(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分散型マルチセグメント進行波グリッドを有するゲル電気泳動システムであって、
生体分子のゲル電気泳動における使用に適したゲルの層と、
前記ゲルに接触して配置され、互いに狭い間隔で平行に配置される複数の第１電極を含む、進行波グリッドの第１セグメントと、
前記ゲルに接触して配置され、互いに狭い間隔で平行に配置される複数の第２電極を含む、進行波グリッドの第２セグメントと、
前記進行波グリッドの前記第１セグメントおよび前記第２セグメントのうちの少なくとも一方に電気的に接続される電圧制御器と、を有し、
前記電圧制御器が選択的に、（ｉ）前記進行波グリッドの前記第１セグメントおよび前記進行波グリッドの前記第２セグメントのうちの少なくとも一方に、第１の多相電気信号を供給し、（ｉｉ）前記進行波グリッドの前記第１セグメントおよび前記進行波グリッドの前記第２セグメントのうちの少なくとも一方に、前記第１の電気信号とは異なる第２の多相電気信号を供給することを特徴とするゲル電気泳動システム。
【請求項２】
請求項１に記載のシステムにおいて、さらに、前記進行波グリッドの前記第１セグメントおよび前記第２セグメントのうちの少なくとも一方に電気的に接続される第２の電圧制御器を有することを特徴とするゲル電気泳動システム。
【請求項３】
請求項２に記載のシステムにおいて、前記第２の電圧制御器が、前記進行波グリッドの前記第１セグメントおよび前記進行波グリッドの前記第２セグメントのうちの少なくとも一方に、第３の多相電気信号を選択的に供給することを特徴とするゲル電気泳動システム。
【請求項４】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記進行波グリッドの前記第１セグメントが、前記進行波グリッドの隣接する前記第２セグメントに接続されていることを特徴とするゲル電気泳動システム。
【請求項５】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記ゲル層には、第１面と、前記第１面とは反対側の第２面とが形成されており、前記進行波グリッドの前記第１セグメントが、前記ゲル層の前記第１面に接触し、前記システムはさらに、
前記ゲル層の前記第２面に接触し、前記第１セグメントの反対側に配置される、進行波グリッドの第３セグメントを有することを特徴とするゲル電気泳動システム。
【請求項６】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記ゲル層には、第１面と、前記第１面とは反対側の第２面とが形成されており、前記システムはさらに、
前記ゲルの前記第１面に沿って設けられた第１導電層と、
前記ゲルの前記第２面に沿って設けられた第２導電層と、
前記第１導電層および前記第２導電層に電気的に接続する電圧源と、を有し、
前記電圧源を用いて、前記ゲル層にわたって電圧ポテンシャルを印加すると、前記ゲル内の生体分子が、前記進行波グリッドの前記第１セグメントおよび前記第２セグメントのうちの少なくとも一方に向かって進められることを特徴とするゲル電気泳動システム。
【請求項７】
ゲル電気泳動システムを用いてサンプルから様々な生体分子を分離する方法であって、前記システムは、（ｉ）同一平面内に配置された２つの基板の間に位置する、電気泳動に適したゲルの層と、（ｉｉ）前記ゲルの第１の面に接触して配置される進行波グリッドの第１セグメントであって、互いに狭い間隔で平行に配置された第１の複数の電極を有する第１セグメントと、前記ゲルの第２の面に接触して配置される進行波グリッドの第２セグメントであって、互いに狭い間隔で平行に配置された第２の複数の電極を有する第２セグメントと、（ｉｉｉ）前記第１セグメントおよび前記第２セグメントに選択的に電気的接続され、少なくとも１つの多相電気信号を供給するよう構成される電圧制御器と、を有し、
前記ゲル層に前記サンプルを載置する工程と、
前記電圧制御器からの前記第１の多相電気信号を、前記第１セグメントおよび前記第２セグメントのうちの少なくとも一方に印加する工程であって、前記サンプル中の生体分子の少なくとも一部が前記ゲル内を移動する工程と、
前記電圧制御器からの第２の多相電気信号を、前記第１セグメントおよび前記第２セグメントのうちの少なくとも一方に印加する工程であって、（ｉ）生体分子の前記一部が前記ゲル内をさらに移動するか、あるいは（ｉｉ）前記サンプル中の生体分子の他の一部が前記ゲル内を移動する工程と、を含む方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、前記システムは、さらに前記ゲル層に電気的に接続する電圧源を有し、
前記ゲル層にサンプルを載置した後、前記ゲル層の厚さ方向にわたって電圧ポテンシャルを印加する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気泳動による分子の分離と、ゲル電気泳動におけるタンパク質の初期急速移送およびその後の集中または集束と、電界に応じた粒子の移動の観察結果に基づく分析方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
電気泳動の典型的な手順の１つは、異なるｐＨ値を有する溶液を電界の各端部に設け、それらの間がｐＨの勾配になっている状態を作成することである。特定のｐＨにおいて分子は等電点に達し、その分子の実効電荷がゼロになる。したがって、分子がｐＨ勾配中を進行するにつれて、等電点に達し、それ以降は電界内で不動になる。このように、この電気泳動の手法では、異なる等電点に基づいて分子が分離される。
【０００３】
詳細には、上述の方法は等電点電気泳動（ＩＥＦ）と呼ばれ、ｐＨ勾配内の分子に電界を印加して、実効電荷がゼロになる位置、すなわち分子の等電点まで、分子を移動させる。
【０００４】
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（ＣＨ3（ＣＨ2）10ＣＨ2ＯＳＯ3Ｎａ；ラウリル硫酸ナトリウムとしても知られている）と、サンプル処理と、ポリアクリルアミドゲル電気泳動との組み合わせは、１９６０年代後半に初めて開示されている。
【０００５】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によれば、分子が厳密にサイズ、すなわち分子量に基づいて分離される。ＳＤＳで処理したサンプルがゲル内を移動して電気泳動する際の主要な差異は、サイズまたは長さである。小さな分子は、より大きな分子に比べて、基質（matrix）内をより速く移動する。ポリアクリルアミドゲル内を分子が移動する速度は、分子量の対数に反比例する（inversely linear）。したがって、変性したサンプルを、既知の分子量の標準値に基づいて分析し、物質の物理的サイズを判断する手段とすることができる。
【０００６】
二次元（２Ｄ）電気泳動は、再現可能かつ高感度な分析方法を提供するユニークな手法である。２Ｄと呼ばれる理由は、２つの異なる電気泳動方法を２つの異なる次元で用いて、１つの結果を得るからである。２Ｄ分析において通常使用される一対の電気泳動手法は、上述の等電点電気泳動（ＩＥＦ）と、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とである。ＩＥＦは、サンプル化合物を等電点に基づいて分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、化合物を分子量に基づいて分離する。上述のとおり、多くのタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）（分子量に基づく）、もしくは変性ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動（ＩＥＦ）（分子電荷に基づく）によって、分離できる。その両方の手法を二次元的に連係させて用いることで、最高の分離能が得られる。
【０００７】
粒子は、様々な構成の電極および電極アレイによって生成された不均一電界を用いて操作される。バイオテクノロジの一般的なツールとして、誘電泳動は非常に強力である。粒子の移動速度の測定によって、粒子の誘電性を検出できる。誘電泳動分離の強力な拡張機能は、進行波誘電泳動（ＴＷＤ）である。ＴＷＤでは、電極システムにおいて、時間変化電位を電極に順次印加することによって可変電界を生成する。このような進行波電界移動方法は、Parton et al.によって米国特許第５，６５３，８５９号に開示されている。その他、いくつか従来技術がある（特許文献２から特許文献５）。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，６５３，８５９号明細書
【特許文献２】米国特許第４，４７３，４５２号明細書
【特許文献３】米国特許第４，６４７，１７９号明細書
【特許文献４】米国特許第４，７３７，２５１号明細書
【特許文献５】米国特許第６，２７２，２９６号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様において本発明は、分散型マルチセグメント進行波グリッドを有するゲル電気泳動システムを提供する。該システムは、生体分子のゲル電気泳動における使用に適したゲルの層を有する。該システムはさらに、ゲルに接触して配置される、進行波グリッドの第１セグメントを有する。第１セグメントは、互いに狭い間隔で平行に配置される複数の第１電極を含む。該システムはまた、ゲルに接触して配置される、進行波グリッドの第２セグメントを有する。第２セグメントは、互いに狭い間隔で平行に配置される複数の第２電極を含む。該システムはさらに、進行波グリッドの第１セグメントおよび第２セグメントのうちの少なくとも一方に電気的に接続する電圧制御器を有する。その電圧制御器は選択的に、（ｉ）グリッドの第１セグメントおよびグリッドの第２セグメントのうちの少なくとも一方に第１の多相電気信号を供給し、（ｉｉ）グリッドの第１セグメントおよびグリッドの第２セグメントのうちの少なくとも一方に、第１の電気信号とは異なる第２の多相電気信号を供給するよう構成される。
【００１０】
他の態様において本発明は、ゲル電気泳動システムを用いてサンプルから様々な生体分子を分離する方法を提供する。該システムは、（ｉ）同一平面内に配置された２つの基板の間に位置する、電気泳動に適したゲルの層と、（ｉｉ）前記ゲルの第１の面に接触して配置される進行波グリッドの第１セグメントであって、互いに狭い間隔で平行に配置された第１の複数の電極を有する第１セグメントと、前記ゲルの第２の面に接触して配置される進行波グリッドの第２セグメントであって、互いに狭い間隔で平行に配置された第２の複数の電極を有する第２セグメントと、（ｉｉｉ）前記第１セグメントおよび前記第２セグメントに選択的に電気的接続され、少なくとも１つの多相電気信号を供給するよう構成される電圧制御器と、を有し、前記ゲル層に前記サンプルを載置する工程と、前記電圧制御器からの前記第１の多相電気信号を、前記第１セグメントおよび前記第２セグメントのうちの少なくとも一方に印加する工程であって、前記サンプル中の生体分子の少なくとも一部が前記ゲル内を移動する工程と、前記電圧制御器からの第２の多相電気信号を、前記第１セグメントおよび前記第２セグメントのうちの少なくとも一方に印加する工程であって、（ｉ）生体分子の前記一部が前記ゲル内をさらに移動するか、あるいは（ｉｉ）前記サンプル中の生体分子の他の一部が前記ゲル内を移動する工程と、を含む方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
図１は、好適な実施形態のゲル電気泳動システム１０を示す略図である。システム１０は、ガラスプレート３０とプレキシグラスのバックプレート４０との間に設けられたポリアクリルアミドゲルの薄層２０を含む。ゲル厚さは、テフロン（登録商標）のシムを用いて調節される。進行波グリッド５０は、ガラス３０上にプラチナ電極を設けることによって形成される。チタンの薄層を用いて、プラチナとガラスとの接着を向上させてもよい。他方のプレートにも、ガラス上にもう１つの同様の進行波グリッドを設けてもよく、それによって両側構造が備えられる。電極およびゲルアセンブリは、電圧源８０に電気的に接続される。代表的なアセンブリでは、電極およびゲルアセンブリは適切な導電性緩衝液中に浸漬される。それぞれ７０および７２で示す内部および外部チャンバは、緩衝液を収容する。以下から判るとおり、電極およびゲルアセンブリにおける電子の流れの唯一の経路が、電圧源８０へおよび電圧源８０から緩衝液を経由したものとなるように、電圧源８０を用いて電気回路を形成する。さらに、外部チャンバ７２内の緩衝液は、その中に浸漬された電極およびゲルアセンブリを冷却する機能も有する。ゲルの両側に進行波グリッドを用いることの利点は、同じゲル厚さにおいて面内電界を２倍にできること、あるいは、同じ電界を用いてゲル厚さを２倍にできることである。後者は、ゲル内のタンパク質充填（packing）容量が重要である場合に、サンプル検出において最小レベルを達成するために特に有用である。図１のチャンバ７０および７２内の２つの緩衝液などのイオン緩衝剤は、互いの間に直流電界が印加される２つの電極として機能する。タンパク質サンプルは通常、ゲルの最上部に供給され、電気泳動電流がゲル内に流される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ工程では、サンプル内のタンパク質または生体分子は、分子量に基づいてゲル内を移動し、最も軽い分子が最も長い距離を移動する。図１の略図では、移動するタンパク質は、ゲル層２０内を下に向かって流れる。
【００１２】
図２に示す他の好適な実施形態のシステムでは、プレキシグラスのバックプレート１４０の内面１４２に、２００オングストロームの薄層のプラチナが設けられ、ゲル１２０に接するようになっている。その電極およびゲルアセンブリに電気的に接続するように、電圧源１８０が設けられる。プラチナは、進行波グリッド１５０に向けてタンパク質１６０を進行させ図２に示すタンパク質進行を促進させる静電圧力をもたらす、対向電極を形成する。厚さ１００μｍのゲル層では、たった−０．１Ｖで、ＳＤＳ処理済みのマイナス電荷のタンパク質に必要な静電圧力が十分に得られる。この電圧は、ガスを有意に発生させる閾値より低い。グリッドに向けてタンパク質を「進行させる」図２の実施形態は、図１の実施形態と組み合わせて使用できると考えられる。
【００１３】
図３および図４はそれぞれ、片側および両側構成の進行波グリッドアセンブリの好適な実施形態を示す図である。各アセンブリは、密接な状態で設けられた有効量のゲルを含む。詳細には図３は、片面グリッドアセンブリ２００を示す。アセンブリ２００は、プレート２１０と、狭い間隔で平行に設けられた複数の電極２１２，２１４，２１６，および２１８と、それらの電極に電気的に接続する有効量のゲル２２０とを有する。より好ましくは電極は、プラチナまたはその合金から成る。また、好ましくはガラスであるプレート上に、チタンの薄層を設けて、電極とプレートとの接着を向上させることが好ましい。本明細書で説明するとおり、好適な実施形態のシステム、アセンブリ、およびグリッドでは、４相電気信号を使用することが好ましい。したがって、たとえば電極２１２である第１の電極が、電気信号の第１相Ｎ1に用いられることが好ましい。同様に、第１の電極に隣接する第２の電極（たとえば電極２１４）は、電気信号の第２相Ｎ2に用いられることが好ましい。また、第２の電極に隣接する第３の電極（たとえば電極２１６）は、電気信号の第３相Ｎ3に用いられることが好ましい。そして、第３の電極に隣接する第４の電極（たとえば電極２１８）は、電気信号の第４相Ｎ4に用いられることが好ましい。本明細書でさらに詳述するとおり、隣接する電極の中心間の距離はピッチと呼ばれ、「ｐ」で示される。電極の幅は、「ｗ」で示す。隣接する電極同士の対面する側壁または縁部間の距離は、「ｓ」で示す。
【００１４】
図４は、好適な両側グリッドアセンブリ３００を示す略図である。アセンブリ３００は、第１プレート３１０と、狭い間隔で平行に設けられた複数の第１電極３１２，３１４，３１６および３１８と、第２プレート３４０と、狭い間隔で平行に設けられた複数の第２電極３４２，３４４，３４６および３４８と、それらの複数の第１および第２電極に電気的に接続する有効量のゲル３２０とを有する。
【００１５】
図５は、本発明の好適な実施形態のシステムおよび進行波グリッドで使用する、代表的な４相電圧パターンまたは波形を示す。詳細には図５は、各相が９０°ずれた４相電圧波形を表す。各相において生成される各波形は、方形波パルスである。各パルスを、隣接する電極に順次印加する。したがって、第１相Ｎ1における第１パルスを、たとえばＴ／４などの所望期間だけ第１電極に印加する。たとえば時点Ｔ／４などの、その第１パルスを完了した時点で、第２相Ｎ2における第２パルスを、好ましくは第１電極に隣接する第２電極に印加する。たとえば時点Ｔ／２などの、第２パルスを完了した時点で、第３相Ｎ3における第３パルスを、好ましくは第２電極に隣接する第３電極に印加する。たとえば時点３Ｔ／４などの、第３パルスを完了した時点で、第４相Ｎ4における第４パルスを、好ましくは第３電極に隣接する第４電極に印加する。このような一連の順序付けられた順次電圧パルス印加によって、ゲル内に分散した生体分子が、１つの電極の近辺から他の電極へ「ホップ」する（跳ぶ）。その伝搬の同期的モードを図６に示す。これは、生体分子またはタンパク質が電極から電極へ、パルス列の方向にホップする「ホッピング」モードであると説明できる。誘電空間の横断にかかる通過時間は、ｔtransit＝ｓ／μＥによって与えられる。ここで、ピッチはｐ＝ｗ＋ｓであり、ｗおよびｓはそれぞれ電極幅および誘電空間である。電界および可動性はそれぞれ、Ｅおよびμである。４相にわたる１周期の期間は４＊ｔtransitであるため、最大掃引周波数は、ｆ＜μＥ／４ｓによって与えられる。
【００１６】
持続的移動を達成するには、タンパク質は、十分な速度（μＥ）および適切な時間（ｔtransit）にて誘電空間ｓの距離を横断しなければならない。このことはすなわち、持続的移動において、特定の可動性を有するタンパク質には、臨界周波数があることを示す。したがって、最大の運転周波数から開始して、該当の可動性を有するタンパク質が移動し始めるまで、周波数をだんだんと下げてスキャンすればよい。それにより、最速の（分子量が最も小さい）タンパク質から１つずつを、生体分子サンプルから分離することが可能である。
【００１７】
下記の表１に、従来のゲル電気泳動と比較した場合の速度の向上を表す。本発明の目的の一つは、ガスを有意に発生させる閾値より低い電圧で運転することである。それは、測定によって検出され理論によって確認された値である、１．５〜２Ｖ未満で運転するということである。最大電圧は、システムパラメータや存在する生体分子などの多数の要因に依存すると理解される。図７は、ガラス電極上にプラチナを用いたシステムにおける、様々な電流および電圧レベルでの加水分解の発生を示す。グリッドにおけるデバイの二層遮蔽（Debye double-layer shielding）を防ぐために、進行波電極は、ゲルおよび緩衝剤中のイオンに直に接触した状態で運転される。加水分解がいくらかは発生し、非ゼロの正味電流が生じる。ゲルの２つの末端部の間に典型的に印加される通常の直流バイアスを用いて、最初にタンパク質をゲル内へ供給し、進行波グリッド上へ移動させることもできる。実際、それらの２つの電極を、ゲルから離れた予備の加水分解電極として機能させてもよく、それらにおいて必要レベルの電気泳動電流が得られる。
【００１８】
【表１】
0004620386.tif 000002
【００１９】
表１において、ｐは電極グリッドのピッチである。符号ｓは、電極間の間隔である。ΔＶは、電極に印加される電気信号の電圧ポテンシャルである。最大Ｅは、電極に電圧信号を印加した結果生じた、その電極周辺に広がる最大の伝搬電界である。最小ｔtransitは、１ピッチの距離を生体分子が移動するのにかかる通過時間である。これは、電気信号の１周期の時間の１／４に相当する。最小Ｔは、電気信号の１周期の時間である。最大ｆは、電気信号の周波数である。最大ｖは、システム内の生体分子の最大伝搬速度である。
【００２０】
表１はさらに、進行波グリッドの寸法、電圧バイアス、該当の掃引周波数、および予測理想最大速度の、いくつかの好適な組み合わせを明らかにしている。予測される速度の値は、電界が完全に平坦であるとの仮定に基づくものなので、最大予測値である。実際の速度値は、その１／２から１／３になる。第１のパラメータセットａは、Bio−Rad社製の通常の市販の装置に従うものである。同じ処理時間を達成するには、ピッチが２００μｍの進行波グリッドの場合、０．２３５Ｖを、０．０２３７３Ｈｚ未満の掃引周波数でバイアスしなければならない。しかし、セットｂのように電圧を１Ｖに上昇させると、周波数を０．１１５Ｈｚまで増大でき、最大速度は約４倍になる。セットｄおよびｅに示すようにより小さいピッチを使用した場合、局所電界がはるかに強くなり、１Ｖバイアスでは、１４倍の速度まで達成可能である。ＰＡＧＥは通常は６５分間かかるので、進行波の使用によって、８．５ｃｍの基準２Ｄゲルにおける処理時間を数分程度までかなり短縮できる。
【００２１】
他の好適な実施形態において本発明は、分散型マルチセグメント進行波グリッドを有するゲル電気泳動システムを提供する。該システムは、生体分子のゲル電気泳動における使用に適したゲル層と、複数の進行波グリッドから成るマルチセグメントシステムと、それらのグリッドに電気的に接続する電圧制御器とを有する。各グリッドセグメントは、ゲルに接触する状態で、狭い間隔で平行に設けられた複数の電極を含む。電圧制御器は、１つ以上のグリッドセグメントに、１つ以上の選択可能な多相電気信号を供給するよう構成される。特に好適な実施形態では、電圧制御器は、第１の多相電気信号を少なくとも１つのグリッドセグメントに供給し、第２の多相電気信号を全てまたはいくつかのみのグリッドセグメントに供給する。さらに別の好適な態様においてシステムは、２つ、３つ、またはそれ以上の電圧制御器を有し、それらの電圧制御器は、１つ以上の特定の多相電気信号を、進行波グリッドの１つ以上のグリッドセグメントに供給するよう構成される。
【００２２】
本発明は、タンパク質を集束、分離、および集中させる特定の波形の設計において、革新を図る重大な機会を提供するものである。好適な手法の一つは、各用途別にリコンフィギュア（再構成）するための最大の柔軟性を得られるよう、進行波グリッドのピッチを最小に形成することである。図８は、分散型でリコンフィギュア可能かつ再プログラム可能な進行波グリッドを用いた、好適な実施形態のゲル電気泳動システム４００を示す略図である。詳細には図８は、好適なマルチセグメント型進行波グリッドシステムを表す。好適なマルチセグメント型進行波グリッドシステムは、第１グリッドセグメント４１０と、第２グリッドセグメント４２０と、第３グリッドセグメント４３０とを有する。以下から判るとおり各セグメントは、狭い間隔で平行に設けられた複数の電極を含む。両側に設けられた２つの連続的パッドが、１つ以上のバス４４０，４５０，および４６０を介して４相回路への接続を実現する。システム４００はさらに、たとえば図８に示す制御器Ａ，Ｂ，およびＣなどの、１つ以上のプログラム可能な電圧制御器を含むことが好ましい。以下から判るとおり制御器は、上述のバスを通じて進行波グリッド（またはそのセグメント）に電気的に接続する。
【００２３】
好適な実施形態のシステム４００を使用する際に特に好適な手法の一つでは、制御器Ａを用いて、対象のタンパク質を、個々の局所的な進行波グリッドセグメントに移動させた後に、制御器ＢやＣなどを用いて、それらのタンパク質にさらなる処理を施す。各制御器は、別個のＰＩＣ装置であってもよいし、あるいは、事前にプログラムされた複数の指示を有する１つのＰＩＣであってもよい。運転時にはたとえば以下に説明するとおり、図８の好適な実施形態のシステム４００を使用して様々な生体分子を含むサンプルを分離することができる。サンプル４７０を、グリッドセグメント４１０上に載置する。サンプルは、領域４７２に移動し、隣接するグリッドセグメント４２０上へ移動し続ける。システム４００の運転は、グリッドセグメント４２０上に、生体分子の領域４７４が形成されるまで継続される。生体分子と、グリッドのパラメータとによっては、領域４７４を構成する生体分子が、隣接するグリッドセグメント４３０へさらに移動して、生体分子の領域４７６を形成する。この手法では一般的に、第１制御器を用いて初期分離を実施し、他の制御器およびグリッドセグメントを用いて二次的精製またはさらなる分離を実施する。二次的精製には、移動後の生体分子をさらに集中させることと、バンドまたはパッチを集束させることとが含まれる。
【００２４】
さらに別の好適な実施形態において本発明は、サンプルから様々な生体分子を分離する方法を提供する。該方法では、同一平面内に配置された２つの基板の間に位置する、電気泳動に適したゲル層を有する、ゲル電気泳動システムを用いる。システムはさらに、少なくとも第１のグリッドセグメントと第２のグリッドセグメントとを含む進行波グリッドを有する。システムはまた、第１グリッドセグメントおよび第２グリッドセグメントに選択的に接続する電圧制御器を有する。該方法は、生体分子のサンプルをゲル層上に載置する第１ステップを含む。続いて、４相電気信号などの第１の多相電気信号を、第１および第２グリッドセグメントのうちの一方または両方に印加する。それにより、サンプル中の生体分子の少なくとも一部が、ゲル内を移動する。第２の多相電気信号を第１および第２グリッドセグメントのうちの一方または両方に印加することで、生体分子の同じ一部がゲル内をさらに移動するか、あるいは、サンプル中の生体分子の他の一部がゲル内を移動する。適切な多相電気信号を一方または両方のグリッドセグメントに選択的に印加することによって、サンプルを選択的に分析または分離することができる。
【００２５】
システムにおいて複数の電圧制御器を使用する場合には、該方法ではさらに、追加の制御器によって生成された１つ以上の多相電気信号を、様々なグリッドセグメントに必要に応じて印加することが考えられる。さらに、そのシステムで用いる様々な電圧制御器の各々は、変動または変化する多相電気信号を供給するよう構成されてもよい。その信号における変化には、電圧レベル、周波数、または他の電気的パラメータの変化が含まれる。また本発明は、電圧制御器と１つ以上の進行波グリッドとの間のインタフェースを変化させることを含む方法を含む。たとえば、１つの多相電気信号をグリッド内の特定の電極アレイに印加することが考えられる。その際、分離工程において所望の段階を達成した後に、その多相電気信号が印加されている電極を変更する。この手法を用いることで、サンプル中の幅広い種類の生体分子を選択的に分析および分離することができる。
【００２６】
移送速度は、ピッチの縮小に線形比例して増大するので、タンパク質が十分な量にて使用可能であって効率的に供給できれば、極めて迅速な移送が可能になる。図９は、ピッチが２００μｍのグリッドと比較すると、ピッチが４０μｍの進行波グリッドにおいて、電極間空間にかなりより強い平坦電界が生成されることを示す。すなわち、２００μｍのピッチと比較して４０μｍのピッチを使用した場合に、同じ電圧（１Ｖ）を用いてより強い電界が生成可能である。最適には、電極幅ｗを最小にすることで、電極間空間ｓにおける面内電界成分を最大にする。慎重な接続変更、および、適切な接点パッドの浮動状態を用いて、より目が粗い有効ピッチを実現することが可能である。たとえば、各４相グループ内の偶数相を飛ばすことによって、基本の空間ピッチを効果的に２倍にできる。その場合には、奇数パッドのみをアドレスし、偶数パッドは浮動状態にしておく。３グループのセットを考慮した場合には、有効ピッチを３倍にできる。本例では、電極１および４をグループ１、電極３をグループ２、そして電極２をグループ３として、新たな４相回路として駆動する。それ以外の電極は、浮動状態にしておく。寸法に関する最適化を図って、進行波グリッドのピッチに適合する最適なゲル厚さを検出する。本発明の範囲には、電極およびグリッド構成の、一連の様々な組み合わせが含まれる。
【００２７】
図１０は、本発明による好適な進行波グリッドにおける、２つの隣接する電極間の電界または等電位線を示すグラフである。図１０は、ピッチ０．２０ｃｍにて配置された２つの電極５１２および５１４の間の等電位線を表す。ゲルは、厚さが０．１１ｃｍである。したがって、図１０に示すシミュレーションから判るとおり、この構成におけるゲル厚さ対ピッチの比率は、約５／８である。すなわち、最小厚さが７５０μｍである市販の典型的な規格品のゲルでは厚すぎて、一般的に不適当である。本発明に合わせて、極薄の１００μｍのポリアクリルアミドゲルを形成したところ、タンパク質分離において良好に使用できた。対向プレートにバイアス電圧を用いることは、進行波グリッド上へタンパク質を効果的に進行させるのに特に重要である。より強い電界と、それに伴うより速いスピードとを達成するには、より小さいピッチと、それに応じたより薄いゲルとが必要である。薄いゲルは、少量の精製されたタンパク質サンプルについての特定の情報が必要であるという特殊なケースにおいて使用するとよいと推測される。１０μｍ程度の構成の場合、スピンコーティングが、ゲルの薄層の形成に適した技術であると考えられる。
【００２８】
本発明の概念の最初の証明は、実験およびモデリングの両方によって達成された。ＩＥＦおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離のための粒子モデルを作成し、２セットのサンプルタンパク質の実験室データに照らし合わせて検証した。その２セットのサンプルタンパク質とは、Bio−Rad社の基準タンパク質と、刊行物からの４つの基準タンパク質であった。分子量の関数としての移動距離に関する実験データを用いて有効可動性を抽出し、それをモデルにおいて使用する。そして、進行波フィールドをシミュレートし、可動性モデルに印加して、タンパク質の移動を予測する。図１１は、ＩＥＦおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の、２Ｄ基準ゲルにおけるタンパク質の位置を示す。Bio−Rad社の２Ｄ基準タンパク質を使用している。実験データは、塗りつぶさずに囲んだ「白」領域で示し、シミュレーション予測は、塗りつぶした領域で示す。移動を表す縦軸においては、比較的密接な相関関係が明白である。横方向の不一致は、ゲルの膨張と、取扱いと、固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップにわたるｐＨ勾配の不均一性との組み合わせに起因すると考えられる。シミュレーションの結果、ＰＡＧＥ分離では、マイナス電圧と比較すると、プラス電圧のほうがバンド拡大を起こしにくいことが立証された。
【００２９】
図１２および図１３はそれぞれ、マイナスおよびプラスの進行波電圧を用いた移送モードを表す。詳細には図１２は、マイナス電圧波形によって、４相グループ内の３つの電極から生体分子がはじかれるよう作用させる、分散動作を表す。すなわちこの構成では、生体分子が１つの電極から他の３つへ放出されると考えられる。図１３は、プラス電圧波形によって、生体分子がまずは、４相グループ内の上記電極群へ誘引されるよう作用させる、集束動作を表す。すなわちこの構成では、生体分子が実質的に集められることで、バンド拡大が低減されると考えられる。プラス電圧波形に対するワンステップのホップのほうが短いため、バンド分散が低減され、移送速度が速くなる。集束動作を採用することによって、進行波がより効率的に生体分子を捕捉できると考えられる。
【００３０】
図１４は、無作為抽出のタンパク質が移動方向にホップする際の軌道を示す。図１４および図１５は、ピッチが約２００μｍ、幅が約１００μｍ、かつ運転電圧が１Ｖの進行波グリッドを有する電極アセンブリに基づく。図１５は、時間を関数としたタンパク質の移動を示す。図１５でもまた、ホッピングのメカニズムが反映されている。図１５の線の傾きは、タンパク質の伝搬速度の度合いを示す。
【００３１】
他の興味深い点は、電極から成る各４相グループにおいて、移送の際のタンパク質分布に独特の特徴が見られることである。図１６は、４相グループ内の２つの隣接電極間を通過するタンパク質群をある時点でとらえたスナップショットを示す。それによれば、タンパク質の空間的分離能（または最小の分解可能な特徴）は、ｎｐによって与えられ、ここでｎは相の数である。したがって、この分離能を向上させるには、相の数を３に減らし、極めて細かいピッチを用いることが考えられる。
【００３２】
本明細書で説明する電極および電極グリッドとして、様々な構造、構成、および寸法を用いることが可能であるが、いくつかの代表的な態様は以下のとおりである。電極のピッチは、約６００〜１０μｍの範囲であると好ましく、約２００〜４０μｍであるとさらに好ましい。隣接する電極同士の対向する縁部間の間隔は、約３００〜７．５μｍであると好ましく、約１００〜３０μｍであるとさらに好ましい。グリッドおよび電極に印加される好適な電圧レベルは、約５〜０．００１Ｖであると好ましく、約２〜０．１０Ｖであるとさらに好ましい。電気信号の好適な周波数は、移動される生体分子にもよるが、約０．００１〜１０Ｈｚの範囲の周波数が有用であることが見いだされており、約２〜０．０２０Ｈｚが好適な周波数であると考えられる。
【００３３】
数々の市販の電気泳動用機器を、本発明に合致するよう修正または改造することが可能である。
＜付記＞
（１）請求項７に記載の方法において、前記第１の多相電気信号を印加する工程は、前記第１の信号を前記第１グリッドセグメントおよび前記第２グリッドセグメントの両方に印加することによって実施される、方法。
（２）上記（１）に記載の方法において、前記第２の多相電気信号を印加する工程は、前記第２の信号を前記第２グリッドセグメントに印加することによって実施される、方法。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明による好適なゲル電気泳動システムを示す略図である。
【図２】本発明による他の好適なゲル電気泳動システムを示す略図である。
【図３】本発明による、ゲルを伴う進行波グリッドの好適な片側構成を示す略図である。
【図４】本発明による、ゲルを伴う進行波グリッドの好適な両側構成を示す略図である。
【図５】本発明による好適なシステムおよび進行波グリッドにおいて使用される、代表的な４相進行波電圧パターンを示す図である。
【図６】１つの電極から他の電極への生体分子の移動を示す略図である。
【図７】ガラス電極上にプラチナを用いたシステムにおける加水分解の発生を示すグラフである。
【図８】分散型であってリコンフィギュア可能かつリプログラム可能な進行波グリッドを用いたゲル電気泳動システムの、本発明による好適な実施形態を示す略図である。
【図９】面内電界と電極寸法との関係を示すグラフである。
【図１０】本発明による好適な進行波グリッドにおける、２つの隣接する電極間の電位形状を示すグラフである。
【図１１】本発明による好適な実施形態のシステムで分離された生体分子の、予測位置と実際位置との比較を示すグラフである。
【図１２】本発明によって移動される生体分子の分散動作を示す図である。
【図１３】本発明によって移動される生体分子の集束動作を示す図である。
【図１４】本発明による好適なゲル電気泳動システムにおける、生体分子の軌跡を示すグラフである。
【図１５】図１４に示す軌跡を有する生体分子が移動した距離を、時間の関数として示すグラフである。
【図１６】本発明による進行波グリッドを横断移動する生体分子群を示すグラフである。
【符号の説明】
【００３５】
１０，１００，４００  電気泳動システム、４０，１２０  ゲル層、５０，１５０  進行波グリッド、８０，１８０  電圧源、３１２，３１４，３１６，３１８，３４２，３４４，３４６，３４８  電極、４１０，４２０，４３０  進行波グリッドセグメント、４７０  生体分子サンプル、Ａ，Ｂ，Ｃ  電圧制御器。
【図１】
0004620386.tif 000003
【図２】
0004620386.tif 000004
【図３】
0004620386.tif 000005
【図４】
0004620386.tif 000006
【図５】
0004620386.tif 000007
【図６】
0004620386.tif 000008
【図７】
0004620386.tif 000009
【図８】
0004620386.tif 000010
【図９】
0004620386.tif 000011
【図１０】
0004620386.tif 000012
【図１１】
0004620386.tif 000013
【図１２】
0004620386.tif 000014
【図１３】
0004620386.tif 000015
【図１４】
0004620386.tif 000016
【図１５】
0004620386.tif 000017
【図１６】
0004620386.tif 000018