(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エチレンビニルアルコールを含む少なくとも１つの酸素バリア層を有する透明ポリマー材料を含み、２５℃、外部相対湿度５０％の雰囲気あたりの酸素透過性が２４時間につき１００平方センチメートルあたり０．１５５ｃｃ未満である酸素バリアフィルム一次パッケージ内で脱酸素化ヘモグロビン代用血液を維持する工程を含む、脱酸素化ヘモグロビン代用血液の保存方法。
【請求項２】
ポリマー材料が、ポリオレフィンを含む外層をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記外層が中密度ポリエチレンを含む請求項２記載の方法。
【請求項４】
外層および酸素バリア層が、共押出しされている請求項３記載の方法。
【請求項５】
酸素バリア層が、酸化ケイ素で被覆されたポリエステル層をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
ポリマー材料が、ポリオレフィンを含む内層をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
内層が、線状低密度ポリエチレンを含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
ヘモグロビン代用血液が、窒素、アルゴンまたはヘリウム雰囲気下で維持される請求項１記載の方法。
【請求項９】
ａ）脱酸素化ヘモグロビン代用血液；および
ｂ）エチレンビニルアルコールを含む少なくとも１つの酸素バリア層を有する透明ポリマー材料を含み、２５℃、外部相対湿度５０％の雰囲気あたりの酸素透過性が２４時間につき１００平方センチメートルあたり０．１５５ｃｃ未満であり、その内部に脱酸素化ヘモグロビン代用血液が封入されており、それにより脱酸素化ヘモグロビン代用血液が実質的に無酸素環境下で保存される、酸素バリアフィルム一次パッケージ、
を含んでなる、保存された脱酸素化ヘモグロビン代用血液。
【請求項１０】
ポリマー材料が、ポリオレフィンを含む外層をさらに含んでなるものである請求項９記載の保存された脱酸素化代用血液。
【請求項１１】
前記外層が、中密度ポリエチレンを含んでなるものである請求項１０記載の保存された脱酸素化代用血液。
【請求項１２】
外層および酸素バリア層が、共押出しされている請求項１１記載の保存された脱酸素化代用血液。
【請求項１３】
酸素バリア層が、酸化ケイ素で被覆されたポリエステル層をさらに含んでなるものである請求項９記載の保存された脱酸素化代用血液。
【請求項１４】
ポリマー材料が、ポリオレフィンを含む内層をさらに含んでなるものである請求項９記載の保存された脱酸素化代用血液。
【請求項１５】
内層が、線状低密度ポリエチレンを含んでなるものである請求項１４記載の保存された脱酸素化代用血液。
【請求項１６】
ヘモグロビン代用血液が、窒素、アルゴンまたはヘリウム雰囲気下で維持されてなるものである請求項９記載の保存された脱酸素化代用血液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本願は、１９９５年３月２３日に提出された米国出願番号第０８／４０９，３３７号（現在は米国特許第５，８５４，２０９号）の継続出願である１９９５年６月２日に提出された米国特許出願番号第０８／４５８，９１６号（現在は米国特許第５，８４０，８５２）の一部継続出願である１９９５年６月７日に提出された米国特許出願第０８／４７１，５８３号（現在は米国特許第５，６９１，４５２号）の継続出願である１９９７年１１月１９日に提出された同時継続中の米国特許出願番号第０８／９７４，６５８号（現在は放棄されている）の一部継続出願である１９９８年１０月１４日に提出された同時継続中の米国特許出願第０９／１７３，１８９号の継続出願であって、それらの全教示は参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
発明の背景
血液損失（例えば急性出血からまたは外科手術の間に）から、貧血（例えば悪性貧血または鎌状赤血球貧血から）から、あるいはショック（例えば循環血液量減少性ショック、アナフィラキシーショック、敗血症ショックまたはアレルギー性ショック）から生じる低酸素症を治療または予防するために代用血液が求められている。これらの代用血液としての能力を有する血液および血液分画の使用には危険性が伴う。例えば、全血の使用は、しばしば、患者の回復を悪化させたり、患者を死に至らしめることもある肝炎誘発ウイルスやＡＩＤＳ誘発ウイルスの伝播の危険性を伴う。さらに全血の使用は、免疫血液学的問題およびドナー間の不適合性を回避するための血液型検査と交差適合試験を必要とする。
【０００３】
代用血液としてのヒトヘモグロビンは、浸透作用ならびに酸素を輸送および移入するための能力を有するが、腎経路によっておよび血管壁を通して循環から速やかに除去されるという欠点を持ち、非常に短い、従って一般的には満足できない半減期をもたらす。さらに、ヒトヘモグロビンは、しばしば有毒なレベルのエンドトキシン、細菌および／またはウイルスで汚染されている。
【０００４】
非ヒトヘモグロビンもヒトヘモグロビンと同じ欠点を有する。さらに、非ヒト供給源からのヘモグロビンもまた、一般的には抗体などのタンパク質で汚染されており、受容者において免疫系応答を引き起こしうる。
【０００５】
これまで、ペルフルオロ化学物質、合成ヘモグロビン類似体、リポソーム被包ヘモグロビンおよび化学修飾ヘモグロビンを含む、少なくとも４種類の他の代用血液が使用されてきた。しかしながら、これらの代用血液の多くが一般的には血管内貯留時間が短く、異物として循環系によって排除されるか若しくは肝臓や脾臓および他の組織に停留してきた。また、これらの代用血液の多くは生体系とは生物学的に不適合であった。
【０００６】
従って、ヘモグロビンベース代用血液の調製における最近の進歩にも関わらす、代用血液の注入から生じる免疫系応答および任意の毒性影響を一般に防止するのに十分低いレベルのエンドトキシン、細菌、ウイルス、リン脂質および非ヘモグロビンタンパク質等の夾雑物を有する代用血液が引き続き必要とされている。さらに、代用血液はまた、外界の条件下で適切な量の酸素を組織に運搬および伝達することが可能でなければならず、良好な血管内保持時間を有さねばならない。
【０００７】
さらに、代用血液は、１）全血と概して等価な腫脹活性を有し、２）クロスマッチングまたは感受性試験を必要とすることなく、ほとんどのレシピエントに注入され得、３）冷蔵の最小量で長期間保存され得ることが好ましい。
【０００８】
発明の要旨
本発明は、脱酸素化したヘモグロビン代用血液の保存方法および保存された脱酸素化した代用血液に関する。
【０００９】
本発明は、脱酸素化したヘモグロビン代用血液を酸素バリアフィルム一次（ｐｒｉｍａｒｙ）パッケージ中で維持する工程を含む、脱酸素化したヘモグロビン代用血液を保存する方法に関し、該パッケージは、約２５℃および約５０％の外部相対湿度の雰囲気あたりの酸素透過性が２４時間につき１００平方インチあたり約１．０ｃｃ（または１００平方センチメートルあたり約０．１５５ｃｃ）未満である。
【００１０】
本発明はまた、保存された脱酸素化したヘモグロビン代用血液に関する。前記保存された代用血液は、脱酸素化したヘモグロビン代用血液および酸素遮断フィルム基本パッケージを含有する。前記酸素遮断フィルム基本パッケージは、２５℃および約５０％の外部の相対湿度の雰囲気下あたりの酸素透過性が、２４時間につき、１００平方インチあたり約１．０ｃｃ（または１００平方センチメートルあたり０．１５５ｃｃ）未満である透明な積層材料を含有し、その中に、脱酸素化したヘモグロビン代用血液が封入され、それにより実質的に酸素を有さない雰囲気下で脱酸素化したヘモグロビン代用血液が保存される。
【００１１】
本発明の利点の１つは、本発明の方法により製造および保存されたヘモグロビンがより高い純度およびより長い貯蔵寿命を有することである。高い酸素遮断性を有する基本パッケージにより、高遮断性うわ包装を施す前またはうわ包装を取り除いた後の産物安定性を保護することが可能になる。また、透明基本パッケージは、製造状態の目視による検査を可能にする。さらに、本発明は、ヘモグロビン代用血液の保存におけるさらなる遮断体、うわ包装などのさらなる遮断体の必要性をなくすことにより、プラスチックの医療廃棄物が減る。
【００１２】
代用血液は、室温で２年またはそれ以上の間まで、安定な状態で維持することができ、これまでの方法よりもかなり改善されている。さらに、本発明の精製ヘモグロビンにより、１つの種由来のヘモグロビンを、受容種が重要な副作用を被ることなく、異なる種において代用血液として首尾良く使用することができる。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明の工程の特徴およびその他詳細についてより詳しく記載し、特許請求の範囲において指し示す。本発明の特定の態様は、例として示すものであり、本発明を制限するものとしてでないことが理解されるであろう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく様々な態様で使用することができる。
【００１４】
一態様において、本発明は、脱酸素化ヘモグロビン代用血液の安定性を保持する方法に関する。この方法は、脱酸素化ヘモグロビン代用血液を酸素遮断フィルム基本パッケージ内に維持する工程を含む。一態様において、酸素遮断フィルム基本パッケージは、約２５℃、外部相対湿度約５０％の雰囲気あたりの酸素透過性が２４時間につき１００平方インチあたり約１．０ｃｃ未満（または、１００平方センチメートルあたり約０．１５５ｃｃ）である透明ポリマーフィルムを含む。好ましくは、基本パッケージは、約２５℃雰囲気あたりの酸素透過性が２４時間につき１００平方インチあたり約０．６ｃｃ未満（または、１００平方センチメートルあたり約０．０９３ｃｃ）である。別の態様において、ポリマーフィルムは積層体である。
【００１５】
別の態様において、本発明は、脱酸素化ヘモグロビン代用血液および酸素遮断フィルム基本パッケージを含む保存された脱酸素化ヘモグロビン代用血液に関する。一態様において、酸素遮断フィルム基本パッケージは透明ポリマーフィルムを含む。基本パッケージは、約２５℃、外部相対湿度約５０％の雰囲気あたりの酸素透過性が２４時間につき１００平方インチあたり約１．０ｃｃ未満（または、１００平方センチメートルあたり約０．１５５ｃｃ）であり、その内部に脱酸素化ヘモグロビン代用血液が封入されており、それにより脱酸素化ヘモグロビン代用血液が実質的に無酸素環境下で保存される。別の態様において、ポリマーフィルムは積層体である。
【００１６】
酸素遮断フィルムは、適当な酸素遮断材料を、該材料が２５℃、周囲湿度、例えば相対湿度５０％において好適な酸素遮断特性を有するように含む。本発明の一態様では、酸素遮断材料は、少なくとも１つの層を有する透明ポリマーフィルムを含む。より具体的な態様では、フィルムは、ポリオレフィン外層（ポリエチレンまたはポリプロピレンなど）、酸素遮断層およびポリオレフィン内層の積層体を含んでなり、内層はパッケージの内容物と接触している。本発明のポリオレフィンは、２種またはそれ以上のモノマーの共重合体を含み、モノマーは、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｔｈｙｌｅｎｅ）またはブチレンでありうる。別の態様では、エチレンビニルアセテートなどの他のモノマーをコポリマーに含めることができる。酸素遮断層の種類により、積層体は任意に支持層を含みうる。理論に拘束されることを望まないが、支持層は、自動化装置を用いるバッグの製造を容易にする。好ましい態様では、支持層はナイロンなどの二軸延伸材料である。一態様において、透明材料は、当該技術分野において公知の方法を用いて、光分解を回避するよう作製することができる。
【００１７】
一態様において、ポリオレフィン外層および酸素遮断層は共押出されている。好ましい態様では、ポリオレフィン外層が中密度（medium density）ポリエチレンであり、酸素遮断層がエチレンビニルアルコールである。
【００１８】
本発明の別の態様では、酸素遮断フィルムは、約０．００２２ｉｎ．（または約５６マイクロメーター（μｍ））の厚みを有する共押出された中密度ポリエチレン／エチレンビニルアルコール層；約０．０００４８ｉｎ．（または約１２．２μｍ）の厚みを有するナイロン層；および約０．００２０ｉｎ．（または約５０．８μｍ）の厚みを有する低密度ポリエチレン層を含む。
【００１９】
理論に拘束されることを望まないが、ポリオレフィンの外層および内層は、蒸気遮断体である。どちらの層の蒸気遮断特性も、層の厚みを大きくすることにより増大しうる。パッケージの外側に蒸気遮断体を有する必要はないが、滅菌されたバッグを自動製造する目的には、外層が滅菌工程の際に酸素遮断層の安定性を保護するため、中密度ポリエチレン層などのポリオレフィン外層を有することが望ましい。例えば、この層は、過酸化水素浴を通してフィルムを引き上げる工程の際に酸素遮断層を保護する。他の好適な外層には、例えば、線状低密度(linear low density)ポリエチレン、低密度ポリエチレン、高密度ポリエチレンまたはポリプロピレンが含まれる。例えば、滅菌手順が必要とされない場合はポリオレフィン外層は必要ないことが理解される。また、酸素遮断層に影響しない異なる滅菌技術を使用する、または滅菌工程に耐える酸素遮断層を使用する場合、ポリオレフィン外層は必要ない。
【００２０】
本発明の別の態様では、酸素遮断層は、被覆された支持材料を含む本質的に酸素不透過性のポリマーを含む。一態様では、支持材料は、例えばポリエステルまたはポリアミド（ナイロンなど）でありえ、被覆は、例えば酸化ケイ素（ＳｉＯX ）または金属酸化物などの支持体上に析出してそれを酸素不透過性としうる他の材料でありうる。
【００２１】
任意に、うわ包装を使用しうる。うわ包装は、ポリマーフィルム（例えば、本質的に酸素不透過性のポリエステル、ポリプロピレン、エチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）またはナイロン）などの適当な材料、またはホイル積層体（例えば、銀またはアルミニウムのホイル積層体）もしくは他の酸素遮断積層体などの積層体から製造される。うわ包装がポリエステルフィルムなどのフィルムである場合、フィルムは種々の適当な方法により本質的に酸素不透過性とされうる。一態様では、製造されたフィルムは本質的に酸素不透過性である。あるいはまた、ポリマー材料が所望の仕様に合うのに十分酸素不透過性でない場合、フィルムを積層するか、またはそうしない場合は酸素透過性を低下または消去するために処理しうる。好ましい態様では、ホイルがアルミニウム、銀、金またはその他の金属であるホイル積層体を使用する。ホイル層は、好ましくは約０．０００１〜０．００１インチ（または約２．５４〜２５．４μｍ）の厚みを有し、より好ましくは約０．０００３インチ（または約７．６２μｍ）の厚みを有する。積層体は、典型的には１つまたはそれ以上のポリマー層を含む。ポリマーは、例えばポリエステル層（例えば、４８ゲージ、または約１２．２μｍポリエステル）、ナイロン、エチレンビニルアルコール、塩化ポリビニリデンなどを含む、種々のポリマー材料を含有しうる。
【００２２】
基本パッケージ、およびうわ包装（存在する場合）は、バイアル、シリンダー、箱などを含む種々の構造でありうる。好ましい態様では、基本パッケージは、バッグの形態である。好適なバッグは、例えば、１枚またはそれ以上（例えば２枚）のシートをその外周部で連続的に結合して、中心部に内容物を充填しうる密閉された酸素不透過性の構造を形成することにより形成することができる。結合は、任意の好適な材料を用いて行うことができる。線状低密度、低密度、中密度または高密度のポリエチレンを材料の内層として使用する場合、シートを適切な条件下で加熱することにより封止することができる。ポリエチレンが適切な条件下で熱により自身を封止しうることは当該技術分野において周知である。パラメータを変更してフィルムのポリオレフィン表面の適正な結合を得ることは当該技術分野において周知であり、これらのパラメータには温度、圧力および「滞留時間」が含まれ、ここで滞留時間とはシートが圧力および温度下に置かれる時間である。典型的には、線状低密度ポリエチレンはあまり熱を必要とせず、密度の高いポリエチレンほどより多くの熱を必要とする。例えば、１．５ミル（０．００１５ｉｎ．または３８．１μｍ）の線状低密度ポリエチレンを２枚のシートの内側表面に有する積層体材料を３００°Ｆ（１４９℃）、５０ｐｓｉ（３４．４７ニュートン／ｃｍ2 ）に１秒間曝すと、本発明の方法に適する封止部が得られる。また、より高密度のポリオレフィンは、典型的には、結合プロセス中の高圧に耐える。一般に、圧力が過度である場合、加熱された材料は接触領域から押し退けられ、弱い封止部が生じる。ポリエステル／ホイル積層体材料の場合は、例えばポリエステル接着剤を用いることができる。
【００２３】
好ましい態様では、代用血液は実質的に無酸素環境下でパッケージングされている。好適な雰囲気の例には、窒素、アルゴンおよびヘリウムが含まれる。
【００２４】
本明細書に規定する代用血液は、少なくとも生体臓器および組織に酸素を輸送して移入することができ、十分な血管内膨張圧を維持することができる、ヒト、哺乳動物および他の脊椎動物において使用するためのヘモグロビンベースの酸素運搬組成物である。脊椎動物は古典的に定義されている通りであり、ヒトまたは組織に酸素を運ぶために循環系の血液を使用する他のあらゆる脊椎動物を含む。さらに、循環系の定義は、古典的に定義されている通りであり、心臓、動脈、静脈および毛細血管のようなより小さな脈管構造を含む微小循環（ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）からなる。
【００２５】
本発明の代用血液は、好ましくは、顕著な免疫応答をもたらさず、受容者にとって非毒性であるレベルのエンドトキシン、リン脂質、外来タンパク質および他の夾雑物を有する。好ましくは、代用血液は超高純度である。本文中で定義する超高純度とは、０．５ＥＵ／ｍｌ未満のエンドトキシン、３．３ｎｍｏｌ／ｍｌ未満のリン脂質およびほとんどまたは全く検出できないレベルの血清アルブミンまたは抗体などの非ヘモグロビンタンパク質を含むことを意味する。
【００２６】
「エンドトキシン」の語は、多くの条件下で毒性である、グラム陰性菌細胞壁の外層の一部として産生される細胞結合リポ多糖類をさす。動物に注入したとき、エンドトキシンは発熱、下痢、出血性ショック、および他の組織損傷を引き起こしうる。エンドトキシン単位（ＥＵ）は、１９８３年の米国薬局方協約、３０１４ページにより、米国標準品ロットＥＣ−５の０．１ナノグラムに含まれる活性として定義された。ＥＣ−５の１バイアルは、１０，０００ＥＵを含む。代用血液中のエンドトキシン濃度を測定するための適当な手段の例としては、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｗｏｏｄｓ  Ｈｏｌｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓによって開発された方法「速度論的／比濁測定リムルスアメーバ様細胞溶解産物〔Ｋｉｎｅｔｉｃ／Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  Ｌｉｍｕｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｉｃ  Ｌｙｓｔａｔｅ〕（ＬＡＬ）５０００法」が挙げられる。
【００２７】
本明細書で規定する安定重合ヘモグロビンは、２年以上にわたる適当な保存温度での保存期間中、好ましくは低酸素環境で保存したとき２年以上にわたって、分子量分布および／またはメトヘモグロビン含有量を実質的に上昇または低下させない、ヘモグロビンベースの酸素運搬組成物である。１年以上にわたる保存のための適当な保存温度は：約０℃〜約４０℃である。好ましい保存温度範囲は、約０℃〜約２５℃である。
【００２８】
適当な低酸素環境、あるいは実質的に無酸素である環境とは、少なくとも約２ヵ月間、好ましくは少なくとも約１年間、あるいはより好ましくは少なくとも約２年間の保存期間にわたって、代用血液中約１５重量％未満のメトヘモグロビン濃度をもたらす、代用血液と接触する酸素の累積量と定義される。酸素の累積量は、代用血液パッケージ内への酸素の侵入および代用血液とパッケージの最初の酸素含有量を含む。
【００２９】
赤血球（ＲＢＣ）の採集からヘモグロビン重合まで、本方法全体を通して、血液溶液、ＲＢＣおよびヘモグロビンは、温度を約２０℃より低く、０℃を超える温度に保持することなど、細菌増殖あるいは生物負荷量（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）を最小限に抑えるのに十分な条件下に保持する。好ましくは温度を約１５℃以下に保持する。より好ましくは、温度を１０±２℃に保持する。
【００３０】
本方法においては、安定重合ヘモグロビン代用血液を調製する工程のための成分の一部は、無菌産物を製造するに十分に衛生的にする。無菌は、当該分野において定義されている通りであり、具体的には、溶液がＵＳＰ  ＸＸＩＩ、第７１章、１４８３−１４８８頁に規定されている無菌性についての米国薬局方の要件に合致することである。さらに、工程の流れにさらされる成分の部分は、通常、工程の流れと反応しないまたは工程の流れを汚染しない物質で製造されるかまたはおおわれる。かかる物質としては、ステンレス鋼およびインコネルなどの他の鋼合金が挙げられうる。
【００３１】
適当なＲＢＣ供給源は、ヒト血液、ウシ血液、ヒツジ血液、ブタ血液、他の脊椎動物由来の血液、ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１２：５５−５９（１９９４）に述べられているトランスジェニックＨｂなどの遺伝子導入によって産生されるヘモグロビンなどが挙げられる。
【００３２】
血液は、生存ドナーまたは屠殺したばかりのドナーから採集することができる。ウシ全血を採集するための１つの方法が、Ｒａｕｓｃｈらに付与された米国特許第５，０８４，５５８号明細書および同第５，２９６，４６５号明細書に述べられている。血液は衛生的に採集することが好ましい。
【００３３】
採集時または採集直後に、血液の顕著な凝固を防ぐために血液を少なくとも１種の抗凝固薬と混合する。血液のための適当な抗凝固薬は当該技術において古典的に知られている通りであり、例えば、クエン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、ヘパリンなどが挙げられる。血液と混合する場合、抗凝固薬は、粉末などの固形形態または水溶液でありうる。
【００３４】
血液溶液供給源は、採集されたばかりのサンプル由来または血液銀行の使用期間終了後のヒト血液のような古いサンプル由来でありうることが理解される。さらに、血液溶液は、それまで凍結状態および／または液体状態で保持されていたものであってもよい。血液溶液は、本方法において使用する前に凍結されていないことが好ましい。
【００３５】
他の態様では、血液溶液に抗凝固薬を導入する前に、ペニシリンなどの血液溶液中の抗生物質のレベルを測定する。血液サンプルのドナーが抗生物質で治療されていなかったことを確認することにより、抗生物質レベルを測定して、血液サンプルが感染性生物を含まないというある程度の保証を与える。抗生物質に関する適当なアッセイとしては、例えば、「乳中のペニシリンの迅速検出」と題する方法を用いるペニシリンアッセイキット（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）が挙げられる。血液溶液は、約０．００８単位／ｍｌに等しいかまたはそれ以下のペニシリンレベルを含むことが好ましい。一方、ウシにおいて疾患がないことあるいは抗生物質治療が行われていないことをモニターするための牛群管理プログラムを使用してもよい。
【００３６】
好ましくは、大きな凝集物や粒子を取り除くために、抗凝固ステップの前またはその間に、例えば、濾過器を通すことによって血液溶液を濾す。６００メッシュスクリーンは適当なストレーナーの例である。
【００３７】
次に血液溶液中のＲＢＣを透析濾過（ダイアフィルトレーション）または等張液などの少なくとも１種の溶液による個別の希釈と濃縮段階の組合せなどの適当な手段によって洗浄し、血清アルブミンまたは抗体（例えば免疫グロブリン（ＩｇＧ））などの細胞外血漿タンパク質からＲＢＣを分離する。ＲＢＣをバッチでまたは連続的供給モードで洗浄できることが理解される。
【００３８】
許容されうる等張液は、当該分野において知られている通りであり、ＲＢＣの細胞膜を破壊せず、かつ全血の血漿部分を置換するｐＨと浸透圧モル濃度を有する、クエン酸塩／生理食塩水などの溶液が挙げられる。好ましい等張液は、中性ｐＨと約２８５−３１５ｍＯｓｍの浸透圧モル濃度とを有する。好ましい態様では、等張液はクエン酸ナトリウム二水和物（６．０ｇ／ｌ）と塩化ナトリウム（８．０ｇ／ｌ）との水溶液で構成される。
【００３９】
本発明の方法において使用されうる水は、蒸留水、脱イオン水、注射用蒸留水（ＷＦＩ）および／または低発熱原性水（ＬＰＷ）などが挙げられる。好ましいＷＦＩは、注射用蒸留水に関する米国薬局方規格（Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）に適合する脱イオン化された蒸留水である。ＷＦＩはさらにＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１１，１５−２３（１９９１）の中に記述されている。好ましいＬＰＷは、０．００２ＥＵ／ｍｌ未満を含む脱イオン水である。
【００４０】
等張液は、血液溶液に加える前に濾過することが好ましい。適当なフィルターとしては、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ  ＃ＣＤＵＦ  ０５０  Ｇ１フィルターなどのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  １０，０００ダルトン限外濾過膜あるいはＡ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ中空糸、１０，０００ダルトン（Ｃａｔ  ＃ＵＦＰ−１０−Ｃ−８５）などが挙げられる。
【００４１】
好ましい態様では、血液溶液中のＲＢＣを透析濾過によって洗浄する。適当なダイアフィルターとしては、０．１μｍ〜０．５μｍのフィルター（例えば０．２μｍ中空糸フィルター、Ｍｉｃｒｏｇｏｎ  Ｋｒｏｓｆｌｏ  ＩＩ−マイクロフィルトレーションカートリッジ）などの実質的により小さな血液溶液成分からＲＢＣを分離する孔サイズの微小孔膜などが挙げられる。同時に、ダイアフィルターを通して失われる濾液の割合（または容量）に等しい割合で相殺として濾過した等張液を継続的に（またはバッチで）加える。ＲＢＣ洗浄の際に、直径がＲＢＣよりも有意に小さい直径であるか、あるいは血漿のように液体である血液溶液の成分はダイアフィルターの壁を通過して濾液中に入る。ＲＢＣ、血小板および白血球などの希釈血液溶液のより大きな物質が保持され、これらを等張液と混合して、継続的にまたはバッチごとに加えて透析された血液溶液を形成する。
【００４２】
より好ましい態様では、一定容量の濾過した等張液を透析濾過タンクに加えて、透析濾過タンク中の血液溶液の容量を最初に希釈する。好ましくは、加える等張液の容量は血液溶液の最初の容量にほぼ等しい。
【００４３】
別の態様では、一連の連続的（または逆連続的）希釈と濃縮ステップを通してＲＢＣを洗浄し、ここで、少なくとも１種の等張液を添加することにより血液溶液を希釈し、フィルターを通して濃縮し、それにより、透析された血液溶液を形成する。
【００４４】
ＲＢＣが混ざった血漿タンパク質のレベルが実質的に低下したとき（典型的には少なくとも約９０％）、ＲＢＣ洗浄を終了する。典型的には、ダイアフィルター３４から排出される濾液の容量が、血液溶液を濾過等張液で希釈する前に透析濾過タンク中に入っていた血液溶液の容量の約３００％以上になったとき、ＲＢＣ洗浄を終了する。追加的ＲＢＣ洗浄によってＲＢＣから細胞外血漿タンパク質をさらに分離してもよい。例えば、６容量の等張液による透析濾過は少なくとも約９９％のＩｇＧを血液溶液から除去することができる。
【００４５】
次に透析した血液溶液を、遠心分離などによる、透析血液溶液中のＲＢＣを白血球および血小板から分離するための手段に供する。
【００４６】
ＲＢＣを他の血液成分から分離するために、当該技術分野において一般的に知られる他の方法が使用できることが理解される。例えば沈殿が使用でき、かかる分離方法は、他の血液成分からＲＢＣを分離する前に、ＲＢＣの有意の量の細胞膜を破壊しない、例えば約ＲＢＣの約３０％未満しか破壊しない。
【００４７】
ＲＢＣの分離後、ＲＢＣを溶解するための手段によってＲＢＣを溶解し、ＲＢＣからヘモグロビンを放出させてヘモグロビン含有溶液を形成する。溶解手段は、機械的溶解、化学的溶解、低張性溶解、あるいは酸素を運搬して放出するＨｂの能力を有意に損傷することなくヘモグロビンを放出させる他の既知の溶解方法のように、種々の溶解方法が使用できる。
【００４８】
さらに他の態様では、Ｎａｔｕｒｅ，３５６：２５８−２６０（１９９２）に述べられている組換えによって生成されたヘモグロビンのような、組換えによって生成されるヘモグロビンをＲＢＣの代わりに本発明の方法において処理することができる。ヘモグロビンを含む細菌細胞を上記に述べられているように洗浄して、夾雑物から分離することができる。次にこれらの細菌細胞をボールミルのような当該技術分野において既知の手段によって機械的に破壊し、細胞からヘモグロビンを放出させて溶解細胞相を形成する。その後この溶解細胞相を溶解ＲＢＣ相と同様に処理する。
【００４９】
溶解後、溶解ＲＢＣ相を限外濾過して、分子量約１００，０００ダルトンを超えるタンパク質のようなより大きな細胞デブリを除去する。一般に細胞デブリは、Ｈｂ、より小さな細胞タンパク質、電解質、補酵素および有機代謝中間体を除く、すべての完全なおよび断片化された細胞成分を含む。許容される限外濾過器としては、例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｃａｔ  ＃ＣＤＵＦ  ０５０  Ｈ１）およびＡ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ．；Ｍｏｄｅｌ  Ｎｏ．ＵＦＰ１００Ｅ５５）によって製造されている１００，０００ダルトンのフィルターなどが挙げられる。
【００５０】
溶解ＲＢＣ相中のＨｂの濃度が８グラム／リットル（ｇ／ｌ）未満になるまで限外濾過を継続し、重合に使用できるヘモグロビンの収率を最大にすることが好ましい。溶解ＲＢＣ相からＨｂを分離するためには、沈殿、遠心分離あるいはマイクロフィルトレーションを含めた他の方法が使用できる。
【００５１】
次にＨｂ限外濾液を限外濾過して、電解質、補酵素、代謝中間体および分子量約３０，０００ダルトン未満のタンパク質のようなより小さな細胞デブリとＨｂ限外濾液からの水を除去することができる。好適な限外濾過器には、３０，０００ダルトンの限外濾過器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ  ＃ＣＤＵＦ  ０５０  Ｔ１および／またはＡｒｍｉｃｏｎ，＃５４０  ４３０）が含まれる。
【００５２】
次いで、濃縮Ｈｂ溶液を、１以上の平行（ｐａｒａｌｌｅｌ）クロマトグラフィーカラムに負荷し、高速液体クロマトグラフィーによって、抗体、エンドトキシン、リン脂質および酵素などのその他の夾雑物ならびにウイルスから、ヘモグロビンをさらに分離する。適切な媒体の例としては、陰イオン交換媒体、陽イオン交換媒体、疎水性相互作用媒体およびアフィニティー媒体が挙げられる。好ましい態様では、クロマトグラフィーカラムは、非ヘモグロビンタンパク質からＨｂを分離するのに適した陰イオン交換媒体を含む。適当な陰イオン交換媒体としては、例えば、シリカ、アルミナ、チタニアゲル、架橋デキストラン、アガロース、あるいはジエチルアミノエチルまたは第四アミノエチル基のような陽イオン性化学官能基によって誘導体化された、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリレートまたはスチレンジビニルベンゼンのような誘導体化された部分（ｍｏｉｅｔｙ）が挙げられる。溶解ＲＢＣ相に生じやすい他のタンパク質および夾雑物に比してＨｂの選択的吸着と脱着のために適当な陰イオン交換媒体および対応する溶出物は、通常の当業者によって容易に決定できる。
【００５３】
より好ましい態様では、熱水処理して孔サイズを増大させ、γ−グリシドキシプロピルシランに曝露して活性エポキシド基を形成し、ついでＣ3 Ｈ7 （ＣＨ3 ）2 ＮＣｌに曝露させて第四アンモニウム陰イオン交換媒体を形成する、シリカゲルから陰イオン交換媒体を形成するために方法を使用する。この方法は、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１２０：３２１〜３３３（１９７６）に記載されている。
【００５４】
クロマトグラフィーカラムは、Ｈｂ結合を促進する第一の溶出液を流すことにより最初に前処理される。次いで、濃縮Ｈｂ溶液がカラムの媒体にインジェクトされる。濃縮Ｈｂ溶液をインジェクトした後、クロマトグラフィーカラムは、種々の溶出液で連続的に洗浄され、分離した精製Ｈｂ溶出物が作製される。
【００５５】
好ましい態様では、酵素カルボニックアンヒドラーゼ、リン脂質、抗体およびエンドトキシンのようなタンパク質夾雑物をＨｂから分離するために、クロマトグラフィーカラムにおいてｐＨグラジエントが使用される。異なるｐＨ値を有する一連の緩衝液を逐次的にカラムにインジェクトして、クロマトグラフィーカラムの媒体内にｐＨグラジエントをつくる。緩衝液を適当な１０，０００ダルトンの脱発熱原性化（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）膜などで濾過することが好ましい。Ｈｂおよび非ヘモグロビン夾雑物の溶出が一般にｐＨに依存し、イオン強度には有意に依存しないように、Ｈｂを分離するために使用される緩衝液は低いイオン強度を有さねばならない。一般的には、約５０ｍＭ以下のイオン濃度の緩衝液は、適切な低イオン強度を有する。
【００５６】
第１の緩衝液は、濃縮されたＨｂ溶液をクロマトグラフィーカラムの媒体に運搬し、媒体へのＨｂの結合を促進する。次いで、第２の緩衝液は、媒体に結合したＨｂを維持しながら夾雑する非ヘモグロビン成分を溶出するために、カラム内のｐＨを調整する。次いで、第３の緩衝液は、Ｈｂを溶出する。次いで、Ｈｂ溶出物を回収する。Ｈｂ溶出物を滅菌フィルターに通すことが好ましい。適当な滅菌フィルターとしては、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｂｒａｎ  Ｃａｔ  ＃５２３２５０７  Ｇ１ＰＨフィルターなどの０．２２μｍフィルターが挙げられる。
【００５７】
好ましい態様では、Ｈｂ溶出物の純度を保証するためにＨｂ溶出物の最初の３％〜４％およびＨｂ溶出物の最後の３％〜４％を廃棄する。
【００５８】
クロマトグラフィーカラムを再使用する場合には、カラムに残存する夾雑非ヘモグロビンタンパク質とエンドトキシンとを第四の緩衝液によって溶出する。
【００５９】
非ヘモグロビン夾雑物からＨｂを分離するためのｐＨグラジエントの使用は、１９９５年６月７日に提出された米国特許第５，６９１，４５２号にさらに記載されている。好ましい態様では、第１の緩衝液は、トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）溶液（濃度約２０ｍＭ；ｐＨ約８．４〜約９．４）である。第２の緩衝液は、第１の緩衝液と第３の緩衝液の混合物であり、第２の緩衝液は約８．２〜約８．６のｐＨを有する。第３の緩衝液は、トリス溶液（濃度約５０ｍＭ；ｐＨ約６．５〜約７．５）である。第４の緩衝液は、ＮａＣｌ／トリス溶液（約１．０Ｍ  ＮａＣｌと約２０ｍＭトリスの濃度；約８．４〜約９．４、好ましくは約８．９〜９．１のｐＨ）である。第２の緩衝液のｐＨは、約８．２〜約８．４であることが特に好ましい。
【００６０】
一般的には、使用する緩衝液は、約０℃〜約５０℃の範囲の温度である。好ましくは、緩衝液の温度は、使用中約１２．４±１．０℃である。さらに、緩衝液は、一般的には約９℃〜約１１℃の範囲の温度で保存する。
【００６１】
次に、好ましくはＨｂ溶出物を、変性あるいは酸化ヘモグロビン（ｍｅｔＨｂ）の形成から生じるであろうような、Ｈｂ溶出物中のＨｂが酸素を運搬し、放出する能力を有意に低下させることなくＨｂを実質的に脱酸素化する手段によって、重合の前に脱酸素化して脱酸素化されたＨｂ溶液（以下、ｄｅｏｘｙ−Ｈｂという）を形成することが好ましい。
【００６２】
１つの態様では、相の膜を越えて不活性ガスを移動させることによってＨｂ溶出物を脱酸素化する。そのような不活性ガスとしては、例えば、窒素、アルゴンおよびヘリウムが挙げられる。当該技術において既知の、ヘモグロビンの溶液を脱酸素化するための他の手段を使用してＨｂ溶出物を脱酸素化できることがわかっている。そのような他の手段は、例えばＨｂ溶出物の窒素スパージング、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、システイン、亜ジチオン酸ナトリウムまたはアスコルビン酸ナトリウムのような還元剤による化学的除去、あるいは光による光分解を含みうる。
【００６３】
クロマトグラフィーカラムからの溶出後、好ましくはＨｂ溶出物を濃縮して工程の効率を高める。Ｈｂ溶出物を限外濾過器を通して再循環させてＨｂ溶出物を濃縮し、濃縮Ｈｂ溶液を形成する。好適な限外濾過器には、例えば３０，０００ダルトンまたはそれより小さい限外濾過器（例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｈｅｌｉｃｏｎ，Ｃａｔ  ＃ＣＤＵＦ０５０Ｇ１またはＡｍｉｃｏｎ  Ｃａｔ  ＃５４０４３０）が含まれる。典型的には、Ｈｂの濃度が約１００〜約１２０ｇ／ｌになったとき、Ｈｂ溶出物の濃縮を終了する。Ｈｂ溶出物を濃縮する間、好ましくはＨｂ溶出物の温度を約８〜１２℃に保持する。
【００６４】
次に、好ましくは濃縮されたＨｂ溶液に緩衝液を加えてＨｂ溶液のイオン強度を調整し、Ｈｂの脱酸素化を強化する。イオン強度を約１５０ｍｅｑ／ｌ〜約２００ｍｅｑ／ｌに調整して、Ｈｂ溶液中のＨｂの酸素親和性を低下させることが好ましい。適当な緩衝液は、Ｈｂタンパク質の有意な変性を生じないが、Ｈｂの脱酸素化を促進するうえで十分に高いイオン強度を有するｐＨの緩衝液を含む。適当な緩衝液としては、例えば、約６．５〜約８．９のｐＨ範囲を有する生理食塩水が挙げられる。好ましい緩衝液は、ｐＨ約８．９の１．０Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス水溶液である。
【００６５】
好ましくは、得られた緩衝Ｈｂ溶液を次いで限外濾過器を通して再循環させ、再びＨｂ溶液を濃縮して工程の効率を高める。好ましい態様では、Ｈｂの濃度が約１００ｇ／ｌ〜約１２０ｇ／ｌになったとき、濃縮を終了する。
【００６６】
脱酸素化の間、適当な相間移動膜を通してＨｂ溶液を循環させる。適切な相間移動膜には、例えば０．０５μｍポリプロピレン中空ファイバーマイクロフィルター（例えばＨｏｅｃｈｓｔ−Ｃｅｌａｎｅｓｅ  Ｃａｔ  ＃  ５ＰＣＭ−１０７）が含まれる。同時に、相間移動膜を越えて不活性ガスの向流を通過させる。適当な不活性ガスとしては、例えば、窒素、アルゴン、ヘリウムなどが挙げられる。相間移動膜を越えたガス交換によりＨｂ溶液から酸素を取り除く。
【００６７】
Ｈｂ溶液中の酸化Ｈｂ（オキシヘモグロビンまたはＨｂＯ2 ）含有量が約２０％またはそれより小さいレベルにＨｂ溶液のｐＯ2 が低下するまで、脱酸素化を続ける。好ましい態様では、Ｈｂ溶液中のＨｂＯ2 含有量は約１０％またはそれより小さい。
【００６８】
脱酸素化の間、Ｈｂ溶液の温度を、典型的にはメトヘモグロビン形成の速度に対して脱酸素化の速度を釣り合わせるレベルに保持する。メトヘモグロビン含有量を２０％未満に制限するように温度を保持する。さらにＨｂ溶液の脱酸素化しながら、至適温度によって約５％未満のメトヘモグロビン含有量、好ましくは約２．５％未満のメトヘモグロビン含有量を生じさせる。典型的には、脱酸素化の間、Ｈｂ溶液の温度を約１９℃〜約３１℃に保持する。
【００６９】
脱酸素化の間、そしてその後本発明の方法の残りの段階を通して、Ｈｂを低酸素環境に保持してＨｂによる酸素吸収を最小限に抑え、約２０％未満、好ましくは約１０％未満のＨｂＯ2 含有量を保持する。
【００７０】
次に脱酸素化されたＨｂを、好ましくは、スルフヒドリル化合物を含む低酸素含有量保存緩衝液で平衡させ、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを形成する。適当なスルフヒドリル化合物には、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、Ｄ，Ｌ−システイン、γ−グルタミル−システイン、グルタチオン、２，３−ジメルカプト−１−プロパノール、１，４−ブタンジチオール、チオグリコレート、および他の生体適合性スルフヒドリル化合物のような非毒性還元剤が含まれる。低酸素含有量保存緩衝液の酸素含有量は、緩衝液中のスルフヒドリル化合物の濃度を有意に低下させず、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂ中のオキシヘモグロビン含有量を約２０％またはそれより低い、好ましくは約１０％未満に制限するのに十分な低さでなければならない。典型的には、保存緩衝液は約５０トル未満のｐＯ2 を有する。
【００７１】
好ましい態様では、保存緩衝液は、Ｈｂ重合とメトヘモグロビン形成を相殺するために適当なｐＨ、典型的には約７．６〜約７．９のｐＨを有していなければならない。
【００７２】
ｄｅｏｘｙ−Ｈｂと混合するスルフヒドリル化合物の量は、重合の際にＨｂの分子内架橋を高めるのに十分多く、且つ高いイオン強度によってＨｂ分子の分子間架橋を有意に低下させることがない十分少ない量である。典型的には、約０．２５モル〜約５モルのｄｅｏｘｙ−Ｈｂを酸化に対して安定化するために約１モルのスルフヒドリル官能基（−ＳＨ）が必要である。
【００７３】
好ましい態様では、保存緩衝液は約２５〜３５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液  （ｐＨ７．７〜７．８）を含み、さらに酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂ中のＮＡＣ濃度が約０．００３重量％〜約０．３重量％であるような量のＮＡＣを含む。より好ましくは、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂ中のＮＡＣ濃度は約０．０５重量％〜約０．２重量％である。
【００７４】
好ましくは、ｄｅｏｘｙ−Ｈｂと混合する前に、１０，０００ダルトンの限外濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｈｅｌｉｃｏｎ  Ｃａｔ  ＃ＣＤＵＦ０５０Ｇ１またはＡ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｍａｘｃｅｌｌ  Ｃａｔ  ＃ＵＦＰ−１０−Ｃ−７５）などを通して、保存緩衝液を濾過する。
【００７５】
１つの態様では、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを次いで任意のフィルターに通過させる。適当なフィルターには、０．２μｍポリプロピレンプレフィルターおよび０．５μｍ滅菌マイクロフィルター（Ｐａｌｌ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  ＩＩ，Ｃａｔ  ＃ＡＢＩＹ００５Ｚ７またはＧｅｌｍａｎ  Ｓｕｐｏｒ）が含まれる。ｄｅｏｘｙ−Ｈｂを実質的に酸素不含の大気下に保持する。これは、例えば工程の装置を酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂの充填前および充填後に窒素のような不活性ガスで清掃し、おおうことによって実現できる。
【００７６】
任意に、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを重合に移す前に、適切な量の水を重合反応器に加える。１つの態様では、水の適切な量は、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを重合反応器に加えるとき約１０〜約１００ｇ／ｌ  Ｈｂの濃度の溶液を生じる量である。好ましくは水は酸素除去されている。
【００７７】
重合工程で水のｐＯ2 を、ＨｂＯ2 含有量を約２０％に制限するのに十分なレベル、典型的には約５０トル未満に低下したあと、重合反応器を窒素のような不活性ガスでおおう。その後、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを重合反応器に移し、同時にそれを適切な流量の不活性ガスでおおう。
【００７８】
重合反応器中の酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂ溶液の温度を、架橋剤と接触したとき酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂの重合を至適にする温度まで上昇させる。典型的には、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂの温度は重合の間を通じて約２５℃〜約４５℃、好ましくは約４１℃〜約４３℃である。重合反応器を加熱するための許容される熱伝達手段の例は、ジャケットを通して高温のエチレングリコールを適用することによって加熱する、ジャケット式加熱系である。
【００７９】
次に酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを、約２時間〜約６時間にわたって酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを重合させるのに十分な温度で適当な架橋剤に曝し、重合ヘモグロビン（ポリ（Ｈｂ））の溶液を形成する。
【００８０】
好適な架橋剤としては、例えば、特に、グルタルアルデヒド、スクシンジアルデヒド、活性形態のポリオキシエチレンおよびデキストランのようなＨｂタンパク質を架橋結合する多官能性薬剤、グリコールアルデヒドのようなα−ヒドロキシアルデヒド、Ｎ−マレイミド−６−アミノカプロイル−（２’  −ニトロ，４’  −スルホン酸）−フェニルエステル、ｍ−マレイミド安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシニミドエステル、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、スクシンイミジル    ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、スルホスクシンイミジル    ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド、Ｎ，Ｎ’  −フェニレンジマレイミド、ならびにビス−イミデート類、アシルジアジド類またはアリール二ハロゲン化物類に属する化合物などが挙げられる。
【００８１】
架橋剤の好適な量は、分子内架橋がＨｂを安定化し、また分子間架橋がＨｂのポリマーを形成して、それによって血管内貯留を高めることができる量である。典型的には、架橋剤の好適な量は、架橋剤対Ｈｂのモル比が約２：１を超える量である。好ましくは架橋剤対Ｈｂのモル比は約２０：１〜４０：１である。
【００８２】
好ましくは、重合は、約３５ミリモル未満またはそれと等しい塩化物濃度を有し、ｐＨが約７．６〜約７．９である緩衝液中で実施する。
【００８３】
好ましい態様では、適当な量の架橋剤を酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂに加え、それを次いで低い剪断で混合するための手段によって混合する。好適な低剪断混合手段にはスタティックミキサーが含まれる。好適なスタティックミキサーは、例えばＣｈｅｍｉｎｅｅｒ，Ｉｎｃ．から入手される「Ｋｅｎｉｃｓ」スタティックミキサーである。
【００８４】
１つの態様では、スタティックミキサーを通して酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂと架橋剤を再循環させると、架橋剤と酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂの概して均一な混合を伴う乱流状態を生じ、それにより高濃度の架橋剤を含むｄｅｏｘｙ−Ｈｂのポケットを形成する潜在的可能性を低下させる。架橋剤とｄｅｏｘｙ−Ｈｂの概して均一な混合は、高分子量のＨｂポリマー、すなわち５００，０００ダルトンより大きい重量のポリマーの形成を低減し、同時に重合の際に架橋剤とｄｅｏｘｙ−Ｈｂのより速やかな混合を可能にする。さらに、スルフヒドリル化合物、好ましくはＮＡＣの存在により、Ｈｂ重合の間に有意のＨｂ分子内架橋が生じる。スルフヒドリル化合物とグルタルアルデヒドおよび／またはＨｂの相互作用の正確な機序は不明であるが、スルフヒドリル化合物は、高分子量Ｈｂポリマーの形成を少なくとも部分的に阻害し、安定化された四量体Ｈｂを選択的に形成するようにＨｂ／架橋剤の化学結合に影響を及ぼすと考えられる。
【００８５】
ポリ（Ｈｂ）は、ポリ（Ｈｂ）においてＨｂ分子の実質的な部分（例えば少なくとも約５０％）が化学結合しており、約１５％未満のような小量だけが高分子量の重合ヘモグロビン鎖内に含まれる場合、有意の分子内架橋を有すると定義される。高分子量のポリ（Ｈｂ）分子は、例えば約５００，０００ダルトンを超える分子量を有する分子である。
【００８６】
好ましい態様では、グルタルアルデヒドを架橋剤として使用する。典型的には、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂ１キログラムにつき約１０〜約７０グラムのグルタルアルデヒドを使用する。より好ましくは、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂ１キログラムにつき約２９〜３１グラムのグルタルアルデヒドが添加されるまで、５時間かけてグルタルアルデヒドを加える。
【００８７】
重合後、重合反応器中のポリ（Ｈｂ）溶液の温度を典型的には約１５℃〜約２５℃に低下させる。
【００８８】
使用する架橋剤がアルデヒドでない場合には、形成されるポリ（Ｈｂ）は一般に安定なポリ（Ｈｂ）である。使用する架橋剤がアルデヒドである場合には、形成されるポリ（Ｈｂ）は、適当な還元剤と混合してポリ（Ｈｂ）中のあまり安定でない結合を低減し、より安定な結合を形成するまでは一般に安定でない。適当な還元剤としては、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）、亜ジチオン酸ナトリウム、トリメチルアミン、ｔ−ブチルアミン、モルホリンボラン、ピリジンボランなどが挙げられる。還元剤を加える前に、任意にポリ（Ｈｂ）溶液の濃度が約７５〜約８５ｇ／ｌに上昇するまで、限外濾過によってポリ（Ｈｂ）溶液を濃縮する。好適な限外濾過器の例は、３０，０００ダルトンフィルター（例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｈｅｌｉｃｏｎ，Ｃａｔ  ＃ＣＤＵＦ０５０ＬＴおよびＡｍｉｃｏｎ，Ｃａｔ  ＃５４０４３０）である。
【００８９】
次に、還元剤を保存するため、およびその後の還元の際にＨｂを変性させることがある水素ガスの発生を防ぐために、ポリ（Ｈｂ）溶液のｐＨをアルカリｐＨの範囲に調整する。１つの態様では、ｐＨを１０より大きく調整する。重合の間または重合後にポリ（Ｈｂ）溶液に緩衝液を加えることによってｐＨを調整することができる。ポリ（Ｈｂ）内は、典型的には精製して非重合ヘモグロビンを除去する。これは、透析濾過（ｄｉａｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって実施できる（例えば、米国特許第５，６９１，４５３号参照）。
【００９０】
ｐＨの調整後、典型的には脱酸素化ループを通して少なくとも１つの還元剤、好ましくは水素化ホウ素ナトリウム溶液を重合工程に加える。典型的には、ポリ（Ｈｂ）のＨｂ四量体１モルにつき（６４，０００ダルトンのＨｂにつき）約５〜約１８モルの還元剤を加える。好ましい態様では、重合サブシステム９８においてポリ（Ｈｂ）溶液９リットルごとに０．２５Ｍ水素化ホウ素ナトリウム溶液１リットルを０．１〜０．１２ｌｐｍの速度で加える。
【００９１】
その後、安定なポリ（Ｈｂ）を適当なｐＨと生理的電解質レベルを有する透析濾過液で透析濾過することにより、安定なポリ（Ｈｂ）のｐＨと電解質を生理的レベルに回復させて、安定な重合ヘモグロビン代用血液を形成することができる。好ましくは、透析濾過液は緩衝液である。
【００９２】
ポリ（Ｈｂ）を還元剤で還元した場合、透析濾過液は酸性ｐＨ、好ましくは約４〜約６のｐＨを有する。
【００９３】
また、最終的な重合ヘモグロビン代用血液の安定性を高めるための酸素捕捉剤として非毒性スルフヒドリル化合物を安定なポリ（Ｈｂ）溶液に加えることができる。スルフヒドリル化合物は、透析濾過液の一部としておよび／または別途に加えることができる。保存期間中、酸素を捕捉してメトヘモグロビン含有量を約１５％未満に保持するスルフヒドリル濃度を確立する量のスルフヒドリル化合物を加える。好ましくは、スルフヒドリル化合物はＮＡＣである。典型的には、加えるスルフヒドリル化合物の量は、約０．０５重量％〜約０．２重量％のスルフヒドリル濃度を確立するのに十分な量である。
【００９４】
好ましい態様では、重合反応器および残りの輸送装置において不活性な実質的に酸素不含の大気で圧を保持しながら、無菌取扱い条件下で代用血液を包装する。
【００９５】
本発明の方法によって形成される適当な安定な重合ヘモグロビン代用血液に関する規格を表Ｉに提供する。
【００９６】
【表１】
0004674358.tif 000002
【００９７】
その後安定な代用血液を、上記で詳述したような低酸素環境を有する、短期保存容器または滅菌保存容器中で保存する。保存容器はまた、保存期間中の蒸発による代用血液の有意の濃縮を防ぐために、水蒸気通過に対して十分に不透過性でなければならない。代用血液の有意の濃縮とは、代用血液の１またはそれ以上のパラメータが規格から逸脱して高くなる濃縮である。
【００９８】
本発明の方法に従って形成される安定な重合ヘモグロビン代用血液の合成は、さらに米国特許第５，２９６，４６５号明細書に述べられている。
【００９９】
本発明の方法によって形成される代用血液を受容することができる脊椎動物としては、ヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、ラット、ウマまたはヒツジなどの哺乳動物が挙げられる。さらに、当該代用血液を受容することができる脊椎動物としては、胎児（出生前脊椎動物）、出生後脊椎動物、出生時の脊椎動物などが挙げられる。
【０１００】
本発明の代用血液は、１以上の注入法により、代用血液を直接および／または間接的に脊椎動物の循環系に注入することによって循環系に投与することができる。直接注入法としては、例えば、静脈内および動脈内注射のような血管内注射、ならびに心臓内注射などが挙げられる。間接注入法としては、例えば、腹腔内注射、代用血液がリンパ系によって循環系に輸送される皮下注射、トロカールまたはカテーテルによる骨髄への注射などが挙げられる。好ましくは、代用血液を静脈内投与する。
【０１０１】
治療する脊椎動物は、代用血液の注入の前、注入中、および／または注入後に正常血液量、血液量過多あるいは血液量減少でありうる。代用血液は、トップローディングのような方法および交換法によって循環系に投与することができる。
【０１０２】
代用血液は、循環系の一部または全体を通じてのＲＢＣ流の低下、貧血およびショックを含めた多くの異なる原因から生じる脊椎動物内の酸素欠乏組織を処置するために治療的に投与することができる。さらに代用血液は、脊椎動物の組織への、あるいは脊椎動物の循環系全体でのＲＢＣ流の起こりうるまたは予想される低下から生じうる、脊椎動物内の組織の酸素枯渇を防ぐために予防的に投与することができる。さらに、１９９５年３月２３日に提出された同時係属の米国特許出願番号第０８／４０９，３３７号、現在は米国特許第５，８５４，２０９号に、特に部分的動脈閉塞由来または微小循環における部分的遮断由来の低酸素症を処置するために治療的または予防的にヘモグロビンを投与すること、ならびにその場合に使用する用量を記述している。
【０１０３】
典型的には、代用血液の好適な用量または用量の組合せは、血漿中に入ったとき、脊椎動物の血液中で約０．１〜約１０グラムＨｂ／ｄｌ、あるいは大量の血液喪失を補うために必要であればそれ以上の総ヘモグロビン濃度を生じる量である。
【０１０４】
下記の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【０１０５】
実施例１
安定な重合Ｈｂ代用血液の合成
米国特許第５，２９６，４６５号明細書に述べられているように、ウシ全血のサンプルを採集し、クエン酸ナトリウム抗凝固薬と混合して血液溶液を形成した。
【０１０６】
各々の血液溶液サンプルは採集後約２℃の温度に保持し、次いで、６００メッシュスクリーンで漉して大きな凝集物と粒子を除去した。
【０１０７】
プールする前に、血液溶液中のペニシリンレベルが＜０．００８単位／ｍｌであることを確認するため、「乳中のペニシリンの迅速検出（”Ｒａｐｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｉｎ  Ｍｉｌｋ”）」と題する方法を用いる、ミシガン州デトロイトのＤｉｆｃｏ社から購入したアッセイキットで各血液溶液サンプル中のペニシリンレベルを測定した。
【０１０８】
その後血液溶液サンプルをプールし、脱発熱原性化した（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅｄ）クエン酸ナトリウム水溶液と混合して、ウシ全血中０．２重量％クエン酸ナトリウム溶液（以下「０．２％クエン酸ナトリウム血液溶液」）を形成した。
【０１０９】
次に０．２％クエン酸ナトリウム血液溶液を連続的に８００μｍと５０μｍのポリプロピレンフィルターに通して、直径約５０μｍまたはそれより大きい大きな血液溶液デブリを除去した。
【０１１０】
次いでＲＢＣを洗浄して、ＢＳＡあるいはＩｇＧのような細胞外血漿タンパク質をＲＢＣから分離した。血液溶液に含まれるＲＢＣを洗浄するために、最初に透析濾過タンク中の血液溶液の容量を、等容量の濾過等張液を透析濾過タンクに加えることによって希釈した。等張液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｃａｔ  ＃ＣＤＵＦ  ０５０  Ｇ１）１０，０００ダルトン限外濾過膜で濾過した。等張液は、注射用蒸留水（ＷＦＩ）中６．０ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム二水和物および８．０ｇ／ｌ塩化ナトリウムを含有した。
【０１１１】
その後、希釈した血液溶液を、０．２μｍ中空ファイバー（Ｍｉｃｒｏｇｏｎ  Ｋｒｏｓｆｌｏ  ＩＩマイクロフィルトレーションカートリッジ）ダイアフィルターを通して透析濾過することにより、もとの容量まで濃縮した。同時に、０．２μｍダイアフィルターによる濾液損失の割合に等しい割合で、相殺として濾過等張液を継続的に加えた。透析濾過の間に、直径がＲＢＣより有意に小さかった、または血漿のような液体である希釈血液溶液の成分は、濾液と共に０．２μｍダイアフィルターの壁を通過した。ＲＢＣ、血小板、および白血球のような希釈血液溶液のより大きな物質は、継続的に添加する等張液と共に保持され、透析された血液溶液を形成した。
【０１１２】
ＲＢＣ洗浄の間、希釈血液溶液を約１０〜２５℃の温度に保持し、ダイアフィルターの入口での流体圧を約２５ｐｓｉ〜約３０ｐｓｉにして工程の効率を高めた。
【０１１３】
ダイアフィルターから排出される濾液の容量が濾過等張液で希釈する前の血液溶液の容量の約６００％に等しくなったとき、ＲＢＣ洗浄を終了した。
【０１１４】
次に透析した血液溶液を、＃２８リングダムを取り付けたＳｈａｒｐｌｅｓ  Ｓｕｐｅｒ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、Ｍｏｄｅｌ＃ＡＳ−１６型に約４ｌｐｍの速度で継続的にポンプで送り込んだ。同時に透析血液溶液を供給しながら遠心分離操作を実施し、白血球および血小板からＲＢＣを分離した。操作中、ＲＢＣを重いＲＢＣ相に分離し、同時に白血球（ＷＢＣ）と血小板の大部分を軽いＷＢＣ相に分離するのに十分な速度、具体的には約１５，０００ｒｐｍで遠心分離機を回転させた。操作の間、ＲＢＣ相とＷＢＣ相の分画を別々に且つ継続的に遠心分離機から排出した。
【０１１５】
ＲＢＣの分離後、ＲＢＣを溶解してヘモグロビン含有溶液を形成した。ＲＢＣを遠心分離機から排出しながら、ＲＢＣの実質的な部分を機械的に溶解した。ＲＢＣの細胞膜を、遠心分離機からのＲＢＣ相の流出に対し角度を為してＲＢＣ相排出ラインの壁に衝突させて破壊し、それによりＲＢＣからのヘモグロビン（Ｈｂ）をＲＢＣ相に放出した。
【０１１６】
次に溶解したＲＢＣ相をＲＢＣ相排出ラインを通してスタティックミキサー（６エレメントのＫｅｎｉｃｓ  １／２インチ、Ｃｈｅｍｉｎｅｅｒ，Ｉｎｃ．）に流入した。ＲＢＣ相のスタティックミキサーへの移動と同時に、等量のＷＦＩもスタティックミキサーに注入して、ＷＦＩをＲＢＣ相と混合した。ＲＢＣ相とＷＦＩのスタティックミキサーへの流速は、それぞれ約０．２５ｌｐｍである。
【０１１７】
スタティックミキサーにおいてＲＢＣ相とＷＦＩを混合すると、溶解ＲＢＣコロイドが生じた。次いで、溶解ＲＢＣコロイドをスタティックミキサーから、Ｈｂを非ヘモグロビンＲＢＣ成分から分離するのに適したＳｈａｒｐｌｅｓ  Ｓｕｐｅｒ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｍｏｄｅｌ＃ＡＳ−１６型、Ｓｈａｒｐｌｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｆａ−Ｌａｖａｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）に移した。溶解ＲＢＣコロイドを軽いＨｂ相と重相に分離するのに十分な速度で遠心分離機を回転させた。軽相はＨｂを含み、またＨｂの密度にほぼ等しいかまたはそれより小さい密度を有する非ヘモグロビン成分も含んだ。
【０１１８】
０．４５μｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ，Ｃａｔ  ＃ＨＶＬＰ  ０００  Ｃ５マイクロフィルターを通して、Ｈｂ相を遠心分離機からＨｂ精製に備えて保持タンクに連続的に排出した。次いで、細胞支質を保持物質とともにマイクロフィルターから保持タンクに戻した。マイクロフィルトレーションの間、保持タンク内の温度を１０℃またはそれ以下に保持した。効率を高めるため、マイクロフィルター入口の流体圧が約１０ｐｓｉの初期圧から約２５ｐｓｉに上昇したとき、マイクロフィルトレーションを終了した。その後Ｈｂマイクロフィルトレートをマイクロフィルターからマイクロフィルトレートタンクに移した。
【０１１９】
その後、Ｈｂマイクロフィルトレートをポンプで１００，０００Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ  ＃ＣＤＵＦ  ０５０  Ｈ１限外濾過器に通した。Ｈｂマイクロフィルトレートに含まれるＨｂと水の実質的な部分が１００，０００ダルトンの限外濾過器を透過してＨｂ限外濾液を形成し、一方分子量が約１００，０００ダルトンを超えるタンパク質のような大きな細胞デブリは保持され、マイクロフィルトレートタンク内に再循環された。同時に、限外濾液中の失われた水を補うためにＷＦＩを継続的にマイクロフィルトレートタンクに加えた。一般に細胞デブリは、Ｈｂ、より小さな細胞タンパク質、電解質、補酵素および有機代謝中間体を除く、すべての完全なおよび断片化した細胞成分を含む。マイクロフィルトレートタンク中のＨｂ濃度が８グラム／リットル（ｇ／ｌ）未満になるまで限外濾過を継続した。Ｈｂを限外濾過する間、マイクロフィルトレートタンクの内部温度を約１０℃に保持した。
【０１２０】
Ｈｂ限外濾液を限外濾液タンクに移し、次いで３０，０００ダルトンのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ  ＃ＣＤＵＦ  ０５０  Ｔ１限外濾過器を通してＨｂ限外濾液を再循環させて、電解質、補酵素、代謝中間体および分子量約３０，０００ダルトン未満のタンパク質などのより小さな細胞成分と、Ｈｂ限外濾液からの水を除去し、それによって約１００ｇ  Ｈｂ／ｌを含む濃縮Ｈｂ溶液を生成した。
【０１２１】
次に濃縮Ｈｂ溶液を限外濾液タンクから、平行するクロマトグラフィーカラム（長さ２フィート、内径８インチ）に含まれる担体に移して、高性能液体クロマトグラフィーによってＨｂを分離した。クロマトグラフィーカラムは、非ヘモグロビンタンパク質からＨｂを分離するのに適した陰イオン交換担体を含んだ。陰イオン交換担体はシリカゲルから形成された。シリカゲルをγ−グリシドキシプロピルシランに接触させて活性エポキシド基を形成し、さらにＣ3 Ｈ7 （ＣＨ3 ）2 ＮＣｌに接触させて第四アンモニウム陰イオン交換担体を形成した。シリカゲルを処理するこの方法は、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１２０：３２１−３３３（１９７６）に述べられている。
【０１２２】
Ｈｂ結合を促進する第一緩衝液でクロマトグラフィーカラムを洗い流して、各々のカラムを前処理した。次に濃縮Ｈｂ溶液４．５２リットルを各クロマトグラフィーカラムに注入した。濃縮Ｈｂ溶液の注入後、クロマトグラフィーカラムに３種の異なる緩衝液を連続的に通過させてクロマトグラフィーカラムを洗浄し、カラム内にｐＨグラジェントを作製することによりＨｂ溶出物を調製した。使用時の各緩衝液の温度は約１２．４℃であった。クロマトグラフィーカラムに注入する前に、緩衝液を１０，０００ダルトン限外濾過膜に通して前濾過した。
【０１２３】
第一緩衝液である２０ｍＭトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）（ｐＨ約８．４から約９．４）は、濃縮Ｈｂ溶液をクロマトグラフィーカラムの媒体（medium）中に運搬し、Ｈｂを結合させた。第一緩衝液と第三緩衝液との混合物であり、約８．３のｐＨを有する第二緩衝液でクロマトグラフィーカラム内のｐＨを調整し、Ｈｂを保持しながら、夾雑する非ヘモグロビン成分をクロマトグラフィーカラムから溶出した。カラム当り約３．５６ｌｐｍの流速で約３０分間、第二緩衝液での平衡化を継続した。第二緩衝液からの溶出物は廃棄した。次いで、第三緩衝液の５０ｍＭトリス（ｐＨ約６．５から約７．５）で、クロマトグラフィーカラムからＨｂを溶出した。
【０１２４】
次に滅菌０．２２μ  Ｓａｒｔｏｂｒａｎ  Ｃａｔ  ＃５２３２５０７  Ｇ１ＰＨフィルターを通してＨｂ溶出物をタンクに導入し、そこにＨｂ溶出物を集めた。Ｈｂ溶出物の最初の３〜４％とＨｂ溶出物の最後の３〜４％は廃棄した。
【０１２５】
溶出物が０．０５ＥＵ／ｍｌ未満のエンドトキシンを含み、３．３ｎｍｏｌ／ｍｌ未満のリン脂質を含む場合には、Ｈｂ溶出物をさらに使用した。１００ｇ  Ｈｂ／ｌの濃度を有する超高純度の溶出物６０リットルに、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．９）緩衝液９ｌを加えて１６０ｍＭのイオン強度を有するＨｂ溶液を形成し、Ｈｂ溶液中のＨｂの酸素親和性を低下させた。その後限外濾過器、具体的には１０，０００ダルトンのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｈｅｌｉｃｏｎ，Ｃａｔ  ＃ＣＤＵＦ０５０Ｇ１フィルターを通して再循環させることにより、Ｈｂ濃度が１１０ｇ／ｌになるまでＨｂ溶液を１０℃で濃縮した。
【０１２６】
次に、０．０５μｍ  Ｈｏｅｃｈｓｔ−Ｃｅｌａｎｅｓｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｃａｔ  ＃Ｇ−２４０／４０）のポリプロピレンマイクロフィルター相転移膜を通して１２ｌｐｍでＨｂ溶液を再循環させることにより、Ｈｂ溶液のｐＯ2 が、ＨｂＯ2 含有量が約１０％であるレベルに低下するまでＨｂ溶液を脱酸素化し、脱酸素化Ｈｂ溶液（以下「ｄｅｏｘｙ−Ｈｂ」）を生成した。同時に相転移膜の反対側を通して６０ｌｐｍ流量の窒素ガスを適用した。脱酸素化の間、Ｈｂ溶液の温度を約１９℃〜約３１℃に保持した。
【０１２７】
また、脱酸素化の間およびその後の工程全体を通して、Ｈｂを低酸素環境に保持してＨｂによる酸素吸収を最小限に抑え、ｄｅｏｘｙ−Ｈｂ中の酸化Ｈｂ（オキシヘモグロビンまたはＨｂＯ2 ）含有量を約１０％未満に保った。
【０１２８】
次に、０．２重量％のＮ−アセチルシステイン、５０ｔｏｒｒ未満のｐＯ2 を有する３３ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を含む保存緩衝液１８０ｌにより、限外濾過器を通してｄｅｏｘｙ−Ｈｂ  ６０ｌを透析濾過し、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを生成した。ｄｅｏｘｙ−Ｈｂと混合する前に、保存緩衝液を１０，０００ダルトンのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｈｅｌｉｃｏｎ，Ｃａｔ  ＃ＣＤＵＦ０５０Ｇ１脱発熱原性フィルターで脱発熱原性化した。
【０１２９】
限外濾過器を通しての液体損失にほぼ等しい割合で保存緩衝液を継続的に加えた。限外濾過器での透析濾過を通して失われた液体の容量がｄｅｏｘｙ−Ｈｂの初期容量の約３倍になるまで透析濾過を継続した。
【０１３０】
酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを重合装置に移す前に、酸素除去ＷＦＩを重合反応器に加えて、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂの酸化を防ぐために重合装置から酸素を一掃した。重合装置に加えたＷＦＩの量は、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを重合反応器に加えたとき、約４０ｇ  Ｈｂ／ｌの濃度を有するＨｂ溶液を生じる量であった。その後重合装置全体を通してＷＦＩを再循環させ、０．０５μｍポリプロピレンマイクロフィルター相転移膜（Ｈｏｅｃｈｓｔ−Ｃｅｌａｎｅｓｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｃａｔ  ＃５ＰＣＭ−１０８、８０平方フィート）を通して加圧窒素の向流に対して流すことによりＷＦＩを脱酸素化した。相転移膜を通るＷＦＩと窒素ガスの流速は、それぞれ約１８〜２０ｌｐｍと４０〜６０ｌｐｍであった。
【０１３１】
重合装置中のＷＦＩのｐＯ2 を約２ｔｏｒｒ  ｐＯ2 未満に低下させたあと、約２０ｌｐｍの窒素を重合装置の上方空隙に流入して重合反応器を窒素でおおった。その後酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを重合反応器に移した。
【０１３２】
約３５ミリモル濃度またはそれ以下の塩化物濃度を有するｐＨ７．８の１２ｍＭリン酸緩衝液において重合を実施した。
【０１３３】
その後、Ｈｂ溶液を４０℃に加熱し、６エレメントのＫｅｎｉｃｓ  １−１／インチスタティックミキサー（Ｃｈｅｍｉｎｅｅｒ，Ｉｎｃ．）を通して再循環させながら、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−ＨｂとＮ−アセチルシステインを架橋剤であるグルタルアルデヒドと５時間にわたってゆっくり混合し、具体的にはＨｂ１キログラムにつきグルタルアルデヒド２９．４グラムと混合して、重合Ｈｂ（ポリ（Ｈｂ））溶液を生成した。
【０１３４】
酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂとグルタルアルデヒドをスタティックミキサーを通して再循環させることにより、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂとグルタルアルデヒドの概して均一な混合を伴う乱流条件を生じさせ、それによって高濃度のグルタルアルデヒドを含むｄｅｏｘｙ−Ｈｂのポケットが形成される潜在的可能性を低下させた。グルタルアルデヒドとｄｅｏｘｙ−Ｈｂの概して均一な混合は、高分子量のポリ（Ｈｂ）（５００，０００ダルトンを超える分子量を有する）の形成を低減し、同時に重合の際にグルタルアルデヒドとｄｅｏｘｙ−Ｈｂのより速やかな混合を可能にした。
【０１３５】
さらに、Ｈｂの重合の際にＮ−アセチルシステインが存在することの結果として、Ｈｂ重合の間にかなりのＨｂ分子内架橋が生じた。
【０１３６】
重合後、重合反応器中のポリ（Ｈｂ）溶液の温度を約１５℃から約２５℃の温度に低下した。
【０１３７】
次に、ポリ（Ｈｂ）の濃度が約８５ｇ／ｌに上昇するまで限外濾過器を通してポリ（Ｈｂ）溶液を再循環させることにより、ポリ（Ｈｂ）溶液を濃縮した。適切な限外濾過器は、３０，０００ダルトンフィルター（例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｈｅｌｉｃｏｎ，Ｃａｔ  ＃ＣＤＵＦ０５０ＬＴ）である。
【０１３８】
その後、ポリ（Ｈｂ）溶液を水素化ホウ素ナトリウム６６．７５ｇと混合して再びスタティックミキサーで再循環させた。具体的には、ポリ（Ｈｂ）溶液９リットルごとに、０．２５Ｍ水素化ホウ素ナトリウム溶液１リットルを０．１から０．１２ｌｐｍの速度で加えた。
【０１３９】
ポリ（Ｈｂ）溶液に水素化ホウ素ナトリウムを加える前に、水素化ホウ素ナトリウムを保存し、水素ガスの発生を防ぐために、ｐＨを約ｐＨ１０に調整することによってポリ（Ｈｂ）溶液のｐＨを塩基性にした。ポリ（Ｈｂ）溶液のｐＨは、約１０．４から約１０．６のｐＨを有する、脱発熱原性化し、脱酸素化した１２ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液約２１５ｌでポリ（Ｈｂ）溶液を透析濾過することによって調整した。ポリ（Ｈｂ）溶液を３０ｋＤ限外濾過器を通して重合反応器から再循環させることにより、ポリ（Ｈｂ）溶液を透析濾過した。透析濾過による限外濾過器を通しての液体損失の割合にほぼ等しい割合で、ホウ酸ナトリウム緩衝液をポリ（Ｈｂ）溶液に加えた。透析濾過により限外濾過器を通して失われた液体の容量が重合反応器中のポリ（Ｈｂ）溶液の初期容量の約３倍になるまで透析濾過を継続した。
【０１４０】
ｐＨ調整後、水素化ホウ素ナトリウム溶液を重合反応器に加え、ポリ（Ｈｂ）溶液中の結合を結合に還元して、溶液中に安定なポリ（Ｈｂ）を生成した。水素化ホウ素ナトリウムを添加する間、重合反応器中のポリ（Ｈｂ）溶液をスタティックミキサーと０．０５μｍポリプロピレンマイクロフィルター相転移膜を通して継続的に再循環させ、溶解した酸素および水素を除去した。スタティックミキサーを通して流すことはまた、水素化ホウ素ナトリウムとポリ（Ｈｂ）溶液を速やかに且つ有効に混合する水素化ホウ素ナトリウム乱流条件を提供した。０．０５μｍ相転移膜を通るポリ（Ｈｂ）溶液と窒素ガスの流速は、それぞれ約２．０〜４．０ｌｐｍと約１２〜１８ｌｐｍであった。水素化ホウ酸ナトリウムの添加が完了したあと、重合反応器において、その中に含まれる撹拌器を約７５回転／分で回転させながら、還元を継続した。
【０１４１】
水素化ホウ素ナトリウムの添加から約１時間後に、安定なポリ（Ｈｂ）溶液の濃度が１１０ｇ／ｌになるまで、３０，０００ダルトンの限外濾過器を通して重合反応器から安定なポリ（Ｈｂ）溶液を再循環させた。濃縮後、ＷＦＩ中２７ｍＭ乳酸ナトリウム、１２ｍＭ  ＮＡＣ、１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌおよび１．３６ｍＭ  ＣａＣｌ2 を含む、濾過して脱酸素化した低ｐＨ緩衝液（ｐＨ５．０）で、３０，０００ダルトンの限外濾過器を通して安定なポリ（Ｈｂ）溶液を透析濾過することにより、安定なポリ（Ｈｂ）溶液のｐＨと電解質を生理的レベルに回復させて、安定な重合Ｈｂ代用血液を生成した。限外濾過器で透析濾過により失われた液体の容量が、濃縮Ｈｂ産物の透析濾過前の容量の約６倍になるまで透析濾過を継続した。
【０１４２】
ｐＨと電解質を生理的レベルに回復させたあと、濾過して脱酸素化した低ｐＨ緩衝液を重合反応器に加えることにより、安定な重合Ｈｂ代用血液を５．０ｇ／ｄｌの濃度に希釈した。次いで、希釈した代用血液を、ＷＦＩ中２７ｍＭ乳酸ナトリウム、１２ｍＭ  ＮＡＣ、１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌおよび１．３６ｍＭ  ＣａＣｌ2 を含む、濾過して脱酸素化した緩衝液（ｐＨ７．８）に対してスタティックミキサーと１００，０００ダルトンの精製フィルターを通して重合反応器から再循環させることによって透析濾過した。代用血液が、解離条件下で実施したＧＰＣにより約１０％またはそれより少ない改変四量体および非改変四量体種を含むまで、透析濾過を継続した。
【０１４３】
精製フィルターは、制限透過ラインを有する低い膜内外圧の条件下で操作した。実質的な量の改変四量体Ｈｂと非改変四量体Ｈｂを除去したあと、代用血液の濃度が約１３０ｇ／ｌになるまで３０，０００ダルトンの限外濾過器を通して代用血液の再循環を継続した。
【０１４４】
その後、低酸素環境で且つ酸素侵入の少ない適切な容器中で安定な代用血液を保存した。
【０１４５】
実施例３
ヘモグロビン代用血液の保存：一次パッケージ
実施例１で作製したヘモグロビン代用血液を酸素バリア一次パッケージ（Ｅ−１３１３５およびＥ１３２４２、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎ）内にパッケージングした。一次パッケージの構造は、先に詳細に記載している。一次パッケージは、厚み約０．００５インチ（または約１２７μｍ）の積層体材料であり、中密度ポリエチレン／エチレンビニルアルコール層、ナイロン層および線状低密度ポリエチレン密閉層を含む。積層体の酸素透過性は、０．００８４ｃｃ／１００ｉｎ2／気圧−日（２５℃、１００％／５０％ＲＨ）または１．３×１０-3ｃｃ／ｃｍ2／気圧−日（２５℃、１００％／５０％ＲＨ）である。水蒸気透過性は、２５．０ｍｇ／１００ｉｎ2／気圧−日（２５℃、１００％／５０％ＲＨ）（または３．８７ｍｇ／１００ｃｍ2／気圧−日（２５℃、１００％／５０％ＲＨ））である。
【０１４６】
パッケージングされた代用血液を、促進された安定条件下でうわ包装なしで９０日間維持した後、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、ビス−Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ2 ）、総Ｈｂ（ＴＨｂ）、酸化ヘモグロビン（ＨｂＯ2 ）およびメトヘモグロビン（ｍｅｔＨｂ）の濃度および／またはレベルのサンプリングを行なった。促進された安定条件は、４０℃、７５％相対湿度（ＲＨ）である。パッケージング材料の遮断性は、より高い温度および相対湿度で低下するため、このような促進された安定条件は、周囲条件下（２５℃および５０％ＲＨ）に少なくとも１年間で測定された安定性に匹敵する。結果を表ＩＩに示す。
【０１４７】
【表２】
0004674358.tif 000003
【０１４８】
実施例４
重合ヘモグロビンの分析
ヘモグロビン産物中のエンドトキシン濃度を、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｗｏｏｄｓ  Ｈｏｌｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｊ．Ｌｅｖｉｎら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，７５：９０３−９１１（１９７０）によって開発された「速度論的／比濁測定ＬＡＬ５０００法」という方法によって測定する。極微量の支質を調べるために様々な方法、例えば沈降アッセイ、免疫ブロッティング、および当業者に既知の特異的細胞膜タンパク質あるいは糖脂質に関する固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用した。
【０１４９】
「注入液中の微粒子物：単回用量輸注のための大容量注入液」、米国薬局方、２２：１５９６、１９９０の方法によって微粒子数を測定した。
【０１５０】
グルタルアルデヒド濃度を調べるため、ヘモグロビン産物の代表的サンプル４００μｌをジニトロフェニルヒドラジンで誘導体化し、その後誘導体溶液の１００μｌアリコートを、グラジエントに沿って１ｍｌ／分の速度で、２７℃でＹＭＣ  ＡＱ−３０３  ＯＤＳカラムに注入した。グラジエントは２つの移動相、水中０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）およびアセトニトリル中０．０８％ＴＦＡから成った。グラジエントの流れは、一定な６０％のアセトニトリル中０．０８％ＴＦＡを６．０分間、８５％のアセトニトリル中０．０８％ＴＦＡまでのリニアグラジェントを１２分間以上、１００％のアセトニトリル中０．０８％ＴＦＡまでのリニアグラジェントを４分間以上から成り、１００％のアセトニトリル中０．０８％ＴＦＡで２分間保持し、４５％の水中０．１％ＴＦＡで再平衡させた。３６０ｎｍで紫外線検出を測定した。
【０１５１】
ＮＡＣ濃度を調べるため、ヘモグロビン産物のアリコートを脱気したリン酸ナトリウム水溶液で１：１００に希釈し、５０μｌを、グラジエントとともにＹＭＣ  ＡＱ−３０３ＯＤＳカラムに注入した。グラジエント緩衝液は、リン酸ナトリウム水溶液および水中８０％アセトニトリルと０．０５％ＴＦＡの混合物から成った。グラジエントの流れは、１００％の水中リン酸ナトリウムを１５分間、次に１００％の８０％アセトニトリルと０．０５％ＴＦＡ混合物までのリニアグラジエントを５分間以上から成り、５分間保持した。その後系を１００％リン酸ナトリウムで２０分間再平衡させた。
【０１５２】
次の２つの論文に述べられている手順に基づく方法によってリン脂質分析を実施した：Ｋｏｌａｒｏｖｉｃら、「生物学的供給源からリン脂質を分離するための抽出法の比較」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５６：２４４−２５０，１９８６およびＤｕｃｋ−Ｃｈｏｎｇ，Ｃ．Ｇ．、「硝酸マグネシウムによる消化を含む、リン脂質のリンを測定するための速やかで感受性の高い方法」Ｌｉｐｉｄｓ，１４：４９２−４９７，１９７９。
【０１５３】
Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｒｙｏｍａｔｉｃ  Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ，＃３Ｃ２型、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｅｄｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓでの分析により、浸透圧モル濃度を測定した。
【０１５４】
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓのＣｏ−Ｏｘｉｍｅｔｅｒ  ＃４８２型で、総ヘモグロビン、メトヘモグロビンおよびオキシヘモグロビン濃度を測定した。
【０１５５】
Ｎａ+ 、Ｋ+ 、Ｃｌ- 、Ｃａ+ + 、ｐＯ2 濃度は、Ｎｏｖａｓｔａｔ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  ４，Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓによって測定した。
【０１５６】
酸素結合定数Ｐ50は、Ｈｅｍｏｘ−Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＴＣＳ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｏｕｔｈｈａｍｐｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａによって測定した。
【０１５７】
温度とｐＨは、当業者に既知の標準的方法によって測定した。
【０１５８】
解離条件下でヘモグロビン産物に関するゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を実施することにより分子量（Ｍ．Ｗ．）を決定した。ヘモグロビン産物の代表的サンプルを分子量分布に関して分析した。５０ｍＭ  ビス−トリス（ｐＨ６．５）、７５０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡの移動相内でヘモグロビン産物を４ｍｇ／ｍｌに希釈した。この緩衝液は、ポリ（Ｈｂ）からＨｂ四量体を、分子内あるいは分子間架橋を通して他のＨｂ二量体に架橋結合していない二量体に解離するのに役立つ。希釈したサンプルをＴｏｓｏＨａａｓ  Ｇ３０００ＳＷカラムに注入した。流速は０．５ｍｌ／分で、２８０ｎｍで紫外線検出を記録した。
【０１５９】
本発明の方法に従って作製した動物用（ＯＸＹＧＬＯＢＩＮTM）および人体用Ｈｂ代用血液に関する上記の試験の結果をそれぞれ表III とIVに要約する。
【０１６０】
【表３】
0004674358.tif 000004
【０１６１】
【表４】
0004674358.tif 000005
【０１６２】
均等物
当業者は、単なる常套的な実験を使用して、ここで述べた本発明の特定態様の多くの均等物を認識し、確認することができるであろう。これらやその他すべてのそのような均等物は、下記の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。