(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗Mpl抗体の２つ以上の重鎖可変領域と、該Mpl抗体の２つ以上の軽鎖可変領域をリンカーで結合させ、一本鎖ポリペプチドにすることにより、該抗Mpl抗体の活性を増強させる方法。
【請求項２】
リンカーで結合された該抗Mpl抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む第一のポリペプチドと、リンカーで結合された該抗Mpl抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む第二のポリペプチドをリンカーで結合することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一本鎖ポリペプチドがsc(Fv)2である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
活性がアゴニスト活性である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
リンカーがペプチドリンカーであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ペプチドリンカーの長さが5〜30アミノ酸であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ペプチドリンカーの長さが12〜18アミノ酸であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ペプチドリンカーの長さが15アミノ酸であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法により、活性が増強された抗Mpl抗体。
【請求項１０】
以下の工程を含む、請求項９に記載の抗Mpl抗体の製造方法。
（ａ）  抗Mpl抗体の２つ以上の重鎖可変領域、該Mpl抗体の２つ以上の軽鎖可変領域、及び各可変領域を結合するペプチドリンカーをコードするDNAを作製する工程、
（ｂ）  該DNAを含むベクターを作製する工程、
（ｃ）  該ベクターを宿主細胞に導入する工程、
（ｄ）  該宿主細胞を培養し、一本鎖ポリペプチドを得る工程
【請求項１１】
DNAが、２つの重鎖可変領域、２つの軽鎖可変領域、3つのペプチドリンカーをコードしていることを特徴とする、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
DNAが、重鎖可変領域、ペプチドリンカー、軽鎖可変領域、ペプチドリンカー、重鎖可変領域、ペプチドリンカー、軽鎖可変領域の順でコードしていることを特徴とする、請求項１１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、抗体の活性を増強させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  抗体は血中での安定性が高く、抗原性も少ないことから医薬品として注目されている。その中でも、受容体などの細胞表面に発現するタンパク質を認識し、特異的反応を細胞に生じさせることが可能なアゴニスト抗体は医薬品として有用であると考えられている。エリスロポエチン受容体に対するアゴニスト抗体（非特許文献１参照）、トロンボポエチン受容体に対するアゴニスト抗体やＣＤ４７に対するアゴニスト抗体（特許文献１および２参照）など、既に幾つかのアゴニスト抗体が報告されている。【０００３】
これらのアゴニスト抗体は、それぞれ各種アッセイ法でアゴニスト活性が測定されてはいるが、その活性は、天然のリガンドと比較すれば、いずれも弱いものである。例えば、サイトカイン受容体ファミリーに属するトロンボポエチン受容体に対するアゴニスト抗体では、アゴニスト活性を示すためには、まずTPO受容体を2量体化させ、そのシグナルを伝達するための適当な距離をとらせることが必須である。ところが、抗体分子は２価であり、受容体の２量体化には問題ないと考えられるが、分子量が約150kDと巨大な分子であり、構造の自由度は少ないと考えられることから、抗体が結合した受容体をシグナル伝達に適した距離をとらせることが難しいため充分な活性を伝えることができないと予想される。
【０００４】
【特許文献１】国際公開第０２／３３０７２号
【特許文献２】国際公開第０２／３３０７３号
【非特許文献１】Ｅｌｌｉｏｔｔ  Ｓら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６年、Ｖｏｌ．２７１（４０）、ｐ．２４６９１−２４６９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的は抗体の活性を増強させる方法を提供することにある。詳しくは、２つ以上の重鎖可変領域と、２つ以上の軽鎖可変領域をリンカーで結合し、一本鎖ポリペプチドとすることにより抗体の活性を増強させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  低分子化抗体、具体的にはＤｉａｂｏｄｙやｓｃ（Ｆｖ）２では、分子量は約６０ｋＤと半分以下となり、さらに構造上の自由度も比較的高いと推定されることなどから、より効率的に、あるいはリガンドと同程度に、受容体を２量体化することも可能と考えられ、高い活性を示すことができるようになると考えられる。【０００７】  本発明者らは、抗ヒトＭｐｌ抗体を取得・精製し、更に遺伝子工学的手法を用いて抗ヒトＭｐｌ抗体ＶＢ２２Ｂの一本鎖抗体を作製した。更に、抗ヒトＭｐｌ抗体ｓｃ（Ｆｖ）２発現ベクターを構築し、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞で一本鎖抗体の一過性発現を行い、培養上清より抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体であるＶＢ２２Ｂ  ｓｃ（Ｆｖ）２を取得した。なお、対照として、抗ヒトＭｐｌ抗体Ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターを構築し、ＣＯＳ７細胞を用いてその培養上清よりＶＢ２２ＢＤｉａｂｏｄｙを取得した。それぞれの抗体のＴＰＯ様アゴニスト活性を評価したところ、一本鎖抗体の方がアゴニスト活性が高いことが確認された。このことは、２つ以上の重鎖可変領域と、２つ以上の軽鎖可変領域をリンカーで結合し、一本鎖ポリペプチドとすることにより抗体の活性を増強できることを示している。【０００８】  つまり本発明は、抗体の活性を増強させる方法に関し、より具体的には、
〔１〕２つ以上の重鎖可変領域と、２つ以上の軽鎖可変領域をリンカーで結合し、一本鎖ポリペプチドにすることにより、抗体の活性を増強させる方法、
〔２〕抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む第一のポリペプチドと、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む第二のポリペプチドをリンカーで結合することにより、抗体の活性を増強させる方法、
〔３〕抗体をｓｃ（Ｆｖ）２にすることにより、抗体の活性を増強させる方法、
〔４〕活性がアゴニスト活性である〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法、
〔５〕リンカーがペプチドリンカーであることを特徴とする、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法、
〔６〕ペプチドリンカーの長さが５〜３０アミノ酸であることを特徴とする、〔５〕に記載の方法、
〔７〕ペプチドリンカーの長さが１２〜１８アミノ酸であることを特徴とする、〔６〕に記載の方法、
〔８〕ペプチドリンカーの長さが１５アミノ酸であることを特徴とする、〔７〕に記載の方法、
〔９〕〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法により、活性が増強された抗体、
〔１０〕以下の工程を含む、〔９〕に記載の抗体の製造方法、
（ａ）２つ以上の抗体重鎖可変領域、２つ以上の抗体軽鎖可変領域、及び各可変領域を結合するペプチドリンカーをコードするＤＮＡを作製する工程、
（ｂ）該ＤＮＡを含むベクターを作製する工程、
（ｃ）該ベクターを宿主細胞に導入する工程、
（ｄ）該宿主細胞を培養する工程
〔１１〕ＤＮＡが、２つの重鎖可変領域、２つの軽鎖可変領域、３つのペプチドリンカーをコードしていることを特徴とする、〔１０〕に記載の製造方法、
〔１２〕ＤＮＡが、重鎖可変領域、ペプチドリンカー、軽鎖可変領域、ペプチドリンカー、重鎖可変領域、ペプチドリンカー、軽鎖可変領域の順でコードしていることを特徴とする、〔１１〕に記載の製造方法、に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】抗ヒトＭｐｌ抗体（Ｈ鎖およびＬ鎖）のアミノ酸配列を示す図である。図中に示したＶＢ１４０（Ｈ鎖）のアミノ酸配列を配列番号：１９、ＶＢ４５Ｂ（Ｈ鎖）のアミノ酸配列を配列番号：２０、ＶＢ２２Ｂ（Ｈ鎖）のアミノ酸配列を配列番号：２１、ＶＢ１６（Ｈ鎖）のアミノ酸配列を配列番号：２２、ＴＡ１３６（Ｈ鎖）のアミノ酸配列を配列番号：２３に示す。またＶＢ１４０（Ｌ鎖）のアミノ酸配列を配列番号：２４、ＶＢ４５Ｂ（Ｌ鎖）のアミノ酸配列を配列番号：２５、ＶＢ２２Ｂ（Ｌ鎖）のアミノ酸配列を配列番号：２６、ＶＢ１６（Ｌ鎖）のアミノ酸配列を配列番号：２７、ＴＡ１３６（Ｌ鎖）のアミノ酸配列を配列番号：２８に示す。
【図２】一本鎖抗体ｓｃ（Ｆｖ）２の作製過程を示す図である。
【図３】ＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌを用いたＶＢ２２Ｂ抗体のアゴニスト活性評価の結果を示すグラフである。
【図４】ＢａＦ３−ｍｏｎｋｅｙ  Ｍｐｌを用いたＶＢ２２Ｂ抗体のアゴニスト活性評価の結果を示すグラフである。
【図５】ＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌを用いたＶＢ１６抗体のアゴニスト活性評価の結果を示すグラフである。
【図６】ＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌを用いたＶＢ１４０抗体のアゴニスト活性評価の結果を示すグラフである。
【図７】ＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌを用いたＶＢ４５Ｂ抗体のアゴニスト活性評価の結果を示すグラフである。
【図８】ＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌを用いたＴＡ１３６抗体のアゴニスト活性評価の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】  本発明は、２つ以上の重鎖可変領域と、２つ以上の軽鎖可変領域をリンカーで結合し、一本鎖ポリペプチドにすることにより、抗体の活性を増強させる方法を提供する。
本発明の方法により、活性が増強される抗体は如何なる抗体でもよく、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ラクダ抗体など、どのような動物由来の抗体でもよい。さらに、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体などのアミノ酸配列を置換した改変抗体でもよいし、又、各種分子を結合させた抗体修飾物、抗体断片、糖鎖改変抗体など、いかなる抗体でもよい。
又、本発明の抗体によって活性が増強される抗体は、全長抗体でもよいし、Ｄｉａｂｏｄｙなどの低分子化抗体でもよい。【００１１】  本発明の一本鎖ポリペプチドとしては、例えば、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む第一のポリペプチドと、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む第二のポリペプチドをリンカーで結合した一本鎖ポリペプチドを挙げることができる。
抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む第一のポリペプチドと、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む第二のポリペプチドは、同一のポリペプチドでもよいし、異なるポリペプチドでもよい。第一のポリペプチドと第二のポリペプチドが異なる場合、同一の抗原又はエピトープを認識する抗体でもよいし、異なる抗原又はエピトープを認識する二種特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。【００１２】  抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含むポリペプチドの具体的な例としては、例えば、ｓｃＦｖ（シングルチェインＦｖ）を挙げることができる。よって、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む第一のポリペプチドと、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む第二のポリペプチドをリンカーで結合した一本鎖ポリペプチドとしては、ｓｃ（Ｆｖ）２が挙げられる。ｓｃ（Ｆｖ）２は、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域をリンカー等で結合して一本鎖ポリペプチドにした抗体である（Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９９；２３１：１７７−１８９）。【００１３】  ｓｃ（Ｆｖ）２の場合、結合される２つの重鎖可変領域（ＶＨ）と２つの軽鎖可変領域（ＶＬ）の順序は特に限定されず、どのような順序で並べられていてもよいが、例えば、以下のような配置を挙げることができる。
［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］
［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］
［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］
［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］
［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］
［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］
本発明においては、好ましくは、［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］の配置を有するｓｃ（Ｆｖ）２である。【００１４】  重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。さらに、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を会合させた場合に、抗原結合活性を有する限り、一部を欠損させてもよいし、他のポリペプチドを付加してもよい。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。
アミノ酸の置換、欠失、付加及び／又は挿入や、ヒト化、キメラ化などのアミノ酸配列の改変は、本発明の方法により活性を増強させた後に行ってもよいし、又、アミノ酸配列の改変を行った後に本発明の方法により活性を増強させてもよい。
キメラ抗体は、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体であり、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体などである。キメラ抗体の作製は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。【００１５】  ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３号公報、ＷＯ  ９６／０２５７６号公報参照）。【００１６】  具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成する（ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法を参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。【００１７】  キメラ抗体及びヒト化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
一般的に、キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。【００１８】  なお、キメラ抗体やヒト化抗体を作製した後に、さらに可変領域（例えば、ＦＲ）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等してもよい。抗体の可変領域の配列は、既に公知の抗体の可変領域の配列を用いてもよいし、又、任意の抗原を用いて当業者に公知の方法により抗体を作製し、その抗体の配列を取得して用いることも可能である。具体的には、例えば以下のようにして行うことができる。抗原を用いて、通常の免疫方法にしたがってマウス等の免疫動物を免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングする。抗原の調製は公知の方法により行うことができる。ハイブリドーマの作製は、例えば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３：３−４６）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。その後、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡの配列を公知の方法により解読すればよい。【００１９】  又、ヒト抗体の取得方法も広く知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原を投与して抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞から抗原に対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／２５５８５号公報、ＷＯ  ９３／１２２２７号公報、ＷＯ９２／０３９１８号公報、ＷＯ  ９４／０２６０２号公報参照）。【００２０】  本発明において、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を結合するリンカーは、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９（３），２９９−３０５，１９９６に開示されるリンカー）を用いることができる。【００２１】  ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通常、１〜１００アミノ酸、好ましくは５〜３０アミノ酸、特に好ましくは１２〜１８アミノ酸（例えば、１５アミノ酸）である。【００２２】  ペプチドリンカーのアミノ酸配列としては、例えば、以下のような配列を挙げることができる。
Ｓｅｒ
Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
（Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ）ｎ
（Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ）ｎ
［ｎは１以上の整数である］等を挙げることができる。【００２３】  合成化学物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＧＳ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−ＤＳＴ）、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビス［２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）などであり、これらの架橋剤は市販されている。
また本発明は、上記方法により活性が増強された抗体も提供する。【００２４】  また本発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）に記載の工程を含む抗体の製造方法を提供する。
（ａ）２つ以上の抗体重鎖可変領域、２つ以上の抗体軽鎖可変領域、及び各可変領域を結合するペプチドリンカーをコードするＤＮＡを作製する工程、
（ｂ）該ＤＮＡを含むベクターを作製する工程、
（ｃ）該ベクターを宿主細胞に導入する工程、
（ｄ）該宿主細胞を培養する工程
この方法においてはまず、２つ以上の抗体重鎖可変領域、２つ以上の抗体軽鎖可変領域、及び各可変領域を結合するペプチドリンカーをコードするＤＮＡを作製する。このようなＤＮＡとしては、例えば２つの重鎖可変領域（ＶＨ）、２つの軽鎖可変領域（ＶＬ）、３つのペプチドリンカーをコードしているＤＮＡが挙げられ、好ましくはｓｃ（Ｆｖ）２が挙げられる。【００２５】  結合される２つのＶＨと２つのＶＬの順序は特に限定されず、どのような順序で並べられていてもよく、例えば、以下のような配置を挙げることができる。
［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］
［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］
［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］
［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］
［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］
［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］
本発明においては、［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］の配置が好ましい。【００２６】  重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。さらに、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を会合させた場合に、抗原結合活性を有する限り、一部を欠損させてもよい。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。【００２７】  本方法においては次いで、上記ＤＮＡを含むベクターを作製する。
ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。【００２８】  本発明のベクターとしては、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。【００２９】  また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。【００３０】  大腸菌以外にも、例えば、本発明のベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰ���６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。【００３１】  ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。【００３２】  さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０  Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。【００３３】  本方法においては次いで、該ベクターを宿主細胞に導入する。ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。宿主細胞は、例えば、本発明の２つ以上の抗体重鎖可変領域、２つ以上の抗体軽鎖可変領域、及び各可変領域を結合するペプチドリンカーからなるポリペプチドの製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。【００３４】  真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。本発明においては、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１、ＣＯＳ７細胞、ＢＨＫが好適に用いられる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。【００３５】  植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。【００３６】  本方法においては次いで上記宿主細胞を培養する。目的とするＤＮＡにより形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより、抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、ＦＢＳ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。【００３７】  一方、ｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。【００３８】  動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。【００３９】  例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のタンパク質を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるタンパク質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。【００４０】  また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の抗体を得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。【００４１】  さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とする抗体をコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ  Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ��ｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。【００４２】  これにより得られた抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば抗体を分離、精製することができる。【００４３】  クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。【００４４】  なお、抗体の精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。【００４５】  本発明において増強される抗体の活性は、結合活性、中和活性、細胞傷害活性、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性、酵素活性など、いかなる活性でもよく特に限定されないが、生体、組織、細胞、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等に量的及び／又は質的な変化、影響をもたらす活性であることが好ましく、特にアゴニスト活性が好ましい。【００４６】  アゴニスト活性とは、受容体などの抗原に抗体が結合することにより、細胞内にシグナルが伝達される等して、何らかの生理的活性の変化を誘導する活性である。生理的活性としては、例えば、増殖活性、生存活性、分化活性、転写活性、膜輸送活性、結合活性、タンパク質分解活性、リン酸化／脱リン酸化活性、酸化還元活性、転移活性、核酸分解活性、脱水活性、細胞死誘導活性、アポトーシス誘導活性、などを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。【００４７】  本発明において抗原は特に限定されず、どのような抗原でもよい。抗原の例としては、例えば、受容体、癌抗原、ＭＨＣ抗原、分化抗原、などを挙げることができる。【００４８】  受容体の例としては、例えば、造血因子受容体ファミリー、サイトカイン受容体ファミリー、チロシンキナーゼ型受容体ファミリー、セリン／スレオニンキナーゼ型受容体ファミリー、ＴＮＦ受容体ファミリー、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリー、ＧＰＩアンカー型受容体ファミリー、チロシンホスファターゼ型受容体ファミリー、接着因子ファミリー、ホルモン受容体ファミリー、等の受容体ファミリーに属する受容体などを挙げることができる。これら受容体ファミリーに属する受容体、及びその特徴に関しては多数の文献が存在し、例えば、Ｃｏｏｋｅ  ＢＡ．，Ｋｉｎｇ  ＲＪＢ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｏｌｅｎ  ＨＪ．ｅｄ．Ｎｅｗ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｓｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．１８Ｂ″Ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ａｃｔｉｏｎｓ  Ｐａｒｔ  ＩＩ″ｐｐ．１−４６（１９８８）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  ＢＶ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ、Ｐａｔｔｈｙ  Ｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ，６１：１３−１４．、Ｕｌｌｒｉｃｈ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ，６１：２０３−２１２．、Ｍａｓｓａｇｕｌ  Ｊ．（１９９２）Ｃｅｌｌ，６９：１０６７−１０７０．、Ｍｉｙａｊｉｍａ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０：２９５−３３１．、Ｔａｇａ  Ｔ．ａｎｄ  Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ．（１９９２）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，７：３３８７−３３９６．、Ｆａｎｔｌ  ＷＩ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２：４５３−４８１．、Ｓｍｉｔｈ  ＣＡ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ，７６：９５９−９６２．、Ｆｌｏｗｅｒ  ＤＲ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４２２：２０７−２３４．、宮坂昌之監修，細胞工学別冊ハンドブックシリーズ「接着因子ハンドブック」（１９９４）（秀潤社，東京，日本）等が挙げられる。【００４９】  上記受容体ファミリーに属する具体的な受容体としては、例えば、ヒト又はマウスエリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体、ヒト又はマウス顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）受容体、ヒト又はマウストロンボポイエチン（ＴＰＯ）受容体、ヒト又はマウスインスリン受容体、ヒト又はマウスＦｌｔ−３リガンド受容体、ヒト又はマウス血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体、ヒト又はマウスインターフェロン（ＩＦＮ）−α、β受容体、ヒト又はマウスレプチン受容体、ヒト又はマウス成長ホルモン（ＧＨ）受容体、ヒト又はマウスインターロイキン（ＩＬ）−１０受容体、ヒト又はマウスインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ受容体、ヒト又はマウス白血病抑制因子（ＬＩＦ）受容体、ヒト又はマウス毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体等を例示することができる（ｈＥＰＯＲ：Ｓｉｍｏｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ  ７６，３１−３５．；ｍＥＰＯＲ：Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，ＡＤ．Ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５７，２７７−２８５．；ｈＧ−ＣＳＦＲ：Ｆｕｋｕｎａｇａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７，８７０２−８７０６．；ｍＧ−ＣＳＦＲ：Ｆｕｋｕｎａｇａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６１，３４１−３５０．；ｈＴＰＯＲ：Ｖｉｇｏｎ，Ｉ．ｅｔ  ��ｌ．（１９９２）８９，５６４０−５６４４．；ｍＴＰＯＲ：Ｓｋｏｄａ，ＲＣ．Ｅｔ  ａｌ．（１９９３）１２，２６４５−２６５３．；ｈＩｎｓＲ：Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３，７５６−７６１．；ｈＦｌｔ−３：Ｓｍａｌｌ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１，４５９−４６３．；ｈＰＤＧＦＲ：Ｇｒｏｎｗａｌｄ，ＲＧＫ．Ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５，３４３５−３４３９．；ｈＩＦＮα／βＲ：Ｕｚｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６０，２２５−２３４．及びＮｏｖｉｃｋ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７７，３９１−４００．）。【００５０】  癌抗原は細胞の悪性化に伴って発現する抗原であり、腫瘍特異性抗原とも呼ばれる。又、細胞が癌化した際に細胞表面やタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖も癌抗原となり、特に癌糖鎖抗原と呼ばれる。癌抗原の例としては、例えば、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、シリアルＳＳＥＡ−１（ＳＬＸ）などを挙げることができる。【００５１】  ＭＨＣ抗原には、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ抗原とＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ抗原に大別され、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ抗原には、ＨＬＡ−Ａ，−Ｂ，−Ｃ，−Ｅ，−Ｆ，−Ｇ，−Ｈが含まれ、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ抗原には、ＨＬＡ−ＤＲ，−ＤＱ，−ＤＰが含まれる。
分化抗原には、
ＣＤ１，ＣＤ２，ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ５，ＣＤ６，ＣＤ７，ＣＤ８，ＣＤ１０，ＣＤ１１ａ，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ１１ｃ，ＣＤ１３，ＣＤ１４，ＣＤ１５ｓ，ＣＤ１６，ＣＤ１８，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２１，ＣＤ２３，ＣＤ２５，ＣＤ２８，ＣＤ２９，ＣＤ３０，ＣＤ３２，ＣＤ３３，ＣＤ３４，ＣＤ３５，ＣＤ３８，ＣＤ４０，ＣＤ４１ａ，ＣＤ４１ｂ，ＣＤ４２ａ，ＣＤ４２ｂ，ＣＤ４３，ＣＤ４４，ＣＤ４５，ＣＤ４５ＲＯ，ＣＤ４８，ＣＤ４９ａ，ＣＤ４９ｂ，ＣＤ４９ｃ，ＣＤ４９ｄ，ＣＤ４９ｅ，ＣＤ４９ｆ，ＣＤ５１，ＣＤ５４，ＣＤ５５，ＣＤ５６，ＣＤ５７，ＣＤ５８，ＣＤ６１，ＣＤ６２Ｅ，ＣＤ６２Ｌ，ＣＤ６２Ｐ，ＣＤ６４，ＣＤ６９，ＣＤ７１，ＣＤ７３，ＣＤ９５，ＣＤ１０２，ＣＤ１０６，ＣＤ１２２，ＣＤ１２６，ＣＤｗ１３０などが含まれる。【００５２】  活性の変化を測定する為に用いる検出指標としては、量的及び／又は質的な変化が測定可能である限り使用することができる。例えば、無細胞系（ｃｅｌｌ  ｆｒｅｅ  ａｓｓａｙ）の指標、細胞系（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ）の指標、組織系の指標、生体系の指標を用いることができる。【００５３】  無細胞系の指標としては、酵素反応やタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡの量的及び／又は質的な変化を用いることができる。酵素反応としては、例えば、アミノ酸転移反応、糖転移反応、脱水反応、脱水素反応、基質切断反応等を用いることができる。また、タンパク質のリン酸化、脱リン酸化、二量化、多量化、分解、乖離等や、ＤＮＡ、ＲＮＡの増幅、切断、伸長を用いることができる。例えばシグナル伝達経路の下流に存在するタンパク質のリン酸化を検出指標とすることができる。【００５４】  細胞系の指標としては、細胞の表現型の変化、例えば、産生物質の量的及び／又は質的変化、増殖活性の変化、細胞数の変化、形態の変化、特性の変化等を用いることができる。産生物質としては、分泌タンパク質、表面抗原、細胞内タンパク質、ｍＲＮＡ等を用いることができる。形態の変化としては、突起形成及び／又は突起の数の変化、偏平度の変化、伸長度／縦横比の変化、細胞の大きさの変化、内部構造の変化、細胞集団としての異形性／均一性、細胞密度の変化等を用いることができる。これらの形態の変化は検鏡下での観察で確認することができる。特性の変化としては、足場依存性、サイトカイン依存応答性、ホルモン依存性、薬剤耐性、細胞運動性、細胞遊走活性、拍動性、細胞内物質の変化等を用いることができる。細胞運動性としては、細胞浸潤活性、細胞遊走活性がある。また、細胞内物質の変化としては例えば、酵素活性、ｍＲＮＡ量、Ｃａ２＋やｃＡＭＰ等の細胞内情報伝達物質量、細胞内タンパク質量等を用いることができる。また、細胞膜受容体の場合には、受容体の刺激によって誘導される細胞の増殖活性の変化を指標とすることができる。【００５５】  組織系の指標としては、使用する組織に応じた機能変化を検出指標とすることができる。生体系の指標としては組織重量変化、血液系の変化、例えば血球細胞数の変化、タンパク質量や、酵素活性、電解質量の変化、また、循環器系の変化、例えば、血圧、心拍数の変化等を用いることができる。【００５６】  これらの検出指��を測定する方法としては、特に制限はなく、吸光、発光、発色、蛍光、放射活性、蛍光偏光度、表面プラズモン共鳴シグナル、時間分解蛍光度、質量、吸収スペクトル、光散乱、蛍光共鳴エネルギー移動、等を用いることができる。これらの測定方法は当業者にとっては周知であり、目的に応じて、適宜選択することができる。【００５７】  例えば、吸収スペクトルは一般的に用いられるフォトメータやプレートリーダ等、発光はルミノメータ等、蛍光はフルオロメータ等で測定することができる。質量は質量分析計を用いて測定することができる。放射活性は、放射線の種類に応じてガンマカウンターなどの測定機器を用いて、蛍光偏光度はＢＥＡＣＯＮ（宝酒造）、表面プラズモン共鳴シグナルはＢＩＡＣＯＲＥ、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動などはＡＲＶＯなどにより測定できる。さらに、フローサイトメータなども測定に用いることができる。これらの測定方法は、一つの測定方法で２種以上の検出指標を測定しても良く、簡便であれば、２種以上の測定を同時及び／又は連続して測定することによりさらに多数の検出指標を測定することも可能である。例えば、蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動を同時にフルオロメータで測定することができる。【００５８】  本発明において、アゴニスト活性の測定は当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、実施例に記載のように細胞増殖を指標にアゴニスト活性を測定する方法により判定することが可能である。より具体的には、アゴニスト依存性増殖を示す細胞に、アゴニスト活性を測定したい抗体を添加し、培養する。その後、ＷＳＴ−８のような生細胞数に応じて特定の波長において発色反応を呈する試薬を添加して吸光度を測定し、得られた吸光度を指標にアゴニスト活性を測定することが可能である。【００５９】  アゴニスト依存性増殖を示す細胞も当業者に公知の方法により作製することが可能であり、例えば、抗原が細胞増殖シグナルを発する受容体である場合には、該受容体を発現している細胞を用いればよい。又、抗原が細胞増殖シグナルを出さない受容体である場合には、細胞増殖シグナルを発する受容体の細胞内領域と、細胞増殖シグナルを出さない受容体の細胞外領域からなるキメラ受容体を作製し、該キメラ受容体を細胞で発現させればよい。細胞増殖シグナルを発する受容体の例としては、例えば、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ｍｐｌ、ｎｅｕ、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、ＥＰＯ受容体、ｃ−ｋｉｔ、ＦＬＴ−３等を挙げることができる。受容体を発現させる細胞としては、例えば、ＢａＦ３、ＮＦＳ６０、ＦＤＣＰ−１、ＦＤＣＰ−２、ＣＴＬＬ−２、ＤＡ−１、ＫＴ−３等を挙げることができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００６０】  以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。【００６１】〔実施例１〕抗ヒトＭｐｌ抗体の作製
１．１  Ｍｐｌ発現ＢａＦ３細胞株の樹立
ＴＰＯ依存増殖性細胞株を得るために、全長Ｍｐｌ遺伝子を発現するＢａＦ３細胞株の樹立を行った。全長ヒトＭｐｌ  ｃＤＮＡ（Ｐａｌａｃｉｏｓら、Ｃｅｌｌ  １９８５；４１：７２７−７３４）（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＭ＿００５３７３）をＰＣＲにより増幅し、ｐＣＨＯＩ（Ｈｉｒａｔａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ  １９９４；３５６：２４４−２４８）のＤＨＦＲ遺伝子発現部位を除去し、ＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１（Ｓａｔｏら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；３１：３７１−３８１）のＮｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子発現部位を挿入した発現ベクターｐＣＯＳ２にクローニングし、ｐＣＯＳ２−ｈＭｐｌｆｕｌｌを構築した。また、カニクイザル骨髄細胞から抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡからＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、カニクイザルＭｐｌ  ｃＤＮＡ（配列番号：１、該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２）をクローニングした。得られたカニクイザルｃＤＮＡをｐＣＯＳ２に挿入し、ｐＣＯＳ２−ｍｏｎｋｅｙＭｐｌｆｕｌｌを構築した。【００６２】  作製した各ベクター（２０μｇ）をＰＢＳに懸濁したＢａＦ３細胞（１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）に混合し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒキュベットに加え、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて０．３３ｋＶ，９５０μＦＤの容量でパルスを加えた。エレクトロポーレーション処理により遺伝子導入したＢａＦ３細胞を１ｎｇ／ｍＬマウスインターロイキン３（以下、ｍＩＬ−３、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に加えて選抜し、ヒトＭｐｌ発現ＢａＦ３細胞株（以下、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌ）およびサルＭｐｌ発現ＢａＦ３細胞株（以下、ＢａＦ３−ｍｏｎｋｅｙ  Ｍｐｌ）を樹立した。選抜後は、１ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＴＰＯ（Ｒ＆Ｄ社製）、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養、維持した。【００６３】１．２  Ｍｐｌ発現ＣＨＯ細胞株の樹立
Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いた結合活性評価用の細胞株を得るために、全長Ｍｐｌ遺伝子を発現するＣＨＯ細胞株の樹立を行った。はじめに、ｐＣＸＮ２（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ  １９９１；１０８：１９３−１９９）のＨｉｎｄＩＩＩ部位にｐＣＨＯＩのＤＨＦＲ遺伝子発現部位を挿入して、発現ベクターｐＣＸＮＤ３を作製した。ｐＣＯＳ２−ｈＭｐｌｆｕｌｌ、ｐＣＯＳ２−ｍｏｎｋｅｙＭｐｌｆｕｌｌを鋳型にして、Ｈｉｓ−ｔａｇ配列を含むＰｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲにより増幅した各Ｍｐｌ遺伝子をｐＣＸＮＤ３にクローニングし、ｐＣＸＮＤ３−ｈＭｐｌ−ＨｉｓおよびｐＣＸＮＤ３−ｍｏｎｋｅｙ  Ｍｐｌ−Ｈｉｓを構築した。【００６４】  作製した各ベクター（２５μｇ）をＰＢＳに懸濁したＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）に混合し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒキュベットに加え、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて１．５ｋＶ，２５μＦＤの容量でパルスを加えた。エレクトロポーレーション処理により遺伝子導入したＣＨＯ細胞を５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、１ｘＨＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に加えて選抜し、ヒトＭｐｌ発現ＣＨＯ細胞株（以下、ＣＨＯ−ｈｕｍａｎＭｐｌ）およびサルＭｐｌ発現ＣＨＯ細胞株（以下、ＣＨＯ−ｍｏｎｋｅｙ  Ｍｐｌ）を樹立した。【００６５】１．３  可溶型ヒトＭｐｌタンパク質の調製
可溶型ヒトＭｐｌタンパク質を調製するため、昆虫細胞Ｓｆ９細胞で分泌産生する発現系を以下のように構築した。ヒトＭｐｌの細胞外領域（Ｇｌｎ２６からＴｒｐ４９１）の下流にＦＬＡＧタグを付加した遺伝子を作製し、ｐＢＡＣＳｕｒｆ−１  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＰｓｔＩ−ＳｍａＩ部位に挿入し、ｐＢＡＣＳｕｒｆ１−ｈＭｐｌ−ＦＬＡＧを作製した。続いて、Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、４μｇのｐＢＡＣＳｕｒｆ１−ｈＭｐｌ−ＦＬＡＧをＳｆ９細胞に導入した。培養３日後に培養上清を回収し、プラークアッセイにより組換えウイルスを単離した。ウイルスストックを調製後にＳｆ９細胞に感染させて培養上清を回収した。【００６６】  得られた培養上清を用いて、以下のように可溶型ヒトＭｐｌタンパク質を精製した。培養上清をＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に吸着させた後に、５０ｍＭ  Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ，０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）を用いて溶出した。溶出液をＦＬＡＧ  Ｍ２−Ａｇａｒｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）に吸着させた後に、１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ３．５）を用いて溶出した。溶出後、直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）により中和し、ＰＤ−１０ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、ＰＢＳ（−），０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０に置換を行った。精製した可溶型Ｍｐｌタンパク質をｓｈＭｐｌ−ＦＬＡＧと称する。【００６７】１．４  ヒトＭｐｌ−ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質の調製
ヒトＭｐｌ−ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質遺伝子はＢｅｎｎｅｔｔらの方法（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１；２６６：２３０６０−２３０６７）に従って作製した。ヒトＭｐｌの細胞外領域（Ｇｌｎ２６からＴｒｐ４９１）をコードする塩基配列をヒトＩｇＧ−γ１のＦｃ領域（Ａｓｐ２１６よりの下流の領域）をコードする塩基配列に連結し、連結部にＦｕｓｉｏｎ  ＬｉｎｋｅｒとしてＢｓｔＥＩＩ配列（アミノ酸Ｖａｌ−Ｔｈｒ）を付加した。シグナル配列は、ヒトＩｇＧ  Ｈ鎖可変領域のシグナルペプチド１９アミノ酸を使用した。得られたヒトＭｐｌ−ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質遺伝子をｐＣＸＮＤ３にクローニングし、ｐＣＸＮＤ３−ｈＭｐｌ−Ｆｃを構築した。【００６８】  作製した各ベクター（２５μｇ）をＰＢＳに懸濁したＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）に混合し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒキュベットに加え、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて１．５ｋＶ，２５μＦＤの容量でパルスを加えた。エレクトロポーレーション処理により遺伝子導入したＣＨＯ細胞を５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、１ｘＨＴを含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地に加えて選抜し、ｓｈＭＰＬ−Ｆｃ発現ＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−ｈＭｐｌ−Ｆｃ）を樹立した。【００６９】  得られた培養上清を用いて、以下のようにヒトＭｐｌ−ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質を精製した。培養上清をＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に吸着させた後に、５０ｍＭ  Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ，０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．６）を用いて溶出した。溶出液をＨｉＴｒａｐ  ｐｒｏｔｅｉｎＧ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に吸着させた後に、０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ２．７）を用いて溶出した。溶出後、直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）により中和し、ＰＤ−１０ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、ＰＢＳ（−），０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０に置換を行った。精製した可溶型Ｍｐｌタンパク質をｈＭｐｌ−Ｆｃと称する。【００７０】１．５  ｓｈＭｐｌ−ＦＬＡＧおよびＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌの免疫、ハイブリドーマの選抜
ＭＲＬ／ＭｐＪＵｍｍＣｒｊ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（以下、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス、日本チャールス・リバーより購入）を用いて、８週令より免疫を開始した。初回免疫は１００μｇ／匹のｓｈＭＰＬ−ＦＬＡＧにフロイント完全アジュバント（Ｈ３７  Ｒａ、ベクトン・ディッキンソン社製）を加え、エマルジョン化したものを皮下に投与した。追加免疫は５０μｇ／匹のｓｈＭＰＬ−ＦＬＡＧにフロイント不完全アジュバント（ベクトン・ディッキンソン社製）を加え、エマルジョン化したものを皮下に投与した合計６回免疫を行ったマウス３匹に対し、５０μｇ／匹のｓｈＭＰＬ−ＦＬＡＧを尾静脈内投与することにより最終免疫を行った。マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１、ＡＴＣＣより購入）とマウス脾臓細胞を混合し、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  １５００（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を加えながら混合することにより細胞融合を行った。翌日よりＨＡＴ培地を用いて選抜を行い、培養上清を用いてｓｈＭｐｌ−ＦＬＡＧまたはｈＭｐｌ−Ｆｃを固相化したイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡおよびＢａＦ３−ｈＭｐｌを用いた細胞増殖活性を指標としたスクリーニングを実施した。陽性クローンについて、限界希釈法によりモノクローン化した後に、拡大培養を行い、培養上清を回収した。この方法により、抗ヒトＭｐｌ抗体を産生するハイブリドーマＶＢ２２Ｂ，ＶＢ１６，ＶＢ１４０，ＶＢ４５Ｂを取得した。【００７１】  一方で、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  ＭｐｌをＢａｌｂ／Ｃマウス（日本チャールス・リバーより購入）に１ｘ１０７細胞を１週間から５ヶ月の間隔で腹腔内に合計１１回投与したマウスのマウス脾臓細胞をマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１と上述と同様に細胞融合を行った。翌日よりＨＡＴ培地を用いて選抜を行い、培養上清を用いてＢａＦ３−ｈＭｐｌを用いた細胞増殖活性を指標としたスクリーニングを実施した。陽性クローンについて、限界希釈法によりモノクローン化した後に、拡大培養を行い、培養上清を回収した。この方法により、抗ヒトＭｐｌ抗体を産生するハイブリドーマＴＡ１３６を取得した。【００７２】１．６  抗ヒトＭｐｌ抗体の解析
抗体濃度はヤギ抗マウスＩｇＧ（ｇａｍｍａ）（ＺＹＭＥＤ社製）とアルカリフォスファターゼ−ヤギ抗マウスＩｇＧ（ｇａｍｍａ）（ＺＹＭＥＤ社製）を用いたマウスＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、アイソタイプの等しい市販抗体をスタンダードにして、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＵＳＡ）を用いて検量線を作成し、抗体濃度の換算を行った。【００７３】  抗体のアイソタイプは、アイソタイプ特異的な二次抗体を用いた抗原依存的ＥＬＩＳＡにて決定した。ｈＭｐｌ−Ｆｃを１μｇ／ｍＬとなるようにｃｏａｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６），０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３）で希釈したものをに加え、４℃にて一晩反応し、コーティングした。Ｄｉｌｕｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１），１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３，１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）にてブロッキング処理を行った後、ハイブリドーマの培養上清を加え、室温で１時間放置した。Ｒｉｎｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ＰＢＳ）にて洗浄した後、Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識したアイソタイプ特異的二次抗体を加え、室温で１時間放置した。発色はＳＩＧＭＡ１０４（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を１ｍｇ／ｍＬとなるようにＳｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．８），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に希釈したものを用い、４０５ｎｍの吸光度をＢｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にて測定した。【００７４】  ｓｈＭｐｌ−ＦＬＡＧおよびｈＭＰＬ−Ｆｃに対する結合活性は、ＥＬＩＳＡにより評価した。精製したｓｈＭｐｌ−ＦＬＡＧおよびｈＭＰＬ−Ｆｃを１μｇ／ｍＬになるようにコーティングし、Ｄｉｌｕｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒにてブロッキング処理を行った。ハイブリドーマの培養上清を加え、室温で１時間放置した後、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を加え、上記方法と同様に発色を行った。室温で１時間発色させた後に４０５ｎｍの吸光度を測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いてＥＣ５０値を算出した。【００７５】  ＣＨＯ−ｈｕｍａｎ  ＭｐｌまたはＣＨＯ−ｍｏｎｋｅｙ  Ｍｐｌを回収し、１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（１％ＦＢＳ／ＰＢＳ）に懸濁した。１００μＬ／ｗｅｌｌとなるようにＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に分注し、遠心操作にて培養上清を除去した。５μｇ／ｍＬになるように希釈した培養上清を加え、氷上にて３０分間反応させた。細胞をＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒにて１回洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を添加し、氷上にて３０分間反応させた。反応後、５００ｒｐｍで１分間遠心し、上清を除き、ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ４００μＬに懸濁し、ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ  ＥＳＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてフローサイトメトリーを行った。前方散乱光（ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ）及び側方散乱光（ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ）のヒストグラムにて生細胞集団にゲートを設定した。【００７６】  抗体のアゴニスト活性は、ＴＰＯ依存性増殖を示すＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  ＭｐｌまたはＢａＦ３−ｍｏｎｋｅｙ  Ｍｐｌを用いて評価した。各細胞をそれぞれ４ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、６０μＬ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注した。ｒｈＴＰＯ（Ｒ＆Ｄ社製）およびハイブリドーマ培養上清の濃度を振り、各ｗｅｌｌに４０μＬ加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で、２４時間培養した。１０μＬ／ｗｅｌｌでＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ（ナカライテスク社製）を加え、２時間培養後に、４５０ｎｍの吸光度（対照６５５ｎｍ）をＢｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓにて測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いてＥＣ５０値を算出した。【００７７】  以上に示す解析により、ヒトＭｐｌに結合する抗体ＶＢ２２Ｂ，ＶＢ１６，ＶＢ１４０，ＶＢ４５Ｂ，ＴＡ１３６を取得した。【００７８】１．７  抗ヒトＭｐｌ抗体の精製
ハイブリドーマの培養上清を用いて、以下のように抗ヒトＭｐｌ抗体を精製した。培養上清をＨｉＴｒａｐ  ｐｒｏｔｅｉｎＧ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に吸着させた後に、０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）を用いて溶出した。溶出後、直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ９．０）により直ちに中和し、ＰＢＳで一昼夜透析を行い、バッファー置換を行った。【００７９】〔実施例２〕  抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体の作製
以下に抗ヒトＭｐｌ抗体ＶＢ２２Ｂの一本鎖抗体作製例について示す。
２．１  抗ヒトＭｐｌ抗体可変領域のクローニング
抗ヒトＭｐｌ抗体を産生するハイブリドーマより抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて１ｘ１０７細胞のハイブリドーマより抽出した。【００８０】  １μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを使用して、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて、マウスＩｇＧ２ｂ定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドＭＨＣ−ＩｇＧ２ｂ（配列番号：３）またはマウスκ鎖定常領域塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドｋａｐｐａ（配列番号：４）を用いて、５’末端側遺伝子断片を増幅した。逆転写反応は４２℃で１時間３０分間反応させた。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
５μＬの１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ、
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ
（以上の成分はいずれもＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）
２．５μＬの逆転写反応産物、
１０ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチドＭＨＣ−ＩｇＧ２ｂまたはｋａｐｐａ
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／５秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復
９４℃／５秒間、７０℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復、
９４℃／５秒間、６８℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを２５回反復
最後に反応産物を７２℃で７分間加熱した。【００８１】  ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へクローニングした。さらに、ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて塩基配列を決定した。クローニングしたＶＢ２２Ｂ  Ｈ鎖可変領域（以下、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨ）の塩基配列を配列番号：５に、該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：６に、Ｌ鎖可変領域（以下、ＶＢ２２Ｂ−ＶＬ）の塩基配列を配列番号：７に、該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：８に示す。また、ＶＢ２２Ｂ，ＶＢ１６，ＶＢ１４０，ＶＢ４５Ｂ，ＴＡ１３６のアミノ酸配列を図１に示す。【００８２】２．２  抗ヒトＭｐｌ抗体Ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターの作製
５アミノ酸からなるリンカー配列を用いたＶＢ２２Ｂ一本鎖Ｆｖ（以下、ＶＢ２２Ｂ  Ｄｉａｂｏｄｙ）をコードする遺伝子は、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨをコードする遺伝子の３’末端およびＶＢ２２Ｂ−ＶＬをコードする遺伝子の５’末端に（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１から成るリンカーをコードする塩基配列を付加させた遺伝子について、それぞれＰＣＲ法を用いて増幅し、連結することにより構築した。【００８３】  ＶＢ２２Ｂ−ＶＨの前方プライマー７０・１１５ＨＦ（配列番号：９）は、ＥｃｏＲＩ部位を有するように設計し、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨの後方プライマー３３・１１５ＨＲ（配列番号：１０）は、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨのＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、かつ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１から成るリンカーをコードする塩基配列ならびにＶＢ２２Ｂ−ＶＬのＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズする塩基配列を有するように設計した。ＶＢ２２Ｂ−ＶＬの前方プライマー３３・１１５ＬＦ（配列番号：１１）は、ＶＢ２２Ｂ−ＶＬのＮ末端をコードする塩基配列ならびに（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１から成るリンカーをコードする塩基配列、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨのＣ末端をコードする塩基配列を有するように設計した。ＶＢ２２Ｂ−ＶＬの後方プライマー３３・１１５ＬＲ（配列番号：１２）は、ＶＢ２２Ｂ−ＶＬのＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、かつＦＬＡＧタグ（ＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ／配列番号：１３）をコードする塩基配列を有し、さらにＮｏｔＩ部位を有するように設計した。【００８４】  第一ＰＣＲにおいて、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨおよびリンカー配列とＶＢ２２Ｂ−ＶＬおよびリンカー配列を含む２つのＰＣＲ反応物を以下のように合成した。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ
（以上の成分はいずれも宝酒造社製）、
１０ｎｇのＶＢ２２Ｂ−ＶＨまたはＶＢ２２Ｂ−ＶＬ遺伝子を含むｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター、
１０ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチド７０・１１５ＨＦ、３３・１１５ＨＲまたは３３・１１５ＬＦ、３３・１１５ＬＲ
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／１５秒間、７２℃／２分間のサイクルを５回反復
９４℃／１５秒間、７０℃／２分間のサイクルを５回反復、
９４℃／１５秒間、６８℃／２分間のサイクルを２８回反復
最後に反応産物を７２℃で５分間加熱した。【００８５】  約４００ｂｐのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、各ＰＣＲ産物の一部を用いて以下のように第二ＰＣＲを行った。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ
（以上の成分はいずれも宝酒造社製）、
１μＬの第一ＰＣＲ産物（２種類）、
１０ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチド７０・１１５ＨＦ、３３・１１５ＬＲ
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／１５秒間、７２℃／２分間のサイクルを５回反復
９４℃／１５秒間、７０℃／２分間のサイクルを５回反復、
９４℃／１５秒間、６８℃／２分間のサイクルを２８回反復
最後に反応産物を７２℃で５分間加熱した。【００８６】  約８００ｂｐのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ｐＣＸＮＤ３にクローニングし、ｐＣＸＮＤ３−ＶＢ２２Ｂ  ｄｂを作製した。【００８７】２．３  抗ヒトＭｐｌ抗体ｓｃ（Ｆｖ）２発現ベクターの作製
ＶＢ２２Ｂ由来の２つのＨ鎖可変領域および２つのＬ鎖可変領域を含む改変抗体［ｓｃ（Ｆｖ）２］を発現するプラスミドを作製するために、前述のｐＣＸＮＤ３−ＶＢ２２Ｂ  ｄｂを用いて以下のようにＰＣＲ法により修飾した。ｓｃ（Ｆｖ）２遺伝子の構築過程について、図２に示した。【００８８】  はじめに、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨをコードする遺伝子の３’末端およびＶＢ２２Ｂ−ＶＬをコードする遺伝子の５’末端に１５アミノ酸から成るリンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３をコードする塩基配列を付加させた遺伝子について、それぞれＰＣＲ法を用いて増幅し、連結することにより構築した。この構築過程において、３種類のプライマーを新たに設計した。ＶＢ２２Ｂ−ＶＨの前方プライマーＶＢ２２Ｂ−ｆｐｖｕ（プライマーＡ，配列番号：１４）は、５’末端にＥｃｏＲＩ部位を有し、ＶＢ２２Ｂ  ｄｂのＧｌｎ２２およびＬｅｕ２３がＰｖｕＩＩ部位に変換するように設計した。
ＶＢ２２Ｂ−ＶＨの後方プライマーｓｃ−ｒＬ１５（プライマーＢ，配列番号：１５）は、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨのＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、かつ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３から成るリンカーをコードする塩基配列ならびにＶＢ２２Ｂ−ＶＬのＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズする塩基配列を有するように設計した。ＶＢ２２Ｂ−ＶＬの前方プライマーｓｃ−ｆＬ１５（プライマーＣ，配列番号：１６）は、ＶＢ２２Ｂ−ＶＬのＮ末端をコードする塩基配列ならびに（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３から成るリンカーをコードする塩基配列、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨのＣ末端をコードする塩基配列を有するように設計した。【００８９】  第一ＰＣＲにおいて、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨおよびリンカー配列とＶＢ２２Ｂ−ＶＬおよびリンカー配列を含む２つのＰＣＲ反応物を以下のように合成した。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ
（以上の成分はいずれも宝酒造社製）、
１０ｎｇのｐＣＸＮＤ３−ＶＢ２２Ｂ  ｄｂ、
１０ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチドＶＢ２２Ｂ−ｆｐｖｕ、ｓｃ−ｒＬ１５またはｓｃ−ｆＬ１５、３３・１１５ＬＲ（プライマーＤ）
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／１５秒間、７２℃／２分間のサイクルを５回反復
９４℃／１５秒間、７０℃／２分間のサイクルを５回反復、
９４℃／１５秒間、６８℃／２分間のサイクルを２８回反復
最後に反応産物を７２℃で５分間加熱した。【００９０】  約４００ｂｐのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、各ＰＣＲ産物の一部を用いて以下のように第二ＰＣＲを行った。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ
（以上の成分はいずれも宝酒造社製）、
１μＬの第一ＰＣＲ産物（２種類）、
１０ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチド７０・１１５ＨＦ、３３・１１５ＬＲ
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／１５秒間、７２℃／２分間のサイクルを５回反復
９４℃／１５秒間、７０℃／２分間のサイクルを５回反復、
９４℃／１５秒間、６８℃／２分間のサイクルを２８回反復
最後に反応産物を７２℃で５分間加熱した。【００９１】  約８００ｂｐのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ｐＢａｃＰＡＫ９（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）にクローニングし、ｐＢａｃＰＡＫ９−ｓｃＶＢ２２Ｂを作製した。【００９２】  次に、ｐＢａｃＰＡＫ９−ｓｃＶＢ２２ＢのＰｖｕＩＩ部位に挿入する断片を作製した。すなわちＮ末端が欠けたＶＢ２２Ｂ−ＶＨとＶＢ２２Ｂ−ＶＬを（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３から成るリンカーで連結したアミノ酸をコードする遺伝子をさらにＶＢ２２Ｂ−ＶＨのＮ末端をコードする遺伝子と（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３から成るリンカーをコードする塩基配列で連結する断片で、両末端がＰｖｕＩＩ認識配列となる断片である。２種類のプライマーを新たに設計し、ＰＣＲ法を用いて、この断片を作製した。目的断片の前方プライマーＦｖ２−ｆ（プライマーＥ，配列番号：１７）は、５’末端にＰｖｕＩＩ部位を有し、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨの５’末端側の配列を持つように設計した。目的断片の後方プライマーＦｖ２−ｒ（プライマーＦ，配列番号：１８）は、ＶＢ２２Ｂ−ＶＬのＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、かつ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３から成るリンカーをコードする塩基配列ならびにＶＢ２２Ｂ−ＶＨのＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズする塩基配列、さらにＰｖｕＩＩ部位を有するように設計した。ｐＢａｃＰＡＫ９−ｓｃＶＢ２２Ｂを鋳型にして、以下のようにＰＣＲを行った。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ
（以上の成分はいずれも宝酒造社製）、
１０μｇのｐＢａｃＰＡＫ９−ｓｃＶＢ２２Ｂ、
１０ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチドＦｖ２−ｆ、Ｆｖ２−ｒ
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／１５秒間、７２℃／２分間のサイクルを５回反復
９４℃／１５秒間、７０℃／２分間のサイクルを５回反復、
９４℃／１５秒間、６８℃／２分間のサイクルを２８回反復
最後に反応産物を７２℃で５分間加熱した。【００９３】  約８００ｂｐのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へクローニングした。塩基配列の決定後、制限酵素ＰｖｕＩＩ（宝酒造社製）で消化した後に、目的断片を回収した。ｐＢａｃＰＡＫ９−ｓｃＶＢ２２Ｂを制限酵素ＰｖｕＩＩ（宝酒造社製）で消化した後に、回収した断片を連結し、ｐＢａｃＰＡＫ９−ＶＢ２２Ｂ  ｓｃ（Ｆｖ）２を作製した。作製したベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約１８００ｂｐの断片をアガロースゲルから精製し、発現ベクターｐＣＸＮＤ３にクローニングし、ｐＣＸＮＤ３−ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２を作製した。【００９４】２．４  動物細胞を用いた抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体の発現
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を用いた一本鎖抗体の安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。Ｇｅｎｅ  ＰｕｌｓｅｒＩＩ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いたエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。発現ベクター（２５μｇ）とＰＢＳに懸濁したＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（１×１０７細胞／ｍＬ）の０．７５ｍＬを混合したものを氷上で１０分間冷却し、キュベットに移した後に１．５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に加えて選抜し、発現ＣＨＯ細胞株を樹立した。ＶＢ２２Ｂ  ｓｃ（Ｆｖ）２は、この方法で安定発現細胞株およびその培養上清を調製した。【００９５】  ＣＯＳ７細胞を用いた一本鎖抗体の一過性発現は次のようにして行った。発現ベクター（１０μｇ）とＰＢＳに懸濁したＣＯＳ７細胞（１×１０７細胞／ｍＬ）の０．７５ｍＬを混合したものを氷上で１０分間冷却し、キュベットに移した後に１．５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に加え、一晩培養した後に、ＰＢＳで洗浄後にＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地を加えて約３日間培養した。ＶＢ２２Ｂ  Ｄｉａｂｏｄｙは、この方法で培養上清を調製した。【００９６】２．５  培養上清中の抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体の定量
ＣＯＳ７細胞あるいはＣＨＯ細胞に一過性発現させた抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体の培養上清中の濃度は、表面プラズモン共鳴を利用して測定した。すなわちＢＩＡｃｏｒｅ２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）にＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）をセットし、ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を結合した。流速５ｍＬ／ｓｅｃで適濃度のサンプルを流し、５０ｍＭジエチルアミンを流して結合した抗体を解離させた。サンプルを流したときの質量変化を測定し、標準品の質量変化に基づいて作成した検量線を用いて、濃度を算出した。Ｄｉａｂｏｄｙについての標準品は、ｄｂ１２Ｅ１０（特願２００１−２７７３４参照）を使用し、ｓｃ（Ｆｖ）２についての標準品は同じ遺伝子構造を持つ１２Ｅ１０ｓｃ（Ｆｖ）２を使用した。【００９７】２．６  抗Ｍｐｌ  Ｄｉａｂｏｄｙおよび一本鎖抗体の精製
ＶＢ２２Ｂ  Ｄｉａｂｏｄｙ発現ＣＯＳ７細胞あるいはＣＨＯ細胞の培養上清を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で平衡化したＡｎｔｉ−Ｆｌａｇ  Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）カラムに吸着させ、１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．５）で溶出させた。溶出画分は、直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和を行い、ＨｉＬｏａｄ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）カラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。ゲルろ過クロマトグラフィーのバッファーは、ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。【００９８】  ＶＢ２２Ｂ  ｓｃ（Ｆｖ）２発現ＣＯＳ７細胞あるいはＣＨＯ細胞の培養上清を、Ｄｉａｂｏｄｙ精製と同一条件で精製を行った。また、大量に調製する場合には、ＣＨＯ細胞の培養上清を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｔｙｐｅ  Ｉ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）カラムにかけ、２５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で段階的に溶出した。溶出画分は、限外ろ過膜を用いて濃縮後、ＨｉＬｏａｄ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラムを用いて、ゲルろ過クロマトグラフィーを行い、分子量が約７０ｋＤ〜４０ｋＤに相当する画分を分取した。この画分を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で平衡化したＡｎｔｉ−Ｆｌａｇ  Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌカラムに吸着させ、１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．５）で溶出させた。溶出画分は、直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和を行い、ＨｉＬｏａｄ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。ゲルろ過クロマトグラフィーのバッファーは、２０ｍＭ酢酸（ｐＨ６．０），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を使用した。
各精製ステップにおいて、Ｄｉａｂｏｄｙおよびｓｃ（Ｆｖ）２の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｆｌａｇ抗体（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＬＩＣＨ社）を用いたＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇを用いて行った。それぞれ、分取したピーク画分をＬａｅｍｌｉの方法に準じて電気泳動し、クマシーブリリアントブルーで染色した結果、Ｄｉａｂｏｄｙでは、見かけ上の分子量約２９ｋＤａに、またｓｃ（Ｆｖ）２では、見かけ上の分子量約５５ｋＤａに、それぞれの単一のバンドが検出された。【００９９】２．７  抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体のＴＰＯ様アゴニスト活性の評価
ＴＰＯ依存性増殖を示すＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌを用いてＴＰＯ用アゴニスト活性を評価した。各細胞を１％Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で２回洗浄した後、４ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍを含むＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、６０μＬ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注した。ｒｈＴＰＯ（Ｒ＆Ｄ社製）、ＣＯＳ７培養上清または精製品の濃度を振り、各ｗｅｌｌに４０μＬ加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で、２４時間培養した。１０μＬ／ｗｅｌｌでＷＳＴ−８試薬（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ、ナカライテスク社製）を加え、直後にＢｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓを用いて４５０ｎｍの吸光度（対照６５５ｎｍ）を測定し、２時間培養後に、再度４５０ｎｍの吸光度（対照６５５ｎｍ）を測定した。ＷＳＴ−８試薬は生細胞数に応じて４５０ｎｍの発色反応を呈することから、２時間の吸光度変化を指標にＴＰＯ様アゴニスト活性を評価した。また、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いてＥＣ５０値を算出した。【０１００】  精製したＶＢ２２Ｂ  ＤｉａｂｏｄｙおよびＶＢ２２Ｂ  ｓｃ（Ｆｖ）２を用いて、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌ，ＢａＦ３−ｍｏｎｋｅｙ  ＭｐｌでのＴＰＯ様アゴニスト活性を評価した結果を図３、図４に示す。また、ＣＯＳ７でＶＢ１６，ＶＢ１４０，ＶＢ４５Ｂ，ＴＡ１３６の一本鎖抗体（Ｄｉａｂｏｄｙ，ｓｃ（Ｆｖ）２）を発現させ、培養上清を用いてＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  ＭｐｌでのＴＰＯ様アゴニスト活性を評価した結果をそれぞれ図５、図６、図７、図８に示す。さらに、これらの解析により得られたＥＣ５０値を表１に示す。【０１０１】
【表１】
0004634305.tif 000002
各抗体を用いたＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌ，ＢａＦ３−ｍｏｎｋｅｙ  Ｍｐｌのアゴニスト活性（ＥＣ５０値：ｐＭ）【０１０２】
この結果より、Diabodyよりsc(Fv)2構造をもつ一本鎖抗体の方が、アゴニスト活性が高いことが確認された。アゴニスト活性は、抗原結合部位が２価であることが重要であるが、抗原結合部位間の距離や角度も重要な要素であると考えられる（WO 02/33072およびWO 02/33073参照）。取得した抗体の認識するエピトープの違いにより、最適な距離や角度が異なることから、最適なリンカーの長さは、各抗体に依存すると考えられる。しかし、リンカーの長さが5〜12merと短いときには、non-covalentなDiabodyを形成するが、リンカー長を長くする(12mer以上)ではDiabodyは形成されずにscFv一量体を形成することが報告されている（Hudson ら、J Immunol. Methods 1999；231：177-189）。よって、長いリンカーを使用しても２価の抗原結合部位が形成されるsc(Fv)2は、高いアゴニスト活性を有する可能性が高くなると推測される。また、non-covalentなDiabodyよりもsc(Fv)2の方が安定性に優れていることから、高い活性を誘起できる可能性もある。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】  本発明により、完全長の抗体としては、アゴニスト活性が弱いかあるいは、ほとんど活性がない場合においても、低分子化、具体的にはＤｉａｂｏｄｙ化、あるいはｓｃ（Ｆｖ）２化することによって、活性を上昇させることが可能となる。これにより、従来は、完全長抗体としては活性が弱いため、医薬品等として開発が困難であったものであっても、低分子化することにより、医薬品等として開発が可能となる。また、比活性が上昇することにより、生産面でも、コストを削減することが可能になる。また、低分子化抗体は、糖鎖の結合がないことから、組換え体を作製する場合においても、動物細胞、酵母、大腸菌など各種発現系の利用が可能であり、利便性が高くなる。
【図１】
0004634305.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0004634305.tif 000007
【図６】
0004634305.tif 000008
【図７】
0004634305.tif 000009
【図８】
0004634305.tif 000010
【配列表】
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