(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エシェリヒア・コリの野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１５位〜１９位のアミノ酸配列が配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列で置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素。
【請求項２】
エシェリヒア・コリの野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１５位〜１９位のアミノ酸配列が配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列で置換され、さらに、１５位〜１９位以外の位置において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の変異型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡで形質転換され、かつ、Ｌ−アルギニン生産能を有するエシェリヒア属細菌。
【請求項５】
請求項４記載のエシェリヒア属細菌を培地で培養し、Ｌ−アルギニンを培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−アルギニンを採取することを特徴とするＬ−アルギニンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物工業に関し、Ｌ−アルギニンの製造法及びエシェリヒア・コリのアルギニン生産菌のアルギニン生合成系における新規なフィードバック阻害型変異酵素の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エシェリヒア・コリ細胞におけるグルタミン酸からアルギニンへの生合成は、Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素（以下、「NAGS」ともいう）によるグルタミン酸のアセチル化に始まる連続反応によって行われる。このプロセスは、アルギニンによる、レギュロンの転写抑制及びNAGSのフィードバック阻害を介して調節されている（Cunin R., et al., Microbiol. Rev., 50, 314-352, 1986）。アルギニンは、argAの発現を２５０倍以上抑制し、NAGS活性を阻害する（Ki=0.02 mM）（Leisinger T., Haas D., J. Biol. Chem., 250, 1690-1693, 1975）。エシェリヒア・コリにおいてアルギニン生合成を増強するためには、フィードバック阻害に対して耐性（fbr）なNAGS酵素が必要である。
【０００３】
フィードバック耐性変異酵素は、自然突然変異により、又は化学的もしくは部位特異的変異により取得され得る。
いくつかのargAのfbr変異が単離され、研究されている。セラチア・マルセッセンスは、染色体上にargAのfbr変異を持つと細胞は不安定となり、活性の減少又はグルタミン酸に対する親和性の変化を伴うargA変異が生じる（Takagi T, et al., J. Biochem., 99, 357-364, 1986）。
【０００４】
fbrのNAGSを持つ５株のエシェリヒア・コリ由来のfbr argA遺伝子がクローニングされ、各々のfbr NAGS株においてargA遺伝子中に別々の一塩基置換が見出され、１５位のHisからtyr、１９位のTyrからCys、５４位のSerからAsn、５８位のArgからHis、２８７位のGlyからSer、及び、４３２位のGlnからArgへの置換が明らかになっている（Rajagopal, B.S. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1998, v.64. No.5, p.1805-1811）。
【０００５】
酵素のfbr形質は、大抵の場合、１又は数個の位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸による置換の結果として生じる。これらの置換は、酵素活性の低下につながる。例えば、エシェリヒア・コリのセリンアセチルトランスフェラーゼ（SAT）（cysE遺伝子）における２５６位の天然Metが他のアミノ酸残基によって置換されると、多くの場合fbr形質になるが、変異SATタンパク質は天然SATの活性のレベルには維持されない（Nakamuri S. et al., AEM, 64(5):1607-11, 1998）。このように、これらの方法によって得られる変異酵素の不利な点は、変異酵素は野生型酵素に比べて活性が低いことである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、エシェリヒア・コリのアルギニン生合成において、重要な役割を果たす酵素について、フィードバック阻害に耐性な変異を有し、かつ、高い活性を有する酵素を提供することを、課題の一つとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明においては、argA遺伝子断片の完全無作為化による、多数組の変異型argA遺伝子の新規な合成法が提案される。タンパク質配列のうちfbr変異を局在化し得る断片において、いくつかのアミノ酸を同時置換することによって、酵素の三次元構造がより正しく維持されることにより天然体に近い活性のレベルを維持した変異型タンパク質を取得することができる。
【０００８】
かくして、以下に示す本発明がなされるに至った。、
（１）野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素の１５位〜１９位に相当するアミノ酸配列が配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列で置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素。
（２）野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素がエシェリヒア・コリのＮ−アセチルグルタミン酸合成酵素である（１）の変異型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素。
（３）１５位〜１９位以外の１又は複数の位置において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含み、かつ、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された（１）又は（２）の変異型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素。
（４）（１）〜（３）のいずれかの変異型Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素をコードするＤＮＡ。
（５）（４）のＤＮＡで形質転換され、かつ、Ｌ−アルギニン生産能を有するエシェリヒア属細菌。
（６）（５）のエシェリヒア属細菌を培地で培養し、Ｌ−アルギニンを培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−アルギニンを採取することを特徴とするＬ−アルギニンの製造法。
【０００９】
本明細書において、上記のようなfbr変異を有するNAGSを変異型NAGS、変異型NAGSをコードするＤＮＡを変異型argA遺伝子ということがある。また、前記変異を有しないNAGSを野生型NAGSということがある。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
＜１＞変異型NAGS及び変異型argA遺伝子
本発明の変異型NAGS及びそれをコードする変異型argA遺伝子は、無作為化断片による突然変異誘発によって取得された。argA遺伝子における多数の変異を得るため、タンパク質配列の１５位から１９位のアミノ酸残基の領域をコードするargA遺伝子の１５ヌクレオチドからなる断片の完全無作為化を行った。完全無作為化された１５ヌクレオチドの断片は、415すなわち約1019の異なるDNA配列を生じさせ、これらは５merのペプチドにおいて205の異なるアミノ酸残基をコードすることができる。これらの配列においてストップコドンがフレームに入らない確率は、約0.955すなわち78％に相当する。したがって、１５位から１９位のアミノ酸残基のペプチドをコードするargA遺伝子断片の完全無作為化は、NAGS構造におけるこのペプチドの多様性を有するおよそ250万の異なるタンパク質配列を生じさせるはずである。
【００１２】
続いて、発現ベクターにクローニングされた変異型argA遺伝子を保持する組換え株に選択及びスクリーニングを行うことによって、抑制解除された野生型NAGSの活性レベルに至るまでの種々のレベルの生理活性を有するfbr変異体を選択することに成功した。その際、argD-、かつ、proB-又はproA-の菌株は、培地中に過剰のＬ−アルギニンが存在するとNAGSが阻害されてＬ−プロリンが合成できず生育できないが、fbrのNAGSを保持している場合は最少培地で生育できるので、変異型argA保持株を選択することができると考えた。しかし、後記実施例に示すように、この方法では活性の高いfbr NAGSを得ることが難しく、変異型argA遺伝子を野生株に導入し、生育の遅い株を選択することによって、活性の高いfbr NAGSが得られることを見い出した。
【００１３】
本発明により、fbr形質のNAGSとして適した変異型NAGSの配列が明らかとなったので、変異型NAGS及びそれをコードする変異型argA遺伝子は、それらの配列に基づいて、野生型argA遺伝子に通常の方法にしたがって変異を導入することによって調製することができる。野生型argA遺伝子としては、エシェリヒア・コリのargA遺伝子（GenBank Accession Y00492）が挙げられる。エシェリヒア・コリのargA遺伝子は、公知の塩基配列に基づいて調製したプライマーを用いたＰＣＲにより、エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡから増幅することによって取得することができる。
【００１４】
本発明の変異型NAGSの１５位から１９位のアミノ酸配列は、配列番号１〜４のいずれかである。尚、エシェリヒア・コリの公知の変異型NAGS（１９位のTyrのCysへの置換）及び野生型NAGSの相当するアミノ酸配列を配列番号５、６に示す。また、各々のアミノ酸配列をコードする塩基配列の例を配列番号７〜１２に示す。これらの配列を表１に示す。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
また、本発明の変異型NAGSは、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除され、NAGS活性、すなわち、Ｌ−グルタミン酸をアセチル化してＮ−アセチルグルタミン酸を生成する反応を触媒する活性を有する限り、１５位〜１９位以外の１又は複数の位置において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含んでいてもよい。
【００１７】
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なる。それは、アミノ酸によっては、類縁性の高いアミノ酸が存在し、そのようなアミノ酸の違いが、タンパク質の立体構造に大きな影響を与えないことに由来する。従って、NAGSを構成するアミノ酸配列全体に対し、３０〜５０％以上、好ましくは５０〜７０％以上、より好ましくは８０％以上の相同性を有し、fbr形質のNAGS活性を有するものであってもよい。
【００１８】
尚、本発明において、１５位〜１９位に相当するアミノ酸配列とは、エシェリヒア・コリの野生型NAGSのアミノ酸配列における１５位〜１９位のアミノ酸配列に相当する配列をいう。上記のような活性に影響を与えないアミノ酸の欠失、挿入又は付加によってアミノ酸残基の位置が前後することがある。例えば、Ｎ末端部に１つのアミノ酸残基が挿入されれば本来１５位のアミノ酸残基は１６位となるが、そのような１５位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を、本発明においては１５位のアミノ酸残基と呼ぶこととする。
【００１９】
上記のような変異型NAGSと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、変異型argA遺伝子を含むＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び変異型argA遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００２０】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入又は付加等には、NAGSを保持する微生物の属、種、又は菌株の個体差に基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれる。
【００２１】
上記のような変異を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物のNAGS活性を調べることにより、変異型NAGSと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
【００２２】
また、変異型NAGSを保持する細胞を変異処理し、同細胞から公知のargA遺伝子配列を有するＤＮＡ又は同遺伝子配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、NAGS活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、変異型NAGSと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
【００２３】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、好ましくは６５℃で、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２４】
このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性が低下又は消失したものも含まれるが、それらについては、市販の発現ベクターにつなぎNAGS活性を調べることによって容易に取り除くことができる。
【００２５】
＜２＞本発明のエシェリヒア属細菌
本発明のエシェリヒア属細菌は、上記の変異型argA遺伝子が導入されたエシェリヒア属細菌である。エシェリヒア属細菌として具体的には、エシェリヒア・コリが挙げられる。変異型argA遺伝子は、同遺伝子を含むＤＮＡ断片をエシェリヒア属細菌中で機能するベクターに連結して得られる組換えＤＮＡを用いてエシェリヒア属細菌を形質転換することによって、導入することができる。また、染色体ＤＮＡ上のargA遺伝子を変異型argAに置き換えることによっても、変異型argA遺伝子を導入することができる。
【００２６】
argA遺伝子の導入に用いるベクターとしては、pBR322、pMW118、pUC19等のプラスミドベクター、λ1059、λBF101、M13mp9等のファージベクター、Mu、Tn10、Tn5等のトランスポゾン等が挙げられる。
【００２７】
エシェリヒア属細菌へのＤＮＡの導入は、D.A.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等により行うことができる。
【００２８】
Ｌ−アルギニン生産能を有するエシェリヒア属細菌において、上記のようにして変異型argA遺伝子を導入すると、Ｌ−アルギニンの生産量を増大させることができる。また、変異型argA遺伝子を保持するエシェリヒア属細菌に、Ｌ−アルギニン生産能を付与してもよい。
【００２９】
Ｌ−アルギニン生産能を有するエシェリヒア・コリとしては、エシェリヒア・コリ237株（VKPM B-7925）が挙げられる。同株は、2000年４月10日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）にVKPM B-7925の番号で寄託され、2001年５月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。
【００３０】
＜３＞Ｌ−アルギニンの製造法
上記のようにして、変異型argA遺伝子が導入され、Ｌ−アルギニン生産能を有するエシェリヒア属細菌を好適な培地で培養し、該培地中にＬ−アルギニンを生産蓄積せしめ、該培地からＬ−アルギニンを採取することにより、Ｌ−アルギニンを効率よく製造することができる。
【００３１】
本発明の製造法におけるエシェリヒア属細菌の培養および培養液からのＬ−アルギニンの採取、精製等は、従来の微生物を用いた発酵法によるＬ−アルギニンの製造法と同様にして行えばよい。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物を含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でもよい。炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸があげられる。また使用する微生物の資化性によってはエタノールやグリセロール等のアルコールを用いることが出来る。窒素源としては、アンモニアや、硫酸アンモニウム等の各種のアンモニウム塩類や、アミン類その他の窒素化合物や、ペプトン、大豆加水分解物、発酵菌体分解物等の天然窒素源を用いることが出来る。無機物としては、燐酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００３２】
培養は、振盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましく、培養温度は２０〜４０℃で、好ましくは３０〜３８℃の範囲で行う。培地のｐＨは通常５〜９の範囲であり、６．５〜７．２の範囲が好ましい。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによって調整することができる。通常、１〜３日の培養によって、培養液中にＬ−アルギニンが蓄積する。
【００３３】
培養終了後、培養液から菌体などの固形物を遠心分離や膜分離法で除去し、イオン交換法、濃縮法、晶析法等によってＬ−アルギニンを採取、精製することが出来る。
【００３４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３５】
【実施例１】
＜１＞無作為化断片による突然変異誘発
野生型argA遺伝子を有するBamHI-SalI染色体ＤＮＡ断片（2.02 kbp）をプラスミドpUC19にクローニングし、プラスミドpUC19-ArgAを得た。PCR増幅に用いたPyrobestTM DNA ポリメラーゼは、宝酒造株式会社（日本）から入手し、同社が推奨する条件下で使用した。
【００３６】
変異argA遺伝子のプールを作製するため、第１段階として、NAGSの２０位から末端までの配列をコードするargA遺伝子の断片を増幅した（図１）。プラスミドpUC19-ArgAを鋳型として用い、センスプライマーP1:5'-CGAGGGATTCCGNNNNNNNNNNNNNNATCAATACCCACCGGG-3'（配列番号１３）は、argAの塩基配列に基づいて設計し、標準M13リバースプライマーは、アンチセンスプライマーP2として用いた。プライマーP1の固定された１６ヌクレオチドの３’末端配列は、argA遺伝子のTyr-19コドンから下流配列と相同であり、固定された１３ヌクレオチドの５’末端配列は、His-15コドンの上流配列と相同である。argA配列に対するP1の３’末端部分の相同性は、1.75kbpのＤＮＡ断片を２０回のPCRサイクルによって合成するのに用いた。
【００３７】
100ngのpUC19-ArgAを鋳型として、２つのプライマー（40pmol）のそれぞれを含むPCR溶液（50μml）に加えた。２０サイクルのPCR（９４℃で０．６分、５５℃で０．５分、７２℃で２分）を、モデル2400 DNAサーマルサイクラー（Perkin-Elmer Co., Foster City, Calif.）を用いて行った。
【００３８】
第２段階では、８サイクル（９４℃で１分、３７℃で１分、７２℃で０．５分）の増幅を行った。ここでは、増幅断片の（−）鎖が、それを延長して全遺伝子配列を得るために「プライマー」として機能する。
【００３９】
第３段階では、反応混合物の１０μｌづつを、argA遺伝子の５’末端配列に相同なセンスプライマーP3:5'-TGCCATGGTAAAGGAACGTAAAACC-3'（配列番号１４）、およびアンチセンスプライマーP2を100pmol含む新たな反応混合物（４０μｌ）に加え、さらに１０サイクル（９４℃で０．５分、５２℃で０．５分、７２℃で２分）行った。
【００４０】
完全長argA遺伝子の変異型のプールをコードする1.78kbpのDNA断片を、アガロースゲル電気泳動により精製し、NcoI（argA遺伝子の開始ATGコドンを含む部位）およびHindIIIで消化し、NcoIおよびHindIIIで消化したpKK2333-2ベクター (Pharmacia, Sweden)と連結した。
【００４１】
連結したDNAの約150ngを、以下の各実験においてE．coli受容細胞の形質転換に用い、約2000づつの組み換えクローンを得た。
【００４２】
＜２＞新規な変異型argAの単離およびNAGSの触媒特性におけるアミノ酸置換の効果
プラスミドベクターpKK233-2（Pharmacia, Sweden）を、変異型argA遺伝子のクローニングおよび発現に用いた。E．coli受容菌株は、TG1 (supE hsdD5 thiD (lac- proAB) F'[traD36 proAB+ lacZDM15])（J. Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989）である。組み換えプラスミドpKK-argA-random（変異型argA遺伝子を有する）のセットを保持するTG1細胞の選択を、LB寒天プレート上で行った。いくつかの変異クローンでは細胞生育の遅延が観察され、この効果は活性なfbr NAGS変異酵素の生産と相関があると思われた。いくつかのクローンからプラスミドを精製し、変異型argA遺伝子の５’断片のDNA配列を、ダイデオキシ・チェイン・ターミネーション法によって決定した（表２）。
【００４３】
NAGS活性を測定するため、アルギニン栄養要求変異株であるE. coli B3083株(argA-, metB-) を、上記プラスミドで形質転換した。超音波処理した組換え細胞から得られた可溶性フラクションにおける酵素を、硫酸アンモニウム沈殿により部分的に精製し、後述のようにしてアッセイした。プラスミドpKK-argA-r11（3390nmol/分×mg）、pKK-argA-r12（1220nmol/分×mg) およびpKK-argA-r13 （3120nmol/分×mg）を保持する菌株のNAGS活性は、pKK-argA-r4 (300nmol/分×mg)を保持する菌株のNAGS活性よりも極めて高かった。最後のプラスミドは、Rajagopal, B.S.ら（Rajagopal, B.S. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1998, v.64, No.5, p.1805-1811）により、単一の置換を有するargA遺伝子の最も活性のある変異型であると記載されたのと同一の置換（Y19C）を有する変異型argA遺伝子を保持する。
【００４４】
また、プラスミドpKK-argA(wt)（野生型argA）を保持する菌株におけるNAGSの活性も、pKK-argA-r11、pKK-argA-r12及びpKK-argA-r13の場合よりも低かった。変異酵素の活性レベルは、10mMアルギニンの存在下でほぼ同じであったが、野生型酵素は、明らかにアルギニンにより阻害された（1/10以下）。これらの結果は、１５位から１９位のアミノ酸残基のペプチド断片は、Ｌ−アルギニンによるNAGSのフィードバック阻害だけでなく、変異NAGSの触媒能力のレベルを担っていることを示唆している。
【００４５】
（酵素アッセイ）
アセチルコエンザイムＡおよび使用した全ての化合物は、Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.から購入した。
NAGS活性を測定するため、組換えプラスミドを有する細胞E. coli B3083 (argA-, metB-)を、M9培地（5ml）で後期指数増殖期まで培養し、0.14M NaCl溶液で洗浄し、2mlの100mM KClを含む40mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）に再懸濁した。細胞を超音波処理し、遠心分離した。NAGSを含むフラクションを、５容量の飽和(NH4)2SO4で沈殿させ、沈殿物を、100mM KClおよび30%(vol/vol)グリセロールを含む40mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）2mlに溶解した。NAGS溶液を、O.1mlの反応混合物（100mM Tris-HCl (pH 8.5), 35mM KCl, 20mMＬ−グルタミン酸、1.2 mMアセチルコエンザイムＡ）に加え、反応混合物を37℃で10分間インキュベートした。
【００４６】
0.3 mlのエタノールを加えることにより反応を停止し、反応混合物を遠心分離した。0.95mlの0.24mM DTNB（5,5-ジチオ-bis-2-ニトロベンゾエート）溶液を上清に加え、混合物を15分間インキュベートした。NAGS活性は、412nmの吸光度をモニターすることにより分析した。
【００４７】
＜３＞新規なargA変異のB16-4(pro- argD-)細胞における選択による単離
E. coli B16-4株におけるargA変異体（pKK-argA-random）のセレクションを、上述した方法により行った。寒天プレートからの組換えクローンを、Ｌ−アルギニンを含むM9培地に懸濁し、定常期まで培養を行い、培養液の一部を新しい培地に懸濁し、同様の培養の手順を４回繰り返した。これらの後、培養液の一部を、 5 mg/mlのＬ−アルギニン、および100μgのアンピシリンを含むM9寒天培地にプレーティングした。幾つかのクローンからプラスミドを精製し、変異型argA遺伝子の５’断片についてシークエンスし、変異型NAGSの活性のレベルを、前記と同様にしてアッセイした。変異体の60%は、酵素の変異断片において配列-Gly-Trp-Pro-Cys-Val-（配列番号４）を有しており、弱い(約10nmol/分×mg)が、fbr NAGS活性を有していた。明らかに、この変異タンパク質は、使用した選択条件でpro- argD-細胞が生育するのに最適なレベルのNAGS活性を提供する。したがって、前記の選択条件によって、得られる変異型NAGSの活性が定まると考えられる。
【００４８】
【表２】
0004682454.tif 000003
【００４９】
＜４＞変異型argA遺伝子を用いたＬ−アルギニンの製造
組換えプラスミドpKKArgA-r4、pKKArgA-r11、pKKArgA-r12、pKKArgA-r13およびpKKArgA-r32をBamHIおよびSalIで消化し、trcプロモーター下に変異型argA遺伝子を含む断片を、低コピープロモーターpMW119（ニッポンジーン社、東京）にサブクローン化した。得られたプラスミドは、それぞれpMADS4、pMADS11、pMADS12、pMADS13およびpMADS32と命名された。これらのプラスミドは、Ｌ−アルギニン生産株であるエシェリヒア・コリ237株（VKPM B-7925）に導入された。形質転換株のＬ−アルギニン（Arg）およびシトルリン（Cit）の生産を、表３に示した。新規な変異型NAGSを保持する生産株のほとんどは、受容株又は公知のTyr19Cys変異型NAGS（pMADS4）に比べて、Ｌ−アルギニン及びシトルリンについて高い生産性を示した。
【００５０】
【表３】
0004682454.tif 000004
【００５１】
（試験管内発行の培養条件）
発酵培地は、水道水１Ｌ中に、60 g/L グルコース、 25 g/L 硫酸アンモニウム、2 g/L KH2PO4、1 g/L MgSO4、O.1 mg/L チアミン、5 g/L イースト イクストラクト（Difco）、25 g/L 沈降性炭酸カルシウムを含む（pH 7.2）。グルコースと沈降性炭酸カルシウムは、別殺菌した。2 mlの培地を試験管に入れ、被検微生物を１白金耳接種し、振盪しながら32℃で３日間培養を行った。
【００５２】
【発明の効果】
本発明により、エシェリヒア属細菌のＬ−アルギニン生産能を向上させることができる。
【００５３】
【配列表】
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【００５４】
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【００５５】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  変異型argA遺伝子のプールの構築のスキームを示す図。
【図１】
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