(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテイナーゼＫを０．１ｗ／ｖ％、３０℃で１２０分間作用させた場合に溶解することがない難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼの産生能を有し、ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３６）及びその誘導菌株であることを特徴とするストレプトミセス属微生物。
【請求項２】
下記Ａ〜Ｃの菌学的性質を有する請求項１に記載のストレプトミセス属微生物。
Ａ．形態的性質
（１）分枝した基生菌糸より、比較的長い波状の気菌糸を伸長し、稀にかぎ状あるいはループ状を呈する。
（２）成熟した胞子鎖は１０〜５０個の卵円形の胞子を連鎖し、胞子の大きさは約０.６〜０.７×０.８〜１.０μｍである。
（３）胞子の表面は平滑である。
（４）輪生枝、菌束糸、胞子のう及び運動性胞子は認められない。
Ｂ．細胞壁組成としてＬＬ型の２，６−ジアミノピメリン酸を含有する。
Ｃ．１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列（４００〜５００ｂｐ）によるストレプトミセス属放線菌に対する相同性が９０％以上である。
【請求項３】
更に下記Ｄの菌学的性質を有する請求項２に記載のストレプトミセス属微生物。
Ｄ．各種培地における生育状態
（１）イ−スト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、２７℃培養）、うす黄［２ｅａ,ＬｔＷｈｅａｔ］の発育上に、灰白［１ｄｃ,Ｐｕｔｔｙ］〜明るいオリーブ灰[１１／２ｇｅ，Ｌｔ Ｏｌｉｖｅ Ｇｒａｙ]の気菌糸を僅かに着生し、可溶性色素は認められない。
（２）オ−トミ−ル寒天培地（ＩＳＰ−培地３、２７℃培養）、無色〜うす黄［１１／２ｃａ,Ｃｒｅａｍ］の発育上に、白の気菌糸を僅かに着生し、可溶性色素は認められない。
（３）スタ−チ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、２７℃培養）、無色の発育上に、白の気菌糸を僅かに着生し、可溶性色素は認められない。
（４）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培地５、２７℃培養）、発育は無色、気菌糸は着生せず、可溶性色素は認められない。
（５）シュクロ−ス・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）、無色の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、可溶性色素は認められない。
【請求項４】
難分解性蛋白質が、過塩素酸可溶性蛋白質、異常プリオン蛋白質、及びケラチンから選択される請求項１から３のいずれかに記載のストレプトミセス属微生物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のストレプトミセス属微生物を培養することにより得られ、プロテイナーゼＫを０．１ｗ／ｖ％、３０℃で１２０分間作用させた場合に溶解することがない難分解性蛋白質を分解可能であり、至適ｐＨが９〜１２でありかつ至適温度が６０〜７０℃であることを特徴とする難分解性蛋白質分解プロテアーゼ。
【請求項６】
Ｎ末端のアミノ酸配列が、ＹＤＬＶＧＧＤＡＹＹＩＧ、で表される請求項５に記載の難分解性蛋白質分解プロテアーゼ。
【請求項７】
難分解性蛋白質が、過塩素酸可溶性蛋白質、異常プリオン蛋白質、及びケラチンから選択される請求項５から６のいずれかに記載の難分解性蛋白質分解プロテアーゼ。
【請求項８】
請求項１から４のいずれかに記載のストレプトミセス属微生物を培養することにより得られ、プロテイナーゼＫを０．１ｗ／ｖ％、３０℃で１２０分間作用させた場合に溶解することがない難分解性蛋白質を分解可能であることを特徴とする難分解性蛋白質分解用組成物。
【請求項９】
難分解性蛋白質を分解可能であり、至適ｐＨが９〜１２でありかつ至適温度が６０〜７０℃である難分解性蛋白質分解プロテアーゼを含む請求項８に記載の難分解性蛋白質分解用組成物。
【請求項１０】
難分解性蛋白質分解プロテアーゼのＮ末端のアミノ酸配列が、ＹＤＬＶＧＧＤＡＹＹＩＧ、で表される請求項９に記載の難分解性蛋白質分解用組成物。
【請求項１１】
難分解性蛋白質が、過塩素酸可溶性蛋白質、異常プリオン蛋白質、及びケラチンから選択される請求項８から１０のいずれかに記載の難分解性蛋白質分解用組成物。
【請求項１２】
請求項１から４に記載のストレプトミセス属微生物を培養し、プロテイナーゼＫを０．１ｗ／ｖ％、３０℃で１２０分間作用させた場合に溶解することがない難分解性蛋白質を分解可能であり、至適ｐＨが９〜１２でありかつ至適温度が６０〜７０℃である難分解性蛋白質分解プロテアーゼを産生させることを特徴とする難分解性蛋白質分解プロテアーゼの製造方法。
【請求項１３】
請求項５〜７のいずれか記載の難分解性蛋白質プロテアーゼ及び請求項８〜１１のいずれかに記載の難分解性蛋白質分解用組成物の少なくともいずれかを用いて、プロテイナーゼＫを０．１ｗ／ｖ％、３０℃で１２０分間作用させた場合に溶解することがない難分解性蛋白質を分解させることを特徴とする難分解性蛋白質の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン、ケラチン等の難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼ産生能を有するストレプトミセス属微生物、該ストレプトミセス属微生物により生産され、前記難分解性蛋白質分解を分解可能な難分解性蛋白質分解プロテアーゼ及び難分解性蛋白質分解用組成物、並びに、これらを用いて前記難分解性蛋白質を分解する難分解性蛋白質の分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種の蛋白質をペプチド乃至アミノ酸に分解する技術は、例えば、医薬品や食品等の製造業をはじめとする広い分野で利用されている。前記蛋白質を分解する方法としては、化学的分解方法と、酵素的分解方法とが知られている。
前記化学的分解方法は、塩酸等を用いて前記蛋白質を化学的に分解する方法であり、分解効率に優れてはいるものの、環境汚染や過酷な分解条件により、好ましくない副産物を生成する懸念がある。一方、前記酵素的分解方法は、土壌乃至生物性汚泥など単離した微生物が産生するプロテアーゼ等の酵素を用いて前記蛋白質を酵素分解する方法であり、前記化学的分解方法における前記懸念がないため、医薬品や食品等の製造分野などをはじめとして広く利用されている（特許文献１から２参照）。
【０００３】
ところが、前記蛋白質の中には、厨芥、排水、有機廃液、産業廃棄物などに含まれ、公知のプロテアーゼでは完全に分解することができない難分解性蛋白質が存在しており、該難分解性蛋白質としては、近時話題のＢＳＥ（狂牛病）の原因タンパク質である異常プリオンなどが知られている。また、該異常プリオン以外にも、該異常プリオンと類似の構造を持ち、動物から原核生物に至るまで保存され、環境中に広く存在し、本発明者らによって発見され、過塩素酸によって肝臓細胞質画分より抽出され、蛋白質合成阻害活性を有する過塩素酸可溶性蛋白質（以下「ＰＳＰ」と称することがある）なども知られている（非特許文献１から２参照）。
【０００４】
そこで、前記異常プリオン等の難分解性蛋白質を酵素的に分解可能な各種の組成物が提案されてきている。例えば、中〜高温度以上の温度域での熱安定性と優れた蛋白質低分子化能力とを併せ持ち、難分解性蛋白質を効率よく分解可能なバチルス・ズブチリスに由来する酵素組成物（特許文献３参照）や、難分解性蛋白質の汚れ成分に対して優れた洗浄力を持つ、ピロコッカス属細菌に由来する超耐熱性プロテアーゼを含む蛋白質分解洗剤用組成物（特許文献４参照）などが知られている。
前記異常プリオン等の難分解性蛋白質を分解するには、これらの組成物以外に新規な組成物の提供が望まれており、各種の前記難分解性蛋白質を容易に効率良く、しかも完全に分解可能な酵素的分解方法に関する技術の開発が望まれているのが現状である。
【０００５】
【特許文献１】特公平７−５３１０６号公報
【特許文献２】特開平１１−７５７６５号公報
【特許文献３】特開２００１−０３７４７４号公報
【特許文献４】国際公開第００／６１７１１号パンフレット
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，３００６０，１９９５
【非特許文献２】バイオサイエンスとインダストリー，５８，１７−２２（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来における問題を解決し、前記要望に応え、厨芥、排水、有機廃液、産業廃棄物などに含まれる、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン、ケラチン等の難分解性蛋白質を効率良く分解可能なプロテアーゼ産生能を有するストレプトミセス属微生物、該ストレプトミセス属微生物により生産され、前記難分解性蛋白質分解を効率良く分解可能な難分解性蛋白質分解プロテアーゼ及び難分解性蛋白質分解用組成物、並びに、これらを用いて前記難分解性蛋白質を効率良く分解する難分解性蛋白質の分解方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために本発明者らが鋭意検討した結果、土壌中からスクリーニングした新規なストレプトミセス属微生物が産生するプロテアーゼが難分解性蛋白質を分解可能であること見出した。本発明は、本発明者らによるかかる知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段は、以下の通りである。即ち、
＜１＞  プロテイナーゼＫを０．１ｗ／ｖ％、３０℃で１２０分間作用させた場合に溶解することがない難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼの産生能を有することを特徴とするストレプトミセス属微生物である。
＜２＞  ストレプトミセス・エスピーである前記＜１＞に記載のストレプトミセス属微生物である。
＜３＞  ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３６）及びその誘導菌株である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のストレプトミセス属微生物である。
＜４＞  下記Ａ〜Ｃの菌学的性質を有する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のストレプトミセス属微生物である。
Ａ．形態的性質
（１）分枝した基生菌糸より、比較的長い波状の気菌糸を伸長し、稀にかぎ状あるいはループ状を呈する。
（２）成熟した胞子鎖は１０〜５０個の卵円形の胞子を連鎖し、胞子の大きさは約０.６〜０.７×０.８〜１.０μｍである。
（３）胞子の表面は平滑である。
（４）輪生枝、菌束糸、胞子のう及び運動性胞子は認められない。
Ｂ．細胞壁組成としてＬＬ型の２，６−ジアミノピメリン酸を含有する。
Ｃ．１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列（４００〜５００ｂｐ）によるストレプトミセス属放線菌に対する相同性が９０％以上である。
＜５＞  更に下記Ｄの菌学的性質を有する前記＜４＞に記載のストレプトミセス属微生物である。
Ｄ．各種培地における生育状態
（１）イ−スト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、２７℃培養）、うす黄［２ｅａ,ＬｔＷｈｅａｔ］の発育上に、灰白［１ｄｃ,Ｐｕｔｔｙ］〜明るいオリーブ灰[１１／２ｇｅ，Ｌｔ Ｏｌｉｖｅ Ｇｒａｙ]の気菌糸を僅かに着生し、可溶性色素は認められない。
（２）オ−トミ−ル寒天培地（ＩＳＰ−培地３、２７℃培養）、無色〜うす黄［１１／２ｃａ,Ｃｒｅａｍ］の発育上に、白の気菌糸を僅かに着生し、可溶性色素は認められない。
（３）スタ−チ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、２７℃培養）、無色の発育上に、白の気菌糸を僅かに着生し、可溶性色素は認められない。
（４）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培地５、２７℃培養）、発育は無色、気菌糸は着生せず、可溶性色素は認められない。
（５）シュクロ−ス・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）、無色の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、可溶性色素は認められない。
＜６＞  難分解性蛋白質が、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン蛋白質、及びケラチンから選択される前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のストレプトミセス属微生物である。
＜７＞  前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のストレプトミセス属微生物を培養することにより得られ、プロテイナーゼＫを０．１ｗ／ｖ％、３０℃で１２０分間作用させた場合に溶解することがない難分解性蛋白質を分解可能であり、至適ｐＨが９〜１２でありかつ至適温度が６０〜７０℃であることを特徴とする難分解性蛋白質分解プロテアーゼである。
＜８＞  Ｎ末端のアミノ酸配列が、ＹＤＬＶＧＧＤＡＹＹＩＧ、で表される前記＜７＞に記載の難分解性蛋白質分解プロテアーゼである。
＜９＞  難分解性蛋白質が、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン蛋白質、及びケラチンから選択される前記＜７＞から＜８＞のいずれかに記載の難分解性蛋白質分解プロテアーゼである。
＜１０＞  前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のストレプトミセス属微生物を培養することにより得られ、プロテイナーゼＫを０．１ｗ／ｖ％、３０℃で１２０分間作用させた場合に溶解することがない難分解性蛋白質を分解可能であることを特徴とする難分解性蛋白質分解用組成物である。
＜１１＞  難分解性蛋白質を分解可能であり、至適ｐＨが９〜１２でありかつ至適温度が６０〜７０℃である難分解性蛋白質分解プロテアーゼを含む前記＜１０＞に記載の難分解性蛋白質分解用組成物である。
＜１２＞  難分解性蛋白質分解プロテアーゼのＮ末端のアミノ酸配列が、ＹＤＬＶＧＧＤＡＹＹＩＧ、で表される前記＜１１＞に記載の難分解性蛋白質分解用組成物である。
＜１３＞  難分解性蛋白質が、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン蛋白質、及びケラチンから選択される前記＜１０＞から＜１２＞のいずれかに記載の難分解性蛋白質分解用組成物である。
＜１４＞  前記＜１＞から＜６＞に記載のストレプトミセス属微生物を培養し、プロテイナーゼＫを０．１ｗ／ｖ％、３０℃で１２０分間作用させた場合に溶解することがない難分解性蛋白質を分解可能であり、至適ｐＨが９〜１２でありかつ至適温度が６０〜７０℃である難分解性蛋白質分解プロテアーゼを産生させることを特徴とする難分解性蛋白質分解プロテアーゼの製造方法である。
＜１５＞  難分解性蛋白質分解プロテアーゼを産生させたストレプトミセス属微生物の培養物から、該ストレプトミセス属微生物を除去する前記＜１４＞に記載の難分解性蛋白質分解プロテアーゼの製造方法である。
＜１６＞  前記＜７＞から＜９＞のいずれか記載の難分解性蛋白質プロテアーゼ及び前記＜１０＞から＜１３＞のいずれかに記載の難分解性蛋白質分解用組成物の少なくともいずれかを用いて、プロテイナーゼＫを０．１ｗ／ｖ％、３０℃で１２０分間作用させた場合に溶解することがない難分解性蛋白質を分解させることを特徴とする難分解性蛋白質の分解方法である。
＜１７＞  難分解性蛋白質が、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン蛋白質、及びケラチンから選択される前記＜１６＞に記載の難分解性蛋白質の分解方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、従来における問題を解決することができ、厨芥、排水、有機廃液、産業廃棄物などに含まれる、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン、ケラチン等の難分解性蛋白質を効率良く分解可能なプロテアーゼ産生能を有するストレプトミセス属微生物、該ストレプトミセス属微生物により生産され、前記難分解性蛋白質分解を効率良く分解可能な難分解性蛋白質分解プロテアーゼ及び難分解性蛋白質分解用組成物、並びに、これらを用いて前記難分解性蛋白質を効率良く分解する難分解性蛋白質の分解方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（ストレプトミセス属微生物）
本発明のストレプトミセス属微生物は、難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼの産生能を有するストレプトミセス属である限り、その種や株等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、下記Ａ〜Ｃの菌学的性質を有するものが好適に挙げられ、下記Ａ〜Ｄの菌学的性質を有するものがより好適に挙げられる。なお、本発明においては、前記Ａ〜Ｃ又は前記Ａ〜Ｄの菌学的性質を有するものの中で、後述する、前記難分解性蛋白質の分解能が互いに異なるものは、互いに異なる菌株であるが、これらは、いずれも本発明の前記ストレプトミセス属微生物であることに変わりがない。
【００１０】
Ａ．形態的性質
（１）分枝した基生菌糸より、比較的長い波状の気菌糸を伸長し、稀にかぎ状あるいはループ状を呈する。
（２）成熟した胞子鎖は１０〜５０個の卵円形の胞子を連鎖し、胞子の大きさは約０.６〜０.７×０.８〜１.０μｍである。
（３）胞子の表面は平滑である。
（４）輪生枝、菌束糸、胞子のう及び運動性胞子は認められない。
Ｂ．細胞壁組成としてＬＬ型の２，６−ジアミノピメリン酸を含有する。
Ｃ．１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列（４００〜５００ｂｐ）によるストレプトミセス属放線菌に対する相同性が９０％以上である。
【００１１】
なお、前記形態的性質は、前記ストレプトミセス属微生物を、例えば、以下の組成を有するコロイダル・キチン寒天培地等に接種して培養することにより、好適に調べることができる。
［コロイダル・キチン寒天培地（ｐＨ７．０）組成］
コロイダル・キチン                      ２ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４                          ０．７ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                          ０．３ｇ
ＭｇＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                  ０．５ｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                ０．０１ｇ
ＺｎＳＯ４                        ０．００１ｇ
ＭｎＣｌ２                        ０．００１ｇ
寒天                                  ２０ｇ
脱イオン水                      １０００ｍｌ
（なお、上記コロイダル・キチンは、微生物実験マニュアル（講談社、協和発酵東京研究所編、１９８６）記載の方法に従って作製した。即ち、粗キチン（和光純薬工業社製）を苛性ソーダ、１Ｎ塩酸で２４時間洗浄した。これを５回ずつ行った後、９５％エタノールで４回洗浄した。こうして得られた白色キチン（１５ｇ）を濃塩酸１００ｍｌ中に入れ、氷で冷やし撹拌した。ガラスウールでろ過したろ液を氷冷水中に注ぎ、キチンの沈殿を形成させた。なお、グラスウール上のものは更に塩酸で処理し、同様な操作を繰り返してキチンを回収した。キチン溶液は一晩放置した後、苛性ソーダでｐＨ７．０に調整し、遠沈で分離、洗浄することによりキチンを回収した。）
【００１２】
Ｄ．各種培地における生育状態
（１）イ−スト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、２７℃培養）、うす黄［２ｅａ,ＬｔＷｈｅａｔ］の発育上に、灰白［１ｄｃ,Ｐｕｔｔｙ］〜明るいオリーブ灰[１１／２ｇｅ，Ｌｔ Ｏｌｉｖｅ Ｇｒａｙ]の気菌糸を僅かに着生し、可溶性色素は認められない。
（２）オ−トミ−ル寒天培地（ＩＳＰ−培地３、２７℃培養）、無色〜うす黄［１１／２ｃａ,Ｃｒｅａｍ］の発育上に、白の気菌糸を僅かに着生し、可溶性色素は認められない。
（３）スタ−チ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、２７℃培養）、無色の発育上に、白の気菌糸を僅かに着生し、可溶性色素は認められない。
（４）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培地５、２７℃培養）、発育は無色、気菌糸は着生せず、可溶性色素は認められない。
（５）シュクロ−ス・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）、無色の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、可溶性色素は認められない。
【００１３】
これらのストレプトミセス属微生物の中でも、難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼ産生能に優れる点で、ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ）が好ましい。該ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ.）は、土壌に多く存在し、病原性は確認されていない。
前記ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ.）の中でも、ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３６）、ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−３株、これらの誘導菌株などがより好ましく、ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３６）及びその誘導菌株が特に好ましい。
【００１４】
なお、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株は、独立行政法人産業技術総合研究所に寄託されており（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３６）、入手可能である。該ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株及びストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−３株は、例えば、以下のようにして、土壌から分離することができる。即ち、例えば、採取した土壌１ｇを滅菌した９ｍｌの脱イオン水で希釈し、それを更に１０２、１０３倍に希釈する。次に、各希釈液の０.１ｍｌを後述のColloidal chitin agar培地の寒天平面に撒き、２７℃で培養する。そして、微生物の識別はコロニーの形状、微生物菌体の顕微鏡観察及び生化学試験により、また、複数の菌株が混じっているときは更に希釈法によって、上述したＡ〜Ｄの菌学的性質を有する菌株を分離することにより、土壌から分離することができる。
【００１５】
前記誘導菌株としては、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼの産生能を有する限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３６）等の子孫、変異株、などが挙げられる。
前記子孫としては、例えば、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼ産生能を有する前記ストレプトミセス属微生物を系代培養することにより得られた菌株、などが挙げられる。
前記変異株としては、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼの産生能を有する前記ストレプトミセス属微生物の変異株であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、変異の原因としては、人工的であってもよいし、自然発生的であってもよく、前者の原因による変異株を人工変異株（人工変異体）を称し、後者の原因による変異株を自然変異株（自然変異体）と称することがある。前記変異の原因の具体例としては、紫外線、エックス線等の電離放射線、薬剤、遺伝子組換え、などが挙げられる。前記変異の原因は、１種単独である場合もあれば、２種以上の組合せによる場合もある。
なお、前記ストレプトミセス属微生物、特に、前記前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３６）等の菌株は、その性状が変化し易く、例えば、紫外線、エックス線、薬剤等により、容易に変異し、変異株（変異体）となる。
【００１６】
前記難分解性蛋白質とは、プロテイナーゼＫを０．１ｗ／ｖ％、３０℃で１２０分間作用させた場合にも溶解しない蛋白質を意味し、特に制限はなく、公知のものが挙げられ、例えば、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン蛋白質、ケラチン、などが挙げられる。
なお、これらの難分解性蛋白質は、例えば、厨芥、排水、有機廃液、産業廃棄物などに含まれている。
【００１７】
本発明において、前記難分解性蛋白質を「分解可能」とは、ブタ肝臓由来の過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）０．６ｍｇ/ｍｌと、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３６）の培養液中のプロテアーゼ０．００３ｍｇ/ｍｌとを混合し、３７℃で６０分間反応させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、前記ＰＳＰバンドの消失乃至残存を観察する蛋白質分解試験において該ＰＳＰバンドが消失したことを意味する（なお、前記ＰＳＰバンドの消失乃至残存については、前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で電気泳動させたサンプルをウエスタン・ブロティングしたものを目視にて観察することができる）。
【００１８】
また、本発明において、前記過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）を「分解可能」とは、ブタ肝臓由来の過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）０．６ｍｇ/ｍｌと、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３６）の培養液中のプロテアーゼ０．００３ｍｇ/ｍｌとを混合し、３７℃で６０分間反応させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、前記ＰＳＰバンドの消失乃至残存を観察する蛋白質分解試験において該ＰＳＰバンドが消失したことを意味し、また、前記異常プリオン蛋白質を「分解可能」とは、クロイツフェルト・ヤコブ病由来又はスクレイピー由来の異常プリオン蛋白質０．６ｍｇ/ｍｌと、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３６）の培養液中のプロテアーゼ０．００３ｍｇ/ｍｌとを混合し、３７℃で６０分間反応させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、前記異常プリオン蛋白質バンドの消失乃至残存を観察する蛋白質分解試験において該異常プリオン蛋白質バンドが消失したことを意味し、また、前記ケラチンを「分解可能」とは、ケラチン０．６ｍｇ/ｍｌと、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３６）の培養液中のプロテアーゼ０．００３ｍｇ/ｍｌとを混合し、３７℃で６０分間反応させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、ケラチンバンドの消失乃至残存を観察する蛋白質分解試験において該ケラチンバンドが消失したことを意味する。なお、前記ＰＳＰバンド、前記異常プリオンバンド、又は前記ケラチンバンドの消失乃至残存については、前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で電気泳動させたサンプルをウエスタン・ブロティングしたものを目視にて観察することができる。
【００１９】
なお、前記培養液における培地組成は、ＳＡ培地（ｐＨ７.０）＜肉エキス（極東製薬工業社製）：０．３ｇ、トリプトース（Ｄｉｆｃｏ社製）：０．５ｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）：０．５ｇ、グルコース（和光純薬工業社製）：０．１ｇ、溶性でんぷん（和光純薬工業社製）：２．４ｇ、ＣａＣＯ３：０．２ｇ、脱イオン水：１００ｍｌ＞であり、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３６）の接種量は、１〜２質量％であり、培養条件は、三角フラスコ内で２０℃〜４０℃、４〜６日間、１８０ｒｐｍの液体振とう培養である。
【００２０】
前記蛋白質分解試験においては、３７℃で６０分間反応させた後における前記ＰＳＰバンドの消失を確認することにより、前記難分解性蛋白質が「分解可能」であると判定するが、このことは、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３６）の培養液が、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼ活性を有することを意味し、前記ＰＳＰバンドの消失に要する時間が短い程、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３６）の培養液における、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼ活性が高いことを意味する（例えば、前記ＰＳＰバンドの消失までに要する時間が６０分間よりも２０分間の方が前記プロテアーゼ活性が高く、２０分間よりも５分間の方が前記プロテアーゼ活性が高い）。なお、本発明においては、前記プロテアーゼ活性が異なる菌株どうしは、互いに異なる菌株であるが、該プロテアーゼ活性を有する限り、前記難分解性蛋白質を「分解可能」であることに変わりがない。
【００２１】
前記ストレプトミセス属微生物は培養することにより、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼを産生するが、該培養としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液体培養法、寒天培養法、固体培養法、などが挙げられる。これらは、１種単独で採用してもよいし、２種以上組合せて採用してもよい。
前記液体培養法としては、例えば、振とう培養、静置培養、などが挙げられる。
前記寒天培養法としては、例えば、スラント培養、プレート培養、などが挙げられる。
前記固体培養法としては、例えば、前記寒天培地以外の培地上で培養する方法などが挙げられる。
これらの中でも、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼが培養液中に分泌され、該プロテアーゼが効率的に得られる点で、液体培養が好ましく、その中でも、振とう培養がより好ましい。
【００２２】
前記培養の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、その温度としては、２０℃〜４０℃が好ましく、そのｐＨとしては、弱酸性乃至アルカリ性（具体的にはｐＨ６〜１１）が好ましく、その培養日数としては、前記プロテアーゼの産生量に応じて適宜決定すればよいが、例えば液体培養の場合には４〜６日間が好ましい。通常は、この程度の期間の培養で、培養液中に前記プロテアーゼの十分な量が生成蓄積される。
【００２３】
前記培養のための培地としては、特に制限はなく、公知の放線菌培養培地、ストレプトミセス属微生物の培養培地として使用されているものなどが挙げられる。
前記培地の炭素源としては、例えば、グルコ−ス、ポテトスタ−チ、デキストリンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記培地の無機窒素源及び有機窒素源としては、例えば、酵母エキス、トリプトース、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、肉エキス、トマトピューレなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記培地には、その他必要に応じて、食塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、硫酸鉄、硫酸亜鉛、塩化マンガン、塩化コバルト、燐酸塩などの無機塩類を添加してもよいし、アミノ酸類、ビタミン類、核酸類などの有機物などを添加してもよい。
【００２４】
例えば、前記ストレプトミセス属微生物を、前記ＳＡ培地１００ｍｌに１〜２ｍｌだけ接種し、３０℃で５日間、振とう培養（１８０ｒｐｍ）すると、その培養液中には、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼが産生される。
前記ストレプトミセス属微生物の前記培養液は、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼを含有しているので、そのままで又は前記ストレプトミセス属微生物をろ別乃至除去することにより、後述する本発明の難分解性蛋白質分解用組成物が得られ、また、該培養液から前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼを分離することにより、後述する本発明の難分解性蛋白質分解プロテアーゼが得られる。
【００２５】
本発明のストレプトミセス属微生物は、培養することにより、後述する、本発明の難分解性蛋白質分解用組成物又は本発明の難分解性蛋白質分解プロテアーゼの製造に好適に使用することができ、また、厨芥、排水、有機廃液、産業廃棄物等に含まれる前記難分解性蛋白質を効率的に分解する目的で、これらに直接付与されて使用することができる。
後者の場合には、本発明の前記ストレプトミセス属微生物をそのまま付与してもよいし、その培養物（培養液等）を付与してもよく、該培養物（培養液等）を付与する場合には、該培養物（培養液等）をそのまま散布してもよいし、常法により製剤化、粉末化等してから付与してもよい。
【００２６】
（難分解性蛋白質分解用組成物及び難分解性蛋白質分解プロテアーゼ）
本発明の難分解性蛋白質分解用組成物は、本発明の前記ストレプトミセス属微生物を培養することにより得られる。該難分解性蛋白質分解用組成物としては、例えば、前記ストレプトミセス属微生物の培養物（培養液など）をそのまま使用してもよいし、該培養物から前記ストレプトミセス属微生物を除去（例えば、ろ別等）して得た培養上清を使用してもよい。なお、前記培養上清に対しては、更に不純物等の除去等を行い、精製処理等を行ってもよい。
なお、前記ストレプトミセス属微生物の培養等の詳細にについては、上述した通りである。
【００２７】
前記難分解性蛋白質分解用組成物としては、プロテイナーゼＫを０．１質量％、３０℃で１２０分間作用させた場合に溶解することがない難分解性蛋白質を分解可能であれば、その組成等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記難分解性蛋白質を分解可能な本発明の難分解性蛋白質分解プロテアーゼを含有するものが好適に挙げられる。
【００２８】
前記難分解性蛋白質分解用組成物における前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、該難分解性蛋白質分解用組成物が前記難分解性蛋白質を分解可能な程度であればよく、０．０２〜０．３ｗ／ｖ％などが挙げられる。
【００２９】
本発明の前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼは、例えば、前記難分解性蛋白質分解用組成物を精製することにより好適に得られ、また、本発明の前記ストレプトミセス属微生物を上述のように培養し、難分解性蛋白質分解プロテアーゼを産生させること、好ましくは更に産生した該難分解性蛋白質分解プロテアーゼを分離乃至精製することにより得られる。
【００３０】
前記精製の方法、前記分離乃至精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール沈殿、酸抽出、透析、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、などの方法が好適に挙げられる。これらは、単独で行ってもよいし、２以上を併用してもよい。これらの中でも、前記高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどが好ましく、該アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明の前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼに対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、本発明の前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼに通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラム、などが好適に挙げられる。
【００３１】
前記難分解性蛋白質分解プロテーゼの純度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、０．３質量％以上が好ましく、純品（１００％）であるのが特に好ましい。
【００３２】
前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼの物性としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、そのｐＨとしては、例えば、９〜１２であるのが好ましく、その至適温度としては、６０〜７０℃であるのが好ましい。
前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼの中でも、Ｎ末端のアミノ酸配列が、ＹＤＬＶＧＧＤＡＹＹＩＧ、で表されるアミノ酸配列（後掲のアミノ酸配列表リスト参照）を有するものが、前記難分解性蛋白質の分解活性等の点で、特に好ましい。
なお、前記難分解性蛋白質としては、上述した通りであり、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン蛋白質、ケラチン、などが挙げられる。これらの難分解性蛋白質は、例えば、厨芥、排水、有機廃液、産業廃棄物などに含まれている。
【００３３】
本発明の前記難分解性蛋白質分解用組成物及び前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼは、前記難分解性蛋白質の分解に使用することができ、後述する本発明の難分解性蛋白質の分解方法に特に好適に使用することができる。前記難分解性蛋白質又はそれを含む対象に対し、本発明の前記難分解性蛋白質分解用組成物及び前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼの少なくともいずれかを作用させると、前記難分解性蛋白質を確実に分解させることができる点で有利である。
【００３４】
（難分解性蛋白質の分解方法）
本発明の難分解性蛋白質の分解方法は、上述した、本発明の前記難分解性蛋白質プロテアーゼ及び本発明の前記難分解性蛋白質分解用組成物の少なくともいずれかを用いて、前記難分解性蛋白質を分解させることを含み、更に必要に応じて適宜選択したその他の処理を含む。
前記難分解性蛋白質の分解の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐＨとしては９〜１２などが好ましく、温度としては６０〜７０℃が好ましい。
なお、前記分解の際には、反応を効率的にすることができる点で、攪拌等を行うのが好ましい。
また、前記難分解性蛋白質に対し、作用させる前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼの量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０２〜０．３ｗ／ｖ％が好ましく、０．６ｗ／ｖ％以上がより好ましい。
【００３５】
前記難分解性蛋白質としては、上述した通りであり、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン蛋白質、ケラチン、などが挙げられる。これらの難分解性蛋白質は、例えば、厨芥、排水、有機廃液、産業廃棄物などに含まれている。
本発明の前記難分解性蛋白質の分解方法は、前記難分解性蛋白質の分解に特に好適に使用することができる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３７】
（実施例１）
−ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の単離−
採取した土壌１ｇを滅菌した９ｍｌの脱イオン水で希釈し、それを更に１０２、１０３倍に希釈した。次に、各希釈液の０.１ｍｌを後述のコロイダル・キチン寒天培地（Colloidal chitin agar 培地）のプレートに撒き、２７℃で培養した。なお、微生物の識別はコロニーの形状、微生物菌体の顕微鏡観察及び生化学試験により、また、複数の菌株が混じっているときは更に希釈法によって、上述したＡ〜Ｄの菌学的性質を有する菌株を分離した。なお、上述したＡ．形態的性質を観察した際の電子顕微鏡写真を図１に示し、上述したＤ．生育状態を観察した際の電子顕微鏡写真を図２に示した。前記電子顕微鏡写真は、常法に従い、試料を臨界点で乾燥後に金蒸着してから走査型顕微鏡を用いて撮影したものである。
分離した微生物菌株の諸性質は、ストレプトミセス属微生物が所有する諸性質とよく対応したが、従来公知のストレプトミセス属微生物とは、その１６Ｓリボゾーム遺伝子の部分塩基配列（４５９ｂｐ）による相同性が９５％であり、完全に一致しなかったので、この分離微生物菌株を新規微生物と判断し、ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株と命名した。得られたストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株は、平成１５年５月７日に本出願人によって独立行政法人産業技術総合研究所にて寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３６が付与された。
【００３８】
［コロイダル・キチン寒天培地（ｐＨ７．０）組成］
コロイダル・キチン                      ２ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４                          ０．７ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                          ０．３ｇ
ＭｇＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                  ０．５ｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                ０．０１ｇ
ＺｎＳＯ４                        ０．００１ｇ
ＭｎＣｌ２                        ０．００１ｇ
寒天                                  ２０ｇ
脱イオン水                      １０００ｍｌ
（なお、上記コロイダル・キチンは、微生物実験マニュアル（講談社、協和発酵東京研究所編、１９８６）記載の方法に従って作製した。即ち、粗キチン（和光純薬工業社製）を苛性ソーダ、１Ｎ塩酸で２４時間洗浄した。これを５回ずつ行った後、９５％エタノールで４回洗浄した。こうして得られた白色キチン（１５ｇ）を濃塩酸１００ｍｌ中に入れ、氷で冷やし撹拌した。ガラスウールでろ過したろ液を氷冷水中に注ぎ、キチンの沈殿を形成させた。なお、グラスウール上のものは更に塩酸で処理し、同様な操作を繰り返してキチンを回収した。キチン溶液は一晩放置した後、苛性ソーダでｐＨ７．０に調整し、遠沈で分離、洗浄することによりキチンを回収した。）
【００３９】
（実施例２）
−難分解性蛋白質分解用組成物の調製及び難分解性蛋白質の分解−
ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株を以下のＳＡ培地で２７℃、５日間、液体振とう培養（１８０ｒｐｍ）した。
［ＳＡ培地（ｐＨ７.０）組成］
肉エキス（極東製薬工業社製）         ０．３ｇ
トリプトース（Ｄｉｆｃｏ社製）       ０．５ｇ
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）         ０．５ｇ
グルコース（和光純薬工業社製）       ０．１ｇ
溶性でんぷん（和光純薬工業社製）     ２．４ｇ
ＣａＣＯ３                             ０．２ｇ
脱イオン水                          １００ｍｌ
【００４０】
培養終了後、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の菌体を遠心分離により除いた後、培養上清を５５℃で１時間加熱し、前記プロテアーゼ以外の蛋白質を失活させた。こうしてストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の培養液による本発明の難分解性蛋白質分解用組成物を調製した。
ここで、調製した難分解性蛋白質分解用組成物の、前記難分解性蛋白質の分解活性を以下のようにして調べた。即ち、前記難分解性蛋白質分解用組成物としての、ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の培養液２０μｌ（０．００３ｍｇ/ｍｌ）と、前記難分解性蛋白質として、文献（J. Biol. Chem., 270, 30060, 1995）記載の方法に準じて調製したブタ肝臓由来蛋白質ＰＳＰ２０μｌ（０．６ｍｇ/ｍｌ）とを混合し、３７℃で６０分間反応させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、前記ＰＳＰバンドの消失乃至残存を観察する蛋白質分解試験において該ＰＳＰバンドが消失したかどうかを観察した（なお、前記ＰＳＰバンドの消失乃至残存については、前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で電気泳動させたサンプルをウエスタン・ブロティングしたものを目視にて観察した）。
【００４１】
結果を図３（右）に示した。また、対照として、既知のプロテアーゼであるプロテイナーゼＫ（和光純薬工業社製）を用いて同様の蛋白質分解試験を行った結果を図３（左）に示した。図３に示す結果からも明らかなように、前記難分解性蛋白質分解用組成物としての、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の培養液の場合、ＰＳＰバンドが反応開始から５分間で完全に消失し、該ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株が前記難分解性蛋白質である前記ＰＳＰに対して優れた分解能を有し、難分解性蛋白質分解プロテアーゼの産生能に優れた菌株であることが判った。なお、このことは、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株が、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼの産生能を有していたことを意味する。
一方、対照である前記プロテイナーゼＫの場合では、３７℃で６０分間反応させた場合にはＢＳＡ（牛血清アルブミン；シグマ社製）は分解できたものの前記ＰＳＰについては分解することができなかった。
【００４２】
上記同様に、前記難分解性蛋白質分解用組成物としての、ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の培養液２０μｌ（０．００３ｍｇ/ｍｌ）と、前記難分解性蛋白質として、クロイツフェルト・ヤコブ病由来異常プリオン蛋白質（ＣＪＤ）若しくはスクレイピー由来異常プリオン蛋白質２０μｌ（３ｍｇ/ｍｌ）又は４０μｌ（３ｍｇ／ｍｌ）とを混合し、３７℃で６０分間反応させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、前記異常プリオン蛋白質バンドの消失乃至残存を観察する蛋白質分解試験において該異常プリオン蛋白質バンドが消失したかどうかを観察した（なお、前記異常プリオン蛋白質バンドの消失乃至残存については、前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で電気泳動させたサンプルをウエスタン・ブロティングしたものを目視にて観察した）。
【００４３】
結果を４（右）に示した。また、対照として、既知のプロテアーゼであるプロテイナーゼＫ（和光純薬工業社製）を、濃度を変更して（２μｇ／２０μｌ、４μｇ／２０μｌ、１０μｇ/２０μｌ）用いて同様の蛋白質分解試験を行った結果を図４（左）に示した。図４に示す結果からも明らかなように、前記難分解性蛋白質分解用組成物としての、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の培養液の場合、前記異常プリオン蛋白質バンドが反応開始から５分間で完全に消失し、該ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株が前記難分解性蛋白質である前記異常プリオン蛋白質に対して優れた分解能を有し、難分解性蛋白質分解プロテアーゼの産生能に優れた菌株であることが判った。なお、このことは、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株が、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼの産生能を有していたことを意味する。
一方、対照である前記プロテイナーゼＫの場合では、３７℃で６０分間反応させても異常プリオン蛋白質を分解することができなかった。
【００４４】
上記同様に、前記難分解性蛋白質分解用組成物としての、ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の培養液２０μｌ（０．００３ｍｇ/ｍｌ）と、前記難分解性蛋白質として、ケラチン２０μｌ（０．６ｍｇ/ｍｌ）とを混合し、３７℃で６０分間反応させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、前記ケラチンバンドの消失乃至残存を観察する蛋白質分解試験において該ケラチンバンドが消失したかどうかを観察した（なお、前記ケラチンバンドの消失乃至残存については、前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で電気泳動させたサンプルをウエスタン・ブロティングしたものを目視にて観察した）。
【００４５】
結果としては、前記難分解性蛋白質分解用組成物としての、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の培養液の場合、前記ケラチンバンドが反応開始から５分間で完全に消失し、該ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株が前記難分解性蛋白質である前記ケラチンに対して優れた分解能を有し、難分解性蛋白質分解プロテアーゼの産生能に優れた菌株であることが判った。なお、このことは、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株が、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼの産生能を有していたことを意味する。
一方、対照である前記プロテイナーゼＫの場合では、３７℃で６０分間反応させてもケラチンを分解することができなかった。
【００４６】
（実施例３）
−難分解性蛋白質分解プロテアーゼの調製−
実施例２で調製した難分解性蛋白質分解用組成物に対し、２０％硫酸アンモニウム沈殿を行い、その沈殿物を除去し、残りの上清に対し、８０％硫酸アンモニウムで飽和し、遠心分離により粗精製酵素を得た。この粗精製酵素を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に対し透析し、透析内液をＳｅｐｈａｄｅｘ−ＳＰイオン交換により精製した。以上により、実施例２で調製した難分解性蛋白質分解用組成物から難分性蛋白質分解プロテアーゼを得た。
【００４７】
得られた前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、前記ＰＳＰ、前記異常プリオン蛋白質、又は前記ケラチンの各バンドの消失乃至残存を観察する蛋白質分解試験を実施例２において、前記難分解性蛋白質分解用組成物としての、ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の培養液に代えて、得られた前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼに代えた以外は、実施例２と同様にして行ったところ、実施例２における前記難分解性蛋白質分解用組成物と同様に、実施例３の難分解性蛋白質分解プロテアーゼも前記難分解性蛋白質の分解活性を有していることが判った。
【００４８】
（実施例４）
−難分解性蛋白質分解プロテアーゼの理化学的性質−
実施例３で調製した難分解性蛋白質分解プロテアーゼの至適ｐＨ、至適温度、分子量、末端アミノ酸配列について、以下のようにして調べた。
即ち、実施例３で得られた難分解性蛋白質分解プロテアーゼの至適温度は、ｐＨ１１．５の緩衝液に、前記ＰＳＰと、前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼとを加えて５０μｌとし（前記ＰＳＰの濃度は０．６ｍｇ／ｍｌ、前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼの濃度は０．００３ｍｇ／ｍｌ）、種々の温度で１０分間インキュベートした後、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ：１ｍＭ）を含む２倍希釈のサンプルバッファーを加えて１００℃で５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロットとを行い、イメージアナライザー（富士写真フィルム社製）を用いて得られたバンドをスキャンすることにより調べた。結果を図５（左）示した。
【００４９】
また、実施例３で得られた難分解性蛋白質分解プロテアーゼの至適ｐＨは、ｐＨ３〜１２までの緩衝液に、前記ＰＳＰと、前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼとを加えて５０μｌとし（前記ＰＳＰの濃度は０．６ｍｇ／ｍｌ、前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼの濃度は０．００３ｍｇ／ｍｌ）、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ：１ｍＭ）を含む２倍希釈のサンプルバッファーを加えて１００℃で５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロットとを行い、イメージアナライザー（富士写真フィルム社製）を用いて得られたバンドをスキャンすることにより調べた。結果を図５（右）に示した。
【００５０】
また、実施例３で得られた難分解性蛋白質分解プロテアーゼの分子量は、マススペクトル分析器（日本電子社製）を用いた質量分析により測定したところ、１９，３２７であった。
また、実施例３で得られた難分解性蛋白質分解プロテアーゼのＮ末端のアミノ酸配列は、ＨＰ  Ｇ１００５Ａ  プロテイン・シークエンシング・システム（ヒューレット・パッカード社製）を用いたエドマン分解法により測定したところ、ＹＤＬＶＧＧＤＡＹＹＩＧ、で表されるアミノ酸配列（後掲のアミノ酸配列表リスト参照）を有していることが判った。
【００５１】
実施例３で調製した難分解性蛋白質分解プロテアーゼは、Ｎ末端のアミノ酸配列が、Tyr  Asp  Leu  Val  Gly  Gly  Asp  Ala  Tyr  Tyr  Ile  Gly  （ＹＤＬＶＧＧＤＡＹＹＩＧ）（配列番号１）で表される点で、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ.  ＹＳＡ−１３０により産生され、ＣＭ−セファデックス・カラムクロマトグラフィー及び結晶化により均一に精製された細胞外アルカリ性セリンプロテアーゼであり、Ｎ末端アミノ酸配列が、Tyr  Asp  Leu  Val  Gly  Gly  Asp  Ala  Tyr  Tyr  Met  Gly  Gly  Gly  Asp（ＹＤＬＶＧＧＤＡＹＹＭＧＧＧＤ）（配列番号２）で表される既知のＳＡＰとは異なることが判った。
なお、前記ＳＡＰは、分子量が１９，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びゲル濾過で測定）の単量体タンパク質であり、そのアミノ産組成物及びＮ末端配列は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓプロテアーゼＡ及びＢ、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｘｙｍｏｇｅｎｅｓ  α−溶解プロテアーゼ、及びＮｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｐｒａｓｉｎａ  ＯＰＣ−２１０  アルカリ性セリンプロテアーゼＮＤＰ−Ｉなどのその他の細菌性セリンプロテアーゼのアミノ産組成物及びＮ末端配列に酷似し、その至適温度及び至適ｐＨは６０℃及びｐＨ１１．５であり、温度５０℃までｐＨ４〜１２の間で安定的であり、その活性は、Ａｇ＋、Ｈｇ＋、Ｃｏ２＋、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ−ブロモこはく酸イミド、ＤＦＰ（diisopropyl  N-ethylmaleimide）、ＤＴＮＢ（2,3-ブタンジオン,  5,5'-ジチオビス-(２-nitrobenzonic  acid)）、ヨード酢酸、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、フェニルメタンスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）及びフェニルグリオキサールにより阻害されることが報告されている（Biosci.  Biotech.  Biochem.,  58(3),  470-474,  1994参照）。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明のストレプトミセス属微生物、難分解性蛋白質分解プロテアーゼ、難分解性蛋白質分解用組成物、及び難分解性蛋白質の分解方法は、厨芥、排水、有機廃液、産業廃棄物などに含まれる、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン、ケラチン等の難分解性蛋白質を効率良く分解し、発生する残渣の発生量を大幅に低減させるのに好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、上述したＡ．形態的性質を観察した際の電子顕微鏡写真である。
【図２】図２は、上述したＤ．生育状態を観察した際の電子顕微鏡写真である。
【図３】図３は、本発明のストレプトミセス属微生物であるストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の優れた難分解性蛋白質ＰＳＰ分解プロテアーゼ活性を示す実験データであり、右図は、ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５の培養液とＰＳＰとを３７℃で、０、１、５、１５分間それぞれ反応させたときのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像であり、左図は、既知プロテアーゼであるプロテイナーゼＫを、ＢＳＡ又はＰＳＰと３７℃で０分間又は６０分間反応させたときのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。
【図４】図４は、本発明のストレプトミセス属微生物であるストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の優れた難分解性蛋白質異常プリオン分解プロテアーゼ活性を示す実験データであり、右図は、ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５の培養液２０μｌ若しくは４０μｌ、又は、既知プロテアーゼであるプロテイナーゼＫ２μｇ／２０μｌ、４μｇ／２０μｌ、１０μｇ/２０μｌと、クロイツフェルト・ヤコブ病由来異常プリオン蛋白質（ＣＪＤ）を３７℃で６０分反応させたときのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像であり、左図は、ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５の培養液２０μｌ若しくは４０μｌ、又は、既知プロテアーゼであるプロテイナーゼＫ２μｇ／２０μｌ、４μｇ／２０μｌ、１０μｇ/２０μｌと、スクレイピー由来異常プリオン蛋白質を３７℃で６０分間反応させたときのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。
【図５】図５の左図は、本発明の難分解性蛋白質分解プロテアーゼの至適温度を表す実験データのグラフであり、右図は、本発明の難分解性蛋白質分解プロテアーゼの至適ｐＨを表す実験データのグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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