(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
ａ）伸長されたメチル化なしのＣｐＧ島；
ｂ）該伸長されたメチル化なしのＣｐＧ島に作動可能に連結された、発現可能なオープンリーディングフレーム；
ｃ）該オープンリーディングフレームに作動可能に連結されたプロモーターであって、ここで該プロモーターは、該ＣｐＧ島に天然には連結されていない、プロモーター；
を含み、該ＣｐＧ島は、配列番号１および配列番号２からなる群より選択されるポリヌクレオチドからなり、ここで該オープンリーディングフレームの再現可能な発現は、２種以上の組織型において得られることを特徴とする、
単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
Ｅｓｐ３Ｉ制限フラグメントを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ＣｐＧ島は、配列番号１の配列からなる、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
ＢｓｐＥ１〜Ｅｓｐ３Ｉ制限フラグメントを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ＣｐＧ島は、配列番号２の配列からなる、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項７】
前記ベクターはエピソームベクターである、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
前記ベクターは組み込みベクターである、請求項６に記載のベクター。
【請求項９】
前記ベクターはプラスミドである、請求項６〜８のいずれかに記載のベクター。
【請求項１０】
作動可能に連結される遺伝子は、治療用核酸である、請求項６〜９のいずれかに記載のベクター。
【請求項１１】
配列番号１もしくは配列番号２のいずれか、ＣＭＶプロモーター、マルチクローニング部位、ポリアデニル化配列および適切な制御エレメントの下にある選択マーカーをコードする遺伝子を含む、請求項６〜１０のいずれかに記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または請求項６〜１１のいずれかに記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１３】
遺伝子治療において使用するための、請求項１〜５のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項６〜１１のいずれかに記載のベクター、または請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
遺伝子治療における使用のための医薬品の製造における、請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項６〜１１のいずれかに記載のベクター、または請求項１２に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項６〜１１のいずれかに記載のベクター、または請求項１２に記載の宿主細胞を、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
望ましい遺伝子生成物を得るための、細胞培養系における請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項６〜１１のいずれかに記載のベクター、または請求項１２に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１７】
内因性遺伝子の発現を増大させるための、ヒト以外における配列番号１または配列番号２のいずれかのポリヌクレオチドの使用であって、該内因性遺伝子と作動可能に連結された位置で、細胞のゲノムに該ポリヌクレオチドを挿入し、それにより、該遺伝子の発現のレベルを増大させることを包含する、使用。
【請求項１８】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたは請求項６〜１１のいずれかに記載のベクターを含む細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物であって、ここで該ポリヌクレオチドは、人工的に導入されている、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１９】
アンチセンス遺伝子配列の発現を得て、その対応する遺伝子配列の発現を不活性化させる、ヒト以外における請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項６〜１１のいずれかに記載のベクター、または請求項１２に記載の宿主細胞の使用。
【請求項２０】
発現ライブラリーの調製における、請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項６〜１１のいずれかに記載のベクターの使用。
【請求項２１】
非ヒト動物において発現可能な遺伝子を同定するための方法における配列番号１または配列番号２のいずれかに従うポリヌクレオチドの使用であって、該ポリヌクレオチドを含む構築物を、該非ヒト動物の胚性幹細胞に挿入することを包含し、ここで該構築物は、発現される遺伝子への挿入の後に、薬物選択を可能にする、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、改善された、より小さな遍在性クロマチンオープニングエレメント（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ−ｏｐｅｎｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＵＣＯＥ）を含むポリヌクレオチドに関する。発現可能な核酸配列に作動可能に連結される場合、このエレメントは、高く、かつ再現可能なレベルの遺伝子発現を提供する。本発明はまた、そのポリヌクレオチド配列を含むベクター、そのベクターを含む宿主細胞、ならびに治療におけるそのポリヌクレオチド、ベクターもしくは宿主細胞の使用、または細胞培養におけるタンパク質発現を包含する適用のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
高等真核生物におけるクロマチン構造の現在のモデルは、遺伝子が「ドメイン」に組織化されていることを前提としている（Ｄｉｌｌｏｎ，Ｎ．＆Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｆ．  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｕｎｉｔｓ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．４，２６０−２６４（１９９４）；Ｈｉｇｇｓ，Ｄ．Ｒ．  Ｄｏ  ＬＣＲｓ  ｏｐｅｎ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｄｏｍａｉｎｓ？  Ｃｅｌｌ  ９５，２９９−３０２（１９９８））。クロマチンドメインは、凝縮して「密集した（ｃｌｏｓｅｄ）」、転写的にサイレントな状態、または脱凝縮して「開いた（ｏｐｅｎ）」、かつ転写的に能力のある構成のいずれかで存在すると認識されている。ＤＮａｓｅI感受性の増大、ＤＮＡ低メチル化およびヒストン過剰メチル化によって特徴づけられる開いたクロマチン構造の確立は、遺伝子発現の開始に欠くことができないものであると考えられている。
【０００３】
クロマチン領域の開いた性質および密集した性質は、宿主細胞ゲノムに無作為に組み込まれる導入遺伝子の挙動に反映される。同一の構築物が、マウスゲノムにおける異なる位置に組み込まれた場合に、組織特異的発現および発生段階特異的発現の異なるパターンを与える（Ｐａｌｍｉｔｅｒ，  Ｒ．Ｄ．＆Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．  Ａｎｎ．Ｒｅｆ．Ｇｅｎｅｔ．２０，４６５−４９９（１９８６）；Ａｌｌｅｎ，Ｎ．Ｄ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３３，８５２−８５５（１９８８）；Ｂｏｎｎｅｒｏｔ，Ｃ．，Ｇｒｉｍｂｅｒ，Ｇ．，Ｂｒｉａｎｄ，Ｐ．＆Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｊ．Ｆ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６３３１−６３３５（１９９０））。
【０００４】
所定のトランスジェニックマウス組織内で変化に富んだ発現パターン（位置効果多葉性（ＰＥＶ）として公知）もまた、頻繁に観察される（Ｋｉｏｕｓｓｉｓ，Ｄ．＆Ｆｅｓｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ｒ．  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．７，６１４−６１９（１９９７））。外因性遺伝子がインビトロで哺乳動物細胞培養物の染色体に組み込まれる場合、その組み込み事象の多くは、その導入遺伝子の迅速なサイレンシングを生じ、その残りは、発現レベルにおいて大きな変異性を与える（Ｐｉｋａａｒｔ，，Ｍ．Ｊ．，Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ，Ｆ．＆Ｆｅｌｓｅｎｆｉｅｌｄ，Ｇ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２，２８５２−２８６２（１９９８）；Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｍ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｈａｕｓｅｒ，Ｈ．＆Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｐ．Ｐ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７，３５−４２（１９９９））。これらの位置効果は、基礎研究および生物工学適用の両方に関連して、導入遺伝子発現を不十分にする。
【０００５】
遺伝子組織化のクロマチンドメインモデルにより、転写的に能力のある開いたクロマチン構造を確立しかつ維持することが可能な遺伝子制御エレメントが、そのゲノムの活性な領域と関連づけられるべきであることが示唆される。
【０００６】
遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）は、長い距離のクロマチン再構築能を有する転写調節エレメントのクラスである。ＬＣＲは、シスで連結された遺伝子（特に、１コピーの導入遺伝子）に、組み込み部位非依存性（ｓｉｔｅ−ｏｆ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）で、導入遺伝子コピー数依存性の発現の生理学的レベルを付与するそれらの能力によって、トランスジェニックマウスにおいて機能的に規定される。Ｆｒａｓｅｒ，Ｐ．＆Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｆ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０，３６１−３６５（１９９８）；Ｌｉ，Ｑ．，Ｈａｒｊｕ，Ｓ．＆Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１５：４０３−４０８（１９９９）。重要なことに、このような発現は、組織特異的である。ＬＣＲは、ヘテロクロマチンの拡がりを遮り、ＰＥＶを防止することが可能であり（Ｋｉｏｕｓｓｉｓ，Ｄ．＆Ｆｅｓｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ｒ．  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．７，６１４−６１９（１９９７）、それらが調節する遺伝子の５’側または３’側のいずれかに位置し得る一連のＤＮａｓｅＩ高感受性領域からなる（Ｌｉ，Ｑ．，Ｈａｒｊｕ，Ｓ．＆Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｒ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１５：４０３−４０８（１９９９））。
【０００７】
ＬＣＲは、２つの別個であるが、必ずしも独立していない成分から構成されるようである。第１に、「開いたクロマチンドメイン」の確立、第２に導入遺伝子コピー数依存性発現を付与する優性転写活性化能（Ｆｒａｓｅｒ，Ｐ．＆Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｆ．  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０，３６１−３６５（１９９８））。ＬＣＲがそれらの機能を発揮する分子機構は、競合（ｃｏｎｔｅｎｔｉｏｎ）点を残す（Ｈｉｇｇｓ，Ｄ．Ｒ．  Ｃｅｌｌ  ９５，２９９−３０２（１９９８）；Ｂｕｌｇｅｒ，Ｍ．＆Ｇｒｏｕｄｉｎｅ，Ｍ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３，２４６５−２４７７（１９９９）；Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｆ．  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｔ．Ｄｅｖ．９  １５２−２５７（１９９９）；Ｂｅｎｄｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｂｕｌｇｅｒ，Ｍ．，Ｃｌｏｓｅ，Ｊ．＆Ｇｒｏｕｄｉｎｅ，Ｍ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ５，３８７−３９３（２０００））。
【０００８】
高レベルの治療用タンパク質生成物生成する培養哺乳動物細胞株の生成は、大きな発展途上の産業である。クロマチン位置効果により、その産業は、困難な、時間のかかる、かつ高価なプロセスになっている。このような哺乳動物「細胞工場」の生成に対する最も一般に使用されるアプローチは、薬物耐性遺伝子の組み合わせによって誘導される遺伝子増幅（例えば、ＤＨＦＲ、グルタミンシンセターゼ（Ｋａｕｆｍａｎ  ＲＪ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８５，５３７−５６６（１９９０））およびストリンジェントな選択圧の維持に依存している。適切な組織に由来する細胞を用いて、高度に発現される遺伝子ドメインに由来するＬＣＲを含むベクターを使用すると、その手順が非常に単純化され、安定した高レベルの発現を示す、高い割合のクローン性細胞株が与えられる（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｍ、Ｇｏｏｄｉｎｇ  Ｃ，Ｈｕｄｓｏｎ  Ｋ，Ａｎｔｏｎｉｏｕ  Ｍ，Ｇｒｏｓｆｅｌｄ  Ｆ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｓ  Ｍ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ６，１２４−１３１（１９９５））。
【０００９】
しかし、ＬＣＲの組織特異性は、ある状況においては有用ものの、多くの適用について大きな制限でもある（例えば、発現が必要とされる組織について既知である場合、または多くのまたは全ての組織における発現が必要な場合）。
【００１０】
本発明者らの同時係属中の特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９９／０２３５７（ＷＯ００／０５３９３）、ＵＳ０９／３５８０８２、ＧＢ００２２９９５．５およびＵＳ６０／２５２，０４８（本明細書に参考として援用される）は、それらの天然の染色体の状況において、遍在して発現されるハウスキーピング遺伝子から専らなる遺伝子座にわたって開いたクロマチン構造の確立を担うエレメントを記載する。これらのエレメントは、ＬＣＲに由来せず、伸長したメチル化ＣｐＧ島（ｉｓｌａｎｄ）を含む。本発明者らは、このようなエレメントを記載するために用語「遍在性クロマチンオープニングエレメント」を使用した。
【００１１】
哺乳動物ＤＮＡにおいて、ジヌクレオチドＣｐＧは、シトシンを５−メチルシトシンへとメチル化するＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素によって認識される。しかし、５−メチルシトシンは不安定であり、かつチミンに変換される。結果として、ＣｐＧジヌクレオチドは、偶然に予測されるよりも、現れる頻度は遙かに低い。にもかかわらず、ゲノムＤＮＡのいくつかの部分は、予測されるものに近いＣｐＧの頻度を有し、これらの配列は、「ＣｐＧ島」として公知である。本明細書中で使用される場合、用語「ＣｐＧ島」とは、少なくとも５０％のＣｐＧ含有量、および少なくとも０．６の観察される／予測されるＣｐＧ含有量の比（すなわち、偶然に予測されるＣｐＧジヌクレオチド含有量の少なくとも６０％のＣｐＧジヌクレオチド含有量）を有する、少なくとも２００ｂｐのＤＮＡ配列として規定される（Ｇａｒｄｉｎｅｒ−Ｇｒｅｅｎ  Ｍ  ａｎｄ  Ｆｒｏｍｍｅｒ  Ｍ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６，２６１−２８２（１９８７）；Ｒｉｃｅ  Ｐ，Ｌｏｎｇｄｅｎ  Ｉ  ａｎｄ  Ｂｌｅａｓｂｙ  Ａ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １６，２７６−２７７（２０００）。
【００１２】
メチル化なしのＣｐＧ島は、当該分野で周知であり（Ｂｉｒｄら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４０：９１−９９，Ｔａｚｉ  ａｎｄ  Ｂｉｒｄ（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６０：９０９−９２０）、シトシン残基の実質的割合が、メチル化されておらず、通常、２つの近くに間隔をあけられた（０．１〜３ｋｂ）多様に（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔｌｙ）転写された遺伝子の５’末端を超えてのびるＣｐＧ島として規定され得る。これらのＤＮＡ領域は、発生の間中、全ての組織において低メチル化されたままであることが報告されており（Ｗｉｓｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｖｔｃｈｅｖａ（１９９９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６０：２５８−２７１）。これらはしばしば、組織制限発現プロフィールを示す遺伝子の概算４０％と同様に、遍在的に発現される遺伝子の５末端と関連づけられ（Ａｎｔｅｑｕｅｒａ，Ｆ．＆Ｂｉｒｄ，Ａ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，１１９５−１１９９９（１９９３）；Ｃｒｏｓｓ，Ｓ．Ｈ．＆Ｂｉｒｄ，Ａ．Ｐ．  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ，Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５，３０９−３１４（１９９５）、活性クロマチンの局在した領域であることが公知である（Ｔａｚｉ，Ｊ．＆Ｂｉｒｄ，Ａ．  Ｃｅｌｌ  ６０，９０９−９２０（１９９０）。
【００１３】
「伸長された」メチル化なしのＣｐＧ島は、１つを超える転写開始部位を含む領域にまたがってのび、そして／または３００ｂｐを超えて、好ましくは５００ｂｐを超えてのびる、メチル化なしのＣｐＧ島である。その伸長したメチル化なしのＣｐＧ島の境界は、制限エンドヌクレアーゼ酵素（それらの認識配列においてＤＮＡを消化する（切断する）能力が、存在する任意のＣｐＧ残基のメチル化状態に感受性である）と組み合わて、その領域にまたがってＰＣＲを使用することにより機能的に規定される。１つのこのような酵素は、ＨｐａＩＩであり、この酵素は、ＣｐＧ島内で通常見いだされるが、中心ＣＧ残基がメチル化されていない場合のみ、部位ＣＣＧＧを認識して、消化する。従って、ＨｐａＩＩ消化ＤＮＡを用い、ＨｐａＩＩ部位を有する領域にまたがって行ったＰＣＲは、そのＤＮＡがメチル化されていなければ、ＨｐａＩＩ消化に起因して、増幅生成物を与えない。そのＰＣＲは、そのＤＮＡがメチル化されていれば、増幅生成物を与えるにすぎない。従って、そのメチル化なしの領域を超えると、ＨｐａＩＩは、そのＤＮＡを消化せず、ＰＣＲ増幅生成物が観察され、それによって、「伸長したメチル化なしのＣｐＧ島」の境界を規定する。
【００１４】
本発明者らは、ヒトＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）／プロテオソームコンピテントＢ１（ＰＳＭＢＩ）および異種核リボ核タンパク質Ａ２／Ｂ１（ｈｎＲＮＰＡ２）／ヘテロクロマチンタンパク質１Ｈｓγ（ＨＰ１Ｈｓγ遺伝子座に由来する、二重の多様に転写されたプロモーターを含むメチル化なしのＣｐＧ島にまたがる領域は、再現可能な、生理学的レベルの遺伝子発現を与え、それらの領域は、変化に富んだ発現パターンおよびセントロメアヘテロクロマチン内の導入遺伝子組み込みとともに通常起こるサイレンシングを防止することができることを実証した（ＷＯ００／０５３９３）。
【００１５】
本明細書で使用される場合、用語「再現可能な発現」とは、本発明のポリヌクレオチドが、そのクロマチン環境に関わりなく、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドが存在し得る細胞型もしくは組織型に関わりなく、実質的に同じ発現レベルで発現可能な遺伝子の発現を指向することを意味する。当業者は、本願ポリヌクレオチドのクロマチン環境とは関わりなく、細胞が活性な遺伝子発現可能であるとすると、好ましくは、その細胞型とは関わりなく、作動可能に連結された発現可能な遺伝子の実質的に同じレベルの発現が達成されることを認識する。
【００１６】
本発明者らは、活性に転写しているプロモーターと関連づけられたメチル化なしのＣｐＧ島が、クロマチンを再構築する能力を有することを示し（ＷＯ００／０５３９３）、よって、ハウスキーピング遺伝子座において開いたドメインを確立し、維持することにおいて重要な決定因子であると考えられる。
【００１７】
ＵＣＯＥは、導入遺伝子発現のレベルおよび安定性が改善した生産的な遺伝子送達事象の割合の増大を与える。これは、トランスジェニック動物、および培養細胞における組換えタンパク質生成物の生成を含む、重要な研究適用および生物学的適用を有する。本発明者らは、分泌された薬学的に価値のあるタンパク質であるエリスロポエチンとともに、ＣＭＶ−ＥＧＦＰレポーター構築物の発現に対するＵＣＯＥの有益な効果を示した（ＷＯ００／０５３９３）。ＵＣＯＥの特性はまた、遺伝子治療の有用性を示唆し、その有効性は、しばしば、生産的遺伝子送達事象が低頻度であること、ならびに発現の不適切なレベルおよび持続時間によって制限されている（Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．＆Ｓｏｍｉａ，Ｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：２３９−２４２（１９９７）。
【００１８】
本発明者らの前述の出願ＰＣＴ／ＧＢ９９／０２３５７（ＷＯ００／０５３９３）は、約４．０ｋｂ、特に図２１のヌクレオチド４１０２〜８２８６によって規定される「５．５  ＲＮＰ」フラグメント（第１１頁、６行目および７行目に開示される）の機能的ＵＣＯＥフラグメントを開示する。その同じ出願は、「１．５ｋｂ  ＲＮＰ」フラグメント（図２２および２９、第５１頁１行目〜５行目に記載される由来）を開示する。しかし、このフラグメントは、実際に、その出願の図２１のヌクレオチド４１０２〜６２６７からなる、上記の「５．５  ＲＮＰ」フラグメントの２１６５ｂｐ  ＢａｍＨＩ−Ｔｔｈ１１１Ｉフラグメントである。
【００１９】
さらなる出願（ＷＯ０２／２４９３０）において、本発明者らは、天然に存在するＣｐＧ島のフラグメントから構成される、人工的に構築したＵＣＯＥを開示する。開示されるフラグメントは、本願のフラグメントよりも大きく、その当時、小さなフラグメントを個々に使用することが可能であるとは考えられておらず、むしろ合成または「ハイブリッド」ＵＣＯＥ構築物の成分にすぎないと考えられていた。
【００２０】
これらの重要な推測および広い範囲の出願を考慮すると、導入遺伝子発現レベルをさらに最適化することが望ましい。導入遺伝子発現のレベルを、特に、インビボ遺伝子治療の分野で、および組換えタンパク質のインビトロ生成のために、さらに最適化することが必要である。
【００２１】
１つの詳細な必要性は、遺伝子発現を増強するために使用されるエレメントのサイズを小さくすることである。そうすることによって、より小さなベクターまたは挿入物にサイズに関してより大きな収容能力を有するベクターが生成され得、それらは、安定に含み、かつ発現し得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の要旨）
本発明の目的は、作動可能に連結された導入遺伝子のレベルおよび再現性を増強する、より小さなクロマチンオープニングエレメントを提供することである。
【００２３】
本発明に従って、ＵＣＯＥの小さな機能的フラグメントを含むポリヌクレオチドが提供される。このようなポリヌクレオチドは、わずか約２ｋｂのメチル化なしのＣｐＧ島、または約２ｋｂ以下のより大きなこのような島のフラグメントを含む。伸長したメチル化なしのＣｐＧ島を含むより大きなポリヌクレオチドは当該分野で公知であるが（出願人自身の以前の出願ＷＯ００／０５３９３を参照のこと）、有意により小さなフラグメントを使用し、より大きなＵＣＯＥ／メチル化なしのＣｐＧ島で得られた発現のレベルおよび一貫性の増強をなお維持しすることが可能か否かは、以前に確立されていなかった。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結される」とは、本発明のポリヌクレオチドにおけるエレメント間の機能（作動）の関係をいう。「作動可能に連結される」とは、シス作用性ＤＮＡ配列の間の機能的関係を記載する、当業者に周知の用語である。その正確な構造的関係は、関連があってもよいし、なくてもよく、異なる型のエレメントについては異なる。プロモーターについては、このプロモーターが駆動するオープンリーディングフレームに対して５’側の（通常、１００ｂｐ未満内で）本質的に隣接する位置を暗示する。伸長したメチル化なしのＣｐＧ島の場合において、クロマチン構造に対する領域の効果が、遺伝子発現のレベルおよび一貫性の増大を担うようである。例示によれば、伸長したメチル化なしのＣｐＧ島を含むエレメントは、発現可能な遺伝子の転写を制御するプロモーターのすぐ５’側に位置する。しかし、「作動可能に連結される」は、明瞭な機能的効果が実証され得る限り、それがほかの場所に位置する可能性を包含する。
【００２５】
本発明は、以下：
ａ）伸長したメチル化なしのＣｐＧ島；
ｂ）その伸長したメチル化なしのＣｐＧ島に作動可能に連結された発現可能なオープンリーディングフレーム；
ｃ）そのオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたプロモーターであって、ここでそのプロモーターは、上記ＣｐＧ島に天然には連結されていない、プロモーター；
を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供し、上記ＣｐＧ島は、サイズが２ｋｂ以下であることを特徴とし、上記オープンリーディングフレームの再現可能な発現が、２種以上の組織型から得られる。
【００２６】
あるいは、そのポリヌクレオチドは、１５４６ｂｐ  Ｅｓｐ３Ｉ制限フラグメント、より好ましくは、図２の配列（ヌクレオチド９７７〜２５２２（配列番号１））、またはその機能的ホモログを含む、わずか２ｋｂの、好ましくは、わずか１．６ｋｂのヒトｈｎＲＮＰ  Ａ２遺伝子のフラグメントを含む。好ましくは、上記フラグメントは、正方向に配向される。
【００２７】
「機能的ホモログ」とは、ストリンジェントな条件下で、開示された配列にハイブリダイズし得、２種以上の組織で作動可能に連結された発現可能なオープンリーディングフレームの再現可能な発現を付与するという類似の特性を有するポリヌクレオチド配列を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション／洗浄条件下は、当該分野で周知である。例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、６０℃での洗浄後に安定な核酸ハイブリッド。最適なハイブリダイゼーション条件は、核酸配列が既知であれば、計算し得ることは、当該分野で周知である。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションに供する核酸のＧＣ含量によって決定され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈを参照のこと。特定された相同性の核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために必要なストリンジェンシー条件を計算するための一般式は、以下である：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１［％  Ｇ＋Ｃ］−０．６３（％ホルムアミド）
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、非組織特異的に作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にする。
【００２８】
さらなる好ましい実施形態において、そのポリヌクレオチドは、わずか約１ｋｂの、好ましくは、９８７ｂｐ  ＢｓｐＥ１−Ｅｓｐ３Ｉ制限フラグメントを含み、より好ましくは、図２の配列（ヌクレオチド１５３６〜２５２２（配列番号２））を含む、ヒトｈｎＲＮＰ  Ａ２遺伝子のフラグメントを含む。
【００２９】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、１以上の天然に存在するプロモーターを含む。
【００３０】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、多様に転写する二重プロモーター（ｄｕａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）または２方向性プロモーター（ｂｉ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を含む。
【００３１】
代替的実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、β−アクチンＣｐＧ島／プロモーター領域のフラグメント、好ましくはヒト起源のフラグメントを含む。より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ヒトβ−アクチンＣｐＧ島／プロモーター領域にまたがる１００ｂｐ〜２ｋｂの範囲内のＤＮＡフラグメントを含む。
【００３２】
さらなる代替において、本発明のポリヌクレオチドは、そのＰＤＣＤ２  ＣｐＧ島／プロモーター領域のフラグメント、好ましくはヒト起源のフラグメントを含む。より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ヒトＰＤＣＤ２  ＣｐＧ島／プロモーター領域にまたがる１００ｂｐ〜２ｋｂの範囲内のＤＮＡフラグメントを含む。
【００３３】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ヒトβ−アクチンＣｐＧ島／プロモーター領域にまたがる１００ｂｐ〜１．９ｋｂの範囲内のＤＮＡフラグメントおよびヒトＰＤＣＤ２  ＣｐＧ島／プロモーター領域にまたがる１００ｂｐ〜２ｋｂの範囲内のＤＮＡフラグメントを含む。好ましくは、上記フラグメントは、異なって配向されたそれらのプロモーターと直接隣接している。
【００３４】
別の局面において、本発明は、上記で議論されるように、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。好ましくは、上記ベクターは、真核生物遺伝子発現に適合された発現ベクターである。
【００３５】
代表的には、上記の適合は、例示であって限定ではなく、細胞／組織特異的発現を媒介する転写制御配列（プロモーター配列）の供給を包含する。
【００３６】
プロモーターおよびエンハンサーは、当該分野で周知の用語であり、例示であって、限定としてではなく提供される以下の特徴を包含する。プロモーターは、転写の開始に直接関連した５’側のシス作用性調節配列である。プロモーターエレメントは、転写開始部位を選択する用に機能する、いわゆるＴＡＴＡボックスおよびＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列を含む。これらの配列はまた、特に、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を容易にするように機能するポリペプチドを結合する。
【００３７】
好ましくは、そのプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ−Ｉα、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、もしくはＨＩＶ２  ＬＴＲまたはこれらに由来する配列の組み合わせから選択される。より好ましくは、そのプロモーターは、ＣＭＶ最初期／初期プロモーターである。最も好ましくは、それは、マウスＣＭＶ最初期／初期プロモーターである。
【００３８】
ベクターの好ましい実施形態において、本発明のＣｐＧ島は、その発現可能なオープンリーディングフレームの発現を制御するその作動性のプロモーターに対して５’側に隣接して位置する。
【００３９】
エンハンサーエレメントは、遺伝子の転写開始部位に対して５’側でしばしば見いだされる、シス作用性核酸配列である（エンハンサーは、遺伝子配列に対して３’側にも見いだされ、イントロン配列中にさえ位置し、よって、位置非依存性である）。エンハンサーは、エンハンサーが連結される遺伝子の転写の速度を増大するように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサーエレメントに特異的に結合することが示された、トランス作用性転写因子（ポリペプチド）に応答性である。転写因子の結合／活性は、多くの環境的きっかけ（例えば、中間代謝産物（例えば、グルコース）があげられるが、これらに限定されない）、環境的エフェクター（例えば、熱）に応答性である。（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ，Ｄａｖｉｄ  Ｓ  Ｌａｔｃｈｍａｎによる，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏを参照のこと）。
【００４０】
適合はまた、選択マーカーおよび自己複製配列の供給を包含し、選択マーカーおよび自己複製配列はともに、真核生物細胞または原核生物宿主のいずれかにおいて、上記ベクターの維持を容易にする。自立的に維持されるベクターは、エピソームベクターといわれる。エピソームベクターは、自己複製可能であり、よって組み込みを必要とすることなく残るので、望ましい。この型のエピソームベクターは、ＷＯ９８／０７８７６に記載される。
【００４１】
ベクターコード遺伝子の発現を容易にする適合は、転写終結／ポリアデニル化配列の供給を包含する。これまたはバイシストロン発現カセットまたはマルチシストロン発現カセットには位置されるベクターコード遺伝子の発現を最大化するように機能する内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の供給を含む。
【００４２】
これらの適合は、当該分野で周知である。一般に、発現ベクター構築および組換えＤＮＡ技術に関する刊行された文献の量は、多い。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹおよびそこに引用される参考文献；Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｆ（１９８７）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｖｏｌ  ＩＩＩ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  ＵＫ；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｆ  Ｍ  Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９８４）を参照のこと。
【００４３】
ベクターは、エピソームベクターまたは組み込みベクターであり得る。好ましくは、そのベクターは、プラスミドである。あるいは、そのベクターは、ウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルスまたは他のレトロウイルス）であり得る。
【００４４】
好ましくは、そのベクターは、作動可能に連結された、治療用核酸である遺伝子を含む。このような治療用核酸は、疾患（例えば、嚢胞性線維症、サラセミア（ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ）、鎌状赤血球貧血（ｓｉｃｋｌｅ  ａｎａｅｍｉａ）、ファンコーニ貧血、血友病、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、α−１アンチトリプシン欠損、デュシェーヌ筋ジストロフィー、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損または骨形成不全症）を引き起こす欠損遺伝子の機能を置き換えるかまたは補充することによって作用し得る。あるいは、治療用核酸は、標的細胞（例えば、悪性癌細胞）を殺傷するために、標的細胞において選択的に発現される細胞傷害性薬剤またはプロドラッグ変換酵素をコードし得る。このような適用などは、当業者に周知であり、治療用核酸の発現を増強することにおける本発明の関連性は、このような当業者に明らかである。
【００４５】
最も好ましくは、そのベクターは、配列番号１もしくは配列番号２、ＣＭＶプロモーター、マルチクローニング部位、ポリアデニル化配列および適切な制御エレメント下での選択マーカーをコードする遺伝子のいずれか１つを含む。
【００４６】
そのベクターでトランスフェクトされた宿主細胞もまた提供される。好ましくは、これは、真核生物細胞であり、より好ましくは、哺乳動物細胞であり、最も好ましくは、ヒト細胞もしくは齧歯類細胞である。
【００４７】
あるいは、その宿主細胞はまた、植物細胞であり得る。
【００４８】
本発明の別の局面は、単離されたポリヌクレオチド、メチル化なしの伸長されたＣｐＧ島（特に、配列番号１もしくは配列番号２により開示される）、治療において、上記で開示されたベクターもしくは宿主細胞のいずれかの使用、特に遺伝子治療におけるそれらの使用である。
【００４９】
本発明はまた、遺伝子治療において使用するための医薬品または組成物の製造におけるポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の使用を提供する。
【００５０】
本発明はまた、処置方法を提供し、この方法は、このような処置を必要とする患者に、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の有効用量を投与する工程を包含する。好ましくは、その患者は、遺伝子治療によって処置可能な疾患に罹患している。
【００５１】
本発明はまた、疾患を処置するか、またはその細胞もしくは特定の組織の有利なタンパク質もしくは機能を提供する治療のための、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤と混合して、上記ポリヌクレオチドおよび／または上記ベクターおよび／または宿主細胞を含む薬学的組成物を提供する。
【００５２】
本発明のポリヌクレオチドもしくはベクターもしくは宿主細胞、または薬学的組成物は、全身性の筋肉内注入、静脈内注入、エアロゾル注入、経口（固体もしくは液体の形態）注入、局所的注入、眼への注入、直腸注入、腹腔内注入、および／または髄腔内注入および局所的直接注入を含む経路を介して投与され得る。
【００５３】
正確な投薬レジメンは、当然のことながら、個々の患者に対する個々の医師によって決定されることが必要であり、これは、続いて、目的の遺伝子によって発現されるタンパク質の正確な性質および処置の標的になる組織型によって制御される。
【００５４】
投薬量はまた、疾患の指標および投与経路に依存する。投与の回数は、疾患、および臨床試験からの有効性データに依存する。
【００５５】
本発明に従う有効な遺伝子治療のために送達されるポリヌクレオチドもしくはベクターＤＮＡの量は、好ましくは、体重１ｋｇあたり５０ｎｇ〜１０００μｇの範囲；より好ましくは、１ｋｇあたり１〜１００μｇのベクターＤＮＡの範囲である。
【００５６】
本発明に従えば、そのポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞をインビボでの細胞取り込みのために哺乳動物に投与することは好ましいが、エキソビボアプローチが使用され得、そのアプローチによって、細胞が動物から取り出され、そのポリヌクレオチドもしくはベクターで形質導入され、ついで、その動物に再移植され得る。肝臓は、例えば、肝細胞を動物から取り出し、その肝細胞をインビトロで形質導入し、その形質導入された肝細胞をその動物に再移植することによるエキソビボアプローチによって到達され得る（例えば、ウサギについては、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１８０２−１８０５，１９９１に記載されるように、またはヒトにおいては、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１７９−２２２，１９９２により記載されるように）。このような方法はまた、循環系またはリンパ系における細胞（例えば、赤血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞および造血幹細胞）の種々の集団に送達するために有効であり得る。
【００５７】
さらなる局面において、本発明は、望ましい遺伝子産物を得るために、細胞培養系における本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の使用を提供する。好ましくは、その発現可能な核酸は、インビトロ細胞培養系において発現するための組換えタンパク質をコードする。
【００５８】
適切な細胞培養系は、当該分野で周知であり、当業者に公知の一連の文献において十分に記載されている。本発明に従うポリペプチドの生成のための方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：
ｉ）本発明に従うポリヌクレオチドで形質転換／トランスフェクトされた細胞を提供する工程；
ｉｉ）その細胞を、そのポリペプチドの製造を行う条件下で増殖させる工程；および
ｉｉｉ）そのポリペプチドをその細胞もしくはその増殖環境から精製する工程。
【００５９】
あるいは、その発現可能な遺伝子は、非ポリペプチド生成物（例えば、ＲＮＡ）をコードする。このようなＲＮＡは、転写後レベルで特定の遺伝子の発現を阻害し得るアンチセンスＲＮＡであってもよいし、酵素機能（リボザイム）または他の機能（例えば、リボソームＲＮＡ）を有していてもよい。
【００６０】
内因性遺伝子の発現を増大させるために、配列番号１もしくは配列番号２のいずれかに従う、伸長したメチル化なしのＣｐＧ島ポリヌクレオチドの使用もまた提供され、内因性遺伝子と作動可能に関連づけられた位置で細胞のゲノムにポリヌクレオチドを挿入し、それによって、その遺伝子の発現レベルを増大させることを包含する。
【００６１】
本発明の別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドもしくは本発明のベクターのいずれか、または本発明の伸長したメチル化なしのＣｐＧ島（ここでそのＣｐＧ島は、人工的に導入される）のいずれかを含む、非ヒトトランスジェニック動物が提供される。トランスジェニックマウス（Ｇｏｒｄｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：７３８０（１９８０）；Ｈａｒｂｅｒｓｅｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ２９３：５４０（１９８１）；Ｗａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：５０１６（１９８１）；およびＷａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６３７６（１９８１）、トランスジェニックヒツジ、トランスジェニックブタ、トランスジェニックニワトリ（Ｈａｍｍｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：６８０（１９８５）を参照のこと）などを作出する方法は、当該分野で周知であり、本発明に従う使用のために企図される。
【００６２】
本発明のポリヌクレオチドを含むこのようなトランスジェニック動物はまた、目的のタンパク質を長期間生成するために使用される。
【００６３】
本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を使用して、遺伝子治療の効力を決定するための哺乳動物モデルもまた提供される。その哺乳動物モデルは、その細胞が本発明のベクターを含むトランスジェニック動物を含む。このような動物は、ヒトにおける臨床試験の前に試験することを可能にする。
【００６４】
本発明はまた、トランスジェニック植物を生成することにおける本発明のポリヌクレオチドおよび伸長したメチル化なしのＣｐＧ島の使用を提供する。
【００６５】
収量の増大、または疾患、病害虫、干魃もしくは塩に対する耐性の増大を有するトランスジェニック植物の生成は、当業者に周知である。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を含むトランスジェニック植物を提供する。本発明のポリヌクレオチドを含む細胞のいくつかまたは全てが、植物から生じ得る。
【００６６】
本発明はまた、機能ゲノミクス適用における本発明のポリヌクレオチド、ベクターもしくは伸長したメチル化なしのＣｐＧ島の使用に関する。機能ゲノミクスは、主に、特定の細胞型もしくは疾患状態において特異的に発現される遺伝子の同定に関し、ここで創薬もしくは遺伝子治療目的で潜在的に目的の新規な数千もの遺伝子配列を提供する。新規な治療の開発のためのこの情報を使用することにおける大きな問題は、どのようにして、これらの遺伝子の機能を決定するかということにある。本発明のポリペプチドは、遺伝子配列の機能を決定するために、多くの機能ゲノミクス適用において使用され得る。本発明の機能ゲノミクス適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
（１）その遺伝子配列またはリボザイムノックダウンライブラリーのアンチセンスバージョンの持続した発現を達成して、それにより細胞表現形に対するその遺伝子の不活性化の影響を決定するために、本発明のポリヌクレオチドを使用すること。
【００６７】
（２）細胞への送達が、その遺伝子配列の信頼性のある、再現可能な持続性の発現を生じるように、その遺伝子配列のための発現ライブラリーを調製するために、本発明のポリヌクレオチドを使用すること。その遺伝子配列を発現する得られた細胞は、機能決定および創薬に対する種々のアプローチにおいて使用され得る。例えば、その遺伝子産物に対する中和抗体を惹起すること；構造研究、機能研究または薬物スクリーニング研究における使用のためにその遺伝子自身のタンパク質生成物を迅速に精製すること；または細胞ベースの薬物スクリーニングにおいて。
【００６８】
（３）マウス胚性幹（ＥＳ）細胞およびトランスジェニックマウスに関与するアプローチにおいて、本発明のポリヌクレオチドを使用すること。最も強力な機能ゲノミクスアプローチの１つは、マウスＥＳ細胞における遺伝子に、発現される遺伝子へ挿入した後に薬物選択を可能にするのみであり、かつ配列決定のために容易に取り出され得る構築物をランダムに挿入することを包含する（Ｇ．Ｈｉｃｋｓら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６，３３８−３３４）。新規な配列を有する遺伝子においてノックアウト変異を有するトランスジェニックマウスは、次いで、それらの機能をプローブするために作出され得る。現時点で、この技術は、マウスＥＳ細胞において十分に発現されるマウス遺伝子の１０％について十分に機能する。本発明のポリヌクレオチドを組み込み構築物に組み込むことは、この技術により、マウスにおいて発現される全ての遺伝子を同定することが予測されるようになる。
【００６９】
本発明は、ここで例示によって、かつ添付の図面を参照して、記載される。
【実施例】
【００７０】
（実施例１：１．５ｋｂ  ＨＰ−１／ｈｎＲＮＰ  Ａ２  ＵＣＯＥは、発現を高める）
（材料および方法）
（ベクターの構築）
本発明者らの先の出願ＷＯ００／０５３９３において議論されるように、ベクターＣＥＴ２０を、ヒトＨＰ−１／ｈｎＲＮＰ  Ａ２遺伝子座の８．３ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（これは、ＨＰ１／ＲＮＰプロモーターおよび伸長したＣｐＧ島を含む）を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングすることによって、生成した。
【００７１】
挿入物の４１８６ｂｐ（４ｋｂといわれる）フラグメントを、次いで、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することによって取り出した。このフラグメントの末端を、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して埋めて、ＡｓｅＩで消化し、かつ末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して再び埋めたｐＥＧＦＰＮ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に連結した。次いで、両方の配向にあるフラグメントを有するクローンを、単離した。
【００７２】
１５４６ｂｐ  Ｅｓｐ３Ｉ（ＢｓｍＢＩのイソシゾマー）フラグメント（１．５ｋｂフラグメントといわれる）を、Ｅｓｐ３Ｉ（ＢｓｍＢＩ）で消化することによってＣＥＴ２０から再び単離し、次いで、末端を埋めた。次いで、これを、上記のｐＥＧＦＰＮ−１のＡｓｅＩ部位に連結し、両方の配向にあるフラグメントを有するクローンを同定した（その「正方向」の配向は、ＲＮＰＡ２プロモーターが、そのＥＧＦＰ導入遺伝子が転写された、隣接する下流の作動性ＣＭＶプロモーターと同じ、５’から３’方向に配向に配向された状態である）。
【００７３】
（トランスフェクション）
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、標準的な方法に従って、同時係属中の出願（参考として援用される）に記載されるように、トランスフェクトし、Ｇ４１８中で選択した。
【００７４】
（ＧＦＰ発現の分析）
トランスフェクトした細胞を、６００μｇ／ｍｌのＧ４１８選択に対して維持した。細胞を標準的なリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、標準的な方法に従って、トリプシン／ＥＤＴＡで基材からはがした。過剰な栄養混合物Ｆ１２（ＨＡＭ）培地（Ｇｉｂｃｏ）を添加し、その細胞を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎに夜分析のために、５ｍｌの丸底ポリスチレンチューブに移した。ＧＦＰ蛍光を検出し、親細胞集団の自己蛍光と比較した。細胞集団の発現を、メジアン蛍光を、（標準的な方法に従って）コントロールに対する任意の単位設定として図で線形スケールで、および陽性発現物として判断される細胞％に関しての両方で表した。
【００７５】
（結果）
図３に示されるように、その１．５ｋｂフラグメントは、コントロールと比較して、メジアン蛍光に関して有意な発現の増強（少なくとも７０日間にわたって約１０倍）が与えられ、正方向に挿入した場合、４ｋｂフラグメントでは約６０％の増強が認められた。図５に示される実験において、その正方向１．５ｋｂフラグメントの発現は、４ｋｂフラグメントで得られる発現に匹敵する。しかし、その逆方向は、図３に示されるように、メジアン蛍光に関して、かなり有効ではないようである。
【００７６】
図４は、両方の配向が、陽性細胞％に関して匹敵することを示す。にも拘わらず、これらのデータは、このフラグメントがある程度の指向性を有し得ること、および目的の大部分で、正方向が好ましいことを示唆する。
【００７７】
（実施例２：１ｋｂ  ＨＰ−１／ｈｎＲＮＰ  Ａ２  ＵＣＯＥは、発現を高める）
（材料および方法）
（ベクターの構築）
その１ｋｂ  ＵＣＯＥ含有ベクターを、１．５ｋｂ  Ｅｓｐ３Ｉフラグメントを正方向で有するｐＥＧＦＰＮ−１ベクターを、ＰｃｉＩおよびＢｓｐＥＩで消化して５’５００ｂｐを取り出し、続いて、末端を埋め、再連結することによって構築した。このことにより、１つの配向にのみ９８７ｂｐ  ＢｓｐＥＩ−Ｅｓｐ３Ｉフラグメントを有するベクターを生成した。
【００７８】
（結果）
正方向のその１ｋｂ（９８７ｂｐ）フラグメントは、メジアン蛍光（図５）および陽性細胞％（図６）の両方に関して、正方向にある１．５ｋｂフラグメントに匹敵するようである。
【００７９】
（実施例３：１．５ｋｂ  ＨＰ−１／ｈｎＲＮＰ  Ａ２  ＵＣＯＥは、アデノウイルスにコードされる構築物における発現を高める）
（材料および方法）
（細胞培養）
ＨｅＬａを、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入した。ＰＥＲ．Ｃ６を、Ｃｒｕｃｅｌｌ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得た。全ての購入した細胞株を、供給元により推奨されるように培養した。９１１細胞は、Ｌ．Ｓ．Ｙｏｕｎｇ教授（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＵＫ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）から譲ってもらい、抗生物質を含むＤＭＥＭ／１０％  ＦＣＳ中で培養した。
【００８０】
（プラスミド構築）
ＰＧＬ３ｂａｓｉｃを、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）から購入した。これは、マルチクローニング部位から下流側にルシフェラーゼ−ＳＶ４０ｐ（Ａ）カセットを含む。ヒトＣＭＶエンハンサー／プロモーター（０．９ｋｂ）を、ＳｍａＩ消化したｐＧＬ３ｂａｓｉｃにクローニングして、ｐＧＬ３／ＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＳＶ４０ｐ（Ａ）を生成した。ｐＧＬ３／１．５ｋｂ（Ｆ）ＵＣＯＥ−ＣＭＶ−ＳＶ４０ｐ（Ａ）を生成するために、その１．５ｋｂ  ＵＣＯＥ  Ｅｓｐ３Ｉフラグメント（図１および２を参照のこと）を、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）で平滑末端化し、次いで、ＮｈｅＩ消化しかつＴ４で平滑末端化したｐＧＬ３ｂａｓｉｃ／ＣＭＶ−Ｌｕｃに連結した。
【００８１】
（ウイルスベクター構築）
ｐＰＳ１１２８／ＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＳＶ４０ｐ（Ａ）およびｐＰＳ１１２８／１．５ｋｂ（Ｆ）ＵＣＯＥ−ＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＳＶ４０ｐ（Ａ）を構築するために、それらの発現カセットを、ｐＧＬ３／ＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＳＶ４０ｐ（Ａ）からＰｖｕＩ／ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ消化によって、およびｐＧＬ３／１．５ｋｂ（Ｆ）ＵＣＯＥ−ＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＳＶ４０ｐ（Ａ）からＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ消化によって切り出し、両方のカセットを、次いで、平滑末端化し、ＳｐｅＩ消化し、かつ平滑末端化したｐＰＳ１１２８にクローニングした（Ｄｊｅｈａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０００：７２１−７３１）。プラスミドを、制限酵素消化により分析した。
【００８２】
ウイルスＡｄ．ＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＳＶ４０ｐ（Ａ）およびＡｄ．１．５ｋｂ（Ｆ）ＵＣＯＥ−ＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＳＶ４０ｐ（Ａ）を、それぞれｐＰＳ１１２８／ＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＳＶ４０ｐ（Ａ）およびｐＰＳ１１２８／１．５ｋｂ（Ｆ）ＵＣＯＥ−ＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＳＶ４０ｐ（Ａ）、ならびにその重なり合うアデノウイルス骨格ベクターｐＰＳ１１６０（Ｄｊｅｈａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０００：７２１−７３１）を使用して、ＰＥＲ．Ｃ６における相同組換えにより構築し、スケールアップし、ＣｓＣｌ精製し、他で記載されるように力価測定した（Ｌｉｐｉｎｓｋｉら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，８，２００１：２７４−２８１）。
【００８３】
（ウイルス感染およびルシフェラーゼ活性アッセイ）
ＨｅＬａ細胞（５．０×１０４／６ウェル）を、それぞれ２００μｌの感染培地（抗生物質を含むＥＭＥＭ／１％  ＦＣＳ）中にそれぞれのウイルスを含有する懸濁液中で、２〜３時間にわたって感染させた。次いで、１ｍｌの完全培地を添加し、細胞を６ウェルプレートに播種した。全細胞抽出物を、２００μｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．８，８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、１５％  グリセロール）中でそれらの細胞を溶解し、その溶解物を遠心分離（１分間、１３，０００×ｇ、ＲＴ）で清澄にすることによって調製した。各上清のアリコートを、示された時点で、ルミノメーター（Ｌｕｍａｔ  ＬＢ  ９５０１，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｗｉｌｄｂａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して線形範囲でルシフェラーゼ活性についてアッセイした。
【００８４】
（結果）
そのＵＣＯＥが、アデノウイルスベクターにおける遺伝子発現を高め得るか否かを分析するために、その１．５ｋｂ  ＵＣＯＥを、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を駆動するヒトＣＭＶエンハンサー／プロモーターの上流に（ＲＮＰプロモーターは、ＣＭＶプロモーターと同じ配向を有する）正方向でクローニングした。図７は、それらのルシフェラーゼ活性について比較した、２つのウイルスの構造を模式的に示す。ＨｅＬａ細胞に、５０のＭＯＩで、そのそれぞれのウイルスを感染させ、ルシフェラーゼ活性を、感染させて２日後に分析した。図８は、その１．５ｋｂ  ＵＣＯＥフラグメントが、ＨｅＬａ細胞におけるレポーター遺伝子発現のレベルを劇的に増大させ得ることを明らかに示す。ウイルス増殖に関連した特異的効果を排除するために、本発明者らは、両方のウイルスの新たな調製物を準備し、その実験を繰り返した。図９は、そのＵＣＯＥ効果が、ウイルス調製物に依存しなかったこと、および新たな独立した調製物で十分に再現性があったことを示す。
【００８５】
（実施例４：１．５ｋｂ  ＨＰ−１／ｈｎＲＮＰ  Ａ２  ＵＣＯＥは、レトロウイルスによりコードされる構築物における発現を高める）
（材料および方法）
（細胞培養）
ＨｅＬａ、ＣＨＯ−Ｋ１および２９３を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から得た。ＨｅＬａおよび２９３を、ともに、ＤＭＥＭ、１０％  ＦＣＳ（１％  ＮＥＡＡ添加および抗生物質含有）中で培養した。ＣＨＯ−Ｋ１を、栄養混合物Ｆ１２（ＨＡＭ）培地（１０％  ＦＣＳおよび抗生物質を含む）中で培養した。
【００８６】
（プラスミド構築）
プラスミドｐＶＰａｃｋ−ＧＰおよびｐＶＰａｃｋ−ＶＳＶ−Ｇを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）から得た。これらは、それぞれ、レトロウイルスｇａｇ−ｐｏｌおよびエンベロープＶＳＶ−Ｇタンパク質を発現させる。レトロウイルスベクターｐＱＣＸＩＸを、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。これは、導入遺伝子発現のためのヒトＣＭＶプロモーターを含む。プラスミドｐｈｒＧＦＰ−１をＳｔｒａｔａｇｅｎｅから購入し、これを、改変ＧＦＰ  ｃＤＮＡの供給源として使用した。ｐＱＣＸＩＸ−ＣＭＶ−ｈｒＧＦＰをクローニングするために、そのｈｒＧＦＰ  ｃＤＮＡを、ｐｈｒ−ＧＦＰ−１からＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ消化によって切り出し、ＢａｍＨｌ／ＥｃｏＲＶ消化したｐＱＣＸＩＸにクローニングした。ｐＱＣＸＩＸ−１．５ＵＣＯＥ−ＣＭＶ−ｈｒＧＦＰを生成するために、その１．５ｋｂ  ＵＣＯＥフラグメント（Ｅｓｐ３Ｉ／ＢｓｍＢＩフラグメント）を、Ｘｂａｌ消化しかつ平滑末端化したｐＱＣＸＩＸ−ＣＭＶ−ｈｒＧＦＰに、平滑末端化フラグメントとしてクローニングした。
【００８７】
（両栄養性ＶＳＶ−Ｇ−エンベロープ化レトロウイルス粒子の生成）
全てのウイルスを、両栄養性ＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質）エンベロープで擬型化し、非常に効率的かつ広い宿主範囲の形質導入を可能にした。その使用したレトロウイルスベクター（ｐＱＣＸＩＸ）は、逆転写後に、その５’ＬＴＲにコピーされ、よって、その５’ＬＴＲからのいかなるさらなる転写をも阻害するその３’ＬＴＲのＵ３領域の欠失に起因して、自己不活性化ウイルスを生成する。
【００８８】
４．５×１０６の２９３細胞（翌日、細胞は、８０〜９０％コンフルエントになっているはずである）を、一過性トランスフェクションの前の日に、Ｉ型コラーゲンコーティングした８．４ｃｍ直径（５５．６ｃｍ２）のディッシュに播種した。次の日、１１４μｌのリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｅｎｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、２８６μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、室温（ＲＴ）にて５分間インキュベートした。平行して、１．５μｇの各プラスミドｐＶＰａｃｋ−ＧＰ、ｐＶＰａｃｋ−ＶＳＶ−Ｇおよびレトロウイルスベクターを、ＯｐｔｉＭＥＭと混合して、最終容量４００μｌを得た。そのＤＮＡミックスを、そのリポフェクタミン２０００溶液に添加し、ＲＴにて２０〜３０分間インキュベートした。このインキュベーションの間に、その２９３細胞をＰＢＳで１回洗浄し、６ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ／１０％  ＦＣＳをその細胞に添加した。最終的に、そのＤＮＡ／リポフェクタミンミックスを、その細胞に滴下して、その細胞を、５％  ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で５時間インキュベートした。その培地を、次いで、８ｍｌの新しい２９３培養培地と交換し、その細胞を、さらに２４〜３６時間インキュベートした。最後に、ウイルス粒子を含む上清を、細胞から回収し、１０００ＲＰＭで５分間遠心分離して、細胞および細胞細片をペレットにし、その上清を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶ  ＰＶＤＦ低タンパク質結合０．４５μｍフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｏｌｓｈｅｉｍ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いてフィルター滅菌した。その上清を、アリコートに分け、液体窒素で急速凍結し、−８０℃で保存した。
【００８９】
（標的細胞株のレトロウイルス形質導入）
標的細胞（ＨｅＬａ、ＣＨＯ−Ｋ１）を、感染の前日に、１×１０５細胞／ウェルで、６ウェルプレート中に播種した。ウイルス形質導入のために、上清を含む種々の量のウイルスを、８．０μｇ／ｍｌ  ポリブレン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）の存在下で添加した。細胞を、２４時間にわたってそのウイルスとともにインキュベートし、次いで、その培地を新しい培地と交換した。遺伝子発現は、形質導入の２日後から観察できる。細胞効果あたりの複数コピーを防止するために、全ての分析物について、標的細胞に、１００％  形質導入効率（通常は、１〜２０％のＧＦＰ陽性細胞）より遙かに低いウイルス量を感染させた。この範囲の形質導入効率内で、感染のために使用される上清の容量は、陽性細胞数と線形的に相関するのに対して、平均発現レベルは、より低い増加を示す。
【００９０】
（ＦＡＣＳ分析）
ＦＡＣＳ分析のために、標的細胞をＰＢＳで洗浄して、トリプシン処理し、完全培地中で再懸濁、ｈｒＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）発現を、各研究について一定の機器設定を使用して、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）で分析した。データを、Ａｐｐｌｅ  ＭｃＩｎｔｏｓｈ用のＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアで分析した。
【００９１】
（ＦＡＣＳソーティング）
ＧＦＰを発現するＨｅＬａ細胞およびＣＨＯ−Ｋ１細胞をソートするために、細胞をＦＡＣＳ分析用として調製し、次いで、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＦＡＣＳ−Ｓｏｒｔｅｒ（Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫに準備してもらった）でソートした。ソートした単一のクローンおよびプールを、次いで、増殖させ、ＧＦＰ発現を経時的に追跡した。
【００９２】
（結果）
第１の研究において、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、そのレトロウイルスＣＭＶ−ｈｒＧＦＰ（ＣＭＶ）および１．５ＵＣＯＥ−ＣＭＶ−ｈｒＧＦＰ（１．５ＵＣＯＥ−ＣＭＶ）を含む細胞上清で形質導入した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、材料および方法において記載されるように形質導入し、感染させて３日後、ＧＦＰ陽性細胞を、集団プール（各ウイルス構築物につき３６，０００細胞）としてＦＡＣＳでソートし、次いで、増殖させた。ＧＦＰ発現およびヒストグラムパターンを、経時的に追跡し、それぞれ図１Ａおよび１Ｂに例示する。分析の１７日目に、その１．５ＵＣＯＥ−ＣＭＶプールの平均値は、そのＣＭＶプールの平均値より２．６倍高い。さらに、図１０Ｂに示されるヒストグラムと同様に、その１．５ＵＣＯＥ−ＣＭＶプールは、そのＣＭＶプールよりも高いＧＦＰ発現のピークを与える。マーカー１における、ＧＦＰ陽性細胞についてのその平均ＣＶ値（変動係数；これは、ＧＦＰ発現の均質性についてのマーカーである）は、そのＣＭＶプールについては１４６．０であり、１．５ＵＣＯＥ−ＣＭＶプールについては８３．０である。
【００９３】
この研究と同様に、ＣＨＯ−Ｋ１を形質導入し、その集団を、ＦＡＣＳソーティングをせずに経時的に追跡した。そのＭＯＩを、比較的低いパーセンテージの陽性細胞を与えるように選択して、細胞効果あたりの複数コピーを排除した。図１１Ａ（プールＩは約５％  ＧＦＰ陽性細胞を有する）に示されるように、測定の最後の時点での１．５ＵＣＯＥ−ＣＭＶ集団についての陽性細胞の平均は、そのＣＭＶ集団の平均よりも２．８倍高い。プールＩＩについて（約１５〜２５％のＧＦＰ陽性細胞；図１２Ａ）、測定の最後の時点での１．５ＵＣＯＥ−ＣＭＶ集団の平均は、そのＣＭＶ集団についての平均より２．３倍高い。
【００９４】
ＦＡＣＳソートした集団と同様に、その１．５ＵＣＯＥ−ＣＭＶ集団は、分析した全ての時点で、そのＣＭＶ集団と比較して、、明らかに密集したピークを与える（図１１Ｂおよび図１２Ｂ）。
【００９５】
ＣＨＯ−Ｋ１に関して、そのレトロウイルス構築物で安定して形質導入した１０，０００個のＨｅＬａ細胞のプールを、ＦＡＣＳでソートした。図１３Ａにおいて、ＦＡＣＳソーティング（５日目）の日での平均値を含む、その平均ＧＦＰ値を示す。測定の最後の日に、その１．５ＵＣＯＥ−ＣＭＶプールの平均は、そのＣＭＶプールの平均より１．６倍高い。図１３Ｂにおけるヒストグラムに例示されるように、そのＣＭＶ細胞の多くは、時間を経るにつれてそれらの高いＧＦＰ発現レベルが緩くなり；対照的に、その１．５ＵＣＯＥ−ＣＭＶ細胞の大部分は、それらの高いＧＦＰ発現を保持する。
【００９６】
ＨｅＬａの単一細胞クローンもまた、ＦＡＣＳで選択し、６ウェルプレート中で増殖させた。そのＣＭＶクローンは、その１．５ＵＣＯＥ−ＣＭＶクローンよりもわずかに高いピークの発現を与える傾向があるが、発現レベルの一貫性（クローン内およびクローン間の両方）は、その分析した全てのクローンのヒストグラムにより示されるように、ＵＣＯＥの存在により有意に増大される（図１４Ａ〜Ｅ）。図１５は、ＧＦＰ発現の平均変動係数（ＣＶ）およびその標準偏差（ＳＤ）を示す。そのＣＭＶクローンについてのＣＶ±ＳＤ値は、１３５．０±１６５．３であり、１．５ＵＣＯＥ−ＣＭＶクローンについては、４９．４±１０．９である。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、種々の４ｋｂ、２ｋｂ、１．５ｋｂおよび１ｋｂのＣｐＧ島フラグメントを規定するＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、Ｔｔｈ１１１ＩおよびＢｓｐＥＩ制限部位を示すＨＰ−１／ｈｎＲＮＰＡ２遺伝子座のマップを示す。
【図２】図２は、ＢａｍＨＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＢｓｐＥＩおよびＴｔｈ１１１Ｉ制限部位を示すＨＰ−１／ｈｎＲＮＰＡ２遺伝子座のヌクレオチド配列を示す。
【図３】図３は、４ｋｂおよび１．５ｋｂの（両方の配向にある）ＣｐＧ島フラグメントに作動可能に連結されたＥＧＦＰレポーター遺伝子の発現を示す。ＦＡＣＳｃａｎデータを、７１日間にわたるメジアン蛍光として表した。
【図４】図４は、４ｋｂおよび１．５ｋｂの（両方の配向にある）ＣｐＧ島フラグメントに作動可能に連結されたＥＧＦＰレポーター遺伝子の発現を示す。ＦＡＣＳｃａｎデータを、７１日間にわたる陽性細胞％として表した。
【図５】図５は、４ｋｂ、１．５ｋｂおよび１ｋｂのＣｐＧ島フラグメントに作動可能に連結されたＥＧＦＰレポーター遺伝子の発現を示す。ＦＡＣＳｃａｎデータを、６８日間にわたるメジアン蛍光として表した。
【図６】図６は、４ｋｂ、１．５ｋｂおよび１ｋｂのＣｐＧ島フラグメントに作動可能に連結されたＥＧＦＰレポーター遺伝子の発現を示す。ＦＡＣＳｃａｎデータを、６８日間にわたる陽性細胞％として表した。
【図７】図７は、２つのアデノウイルス構築物Ａｄ．ＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＳＶ４０ｐ（Ａ）およびＡｄ．１．５ｋｂ（Ｆ）ＵＣＯＥ−ＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＳＶ４０ｐ（Ａ）の構造を示し、これら２つの構築物は、アデノウイルス血清型５に基づく。そのルシフェラーゼ発現カセットを、左側から右側の方向で、Ｅ１領域に挿入した。そのＥ１領域およびＥ３領域を、そのウイルスから欠失させる。Ｅ１の欠失に起因して、そのウイルスは、複製欠損である。ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）は、ヒトＣＭＶエンハンサー／プロモーターである。ＳＶ４０ｐ（Ａ）は、ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に由来するＳＶ４０ウイルス後期ポリアデニル化シグナルである。
【図８】図８は、１．５ｋｂ  ＵＣＯＥが、アデノウイルスベクターによって送達される場合、ＨｅＬａ細胞における遺伝子発現を高めることを示す。ＨｅＬａ細胞に、２００μｌの感染培地（１％  ＦＣＳのみを含む通常のＨｅＬａ培地）中で、ウイルスＡｄ．ＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＳＶ４０ｐ（Ａ）およびＡｄ．１．５ｋｂ（Ｆ）ＵＣＯＥ−ＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＳＶ４０ｐ（Ａ）を、２〜３時間にわたって、５０のＭＯＩで感染させた。インキュベートした後、２ｍｌの完全培地を添加し、細胞を６ウェルプレートに播種した。ルシフェラーゼ活性を、感染させて２日後に分析した。３回の独立した実験の結果を示す。実験を、三連で行った。平均±標準偏差を示す。
【図９】図９は、１．５ｋｂ  ＵＣＯＥ効果が、ウイルス増殖とは無関係であることを示す。ＨｅＬａ細胞に、２００μｌの感染培地（１％  ＦＣＳのみを含む通常のＨｅＬａ培地）中で、各々、２つの独立したウイルス調製物に由来するウイルスＡｄ．ＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＳＶ４０ｐ（Ａ）およびＡｄ．１．５ｋｂ（Ｆ）ＵＣＯＥ−ＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＳＶ４０ｐ（Ａ）を、２〜３時間にわたって、５０のＭＯＩで感染させた。インキュベートした後、２ｍｌの完全培地を添加し、細胞を６ウェルプレートに播種した。ルシフェラーゼ活性を、感染させて２日後に分析した。１つの代表的な実験からの結果を示す。実験を、三連で行った。
【図１０Ａ】図１０は、１．５ｋｂ  ＵＣＯＥは、レトロウイルスで形質導入したＣＨＯ−Ｋ１プールにおいて、導入遺伝子発現レベルおよび安定性を増大させることを示す。（Ａ）ＣＭＶ構築物および１．５ＵＣＯＥ−ＣＭＶ構築物のウイルス形質導入後の、ＦＡＣＳソートしたＣＨＯ−Ｋ１プール（はじめにＦＡＣＳソートした３６，０００細胞）についての経時的な平均ＧＦＰ値。１日目とは、測定の１日目（ＦＡＣＳソートして８日後）を示す。
【図１０Ｂ】図１０は、１．５ｋｂ  ＵＣＯＥは、レトロウイルスで形質導入したＣＨＯ−Ｋ１プールにおいて、導入遺伝子発現レベルおよび安定性を増大させることを示す。（Ｂ）測定の各時点についての、ＦＡＣＳソートしたＣＨＯ−Ｋ１プールのヒストグラム。
【図１１Ａ】図１１は、低ＭＯＩ感染後に、形質導入したＣＨＯ−Ｋ１（プール１）のＧＦＰ発現を示す。（Ａ）各時点についてのレトロウイルス形質導入後の、ＧＦＰ陽性（Ｍ１）ＣＨＯ−Ｋ１集団についての平均ＧＦＰ値。そのＣＭＶ集団は、３．１９％のＧＦＰ陽性細胞で始まり、１．５ＵＣＯＥ−ＣＭＶ集団は、４．９９％のＧＦＰ陽性細胞で始まった。
【図１１Ｂ】図１１は、低ＭＯＩ感染後に、形質導入したＣＨＯ−Ｋ１（プール１）のＧＦＰ発現を示す。（Ｂ）各時点でのその集団についてのヒストグラム。
【図１２Ａ】図１２は、中間のＭＯＩ感染後の、形質導入したＣＨＯ−Ｋ１（プール１）のＧＦＰ発現を示す。（Ａ）各時点についてのレトロウイルス形質導入後の、ＧＦＰ陽性（Ｍ１）ＣＨＯ−Ｋ１集団についての平均ＧＦＰ値。そのＣＭＶ集団は、２５．２％のＧＦＰ陽性細胞で始まり、１．５ＵＣＯＥ−ＣＭＶ集団は、１４．３５％のＧＦＰ陽性細胞で始まる。
【図１２Ｂ】図１２は、中間のＭＯＩ感染後の、形質導入したＣＨＯ−Ｋ１（プール１）のＧＦＰ発現を示す。（Ｂ）各時点についての集団のヒストグラム。
【図１３Ａ】図１３は、その１．５ｋｂ  ＵＣＯＥが、レトロウイルスで形質導入下ＨｅＬａプールにおける導入遺伝子発現レベルおよび安定性を増大させることを示す。（Ａ）ＣＭＶ構築物および１．５ＵＣＯＥ−ＣＭＶ構築物についてのレトロウイルス形質導入後の、ＦＡＣＳソートしたＨｅＬａプール（はじめにＦＡＣＳソートした１０，０００細胞）についての経時的な平均ＧＦＰ値。１日目とは、測定の１日目（ＦＡＣＳソートして５日後）を示す。
【図１３Ｂ】図１３は、その１．５ｋｂ  ＵＣＯＥが、レトロウイルスで形質導入下ＨｅＬａプールにおける導入遺伝子発現レベルおよび安定性を増大させることを示す。（Ｂ）測定の各時点についてのＦＡＣＳソートしたＨｅＬａプールのヒストグラム。
【図１４Ａ】図１４は、１．５ｋｂ  ＵＣＯＥが、レトロウイルスで形質導入したＨｅＬａ細胞クローンによる、およびそのクローン間の両方のＧＦＰ発現の一貫性を増大させることを示す。ＦＡＣＳソートしたＨｅＬａクローンを、６ウェルサイズにまで増殖させ、ＧＦＰ発現を分析した。（Ａ〜Ｃ）全てのＣＭＶクローンについてのヒストグラム。
【図１４Ｂ】図１４は、１．５ｋｂ  ＵＣＯＥが、レトロウイルスで形質導入したＨｅＬａ細胞クローンによる、およびそのクローン間の両方のＧＦＰ発現の一貫性を増大させることを示す。ＦＡＣＳソートしたＨｅＬａクローンを、６ウェルサイズにまで増殖させ、ＧＦＰ発現を分析した。（Ａ〜Ｃ）全てのＣＭＶクローンについてのヒストグラム。
【図１４Ｃ】図１４は、１．５ｋｂ  ＵＣＯＥが、レトロウイルスで形質導入したＨｅＬａ細胞クローンによる、およびそのクローン間の両方のＧＦＰ発現の一貫性を増大させることを示す。ＦＡＣＳソートしたＨｅＬａクローンを、６ウェルサイズにまで増殖させ、ＧＦＰ発現を分析した。（Ａ〜Ｃ）全てのＣＭＶクローンについてのヒストグラム。
【図１４Ｄ】図１４は、１．５ｋｂ  ＵＣＯＥが、レトロウイルスで形質導入したＨｅＬａ細胞クローンによる、およびそのクローン間の両方のＧＦＰ発現の一貫性を増大させることを示す。ＦＡＣＳソートしたＨｅＬａクローンを、６ウェルサイズにまで増殖させ、ＧＦＰ発現を分析した。（Ｄ−Ｅ）全ての１．５ＵＣＯＥ−ＣＭＶクローンについてのヒストグラム。
【図１４Ｅ】図１４は、１．５ｋｂ  ＵＣＯＥが、レトロウイルスで形質導入したＨｅＬａ細胞クローンによる、およびそのクローン間の両方のＧＦＰ発現の一貫性を増大させることを示す。ＦＡＣＳソートしたＨｅＬａクローンを、６ウェルサイズにまで増殖させ、ＧＦＰ発現を分析した。（Ｄ−Ｅ）全ての１．５ＵＣＯＥ−ＣＭＶクローンについてのヒストグラム。
【図１５】図１５は、１．５ｋｂ  ＵＣＯＥが、ＨｅＬａ細胞クローンにおけるＧＦＰ発現の変動係数（ＣＶ）を減少させることを示す。図５からの、レトロウイルスで形質導入し、ＦＡＣＳソートしたＨｅＬａクローンの全てについての平均の標準ＣＶ値（±ＳＤ）を示す。１．５ＵＣＯＥ−ＣＭＶクローンのＣＶおよびその標準偏差（ＳＤ）両方が、ＣＭＶクローンと比較して、有意に減少した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５】
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【配列表】
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