(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被測定試料に赤外光を照射して特定のタンパク質二次構造の存在比を測定し得る面分布測定方法において、
被測定試料の全体または特定範囲を微小な領域として特定部位に区分し、該被測定試料に赤外光を照射し、前記被測定試料の特定部位からの光より前記特定部位毎に被測定物のスペクトルを測定しながら、
該スペクトルをあらかじめ得ていた特定のタンパク質二次構造のスペクトルと対応する特定部位毎に照合することにより特定部位毎に特定のタンパク質二次構造の存在比（αへリックス：βシート：βターン：ランダム構造）を測定してゆき、
前記被測定試料の全体または特定範囲において、特定のタンパク質二次構造の存在比（αへリックス：βシート：βターン：ランダム構造）を利用して面分布状態を測定することを特徴とするタンパク質二次構造の面分布測定方法。
【請求項２】
被測定試料に赤外光を照射して特定のタンパク質二次構造の存在比を測定し得る面分布測定方法において、
被測定試料の全体または特定範囲を微小な領域として特定部位に区分し、該被測定試料に赤外光を照射し、前記被測定試料の特定部位からの光より前記特定部位毎に被測定物のスペクトルを測定した後、
該スペクトルをあらかじめ得ていた特定のタンパク質二次構造のスペクトルと対応する特定部位毎に照合することによりすべての特定部位のタンパク質二次構造の存在比（αへリックス：βシート：βターン：ランダム構造）を算出し、
前記被測定試料の全体または特定範囲において、特定のタンパク質二次構造の存在比（αへリックス：βシート：βターン：ランダム構造）を利用しての面分布状態を測定することを特徴とするタンパク質二次構造の面分布測定方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質二次構造の面分布測定方法において、測定されたタンパク質二次構造の面分布状態の測定結果を、三次元グラフ化して表記することを特徴とするタンパク質二次構造の面分布測定方法。
【請求項４】
請求項１乃至３に記載のタンパク質二次構造の面分布測定方法において、被測定試料のタンパク質濃度が１％以上であることを特徴とするタンパク質二次構造の面分布測定方法。
【請求項５】
被測定試料に赤外光を照射して特定のタンパク質二次構造の存在比を測定し得る面分布測定装置において、
被測定試料に赤外光を照射する赤外光照射手段と、
前記被測定試料の全体または特定範囲を微小な領域として特定部位に区分し、前記被測定試料の特定部位からのスペクトルを得るための検出手段と、
あらかじめ得ていた特定のタンパク質二次構造のスペクトルをデータ化して記憶した記憶手段と、
前記検出手段によって得られた検出結果からスペクトルを割り出し、前記スペクトルを前記記憶手段に記憶された特定のタンパク質二次構造のスペクトルと特定部位毎に照合し、前記照合結果より特定のタンパク質二次構造の存在比（αへリックス：βシート：βターン：ランダム構造）を特定部位毎に計算する解析手段と、
前記被測定試料の全体または特定範囲において、前記特定のタンパク質二次構造の存在比（αへリックス：βシート：βターン：ランダム構造）を利用して面分布状態の測定結果を表示する表示手段と、
を有することを特徴とするタンパク質二次構造の面分布測定装置。
【請求項６】
請求項５に記載のタンパク質二次構造の面分布測定装置において、該赤外光照射手段がフリーエ変換赤外分光光度計であることを特徴とするタンパク質二次構造の面分布測定装置。
【請求項７】
請求項５または６に記載のタンパク質二次構造の面分布測定装置において、該被測定試料を拡大して観察するための光学系を有する顕微透過法によって測定が行われることを特徴とするタンパク質二次構造の面分布測定装置。
【請求項８】
請求項５または６に記載のタンパク質二次構造の面分布測定装置において、該被測定試料を拡大して観察するための光学系を有する顕微ＡＴＲによって測定が行われることを特徴とするタンパク質二次構造の面分布測定装置。
【請求項９】
請求項５乃至８のいずれかに記載のタンパク質二次構造の面分布測定装置において、該検知手段によって検知された測定結果で特定波数におけるピーク高さが特定の値以上である部位、或いは特定波数におけるピーク高さが特定の値以下である部位の測定データを破棄し、該解析手段において前記部位の特定タンパク質の存在比を０、或いは特定値以下であるとして処理することを特徴とするタンパク質二次構造の面分布測定装置。
【請求項１０】
請求項５乃至８のいずれかに記載のタンパク質二次構造の面分布測定装置において、該解析手段において該検出手段によって得られた検出結果からスペクトルを割り出し、前記スペクトルを前記記憶手段に記憶された特定のタンパク質二次構造のスペクトルと照合し、前記照合結果より特定のタンパク質二次構造の存在比を計算した結果が、存在比が１００％を超えるなど明らかに誤りである場合に、測定部位の測定データを破棄し、解析手段において前記部位の特定タンパク質の存在比を０、或いは特定値以下であるとして処理することを特徴とするタンパク質二次構造の面分布測定装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
【０００１】
本発明は赤外光を使用してタンパク質の二次構造解析を行い得る方法及び装置、特にその面分布状態を存在比で計測する方法及び装置に関する。
【従来の技術】
【０００２】
タンパク質はその機能と構造が密接に関係しており、タンパク質の構造を解析することはタンパク質の機能を研究する上でも重要である。
タンパク質の構造には１〜４次構造まであるが、このうち２次構造とはタンパク質の特定部位ごとの立体構造である。具体的にはタンパク質分子は大きく分けて４種類の２次構造から形成されている。これらは螺旋型のαへリックス、ジグザグ構造のβシート、その端末部分のβターン、そしてランダム構造であり、これらの存在比を１００分率で示すことがタンパク質の２次構造解析である。
従来このようなタンパク質の２次構造解析は、旋光分散計や、Ｘ線によって解析が行われていた。
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
旋光分散計を用いて行うタンパク質の２次構造解析は、希少な試料をシビアな測定条件で行うのに有効であった。つまり被測定試料となる対象が液体であり濃度も１％以下であることが必要とされた。また温度精度は０．１℃で行わなければならなかった。このように旋光分散計を用いて行う測定は測定条件が非常に厳しいものであった。さらに旋光分散計による装置は、装置自体が比較的高価であった。
またＸ線によって行うタンパク質の２次構造解析は、測定対象となる被測定試料が結晶でなければならなかった。
このように旋光分散計やＸ線では測定対象がアモルファス状態などの不均一な状態の試料を測定することはできなかった。また不純物が多い状態での測定も行うことができず、このような被測定試料を解析し得る方法及び装置が望まれた。
さらに被測定試料の面分布状態を解析し得るような方法及び装置も存在しなかったが、生体組織のようなもののタンパク質の２次構造を面分析可能であれば、医学、生命科学の分野において著しい貢献が期待できる。
【０００４】
本発明は前記課題に鑑みなされたものであり、その目的は被測定試料が不均一な状態や不純物が多い状態であっても測定を行うことができる方法、及び被測定試料の面分布状態のマッピングを行い得る安価な装置及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために本発明にかかるタンパク質二次構造の面分布測定方法は、  被測定試料の全体または特定範囲を微小な領域として特定部位に区分し、該被測定試料に赤外光を照射し、前記被測定試料の特定部位からの光より前記特定部位毎に被測定物のスペクトルを測定しながら、該スペクトルをあらかじめ得ていた特定のタンパク質二次構造のスペクトルと対応する特定部位毎に照合することにより特定部位毎に特定のタンパク質二次構造の存在比（αへリックス：βシート：βターン：ランダム構造）を測定してゆき、前記被測定試料の全体または特定範囲において、特定のタンパク質二次構造の存在比（αへリックス：βシート：βターン：ランダム構造）を利用して面分布状態を測定することを特徴とする。
【０００６】
また、本発明のタンパク質二次構造の面分布測定方法は、被測定試料に赤外光を照射して特定のタンパク質二次構造の存在比を測定し得る面分布測定方法において、被測定試料の全体または特定範囲を微小な領域として特定部位に区分し、該被測定試料に赤外光を照射し、前記被測定試料の特定部位からの光より前記特定部位毎に被測定物のスペクトルを測定した後、該スペクトルをあらかじめ得ていた特定のタンパク質二次構造のスペクトルと対応する特定部位毎に照合することによりすべての特定部位のタンパク質二次構造の存在比（αへリックス：βシート：βターン：ランダム構造）を算出し、前記被測定試料の全体または特定範囲において、特定のタンパク質二次構造の存在比（αへリックス：βシート：βターン：ランダム構造）を利用しての面分布状態を測定することを特徴とする。
また本発明のタンパク質二次構造の面分布測定方法において、測定されたタンパク質二次構造の面分布状態の測定結果を、三次元グラフ化して表記することが好適である。
また本発明のタンパク質二次構造の面分布測定方法において、被測定試料のタンパク質濃度が１％以上であることが好適である。
【０００７】
また本発明におけるタンパク質二次構造の面分布測定装置は、被測定試料に赤外光を照射して特定のタンパク質二次構造の存在比を測定し得る面分布測定装置において、
被測定試料に赤外光を照射する赤外光照射手段と、前記被測定試料の全体または特定範囲を微小な領域として特定部位に区分し、前記被測定試料の特定部位からのスペクトルを得るための検出手段と、あらかじめ得ていた特定のタンパク質二次構造のスペクトルをデータ化して記憶した記憶手段と、前記検出手段によって得られた検出結果からスペクトルを割り出し、前記スペクトルを前記記憶手段に記憶された特定のタンパク質二次構造のスペクトルと特定部位毎に照合し、前記照合結果より特定のタンパク質二次構造の存在比（αへリックス：βシート：βターン：ランダム構造）を特定部位毎に計算する解析手段と、前記被測定試料の全体または特定範囲において、前記特定のタンパク質二次構造の存在比（αへリックス：βシート：βターン：ランダム構造）を利用して面分布状態の測定結果を表示する表示手段と、を有することを特徴とする。
【０００８】
また本発明のタンパク質二次構造の面分布測定装置において、該赤外光照射手段がフリーエ変換赤外分光光度計であることが好適である。
また本発明のタンパク質二次構造の面分布測定装置において、該被測定試料を拡大して観察するための光学系を有する顕微透過法によって測定が行われることが好適である。
また本発明のタンパク質二次構造の面分布測定装置において、該被測定試料を拡大して観察するための光学系を有する顕微ＡＴＲによって測定が行われることが好適である。
また本発明のタンパク質二次構造の面分布測定装置において、該検知手段によって検知された測定結果で特定波数におけるピーク高さが特定の値以上である部位、或いは特定波数におけるピーク高さが特定の値以下である部位の測定データを破棄し、該解析手段において前記部位の特定タンパク質の存在比を０、或いは特定値以下であるとして処理することが好適である。
また本発明のタンパク質二次構造の面分布測定装置において、該解析手段において該検出手段によって得られた検出結果からスペクトルを割り出し、前記スペクトルを前記記憶手段に記憶された特定のタンパク質二次構造のスペクトルと照合し、前記照合結果より特定のタンパク質二次構造の存在比を計算した結果が、存在比が１００％を超えるなど明らかに誤りである場合に、部位の測定データを破棄し、解析手段において前記部位の特定タンパク質の存在比を０、或いは特定値以下であるとして処理することが好適である。
【発明の実施の形態】
【０００９】
以下、本発明の一実施形態である装置を用いて本発明の方法及び装置を詳しく説明する。
図１に本発明の一実施形態であるタンパク質二次構造の面分布測定装置の概要構成図を記載する。同図に示すタンパク質二次構造の面分布測定装置２は、被測定試料４に赤外光を照射して特定のタンパク質二次構造の存在比を測定し得る面分布測定装置において、被測定試料４に赤外光を照射する赤外光照射手段６と、前記被測定試料の特定部位からの被測定試料の情報を含む光を計測してスペクトルを得るための検出手段８と、あらかじめ測定された特定のタンパク質二次構造のスペクトルをデータ化して記憶した記憶手段１０と、前記検出手段８によって得られた検出結果からスペクトルを割り出し、前記スペクトルを前記記憶手段１０に記憶された特定のタンパク質二次構造のスペクトルと照合し、前記照合結果より特定のタンパク質二次構造の存在比を計算する解析手段１２と、前記被測定試料の全体または特定範囲において、特定のタンパク質二次構造の存在比の面分布状態の測定結果を表示する表示手段１４とを有する。
【００１０】
同図に示す本発明の一実施形態では赤外光照射手段６は、フリーエ変換赤外分光光度計からなっている。また検出手段８は多波長検出器を用いており、これによって多波長同時検出が可能となり、測定時間を大幅に短縮することができる。
また本実施形態では記憶手段１０と解析手段１２はコンピュータ１６によって兼ねられており、記憶手段１０としてはハードディスクが用いられ、解析手段１２としてはコンピュータ１６そのものがその役割を果たすようになっている。
表示手段１４は本実施形態ではディスプレイが使用されている。このような表示手段１４としてはプリンタやその他の出力機器等を用いてもよい。
本実施形態において、面分布測定装置２はコンピュータ１６とフーリエ変換分光光度計６、多波長検出器８、ディスプレイ１４がそれぞれ双方向で通信可能となっており、各部の動作をコンピュータによって制御、操作することはもちろん、測定されたデータはコンピュータに送られハードディスク上に保存され、コンピュータによって解析することが可能となっている。
さらに本実施形態では被測定試料の測定に顕微鏡１８が用いられている。このように顕微赤外分光光度計による測定を行えば、微小な被測定試料の解析を詳しく行うことができるため好適である。特に、顕微透過法よって測定を行うと、被測定試料が液体やアモルファス状態などの不均一な状態であっても測定を行うことができるため好適である。
また、顕微ＡＴＲを用いれば被測定物に対する制約を大きく削減できる。
このように本発明の装置を用いれば、赤外光によって被測定試料の測定を行うため、温度精度は１℃前後でよく、不純物の多い試料などでも測定を行うことが可能である。
【００１１】
以下、実際に被測定試料を測定する際の装置の動作と本発明のタンパク質二次構造の面分布測定方法について説明する。
まず、被測定試料をステージ上に載置し、赤外光照射手段６を作動させ被測定試料に赤外光を照射し、前記被測定試料の特定部位で、被測定試料の情報を含む光を計測するのである。
【００１２】
ここでいう特定部位とは被測定試料の観察面上における微小に区切られた領域内の部位のことを言う。つまり図２（ａ）に示すように観察面２０上の全体において被測定試料を複数の微小な領域２２群に分け、この微小な領域それぞれにおいて測定を行っていくのである。そして、得られた結果から被測定試料のスペクトルが解析される。
得られた測定スペクトルは、あらかじめ得ていた特定のタンパク質二次構造のスペクトルと照合され、その存在比が計算されるのである。
このように微小領域に区切って測定を行っていく方法としては、アパーチャを用いて行う方法や、２次元検出器などを用いることができ、このような測定が行い得る様々な手段を使用すればよく、このような方法に特に限定は無い。
特定のタンパク質二次構造のスペクトルとは被測定試料が含むタンパク質に該当するタンパク質のスペクトルのことを言うものとする。
【００１３】
本発明の一実施形態である図１に記載した装置においては、標準試料のタンパク質で測定されたスペクトルデータまたはタンパク質の知られているスペクトルデータが１７種のタンパク質についてαへリックス、βシート、βターン、ランダム構造についてそれぞれ記憶されている。これらのデータと測定データを照合して行き、その存在比が計算されるのである。この計算はバンド分解、ＰＣＲ、ＰＬＳなどで行うことができる。
また本発明の装置においては、被測定試料にあわせて、あらかじめ標準試料となるタンパク質のスペクトルを測定し、そのデータを記憶手段に記憶されたデータベースに追加しておくことも可能である。
【００１４】
このようにある一つの微小領域についてスペクトルが測定され、その存在比が計算されたら、他の微小領域で同様の測定を行っていき、被測定試料の全体において順次特定のタンパク質二次構造の存在比を測定してゆくのである。そしてその測定結果は記憶手段に記憶される。
本実施形態ではコンピュータによって測定結果を表のように表示手段上に表示させることが可能である。また測定結果を表示する際には三次元グラフ化して表記すると、視覚的にタンパク質二次構造の分布状況を把握することができるため好適である。
【００１５】
前記測定によって得られた測定結果から本発明の一実施形態における装置によって表示された三次元グラフを図３に示す。
同図に示す３次元グラフは生体試料の切片であり０．１ｍｍ四方の試料のαへリックスの分布状態を調べたものである。これは癌細胞におかされた生体組織を測定したものである。癌細胞に犯された部分ではαへリックスが減少することが知られている。この図を見てわかるように癌細胞に侵された部分が視覚的に見てわかる。
このように三次元グラフで測定結果を表示できれば、その分布状況が一目でわかるようになっている。なおこのような三次元グラフ以外でも等高線グラフなど視覚的に分布状況が把握し得る表示方法を用いることもできる。
なお前記本発明の装置での説明では図２（ａ）に示したように微小領域２２を被測定試料面全体に設定したが、図２（ｂ）に示すようにある特定範囲２４を定めその中に微小領域２６を設定するようにすることも可能である。
【００１６】
また前記本発明の装置での説明では、ある一つの微小領域についてスペクトルが測定され、その存在比が計算されたら、他の微小領域で同様の測定を行っていき、被測定試料の全体において順次特定のタンパク質二次構造の存在比を測定してゆく手順によって測定が行われている例をあげたが、被測定試料の全体または特定範囲において順次前記被測定試料の特定部位でのスペクトルを測定した後、測定されたスペクトルをあらかじめ得ていた特定のタンパク質二次構造のスペクトルと順次照合し、前記照合結果より特定のタンパク質二次構造の存在比を順次計算して、被測定試料の全体または特定範囲において特定のタンパク質二次構造の存在比を算出して行く手順であってもよく、このような測定方法に特に限定は無い。
【００１７】
なお測定しようとする特定のタンパク質二次構造の存在比が被測定試料のある部位において無い場合、或いは非常に少なかった場合、解析手段における存在比の計算で誤りが生じる場合がある。そのため本発明の装置では、該検知手段によって検知された測定結果で特定波数におけるピークが存在しない部位、あるいは特定波数におけるピーク高さがある一定の値より大きいないし小さい部位の測定データを破棄し、該解析手段において前記部位の特定タンパク質の存在比を０或いは、特定値以下であるとして処理することで測定結果に間違いが含まれることを防止している。
【００１８】
またその他の方法としては、該解析手段において該検出手段によって得られた検出結果からスペクトルを割り出し、前記スペクトルを前記記憶手段に記憶された特定のタンパク質二次構造のスペクトルと照合し、前記照合結果より特定のタンパク質二次構造の存在比を計算した結果が、存在比が１００％を超えるなど明らかに誤りである場合に、部位の測定データを破棄し、解析手段において前記部位の特定タンパク質の存在比を０或いは、特定値以下であるとして処理することでも測定結果に間違いが含まれることを防止することができる。
本発明の装置においては、前記２通りのどちらかの方法、或いはその両者を採用することが可能であり、これによって測定結果に間違いが含まれることが好適に防止できる。
【００１９】
以上説明したように本発明のタンパク質二次構造の面分布測定方法及び装置は測定に赤外光を使用することとしたので、被測定試料のタンパク質濃度が１％以上さらには５％以上であっても好適に測定を行うことが可能である。
またある程度大量にあるタンパク質の２次構造を簡便に解析したい場合などにも有効であるため、ＣＤを用いた従来の測定では行うことのできなかったルーチン分析、テーラリングしたタンパク質などの構造活性相関、アモルファス状態のタンパク質の測定、細胞や組織などのマッピング、ＳＣＦなど特殊環境下でのタンパク質の構造決定などが可能となる。
また、ＦＴＩＲによる装置構成のため非常に安価に装置を提供することが可能となる。
【発明の効果】
【００２０】
以上説明したように、本発明におけるタンパク質二次構造の面分布測定方法及び装置によれば、タンパク質二次構造の面分布状況が確認できる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】  図１は本発明の一実施形態であるタンパク質二次構造の面分布測定装置の概要構成図である。
【図２】  図２は被測定試料の観察面上に設定された複数の微小な領域を説明する説明図である。
【図３】  図３は測定によって得られた測定結果から本発明の一実施形態における装置によって表示された三次元グラフである。
【符号の説明】
【００２２】
２  タンパク質二次構造の面分布測定装置
４  被測定試料
６  赤外光照射手段
８  検出手段
１０  記憶手段
１２  解析手段
１４  表示手段
１６  コンピュータ
１８  顕微鏡
【図１】
0004644383.tif 000002
【図２】
0004644383.tif 000003
【図３】
0004644383.tif 000004