(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２価の陽イオンを吸着出来る交換基を有した不溶性担体を充填したカラムを用いてリポ蛋白質を分析する方法において、
前記カラムを少なくとも２価の陽イオン濃度が１００ｍＭ以下である溶液で平衡化し、
カラム体積に対して１０％以下の試料を導入し、
リポ蛋白質を前記２価の陽イオン存在下でカラムに吸着させ、
１種類以上の溶液で、少なくとも高密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、超低密度リポ蛋白質を分離溶出させ、
分離したリポ蛋白質を測定する、リポ蛋白質分析方法であって、
低密度リポ蛋白質画分中に高吸着画分のピーク頂点が認められれば、脂質代謝異常患者に由来する試料であると分析する、前記分析方法。
【請求項２】
２価の陽イオンを吸着出来る交換基を有した不溶性担体を充填したカラムを用いてリポ蛋白質を分析する方法において、
前記カラムを少なくとも２価の陽イオン濃度が１００ｍＭ以下である溶液で平衡化し、
カラム体積に対して１０％以下の試料を導入し、
リポ蛋白質を前記２価の陽イオン存在下でカラムに吸着させ、
１種類以上の溶液で、少なくとも高密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、超低密度リポ蛋白質を分離溶出させ、
分離したリポ蛋白質を測定する、リポ蛋白質分析方法であって、
低密度リポ蛋白質画分のピーク頂点より早く溶出する画分の面積と、
ピーク頂点より遅く溶出する画分の面積との差又は比を測定し、
健常人試料の該差又は該比と比べて大きい場合、脂質代謝異常患者に由来する試料であると分析する、前記分析方法。
【請求項３】
２価の陽イオンを吸着出来る交換基を有した不溶性担体を充填したカラムを用いてリポ蛋白質を分析する方法において、
前記カラムを少なくとも２価の陽イオン濃度が１００ｍＭ以下である溶液で平衡化し、
カラム体積に対して１０％以下の試料を導入し、
リポ蛋白質を前記２価の陽イオン存在下でカラムに吸着させ、
１種類以上の溶液で、少なくとも高密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、超低密度リポ蛋白質を分離溶出させ、
分離したリポ蛋白質を測定する、リポ蛋白質分析方法であって、
低密度リポ蛋白質が溶出する時間の間に位置する一個所以上の時間点で低密度リポ蛋白質画分のピークを区切り、区切られた二個以上の画分の面積を測定し、
高吸着画分を多く含む画分の面積値又は高吸着画分を多く含む画分の面積とそれ以外の画分との面積比が健常人試料よりも大きい場合、脂質代謝異常患者に由来する試料であると分析する、前記分析方法。
【請求項４】
２価の陽イオンを吸着出来る交換基を有した不溶性担体を充填したカラムを用いてリポ蛋白質を分析する方法において、
前記カラムを少なくとも２価の陽イオン濃度が１００ｍＭ以下である溶液で平衡化し、
カラム体積に対して１０％以下の試料を導入し、
リポ蛋白質を前記２価の陽イオン存在下でカラムに吸着させ、
１種類以上の溶液で、少なくとも高密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、超低密度リポ蛋白質を分離溶出させ、
分離したリポ蛋白質を測定する、リポ蛋白質分析方法であって、
低密度リポ蛋白質画分のうち低吸着画分のピーク幅の値又はピーク面積をピーク高さで割った値を測定し、その値が健常人試料の値と比べて大きい場合、脂質代謝異常患者に由来する試料であると分析する、前記分析方法。
【請求項５】
２価の陽イオンを吸着出来る交換基を有した不溶性担体を充填したカラムを用いてリポ蛋白質を分析する方法において、
前記カラムを少なくとも２価の陽イオン濃度が１００ｍＭ以下である溶液で平衡化し、
カラム体積に対して１０％以下の試料を導入し、
リポ蛋白質を前記２価の陽イオン存在下でカラムに吸着させ、
１種類以上の溶液で、少なくとも高密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、超低密度リポ蛋白質を分離溶出させ、
分離したリポ蛋白質を測定する、リポ蛋白質分析方法であって、
超低密度リポ蛋白質画分中に高吸着画分のピーク頂点が認められれば、脂質代謝異常患者に由来する試料であると分析する、前記分析方法。
【請求項６】
２価の陽イオンを吸着出来る交換基を有した不溶性担体を充填したカラムを用いてリポ蛋白質を分析する方法において、
前記カラムを少なくとも２価の陽イオン濃度が１００ｍＭ以下である溶液で平衡化し、
カラム体積に対して１０％以下の試料を導入し、
リポ蛋白質を前記２価の陽イオン存在下でカラムに吸着させ、
１種類以上の溶液で、少なくとも高密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、超低密度リポ蛋白質を分離溶出させ、
分離したリポ蛋白質を測定する、リポ蛋白質分析方法であって、
超低密度リポ蛋白質画分のピーク頂点より早く溶出する画分の面積と、
ピーク頂点より遅く溶出する画分の面積との差又は比を測定し、
健常人試料の該差又は該比と比べて大きい場合、脂質代謝異常患者に由来する試料であると分析する、前記分析方法。
【請求項７】
２価の陽イオンを吸着出来る交換基を有した不溶性担体を充填したカラムを用いてリポ蛋白質を分析する方法において、
前記カラムを少なくとも２価の陽イオン濃度が１００ｍＭ以下である溶液で平衡化し、
カラム体積に対して１０％以下の試料を導入し、
リポ蛋白質を前記２価の陽イオン存在下でカラムに吸着させ、
１種類以上の溶液で、少なくとも高密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、超低密度リポ蛋白質を分離溶出させ、
分離したリポ蛋白質を測定する、リポ蛋白質分析方法であって、
超低密度リポ蛋白質成分の溶出する時間の間に位置する一個所以上の時間点で超低密度リポ蛋白質画分のピークを区切り、区切られた二個以上の画分の面積を測定し、
高吸着画分を多く含む画分の面積値又は高吸着画分を多く含む画分の面積とそれ以外の画分との面積比が健常人試料よりも大きい場合、脂質代謝異常患者に由来する試料であると分析する、前記分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、組織抽出液、血清、血漿などの試料中に含まれるリポ蛋白質の分析方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リポ蛋白質は、コレステロール、トリグリセライド（中性脂肪）、リン脂質、ビタミンＥ、そしてアポ蛋白質等が会合した複合体である。リポ蛋白質はその粒子径や含有されるアポ蛋白質の種類により、高密度リポ蛋白質（以下「ＨＤＬ」と記載する）、低密度リポ蛋白質（以下「ＬＤＬ」と記載する）、超低密度リポ蛋白質（以下「ＶＬＤＬ」と記載する）、カイロミクロン（以下「ＣＭ」と記載する）に分類されている。そして近年では、これらに加え、中間型リポ蛋白質（以下「ＩＤＬ」と記載する）の存在も明らかになっている。ヒト血清中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬのそれぞれに含まれるコレステロール、トリグリセライド（中性脂肪）、リン脂質の含有量と、虚血性心疾患、肝疾患、糖尿病等の疾病や糖質代謝異常とが関連することが知られており、これらを分析することは、臨床診断上重要である。
【０００３】
ＩＤＬは、ＶＬＤＬがＬＤＬに代謝される過程で生じるＶＬＤＬレムナントを初めとする中間体が主要成分と考えられており、ＣＭがリポ蛋白リパーゼの働きにより水解され比重が増加するとＩＤＬ画分に含まれるようになるとの報告がある（多田紀夫、高脂血症（南江堂）、ｐ２０９、１９９１年）。またＩＤＬは健常人では見られないリポ蛋白質であり、冠動脈疾患の進展を反映するとの報告もなされており、その分析が臨床診断上重要になりつつある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
リポ蛋白質を分析するには、ＣＭ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬを分離することが重要である。しかしながらＣＭ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ及びＨＤＬの比重はそれぞれ０．９３０ｇ／ｍＬ以下、０．９３０から１．００６ｇ／ｍＬ、１．００６から１．０１９ｇ／ｍＬ、１．０１９から１．０６３ｇ／ｍＬ、１．０６３から１．２１０ｇ／ｍＬと近似しており、またその直径もそれぞれ７５から１２００ｎｍ、３０から８０ｎｍ、２５から３５ｎｍ、１８から２５ｎｍ、９から１２ｎｍである（Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２８、ｐ１０、１９８６年）ため、これらを分離するのは困難であったり、可能であったとしても複雑な操作や特殊な装置が必要であった。
【０００５】
実際に超遠心分離装置、ゲルろ過クロマトグラフィー、電気泳動、通常の陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる分離が報告されている。超遠心分離法では、遠心分離後の試料の入ったチューブの底からペリスターポンプで試料を抜き取り、オンラインでコレステロール酵素液を混合し、反応し、検出する方法により、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬを分離検出することが出来る（Ｂｙｕｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２８、ｐ１８１、１９８６年）ものの、超遠心分離器が必須で、分離自体に時間を要するため、当然に迅速分析が出来ないという課題がある。
【０００６】
アガロースゲル電気泳動及びセルロースアセテート膜電気泳動では、ＨＤＬ、ＬＤＬ及びＶＬＤＬは分離可能であるが、ＬＤＬとＩＤＬ、ＩＤＬとＶＬＤＬの分離は出来ず、この結果ＩＤＬの分析を実施し得ないという課題がある。アクリルアミドゲルディスク電気泳動では、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ及びＶＬＤＬを分離することは可能であるが、ディスクの調整に時間がかかり、しかも該ディスクは使い捨てで、一回の操作で分離可能な量には限りがあり、更には定量が困難であるという課題がある。
【０００７】
ゲルろ過カラムによる分離法については、ＣＭ、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及びＨＤＬを分離し得るという報告（Ｏｋａｚａｋｉら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ（ＡＡＣＣ）、ｐ５３１、１９９７年）はあるが、ＩＤＬを分離可能な方法は報告されていない。一方、陰イオン交換カラムによる分離法では、表面が親水性に富んだリポ蛋白質に対してダメージを最低限に押さえたゲル担体にジエチルアミノエチル基を導入したカラムを用いた報告（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ、７１６、ｐ５７、１９９８年）があるが、ＩＤＬの分離については報告されていない。
【０００８】
先に本願出願人は、２価の陽イオンを吸着出来る交換基を有した不溶性担体を充填したカラムを用いてリポ蛋白質を分析する方法において、前記カラムを少なくとも２価の陽イオン濃度が１００ｍＭ以下である溶液で平衡化し、カラム体積に対して１０％以下の試料を導入し、リポ蛋白質を前記２価の陽イオン存在下でカラムに吸着させ、1種類以上の溶液で、少なくとも高密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、そして超低密度リポ蛋白質を溶出させることで、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬを分離し分析可能で、脂質代謝異常（高脂血症）患者に由来する血清試料をこの方法で分離すると、ＬＤＬ画分について溶出時間の遅い高吸着画分（ＬＤＬ成分中の高吸着画分）に健常人に由来する血清試料には認められないピークが出現することや、脂質代謝異常患者に由来する血清試料は、健常人に由来する血清試料とは異なる、区別可能なクロマトグラムプロファイルを示すこと等を知見した（特願平２０００−３２７６８号、及び、特願２０００−７２４９２号）。そして今回、本願出願人の更なる研究により、前記出願において分離・溶出されていたＬＤＬ画分の溶出時間の遅い高吸着画分（ＬＤＬ成分中の高吸着画分）がＩＤＬであることが確認され（従って先の出願においてＬＤＬ低吸着画分として記載していたものはＬＤＬである）、同時に、２価の陽イオンを吸着出来る交換基として硫酸基を有し、かつ、径が５００ｎｍ以上又は１８ｎｍ以下の細孔を有するか、或いは細孔を有していない不溶性担体を用いた場合はＩＤＬの分離を更に良好にし得ることを新たに知見した。
【０００９】
このように本願発明の第１の構成は、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ及び／又はＶＬＤＬを通常の液体クロマトグラフィー装置を用いて分離し測定することを含むリポ蛋白質の分析方法を提供するものである。そして本願発明の第２の構成は、試料中に存在するＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ及び／又はＶＬＤＬを通常の液体クロマトグラフィー装置を用いて分離することを含むこれらリポ蛋白質画分の製造方法を提供するものである。前者は高脂血症等脂質代謝異常の診断や治療経過の観察を容易にするものであり、後者は前記各画分に含まれる分子種に特異的な抗体の製造や、いわゆる標準物質の製造を可能にする効果を通して高脂血症等の脂質代謝異常発生メカニズムや脂質代謝異常を検知するための新たな診断法を開発・確立するために有用である。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本願請求項１の発明は、２価の陽イオンを吸着出来る交換基を有した不溶性担体を充填したカラムを用いてリポ蛋白質を分析する方法において、前記カラムを少なくとも２価の陽イオン濃度が１００ｍＭ以下である溶液で平衡化し、カラム体積に対して１０％以下の試料を導入し、リポ蛋白質を前記２価の陽イオン存在下でカラムに吸着させ、1種類以上の溶液で、少なくともＨＤＬ、ＬＤＬ、そしてＶＬＤＬを分離溶出させ、そして、分離したリポ蛋白質を測定する、リポ蛋白質分析方法である。本願請求項２の発明は、請求項１の発明に係り、少なくともＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、そしてＶＬＤＬを分離溶出させ、そして分離したリポ蛋白質を測定することを特徴とする。
【００１１】
本願請求項３の発明は請求項１の発明に係り、ＬＤＬ成分中の低吸着画分のピーク頂点より早く溶出する画分の面積と、高吸着画分、即ちＩＤＬを含む低吸着画分のピーク頂点より遅く溶出する画分の面積との差又は比を測定することを特徴とする。本願請求項４の発明は請求項１の発明に係り、ＬＤＬ成分の溶出する時間の間に位置する一個所以上の時間で、ＬＤＬ画分を区切ることにより得られる二個以上の画分の面積を測定することを特徴とする。本願請求項５の発明は請求項４の発明に係り、ＬＤＬ成分中の低吸着画分のピーク幅又は面積と高さの比を測定することを特徴とする。本願請求項６の発明は請求項１の発明に係り、ＶＬＤＬ成分中の低吸着画分のピーク頂点より早く溶出する画分の面積と、高吸着画分を含む低吸着画分のピーク頂点より遅く溶出する画分の面積との差又は比を測定することを特徴とする。本願請求項７の発明は請求項６の発明に係り、ＶＬＤＬ成分の溶出する時間の間に位置する一個所以上の時間で、ＶＬＤＬ画分を区切ることにより得られた二個以上の画分の面積を測定することを特徴とする。
【００１２】
本願請求項８の発明は請求項１の発明に係り、２価の陽イオンを吸着出来る交換基が硫酸基、リン酸基、ほう酸基又は２価陽イオンとキレート結合する化合物であることを特徴とする。本願請求項９の発明は請求項１の発明に係り、リポ蛋白質を吸着させる際に共存させる前記２価の陽イオンがマグネシウムイオン、カルシウムイオン、バリウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉛イオン又は亜鉛イオンであることを特徴とする。
【００１３】
本願請求項１０の発明は請求項１の発明に係り、カラムに吸着した各リポ蛋白質を分離溶出が塩濃度のステップグラジエント、リニアグラディエント、コンベックスグラディエント及び／又はコーンケーブグラディエントより行われることを特徴とする。本願請求項１１の発明は請求項１の発明に係り、２価の陽イオンを吸着出来る交換基を有した不溶性担体が、径が５００ｎｍ以上又は１８ｎｍ以下の細孔を有するか、或いは細孔を有していないものであることを特徴とする。
【００１４】
そして本願請求項１２の発明は、２価の陽イオンを吸着出来る交換基を有した不溶性担体を充填したカラムを用いてリポ蛋白質を分析する方法において、前記カラムを少なくとも２価の陽イオン濃度が１００ｍＭ以下である溶液で平衡化し、カラム体積に対して１０％以下の試料を導入し、リポ蛋白質を前記２価の陽イオン存在下でカラムに吸着させ、1種類以上の溶液で分離溶出させることからなる、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ及び／又はＶＬＤＬ画分の製造方法である。以下、本願発明を詳細に説明する。
【００１５】
本願発明では、マイナスチャージのリポ蛋白質をカラムに吸着させる際に、２価の陽イオンを間においた形でマイナスチャージの交換基をもつ不溶性担体に吸着させ、必要以上にリポ蛋白質と不溶性担体とを強固に吸着させないようにするため、結果的にリポ蛋白質の構造に与えるダメージを抑制し、安定したリポ蛋白質の分離を達成するものである。２価の陽イオンを吸着出来る交換基を有した不溶性担体としては、硫酸基、リン酸基、ほう酸基などを有した担体、また、２価陽イオンとキレート吸着する化合物を吸着した担体等が例示できる。中でも硫酸基を有する不溶性担体を使用すると、ＩＤＬ成分を他の成分から良好に分離可能となる。不溶性担体は、分離に供する試料中のリポ蛋白質の量を推定したうえで、これを十分に吸着し得るイオン交換容量となるようにカラム等に充填して使用する。なお不溶性担体を充填するカラムは、通常の、円柱状の液体クロマトグラフ用のもの等を利用できるが、これに制限されるものではない。
【００１６】
不溶性担体としては、シリカ系、ポリマー系等、特に制限なく使用することができるが、リポ蛋白質各成分の良好な分離を実現するためには形状が球形で、かつ、直径が１から１００ミクロン程度のものが好ましい。ところで、本願発明はイオン交換クロマトグラフィーの原理によってこれらを分離・溶出させるものであり、溶離液中のイオン強度を徐々に高めることでＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬを連続的に溶出できる。ところが、リポ蛋白質の粒子径はＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬの順に大きくなることから、不溶性担体が１００ｎｍ程度の細孔を有する多孔性担体であると、サイズ排除クロマトグラフィーの原理によってリポ蛋白質は粒子径の大きい順（ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）に分離、溶出されるが、ここでＬＤＬ、ＩＤＬ及びＶＬＤＬを完全に分離することは困難であることから、本願発明においてはかかるサイズ排除クロマトグラフィーの原理が作用しない、径が５００ｎｍ以上又は１８ｎｍ以下の細孔を有する担体を使用することが好ましく、特に好ましくは細孔を有していない担体を使用する。１００ｎｍ程度の細孔を有する担体を使用する場合には、上記したサイズ排除クロマトグラフィー的な作用が弱くなるように、例えば担体あたりのイオン交換基の数（量）を多くし、かつ、カラムの体積を小さくする等すれば良い。
【００１７】
前記した硫酸基を有する不溶性担体としては、例えば市販のスルホプロピル基を持つポリマー系のＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−ＮＰＲ、同ＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−５ＰＷ（いずれも商品名、東ソー（株）製、前者は細孔を有しない担体である）等を例示できるが、ヘパリンやデキストラン硫酸等の硫酸基を有した物質を不溶性担体に結合して調製することもできる。２価陽イオンとキレート結合する化合物を結合した担体としては、例えばイミジノ酢酸を結合した担体を例示できるが、市販のものとしてＴＳＫｇｅｌ  Ｃｈｅｌａｔｅ−５ＰＷ（商品名、東ソー（株）製）等を例示できる。ほう酸基を有した担体としては、例えばアミノフェニルボロン酸を結合した担体を例示できるが、市販のものとしてＴＳＫｇｅｌ  Ｂｏｒｏｎａｔｅ−５ＰＷ（商品名、東ソー（株）製）等を例示できる。
【００１８】
２価の陽イオンを吸着出来る交換基を有した不溶性担体を充填したカラムは、１００ｍＭ以下、好ましくは１から１０ｍＭ程度の２価陽イオンを含んだ溶液で平衡化し、前記交換基にイオンを配位させた状態にしておく。また、１００ｍＭ以上の２価の陽イオンを含んだ溶液をカラムに導入し、交換基にイオンを配位させた後、２価の陽イオンを含まず、かつ、他の塩の濃度も１０ｍＭ以下と低い濃度の溶液で平衡化しても良い。この場合には、平衡化後、直ちに試料を導入することが好ましい。平衡化後、交換基に配位したイオンが徐々にはずれてしまうからである。この平衡化に用いる２価陽イオンとしては、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、バリウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉛イオン、亜鉛イオン等を例示できる。この溶液には緩衝作用を持たせることが好ましく、そのｐＨはリポ蛋白質が安定な６．５から８．５が適当である。かかる緩衝作用は、従来常用されている種々の緩衝剤を利用することにより、前記溶液に付与することができる。このように、カラムを平衡化する溶液は、中性から弱アルカリ性のｐＨを有することが好ましいことから、このようなｐＨ範囲での溶解度が高い、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、バリウムイオンを使用することが特に好ましい。
【００１９】
上記２価の陽イオンは、複数イオンを混合しても良いが、再現性を高めるためには１種類のイオンを用いることが好ましい。このカラムの平衡化は、上記したようにカラムへの試料の導入に先だって行えば良いが、後述するように、試料の導入と同時、即ち試料を導入する際の溶液として上記のような溶液を用いることでカラムの平衡化と試料の導入を同時に行うようにしても良い。なお、カラムの平衡化において、２価の陽イオン濃度が１００ｍＭを越える溶液を使用すると、試料中のリポ蛋白質が担体に速やかに吸着しないために、その後の分離が不十分となって、各リポ蛋白質の正確な分析が困難になる場合があるため、注意が必要である。
【００２０】
カラムの平衡化と同時に、あるいは、カラムの平衡化の後に、カラムに試料を導入し、不溶性担体にリポ蛋白質を吸着させる。リポ蛋白質の吸着は、２価陽イオンの存在下で行うが、その２価陽イオンは前記平衡化の際に使用したイオンである。むろん、カラム平衡化の後に、いったんイオンの置換を行うことも可能ではあるが、迅速な分析の実施という観点から実務的ではない。また試料の導入は、カラムの平衡化、即ち２価陽イオンをカラムに導入してイオンを吸着出来る交換基に２価陽イオンを配位・吸着させた状態とする作業と同時に行うこともできる。この場合、リポ蛋白質を含む試料をあらかじめ２価陽イオンを含んだ溶液を加えた後、これをカラムに導入する。
【００２１】
カラムに導入する試料は、カラム体積に対して１０％（ｖ／ｖ）以下とする。これを越える量の試料をカラムに導入すると、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ及び／又はＶＬＤＬを溶出させるときに、各リポ蛋白質の溶出画分が重複してしまい、これらの分離が不十分となって、各リポ蛋白質の正確な分析が困難になる。
【００２２】
不溶性担体に吸着したリポ蛋白質の分離溶出は、カラム内の溶液のイオン強度を増加させて担体とリポ蛋白質の吸着を乖離させることにより行うか、カラムの平衡化に用いた溶液と同一のイオン強度液をカラムに導入し続けることにより行う。後者は、リポ蛋白質の分離溶出のための溶液を必要としないという利点があるが、反面、リポ蛋白質の分離溶出に時間がかかり、更にはカラム容量と導入した試料の量によってはリポ蛋白質の分離が不十分となる可能性があるため、前者を実施することが好ましい。
【００２３】
上記のためには、例えばＮａＣｌやＮａＮＯ3等の塩を高濃度で含む溶液や、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、バリウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉛イオン又は亜鉛イオン等の２価の陽イオンを高濃度で含む溶液を使用することが例示できる。これらは２種以上を組み合わせて使用することも可能であるが、特に２価の陽イオンを含む溶液を使用する場合は、カラムの平衡化で使用したのと同一のイオンを含む溶液を使用することが好ましい。またこの溶液には緩衝作用を持たせることが好ましく、そのｐＨはリポ蛋白質が安定な６．５から８．５が適当である。従って、通常は、カラムを平衡化する際に使用した溶液と同一のｐＨとすることが好ましい。かかる緩衝作用は、従来常用されている種々の緩衝剤を利用することにより、前記溶液に付与することができる。また、２価の陽イオンを高濃度で含む溶液を使用する場合には、中性から弱アルカリ性のｐＨで溶解度が高いマグネシウムイオン、カルシウムイオン、バリウムイオンを使用することが特に好ましい。
【００２４】
Ｎａｃｌ等の塩溶液を用いる場合、あるいは、２価の陽イオンを含む溶液を使用する場合のいずれの場合でも、リポ蛋白質の溶出にあたっては、溶液中のイオン強度徐々に高めることにより、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬを連続的に分離溶出することが可能となり、より短時間でのリポ蛋白質分析が可能になる。これは、例えば塩濃度を５から５００ｍＭの範囲で連続的又は段階的に上昇させたり、例えば２価の陽イオン濃度（実際は、溶液中で２価の陽イオンを生成する物質の濃度）を５から５００ｍＭの範囲で連続的又は段階的に上昇するで実施できる。
【００２５】
塩濃度や２価の陽イオン濃度の上げ方としては、段階的にこれらの濃度を上げるステップグラディエント、直線的に塩濃度を上げるリニアグラディエント、徐々に一定時間における塩濃度の上げ幅を小さくしていくコンベックスグラディエント又は徐々に一定時間における塩濃度の上げ幅を大きくしていくコーンケーブグラディエントを例示することができ、更にはこれら２つ以上の方法を組み合わせたグラディエントのいずれでも良い。ＬＤＬからＶＬＤＬの溶出をゆっくりと行うことにより、ＬＤＬからＶＬＤＬにかけての分布も確認することが出来る。迅速かつ正確なリポ蛋白質の分析を行うために好適なグラジエントとして、２０分間で、１００から５００ｍＭまで塩濃度を上げるグラディエントや、２０分間で、１００から４００ｍＭまで２価の陽イオン濃度を上げるグラディエントを好ましい例として例示できる。
【００２６】
脂質代謝異常（高脂血症）患者の血清を分離すると、ＬＤＬ画分について溶出時間の遅い高吸着画分に健常人由来血清では認められないピークが出現する。これがＩＤＬ画分である。本願発明において、例えば硫酸基を有し、かつ、細孔を有しない担体を使用するなどしてリポ蛋白質の分離が最も良好な状態で行えば、このＩＤＬの画分をＬＤＬ及びＶＬＤＬの画分とより明確に分離することが可能である。ＩＤＬは、高脂血症や動脈硬化等の脂質代謝異常を反映するＬＤＬ分子種の一つであるが、この画分を分離溶出するために特に好適な条件は、ステップグラディエントの場合には１５０ｍＭから２５０ｍＭの塩濃度範囲での、リニアグラディエントの場合は１５から３０分間程度かけての１００から３００ｍＭの塩濃度範囲での溶出である。ＶＬＤＬ画分を分離溶出するために特に好適な条件は、ステップグラディエントの場合には３００ｍＭから４００ｍＭの塩濃度範囲での、リニアグラディエントの場合は２０分間程度かけての３００から４００ｍＭの塩濃度範囲での溶出である。従って本願発明を実施する場合には、分離・溶出させようとする対象成分を考えて塩濃度の範囲、塩濃度の上げ方並びに塩濃度を上げるための時間等の諸条件を予備的実験を行う等して決定しておくことが好ましい。
【００２７】
本願発明のようなカラムクロマトグラフィーによる分析方法は、１回の分析を短時間かつ簡便に実施し得るという迅速性・容易性に加えて、同一又は異なる複数の試料を連続的に分析し得るという連続実施可能性を有している。本願発明においても、迅速性・容易性に加え、同一又は異なる複数の試料を連続的に分析可能である。連続分析を行う場合には、リポ蛋白質の溶出に際して、カラムの平衡化に用いたのと同一で、より高濃度の２価イオンを含む溶液を使用するか、あるいは、グラディエントにて、最終的により高濃度の２価陽イオン濃度となるようにすることが好ましい。最終的に高濃度の２価陽イオンを含む溶液でリポ蛋白質を分離溶出させると、再度カラムを平衡化するのに要する時間を短縮でき、結果として次の試料導入までに要する時間を短縮できるからである。
【００２８】
カラムから分離溶出されたリポ蛋白質を含む溶出液に対して、既存の測定を実施することで、試料中に存在するＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ各々の量（濃度）を分析することができる。具体的には、リポ蛋白質の構成成分であるコレステロール、トリグリセライド（中性脂肪）、リン脂質、アポ蛋白質等に着目し、これらのいずれか１つ以上に特異的な酵素を用いて測定することが例示できる。より具体的に、コレステロールは、コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼに反応させ、発生する過酸化水素の量を測定する方法、トリグリセライド（中性脂肪）は、リポプロテインリパーゼとリポプロテインオキシダーゼに反応させ、発生する過酸化水素の量を測定する方法、リン脂質は、ホスホリパーゼとコリンオキシダーゼに反応させ発生する過酸化水素の量を測定する方法等が例示できる。
【００２９】
上記測定は、酵素試薬を使用することにより、容易に実施できる。例えばコレステロールの測定にはデタミナーＬＴＣ（商品名、協和メディクス（株）製）、コレスカラーリキッド（商品名、東洋紡（株）製）、ピュアオートＳ  ＣＨＯ−Ｎ（商品名、第一化学薬品（株）製）、そして、コレステロールＥテストワコー（商品名、和光純薬（株）製）が、トリグリセライドの測定にはデタミナーＴＧ（商品名、協和メディクス（株）製）、ピュアオートＳ  ＴＧ−Ｎ（商品名、第一化学薬品（株）製）、そしてトリグリセライドＥテストワコー（商品名、和光純薬（株）製）が、リン脂質の測定にはデタミナーＰＬ（商品名、協和メディクス（株）製）、そしてリン脂質テストワコー（商品名、和光純薬（株）製）等が例示できる。また、上記のような酵素を固定化した膜を過酸化水素電極上に設置した酵素センサー等を使用することもできる。またリン脂質については、その存在下で蛍光を発する試薬（ｃｉｓ−パリナリン酸；商品名、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．製）等を利用して測定することもできる。
【００３０】
上記のような酵素試薬を用いてリポ蛋白質の測定を行う場合には、カラムで分離され溶出した各画分と酵素試薬（酵素液）との反応に最適な混合比はおのずと決まっていることから、溶出液の全てを反応に供する必要はなく、カラムの後の流路に分岐路を設けて溶出液の一部のみを反応に供すれば、測定に要する時間はそのままで、測定に要する酵素試薬の量を軽減することができる。なお、カラムで分離され溶出した溶出液を光散乱光度計で測定すれば、各リポ蛋白質の濃度及び分子量の両方を一度に分析することも可能である。
【００３１】
本願発明は、試料を導入する試料注入部、導入された試料中のリポ蛋白質を吸着分離する硫酸基などの２価の陽イオンを吸着出来る交換基を有した水不溶性担体を充填したカラム、分離溶出したリポ蛋白質を分析する分析系を有した検出部、リポ蛋白質をカラムに吸着させるために必要な２価陽イオンを含んだ溶液の容器、その溶液をカラムに送液するポンプ、を含む装置により実施できる。ここで好ましくは、複数の試料をセットすることにより、一定時間ごとに一定量の試料を自動的に導入する試料注入部を含んだオートサンプラーや、２価陽イオンを低濃度含む溶液と高濃度含む溶液の２種類の溶液を有し、それぞれの溶液を指定した流量で流すことが出来るポンプ、２つのポンプ出口の流路を結合させたうえで２種類の溶液を均一にする混合部、試料注入部、２価の陽イオンを吸着出来る交換基を有した担体を充填したカラム、そして検出部をこの順に連結すれば、ポンプの流速を制御して２種類の溶液を指定した比率で導入してグラディエントを発生させるとともに、複数の試料を自動的に分析する装置を提供できる。また１台のポンプを用いる場合であっても、２価陽イオン濃度の異なる２から４種類の溶液を用い、それぞれの流路に電磁弁を配置し、ポンプ入口側で流路を結合させ１本の流路としポンプ入口に結合し、ポンプ出口側の流路を、試料注入部、カラム、検出部へと順に連結した装置であれば、前記同様の自動分析を行い得る。そして、それぞれの溶液を配置した電磁弁の開閉を制御することにより、カラムに流れる溶液中の２価陽イオン濃度を順次上げながら導入することが出来る。
【００３２】
更には、上記のような構成の装置に、試料注入部、ポンプなど各部を制御するとともに、検出部から得られたクロマトパターンを解析し数値化する機能を有する制御部を付加すれば、完全自動の試料中のリポ蛋白質分析装置を提供できる。
【００３３】
後の実施例で詳細に示したように、具体的に、カラム体積の１０％以下の試料（高脂血症患者由来の血清）を１００ｍＭのマグネシウムイオン存在下で０．０４ミリ当量／カラムの硫酸基を有した担体を充填したカラムに導入し、リポ蛋白質を吸着させた後、２４４ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）で溶出すると、健常人由来血清中のＬＤＬ画分のピークトップ（ＬＤＬ低吸着画分のピークトップ）はカラム体積の５ないし６倍量の位置に溶出する。従ってＬＤＬ高吸着画分（ＩＤＬ）はカラム体積の５ないし６倍量の位置以降からカラム体積の１５ないし１８倍量の位置に溶出する。これを目安とするか、或いは予備的な分離を行った結果に基づいて溶出液を分取することにより、ＬＤＬ高吸着画分（ＩＤＬ）を取得することができる。なお、ＬＤＬ画分中のＬＤＬ高吸着画分（ＩＤＬ）の割合が５０％以上であるような試料が大量に入手可能であれば、前記方法にてＬＤＬ高吸着画分（ＩＤＬ）を容易に製造できるが、該画分の割合が低い試料について分取を行うとＬＤＬ低吸着画分（ＬＤＬ）が混入し易くなり、ＩＤＬの純度が低下する。このような場合には、カラムサイズを大きくし、カラムに導入する試料の量をカラム体積に対して１％以下とすること等によってＬＤＬ高吸着画分（ＩＤＬ）とＬＤＬ低吸着画分（ＬＤＬ）の分離を向上したうえでＬＤＬ高吸着画分（ＩＤＬ）を分取・製造することが好ましい。
【００３４】
本願発明の分析方法の１の形態では、未知の血清や血漿試料について前記したようにリポ蛋白質を分離し、上記ＬＤＬ高吸着画分（ＩＤＬ）のピークトップが認められるか否かを分析するものである。該ピークトップが認められれば、その試料は脂質代謝異常患者に由来する試料であると分析できる。従って、ＩＤＬを明確に分離し得る本願発明の形態では、ＩＤＬに由来するピークが検出できるか否かを確認するだけで良く、ＩＤＬをＬＤＬ画分と明確に分離しない本願発明の形態では、ＬＤＬの高吸着画分（即ちＩＤＬに由来するピーク）が検出できるか否かを確認するだけで良い。
【００３５】
本願発明の分析方法の他の形態は、ＩＤＬをＬＤＬ画分と明確に分離しない本願発明の形態に対して適用され、ＬＤＬ画分のピークトップより早く溶出するＬＤＬ画分（以下「ＬＤＬ−ａ画分」とする）とＬＤＬ画分のピークトップより遅く溶出する画分（以下「ＬＤＬ−ｂ画分」とする）の面積の差や比を算出したり、或いは両画分の面積の差を、ＬＤＬ画分の総面積、ＬＤＬ画分面積とＶＬＤＬ画分面積の和、リポ蛋白質画分の総面積等で除した値を算出し、健常人における同様の値と比較することを含むものである。この差が健常人の該差と比べて大きい場合や、例えばＬＤＬ−ｂ画分の面積とＬＤＬ−ａ画分の面積の比（ＬＤＬ−ｂをＬＤＬ−ａで除した値）が健常人の該比と比べて大きい場合には、その試料は脂質代謝異常患者に由来する試料であると分析できる。
【００３６】
また本願発明の分析方法の他の形態も、ＩＤＬをＬＤＬ画分と明確に分離しない本願発明の形態に対して適用され、ＬＤＬが溶出する時間の間に位置する一個所以上の時間点でＬＤＬ画分のピークを区切り、区切られた２個以上の画分の面積を分析することを含むものである。この場合、溶出時間が遅い画分にはＬＤＬ高吸着画分（ＩＤＬ）が多く含まれることになる。画分の分割数は２個以上であれば良いが、好ましくは２から５程度である。得られた複数の面積値については、ＬＤＬ高吸着画分（ＩＤＬ）を多く含む画分の面積値をそのまま用いても良いし、その値をＬＤＬ画分の総面積、ＬＤＬ画分面積とＶＬＤＬ画分面積の和、又は、リポ蛋白質の総面積で割った値として用いても良い。また、ＬＤＬ高吸着画分（ＩＤＬ）を多く含んだ画分の面積とそれ以外の画分の面積との比を用いても良い。前記分割する時間点については、測定条件によっても最適時間点が異なるものの、例えば、検出系にコレステロール反応試薬を用いた場合は実施例に示したように、８〜１２分の間で分割することを例示できる。また例えば検出系にトリグリセライド反応試薬を用いた場合は実施例２に示したように、２０〜２２分の間で分割することを例示できる。そして、以上のような値を健常人における同様の値と比較すれば良いのであるが、値が健常人の値よりも大きい場合にはその試料は脂質代謝異常患者に由来する試料であると分析できる。
【００３７】
ＬＤＬ画分のうち、溶出時間の部分のピーク、即ち充填剤との吸着が弱い成分の画分（以下「ＬＤＬ低吸着画分」とする）のピークは、試料によりその幅が異なる。このことは、該成分が複数の分子種から構成されることを意味する。従って、ＩＤＬをＬＤＬ画分と明確に分離しない本願発明の形態に適用される本願発明の分析方法の他の形態では、このピーク形状の相違に基づいて試料が脂質代謝異常や動脈硬化の患者に由来するか否かを分析するものである。ピーク幅は、どの高さのピーク幅を用いても良いが、ベースラインからピークトップの高さを３分割した場合の、ベースラインから２分割目の高さより、１０分割しベースラインから１分割目までの範囲の高さにおけるピーク幅を用いることを例示できる。ピークは高さが一定である場合、ピーク面積が大きくなる時には必ずピーク幅が広くなるから、前記に代えてＬＤＬ低吸着画分の面積とピーク高さの比の値を用いても同様である。この時のＬＤＬ低吸着分画面積として、前記ＬＤＬ−ａ画分の面積や、一定の時間点より前の、ＬＤＬ低吸着画分が多く含まれるＬＤＬ画分部分の面積を用いても良い。そして、以上のような値を健常人における同様の値と比較すれば良いのであるが、ピーク幅の値、ピーク面積をピーク高さで割った値が健常人の値と比べて大きい場合には、その試料は脂質代謝異常患者に由来する試料であると分析できる。
【００３８】
上記した本願発明の形態のうち、第２から４番目の形態は、先に述べたようにＩＤＬをＬＤＬ画分と明確に分離しない本願発明の形態に適用できるが、それ以外にも、カラムに吸着したリポ蛋白質を溶出させる際の条件が適当でない場合や、試料中にＬＤＬ高吸着画分（ＩＤＬ）の成分が少量にしか存在しない場合等のように、ＬＤＬ高吸着画分（ＩＤＬ）のピークトップが不明確になり、見かけ上、溶出時間の早いＬＤＬ画分の一部として確認されてしまうような場合にも効果的である。
【００３９】
また後の実施例で詳細に示したように、脂質代謝異常患者由来の試料では、健常人由来血清で出現するＶＬＤＬ画分ピークよりも遅く溶出するＶＬＤＬ画分（以下「ＶＬＤＬ高吸着画分」とする）が溶出することがある。カラム体積の１０％以下の試料（高脂血症患者由来の血清）を１００ｍＭのマグネシウムイオン存在下で０．０４ミリ当量／カラムの硫酸基を有した担体を充填したカラムに導入し、リポ蛋白質を吸着させ、カラム体積の９から１０倍程度の２４４ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）を導入してＬＤＬ成分を溶出させ、カラムの２倍程度の容量を導入する間に４００ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）に溶出液を変更すると、ＶＬＤＬ画分のピークトップはカラム体積の１ないし２倍量の位置に溶出する。従ってこの画分は、例えば予備的な分離を行った結果に基づいて溶出液を分取することにより製造することができる。なお、ＶＬＤＬ画分中のＶＬＤＬ高吸着画分の割合が５０％以上であるような試料が大量に入手可能であれば、前記方法にてＶＬＤＬ高吸着画分を容易に製造できるが、該画分の割合が低い試料を用いて製造を行うとＶＬＤＬ低吸着画分が混入し易くなる。このような場合には、カラムサイズを大きくし、カラムに導入する試料の量をカラム体積に対して１％以下とすること等によってＶＬＤＬ高吸着画分とＶＬＤＬ低吸着画分の分離を向上したうえでＶＬＤＬ高吸着画分を製造することが好ましい。
【００４０】
本願発明の分析方法の他の形態は、ＶＬＤＬ高吸着画分について分析することにより、試料が脂質代謝異常や動脈硬化の患者に由来するか否かを分析するものである。これは、未知の血清や血漿試料について前記したようにリポ蛋白質を分離し、上記ＶＬＤＬ高吸着画分のピークトップが認められるか否かを分析するものである。該ピークトップが認められれば、その試料は脂質代謝異常患者に由来する試料であると分析できる。
【００４１】
本願発明の分析方法の他の形態は、ＶＬＤＬ画分のピークトップより早く溶出するＶＬＤＬ画分（以下「ＶＬＤＬ−ａ画分」とする）とＶＬＤＬ画分のピークトップより遅く溶出する画分（以下「ＶＬＤＬ−ｂ画分」とする）の面積の差や比を算出したり、或いは両画分の面積の差を、ＶＬＤＬ画分の総面積、ＶＬＤＬ画分面積とＬＤＬ画分面積の和、リポ蛋白質画分の総面積等で除した値を算出し、健常人における同様の値と比較するものである。該差や比が大きい場合にはその試料は脂質代謝異常患者に由来する試料であると分析できる。
【００４２】
また本願発明の分析方法の他の形態は、ＶＬＤＬが溶出する時間の間に位置する一個所以上の時間点でＶＬＤＬ画分のピークを区切り、区切られた２個以上の画分の面積を分析することを例示できる。この場合、溶出時間が遅い画分にはＶＬＤＬ高吸着画分が多く含まれることになる。画分の分割数は２個以上であれば良いが、好ましくは２から５程度である。得られた複数の面積値については、ＶＬＤＬ高吸着画分を多く含む画分の面積値をそのまま用いても良いし、その値をＶＬＤＬ画分の総面積、ＶＬＤＬ画分面積とＬＤＬ画分面積の和、又は、リポ蛋白質の総面積で割った値として用いても良い。また、ＶＬＤＬ高吸着画分を多く含んだ画分の面積とそれ以外の画分の面積との比を用いても良い。前記分割する時間点については、測定条件によっても最適時間点が異なるものの、例えば、検出系にコレステロール反応試薬を用いた場合は実施例に示したように、１７〜１９分の間で分割することを例示できる。そして、以上のような値を健常人における同様の値と比較すれば良い。この差が健常人の該差と比べて大きい場合や、例えばＶＬＤＬ−ｂをＶＬＤＬ−ａで除した値を用いるのであれば、その比が健常人の該比に比べて大きい場合には、その試料は脂質代謝異常患者に由来する試料であると分析できる。
【００４３】
【発明の実施の形態】
以下、本願発明を実施例により詳細な説明をするが、本願発明は実施例に限定されるものではない。
【００４４】
実施例１
図１の装置を用いてリポ蛋白質の測定を行った。リポ蛋白質の分離溶出用の溶液Ａ、Ｂ（以下、溶離液Ａ、Ｂと記載する）として、それぞれ５０ｍＭトリス及び１０ｍＭ塩化マグネシウムを含むｐＨ７．８の溶液、５０ｍＭトリス及び５００ｍＭ塩化マグネシウムを含むｐＨ７．８の溶液を使用した。
【００４５】
溶出したリポ蛋白質の測定には、市販のコレステロール測定試薬であるデタミナーＬＴＣ（商品名、協和メディクス（株）製）を用いた。この試薬は２つの液状試薬１と試薬２から構成されるが、試薬１と試薬２をあらかじめ３：１で混合して用いた。
【００４６】
図１の装置において、デガッサーはＳＤ−８０２２（商品名、東ソー（株）製）を用い、ポンプへ送る前に溶離液Ａ、Ｂ中に溶存する気体成分を除去するようにした。溶離液Ａ、Ｂを送液するポンプはＣＣＰＭ−ＩＩ（東ソー（株）製）を用いた。溶離液Ａ、Ｂは、その後、ミキサー（ＭＸ−８０１０、商品名、東ソー（株）製）により均一に混合された後、カラムへと送られる。カラムは、ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−５ＰＷ（商品名、東ソー（株）製、カラムサイズ７．５ｍｍＩ．Ｄ．×７５ｍｍ）を用い、カラムの前にはフィルター（フィルターＫ、商品名、東ソー（株）製）を設置した。オートサンプラーはＡＳ−８０２０（商品名、東ソー（株）製）を用い、試料の導入量は２０μｌとした。カラムオーブン（ＣＯ−８０２０、商品名、東ソー（株）製）の設定温度は２５℃とした。
【００４７】
カラムからの溶出液は、スプリッター（マイクロスプリッターＰ−４５０、商品名、ＵＰＣＨＵＲＣＨ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＩＮＣ．製）により、その半分量を捨てるように設定した。残りの半分量をコレステロール測定試薬の混合液と混合し、反応コイル（サイズ０．４ｍｍＩ．Ｄ．×７．５ｍ）に導いた。リアクター（ＣＯ−８０２０、商品名、東ソー（株）製）の設定温度は３７℃とした。
【００４８】
検出器としてはＵＶ−８０２０（商品名、東ソー（株）製）を用い、測定波長は５５０ｎｍとした。エアートラップはエアートラップＧ（商品名、東ソー（株）製）を用い、測定試薬の混合液はエアートラップを通ってポンプへ送られるようにした。なお測定試薬の混合液を送液するポンプにはＤＰ−８０２０（商品名、東ソー（株）製）を用い、流速は０．１５ｍｌ／分とした。ＤＰ−８０２０に付けた抵抗管のサイズは０．２ｍｍＩ．Ｄ．×２ｍとし、２本直列に接続して用いた。
【００４９】
試料としては、人血清由来のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）をそれぞれ１、０．２５、０．１３ｍｇ／ｍｌとなるよう生理食塩水で希釈し用いた。溶離液の流速は、溶離液Ａ、Ｂ合わせて０．６ｍｌ／分で一定になるようにし、溶離液のグラディエントの設定は、試料導入時から１２分間は溶離液Ａ１００％とし、１２から２０分にかけては溶離液Ａ１００％からＢ１００％のリニアグラディエントとし、２０から４０分は溶離液Ｂ１００％とし、４０分以降は溶離液Ａ１００％とした。つまり、カラム平衡化は溶離液Ａで行い、リポ蛋白質の分離溶出は溶離液Ａ及びＢの混合液（グラディエント）で行い、カラムの洗浄は溶離液Ｂにより行った。なお、本実施例では、７０分ごとに新たな試料を導入して連続的に測定を行った。
【００５０】
ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ試料の測定結果を図２、３、４に示す。ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬの溶出時間はそれぞれ６．５１分、２３．２４分、２４．９３分であり、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬの順に、良好に分離した状態で溶出することが確認された。
【００５１】
実施例  ２
本実施例では、２価陽イオンとしてニッケルイオンを、カラムとしてＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−ＮＰＲ（商品名、カラムは東ソー（株）製、カラムサイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×３５ｍｍ）を、溶離液Ａ、Ｂとしてそれぞれ５０ｍＭトリス及び１０ｍＭ塩化ニッケルを含むｐＨ７．８の溶液、５０ｍＭトリス、３０ｍＭ塩化ニッケル及び５００ｍＭ硝酸ナトリウムを含むｐＨ７．８の溶液を用いた。
【００５２】
試料としては、人血清由来のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）の超遠心分離によるＨＤＬ分画、ＬＤＬ分画、ＶＬＤＬ分画を、それぞれ０．５、０．２５、０．２５ｍｇ／ｍｌとなるように生理食塩水で希釈し用いた。溶離液の流速は溶離液Ａ、Ｂ合わせて０．６ｍｌ／分で一定になるようにし、溶離液のグラディエントの設定は、試料導入時から５分間は溶離液Ａ１００％とし、５から５０分にかけては溶離液Ａ１００％からＢ１００％のリニアグラディエントとし、５０から７０分は溶離液Ｂ１００％とし、７０分以降は溶離液Ａ１００％とした。つまり、カラム平衡化は溶離液Ａで行い、リポ蛋白質の分離溶出は溶離液Ａ及びＢの混合液（グラディエント）で行い、カラムの洗浄は溶離液Ｂにより行った。なお、本実施例では、１００分ごとに新たな試料を導入して連続的に測定を行った。
【００５３】
上記以外は、実施例１と同様である。
【００５４】
ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ試料の測定結果を図５、６、７に示す。分離溶出の際、塩化ニッケルの濃度が上昇するとともに、クロマトグラムのベースの吸光度も上昇した。ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬの溶出時間はそれぞれ４０．９２分、４５．６７分、５０．６７分となり、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬの順に分離溶出することが確認された。
【００５５】
実施例  ３
本実施例では、２価陽イオンとしてマグネシウムイオンを、カラムとしてＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−ＮＰＲ（商品名、東ソー（株）製、カラムサイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×３５ｍｍ）を、溶離液Ａ、Ｂとしてそれぞれ５０ｍＭトリス及び１０ｍＭ塩化マグネシウムを含むｐＨ７．８の溶液、５０ｍＭトリス及び５００ｍＭ塩化マグネシウムを含むｐＨ７．８の溶液を用いた。
【００５６】
試料としては、人血清と人血清由来のＶＬＤＬ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）を用いた。人血清は生理食塩水により４倍希釈とし、ＶＬＤＬは０．２５ｍｇ／ｍｌになるよう生理食塩水で希釈し用いた。溶離液の流速は溶離液Ａ、Ｂ合わせて０．６ｍｌ／分で一定になるようにし、溶離液のグラディエントの設定は、試料導入時から０．５分間は溶離液Ａ１００％とし、０．５から０．６分にかけては溶離液Ａ１００％から溶離液Ａ７０％・溶離液Ｂ３０％へのリニアグラディエントとし、０．６から１０分は溶離液Ａ７０％・溶離液Ｂ３０％の比率（固定）とし、１０から１２分にかけては溶離液Ａ７０％・溶離液Ｂ３０％の比率から溶離液Ｂ１００％のリニアグラディエントとし、１２から１５分は溶離液Ｂ１００％とし、１５分以降は溶離液Ａ１００％とした。なお、本実施例では、２３分ごとに新たな試料を導入して連続的に測定を行った。上記以外は、実施例１と同様である。
【００５７】
測定結果を図８、９に示す。人血清では、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬの順に分離溶出することが確認された。ＬＤＬのピークは７．６７分を最大であった。１０分以降からＶＬＤＬが溶出するまでの間でもベース以上の吸光度が観察され、微量ではあるがリポ蛋白質が溶出していることが確認できた。このリポ蛋白質は、ＶＬＤＬからＬＤＬに移行する中間体に相当するものと思われる。ＶＬＤＬ試料の測定結果では、そのほとんどが１６．１６分のピークとして溶出した。
【００５８】
実施例  ４
２価陽イオンとしてカルシウムイオンを、カラムとしてＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−ＮＰＲ（商品名、東ソー（株）製、カラムサイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×３５ｍｍ）を、溶離液Ａ、Ｂとしてそれぞれ５０ｍＭトリス及び５ｍＭ塩化カルシウムを含むｐＨ７．５の溶液、５０ｍＭトリス及び４００ｍＭ塩化カルシウムを含むｐＨ７．５の溶液を用いた。コレステロール測定試薬としてはコレステロールＥテストワコー（商品名、和光純薬（株）製）を用い、測定波長は６００ｎｍとした。
【００５９】
試料としては、人血清を生理食塩水により４倍希釈としたものを用いた。溶離液の流速は溶離液Ａ、Ｂ合わせて０．６ｍｌ／分で一定になるようにし、溶離液のグラディエントの設定は、試料導入時から０．５分間は溶離液Ａ１００％とし、０．５から０．６分にかけては溶離液Ａ１００％から溶離液Ａ５５％・溶離液Ｂ４５％へのリニアグラディエントとし、０．６から１０分は溶離液Ａ５５％・溶離液Ｂ４５％の比率（固定）とし、１０から１２分にかけては溶離液Ａ５５％・溶離液Ｂ４５％の比率から溶離液Ｂ１００％のリニアグラディエントとし、１２から１５分は溶離液Ｂ１００％とし、１５分以降は溶離液Ａ１００％とした。なお、本実施例では、２５分ごとに新たな試料を導入して連続的に測定を行った。
【００６０】
上記以外は、実施例１と同様である。
【００６１】
測定結果を図１０に示す。ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬの順に分離溶出することが確認された。
【００６２】
実施例  ５
２価陽イオンとしてバリウムイオンを、カラムとしてＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−ＮＰＲ（商品名、東ソー（株）製、カラムサイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×３５ｍｍ）を、溶離液Ａ、Ｂとしてそれぞれ５０ｍＭトリス及び５ｍＭ塩化バリウムを含むｐＨ７．５の溶液、５０ｍＭトリス及び４００ｍＭ塩化バリウムを含むｐＨ７．５の溶液を用いた。コレステロール測定試薬としてはコレステロールＥテストワコー（商品名、和光純薬（株）製）を用い、測定波長は６００ｎｍとした。
【００６３】
試料としては、人血清を生理食塩水により４倍希釈としたものを用いた。溶離液の流速は溶離液Ａ、Ｂ合わせて０．６ｍｌ／分で一定になるようにし、溶離液のグラディエントの設定は、試料導入時から０．５分間は溶離液Ａ１００％とし、０．５から０．６分にかけては溶離液Ａ１００％から溶離液Ａ７０％・溶離液Ｂ３０％へのリニアグラディエントとし、０．６から１０分は溶離液Ａ７０％・溶離液Ｂ３０％の比率（固定）とし、１０から１２分にかけては溶離液Ａ７０％・溶離液Ｂ３０％の比率から溶離液Ｂ１００％のリニアグラディエントとし、１２分から１５分は溶離液Ｂ１００％とし、１５分以降は溶離液Ａ１００％とした。なお、本実施例では、２５分ごとに新たな試料を導入して連続的に測定を行った。
【００６４】
上記以外は、実施例１と同様である。
【００６５】
測定結果を図１１に示す。ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬの順に分離溶出することが確認された。
【００６６】
実施例  ６
以後の実験に先立ち、健常人由来の血清試料（１検体）と脂質代謝異常の患者血清（６検体）についてアガロース電気泳動を行った。電気泳動は、０．６％アガロースゲルを用い、１μｌの血清を供し、４００Ｖで１５分行った。アガロース電気泳動において、Ｃｈｙ（カイロミクロン）画分、β画分、ｐｒｅβ画分、α画分に分離される。β画分はＬＤＬ画分に相当し、ｐｒｅβ画分はＶＬＤＬ画分に相当し、α画分はＨＤＬ画分に相当する。
【００６７】
電気泳動収量後、Ｆａｔ  Ｒｅｄ  ７Ｂによりゲルを染色し、スキャンした。結果を図１２から図１８に示す。図１３から図１８の脂質代謝異常の患者血清では、図１２の健常人由来血清と比較してｐｒｅβ及びβ画分に変化が認められる。
【００６８】
実施例  ７
図１の装置を用いてリポ蛋白質の分析を行った。リポ蛋白質の分離溶出用の溶液Ａ、Ｂ（以下、溶離液Ａ、Ｂと記載する）として、それぞれ５０ｍＭトリス及び１０ｍＭ塩化マグネシウムを含むｐＨ７．５の溶液、５０ｍＭトリス及び４００ｍＭ塩化マグネシウムを含むｐＨ７．５の溶液を使用した。なお本実施例では、カラムとしてＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−ＮＰＲ（商品名、東ソー（株）製、カラムサイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×３５ｍｍ）を用い、カラムの前にはフィルター（フィルターＫ、商品名、東ソー（株）製）を設置した。このカラムは交換基容量が０．０４ｍ当量／カラムであり、ゲルのポアサイズとしてはポリエチレングリコールで分子量１０００以下で、事実上非多孔性である。
【００６９】
溶出したリポ蛋白質の分析には、市販のコレステロール分析試薬であるコレステロールＥテストワコー（商品名、和光純薬（株）製）を用い、測定波長は６００ｎｍとした。
【００７０】
試料としては、実施例６で使用した健常人由来血清（１検体）及び脂質代謝異常患者由来血清（６検体）をそれぞれ生理食塩水で４倍に希釈し、２０μｌとした。溶離液の流速は、溶離液Ａ、Ｂ合わせて０．６ｍｌ／分で一定になるようにし、溶離液のグラディエントの設定は、試料導入時から０．５分間は溶離液Ａ１００％とし、０．５から０．６分にかけては溶離液Ａ１００％から溶離液Ａ４０％・溶離液Ｂ６０％の比率までのリニアグラディエントとし、０．６分から１０分にかけては溶離液Ａ４０％・溶離液Ｂ６０％の比率とし、１０から１２分にかけて溶離液Ａ４０％・溶離液Ｂ６０％の比率から溶離液Ｂ１００％のリニアグラディエントとし、１２分から１５分にかけては溶離液Ｂ１００％の比率とした。１５分以降は溶離液Ａ１００％とし、カラムを平衡化し２６分ごとに試料を導入した。
【００７１】
図１９から２５は、それぞれ健常人由来血清又は脂質代謝異常患者由来血清１から６の測定結果を示すクロマトグラムである。全検体について、ＨＤＬ、ＬＤＬ及びＶＬＤＬは良好に分離された。特に代謝異常患者由来血清３（図２２）では、ＬＤＬ高吸着画分（ＩＤＬ、図中矢印を付す）が認められ、同血清５（図２４）ではＶＬＤＬ高吸着画分（図中矢印を付す）が認められ、そして同血清６（図２５）では健常人由来血清（図１９）に比較して明らかに広いＬＤＬ低吸着画分のピーク（図中矢印を付す）が認められた。
【００７２】
表１は、それぞれの測定結果についてＬＤＬ−ｂ画分の面積からＬＤＬ−ａ画分の面積を引いた値（以下「ＬＤＬ−ｂａ」とする）、ＬＤＬ−ｂａをＬＤＬ画分の総面積で除した値（以下「ＬＤＬ−ｂａ％」とする）、ＬＤＬ―ｂをＬＤＬ−ａで除した値（以下「ＬＤＬ−ｂ／ａ」とする）を示したものである。なお代謝異常患者由来血清３では、ＬＤＬ高吸着分画の面積はＬＤＬ−ｂ分画に含めてた。健常人由来血清と比べて代謝異常患者由来血清１、３及び４ではＬＤＬ−ｂａが大きく、ＬＤＬ−ｂａ％とＬＤＬ−ｂ／ａでは、健常人血清に比べ、代謝異常患者由来血清１、３、４及び５が大きかった。
【００７３】
【表１】
0004644948.tif 000002
またそれぞれの測定結果について、ＬＤＬ画分を溶出時間が９分より早い画分の面積（以下「ＬＤＬ−ｃ」とする）と遅い分画の面積（以下「ＬＤＬ−ｄ値」とする）に分割した。なお代謝異常患者由来血清３では、ＬＤＬ高吸着分画（ＩＤＬ）の面積はＬＤＬ−ｄ値に含めた。ＬＤＬ−ｄ、ＬＤＬ−ｄとＬＤＬ分画の総面積の比（以下「ＬＤＬ−ｄ％」とする）、ＬＤＬ−ｄをＬＤＬ−ｃで除した値（以下「ＬＤＬ−ｄ／ｃ」とする）を算出し、表２に示した。ＬＤＬ−ｄ、ＬＤＬ−ｄ％、ＬＤＬ−ｄ／ｃ共に、健常人血清に比べ、代謝異常患者由来血清１、３、４及び５が大きかった。
【００７４】
【表２】
0004644948.tif 000003
またそれぞれの測定結果について、ＬＤＬ低吸着分画（ＬＤＬ）の１／２ピーク幅（ベースラインからピークトップの高さを２分割したときの、ベースラインから１分割目の高さ、以下「２Ｈ」とする）、１／５ピーク幅（ベースラインからピークトップの高さを５分割したときの、ベースラインから１分割目の高さ、以下「５Ｈ」とする）、或いは、ＬＤＬ低吸着分画（ＬＤＬ）のピーク高さで、ＬＤＬ−ａ、又はＬＤＬ−ｃを除した値（以下それぞれ「ＬＤＬ−ａ／ｈ」又は「ＬＤＬ−ｃ／ｈ」という）を算出し、結果を表３に示した。この結果、全ての値において、健常人血清に比べ、代謝異常患者由来血清が大きかった。
【００７５】
【表３】
0004644948.tif 000004
またそれぞれの測定結果について、ＶＬＤＬ−ｂ分画の面積からＶＬＤＬ−ａ分画の面積を引いた値（以下「ＶＬＤＬ−ｂａ」とする）、ＶＬＤＬ−ｂａをＶＬＤＬ分画の総面積で除した値（以下「ＶＬＤＬ−ｂａ％」という）と、ＶＬＤＬ−ｂ画分の面積をＶＬＤＬ−ａ画分の面積で除した値（以下「ＶＬＤＬ−ｂ／ａ」とする）を算出し、表４に示した。この結果、全ての値において、健常人血清に比べ、代謝異常患者由来血清１、２、３及び５が大きかった。
【００７６】
【表４】
0004644948.tif 000005
またそれぞれの測定結果について、ＶＬＤＬ分画を１８分より早く溶出した部分の面積（以下「ＶＬＤＬ−ｃ」とする）と遅く溶出した部分の面積（以下「ＶＬＤＬ−ｄ」とする）に分割した。ＶＬＤＬ−ｄ、ＶＬＤＬ−ｄとＬＤＬ分画の総面積の比（以下「ＶＬＤＬ−ｄ％」とする）、ＶＬＤＬ−ｄをＬＤＬ−ｃで除した値（以下「ＶＬＤＬ−ｄ／ｃ」とする）を算出し、表５に示した。ＶＬＤＬ−ｄは、健常人血清に比べ、代謝異常患者由来血清１、２、３及び５が大きかった。ＶＬＤＬ−ｄ％とＶＬＤＬ−ｄ／ｃは、健常人血清に比べ、代謝異常患者由来血清１、２及び５が大きかった。
【００７７】
【表５】
0004644948.tif 000006
実施例  ８
実施例７に示した装置において、トリグリセライド測定試薬であるトリグリセリドＥテストワコー（商品名、和光純薬（株）製）を用い、カラムからの溶出液は、スプリッター（製マイクロスプリッターＰ−４５０、商品名、ＵＰＣＨＵＲＣＨ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＩＮＣ．製）により、溶離液（流量０．６ｍｌ／分）中の０．３５ｍｌ／分相当量を捨てるように設定した。残りの０．２５ｍｌ／ｍｉｎ分は酵素液と混合し、反応コイルに導いた。
【００７８】
測定試料として、実施例６及び７で用いた健常人血清（１検体）及び代謝異常患者由来血清１から５（５検体）を生理食塩水で２倍に希釈し、試料導入量は３０μＬとした。溶離液の流速は溶離液Ａ、Ｂ合わせて０．６ｍｌ／分と一定になるようにし、溶離液のグラディエントの設定は、試料導入時から０．５分は溶離液Ａ１００％とし、０．５分から０．６分にかけて溶離液Ａ１００％から溶離液Ａ４０％・溶離液Ｂ６０％の比率までのリニアグラディエントとし、０．６分から１０分にかけて溶離液Ａ４０％・溶離液Ｂ６０％の比率とし、１０分から１２分にかけて溶離液Ａ４０％・溶離液Ｂ６０％の比率から溶離液Ｂ１００％のリニアグラディエントとし、１２分から１６分にかけて溶離液Ｂ１００％の比率とした。１６分以降は溶離液Ａ１００％とし、カラムを平衡化し２８分ごとに試料を導入した。酵素液の流速は０．１５ｍｌ／分とした。上記以外は、実施例７と同様である。
【００７９】
結果を図２６から３１はそれぞれ健常人由来血清又は脂質代謝異常患者由来血清１から５の測定結果を示すクロマトグラムである。全検体について、ＨＤＬ、ＬＤＬ及びＶＬＤＬは良好に分離された。特に代謝異常患者由来血清２（図２８）、３（図２９）及び５（図３１）では、ＬＤＬ高吸着画分（ＩＤＬ、図中矢印を付す）が認められた。
【００８０】
表６は、それぞれの測定結果についてＬＤＬ−ｂ画分の面積からＬＤＬ−ａ画分の面積を引いた値（以下「ＬＤＬ−ｂａ」とする）、ＬＤＬ−ｂａをＬＤＬ画分の総面積で除した値（以下「ＬＤＬ−ｂａ％」とする）、ＬＤＬ―ｂの面積をＬＤＬ−ａの面積で除した値（以下「ＬＤＬ−ｂ／ａ」とする）を示したものである。なお代謝異常患者由来血清２、３及び５では、ＬＤＬ高吸着分画の面積はＬＤＬ−ｂ分画に含めてた。健常人由来血清と比べて全代謝異常患者由来血清でＬＤＬ−ｂａとＬＤＬ−ｂａ％が大きく、ＬＤＬ−ｂ／ａでは健常人血清に比べ、代謝異常患者由来血清１及び４が大きかった。
【００８１】
【表６】
0004644948.tif 000007
またそれぞれの測定結果について、ＬＤＬ画分を溶出時間が２１分より早い画分の面積（以下「ＬＤＬ−ｃ」とする）と遅い分画の面積（以下「ＬＤＬ−ｄ値」とする）に分割した。なお代謝異常患者由来血清２、３及び５では、ＬＤＬ高吸着分画（ＩＤＬ）の面積はＬＤＬ−ｄに含めた。ＬＤＬ−ｄ、ＬＤＬ−ｄとＬＤＬ分画の総面積の比（以下「ＬＤＬ−ｄ％」とする）、ＬＤＬ−ｄをＬＤＬ−ｃで除した値（以下「ＬＤＬ−ｄ／ｃ」とする）を算出し、表７に示した。ＬＤＬ−ｄでは、健常人血清に比べ、全代謝異常患者由来血清が大きく、ＬＤＬ−ｄ％及びＬＤＬ−ｄ／ｃでは、健常人血清に比べ、代謝異常患者由来血清１、２、３及び５が大きかった。
【００８２】
【表７】
0004644948.tif 000008
またそれぞれの測定結果について、ＬＤＬ低吸着分画（ＬＤＬ）の１／２ピーク幅（ベースラインからピークトップの高さを２分割したときの、ベースラインから１分割目の高さ、以下「２Ｈ」とする）、或いは、ＬＤＬ低吸着分画（ＬＤＬ）のピーク高さで、ＬＤＬ−ａ、又はＬＤＬ−ｃを除した値（以下それぞれ「ＬＤＬ−ａ／ｈ」又は「ＬＤＬ−ｃ／ｈ」という）を算出し、結果を表８に示した。この結果、２ＨとＬＤＬ−ａ／ｈでは、健常人血清に比べ、代謝異常患者由来血清１、３及び４が大きく、ＬＤＬ−ｃ／ｈでは、健常人血清に比べ、代謝異常患者由来血清１、３、４及び５が大きかった。
【００８３】
【表８】
0004644948.tif 000009
実施例９
図１の装置を用いてリポ蛋白質の分析を行った。リポ蛋白質の分離溶出用の溶液Ａ、Ｂ（以下、溶離液Ａ、Ｂと記載する）として、それぞれ５０ｍＭトリス及び１０ｍＭ硝酸マグネシウムを含むｐＨ７．５の溶液、５０ｍＭトリス及び３００ｍＭ硝酸マグネシウムを含むｐＨ７．５の溶液を使用した。なお本実施例でもカラムとしてはＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−ＮＰＲ（商品名、東ソー（株）製、カラムサイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×３５ｍｍ）を用い、カラムの前にはフィルター（ＨＬＣ７２３ＧＨｂＩＩＩ用フィルターＳ、商品名、東ソー（株）製）を設置した。
【００８４】
溶出したリポ蛋白質の分析には、市販のコレステロール分析試薬であるコレステロールＥテストワコー（商品名、和光純薬（株）製）を用い、測定波長は６００ｎｍとした。なお反応コイルは、サイズが０．４ｍｍＩ．Ｄ．×２０ｍのものとした。
【００８５】
試料としては、インフォームドコンセントを得て取得した脂質代謝異常患者由来血清（３検体、これまでの実施例で用いたものとは異なるもの）を用い、試料導入量はそれぞれ５μｌとした。溶離液の流速は、溶離液Ａ、Ｂ合わせて０．６ｍｌ／分で一定になるようにし、溶離液のグラディエントの設定は、試料導入時から１分間は溶離液Ａ１００％とし、１から２０分にかけては溶離液Ａ１００％から溶離液Ａ６０％・溶離液Ｂ４０％の比率のリニアグラディエントとし、２０から３０分にかけては溶離液Ａ６０％・溶離液Ｂ４０％の比率で固定し、３０から４０分にかけては溶離液Ｂ１００％の比率で固定した。４０分以降は溶離液Ａ１００％とした。なお、本実施例では、５５分ごとに新たな試料を導入して連続的に分析を行った。
【００８６】
これとは別に、市販のアクリルアミドゲル電気泳動による市販リポ蛋白質分析キット（リポフォー、商品名、（株）常光製）を用いて検体の分析を行った。このキットは、スダンブラックＢによる脂質前染色キットである。測定はキットに付属するマニュアルに従って行った。分析後、分離ゲルをデンシトメーターでスキャンして結果をグラフ化した。
【００８７】
図３２から３６は上記の結果を示すものであり、図３２、３４及び３６はそれぞれ検体１から３についての本願発明による分析結果（クロマトグラム）、そして図３３、３５及び３７はそれぞれ検体１から３についての電気泳動の結果である。検体１では、いずれの結果においてもＩＤＬのピークは確認されず、検体２及び３ではいずれの結果でもＩＤＬのピークがＬＤＬから完全に分離された状態で観察される。本実施例から明らかなように、ＩＤＬが試料中に含まれている場合には、本願発明を実施することによりこれを分離することが可能である。
【００８８】
実施例  １０
図１の装置を用いてリポ蛋白質の分析を行った。リポ蛋白質の分離溶出用の溶液Ａ、Ｂ（以下、溶離液Ａ、Ｂと記載する）として、それぞれ５０ｍＭトリス及び１０ｍＭ酢酸マグネシウムを含むｐＨ７．５の溶液、５０ｍＭトリス、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び４００ｍＭ塩化マグネシウムを含むｐＨ７．５の溶液を使用した。なお本実施例でもカラムとしてはＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−ＮＰＲ（商品名、東ソー（株）製、カラムサイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×３５ｍｍ）を用い、カラムの前にはフィルター（ＨＬＣ７２３ＧＨｂＩＩＩ用フィルターＳ、商品名、東ソー（株）製）を設置した。溶出したリポ蛋白質の分析には、市販のコレステロール分析試薬であるコレステロールＥテストワコー（商品名、和光純薬（株）製）を用い、測定波長は６００ｎｍとした。なお反応コイルは、サイズが０．４ｍｍＩ．Ｄ．×２０ｍのものとした。
【００８９】
試料としては、インフォームドコンセントを得て取得した脂質代謝異常患者由来血清（１検体、これまでの実施例で用いたものとは異なるもの）を用い、試料導入量はそれぞれ５μｌとした。溶離液の流速は、溶離液Ａ、Ｂ合わせて０．６ｍｌ／分で一定になるようにし、溶離液のグラディエントの設定は、試料導入時から２分間は溶離液Ａ１００％とし、２から２０分にかけては溶離液Ａ１００％から溶離液Ａ６０％・溶離液Ｂ４０％の比率のリニアグラディエントとし、２０から２５分にかけては溶離液Ａ６０％・溶離液Ｂ４０％の比率で固定し、２５から３０分にかけては溶離液Ｂ１００％の比率で固定した。３０分以降は溶離液Ａ１００％とした。なお、本実施例では、４５分ごとに新たな試料を導入して連続的に分析を行った。結果（クロマトグラム）を図３８に示す。
【００９０】
次に、検体を超遠心分離にかけて得たＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ及びＶＬＤＬの４つの分画を試料として、上記の液体クロマトグラフィー操作を実施した。まず、検体０．８ｍＬにＮａＢｒ０．２７ｇを加えて溶解し、遠心分離チューブに入れた後、比重をそれぞれ１．２１０ｇ／ｍＬ、１．０６３ｇ／ｍＬ、１．０１９ｇ／ｍＬ、１．００６ｇ／ｍＬに調整したＮａＢｒ溶液をそれぞれ２．６ｍＬ、３．３ｍＬ、３．０ｍＬ、１．１ｍＬずつこの順に重層した。次に遠心分離チューブを遠心分離ロータ（ＲＰＳ４０Ｔ、商品名、（株）日立製作所製）に入れ、１５℃、３００００ｒｐｍで２４時間遠心分離した。
【００９１】
遠心分離後、上層から０．５ｍＬずつ４サンプル（以後Ｆｒ．１からＦｒ．４とする）、１．０ｍＬずつ６サンプル（以後Ｆｒ．５からＦｒ．１０とする）の合計１０試料を得た。Ｆｒ．１からＦＲ．１０の結果（クロマトグラム）を図３９から４８に示す。
【００９２】
Ｆｒ．１（図３９）ではＶＬＤＬ及びＩＤＬが確認された。Ｆｒ．２からＦｒ．４（図４０から４２）では、ＬＤＬ分画の中でも溶出時間の遅い、ＩＤＬに近い性質のＬＤＬが主成分として確認された。Ｆｒ．５からＦｒ．７（図４３から４５）の主成分はＬＤＬであった。Ｆｒ．８からＦｒ．１０（図４６から４８）の主成分はＨＤＬであった。
【００９３】
【発明の効果】
以上に説明したように、本発明によれば、カラムクロマトグラフィーの手法により、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及び／又はＩＤＬを分離することができる。この結果、これらのリポ蛋白質を製造したり分析することが容易となる。またかかる操作１回あたりに要する時間も２０分程度に短縮することができ、しかも、担体に吸着したリポ蛋白質の分離溶出に使用する溶液を工夫することにより、カラムを再平衡化するためにわずかな時間を要するのみで、複数の試料を次々と連続的に処理することも可能である。
【００９４】
本発明の方法では、カラムやポンプというような、超遠心分離装置等に比較して安価かつ入手し易い分析装置等によって実施可能である。しかも、超遠心分離を行う方法と比較して短時間で測定操作を終了できるという効果を有する。また本発明の方法は、実施例の記載からも明らかなように、従来のゲルろ過クロマトグラフィーによる方法やイオン交換カラムによる方法では分離できなかったリポ蛋白質をも分離可能である。この結果、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及び／又はＩＤＬをそれぞれ正確に分析したり、高純度の標品を製造する、という、従来の方法では困難で、達成されていない効果を初めて達成するものである。
【００９５】
以上に説明したように、簡便で、自動分析やルーチン分析に好適な液体クロマトグラフの手法により試料中のリポ蛋白質を分離し、分離結果を分析することによって当該試料が高脂血症等の脂質代謝異常患者や動脈硬化患者に由来する試料であるか否かを知ることが可能である。従来の液体クロマトグラフの手法では、リポ蛋白質を完全に分離することはできず、上記のような分析を実施することは困難である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例で使用した測定装置の概要を示す図である。
【図２】実施例１におけるＨＤＬ試料の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬは高密度リポ蛋白質のピークを示す。
【図３】実施例１におけるＬＤＬ試料の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＬＤＬは低密度リポ蛋白質のピークを示す。
【図４】実施例１におけるＶＬＤＬ試料の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＶＬＤＬは超低密度リポ蛋白質のピークを示す。
【図５】実施例２におけるＨＤＬ試料の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬは高密度リポ蛋白質のピークを示す。
【図６】実施例２におけるＬＤＬ試料の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＬＤＬは低密度リポ蛋白質のピークを示す。
【図７】実施例２におけるＶＬＤＬ試料の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＶＬＤＬは超低密度リポ蛋白質のピークを示す。
【図８】実施例３における血清試料の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬは、それぞれ超低密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、高密度リポ蛋白質のピークを示す。
【図９】実施例３におけるＶＬＤＬ試料の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＶＬＤＬは超低密度リポ蛋白質のピークを示す。
【図１０】実施例４における血清試料の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬは、それぞれ超低密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、高密度リポ蛋白質のピークを示す。
【図１１】実施例５における血清試料の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬは、それぞれ超低密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、高密度リポ蛋白質のピークを示す。
【図１２】実施例６における、健常人由来血清の電気泳動結果を示すものである。
【図１３】実施例６における、脂質代謝異常患者由来血清の電気泳動結果を示すものである。
【図１４】実施例６における、脂質代謝異常患者由来血清の電気泳動結果を示すものである。
【図１５】実施例６における、脂質代謝異常患者由来血清の電気泳動結果を示すものである。
【図１６】実施例６における、脂質代謝異常患者由来血清の電気泳動結果を示すものである。
【図１７】実施例６における、脂質代謝異常患者由来血清の電気泳動結果を示すものである。
【図１８】実施例６における、脂質代謝異常患者由来血清の電気泳動結果を示すものである。
【図１９】実施例７における健常人由来血清の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬは、それぞれ超低密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、高密度リポ蛋白質を示す。
【図２０】実施例７における脂質代謝異常患者由来血清１の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬは、それぞれ超低密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、高密度リポ蛋白質を示す。
【図２１】実施例７における脂質代謝異常患者由来血清２の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬは、それぞれ超低密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、高密度リポ蛋白質を示す。
【図２２】実施例７における脂質代謝異常患者由来血清３の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬは、それぞれ超低密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、高密度リポ蛋白質を示す。ＬＤＬ分画は、６．３４分にピークトップを持つ低吸着分画と、９．１５分にピークトップを持つ高吸着分画の２つの分画に分かれて溶出している。
【図２３】実施例７における脂質代謝異常患者由来血清４の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬは、それぞれ超低密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、高密度リポ蛋白質を示す。
【図２４】実施例７における脂質代謝異常患者由来血清５の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬは、それぞれ超低密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、高密度リポ蛋白質を示す。ＶＬＤＬ分画は、１６．０２分にピークトップを持つ低吸着分画の後にピークとして分離されていないが、高吸着分画が確認される。
【図２５】実施例７における脂質代謝異常患者由来血清６の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬは、それぞれ超低密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、高密度リポ蛋白質を示す。
【図２６】実施例８における健常人由来血清の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬは、それぞれ超低密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、高密度リポ蛋白質を示す。
【図２７】実施例８における脂質代謝異常患者由来血清１の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬは、それぞれ超低密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、高密度リポ蛋白質を示す。
【図２８】実施例８における脂質代謝異常患者由来血清２の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬは、それぞれ超低密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、高密度リポ蛋白質を示す。ＬＤＬ分画は、１８．７６分にピークトップを持つ低吸着分画と、２２．３９分にピークトップを持つ高吸着分画の２つの分画に分かれて溶出している。
【図２９】実施例８における脂質代謝異常患者由来血清３の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬは、それぞれ超低密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、高密度リポ蛋白質を示す。ＬＤＬ分画は、１８．１８分にピークトップを持つ低吸着分画と、２０．６７分にピークトップを持つ高吸着分画の２つの分画に分かれて溶出している。
【図３０】実施例８における脂質代謝異常患者由来血清５の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬは、それぞれ超低密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、高密度リポ蛋白質を示す。
【図３１】実施例８における脂質代謝異常患者由来血清６の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬは、それぞれ超低密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、高密度リポ蛋白質を示す。ＬＤＬ分画は、１７．５３分にピークトップを持つ低吸着分画と、２１．２５分にピークトップを持つ高吸着分画の２つの分画に分かれて溶出している。
【図３２】実施例９における分析結果（クロマトグラム）を示すものであり、図中横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬはそれぞれ高密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、超低密度リポ蛋白質を示す。
【図３３】実施例９における電気泳動の結果（デンシトグラム）を示すものであり、図中横軸は泳動における移動距離（ｄｏｔ）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬはそれぞれ高密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、超低密度リポ蛋白質を示す。
【図３４】実施例９における分析結果（クロマトグラム）を示すものであり、図中横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬはそれぞれ高密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、中間型リポ蛋白質、超低密度リポ蛋白質を示す。
【図３５】実施例９における電気泳動の結果（デンシトグラム）を示すものであり、図中横軸は泳動における移動距離（ｄｏｔ）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬはそれぞれ高密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、中間型リポ蛋白質、超低密度リポ蛋白質を示す。
【図３６】実施例９における分析結果（クロマトグラム）を示すものであり、図中横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬはそれぞれ高密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、中間型リポ蛋白質、超低密度リポ蛋白質を示す。
【図３７】実施例９における電気泳動の結果（デンシトグラム）を示すものであり、図中横軸は泳動における移動距離（ｄｏｔ）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬはそれぞれ高密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、中間型リポ蛋白質、超低密度リポ蛋白質を示す。
【図３８】実施例１０における検体の分析結果（クロマトグラム）を示すものであり、図中横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬはそれぞれ高密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質、中間型リポ蛋白質、超低密度リポ蛋白質を示す。
【図３９】実施例１０におけるＦｒ．１の分析結果（クロマトグラム）を示すものであり、図中横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＩＤＬ、ＶＬＤＬはそれぞれ中間型リポ蛋白質、超低密度リポ蛋白質を示す。
【図４０】実施例１０におけるＦｒ．２の分析結果（クロマトグラム）を示すものであり、図中横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中ＬＤＬは低密度リポ蛋白質を示す。
【図４１】実施例１０におけるＦｒ．３の分析結果（クロマトグラム）を示すものであり、図中横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＬＤＬは低密度リポ蛋白質を示す。
【図４２】実施例１０におけるＦｒ．４の分析結果（クロマトグラム）を示すものであり、図中横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＬＤＬは低密度リポ蛋白質を示す。
【図４３】実施例１０におけるＦｒ．５の分析結果（クロマトグラム）を示すものであり、図中横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＬＤＬは低密度リポ蛋白質を示す。
【図４４】実施例１０におけるＦｒ．６の分析結果（クロマトグラム）を示すものであり、図中横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＬＤＬは低密度リポ蛋白質を示す。
【図４５】実施例１０におけるＦｒ．７の分析結果（クロマトグラム）を示すものであり、図中横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＬＤＬは低密度リポ蛋白質を示す。
【図４６】実施例１０におけるＦｒ．８の分析結果（クロマトグラム）を示すものであり、図中横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬは高密度リポ蛋白質を示す。
【図４７】実施例１０におけるＦｒ．９の分析結果（クロマトグラム）を示すものであり、図中横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬは高密度リポ蛋白質を示す。
【図４８】実施例１０におけるＦｒ．１０の分析結果（クロマトグラム）を示すものであり、図中横軸は試料を装置に供してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬは高密度リポ蛋白質を示す。
【符号の説明】
１溶離液Ａ、２溶離液Ｂ、３酵素液、４デガッサー、５エアートラップ、６・７送液ポンプ、８ミキサー、９フィルター、１０カラム、１１カラムオーブン（恒温器）、１２抵抗管、１３反応コイル、１４リアクター（恒温器）、１５検出器、１６スプリッター、１７オートサンプラー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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