(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バルプロ酸を用いた療法に応答する患者または腫瘍実体の識別方法であって、前記バルプロ酸によって処理された細胞に由来するサンプル中の、ＨＤＡＣ−２ ＲＮＡ、ＨＤＡＣ−２タンパク質、Ｕｂｃ８ ＲＮＡ、ＵＢＣ８タンパク質、ＲＬＩＭ ＲＮＡ、ＲＬＩＭタンパク質、ＴＲＡＩＬ ＲＮＡおよびＴＲＡＩＬタンパク質から成る群より選択される分子マーカーの量を決定することを含む方法。
【請求項２】
前記サンプルが、皮膚癌、メラノーマ、エストロゲンレセプタ依存性および非依存性乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、結腸および結腸直腸癌、膵臓癌、頭部および頚部癌、小細胞および非小細胞肺癌、白血病および他の血液細胞癌ならびに甲状腺耐性症候群から成る群より選択される障害によって影響を受けた組織に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記障害が結腸および結腸直腸癌である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプル中の細胞分化および／またはアポトーシスを測定する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記分子マーカーがリボ核酸であり、分子マーカーの量がＲＴ−ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションによって決定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記分子マーカーがタンパク質であり、分子マーカーの量が分子マーカーに対する抗体の使用によって決定される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記分子マーカーの量がウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、免疫組織化学および／またはフローサイトメトリー法によって決定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
インヒビターが分子マーカーの発現を調節する活性を持つ場合、インヒビターを選択するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記分子マーカーの量を決定するステップであって、参照サンプルが前記ＨＤＡＣインヒビターまたは潜在的なＨＤＡＣインヒビターによって処置されていない細胞由来である、参照サンプル中の前記分子マーカーの量を決定するステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）ＨＤＡＣ−２ ＲＮＡ、ＨＤＡＣ−２タンパク質、Ｕｂｃ８ ＲＮＡ、ＵＢＣ８タンパク質、ＲＬＩＭ ＲＮＡ、ＲＬＩＭタンパク質、ＴＲＡＩＬ ＲＮＡおよびＴＲＡＩＬタンパク質から成る群より選択される分子マーカーの量を決定する手段であって、該手段が、
ＨＤＡＣ−２タンパク質、ＵＢＣ８タンパク質、ＲＬＩＭタンパク質、ＴＲＡＩＬ ＲＮＡおよびＴＲＡＩＬタンパク質からなる群より選択されるタンパク質に対する抗体、または
ＲＬＩＭ ｍＲＮＡ、ＲＬＩＭ ｃＤＮＡ、Ｕｂｃ８ ｍＲＮＡ、Ｕｂｃ８ ｃＤＮＡ、ＴＲＡＩＬ ｍＲＮＡ、ＴＲＡＩＬ ｃＤＮＡ、ＨＤＡＣ−２ ｍＲＮＡ、ＨＤＡＣ−２ ｃＤＮＡおよびその相補鎖から成る群より選択されるポリヌクレオチド
である手段、ならびに
（ｉｉ）バルプロ酸
を含有する、バルプロ酸を用いた療法に応答する患者または腫瘍実体の識別のための診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒストンデアセチラーゼ活性を有する酵素のインヒビターの前臨床および臨床プロファイリングのための、分子マーカーおよび関連シグナル伝達機構の使用に関する。本発明は、このようなインヒビターを用いた腫瘍患者の処置のための、診断および／または予後ツールとしてのこのようなマーカーの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマチンの局所リモデリングは、遺伝子の転写活性化における重要なステップである。ＤＮＡのヌクレオソームパッケージングにおける動的変化は、転写タンパク質をＤＮＡの鋳型と接触させるために発生する必要がある。クロマチンのリモデリングおよび遺伝子の転写に影響する最も重要な機構のひとつは、アセチル化によるヒストンおよび他の細胞タンパク質の翻訳後修飾およびそれに続くクロマチン構造の変化である（Davie, 1998, Curr Opin Genet Dev 8,173-8 ;Kouzarides, 1999, Curr Opin Genet Dev 9,40-8 ; Strahl and Allis, 2000, Nature 403,41-4）。ヒストン過剰アセチル化の場合、ＤＮＡへの静電気引力の変化および疎水性アセチル基によって導入された立体異性は、ヒストンのＤＮＡとの相互作用の不安定化を引き起こす。結果としてヒストンのアセチル化は、ヌクレオソームを破壊し、ＤＮＡが転写機構へアクセスできる。アセチル基の除去は、ヒストンをＤＮＡへ、および隣接するヌクレオソームへさらにしっかりと結合させ、それゆえ転写的に抑制されたクロマチン構造を維持することができる。アセチル化は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）活性を持つ一連の酵素によって仲介される。反対にアセチル基は、特異的ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）酵素によって除去される。これらの機構の破壊は転写調節不全を生じさせ、腫瘍化を引き起こす。
【０００３】
加えて、転写因子などの他の分子は、アセチル化状態に応じてその活性および安定性を変化させる。たとえば急性前骨髄球性白血病（APL）に関連する融合タンパク質であるＰＭＬ−ＲＡＲは、ｐ５３の脱アセチル化および分解を仲介することによってｐ５３を阻害し、それゆえAPL芽細胞にｐ５３依存性癌調査経路を回避させる。造血前駆物質におけるＰＭＬ−ＲＡＲの発現は、ｐ５３仲介転写活性化の抑制、および遺伝毒性ストレス（Ｘ線、酸化ストレス）が引き起こすｐ５３依存性アポトーシスからの保護を生じさせる。しかしながらｐ５３の機能は、ＨＤＡＣの活性補充に関与するＨＤＡＣインヒビターの存在下で、ｐ５３阻害の基礎を成す機構としてのＰＭＬ−ＲＡＲによって、ｐ５３に再組み込みされる（Insinga et al. 2002, 投稿中）。したがって因子アセチル化は、ＨＤＡＣインヒビターの抗腫瘍活性において決定的な役割を果たす。
【０００４】
核ホルモンレセプタは、遺伝子発現の正および負の対照の両方を通じて発生およびホメオスタシスを制御する、リガンド依存性転写因子である。これらのレギュレータプロセスの欠陥は、多くの疾患の原因の基礎を成し、癌の発生で重要な役割を果たす。Ｔ３Ｒ、ＲＡＲおよびＰＰＡＲを含む多くの核レセプタは、リガンドの非存在下でコリプレッサＮ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴと相互作用し、それによって転写を阻害することができる。さらにＮ−ＣｏＲは、アンタゴニストに占有されたプロゲステロンおよびエストロゲンレセプタと相互作用することも報告されている。Ｎ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴは、ｍＳｉｎ３タンパク質およびヒストンデアセチラーゼも含有する大型のタンパク質複合体中に存在することが示されている（Pazin and Kadonaga, 1997; Cell 89,325-8）。それゆえ抑制から活性化への核レセプタのリガンド誘導スイッチは、アンタゴニスト酵素活性を用いた、コリプレッサおよびコアクチベータ複合体の交換を反映している。
【０００５】
Ｎ-ＣｏＲコリプレッサ複合体は、核レセプタによる抑制を仲介するだけでなく、Ｍａｄ−１、ＢＣＬ−６およびＥＴＯを含むさらなる転写因子と相互作用もする。これらのタンパク質の多くは、細胞増殖および分化の障害において重要な役割を果たす（Pazin and Kadonaga, 1997, Cell 89,325-8 ; Huynh and Bardwell, 1998, Oncogene 17,2473-84 ; Wang, J. et al., 1998, Proc Natl Acad Sci U S A 95,10860-5）。たとえばＴ３Ｒは、当初はウィルス発癌遺伝子ｖ−ｅｒｂＡとの相同性に基づいて同定され、野生種レセプタとは対照的にウィルス発癌遺伝子ｖ−ｅｒｂＡはリガンドを結合せず、転写の構成リプレッサとして機能する。さらにＲＡＲにおける突然変異は、多くのヒト癌、特に急性前骨髄球性白血病（APL）および肝細胞癌に関連付けられている。ＡＰＬ患者では、染色体転座から生じるＲＡＲ融合タンパク質が、前骨髄球性白血病タンパク質（PML）または前骨髄球性ジンクフィンガータンパク質（PLZF）のどちらかを包含する。どちらの融合タンパク質もコリプレッサ複合体の成分と相互作用できるが、レチノイン酸の添加はＰＭＬ−ＲＡＲからのコリプレッサ複合体を退けるのに対して、ＰＬＺＦ−ＲＡＲは構成的に相互作用する。これらの発見結果は、ＰＭＬ−ＲＡＲ  ＡＰＬ患者がレチノイン酸処置後に完全な寛解を実現するのに対して、ＰＬＺＦ−ＲＡＲ  ＡＰＬ患者が非常に乏しい応答をする理由の説明となる（Grignani et al., 1998, Nature 391,815-8 ; Guidez et al., 1998, Blood 91,2634-42 ; He et al., 1998, Nat Genet 18,126-35 ; Lin etal., 1998, Nature 391,811-4）。さらに、レチノイン酸による処置後に複数回の再発を経験したＰＭＬＲＡＲ患者は最近、ＨＤＡＣインヒビターのフェニルブチラートによって処置され、白血病の完全寛解を生じている（Warrell et al., 1998, J.Natl. Cancer Inst. 90,1621-1625）。
【０００６】
現在までに、密接に関連した酪酸誘導体のＰｉｖａｎｅｘ（Titan Pharmaceuticals）を単剤療法として用いた臨床第ＩＩ相試験が完了し、ＩＩＩ／ＩＶ期非小細胞肺癌において活性を示している（Keer et al., 2002, ASCO, Abstract No. 1253）。さらなるＨＤＡＣインヒビターが同定され、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４（Novartis）およびＳＡＨＡ（Aton Pharma Inc.）は、第Ｉ相臨床試験において試験されたヒドロキサム酸の構造クラスの構成要素である（Marks et al., 2001, Nature Reviews Cancer 1,194-202）。別のクラスは、環状テトラペプチド、たとえば、Ｔ細胞リンパ腫の処置の第ＩＩ相試験で成功裏に使用されたデプシペプチド（FR901228-藤沢）を含む（Piekarz et al., 2001, Blood 98,2865-8）。さらに、ベンズアミドのクラスに関連する化合物であるＭＳ−２７−２７５（三井製薬）は、血液悪性腫瘍を持つ第Ｉ相試験の患者で現在試験中である。
【０００７】
ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）およびヒストンデアセチラーゼ（HDAC）の補充は、細胞増殖および分化において重要な役割を果たしている多くの遺伝子の動的調節の主要な要素と考えられている。ヒストンＨ３およびＨ４のＮ末端テールの過剰アセチル化は、遺伝子活性化と相関しているが、これに対して脱アセチル化は、転写抑制を仲介できる。結果として、多くの疾患が、転写因子に影響する突然変異によって引き起こされた遺伝子発現における変化に結び付けられてきた。白血病融合タンパク質、たとえばＰＭＬ−ＲＡＲ、ＰＬＺＦ−ＲＡＲ、ＡＭＬ−ＥＴＯおよびＳｔａｔ５−ＲＡＲによる異常抑制は、この点でプロトタイプ例である。これらの場合のすべてにおいて、染色体転座は転写アクチベータをリプレッサに変換し、リプレッサはＨＤＡＣの補充を介して、造血分化に重要な標的遺伝子を構成的に抑制する。同様の事象が多くの他の種類の癌における病原にも寄与することが信頼できる。
【０００８】
哺乳動物ヒストンデアセチラーゼは、３つのサブクラスに分類できる（Gray andEkstrom, 2001）。酵母ＲＰＤ３タンパク質のホモローグであるＨＤＡＣ１、２、３、および８は、クラスＩを構成する。ＨＤＡＣ４、５、６、７、９、および１０は、酵母Ｈｄａ  １タンパク質に関連し、クラスＩＩを形成する。最近、酵母Ｓｉｒ２タンパク質の複数の哺乳動物ホモローグが、ＮＡＤ依存性であるデアセチラーゼの第３のクラスを形成することが確認された。これらのＨＤＡＣはすべて、大量の多タンパク質複合体のサブユニットとして、細胞中に存在すると思われる。特にクラスＩおよびＩＩ  ＨＤＡＣは、転写因子へのＨＤＡＣの補充に必要な架橋因子として作用する転写コリプレッサのｍＳｉｎ３、Ｎ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴと相互作用することが示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
癌療法における分子マーカー  ヒト癌の診断およびステージングのための新たな分子マーカーの発見は、なお進行中の作業であり、正しい治療方法の選択には必須である。乳癌の場合、分子マーカー、たとえばＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ５３、ＢＣＬ−２およびエストロゲン／プロゲステロンレセプタ発現レベルが、疾患の状態および進行と相関することが明確に示されている。転移性乳癌患者の血清中のＨＥＲ２濃度を測定する、新たに承認されたキットは現在、これらの患者の追跡調査およびモニタリングに使用できる。複数の大規模な研究が、ＨＥＲ２血清濃度が疾患の重症度に関連付けられ、さらに重要なことには−療法に応答する患者において、療法の種類とは無関係にＨＥＲ２濃度が低下することを示した。この例は、癌療法での診断および予後マーカーの価値を証明する。
【００１０】
ＨＤＡＣインヒビターに関連する新しい診断および予後ツールに対する医療上の必要性
癌療法でのＨＤＡＣ阻害およびその関連の臨床上の利益は、最近複数の場所で調査されている。初期の研究による結果は、ＨＤＡＣインヒビターが急性骨髄性白血病、Ｔ細胞リンパ腫、および肺癌の処置において有益であることを示しているが、他の癌の実体が効果的に処置されることが大いに考えられる。今までのところは、調査中のＨＤＡＣインヒビターの多くが、副作用を有することが多く、新世代のＨＤＡＣインヒビターのさらなる開発が要求されている。したがって、ＨＤＡＣインヒビターとして成功する候補の特徴的な特性を識別することが必須である。このことは、新たな化合物の開発における費用および時間の節約に劇的な因果関係を持つ。第二の主な作業は次に、これらのＨＤＡＣインヒビターを用いた療法から利益を得る患者を早期に識別して、療法の間にこれらの患者をモニタリングすることである。どちらの問題も、本特許出願で取り扱う。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ＨＤＡＣインヒビターの開発および使用のための診断および予後ツールを提供することを目的とする。驚くべきことに、ＨＤＡＣインヒビターであるバルプロ酸（VPA）によって処置された細胞でのあるタンパク質のレベルが、ＶＰＡ処置に応じてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされることが見出されている。これらのタンパク質またはそれをコード化するＲＮＡは、分子マーカーとして使用できる。したがって、本発明の１つの態様は、ＨＤＡＣインヒビターのプロファイリングのための特異的分子マーカーの使用である。
【００１２】
本発明は、サンプル中の分子マーカーの量を決定することを含む、ＨＤＡＣインヒビターまたは潜在的なＨＤＡＣインヒビターのキャラクタリゼーションの方法に関し、ここでサンプルは、前記ＨＤＡＣインヒビターまたは潜在的なＨＤＡＣインヒビターによって処置された細胞に由来する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
「分子マーカー」という用語は本明細書で使用されるように、遺伝子産物、すなわちタンパク質または前記遺伝子から発現されたｍＲＮＡを含むリボ核酸を指し、細胞中の前記遺伝子産物の量は、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｆ９、Ｋ５６２、ＨＬ６０、および白血病骨髄などの細胞系中のＨＤＡＣインヒビターＶＰＡによって、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされる。たとえばＶＰＡは、ＨＤＡＣ−２およびＢＣＬ−ＸＬ、ｐ２１  （ＷＡＦ）、ＵＢＣ８、ＲＬＩＭ、ＣＡＳＰＡＳＥ  ８、ならびにＴＲＡＩＬの発現を調節する。本発明による好ましいマーカーは、ＨＤＡＣ−２タンパク質、Ｕｂｃ８  ＲＮＡ、ＵＢＣ８タンパク質、ＲＬＩＭタンパク質、ＴＲＡＩＬ  ＲＮＡおよびＴＲＡＩＬタンパク質である。
【００１４】
「ＨＤＡＣインヒビターまたは潜在的なＨＤＡＣインヒビターのキャラクタリゼーション」は、前記ＨＤＡＣインヒビターまたは潜在的なＨＤＡＣインヒビターを用いた療法に応答する患者および腫瘍実体の識別と；患者のＨＤＡＣインヒビター処置の有効性をモニタリングすることと；ＨＤＡＣインヒビターに対する治療応答を予測することと；ＨＤＡＣインヒビターまたは潜在的なＨＤＡＣインヒビターをプロファイルすることと；および疾患、たとえば結腸癌を診断することと；を含む。
【００１５】
サンプルは、ＨＤＡＣインヒビターまたは潜在的なＨＤＡＣインヒビターによって処置された細胞に由来する組成物である。細胞は、前記ＨＤＡＣインヒビターまたは潜在的なＨＤＡＣインヒビターに接触させられた細胞培養細胞である。インヒビターは、細胞の生育培地に添加できる。この実施形態は、ＨＤＡＣインヒビターまたは潜在的なＨＤＡＣインヒビターのプロファイリングに特に適している。
【００１６】
本発明の別の態様は、これらのＨＤＡＣインヒビターを用いた療法に応答する患者および腫瘍実体を識別するための、上に挙げた分子マーカーの使用である。さらにこれらのマーカーは、患者におけるＨＤＡＣインヒビター処置の有効性をモニタリングするために使用できる。予後および診断のモニタリングは、ヒストンまたは他の分子の過剰アセチル化の誘導が患者の腫瘍細胞の分化および／またはアポトーシスを生じさせ、それゆえ患者の症状の臨床的改善を引き起こす有益な効果を有する疾患に適している。
【００１７】
したがって細胞は、ＨＤＡＣインヒビターによって処置した個人の組織にも由来する。この実施形態において、サンプルは好ましくは、障害に影響される組織から由来する。障害に影響される障害は、健常者の対応組織とは異なる組織である。相違は、形態、組織、遺伝子発現、処置またはタンパク質組成物に対する応答などにおける相違である。障害によって影響される組織は、これに限定されるわけではないが、骨髄、結腸、皮膚、胸、卵巣、前立腺、腎臓、膀胱、食道、胃、脳、肺、リンパ節、および膵臓に由来する癌疾患の症例における腫瘍組織である。そのような疾患の例は、これに限定されるわけではないが、皮膚癌、メラノーマ、エストロゲンレセプタ依存性および非依存性乳癌、卵巣癌、テストステロンレセプタ依存性および非依存性前立腺癌、腎臓癌、結腸および結腸直腸癌、膵臓癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、泌尿生殖器癌、消化管癌、子宮癌、星状細胞腫、神経膠腫、基底細胞癌ならびに扁平上皮癌、カポジ肉腫および骨肉腫などの肉腫、頭部および頚部癌、小細胞および非小細胞肺癌、白血病、リンパ腫および他の血液細胞癌を含む。
【００１８】
本発明は、最小残存腫瘍疾患または腫瘍転移の処置をモニタリングするための、これらのマーカーの使用も含む。
【００１９】
本発明のもう１つの態様は、ヒストンデアセチラーゼ活性の異常補充を示す疾患、たとえば甲状腺抵抗性症候群、または異常遺伝子発現と関連する他の症状、たとえば炎症性障害、糖尿病、サラセミア、肝硬変、原虫感染などおよびあらゆる種類の自己免疫疾患、特に関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、あらゆる形のリウマチ、骨関節炎、痛風性関節炎、多発性硬化症、インスリン依存性真性糖尿病および非インスリン依存性糖尿病、喘息、鼻炎、ブドウ膜炎、紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患および、他の慢性炎症、慢性下痢における、これらのマーカーの使用である。
【００２０】
さらに本発明は、他の増殖性疾患、たとえば乾癬、線維症および他の皮膚障害での、上述のマーカーの診断および予後使用に関する。「増殖性疾患」および「細胞増殖」という用語は、本明細書では互換的に使用され、インビトロまたはインビボにかかわらず、望ましくない過剰または異常細胞の望ましくないまたは制御されない細胞増殖、たとえば腫瘍性または過形成性成長に関する。増殖性症状の例は、これに限定されるわけではないが、悪性新生物および腫瘍を含む前悪性および悪性細胞増殖、癌、白血病、乾癬、骨疾患、線維増殖性障害（たとえば結合組織）、ならびにアテローム性動脈硬化を含む。これに限定されるわけではないが、肺、結腸、胸、卵巣、前立腺、肝臓、膵臓、脳、および皮膚を含むどの種の細胞も処置され、再生不良性貧血およびディジョーニ症候群、グレーブズ病などの障害のどの処置も、Ｔ細胞を包含する。
【００２１】
細胞は通常、分子マーカーの量の決定に利用される方法に適した状態に処理される。処理は、均質化、抽出、固定化、洗浄および／または透過処理を含む。処理の方法は主として、分子マーカーの量の決定に使用される方法によって変わる。サンプルは、患者の生検に由来する。生検は、分子マーカーの量を決定するために使用する方法に適した条件のサンプルを生成するために、さらに処理される。
【００２２】
各種の方法を利用して、サンプル中の分子マーカーの量を決定することができる。使用される方法の種類は、分子マーカーの性質によって変わる。分子マーカーがタンパク質である場合、分子マーカーの量は好ましくは、分子マーカーに対する抗体の使用によって決定される。
【００２３】
本明細書で使用されるように、「抗体」という用語は、免疫グロブリンまたは同じ結合特異性を有するその誘導体を指す。本発明によって使用される抗体は、モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗血清に由来するまたはそれに含まれる抗体であるが、モノクローナル抗体が好ましい。「抗体」という用語は、本明細書で使用されるように、誘導体、たとえばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはｓｃＦｖ断片をさらに含む：たとえばHarlow and Lane,"Antibodies, A Laboratory Manual"CSH Press 1988,Cold Spring Harbor N.Yを参照。抗体またはその誘導体は天然起源であるか、あるいは（半）合成的に産生できる。そのような合成産物は、本発明の抗体と同じまたは本質的に同じ結合特異性を有する、タンパク性または半タンパク性物質も含む。そのような産物はたとえば、ペプチドミメティックスによって得られる。分子マーカータンパク質に対する抗体を産生する方法は、当該分野で既知である（Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual"CSH Press 1988, Cold Spring Harbor N. Y.）。分子マーカーであるＨＤＡＣ−２タンパク質、ＵＢＣ８タンパク質、ＲＬＩＭタンパク質およびＴＲＡＩＬタンパク質のアミノ酸配列は、Yang, W. M. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93,12845-12850 ; Kaiser, P. et al., 1994, J.Biol. Chem. 269,8797-8802 ; Ostendorff, H. P etal., 2000, Genomics 69,120-130 ; Wiley, S. R. et al., 1995, Immunity 3 (6), 673-682; Mariai, S. M. et al., 1997, J Cell Biol 137,221-229にそれぞれ述べられている。分子マーカーであるＨＤＡＣ−２タンパク質、ＵＢＣ８タンパク質、ＲＬＩＭタンパク質およびＴＲＡＩＬタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４にそれぞれ示す。抗体は、当業者に既知である方法、たとえばウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学および／またはフローサイトメトリーで使用される。
【００２４】
当該分野で一般に既知であるウェスタンブロッティングが使用できる。細胞物質または組織をホモジナイズし、変性および／または還元剤によって処理してサンプルを得る。サンプルをポリアクリルアミドゲルに装填してタンパク質を分離し、続いて膜に移すか、固相に直接スポットする。次に抗体をサンプルに接触させる。１回以上の洗浄ステップの後、当該分野で既知の技法を使用して、結合した抗体を検出する。タンパク質のゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングは、Golemis,"Protein-Protein Interactions : A Laboratory Manual", CSH Press 2002, Cold Spring Harbor N. Y.で述べられている。
【００２５】
免疫組織化学は、組織材料、たとえば固形腫瘍片の固定化および透過処理の後に使用できる。次に抗体をサンプルとともにインキュベートし、１回以上の洗浄ステップの後に、結合抗体を検出する。技法は、Harlow and Lane, "Antibodies, A LaboratoryManual"CSH Press 1988, Cold Spring Harbor N. Y.に概説されている。
【００２６】
好ましい実施形態において、分子マーカーの量は、ＥＬＩＳＡによって決定される。多様な形式のＥＬＩＳＡが考えられる。１つの形式において、抗体がマイクロタイタープレートなどの固相に固定化され、非特異的結合部位のブロッキングおよびサンプルによるインキュベーションが続く。別の形式では、サンプル中に含有された分子マーカータンパク質を固定化するために、サンプルを最初に固相に接触させる。ブロッキングおよび場合により洗浄の後で、抗体を固定化サンプルと接触させる。ＥＬＩＳＡ技法は、Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual"CSH Press 1988, Cold Spring Harbor N. Y.に述べられている。
【００２７】
最も好ましくは、分子マーカーの量は、フローサイトメトリーによって決定される。細胞、たとえば細胞培養細胞または血液細胞または骨髄からの細胞は、固定化および透過処理されて、抗体を分子マーカータンパク質に到達させる。任意の洗浄およびブロッキングステップの後、抗体を細胞に接触させる。次に分子マーカータンパク質に結合した抗体を有する細胞を判定するために、当該分野で既知の手順に従ってフローサイトメトリーを実施する。各種のフローサイトメトリー法がRobinson"Current Protocols inCytometry"JohnWiley & Sons Inc., New Yorkに述べられている。
【００２８】
分子マーカーがｍＲＮＡなどのリボ核酸である場合、サンプル中の分子マーカーの量を決定するために、通常、核酸技術が使用される。好ましくはハイブリダイゼーション技法および／またはＰＣＲ技法が利用される。サンプル中のＲＮＡマーカーの量を決定するには、ノザンブロッティング技法が使用できる。好ましい実施形態において、ＲＴ−ＰＣＲが使用される。当業者は、各マーカーのヌクレオチド配列に基づいて、これらの方法で使用される適切なプライマーおよび／またはプローブを設計することができる。Ｕｂｃ８,RLIM and TRAIL のｃＤＮＡ配列は、Wiley, S. R. etal., 1995, Immunity 3 (6), 673-682; Mariani, S. M. et al., 1997, J Cell. Biol. 137,221-229 ; Kaiser, P. et al., 1994, J.Biol. Chem. 269,8797-8802, Ostendorff, H. P etal., 2000, Genomics 69,120-130 ;にそれぞれ述べられている。プライマーおよびプローブを設計する方法は、Dieffenbach"PCR Primer: A Laboratory Manual"CSH Press 1995, Cold Spring Harbor N. Y.に述べられている。ＨＤＡＣ−２、Ｕｂｃ８、ＲＬＩＭおよびＴＲＡＩＬのｃＤＮＡ配列は、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７および配列番号：８にそれぞれ示されている。
【００２９】
さらなる実施形態において、インヒビターが分子マーカーの発現を調節する活性を有するならば、方法はインヒビターを選択するステップを含む。本明細書で使用されるように「分子マーカーの発現を調節する」は、細胞との接触時に細胞中の分子マーカーの量の増加または減少を引き起こす、化合物の能力または活性を指す。ＨＤＡＣインヒビターまたは潜在的なＨＤＡＣインヒビターがこの活性を持つかどうかを判定するために、通常、参照サンプル中の分子マーカーの量が決定され、ここで参照サンプルは前記ＨＤＡＣインヒビターまたは潜在的なＨＤＡＣインヒビターによって処置されていない細胞に由来する。サンプル中および参照サンプル中の分子マーカーの量の決定は、並行して実施できる。細胞培養細胞の場合、２つの細胞組成物が提供され、その一方をＨＤＡＣインヒビターまたは潜在的なＨＤＡＣインヒビターによって処置し、それに対して他方を未処置のまま放置する。続いて両方の組成物をさらに処理し、分子マーカーのそれぞれの量を決定する。
【００３０】
患者の場合、サンプルは、ＨＤＡＣインヒビターまたは潜在的なＨＤＡＣインヒビターによって処置された患者に由来する。参照サンプルは、前記ＨＤＡＣインヒビターまたは潜在的なＨＤＡＣインヒビターによって処置されていない、同じ障害に苦しむ別の患者に、または健常者に由来する。この参照サンプルが由来する組織は、サンプルが由来する組織に一致する。たとえばサンプルが乳癌患者からの腫瘍組織に由来する場合、参照サンプルも乳癌患者からの腫瘍組織または健常者からの胸組織に由来する。サンプルおよび参照サンプルが同じ個人に由来することも考えられる。この場合、参照サンプルが由来する組織は、ＨＤＡＣインヒビターによる個人の処置の前または後に個人から入手した。好ましくは組織は、処置の中止後に分子マーカーの発現に対するインヒビター処置の考えられる後効果を除外するために、処置の前に入手した。
【００３１】
本発明の別の態様は、ＨＤＡＣインヒビターまたは潜在的なＨＤＡＣインヒビターをプロファイルするための、分子マーカーの量を決定する手段の使用である。
【００３２】
分子マーカーの量を決定するための方法は、上で述べた。それゆえ分子マーカーの量を決定するための好ましい手段は、分子マーカータンパク質に対する抗体、それに由来する分子マーカーＲＮＡまたはｃＤＮＡを増幅するために使用できるプライマー、それに由来する分子マーカーＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズできるプローブである。もっとも好ましい手段は、ＴＲＡＩＬタンパク質、ＨＤＡＣ−２タンパク質、ＲＬＩＭまたはＵＢＣ８タンパク質に対する抗体；ＴＲＡＩＬ  ＲＮＡ、ＴＲＡＩＬ  ｃＤＮＡ、Ｕｂｃ８  ＲＮＡ  またはＵｂｃ８  ｃＤＮＡを特異的に増幅できるプライマー；および標準条件下でＴＲＡＩＬ  ＲＮＡ、ＴＲＡＩＬ  ｃＤＮＡ、Ｕｂｃ８  ＲＮＡ  またはＵｂｃ８  ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズできるプローブを含む。プライマーおよびプローブは通常、１０〜５０ヌクレオチド長、好ましくは１５〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは１５〜２４ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドである。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、０．１ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳおよび６５℃などの条件下で各標的配列にハイブリダイズする。適切な条件の設定は、Sambrook et al.,"Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989; or Hames and Higgins "Nucleic acid hybridization, a practical approach", IRL press, 1985に述べられている。
【００３３】
特定の実施形態において、本発明によって使用したオリゴヌクレオチドは、ＨＤＡＣ−２ｃＤＮＡ、Ｕｂｃ８  ｃＤＮＡ、ＲＬＩＭ  ｃＤＮＡ、ＴＲＡＩＬ  ｃＤＮＡ、およびその相補鎖からなる群より選択されるポリヌクレオチドの、１０〜５０個の、好ましくは１５〜２４個の近接ヌクレオチドを含むか、またはそれより成る。例は、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８およびその相補鎖からなる群より選択される配列の１０〜５０個の近接ヌクレオチドを含むか、またはそれより成るオリゴヌクレオチドである。
【００３４】
分子マーカーを増幅できるプライマーの具体例は以下のとおりである：
ＨＤＡＣ−２：
フォワード  ５’−ｇｇａｇａａｇａｔｔｇｔｃｃａｇｃｇｔｔ−３’
リバース  ５’−ｃｔａｔａｃｃａｔｃａｃａｃａｔｔｇｇａ−３’
ＵＢＣ８：
フォワード  ５’−ｇｇｔｃａａｇｃｔｃａｔｃｇａｇａｇｔａ−３’
リバース  ５’−ｔｃａｇｃｇｃｃｔｃｃｔｃｃｇｔｇｇｃｇ−３’
ＲＬＩＭ：
フォワード  ５’−ｃａｇａｇｇｔｃｃｃａｃｃｔａｃｃａｇａ−３’
リバース  ５’−ｃｔａｔｇｃｔａｔｃｔｃｔｃｔｇｃｃｇａ−３’
ＴＲＡＩＬ：
フォワード  ５’−ｇｇｇａｃａｇａｃｃｔｇｃｇｔｇｃｔｇａ−３’
リバース  ５’−ｃｔｃｃｔｔｇａｔｇａｔｔｃｃｃａｇｇａ−３’
【００３５】
もう１つの態様において、本発明は、疾患を診断するための、分子マーカーの量を決定する手段の使用に関する。好ましくはＨＤＡＣ−２タンパク質の量を決定する手段は、結腸癌を診断するために使用される。特に本発明は、結腸癌を診断するための、ＨＤＡＣ−２タンパク質に対する抗体の使用に関する。
【００３６】
本発明はさらに、障害のＨＤＡＣインヒビターを用いた処置が開始／継続されるかどうかを判断するための、分子マーカーの量を決定する手段の使用に関する。この態様は、前記ＨＤＡＣインヒビターまたは潜在的なＨＤＡＣインヒビターを用いた療法に応答する患者および腫瘍実体の識別と、患者におけるＨＤＡＣ処置の有効性をモニタリングすることと；ＨＤＡＣインヒビターへの治療応答を予測することと；疾患、たとえば結腸癌を診断することと、を含む。
【００３７】
本発明は、（ｉ）分子マーカーの量を決定する手段；および（ｉｉ）ＨＤＡＣインヒビターを含有する診断キットにも関する。キットの好ましい実施形態は、上述したような本発明の方法または使用の好ましい実施形態に一致する。
【００３８】
好ましくは本発明の使用または方法は、インビトロで実施されるステップのみを含む。したがってこの実施形態により、ヒトまたは動物の体から組織材料を入手するステップは、本発明には含まれない。
【００３９】
ＨＤＡＣインヒビターによるＨＤＡＣ−２の選択的プロテオソーム分解
ＨＤＡＣインヒビターを用いる癌療法は、腫瘍細胞における分化および／またはアポトーシスを誘導する。これはＨＤＡＣ依存性物質、たとえばヒストンおよび転写因子（たとえば腫瘍サプレッサｐ５３）の過剰アセチル化を包含するプロセスで実現され、次に分化またはアポトーシスを促進する遺伝子の発現を調節する。したがって本発明は、あるＨＤＡＣインヒビターが、Ｅ２ユビキチン結合酵素Ｕｂｃ８の発現、およびＥ３ユビキチンリガーゼＲＬＩＭによる、イソ酵素ＨＤＡＣ−２の同時に起こる特異的プロテアソーム分解を誘導する能力にも関し、このことはヒストンデアセチラーゼの酵素阻害と相乗的に作用する、特定のＨＤＡＣインヒビター、たとえばバルプロ酸の活性に新規な態様を加える。
【００４０】
本発明は、Ｕｂｃ８をアップレギュレートして、ＨＤＡＣ−２発現をダウンレギュレートするＨＤＡＣインヒビター、たとえばバルプロ酸に対する治療応答を予測するための、患者からの腫瘍におけるＵｂｃ８およびＨＤＡＣ−２発現の診断使用にも関する。特定のＨＤＡＣインヒビター、たとえばバルプロ酸の治療中の有効性をモニタリングするために、腫瘍中のＨＤＡＣ−２発現の使用も含む。
【００４１】
さらに本発明の詳細な態様は、ＨＤＡＣインヒビターまたは推定されるＨＤＡＣインヒビター活性を備えた化合物の、ＨＤＡＣ−２および／またはＲＬＩＭ発現をダウンレギュレートして、Ｕｂｃ８発現をアップレギュレートする能力についてのプロファイリングに関する。ＨＤＡＣ−２、ＲＬＩＭおよびＵｂｃ８の発現を分析する方法は、検出のための核酸技術の、好ましくはハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応の使用を含む。しかしながら他の種類の核酸技術も利用できる。本発明の別の実施形態は、検出のための上述のタンパク質に対する特異的抗体の使用を含む。
【００４２】
ＨＤＡＣインヒビターによって誘導されたアポトーシス経路の分子マーカー
正常細胞は、プログラムされた細胞死またはアポトーシスと呼ばれる自己破壊の固有機構を有する。このバランスは、多すぎる成長および少なすぎる死を誘導する癌細胞において妨害されることが多い（Igney and Kramer, 2002, Nature Reviews Cancer 2: 277-288）。これらの機構の分子レベルでの理解は最終的に、アポトーシス感受性の調節に基づく新しい治療手法に至る。アポトーシスは、腫瘍壊死因子（TNF）レセプタスーパーファミリーに属する、いわゆるデスレセプターの活性化によって誘導できる。デスレセプターは、その天然リガンドである、ＴＮＦアルファ、ＣＤ９５ＬおよびＴＲＡＩＬを含むＴＮＦファミリによって活性化される。このことは、次にアポトーシスを誘導するカスパーゼ８を含有する、死誘導シグナル伝達複合体（DISC）の活性化を引き起こす。この経路のいずれかの構成要素のアップレギュレーションは、アポトーシス促進性シグナルの効果を向上させる。
【００４３】
アポトーシスプロセスは、各種のレギュレータタンパク質、たとえば中でも最も重要なミトコンドリアＢＣＬ２ファミリ構成要素によって厳密に制御される。ＢＣＬ２ファミリの構成要素は、抗アポトーシス性、たとえばＢＣＬ２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−ｗ、および前アポトーシス性タンパク質、たとえばＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＩＤ、ＢＡＤに分類できる。抗アポトーシス性ＢＣＬ２ファミリ構成要素は、腫瘍のアポトーシスに対する耐性に関与するように思われる。たとえばＢＣＬ−ＸＬは、癌細胞における複数のアポトーシス誘導経路への耐性を付与することが可能であり、構成的活性上皮成長因子レセプタによってアップレギュレートされるように思われる。ＢＣＬ−ＸＬの高発現は、多くのヒト癌に見いだされ、しばしば負の予後因子である。したがって、特定の癌細胞におけるＢＣＬ−ＸＬ発現のダウンレギュレーションは、アポトーシスを直接誘導するか、アポトーシス性刺激に対して細胞を感作させるかのどちらかである。
【００４４】
本発明は、特定のＨＤＡＣインヒビター、たとえばバルプロ酸の、癌細胞においてアポトーシス促進性分子ＴＲＡＩＬおよびカスパーゼ８の発現を特異的に誘導させて、抗アポトーシス性分子ＢＣＬ−ＸＬの発現をダウンレギュレートする能力に関し、これらのＨＤＡＣインヒビターによって誘導されるアポトーシスの誘導およびアポトーシス性刺激に対する感作の機構へのより深い洞察を提供する。加えて本発明は、ＴＲＡＩＬおよびカスパーゼ８発現をアップレギュレートし、ＢＣＬ−ＸＬ発現をダウンレギュレートするＨＤＡＣインヒビター、たとえばバルプロ酸への治療応答を予測するために、患者からの腫瘍におけるＴＲＡＩＬ、カスパーゼ８およびＢＣＬ−ＸＬ発現の診断使用に関する。治療の途中での特定のＨＤＡＣインヒビター、たとえばバルプロ酸の有効性をモニタリングするための、腫瘍におけるＴＲＡＩＬ、カスパーゼ８およびＢＣＬ−ＸＬ発現の使用も含む。
【００４５】
もう１つの実施形態において、本発明は、ＨＤＡＣインヒビターまたは推定されるＨＤＡＣインヒビター活性を備えた化合物の、ＢＣＬ−ＸＬ発現をダウンレギュレートして、ＴＲＡＩＬおよびカスパーゼ８発現をアップレギュレートする能力についてのプロファイリングに関する。ＴＲＡＩＬ、カスパーゼ８、およびＢＣＬ−ＸＬ  発現を分析する方法は、検出のための核酸技術の、好ましくはハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応の使用を含む。しかしながら他の種類の核酸技術も利用できる。別の実施形態において、方法は、検出のための上述のタンパク質に対する特異的抗体の使用を含む。
【００４６】
以下の実施例は、本発明をさらに説明する：
【実施例１】
【００４７】
ＨＤＡＣインヒビターは正常血液細胞においてではなく、癌細胞において、ＴＲＡＩＬ発現、カスパーゼ８活性化およびアポトーシスを誘導する（図１〜５）。
【００４８】
別個の作用機構が変化するが、癌療法はなお、最終経路として、癌細胞でアポトーシスを引き起こす能力に依存している。ＨＤＡＣインヒビターは、抗アポトーシス性分子、たとえばＢＣＬ−ＸＬおよびＢＣＬ−２のダウンレギュレーションによって、特定の癌細胞におけるアポトーシスを誘導することがすでに示されている。一般にアポトーシスの誘導は、癌療法においてＨＤＡＣインヒビターを用いて、治療的に活用できる。我々は、ＨＤＡＣインヒビター（すなわちバルプロ酸−VPA）が、急性前骨髄球性白血病（APL；図１）のマウス白血病モデルを使用した癌処置に使用できるという、新たな証拠を示す。我々は、ＨＤＡＣインヒビター、たとえばＶＰＡがＡＰＬを有するマウスの白血病細胞中のヒストン過剰アセチル化（図２）およびアポトーシス（図３）を誘導することを証明する。本発明により、ＨＤＡＣインヒビター（すなわちバルプロ酸）は、ＴＲＡＩＬ発現をアップレギュレートし、カスパーゼ８を活性化することによって、白血病細胞癌細胞におけるアポトーシスを誘導する。このプロセスは、正常細胞には見られない。
【００４９】
方法
図１：（Ａ）二次急性前骨髄球性白血病をマウスに誘導した。簡単には、一次白血病をＰＭＬ−ＲＡＲ発現骨髄細胞を尾静脈に注入することによって、マウスに誘導した。顕性白血病を持つマウスを安楽死させ、白血病細胞を脾臓から収集した。白血病細胞（１ｘ１０7細胞／マウス）を、非照射同系レシピエントマウスに再度静脈内注射した。二次レシピエントマウスは、２〜３週間後に顕性白血病を発症した。次に白血病マウスおよび健常マウス（対照）を、プラセボ（レーン１、２）またはＶＰＡ（１２時間ごとに４００ｍｇ／ｋｇ）で連続２週間処置した。（Ｂ）白血病マウスをプラセボ（より少量、対照）またはＶＰＡ（１２時間ごとに４００ｍｇ／ｋｇ、上）で１週間処置した。処置の終了時に、マウスを殺処分し、脾臓を写真撮影した。
【００５０】
図２：（Ａ）二次急性前骨髄球性白血病を上述のように、マウスに誘導させた。次に（Ａ）白血病マウスまたは健常マウス（対照）をプラセボまたはＶＰＡ（４００ｍｇ／ｋｇ）によって３時間および６時間処置した。次にマウスを殺処分して、脾臓から全細胞抽出物を調製し（＞７０％白血病浸潤を用いて）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてアセチル化ヒストンＨ３に対する市販の抗体を使用したウェスタンブロット分析によって分析した。（Ｂ）アセチル化ヒストンに対するモノクローナル抗体を使用する、ＶＰＡ処置白血病マウスの免疫組織化学分析。
【００５１】
図３（Ａ）二次急性前骨髄球性白血病を上述のように、マウスに誘導させた。次に白血病マウスを、プラセボ（対照）、またはＶＰＡ（１２時間ごとに４００ｍｇ／ｋｇ）で処置した。処置開始の４８時間後にマウスを殺処分して、次に白血病脾臓を固定化し、組織検査のために染色するか（ヘマトキシリン−エオシン、左パネル）、あるいはアポトーシス細胞の存在について分析した（ＴＵＮＥＬアッセイ、右パネル）。（Ｂ）二次白血病を上のように得た。末梢器官の白血病による浸潤が＞７５％（脾臓）であるときに、マウスを殺処分した。健常マウスからの脾細胞（対照として採取、左パネル）、または白血病マウスからの脾細胞（＞７５％芽細胞、右パネル）を、培地に置き、次にＶＰＡ（１ｍＭ）で４８時間処置した。処置の終了時に、ヨウ化プロピジウム染色によってアポトーシスを測定した。これらのサブＧ１エリアは、アポトーシスを受けている断片化ＤＮＡを備えた細胞に相当する、低二倍体ＤＮＡピークを示す。
【００５２】
図４：（Ａ）二次急性前骨髄球性白血病を上述のように、マウスに誘導させた。次に白血病マウスまたは健常マウス（対照）を、プラセボ（レーン１、３）、ＶＰＡ（１２時間ごとに４００ｍｇ／ｋｇ）、全トランスレチノイン酸（ＲＡ  ５ｍｇを含有する２１日間放出ペレットまたはプラセボ：レーン８−９）、およびＶＰＡ＋レチノイン酸（レーン１０−１１）で処置した。マウスは、処置の開始の１８時間後（レーン４−５）、または３６時間後（レーン３、６−７、１０−１１）に殺処分した：全ＲＮＡを脾臓（Ｇｉｅｍｓａ染色によって評価されたように、白血病芽細胞の＞７５％浸潤）から収集し、ＲＮＡｓｅタンパク質保護アッセイによって分析して、ＴＲＡＩＬの発現を確認した。ＦａｆおよびＧＡＰＤＨは、これらの処置によって影響されない対照として使用した。（Ｂ）Ｃａｌｕ−３細胞（ヒト、非小細胞肺癌由来細胞系）を、ＶＰＡ（１ｍＭ）によって指示した回数処置した。ＲＮＡを抽出し、ＴＲＡＩＬに対して特異的なプライマーを使用して定量ＰＣＲ（Perkin-Elmer）によって分析した。ＧＡＰＤＨを使用して正規化した。
【００５３】
図５：白血病芽細胞は、組織検査によって評価されたように、腫瘍細胞の＞７５％浸潤を有する二次白血病マウスの脾臓から採取した。細胞を培地に置き、指示したように、指示されたＴＲＡＩＬおよび／またはカスパーゼ８インヒビターの非存在下または存在下でＶＰＡ（１ｍＭ）を用いて４８時間処置した。処置の終了時に、アポトーシスを上述のように測定した。
【００５４】
結果
ＨＤＡＣインヒビター処置の有効性をマウス白血病モデルにおいて試験した。顕性二次白血病のマウスの生存曲線は、ＶＰＡ処置が白血病マウスの生存を統計的に有意な方法で延長することを示した（Ｐ＜０．０１、図１Ａ）。加えてＶＰＡは、芽細胞浸潤によって引き起こされた脾腫の劇的な減少を引き起こした（プラセボをＶＰＡ処置と比較、図１Ｂ）。ＨＤＡＣインヒビター処置の活性をさらに分析するために、我々は、脾臓（正常脾臓または＞７０％白血病浸潤を有する白血病脾臓のどちらか）から調製した全細胞抽出物を使用した。ＶＰＡは、正常マウスと、白血病マウスの両方でヒストンアセチル化のレベル上昇を誘起した（図２Ａ）。さらにアセチル化ヒストンに対するモノクローナル抗体を使用したＶＰＡ処置白血病マウスの免疫組織化学分析はＶＰＡ処置時に、白血病芽細胞を含むすべての細胞においてヒストンアセチル化の劇的な上昇を示す（図２Ｂ）。次に白血病脾臓から得た細胞をＶＰＡを用いた、または用いない処置後にアポトーシス細胞の存在について分析した（ＴＵＮＥＬアッセイ、図３Ａ、右パネル）。結果は、ＶＰＡが白血病脾臓内で広範囲のアポトーシスを誘導することを示している。これらのデータを確認するために、健常マウス（対照として採取、図３Ｂ、左パネル）からの、または白血病マウス（＞７５％芽細胞、図３Ｂ、右パネル）の脾細胞を培地に置き、次にＶＰＡ（１ｍＭ）を用いて４８時間処置した。処置の終了時に、アポトーシスをヨウ化プロピジウムで測定し、ＶＰＡは、白血病細胞の広範囲のアポトーシスを誘導するが、正常脾細胞のアポトーシスを誘導できないことが示された。
【００５５】
癌細胞におけるアポトーシスの選択的誘導の病理機構を理解するために、我々はＨＤＡＣインヒビター処置がＴＲＡＩＬ発現を向上させるかどうかを調査した。図４Ａに示すように、インビボＶＰＡ処置は、健常マウスの脾臓においてＴＲＡＩＬ発現の誘導を引き起こさなかった（レーン１−２）のに対して、分析した白血病マウスの２つの独立のセットにおける処置の全期間に渡って、レチノイン酸処置９６時間（レーン８−９）と同じ強さで、ＴＲＡＩＬを発現した（レーン３−５、実験１；レーン６−７、実験２）組合せＲＡ＋ＶＰＡ処置は、ＴＲＡＩＬ発現をさらに上昇させなかった（レーン１０−１１）。さらに図４Ｂに示すように、ＴＲＡＩＬはＶＰＡによる処置によって、ヒトＣａＬｕ−３癌細胞において強力に誘導され、ＴＲＡＩＬも非白血病癌細胞におけるＶＰＡの標的であることが示され、ＶＰＡ処置の結果として、ＴＲＡＩＬ誘導が腫瘍細胞における細胞死の誘導に幅広く寄与するという原則が拡張される。このことは、白血病細胞をＴＲＡＩＬまたはカスパーゼ８のインヒビターによりアポトーシスから救出できた実験において確認された。図５のデータからわかるように、ＴＲＡＩＬレセプタ／Ｆｃキメラ活性（ＴＲＡＩＬを滴定可能であり、内在性レセプタを通じたシグナル伝達を阻害する）による、またはカスパーゼ８インヒビター（活性化ＴＲＡＩＬ下流のカスパーゼ８の活性化を直接ブロック）によるＴＲＡＩＬの阻害が、ＶＰＡの効果を一部（単一処置）、または全体的に（複合処置）ブロックできた実験において、ＴＲＡＩＬ経路がＶＰＡ作用の重要なエフェクタであることを示す。
【実施例２】
【００５６】
バルプロ酸が、ＨＤＡＣ−２のプロテアソーム分解を誘導するＨＤＡＣインヒビターのクラスを定義する（図６−１０）。
【００５７】
ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）およびヒストンデアセチラーゼ（HDAC）の補充は、細胞増殖および分化において重要な役割を果たしている多くの遺伝子の動的調節の主要な要素と考えられている。ヒストンＨ３およびＨ４のＮ末端テールの過剰アセチル化は、遺伝子活性化と相関しているが、これに対して脱アセチル化は、転写抑制を仲介することができる。結果として多くの疾患が、転写因子に影響する突然変異によって引き起こされた遺伝子発現における変化に結び付けられてきた。白血病融合タンパク質、たとえばＰＭＬ−ＲＡＲ、ＰＬＺＦ−ＲＡＲ、ＡＭＬ−ＥＴＯおよびＳｔａｔ５−ＲＡＲによる異常抑制は、この点でプロトタイプ例を勤めるが、同様の事象が多くの他の種類の癌における病原にも寄与することがますます明白になっている。
【００５８】
哺乳動物ヒストンデアセチラーゼは、３つのサブクラスに分類できる（Gray andEkstrom, 2001）。酵母ＲＰＤ３タンパク質のホモローグであるＨＤＡＣ１、２、３、および８は、クラスＩを構成する。ＨＤＡＣ４、５、６、７、９、および１０は、酵母Ｈｄａ  １タンパク質に関連し、クラスＩＩを形成する。最近、酵母Ｓｉｒ２タンパク質の複数の哺乳動物ホモローグが、ＮＡＤ依存性であるデアセチラーゼの第３のクラスを形成することが確認された。これらのＨＤＡＣはすべて、大量の多タンパク質複合体のサブユニットとして、細胞中に存在すると思われる。特にクラスＩおよびＩＩ  ＨＤＡＣは、転写因子へのＨＤＡＣの補充に必要な架橋因子として作用する転写コリプレッサのｍＳｉｎ３、Ｎ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴと相互作用することが示されている。
【００５９】
プロテアソームは、多くの律速酵素、転写レギュレータおよび重要な調節タンパク質の迅速な分解を触媒するＡＴＰ依存性タンパク質分解経路の不可欠な成分である、非リソソームタンパク質分解の中心酵素複合体として幅広く認識されている。プロテアソームは、突然変異または翻訳後損傷を介して生じる高度に異常なタンパク質の除去に必須であり、哺乳動物細胞中のタンパク質塊のより低速の分解において主要な役割を果たす。プロテアソームは、より高等な真核生物で抗原プロセシングに決定的に関与している。
【００６０】
本発明は、特定のＨＤＡＣインヒビター、特にバルプロ酸がＨＤＡＣ−２タンパク質の分解を選択的に誘導する能力を、そのＨＤＡＣ阻害活性に加えて示す。ＨＤＡＣ−２タンパク質レベルのこの選択的低下は、バルプロ酸および酪酸による刺激の後に見られるが、他のＨＤＡＣインヒビター、たとえばトリコスタチンＡ、トラポキシン、およびＭＳ−２７５による刺激の後には見られない。それゆえＨＤＡＣインヒビター、たとえばバルプロ酸は、２つの異なる作用方式によってＨＤＡＣ−２を不活化する：それらはＨＤＡＣ−２活性を阻害し、プロテアソーム分解を誘導させる。これらの複合活性の測定は、ＨＤＡＣ活性を有する酵素の、新規な、そして潜在的にさらに強力なインヒビターの同定のためのプロファイリングツールとして役立つ。
【００６１】
方法
図６：（Ａ）Ｆ９奇形癌またはＨＥＫ２９３Ｔ胚性腎臓細胞を、１ｍＭ  ＶＰＡに指示された時間暴露した。ＨＤＡＣ−２および参照のためのＨＤＡＣ  １または３（ＨＤＡＣ８；Ｎ−ＣｏＲおよびＳｉｎ３、データは示さず）のタンパク質レベルを、ウェスタンブロット分析によって決定した。（Ｂ）ＨＤＡＣ−２タンパク質低下のＶＰＡ用量への依存性は、暴露３６時間後にＦ９またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で決定した。（Ｃ）ＨＤＡＣ−２タンパク質の量に対する他のＨＤＡＣインヒビターの効果は、Ｆ９細胞中の経時分析でＴＳＡ（１００ｎＭ）を用いて決定した（左パネル）。ＨＤＡＣインヒビターＴＳＡ（１００ｎＭ）、トラポキシン（ＴＰＸ、１０ｎＭ）、ブチラート（１．５ｍＭ）またはＭＳ２７５（５μＭ）を  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞での単回暴露で試験した（右パネル）。
【００６２】
図７：Ｆ９細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１ｍＭ  ＶＰＡによって指示された時間だけ処置して、ＨＤＡＣ−２  ｍＲＮＡのレベルをポリＡ+ＲＮＡ  ５μｇからノザンブロット分析によって決定した。
【００６３】
図８：ＨＤＡＣ−２の合成および分解速度は、35Ｓ−メチオニンによるパルス代謝標識およびパルス追跡分析によって分析した。35Ｓ標識ＨＤＡＣ−２はＨＤＡＣ−２特異的免疫沈降によって検出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離およびオートラジオグラフィーを続けた。（Ａ）パルス標識は、未処置のままか、または１ｍＭ  ＶＰＡで２４時間処置したＦ９およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で１時間実施した。（Ｂ）パルス追跡分析の場合、細胞は未処置のままか、１ｍＭ  ＶＰＡで２４時間処置し、ＶＰＡの存在下または非存在下で35Ｓ−メチオニンによってさらに１時間標識した。35Ｓ−メチオニンの除去および非標識メチオニンの添加の後に、放射性標ＨＤＡＣ−２の除去を６時間に渡って続けた。パルス追跡分析も、ＶＰＡ前処置なしで、追跡期間が開始したときのみにＶＰＡを添加して（（＋）列によって示す）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で実施した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞抽出物からＨＤＡＣ−３も参照のために沈降させた。
【００６４】
図９：（Ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＶＰＡで２４時間処置するか、または未処置のままとした。細胞浸透性プロテアーゼインヒビターのペプスタチンＡ、ロイペプチン、またはＡＬＬＭをＶＰＡ添加時に指定通りに添加した。（Ｂ）プロテアソームインヒビターＡＬＬＮ  またはＭＧ−１３２を指定された濃度で、細胞を収集する４時間前に添加した。ＨＤＡＣ−２のタンパク質レベルは、ウェスタンブロット分析によって決定した。
【００６５】
図１０：（Ａ）高分子量ポリユビキチン化タンパク質の総量は、細胞のＶＰＡ処置によって変化しなかった（左２レーン）。抗ＨＤＡＣ−２免疫沈降物中のユビキチン化タンパク質の存在を、パネルの右部分に示す。細胞は未処置のままか、ＶＰＡ（１．５ｍＭ、２４時間）またはプロテアソームインヒビターＡＬＬＮ（５μＭ、２４時間）またはその両方に暴露させた。沈降物中のユビキチン化タンパク質は、ウェスタンブロット分析によって検出した。レーンNでは、抗ＨＤＡＣ−２抗体の代わりに非免疫血清を使用した。（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＶＰＡ処置時のモノ−および／またはオリゴ−ユビキチン化ＨＤＡＣ−２の存在は、Ｈｉｓ６標識ユビキチンの異所性発現によって決定し、ＶＰＡ処置を指示された通りに３６時間に渡って続けた。分析の４時間前にプロテアソームインヒビターＭＧ−１３２を添加して、ユビキチン化タンパク質の蓄積を向上させた。非ユビキチン化ＨＤＡＣ−２の電気泳動移動度および不変の存在は、全細胞抽出物のウェスタンブロット分析によって決定した（左パネル）。ユビキチン化タンパク質は、Ｎｉ2+−ＮＴＡ−アガロースを用いて沈降させ、ユビキチン化ＨＤＡＣ−２の存在について、沈降物のウェスタンブロット分析によって分析した（中央パネル）。モノ−またはポリ−ユビキチン化ＨＤＡＣ−２の予想された移動度を持つ抗ＨＤＡＣ−２免疫反応性バンドを、カッコによって示す。沈降物のウェスタンブロットも、標識ユビキチンの匹敵する発現および対照およびＶＰＡ処置細胞のユビキチン化タンパク質の一般細胞プール内への標識ユビキチンの等しい取込み効率を確保するために、ポリヒスチジンタグに対する抗体によって（右パネル）プローブした。
【００６６】
結果
細胞およびマウスのＶＰＡ処置によるＨＤＡＣ−２タンパク質レベルの低下
ＶＰＡまたは他のＨＤＡＣインヒビターがまた、ＨＤＡＣ酵素活性を阻害することに加えて、たとえば代償性フィードバックループにおいて発現またはＨＤＡＣタンパク質レベルに影響を及ぼすかどうかを試験する間に、我々は、ＶＰＡ処置細胞におけるＨＤＡＣ−２タンパク質レベルの一貫したダウンレギュレーションを見出した。タンパク質レベルの、未処置細胞の約３０％までの低下は、ＶＰＡ暴露の２４時間後に見出され、少なくとも４８時間まで持続する（図６Ａ）。ＨＤＡＣ−２タンパク質レベルは、ネズミＦ９奇形癌、ヒト胚性腎臓ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図６Ａ）、ヒトＫ５６２白血病細胞およびマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞で低下する。ＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−３のタンパク質レベルは低下しないが、一部の実験で一時的な誘導を示す（図６Ａ）。ＨＤＡＣ−２タンパク質レベルは、ＶＰＡ暴露に対して遅延応答を示し、中間ステップ、たとえば中間遺伝子産物の誘導の必要性を示唆する。ＨＤＡＣ−２タンパク質レベルの低下に必要なＶＰＡ用量は、ＨＤＡＣ酵素活性の阻害に必要な用量と同様であり、たとえば明確な効果は０．５〜１ｍＭで検出される。ＶＰＡのより高い容量に耐える一部の細胞、たとえばＨＥＫ２９３Ｔにおいて、ＶＰＡ濃度を５または１０ｍＭに上昇させると、わずかにより顕著な低下が見られる（図６Ｂ）。
【００６７】
ＨＤＡＣ−２タンパク質レベルの低下は、カルボン酸ＨＤＡＣインヒビター、たとえばＶＰＡ、ブチラートおよびＥＸＨＡに特異的である。ヒドロキサム酸ＴＳＡによる４８時間までの処置は、ＨＤＡＣ−２レベルをＦ９またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞のどちらにおいても低下させない（図６Ｃ）。Ｆ９細胞において、４８時間ＴＳＡは、細胞消失およびアクチン負荷対照における低下によって示されるように毒性である。ＨＤＡＣを阻害しないＶＰＡ由来アミドのバルプロミドは、ＨＤＡＣ−２タンパク質レベルに影響を与えない。環状テトラペプチドＨＤＡＣインヒビターのトラポキシンも、アニリドベースのＨＤＡＣインヒビターのＭＳ−２７５も、ＨＤＡＣ−２タンパク質レベルの低下を誘導しない。
【００６８】
しかしながら、ＨＤＡＣ−２タンパク質レベルの低下を引き起こす条件下では、ＨＤＡＣ−２  ｍＲＮＡレベルの応答は、Ｆ９細胞でも、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のどちらでも見られなかった（図７）。
【００６９】
ＨＤＡＣ−２タンパク質の誘導されたプロテアソーム分解
定常状態ｍＲＮＡレベルの変化の非存在下で変化したタンパク質レベルは、タンパク質合成またはタンパク質分解の速度に対する効果を強く示唆している。ＶＰＡ前処置（２４時間）ありおよびなしのＨＤＡＣ−２タンパク質合成速度は、Ｆ９細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞における35Ｓ−メチオニンを用いたパルス標識によって比較した。対照とＶＰＡ処置細胞との間のＨＤＡＣ−２合成速度の実質的な相違は、見出されなかった（図８Ａ）。
【００７０】
タンパク質の半減時間は、Ｆ９細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞の両方において、パルス追跡分析によって決定した。ＨＤＡＣ−２の半減期は、ＶＰＡを用いた細胞の前処理によって実質的に短縮された（図８Ｂ）。ＶＰＡは、追跡時間においてのみ添加した場合、ＨＤＡＣ−２タンパク質分解速度に対する影響を持たず（図８Ｂで（＋）が付いたパネル）、ＶＰＡへに対するＨＤＡＣ−２タンパク質レベルの応答がたとえばＨＤＡＣ−２の立体配座変化に対する直接応答というよりはむしろ、間接応答であるというさらなる示唆を与える。ＨＤＡＣ−３の分解は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＶＰＡ前処置によって影響を受けず（図８Ｂ）、ＶＰＡ処置時の定常状態ＨＤＡＣ−３タンパク質レベルの低下の欠如と一致していた。
【００７１】
ＨＤＡＣ−２分解がプロテアーゼ依存性またはプロテアソーム分解のどちらによるかを判定するため、プロテアーゼ（図９Ａ）またはプロテアソーム（図９Ｂ）の複数のインヒビターを、ＶＰＡと組合わせて利用した。プロテアーゼインヒビターのペプスタチンＡ、ロイペプチンまたはＡＬＬＭのいずれも、対照またはＶＰＡ抑制ＨＤＡＣ−２タンパク質レベル（図９Ａ）に対して効果を持たなかった。プロテアソームインヒビターＡＬＬＮまたはＭＧ−１３２を用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の同時処置は、ＨＤＡＣ−２のＶＰＡ誘導性分解を完全に消滅させた（図９Ｂ）。それゆえ中間因子の合成を含む間接機構によるプロテアソーム分解の増加は、ＨＤＡＣ−２タンパク質のＶＰＡ誘導性分解の最も適した機構と考えられる。
【００７２】
プロテアソーム分解の必要条件は、プロテアソームによる認識のための、基質タンパク質の「標識付け」である。プロテアソーム標的化の最も一般的な機構は、ポリユビキチン化に依存し、したがってユビキチン化ＨＤＡＣ−２の存在およびＶＰＡ依存性誘導を試験した。第一にＨＤＡＣ−２に対する抗体を用いて調製した免疫沈降物を、高分子量ユビキチン化タンパク質の存在について、ユビキチンに対するウェスタンブロットによって分析した。未処置細胞は、ＨＤＡＣ−２に対する抗体によって沈降するタンパク質を含有する少量のユビキチンを含有している（図１０Ａ）。ユビキチン化タンパク質の分解を防止するためのプロテアソームインヒビターＡＬＬＮによる、あるいはＶＰＡによる、細胞の前処置は、この抗ユビキチン反応性タンパク質の量を増加させる。ＶＰＡおよびＡＬＬＮによる同時処置は、高分子量ユビキチン化タンパク質の量をさらにもっと増加させる。これに対して、細胞ユビキチン化タンパク質の全量は、ＶＰＡ処置によって適度に減少される。ＴＳＡは、免疫沈降抗ユビキチン反応性物質の量に対して効果を持たない。これらのデータは、ＶＰＡ処置がＨＤＡＣ−２に対する抗体によって沈降するタンパク質のユビキチン化を誘導することを示唆する。
【００７３】
ＨＤＡＣ−２のユビキチン化の形態を検出することを狙った後者の種類のアッセイは、Ｈｉｓ6−標識ユビキチンの一時的発現によって、沈殿のためのＮｉ2+−ＮＴＡアガロースを使用してさらに改良される（図１０Ｂ）。組換えユビキチンの発現は、ＨＤＡＣ−２の全細胞量に実質的に影響を与えず、仮にも存在する場合は、ＨＤＡＣ−２のユビキチン化形は、全細胞抽出物からのウェスタンブロット分析の検出限界以下である（左パネル）。Ｎｉ2+−ＮＴＡアガロース沈降物は、ウェスタンブロットが抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体によってプローブされるときに、分離されたタンパク質サイズのほぼ全範囲に渡るユビキチン化タンパク質を含有する（右パネル）。ユビキチン化タンパク質の検出は、標識ユビキチンを発現するために形質転換されないならばシグナルが見られないので、特異的である。全体的に多量なユビキチン化タンパク質は、細胞のＶＰＡ処置によって変化しない。約６０ｋＤにおける顕著なバンドはたいてい、発現ベクターによってコード化されたユビキチンコンカテマーを表す。ＨＤＡＣ−２の存在についてプローブされた場合、Ｎｉ2+−ＮＴＡアガロース沈降物は、オリゴ−およびポリユビキチン化ＨＤＡＣ−２の存在を明らかに示す（中間パネル）。６４および８１ｋＤａの間で移動する顕著なバンドはたいてい、モノユビキチン化ＨＤＡＣ−２を示し、高分子量ポリユビキチン化までの任意の程度のＨＤＡＣ−２ユビキチン化の予想移動度と一致する、バンドのラダーが見いだされる。これらのバンドは、未処置細胞からの沈降物中の少ない量においても見られ、細胞がＶＰＡによって前処置される場合には、はるかに豊富である。Ｈｉｓ標識ユビキチンを発現しない場合にはそのようなバンドは見られないため、検出はユビキチン化ＨＤＡＣ−２に対して特異的である。ＨＤＡＣ−２特異性は、固有の抗体の使用によって確立される。６４ｋＤａのすぐ下でＨＤＡＣ−２と同時移動するバンドはたいてい、すべてがユビキチン化される必要のない複数のＨＤＡＣ−２分子を含有するより大きなコリプレッサ複合体と共によく同時沈降できる非修飾ＨＤＡＣ−２に一致する。要約すれば、データのこの部分は、ＴＳＡによってではなく、ＶＰＡによって誘起できる機構によりプロテアソームによって、ＨＤＡＣ−２がユビキチン化および分解できることを示している。
【実施例３】
【００７４】
バルプロ酸は、Ｅ２ユビキチン結合酵素Ｕｂｃ８の発現を誘導し、Ｅ３ユビキチンリガーゼ、ＲＬＩＭによるＨＤＡＣ１−３のユビキチン化を引き起こす、ＨＤＡＣインヒビターのクラスを定義する（図１１〜１３）。
【００７５】
ユビキチン経路を介したタンパク質の分解は、２つの連続ステップ：（１）複数のユビキチン分子の共有結合による基質の標識化、そして（２）遊離および再利用可能なユビキチンの放出による２６Ｓプロテアソーム複合体による標識タンパク質の分解、を包含する。
２６Ｓプロテアソームは、タンパク質分解のユビキチン／ＡＴＰ依存性経路の主要な酵素複合体である。２６Ｓ複合体はＡＴＰを結合し、ユビキチンとの結合による分解を標的としたタンパク質の分解の原因である。ユビキチンは、一連のユビキチン結合酵素Ｅ１、Ｅ２およびＥ３によって標的上のリジンのイプシロン−アミノ基とユビキチンのＣ末端グリシン残基との間に形成されたイソペプチド結合によって、標的タンパク質に結合される。ユビキチン結合酵素は、ユビキチン鎖を１つの酵素から次の酵素に移動させ、続いてＥ２酵素からの活性化ユビキチン鎖を標的タンパク質へ移動させることによって連続して作用する。次にモノユビキチン化タンパク質に対して再度作用され、同じ酵素が追加のユビキチン分子を前の酵素に結合させる。ユビキチン結合は継続して、高分子量タンパク質複合体を生じさせる。次にこのポリユビキチン化産物は、イソペプチダーゼによって触媒されたユビキチンの付随する再生利用により、２６Ｓプロテアソームによる迅速な分解の標的となる（Ciechanover and Schwartz, 2002, Hepatology 35 : 3-6）。
【００７６】
本発明は、特定のＨＤＡＣインヒビター、すなわちバルプロ酸が、Ｅ３ユビキチンリガーゼ、ＲＬＩＭの発現を変更することなく、Ｅ２ユビキチン結合酵素Ｕｂｃ８の発現を選択的に誘導する能力を示す。Ｕｂｃ８の誘導は、ＲＬＩＭ関連タンパク質、たとえばＨＤＡＣ−２のユビキチン化を向上させる。これに対して、一部のＨＤＡＣインヒビター（たとえばＴＳＡ）が、Ｅ３リガーゼＲＬＩＭの向上したプロテアソーム分解を誘導させ、これが結果的にＨＤＡＣ−２ターンオーバーの限定要因となる。これらの観察は、異なるＨＤＡＣインヒビターによる処置時に見られたＨＤＡＣ−２タンパク質レベルに対する差次的効果についての、説得力のある説明を提供する。
【００７７】
方法
図１１（Ａ）Ｆ９細胞を１ｍＭ  ＶＰＡによって指示された回数だけ処置し、ポリＡ+ｍＲＮＡ  ５μｇから、ｃＤＮＡの３’−ＵＴＲに由来するプローブを用いてＵｂｃ８  ｍＲＮＡの存在量をノザンブロット分析によって決定した。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡは参照として決定された。定量評価のためにＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ分析を実施し、ＧＡＰＤＨに正規化された相対値をグラフの下に示す。同じ結果の２つの実験の一方を示す。（Ｂ）Ｕｂｃ８  ｍＲＮＡは、１サイクル当たり１．５倍増幅と仮定して、リアルタイムＰＣＲによっても決定した。アンプリコンは、Ｕｂｃ８  ｍＲＮＡのコード化配列の一部であった。Ｆ９細胞を１ｍＭ  ＶＰＡ（Ｖ）または１００ｎＭ  ＴＳＡ  （Ｔ）を用いて１７時間処置した。結果は、ＧＡＰＤＨ発現について正規化した。２回の測定の平均値±範囲を示す。
【００７８】
図１２（Ａ）ＲＬＩＭタンパク質レベルは、ＨＤＡＣインヒビターＶＰＡ（０．５、１．５、または５ｍＭ）、ＴＳＡ（３０、１００または３００ｎＭ）またはＶＰＡ（１．５ｍＭ）  およびＴＳＡ（１００ｎＭ）の組合せを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の処置の２４時間後に、ウェスタンブロット分析によって決定した。アクチンタンパク質レベルを、等しい負荷の対照として示す。（Ｂ）ＲＬＩＭタンパク質レベルは、ＨＤＡＣインヒビターＴＳＡ（１００ｎＭ）、プロテアソームインヒビターＡＬＬＮ（２．５μＭ）または両方の組合せを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の処置の２４時間後に、ウェスタンブロット分析によって決定した。アクチンタンパク質レベルは、等しい負荷の対照として示す。
【００７９】
図１３：インビトロ翻訳35Ｓ−メチオニン標識ＨＤＡＣ１−３は、Ｅ１ユビキチンリガーゼおよびユビキチンのみを含む緩衝液中で、またはnＥ３リガーゼＲＬＩＭなしの、Ｅ３リガーゼＲＬＩＭを含む、組換え発現されたＥ２ユビキチンリガーゼＵｂｃ８を含有する反応物中で、２時間インキュベートした。対照（左レーン）では、反応をユビキチンおよびＥ１リガーゼの添加直後に停止させた。インプットＨＤＡＣの消失および高分子量の放射性標識タンパク質の出現は、ＳＤＳ−ＰＡＧEによって、続いてオートラジオグラフィーによって決定した。
【００８０】
結果
ＨＤＡＣ１−３のユビキチンリガーゼの同定
ＨＤＡＣ−２分解を仲介できるユビキチン化機構のタンパク質は、２つの手法によって同定した。Ｆ９細胞中でのＶＰＡ誘導性遺伝子の体系的な探索は、Ｅ２結合酵素Ｕｂｃ８をコード化する遺伝子の発現が、ＶＰＡによって誘導されることを明らかにした（図１１）。ＲＬＩＭのｍＳｉｎ３コリプレッサとの結合（Ostendorff et al., 2002, Nature 416: 99-103）は、Ｅ３ユビキチンリガーゼを、コリプレッサ複合体の他の成分、たとえばＨＤＡＣに対しても活性となる第一の候補として同定した。興味深いことに、Ｕｂｃ８はＲＬＩＭリガーゼに対してＥ２結合酵素として作用するため、両方のタンパク質が相乗的に作用する。
【００８１】
ＶＰＡとは対照的に、一部のＨＤＡＣインヒビター、たとえばＴＳＡは、２６ＳプロテアソームインヒビターＡＬＬＮによって遮断することができるＥ３リガーゼＲＬＩＭのプロテアソーム分解の向上を誘導する（図１２）。結果として、ＲＬＩＭは、ＴＳＡの存在下で、ＨＤＡＣ−２ターンオーバーの限定因子となる。したがって、異なるＨＤＡＣインヒビターによる処置時に、ＨＤＡＣ−２タンパク質レベルに対する異なる効果が見られる。
【００８２】
Ｕｂｃ８をＥ２ユビキチンリガーゼとして、ＲＬＩＭをＥ３ユビキチンリガーゼとして用いたインビトロユビキチン化アッセイは、複数のクラスＩ  ＨＤＡＣ、たとえばＨＤＡＣ１−３（図１３）、およびクラスＩＩ  ＨＤＡＣ−４がＵｂｃ８／ＲＬＩＭの基質であることを示した。非修飾インビトロ翻訳ＨＤＡＣの消失は、モノ−、オリゴ−、およびポリ−ユビキチン化ＨＤＡＣの予想移動度の低速移動タンパク質の出現と同様にどちらも観察できる。効果的なユビキチン化は、両方の組換え発現タンパク質、Ｕｂｃ８およびＲＬＩＭが反応に含まれる場合のみに見られるが、ユビキチンおよびＥ１リガーゼのみが存在する場合には見られない。ＨＤＡＣ−２の場合、未修飾タンパク質の消失および低速移動ポリ−ユビキチン化形の出現が最も顕著であった。モノ−およびオリゴ−ユビキチン化の各種の形をおそらく表すラダーの形成は、ＨＤＡＣ−１の場合によく見られた。どちらの場合も、データは、Ｕｂｃ８およびＲＬＩＭが、細胞を含まないインビトロ反応において、ＨＤＡＣ１、２、および３をユビキチン化できることを明確に示している。
【実施例４】
【００８３】
ＨＤＡＣ−２は、ヒト結腸癌で過剰発現される（図１４、表１）。
【００８４】
結腸癌は、米国で２番目に頻繁に診断される悪性腫瘍であるとともに、癌死の２番目に多い原因である。外科手術が主要な処置であり、患者の約５０％に治癒をもたらす。外科手術後の再発が大きな問題であり、しばしば最終的な死因である。癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の前処置血清レベルの上昇は、負の予後の関連を有する。ここで我々は、ＨＤＡＣ−２がこれまで調査した結腸癌プローブの８０％超で過剰発現される証拠を示す。
【００８５】
本発明の１つの態様は、ＨＤＡＣインヒビターを用いた療法に反応する患者および腫瘍実体を識別するための、分子マーカーとしてのＨＤＡＣ−２発現の使用である。さらに腫瘍細胞におけるＨＤＡＣ−２発現は、患者におけるＨＤＡＣインヒビター処置の有効性をモニタリングするために使用できる。
【００８６】
方法
図１４：結腸癌および適合正常組織パラフィンアレイ（Biocat, Heidelberg）は、キシレンおよび下降エタノール濃度勾配（エタノール濃度:１００％  ２ｘ５分；９５％  ３分；７０％  ３分）の取替え２回によって脱パラフィン化して、ＰＢＳ中で洗浄した。ブロッキングは、ＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清（DAKO Diagnostika, Hamburg）内で１５分間実施した。ＨＤＡＣ−２−ウサギポリクローナル抗体（Zymed, San Francisco）の１０％  ＦＣＳ／ＰＢＳ中での１０μｇ／ｍｌによるインキュベーションを１時間実施した。スライドをＰＢＳで３回洗浄した後、切片をＣｙ３結合ヤギα−ウサギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−フラグメント（１０％  ＦＣＳ／ＰＢＳ中、１：５００）（Dianova, Hamburg）によって３０分間、インキュベートした。ＰＢＳ中での最終洗浄（３回）の後、切片をカバースリップで覆った。すべての写真は、Ｃｙ３に適したフィルタを用いてＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０レーザスキャニング倒立共焦点顕微鏡をによって撮影した。
【００８７】
結果
ヒト組織におけるＨＤＡＣ−２発現を調査するために、各患者からの腫瘍組織および正常結腸組織の療法を含有する結腸癌患者４６名からの生検をヒトＨＤＡＣ−２に対する抗体および免疫蛍光検査のための二次抗体によって染色した。図１４に見られるように、ＨＤＡＣ−２発現の非常にわずかな染色が正常組織で検出できるが、腫瘍組織からの生検の８０％超がＨＤＡＣ−２の強力な発現を示した（図１４および表１）。これは、ＨＤＡＣ−２過剰発現が結腸癌の非常に一般的な特徴であり、結腸癌患者での予後および診断として使用できることを示している。さらにこれらの結果は、結腸癌患者が腫瘍組織でのＨＤＡＣ−２発現を低下させることを狙った処置から利益を得るという期待を向上させる。
【００８８】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】ＶＰＡは、急性前骨髄球性白血病マウスの生存を向上させ（図１Ａ）、ＶＰＡによる処置後に急性前骨髄球性白血病マウスの脾腫を低下させた（図１Ｂ）（実施例１）。
【図２】ＶＰＡによる処置（４００ｍｇ／ｋｇ）後の正常および白血病マウスにおける脾細胞でのヒストン過剰アセチル（図２ＡおよびＢ）（実施例１）。
【図３】ＶＰＡは、インビボ（図３Ａ）およびインビトロ（図３Ｂ）で白血病細胞でのアポトーシスを誘導するが、正常脾細胞では誘導しない（実施例１）。
【図４】ＶＰＡは、インビボでの白血病細胞における（図４Ａ）、および非白血病腫瘍細胞系における（図４Ｂ）、ＴＲＡＩＬ発現を誘導する（実施例１）。
【図５】ＴＲＡＩＬおよびカスパーゼ８の阻害が、ネズミＡＰＬ芽細胞のＶＰＡ誘導アポトーシスを損なう（実施例１）。
【図６】ＴＳＡでなく、ＶＰＡがＨＤＡＣ−２タンパク質レベルの低下を誘導する（実施例２）。
【図７】ＶＰＡは、ＨＤＡＣ−２ｍＲＮＡレベルを変化させない（実施例２）。
【図８】ＶＰＡによるＨＤＡＣ−２タンパク質分解の誘導（実施例２）。
【図９】プロテアーゼインヒビターではなく、プロテアソームインヒビターがＶＰＡ誘導ＨＤＡＣ−２分解を抑制する（実施例２）。
【図１０】ＨＤＡＣ−２が、ＶＰＡ処置に応答してユビキチン化される（実施例２）。
【図１１】ＶＰＡは、Ｅ２ユビキチンコンジュガーゼＵｂｃ８の発現を誘導する（実施例３）。
【図１２】ＶＰＡではなく、ＨＤＡＣインヒビターＴＳＡがＥ３ユビキチン化酵素ＲＬＩＭのプロテアソーム分解を誘導する（実施例３）。
【図１３】ＨＤＡＣの１−３のユビキチン化を誘導する、Ｅ３ユビキチン化酵素、ＲＬＩＭの同定（実施例３）。
【図１４】ヒト結腸癌組織でアップレギュレートされる（実施例４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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