(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクテラリア属（Scutellaria）に由来しバイカリンを含有する抽出物とアカシア属（Acacia）に由来しカテキン又はエピカテキンを含有する抽出物との混合物を含む、ざ瘡、局所的創傷、真菌、細菌およびウイルスの感染を原因とする軽症の炎症の状態、白斑、化学物質、熱、風および乾燥の環境への暴露に起因する皮膚の損傷、小じわ、皮膚のたるみ、及び目の周囲のしわおよびくまから成る群から選択されるシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）およびリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）を介した皮膚の疾患および状態を予防又は治療するための組成物。
【請求項２】
スクテラリア属（Scutellaria）に由来しバイカリンを含有する抽出物とアカシア属（Acacia）に由来しカテキン又はエピカテキンを含有する抽出物との混合物を含む、ＣＯＸおよびＬＯＸ経路により仲介される哺乳動物の皮膚の外観を改善するための組成物であって、改善された皮膚の外観が、弾力性の改善された滑らかな若々しい皮膚、低減され遅延された老化、高められた若々しい外観および皮膚のきめ、ならびに増加された柔軟性、はり、滑らかさおよびしなやかさからなる群から選択される、組成物。
【請求項３】
前記組成物中のバイカリン対カテキン又はエピカテキンの比率が、９９．９：０．１のバイカリン：カテキン又はエピカテキンから、０．１：９９．９のバイカリン対カテキン又はエピカテキンの範囲から選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物中のバイカリン対カテキン又はエピカテキンの比率が、８０：２０、５０：５０及び２０：８０のバイカリン：カテキン又はエピカテキンからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物中のスクテラリア属に由来しバイカリンを含有する抽出物とアカシア属に由来しカテキン又はエピカテキンを含有する抽出物との重量比が、１２：８８及び１５：８５のスクテラリア属由来抽出物：アカシア属由来抽出物からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項６】
前記バイカリン及びカテキン又はエピカテキンが、茎、茎の皮、幹、幹の樹皮、小枝、塊茎、根、根の皮、若芽、種子、根茎、花およびその他の生殖器官、葉およびその他の地上に出ている部分からなる群から選択される植物の部分から単離又は抽出される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記カテキン又はエピカテキンが、アセンヤクノキ(Acacia catechu)、アカシア・コンシナ(Acacia concinna)、キンゴウカン(Acacia farnesiana)、アカシア・セネガル(Acacia Senegal)、アカシア・スペシオサ(Acacia speciosa)、アカシア・アラビカ(Acacia Arabica)、アカシア・カエシア(A. caesia)、アカシア・ペンナタ(A.pennata)、アカシア・シヌアテ(A. sinuate)、モリシマアカシア(A. mearnsii)、アカシア・ピクナンタ(A. picnantha)、ミモザ(A. dealbata)、カマバアカシア(A. auriculiformis)、アカシア・ホロセレシア(A. holoserecia)およびアカシア・マンギューム(A. mangium)から成る群から選択される植物の種から単離又は抽出される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
医薬的、皮膚科的又は美容的に受容可能な担体中の、およそ０．００１重量パーセント（ｗｔ％）から４０．０ｗｔ％の、スクテラリア属に由来しバイカリンを含有する抽出物とアカシア属に由来しカテキン又はエピカテキンを含有する抽出物との混合物を含むように医薬的、皮膚科的又は美容的製剤の形態で製剤化されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
局所、エアゾール、坐剤、皮膚内、筋肉内、および静脈内の投与から成る群から選択される投与経路のために製剤化されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
局所的投与経路のために製剤化されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
くっつかないタイプのガーゼ、バンデージ、綿棒、拭き取り用の布、パッチ、マスク、保護剤、クレンジング剤、消毒剤、溶液、クリーム、ローション、軟膏、ゲルまたはエマルジョン、リキッド、ペースト、石鹸、または粉末剤を用いて投与するために製剤化されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
さらに、局所塗布用に医薬的、皮膚科的および美容的に適する従来の賦形剤、ならびに所望によりアジュバント、および/または担体、および/または規定のまたはコントロールされた放出媒体を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全体として、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）およびリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）により仲介される疾患および状態の予防および治療のための方法に関する。具体的には本発明は、ＣＯＸおよびＬＯＸ経路により仲介される皮膚の疾患および状態の予防および治療に使用するための、化合物の２つの特定のクラス−−フリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバン−−を混合したものの混合物で構成される、ここで問題とする新規組成物に関する。本発明に含まれるのは、日光による熱傷、熱による熱傷、ざ瘡、局所的創傷、真菌、細菌およびウイルスの感染を原因とする軽症の炎症の状態、白斑、全身性紅斑性狼瘡、乾癬、癌、黒色腫、ならびにその他の哺乳動物の皮膚癌、紫外線（ＵＶ）放射、化学物質、熱、風および乾燥の環境への暴露に起因する皮膚の損傷、小じわ (wrinkles)、皮膚のたるみ、目の周囲のしわ(lines)およびくま、皮膚病およびその他のアレルギーに関連する皮膚の状態を含むがこれに限定されない、ＣＯＸおよびＬＯＸを介した疾患および状態の予防および治療のための方法である。当明細書に記載する組成物の使用はまた、弾力性の改善された滑らかな若々しい皮膚、低減され遅延された老化、高められた若々しい外観および皮膚のきめ、ならびに増加された柔軟性、はり、滑らかさおよびしなやかさという利点を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
（発明の背景）
日光は、早発性老化、皮膚癌、およびホストのその他の皮膚の変化、例えば紅斑および皮膚の黒化の原因となる、皮膚への著明な影響を有する。日光が原因となる損傷の大半は、２００ｎｍから４００ｎｍの波長を有する紫外線（ＵＶ）放射による。紫外線の放射は波長に依存して３つの分類、ＵＶＡ、ＵＶＢまたはＵＶＣに分けられる。３２０−４００ｎｍの範囲の波長を有するＵＶＡは、皮膚の黒化および軽度の日光皮膚炎の原因となり得る。２９０−３２０ｎｍの範囲の波長を有するＵＶＢは、日光皮膚炎の原因となり色素沈着を刺激し得る。１００−２９０ｎｍの範囲の波長を有するＵＶＣは損傷の原因となり得るが皮膚の黒化の原因とはならない。ＵＶ放射への皮膚の暴露は、二段階の反応を誘導する。したがって最初の暴露で即時の紅斑の反応が起こるが、これは３０分以内に消失する弱い反応である。遅れての紅斑の反応は暴露の２−５時間後に起こり、１０−２４時間位にピークになる。増強されたプロスタグランジンおよびロイコトリエンの産生が、ＵＶ、日光、および化学的/熱的原因の紅斑に関する作用の主な機序である(Wang (2002) Adv. Dermatol. 18: 247)。
【０００３】
細胞膜からのアラキドン酸（ＡＡ）の遊離および代謝は、いくつかの異なる経路により前炎症代謝の生成をもたらす。論証できることとして炎症への最も重要な経路の２つは、酵素のリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）およびシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）により仲介される。これらは各々ロイコトリエンおよびプロスタグランジンの生成をもたらす平行する経路であり、炎症応答の開始および進行に重要な役割を担っている。これらの血管に作用する化合物は走化性因子(chemotaxin)であり、双方とも炎症細胞の組織内への浸潤を促進し、炎症応答の長期化を助長する。結果的にはこれらの炎症の仲介物質の生成の原因となる酵素を本発明の標的として、疾患および状態、例えば日光による熱傷、熱による熱傷、湯焼、ざ瘡、局所的創傷、紅斑性狼瘡、乾癬、癌、黒色腫、および哺乳類の他の皮膚癌の生理学的および病理学的過程に寄与する双方の経路に起因する炎症の二重の阻害を目的とする、局所的に投与する療法薬を開発した。
【０００４】
ＣＯＸ酵素の阻害は、ほとんどの非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）による作用機序である。ＣＯＸ酵素の２つの別個のアイソフォーム（ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２）があり、およそ６０％の配列の相同性を共有するが、発現の概要および機能は異なる。ＣＯＸ−１は生理学的に重要なプロスタグランジンの産生にリンクしていた酵素の構成的な形であり、正常な生理学的機能、例えば血小板の凝集、胃における細胞機能の保護、および正常な腎臓機能の維持を調節する手助けをする(Dannhardt and Kiefer (2001) Eur. J. Med. Chem. 36: 109-26)。第２のアイソフォームであるＣＯＸ−２は、前炎症のサイトカイン、例えばインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）およびその他の成長因子により誘導され得る酵素の形である(Herschmann (1994) Cancer Metastasis Rev. 134: 241-56; Xie et al. (1992) Drugs Dev. Res. 25: 249-65)。このアイソフォームは、アラキドン酸（ＡＡ）からのプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の産生を触媒する。ＣＯＸを阻害することが、従来のＮＳＡＩＤの抗炎症活性の要因となる。
【０００５】
ＣＯＸおよびＬＯＸに対して二重の特異性を示す阻害薬は、アラキドン酸代謝の複数の経路を阻害するという明確な利点を有することになるだろう。このような阻害薬はプロスタグランジン（ＰＧ）の炎症効果、ならびに複数のロイコトリエン（ＬＴ）の炎症効果を、それらの産生を制限することにより遮断することになる。この効果には、アナフィラキシー遅延反応物質としても知られるＰＥＧ２、ＬＴＢ４、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４の血管拡張、血管透過性および白血球走化性の効果を含む。これらの内、ＬＴＢ４が最も強い白血球走化性および化学運動性の効果を有する。(Moore (1985) Prostanoids: pharmacological, physiological and clinical relevanceにて、 Cambridge University Press, N.Y., pp. 229-230)。
【０００６】
ＣＯＸ阻害薬の作用機序は、ほとんどの従来のＮＳＡＩＤの作用機序にオーバーラップするため、ＣＯＸ阻害薬は、炎症が決定的な役割を担う一過性の状態および慢性疾患における炎症に伴う疼痛および腫脹を含む多くの同様の症状を治療するために使用される。一過性の状態には、軽症の擦傷または接触性皮膚炎に伴う炎症、ならびにプロスタグランジンおよびロイコトリエン経路に直接関連付けられる皮膚の状態、例えば皮膚の色素増加症、加齢性色素斑、白斑、全身性紅斑性狼瘡、乾癬、癌、黒色腫、および哺乳類のその他の皮膚癌の治療を含む。ＣＯＸ阻害薬の使用は、疾患、例えば全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）(Goebel et al. (1999) Chem. Res. Toxicol. 12: 488-500; Patrono et al. (1985) J. Clin. Invest. 76: 1011-1018)、ならびにリウマチ性の皮膚の状態、例えば強皮症を含むまでに拡大してきた。ＣＯＸ阻害薬はまた、リウマチ由来ではない炎症性の皮膚の状態、例えば乾癬の軽減のためにも使用され、これらの場合プロスタグランジンの過剰産生に起因する炎症を低減することで、直接的な利益を提供することができる。(Fogh et al. (1993) Acta Derm Venerologica 73: 191-193)。近年、全身性硬化症の患者の皮膚における５−リポキシゲナーゼの過剰発現が報告された。このことから、ＬＯＸ経路が全身性硬化症の病因において有意であると考えられ、有効な治療標的を意味すると考えられるという示唆が導かれた。(Kowal-Bielecka (2001) Arthritis Rheum. 44(8): 1865)。最後に、アレルゲン注入部位でのＣＯＸ−２および５−ＬＯＸ双方の増加した酵素活性は、皮膚のアレルギー性応答の早期および後期双方の段階の症状を治療するために、二重のＣＯＸ/ＬＯＸ阻害薬を使用することの可能性を示唆する。(Church (2002) Clin. Exp. Allergy. 32(7): 1013)。
【０００７】
選択的シクロオキシゲナーゼ阻害薬の局所塗布は、急性および長期的暴露双方の後のＵＶＢを介した皮膚の炎症を抑制することが示された。加えて浮腫、真皮の好中球の浸潤および活性化、ＰＧＥ２レベル、および日光皮膚炎の細胞の形成は、ＣＯＸ阻害薬の局所塗布により低減された。(Wilgus (2000) Prostaglandins Other Lipid Mediat. 62(4): 367)。ＣＯＸ阻害薬のセレブレックス(Celebrex)（登録商標）は、全身投与 (Wilgus et al. (2002) Adv. Exp. Med. Biol. 507: 85)、および局所的投与(Wilgus et al. (2000) Prostaglandins Other Lipid Mediat. 62: 367)した場合に、ＵＶに誘発される炎症の効果を低減することが示された。動物モデルにおいて、公知のＣＯＸ阻害薬であるアスピリンおよび様々なリポオキシゲナーゼ阻害薬は、ＵＶ照射に起因する炎症および血管抑制に対して血管保護活性を示した(Kuhn (1988) Biomed. Biochim. Acta. 47: S320)。急性および長期的な慢性的ＵＶ暴露は、真皮表面におけるコラーゲンの変性および異常なエラスチンの蓄積を特徴とする皮膚の損傷および日光による老化の原因となる。二重のＣＯＸ/ＬＯＸ阻害薬を使用して、走化性因子−プロスタグランジン（ＰＧ）の血管拡張、血管透過性、白血球走化性、ならびに複数のロイコトリエン（ＬＴ）のこれらの作用を有意に低減することにより、炎症性浸潤を原因とするコラーゲンの変性を予防および治療することができる。(Bosset (2003) Br. J. Dermatol. 149(4): 826; Hase (2000) Br. J. Dermatol. 142(2): 267)。加えて口の皮膚における化学的に誘発される酸化的ストレスを、ＣＯＸおよびＬＯＸの阻害薬を別々に投与することにより阻害し、白血球の接着、浸潤およびＨ２Ｏ２の生成を低減することができる。(Nakamura (2003) Free Radical Biol. Med. 35(9): 997)。  
【０００８】
抗炎症薬としてのそれらの使用に加えて、ＣＯＸ阻害薬のもう１つの可能性のある役割は癌の治療におけるものである。ＣＯＸの過剰発現が様々なヒトの悪性腫瘍で示されており、ＣＯＸの阻害薬が皮膚の腫瘍を有する動物の治療に効能があることが示された。作用機序は完全には理解されていないが、ＣＯＸの過剰な発現がアポトーシスを阻害し、腫瘍形成の細胞のタイプの侵襲性を増加することが示された。(Dempke et al. (2001) J. Can. Res. Clin. Oncol. 127: 411-17; Moore and Simmons (2000) Current Med. Chem. 7: 1131-1144)。アップレギュレーションしたＣＯＸの産生は、皮膚の光線性角化症および扁平上皮癌の生成に関係していた。ＣＯＸの増加した量はまた、ＤＮＡ損傷により産生される病変にも見出された。(Buckman et al. (1998) Carcinogenesis 19: 723)。このためＣＯＸの発現またはタンパク質機能をコントロールすることは、炎症応答そして結果的には癌への進行の低減をもたらすものと思われる。事実ＣＯＸ阻害薬、例えばインドメタシンおよびセレブレックス（登録商標）は、ＵＶに誘発される紅斑および腫瘍形成の治療に有効であることが見出された。(Fischer (1999) Mol. Carcinog.25: 231; Pentland (1999) Carcinogenesis 20: 1939)。近年、リポオキシゲナーゼの過剰な発現はまた、表皮の腫瘍の発症(Muller (2002) Cancer Res. 62(16): 4610)および黒色腫の発癌(Winer (2002) Melanoma Res. 12(5): 429)に関連することが示された。リポオキシゲナーゼ経路から生成されるアラキドン酸（ＡＡ）の代謝は、シグナル伝達に関連する腫瘍の成長に重要な役割を担っており、リポオキシゲナーゼ経路の阻害が癌の進行を予防するための有効な標的であるはずであることを示唆する。(Cuendet (2000) Drug Metabol Drug Interact 17(4): 109; Steele (2003) Mutat Res.523-524: 137)。このように二重のＣＯＸ/ＬＯＸ阻害活性を有する療法薬の使用は、癌の化学的予防において有意な有利性を提供する。
【０００９】
プロスタグランジンおよびロイコトリエンはまた、創傷、熱傷、湯焼、ざ瘡、細菌感染、皮膚炎、および多くの他の皮膚の疾患および状態の、生理学的および病理学的過程においても重要な役割を担っている。有意に上昇したシクロオキシゲナーゼおよびリポキシゲナーゼの活性を伴う、熱的または化学的熱傷後の前炎症カスケードの活性化は十分に実証されており、多臓器不全をもたらすかもしれない、続いて起こる重篤な症状および免疫機能不全の発症に重要な役割を担う。(Schwacha (2003) Burns 29(1): 1; He (2001) J. Burn Care Rehabil. 22(1): 58)。
【００１０】
ざ瘡は、皮脂産生の異常、小胞性の上皮剥離、細菌増殖および炎症を伴う毛包脂腺単位の疾患である。ざ瘡の炎症の特性は偏光写真により検出し、ざ瘡の範囲の評価および治療の有効性の決定も含む臨床的診断に利用することができる。(Phillips (1997) J. Am. Acad. Dermatol. 37(6): 948)。ざ瘡の予防および治療のための現行の療法薬は、レチノイドのような抗炎症薬、抗生剤およびホルモン剤を含む。(Leyden (2003) J. Am. Acad. Dermatol. 49(3 Suppl): S200)。抗炎症薬、例えばレチノイド (Millikan (2003) J. Am. Acad. Dermatol. 4(2): 75)およびＣＯＸ阻害薬であるサリチル酸(Lee (2003) Dermatol Surg 29(12): 1196)の局所塗布は、ざ瘡の治療のための有効で安全な療法として臨床的に示された。加えて非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の使用は、ざ瘡、乾癬、日光による熱傷、結節性紅斑、クリオグロブリン血症、スイート症候群、全身性肥満細胞症、蕁麻疹様血管炎、皮斑様血管炎、および結節性脈管炎を含む一般的なおよび一般的はでない皮膚病用の療法薬として、十分に実証されている。(Friedman (2002) J. Cutan Med. Surg. 6(5): 449)。
【００１１】
フラボノイドまたはバイオフラボノイドは広く分布している天然の生成物の群であり、抗菌、抗炎症、抗アレルギー、突然変異抑制、抗ウイルス、抗新形成、抗トロンビン、および血管弛緩の活性を有することが報告されている。この化合物の群に共通する構造ユニットは、以下の一般構造式：
【００１２】
【化１】
0004769184.tif 000002
【００１３】
により示すような３−炭素環の両サイドに２つのベンゼン環を含む。この３環の一般構造に結合する、ヒドロキシル基、糖、酸素およびメチル基の多様な組み合わせが、フラバノール、フラボノン、フラバン−３−オル（カテキン）、アントシアニン、およびイソフラボンを含む、フラボノイドの多様なクラスを形成する。
【００１４】
フリーのＢ環のフラボンおよびフラボノールは、フラボノイドの特定のクラスであリ、これらは以下の一般構造：
【００１５】
【化２】
0004769184.tif 000003
【００１６】
により示すように、芳香族のＢ環に置換基を有していない（当明細書においてフリーのＢ環のフラボノイドと言う）、
式中
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−；アルドペントース、メチル−アルドペントース、アルドヘキソース、ケトヘキソース、およびそれらの化学的誘導体を含むがこれに限定されない、単一の糖または複数の糖の組み合わせの炭素、酸素、窒素またはイオウのグリコシド、から成る群から独立して選択される；
式中
Ｒは１ないし１０の炭素原子を有するアルキル基である；そして
Ｘは、ヒドロキシル、塩化物、ヨウ化物、フッ化物、スルフェート、ホスフェート、アセテート、カルボネート等を含むがこれに限定されない、医薬的に受容可能な対アニオンの群から選択される。
【００１７】
フリーのＢ環のフラボノイドは比較的稀である。合成されたまたは天然の材料から単離された９，３９６のフラボノイドの内、わずか２３１のフリーのＢ環のフラボノイドが知られているに過ぎない(The Combined Chemical Dictionary, Chapman & Hall/CRC, Version 5:1 June 2001)。フリーのＢ環のフラボノイドは、別種の生物学的活性を有することが報告された。例えばガランギン（３，５，７−トリヒドロキシフラボン）は、抗酸化物質およびフリーのラジカルスカベンジャーとして作用し、抗遺伝毒性および癌の化学的予防のための有望な候補物質であると考えられている。(Heo et al. (2001) Mutat. Res. 488(2): 135-150)。同物質はチロシナーゼモノフェノラーゼの阻害薬(Kubo et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. 8(7): 1749-1755)、ウサギ心臓のカルボニル還元酵素の阻害薬(Imamura et al. (2000) J. Biochem. 127(4): 653-658)であり、抗菌活性(Afolayan and Meyer (1997) Ethnopharmacol. 57(3): 177-181)、および抗ウイルス活性(Meyer et al. (1997) J. Ethnopharmacol. 56(2): 165-169)を有する。バカレインおよび２つの他のフリーのＢ環のフラボノイドは、ヒト乳癌細胞に対する抗増殖活性を有する(So et al. (1997) Cancer Lett. 112(2): 127-133)。
【００１８】
典型的にはフラボノイドは、それらの利用可能性に基づいて無作為に生物学的活性について検討されてきた。時にはＢ環の置換の必要性が、特異的な生物学的活性のため、例えばｐ−糖タンパク質への高いアフィニティー結合 (Boumendjel et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11(1): 75-77);強心性の効果(Itoigawa et al. (1999) J. Ethnopharmacol. 65(3): 267-272)、リノール酸のヒドロペルオキシド誘発性の毒性に対する内皮細胞における保護効果(Kaneko and Baba (1999) Biosci Biotechnol. Biochem 63(2): 323-328)、ＣＯＸ−１阻害活性(Wang (2000) Phytomedicine 7: 15-19)およびプロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ(Kalkbrenner et al. (1992) Pharmacology 44(1): 1-12)、のために必要なＢ環の置換が強調された。いくつかの公開公報のみが、フリーのＢ環のフラボノイドの置換されていないＢ環の有意性を述べているに過ぎない。一例は、ＮＡＤＰＨによるキノンを受容体とする酸化還元酵素を阻害する、可能性のある抗凝固薬としての２−フェニルフラボンの使用である。(Chen et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 61(11): 1417-1427)。
【００１９】
様々なフリーのＢ環のフラボノイドの抗炎症活性に関する作用機序は、議論の的となってきた。フリーのＢ環のフラボノイドであるクリシン(Liang et al. (2001) FEBS Lett. 496(1): 12-18)、オウゴニン(Chi et al. (2001) Biochem, Pharmacol. 61: 1195-1203)およびハランギン(halangin)(Raso et al. (2001) Life Sci. 68(8): 921-931)の抗炎症活性は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲγ）の活性化を経ての誘導型シクロオキシゲナーゼおよび一酸化窒素合成酵素の抑制、および脱顆粒およびＡＡ放出への影響に関係付けられた。(Tordera et al. (1994) Z, Naturforsch [C] 49: 235-240)。オロキシリン、バイカレインおよびオウゴニンは、シクロオキシゲナーゼに影響を及ぼすことなく１２−リポオキシゲナーゼ活性を阻害することが報告された。(You et al. (1999) Arch. Pharm. Res. 22(1): 18-24)。より最近ではオウゴニン、バイカリン、バイカレインの抗炎症活性は、一酸化窒素阻害薬およびリポ多糖により誘導される、誘導型一酸化窒素合成酵素およびｃｏｘ−２遺伝子発現の阻害を通して起こるものとして報告された。(Chen et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 61(11): 1417-1427)。オロキシリンは、ＮＦκＢ活性化の抑制により作用することもまた報告された。(Chen et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 61(11): 1417-1427)。最後にオウゴニンは報告によれば、マクロファージにおける誘導型ＰＧＥ２の産生を阻害する。(Wakabayashi and Yasui (2000) Eur. J. Pharmacol. 406(3): 477-481)。
【００２０】
バイカレインによるマイトジェン活性化プロテインキナーゼのリン酸化の阻害、およびＣａ２＋イオノフォアＡ２３１８７に誘導されるＰＧＥ２放出の阻害が、オウゴン(Scutellariae radix)の抗炎症活性の機序として報告された。(Nakahata et al. (1999) Nippon Yakurigaku Zasshi, 114, Supp. 11: 215P-219P; Nakahata et al. (1998) Am. J. Chin Med. 26: 311-323)。コガネバナ(Scutellaria baicalensis)由来のバイカリンは、報告によればスーパー抗原であるブドウ球菌の外毒素に刺激されるＴ細胞の増殖およびＩＬ−１β、ＩＬ−６、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の産生を阻害する(Krakauer et al. (2001) FEBS Lett. 500: 52-55)。このようにバイカリンの抗炎症活性は、スーパー抗原により活性化される前炎症サイトカインを介してのシグナル経路を阻害することに関係付けられた。しかしバイカリンの抗炎症活性は、様々なケモカインの結合によるものであり、そのことがそれらの生物学的活性を制限することもまた提案された。(Li et al. (2000) Immunopharmacology 49: 295-306)。近年、トロンビンおよびトロンビン受容体アゴニストのペプチドにより誘導される接着分子の発現におけるバイカリンの効果(Kimura et al. (2001) Planta Med. 67: 331-334)、ならびにマイトジェン活性化プロテインキナーゼカスケード（ＭＡＰＫ）の阻害(Nakahata et al. (1999) Nippon Yakurigaku Zasshi, 114, Supp. 11: 215P-219P; Nakahata et al. (1998) Am. J. Chin Med. 26: 311-323)が報告された。
【００２１】
漢方医学の植物であるコガネバナは、バイカレイン、バイカリン、オウゴニンおよびバイカレノシド(baicalenoside)を含むフリーのＢ環のフラボノイドの有意な量を含有する。伝統的にこの植物は、clearing away heat、purging fire（発熱）、dampness-warm、およびsummer fever症候群；高熱に起因する煩渇多飲；カルブンケル、びらん、およびその他の化膿性皮膚感染；上気道感染、例えば扁桃炎、咽頭喉頭炎および猩紅熱；ウイルス性肝炎；腎炎；骨盤炎；赤痢；吐血および鼻出血を含む多数の状態を治療するために使用されてきた。この植物はまた伝統的に流産の予防にも使用されてきた。(Encyclopedia of Chinese Traditional Medicine, ShangHai Science and Technology Press, ShangHai, China, 1998)。臨床的にはスクテラリア属は今日、小児肺炎、小児細菌性下痢、ウイルス性肝炎、急性胆嚢炎、高血圧、切創および手術に起因する局所的な急性の炎症、気管支喘息および上気道感染を治療するために使用される。(Encyclopedia of Chinese Traditional Medicine, ShangHai Science and Technology Press, ShangHai, China, 1998)。気管支喘息の治療のためのスクテラリア属の根の薬理学的効能は、報告によればフリーのＢ環のフラボノイドの存在、および好酸球の漸増にかかわるエオタキシンのそれらによる抑制に関する。(Nakajima et al. (2001) Planta Med. 67(2): 132-135)。
【００２２】
今日までに、天然に生成されるフリーのＢ環のフラボノイドの多数が、様々な用途で市販されてきた。例えばスクテラリア属の抽出物のリポソーム製剤は、スキンケアに使用された（米国特許第５，６４３，５９８号；５，４４３，９８３号）。バイカリンは、腫瘍形成遺伝子におけるその阻害効果により、癌の予防に使用された（米国特許第６，２９０，９９５号）。バイカリンおよびその他の化合物は、抗ウイルス、抗菌および免疫調節の薬剤として（米国特許第６，０８３，９２１号およびＷＯ９８/４２３６３）、そして天然の抗酸化体として（ＷＯ９８/４９２５６およびポーランド公開公報第９，８４９，２５６号）使用された。コガネバナの根の抽出物は、局所製剤中の各々の個別の成分による累加的なＳＰＦの付加効果を有する補足的なサンスクリーン剤として製剤化された（ＷＯ９８/１９６５１）。クリシンは、その不安の低減特性に関して使用された（米国特許第５，７５６，５３８号）。抗炎症フラボノイドは、肛門直腸および結腸の疾患のコントロールおよび治療（米国特許第５，８５８，３７１号）、ならびにリポキシゲナーゼの阻害（米国特許第６，２１７，８７５号）のために使用されている。これらの化合物はまた、結合組織の補修および維持のため、グルコサミンコラーゲンおよびその他の成分と共に製剤化された（米国特許第６，３３３，３０４号）。フラボノイドエステルは美容組成物用の活性成分を構成する（米国特許第６，２３５，２９４号）。“効能あるＣＯＸ−２阻害薬としてのフリーのＢ環のフラボノイドの同定”という表題の、２００２年３月１日に提出された米国特許出願第１０/０９１，３６２号、および“療法薬としてのフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの混合物の製剤”という表題の、２００３年７月２２日に提出された米国特許出願第１０/４２７，７４６号の双方は、フリーのＢ環のフラボノイドを包含する組成物、またはフリーのＢ環のフラボノイドの混合物を含有する組成物を、それを必要とするホストに投与することによる、シクロオキシゲナーゼ酵素のＣＯＸ−２を阻害するための方法を開示している。これは、フリーのＢ環のフラボノイドおよびＣＯＸ−２阻害活性との間のリンクに関する最初の報告である。これらの出願を特定的にそれらの全内容において当明細書にて参照として援用する。
【００２３】
日本特許第６３０２７４３５号は、バイカレインの抽出および強化について記載しており、日本特許第６１０５０９２１号は、バイカリンの精製について記載している。
フラバンは以下の一般構造：
【００２４】
【化３】
0004769184.tif 000004
【００２５】
により示す化合物を含み、
式中
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＣＨ３、−ＳＣＨ３、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＲＨ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−；ガレート、アセテート、シンナモイルエステルおよびヒドロキシル−シンナモイルエステル、トリヒドロキシベンゾイルエステル、およびカフェオイルエステル、ならびにそれらの化学的誘導体を含むがこれに限定されない、記載した置換基のエステル；アルドペントース、メチルアルドペントース、アルドヘキソース、ケトヘキソースおよびそれらの化学的誘導体を含むがこれに限定されない、単一の糖または複数の糖の組み合わせの炭素、酸素、窒素またはイオウのグリコシド；ダイマー、トリマーおよびその他のポリマー化したフラバン、から成る群から独立して選択される；
式中
Ｒは１ないし１０の炭素原子を有するアルキル基である；そして
Ｘは、ヒドロキシル、塩化物、ヨウ化物、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フッ化物およびカルボネート等を含むがこれに限定されない、医薬的に受容可能な対アニオンの群から選択される。
【００２６】
カテキンは、最初に緑茶中に発見された、以下の構造：
【００２７】
【化４】
0004769184.tif 000005
【００２８】
を有するフラバンである。カテキンは単独で、および茶葉中に見出される他のフラボノイドと共にのいずれでも作用し、抗ウイルス活性および抗酸化活性の双方を有する。カテキンは、ウイルス性肝炎の治療に有効であることが示された。カテキンはまた、心臓、腎臓、肺および脾臓への酸化的損傷を予防すると考えられており、胃癌細胞の成長を阻害することが示された。
【００２９】
カテキンおよびその異性体のエピカテキンは、プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼを４０μＭのＩＣ５０値で阻害する。(Kalkbrenner et al. (1992) Pharmacol. 44: 1-12)。以下の４種の植物：アツナ・ラセモサ(Atuna racemosa)、シジギューム・カリノカルプム(Syzygium carynocarpum)、マレーフトモモ(Syzygium malaccense)およびバンタネア・ペルビアナ(Vantanea peruviana)から単離された、（＋）−カテキンおよびガロカテキンを含む５つのフラバン−３−オル誘導体は、３．３μＭから１３８μＭの範囲のＩＣ５０値で、ＣＯＸ−１との関連においてＣＯＸ−２に対して等しいからより弱い阻害活性を示す(Noreen et al. (1988) Planta Med. 64: 520-524)。バンヤノキ(Ceiba pentandra )の樹皮から単離された（＋）−カテキンは、８０μＭのＩＣ５０値でＣＯＸ−１を阻害する(Noreen et al. (1988) J. Nat. Prod. 61: 8-12)。市販品より入手可能な純粋な（＋）−カテキンは、実験条件に依存しておよそ１８３から２７９μＭのＩＣ５０値でＣＯＸ−１を阻害し、ＣＯＸ−２への選択性はない (Noreen et al. (1998) J. Nat. Prod. 61: 1-7)。
【００３０】
緑茶カテキンは、スップラーグ・ダウレイ(Sprague dawley) 雄ラットの食餌に補充した場合、血小板ＰＬＡ２の活性レベルを低下させ、血小板シクロオキシゲナーゼレベルを有意に低下させた。(Yang et al. (1999) J. Nutr. Sci. Vitaminol. 45: 337-346)。カテキンおよびエピカテキンは報告によれば、ヒト結腸癌ＤＬＤ−１細胞におけるｃｏｘ−２遺伝子の転写を軽度に抑制する（ＩＣ５０＝４１５．３μＭ）。(Mutoh et al. (2000) Jpn. J. Cancer Res. 91: 686-691)。赤ワイン由来の（＋）−カテキンの神経保護能力は、細胞内酵素、例えばシクロオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ、または一酸化窒素合成酵素への阻害効果よりむしろ、カテキンの抗酸化特性に起因する(Bastianetto et al. (2000) Br. J. Pharmacol. 131: 711-720)。緑茶および紅茶から精製されたカテキン誘導体、例えばエピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピカテキン−３−ガレート（ＥＣＧ）、およびテアフラビンは、ヒト結腸粘膜および結腸腫瘍組織におけるシクロオキシゲナーゼおよびリポキシゲナーゼに依存するＡＡの代謝 の阻害(Hong et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 62: 1175-1183)、ならびにｃｏｘ−２発現およびＰＧＥ２産生の誘導 の阻害(Park et al. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 286: 721-725)を示した。ツルウメモドキ(Celastrus orbiculatus)の地上に出ている部分から単離されたエピアフゼレチン(epiafzelechin)は、１５μＭのＩＣ５０値で用量依存性のＣＯＸ−１活性の阻害を示し、１００ｍｇ/ｋｇの投与量での経口投与後のカラゲニン誘発性マウス足底浮腫に対する抗炎症活性もまた示した。(Min et al. (1999) Planta Med. 65: 460-462)。
【００３１】
アカシアは、マメ科の木および低木の属である。アカシア属は、マメ科のファミリーおよびネムノキ亜科のサブファミリーに属する１０００種以上を含む。アカシアは中央アメリカおよび南部アメリカ、アフリカ、アジアの一部、ならびにオーストラリアの熱帯地域および亜熱帯地域において世界的に広く分布し、固有種の最大数を有する。アカシアは経済的に非常に重要であり、タンニン、ゴム、材木、燃料および家畜の飼料の原料を提供する。タンニンは主として樹皮から単離され、獣の皮および皮膚のなめしに広く使用される。一部のアカシアの樹皮はまた、地酒の風味付けにも使用される。エダウチクサネム(A. sinuate) のような一部の自生種はまたサポニンを産するが、これは水と混合し激しく撹拌すると石鹸の泡を形成する多様な植物性グルコシドのいずれかである。サポニンは、洗剤、発泡剤およびエマルジョン化剤中に使用される。一部のアカシア種の花は香りがよく、香水を製造するために使用される。多くのアカシアの芯材は、農機具を製造するために使用され、薪の原料もまた提供する。アカシアゴムは薬剤および製菓中に、そして繊維産業におけるにじみ止め剤および仕上げ剤として広範囲な使用が認められている。
【００３２】
今日まで、およそ３３０の化合物が様々なアカシア種から単離された。フラボノイドは、アカシアから単離される化合物の主要なクラスである。およそ１８０の異なるフラボノイドが同定され、そのうち１１１がフラバンである。テルペノイドはアカシア属の種から単離される化合物の第２の大きなクラスであり、４８の化合物が同定されている。アカシアから単離される化合物のその他のクラスには、アルカノイド（２８）、アミノ酸/ペプチド（２０）、タンニン（１６）、炭水化物（１５）、酸素の複素環（１５）、および脂肪族化合物（１０）を含む。(Buckingham, The Combined Chemical Dictionary, Chapman & Hall CRC, version 5:2、２００１年１２月)。
【００３３】
フェノール化合物、特にフラバンは、すべてのアカシア種において中程度から高い濃度で見出される。(Abdulrazak et al. (2000) Journal of Animal Sciences. 13: 935-940)。歴史的には、アカシア属の植物および抽出物のほとんどは、胃腸障害、下痢、消化不良を治療するため、および止血のための収斂剤として利用されてきた。(Vautrin (1996) Universite Bourgogne (France) European abstract 58-01C: 177; Saleem et al. (1998) Hamdard Midicus. 41: 63-67)。アラビアゴムモドキ(Acacia arabica Willd.)の樹皮およびさやは、多量のタンニンを含有し、収斂剤および去痰剤として利用されてきた。(Nadkarni (1996) India Materia Medica, Bombay Popular Prakashan, pp. 9-17)。ソマリア産のアカシア・トルティリス(Acacia tortilis) の幹の樹皮から単離されたジアリールプロパノール誘導体は、平滑筋弛緩効果を有することが報告された。(Hagos et al. (1987) Planta Medica. 53: 27-31, 1987)。アカシア・ビクトリア(Acacia victoriae) から単離されたテルペノイドサポニンは、ジメチルベンゾアントラセンに誘発されるハツカネズミの皮膚の発癌において阻害効果を有し(Hanausek et al. (2000) Proceedings American Association for Cancer Research Annual Meetig 41: 663)、アポトーシスを誘発する(Haridas et al. (2000) Proceedings American Association for Cancer Research Annual Meetig 41: 600)ことがまた報告された。アカシア・ニロティカ(Acacia nilotica)由来の植物抽出物は、痙縮薬、血管収縮薬、および降圧薬の活性を有し (Amos et al. (1999) Phytotherapy Research 13: 683-685; Gilani et al. (1999) Phytotherapy Research. 13: 665-669)、抗血小板凝集活性を有する(Shah et al. (1997) General Pharmacology. 29: 251-255)ことが報告された。抗炎症活性がアカシア・ノルティカについて報告された。フラボノイド、多糖および有機酸は潜在的な活性成分であることが推測された。(Dafallah and Al-Mustafa (1996) American Journal of Chinese Medicine. 24: 263-269)。今日までに唯一報告された、アカシアから単離された５−リポキシゲナーゼ阻害薬はモノテルペノイドのカルボキサミドである(Seikine et al. (1997) Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 45: 148-11)。
【００３４】
アカシア の樹皮由来の抽出物は、ホワイトニング剤(Abe、日本特許１００２５２３８)として、歯科での適用のためのグルコシルトランスフェラーゼ阻害薬(Abe、日本特許０７２４２５５５)として、タンパク質合成阻害薬(Fukai、日本特許０７１６５５９８)として、皮膚外用調製剤用の活性酸素掃徐剤(Honda、日本特許０７０１７８４７、Bindra 米国特許第６，１２６６，９５０号)として、および炎症、花粉症および咳を予防するための経口消費用ヒアルロンダーゼ阻害薬（Ogura、日本特許０７０１０７６８）として、外用の使用について日本で特許が取得されている。
【００３５】
今日までに、哺乳動物の皮膚の状態に有意な利益をもたらすＣＯＸ/ＬＯＸ酵素の二重の阻害のための、主な生物学的活性成分としてフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンのみを組み合わせている製剤に関するいかなる報告も目にしてはいない。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
（発明の概要）
本発明は、皮膚に関連する疾患および状態の予防および治療に使用するための、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）およびリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）の酵素の双方を同時に阻害する上で有効である方法を含む。ＣＯＸおよびＬＯＸの酵素を同時に二重に阻害するための方法は、合成されたおよび/または単一の植物もしくは複数の植物から単離された、フリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの混合物で構成される組成物を、それを必要とするホストに、好ましくは局所的に投与することで構成される。ここで問題とする組成物を、当明細書においてソリプリン (Soliprin)（登録商標）と言う。本方法の効能は、異なる細胞株にて、複数の動物モデルにて、そして最終的にはヒトの臨床試験にて、精製された酵素を用いて示した。本組成物中のフリーのＢ環のフラボノイド  対  フラバンの比率は、９９．９：０．１のフリーのＢ環のフラボノイド：フラバンから、０．１：９９．９のフリーのＢ環のフラボノイド：フラバンの範囲とすることができる。本発明の具体的な態様においてフリーのＢ環のフラボノイド  対  フラバンの比率は、およそ９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０および１０：９０から成る群から選択される。本発明の好ましい態様において、ここで問題とする組成物中のフリーのＢ環のフラボノイド：フラバンの比率は、８０：２０である。好ましい態様においてフリーのＢ環のフラボノイドは、植物のスクテラリア属の１つまたは複数の植物から単離され、フラバンは、植物のアカシア属の１つまたは複数の植物から単離される。
【００３７】
本発明はまた、ＣＯＸおよびＬＯＸを介した皮膚の疾患および状態の予防および治療のための方法を含む。ＣＯＸおよびＬＯＸを介した皮膚の疾患および状態を予防および治療するための方法は、それを必要とするホストに、合成されたおよび/または単一の植物もしくは複数の植物から単離された、フリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの混合物、および医薬的に受容可能な担体を包含する組成物の有効量を、好ましくは局所的に投与することで構成される。該組成物中のフリーのＢ環のフラボノイド  対  フラバンの比率は、９９．９：０．１のフリーのＢ環のフラボノイド：フラバンから、０．１：９９．９のフリーのＢ環のフラボノイド：フラバンの範囲とすることができる。本発明の具体的な態様においてフリーのＢ環のフラボノイド  対  フラバンの比率は、およそ９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０および１０：９０から成る群から選択される。本発明の好ましい態様において、ここで問題とする組成物中のフリーのＢ環のフラボノイド：フラバンの比率は、８０：２０である。好ましい態様においてフリーのＢ環のフラボノイドは、植物のスクテラリア 属の１つまたは複数の植物から単離され、フラバンは、植物のアカシア属の１つまたは複数の植物から単離される。
【００３８】
以下の発明に従って使用することのできるフリーのＢ環のフラボノイドは、当明細書においてフリーのＢ環のフラボンおよびフラボノールとも言うが、以下の一般構造：
【００３９】
【化５】
0004769184.tif 000006
【００４０】
により示す化合物を含み、
式中
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−；アルドペントース、メチル−アルドペントース、アルドヘキソース、ケトヘキソースおよびそれらの化学的誘導体を含むがこれに限定されない、単一の糖または複数の糖の組み合わせの炭素、酸素、窒素またはイオウのグリコシド、から成る群から独立して選択される；
式中
Ｒは１ないし１０の炭素原子を有するアルキル基から選択される；そして
Ｘは、ヒドロキシル、塩化物、ヨウ化物、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フッ化物、カルボネート等を含むがこれに限定されない、医薬的に受容可能な対アニオンの群から選択される。
【００４１】
本発明のフリーのＢ環のフラボノイドは合成法により得てもよいし、以下のバンレイシ科(Annonaceae)、キク科(Asteraceae)、ノウゼンカズラ科(Bignoniaceae)、シクシン科(Combretaceae)、キク科(Compositae)、トウダイグサ科(Euphorbiaceae)、シソ科(Labiatae)、ラウランセアエ(Lauranceae)、マメ科(Leguminosae)、クワ科(Moraceae)、マツ科(Pinaceae)、ワラビ科(Pteridaceae)、シノプテリダセアエ(Sinopteridaceae)、ニレ科(Ulmaceae)およびジンギベラセアエ(Zingiberacea) を含むがこれに限定されない植物のファミリーから抽出してもよい。フリーのＢ環のフラボノイドは、デスモス(Desmos )、キク科(Achyrocline)、オロキシルム(Oroxylum)、ブケナビア(Buchenavia)、アナファリス (Anaphalis)、コツラ(Cotula)、キク科ヤマハハコグサ属(Gnaphalium)、ヘリクリサム属(Helichrysum)、キク科セントウレア属(Centaurea)、キク科ヒヨドリバナ属(Eupatorium)、キク科サワギク属(Baccharis)、トウダイグサ科(Sapium)、スクテラリア属(Scutellaria)、モルサ(Molsa)、コレブロッケア(Colebrookea)、シソ科スタキス属(Stachys)、シソ科オリガナム属(Origanum)、ジジフォラ(Ziziphora)、クスノキ科クロモジ属(Lindera)、クスノキ科カゴノキ属(Actinodaphne)、アカシア属(Acacia)、マメ科デリス属(Derris)、マメ科カンゾウ属(Glycyrrhiza)、マメ科ナツフジ属(Millettia)、マメ科クロヨナ属(Pongamia)、テフォロシア(Tephrosia)、クワ科アルトカルプス属(Artocarpus)、フィクス(Ficus)、キンシダ科(Pityrogramma)、ノトラエナ(Notholaena)、マツ科マツ属(Pinus)、ニレ科ニレ属(Ulmus)およびショウガ科アルピニア属(Alpinia) を含むがこれに限定されないhigh plantsの属から抽出、濃縮、および精製することができる。
【００４２】
以下の発明に従って使用することのできるフラバンは、以下の一般構造：
【００４３】
【化６】
0004769184.tif 000007
【００４４】
により示す化合物を含み、
式中
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＣＨ３、−ＳＣＨ３、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＲＨ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−；ガレート、アセテート、シンナモイルエステルおよびヒドロキシル−シンナモイルエステル、トリヒドロキシベンゾイルエステル、およびカフェオイルエステルを含むがこれに限定されない、記載した置換基のエステル；アルドペントース、メチルアルドペントース、アルドヘキソース、ケトヘキソースおよびそれらの化学的誘導体を含むがこれに限定されない、単一の糖または複数の糖の組み合わせの炭素、酸素、窒素またはイオウのグリコシド；ダイマー、トリマーおよびその他のポリマー化したフラバン、から成る群から独立して選択される；
式中
Ｒは１ないし１０の炭素原子を有するアルキル基から選択される；そして
Ｘは、ヒドロキシル、塩化物、ヨウ化物、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フッカ物、カルボネート等を含むがこれに限定されない、医薬的に受容可能な対アニオンの群から選択される。
【００４５】
本発明のフラバンはアカシア属から選択される１つまたは複数の植物から得てもよい。好ましい態様において該植物は、アセンヤクノキ(Acacia catechu)、アカシア・コンシナ(Acacia concinna)、キンゴウカン(Acacia farnesiana)、アカシア・セネガル(Acacia Senegal)、アカシア・スペシオサ(Acacia speciosa)、アカシア・アラビカ(Acacia Arabica)、アカシア・カエシア(A. caesia)、アカシア・ペンナタ(A.pennata)、アカシア・シヌアテ(A. sinuate)、モリシマアカシア(A. mearnsii)、アカシア・ピクナンタ(A. picnantha)、ミモザ(A. dealbata)、カマバアカシア(A. auriculiformis)、アカシア・ホロセレシア(A. holoserecia)およびアカシア・マンギューム(A. mangium)から成る群から選択される。
【００４６】
１つの態様において本発明は、日光による熱傷、熱による熱傷、ざ瘡、局所的創傷、真菌、細菌およびウイルスの感染を原因とする軽症の炎症の状態、白斑、全身性紅斑性狼瘡、乾癬、癌、黒色腫、ならびにその他の哺乳動物の皮膚癌を含むがこれに限定されない、ＣＯＸおよびＬＯＸを介した多数の皮膚の疾患および状態を予防および治療するための方法を含む。もう１つの態様において本発明は、紫外線（ＵＶ）放射、化学物質、熱、風および乾燥の環境への暴露に起因する皮膚の損傷を予防および治療するための方法を含む。なおもう１つの態様において本発明は、小じわ、皮膚のたるみ、目の周囲のしわおよびくま、皮膚病およびその他のアレルギーに関連する皮膚の状態を含む。
【００４７】
本発明はさらに、本発明の療法薬を包含する療法組成物を含む。上に記載した皮膚の疾患および状態の予防および治療のためのそれらの使用に加えて、当明細書に記載する療法組成物はまた、過敏な皮膚を和らげるため、そして弾力性の改善された滑らかな若々しい皮膚、低減され遅延された老化、高められた若々しい外観および皮膚のきめ、ならびに増加された柔軟性、はり、滑らかさおよびしなやかさを提供するために使用することができる。
【００４８】
本発明に従っての予防法および治療法は、単一の材料または複数の材料から単離されたフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンを製剤化したものの療法的有効量を、それを必要とするホストに、局所的に投与することを包含する。個々のフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバン、ならびに/または複数のフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの混合物の純度は、該化合物（単数または複数）を得るために使用する方法に依存して、０．０１％から１００％を含むがこれに限定されない。好ましい態様において、該化合物を含有するフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの混合物の用量は、局所用製剤の総重量を基準として０．００１％から１００％の範囲から一般に選択される、効能のある非毒性の量である。ルーチーンの臨床検査を使用する当業者は、治療する特定の病気に関する至適用量を決定することができるだろう。
【００４９】
本発明は、製剤を至適化し、所望の生理学的活性を得るための、酵素モデルおよびin vivoのモデルを使用しての、フリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの種々の組成物の評価を含む。本製剤の効能および安全性はまた、ヒトの臨床試験においても示す。本発明の組成物は、当業者に知られているあらゆる技術により投与することができる。投与の形式は、腸溶性（経口）投与、非経口（静脈内、皮下および筋肉内）投与、ならびに局所塗布を含むがこれに限定されない。好ましい態様において本発明に従っての治療法は、それを必要とするホストに、合成されたおよび/または単一の植物もしくは複数の植物から単離されたフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの混合物の療法有効量を、局所的に投与することを包含する。
【００５０】
前述の一般的な記載および以下の詳細な記載の双方とも、代表的および説明的なものに過ぎず、請求項のように本発明を制限する訳ではないことと、理解されなければならない。
（発明の詳細な説明）
本発明の側面に言及するため、様々な用語を当明細書において使用する。本発明の構成要素の記載を明確にする手助けとなるよう、以下の定義を提供する。
【００５１】
“ａ”“ａｎ”という用語を冠詞とする実体は、１つまたはそれより多くのその実体を言うことに注意しなければならない；例えばa flavonoid（フラボノイド）は、１つまたはそれより多くのフラボノイドを言う。このように“ａ”または“ａｎ”、“１つまたはそれより多く”、および“少なくとも１つ”と言う用語は、当明細書において互変性を持って使用する。
【００５２】
“フリーのＢ環のフラボノイド”は当明細書で使用する場合フラボノイドの１つの特定のクラスであり、以下の一般構造：
【００５３】
【化７】
0004769184.tif 000008
【００５４】
により示すように、芳香族のＢ環に置換基を有していない、
式中
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−；アルドペントース、メチル−アルドペントース、アルドヘキソース、ケトヘキソース、およびそれらの化学的誘導体を含むがこれに限定されない、単一の糖または複数の糖の組み合わせの炭素、酸素、窒素またはイオウのグリコシド、から成る群から独立して選択される；
式中
Ｒは１ないし１０の炭素原子を有するアルキル基である；そして
Ｘは、ヒドロキシル、塩化物、ヨウ化物、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フッ化物、カルボネート等を含むがこれに限定されない、医薬的に受容可能な対アニオンの群から選択される。
【００５５】
“フラバン”は当明細書で使用する場合フラボノイドの１つの特定のクラスを言い、以下の一般構造：
【００５６】
【化８】
0004769184.tif 000009
【００５７】
により一般的に表すことができる、
式中
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＣＨ３、−ＳＣＨ３、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＲＨ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−；ガレート、アセテート、シンナモイルエステルおよびヒドロキシル−シンナモイルエステル、トリヒドロキシベンゾイルエステル、およびカフェオイルエステル、ならびにそれらの化学的誘導体を含むがこれに限定されない置換基のエステル；アルドペントース、メチルアルドペントース、アルドヘキソース、ケトヘキソースおよびそれらの化学的誘導体を含むがこれに限定されない、単一の糖または複数の糖の組み合わせの炭素、酸素、窒素またはイオウのグリコシド；ダイマー、トリマーおよびその他のポリマー化したフラバン、から成る群から独立して選択される；
式中
Ｒは１ないし１０の炭素原子を有するアルキル基である；そして
Ｘは、ヒドロキシル、塩化物、ヨウ化物、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フッ化物、カルボネート等を含むがこれに限定されない、医薬的に受容可能な対アニオンの群から選択される。
【００５８】
“療法的”は当明細書で使用する場合、治療および/または予防を含む。同用語を使用する場合、療法的という用語は、ヒトならびにその他の動物に対して言う。
“医薬的にまたは療法的に有効な用量または量”は、所望の生物学的結果を誘導するのに十分な投与量レベルを言う。この結果は、疾患の兆候、症状または原因の軽減でもよいし、所望される生物学的な系のあらゆるその他の変化でもよい。
【００５９】
“プラセボ”は、疾患の兆候、症状または原因を軽減すると思われる所望の生物学的（系）を誘導するのに十分な、医薬的または療法的に有効な用量または投与量の代替物で活性物質を含まないものを言う。
【００６０】
“ホスト”または“患者”は、当明細書に記載した組成物を投与する、生きている被験者、すなわちヒトまたは動物である。したがって当明細書に記載する本発明は、獣医学的にならびにヒトへの適用として使用してよく、“患者”または“ホスト”という用語は、限定するものと解釈されるべきではない。獣医学的適用のケースでは、投与量の範囲は動物の体重を考慮して後述するように決定することができる。
【００６１】
本出願を通して様々な引用文献を提供していることに注目されたい。各引用文献をその全内容において当明細書にて参照として特定して援用する。
当発明は、フリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンを含有する植物の、有機溶媒および水性溶媒による抽出法（実施例１、表１）を提供する。粗抽出物を、シクロオキシゲナーゼの阻害活性についてアッセイした（実施例２、表２および３）。精製したフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンは、各々実施例３および４に示すように、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）およびリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）に対する阻害活性を示した。抽出物を分析および定量する方法は実施例５および６に記載し、植物の材料から標準化したフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンを生成する方法は、実施例７および８に提供する。
【００６２】
本発明の１つの態様において、標準化したフリーのＢ環のフラボノイド抽出物は、実施例１、２、５および８に定義するようにフリーのＢ環のフラボノイドの総計で１−９９％（重量比）の間の純度を有する活性化合物で構成される。バイカリンは抽出物中の主要な活性成分であり、これはフリーのＢ環のフラボノイドの総計のおよそ５０−９０％（重量比）を占める。好ましい態様においてこの標準化した抽出物は、フリーのＢ環のフラボノイドの総計で＞７０％を含有し、その内、フリーのＢ環のフラボノイドの総計の＞７５％はバイカリンである。
【００６３】
１つの態様において標準化したフラバン抽出物は、実施例１、４，６および７に定義するように、フラバンの総計で１−９９％（重量比）の間の純度を有する活性化合物で構成される。カテキンは抽出物中の主要な活性成分であり、フラバンの総計の５０−９５％（重量比）を占める。好ましい態様において標準化したフラバン抽出物は、フラバンの総計で＞８０％を含有し、その内、フラバンの＞７０％はカテキンである。
【００６４】
１つの態様においてソリプリン（登録商標）は、上の２つの抽出物または合成化合物を９９：１から１：９９の比率で混合することにより製造する。フリーのＢ環のフラボノイド  対  フラバンの好ましい比率は、実施例９および表１０に定義するように８０：２０であり、そして実施例９に定義するように１５：８５である。
【００６５】
ソリプリン（登録商標）中のフリーのＢ環のフラボノイドの濃度は約１％から９９％とすることができ、ソリプリン（登録商標）中のフラバンの濃度は９９％から１％とすることができる。本発明の好ましい態様において、ソリプリン（登録商標）中のフリーのＢ環のフラボノイドの総計の濃度は、ソリプリン（登録商標）の総重量のおよそ１５％のバイカリン含有量を含むおよそ２０％である；そしてソリプリン（登録商標）中のフラバンの総計の濃度は、およそ７０％のカテキン含有量を含むおよそ７５％である。本態様において、ソリプリン（登録商標）中の活性成分の総計（フリーのＢ環のフラボノイド＋フラバン）は、総重量の＞９０％である。
【００６６】
本発明は、皮膚に関連する疾患および状態の予防および治療に使用するための、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）およびリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）の酵素の双方を同時に阻害する上で有効である方法を含む。ＣＯＸおよびＬＯＸの酵素を同時に二重に阻害するための方法は、合成されたおよび/または単一の植物もしくは複数の植物から単離された、フリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの混合物で構成される組成物を、それを必要とするホストに、好ましくは局所的に投与することで構成される。ここで問題とする本組成物を当明細書においてソリプリン（登録商標）と言う。本方法の効能は、異なる細胞株にて、複数の動物モデルにて、そして最終的にはヒトの臨床試験にて、精製された酵素を用いて示した。組成物中のフリーのＢ環のフラボノイド  対  フラバンの比率は、９９．９：０．１のフリーのＢ環のフラボノイド：フラバンから、０．１：９９．９のフリーのＢ環のフラボノイド：フラバンの範囲とすることができる。本発明の具体的な態様においてフリーのＢ環のフラボノイド  対  フラバンの比率は、およそ９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０および１０：９０から成る群から選択される。本発明の好ましい態様において、ここで問題とする組成物中のフリーのＢ環のフラボノイド：フラバンの比率は、２０：８０である。好ましい態様においてフリーのＢ環のフラボノイドは、植物のスクテラリア 属の１つまたは複数の植物から単離され、フラバンは、植物のアカシア属の１つまたは複数の植物から単離される。
【００６７】
本発明はまた、ＣＯＸおよびＬＯＸを介した皮膚の疾患および状態の予防および治療のための方法を含む。ＣＯＸおよびＬＯＸを介した皮膚の疾患および状態を予防および治療するための方法は、合成されたおよび/または単一の植物もしくは複数の植物から単離されたフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの混合物、および医薬的に受容可能な担体で構成される組成物の有効量を、それを必要とするホストに、好ましくは局所的に投与することで構成される。該組成物中のフリーのＢ環のフラボノイド  対  フラバンの比率は、９９．９：０．１のフリーのＢ環のフラボノイド：フラバンから、０．１：９９．９のフリーのＢ環のフラボノイド：フラバンの範囲とすることができる。本発明の具体的な態様においてフリーのＢ環のフラボノイド  対  フラバンの比率は、およそ９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０および１０：９０から成る群から選択される。本発明の好ましい態様において、ここで問題とする組成物中のフリーのＢ環のフラボノイド：フラバンの比率は、２０：８０である。好ましい態様においてフリーのＢ環のフラボノイドは、植物のスクテラリア 属の１つまたは複数の植物から単離され、フラバンは、植物のアカシア属の１つまたは複数の植物から単離される。
【００６８】
１つの態様において本発明は、日光による熱傷、熱による熱傷、ざ瘡、局所的創傷、真菌、細菌およびウイルスの感染を原因とする軽症の炎症の状態、白斑、全身性紅斑性狼瘡、乾癬、癌、黒色腫、ならびにその他の哺乳動物の皮膚癌を含むがこれに限定されない、ＣＯＸおよびＬＯＸを介した多数の皮膚の疾患および状態を予防および治療するための方法を含む。もう１つの態様において本発明は、紫外線（ＵＶ）放射、化学物質、熱、風および乾燥の環境への暴露に起因する皮膚の損傷を予防および治療するための方法を含む。なおもう１つの態様において本発明は、小じわ、皮膚のたるみ、目の周囲のしわおよびくま、皮膚病およびその他のアレルギーに関連する皮膚の状態を含む。
【００６９】
本発明はさらに、本発明の療法薬を包含する療法組成物を含む。上に記載した皮膚の疾患および状態の予防および治療のためのそれらの使用に加えて、当明細書に記載する療法組成物は、過敏な皮膚を和らげるために、そして弾力性の改善された滑らかな若々しい皮膚、低減され遅延された老化、高められた若々しい外観および皮膚のきめ、ならびに増加された柔軟性、はり、滑らかさおよびしなやかさを提供するために使用することができる。
【００７０】
当発明に従って使用することのできるフリーのＢ環のフラボノイドは、前述の一般構造により示した化合物を含む。本発明のフリーのＢ環のフラボノイドは合成法により得てもよいし、バンレイシ科、キク科、ノウゼンカズラ科、シクシン科、キク科、トウダイグサ科、シソ科、ラウランセアエ、マメ科、クワ科、マツ科、ワラビ科、シノプテリダセアエ、ニレ科およびジンギベラセアエを含むがこれに限定されない植物のファミリーから抽出してもよい。フリーのＢ環のフラボノイドは、デスモス、キク科、オロキシルム、ブケナビア、アナファリス、コツラ、キク科ヤマハハコグサ属、ヘリクリサム属、キク科セントウレア属、キク科ヒヨドリバナ属、キク科サワギク属、トウダイグサ科、スクテラリア属、モルサ、コレブロッケア、シソ科スタキス属、シソ科オリガナム属、ジジフォラ、クスノキ科クロモジ属、クスノキ科カゴノキ属、アカシア属、マメ科デリス属、マメ科カンゾウ属、マメ科ナツフジ属、マメ科クロヨナ属、テフォロシア、クワ科アルトカルプス属、フィクス、キンシダ科、ノトラエナ、マツ科マツ属、ニレ科ニレ属およびショウガ科アルピニア属を含むがこれに限定されないhigh plantsの属から抽出、濃縮、および精製することができる。
【００７１】
フラボノイドは、茎、茎の皮(bark)、小枝、塊茎、根、根の皮、若芽、種子、根茎、花およびその他の生殖器官、葉およびその他の地上に出ている部分を含むがこれに限定されない、植物の種々の部分に発見することができる。フリーのＢ環のフラボノイドの単離および精製のための方法は、“効能あるＣｏｘ−２阻害薬としてのフリーのＢ環のフラボノイドの同定”という表題の、２００２年３月１日に提出された米国特許出願第１０/０９１，３６２号に記載されており、同文献をその全内容において当明細書にて参照として援用する。
【００７２】
本発明の方法に従って使用することのできるフラバンは、前述の一般構造により示した化合物を含む。本発明のフラバンは、植物のアカシア属から選択される１つまたは複数の植物から単離する。好ましい態様において、該植物はアセンヤクノキ、アカシア・コンシナ、キンゴウカン、アカシア・セネガル、アカシア・スペシオサ、アカシア・アラビカ、アカシア・カエシア、アカシア・ペンナタ、アカシア・シヌアテ、モリシマアカシア、アカシア・ピクナンタ、ミモザ、カマバアカシア、アカシア・ホロセレシアおよびアカシア・マンギュームから成る群から選択される。
【００７３】
フラバンは、茎、茎の皮、幹、幹の樹皮、小枝、塊茎、根、根の皮、若芽、種子、根茎、花およびその他の生殖器官、葉およびその他の地上に出ている部分を含むがこれに限定されない、植物の種々の部分に発見することができる。フラバンの単離および精製のための方法は、“アカシアからのＣｏｘ−２および５−リポキシゲナーゼの二重の阻害薬の単離”という表題の、２００２年３月２２日に提出された米国特許出願第１０/１０４，４７７号に記載されており、同文献をその全内容において当明細書にて参照として援用する。
【００７４】
本発明は、一連のin vivo の炎症および毒性の試験ならびにin vitroの生化学、細胞、および遺伝子発現のスクリーニングを結びつけて、ＣＯＸおよびＬＯＸの酵素活性を特異的に阻害し、ｍＲＮＡの遺伝子発現に影響を与え、炎症を低減する活性な植物抽出物を同定する戦略を与える。ＣＯＸおよびＬＯＸを特異的に阻害する活性な植物抽出物を同定するために、当明細書にて使用する方法は、実施例１および２に、ならびに“効能のあるｃｏｘ−２阻害薬としてのフリーのＢ環のフラボノイドの同定”という表題の、２００２年３月１日に提出された米国特許出願第１０/０９１，３６２号；“アカシアからのＣｏｘ−２および５−リポキシゲナーゼの二重の阻害薬の単離”という表題の、２００２年３月２２日に提出された米国特許出願第１０/１０４，４７７号、および“Ｃｏｘ−２および５−リポキシゲナーゼの二重の阻害活性を有する製剤”という表題の、２００３年４月３０日に提出された米国特許出願第１０/４２７，７４６号に記載されており、これら各文献をその全内容において当明細書にて参照として援用する。
【００７５】
ＣＯＸの阻害を測定するために使用する生化学的アッセイは、ヘムおよびアラキドン酸の存在下でのタンパク質のペルオキシダーゼ活性による。実施例３に記載する本試験は、精製されたフリーのＢ環のフラボノイド、すなわちコガネバナから単離されたバイカリンおよびバイカレイン、ならびにアセンヤクノキから単離されたフラバン抽出物、そして高濃度のフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンを含有する各々の個々の標準化した抽出物は、ＣＯＸ活性を阻害することを示した（図１−５）。加えて、実施例９に示すように調製した、個々の標準化した抽出物の各々の異なる比率を有する組成物（すなわち８０：２０、５０：５０、２０：８０のフリーのＢ環のフラボノイド：フラバン）は、in vitro でのＣＯＸ活性の阻害においてすべて非常に有効であった（図６−８）。アセンヤクノキから単離されたフラバン抽出物によるＬＯＸ活性の阻害は、実施例４に記載するようにin vitroのリポキシゲナーゼのスクリーニングアッセイを用いて評価した。結果を図９に示す。加えて、ＬＯＸ経路でのアラキドン酸の分解、すなわちロイコトリエンＢ４における化合物による阻害を標的とする細胞アッセイは、実施例１０に記載するようにソリプリン（登録商標）サンプルを用いて行った。ソリプリン（登録商標）によるＬＴＢ４の阻害の結果は、図１１および１２に示す。
【００７６】
in vivoの効能は、実施例１１に記載するようにマウスの耳介および足首関節に皮膚刺激物質、例えばＡＡを塗布し、ソリプリン（登録商標）で治療したマウスにおける腫脹の低減を測定することにより示した。結果を図１３および１４に示す。最後に、ＵＶに誘発される皮膚の紅斑の予防および治療におけるソリプリン（登録商標）の局所塗布の効能を、実施例１２および図１５に示す。実施例１２に記載する試験において、フリーのＢ環のフラボノイド:フラバンの８０：２０の混合比のソリプリン（登録商標）を水に溶かし、各々ＵＶ暴露前および暴露後の双方に無毛マウスの皮膚に２種類の濃度で局所的に塗布した。ソリプリン（登録商標）の４群の無毛マウスの紅斑のスコアは、双方の濃度においてそしてＵＶ暴露前または暴露後の塗布時間にかかわりなく、コントロール群およびSooth-A Cain で処置した群の双方における紅斑の重症度および範囲と比較して、すべてのマウスがより小さな皮膚領域にはるかに少ない赤みを示した。
【００７７】
実施例１３（表１１および１２）は、医薬的、皮膚科的および美容的に受容可能な賦形剤を用いたソリプリン（登録商標）クリームの調製のための一般的な方法を記載する。説明を目的として、本実施例は０．５重量％および１．５重量％  ソリプリン（登録商標）クリーム双方の調製に関する詳細な方法を提供する。最後に実施例１３に記載するように調製したソリプリン（登録商標）クリームの双方を、刺激の可能性および接触感作の誘導についてヒトの皮膚で評価した。総計９７および１０１名の被験者が、各々０．５％および１．５％のソリプリン（登録商標）クリームを用いての誘導およびチャレンジを完了した。検査結果は、０．５％および１．５％濃度のソリプリン（登録商標）クリームは最小の刺激にとどまり、誘導された接触感作のエビデンスは認められなかった。
【００７８】
まとめとして、本発明は、ＣＯＸおよびＬＯＸの酵素双方を同時に阻害することにおいて有効である方法を含む。ＣＯＸおよびＬＯＸの経路を同時に二重に阻害するための方法は、合成されたおよび/または単一の植物もしくは複数の植物から単離された、フリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの混合物を包含する組成物を、それを必要とするホストに投与することで構成される。組成物中のフリーのＢ環のフラボノイド  対  フラバンの比率は、９９：１のフリーのＢ環のフラボノイド：フラバンから、１：９９のフリーのＢ環のフラボノイド：フラバンの範囲とすることができる。本発明の具体的な態様においてフリーのＢ環のフラボノイド  対  フラバンの比率は、およそ９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０および１０：９０から成る群から選択される。本発明の好ましい態様において、ここで問題とする組成物中のフリーのＢ環のフラボノイド：フラバンの比率は、およそ２０：８０である。好ましい態様においてフリーのＢ環のフラボノイドは、植物のスクテラリア 属の１つまたは複数の植物から単離され、フラバンは、植物のアカシア属の１つまたは複数の植物から単離される。
【００７９】
本発明はさらにＣＯＸおよびＬＯＸを介した皮膚の疾患および状態の予防および治療のための方法を含む。ＣＯＸおよびＬＯＸを介した皮膚の疾患および状態を予防および治療するための方法は、それを必要とするホストに、合成されたおよび/または単一の植物もしくは複数の植物から単離されたフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの混合物を医薬的に受容可能な担体と共に包含する組成物の有効量を、投与することで構成される。フリーのＢ環のフラボノイド  対  フラバンの比率は、９９：１のフリーのＢ環のフラボノイド：フラバンから、１：９９のフリーのＢ環のフラボノイド：フラバンの範囲とすることができる。本発明の具体的な態様においてフリーのＢ環のフラボノイド  対  フラバンの比率は、およそ９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０および１０：９０から成る群から選択される。本発明の好ましい態様において、ここで問題とする組成物におけるフリーのＢ環のフラボノイド：フラバンの比率は、およそ２０：８０である。好ましい態様においてフリーのＢ環のフラボノイドは、植物のスクテラリア 属の１つまたは複数の植物から単離され、フラバンは、植物のアカシア属の１つまたは複数の植物から単離される。
【００８０】
“アカシアからのＣＯＸ−２および５−リポキシゲナーゼの二重の阻害薬の単離”という表題の、２００２年３月２２日に提出された米国特許出願第１０/１０４，４７７号が、ＣＯＸおよびＬＯＸに対する二重の特異性を示す、植物のアカシア属から単離されたここで問題とする組成物の最初の報告であり、“効能あるＣＯＸ−２阻害薬としてのフリーのＢ環のフラボノイドの同定”という表題の、２００２年３月１日に提出された米国特許出願第１０/０９１，３６２号が、フリーのＢ環のフラボノイド構造およびＣＯＸ阻害活性との間の相関についての最初の報告であると、筆者は思う。これらの発見が、特異的な化合物の２つのクラス−−フリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバン−−の新規混合へと導き、当明細書にてソリプリン（登録商標）として言うここで問題とする組成物を形成するに至ったが、本組成物は、“Ｃｏｘ−２および５−リポキシゲナーゼの二重の阻害活性を有する製剤”という表題の、２００３年４月３０日に提出された米国特許出願第１０/４２７，７４６号に記載されているように、ＣＯＸおよびＬＯＸを介した疾患および状態の予防および治療のために使用することができる。ＣＯＸおよびＬＯＸを介しての疾患および状態は、日光による熱傷、熱による熱傷、ざ瘡、局所的創傷、真菌、細菌およびウイルスの感染を原因とする軽症の炎症の状態、白斑、全身性紅斑性狼瘡、乾癬、癌、黒色腫、ならびにその他の哺乳動物の皮膚癌、ＵＶ放射、化学物質、熱、風および乾燥の環境への暴露に起因する皮膚の損傷、小じわ、皮膚のたるみ、目の周囲のしわおよびくま、皮膚病およびその他のアレルギーに関連する皮膚の状態を含むがこれに限定されない、皮膚の疾患および状態を含むがこれに限定されない。理論により限定する訳ではないが、化合物の本クラスの作用機序は、ＣＯＸおよびＬＯＸ双方の酵素活性の直接的な二重の阻害であると考えられる。
【００８１】
本発明はさらに、その多様な製剤を含む、本発明の療法薬を包含する療法組成物を含む。これら組成物の調整法を、それらの純度および具体的な組成の決定法と合わせて、実施例５−９および図１０に記載する。
【００８２】
好ましい態様において、本発明に従ってのＣＯＸおよびＬＯＸを介した皮膚に関連する疾患および状態の予防法および治療法は、それを必要とするホストに、単一の材料または複数の材料から単離されたフリーのＢ環のフラボノイドおよび/またはフラバンの製剤化されたものの療法的有効量を、局所的に投与することを包含する。個々のおよび/または混合物のフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの純度は、化合物（単数または複数）を得るために使用する方法に依存して、０．０１％から１００％を含むがこれに限定されない。好ましい態様において、該化合物を含有するフリーのＢ環のフラボノイドおよび/またはフラバンの混合物の用量は、局所用製剤の総重量を基準として０．００１％から１００％の範囲から一般に選択される、効能のある非毒性の量である。ルーチーンの臨床検査を使用する当業者は、治療する特定の病気に関する至適用量を決定することができるだろう。
【００８３】
本発明は、以下に記載するように製剤を至適化し、最大の効能を得るための、酵素モデルおよびin vivoの抗炎症モデルを使用してのフリーのＢ環のフラボノイドおよびフランの種々の組成物の評価を含む。本発明は、所望の生理学的活性を有するここで問題とする組成物を得るための、単離、精製、およびアカシアのフラバンとフリーのＢ環のフラボノイドとの組み合わせに関する市販レベルで実行可能な過程を提供する。上記記載の皮膚の疾患および状態の予防および治療へのそれらの使用に加えて、当明細書に記載の療法的組成物はまた、過敏な皮膚を和らげるため、そして弾力性の改善された滑らかな若々しい皮膚、低減され遅延された老化、高められた若々しい外観および皮膚のきめ、ならびに増加された柔軟性、はり、滑らかさおよびしなやかさを提供するために使用することができる。
【００８４】
本発明の組成物は、他の成分、例えば医薬的および/または美容的に受容可能な賦形剤、アジュバント、および/または担体を含む医薬組成物として製剤化することができる。例えば本発明の組成物は、治療するホストが耐えることのできる賦形剤中に製剤化することができる。賦形剤は、薬剤用の希釈剤または媒体として使用される不活性な物質である。このような賦形剤の例は、水、バッファー、食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、マンニトール、ハンクス溶液、保存剤およびその他の水性の生理学的に平衡な塩溶液を含むがこれに限定されない。非水性媒体、例えば固定油、ゴマ油、オレイン酸エチル、またはトリグリセリドもまた使用してよい。他の有用な製剤化物質は、粘性を高める物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有する懸濁液を含む。賦形剤はまた少量の添加剤、例えば等張性および化学的安定性を高める物質を含有することができる。バッファーの例は、リン酸バッファー、重炭酸バッファー、トリスバッファー、ヒスチジン、クエン酸塩、およびグリシン、またはそれらの混合物を含み、保存剤の例はチメロサル、ｍ−またはｏ−クレゾール、ホルマリン、およびベンジルアルコールを含むがこれに限定されない。標準的な製剤は液体または固体のいずれかとすることができ、これらは投与用の懸濁液または溶液として適切な液体中に溶解させることができる。したがって非液体製剤では、賦形剤はデキストロース、ヒト血清アルブミン、保存剤等を包含することができ、投与前にこれらに滅菌した水または食塩水を加えることができる。
【００８５】
本発明の１つの態様において、組成物はまたアジュバントまたは担体を含むことができる。アジュバントは典型的には、特異的な生物活性物質に対する哺乳動物の生物学的応答を一般に高める物質である。適切なアジュバントは、フロイントアジュバント；他の細菌細胞壁成分；アルミニウムベースの塩；カルシウムベースの塩；シリカ；ポリヌクレオチド；トキソイド；血清蛋白質；ウイルスのコートタンパク質；他の細菌由来の調製物質；ガンマインターフェロン；ブロックコポリマーアジュバント、例えばHunter’s Titermax アジュバント(Vaxcel.TM., Inc. Norcross, Ga.)；Ribi アジュバント(Ribi Immuno Chem Research, Inc., Hmilton, Mont.より入手可能)；およびサポニンおよびそれらの誘導体、例えばQuil A (Superfos Biosector A/S, Dnmark より入手可能)を含むが、これに限定されない。担体は典型的には、治療するホストの体内で療法組成物の半減期を延長させる化合物である。適切な担体は、ポリマーのコントロールされた放出の製剤、生体内で分解可能なインプラント、リポソーム、細菌、ウイルス、油、エステル、およびグリコールを含むがこれに限定されない。
【００８６】
１つの態様において組成物は、ホストの体内に本発明の組成物をゆっくり放出する、コントロールされた放出の製剤として調製する。当明細書において使用する場合、コントロールされた放出の製剤は、コントロールされた放出媒体中に本発明の組成物を包含する。適切なコントロールされた放出媒体は、当業者の知るところであろう。好ましいコントロールされた放出の製剤は、生体内で分解可能（すなわち生体内で侵食可能）である。
【００８７】
当発明の療法薬は、軟膏、ゲル、ローション、またはクリームベースとして、またはエマルジョンとして、パッチ、ドレッシングまたはマスク、くっつかないタイプの(nonsticking)ガーゼ、バンデージ、綿棒または拭き取り用の布(cloth wipe)として、を含むがこれに限定されない療法組成物を局所的に投与するための、当業者に知られているあらゆる適切な方法により、好ましくは局所的に投与する。このような局所塗布は、局所投与用に知られているあらゆる標準的な方法を用いて、あらゆる患部に局部的に投与することができる。療法組成物は、投与法に依存して様々なユニット投与剤形で投与することができる。送達の特定の形式用に、本発明の療法組成物を本発明の賦形剤中に製剤化することができる。本発明の療法試薬は、あらゆるホストに、好ましくは哺乳動物に、より好ましくはヒトに投与することができる。投与の特定の形式は、治療する状態に依存することになるだろう。
【００８８】
１つの態様において適切な軟膏は、局所用製剤の総重量を基準として０．００１％から１００％の範囲から一般に選択される効能のある非毒性の量である、所望の濃度のフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの混合物、６５から１００％（好ましくは７５から９６％）の白色軟性パラフィン(soft paraffin)、０から１５％の流動パラフィン、および０から７％（好ましくは３から７％）のラノリンまたはその合成均等物の誘導体で構成される。もう１つの態様において軟膏は、ポリエチレン−流動パラフィンマトリックスを包含してもよい。
【００８９】
１つの態様において適切なクリームは、上に提供したようなフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの混合物の所望の濃度を共に含むエマルジョン化の系で構成される。エマルジョン化の系は好ましくは、２から１０％のポリオキシエチレンアルコール（例えば登録商標セトマクロゴール(Cetomacrogol)（登録商標）１０００にて入手可能な混合物）、１０から２５％のステアリルアルコール、２０から６０％の流動パラフィン、および１０から６５％の水；それと共に１つまたはそれより多くの保存剤、例えば０．１から１％のＮ，Ｎ”−メチレンビス［Ｎ’−［３−（ヒドロキシメチル）−２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル］ウレア］（Imidurea USNF という名称にて入手可能）、０．１から１％のアルキル４−ヒドロキシベンゾエート（例えば登録商標Nipastat にてNipa Laboratories より入手可能な混合物）、０．０１から０．１％のナトリウムブチル４−ヒドロキシベンゾエート（登録商標Nipabutyl sodium にてNipa Laboratories より入手可能）、および０．１から２％のフェノキシエタノール、で構成される。実施例１３は、クリームとしての本発明の組成物の２つの異なる濃度の製剤について記載しており、実施例１４は、皮膚の刺激および感作についてクリームを評価するために施行した試験について記載している。本試験より、ソリプリン（登録商標）は、皮膚の刺激または感作の原因となることなく、効能のある濃度で局所的に塗布することのできる安全な組成物であることが決定された。
【００９０】
１つの態様において適切なゲルは、高度の架橋を伴う３次元のポリマーマトリックス内に液層を閉じ込めている半固体の系で構成される。この液相は、水、それと共に所望の量のフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの混合物、０から２０％の水混和性の添加物、例えばグリセロール、ポリエチレングリコール、またはプロピレングリコール、および０．１から１０％、好ましくは０．５から２％の増粘剤、すなわち天然成分、例えばトラガカント、ペクチン、トチャカ、アガーおよびアルギン酸、または合成もしくは半合成化合物、例えばメチルセルロースおよびカルボキシポリメチレン（カルボポール）としてよい；それと共に１つまたはそれより多くの保存剤、例えば０．１から２％のメチル４−ヒドロキシベンゾエート（メチルパラベン）またはフェノキシエタノール-differentialで構成されてよい。もう１つの適切なベースは、所望の量のフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの混合物、それと共に７０から９０％のポリエチレングリコール（例えば米国処方規定(U.S. National Formulary (USNF))に従って調製された、４０％のポリエチレングリコール３３５０および６０％のポリエチレングリコール４００を含有するポリエチレングリコール軟膏）、５から２０％の水、０．０２から０．２５％の抗酸化剤（例えばブチル化したヒドロキシトルエン）、ならびに０．００５から０．１％のキレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））で構成される。
【００９１】
上で使用したような軟性パラフィンという用語は、クリームまたは軟膏ベースの白色軟性パラフィンおよび黄色軟性パラフィンを包含する。ラノリンという用語は、天然の羊毛脂肪および精製された羊毛脂肪を包含する。ラノリンの誘導体は特に、それらの物理的または化学的特性を変えるために化学的に修飾されたラノリンを含み、ラノリンの合成均等物は特に、医薬および美容の技術分野において、ラノリンの代替物質として知られ使用されている、例えばラノリンの代用品と言ってもよい、合成または半合成の化合物および混合物を含む。
【００９２】
使用してよい１つの適切なラノリンの合成均等物は、ソフチサン(Softisan )６４９ として知られている登録商標ソフチサン（登録商標）にて入手可能な材料である。ソフチサン６４９は、Dynamit Nobel Aktiengesellschaft より入手できるが、天然の植物性脂肪酸、すなわちイソステアリン酸およびアジピン酸のグリセリンエステルである；その特性はH.HermsdorfによりFett, Seifen, Anstrichmittel, Issue No. 84, No.3 (1982), pp. 3-6 に考察されている。
【００９３】
適切な軟膏またはクリームベースの構成成分として、当明細書にて先に述べたその他の物質およびそれらの特性は、標準的な参考文献、例えば薬局方(pharmacopoeia)に考察されている。セトマクロゴール１０００は、式ＣＨ３（ＣＨ２）ｍ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨを有し、式中ｍは１５または１７としてよく、ｎは２０から２４としてよい。ブチル化したヒドロキシトルエンは２，６−ジ−tert−ブチル−ｐ−クレゾールである。ニパスタット(Nipastat)は、メチル、エチル、プロピルおよびブチル４−ヒドロキシベンゾエートの混合物である。
【００９４】
本発明の組成物は従来の医薬的技術により生成してよい。したがって前述の組成物は、例えば高い温度で、好ましくは６０−７０℃で、軟性パラフィン、存在する場合には流動パラフィン、およびラノリンまたはその誘導体またはその合成均等物を合わせて混合することにより従来どおり調製してよい。その後混合物を室温に冷却し、ムピロシンのカルシウム含水塩の結晶を、コルチコステロイドおよびあらゆるその他の成分と共に添加後、撹拌して確実に十分に分散させる。
【００９５】
投与方法にかかわりなく具体的な用量はホストのおよその体重に従って計算される。上述の各製剤を伴う治療のための適当な投与量を決定するのに必要なさらに厳密な計算は、特に当明細書に開示した投与量の情報およびアッセイを照らし合わせて、過度の実験を行うことなく当業者によりルーチーンに施行される仕事の範疇である。これらの投与量は、適当な用量−応答データと共に利用される投与量の決定に関する確立されたアッセイを使用することで、確認してもよい。
【００９６】
当明細書に記載した発明は、獣医ならびにヒトへの適用として使用してよく、“ホスト”という用語は限定するものと解釈されるべきではないことは、注目すべきであろう。獣医的に適用するケースでは、投与量の範囲は、動物の体重を考慮して上に記載したように決定することができる。
【００９７】
本発明の組成物は、当業者に知られているあらゆる方法により投与することができる。投与の形式は、腸溶性（経口）投与、非経口（静脈内、皮下および筋肉内）投与、ならびに局所投与を含むがこれに限定されない。本発明に従っての治療法は、それを必要とするホストに、合成されたおよび/または単一の植物もしくは複数の植物から単離されたフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの混合物の療法有効量を、経口的または局所的に投与することを包含する。好ましい態様において本組成物は局所的に投与する。
【００９８】
以下の実施例は説明を目的として提供しているに過ぎず、発明の範疇を限定する意図はない。
【実施例】
【００９９】
実施例１． アカシア 属およびスクテラリア属の植物からの有機抽出物および水性抽出物の調製
アラビアゴムモドキ(Acacia catechu (L) Willd. )の樹皮、スクテラリア・オルトカリクス(Scutellaria orthocalyx)の根、コガネバナの根、またはスカルキャップ(Scutellaria lateriflora)の植物全体由来の植物の材料を、２ｍｍより大きくない粒度に挽いた。次に挽いた植物の材料を乾燥させたもの（６０ｇ）を 三角フラスコに移し、メタノール：ジクロロメタン（１：１）（６００ｍＬ）を加えた。混合物を１時間振盪し、濾過して、バイオマスからメタノール：ジクロロメタン（１：１）（６００ｍＬ）で再度抽出した。有機抽出液を合わせて真空下で蒸発させ、有機抽出物を提供した（下の表１参照）。有機抽出の後、バイオマスを空気乾燥し、超純水（６００ｍＬ）で１回抽出した。水溶液を濾過、凍結乾燥して、水性抽出物を提供した（下の表１参照）。
【０１００】
【表１】
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【０１０１】
実施例２． アセンヤクノキ、様々なスクテラリア種、およびその他の植物由来の植物抽出物による、ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１のペルオキシダーゼ活性の阻害
特異的なＣＯＸ−２阻害薬の同定に関するスクリーニング法への方向付けを行うバイオアッセイをデザインし、以下に記載するように酵素のペルオキシダーゼ活性のアッセイを行った。
【０１０２】
ペルオキシダーゼアッセイ  ＣＯＸ−２の阻害薬を検出するためのアッセイを、ハイスループットプラットホーム(Raz)用に修飾した。手短には、ペルオキシダーゼバッファー（１００ｍＭ  ＴＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１μＭ  ヘム、１ｍｇ  エピネフリン、０．０９４％  フェノール）中のリコンビナントヒツジＣＯＸ−２(Cayman)を、抽出物（１：５００希釈）と共に１５分間インキュベーションした。クアンタブル（Quantablu ）(Pierce)基質を加え、４５分間２５℃で反応を進行させた。その後発光をWallac Victor 2プレートリーダーを用いて読み取った。結果を表２に示す。
【０１０３】
表２は、構造的に類似するフリーのＢ環のフラボノイドで構成される、アセンヤクノキの樹皮、２種のスクテラリアの根、および３種の他の植物種由来の抽出物を含む５種の植物種から得られた有機抽出物および水性抽出物による、酵素の阻害について示す。データは、リコンビナントヒツジＣＯＸ−２酵素および基質のみのものとの関連における、ペルオキシダーゼ活性のパーセントとして表す。有機抽出物による阻害のパーセントは、３０％から９０％の範囲であった。
【０１０４】
【表２】
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【０１０５】
ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２のアイソフォームの相対的な阻害を比較するには、これら各酵素のＩＣ５０値を得る必要がある。ＩＣ５０は、特定の阻害薬によりコントロールとの関係において酵素活性の５０％の阻害が達成される濃度、として定義される。これらの実験において、ＩＣ５０値は表３に示したように、ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１の酵素に対して、各々６から５０μｇ/ｍＬおよび７から８０μｇ/ｍＬであった。ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１のＩＣ５０値の比較は、これら各酵素に対する多様な植物由来の有機抽出物の特異性を示す。スカルキャップ の有機抽出物は例えば、ＣＯＸ−２のＣＯＸ−１を上回る選択的阻害を示し、各々３０および８０μｇ/ｍＬのＩＣ５０値を有する。一部の抽出物ではＣＯＸ−２の選択的阻害が実証されたが、他は示していない。ＨＴＰ分画およびこれらの分画から精製された化合物を検討するには、これらの抽出物および化合物に関する阻害の厳密な特異性を決定する必要がある。
【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
実施例３． ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２のペルオキシダーゼ活性の阻害
ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の活性を阻害する化合物をスクリーニングするため、双方の酵素のペルオキシダーゼ活性の阻害を利用した、ハイスループットのin vitro のアッセイが開発された。(Needliman et al. (1986) Annu Rev Biochem. 55:69)。手短には、検討する組成物または化合物を、固定された量のＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の酵素に対して滴定した。結合することのできるペルオキシド発色団をアッセイに含めて、補因子としてのアラキドン酸の存在下で各酵素のペルオキシダーゼ活性を視覚化した。典型的にはアッセイは９６ウェルのフォーマットにて行った。１００％ＤＭＳＯ中の１０ｍｇ/ｍＬストック溶液から採取した各阻害剤を、以下の濃度範囲：０、０．１、１、５、１０、２０、５０、１００および５００μｇ/ｍＬを用いて、室温にてトリプルで検査した。各ウェルに１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５  １５０μＬを、トリスバッファー中に希釈した２２μＭ  ヘマチン  １０μＬ、ＤＭＳＯ中に希釈した阻害薬  １０μＬ、およびＣＯＸ−１またはＣＯＸ−２のいずれかの酵素  ２５ユニットと共に添加した。回転式プラットフォーム上で成分を１０秒間撹拌した後、２ｍＭ  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＴＭＰＤ）２０μＬ、および１．１ｍＭ  アラキドン酸  ２０μＬを加えて、反応を開始させた。プレートを１０秒間振盪した後、５分間インキュベーションし、５７０ｎｍの吸収を読んだ。阻害薬の濃度  ｖｓ  阻害％をプｌｏｔし、等温式に沿って最大値の１/２のポイントを取り、Ｘ軸に下ろして濃度を読み取ることにより、ＩＣ５０を決定した。その後ＩＣ５０を、アッセイの酵素ユニットの数値に対して正規化した。結果を表４にまとめる。
【０１０８】
【表４】
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【０１０９】
標準化したフリーのＢ環のフラボノイド抽出物である、バイカリン、およびコガネバナの根から単離したバイカレインに関する用量応答性およびＩＣ５０値を、図１、２および３に各々提供する。アセンヤクノキ の芯材から単離した２種の標準化したフラバン抽出物（各々５０％および＞９０％のフラバン）に関する用量応答性およびＩＣ５０値を、各々図４および５に提供する。フリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの異なる組成の３つの製剤に関する用量応答性およびＩＣ５０値を、各々図６（８０：２０の混合）、図７（５０：５０の混合）および図８（２０：８０の混合）に提供する。
【０１１０】
実施例４． アセンヤクノキから単離されたカテキンによる５−リポキシゲナーゼの阻害
炎症応答に関与する最も重要な経路の１つは、非ヘム鉄を含有するリポキシゲナーゼ（５−ＬＯ、１２−ＬＯ、および１５−ＬＯ）により生成されるが、この酵素は脂肪酸、例えばＡＡ（ＡＡ）への酸素分子の添加を触媒して、ヒドロペルオキシドの５−、１２−および１５−ＨＰＥＴＥを生成し、これが次にロイコトリエンに変換する。A. catechu由来のフラバン抽出物がＬＯＸのある程度の阻害を提供し、それにより５−ＨＰＥＴＥの形成を妨げるのかもしれないという示唆は早期になされた。Lipoxygenase Inhibitor Screening Assay Kit （リポキシゲナーゼ阻害薬スクリーニングアッセイキット）(Cayman Chemical, Inc., Ca# 760700)を使用して、＞９０％のフラバンを含有するA. catechuから単離された抽出物がin vitro でＬＯＸを直接阻害するかどうかを評価した。精密濾過を用いてリン酸バッファーからトリスベースのバッファーにバッファーを変換した後、同キットで規定で使用される大豆由来の１５−ＬＯをポテトＬＯＸに置き換えた。本アッセイは、酸素を探知する発色団を通してヒドロペルオキシドの形成を検出する。手短にはアッセイは、０．１７ユニット/μＬ  ポテト５−ＬＯ  ９０μＬ、１．１ｍＭ  ＡＡ  ２０μＬ、酸素を探知する発色団  １００μＬ、および最終濃度を０から５００μｇ/ｍＬの範囲とする精製したフラバン阻害薬  １０μＬを加えることにより、トリプルで行った。本組成物による５−ＬＯの阻害に関するＩＣ５０は、１．３８μｇ/ｍＬ/酵素ユニットであると決定された。結果を図９に示す。
【０１１１】
実施例５． スクテラリア・オルトカリクス（根）、コガネバナ（根）およびソリザヤノキ(Oroxylum indicum)（種子）から単離された活性抽出物中のフリーのＢ環のフラボノイドのＨＰＬＣによる定量化
実施例１および２に記載したような、３つの異なる植物種から単離した５つの活性抽出物中のフリーのＢ環のフラボノイドの存在および定量をＨＰＬＣにより決定し、結果を以下の表５に示す。フリーのＢ環のフラボノイドを、ＨＰＬＣにより、Ｌｕｎａ  Ｃ−１８カラム（２５０×４．５ｍｍ、５μｍ）にて、２２分で１％リン酸およびアセトニトリルの８０％から２０％の濃度勾配を用いて、定量的に分析した。フリーのＢ環のフラボノイドは、２５４ｎｍでＵＶ検出器を用いて検出し、バイカリン、バイカレイン、およびその他のフリーのＢ環のフラボノイドのスタンダードとの比較により、保持時間に基づいて同定した。
【０１１２】
【表５】
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【０１１３】
実施例６． アセンヤクノキ由来の活性抽出物のＨＰＬＣによる定量化
実施例１および２に示したようにアセンヤクノキから単離した有機抽出物および水性抽出物中のフラバンを、ＨＰＬＣにより、PhotoDiode Array 検出器（ＨＰＬＣ/ＰＤＡ）およびＬｕｎａ  Ｃ−１８カラム（２５０×４．６ｍｍ）を用いて定量した。フラバンは、２０分間にわたるアセトニトリルの１０％から３０％ＡＣＮの濃度勾配、続いて５分間の６０％ＡＣＮを用いて、カラムから溶出させた。結果を表６に示す。フラバンは、カテキンおよびエピカテキンをスタンダードとして使用して保持時間およびＰＤＡデータに基づいて定量した。２つの主要なナフラバンの保持時間は、各々１２．７３分および１５．７６分であった。
【０１１４】
【表６】
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【０１１５】
実施例７． アセンヤクノキ由来の標準化した抽出物の調製
アセンヤクノキ（地中の根  ５００ｍｇ）から、以下の溶媒系  ２５ｍＬで２回（２×２５ｍＬ）抽出した。（１）１００％水、（２）８０：２０  水:メタノール、（３）６０：４０  水:メタノール、（４）４０：６０  水:メタノール、（５）２０：８０  水:メタノール、（６）１００％メタノール、（７）８０：２０  メタノール：ＴＨＦ、（８）６０：４０  メタノール：ＴＨＦ。各々の個別の抽出から２回の抽出物を合わせて、濃縮し、減圧下で乾燥させた。各抽出物中の化学成分の同定は、ＨＰＬＣによりPhotoDiode Array 検出器（ＨＰＬＣ/ＰＤＡ）および２５０ｍｍ×４．６ｍｍ  Ｃ１８カラムを用いて達成した。化学成分は、スタンダードとしてカテキンおよびエピカテキンを用いて、保持時間およびＰＤＡデータに基づいて定量した。結果を表７に示す。表７に示すように、８０％メタノール/水による溶媒抽出から生成されたフラバン抽出物が、最も高濃度のフラバン成分を提供した。
【０１１６】
【表７】
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【０１１７】
より高純度の材料は、再結晶溶媒としてアルコール/水および/または水性溶媒を用いて、８％−１５％の間のカテキン含有量を有する抽出物の再結晶化により得ることができる。抽出物の加熱した飽和溶液に活性炭またはその他の脱色剤を加えることにより、再結晶化の前に脱色することが必要かもしれない。その後加熱した飽和溶液を冷却して、高純度のカテキンを結晶化させた。その後結晶を濾過して溶媒を除去し、乾燥させ、微細な粉末に挽いた。再結晶化は必要なら繰り返し行い、所望のレベルの純度（６０％−１００％のカテキンフラバン）を達成することができる。
【０１１８】
実施例８． 多様なスクテラリア 種由来の標準化したフリーのＢ環のフラボノイド抽出物の調製
スクテラリア・オルトカリクス（地中の根  ５００ｍｇ）を、以下の溶媒系  ２５ｍＬで２回抽出した。（１）１００％水、（２）８０：２０  水:メタノール、（３）６０：４０  水:メタノール、（４）４０：６０  水:メタノール、（５）２０：８０  水:メタノール、（６）１００％メタノール、（７）８０：２０  メタノール：ＴＨＦ、（８）６０：４０  メタノール：ＴＨＦ。抽出物を合わせて、濃縮し、減圧下で乾燥させた。各抽出物中の化学成分の同定は、ＨＰＬＣによりPhotoDiode Array 検出器（ＨＰＬＣ/ＰＤＡ）および２５０ｍｍ×４．６ｍｍ  Ｃ１８カラムを用いて行った。化学成分は、スタンダードとしてバイカレイン、バイカリン、スクテラレイン、およびオウゴニンを用いて、保持時間およびＰＤＡデータに基づいて定量した。結果を表８に示す。
【０１１９】
【表８】
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【０１２０】
コガネバナ（地中の根  １０００ｍｇ）を、以下のような水およびメタノールの混合液  ５０ｍＬを用いて２回抽出した：（１）１００％水、（２）７０：３０  水:メタノール、（３）５０：５０  水:メタノール、（４）３０：７０  水:メタノール、（５）１００％メタノール。抽出物を合わせて、濃縮し、減圧下で乾燥させた。化学成分の同定は、ＨＰＬＣによりPhotoＤiode Array 検出器（ＨＰＬＣ/ＰＤＡ）および２５０ｍｍ×４．６ｍｍ  Ｃ１８カラムを用いて行った。各抽出物中の化学成分は、バイカレイン、バイカリン、スクテラレイン、およびオウゴニンのスタンダードを用いて、保持時間およびＰＤＡデータに基づいて定量した。結果を表９に示す。
【０１２１】
【表９】
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【０１２２】
高純度のフリーのＢ環のフラボノイドは、再結晶溶媒としてアルコール/水を用いて、８％−１５％の間のフリーのＢ環のフラボノイド含有量を有する抽出物の再結晶化により得ることができる。抽出物の加熱した飽和溶液に活性炭またはその他の脱色剤を加えることにより、再結晶化の前に脱色することが必要かもしれない。冷却下でフリーのＢ環のフラボノイドを結晶化させた。結晶を濾過、乾燥させ、微細な粉末に挽いた。再結晶化は必要なら繰り返し行い、所望のレベルの純度（６０％−１００％のフリーのＢ環のフラボノイド）を達成することができる。
【０１２３】
実施例９． コガネバナの根由来の標準化したフリーのＢ環のフラボノイド抽出物、およびアセンヤクノキの樹皮由来の標準化したフラバン抽出物を含む製剤の調製
当明細書においてソリプリン（登録商標）と言う、ここで問題とする新規組成物は、アカシア属およびスクテラリア属から各々単離した２つの標準化した抽出物を用いて、１つまたはそれより多くの賦形剤と共に製剤化した。このような組成物を調製するための一般的な実施例を以下に述べる。本実施例で使用したアカシアの抽出物は、カテキンおよびエピカテキンとして＞８０％のフラバンの総計を含有し、スクテラリア属の抽出物は、主にバイカリンである＞８０％のフリーのＢ環のフラボノイドを含有していた。スクテラリア属の抽出物はまた、表１１に示すように他の少量のフリーのＢ環のフラボノイドも含有していた。１つまたはそれより多くの賦形剤/保存剤もまた、ここで問題とする組成物に加えた。フラバンおよびフリーのＢ環のフラボノイドの比率は、ＣＯＸ  ｖｓ  ＬＯの阻害、皮膚透過性の必要性、および製品の効能の必要性、例えば必要とされる効能の期間、等に関する適応および具体的な必要性に基づいて調整することができる。賦形剤の量は、各成分の実際の活性含有量に基づいて調整することができる。製品の各々個々のバッチに関する混合表は、成分の個々のバッチに関する製品の明細およびＱＣの結果に基づいて作成しなくてはならない。２−５％の範囲での活性成分の量の付加も、製品の明細に見合うためには推奨される。
【０１２４】
フリーのＢ環のフラボノイド含有量  ８２．２％（バイカリン）を有するコガネバナの根の抽出物（３８．５ｋｇ）（ｌｏｔ＃ＲＭ０５２３０２−０１）；フラバン含有量の総計  ８０．４％を含むアセンヤクノキの樹皮の抽出物（６．９ｋｇ）（ｌｏｔ＃ＲＭ０５２９０２−０１）；および賦形剤（カンデックス(Candex) ５．０ｋｇ）を合わせて、活性なフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの重量による混合比  ８５：１５を有するソリプリン（登録商標）製剤（５０．４ｋｇ）を提供した。表１０に、実施例６および８に提供した方法を用いて決定した、ソリプリン（登録商標）（Ｌｏｔ＃Ｇ１７０２−ＣＯＸ−２）のこの特定のバッチの活性なフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの定量化した値を提供する。表１０に関して、ソリプリン（登録商標）のこの特定のバッチは、７５．７％のフリーのＢ環のフラボノイドおよび１０．３％のフラバンを含む、８６％の活性成分の総計を含有する。図１０は、活性なフリーのＢ環のフラボノイドおよびフラバンの重量による混合比  ８０：２０を有する、代表的なソリプリン（登録商標）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【０１２５】
【表１０】
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【０１２６】
同じアプローチを用いてソリプリン（登録商標）の以下のバッチを、コガネバナの根由来の標準化したフリーのＢ環のフラボノイド抽出物、およびアセンヤクノキの樹皮由来の標準化したフラバン抽出物の、各々１２：８８および１５：８５の混合比を有する組み合わせを用いて調製した。
【０１２７】
フリーのＢ環のフラボノイド含有量  ８７．９％（バイカリンとして）を有するコガネバナの根の抽出物（５８．０ｇ）（ｌｏｔ＃ＲＭ０２１２０３−０１）、およびフラバン含有量の総計  ８４．９％を含むアセンヤクノキの樹皮の抽出物（４４２．０ｇ）（ｌｏｔ＃０５０６０３−０１）を混合して、重量による混合比  １２：８８を有するソリプリン（登録商標）組成物（５００ｇ、ｌｏｔ＃ＱＪ２０５−１９）を提供した。実施例６および８に提供した方法を使用したところ、ソリプリン（登録商標）（ｌｏｔ＃ＱＪ２０５−１９）のこの特定のバッチにおいてフリーのＢ環のフラボノイド含有量（バイカリン）は９．６５％であり、フラバン含有量（カテキンおよびエピカテキンの総計）は７３．２％であった。
【０１２８】
フリーのＢ環のフラボノイド含有量  ８２．９％（バイカリンとして）を有するコガネバナの根の抽出物（３００ｇ）（ｌｏｔ＃ＲＭ０６０４０３−０１）、およびフラバン含有量の総計  ９０．８％を含むアセンヤクノキの樹皮の抽出物（１７００ｇ）（ｌｏｔ＃０５０６０３−０１）を混合して、重量による混合比  １５：８５を有するソリプリン（登録商標）組成物（２０００ｇ、ｌｏｔ＃Ａ１９０４）を提供した。実施例６および８に提供した方法を使用したところ、ソリプリン（登録商標）（ｌｏｔ＃Ａ１９０４）のこの特定のバッチにおけるフリーのＢ環のフラボノイド（バイカリン）含有量は１５．６％であり、フラバン含有量（カテキンおよびエピカテキンの総計）は７５．０％であった。
【０１２９】
実施例１０． ソリプリン（登録商標）の製剤による５−ＬＯ酵素の阻害の用量応答性およびＩＣ５０値の測定
ソリプリン（登録商標）製剤（８０：２０）は実施例９に記載したように（“ＣＯＸ−２および５−リポキシゲナーゼの二重の阻害活性を有する製剤”という表題の、２００３年４月３０日に提出された米国特許出願第１０/４２７，７４６号の実施例１４もまた参照のこと、同文献をその全内容において当明細書にて参照として援用する）コガネバナの根由来の標準化したフリーのＢ環のフラボノイド抽出物、およびアセンヤクノキの樹皮由来の標準化したフラバン抽出物を、混合比  ８０：２０で合わせたものを用いて調製した。ＴＨＰ−１またはＨＴ−２９の細胞；ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２および５−ＬＯＸを発現する単核細胞株、を含有する組織培養培地にて、サンプルを滴定した。ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４；Neogen, Inc., Cat#406110）の競合的ＥＬＩＳＡを使用して、５−ＬＯＸ経路におけるソリプリン（登録商標）の阻害効果の測定として、各細胞株に存在するＬＴＢ４の新たに合成されたレベルにおける本ソリプリン（登録商標）製剤の効果を評価した。本アッセイは、６ウェルプレートにて１ウェルあたり１６０，０００から１８０，０００の細胞を加えることにより、ダブルで行った。ソリプリン（登録商標）製剤をＴＨＰ−１培養に３、１０および１００μｇ/ｍＬで加え、３７℃、５％ＣＯ２にて加湿した環境下で一晩（〜１２−１５時間）インキュベーションした。結果を図１１に示すが、新たにＬＰＳに誘導されるＬＴＢ４の産生が、ＴＨＰ−１培養への３および１０μｇ/ｍＬの間のソリプリン（登録商標）の添加により、ほぼ完全に阻害されたことを示す。
【０１３０】
ソリプリン（登録商標）、およびもう１つの公知の５−ＬＯＸ阻害薬であるイブプロフェンを、ＨＴ−２９細胞に３μｇ/ｍＬで加え、３７℃、５％ＣＯ２にて加湿した環境下で４８時間インキュベーションした。その後処理した各細胞株を遠心して集め、生理学的バッファー中でドウンス(dounce)型ホモゲナイザーの緩やかな溶菌により破壊した。図１２に示すように、ソリプリン（登録商標）はＨＴ−２９細胞において新たに合成されるＬＴＢ４の８０％の産生を阻害した。イブプロフェンは、同じ時間でＬＴＢ４の量の２０％の低減を示しただけであった。
【０１３１】
実施例１１． in vivo のマウス耳介腫脹モデルを用いてのソリプリン（登録商標）の効能の評価
実施例９に記載したように、コガネバナの根由来の標準化したフリーのＢ環のフラボノイド抽出物、およびアセンヤクノキの樹皮由来の標準化したフラバン抽出物の、混合比  ８０：２０で合わせたものを用いて調製した。本組成物を使用してin vivo の炎症を治療することができるかどうかを検査するため、該組成物を４−５週齢ＩＣＲマウス(Harlan Labs)に、アラキドン酸（ＡＡ）によるマウスの耳介の処置前１日に、経口胃管栄養により投与した。検査用マウスにはオリーブオイルに懸濁させたソリプリン（登録商標）５０、１００および２００ｍｇ/ｋｇの均等な用量を与え、コントロール用マウスにはオリーブオイルのみを与えた。翌日、９５％アルコール中の３３０ｍＭ  ＡＡ  ２０μＬを各マウスの片側耳介に塗布し、対側耳介にはコントロールとしてアルコールを塗布した。ソリプリン（登録商標）で治療したマウスは図１３に示したように、ソリプリン（登録商標）の用量の増加に伴って測定可能な用量応答性を示した。図１３に関して、２００ｍｇ/ｋｇ用量は、“未治療”のコントロールに比して５０％以上まで腫脹を低減させている。ソリプリン（登録商標）の５０ｍｇ/ｋｇ用量は、もう１つの強力な抗炎症薬であるインドメタシンの５０ｍｇ/ｋｇ用量と同程度の有効性であった。
【０１３２】
ソリプリン（登録商標）の抗炎症活性を実証するためにデザインされたもう１つの動物モデルにおいて、４−５週齢ＩＣＲマウス(Harlan Labs)の後脚足首関節内への９５％エタノール中の１００ｍＭ  ＡＡ  ２０μＬ注入前〜１２時間に、上に記載した８０：２０製剤を、オリーブオイルに懸濁させた１００ｍｇ/ｋｇの用量でマウスに経口投与した。検査群にはソリプリン（登録商標）製剤を与え、もう一方の群には製剤を与えなかった。コントロール群は、アラキドン酸注入を受けなかったマウス（ネガティブコントロール）、およびＡＡを含まない９５％エタノールを注入した群（媒体コントロール）を含むものとした。これらの群にはソリプリン（登録商標）も与えなかった。結果を図１４に示す。図１４に関して、ＡＡを注入したソリプリン（登録商標）を与えたマウスは、（２つの）コントロールおよび未治療のアラキドン酸注入群と比較して、バックグラウンドレベルの腫脹を示した。これらの結果は、作用部位である関節の腫脹を低減するためのソリプリン（登録商標）の有効性を実証している。
【０１３３】
実施例１２． ＵＶ放射への皮膚の暴露に起因する損傷の予防および治療におけるソリプリン（登録商標）の効能の評価
無毛メスマウスの６群（１群当たりマウス５頭）(Stain SKH-1, Harlan Labs)を、麻酔している間に０．６２６ｍＷ/ｃｍ２で３分間を３日間連続して照射し、ＵＶ放射への皮膚の暴露に起因する損傷の予防および治療におけるソリプリン（登録商標）製剤の有効性を検査した。ソリプリン（登録商標）製剤は実施例９に記載したように、コガネバナの根由来の標準化したフリーのＢ環のフラボノイド抽出物、およびアセンヤクノキの樹皮由来の標準化したフラバン抽出物を、混合比  ８０：２０で合わせたものを用いて調製した。６治療群は以下の通りとした：
群＃
１  コントロール群：ＵＶ照射前または後に治療なし
２  ポジティブコントロール：ＵＶ照射後にスース・ア・カイン(Sooth-A-Caine )(Banana Boat)の局所塗布にて治療
３  ソリプリン（登録商標）治療Ｂ−１：ＵＶ照射前に、水中の１ｍｇ/ｍＬ  ソリプリン（登録商標）の局所塗布にて治療
４  ソリプリン（登録商標）治療Ａ−１：ＵＶ照射後に、水中の１ｍｇ/ｍＬ  ソリプリン（登録商標）の局所塗布にて治療
５  ソリプリン（登録商標）治療Ｂ−２：ＵＶ照射前に、水中の５ｍｇ/ｍＬ  ソリプリン（登録商標）の局所塗布にて治療
６  ソリプリン（登録商標）治療Ａ−２：ＵＶ照射後に、水中の５ｍｇ/ｍＬ  ソリプリン（登録商標）の局所塗布にて治療
ＵＶ暴露および治療の３日後、マウスは以下のスケールを用いて紅斑（赤み）のレベルでスコア表示した；０−紅斑が認められない；１−非常にわずかな紅斑；２−十分に定義される紅斑；３−重篤な紅斑、４−腫瘍形成。紅斑は、各群について目で見てスコア表示した。結果を図１５に示す。図１５に関して、コントロール群（１群）は第３日（ＵＶ放射への３日間暴露後の７２時間）に重篤な赤みを有していたことがわかる。スース・ア・カイン群（２群）もまた第３日に最大の赤みを有した。ソリプリン（登録商標）治療群（３−６群）の赤みは、スコア２を越えることは全くなかった。これらのスコアは主観的ではあるが、ソリプリン（登録商標）がＵＶを原因とする皮膚の紅斑の予防および治療の双方において有効であることを示す。
【０１３４】
第４日の代表的なマウスの写真は、コントロール群、スース・ア・カイン（登録商標）治療群、およびソリプリン（登録商標）治療群間の差異を明確に示す（データ未発表）。コントロール群およびスース・ア・カイン（登録商標）治療の動物は、ＵＶ暴露前および後の双方にソリプリン（登録商標）製剤で治療した動物と比較して、紅斑の非常に広範囲なパターンおよび赤みを示した。ＵＶ照射前に５ｍｇ/ｍＬ  ソリプリン（登録商標）で治療した動物が、他の動物すべてと比較して最小量の紅斑を示した。
【０１３５】
実施例１３． クリーム中へのソリプリン（登録商標）組成物の製剤化
２つの異なる濃度のソリプリン（登録商標）（ソリプリン（登録商標）の重量にて０．５％および１．５％）（ｌｏｔ＃Ａ１９０４  実施例９に記載した通り）を、以下の方法および表１１および１２に示すようにクリームとして製剤化した。
【０１３６】
ソリプリン（登録商標）（ｌｏｔ＃Ａ１９０４）を室温で水中に溶かし、溶液中に完全に分散するまでブレンダーで均一にした（およそ５分）。室温で溶液を撹拌したり振動させたりせずに、ウルトレツ２１カーボマー(Ultrez-21 carbomer) を溶液の表面上に振りかけることにより加え、完全に湿らせ（白色の部分が見えなくなる）、溶液中に沈ませた。その後、緩やかに撹拌しながら溶液を４０℃に加熱し、グリセリンを加えた（パートＡ）。その後混合液をさらに５分間撹拌した。残りの成分（パートＢ）の重さを量り、撹拌しながら４０℃に加熱した。４０℃で残りの成分（パートＢ）をパートＡに加え、得られる組成物を均一になるまで（およそ５分間）十分に混合した。このエマルジョンを３０℃に冷却し、撹拌棒および/またはスパチュラで撹拌しながら、中和剤にて滴定することにより、ｐＨをおよそ５．５（５．３から５．７）に調整した。中和剤に誘導されるカーボマーの立体配座の変化により、エマルジョンは非常に粘性が増加した。エマルジョンは最終的には、エマルジョンクリーム用に適する粘性に達した。その後エマルジョンクリームを一様になるまで混合し、その後清浄な保存容器に注ぎ、２から８℃で１ヶ月間保存した。
【０１３７】
【表１１】
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【０１３８】
【表１２】
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【０１３９】
実施例１４． ヒトの皮膚への繰り返し塗布による刺激および接触感作の誘導に関するソリプリン（登録商標）の評価
Draize Patch Test（Draizeパッチ検査） (Marzulli and Maibach (1977) Contact Allergy: Predictive Testing in Humans. Advances in Modern Texicology, Dermatotoxilogy and Pharmacology.にて 、Mauzulli, F.N. and Maibaci, H. I.編、 4, 353-372)に準じて、ヒトの皮膚でソリプリン（登録商標）を検査した。検査部位は上腕または背中の脊柱傍の位置とした。各検査剤は誘導部位およびチャレンジ部位にて行うものとした。誘導部位は、２つのサブ部位：オリジナル部位および移動部位、で構成される。ソリプリンクリーム０．２ｍｌを各パッチ上に含有するパッチを、移動部位にパッチを塗布することが必要になるほど強い刺激反応を発症しなければ、オリジナル部位に繰りかえし塗布した。パッチは臨床研究施設により塗布し、およそ２４または４８/７２時間後に被験者がはずして廃棄した。誘導段階(phase)において、皮膚の同じ部位への検査剤の繰り返し塗布および合計９回の誘導パッチを、４週の期間内に塗布した。休止期間は、最後の誘導パッチの塗布およびチャレンジパッチの塗布の間の、１０から２１日とした。この期間中検査剤またはいかなる他の材料も検査領域に塗布しないものとした。チャレンジ段階では、検査剤を体の反対側の本来の部位に塗布し、およそ２４または４８時間後に被験者が廃棄した。
【０１４０】
各パッチの塗布に対する皮膚の応答を検討し、１００ワット白熱blue bulbの採光下、デザインされたスコアのスケールにより段階表示した。強い刺激反応により検査剤の移動部位への塗布が認られた場合、先に暴露させた全ての部位について、誘導の終了時まで（または誘導後の反応の持続が完了しているかどうかが決定されるまで）、残りの期間のスコアを記録するものとした。チャレンジ段階の間、皮膚の応答は、パッチ塗布後およそ４８および７２または９６時間に評価した。誘導された感作に関しての結論は、主としてチャレンジの評価より導いた。
【０１４１】
実施例１３で調製した０．５％および１．５％  ソリプリン（登録商標）濃度の２つのソリプリン（登録商標）クリームを、上のプロトコルに従って評価した。各群に総計１２０名の被験者が参加した。０．５％  ソリプリン（登録商標）群に関しては９７名の被験者が試験を完了し、１．５  ％  ソリプリン（登録商標）群に関しては１０１名の被験者が完了した。０．５％および１．５％  ソリプリン（登録商標）クリームのいずれかについて、感作反応のエビデンスは認められなかった。０．５％  ソリプリン（登録商標）について、誘導中１６名の被験者が微小から軽度の紅斑の時折の発症（スコア  ＋および/または１）を示した。チャレンジ時には、４名の被験者が４８時間に微小から軽度の紅斑を示したが、９６時間までに消失した。１．５％ソリプリン（登録商標）について、誘導中に２６名の被験者が微小から軽度の紅斑の時折の発症（スコア＋および/または１）を示した。チャレンジ時には、１名の被験者が４８時間に微小から軽度の紅斑を示したが、９６時間までに消失した。
【０１４２】
本試験は、ソリプリン（登録商標）が刺激または感作の原因となることなく、効能ある濃度でヒトの皮膚に局所的に塗布することができる安全な成分であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】コガネバナ から単離された、標準的なフリーのＢ環のフラボノイド抽出物（ＨＰＬＣに基づき８３％バイカリン）による、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の阻害の概要をグラフにて表す。該抽出物を、リコンビナントのヒツジＣＯＸ−１（◆）およびヒツジＣＯＸ−２（ざ）のペルオキシダーゼ活性の同抽出物による阻害について検討した。データは阻害のパーセントｖｓ阻害薬の濃度（μｇ/ｍＬ）として表す。ＣＯＸ−１に関するＩＣ５０は、０．２４μｇ/ｍＬ/酵素ユニットと算出され、一方ＣＯＸ−２に関するＩＣ５０は、０．４８μｇ/ｍＬ/ユニットと算出された。
【図２】コガネバナ から単離された、精製成分バイカリンによる、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の阻害の概要をグラフにて表す。該化合物を、リコンビナントのヒツジＣＯＸ−１（◆）およびヒツジＣＯＸ−２（■）のペルオキシダーゼ活性の同化合物による阻害について検討した。データは阻害のパーセントｖｓ阻害薬の濃度（μｇ/ｍＬ）として表す。ＣＯＸ−１に関するＩＣ５０は、０．４４μｇ/ｍＬ/酵素ユニットであると決定され、ＣＯＸ−２に関するＩＣ５０は、０．２８μｇ/ｍＬ/ユニットであると決定された。
【図３】コガネバナ から単離された、精製された成分のバイカレインによる、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の阻害の概要をグラフにて表す。該化合物を、リコンビナントのヒツジＣＯＸ−１（◆）およびヒツジＣＯＸ−２（■）のペルオキシダーゼ活性の同化合物による阻害について検討した。データは阻害のパーセントｖｓ阻害薬の濃度（μｇ/ｍＬ）として表す。ＣＯＸ−１に関するＩＣ５０は、０．１８μｇ/ｍＬ/酵素ユニットであると決定され、ＣＯＸ−２に関するＩＣ５０は、０．２８μｇ/ｍＬ/ユニットであると決定された。
【図４】アセンヤクノキから単離された、５０％のフラバンの総計を含有する標準化したフラバンの抽出物による、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の阻害の概要をグラフにて表す。該抽出物を、リコンビナントのヒツジＣＯＸ−１（◆）およびヒツジＣＯＸ−２（■）のペルオキシダーゼ活性の同抽出物による阻害について検討した。データは阻害のパーセントｖｓ阻害薬の濃度（μｇ/ｍＬ）として表す。ＣＯＸ−１に関するＩＣ５０は、０．１７μｇ/ｍＬ/酵素ユニットと算出され、ＣＯＸ−２に関するＩＣ５０は、０．４１μｇ/ｍＬ/ユニットと算出された。
【図５】アセンヤクノキから単離された、９０％より多くのフラバンで構成されるここで問題とする組成物による、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の阻害の概要をグラフにて表す。該組成物を、リコンビナントのヒツジＣＯＸ−１（◆）およびヒツジＣＯＸ−２（ざ）のペルオキシダーゼ活性の同組成物による阻害について検討した。データは阻害のパーセントｖｓ阻害薬の濃度（μｇ/ｍＬ）として表す。ＣＯＸ−１に関するＩＣ５０は、０．１１μｇ/ｍＬ/酵素ユニットと算出され、ＣＯＸ−２に関するＩＣ５０は、０．４２μｇ/ｍＬ/ユニットと算出された。
【図６】コガネバナ の根から単離された、フリーのＢ環のフラボノイドの抽出物、およびアセンヤクノキの樹皮から単離されたフラバンの抽出物を、８０：２０の比率で合わせることにより製造された製剤による、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の阻害の概要をグラフにて表す。当明細書においてソリプリン（登録商標）とも言うここで問題とする組成物を、リコンビナントのヒツジＣＯＸ−１（◆）およびヒツジＣＯＸ−２（■）のペルオキシダーゼ活性の同製剤による阻害について検討した。データは阻害のパーセントｖｓ阻害薬の濃度（μｇ/ｍＬ）として表す。ＣＯＸ−１に関するＩＣ５０は、０．７６μｇ/ｍＬ/酵素ユニットと算出され、ＣＯＸ−２に関するＩＣ５０は、０．８０μｇ/ｍＬ/ユニットと算出された。
【図７】コガネバナ の根から単離された、フリーのＢ環のフラボノイドの抽出物、およびアセンヤクノキの樹皮から単離されたフラバンの抽出物を、約５０：５０の比率で合わせることにより製造された製剤による、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の阻害の概要をグラフにて表す。該組成物、すなわちソリプリン（登録商標）を、リコンビナントのヒツジＣＯＸ−１（◆）およびヒツジＣＯＸ−２（■）のペルオキシダーゼ活性の同組成物による阻害について検討した。データは阻害のパーセントｖｓ阻害薬の濃度（μｇ/ｍＬ）として表す。ＣＯＸ−１に関するＩＣ５０は、０．３８μｇ/ｍＬ/酵素ユニットと算出され、一方ＣＯＸ−２に関するＩＣ５０は、０．８４μｇ/ｍＬ/ユニットと決定された。
【図８】コガネバナ の根から単離されたフリーのＢ環のフラボノイドの抽出物、およびアセンヤクノキの樹皮から単離されたフラバンの抽出物を、約２０：８０の比率で合わせることにより製造された製剤による、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の阻害の概要をグラフにて表す。該組成物、すなわちソリプリン（登録商標）を、リコンビナントのヒツジＣＯＸ−１（◆）およびヒツジＣＯＸ−２（■）のペルオキシダーゼ活性の同組成物による阻害について検討した。データは阻害のパーセントｖｓ阻害薬の濃度（μｇ/ｍＬ）として表す。ＣＯＸ−１に関する本組成物のＩＣ５０は、０．１８μｇ/ｍＬ/酵素ユニットであり、一方ＣＯＸ−２に関するＩＣ５０は、０．４１μｇ/ｍＬ/ユニットであった。
【図９】アセンヤクノキから抽出されたフラバンによる５−ＬＯの阻害の概要をグラフにて表す。該組成物を、実施例４に述べたようにリコンビナントのポテト５−リポキシゲナーゼ活性（◆）の同組成物による阻害について検討した。データは阻害薬を加えなかった場合のアッセイの阻害のパーセントとして表す。５−ＬＯに関するＩＣ５０は、１．３８μｇ/ｍＬ/酵素ユニットであった。
【図１０】コガネバナ の根から単離されたフリーのＢ環のフラボノイド、およびアセンヤクノキの樹皮から単離されたフラバンの８０：２０の比率の混合物で構成される典型的な製剤の、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のクロマトグラムを示す。
【図１１】実施例１０に記載したようにＴＨＰ−１細胞またはＨＴ−２９細胞（ＡＴＣＣ）において、ＥＬＩＳＡにより決定された場合の、ＬＰＳに誘発された新たに合成されたＬＴＢ４（◆）の量におけるソリプリン（登録商標）の濃度の増加の効果を、グラフにて表す。ソリプリン（登録商標）は、コガネバナ の根から単離されたフリーのＢ環のフラボノイド、およびアセンヤクノキの樹皮から単離されたフラバンの、標準化した抽出物を８０：２０の比率で合わせることにより製造した。ソリプリン（登録商標）製剤の活性は、誘発されるＬＴＢ４の合成の阻害の％として表す。
【図１２】実施例１０に記載したように、ＥＬＩＳＡにより決定された場合の、誘発されていない細胞における３μｇ/ｍＬ  ソリプリン（登録商標）での処理後のＨＴ−２９細胞に残存するＬＴＢ４レベルを、３μｇ/ｍＬ  イブプロフェンでの処理と比較する。ソリプリン（登録商標）製剤は、処理の２日後にＨＴ−２９細胞におけるＬＴＢ４産生の８０％阻害を示した。
【図１３】実施例１１に記載したように炎症の阻害の測定として、耳介腫脹のータをグラフにて表す。コガネバナ の根から単離されたフリーのＢ環のフラボノイド、およびアセンヤクノキの樹皮から単離されたフラバンの、標準化した抽出物を８０：２０の比率で合わせたることにより製造したソリプリン（登録商標）を、未治療のマウス、および経口胃管栄養にてインドメタシン（１．５μｇ/ｋｇ）を与えたマウスと比較した。データは、各マウスの未治療の耳たぶ  対  治療した耳たぶのミクロン単位の測定における差異として表す。
【図１４】コガネバナ の根から単離されたフリーのＢ環のフラボノイド、およびアセンヤクノキの樹皮から単離されたフラバンの、標準化した抽出物を８０：２０の比率で合わせることにより製造したソリプリン（登録商標）の１００ｍｇ/ｋｇの効果を、ＡＡを注入したマウスの足首（ソリプリン（登録商標）＋アラキドン酸）にて、未治療のマウス（未治療＋アラキドン酸）、ＡＡ注入をしないマウス（ネガティブコントロール）、または液体の担体を注入したマウス（媒体コントロール）と比較した。
【図１５】実施例１２に記載したようにＵＶ光によるマウスへの照射後の時間の関数として、種々の治療群における無毛マウスの皮膚の紅斑のスコアの変化をグラフにて表す。Ｂ−１，Ａ−１、Ｂ−２およびＡ−２群のマウスは、照射前（Ｂ−１およびＢ−２群）または照射後（Ａ−１およびＡ−２群）のいずれかにソリプリン（登録商標）で治療を行った。ソリプリン（登録商標）は、コガネバナ の根から単離されたフリーのＢ環のフラボノイド、およびアセンヤクノキの樹皮から単離されたフラバンの、標準化した抽出物を８０：２０の比率で合わせることにより製造した。図１５に関して、ＵＶ照射の前後双方でのソリプリン（登録商標）の局所塗布は、コントロール群および標準的な治療薬スース・ア・カインを投与した群と比較して、紅斑のスコアを有意に低減したとみなすことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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