(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ex vivoにおけるヘパシウイルス様感染性粒子の生産方法であって、以下のステップ：
−パッケージング能力を有するレトロウィルス由来ゲノムを含む第一の核酸配列を提供し；
−前記レトロウィルス由来のコアタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第二の核酸配列を提供し；
−連続するタイプＩ膜タンパク質由来シグナルペプチド、並びにヘパシウイルスＥ１タンパク質及び／又はヘパシウイルスＥ２タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第三の核酸配列を提供し；ここで、Ｅ１及びＥ２タンパク質のＣ末端膜貫通ドメインが、天然Ｅ１及びＥ２タンパク質に対して改変されておらず；
−前記核酸配列により宿主細胞をトランスフェクトし、そしてヘパシウイルス及びレトロウィルス由来の構造タンパク質を生産するため、培養中でｃＤＮＡの発現を可能にする十分な時間トランスフェクトした細胞を保持し；そして当該構造タンパク質にウィルス様粒子を形成させる、
を含んで成る生産方法。
【請求項２】
前記第三の核酸配列が、連続するヘパシウイルスコアタンパク質、並びにヘパシウイルスＥ１タンパク質及び／又はヘパシウイルスＥ２タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含んで成る請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記パッケージング能力を有するレトロウィルス由来ゲノム及びコアタンパク質が、MLV,ALV,RSV,MPMV,HIV-1,HIV-2,SIV,EIAV,CAEV,又はHFVから成る群から選定される、請求項１又は請求項２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリタンパク質が、ヘパシウイルスコアタンパク質及びヘパシウイルスＥ１タンパク質を含んで成る、請求項２又は請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリタンパク質が、ヘパシウイルスコアタンパク質及びヘパシウイルスＥ２タンパク質を含んで成る、請求項２から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第三の核酸配列が、更にヘパシウイルスｐ７タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含んで成る、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリタンパク質が、天然ヘパシウイルスＥ１及び／又はＥ２タンパク質を含んで成る、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリタンパク質が、天然ヘパシウイルスｐ７タンパク質を含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリタンパク質が、天然ヘパシウイルスコアタンパク質、天然ヘパシウイルスＥ１タンパク質及び天然ヘパシウイルスＥ２タンパク質を含んで成る、請求項２から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリタンパク質が、天然ｐ７タンパク質を含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
コアタンパク質、Ｅ１タンパク質及びＥ２タンパク質、並びにｐ７タンパク質が、同一のヘパシウイルス由来である、請求項２から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヘパシウイルスが、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＣＶコアタンパク質が、ＨＣＶコアのカルボキシ末端の最後の２１アミノ酸を含んで成る請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｅ２タンパク質が、Ｃ末端のアミノ酸残基をそこから欠失させたＥ２タンパク質、及び超可変領域１（ＨＶＲ１）を欠失させた天然Ｅ２タンパク質から成る群から選定された突然変異したＥ２タンパク質である、請求項１１又は請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸配列が、更に導入遺伝子を含むパッケージング能力を有するレトロウィルス由来ゲノムを含んで成る、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
レトロウィルス由来コアタンパク質、並びにＥ１ヘパシウイルス糖タンパク質及び／又はＥ２ヘパシウイルス糖タンパク質を含んで成る、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法により得ることのできるヘパシウイルス様感染性粒子であって、当該Ｅ１及びＥ２タンパク質のＣ末端膜貫通ドメインが、天然Ｅ１及びＥ２タンパク質に対して改変されていない、前記ヘパシウイルス様感染性粒子。
【請求項１７】
Ｅ１及びＥ２ヘパシウイルス糖タンパク質を含んで成る請求項１６に記載の感染性粒子。
【請求項１８】
Ｅ１ヘパシウイルス糖タンパク質を含んで成る請求項１６に記載の感染性粒子。
【請求項１９】
Ｅ２ヘパシウイルス糖タンパク質を含んで成る請求項１６に記載の感染性粒子。
【請求項２０】
更にヘパシウイルスｐ７タンパク質を含む、請求項１６から１９のいずれか１項に記載の感染性粒子。
【請求項２１】
天然Ｅ１及び／又はＥ２ヘパシウイルス性糖タンパク質を含んで成る請求項１６から２０のいずれか１項に記載の感染性粒子。
【請求項２２】
天然ｐ７タンパク質を含む、請求項２１に記載の感染性粒子。
【請求項２３】
コアＥ１及びＥ２タンパク質、並びにｐ７タンパク質が、同一のヘパシウイルスから由来する、請求項１６から２２のいずれか１項に記載の感染性粒子。
【請求項２４】
前記ヘパシウイルスがＨＣＶである、請求項２３に記載の感染性粒子。
【請求項２５】
前記Ｅ２タンパク質が、Ｃ末端アミノ酸残基をそこから欠失させた天然Ｅ２タンパク質、及び超可変領域１（ＨＶＲ１）を欠失させた天然Ｅ２タンパク質から成る群から選定された突然変異したＥ２タンパク質である、請求項２４に記載の感染性粒子。
【請求項２６】
前記レトロウィルスが、MLV,ALV,RSV,MPMV,HIV-1,HIV-2,SIV,EIAV,CAEV,又はHFVから成る群から選定される、請求項１６から２５のいずれか１項に記載の感染性粒子。
【請求項２７】
前記核酸配列が、更に導入遺伝子を含むパッケージング能力を有するレトロウィルス由来ゲノムを含んで成る、請求項１６から２６のいずれか１項に記載の感染性粒子。
【請求項２８】
肝炎に対するワクチンとして有用である医薬の調製のための３つの核酸配列の使用であって、当該核酸配列が：
−パッケージング能力を有するレトロウィルス由来ゲノムを含む第一の核酸配列；
−前記レトロウィルス由来のコアタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第二の核酸配列；
−連続するタイプＩ膜タンパク質由来シグナルペプチド、並びにヘパシウイルスＥ１タンパク質及び／又はヘパシウイルスＥ２タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第三の核酸配列；ここで当該Ｅ１及びＥ２タンパク質のＣ末端膜貫通ドメインは、天然Ｅ１及びＥ２タンパク質に対して改変されておらず；
であり、そして対象の細胞中へ転移した時、当該核酸配列はヘパシウイルス及びレトロウィルスから構造タンパク質を生産することができ、前記ウィルス様粒子由来の構造タンパク質は免疫原性である使用。
【請求項２９】
前記第三の核酸配列が、連続するヘパシウイルスコアタンパク質、及びヘパシウイルスＥ１タンパク質及び／又はヘパシウイルスＥ２タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含んで成る、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記第三の核酸配列が、更にヘパシウイルスｐ７タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含んで成る、請求項２８又は請求項２９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３１】
前記ヘパシウイルスがＨＣＶである、請求項２８から３０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３２】
請求項１６から２６のいずれか１項に記載の感染性粒子の細胞受容体への結合の検出を含む、ヘパシウイルスＥ１及び／又はＥ２糖タンパク質のための受容体のex vivoにおける同定方法。
【請求項３３】
ヘパシウイルスのための細胞受容体をex vivoで同定する方法であって、以下から成るステップ：
−ヘパシウイルス感染を許容しない細胞に、ヘパシウイルスの受容体になるようなタンパク質をコードする核酸配列をトランスフェクトし；
−前記形質転換した細胞と請求項１６から２６のいずれか１項に記載のヘパシウイルス様粒子を接触させ；
−前記形質転換した細胞がヘパシウイルス感染を許容するに至ったか否かを決定し；そして、
−形質転換され感染を許容するに至った細胞により発現する前記タンパク質をヘパシウイルスの細胞受容体として同定する、
を含んで成る方法。
【請求項３４】
ヘパシウイルスのための細胞受容体をex vivoで同定するための方法であって、以下から成るステップ：
−ヘパシウイルス感染を許容する細胞から得られた発現ｃＤＮＡライブラリーを提供し；
−前記発現ｃＤＮＡライブラリーによりヘパシウイルス感染を許容しない細胞をトランスフェクトし；
−前記形質転換した細胞と請求項１６から２６のいずれか１項に記載のヘパシウイルス様粒子を接触させ；
−ヘパシウイルス感染を許容するに至ったそれらの形質転換した細胞を同定及び単離し；
−許容性に至った細胞中でトランスフェクトした発現ベクターを単離し；そして
−前記単離した発現ベクターのｃＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質をヘパシウイルスの受容体として同定する、
を含んで成る方法。
【請求項３５】
候補分子の存在下又は不存在下における請求項１６から２６のいずれか１項に記載の感染性粒子による細胞感染のレベルの比較を含めて、細胞中に侵入するヘパシウイルスを干渉することができる分子のex vivoでのスクリーニング又は同定の方法。
【請求項３６】
患者におけるヘパシウイルスの検出方法であり、患者の生物学的サンプル中に存在するような抗ヘパシウイルス抗体と請求項１６から２６のいずれか１項に記載のヘパシウイルス様粒子との相互作用により形成される免疫複合体を検出することを含んで成る方法。
【請求項３７】
患者におけるヘパシウイルスの検出方法であり、請求項１６から２６のいずれか１項に記載のヘパシウイルス様粒子による許容性細胞への感染に対する、患者の生物学的サンプル中に存在していると思われる抗−ヘパシウイルス抗体の阻害的効果を検出することを含んで成る方法。
【請求項３８】
請求項１６から２６のいずれか１項に記載のヘパシウイルス様粒子及び前記免疫複合体の適切な検出手段を含んで成る、請求項３７記載の方法のための有用な診断キット。
【請求項３９】
請求項１６から２７のいずれか１項に記載のヘパシウイルス様粒子及び医薬的に許容され得る担体を含んで成るワクチン組成物。
【請求項４０】
注目の導入遺伝子を運搬する請求項１６から２７のいずれか１項に記載のヘパシウイルス様粒子で細胞を感染させること含む肝細胞に注目の導入遺伝子をin vitroにおいて転移する方法。
【請求項４１】
患者の疾患予防又は治療のための医薬の調製のための注目の導入遺伝子を運搬する請求項１６から２７のいずれか１項に記載のヘパシウイルス様粒子の使用であって、ここで患者の細胞中へ当該注目の導入遺伝子の転移を可能にし、そして疾患に対する予防又は治療効果を有す産物をコードする前記ヘパシウイルス様粒子の使用。
【請求項４２】
以下：
−パッケージング能力を有するレトロウィルス由来ゲノムを含む第一の核酸配列；
−前記レトロウィルス由来のコアタンパク質をコードしたｃＤＮＡを含む第二の核酸配列；及び
−連続するタイプＩ膜タンパク質由来シグナルペプチド、並びにヘパシウイルスＥ1タンパク質及び／又はヘパシウイルスＥ２タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第三の核酸配列；ここで当該Ｅ１及びＥ２タンパク質のＣ末端膜貫通ドメインが、天然Ｅ１及びＥ２タンパク質に対して改変されていない；
含んで成る形質転換した宿主細胞。
【請求項４３】
前記第三の核酸配列が、連続するヘパシウイルスコアタンパク質、並びにヘパシウイルスＥ１タンパク質及び／又はヘパシウイルスＥ２タンパク質を含むポリタンパク質をコードしたｃＤＮＡを含んで成る、請求項４２に記載の形質転換した宿主細胞。
【請求項４４】
前記第三の核酸配列が、更にＨＣＶｐ７タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含んで成る、請求項４２又は請求項４３のいずれか１項に記載の形質転換した宿主細胞。
【請求項４５】
前記ヘパシウイルスがＨＣＶである、請求項４２から４４のいずれか１項に記載の形質転換した宿主細胞。
【請求項４６】
候補分子の存在下又は不存在下における請求項４２から４５のいずれか１項に記載の形質転換した宿主細胞の標的宿主細胞への融合のレベルの比較を含む、細胞中に侵入するヘパシウイルスに干渉することができる分子のex vivoでのスクリーニング方法。
【請求項４７】
以下から成るステップ：
−合胞体フォーメーションを許容する条件下、即ち、細胞−細胞融合、及び任意の候補分子の不存在下において標的宿主細胞中へヘパシウイルス様粒子が侵入する条件下で、候補分子の不存在下又は存在下において、標的宿主細胞と前記形質転換した宿主細胞を共培養し；
−前記候補分子の不存在下又は存在下において合胞体フォーメーションを評価し；
−前記候補分子の存在下において測定した合胞体フォーメーションと、任意の候補分子の不存在下において測定した合胞体のフォーメーションを比較し；
−任意の候補分子の不存在下において測定した合胞体フォーメーションと比較して前記分子の存在下において測定した合胞体フォーメーションが減少している前記候補分子を、ヘパシウイルス侵入を妨げることができる分子として同定する、
を含んで成る請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ヘパシウイルスがＨＣＶである、請求項３２から３７、４０及び４６から４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
ex vivoにおけるＨＣＶ様感染性粒子の生産方法であって、以下のステップ：
−パッケージング能力を有するレトロウィルス由来ゲノムを含む第一の核酸配列を提供し；
−前記レトロウィルス由来のコアタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第二の核酸配列を提供し；
−連続するタイプＩ膜タンパク質由来シグナルペプチド、並びにＨＣＶＥ１タンパク質及び／又はＨＣＶＥ２タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第三の核酸配列を提供し；ここで、Ｅ１及びＥ２タンパク質のＣ末端膜貫通ドメインが、天然Ｅ１及びＥ２タンパク質に対して改変されておらず；
−前記核酸配列により宿主細胞をトランスフェクトし、そしてＨＣＶ及びレトロウィルス由来の構造タンパク質を生産するため、培養中でｃＤＮＡの発現を可能にする十分な時間トランスフェクトした細胞を保持し；そして当該構造タンパク質にウィルス様粒子を形成させる、
を含んで成る生産方法。
【請求項５０】
前記第三の核酸配列が、連続するＨＣＶコアタンパク質、並びにＨＣＶＥ１タンパク質及び／又はＨＣＶＥ２タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含んで成る請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記第三の核酸配列が、更にＨＣＶｐ７タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含んで成る、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ポリタンパク質が、天然ＨＣＶＥ１及び／又はＥ２タンパク質を含んで成る、請求項４９から５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ポリタンパク質が、天然ヘパシウイルスコアタンパク質、天然ＨＣＶＥ１タンパク質及び天然ＨＣＶＥ２タンパク質を含んで成る、請求項５０から５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ポリタンパク質が、天然ｐ７タンパク質を含んでなる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＨＣＶコアタンパク質が、ＨＣＶコアのカルボキシ末端の最後の２１アミノ酸を含んで成る請求項５０〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記Ｅ２タンパク質が、Ｃ末端のアミノ酸残基をそこから欠失させたＥ２タンパク質、及び超可変領域１（ＨＶＲ１）を欠失させた天然Ｅ２タンパク質から成る群から選定された突然変異したＥ２タンパク質である、請求項５０〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
レトロウィルス由来コアタンパク質、並びにＥ１ＨＣＶ糖タンパク質及び／又はＥ２ＨＣＶ糖タンパク質を含んで成る、請求項４９から５６のいずれか１項に記載の方法により得ることのできるＨＣＶ様感染性粒子であって、当該Ｅ１及びＥ２タンパク質のＣ末端膜貫通ドメインが、天然Ｅ１及びＥ２タンパク質に対して改変されていない、前記ヘパシウイルス様感染性粒子。
【請求項５８】
更にＨＣＶｐ７タンパク質を含む、請求項５７に記載の感染性粒子。
【請求項５９】
天然Ｅ１及び／又はＥ２ＨＣＶ性糖タンパク質を含んで成る請求項５７又は５８に記載の感染性粒子。
【請求項６０】
天然ｐ７タンパク質を含む、請求項５９に記載の感染性粒子。
【請求項６１】
前記Ｅ２タンパク質が、Ｃ末端アミノ酸残基をそこから欠失させた天然Ｅ２タンパク質、及び超可変領域１（ＨＶＲ１）を欠失させた天然Ｅ２タンパク質から成る群から選定された突然変異したＥ２タンパク質である、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の感染性粒子。
【請求項６２】
前記レトロウィルスが、MLV,ALV,RSV,MPMV,HIV-1,HIV-2,SIV,EIAV,CAEV,又はHFVから成る群から選定される、請求項５７から６１のいずれか１項に記載の感染性粒子。
【請求項６３】
肝炎に対するワクチンとして有用である医薬の調製のための３つの核酸配列の使用であって、当該核酸配列が：
−パッケージング能力を有するレトロウィルス由来ゲノムを含む第一の核酸配列；
−前記レトロウィルス由来のコアタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第二の核酸配列；
−連続するタイプＩ膜タンパク質由来シグナルペプチド、並びにＨＣＶＥ１タンパク質及び／又はＨＣＶＥ２タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第三の核酸配列；ここで当該Ｅ１及びＥ２タンパク質のＣ末端膜貫通ドメインは、天然Ｅ１及びＥ２タンパク質に対して改変されておらず；
であり、そして対象の細胞中へ転移した時、当該核酸配列はＨＣＶ及びレトロウィルスから構造タンパク質を生産することができ、前記ウィルス様粒子由来の構造タンパク質は免疫原性である使用。
【請求項６４】
前記第三の核酸配列が、連続するＨＣＶコアタンパク質、及びＨＣＶＥ１タンパク質及び／又はＨＣＶＥ２タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含んで成る、請求項６３に記載の使用。
【請求項６５】
前記第三の核酸配列が、更にＨＣＶｐ７タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含んで成る、請求項６３又は６４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６６】
請求項５７から６１のいずれか１項に記載の感染性粒子の細胞受容体への結合の検出を含む、ＨＣＶＥ１及び／又はＥ２糖タンパク質のための受容体のex vivoにおける同定方法。
【請求項６７】
ＨＣＶのための細胞受容体をex vivoで同定する方法であって、以下から成るステップ：
−ＨＣＶ感染を許容しない細胞に、ＨＣＶの受容体になるようなタンパク質をコードする核酸配列をトランスフェクトし；
−前記形質転換した細胞と請求項５７から６１のいずれか１項に記載のＨＣＶ様粒子を接触させ；
−前記形質転換した細胞がＨＣＶ感染を許容するに至ったか否かを決定し；そして、
−形質転換され感染を許容するに至った細胞により発現する前記タンパク質をＨＣＶの細胞受容体として同定する、
を含んで成る方法。
【請求項６８】
ＨＣＶのための細胞受容体をex vivoで同定するための方法であって、以下から成るステップ：
−ＨＣＶ感染を許容する細胞から得られた発現ｃＤＮＡライブラリーを提供し；
−前記発現ｃＤＮＡライブラリーによりＨＣＶ感染を許容しない細胞をトランスフェクトし；
−前記形質転換した細胞と請求項５７から６１のいずれか１項に記載のＨＣＶ様粒子を接触させ；
−ＨＣＶ感染を許容するに至ったそれらの形質転換した細胞を同定及び単離し；
−許容性に至った細胞中でトランスフェクトした発現ベクターを単離し；そして
−前記単離した発現ベクターのｃＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質をＨＣＶの受容体として同定する、
を含んで成る方法。
【請求項６９】
候補分子の存在下又は不存在下における請求項５７から６１のいずれか１項に記載の感染性粒子による細胞感染のレベルの比較を含めて、細胞中に侵入するＨＣＶを干渉することができる分子のex vivoでのスクリーニング又は同定の方法。
【請求項７０】
患者におけるＨＣＶの検出方法であり、患者の生物学的サンプル中に存在するような抗ＨＣＶ抗体と請求項５７から６１のいずれか１項に記載のＨＣＶ様粒子との相互作用により形成される免疫複合体を検出することを含んで成る方法。
【請求項７１】
患者におけるヘパシウイルスの検出方法であり、請求項５７から６１のいずれか１項に記載のＨＣＶ様粒子による許容性細胞への感染に対する、患者の生物学的サンプル中に存在していると思われる抗−ＨＣＶ抗体の阻害的効果を検出することを含んで成る方法。
【請求項７２】
請求項５７から６１のいずれか１項に記載のＨＣＶ様粒子及び前記免疫複合体の適切な検出手段を含んで成る、請求項７１記載の方法のための有用な診断キット。
【請求項７３】
請求項５７から６１のいずれか１項に記載のＨＣＶ様粒子及び医薬的に許容され得る担体を含んで成るワクチン組成物。
【請求項７４】
注目の導入遺伝子を運搬する請求項５７から６１のいずれか１項に記載のＨＣＶ様粒子で細胞を感染させること含む肝細胞に注目の導入遺伝子をin vitroにおいて転移する方法。
【請求項７５】
患者の疾患予防又は治療のための医薬の調製のための注目の導入遺伝子を運搬する請求項５７から６１のいずれか１項に記載のＨＣＶ様粒子の使用であって、ここで患者の細胞中へ当該注目の導入遺伝子の転移を可能にし、そして疾患に対する予防又は治療効果を有す産物をコードする前記ＨＣＶ様粒子の使用。
【請求項７６】
以下： 
−パッケージング能力を有するレトロウィルス由来ゲノムを含む第一の核酸配列；
−前記レトロウィルス由来のコアタンパク質をコードしたｃＤＮＡを含む第二の核酸配列；及び
−連続するタイプＩ膜タンパク質由来シグナルペプチド、並びにＨＣＶＥ1タンパク質及び／又はＨＣＶＥ２タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第三の核酸配列；ここで当該Ｅ１及びＥ２タンパク質のＣ末端膜貫通ドメインが、天然Ｅ１及びＥ２タンパク質に対して改変されていない；
含んで成る形質転換した宿主細胞。
【請求項７７】
前記第三の核酸配列が、連続するＨＣＶコアタンパク質、並びにＨＣＶＥ１タンパク質及び／又はＨＣＶＥ２タンパク質を含むポリタンパク質をコードしたｃＤＮＡを含んで成る、請求項７６に記載の形質転換した宿主細胞。
【請求項７８】
前記第三の核酸配列が、更にＨＣＶｐ７タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含んで成る、請求項７６又は請求項７７に記載の形質転換した宿主細胞。
【請求項７９】
候補分子の存在下又は不存在下における請求項７６から７８のいずれか１項に記載の形質転換した宿主細胞の標的宿主細胞への融合のレベルの比較を含む、細胞中に侵入するＨＣＶに干渉することができる分子のex vivoでのスクリーニング方法。
【請求項８０】
以下から成るステップ：
−合胞体フォーメーションを許容する条件下、即ち、細胞−細胞融合、及び任意の候補分子の不存在下において標的宿主細胞中へＨＣＶ様粒子が侵入する条件下で、候補分子の不存在下又は存在下において、標的宿主細胞と前記形質転換した宿主細胞を共培養し；
−前記候補分子の不存在下又は存在下において合胞体フォーメーションを評価し；
−前記候補分子の存在下において測定した合胞体フォーメーションと、任意の候補分子の不存在下において測定した合胞体のフォーメーションを比較し；
−任意の候補分子の不存在下において測定した合胞体フォーメーションと比較して前記分子の存在下において測定した合胞体フォーメーションが減少している前記候補分子を、ＨＣＶ侵入を妨げることができる分子として同定する、
を含んで成る請求項７９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レトロウィルスコア粒子上で集成した機能的Ｅ１，Ｅ２エンベロープ糖タンパク質を含むヘパシウイルス シュード粒子（hepacivirus pseudo-particles）の作製及び使用に関する。これらの粒子は高い感染性があり、そして有効なヘパシウイルスビリオンのモデルを構成する。
【背景技術】
【０００２】
全世界で数億人がＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）に感染している（Lavanchy等.,1999）。慢性疾患への進行はＨＣＶに感染した人々の大部分に起こる。感染は肝疾患のリスク及び肝細胞性癌の増加と関連し、並びに肝臓移植の主な指標となった。ＨＣＶ感染は、ＨＩＶに感染した人々の合併症の数も増加させる（Dieterich,2002）。現在のところ新しい感染を予防するための役立つワクチンはなく、そして慢性Ｃ型肝炎のための治療にのみインターフェロンα単独療法、又はグアノシンアナログであるリバビリンとの併用療法のいずれかがある。しかしながら４０％に満たない患者にのみ治療の応答があるだけである。明確には、ＨＣＶに感染した人の健康の犠牲は、今後数１０年以内に激高することが予測されるため、新規治療戦略が早急に求められる。
【０００３】
そのゲノム構造及び複製機構に基づき、ＨＣＶはウィルスの新規分類のプロトタイプとみなされ、そしてHepacivirus属Flaviviridaeウィルスファミリー中に仮に分類された（Robertson等.,1998）。
【０００４】
構造的及び非構造的なタンパク質であるヘパシウイルスタンパク質は一つのポリタンパク質前駆体から発現し、そして細胞性及びウィルス性プロテアーゼによってそれぞれ開裂し、個々に細胞区画へ放出される(Lindenbach及びRice,2001)。Flaviviridaeの他のメンバー、ヘパシウイルス、及び特にＨＣＶゲノム構成によって、２つのエンベロープ糖タンパク質Ｅ１及びＥ２を含む脂質エンベロープで覆われたウィルスゲノム及びコアタンパク質（Ｃ）を含む、ヌクレオカプシドから成るウィルスが示唆される。
【０００５】
今までのこところ、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）の研究は、ウィルス増幅のための有効且つ信頼できる培養システムの不足によって、及びin vivoにおけるＨＣＶ複製を研究するための適した動物モデル(Lindenbach及びRice,2001)の不足によって阻止されてきた。最近、細胞培養中にミニゲノムを施した自己複製に基づくＨＣＶ複製のためのモデルが確立された（Blight等.,2000；Lohmann等.,1999）。ＨＣＶゲノム複製を研究することは非常に有用であるが、このシステムはＨＣＶ粒子の生産を支援しないシステムである（Pietschmann等.,2002）。
【０００６】
昆虫細胞中のＨＣＶウィスル様粒子（ＶＬＰ）の生産は既に報告されている（WO98/21338,Wellnitz等.,2002；Baumert等.;1998,Owsianka等.,2001）。しかしながら、これらの粒子は分泌されず、そして細胞内画分由来のそれらの抽出物は、感染性でないＶＬＰ製剤を産出した。
【０００７】
シュード型の水泡性口内炎ウィルス（ＳＶＳ）ウィルス性粒子は、キメラのＥ１及び／又はＥ２糖タンパク質に設計され、それらの膜貫通ドメインは細胞表面へそれらを輸送することができるように修飾された（Buonocore等.,2002；Matsuura等.,2001）。しかしながら、かかる修飾は、Ｅ１Ｅ２複合体の立体配座及び機能を妨げるようであり（Matsuura等.,2001）、そしてかかるシュード粒子は候補ＨＣＶワクチンであるにもかかわらず（Rose等.,2001）、ＨＣＶ集成及び細胞進入を調査するための道具としてのそれらの使用は、それらの以前の結果が人工的であるという目下のコンセンサスがあるため、論争の余地を残す（Buonocore等.,2002）。
【０００８】
同様に、国際特許出願WO02/074941は、修飾されたＥ１及びＥ２ ＨＣＶ糖タンパク質（それらの膜貫通ドメインの変化を有す）を提示するレンチウィルスに基づくシュード粒子が、293ヒト腎細胞及びＨｅｐＧ２肝癌細胞中へ感染することができることを開示する。この特許出願は更に293及びＨｅｐＧ２細胞へ感染することもできる修飾されていないＥ１Ｅ２糖タンパク質を提示するヒト泡沫ウィルス由来のシュード粒子を示す。しかしながら、これらの発見は、上記の通り、ＨＣＶシュード粒子上に施されたＥ１Ｅ２の膜貫通の修飾（Hsu等.,2003）はそれらの機能的特性を撤廃するから、そして野生型のＨＣＶは293及びＨｅｐＧ２細胞へ感染性でないから（Bartosch等.,2003ａ及びｂ）、人工的なものである。
【０００９】
キメラのＨＣＶ−ＢＶＤＶ（ウシウィルス性下痢ウィルス）粒子は、ヒト肝細胞株Ｈｕｈ-7（WO 00/75352）に感染性であることを示した。しかしながら、感染はＨＣＶに対する抗血清により中和することができず、これらの粒子はＨＣＶビリオンの有効なモデルを構成しなかったことを示した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、新たなアプローチでは、ＨＣＶ細胞進入阻害剤をデザインするためにＨＣＶ集成及び細胞への進入を研究すること、並びにＨＣＶに対する体液性免疫応答を研究することが非常に必要とされる。増幅し得るＨＣＶ粒子の感染性の利用性は、診断への応用及び治療薬の開発のための有用な材料も提供するであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、レトロウィルス及びレンチウィルスのコア粒子上に機能的な、特に改変されていない、ＨＣＶ糖タンパク質を提示することにより、集成できる感染性シュード粒子を首尾よく作製した。これらのＨＣＶシュード粒子中へパッケージされた緑色蛍光タンパク質マーカー遺伝子の存在は、ＨＣＶ糖タンパク質によって仲介される感染の信頼性及び迅速な測定を可能にする。主要な肝細胞及び肝癌細胞は、in vitroでの感染の主要なターゲットであることを見出した。たとえ低い残存感染性がＥ１又はＥ２糖タンパク質のいずれかを担持するシュード粒子で観察されても、シュード粒子の高い感染性はＥ１及びＥ２ ＨＣＶ糖タンパク質の両方を要求した。感染性は更にＨＣＶ感染患者からの血清、及びいくつかの抗Ｅ２モノクローナル抗体によって中和されることを見出した。これらの結果をまとめると、本明細書において発表するシュード粒子が、野生型のＨＣＶ（Bartosch等.,2003a;Castet,2003）の早期感染ステップを真似る今まで初めて報告されたシュード粒子であることを示す。
【００１２】
本発明はこのようにヘパシウイルスビリオンの妥当なモデルを構成する感染性ヘパシウイルス シュード粒子、並びに特にＥ１及びＥ２糖タンパク質を担持するＨＣＶシュード粒子を発案する。
【００１３】
定義
用語“ベクター”、“クローニングベクター”及び“発現ベクター”とは、宿主を形質転換し、導入する配列の発現を促進するように（例えば転写及び翻訳）宿主細胞に導入することができるＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）による媒体を意味する。ベクターとは、典型的に挿入される外来ＤＮＡ中の伝達可能物質のＤＮＡを含む。ＤＮＡの他のセグメント中へＤＮＡの１のセグメントを挿入する共通の方法は、制限サイトと呼ばれる特異的なサイト（ヌクレオチドの特異的な官能基）でＤＮＡを切断する制限酵素と呼ばれる酵素の使用に関与する。一般的に外来ＤＮＡは１以上のベクターＤＮＡの制限サイトに挿入され、その後、伝達可能ベクターＤＮＡと一緒に宿主細胞の中へベクターによって運搬される。ＤＮＡのセグメント又は配列は、発現ベクターのような挿入された又は付加されたＤＮＡを有し、“ＤＮＡ構造体”と呼ぶこともできる。ベクターの共通のタイプは、“プラスミド”であり、通常バクテリア起源の一般的に２本鎖ＤＮＡ分子を自己に含み、追加の（外来の）ＤＮＡを容易に受け入れることができ、そして適した宿主細胞中へ容易に導入することができる。プラスミドベクターとは、しばしばコードされたＤＮＡ及びプロモーターＤＮＡを含有し、そして外来ＤＮＡを挿入するために適した１以上の制限サイトを有す。コードされたＤＮＡとは、特定のタンパク質又は酵素のための特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡとは、開始、調節、又は他のメディエーターもしくはコードされたＤＮＡの発現を調節するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡ及びコードされたＤＮＡは同一の遺伝子由来又は異なる遺伝子由来でもよく、並びに同一又は異なる有機体由来でもよい。ベクターの多くは、プラスミド及び真菌類のベクターを含み、多様な真核生物及び原核生物宿主中で複製及び／又は発現すると発表された。
【００１４】
“コードされた配列”又はＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、もしくは酵素といった発現産物を“コード”する配列とは、ヌクレオチド配列、即ち、ポリペプチド、タンパク質、もしくは酵素のためのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、であり、それが発現した時、そのＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、又は酵素の生産をもたらす。
【００１５】
用語“トランスフェクション”とは、細胞中への外来核酸（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ）の導入を意味し、ゆえに宿主細胞は所望される物質、典型的には導入された遺伝子もしくは配列によりコードされたタンパク質、を生産するために導入された遺伝子又は配列を発現させるであろう。導入される遺伝子は開始、終結、プロモーター、シグナル、分泌、又は細胞の遺伝の仕組みにより使用される他の配列のような制御又は調節配列を含んでよい。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受容及び発現する宿主細胞は、“形質転換”された。
【００１６】
用語“宿主細胞”とは、細胞による物質の生産、例えば細胞による遺伝子、ＤＮＡ配列、タンパク質、ビリオンの発現のため、任意の方法で選定され、修飾され、形質転換され、増殖させ、或いは使用又は処理された任意の組織の任意の細胞を意味する。本明細書中では、宿主細胞とは哺乳動物の細胞である。適した宿主細胞は、Ｈｕｈ−７ヒト肝細胞性癌（Nakabayashi等.,1982）、Ｈｅｐ３Ｂヒト肝細胞性癌（ATCC HB-8064）、ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞性癌（HB-8065）、ＨＴ−１０８０ヒト繊維肉腫（CCL-121）、２９３Ｔヒト胚腎性細胞（ATCC CRL-1573）、ＴＥ６７１ヒト横紋筋肉腫（ATCC CRL-8805）、JurkatヒトＴ細胞白血病（TIB-152）、ＣＥＭヒトリンパ芽球性白血病（CCL-119）、ＣＯＳ−７アフリカ緑サル繊維芽細胞腎（CRL-1651）、ＶＥＲＯアフリカ緑サル腎（CCL-81）、ＰＧ−４ネコアストロサイト（CRL-2032）、ＢＨＫ−２１ゴールデンハムスター腎（CCL-10）、ＣＨＯチャイニーズハムスター卵巣（ATCC CCL-61）、及びＮＩＨ３Ｔ３マウス繊維芽細胞を含む。特定の態様における前記宿主細胞は、２９３Ｔである。
【００１７】
本明細書において、用語“許容細胞”とは、ヘパシウイルス感染を許容する細胞を意味する。
【００１８】
“ヘパシウイルス”とは、Ｃ型肝炎ウイルス、ＧＢ型ウィルス、即ちＧＢウィスルＡ、ＧＢウィルスＢ、ＧＢウィスルＣ、及びＧＢＶ−Ａ様作用物質、並びにＧ型肝炎ウィルスを意味する。好適には前記ヘパシウイルスはＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）である。本発明の明細書において、前記ヘパシウイルスは、そこにおいて適した任意の種、遺伝子型、及びサブタイプ、並びにそれらの変異体でもよい。
【００１９】
“Ｃ型肝炎ウィルス”又は“ＨＣＶ”は、Flaviviridaeファミリーの一員である。他のヘパシウイルスゲノムと同様にＨＣＶゲノムは、一つのポリタンパク質 ＮＨ2-Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−Ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨをコードし、それは構造的（“コア”（Ｃ）と呼ばれるＮ末端ヌクレオカプシドタンパク質、並びに糖タンパク質Ｅ１及びＥ２）、及び非構造的（ＮＳ）タンパク質の両方へ同時及び後翻訳的にプロセシングされる。ポリタンパク質のアミノ末端部分は、宿主細胞のプロテアーゼ及びその産物により切断され、コア及びエンベロープ（Ｅ１及びＥ２）タンパク質がＨＣＶ粒子（ビリオン）の主要な構成物質になると信じられている。
【００２０】
翻訳が完了するまでの間又は翻訳後速やかに、ポリタンパク質前駆体中の最大の切断が起こるにもかかわらず、Ｅ２のカルボキシ末端で見出された疎水性ドメインのＥ２及びｐ７の間のプロセシングは不完全であり、十分にプロセシングされたＥ２及び切断されないＥ２−ｐ７の生産をもたらす。ＨＣＶのｐ７ポリペプチドは小さな疎水性タンパク質であり、未だ十分に特徴化されていない。確かに、この長さ63アミノ酸のポリペプチドの構造は決定されておらず、そしてその推定されている機能は未知のままである。
【００２１】
本発明の明細書中におけるＨＣＶは、任意の遺伝子型、例えば１，２，３，４，５，６及びサブタイプ、例えばａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈ，ｋ及びそれらの変異体である。
【００２２】
ＨＣＶ株Ｈのポリタンパク質配列（遺伝子バンクアクセス番号AF009606）はＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜１６において示される。ＨＣＶ Ｅ１、Ｅ２、ｐ７及びコアタンパク質のアミノ酸の位置は、この配列ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜１６を参照することにより後に示す。
【００２３】
用語“変異体”とは、相同のポリヌクレオチド配列をいい、対応するアミノ酸配列が、ＨＶＣの超可変性のために、異なるＨＣＶ株中で見出された。
【００２４】
好適には、ＨＣＶは１ａ又は１ｂのいずれかの遺伝子型を有し（Dubuisson等.,1994）、特にここに挙げたＨＣＶ遺伝子型は、最も優勢であり、そして最もインターフェロンα治療（Zein,2000）に抵抗性を示す。同様に、好適にはＨＣＶは遺伝子型２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ａ又は４ｂのいずれかを有す。
【００２５】
本明細書において用いられる用語“ヘパシウイルス様粒子”、“ヘパシウイルス様 シュード粒子”、或いは“ヘパシウイルス シュード粒子”又は“ヘパシウイルス シュードタイプ粒子”とは、自然に発生するウィルス粒子ではなく、ヘパシウイルスのエンベロープタンパク質を含むものを言う。好適には、本発明に従ったヘパシウイルス様粒子は野生型のヘパシウイルスビリオンと同じように細胞向性を示す。
【００２６】
本明細書において用いられる用語“ＨＣＶ様粒子”又は“ＨＣＶシュード粒子”又は“ＨＣＶシュードタイプ粒子”とは、自然に発生するウィスル粒子ではなく、ＨＣＶのエンベロープタンパク質を含むものを言う。
【００２７】
本発明の粒子は、より詳細にはレトロウィルスコアタンパク質を含む。かかる粒子は当業界における当業者により容易に生産することができる。当業者は例えば免疫応答を調節するための抗原を発現する合成レトロウィルス粒子の生産について発表したEP 1 201 750を参照することができる。
【００２８】
本発明のヘパシウイルス、特にＨＣＶ、シュード粒子は、標的細胞へ感染性である。好適には、ＨＣＶシュード粒子は野生型のＨＣＶビリオンと同じような向性、即ち、肝細胞の優先的な向性を示す（“野生型のＨＣＶビリオンの向性”とも呼ばれる）。好適には肝標的細胞は、主要なヒト肝細胞、及び肝癌細胞株ＨｕＨ７，ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、又はＨｅｐ３Ｂ由来の細胞、及びＣＤ８１（“ＨｅｐＧ２−ＣＤ８１”）を発現させるために遺伝学子操作されたＨｅｐＧ２細胞から成る群から選定され得る。上記の通り、野生型のＨＣＶはＨｅｐＧ２細胞株に感染性ではなく、及び本明細書において記載の通りＨｅｐＧ２細胞株は、本発明のＨＣＶシュード粒子による非常に弱いレベルの感染を見せる。しかしながら、発明者等は、ＣＤ８１の発現がＨｅｐＧ２細胞中（Bartosch等.,2003ｂ）へのＨＣＶシュード粒子の侵入を回復させるために十分であることを証明した。ＨｅｐＧ２−ＣＤ８１はこのようにＨＣＶビリオン及びＨＣＶシュード粒子のための肝の標的細胞の更なる例を示す。
【００２９】
本発明の明細書において、用語“感染性”は細胞へ入ることを導くウィルスサイクルの最初のステップを完全にする本発明の粒子の能力を記載するために用いる。しかしながら、宿主細胞との相互作用により、ヘパシウイルス様粒子は子孫ウィルスを生産するかもしれないし、しないかもしれない。
【００３０】
用語“ヘパシウイルスのエンベロープタンパク質”はヘパシウイルスの天然Ｅ１又はＥ２糖タンパク質又はそれらの突然変異体を意味する。
【００３１】
“Ｅ１糖タンパク質”又は“Ｅ１タンパク質”とは、ヘパシウイルス株の任意の種、遺伝子型、サブタイプ及び変異体由来のエンベロープ１タンパク質（Ｅ１）を意味する。
【００３２】
“Ｅ２糖タンパク質”又は“Ｅ２タンパク質”とは、ヘパシウイルス株の任意の種、遺伝子型、サブタイプ及び変異体由来のエンベロープ２タンパク質（Ｅ２）を意味する。
【００３３】
好適には、Ｅ１及びＥ２糖タンパク質は同一のヘパシウイルス株由来物である。好適には、Ｅ１及び／又はＥ２糖タンパク質は天然である。
【００３４】
“ｐ７タンパク質”はヘパシウイルス株の任意の種、遺伝子型、サブタイプ、及び変異体由来の天然ｐ７タンパク質、又はそれらの突然変異体を意味する。好適には、ｐ７タンパク質並びにＥ１及び／又はＥ２糖タンパク質は同一のヘパシウイルス株由来である。好適には、ｐ７タンパク質並びにＥ１及び／又はＥ２糖タンパク質は天然である。
【００３５】
用語“ＨＣＶのエンベロープタンパク質”とは、ＨＣＶのＥ１もしくはＥ２糖タンパク質、又はそれらの突然変異体を意味する。
【００３６】
“ＨＣＶ Ｅ１糖タンパク質”又は“ＨＣＶ Ｅ１タンパク質”とは、ＨＣＶ株の任意の遺伝子型、サブタイプ及び変異体由来エンベロープ１タンパク質（Ｅ１）を意味する。全長Ｅ１タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜１６の１９２から３８３アミノ酸により定義づけられる。
【００３７】
“ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質”又は“ＨＣＶ Ｅ２タンパク質”とは、ＨＣＶ株の任意の遺伝子型、サブタイプ及び変異体由来エンベロープ２タンパク質（Ｅ２）を意味する。全長Ｅ２タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜１６の３８４から７４６アミノ酸により定義づけられる。
【００３８】
好適には、ＨＣＶ Ｅ１及びＥ２糖タンパク質は同一のＨＣＶ株から由来する。好適には、ＨＣＶ Ｅ１及び／又はＥ２糖タンパク質は天然である。
【００３９】
“ＨＣＶ ｐ７タンパク質”とは、ＨＣＶ株の任意の遺伝子型、サブタイプ、及びそれらの変異体由来の天然ｐ７タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜１６中で見られるような７４７から８０９アミノ酸）、又はそれらの突然変異体を意味する。好適には、ＨＣＶｐ７タンパク質並びにＥ１及び／又はＥ２糖タンパク質は同一のＨＣＶ株に由来する。好適には、ＨＣＶ ｐ７タンパク質並びにＥ１及び／又はＥ２糖タンパク質は天然である。
【００４０】
用語“突然変異体”又は“突然変異”とは、ＤＮＡ配列の変化を意味し、天然のＥ１、Ｅ２、又はｐ７タンパク質のアミノ酸配列の修飾をもたらす。かかる修飾は例えば１以上のアミノ酸の置換及び／又は欠失を可能とする。突然変異体には天然Ｅ１、Ｅ２、及びｐ７タンパク質のフラグメントを特に含む。変異体は、天然的に生じる突然変異体の特殊な例である。突然変異体は、ワクチン接種の目的のための細胞感染性の維持、或いはＥ１及び／又はＥ２の抗原性の増加のために必要であるＥ１及び／又はＥ２タンパク質、並びに任意にｐ７タンパク質の構造的要素を同定するために有用であるとしてより詳細に考慮される。
【００４１】
好適には、ｉ）突然変異体Ｅ１、Ｅ２、又はｐ７タンパク質はレトロウィルスに基づくシュード粒子上へ集成する能力を保持し、そして宿主細胞によって放出されるようにシュード粒子を作製することを可能にし；及び／又はii）突然変異体Ｅ１、Ｅ２、又はｐ７タンパク質を担持する当該シュード粒子は肝細胞のＨＣＶビリオンの優先的な向性を保持する。
【００４２】
これに関して、糖タンパク質の膜への固定し、そうしてウイルス粒子上への集合を可能にするＥ１又はＥ２糖タンパク質のＣ末端膜貫通ドメインの実質的な変更は、好ましくは避けるべきである。なぜなら、これらの変更は、細胞向性の変化をもたらすか、及び／又はシュード粒子の組み立て及び放出を妨げる可能性があるからである。より詳細には、膜貫通ドメイン及び／又は細胞質尾部が異種タンパク質、例えばＶＳＶ−Ｇタンパク質の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質尾部により、少なくとも部分的に、好ましくは実質的に全体的に置換された突然変異Ｅ１又はＥ２タンパク質は、特にそのようにして生産されたシュード粒子がもはや野生型ＨＣＶビリオンの向性を示さないような場合、本発明の範囲から除外されるべきである。
【００４３】
好都合には、突然変異したＥ１、Ｅ２、又はｐ７タンパク質を有すヘパシウイルス シュード粒子は、対応する天然Ｅ１、Ｅ２、又はｐ７タンパク質を担持するシュード粒子と比較したところ、それらの感染性の減少は見られないものを言う。この観点から、好適なヘパシウイルス シュード粒子は、細胞レセプターへ付着するヘパシウイルス中に含まれるＥ１又はＥ２のドメインに影響する突然変異体を含まない。特に、前記シュード粒子はＨＣＶ細胞受容体であると推定されている（Pileri等.,1998;Scarselli等.,2002）ＣＤ８１への結合ドメインの又はスカベンジャー受容体クラスＢタイプ１（SR-B1）の一つを突然変異させたＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質を含まないであろう。ＣＤ８１へのＥ２結合ドメインは、Ｅ２（ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜１６の４７４−４９４、５２２−５５１及び６１２−６２０アミノ酸）の両末端で３つに分離したセグメントとして定義され、Ｅ２糖タンパク質ホモ二量体の頭部から尾部までのモデルにおいて互いに結合することができ（Yagnik等.,2000）、一方ＳＲ−Ｂ１へ結合するＥ２は、超可変領域１により仲介される（ＨＶＲ１、ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜１６の３８４から４１０アミノ酸）（Bartosch等.,2003ｂ；Scarselli等.,2002）。
【００４４】
Ｅ１、Ｅ２又はｐ７の好適な突然変異体は、それらを担持するヘパシウイルス シュード粒子の感染性の増加をもたらす。特に前記Ｅ２突然変異体は、最後のＣ末端残基を欠失させたＥ２糖タンパク質であってよい（ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜１６中に示されるＡｌａ７４６）。１０から５０倍の感染性の増強は、Ｅ２タンパク質のＣ末端の切断（ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜１６の３８４から７４５アミノ酸）したものを担持するＨＣＶシュード粒子と天然の全長Ｅ２糖タンパク質を担持するＨＣＶシュード粒子との比較で観察された。
【００４５】
しかしながら、本発明に伴うヘパシウイルス シュード粒子は、突然変異したＥ１、Ｅ２、又はｐ７タンパク質を含んでよく、そして天然Ｅ１、Ｅ２、又はｐ７タンパク質を担持する対応するシュード粒子との比較において感染性を減少させることを示した。それにもかかわらず、かかるシュード粒子はワクチン接種の目的のため有益であり、そしてウィルスの細胞侵入メカニズムの理解のための興味深いツールであることを示す。従って、当該突然変異体は超可変領域１（ＨＶＲ１）を欠失させたＥ２糖タンパク質を包含してよく、一方その粒子は、感染力が減少したにもかかわらず、感染性を残したまま生産された。
【００４６】
用語“ヘパシウイルスコア”とは、ヘパシウイルス株、それらのフラグメント、又はそれらの変異体の天然、全長、コアタンパク質を意味する。一つの態様によると、コアタンパク質はコアシグナルペプチドを含むヘパシウイルスコア（ΔＣ）のＮ末端的に切断されたフォームである。その機能が達成された後、コアタンパク質は細胞性プロテアーゼによりプロセシングされ、それによってポリタンパク質Ｅ１Ｅ２から切断される。従って、ヘパシウイルスコアタンパク質は本発明に係るシュード粒子中に見出されない。当業者はヘパシウイルスのコアタンパク質が任意の異種のタイプＩ膜タンパク質（即ち、そのＣ末端により膜に固定されたタンパク質）のシグナル配列を含むペプチド配列により置き換えることができることを容易に理解するであろう。
【００４７】
“シグナルペプチド”とは、タンパク質上に存在するペプチドを意味し、分泌されるか、又は膜成分とされるか、のいずれかの目的とされる。シグナルペプチドは普通Ｎ末端に位置し、通常成熟タンパク質には存在しない。それは通常シグナル認識粒子と相互作用する配列（約２０個の長さのアミノ酸）を言い、そして共翻訳的な挿入が起こる小胞体へリボソームを導く。シグナル配列は、通常は小胞体の槽表面上に位置する特異的なプロテアーゼであるシグナルペプチターゼによって成長したペプチド鎖から除去される。
【００４８】
本発明の明細書中における“異種の”とは、ヘパシウイルスビリオン中、及び特にＨＣＶビリオン中において非天然に生じたタンパク質を意味する。
【００４９】
タイプＩ膜タンパク質からのシグナル配列の例は、当業界における当業者に周知である。例えば参考文献では、免疫グロブリンのシグナル配列、又はウィルス性タイプＩ糖タンパク質のシグナル配列、特にレトロウィルスの表面の糖タンパク質を作製し得る。タイプＩ糖タンパク質の例は、Paetzel等（2002）及びvon Heijne（1990）において更に発表された。
【００５０】
本明細書において用いられる用語“ＨＣＶコア”とは、様々なＨＣＶ株の天然コアタンパク質、それらのフラグメント、又はそれらの変異体を意味する。ＨＣＶコアは、そこへ結合したＥ１又は任意にＥ２のためのシグナルペプチドを提供し、それは小胞体へのタンパク質トランスロケーションを可能にする。ＨＣＶコアシグナルペプチドはＨＣＶコアのカルボキシ末端の最後の２１残基に相当する（ＧＣＳＦＳＩＦＬＬＡＬＬＳＣＬＴＶＰＡＳＡ，ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜１；ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜１６の１７１から１９１アミノ酸に対応する）。一つの態様によると、コアタンパク質はこのようなＨＣＶコア（ΔＣ）のフォームをＮ末端的に切断する。好適にはΔＣはＨＣＶコアのカルボキシ末端の最後の２１残基を含む。特にＨＣＶコアはＨＣＶコアのカルボキシ末端の最後の６０残基から構成されてよい（ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜１６の１３２から１９１アミノ酸）。
【００５１】
本発明の明細書中において、用語“天然”又は“非修飾”とは、野生型の、全長タンパク質を記載するために中立的に用いられる。
【００５２】
本明細書において使用される用語“ポリタンパク質”とは、本来の適切な生物学的活性を保持する配列において互いに結合した個々のタンパク質から構成されるタンパク質構造体を記載するために使用した。
【００５３】
用語“ヘパシウイルスＥ１タンパク質及び／又はヘパシウイルスＥ２タンパク質へ結合したヘパシウイルスコアタンパク質を含むポリタンパク質”、又は“連続するヘパシウイルスコアタンパク質、及びヘパシウイルスＥ１タンパク質及び／又はヘパシウイルスＥ２タンパク質を含むポリタンパク質”とは、ＣＥ１Ｅ２，ＣＥ２Ｅ１，ＣＥ１，ＣＥ２，ΔＣＥ１Ｅ２，ΔＣＥ２Ｅ１，ΔＣＥ１，及びΔＣＥ２ポリタンパク質を含む。任意に、前記ポリタンパク質は更にｐ７タンパク質を含む。ヘパシウイルスＥ１タンパク質及び／又はヘパシウイルスＥ２タンパク質と結合したヘパシウイルスコアタンパク質を含むポリタンパク質はこのようにして付加的にＣＥ１Ｅ２ｐ７，ＣＥ２ｐ７Ｅ１，ＣＥ１ｐ７，ＣＥ２ｐ７，ΔＣＥ１Ｅ２ｐ７，ΔＣＥ２ｐ７Ｅ１，ΔＣＥ１ｐ７，及びΔＣＥ２ｐ７ポリタンパク質を含む。
【００５４】
“ＣＥ１Ｅ２”とは、連続的にヘパシウイルスコアタンパク質、ヘパシウイルスＥ１タンパク質及びヘパシウイルスＥ２タンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ＣＥ２Ｅ１”とは、連続的にヘパシウイルスコアタンパク質、ヘパシウイルスＥ２タンパク質及びヘパシウイルスＥ１タンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ＣＥ１”とは、ヘパシウイルスＥ１タンパク質と結合したヘパシウイルスコアタンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ＣＥ２”とは、ヘパシウイルスＥ２タンパク質と結合したヘパシウイルスコアタンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ΔＣＥ１Ｅ２”とはヘパシウイルスコアタンパク質のカルボキシ末端、並びにヘパシウイルスＥ１及びヘパシウイルスＥ２タンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ΔＣＥ２Ｅ１”とはヘパシウイルスコアタンパク質のカルボキシ末端、並びにヘパシウイルスＥ２及びヘパシウイルスＥ１タンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ΔＣＥ１”とは、ヘパシウイルスＥ１タンパク質と結合したヘパシウイルスコアタンパク質のカルボキシ末端を含むポリタンパク質をいう。“ΔＣＥ２”とは、ヘパシウイルスＥ２タンパク質と結合したヘパシウイルスコアタンパク質のカルボキシ末端を含むポリタンパク質をいう。ΔＣＥ１Ｅ２、及びΔＣＥ２は、Ｅ２末端での終止コドンを挿入することによって構築し、一方ΔＣＥ２Ｅ１及びΔＣＥ１はＥ１末端での終止コドンを挿入することにより構築した。“ＣＥ１Ｅ２ｐ７”とは、連続するヘパシウイルスコアタンパク質、ヘパシウイルスＥ１タンパク質、ヘパシウイルスＥ２タンパク質、及びヘパシウイルスｐ７タンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ＣＥ２ｐ７Ｅ１”とは、連続するヘパシウイルスコアタンパク質、ヘパシウイルスＥ２タンパク質、ヘパシウイルスｐ７タンパク質、及びヘパシウイルスＥ２タンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ＣＥ１ｐ７”とは、連続するヘパシウイルスコアタンパク質、ヘパシウイルスＥ１タンパク質、及びヘパシウイルスｐ７タンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ＣＥ２ｐ７”とは、連続するヘパシウイルスコアタンパク質、ヘパシウイルスＥ２タンパク質、及びヘパシウイルスｐ７タンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ΔＣＥ１Ｅ２ｐ７”とはヘパシウイルスコアタンパク質のカルボキシ末端、ヘパシウイルスＥ１タンパク質、ヘパシウイルスＥ２タンパク質、及びヘパシウイルスｐ７タンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ΔＣＥ２ｐ７Ｅ１”とはヘパシウイルスコアタンパク質のカルボキシ末端、ヘパシウイルスＥ２タンパク質、ヘパシウイルスｐ７タンパク質、及びヘパシウイルスＥ１タンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ΔＣＥ１ｐ７”とはヘパシウイルスコアタンパク質のカルボキシ末端、ヘパシウイルスＥ１タンパク質、及びｐ７タンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ΔＣＥ２ｐ７”とはヘパシウイルスコアタンパク質のカルボキシ末端、ヘパシウイルスＥ２タンパク質、及びｐ７タンパク質を含むポリタンパク質をいう。ΔＣＥ１Ｅ２ｐ７、ΔＣＥ１ｐ７及びΔＣＥ２ｐ７は、ｐ７の末端に終止コドンを挿入することにより構築され、一方ΔＣＥ２ｐ７Ｅ１はＥ１の末端で終止コドンを挿入することにより構築された。
【００５５】
用語“ＨＣＶ Ｅ１タンパク質及び／又はＨＣＶ Ｅ２タンパク質へ結合したＨＣＶコアタンパク質を含むポリタンパク質”、又は“連続するＨＣＶコアタンパク質、並びにＨＣＶ Ｅ１タンパク質及び／又はＨＣＶ Ｅ２タンパク質を含むポリタンパク質”とは、ＨＣＶ ＣＥ１Ｅ２，ＣＥ２Ｅ１，ＣＥ１，ＣＥ２，ΔＣＥ１Ｅ２，ΔＣＥ２Ｅ１，ΔＣＥ１，及びΔＣＥ２ポリタンパク質を含む。任意に、前記ポリタンパク質は更にｐ７タンパク質を含む。ＨＣＶ Ｅ１タンパク質及び／又はＨＣＶ Ｅ２タンパク質と結合したＨＣＶコアタンパク質を含むポリタンパク質は、このようにして付加的にＨＣＶ ＣＥ１Ｅ２ｐ７，ＣＥ２ｐ７Ｅ１，ＣＥ１ｐ７，ＣＥ２ｐ７，ΔＣＥ１Ｅ２ｐ７，ΔＣＥ２ｐ７Ｅ１，ΔＣＥ１ｐ７，及びΔＣＥ２ｐ７ポリタンパク質を含む。”ＨＣＶ ＣＥ１Ｅ２”とは、連続するＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質及びＨＣＶ Ｅ２タンパク質を含むポリタンパク質をいう。”ＨＣＶ ＣＥ２Ｅ１”とは、連続するＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質及びＨＣＶ Ｅ１タンパク質を含むポリタンパク質をいう。”ＨＣＶ ＣＥ１”とはＨＣＶ Ｅ１タンパク質と結合したＨＣＶコアタンパク質を含むポリタンパク質をいう。”ＨＣＶ ＣＥ２”とはＨＣＶ Ｅ２タンパク質と結合したＨＣＶコアタンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ＨＶＣ ΔＣＥ１Ｅ２”とは、ＨＣＶコアタンパク質のカルボキシ末端、並びにＨＣＶ Ｅ１及びＨＣＶ Ｅ２タンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ＨＶＣ ΔＣＥ２Ｅ１”とは、ＨＣＶコアタンパク質のカルボキシ末端、並びにＨＣＶ Ｅ２及びＨＣＶ Ｅ１タンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ＨＶＣ ΔＣＥ１”とは、ＨＣＶコアタンパク質のカルボキシ末端、並びにＨＣＶ Ｅ１タンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ＨＶＣ ΔＣＥ２”とは、ＨＣＶコアタンパク質のカルボキシ末端、並びにＨＣＶ Ｅ２タンパク質を含むポリタンパク質をいう。ＨＣＶ ΔＣＥ１Ｅ２、及びＨＣＶ ΔＣＥ２は、Ｅ２の末端に終止コドンを挿入することにより構築し、一方、ΔＣＥ２Ｅ１、及びΔＣＥ１はＥ１の末端に終止コドンを挿入することにより構築した。“ＨＣＶ ＣＥ１Ｅ２ｐ７”とは、連続するＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、及びＨＣＶ ｐ７タンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ＨＣＶ ＣＥ２ｐ７Ｅ１”とは、連続するＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、ＨＣＶ ｐ７タンパク質、及びＨＣＶ Ｅ２タンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ＨＣＶ ＣＥ１ｐ７”とは、連続するＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質、及びＨＣＶ ｐ７タンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ＨＣＶ ＣＥ２ｐ７”とは、連続するＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、及びＨＣＶ ｐ７タンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ＨＣＶ ΔＣＥ１Ｅ２ｐ７”とは、ＨＣＶコアタンパク質のカルボキシ末端、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、及びＨＣＶ ｐ７タンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ＨＣＶ ΔＣＥ２ｐ７Ｅ１”とは、ＨＣＶコアタンパク質のカルボキシ末端、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、ＨＣＶ ｐ７タンパク質、及びＨＣＶ Ｅ１タンパク質を含むポリタンパク質を��う。“ＨＣＶ ΔＣＥ１ｐ７”とは、ＨＣＶコアタンパク質のカルボキシ末端、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質、及びｐ７タンパク質を含むポリタンパク質をいう。“ＨＣＶ ΔＣＥ２ｐ７”とは、ＨＣＶコアタンパク質のカルボキシ末端、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、及びｐ７タンパク質を含むポリタンパク質をいう。ＨＣＶ ΔＣＥ１Ｅ２ｐ７、ＨＣＶ ΔＣＥ１ｐ７、及びＨＣＶ ΔＣＥ２ｐ７は、ｐ７の末端で終止コドンを挿入することにより構築し、一方、ΔＣＥ２ｐ７Ｅ１はＥ１の末端で終止コドンを挿入することにより構築した。
【００５６】
“レトロウィルス”とは、ＲＮＡ分子から成るゲノムを持つウィルスを意味し、逆転写酵素、即ちレトロウィルス科ファミリーのメンバー、を含む。レトロウィルスはオンコウィルス、レンチウィルス及びスプマウィルスの中で分類される。好適には前記レトロウィルスはオンコウィルス（例えばＭＬＶ，ＡＬＶ，ＲＳＶ，又はＭＰＭＶ）、レンチウィルス（例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＥＩＡＶ，又はＣＡＥＶ）、或いはＨＦＶのようなスプマウィルスである。これらのレトロウィルスのゲノムは、データバンクで容易に入手できる。
【００５７】
本発明の明細書中における“パッケージング能力を有するレトロウィルス由来ゲノムを含む核酸配列”とは、“シス−作用”配列として公知のレトロウィルスの核酸配列を含む配列を意味する。これらは、転写及び組込みの制御のための末端反復配列（ＬＴＲｓ）、カプシド化のために必要なpsi配列、及びプライマー結合サイト（ＰＢＳ）及びレトロウィルスゲノムの逆転写のために必要なポリプリントラック（ＰＰＴ）配列を含む。好都合には、パッケージング能力を有するレトロウィルス由来ゲノムを含む前記核酸配列は、更に導入遺伝子を含む。
【００５８】
前記レトロウィルスゲノムは、任意のトランス−相補機能不存在下において、複製欠陥的又は複製能的であってよい。複製能的ゲノムは、更にgag,pol,及びenvレトロウィルス遺伝子を含む。複製欠陥的ゲノム中においては、ウィルス遺伝子gag,pol,及びenvは欠失している。しかしながら、ウィルス性シュード粒子の集成は、gag,pol及びenvを含むが、“シス”配列に対して欠陥である他のベクターをトランス位置に提供することによって達成してよい。それらの発現は、ウィルス遺伝子の増殖のため、及び完全なウィルス粒子の形成のため必要である遺伝子を排除した外来遺伝子のカプシド化を可能にする。
【００５９】
本明細書において使用される用語“導入遺伝子”とは、本発明の粒子により感染した標的細胞中で発現する遺伝子をいう。
【００６０】
導入遺伝子の例は、治療に関連した分子をコードする遺伝子、マーカー遺伝子、免疫調節因子をコードする遺伝子、抗原、又は自殺遺伝子を含む。
【００６１】
“マーカー遺伝子”とは発現を検出することができる遺伝子をいう。例えばマーカー遺伝子の発現は、蛍光放出、色素原反応、又は発現が起こるところの細胞を優先的に成長される（抗生物質耐性遺伝子）といった検出可能シグナルを産出ことができる。
【００６２】
“免疫調節因子”とは、in vivoにおいて対象の免疫システム活性を調節する遺伝子産物をいう。免疫調節因子の発現は、サイトカイン（例えば、インターロイキン、インターフェロン、又は造血コロニー刺激因子）、ケモカイン及び類似物を含む。形質転換した細胞による免疫調節因子の発現は、細胞環境を変え、及び免疫細胞の識別性を変えてよく、そしてこのようにして与えられる抗原に対する免疫応答のタイプ及び強度の調節を引き起こす。
【００６３】
“抗原”とは、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のような分子をいい、免疫応答に対して求められる。当該抗原は、例えば腫瘍性、バクテリア性、病原性、タンパク質性、又はウィルス性抗原であってよい。
【００６４】
“自殺遺伝子”とは、条件つきの単純ヘルペスウィルスタイプＩチミジンキナーゼ遺伝子のようなプログラムされた細胞死（アポトーシス）を含む細胞中での遺伝子の発現を意味する。
【００６５】
“レトロウィルス由来のコアタンパク質”とは、gag及びpol遺伝子によりコードされたタンパク質をいう。当該gag遺伝子は、更にコアを含む構造タンパク質中で、レトロウィルス性プロテアーゼにより処理されるポリタンパク質をコードする。当該pol遺伝子はレトロウィルス性プロテアーゼ、逆転写酵素、及びインテグラーゼをコードする。
【００６６】
“医薬的に許容され得る担体”とは、本発明に係るワクチン組成物を製剤化することができる任意の媒体をいう。それはリン酸塩緩衝液のような塩溶液を含む。一般的に、希釈剤又は担体は投与形態及び経路、並びに標準的な医薬の慣行に基づき選定される。
【００６７】
本出願の明細書中における“ワクチン接種”とは予防的又は治療的なワクチン接種を意図する。“治療的なワクチン接種”とはＨＣＶ感染患者へのワクチン接種を意味する。
【００６８】
本発明による用語“対象”又は“患者”とは、ヘパシウイルス、特にＨＣＶに感染したらしい、任意の哺乳動物を意味する。ヒト、チンパンジー、タマリン、及びマウス、特にヒト肝−異種移植されたマウスがヘパシウイルス、及び特にＨＣＶの宿主の例である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６９】
ヘパシウイルス シュード粒子の生産
本発明者等は、機能的な、そしてより詳細には改変されていないヘパシウイルス糖タンパク質、特にレトロウィルスコア粒子上に集成するＨＣＶ糖タンパク質、を含む感染性シュード粒子を生産した。ヘパシウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１Ｅ２、及び任意にｐ７は、コア（Ｃ）タンパク質又はそれらのフラグメント（特にＥ１又はＥ２のシグナルペプチドとして働くＣタンパク質のカルボキシ末端）並びにＥ１及び／又はＥ２糖タンパク質を含むポリタンパク質から発現される。より一般的にはヘパシウイルスＥ１Ｅ２は異種のタイプＩ膜タンパク質からのシグナルペプチドを含むポリタンパク質から発現されてよい。
【００７０】
本発明は、このように以下のステップ：
−パッケージング能力を有するレトロウィルス由来ゲノムを含む第一の核酸配列を提供し；
−前記レトロウィルス由来のコアタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第二の核酸配列を提供し；
−連続するタイプＩ膜タンパク質由来シグナルペプチド、好適にはヘパシウイルスコアタンパク質、及びヘパシウイルスＥ１タンパク質及び／又はヘパシウイルスＥ２タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第三の核酸配列を提供し；
−前記核酸配列により宿主細胞をトランスフェクトし、そしてヘパシウイルス及びレトロウィルス由来の構造タンパク質を生産するため、培養中でｃＤＮＡの発現を可能にする十分な時間トランスフェクトした細胞を保持し；そして当該構造タンパク質にウィルス様粒子を形成させる、を含んで成るex vivoでのヘパシウイルス様粒子を生産するための方法を提供する。
【００７１】
本発明は、in vivoにおいてヘパシウイルス様粒子を産出するための方法を更に提供し、当該方法は以下のステップ：
−パッケージング能力を有するレトロウィルス由来ゲノムを含む第一の核酸配列を提供し；
−前記レトロウィルス由来のコアタンパク質をコードしたｃＤＮＡを含む第二の核酸配列を提供し；
−連続するタイプＩ膜タンパク質由来シグナルペプチド、好適にはヘパシウイルスＥ１タンパク質及び／又はヘパシウイルスＥ２タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含んで成る第三の核酸配列を提供し；
−ヘパシウイルス及びレトロウィルスから構造的なタンパク質を生産するためにｃＤＮＡの発現をもたらすべく、前記核酸配列により対象の細胞をin vivoにおいてトランスフェクトし；及びウィルス様粒子を形成するための構造タンパク質を可能にする、を含んで成る。
【００７２】
本発明の他の観点では、ヘパシウイルス感染、即ち肝炎、に対するワクチンとして有用である医薬の調製のための３つの核酸配列の使用であり、ここで核酸配列は：
−パッケージング能力を有するレトロウィルス由来ゲノムを含む第一の核酸配列；
−前記レトロウィルス由来のコアタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第二の核酸配列；
−連続するタイプＩ膜タンパク質由来シグナルペプチド、好適にはヘパシウイルスコアタンパク質、並びにヘパシウイルスＥ１タンパク質及び／又はヘパシウイルスＥ２タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第三の核酸配列；であり、対象の細胞中へ転移した時、当該核酸配列はヘパシウイルス及びレトロウィルスから構造タンパク質を生産することができ、ここでウィルス様粒子由来の当該構造タンパク質は、免疫原性である。
【００７３】
好適には、前記第三の核酸配列は、ポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含み、更にヘパシウイルスｐ７タンパク質を含む。このようにして、好適には前記ポリタンパク質は連続するタイプＩ膜タンパク質由来シグナルペプチド、好適にはヘパシウイルスコアタンパク質、ヘパシウイルスＥ１タンパク質及び／又はヘパシウイルスＥ２タンパク質、並びに任意にヘパシウイルスｐ７タンパク質を含む。
【００７４】
特定な態様に従った前記パッケージング能力を有するレトロウィルスゲノム及びコアタンパク質は、MLV,ALV,RSV,MPMV,HIV-1,HIV-2,SIV,EIAV,CAEV,及びHFVから成る群から選定されるレトロウィルスから由来する。
【００７５】
好都合には、パッケージング能力を有するレトロウィルスゲノムは更にマーカー遺伝子又は免疫調節因子を含む。
【００７６】
本発明の方法において、前記ポリタンパク質はヘパシウイルスＥ１タンパク質に結合したヘパシウイルスコアタンパク質、又はヘパシウイルスＥ２タンパク質に結合したヘパシウイルスコアタンパク質、或いは連続するヘパシウイルスコアタンパク質、ヘパシウイルスＥ１タンパク質及びヘパシウイルスＥ２タンパク質、又は連続するヘパシウイルスコアタンパク質、ヘパシウイルスＥ２タンパク質及びヘパシウイルスＥ１タンパク質を含んでよい。前記ポリタンパク質は更に連続するヘパシウイルスコアタンパク質、ヘパシウイルスＥ１タンパク質及びｐ７タンパク質、又は連続するヘパシウイルスコアタンパク質、ヘパシウイルスＥ２タンパク質及びヘパシウイルスｐ７タンパク質、或いは連続するヘパシウイルスコアタンパク質、ヘパシウイルスＥ１タンパク質、ヘパシウイルスＥ２タンパク質及びヘパシウイルスｐ７タンパク質、又は連続するヘパシウイルスコアタンパク質、ヘパシウイルスＥ２タンパク質、ヘパシウイルスｐ７タンパク質、及びヘパシウイルスＥ１タンパク質を含む。
【００７７】
一つの態様によると、Ｅ１及び／又はＥ２、並びに任意にｐ７タンパク質は、天然タンパク質である。他の態様によると、Ｅ１及び／又はＥ２糖タンパク質、並びに任意にｐ７タンパク質は、おそらくヘパシウイルス感染性のための糖タンパク質決定要素を特徴づけるために有用であろう粒子を得るために突然変異する。
【００７８】
前記Ｅ１及びＥ２糖タンパク質が共に同一のヘパシウイルス株から由来することが好ましい。前記Ｅ１又はＥ２糖タンパク質及びｐ７タンパク質が共に同一のヘパシウイルス株から由来することが好ましい。更に、前記Ｅ１及びＥ２糖タンパク質、並びにｐ７タンパク質が共に同一のヘパシウイルス株から由来することが好ましい。
【００７９】
他の態様によれば、前記ヘパシウイルスコアタンパク質は、コアタンパク質シグナルペプチドを含むヘパシウイルスコアタンパク質のカルボキシ末端フォーム（ΔＣ）である。
【００８０】
好適には、前記ヘパシウイルスはＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）である。
【００８１】
本発明はこのようにしてＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）様粒子のex vivoで生産するための方法を提供し、当該方法は以下のステップ：
−パッケージング能力を有するレトロウィルス由来ゲノムを含む第一の核酸配列を提供し；
−前記レトロウィルス由来のコアタンパク質をコードしたｃＤＮＡを含む第二の核酸配列を提供し；
−連続するタイプＩ膜タンパク質由来シグナルペプチド、好適にはＨＣＶコアタンパク質、及びＨＣＶ Ｅ１タンパク質、及び／又はＨＣＶ Ｅ２タンパク質を含むポリタンパク質をコードしたｃＤＮＡを含む第三の核酸配列を提供し；
−Ｃ型肝炎ウィルス及びレトロウィルス由来の構造タンパク質を生産するため、前記核酸配列により宿主細胞をトレンスフェクトし、及び培養中でｃＤＮＡの発現を可能にする十分な時間トランスフェクトした細胞を保持し；及びウィルス様粒子を形成するための構造タンパク質を可能にする、を含んで成る。
【００８２】
本発明はin vivoにおいてＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）−様粒子を生産するための方法を更に提供し、当該方法は以下のステップ：
−パッケージング能力を有するレトロウィルス由来ゲノムを含む第一の核酸配列を提供し；
−前記レトロウィルスからのコアタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第二の核酸配列を提供し；
−連続するタイプＩ膜タンパク質由来シグナルペプチド、好適にはＨＣＶコアタンパク質、及びＨＣＶ Ｅ１タンパク質及び／又はＨＣＶ Ｅ２タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第三の核酸配列を提供し；
−Ｃ型肝炎ウィルス及びレトロウィルス由来の構造タンパク質を生産するため、前記核酸配列により対象の細胞をin vivoにおいてトランスフェクトし；及びウィルス様粒子を形成するための構造タンパク質を可能にする、含んで成る。
【００８３】
本発明の他の観点では、Ｃ型肝炎に対するワクチンとして有用である医薬の調製のための３つの核酸配列の使用であり、ここで核酸配列は：
−パッケージング能力を有するレトロウィルス由来ゲノムを含む第一の核酸配列；
−前記レトロウィルス由来のコアタンパク質をコードしたｃＤＮＡを含む第二の核酸配列；
−連続するタイプＩ膜タンパク質由来シグナルペプチド、好適にはＨＣＶコアタンパク質、及びＨＣＶ Ｅ1タンパク質、及び／又はＨＣＶ Ｅ２タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第三の核酸配列；であり、及び、対象の細胞中へ転移した時、当該核酸配列はＣ型肝炎ウィルス及びレトロウィルスから構造タンパク質を生産することができ、ここでウィルス様粒子由来の当該構造タンパク質は、免疫原性である。
【００８４】
特定の態様によれば、前記パッケージング能力を有するレトロウィルスゲノム、及びコアタンパク質は、MLV,ALV,RSV,MPMV,HIV-1,HIV-2,SIV,EIAV,CAEV,及びHFVから成る群から選定されたレトロウィルスに由来する。
【００８５】
好都合には、当該パッケージング能力を有するレトロウィルスゲノムは、更にマーカー遺伝子、又は免疫調節因子を含む。
【００８６】
好適には、前記第三の核酸配列は、更にＨＣＶ ｐ７タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。このように、好適には前記ポリタンパク質は連続するタイプＩ膜タンパク質由来シグナルペプチド、好適にはＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ Ｅ1タンパク質、及び／又はＨＣＶ Ｅ２タンパク質、並びに任意にＨＣＶ ｐ７タンパク質を含む。
【００８７】
ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２及びレトロウィルスの発現構造体の例は、図６Ａ及び６Ｂに示す。
【００８８】
本発明の方法において、前記ポリタンパク質はＨＣＶ Ｅ１タンパク質と結合したＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質と結合したＨＣＶコアタンパク質、或いは連続するＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質、及びＨＣＶ Ｅ２タンパク質、又は連続するＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、及びＨＣＶ Ｅ１タンパク質を含んでよい。前記ポリタンパク質は連続するＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質、及びｐ７タンパク質、又は連続するＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、及びＨＣＶ ｐ７タンパク質、或いは連続するＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、及びＨＣＶ ｐ７タンパク質、又は連続するＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、ＨＣＶ ｐ７タンパク質、及びＨＣＶ Ｅ１タンパク質を更に含む。
【００８９】
一つの態様によれば、ＨＣＶ Ｅ１及び／又はＥ２、並びに任意にＨＣＶ ｐ７タンパク質は、天然タンパク質である。他の態様によれば、ＨＣＶ Ｅ１及び／又はＥ２糖タンパク質、並びに、任意にＨＣＶ ｐ７タンパク質は、ＨＣＶ感染性のための糖タンパク質決定要素を特徴づけるために有用であるだろう粒子を得るために突然変異する。好適なＥ２タンパク質の突然変異体は、Ｅ２タンパク質のフォームをＣ末端で切断し、ここでＣ末端Ａｌａ残基（ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜１６の７４６アミノ酸）を欠失させた。他の好適なＥ２タンパク質の突然変異体は、超可変領域Ｉ（Ｎ末端領域中に位置する、即ちシグナルペプチド後のＥ２タンパク質の最初の２７アミノ酸、即ちＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜１６の３８４から４１０アミノ酸）を欠失させた。
【００９０】
好適には、前記Ｅ１及びＥ２糖タンパク質は、共に同一のＨＣＶ株から由来する。好適には、前記Ｅ１又はＥ２糖タンパク質、及びｐ７タンパク質は共に同一のＨＣＶ株から由来する。更に好適には、前記Ｅ１及びＥ２糖タンパク質、並びにｐ７タンパク質は同一のＨＣＶ株から由来する。
【００９１】
他の態様によると前記ＨＣＶコアタンパク質は、ＨＣＶコアタンパク質のカルボキシ末端のフォーム（ΔＣ）である。特に、前記ＨＣＶコアタンパク質はＨＣＶコアのカルボキシ末端の最後の２１アミノ酸を含んでよい。
【００９２】
トランスフェクションの目的のため、前記、第一、第二、及び第三の核酸配列は、同一のベクター、或いは２又は３の別個のベクターで運搬してよい。
【００９３】
特に、プラスモウィルス（plasmoviruses）,アデノレトロウィルス及び複製したシュードウィルスは、上記配列を運搬するために適したベクターの例である。プラスモウィルスワクチンはかかるプラスミドＤＮＡ製剤の中に存在し、前記ヘパシウイルスに対する免疫応答を引き出すために患者へ投与した後、ヘパシウイルス シュード粒子の発現を許容する。かかるプラスモウィルスワクチンの投与は、ヘパシウイルス感染患者へのヘパシウイルス誘導疾患のリスクにある人々への予防的ワクチン接種のため、又は治療的ワクチン接種のために成された。アデノレトロウィルスは、ヘパシウイルス シュード粒子をコードする上記核酸配列を提供するための他の方法を存する。この場合、３つの独立したアデノレトロウィルス、即ち、上記３つの核酸配列をコードする組換えアデノウィルス（レトロウィルス性コア及びゲノム、並びにヘパシウイルス糖タンパク質）をデザインすることが可能であり、或いは“guttless”組換えアデノウィルスに由来する１つのアデノウィルスをデザインすることも可能であり、それは異なる核酸配列を含む。かかるアデノウィルスは、抗-ヘパシウイルス免疫応答を引き起こすためにプラスモウィルスに関する限りでは患者へ投与することができる。複製シュードレトロウィルスは、ヘパシウイルス シュード粒子をコードする上記全ての核酸配列を発現する他の可能性である。かかる構造体は事実ヘパシウイルス シュード粒子があって、感染した後、接種された患者の細胞の中での増殖が可能となり、かくして更なる複製ヘパシウイルス シュード粒子の生産が誘導されるようにそのゲノムが操作された粒子である。この場合、レトロウィルスのゲノムはレトロウィルスのEnv遺伝子（レトロウィルス糖タンパク質をコードする）の代わりにヘパシウイルスＥ１Ｅ２糖タンパク質を発現するように改変される。レトロウィルスのコアタンパク質をコードした遺伝子は変化しないままである。更に例えば、マーカー遺伝子又は免疫調節因子をコードした追加の遺伝子が、このゲノムから発現され得る。
【００９４】
本発明に従うことにより、当業者間で、慣例的な分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術に用いることができる。かかる技術は十分に文献中において説明されている。例えば、Sambrook等.,1989；ＤＮＡクローニング：A Practical Approach, VolumesＩ及びII(D.N.Glover ed.1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984);Nucleic Acid Hybridization〔B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1985)〕;Transcription and Translation〔B.D.Hames&S.J.Higgins, eds.(1984)〕；Animal Cell culture〔R.I.Freshney,ed.(1986)〕；Immnobilized Cell and Enzymes〔IRL Press,(1986)〕;B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);F.M.Ausubel等.,1994参照。
【００９５】
特に本発明のベクターは、ex vivo、又はin vivoにおけるいずれかの培養中において、細胞の核へ核酸を運搬するための任意の公知技術によって標的細胞中へ導入され得る。
【００９６】
核酸配列の導入は、当業界における当業者に周知の任意の標準方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、又は遺伝子ガンの使用（例えば、Wu等.,1992；Wu等,1998参照）によって実施され得る。
【００９７】
ドナー核酸ターゲッティングシステムは、リポフェクションによっても導入され得る。一定の態様において、リポソーム及び／又はナノ粒子の使用は、宿主細胞へのドナー核酸ターゲッティングシステムの導入のため期待される。ナノカプセルは一般的に安定状態、及び再生産し得る方法において、化合物をトラップ化することができる。超微粒子（サイズ約0.1μｍ）は、本発明において使用が期待される、生物分解性のあるポリアルキル−シアノアクリレートポリマーの使用をデザインすることができ、そしてかかる粒子は容易に作製することができる。
【００９８】
リポソームは水性培地中で分散させたリン脂質から形成され、そして自発的に多層板の同心の２層の小胞を形成する（マルチラメラー小胞（MLVｓ）とも呼ばれる）。ＭＬＶｓは一般的に直径２５ｎｍから４μｍを有する。ＭＬＶｓの音波破砕は、コア中に水性溶液を含む直径２００から５００Åの範囲にある小さい同一層板小胞（ＳＵＶｓ）のフォーメーションをもたらす。陽性脂質の使用は、陰性的に添加された核酸のカプセル化を促進し、そして陰性的に添加された細胞膜による融合も促進することができる（Felgner等.,1989）。
【００９９】
In vivoにおける標的にされた遺伝子の運搬は、国際公開WO 95/28 494において発表されている。或いは、ベクターは、in vivoにおいて上記の通りリポソーム又はナノ粒子を用いたリポフェクションにより導入することができる。In vitroにおいて使用される技術と類似した技術を用いて、in vivoにおいてベクターを導入することも可能である（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション）。
【０１００】
形質転換細胞
本発明は、更に以下を： 
−パッケージング能力を有するレトロウィルス由来ゲノムを含む第一の核酸配列；
−前記レトロウィルス由来のコアタンパク質をコードしたｃＤＮＡを含む第二の核酸配列；及び
−連続するタイプＩ膜タンパク質由来シグナルペプチド、好適にはヘパシウイルスコアタンパク質、並びにヘパシウイルスＥ1タンパク質及び／又はヘパシウイルスＥ２タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第三の核酸配列；含んで成る形質転換した宿主細胞に関する。
【０１０１】
好適には、前記第三の核酸配列は、更にヘパシウイルスｐ７タンパク質を含むポリタンパク質をコードしたｃＤＮＡを含む。このように、好適には前記ポリタンパク質は、連続するタイプＩ膜タンパク質由来シグナルペプチド、好適にはヘパシウイルスコアタンパク質、ヘパシウイルスＥ1タンパク質、及び／又はヘパシウイルスＥ２タンパク質、並びに任意にヘパシウイルスｐ７タンパク質を含む。
【０１０２】
かかる形質転換した宿主細胞は、上記方法で発表された通り得ることができる。
【０１０３】
他の観点においては、本発明は細胞に侵入するヘパシウイルスを妨げることを可能にする分子の同定のために上記で定義したような形質転換した宿主細胞の使用に関する。本発明は、特に候補分子の存在下又は不存在下における、標的宿主細胞へ融合する形質転換した宿主細胞のレベルの比較を含み、ex vivoでのスクリーニング又は細胞に侵入するヘパシウイルスによる感染を可能にする分子の同定方法を提供する。前記方法は、好適には以下から成るステップ：
−合胞体フォーメーションを許容する条件下、即ち、細胞−細胞融合、及び任意の候補分子の不存在下において標的宿主細胞中へヘパシウイルス様粒子が侵入する条件下で、候補分子の不存在下又は存在下において、標的宿主細胞と形質転換した宿主細胞を共培養し；
−前記候補分子の不存在下及び存在下において合胞体フォーメーションを評価し；
−前記候補分子の存在下において測定した合胞体フォーメーションと、任意の候補分子の不存在下において測定した合胞体のフォーメーションを比較し；
−任意の候補分子の不存在下において測定した合胞体フォーメーションと比較して前記分子の存在下において測定した合胞体フォーメーションが減少している候補分子を、ヘパシウイルス侵入を妨げることができる分子として同定する、を含んで成る。
【０１０４】
好適には、前記ヘパシウイルスはＣ型肝炎ウィルスである。本発明は、このようにして以下： 
−パッケージング能力を有するレトロウィルス由来ゲノムを含む第一の核酸配列；
−前記レトロウィルス由来のコアタンパク質をコードしたｃＤＮＡを含む第二の核酸配列；及び
−連続するタイプＩ膜タンパク質由来シグナルペプチド、好適にはＨＣＶ コアタンパク質、並びにＨＣＶ Ｅ1タンパク質、及び／又はＨＣＶ Ｅ２タンパク質を含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第三の核酸配列；を含んで成る形質転換した宿主細胞にも関する。
【０１０５】
他の態様によれば、前記第三の核酸配列は、ＨＣＶ ｐ７タンパク質を更に含むポリタンパク質をコードするｃＤＮＡを含んで成る。好適には、前記ポリタンパク質は、連続するタイプＩ膜タンパク質由来シグナルペプチド、好適にはＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ Ｅ1タンパク質、及び／又はＨＣＶ Ｅ２タンパク質、並びに任意にＨＣＶ ｐ７タンパク質を含んで成る。
【０１０６】
かかる形質転換した宿主細胞は上記方法中で記載されたように得ることができる。
【０１０７】
他の観点では、本発明は上記定義の通り、細胞中へのＨＣＶ侵入を妨げることができる分子の同定のための形質転換した宿主細胞の使用に関する。本発明は特に候補分子の存在下、又は不存在下において、標的宿主細胞へ融合した形質転換した宿主細胞のレベルの比較を含むＨＣＶによる細胞進入を妨げることを可能にする分子のex vivoスクリーニング方法、又は同定方法を提供する。前記方法は、好適には以下から成るステップ：
−候補分子の不存在下又は存在下において、合胞体のフォーメーションを許容する条件下で、標的宿主細胞と形質転換した宿主細胞を共培養し（即ち、細胞−細胞融合）、そしてＨＣＶ−様粒子が任意の候補分子の不存在下において、標的宿主細胞中へ侵入し；
−前記候補分子の不存在下及び存在下において合胞体フォーメーションを評価し；
−前記候補分子の存在下において測定した合胞体フォーメーションと、任意の候補分子の不存在下において測定した合胞体のフォーメーションを比較し；
−任意の候補分子の不存在下において測定した合胞体フォーメーションと比較して減少した前記分子の存在下において測定したような候補分子のための合胞体フォーメーションをＨＣＶ侵入を妨げることができる分子として同定する、を含んで成る。
【０１０８】
標的宿主細胞と形質転換した宿主細胞を接触させ、そして候補分子は、前記形質転換した宿主細胞、標的細胞及び候補分子を同時に接触させることにより実行させることができる。別の方法では、それらの３つの要素の２つは、欠損した３つ目の要素の付加の前にそれらの相互作用を許容するための十分な条件下において接触させることができる。
【０１０９】
好適には前記標的宿主細胞は形質転換されておらず、即ち、前記宿主細胞は、上記の通り定義した第一、第二、及び第三の核酸配列の少なくとも１つを含まない。
【０１１０】
合胞体フォーメーションは、当業界における当業者によって容易に評価され得る。簡潔には、共培養はｐＨ−５で５分間の培養で酸性ｐＨ滴定され、そして追加の１２時間通常の培地中で培養させる。培養はその後、製造業者が勧める通り、May-Grunwald及びGiemsa溶液（MERCK）を付加することにより染色される。２以上の核を含む細胞は、合胞体として定義され得る。融合インデックスはその後（Ｎ−Ｓ）／Ｔのパーセンテージとして定義され、ここでＮは合胞体中の核の数であり、Ｓは合胞体の数であり、Ｔは数えられる核の総数である。
【０１１１】
ヘパシウイルス−様粒子
上記方法において、Ｅ１Ｅ２糖タンパク質の構造的修飾は、レトロウィルスコア上でそれらの適当な集成のために要求されない。本発明の方法は、このように機能的Ｅ１Ｅ２糖タンパク質を有する高い力価の感染性ヘパシウイルス シュード粒子、及び特にＨＣＶシュード粒子を生産することを可能にする。本明細書に記載の通り、これらの粒子はウィルス感染サイクルの早期のステップに関しては、ヘパシウイルスビリオン、及び特にＨＣＶビリオンの有効なモデルを構成する。しかしながら、本発明のシュード粒子の意図した使用に依存する突然変異体Ｅ１、Ｅ２又はｐ７タンパク質は、定義の欄で説明した制限をもって、ヘパシウイルス様粒子上に集成され得る。
【０１１２】
本発明は、更にレトロウィルス由来コアタンパク質、Ｅ１及び／又はＥ２ヘパシウイルス糖タンパク質、並びに任意にヘパシウイルスｐ７タンパク質を含むヘパシウイルス様感染性粒子に関する。かかる粒子は上記の通りの方法によって得ることができる。
【０１１３】
一つの態様によると、本発明の感染性粒子は、天然ヘパシウイルスＥ1タンパク質、又は天然ヘパシウイルスＥ２タンパク質、或いは天然ヘパシウイルスＥ1タンパク質及び天然ヘパシウイルスＥ２タンパク質を含んでよい。好適には、前記Ｅ１及びＥ２糖タンパク質はともに同一のヘパシウイルス株から由来する。他の態様によると、Ｅ１及び／又はＥ２糖タンパク質は突然変異される。
【０１１４】
他の態様によると、本発明の感染性粒子は、天然ヘパシウイルスＥ1及び天然ヘパシウイルスｐ７タンパク質、又は天然ヘパシウイルスＥ２及び天然ヘパシウイルスｐ７タンパク質、或いは天然ヘパシウイルスＥ1タンパク質、天然ヘパシウイルスＥ２タンパク質及び天然ヘパシウイルスｐ７タンパク質を含み、好適には、前記Ｅ１又はＥ２糖タンパク質及びｐ７タンパク質は、共に同一のヘパシウイルス株から由来する。更に好適には、前記Ｅ１及びＥ２糖タンパク質、並びにｐ７タンパク質は、同一のヘパシウイルス株から由来する。他の態様によると、Ｅ１及び／又はＥ２糖タンパク質並びに／或いは、ｐ７タンパク質は突然変異される。
【０１１５】
好適には、前記ヘパシウイルスは、Ｃ型肝炎ウィルスである。本発明はこのように、レトロウィルス由来のコアタンパク質、Ｅ１及び／又はＥ２ ＨＣＶ糖タンパク質、並びに任意にｐ７タンパク質を含むＨＣＶ様感染性粒子にも関する。かかる粒子は上記のような方法によって得ることができる。
【０１１６】
一つの態様によると、本発明の感染性粒子は、天然ＨＣＶ Ｅ１タンパク質、又は天然ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、或いは天然ＨＣＶ Ｅ１タンパク質及び天然ＨＣＶ Ｅ２タンパク質を含んでよい。好適には前記Ｅ１及びＥ２糖タンパク質は共に同一のＨＣＶ株から由来する。他の態様によると、Ｅ１及び／又はＥ２糖タンパク質は突然変異される。
【０１１７】
他の態様によると、本発明の感染性粒子は、天然ＨＣＶ Ｅ１及び天然ＨＣＶ ｐ７タンパク質、又は天然ＨＣＶ Ｅ２及び天然ＨＣＶ ｐ７タンパク質、或いは天然ＨＣＶ Ｅ１タンパク質、天然ＨＣＶ Ｅ２タンパク質及び天然ＨＣＶ ｐ７タンパク質を含んでよい。好適には、前記Ｅ１又はＥ２糖タンパク質及びｐ７タンパク質は共に同一のＨＣＶ株由来である。更に好適には、前記Ｅ１及びＥ２糖タンパク質、並びにｐ７タンパク質は同一のＨＣＶ株から由来する。他の態様によると、Ｅ１及び／又はＥ２糖タンパク質並びに／或いはｐ７タンパク質は突然変異される。
【０１１８】
上記態様において、突然変異したＥ２タンパク質は、好適にはＥ２タンパク質からＣ末端側を切断し、ここでＣ末端のＡｌａ残基（ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜１６の７４６アミノ酸）を欠失させた。
【０１１９】
他の好適な態様は、超可変領域Ｉ（Ｎ末端領域、即ち、シグナルペプチド後のＥ２タンパク質の最初の２７アミノ酸に位置する、即ち、ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜１６の３８４−４１０アミノ酸）を欠失させる。Ｅ２タンパク質をこの領域から欠失させることにより生産されるＨＣＶ−様粒子（ΔＨＶＲ１と呼ばれる）は、特に中和抗体の導入又は結合を増強させるための診断ツールとして又はワクチン接種において好都合である。当該ΔＨＶＲ１ ＨＣＶ-様粒子は、抗体の中和又は他の治療薬によって標的にされ／阻害されることができるＨＣＶ糖タンパク質の中において、エピトープ／メカニズムを同定することにも関与する。
【０１２０】
前記レトロウィルスはMLV、ALV、RSV、MPMV、HIV-1、HIV-2、SIV、EIAV、CAEV、及びHFVから成る群から選定され得る。
【０１２１】
前記感染性粒子が、更に導入遺伝子を運搬することが好都合である。例えば前記導入遺伝子は、本発明の感染性粒子による細胞感染の追跡を可能にするマーカー遺伝子に成ることができ、そして例えば、ヘパシウイルスの侵入、及び特にＨＣＶの侵入に関与する細胞受容体の同定のための応用を見出すことができる。前記導入遺伝子は、治療に関する分子をコードする遺伝子、及び／又は自殺遺伝子であってもよい。従って、特に主要な又は癌性の肝細胞を標的とする本発明の粒子は、遺伝子転移、及び／又は遺伝子治療のための有用なベクターを含む。
【０１２２】
本発明のヘパシウイルス様感染性粒子の使用
【０１２３】
ヘパシウイルス細胞受容体同定
これらの粒子の高い感染性は、細胞侵入におけるヘパシウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１及びＥ２糖タンパク質、並びにそれらの潜在的受容体の役割、ヘパシウイルス宿主範囲、そしてヘパシウイルス患者血清由来抗体による中和の調査を可能にする。これらの粒子は、Ｅ１Ｅ２突然変異体及び機能、ウィルス集成、発芽並びに放出におけるｐ７タンパク質の役割の調査を可能にする。
【０１２４】
本発明は、それゆえに上記の通り、ヘパシウイルスＥ１及び／又はＥ２糖タンパク質のための細胞受容体のex vivo同定のため、ヘパシウイルス様感染性粒子の使用に関する。
【０１２５】
一つの態様によると、本発明は細胞受容体への前記粒子の結合の検出を含むヘパシウイルスＥ１及び／又はＥ２糖タンパク質のための受容体のex vivoでの同定のための方法を提供する。より詳細には、本方法は以下から成るステップ：
−ヘパシウイルス感染性細胞の表面で発現する受容体へヘパシウイルス様感染性粒子の特異的結合を許容する十分な条件下において、本発明の前記ヘパシウイルス様感染性粒子と前記ヘパシウイルス感染性細胞を接触させ；
−受容体への前記粒子の結合を検出し；そして
−前記受容体を同定する、を含んでよい。
【０１２６】
好適には、前記ヘパシウイルスはＣ型肝炎ウィルスである。本発明はそれゆえに上記の通りex vivoでのＨＣＶ Ｅ１及び／又はＥ２糖タンパク質のための細胞受容体の同定のためＨＣＶ様感染性粒子の使用に関する。
【０１２７】
一つの態様によると、本発明は細胞受容体への前記粒子の結合の検出を含むex vivoでのＨＣＶ Ｅ１及び／又はＥ２糖タンパク質のための受容体の同定方法を提供する。より詳細には、当該方法は以下から成るステップ：
−ＨＣＶ感染性細胞の表面で発現する受容体へＨＣＶ様感染性粒子の特異的結合を許容する十分な条件下において、本発明の前記ＨＣＶ様感染性粒子と前記ＨＣＶ感染性細胞を接触させ；
−受容体への前記粒子の結合を検出し；そして
−前記受容体を同定する、を含んでよい。
【０１２８】
ヘパシウイルス感染性、そして特にＨＣＶ感染性細胞は、好適にはＨｕｈ−７ヒト肝細胞性癌腫（Nakabayashi等.,1982）、PLC/PRF/5ヒト肝癌（CRL-8024）、Hep３Bヒト肝細胞性癌腫（ATCC HB-8064）、又はHepG2ヒト肝細胞性癌腫（HB-8065）、及び主なヒト肝細胞のような肝細胞株から成る群から選定されてよい。主なヒト肝細胞は、当業界における当業者により周知な手段によって、ヒト成人生検サンプルから単離され得る。当業者は、例えばGuguen-Guillouzo及びGuillouzo（1986）を参照することができる。別の方法では、かかる細胞は商業的に入手でき、例えばBiopredic International(Rennes,仏)から購入できる。
【０１２９】
受容体に結合した粒子の検出は、当業界における当業者にとって周知な古典的手段によって達成され得る。例えば、これは本発明の粒子の放射活性、酵素又は蛍光ラベル、及び適切な方法による後の検出を含むことができる。蛍光材料の多くは公知であり、そしてラベルとして用いることができる。これらは、例えばフルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッドを含む。酵素ラベルは関連分子、例えばポリペプチド、への酵素の結合にあり、そして任意の比色定量、分光光度、又は蛍光分光光度技術により検出され得る。フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）と本発明のシュード粒子に担持されるＥ１又はＥ２タンパク質に対しラベルされた抗体も適切である。
【０１３０】
他の態様によると、本発明はヘパシウイルスのための細胞受容体をex vivoで同定する方法を提供し、当該発明は以下から成るステップ：
−ヘパシウイルス感染を許容しない細胞に、ヘパシウイルスの受容体になるようなタンパク質をコードする核酸配列をトランスフェクトし；
−前記形質転換した細胞と本発明のヘパシウイルス様粒子を接触させ；
−前記形質転換した細胞がヘパシウイルス感染を許容するに至ったか否かを決定し；そして、
−形質転換され感染を許容するに至った細胞により発現する前記タンパク質をヘパシウイルスの細胞受容体として同定する、を含んで成る。
【０１３１】
好適には、本発明はＨＣＶのための細胞受容体をex vivoで同定する方法を提供し、当該方法は以下から成るステップ：
−ＨＣＶ感染を許容しない細胞に、ＨＣＶの受容体になるようなタンパク質をコードする核酸配列をトランスフェクトし；
−前記形質転換した細胞と本発明のＨＣＶ様粒子を接触させ；
−前記形質転換した細胞がＨＣＶ感染を許容するに至ったか否かを決定し；そして、
−形質転換され感染を許容するに至った細胞により発現する前記タンパク質をＨＣＶの細胞受容体として同定する、を含んで成る。
【０１３２】
形質転換した細胞がヘパシウイルス感染、及び特にＨＣＶ感染を許容するに至ったか否かを決定することは、本発明のヘパシウイルス様（ＨＣＶ様）粒子を用いて容易に達成され得る。特に、ここで前記粒子は、ＧＦＰのようなマーカー遺伝子を運搬し、許容性（即ちヘパシウイルスにより又はヘパシウイルス様粒子により、特にＨＣＶ粒子又はＨＣＶ様粒子により感染する細胞の受容能）は、形質転換した細胞のＦＡＣＳ分析により評価され得る。マーカー遺伝子である抗体耐性遺伝子があるところにおける、ヘパシウイルス様（ＨＣＶ様）粒子により感染した細胞の同定は、前記抗体の暴露を通して容易に達成される。
【０１３３】
所定のタンパク質が細胞中へのヘパシウイルス侵入のための受容体でないと思われる場合、上記方法はＨＣＶのようなヘパシウイルスのための細胞受容体のスクリーニング及び同定のために都合よく適用できる。特に発現ｃＤＮＡライブラリー（例えば、ヘパシウイルス感染、特にＨＣＶ感染に許容的である細胞からの細胞性ｍＲＮＡの逆転写により得られたｃＤＮＡライブラリー由来）を調製することができる。かかるｃＤＮＡライブラリーの発現は、その核酸配列が適したベクター中のｃＤＮＡライブラリーへ融合された本質的なプロモーターにより制御されるだろう。かかるライブラリーは、ヘパシウイルス、例えばＨＣＶの細胞受容体をコードするベクターを含むであろう。非許容性細胞は、その後本発現ライブラリーによりトランスフェクトすることができ、更にヘパシウイルスの細胞受容体の同定のためにスクリーニングすることができる。
【０１３４】
従って、本発明はヘパシウイルスのための細胞受容体をex vivoで同定するための方法を提案し、当該方法は以下から成るステップ：
−ヘパシウイルス感染を許容する細胞から得られた発現ｃＤＮＡライブラリーを提供し；
−前記発現ｃＤＮＡライブラリーによりヘパシウイルス感染を許容しない細胞をトランスフェクトし；
−前記形質転換した細胞と本発明のヘパシウイルス様粒子を接触させ；
−ヘパシウイルス感染を許容するに至ったそれらの形質転換した細胞を同定及び単離し；
−許容性に至った細胞中でトランスフェクトした発現ベクターを単離し；そして
−前記単離した発現ベクターのｃＤＮＡ配列によりコードされるヘパシウイルスタンパク質をヘパシウイルスの受容体として同定する、を含んで成る。
【０１３５】
好適には、前記ヘパシウイルスはＣ型肝炎ウィルスである。本発明はこのようにしてＨＣＶのための細胞受容体をex vivoで同定する方法を提案し、当該方法は以下から成るステップ：
−ＨＣＶ感染を許容する細胞から得られた発現ｃＤＮＡライブラリーを提供し；
−前記発現ｃＤＮＡライブラリーによりＨＣＶ感染を許容しない細胞をトランスフェクトし；
−前記形質転換した細胞と本発明のＨＣＶ様粒子を接触させ；
−ＨＣＶ感染を許容するに至ったそれらの形質転換した細胞を同定及び単離し；
−許容性に至った細胞中でトランスフェクトされた発現ベクターを単離し；そして
−前記単離した発現ベクターのｃＤＮＡ配列によりコードされたタンパク質をＨＣＶの受容体として同定する、を含んで成る。
【０１３６】
形質転換した細胞がヘパシウイルス（ＨＣＶ）感染を許容するに至ったかどうかの決定は、本発明のヘパシウイルス様（ＨＣＶ様）粒子を用いて容易に達成され得る。ここで前記粒子は、ＧＦＰのようなマーカー遺伝子を運搬し、許容性（即ちヘパシウイルスにより及び特にヘパシウイルス様粒子により、例えばＨＣＶにより又はＨＣＶ様粒子により感染する細胞の受容能）は、形質転換した細胞のＦＡＣＳ分析により評価され得る。マーカー遺伝子である抗体耐性遺伝子があるところにおける、ヘパシウイルス様粒子、特にＨＣＶ様粒子により感染した細胞の同定は、前記抗体の暴露を通して容易に達成させる。
【０１３７】
好都合には、発現ｃＤＮＡライブラリーは、ヘパシウイルス（ＨＣＶ）非感染性細胞の感染を許容する糖タンパク質を含むレトロウィルスベクターから発現される。かかる糖タンパク質は、その受容体がex vivoにおいて大部分の細胞中で発現するタイプである水泡性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）由来ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質であってよい。かかるウィルス粒子は、発現ｃＤＮＡライブラリー、及び任意にマーカー遺伝子を含むパッケージング能力を有する相補性レトロウィルス由来ゲノムを用いて集成することができる。本態様によれば、本発明のヘパシウイルス様（ＨＣＶ様）粒子による感染を許容するに至った細胞中に発現した発現ベクターを単離するための方法は、大いに容易となる。確かにこの後者の態様は、細胞トランスフェクションと比較すると、より有効性を持つレトロウィルスベクターによる細胞感染の過程において、特に好都合である。更に、細胞感染は、注目のｃＤＮＡの回収及び単離を大いに促進する細胞性ゲノム中のウィルスゲノムの安定した融合を導く。従って、本発明のシュード粒子により運搬される導入遺伝子、即ちｃＤＮＡ及びマーカー遺伝子は、感染細胞によって安定的に発現されることを見出した。トランスフェクションに用いられる古典的なベクターと対比すると、細胞性ゲノム中で融合されず、及びその発現は一過性のものとなるであろう。
【０１３８】
ヘパシウイルス感染に干渉する作用物質の同定
他の観点では、本発明は、細胞中に侵入するヘパシウイルス、及び特にＨＣＶに干渉することができる分子の同定のための、上記定義のような感染性粒子の使用に関する。
【０１３９】
特に本明細書において、候補分子の存在下又は不存在下における本発明の粒子による細胞感染のレベルの比較を含め、細胞中に侵入するヘパシウイルスに干渉することができる分子のex vivoでのスクリーニング又は同定の方法を提供する。前記方法は、好適には以下から成るステップ：
−任意の候補分子の不存在下においてヘパシウイルス様粒子による細胞感染を許容する条件下で、候補分子の存在下又は不存在下において、ヘパシウイルス感染性細胞とヘパシウイルス様感染性粒子を接触させ；
−前記候補分子の不存在下において、及び存在下において細胞感染性を評価し；
−前記候補分子の存在下において測定した細胞感染性と任意の候補分子の不存在下において測定した細胞感染性を比較し；
−任意の候補分子の不存在下において測定された細胞感染性と比較して、前記分子の存在下で測定された細胞感染性を減少させた候補分子をヘパシウイルス侵入に干渉することを可能にする分子として同定する、を含んで成る。
【０１４０】
ヘパシウイルス感染性細胞と、ヘパシウイルス様感染性粒子、及び候補分子を接触させることは、前記細胞、ヘパシウイルス様粒子及び候補分子を同時に接触させることにより実行することができる。別のやり方では、それらの３つの要素の内の２つが、３つ目の欠損した要素を付加する前に、それらの相互作用を許容するに十分な条件下で接触させることができる。
【０１４１】
細胞感染性は当業界における当業者により容易に評価されることができる。当業者は、ヘパシウイルス様感染性粒子が、細胞感染を検出するため検出可能なマーカー遺伝子を運搬するという態様を利用することができる。好適な態様では、マーカー遺伝子はＧＦＰのような蛍光マーカー遺伝子であり、そして感染は蛍光測定、例えば前記感染性粒子と接触させた細胞のフローサイトメトリー分析によって検出される。
【０１４２】
ヘパシウイルス細胞侵入に干渉する分子の同定方法において使用される、適した細胞は、上記の通り肝細胞株、及び主要なヒト肝細胞から成る群から選定され得る。
【０１４３】
好適には前記ヘパシウイルスはＣ型肝炎ウィルスである。本発明はこのようにして候補分子の存在下又は不存在下における本発明の粒子による細胞感染のレベルの比較を含めて、ＨＣＶ細胞侵入に干渉することができる分子のex vivoでのスクリーニング又は同定の方法を更に提供する。前記方法は、好適には以下から成るステップ：
−任意の候補分子の不存在下においてＨＣＶ様粒子による細胞感染を許容する条件下で候補分子の存在下又は不存在下において、ＨＣＶ感染性細胞とＨＣＶ様感染性粒子を接触させ；
−前記候補分子の不存在下において、及び存在下において細胞感染性を評価し；
−前記候補分子の存在下において測定した細胞感染性と任意の候補分子の不存在下において測定した細胞感染性を比較し；
−任意の候補分子の不存在下において測定された細胞感染性と比較して、前記分子の存在下で測定された細胞感染性を減少させた候補分子をＨＣＶ侵入に干渉することを可能にする分子として同定する、を含んで成る。
【０１４４】
ＨＣＶ感染性細胞と、ＨＣＶ様感染性粒子、及び候補分子を接触させることは、前記細胞、ＨＣＶ様粒子及び候補分子を同時に接触させることにより実行することができる。別のやり方では、それらの３つの要素の内の２つが、３つ目の欠損した要素を付加する前に、それらの相互作用を許容するに十分な条件下で接触させることができる。
【０１４５】
細胞感染性は当業界における当業者により容易に評価されることができる。当業者は、ＨＣＶ様感染性粒子が、細胞感染を検出するため検出可能なマーカー遺伝子を運搬するという態様を利用することができる。好適な態様では、マーカー遺伝子はＧＦＰのような蛍光マーカー遺伝子であり、そして感染は蛍光測定、例えば前記感染性粒子と接触させた細胞のフローサイトメトリー分析によって検出される。
【０１４６】
ＨＣＶ細胞侵入に干渉する分子の同定方法において使用される、適した細胞は、上記の通り肝細胞株、及び主要なヒト肝細胞から成る群から選定され得る。
【０１４７】
ヘパシウイルスによる、及び特にＨＣＶによる、細胞侵入に干渉することができるかかる分子は、新規の抗ウィルス剤を構成するであろう。
【０１４８】
ヘパシウイルス感染診断
本発明の感染性粒子は、更にヘパシウイルス感染の診断、及びヘパシウイルス感染の追跡、例えば患者の治療効果を評価するために有用である。
【０１４９】
本発明はこのようにヘパシウイルスにより感染しやすい対象由来の生物学的サンプル中におけるヘパシウイルスに対するin vitroでの抗体検出のためのヘパシウイルス様感染性粒子の使用に関する。前記生物学的サンプルは、血液、又は血清のような生物学的流動体、或いは組織生検であってよい。特定の態様では、前記抗体はＥ１及び／又はＥ２ヘパシウイルス糖タンパク質に対するものである。
【０１５０】
従って本発明は、患者におけるヘパシウイルス感染のin vitroでの診断方法を提供し、当該方法は患者の生物学的サンプル中に存在するような抗ヘパシウイルス抗体と本発明のヘパシウイルス様粒子との相互作用により形成される免疫複合体を検出することを含んで成る。前記方法は特に以下から成るステップ：
−生物学的サンプル中に存在するヘパシウイルスに対する抗体に前記感染性粒子が結合することにより、複合体のフォーメーションを許容するに十分な条件下において、生物学的サンプルと本発明のヘパシウイルス様感染性粒子を接触させ；
−ヘパシウイルス感染を示す存在である前記複合体を検出する、を含んで成る。
【０１５１】
ヘパシウイルス様粒子と反応的である抗体の存在は、イムノアッセイ、例えば競合、直接的反応、又はサンドウィッチタイプアッセイを含む標準的な電気泳動及び免疫診断の技術を用いて検出することができる。かかるアッセイは、制限されずに、ウェスタンブロット；凝集反応検査；ＥＬＩＳＡｓのような酵素ラベルされた及び酵素媒介されたイムノアッセイ；ビオチン／アビジンタイプアッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動法；免疫沈降法、等を含む。反応は一般的に蛍光、化学発光、放射活性、酵素的ラベルもしくは染色分子のような提示ラベル、又は他のヘパシウイルス様粒子及び抗体の複合体のフォーメーション、もしくはそれらと反応する抗体を検出するための他の方法を含む。
【０１５２】
他の態様では、患者におけるヘパシウイルス感染の前記in vitroにおける診断の方法は、本発明のヘパシウイルス様粒子による許容性細胞への感染に対する、患者の生物学的サンプル中に存在していると思われる抗−ヘパシウイルス抗体の阻害的効果を検出することを含む。前記方法は特に以下から成るステップ：
−ヘパシウイルス感染を許容する細胞とヘパシウイルス様粒子及び生物学的サンプルを接触させ；
−前記生物学的サンプルの存在下で測定した細胞感染性と、前記生物学的サンプルの不存在下で測定した細胞感染性を比較し；
−前記生物学的サンプルの不存在下で測定した細胞感染性と比較して、前記生物学的サンプルの存在下で測定した細胞感染性の減少として、感染許容細胞へのヘパシウイルス様粒子感染の阻害を検出し、前記阻害はヘパシウイルス感染の指標となる、を含んで成る。
【０１５３】
本態様は、細胞感染を中和する特異的な抗体（即ち、これらの患者の抗体はウィルス血症に対して効果的である）の検出に頼る方法において都合がよい。
【０１５４】
本発明の更なる態様では、ヘパシウイルス粒子及びヘパシウイルスにより感染されやすい対象由来の生物学的サンプル中のヘパシウイルスに対する抗体によって形成される免疫複合体の存在下又は不存在下において検出することによる、或いは抗ヘパシウイルス（患者の生物学的サンプル中に存在すると思われる中和抗体）によって許容細胞のヘパシウイルス様粒子感染の阻害を検出することによる、商業的な診断キットは、上記診断方法を実行するために有用である。かかるキットは少なくとも本発明のヘパシウイルス様粒子を含んでよい。免疫複合体の検出に関与する方法であるところの、当該キットは、更に前記免疫複合体の適切な検出手段を含む。好適には、本発明の当該キットは、更に選択された方法、例えば“競合的”、“サンドウィッチ”、及びそれらと類似した方法、に依存した指示、及びプロトコールを含む。当該キットは緩衝剤、安定化剤等、のような核とはならない試薬を含んでもよい。
【０１５５】
好適には前記ヘパシウイルスはＣ型肝炎ウィルスである。本発明の感染性粒子は、更にＨＣＶ感染の診断、及びＨＣＶ感染の追跡、例えば患者の治療の有効性評価のために有用である。
【０１５６】
本発明は、このようにしてＨＣＶにより感染しやすい対象由来の生物学的サンプルにおけるＨＣＶに対する抗体のin vitro検出のためのＨＣＶ様感染性粒子の使用に関する。前記生物学的サンプルは、血液又は血清、或いは組織生検のような生物学的流体物であってよい。特定の態様では前記抗体はＥ１及び／又はＥ２ ＨＣＶ糖タンパク質に対する抗体である。
【０１５７】
従って、本発明は患者のＨＣＶ感染のin vitroにおける診断方法を提供し、当該方法は患者の生物学的サンプル中に存在すると思われる抗−ＨＣＶ抗体と本発明のＨＣＶ様粒子との相互作用により形成される免疫複合体を検出することを含んで成る。前記方法は特に以下から成るステップ：
−生物学的サンプル中で存在するＨＣＶに対する抗体への前記感染性粒子の結合により、免疫複合体の形成を許容するに十分な条件下において、生物学的サンプルと本発明のＨＣＶ様感染性粒子を接触させ；
−ＨＣＶ感染を提示する存在である前記複合体を検出する、を含んでよい。
【０１５８】
ＨＣＶ様粒子と反応する抗体の存在は、上記の通り、競合、直接反応、又はサンドウィッチタイプアッセイのようなイムノアッセイを含む標準の電気泳動及び免疫診断技術を用いて検出することができる。
【０１５９】
反応は一般的に蛍光、化学発光、放射活性、酵素ラベルもしくは染色分子のような提示ラベル、又は他のＨＣＶ様粒子及び抗体の複合体のフォーメーション、或いはそれらと反応する抗体を検出するための他の方法を含む。
【０１６０】
他の態様では、患者のＨＣＶ感染の前記in vitro診断方法は、本発明のＨＣＶ様粒子により感染を許容する細胞上で、患者の生物学的サンプル中に存在していると思われる抗−ＨＣＶ抗体の阻害的効果を検出することを含む。前記方法は特に以下から成るステップ：
−ＨＣＶ感染を許容する細胞とＨＣＶ様粒子及び生物学的サンプルを接触させ；
−前記生物学的サンプルの存在下で測定した細胞感染性と、前記生物学的サンプルの不存在下で測定した細胞感染性を比較し；
−前記生物学的サンプルの不存在下で測定した細胞感染性と比較して、前記生物学的サンプルの存在下で測定した細胞感染性の減少として、感染許容細胞へのＨＣＶ様粒子感染の阻害を検出し、前記阻害はヘパシウイルス感染の指標となる、を含んで成る。
【０１６１】
本態様は、細胞感染を中和する特異的な抗体（即ち、これらの患者の抗体はウィルス血症に対して効果的である）の検出に頼る方法の中で都合がよい。
【０１６２】
本発明の更なる態様では、ＨＣＶ粒子及びＨＣＶにより感染されやすい対象由来の生物学的サンプル中のＨＣＶに対する抗体によって形成される免疫複合体の存在下又は不存在下において検出することによる、或いは抗ＨＣＶ（患者の生物学的サンプル中に存在すると思われる中和抗体）によって許容細胞のＨＣＶ様粒子感染の阻害を検出することによる、商業的な診断キットは、上記診断方法を実行するために有用である。かかるキットは少なくとも本発明のＨＣＶ様粒子を含んでよい。免疫複合体の検出に関与する方法であるところの、当該キットは、おそらく更に前記免疫複合体の適切な検出手段を含む。好適には、本発明の当該キットは、更に選択された方法、例えば“競合的”、“サンドウィッチ”、及びそれらと類似した方法、に依存した指示、及びプロトコールを含む。当該キットは緩衝剤、安定化剤等、のような核とはならない試薬を含んでもよい。
【０１６３】
ヘパシウイルス感染に対するワクチン接種
本発明の他の観点では、ヘパシウイルス様感染性粒子はワクチン接種の目的のために用いることができる。
【０１６４】
一つの態様によると、本発明はこのようにしてワクチン接種の方法を提案し、特にヘパシウイルス感染に対して、それらを必要とする対象へのヘパシウイルス様粒子の投与を含む。本発明はヘパシウイルス様粒子及び医薬的に許容され得る担体を含むワクチン組成物にも関する。本発明は、更に本明細書において開示した医薬的に許容され得る担体、ヘパシウイルス様粒子の中に含まれる免疫原性組成物を提供する。
【０１６５】
本発明のワクチン及び免疫原性組成物は、ヘパシウイルスに対する免疫性を与え、又は免疫応答の誘引を引き出すことができる。
【０１６６】
しかしながら、本発明のヘパシウイルス様粒子は、更にヘパシウイルス抗原とは異なる他の抗原をコードする追加の遺伝子を運搬し、本発明は前記抗原に対する免疫応答を高めるために有用である組換えウィルス性ワクチンを提供する。実際に本明細書において記載されたシュード粒子の使用は、いくつかの抗原の提示とプロセシング経路との組み合わせを通して、免疫応答の誘引を改善させることができる。例えば、本発明のワクチン組成物は、投与された時、ヘパシウイルス様粒子が感染した宿主細胞をもたらす。抗原をコードした導入遺伝子は、その後細胞性ゲノム中で融合し、続けて細胞で発現するので、ワクチン組成物により誘引される細胞性及び体液性の両免疫応答が存在する。
【０１６７】
好都合には、ヘパシウイルス様粒子は、更に上昇した免疫反応の増強を可能にする免疫分子をコードする導入遺伝子を運搬することができる。
【０１６８】
好適には、前記ヘパシウイルスはＣ型肝炎ウィルスである。本発明はこのようにしてワクチン接種の方法を提案し、特にＨＣＶ感染に対して、それらを必要とする対象へのＨＣＶ様粒子の投与を含む。本発明はＨＣＶ様粒子及び医薬的に許容され得る担体を含むワクチン組成物にも関する。本発明は、更に医薬的に許容され得る担体、本明細書中において開示されたＨＣＶ様粒子の中に含まれる免疫原性組成物を提供する。
【０１６９】
本発明のワクチン及び免疫原性組成物は、ＨＣＶに対する免疫性を与え、又は免疫応答の誘引を引き出すことができる。
【０１７０】
しかしながら、本発明のＨＣＶ様粒子は、更にＨＣＶ抗原とは異なる他の抗原をコードする追加の遺伝子を運搬し、本発明は前記抗原に対する免疫応答を高めるために有用である組換えウィルス性ワクチンを提供する。実際に本明細書において記載されたシュード粒子の使用は、いくつかの抗原の提示とプロセシング経路との組み合わせを通して、免疫応答の誘引を改善させることができる。例えば、本発明のワクチン組成物は、投与された時、ＨＣＶ様粒子が感染した宿主細胞をもたらす。抗原をコードした導入遺伝子は、その後細胞性ゲノム中で融和し、続けて細胞で発現するので、ワクチン組成物により誘引される細胞性及び体液性の両免疫応答が存在する。
【０１７１】
好都合には、ＨＣＶ様粒子は、更に上昇した免疫反応の増強を可能にする免疫分子をコードする導入遺伝子を運搬することができる。
【０１７２】
本発明のワクチン接種又は免疫原性組成物は、更にアジュバントを含んでよい。多くの数のアジュバントが当業界における当業者に公知である。安定したアジュバントの例は、例えば水酸化アルミニウム；サポニン；Tween80のような界面活性剤；動物性、鉱物性、又はベジタブルオイル，Corynebacterium又はPropionibacterium由来のアジュバント；Mycobacterium bovis(Bacillus calmette 及びGuerinn,又はBCG)；サイトカイン；カルボマーのようなアクリル酸ポリマー；ＥＭＡ；又はそれらの組み合わせを含む。
【０１７３】
投与経路はワクチン分野において用いられる任意の慣用的な経路である。一般的な手引きとして、本発明のワクチン組成物は、例えば眼、鼻、肺、口、腸、直腸、膣、及び尿路表面のような粘膜表面；又は例えば静脈内、皮下、腹膜内、皮膚内、表皮内、又は筋肉内経路のような非経口経路を経由して投与される。投与経路の選択は選定される製剤に依存する。
【０１７４】
遺伝子転移及び／又は治療のためのベクター
更に本発明の粒子の他の態様では、遺伝子転移及び／又は治療のためのベクターとして使用し得る。遺伝子治療はいずれかのその表現型又は遺伝子型の変化のため、細胞中への遺伝材料の導入として定義されている。主要な、又は癌性のいずれかの肝細胞へのそれらの向性のため、ヘパシウイルス様粒子、特に本明細書において開示されるＨＣＶ様粒子は特異的な肝細胞への効率的な遺伝子デリバリーシステムを含む。更にかかるデリバリーシステムは感染の大きな力価を再生産的に生み出すため、複製欠陥的なヘパシウイルス様粒子、特にＨＣＶ様粒子のスケールアップを可能にする。
【０１７５】
従って、本発明は細胞中に注目の導入遺伝子を転移するin vivo又はin vitroでの方法に関し、当該方法は本発明のヘパシウイルス様粒子により感染した細胞を含み、ここで当該粒子は注目の導入遺伝子を運搬する。
【０１７６】
本発明は更に本発明のヘパシウイルス様粒子の使用に関し、当該粒子は患者の疾患の予防又は治療のための医薬の調製のため、注目の導入遺伝子を運搬し、ここでヘパシウイルス様粒子は患者の細胞中へ注目の導入遺伝子を転移することを可能にし、そして疾患に対する予防又は治療効果を有す産物をコードする。
【０１７７】
好ましくは、前記ヘパシウイルスはＣ型肝炎ウィルスである。本発明はこのように細胞中へ注目の導入遺伝子を転移するin vivo又はin vitroのための方法を提案し、当該方法は本発明のＨＣＶ様粒子により細胞を感染させることを含み、ここで当該粒子は注目の導入遺伝子を運搬する。
【０１７８】
本発明は更に本発明のＨＣＶ様粒子の使用に関し、それは患者の疾患の予防又は治療のための医薬の調製のため、注目の導入遺伝子を運搬し、ここでＨＣＶ様粒子は患者の細胞中へ注目の導入遺伝子を転移することを可能にし、そして疾患に対する予防又は治療効果を有す産物をコードする。
【０１７９】
好適には、標的にされる細胞は肝細胞である。
【０１８０】
本発明は以下の実施例及び添付の図面を考慮して更に理解されるであろう。
【実施例１】
【０１８１】
ＨＣＶシュード粒子（ＨＣＶｐｐ）の生産
ＨＣＶシュード粒子（ＨＣＶｐｐ）を、ネズミ白血病ウィルス（ＭＬＶ）由来のレトロウィルスコアタンパク質上へ、全長、非修飾Ｅ１糖タンパク質及びＣ末端的に切断したＥ２タンパク質（Ｃ末端Ａｌａ７４６残基の欠失、ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜１６）のフォームを集成することにより生産した。機能的ＨＣＶｐｐがトランス中で発現したＥ１及びＥ２により、又は２つの糖タンパク質の１つのみにより生産することができるかどうかの更なる調査では、Ｅ１又はＥ２糖タンパク質のいずれかを個々にコードした発現ベクターをデザインした。
【０１８２】
ウィルス構成要素をコードした発現ベクターの構造、即ち、Ｅ１、Ｅ２又はＥ１Ｅ２糖タンパク質及びウィルスコアタンパク質。
野生型Ｅ１Ｅ２ポリタンパク質を発現するプラスミドを、標準的な方法により構築した（Sambrook 等.,1989）。
【０１８３】
簡潔には、１ａタイプＨＣＶ由来Ｅ１及びＥ２糖タンパク質をコードするｐｈＣＭＶ−７ａ発現ベクターは、BamH1消化、及びKlenow平滑末端化ベクターｐｈＣＭＶ−Ｇ（Negre等.,2000）の中に、ＨＣＶコア（Ｃ）の最後の６０残基、並びにｐＴＭ１ｐ５Ｅ１Ｅ２（７４５）ベクター（Op De Beeck等.,2000）由来のＥ１及びＥ２タンパク質全体をコードする平滑末端化ClaＩ及びStuＩ制限フラグメントを挿入することによって作製した。
【０１８４】
ＨＣＶ Ｅ１糖タンパク質のみ発現するｐＨＣＭＶ−Ｅ１発現ベクターは、プライマー5’-actggacgacgcaaagctgc(ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜２）及び5’-cgcggatcctacgcgtcgacgccggc aaa(ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜３）を有するＥ１のＣ末端へ停止コドンを付加することによりｐｈＣＭＶ−７ａから得られた。得られたＰＣＲフラグメントは、BamH1により消化させ、そして消化したBamH1をｐｈＣＭＶ−７ａへと結合させた。
【０１８５】
ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質のみ発現するｐＨＣＭＶ−Ｅ２は、２つのＰＣＲフラグメント（5’-tgcccgcttcagccgaaacccacgtcaccggggga(ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜４）＋5’-gccagaagtcagatgctcaagg(ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜５)及び5’-tactctgagtccaaaccg(ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜６)＋5’-gtgacgtgggtttcggctgaagcgggcacagtcag(ＳＥＱ ＩＤ  Ｎ゜７)の２つのプライマー対により生産される)を用いて、Ｅ２のＮ末端をＨＣＶコアのＣ末端へ融合することにより得た。当該２つのＰＣＲフラグメントはその後ＰＣＲの第二ラウンドで融合した。得られたＤＮＡフラグメントはBamH1により消化され、そしてBamH1が切断したｐｈＣＭＶ−７ａへと結合した。
【０１８６】
ｐｈＣＭＶ−ΔＣ Ｅ１ベクターの配列は、ＳＥＱ ＩＤ  Ｎｏ８中に見られ、一方、Ｅ１タンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ  Ｎｏ９中に見られる。ｐｈＣＭＶ−ΔＣ Ｅ１Ｅ２ベクターの配列はＳＥＱ ＩＤ  Ｎｏ１０中に見られ、一方、Ｅ１Ｅ２ポリタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ  Ｎｏ１１中に見られる。ｐｈＣＭＶ−ΔＣ Ｅ２ベクターの配列はＳＥＱ ＩＤ  Ｎｏ１２中に見られるが、一方Ｅ２タンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ  Ｎｏ１３中に見られる。
【０１８７】
１ｂ遺伝子型のＥ１Ｅ２糖タンパク質のための発現ベクターを、類似の戦略により構築した。
【０１８８】
従って、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２は、Ｅ１、Ｅ２又はＥ１及びＥ２糖タンパク質のためのシグナルペプチドとして働くコア（ΔＣ）タンパク質のカルボキシ末端を含むポリタンパク質から発現した。
【０１８９】
ＨＣＶシュード粒子の生産
レトロウィルスはＨＣＶｐｐの集成のためのプラットホームとして選定される。なぜならそれらのコアは多種多様な細胞及びウィルスの糖タンパク質を組み込むことができるからであり、並びにそれらは容易に宿主細胞ＤＮＡ中にパッケージすることができ、及び一般的なマーカー遺伝子を融合させることができるからである。
【０１９０】
ＨＣＶｐｐを、ΔＣＥ１Ｅ２、ΔＣＥ１又はΔＣＥ２ポリタンパク質、ＭＬＶコアタンパク質、及びＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）マーカー遺伝子を担持するパッケージング競合ＭＬＶ由来ゲノムをコードする３つの発現ベクターにより、２９３Ｔヒト胚腎細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）をトランスフェクトすることにより生産した。この構造体はその発現がＣＭＶ（サイトメガロウィルス）の迅速で早期のプロモーターにより制御されるＧＦＴマーカー遺伝子を含む。ＭＬＶ由来のレトロウィルス性ベクター(ここにおけるgag,pol,及びenvウィルス遺伝子は除去され、ここにおけるレトロウィルス性シス作用要素はベクターゲノムパッケージング、逆転写及び融合を制御する)、中に挿入されたＣＭＶ及びＧＦＰの両核酸配列を保持した。
【０１９１】
コントロールシュード粒子を、ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質（Negre等.,2000）、ＲＤ１１４ウィルスエンベロープ糖タンパク質（Sandrin等.,2002）、及び／又は集成欠陥ＭＬＶコアタンパク質（ＭＬＶ−Ｇ２Ａ）（Swanstrom等.,1997）により生産した。
【０１９２】
簡潔には、２．５×１０6個の２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした発現構成物を、製造業者の勧めに従ったリン酸カルシウムトランスフェクションプロトコール（Clontech、仏）を用いて、１０ｃｍプレート中に前日に播種した。培地（８ｍＬ／プレート）をトランスフェクション後１６時間で置き換えた。シュード粒子を含む上清液を２４時間後に採取し、０．４５μｍ−孔−サイズの膜に通してろ過し、そして以前発表された通り処理した（Negre等.,2000）。
【０１９３】
シュード粒子の構成成分のイムノブロット分析
トランスフェクトされた細胞及び２０％スクロース−クッションを通してペレット化したシュード粒子の溶解産物をイムノブロットした。ＨＣＶ−１ａ遺伝子型由来のＥ１及びＥ２糖タンパク質、及びＭＬＶコアタンパク質の発現は、以前に発表されたように（Sandrin等.,2002）、Ｅ１（Ａ４）（Dubuisson等.,1994）及びＥ２（Ｈ５２）（Flint等.,1999）に対するモノクローナル抗体、或いは抗−キャプシド（ＭＬＶ ＣＡ）抗血清（ViroMed Biosafety Laboratories,米）による還元及び変性条件中で現れた。コントロールシュード粒子中で発現したＶＳＶ−Ｇを、モノクローナル抗体Ｐ５Ｄ４（シグマ−アルドリッチ，仏）により検出した。
【０１９４】
トランスフェクトされた細胞のイムノブロット分析では、シュード粒子の構成成分を予想される分子量；即ち、Ｅ１を３０ｋＤａ、Ｅ２を６０ｋＤａ、ＶＳＶ−Ｇを６０ｋＤａ、及びＲＤ１１４糖タンパク質を７０ｋＤａ、で容易に検出した。ＭＬＶコアタンパク質は、成熟コア成分中への、ＭＬＶプロテアーゼにより部分的に処理された６５ｋＤａのGagタンパク質前駆体として検出した。
【０１９５】
Ｅ１及びＥ２糖タンパク質を、ウィルス集成欠陥ＭＬＶ−Ｇ２Ａ突然変異体によるものでない野生型ＭＬＶコア粒子により産出した精製ビリオンのペレット中で容易に検出した。Ｅ２は、ゴルジ酵素による結合グリカンの修飾のために、細胞結合フォームよりややゆっくり移動したウィルスペレットの中で存在する。
【０１９６】
ＭＬＶ−Ｇ２Ａ集成欠陥コアタンパク質により生産されウィルスペレット中のＶＳＶ−Ｇの存在は、ＶＳＶ−Ｇそれ自体により形成される空の小胞のためである（Negre等.,2000）。
【０１９７】
前駆細胞溶解産物とウィルスペレットにおけるＶＳＶ−Ｇ又はＨＣＶ糖タンパク質の相関性レベルの比較は、ウィルス性粒子中へのＥ１及びＥ２の効果的な組み込みを示唆する。同様に、Ｅ１及びＥ２糖タンパク質は、ＨＩＶ−１から由来するレトロウィルス性コアタンパク質上へ効果的に集成でき、ＨＣＶ及びＨＩＶを有する患者の共感染として知られている、２つの親ウィルス間のin vivoでの病原相互作用の可能性を高めることができた（Dieterich,2002）。
【０１９８】
それにもかかわらず、これらの結果は、レトロウィルスコアにより生産されるシュード粒子中へＨＣＶ糖タンパク質の特異的及び効果的な導入を導く２９３Ｔ細胞中のＥ１及びＥ２の一時的な過剰発現を示す。ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質はＥＲ（Op De Beeck等.2001）中で保持されることが示されたから、ＥＲ腔中へ発芽することにより形成するＨＣＶｐｐを保持し、或いは、ＥＲ保持の飽和／漏洩がＭＬＶ発芽を正常に起こす（Swanstrom及びwills,1997）細胞表面に達するため、Ｅ１Ｅ２のフラクションを許容する。
【０１９９】
異なる発現ユニット由来のトランスにおけるＥ１及びＥ２の個々の発現又は共発現は、一つのＥ１Ｅ２ポリタンパク質由来の、シスにおける両糖タンパク質の発現と比較し、通常レベルの合成へと導く。更に、たとえＥ１とシス又はトランスとの関係で単独で、又は共発現したとしても、ＨＣＶｐｐに類似のレベルのＥ２糖タンパク質が導入されたことを見出した。最後に、Ｅ２とトランスとの関係で単独で又は共発現するＥ１の導入は、わずかなレベルでしか起きず、Ｅ２のシャペロン活性と一致する（Op De Beeck等.,2001）。Ｅ１又はＥ２のみを運搬するＨＣＶｐｐの形成はＨＣＶの細胞侵入及び感染性におけるそれらの個々の役割の調査を許容するであろう。
【実施例２】
【０２００】
ＨＣＶｐｐ細胞株感染性
ＨＣＶｐｐの感染性は、：Ｈｕｈ−７ヒト肝細胞性癌（Nakabayashi等.,1982）、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５ヒト肝癌（ＣＲＬ−８０２４）、Ｈｅｐ３Ｂヒト肝細胞性癌（ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６４）、ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞性癌（ＨＢ−８０６５）、Ａ４３１ヒトエピデルモイド癌（ＣＲＬ−１５５５）、Caco−２ヒト結腸腺癌（ＨＴＢ−３７）、ＨＣＴ １１６ヒト結腸直腸腺癌（ＣＣＬ−２４７）、ＨＯＳヒト骨肉種（ＣＲＬ−１５４３）、ＨＴ−１０８０ヒト繊維肉腫（ＣＣＬ−１２１）、ＨＴ−２９ヒト結腸直腸腺癌（ＨＴＢ−３８）、ＬｏＶｏヒト結腸直腸腺癌（ＣＣＬ−２２９）、ＭＣＦ−７ヒト乳腺癌（ＨＴＢ−２２）、２９３Ｔ、ＴＥ６７１ヒト横紋筋肉腫（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８８０５）、Ｕ１１８ヒトグリア芽細胞種（ＨＴＢ−１５）、JurkatヒトＴ細胞白血病（ＴＩＢ−１５２）、ＣＥＭヒトリンパ芽球白血病（ＣＣＬ−１１９）、Ｍｏｌｔ−４ヒトリンパ芽球白血病（ＣＲＬ−１５８２）、Raji Burkitt’sリンパ腫（ＣＣＬ−８６）、ＣＭＭＴアカゲザル哺乳動物性癌（ＣＲＬ−６２９９）、ＣＯＳ−７アフリカ緑サル繊維芽細胞腎（ＣＲＬ−１６５１）、ＶＥＲＯアフリカ緑サル腎（ＣＣＬ−８１）、ＰＧ−４ネコのアストロサイト（ＣＲＬ−２０３２）、ＢＨＫ−２１ゴールデンハムスター腎（ＣＣＬ−１０）、ＣＨＯチャイニーズハムスター卵巣（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、ＢＲＬ ３Ａラット肝細胞（ＣＲＬ−１４４２）、ＮＩＨ３Ｔ３マウス繊維芽細胞（ＣＲＬ−１６５８）及びＱＴ６ウズラ繊維肉腫（ＣＲＬ−１７０８）の標的細胞株のパネル上で評価された。標的細胞はＡＴＣＣ（American Type Culture Collection, Rockville,MD,米）が推奨するように育成した。
【０２０１】
標的細胞（前日に８×１０4細胞／１２ウェルプレートに播種した）を、ＨＣＶｐｐを含む生産細胞由来の上清液の希釈物と共に３時間培養し、その後洗浄し、そして７２時間後ＦＡＣＳ分析で集成したビリオンが担持するＧＦＰマーカー遺伝子発現まで培養した（Sandrin等.,2002）。ＨＶＰｐｐは複製欠陥性ウィルス成分により作製されるので、本手順は感染過程の１ラウンド後のシュード粒子の特異的な感染性の評価を可能にする。
【０２０２】
ＨＣＶｐｐの１．１×１０5ＴＵ／ｍＬまでの感染力性価をＨｕｈ−７ヒト肝癌細胞上で検出した（図１）。超遠心分離による生産細胞の上清液濃度（Sandrin等.,2002）において、平均２×１０6の感染性力価を容易に得ることができた。感染アッセイにおいて用いられた他の標的細胞タイプでは、ＨＣＶｐｐによる感染レベルがより弱く（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、Ｃａｃｏ−２、ＨＴ１０８０、ＨＴ−２９、ＬｏＶｏ、ＭＣＦ−７、Ｕ１１８，２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ）又は検出さない（Ａ４３１，ＨＣＴ １１６、ＨＯＳ、ＴＥ６７１、Ｊｕｒｋａｔ，Ｍｏｌｔ−４、ＣＥＭ、Ｒａｊｉ、ＣＭＭＴ、Ｃｏｓ−７、ＢＨＫ−２１、ＣＨＯ、ＰＧ−４，ＢＲＬ ３Ａ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＱＴ６）ことが示された。コントロールシュード粒子による感染性は、標的細胞（全てのこれらの細胞がコントロールシュード粒子により容易に感染したことを示す）のタイプに依存して７×１０6から２×１０7ＴＵ／ｍＬの範囲で、ＶＳＶ−Ｇにより発生した。これは以前の細胞タイプのみの中で明確に発現したＨＣＶ侵入のために必要な全ての分子を示唆した。
【０２０３】
感染性ＨＣＶｐｐは、ＨＣＶ遺伝子型１ａ及び１ｂから由来するＥ１Ｅ２糖タンパク質（レーンｈ及びｉ；図２）、並びに／或いはＨＩＶ−１又はＭＬＶのいずれから由来するレトロウィルスコアタンパク質（レーンｄ及びｈ；図２）と同等の効率で引き起こすことができる。
【０２０４】
ＡＺＴと共にＨＣＶｐｐ及び標的細胞を培養したところ、融合能プロウィルス性ＤＮＡのような、ＨＣＶｐｐのレトロウィルス性ＲＮＡゲノムの転換を妨げる逆転写酵素阻害剤は、形質導入を阻害した（レーンｊ；図２）。
【０２０５】
更に、ＧＦＰの長期発現は、１月以上の感染細胞の連続的な経過を経て、証明することができた。
【０２０６】
これらの結果は宿主細胞ＤＮＡ中での融合を導く標的細胞の感染、及びＨＣＶｐｐにより導入されたＧＦＰマーカー遺伝子の安定した発現を示した。更に、Ｅ１及びＥ２両糖タンパク質、又はコアタンパク質を欠いたウィルス粒子により、或いはＭＬＶ−Ｇ２Ａ集成−欠損コアタンパク質を用いた場合得ることができた感染はなかった（レーンａ−ｃ；図２）。
【０２０７】
本発明者等は、肝細胞感染が遺伝子型２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ａ及び４ｂのＥ１並びにＥ２糖タンパク質を担持するＨＣＶｐｐにより達成され得ることを更に証明した。
【０２０８】
完全にこれらの結果は、任意の遺伝子型のＥ１及びＥ２糖タンパク質及びレトロウィルスコアタンパク質を担持するＨＣＶｐｐが感染性であり、それらのベクターゲノムをレトロウィルス媒介融合へ導くことを支援する。
【０２０９】
最終的に、Ｅ１導入のレベルを減少させるにもかかわらず、別個のベクターからトランスにおいて発現するＥ１及びＥ２糖タンパク質を有す生産されたＨＣＶｐｐは、Ｅ１Ｅ２ポリタンパク質構成物を有す生産されたＨＣＶｐｐとほぼ同じ感染性であった（レーンｇ及びｈ；図２）。しかしながら、Ｅ１又はＥ２糖タンパク質のいずれにより集成したＨＣＶｐｐは５００倍低い感染性しかなく（レーンｅ−ｆ；図２）、両糖タンパク質が効率のよいウィルス侵入及び感染を許容するためにＨＣＶｐｐ上に共導入されることが必要であることを証明する。
【実施例３】
【０２１０】
ＨＣＶｐｐ主要肝細胞感染性
肝細胞はin vivoにおける主要なＨＣＶ複製サイトを表し、更にex vivoにおける研究では、ＨＣＶがリンパ球細胞にも感染し得ることが示唆された（Lindenbach及びRice,2001）。いずれかの細胞タイプに感染することができるかどうかを確認するため、ヒト成人肝細胞（図３）及び抹消血単核球（ＰＢＭＣｓ）に形質導入した。シュード粒子は、増殖していない標的細胞の形質導入を許さないＭＬＶ由来よりもむしろＨＩＶ−１由来のコアタンパク質により生産した（Nerge等.,2000）。
【０２１１】
ＨＢＶ、ＨＣＶ及びＨＩＶが存在しないことが確認されたヒト成人生検サンプルから単離した冷凍保存された主要肝細胞は、Biopredic International(Rennes,仏)から購入し、業者が薦める方法によってコラーゲンＩで覆われたプレート上で培養した。肝細胞の形質導入はＵＶマイクロスコープの下でＧＦＰ−陽性細胞を数えることによって測定した。感染の特殊性は、糖タンパク質を欠いたシュード粒子（ｐｐコア）により標的細胞が感染した際の形質導入の不存在により、又は標的細胞を感染前にＪＳ−８１抗−ＣＤ８１抗体（３０μｇ／ｍＬ）により前培養した際の形質導入のレベル減少により証明された。健常ドナーから単離したヒトＰＢＭＣｓの感染は、以前に発表された通りに処理された（Sandrin等.,2002）。
【０２１２】
Ｈｕｈ−７細胞の感染に関連して、ＨＣＶｐｐは異なるドナー由来の主要な肝細胞を容易に感染させることができ（図３）、更に形質導入の効果は、個々の生検の生存に適した質及び細胞培養により変動した。対照的に、ＨＶＰｐｐによるＰＢＭＣｓの感染は殆どないか又は検出不可能であることを見出したが、ＶＳＶ−Ｇにより生産されたコントロールシュード粒子はそれらの主要な細胞に容易に感染することができた。
【０２１３】
これらのデータは、ＨＣＶｐｐの緊密に類似した向性、及び野生型のＨＣＶによりより早期に感染が起こり、並びに肝細胞及び肝性癌細胞へ優先的に感染することを完全に示す。
【実施例４】
【０２１４】
ＨＣＶｐｐはＨＣＶ感染の早期ステップの有効なモデルである。
ＨＣＶｐｐの感染性はＥ１及びＥ２糖タンパク質により仲介される。
ＨＣＶｐｐの感染性がＥ１及びＥ２により特異的に仲介されるかどうか、そして細胞表面受容体とのそれらの相互作用の有無を更に測定した。ＨＣＶ−１ａ糖タンパク質に対し特異的に反応することが以前に示されたモノクローナル抗体のパネル（Dubuisson等.,1994;Flint等.,1999；Patel等.,2000）を使用した。
【０２１５】
ＨＣＶ−１ａＥ１Ｅ２により、及びＭＬＶコアタンパク質により生産されるＨＣＶｐｐを、遺伝子型１ａのＥ１（Ａ４）又はＥ２（Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ４４、Ｈ４８、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ６０及びＨ６１）糖タンパク質に対するモノクローナル抗体の飽和濃度（２０μｇ／ｍｌ）により、或いは貯蔵された抗体（Ｈｍｉｘ）により、Ｈｕｈ−７細胞の感染前に前培養した。コントロール実験では、抗体を使用せず、又はＶＳＶ−Ｇ（ＶＳＶ−Ｇｐｐ）により生産したシュード粒子を使用して実施した。
【０２１６】
それらのＨ３５及びＨ４８のようなモノクローナル抗体のいくつかは、例えば、遺伝子型１ａのＨＣＶｐｐを中和し、そして７０％までそれらの感染性を減少させることができた（図４）。不完全な中和は、細胞内のＥ１Ｅ２複合体へ結合するために開発され、選定されたそれらのモノクローナル抗体がＥ２の翻訳後修飾を受けやすいことを示した（Flint M.等.,2000）事実によるのであろう。確かに、その細胞内の対応部分との比較では、糖修飾が起こったことが見出されたＨＣＶｐｐに関連するＥ２は、細胞分泌経路を通して外へ運ばれるという結果に最もなりそうである。
【０２１７】
対照的に、それらの遺伝子型１ａ−特異的抗体は、遺伝子型１ｂのＨＣＶｐｐ、又はＶＳＶ−Ｇにより生産したコントロールシュード粒子を中和できるものはない（図４）。これらのコントロールシュード粒子の感染性の中和は、ＶＳＶ−Ｇ中和４１Ａ.モノクローナル抗体を用いることにより達成した。
【０２１８】
従ってこれらのデータは、シュード粒子の感染性が特にＥ１及びＥ２糖タンパク質導入によるものであること、これらのＨＣＶｐｐがＨＣＶ感染の早期ステップ、即ち、受容体結合、膜融合及びエンベロープ非被覆、を調査するための有効なモデルを表すことを示すこと、を証明した。
【０２１９】
ＨＣＶ感染はＨＣＶ感染患者由来の血清により中和される。
ＨＣＶｐｐの感染性を中和するための慢性ＨＣＶ感染患者由来の血清の能力を更に評価した。
【０２２０】
遺伝子型１ａ又は１ｂのＨＣＶｐｐを、Ｈｕｈ−７標的細胞への感染前に１／５０に希釈した慢性ＨＣＶ感染患者由来血清と一緒に３０分間室温で前培養した。コントロール実験は、ヒト補体への感度を示すＶＳＶ−Ｇ（Sandrin等.,2002）よりもむしろ、ＲＤ１１４糖タンパク質（ＲＤ１１４ｐｐ）により生産したシュード粒子を用いて実施した。能率のよいコントロールシュード粒子の中和は、ＲＤ１１４ ＳＵ糖タンパク質に対し上昇した高い免疫性のヤギ血清を用いて証明した（ViroMed Biosafety Laboratories,米）。
【０２２１】
コントロールシュード粒子の全くない中和、もしくは弱い中和は、ＨＣＶ感染患者の血清を用いることにより検出することができた。対照的に、健常ドナー由来血清と比較してそれらの血清の全てがＨＣＶｐｐの感染性を中和できるのではないとしても、大抵はＨＣＶｐｐの感染性を中和できる。様々なレベルでの中和はドナーに依存し、並びに１ａ及び１ｂの両遺伝子型のＨＣＶｐｐの阻害を２０％から９０％までの範囲で検出した。１ｂ遺伝子型のＨＣＶによる感染患者由来の血清は、類似の効率で遺伝子型１ａ又は１ｂのＥ１Ｅ２により生産したＨＣＶｐｐを中和することができた（図５）。
【実施例５】
【０２２２】
ＨＣＶシュード粒子による細胞侵入受容体の使用。
共にテトラスパニン受容体ファミリーのメンバーであるＬＤＬ受容体（ＬＤＬｒ）及びＣＤ８１は、ＨＣＶ受容体と推定されることが発表された（Pileri等.,1998；Agnello等.,1999）。しかしながら、最近の研究ではＨＣＶ粒子及び／又は糖タンパク質とのそれらの明白な結合能があるにもかかわらず、細胞侵入受容体としてのそれらの分子の役割を問いかけた（2023）。このようにして、ＨＣＶ細胞侵入の早期段階におけるいずれの細胞表面分子の貢献は、受容体−競合アッセイを実施することにより調査された。
【０２２３】
更に最近では、セロトニン性組織中で発現したＳＲ−Ｂ１ヒトスカベンジャー受容体クラスＢタイプＩが、その他の推定されるＨＣＶ受容体であるとして意見が出された（Scarselli,Ansuini等.2002）。このようにして、ＨＣＶ細胞侵入の早期段階におけるＳＲ−Ｂ１の貢献を、このＨＣＶ受容体候補物質を発現するために設計された非−許容性標的細胞における感染アッセイを実施することにより調査した。
【０２２４】
ＬＤＬｒ
ＬＤＬｒはＬＤＬ中のアポリポタンパク質Ｂ並びにＶＬＤＬ複合体中のアポリポタンパク質Ｂ及びＥ（ＡｐｏＢ及びＡｐｏＥ）と結合し；両複合体は感染患者の血漿中のＨＣＶ粒子と関連することが見出された（Andre等.,2002）。
【０２２５】
ＬＤＬ受容体競合アッセイは、シュード粒子感染前に前培養された精製したＬＤＬｓ（１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ；シグマ−アルドリッチ、仏）、或いはモノクローナル抗体５Ｅ１１（１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ）、４Ｇ３（抗−ＡｐｏＢ；１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ）又は１Ｂ７（抗−ＡｐｏＥ；１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ）（Ottawa Heart Institute Research corporation, Ottawa, Ontario, カナダ）もしくは混合された５Ｅ１１、４Ｇ３及び１Ｂ７抗体（それぞれの濃度は１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ）を用いて実施した。
【０２２６】
精製したＬＤＬｓでは、１００μｇ／ｍｌより高い濃度で使用した場合でさえ、Ｈｕｈ−７ＬＤＬｒ−陽性細胞上のＨＣＶｐｐの外部競合感染が見出されなかった。モノクローナル抗体が、ＨＣＶｐｐにより前培養されたＡｐｏＢ及びＡｐｏＥの受容体結合サイトを標的にした場合、抗−ＡｐｏＥ抗体のみがＨＣＶｐｐの感染性をたとえ弱くとも、阻害することができた。これは、ＨＣＶｐｐが、ＨｅｐＧ２、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＥＭ、Ｍｏｌｔ−４、Ｒａｊｉ及びＴＥ６７１のようなＬＤＬｒ−陽性細胞株に感染できないか、もしくは殆ど感染できないかである、という我々の観察と一致する（図１）。従って、これらの結果はＨＣＶ侵入におけるＬＤＬｒの役割を排除しないが、ひょっとしたらＨＣＶ粒子によるＬＤＬｓとの関連によって（Andre等.,2002）、それらはＬＤＬｒがＨＣＶｐｐ侵入の主要な受容体でないことを示唆する。
【０２２７】
ＣＤ８１
ＨＣＶ Ｅ２への結合を見せたヒトＣＤ８１の大きな細胞外ループ（ＬＥＬ）を取り囲む組換えＧＳＴ−融合ポリペプチドは（Flint等.,1999,Pileri等.,1998）、その後ＨＣＶｐｐ細胞侵入におけるｈＣＤ８１の役割を調査するために用いた。
【０２２８】
ｈＣＤ８１−ＬＥＬ ＧＳＴ−融合ポリペプチド（４μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ）を感染前にシュード粒子と共に前培養し、又はＪＳ−８１抗−ＣＤ８１抗体（４μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ；Pharmingen,仏）を感染前に標的細胞と共に前培養した。阻害剤の不存在下において得られた力価と相関するＨｕｈ−７細胞上で得られた感染性力価の阻害パーセンテージを計算した。コントロール実験はＶＳＶ−Ｇにより生産されたシュード粒子（ＶＳＶ−Ｇｐｐ）を用いて実施した。ＨＣＶｐｐ及びＶＳＶ−Ｇにより生産したコントロールシュード粒子を感染させたＮＩＨ３Ｔ３，ＮＩＨ３Ｔ３−ｈＣＤ８１及びＨｕｈ−７細胞で、比較実験を更に実施した。
【０２２９】
ＨＣＶｐｐにより前培養されたＧＳＴ融合ｈＣＤ８１−ＬＥＬポリペプチドは、Ｅ１Ｅ２複合体を特異的に引き起こし、Ｅ２糖タンパク質へのそれらの結合能を確認し（Flint等.,1999；Pileri等.,1998）、及びＨｕｈ−７細胞上のＨＣＶｐｐの感染性を中和し、更に比較的効率が良くないことを見出した。阻害は、３８％から５４％の感染性阻害の範囲にあり、用量依存性であるようだ。
【０２３０】
Ｈｕｈ−７細胞とｈＣＤ８１へのＥ２組換え体（Flient等.,1999）の結合を遮断するＪＳ−８１モノクローナル抗体の前培養は、一貫して、Ｈｕｈ−７標的細胞及びヒト主要肝細胞の両方においてＨＣＶｐｐの感染性を阻害することを見出した。高濃度抗体では（３０μｇ／ｍｌ）、９０％を超えた感染の阻害は、遺伝子型１ａと遺伝子型１ｂに基づくＨＣＶｐｐに得ることができた。しかしながら、ＨＣＶｐｐによる感染を許容しない、ＴＥ６７１、Jurkat、ＣＥＭ、Ｍｏｌｔ−４及びＲａｊｉ細胞のような、いくつかの標的細胞では（図１）、ｈＣＤ８１（ＣＤ８１発現及び感染性の間の相関不足を示す）の高密度の発現を見出した。
【０２３１】
更に、非許容性ＮＩＨ３Ｔ３マウス繊維化細胞の発現は、ＨＣＶｐｐによる感染を許容しない（図４Ｃ）。
【０２３２】
これらの結果は、ｈＣＤ８１がＨＣＶ Ｅ２に結合し、及びＨＣＶの細胞表面結合を助けることができるが、それ自体ではＨＣＶｐｐによる感染を許容するに十分ではないことを完全に証明した。
【０２３３】
ＳＲ−Ｂ１
ＣＬＡ−１としても公知である（ＣＤ３６及びＬＩＭＰＩＩアナログ１）（Calvo及びVega 1993;Webb等.,1998）ＳＲ―Ｂ１をコードしたｃＤＮＡを、ＭＬＶレトロウィスル性ベクター中に導入し、そしてベクター粒子をＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質により生産し、そしてシュードタイプ化した。それらはＣＨＯ及び３Ｔ３細胞を形質導入するために使用し、図１に示されるようにＨＣＶｐｐ感染に非許容性である。これらの形質導入細胞におけるＳＲ−Ｂ１の発現を、ＳＲ−Ｂ１表皮ドメインに対する抗体を用いたＦＡＣＳ分析により確認した。
【０２３４】
ＳＲ−Ｂ１形質導入細胞は及び親細胞は、ＨＣＶｐｐを用いた感染アッセイのための標的細胞として使用した。Ｈｕｈ細胞はコントロール許容性標的細胞として使用した。
【０２３５】
対照的にＨｕｈ−７細胞は、ＳＲ−Ｂ１形質導入細胞又は親ＣＨＯもしくは３Ｔ３細胞のいずれもＨＣＶｐｐにより感染することができない。これらのデータはＥ２を結合するＳＲ−Ｂ１（Scarselli等.,2002）であってもＨＣＶｐｐの細胞中への侵入を許容するに十分ではないことを示す。
【０２３６】
従って、ｈＬＤＬＲ及びｈＣＤ８１のためとして、ＳＲ−Ｂ１単独発現の発現は、感染のための細胞許容性に変えるに十分でない。
【０２３７】
ＨＣＶｐｐ感染を許容する全ての分子を共発現することが必要とされるＨＣＶ標的細胞、ＣＨＯ及び２９３標的細胞が、それぞれにＳＲ−Ｂ１発現を有さないか、又は低いＳＲ−Ｂ１発現を有すか、そしてＨＣＶｐｐによる感染の許容性は共にないか（Bartosch等.,2003a及びｂ）、の可能性を確認するためにそれぞれにヒトＣＤ８１及びＳＲ−Ｂ１を運搬する２つのＶＳＶ−Ｇ−シュードタイプのレトロウィルスベクターにより共感染させた。いずれの細胞タイプ上の両細胞表面分子の共発現を形質導入した２日後ＦＡＣＳ分析により証明した。
【０２３８】
ＣＤ８１及びＳＲ−Ｂ１共発現ＣＨＯ又は２９３細胞は、その後ＨＣＶｐｐを用いた感染アッセイのための標的細胞として使用した。同類の親ＣＨＯ細胞及びＣＤ８１又はＳＲ−Ｂ１発現レトロウィルス性ベクターのいずれかによって個々に形質導入された同一の細胞は、感染性の不存在という結果となった。親２９３細胞及びＣＨＯ−ＣＤ８１／ＳＲ−Ｂ１細胞との対比では、ＳＲ−Ｂ１−形質導入された２９３細胞は感染の許容性が見出だされ、ＣＤ８１及びＳＲ−Ｂ１の共発現がヒト細胞中における感染のために要求されることが示された。
【０２３９】
ＨｅｐＧ２ヒト肝性癌細胞がＨＣＶｐｐによる感染に非許容性であるため、本発明者等は更にそれらの非許容性がＣＤ８１及びＳＲ−Ｂ１の両方の共発現の不足のせいであると考えた。実際にＨｅｐＧ２細胞は、ＣＤ８１発現を不足させず、ＳＲ−Ｂ１を発現した。
【０２４０】
従って、ＨｅｐＧ２細胞をＶＳＶ−Ｇによりシュードタイプ化したＣＤ８１を運搬するＭＬＶレトロウィルスベクターにより形質導入した。ＣＤ８１発現は、形質導入２日後、ＦＡＣＳ分析により証明され、及びＣＤ８１を形質導入したＨｅｐＧ２細胞はその後ＨＣＶｐｐを用いた感染アッセイのための標的細胞として使用した。
【０２４１】
親ＨｅｐＧ２細胞と比較して、ＨＣＶｐｐによるより弱い感染があり、これらの細胞内におけるＣＤ８１の外部発現はＨＣＶｐｐの高い感染性をもたらし、同様にＨｕｈ−７細胞中で観察された。
【実施例６】
【０２４２】
超可変領域Ｉの欠失
ＨＣＶ感染は８０％を超える患者により明確にされず、慢性化は肝疾患の様々なフォームに関連する。慢性感染は、宿主免疫応答を免れるためのウィルスを助けるＨＣＶの高い突然変異率により引き起こされると想定される。ＨＣＶゲノム中における注目されるいくつかの突然変異の一つは、Ｅ２糖タンパク質のＮ末端に集中した。これはいわゆる超可変領域Ｉと呼ばれ、in vivoにおける主要Ｂ細胞のエピトープ及び中和抗体の標的である。実際にＨＣＶｐｐは、マウスモノクローナル抗体により、又はＨＶＲ１に対し上昇するウサギ高免疫性血清（Bartosch等.,2003ｂ）により、非常に効率よく中和させることができる。しかしながら、かかる抗体は相同配列に高特異的であり、そしてウィルスの軽度に分散したＨＶＲ１変異体、及びΔＨＶＲ１ ＨＣＶｐｐを中和しない（Bartosch等.,2003b）。従って、その変わりやすさから、ＨＶＲ１は宿主の免疫応答を免れるＨＣＶを許容する重要な役割を果たすと想定される。ＨＶＲ１のアレルギーのバリエーションは、異種のＨＣＶ株／遺伝子型による再感染に対する保護的免疫応答の発達を阻害することもできる。最終的に抗原的優性及びＨＶＲ１の過度の変わりやすさは、ＨＣＶに対するワクチン開発を遅らせることになる。有効な治療（そのターゲットはＨＣＶ糖タンパク質の部分をより保つ）を開発するための長期の目的により、本発明者等はＨＶＲ１が感染に必要でないか否かを調査した。
【０２４３】
野生型Ｅ１Ｅ２又は突然変異体バージョンのポリタンパク質をコードする発現構成体を目的とするため、ＨＶＲ１＝Ｅ２の最初の２７残基を生産したポリタンパク質から欠失させた。ＨＣＶシュード粒子（ＨＣＶｐｐ）を野生型又はΔＨＶＲ１ ΔＣＥ１Ｅ２のポリタンパク質のいずれかにより生産した。野生型及び突然変異体Ｅ２タンパク質の両方を示したトランスフェクトされた細胞のイムノブロット分析では、同一のレベルで発現した。ウィルス性粒子をトランスフェクトされた細胞の上清液から採取し、高密度スクロースクッションを通して超遠心分離により精製した。ΔＨＶＲ１及び野生型Ｅ２を同一レベルの粒子中へ組み入れた（図７）。野生型及び突然変異体ＨＣＶｐｐの感染性はＨｕｈ−７標的細胞上より前に検査した。２．６×１０5ＴＵ／ｍｌまでの感染性力価を野生型ＨＣＶｐｐのために検出した（図８）。ΔＨＶＲ１ ＨＣＶｐｐは約５から１０倍低い感染性であり、更に５．１×１０4ＴＵ／ｍｌの最大力価は、ＳＲ−Ｂ１受容体への相互作用を経由して、感染過程を補助するＨＶＲ１を示唆することを観察した（Scarselli等.,2002：Bartosch等.,2003b）。
【０２４４】
ΔＨＶＲ１ ＨＣＶｐｐは、中和をより保持するエピトープに対する抗体を誘導するだけでなく、中和を検出するためのツールとしてのエピトープは、ＨＣＶ感染により誘導される体液性応答のターゲットでもある。体液性応答は、少数のＨＣＶ感染患者由来、及び実験的に予防接種されたチンパンジー由来の血清中で特徴付けられた（Bartosch等.,2003C）。慢性感染由来抗体の中和は、相同及び異種の遺伝子型１a ppに対し比較的高く滴定し、そして通常、常にではなく、異なる亜型遺伝子のシュードタイプ化ウィルスを交差中和した。本願において検査された起源血清が、ＨＣＶエンベロープタンパク質のＨＶＲ１領域の外部エピトープにより反応するかどうかの決定は、血清のパネルをΔＨＶＲ１ ＨＣＶｐｐに対して１：５０の希釈物で検査した。親のＨＣＶｐｐを中和した血清の全ては、ΔＨＶＲ１ ＨＣＶｐｐも中和した。従って、患者及びチンパンジー由来の中和抗体は、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質中のどこか他のところにある１以上の追加のエピトープと反応したＨＣＶにより持続的に感染した。かかる慢性的に感染した患者から調製された免疫グロブリンの観察と一致する、抗−ＨＣＶ抗体を中和させる慢性的に感染したチンパンジー及びヒト、並びに幅広く交差感染性である本抗体の観察では、ＨＣＶ感染に対し保護することができる。抗体に基づきＨＣＶに対する受動的免疫予防及び能動的免疫予防の開発戦略の実行可能性を再考するため、並びに慢性ＨＣＶ感染のコントロールにおける体液性及び細胞性免疫に関連する重要性を再評価するために重要な含意を有する。
【実施例７】
【０２４５】
ＨＣＶｐｐ及び細胞−細胞融合アッセイ。
細胞−細胞融合アッセイは、Ｅ１Ｅ２−トランスフェクトされた２９３Ｔ（ドナー）細胞と標的（エフェクター）細胞の共培養によりデザインした。当該エフェクター細胞は肝性癌細胞、又はコントロールとして、２９３Ｔ細胞であった。
【０２４６】
エンベロープ糖タンパク質を発現している構造体によりトランスフェクトされた形質転換細胞を、同一の濃度で、６つのウェルプレート中で（３×１０5細胞／ウェル）分離し、数え、そして再接種した。新鮮な標的宿主細胞（ウェル当たり、１×１０6細胞）をその後トランスフェクトされた細胞上に付加し、そして２４時間共培養した。
【０２４７】
共培養は、ｐＨ５に緩衝されたＤＭＥＭにより置き換えた培養培地により、５分間、酸性ｐＨ滴下し、そしてその後正常（中性のｐＨ培地）により置き換えた酸性培地を５分間培養し、そして培養を、合胞体をスコアリングすることによって評価される細胞−細胞融合になるまで、１２時間成長させた。
【０２４８】
培養はその後、製造業者が勧める通り、May-Grunwald及びGiemsa水溶液（ＭＥＲＣＫ）を付加することにより染色した。２以上の核を含む細胞は合胞体として定義され得る。融合インデックスは、その後（Ｎ−Ｓ）／Ｔのパーセンテージとして定義され、ここでＮは合胞体中の核の数、Ｓは合胞体の数、そしてＴは数えられた核の総数である。
【０２４９】
合胞体のスコアリングの結果は表１に示す。
【表１】
0004634152.tif 000002
【０２５０】
コントロール両方向性ネズミ白血病性ウィルス（ＭＬＶ−Ａ）ｐＨ非依存性糖タンパク質の発現は、これらの実験条件において合胞体をもたらさなかった。しかしながら、広い合胞体のフォーメーションは細胞質への尾を短くすることによるＭＬＶ−Ａ糖タンパク質の突然変異体フォーム（ＭＬＶ−Ａ−Ｒｌｅｓｓ）を用いた時、検出された。
【０２５１】
ｐＨ依存性トリ伝染病ウィルス血球凝集素（ＦＰＶ−ＨＡ）の発現は、共培養が５分間、ｐＨ５で培養された時にのみ、合胞体フォーメーションをもたらした。
【０２５２】
ＶＳＶのｐＨ依存性Ｇ糖タンパク質の発現は、中性ｐＨでの小さな合胞体フォーメーション、及び酸性ｐＨでの広い合胞体フォーメーションをもたらした。
【０２５３】
ＨＣＶ Ｅ１又はＨＣＶ Ｅ２単独の発現が、いずれかの実験条件下において合胞体をもたらさなかったが、Ｈｕｈ−７細胞と共に共培養させた２９３Ｔ細胞中におけるＥ１及びＥ２の両方の共発現は、合胞体のフォーメーションを誘導するに十分であった。これは、かかる実験的条件下において、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２が適切なＨＣＶ受容体を発現する細胞を融合することができることを示す。
【０２５４】
更に、これらの結果は、多くのレトロウィルス性糖タンパク質（例えば、ＭＬＶ−Ａ）と似ていないが、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２のfusogenicityが、酸性ｐＨにより引き起こされるインフルエンザウィルス血球凝集素（例えば、ＦＰＶ−ＨＡ）又はＶＳＶ−Ｇと似ていることを示す。これらの発見は、エンドソームの酸性化の阻害剤へのＨＣＶシュード粒子の感受性により確認される（表２）。
【表２】
0004634152.tif 000003
【０２５５】
1ＧＦＰ−運搬シュード粒子は、バフィロマイシンＡが記載された濃度で存在する中において、Ｈｕｈ−７細胞を感染させるために用いた記載された糖タンパク質により生産した。阻害剤を３時間後に除去し、感染性を３日後にＦＡＣＳ分析により測定した。
【０２５６】
2バフィロマイシンＡの記載された濃度での感染の結果は、阻害剤の不存在下において測定された感染性のパーセンテージとして表す。
【０２５７】
このように、本新規細胞−細胞ＨＣＶ融合アッセイは、ＨＣＶ結合を阻害することができる分子のスクリーニングのため、そして膜融合による細胞侵入のために高い価値がある。
【実施例８】
【０２５８】
ＨＣＶｐ７の存在下におけるＨＣＶシュード粒子の集成及び感染性の増加。
【０２５９】
ＨＣＶエンベロープタンパク質のコンホメーションの変化に影響を与えるであろうｐ７タンパク質は、細胞結合及びＨＣＶビリオンの侵入におそらく重要であるだろう。従って、ｐ７タンパク質の更なる情報を得るため、Ｅ１Ｅ２ｐ７ポリタンパク質を発現する発現構造体を作製した。
【０２６０】
ＨＣＶ１ａタンパク質デルタコア、Ｅ１、Ｅ２及びｐ７を発現する、ｐｈＣＭＶ−ΔＣＥ１Ｅ２ｐ７（ｐｈＣＭＶ７ａ ｐ７−１）発現ベクターは、ＨＣＶ遺伝子型１ａのＥ１、Ｅ２及びｐ７を含むプラスミドｐＴＭ１ｐ５Ｅ１Ｅ２ｐ７由来のデザインされたフラグメントStu 1, Bcl 1を用いて構成した（Fournillier-Jacob等,1996；Cocquerel等,2000）。本フラグメントを、Bcl lによるBsu36 l消化、平滑末端化及びサブ配列消化の後に、以前に発表されたプラスミドphCMV-7a中に結合させた。phCMV-ΔCE1E2ベクターの配列は、ＳＥＱ ＩＤ  Ｎｏ１４に見られ、一方ΔＣＥ１Ｅ２ポリタンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ  Ｎｏ１５に見られる。
【０２６１】
ｐ７（ＨＣＶ−ｐ７ｐｐ）により生産されたＨＣＶシュード粒子の感染性をＨＣＶｐｐと比較した。ＨＣＶシュード粒子の集成の間中のｐ７の発現は、１０倍までに増加した力価をもたらした。同様にｐ７発現により仲介された感染性力価の増加は、ＨＣＶ遺伝子型１ａ及び１ｂ由来のＥ１Ｅ２糖タンパク質により集成したＨＣＶｐｐを得た。
【実施例９】
【０２６２】
成熟Ｅ２糖タンパク質のＣ末端アミノ酸残基の欠失。
【０２６３】
ΔＣＥ１Ｅ２ポリタンパク質を発現するために用いられるＨＣＶポリタンパク質のフラグメントは、通常、総ＨＣＶポリタンパク質に相関して数えられる。１ａ株Ｈ ＨＣＶ遺伝子型のため（遺伝子バンクのアクセスナンバー：AF009606）、ΔＣはアミノ酸１３２−１９１（シグナルペプチド：アミノ酸１７１−１９１）、アミノ酸１９２−３８３によるＥ１、及びアミノ酸３８４−７４６によるＥ２（ＨＶＲ１：アミノ酸：３８４−４１０）により取り囲まれる。
【０２６４】
本発明者等は、感染性ＨＣＶシュード粒子を集成させるために要求される他の成分と共に、アミノ酸１３２から７４６の本全長ポリペプチド（ΔＣのアミノ末端を融合させた短い配列ＭＮＳを有し、及びそれはΔＣＥ１Ｅ２ポリペプチド遺伝子の翻訳開始サイトの近くにコードされる）を共発現させた。ＨＣＶシュード粒子はΔＣＥ１Ｅ２ポリタンパク質の短いバージョンにより、アミノ酸１３２−７４５（及びＭＮＳアミノ末端ペプチド）を集成させ、取り囲むこともできる。
【０２６５】
ＨＣＶシュード粒子の両タイプ、即ち、全長Ｅ１Ｅ２糖タンパク質（ＨＣＶｐｐ（７４６））を運搬するもの、及び７４６に位置する最後のアミノ酸を欠失させたＥ１Ｅ２糖タンパク質を運搬するもの、アラニン、（ＨＣＶｐｐ（７４５））は、糖タンパク質の正常レバルを含む。しかしながら、当該ＨＣＶｐｐ（７４５）シュード粒子は、ＨＣＶｐｐ（７４６）シュード粒子の１０−５０倍の感染性と一致する。従って、この感染性の改変は、感染アッセイ並びに中和化合物及び抗体のスクリーニングにおいて重要である。
【実施例１０】
【０２６６】
中和抗体を引き出すＨＣＶｐｐによるマウス免疫化。
【０２６７】
Balb/cマウス、生後４−５週間、４動物の群において、実施例６に記載の通り遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａのＥ１Ｅ２糖タンパク質、又はＨＣＶｐｐ ΔＨＶＲ１ ΔＣＥ１Ｅ２を担持する精製したＨＣＶｐｐ、或いはコントロールとして、ウィルスの表面糖タンパク質を欠いている、又はＲＤ１１４ネコ内因性ウィルス（Bartosch等.,2003a）由来の関連のない糖タンパク質を運搬するシュード粒子と一緒に腹腔内注射した。１ｅ９体内粒子とだいたい一致する精製された１ｅ６ＨＣＶｐｐをマウスごとに使用した。いずれのマウスも、同一の接種により２倍に増加した。採取した動物の血清及びそれらの中和活性を、ＨＣＶｐｐを用いた感染アッセイにおいて、以前に免疫処理した同一の動物から採取したコントロール血清と比較した。
【０２６８】
これらのコントロール血清でもコントロールシュード粒子により免疫処理された動物由来血清でも、ＨＣＶシュード粒子の異なるタイプの感染性を中和することができなかった。対照的に、ＨＣＶシュード粒子により免疫処理されたマウスの血清は、免疫化のために使用される適合したＨＣＶシュード粒子タイプ、及びＨＣＶシュード粒子の他のタイプの両方の感染性を効果的に中和することができた。これは、ＨＣＶｐｐとの培養の前に、ＨＣＶｐｐにより免疫処理されたマウスの血清が１／８０に希釈された時、９０％以上の感染性の阻害をもたらした。
【０２６９】
これらのデータは、ＨＣＶシュード粒子が中和抗体、及び交差中和抗体のフォーメーションを引き出すために有用である。中和抗−ＨＣＶ抗体を誘導する能力は、Ｃ型肝炎に対する受動的及び能動的な免疫予防を仲介する良好な抗体の可能性の評価を可能にするであろう。
【０２７０】
結果として、本発明はＥ１Ｅ２糖タンパク質（成熟過程）のウィルス集成及びＨＣＶの細胞侵入のそれらの役割の正確な調査を可能にするツールを提供する。Ｅ１Ｅ２糖タンパク質の構造的改変が、レトロウィルス及びレンチウィルスのコア上のそれらの正確な集成のため、及び機能的Ｅ１Ｅ２糖タンパク質による高い力価の感染性ＨＣＶｐｐを生産するために要求されることはなかった。ＨＣＶ Ｅ２タンパク質のＣ末端残基の欠失は、更に生産されたＨＣＶシュード粒子の感染性を大きく増加させることを見出した。ＨＣＶｐｐへのマーカー遺伝子の挿入は、フローサイトメトリーによるこれらのシュード粒子の感染性の正確且つ迅速な測定を可能にした。
【０２７１】
それらの機能的な感染性ＨＣＶシュード粒子の開発は、新規ＨＣＶ受容体又は共受容体の同一性の確認のような、ＨＣＶ感染の早期事象を調査すること、セロコンバートされた患者における中和抗体の検出のための診断アッセイを行うこと、及びＨＣＶ感染への効果的な阻害剤を開発すること、を今般可能にする。
【表３】
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【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０２７２】
【図１】１ａ遺伝子型のＨＣＶシュード粒子及び異なる標的細胞タイプにより実施した感染性実験の結果を描写する。結果はＨＣＶｐｐのための上清液（６までの実験の平均±標準偏差）のｍＬあたりの形質導入ユニット（ＴＵ）として示す。超遠心分離により１００倍に濃縮されたＨＣＶｐｐのＨｕｈ−７細胞上の感染性を示す（１００×）。
【０２７３】
【図２】Ｅ１Ｅ２が不存在（レーンａ）、レトロウィルスコアタンパク質が不存在（レーンｂ）、ＭＬＶ−Ｇ２Ａ集成欠陥コアタンパク質が存在（レーンｃ）、ＨＩＶ−１コアタンパク質が存在（レーンｄ）、Ｅ１又はＥ２が単独で存在（それぞれレーンｅ又はｆ）、トランスの２つの独立したベクターから発現したＥ１＋Ｅ２が存在（レーンｇ）、シスの同一ベクターから発現したＨＣＶ−１ａＥ１Ｅ２が存在（レーンｈ）、又はＨＣＶ−１ｂＥ１Ｅ２が存在（レーンｉ）で生産されたＨＣＶシュード粒子によるＨｕｈ−７標的細胞上で測定された感染性力価を表す。ＨＣＶｐｐは、標的細胞への感染の前及び感染の間、２５μＭ ＡＺＴ（３’−アジド−３’−デオキシチミジン；シグマ−アルドリッチ，仏）で処理した（レーンｊ）。ＨＣＶシュード粒子の感染性は、１ａＨＣＶ遺伝子型からのＥ１及び１ｂＨＣＶ又は遺伝子型からのＥ２（レーンＫ）或いは１ｂＨＣＶ遺伝子型からのＥ１及び１ａＨＣＶ又は遺伝子型からのＥ２（レーンＩ）により発生した。結果は、ＴＵ／ｍＬとして表し、４までの実験の平均±標準偏差として示す。
【０２７４】
【図３】遺伝子型１ａのＨＣＶｐｐを有す２人のドナー由来ヒト主要肝細胞上での感染の結果を示す。感染性はＨｕｈ−７細胞上で測定される感染性のパーセンテージとして表す。
【０２７５】
【図４】遺伝子型１ａの糖タンパク質Ｅ１（Ａ４）又はＥ２（Ｈ31、Ｈ33、Ｈ35、Ｈ44、Ｈ48、Ｈ53、Ｈ54、Ｈ60及びＨ61）に対するモノクローナル抗体、抗体が貯蔵された場合（Ｈｍｉｘ）、抗体が存在しない場合のＨＣＶシュード粒子の中和を或いはＶＳＶ−Ｇ（コントロール）により生産したシュード粒子を用いた中和を示す。コントロールの中和はＶＳＶ−Ｇを中和する41A.1モノクローナル抗体により達成された。結果は抗体の不存在下における培養に関連した平均感染性力価±標準偏差の阻害のパーセンテージとして表す。
【０２７６】
【図５】ＨＣＶ患者血清によるＨＣＶｐｐの中和を表す。それらの患者で診断されるＨＣＶの遺伝子型は黒塗りで示す。結果は個々の健常者からのコントロール血清と一緒の培養に関連した平均感染性力価±標準偏差の阻害のパーセンテージとして表す。
【０２７７】
【図６】ＨＣＶＥ１Ｅ２及びレトロウィルス発現構造体を示す。（Ａ）：ＨＣＶポリタンパク質遺伝子から由来するｃＤＮＡはＥ１Ｅ２糖タンパク質及びＥ１（ＳＰ Ｅ１）のためのシグナルペプチドを提供するＣタンパク質のカルボキシ末端を発現するために使用した。タンパク質の翻訳を終わらせるための発現構造体を挿入した終止コドン（star）の位置を示す。Ｅ１の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）はＥ２糖タンパク質のためのシグナルペプチド（ＳＰ Ｅ２）を提供する。（Ｂ）：感染性シュード粒子を集成することを要求する異なる化合物をコードする発現構造体を示す。ウィルス性遺伝子及びマーカー遺伝子（ＧＦＰ）を表すファイルされたボックスは、感染細胞へ転移される。オープンボックスはシス−作用配列を見せる。ＬＴＲは末端反復配列；ＣＭＶはヒトサイトメガロウィルスの迅速で早期のプロモーター；ＰＢＳはプライマー結合サイト；Ψはパッケージング配列；ＰＰＴはポリプリントラック；ポリＡはポリアデニル化サイト；ＳＤはスプライスドナーサイト；ＳＡはスプライスアクセプターサイトである。ベクター粒子はパッケージング機能、転移ベクター、及び２９３Ｔ細胞中ヘのウィルス性糖タンパク質を担持するプラスミドの共トランスフェクションにより生産した。当該ウィルス性糖タンパク質は、個々に、或いはＣＥ１Ｅ２として発現するＨＣＶ Ｅ１及びＥ２糖タンパク質、ＶＳＶ−Ｇ又はＲＤ114糖タンパク質である。トランスフェクトした細胞の上清液を一過性の発現の間に集め、超遠心分離により濃縮し、そして標的細胞の形質導入のために用いた。
【０２７８】
【図７】ΔＨＶＲ１ ＨＣＶシュード粒子の導入を示す。トランスフェクトされた293Ｔ細胞の溶解産物及び２０％スクロースクッションを通してペレット化されたシュード粒子のイムノブロットを示す。分子量マーカーの位置を示す（ｋＤａ）。
【０２７９】
【図８】ΔＨＶＲ１ ＨＣＶシュード粒子の感染性を表す。感染後３日間の形質導入効率をＦＡＣＳ分析によって評価する前に、生産細胞からの上清液を希釈し、そしてＨｕｈ−７標的細胞を感染させるために用いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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