(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地に、（１）配列表の配列番号１に示される抗菌ペプチド、（２）ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦからなる細胞発育因子、及び、（３）インスリン、トランスフェリン、セレン酸及びリノール酸からなる添加成分を添加してなる動物幹細胞培養用無血清培地。
【請求項２】
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地が、Dulbeco改変Eagle培地であるＤＥＭＥであることを特徴とする請求項１記載の動物幹細胞培養用無血清培地。
【請求項３】
動物幹細胞が、間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載の動物幹細胞培養用無血清培地。
【請求項４】
請求項１又は２記載の動物幹細胞培養用無血清培地を用いて、動物幹細胞を培養することを特徴とする無血清培地を用いた動物幹細胞の培養増殖方法。
【請求項５】
動物幹細胞を、血清を含む動物細胞用培地で培養した後、培地を請求項１又は２記載の動物幹細胞培養用無血清培地に交換して、動物幹細胞を培養増殖することを特徴とする動物幹細胞の培養増殖方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞のような動物幹細胞を血清非存在下において培養することが可能な動物幹細胞培養用無血清培地、及び、該無血清培地を用いた動物幹細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医科歯科領域においては、組織再生医学に関する研究及び臨床応用が趨勢を極めており、バイオビジネスの分野においても、組織再生医療、すなわち事故や病気や生活習慣病で組織や臓器を欠損させてしまった場合、欠損組織等に分化する機能を保持した幹細胞を用いて欠損部分を元の組織に再生させる再生医療が注目を集めている。このような組織再生には、主として患者から採取した自己細胞（特に幹細胞）を体外で培養、増殖、分化させ、再生した組織を移植するという型がとられている。
【０００３】
従来、哺乳動物細胞を培養するための培養用培地としては、生体に近い条件を作り出すために血清を加えたものを使用するのが主流であり、この血清としてはウシ胎児血清（ＦＢＳ）が最も一般的に用いられている。しかしながら、血清は狂牛病をはじめとする外来性の汚染やウイルスの感染源となり得るため、人体に用いるための細胞の増殖やワクチンの製造といった分野では問題が生じる虞があった。組織再生医療において、幹細胞の培養は、現在のところ、ヒトあるいは仔牛胎児血清を用いた培養が主流であるが、しかし、自己血清では十分な増殖を得られないケースもあり、また自己血清以外の血清を用いた培養は事業化・実用化の過程で、ＢＳＥやウィルス性疾患の水平感染などの様々な問題を含んでいる。
【０００４】
従来より、上記のような問題を解決するために、動物細胞を血清の非存在下で培養するための無血清細胞培養培地の開発が行われている。例えば、特開平６−７８７５９号公報には、基礎培地に、ヒトトランスフェリン、ヒトインスリン、エタノールアミン及び亜セレン酸ナトリウムを添加した動物タンパク質を含まない無血清細胞培養培地が開示され、特開平７−８２７３号公報には、細胞接着活性を有するコラーゲン、ゼラチン、ケラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニンからなる群より選択される天然高分子化合物を、細胞培養用担体の表面に存在させ、血清を含有せず、血清アルブミンを含有する無血清培地が開示されている。
【０００５】
また、特開平７−２３７８０号公報には、増殖因子であるタンパク質を全く含有せず、グリシルグリシンを含有する動物細胞の高密度培養用の完全無タンパク培地が、特開平９−２５２７６７号公報には、インスリン、ペプトン及びトランスフェリンを含有する動物細胞用の無血清培地が、特表平１１−５０６６１０号公報には、最小必須培地、血清アルブミン、鉄源、インスリン或いはインスリン状成長因子、及び、グルタミン、アルギニン及びシステインから選択される少なくとも１個のアミノ酸を含むヒト間葉幹細胞培養用無血清培地が、開示されている。
【０００６】
更に、特開２００４−１３５６７２号公報には、アルブミン代替物、トランスフェリン代替物及びインスリン代替物を含む組成物であって、アルブミン代替物が１重量％未満の量のポリエチレングリコールである、動物タンパク質を含まない動物細胞培養用の培地が、及び、特開２００４−２７５０４７号公報には、基礎培地に、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、リジン、セリン、スレオニン、バリンを添加した哺乳動物細胞培養用の無血清培地が開示されている。
【０００７】
上記のとおり、動物細胞培養用の無血清培地は、種々のものが開示されているが、組織再生医療において、移植用の幹細胞を大量に、培養、増殖するためには、幹細胞の分化機能を保持したままの細胞を、血清非存在下において効率的に培養、増殖できる無血清培地が必要となり、そのための細胞増殖能の優れた培地の開発が更に望まれている。
【０００８】
【特許文献１】特開平６−７８７５９号公報。
【特許文献２】特開平７−８２７３号公報。
【特許文献３】特開平７−２３７８０号公報。
【特許文献４】特開平９−２５２７６７号公報。
【特許文献５】特表平１１−５０６６１０号公報。
【特許文献６】特開２００４−１３５６７２号公報。
【特許文献７】特開２００４−２７５０４７号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、組織再生医療等において用いられる動物幹細胞を培養、増殖するために、安全性を担保すること、すなわち、ＢＳＥやウィルス性疾患の水平感染などの血清を用いた場合の様々な問題の発生するのを防止し、しかも、血清を用いた場合に匹敵する十分な増殖を得られる、動物幹細胞培養用無血清培地を提供すること、及び、該無血清培地を用いた動物幹細胞の培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく、鋭意検討する中で、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地に、特定の抗菌ペプチドを添加することにより、動物幹細胞の培養において、血清の非存在下であっても、血清を用いた場合に匹敵する十分な増殖が得られ、しかも、分化能など動物幹細胞としての機能をそのまま保持した動物幹細胞の培養、増殖が可能であることを見い出し、該抗菌ペプチドを添加してなる動物幹細胞培養用無血清培地として調製して、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地に、配列表の配列番号１に示される抗菌ペプチドを添加してなる動物幹細胞培養用無血清培地よりなる。本発明の抗菌ペプチドは、配列表の配列番号１に示される構造のペプチドであり、合成によって調製することができる。
【００１１】
更に、本発明においては、該動物幹細胞培養用無血清培地に、ｂＦＧＦ（繊維芽細胞成長因子）及び／又はＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、及び、インスリン、トランスフェリン、セレン酸及びリノール酸からなるグループから選択される１又は２以上の成分を添加して、増殖能の高い動物幹細胞培養用無血清培地を提供することを可能とした。本発明において、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地に、配列表の配列番号１に示される抗菌ペプチドと、２種の発育因子すなわち、ｂＦＧＦ及びＰＤＦＧを応用して、間葉系幹細胞のような動物幹細胞を無血清で培養することを可能とし、従来技術による無血清培養に比べて約１００倍の増殖能を与える増殖能の高い動物幹細胞培養用無血清培地を提供することを可能とした。本発明は、本発明の動物幹細胞培養用無血清培地を用いて、間葉系幹細胞のような動物幹細胞の培養を行う方法を包含する。
【００１２】
すなわち具体的には本発明は、（１）血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地に、（Ａ）配列表の配列番号１に示される抗菌ペプチド、（Ｂ）ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦからなる細胞発育因子、及び、（Ｃ）インスリン、トランスフェリン、セレン酸及びリノール酸からなる添加成分を添加してなる動物幹細胞培養用無血清培地や、（２）血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地が、Dulbeco改変Eagle培地であるＤＥＭＥであることを特徴とする上記（１）記載の動物幹細胞培養用無血清培地や、（３）動物幹細胞が、間葉系幹細胞であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の動物幹細胞培養用無血清培地からなる。
【００１３】
また本発明は、（４）上記（１）又は（２）記載の動物幹細胞培養用無血清培地を用いて、動物幹細胞を培養することを特徴とする無血清培地を用いた動物幹細胞の培養増殖方法や、（５）動物幹細胞を、血清を含む動物細胞用培地で培養した後、培地を上記（１）又は（２）記載の動物幹細胞培養用無血清培地に交換して、動物幹細胞を培養増殖することを特徴とする動物幹細胞の培養増殖方法からなる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の動物幹細胞培養用無血清培地は、血清の非存在下で、血清を添加した培地に匹敵する動物幹細胞の増殖効果を示し、しかも、動物幹細胞の幹細胞としての機能を保持しつつ、培養、増殖することが可能であり、組織再生医療等に用いる動物幹細胞用の培養用の培地として、実用上有用な無血清培地を提供する。本発明の動物幹細胞培養用無血清培地によって、血清を用いることによって発生する、ＢＳＥやウィルス性疾患の水平感染などの様々な問題を回避することができ、本発明の無血清培地は、特に、組織再生医療等に用いる間葉系幹細胞等、動物幹細胞の調製のための手段として大きく貢献することができる。
【００１５】
更に、従来、動物の細胞培養には、ペニシリンや、ストレプトマイシン等の抗生物質或いはアンホテリシンなどの抗真菌物質の少量添加が必須とされており、これらの抗生物質、抗真菌物質には動物細胞増殖の抑制作用があるといわれていたが、これらの抗生物質、抗真菌物質は、細胞を再び生体にもどす再生医療を行う場合には、添加する物質として好ましい物質ではなかった。本発明の抗菌ペプチドはこのような動物細胞増殖の抑制作用はなく、抗菌性と抗真菌性があることが分かっており、本発明の無血清培地は、再生医療用の幹細胞の増殖培地として用いるに非常に好ましいものである。特に、本発明の抗菌ペプチド＋ＰＤＧＦ+ｂＦＧＦ＋ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン、セレン酸及びリノール酸）の組み合わせは１０％ＦＢＳに匹敵する細胞増殖能を示したことから、再生医療用の幹細胞の増殖培地として特に優れた動物幹細胞培養用無血清培地を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地に、配列表の配列番号１に示される抗菌ペプチドを添加してなる動物幹細胞培養用無血清培地からなる。
本発明で使用する動物細胞培養用基礎培地としては、動物細胞培養用に使用されている適宜の基礎培地を使用することができるが、ＤＭＥＭ（Dulbeco改変Eagle培地）が有利に使用することができる。
【００１７】
本発明の動物幹細胞培養用無血清培地の調製に使用される抗菌ペプチドは、Lys-Arg-Leu-Phe-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Tyrからなるペプチド（以下、「８１９４抗菌ペプチド」という）であり（（配列表の配列番号１）、抗菌ペプチドとして、公知のペプチドである（Oral Disease、10,4,221-228；特許第３４７２８２１号）。
【００１８】
本発明のペプチドは、ぺプチド合成法で取得することができる。ペプチド合成には、液相法及び固相法が存在するが、本発明のペプチドは、液相法及び固相法のいずれの方法も使用することができる。液相法は、反応を溶液状態で行い反応混合物から生成物を単離精製し、この生成物を中間体として次のペプチド伸長反応に用いる方法である。一方、固相法は、反応溶媒に不溶の固相担体にアミノ酸を結合させ、このアミノ酸に準じ縮合反応を行いペプチド鎖を伸長させていく方法である。
【００１９】
ペプチドの化学合成は、カルボキシル基を保護したアミノ酸にアミノ基を保護したアミノ酸を脱水縮合させ、ペプチド結合を形成させ、次にアミノ保護基を除去後、遊離したアミノ基に次のアミノ基保護アミノ酸を順次、C末端からN末端に向かって一つずつ延長していく方法が基本である。脱水縮合反応では、カルボキシル基を活性化して、結合させようとするアミノ基と反応させる。この活性化には、ジシクロへキシカルボジイミド（ＤＣＣ）法、活性エステル法、酸無水物法、アジド法等があるがその反応性の高さとラセミ化その他の副反応を考慮して選ばれる。縮合反応時の副反応を防止するためにアミノ酸のアミノ基、カルボキシル基、側鎖(R)の官能基には保護基が導入される。これらの保護基は、縮合反応の条件で安定であり、必要なときには速やかに除去されるものが好ましい。また、アミノ基の保護基とカルボキシル基の保護基とは互いに選択的に除去されることが好ましい。
【００２０】
縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下、あるいはN−保護アミノ酸活性エステル又はペプチド活性エステルを用いて実施する。縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相の場合は更に、ペプチドのC末端と樹脂との結合を切断する。製造されたペプチドは通常の方法に従い精製される。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。合成したペプチドは、エドマン分解法でC-末端からアミノ酸配列を読み取るプロティンシークエンサー、ＧＣ−ＭＳ、ＴＯＦ−ＭＳ等で分析される。
【００２１】
本発明の動物幹細胞培養用無血清培地の調製において、動物細胞培養用基礎培地に添加される、ｂＦＧＦ（繊維芽細胞成長因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、及び、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン、セレン酸及びリノール酸）は、適宜市販のものを用いることができる。
【００２２】
本発明の無血清培地は、組織再生医療等の分野において、本発明の無血清培地を用いて、間葉系幹細胞のような動物幹細胞の培養、増殖を行うには、該無血清培地を用いて、採取した幹細胞を、動物細胞の通常の培養条件に従って培養することにより、行うことができる。また、採取した細胞を、予め、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した培地で培養して、細胞を増殖し、その後、本発明の無血清培地に、培地交換することにより、効率的に動物幹細胞の無血清培養を行うことができる。
【００２３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
（材料と方法）
使用した細胞：ヒト腸骨由来骨髄間葉系幹細胞（CAMBREX社より購入）（以下「ＭＳＣ」という）。
培養条件：通法に従って培養したＭＳＣを２４穴培養皿に５０００細胞/穴になるような密度で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と抗生物質を含むＤＭＥＭ（Sigma社）培地にて播種、培養した。翌日にＦＢＳを含まないＤＭＥＭ（抗生物質は含む）に培地交換し、被検因子を添加し、３日後に増殖した細胞を培養穴からトリプシンを用いて剥離し、コールターカウンター（ベックマン社）によって実細胞数を計測した。対照には、被検因子を希釈するのに用いた０．３％ＢＳＡ／ＰＢＳのみを添加した。Ｎ＝３で、平均と標準偏差をグラフ化した。
【００２５】
被検因子：濃度は培地添加後の終濃度をあらわす。（ａ）８１９４抗菌 ペプチド（合成依頼品）１０マイクロM；（ｂ）ｂＦＧＦ （Sigma社製）１０ｎｇ／ｍｌ；（ｃ）ＰＤＧＦ−ＢＢ（R&D社製）１０ｎｇ／ｍｌ（ここではＰＤＧＦと略す）；（ｄ）ＩＴＳ（ＢＤ Biosciences社製、Insulin, Transferrin, Selenious Acid,Linoleic Acidの混和物） メーカー指定で最終倍率１となるように希釈した。（ａ）〜（ｄ）の混和物をＤＭＥＭに添加した。
【００２６】
（結果）
結果を図に示す。縦軸は各条件での培養穴中の細胞数を、横軸には添加物を示す。横軸の添加物にさらに８１９４抗菌ペプチド、若しくは、ＩＴＳ＋８１９４抗菌ペプチドを添加したグラフを付している。１０％ＦＢＳとはウシ胎児血清を最終濃度１０％となるようにＤＭＥＭに混和した条件である。１０％ＦＢＳ添加群は対照（０．３％BSA in PBS）と比べて細胞増殖を引き起こした。８１９４抗菌ペプチド＋ＰＤＧＦ+ｂＦＧＦ＋ＩＴＳの４因子を混和したものは、１０％ＦＢＳに匹敵する増殖性を示した。各因子の欠けたものはそれぞれ増殖性が強く示されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の実施例において、培地に添加したファクターに対する細胞数／培養穴の結果を示す図である。
【図１】
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【配列表】
0004745750000001.app