(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基とを有する、８〜３２個のアミノ酸残基からなる自己組織化ペプチドであって、
該極性アミノ酸残基として酸性アミノ酸残基及び塩基性アミノ酸残基を含み、
中性領域において、該酸性アミノ酸残基の電荷と該塩基性アミノ酸残基の電荷との総和が−３〜−２、又は＋２〜＋３であり、
中性水溶液中において自己組織化した際に該非極性アミノ酸残基のみが一方の面に配置されたβ−シート構造を形成しうるものであり、
該非極性アミノ酸残基が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基及びグリシン残基からなる群より選択されたアミノ酸残基である自己組織化ペプチド。
【請求項２】
中性水溶液中において自己組織化した際に、非極性アミノ酸残基のみが一方の面に配置され、極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基とが他方の面に配置されたβ−シート構造を形成しうる、請求項１記載の自己組織化ペプチド。
【請求項３】
前記極性アミノ酸残基として、少なくとも１個の中性アミノ酸残基をさらに含有してなる、請求項１記載の自己組織化ペプチド。
【請求項４】
前記中性アミノ酸残基が、アスパラギン残基、グルタミン残基、セリン残基、トレオニン残基、チロシン残基及びシステイン残基からなる群から選択されたアミノ酸残基である、請求項３記載の自己組織化ペプチド。
【請求項５】
前記酸性アミノ酸残基が、アスパラギン酸残基及び／又はグルタミン酸残基である、請求項１記載の自己組織化ペプチド。
【請求項６】
前記塩基性アミノ酸残基が、アルギニン残基、ヒスチジン残基、リジン残基及びオルニチン残基からなる群から選択されたアミノ酸残基である、請求項１記載の自己組織化ペプチド。
【請求項７】
８〜１６個のアミノ酸残基からなる、請求項１記載の自己組織化ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、自己組織化ペプチド及び該ペプチドが自己組織化したゲルに関する。
【背景技術】
【０００２】  一般に、生体内で三次元的に増殖する細胞を三次元的に培養する際、該細胞の足場としては、例えば、コラーゲンゲルが知られている。しかしながら、前記コラーゲンゲルは、材料の供給源となる動物等により、用途が限定されるという欠点がある。【０００３】  また、前記細胞の足場として、ペプチドから構成されるゲルが知られている（例えば、特許文献１、特許文献２を参照）。しかしながら、前記特許文献１及び２に開示されたゲルは、使用の際に、煩雑な操作を要するという欠点がある。
【特許文献１】米国特許第５，６７０，４８３号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９５５，３４３号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  本発明は、中性領域において安定したゲルを形成すること、中性領域において優れたゲル形成性を発揮すること、中性領域において優れた透明性を発揮するゲルを形成すること、簡便な操作でゲルを作製できること等の少なくともいずれかを達成しうる、自己組織化ペプチドを提供することに関する。また、本発明は、中性領域において優れた安定性を発揮すること、中性領域において優れた透明性を発揮すること、培養対象となる細胞に適した条件下で三次元培養を行なうこと、迅速に操作を行なうこと、生体環境に実質的に近い条件下で細胞を維持すること等の少なくともいずれかを達成しうるゲルを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち、本発明は
〔１〕極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基とを有する、８〜３２個のアミノ酸残基からなる自己組織化ペプチドであって、
該極性アミノ酸残基として酸性アミノ酸残基及び塩基性アミノ酸残基を含み、
中性領域において、該酸性アミノ酸残基の電荷と該塩基性アミノ酸残基の電荷との総和が−３〜−２、又は＋２〜＋３であり、
中性水溶液中において自己組織化した際に該非極性アミノ酸残基のみが一方の面に配置されたβ−シート構造を形成しうるものであり、
該非極性アミノ酸残基が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基及びグリシン残基からなる群より選択されたアミノ酸残基である自己組織化ペプチド
に関する。
【発明の効果】
【０００６】  本発明の自己組織化ペプチドによれば、中性領域において、優れた透明性を発揮する安定したゲルを形成させることができ、優れたゲル形成性を発揮させることができ、簡便な操作でゲルを作製できるという優れた効果を奏する。また、本発明のゲルによれば、中性領域において、優れた安定性及び透明性を発揮し、培養対象となる細胞に適した条件下で三次元培養を行なうことができ、迅速に操作を行なうことができ、生体環境に実質的に近い条件下で細胞を維持することができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】  本発明は、一つの側面では、極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基とを有する自己組織化ペプチドであって、該極性アミノ酸残基として酸性アミノ酸残基及び塩基性アミノ酸残基を含み、中性領域において、該酸性アミノ酸残基の電荷と該塩基性アミノ酸残基の電荷との総和が０を除く数であり、水溶液中において自己組織化した際に該非極性アミノ酸残基のみが一方の面に配置されたβ−シート構造を形成しうる自己組織化ペプチドに関する。【０００８】  本発明の自己組織化ペプチドは、極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基とを有するペプチドであって、該極性アミノ酸残基として酸性アミノ酸残基及び塩基性アミノ酸残基を含み、中性領域において、該酸性アミノ酸残基の電荷と該塩基性アミノ酸残基の電荷との総和が０を除く数であることに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の自己組織化ペプチドによれば、中性領域において、静電的引力と静電的斥力とをバランスよく生じうる。そのため、本発明の自己組織化ペプチドによれば、過度の会合を実質的に生じずに、安定的にゲルを形成することができるという優れた効果を発揮する。さらには、本発明の自己組織化ペプチドによれば、中性領域において、白濁及び／又は沈殿を実質的に生じることがないという優れた効果を発揮する。【０００９】  また、本発明の自己組織化ペプチドは、中性領域において、酸性アミノ酸残基の電荷と塩基性アミノ酸残基の電荷との総和が０を除く数となるように、極性アミノ酸残基、即ち、酸性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基とを含有していることにも１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の自己組織化ペプチドによれば、中性領域において、優れた透明性を発揮するゲルを形成させることができる。また、本発明の自己組織化ペプチドによれば、簡便な操作でゲルを作製できるという優れた効果を発揮する。【００１０】  本発明の自己組織化ペプチドは、水溶液中において自己組織化した際に、非極性アミノ酸のみが一方の面に配置されたβ−シート構造を形成しうることにも１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の自己組織化ペプチドによれば、安定的に、ファイバーを形成することができるという優れた効果を発揮する。そのため、本発明の自己組織化ペプチドによれば、安定的にゲルを形成することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の自己組織化ペプチドによれば、優れたゲル形成性を発現する。この優れたゲル形成性により、本発明の自己組織化ペプチドを、例えば、細胞の三次元培養における足場として好適に利用し得る。【００１１】  本発明において、前記「自己組織化ペプチド」とは、溶媒中において、水素結合、静電的相互作用、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等の相互作用を介して自発的に集合するペプチドをいう。具体的には、例えば、「水溶液中において、自己組織化してナノファイバーやゲルを形成するペプチド」を、「自己組織化ペプチド」という。【００１２】  なお、本明細書において、前記「ナノファイバー」とは、ナノメートルスケールの幅を有する繊維状の分子集合体をいう。かかるナノファイバーが、ファイバー間に働く静電的引力及び斥力により三次元網状構造を形成することにより、本発明の自己組��化ペプチドはゲルを形成し得ると推測される。【００１３】  例えば、後述の実施例に記載のように、原子間力顕微鏡を用い、ピエゾ素子への印加電圧に基づく走査範囲から見積もったファイバーの幅や高さがナノスケールである場合、ナノファイバーの形成が確認されうる。【００１４】  また、本明細書において、「ゲル」とは、粘性的な性質と弾性的な性質とを併せ持つ粘弾性物質をいう。具体的には、前記ゲルは、動的粘弾性測定を行なって、貯蔵弾性率Ｇ’及び損失弾性率Ｇ’’を測定したときに、Ｇ’＞Ｇ’’であるものをいう。なお、前記貯蔵弾性率Ｇ’は、弾性的性質を示す。また、前記損失弾性率Ｇ’’は、粘性的性質を示す。【００１５】  動的粘弾性は、後述の実施例に記載のように、動的粘弾性測定装置を用いて測定され得る。具体的には、鉄製プレート上にサンプルを置き、鉄製コーンでサンプルを押しつぶし、鉄製コーンを回転させたときに該コーンを回転させるモーターにかかる力をモニターすることで動的粘弾性を測定することができる。【００１６】  本発明の自己組織化ペプチドは、極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基とを含有する。【００１７】  具体的には、本発明の自己組織化ペプチドは、酸性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基とを少なくとも含有する。本発明の自己組織化ペプチドは、自己組織化のために適度な疎水性相互作用および／または静電的相互作用を得る観点から、好ましくは少なくとも１個の中性アミノ酸残基をさらに含有する。【００１８】  なお、本明細書においては、中性アミノ酸残基は、水酸基、酸アミド基、チオール基等を有するため、極性を有するものとして、極性アミノ酸残基に分類するものとする。また、グリシンは、該グリシン中に含まれるアミノ基とカルボキシル基とが、アミノ酸同士のペプチド結合に用いられ、極性基を露出することがないため、非極性アミノ酸残基に分類するものとする。【００１９】  本発明において、前記アミノ酸残基は、天然型アミノ酸又は非天然型アミノ酸のいずれの残基でもよい。前記アミノ酸残基としては、特に限定されるものではないが、容易にβ−シート構造を形成する観点から、好ましくは、以下の表１に示されるアミノ酸が挙げられる。【００２０】
【表１】
0004766528.tif 000002
【００２１】  なかでも、本発明に用いられる中性アミノ酸残基としては、適度な疎水性相互作用を得る観点から、親水性が高いアミノ酸残基が好ましく、またβ−シートを形成しやすいアミノ酸残基が好ましい。かかるアミノ酸残基としては、好ましくは、セリン残基、アスパラギン残基、チロシン残基、トレオニン残基、グルタミン残基またはシステイン残基、より好ましくは、セリン残基またはアスパラギン残基が望ましい。【００２２】  また、本発明に用いられる酸性アミノ酸残基としては、低価格で合成が容易であるという観点から、好ましくは天然の酸性アミノ酸、より好ましくは、アスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基が望ましい。【００２３】  本発明に用いられる塩基性アミノ酸残基としては、中性領域における高い水溶性および合成の容易さの観点から、好ましくはアルギニン残基、リジン残基、オルニチン残基またはヒスチジン残基、より好ましくはアルギニン残基またはリジン残基が望ましい。【００２４】  また、本発明に用いられる非極性アミノ酸残基としては、高い水溶性および合成の容易さの観点から、好ましくはアラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、トリプトファン残基、グリシン残基またはフェニルアラニン残基、より好ましくはアラニン残基またはフェニルアラニン残基が望ましい。【００２５】  本発明の自己組織化ペプチドは、例えば、水溶液中におけるペプチド分子間の静電的相互作用、水素結合及び疎水性相互作用などの相互作用などを介して自己組織化しうる。【００２６】  自己組織化のために十分な相互作用をペプチド分子間に働かせる観点から、本発明の自己組織化ペプチドは、好ましくは８個以上、より好ましくは１０個以上、さらに好ましくは１２個以上のアミノ酸残基からなる。また、β−シート形成の容易化及び合成の簡易化の観点から、好ましくは２００個以下、より好ましくは５０個以下、さらに好ましくは３２個以下のアミノ酸残基からなる。【００２７】  本発明の自己組織化ペプチドは、水溶液中においてβ−シート構造を形成しうる。前記β−シート構造において、一方の面には、非極性アミノ酸残基のみが配置される。また、他方の面には、極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基との双方が配置されていてもよく、極性アミノ酸残基のみが配置されていてもよい。本発明の自己組織化ペプチドにより形成されるβ−シート構造は、前記したように、一方の面は非極性アミノ酸残基のみが配置された疎水面となり、他方の面は極性アミノ酸残基が配置された親水面となる。したがって、かかる疎水面と親水面とを併せ持つβ−シートが、水溶液中において疎水面を隠すように集合して二層構造を形成する。また、その結果、例えば、両面に極性アミノ酸残基が配置されたシートとなり、さらに分子の自己組織化が進むにつれてこのシートが伸びていき、ナノファイバーを構成しうると推測される。尚、β−シート構造形成の有無は、後述の実施例に記載のように、円二色性測定法により確認することができる。【００２８】  中性領域における本発明の自己組織化ペプチドの電荷、即ち、該ペプチドに含まれるアミノ酸残基の電荷の総和は０を除く数である。そのため、本発明の自己組織化ペプチドは、中性領域において該自己組織化ペプチドに含まれる極性アミノ酸残基の側鎖が全てイオン化している状態でも、アミノ酸残基に由来するプラス電荷とマイナス電荷とが実質的に相殺されないという優れた性質を発現する。したがって、本発明の自己組織化ペプチドは、例えば、ペプチド間に静電的引力に加えて静電的斥力が働き、これらの微妙なバランスが保たれることで過度の会合が実質的に生じないため、中性領域で沈殿することなく安定なゲルを形成しうると推測される。【００２９】  前記「中性領域における本発明の自己組織化ペプチドの電荷」は、前記自己組織化ペプチドに含まれるアミノ酸の中性領域における電荷の総和を意味する。より具体的には、前記電荷は、酸性アミノ酸残基の中性領域における電荷と塩基性アミノ酸残基の中性領域における電荷との総和を意味する。【００３０】  ゲル形成に適した静電的引力及び斥力のバランスを保つ観点から、前記中性領域における電荷は、好ましくは、−２５〜−０．０３、又は＋０．０３〜＋２５であることが望ましく、また、製造のしやすさの観点からアミノ酸残基数は３２残基程度までがよく、その場合は、−３〜−１、又は＋１〜＋３であることが好ましく、より好ましくは、−３、−２、＋２又は＋３であることが望ましい。【００３１】  各ｐＨにおける本発明の自己組織化ペプチドの電荷は、例えば、レーニンジャー（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ）〔Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９７９〕の方法に従って算出されうる。前記レーニンジャーの方法は、例えば、ＥＭＢＬ  ＷＷＷ  Ｇａｔｅｗａｙ  ｔｏ  Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｐｏｉｎｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ｃｇｉ／ｐｉ−ｗｒａｐｐｅｒ．ｐｌ）上で利用可能なプログラムにより行なわれうる。【００３２】  なお、本明細書において、中性領域とは、ｐＨ６〜８、好ましくは、ｐＨ６．５〜７．５の領域をいう。また、水溶液としては、ｐＨ調節可能な水溶液であればよく、特に限定はない。かかる水溶液としては、例えば、水酸化ナトリウムや塩酸でｐＨを調節した水溶液、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の各種緩衝液、又はＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２（１：１（容量比））培地（インビトロジェン社製）などの細胞培養用培地などが挙げられる。【００３３】  本発明の自己組織化ペプチドは、当該分野で公知の方法により作製されうる。例えば、本発明の自己組織化ペプチドは、後述の実施例に記載されるようにＦｍｏｃ法等の固相法又は液相法等の化学合成方法により合成されてもよく、遺伝子組換え発現等の分子生物学的方法により作製されてもよい。【００３４】  本発明の自己組織化ペプチドの例としては、例えば、下記の表２〜表７に記載のペプチドが挙げられる。また、例えば、配列表の配列番号１〜９のペプチドは、水溶液中で自己組織化して安定なゲルを形成する。なお、表２〜表７中、Ｘはアラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、グリシン残基、チロシン残基、セリン残基、トレオニン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基またはシステイン残基を示す。また、Ｚはアラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基またはグリシン残基を示す。【００３５】
【表２】
0004766528.tif 000003
【００３６】
【表３】
0004766528.tif 000004
【００３７】
【表４】
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【００３８】
【表５】
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【００３９】
【表６】
0004766528.tif 000007
【００４０】
【表７】
0004766528.tif 000008
【００４１】  本発明は、別の側面では、前記自己組織化ペプチドが自己組織化したゲルに関する。【００４２】  本発明のゲルは、少なくとも１種の本発明の自己組織化ペプチドを、前記水溶液に、例えば、終濃度が０．３〜５．０重量％、好ましくは０．５〜１．５重量％となるように溶解し、しばらく放置して自己組織化させることにより作製されうる。放置する際の温度又は時間は、前記の自己組織化ペプチドが自己組織化する限り特に制限はなく、ゲルの使用目的や該ペプチドの種類や水溶液中の濃度に応じて適宜調整すればよい。【００４３】  本発明のゲルを、例えば、細胞の三次元培養の足場として用いる場合、ゲル形成時における本発明の自己組織化ペプチドの使用濃度は、ゲル形成の容易さの観点から、細胞培養用培地中、好ましくは０．３重量％以上、より好ましくは０．５重量％以上であり、細胞との混合のしやすさの観点から、好ましくは５重量％以下、より好ましくは２重量％以下であることが望ましい。また、かかる場合、蛍光顕微鏡等による細胞観察の容易さの観点から、ゲルは透明であることが好ましい。例えば、０．５重量％の自己組織化ペプチドを含有してなるゲルにおいて、光路長１０ｍｍのセル中、３８０ｎｍ〜７８０ｎｍの吸光度で測定した可視光透過率が、少なくとも５０％／ｃｍであることが望ましく、好ましくは、７０％／ｃｍ以上、より好ましくは、９０％／ｃｍ以上が望ましい。さらに、前記ゲルを、長期間、例えば２ヶ月間、室温で放置した後のゲルの可視光透過率は、ゲルの長期安定性の観点から、好ましくは、５０％／ｃｍ以上、より好ましくは、７０％／ｃｍ以上、さらに好ましくは９０％／ｃｍ以上であり、可視光透過率の低下率（％）（１００−（保存後の可視光透過率／保存前の可視光透過率×１００））が、好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下が望ましい。前記ゲルの透明度は、後述の実施例に記載のように、ＵＶ／ＶＩＳ測定装置を用いて測定することができる。【００４４】  尚、本発明において、透明であるゲルとは、例えば、光路長１０ｍｍのセル中、３８０ｎｍ〜７８０ｎｍの吸光度で測定した場合に、５０％／ｃｍ以上の可視光透過率を有するゲルをいう。【００４５】
本発明の自己組織化ペプチド、該ペプチドが自己組織化してなるナノファイバー、及び該ペプチドが自己組織化してなるゲルは、化粧品（スキンケア用品、ヘアケア用品等）、細胞培養用基材（医薬品開発スクリーニング、再生医療等に用いられるもの）、医薬品および医療機器（じょくそう製剤、骨充填・美容形成用注入剤、眼科用手術補助剤、人工硝子体、人工水晶体、関節潤滑剤、点眼剤、ＤＤＳ基材、止血剤等）、湿潤用保水剤、乾燥剤、または医療機器等へのコーティング剤等に使用され得る。
【実施例】
【００４６】製造例１  ペプチドの合成
ペプチドＮｏ．１（配列−ＲＡＳＡＲＡＤＡＲＡＳＡＲＡＤＡ、配列番号：１）の合成を、以下のように、Ｆｍｏｃ固相合成法により行なった。【００４７】１）固相担体樹脂の調製
ペプチド合成用の固相担体樹脂であるＣＬＥＡＲＴＭ−Ａｍｉｄｅ  Ｒｅｓｉｎ（コード番号：ＲＣＹ−１２５０−ＰＩ、１００−２００メッシュ、４−（２，４−ジメトキシフェニル−フルオレニルメチルオキシカルボニル−アミノメチル）フェノキシアセチル−ノルロイシル−ＣＬＥＡＲ  Ｒｅｓｉｎ、ペプチド  インスティチュート（ＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ製）４００ｍｇを、固相合成装置（商品名：Ｓｏｌｉｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  ＣＣＳ−１５０Ｍ、アイラ（ＥＹＥＬＡ）社製）上の反応容器に入れた。【００４８】  ついで、前記固相担体樹脂に、ジクロロメタン（和光純薬株式会社製）５ｍＬを添加した。得られた混合物を、室温で１０分間攪拌して、前記固相担体樹脂を膨潤させた。得られた産物を吸引ろ過に供して、それにより、ジクロロメタンを除去した。さらに、ジクロロメタンによる前記固相担体樹脂の膨潤及び該ジクロロメタンの除去の操作を行なった。【００４９】２）アミノ酸のカップリング
前記１）で得られた産物を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（和光純薬株式会社製）５ｍＬの存在下に、室温で１分間攪拌した。ついで、得られた産物を吸引ろ過に供して、それにより、ＤＭＦを除去した。その後、前記ＤＭＦ存在下での攪拌及びＤＭＦの除去の操作（以下、「ＤＭＦ処理」という）をさらに４回行なった。【００５０】  得られた産物に、ピペリジン（和光純薬株式会社製）／ＤＭＦ混合溶媒（ピペリジン：ＤＭＦ＝１：４（容量比））５ｍＬを添加し、得られた混合物を、室温で３分間攪拌することにより、前記固相担体樹脂中のフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基を除去した。得られた産物を、吸引ろ過に供して、混合溶媒を除去した。さらに、前記Ｆｍｏｃ基の除去及び混合溶媒の除去の操作を同様に行なった。ついで、攪拌時間を１５分間としたことを除き、前記Ｆｍｏｃ基の除去及び混合溶媒の除去の操作を同様に行なった。【００５１】  その後、得られた産物を、前記と同様に、ＤＭＦ処理に供した。なお、前記ＤＭＦ処理を、５回行なった。【００５２】  得られた固相担体樹脂と、該固相担体樹脂の活性末端の３倍等量（０．３８４ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃアミノ酸誘導体（ペプチド  インスティチュート製、商品名：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ・Ｈ２Ｏ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−アラニン−１水和物））を含むＤＭＦ溶液  ３ｍＬと、１２８ｍＭ  １−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）を含むＤＭＦ溶液  １ｍＬと、３８４ｍＭ  Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）を含むＤＭＦ溶液  １ｍＬとを混合し、２時間攪拌した。得られた産物を、吸引ろ過に供して、反応溶液を除去した。なお、ペプチドＮｏ．１のアミノ酸配列に従って、前記Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体として、所望のアミノ酸残基に対応するＦｍｏｃ誘導体を用いて同様の操作を繰り返した。【００５３】  得られた産物を、前記と同様に、ＤＭＦ処理に供した。なお、かかるＤＭＦ処理を５回繰り返した。【００５４】  得られた産物に、７６８ｍＭ  無水酢酸（ナカライテスク社製）（該産物中の活性末端の１０倍等量に相当）を含むＤＭＦ溶液を添加し、室温で２時間攪拌した。得られた産物を、吸引ろ過に供して、反応溶液を除去した。得られた産物を、前記と同様に、ＤＭＦ処理に供した。なお、前記ＤＭＦ処理を、５回繰り返した。【００５５】  その後、得られた産物に、ジクロロメタン  ５ｍＬを添加し、室温で１０分間攪拌することにより、ジクロロメタン処理を行なった。その後、得られた産物を、吸引ろ過に供した。なお、前記ジクロロメタン処理及び吸引ろ過を２０回繰り返した。【００５６】
得られた樹脂を乾燥させ、バイアルに移した。前記バイアルに、９５容積％  トリフルオロ酢酸（ナカライテスク社製）  ９．５ｍＬと、１，２−エタンジチオール〔ティーシーアイ  オーガニック  ケミカルズ（TCI Organic Chemicals）社製〕  ０．８５ｍＬと、チオアニソール（ティーシーアイ  オーガニック  ケミカルズ社製）  ０．５ｍＬと、水  ０．５ｍＬとを添加した。その後、得られた混合物を、３時間攪拌することにより、樹脂から、目的のペプチドを切断した。
【００５７】  得られたペプチド含有溶液に、ジエチルエーテル（ナカライテスク社製）１００ｍＬ（該ペプチド含有溶液の約１０倍容量）を添加した。得られた産物を、３５００ｒ／ｍｉｎで５分間、室温で遠心分離して、上澄みを除去した。得られた沈殿物に、ジエチルエーテル５０ｍＬを添加して、室温で、１０分間攪拌した。得られた混合物を、３５００ｒ／ｍｉｎで５分間、室温で遠心分離して、上澄みを除去した。得られた沈殿物を、真空乾燥させ、ペプチド  ２００ｍｇを得た。【００５８】製造例２  ペプチドの合成
前記製造例１と同様にして、下記表８記載のペプチドＮｏ．２〜１２のペプチドを合成した。【００５９】
【表８】
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【００６０】参考例１  ペプチドの電荷計算
レーニンジャー（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ）〔Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９７９〕の方法に従って、各ｐＨにおけるペプチド全体の電荷を計算した。前記レーニンジャーの方法を、ＥＭＢＬ  ＷＷＷ  Ｇａｔｅｗａｙ  ｔｏ  Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｐｏｉｎｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ｃｇｉ／ｐｉ−ｗｒａｐｐｅｒ．ｐｌ）上で利用可能なプログラムを用いて行なった。【００６１】  なお、アラニン、バリン、アスパラギン及びグルタミンは電荷を持たないアミノ酸であるため、前記プログラムでは区別することができなかった。そこで、これらを同一のものとして計算した。また、前記プログラムでは、ペプチド分子の両末端が、それぞれ、アミノ基及びカルボキシル基になっているものと仮定して計算を行ない、自己組織化ペプチドの計算値から該自己組織化ペプチドと同じ重合度のポリアラニン（両末端のみ電荷を有する）の計算値を引くことによって、末端部分による電荷を補正した。これにより、前記ペプチドの末端のアミノ基及びカルボキシル基のそれぞれの影響を排除し、より現実的構造に近似する値を求めた。ペプチドＮｏ．１〜１２のそれぞれのｐＨ７．０における電荷の算出値を、表９に示す。【００６２】
【表９】
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【００６３】  その結果、表９に示すように、前記ペプチドＮｏ．１〜９のｐＨ７．０における電荷は、０ではないことが確認できた。なお、ペプチドＮｏ．１２のｐＨ７．０における電荷は０ではないが、該ペプチドは、非極性アミノ酸残基を有しないペプチドであるため、本発明のペプチドではない。【００６４】参考例２  ペプチドのβ−シート構造形成能の確認
前記製造例１及び２で合成したペプチドＮｏ．１〜９及びＮｏ．１２それぞれのβ−シート構造の形成を、円二色測定法により確認した。具体的には、ペプチドをそれぞれ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解して、３ｘ１０−３Ｍ  ペプチド溶液を調製した。得られたペプチド溶液を、光路長０．５ｍｍの石英セル（ジャスコ（ＪＡＳＣＯ）社製、商品名１１０Ｊ円筒型セル、０．０４ｍＬ容）に満たし、商品名：Ｊ−８２０Ｋ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ（ＪＡＳＣＯ社製）に前記石英セルをセットして、ペプチド溶液について、円二色測定法により、１９５ｎｍ〜２６０ｎｍのモル楕円率を測定した。結果を図１に示す。【００６５】  その結果、図１に示されるように、前記ペプチドＮｏ．１〜９は、２１６ｎｍのモル楕円率が負の値となった。したがって、前記ペプチドＮｏ．１〜９は、水溶液中でβ−シート構造を形成することがわかった。一方、前記ペプチドＮｏ．１２は、β−シート構造を形成しないことがわかった。【００６６】実施例１  ナノファイバー形成の確認
製造例１及び２で合成したペプチドＮｏ．１〜９を、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解して、それぞれ０．５重量％  ペプチド溶液を調製した。得られたペプチド溶液を、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１／２０濃度となるように希釈した。【００６７】  得られた希釈液  １μＬを、劈開させたマイカ基板上に滴下した。その後、前記マイカ基板上の余分なペプチドを、イオン交換水で洗い流した。ついで、室温（２５℃）で基板を乾燥させた。【００６８】  乾燥後のマイカ基板上のペプチドを、原子間力顕微鏡（商品名：ＮａｎｏＳｃｏｐｅ  ＩＩＩａ、デジタルインストゥルメンツ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）社製）を用いて観察した。その結果を、図２に示す。【００６９】  図２に示されるように、前記ペプチドＮｏ．１〜９は、いずれも、自己組織化してナノファイバーを形成することがわかった。【００７０】試験例１  ゲル形成の確認１
商品名：ＡＲ１０００（ＴＡ  インストゥルメンツ  ジャパン社製）を用いて、０．５重量％  ペプチド（前記ペプチドＮｏ．１〜１０）含有水溶液の貯蔵弾性率Ｇ’及び損失弾性率Ｇ’’を測定した。具体的には、室温で１日放置した０．５重量％  ペプチド含有水溶液  ８００μＬを鉄のプレート上に乗せ、該０．５重量％  ペプチド含有水溶液の上に鉄製のコーン（直径４０ｍｍ、コーン角２°）を置いた。ついで、前記０．５重量％  ペプチド含有水溶液を押しつぶし、前記鉄製のコーンを回転させたときに、モーターにかかる力を、コーンの周波数を０．１〜１０ｒａｄ／ｓｅｃの範囲で変化させてモニターした。結果を表１０に示す。【００７１】
【表１０】
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【００７２】  表１０に示されるように、前記ペプチドＮｏ．１〜９（実施例２〜１０）は、いずれもＧ’＞Ｇ’’であった。また、前記ペプチドＮｏ．１〜９では、コーンの周波数を変化させても、Ｇ’及びＧ’’の値が比較的一定であった。したがって、前記ペプチドＮｏ．１〜９は、少なくとも前記範囲で周波数を変化させても、ゲルを形成することがわかった。なお、表１０に示されるように、ｐＨ７．０における電荷が０であるペプチドＮｏ．１０（比較例１）は、酸性水溶液中でゲルを形成することが分かった。【００７３】試験例２  ゲル形成の確認２
製造例１及び２で合成したペプチドＮｏ．１、２、４、５、６、１０及び１１を、表１１に示される各水溶液に溶解させた。得られたペプチド含有水溶液  １ｍＬを、１．５ｍＬ容のテストチューブに入れた。ついで、前記テストチューブを、３７℃で２４時間静置させた。【００７４】  その後、チューブを逆さまにしても内容物が落ちなかったものを、ゲル形成が「良好」であると評価し、内容物が落ちたものを「不良」と評価した。結果を表１１に示す。【００７５】
【表１１】
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【００７６】  表１１に示されるように、ペプチドＮｏ．１、２、４、５及び６（実施例１１〜３０）は、各種の中性水溶液中でゲルを形成することがわかった。一方、ｐＨ７．０における電荷が０であるペプチドＮｏ．１０及び１１（比較例２及び３）は、中性水溶液中でゲルを形成しないことがわかった。【００７７】実施例３１  ペプチド水溶液の可視光透過率測定
製造例１及び２で合成したペプチドＮｏ．１〜９を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解し、０．５重量％  ペプチド溶液からなるゲルを調製した。光路長１０ｍｍのセルと商品名：Ｖ−５５０  ＵＶ／ＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ジャスコ社製）とを用いて、調製したゲルの３８０ｎｍ〜７８０ｎｍの範囲における可視光透過率を測定した。かかる範囲における可視光透過率の平均値を表１２に示す。【００７８】
【表１２】
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【００７９】  表１２に示されるように、ペプチドＮｏ．１〜９のそれぞれから構成されるゲルは、いずれも高い可視光透過率を示した。したがって、前記ペプチドＮｏ．１〜９は、それぞれ透明なゲルを形成することがわかった。また、前記ゲルのうち、ペプチドＮｏ．１、４、６または７のそれぞれから構成されるゲルを室温で２ヶ月放置し、前記と同様にして可視光透過率を測定したところ、その平均値は、それぞれ８８、８７、９１または９３％／ｃｍであり、低下率は、それぞれ９．３、５．４、６．２または４．１％であった。即ち、調製後２ヶ月経過したゲルも高い可視光透過率を維持した。したがって、ペプチドＮｏ．１、４、６または７のそれぞれから構成されるゲルは、長期間にわたり白濁等することなく安定であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の自己組織化ペプチド、該自己組織化ペプチドが自己組織化してなるナノファイバー、及び該自己組織化ペプチドが自己組織化したゲルは、化粧品（スキンケア用品、ヘアケア用品等）、細胞培養用基材（医薬品開発スクリーニング、再生医療等に用いられるもの）、医薬品および医療機器（じょくそう製剤、骨充填・美容形成用注入剤、眼科用手術補助剤、人工硝子体、人工水晶体、関節潤滑剤、点眼剤、ＤＤＳ基材、止血剤等）、湿潤用保水剤、乾燥剤、または医療機器等へのコーティング剤等に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、ペプチド水溶液の１９５〜２６０ｎｍにおけるモル楕円率を示すグラフである。図中、（１）はペプチドＮｏ．１、（２）はペプチドＮｏ．２、（３）はペプチドＮｏ．３、（４）はペプチドＮｏ．４、（５）はペプチドＮｏ．５、（６）はペプチドＮｏ．６、（７）はペプチドＮｏ．７、（８）はペプチドＮｏ．８、（９）はペプチドＮｏ．９、（１０）はペプチドＮｏ．１２、の３ｘ１０−３Ｍ  水溶液のモル楕円率を示す。
【図２】図２は、原子間力顕微鏡を用いて観察したペプチド水溶液中のナノファイバーの写真である。パネル（Ａ）は、ペプチドＮｏ．１、パネル（Ｂ）はペプチドＮｏ．２、パネル（Ｃ）はペプチドＮｏ．３、パネル（Ｄ）はペプチドＮｏ．４、パネル（Ｅ）はペプチドＮｏ．５、パネル（Ｆ）はペプチドＮｏ．６、パネル（Ｇ）はペプチドＮｏ．７、パネル（Ｈ）はペプチドＮｏ．８、パネル（Ｉ）はペプチドＮｏ．９、の０．５重量％水溶液の写真を表す。図中、スケールバーは、５００ｎｍを示す。
【配列表フリーテキスト】
【００８２】配列表の配列番号１は、本発明の自己組織化ペプチドである。
配列表の配列番号２は、本発明の自己組織化ペプチドである。
配列表の配列番号３は、本発明の自己組織化ペプチドである。
配列表の配列番号４は、本発明の自己組織化ペプチドである。
配列表の配列番号５は、本発明の自己組織化ペプチドである。
配列表の配列番号６は、本発明の自己組織化ペプチドである。
配列表の配列番号７は、本発明の自己組織化ペプチドである。
配列表の配列番号８は、本発明の自己組織化ペプチドである。
配列表の配列番号９は、本発明の自己組織化ペプチドである。
配列表の配列番号１０は、本発明の自己組織化ペプチドでないペプチドである。
配列表の配列番号１１は、本発明の自己組織化ペプチドでないペプチドである。
配列表の配列番号１２は、本発明の自己組織化ペプチドでないペプチドである。
【図１】
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【図２】
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