の重鎖可変領域配列（ＶＨ）と軽鎖可変領域配列（ＶＬ）が、ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬの並びになるように、それぞれを１５ｍｅｒのリンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ  ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）で接続した２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２をコードするＤＮＡ発現ベクターを以下の手順で作製した。【００７４】  ＷＯ２００４／０３３４９９に記載の方法で作成した、ＶＨ−ＶＬを５ｍｅｒのリンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）で連結した２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙ（ＨＬ５）発現ベクターを鋳型にして、プライマー２Ｄ７ＤＢＨ１（配列番号：１５）、プライマー２Ｄ７ＰＡ２（配列番号：１６）でＰＣＲ反応を行い、断片Ａを増幅した。同様に、プライマー２Ｄ７ＰＡ３（配列番号：１７）、プライマー２Ｄ７ＰＡ５（配列番号：１８）でＰＣＲ反応を行い、断片Ｂを増幅した。ここで得られた断片Ａ及び断片Ｂを、同一チューブ内で混合し、ＰＣＲ−ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ反応を行うことで、断片Ａと断片Ｂを連結させた。これにより、Ｎ末にＶＨのシグナル配列を含み、ＶＨ−ＶＬが１５ｍｅｒのリンカーで連結したＤＮＡ断片″２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙＨＬ１５−１″を得た。【００７５】  続いて、２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙ（ＨＬ５）発現ベクターを鋳型にして、プライマー２Ｄ７ＰＡ６（配列番号：１９）、プライマー２Ｄ７ＰＡ２（配列番号：１６）でＰＣＲ反応を行い、断片Ｃを増幅した。同様に、プライマー２Ｄ７ＰＡ３（配列番号：１７）、プライマー２Ｄ７ＤＢＬ２（配列番号：２０）でＰＣＲ反応を行い、断片Ｄを増幅した。ここで得られた断片Ｃ及び断片Ｄを同一チューブ内で混合し、ＰＣＲ−ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ反応により、２つの断片を連結させた。この操作によって、ＶＨ−ＶＬが１５ｍｅｒのリンカーで連結し、Ｃ末にＦｌａｇ−ｔａｇ領域を含むＤＮＡ断片″２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙＨＬ１５−２″を得た。【００７６】  上記反応により得られた２つのＤＮＡ断片、すなわち″２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙＨＬ１５−１″ＤＮＡ断片、及び、″２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙＨＬ１５−２″ＤＮＡ断片を、それぞれＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ、及び、ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩで切断し、両ＤＮＡ断片をあらかじめＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩで切断し開裂した発現ベクターｐＣＸＮＤ３に挿入した。インサートＤＮＡの塩基配列を解析し、目的どおりｓｉｇｎａｌ−ＶＨ（１５）ＶＬ（１５）ＶＨ（１５）ＶＬ−ＦｌａｇをコードするｃＤＮＡが、ｐＣＸＮＤ３のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ間に挿入されていることを確認し、２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２発現ベクター（ｐＣＸＮＤ３−２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２）の構築を終了した。２��７ｓｃ（Ｆｖ）２の塩基配列（配列番号：１）およびアミノ酸配列（配列番号：２）を図２に示す。【００７７】〔実施例２〕２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２産生発現細胞株の樹立
ＰｖｕＩで切断し直鎖化したｐＣＸＮＤ３−２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２  ２０μｇをＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株）に以下のようにｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ法により導入した。【００７８】  ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ培地（インビトロジェン）で培養したＤＧ４４細胞をｉｃｅ−ｃｏｌｄ  ＰＢＳで２回洗浄した後１Ｘ１０７／ｍｌになるようにＰＢＳに懸濁した。これに２０μｇの上記プラスミドを混合し、電気パルス（１．５ＫＶ，２５μＦＤ）を与えた。適当な割合で細胞を希釈し９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに細胞を撒きこみ、終濃度５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（インビトロジェン）を添加したＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ培地中で培養を行った。生育した単一コロニーを約３０クローンほどピックアップし、それら培養上清中の２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２の発現量を抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ）を用いたウエスタンブロットにより調べた。最も発現の高かったクローンを５ｎＭ  ＭＴＸを含む核酸フリーのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ培地（インビトロジェン）で培養を行い、培養スケールを拡大した。その結果得られた株を高産生細胞株とした。【００７９】〔実施例３〕２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２の大量精製
Ｔ−１２５フラスコでサブコンフルエントの２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２高産生ＣＨＯ細胞株を１Ｘ１０５／ｍｌになるようにローラーボトル（ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ培地２５０ｍｌ／ボトル）に移した。３７℃で培養し、６日後に培養液を回収した。遠心によって死細胞を除去した後、０．４５μｍフィルターを通してこれを精製に用いた。【００８０】  ２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２の精製は以下のとおり行った。
まず、ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（２０ｍＭ  Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐＨ６．８）で平衡化したＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅカラム（ｍｉｃｒｏ  ｐｒｅｐ  ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ｔｙｐｅ  Ｉ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に回収した培養上清をａｐｐｌｙした。ｂｕｆｆｅｒ  Ａでカラムを洗浄した後、ｂｕｆｆｅｒ  Ｃ（２５０ｍＭ  Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐＨ６．８）で２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２を溶出した。２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２を含むフラクションを等量のｂｕｆｆｅｒ  Ａで希釈した後、これをＡｎｔｉ−Ｆｌａｇ  Ｍ２アガロースアフィニティカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にａｐｐｌｙした。このカラムをｂｕｆｆｅｒ  Ｃ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した後、ｂｕｆｆｅｒ  Ｄ（１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｈ３．５，０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２を溶出した。回収したサンプルは直ちに終濃度２５ｍＭになるようにＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０で中和した。その後、このフラクションを、セントリプレップＹＭ−１０（ＡＭＩＣＯＮ）で濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ（２６／６０）カラム（アマシャムファルマシア）によるゲルろ過クロマトグラム精製に使用した。
０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでゲルろ過クロマトグラム精製を行い、サンプル溶出時のチャートを図３に示した。２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２高産生ＣＨＯ細胞株より産生された低分子化抗体は、そのほとんどが分子量約５２Ｋｄの位置に溶出ピークを有し（図３（１）参照）、同じく５２Ｋｄで溶出される２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙのピークと完全に一致した（図３（２）参照）。このことから本発明で構築した２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２は、当初の目的どおり図１Ｂに示す構造（１本鎖抗体が分子内で折れ曲がることで形成されるｓｃ（Ｆｖ）２構造）を形成していると考えられた。
ゲルろ過クロマトグラム精製により分離された５２Ｋｄのピークのみを回収し、これを２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２蛋白標品とした。回収したサンプルの一部をＳＤＳ電気泳動および銀染色を行うことで、目的の蛋白が１００％の純度で精製されていることを確認した。回収した精製標品はセントリプレップＹＭ−１０（ＡＭＩＣＯＮ）で濃縮し、２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２精製標品として以下の実験に使用した。【００８１】  〔実施例４〕２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２の細胞死誘導活性の測定
ヒト骨髄腫細胞株ＡＲＨ７７細胞を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン）で１Ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに細胞を撒いた。これに、精製した２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２を終濃度１００ｎｇ／ｍｌ、及び、２５０ｎｇ／ｍｌになるように添加した。また比較検体として、精製した２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙ（ＨＬ５）を別のｗｅｌｌに同一条件で添加した。３７℃で３時間培養後、各細胞を回収し、ＰＩ溶液（５μｇ／ｍｌ  ＰＩ，２％ＦＣＳ／ＰＢＳ）に細胞を懸濁した。遮光して室温で１５分インキュベートした後、ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙを用いてＰＩで染色された死細胞の割合を測定した（ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ，ＣＯＵＬＴＥＲ）。【００８２】  その結果、２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２は濃度依存的に細胞死を誘導する活性を有していることが明らかになった。またその活性は、ｌｉｎｋｅｒ  ５ｍｅｒでＶＨとＶＬをつないだ２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙ（ＨＬ５）とほぼ同レベルであることが分かった。以上の結果より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞死誘導活性に関しては、２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２は２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙ（ＨＬ５）と同様の活性を有していることが分かった（図４）。【００８３】〔実施例５〕２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２の細胞増殖抑制活性の測定
ヒトＥＢＶ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  Ｂ細胞株ＩＭ９細胞（ＡＴＣＣ）を３Ｘ１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、またヒトバーキットリンパ腫由来細胞株ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ細胞を１Ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で希釈し、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに撒いた。これに、精製した２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２、および、２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙ（ＨＬ５）を終濃度０、０．００３２、０．０１６、０．０８、０．４、２μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で培養した。３日間培養後、細胞数測定ＷＳＴ−８キット（同仁化学）を用いて生細胞数を測定した。
生細胞数の割合（％）＝（抗体存在下で培養した生細胞数）／（抗体非添加で培養した生細胞数）で算出し、これに１００を乗じ縦軸に示した（図５）。
その結果、２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２は濃度依存的にＩＭ９細胞、および、ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ細胞の増殖を阻害し、２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙと同等の細胞増殖抑制活性を持つことがわかった。【００８４】〔実施例６〕放射性標識２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２および放射性標識２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙ（ＨＬ５）の調製
丸底ポリエチレンチューブの底の部分を約１ｃｍの深さに切り取り、この底の部分に２５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ及びＴｗｅｅｎ２０  ０．０５ｖｏｌ％含有２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、Ｎａ１２５Ｉ溶液及び２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２または２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙ（ＨＬ５）溶液を添加した。０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ溶液を染み込ませ乾燥させたろ紙（５×５ｍｍ）をカバーガラス上にのせ、ろ紙に３２ｍｇ／ｍＬ  Ｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ  Ｔ溶液を染み込ませ、ろ紙が内側になるようにカバーガラスを反応チューブの上にかぶせた。【００８５】  室温で５分間放置した後、新たに３２ｍｇ／ｍＬ  Ｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ  Ｔ溶液を染み込ませたろ紙に取り替え、前述と同様に反応チューブの上にかぶせ室温でさらに５分間放置した。
反応液にＴｗｅｅｎ２０  ０．０５ｖｏｌ％含有ＰＢＳ（−）を添加後、反応液をＴｗｅｅｎ２０  ０．０５ｖｏｌ％含有ＰＢＳ（−）で平衡化したＰＤ−１０ｃｏｌｕｍｎ（アマシャムファルマシア）にのせ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５ｖｏｌ％含有ＰＢＳ（−）にて溶出させ未反応の１２５Ｉを除去した。さらに、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００ＧＬカラム（アマシャムファルマシア）によりゲルろ過精製し、放射性ヨード標識２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２および放射性ヨード標識２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙ（ＨＬ５）を調製した。【００８６】〔実施例７〕マウスに放射性標識２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２および放射性２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙ（ＨＬ５）を単回静脈内投与したときの血漿中放射能濃度推移
雄性マウス（Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ  Ｓｃｉｄ  Ｊｃｌ、日本クレア）に放射性標識２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２および放射性標識２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙ（ＨＬ５）を１ｍｇ／５  ＭＢｑ／ｋｇで単回尾静脈内投与した。投与１５、３０分、１、２、４、８、２４時間後にエーテル麻酔下マウスを開腹し、心臓よりヘパリン処理した２５Ｇ注射針付テルモシリンジを用いて採血した。採取した血液は直ちに４℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、血漿を分離した。
血漿試料の放射能をγ−カウンターにて測定した。また、投与液の放射能を同時に測定し、投与液中の放射性標識被験物質の比放射能を算出し、それを基に血漿中総放射能濃度を算出した。放射能測定後、血漿試料に精製水およびＴＣＡ２５ｗ／ｖ％溶液を加え、攪拌後、４℃で３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。上清をアスピレーターで吸引後、沈殿物の放射能を測定した。総放射能に対する沈殿物の放射能の割合を血漿中総放射能濃度に乗じて血漿中ＴＣＡ沈殿画分放射能濃度を算出した。【００８７】  放射性標識２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２および放射性標識２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙ（ＨＬ５）投与群ともに血漿中ＴＣＡ沈殿画分放射能濃度は二相性で減少した（図６）。放射性標識２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２は放射性標識２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙ（ＨＬ５）より高い血漿中ＴＣＡ沈殿画分放射能濃度を与え、消失相の半減期はそれぞれ２．３０時間および１．６４時間で２Ｄ７ｓｃ（Ｆｖ）２は２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙ（ＨＬ５）より長い半減期を与えた。
【産業上の利用可能性】
【００８８】  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＡを認識する低分子抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）をｓｃ（Ｆｖ）２へと構造改変することにより、高い細胞死誘導活性と細胞増殖抑制活性を保持させながら、血中での安定性をより高め、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて優れた薬効を発揮させることにある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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