(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対照血液溶液の有核赤血球画分を製造する方法であって、
ａ．鳥類または魚類の全血または赤血球層を提供するステップと、
ｂ．全血または赤血球層と溶解試薬を混合して、１分〜５分間合わせて核を露出させるステップと、
ｃ．ステップｂの溶解し、希釈した細胞懸濁液と固定剤とを合わせ、６０℃〜７０℃で１０分間インキュベートして、核を固定し、安定化し、ここで固定剤と細胞懸濁液の比は１：８から１：１１であるステップと、
ｄ．ステップｃの混合物を室温まで冷却し、懸濁液を沈殿させるステップと、
ｅ．ステップｄで形成された上清を捨て、ステップｂの溶解試薬およびステップｃの固定剤を除去するのに十分、得られた固定した核を洗うステップと、
ｆ．固定し、洗浄した核を再懸濁用媒質に再懸濁するステップと
を含む方法。
【請求項２】
ステップｂにおいて、赤血球層１部に対して溶解試薬１０部の割合で赤血球層と溶解試薬溶液を混合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対照血液溶液の有核赤血球疑似画分を製造する方法であって、
ａ．哺乳動物のリンパ球を提供するステップと、
ｂ．リンパ球と溶解試薬を、リンパ球と溶解試薬との比１：５から１：３０で、５分〜３時間合わせて核を露出させるステップと、
ｃ．ステップｂの核懸濁液と固定剤とを合わせ、５５℃〜６０℃で１０分間インキュベートして、核を固定し、安定化し、ここで固定剤と細胞懸濁液の比は１：１から１：１０であるステップと、
ｄ．ステップｃの混合物を室温まで冷却し、懸濁液を沈殿させるステップと、
ｅ．ステップｄで形成された上清を捨て、ステップｂの溶解試薬およびステップｃの固定剤を除去するのに十分、得られた固定した核を洗うステップと、
ｆ．固定し、洗浄した核を再懸濁用媒質に再懸濁するステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対照血液組成物、その製法および基準品への使用に関する。より詳細には、本発明は、安定化した白血球（ＷＢＣ）および哺乳類のＷＢＣまたは鳥類もしくは魚類の赤血球の核を含有する基準対照血液懸濁液に関する。さらに詳細には、本発明は、安定化した状態で多角度光散乱特性を保持するように、製造中に全血溶解プロセスにかけてある安定化したＷＢＣを含有する基準対照血液懸濁液に関する。この結果、この安定化した細胞は、多角度光散乱信号にのみ基づいてＷＢＣを識別する血液分析器で使用したときに、全血のＷＢＣ信号を模倣した多角度光散乱信号を生成することができる。
【背景技術】
【０００２】
現在、いくつかの異なる銘柄の自動血液測定機器が市販されている。これらの種々の分析装置では、好中球、リンパ球、単球、好酸球および好塩基球を定量するために種々の検出手法を使用している。使用されている検出手法には、電子インピーダンス、前方光散乱、偏光９０゜光散乱、吸光、高周波およびそれらの組み合わせがある。光学ベンチ設計が異なると、安定化した対照細胞から得られる光学信号の特性に大きく影響する。これらの測定機器は白血球分類分析（ＷＢＣ／Ｄｉｆｆ）に種々の検出法を使用しているため、特定な種類の機器で実施する場合に、全血球細胞と類似した対照細胞特性を得るためには、種々の型のＷＢＣ／Ｄｉｆｆ対照溶液の使用が必要となる。
【０００３】
現在ある種類の機器では、細胞を他の細胞から識別し、決定するために、インピーダンス、インピーダンスと光散乱（必ずしも、多角度光散乱でなくてもよい）、または、光散乱とインピーダンスと高周波信号を使用する必要がある。さらに、これらの現在利用できる血液測定機器では有核赤血球（ＮＲＢＣ）の定量はできない。ＮＲＢＣは正確なＷＢＣ／Ｄｉｆｆ分析を妨害する。現在利用できる血液測定機器は検体中にＮＲＢＣの存在することを「知らせる」だけである。しかし、まもなく発売されるＡｂｂｏｔｔ  Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ４０００血液分析器システムでは、ＷＢＣ／ＤｉｆｆとＮＲＢＣの同時全血分析が実施できるであろう。Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）の測定機器は、ＷＢＣとＮＲＢＣとを識別するために蛍光を適宜使用することを含めて、多角度光散乱のみを使用して同時に全血を分析する。そのため、ＷＢＣ／ＤｉｆｆとＮＲＢＣを分析するための新しい対照血液の開発が必要となった。この新しい基準対照の対照細胞は、それらが模倣すると思われる全血検体の細胞の多角度光散乱能を全て有している必要がある。
【０００４】
現在、当業界では、現在の種類の分析器、すなわち、多角度光散乱によるＷＢＣ／Ｄｉｆｆ分析のみを実施するのではない分析器用の基準対照血液を製造するための方法および試薬系を記載している特許がいくつかある。本出願人らは、ＷＢＣおよびＮＲＢＣの多角度光散乱分析用の血液学的基準対照の製造および使用のための方法および試薬系について記載したものはまったく知らない。
【０００５】
Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社に譲渡されたＣａｒｖｅｒ他の米国特許第４７０４３６４号はヒト白血球の主要三成分を模倣した３成分系の製造法を開示している。しかし、これらの疑似細胞はインピーダンスによる検出系で検出されるが、多角度光散乱検出系では検出されない。Ｃａｒｖｅｒ他は、ヒト顆粒球を模倣するためにテンジクザメ由来の固定した赤血球（ＲＢＣ）を、ヒト単核細胞を模倣するためにシチメンチョウ由来の固定したＲＢＣを、ヒトリンパ球を模倣するために固定したヒトＲＢＣを使用している。白血球の三つの成分は大きさ（インピーダンス）によってのみ識別され、光学特性では識別されないため、Ｃａｒｖｅｒ他の教示により製造した対照血液は、三成分についてのＷＢＣ／Ｄｉｆｆの電子インピーダンスによる測定にのみ有用である。
【０００６】
Ｃａｒｖｅｒ他の方法で製造したこれらの三つの成分は、ヒトＷＢＣと類似の細胞表面構造や、実質的にヒトＷＢＣと等しい細胞質顆粒度（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｇｒａｎｕｌａｒｉｔｙ）を有していない。従って、この三成分は多角度光散乱に基づく系の基準対照としては使用できない。本出願人らは、まもなく市販されるＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ４０００分析器でこれらの疑似細胞を調べ、Ｃａｒｖｅｒ他の対照中の模倣されたＷＢＣの光散乱特性が、正常な血液検体とは非常に異なる多角度光散乱信号を発生させることを見出した。第１ａ図〜第１ｃ図は正常血についてＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ４０００血液分析器で得られたドットプロットを再現したものである。
【０００７】
以下の図面で軸を表示するために使用する略号を示す。
【０００８】
【表１】
0004686506.tif 000002
【０００９】
第４ａ図〜第４ｃ図は、Ｃｏｕｌｔｅｒ社の製品４Ｃ（登録商標）  Ｐｌｕｓ  Ｃｅｌｌ対照で具体化されたＣａｒｖｅｒ他の疑似ＷＢＣ対照について、Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ４０００分析器で得られた結果を示している。第４ａ図〜第４ｃ図から判るように、これらのクラスタは同定できない。
【００１０】
Ｒｙａｎの米国特許第５２７０２０８号は、ＷＢＣ／Ｄｉｆｆ分析のための基準対照血液を製造する別の方法を開示している。Ｒｙａｎの方法では、アルデヒドで固定したヒトＷＢＣを、全血から得られるものと実質的に同様のＷＢＣ特徴プロフィールを与える混合物を提供するのに十分な量のリポタンパク質を含む等張水性媒質に懸濁する。Ｒｙａｎはクレームを支持するために、横軸をＤＦ１とし、縦軸を容積として、Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＳＴＫ−Ｓ（登録商標）分析器のドットプロットでＷＢＣの分布を示した。ＲｙａｎのＷＢＣ調製物は、Ｓｔｒｅｃｋ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからＰＡＲＡ  １２（登録商標）（低、正常、高）三レベル血液学対照という名前で市販されていると考えられる。本出願人はこの市販の物質について、多角度光散乱（軸方向の光の消失、多次元光散乱および蛍光）によりＷＢＣ／ＤｉｆｆとＮＲＢＣを同時に分析するＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ４０００分析器で調べた。この結果（第５ａ図〜第５ｃ図参照）から、Ｒｙａｎの調製物のＷＢＣ成分は全血から得られたものと有意に異なる光散乱特性を示すことが明らかとなった。第５ａ図〜第５ｃ図から明らかなように、この製品の好中球成分は全血のものに比べ軸方向の光の消失および偏光側の散乱信号が非常に少なく、好中球からの偏光解消光側の散乱信号が大きすぎるため好酸球の信号から分離されず、単球クラスタは好中球クラスタからまったく分離されず、リンパ球成分は全血に比べ非常に大きな中間角度の散乱（７゜）信号を生じ、その結果、好塩基球の領域と重なり、この領域がなくなってしまう。
【００１１】
Ｙｏｕｎｇ他の米国特許第５３２０９６４号は白血球類似体を製造するための方法および試薬組成物を開示している。Ｙｏｕｎｇ他のリンパ球類似体は低張リン酸塩緩衝溶液（１５〜２５ｍＯｓｍ／ｋｇ）中で固定したアヒルＲＢＣから調製し、単球類似体は低張緩衝溶液（１５〜２５ｍＯｓｍ／ｋｇ）中で固定したワニＲＢＣから調製し、好酸球類似体も低張緩衝溶液（７５〜８５ｍＯｓｍ／ｋｇ）中で固定したワニＲＢＣから調製し、好中球類似体は低張緩衝溶液（４５〜６５ｍＯｓｍ／ｋｇ）中で固定したワニＲＢＣから調製している。アヒルのＲＢＣとワニのＲＢＣのいずれも楕円形で、有核であり、滑らかな細胞表面を有している。Ｙｏｕｎｇ他は、かれらの手法で調製した固定細胞は、各々がヒト白血球の物理特性を少なくとも二つ有している少なくとも二つの異なるヒト白血球を模倣すると主張している。これらの特性は、（ａ）直流電流で測定される容積、（ｂ）高周波（ＲＦ）サイズ、（ｃ）不透明性、（ｄ）光散乱から選択される。光散乱の種類を特定していないが、Ｙｏｕｎｇ他のアヒルおよびワニのＲＢＣから調製した疑似ＷＢＣ成分は細胞表面構造および細胞質の顆粒度については、哺乳類のＷＢＣと同じ特性は有していない。従って、これらの細胞は、ヒト全血ＷＢＣと実質的に等しいかまたは類似の偏光および偏光解消光９０゜光散乱の多角度光散乱信号と軸方向の光の消失の信号は発生しない。従って、Ｙｏｕｎｇ他の製品は多角度光散乱、軸方向の光の消失および蛍光信号を使用する、Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ４０００分析器などの高度な血液測定機器で、ＷＢＣ／ＤｉｆｆおよびＮＲＢＣの定量のための標準対照血液として使用することはできない。実際、Ｙｏｕｎｇ他の細胞を低張緩衝溶液で固定すると、次の二つ、すなわち、溶液の浸透圧が非常に低い（５〜２５ｍＯｓｍ／ｋｇ）場合、細胞の細胞質が溶解するか、あるいは、浸透圧が約８５ｍＯｓｍ／ｋｇの場合、細胞容積が大きくなる、のいずれかになる。
【００１２】
第１８ａ図〜第１８ｄ図は、対照細胞として固定したワニのＲＢＣを含む対照細胞溶液を多パラメータの光散乱に基づいて分析した結果を示している。図から明らかなように、固定したワニのＲＢＣは検出可能なＰＳＳ信号を発生せず、ＩＡＳ信号はリンパ球領域と塩基球領域の間にあり、ＡＬＬ信号が低すぎるため好中球および好酸球のいずれとしても計測されない。
【００１３】
第６ａ図〜第６ｃ図は、別の市販の対照である、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のＣＢＣ−３ｋ（商標）対照血液についての結果を示している。ＣＢＣ−３ｋ（商標）の製品が特許査定されているかどうかは判らない。図に示すように、クラスタは同定できない。
【発明の開示】
【００１４】
本発明のこれらの特徴およびその他の特徴ならびに利点は以下の本発明の好適実施形態の説明から明らかとなろう。
【００１５】
本発明の一つの目的は、多次元光散乱ＷＢＣ／Ｄｉｆｆ分析を使用するＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ３０００機器などの自動血液測定機器の基準対照血液を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、ＷＢＣ／ＤｉｆｆとＮＲＢＣを同時に分析するために、多次元光散乱、軸方向の光の消失および蛍光を利用するＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ４０００機器などの自動血液測定システムの基準対照血液を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、ＷＢＣ／ＤｉｆｆおよびＮＲＢＣを同時に分析するために、多次元光散乱、軸方向の光の消失および蛍光を使用するＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ４０００機器などの自動血液測定システムで使用できる、安定化したＲＢＣ、血小板、好中球、リンパ球、好酸球、好塩基球およびＮＲＢＣ成分を含有する安定な基準対照血液を提供することである。
【００１８】
広範には、本発明は、安定なＷＢＣおよびＮＲＢＣ成分ならびにこれらの成分を一つまたは複数含有する基準対照血液溶液の製造方法に関する。この方法では、ヒト全血細胞の電子光学信号と類似の信号を発生する、しっかりと固定し、安定化したＷＢＣおよび疑似ＮＲＢＣが製造され、その結果、新鮮なヒト血液試料用の分析器で使用するものと同じアルゴリズムを使用する完全なＷＢＣ／Ｄｉｆｆ／ＮＲＢＣ分析が可能となる。本発明方法で製造される固定したＷＢＣおよび疑似ＮＲＢＣはクランプを含まず、適当な血漿様媒質中で冷蔵下、長期にわたり安定であり、多パラメータ光散乱を使用する機器などの日常的な臨床血液学測定機器のＷＢＣ／Ｄｉｆｆ／ＮＲＢＣ用の血液学的対照として使用できる。これらの利点は従来技術に対する実質的な改良に相当する。
【００１９】
図面の簡単な説明
本発明およびその利点をより完全に理解するために、添付図面と共に以下の説明を参照する。
【００２０】
第１ａ図〜第１ｃ図は、多角度光散乱に基づく分析器で実施した正常血のＷＢＣサイトグラムである。
【００２１】
第２ａ図〜第２ｃ図は、１．７８ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床検体について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【００２２】
第３ａ図〜第３ｃ図は、４０．４Ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床検体について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【００２３】
第４ａ図〜第４ｃ図は、Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）  ４Ｃ（登録商標）  Ｐｌｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００２４】
第５ａ図〜第５ｃ図は、正常レベルのＳｔｒｅｃｋ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＰＡＲＡ  １２（登録商標）  Ｍｕｌｔｉ−Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００２５】
第６ａ図〜第６ｄ図は、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍのＣＢＣ−３Ｋ（商標）  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００２６】
第７ａ図〜第７ｃ図は、本発明の基準対照血液について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００２７】
第８ａ図〜第８ｃ図は、本発明方法で製造した固定したマスの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００２８】
第９ａ図〜第９ｃ図は、第８ａ図〜第８ｃ図の固定したマスの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００２９】
第１０ａ図〜第１０ｃ図は、本発明方法で製造した固定したニワトリの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３０】
第１１ａ図〜第１１ｃ図は、第１０ａ図〜第１０ｃ図の固定したニワトリの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３１】
第１２ａ図〜第１２ｃ図は、本発明方法で製造した固定したシチメンチョウの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３２】
第１３ａ図〜第１３ｃ図は、第１２ａ図〜第１２ｃ図の固定したシチメンチョウの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３３】
第１４ａ図〜第１４ｃ図は、本発明方法で製造した固定したブタのリンパ球の核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３４】
第１５ａ図〜第１５ｃ図は、本発明方法で製造したウシのＷＢＣの核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３５】
第１６ａ図〜第１６ｃ図は、すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３６】
第１７ａ図〜第１７ｄ図は、本発明方法で製造した固定したウシのＷＢＣについてインピーダンスと光散乱の両者を使用する分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３７】
第１８ａ図〜第１８ｄ図は、対照細胞として固定したワニのＲＢＣを含有する対照細胞溶液について、多パラメータ光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
細胞を検出し、分類するための自動システムではいずれも、そのシステムが適切に作動していることを確認するために基準対照の使用が必要である。これはどんな検出システムを使用した場合にもいえる。
【００３９】
新しい検出方式、主として検体中のＷＢＣのサブポピュレーションおよびＮＲＢＣを分類し、識別するために多角度／パラメータ光散乱信号のみを使用する（他のすべての非光信号を除く）検出方式が出現したため、新しい対照が必要となった。当業界の現在の基準対照はこのような多パラメータシステムで適切に機能しない。
【００４０】
本発明者らは、現在の対照が、多角度光散乱に基づく血液分析器で機能しない理由を発見し、機能する対照を製造する方法を考案した。本発明の対照は多パラメータ光散乱に基づくシステムで機能するだけではなく、他の検出法に基づくシステムでも機能するはずである。これは、新しい対照の細胞が、処理しただけの血液試検体で認められる細胞と同じであるためである。従って、新しい対照の細胞はそれらの細胞の光散乱特性を保持している。
【００４１】
本発明の基準対照懸濁液の細胞性成分は、多パラメータ光散乱に基づく検出システムにかけると、全血検体中のＷＢＣまたはＮＲＢＣの多パラメータ光散乱特性を実質的に模倣する。
【００４２】
本発明では、多パラメータ、多角度または多次元光散乱とは、検体の細胞を測定または分類するために、偏光および偏光解消光９０゜光散乱および軸方向の光の消失の信号およびこれらを組み合わせたもののみ（すなわち、非の付くものを除く）を使用することを含む。この測定には、その他の光ベースではない信号は使用できない。蛍光などのその他の種類の光信号も使用できるが、インピーダンスおよびその他の光ベースではない信号は使用できない。しかし、例えば、光ベースではない信号、または光散乱とインピーダンスとの組み合わせを使用する機器にも本発明の対照は役立つが、現在のところ、多角度光散乱に基づく測定機器には、利用できるこのような対照がないため、最も恩恵を受けるのはこのような機器であろう。
【００４３】
本発明の対照懸濁液のＷＢＣ成分は、（血液検体を分析する分析器内における環境と同様な）非常に緩和な溶解環境におき、次いで固定された、血液由来のＷＢＣである。ＮＲＢＣ成分についても同様であり、核を溶解環境に露出し、固定してその細胞特性を保持する。しかし、ＮＲＢＣ成分については、哺乳類の有核赤血球は遊離した核の源として使用できる唯一の細胞ではない。鳥類または魚類の赤血球もこの画分に使用できる。
【００４４】
対照細胞が検体細胞の光散乱特性を模倣できるのは、先ず、細胞組成（すなわち光散乱特性）により細胞を選択したためである。最初に緩和な溶解環境においてＲＢＣを溶解し、次いで、所望の細胞特性が失われる前に、残存するＷＢＣおよびＮＲＢＣの核を固定することにより、対照細胞のこれらの細胞成分が製造プロセス中保存される。この製造プロセスは、「本当の」血球が分析器の内部を通過する際におかれる環境を模倣している。対照細胞は「固定」されているため、分析器を通過するときに溶解環境の影響はそれほど受けず、その結果、所望の特性を保持する。さらに、固定した細胞は対照溶液中で安定であるが、全血細胞は安定ではない。しかし、細胞の光散乱特性を主として決定する屈折率が実質的に同じとなるようにするには、検体中の血球が分析器中でおかれる溶解環境と同じまたは同様の環境に対照細胞をおく必要があると考えられている。このように、対照細胞はその機器によって「機器で溶解した」検体の細胞とみなされ、そのように記録される。
【００４５】
また、本発明の同じ細胞成分は、溶解環境におかれる前に「固定する」と、多角度光散乱に基づくシステムで満足に機能しないことも判明した。これらの細胞は「固定する」前に、溶解環境におく必要がある。その後、これらの細胞が分析中で対照細胞として処理されると、これらの処理された細胞は分析器によって検体の血球と「みなされる」。これは、多パラメータ光散乱に基づく分析器が、分析器の内部処理環境で全血細胞を認識するようにしかプログラムされていないためである。従って、基準の対照細胞または細胞成分が適当な細胞特性を保持しており、その結果、全血と実質的に同様に反応または行動（光および／または蛍光を散乱）しない限り、分析器によって異なる細胞であるまたは完全に認識できないと「みなされる」。
【００４６】
従って、本発明の主な方法では、基準対照を製造するプロセス中の「固定」の前に、細胞または細胞成分を、基準対照として使用されるときに分析器内で遭遇するであろう溶解環境におく。
【００４７】
以下の実施例では、次の試薬処方を使用した。
（実施例）
【００４８】
溶解試薬：
約０．７５Ｍ〜約１．１０Ｍの塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）
約０．１Ｍ〜約０．４Ｍのホルムアルデヒド（ＨＣＨＯ）
約１０ｍＭ〜約２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）
約１０ｍＭ〜約２５ｍＭの重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）
約５０ｍｇ／Ｌ〜約２５０ｍｇ／Ｌのサポニン
約０．２ｇ／Ｌ〜約０．４ｇ／ＬのＰｒｏｃｌｉｎ  ３００
ＷＢＣ−Ｃｙｔｏ−Ｌｙｓｅ：
約２．５ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌのマレイン酸、コハク酸またはフタル酸
約１０．０ｇ／Ｌから約３０．０ｇ／ＬのＢｒｉｊ  ３５、Ｔｗｅｅｎ  ２０またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
固定液：
約３．０ｇ／Ｌから約５．０ｇ／Ｌのリン酸一ナトリウム
約６．０ｇ／Ｌから約７．０ｇ／Ｌのリン酸二ナトリウム
約１００ｍｌ／Ｌから約２００ｍｌ／Ｌのホルマリン（３７〜４０％のホルムアルデヒド溶液）
第２ａ図〜第２ｃ図および第３ａ図〜第３ｃ図は各々、ＮＲＢＣ
を１．７８ｋ／ｍＬおよび４０．４ｋ／ｍＬ含む臨床血液試料についてＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ４０００多パラメータ光散乱に基づくシステムで得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣ分布のサイトグラムである。これらの図面は、本明細書の図面中に記載され、示された種々の方法で製造される対照または細胞との比較の目的で示している。
【００４９】
本発明の鳥類、魚類および哺乳類の固定したＷＢＣおよび細胞の核は挿入物のため、任意の緩衝食塩水に再懸濁でき、緩衝食塩水はクランピングを防止するなんらかのタンパク質を含んでいてもよい。しかし、これらの固定した細胞は、全域対応型対照血液を製造するためには、固定していないが、安定化したＲＢＣと合わせる必要があり、細胞再懸濁媒質は安定化したＲＢＣを溶解から保護できなければならない。下記の処方は、本発明の対照細胞と共に良好に使用できることが判っている再懸濁用媒質の例である。この処方は、固定したＷＢＣおよび核のクランピングを防ぎ、対照溶液中のＲＢＣ成分を溶解から保護する血漿様細胞再懸濁液である。
【００５０】
【表２】
0004686506.tif 000003
【００５１】
本発明方法で製造した血液学的対照を、多次元光散乱、軸方向の光の消失および蛍光によりＷＢＣ／Ｄｉｆｆ／ＮＲＢＣを分析するＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ４０００血液測定機器で使用すると、試薬と共にシステムの性能を毎日モニターできる。Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ４０００システムでこの製品を使用して結果の質をモニターできるパラメータは以下の通りである。
【００５２】
【表３】
0004686506.tif 000004
【実施例１】
【００５３】
この実施例では、上記の溶解試薬および固定液を使用する。以下の手順で、安定で、クランプを含まない、固定したヒトＷＢＣを調製する。この実施例の固定したヒトＷＢＣについてＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ４０００血液測定機器で得られたＷＢＣのサイトグラムの例を第７ａ図〜第７ｃ図に示す。
１．ヒトのバフィコート層１部を（予め４２℃に温めた）溶解試薬５部と混合した。直ちに、緩和に渦状に回転させて、成分を混合し、室温に５０秒間放置して、ＲＢＣを完全に溶解させた。
２．ステップ１で溶解したＷＢＣ懸濁液１部を固定液１０部と混合し、直ちに６０℃〜７０℃の水浴に入れ、ゆっくりと混合することにより１０分間固定させた。
３．固定した細胞の懸濁液を室温に冷却し、１０℃で、２，５００ｒｐｍで５分間遠心して、固定液を除去し、中性ｐＨの等張リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用して、同じ遠心速度で３回洗浄した後、ＣＲＳＭに再懸濁させた。
４．最終生成物のアリコートをＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ４０００血液学的測定機器にかけて、ＷＢＣ数および分布を調べた。
５．固定した細胞の濃度を、正常レベルの対照については、最終濃度が再懸濁用媒質中約７，５００／μＬとなるよう調整した。
【実施例２】
【００５４】
実施例１に使用したものと同じ溶解試薬および固定試薬を使用したが、ＲＢＣの溶解およびＷＢＣの固定を下記プロトコールに従って実施した。
１．ヒトのバフィコート層１部を溶解試薬溶液５部と共に緩和に渦状に回転させて、直ちに混合させ、室温に１０分間放置して、ＲＢＣを完全に溶解させた。
２．ステップ１で溶解したＷＢＣ懸濁液１部を固定液１０部と合わせ、混合し、室温で２〜３時間固定した。
３．固定した細胞の懸濁液を１０℃、２，５００ｒｐｍで５分間遠心して、固定剤を除去し、中性ｐＨのリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用して、同じ遠心速度で３回洗浄し、ＣＲＳＭに再懸濁した。
４．最終生成物のアリコートをＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ４０００血液測定機器にかけて、ＷＢＣ数および分布を調べた。
５．固定した細胞の濃度を、低濃度の対照については、最終濃度が約２，０００／μＬとなるように調整した。
【実施例３】
【００５５】
次のプロトコールおよびＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ４０００血液測定機器の例示に従ってシチメンチョウの赤血球からＮＲＢＣ画分を調製した。固定したシチメンチョウの赤血球の核および固定したシチメンチョウの赤血球の核でスパイクした正常ヒトのＮＲＢＣサイトグラムを各々第１２ａ図〜第１２ｅ図および第１３ａ図〜第１３ｃ図に示す。
Ａ．材料：
１．シチメンチョウ全血
２．溶解試薬：実施例１に記載の通り
３．固定液：ｗ／デキストロース：リン酸一ナトリウム  ４グラム／Ｌ、リン酸二ナトリウム  ６．５グラム／Ｌ、ホルマリン  １５０ｍｌ／Ｌ、デキストロース  １００ｇ／Ｌ、ｐＨ約６．８
４．細胞洗浄液：リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）
５．ＣＲＳＭ：上記と同じＣＲＳＭ
Ｂ．シチメンチョウ赤血球核固定用プロトコール：
１．溶解試薬のアリコート１０ｍｌを３７℃まで加温する。
２．シチメンチョウ全血を３０００ｒｐｍで１０分間遠心して、血漿層を分離し、バフィコート層を除去する。濃縮赤血球層に血漿を戻し、混合する。
３．予熱した溶解試薬溶液にＲＢＣ層１．０ｍｌを加え、蓋をして、直ちに３回上下混合する。全速で約１０秒間渦状に回転させ、ＲＢＣの細胞質の溶解を促進する。約１０分間または細胞質の溶解が完了するまで室温に放置する。細胞質が完全に溶解していることを顕微鏡下で確認する。
４．２０００ｒｐｍで１５分間遠心し、細胞ペレットを再懸濁するのに調度十分な量を残して、上清をすべてサイホンで除去する。細胞のクランプが見えなくなるまで緩和に攪拌して細胞を再懸濁する。
５．ステップ４と同じ遠心条件でＰＢＳを使用して、細胞を３回洗う。
６．固定液１０ｍｌを加え、混合し、直ちに６０℃の水浴に入れ、細胞のクランピングを防ぐために撹拌を続けながら、少なくとも５分間固定させる。
７．細胞懸濁液を室温に３０分または一晩放置する。
８．混合し、ステップ４および５を２回繰り返す。
９．固定した核をＣＲＳＭに再懸濁する。
１０．Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ４０００血液測定機器にかけて、ＦＬ３＋の核の濃度とクラスタの位置を測定する。
【実施例４】
【００５６】
実施例３に記載したものと同じ試薬およびプロトコールを使用して、マスの赤血球からＮＲＢＣ画分を調製した。固定したマスの赤血球の核および固定したマスの赤血球の核でスパイクした正常な全血をＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ４０００血液測定機器にかけて得られたＮＲＢＣサイトグラムの例を第８ａ図〜第８ｃ図および第９ａ図〜第９ｃ図に示す。
【実施例５】
【００５７】
下記の材料および方法によりブタのリンパ球からＮＲＢＣ画分を調製し、固定したブタのリンパ球の核をＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ４０００血液測定機器にかけて得られたＮＲＢＣサイトグラムの例を第１４ａ図〜第１４ｃ図に示す。
Ａ．材料：
ブタのバフィコート層（血小板を既に除去したもの）
Ｃｙｔｏ−Ｌｙｓｅ：
Ｂｒｉｊ  ３５：１５．０ｇ／Ｌ
フタル酸：５．５ｇ／Ｌ
溶解試薬：実施例１と同様
固定液：実施例１と同様
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）
Ｂ．手順：
１．ブタのリンパ球高含有層１部を溶解試薬５部で希釈し、室温に５分間放置して、細胞懸濁液に残っているＲＢＣの溶解を完了させる。
２．細胞懸濁液を３０００ｒｐｍで３回遠心し、上清を注ぎ出し、細胞ペレットを取り出す。
３．この細胞をＣｙｔｏ−Ｌｙｓｅと１対１０の比で混合し、室温に２時間放置する。
４．核をＣｙｔｏ−Ｌｙｓｅに再懸濁し、３０００ｒｐｍで３分間回転させ、上清を注ぎ出す。
５．核を少なくとも２倍容の固定剤に再懸濁し、混合する。
６．６０℃で１０分間（または室温で４時間）固定し、室温に冷却する。
７．核を３０００ｒｐｍで３分間回転させ、上清を注ぎ出す。
８．細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁し、核を３回洗浄する。
９．核をＣＲＳＭに再懸濁する。
【実施例６】
【００５８】
ウシのＷＢＣを実施例１に記載のプロトコールで固定し、実施例４に記載の手順に従って調製した固定したブタの核と混合する。固定したウシのＷＢＣのみおよびブタのリンパ球核と混合した固定したウシのＷＢＣについてＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ４０００血液測定機器で得られたＷＢＣチャネルサイトグラムの例を第１５ａ図〜第１５ｃ図および第１６ａ図〜第１６ｆ図に示す。
【実施例７】
【００５９】
実施例３に記載のプロトコールに従ってニワトリの赤血球からＮＲＢＣ画分を調製し、固定したニワトリの赤血球核および固定したニワトリの赤血球核でスパイクした正常なヒトの全血についてＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ４０００血液測定機器で得られたＮＲＢＣサイトグラムの例を第１０ａ図〜第１０ｃ図および第１１ａ図〜第１１ｃ図に示す。
【００６０】
本発明の方法で製造した対照血液は、Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ３０００または３５００血液測定機器にかけて次のパラメータをモニターするのに使用できる。上記機器は光散乱およびインピーダンス信号の両者を使用して、次のＷＢＣ／Ｄｉｆｆパラメータを追跡できる。
【００６１】
【表４】
0004686506.tif 000005
【００６２】
第１７ａ図〜第１７ｄ図は、本発明方法で製造した、固定したウシＷＢＣについて、光散乱パラメータ（軸方向の光の消失または蛍光ではない）を使用してＷＢＣ／Ｄｉｆｆ分析を実施し、インピ−ダンスを使用してＲＢＣおよび血小板を測定するＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）  ３５００分析機器で得たＷＢＣサイトグラムである。この図では、ＷＢＣ画分と、固定した血小板および安定化したが固定していないＲＢＣとを合わせて、全域対応型対照懸濁液を製造した。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１ａ】多角度光散乱に基づく分析器で実施した正常血のＷＢＣサイトグラムである。
【図１ｂ】多角度光散乱に基づく分析器で実施した正常血のＷＢＣサイトグラムである。
【図１ｃ】多角度光散乱に基づく分析器で実施した正常血のＷＢＣサイトグラムである。
【図２ａ】１．７８ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床検体について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【図２ｂ】１．７８ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床検体について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【図２ｃ】１．７８ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床検体について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【図３ａ】４０．４Ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床検体について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【図３ｂ】４０．４Ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床検体について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【図３ｃ】４０．４Ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床検体について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【図４ａ】Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）  ４Ｃ（登録商標）  Ｐｌｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図４ｂ】Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）  ４Ｃ（登録商標）  Ｐｌｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図４ｃ】Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）  ４Ｃ（登録商標）  Ｐｌｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図５ａ】正常レベルのＳｔｒｅｃｋ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＰＡＲＡ  １２（登録商標）  Ｍｕｌｔｉ−Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図５ｂ】正常レベルのＳｔｒｅｃｋ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＰＡＲＡ  １２（登録商標）  Ｍｕｌｔｉ−Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図５ｃ】正常レベルのＳｔｒｅｃｋ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＰＡＲＡ  １２（登録商標）  Ｍｕｌｔｉ−Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図６ａ】Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍのＣＢＣ−３Ｋ（商標）  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図６ｂ】Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍのＣＢＣ−３Ｋ（商標）  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図６ｃ】Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍのＣＢＣ−３Ｋ（商標）  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図６ｄ】Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍのＣＢＣ−３Ｋ（商標）  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図７ａ】本発明の基準対照血液について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図７ｂ】本発明の基準対照血液について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図７ｃ】本発明の基準対照血液について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図８ａ】本発明方法で製造した固定したマスの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図８ｂ】本発明方法で製造した固定したマスの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図８ｃ】本発明方法で製造した固定したマスの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図９ａ】第８ａ図〜第８ｃ図の固定したマスの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図９ｂ】第８ａ図〜第８ｃ図の固定したマスの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図９ｃ】第８ａ図〜第８ｃ図の固定したマスの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１０ａ】本発明方法で製造した固定したニワトリの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１０ｂ】本発明方法で製造した固定したニワトリの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１０ｃ】本発明方法で製造した固定したニワトリの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１１ａ】第１０ａ図〜第１０ｃ図の固定したニワトリの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１１ｂ】第１０ａ図〜第１０ｃ図の固定したニワトリの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１１ｃ】第１０ａ図〜第１０ｃ図の固定したニワトリの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１２ａ】本発明方法で製造した固定したシチメンチョウの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１２ｂ】本発明方法で製造した固定したシチメンチョウの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１２ｃ】本発明方法で製造した固定したシチメンチョウの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１３ａ】第１２ａ図〜第１２ｃ図の固定したシチメンチョウの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１３ｂ】第１２ａ図〜第１２ｃ図の固定したシチメンチョウの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１３ｃ】第１２ａ図〜第１２ｃ図の固定したシチメンチョウの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１４ａ】本発明方法で製造した固定したブタのリンパ球の核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１４ｂ】本発明方法で製造した固定したブタのリンパ球の核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１４ｃ】本発明方法で製造した固定したブタのリンパ球の核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１５ａ】本発明方法で製造したウシのＷＢＣの核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１５ｂ】本発明方法で製造したウシのＷＢＣの核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１５ｃ】本発明方法で製造したウシのＷＢＣの核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１６ａ】すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１６ｂ】すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１６ｃ】すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１６ｄ】すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１６ｅ】すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１６ｆ】すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１７ａ】本発明方法で製造した固定したウシのＷＢＣについてインピーダンスと光散乱の両者を使用する分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１７ｂ】本発明方法で製造した固定したウシのＷＢＣについてインピーダンスと光散乱の両者を使用する分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１７ｃ】本発明方法で製造した固定したウシのＷＢＣについてインピーダンスと光散乱の両者を使用する分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１７ｄ】本発明方法で製造した固定したウシのＷＢＣについてインピーダンスと光散乱の両者を使用する分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１８ａ】対照細胞として固定したワニのＲＢＣを含有する対照細胞溶液について、多パラメータ光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１８ｂ】対照細胞として固定したワニのＲＢＣを含有する対照細胞溶液について、多パラメータ光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１８ｃ】対照細胞として固定したワニのＲＢＣを含有する対照細胞溶液について、多パラメータ光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１８ｄ】対照細胞として固定したワニのＲＢＣを含有する対照細胞溶液について、多パラメータ光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１ａ】
0004686506.tif 000006
【図１ｂ】
0004686506.tif 000007
【図１ｃ】
0004686506.tif 000008
【図２ａ】
0004686506.tif 000009
【図２ｂ】
0004686506.tif 000010
【図２ｃ】
0004686506.tif 000011
【図３ａ】
0004686506.tif 000012
【図３ｂ】
0004686506.tif 000013
【図３ｃ】
0004686506.tif 000014
【図４ａ】
0004686506.tif 000015
【図４ｂ】
0004686506.tif 000016
【図４ｃ】
0004686506.tif 000017
【図５ａ】
0004686506.tif 000018
【図５ｂ】
0004686506.tif 000019
【図５ｃ】
0004686506.tif 000020
【図６ａ】
0004686506.tif 000021
【図６ｂ】
0004686506.tif 000022
【図６ｃ】
0004686506.tif 000023
【図６ｄ】
0004686506.tif 000024
【図７ａ】
0004686506.tif 000025
【図７ｂ】
0004686506.tif 000026
【図７ｃ】
0004686506.tif 000027
【図８ａ】
0004686506.tif 000028
【図８ｂ】
0004686506.tif 000029
【図８ｃ】
0004686506.tif 000030
【図９ａ】
0004686506.tif 000031
【図９ｂ】
0004686506.tif 000032
【図９ｃ】
0004686506.tif 000033
【図１０ａ】
0004686506.tif 000034
【図１０ｂ】
0004686506.tif 000035
【図１０ｃ】
0004686506.tif 000036
【図１１ａ】
0004686506.tif 000037
【図１１ｂ】
0004686506.tif 000038
【図１１ｃ】
0004686506.tif 000039
【図１２ａ】
0004686506.tif 000040
【図１２ｂ】
0004686506.tif 000041
【図１２ｃ】
0004686506.tif 000042
【図１３ａ】
0004686506.tif 000043
【図１３ｂ】
0004686506.tif 000044
【図１３ｃ】
0004686506.tif 000045
【図１４ａ】
0004686506.tif 000046
【図１４ｂ】
0004686506.tif 000047
【図１４ｃ】
0004686506.tif 000048
【図１５ａ】
0004686506.tif 000049
【図１５ｂ】
0004686506.tif 000050
【図１５ｃ】
0004686506.tif 000051
【図１６ａ】
0004686506.tif 000052
【図１６ｂ】
0004686506.tif 000053
【図１６ｃ】
0004686506.tif 000054
【図１６ｄ】
0004686506.tif 000055
【図１６ｅ】
0004686506.tif 000056
【図１６ｆ】
0004686506.tif 000057
【図１７ａ】
0004686506.tif 000058
【図１７ｂ】
0004686506.tif 000059
【図１７ｃ】
0004686506.tif 000060
【図１７ｄ】
0004686506.tif 000061
【図１８ａ】
0004686506.tif 000062
【図１８ｂ】
0004686506.tif 000063
【図１８ｃ】
0004686506.tif 000064
【図１８ｄ】
0004686506.tif 000065