(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスコルビン酸を含む可能性のある被検試料と、フリーラジカルと、ｏ−フェニレンジアミン又はその誘導体とを接触させ、デヒドロアスコルビン酸とｏ−フェニレンジアミン又はその誘導体とからのフルフラール縮合体の生成を光学的に分析することを特徴とする、アスコルビン酸の分析方法。
【請求項２】
前記フリーラジカルが、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジニルオキシ、３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−イロキシ、及び３−カルボキシ−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシからなる群から選択される化合物１種以上である、請求項１に記載のアスコルビン酸の分析方法。
【請求項３】
ｏ−フェニレンジアミンを使用する、請求項１又は２に記載のアスコルビン酸の分析方法。
【請求項４】
少なくとも１種のフリーラジカルと、ｏ−フェニレンジアミン又はその誘導体とを含み、前記フリーラジカルが、不対電子を有する化学種であって、その構造式中に＞Ｎ−Ｏを有する化学種であることを特徴とする、アスコルビン酸の分析用試薬。
【請求項５】
ｏ−フェニレンジアミンの誘導体が２，３−ジアミノフェナジン又は２，３−ジカルボノアミンである、請求項１又は２に記載のアスコルビン酸の分析方法。
【請求項６】
前記フリーラジカルが、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジニルオキシ、３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−イロキシ、及び３−カルボキシ−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシからなる群から選択される化合物１種以上である、請求項４に記載のアスコルビン酸の分析用試薬。
【請求項７】
ｏ−フェニレンジアミンを含む、請求項４又は６に記載のアスコルビン酸の分析用試薬。
【請求項８】
ｏ−フェニレンジアミンの誘導体が２，３−ジアミノフェナジン又は２，３−ジカルボノアミンである、請求項４又は６に記載のアスコルビン酸の分析用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アスコルビン酸の分析方法及びアスコルビン酸の分析用試薬に関する。なお、本明細書における前記「分析」には、アスコルビン酸の濃度を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、アスコルビン酸の存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。
【０００２】
【従来の技術】
ビタミンＣ（アスコルビン酸、以下、ＡｓＡと略称することがある）は、抗壊血病活性を有する水溶性ビタミンであり、抗壊血病因子とも呼ばれている。ＡｓＡの生理的役割には、結合織（コラーゲン）の生成及び維持に加え、抗酸化物質としての働き［例えば、ビタミンＥの再生、ラジカル消去、又は低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）及びＤＮＡ酸化の抑制］、鉄及び銅原子の還元、コレステロールの代謝、創傷の治癒、並びに白血球の作用増加による免疫機能増強作用等が知られている。ＡｓＡは、ビタミン類の中では最も大量に必要とされるものであるが、人体においては生合成されないため、食物や薬剤により摂取しなくてはならない。ＡｓＡの欠乏により壊血病になることは周知で、臨床検査では血清（血漿）や尿中のＡｓＡ濃度を評価し、壊血病診断の指標としている。
【０００３】
ＡｓＡの分析方法は、種々開発されている。例えば、血清をメタリン酸又はトリクロロ酢酸等で除タンパク質処理した後、２，４−ジニトロフェニルヒドラジンの硫酸溶液と反応させて呈色するジニトロフェニルヒドラジン法、あるいは、除タンパク質処理した試料を、例えば、逆相系の高速液体クロマトグラフィで分離し、紫外部の吸光度を測定するＨＰＬＣ法等を挙げることができる。また、臨床診断の分野においては、除タンパク質処理した試料にアスコルビン酸オキシダーゼ（以下、ＡＳＯと略称することがある）を作用させることにより、ＡｓＡをデヒドロアスコルビン酸に変換し、ｏ−フェニレンジアミンと反応させて吸光度変化を測定する酵素法、あるいは、試料に、ヨウ素酸とトリンダー試薬とカップラーとを同時に含む試薬と反応させ、ＡｓＡの還元力により発色させる方法等が繁用されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記ジニトロフェニルヒドラジン法は、操作法が煩雑であり、しかも、硫酸を使用するため危険であり、更には、試験には長時間を要する割に低感度である。また、前記ＨＰＬＣ法は、専用機器が必要であり、測定精度も充分とはいえない。従って、これらの方法は、多数の検体を迅速に分析するには不向きである。
一方、ＡＳＯを用いる前記酵素法は、酵素試薬の安定性や色素原の自動酸化に注意が必要であり、しかも、各種安定化剤の併用と相まって、高コストとなってしまう。また、前記発色法は、血液中のＡｓＡ以外の還元性物質の補正のために盲検を要することから、コスト高となる。
更に、これらの全ての従来法では、血清試料などをメタリン酸やトリクロロ酢酸等で除タンパク質処理するという前処理が必要であった。
【０００５】
従って、本発明の課題は、従来技術の前記の欠点を解消し、迅速且つ簡便にＡｓＡを分析することのできる方法、及び迅速且つ簡便にＡｓＡを測定することができ、しかも、安価で、且つ保存性に優れたＡｓＡ分析用試薬を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、アスコルビン酸を含む可能性のある被検試料と、フリーラジカルと、ジケト反応化剤とを接触させ、デヒドロアスコルビン酸とジケト反応化剤とからのフルフラール縮合体の生成を光学的に分析することを特徴とする、アスコルビン酸の分析方法によって解決することができる。
また、本発明は、少なくとも１種のフリーラジカルと、ジケト反応化剤とを含むことを特徴とする、アスコルビン酸の分析用試薬に関する。
なお、本発明による分析方法及び分析用試薬は、総アスコルビン酸の分析方法及び分析用試薬である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明によるアスコルビン酸の分析方法の基本原理は、ＡｓＡを含む可能性のある被検試料と、フリーラジカルと、ジケト反応化剤［例えば、ｏ−フェニレンジアミン（以下、ＯＰＤＡと略称することがある）］とを接触させると、被検試料中にＡｓＡが含まれる場合には、前記フリーラジカルによってＡｓＡが酸化されてデヒドロアスコルビン酸（以下、ＤＡｓＡと略称することがある）に変換され、続いて、このＤＡｓＡと前記ジケト反応化剤とが特異的に反応してフルフラール縮合体が生成されるので、このフルフラール縮合体の生成を光学的に分析することで、被検試料に含まれるＡｓＡ濃度を求めるものである。
【０００８】
本発明のアスコルビン酸分析方法及び本発明のアスコルビン酸分析用試薬に用いるフリーラジカルは、不対電子を有する化学種であって、しかも、アスコルビン酸をデヒドロアスコルビン酸に酸化（変換）させることができる化合物である限り、特に限定されるものではないが、例えば、その構造式中に＞Ｎ−Ｏを有するピペラジン、ピペリジン、ピロリジン、又はオキサゾリン等の誘導体を挙げることができ、ピペリジン又はピロリジンの誘導体が好ましい。具体的には、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ−ＯＨ）、３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−イロキシ（３−カルバモイル−ＰＲＯＸＹＬ）、又は３−カルボキシ−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（３−カルボキシ−ＰＲＯＸＹＬ）がより好ましい。
【０００９】
本発明のアスコルビン酸分析方法においては、これらのフリーラジカルを１種のみ単独で、あるいは、複数種併用して使用することができる。被検試料に添加するフリーラジカルの濃度は、ＡｓＡをＤＡｓＡに酸化（変換）するに充分な量である限り、特に限定されるものではない。用いるフリーラジカルによって、ＡｓＡの酸化能が異なるため、一概には言えないが、例えば、ＡｓＡの予想モル量に対して、１０〜１００倍量、好ましくは２０〜１００倍量、より好ましくは４０〜１００倍量のフリーラジカルを用いることができ、当業者であれば適宜選択して用いることができる。フリーラジカルの量が１０倍量未満だと、ＡｓＡをＤＡｓＡに酸化（変換）するのに長時間要したり、あるいは、酸化（変換）が不充分となることがある。また、１００倍量を超えても酸化（変換）能が更に向上することはなく、従って、コスト面から考えて前記濃度範囲内で用いることが好ましい。例えば、フリーラジカルとしてＴＥＭＰＯ−ＯＨを用いる場合には、ＡｓＡに対して約６４当量加えて用いることができる。
【００１０】
本発明のアスコルビン酸分析方法及び本発明のアスコルビン酸分析用試薬に用いるジケト反応化剤は、ＤＡｓＡと一緒になってフルフラール縮合体を形成することのできる化合物である限り、特に限定されるものではなく、例えば、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤＡ）又はその誘導体（例えば、２，３−ジアミノフェナジン又は２，３−ジカルボノアミン）を挙げることができる。
【００１１】
本発明方法において用いるジケト反応化剤の濃度は、系中に存在するＤＡｓＡを、フルフラール縮合体に変換するのに充分な量である限り、特に限定されるものではないが、例えば、０．０２５〜１重量％であることが好ましく、０．０２５〜０．５重量％であることがより好ましく、０．０２５〜０．１重量％であることが更に好ましい。
【００１２】
ＤＡｓＡと、ジケト反応化剤（例えば、ＯＰＤＡ）との反応それ自体は、公知で且つ特異的であり、反応生成物としてフルフラール縮合体が生成する。ジケト反応化剤を過剰に存在させておくと、試料中のＡｓＡ濃度依存的にフルフラール縮合体が生成するため、例えば、この反応時の吸光度の増加を波長３４０ｎｍ付近において分光学的に測定し、これとは別に測定しておいたＡｓＡ標準品による同様操作の吸光度変化量と比較することにより、試料中のＡｓＡ濃度を定量することができる。前記フルフラール縮合体を光学的に分析する方法としては、例えば、エンドポイント（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）法又はレートアッセイ（ｒａｔｅ−ａｓｓａｙ）法を用いることができる。
なお、ジケト反応化剤は被検試料（例えば、血清試料）中に含まれる既存のＤＡｓＡとも反応するので、本発明方法で求められる測定値は、総ＡｓＡ濃度（すなわち、被検試料中に含まれるＡｓＡ濃度とＤＡｓＡ濃度との総和）である。従来公知のジニトロフェニルヒドラジン法やＨＰＬＣ法を用いて総ＡｓＡ濃度を求める場合には、還元剤（例えば、塩化スズ又はジチオスレイトール）でＤＡｓＡをＡｓＡに変換する必要があるが、本発明方法では還元剤を必要としない。
【００１３】
本発明のアスコルビン酸分析方法においては、被検試料にフリーラジカルを最初に添加し、続いて、ジケト反応化剤を添加することができる。フリーラジカル添加後の反応温度は、ＡｓＡからＤＡｓＡへの酸化（変換）反応が、充分に進行することのできる温度である限り、特に限定されるものではないが、２５〜４５℃であることが好ましく、３０〜４０℃であることがより好ましい。
また、反応系のｐＨも、ＡｓＡからＤＡｓＡへの酸化（変換）反応が、充分に進行することのできるｐＨである限り、特に限定されるものではないが、弱酸性〜中性のｐＨ域で行なうことが好ましい。
【００１４】
また、ジケト反応化剤添加後の反応温度は、フルフラール縮合体の生成反応が、充分に進行することのできる温度である限り、特に限定されるものではないが、２５〜４５℃であることが好ましく、３０〜４０℃であることがより好ましい。
また、反応系のｐＨも、フルフラール縮合体の生成反応が、充分に進行することのできるｐＨである限り、特に限定されるものではないが、弱酸性〜中性のｐＨ域で行なうことが好ましい。
【００１５】
本発明によるアスコルビン酸の分析用試薬は、少なくとも１種のフリーラジカルと、ジケト反応化剤とを含む。本発明によるアスコルビン酸の分析用試薬は、例えば、２試薬系として調製することができ、例えば、少なくとも１種のフリーラジカルを含む第一試薬と、ジケト反応化剤を含む第二試薬とからなる構成とすることができる。
なお、本発明のアスコルビン酸分析用試薬は、従来法で使用しているアスコルビン酸オキシダーゼを含むこともできるが、実質的な量で含まないことが好ましい。
【００１６】
本発明によるアスコルビン酸の分析用試薬を用いて、本発明のアスコルビン酸分析方法を実施する場合には、先に述べたように、弱酸性〜中性のｐＨ域で行なうことが好ましいので、前記構成成分を、弱酸性〜中性のｐＨ域でｐＨ緩衝能を有する緩衝液（例えば、リン酸緩衝液又はグッド緩衝液）に溶解することにより、本発明によるアスコルビン酸の分析用試薬を調製することが好ましい。また、ＡｓＡはｐＨ６．５付近で安定であるので、前記ｐＨ付近でｐＨ緩衝能を有する緩衝液を用いて、本発明によるアスコルビン酸の分析用試薬を調製することがより好ましい。
【００１７】
少なくとも１種のフリーラジカルを含む第一試薬と、ジケト反応化剤を含む第二試薬とからなる本発明によるアスコルビン酸の分析用試薬を用いて、本発明のアスコルビン酸分析方法を実施する場合には、例えば、前記第一試薬と被検試料とを３７℃で混合反応させ、次いで、前記第二試薬を添加して波長３４０ｎｍ付近における吸光度の変化を測定し、これとは別に測定しておいたＡｓＡ標準品による同様操作の吸光度変化量と比較することにより、試料中のＡｓＡ濃度を定量することができる。
【００１８】
本発明によるアスコルビン酸の分析用試薬は、例えば、ｐＨ６．５の緩衝液を用いて調製した場合には、少なくとも冷蔵庫で１か月間安定であり、従って、反応に不必要な安定化剤を極力排除することができる。また、アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯ）といった酵素を用いていないので、コスト的にも大幅な低減が可能である。しかも、このように安価に製造可能であるにもかかわらず、ＡｓＡの測定精度の点に関しても、例えば、低濃度の欠乏症診断も可能であり、しかも、酵素法又はＨＰＬＣ法との相関も充分であり、簡便な操作で迅速にＡｓＡを分析することができる。
【００１９】
本発明のアスコルビン酸分析方法又は本発明のアスコルビン酸分析用試薬を用いて分析することのできる被検試料は、ＡｓＡを含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではない。臨床診断的には、例えば、生体由来液、例えば、血清、血漿、又は尿を挙げることができる。また、ＡｓＡ含有医薬製剤、あるいは、ＡｓＡを含む可能性のある食品、例えば、天然物（例えば、レモン）、又はＡｓＡ添加食品若しくはドリンク剤のＡｓＡ定量にも適用することができる。これらをそのまま、あるいは、適当な溶剤（例えば、緩衝液又は精製水）で処理した抽出液を用いて、本発明方法を実施することができる。
【００２０】
本発明のアスコルビン酸分析方法によれば、被検試料として血清を用いる場合に従来法で必須であった検体の「除タンパク質処理」を必要としない。本発明方法において使用するフリーラジカルは、血清タンパク質成分のほとんどと反応せず、血清タンパク質を凝固させることがなく、しかも、ジケト反応化剤としてＯＰＤＡを用いた場合、ＯＰＤＡとＡｓＡとの縮合体形成は、高感度（０．０４〜０．０８ｍｇ／ｄＬ）であるからである。
なお、本発明方法は、除タンパク質処理を行なった被検試料の分析に用いても問題はない。従って、除タンパク質処理を行なうことが必要な検体（例えば、ヘモグロビンを含有し、溶血を回避不能な検体、あるいは、白血球又は臓器ホモジネート）であっても、除タンパク質処理を行なった後、本発明方法を適用することができる。
【００２１】
以上、本発明によるアスコルビン酸の分析用試薬を、２試薬系試薬の態様について説明したが、本発明によるアスコルビン酸の分析用試薬は、これに限定されるものではない。また、本発明のアスコルビン酸分析方法を、フリーラジカル及びジケト反応化剤をこの順に添加する態様について説明したが、それらの添加順序も限定されるものではない。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《種々のフリーラジカルにおけるアスコルビン酸酸化効果の確認》
アスコルビン酸を、２．５ｍｇ／ｄＬの濃度になるように、精製水で溶解することにより、アスコルビン酸標準溶液を調製した。
また、４種類のフリーラジカル［２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（以下、ＴＥＭＰＯと略称する）、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジニルオキシ（以下、ＴＥＭＰＯ−ＯＨと略称する）、３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−イロキシ（以下、３−カルバモイル−ＰＲＯＸＹＬと略称する）、及び３−カルボキシ−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（以下、３−カルボキシ−ＰＲＯＸＹＬと略称する）；全てシグマ社］を、それぞれ、２０ｍｇ／ｄＬの濃度になるように、１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解することにより、４種類のフリーラジカル溶液を調製した。
【００２３】
前記アスコルビン酸標準溶液０．２５ｍＬに、それぞれ、前記フリーラジカル溶液２ｍＬを添加した後、２７０ｎｍ（３−カルバモイル−ＰＲＯＸＹＬの場合）又は２７５ｎｍ（３−カルバモイル−ＰＲＯＸＹＬ以外の３種類の場合）における吸光度の経時的変化を、室温（２５℃）にて３０分間測定した。なお、２７５ｎｍは、アスコルビン酸の吸収極大である。また、各フリーラジカル溶液をブランクとして使用したので、前記吸光度は、いわゆる、差スペクトルである。
【００２４】
結果を図１に示す。図１において、折れ線ａは、ＴＥＭＰＯを用いた場合の吸光度の経時的変化を示し、折れ線ｂは、ＴＥＭＰＯ−ＯＨを用いた場合の吸光度の経時的変化を示し、折れ線ｃは、３−カルバモイル−ＰＲＯＸＹＬを用いた場合の吸光度の経時的変化を示し、そして、折れ線ｄは、３−カルボキシ−ＰＲＯＸＹＬを用いた場合の吸光度の経時的変化を示す。
【００２５】
例えば、ＴＥＭＰＯ−ＯＨ（濃度＝２０ｍｇ／ｄＬ；６４当量）においては、濃度が２．５ｍｇ／ｄＬであるアスコルビン酸溶液を、自動分析装置の一般的な設定測定範囲である５分間で完全酸化が可能であった。また、２０ｍｇ／ｄＬの３−カルボキシ−ＰＲＯＸＹＬでは、自動分析装置の一般的な設定測定範囲である１０分間で完全酸化が可能であったが、ＴＥＭＰＯと３−カルバモイル−ＰＲＯＸＹＬについては、２０ｍｇ／ｄＬの濃度では、１０分間での完全酸化を期待することができなかった。
【００２６】
また、５〜２０ｍｇ／ｄＬのＴＥＭＰＯ−ＯＨ溶液を用いた場合の結果を図２に示す。図２において、折れ線ａは、濃度が５ｍｇ／ｄＬであるＴＥＭＰＯ−ＯＨ溶液を用いた場合の吸光度の経時的変化を示し、折れ線ｂは、濃度が１０ｍｇ／ｄＬであるＴＥＭＰＯ−ＯＨ溶液を用いた場合の吸光度の経時的変化を示し、そして、折れ線ｃは、濃度が２０ｍｇ／ｄＬであるＴＥＭＰＯ−ＯＨ溶液を用いた場合の吸光度の経時的変化を示す。
【００２７】
濃度が２０ｍｇ／ｄＬであるＴＥＭＰＯ−ＯＨ溶液（６４当量）を用いた場合に、濃度が２．５ｍｇ／ｄＬであるアスコルビン酸を、自動分析装置の一般的な設定測定範囲である５分間で完全酸化が可能であった。１０ｍｇ／ｄＬ溶液では１０分間を要し、５ｍｇ／ｄＬ溶液では１５分間においても完全酸化を認めなかった。
【００２８】
【実施例２】
《本発明方法の最低検出感度及び測定可能濃度域の評価》
本発明のアスコルビン酸分析用試薬における第一試薬として、ＴＥＭＰＯ−ＯＨを、２０ｍｇ／ｄＬの濃度となるように、１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した溶液を用いた。また、本発明のアスコルビン酸分析用試薬における第二試薬として、ＯＰＤＡ（和光純薬工業）５ｍｇを、１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１０ｍＬに溶解した溶液を用いた。
また、種々濃度のＡｓＡ標準溶液として、５．０ｍｇ／ｄＬのＡｓＡ溶液を段階的に精製水で倍々希釈して、０．０２ｍｇ／ｄＬまでの濃度溶液を調製した。このＡｓＡ標準溶液は、後述する実施例３で使用する「未除タンパク質処理血清」に相当する。更に、後述する実施例３で使用する「除タンパク質処理血清上清」に相当する標準溶液として、５．０ｍｇ／ｄＬのＡｓＡ溶液を段階的に精製水で倍々希釈して、０．０２ｍｇ／ｄＬまでの濃度溶液を調製し、これに１／１０容量倍の４０％メタリン酸を添加したものを調製した。
【００２９】
本発明方法による試験は、自動分析装置（ＣＯＢＡＳ  ＭＩＲＡ  Ｓ；Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、以下に示す手順に従って実施した。すなわち、種々濃度の標準溶液０．０２５ｍＬを、第一試薬０．２ｍＬに添加した後、３７℃で５分間反応させ、ＡｓＡをＤＡｓＡに変換した。続いて、第二試薬０．０８５ｍＬを加え、１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）の吸光度変化を対照として、波長３４０ｎｍで２５秒間隔で５分間に亘って吸光度変化を測光した。なお、被検試料及び第二試薬の分注は、１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）０．０１ｍＬで押し出して排出した。
各濃度について５重測定を行ない、１分間における３４０ｎｍの吸光度の変化を求め、検量線を作成した。５回測定の平均値と標準偏差（ＳＤ）とから「平均値±２ＳＤ」の範囲を求め、隣り合う濃度間で前記範囲が重ならない最小濃度を最低検出濃度とした。
【００３０】
本発明方法を自動分析装置（ＣＯＢＡＳ  ＭＩＲＡ  Ｓ）に応用した場合の検量線を図３に示す。図３において、「白正方形」は、ＡｓＡ溶液をそのまま測定した場合（すなわち、未除タンパク質処理血清に相当）の測定結果であり、「黒丸」は、ＡｓＡ溶液に１／１０容量倍の４０％メタリン酸を添加したもの（除タンパク質処理血清上清に相当）の測定結果である。３４０ｎｍにおける１分間の吸光度変化の「平均値±２ＳＤ」の重ならない濃度、すなわち、最低検出濃度は、未除タンパク質処理血清では０．０８ｍｇ／ｄＬにあり、除タンパク質処理血清上清では０．０４ｍｇ／ｄＬにあった。本発明方法の検出感度は、ビタミンＣ欠乏症の診断値である０．２ｍｇ／ｄＬを充分に測定することができることを示した。また、５．０ｍｇ／ｄＬまで直線となる検量線は、血清中のビタミンＣ濃度の基準範囲から増加域まで充分に測定可能であることを示した。
【００３１】
【実施例３】
《本発明方法と従来法であるＨＰＬＣ法との相関関係の評価》
（１）総ＡｓＡ濃度に関する相関関係の評価
本発明方法による試験は、自動分析装置（ＣＯＢＡＳ  ＭＩＲＡ  Ｓ）を用いて、以下に示す手順に従って実施した。
なお、本発明のアスコルビン酸分析用試薬における第一試薬及び第二試薬としては、前記実施例２で調製したのと同じ試薬を用いた。また、被検試料としては、ヒト血清（以下、未除タンパク質処理血清と称する）と、ヒト血清を除タンパク質処理した血清上清、すなわち、ヒト血清にその１／１０容量倍の４０％メタリン酸を添加して混和した後、２５℃で１０分間静置して除タンパク質処理した上清（以下、除タンパク質処理血清上清と称する）とを使用した。
【００３２】
被検試料（未除タンパク質処理血清又は除タンパク質処理血清上清）０．０２５ｍＬを、第一試薬０．２ｍＬに添加した後、３７℃で５分間反応させ、ＡｓＡをＤＡｓＡに変換した。続いて、第二試薬０．０８５ｍＬを加え、１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）の吸光度変化を対照として、波長３４０ｎｍで２５秒間隔で５分間に亘って吸光度変化を測光した。なお、被検試料及び第二試薬の分注は、１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）０．０１ｍＬで押し出して排出した。
【００３３】
これとは別に、未除タンパク質処理血清又は除タンパク質処理血清上清に代えて、実施例１で調製したのと同じアスコルビン酸標準溶液を用いて同様の操作を行ない、検量線を作成した。先に得られた測光結果と前記検量線とから、未除タンパク質処理血清又は除タンパク質処理血清上清中の総ＡｓＡ濃度を算出した。
【００３４】
一方、従来法であるＨＰＬＣ法は、以下に示す手順に従って実施した。なお、被検試料としては、ヒト血清を除タンパク質処理した血清上清、すなわち、ヒト血清０．１ｍＬに、１０％メタリン酸０．０５ｍＬと１ｇ／ｄＬジチオスレイトール含有溶液０．０５ｍＬとを添加して混和した後、２５℃で１０分間静置して除タンパク質処理した上清を使用した。この血清上清を用いて、ヒト血清中の総ＡｓＡ濃度をＨＰＬＣにより測定した。
【００３５】
なお、ＨＰＬＣは、カラムとしてＯＤＳ−２（１５０×４ｍｍ；ＧＬサイエンス）を使用し、溶離液として０．１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ含有３０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＨ2ＰＯ4溶液（ｐＨ２．３）を使用し、検出器としてＡｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ＬＣ−４Ｃ（＋６００ｍＶ；ＢＡＳ社）を使用し、ＨＰＬＣ装置としてＳｈｉｍａｄｚｕ  １０Ａを使用し、分析ソフトとしてＰｏｗｅｒ  Ｃｈｒｏｍ（ＡＤ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用し、１０μＬの注入容量で、流速が０．７ｍＬ／分の条件で実施した。
【００３６】
本発明方法により求めた未除タンパク質処理血清又は除タンパク質処理血清上清中の総ＡｓＡ濃度と、ＨＰＬＣ法により求めた除タンパク質処理血清上清中の総ＡｓＡ濃度との相関関係を、図４に示す。前記評価には、５６検体から採取したヒト血清を使用した。
図４において、各「白正方形」及び「波線で示す直線」は、本発明方法により求めた未除タンパク質処理血清中の総ＡｓＡ濃度と、ＨＰＬＣ法により求めた除タンパク質処理血清上清中の総ＡｓＡ濃度との相関関係を示し、各「黒丸」及び「実線で示す直線」は、本発明方法により求めた除タンパク質処理血清上清中の総ＡｓＡ濃度と、ＨＰＬＣ法により求めた除タンパク質処理血清上清中の総ＡｓＡ濃度との相関関係を示す。
【００３７】
本発明方法により求めた未除タンパク質処理血清中の総ＡｓＡ濃度と、ＨＰＬＣ法により求めた除タンパク質処理血清上清中の総ＡｓＡ濃度との相関係数は、０．９６１であり、回帰式は、Ｙ＝０．７８Ｘ＋０．２４［Ｓｙ．ｘ（回帰直線に関する標準偏差）＝０．０６ｍｇ／ｄＬ］であった。また、本発明方法により求めた除タンパク質処理血清上清中の総ＡｓＡ濃度と、ＨＰＬＣ法により求めた除タンパク質処理血清上清中の総ＡｓＡ濃度との相関係数は、０．９７５であり、回帰式は、Ｙ＝０．９４Ｘ＋０．０４（Ｓｙ．ｘ＝０．０６ｍｇ／ｄＬ）であった。
【００３８】
（２）還元型ＡｓＡ濃度に関する相関関係の評価
前記実施例３（１）で使用した前記第一試薬の代わりに１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用い、標準溶液として２．５ｍｇ／ｄＬ−ＤＡｓＡ溶液（シグマ社）を用いること以外は、前記実施例３（１）に記載の本発明方法の操作を繰り返すことにより、除タンパク質処理血清上清中のＤＡｓＡ濃度を算出した。前記実施例３（１）で求めた総ＡｓＡ濃度から、前記ＤＡｓＡ濃度を差し引くことにより、還元型ＡｓＡ濃度を算出した。
また、前記実施例３（１）で使用した前記除タンパク質処理血清上清の代わりに、ヒト血清０．１ｍＬに５％メタリン酸０．１ｍＬを添加して混和した後、２５℃で１０分間静置して除タンパク質処理した上清を用いること以外は、前記実施例３（１）に記載のＨＰＬＣ法の操作を繰り返すことにより、除タンパク質処理血清上清中の還元型ＡｓＡ濃度を算出した。
【００３９】
本発明方法により求めた除タンパク質処理血清上清中の還元型ＡｓＡ濃度と、ＨＰＬＣ法により求めた除タンパク質処理血清上清中の還元型ＡｓＡ濃度との相関関係を、図５に示す。前記評価には、４０検体から採取したヒト血清を使用した。
【００４０】
本発明方法により求めた除タンパク質処理血清上清中の還元型ＡｓＡ濃度と、ＨＰＬＣ法により求めた除タンパク質処理血清上清中の還元型ＡｓＡ濃度との相関係数は、０．９０９であり、回帰式は、Ｙ＝０．９１Ｘ＋０．０１（Ｓｙ．ｘ＝０．１８ｍｇ／ｄＬ）であった。
【００４１】
（３）ＤＡｓＡ濃度に関する相関関係の評価
本発明方法により求めた除タンパク質処理血清上清中のＤＡｓＡ濃度のデータとしては、前記実施例３（２）のデータをそのまま使用した。
また、ＨＰＬＣ法による除タンパク質処理血清上清中のＤＡｓＡ濃度は、前記実施例３（１）で求めた総ＡｓＡ濃度から、前記実施例３（２）で求めた還元型ＡｓＡ濃度を差し引くことにより算出した。
本発明方法により求めた除タンパク質処理血清上清中のＤＡｓＡ濃度と、ＨＰＬＣ法により求めた除タンパク質処理血清上清中のＤＡｓＡ濃度との相関関係を、図６に示す。前記評価には、４０検体から採取したヒト血清を使用した。また、血清中のＤＡｓＡ濃度は０．８ｍｇ／ｄＬ以下を示すので、測定は検出感度の高い除タンパク質処理法を選択した。
【００４２】
本発明方法により求めた除タンパク質処理血清上清中のＤＡｓＡ濃度と、ＨＰＬＣ法により求めた除タンパク質処理血清上清中のＤＡｓＡ濃度との相関係数は、０．６５７であり、回帰式は、Ｙ＝０．６４Ｘ＋０．０６（Ｓｙ．ｘ＝０．０６ｍｇ／ｄＬ）であった。なお、ＨＰＬＣ法は、分析した４０例中７例の還元型ＡｓＡ濃度が総ＡｓＡ濃度を上回る成績を得、その結果、ＤＡｓＡ濃度は０．００ｍｇ／ｄＬと極めて低値となった。ＤＡｓＡ濃度における本発明方法とＨＰＬＣ法との低い相関係数は、ＨＰＬＣ法の測定精度の悪さに起因した。
【００４３】
【実施例４】
《本発明方法と従来法である酵素法（アスコルビン酸オキシダーゼ法）との相関関係の評価》
本発明方法により求めた未除タンパク質処理血清又は除タンパク質処理血清上清中の総ＡｓＡ濃度のデータとしては、前記実施例３（１）のデータをそのまま使用した。
一方、従来法であるアスコルビン酸オキシダーゼ法は、以下に示す手順に従って実施した。なお、被検試料としては、前記実施例３（１）で調製した除タンパク質処理血清上清を使用した。
アスコルビン酸オキシダーゼ法における第一試薬として、アスコルビン酸オキシダーゼを、８０ｍｇ／Ｌ（１４６単位／ｍｇ）の濃度となるように、１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した溶液を用いた。また、アスコルビン酸オキシダーゼ法における第二試薬として、前記実施例２で調製した本発明のアスコルビン酸分析用試薬における第二試薬と同じ溶液、すなわち、ＯＰＤＡ（和光純薬工業）５ｍｇを、１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１０ｍＬに溶解した溶液を用いた。
前記実施例３（１）で用いた第一試薬の代わりに、アスコルビン酸オキシダーゼ法における前記第一試薬を用いたこと以外は、前記実施例３（１）に記載の本発明方法の手順を繰り返すことにより、アスコルビン酸オキシダーゼ法による総ＡｓＡ濃度の測定を実施した。
【００４４】
本発明方法により求めた未除タンパク質処理血清又は除タンパク質処理血清上清中の総ＡｓＡ濃度と、アスコルビン酸オキシダーゼ法により求めた除タンパク質処理血清上清中の総ＡｓＡ濃度との相関関係を、図７に示す。前記評価には、５６検体から採取したヒト血清を使用した。
図７において、各「白正方形」及び「波線で示す直線」は、本発明方法により求めた未除タンパク質処理血清中の総ＡｓＡ濃度と、アスコルビン酸オキシダーゼ法により求めた除タンパク質処理血清上清中の総ＡｓＡ濃度との相関関係を示し、各「黒丸」及び「実線で示す直線」は、本発明方法により求めた除タンパク質処理血清上清中の総ＡｓＡ濃度と、アスコルビン酸オキシダーゼ法により求めた除タンパク質処理血清上清中の総ＡｓＡ濃度との相関関係を示す。
【００４５】
本発明方法により求めた未除タンパク質処理血清中の総ＡｓＡ濃度と、アスコルビン酸オキシダーゼ法により求めた除タンパク質処理血清上清中の総ＡｓＡ濃度との相関係数は、０．９６４であり、回帰式は、Ｙ＝０．８２Ｘ＋０．２２（Ｓｙ．ｘ＝０．０６ｍｇ／ｄＬ）であった。また、本発明方法により求めた除タンパク質処理血清上清中の総ＡｓＡ濃度と、アスコルビン酸オキシダーゼ法により求めた除タンパク質処理血清上清中の総ＡｓＡ濃度との相関係数は、０．９９２であり、回帰式は、Ｙ＝１．００Ｘ＋０．０１（Ｓｙ．ｘ＝０．０３ｍｇ／ｄＬ）であった。
【００４６】
【発明の効果】
本発明によれば、迅速且つ簡便に、被検試料中のＡｓＡを正確に分析することが可能である。特に、多量検体を扱う機関、例えば、臨床検査の現場においては、除タンパク質操作を省略することができるということは、格別な利点であり、その貢献度は絶大である。また、本発明によれば、極めて安価に迅速、簡便、且つ正確にＡｓＡを分析可能な試薬を提供することができる。更に、試薬の構成が極めてシンプルであるが故に、その安定性は従来の酵素を用いた試薬と比しても大幅に向上する。
【図面の簡単な説明】
【図１】４種のフリーラジカルにおけるアスコルビン酸酸化効果を示すグラフである。
【図２】フリーラジカルとして、種々濃度のＴＥＭＰＯ−ＯＨを用いた場合のアスコルビン酸酸化効果を示すグラフである。
【図３】本発明方法の最低検出感度及び測定可能濃度域を示すグラフである。
【図４】本発明方法と従来法であるＨＰＬＣ法とにより測定した総アスコルビン酸濃度の相関関係を示すグラフである。
【図５】本発明方法と従来法であるＨＰＬＣ法とにより測定した還元型アスコルビン酸濃度の相関関係を示すグラフである。
【図６】本発明方法と従来法であるＨＰＬＣ法とにより測定したデヒドロアスコルビン酸濃度の相関関係を示すグラフである。
【図７】本発明方法と従来法である酵素法（アスコルビン酸オキシダーゼ法）とにより測定した総アスコルビン酸濃度の相関関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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