(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記段階ａ）〜ｃ）
ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるヒトチロシナーゼをコード化するポリヌクレオチドを含む組換えベクターで細菌を形質転換する段階；
ｂ）前記ａ）段階で形質転換された細菌を培養する段階；及び
ｃ）前記ｂ）段階で培養された培養物をＤＥＡＥ−セファセルイオン交換クロマトグラフィーは使用せず、Ｈｉｓバインドレジンクロマトグラフィーだけで精製する段階；
を含み、
下記酵素的特性１）〜３）
１）分子量：５３ｋＤａ
２）比活性度
・チロシン水酸化酵素活性に対する比活性度：１０８．３±２．１０μｍｏｌ／ｍｇ／ｈ
・ドーパ酸化酵素活性に対する比活性度：８０７（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）
３）基質に対するｋｍ値
・Ｌ−チロシン：１．３２μＭ
・Ｌ−ドーパ：０．３４ｍＭ
を有する配列番号２のアミノ酸配列からなるヒトチロシナーゼを生産する方法。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列からなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えヒトチロシナーゼ及びその生産方法に関し、より詳しくは、カルボキシル末端に位置した膜貫通部位が除去されたヒトチロシナーゼ遺伝子を発現させ、分離、精製した組換えヒトチロシナーゼ及びその生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚におけるメラニン色素の形成と表面沈着は自然現象にして、太陽光に含まれている有害な紫外線から身体を保護しようとする一種の人体防御システムである。皮膚に存在する高分子性メラニン色素は紫外線を吸収して熱エネルギーに変換して分散させ、さらに、紫外線が皮膚の脂質に作用して生成した自由ラジカルと皮膚細胞に、酸化による損傷を誘発する他の分子等を吸収することにより、身体を防御するようになる。
【０００３】
遺伝的にメラニン色素が不足な皮膚は紫外線に露出された場合、皮膚角質層の厚さが厚くなり、この角質層の蛋白質が紫外線を散乱させるか又は分散させ、人体を防御するようになる。一般的な人体の場合、皮膚に紫外線が照射されると、皮膚の基底層に存在するメラニン形成細胞は直ちにメラニンを生成し、生成されたメラニンはケラチン形成細胞に伝達され、表皮上部に運搬され、皮膚は紫外線遮断膜（紫外線遮断指数（ＳＰＦ：Sun protection factor）３乃至５）が形成されて黒色に変化するようになる。しかしながら、生成されたメラニン色素が均一に分散されておらず、非正常的に塊になっている場合に、シミとそばかす等の症状が現れる。
【０００４】
このようにメラニン形成細胞において、メラニンを合成する際にチロシナーゼが作用するようになり、チロシナーゼはメラニン生成初期にアミノ酸の一種であるチロシン（ヒドロキシフェニルアラニン）に作用してジヒドロキシフェニルアラニン（DOPA）の形成を誘発し、引き続きジヒドロキシフェニルアラニン（DOPA）の酸化を促進し、キノン（ドーパキノン：DOPA  Quinone）に変形させる。このように生成されたドーパキノンは一連の段階を経てメラニンが生成される。
【０００５】
チロシナーゼ（Tyrosinase, monophenol monooxgenase, EC 1.14.18.1）は哺乳動物、植物等に広く分布し、植物性チロシナーゼは果物及び野菜の加工の際に褐変する現象に関与している。哺乳動物のチロシナーゼは皮膚、毛嚢、目等に分布するメラニン形成細胞（melanocyte）に含まれ、紫外線による損傷を防御する役割をする。今まで複数種の生物体より多くのチロシナーゼが分離、精製され、その中で茸と鼠から分離されたチロシナーゼの構造及び機能に対する研究が最も活発になされた（Laskin and Paccinini, J. Biol. Chem. 261: 16626-16635, 1986; Mayer, Phytochem. 26: 11-20, 1987; Jimenez-Cervantes et al., Pigment Cell Res. 6: 394-399, 1993; Sanchez-Ferrer et al., Biochim Biophys Acta. 1247: 1-5, 1995; Della Longa et al., J. Biol. Chem. 35: 21025-21030, 1996）。
【０００６】
チロシナーゼは活性部位に一対の銅イオンを含んでいる金属含有蛋白質（metalloprotein）である。人体に存在するチロシナーゼは分子量が約６６，０００Ｄａであり、疎水性信号ペプチドを除外すれば５４８個のアミノ酸で構成されており、分子量は６２，１５０Ｄａである。チロシナーゼは下記反応式１の通り、モノヒドロキシフェノール（monohydroxyphenol）をＯ−ジヒドロキシフェノール（dihydroxyphenol）に転換させる水酸化（hydroxylation）反応を触媒するチロシン水酸化酵素活性（tyrosine hydroxylase activity）と、Ｏ−ジヒドロキシフェノールをＯ−キノン（quinone）に酸化させる反応を触媒するドーパ酸化酵素活性（DOPA oxidase activity)を有する(Mason, Annu Rev. Biochem. 34: 105-184, 1965）。
【０００７】
【化１】
0004769746.tif 000002
【０００８】
ヒトチロシナーゼは黒色種細胞（melanoma cell）から分離され（Wittbjer, Acta Derm. Venereol. 69: 125-131, 1989; Wittbjer, Acta Derm. Venereol. 70: 291-294, 1990）、米国特許（ＵＳＰ  ４，８９８，８１４；１９９０：特許文献１）にはヒトチロシナーゼの生成を誘導するｃＤＮＡを発見してその塩基配列が開示されている。国際特許（ＷＯ  ９０／１２８６９）には非メラニン生成細胞型眞核細胞（non-melanocytic eucaryotic cell）を利用して活性ヒトチロシナーゼを生産する方法を記述しているところ、ヒトチロシナーゼを誘導するＤＮＡをレトロウィルス（retrovirus）等のような適切な発現ベクターに挿入して新たな形質転換ベクターを生産した後、これをさらに、繊維芽細胞（fibroblast）等のような眞核細胞に導入後、導入された細胞を培養後分離、精製してヒトチロシナーゼを製造する方法が開示されている。
【０００９】
しかしながら、前記方法はヒトチロシナーゼを形成するＤＮＡをレトロウィルス（retrovirus）のような発現ベクターに導入し、これをさらに繊維芽細胞に導入した後、細胞培養によりチロシナーゼを増量させた後、細胞膜を破砕し、複数の付属器官が存在する細胞内原形質においてヒトチロシナーゼを分離精製することにより、技術的に複雑で難しく大量生産による商業化が困難な短所があった。
【００１０】
一方、本発明者は、先行研究を通じて大腸菌を利用した組換えヒトチロシナーゼの製造方法を特許出願（韓国特許出願２００１−００５７３７９号、韓国特許出願２００２−００７３７２８号）している。しかしながら、前記記述された方法はＤＥＡＥ−セパセルイオン交換クロマトグラフィーを利用して１次精製後、Ｈｉｓ・バインドレジンクロマトグラフィーで２次精製することにより、精製収率が減少する短所があった。
【００１１】
ここに、本発明者は、組換えヒトチロシナーゼの生産方法を研究している最中、カルボキシル末端に位置した膜貫通部位が除去されたヒトチロシナーゼ遺伝子を発現させる場合、不溶性凝集体の形成無しに高い酵素活性を有する組換えヒトチロシナーゼを生産することができ、Ｈｉｓ・バインドレジンクロマトグラフィーで１次精製のみを実施しても、精製収率が向上する効果を確認することにより本発明を完成した。
【００１２】
【特許文献１】ＵＳＰ  ４，８９８，８１４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の目的は、組換えヒトチロシナーゼ及びこれの生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的を達成するために、本発明は、
下記段階ａ）〜ｃ）
ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるヒトチロシナーゼをコード化するポリヌクレオチドを含む組換えベクターで細菌を形質転換する段階；
ｂ）前記ａ）段階で形質転換された細菌を培養する段階；及び
ｃ）前記ｂ）段階で培養された培養物をＤＥＡＥ−セファセルイオン交換クロマトグラフィーは使用せず、Ｈｉｓバインドレジンクロマトグラフィーだけで精製する段階；
を含み、
下記酵素的特性１）〜３）
１）分子量：５３ｋＤａ
２）比活性度
・チロシン水酸化酵素活性に対する比活性度：１０８．３±２．１０μｍｏｌ／ｍｇ／ｈ
・ドーパ酸化酵素活性に対する比活性度：８０７（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）
３）基質に対するｋｍ値
・Ｌ−チロシン：１．３２μＭ
・Ｌ−ドーパ：０．３４ｍＭ
を有する配列番号２のアミノ酸配列からなるヒトチロシナーゼを生産する方法を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列からなることを特徴とする前記方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明では、カルボキシル末端に位置した膜貫通部位が除去されたヒトチロシナーゼ遺伝子を発現させ、分離精製した組換えヒトチロシナーゼを生産した。本発明による生産方法は、不溶性凝集体（inclusion body）の形成無しに高い酵素活性を示す組換えヒトチロシナーゼを大量生産できる優れた効果があり、精製工程が簡単で精製収率が向上される効果があるので、生物医薬、食品、化粧品、化学工業等の多様な産業分野で有用に用いられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、組換えヒトチロシナーゼを提供する。より具体的に、配列番号２で表示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするヒトチロシナーゼを提供する。
【００１８】
前記組換えヒトチロシナーゼの酵素学的特性を整理すると、下記の通りである。
１）分子量：５３ｋＤａ
２）比活性度（specific activity）
・チロシン水酸化酵素（tyrosine hydroxylase）活性に対する比活性度：１０８．３±２．１０μｍｏｌ／ｍｇ／ｈ
・ドーパ酸化酵素（DOPAoxidase）活性に対する比活性度：８０７ｕｎｉｔｓ／ｍｇ
３）基質に対するＫｍ値
・Ｌ−チロシン（L-tyrosine）：１．３２μＭ
・Ｌ−ドーパ（L-DOPA）：０．３４ｍＭ
【００１９】
本発明の組換えヒトチロシナーゼは、ヒトチロシナーゼアミノ酸配列の内、膜貫通（transmembrane）部位が除去された蛋白質にして、ヒトチロシナーゼの全体の遺伝子配列は、Ｍ２７１６０に記述されており、Ｎ末端のシグナル配列（signal sequnce）とＣ末端の膜貫通部位を除いた５５７番塩基配列から１９２４番塩基配列によりコード化された蛋白質である。
【００２０】
本発明においてヒトチロシナーゼ配列の内“膜貫通（transmembrane）域が欠失”されたということは、ヒトチロシナーゼ配列の内、カルボキシル末端から５５個のアミノ酸が欠失されたことをいう。
【００２１】
前記のような特性を有する本発明の組換えヒトチロシナーゼは、配列番号２で表示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの場合であることもあり得る。さらに、本発明で組換えヒトチロシナーゼは前記ポリペプチドの機能的同等物を含む。前記機能的同等物とは、アミノ酸の付加、置換又は欠失の結果、配列番号２で表示されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上の配列相同性を有するものにして、本発明の膜貫通（transmembrane）部位が除去された組換えヒトチロシナーゼと実質的に同質の生理活性を示すポリペプチドをいう。ここで、“実質的に同質の生理活性”とは、チロシン水酸化酵素活性及びドーパ酸化酵素活性を意味する。
【００２２】
前記機能的同等物には、例えば、配列番号２で表示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸の内、一部が置換されたり、又は欠失或いは付加されたりしたアミノ酸配列変形体が含まれる。アミノ酸の置換は好ましくは保存的置換である。天然に存在するアミノ酸の保存的置換の例は次の通りである；脂肪属アミノ酸（Gly, Ala, Pro）、疎水性アミノ酸（Ile, Leu, Val）、芳香族アミノ酸（Phe, Tyr, Trp）、酸性アミノ酸（Asp, Glu）、塩基性アミノ酸（His, Lys, Arg, Gln, Asn）及び硫黄含有アミノ酸（Cys, Met）。
【００２３】
アミノ酸の欠失は、好ましくは本発明の組換えヒトチロシナーゼの活性に直接関与しない部分に位置する。さらに、本発明の機能的同等物の範囲には、本発明に伴う組換えヒトチロシナーゼの基本骨格及びその生理活性を維持しながらポリペプチドの一部化学構造が変形されたポリペプチド誘導体も含まれる。例えば、本発明のポリペプチドの安定性、貯蔵性、揮発性又は溶解度等を変更させるための構造変更がこれに含まれる。
【００２４】
さらに、本発明の組換えヒトチロシナーゼは、膜貫通部位が除去された天然型アミノ酸配列を有するヒトチロシナーゼのみならず、そのアミノ酸配列変異体も含む。ヒトチロシナーゼの変異体とは、膜貫通部位が除去されたヒトチロシナーゼ天然アミノ酸配列と、一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的若しくは保全的置換又はこれらの組み合わせにより相異した配列を有する蛋白質を意味する。分子の活性を全体的に変更させない蛋白質及びペプチドにおける、アミノ酸交換は当該分野で公知されている（H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979）。最も通常的に起こる交換はアミノ酸残基Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly間の交換である。
【００２５】
さらに、場合によってはリン酸化（phosphorylation）、硫黄化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、糖化（glycosylaion）、メチル化（methylation）、ファネシル化（farnesylaion）等で修飾（modification）されることもあり得る。
【００２６】
さらに、本発明は前記膜貫通部位が除去されたヒトチロシナーゼをコード化するポリヌクレオチドを提供する。好ましく前記ポリヌクレオチドは配列番号１で表示される塩基配列からなるＤＮＡ又はＲＮＡの場合もあり得る。前記ポリヌクレオチドは自然の中で分離されるか又は化学的合成法により製造することもできる。
【００２７】
本発明はさらに、ヒトチロシナーゼをコード化するポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。本発明で“組換えベクター”とは、適当な宿主細胞において目的蛋白質又は目的ＲＮＡを発現できるベクターにして、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子作製物をいう。
【００２８】
本発明において、用語“作動可能に連結された（operably linked）”は一般的な機能を行うように核酸発現調節配列と目的とする蛋白質又はＲＮＡをコーディングする核酸配列が機能的に連結（functional linkage）されていることをいう。例えば、プロモーターと蛋白質又はＲＮＡをコーディングする核酸配列が作動可能に連結され、コーディングする核酸配列の発現に影響を及ぼし得る。組換えベクターとの作動的連結は、当該技術分野で公知された遺伝子組換え技術を利用して製造することができ、部位−特異的ＤＮＡ切断及び連結は当該技術分野において一般的に公知された酵素等を用いる。
【００２９】
本発明のベクターはプラスミドベクター、コズミドベクター、バクテリオファージベクター及びウィルスベクター等を含むものの、これらに制限されない。適切な発現ベクターはプロモーター、オペレーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル及びインハンサーのような発現調節エレメントの他にも、膜標的化又は分泌のためのシグナル配列又はリーダー配列を含み、目的により多様に製造できる。ベクターのプロモーターは構成的又は誘導的の場合もある。
【００３０】
さらに、発現ベクターはベクターを含む宿主細胞を選択するための選択マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合複製起源を含む。シグナル配列には宿主が大腸菌の場合は、ＰｈｏＡシグナル配列、ＯｍｐＡシグナル配列等が、宿主がバシラス属菌の場合はα−アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグ  ナル配列等が、宿主が酵母の場合にはＭＦαシグナル配列、ＳＵＣ２シグナル配列等が、宿主が動物細胞の場合はインシュリンシグナル配列、α−インタフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列等を利用できるものの、これらに制限されない。
【００３１】
本発明の一実施例では、蛋白質の精製を容易にする目的で、組換えヒトチロシナーゼに人為的に６個のヒスチジン（Histidine）を含ませて発現させるために、Ｈｉｓ  Ｔａｇ配列を有しているｐＥＴ２６Ｂ（＋）ベクター（Novagen）を用いた。
【００３２】
本発明はさらに、前記組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供する。形質転換は核酸を有機体、細胞、組織又は器官に導入するあらゆる方法も含まれ、当分野で公知された通り、宿主細胞により適切な標準技術を選択して行える。このような方法には電気衝撃遺伝子伝達法（electroporation）、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈澱、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、シリコンカーバイト繊維を利用した撹拌、アグロバクテリアが媒介された形質転換、ＰＥＧ、デキストラン硫酸、リポフェクトアミン等が含まれるものの、これに制限されない。
【００３３】
宿主細胞によって蛋白質の発現量と修飾等が異なって現れるので、目的に最も適合した宿主細胞を選択して用いれば良い。宿主細胞には大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、シュードモナス（Pseudomonas）、プロテウス菌（Proteus mirabilis）又はブドウ球菌（Staphylococcus）のような原核宿主細胞があるものの、これらに制限されるものではない。さらに、眞菌（例えば、アスペルギルス（Aspergillus）、酵母（例えば、ピキア酵母（Pichia pastoris）、サカロマイセスセルビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces）、アカパンカビ（Neurospora crassa）等のような下等眞核細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物等を含む高等眞核生物由来の細胞を宿主細胞として利用できるものの、好ましくは大腸菌である。
【００３４】
本発明はさらに、本発明の膜貫通部位が除去されたヒトチロシナーゼ遺伝子を含む組換えベクターが導入された形質転換体を培養及び精製することを含む  組換えヒトチロシナーゼの生産方法を提供する。
【００３５】
前記方法は、前記形質転換された宿主細胞内で本発明の組換えヒトチロシナーゼをコーディングする、ポリヌクレオチドが発現されるように適切な培地及び条件下で培養することを含む。前記形質転換された細胞を培養して組換え蛋白質を発現させる方法は当業界に公知されており、例えば、形質転換された細胞が成長できる適切な培地に接種して種培養後、これを本培養用培地に接種し、適合した条件で培養することにより蛋白質の発現を誘導することができる。以降、前記形質転換された細胞で発現が誘導された本発明のヒトチロシナーゼの分離及び精製は、当業界に公知された多様な分離及び精製方法を通じて行うことができ、例えば、前記細胞を溶解後、溶解物を遠心分離して塩析（硫酸アンモニウムの沈澱及びリン酸ナトリウムの沈澱）、溶媒沈澱（アセトン、エタノール等を利用した蛋白質の分劃沈澱）、透析、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆状カラムクロマトグラフィー及び親和性クロマトグラフィー等の技法を単独又は組み合わせで適用させ、本発明の組換えヒトチロシナーゼを生産できる（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)）。
【００３６】
本発明の一実施例では組換えヒトチロシナーゼを生産するために、発現ベクターｐＥＴ−ｈＴｙｒｏｓｉｎａｓｅ（ＴＭ−）を導入した大腸菌を培養して、膜貫通部位が除去された組換えヒトチロシナーゼの発現を誘導し、前記菌を破砕して遠心分離し、上澄液を収得し、これをＨｉｓ・バインドレジンクロマトグラフィー（His・Bind Resin chromatography, Novagen）を利用して精製した。
【００３７】
上述の通り、本発明に伴う膜貫通部位が除去された組換えヒトチロシナーゼの生産方法は、ＤＥＡＥ−セファセルイオン交換クロマトグラフィーを利用する精製過程が不要であることを特徴とする。Ｈｉｓ・バインドレジンクロマトグラフィーを利用するためには組換え蛋白質に人為的に６個のヒスチジン（Histidine）を含ませて発現させるものの、蛋白質の固有構造により、６個のヒスチジンが部分的に隠される場合、Ｈｉｓ・バインドレジンクロマトグラフィーで精製の際、低いモル（mole）数のイミダゾールで精製しなければならない。本発明者の先行研究（大韓民国特許出願第２００２−００７３７２８号（比較例２））において製造されたｐＥＴ−ｈＴｙｒ発現ベクターを利用して、大腸菌で生産された組換えヒトチロシナーゼの精製のためには、チロシナーゼのＣ末端に人為的に含ませた６個のヒスチジンが構造的に隠されるため、低いモル数のイミダゾールを利用して精製しなければならなかった。
【００３８】
低いモル数のイミダゾールの使用は、組換えヒトチロシナーゼの他に、別の不要な蛋白質の溶出を引き起し、したがってＨｉｓ・バインドレジンクロマトグラフィーを利用する前に、ＤＥＡＥ−セファセルイオン交換クロマトグラフィーを利用した精製過程が必要であった。しかしながら、本発明に伴う膜貫通部位が除去された組換えヒトチロシナーゼの場合、精製のための６個のヒスチジンが構造的に隠される問題が解決され、高いモル数のイミダゾールを用いることができ、それに伴いＤＥＡＥ−セファセルイオン交換クロマトグラフィーの精製過程を行わずとも精製が可能となった。
【００３９】
さらに、本発明に伴う膜貫通部位が除去された組換えヒトチロシナーゼの生産方法は、不溶性凝集体を形成しないので、その生産過程で界面活性剤の使用が不要であることを特徴とする。膜貫通部位は一般的に疎水性残基等で構成されているものの、疎水性残基等はその物理的特性上、水溶液で疎水性残基等同志で結合しようとする。しかしながら、このような疎水性残基等で構成された膜貫通部位は界面活性剤（detergent）を利用すればある程度不溶性凝集体の形成を防げる。本発明者等が出願した先行技術（大韓民国特許出願第２００２−００７３７２８号）では界面活性剤として、１％トリトンＸ−１００を用いてチロシナーゼ蛋白質の不溶性凝集体形成を防いだ。しかしながら、本発明ではチロシナーゼの膜貫通部位を除去することにより、大韓民国特許出願第２００２−００７３７２８号とは別に、１％トリトンＸ−１００を用いずとも、不溶性凝集体の形成を防ぐことができて、高い酵素活性を有するヒトチロシナーゼを生産することができた。
【００４０】
さらに、本発明の生産方法は蛋白質精製の際、ヒスチジンタグ（tag）を除去する別途の工程が不要であることを特徴とする。本発明では蛋白質の精製を容易にする目的で組換えヒトチロシナーゼに人為的に６個のヒスチジン（Histidine）を含めて発現させるものの、本発明者等が出願した先行技術（大韓民国特許出願第２００１−００５７３７９号）ではヒスチジンをＮ末端に位置させることにより、チロシナーゼの活性に影響を与えてこれを除去する工程が必要であった。しかしながら、本発明者は前記ヒスチジンをＣ−末端に存在するようにベクターシステムを構築することにより、チロシナーゼの活性に影響を与えないようにして、ヒスチジンを除去する工程が不要となった。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであることから、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものとは解釈されない。
【００４２】
＜実施例１＞
膜貫通部位が除去されたヒトチロシナーゼ遺伝子のクローニング及び発現
＜１−１＞プライマー製作
プライマーはジーンバンク登録番号Ｍ２７１６０に開示されたメラノマＤＮＡ（melanoma DNA）のチロシナーゼ（tyrosinase）をコード化しているｃＤＮＡ配列を基に製作した。Ｎ末端のシグナル配列とＣ−末端の膜貫通部位を除外した、つまり、Ｍ２７１６０の５５７番塩基配列から１９２４番塩基配列まで合成されるようにプライマーを合成し、蛋白質合成のために、Ｍ２７１６０配列の５５７番位置の塩基配列の前に、ＭｅｔをコードしているＡＴＧをＮプライマー内部に人為的に挿入した。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉコードン使用頻度（E. coli codon usage）を利用して蛋白質がよく合成されるように誘導するために、開始コードンＡＴＧの次のｃａｔ配列をｃａｃに置換し、プライマーの配列内にＮｄｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉの制限酵素の座が存在するように製作した。Ｎｄｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉサイトは下線で表示した。
正方向プライマー（４０ｍｅｒ）：
5'-GGAATTCCATATGCACTTCCCTAGAGCCTGTGTCTCCTCT-3'（配列番号３）。
逆方向プライマー（３１ｍｅｒ）：
5'-CCGCTCGAGCGGGATCCGACTCGCTTGTTCC-3'（配列番号４）。
【００４３】
＜１−２＞  ＰＣＲによる膜貫通部位が除去されたヒトチロシナーゼ遺伝子の増幅
膜貫通部位が除去されたヒトチロシナーゼ遺伝子をクローニングするために、人体５’−ストレッチプラスｃＤＮＡライブラリー（human5'-stretch plus cDNA library, Clontech, Palo Alto CA, USA）を鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは鋳型ＤＮＡ１００ｎｇ、０．８μＭの正方向及び逆方向プライマー、最終濃度０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合物（TaKaRa）、１０×Ｚ−Ｔａｑ緩衝溶液５μＬ、Ｚ−Ｔａｑ重合酵素（TaKaRa）１μＬを含む総嵩５０μＬのＰＣＲ反応液を利用して行われた。ＰＣＲ反応は９８℃で１０秒；６５℃で３０秒；及び７２℃で６０秒を１サイクルとして、３５回繰返し行った。以降、１％アガロスゲルで電気泳動を行い、増幅されたＰＣＲ産物を確認し、ジーングリーンキット（Geneclean kit, BIO101）を利用してゲルよりＤＮＡを抽出した。
【００４４】
＜１−３＞  クローニング及び発現
増幅されたＰＣＲ産物のクローニング過程を図１に示した。まず、前記ゲルより抽出された１３９９ｂｐ大のＤＮＡ断片をライゲーション反応液（pGEM-T easy vector 0.3μL. 2×buffer 2.5μL. Ligase 0.5μL）と混合してｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Promega. USA）に挿入した。以降、４２℃で４０秒間熱衝撃（heat shock）を加えて前記チロシナーゼ遺伝子が挿入されたｐＧＥＭ−Ｔ  ＥａｓｙベクターをＢＬ２１ｓｔａｒ（DE3）に形質転換させた。前記形質転換後５０μｇ／ｍＬのアンピシリン（Ampicillin）が含まれた平板Ｌ−ブロツ（Broth）培地上に培養して形質転換された大腸菌を選別した。培養されたコロニーの中で一つを選び、再度液体Ｌ−ブロツ培地に培養し、これよりＤＮＡを抽出した。
【００４５】
一方、本発明の組換えヒトチロシナーゼの精製を容易にする目的で、組換えヒトチロシナーゼに人為的に６個のヒスチジン（Histidine）を含めて発現させようとした。このため、Ｈｉｓ  Ｔａｇ配列を有しているｐＥＴ２６Ｂ（＋）ベクター（Novagen）にヒトチロシナーゼ遺伝子を挿入した。
【００４６】
まず、前記抽出されたＮｄｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉで切断した後、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）ベクター（Novagen）のＮｄｅ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉの位置にＴ４  ＤＮＡライゲーズ（ligase）を利用して１６℃で２４時間反応させた。ライゲーションの結果生成された組換え発現ベクターを‘ｐＥＴ−ｈＴｙｒｏｓｉｎａｓｅ（ＴＭ−）’と命名した。以降、熱衝撃（４２℃）を加えて前記  ｐＥＴ−ｈＴｙｒｏｓｉｎａｓｅ（ＴＭ−）をＢＬ２１（ＤＥ３）に導入させた。形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンが含まれたＬＢ−アガプレートで１２時間培養した。以降、各プレートで育ったコロニーの中で一つを選び組換えヒトチロシナーゼの大量発現に利用した。本発明により形質転換された大腸菌で発現される組換えヒトチロシナーゼは、ヒスチジン（histidine）６分子が結合された形態の融合蛋白質で発現される。
【００４７】
＜実施例２＞
ｐＥＴ−ｈＴｙｒｏｓｉｎａｓｅ（ＴＭ−）を利用した組換えヒトチロシナーゼ蛋白質の発現及び精製
実施例１の通り、発現ベクターｐＥＴ２６とヒトチロシナーゼ誘導ＤＮＡ（Human tyrosinase cDNA）を組換えして得た発現ベクターｐＥＴ−ｈＴｙｒｏｓｉｎａｓｅ（ＴＭ−）を導入した大腸菌を３０μＬ／ｍＬのカナマイシン（kanamycin）が含まれたＬＢ培地ＩＬにおいて、３７℃で２時間培養した。６００ｎｍにおける吸光度が０．４−０．５になった時ＩＰＴＧ（isopropyl β-D-thoigalactopyranoside）を０．４ｍＭ投入して酵素の合成を誘導し、８−１０時間培養後、８，０００ｇで１０分間遠心分離して菌を集菌した。トリトンＸ−１００を含まない５００ｍＭ  ＮａＣｌが含まれた２０ｍＭトリスー塩酸（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ）緩衝溶液（ｐＨ７．９；以下‘緩衝溶液Ａ’と称す）を加えて菌を均質化し、超音波破砕機（Sonics amp; Materials INC.）を利用して４℃で３０−４０ｗａｔｔｓ、アンプリチュード（amplitude）８％の条件で９秒間パルス（pulse）を加え、１秒間止めることを繰返して２０分間菌を破壊した。以降、８，０００ｇで２０分間遠心分離して別の蛋白質の滓を除去した粗抽出物を収得した。前記粗抽出物をＨｉｓバインドレジンクロマトグラフィー（His bind resin chromatography, Novagen）に導入して吸着させ、不要な蛋白質を除去するために、５０ｍＭイミダゾ−ル（imidazol）が含まれた緩衝溶液Ａで十分に洗浄した。この際、洗浄は洗浄された液のＯＤ  ２８０値を測定してＯＤ  ２８０＝０になるまで洗浄した。以降、５００ｍＭのイミダゾ−ルが含まれた緩衝溶液Ａで１ｍＬ／ｍｉｎの速度で溶出させた。溶出液に含まれたイミダゾールを除去するために、２０ｍＭのトリスー塩酸（Tris-C1）緩衝溶液（ｐＨ７．９）を用いて８時間ずつ３回透析した。精製されたチロシナーゼの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
【００４８】
実験結果は、図２に示した通り、本発明に伴う膜貫通部位が除去された組換えヒトチロシナーゼの分子量は約５３ｋＤａとして表れた。一般的に哺乳動物のチロシナーゼは翻訳後変形（post-translational modification）過程で糖質化（glycosylation）が起こり、分子量が増加するものと知られ（Imokawa and Mishima, J. Invest. Derm. 85: 165-168, 1985; Imokawa, J. Invest. Derm. 95: 39-49, 1990）、糖質化が起こったチロシナーゼの分子量は約７０ｋＤａとして報告された（Laskin and Paccinini, J. Biol. Chem. 261: 16626-16635, 1986）。しかしながら、図２の結果から本発明により大腸菌より発現された膜貫通部位が除去された組換えヒトチロシナーゼは糖質化が起こっていないことが確認できた。
【００４９】
＜比較例１＞
大韓民国特許出願第２００１−００５７３７９号に開示された方法によりヒトチロシナーゼを生産
本発明者の先行研究である大韓民国特許出願第２００１−００５７３７９号に開示された方法によりヒトチロシナーゼを生産した。発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓとヒトチロシナーゼ誘導ＤＮＡ（Human tyrosinase cDNA）を組換えで得た発現ベクターｐＨｉｓ−ｈＴｙｒを導入した大腸菌を５０μＬ／ｍＬのアンピシリンが含まれたＬＢブロツ培地ＩＬで３７℃で２時間培養した。６００ｎｍにおける吸光度が０．４−０．５程度になった時、ＩＰＴＧ（isopropyl β-D-thoigalactopyranoside）を１ｍＭ投入して酵素の合成を誘導した。継続して８−１０時間培養後、８，０００ｇで１０分間遠心分離して菌を集菌し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝溶液／１％トリトンＸ−１００、ｐＨ６．８（緩衝液Ｂ）を加えて菌を均質化し、超音波破砕機で菌を破砕した。前記破砕物を２０，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、上澄液を採り、緩衝溶液Ｂで平衡させたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌコラムの上層部に導入した。前記コラムに結合されずに溶離されたポリヒスチジンーチロシナーゼ融合蛋白質を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝溶液／５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ７．８（緩衝溶液Ｃ）で平衡させた固定化金属親和コラム（metal affinity column）に導入する。コラムを緩衝液Ｃで数回洗浄後５０ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液Ｃで融合蛋白質を脱着させ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０（緩衝液Ｄ）に対して透析した。過量（酵素：基質＝１：５０）のエンテロキナーゼ（Biozyme）を溶解させた緩衝液Ｄにおいて、３７℃で２時間反応させ、融合ペプチドを切断し、固定化金属親和コラムに導入して、ポリヒスチジンペプチドを吸着除去した。結合されない酵素部分は緩衝液Ｂに対して透析して精製された組換えチロシナーゼを収得した。
【００５０】
＜比較例２＞
大韓民国特許出願第２００２−００７３７２８号に開示された方法によりヒトチロシナーゼを生産
本発明者の先行研究である特許出願第２００２−００７３７２８号に開示された方法によりヒトチロシナーゼを生産した。ｐＥＴ−ｈＴｙｒ発現ベクターで形質転換されたＢＬ２１（DE3）を培養して収得された菌体を、１％トリトンＸ−１００  が含まれた２０ｍＭリン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ６．８；以下‘緩衝溶液Ｅ’と称す）１０ｍＬで２−３回洗浄後、菌体を再度緩衝溶液Ｅ１０ｍＬで均質化させた。以降、超音波破砕機（Sonics amp; Materials INC.）を利用して菌を破壊した。菌破砕後に２０，０００ｇで４℃で２０分間遠心分離して蛋白質と異なる細胞滓を分離した。このようにして、異なる細胞不純物が除去された粗抽出物を収得した。前記上澄液を緩衝溶液Ｅで平衡化させたＤＥＡＥ−セファセルイオン交換クロマトグラフィー（DEAE-Sephacel ion exchange chromatography）（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）に吸着させ、１ｍＬ／ｍｉｎの速度で溶出させた。溶出された濾液を収集して１％トリトンＸ−１００と５００ｍＭ  ＮａＣｌが含まれた２０ｍＭトリス−塩酸（Tris-C1）  緩衝溶液（ｐＨ７．９；以下‘緩衝溶液Ｆ’と称す）で８時間ずつ３回透析した。以降、透析液を緩衝溶液Ｆで平衡化させたＨｉｓバインドレジンクロマトグラフィー（His・Bind Resin chromatography, Novagen）に吸着させた。その後、不要な蛋白質を除去するために、１０ｍＭイミダゾール（imidazol）が含まれた緩衝溶液Ｆで十分に洗浄した。この際、洗浄は洗浄された液のＯＤ２８０値を測定し、ＯＤ  ２８０＝０になるまで洗浄した。以降、１００ｍＭイミダゾールが含まれた緩衝溶液Ｆで１ｍＬ／ｍｉｎの速度で溶出させた。溶出液を再度緩衝溶液Ｅで８時間ずつ３回透析した。透析液を２０，０００ｇで４℃で２０分間遠心分離して組換えヒトチロシナーゼを分離した。
【００５１】
＜実験例１＞
ヒトチロシナーゼのチロシン水酸化酵素活性の比較
実施例２で製造した組換えヒトチロシナーゼと比較例２で製造した組換えヒトチロシナーゼのチロシン水酸化酵素活性を比較した。チロシン水酸化酵素活性度測定はフューサイン等の方法（Husain et al., J. Invest. Dermatol. 78: 243-252, 1982）により行った。Ｌ−ドーパ（DOPA）の濃度を０−３０ｍＭの範囲にして水酸化（hydroxylation）反応をさせ、Ｌ−ドーパに対する標準曲線を作成した。前記標準曲線を利用して反応後に生成されたＬ−ドーパの量を決定した。反応溶液は５０Ｍｍのリン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ６．８）に１００μＭのＬ−チロシン、各濃度のＬ−ドーパ、４ｍＭのアスコルビン酸（ascorbicacid）及びヒトチロシナーゼ１００μＬを加えて総量２．５ｍＬに製造した。以降、３７℃で３時間反応させた。この際、対照区としては精製されたヒトチロシナーゼを添加せずに反応させた。以降、ラム等の方法（Ramet al., J. Biol. Chem. 267: 23707-23712, 1992）により蛍光（fluorescence）を利用して３６０ｎｍで励起（excitation）させ、４９０ｎｍで発光（emission）させ、この時の強度を測定した。測定された値をＬ−ドーパの濃度に転換し、酵素の活性を測定した。本発明により精製されたヒトチロシナーゼのチロシン水酸化酵素活性に対する比活性度（specificactivity）は、時間（ｈ）当りの酵素の量（μｇ）に対するＬ−ドーパの生成モル数（ｍｍｏｌ）で定めた。
【００５２】
【表１】
0004769746.tif 000003
【００５３】
測定結果は、前記表１に記載された通り、ｐＥＴ−ｈＴｙｒ発現ベクターを利用して大腸菌から生産された組換えヒトチロシナーゼ（大韓民国特許出願第２００２−００７３７２８号）は、粗抽出物に比べてＨｉｓ・バインドレジンクロマトグラフィーで最終精製された組換えヒトチロシナーゼのチロシン水酸化酵素活性に対する比活性度が約４９倍程増加された反面、本発明に伴う最終精製された膜貫通部位が除去された組換えヒトチロシナーゼの水酸化酵素の活性は粗抽出物に比べて約５２倍程増加した。一方、人のＨｅＬａ細胞から精製したチロシナーゼのチロシン水酸化酵素に対する比活性度（specific activity）が２２．３±０．０１ｐｍｏｌ／μｇ／ｈのものと比較すると（Spritz et al., J.Invest. Dermato., 109:207-212, 1997）、本発明により大腸菌において、膜貫通部位が除去された状態で発現された組換えヒトチロシナーゼが、より優れたチロシン水酸化酵素活性を有していることが分かった。
【００５４】
＜実験例２＞
ヒトチロシナーゼのドーパ酸化酵素活性の比較
実施例２で製造した組換えヒトチロシナーゼと比較例１及び比較例２で製造した組換えヒトチロシナーゼのドーパ酸化酵素活性を比較した。ドーパ酸化酵素の活性度測定はフリンジ等の方法（Fling et al. J. Biol. Chem. 238: 2045-2053, 1963）により行った。ドーパ酸化酵素の基質であるＬ−ドーパがチロシナーゼによりドーパクロム（DOPAchrome）の褐変生成物に転換されるのを４７５ｎｍで測定した。ドーパクロムは４７５ｎｍで濃度に伴う最大の吸光度値を最大に示し、この時のモル吸光係数は３６００（Ｍ−１ｃｍ−１）である。５０ｍＭトリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）に３ｍＭ  Ｌ−ドーパを添加して３７℃で１０分間静置し、ヒトチロシナーゼ３０μＬを添加した後、直に４７５ｎｍで３分間吸光度の変化を測定した。この時、酵素の活性度の単位は１分当りに１μｍｏｌｅのドーパクロームが生成されるのを１ｕｎｉｔ（μｍｏｌｅ／ｍｉｎ）として定めた。さらに、比活性度は酵素１ｍｇ当たりに１ｕｎｉｔにした。
【００５５】
【表２】
0004769746.tif 000004
【００５６】
測定結果は、前記表２に記載された通り、本発明の方法により実施例２で生産された膜貫通部位が除去された組換えヒトチロシナーゼの蛋白質量（粗抽出物の蛋白質量）が、大韓民国特許出願第２００１−００５７３７９号（比較例１）と大韓民国特許出願第２００２−００７３７２８号（比較例２）に開示された方法により生産された組換えヒトチロシナーゼの蛋白質量とほぼ類似することが確認できた。しかしながら、本発明による組換えヒトチロシナーゼの総活性は、大韓民国特許出願第２００１−００５７３７９号（比較例１）と大韓民国特許出願第２００２−００７３７２８号（比較例２）の組換えヒトチロシナーゼの総活性より著しく高く、これにより、比活性（specific activity）が大韓民国特許出願第２００１−００５７３７９号（比較例１）に比べて約３１倍程増加し、大韓民国特許出願第２００２−００７３７２８号（比較例２）に比べては約１．２倍程増加したことが確認できた。これは、本発明の方法による大腸菌から生産された膜貫通部位が除去された組換えヒトチロシナーゼは不溶性凝集体を形成せずに、完全な活性を有する酵素として発現されたことを示す結果である。さらに、最終的に精製された酵素の量が本発明で著しく多いことが確認できた。
【００５７】
＜実験例３＞
Ｌ−チロシンの濃度に対する影響
基質であるＬ−チロシンの濃度を０．０１−１ｍＭの範囲にして、実施例２で製造した組換えヒトチロシナーゼに対する基質濃度の影響を調査した。前記実験例１のチロシン水酸化酵素の活性度測定方法と同一な方法により行った。本発明による組換えヒトチロシナーゼのＫｍ値をラインウェーバー・バークプロット（Lineweaver et al., J. Am. Chem. Soc., 56: 658-666, 1934）により計算した。
【００５８】
実験結果は、本発明に伴う組換えヒトチロシナーゼのＬ−チロシンに対するＫｍ値は１．３２μＭで計算された。これは、本発明者の先行研究結果において製造されたヒトチロシナーゼのＫｍ値０．１７ｍＭ（大韓民国特許出願第２００１−００５７３７９号）、Ｋｍ値２．３４μＭ（大韓民国特許出願第２００２−００７３７２８号）とメラノマ細胞（melanoma cell）で抽出されたチロシナーゼのＫｍ値である０．２ｍＭ（Sangjin et al., Korean Biochem. J. 26: 632-637, 1993）より最大１３０倍程低い値である。これより、基質であるＬ−チロシンに対する本発明による膜貫通部位が除去された組換えヒトチロシナーゼの親和力が１００倍以上高いことがわかった。さらに、前記結果は本発明による膜貫通部位が除去された組換えヒトチロシナーゼの高次構造が完全にホールディングされたことばかりで無く、基質がヒトチロシナーゼの反応触媒機構（active site）への接近がより容易になったことを示す。
【００５９】
＜実験例４＞
Ｌ−ドーパの濃度に対する影響
ヒトチロシナーゼのさらに異なる基質であるＬ−ドーパの濃度を０．０５−５ｍＭの範囲にし、実施例２で製造した組換えヒトチロシナーゼに対する基質濃度の影響を調査した。前記実験例２のドーパ酸化酵素活性度の測定方法と同一な方法により行った。以降、実験例３と同一な方法により、Ｌ−ドーパに対する本発明による組換えヒトチロシナーゼのＫｍ値を計算した。
【００６０】
実験結果は、本発明による組換えヒトチロシナーゼのＬ−ドーパに対するＫｍ値は０．３４ｍＭに計算された。これはメラノマ細胞で精製されたチロシナーゼのＬ−ドーパに対するＫｍ値の０．４ｍＭとほぼ類似した数値であった（Kang et al., Korean Biochem. J., 26: 632-637, 1993）。これよりＬ−ドーパに対する結合力において、本発明により大腸菌において発現された膜貫通部位が除去された組換えヒトチロシナーゼと、メラノマ細胞のチロシナーゼが殆ど差のないことがわかる。  
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は本発明に伴う組換え発現ベクターｐＥＴ−ｈＴｙｒｏｓｉｎａｓｅ（ＴＭ−）の製作過程を示す模式図である。
【図２】図２は粗抽出物より精製された組換えヒトチロシナーゼを確認するために、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示すゲル写真である。レーンＭ：分子量マーカーレーン１：粗抽出物レーン２：Ｈｉｓ・バインドレジンクロマトグラフィーで精製された膜貫通部位が除去された組換えヒトチロシナーゼ
【図１】
0004769746.tif 000005
【図２】
0004769746.tif 000006
【配列表】
0004769746000001.app