(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸であって、ここで該融合ポリペプチドが以下：
ａ）シアリルトランスフェラーゼ；および
ｂ）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼ
を含む融合ポリペプチドである、核酸。
【請求項２】
前記シアリルトランスフェラーゼがα２，３−シアリルトランスフェラーゼである、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼがナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）に由来する、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが発現カセットの一部であり、前記融合ポリペプチドが原核生物において発現され得る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項５】
前記核酸が、前記融合ポリペプチドと連結されるシグナル配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされる、融合ポリペプチド。
【請求項８】
融合ポリペプチドを作製する方法であって、請求項６に記載の発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換された宿主細胞を産生する工程；および該融合ポリペプチドを発現するために適切な条件下で、該形質転換された宿主細胞を培養する工程、を包含する、方法。
【請求項９】
前記融合ポリペプチドがその発現後に精製される、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、１９９７年１２月１５日に出願された、米国仮出願第６０／０６９，４４３号の一部継続出願であり、そしてこの出願の利益を請求し、この出願は、全ての目的のために本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、オリゴ糖の酵素学的合成の分野に関係し、この酵素学的合成に関わる１を超える反応を触媒し得る融合タンパク質を使用する。
【０００３】
（背景）
細胞の表面上の認識エレメントとしての炭水化物の役割の理解の増加は、定義された構造の炭水化物分子の生成における関心の増加を導いてきた。例えば、シアリルＬｅｗｉｓリガンド（シアリルＬｅｗｉｓxおよびシアリルＬｅｗｉｓ1）を含む化合物は、ＥＬＡＭ−１レセプターおよびＧＭＰ
１４０レセプターのようなレセプターと結合する、白血球細胞株および非白血球細胞株において存在する。Ｐｏｌｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：６２２４およびＰｈｉｌｌｉｐｓら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１１３０、米国特許第５，７５３，６３１号もまた参照のこと。
【０００４】
所望の炭水化物構造を作製する際における関心が原因で、グリコシルトランスフェラーゼ、および炭水化物の酵素触媒による合成におけるグリコシルトランスフェラーゼの役割が、現在広範に研究されている。これらの酵素は、高い特異性を示し、そして規定された配列の炭水化物構造を形成する際に有用である。結果的に、グリコシルトランスフェラーゼは、治療および他の目的のために使用される多数の炭水化物の合成における酵素触媒として、ますます使用される。合成炭水化物化学の分野に対する酵素の適用において、炭水化物の酵素学的合成のためのグリコシルトランスフェラーゼの使用は、この酵素により提供される事実上完全な立体選択性および結合特異性（Ｉｔｏら（１９９３）Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ  ６５：７５３；ならびに米国特許第５，３５２，６７０号および同第５，３７４，５４１号）に起因する、化学的方法にわたる利点を提供する。
【０００５】
従って、オリゴ糖およびその対応する誘導体の化学酵素学的合成は、新規な治療剤を開発するための興味深い機会を示す。しかし、このアプローチは、必要とされるグリコシルトランスフェラーゼの比較的貧弱な有効性、ならびにこれらの酵素のための基質を得ることの困難さおよび費用により、未だ妨げられている。オリゴ糖の大規模な酵素学的合成もまた、グリコシルトランスフェラーゼにより供与体として使用される糖ヌクレオチドの合成のために必要な、大量の補助酵素（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｅｎｚｙｍｅ）を必要とする。本発明は、オリゴ糖の酵素学的合成のために有用な酵素の精製を簡単にする融合タンパク質を提供する。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、オリゴ糖の酵素学的合成のために有用な融合ポリペプチドを提供する。本発明の融合ポリペプチドは、補助酵素の触媒ドメインと連結されたグリコシルトランスフェラーゼの触媒ドメインを有する。補助酵素の触媒ドメインは、例えば、グリコシルトランスフェラーゼのための供与体であるヌクレオチド糖の形成におけるステップを触媒し得、またはグリコシルトランスフェラーゼサイクルに関わる反応を触媒し得る。
【０００７】
別の実施態様において、本発明は、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を提供する。この融合ポリペプチドは、グリコシルトランスフェラーゼの触媒ドメイン、および補助酵素の触媒ドメインを有する。この核酸を含む発現カセットおよび発現ベクターもまた、提供され、本発明の核酸を含む宿主細胞も同様に提供される。
【０００８】
本発明はまた、グリコシルトランスフェラーゼの触媒ドメインおよび補助酵素の触媒ドメインを有する、融合ポリペプチドを作製する方法を提供する。この方法は、この融合ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞に導入して、形質転換された宿主細胞を作製する工程；およびこの形質転換された宿主細胞を、この融合ポリペプチドを発現するために適切な条件下で培養する工程を含む。
【０００９】
（詳細な説明）
（定義）
本発明の融合タンパク質は、供与体基質から受容体分子へ単糖を転移するために、および／または糖類転移反応に関与する反応物を形成するために有用である。一般に、付加は、生体分子でオリゴ糖または炭水化物部分の非還元末端で起こる。
【００１０】
本明細書中で定義されるような生体分子としては、炭水化物、タンパク質（例えば、糖タンパク質）、および脂質（例えば、糖脂質、リン脂質、スフィンゴリピドおよびガングリオシド）のような生物学的に重要な分子が挙げられるが、これらに限定されない。
以下の略語が、本明細書中で使用される：
Ａｒａ＝アラビノシル；
Ｆｒｕ＝フルクトシル；
Ｆｕｃ＝フコシル；
Ｇａｌ＝ガラクトシル；
ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトシルアミノ；
Ｇｌｃ＝グルコシル；
ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコシルアミノ；
Ｍａｎ＝マンノシル；および
ＮｅｕＡｃ＝シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル）。
【００１１】
オリゴ糖は、還元末端および非還元末端を有すると考えられ、いずれにせよ還元末端において糖類は、実際に還元糖である。認められた命名法に従って、オリゴ糖は、本明細書中で左に非還元末端および右に還元末端を有するように示される。
【００１２】
本明細書中で記載される全てのオリゴ糖は、非還元糖類に対する名称または略語（例えば、Ｇａｌ）、続いてグリコシド結合の配置（αまたはβ）、環結合、結合に関与する還元糖類の環の位置、次いで、還元糖類の名称または略語（例えば、ＧｌｃＮＡｃ）で記載される。２つの糖の間の連結は、例えば、２，３、２→３、または（２，３）のように表され得る。各々の糖類は、ピラノースまたはフラノースである。
【００１３】
グリコシルトランスフェラーゼのための供与体基質は、活性化ヌクレオチド糖である。このような活性化糖は、一般に、ウリジン、グアノシン、およびヌクレオシド一リン酸またはヌクレオシド二リン酸が脱離基として作用する、糖のシチジン一リン酸誘導体またはシチジン二リン酸誘導体からなる。シアリルトランスフェラーゼのための受容体基質は、例えば、所望のシアル酸を含有する活性化糖ヌクレオチドである。例えば、ＮｅｕＡｃの場合、活性化糖は、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃである。
【００１４】
用語「シアル酸」とは、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）または５−Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）をいうが、同様に他のシアル酸は、これらの場所において使用され得る。本発明において適切なシアル酸の異なる形態の総説については、Ｓｃｈａｕｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、５０：６４〜８９（１９８７）、およびＳｃｈａｕｒ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４０：１３１〜２３４を参照のこと。
【００１５】
本発明の「融合グリコシルトランスフェラーゼポリペプチド」は、グリコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインおよび補助酵素（例えば、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃシンテターゼまたはＵＤＰ−グルコース４’エピメラーゼ（ｇａｌＥ））からの第２の触媒ドメインを含むグリコシルトランスフェラーゼ融合ポリペプチドであり、そして供与体基質（例えば、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃまたはＵＤＰ−Ｇａｌ）から受容体分子へのオリゴ糖類残基の転移を触媒し得る。代表的に、このようなポリペプチドは、本明細書中で開示される、例示されたタンパク質に実質的に類似する。
【００１６】
本明細書中で言及される「補助酵素」とは、例えば、グリコシルトランスフェラーゼのための基質を形成する反応を触媒することに関与する酵素である。例えば、補助酵素は、グリコシルトランスフェラーゼによって供与体部分として使用されるヌクレオチド糖の形成を触媒し得る。補助酵素はまた、ヌクレオチド糖の形成に必要であるヌクレオチド三リン酸の生成において、またはヌクレオチド糖中に取り込まれる糖の生成において使用される酵素であり得る。
【００１７】
「触媒ドメイン」とは、通常酵素によって実行される酵素反応を触媒するために十分な酵素の一部をいう。例えば、シアリルトランスフェラーゼの触媒ドメインは、供与体から受容体糖類へシアル酸残基を転移するために十分な、シアリルトランスフェラーゼの一部を含む。触媒ドメインは、酵素全体、酵素の部分配列を含み得、または天然に見出されるような酵素または部分配列に結合していない、付加的なアミノ酸配列を含み得る。
【００１８】
本出願において要求される、命名および一般的な実験手順の多くは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、第１巻〜第３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９において見出され得る。このマニュアルは、本明細書の以下において「Ｓａｍｂｒｏｏｋら」として参照される。
【００１９】
用語「核酸」とは、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかにおけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーをいい、他に限定されない限り、天然に生じるヌクレオチドと同様の様式で核酸にハイブリダイズする、天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む。他に示さない限り、特定の核酸配列は、その相補的配列を含む。
【００２０】
用語「作動可能に連結された」とは、核酸の発現制御配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、または転写因子結合部位のアレイ）と第２の核酸配列との間の機能的な連結をいい、ここでこの発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写および／または翻訳に影響を与える。
【００２１】
本明細書中で使用される、「異種配列」または「異種核酸」は、特定の宿主細胞に対して異質の供給源に由来するものであるか、または、同一の供給源からの場合、その本来の形態から改変されたものである。従って、特定の宿主細胞中の異種グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内因性であるが改変されていない、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。異種核酸の改変は、例えば、制限酵素でＤＮＡを処理して、プロモーターに作動可能に連結し得るＤＮＡフラグメントを産生することによって生じ得る。部位特異的変異誘発のような技術はまた、異種核酸を改変するために有用である。
【００２２】
「部分配列」とは、核酸またはアミノ酸（例えば、ポリペプチド）のそれぞれの、より長い配列の一部を含む、核酸またはアミノ酸の配列をいう。
【００２３】
用語「組換え体」は、細胞に関して使用される場合、細胞が異種核酸を複製すること、または異種核酸によってコードされるペプチドまたはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、ネイティブな（非組換え）形態の細胞中で見出されない遺伝子を含み得る。組換え細胞はまた、ネイティブ形態の細胞において見出され得る遺伝子を含み得、ここで遺伝子は改変され、そして人工的な手段によって細胞中に再導入される。この用語はまた、細胞から核酸を除去することなく改変されている細胞に対して内因性の核酸を含む細胞を含む；このような改変は、遺伝子置換、部位特異的変異、および関連する技術によって得られる改変を含む。
【００２４】
「組換え発現カセット」または単に「組換えカセット」は、このような配列に適合する宿主において構造遺伝子の発現に影響を与え得る核酸エレメントを有する組換え的または合成的に生成された核酸構築物である。発現カセットは、少なくともプロモーターを含み、そして必要であれば、転写終結シグナルを含む。代表的に、組換え発現カセットは、転写されるための核酸（例えば、所望のポリペプチドをコードする核酸）、およびプロモーターを含む。発現をもたらすのに必要または有用なさらなる因子はまた、本明細書中で記載されるように使用され得る。例えば、発現カセットはまた、宿主細胞からの発現されたタンパク質の分泌を指向するシグナル配列をコードする、ヌクレオチド配列を含み得る。転写終結シグナル、エンハンサー、および遺伝子発現に影響を与える他の核酸配列はまた、発現カセットに含まれ得る。
【００２５】
用語「単離された」とは、実質的または本質的に、そのネイティブ状態において見出されるような、通常物質に付随する成分を含まない物質をいわなければならない。従って、単離された物質は、通常、それらのインサイチュな環境で会合している物質を含まない。代表的に、本発明の単離されたタンパク質は、銀染色ゲル上のバンドの強度、または純度を決定するための他の方法によって測定される場合に、少なくとも約８０％純粋であり、通常少なくとも約９０％純粋であり、そして好ましくは少なくとも約９５％純粋である。タンパク質の純度または均質性は、当該分野で周知の多くの手段（例えば、タンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動に続く、染色による可視化）によって同定され得る。特定の目的のために、高分解能が必要とされ、そしてＨＰＬＣまたは同様の精製手段が利用される。
【００２６】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の関係において、用語「同一」またはパーセント「同一性」とは、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、または視覚的な検査によって測定され、最大対応のために比較され、そして整列された場合、同一である、もしくは特定の百分率の同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分配列をいう。
【００２７】
２つの核酸配列またはポリペプチドの関係において、語句「実質的に同一」とは、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、または視覚的な検査によって測定されて、最大対応のために比較され、そして整列された場合、少なくとも６０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０〜９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する２つ以上の配列または部分配列をいう。好ましくは、実質的な同一性は、長さが少なくとも約５０残基である配列の領域にわたって、より好ましくは、少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、そして最も好ましくは、これらの配列は、少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一である。最も好ましい実施態様において、これらの配列は、コード領域の全長にわたって実質的に同一である。
【００２８】
配列の比較のために、代表的に１つの配列が参照配列として振る舞い、これに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピューター中に入力して部分配列座標を必要であれば指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較して、試験配列についてパーセント配列同一性を計算する。
【００２９】
比較のために最適な配列の整列は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性方法についての探索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータでの実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または視覚的な検査（一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間の合弁事業（１９９５  増補）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照のこと）によって実施され得る。
【００３０】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｅｌら（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２に記載される。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって公に利用可能である。このアルゴリズムは、データベースの配列中の同一長のワードとともに整列される場合、いくつかの正の値のしきいスコアＴに適合するかまたは満足するかのいずれかである、問い合わせ配列中の長さＷの短いワード（ｓｈｏｒｔ  ｗｏｒｄ）を同定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、隣接のワードのしきいスコアとして言及される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の隣接ワードのヒットは、これらを含む、より長いＨＳＰを見出すために探索を開始するための核として作用する。次いで、ワードのヒットは、累積整列スコアが増加する限り、各々の配列に沿って両方の方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列に対して、パラメーターＭ（一対の適合残基に対する報酬スコア；常に＞０）およびパラメーターＮ（不適合残基に対する罰点スコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列に対して、スコア付け行列を使用して、累積スコアを計算する。各々の方向におけるワードのヒットの伸長は、以下：累積整列スコアがその最大達成値から量Ｘだけ減少する場合；１つ以上の負にスコア付けする残基の整列の蓄積によって、累積スコアがゼロまたはそれより下になる場合；またはいずれかの配列の末端のに到達した場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、整列の感度ならびに速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対する）は、デフォールトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に対して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォールトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア付け行列を使用する（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）。
【００３１】
パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的な分析を実行する（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の適合が偶然によって生じる確率の指標を提供する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較において、最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は、参照配列に類似すると考えられる。
【００３２】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることのさらなる指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。従って、ポリペプチドは、代表的に、例えば、２つのペプチドが、保存的置換によってのみ異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、以下に記載されるように、２つの分子が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【００３３】
語句「特異的にハイブリダイズする」とは、特定のヌクレオチド配列が複合体混合物（例えば、全細胞性の）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合の、ストリンジェントな条件下での特定のヌクレオチド配列のみに対する分子の結合、二重体形成、またはハイブリダイズすることをいう。
【００３４】
用語「ストリンジェントな条件」とは、プローブがその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、そして異なる環境において異なる。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列に対する熱融点（Ｔｍ）よりも約１５℃低く選択される。Ｔｍとは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡で標的配列にハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）である（一般に、標的配列は過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、プローブの５０％が、平衡で占められる）。代表的に、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ  Ｎａイオン未満、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度（または他の塩）であり、そして温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に対して少なくとも約３０℃、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドよりも長い）に対して少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加で達成され得る。
【００３５】
語句「タンパク質に特異的に結合する」または「特異的に免疫反応性である」とは、抗体に関する場合、タンパク質または他の生物製剤の不均質な集団の存在下において、タンパク質の存在を決定する結合反応をいう。従って、指定された免疫アッセイの条件下で、特定の抗体は、特定のタンパク質に対して優先的に結合し、そしてサンプル中に存在する他のタンパク質に対して、有意な量で結合しない。このような条件下における、タンパク質に対する特異的な結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択された抗体を必要とする。種々の免疫アッセイの形式を使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択し得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイは、慣用的に使用され、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択する。特異的な免疫反応性を決定するために使用され得る、免疫アッセイの形式および条件の説明については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。
【００３６】
特定のポリヌクレオチド配列の「保存的に改変された変異」とは、同一の、もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、またはこのポリヌクレオチドがアミノ酸配列をコードしない場合は本質的に同一の配列いう。遺伝コードの縮重によって、多くの機能的に同一な核酸は、任意の所定のポリペプチドをコードする。例えば、コドン、ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧは全て、アミノ酸であるアルギニンをコードする。従って、アルギニンがコドンによって特定されるあらゆる位置で、このコドンは、コードされたポリペプチドを変化させることなしに、記載された任意の対応するコドンに変更され得る。このような核酸の変異は、「サイレントな変異」であり、これは、「保存的に改変された変異」の一種である。ポリペプチドをコードする、本明細書中に記載されたあらゆるポリヌクレオチド配列はまた、他で示されるものを除いて、あらゆる可能性のあるサイレントな変異を記載する。当業者は、核酸中の各々のコドン（ＡＵＧ（これは、通常メチオニンに対する唯一のコドンである）、およびＵＧＧ（これは、通常トリプトファンに対する唯一のコドンである）を除く）が、標準的な技術によって機能的に同一な分子を生成するために改変され得ることを認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の、各々の「サイレントな変異」は、各々記載された配列において内在する。
【００３７】
さらに、当業者は、コードされた配列において単一のアミノ酸または少ない百分率（代表的には５％未満、より代表的には１％未満）のアミノ酸を変化、付加、または欠失させる、個々の置換、欠失または付加は、「保存的に改変された変異」であり、ここでこの変化が、化学的に同様のアミノ酸でのアミノ酸の置換を生じることを認識する。機能的に同様なアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該分野で周知である。
【００３８】
当業者は、融合タンパク質および融合タンパク質をコードする核酸の多くの保存的変異が、本質的に同一の産物を産生することを理解する。例えば、遺伝コードの縮重に起因して、「サイレントな置換」（すなわち、コードされたポリペプチドにおいて変化をもたらさない核酸配列の置換）は、アミノ酸をコードするあらゆる核酸配列に内在する特徴である。本明細書中に記載されるように、配列は、好ましくは、キメラのエンドヌクレアーゼを産生するために使用される特定の宿主細胞（例えば、酵母、ヒトなど）における発現のために最適化される。同様に、アミノ酸配列中の１つまたはいくつかのアミノ酸において、「保存的アミノ酸置換」は、極めて類似の特性を有する異なるアミノ酸を用いて置換され（定義の節（前出）を参照のこと）、また、特定のアミノ酸配列に対して、またはアミノ酸をコードする特定の核酸配列に対して極めて類似していると容易に同定される。任意の特定の配列のこのような保存的に置換された変異は、本発明の特徴である。また、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと。さらに、コードされた配列において単一のアミノ酸または少ない百分率のアミノ酸を変化、付加、または欠失させる、個々の置換、欠失または付加はまた、「保存的に改変された変異」である。
【００３９】
（好ましい実施態様の説明）
本発明は、グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用ドメインおよび１つ以上の補助酵素の少なくとも１つの触媒作用ドメインを含む融合ポリペプチドを提供する。補助酵素は、例えば、グリコシルトランスフェラーゼに関する供与体であるヌクレオチド糖の形成の工程を触媒し得る。融合ポリペプチドをコードする核酸はまた提供され、同様に、これらの核酸を含む発現ベクターおよび宿主細胞が提供される。
【００４０】
本発明の融合ポリペプチドは、オリゴ糖の酵素学的な合成における使用を見い出す。有意な利点が、融合ポリペプチドにより提供される。例えば、２つ以上の酵素学的活性を有する融合ポリペプチドの使用は、所定の合成に関して得られなければならないポリペプチドの数を減少する。従って、精製は、単純化される。
【００４１】
（Ａ．グリコシルトランスフェラーゼ）
本発明の融合ポリペプチドは、グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用ドメインを含む。触媒作用ドメインは、広範な種々のグリコシルトランスフェラーゼのいずれかに由来し得る。この触媒作用ドメインを獲得し得るグリコシルトランスフェラーゼの中には、シアリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、およびマンノシルトランスフェラーゼがある。
【００４２】
このグリコシルトランスフェラーゼは、原核生物のグリコシルトランスフェラーゼまたは真核生物のグリコシルトランスフェラーゼのいずれかであり得る。
【００４３】
（真核生物のグリコシルトランスフェラーゼ）
本発明の融合ポリペプチドは、真核生物のグリコシルトランスフェラーゼの触媒作用ドメインを含み得る。代表的には、真核生物のグリコシルトランスフェラーゼは、触媒活性を必要としないそれらのアミノ末端に位相的なドメインを有する（米国特許第５，０３２，５１９号を参照のこと）。「細胞質ドメイン」（これは、最も一般的には約１個のアミノ酸と約１０個のアミノ酸との間の長さである）は、最もアミノ末端のドメインである。隣接するドメインは（「シグナルアンカードメイン」と呼ばれる）、一般的には約１０個〜約２５個のアミノ酸の長さである。シグナルアンカードメインに隣接するのは、「ステム（ｓｔｅｍ）領域」であり、これは代表的には約２０個と約６０個との間のアミノ酸の長さである。ステム領域は、保持シグナルとして機能し、ゴルジ装置中のグリコシルトランスフェラーゼを保持する。グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用ドメインは、ステム領域のカルボキシル側に見出される。
【００４４】
現在の好ましい実施態様において、本発明の融合タンパク質中に存在するグリコシルトランスフェラーゼの触媒作用ドメインは、１つ以上の細胞質ドメイン、シグナルアンカードメイン、およびステム領域ドメインを実質的に欠く。より好ましくは、これらのドメインの２つは、融合タンパク質に少なくとも実質的に存在せず、そして最も好ましくは、細胞質ドメイン、シグナルアンカードメイン、およびステム領域の３つ全てが、本発明の融合タンパク質に実質的にまたは完全に存在しない。
【００４５】
多くの哺乳動物のグリコシルトランスフェラーゼが、クローン化および発現されており、そして組換えタンパク質は、供与体の特異性および受容体の特異性に関して特徴づけされており、そしてこれらはまた、供与体の特異性または受容体の特異性のいずれかに関与する残基を明確にするために、部位特異的突然変異誘発を通して調査されている（Ａｏｋｉら、（１９９０）ＥＭＢＯ．Ｊ．９：３１７１−３１７８；Ｈａｒｄｕｉｎ−Ｌｅｐｅｒｓら、（１９９５）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５（８）：７４１−７５８；ＮａｔｓｕｋａおよびＬｏｗｅ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：６８３−６９１；Ｚｕら、（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２０６（１）：３６２−３６９；Ｓｅｔｏら、（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３４：３２３−３２８；Ｓｅｔｏら、（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４１３３−１４１３８８）。
【００４６】
いくつかの実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用ドメインは、フコシルトランスフェラーゼから得られた。多くのフコシルトランスフェラーゼは、当業者に公知である。手短に言えば、フコシルトランスフェラーゼは、ＧＤＰ−フコースからＬ−フコースを受容体の糖のヒドロキシ位へ転移する任意のこれらの酵素を含む。いくつかの実施態様において、例えば、受容体の糖は、オリゴ糖グリコシドの中のＧａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃ基の中のＧｌｃＮＡｃである。この反応についての適切なフコシルトランスフェラーゼは、ヒト母乳から得られる、Ｇａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃα（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＩＩ、Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６５）（Ｐａｌｃｉｃら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１９０：１−１１（１９８９）；Ｐｒｉｅｅｌｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１０４５６−１０４６３（１９８１）；およびＮｕｎｅｚら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５９：２０８６−２０９５（１９８１）を参照のこと）、およびヒト血清において見出される、Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃα（１→３）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩ、およびＦＴＶＩＩ、Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６５）を含む。組換え形態のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃα（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼもまた、利用可能である（Ｄｕｍａｓら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １：４２５−４２８（１９９１）およびＫｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ４：１２８８−１３０３（１９９０）を参照のこと）。他の例示的なフコシルトランスフェラーゼは、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６９）を含む。酵素学的なフコシル化は、Ｍｏｌｌｉｃｏｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：１６９−１７６（１９９０）または米国特許第５，３７４，６５５号に記載される方法により実施され得る。
【００４７】
他のグループの実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用ドメインは、ガラクトシルトランスフェラーゼから得られる。例示的ガラクトシルトランスフェラーゼは、α１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．１５１、例えば、Ｄａｂｋｏｗｓｋｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２５：２９２１（１９９３）、およびＹａｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：２２９−２３３（１９９０）、ウシ（ＧｅｎＢａｎｋ  ｊ０４９８９、Ｊｏｚｉａｓｓｅら、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２９０−１４２９７）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ  ｍ２６９２５；Ｌａｒｓｅｎら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２２７−８２３１）、ブタ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ３６１５２；Ｓｔｒａｈａｎら、（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：１０１−１０５））を含む。別の適切なα１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、血液型Ｂの抗原の合成に関与している（ＥＣ  ２．４．１．３７、Ｙａｍａｍｏｔｏら、（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１４６−１１５１（ヒト））。また、本発明の融合ポリペプチドの使用に適切なのは、α１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼであり、これらは以下を含む、例えば、ＥＣ  ２．４．１．９０（ＬａｃＮＡｃシンテターゼ）およびＥＣ  ２．４．１．２２（ラクトースシンテターゼ）（ウシ（Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏら、（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：２１１−２１７）、ヒト（Ｍａｓｒｉら、（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５７：６５７−６６３）、マウス（Ｎａｋａｚａｗａら、（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４：１６５−１６８）、ならびにＥ．Ｃ．２．４．１．３８およびセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．４５、Ｓｔａｈｌら、（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３８：２３４−２４２）。他の適切なガラクトシルトランスフェラーゼは、例えば、α１，２−ガラクトシルトランスフェラーゼを含む（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ由来、Ｃｈａｐｅｌｌら、（１９９４）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ５：５１９−５２８）。
【００４８】
シアリルトランスフェラーゼは、本発明の組換え細胞および反応混合物に有用な別の型のグリコシルトランスフェラーゼである。本発明における使用に適切であるシアリルトランスフェラーゼの例は、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ（好ましくは、ラットＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ）、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＶ、ＳＴ３Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ  Ｖ、ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  Ｉ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  ＩＩ、およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  ＩＩＩ（本明細書で使用されるシアリルトランスフェラーゼの命名法は、Ｔｓｕｊｉら、（１９９６）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６：ｖ−ｘｉｖに記載されるとおりである）。例示的なα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．６）は、シアル酸をＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ二糖類またはグリコシドの非還元性末端のＧａｌへ転移する。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６：３１５９（１９８１）、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：１３８４５（１９８２）およびＷｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２１０１１（１９９２）を参照のこと。別の例示的α２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．４）は、シアル酸をＧａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃ二糖類またはグリコシドの非還元性末端のＧａｌへ転移する。Ｒｅａｒｉｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４：４４４４（１９７９）およびＧｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２１００４（１９９２）を参照のこと。さらなる例示的な酵素は、Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ  α−２，６シアリルトランスフェラーゼ（Ｋｕｒｏｓａｗａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５−３８１（１９９４）を参照のこと）。シアリルトランスフェラーゼの命名法は、Ｔｓｕｊｉ，Ｓ．ら、（１９９６）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６：ｖ−ｖｉｉに記載される。
【００４９】
このシアリルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、およびフコシルトランスフェラーゼに関して、本発明の融合ポリペプチドに使用され得る他のグリコシルトランスフェラーゼが、詳細に記載されている。特に、このグリコシルトランスフェラーゼはまた、例えば、グルコシルトランスフェラーゼ（例えば、Ａｌｇ８（Ｓｔａｇｌｊｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５９７７（１９９４））またはＡｌｇ５（Ｈｅｅｓｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：７１（１９９４）））、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（米国特許第５，６９１，１８０号、Ｎａｇａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２−１２０８９（１９９２）、およびＳｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２（１９９４）））、およびポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９（１９９３））、であり得る。適切なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、ＧｎＴＩ（２．４．１．１０１、Ｈｕｌｌら、ＢＢＲＣ  １７６：６０８（１９９１））、ＧｎｔＩＩ、およびＧｎｔＩＩＩ（Ｉｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：６９２（１９９３））、ＧｎＴＶ（Ｓｈｏｒｅｉｂａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５３８１（１９９３））、Ｏ結合Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３２６（１９９２））、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスフェートトランスフェラーゼ（Ｒａｊｐｕｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８５：９８５（１９９２）、およびヒアルロン酸シンターゼを含む。プロテオグリカンの合成に関与する酵素、（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼＩ（ＥＣ２．４．１．１７４））およびコンドロイチン硫酸の合成に関与する酵素（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＥＣ２．４．１．１７５）もまた興味がもたれる。適切なマンノシルトランスフェラーゼは、α（１，２）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，３）マンノシルトランスフェラーゼ、β（１，４）マンノシルトランスフェラーゼ、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎシンターゼ、ＯＣｈ１、およびＰｍｔｌを含む。キシロシルトランスフェラーゼは、例えば、プロテインキシロシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．２．２６）を含む。
【００５０】
（原核生物グリコシルトランスフェラーゼ）
他の実施態様において、本発明の融合タンパク質は、原核生物のグリコシルトランスフェラーゼ由来のグリコシルトランスフェラーゼ触媒作用ドメインを含む。いくつかの原核生物のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、クローン化され、そして特徴づけされており、そして本発明の融合タンパク質に使用され得る。真核生物のグリコシルトランスフェラーゼと同様に、原核生物のグリコシルトランスフェラーゼは、しばしば（所望される場合、融合ポリペプチドから）取り除かれ得るアミノ末端付近に膜架橋ドメインを有する。
【００５１】
適切な原核生物のグリコシルトランスフェラーゼは、リポオリゴ糖の合成（ＬＯＳ）に関与する酵素を含み、これは多くのグラム陰性細菌により産生される。このＬＯＳは、代表的にはヒト上皮性細胞の表面上に、または宿主分泌物中に見出される複合糖質を模倣する末端のグリカン配列を有する（Ｐｒｅｓｔｏｎら、（１９９６）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２３（３）：１３９−１８０）。このような酵素は、α１，６−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびα１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、ＥＭＢＬ  登録番号Ｍ８０５９９およびＭ８６９３５（Ｅ．ｃｏｌｉ）；ＥＭＢＬ  登録番号Ｓ５６３６１（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を参照のこと）、グルコシルトランスフェラーゼ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ２５７４０（Ｅ．ｃｏｌｉ）、α１，２−グルコシルトランスフェラーゼ（ｒｆａＪ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｏｒｔ登録番号Ｐ２７１２９（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ１９８１７（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、ならびにα１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ｒｆａＫ）（ＥＭＢＬ登録番号Ｕ０００３９（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含むＥ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのような種のｒｆａオペロンのタンパク質を含むが、これらに限定されない。アミノ酸配列および／または核酸配列が公知の他のグリコシルトランスフェラーゼは、ｒｆａＢのようなオペロンによりコードされるこれらを含み、生物体（例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒｏｓｕｍ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのｒｈ１オペロン）中で特徴づけされている。
【００５２】
また本発明の融合タンパク質中で使用するのに適するのは、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−β−１，３−Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｄ−グルコース、およびＰK血液型三糖類配列、Ｄ−ガラクトシル−α−１，４−Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｄ−グルコースを含む構造の生成に関与するグリコシルトランスフェラーゼであり、粘膜病原体Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｎｏｒｈｏｅａｅ  およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＬＯＳにおいて同定されている（Ｓｃｈｏｌｔｅｎら、（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：２３６−２４３）。これらの構造の生合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼをコードするＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の遺伝子は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫型Ｌ３およびＬ１（Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：７２９−７４０）およびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ変異体Ｆ６２（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２１８１−２１９０）から同定されている。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて、ｌｇｔＡ、ｌｇｔＢおよびｌｇＥの３つの遺伝子からなる遺伝子座は、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース鎖中の最後の３つの糖の付加を要求するグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする（Ｗａｋａｒｃｈｕｋら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９１６６−７３）。最近、ｌｇｔＢおよびｌｇｔＡ遺伝子産物の酵素活性が証明され、これらの提案したグリコシルトランスフェラーゼの機能に対する初めての直接証拠を提供した（Ｗａｋａｒｃｈｕｋら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４５）：２８２７１−２７６）。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいて、２つの付加遺伝子、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース構造の末端のガラクトースの３位へβ−Ｄ−ＧａｌＮＡｃを付加するｌｇｔＤ、および短縮型ＬＯＳのラクトースエレメントへ末端α−Ｄ−Ｇａｌを付加するｌｇｔＣが存在し、従ってこれらはＰK血液型抗原構造を形成する（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ（１９９４）、前出）。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて、別個の免疫型Ｌ１はまた、ＰK血液型抗原を発現し、そしてｌｇｔＣ遺伝子を保持することが示されている（Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、（１９９５）、前出）。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａグリコシルトランスフェラーゼおよび関連する遺伝子はまた、米国特許第５，５４５，５５３号（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ）に記載されている。Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ由来のα１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子はまた、特徴づけされている（Ｍａｒｔｉｎら、（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２１３４９−２１３５６）。
【００５３】
原核細胞由来のシアリルトランスフェラーゼは、例えば、Ｗｅｉｓｇｅｒｂｅｒら、（１９９１）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．１：３５７−３６５；Ｆｒｏｓｃｈ，Ｍ．ら、（１９９１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１２５１−１２６３；およびＧｉｌｂｅｒｔ，Ｍ．ら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２８２７１−２８２７６により記載されている。細菌のシアリルトランスフェラーゼは、それらの哺乳動物の対応物よりも広いスペクトルの受容体を有し得ることが示唆されている（Ｋａｊｉｈａｒａ，Ｙ．ら、（１９９６）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６１：８６３２−８６３５およびＧｉｌｂｅｒｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９：１８７−１９４（１９９７））。
【００５４】
真核生物のグリコシルトランスフェラーゼと同様に、本発明に従い融合ポリペプチドを構築するのに使用され得る他の原核生物のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸は容易に入手し得る。
【００５５】
（Ｂ．ヌクレオチド糖の形成に関与する補助酵素）
本発明の融合ポリペプチドは、グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用ドメイン（複数）に加えて、補助酵素由来の少なくとも１つの触媒作用ドメインを含む。補助酵素は、例えば、ヌクレオチド糖の形成に関与するこれらの酵素を含む。例えば、補助酵素は、ヌクレオチドへの糖の付着に関与し得るか、または糖またはヌクレオチドを生成することに関与し得る。ヌクレオチド糖は、一般的に、特定の融合ポリペプチドのグリコシルトランスフェラーゼの触媒作用ドメインにより単糖供与体として利用される。グリコシルトランスフェラーゼにより糖供与体として使用されるヌクレオチド糖の例は、例えば、特に、ＧＤＰ−Ｍａｎ、ＵＤＰ−Ｇｌｃ、ＵＤＰ−Ｇａｌ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＣＭＰ−シアル酸、ＵＤＰ−キシロース、ＧＤＰ−Ｆｕｃ、ＧＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、を含む。
【００５６】
ヌクレオチド糖の合成に関与する補助酵素は、当業者に周知である。細菌の多糖類合成および遺伝子の命名法の総説については、例えば、Ｒｅｅｖｅｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：４９５−５０３（１９９６）を参照のこと。グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を得るための上記の方法はまた、ヌクレオチド糖の形成に関与する酵素をコードする核酸を得ることに応用し得る。例えば、当業者に公知の核酸の１つを（これらのいくつかは、以下に列挙される）、直接またはプローブとして使用して、目的の他の生物体由来の対応する核酸を単離し得る。
【００５７】
１つの例として、ガラクトシル化した可溶性のオリゴ糖を生成するために、ガラクトシルトランスフェラーゼが、しばしば使用される。しかし、一般的に、ガラクトシルトランスフェラーゼは、ガラクトース供与体として活性化ヌクレオチド糖ＵＤＰ−Ｇａｌ（これは比較的高価である）を使用する。反応の支出を削減するために、ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒作用ドメインおよびＵＤＰ−Ｇａｌを生じる生合成経路に関与する補助酵素の１つに由来する触媒作用ドメインもまた有する１つ以上の融合ポリペプチドを構築し得る。例えば、グルコキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１２）は、グルコースのリン酸化を触媒して、Ｇｌｃ−６−Ｐを形成する。グルコキナーゼをコードする遺伝子は、特徴づけされている（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＥ０００４９７  Ｕ０００９６、Ｂｌａｔｔｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：１４５３−１４７４（１９９７）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ９９１２４，ＡＬ００９１２６、Ｋｕｎｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９０、２４９−２５６（１９９７））、従って、例えば、ハイブリダイゼーションまたは増幅により、多くの生物体から容易に入手し得る。従って、この酵素由来の触媒作用ドメイン、ならびに以下に示すような経路における後の酵素の触媒作用ドメインを含む融合ポリペプチドは、容易に入手可能なグルコースからＵＤＰ−グルコースを形成し得、これは生物体により生成されるか、反応混合物に添加されるかのいずれかであり得る。
【００５８】
ＵＤＰ−Ｇａｌを生じる経路における次の工程は、ホスホグルコムターゼ（ＥＣ５．４．２．２）により触媒され、これは、Ｇｌｃ−６−ＰをＧｌｃ−１−Ｐへ変換する。さらに、この酵素をコードする遺伝子は、広範な生物体に関して特徴づけされている（例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ：ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ０３３８５６、Ｕｔｔａｒｏら、Ｇｅｎｅ  １５０：１１７−１２２（１９９４）［公開された、正誤表が、Ｇｅｎｅ（１９９５）１５５：１４１−３に認められる］；Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｙ１４４４４、Ｏｒｔｎｅｒら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．９０，１２１−１２９（１９９７）；Ｍｅｓｅｍｂｒｙａｎｔｈｅｍｕｍ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｕｍ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ８４８８８；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ７２０１６，Ｕ０９４９９，Ｘ７４８２３，Ｂｏｌｅｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２０：８３−９６（１９９４）、Ｆｕら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７（１１），３０８７−３０９４（１９９５）；ヒト：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ８３０８８（ＰＧＭ１）、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４１１−４１５（１９９２）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ８３２３１、Ｋｏｅｐｌｉｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：１９１−１９９（１９９２）；Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ２４０７７、Ｂｒａｕｔａｓｅｔら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４０（Ｐｔ５）、１１８３−１１８８（１９９４）；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ０２４９０、Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１５）、１１１６２−１１１６９（１９９４）。
【００５９】
ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（ＥＣ２．７．７．９）は、その経路の次の工程（Ｇｌｃ−１−ＰからＵＤＰ−Ｇｌｃへの変換）を触媒する。ＵＤＰ−Ｇｌｃピロホスホリラーゼをコードする遺伝子は、多くの生物体について記載されている（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ９８８３０、Ｗｅｉｓｓｂｏｒｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：２６１１−２６１８（１９９４）；Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ：ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ００４３６８、Ｆｌｏｒｅｓ−Ｄｉａｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２３７８４−２３７９１（１９９７）；Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ７６５４８、Ｂｒｅｄｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３、７０４２−７０４５（１９９１）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ｇａｌＵ）：ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＪ０１０７３４、Ｕ０３７５１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＪ００４８６９；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ２２５１６、Ｌ１２２７２；Ｓｏｌｄｏら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１３９（Ｐｔ１２）、３１８５−３１９５（１９９３）；Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ２０３４５、Ｌ７７０９２、Ｌ７７０９４、Ｌ７７０９５、Ｌ７７０９６、Ｌ７７０９８、Ｕ５９１８２、Ｋａｔｓｕｂｅら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０８：３２１−３２６（１９９０）；Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ（ｂａｒｌｅｙ）：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ９１３４７；Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ３２８１１、Ｓａｎｄｌｉｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：２２９−２３７（１９９５）；ヒト：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ２７４６０、Ｄｕｇｇｌｅｂｙら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３５（１−２）、１７３−１７９（１９９６）；ウシ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ１４０１９、Ｋｏｎｉｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４、６１−６８（１９９３）。
【００６０】
最後に、ＵＤＰ−Ｇｌｃ４’−エピメラーゼ（ＵＤＰ−Ｇａｌ４’−エピメラーゼ；ＥＣ５．１．３．２）は、ＵＤＰ−ＧｌｃからＵＤＰ−Ｇａｌへの変換を触媒する。Ｐｏｏｌｍａｎら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：４０３７−４０４７（１９９０））により記載される、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＵＤＰガラクトース４−エピメラーゼ遺伝子は、本発明において有用である遺伝子の特定な例である。ＵＤＰグルコース４−エピメラーゼをコードする例示的な遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ、およびＥ．ｓｔｅｗａｒｔｉｉ、ならびにＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種の遺伝子を含む。ヌクレオチド配列は、いくつかの生物体由来のＵＤＰ−Ｇｌｃ４’−エピメラーゼについて知られ、以下を参照のこと含む：
【００６１】
【数１】
0004634606.tif 000002
しばしば、ヌクレオチド糖合成に関与する経路を構成する酵素をコードする遺伝子は、単一オペロンまたは染色体ＤＮＡの領域中に見出される。例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓホスホグルコムターゼ、ホスホマンノムターゼ、（ｘａｎＡ）、ホスホマンノースイソメラーゼ、およびＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ（ｘａｎＢ）遺伝子は、単一の連続した核酸フラグメントに見出される（Ｋｏｅｐｌｉｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４、１９１−１９９（１９９２））。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅガラクトキナーゼ、ガラクトース−１−ホスフェート、ウリジルトランスフェラーゼ、およびＵＤＰ−ガラクトース４’−エピメラーゼはまた、単一のオペロンで見出された（Ｐｅｎｇら、（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１２：６０４−６０８）。多くの他の例が、本明細書中に引用される参考文献に記載される。
【００６２】
他のガラクトシルトランスフェラーゼ融合ポリぺプチドは、Ｇａｌ−１−ＰをＵＤＰ−Ｇａｌに転化する、ＵＤＰ−Ｇａｌピロホスホリラーゼ（ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ）に由来する触媒ドメインを含み得る。ＵＤＰ−Ｇａｌピロホスホリラーゼをコードする遺伝子は、いくつかの生物体について特徴付けられている（例えば、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ０５５４１，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈら，ＤＮＡ  Ｓｅｑ，３：３１１〜３１８（１９９３）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ：ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ００５９３３（ガラクトキナーゼ（ｇａｌＫ）、ＵＤＰ−ガラクトース  ４−エピメラーゼ（ｇａｌＥ）、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ｇａｌＴ）のクラスター），Ｂｅｔｔｅｎｂｒｏｃｋら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：２０１３−２０１９（１９９８）；Ｅ．ｃｏｌｉ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ０６２２６（ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼおよびガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼに対するｇａｌＥおよびｇａｌＴ），Ｌｅｍａｉｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：７７０５−７７１１（１９８６）；Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ９９１２３  ＡＬ００９１２６；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ５００２３、Ｕｌｌｒｉｃｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：６９０２−６９０９（１９９５）；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ６５９３４（ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ムタロターゼリプレッサーおよびガラクトースリプレッサーのクラスター）、Ｍａｓｋｅｌｌら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：３０５１−３０６３（１９９２）、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ１２３４８およびＭ１２９９９、Ｔａｊｉｍａら、Ｙｅａｓｔ  １：６７−７７（１９８５）；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ８１３２４、Ｓｃｈａａｆｆ−Ｇｅｒｓｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒら、Ｙｅａｓｔ  １１：７９−８３（１９９５）；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ４１２８２；ｈｕｍａｎ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ９６２６４、Ｍ１８７３１、Ｌｅｓｌｉｅら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １４：４７４−４８０（１９９２）、Ｒｅｉｃｈａｒｄｔら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．５：１０７−１２２（１９９８）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ：Ｍ１８９５３（ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース  ４−エピメラーゼ、およびガラクトキナーゼ）、Ａｄａｍｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：２０３−２１２（１９８８）が挙げられる）。
【００６３】
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃへの転化およびその逆反応を触媒する、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４’ エピメラーゼ（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ４’ エピメラーゼ）（ＥＣ  ５．１．３．７）の触媒ドメインはまた、本発明の融合ポリぺプチドの使用に適している。この酵素をコードするいくつかの遺伝子座は上記の通りである（米国特許第５，５１６，６６５号もまた参照のこと）。
【００６４】
本発明によって提供される融合ポリぺプチドの別の実施例は、フコシル化可溶性オリゴ糖の産生のために使用される。フコシルトランスフェラーゼのための供与体ヌクレオチド糖は、ＧＤＰ−フコースであり、これは産生するのに高価である。フコシル化オリゴ糖の産生コストを減少するために、本発明は、安価なＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−フコースに変換し得、次いでフコースの受容体単糖への転化を触媒し得る、融合ポリペプチド提供する。これらの融合ポリぺプチドは、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース３，５−エピメラーゼ、またはＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｌ−グルコース  ４−レダクターゼの少なくとも１つの触媒ドメインを含む。これらの各々の酵素活性が提供された場合、ＧＤＰ−マンノースはＧＤＰ−フコースに転化され得る。
【００６５】
ＧＤＰ−フコース合成酵素をコードする、Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列は、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎらによって記載される（（１９９６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：４８８５−４８９３；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３８４７３）。この遺伝子クラスターは、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼに対するオープンリーディングフレームを含むことが報告された（８６３３〜９７５４ヌクレオチド；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、前出）。最近、この遺伝子クラスターはまた、３，５エピマー化および４−レダクターゼ活性を有する酵素をコードするオープンリーディングフレームを含み（同一人に譲渡された米国仮特許出願番号６０／０７１，０７６，１９９８年１月１５日出願を参照のこと）、従って、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ反応（ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース）の産物をＧＤＰ−フコースに転化し得ることが発見された。ＹＥＦ  Ｂと呼ばれるこのＯＲＦは、９７５７〜１０７２２のヌクレオチド間で見出される。ＹＥＦ  Ｂが２つの活性を有する酵素をコードするというこの開示以前は、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースのＧＤＰ−フコースへの転化に、１つまたは２つの酵素が必要とされるかどうかは知られていなかった。ヒトＦｘ酵素をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ５８７６６に見出される。
【００６６】
マンノシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン、およびＭａｎ−１−ＰをＧＤＰ−Ｍａｎに転化するＧＤＰ−Ｍａｎピロホスホリラーゼ（ＥＣ  ２．７．７．２２）の触媒ドメインを含む融合ポリぺプチドもまた、提供される。多数の生物体由来の適切な遺伝子は知られている（Ｅ．ｃｏｌｉ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ１３６２９、ＡＢ０１０２９４、Ｄ４３６３７、Ｄ１３２３１、Ｂａｓｔｉｎら、Ｇｅｎｅ  １６４：１７−２３（１９９５）、Ｓｕｇｉｙａｍａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：２７７５−２７７８（１９９８）、Ｓｕｇｉｙａｍａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４０（Ｐｔ１）：５９−７１（１９９４）、Ｋｉｄｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：２１７８−２１８７（１９９５）；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ０１０２９６、ＡＢ０１０２９５、Ｓｕｇｉｙａｍａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０；２７７５−２７７８（１９９８）；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ５６７９３  Ｍ２９７１３、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：４８８５−４８９３（１９９６）が挙げられる）。
【００６７】
単糖受容体のフルコシル化に関する本発明の融合ポリペプチドはまた、ＧＤＰ−フコース形成のための、微量または「除去（ｓｃａｖｅｎｇｅ）」経路を提供する酵素を利用し得る。この経路では、遊離のフコースは、フコキナーゼによってリン酸化されフコース１−リン酸を形成し、これは、グアノシン５’−三リン酸（ＧＴＰ）と共に、ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼによって使用され、ＧＤＰ−フコースを形成する（Ｇｉｎｓｂｕｒｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３６：２３８９−２３９３（１９６１）およびＲｅｉｔｍａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５：９９００−９９０６頁（１９８０））。従って、フコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインは、ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼに由来する触媒ドメインに連結され得、適切な核酸は、１９９７年４月９日出願の同時係属の同一人に譲渡された米国特許出願番号０８／８２６，９６４に記載される。フコキナーゼをコードする核酸は、例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：４９６−５１２）およびＥ．ｃｏｌｉ（ＬｕおよびＬｉｎ（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４８８３−４８８４）について記載されている。
【００６８】
糖リン酸をヌクレオチド糖に転化する他のピロホスホリラーゼが公知である。例えば、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃピロホスホリラーゼは、ＧａｌＮＡｃのＵＤＰ−ＧａｌＮａｃへの転化を触媒する。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ（ＥＣ  ２．７．７．２３）は、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに転化する（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ９９１０４  ＡＬ００９１２６、Ｋｕｎｓｔら、前出；Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ：ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ０１１００３、Ｍｉｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（２３）、１４３９２−１４３９７（１９９８）；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ０１１２７２、Ｍｉｏら、前出；ｈｕｍａｎ：ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ０１１００４、Ｍｉｏら、前出）。これらはまた、本発明の融合ポリぺプチドに使用され得る。
【００６９】
本発明はまた、シアリル化反応に有用である融合ポリぺプチドを提供する。これらの融合ポリぺプチドは、シアリルトランスフェラーゼ由来の触媒ドメインおよびＣＭＰ−シアル酸シンテターゼ（ＥＣ  ２．７．７．４３、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ）由来の触媒ドメインを含む。このような遺伝子は、例えば、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＪ００６２１５，Ｍｕｎｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：９１４０−９１４５（１９９８））、ラット（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ａｐａｒｉｃｉｏら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９２５７−６３）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ（Ｔｕｌｌｔｕｓら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１５３７３−８０）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｇａｎｇｕｌｉら（１９９４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：４５８３−９）、Ｂ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（Ｈａｆｔら（１９９４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：７３７２−４）、およびＥ．ｃｏｌｉ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｊ０５０２３、Ｚａｐａｔａら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４７６９−１４７７４）から利用可能である。あるいは、シアリル化反応のための融合タンパク質は、ＧｌｃＮＡｃをＭａｎＮＡｃに転化するＧｌｃＮＡｃ２’ エピメラーゼ（ＥＣ  ５．１．３．８）およびＭａｎＮＡｃを順番にシアル酸に転化するノイラミ酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．３．３；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ登録番号Ｐ０６９９５）のいずれか、または両方に由来する触媒ドメインを有し得る。
【００７０】
触媒ドメインを入手し得るさらなる補助酵素は、グリコシルトランスフェラーゼ回路で消費される反応物の形成に関連する。例えば、任意のいくつかのリン酸キナーゼは、補助酵素として有用である。ポリリン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．４．１）は、例えば、ＡＴＰの形成を触媒する；ヌクレオシドリン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．４．４）は、それぞれのヌクレオシド二リン酸を形成し得る；クレアチンリン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．３．２）；ミオキナーゼ（ＥＣ  ２．７．４．３）；Ｎ−アセチルグルコサミンアセチルキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．５９）；アセチルリン酸キナーゼ；およびピルビン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．４０）。
【００７１】
（Ｃ．グリコシルトランスフェラーゼおよび補助酵素の核酸のクローニング）  グリコシルトランスフェラーゼおよび補助酵素をコードする核酸、およびこのような核酸を得る方法は、当業者に公知である。適切な核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノム、または部分配列（プローブ））は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅システム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ：ＴＡＳ）、自己持続配列複製システム（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ：ＳＳＲ）のようなインビトロ方法によってクローンニングまたは増幅され得る。クローニングおよびインビトロ増幅の広範な種々の方法論は、当業者に周知である。多数のクローニング演習を通じて当業者を指示するに十分な、これらの技術および説明の例は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋら）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃとの間の合弁企業（１９９４補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）；Ｃａｓｈｉｏｎら、米国特許第５，０１７，４７８号；およびＣａｒｒ、欧州特許第０，２４６，８６４号において見出される。
【００７２】
グリコシルトランスフェラーゼおよび補助酵素ポリぺプチドをコードするＤＮＡ、またはその部分配列は、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限を含む、上記の任意の適切な方法によって調製され得る。１つの好ましい実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼまたは補助酵素をコードする核酸は、慣用的なクローニング方法によって単離され得る。例えばＧｅｎＢａｎｋまたは他の配列データベース（上述）に提供されるグリコシルトランスフェラーゼまたは補助酵素のヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡサンプルにおいてグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子または補助酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブ、または総ＲＮＡサンプルにおいてグリコシルトランスフェラーゼｍＲＮＡおよび補助酵素ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを提供するために使用され得る（例えば、サザンブロットまたはノーザンブロットにおいて）。いったん、標的グリコシルトランスフェラーゼ核酸または補助酵素核酸が同定されると、それらは、当業者に公知の標準的な方法に従って単離され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｔｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２巻：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；またはＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ  ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇおよびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。あるいは、部分配列はクローニングされ、そして適切な部分配列は適切な制限酵素を使用して切断され得る。次いで、このフラグメントは、所望のＤＮＡ配列を産生するために連結され得る。
【００７３】
グリコシルトランスフェラーゼの核酸はまた、物理学的、化学的、または免疫学的な特性に基づくアッセイによって、発現された産物を検出することによってクローニングされ得る。例えば、核酸によってコードされるポリぺプチドの、単糖の供与体から受容体部分への移動を触媒する能力によって、クローンニングされたグリコシルトランスフェラーゼの核酸を同定し得る。好ましい方法において、キャピラリー電気泳動が反応産物を検出するために使用される。この高感度なアッセイは、フルオレセインで標識された単糖類アミノフェニル誘導体または二糖類アミノフェニル誘導体のいづれかの使用に関する（これらの誘導体は、Ｗａｋａｒｃｈｕｋら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４５）：２８２７１−２７６に記載される）。例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌｇｔＣ酵素についてのアッセイのために、ＦＣＨＡＳＥ−ＡＰ−ＬａｃまたはＦＣＨＡＳＥ−ＡＰ−Ｇａｌのいずれかが使用され得るのに対し、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌｇｔＢ酵素については、適切な薬剤はＦＣＨＡＳＥ−ＡＰ−ＧｌｃＮＡｃである（同書）。
【００７４】
グリコシルトランスフェラーゼまたは補助酵素の遺伝子またはｃＤＮＡをクローニングすることの代替えとして、グリコシルトランスフェラーゼの核酸は、グリコシルトランスフェラーゼをコードする公知の配列から化学的に合成され得る。適切な方法として、リン酸トリエステル方法（Ｎａｒａｎｇら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９）；リン酸ジエステル方法（Ｂｒｏｗｎら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１）；ジエチルホスホラミダイト方法（Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−１８６２）；および固体支持体方法（米国特許第４，４５８，０６６号）が挙げられる。化学合成は一本鎖オリゴヌクレオチドを産生する。これは、相補配列とのハイブリダイゼーションによって、またはテンプレートとして一本鎖を使用するＤＮＡポリメラーゼとの重合反応によって、二本鎖ＤＮＡに変換され得る。ＤＮＡの化学合成は頻繁に、約１００塩基の配列に限定されるが、より長い配列はより短い配列の連結によって入手され得ることを当業者は理解する。
【００７５】
グリコシルトランスフェラーゼおよび補助酵素の核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のようなＤＮＡ増幅方法を使用してクローニングされ得る。従って、例えば、核酸配列または部分配列は、１つの制限部位（例えば、ＮｄｅＩ）を含むセンスプライマー、および他の制限部位（例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ）を含むアンチセンスプライマーを使用してＰＣＲ増幅される。これは、所望のグリコシルトランスフェラーゼまたは補助酵素の配列または部分配列をコードし、末端制限部位を有する核酸を産生する。次いで、この核酸は、第２の分子をコードする核酸を含み、そして適切に対応する制限部位を有するベクターに容易に連結され得る。適切なＰＣＲプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の供給源で提供される配列情報を使用して、当業者によって決定され得る。適切な制限部位はまた、部位特異的変異誘発によって、グリコシルトランスフェラーゼのタンパク質またはタンパク質部分配列をコードする核酸に付加され得る。グリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列または部分配列を含むプラスミドは、適切な制限エンドヌクレアーゼで切断され、次いで、標準的な方法に従って、増幅および／または発現に適切なベクターに連結される。インビトロでの増幅を通じて当業者を指示するに十分な技術の例は、Ｂｅｒｇｅｒ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＡｕｓｕｂｅｌ、ならびにＭｕｌｌｉｓら（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；ＡｒｎｈｅｉｍおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃ＆ＥＮ  ３６−４７；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１−９４；（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７、１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３５：１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２９１−２９４；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ  ４：５６０；ならびにＢａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９：１１７。
【００７６】
特定の核酸から発現されたポリぺプチドの他の物理学的特性は、公知のグリコシルトランスフェラーゼまたは補助酵素の特性と比較され、適切な核酸を同定する別の方法を提供し得る。あるいは、推定上のグリコシルトランスフェラーゼまたは補助酵素の遺伝子は変異され得、そしてグリコシルトランスフェラーゼまたは補助酵素としてのその役割は、グリコシルトランスフェラーゼまたは補助酵素によって正常に産生されたオリゴ糖の構造における変異を検出することによって確立され得る。
【００７７】
いくつかの実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼおよび／または補助酵素の核酸を改変することが望まれ得る。当業者は、所定の核酸構築物における変化を産生する多くの方法を認識する。このような周知の方法としては、部位特異的変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲ増幅、核酸を含む細胞の変異原性薬剤または放射線への曝露、所望のオリゴヌクレオチドの化学的合成（例えば、大きな核酸を産生するための連結および／またはクローニングと組み合わせ）、および他の周知技術が挙げられる。ＧｉｌｉｍａｎおよびＳｍｉｔｈ（１９７９）Ｇｅｎｅ  ８：８１−９７、Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１−７３４を参照のこと。
【００７８】
例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよび／または補助酵素の核酸は、本発明の融合ポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドを得るために、２つのドメインの連結を促進するように改変され得る。このような方法によって改変された、グリコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインおよび補助酵素触媒ドメインはまた、本発明の一部である。例えば、システイン残基に対するコドンは、ドメインのいずれかの末端に配置され得、その結果、ドメインは、例えばスルフィド結合によって連結され得る。改変は、組換え方法または化学的方法のいずれかを使用して実施され得る（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．カタログ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）。グリコシルトランスフェラーゼおよび／または補助酵素の触媒ドメインは、代表的には、このリンカードメインは、代表的には、約５〜２００アミノ酸、代表的には、約１０〜１００アミノ酸の間のポリグリシンリンカードメインによって結合される配列のようなポリぺプチド配列である。いくつかの実施態様において、プロリン残基は、リンカーによって、有意な二次構造エレメントの形成を妨げるようにリンカー中に組み込まれる。好ましいリンカーは、頻繁には、組換え融合タンパク質の一部として合成された可撓性アミノ酸部分配列である。１つの実施態様において、可撓性リンカーは、Ｇｌｙ（ｘ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（ｘ）（ｘは約３〜約１００の間の番号である）のようなプロリンを含むアミノ酸部分配列である。他の実施態様において、化学的リンカーを使用して、合成的または組換え的に産生された、グリコシルトランスフェラーゼおよび補助酵素の触媒ドメインを結合する。このような可撓性リンカーは当業者に公知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａから入手可能である。これらのリンカーは、必要に応じて、アミド結合、スルフヒドリル結合、またはヘテロ機能性（ｈｅｔｅｒｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）結合を有する。
【００７９】
好ましい実施態様において、本発明の細胞に存在する組換え核酸は、選択された生物において、核酸の転写を増強する好ましいコドンを提供するために改変される（例えば、酵母の好ましいコドンは、酵母における発現のためのコード核酸に置換される）。
【００８０】
（Ｄ．融合ポリぺプチドの発現のための発現カセットおよび宿主細胞）
代表的には、融合ポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドは、所望の宿主細胞において機能的であるプロモーターの制御下に置かれる。非常に広範な種々のプロモーターが周知であり、これらは、特定の用途に依存して本発明の発現ベクターに使用され得る。通常、選択されるプロモーターは、そのプロモーターが活性である細胞に依存する。リボソーム結合部位、転写終結部位などのような他の発現制御配列はまた、必要に応じて含まれる。これらの１つ以上の制御配列を含む構築物は、「発現カセット」と呼ばれる。従って、本発明は、融合ポリぺプチドをコードする核酸が、所望の宿主細胞において高レベル発現のために組み込まれた発現カセットを提供する。
【００８１】
特定の宿主細胞での使用に適切である発現制御配列は、細胞で発現される遺伝子のクローニングによって、頻繁に得られる。通常使用される原核生物の制御配列は、リボソーム結合部位配列と共に転写開始に関するプロモーター、必要に応じてオペレーターとともに含むように本明細書において定義され、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）１９８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８０）８：４０５７）、ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８３）８０：２１−２５）；およびλ由来ＰLプロモーターおよびＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）のような通常使用されるプロモーターを含む。特定のプロモーター系は、本発明にとって重要ではなく、原核生物において機能する任意の利用可能なプロモーターが使用され得る。
【００８２】
Ｅ．ｃｏｌｉ以外の原核生物細胞での融合ポリぺプチドの発現のために、特定の原核生物種において機能するプロモーターが要求される。このようなプロモーターは、その種からクローニングされた遺伝子から入手され得るか、または異種プロモーターが使用され得る。例えば、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉに加えて、Ｂａｃｉｌｌｕｓにおいて機能する。
【００８３】
リボソーム結合部位（ＲＢＳ）は、本発明の発現カセットに都合よく含まれる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＲＢＳは、開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する３〜９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列からなる（ＳｈｉｎｅおよびＤａｌｇａｒｎｏ、Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５４：３４；Ｓｔｅｉｔｚ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編）、第１巻、３４９頁、１９７９、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ＮＹ）。
【００８４】
酵母における融合ポリペプチドの発現について、都合のよいプロモーターは、ＧＡＬ１〜１０（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＤａｖｉｅｓ（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４４０〜１４４８）、ＡＤＨ２（Ｒｕｓｓｅｌｌら、（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４〜２６８２）、ＰＨＯ５（ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８２）６：６７５〜６８０）、ならびにＭＦα（ＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚおよびＯｓｈｉｍａ（１９８２）Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ、Ｊｏｎｅｓ、およびＢｒｏａｃｈ編）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１８１〜２０９頁）を含む。酵母における使用のための別の適切なプロモーターは、Ｃｏｕｓｅｎｓら、Ｇｅｎｅ  ６１：２６５〜２７５（１９８７）に記載されるようなＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨハイブリッドプロモーターである。例えば、真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの系統（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許第４，９３５，３４９号）のような糸状真菌について、有用なプロモーターの例は、ＡＤＨ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２０９３〜２０９９（１９８５））およびｔｐｌＡプロモーターのようなＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  解糖系遺伝子由来のプロモーターを含む。適切なターミネーターの例は、ＡＤＨ３ターミネーターである（ＭｃＫｎｉｇｈｔら）。
【００８５】
植物における使用のための適切な構成的プロモーターは、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域および領域ＶＩプロモーター、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡ由来の１’プロモーターまたは２’プロモーター、および当業者に公知である植物細胞において活性である他のプロモーターを含む。他の適切なプロモーターは、Ｆｉｇｗｏｒｔモザイクウイルス由来の全長転写プロモーター、アクチンプロモーター、ヒストンプロモーター、チューブリンプロモーター、またはマンノピン（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ）シンターゼプロモーター（ＭＡＳ）を含む。他の構成的な植物プロモーターは、とりわけ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（ＳｕｎおよびＣａｌｌｉｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１１（５）：１０１７〜１０２７（１９９７））、ｍａｓ、ＭａｃまたはＤｏｕｂｌｅＭａｃプロモーター（米国特許第５，１０６，７３９号およびＣｏｍａｉらによるＰｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：３７３〜３８１（１９９０）に記載）由来の種々のユビキチンまたはポリユビキチンプロモーター、ならびに当業者に公知である種々の植物遺伝子由来の他の転写開始領域を含む。このような遺伝子は、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のＡＣＴ１１（Ｈｕａｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：１２５〜１３９（１９９６））、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のＣａｔ３（ＧｅｎＢａｎｋ番号、Ｕ４３１４７、Ｚｈｏｎｇら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５１：１９６〜２０３（１９９６））、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ由来のステアロイル（ｓｔｅａｒｏｙｌ）−アシルキャリアタンパク質不飽和化酵素をコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｘ７４７８２、Ｓｏｌｏｃｏｍｂｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１１６７〜１１７６（１９９４））、トウモロコシ由来のＧＰｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｘ１５５９６、Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０８：５５１〜５６５（１９８９））、ならびにトウモロコシ由来のＧｐｃ２（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ４５８５５、Ｍａｎｊｕｎａｔｈら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：９７〜１１２（１９９７））を含む。植物についての有用なプロモーターはまた、植物細胞、植物ウイルス、またはプロモーターが植物で機能的であることが見出されている他の宿主由来のＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドから得られるプロモーターを含む。植物で機能し、従って本発明の方法における使用に適切である細菌プロモーターは、オクトピン（ｏｃｔｏｐｉｎｅ）シンテターゼプロモーター、ノパリン（ｎｏｐａｌｉｎｅ）シンターゼプロモーター、およびマノピン（ｍｏｎｏｐｉｎｅ）シンテターゼプロモーターを含む。適切な内因性の植物プロモーターは、リブロース−１，６−ビホスフェート（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）プロモーター、（α−コングリシニンプロモーター、ファゼオリンプロモーター、ＡＤＨプロモーター、および熱ショックプロモーターを含む。
【００８６】
構成的かまたは調節されるプロモーターのいずれかを、本発明で使用し得る。調節されるプロモーターは、融合ポリペプチドの発現が誘導される前に宿主細胞が高密度に増殖され得るために有利であり得る。異種タンパク質の高レベルの発現は、いくつかの状況で細胞増殖を遅らせる。誘導性プロモーターは、発現のレベルが、例えば、温度、ｐＨ、嫌気性または好気性条件、光、転写因子および化学薬品のような環境性および発達性因子によって変化し得る、遺伝子の発現を指向するプロモーターである。このようなプロモーターは、本明細書中で「誘導性」プロモーターとして呼ばれ、このことは、ヌクレオチド糖合成に関するグリコシルトランスフェラーゼまたは酵素の発現のタイミングを制御することを可能にする。Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌宿主については、誘導性プロモーターは、当業者に公知である。これらは、例えば、ｌａｃプロモーター、バクテリオファージλＰLプロモーター、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター（Ａｍａｎｎら、（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２５：１６７；ｄｅ  Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１）、およびバクテリオファージＴ７プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１０７４〜８）を含む。これらのプロモーターおよびそれらの使用は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、において記載される。原核生物中での発現について特に好ましい誘導性プロモーターは、ガラクトース代謝に関与する酵素をコードする遺伝子（単数または複数）（例えば、ＵＤＰガラクトース４−エピメラーゼ遺伝子（ｇａｌＥ）由来のプロモーター）から得られるプロモーター成分に連結されたｔａｃプロモーター成分を含む二重（ｄｕａｌ）プロモーターである。ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ９８／２０１１１号に記載される二重ｔａｃ−ｇａｌプロモーターは、いずれかのプロモーターが単独で提供された場合よりも強い発現レベルを提供する。
【００８７】
植物における使用のための誘導性プロモーターは、当業者に公知であり（例えば、Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒら（１９８７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８：２２１中で引用される参考文献を参照のこと）、そして光誘導性かつ光合成組織でのみ活性である、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの１，５−リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子プロモーター（「ｓｓｕ」プロモーター）、葯特異的プロモーター（ＥＰ３４４０２９）、および例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの種子特異的プロモーター（Ｋｒｅｂｂｅｒｓら（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：８５９）を含む。
【００８８】
他の生物体についての誘導性プロモーターはまた、当業者に周知である。これらは、例えば、アラビノースプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、メタロチオネインプロモーター、および熱ショックプロモーター、ならびに多数の他のプロモーターを含む。
【００８９】
適切な宿主細胞に置かれた場合、ポリヌクレオチドの発現を駆動する遺伝子発現制御シグナルに作動可能に連結された目的のポリヌクレオチドを含む構築物は、「発現カセット」と呼ばれる。本発明の融合ポリペプチドをコードする発現カセットは、しばしば宿主細胞に導入する発現ベクター中に配置される。このベクターは、代表的には、発現カセットに加えて、このベクターが１つ以上の選択された宿主細胞中で独立して複製し得るようにする核酸配列を含む。一般的に、この配列は、このベクターが宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製することを可能にし、そして複製起点または自己複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌について周知であり、例えば、プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に対して適切である。あるいは、このベクターは、宿主細胞ゲノム補体に組み込まれ、そして細胞がＤＮＡ複製を行うときに複製されることによって、複製し得る。細菌細胞での酵素の発現のために好ましい発現ベクターは、ｐＴＧＫである。このｐＴＧＫは、二重ｔａｃ−ｇａｌプロモーターを含み、そしてＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ９８／２０１１１号に記載される。
【００９０】
ポリヌクレオチド構築物の構築は、一般に、細菌中で複製し得るベクターの使用を必要とする。多くのキットは、細菌からのプラスミドの精製のために市販されている。それらの適切な使用については、製造業者の指示に従う（例えば、両方ともＰｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｏｔｅｃｈからのＥａｓｙＰｒｅｐＪ、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐＪ；ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＳｔｒａｔａＣｌｅａｎＪ；およびＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｑｉａｇｅｎを参照のこと）。次いで、この単離かつ精製されたプラスミドをさらに操作し、他のプラスミドを産生し、そしてトランスフェクト細胞に使用し得る。ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ中でのクローニングもまた、可能である。
【００９１】
選択マーカーは、しばしば、本発明のポリヌクレオチドを発現するために使用される発現ベクターに組み込まれる。これらの遺伝子は、選択的な培養培地中で増殖した形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要であるタンパク質のような、遺伝子産物をコードし得る。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培養培地中で生存しない。代表的な選択遺伝子は、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリンのような抗生物質または他の毒素に抵抗性を与えるタンパク質をコードする。あるいは、選択マーカーは、栄養素要求株欠損を補うか、または複合培地からは利用可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードし得る（例えば、ＢａｃｉｌｌｉのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。しばしば、このベクターは、例えば、宿主細胞内に導入されている前に、ベクターが複製されるＥ．ｃｏｌｉまたは他の細胞において機能する１つの選択マーカーを有する。多数の選択マーカーは、当業者に公知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら、前出、中に例示として記載される。細菌細胞中での使用のための好ましい選択マーカーは、カナマイシン抵抗性マーカーである（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ  １９：２５９（１９８２））。カナマイシン選択の使用は、例えば、アンピシリン選択に対して有利である。なぜならば、アンピシリンは、培養培地中のβラクタマーゼにより急速に分解され、従って、選択圧を取り除き、そしてこの培養物がそのベクターを含まない細胞の過増殖になることを可能にするからである。
【００９２】
哺乳動物細胞での使用のための適切な選択マーカーは、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）、または薬物耐性を与える原核生物遺伝子、真菌フェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）で選択され得るｇｐｔ（キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）；Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはピューロマイシンで選択され得るｎｅｏ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）；およびメトトレキセートで選択され得る、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２；ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７）。
【００９３】
植物および／または他の真核生物細胞に対する選択マーカーは、しばしば、例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシンもしくはクロラムフェニコールのような殺生剤または抗生物質に対する耐性、あるいはクロルスルフロン（ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ）またはＢａｓｔａに対する耐性のような除草剤耐性を与える。選択マーカーについての適切なコード配列の例は、以下である：抗生物質のカナマイシンに対する耐性を与える酵素のネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするｎｅｏ遺伝子（Ｂｅｃｋら（１９８２）Ｇｅｎｅ  １９：３２７）；酵素のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードし、かつ抗生物質のハイグロマイシンに対する耐性を与える、ｈｙｇ遺伝子（ＧｒｉｔｚおよびＤａｖｉｅｓ（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２５：１７９）；ならびに除草剤化合物（フォスフィノスリシンおよびビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）に対する耐性を与えるフォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするｂａｒ遺伝子（ＥＰ２４２２３６）。
【００９４】
１つ以上の上記の成分を含む適切なベクターの構築は、上記の参考文献に記載されるように標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを切断し、調製し、そして必要とされるプラスミドを生成するために所望の形態で再連結する。プラスミド構築物中の正確な配列を確認するために、このプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼ消化、および／または公知の方法に従う配列決定のような、標準的な技術によって分析し得る。これらの目的を達成するための分子クローニング技術は、当該分野で公知である。組換え核酸の構築に適切である、広範な種々のクローニング方法およびインビトロ増幅方法は、当業者に周知である。多数のクローニングの実施を通じて当業者を導くために十分なこれらの技術および指示の例は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ．ら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との共同事業（１９９８補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）。
【００９５】
本発明の発現ベクターを構築するための開始材料として使用に適切である種々の共通なベクターは、当該分野で周知である。細菌でのクローニングについては、共通のベクターは、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴTM、およびλ−ファージ由来ベクターのようなｐＢＲ３２２由来ベクターを含む。酵母において、ベクターは、酵母組込みプラスミド（例えば、ＹＩｐ５）および酵母複製プラスミド（ＴＲｐ系列プラスミド）およびｐＧＰＤ−２を含む。哺乳動物細胞中での発現は、ｐＳＶ２、ｐＢＣ１２ＢＩ、およびｐ９１０２３、ならびに溶菌性ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびバキュロウイルス）、エピソームウイルスベクター（例えば、ウシパピローマウイルス）、およびレトロウイルスベクター（例えば、マウスのレトロウイルスベクター）を含む、種々の一般に利用可能なプラスミドを使用して達成され得る。
【００９６】
選択された宿主細胞に発現ベクターを導入するための方法は、特に重要ではなく、このような方法は、当業者に公知である。例えば、発現ベクターは、塩化カルシウム形質転換によってＥ．ｃｏｌｉを含む原核生物細胞に、およびリン酸カルシウム処理またはエレクロトポレーションによって真核生物細胞中に導入され得る。他の形質転換方法もまた、適切である。
【００９７】
翻訳共役（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を使用し、発現を増強する。このストラテジーは、翻訳系に対して天然である高度に発現された遺伝子由来の短い上流のオープンリーディングフレームを使用する。これは、プロモーター、およびリボソーム結合部位および数個のアミノ酸コドンの後に続く終止コドンの下流に配置される。終止コドンのちょうど手前に、第２のリボソーム結合部位があり、そしてその終止コドンの後に、翻訳の開始のための開始コドンがある。この系は、ＲＮＡの二次構造を無効にし、翻訳の効率的な開始を可能にする。Ｓｑｕｉｒｅｓら（１９８８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１６２９７〜１６３０２を参照のこと。
【００９８】
この融合ポリペプチドは、細胞内に発現され得るか、または細胞から分泌され得る。細胞内発現は、しばしば、高い収率を生じる。必要な場合、可溶性で、活性な融合ポリペプチドの量を、再折り畳み（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）手順を実行することによって増加し得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ｍａｒｓｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）２：８００；Ｓｃｈｏｎｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８５）３：１５１を参照のこと）。融合ポリペプチドが、細胞からペリプラズム内にかまたは細胞外培地のいずれかに、分泌される実施態様において、このＤＮＡ配列は、切断可能なシグナルペプチド配列に連結される。このシグナル配列は、細胞膜を介して融合ポリペプチドの転座を指向する。プロモーターシグナル配列ユニットを含むＥ．ｃｏｌｉ中での使用に適切なベクターの例は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｈｏＡプロモーターおよびシグナル配列を有する、ｐＴＡ１５２９である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｏｋら、前出；Ｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：７２１２；Ｔａｌｍａｄｇｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  （１９８０）７７：３９８８；Ｔａｋａｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８５）２６０：２６７０）。
【００９９】
本発明の融合ポリペプチドはまた、さらに他の細菌タンパク質に連結され得る。このアプローチは、しばしば、高い収率を生じる。なぜならば、通常の原核生物制御配列は、転写および翻訳を指向するからである。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ｌａｃＺ融合は、しばしば、異種タンパク質を発現するために使用される。適切なベクターは、ｐＵＲ、ｐＥＸ、およびｐＭＲ１００系列のように容易に利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、を参照のこと）。特定の適用について、精製後の融合タンパク質から非グリコシルトランスフェラーゼおよび／または補助酵素のアミノ酸を切断することが所望され得る。これは、臭化シアン、プロテアーゼによってか、または第Ｘａ因子による切断を含む、当該分野で公知のいくつかの任意の方法によって達成され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ｉｔａｋｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９７７）１９８：１０５６；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１０６；Ｎａｇａｉら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３０９：８１０；Ｓｕｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：５６１を参照のこと）。切断部位は、切断の所望の部位において融合タンパク質の遺伝子内に操作され得る。
【０１００】
１つより多い融合ポリペプチドは、単一の発現ベクター内に複数の転写カセットを配置することによってか、またはクローニングストラテジーに用いられる発現ベクターの各々に対する異なる選択マーカーを利用することによって単一宿主細胞内で発現され得る。
【０１０１】
Ｅ．ｃｏｌｉから、そのＮ末端の完全性を維持する組換えタンパク質を入手するための適切な系は、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：６９８〜７０４（１９８９）に記載されている。この系において、目的の遺伝子は、ペプチダーゼ切断部位を含む酵母ユビキチン遺伝子の初めの７６残基へのＣ末端融合として産生される。２つの部分の接合部での切断は、インタクトな標準のＮ末端残基を有するタンパク質の産生を生じる。
【０１０２】
本発明の融合ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ、他の細菌宿主、酵母、および種々のより高度な真核生物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞株、ＣＨＯ細胞株およびＨｅＬａ細胞株ならびにミエローマ細胞株）を含む、種々の宿主細胞において発現され得る。この宿主細胞は、哺乳動物細胞、植物細胞、または微生物（例えば、酵母細胞、細菌細胞、または真菌細胞）であり得る。適切な宿主細胞の例は、例えば、多くのものの中でとりわけ、以下を含む：Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．（例えば、Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐ．（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、ＰａｒａｃｏｃｃｕｓおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．。この細胞は、以下を含む任意のいくつかの属であり得る：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｃａｎｄｉｄａ（例えば、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．ｚｅｙｌａｎｏｉｄｅｓ、Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、およびＣ．ｈｕｍｉｃｏｌａ）、Ｐｉｃｈｉａ（例えば、Ｐ．ｆａｒｉｎｏｓａおよびＰ．ｏｈｍｅｒｉ）、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ（例えば、Ｔ．ｃａｎｄｉｄａ、Ｔ．ｓｐｈａｅｒｉｃａ、Ｔ．ｘｙｌｉｎｕｓ、Ｔ．ｆａｍａｔａ、およびＴ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｄ．ｓｕｂｇｌｏｂｏｓｕｓ、Ｄ．ｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ、Ｄ．ｇｌｏｂｏｓｕｓ、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ、およびＤ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉおよびＺ．ｂａｉｌｉｉ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ（例えば、Ｈ．ａｎｏｍａｌａおよびＨ．ｊａｄｉｎｉｉ）、およびＢｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｂ．ｌａｍｂｉｃｕｓおよびＢ．ａｎｏｍａｌｕｓ）。有用な細菌の例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｉａを含むがこれらに限定されない。
【０１０３】
本発明の発現ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉについては塩化カルシウム形質転換、および哺乳動物細胞についてはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションのような、周知の方法によって選択された宿主細胞に移入され得る。このプラスミドにより形質転換された細胞は、プラスミドに含まれる遺伝子（例えば、ａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏおよびｈｙｇ遺伝子）により与えられた抗生物質に対する耐性によって選択され得る。
【０１０４】
好ましい実施態様において、真核生物のグリコシルトランスフェラーゼおよび補助酵素の触媒ドメインを含む融合ポリペプチドは、真核生物の宿主細胞において発現される。同様に、原核生物の触媒ドメインを含む融合ポリペプチドは、好ましくは、原核生物の細胞において発現される。あるいは、原核生物の宿主細胞において哺乳動物の融合ポリペプチドを発現するか（Ｆａｎｇら（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：６６３５〜６６３８）、その逆であり得る。
【０１０５】
一旦、発現されると、この組換え融合ポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当該分野の標準的な手順に従い精製され得る（一般に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照のこと）。少なくとも約９０〜９５％の均一性を有する実質的に純粋な組成物が、好ましく、そして９８〜９９％またはそれ以上の均一性が、最も好ましい。一旦、部分的にかまたは所望される均一性まで精製されると、次いで、そのポリペプチドが、使用され得る（例えば、抗体産生の免疫原として）。
【０１０６】
本発明の融合ポリペプチドの精製を容易にするために、融合ポリペプチドをコードする核酸はまた、親和性結合試薬が利用可能であるエピトープかまたは「タグ」のコード配列を含み得る。適切なエピトープの例は、ｍｙｃおよびＶ−５レポーター遺伝子を含む；これらのエピトープを有する融合ポリペプチドの組換え産生に有用な発現ベクターは、市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）ベクターのｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓは、哺乳動物細胞中での発現に適切である）。タグを本発明の融合タンパク質に付着するために適切なさらなる発現ベクター、および対応する検出系は、当業者に公知であり、そしていくつかは、市販されている（例えば、ＦＬＡＧ（Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  ＮＹ）。適切なタグの別の例は、金属キレート親和性リガンドに結合し得るポリヒスチジン配列である。代表的には、６つの隣接性ヒスチジンが使用されるが、６より多くかまたは６未満を使用し得る。ポリヒスチジンタグに対して結合部分として作用し得る適切な金属キレート親和性リガンドは、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）を含む（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．（１９９０）「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｌ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ａｄｓｏｒｂｅｎｔｓ」Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｑｉａｇｅｎ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ、ＣＡ）から市販されている）。
【０１０７】
タグとしての使用に適切である他のハプテンは、当業者に公知であり、そして例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ）に記載される。例えば、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ジゴキシゲニン、バルビツール酸塩（例えば、米国特許第５，４１４，０８５号を参照のこと）、およびいくつかの型の発蛍光団は、これらの化合物の誘導体と同様に、ハプテンとして有用である。キットは、ハプテンおよび他の部分をタンパク質および他の分子に連結するために市販される。例えば、ハプテンがチオールを含む場合、ヘテロ二官能性リンカー（例えば、ＳＭＣＣ）を用いて、タグを、捕獲試薬中に存在するリジン残基に結合させ得る。
【０１０８】
当業者は、改変が、グリコシルトランスフェラーゼおよび補助酵素触媒ドメインに対して、それらの生物学的活性を低減させることなく行われ得ることを認識する。いくつかの改変を行って、融合タンパク質への触媒ドメインのクローニング、発現、または取込みを容易にし得る。このような改変は、当業者に周知であり、そして例えば、開始部位を提供するためにアミノ末端に付加されるメチオニン、またはいずれかの末端に配置されて便利に位置する制限部位もしくは終結コドンもしくは精製配列を作製するさらなるアミノ酸（例えば、ポリＨｉｓ）を例えば提供するためのコドンの、触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドのいずれかの末端での付加を含む。
【０１０９】
（Ｅ．融合ポリペプチドの使用）
本発明は、本明細書中に記載の方法を用いて生成される融合ポリペプチドを使用して、（２以上の単糖類から構成される）所望のオリゴ糖を調製する方法を提供する。本発明のグリコシルトランスフェラーゼ反応は、少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ、受容体糖、および代表的には可溶性二価金属カチオンを含有する反応媒体中で起こる。補助酵素触媒部分についての基質もまた存在し、その結果、この補助酵素がグリコシルトランスフェラーゼについての供与体部分を合成し得る。この方法は、グリコシルトランスフェラーゼの使用に依存して、基質単糖類への単糖類の付加を触媒する。例えば、本発明は、本明細書中に記載される方法に従って調製されたα２，３−シアリルトランスフェラーゼ／ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテターゼ融合ポリペプチドの存在下でＧａｌ残基を含有する受容体部分を含む反応混合物を接触させることによって、ガラクトース残基へシアル酸をα２，３結合で付加する方法を提供する。反応混合物はまた、シアル酸およびＣＴＰ、ならびにシアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテターゼの活性に必要な他の成分を含む。
【０１１０】
所望のオリゴ糖構造体を合成するためにグリコシルトランスフェラーゼを用いる多数の方法が、公知である。例示的な方法は、例えば、ＷＯ  ９６／３２４９１、Ｉｔｏら（１９９３）Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３、および米国特許第５，３５２，６７０号、同第５，３７４，５４１号、および同第５，５４５，５５３号に記載される。
【０１１１】
本明細書中に記載される通りに調製される融合ポリペプチドは、さらなるグリコシルトランスフェラーゼと組み合わせて使用され得る。例えば、シアリルトランスフェラーゼ融合ポリペプチドと、融合ポリペプチドの一部であってもそうでなくともよいガラクトシルトランスフェラーゼとの組合せを用い得る。この群の実施態様では、この酵素および基質は、最初の反応混合物において組合せられ得るか、または好ましくは、この酵素および第２のグリコシルトランスフェラーゼ反応のための試薬が、第１のグリコシルトランスフェラーゼ反応が一旦完了に近づいたら、反応媒体に添加され得る。２つのグリコシルトランスフェラーゼ反応を連続して単一の容器において実施することにより、中間体種が単離される手順に対して全体の収率が改善される。さらに、余分な抽出溶媒および副産物の洗浄および廃棄が低減される。
【０１１２】
上記のプロセスにより生成される産物は、精製せずに用いられ得る。しかし、産物を回収することが通常好ましい。グリコシル化された単糖類の回収のための標準的な周知の技術（例えば、薄層または厚層（ｔｈｉｃｋ  ｌａｙｅｒ）クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または膜濾過）が用いられ得る。膜濾過を用いることが好ましく、より好ましくは、１９９７年１０月９日に出願された、同一人に譲渡された米国特許出願第０８／９４７，７７５号に記載されるようなナノ濾過（ｎａｎｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）または逆浸透膜の利用である。例えば、膜が約１０００〜約１０，０００の分子量カットオフを有する膜濾過を用いて、タンパク質を除去し得る。次いで、ナノ濾過または逆浸透は、塩を除去するために用いられ得る。ナノ濾過膜は、一価の塩は通過させるが、多価の塩および使用される膜に依存して約２００〜約１０００ダルトンより大きな非荷電溶質を保持する一種の逆浸透膜である。従って、代表的な適用では、本発明のオリゴ糖は、膜に保持され、そして夾雑塩は、通過する。
【０１１３】
（実施例）
以下の実施例は、例示のために提供されるが、本発明を限定するために提供されるわけではない。
【０１１４】
（実施例１）
（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼ／α２，３−シアリルトランスフェラーゼ融合タンパク質の構築）
本実施例は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼ活性およびα２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの構築および発現を記載する。末端Ｎ−アセチルノイラミン酸残基を含有するオリゴ糖の大規模酵素合成は、大量のシアリルトランスフェラーゼおよび対応する糖−ヌクレオチドシンテターゼを、不安定な化合物である糖−ヌクレオチド供与体、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃの合成のために必要とする。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからクローニングした遺伝子を用いて、本発明者らは、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａシンテターゼ活性およびα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有する融合タンパク質を構築した。この融合タンパク質を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて高収量で（α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性アッセイを用いて測定して、１リットルあたり１，２００ユニットを超える）生成し、そして機能的に純粋な酵素を、単純なプロトコルを用いて入手し得た。小規模酵素合成では、本発明者らは、この融合タンパク質が、種々のオリゴ糖受容体（分岐状および直鎖状）をＮ−アセチルノイラミン酸ならびにＮ−グリコリル−ノイラミン酸およびＮ−プロピオニルノイラミン酸を用いて高変換収率でシアル酸付加（ｓｉａｌｙｌａｔｅ）し得ることを示した。融合タンパク質をまた用いて、α−２，３−シアリルラクトースを１００ｇのスケールで、ラクトース、シアル酸、ホスホエノールピルビン酸ならびに触媒量のＡＴＰおよびＣＭＰから開始される糖ヌクレオチドサイクル反応を用いて生成した。
【０１１５】
以前に、本発明者らは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼ（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：４１７−４２０）およびα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２８２７１−２８２７６；Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９：１８７−１９４）の両方のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおけるクローニングおよび過剰発現を報告した。これらの２つの酵素を一緒に用いて、ミリグラム量のシアリルラクトース、シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミンおよびシアリル−Ｐk（Ｎｅｕ５Ａｃ−α−（２→３）−Ｇａｌ−α−（１→４）−Ｇａｌ−α−（１→４）−Ｇｌｃ）を合成した。ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼをまた用いて、対応するシアロ−オリゴ糖アナログを合成するためにシアル酸アナログのＣＭＰ誘導体を生成し得る（同上）。
【０１１６】
本発明者らは、高収量（７５０Ｕ／Ｌ）のα−２，３−シアリルトランスフェラーゼをＥ．ｃｏｌｉにおいて得たが（同上）、この精製した酵素は、比較的不溶性であり、そして貯蔵の間に沈澱し、そして活性を失う傾向を有した。ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼは、合成目的のために必須であり、そして可溶性の酵素であるので、本発明者らは、融合形態のこれらの２つの酵素を作製してこれが個々のα−２，３−シアリルトランスフェラーゼよりも可溶性であるか否かをみることを決定した。それゆえ、以下の２つの反応は、同じポリペプチドにより触媒され得る：
【０１１７】
【化１】
0004634606.tif 000003
この融合した形態のこれらの酵素はまた、反応速度論的に好ましい。なぜなら、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼは、３１．４秒-1の代謝回転数（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：４１７−４２０）を有するが、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼは、受容体に応じて０．１〜１．４秒-1の範囲の代謝回転数を有する（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９：１８７−１９４および未公開データ）からである。この融合した形態は、増殖させるための単一の培養物、および精製して２つの活性を得るための単一の産物を有することによる酵素生成コストの削減というさらなる利点を有する。
【０１１８】
（材料および方法）
（融合ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼ／α−２，３−シアリルトランスフェラーゼの構築）
ＰＣＲを、Ｐｗｏポリメラーゼを製造業者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｌａｖａｌ，Ｑｕｅ）により記載される通りに用いて行った。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼを、ＳＹＮＴＭ−Ｆ１を５’プライマー（４１マー：
【０１１９】
【化２】
0004634606.tif 000004
（配列番号３）；ＮｄｅＩ部位は斜体である）として、そしてＳＹＮＴＭ−Ｒ６を３’プライマー（４５マー：
【０１２０】
【化３】
0004634606.tif 000005
（配列番号４）；ＥｃｏＲＩ部位は斜体である）として、そしてｐＮＳＹ−０１（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：４１７−４２０）をテンプレートとして用いて増幅した。
【０１２１】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  α−２，３−シアリルトランスフェラーゼを、ＳＩＡＬＭ−２２Ｆを５’プライマー（３７マー：
【０１２２】
【化４】
0004634606.tif 000006
（配列番号５）；ＥｃｏＲＩ部位は斜体である）として、そしてＳＩＡＬＭ−２３Ｒを３’プライマー（５９マー：
【０１２３】
【化５】
0004634606.tif 000007
（配列番号６）；ＳａｌＩ部位は斜体であり、６−Ｈｉｓテールは下線を付し、そしてｃ−ｍｙｃタグは太字である）として、そしてｐＮＳＴ−０９（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２８２７１−２８２７６）をテンプレートとして用いて増幅した。プラスミドｐＦＵＳ−０１を、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃシンテターゼＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そしてα−２，３−シアリルトランスフェラーゼＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、そしてｌａｃＺα遺伝子フラグメントが欠失している改変バージョンのｐＣＷori+（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９：１８７−１９４）中にこれらをクローニングすることにより構築した。
【０１２４】
（Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現および融合タンパク質の精製）
ｐＦＵＳ−０１バージョンの最初のスクリーニングを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＭＨ７１−１８を宿主として用いて行った。融合タンパク質の大規模生成について、本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＤ２０２（ＣＧＳＣ＃７２９７）を用いた。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＤ２０２／ｐＦＵＳ−０１／２の２１Ｌ培養物を、２８−Ｌ  Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）発酵槽（ＭＦ  １２８Ｓ型）中で以前に記載された通り（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９：１８７−１９４）増殖させた。細胞を、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７）に、８０ｍＬの緩衝液について２０ｇの湿潤細胞ペーストの比で再懸濁した。細胞抽出物を、Ａｖｅｓｔｉｎ  Ｃ５  Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ細胞破砕機（Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｏｔｔａｗａ，Ｏｎｔ．）を用いて調製した。ポリエチレングリコール（平均分子量８，０００Ｄａ）およびＮａＣｌを、それぞれ４％および０．２Ｍで添加し、そして細胞抽出物を４℃にて２０分間攪拌した。抽出物を、８０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、そしてこのペレットを５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７）、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、４％  ＰＥＧを用いて２回洗浄した。このペレットを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁し、そしてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（還元されておりそしてペルオキシドを含まない）を１％  ｖ／ｖまで添加した。再懸濁したペレットを、４℃にて３０分間攪拌し、そして１３，０００×ｇにて１時間の遠心分離により明澄化した。上清を、Ｎｉ2+で荷電した２本の５−ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）にアプライした。最大負荷は各試行において２５ｍｇ全タンパク質であった。このカラムを、０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７）中の６０〜８００ｍＭ  イミダゾール勾配で展開した。
【０１２５】
（アッセイ）
タンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）からのビシンコニン酸タンパク質アッセイキットを用いて決定した。全ての酵素アッセイについて、１ユニットの活性は、１分間あたりに１μｍｏｌの産物を生成する酵素量として定義された。ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼ活性を、最終容量５０μＬ中の３ｍＭ  Ｎｅｕ５Ａｃ、３ｍＭ  ＣＴＰ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、０．２ｍＭ  ＤＴＴ、および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を用いて３７℃にてアッセイした。反応を、１０分後に、２０ｍＭの最終濃度になるようなＥＤＴＡの添加により停止し、そして反応混合物を、２７１ｎｍに設定したＰ／ＡＣＥダイオードアレイ検出器を備えたＢｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）Ｐ／ＡＣＥ  ５５１０を用いて実施したキャピラリー電気泳動により、そして以前に記載された分離条件（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：４１７−４２０）を用いて分析した。
【０１２６】
全ての受容体を、ＦＥＸ（＃Ｆ−６１３０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）をＬａｃＮＡｃ受容体についてＦＣＨＡＳＥの代わりに用いたこと以外は、以前に記載された通り（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９：１８７−１９４；Ｗａｋａｒｃｈｕｋら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９１６６−１９１７３）に合成した。
【０１２７】
α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を、３７℃にて、最終容量１０μＬ中の０．５ｍＭ  ＬａＮＡｃ−ＦＥＸ、０．２ｍＭ  ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ、５０ｍＭ  Ｍｅｓ（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ2を用いてアッセイした。５分後、反応を、１０ｍＭ  ＮａＯＨでの希釈により終結させ、そして以前に記載された分離条件（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９：１８７−１９４）を用いて行ったキャピラリー電気泳動により分析した。
【０１２８】
結合させたアッセイを、インキュベーション時間が１０分間であり、そして反応混合物が０．５ｍＭ  ＬａｃＮＡｃ−ＦＥＸ、３ｍＭ  ＣＴＰ、３ｍＭ  Ｎｅｕ５Ａｃ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．２ｍＭ  ＤＴＴ、および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2以外は類似の条件を用いて行った。代わりの受容体（Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥおよびＰk−ＦＣＨＡＳＥ）または代わりの供与体（Ｎｅｕ５ＧｃおよびＮｅｕ５Ｐｒ）を試験する場合、反応時間が６０〜１２０分であること以外は同じ試薬濃度を用いた。
【０１２９】
二アンテナ性（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）受容体のシアル酸付加を、９０分間の反応における１ｍｇのＧａｌ−β−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−β−（１→２）−Ｍａｎ−α−（１→６）−［Ｇａｌ−β−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−β−（１→２）−Ｍａｎ−α−（１→３）−］−Ｍａｎ−β−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−β−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃを用いて行った。反応の進行を、イソプロパノール／Ｈ2Ｏ／過酸化アンモニウム（６：３：１）を用いてプレートを展開するＴＬＣによりモニタリングし、そしてシアル酸付加された産物を、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−４（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）でのゲル濾過により精製した。単離された化合物の質量を、質量分析法（陰イオンモード）により決定した。
【０１３０】
（１００ｇスケールでの合成における使用）
反応を、２．２Ｌの総容量において行い、そして以下の試薬を順番に添加した：ラクトース一水和物（５９．４ｇ、０．１６５ｍｏｌ）、ホスホエノールピルビン酸一カリウム塩（３４ｇ、０．１６５ｍｏｌ）、ウシ血清アルブミン（２．２ｇ）、シアル酸（５１ｇ、０．１６５ｍｏｌ）、ＣＭＰ（２．８４ｇ、８．７９ｍｍｏｌ）、ＡＴＰ（０．５３２ｇ、０．８７９ｍｍｏｌ）、およびアジ化ナトリウム（０．４４ｇ）。ｐＨを、ＮａＯＨを用いて７．４に調整し、そしてＭｎＣｌ2を３０ｍＭの最終濃度になるまで添加した。反応を、１３，２００ユニットのミオキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、１９，８００ユニットのピルビン酸キナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、およびＰＥＧ／ＮａＣｌ沈澱物のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００での抽出によって得た８２０ユニット（α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性に基づく）の融合タンパク質の添加後に室温にて進行させた。反応の進行を、イソプロパノール／Ｈ2Ｏ／過酸化アンモニウム（７：２：１）を用いてプレートを展開し、そしてオルシノール／硫酸、続いて加熱により産物を可視化するＴＬＣにより毎日モニタリングした。Ｍｎ2+を、イオンクロマトグラフィーにより毎日モニタリングし、そして反応混合物に１Ｍ  ＭｎＣｌ2を補充して３０ｍＭの最終濃度を保持した。補助的なホスホエノールピルビン酸を、２日後（０．１６５ｍｏｌ）および４日後（０．０５５ｍｏｌ）に添加した。
【０１３１】
６日間の総反応時間の後、粗α−２，３−シアリルラクトース溶液を、２枚のＷｈａｔｍａｎ濾紙を通して濾過して沈澱物を除去し、黄色の濾液を生成した。次いで、タンパク質を、３，０００  ＭＷＣＯ膜（＃Ｐ２ＰＬＢＣＣ０１，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて接線方向流（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ）限外濾過により除去し、明澄な黄色溶液を得た。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を、５００ｇのＣ１８逆相樹脂を含有するカラムを通す濾過により反応混合物から除去した。次いで、溶出液を、渦巻膜（ｓｐｉｒａｌ  ｗｏｕｎｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）（＃ＧＥ２５４０Ｃ１０７６）を備えたナノ濾過装置（＃１９Ｔ−ＳＳＸＹＣ−ＰＥＳ−３１６−ＳＰ，Ｏｓｍｏｎｉｃｓ，Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ，ＭＮ）を用いて、そして２つの異なるｐＨを用いてさらに精製した。溶液のｐＨを最初に濃ＨＣｌでｐＨ＝３．０に調整し、そして供給溶液を、脱イオン水の連続添加により供給物の総容量を維持しながら１０時間で再循環させた。浸透溶液の伝導度が２２ｍＳに達した場合に、ｐＨを、５０％  ＮａＯＨを用いてｐＨ＝７．０に調整した。脱イオン水で供給容量を維持しながらのこの溶液の再循環を、さらに２時間行った。供給溶液を８００ｍＬに濃縮し、次いでＡＧ５０ＷＸ８（Ｈ＋）Ｄｏｗｅｘ樹脂で２．０のｐＨに達するまで処理した。濾過により樹脂を除去した後、ｐＨを、ＮａＯＨを用いて７．０に調整し、そしてこの溶液を、活性炭に通すことにより脱色した。この溶液を最終的に凍結乾燥して、白色粉末を得、そしてα−２，３−シアリルラクトース含量を、１，２−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノースを参照標準として用いるＤ2Ｏ中での1Ｈ  ＮＭＲ分析により決定した。
【０１３２】
（結果）
（融合ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼ／α−２，３−シアリルトランスフェラーゼの構築）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼを、ＰＣＲにより、ＮｄｅＩ部位を含むプライマー（５’）およびＥｃｏＲＩ部位を含むプライマー（３’）を用いて増幅させ、一方、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  α−２，３−シアリルトランスフェラーゼを、ＥｃｏＲＩ部位を含むプライマー（５’）およびＳａｌＩ部位を含むプライマー（３’）を用いて増幅した。２つのＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩを用いて消化した改変バージョンのｐＣＷori+（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９：１８７−１９４）中に一緒にクローニングした。得られた構築物（ｐＦＵＳ−０１）において、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼの開始コドンは、３つの連続したＩＰＴＧ誘導性プロモーターおよびｐＣＷori+中に存在するリボソーム結合部位の下流にあった。α−２，３−シアリルトランスフェラーゼを、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃシンテターゼのＣ末端に４残基のペプチドリンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ；配列番号１８）を介して連結した。そして、融合タンパク質のＣ末端は、免疫検出のためのｃ−Ｍｙｃエピトープタグ、および固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製のためのＨｉｓテール（配列番号１３）を含む。ｐＦＵＳ−０１のクローニングのプロセスでは、本発明者らはまた、リンカー領域にさらなる残基を含む２つのクローンを得た。ｐＦＵＳ−０１／２のリンカー（図１を参照のこと）は、９残基長（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ；配列番号７）であり、一方、ｐＦＵＳ−０１／４のリンカーは８残基長（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ；配列番号８）である。さらなる残基を用いる２つのバージョンのＤＮＡ配列決定による分析は、これらが、ＰＣＲ産物の不完全な制限酵素消化に起因する、クローニングによるアーティファクトであることを示唆した。
【０１３３】
（融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉでの発現および精製）
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＭＨ７１−１８を、３つのバージョンのｐＦＵＳ−０１で形質転換し、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性のレベルを、小スケールの培養（２０ｍＬ）において比較した。ｐＦＵＳ−０１／２で、最も高い活性が得られ、それは、ｐＦＵＳ−０１／４より４０％高い活性、そしてｐＦＵＳ−０１より６０％高い活性を与えた。ｐＦＵＳ−０１／２にコードされる融合タンパク質は、２つの構成成分の独立した折り畳みを助け得る、最も長いリンカーを有する。しかし、リンカー組成物およびリンカーの長さの効果をさらに研究せず、そしてｐＦＵＳ−０１／２を、産生でのスケールアップおよび反応速度論的比較のために使用した。
【０１３４】
本発明者らは、ｐＦＵＳ−０１／２をＥ．ｃｏｌｉ  ＢＭＨ７１−１８で発現させた場合、Ｏｍｐ−Ｔ触媒の分解を観察したために（データは示さず）、本発明者らは、ｏｍｐ−Ｔ欠損の宿主株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＤ２０２）を発現に使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＤ２０２／ｐＦＵＳ−０１／２の２１Ｌ培養において、本発明者らは、α−２、３−シアリルトランスフェラーゼ活性に対するアッセイを使用して１，２００Ｕ／リットル、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンセターゼ活性に対するアッセイを使用して１１，５００Ｕ／リットル、および組合せたＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンセターゼ／α−２、３−シアリルトランスフェラーゼのアッセイを使用して３００Ｕ／リットルの産生を測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、融合酵素の予想される分子量（７０．２ｋＤａ）のバンドが、抽出液において優勢であることを示した。活性は、その抽出液の不溶性画分に結合された。なぜなら、その抽出液を１００，０００×ｇ、１時間で遠心分離した場合、ペレットにおいて９５％を超える活性を回収したからである。この状況は、Ｅ．ｃｏｌｉ（同上）で過剰発現した場合の、別のα−２，３−シアリルトランスフェラーゼで観察した状況と類似した。α−２，３−シアリルトランスフェラーゼは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓで膜結合し（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２８２７１−２８２７６）、そしてＥ．ｃｏｌｉにおいて別々にまたは融合タンパク質として過剰発現させた場合、その一部が、膜および／または細胞片に結合されたことは驚くことではない。
【０１３５】
大スケールの超遠心を避けるために、本研究者らは、より低い遠心分離速度（１２，０００×ｇ）で不溶性画分に結合される活性を回収するための、沈殿戦略を開発した。４％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）および０．２Ｍ  ＮａＣｌでの沈殿により、９５％を超えるペレット中の活性を回収し得、粗抽出液（０．３２Ｕ／ｍｇ）とＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿物（０．５８Ｕ／ｍｇ）との間の比活性において１．８倍の上昇を得た。そのペレットを、ＰＥＧ／ＮａＣｌを含む緩衝液で洗浄し、標的のオリゴ糖類の酵素的合成で使用される必須の補因子および基質を分解し得る加水分解酵素のような微量の可溶性（細胞質ゾルの）酵素を除去した。洗浄工程により、酵素の回収がわずかに減少したが、機能的に純粋な融合タンパク質を得ることが重要である。
【０１３６】
ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿物を、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で抽出し、活性を可溶化した。本研究者らは、可溶性画分中に６０〜７０％の酵素活性を回収した。これは全抽出液中に存在する活性と比較した場合の４０〜５５％の収量を示し、そして比活性で３倍（１Ｕ／ｍｇ）の増加を示す。ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿物からＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で抽出した物質は、４℃で少なくとも１ヶ月安定であり、そして以下に示す合成反応に使用した。
【０１３７】
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００抽出液について行い、そして融合タンパク質は、４００ｍＭと５５０ｍＭとの間のイミダゾールで抽出した画分に現れた。精製した融合タンパク質は、１〜２Ｕ／ｍｇの比活性を有し、そして全体の精製収率は５％未満であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製タンパク質の分析により、それが少なくとも９０％純粋であることを示した。
【０１３８】
（融合タンパク質と個々の酵素との比較）
この比較は、酵素が均質に精製される場合のそれらの可溶性および凝集の傾向において広範に異なるという事実により、困難であった。本研究者らは、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンセターゼが、２０ｍｇ／ｍＬを超えて可溶性であった（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：４１７−４２０）のに対して、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼは、それを１ｍｇ／ｍＬを超えて濃縮するように試行した場合、たとえ界面活性剤の存在下であっても沈殿した（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９：１８７−１９４）ことを以前に観察した。ＩＭＡＣ精製した融合タンパク質を、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下で約５ｍｇ／ｍＬに溶解した。α−２，３−シアリルトランスフェラーゼアッセイを使用して、本研究者らは、精製した別個のα−２，３−シアリルトランスフェラーゼの異なるバッチに対して１〜１．５Ｕ／ｍｇの範囲の比活性を、そして精製融合タンパク質の異なるバッチに対して１〜２Ｕ／ｍｇの範囲の比活性を見出した。凝集する傾向は、ＩＭＡＣ精製した融合タンパク質の異なるバッチ間の比活性における比較的大きな変化を説明し得る。
【０１３９】
以前に、本研究者らは、部分精製したα−２，３−シアリルトランスフェラーゼを、超遠心（同上）によって得られた膜画分からＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で抽出し得ることを観察した。この手順は、ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿物からの融合タンパク質の抽出に類似するが、膜からの抽出は、より純粋な物質を生ずる。融合タンパク質および別個のα−２，３−シアリルトランスフェラーゼの両方のそのような沈殿物は、ＩＭＡＣ精製した物質より、より安定であったが、酵素は均質でなかったために、タンパク質濃度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度測定を走査することにより推定した。この手順を使用して、本研究者らは、別個のα−２，３−シアリルトランスフェラーゼに対して２．０Ｕ／ｍｇの比活性、および融合タンパク質に対して２．７Ｕ／ｍｇの比活性を観察した。これら２つのタンパク質の分子量を考慮した場合、本発明者らは、別個のα−２，３−シアリルトランスフェラーゼに対して１．４秒-1の回転回数、および融合酵素に対して３．２秒-1の回転回数を算出した。これら２つのタンパク質の異なる溶解度特性が与えられるため、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼが融合形態にある場合、そのいずれの本当の触媒作用の改良が存在するか否か結論付けること、またはそれがアッセイ条件下で単により安定であるか否かを結論付けることは困難である。一方、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンセターゼの融合形態での回転回数は、別個のＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンセターゼの回転回数に匹敵する（それぞれ、３９．５秒-1および３１．４秒-1）。
【０１４０】
（種々の供与体および受容体での小スケールの合成）
融合タンパク質の、異なる供与体および受容体を使用する能力を、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼの最適ｐＨ（ｐＨ６）（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２８２７１−２８２７６）とＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンセターゼの最適ｐＨ（ｐＨ８．５）（ＷａｒｒｅｎおよびＢｌａｃｋｌｏｗ（１９６２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３７：３５２７−３５３４）との間の中間であるｐＨ７．５で行う分析用（５ｎｍｏｌ）の組合せた反応において試験した。融合タンパク質は、Ｎ−アセチルラクトサミン−ＦＥＸおよびラクトース−ＦＣＨＡＳＥを、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸、ならびにＮ−プロピオニル−アナログおよびＮ−グリコリル−アナログで、１時間に９７％を超える収量で、シアル酸付加し得た（表１）。Ｎ−アセチル−ラクトサミン−ＦＥＸおよびラクトース−ＦＣＨＡＳＥの両方は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａのα−２，３−シアリルトランスフェラーゼに対する天然の受容体である、末端β−Ｇａｌを有する（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９：１８７−１９４）。
【０１４１】
【表１】
0004634606.tif 000008
Ｐk−ＦＣＨＡＳＥ（Ｇａｌ−α−（１→４）−Ｇａｌ−β−（１→４）−Ｇｌｃ−ＦＣＨＡＳＥ）を、２時間反応で受容体として使用した場合、シアル酸付加の収率はＮ−アセチル−ノイラミン酸またはＮ−プロピオニル−ノイラミン酸のいずれかを用いると、８４％であったが、Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸を用いると、それは５５％であった（表１）。本発明者らは以前に、Ｐk−ＦＣＨＡＳＥが、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼの基質であることを観察したが、末端β−Ｇａｌを有する基質より、４分の１〜４０分の１低いＫcat／Ｋmを有することが見出された（Ｇｉｌｂｅｒｔら、（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９：１８７−１９４）。Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸は、試験した３つの受容体で最も低いシアル酸付加収率を与えたが、ＮｅｉｓｓｅｒｉａのＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンセターゼは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸とよりも、Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸と８倍高いＫmを有することから（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：４１７−４２０）、驚くことではない。
【０１４２】
本発明者らが、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸を供与体として使用して、アシアロ−ガラクトシル化された２アンテナの（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ結合型オリゴ糖の９９％を超えるシアル酸付加を観察した（表１）ことから、融合タンパク質はまた、分枝オリゴ糖を受容体として使用し得る。この反応は、誘導体化されていないオリゴ糖を使用して、１ｍｇスケールで行い、そして単離された産物の分子量（２２２４．０Ｄａ）は、予想される２個のシアル酸付加された（ｄｉ−ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）２アンテナのオリゴ糖の分子量（２２２３．３Ｄａ）と一致することが見出された。
【０１４３】
（１００ｇスケール合成における使用）
ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿物からＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で抽出した物質を、１００ｇスケール合成で使用して、ラクトース、シアリル酸、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、ならびに触媒作用量のＡＴＰおよびＣＭＰから始まるシアリルトランスフェラーゼサイクル（Ｉｃｈｉｋａｗａら（１９９１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：４６９８−４７００）を用いる、α−２，３−シアリルラクトースを生成した。反応６日後、反応は、完了に達し、それはＴＬＣ分析によるシアリル酸の消失により確認した。次いで、産物を一連の限外濾過、微小濾過（ｎａｎｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）およびイオン交換により精製した。このプロセスにより、７７ｇの白色固体が生成し、これは８８％のα−２，３−シアリルラクトース含量および７％の水含量を有した。単離された産物のα−２，３−シアリルラクトース含量に基づいて、合成および単離に対する全体の収率は６８％であった。
【０１４４】
（考察）
ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンセターゼ／α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ融合タンパク質を、費用効果的な発現系において高レベルで発現し、これは、個々の酵素の活性に匹敵するレベルでの両方の酵素の活性を示した。これは、沈殿および界面活性剤抽出を含み、従って、高価なクロマトグラフィー工程をさける簡潔なプロトコールにより、容易に回収可能であった。この界面活性剤抽出された融合タンパク質は、機能的に純粋であった（すなわち、糖ヌクレオチドまたは補因子再生系の他の構成成分を加水分解し得る酵素活性の混入が全くない）。
【０１４５】
大スケールの炭水化物合成に有用であるためは、融合タンパク質は、糖ヌクレオチドサイクルに適用可能であるべきである。このサイクルを、低費用の前駆体からインサイチュで酵素的に再生される、触媒作用量の高価な糖ヌクレオチドおよびヌクレオシドリン酸のみを使用するために設計する。変換された補因子の再利用はまた、最終産物の阻害を防止する。α−２，３−シアリルラクトースの１００ｇスケールの合成は完了したが、これは重要である。なぜなら、基質の化学量論的変換が、試薬の費用を最小化するためだけでなく、これが大スケール合成からの産物の精製を大幅に単純化するために望ましいからである。融合タンパク質の別の興味深い特徴は、異なる供与体アナログおよび末端ガラクトース残基を有する種々の受容体を直接的に使用し得ることである。結果的に、これは、新規な特性による天然の炭水化物および合成誘導体の両方の合成に使用され得る。
【０１４６】
ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンセターゼ／α−２、３−シアリルトランスフェラーゼ融合タンパク質を、少なくとも個々の酵素と同じに活性である２つの構成成分（それらは適切に折り畳まれていることを示す）を有する、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて高収率で発現した。この例は、融合タンパク質の構築および発現が、複数の酵素的工程を含む大スケールの生物工学的プロセスに必要とされる酵素の生産に一般に有用であり得ることを示唆する。
【０１４７】
（実施例２）
（ＵＤＰ−グルコースエピメラーゼ／β−１、４−ガラクトシルトランスフェラーゼ融合タンパク質の構築）
糖ヌクレオチドサイクリング系（ＳＮＣ）のオリゴ糖合成の使用は、多くの酵素を必要とする。これらの酵素の精製は、このプロセスの時間のかかる、そして高価な部分である。第一の例において、本発明者らは、トランスフェラーゼを、それに対応する糖ヌクレオチドシンセターゼと結合する融合タンパク質（ＦＵＳ−０１）を作製し、そして２つの活性の簡単な精製の利点を示した。この例において、本研究者らは、ＳＮＣ反応において使用される二つの他のタンパク質、ＵＤＰ−グルコース４エピメラーゼ（ｇａｌＥ）およびβ−１、４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｌｇｔＢ）の融合を作製した。
【０１４８】
（材料および方法）
（ＤＮＡ操作）
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＵＤＰ−グルコース４’エピメラーゼ（ｇａｌＥ）遺伝子を、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のｇａｌＥ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３８１７５）のヌクレオチド配列に由来するプライマーを使用して、ｐＴＧＫ−ＥＰ１から増幅した。ＧａｌＥ−５ｐを、５’プライマー（５８マー：
【０１４９】
【化６】
0004634606.tif 000009
（配列番号９）；ＢａｍＨＩ部位は太字かつイタリックである）として使用し（本実施例で使用したプライマーを、図４に示す）、およびＧａｌＥ−３ｐを３’プライマー（４２マー：
【０１５０】
【化７】
0004634606.tif 000010
（配列番号１０）；ＮｈｅＩ部位はイタリックである）として使用した。ｇａｌＥ遺伝子を含む、プラスミドｐＴＧＫ／ＥＰ１をテンプレートとして使用した（ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ９８／２０１１１を参照のこと）。
【０１５１】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを、ＬｇｔＢ−ＮｈｅＩを５’プライマー（３８マー：
【０１５２】
【化８】
0004634606.tif 000011
（配列番号１１）；ＮｈｅＩ部位はイタリックである）、およびＬｇｔＢ−ＳａｌＩを３’プライマー（４５マー：
【０１５３】
【化９】
0004634606.tif 000012
（配列番号１２）；ＳａｌＩ部位はイタリックである）として使用し、そしてｐＣＷ−ｌｇｔＢ（ＭＣ５８）（Ｗａｋａｒｃｈｕｋら（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：２９５−３０２）をテンプレートとして使用して、増幅した。サーモサイクラーのパラメーターは、９４℃、３分、および５５℃、３０秒、７２℃、３０秒、９４℃、３０秒の３０サイクルである。ＰＣＲは、Ｐｗｏポリメラーゼを製造者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｌａｖａｌ、Ｑｕｅ．）に記載されるように用いて行った。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列（配列番号１３）および推定アミノ酸配列（配列番号１４）を、図２に示す。
【０１５４】
プラスミドｐＦＵＳ−ＥＢを、以下のように構築した（図３）。ＵＤＰ−グルコース４エピメラーゼＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化し、そしてβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼＰＣＲ産物を、ＮｈｅＩおよびＳａｌＩで消化して、次いで、製造者の説明書に従ってＰｒｅｐ−ａ−ＧｅｎｅTM樹脂（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、反応混液から回収した。次いで、その２つの遺伝子を、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化したベクターｐＣＷｏｒｉ+（Ｗａｋａｒｃｈｕｋら（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３：４６７−４７５）を用いて、標準条件下での３フラグメントのライゲーションにより結合した。ＤＮＡを、１μｌのライゲーション反応液でのエレクトロポレーションを使用してＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１２Ｓ内に導入した。形質転換体を、クローニング部位に隣接するベクター配列に特異的なプライマーでの、コロニーＰＣＲを使用してスクリーニングした。次いで、正確な大きさの挿入物を有するコロニーを液体培地で増殖し、そして酵素活性について試験した。
【０１５５】
（酵素活性の決定）
β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素についての標準的な反応を、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ2、１．０ｍＭ  フルオレセイン標識受容体、１．０ｍＭ  ＵＤＰ−Ｇａｌ供与体、およびクローン化した遺伝子を含む組換えＥ．ｃｏｌｉからの種々の量の酵素抽出液を含む、２０μｌのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ７．５中３７℃で行った。フルオレセイン標識受容体の調製は、Ｗａｋａｒｃｈｕｋら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３２）：１９１６６−１９１７３およびＷａｋａｒｃｈｕｋら（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：２９５−３０２に記載される通りであった。
【０１５６】
エピメラーゼ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を評価するための反応を、ＵＤＰ−Ｇａｌに代えて、１．０ｍＭ  ＵＤＰ−グルコースを用いて行った。１ｍｇ／ｍｌのアセチル化ウシ血清アルブミンを含む緩衝液に抽出液を希釈後、酵素をアッセイした。酵素活性の算出について、酵素の希釈率を、５〜１５分の反応時間で、受容体の産物への約１０％の変換が達成されるように選択した。反応は、等量の２％ＳＤＳの添加および７５℃、３分間の加熱によるか、１０ｍＭ  ＮａＯＨで反応液を希釈することのいずれかにより終結した。次いで、これらのサンプルを、キャピラリー電気泳動による分析の前に、水に適切に希釈した（Ｗａｋａｒｃｈｕｋら、（１９９６）前述）。
【０１５７】
小スケールの抽出物を、以下のように作製した。細胞を、１．５ｍｌの微量遠心分離チューブ内に、２分間、最大速度で、ペレット化し、そして培地を排除した。このペレットを微量遠心分離チューブ内で、凍結し、次いで２容量の１５０μｍガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ）で混合し、そしてガラス乳鉢で粉砕した。次いで、この混合物を、５０μｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．５で、２回抽出した。これからの上清を、酵素アッセイのための物質の供給源として使用した。大スケールの抽出およびＰＥＧ−８０００沈殿は、Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：７６９−７７２に記載されるように行った。
【０１５８】
ＵＤＰ−Ｇｌｃを使用したエピメラーゼ−トランスフェラーゼ融合体での反応由来の産物が、Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮａｃ−アミノフェニル−ＦＥＸ（ＦＥＸ−ＬａｃＮＡｃ）であることを検証するために、反応産物をＴＬＣで分離し、次いでメタノールで抽出した。真空下での乾燥後、サンプルを水に溶解し、そしてグリコシダーゼアッセイを、Ｗａｋａｒｃｈｕｋら（１９９６）（前述）に記載のように行った。次いで、これらのサンプルを、ＦＥＸ−ＬａｃＮａｃおよびその分解産物、ＦＥＸ−ＧｌｃＮＡｃのスタンダードに対するＴＬＣにより分析した（データは示さない）。
【０１５９】
（結果）
ｐＦＵＳ−ＥＢ構築物を、その誘導動力学について研究した。融合タンパク質は、誘導性であるが、しかし酵素活性は、ＩＰＴＧが全く添加されない振盪フラスコにおいて、その最も高いレベルに集積した。融合タンパク質の活性は、供与体としてＵＤＰ−ＧａｌまたはＵＤＰ−Ｇｌｃのいずれかを用いて測定した。受容体としてＦＥＸ−ＧｌｃＮＡｃを使用して行ったアッセイは、供与体としてＵＤＰ−Ｇｌｃを使用するトランスフェラーゼ活性の量が、供与体としてＵＤＰ−Ｇａｌを使用するトランスフェラーゼ活性の量と同様であることを示す。発現のレベルは、１Ｌの振盪フラスコ培養から１３０〜２００Ｕの間で産生されるようなレベルである。
【０１６０】
ＣＭＰ−ＮＡＮＡ／α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ融合タンパク質を用いて、本研究者らは、ＰＥＧ−８０００／ＮａＣｌ沈殿による酵素の濃縮の有用性を示した（実施例１）。本研究者らは、ＰＥＧ−８０００／ＮａＣｌを使用して、無細胞抽出液からβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ融合／ＵＤＰ−グルコース４エピメラーゼ融合ポリペプチドの回収について研究した。それは、非常に溶解しやすいタンパク質であると思われるので、本研究者らは、１６％のＰＥＧ−８０００を使用した。これは、他の融合タンパク質について本発明者らが使用した場合より高いレベルである、本研究者らは、ＰＥＧ−８０００の回収工程後、酵素活性についていずれの逆効果も見出さなかった。タンパク質はＰＥＧ沈殿工程により阻害されないようであり、そして活性タンパク質の回収率は高いようである。また、より高濃度の酵素（前形成されたＵＤＰ−Ｇａｌを使用する）を含むサンプルで活性を測定した場合、その活性はより低いようである。このことは、エピメラーゼがいくらかのＵＤＰ−ＧａｌをＵＤＰ−Ｇｌｃに逆に変換するためであり得、それによって、活性をより低く現す。
【０１６１】
本明細書に記載される実施例および実施態様は、例示的目的のためだけであり、そしてこれらの容易な種々の改変および変更は、当業者に示唆され、そして本願の精神および本文ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれ得ることは理解される。本明細書に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のため、参考として本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明の組換えシアリルトランスフェラーゼ／ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテターゼ融合タンパク質の模式図である。ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃシンテターゼのＣ末端は、９残基ペプチドリンカーを介してα−２，３−シアリルトランスフェラーゼのＮ末端に、共有結合的に連結される。α−２，３−シアリルトランスフェラーゼの最初のＭｅｔ残基は、Ｌｅｕ残基（リンカー配列（配列番号１４）中に下線を引かれる）により置換された。この融合タンパク質のＣ末端もまた、免疫検出のためのｃ−Ｍｙｃエピトープタグ、およびＩＭＡＣによる精製のためのＨｉｓ6テール（配列番号１３）を含む。ｐＦＵＳ−０１／２によりコードされる融合タンパク質の全長は６２５残基である。
【図２】  図２は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のｌｇｔＢのヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】  図３は、供与体から受容体へのガラクトース残基の転移を触媒する、組換え融合タンパク質の模式図を示す。ＵＤＰ−Ｇｌｃ／ＧａｌエピメラーゼのＣ末端は、４残基ペプチドリンカーを介してβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼのＮ末端に、共有結合的に連結される。β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの最初のＭｅｔ残基は、Ｖａｌ残基（リンカー配列（配列番号１５中に下線を引かれる）により置換された。ｐＦＵＳ−ＥＢによりコードされる融合タンパク質の全長は、６１１残基である。
【図４】  図４は、ＵＤＰ−Ｇｌｃ／Ｇａｌエピメラーゼ／β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ融合タンパク質の構築において使用されたプライマーを示す（配列番号９〜１２）。ｇａｌＥ−ｌｇｔＢ融合物の連結領域のヌクレオチド配列（配列番号１６）およびアミノ酸配列（配列番号１７）が、図４Ｅに示される。
【図１】
0004634606.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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