(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＨＣＲ２４を認識する抗体を含む、がんの診断薬。
【請求項２】
ＤＨＣＲ２４を認識する抗体が、ＤＨＣＲ２４を特異的に認識する抗体である、請求項１に記載の診断薬。
【請求項３】
ＤＨＣＲ２４を認識する抗体が、肝がんを診断することができる抗体である、請求項１に記載のがんの診断薬。
【請求項４】
ＤＨＣＲ２４を認識する抗体が、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入し、該細胞で動物を免疫することを含む抗体作製方法により得ることのできる抗体である、請求項１に記載のがんの診断薬。
【請求項５】
ＤＨＣＲ２４を認識する抗体が、肝がん細胞で動物を免疫することを含む抗体作製方法により得ることのできる抗体である、請求項１に記載のがんの診断薬。
【請求項６】
ＤＨＣＲ２４を認識する抗体によって認識されるＤＨＣＲ２４がタンパク質である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のがんの診断薬。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の診断薬中のＤＨＣＲ２４を認識する抗体を、生細胞又は細胞溶解物と反応させることを含む、がんを診断するためのＤＨＣＲ２４の検出方法。
【請求項８】
該細胞が肝がん細胞である、請求項７に記載の検出方法。
【請求項９】
ＤＨＣＲ２４を認識する抗体及び医薬的に許容可能な担体を含む、抗がん剤。
【請求項１０】
ＤＨＣＲ２４を認識する抗体が、ＤＨＣＲ２４を特異的に認識する抗体である、請求項９に記載の抗がん剤。
【請求項１１】
ＤＨＣＲ２４を認識する抗体が、肝がんを治療するのに有効である、請求項９に記載の抗がん剤。
【請求項１２】
ＤＨＣＲ２４を認識する抗体が、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入し、該細胞で動物を免疫することを含む抗体作製方法により得ることのできる抗体である、請求項９に記載の抗がん剤。
【請求項１３】
ＤＨＣＲ２４を認識する抗体が、肝がん細胞で動物を免疫することを含む抗体作製方法により得ることのできる抗体である、請求項９に記載の抗がん剤。
【請求項１４】
ＤＨＣＲ２４を認識する抗体によって認識されるＤＨＣＲ２４がタンパク質である、請求項９ないし１３のいずれか１項に記載の抗がん剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＤＨＣＲ２４を認識する抗体に関する。さらに、本発明はＤＨＣＲ２４を検出することを含むがんの診断方法に関する。
【背景技術】  Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は輸血後の非Ａ非Ｂ肝炎の主な原因ウイルスであり、このウイルスに起因する肝炎は慢性化率が高い。このウイルスのｃＤＮＡは、１９８９年にＣｈｏｏらによりクローニングされ（Ｃｈｏｏ，Ｑ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，３５９−３６２，１９８９）、フラビウイルス科に属する１本鎖ＲＮＡウイルスであることが知られている（Ｋａｔｏ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，９５２４−９５２８，１９９０）。又、幾つかのグループにより全塩基配列およびアミノ酸配列の解明がなされている。
本発明者らは、以前にＨＣＶの完全長遺伝子を発現するベクターを作製している（ＷＯ９９／６７３９４号）。
Ｃ型肝炎の治療手段の発見が急がれているが、その理由の１つとして、Ｃ型肝炎から肝癌・肝硬変に移行する確立が高いことが挙げられる。特にＣ型肝炎から移行する肝癌については、早急な治療手段の確立が必要とされている。
近年、効率的にがん細胞を攻撃するターゲットとしてがん抗原タンパク質が注目されている。がん抗原タンパク質はがん細胞に存在し、正常細胞にはほとんど発現していない抗原の総称であり、がん抗原タンパク質としては、ＣＥＡ（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８７：９８２，１９９５）、ｇｐ１００（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１００５，１９９４）、ＭＡＲＴ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３５１５，１９９４）、チロシナーゼ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：４８９，１９９３）、ＨＥＲ２（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８１：２１０９，１９９５）、ＰＳＡ（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８９：２９３，１９９７）などが知られている。
がん細胞で特異的に高発現しているがん抗原タンパク質のようなタンパク質は、腫瘍マーカーとしてがんの診断に用いられており、又、がん抗原タンパク質を特異的に認識する抗体を用いた抗がん剤のように、がん治療薬のターゲットにもなり得る。例えば、乳がん細胞で高発現しているＨＥＲ２を特異的に認識するヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体が、乳がん治療剤として用いられている（ＷＯ８９／０６６９２号）。このようにがん細胞で特に高発現しているタンパク質および該タンパク質に結合する抗体は、がんの診断・治療などに特に有用であると考えられている。
【発明の開示】
本発明は、簡便かつ高精度ながんの診断を可能にする抗体を提供することを目的とする。また、本発明は、がん細胞に特異的に発現する抗原を検出することによるがんの診断方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、まず、ＨＣＶタンパク質をコードする遺伝子を導入した細胞を免疫原としてマウスを免疫し、抗体を取得した。その後、得られた抗体の中から、肝癌細胞を特異的に認識する抗体を選択した。その後の解析により、該抗体はＤＨＣＲ２４を認識する抗体であることが判明した。さらに本発明者らは、ＤＨＣＲ２４が、正常細胞や肝癌患者の非癌部と比較して、肝癌患者の癌部及び肝癌細胞株において高発現していることを見出した。ＤＨＣＲ２４はＨＣＶ陽性の肝癌患者において特に高発現していると推測された。
従って、がん細胞に高発現しているＤＨＣＲ２４を検出することにより、高精度ながんの診断が可能であることを見出した。また、ＤＨＣＲ２４を認識する抗体は、がんの診断や治療に有効であることを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成したものである。
すなわち、本発明はＤＨＣＲ２４を認識する抗体を提供するものである。
また、本発明はＤＨＣＲ２４を特異的に認識する抗体を提供するものである。
さらに、本発明は、がんを診断することができる、ＤＨＲＣ２４を認識する抗体を提供する。
さらに、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入し、該細胞で動物を免疫する、ことを含む抗体作製方法により得ることのできるＤＨＣＲ２４を認識する抗体を提供する。
さらに、本発明は、肝がん細胞で動物を免役することを含む抗体作製方法により得ることのできるＤＨＣＲ２４を認識する抗体を提供する。
また、本発明は上記抗体を含む、がんの診断薬を提供するものである。
さらに、本発明は、上記抗体及び医薬的に許容可能な担体を含む、抗がん剤を提供するものである。
さらに、本発明はＤＨＣＲ２４を検出することを含むがんの診断方法を提供する。
さらに、本発明は、上記抗体を生細胞又は細胞溶解物と反応させることを含む、がんを診断するためのＤＨＣＲ２４の検出方法を提供する。
さらに、本発明は、上記抗体を投与することを含む、がんの治療方法を提供するものである。
さらに、本発明は、抗ＤＨＣＲ２４抗体を用いて、ＤＨＣＲ２４を発現しているがん細胞を死滅させる方法、該がん細胞に細胞障害を引き起こす方法、該がん細胞の増殖を抑制する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１Ａは、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いたＨＣＶタンパク質発現系の概略を示す図である。
図１Ｂは、図１Ａに示すＨＣＶタンパク質発現系を組み込んだ細胞株におけるＨＣＶタンパク質の発現を示す図である。
図２は、Ｒｚ−ＨｅｐＭ２−１８−６  ４８ｄ細胞に対するモノクローナル抗体を作出し、生細胞ＥＬＩＳＡ系を用いてスクリーニングした結果を示す図である。
図３は、モノクローナル抗体クローン２−１５２、２−２４３及び２−４３３を用いて、各種細胞株における抗体認識抗原分子の発現を解析した結果を示す図である。
図４は、肝癌患者の癌部と非癌部の組織における認識抗原の発現量をウエスタンブロットで解析した結果を示す図である。
図５は、モノクローナル抗体クローン２−１５２を用いてＰ５５の細胞内局在を蛍光抗体法により解析した結果を示す図である。
図６は、（Ａ）ＨＣＲ６−Ｒｚ遺伝子をＷＲＬ６８及びＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクションした場合、並びに（Ｂ）Ｒｚ−ＨｅｐＭ２−１８−６細胞でＨＣＶを発現させた場合（Ｍ６  Ｔｍ＋）及び同細胞でＨＣＶを発現・継代した場合（Ｍ６−４８ｄ）のＰ５５の発現について解析した結果である。
図７は、（Ａ）ＨｅｐＧ２細胞にＨＣＶ遺伝子をトランスフェエクションし、２−１５２、抗ＨＣＶ−ｃｏｒｅ（ウサギＲＲ８血清）で２重染色した図である。（Ｂ）ＨｅｐＧ２細胞にＣＡＧコントロールプラスミドをトランスフェクションし、同様に多重染色した図である。（Ｃ）ＷＲＬ６８細胞にＨＣＶ遺伝子をトランスフェクションし、２−１５２、抗ＨＣＶ−ｃｏｒｅ（ウサギＲＲ８血清）で２重染色した図である。（Ｄ）ＷＲＬ６８細胞にＣＡＧコントロールプラスミドをトランスフェクションし、同様に多重染色した図である。
図８は、Ｒｚ−ＨｅｐＭ２−１８−６細胞でＨＣＶを発現させ、２−１５２、抗ｃｏｒｅ抗体で２重染色した図である（発現４日後）。
図９は、Ｒｚ−ＨｅｐＭ２−１８−６細胞でＨＣＶを発現・継代（４８日以上）し、２−１５２、抗ｃｏｒｅ抗体で２重染色した図である。
図１０は、モノクロナール抗体クローン２−１５２を用いてＤＨＣＲ２４を認識した結果を示す図である。（Ａ）ｐＧＥＭ−Ｔ−ＤＨＣＲ２４（Ｅｘｐ．１）の試験管内翻訳、（Ｂ）ｐＧＥＭ−Ｔ−ＤＨＣＲ２４の試験管内翻訳タンパク質と２−１５２の反応（ウェスタンブロッティング）、（Ｃ）ｐＣＡＧ−ＤＨＣＲ２４（Ｅｘｐ．２）をＷＲＬ６８細胞にトランスフェクション後、２−１５２と反応（ウェスタンブロッティング）を示す。
図１１は、細胞株ＷＲＬ６８、ＨｅｐＧ２またはＨｕＨ−７に対する、モノクローナル抗体２−１５２または正常マウスＩｇＧのＣＤＣ活性を表したグラフである。
図１２は、ＨＣＶ感染ＨＣＣ患者の肝臓の癌部組織（Ａ）または非癌部組織（Ｂ）を免疫染色した顕微鏡写真（６００倍）である。左図は、それぞれモノクローナル抗体２−１５２染色、ＴＯ−ＰＲＯ−３染色、これらの２重染色（Ｍｅｒｇｅ）、および正常ＩｇＧ（Ｎｏｒｍａｌ）染色を表す。右図は、細胞の形態を観察するためにＨＥ染色した顕微鏡写真である。
【発明を実施するための最良の形態】  ＤＨＣＲ２４は、正常肝細胞では細胞膜上にはほとんど発現していないと考えられるが、肝細胞のがん化に伴い、その分布が崩れ、細胞膜上に発現すると考えられる。このことは、抗ＤＨＣＲ２４抗体が、肝癌細胞へは容易に到達することが可能であるが、正常肝細胞へは到達が困難であることを示している。したがって、抗ＤＨＣＲ２４抗体はがんの診断・治療に有用であると考えられる。
本発明のＤＨＣＲ２４を認識する抗体は、ＤＨＣＲへの結合能を有していれば、いかなる抗体でもよく、由来や形状などで限定されない。なお、ＤＨＣＲへの結合能は、ＤＨＣＲに特異的に結合することが好ましい。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、治療や診断に用いる場合には、モノクローナル抗体であることが好ましい。
また、本発明の抗体はマウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体など、どのような動物由来の抗体でもよい。
さらに、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体などのアミノ酸配列を置換した改変抗体でもよいし、又、各種分子を結合させた抗体修飾物、抗体断片、低分子化抗体、糖鎖改変抗体など、いかなる抗体でもよい。
１．  抗ＤＨＣＲ２４抗体
本発明で使用される抗ＤＨＣＲ２４抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明の抗ＤＨＣＲ２４抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるもの、などを含む。
このような抗体は、例えば、以下のような当業者に公知の方法によって得ることが可能である。
２．  抗体産生ハイブリドーマ
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、例えば以下のようにして作製できる。すなわち、ＤＨＣＲ２４タンパク質又はＤＨＣＲ２４発現細胞（例えば、ＨＣＶタンパク質をコードする遺伝子を導入した肝細胞、肝癌細胞、など）を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるＤＨＣＲ２４タンパク質を、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿０１４７６２に開示されたＤＨＣＲ２４遺伝子／アミノ酸配列を発現させることによって得る（又はＡｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６９（４），６８５−６９４（２００１）；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０（１９），７３４５−７３５２（２０００）に記載の配列）。すなわち、ＤＨＣＲ２４をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトＤＨＣＲ２４タンパク質を公知の方法で精製する。
次に、この精製ＤＨＣＲ２４タンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、ＤＨＣＲ２４の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒトＤＨＣＲ２４のアミノ酸配列より化学合成により得ることも可能である。
本発明の抗ＤＨＣＲ２４抗体の認識するＤＨＣＲ２４分子上のエピトープは特定のものに限定されず、ＤＨＣＲ２４分子上に存在するエピトープならばどのエピトープを認識してもよい。従って、本発明の抗ＤＨＣＲ２４抗体を作製するための抗原は、ＤＨＣＲ２４分子上に存在するエピトープを含む断片ならば、如何なる断片も用いることが可能である。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．１２３，１５４８−１５５０，１９７９）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１−７，１９７８）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９，１９７６）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８，４０５−４１５，１９７６）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０，１９７８）、ＦＯ（ｄｅＳｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５，１−２１，１９８０）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ，Ｓ．Ｊ，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４８，３１３−３２３，１９７８）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７７，１３１−１３３，１９７９）等が好適である。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３，３−４６，１９８１）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ  １６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１，０００〜６，０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＨＣＲ２４に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、ＤＨＣＲ２４への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＤＨＣＲ２４を投与して抗ＤＨＣＲ２４抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からＤＨＣＲ２４に対するヒト抗体を取得してもよい（ＷＯ９４／２５５８５号公報、ＷＯ９３／１２２２７号公報、ＷＯ９２／０３９１８号公報、ＷＯ９４／０２６０２号公報参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
３．  組換え型抗体
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。
具体的には、抗ＤＨＣＲ２４抗体を産生するハイブリドーマから、抗ＤＨＣＲ２４抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４−５２９９，１９７９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９，１９８７）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。
ＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，８９９８−９００２，１９８８；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７，２９１９−２９３２，１９８９）等を使用することができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
目的とする抗ＤＨＣＲ２４抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。
本発明で使用される抗ＤＨＣＲ２４抗体を製造するには、通常、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ９４／１１５２３号公報参照）。
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２，６９９−７０２，１９９４）。
４．  改変抗体
本発明の抗体には、上記抗体のほかに、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した改変抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体などを含む。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。この既知の方法を用いて、キメラ抗体を得ることができる。
ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（ＥＰ１２５０２３号公報、ＷＯ９６／０２５７６号公報参照）。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成する（ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法を参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３，８５１−８５６，１９９３）。
キメラ抗体及びヒト型化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
一般的に、キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。キメラ抗体やヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、治療目的などでヒトに投与する場合に有用と考えられる。
５．  抗体修飾物
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られずＤＨＣＲ２４に結合する限り、抗体の断片又はその修飾物であってもよく、２価抗体も１価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させた１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙなどが挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８−２９７６，１９９４；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１７８，４７６−４９６，１９８９；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１７８，４７６−４９６，１９８９；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１，６５２−６６３，１９８９；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１，６６３−６６９，１９８９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ，９，１３２−１３７，１９９１参照）。
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，５８７９−５８８３，１９８８）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸５〜２０残基程度の任意の１本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物として、細胞障害性物質やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗ＤＨＣＲ２４抗体を挙げることができる。細胞障害性物質としては、例えば、放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等を挙げることができる。本発明における「抗体」には、このような他の物質と結合している抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
さらに、本発明で使用される抗体は、２重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。２重特異性抗体はＤＨＣＲ２４分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する２重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がＤＨＣＲ２４を認識し、他方の抗原結合部位が化学療法剤、細胞由来トキシン、放射性物質等の細胞障害性物質を認識してもよい。この場合、ＤＨＣＲ２４を発現している細胞に直接細胞障害性物質を作用させ腫瘍細胞に特異的に傷害を与え、腫瘍細胞の増殖を抑えることが可能である。２重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて２重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により２重特異性抗体を作製することも可能である。
又、抗体の細胞障害活性を増強させる目的で、抗体の糖鎖を改変してもよい。抗体の糖鎖改変技術は既に知られている（例えば、ＷＯ／００６１７３９号、ＷＯ０２／３１１４０号など）。
抗ＤＨＣＲ２４抗体は、細胞障害活性として、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｔｙ）活性又はＣＤＣ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｔｙ）活性を有していてもよい。
ＡＤＣＣ活性は、例えば、抗ＤＨＣＲ抗体とエフェクター細胞を標的細胞と混合し、ＡＤＣＣの程度を調べることにより測定することができる。エフェクター細胞としては例えば、マウス脾細胞やヒト末梢血または骨髄から分離した単核球等を利用することができる。標的細胞としては、ヒト肝細胞株ＨｕＨ−７等のヒト株化細胞を用いることができる。標的細胞を予め５１Ｃｒで標識し、これに抗ＤＨＣＲ２４抗体を加えてインキュベーションを行い、その後、標的細胞に対し適切な比のエフェクター細胞を加えてインキュベーションを行う。インキュベーション後、上清を採取し、上清中の放射活性をカウントすることによりＡＤＣＣ活性を測定することができる。
また、ＣＤＣ活性は、上述の標識標的細胞と抗ＤＨＣＲ２４抗体を混合し、その後補体を添加してインキュベーションを行い、培養後に上清中の放射活性をカウントすることにより測定することができる。
抗体が細胞障害活性を発揮するには、通常、Ｆｃ部分が必要である。したがって、本発明の抗癌剤が抗体の細胞障害活性を利用したものである場合は、本発明に使用する抗ＤＨＣＲ２４抗体はＦＣ部分を含んでいることが好ましい。
抗ＤＨＣＲ２４抗体をＤＨＣＲ２４を発現しているがん細胞、特に肝癌細胞に接触させることにより、該がん細胞に細胞障害を引き起こすことが可能であり、さらに、該がん細胞を死滅させることが可能である。さらに、抗ＤＨＣＲ２４抗体を用いることにより、ＤＨＣＲ２４を発現しているがん細胞の増殖を抑制することも可能である。したがって、本発明は、抗ＤＨＣＲ２４抗体を用いて、ＤＨＣＲ２４を発現しているがん細胞を死滅させる方法、該がん細胞に細胞障害を引き起こす方法、または該がん細胞の増殖を抑制する方法を提供する。
６．  組換え型抗体または改変抗体の発現および産生
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２７７，１０８，１９７９）により、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合はＷａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４−５４６，１９９８；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，６，２４２２−２４２７，１９９２）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はＢｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０４１−１０４３，１９８８）により発現させることができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，４３７９，１９８７）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。
次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
７．  抗体の分離、精製
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
８．  抗体の活性の確認
抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）の測定には公知の手段を使用することができる。
本発明で使用される抗ＤＨＣＲ２４抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、ＤＨＣＲ２４をコーティングしたプレートに、抗ＤＨＣＲ２４抗体を含む試料、例えば、抗ＤＨＣＲ２４抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した２次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニルリン酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
９．  投与方法および製剤
本発明の抗体を抗がん剤として用いる場合、有効投与量は、１回につき体重１ｋｇあたり０．００１〜１，０００ｍｇの範囲で選ぶことができる。あるいは、患者あたり０．０１〜１００，０００ｍｇ／ｂｏｄｙの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の抗ＤＨＣＲ２４抗体を含有する抗がん剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
また、本発明の抗がん剤の投与時期としては、疾患の臨床症状が生ずる前後を問わず投与することができる。
本発明の抗がん剤は１日１〜３回、１週間に１〜７日投与することが可能である。
本発明の抗がん剤は、通常、非経口投与で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）で投与されるが、特に限定されず、経皮、経粘膜、経鼻、経肺、経口などで投与してもよい。
しかしながら、本発明の抗がん剤は上記投与量、投与方法などに限定されるものではない。
本発明の抗ＤＨＣＲ２４抗体を有効成分として含有する抗がん剤は、常法にしたがって製剤化することができ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，米国）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
このような担体および医薬添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
実際の添加物は、本発明の抗がん剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗ＤＨＣＲ２４抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
１０．  がんの診断
本発明は、ＤＨＣＲ２４を検出することによるがんの診断方法に関するものである。
ＤＨＣＲ２４の検出は、ＤＨＣＲ２４遺伝子（例えば、ｍＲＮＡなど）を検出してもよいし、ＤＨＣＲ２４タンパク質を検出してもよい。
本発明のがんの診断方法は特に肝癌の診断に有用である。
本発明において検出とは、定量的又は非定量的な検出を含み、例えば、非定量的な検出としては、単にＤＨＣＲ２４タンパク質が存在するか否かの測定、ＤＨＣＲ２４タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定、ＤＨＣＲ２４タンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定などを挙げることができ、定量的な検出としては、ＤＨＣＲ２４タンパク質の発現量の測定などを挙げることができる。
被検試料とは、ＤＨＣＲ２４タンパク質またはＤＨＣＲ２４遺伝子が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されず、被検試料の具体的な例としては、例えば、がんの診断が必要とされる患者若しくは健常者から採取された細胞（肝細胞など）や、該細胞を破砕して得られた試料などを挙げることができる。
ＤＨＣＲ２４タンパク質を検出する場合、ＤＨＣＲ２４タンパク質の検出はどのような方法により行ってもよいが、例えば、本発明の抗ＤＨＣＲ２４抗体を用いた免疫学的方法により検出することが可能である。免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができる。
ウエスタンブロット法は電気泳動により分離されたタンパク質を抗原抗体反応を用いて検出する方法である。ＤＨＣＲ２４タンパク質を尿素、ＳＤＳ、２−メルカプトエタノールなどの変性剤や還元剤で可溶化し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離する。分離されたバンドは電気泳動的にニトロセルロース膜などの固体支持体に移し、抗原に特異的な抗体を反応させる。結合した抗体は、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどが結合した抗ＩｇＧ抗体や１２５Ｉ標識プロテインＡなどを用いて検出する。
又、抗ＤＨＣＲ２４抗体を用いた他の検出方法としては、例えば、抗ＤＨＣＲ２４抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い、抗ＤＨＣＲ２４抗体とＤＨＣＲ２４を結合させた後に洗浄して、抗ＤＨＣＲ２４抗体を介して支持体に結合したＤＨＣＲ２４を検出することにより、被検試料中のＤＨＣＲ２４の検出を行う方法を挙げることができる。支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネート樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルブレート等）、やバイオセンサーチップなどを用いることができる。抗ＤＨＣＲ２４抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。
抗ＤＨＣＲ２４抗体とＤＨＣＲ２４との結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜室温にて１〜２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、ＤＨＣＲ２４と抗ＤＨＣＲ２４抗体の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
本発明のＤＨＣＲ２４の検出方法においては、ＤＨＣＲ２４を検出したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、ＤＨＣＲ２４を含まない陰性コントロール試料やＤＨＣＲ２４を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、ＤＨＣＲ２４を含まない陰性コントロール試料で得られた結果と、ＤＨＣＲ２４を含む陽性コントロール試料で得られた結果とを比較することにより、被検試料中のＤＨＣＲ２４を検出することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検試料の数値から標準曲線に基づいて、被検試料に含まれるＤＨＣＲ２４を定量的に検出することも可能である。
抗ＤＨＣＲ２４抗体を介して支持体に結合したＤＨＣＲ２４の検出の好ましい態様として、標識物質で標識された抗ＤＨＣＲ２４抗体を用いる方法を挙げることができる。
例えば、支持体に固定された抗ＤＨＣＲ２４抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、ＤＨＣＲ２４を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。
この際、支持体に固定される抗ＤＨＣＲ２４抗体と標識物質で標識される抗ＤＨＣＲ２４抗体はＤＨＣＲ２４分子の同じエピトープを認識してもよいが、異なるエピトープを認識することが好ましい。
抗ＤＨＣＲ２４抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ（３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉなど）、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチンなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗ＤＨＣＲ２４抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。
具体的には、抗ＤＨＣＲ２４抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＤＨＣＲ２４抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗ＤＨＣ２４抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、プレートに残った標識抗ＤＨＣＲ２４抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、１，２−フェニレンジアミン（オルソ−フェニレンジアミン）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＥ）などを挙げることができる。蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することができる。
本発明のＤＨＣＲ２４の検出方法の他の態様として、ビオチンで標識された抗ＤＨＣＲ２４抗体及びアビジンを用いる方法を挙げることができる。
具体的には、抗ＤＨＣＲ２４抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＤＨＣＲ２４抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ビオチン標識抗ＤＨＣＲ２４抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素と結合したアビジンを加える。インキュベーション後、プレートを洗浄し、アビジンに結合している酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にＤＨＣＲ２４を検出する。
本発明のＤＨＣＲ２４の検出方法の他の態様として、ＤＨＣＲ２４を特異的に認識する１次抗体、及び該１次抗体を特異的に認識する２次抗体を用いる方法を挙げることができる。
例えば、支持体に固定された抗ＤＨＣＲ２４抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているＤＨＣＲ２４を、１次抗ＤＨＣＲ２４抗体及び該１次抗体を特異的に認識する２次抗体により検出する。この場合、２次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。
具体的には、抗ＤＨＣＲ２４抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＤＨＣＲ２４抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、１次抗ＤＨＣＲ２４抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、次いで１次抗体を特異的に認識する２次抗体を加える。適度なインキュベーションの後、洗浄して、プレートに残った２次抗体を検出する。２次抗体の検出は前述の方法により行うことができる。
本発明のＤＨＣＲ２４の検出方法の他の態様としては、凝集反応を利用した検出方法を挙げることができる。該方法においては、抗ＤＨＣＲ２４抗体を感作した担体を用いてＤＨＣＲ２４を検出することができる。抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。感作した粒子と試料を混合し、一定時間攪拌した後に、試料中に抗ＤＨＣＲ２４抗体が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、凝集を肉眼でみることによりＤＨＣＲ２４を検出することができる。また、凝集による濁度を分光光度計等で測定することにより検出することが可能である。
本発明のＤＨＣＲ２４の検出方法の他の態様としては、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等のバイオセンサーを用いることによりＤＨＣＲ２４と抗ＤＨＣＲ２４抗体の結合を検出することが可能である。具体的には、抗ＤＨＣＲ２４抗体を固定化したセンサーチップに、被検試料を接触させ、抗ＤＨＣＲ２４抗体に結合するＤＨＣＲ２４を共鳴シグナルの変化として検出することができる。
本発明の検出方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。
又、被検細胞に、蛍光物質などで標識した抗ＤＨＣＲ２４抗体を接触させ、ＤＨＣＲ２４に結合していない抗ＤＨＣＲ２４抗体を除いた後に、蛍光物質などの標識物質を検出することにより、細胞がＤＨＣＲ２４を発現しているか否かを検出することも可能である。蛍光などの標識物質の検出は当業者に公知の方法で行うことが可能である。
さらに本発明においては、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法などの、抗ＤＨＣＲ２４抗体を使用しない方法を用いてＤＨＣＲ２４タンパク質を検出してもよい。
本発明においては、ＤＨＣＲ２４タンパク質の検出だけでなく、ＤＨＣＲ２４遺伝子の検出をすることによりがんの診断を行ってもよい。
例えば、本発明の診断方法の１つの態様としては、まず、被検者からＲＮＡ試料を調製する。次いで、該ＲＮＡ試料に含まれるＤＨＣＲ２４タンパク質をコードするＲＮＡの量を測定する。次いで、測定されたＲＮＡの量を対照と比較する。
別の態様としては、まず、被検者からｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、該ｃＤＮＡ試料に含まれるＤＨＣＲ２４タンパク質をコードするｃＤＮＡの量を測定する。次いで、測定されたｃＤＮＡの量を対照と比較する。
これらのような方法としては、当業者らに周知の方法、例えばノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ法等を挙げることができる。
例えば、ＤＮＡアレイ法においては、被検者から調製したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡ試料を調製し、ＤＨＣＲ２４遺伝子とハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが固定された基板と接触させ、該ｃＤＮＡ試料と該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該ｃＤＮＡ試料に含まれる遺伝子の発現量を測定する。次いで、測定された遺伝子の発現量を対照と比較する。ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡまたはこれに対応するＲＮＡが、溶液中でまたは固体支持体上で、別のＤＮＡまたはＲＮＡ分子と水素結合相互作用により結合することを意味する。このような相互作用の強さは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変化させることにより評価することができる。所望の特異性および選択性によって、種々のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を用いることができ、ストリンジェンシーは、塩濃度または変性剤の濃度を変化させることにより調節することができる。そのようなストリンジェンシーの調節方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｄｓ．、１９８９に記載されている。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ＰＨ６．８、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ超音波処理サケ精子ＤＮＡ、および５×デンハルト溶液中、４２℃で一夜のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４５℃での洗浄；および０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４５℃での洗浄である。
本発明で用いられるヌクレオチドプローブは、当業者に公知の方法で製造することが可能である。例えば、当該技術分野において知られるプロトコルを用いて、市販のＤＮＡ合成機（例えば３９４合成器、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で合成することができる。あるいは、ＤＨＣＲ２４の配列情報に基づいて、適当なテンプレートとプライマーとを組み合わせて用いて、当該技術分野においてよく知られるＰＣＲ増幅技術により製造することができる。
ヌクレオチドプローブは、通常、ＤＨＣＲ２４塩基配列またはこれと相補的な塩基配列の少なくとも１２塩基、２０、３０、５０または１００塩基またはそれ以上の連続する塩基配列を有し、ＤＨＣＲ２４遺伝子の特定の領域に特異的にハイブリダイズするよう選択される。
プローブは、固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例としては、限定されないが、プラスチック、アガロース、セファロース、ポリアクリルアミド、ラテックスビーズおよびニトロセルロース等が含まれる。プローブをそのような固体支持体に結合させる技術は当該技術分野においてよく知られている。プローブは、標準的な標識技術、例えば放射性標識、酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、蛍光標識、ビオチン−アビジン標識、化学発光等を用いて標識することにより可視化することができる。
被検者からのｃＤＮＡ試料の調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。ｃＤＮＡ試料の調製の好ましい態様においては、まず被検者の細胞あるいは組織（例えば、肝臓など）から全ＲＮＡの抽出を行う。全ＲＮＡの抽出は、当業者にとって周知の方法、例えば次のようにして行うことができる。全ＲＮＡ抽出には純度の高い全ＲＮＡが調製できる方法であれば、既存の方法およびキット等を用いることが可能である。例えばＡｍｂｉｏｎ社製ＲＮＡ  ｌａｔｅｒを用いて前処理を行った後、ニッポンジーン社製Ｉｓｏｇｅｎを用いて全ＲＮＡの抽出を行う。具体的方法にはそれらの添付プロトコールに従えばよい。
次いで、抽出した全ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡの合成を行い、ｃＤＮＡ試料を調製する。全ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、当業者に周知の方法で実施することができる。調製したｃＤＮＡ試料には、必要に応じて、検出のための標識を施す。標識物質としては、検出可能なものであれば特に制限はなく、例えば、蛍光物質、放射性元素等を挙げることができる。標識は、当業者によって一般的に行われる方法（Ｌ  Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｌａｓｅｒ−ｃａｐｔｕｒｅｄ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９９，１１７−１２２）で実施することができる。
ヌクレオチドプローブと該ｃＤＮＡとのハイブリダイズの強度の検出は、ｃＤＮＡ試料を標識した物質の種類に応じて当業者においては適宜行うことができる。例えば、ｃＤＮＡが蛍光物質によって標識された場合、スキャナーで蛍光シグナルを読み取ることによって検出することができる。
上記の方法において、対照と比較して、遺伝子またはタンパク質の発現量が有意に上昇していた場合、被検者は、がんを発症している、もしくは発症する可能性が高いと判定される。
本発明はまた、がんの検査方法に用いるための検査薬を提供する。このような検査薬としては、ＤＨＣＲ２４とハイブリダイズ可能なヌクレオチドプローブを含む検査薬（ヌクレオチドプローブが固定された基板を含む）または本発明の抗体を含む検査薬などが挙げられる。上記抗体は、検査に用いることが可能な抗体であれば、特に制限はない。プローブや抗体は必要に応じて標識される。
上記の検査薬においては、有効成分であるヌクレオチドプローブや抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（ＢＳＡやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。又、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
ＤＨＣＲ２４は、特定のヒトがん組織においてその発現が亢進されている。したがって、治療目的でＤＨＣＲ２４遺伝子の発現を阻害する場合は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ等を用いることができる。
アンチセンス、リボザイム、ｓｉＲＮＡなどを用いる場合、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは少なくとも１２ヌクレオチド以上の鎖長を有していることが好ましく、さらに好ましくは１２〜５０ヌクレオチドであり、特に好ましくは１２〜２５ヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、所望のアンチセンス、リボザイムまたはｓｉＲＮＡの活性を有する限り、標的部位の相補配列から、１または数個の塩基が欠失、置換または付加された変異体であってもよい。このような変異体は、好ましくは、標的部位の相補配列と、少なくとも７０％、好ましくは９０％またはそれ以上、より好ましくは９５％またはそれ以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。
塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ，ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
あるいは、このようなポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ＤＨＣＲ２４をコードする遺伝子配列またはその相補配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。
アンチセンス、リボザイムおよびｓｉＲＮＡ技術を用いて遺伝子発現を制御する方法は当該技術分野においてよく知られている。例えば、アンチセンス、リボザイム、ｓｉＲＮＡを適当な担体とともに投与してもよく、あるいは、アンチセンス、リボザイムまたはｓｉＲＮＡをコードするベクターを投与してインビボでこれらの発現を誘導してもよい。
「リボザイム」との用語は、ｍＲＮＡを切断する触媒活性を有する核酸分子を表す。リボザイムは、一般に、エンドヌクレアーゼ、リガーゼまたはポリメラーゼ活性を示す。種々のタイプのトランス作用性リボザイム、例えばハンマーヘッドおよびヘアピンタイプのリボザイムが知られている。
「アンチセンス」とは、ゲノムＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、その転写および／または翻訳を阻害することによりそのタンパク質の発現を阻害する、核酸分子またはその誘導体を表す。結合は一般的な塩基対相補性によるものでもよく、または、例えば、ＤＮＡデュープレックスへの結合の場合には、２重ヘリックスの主溝における特異的相互作用によるものでもよい。アンチセンス核酸の標的部位としては、ｍＲＮＡの５’末端、例えばＡＵＧ開始コドンまでおよびこれを含む５’非翻訳配列が好ましいが、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列またはコーディング領域の配列もｍＲＮＡの翻訳の阻害に有効であることが知られている。
「ｓｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を行うことができる２本鎖核酸を意味する（例えば、Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８を参照）。ｓｉＲＮＡは、配列特異的にｍＲＮＡを分解し、このことにより遺伝子の発現を抑制することができる。ｓｉＲＮＡは、典型的には、標的とする配列に相補的な配列を含む２０〜２５塩基対の長さの２本鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡ分子は、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【実施例】［実施例１］
１．  材料と方法
１．１培養細胞株
本研究で用いた細胞株の性状を表１に示す。
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これらの細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。ＨｕＨ−７、２９３、ＨｅｐＧ２細胞はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；ＳＩＧＭＡ）に１０％ＦＣＳ（ＳＩＧＭＡ）を加えて培養した。ＷＲＬ６８細胞は１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭに１ｍＭ  Ｎａ  Ｐｙｒｕｖａｔｅ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、０．１ｍＭ  Ｎｏｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を加えて培養した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ＤＭＥＭに５％ｎｅｏｎａｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ（ＳＩＧＭＡ）を加えて培養した。
ハイブリドーマやミエローマのＰＡＩ細胞は、１０％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ）で培養した。
全長ＨＣＶ  ｃＤＮＡクローン（ＨＣＲ６−Ｒｚ）をＣｒｅ／ｌｏｘＰのスイッチング発現システムの下流に組み込んだユニット（図１Ａ、上段）を、ｎｅｏ遺伝子を利用してＨｅｐＧ２細胞に組み込み、細胞株を樹立した（Ｒｚ−Ｈｅｐ２−１８細胞）。さらに、これにＭｅｒ−Ｃｒｅ−Ｍｅｒシステム（図１Ａ、下段）を組み込んだ細胞株も樹立した（Ｒｚ−ＨｅｐＭ２−１８−６細胞）。Ｒｚ−ＨｅｐＭ２−１８−６細胞株をタモキシフェン（Ｔｍ）で処理するとＣｒｅ酵素が産生され、全長ＨＣＶがスイッチング発現する（図１Ｂ）。
１．２  患者材料
東京都立駒込病院・肝臓内科を訪れた１５人の肝癌患者検体を用いた（表２）。癌部、非癌部の検体は外科的に切除した組織から得た。これらの患者から本研究利用へのインフォームドコンセントは得ている。
１．３  ＥＬＩＳＡ系
（１）生細胞ＥＬＩＳＡ系
丸底の９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）をＰｏｌｙ  Ｌ  ｌｉｓｉｎｅ  １０μｇ／ｍｌ−ＰＢＳ（−）で室温３０分インキュベートした。ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、細胞をウェル当たり１〜５×１０５でまき、１５００ｒｐｍ、４℃、１分遠心後、上清を吸引除去し、細胞ペレットをボルテックスミキサーで撹拌した。細胞を遠心しながら（１５００ｒｐｍ、１分、４℃）冷ＰＢＳ（−）で４回洗浄した。細胞を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで室温１〜２時間反応させた。１％ＢＳＡ−ＰＢＳで適当に希釈した抗体液を１００μｌずつ加え、室温で１５分間に１回緩やかに撹拌しながら２時間反応させた。細胞を同様に２回洗浄後、ＨＲＰ標識２次抗体Ｆ（ａｂ’）２−ｅｎｚｙｍｅ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）（１００ｎｇ／ｍｌ）１００μｌを加えた。４℃で１時間半、１５分間隔で振盪しながら反応させ、細胞を３回洗浄して基質を加え、吸光度をＯＤ６５５で測定した。
（２）細胞溶解物ＥＬＩＳＡ系
１０６個の細胞をライセートバッファー（１％ＳＤＳ／０．５％ＮＰ−４０／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＤＴＴ）１００μｌで溶解し、これを抗原として（２μｇ／ウェル）常法に従いＥＬＩＳＡを行った。
１．４  モノクロナール抗体の作製
Ｒｚ−ＨｅｐＭ２−１８−６細胞をタモキシフェン処理してＨＣＶを発現させた後、４８日以上継代した細胞Ｒｚ−ＨｅｐＭ２−１８−６  ４８ｄ（５×１０６個）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に８回以上免疫し、脾臓を取りだし、ＰＥＧ  １５００（Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒ）を用いてＰＡＩミエローマ細胞と融合させた（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５）。ハイブリドーマ細胞はＨＡＴ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）で選択し、培養上清を生細胞ＥＬＩＳＡ系で解析した。
１．５  イムノブロット解析
１０６個の細胞を１００μｌのＲＩＰＡ溶液（１％ＳＤＳ／０．５％ＮＰ−４０／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＤＴＴ）に溶かし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルはナイロン膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ）に転写してモノクロナール抗体とＨＲＰ標識抗マウス２次抗体（ＤＡＫＯ）を反応させた。凍結した患者組織はダンスホモジェナイザー（Ｗｈｅａｔｏｎ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ）を用いてＲＩＰＡに氷中で溶解した。抗アクチンポリクロナール抗体（Ｃ−１１、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）を内部標準として使用した。
１．６  蛍光抗体法（ＩＦＡ）
細胞はアセトン−メタノール（１：１）溶液を用いて−２０℃で１０分間固定するか、ＰＢＳでバッファライズしたホルマリン（ＷＡＫＯ）で固定した。これらを抗体と室温で６０分間反応させ、ＰＢＳで洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗マウス２次抗体（ＤＡＫＯ）と室温で３０分間反応させた。
１．７  抗原精製とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦ  ＭＳによる抗原決定
モノクロナール抗体クローン２−１５２  ０．７ｍｇをＨｉ  ＴｒａｐＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰカラム（ファルマシア）に結合させた抗体カラムを作製し、１０７個のＨｕＨ−７細胞の溶解液（ライセートバッファー：１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００／２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．５／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＤＴＴ／１ｍＭ  ＤＦＰ）１ｍｌを抗体カラムに流速１滴／２秒で流し、室温で３０分通し続けた。ライセートバッファーで未吸着画分を洗浄し、結合画分を溶出バッファー（０．２Ｍグリシン−塩酸緩衝液、ｐＨ３．０）５ｍｌで溶出した。ピーク画分を凍結乾燥機にかけて濃縮し、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動後クマシー染色を行い、染色されたバンドを切り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦＭＳによってアミノ酸配列を決定した。
１．８  ＤＨＣＲ２４タンパク質の発現
ＤＨＣＲ２４の遺伝子配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０１４７６２）に基づいてプライマー（センス；５’−ＧＴＴＣＴＣＧＡＧＣＡＧＴＧＡＣＡＧＧＡＧＧＣＧＡＡＣ−３’、アンチセンス；５’  −ＧＴＴＣＴＣＧＡＧＴＣＣＡＧＧＣＧＧＧＣＴＣＣＡＧＣＴＣＡ−３’）を合成し、ＨｕＨ−７細胞のｍＲＮＡからｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ＰＣＲ法によってｃＤＮＡを得た。これをｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ）に組み込み、ＴＮＴ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ（プロメガ）、３５Ｓメチオニン（ＮＥＮ）を用いてＤＨＣＲ２４タンパク質を合成した。また、３５Ｓメチオニンを加えずに合成した細胞溶解物を抗原とし、ウェスタンブロッティング法によりモノクロナール抗体クローン２−１５２との反応を検討した。さらに、ＤＨＣＲ２４遺伝子をｐＣＡＧ−ＰＵＲＯベクターに組み込み、ＷＲＬ６８細胞にリン酸カルシウム法か、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ  ２０００でトランスフェクション後、ＤＨＣＲ２４タンパク質の発現をウェスタンブロッティング法で解析した。
２．  結果
Ｒｚ−Ｈｅｐ細胞を用いた生細胞ＥＬＩＳＡ系の開発とモノクローナル抗体の樹立
発明者らは、先に全長ＨＣＶ遺伝子：ＨＣＲ６−Ｒｚを発現するスイッチング発現系を確立し（図１Ａ）、これをＨｅｐＧ２細胞に組み込んで細胞株を樹立している（Ｒｚ−Ｈｅｐ２−１８−６細胞；Ｋｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ）。ＨＣＶ発現細胞にがんに関連するような細胞表面抗原が表出するかを解析するため、生細胞の表面抗原を認識するようなＥＬＩＳＡ系を確立した。この系は免疫したマウスの血清に特異的に反応することが確認された（図２）。同時に、タモキシフェン（Ｔｍ）処理によりＨＣＶを発現させ、その後４８日以上継代することによって腫瘍原性が亢進したＲｚ−Ｈｅｐ細胞（Ｒｚ−ＨｅｐＭ２−１８−６  ４８ｄ細胞；Ｋｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）をマウスに免疫し、モノクロナール抗体を樹立した。免疫したマウスの血清は、３２，０００倍まで細胞に反応した（図２）。
次に、Ｒｚ−ＨｅｐＭ２−１８−６  ４８ｄ細胞を８回以上マウスに免疫し、脾臓細胞をミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作製した。１，０００クローン以上から上清を回収し、生細胞ＥＬＩＳＡ系で解析した。このうち、Ｒｚ−ＨｅｐＭ２−１８−６  ４８ｄ細胞への反応性とＲｚ−ＨｅｐＭ２−１８−６未発現細胞への反応性が異なるクローンを抽出し、さらにその反応性を蛍光抗体法（ＦＡ）とＷＢ法で解析した。その結果、Ｒｚ−ＨｅｐＭ２−１８−６  ４８ｄ細胞に反応する３つのクローンを得た。１つはクローン２−１５２で５５ｋＤａの分子（Ｐ５５）を認識し、クローン２−２４３は７０ｋＤａの分子（Ｐ７０）、クローン２−４３３は３０ｋＤａの分子（Ｐ３０）を認識した（図３）。これら分子の発現レベルを各種細胞株：ヒト肝芽腫細胞ＨｅｐＧ２；ヒト肝癌細胞ＨｕＨ−７；ヒト胎児肝細胞ＷＲＬ６８；ヒト胎児腎細胞２９３細胞；及びマウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（図３）で解析した。これら細胞の腫瘍原性を表１に示す。Ｐ５５、Ｐ７０、Ｐ３０はＨｕＨ−７細胞での発現が最も高かった。Ｐ５５、Ｐ３０のこれら細胞群での発現は腫瘍原性に応じて変化していた。腫瘍原性の低いＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＰ５５、Ｐ７０、Ｐ３０の発現レベルは低かった。
以上より、肝臓由来細胞株では腫瘍原性が高い程、各分子の発現が上昇している傾向がみられた。また上皮細胞（２９３細胞）やＮＩＨ３Ｔ３細胞では発現が低かった。
さらに、これら分子の発現レベルが細胞の腫瘍原性と関連する可能性が考えられたので、肝癌患者（ＨＣＣ）の癌部、非癌部における発現を解析した（図４）。５例がＨＣＶ陽性（ＨＣＶ（＋））患者群（Ｎｏ．１、２、３、９及び１０）、５例がＨＣＶ、ＨＢＶ感染陰性（ＮＢＮＣ）患者群（Ｎｏ．４、５、６、７及び８）、５例がＨＢＶ陽性（ＨＢＶ（＋））患者群（Ｎｏ．１１、１２、１３、１４及び１５）であった（表２）。
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これら患者の凍結した各組織の細胞溶解物をＷＢ法で解析した結果、Ｐ５５の発現は、ＨＣＶ（＋）患者５例全例の癌部で上昇していた（図４）。ＨＢＶ（＋）では５例中３例が、ＮＢＮＣ患者群では５例中２例が癌部での発現が上昇していた。Ｐ７０の発現は、一部の患者群（Ｎｏ．１、３、６、７、１０、１１、１２及び１４）の癌部では上昇していたが、他の患者群では癌部での発現上昇は見られなかった（Ｎｏ．２、４、５、９、１３及び１５）。Ｐ３０の発現は、患者Ｎｏ．１、２、３、８、１０、１１、１２及び１４の癌部で発現上昇が見られたが、患者Ｎｏ．５、６、９、１３及び１５では見られなかった。このように、Ｐ５５はＨＣＶ（＋）患者群において最も高い割合で発現上昇が見られた（表３）。
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以上より、モノクローナル抗体クローン２−２４３や２−４３３の認識する７０ｋＤａ、３０ｋＤａ分子は、２０〜６０％の患者で癌部での発現上昇が見られた。これに対しクローン２−１５２の認識する５５ｋＤａ分子はＨＣＶ（＋）の全ての患者で発現が上昇していた。またＨＢＶ（＋）やＮＢＮＣ肝癌患者での発現上昇率は４０〜６０％だった。
さらに、Ｐ５５に関して解析した。まず、Ｐ５５の細胞内局在を明らかにするため、蛍光抗体法を行った（図５）。細胞を１％パラフォルムアルデヒドで固定し、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理（Ｆｉｘ）あるいは未処理（ｎｏｎ−ｆｉｘｅｄ）後、モノクローナル抗体２−１５２と反応させた。また、小胞体のマーカーであるＰＤＩに対する抗体（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ社製）とも同時に反応させた。その結果、小胞体のマーカーであるＰＤＩは細胞を固定（透過）しないと検出されないのに対し、Ｐ５５は細胞を固定（透過）しなくとも検出されるため、細胞表面膜に存在すると考えられた。
次にＨＣＶの発現と、ｐ５５の発現の関連性を検討した。
まず、ＨＣＶ遺伝子（ＨＣＲ６−Ｒｚ）の発現とｐ５５の発現に関連性があるか検討した。ＷＲＬ６８細胞やＨｅｐＧ２細胞にＨＣＶ遺伝子をトランスフェクションしたところ、ＷＲＬ６８細胞では発現は見られなかったが、ＨｅｐＧ２細胞でＰ５５の発現が上昇した（図６Ａ）。同様な結果が蛍光抗体法でも観察された（図７）。ＨＣＶ発現細胞株Ｒｚ−ＨｅｐＭ２−１８−６細胞、あるいは発現継代細胞（Ｒｚ−ＨｅｐＭ２−１８−６  ４８ｄ）でのｐ５５の発現変化も観察したが、ＨＣＶの発現に伴う発現上昇が見られた（図６Ｂ）。蛍光抗体法の観察によるとＲｚ−ＨｅｐＭ２−１８−６細胞でＨＣＶを発現しているもののうち５０％程度でｐ５５の発現が上昇していた（図８及び図９）。
そこで、ｐ５５を同定するため、モノクローナル抗体クローン２−１５２の抗体カラムを作製し、ＨｕＨ−７細胞溶解物を流してカラムに結合させた。結合分画を凍結乾燥後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行いＣＢＢ染色した。染色されたバンドを切り出してアミノ酸配列を決定するため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析計（ミリポア）でアミノ酸配列を決定した。その結果、ｐ５５はＤＨＣＲ２４と呼ばれる分子である確率が最も高いと考えられた。
次に、ＤＨＣＲ２４遺伝子を上述の方法でクローニングし、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターのＴ７プロモーター下流に組み込んで（ｐＧＥＭ−Ｔ−ＤＨＣＲ２４）試験管内で合成した。その結果、分子量約５５ｋＤａのタンパク質が合成され（図１０Ａ）、これがクローン２−１５２抗体と反応した（図１０Ｂ）。また、ＣＡＧプロモーター下流にＤＨＣＲ２４を組み込んだｐＣＡＧ−ＤＨＣＲをＷＲＬ６８細胞にトランスフェクションしたところ、発現が見られた（図１０Ｃ）。従って、モノクロナール抗体クローン２−１５２はＤＨＣＲ２４分子を認識していると考えられた。
［実施例２］
ＣＤＣ活性の測定
標的細胞（１０６／ｍｌ、０．１ｍｌ）に抗体（０．１ｍｌ）を加えて３０℃で３０分間インキュベーションした。次に細胞をＧＶＢバッファーで洗浄し、希釈したモルモット血清（ＳＩＧＭＡ）０．１ｍｌを加えて３７℃で６０分間インキュベーションした。細胞を０．０５％トリパンブルー０．１ｍｌで染色することにより、生存率を測定した。用いた標的細胞、抗体および補体を以下に示す。
標的細胞：ＷＲＬ６８、ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ−７
抗体：２−１５２（１、１０μｇ／ｍｌ）
正常マウスＩｇＧ（１、１０μｇ／ｍｌ）
補体：モルモット由来（ＧＶＢバッファーで１：８に希釈）
本抗体２−１５２は、補体存在下で容量依存的かつ選択的にＨｕＨ−７細胞を障害することが明らかとなった（図１１）。
蛍光抗体法（ＩＦＡ）
Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）ＯＣＴ化合物（ＴＥＤ  ＰＥＬＬＡ  Ｉｎｃ．）中のＨＣＣ患者肺のがん組織及び非がん組織の凍結切片を室温で融解し、ＰＢＳ（−）で洗浄後、ＰＢＳ（−）中の１％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定した。組織切片を１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）を用いて室温で１時間ブロッキングし、ＰＢＳ（−）で洗浄後、モノクローナル抗体２−１５２（５μｇ／ｍｌ）を加えて４℃で一晩反応させた。さらに、切片をＰＢＳ（−）で３回洗浄後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（−）中の抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ４８８（１：１０００；ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ’）２フラグメントＦｌｕｏｒ４８８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を加えて室温で３０分間反応させた。切片をＰＢＳ（−）で３回洗浄後、ＴＯ−ＰＲＯ−３（１０μｇ／ｍｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含有するベクターシールド（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｉｎｃ．）を用いてマウントした。
本抗体２−１５２は、ＨＣＣ患者の肝臓組織のうち、非癌部よりも癌部を強く染色し、かつ癌部組織の細胞膜を染色することが明らかとなった（図１２）。
【産業上の利用可能性】  ＤＨＣＲ２４を検出することにより、高精度ながんの診断が可能である。また、本発明のＤＨＣＲ２４認識抗体を用いることにより、これまで検出できなかったがんの診断や治療が可能である。
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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