(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原性微生物由来の抗原性タンパク質をコードするＤＮＡと、その上流に連結されたイネ胚乳特異的プロモーターとを含むＤＮＡ構築物が発現可能にゲノムＤＮＡに組み込まれたトランスジェニックイネであって、経粘膜投与したときに抗原特異的免疫応答を誘導できる米を産生する前記トランスジェニックイネ。
【請求項２】
前記抗原性タンパク質の単量体としての分子量が１０万ダルトン以下である請求項１記載のトランスジェニックイネ。
【請求項３】
前記抗原性タンパク質がホモ多量体を構成するサブユニットである請求項１又は２記載のトランスジェニックイネ。
【請求項４】
前記ホモ多量体の分子量が１００万ダルトン以下である請求項３記載のトランスジェニックイネ。
【請求項５】
前記抗原性タンパク質がヘテロ多量体を構成するサブユニットである請求項１又は２記載のトランスジェニックイネ。
【請求項６】
前記ＤＮＡ構築物が、前記ヘテロ多量体を構成する各サブユニットをコードするＤＮＡを含む請求項５記載のトランスジェニックイネ。
【請求項７】
前記ヘテロ多量体の分子量が１００万ダルトン以下である請求項６記載のトランスジェニックイネ。
【請求項８】
前記抗原性タンパク質が、コレラ毒素Ｂサブユニット若しくはコレラ毒素Ｂサブユニットとエイズウイルスの中和エピトープとの融合タンパク質、又はボツリヌス毒素Ｈｃドメインである請求項１又は２記載のトランスジェニックイネ。
【請求項９】
前記イネ胚乳特異的プロモーターが、イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターである請求項１〜８のいずれかに記載のトランスジェニックイネ。
【請求項１０】
前記イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子が、グルテリン遺伝子、プロラミン遺伝子又はグロブリン遺伝子である請求項９記載のトランスジェニックイネ。
【請求項１１】
前記グルテリン遺伝子がグルテリンＧｌｕＢ−１遺伝子である請求項１０記載のトランスジェニックイネ。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ構築物が、前記抗原性タンパク質をコードするＤＮＡの下流に連結されたイネ胚乳特異的ターミネーターを含む請求項１〜１１のいずれかに記載のトランスジェニックイネ。
【請求項１３】
前記イネ胚乳特異的ターミネーターが、イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のターミネーターである請求項１２記載のトランスジェニックイネ。
【請求項１４】
前記イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子が、グルテリン遺伝子、プロラミン遺伝子又はグロブリン遺伝子である請求項１３記載のトランスジェニックイネ。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ構築物の発現により、前記抗原性タンパク質とそのＮ末端に連結されたイネ胚乳貯蔵タンパク質のシグナルペプチドとを含む融合タンパク質が産生されるように、前記ＤＮＡ構築物が、前記抗原性タンパク質をコードするＤＮＡの上流に連結された前記シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含む請求項１〜１４のいずれかに記載のトランスジェニックイネ。
【請求項１６】
前記イネ胚乳貯蔵タンパク質のシグナルペプチドが、グルテリン、プロラミン又はグロブリンのシグナルペプチドである請求項１５記載のトランスジェニックイネ。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ構築物の発現により、前記抗原性タンパク質とそのＣ末端に連結された小胞体局在化シグナルペプチドとを含む融合タンパク質が産生されるように、前記ＤＮＡ構築物が、前記抗原性タンパク質をコードするＤＮＡの下流に連結された前記小胞体局在化シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含む請求項１〜１６のいずれかに記載のトランスジェニックイネ。
【請求項１８】
前記小胞体局在化シグナルペプチドが配列番号２記載のアミノ酸配列からなる請求項１７記載のトランスジェニックイネ。
【請求項１９】
前記抗原性タンパク質をコードするＤＮＡに含まれるコドンが植物型コドンに改変されている請求項１〜１８のいずれかに記載のトランスジェニックイネ。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載のトランスジェニックイネから採取された米又は抗原性タンパク質を含有する米加工物。
【請求項２１】
請求項２０記載の米又は抗原性タンパク質を含有する米加工物を有効成分として含有するワクチン組成物。
【請求項２２】
請求項２１記載のワクチン組成物をヒト以外の動物に経粘膜投与する工程を含む、ヒト以外の動物における免疫応答誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニックイネ、該トランスジェニックイネから採取された米又はその加工物を利用したワクチン組成物、及び該ワクチン組成物を利用した免疫応答誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザ、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）、エイズ、結核をはじめとする重篤な新興再興感染症の多くが鼻腔、口腔、上気管支、腸管、泌尿生殖器等の粘膜で覆われた組織を介して引き起こされるという事実から、粘膜面での防御が感染症の予防に最も効果的であることは明らかである。そして、粘膜面での防御機構を形成しているのが、分泌型免疫グロブリンＡ（S-IgA）を中心とする粘膜系免疫である。【０００３】
ところが現在用いられている注射による免疫法では、全身系の抗原特異的免疫応答を誘導することはできるものの、粘膜系の抗原特異的免疫応答を十分に誘導することができない（Czerkinsky C et al. Immunol Rev 170. 197-222. 1999）。これに対して、粘膜ワクチンは粘膜系及び全身系の両方の免疫機構に抗原特異的な免疫を成立させることができる点で理想的なワクチンといえる。【０００４】
1990年、Curtiss等は、S.mutansの表面タンパク質SpaAをタバコ植物体で発現させ、これをマウスに食べさせることにより粘膜系の抗原特異的免疫応答を誘導することに成功した（特許文献１）。この実験によって、抗原性タンパク質を発現させた植物体をそのまま（すなわち、植物から抗原タンパク質を精製することなく）「食べるワクチン」として使用できる可能性が示された。粘膜ワクチンの一つである「食べるワクチン」は、粘膜系及び全身系の両方の免疫機構に抗原特異的免疫を成立させることができる点で理想的なワクチンといえる（非特許文献１）。【０００５】
Curtiss等の実験の後、タバコ、ジャガイモ又はトウモロコシにおける大腸菌易熱性毒素抗原の発現（非特許文献２，３，４）、ジャガイモにおけるコレラ毒素抗原の発現（非特許文献５）、レタス又はジャガイモにおけるＢ型肝炎ウイルス抗原の発現（非特許文献６，７）、タバコ又はジャガイモにおけるノーウオークウイルス抗原の発現（非特許文献８）、トマトにおける狂犬病ウイルス抗原又はＲＳウイルス抗原の発現（非特許文献９，１０）、タバコにおけるサイトメガロウイルス抗原の発現（非特許文献１１）、アルファルファにおける口蹄疫ウイルス抗原の発現（非特許文献１２）、シロイヌナズナにおけるブタ伝染性胃腸炎ウイルス抗原の発現（非特許文献１３）等が行われた。【０００６】
しかしながら、植物体において抗原性タンパク質を発現できることと、抗原性タンパク質を発現させた植物体を「食べるワクチン」として使用できることとは別問題である。すなわち、抗原性タンパク質を発現させた植物体を経口投与したときに目的の免疫応答を誘導できるか否かは、植物体における抗原性タンパク質の発現量、植物体で発現した抗原性タンパク質の立体構造、植物体に含まれる他の成分との相互作用等、様々な因子によって決定されるものであり、抗原性タンパク質を発現させた植物体を経口投与したからといって直ちに目的の免疫応答を誘導できるわけではない。例えば、植物体における抗原性タンパク質の発現量が不十分であるため目的の免疫応答を誘導できない場合、植物体で発現した抗原性タンパク質の立体構造が元の立体構造と異なるため目的の免疫応答を誘導できない場合（例えば、α1-3フコース、β1-2キシロース等の植物特異的糖鎖が付加されて異なる立体構造となる場合）、抗原性タンパク質と必然的に同時に投与されることとなる植物体に含まれる他の成分が障害となって目的の免疫応答を誘導できない場合等がある。したがって、精製された十分量の抗原性タンパク質を経口投与したときに抗原特異的免疫応答を誘導できる場合であっても、当該抗原性タンパク質を発現させた植物体を経口投与したときに抗原特異的免疫応答を誘導できるか否かを予測することは極めて困難である。【０００７】
また、抗原性タンパク質を発現させた植物体を経口投与したときに目的の免疫応答を誘導できるか否かを決定する、植物体における抗原性タンパク質の発現量、植物体で発現した抗原性タンパク質の立体構造、植物体に含まれる他の成分との相互作用等の因子は、植物体の種類、植物体における抗原性タンパク質の発現部位、植物体における抗原性タンパク質の蓄積部位、抗原性タンパク質の発現系（例えば、プロモーター等）等の様々な条件に影響されるものであり、抗原性タンパク質を発現させた植物体を経口投与したときに目的の免疫応答を誘導できるような条件を設定することは極めて困難である。
【特許文献１】国際公開WO90/02484号公報
【非特許文献１】Yuki Y等，「レビュー イン メディカル ヴァイロロジー（Reviews in Medical Virology）」，2003年，第13巻，p.293-310
【非特許文献２】Haq TA等，「サイエンス（Science）」，1995年，第268巻，p.714-716
【非特許文献３】Mason HS等，「ワクチン（Vaccine）」，1998年，第16巻，p.1336-1343
【非特許文献４】Streatfield SJ等，「ワクチン（Vaccine）」，2001年，第19巻，p.2742-2748
【非特許文献５】Arakawa T等，「ネイチャー バイオテクノロジー（nature biotechnology）」，1998年，第16巻，p.292-297
【非特許文献６】Kapusta J等，「ザ FASEB ジャーナル（The FASEB JOURNAL）」，1999年，第13巻，p.1796-1799
【非特許文献７】Richter LJ等，「ネイチャー バイオテクノロジー（nature biotechnology）」，2000年，第18巻，p.1167-1171
【非特許文献８】Mason HS等，「米国科学アカデミー紀要（Proceedings of National Academy of Science U S A.）」，1996年，第93巻，p.5335-5340
【非特許文献９】McGarvey PB等，「バイオテクノロジー（Biotechnology）」，1995年，第13巻，p.1484-1487
【非特許文献１０】Sandhu JS等，「トランスジェニック リサーチ（Transgenic Research）」，2000年，第9巻，p.127-135
【非特許文献１１】Tackaberry ES等，「ワクチン（Vaccine）」，1999年，第17巻，p.3020-3029
【非特許文献１２】Dus Santos MJ等，「ワクチン（Vaccine）」，2002年，第20巻，p.1141-1147
【非特許文献１３】Gomez N等，「ヴァイロロジー（Virology）」，1998年，第249巻，p.352-358
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
今までのワクチンは低温状態で保存輸送される、いわゆるコールドチェーンが必要不可欠である。
これに加えて、注射型ワクチンは、その安全性の点から注射できるレベルまで精製する必要であり、上記低温状態での保存輸送も考慮するとコストの点で高価なものにならざるを得ない。【０００９】
一方、比較的低コストの病原性微生物の弱毒株を用いる非組換え型ワクチンは安全性の点で問題がある。また、比較的低コストで開発可能な組換え細菌等にワクチン抗原を発現させ経口投与する方法は、ワクチンを同一個体に繰り返し利用できないという問題がある。というのは、この方法では、期待されるワクチンに対する免疫応答ばかりでなく、ベクターとしての組換え微生物等に対しても強い免疫応答が誘導され、追加免疫された組換え微生物自身が排除される可能性があるからである。【００１０】
これに対して、米は大量生産可能であるとともに室温で長期間保存可能であり、さらには開発途上国を含めた遠隔地への輸送が簡単である。したがって、「食べるワクチン」として使用できる米が開発されれば、安価で多種多様な大量のワクチンを長期間保存することが可能となる。そして、世界的規模でのワクチン投与（グローバルワクチネーション）や、世界規模での公衆衛生（グローバルパブリックヘルス）を実現することが可能となる。【００１１】
そこで、本発明は、第一に、「食べるワクチン」として使用できる米、すなわち経口投与等の経粘膜投与したときに所望の免疫応答を誘導できる米を産生できるトランスジェニックイネを提供することを目的とする。
また、本発明は、第二に、上記トランスジェニックイネから採取された米又は抗原性タンパク質を含有する米加工物を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、第三に、上記米又は抗原性タンパク質を含有する米加工物を有効成分として含有するワクチン組成物を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、第四に、上記ワクチン組成物を利用した免疫応答誘導方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、
（ａ）単量体としての分子量が１０万ダルトン以下である様々な抗原性タンパク質（ワクチン抗原）を米で発現させることができること
（ｂ）抗原性タンパク質（ワクチン抗原）をコードするＤＮＡのコドンを植物型（イネ型）に変えることにより、米において抗原性タンパク質を高発現させることができること
（ｃ）米で発現させた抗原性タンパク質（ワクチン抗原）は室温で１年以上安定であること
（ｄ）抗原性タンパク質（ワクチン抗原）を発現させた米を経口投与等の経粘膜投与することにより、全身系及び粘膜系の抗原特異的免疫応答を誘導できること
（ｅ）抗原性タンパク質（ワクチン抗原）を米で発現させることにより、ペプシン抵抗性を付与できること
（ｆ）米で発現させた抗原性タンパク質（ワクチン抗原）は胃での消化を免れることができるので、全身系及び粘膜系の抗原特異的免疫応答を誘導するために必要な抗原性タンパク質の経口投与量は、精製された抗原性タンパク質よりも少量で済むこと
（ｇ）抗原性タンパク質（ワクチン抗原）を米で発現させると、抗原性タンパク質は、イネ胚乳細胞内のＩ型貯蔵蛋白体（プロテインボディーＩ）、ＩＩ型貯蔵蛋白体（プロテインボディーＩＩ）等に集積するが、抗原性タンパク質にペプシン抵抗性を付与するためには、抗原性タンパク質がイネは胚乳細胞内のＩ型貯蔵蛋白体（プロテインボディーＩ）に集積することが重要であること
（ｈ）米で発現させた抗原性タンパク質（ワクチン抗原）は、胃での消化を免れて腸管に達し、粘膜誘導組織であるパイエル板等に存在する抗原取り込み能を有する細胞（例えばＭ細胞）から取り込まれることにより、抗原特異的免疫応答を誘導できること
等を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、上記目的を達成するために、本発明は、以下のトランスジェニックイネ、米又は米加工物、ワクチン組成物及び免疫応答誘導方法を提供する。
（１）抗原性タンパク質をコードするＤＮＡと、その上流に連結されたイネ胚乳特異的プロモーターとを含むＤＮＡ構築物が発現可能にゲノムＤＮＡに組み込まれたトランスジェニックイネ。
（２）前記抗原性タンパク質の単量体としての分子量が１０万ダルトン以下である前記（１）記載のトランスジェニックイネ。
（３）前記抗原性タンパク質がホモ多量体を構成するサブユニットである前記（１）又は（２）記載のトランスジェニックイネ。
（４）前記ホモ多量体の分子量が１００万ダルトン以下である前記（３）記載のトランスジェニックイネ。
（５）前記抗原性タンパク質がヘテロ多量体を構成するサブユニットである前記（１）又は（２）記載のトランスジェニックイネ。
（６）前記ＤＮＡ構築物が、前記ヘテロ多量体を構成する各サブユニットをコードするＤＮＡを含む前記（５）記載のトランスジェニックイネ。
（７）前記ヘテロ多量体の分子量が１００万ダルトン以下である前記（６）記載のトランスジェニックイネ。
（８）前記抗原性タンパク質が、コレラ毒素Ｂサブユニット若しくはコレラ毒素Ｂサブユニットとエイズウイルスの中和エピトープとの融合タンパク質、又はボツリヌス毒素Ｈｃドメインである前記（１）又は（２）記載のトランスジェニックイネ。
（９）前記イネ胚乳特異的プロモーターが、イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターである前記（１）〜（８）のいずれかに記載のトランスジェニックイネ。
（１０）前記イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子が、グルテリン遺伝子、プロラミン遺伝子又はグロブリン遺伝子である前記（９）記載のトランスジェニックイネ。
（１１）前記グルテリン遺伝子がグルテリンＧｌｕＢ−１遺伝子である前記（１０）記載のトランスジェニックイネ。
（１２）前記ＤＮＡ構築物が、前記抗原性タンパク質をコードするＤＮＡの下流に連結されたイネ胚乳特異的ターミネーターを含む前記（１）〜（１１）のいずれかに記載のトランスジェニックイネ。
（１３）前記イネ胚乳特異的ターミネーターが、イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のターミネーターである前記（１２）記載のトランスジェニックイネ。
（１４）前記イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子が、グルテリン遺伝子、プロラミン遺伝子又はグロブリン遺伝子である前記（１３）記載のトランスジェニックイネ。
（１５）前記ＤＮＡ構築物の発現により、前記抗原性タンパク質とそのＮ末端に連結されたイネ胚乳貯蔵タンパク質のシグナルペプチドとを含む融合タンパク質が産生されるように、前記ＤＮＡ構築物が、前記抗原性タンパク質をコードするＤＮＡの上流に連結された前記シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含む前記（１）〜（１４）のいずれかに記載のトランスジェニックイネ。
（１６）前記イネ胚乳貯蔵タンパク質のシグナルペプチドが、グルテリン、プロラミン又はグロブリンのシグナルペプチドである前記（１５）記載のトランスジェニックイネ。
（１７）前記ＤＮＡ構築物の発現により、前記抗原性タンパク質とそのＣ末端に連結された小胞体局在化シグナルペプチドとを含む融合タンパク質が産生されるように、前記ＤＮＡ構築物が、前記抗原性タンパク質をコードするＤＮＡの下流に連結された前記小胞体局在化シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含む前記（１）〜（１６）のいずれかに記載のトランスジェニックイネ。
（１８）前記小胞体局在化シグナルペプチドが配列番号２記載のアミノ酸配列からなる前記（１７）記載のトランスジェニックイネ。
（１９）前記抗原性タンパク質をコードするＤＮＡに含まれるコドンが植物型コドンに改変されている前記（１）〜（１８）のいずれかに記載のトランスジェニックイネ。
（２０）前記（１）〜（１９）のいずれかに記載のトランスジェニックイネから採取された米又は抗原性タンパク質を含有する米加工物。
（２１）前記（２０）記載の米又は抗原性タンパク質を含有する米加工物を有効成分として含有するワクチン組成物。
（２２）前記（２１）記載のワクチン組成物をヒト以外の動物に経粘膜投与する工程を含む、ヒト以外の動物における免疫応答誘導方法。
（２３）前記（２１）記載のワクチン組成物をヒトに経粘膜投与する工程を含む、ヒトにおける免疫応答誘導方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、第一に、「食べるワクチン」として使用できる米、すなわち経口投与等の経粘膜投与したときに所望の免疫応答を誘導できる米を産生できるトランスジェニックイネが提供される。また、第二に、上記トランスジェニックイネから採取された米又は抗原性タンパク質を含有する米加工物が提供される。さらに、第三に、上記米又は抗原性タンパク質を含有する米加工物を有効成分として含有するワクチン組成物が提供される。さらに、第四に、上記ワクチン組成物を利用した免疫応答誘導方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
「イネ」とは、Oryza sativaに属する植物を意味し、遺伝子組換えの対象となるイネの品種は、Oryza sativaに属する限り特に限定されるものではない。【００１５】
「抗原性」には、抗体産生及び細胞性免疫を誘導させる性質（免疫原性）と、抗原抗体反応及び細胞性免疫反応を生じる性質とが含まれるが、「抗原性タンパク質」とは、少なくとも免疫原性を有するタンパク質を意味する。抗原性タンパク質が有する免疫原性は、抗原性タンパク質を単独で又は免疫アジュバントとともに、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、経口、経鼻、経膣、経肛門、経肺等の投与経路のうちいずれかの投与経路を介してヒト又はその他の動物に投与したときに、その生体内において発揮されればよい。なお、「免疫アジュバント」とは、タンパク質の抗原性を増強させる抗原性補強剤をいう。【００１６】
抗原性タンパク質の種類は、抗原性タンパク質を単独で又は免疫アジュバントとともに、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、経口、経鼻、経膣、経肛門、経肺等の投与経路のうちいずれかの投与経路を介してヒト又はその他の動物に投与したときに、その生体内において免疫応答を誘導できる限り特に限定されるものではない。抗原性タンパク質は、投与形態、投与量、投与経路等を最も好ましい条件に設定したときに（例えば、精製された十分量の抗原性タンパク質を投与したときに）、免疫応答を誘導できればよい。「免疫応答」には、抗体産生、抗原抗体反応、細胞性免疫応答等の様々な免疫応答が含まれるが、本発明においては、少なくとも抗体産生を含む意味で用いられる。「動物」には、ヒト及びその他の脊椎動物（例えば、哺乳類、鳥類、両性類、魚類、爬虫類等）が含まれる。「経粘膜投与」には、経口投与、口腔内投与、鼻孔内投与、経肛門投与、経膣投与、経肺投与等が含まれる。「抗原性タンパク質」には、糖タンパク質も含まれる。【００１７】
抗原性タンパク質としては、例えば、病原性微生物に由来するタンパク質であって、それ自体は病原性又は毒性を有しないか或いは生体に悪影響を与えない程度に弱い病原性又は毒性しか有しないが、免疫原性は保持しているタンパク質が挙げられる。【００１８】
病原性微生物の種類は特に限定されるものではないが、例えば、コレラ菌、病原性大腸菌、インフルエンザ菌、肺炎球菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ペスト菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、炭ソ菌、野兎病菌、大腸菌O157、サルモネラ菌、MRSA（黄色ブドウ球菌）、VRE（腸球菌）、結核菌、赤痢菌、腸チフス菌、パラチフス菌、クラミジア菌、アメーバ赤痢、レジオネラ菌、ライム病ボレリア菌、ブルセラ病（波状熱）菌等の病原性細菌；ロタウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ノーウオークウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＳウイルス、サイトメガロウイルス、口蹄疫ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、風疹ウイルス、ATLウイルス、アデノウイルス、マンプス（おたふく風邪）ウイルス、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス、ヘルペスウイルス、天然痘ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、日本脳炎ウイルス、テング熱ウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、SARS(コロナウイルス)、インフルエンザウイルス、HIV（AIDSウイルス）、エボラ出血熱ウイルス（フィロウイルス）、マールブルグウイルス（フィロウイルス）、ラッサ熱ウイルス、ハンタウイルス、ニパウイルス等の病原性ウイルス；Ｑ熱リケッチャ、クラミジア等のリケッチャ；マラリア原虫、トリパノソーマ等の原虫が挙げられ、病原性微生物に由来するタンパク質としては、病原性微生物を構成するタンパク質又はペプチド（例えば、表面タンパク質、カプシドタンパク質、繊毛タンパク質等）、病原性微生物が産生するタンパク質又はペプチド（例えば、毒素、酵素、ホルモン、免疫調節物質、受容体及びそのリガンド等）、それらの断片又はドメイン等が挙げられる。【００１９】
病原性微生物に由来するタンパク質であって、それ自体は病原性又は毒性を有しないか或いは生体に悪影響を与えない程度に弱い病原性又は毒性しか有しないが、免疫原性は保持しているタンパク質としては、例えば、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、大腸菌易熱性毒素Ｂサブユニット（ＬＴＢ）、炭そ菌防御抗原、破傷風毒素ＴｏｘＣドメイン、ボツリヌス毒素Ｈｃドメイン、インフルエンザウイルスＨＡ抗原、ペスト菌Ｆ１抗原又はＶ抗原、マラリアＳＥＲＡｎ抗原、ロタウイルスＶＰ６又はＶＰ７、エイズウイルス由来ｇｐ−１６０、ｎｅｆ、ｇａｇ、ｅｎｖ又はｔａｔタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスＳタンパク質等が挙げられる。【００２０】
抗原性タンパク質は、２種類以上のタンパク質又はペプチドからなる融合タンパク質（キメラタンパク質）であってもよい。融合タンパク質としては、例えば、粘膜免疫応答の調節、増強等の作用を有するＣＴＢ又はＬＴＢと、その他の抗原性タンパク質又はそのエピトープ（例えば、Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、中和エピトープ等）とからなる融合タンパク質が挙げられる。【００２１】
抗原性タンパク質の単量体としての分子量は特に限定されるものではないが、通常１０万ダルトン以下、好ましくは８万ダルトン以下、さらに好ましくは５万ダルトン以下である。抗原性タンパク質の単量体としての分子量が上記範囲にあると、抗原性タンパク質がその抗原性を失うことなくイネ胚乳細胞内で発現することができ、トランスジェニックイネから採取された米又はその加工物をヒト又はその他の動物に経粘膜投与したときに、その生体内において、抗原性タンパク質に対する全身系免疫及び粘膜系免疫を効果的に誘導することができる。なお、抗原性タンパク質の単量体としての分子量の下限値は、抗原性が発揮される限り特に限定されるものではないが、通常１,０００ダルトン以上、好ましくは３,０００ダルトン以上、さらに好ましくは５,０００ダルトン以上である。【００２２】
抗原性タンパク質がホモ多量体を構成するサブユニットである場合、イネ胚乳細胞内で抗原性タンパク質が発現するとホモ多量体が形成される。このとき、ホモ多量体の分子量は、通常１００万ダルトン以下、好ましくは６０万ダルトン以下、さらに好ましくは３０万ダルトン以下である。ホモ多量体の分子量が上記範囲にあると、トランスジェニックイネから採取された米又はその加工物をヒト又はその他の動物に経粘膜投与したときに、その生体内において、ホモ多量体に対する全身系免疫及び粘膜系免疫を効果的に誘導することができる。【００２３】
抗原性タンパク質がヘテロ多量体を構成するサブユニットである場合、イネ胚乳細胞内でヘテロ多量体を構成する各サブユニットが発現するとヘテロ多量体が形成される。このとき、ヘテロ多量体の分子量は、通常１００万ダルトン以下、好ましくは６０万ダルトン以下、さらに好ましくは３０万ダルトン以下である。ヘテロ多量体の分子量が上記範囲にあると、トランスジェニックイネから採取された米又はその加工物をヒト又はその他の動物に経粘膜投与したときに、その生体内において、ヘテロ多量体に対する全身系免疫及び粘膜系免疫を効果的に誘導することができる。【００２４】
ホモ多量体からなる抗原性タンパク質としては、例えば、コレラ毒素Ｂサブユニットの５量体タンパク質（ＣＴＢ５）、大腸菌易熱性毒素Ｂサブユニットの５量体タンパク質（ＬＴＢ５）、炭そ菌防御抗原の７量体タンパク質（ＰＡ７）等が挙げられ、ヘテロ多量体からなる抗原性タンパク質としては、無毒変異型コレラトキシン（ｍＣＴＡ−ＣＴＢ５）、無毒キメラ変異型トキシン（ｍＣＴＡ−ＬＴＢ５）等が挙げられる。【００２５】
無毒変異型コレラトキシンは、毒性活性を有するコレラトキシンＡサブユニットのＡＤＰリボシルトランスフェラーゼの活性中心である６１番目のＳｅｒ（Ｓ）がＰｈｅ（Ｆ）に置換されたＳ６１Ｆ、又は１１２番目のＧｌｕ（Ｅ）がＬｙｓ（Ｋ）に置換されたＥ１１２Ｋと、コレラトキシンＢサブユニットとからなり、無毒であるが、コレラトキシンが有する粘膜免疫アジュバント活性は保持する（Yamamoto S et.al. J Exp Med. 185 : 1203-10 (1997) ; Yamamoto S et.al. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 : 5267-72 (1997)）。【００２６】
また、無毒キメラ変異型トキシンは、上記コレラトキシンの無毒化ＡサブユニットＥ１１２Ｋと、コレラトキシンＢサブユニットのかわりに、同じような免疫アジュバント活性をもつ大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）Ｂサブユニット（ＬＴＢ）とを組み合わせたものであり、無毒であるが、粘膜免疫アジュバント活性は有する（Kweon MN et.al J Infect Dis. 2002 186 : 1261-9 (2002)）。【００２７】
抗原性タンパク質は、所望の抗原性を有する限り、天然型タンパク質及び変異型タンパク質のいずれであってもよい。「変異型タンパク質」とは、天然型タンパク質のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列からなり、天然型タンパク質と同様の抗原性を有するタンパク質を意味する。【００２８】
抗原性タンパク質は、所望の抗原性を有する限り、その他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質であってもよい。
融合タンパク質としては、例えば、抗原性タンパク質とそのＮ末端に連結されたイネ胚乳貯蔵タンパク質のシグナルペプチドとを含む融合タンパク質が挙げられる。抗原性タンパク質がイネ胚乳貯蔵タンパク質のシグナルペプチドを有することにより、イネ胚乳細胞内で発現させた抗原性タンパク質をイネ胚乳細胞内に効率よく蓄積させることができ、免疫応答を誘導するのに十分な量の抗原性タンパク質をイネ胚乳細胞内に蓄積させることができる。【００２９】
イネ胚乳貯蔵タンパク質のシグナルペプチドとしては、例えば、グルテリン、プロラミン又はグロブリンのシグナルペプチドが挙げられる。イネ胚乳貯蔵タンパク質のシグナルペプチドの具体例として、グルテリンＧｌｕＢ-１のシグナルペプチドのアミノ酸配列を配列番号１６に、それをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１５に示す。グルテリン、プロラミン又はグロブリンのシグナルペプチドはイネ胚乳細胞内の貯蔵蛋白体（プロテインボディー）への蓄積に関与する。抗原性タンパク質がグルテリン、プロラミン又はグロブリンのシグナルペプチドを有することにより、抗原タンパク質をイネ胚乳細胞内の貯蔵蛋白体（プロテインボディーＩ，ＩＩ）等へ効率よく蓄積させることができる。そして、イネ胚乳細胞内の貯蔵蛋白体（プロテインボディーＩ，ＩＩ）においては、免疫応答を誘導するのに十分な量の抗原性タンパク質がその抗原性を失うことなく蓄積され、トランスジェニックイネから採取された米又はその加工物をヒト又はその他の動物に経粘膜投与したときに、その生体内において、抗原性タンパク質に対する全身系免疫及び粘膜系免疫を効果的に誘導することができる。【００３０】
また、融合タンパク質としては、例えば、抗原性タンパク質とそのＣ末端に連結された小胞体局在化シグナルペプチドとを含む融合タンパク質が挙げられる。抗原性タンパク質が小胞体局在化シグナルペプチドを有することにより、イネ胚乳細胞内で発現させた抗原性タンパク質をイネ胚乳細胞内の貯蔵蛋白体（プロテインボディーＩ，ＩＩ）等に効率よく蓄積させることができ、免疫応答を誘導するのに十分な量の抗原性タンパク質をイネ胚乳細胞内に蓄積させることができる。小胞体局在化シグナルペプチドとしては、例えば、アミノ酸配列ＫＤＥＬ（配列番号２）からなるペプチド、アミノ酸配列ＨＤＥＬ（His−Asp-Glu-Leu）からなるペプチド等が挙げられる。【００３１】
また、融合タンパク質としては、例えば、抗原性タンパク質と、抗原性タンパク質のＮ末端に連結されたイネ胚乳貯蔵タンパク質のシグナルペプチドと、抗原性タンパク質のＣ末端に連結された小胞体局在化シグナルペプチドとを含む融合タンパク質が挙げられる。抗原性タンパク質がイネ胚乳貯蔵タンパク質のシグナルペプチド及び小胞体局在化シグナルペプチドを有することにより、イネ胚乳細胞内で発現させた抗原性タンパク質をイネ胚乳細胞内の貯蔵蛋白体（プロテインボディーＩ，ＩＩ）等により一層効率よく蓄積させることができ、免疫応答を誘導するのに十分な量の抗原性タンパク質をイネ胚乳細胞内に蓄積させることができる。【００３２】
抗原性タンパク質をコードするＤＮＡに含まれるコドンは植物型コドンに改変されていることが好ましい。植物型コドンに改変されることにより、イネ胚乳細胞内における抗原性タンパク質の発現効率を向上させることができ、免疫応答を誘導するのに十分な量の抗原性タンパク質をイネ胚乳細胞内で発現させることができる。【００３３】
「イネ胚乳特異的プロモーター」及び「イネ胚乳特異的ターミネーター」とは、イネ胚乳細胞において特異的に機能するプロモーター及びターミネーターを意味し、その種類は特に限定されるものではない。イネ胚乳特異的プロモーター及びターミネーターとしては、例えば、イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーターが挙げられる。イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーターを利用することにより、イネ胚乳細胞内で抗原性タンパク質を効率よく発現させることができ、免疫応答を誘導するのに十分な量の抗原性タンパク質をイネ胚乳細胞内の貯蔵蛋白体（プロテインボディーＩ，ＩＩ）等に蓄積させることができる。【００３４】
「イネ胚乳貯蔵タンパク質」とは、イネ胚乳細胞内で特異的に発現し、イネ胚乳細胞内に蓄積されるタンパク質を意味し、その種類は特に限定されるものではない。イネ胚乳貯蔵タンパク質としては、例えば、グルテリン、プロラミン、グロブリン等が挙げられる。【００３５】
イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターは、グルテリンＧｌｕＢ-１遺伝子のプロモーターであることが好ましい。グルテリンＧｌｕＢ-１遺伝子のプロモーターは、その他のイネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターよりもプロモーター活性が高いので、イネ胚乳細胞内で抗原性タンパク質を効率よく発現させることができ、免疫応答を誘導するのに十分な量の抗原性タンパク質をイネ胚乳細胞内の貯蔵蛋白体（プロテインボディーＩ，ＩＩ）等に蓄積させることができる。【００３６】
イネ胚乳特異的プロモーターは、イネ胚乳特異的プロモーター活性を有する限り、天然型プロモーター及び変異型プロモーターのいずれであってもよい。「変異型プロモーター」とは、天然型プロモーターの塩基配列において１又は複数個の塩基が置換、欠失又は付加した塩基配列からなり、イネ胚乳特異的プロモータープロモーター活性を有するプロモーターを意味する。イネ胚乳特異的ターミネーターについても同様である。【００３７】
天然型プロモーター及びターミネーターの具体例として、イネグルテリンGluB-1遺伝子のプロモーター及びターミネーターの塩基配列をそれぞれ配列番号１７及び１８に示す。また、変異型プロモーターの具体例としては、配列番号１７記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が置換、欠失又は付加した塩基配列からなり、イネ胚乳特異的プロモーター活性を有するプロモーターが挙げられ、変異型ターミネーターの具体例としては、配列番号１８記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が置換、欠失又は付加した塩基配列からなり、イネ胚乳特異的ターミネーター活性を有するターミネーターが挙げられる。【００３８】
イネのゲノムＤＮＡに発現可能に組み込まれるＤＮＡ構築物は、抗原性タンパク質をコードするＤＮＡと、その上流に連結されたイネ胚乳特異的プロモーターとを含む。【００３９】
抗原性タンパク質がヘテロ多量体を構成するサブユニットである場合、ＤＮＡ構築物は、ヘテロ多量体を構成する各サブユニットをコードするＤＮＡを含むことが好ましい。これにより、イネ胚乳細胞内でヘテロ多量体を形成させることができる。【００４０】
抗原性タンパク質と、そのＮ末端に連結されたイネ胚乳貯蔵タンパク質のシグナルペプチドとを含む融合タンパク質を発現させる場合、ＤＮＡ構築物は、抗原性タンパク質をコードするＤＮＡの上流に連結された当該シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含む。なお、当該シグナルペプチドをコードするＤＮＡはイネ胚乳特異的プロモーターの下流に連結される。【００４１】
抗原性タンパク質と、そのＣ末端に連結された小胞体局在化シグナルペプチドとを含む融合タンパク質を発現させる場合、ＤＮＡ構築物は、抗原性タンパク質をコードするＤＮＡの下流に連結された当該小胞体局在化シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含む。なお、当該小胞体局在化シグナルペプチドをコードするＤＮＡは、イネ胚乳特異的ターミネーターの上流に連結される。【００４２】
ＤＮＡ構築物がゲノムＤＮＡに発現可能に組み込まれたトランスジェニックイネの作出方法は特に限定されるものではない。トランスジェニックイネは、例えば、イネ細胞に、ＤＮＡ構築物を含むベクターを導入した後、形質転換イネ細胞を培養してイネ植物体を再生させることにより作出することができる。ベクターを導入するイネ細胞の形態は、植物体に再生可能である限り特に限定されるものではなく、例えば、培養細胞、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根、カルス等が挙げられる。ベクターとしてプラスミドを用いる場合は、ベクターが導入されたイネ細胞を効率よく選択することができるように、ハイグロマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を含有させておくことが好ましい。イネ細胞へのベクターの導入方法は特に限定されるものではないが、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・リゾゲネス等を利用した間接導入法（Hiei,Y.et al.,Plant J.,6,271-282,1994；Takaiwa,F.et al.,Plant Sci.111,39-49,1995；日本特許第3141084号）、エレクトロポレーション法（Tada,Y. et al. Theor.Appl.Genet,80,475,1990）、ポリエチレングリコール法（Datta,S.K.et al.,Plant MolBiol.,20,619-629,1992）、パーティクルガン法（Christou,P.et al.,Plant J.2,275-281,1992、Fromm,M.E.,Bio/Technology,8,833-839,1990）等の直接導入法が挙げられる。イネ細胞を培養してイネ植物体を再生させる方法は特に限定されるものではなく、公知の方法に従えばよい。【００４３】
トランスジェニックイネの胚乳細胞内には免疫応答を誘導するのに十分な量の抗原性タンパク質がその抗原性を失うことなく蓄積されているので、トランスジェニックイネから採取された米又はその加工物をヒト又はその他の動物へ経粘膜投与することにより、その生体内において全身系免疫及び粘膜系免疫を誘導することができる。したがって、トランスジェニックイネから採取された米又はその加工物は、ワクチン組成物の有効成分として使用することができ、ワクチン組成物をヒト又はその他の動物に経粘膜投与することにより、その生体内において所望の免疫応答を誘導することができる。また、抗原性タンパク質がイネ胚乳細胞（特にプロテインボディーＩ）に蓄積されることにより、抗原性タンパク質にはペプシン抵抗性が付与される。したがって、イネ胚乳細胞（特にプロテインボディーＩ）に蓄積された抗原性タンパク質は、胃での消化を免れて腸管に達し、粘膜誘導組織であるパイエル板等に存在する抗原取り込み能を有する細胞（例えばＭ細胞）から取り込まれることにより、抗原特異的免疫応答を誘導することができる。このため、全身系及び粘膜系の抗原特異的免疫応答を誘導するために必要な抗原性タンパク質の経口投与量は、精製された抗原性タンパク質よりも少量で済む。【００４４】
「米」とは、胚乳を含有する組織又はその部分を意味し、籾、玄米、種子、白米、これらの部分等が含まれる。「米加工物」には、抗原性タンパク質を含有する限りいかなる加工物も含まれる。米に施す加工としては、例えば、脱穀、粉末化、タンパク質画分の抽出、抽出されたタンパク質画分の精製等が挙げられる。【００４５】
米又はその加工物を投与する動物としては、例えば、ヒト及びその他の脊椎動物（例えば、哺乳類、鳥類、両性類、魚類、爬虫類）等が挙げられる。経粘膜投与としては、例えば、経口投与、口腔内投与、鼻孔内投与等が挙げられる。
ワクチン組成物の形態は、投与経路等に応じて適宜選択することができる。ワクチン組成物の形態としては、医薬組成物、飲食品組成物、飼料組成物等が挙げられる。医薬組成物、飲食品組成物、飼料組成物等の種々の形態の組成物は常法に従って調製することができる。ワクチン組成物は適当なアジュバントとともに投与してもよい。【００４６】
ワクチン組成物の投与量は、投与動物の年齢、性別、体重、症状、投与経路等の条件に応じて適宜設定することができるが、一般的には、抗原性タンパク質の投与量に換算して一日あたり１〜３０００μｇ／ｋｇ体重の範囲であり、好ましくは５〜１０００μｇ／ｋｇ体重の範囲であり、特に好ましくは２５〜４００μｇ／ｋｇ体重の範囲である。上記投与量は、数日間隔で投与してもよいし、数週間〜数ヶ月間隔、例えば１〜１２週間隔又は１〜１２ヶ月間隔で投与してもよい。また、投与回数は、数回から数十回が適当であるが、特に限定されるものではない。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。なお、以下の実施例において、遺伝子工学的手法についての詳細な実験操作は、特に述べる場合を除き、モレキュラークローニング第２版（Sambrook et al. eds.Col Spring Harbar Laboratory Pres, New York 1989）又は製造業者の取り扱い説明書に従って行った。【００４８】
〔実施例１〕コレラ毒素Ｂサブユニット（cholera toxin subunit B ：ＣＴＢ）遺伝子を組み込んだＴ−ＤＮＡベクターの構築
ＣＴＢ遺伝子として、天然型ＣＴＢ（ｎＣＴＢ）遺伝子及び植物コドン変更型ＣＴＢ（変異型ＣＴＢ，ｍＣＴＢ）遺伝子の２種類を調製した。
V.choleraのコレラ毒素（cholera toxin ：ＣＴ）遺伝子（Sanchez, J and Holmgren, J. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol 86, pp 481-485）を鋳型としたＰＣＲにより、天然型ＣＴＢ遺伝子（ｎＣＴＢ遺伝子）を増幅した。ＰＣＲは、forwardプライマー CTB-F-NcoI（配列番号３）及びreverseプライマー CTB-KDEL-R（配列番号４）を使用して行い、ＰＣＲ産物として、ｎＣＴＢ遺伝子の３'末端にＫＤＥＬ（配列番号２）をコードするＤＮＡ（配列番号１）が付加されたｎＣＴＢ−ＫＤＥＬ遺伝子を得た。【００４９】
ｎＣＴＢ遺伝子のコドンを植物型コドン（特にイネのコドン）に改変し、イネにおける発現に最適なコドンにした。すなわち、ｎＣＴＢ遺伝子のコドンのうち、植物ではほとんど利用されない１２ヶ所のコドンを植物型コドンに改変し（表１）、変異型ＣＴＢ遺伝子（ｍＣＴＢ遺伝子：配列番号５）を調製した。なお、ｎＣＴＢ遺伝子及びｍＣＴＢ遺伝子にコードされるＣＴＢのアミノ酸配列を配列番号６に示す。【００５０】
【表１】
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【００５１】
ｍＣＴＢ遺伝子は長さ約１７０ｂｐｓの２つのフラグメント（Ｆ１，Ｆ２）から構成される。その２つのＤＮＡフラグメントは、アニーリングさせた相補的なオリゴＤＮＡペア（Ｆ１についてはF1-up（配列番号７）及びF1-low（配列番号８）からなるオリゴＤＮＡペア，Ｆ２についてはF2-up（配列番号９）及びF2-low（配列番号１０）からなるオリゴＤＮＡペア）をクローン化したプラスミドを鋳型としたＰＣＲにより調製した。この際、Ｆ１増幅用プライマーとしては、forwardプライマー F1-Fd（配列番号１１）及びreverseプライマー F1-Rv（配列番号１２）を使用し、Ｆ２増幅用プライマーとしては、forwardプライマー F2-Fd（配列番号１３）及びreverseプライマー F2-Rv（配列番号１４）を使用した。【００５２】
ｍＣＴＢ遺伝子を鋳型とし、forwardプライマー F1-Fd（配列番号１１）及びreverseプライマー CTB-KDEL-R（配列番号４）を使用してＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物として、ｍＣＴＢ遺伝子の３'末端にＫＤＥＬ（配列番号２）をコードするＤＮＡ（配列番号１）が付加されたｍＣＴＢ−ＫＤＥＬ遺伝子を得た。【００５３】
ＰＣＲ産物として得られたｎＣＴＢ−ＫＤＥＬ遺伝子又はｍＣＴＢ−ＫＤＥＬ遺伝子をそれぞれ、イネグルテリンＧｌｕＢ−１遺伝子のプロモーター（２．３ｋｂｓ）（配列番号１７）の下流に連結されたイネグルテリンＧｌｕＢ−１のシグナルペプチド（配列番号１６）をコードするＤＮＡ（配列番号１５）と、イネグルテリンＧｌｕＢ−１遺伝子のターミネーター（０．６ｋｂｓ）（配列番号１８）との間に制限酵素ＮｃｏＩ及びＳａｃＩを用いてサブクローニングした。こうして、イネグルテリンＧｌｕＢ−１遺伝子のプロモーターと、その下流に連結されたイネグルテリンＧｌｕＢ−１のシグナルペプチドをコードするＤＮＡと、その下流に連結されたｎＣＴＢ遺伝子又はｍＣＴＢ遺伝子と、その下流に連結されたＫＤＥＬをコードするＤＮＡと、その下流に連結されたイネグルテリンＧｌｕＢ−１遺伝子のターミネーターとを含むＤＮＡ構築物を調製した。このＤＮＡ構築物をＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとしてハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を含むpGPTV-35S-HPTに導入した。【００５４】
以上のようにして、ｍＣＴＢ遺伝子を組み込んだＴ−ＤＮＡベクター pGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-mCTB（図１参照）及びｎＣＴＢ遺伝子を組み込んだＴ−ＤＮＡベクター pGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-nCTB（図１参照）を構築した。【００５５】
〔実施例２〕アグロバクテリウムへのＴ−ＤＮＡベクターの導入
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０５株を、１０ｍＬのＹＥＡ液体培地（ビーフエキス５ｇ／Ｌ，酵母エキス１ｇ／Ｌ，ペプトン１ｇ／Ｌ，ショ糖５ｇ／Ｌ，２ｍＭ ＭｇＳＯ４）（ｐＨ７．２）に接種し、ＯＤ６３０ｎｍが０．４〜０．６の範囲になるまで、２８℃で培養した。培養液を６９００×ｇ、４℃で１０分間遠心し集菌した後、菌体を２０ｍＬの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）に懸濁し、再度遠心し集菌した。次いで、この菌体をＹＥＢ液体培地に懸濁して、これをプラスミド導入菌液とした。【００５６】
アグロバクテリウムへのＴ−ＤＮＡベクター pGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-mCTB又はpGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-nCTBの導入は、エレクトロポレーション法によって行った。各プラスミド３μgを混合したプラスミド導入菌液５０μＬに対し、電極間距離０．２ｃｍにて２．５ｋＶ，２５μＦ，２００ωの電気パルスを付与することにより、各プラスミドをアグロバクテリウムに導入した。電気パルスの付与には、バイオラッド社製 Genepulser IIを使用した。【００５７】
エレクトロポレーション後、菌体を０．２ｍＬのＹＥＢ液体培地に加えて２５℃で１時間振とう培養した後、５０ｍｇ/Ｌカナマイシン添加ＹＥＢ固体培地に播種し、２８℃で２日間培養することによりプラスミド導入株を選択した。プラスミド導入の最終的確認は、選択された株よりアルカリＳＤＳ法で抽出したプラスミドを制限酵素にて切断して、その切断断片の電気泳動パターンを比較することで行った。【００５８】
〔実施例３〕ＣＴＢ遺伝子導入イネの作出
実施例２で選抜したpGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-mCTB又はpGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-nCTB導入アグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０５株を、再度ＹＥＢ固体培地にて２８℃で２日間培養した後、ＹＥＢ液体培地にて２５℃、１８０ｒｐｍで一晩培養し、培養物を３００ｒｐｍで２０分間遠心し集菌した後、アセトシリンゴン１０ｍｇ／Ｌ、２,４−Ｄ(２,４ジクロロフェノキシ酢酸)２ｍｇ／Ｌ及びシュクロース３０ｇ／Ｌを含むＮ６液体培地に、ＯＤ６００ｎｍが０．１となるように懸濁し、感染用アグロバクテリウム菌液とした。【００５９】
ＣＴＢ遺伝子導入イネは、日本特許第３１４１０８４号に従い、イネ完熟種子に、pGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-mCTB又はpGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-nCTB導入アグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０５株を感染させることにより作出した。具体的な方法は以下の通りである。【００６０】
（１）殺菌
Oryza sativa cv. Kitaake由来のイネ種子を、籾殻の除去後、無傷の状態で、２．５％次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）溶液中で殺菌した。水での十分な洗浄の後、イネ種子を以下の無菌操作に供した。【００６１】
（２）前培養
イネ種子を、２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地（３０ｇ／ｌスクロース、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２．８ｇ／ｌプロリン、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ５．８）に播種し、５日間、２７℃〜３２℃で保温した。この間にイネ種子は発芽した。【００６２】
（３）アグロバクテリウム感染
感染用アグロバクテリウム菌液に、前培養したイネ種子を浸漬した後、２Ｎ６−ＡＳ培地（３０ｇ／Ｌ スクロース，１０ｇ／Ｌ グルコース，０．３ｇ／Ｌ カザミノ酸，２ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ，１０ｍｇ／Ｌ アセトシリンゴン，４ｇ／Ｌ ゲルライト，ｐＨ５．２）に移植した。暗黒下で３日間、２８℃で保温して共存培養した。【００６３】
（４）除菌及び選抜
共存培養の完了後、５００ｍｇ／Ｌ カルベニシリンを含有するＮ６Ｄ培地を用いて、種子から、アグロバクテリウムを洗い流した。次いで、形質転換された種子の選抜を、以下の条件で行った。
第１回目の選抜：カルベニシリン（５００ｍｇ／Ｌ）及びハイグロマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を補充した、２ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地上に、種子を置き、７日間、２７℃〜３２℃で保温した。
第２回目の選抜：カルベニシリン（５００ｍｇ／Ｌ）及びハイグロマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を補充した、２〜４ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地上に、種子を置き、さらに７日間、２７℃〜３２℃で保温した。【００６４】
（５）再分化
選抜された形質転換種子を、以下の条件で再分化させた。
第１回目の再分化：再分化培地（カルベニシリン（５００ｍｇ／Ｌ）及びハイグロマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を補充したＭＳ培地（３０ｇ／Ｌ スクロース，３０ｇ／Ｌ ソルビトール，２ｇ／Ｌ カザミノ酸，２ｍｇ／Ｌ カイネチン，０．００２ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，４ｇ／Ｌ ゲルライト，ｐＨ５．８）上に、選抜した種子を置き、２週間、２７℃〜３２℃で保温した。
第２回目の再分化：第１回目の再分化において使用したのと同じ再分化培地を使用して、さらに２週間、２７℃〜３２℃で保温した。【００６５】
（６）鉢上げ
再分化した形質転換体を、発根培地（ハイグロマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を補充した、ホルモンを含まないＭＳ培地）上に移して、根の発育を確認した後に、鉢上げした。【００６６】
〔実施例４〕ゲノムＰＣＲ
イネのゲノムＤＮＡを調製するため、まず、野生型イネ及びｎＣＴＢ又はｍＣＴＢ遺伝子導入イネの緑葉を約５ｍｍ角に切り、２〜３枚を１．５ｍＬ容のマイクロチューブに入れ、チップの先でつついて細かくした。０．４ｍＬのＤＮＡ抽出液（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)，０．２５Ｍ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％(ｗ／ｖ)ＳＤＳ）を加え、ボルテックスを利用して激しく攪拌した後、室温で１時間静置した。遠心分離で得られる水層に、０．３ｍＬのイソプロパノールを加えて混合した後、遠心分離して沈殿を回収し、７０％(ｖ／ｖ)エタノールで洗浄した。得られた沈殿を０．１ｍＬのＴＥ溶液に溶解して、イネのゲノムＤＮＡ画分とした（植物のＰＣＲ実験プロトコール  細胞工学別冊  秀潤社）。得られたイネゲノムＤＮＡ画分を鋳型としてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動してＣＴＢ遺伝子のバンドを確認した。【００６７】
ＰＣＲには、ｍＣＴＢ遺伝子増幅用プライマーとして、forwardプライマー F1-Fd（配列番号１１）及びreverseプライマー CTB-KDEL-R（配列番号４）を使用し、ｎＣＴＢ遺伝子増幅用プライマーとして、forwardプライマー CTB-F-NcoI（配列番号３）及びreverseプライマー CTB-KDEL-R（配列番号４）を使用した。
その結果、図２に示すように、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ（図２Ａ）及びｎＣＴＢ遺伝子導入イネ（図２Ｂ）のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合には３３０ｂｐｓのＣＴＢ遺伝子のバンドを確認できたが、野生型イネのゲノムＤＮＡを鋳型とした場合にはＣＴＢ遺伝子のバンドは確認できなかった。なお、図２中、「＃」はサンプル番号を示し（他の図においても同様）、「形質転換プラスミド」は、（Ａ）についてはpGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-mCTBを鋳型とした場合の結果を示し、（Ｂ）についてはpGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-nCTBを鋳型とした場合の結果を示す。【００６８】
〔実施例５〕ノーザンブロット解析
野生型イネ及びｎＣＴＢ又はｍＣＴＢ遺伝子導入イネの登熟種子６粒から全ＲＮＡを抽出した。粉末化した種子に、０．４ｍＬのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加えて激しく攪拌した後、０．４ｍＬのＲＮＡ抽出液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ９．０)，０．１Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，１％(ｗ／ｖ)ＳＤＳ）を加えて攪拌した。遠心により回収した水層に、新たに０．４ｍＬのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加えて激しく攪拌した。遠心後の水層を回収し、１ｍＬの１００％(ｖ／ｖ)エタノールを加えて核酸を沈殿させた。遠心後の沈殿を、７０％(ｖ／ｖ)エタノールで洗浄し、乾燥させ、０．３ｍＬの水で沈殿を溶解した後、０．１ｍＬの８Ｍ塩化リチウムを加え、ＲＮＡを沈殿させた。遠心後の沈殿を２Ｍ塩化リチウム及び７０％(ｖ／ｖ)エタノールで洗浄し、乾燥させた。最後に、５０μＬの水に溶解して、種子全ＲＮＡ画分とした（Tada, Y. et al. (2003) Plant Biotechnology Journal, vol 1, pp 411-422）。得られたＲＮＡ１０μｇを、ホルムアルデヒドを含む１％(ｗ／ｖ)アガロース変性ゲルで電気泳動し、ナイロンメンブレンヘ転写した後、32Ｐで標識したＣＴＢ遺伝子全領域のＰＣＲ増幅断片をプローブとして、ＣＴＢ遺伝子の転写産物を検出した。【００６９】
その結果、図３に示すように、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ（図３Ａ）及びｎＣＴＢ遺伝子導入イネ（図３Ｂ）の種子ではＣＴＢ遺伝子の転写産物が確認されたが、野性型イネの種子ではＣＴＢ遺伝子の転写産物が確認されなかった。なお、ＲＮＡをエチジウムブロマイドで染色してｒＲＮＡを可視化することにより、本実験で解析したＲＮＡ量を確認した。【００７０】
〔実施例６〕タンパク質分析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，ウエスタンブロット）
野生型イネ及びｎＣＴＢ又はｍＣＴＢ遺伝子導入イネの完熟種子を微粉末化し、４％ＳＤＳ、８Ｍ尿素、５％βメルカプトエタノール及び２０％グリセロールを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）を用いて室温で１５分間抽出した後、遠心し、その上清を１５％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。実験は二重で行い、一方はクマシーブリリアントブルーを用いてタンパク質染色を行い、他方はＰＶＤＦ膜に電気的に転写後、抗ＣＴＢ家兎血清、ＨＲＰ標識抗家兎ＩｇＧ抗体を用いてウエスタンブロティング抗体染色を行った。【００７１】
その結果、図４に示すように、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネの種子で発現するＣＴＢは、抗体染色（図４Ｂ）だけでなく、タンパク質染色（図４Ａ）でも検出できた。これに対して、ｎＣＴＢ遺伝子導入イネの種子で発現するＣＴＢは、抗体染色（図４Ｂ）でもタンパク質染色（図４Ａ）でも検出できなかった。このことから、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネの種子の方がｎＣＴＢ遺伝子導入イネの種子よりもＣＴＢ発現量が多いことが確認された。【００７２】
さらに発現されているＣＴＢが５量体構造をしているかを確認する為に、野生型イネ及びｍＣＴＢ遺伝子導入イネの完熟種子を微粉末化し、非還元条件下（０．１％ＳＤＳ及び２０％グリセロールを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８））、室温で１５分間抽出した後、遠心し、その上清を１５％ アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。実験は二重で行い、一方はクマシーブリリアントブルーを用いてタンパク質染色を行い、他方はＰＶＤＦ膜に電気的に転写後、抗ＣＴＢ家兎血清、ＨＲＰ標識抗家兎ＩｇＧ抗体を用いてウエスタンブロティング抗体染色を行った。結果を図５に示す。非還元条件下ではタンパク質染色（図５Ａ）及び抗体染色（図５Ｂ）ともに、大部分のバンドが５５〜６５ｋＤａ付近で観察されたことから、イネ種子に発現されたＣＴＢはほぼ５量体構造をしているものと思われる。なお、タンパク質シークエンサー（アプライドバイオシステム社製）を用いてアミノ酸配列を解析した結果、単量体として観測された２本のバンド（１０ｋＤａ，１２ｋＤａ）のうち、低分子側はＮ末端にＴＰＱＮＩは配列を有するＣＴＢであることが確認された。また、高分子側はＮ末端がブロックされているようで、アミノ酸配列を解析できなかったが、グルテリンシグナル配列を有するＣＴＢであると推測された。【００７３】
〔実施例７〕発現タンパク質量
５０〜５００ｎｇの細菌由来の標準ＣＴＢにつき、実施例６と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、その後ＰＶＤＦ膜に転写後、抗ＣＴＢ家兎血清、ＨＲＰ標識抗家兎ＩｇＧ抗体を用いて抗体染色を行った。その後、スキャナー（ChemiDoc XRC システム：日本バイオラッド社製）で相対シグナル強度を読み込み、標準ＣＴＢのデータからＣＴＢタンパク質の検量線を引き、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネの種子のＣＴＢ発現量を定量した。その結果を図６に示す。図６は、雑種第１世代（Ｆ１）の同一形質転換体系統からそれぞれ採取した３〜５個の種子のＣＴＢタンパク質集積量（μｇ／粒）を示す。【００７４】
〔実施例８〕ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子の粉末化（製剤化）
完熟イネ種子から籾殻を取り除き、マルチビーズショカー（安井器機株式会社製）のメタルコーン２ｍＬチューブにこの脱穀後のイネ種子を１本あたり５粒入れてセットし、２０００ｒｐｍで７秒の条件で３回振動させて微粉末に調製した。こうして調製された微粉末イネ種子は１００ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳに懸濁させた場合でもマウス用使い捨て経口ゾンデ（１８Ｇ注射針程度の直径）で懸濁液を通過させることができるほど微粉末化されていた。【００７５】
〔実施例９〕ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子の経口免疫
６週令〜８週令のＢａｌｂ／ｃマウス１群（５〜６匹）に実施例８で微粉末化した完熟イネ種子１００ｍｇを１ｍＬのメイロン液（大塚製薬、Maylon-P）に懸濁させて、マウス用使い捨て経口ゾンデ（フチガミ器機（有））を用いて、５日間隔で６回経口免疫を行った。ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子は実施例７の方法で定量して１００ｍｇ重量あたりＣＴＢ３０μｇ含むように調製した。別の１群は陽性コントロールとして、大腸菌を用いて調製したＣＴＢ（List Biological Laboratories，USA）３０μｇを、さらに別の１群は陰性コントロールとして、野生型完熟イネ種子２０ｍｇを同様に経口免疫した。最終免疫５日後に、各群のマウスからそれぞれ血清及び糞便又は小腸洗浄液を集めた。糞便は１００ｍｇあたり１ｍＬのＰＢＳにて抽出し、遠心上清を糞便検体とした。小腸の洗浄は小腸を切り取り、腸管を開いて約２ｃｍずつ切断して５ｍＬのＰＢＳ中に懸濁洗浄し、その遠心上清を小腸洗浄液とした。【００７６】
〔実施例１０〕血清及び糞便中のＣＴＢ特異的抗体の測定
抗原特異的抗体の測定は、Y.Yukiらの方法（Int. Immunol. 4：537-545(1998)）に従って測定した。すなわち、ファルコン社製マイクロテストIIIアッセイプレートに０．５μｇ／０．１ｍＬのＣＴＢをコーティングし、１％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキング後、段階希釈された血清又は糞便抽出液を加えて室温で２時間インキュベートし、プレートを０．０１％ツイーン２０を含むＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で洗浄後、１０００倍希釈した抗マウスγ、α、μ鎖特異的抗体結合パーオキシターゼ（Southern Biotechnology Birmingham, USA）を各ウエルに０．１ｍＬ加えて２時間室温で反応させ、ＴＰＢＳで洗浄後、発色基質（3,3',5,5'-tetramethybenzidine, Moss, Pasadena, USA）を加えて１０分室温で発色させ、０．５Ｎ塩酸５０μＬを加えて反応を止めた。ＩｇＧサブクラスの決定にはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３に対する抗体結合パーオキシターゼ（Southern Biotechnology Birmingham, USA）を用いた。最終抗原特異的抗体価は対照と比較してＯＤ４５０ｎｍの値が０．１を超える最終希釈数の底２対数値（Ｌｏｇ２値）として評価した。【００７７】
その結果、図７に示すように、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子粉末又は細菌由来ＣＴＢを経口投与したマウスから得られた血清には、野生型イネ種子粉末を経口投与したマウスから得られた血清と比較して有意に高い抗体価を有するＣＴＢ特異的ＩｇＧが存在していた。また、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子粉末又は細菌由来ＣＴＢを経口投与したマウスから得られた血清には、同等の抗体価を有するＣＴＢ特異的ＩｇＧが存在していた。【００７８】
次に、ＣＴＢ特異的ＩｇＧサブクラスを調べた。その結果、図８に示すように、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子粉末又は細菌由来ＣＴＢを経口投与したマウスから得られた血清には、野生型イネ種子粉末を経口投与したマウスから得られた血清と比較して有意に高い抗体価を有するＣＴＢ特異的ＩｇＧサブクラス抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ａの順番で存在していた。また、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子粉末又は細菌由来ＣＴＢを経口投与したマウスから得られた血清間では、各サブクラスの抗体価に差はなかった。ＩｇＧサブクラス分析によりイネ種子に発現させたＣＴＢも細菌由来ＣＴＢと同様に、マウスへの経口免疫によりＴｈ２型の免疫応答を誘導できることが示唆された。【００７９】
次に、糞便抽出液中のＣＴＢ特異的ＩｇＡの有無を調べた。その結果、図９に示すように、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子粉末投与群又は細菌由来ＣＴＢ投与群では、野生型イネ種子粉末投与群と比較して有意に高い抗体価を有するＣＴＢ特異的ＩｇＡが存在していた。
以上のことから、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子を経口投与することにより抗原特異的免疫応答が全身系のみならず粘膜面にも誘導されていることが確認された。【００８０】
〔実施例１１〕中和抗体の存在の証明
コレラトキシン（ＣＴ）がマウスにおいても下痢症状を起こすことを利用して、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子の経口投与により誘導されたＣＴＢに対する血清及び分泌液中の抗体が、ＣＴの毒素活性を阻害するかを調べた（S. Yamamoto et al. J. Exp. Med 185:1203-1210 (1997)）。
無処理マウスの小腸を取り出し、糸で縛り５ｃｍのループを作り、１μｇのＣＴ（List Biological Laboratories，USA）を実施例９で得られた血清又は小腸洗浄液と混合して小腸ループ内に注射し、約１２時間生かしておいた。その後、小腸ループを取り出して約１ｃｍずつ切断して遠心し、下痢症状の特徴である体内由来の水の量を遠心上清として回収測定した。【００８１】
その結果、図１０に示すように、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子又は細菌由来精製ＣＴＢの経口投与により血清及び小腸分泌液中に誘導された抗体には、ＣＴの活性を阻害する中和抗体が含まれていることが確認された。この中和活性は野生型イネ種子を経口投与されたマウスの血清及び小腸洗浄液には確認されなかった。【００８２】
〔実施例１２〕中和抗体価の測定
ＣＴのＣＨＯ細胞の障害効果を利用して、誘導された中和抗体価を定量した(S. Yamamoto et al. J. Exp. Med 185:1203-1210 (1997))。すなわち、段階希釈された血清又は小腸洗浄液にＣＴ（０．０１μｇ／ｍＬ）を加えて混合し、その混合液５０μＬにＣＨＯ細胞（４×１０5／ｍＬ）５０μＬを加えて、３７℃、５％ＣＯ2中で２４時間、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。その後、生存しているＣＨＯ細胞を測定した。中和抗体価は完全な細胞障害阻止効果をもつ血清又は小腸洗浄液の最大希釈倍率と定義した。【００８３】
その結果、表２に示すように、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子の経口投与によって血清及び小腸洗浄液に誘導された中和抗体価は、細菌由来精製ＣＴＢの経口投与によって誘導された血清及び小腸洗浄液の中和抗体価と遜色はなかった。また、野生型イネ種子を経口投与されたマウスの血清及び小腸洗浄液には中和抗体価を確認できなかった。【００８４】
【表２】
0004769977.tif 000003
【００８５】
以上のことから、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子からＣＴＢを精製することなくｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子をそのまま経口免疫した場合にも、細菌由来精製ＣＴＢとほぼ同様の免疫原性を示し、かつ細菌由来精製ＣＴＢとほぼ同等の中和抗体価を全身系のみならず粘膜面にも誘導できることが示され、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子を「食べるワクチン」として使用できることが確認された。【００８６】
〔実施例１３〕イネ種子蛋白に対する抗体の有無
実施例９の方法で経口免疫された血清中に、イネ種子に含まれるＣＴＢ以外のタンパク質に対する抗体が誘導されてないことを示す為に、野生型イネ及びｎＣＴＢ又はｍＣＴＢ遺伝子導入イネの完熟種子を微粉末化し、４％ＳＤＳ、８Ｍ尿素、５％βメルカプトエタノール及び２０％グリセロールを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）で室温１５分間抽出し、遠心し、その上清を１５％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ＰＶＤＦ膜に電気的に転写し、実施例９で得られた野生型イネの完熟種子、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネの完熟種子又は細菌由来標準ＣＴＢを経口免疫したマウス血清を用いて抗体染色を行った。【００８７】
その結果、図１１に示すように、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子又は細菌由来標準ＣＴＢを経口免疫したマウス血清には、ＣＴＢに対する抗体の存在は確認されたが、イネ種子に含まれるＣＴＢ以外のタンパク質に対する抗体の存在は確認されなかった。このことから、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子の経口免疫により、ＣＴＢに対する免疫応答は誘導されるが、イネ種子に含まれるＣＴＢ以外のタンパク質に対する免疫応答は誘導されないことが示された。【００８８】
〔実施例１４〕ＣＴＢのＣ末端にエイズウイルスの中和エピトープＶ３Ｊ１が結合したキメラタンパク質を産生するトランスジェニックイネの作出
エイズウイルスの中和エピトープＶ３Ｊ１をコードするＤＮＡ（配列番号１９）の３'末端にＫＤＥＬ（配列番号２）をコードするＤＮＡ（配列番号１）が付加されたＶ３Ｊ１−ＫＤＥＬ遺伝子を化学合成により得た。【００８９】
実施例１と同様の要領で、Ｖ３Ｊ１−ＫＤＥＬ遺伝子を、イネグルテリンＧｌｕＢ−１遺伝子のプロモーター（２．３ｋｂｓ）（配列番号１７）の下流に連結されたイネグルテリンＧｌｕＢ−１のシグナルペプチド（配列番号１６）をコードするＤＮＡ（配列番号１５）及びその下流に連結されたｍＣＴＢ遺伝子と、イネグルテリンＧｌｕＢ−１遺伝子のターミネーター（０．６ｋｂｓ）（配列番号１８）との間に制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩを用いてサブクローニングした。
なお、ｍＣＴＢ遺伝子の下流にＶ３Ｊ１−ＫＤＥＬ遺伝子を連結するにあたり、ｍＣＴＢ遺伝子の下流にヒンジペプチド配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ及び制限酵素ＢａｍＨＩサイト（ｇｇａｔｃｃ）をコードするＤＮＡ（配列番号２０）が連結されるように、Ｖ３Ｊ１−ＫＤＥＬ遺伝子の配列をデザインした。【００９０】
こうして、イネグルテリンＧｌｕＢ−１遺伝子のプロモーターと、その下流に連結されたイネグルテリンＧｌｕＢ−１のシグナルペプチドをコードするＤＮＡと、その下流に連結されたｍＣＴＢ遺伝子と、その下流に連結されたＶ３Ｊ１−ＫＤＥＬ遺伝子と、その下流に連結されたイネグルテリンＧｌｕＢ−１遺伝子のターミネーターとを含むＤＮＡ構築物を調製した。このＤＮＡ構築物をＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとしてハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を含むpGTV-35S-HPTに導入した。
以上のようにしてｍＣＴＢ遺伝子及びその下流に連結されたＶ３Ｊ１−ＫＤＥＬ遺伝子を組み込んだＴ−ＤＮＡベクター pGTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-mCTB-V3J1を構築した。【００９１】
その後、実施例２と同様の方法で、アグロバクテリウムへＴ−ＤＮＡベクターを導入し、次いで、実施例３と同様の方法で、ＣＴＢのＣ末端にエイズウイルスの中和エピトープＶ３Ｊ１が結合したキメラタンパク質（ｍＣＴＢ−Ｖ３Ｊ１)を産生するトランスジェニックイネを作出した。【００９２】
〔実施例１５〕キメラタンパク質の発現（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，ウエスタンブロット）
野生型イネ及びｍＣＴＢ−Ｖ３Ｊ１遺伝子導入イネの完熟種子を微粉末化し、４％ＳＤＳ、８Ｍ尿素、５％β−メルカプトエタノール及び２０％グリセロールを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）を用いて室温で１５分間抽出した後、遠心し、その上清について１５％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、その後、ＰＶＤＦ膜に電気的に転写し、抗Ｖ３Ｊ１家兎血清、ＨＲＰ標識抗家兎ＩｇＧ抗体を用いてウエスタンブロッティング抗体染色を行った。【００９３】
その結果、図１２に示すように、ｍＣＴＢ−Ｖ３Ｊ１遺伝子導入イネの種子で発現したＣＴＢ−Ｖ３Ｊ１タンパク質は、抗体染色で検出できた。なお、図中、「Ｃ」は野生型イネの結果、「Ｎｏ.５」、「Ｎｏ.２６」及び「Ｎｏ.２８」はｍＣＴＢ−Ｖ３Ｊ１遺伝子導入イネの結果を示す。【００９４】
〔実施例１６〕サザンブロット解析
実施例４と同様にして、野生型イネ、ｎＣＴＢ遺伝子導入イネ及びｍＣＴＢ遺伝子導入イネの緑葉からゲノムＤＮＡを単離した後、ＤＮＡ１０μｇを制限酵素ＳａｃＩで消化し、０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋膜にブロットした。ｎＣＴＢ遺伝子又はｍＣＴＢ遺伝子の検出は、ｎＣＴＢ又はｍＣＴＢをコードする二本鎖ＤＮＡを[α-32Ｐ]ｄＣＴＰでラベルしたものをプローブとして用いて行った。
その結果、図１３に示すように、ｎＣＴＢ遺伝子導入イネ（図１３Ａのレーン２）及びｍＣＴＢ遺伝子導入イネ（図１３Ｂのレーン１〜３）では、２本のバンドが確認され、それぞれのゲノムに少なくとも２コピーのｎＣＴＢ遺伝子又はｍＣＴＢ遺伝子が導入されていることが判明した。なお、図中、Ｗは野生型イネに関する結果を示す。【００９５】
〔実施例１７〕ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子の安定性
実施例７で定量したｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子のうち６系統を、室温で６ヶ月、室温で１２ヶ月、又は４℃で１２ヶ月保存した後、ＣＴＢ含有量を定量し、個体選抜直後のイネ種子のＣＴＢ含有量と比較した。なお、定量は実施例７と同様の方法で行い、各保存条件ともイネ種子５粒を定量に用いた。【００９６】
その結果、表３に示すように、個体選抜直後のイネ種子のＣＴＢ含有量と、室温又は４℃で１２ヶ月保存したイネ種子のＣＴＢ含有量との間に有意な差は認められなかった。この結果から、ＣＴＢはそれを発現するイネ種子の中で、室温で少なくとも１２ヶ月以上安定であることが示された。このことは、ワクチン遺伝子を発現させた米が、保存及び輸送の点において、従来の低温保存型ワクチンよりも極めて有利であり、次世代ワクチンに求められるコールドチェーンによらない輸送が可能なワクチンであることを意味する。【００９７】
【表３】
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【００９８】
〔実施例１８〕ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子の消化酵素耐性
実施例７で定量したｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子のうち６系統について、次のようにして消化酵素耐性を検討した。ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子粉末１０ｍｇを、酢酸緩衝液（ｐＨ１．７）に溶解させた０．５ｍｇ／ｍＬペプシン（シグマ社）０．１ｍＬに懸濁し、３７℃で１時間反応させた後、実施例６と同様にしてウエスタンブロット解析し、ＣＴＢ、グルテリンＢ１及びプロラミンを検出した。対照として、野生型イネ種子粉末１０ｍｇ又は精製組換えＣＴＢ１５μｇを同様に処理した。ＣＴＢ、グルテリンＢ１及びプロラミンの検出は、それぞれ抗ＣＴＢ抗体、抗グルテリンＢ１抗体及び抗１３Ｋプロラミン抗体を用いて行った。【００９９】
結果を図１４に示す。なお、図中、「Ｗ」は野生型イネ種子、「Ｔ」はｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子、「Ｐ」は精製組換えＣＴＢを示す。
図１４Ａに示すように、ペプシン処理後のｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子においては、ペプシン未処理検体と比較して７５％のＣＴＢが残存していたが、精製組換えＣＴＢはペプシン処理によって完全に分解されていた。また、図１４Ｂに示すように、米貯蔵蛋白グルテリンＢ１はペプシン処理によって９０％が分解されていたが、図１４ｃに示すように、米貯蔵蛋白１３Ｋプロラミンはペプシン処理しても全く分解されていなかった。【０１００】
以上の結果から、ワクチン遺伝子を米で発現させることにより、発現されたワクチン抗原のペプシンに対する抵抗性が飛躍的に高まることが判明した。このことは、ワクチン抗原を発現させた米を経口投与すると、ワクチン抗原の胃での分解は極力抑えられ、無傷なまま腸まで到達できること、すなわち、ワクチン抗原を発現させた米を経口ワクチンとして使用できることを意味する。【０１０１】
〔実施例１９〕抗原特異的抗体を誘導するのに必要なＣＴＢ量
イネ種子で発現させたＣＴＢがペプシンに対して抵抗性を示すことから、生体内での抗原特異的抗体の誘導に必要なＣＴＢ量は、イネ種子で発現させたＣＴＢの方が、精製された組換えＣＴＢよりも少量であると考えられる。このことを証明するために、マウスに経口免疫するＣＴＢ量が３０，１０，３，１，０．３，０．１μｇとなるように、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子及び精製組換えＣＴＢを水に溶解又は懸濁させ、一週間おきに３回、マウスに経口免疫し、最終免疫から１週間後に血清及び糞便中の抗体価を測定した。【０１０２】
その結果、図１５に示すように、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子は、精製組換えＣＴＢの約１／３〜１／１０の投与量（ＣＴＢ量換算）で、精製組換えＣＴＢと同程度の抗原特異的免疫応答（抗ＣＴＢ血清ＩｇＧ（全身系免疫応答，図１５Ａ）及び抗ＣＴＢ糞便ＩｇＡ（粘膜系免疫応答，図１５Ｂ））を誘導できることが判明した。すなわち、米で発現させたＣＴＢは、消化器官での分解を免れることによって、より低濃度で抗原特異的免疫が誘導できることが判明した。この効果は、粘膜系免疫応答（図１５Ｂ）で特に顕著であった。【０１０３】
〔実施例２０〕ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子の免疫電顕
ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子の胚乳細胞中におけるＣＴＢの局在を調べるために、開花後１２日目のイネ種子を４％パラポルムアルデヒドで固定し、脱水した後、ＬＲ−ｗｈｉｔｅ樹脂に包埋して、Ｎｉグリット上で超薄切片を作成した。この切片にウサギ抗ｍＣＴＢ抗体（１／５００希釈）を反応させ、ブロッキングを行い、ヤギ金標識ウサギＩｇＧを反応させた後、洗浄し、２％ウラニル酢酸で染色し、透過型電子顕微鏡で観察した。【０１０４】
結果を図１６に示す。なお、図中、ＡはｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子に関する観察図であり、Ｂは野生型イネ種子に関する観察図である。また、図中、大きな白色部分は澱粉粒、少し黒色がかった部分（矢印）は貯蔵蛋白グルテリンを含むＩＩ型貯蔵蛋白体、少し灰色がかった部分（矢印）は貯蔵蛋白プロラミンを含むＩ型貯蔵蛋白体、小さな黒色点はＣＴＢを示す。【０１０５】
図１６Ａに示すように、ＣＴＢはＩ型貯蔵蛋白体（プロテインボディーＩ）、ＩＩ型貯蔵蛋白体（プロテインボディーＩＩ）及びそれらの間隙（細胞質、小胞体等）に観察された。一方、図１６Ｂに示すように、野生型イネ種子では、ＣＴＢの有意な染色は観察されなかった。実施例１８の結果（米貯蔵蛋白グルテリンＢ１はペプシン処理によって９０％が分解されていたが、米貯蔵蛋白１３Ｋプロラミンはペプシン処理しても全く分解されていなかったこと）と併せて考えると、米で発現させたＣＴＢのペプシン抵抗性は、ＣＴＢがＩＩ型貯蔵蛋白体以外の場所（特にＩ型貯蔵蛋白体）に存在することによって付与されることが示唆された。【０１０６】
〔実施例２１〕ＣＴＢの粘膜誘導組織への取り込み
経口投与されたｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子が消化器官での分解を免れて腸管に達し、粘膜誘導組織であるパイエル板等に存在する抗原取り込み能を有する細胞（特にＭ細胞）から取り込まれることを証明するために、無処理マウスの腸管を結さくし、その中にｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子又は野生型イネ種子粉末の懸濁液を加え、３０分後にパイエル板を取り出し、洗浄した後、パラフィン切片を作成し、抗ＣＴＢ抗体（ＩｇＧ画分）及びＵＥＡ(Ulex Europeus Agglutinin)−１レクチンを用いてＨＲＰ（ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ）酵素染色した。Ｍ細胞はフコースを認識するレクチンＵＥＡ−１で染色され、上皮細胞層に存在する粘液を吐き出す杯細胞や、クリプト（陰窩）とよばれるパイエル板ドームの特殊上皮層に隣接する上皮細胞絨毛層の間に存在するパネート細胞もレクチンＵＥＡ−１で染色される。【０１０７】
結果を図１７に示す。図１７中、「ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子 ＵＥＡ−１」で示される縦列の３枚の図は、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子を投与した場合のＵＥＡ−１染色結果、「野生型イネ種子 ＵＥＡ−１」で示される縦列の３枚の図は、野生型イネ種子を投与した場合のＵＥＡ−１染色結果、「ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子 抗ＣＴＢ抗体」で示される縦列の３枚の図は、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子を投与した場合の抗ＣＴＢ抗体染色結果、「野生型イネ種子 抗ＣＴＢ抗体」で示される縦列の３枚の図は、野生型イネ種子を投与した場合の抗ＣＴＢ抗体染色結果を示す。また、Ａで示される横列の３枚の図は、パイエル板ドームの特殊上皮層の染色結果（Ａにおいて矢印はＭ細胞を示す）、Ｂで示される横列の３枚の図は、上皮細胞絨毛層の染色結果（Ｂにおいて＊は杯細胞を示す）、Ｃで示される横列の３枚の図は、クリプト（陰窩）組織の染色結果（Ｃにおいて矢印はパネート細胞を、＊は杯細胞を示す）を示す。【０１０８】
図１７に示すように、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子及び野生型イネ種子のいずれを投与した場合も、ＵＥＡ−１染色によって、パイエル板ドームの特殊上皮層（Ａ）、上皮細胞絨毛層（Ｂ）及びクリプト（陰窩）組織（Ｃ）が染色された。ＣＴＢの特異的受容体であるＧＭ１ガングリオシドはすべての上皮細胞に存在するので、ミラー染色で同じ場所を抗ＣＴＢ抗体で染色すると、パイエル板ドームの特殊上皮層（Ａ）、上皮細胞絨毛層（Ｂ）及びクリプト（陰窩）組織（Ｃ）においてＣＴＢの存在が確認されたが、パイエル板ドームの特殊上皮層（Ａ）のＵＥＡ−１レクチン染色されたＭ細胞中に特に多くのＣＴＢの存在が確認された。このことは、米で発現させたＣＴＢは、胃での酵素消化を免れ、小腸に達して、粘膜誘導組織であるパイエル板に存在するＭ細胞にとりこまれ、その直下に存在する抗原提示細胞により抗原提示を受けることを示唆する。以上のことから、米で発現させたワクチン抗原を経口投与すると、ワクチン抗原は胃での分解を免れ、腸管に達して、パイエル板等に存在するＭ細胞から効果的に取り込まれることが明らかになった。【０１０９】
〔実施例２２〕ボツリヌスＡ毒素中和ドメイン（ＨｃＡ，分子量５０ＫＤａ）遺伝子導入イネの作出
植物コドン変異型ＨｃＡ（ＰｌａＨｃＡ）遺伝子の５’末端に制限酵素ＮｃｏＩ認識配列が、３’末端にＫＤＥＬ配列及び制限酵素ＳａｃＩ認識配列が付加されたＤＮＡ断片（以下「ＰｌａＨｃＡ−ＫＤＥＬ遺伝子」という。）を化学合成した（配列番号２１）。ＰｌａＨｃＡ−ＫＤＥＬ遺伝子のコドンは、実施例１と同様に、イネにおける発現に最適なコドンにした。なお、ＰｌａＨｃＡ−ＫＤＥＬ遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２２に示す。【０１１０】
実施例１と同様にして、ＰｌａＨｃＡ−ＫＤＥＬ遺伝子を、イネグルテリンＧｌｕＢ１遺伝子のプロモーター（配列番号１７）の下流に連結されたイネグルテリンＧｌｕＢ１のシグナルペプチド（配列番号１６）をコードするＤＮＡ（配列番号１５）と、イネグルテリンＧｌｕＢ１遺伝子のターミネーター（配列番号１８）との間に制限酵素ＮｃｏＩ及びＳａｃＩを用いてサブクローニングした。こうして、イネグルテリンＧｌｕＢ−１遺伝子のプロモーターと、その下流に連結されたイネグルテリンＧｌｕＢ−１のシグナルペプチドをコードするＤＮＡと、その下流に連結されたＰｌａＨｃＡ遺伝子と、その下流に連結されたＫＤＥＬ配列をコードするＤＮＡと、その下流に連結されたイネグルテリンＧｌｕＢ１遺伝子のターミネーターとを含むＤＮＡ構築物を調製した。このＤＮＡ構築物をＳｓｅ８３８７Ｉ／ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＴＬ７（国際公開番号ＷＯ２００４／０８７９１０）に導入して、ｐＴＬＧｌｕＢ１−ＰｌａＨｃＡを構築した。さらに、（１）カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓのプロモーター（３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）とノパリンシンターゼのターミネーター（Ｎｏｓ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）との間に連結されたハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（ＨＰＴ）、（２）カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓのプロモーターとノパリンシンターゼのターミネーターとの間に連結された酵母由来のＲ／ＲＳ部位特異的組換え系の組換え酵素遺伝子（Ｒ）、及び（３）カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓのプロモーターの下流に連結されたアグロバクテリウムＴ−ＤＮＡ由来のサイトカイニン合成酵素遺伝子（ｉｐｔ）とその下流に連結されたサイトカイニン合成酵素遺伝子のターミネーター（ｉｐｔ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）が、同一方向の２つの酵母由来のＲ／ＲＳ部位特異的組換え系の組換え配列（ＲＳ）に挟まれたＳｓｅ８３８７Ｉフラグメントを、ｐＴＬＧｌｕＢ１−ＰｌａＨｃＡに導入した。以上のようにして、ＰｌａＨｃＡ遺伝子を組み込んだＴ−ＤＮＡベクターｐＴＬＧｌｕＢ１−ＰｌａＨｃＡ−１３０ＨｍｉｎｔｒｅｐＲ（図１８参照）を構築した。なお、この構造は、薬剤耐性遺伝子を除去できるＭＡＴベクター（登録商標）である（国際公開番号ＷＯ２００４／０８７９１０）。【０１１１】
その後、実施例２と同様の方法で、アグロバクテリウムへＴ−ＤＮＡベクターを導入し、次いで、ＷＯ２００４／０８７９１０実施例１に記載の方法に従って、ボツリヌス毒素Ｈｃドメイン（ＨｃＡ）を産生するトランスジェニックイネを作出した。【０１１２】
〔実施例２３〕ボツリヌスＡ毒素中和ドメイン遺伝子（ＰｌａＨｃＡ遺伝子）導入イネのＨｃＡ蛋白の発現及び発現部位
実施例６と同様にして、野生型イネ及びＰｌａＨｃＡ遺伝子導入イネの完熟種子を微粉末化し、４％ＳＤＳ、８Ｍ尿素、５％βメルカプトエタノール及び２０％グリセロールを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）を用いて室温で１５分間抽出した後、遠心し、その上清を１５％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜に電気的に転写した後、抗ＨｃＡ家兎血清、ＨＲＰ標識抗家兎ＩｇＧ抗体を用いてウエスタンブロティング抗体染色を行った。その結果、図１９に示すように、ＰｌａＨｃＡ遺伝子導入イネ種子のうち、４系統（レーン３，４，６，７）では、分子量５０ＫＤａ付近にＨｃＡのバンドが確認されたが、野生型（レーン２）、２系統（レーン５，８）では、同一位置にバンドは確認されなかった。今回は、自家受粉Ｆ１のイネ種子で試験を行ったため、レーン５及び８の２系統のようにＨｃＡを発現してないものも存在するが、ＰｌａＨｃＡ遺伝子導入イネに分子量５０ＫＤａのＨｃＡを発現させることができることが証明された。また、ＨｃＡのイネ胚乳細胞中の局在を、実施例２０と同様に免疫電顕で確認した結果、ＣＴＢと同様にＩ型貯蔵蛋白体、ＩＩ型貯蔵蛋白体及びそれらの間隙（細胞質、小胞体等）に観察された。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】ｍＣＴＢ遺伝子を組み込んだＴ−ＤＮＡベクター pGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-mCTB及びｎＣＴＢ遺伝子を組み込んだＴ−ＤＮＡベクター pGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-nCTBの構造を示す図である。
【図２】ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ（図２Ａ）及びｎＣＴＢ遺伝子導入イネ（図２Ｂ）のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲの結果を示す図である。
【図３】ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ（図３Ａ）及びｎＣＴＢ遺伝子導入イネ（図３Ｂ）の種子に関するノーザンブロット解析の結果を示す図である。
【図４】ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ及びｎＣＴＢ遺伝子導入イネの種子に関するタンパク質（図４Ａ)及び抗体染色（図４Ｂ）の結果を示す図である。
【図５】ｍＣＴＢ遺伝子導入イネの種子に関するタンパク質染色（図５Ａ)及び抗体染色（図５Ｂ）の結果を示す図である。
【図６】ｍＣＴＢ遺伝子導入イネの種子におけるＣＴＢ発現量の定量結果を示す図である。
【図７】野生型イネ種子粉末、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子粉末又は細菌由来ＣＴＢを経口投与したマウスから得られた血清の抗体価の測定結果を示す図である。
【図８】野生型イネ種子粉末、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子粉末又は細菌由来ＣＴＢを経口投与したマウスから得られた血清に含まれるＣＴＢ特異的ＩｇＧサブクラス抗体の抗体価の測定結果を示す図である。
【図９】野生型イネ種子粉末、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子粉末又は細菌由来ＣＴＢを経口投与したマウスの糞便抽出液に含まれるＣＴＢ特異的ＩｇＡの抗体価の測定結果を示す図である。
【図１０】野生型イネ種子粉末、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子粉末又は細菌由来ＣＴＢを経口投与したマウスの血清及び小腸分泌液中に誘導された抗体に、ＣＴの活性を阻害する中和抗体が含まれていることを示す図である。
【図１１】野生型イネ種子粉末、ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子粉末又は細菌由来ＣＴＢを経口投与したマウスの血清には、ＣＴＢに対する抗体は存在するがイネ種子に含まれるＣＴＢ以外のタンパク質に対する抗体は存在しないことを示す図である。
【図１２】野生型イネ及びｍＣＴＢ−Ｖ３Ｊ１遺伝子導入イネの種子に関する抗体染色の結果を示す図である。
【図１３】ｎＣＴＢ遺伝子導入イネ（図１３Ａ）及びｍＣＴＢ遺伝子導入イネ（図１３Ｂ）から単離したゲノムＤＮＡのサザンブロット解析の結果を示す図である。
【図１４】ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子の消化酵素（ペプシン）耐性の測定結果を示す図である。
【図１５】抗原特異的免疫応答（抗ＣＴＢ血清ＩｇＧ（全身系免疫応答，図１５Ａ）及び抗ＣＴＢ糞便ＩｇＡ（粘膜系免疫応答，図１５Ｂ））の誘導に必要なＣＴＢ投与量を示す図である。
【図１６】ｍＣＴＢ遺伝子導入イネ種子（図１６Ａ）及び野生型イネ種子（図１６Ｂ）の胚乳細胞中におけるＣＴＢの局在を示す図である。
【図１７】ｍＣＴＢの粘膜誘導組織への取り込みを示す図である。
【図１８】ＰｌａＨｃＡ遺伝子を組み込んだＴ−ＤＮＡベクターｐＴＬＧｌｕＢ１−ＰｌａＨｃＡ−１３０ＨｍｉｎｔｒｅｐＲの構造を示す図である。
【図１９】ボツリヌスＡ毒素中和ドメイン遺伝子（ＰｌａＨｃＡ遺伝子）導入イネの種子に関するウエスタンブロティング抗体染色の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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