(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロヘキシルジアミン四酢酸と、ＳＨ基を有する化合物とを含有するクレアチンキナーゼ活性測定用試薬。
【請求項２】
前記ＳＨ基を有する化合物が、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、Ｎ−グアニル−Ｌ−システイン、システアミン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、システイン、グルタチオン、メルカプトコハク酸、チオグルコース、ジチオエリスリトール、メルカプト酢酸、２−メルカプトエタノール、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム、２−メルカプトエタンスルホン酸及びチオグリセロールからなる群より選択される少なくとも一つである請求項１記載のクレアチンキナーゼ活性測定用試薬。
【請求項３】
グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼ、グルコース、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及びクレアチンリン酸からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物をさらに含有する請求項１又は２記載のクレアチンキナーゼ活性測定用試薬。
【請求項４】
クレアチンキナーゼのＭ型サブユニットに特異的に結合する抗体をさらに含有する請求項１〜３の何れかに記載のクレアチンキナーゼ活性測定用試薬。
【請求項５】
シクロヘキシルジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼ、グルコース、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及びＳＨ基を有する化合物を含有する第一試薬と、クレアチンリン酸を含む第二試薬とからなるクレアチンキナーゼ活性測定用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の活性を測定するための試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＫは、二つのサブユニットからなる二量体のリン酸化酵素である。ＣＫのサブユニットにはＢ型（脳型）及びＭ型（筋型）の二種類が存在する。ＣＫには、二種類のサブユニットの組み合わせによって三種類のアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＭＢ及びＣＫ−ＢＢ）が存在し、ＣＫ−ＭＭは骨格筋に多く含まれ、ＣＫ−ＭＢは心筋に多く含まれ、ＣＫ−ＢＢは脳に多く含まれる。心筋梗塞や筋ジストロフィーなどの疾患によって疾患の原因部位に存在するＣＫアイソザイムが血液中に逸脱するため、臨床検査において血清や血漿などの試料に含まれるＣＫの活性値は上記疾患を診断する際の重要な指標となる。
【０００３】
ＣＫは血液中で速やかに不活性化されるため、生体から採取した試料にＳＨ化合物を添加してＣＫを活性化した後、活性測定を行なう。従って、ＣＫ活性測定用試薬には、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（以下、ＮＡＣとする）やチオグリセロールなどのＳＨ化合物が含有されている。
【０００４】
ＳＨ化合物は不安定な物質であり、試薬の保存中にＳＨ基が徐々に酸化されることによってＳＨ化合物が劣化してしまう。このため、試薬にＳＨ化合物を安定化させる物質を含有させる必要がある。ＳＨ化合物を安定化させる物質としては、キレート剤が用いられる。ＳＨ化合物を安定化させるキレート剤としては、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）が知られている（特許文献１）。しかしながら、ＤＴＰＡはＳＨ化合物を安定化させることができるものの、試薬を保存している間に試薬自体の吸光度が上昇する。そのため、試薬と試料とを混合した直後の吸光度（初期吸光度）も上昇してしまい、測定の精度が低下することがある。
【０００５】
【特許文献１】特開平１１−０３２７９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、試薬溶液中のＳＨ化合物の劣化を防ぎ、且つ試薬自体の吸光度の上昇を抑えることのできるキレート剤を含有するＣＫ活性測定用試薬及び試薬キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、シクロヘキシルジアミン四酢酸（以下、ＣｙＤＴＡとする）と、ＳＨ化合物とを含有するＣＫ活性測定用試薬を提供する。
【０００８】
また、本発明は、シクロヘキシルジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼ、グルコース、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及びＳＨ基を有する化合物を含有する第一試薬と、クレアチンリン酸を含む第二試薬とからなるクレアチンキナーゼ活性測定用試薬キットを提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、ＳＨ化合物を安定化させることができ、試薬自体の吸光度の上昇を抑えることのできるキレート剤を含む、保存安定性の優れたＣＫ活性測定用試薬及び試薬キットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本実施形態のＣＫ活性測定用試薬は、ＣｙＤＴＡとＳＨ化合物とを含有する。ＣｙＤＴＡは白色粉末状で、化学名はtrans-1,2-Diaminocyclohexane-N,N,N',N'-tetraacetic acidであり、キレート作用を有する。試薬中のＣｙＤＴＡの濃度としてはＳＨ化合物を安定化させることができる濃度であれば特に限定されない。本明細書における「ＣｙＤＴＡ」は、ＣｙＤＴＡの塩を含む。ＣｙＤＴＡの塩としては、ＣｙＤＴＡのカリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩などを例示できる。
【００１１】
ＳＨ化合物としては、試料中のＣＫを活性化できれば特に限定されず、例えば、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、Ｎ−グアニル−Ｌ−システイン、システアミン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、システイン、グルタチオン、メルカプトコハク酸、チオグルコース、ジチオエリスリトール、メルカプト酢酸、２−メルカプトエタノール、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム、２−メルカプトエタンスルホン酸、チオグリセロールなどを用いることができる。これらのＳＨ化合物は、二種類以上を組み合わせて用いてもよいが、単独で用いることが好ましい。試料と試薬とを混合した反応液中のＳＨ化合物の濃度（終濃度）は、０．１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭである。
【００１２】
ＣＫ活性測定用試薬の溶液状態におけるｐＨとしては特に限定されないが、５．０〜１０．０であることが好ましい。ｐＨを維持するために、試薬に緩衝剤を含有させることが好ましい。緩衝剤としては、例えばトリス−塩酸緩衝剤、イミダゾール−酢酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グッド緩衝剤などを用いることができる。
【００１３】
ＣＫ活性測定用試薬には、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）又はグルコキナーゼ（ＧＫ）、グルコース、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及びクレアチンリン酸を含有させることが好ましい。
【００１４】
ＣＫ活性測定用試薬は、各成分を凍結乾燥させた状態でも、溶媒に溶解させた溶液状態であってもよい。
また、Ｇ６ＰＤＨ含有試薬は第一試薬及び第二試薬の二試薬からなることが好ましい。この場合、第一試薬及び／又は第二試薬が凍結乾燥した状態であってもよく、両方の試薬が溶液状態であってもよい。ＣｙＤＴＡ及びＳＨ化合物は第一試薬及び第二試薬の何れに含まれていてもよく、両方に含まれていてもよいが、第一試薬に含まれることが好ましい。
【００１５】
ＣＫ活性測定用試薬が第一試薬と第二試薬とからなる場合、第一試薬にＧ６ＰＤＨ、ＣｙＤＴＡ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）又はグルコキナーゼ（ＧＫ）、グルコース、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、マグネシウムイオン及びＳＨ化合物を含有させ、第二試薬にクレアチンリン酸を含有させることが好ましい。
【００１６】
Ｇ６ＰＤＨ、ＨＫ及びＧＫとしては、その由来は特に限定されず、バクテリア、酵母、動植物などに由来するもの、又は遺伝子組み換え技術を用いて生成されたものを用いることができる。Ｇ６ＰＤＨの終濃度は、０．５〜４０Ｕ／ｍｌ、好ましくは１〜１０Ｕ／ｍｌである。ＨＫ又はＧＫの終濃度は、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ、好ましくは１〜６Ｕ／ｍｌである。
【００１７】
本実施形態のＣＫ活性測定用試薬の測定対象となるのは、試料に含まれる全てのＣＫの活性、ＣＫ−ＭＭの活性、ＣＫ−ＭＢの活性及びＣＫ−ＢＢの活性の何れかである。一般的に臨床検査では、試料中の全てのＣＫの活性又はＣＫ−ＭＢの活性が測定される。ＣＫ活性測定用試薬に、ＣＫのＭ型サブユニットに特異的に結合する抗体（以下、抗ＣＫ−Ｍ抗体とする）を含有させることにより、試料中のＣＫ−ＭＢの活性を測定することが可能となる(Wurzburg et al., 1977, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 15:131-135)。抗ＣＫ−Ｍ抗体としては、Ｍ型サブユニットを特異的に認識する抗体であればポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の何れでもよく、これらを混合して用いてもよい。また、抗体のフラグメント及びその誘導体を用いることもできる。抗体のフラグメント及びその誘導体としては、具体的にはＦａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ）２及びｓＦｖフラグメントなど（Blazar et al., 1997, J. Immunol., 159: 5821-5833及びBird et al., 1988, Science, 242: 423-426）が例示される。抗体のサブクラスはＩｇＧに限定されず、ＩｇＭなどでもよい。
【００１８】
測定に供される試料としては、例えば、血清、血漿、血液、髄液、尿、精液などを用いることができるが、血漿又は血清を用いることが好ましい。
【００１９】
以下、ＣＫ活性測定に用いられる反応系について説明する。
ＣＫを含む試料に上記成分を含むＣＫ活性測定用試薬を添加することにより、図１に示すような反応系が構築される。図１において、ＳＨ化合物によって活性化されたＣＫは、クレアチンリン酸及びＡＤＰからクレアチン及びＡＴＰを生成する反応を触媒する（反応１）。試薬に含まれるＨＫ又はＧＫは、試薬に含まれるグルコース及び反応１で生成したＡＴＰからグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）及びＡＤＰを生成させる(反応２)。さらに試薬に含まれるＧ６ＰＤＨは、反応２で生成したＧ６Ｐ及びＮＡＤ又はＮＡＤＰから６−ホスホグルコノ−δ−ラクトン及びＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させる（反応３）。ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが生成すると、試料と試薬との混合液の波長３４０ｎｍ付近での吸光度が上昇する。この吸光度の上昇をモニターすることにより、試料中のＣＫの活性を測定することができる。
【００２０】
上述したように、試薬中のＳＨ化合物は試薬の保存中に徐々に劣化するため、安定化させる必要がある。通常、ＳＨ化合物を安定化させる目的で試薬にキレート剤が添加される。このようなキレート剤の一種であるＤＴＰＡは、試薬を長期保存してもＳＨ化合物の劣化を防止することはできるものの、試薬保存中に試薬自体の吸光度が上昇してしまう。また、日本臨床化学会による勧告法でＳＨ化合物を安定化させるキレート剤として推奨されているＥＤＴＡは、試薬を長期保存しても試薬自体の吸光度は上昇しないが、ＳＨ化合物の劣化を十分に抑えることができない。さらに、ＥＤＴＡを含む試薬を長期保存した後、これを用いてＣＫ活性が高値である試料のＣＫ活性測定を行った場合、保存中に試薬中のＳＨ化合物が劣化してしまうため試料に含まれるＣＫを十分に活性化することができず、正確に測定できないことがある。
【００２１】
ＣＫ活性測定用試薬中でＣｙＤＴＡとＳＨ化合物とを共存させることにより、試薬の長期保存によるＳＨ基の劣化を抑制することができる。また、ＣｙＤＴＡは試薬自体の吸光度の上昇を抑制することができる。さらに、ＣｙＤＴＡを含有したＣＫ活性測定用試薬によると、ＣＫ活性が高値の試料を用いて活性測定を行なった場合でも、ＳＨ化合物の劣化を抑制することができるため正確にＣＫ活性を測定することが可能である。
【００２２】
ＣＫ活性測定用試薬にマグネシウムイオンを含有させることが好ましい。試薬にマグネシウム塩を添加することによってマグネシウムイオンを含有させることができる。マグネシウム塩としては、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどを用いることができる。
【００２３】
防腐剤や界面活性作用を有する化合物を試薬に添加してもよい。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウムなどを用いることができる。界面活性作用を有する化合物としては、例えば非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤、アルブミンなどを用いることができ、具体的にはトライトン類（Union Carbide Chemicals and Plastics Co.の登録商標）、エマルゲン類（花王（株）の登録商標）、ＢＳＡなどを用いることができる。
【００２４】
試料にはアデニレートキナーゼが含まれていることがある。アデニレートキナーゼは特に溶血試料に多く含まれており、ＣＫの活性測定に悪影響を及ぼす。この悪影響を回避するため、試薬にアデニレートキナーゼの作用を阻害する阻害剤を加えることが好ましい。阻害剤の種類としてはアデニレートキナーゼの作用を阻害するものであれば特に限定されないが、例えばアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）やＰ１Ｐ５ジアデノシン−５’−ペンタリン酸（ＡＰ５Ａ）などを用いることができる。
【００２５】
さらに、ダブルカイネティック法で活性測定することによりアデニレートキナーゼの悪影響を回避することも可能である。ダブルカイネティック法では、先ずアデニレートキナーゼの活性を測定し、その後クレアチンリン酸を添加し、ＣＫによる酵素反応を開始させて試料に含まれるキナーゼの活性（ＣＫの活性とアデニレートキナーゼの活性との和）を測定する。これらの測定結果の差がＣＫの活性値となる。
【００２６】
（実施例１）
下記に示す物質を下記濃度となるよう精製水に溶解した。
イミダゾール  １２５ｍＭ
酢酸マグネシウム  １２．５ｍＭ
ＡＤＰ  ２．５ｍＭ
ＡＭＰ  ６．２５ｍＭ
ＡＰ５Ａ  １２．５μＭ
グルコース  ２５ｍＭ
ＮＡＤＰ  ２．５ｍＭ
チオグリセロール  ４４ｍＭ
Ｇ６ＰＤＨ  １８７５Ｕ／Ｌ
ヘキソキナーゼ  ３７５０Ｕ／Ｌ
なお、溶液のｐＨは６．６に調整された。
【００２７】
上記組成にＣｙＤＴＡを添加して、ＣｙＤＴＡ濃度の異なる三種類のＣＫ活性測定用試薬を調製した。これらの試薬のＣｙＤＴＡ濃度はそれぞれ、１ｍＭ、２ｍＭ及び４ｍＭであった。これらの試薬に対して３７℃で５日間温度負荷をかけた後、試薬中のＳＨ基の残存量の定量を行なった。
【００２８】
ＣＫ活性測定用試薬は上記試薬（第一試薬）とクレアチンリン酸を含む試薬（第二試薬）とからなるが、本実施例では上記試薬に温度負荷をかけてチオグリセロールの安定性を評価しているため、第二試薬は用いない。
【００２９】
ＳＨ基の定量は、ＤＴＮＢ（5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)）を用いて行なった。試薬にＤＴＮＢを添加すると、ＳＨ化合物が存在する場合はＳＨ化合物のＳＨ基の量に相当する量のジスルフィド結合が切れて5-Mercapto-2-nitrobenzoic acidが生じる。5-Mercapto-2-nitrobenzoic acidが生じると、波長４１２ｎｍにおける吸光度が上昇するため、これを測定することにより試薬中のＳＨ基を定量した。
【００３０】
（比較例１〜６）
比較例１では、−８０℃で保存していた上記試薬のＳＨ基を定量した。ここでは、キレート剤を添加しておらず、また、温度負荷もかけていない。
比較例２では、キレート剤を添加しないこと以外は実施例１と同様にしてチオグリセロールのＳＨ基の残存量の定量を行なった。
比較例３では、上記組成にＣｙＤＴＡではなくＤＴＰＡを添加し、ＤＴＰＡ濃度の異なる三種類の試薬を調製すること以外は実施例１と同様にしてチオグリセロールのＳＨ基の残存量の定量を行なった。それぞれの試薬のＤＴＰＡ濃度は１ｍＭ、２ｍＭ及び４ｍＭであった。
比較例４では、ＣｙＤＴＡではなくグリコールエチレンジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）を添加し、ＧＥＤＴＡ濃度の異なる三種類の試薬を調製すること以外は実施例１と同様にしてチオグリセロールのＳＨ基の残存量の定量を行なった。それぞれの試薬のＧＥＤＴＡ濃度は１ｍＭ、２ｍＭ及び４ｍＭであった。
比較例５では、ＣｙＤＴＡではなくエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加し、ＥＤＴＡ濃度の異なる三種類の試薬を調製すること以外は実施例１と同様にしてチオグリセロールのＳＨ基の残存量の定量を行なった。それぞれの試薬のＥＤＴＡ濃度は１ｍＭ、２ｍＭ及び４ｍＭであった。
比較例６では、ＣｙＤＴＡではなくＥＤＴＡ−ＯＨを添加し、ＥＤＴＡ−ＯＨ濃度の異なる三種類の試薬を調製すること以外は実施例１と同様にしてチオグリセロールのＳＨ基の残存量の定量を行なった。それぞれの試薬のＥＤＴＡ−ＯＨ濃度は１ｍＭ、２ｍＭ及び４ｍＭであった。
比較例７では、ＣｙＤＴＡではなくエチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）を添加し、ＥＤＤＡ濃度の異なる三種類の試薬を調製すること以外は実施例１と同様にしてチオグリセロールのＳＨ基の残存量の定量を行なった。それぞれの試薬のＥＤＤＡ濃度は１ｍＭ、２ｍＭ及び４ｍＭであった。
【００３１】
実施例１及び比較例１〜７の測定結果を下記表１に示す。なお、表１においてチオグリセロールの残存量は百分率で示されている。これらの値は比較例１の測定結果に対する値である。
【００３２】
【表１】
0004781742.tif 000002
【００３３】
実施例１及び比較例２〜７の測定結果より、ＣｙＤＴＡを含む試薬（実施例１）及びＤＴＰＡを含む試薬（比較例３）は、キレート剤を含まない試薬及び他のキレート剤を含む試薬に比べて、温度負荷を行なった後のＳＨ基の残存量が多かった。即ち、上記試薬にＤＴＰＡ又はＣｙＤＴＡを添加することでチオグリセロールの保存安定性を向上できることが判った。
【００３４】
（実施例２）
下記に示す物質を下記濃度となるよう精製水に溶解してＣＫ活性測定用試薬の第一試薬及び第二試薬を調製し、これらを用いて初期吸光度を測定した。
【００３５】
＜第一試薬＞ｐＨ６．６
イミダゾール  １２５ｍＭ
酢酸マグネシウム  １２．５ｍＭ
ＡＤＰ  ２．５ｍＭ
ＡＭＰ  ６．２５ｍＭ
ＡＰ５Ａ  １２．５μＭ
グルコース  ３０ｍＭ
ＮＡＤＰ  ２．５ｍＭ
ＮＡＣ  ４４ｍＭ
Ｇ６ＰＤＨ  １８７５Ｕ／Ｌ
ヘキソキナーゼ  ３７５０Ｕ／Ｌ
ＣｙＤＴＡ  ２ｍＭ
＜第二試薬＞ｐＨ９．０
クレアチンリン酸  １５０ｍＭ
【００３６】
日立７１７０Ｓ形自動分析装置を用いて、第一試薬１８０μｌと、第二試薬４５μｌと、ＣＫを含まない生理食塩水である試料５．６μｌとを混合した後、３４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３７】
また、４℃で１週間保存した第一試薬、４℃で２週間保存した第一試薬、４℃で３週間保存した第一試薬及び４℃で４週間保存した第一試薬をそれぞれ用いて上記と同様に初期吸光度を測定した。
【００３８】
（比較例８〜１３）
上記第一試薬の組成のうちＣｙＤＴＡではなく、別の種類のキレート剤を添加して初期吸光度を測定した。
比較例８では、ＣｙＤＴＡの代わりにＤＴＰＡを２ｍＭ添加すること以外は実施例２と同様にして初期吸光度を測定した。
比較例９では、ＣｙＤＴＡの代わりにＧＥＤＴＡを２ｍＭ添加すること以外は実施例２と同様にして初期吸光度を測定した。
比較例１０では、ＣｙＤＴＡの代わりにＥＤＴＡを２ｍＭ添加すること以外は実施例１と同様にして初期吸光度を測定した。
比較例１１では、ＣｙＤＴＡの代わりにＥＤＴＡ−ＯＨを２ｍＭ添加すること以外は実施例１と同様にして初期吸光度を測定した。
比較例１２では、ＣｙＤＴＡの代わりにＥＤＤＡを２ｍＭ添加すること以外は実施例１と同様にして初期吸光度を測定した。
比較例１３では、ＣｙＤＴＡの代わりにニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を２ｍＭ添加すること以外は実施例１と同様にして初期吸光度を測定した。
【００３９】
実施例２及び比較例８〜１３の測定結果を下記表２に示す。なお、表２における値は測定した吸光度を１００００倍した値である。また、上昇率の欄には、試薬調製直後の初期吸光度に比べて４週間保存した後の初期吸光度がどのくらい上昇したかを百分率で示した。
【００４０】
【表２】
0004781742.tif 000003
【００４１】
実施例２及び比較例８〜１３の測定結果より、ＣｙＤＴＡを添加した試薬（実施例２）、ＥＤＴＡを添加した試薬（比較例１０）及びＥＤＴＡ−ＯＨを添加した試薬（比較例１１）は、他のキレート剤を含む試薬に比べ、長期保存による初期吸光度の上昇率が低かった。即ち、ＣｙＤＴＡ、ＥＤＴＡ及びＥＤＴＡ−ＯＨは、試薬自体の吸光度の上昇を抑制できることが判った。
【００４２】
（実施例３）
実施例２で調製した第一試薬及び第二試薬を用いて、ＣＫを約２０００Ｕ／ｌ含む試料のＣＫ活性を測定した。
【００４３】
日立７１７０Ｓ形自動分析装置を用いて、第一試薬１８０μｌと、第二試薬４５μｌと、試料５．６μｌとを混合して３４０ｎｍにおける吸光度を測定し、試料に含まれるＣＫの活性値を算出した。
【００４４】
また、４℃で２週間保存した第一試薬及び４℃で４週間保存した第一試薬をそれぞれ用いて上記と同様にＣＫの活性値を算出した。
【００４５】
（比較例１４〜１９）
比較例１４では、比較例８で調製した第一試薬を用いること以外は実施例３と同様にしてＣＫの活性値を算出した。
比較例１５では、比較例９で調製した第一試薬を用いること以外は実施例３と同様にしてＣＫの活性値を算出した。
比較例１６では、比較例１０で調製した第一試薬を用いること以外は実施例３と同様にしてＣＫの活性値を算出した。
比較例１７では、比較例１１で調製した第一試薬を用いること以外は実施例３と同様にしてＣＫの活性値を算出した。
比較例１８では、比較例１２で調製した第一試薬を用いること以外は実施例３と同様にしてＣＫの活性値を算出した。
比較例１９では、比較例１３で調製した第一試薬を用いること以外は実施例３と同様にしてＣＫの活性値を算出した。
【００４６】
実施例３及び比較例１４〜１９の測定結果を下記表３に示す。低下率の欄には、試薬調製直後のＣＫ活性値に比べて４週間保存した後の値がどのくらい低下したかを百分率で示した。
【００４７】
【表３】
0004781742.tif 000004
【００４８】
実施例３及び比較例１４〜１９の測定結果より、ＣｙＤＴＡを添加した試薬（実施例３）及びＤＴＰＡを添加した試薬（比較例１４）は、他のキレート剤を含む試薬に比べ、４週間保存した後の測定値の低下率が小さかった。即ち、ＣｙＤＴＡ又はＤＴＰＡを添加した試薬を用いることによって、試薬を長期間保存しても正確にＣＫ活性を測定できることが判った。
【００４９】
実施例１、２、３、及び比較例１〜１８より、ＣｙＤＴＡを含有する試薬は、ＳＨ化合物の保存安定性に優れ、長期間保存した後でも試薬自体の吸光度が大きく上昇せず、さらにこの試薬によるとＣＫ活性が高値の試料を用いた場合でも正確に活性測定を行なえることが判った。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ＣＫ活性測定の反応系を示した模式図である。
【図１】
0004781742.tif 000005