(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’から３’の方向に第１蛋白質又はポリペプチドのコーディング配列に作用可能な状態で連結されたプロモーター、フリン蛋白質分解開裂部位、２Ａ自己プロセッシング開裂配列、及び第２蛋白質又はポリペプチドのコーディング配列、を含む組換え蛋白質の発現ベクター。
【請求項２】
前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、複製可能アデノウイルスベクター、複製欠陥アデノウイルスベクター、ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びアデノウイルスプラスミドからなる群から選ばれる、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記２Ａ配列が口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）の配列である、請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
前記２Ａ配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９として示される配列からなる群より選択される２Ａ開裂部位をコードする、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
前記第１蛋白質又はポリペプチドのコーディング配列が第ＶＩＩＩ因子重鎖、第ＶＩＩＩ因子軽鎖、又はそれらの断片をコードする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項６】
前記コーディング配列が第ＶＩＩＩ因子の重鎖または軽鎖の全長のコーディング配列である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項７】
前記フリン開裂部位がＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）のコンセンサス配列を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項８】
前記プロモーターが、延長因子１−αプロモーター（ＥＦ１ａ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１プロモーター（ＰＧＫ）、サイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、キメラ肝特異的プロモーター（ＬＳＰ）、サイトメガロウイルスのエンハンサー／ニワトリ  βアクチンプロモーター（ＣＡＧ）、テトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）、トランスサイレチン（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）プロモーター（ＴＴＲ）、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、及びＣＫ６プロモーターから成る群から選ばれる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９】
シグナル配列をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１０】
前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１】
前記第１蛋白質又はポリペプチドのコーディング配列及び前記第２蛋白質又はポリペプチドのコーディング配列が、実質的に等モル比率で発現される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のベクターをトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１３】
蛋白質、ポリペプチド、又はその断片の製造方法であって、以下のステップ：
（ｉ）請求項１に記載のベクターを宿主細胞に形質導入し；そして
（ｉｉ）前記形質導入された宿主細胞内で上記組換え蛋白質又はポリペプチドを発現させ、ここで前記第１蛋白質又はポリペプチドのコーディング配列及び前記第２蛋白質又はポリペプチドのコーディング配列が等モル比で発現される；
を含む製造方法。
【請求項１４】
前記２Ａ配列が口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）配列である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記２Ａ配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９として示される配列からなる群より選択される２Ａ開裂部位をコードしている、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記２Ａ配列が、アミノ酸残基ＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号６）を含むオリゴペプチドをコードしている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記フリン開裂部位がＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）のコンセンサス配列を有する、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１蛋白質又はポリペプチドのコーディング配列が、抗体重鎖をコードしている、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は２００３年６月３日出願された米国出願第１０／４５２，２５３号及び２０４年２月２日に出願された米国仮出願第６０／５４０，５５３号に基づく優先権の利益を主張する。当該優先権基礎出願をここに全体として本願明細書中に援用する。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、自己プロセッシングペプチドを用いて組換えポリペプチド又はその断片を発現するようデザインした、新規ベクター又はプラスミドの構築物に関する。当該構築物は、異種蛋白質又はポリペプチドのコーディング配列を細胞に、試験管内、生体外及び生体内においてデリバリーするために又はベクターで遺伝子導入した又はプラスミドでトランスフェクトした細胞による組換えポリペプチドの製造において使用され得る。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
治療に役立つ物理療法としての組換え蛋白質は、最近使用が増加している。多数の組換え蛋白質に基づく治療は、臨床開発における様々な段階にある。組換え蛋白質技術の広範な臨床適用の一つの制限は、２以上のコーディング配列と、機能的なヘテロ二量体分子の産生をもたらす適当な翻訳後プロセッシングを伴って、適当な比率でドメインが発現しているようなドメインとを含む蛋白質製造の困難さである。さらなる制限は臨床適用の適当なレベルの発現に関連する高コストである。
【０００４】
チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞は、グリコシル化されたヒト蛋白質の商業的規模の製造のために、最も一般に使用されている哺乳類細胞系である。単一のベクターを使用した組換えＤＮＡ技術を介して、２以上のドメイン又は鎖（そしてそれ故に、２以上のコーディング配列又は読み取り枠（ＯＲＦ））を含む全長組換え蛋白質を発現させる以前の試みは、あまり成功しておらず、典型的には上記蛋白質又はポリペプチドの２以上のドメイン又は鎖の不均等な発現レベル、そして特に第２コーディング配列の低い発現レベルをもたらす。単一のベクターから２以上のドメイン又は鎖を有する十分に生物学上機能的な蛋白質又はポリペプチド発現させるために、当該２以上のドメイン又は鎖の等モル発現が、典型的に要求される。さらに、遺伝子発現の二つのプロモーター調節に頼る従来のベクターは、当該遺伝子の等モル又は実質的に等モル発現を危うくさせる、プロモーター相互作用（すなわちプロモーター干渉）に常に影響される。単一ベクターからの２以上のコーディング配列の発現する能力を制限する他の要因は、そのベクター自身のパッケージングの制限を含む。例えば、ベクターとコーディング配列との適切な組み合わせを考慮すれば、考えられる要因は以下のものを含む：ベクターの許容量（例えば、ＡＡＶについては約４５００塩基対）；ベクターを形質導入させた細胞による組換え分子の発現持続時間（例えばアデノウイルスのベクターについての短期発現）；ウイルス性ベクターが使用される場合、そのベクターにより感染させられた細胞の型；及び標的遺伝子産物の所望の発現レベル。ウイルス性のベクター、例えばアデノウイルスやＡＡＶ、のパッケージングの制限と共に、２以上の遺伝子産物のコントロールされた発現の要求は、２以上のドメイン又は鎖を有する蛋白質又はポリペプチドの発現のためのベクター構造物とシステムとに関しての選択を制限する。
【０００５】
単一の読み取り枠におけるポリ蛋白質形式での蛋白質の連結は、ピコルナウイルス科を含む多くのウイルスの複製において採用された戦略である。翻訳の際、ウイルスがコードするプロテイナーゼは、速いポリ蛋白質の（シス）分子内開裂を仲介して、別個の成熟蛋白質産物を作り出す。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）は、約２２５kＤのポリ蛋白質をコードする単一の長い読み取り枠を発現するピコルナウイルス科を含む族である。全長翻訳産物は、２Ａ領域自身のプロテイナーゼ様活性によって仲介された当該分裂に伴って、キャップシッド蛋白質前駆体（Ｐ１−２Ａ）と２ＢＣやＰ３といったポリ蛋白質の複製ドメインとの間にある自己プロセッシング開裂部位のＣ末端、例えば２Ａ部位又は領域において、速い（シス）分子内開裂をうける（Ryan et al.,J.Gen.Virol.72:2727-2732,1991）;Vakharia et al.,J.Virol.61:3199-3207,1987)。類似のドメインもまたピコルナウイルスファミリーのアフタウイルス科やカルディオウイルス科のような特徴を有する（Donnelly et al.,J.Gen.Virol.78:13-21,1997 ）。
【０００６】
単一ベクターから２以上のドメイン又は鎖を有する蛋白質やポリペプチドの発現のため、２以上のプロモーター又はインターナルリボソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）配列が、一般的に個々の遺伝子の発現を促すために使用される。単一のベクターにおける２つのプロモーターの使用は、例えばプロモーター干渉に因り、低い蛋白質発現をもたらす。２つの遺伝子がＩＲＥＳ配列と連結しているときには、第二遺伝子の発現レベルは、第一遺伝子よりもしばしばかなり低い（Furler et al.,Gene Therapy8:864-873,2001）。
【０００７】
生物学的に活性のある組換え蛋白質又はポリペプチドの十分な発現量が商業的に手ごろなコストで達成できるような、組換え蛋白質及びポリペプチド、特に２以上のドメイン又は鎖を有する蛋白質又はポリペプチド、産生のための改良された遺伝子発現システムの必要性が未だ存在する。
本発明は、実行可能性の証明と、機能的な組換え蛋白質及びポリペプチドの発現をもたらす自己プロセッシングペプチドをコードする配列を含む単一のベクター又はプラスミド構築物の実行可能性及び使用を立証することによって、上記の必要性を解決する。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の要約
本発明は、個別のポリペプチド産生のための“開裂”部位を提供することによって単一の読み取り枠から２以上のポリペプチドの効果的な発現を促進する自己プロセッシングペプチドの使用による、組換え蛋白質又はポリペプチドの発現のための手段を提供する。
【０００９】
本発明は、単一のベクターから同じプロモーターの転写調節の下、２以上の蛋白質又はポリペプチド又はドメイン又は鎖のためのコーディング配列の実質的に同等の発現を基本とした蛋白質又はポリペプチドの発現システムを提供し、ここで、翻訳は、自己プロセッシング分裂部位、例えば２Ａ又は２Ａ様配列、によって仲介される。
【００１０】
好ましい態様において、本発明は、２以上のドメイン又は鎖（したがって、２以上のコーディング配列又は読み取り枠（ＯＲＦｓ））を有した、２以上の又は単一の組換え蛋白質又はポリペプチドの発現のためのベクター又は構築物を提供する。２つのコーディング配列が発現している典型的な構築物において、当該ベクターは、５’から３’方向に以下の配列：第一蛋白質又はポリペプチドＯＲＦのためのコーディング配列に作用可能な状態で連結されたプロモーター、自己プロセッシング開裂部位をコードする配列、そして第二蛋白質又はポリペプチドＯＲＦのためのコーディング配列、を含み、自己プロセッシング開裂部位をコードする配列は第一蛋白質又はポリペプチドのためのコーディング配列と第二蛋白質又はポリペプチドのためのコーディング配列との間に挿入されている。
【００１１】
当該ベクターは、着目の蛋白質又はポリペプチド又はそこからの断片の発現可能ないかなる組換えベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、複製可能アデノウイルスベクター、複製欠陥アデノウイルスベクター（例えばガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルスベクター）、ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、非ウイルス性プラスミドでもよい。
【００１２】
好ましい自己プロセッシング分裂配列は、２Ａ配列、例えば口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）から誘導された２Ａ配列を含む。
【００１３】
さらに好まれる態様として、当該ベクターは、蛋白質又はポリペプチドの第一鎖のコーディング配列と蛋白質又はポリペプチドの第二鎖のコーディング配列との間に位置する追加の蛋白質分解開裂部位、例えばコンセンサス配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）を伴うフリン（ｆｕｒｉｎ）開裂部位をコードする配列を含むことである。
【００１４】
自己プロセッシングペプチドを使用する組換え蛋白質又はポリペプチドの発現のためのベクターは、多数のプロモーターの内のいずれを含んでいてもよく、その場合、当該プロモーターは、細胞特異的、組織特異的、又は種特異的に、調節可能な又は誘導可能な構成要素となる。
【００１５】
当該ベクターは、当該蛋白質又はポリペプチドのドメインのコーディング配列のためのシグナル配列をさらに含み得る。
【００１６】
本発明のある好ましい態様において、２以上の蛋白質又はポリペプチドのコーディング配列が実質的に等モル比率で発現する。
【００１７】
本発明は、自己プロセッシング開裂部位をコードする配列を単独で、又は追加の蛋白質分解開裂部位をコードする配列とともに含むことを含むベクター又はプラスミドで形質導入した宿主細胞と、組換え蛋白質又はポリペプチドの産生におけるそのような細胞の使用とをさらに提供する。
【００１８】
関連した態様において、本発明は、そのような細胞によって製造された組換え蛋白質又はポリペプチド及び同様のものを産生するための方法を提供する。
【００１９】
他のそしてさらなる目的、特徴、及び利点は、添付の図面を参照して、開示の目的を与えられれば以下の本発明の態様の説明から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の詳細な説明
本発明は、２以上の蛋白質又はポリペプチドの読み取り枠の発現のための単一のベクター又はプラスミドの構築物と、その同様なものの使用方法を提供する。当該ベクターは、単一プロモーターを使用する複数の機能的蛋白質又はポリペプチドの発現を可能にする、当該蛋白質又はポリペプチドのコーディング配列間に自己プロセッシング開裂配列を有している。本発明は、発現が単一プロモーターの作用可能な制御下で生じる場合、単一ベクターを使用する複数のドメイン（又は鎖）を有する複数の蛋白質又はポリペプチド又は１つの蛋白質又はポリペプチドの産生において、有用である。例示的なベクター構築物は、自己プロセッシング開裂部位配列を含み、さらに発現される蛋白質又はポリペプチドからの自己プロセッシング開裂部位の除去のため追加の蛋白質分解開裂配列をさらに含み得る。当該ベクター構築物は、試験管内で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）及び生体内で（ｉｎ  ｖｉｖｏ）生物学的活性のある蛋白質、ポリペプチド、その断片の強化された産生に関連する方法において有用である。
【００２１】
本発明の様々な組成物及び方法が以下に記載されている。特定の組成物及び方法がここに例示されているけれども、多様の他の組成物及び方法が適用され、また本発明を実施する際の使用に適すると理解すべきである。本発明の当該蛋白質又はポリペプチド発現構築物（ベクター）及び方法の評価は、本分野における標準的な手順を用いて実施し得ると理解すべきである。
【００２２】
本発明の実践は、特記しない限り、当業者に知られている、細胞生物学、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、生化学及び免疫学の伝統的なテクニックを用いるであろう。そのような技術は以下のような文献において全て説明されている、“分子クローニング：研究室マニュアル”第２版（Sambrook et ai.,1989）；“オリゴヌクレオチド合成”（M.J. Gait,ed.,1984）；“動物細胞培養”（R.I Freshney,ed.,1987）；“酵素学の方法”（Academic Press,Inc.）；“実験的免疫学のハンドブック”（D.M. Weir&C.C. Blackwell,eds.）;“哺乳類細胞のための遺伝子トランスファーベクター”（J.M.Miller &M.P.Calos,eds.,1987）；“分子生物学の最新プロトコル”（F.M.Ausubel et al.,eds.,1987）；“ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応”（Mullis et al.,eds.,1994）；そして“免疫学の最新プロトコル”（J.E.Coligan et al.,eds.,1991）。
【００２３】
定義
特記しない限り、本明細書に使われる全ての用語は当業者が用いるのと同じ意味を有しており、本発明の実施は当業者の知識を伴って微生物学及び組換えＤＮＡ技術の伝統的テクニックを用いるであろう。
【００２４】
用語“ベクター”は、本明細書において、１以上の異種又は組換えＤＮＡ配列を含んでおり、異なった宿主細胞間を移動するようにデザインされた、プラスミド、ウイルス又は他の媒体のようなＤＮＡ又はＲＮＡ分子をいう。用語“発現ベクター”及び“遺伝子治療ベクター”は、細胞において異種ＤＮＡ断片を組込み及び発現するのに効果的な、いかなるベクターをも言う。クローニング又は発現ベクターは追加的要素を含む可能性があり、例えば、当該発現ベクターが２つの有機体において、例えば、発現のためのヒト細胞において及びクローニング及び増幅のための原核生物の宿主において維持することを可能とする２つの複製システムを有するかもしれない。どんな適したベクターでも、例えば、ウイルスベクター又は非ウイルス性プラスミドベクターでも、蛋白質又はポリペプチド発現が結果として生じるような細胞内への核酸の誘導に効果的な使用ができる。発現のための効果的ないかなる細胞でも、例えば、昆虫細胞や酵母や哺乳類細胞といった有核生物の細胞でも、本発明の実施において有用である。
【００２５】
用語“異種ＤＮＡ”と“異種ＲＮＡ”は、核酸が存在している場合に、当該細胞内因性ではなく又は当該遺伝子の一部でもない核酸のことをいう。一般的に異種ＤＮＡ又はＲＮＡは、以下にさらに記載するように、形質導入、感染、トランスフェクション、形質転換又は同等な方法により、細胞に加えられたものである。そのような核酸は一般的に少なくとも１つのコーディング配列を含むが、当該コーディング配列は発現に必要ではない。用語“異種ＤＮＡ”は、“異種コーディング配列”又は“導入遺伝子”を指すこともある。
【００２６】
本明細書における、用語“蛋白質”と“ポリペプチド”は、相互交換的及び典型的に、自己プロセッシング開裂部位を含む本発明のベクターを使用し発現させた着目の“蛋白質”と“ポリペプチド”をいう。そのような“蛋白質”と“ポリペプチドは、以下にさらに記載するように、研究、診断又は治療目的に役立つ、いかなる蛋白質又はポリペプチドとなり得る。
【００２７】
本発明のウイルス性遺伝子治療ベクターと関連のある、本明細書における用語“複製欠陥”とは、ウイルスベクターが独立してさらにその遺伝子を複製及びパッケージできないことを意味している。例えば、問題となる細胞がｒＡＡＶ粒子で感染させられたとき、当該異種遺伝子はその感染細胞において発現させられるが、当該感染細胞がＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子及び補助機能遺伝子（アクセサリー機能遺伝子）を欠いているという事実に起因し当該ｒＡＡＶは複製することができない。
【００２８】
本明細書における“レトロウイルス性伝達ベクター”は、導入遺伝子をコードする核酸配列を含み及び当該ベクターのパッケージングのために必要な核酸配列をさらに含む発現ベクターをいう。好ましい当該レトロウイルス性伝達ベクターは細胞内において導入遺伝子を発現するために必要な配列をも含む。
【００２９】
本明細書における“パッケージングシステム”とは、組換えウイルスのパッケージングに係わるウイルス性蛋白質をコードする遺伝子を含むウイルス性構築物のセットをいう。典型的には、当該パッケージングシステムの当該構築物は結局パッケージング細胞へ組込まれるであろう。
【００３０】
本明細書における“第二世代”レンチウイルス性ベクターシステムは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、及びｎｅｆといった補助遺伝子が除去されているか又は不活性化されているような、機能的補助遺伝子の欠如したレンチウイルス性パッケージングシステムをいう。例えば、Zufferey et al.,1997,Nat.Biotechnol.15:871-875を参照のこと。
【００３１】
本明細書における“第三世代”レンチウイルス性ベクターシステムは、第二世代ベクターシステムの特徴を有し、ｔａｔ遺伝子といった補助遺伝子が除去されているか又は不活性化されているような、機能的ｔａｔ遺伝子をさらに欠如したレンチウイルスパッケージングシステムをいう。典型的には、ｒｅｖをコードする当該遺伝子は別々の発現構築物で提供される。例えば、Dull et al.,1998,J.Virol.72(11):8463-8471を参照のこと。
【００３２】
本明細書における“偽型”とは、ネイティブなエンベロープ蛋白質を異種の又は機能的に変化させたエンベロープ蛋白質に置き換えることをいう。
【００３３】
組換えＤＮＡ構築物又はベクターと関連して、本明細書における“作用可能な状態での連結”とは、組換えＤＮＡ構築物又はベクターの核酸構成が、選択されたコーディング配列の作用可能な制御のためにお互い機能的に関連していることを意味している。一般的に“作用可能な状態での連結”ＤＮＡ配列は連続しており、分泌リーダーの場合には読み枠において連続している。しかしながら、エンハンサーは連続している必要はない。
【００３４】
本明細書における用語“遺伝子”又は用語“コーディング配列”は、適切な調節配列に作用可能な状態で連結した際に、試験管内又は生体内で転写され（ＤＮＡ）及び翻訳され（ｍＲＮＡ）ポリペプチドになる核酸配列を意味する。遺伝子は、独立したコーディング部分（エキソン）の間に介在する配列（イントロン）と同じように、例えば５’非翻訳領域、（５’ＵＴＲ）又は“リーダー”配列及び３’ＵＴＲ又は“トレーラー”配列といったコーディング領域の前又は後に複数の領域を含むかもしれないし含まないかもしれない。
【００３５】
“プロモーター”は、直接ＲＮＡポリメラーゼに結合しその結果ＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列であり、すなわち直接転写するために十分に小さな配列である。プロモーター及び対応する蛋白質又はポリペプチドの発現は、細胞型特異的、組織特異的、種特異的である。プロモーター配列と連続する又はしないかもしれないエンハンサー配列も本発明における核酸構築物又はベクター内に含まれる。エンハンサー配列は、プロモーター依存性遺伝子発現に影響を与え、ネイティブ遺伝子の５’又は３’領域に存在し得る。
【００３６】
“エンハンサー”とは、隣接する遺伝子の転写を刺激するか又は阻害するかするシス活性要素である。転写を阻害するエンハンサーは“サイレンサー”とも呼ばれる。エンハンサーは、コーディング配列から及び転写領域の下流の位置から数キロベースペア（ｋｂ）までの距離を超えて、どちらの方向にも作用することができる（すなわちコーディング配列と関連することができる）。
【００３７】
“調節プロモーター”とは、その活性がシス又はトランス活性因子によって影響を受けるプロモーターである（すなわち、外部シグナル及び因子のような誘導プロモーター）。
【００３８】
“構成的プロモーター”とは、ほとんどの期間に多くの又は全ての組織／細胞型においてＲＮＡ産生物と直接作用するプロモーターであり、例えば、哺乳類細胞においてクローンＤＮＡ挿入断片の構成的発現を促すヒトＣＭＶ最初期エンハンサー／プロモーター領域がある。
【００３９】
“転写調節蛋白質”、“転写調節因子”及び“転写因子”は、ここで交互に使われており、ＤＮＡ応答配列に結合し結果として転写的に１つの関連遺伝子又は複数の関連遺伝子の発現を調節する核蛋白質をいう。転写調節蛋白質は一般的にＤＮＡ応答配列に直接結合するが、いくつかの場合においてはＤＮＡの結合が、ＤＮＡ応答配列に順番に結合する又は結合させられるもう一つの蛋白質の結合様式によって直接ではないかもしれない。
【００４０】
本明細書における“インターナルリボソームエントリーサイト”又は”ＩＲＥＳ”は、シストロン（蛋白質コーディング領域）のＡＴＧのような開始コドンへ直接的細胞内リボソームエントリーを促し、結果として当該遺伝子のｃａｐ依存性翻訳を導く配列である。例えば、Jackson R J,Howell M T,Kaminski A(1990)Trends Biochem Sci 15(12):477-83)及びJackson R J and Kaminski,A.(1995)RNA1(10):985-1000を参照。ここで描写されている例はＩＲＥＳ配列の使用に関連しており、シストロンの開始コドンへ直接細胞内リボソームエントリーを促すことができる。ここに使われる“ＩＲＥＳの翻訳制御下”とは、翻訳はＩＲＥＳと関連しておりｃａｐ依存性方法で行われることを意味している。
【００４１】
“自己プロセッシング開裂部位”又は“自己プロセッシング開裂配列”は、ここでは翻訳後又は翻訳と同時のプロセッシング開裂部位配列と定義する。そのような“自己プロセッシング開裂”部位又は配列は、ＤＮＡ又はアミノ酸配列をいい、ここでは２Ａ部位配列又はドメイン又は２Ａ様部位配列又はドメインが例示されている。ここで使用されているように“自己プロセッシングペプチド”は、自己プロセッシング開裂部位又は配列をコードし、翻訳上、分離した成熟蛋白質又はポリペプチド産生物を産出するための自己プロセッシング開裂部位を含む蛋白質又はポリペプチドの素早いシス分子内開裂を仲介する、当該ＤＮＡ配列の当該ペプチド発現産生物として定義されている。
【００４２】
本明細書における、用語“追加の蛋白質分解開裂部位”は、２Ａ又は２Ａ様配列のような自己プロセッシング部位に隣接して本発明の発現構築物を組み込み、当該自己プロセッシング開裂配列によって続く開裂の後に残る追加アミノ酸の除去手段を提供する配列である。例示的な“追加の蛋白質分解部位”はここに記載され、限定されない場合を除いて、コンセンサス配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）を伴ったフリン開裂部位を含む。
【００４３】
本明細書における、用語“免疫グロブリン”及び“抗体”は交互に使われており、抗原決定基への結合が可能なＦａ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖのような、そこからの断片だけでなく完全な免疫グロブリン又は抗体分子をいう。そのような“免疫グロブリン”及び“抗体”は、分子量約２３０００ダルトンの２つの同一の軽ポリペプチド鎖及び分子量約５３０００〜７００００の２つの同一の重ポリペプチド鎖を含んでいる。当該４つの鎖は、“Ｙ”構造においてジスルフィド結合によって結合している。重鎖は、ガンマ（ＩｇＧ）、ミュー（ＩｇＭ）、アルファ（ＩｇＡ）、デルタ（ＩｇＤ）、イプシロン（ＩｇＥ）として分類され、免疫グロブリンの当該クラス称号として根拠となる。軽鎖はカッパーとラムダのどちらかとして分類される。ここで“免疫グロブリン又はその断片”という表示がされた場合には、そのような“断片”は免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片であると理解できるであろう。
【００４４】
用語“人間に適応させた抗体”とは、非ヒト抗原の抗原結合領域の複数のアミノ酸がよりヒト抗体にきっちりと似させるために置き換えられ、一方、当該原非ヒト抗原の結合活性はそのままである抗体分子をいう。例えば、米国特許番号6,602,503号を参照。
【００４５】
本明細書における、用語“抗原決定基”とは、特定の抗体と結合する分子の断片（例えばエピトープ）をいう。蛋白質の多くの領域又は蛋白質の断片は、当該蛋白質の３次元構造の与えられた領域に特異的に結合する抗体の産生を導く可能性がある。これらの領域又は構造は抗原決定基として言及されている。抗原決定基は、抗体への結合のための当該完全な抗原（すなわち免疫応答を誘発すために使用される免疫原）と競合するかもしれない。
【００４６】
本発明における組換え蛋白質又はポリペプチドとして言及されている際の用語“断片”とは、一致する全長蛋白質又はポリペプチドのアミノ酸配列の全部ではなく一部と同じであるアミノ酸配列を有し、対応の全長蛋白質又はポリペプチドの機能及び活性の少なくとも１つを残すポリペプチドを意味する。当該断片は、好ましくは、全長蛋白質又はポリペプチドの少なくとも２０〜１００連続アミノ酸残基を含む。
【００４７】
本明細書における、用語“投与”又は“導入”は、１つの細胞に又は複数の細胞にそして又は患者の器官における組換え蛋白質発現のためのベクターのデリバリーをいう。そのような投与又は導入は、生体内で、試験管内で、生体外で起こる可能性がある。組換え蛋白質又はポリペプチド発現のためのベクターは、典型的に物理的手法（例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、又はリポフェクション）；典型的には感染因子経由の誘導をいう感染、すなわちウイルス；又は典型的にはウイルスによる細胞への安定感染、又はウイルス因子（例えばバクテリアファージ）経由である微生物からもうひとつへの遺伝子材料の輸送を意味する遺伝子導入、によって細胞内への異種ＤＮＡの挿入を意味するトランスフェクションによって細胞内に誘導することができる。
【００４８】
“形質転換”とは、典型的に異種ＤＮＡを含むバクテリア又はがん遺伝子を発現し、その結果腫瘍細胞のような連続成長モードに変化する細胞をいう。形質転換させる細胞に使用されるベクターは、プラスミド、ウイルス又は他の媒体である。
【００４９】
典型的に、“形質導入された”、“感染させられた”、“トランスフェクトされた”又は“形質転換された”と言及される細胞は、当該細胞への異種ＤＮＡ（すなわちベクター）の投与、導入、又は挿入のために使用される手段に依存する。用語“形質導入された”、“トランスフェクトされた”及び“形質転換された”は、異種ＤＮＡの導入方法にかかわらず、ここでは相互交換的に使用されている。
【００５０】
本明細書における、用語“安定して形質転換された”、“安定してトランスフェクトされた”及び“トランスジェニック”は、当該遺伝子に組込まれた非天然の（異種の）核酸配列を有している細胞をいう。安定したトランスフェクションは、細胞系又は娘細胞の遺伝子に安定して組込まれた当該トランスフェクトされたＤＮＡを含む娘細胞集団で構成されたクローンの確立によって証明される。いくつかの場合、“トランスフェクション”は安定しておらず、すなわち一過性である。一過性トランスフェクションの場合、当該外来種又は異種ＤＮＡは発現するが、導入された配列は当該遺伝子に組込まれずエピソームとなると考えられている。
【００５１】
本明細書における、用語“生体外投与”とは、一次細胞が実験材料から取り出され、ベクターが形質導入された、感染させた、又はトランスフェクトさせた組換え細胞を産生するために当該細胞に投与され、そして当該組換え細胞が同様の又は異なった実験材料に再び投与されるといったプロセスをいう。
【００５２】
“マルチシストロニック転写”は、複数の蛋白質コーディング領域又はシストロンを含むｍＲＮＡ分子をいう。２つのコーディング配列を含むｍＲＮＡは、“重マルチシストロニック転写”と示される。“５’−近位”コーディング領域又はシストロンは、その翻訳開始コドン（通常ＡＵＧ）がマルチシストロニックｍＲＮＡ分子の５’末端に最も近い当該コーディング領域である。“５’−遠位”コーディング領域又はシストロンは、その翻訳開始コドン（通常ＡＵＧ）がｍＲＮＡの５’末端に最も近い開始コドンではないことをいう。当該“５’−遠位”及び“下流”は、ｍＲＮＡ分子の当該５’末端に隣接しないコーディング領域をいうための同義語として使用される。
【００５３】
本明細書における、“同時翻訳”とは、２つの（又はそれ以上の）コーディング領域又はポリヌクレオチドが単一の転写コントロール又は調節要素の転写コントロール下にあることを意味する。
【００５４】
用語“宿主細胞”は、本明細書において、ベクターで形質導入させた、感染させた、トランスフェクトさせた又は形質転換させた細胞をいう。当該ベクターは、プラスミド、ウイルス性粒子、ファージなどの可能性がある。温度、ｐＨなどのような当該培養条件は、発現のために選択した当該宿主細胞であらかじめ使用されたものであり、当業者にとって明らかであろう。“宿主細胞”は当該最初の形質導入させた、感染させた、トランスフェクトさせた又は形質転換させた細胞及びそこからの子孫をいうということが正しく認識されるだろう。
【００５５】
本明細書における、用語“生物学的活性”及び“生物学的にアクティブ”とは、ＥＬＩＳＡプレートにおけるリガンド−受容体アッセイのような、培養における細胞系又は無細胞系の特定蛋白質に起因する活性をいう。“免疫グロブリン”、“抗体”又はその断片の“生物学的活性”は、抗原決定基へ結合し及びその結果免疫学的機能を促進する能力をいう。
【００５６】
本明細書における、用語“腫瘍”及び“がん”は、成長制御喪失を示し、細胞の異常な大きなクローンを形作る。腫瘍又はがん細胞は、一般的に接触阻止を喪失しており、健康な組織を侵す可能性があり、及び／又は転移能力を有する。
【００５７】
インターナルリボソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）
ＩＲＥＳ配列は初めピコルナウイルスｍＲＮＡｓにおいて発見された（Jackson RJ,Howell MT,Kaminski A(1900)Trends Biochem Sci 15(12):477-83）及びJackson RJ and Kaminski,A.(1995)RNA 1(10):985-1000）。ＩＲＥＳの例は、一般的に、米国特許番号第6,692,736号において記載されているだけでなく表１において記載されているものも含み当業者によって使用されている。本分野において知られている“ＩＲＥＳ”の例は、例えば、免疫グロブリン重鎖結合蛋白質（ＢｉＰ）、血管内被増殖因子（ＶＥＧＦ）（Huez et al.(1998)Mol.Cell.Biol.18(11):6178-6190）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、及びインスリン様増殖因子（ＩＧＦII）のような、ピコルナウイルスから入手できるＩＲＥＳ（Jackson et al.,1990）及びウイルス性の又は細胞のｍＲＮＡ源から入手できるＩＲＥＳに限られることなく、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇ及び酵母転写因子ＴＦIIＤ及びＨＡＰ４、Ｎｏｖａｇｅｎ社から商業的に入手できる脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）（Duke et al.(1992)J.Virol 66(3):1602-9）及びＶＥＧＦ  ＩＲＥＳ（Huez et al.(1998)Mol Cell Biol 18(11):6178-90）を含む。ＩＲＥＳは、カルジオウイルス、ライノウイルス、アフタウイルス、ＨＣＶ、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）及びモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）のような異なるウイルスにおいて報告されている。本明細書において、“ＩＲＥＳ”は、当該変異体がシストロンの当該開始コドンへの直接的内在性リボソームエントリーを促進することができる限り、ＩＲＥＳ配列の機能的変異体を含む。ＩＲＥＳは哺乳類の、ウイルス性の又は原生動物のものであろう。
【００５８】
当該ＩＲＥＳは、ｃａｐ−依存性翻訳を導く、シストロンの下流の開始コドンへの直接的内在性リボソームエントリーを促進する。このように、シストロン下流の産生物は、ポリ蛋白質の開裂又はモノシストロニックｍＲＮＡの産生のどちらも強制することがなければ、バイシストロニック（マルチシストロニック）ｍＲＮＡから発現される。インターナルリボソームエントリーサイトは、長さ約４５０ヌクレオチドで、１次配列の適度な維持及び２次構造の強力な維持によって特徴づけられる。ＩＲＥＳの最も重要な１次配列の特色は、そのスタートが当該ＩＲＥＳの３’末端の約２５ヌクレオチド上流に位置しているピリミジンリッチ部位である。Jackson et al参照のこと。
【００５９】
ピコルナウイルスＩＲＥＳの３つの主要なクラスは確認され特徴付けられている：（１）カルジオ及びアフタウイルスクラス（例えば、脳心筋炎ウイルス、Jang et al.(1990)Gene Dev 4:1560-1572）;（２）エンテロ及びライノウイルスクラス（例えば、ポリオウイルス、Borman et al.(1994)EMBO J.13:314903157）;及び（３）Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）クラス、Glass et al.(1993)Virol193:842-852）。最初の２つのクラスについては、２つの一般的原則が適用される。第１に、当該ＩＲＥＳの４５０ヌクレオチド配列のほとんどは、リボソーム結合及び翻訳開始の助けとなる特に２次及び３次構造を維持するための機能を有する。第２に、当該リボソームエントリーサイトは、保存されているオリゴピリミジン域の約２５ヌクレオチド下流の、当該ＩＲＥＳの３’末端に位置するＡＵＧトリプレットである。翻訳開始は、当該リボソームエントリーサイト（カルジオウイルス）において、又は当該次の下流ＡＵＧ（エンテロ／ライノウイルスクラス）においてのどちらかで発生する。アフタウイルスにおいて、開始は両部位において発生する。
【００６０】
ウシウイルス性下痢性ウイルス（ＢＶＤＶ）又は古典的豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）のようなＨＣＶ及びペスチウイルスは、それぞれ長さ３４１ｎｔ及び３７０ｎｔの５’−ＵＴＲ（非翻訳領域）を有する。これらの５’−ＵＴＲ断片は、似たようなＲＮＡ２次構造を形作り、適度の有効なＩＲＥＳ機能を有することができる（Tsukiyama-Kohara et al.(1992)J.Virol.66:1476-1483;Frolov l et al.,(1998)RNA4:1418-1435）。最近の研究は、フレンド−マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）５’ＵＴＲ及びラットレトロポゾンウイルス様３０Ｓ（ＶＬ３０）の双方の配列がレトロウイルス性由来のＩＲＥＳ構造を含むことを明らかにしている（Torrent et al.(1996)Hum Gene Ther 7:603-612）。
【００６１】
真核細胞において、翻訳は、開始因子の制御下、キャップされたｍＲＮＡ５’末端からのリボソームスキャニングによって正常に開始される。しかしながら、いくつかの細胞のｍＲＮＡｓは、当該キャップ非依存性翻訳を仲介するＩＲＥＳ構造を有することが明らかになっている（van der Velde,et al.(1999)Int J Biochem Cell Biol.31:87-106）。例としては、免疫グロブリン重鎖結合蛋白質（ＢｉＰ）（Macejak et al.(1991) Nature 353:90-94）、ショウジョウバエのアンテナペディアｍＲＮＡ（Oh et al.(1992) Gene and Dev 6:1643-1653）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）（Vagner et al.(1995) Mol Cell Biol 15:35-44）、血小板由来成長因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）（Bernstein et al.(1997)J Biol Chem 272:9356-9362）、インスリン様成長因子II（Teerink et al.(1995)Biochim Biophys Acta 1264:403-408）、及び当該翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇ（Gan et al.(1996) J Biol Chem 271:623-626）。最近、血管内被増殖因子（ＶＥＧＦ）もまたＩＲＥＳ配列を有していることがわかった（Stein et al.(1998)Mol CellBiol 18:3112-3119;Huez et al.(1998)Mol Cel Biol 18:6178-6190）。
【００６２】
ＩＲＥＳ配列は、実施例１において明らかなように試験され及び２Ａ配列と比較され得る。ある例示的なプロトコルにおいて、テストベクター又はプラスミドはＰＦ−４又はＶＥＧＦ−トラップのようなある導入遺伝子で産生させられ、テストされるためのＩＲＥＳ、２Ａ又は２Ａ様配列の翻訳制御下に置かれる。細胞は当該ＩＲＥＳ又は２Ａの応答遺伝子配列を含む当該ベクター又はプラスミドでトランスフェクトされ、分析は当該導入遺伝子の存在を検出することで行われる。ある説明に役立つ例において、当該テストベクターは、ＣＭＶプロモーターによって転写状態にさせられる同時転写されるＰＦ−４及びＶＥＧＦ−トラップのコーディング配列を含み、ＰＦ−４又はＶＥＧＦ−トラップのコーディング配列はテストされるＩＲＥＳ、２Ａ又は２Ａ様配列によって翻訳状態にさせられる。宿主細胞は、当業者に知られている手段によって当該テストベクターで一過性トランスフェクトされ、当該導入遺伝子の発現について分析される。
【００６３】
ＩＲＥＳは本分野において知られている標準的組換え及び合成方法の使用によって用意され得る。クローニングの便利さとして、制限部位は使用されるＩＲＥＳ断片の末端に作られ得る。
【００６４】
単一のベクター又は非ウイルス性ベクターから複数の蛋白質を発現させるために、インターナルリボソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）配列は一般的に第２、第３、第４遺伝子などの発現を引き起こすとして使用される。ＩＲＥＳの当該使用は多数の当業者によく知られていたけれども、２つの遺伝子がＩＲＥＳ経由で連結されているとき第２遺伝子の発現レベルがしばしば重大なほど落ち込む（Furler et al.,Gene Therapy 8:864-873(2001)）。事実、同じプロモーターに作用可能な状態で連結した複数の遺伝子の転写を制御するためのＩＲＥＳの使用は、当該プロモーターに隣接した当該遺伝子と関連する第２、第３遺伝子などの結果としてより低い発現となり得る。加えて、ＩＲＥＳ配列は、当該ベクターのパッケージング限界を伴う問題の存在に対して十分な長さとなり得る、例えばｅＣＭＶ  ＩＲＥＳは５０７塩基対の長さを有する。
【００６５】
【表１】
0004644663.tif 000002
【００６６】
ポリ蛋白質の形成における蛋白質の連結は、ピコルナウイルス科を含む多くのウイルスの複製において採用された戦略である。翻訳上、ウイルスがコードする自己プロセッシングペプチドは、別個の成熟蛋白質産生物を産生するために速い当該ポリ蛋白質のシス細胞内開裂を仲介する。自己プロセッシングペプチド（２Ａペプチドによってここに例示されている）を含む組換え蛋白質又はポリペプチドの発現のためのベクターが単一プロモーターを使用した、実質的等モル比率で発現される複数の蛋白質又はポリペプチドのコーディング配列の発現を促進することを提供されるという点で、本発明はＩＲＥＳの使用の優位性を提供する。
【００６７】
自己プロセッシング開裂部位又は配列
上記に定義されているように“自己プロセッシング開裂部位”又は“自己プロセッシング開裂配列”とは、ＤＮＡ又はアミノ酸配列であり、そこで翻訳上、当該自己プロセッシング開裂部位を含むポリペプチドの速い（シス）細胞内開裂が生じ、結果として別個の成熟蛋白質又はポリペプチド産生物の発現が生じる。翻訳後又は翻訳と同時のプロセッシング開裂部位として言及され得る、そのような“自己プロセッシング開裂部位”は２Ａ部位、配列又はドメインによってここに例示されている。２Ａ部位、配列又はドメインが、エステル結合の加水分解を促進するためにリボソーム活性を修飾し、その結果ある意味で進行のために別個の下流翻訳産生物の合成を許す当該翻訳複合体から当該ポリペプチドを放出することによる翻訳効果を立証することが発表されている（Donnelly,2001）。他に、２Ａ部位、配列又はドメインは、最初の開裂産生物を産生するための、シスの自身Ｃ末端を開裂することによる“自動蛋白質分解”又は“開裂”を立証する（Furler;Palmenberg,Ann.Rev.Microbiol.44:603-623(1990)）。
【００６８】
当該メカニズムは本発明の一部ではないけれども、２Ａ様配列の当該活性は、ペプチド結合の形成を妨げるコドン間のリボソームのスキッピングを含み得る（de Felipe et al.,Human Gene Therapy 11:1921-1931(2000);Donnelly et asl.,J.Gen.Virol.82:1013-1025(2001)）。但し当該ドメインはより自己分解酵素のように作用することが知られている（Ryan et al.,Virol.173:35-45(1989)）。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａコーディング領域が発現ベクターにクローンされ標的細胞にトランスフェクトされたという研究は、小麦麦芽溶解産物及び遺伝子転換タバコ植物（Halpin et al.,USSN 5,846,767;1998及びHalpin et al.,The Plant Journal 17:453-459,1999）；Ｈｓ６８３ヒトグリオーマ細胞系（de Felipe et al.,Gene Therapy 6:198-208,1999）；下記においては“de Felipe II”という）；ウサギ網状赤血球溶解産物及びヒトＨＴＫ−１４３細胞（Ryan et al.,EMBO J. 13:928-933(1994)）；及び昆虫細胞（Roosien et al.,J Gen.Virol.71:1703-1711,1990）における人為的リポーターポリ蛋白質のＦＭＤＶ２Ａ開裂を示した。当該ＦＭＤＶ  ２Ａが仲介する異種ポリ蛋白質の開裂は、ＩＬ−１２（ｐ４０／ｐ３５へテロ二量体；Chaplin et al.,J.Interferon Cytokine Res. 19:235-241,1999）について明らかとなった。当該参考文献は、トランスフェクトされたＣＯＳ７細胞において、ＦＭＤＶ  ２Ａがｐ４０−２Ａ−ｐ３５ポリ蛋白質の開裂によりＩＬ−１２に関連した活性を有する生物学的機能的サブユニットｐ４０及びｐ３５とすることを仲介することを証明している。
【００６９】
当該ＦＭＤＶ  ２Ａ配列は、単独で又はバイシストロニック、トリシストロニック、テトラシストロニックベクターを構築するための異なるＩＲＥＳ配列とともにレトロウイルスに組み込まれる。動物における２Ａが仲介する遺伝子発現の効果は、α−シヌクレイン及びＥＧＦＰ又は銅／亜鉛スーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ−１）及びＦＭＤＶ  ２Ａ配列を経由して連結しているＥＧＦＰをコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用してＦｕｌｅｒ（２００１）によって証明された。ＥＧＦＰ及びα−シヌクレインは、対応するＩＲＥＳを基本としたベクターと関連のある２Ａ配列を含むベクターから実質的に高レベルで発現し、一方ＳＯＤ−１は、それに匹敵するほど又はわずかにより高いレベルで発現した。Ｆｕｒｌｅｒは、当該２Ａ配列は、ラット黒質（ｒａｔ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ  ｎｉｇｒａ）へ２Ａを含むＡＡＶベクターを注入後、生体内バイシストロニック遺伝子の発現を引き起こすことも証明した。
【００７０】
本発明について、自己プロセッシング開裂部位をコードする当該ＤＮＡ配列は、エンテロ−、ライノ−、カルジオ−、アフタ−又は口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）を含むがそれだけに限られないピコルナウイルス由来のウイルス性配列によって例示されている。好ましい態様において、当該自己プロセッシング開裂部位コーディング配列はＦＭＤＶに由来する。自己プロセッシング開裂部位は、２Ａ及び２Ａ様部位、配列又はドメインを含むがそれだけに限られない（Donnelly et al.,J. Gen.Virol. 82:1027-1041(2001)）。
【００７１】
本発明ベクター構築物のための複数の異種ＤＮＡ配列間にある２Ａ配列のポジショナルサブクローニングは、デリバリー及び単一のプロモーターへの作用可能な状態での連結による複数の読み取り枠の発現を可能にする。好ましくは、自己プロセッシング開裂部位、例えばＦＭＤＶ  ２Ａ配列は、単一のウイルス性ベクター、複数の蛋白質、ポリペプチド又はペプチドであって、例えば第VIII因子又はもう一つのへテロ二量体蛋白質、抗体、又は二量体受容体の個々の一部となり得るものからのユニークな発現及びデリバリー手段を提供する。
【００７２】
ＦＭＤＶ  ２Ａは、ＦＭＤＶゲノムにおいて、自身のＣ末端における単一の開裂を指令する機能を有する、従ってシスで機能するポリ蛋白質領域である。当該ＦＭＤＶ  ２Ａドメインは、典型的に、その長さが約１９アミノ酸であるといわれている（（ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１）；ＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２）；Ryan et al.,J.Gen. Virol.72:2727-2732(1991)）、しかしながら、１４アミノ酸残基（ＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３））しかないオリゴペプチドもまた、ネイティブＦＭＤＶポリ蛋白質プロセッシングにおける役割と一応類似している当該２ＡのＣ末端における開裂を仲介することが明らかである。
【００７３】
当該２Ａ配列の変異体は、ポリ蛋白質の有効なプロセッシングを仲介するそれらの能力について研究され続けている（Donnelly MLL et al.2001）。２Ａ配列の相同体（ホモログ）及び変異体（バリアント）は、本発明の範囲に含まれ、以下に示す表２に挙げられている配列を含むがそれだけに限られない。
【００７４】
【表２】
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【００７５】
２Ａ配列又は変異体のような自己プロセッシング開裂配列の明瞭な利点は、自己プロセッシングポリ蛋白質を発現するベクターを産生する場合におけるそれらの使用にある。この発明は、当該自己プロセッシング開裂部位の存在による、当該ポリ蛋白質の開裂に続いて等モル比率の又はほぼ等モル比率の量において当該個別の蛋白質又はポリペプチドが発現されるための、自己プロセッシング開裂部位を介して連結された２以上の蛋白質又はポリペプチドのコーディング配列を含む（プラスミド又はウイルス性を基本とした）いかなるベクターをも含む。これらの蛋白質は、ベクター自身にとって、お互いに又は当該自己プロセッシング開裂部位、例えば、ＦＭＤＶにとって異種由来となり得る。このように、本発明を実施する際に使用する当該自己プロセッシング開裂部位は、異種由来蛋白質又はポリペプチドと、開裂に作用又は仲介する能力において当該自己プロセッシング開裂部位と同じ出所に由来するコーディング配列との差異を識別することはできない。
【００７６】
当該２Ａコーディング配列の小さなサイズは、ＡＡＶのような、コーディング配列に対して限られたパッキング許容量であるベクターにおけるその使用をさらに効果的にする。ＡＡＶベクターの有用性は、当該２Ａ配列に２つのプロモーターの必要性がないことにより、さらに拡大できる。複数のコーディング配列を含む単一の読み取り枠が引き起こす個別の蛋白質、ポリペプチド又はペプチドの発現レベルは、ＩＲＥＳ配列又は２つのプロモーターを使用して達する可能性のある発現レベルと比較して等モルに近い。２つのプロモーターの除去は、結果としてそれぞれのコーディング配列の発現レベルを減少させ及び／又は悪くさせ得るプロモーター干渉を減少させる。
【００７７】
好ましい態様において、本発明に従うベクターに含まれる当該ＦＭＤＶ  ２Ａ配列は、ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１）を含むアミノ酸残基をコードする。他に、本発明に従うベクターは、Donnelly et al.,J.Gen.Virol. 82:1027-1041(2001)で議論されている及び以下に限るものではないがピコルナウイルス、昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルス、トリパノソーマ反復配列又はバクテリウム、ｔｈｅｒｍａｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａからの２Ａ様ドメインを含むような他の２Ａ様領域としてのアミノ酸残基をコードし得る。
【００７８】
本発明は、２Ａ又は２Ａ様ポリペプチドのような自己プロセッシング開裂部位をコードする核酸配列変異体、及び原種（ネイティブ）ヌクレオチドのアミノ酸と関連のある当該アミノ酸の複数の異なるコドンを有する核酸コーディング配列の使用を熟慮している。そのような変異体は、本発明によって特別に熟慮され包含されている。なお、自己プロセッシング開裂ペプチド及びポリペプチドの配列変異体は本発明の範囲にも含まれる。
【００７９】
本明細書における、用語“配列同一性”は、配列比較プログラムを使用して整列させたときに、複数の整列させた配列間において核酸又はアミノ酸配列を同定することを意味する。用語“％相同性（ホモロジー）”と“％同一性（アイデンティテイ）”は、本明細書において相互交換可能に使用され、配列比較プログラムを使用して整列させたときに、複数の整列させた配列間において核酸又はアミノ酸配列の同一性レベルをいう。例えば、８０％相同性とは、定義された状況下における定義されたアルゴリズムによって決定された８０％の配列同一性と同様であることを意味する。
【００８０】
比較のため最適な配列整列は、例えば、Smith&Waterman,Adv.Appl.Math. 2:482(1981)の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman&Wunsch,J Mol.Biol.48:443(1970)の相同性確認アルゴリズムによって、Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)の類似方法としての探索によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行（GAP,BESTFIT,FASTA,and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 science Dr.,Madison,Wis.）によって、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、Altschul et al.,J Mol.Biol.215:403-410(1990)によって、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通して入手できる周知のソフトウエアによって、又は視覚による点検によって（一般的には、Ausubel et al.,infraを参照）実施できる。本発明の目的のため、比較として最適な配列アラインメントは、Smith&Waterman,Adv.Appl.Math. 2:482(1981)の局所相同性アルゴリズムによって実施されることが最も好ましい。Altschul,S.F.et al.,1990及びAltschul,S.F.et al.,1997も参照。
【００８１】
複数の核酸又は蛋白質配列の文脈における、用語“同一の”又はパーセント“同一性”とは、例えば当該スミス−ウォーターマン  アルゴリズム又は視覚による点検といったここに記載されている配列比較アルゴリズムの内の１つを使用して測定された通り、最大一致のために比較及び整列させたときに、全く同じであるか又は同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドのパーセンテージが記載されている複数の配列又はサブシークエンスをいう。
【００８２】
本発明によれば、天然配列と８０、８５、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７．９８、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有する自己プロセッシング開裂ポリペプチド及び自らのポリペプチドをコードする配列変異体も包含される。
【００８３】
もし当該２つの配列が、中〜高のストリンジェンシーハイブリダイゼーション及び洗浄条件下、互いに特異的にハイブリダイズする場合、核酸配列は照合する核酸配列と“選択的にハイブリダイズできる”と考えられる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体又はプローブの融解温度（Ｔｍ）を基本とする。例えば、“最大ストリンジェンシー”とは典型的に約Ｔｍ−５℃（当該プローブのＴｍの５℃下）で生じ；“高ストリンジェンシー”とは当該Ｔｍより約５−１０℃下で；“中ストリンジェンシー”とはプローブのＴｍより約１０−２０℃下で；“低ストリンジェンシー”とはＴｍより約２０−２５℃下で生じることをいう。機能的に、最大ストリンジェンシーを条件とするときは、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な一致又はほぼ厳密な一致を有する配列を識別するために使用されうる；一方、高ストリンジェンシーを条件とするときは、当該プローブと約８０％またはそれ以上の配列一致を有する配列を識別するために使用される。
【００８４】
中及び高ストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件は、本分野においてよく知られている（例えば、Sambrook,et al,1989,９章及び１１章、及びAusubel,F.m.,et al.,1993を参照）。高ストリンジェンシーの例は、約４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、及び室温において２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳで２回洗浄し４２℃において０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳでさらに２回洗浄した後の１００μg/ｍｌの変性させたＤＮＡにおけるハイブリダイゼーションを含む。本明細書に記載された当該２Ａポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチドをコードし、中〜高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする２Ａ配列変異体は、本発明の範囲内にあるものと考えられる。
【００８５】
遺伝暗号の縮重の結果として、多くのコーディング配列は、２Ａ又は２Ａ様ペプチドのような当該同様の蛋白質、ポリペプチド又はペプチドをコードすることを提供され得る。例えば、三つ組ＣＧＴはアミノ酸アルギニンをコードする。アルギニンは、他にＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＡＧＡ及びＡＧＧによってコードされる。その結果、当該コーディング領域における置換は本発明によって範囲にカバーされる配列変異体の中に含まれることが認められる。
【００８６】
そのような配列変異体は、高ストリンジェンシー条件下、当該親配列とハイブリダイズし得る又はし得ないことがさらに認められる。例えば、当該配列変異体が当該親ヌクレオチドによってコードされるアミノ酸それぞれについて異なるコドンを含むとき、この可能性がある。それにもかかわらず、そのような変異体は、本質的に本発明によって想定され、包含される。
【００８７】
自己プロセッシングペプチド配列の除去
２Ａ又は２Ａ様配列のような自己プロセッシングペプチドの使用に関連した重要性は、発現させられたポリペプチドのＣ末端が当該自己プロセッシングペプチド由来のアミノ酸、すなわち２Ａ由来アミノ酸残基を含むことである。これらのアミノ酸残基は、宿主にとって“外来”であり、当該組換え蛋白質が生体内で発現させられたとき（すなわち、遺伝子治療の状況においてウイルス性の又は非ウイルス性のベクターから発現されたとき又は試験管内において産生された組換え蛋白質又はポリペプチドとして投与されたとき）又は試験管内における又は生体外における発現に続き生体内へデリバリーされたとき、免疫応答を誘発し得る。加えて、もし除去できなければ、自己プロセッシングペプチド由来のアミノ酸残基は、産生細胞における蛋白質分泌及び／又は蛋白質コンフォメーション変化に干渉し得る、そしてその結果、最適発現レベルの減少及び／又は減退した当該組換え蛋白質の生物学的活性を引き起こす。
【００８８】
本発明は、追加の蛋白質分解開裂部位が第１蛋白質又はポリペプチドコーディング配列（第１又は５’ＯＲＦ）と発現させた蛋白質産生物において存在する自己プロセッシング開裂部位誘導アミノ酸残基の除去手段としての自己プロセッシング開裂部位との間に供給されるように改変した、発現構築物を含む。
【００８９】
追加の蛋白質分解開裂部位の例はコンセンサス配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）を持つフリン開裂部位であり、当該部位はフリン及びその他のセリンプロテアーゼのような内在性のサブリチン様プロテアーゼによって開裂され得る。実施例６に示されるように、当該発明者は、第１発現蛋白質のＣ末端における自己プロセッシング２Ａアミノ酸残基が、当該第１ポリペプチドと自己プロセッシング２Ａアミノ酸残基との間にフリン開裂部位ＲＡＫＲ（配列番号３８）を導入することにより十分に除去できることを証明した。加えて、２Ａ配列及び当該２Ａ配列に隣接するフリン開裂部位を含むプラスミドの使用は、２Ａ配列だけを含むプラスミドの場合と比べてより高い蛋白質発現レベルをもたらすことが明らかとなった。この改良は、２Ａアミノ酸残基が当該蛋白質のＣ末端から除去されるとき、より長い２Ａ−又は２Ａ様配列又は他の自己プロセッシング配列が使用され得るといった状況において、さらなる利点を提供する。
【００９０】
治療用の蛋白質、ポリペプチド、その断片又は類似体であり全てのヒト特徴を有すものの産生は、しばしば有利である。これらの試薬は、蛋白質、ポリペプチド、その断片又は類似体であり異なる種から生じるものによって導かれる望まれない免疫応答を避ける。自己プロセッシングペプチド由来のアミノ酸残基に対する宿主免疫応答に立ち向かうために、蛋白質分解開裂部位のコーディング配列が、第１蛋白質の当該コーディング配列と自己プロセッシングペプチドのコーディング配列との間に挿入され（本分野において知られる標準的な方法論を用いる）、その結果当該自己プロセッシングペプチドが当該発現蛋白質又はポリペプチドから除去されるようにし得る。これは、生体内の使用のための治療用及び診断用の蛋白質及びポリペプチドにおいて特に有用である。
【００９１】
組換えＤＮＡ技術を使用し発現させた本分野において知られるいかなる追加の蛋白質分解開裂部位でも、本発明の実施において使用し得る。ポリペプチド又は蛋白質コーディング配列と自己プロセッシング開裂部位との間に挿入できる例示的な追加の蛋白質分解開裂部位は、これに限定されるわけではないが以下のもの：
ａ）フリンコンセンサス配列又は部位：ＲＸＫ（Ｒ）（配列番号１０）
ｂ）Ｘａ因子開裂配列又は部位：ＩＥ（Ｄ）ＧＲ（配列番号１１）
ｃ）シグナルペプチダーゼＩ開裂配列又は部位：例えばＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡ（配列番号１２）
ｄ）トロンビン開裂配列又は部位：ＬＶＰＲＧＳ（配列番号１３）
を含む。
【００９２】
蛋白質コーディング配列
本明細書における”第１蛋白質コーディング配列”とは、ポリペプチド又は蛋白質分子又はドメイン又はその鎖であり、これに限定されるわけではないが以下のもの、抗体又は免疫グロブリン分子又はその断片の鎖、サイトカイン又はその断片、成長因子又はその断片、第VIII因子分子の鎖、可溶性又は膜結合受容体又はその断片、ウイルス性の蛋白質又はその断片、免疫原性の蛋白質又はその断片、転写制御因子又はその断片、アポトーシス促進性の分子又はその断片、ガン抑制因子又はその断片、血管形成阻害剤又はその断片などを含むものをコードする異種核酸配列をいう。
【００９３】
本明細書における”第２蛋白質コーディング配列”とは、以下のもの：ポリペプチド又は蛋白質分子又はドメイン又はその鎖であり、これに限定されるわけではないが以下のもの、抗体又は免疫グロブリン分子又はその断片の鎖、サイトカイン又はその断片、成長因子又はその断片、第VIII因子分子の鎖、可溶性又は膜結合受容体又はその断片、ウイルス性の蛋白質又はその断片、免疫原性の蛋白質又はその断片、転写制御因子又はその断片、アポトーシス促進性の分子又はその断片、ガン抑制因子又はその断片、血管形成阻害剤又はその断片などを含むものをコードする異種核酸配列をいう。
【００９４】
本発明におけるベクター構築物は、複数の導入遺伝子又は異種由来のコーディング配列、例えば、第１蛋白質コーディング配列、第２蛋白質コーディング配列、第３蛋白質コーディング配列などを含み得る。多数の導入遺伝子は、本発明の実施に使用される可能性があり、これに限られることはないが以下に記載される複数の蛋白質をコードするヌクレオチド配列又はその断片を含み得る。
【００９５】
１．ＨＩＦ−１α及びＨＩＦβ（ＨＩＦ）、ｐ３５およびｐ４０（ＩＬ−１２）、インスリンのＡ鎖およびＢ鎖、これに限られないがアルファＶベータ３又はアルファＶベータ５のようなインテグリン、抗体の重鎖及び軽鎖及び第VIII因子の重鎖及び軽鎖をコードする配列
【００９６】
２．これに限られないが、ＴＮＴ  ｐ５５及びｐ７５受容体、ＩＬ−２受容体、ＦＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＴＩＥ２、ＩＬ−６受容体及びＩＬ−１受容体を含む可溶性受容体をコードする配列
【００９７】
３．これに限られないが、既に知られている又は最近発見されたサイトカイン、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＩＬ−２４、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ及びエリトロポエチンを含むサイトカインをコードする配列
【００９８】
４．これに限られないが、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、アンジオポエチン−１及び２、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、ＩＤＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−ベータを含む成長因子をコードする配列
【００９９】
５．これに限られないが、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｂｉｋ、カスパーゼ、ＦａｓＬ及びＴＲＡＩＬを含むアポトーシス促進性因子をコードする配列
【０１００】
６．ガン抑制蛋白質又は、これに限られないが、ｐ５３、ｐ１６、ｐ１９−ｐ２１、ｐ２７、ＰＴＥＮ、ＲＢ１を含む細胞周期制御因子をコードする配列
【０１０１】
７．これに限られないが、アンジオスタチン、エンドスタチン、ＴＩＭＰｓ、抗トロンビン、血小板第４因子（ＰＦ４）、可溶性型ＶＥＧＦＲ１（ドメイン１−７）及びＩｇＧ１、ＶＥＧＦ−トラップ、ＰＥＤＦ、ＰＥＸ、トロポニンＩ、トロンボスポンジン、タムスタチン、１６ＫｄプロラクチンのＦｃ分節と融合するＶＥＧＦＲ２（ドメイン１−７）を含む血管形成制御因子をコードする配列
【０１０２】
上記生物学的な活性分子をコードするクローン化された配列及び全長ヌクレオチドは、本分野において周知の方法で手に入れることができる（Sambrook et al.,1989）。一般的には、当該核酸コーディング配列は知られており、公共のデータベース及び／又は科学的出版物から入手し得る。
【０１０３】
異種蛋白質及びポリペプチドのコーディング配列の相同体及び変異体は、公共のデータベース及び／又は自己プロセッシング開裂配列として上記されたような既知の核酸配列とのストリンジェント条件下における選択的ハイブリダイゼーションにおいて入手できる既知の核酸配列との“配列同一性”又は“％相同性”を基本とした本発明の範囲に含まれる。異種蛋白質及びそれらをコードするポリペプチドアミノ酸配列及び核酸配列は、さらに本発明の範囲に含まれる。そのような配列は、上記自己プロセッシング開裂配列のように、公に有用なデータベース及び配列比較プログラムを使用して既知の配列との“配列同一性”を基本として同定され得る。
【０１０４】
蛋白質発現
治療用の蛋白質の高レベル発現は、遺伝子組み換えヤギのミルクにおいてうまく証明されている。例としてモノクローナル抗体を取り上げるとき、抗原結合レベルは、通常の細胞培養技術を使用して産生されたモノクローナル抗体の結合レベルと同程度であったことが明らかとなっている。この方法は、そのミルクにおいてヒト治療用蛋白質を発現することを動物に許容している遺伝情報を保有する、遺伝子組み換え動物のミルク中のヒト治療用蛋白質の開発に基づくものである。いったん産生されれば、これらの組換え蛋白質は、標準的技術を使用し効率よく精製され得る。例えば、Pollock,D.P.et al.,Journal of Immunological Methods.231:147-157,1999及びYoung,M.W.et al.,Res Immunol.Jul-Aug;149(6):609-610,1998を参照のこと。遺伝子組換え動物からの動物ミルク、卵白、血液、尿、精漿、及びカイコの繭は、工業的規模での組換え蛋白質の産生のための源としての潜在性が証明されている（Houdebine LM,Curr Opin Biotechnology,13:625-629,2002;Little M et al.,Immunol Today,21(8):364-70,2000;及びGura T,Nature,417:584-586,2002）。本発明は、本発明における自己プロセッシング開裂部位をコードするベクターを使用した組換え蛋白質又はポリペプチドの発現のための遺伝子組換え動物発現システムの使用を想定している。
【０１０５】
アグロバクテリウム属の感染により形質転換させた米、遺伝子組換えタバコ植物の種子における組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの発現及び植物における一本鎖抗体の発現を非制限的に含む植物における組換え蛋白質の産生も首尾よく証明されている。例えば、Steatfield SJ,Howard JA,Int J Parasitol.33(5-6):479-93,2003;Schillberg S.et al.,Cell Mol Life Sci.60(3):433-45,2003;Pogue GP et al.,Annu Rev Phytopathol.40:45-74,2002;及びMcCormick AA et al.,J Immunological Methods,278(1-2):95-104,2003を参照のこと。本発明は、本発明における自己プロセッシング開裂部位をコードするベクターを使用した組換え蛋白質又はポリペプチドの発現のための遺伝子組換え植物発現システムの使用を想定している。
【０１０６】
昆虫細胞で結合されるバキュロウイルスベクター発現システムもまた、組換え蛋白質産生物の現実的なプラットフォームとして進歩している。バキュロウイルスベクター発現システムは、培養の容易さ及びより高い発現レベルのような、哺乳類細胞培養発現システムに関連した利点を提供すると報告されている。例えば、Ghosh S.et al.,Mol Ther.2002 Jul;6(1):5-11,2002及びIkonomou L et al.,Appl Microbiol Biotechnol.62(1):1-20,2003を参照。本発明は、本発明における自己プロセッシング開裂部位をコードするベクターを使用した組換え蛋白質又はポリペプチドの発現のためのバキュロウイルスベクター発現システムの使用をさらに想定している。
【０１０７】
酵母系は、本発明における自己プロセッシング開裂部位をコードするベクターを使用した組換え蛋白質又はポリペプチドの発現のためにも使用され得る。例えば、Stuart,WD(1997):“ヘテロカリオンにおいて産生される異種由来の二量体蛋白質”;US Patent No.5,643,745を参照のこと。
【０１０８】
自己プロセッシングペプチドを単独で又は蛋白質分解開裂部位のための追加のコーディング配列とともに含む本発明のベクターは、本分野において知られる多くの蛋白質発現システム及びここに記載されている当該システムの例といった、いかなる蛋白質発現システムにおいても、組換え蛋白質及びポリペプチドの発現における有用性があることがわかるであろう。
【０１０９】
発現後、組換え蛋白質は、本分野において知られる標準的技術を使用し当該培養から回収される。組換え蛋白質自身の当該産生及び回収は、本分野において知られる多くの例のような様々な方法で達成できる。例えば、組換え蛋白質、ポリペプチド、類似体又はその断片は、宿主細胞が結果として当該コーディング配列の発現を生じるのに適した培養条件下、当該加工した組換え宿主細胞の培養によって行われる。当該発現の成功をモニターするために、組換え蛋白質又はポリペプチドのレベルは、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロットなどの標準的技術を使用してモニターされる。
【０１１０】
当該組換え蛋白質の精製型は、例えばアフィニティークロマトグラフィーといった本分野において知られる標準精製技術によって、当然容易に用意される。組換え蛋白質は、サイズ限定膜フィルトレーションのような他の技術とともに、イオン交換又はサイズ排除カラムのような従来のクロマトグラフィーを使用しても精製し得る。当該発現システムは、当該結果物としての組換え蛋白質が培地に分泌されるためにシグナルペプチドを含むように好んでデザインされる、しかしながら、細胞内産生にもまた使用可能である。
【０１１１】
本発明の実施可能性は、本発明（実施例１）の当該自己プロセッシング開裂配列を含むベクターを使用する血小板第４因子（ＰＦ４）及びＶＥＧＦ−トラップの発現によってさらに証明されている。自己プロセッシング開裂配列の使用に関する利点は、追加の蛋白質分解開裂部位を第１蛋白質又はポリペプチドの当該コーディング配列と本発明のベクターにおける当該自己プロセッシング開裂配列との間に含むことにより結果として当該自己プロセッシング開裂配列と関連するアミノ酸残基の除去を生じることによって、強調される。当該発明のベクターにおけるフリン開裂部位の組み入れによる２Ａ残基の効果的な除去は、実施例６及び７において証明されている。
【０１１２】
Ａ．血小板第４因子（ＰＦ４）及びＶＥＧＦ−トラップ
血小板第４因子（ＰＦ４）は、ケモカインのＣＸＣファミリーのメンバーであり、強力な試験管内における内被細胞増殖阻害剤及び強力な生体内における血管形成阻害剤であることが明らかである（Maione,TE et al.Science 237:77-79,1990）。さらに、組換えＰＦ−４はＢ１６Ｆ１０メラノーマ及びＨＣＴ大腸ガン細胞の成長を阻害することが明らかになっている（Sharpe,RJ et al.J.Natl.Cancer Inst.82:848-853,1990,Kolber et al.J.Natl.Cancer Inst.87:304-309,1995）。ＰＦ−４（ｓＰＦ−４）分泌型のアデノウイルスの又はレトロウイルスのデリバリーは、血管形成依存的メカニズムを通してラットＲＴ２及びヒトＵ８７ＭＧグリオ細胞腫の成長を阻害することがさらに明らかとなっている（Tanaka et al.,Nat.Med. 3:437-442,1997）。ＰＦ−４は、ＦＧＦ−２の結合及び受容体へのＶＥＧＦの結合を妨害することによって血管形成をブロックしていると思われる（Perollet,C.Blood 91:3289-3299,1998、Gengrinovitch et al,J.Biol.Chem.270:15059-15065,1995）。
【０１１３】
ＶＥＧＦ−トラップは、当該シグナル配列及びＶＥＧＦＲ２のドメイン３に付着したＶＥＧＦＲ１のドメイン２及びヒト  ＩｇＧ  Ｆｃ領域から構成されている（Holash et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.99(17):11393-8,2002;）。それぞれの当該ドメインは下記のオリゴヌクレオチドを使用して別々にＰＣＲ増幅され、当該結果産生物は当該最終ヌクレオチド配列を産生するためにＳＯＥ−ＰＣＲ法によって融合される。ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２の当該ヌクレオチド配列は、ｐＢＬＡＳＴ−ｈＦＬＴ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）及びｐＢＬＡＳＴ−ｈＦＬＫ１（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）のプラスミドから手に入れられる。
【０１１４】
Ｂ．第VIII因子
血友病Ａは、血液凝固因子VIIIにおける欠乏又は機能欠損によって特徴付けられるＸ染色体連鎖の劣性出血遺伝疾患である。米国には２０,０００人の血友病Ａ患者がおり、過酷に発症した個人のための治療コストは年間１００,０００に達している。第VIII因子がなければ、患者はちょっとした引っかき傷や切り傷によって重篤な血液不足を経験し得る。血友病による症状の重症度は、血液中の凝固因子の量に関係する。もし血友病患者の循環する第VIII因子のレベルが通常の第VIII因子のレベルの５％増加したならば、傷害又は手術後を除いた稀な出血において症状は穏やかとなる。血友病患者が直面している最も重要な難題は、治療に使用される産生物の有用性、コスト及び安全性である。第VIII因子濃縮物由来血漿は、１９７０年代及び１９８０年代大規模に使用されていた。不運なことに、これらの血漿は、重大なウイルス混入のリスクを有していた。第VIII因子は、現在いくつかの異なった組換え型式において手に入れられるが、治療は、その有効性、生体内半減期、及び処置の高コストによって限定されている。当該組換え第VIII因子産生物は、自然の全長組換え第VIII因子型及びＢドメイン欠失組換え第VIII因子型を含む。
【０１１５】
血漿中に第VIII因子は、様々なサイズの９０−２００ｋＤａ重鎖及び８０ｋＤａ軽鎖の金属イオンヘテロ二量体として存在する。成熟第VIII因子蛋白質は、６つのドメインすなわちＡ１（１−３３６残基）、Ａ２（３７２−７１０）、Ｂ（７４１−１６４８）、Ａ３（１８９６−２０１９）、Ｃ１（２０２０−２１７２）、Ｃ２（２１７２−２３３２）の整列した２３３２アミノ酸を含む。当該重鎖は当該Ａ１、Ａ２及びＢドメインをコードし、一方当該軽鎖は当該Ａ３、Ｃ１及びＣ２ドメインをコードする。当該第VIII因子蛋白質は高グリコシル化されており、その内１９はＢドメインに存在する、Ｎ連結グリコシル化のためのコンセンサス部位を２５含む。当該Ｂドメインはトロンビンによる活性状態において蛋白質分解的に放出され、試験管内及び生体内において第VIII因子凝血原活性を必要とされない（Lenting,P.J.,et al(1988)Blood 92 11,3983-3996）。第VIII因子Ｂドメイン欠失型の多くが産生されている。通常の第VIII因子構築物は、そのＢドメインが完全に除去されているか又は１−４Ａｒｇ残基が置き換わっているものを含む（Lind,P.,et al.Eur J Biochem 232 1,19-27,1995）。当該Ｂドメインの除去は蛋白質活性における有害な効果は全くなく、その結果第VIII因子のレベルは約２０倍増加となる（Pittman et al.,Blood 81:2925-2935,1993）。
【０１１６】
遺伝子治療は血友病Ａの新しい治療方法の約束を提供すると考えられていた。けれども、遺伝子デリバリー技術を使用した第VIII因子発現の多くのリポートが科学的文献に見いだせ得るが、当該蛋白質の治療レベルの産生には挑戦が残ったままである（Vandendriessche et al.,J.Thromb.Haemost.1:1550-1558,2003）。
【０１１７】
本発明は、改良ベクター及び第VIII因子又はそこからの機能的変異体の発現方法を提供する。当該方法は、生体内、試験管内、又は生体外で細胞への当該第VIII因子ポリペプチド又はその機能的変異体及び自己プロセッシング開裂部位をコードする核酸構築物の安定導入を含む。第VIII因子をコードする当該核酸配列は、ゲノムＤＮＡ又は相補ＤＮＡを含み得る。この方法には多くの応用があり、血友病Ａの予防的な又は急性な治療において使用される組換え第VIII因子の製造が含まれる。他の応用は、例えばＡＡＶ又はレンチウイルスベクターを使用する、患者への生体内及び生体外における第VIII因子のデリバリーを含む。当該第VIII因子の遺伝子を含むＡＡＶベクターの例が、図３に示されている。
【０１１８】
本発明は、なんらかの特異的な第VIII因子配列又は遺伝子デリバリーメカニズムに限られることを意図していない。多くの第VIII因子の自然型及び組換え型が同定され特徴付けられている。そのゆえ、既知の又は最近発見された、本発明の当該ベクター及び当該方法を使用して発現可能な生物学的活性のある第VIII因子をコードするＤＮＡ配列も本発明の範囲に含まれる。第VIII因子の天然型及び組換え型の例は、以下に限られることはないが、High KA,Semin Thromb Hemost.2003 Feb;29(1):107-20;Thompson AR.Semin Thromb Hemost.2003 Feb;29(1):11-22;Sandberg H et al.,Semin Hematol.2001 Apr;38(2 Suppl 4):4-12;Brinkhous K et al., Semin Thromb Hemost.2002 Jun;28(3):269-72;Osterberg T et al.,Semin Hematol.2001 Apr;38(2 Suppl 4):40-3;Kjalke M et al.,Eur J Biochem.1995 Dec 15;234(3):773-9;Lind P et al.,Eur J Biochem.1995 Aug 15;232(1):19-27;Sandberg et al.,XXth lnt.Congress of the world Fed.Of Hemophilia(1992);US Pat.Nos.6,649,375;6,649,375;6,642,028;6,599,724;6,518,482;6,517,830;6,458,563;6,376,463;6,358,703;6,358,236;6,320,029;6,271,025;6,251,632;6,221,349;6,200,560;6,180,371;PCT Publication Nos.WO 03/100053;WO03/087161;WO03/080108/;WO03/047507;WO03/031598;WO02/072023;WO02/24723;WO01/68109;WO01/45510;WO01/27303;WO01/03726;WO00/71141;WO00/23116;WO99/61642;WO99/61595;WO99/46299;WO99/46274;及びWO97/49725を含む特許及び科学的文献において見つけ得る。
【０１１９】
第VIII因子核酸及びアミノ酸配列の相同体及び変異体は、自己プロセッシング開裂配列について上記したように、公共のデータベース及び／又は核酸配列の場合におけるストリンジェント条件下の選択的ハイブリダイゼーションで手に入れられる既知の核酸配列との“配列同一性”又は“％相同性”を基本とした本発明の範囲に含まれる。
【０１２０】
自己プロセッシングペプチドのコーディング配列を単独で又は追加の蛋白質分解開裂部位とともに含む本発明の当該ベクターは、本分野において知られている及びここに記載された例といった、いかなる蛋白質発現システムにおいても、組換え第VIII因子の発現における有用性を有する。
【０１２１】
組換え第VIII因子は、当業者によって日常的に使用される標準的技術によって、試験管内で発現させた場合は培養液から、又は生体内で発現させた場合には血漿又は他の体液から回収される。免疫測定法（例えばＥＬＩＳＡ）及び凝析測定法のような方法は第VIII因子の産生及びその生物学的活性を評価する際に典型的に使用されるが、本発明はいかなる特別な評価方法にも限定することを意図していない。
【０１２２】
Ｃ．免疫グロブリン及びその断片
抗体は、重鎖及び軽鎖のヘテロ二量体である免疫グロブリン蛋白質であり、哺乳類の培養発現システムにおいて単一のベクターから全長型で発現させることが困難であると証明されている。現在脊椎動物の抗体産生のために、以下の３つの方法、“ポリクローナル”抗体産生のための生体内動物の免疫化、モノクローナル抗体産生のための試験管内Ｂ細胞融合細胞種の細胞培養（Kohler,et al.,Eur.J.Immunol.,6:511,1976;Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988）及び組換えＤＮＡ技術（例えば、Cabilly et al.,US Pat.No.6,331,415に記載されている）が使用されている。
【０１２３】
免疫グロブリンポリペプチドの基本的分子構造は、分子量約２３,０００ダルトンの２つの同一の軽鎖及び分子量約５３,０００〜７０,０００ダルトンの２つの同一の重鎖を含み、当該４つの鎖が“Ｙ”配置にジスルフィド結合によって結合していることが知られている。当該アミノ酸配列は、当該Ｙの頂点にあるＮ末端から各鎖の底にあるＣ末端へ走っている。Ｎ末端は、抗原結合の特異性のための（約１００アミノ酸残基の長さの）可変領域である。
【０１２４】
本発明は、これに限られないが、全長抗体及び天然配列（すなわち抗原による刺激に応答し産生される配列）を有する抗体断片、安定した折り畳み構造をとるポリペプチド一本鎖において当該重鎖と当該軽鎖双方の抗原結合可変領域を組み合わせた単鎖抗体；（第２重鎖のＦｃ領域に結合する重鎖／軽鎖二量体を含む）一価抗体；すなわち当該“Ｙ”の側鎖、軽鎖か重鎖のどちらか単独又はその一部である当該免疫グロブリン分子の全長“Ｙ”領域を含む“Ｆａｂ断片”、（すなわち、一般にＦａｂ’として知られている１つの重鎖及び１つの軽鎖の凝集）；複数の異なる抗原に対し特異性を有する“複合型免疫グロブリン”（例えば、クアドローマ又はU.S.Patent No.6,623,940において例として記載されている二重特異性抗体）；異なる種又は特異性から擬態した重鎖及び軽鎖を含む“複合体の免疫グロブリン”；及び当該重鎖及び当該軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれ一部が複数の種由来である（すなわち、可変領域がマウス抗体のような１つの源由来であり、一方定常部がヒト抗体由来のようなもう１つの源由来である）”キメラ抗体”を含む全タイプの免疫グロブリンの産生のための改良された方法を提供する。
【０１２５】
本発明の組成物及び方法は、重鎖又は軽鎖が“哺乳類の”“キメラの”である又はその有効性を強化するためにある意味改造した、免疫グロブリン又はその断片の産生において有用である。改造された抗体は、改造されていない型と同様の生物学的活性を保持するアミノ酸及び核酸配列変異体と当該活性が変化するために、すなわち、膜において補体の固定化、相互作用及びその他の効果的な機能を改良した定常部における変化又は抗原結合の特徴を改良した可変領域における変化するために改造されたアミノ酸及び核酸配列変異体の双方を含む。本発明における当該組成物及び方法は、触媒的な免疫グロブリン又はその断片をさらに含む。
【０１２６】
“変異体”免疫グロブリンがコードするポリヌクレオチド配列は、基準ポリペプチド配列から複数のアミノ酸が変化した“変異体”免疫グロブリンアミノ酸配列をコードし得る。当該変異体ポリヌクレオチド配列は、“保存的”置換を含む変異体アミノ酸配列をコードし得、そこでは、当該置換されたアミノ酸は置き換えられたアミノ酸と似たような構造的又は化学的な特質を有する。加えて、又は二者択一的に、当該変異体ポリヌクレオチド配列は、“非保存的”置換を含む変異体アミノ酸配列をコードし得、そこでは、当該置換されたアミノ酸は置き換えられたアミノ酸と異なる構造的又は化学的特質を有する。変異体免疫グロブリンがコードするポリヌクレオチド配列は、アミノ酸挿入又は欠損又はそれら両方を含む変異体アミノ酸配列をコードし得る。さらに、変異体“免疫グロブリンがコードするポリヌクレオチド”は、当該基準ポリヌクレオチドと同様のポリペプチドをコードし得るが、遺伝子暗号の縮重に起因して基準ポリヌクレオチド配列から複数塩基が変化したポリヌクレオチド配列を有し得る。
【０１２７】
用語“断片”は、本発明の組換え免疫グロブリンについて述べるとき、対応する全長免疫グロブリン蛋白質のアミノ酸配列の全てでなく一部と同様であるアミノ酸配列を有し、当該対応する全長蛋白質と同様の本質的な生物学的機能又は活性を保持するか又は当該対応する全長蛋白質の機能又は活性の少なくとも１つを保持するかのどちらかであるポリペプチドを意味する。当該断片は、好ましくは当該全長免疫グロブリンの少なくとも２０〜１００近接アミノ酸残基を含む。
【０１２８】
治療様式としての抗体の可能性は、産生許容量及び現在の技術の過剰なコストによって限定されている。免疫グロブリン産生のための改良されたウイルス性の又は非ウイルス性の単一発現ベクターは、複数のコーディング配列、すなわち、単一ベクターからの二重特異性又は多重特異性の免疫グロブリンの発現及びデリバリーを可能にし得る。本発明は、これらの限界に取り組み、一本鎖抗体、全長抗体又は抗体断片のような操作された抗体を含む、ここにさらに詳細を記載したいかなる免疫グロブリン（すなわち抗体）又はその断片にも適用できる。
【０１２９】
抗体産生
本発明の１つの例において、蛋白質又はポリペプチドの第１又は第２鎖のコーディング配列は、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＡといった、いかなる免疫グロブリンの重鎖又はその断片のコーディング配列である。二者択一的に、蛋白質又はポリペプチドの第１又は第２鎖のコーディング配列は、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＡといった、いかなる免疫グロブリンの軽鎖又はその断片のコーディング配列である。例えば、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）及びＦ（Ｆａｂ’）2である断片のような、その改良型又は由来型だけでなく全ての抗体分子の遺伝子は、本発明の範囲に含まれる。当該抗体及び断片は、動物由来の、ヒト−マウスキメラの、ヒト化の、ＤｅｌｍｍｕｎｉｚｅｄTMの又は完全にヒトのでもよい。当該抗体は、二重特異性であり、これに限られないがダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）、クアドローマ、ｍｉｎｉ−抗体、ＳｃＢｓ抗体及びｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ型抗体を含む。
【０１３０】
本発明の実施において、組換えＤＮＡ技術を使用する抗体又は変異体（類似体）又はその断片の産生は、結果として当該コーディング配列の発現の生じる宿主細胞の成長に適した培養条件下、改良した組換え宿主細胞の培養によって達成し得る。発生の成功をモニターするために、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロットなどのような標準的技術を使用して、抗原に関する抗体レベルがモニターし得る。当該抗体は、本分野において知られている標準的な技術を使用して当該培養上清から回収される。これらの抗体の精製型は、標準精製技術、例えば、蛋白質Ａ、蛋白質Ｇ又は蛋白質Ｌカラムを介した、又は特定の抗原又は特異性が望まれる当該抗原の特定のエピトープへの結合を基本としたアフィニティークロマトグラフィーによって当然容易に用意され得る。抗体は、硫安沈殿及びサイズ限定膜フィルトレーションのような他の技術と組合った、イオン交換又はサイズ除外カラムのような従来のクロマトグラフィーによっても精製され得る。好まれる発現システムは、精製の容易性を許容するために、当該結果物としての抗体が培養液又は上清に分泌するためシグナルペプチドを含むように好んでデザインされる、しかしながら、細胞内産生にもまた使用可能である。
【０１３１】
ヒトＩｇ遺伝子座において操作されたマウスから抗原特異的完全ヒトモノクローナル抗体を産生又は選択することは、以前に示されている（Jakobovits A.et al.,Advanced Drug Delivery Review Vol.31,pp:33-42(1998);Mendez M,et al.,Nature Genetics Vol.15,pp:146-156(1997);Jakobovits A.et al.,Current Opinion in Biotechnology Vol.6,No.5,pp:561-566(1995);Green L,et al.,Nature Genetics Vol.7,No.1,pp:13-21(1994)）。
【０１３２】
当該抗体自身の産生及び回収は、本分野において知られている様々な方法で達成することができる（Hrrlow et al.,“Antibodies、A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Lab,1988）。
【０１３３】
本発明の実施における使用のためのベクター
本発明は、蛋白質発現を生じさせるために細胞内へ、複数のポリペプチド又は蛋白質のコーディング配列又は自己プロセッシング開裂配列を含む構築物を誘導するための様々なベクターの使用のうちいくつかを想定した。発現ベクターの多くの例は本分野において知られており、ウイルス性の又は非ウイルス性の起源の例である。本発明の実施において使用され得る非ウイルス性の遺伝子デリバリー方法論は、これに限られないが、リポソーム、核酸／リポソーム複合体、カチオン性の脂質などを含む。
【０１３４】
ウイルス性のベクターは、効果的に細胞に形質導入し、自身のＤＮＡを宿主細胞に誘導する。組換えウイルスベクターの産生において、非本質的遺伝子は、着目の蛋白質又はポリペプチドをコードする遺伝子において、置き換えられる。見本のベクターは、ウイルス性の又は非ウイルス性のベクターに限られず、レトロウイルス性ベクター（レンチウイルス性ベクターを含む）、複製組成物、その複製欠陥及びガットレス型を含むアデノウイルス（Ａｄ）性のベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシパピローマベクター、エプスタイン・バーベクター、ヘルペスベクター、ワクシニアベクター、モロニーマウス白血病ベクター、ハーヴェイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳腺癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクター及び非ウイルス性プラスミドのようなものを含む。
【０１３５】
当該ベクターは典型的に複製起点を含み、加えて、当該ベクターが同定され又は選択され得る“マーカー”又は“選択マーカー”機能を含むかもしれないし含まないかもしれない。いかなる選択マーカーも使用できるが、組換えベクターにおいて使用する選択マーカーは一般的に知られており、選択マーカーの適切な選択は宿主細胞に依存するであろう。抗生物質又はその他の毒に対する耐性を与える蛋白質をコードする選択マーカー遺伝子の例は、これに限られず、アンピシリン、メトトレキセート、テトラサイクリン、ネオマイシン（Southem et al,.J.,J Mol Appl Genet.1982;1(4):327-41(1982)）、ミコフェノール酸（Mulligan et al.,Science 209:1422-7(1980)）、ピューロマイシン、ゼオマイシン、ハイグロマイシン（Sugden et al.,Mol Cell Biol.5(2):410-3(1985)）及びＧ４１８を含む。当業者は理解されているであろうが、発現ベクターは典型的に、当該コーディング配列が発現されるのに適するよう、複製起点、リボソーム結合部位だけでなく発現させるための１つの又は複数のコーディング配列に作用可能な状態で連結するプロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終結配列を含む。
【０１３６】
“組換え”としてのベクター又は他のＤＮＡ配列を言及することは、独立している典型的に作用可能な状態はなく自然界にも見られない、典型的ＤＮＡ配列の作用可能な状態での連結を単に意味する。当該発現及び／又はコントロール配列が転写及び適切な核酸配列の翻訳を調節しているとき、調節（発現及び／又はコントロール）配列は、核酸コーディング配列に作用可能な状態で連結している。このように、発現及び／又はコントロール配列は、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、コーディング配列に対する５’ 開始コドン（すなわちＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル及びストップコドンを含み得る。
【０１３７】
アデノウイルスの遺伝子治療ベクターは強い一過性発現、非常に高い力価及び生体内における分裂又は非分裂細胞に遺伝子導入する能力を示すことが知られている（Hitt et al.,Adv in Virus Res 55:479-505,2000）。本願発明の組換えＡｄベクターは、以下の：（１）当該ベクターを複製欠陥Ａｄビリオンに組込めるようにするパッケージング部位；（２）着目の複数の蛋白質又はポリペプチドとしてのコーディング配列；（３）自己プロセッシング開裂部位を単独で又は追加の蛋白質分解開裂部位とともにコードする配列を含む。感染したウイルス粒子へ組み込むのに必要な又は助けとなる他の配列（エレメント）は、当該５’及び３’Ａｄ  ＩＴＲｓ、当該Ｅ２遺伝子、当該Ｅ４遺伝子の一部、及び任意に当該Ｅ５遺伝子を含む。
【０１３８】
本願発明の当該組換えＡｄベクターを包み込む複製欠損Ａｄウイルス粒子は、Ａｄパッケージング細胞及びパッケージング技術を使用して本分野において知られる標準的技術によって作製される。これらの方法の例は、例えば、U.S.Patent NO.5,872,005で見つけられる。着目の複数のポリペプチド又は蛋白質のコーディング配列は、当該ウイルスゲノムのＥ３領域を欠失させた状態において、一般にアデノウイルスに挿入される。本発明の実施において使用のための好ましいアデノウイルス性のベクターは、複数の野生型Ａｄ遺伝子、例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２、Ｅ３、及びＥ４を発現しない。好ましい態様は、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４及び任意の当該Ｅ３遺伝子領域の機能を補完するパッケージング細胞系とともに典型的に使用されるウイルス粒子である。例えば、米国特許番号第5,872,005号、5,994,106号、6,133,028号及び6,127,175号を参照のこと。
【０１３９】
このように、本明細書における“アデノウイルス”及び“アデノウイルス粒子”とは当該ウイルス自身及びその派生物をいい、別な方法で指示したときを除き、全ての血清型及び亜類型及び自然発生型及び組換え型の双方をカバーする。そのようなアデノウイルスは野生型となり得、又は本分野において知られる又はここに記載されているような様々な方法で改造され得る。そのような改造は、感染性のウイルスを作製するために当該粒子においてパッケージされるアデノウイルスゲノムの改造を含む。そのような改造は、当該Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３又はＥ４コーディング領域の１つ又は複数の欠失のような、本分野において知られる欠失を含む。例示的なパッケージング及びプロデューサー細胞は、２９３、Ａ５４９又はＨｅＬａ細胞由来である。アデノウイルスベクターは、本分野において知られる標準的な技術を使用し精製され処方される。
【０１４０】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、染色体形成によって潜在的に細胞に感染できるヘルパー依存的ヒトパルボウイルスである。その染色体性形成能力及び非病原性の性質のために、ＡＡＶは、ヒト遺伝子治療ベクターとして重大な潜在性を有している。本発明の実施において使用するために、ｒＡＡＶウイルス粒子は当業者に知られる標準的な方法論を用いて産生され、転写方向に作用可能な状態で連結させた組成物として、転写開始及び終結配列及び着目の当該コーディング配列を含むように構築された。より特異的に、本願発明の当該ＡＡＶベクターは、以下の；（１）当該ベクターを複製欠損ＡＡＶウイルス粒子に組み入れられるようにするパッケージング部位；（２）着目の複数の蛋白質又はポリペプチドのコーディング配列；（３）自己活性部位を単独で又は追加の蛋白質分解開裂部位とともにコードする配列を含む。本発明の実施における使用のためのＡＡＶベクターは、転写方向に作用可能な状態で連結させた組成物として、転写開始及び終結配列を含むコントロール配列も含む。これらの組成物は、機能的ＡＡＶ  ＩＴＲ配列によって５’末端及び３’末端に隣接されている。“機能的ＡＡＶ  ＩＴＲ配列”とは、当該ＩＴＲ配列が手助けのために意図された当該ＡＡＶウイルス粒子の複製及びパッケージングの役目を果たすことを意味する。
【０１４１】
組換えＡＡＶベクターもまた、当該ベクターが目的細胞における発現及び着目の選択された組換え蛋白質又はポリペプチドの産生を方向付け得ることにおいて特徴付けられる。このように、当該組換えベクターは、キャップシドの形成及び当該組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子の感染のための物理的構造のために、ＡＡＶ必須の配列の全てを少なくとも含む。それ故、本発明のベクターにおける使用のためのＡＡＶ  ＩＴＲｓは、必ずしも野生型ヌクレオチド配列を有さず（例えば、Kotin,Hum.Gene Ther.,5:793-801,1994に記載されている）、挿入、欠損又はヌクレオチドの置換によって変化し得、又は当該ＡＡＶ  ＩＴＲｓは数種のＡＡＶ血清型の内のいくつかからの由来となり得る。一般的に、ＡＡＶベクターは、これに限られないが、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８などを含むアデノ随伴ウイルス血清型由来である。好ましいｒＡＡＶ発現ベクターは、野生型ＲＥＰ及び全て又は一部において欠失されたＣＡＰ遺伝子を有すが、機能的に隣接するＩＴＲ配列は保持している。
【０１４２】
典型的に、ＡＡＶ発現ベクターは、ＡＡＶヘルパー構築物の誘導によって起こるプロデューサー細胞に導入され、そこで当該ヘルパー構築物はプロデューサー細胞において発現され得るＡＡＶコーディング領域を含み当該ＡＡＶ発現ベクターにおけるＡＡＶヘルパー機能不存在を補完する。本明細書における、用語“ＡＡＶヘルパー機能”とは、当該ｒＡＡＶベクターから失われているＡＡＶウイルス性機能を補完するため、宿主細胞において発現されることを可能とするＡＡＶコーディング領域をいう。典型的には、当該ＡＡＶヘルパー機能はＡＡＶｒｅｐコーディング領域及びＡＡＶｃａｐコーディング領域を含む。当該ヘルパー構築物は、米国特許番号第6,548,286号に示されるように、典型的にはＡＴＧからＡＣＧまで５頁に続くスタートコドンを変異させることによって、当該大Ｒｅｐ蛋白質（Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８）の発現低下のためにデザインされ得る。
【０１４３】
プロデューサー細胞へのＡＡＶ発現ベクターの導入は、典型的にプロデューサー細胞へのヘルパーウイルス及び／又は追加のベクターの導入によって生じ、そこで、当該ヘルパーウイルス及び／又は追加のベクターは効果的なｒＡＡＶウイルス産生の補助を可能にする補助機能を提供する。
【０１４４】
“補助機能”とは、複製のためにＡＡＶによって必要とされるものの、当該ＡＡＶウイルス粒子自身によっては提供されない機能をいう。このように、これらの補助機能及び因子は、宿主細胞、ウイルス（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス又はワクシニアウイルス）によって、又は同じ細胞内で共発現する発現ベクターによって提供されなければならない。一般的に、アデノウイルスのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡコーディング領域は、ＡＡＶ複製及びパッケージングのために要求される必要な補助機能の供給のために使用される（Matsushita et al.,Gene Therapy 5:938(1998)）。
【０１４５】
当該プロデューサー細胞は、それからｒＡＡＶ産生のために培養される。これらのステップは、標準的方法論を使用して実施される。本発明における組換えＡＡＶベクターを包み込む複製欠損ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶパッケージング細胞及びパッケージング技術を使用して、本分野において知られる標準的技術によって作製される。これらの方法の例は、例えば、米国特許番号第5,436,146号;5,753,500号,6,040,183号,6,093,570号及び6,548,286号に記載されている。さらにパッケージングの組成物及び方法は、Wang et al.(US 2002/0168342)に記載され、当業者の知識を伴うこれらの技術を含む。ＡＡＶベクター及びＡＡＶヘルパー構築物の双方は、複数の任意の選択マーカー遺伝子を含むために構築され得る。適切な選択培地に対する抗生物質耐性又は感受性といった性質を与える選択マーカー遺伝子は、本分野において一般的に知られている。
【０１４６】
用語“ＡＡＶビリオン”は、“野生型”（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子（ＡＡＶキャップシド蛋白質コートに関連する直線的な、一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含む）のような完全なウイルス粒子をいう。対照的に、“組換えＡＡＶビリオン”及び“ｒＡＡＶビリオン”は、ＡＡＶ  ＩＴＲｓの両サイドに隣接する着目の異種由来ＤＮＡ配列を含む感染性のウイルス性粒子をいう。
【０１４７】
本発明の実施において、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生するための宿主細胞は、哺乳類細胞、昆虫細胞、微生物及び酵母を含む。宿主細胞は、当該ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子が宿主細胞に安定して維持されているパッケージング細胞又は当該ＡＡＶベクターゲノムが安定して維持されパッケージされたプロデューサー細胞にもなり得る。例示のパッケージング及びプロデューサー細胞は、２９３、Ａ５４９、又はＨｅＬａ細胞に由来する。ＡＡＶベクターは、本分野における標準的技術の使用によって精製され処方される。
【０１４８】
レトロウイルス性ベクターも遺伝子デリバリーのための共通の道具である（Miller,Nature 357:455-460,1992）。レトロウイルスベクター及び特にレンチウイルスベクターは、本発明の実施において使われ得る。従って、本明細書における用語“レトロウイルス”又は“レトロウイルスベクター”は、“レンチウイルス”及び“レンチウイルスベクター”それぞれを含む意味である。レトロウイルスベクターは、テストされ、目的細胞の広範囲なゲノムに着目遺伝子の安定導入のための適したデリバリー媒体として見出された。レトロウイルスベクターの細胞内に再編成されていない一本の複製導入遺伝子をデリバリーするための能力は、レトロウイルス性ベクターを細胞内に遺伝子を導入するために十分に適したものにする。さらに、レトロウイルスは宿主細胞の特異的細胞表面受容体へのレトロウイルス性エンベロープ糖蛋白質の結合によって宿主細胞に入る。したがって、コードされている元来のエンベロープ蛋白質が元来のエンベロープ蛋白質とは異なる細胞特異性を有する（例えば、元来のエンベロープ蛋白質と較べて異なる細胞表面受容体に結合する）異種蛋白質に置き換えられている偽型レトロウイルス性ベクターは、本発明の実施において有用性を見出されもする。特異的目的細胞へ複数の目的蛋白質コーディング配列をコードするレトロウイルスベクターのデリバリーを方向付ける能力は、本発明の実施において望むべくものである。
【０１４９】
本発明は、例えば、複数の導入遺伝子を含むレトロウイルス性導入ベクター及び複数のパッケージング配列を含むレトロウイルス性パッケージングベクターを含むレトロウイルスを提供する。特に、本発明は、偽型レトロウイルス産生のための異種由来又は機能的に改造されているエンベロープ蛋白質偽型レトロウイルスベクターを提供する。
【０１５０】
本発明のレトロウイルスベクターの当該コア配列は、例えばスプマウイルス及びレンチウイルスだけでなくＢ、Ｃ及びＤ型レトロウイルスを含む広範なレトロウイルスに容易に由来し得る（ＲＮＡ腫瘍ウイルス、第二版,Cold Spring Harbor Laboratory,1985）。本発明の当該組成物及び方法において使用に適したレトロウイルスの例は、限定するわけではないが、レンチウイルスを含む。本発明の当該組成物及び方法において使用に適したその他のレトロウイルスは、限定するわけではないが、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス及びラウス肉腫ウイルスを含む。好ましいマウス白血病ウイルスは、４０７０Ａ及び１５０４Ａ（Hartly and Rowe,J.Virol.19:19-25,1976）、エイブルソン（ATCC NO.VR-999）、フレンド（ATCC NO.VR-245）、グラッフィ、グロス（ATCC NO.VR-590）、カーステン、ハーヴェイ肉腫ウイルス及びラウスシャー（ATCC NO.VR-998）、及びモロニーマウス白血病ウイルス（ATCC NO.VR-190）を含む。そのようなレトロウイルスは、保管所又はアメリカンタイプカルチャーコレクション（“ＡＴＣＣ”；Rockville,Md）のようなコレクションから容易に手に入れ得、又は一般に入手可能な技術を使用して既存の源から単離し得る。
【０１５１】
好ましくは、本発明のレトロウイルスベクター配列はレンチウイルス由来である。好まれるレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、タイプ１又は２（すなわちＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２、ここでＨＩＶ−１は、以前、リンパ節腫脹関連ウイルス３（ＨＴＬＶ−III ）及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）関連ウイルス（ＡＲＶ）と呼ばれていた。）又は同定されＡＩＤＳ又はＡＩＤＳ様疾病に関連するＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２に関連するもう１つのウイルスである。他のレンチウイルスは、ヒツジ  ビスナ／maediウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウシレンチウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）を含む。
【０１５２】
当該組成物及び方法における使用のために適したレトロウイルスの当該様々な属及び系は、本分野においてよく知られている（例えば、B.N.Fields et al.の編集であるFields Virology,第３版、Lippincott-Raven Publishers(1996)を参照のこと、例えば、５８章  レトロウイルス科：The Viruses and Their Replication,Classification、１７６８−１７７１ページ、表１を含む、を参照のこと）。
【０１５３】
本発明は、プロデューサー細胞産生のためのレトロウイルス性パッケージングシステム及びレトロウイルスを作製するプロデューサー細胞系、及びそのようなパッケージングシステムの作製方法を提供する。したがって、本発明は、そのようなパッケージングシステムへのレトロウイルス性導入ベクターの導入によって産生されるプロデュサー細胞及び細胞系（例えば、遺伝子導入又は感染によって）、及びそのようなパッケージング細胞及び細胞系の作製方法をも提供する。
【０１５４】
本発明の当該パッケージングシステムは、少なくとも２つのパッケージングベクター、１つのｇａｇ遺伝子、１つのｐｏｌ遺伝子、又はｇａｇ遺伝子とｐｏｌ遺伝子を含む第１ヌクレオチド配列を含む第１パッケージングベクター及び異種由来の又は機能的に改造されたエンベロープ遺伝子を含む第２ヌクレオチド配列を含む第２パッケージングベクターを含む。好ましい態様として、当該レトロウイルス性配列は、ＨＩＶのようなレンチウイルス由来である。好ましい当該ベクターは、機能的ｔａｔ遺伝子及び／又は機能的補助遺伝子（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｎｅｆ）を欠損している。さらに好ましい態様としては、当該システムがさらにｒｅｖ遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む第３パッケージングベクターを含む。当該パッケージングシステムは、第１、第２及び任意の第３ヌクレオチド配列を含むパッケージング細胞という形で提供され得る。
【０１５５】
本発明は様々なシステムに応用可能で、当業者はレトロウイルスの異なるグループを横断して共有する共通配列を認識できるだろう。本記載では、代表的な例としてレンチウイルス性システムを使用する。しかしながら、全てのレトロウイルスは、表面の突出物をもつエンベロープで包まれたウイルス粒子の特徴を共有し、そしてそれは１つの直鎖上分子、ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡ、二量体を構成するゲノムを含むこと、及び共通蛋白質ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖといったを含んでいる。
【０１５６】
レンチウイルスは、当該ｅｎｖ遺伝子によってコードされているＳＵ（ｇｐ１２０）及びＴＭ（ｇｐ４１）；当該ｇａｇ遺伝子によってコードされているＣＡ（ｐ２４）、ＭＡ（ｐ１７）及びＮＣ（ｐ７−１１）；当該ｐｏｌ遺伝子によってコードされているＲＴ、ＰＲ及びＩＮといった当該エンベロープ糖蛋白質を含む、共通のいくつかの構造的ウイルス粒子蛋白質を共有している。ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２は、合成及びウイルスＲＮＡのプロセッシング及び他の複製的機能の調節に関わる補助及び他の蛋白質を含む。当該ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ／ｖｐｘ及びｎｅｆ遺伝子によってコードされる当該補助蛋白質は、組換えシステムから取り除かれうる（不活性化される）。加えて、例えば、変異及び欠失によってｔａｔ及びｒｅｖは、取り除かれ／不活性化され得る。
【０１５７】
第１世代レンチウイルス性ベクターパッケージングシステムは、別々のｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖといったパッケージング構築物を提供し、安全性の理由として典型的には異種の又は機能的に改造されたエンベロープ蛋白質を使用する。第２世代レンチウイルス性ベクターパッケージングシステムにおいて、ｖｉｆ、ｖｐｒ，ｖｐｕ及びｎｅｆの当該補助遺伝子は、欠失又は不活性化される。第３世代レンチウイルス性ベクターパッケージングシステムは、本発明の実施において使用が好ましく、当該ｔａｔ遺伝子が欠失されているか、さもなければ変異によって不活性化されていることを含む。
【０１５８】
通常ｔａｔによって提供される当該転写調節の補償は、ヒトサイトメガロウイルス最初期（ＨＣＭＶ−ＩＥ）エンハンサー／プロモーターのような、強力な構成プロモーターの使用によって提供される。他のプロモーター／エンハンサーは、本分野において理解されるように、構成プロモーター活性の強さ、目的組織の特異性（例えば、肝臓特異的プロモーター）、又は過剰発現の望まれるコントロールと関連する他の因子を基本として選択され得る。例えば、いくつかの態様において、コントロールされた発現を達成するためにｔｅｔのような誘導プロモーターの使用が望まれる。ｒｅｖをコードする遺伝子は、好ましくは、典型的な第３世代レンチウイルス性ベクターシステムが４つのプラスミド：ｇａｇｐｏｌの内のどちらか、ｒｅｖ、エンベロープ及び当該導入ベクターと関わるために、別々の発現構築物において提供される。使用される当該パッケージングシステムの世代に関わらず、ｇａｇ及びｐｏｌは１つの構築物として又は別々の構築物として提供され得る。
【０１５９】
典型的には、当該パッケージングベクターは、パッケージング細胞に含まれ、トランスフェクション、遺伝子導入又は感染を経由して当該細胞へ誘導される。トランスフェクション、遺伝子導入又は感染の方法は、当業者によってよく知られている。本発明のレトロウイルス性／レンチウイルス性導入ベクターは、プロデューサー細胞又は細胞系を産生するために、トランスフェクション、遺伝子導入又は感染を経由してパッケージング細胞系に導入され得る。本発明の当該パッケージングベクターは、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション又はエレクトロポレーションを含む標準的方法によって、ヒト細胞又は細胞系に導入され得る。いくつかの態様において、当該パッケージングベクターは、ｎｅｏ、ＤＨＥＲ、グルタミン合成酵素又はＡＤＡのような、適した薬物の存在下における及びクローンの単離における選択によって従わされる優性選択マーカーと共に当該細胞に導入される。選択マーカー遺伝子は、パッケージングベクターによってコードされる遺伝子と物理的に連結し得る。
【０１６０】
当該パッケージング機能が適したパッケージング細胞によって発現するよう形成された安定した細胞系が知られている。例えば、パッケージング細胞について記載されている米国特許番号第5,686,279号;及びOry et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(1996)93:11400-11406を参照。安定した細胞系産生のさらなる記載は、Dull et al.,1998,J.Virology 72(11):8463-8471;及びZufferey et al.,1998,J.Virology 72(12):9873-9880にある。
【０１６１】
Zufferey et al.,1997 Nature Biotechnology 15:871-875に、当該ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を含むｐｏｌの配列３’が欠失させられているレンチウイルス性パッケージングプラスミドについて記載されている。当該構築物はｔａｔを含み、ｒｅｖ配列及び当該３’ＬＴＲがｐｏｌｙＡ配列と置き換わっている。当該５’ＬＴＲ及びｐｓｉ配列は、誘導性のもののような、もう１つのプロモーターに置き換えられている。例えば、ＣＭＶプロモーター又はその派生物が使用され得る。
【０１６２】
好ましいパッケージングベクターは、レンチウイルス性蛋白質発現促進のため及び安全性促進のためにパッケージング機能の追加的変化を含み得る。例えば、ｇａｇの上流のＨＩＶ配列全てが除去され得る。当該エンベロープの下流の配列もまた除去され得る。さらに、当該ＲＮＡのスプライシング及び翻訳を促進するために当該ベクターを修飾するステップを採ることができる。
【０１６３】
Dull et al.,J.Virology 72(11):8463-8471,1998によって記載されているように、任意に、条件的なパッケージングシステムが使用される。例えば、Zufferey et al.,1998,J.Virology 72(12):9873-9880に記載されているように、当該ＨＩＶ−１の長い末端反復配列（ＬＴＲ）の欠失によって当該ベクターの生物学的研究における安全性を改良した自己不活性ベクター（ＳＩＮ）の使用が好ましい。誘導性ベクターは、ｔｅｔ誘導性ＬＴＲを通すように使われ得る。
【０１６４】
本発明の実施における使用のためのいかなるベクターも、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ  ＬＴＲ、及びＰＧＫプロモーター；ｍＴＴＲを含む組織又は細胞型特異的プロモーター、ＴＫ、ＨＢＶ、ｈＡＡＴ、調節可能又は誘導性プロモーター、エンハンサーなどといった、構成プロモーターのような異種由来のコントロール配列を含むだろう。好ましいプロモーターは、ＬＳＰプロモーター（ill et al.,Blood Coagul.Febrinolysis 8S2:23-30,1997）ＥＦ１−αプロモーター（Kim et al.,Gene 91(2):217-23,1990及びGuo et al.,Gene Thfr.3(9):802-10,1996）を含む。最も好ましいプロモーターは、延長因子１−α（ＥＦ１α）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルス最初期遺伝子（ＣＭＶ）プロモーター、キメラ肝臓−特異的プロモーター（ＬＳＰｓ）、サイトメガロウイルス  エンハンサー／ニワトリ  β−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター及びＣＫ６プロモーターを含む。これらの配列及び多数の追加のプロモーターは、本分野において知られている。当該関連性のある配列は、容易に公共データベースから手に入れられ、本発明の実施における使用のためのベクターに組み入れられ得る。
【０１６５】
本発明は、着目の複数のポリペプチド又は蛋白質のコーディング配列のコントロールされた発現のための遺伝子調節システムの包含をも熟慮する。遺伝子調節システムは、特定の単一遺伝子及び複数遺伝子の調節された発現において有用である。ある例示的なアプローチにおいて、遺伝子調節システム又はスイッチは、リガンド結合ドメイン、転写活性ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを有すキメラ転写因子を含む。当該ドメインは、実質的にいかなる源からも手に入れ得、新規蛋白質を手に入れる多くの方法の内いくつかにおいて併用され得る。調節し得る遺伝子システムは、キメラ転写因子と相互作用するＤＮＡ応答配列をも含む。この配列は、調節される遺伝子に隣接して位置づけられている。
【０１６６】
本発明の実施において使用され得る例示的な遺伝子調節システムは、ショウジョウバエ  エクダイソン  システム（Yao et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.,93:3346(1996)）、カイコ  エクダイソン  システム（Suhr et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.,95:7999(1998)）、誘導剤としてＲＵ−４８６を使用するＶａｌｅｎｔｉｓ社のＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ合成プロゲステロン受容体システム（Osterwalder et al.,Proc Natl Acad Sci 98(22):12596-601(2001)）；テトラサイクリン（Ｔｃ）又は例えばドキシサイクリンといった類似物のような小分子を使用する、当該目的物の転写を調節（転写するか又はしないのか）するためのＴＥＴTM＆ＲｅｖＴＥＴTMシステム（BD Bioscience Clontech）（Knott et al.,Biotechniques 32(4):796,798,800(2002)）；それぞれが転写アクチベーター又はＤＮＡ結合蛋白質のどちらかに連結する２つの細胞内分子を共に運ぶための小分子の使用を基本とするＡＲＩＡＤ調節技術を含む。これらの構成要素を一緒にすると、着目の遺伝子の転写が活性化される。Ａｒｉａｄ社は、２つの主要なシステム、ホモ二量体化を基本とするシステム及びヘテロ二量体化を基本とするシステム（Rivera et al.,Nature Med,2(9):1028-1032(1996);Ye et al.,Science 283:88-91(2000)）を有しており、その内のどちらかが、本発明のベクターへ組込まれ得る。
【０１６７】
本発明の実施における使用のために好ましい遺伝子調節システムは、ＡＲＩＡＤ調節技術及びＴＥＴTM＆ＲｅｖＴＥＴTMシステムである。
【０１６８】
細胞への蛋白質又はポリペプチドコーディング配列を含む核酸構築物のデリバリー
異種由来蛋白質又はポリペプチドをコードする核酸配列及び自己プロセッシング開裂部位を単独で又は追加の蛋白質分解開裂部位とともに含む本発明の当該ベクターは、例えば生体内の体細胞といった細胞による異種由来コーディング配列の発現のために、又は試験管内又は生体内でベクターにより遺伝子導入された細胞による組換えポリペプチド産生のために、試験管内で、生体外又は生体内で細胞に導入され得る。
【０１６９】
本発明の当該ベクター構築物は、本分野において知られる標準的方法論を使用して、試験管内で又は生体外で細胞へ導入され得る。そのような技術は、リン酸カルシウム法、培養細胞へのマイクロインジェクション（Capecchi,Cell 22:479-488(1980)）、エレクトロポレーション（Shigekawa et al.,Bio tech.,6:742-751(1988)）、リポソーム媒介遺伝子伝達（Mannio et al.,Bio Techn.,6:682-690(1988)）、脂質媒介遺伝子導入（Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7417(1987)）及び高速微粒子を使用する核酸デリバリー（Klein et al.,Nature 327:70-73(1987)）を使用したトランスフェクションを含む。
【０１７０】
試験管内又は生体外での発現のために、機能的蛋白質を発現するいかなる細胞の有効性も使用され得る。蛋白質発現に使用される細胞及び細胞系の多数の例が、本分野において知られている。例えば、原核生物細胞及び昆虫細胞は発現に使用され得る。加えて、酵母のような真核生物の微生物が使用され得る。原核生物、昆虫及び酵母システムにおける組換え蛋白質の発現は本分野において一般的に知られており、本発明における当該組成物及び方法を使用する蛋白質又はポリペプチド発現に適応し得る。
【０１７１】
発現に有用な例示的な宿主細胞は、繊維芽細胞のような哺乳類細胞、ヒツジ、ブタ、マウス及びウシ細胞のような非ヒト哺乳類からの細胞、昆虫細胞などをさらに含む。哺乳類細胞の特異的な例は、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、２９３細胞、ＮＳＯ細胞、３Ｔ３繊維芽細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＤＵＸ細胞及びＭＤＣＫ細胞を含む。
【０１７２】
宿主細胞は、ありふれた栄養培地で培養され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は当該望むべく配列をコードする遺伝子の増幅のために適するよう改造される。哺乳類宿主細胞は様々な培地で培養され得る。商業的に手に入れ得るＨａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ社）、基礎培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ社）、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｓｉｇｍａ社）及びダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ社）のような培地は、典型的に宿主細胞の培養に適している。与えられた培地は、一般的にホルモン及び／又は（インスリン、トランスフェリン、又は上皮細胞増殖因子のような）他の成長因子、（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩のような）塩、（ＨＥＰＥＳのような）バッファー、（アデノシン及びチミジンのような）ヌクレオシド、抗体、追跡配列、及びグルコース又は等価のエネルギー源を、必要なものとして補われる。その他の必要な補助栄養分は、当業者に知られているであろう適した濃縮物にも含まれ得る。温度、ｐＨなどのような、特定の細胞系に対する適した培養条件は、例えば、“http://www.atcc.org/SearchCatalogs/AllCollections.cfm”にてオンラインで手に入れられるＡＴＣＣカタログにおいて、多数の細胞系の培養のための提示された培養条件で、本分野において一般的に知られている。
【０１７３】
本発明のベクターは、動物モデル又はヒト被験者において、複数の蛋白質又はポリペプチドを発現するための自己プロセッシング開裂配列を経由して連結する同義遺伝子をデリバリーするために、様々なルート（例えば、皮内に、静脈内に、腫瘍内に、脳の中に、門脈内に、腹腔内に、筋肉内に、膀胱の中になど）を経由して生体内で投与され得る。投与ルートに依存して、当該治療上蛋白質はそれらの効果を局所的に（例えば、脳内で又は膀胱内で）又は全身的に（他の投与ルート）誘発する。本発明の当該ベクターにおける蛋白質又はポリペプチドのための読み取り枠への組織特異的５’プロモーターの使用は、当該ベクターによってコードされる複数の蛋白質又はポリペプチドの組織特異的発現をもたらすために使用され得る。
【０１７４】
試験管内で、生体外又は生体内で、目的細胞に導入遺伝子を有する組換えベクターを導入する様々な方法は、以前に記載され本分野において知られている。本発明は、本発明の組換えベクターで目的細胞に遺伝子導入することによる治療上の方法、ワクチン、及び癌治療を提供する。
【０１７５】
例えば、生体内での本発明の組換えベクターのデリバリーは、これに限られないが、脳、肝臓、血管、筋肉、心臓、肺、及び皮膚を含むさまざまな臓器のタイプを標的とし得る。
【０１７６】
生体外遺伝子移行の場合、当該目的細胞は当該宿主から除去され、本発明の組換えベクター及び本分野において周知の方法を使用して研究室内で遺伝的に改造される。
【０１７７】
本発明の当該組換えベクターは、これに限られないが、上記の方法を含むありふれた投与方法を用いて投与され得る。本発明の当該組換えベクターは、液体溶液及び懸濁液、微小胞、人口リン脂質（リポソーム）及び注射用剤又は不溶性の溶液のような様々な処方の内いかなるようにも提供され得る。好ましい形式は、投与の方法及び治療の適用に依存する。どのデリバリールートが適しているかは、当業者が一般的に手に入れられる知識を用いて容易に決定される。
【０１７８】
生体内組換え蛋白質及びポリペプチド産生における当該発明の組換えベクター構築物の使用において認識される多くの利点は、患者における複数の組換え蛋白質又はポリペプチドＯＲＦｓの長期及び持続性の発現のための単一のベクターの投与；生物学的活性を有する複数の組換え蛋白質又はポリペプチドＯＲＦｓの生体内発現；及びヒト細胞において産生された組換え蛋白質又はポリペプチドの自然な翻訳後修飾を含む。
【０１７９】
ある好ましい状況は、組換え蛋白質及びポリペプチドの試験管内での産生のための本発明の当該組換えベクター構築物の使用である。組換え蛋白質産生の方法は本分野においてよく知られており、本発明における自己プロセッシング開裂部位を含むベクター構築物は、そのような標準的方法論を用いた組換え蛋白質及びポリペプチドの発現のために利用され得る。
【０１８０】
本発明のある例示的な状況において、細胞へのベクターの導入又は投与（トランスフェクション）は、以下のステップ： 
（１）当該組換え蛋白質又はポリペプチドの発現を選択するための条件下で遺伝子移入された細胞を培養する；
（２）当該組換え蛋白質又はポリペプチドの発現を評価する；
（３）当該組換え蛋白質又はポリペプチドを収集する
の内複数によって引き起こされる。
【０１８１】
本発明の目的は、一連の実験を通して達成され、その内のいくつかが以下の限定しない例として記載されている。
【実施例】
【０１８２】
実施例１
ＦＭＤＶ  ２Ａ及びＩＲＥＳ配列を使用した２つの分泌蛋白質の発現
【０１８３】
本明細書における方法の例示的な応用において、ＶＥＧＦ−トラップ及び血小板第４因子（ＰＦ４）のコーディング配列は、２Ａ配列又はＩＲＥＳのどちらかを使用する単一のプロモーターから発現される。現在、当該ＩＲＥＳは、単一のプロモーターから２つの蛋白質を発現するための技術水準を意味する。この実験の目的は、２Ａ又は２Ａ様配列を含むベクターからの蛋白質発現とＩＲＥＳを含むベクターからの蛋白質発現とを比較することだった。この実験に使用したプラスミドの模式図は、図１Ａ−Ｄに提供している。ベクター構成成分は以下を含む：
【０１８４】
【表３】
0004644663.tif 000004
【０１８５】
【表４】
0004644663.tif 000005
【０１８６】
この例において、当該２Ａ又はＩＲＥＳ配列はＶＥＧＦ−トラップとｓＰＦ４コーディング配列との間に配置され、完全なカセットは当該ＣＡＧプロモーターによって引き起こされた。Ｆ２Ａ及びＩＲＥＳ配列に関連する２つの遺伝子の配向の両方は、クローン化され評価された（図１Ａ−Ｄ）。これらのプラスミドは、２９３Ｔ細胞への一過性トランスフェクションによって最初に試験され、その試験はＦＵＧＥＮＥ６キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用し６穴皿で実行された。当該トランスフェクションは、１穴あたり２×１０5個の細胞及びＤＮＡ１μｇを使用して３通り行われ、ＣＡＧ−ＧＦＰ発現プラスミド２００ｎｇがトランスフェクションコントロールとしてそれぞれのサンプルに加えられた。細胞培養上清は約４０時間後に回収され、Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ  ＰＦ４  ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ）を用いてＰＦ４の発現について分析した。当該ＶＥＧＦ−トラップ蛋白質は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインに連結するＶＥＧＦＲ１のドメイン２及びＶＥＧＦＲ２のドメイン３を含み、標準曲線産生のため組換えＶＥＧＦＲ１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で検出された。当該細胞は回収され、ＧＦＰ発現のためのＦＡＣｓ分析に供された。これらの分析の結果は、図２Ａ−Ｃに示されている。ＩＲＥＳを含むベクターにおいて、当該ＩＲＥＳの上流の遺伝子は、高レベルで発現しており、一方、ＩＲＥＳの下流遺伝子は、とても低く発現している。これはＦ２Ａを含むベクターと著しく対照的であり、Ｆ２Ａの場合双方の蛋白質は等レベルで発現している。当該２つの蛋白質の発現レベルは、Ｆ２Ａ部位の上流又は下流のどちらに位置してもほとんど同一であり、Ｆ２Ａ配列は配向性／位置と独立した機能であるらしいことを示唆している。これらのデータは、Ｆ２Ａが単一プロモーターからの２つの遺伝子の発現における技術水準を超えた重要な改良を提供することを示している。
【０１８７】
実施例２
２Ａ構築物からのヒト第VIII因子の発現
我々は以前、当該２Ａ配列はヒト及びラットモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の効果的な発現に使われ得ることを証明した（例えば、USSN 60/540,554.）。この実施例において、２Ａ配列は、単一プロモーターを使用するヒト第VIII因子の重鎖及び軽鎖の発現能力について評価された。典型的な第VIII因子発現構築物は、プロモーター、第VIII因子重鎖コーディング配列、フリン開裂部位（ＲＡＫＲ）、２Ａ配列、第VIII因子軽鎖コーディング配列及びポリＡ配列を含んでいる（図３）。図４は、ヒト第VIII因子の当該重鎖及び軽鎖を追加の蛋白質分解部位とともに又は伴わずに自己開裂部位（例えば、２Ａ）に連結する４つの方法が評価上にあることを示す。これらの構築物はＳｅｒ７４３をＧｌｕ１６３８と融合する‘ＳＱ’Ｂドメイン欠失（Lind et al.,Eur.J.Biochem.232:19-27,1995）を基本とする第VIII因子のＢドメイン欠失体を発現するようデザインされ、組換え第VIII因子産生物として認可されたＲｅｆａｃｔｏにおけるＢドメイン欠失と同一である（Eriksson et al.,Semin.Hematol.38:24-31,2001）。
【０１８８】
天然第VIII因子蛋白質において、ＱＮは７４４アミノ酸及び１６３８アミノ酸にて繰り返されている。これらの研究において、ＱＮは当該Ｂドメイン欠失の５’末端に残されていた。第VIII因子重鎖及び軽鎖が別々に発現されているという以前のデータは、当該重鎖はこれらの余分な２つのアミノ酸の追加でより安定となることを示唆した（Yonemura et al.,Protein Eng.6:669-674(1993)）。図４に示される例示の各構築物において、ヒトＩｇＧシグナルペプチド（ＳＳ）が当該軽鎖の上流にクローン化されている。２Ａのような自己プロセッシング配列で２つの蛋白質をつなげるとき、当該Ｃ末端蛋白質は、効果的な分泌のためのシグナル配列を要求することが以前より示されている（de Felipe et al.,J.Biol.Chem.278:11441-11448,2003）。Ｄ１構築物において、追加のフリン（ＲＡＫＲ）だけでなく当該内在性第VIII因子開裂部位と２Ａ開裂部位の両方が存在する。当該Ｄ２及びＥ１構築物は、それぞれ、除去された当該内在性のフリン及びトロンビン開裂部位を有する。当該Ｅ２構築物は、内在性開裂部位及び２Ａ部位の両方を含むが、当該追加のフリン部位は失っている。
【０１８９】
当該Ｄ１構築物のプロセッシングは図５に図示されている。当該２Ａ部位は、蛋白質翻訳の間、最初に開裂される。当該シグナル配列が引き続いて開裂され、そのとき当該フリン開裂及び当該２Ａ配列の除去が当該ＲＡＫＲの存在に起因して生じ得る。当該最後のトロンビン開裂及び第VIII因子の活性化は、典型的に血漿において生じる。この構築物を発現している細胞系は、追加のアミノ酸を全く含まない第VIII因子組換え蛋白質を産生するであろう。
【０１９０】
これらの構築物が、例えばＣＨＯ、ＢＨＫ及び２９３のような細胞系に一過性にトランスフェクトされたとき、細胞培養上清及びライセートは、Ｃｏａｍａｔｉｃアッセイを使用する第VIII因子活性のために、ＥＬＩＺＡによる第VIII因子発現のために、及びウエスタンブロット分析による第VIII因子の開裂及び分泌のために試験される。これらの分析は、第VIII因子蛋白質の発現、開裂、及び分泌の関連する効果を評価するため、当業者に一般的、典型的に使用される。
【０１９１】
実施例３
２９３細胞にトランスフェクトしたＡＡＶ  Ｈ２ＡＬプラスミドからのラットＩｇＧの発現
抗マウスＦＬＫ−１モノクローナルＩｇＧ抗体の重鎖及び軽鎖をコードし、当該ＦＭＤＶ  ２Ａ配列の挿入によって連結されている（図６）ＡＡＶプラスミド（ｐＡＡＶ  Ｈ２ＡＬ）は、２９３Ｔ細胞に一過性トランスフェクションされた。細胞は、１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ−グルタミン及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液で補助したイスコブ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で成長させた。トランスフェクションはＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクションキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して行われた。ｐＡＡＶ  Ｈ２ＡＬプラスミドＤＮＡは、製品説明書に従ってトランスフェクション試薬で混合され、当該ＤＮＡ−脂質混合物は当該細胞培養培地に加えられた。当該トランスフェクトされた細胞は、４８時間又は７２時間インキュベートされ、当該上清が抗体発現のために分析された。当該ｍＡｂ濃縮物は、ラットＩｇＧ  ＥＬＩＳＡアッセイ（Bethyl Laboratories）を使用して測定され、そのアッセイにおいて、当該ｍＡｂＩｇＧ蛋白質はＥＬＩＳＡプレート上で固定化抗ラットＩｇＧ抗体により捕獲され、ＨＲＰで結合させた抗ラットＩｇＧ  Ｆｃ抗体によって検出された。当該ＥＬＩＳＡプレートは現像され、ｍＡｂ濃縮物は、既知のラットＩｇＧ濃縮物での標準曲線と比較されるようなサンプルのＯＤ（光学密度）読みを基本として計算された。ＥＬＩＳＡアッセイの結果は、２Ａ配列を含む当該ＡＡＶプラスミドでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞において、当該組換えラットＩｇＧ抗体が高いレベルで発現していることを明らかにした（図７）。
【０１９２】
当該抗体の生物学的活性は、ＶＥＧＦ−ＦＬＫ−１結合アッセイにおける中和によって評価された。当該アッセイにおいて、組換えＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから。）はＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされ、それから５％ミルクでブロッキングされた。当該ラット抗ＦＬＫ−１抗体は、組換えＦＬＫ−１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに様々な濃度でプレインキュベートされた。当該抗体／ＦＬＫ−１混合物は、ＥＬＩＳＡ穴に移行され、当該プレートはＶＥＧＦ−ＦＬＫ−１の結合を達成するためにインキュベートされた。バランス溶液で水洗した後、ビオチンと結合したヤギ抗ＦＬＫ−１抗体が、ＦＬＫ−１との結合を検出するために使用され、当該ＨＲＰ基質でカラー現像された後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）によって可視化された。
【０１９３】
ＶＥＧＦ／ＦＬＫ−１（リガンド−受容体）結合アッセイを使用することによって、一過性トランスフェクションの後２９３Ｔ細胞から発現された当該抗体は全生物学的活性を示し、親ハイブリドーマ細胞によって発現した自然の抗体の活性と似ていることが証明された（図８）。
【０１９４】
自己プロセッシング２Ａ配列を利用したプラスミドから発現した当該抗体は、ウエスタンブロット分析を使用してさらに特徴付けられた。一過性トランスフェクトした２９３Ｔ細胞の上清における蛋白質又はハイブリドーマ細胞の上清からの蛋白質は、還元又は非還元条件下のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離された。還元ゲルについて、蛋白質サンプルは、２×ＬＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合され、ボイルされ、事前に型にとられた１２％トリス−グリシン  ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に載せられ、そしてトリス−グリシン  ＳＤＳランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で泳動された。非還元ゲルについて、２×ネイティブ  トリス−グリシン  サンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合され、ボイルされ、事前に型にとられた１２％トリス−グリシン  ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に載せられ、そしてトリス−グリシン  ネイティブランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で泳動された。泳動後、当該蛋白質は、２０％メタノールを伴ったトリス−グリシン  トランスファーバッファーにおいてニトロセルロース膜にトランスファーされた。当該膜ブロットはＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｍｉｌｉｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅキット（Ｐｉｅｒｃｅ）の提供する試薬を使用して処理され、蛋白質バンドはＢｉｏｍｅフィルム（Ｋｏｄａｋ）に可視化される。
【０１９５】
ウエスタンブロット分析は、当該親のハイブリドーマ細胞系と当該トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の双方からの当該抗体が非還元ゲル上の約１６０ｋＤバンドに見えることを明らかにした（図９Ａ）。これは、２：１の重鎖及び軽鎖比率であることを示唆する約１３３ｋＤバンドのような追加のバンドは全く検出されなかったので、当該２Ａ開裂部位を経由して産生された当該重鎖及び軽鎖は厳密に１：１の重鎖対軽鎖比率で正しく二量体化することを示す。還元ゲルにおいて、ハイブリドーマ及びトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の双方からの当該抗体は、約５５ｋＤバンド（重鎖）及び約２３ｋＤバンド（軽鎖）として見えた。非開裂７８ｋＤ前駆体ポリペプチドは全く検出されず、当該２Ａペプチドによる効果的な開裂は示唆されなかった（図９Ｂ）。当該Ｈ２ＡＬ構築物から発現された抗体は、わずかに大きい分子量を有するように見え、それは当該２Ａ配列によって寄与される追加のアミノ酸残基に起因し得る。
【０１９６】
これらの結果は、当該２Ａ配列が２９３Ｔ細胞における翻訳プロセスの間ＩｇＧ分子の両鎖の産生を促進する“開裂”部位を提供することを証明する。換言すると、当該キメラＨ２ＡＬポリ蛋白質は、二量体化に続く２つの重鎖及び軽鎖を含む全長、無処置Ｉｇ分子産生のために自己分解開裂を経験した。
【０１９７】
実施例４
ＡＡＶ  Ｈ２ＡＬ構築物からのヒト免疫グロブリンの発現
本発明を説明するもうひとつの例において、自己プロセッシング開裂部位を含むＡＡＶ構築物は、ＫＤＲに向けたヒト  モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の発現のために使われた。新規ヒト抗ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）ｍＡｂ重鎖をコードする配列、自己プロセッシング２Ａ開裂部位をコードする配列、及びヒト抗ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）ｍＡｂ軽鎖をコードする配列を含むＡＡＶベクターは、実施例３において記載したのと同様の戦略を使用して構築された。当該ＡＡＶベクターｈ、ＥＦ１−α又はＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、及びポリＡ配列をも含む。２９３Ｔ細胞は製品説明書を基本としたＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクションキットを使用してＡＡＶプラスミドでトランスフェクトされ、細胞上清は、翻訳後４８時間又は７２時間で回収された。２９３Ｔ細胞上清における当該ｍＡｂ濃縮物は、ヒトＩｇＧのためのサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。このアッセイにおいて、ヒトＩｇＧは、ＥＬＩＳＡプレート上において固定化された抗ヒトＩｇＧ抗体によって捕獲され、ＨＲＰで結合させた抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体によって検出された。カラーは基質溶液を穴に加えた後現像され、ｍＡｂ濃縮物は標準曲線として既知の濃縮物のヒトＩｇＧでのサンプルＯＤ（光学密度）読みを基本として計算された。
【０１９８】
当該結果は、自己プロセッシング２Ａ開裂部位をコードする配列によって連結されるヒト抗体の重鎖及び軽鎖をコードするＡＡＶプラスミドの２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションが、細胞培養上清において全長抗体の高レベル発現を引き起こすことを証明した（図１０）。これらの結果は、ヒト抗体の当該重鎖及び軽鎖が、自己開裂を引き起こす自己プロセッシング２Ａ開裂部位をコードする配列を含むベクターを使用して単一の読み取り枠から産生され得ることを示す。さらに、当該重鎖及び軽鎖は折りたたまれ、適切に分泌される。
【０１９９】
実施例５
ＡＡＶベクターを含む２Ａ自己プロセッシング配列による全長ラット抗ＦＬＫ−１モノクローナル抗体の生体内発現
本発明のもう１つの例において、２つのポリペプチド、ラット抗ＦＬＫ−１モノクローナル抗体の特異的ＩｇＧ重鎖及び軽鎖は、ｒＡＡＶベクターを用いて単一のプロモーターから生体内で発現した。遺伝子治療によるモノクローナル抗体のデリバリーは、診療所において同時に使用される通常の方法と関連する多くの利点を有す。ｒＡＡＶは、その安全性特性により好まれる遺伝子治療ウイルス性システムであり、遺伝子発現を持続する。本発明において、ｒＡＡＶ−６ベクターは、ＡＡＶ  ＩＴＲ、ＣＡＧプロモーター、及びポリＡ配列を含むために構築された。当該ベクターは、当該ベクター内においてＣＡＧプロモーターに作用可能な状態で連結するよう設計されクローン化された、５’から３’方向へ、ラットＩｇＧ重鎖のためのコーディング配列、自己プロセッシング２Ａ配列のためのコーディング配列、及び抗体軽鎖のためのコーディング配列を含む単一の読み取り枠を含む。当該ｒＡＡＶ構築物の総サイズはｒＡＡＶのサイズの限界内であり、ウイルス性粒子は２９３細胞におけるウイルス性産生によって実証されているように効果的にパッケージされている。
【０２００】
複製欠損ｒＡＡＶウイルスは、アデノウイルス存在下でのＡＡＶプラスミドトランスフェクションを使用して２９３細胞において産生された。ｒＡＡＶウイルスはＣｓＣｌ２勾配遠心分離によって精製され、その物理的力価はドットブロット法によって決定される。精製されたｒＡＡＶは２９３細胞又はＵ８７グリア細胞種細胞に感染するために使われ、上清のモノクローナル抗体濃縮物は実施例３に記載されているようにラットＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによって測定された。
【０２０１】
抗体の生体内発生のために、２×１０11ウイルス性粒子がマウスへ筋肉内注入によって投与された。マウスは様々な時点で血を取られた。血清中のモノクローナル抗体レベルは、実施例３に記載されているようにラットＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによって定量化された。当該結果は、モノクローナル抗体の高レベルは全長ラット抗ＦＬＫ−１抗体をコードするｒＡＡＶ−６の筋肉内注入後検出されることを示した。発現は４．５の最大レベルに達し、約２．５μｇ／ｍｌの安定した発現レベルが検出された。いくつかの固体マウスにおいて検出される最も高い血清抗体レベルは、９μｇ／ｍｌ以上であった（２１日）。
【０２０２】
これらの結果は、全長ｍＡｂ重鎖及び軽鎖蛋白質は、２Ａ自己プロセッシング配列を含み、抗体重鎖及び軽鎖の分離を媒介する２Ａ自己プロセッシング配列が試験管内の発現と一致して生体内でも発現することを証明するベクターの使用によってマウスにおいて高レベルでうまく発現させることを証明した。従って、本発明は、長期間の治療効果を達成するために生体内で患者に治療用抗体をデリバリーする手段を提供する。この研究における当該発現カセットは、当業者によって日常的に使用される日常的技術を使用する、レンチウイルス、アデノウイルスなどのような他のベクターシステムに容易に適応させられる。
【０２０３】
実施例６
ＡＡＶ  ＨＦ２ＡＬベクターを経由して発現させられる抗体からの２Ａ開裂部位残基の除去
上記Ｈ２ＡＬ構築物を使用して発現させた抗体重鎖は、２Ａ又は２Ａ様配列のような自己プロセッシング開裂配列由来のアミノ酸残基をそのＣ末端に保有し、当該アミノ酸は開裂後に残っている。本発明における当該発現システムをさらに最適化するために、第１ポリペプチドすなわち特定の構築物における抗体重鎖と当該自己プロセッシング配列との間にプロテアーゼ開裂部位を含むベクター／プラスミドが構築された。当該構築物に使用される開裂部位はＲＡＫＲ（配列番号１１）であり、当該配列はフリン開裂コンセンサス配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）のカテゴリーに所属する。予想される開裂は、フリン又は他のプロテアーゼによってこの開裂部位におけるＡとＫの間で生じる。当該構築物は、５’から３’方向に：ＣＡＧプロモーター、抗体重鎖コーディング配列、フリン開裂部位コーディング配列、２Ａ開裂部位コーディング配列、抗体軽鎖コーディング配列、及びポリＡ配列（ＣＡＧ  ＨＦ２ＡＬ）を含む（図１２）。
【０２０４】
ＣＡＧ  ＨＦ２ＡＬ構築物から当該抗体を発現するために、プラスミドＤＮＡは、ＱｉａｇｅｎプラスミドＤＮＡ精製キットを使用して精製され、ＦＵＧＥＮＥ６キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して６穴組織培養プレートにおいて２９３Ｔ細胞にトランスフェクトするために使用された。次の日、細胞は血清なし培地で養われ、４８時間後に培養上清が回収された。第１コントロール実験において、２９３Ｔ細胞は、同じ抗体及び２Ａ配列を含むが重鎖と２Ａ配列との間のフリン開裂部位が欠落しているＨ２ＡＬプラスミドでトランスフェクションされた。第２コントロール実験において、２９３Ｔ細胞は、抗体重鎖、フリン開裂部位、及び抗体軽鎖を含むが２Ａ配列が欠落しているＨＦＬプラスミドでトランスフェクションされた。培養上清の抗体濃縮物はＥＬＩＳＡによって測定された。図１３に示されるように、当該ＨＦ２ＡＬ構築物は、当該Ｈ２ＡＬ構築物よりもトランスフェクトされた細胞からの上清においてより高い抗体発現レベルを得た。反対に、ＨＦＬ（重鎖−フリン−軽鎖）構築物でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の上清において、かなり限定された少量の抗体量が検出された。
【０２０５】
フリン開裂部位を使用する当該抗体の重鎖から当該追加の２Ａアミノ酸残基の除去の効果は、還元条件下の１２％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ＨＦ２ＡＬ及びＨ２ＡＬがトランスフェクトされた細胞の上清における抗体を分離することによって評価された。当該分離された蛋白質はニトロセルロース膜にトランスファーされ、当該抗体重鎖の蛋白質バンドはラビット抗ラット抗体によって検出された。このウエスタンブロット分析は、２９３Ｔ細胞において当該ＨＦ２ＡＬプラスミドから発現された抗体重鎖は、Ｈ２ＡＬ構築物から発現された重鎖よりも小さいが、親ハイブリドーマ細胞によって発現された抗体重鎖と似た分子量に一本のバンドとして移動することを示した。この結果は、当該ＨＦ２ＡＬ構築物のフリン開裂部位がアミノ酸由来の残留２Ａ除去のために有効な除去手段を提供すること提示した。
【０２０６】
実施例７
２Ａ部位及びフリン開裂部位を含むＡＡＶプラスミドでトランスフェクションした後のフリン−/−細胞における抗体の発現
フリンは、全ての細胞型のほとんどで発現するユビキタスなサブチリシン関連セリンプロテアーゼである。ＬｏＶｏ及びＣＨＯ変異体ＲＰＥ．４０は、変異に起因して機能的フリンを全く有しないことがわかっている。当該ＣＡＧ  ＨＦ２ＡＬ構築物（実施例６）において使用される当該フリン開裂部位ＲＡＫＲは、同じファミリーにおける多くの他のプロテアーゼメンバーだけでなくフリンによっても開裂され得ることを考慮すれば、実験は、当該ＣＡＧ  ＨＦ２ＡＬ構築物から発現された抗体におけるＲＡＫＲの開裂の原因が実際の酵素なのかを明らかにするために行われた。フリン開裂部位を含む又は含まないプラスミド（ＨＦ２ＡＬ又はＨ２ＡＬ）が、ＬｏＶｏ細胞へのトランスフェクトに使用された。ＬｏＶｏは、ＲＸＫ（Ｒ）Ｒのエンド蛋白質分解の活性のために必要であるホモＢドメインをカバーする領域における１つのヌクレオチド欠失のせいで機能的フリンの無いヒト結腸腫瘍細胞系である（Takahashi et al.,Biochem Biophys Res Commun.195:1019-26.(1993)）。
【０２０７】
ＦＵＧＥＮＥ６キットを使用したＬｏＶｏ細胞にＨＦ２ＡＬ及びＨ２ＡＬプラスミドトランスフェクションに続いて、細胞培養上清は組織培養皿から回収された。蛋白質は、実施例３の記載のように、還元条件下の１２％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて分離され、ウエスタンブロット分析で分析された。結果は、ＨＦ２ＡＬプラスミドから発現された抗体重鎖が、Ｈ２ＡＬ構築物から発現された当該重鎖と似ているが、親ハイブリドーマ細胞から発現された抗体重鎖よりも高い分子量に移動することを示した（図１４）。これらの結果は、フリン活性の欠落したＬｏＶｏ細胞において、当該２Ａ開裂部位由来の追加のアミノ酸が抗体重鎖のＣ末端に残っていることを証明し、これは、当該プロテアーゼであるフリンが、２９３Ｔ細胞のようなフリンを含む細胞において発現されるとき、当該抗体からの２Ａ残基の除去の原因となる実際の酵素であることを確かなものとする。
【０２０８】
ＨＦ２Ａベクターから発現される重鎖のＣ末端で当該２Ａペプチド配列から残留アミノ酸の除去をさらに確かめるために、当該抗体重鎖のＣ末端断片がマススペクトル分析によって分析された。発現ベクターは、ラット抗体重鎖、２Ａ開裂部位（ＲＡＫＲ）に隣接するフリン開裂部位、抗体軽鎖、“Ｈｉｓ−タグ”と呼ばれる６ヒスチジンアミノ酸（ＨＦ２ＡＬ６Ｈ）を含むよう構築された。当該プラスミドは、水力学的遺伝子トランスファーを経由してマウスに注入された。当該ｈｉｓ−タグ  モノクローナル抗体は、ニッケルカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用する自然の条件下、マウス血清から精製された。当該抗体重鎖及び軽鎖は、クーマシーブルーで染色された１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離された。当該抗体重鎖バンドはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから単離され、トリプシン消化後マススペクトル分析を受けた。マススペクトルのデータは、抗体重鎖のＣ末端で２Ａ／フリン配列由来の２アミノ酸を除く全ての除去を確証させた。さらに、マススペクトル法及びＰＳＤ（ＭＳ／ＭＳ）シークエンシング分析をともに使用することによって、ＨＦ２ＡＬ構築物から発現された抗体重鎖はＣ末端配列“ＳＬＳＨＳＰＧＫＲＡ”を有し、その配列は天然ラットＩｇＧ重鎖Ｃ末端アミノ酸プラスフリン開裂部位由来の２つの追加アミノ酸（ＲＡ）を含むことが示され得た。
【０２０９】
要約すると、ここに提供される当該結果は、２Ａ又は２Ａ様配列のような自己プロセッシング開裂部位由来の残留アミノ酸が、当該２Ａ開裂部位に隣接する追加の蛋白質分解開裂部位（すなわちフリン開裂部位）の導入による蛋白質発現及び分泌の間効果的に除去され得ることを証明する。２Ａ配列誘導アミノ酸の除去は、生体内で投与されたときさもないと免疫応答を誘発し得る外来アミノ酸残基の欠落する製品の産生を結果として引き起こす。さらに、これらのデータは、２Ａを含む構築物においてフリン開裂部位の追加が、抗体産生レベルにおいて全体的な増加を引き起こすことを提示する。
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１】図１Ａ−Ｄは、可溶性血小板第４因子（ｓＰＦ４）とＶＥＧＦトラップの発現のための具体例としてのプラスミドであり、当該プラスミドは当該コーディング配列及び例１において描写されているものとして選択し得る位置づけにおけるＦ２Ａ配列又はＩＲＥＳのどちらかを含む。図は５’から３’方向に：ｓＰＦ４：Ｆ２Ａ：ＶＥＧＦトラップ（図１Ａ）；ｓＰＦ４：ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ：ＶＥＧＦトラップ（図１Ｂ）；ＶＥＧＦトラップ：Ｆ２Ａ：ｓＰＦ４（図１Ｃ）；ＶＥＧＦトラップ：ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ：ｓＰＦ４（図１Ｄ）；を含むプラスミドを描いている。
【図２】図２Ａ−Ｃは、Ｆ２ＡとＩＲＥＳ配列を使用し単一のプロモーターからＶＥＧＦトラップとｓＰＦ４双方の蛋白質を発現しているプラスミドからの各蛋白質発現レベルを示しており：図２ＡはＥＬＩＺＡ（ｎｇ／ｍｌ）による分析として提示されたＰＦ４のレベルを図解しており；図２Ｂは、ＥＬＩＺＡ（ｎｇ／ｍｌ）による分析として提示されたＶＥＧＦトラップのレベルを図解しており；図２Ｃは、陽性パーセンテージとして示されたＧＦＰトランスフェクションコントロールの発現レベルを図解している。
【図３】図３は、例２において描写されているものとして、２つのポリペプチド（第VIII因子重鎖及び軽鎖）の発現のための発現カセットを描いている。
【図４】図４（配列番号３９〜４１）は、２つのポリペプチド（第VIII因子重鎖及び軽鎖）の発現のための発現カセットを描いており、第VIII因子のＢドメイン欠損体としての様々な配列が存在している。
【図５】図５は、第VIII因子の重鎖及び軽鎖が２Ａ自己プロセッシング開裂部位及び追加の蛋白質分解開裂部位（フリン）を含むＦVIII  Ｈ２ＡＬ（重鎖−２Ａ配列−軽鎖）発現カセットを用いて発現するときにおける、第VIII因子の重鎖及び軽鎖の生物学的プロセッシングの概略図である。
【図６】図６は、例３において描写されているように、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の発現のための具体例としての発現カセットの概要図であり、当該カセットは２Ａ自己プロセッシング開裂部位を含む。
【図７】図７は、抗ＦＬＫ−１／ＡＡＶ  Ｈ２ＡＬ（重鎖−２Ａ配列−軽鎖）プラスミドでトランスフェクションした２９３Ｔ細胞の上清において、全長ラット抗ＦＬＫ−１モノクローナル抗体（ＩｇＧ）の発現を示す。
【図８】図８は、抗ＦＬＫ−１  Ｉｇ／ＡＡＶ  Ｈ２ＡＬプラスミドでトランスフェクションした２９３Ｔ細胞の上清において発現したラット抗ＦＬＫ−１抗体（ＩｇＧ）の生物学上活性を示す。
【図９】図９ＡとＢは、抗ＦＬＫ−１  Ｉｇ／ＡＡＶＨ２ＡＬプラスミドのトランスフェクション後、２９３Ｔ細胞の上清におけるラット抗ＦＬＫ−１抗体（ＩｇＧ）のウエスタンブロット分析の結果を表している。図９Ａは１２％ネイティブゲルを使用したＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）の結果を表し、図９Ｂは１２％還元ゲルを使用したＰＡＧＥの結果を表しており、各図において、レーン１はハイブリドーマから産生されたＩｇＧを表し：レーン２は２９３Ｔ細胞において２Ａ配列を使用し発現させたＩｇＧを表し：レーン３は２９３Ｔのモック（ｍｏｃｋ）コントロールを表す。
【図１０】図１０は、抗ＫＤＲ／ＡＡＶ  Ｈ２ＡＬプラスミドでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の上清において、全長ヒト抗ＫＤＲモノクローナル抗体（ＩｇＧ）の発現を示す。
【図１１】図１１は、ＡＡＶ６  Ｈ２ＡＬウイルスで注入させたマウスにおいて、ラット抗ＦＬＫ−１モノクローナル抗体（ＩｇＧ）の血清レベルを表している。
【図１２】図１２は、実施例６に描写されているように、ラット抗ＦＬＫ−１抗体のための、抗体重鎖、追加の蛋白質分解開裂部位（Ｆｕｒｉｎ）、自己プロセッシング２Ａ開裂部位、抗体軽鎖（ＨＦ２ＡＬ）をコードする発現カセットを描いている。
【図１３】図１３は、実施例６に描写されているように、フリン（ｆｕｒｉｎ）開裂部位を伴う又は伴わない、自己プロセッシング２Ａ分裂部位を伴う抗体重鎖及び抗体軽鎖をコードする配列を含むプラスミドでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の上清におけるラット抗ＦＬＫ−１抗体の発現を表す。
【図１４】図１４は、実施例６及び実施例７に描写されているように、Ｈ２ＡＬ及びＨＦ２ＡＬコンストラクトでトランスフェクトした２９３Ｔ（ｆｕｒｉｎ＋）及びＬｏＶｏ（ｆｕｒｉｎ−）細胞から発現させた抗体重鎖のウエスタンブロットによる特徴づけを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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