(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコールおよび／またはポリビニルピロリドンを含む支持体にポリアルキレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ジエチルアミノエチルデキストランおよびそれらに置換基の導入されたもの、およびこれらの構成するモノマー単位からなる共重合体から選ばれるカチオン性ポリマーが付着した状態で放射線照射することにより支持体にカチオン性ポリマーを固定化することを特徴とする過酸化脂質吸着材の製造方法。
【請求項２】
請求項１記載の支持体へのカチオン性ポリマーの付着した状態が支持体をカチオン性ポリマーの溶液に浸漬した状態であることを特徴とする過酸化脂質吸着材の製造方法。
【請求項３】
請求項１記載の支持体へのカチオン性ポリマーの付着した状態が支持体をカチオン性ポリマーの溶液に浸漬した後、溶液から抜き出し、該支持体を乾燥させず窒素中に封入した状態であることを特徴とする過酸化脂質吸着材の製造方法。
【請求項４】
請求項１記載の支持体へのカチオン性ポリマーの付着した状態が支持体をカチオン性ポリマーの溶液に浸漬した後、該支持体を水洗し、水に浸漬した状態であることを特徴とする過酸化脂質吸着材の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のカチオン性ポリマー溶液の濃度が０．０１ｗｔ％以上であることを特徴とする過酸化脂質吸着材の製造方法。
【請求項６】
支持体が中空糸膜であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の過酸化脂質吸着材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、過酸化脂質吸着材の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、心疾患をもつ患者や人工透析患者は動脈硬化を呈している場合が多く、血中の過酸化脂質濃度が増大している。
【０００３】
過酸化脂質の中でも、特に酸化低密度リポ蛋白（以下、ＬＤＬという）は様々な生物作用をもっており、内皮細胞から一酸化窒素（ＮＯ）産生を抑制するなどの作用以外にも、単球を内皮下に遊送、集積させ、そのものをマクロファージとさせ、酸化ＬＤＬそれ自身を取り込み泡沫細胞とさせ、動脈壁のプラーク形成を促進するほか、内皮細胞や平滑筋細胞傷害を促進するなど、動脈硬化の発症、進展に重要な役割を果たしている。従って、血中から過酸化脂質、特に酸化ＬＤＬを除去することが望まれている。これまで血中の過酸化脂質濃度を低下させる有効な手段はなかった。
【０００４】
また、高密度リポ蛋白質（以下ＨＤＬという）は動脈硬化防御因子としての機能を有するため、透析患者の血中のＨＤＬ濃度を下げてはいけない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、かかる従来技術の欠点を改良し、過酸化脂質を吸着除去できる吸着材の製造方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、支持体にカチオン性ポリマーが付着した状態で放射線照射することにより支持体にカチオン性ポリマーを固定化することを特徴とする過酸化脂質吸着材の製造方法により達成される。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の過酸化脂質吸着材は、支持体にカチオン性ポリマーが固定化されている。カチオン性ポリマーとしては、１級、２級、３級アミノ基、４級アンモニウム塩を有するアミノ基含有ポリマー、アジリジン（エチレンイミン）化合物を有するポリマー、キチン、キトサン、アクリルアミド系ポリマー、およびこれらの共重合体またはノニオン、アニオン性化合物との共重合体などが挙げられる。また、該ポリマーは直鎖状、分岐状、環状、いずれであってもよい。また、ここでポリマーとは、分子量６００以上の化合物のことをいう。
【０００８】
アミノ基含有ポリマーの例として、ポリアルキレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ジエチルアミノエチルデキストランおよびそれらに置換基の導入されたもの、およびこれらの構成するモノマー単位からなる共重合体などが挙げられる。
【０００９】
ポリエチレンイミン誘導体としては、ポリエチレンイミンをアルキル化、カルボキシル化、フェニル化、リン酸化、スルホン化など種々の割合で誘導体化したものが上げられる。
【００１０】
ポリエチレンイミンには、分子量６００以上の直鎖状、分岐状のものが用いられる。
【００１１】
カチオン性ポリマーの中でも毒性の低さ、入手のしやすさ、取り扱いのしやすさなどから分岐状のポリエチレンイミンが好適に用いられる。
【００１２】
本発明の過酸化脂質吸着材の製造方法は、支持体にカチオン性ポリマーが付着した状態で放射線照射することを特徴とする。具体的には、例えば支持体をカチオン性ポリマーの溶液に浸漬した状態で放射線照射する。あるいは、支持体をカチオン性ポリマーの溶液に浸漬した後、溶液から抜き出し、該支持体を乾燥させず窒素中に封入した状態で放射線照射してもよい。すなわち、湿潤状態、窒素雰囲気下で放射線照射する。あるいは、カチオン性ポリマーの溶液に浸漬した後、該支持体を水洗し、水に浸漬した状態で放射線照射してもよい。すなわち、カチオン性ポリマーを支持体に吸着させ、水に浸漬した状態で放射線照射する。カチオン性ポリマーの溶液に浸漬した状態で放射線照射すると、カチオン性ポリマーの固定化量を増やせる利点がある。カチオン性ポリマーの溶液に浸漬した後、溶液から抜き出し、支持体を乾燥させず窒素中に封入した状態で放射線照射する方法は、放射線照射後の洗浄が容易になる利点がある。カチオン性ポリマーの溶液に浸漬した後、支持体を水洗し、水に浸漬した状態で放射線照射する方法は、カチオン性ポリマーの支持体からの溶出がほとんどなくせるという利点がある。これらの方法は、カチオン性ポリマーの性能、安全性などの観点から適宜選択して用いることができる。
【００１３】
支持体にカチオン性ポリマーを付着させた状態で放射線照射することにより、支持体表面積１ｍ2あたりの血漿量が２．８×１０2ｍｌ／ｍ2である条件で吸着操作を施したときに、該血漿中に含まれている初期濃度２μｇ／ｍｌの酸化ＬＤＬの吸着除去率が５％以上を達成できることを見いだした。
【００１４】
支持体を浸漬するカチオン性ポリマー溶液の濃度は、カチオン性ポリマーの固定化量および酸化ＬＤＬの吸着除去率から０．０１ｗｔ％以上であることが望ましい。
【００１５】
支持体の形状は、平膜、中空糸膜、繊維状、粒状などどういう形状であってもよいが、中空糸膜であると、透析を行いながら酸化ＬＤＬの吸着除去ができるので好ましい。中空糸膜における膜厚は１０〜８０μｍが好ましく、２０〜６０μｍがより好ましい。また、膜の平均孔径については、１ｗｔ％アルブミン溶液におけるアルブミン透過率が０．５％以上であることが好ましく、１％以上がより好ましい。内径は１００〜８００μｍであることが好ましく、１５０〜３００μｍがより好ましい。また、中空糸膜は、人工腎臓としての機能を有することが好ましい。ここで、人工腎臓としての機能を有するというのは人工腎臓の機能分類でいうところのＩ型またはII型に属するものであることをいう（透析会誌、３２（１２）：１４６５〜１４６９，１９９９）。
【００１６】
本発明における支持体の素材としては、医療用に用いられている素材が好ましく、例えば、ポリ塩化ビニル、セルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタンなどが挙げられる。この中でも特にポリスルホンは成形が容易であるため、好適に用いられる。
【００１７】
本発明で用いられるポリスルホンは、主鎖に芳香環、スルフォニル基およびエーテル基をもつもので、例えば、次式（１）、（２）の化学式で示されるポリスルホンが好適に使用される。式中のｎは、５０〜８０の整数である。
【００１８】
【化１】
0004686836.tif 000002
【００１９】
ポリスルホンの具体例としては、”ユーデル”Ｐ−１７００、Ｐ−３５００（テイジンアモコ社製）、”ウルトラソン”Ｓ３０１０、Ｓ６０１０（ＢＡＳＦ社製）、”ビクトレックス”（住友化学）、”レーデル”Ａ（テイジンアモコ社製）、”ウルトラソン”Ｅ（ＢＡＳＦ社製）等のポリスルホンが挙げられる。また、本発明で用いられるポリスルホンは上記式（１）および／または（２）で表される繰り返し単位のみからなるポリマーが好適ではあるが、本発明の効果を妨げない範囲で他のモノマーと共重合していても良い。他の共重合モノマーは１０重量％以下であることが好ましい。
【００２０】
本発明においては、支持体の血液適合性を向上させるために、親水性高分子をブレンドすることが好ましい。親水性高分子としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン等が、血液適合性の点で好ましい。また、親水性高分子については、カチオン性ポリマーと放射線架橋できるものであるとより好ましい。ポリスルホンとの相溶性からポリビニルピロリドンが特に好ましい。
【００２１】
ポリビニルピロリドンは、支持体となる支持体と積層されていても良いが、混合ないしは相溶されている方が好ましい。
【００２２】
ポリビニルピロリドンとしては、市販されている重量平均分子量３６万、１６万、４万、１万のものが好適に用いられるが、もちろんそれ以外の分子量のものを使用してもかまわない。ポリビニルピロリドンの重量平均分子量は２０００〜２００００００が好ましく、１００００〜１５０００００がより好ましい。なお、前記分子量は原料段階での分子量であり、最終製品においては、放射線架橋などにより分子量は前記値より遙かに大きなものとなっている場合もある。また、本発明で用いられるポリビニルピロリドンは、支持体とブレンドして用いる場合、ホモポリマーが好適ではあるが、本発明の効果を妨げない範囲で他のモノマーと共重合していても良い。他の共重合モノマーは１０重量％以下であることが好ましい。
【００２３】
なお、前記以外のポリマーなどが、本発明の効果を妨げない範囲で混合されていても良いが、そのようなその他の素材は、支持体全重量中、１０重量％以下であることが好ましい。
【００２４】
本発明における支持体の製法の一例として次のような方法がある。
【００２５】
ポリスルホンとポリビニルピロリドン（重量比率２０：１〜１：５が好ましく、５：１〜１：１がより好ましい）を良溶媒（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジオキサンなどが好ましい）または良溶媒を含む混合溶液に溶解させた原液（濃度は、１０〜３０重量％が好ましく、１５〜２５重量％がより好ましい）を二重環状口金から吐出する際に内側に注入液を流し、乾式部を走行させた後凝固浴へ導き、中空糸膜型の支持体を得る。この際、乾式部の湿度が影響を与えるために、乾式部走行中に膜外表面からの水分補給によって、外表面近傍での相分離挙動を速め、孔径拡大し、結果として透析の際の透過・拡散抵抗を減らすことも可能である。ただし、相対湿度が高すぎると外表面での原液凝固が支配的になり、かえって孔径が小さくなり、結果として透析の際の透過・拡散抵抗を増大する傾向がある。そのため、相対湿度としては６０〜９０％が好適である。また、注入液組成としてはプロセス適性から原液に用いた溶媒を基本とする組成からなるものを用いることが好ましい。注入液濃度としては、例えばジメチルアセトアミドを用いたときは、４５〜８０重量％、さらには６０〜７５重量％の水溶液が好適に用いられる。
【００２６】
以下、本発明の過酸化脂質吸着材の性能測定条件を記載する。
（１）抗酸化ＬＤＬ抗体の作製
板部らが作製したものを用いた（Ｈ．Ｉｔａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５２７４、１９９４）。すなわち、ヒト粥状硬化病巣ホモジェネートをマウスに注射して免疫、そのマウスの脾臓からハイブリドーマを作製し、硫酸銅処理ＬＤＬと反応するものを選別した。抗体クラスは、マウスＩｇＭで、未処理ＬＤＬ、アセチルＬＤＬ、マロンジアルデヒドＬＤＬとは反応しない。フォスファチジルコリンのアルデヒド誘導体やヒドロペルオキシドを含めていくつかのフォスファチジルコリン過酸化反応生成物と反応する。１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解したものを用いた（蛋白濃度０．６０ｍｇ／ｍｌ）。
（２）酸化ＬＤＬの調製
市販のＬＤＬ（フナコシ製）を脱塩した後、０．２ｍｇ／ｍｌとなるようにリン酸緩衝液（以下ＰＢＳという）で希釈後、０．５ｍＭ硫酸銅水溶液を１ｗｔ％添加し、３７℃で１６時間反応させた。２５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（以下ＥＤＴＡという）を１ｗｔ％、１０ｗｔ％アジ化ナトリウムを０．０２ｗｔ％となるように添加したものを酸化ＬＤＬ標品とした。
（３）吸着操作
健常者血漿（日本人、３０歳）に上記酸化ＬＤＬを２μｇ／ｍｌとなるように添加した。
【００２７】
内径２００μｍ、膜厚４０μｍの中空糸膜から、長さ１２ｃｍ、本数７０本のミニモジュール（内表面積５３ｃｍ2）を作成し、内径７ｍｍ（外径１０ｍｍ）、長さ２ｃｍのシリコーンチューブ（製品名ＡＲＡＭ）と異形コネクターを介して、内径０．８ｍｍ（外径１ｍｍ）のシリコーンチューブ（製品名ＡＲＡＭ、３７ｃｍのものを両端に２本）でつなぎ、上記血漿１．５ｍｌを０．５ｍｌ／分の流量で２５℃、４時間中空糸内に灌流した（中空糸膜内表面積１ｍ2あたりの血漿量は２．８×１０2ｍｌ／ｍ2）。
【００２８】
さらにミニモジュールをつけずにシリコーンチューブのみで灌流操作も行った。
【００２９】
灌流前後の血漿中の酸化ＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ濃度を定量することにより、それぞれの吸着除去率を下記式により算出した。
【００３０】
吸着除去率（％）＝ミニモジュールでの吸着除去率（％）−シリコーンチューブのみでの吸着除去率（％）
それぞれの吸着除去率（％）＝１００×（灌流前の濃度−灌流後の濃度）／灌流前の濃度
（４）酸化ＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ濃度の測定
抗酸化ＬＤＬ抗体をＰＢＳで５μｇ／ｍｌに希釈し、９６穴のプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で２時間震盪した後、４℃にて一晩以上壁に吸着させた。
【００３１】
ウェル中の抗体溶液を捨て、１ｗｔ％Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｍｉｎ（ＢＳＡ、”フラクションＶ”、生化学工業）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を２００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で２時間震盪して壁をブロッキングした後、ウェル中のＢＳＡ溶液を捨て、酸化ＬＤＬを含んだ血漿および検量線作成用のスタンダード（０〜２μｇ／ｍｌの酸化ＬＤＬを含むＰＢＳ緩衝液）を１００μｌ／ウェルずつ分注した。その後、室温で３０分震盪した後、４℃で一晩放置した。
【００３２】
室温に戻し、ウェル中の溶液を捨て、０．０５ｗｔ％”トゥイーン−２０”（片山化学）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でウェルを３回洗浄した。洗浄したウェルにＰＢＳで２０００倍に希釈したヒツジ抗アポＢ抗体（ＴＨＥ  ＢＩＮＤＩＮＧ  ＳＩＴＥ）を１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で２時間震盪した後、ウェル中の抗アポＢ抗体を捨て、０．０５ｗｔ％”トゥイーン−２０”を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でウェルを３回洗浄した。洗浄したウェルに２ｗｔ％”ブロックエース”（大日本製薬）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２０００倍に希釈したアルカリ性フォスファターゼ標識ロバ抗ヒツジＩｇＧ抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）を１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で２時間震盪した。その後、ウェル中の標識抗体を捨て、０．０５ｗｔ％”トゥイーン−２０”を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でウェルを３回洗浄し、さらにトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。続いて、ｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ）の１ｍｇ／ｍｌ溶液（０．０００５Ｍ  ＭｇＣｌ2、１Ｍジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８）を１００μｌ／ウェルずつ分注し、適当な時間室温で反応させた後、４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。スタンダードの結果から検量線を引き、酸化ＬＤＬ濃度を決定した。
【００３３】
ＬＤＬの定量はβ−リポ測定キット（和光純薬）を用いて行った。
【００３４】
ＨＤＬの定量はＨＤＬ−Ｃ測定キット（和光純薬）を用いて行った。
【００３５】
【実施例】
実施例１
ポリスルホン（テイジンアモコ社製”ユーデル”Ｐ−３５００）１８重量部、ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製Ｋ３０）９重量部をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド７２重量部、水１重量部に加え、９０℃１４時間加熱溶解した。この製膜原液を外径０．３ｍｍ、内径０．２ｍｍのオリフィス型二重円筒型口金より吐出し、芯液としてジメチルアセトアミド５８重量部、水４２重量部からなる溶液を吐出させ、乾式長３５０ｍｍを通過した後、水１００％の凝固浴に導き中空糸を得た。
【００３６】
得られたポリスルホン中空糸分離膜を７０本束ね、中空糸中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をガラス管モジュールケースに固定し、ミニモジュールを作成し、１ｗｔ％のポリエチレンイミン（分子量１万、和光純薬製）水溶液を充填して、２５ｋＧｙにてγ線照射した。該ミニモジュールの直径は約７ｍｍ、長さは１２ｃｍであった。放射線処理した膜は、再度蒸留水で３７℃で３０分間洗浄した後、吸着実験に供した。
【００３７】
実験結果は、表１に示した。
【００３８】
比較例１
実施例１と同様にしてミニモジュールを作成し、１ｗｔ％のポリエチレンイミン水溶液の代わりに水を充填して、２５ｋＧｙにてγ線照射したものを作成した。
【００３９】
実施例２
実施例１と同様にしてミニモジュールを作成し、１ｗｔ％のポリエチレンイミン水溶液を充填した後、水溶液を抜き出し、窒素ガスを容器内に充填し、素材は濡れた状態で、２５ｋＧｙにてγ線照射したものを作成した。
【００４０】
実施例３
実施例１と同様にしてミニモジュールを作成し、１ｗｔ％のポリエチレンイミン水溶液を充填した後、水溶液を抜き出し、素材を水洗した後、水を充填し、ポリエチレンイミンを素材に吸着させた状態で、２５ｋＧｙにてγ線照射したものを作成した。
【００４１】
実施例１〜３および比較例における酸化ＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬの吸着除去率の結果を表１に示した。
【００４２】
【表１】
0004686836.tif 000003
【００４３】
【発明の効果】
本発明により、血液浄化器などの用途に用いられ、特に心疾患患者や透析患者において動脈硬化の進展を予防したり、その発症を未然に防ぐような場合に好適に用いられる過酸化脂質吸着材を提供することができる。