(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（４）のステップを含むことを特徴とする同位体標識化合物における任意の同位体の含有率を測定する方法。
（１）同位体標識化合物を含む試料をクロマトグラフィーによって分離後、質量分析するステップ
（２）（１）の質量分析によって得られたトータルイオンクロマトグラムをデータ処理して、任意の同位体を含む成分のマススペクトルを採取するステップ
（３）（２）で得られたマススペクトルをデータ処理して、各同位体のそれぞれの、ピークトップのｍ/ｚ＝±０．１ｕ〜±０．３ｕの範囲のピークについて、マスクロマトグラムを採取するステップ
（４）（３）で得られたマスクロマトグラムに基づいて、該同位体標識化合物における任意の同位体の含有率を算出するステップ
【請求項２】
（１）のクロマトグラフィーが液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー又はゲルパーミエーションクロマトグラフィーであることを特徴とする請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
（２）の質量分析のイオン化方法が、電子イオン化（ＥＩ）法、化学イオン化（ＣＩ）法、電界イオン化（ＦＩ）法、高速原子衝突（ＦＡＢ）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）法、または大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）法であることを特徴とする請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
（２）の質量分析を、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間型、タンデム型又はフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型で分析することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の測定方法。
【請求項５】
同位体標識化合物が、重水素、質量数１４の炭素原子及び質量数１５の窒素原子からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む同位体標識化合物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法。
【請求項６】
（４）のステップにおいて、ベースラインの安定しないマスクロマトグラムの同位体を含有率なしと判断するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の測定方法。
【請求項７】
さらに下記（５）のステップを含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の測定方法。
（５）：試料の溶解に用いられた溶媒のみで（１）〜（４）のステップを実施するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同位体標識化合物などの化合物における所望の同位体含有率を正確に測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
同位体標識化合物は、例えば、環境科学研究、薬物動態研究などの分野において、任意の対象化合物の移動を追跡するために該対象化合物の同位体を調製し、該同位体の移動を追跡する手法が汎用されている。このような同位体は同位体標識化合物と呼ばれ、通常、対象化合物の１分子内の軽水素１〜１０個を重水素に置換した同位体標識化合物、対象化合物の１分子内の炭素原子（質量数１２）１〜１０個を質量数１３の炭素原子に置換した同位体標識化合物、対象化合物の１分子内の窒素原子（質量数１４）１〜５個を質量数１５の窒素原子に置換した同位体標識化合物など用いられている。
同位体標識化合物において、例えば、対象化合物１分子に重水素４個が置換された同位体（d4体）を主成分とする同位体標識化合物を用いる場合、調製された同位体標識化合物には、d4体の他、通常、対象化合物１分子に重水素２個が置換された同位体（d2体）、重水素３個が置換された同位体（d3体）、あるいは、全く重水素が置換されていない同位体（d0体）が含まれる可能性がある。このように、通常、同位体標識化合物において所望の同位体の他、質量数の異なる同位体が含まれる場合、用いる同位体標識化合物における所望の同位体の含有率を予め正確に測定しなければ、同位体標識化合物の移動を十分に正確に追跡することができないという問題がある。
同位体標識化合物を用いた対象化合物の移動を追跡する手法としては、例えば、ビタミンＤ３誘導体１分子内に３つの軽水素が重水素に置換された同位体を内部標準物質として用い、ガスクロマトグラフ質量分析法（ＧＣ-ＭＳ）による分子イオンピーク面積比から測定する方法が挙げられる。
【０００３】
【特許文献１】特開平６−３４１９８０号［請求項１、実施例］
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１には、ビタミンＤ３誘導体の同位体標識化合物において、分子内に３つの軽水素が重水素に置換された所望の同位体、１分子内の２個が置換された質量数の異なる同位体などの含有率については開示されていない。
本発明者らは、市販されているフタル酸エステルの１分子内に重水素が４個置換された同位体標識化合物について、該同位体標識化合物における重水素が４個置換された同位体（d4体）の含有率を測定することを試みた。具体的には、まず、該同位体標識化合物を液体クロマトグラフィーで分離したのち質量分析（ＬＣ−ＭＳ）し、得られたトータルイオンクロマトグラムをデータ処理してマススペクトルを求めた。しかしながら、重水素が全く置換されていない同位体（d0体）に相当する質量数を示すピークから重水素が３個置換された同位体（d3体）に相当する質量数を示すピークについてはそれぞれのＳ/Ｎ比が悪く、フタル酸エステル由来（d0体〜d3体）のピークであるか、バックグラウンド由来のピークであるかの判断できず、９割以上のd4体を含むと考えられる該同位体標識化合物について、d4体の含有率を％単位まで正確に測定することができなかった。
本発明の目的は、所望の同位体とは質量数の異なる同位体が含まれる化合物において、所望の同位体の含有率を正確に測定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、下記（１）〜（４）のステップを含むことを特徴とする化合物における任意の同位体の含有率を測定する方法である。
（１）化合物を含む試料をクロマトグラフィーによって分離後、質量分析するステップ
（２）（１）の質量分析によって得られたトータルイオンクロマトグラムをデータ処理して、任意の同位体を含む成分のマススペクトルを採取するステップ
（３）（２）で得られたマススペクトルをデータ処理して、各同位体のそれぞれのマスクロマトグラムを採取するステップ
（４）（３）で得られたマスクロマトグラムに基づいて、化合物における任意の同位体の含有率を算出するステップ。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、同位体標識化合物などの化合物において、所望の同位体とは質量数の異なる同位体が含まれていても、所望の同位体含有率を正確に測定することができる。例えば、1Ｈ（軽水素）と2Ｈ（重水素）との含有比率、12Ｃと13Ｃとの含有比率、14Ｎと15Ｎとの含有比率などを正確に定量することができる。また、質量数の相違する同位体が微量で含まれていてもバックグラウンドと区別できることから、試料が高純度の同位体からなる化合物でも正確に定量できる。さらに、イオントラップ型、四重極型などの分解能の低い質量分析計を用いても、十分正確に定量することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）は、化合物を含む試料をクロマトグラフィーによって分離後、質量分析するステップであり、クロマトグラフィーとしては、例えば、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーなどが挙げられる。中でも、液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーは質量分析計に直結して分析できることから好ましい。
【０００８】
本発明の方法で測定される化合物は、前記クロマトグラフィーで分離できる化合物であればよい。中でも、重水素、14Ｃ、15Ｎなどの同位体を主成分として含む化合物は、同位体含有率を正確に定量できることから好ましい。
【０００９】
質量分析におけるイオン化方法としては、電子イオン化（ＥＩ）法、化学イオン化（ＣＩ）法、電界イオン化（ＦＩ）法、高速原子衝突（ＦＡＢ）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）法、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）法などが例示される。中でも、電子イオン化（ＥＩ）法、化学イオン化（ＣＩ）法は、ガスクロマトグラフィーのイオン化方法に好適であり、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）法は、液体クロマトグラフィーのイオン化方法に好適である。
【００１０】
質量分析における分析計としては、例えば、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間型、タンデム型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などが挙げられる。中でも、四重極型、イオントラップ型、飛行時間型が好適である。
実施例では、Di-2-ethylhexyl Phthalate-3,4,5,6-d4を液体クロマトグラフィーで分離し（保持時間２．５９分、図１参照）、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）によってイオン化し、イオントラップ型の質量分析計で分析した。
【００１１】
（２）は（１）の質量分析によって得られたトータルイオンクロマトグラムをデータ処理して、任意の同位体を含む成分のマススペクトルを採取するステップである。
トータルイオンクロマトグラムとは、全イオンを検出、記録するクロマトグラムであり、そのデータ処理は、トータルイオンクロマトグラムより任意の同位体を含む成分を検出する時間帯における検出、記録されたイオンをマススペクトルで現す操作である。実施例のトータルイオンクロマトグラムは図２に示し、実施例のマスクロマトグラフを図３に示した。本実施例ではトータルイオンクロマトグラムにおけるd4体(質量数３９５、[M+H]+)は３９５．２１をピークトップとするピークで示される。
【００１２】
任意の同位体を含む成分とは、通常、同位体標識化合物などの化合物における同位体含有率の測定対象となる任意の同位体（以下、対象同位体という場合がある）の質量数を含む成分であり、具体的には、対象同位体の質量数の±１０ｕ、好ましくは、±５ｕの質量数の範囲である。イオントラップ型や四重極型のような分解能の低い質量分析計では、スキャン範囲を絞り込み、狭い質量範囲で分析することにより、対象同位体及び対象同位体とは異なる質量数の同位体のそれぞれに相当する質量数のピークの分解能を高めることにより、フルスキャン法に比べてマススペクトルの分解能を向上させ、より正確に定量することができる。
【００１３】
（３）は（２）で得られたマススペクトルをデータ処理して、各同位体のそれぞれのマスクロマトグラムを採取するステップである。
具体的にはまず、（２）のマススペクトルの最も大きなピークトップのｍ/ｚ＝±０．１ｕ〜±０．３ｕの範囲のピーク、好ましくはｍ/ｚ＝±０．２ｕの範囲のピークについて、マスクロマトグラムを求める。続いて、同位体は質量数が１ずつ異なるから、ピークトップの質量数からｍ/ｚ＝±１０〜±１程度のマスクロマトグラムを採取する
実施例では、ベースピークであるｍ/ｚ＝３９５．２１±０．２(d4体、質量数３９５、[M+H]+)のマスクロマトグラムを図４に、ｍ/ｚ＝３９４．２１±０．２(d3体、質量数３９４、[M+H]+)のマスクロマトグラムを図５に、ｍ/ｚ＝３９３．２１±０．２(d2体、質量数３９３、[M+H]+)のマスクロマトグラムを図６に、ｍ/ｚ＝３９２．２１±０．２(d1体、質量数３９２、[M+H]+)のマスクロマトグラムを図７に、ｍ/ｚ＝３９１．２１±０．２(d0体、質量数３９１、[M+H]+)のマスクロマトグラムを図８に示した。
【００１４】
（４）は（３）で得られたマスクロマトグラムに基づいて、化合物における任意の同位体の含有率を算出するステップである。具体的には、得られたマスクロマトグラムから、それぞれの同位体のピーク面積などの出力値を求め、対象同位体及び対象同位体とは異なる同位体のそれぞれの出力値の和に対する対象同位体の出力値の割合が、化合物における任意の同位体の含有率として求めることができる。
マスクロマトグラムの出力値は、通常、マスクロマトグラムのピーク面積あるいはそれに相当する電気信号の値が用いられる。
【００１５】
図６〜８のマスクロマトグラムから明らかなように、一定のベースラインが観測されない場合、ピークは存在しないと判断され、d2体(質量数３９３、[M+H]+)、d1体(質量数３９２、[M+H]+)、d0体(質量数３９１、[M+H]+)の同位体は存在しないことがわかる。
このように、本発明によれば、（２）のマススペクトルではピークが存在するのか判断できない微量の同位体についても、一定のベースラインが観測されないことでかかる同位体は存在しないことが明瞭に判断できる。
【００１６】
さらに、（１）〜（４）のステップを実施することによってカラム、ライン、オートサンプラー、イオン化部分などに化合物や不純物が残存する場合があるので、１測定ごとに溶媒のみのブランクを用いて（１）〜（４）のステップを実施することにより、洗浄することが好ましい。
【実施例】
【００１７】
＜試料の調製＞
Di-2-ethylhexyl Phthalate-3,4,5,6-d4（以下、d4体という）を主成分とする試料（関東化学(株)、環境分析用）０．５ｍｇを正確に量り取り、アセトニトリル５ｍＬで溶解させたものを試料Ａ（濃度：約100ppm）とした。試料Ａ １．２５ｍＬを正確に量り、アセトニトリルを加えて正確に５ｍＬとしたものを試料Ｂ（濃度：約25ppm溶液）とした。
0004800048.tif 000002
【００１８】
＜ステップ（１）＞
試料Ａについて、（１）は下記液体クロマトグラフィーの条件で実施した。試料Ａの液体クロマトグラムを図１に示した。保持時間が2.6分の成分についてステップ（２）の質量分析を実施した。
システム：Agilent 1100シリーズ（アジレント・テクノロジー、ステップ（２）の質量
分析計を含むシステム）
カラム    ：ZORBAX SB-C18 Rapid Resolution Cartridge（3.5μm、2.1mmφ×30mm）
移動相    ：水/アセトニトリル(0.1％酢酸含有)＝１：９(容積比)
流量      ：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
測定波長  ：２５４ｎｍ（ＵＶ）
カラム温度：４０℃
注入量    ：５μl
データ処理  ：LC-MSワークステーション(Qual Browser Ver.1.3)
【００１９】
＜ステップ（２）＞
試料Ａの上記成分について、下記条件で質量分析を行った。
質量分析計：LCQ DECA XP plus（サーモエレクトロン、イオントラップ型）
イオン化法：エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）
イオン極性：Positive
測定モード：m/z=388.5〜398.5のズームスキャン法
データ処理：LC-MSワークステーション(Qual Browser Ver.1.3)
【００２０】
＜ステップ（３）＞
前記で得られたデータから、d4体(質量数３９５、[M+H]+)のマスクロマトグラムを図４に、d3体(質量数３９４、[M+H]+)のマスクロマトグラムを図５に、d2体(質量数３９３、[M+H]+)のマスクロマトグラムを図６に、d1体(質量数３９２、[M+H]+)のマスクロマトグラムを図７に、d0体(質量数３９１、[M+H]+)のマスクロマトグラムを図８に示した。
図６〜８は、ベースラインに対する正のピークが認められないことから、d2体(質量数３９３、[M+H]+)、d1体(質量数３９２、[M+H]+)、d0体(質量数３９１、[M+H]+)の同位体は存在しないと判断された。
【００２１】
＜ステップ（４）＞
ステップ（２）のデータ処理装置を用いて、ピーク面積が観測されたd0〜d4体の[M+H]+に相当するマスクロマトグラムのピーク面積値より、次式に従ってd4体含有率(％)を定量した。
0004800048.tif 000003
【００２２】
d0〜d4体の[M+H]+に相当するマスクロマトグラムのピーク面積値及びd4体含有率を表１に示した。
【００２３】
【表１】
0004800048.tif 000004
【００２４】
＜検出の確認＞
溶媒としてアセトニトリルを用いてステップ（１）〜（４）を繰り返して洗浄（以下、ステップ（５）という）したのち、試料Ｂについてもステップ（１）〜（５）で定量した。
試料Ｂのd4体(質量数３９５、[M+H]+)のマスクロマトグラムにおけるピーク面積値が、試料Ａの定量結果から得たd4体(質量数３９５、[M+H]+)のピーク面積値の２８．２％になることを確認した。結果を表２に示した。
【００２５】
【表２】
0004800048.tif 000005
【００２６】
＜システムの再現性＞
試料Ａの定量（ステップ（１）〜（５）を６回繰り返し、d4体(質量数３９５、[M+H]+)のピーク面積値の相対標準偏差が１．７％になることを確認した。結果を表３に示した。
【００２７】
【表３】
0004800048.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明の測定方法を用いれば、同位体標識化合物の純度測定、環境科学研究、薬物動態研究などの分野において利用される同位体標識化合物の定量測定、放射性同位体の半減期測定などに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】Di-2-ethylhexyl Phthalate-3,4,5,6-d4の液体クロマトグラフィーによるクロマトグラムである。
【図２】Di-2-ethylhexyl Phthalate-3,4,5,6-d4の質量分析によるトータルイオンクロマトグラムである。
【図３】前記トータルイオンクロマトグラムをデータ処理して、Di-2-ethylhexyl Phthalate-3,4,5,6-d4を含む成分のマススペクトルである。
【図４】ｍ/ｚ＝３９５．２１±０．２(d4体相当)のマスクロマトグラムである。
【図５】ｍ/ｚ＝３９４．２１±０．２(d3体相当)のマスクロマトグラムである。
【図６】ｍ/ｚ＝３９３．２１±０．２(d2体相当)のマスクロマトグラムである。
【図７】ｍ/ｚ＝３９２．２１±０．２(d1体相当)のマスクロマトグラムである。
【図８】ｍ/ｚ＝３９１．２１±０．２(d0体相当)のマスクロマトグラムである。
【図１】
0004800048.tif 000007
【図２】
0004800048.tif 000008
【図３】
0004800048.tif 000009
【図４】
0004800048.tif 000010
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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