(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の第１〜４３４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２の第１６〜４３４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２の第２０〜４３４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２の第３３〜４３４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端にメチオニンが付加されたポリペプチド、配列番号２の第４０〜４３４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端にメチオニンが付加されたポリペプチド、配列番号２の第４１〜４３４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端にメチオニンが付加されたポリペプチド、配列番号２の第７８〜４３４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端にメチオニンが付加されたポリペプチド、配列番号２の第８７〜４３４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２の第９６〜４３４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端にメチオニンが付加されたポリペプチド、配列番号２の第１１０〜４３４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２の第１２９〜４３４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端にメチオニンが付加されたポリペプチド、配列番号２の第１３５〜４３４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端にメチオニンが付加されたポリペプチド、配列番号２の第１４７〜４３４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端にメチオニンが付加されたポリペプチド、配列番号２の第１４９〜４３４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端にメチオニンが付加されたポリペプチド、配列番号２の第１６１〜４３４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端にメチオニンが付加されたポリペプチド、配列番号２の第１６５〜４３４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列番号２の第１〜４３４番目のアミノ酸配列において第２０８番目のロイシンがバリンに変化したアミノ酸配列からなるポリペプチド、からなるマンノースイソメラーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載のマンノースイソメラーゼをコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子を含有し、マンノースイソメラーゼを発現する、マンノースイソメラーゼ発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターを有する組換え宿主。
【請求項５】
請求項４に記載の組換え宿主を培養する工程を含む、マンノースイソメラーゼの生産方法。
【請求項６】
請求項１に記載のマンノースイソメラーゼとフラクトースとを反応させる工程を含む、マンノースの製造方法。
【請求項７】
グルコースとグルコースイソメラーゼとを反応させる工程、および得られた反応生成物と請求項１に記載のマンノースイソメラーゼとを反応させる工程を含む、マンノースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、マンノースイソメラーゼを構成するポリペプチド、そのアミノ酸配列、その遺伝子配列、並びにこの遺伝子配列を用いるマンノースイソメラーゼの生産方法、並びにこのマンノースイソメラーゼを用いるマンノースの製造方法に関する。
背景技術
マンノースは、医薬品合成の原料、マンニトールの原料として、又は、動物細胞培養の原料として有用である。さらに、マンノースを飼料に添加することにより、サルモネラ定着抑制が行われ、腸内サルモネラ菌の増殖を著しく抑制すると報告されており、家禽類の飼料としての利用が期待されている（Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６８巻、１３５７頁、１９８９）。
マンノースは、上記のように有用性が高いが、容易に入手するのは困難である。マンノースは、酵母、細菌、植物、および動物の細胞膜および細胞壁の構成成分として存在するほか、糖蛋白質の複合型糖鎖中に多量に含まれ、遊離型は稀にしか存在しないからである。
従来、マンノースは、マンノースを含有する多糖類（グルコマンナン、ガラクトマンナンなど）を酸分解あるいは酵素分解する、または、高温下で、モリブデン酸塩を触媒としてグルコースを処理することにより製造されている。しかし、いずれの方法においても製造コストが高く、収率も高くない。
そこで、原料として安価なフラクトースにマンノースイソメラーゼを作用させる方法、又はグルコースにグルコースイソメラーゼを作用させて、グルコースをフラクトースに変換させた後、フラクトースにマンノースイソメラーゼを作用させる方法が考えられている。
しかし、微生物由来のマンノースイソメラーゼは耐熱性に劣る（最適温度が３５〜４０℃）のに加え、フラクトースからマンノースへの変換効率は低く、工業的利用には適さないという欠点がある。他方、耐熱性の酵素であれば、雑菌の汚染が少なく、反応速度も速いと考えられるので、耐熱性のマンノースイソメラーゼが望まれている。このような耐熱性で変換効率の高いマンノースイソメラーゼとしては、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物由来のマンノースイソメラーゼが特開平６−２９２５７８号公報に、サーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属微生物由来のマンノースイソメラーゼが特開平１１−７５８３６号公報に記載されている。
本発明者らは、新規な耐熱性が高くかつ変換効率の高い微生物由来のマンノースイソメラーゼを見いだした。この酵素の実用化には、酵素を分泌する微生物の生産性の向上が鍵を握っている。そこで、遺伝子配列などの遺伝子情報を利用し、これを遺伝子工学的に改変して、マンノースイソメラーゼの生産性を飛躍的に高める試みを行った。
すなわち、本発明は、耐熱性と変換効率に優れたマンノースイソメラーゼおよびその改変体を遺伝子工学的に提供することを目的とする。それによって、本発明は、優れたマンノースの製造方法を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明は、配列番号２の第２０〜４３４番目のアミノ酸配列、および該アミノ酸配列において１または２以上のアミノ酸が置換され、欠失され、あるいは付加されたアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
また、本発明は、配列番号２の第１〜４３４番目のアミノ酸配列、第１６〜４３４番目のアミノ酸配列、第３３〜４３４番目のアミノ酸配列、第４０〜４３４番目のアミノ酸配列、第４１〜４３４番目のアミノ酸配列、第７８〜４３４番目のアミノ酸配列、第８７〜４３４番目のアミノ酸配列、第８８〜４３４番目のアミノ酸配列、第９６〜４３４番目のアミノ酸配列、第１１０〜４３４番目のアミノ酸配列、第１２９〜４３４番目のアミノ酸配列、第１３５〜４３４番目のアミノ酸配列、第１４７〜４３４番目のアミノ酸配列、第１４９〜４３４番目のアミノ酸配列、第１６１〜４３４番目のアミノ酸配列、第１６５〜４３４番目のアミノ酸配列、および前記各アミノ酸配列において１または２以上のアミノ酸が置換され、欠失され、あるいは付加されたアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
また、本発明は、前記いずれかのポリペプチドを有するマンノースイソメラーゼに関する。
さらに、本発明は、前記いずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子に関する。
また、本発明は、前記いずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含有し、マンノースイソメラーゼを発現する、マンノースイソメラーゼ発現ベクターに関する。
さらに、本発明は、前記発現ベクターを有する組換え宿主に関する。
また、本発明は、前記組換え宿主を培養する工程を含む、マンノースイソメラーゼの生産方法に関する。
また、本発明は、前記ポリペプチドからなるマンノースイソメラーゼとフラクトースとを反応させる工程を含む、マンノースの製造方法に関する。
そして、本発明は、グルコースとグルコースイソメラーゼとを反応させる工程、および得られた反応生成物と前記ポリペプチドからなるマンノースイソメラーゼとを反応させる工程を含む、マンノースの製造方法に関する。
発明を実施するための最良の形態
（マンノースイソメラーゼ活性を有するポリペプチド）
本発明は、配列番号２の第２０〜４３４番目のアミノ酸配列、および該アミノ酸配列において１または２以上のアミノ酸が置換され、欠失され、あるいは付加されたアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、本発明のポリペプチドということがある）に関する。また本発明は、配列番号２の第１〜４３４番目のアミノ酸配列、第１６〜４３４番目のアミノ酸配列、第３３〜４３４番目のアミノ酸配列、第４０〜４３４番目のアミノ酸配列、第４１〜４３４番目のアミノ酸配列、第７８〜４３４番目のアミノ酸配列、第８７〜４３４番目のアミノ酸配列、第８８〜４３４番目のアミノ酸配列、第９６〜４３４番目のアミノ酸配列、第１１０〜４３４番目のアミノ酸配列、第１２９〜４３４番目のアミノ酸配列、第１３５〜４３４番目のアミノ酸配列、第１４７〜４３４番目のアミノ酸配列、第１４９〜４３４番目のアミノ酸配列、第１６１〜４３４番目のアミノ酸配列、第１６５〜４３４番目のアミノ酸配列、および前記各アミノ酸配列において１または２以上のアミノ酸が置換され、欠失され、あるいは付加されたアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、本発明のポリペプチドということがある）に関する。本発明のポリペプチドには、上記のアミノ酸配列と少なくとも約６５％の相同性、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。
本発明のポリペプチドは、アグロバクテリウム・ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）Ｍ３６と同定された菌株から得られるＤＮＡ、およびそのＤＮＡの改変ＤＮＡから生産される。このアグロバクテリウム・ラディオバクターＭ３６は、広島県の土壌から単離され、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号にＦＥＲＭ  ＢＰ−７２０６として寄託されている（原寄託日平成１１年４月２３日）。
この微生物により生産される新規な耐熱性で変換効率の高いマンノースイソメラーゼは、以下の性質：
（１）作用
フラクトースとマンノース、およびリキソースとキシルロースとを相互変換する。
（２）基質特異性
Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−リキソース、およびＤ−キシルロースに作用し、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−フコース、およびＤ−フコースには実質的に作用しない。
（３）最適温度
５５〜６０℃
（４）最適ｐＨ
７〜９
（５）安定温度
約６０℃まで
（６）安定ｐＨ
約６〜１０
（７）分子量
約１４０，０００（ゲル濾過ＨＰＬＣ）
（８）等電点：約５．２（等電点電気泳動）
（９）Ｃａイオンによる熱安定化：実質的に認められない
（１０）マンノースに対するＫｍ値：約０．０１Ｍ
を有している。
このマンノースイソメラーゼは、配列番号２の第２０〜４３４番目のアミノ酸（４１５個）配列を有するポリペプチドから構成される。このアミノ酸配列に相当するＤＮＡ配列は、配列番号１の第３１４〜１５５８番目の配列である。
（ＤＮＡ配列の取得）
配列番号１に記載の染色体ＤＮＡは、以下のようにして得られる。まず、アグロバクテリウム・ラディオバクターＭ３６株を培養し、細胞壁溶解酵素、超音波処理などを用いて菌体を破壊し、常法により染色体ＤＮＡを抽出する。そして、いわゆるショットガンクローニングする。あるいは、アグロバクテリウム・ラディオバクターＭ３６株を培養し、マンノースイソメラーゼを単離、精製して、そのアミノ酸配列の一部を決定し、そのＤＮＡ配列を合成し、これをプローブとして染色体ＤＮＡから単離するか、あるいは、アミノ酸配列の一部のＤＮＡ配列をプライマーとしてＰＣＲ法を用いてＤＮＡを増幅する、またはこれらの方法を組合せて得られる。また、配列決定後、ＤＮＡを化学合成してもよい。
ショットガンクローニングは、当業者に周知の方法であり、例えば、前記得られた染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩのような４塩基認識の制限酵素で部分加水分解し、適切な大きさ（例えば５〜１０ｋｂｐ）のＤＮＡ断片を回収する。回収したＤＮＡ断片を、適切な発現ベクターまたはプラスミド（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋））をＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩなどの適切な制限酵素切断部位に挿入し、これを導入して大腸菌を形質転換し、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドおよびイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシドを含む寒天培地で培養し、白色コロニーを選択する。得られた白色コロニーを、例えば、０．３％フラクトースと２．５ｍｇ／ｍｌリゾチームを含むグルコースＣＩＩ−テストキットに懸濁して、３７℃で一晩静置し、顕著な発色があったコロニーを選別する。
得られた形質転換株がマンノースイソメラーゼを発現しているか否かは、マンノースイソメラーゼの活性を測定することにより、確認される。例えば、イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシドを２５０μｇ／ｍｌ、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含有するＬＢ培地で形質転換株を植菌し、３７℃で適切な時間培養する；培養後、遠心分離により菌体を回収し、洗浄後、適切な緩衝液に懸濁して超音波破砕を行う；超音波破砕液を遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とする；ついで、この粗酵素液と２０％フラクトース溶液とを、例えば、５０℃で２４時間反応させ、ＨＰＬＣでマンノースの生成を確認する；という方法である。
上記の方法により、マンノースイソメラーゼ活性を発現する形質転換体が得られる。この形質転換体からＤＮＡ配列を回収することにより、マンノースイソメラーゼ活性を発現するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（例えば、配列番号１の配列）が得られる。
いったんマンノースイソメラーゼのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が得られると、ＤＮＡ配列が改変され、マンノースイソメラーゼ活性を発現する改変ポリペプチドが得られる。
アミノ酸配列の１または２以上の置換、欠失、付加などを有する改変ポリペプチドは、当業者に周知の、例えば、部位特異的突然変異、部位特異的変異誘発、部位特異的組換えなどの方法でＤＮＡ配列を改変して得られる。例えば、アミノ酸配列の１または２以上の置換、欠失、付加などを有する短いＤＮＡ配列をプライマーとして用い、配列番号１の配列をテンプレートとして、ＰＣＲを行うことにより、容易に改変ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が得られる。例えば、配列番号３、４は、Ｎ末端にアミノ酸が付加されたポリペプチド、および配列番号６〜１９はＮ末端のアミノ酸が欠失したポリペプチドを得る場合のプライマーの例である。
得られたＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、例えば、上述のショットガンクローニングと同じスクリーニング系でマンノースイソメラーゼ活性をスクリーニングすることにより、アミノ酸配列の１または２以上の置換、欠失、付加された、マンノースイソメラーゼ活性を発現するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が得られる。
（発現ベクターの作成）
得られたＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡということがある）は、発現ベクターに導入され、マンノースイソメラーゼ発現ベクターが作成される。通常、プロモーターの下流の適切な部位にクローニング部位を有するプラスミドが使用され、このプロモーターによって、本発明のポリペプチドが発現され、マンノースイソメラーゼが発現される。
本発明の発現ベクターの作成に用いられるプラスミドあるいはベクターとしては、自律複製可能なベクターが好ましく、導入する宿主を考慮して適切な発現ベクターを選択すればよい。大腸菌を宿主とする場合は、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＵＣ１８、ｐＫＫ２２３−３、ｐＣＲ２．１が好適であり、枯草菌を宿主とする場合は、ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＵＢ１１０などが好適である。その他のベクターとして、ｐＬｅｘ、ｐＪＬ３、ｐＳＷ１、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ４２０などのプラスミドベクター、λｇｔ１１、λＺＡＰなどのファージベクターが挙げられる。
プラスミドあるいはベクターは、適切な制限酵素切断部位、例えば、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ切断部位等をクローニングサイトとして有していることが好ましく、マルチクローニングサイトであることがさらに好ましい。このクローニングサイトに適合する制限酵素で切断したＤＮＡ断片を導入することにより、容易に発現ベクターが構築される。
発現ベクターは、マンノースイソメラーゼを分泌するように設計してもよい。分泌のために、予め宿主のリーダーペプチドをコードする配列と本発明のポリペプチドをコードする配列とをイン−フレームで結合させておくか、プロモーターにリーダー配列を結合させておき、そのリーダー配列に本発明のポリペプチドをコードする配列を直結させることにより、本発明のポリペプチドを分泌させることができる。リーダーペプチド配列と本発明のポリペプチドの結合は、例えば、部位特異的突然変異などの、当業者に周知の方法で行われる。
（組換え宿主によるマンノースイソメラーゼの発現）
得られた発現ベクターは、当業者に周知の方法で宿主に導入される。宿主としては、大腸菌、枯草菌、放線菌などの原核細胞、酵母、糸状菌などの真核細胞、動物細胞、植物細胞などが挙げられる。導入方法は、当業者が通常用いる方法、例えば、形質転換、形質導入、エレクトロポレーション、細胞融合などが用いられる。
得られた組換え宿主は、ついで、培養され、本発明のポリペプチドが生産され、会合してマンノースイソメラーゼ活性を発現する。リーダーペプチド配列を用いた場合、ポリペプチドが菌体外（ペリプラズムを含む）に分泌され、会合してマンノースイソメラーゼ活性が生じる。
（マンノースの製造方法）
マンノースイソメラーゼは、菌体内あるいはペリプラズムに存在する場合は、菌体を細胞壁溶解酵素処理、超音波処理などにより溶菌して回収し、菌体外に分泌された場合は、培養液より回収される。回収されたマンノースイソメラーゼはそのまま、あるいは常法により精製して、マンノースの製造に用いられる。
マンノースイソメラーゼが菌体内あるいはペリプラズムに存在する場合は、細胞を固定化して、固定化酵素として用いてもよい。
マンノースイソメラーゼを用いるマンノースの製造方法には、２通りある。一つは、本発明のポリペプチドとフラクトースとを反応させる方法であり、他の一つは、グルコースとグルコースイソメラーゼとを反応させた反応生成物に本発明のポリペプチドを反応させる方法である。
フラクトースからマンノースを製造する場合は、フラクトースを含有する溶液と本発明のポリペプチドからなるマンノースイソメラーゼとを、適切なｐＨ条件および温度条件下で反応させればよい。アミノ酸の置換、欠失、付加を有する改変されたポリペプチドからなるマンノースイソメラーゼは、最適温度、最適ｐＨが改変前のマンノースイソメラーゼと異なる可能性もあるので、使用前に確認しておけばよい。一般的には、ｐＨが約６〜１０、温度が６５℃以下で行うことが好ましい。
グルコースからマンノースを製造する場合、まず、グルコースとグルコースイソメラーゼとの反応を行い、反応生成物を単離して、この反応生成物とマンノースイソメラーゼとを反応させてもよい。あるいは、グルコースと、グルコースイソメラーゼと、マンノースイソメラーゼとを同時に混合して反応させてもよい。この場合、グルコースイソメラーゼは、マンノースイソメラーゼと最適ｐＨおよび最適温度が近いものを選択することが必要となる。前記２つの方法は、酵素（必要に応じて微生物自体）を固定化して連続的に行うこともできる。
反応終了後、例えば、濾過、遠心分離などにより不純物を取り除いた後、活性炭、イオン交換クロマトグラフィー、膜濾過、濃縮などの、当業者が適宜用いる分離、精製プロセスを経て、マンノースが精製される。
（実施例）
以下、本発明を、実施例を挙げて説明するが、本発明はこの実施例にのみ限定されるものではない。なお、本実施例で％というときは重量％を意味する。
（実施例１：マンノースイソメラーゼ遺伝子の取得）
（染色体ＤＮＡの調製）
ＬＢ液体培地（ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％（ｐＨ７．０））５ｍｌにアグロバクテリウム・ラディオバクターＭ３６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２０６）を植菌し、３０℃、１６時間振盪培養した。これを、１００ｍｌのＬＢ培地を含む５００ｍｌのバッフル付きフラスコに移し、３０℃、２４時間培養し、遠心分離により菌体を回収した。
回収した菌体を０．１ＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。この懸濁液にリゾチーム（和光純薬（株））を４ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃、３０分間、穏やかに振盪した後、−８０℃で３０分間凍結乾燥した。解凍後、１％ＳＤＳと１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加え、さらにプロテアーゼＫ（宝酒造（株））を０．５ｍｇ／ｍｌとなるように加えて、３７℃で６時間保温した。この処理液に１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、ＴＥ緩衝液という）で飽和したフェノール溶液を加えて除蛋白処理を行い、上清を得た。上清に冷エタノールを加えて生成した染色体ＤＮＡの沈殿を回収し、これを７０％エタノールに５分間浸した後、ＴＥ緩衝液に溶解した。この溶解液にＲＮａｓｅＡ（シグマ（株））を１０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃、２時間反応させた。反応液にフェノールを加えて再度、除蛋白処理を行い、冷エタノールを加えて生成した染色体ＤＮＡの沈殿を回収した。得られた精製染色体ＤＮＡを７０％エタノールに５分間浸した後、２ｍｇ／ｍｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解し、染色体ＤＮＡ溶液とした。
（ショットガンスクリーニング：マンノースイソメラーゼを発現する形質転換体の選択）
染色体ＤＮＡ溶液の１ｍｌをとり、これに制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを約４０単位加えて３７℃、１時間反応させて染色体ＤＮＡの部分加水分解物を得、アガロースゲル電気泳動法により、約５〜１０ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
別途、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、その０．１μｇと回収したＤＮＡ断片１μｇをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造（株））で連結し、組換えプラスミドを得た。これをコンピテントセル（Ｃｏｍｐｉｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（東洋紡績（株）））１００μｌに加え、氷冷下で３０分間静置した後、４２℃に加温し、ＳＯＣ培地（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭグルコース、ｐＨ７．５）を加えて３７℃、１時間、インキュベートし、組換えプラスミドを大腸菌に導入した。
アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地で形質転換株を選択した。形質転換株を、５０μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドおよび２５０μｇ／ｍｌのイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシドを含むＬＢ寒天培地（ｐＨ７．０）で３７℃、１８時間培養し、白色コロニーを選択した。得られた白色コロニーを、０．３％フラクトースと２．５ｍｇ／ｍｌリゾチームを含むグルコースＣＩＩ−テストワコー（和光純薬（株））に懸濁して、３７℃で一晩静置し、目視で顕著な赤色の発色があったコロニーを選別した。
得られた形質転換株がマンノースイソメラーゼを発現しているか否かを以下のようにして確認した。イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシドを２５０μｇ／ｍｌ、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含有するＬＢ培地に形質転換株を植菌し、３７℃で２４時間培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を回収し、２５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄した。１０ｍｌの同じリン酸緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕を行い、遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。この粗酵素液と２０％フラクトース溶液とを、５０℃で２４時間反応させ、ＨＰＬＣでマンノースの生成を確認した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
ポンプ機種：日本分光（株）製  ＰＵ−１５８０
カラム：資生堂（株）製  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＮＨ２  ＵＧ８０
検出器：昭和電工（株）製  ＲＩ−７１型示差屈折計
溶離液：アセトニトリル：水＝８０：２０
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
ＨＰＬＣの結果を図１に示す。図中、Ｆｒｕはフラクトースを、Ｍａｎはマンノースをそれぞれ表す。この形質転換株は、フラクトースからマンノースを生成すること、すなわちマンノースイソメラーゼ活性を有していることが確認され、１−４２−８株と命名した。
（推定マンノースイソメラーゼ遺伝子の取得と配列決定）
得られた形質転換体１−４２−８株を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃、２４時間培養した。遠心分離により菌体を採取し、アルカリ法により組換えプラスミドを菌体外に溶出させ、常法により精製し、分析したところ、組換えプラスミドは約１０ｋｂｐであり、約７ｋｂｐのＤＮＡ断片が導入されていた。この組換えプラスミドをｐＭＩ１４２８と命名した。組換えプラスミドｐＭＩ１４２８の制限酵素切断地図を図２に示す。図２においてＭＩは、マンノースイソメラーゼを表す。
組換えプラスミド（ｐＭＩ１４２８）をＰＣＲで増幅し、配列を決定した。ＰＣＲに用いた５’プライマーは配列番号２０の５’−ｇｃｃａａｇｃｇｃｇｃａａｔｔａａｃｃｃ−３’（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＭＣＳ５’）であり、３’プライマーは配列番号２１の５’−ｃａｔｇｃｔｃｇａｇｃｔａｔｔｇｇｃｃｇｃａｇａｇｃｇｃｃｔ−３’である。ｐＭＩ１４２８を１μｇ取り、これに前記プライマー０．０２μｇとビッグダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・エフエス・レディー・リアクションキット（パーキンエルマー・アプライド・バイオシステムズ（株））のプレミックス液８μｌをそれぞれ加えた後、さらに適量の水を加えて全量を２０μｌとした。この混合液をタカラ・サーマルサイクラー・ＭＰ型により９４℃で１０秒間、５０℃で５秒間、さらに６０℃で４分間反応を行った。これを２５回繰り返し、相補鎖ＤＮＡを含む反応物を得た。その後、セントリセップ・スピンカラム（パーキンエルマー・アプライド・バイオシステムズ（株））を用いて反応物を精製し、真空乾燥した。得られた粉状物にテンプレート・サプレッション・リエージェント（パーキンエルマー・アプライド・バイオシステムズ（株））を２０μｌ加えてよく混合し、９５℃で２分間加熱後、急冷したものをシーケンシングサンプルとした。これをＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０ジェネティックアナライザー（パーキンエルマー・アプライド・バイオシステムズ（株））を用いて解析した。
得られた約７．０ｋｂｐの配列データを解析し、蛋白質をコードする配列を含有する約１．５ｋｂｐの断片を取得した。この１．５ｋｂｐ断片のＤＮＡ配列は、配列番号１に示されている。この配列番号１の第３１４〜３１６番目のａｔｇが開始コドン、そして、第１５５９〜１５６１番目のｔａａが終止コドンと考えられる。従って、第３１４〜１５５８番目がマンノースイソメラーゼの構造遺伝子であり、配列番号２のアミノ酸配列を有していると推定される。そして、配列番号１の第３１３番目まではプロモーター領域と推定される。
（マンノースイソメラーゼ遺伝子の発現の確認）
配列番号１の第３１４〜３１６番目のａｔｇから始まるアミノ酸配列をコードする配列番号２２（５’−ａａａｇｇａｔｃｃｃａｔｇｃｃｃｇａａｇａｃｇａｔｃａｃａａ−３’）の配列を５’−プライマーとし、配列番号１の第１５５９〜１５６１番目の終止コドンを含む配列番号１９（Ｃ１：５’−ａａａａａｇｃｔｔｔｔａａｔａａｔｃｃｃｃｇｃｃｇｃｔｔｔ−３’）の配列を３’−プライマーとして、ｐＭＩ１４２８をテンプレートにして、上記と同様の条件でＰＣＲを行った。反応後ＤＮＡを回収し、制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。
このＤＮＡ０．１μｇと、予め制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）の０．１μｇとをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造（株））で連結し、組換えプラスミドを得た。この組換えプラスミドは、β−ガラクトシダーゼのＮ末端の３３アミノ酸がＮ末端に融合したマンノースイソメラーゼを発現する。
組換えプラスミドを上記のショットガンクローニングと同様の方法で大腸菌に導入し、得られた形質転換株をグルコースＣＩＩ−テストワコー（和光純薬（株））に懸濁して、３７℃で一晩静置し、目視で顕著な発色があったコロニーを選別し、マンノースイソメラーゼを生産することをＨＰＬＣで確認して、形質転換株を取得した。この結果、配列番号１の第３１４〜１５５８番目のＤＮＡ配列（すなわち、配列番号２の第２０〜４３４番目のアミノ酸配列）が、マンノースイソメラーゼ構造遺伝子であると推定された。
（実施例２：マンノースイソメラーゼのアミノ酸欠失、付加改変体の作成と活性発現）
以下のＮ１〜１６（配列番号３〜１８）を５’−プライマーとし、Ｃ１（配列番号１９）を３’−プライマーとして用いて、マンノースイソメラーゼ改変体を得た。
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Ｎ１〜Ｎ１６とＣ１とを組み合わせて、実施例１で得た染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲキットは、ＴａＫａＲＡ  ＥｘＴａｑ（宝酒造（株））である。ＰＣＲ反応条件は、９３℃で２分、９５℃で１分、５５℃で１分３０秒、７２℃で３分のサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で１５分間保温した。それぞれの反応液に冷エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させ、回収した。
プライマーＮ１（配列番号３）とＣ１（配列番号１９）を用いてＰＣＲを行い、発現ベクターｐＮ１Ｃ１を作成する例を、図３で説明する。アグロバクテリウム・ラディオバクターＭ３６株の染色体ＤＮＡ（１．５ｋｂｐ断片）をテンプレートとし、Ｎ１とＣ１とをプライマーとしてＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物を、まず制限酵素ＸｂａＩで切断し、ついでＳ１ヌクレアーゼを用いて末端を平滑化した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。
他方で、市販のベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア製）を、まずＮｃｏＩで切断し、Ｓ１ヌクレアーゼで平滑末端化し、ついで、ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。このＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するプラスミドに、上記得られたＰＣＲ産物のＨｉｎｄＩＩＩ断片を組み込み、発現ベクターｐＮ１Ｃ１を作成した。
同様の操作をＮ２〜Ｎ１６とＣ１のプライマーを組合せて用いて、それぞれの発現ベクターを作成した。これらの各発現ベクターからは、末端にメチオニンを有するポリペプチドが生じる。これらの発現ベクターを、それぞれ、前記と同様の方法でコンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（宝酒造（株））に導入し、形質転換体を得た。
得られたそれぞれの形質転換大腸菌は、前記グルコースＣＩＩ−テストワコー（和光純薬（株））に懸濁して、３７℃で一晩静置すると顕著な発色があり、ＨＰＬＣでマンノースを生産していることが確認された。表１に用いたプライマー、生じる発現ベクターおよびその発現ベクターで形質転換された大腸菌の命名、およびマンノースイソメラーゼの活性の有無、および生じるポリペプチドを一覧表にして示す。表１のポリペプチドの欄において、数字は配列番号２の配列のアミノ酸の番号を示し、Ｍｅｔ＋はその欄のポリペプチドのＮ末端にメチオニンが付加されていることを示す。なお、プラスミドを含有しないＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９は、マンノースイソメラーゼの活性を発現しなかった。
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以上から、配列表の配列番号２の、第２０〜４３４番目のアミノ酸配列が天然のマンノースイソメラーゼのポリペプチドと考えられるが、このＮ末端にアミノ酸を１９個付加した場合、および１４５個のアミノ酸をＮ末端から欠失させた場合、いずれもマンノースイソメラーゼ活性が発現した。従って、少なくとも第１６５〜４３４番目のアミノ酸配列があれば、マンノースイソメラーゼ活性は認められる。
（実施例３：マンノースイソメラーゼの点突然変異体の作成）
点突然変異は、配列番号２の第２０８番目のロイシンをバリンに変化させることにより行った。点突然変異は、Ｍｕｔａｎ−Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍキット（宝酒造（株））（以下、単に「変異キット」という）を用い、製造者の取扱説明書に従って行った。
図４〜７に基づいて、点突然変異体の作成を順に説明する。実施例２（図３）で得られた組換えＤＮＡ（発現ベクターｐＮ１Ｃ１）の５μｇを、図４に示すように、制限酵素ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動法により、約１．１ｋｂｐのＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片を回収した。他方、変異キット中のプラスミドｐＫＦ１８ｋを、制限酵素ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、その０．１μｇと、前記１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片１μｇとをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造（株））を用いて連結し、組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドをコンピテントセル（Ｃｏｍｐｉｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（東洋紡績（株）））１００μｌに加え、氷冷下で３０分間静置した後、４２℃に加温し、ＳＯＣ培地を加えて３７℃、１時間、インキュベートし、組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入した。ついで、カナマイシン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天培地で３７℃、１８時間培養し、形質転換株を選択した。得られた形質転換株を、カナマイシン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ液体培地で３７℃、１８時間培養し、菌体を遠心分離にて回収後、アルカリ法にて組換えＤＮＡを溶出させ、精製した。得られた組換えプラスミドをｐＫＦＮ１Ｃ１と命名した。
このｐＫＦＮ１Ｃ１は、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋｍ）にアンバー変異（ａｍ２）を有しており、ｐＫＦＮ１Ｃ１を導入されたサプレッサー＋のＥ．ｃｏｌｉは、カナマイシン耐性となるが、ｐＫＦＮ１Ｃ１を導入されたサプレッサー−のＥ．ｃｏｌｉは、カナマイシン感受性となる。
つぎに、変異導入プライマー  ５’−ｃｔｔｃｇｇｔｇａｃｇｔｇｃａｔａｔｔ−３’（配列番号２３：５’末端がリン酸化されている）を用いて、点突然変異の導入を行った。図５にその模式図を示す。図５に基づいて説明すると、まず、この変異導入プライマー５０ｐｍｏｌと変異キット中の選択プライマー５ｐｍｏｌとを０．１μｇのｐＫＦＮ１Ｃ１に加え、１００℃で３分間、熱変性させ、ついで氷中で５分間静置してアニーリングを行った。
なお、選択プライマーは、カナマイシン耐性遺伝子のアンバー変異を修復させる配列を有しており、変異導入プライマーとともにｐＫＦＮ１Ｃ１とアニールし、相補鎖を合成したときには、変異導入プライマー配列と選択プライマー配列とが同一ＤＮＡ鎖中になるように設計されている。
このアニールしたＤＮＡに、ＤＮＡリガーゼ６０単位とＤＮＡポリメラーゼ１単位とを加え、２５℃、２時間、組換えプラスミドの複製を行った。この操作により、図５（３）に示すような、変異導入プライマーの配列と選択プライマーの配列とを同時に有する配列とｐＫＦＮ１Ｃ１の配列のヘテロな二本鎖構造を有する組換えプラスミドが得られる。
この得られた組換えプラスミドを、ａｍ２サプレッサー遺伝子を有する（サプレッサー＋の）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳコンピテントセル（宝酒造（株））１００μｌに加えて、氷冷下、３０分静置した後、４２℃に加温し、ＳＯＣ培地を加えて３７℃、１時間、インキュベートした。ついで、カナマイシン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地で３７℃、１８時間培養し、生育してきた形質転換株を集め、常法によりＤＮＡを精製した。
得られたＤＮＡは、図６の（４）に示すような、点突然変異を有さず、かつ、カナマイシン遺伝子にアンバー変異を有するプラスミド（すなわち、ｐＫＦＮ１Ｃ１）と、点突然変異を有し、かつａｍ２変異が回復された（野生型の）カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＫＦＮ１Ｃ１ＬＶが主として含まれているＤＮＡ混合物と考えられる。
このプラスミドｐＫＦＮ１Ｃ１とプラスミドｐＫＦＮ１Ｃ１ＬＶとの混合物をＥ．ｃｏｌｉ  ＭＶ１１８４コンピテントセル（宝酒造（株））１００μｌに加えて、氷冷下、３０分静置した後、４２℃に加温し、ＳＯＣ培地を加えて３７℃、１時間、インキュベートした。ついで、カナマイシン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天培地で３７℃、１８時間培養し、生育してきた形質転換株を取得した。このＥ．ｃｏｌｉ  ＭＶ１１８４株はサプレッサー−であるので、プラスミドｐＫＦＮ１Ｃ１で形質転換された株は生育できないため、得られた形質転換株はプラスミドｐＫＦＮ１Ｃ１ＬＶを有する株である。
形質転換株を集め、ＤＮＡを精製して、ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を回収し、変異導入プライマーとＣ１プライマーを用いてＰＣＲを行い、実施例１に準じてＤＮＡ配列を決定した。プラスミドｐＫＦＮ１Ｃ１ＬＶは、図６（５）に示されるようなプラスミドであり、マンノースイソメラーゼ遺伝子部分には所望の変異以外に変異が導入されていないことが確認された。
ついで、目的の点突然変異が導入されたマンノースイソメラーゼを発現すプラスミドを構築した。図７にその模式図を示す。プラスミドｐＫＦＮ１Ｃ１ＬＶをＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、点突然変異を有するＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩのＤＮＡ断片を単離した。他方で、ｐＮ１Ｃ１をＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、高分子量のベクターＤＮＡ断片を取得した。１μｇの単離した点突然変異を有するＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩのＤＮＡ断片と、０．１μｇのＰＮ１Ｃ１のベクターＤＮＡ断片とをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造（株））を用いて連結し、組換えプラスミドを得た。この組換えプラスミドをコンピテントセル（Ｃｏｍｐｉｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（東洋紡績（株））１００μｌに加え、氷冷下で３０分間静置した後、４２℃に加温し、ＳＯＣ培地を加えて３７℃、１時間、インキュベートして、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入した。ついで、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天培地で３７℃、１８時間培養し、形質転換株を選択した。得られた形質転換株を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ液体培地で３７℃、１８時間培養し、菌体を遠心分離にて回収後、アルカリ法にて組換えＤＮＡを溶出させ、精製し、図７に示す構造であることを確認した。得られた組換えプラスミドをｐＮ１Ｃ１ＬＶと命名した。
このようにして得られた形質転換体のマンノースイソメラーゼ活性を、実施例１と同様にして測定した結果を表２に示す。
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表２に記載のように、変異型マンノースイソメラーゼ活性は野生型マンノースイソメラーゼとほぼ同等の活性を有していた。
（実施例４：マンノースイソメラーゼの精製およびＮ末端アミノ酸配列の決定）
（マンノースイソメラーゼの精製）
アグロバクテリウム・ラディオバクターＭ３６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２０６）からのマンノースイソメラーゼの精製およびＮ末端アミノ酸配列の決定を、以下のように行った。
２×ＬＢ液体培地（バクトトリプトン２％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム１％（ｐＨ７．０））１００ｍｌを、５００ｍｌバッフル付きマイヤーフラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブ殺菌した。これに、アグロバクテリウム・ラディオバクターＭ３６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２０６）を１白金耳植菌し、３０℃にて１６時間振盪培養して、種培養液とした。
容量５リットルのファーメンターに、種培養の場合と同じ組成の培地約３リットルを入れて滅菌した。温度を３０℃にした後、これに種培養液３ｖ／ｖ％を接種し、３０℃、ｐＨ７．０に保持しながら２４時間通気撹拌培養し、遠心分離によって菌体を回収した。
回収した菌体を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄した後、この緩衝液に懸濁した。この懸濁液を、ガラスビーズを用いて破砕し、遠心分離によって破砕された菌体を除去して、上清を得た。この上清に、硫酸アンモニウムを４０％〜６０％の飽和溶液になるように溶解し、生じた蛋白質の沈殿を遠心分離によって回収した。回収した蛋白質を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した後、この緩衝液に対して透析を行って、粗酵素を得た。
粗酵素を、イオン交換クロマトグラフィーによって、以下のように部分精製した。すなわち、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）によって平衡化したＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（東ソー（株））を詰めたカラムに、粗酵素を添加して、５カラム容量の０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌの上昇濃度勾配によって溶出し、分画分取した。活性のある画分を合わせ、濃縮し、脱塩して、部分精製酵素液を得た。
ついで、この部分精製酵素液に対して以下のように疎水クロマトグラフィーを行った。０．７５Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）によって平衡化したＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＰＨＥ（アマシャム・ファルマシア（株））疎水カラムに、部分精製酵素液を添加して、２０カラム容量の０．７５Ｍ〜０Ｍ硫酸アンモニウム溶液の下降濃度勾配によって溶出し、分画分取した。活性のある画分を合わせて、濃縮し、脱塩し、さらに部分精製した酵素を得た。
さらに、イオン交換クロマトグラフィーを以下のように行うことによって、精製酵素を得た。０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）によって平衡化したＭｏｎｏＱ  ＨＲ  １０／１０（アマシャム・ファルマシア（株））カラムに、部分精製酵素を添加し、２０カラム容量の０．２〜０．４Ｍ  ＮａＣｌの上昇濃度勾配によって溶出し、分画分取した。活性のある画分を回収して精製酵素とし、電気泳動によってその純度を調べた。
得られた精製酵素について、常法に従ってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動および等電点電気泳動を行った。ゲルをクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色したところ、いずれの電気泳動においても一本のバンドのみを検出し、精製酵素が単一の蛋白質であることを確認した。これを、精製マンノースイソメラーゼ酵素液とし、Ｎ末端アミノ酸配列分析の試料とした。
（Ｎ末端アミノ酸配列の決定）
得られた精製マンノースイソメラーゼ酵素液を使用して、常法に従ってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ＰＶＤＦ膜に蛋白質を転写後、ＣＢＢによって染色して蛋白質のバンドを切り出した。これを、常法に従って、気相プロテインシークエンサーＰＩ−２０２０（東ソー（株）製）を使用して分析した。その結果、精製マンノースイソメラーゼは、Ｎ末端に配列番号２の第２０〜２４番目に示すアミノ酸配列、すなわち、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐを有していた。
産業上の利用可能性
本発明のマンノースイソメラーゼのポリペプチドは、耐熱性、変換効率に優れている。このポリペプチドの遺伝子配列を提供することにより、種々のマンノースイソメラーゼ改変体が、安価に、大量に得られるため、マンノースが安価に生産される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、マンノースの生成を示すＨＰＬＣである。
図２は、プラスミドｐＭＩ１４２８の制限酵素地図を示す図である。
図３は、発現ベクターｐＮ１Ｃ１作成の模式図である。
図４は、点突然変異体の作成の模式図である。
図５は、点突然変異体の作成の模式図である。
図６は、点突然変異体の作成の模式図である。
図７は、点突然変異体の作成の模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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