(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペントピラノシルヌクレオシド又はペントピラノシル核酸、並びにペプチド、タンパク質及び核酸から成る群より選択される生体分子を含む結合体であって、該ペントピラノシルヌクレオシドは：
式（Ｉ）
【化１】
0004674964.tif 000047
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｈａｌ（ＨａｌはＢｒまたはＣｌである）であるか、または
【化２】
0004674964.tif 000048
または  −Ｏ−Ｐ［Ｎ（ｉ−Ｐｒ）２］−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）（ｉ−Ｐｒはイソプロピルである）から選択される基であるか、またはＯ−アシル基であり、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して同一または異なり、それぞれ下記のものであり：Ｈ、Ｈａｌ（ＨａｌはＢｒまたはＣｌである）、ＮＲ５Ｒ６、ＯＲ７、ＳＲ８、＝Ｏ、ＣｎＨ２ｎ＋１（ｎは１〜１２の整数である）、式−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｒ１８のβ−脱離性基（Ｒ１８はシアノ−もしくはｐ−ニトロフェニル基である）もしくはフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、または（ＣｎＨ２ｎ）ＮＲ１０Ｒ１１｛Ｒ１０Ｒ１１はＨ、ＣｎＨ２ｎ＋１であるか、またはＲ１０Ｒ１１は次式の基を介して連結しており：
【化３】
0004674964.tif 000049
ここでＲ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、互いに独立して同一または異なり、それぞれＨ、ＯＲ７（Ｒ７は前記の意味を有する）、またはＣｎＨ２ｎ＋１もしくはＣｎＨ２ｎ−１（ｎは前記の意味を有する）である｝、そして
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、互いに独立して同一または異なり、それぞれＨ、ＣｎＨ２ｎ＋１またはＣｎＨ２ｎ−１（ｎは前記の意味を有する）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９（Ｒ９は直鎖または分枝鎖の、置換されていてもよいアルキル基、アリール基、好ましくはフェニル基である）であり、
Ｘ、ＹおよびＺは、互いに独立して同一または異なり、それぞれ＝Ｎ−、＝Ｃ（Ｒ１６）−または−Ｎ（Ｒ１７）−（Ｒ１６およびＲ１７は、互いに独立して同一または異なり、それぞれＨ、または前記の意味を有するＣｎＨ２ｎ＋１もしくは（ＣｎＨ２ｎ）ＮＲ１０Ｒ１１である）を意味し、そして
Ｓｃ１およびＳｃ２は、互いに独立して同一または異なり、それぞれＨ、またはアシル基、トリチル基もしくはアリルオキシカルボニル基から選択される保護基である］または
式（ＩＩ）：
【化４】
0004674964.tif 000050
［式中、
Ｒ１’は、Ｈ、ＯＨ、Ｈａｌ（ＨａｌはＢｒまたはＣｌである）であるか、または
【化５】
0004674964.tif 000051
または  −Ｏ−Ｐ［Ｎ（ｉ−Ｐｒ）２］−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）（ｉ−Ｐｒはイソプロピルである）から選択される基であるか、またはＯ−アシル基であり、
Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は、互いに独立して同一または異なり、それぞれＨ、Ｈａｌ（ＨａｌはＢｒまたはＣｌである）、＝Ｏ、ＣｎＨ２ｎ＋１もしくは−ＣｎＨ２ｎ−１、式−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｒ１８のβ−脱離性基（Ｒ１８はシアノ−もしくはｐ−ニトロフェニル基である）もしくはフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、または（ＣｎＨ２ｎ）ＮＲ１０’Ｒ１１’（Ｒ１０’、Ｒ１１’は互いに独立して前記のＲ１０またはＲ１１の意味を有する）であり、そして
Ｘ’は、＝Ｎ−、＝Ｃ（Ｒ１６’）−または−Ｎ（Ｒ１７’）−（Ｒ１６’およびＲ１７’は、互いに独立して前記のＲ１６またはＲ１７の意味を有する）であり、そして
Ｓｃ１’およびＳｃ２’は前記のＳｃ１またはＳｃ２の意味を有する］
で表される、前記結合体。
【請求項２】
次式のアリルオキシリンカー：
Ｓｃ４ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＣＨ（ＯＰＳｃ５Ｓｃ６）ＣｎＨ２ｎＳｃ７  （ＩＶ）
（式中、Ｓｃ４およびＳｃ７は、互いに独立して同一または異なり、それぞれＦｍｏｃおよび４，４−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基から選択される保護基であり、Ｓｃ５およびＳｃ６は、互いに独立して同一または異なり、それぞれ、アリルオキシ基および／またはジイソプロピルアミノ基であり、ｎは１〜１２の整数であり得る）を装入することを特徴とする、請求項１記載の結合体。
【請求項３】
ペントピラノシルヌクレオシドが、リボ−、アラビノ−、リキソ−および／またはキシロ−ピラノシルヌクレオシドであることを特徴とする、請求項１または２記載の結合体。
【請求項４】
ペントピラノシルヌクレオシドのペントピラノシル部分がＤ−またはＬ−立体配置であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の結合体。
【請求項５】
使用するペントピラノシルヌクレオシドが、ペントピラノシル−プリン、−２，６−ジアミノプリン、−６−プリンチオール、−ピリジン、−ピリミジン、−アデノシン、−グアノシン、−イソグアノシン、−６−チオグアノシン、−キサンチン、−ヒポキサンチン、−チミジン、−シトシン、−イソシトシン、−インドール、−トリプタミン、−Ｎ−フタロイルトリプタミン、−ウラシル、−カフェイン、−テオブロミン、−テオフィリン、−ベンゾトリアゾールまたは−アクリジンであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の結合体。
【請求項６】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ２’、Ｒ３’および／またはＲ４’が、２−フタルイミドエチル基もしくはアリルオキシ基または式−Ｎ［Ｃ（Ｏ）Ｒ９］２の基であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の結合体。
【請求項７】
ペントピラノシルヌクレオシドが、［２’，４’−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−リボピラノシル］ヌクレオシド、Ｎ−ベンゾイル−２’，４’−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシル−ヌクレオシド、Ｎ−イソブチロイル−２’，４’−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシル−ヌクレオシド、Ｏ６−（２−シアノエチル）−Ｎ２−イソブチロイル−２’，４’−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシル−ヌクレオシド、Ｏ６−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ２−イソブチロイル−２’，４’−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシル−ヌクレオシド、β−リボピラノシル−ヌクレオシド、Ｎ−ベンゾイル−、Ｎ−イソブチロイル−、Ｏ６−（２−シアノエチル）−もしくはＯ６−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ２−イソブチロイル−β−リボピラノシルヌクレオシド；４’−ＤＭＴ−ペントピラノシルヌクレオシド、Ｎ−ベンゾイル−４’−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、Ｎ−イソブチロイル−４’−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、Ｏ６−（２−シアノエチル）−Ｎ２−イソブチロイル−４’−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、Ｏ６−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ２−イソブチロイル−４’−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、またはβ−リボピラノシル−Ｎ，Ｎ’−ジベンゾイルアデノシン；もしくはβ−リボピラノシル−Ｎ，Ｎ’−ジベンゾイルグアノシンであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の結合体。
【請求項８】
生体分子が、アミノモディファイア、ビオチン基、式（ＩＶ）のリンカー、若しくはフタルイミドアルキルリンカーを介してペントピラノシルヌクレオシド若しくはペントピラノシル核酸へ連結されたペプチド又はタンパク質であるか、あるいは生体分子が、リン酸基を介してペントピラノシルヌクレオシド若しくはペントピラノシル核酸へ連結されたリボ核酸またはデオキシリボ核酸であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項記載の結合体。
【請求項９】
生体分子が、抗体またはその機能性部分、あるいはその天然形態のＤＮＡおよび／またはＲＮＡであることを特徴とする、請求項８記載の結合体。
【請求項１０】
ペントピラノシルヌクレオシドまたはペントピラノシル核酸が、生体分子と組み合わされることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項記載の結合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）のペントピラノシルヌクレオシド：
【０００２】
【化６】
0004674964.tif 000002
【０００３】
その製造、ならびに療法薬、診断薬および／またはエレクトロニクス構成部品の製造のための使用に関する。
【０００４】
ピラノシル核酸（ｐ−ＮＡ）は一般に、天然ＲＮＡに対する異性体の構造タイプであり、ペントース単位がピラノース形で存在し、Ｃ′−２とＣ′−４の間でホスホジエステル結合により反復連結している（図１）。“核酸塩基”は、本明細書において基本的核酸塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｕ、Ｇを意味するが、イソグアニン／イソシトシン、および２，６−ジアミノプリン／キサンチンの各対、ならびに本発明の意味においては他のプリン類およびピリミジン類も意味するものと理解される。ｐ−ＮＡ、すなわちリボースから誘導されるｐ−ＲＮＡは、最初にＥｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒらにより記載された（Ｐｉｔｓｃｈ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．，Ａｃｔａ  １９９３，７６，２１６１；Ｐｉｔｓｃｈ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．，Ａｃｔａ  １９９５，７８，１６２１；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９９６，１０８，１６１９−１６２３参照）。それらは例外なく、いわゆるワトソン−クリック対合した、すなわちプリン−ピリミジン対合およびプリン−プリン対合した、逆平行の、可逆的に“解ける（ｍｅｌｔｉｎｇ）”、準線状の安定な二本鎖である。反対の意味のキラリティーをもつホモキラルｐ−ＲＮＡ鎖も同様に対制御でき（ｐａｉｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ）、形成された二本鎖において厳密には非らせんである。超分子単位の構築に有用なこの特異性は、リボピラノースホスフェート主鎖の柔軟性が比較的低いこと、連鎖軸に対する塩基平面の傾きが強く、これにより生成二本鎖中で連結した（ｉｎｔｅｒｃａｔｅｎａｒｙ）塩基が積み重なる傾向が生じ、最終的には２′，４′−シス−ジ置換リボピラノース環が主鎖の構築に関与するのに寄与することに関係する。これらの著しく良好な特性のため、ｐ−ＲＮＡ対合系の方がＤＮＡおよびＲＮＡと比較して超分子の構築に用いるのに好ましい。それらは天然核酸に対し直交する（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）対合系を形成する。すなわちそれらは天然のＤＮＡおよびＲＮＡとは対合しない。これは、診断の分野で特に重要である。
【０００５】
図２に示し、以下に説明するｐ−ＲＮＡを、Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒら（前掲、１９９３）が最初に製造した。
【０００６】
これに関し、適切な保護された核酸塩基とテトラベンゾイルリボピラノースのアノマー混合物を、ビス（トリメチルシリル）アセトアミドおよびルイス酸、たとえばトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリルの作用により反応させた（Ｈ．Ｖｏｒｂｒｕｇｇｅｎ，Ｋ．Ｋｒｏｌｉｋｉｅｗｉｃｚ，Ｂ．Ｂｅｎｎｕａ，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，１９８１，１１４，１２３４と同様にして）。塩基（プリン類の場合はＴＨＦ／メタノール／水中のＮａＯＨ；ピリミジン類の場合はＭｅＯＨ中の飽和アンモニア）の作用下で糖からアシル保護基を除去し、生成物の３′，４′−位を酸性触媒下にｐ−アニスアルデヒドジメチルアセタールで保護した。このジアステレオマー混合物の２′−位をアシル化し、この３′，４′−メトキシベンジリデン保護された２′−ベンゾエートを酸性処理により、たとえばメタノール中のトリフルオロ酢酸により脱アセタール化し、ジメトキシトリチルクロリドと反応させた。ｐ−ニトロフェノール／４−（ジメチルアミノ）ピリジン／トリエチルアミン／ピリジン／ｎ−プロパノールで処理することにより、２′→３′のベンゾエート転移を開始した。ほとんどすべての反応をカラムクロマトグラフィーにより仕上げ処理した。この方法で合成した鍵単位、すなわちリボピラノースの４′−ＤＭＴ−３′−ベンゾイル−１′−核酸塩基誘導体を、次いで部分ホスフィチル化し、リンカーにより固相に結合させた。
【０００７】
その後の自動オリゴヌクレオチド合成において、４′−位でキャリヤーに結合した成分を繰り返し酸性脱保護し、結合試薬、たとえばテトラゾール誘導体の作用下でホスホロアミダイトを結合させ、まだ遊離の４′−酸素原子をアセチル化し、オリゴマー生成物を得るためにリン原子を酸化した。次いで残りの保護基を除去し、生成物をＨＰＬＣにより精製および脱塩した。
【０００８】
しかしＥｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒら（前掲、１９９３）が記載した方法は、下記の欠点をもつ：
１．核酸塩基とのヌクレオシド化反応にアノマーとして純粋でないテトラベンゾイルペントピラノースを用いると（Ｈ．Ｇ．Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９５５，７７，５３３７）、その後の作業工程で苛酷なクロマトグラフィー分画を行う必要があるため、最終生成物の収率が低下する。
【０００９】
２．１′−位に核酸塩基をもつリボピラノースから出発して保護された３′−ベンゾエートに至る５つの反応段階では、合成に著しく時間がかかり、工業的規模での実施はほとんど可能である。時間がかかるほか、得られるモノマー単位の収率も低い：プリン単位のアデニンの場合は２９％、ピリミジン単位のウラシルの場合は２４％。
【００１０】
３．オリゴヌクレオチドの合成には、自動ｐ−ＲＮＡ合成の結合試薬として５−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−テトラゾールを用いる。この場合、アセトニトリル中のテトラゾール溶液中におけるこの試薬の濃度が高いため、５−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−テトラゾールが常に合成装置の細いチューブ内で晶出し、したがって合成は早期に終結する。さらに、オリゴマーは５−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−テトラゾールで汚染されていることが認められた。
【００１１】
４．前記のｐ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドの仕上げ処理、特にヒドラジン溶液による塩基不安定性保護基の除去は、オリゴマー中に高い割合のチミジンがある場合は必ずしも常に可能ではない。
【００１２】
したがって本発明の目的は、新規なペントピラノシルヌクレオシド、およびそれらの製造方法であって、既知方法より大規模でペントピラノシルヌクレオシドを製造するのが可能な、かつ前記の欠点を避けられる方法を提供することであった。
【００１３】
したがって本発明の目的は、下記のペントピラノシルヌクレオシドである：
式（Ｉ）
【００１４】
【化７】
0004674964.tif 000003
【００１５】
［式中、
Ｒ1は、Ｈ、ＯＨ、Ｈａｌ（ＨａｌはＢｒまたはＣｌである）であるか、または
【００１６】
【化８】
0004674964.tif 000004
【００１７】
（ｉ−Ｐｒはイソプロピルである）から選択される基であり、
Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立して、同一または異なり、それぞれ下記のものであり：Ｈ、Ｈａｌ（ＨａｌはＢｒまたはＣｌである）、ＮＲ5Ｒ6、ＯＲ7、ＳＲ8、＝Ｏ、ＣnＨ2n+1（ｎは１〜１２、好ましくは１〜８、特に１〜４の整数である）、β−脱離性基、好ましくは式−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｒ18の基（Ｒ18はシアノ−もしくはｐ−ニトロフェニル基である）もしくはフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、または（ＣnＨ2n）ＮＲ10Ｒ11｛Ｒ10Ｒ11はＨ、ＣnＨ2n+1であるか、またはＲ10Ｒ11は次式の基を介して連結しており：
【００１８】
【化９】
0004674964.tif 000005
【００１９】
ここでＲ12、Ｒ13、Ｒ14およびＲ15は、互いに独立して、同一または異なり、それぞれＨ、ＯＲ7（Ｒ7は前記の意味を有する）、またはＣnＨ2n+1もしくはＣnＨ2n-1（ｎは前記の意味を有する）である｝、そして
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は、互いに独立して、同一または異なり、それぞれＨ、ＣnＨ2n+1またはＣnＨ2n-1（ｎは前記の意味を有する）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ9（Ｒ9は直鎖または分枝鎖の、場合により置換されたアルキル基、アリール基、好ましくはフェニル基である）であり、
Ｘ、ＹおよびＺは、互いに独立して、同一または異なり、それぞれ＝Ｎ−、＝Ｃ（Ｒ16）−または−Ｎ（Ｒ17）−（Ｒ16およびＲ17は、互いに独立して、同一または異なり、それぞれＨ、または前記の意味を有するＣnＨ2n+1もしくは（ＣnＨ2n）ＮＲ10Ｒ11である）を意味し、そして
Ｓc1およびＳc2は、互いに独立して、同一または異なり、それぞれＨ、またはアシル基、トリチル基もしくはアリルオキシカルボニル基から選択される保護基、好ましくはベンゾイル基もしくは４，４′−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基である］
または式（ＩＩ）：
【００２０】
【化１０】
0004674964.tif 000006
【００２１】
［式中、
Ｒ1′は、Ｈ、ＯＨ、Ｈａｌ（ＨａｌはＢｒまたはＣｌである）であるか、または
【００２２】
【化１１】
0004674964.tif 000007
【００２３】
（ｉ−Ｐｒはイソプロピルである）から選択される基であり、
Ｒ2′、Ｒ3′およびＲ4′は、互いに独立して、同一または異なり、それぞれＨ、Ｈａｌ（ＨａｌはＢｒまたはＣｌである）、＝Ｏ、ＣnＨ2n+1もしくは−ＣnＨ2n-1、β−脱離性基、好ましくは式−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｒ18（Ｒ18はシアノ−もしくはｐ−ニトロフェニル基である）もしくはフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、または（ＣnＨ2n）ＮＲ10′Ｒ11′（Ｒ10′、Ｒ11′は互いに独立して前記のＲ10またはＲ11の意味を有する）であり、そして
Ｘ′は、それぞれ＝Ｎ−、＝Ｃ（Ｒ16′）−または−Ｎ（Ｒ17′）（Ｒ16′およびＲ17′は、互いに独立して前記のＲ16またはＲ17の意味を有する）を意味し、そしてＳc1′およびＳc2′は前記のＳc1またはＳc2の意味を有する］、
ただし、４′−ＤＭＴ−３′−ベンゾイルリボピラノシル−Ｎ−ベンゾイルアデノシン、Ｎ6，Ｎ6−ジベンゾイル−９−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−アデノシン、リボピラノシル−Ｎ−ベンゾイルアデノシン、４′−ＤＭＴ−３′−ベンゾイルリボピラノシルウラシルおよびリボピラノシルウラシルを除く。
【００２４】
本発明によるペントピラノシルヌクレオシドは一般に、リボ−、アラビノ−、リキソ−および／またはキシロ−ピラノシルヌクレオシド、好ましくはリボピラノシルヌクレオシドであり、これらにおいてペントピラノシル部分はＤ立体配置であってもよく、Ｌ−立体配置であってもよい。
【００２５】
一般に、本発明によるペントピラノシルヌクレオシドは、ペントピラノシル−プリン、−２，６−ジアミノプリン、−６−プリンチオール、−ピリジン、−ピリミジン、−アデノシン、−グアノシン、−イソグアノシン、−６−チオグアノシン、−キサンチン、−ヒポキサンチン、−チミジン、−シトシン、−イソシトシン、−インドール、−トリプタミン、−Ｎ−フタロイルトリプタミン、−ウラシル、−カフェイン、−テオブロミン、−テオフィリン、−ベンゾトリアゾールまたは−アクリジン、特にペントピラノシル−プリン、−ピリミジン、−アデノシン、−グアノシン、−チミジン、−シトシン、−トリプタミン、−Ｎ−フタロイルトリプタミンまたは−ウラシルである。
【００２６】
本発明による化合物には、リンカーとして使用できる、すなわち生体分子、たとえば天然の形の核酸または修飾された核酸（たとえばＤＮＡ、ＲＮＡであるが、ｐ−ＲＮＡであってもよく、好ましくはｐ−ＲＮＡである）に共有結合しうる官能基をもつ化合物として使用できるペントピラノシルヌクレオシドも含まれる。ｐ−ＲＮＡについてはリンカーがまだ知られていないので、これは予想外である。
【００２７】
たとえばこれらには、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ2′、Ｒ3′および／またはＲ4′が２−フタルイミドエチル基もしくはアリルオキシ基であるペントピラノシルヌクレオシドが含まれる。本発明による好ましいリンカーは、たとえばウラシルの５位が好ましくは修飾されているウラシル系リンカー（たとえばＮ−フタロイルアミノエチルウラシル）であるが、インドール系リンカー、好ましくはトリプタミン誘導体（たとえばＮ−フタロイルトリプタミン）であってもよい。
【００２８】
意外にも本発明によれば、より容易に取扱うことができるペントピラノシルヌ−Ｎ，Ｎ−ジアシルクレオシド、好ましくはプリン類、特にアデノシン、グアノシンまたは６−チオグアノシンも得られる。これらの核酸塩基は簡単な方法で完全に脱保護できる。したがって本発明には、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ2′、Ｒ3′および／またはＲ4′が式−Ｎ［Ｃ（Ｏ）Ｒ9］2の基、特にＮ6，Ｎ6−ジベンゾイル−９−（β−Ｄ−リボピラノシル）アデノシンである、本発明のペントピラノシルヌクレオシドも含まれる。
【００２９】
さらに、保護基、好ましくは塩基または金属触媒作用により除去できる保護基、特にアシル基、特に好ましくはベンゾイル基を、もっぱらペントピラノシド部分の３′−酸素原子上にもつペントピラノシルヌクレオシドが本発明により得られるのは予想外である。これらの化合物はたとえば、他の保護基、好ましくは酸−または塩基−不安定基、特にトリチル基、特に好ましくはジメトキシトリチル基を、収率を低下させる追加工程（たとえば追加の精製工程）なしに、ペントピラノシド部分の３′−酸素原子上へ直接導入するための出発物質として用いられる。
【００３０】
さらに、保護基、好ましくは酸−または塩基−不安定基、特にトリチル基、特に好ましくはジメトキシトリチル基を、もっぱらペントピラノシド部分の４′−酸素原子上にもつペントピラノシルヌクレオシドが本発明により得られる。これらの化合物もたとえば、他の保護基、好ましくは塩基または金属触媒作用により除去できる保護基、特にアシル基、特に好ましくはベンゾイル基を、収率を低下させる追加工程（たとえば追加の精製工程）なしに、たとえばペントピラノシド部分の２′−酸素原子上に直接導入するための出発物質として用いられる。
【００３１】
一般に本発明によるペントピラノシルヌクレオシドは、いわゆるワンポット反応によりにより反応させることができ、これにより収率が高まり、したがって特に有利である。
【００３２】
以下の化合物は本発明によるペントピラノシルヌクレオシドの好ましい例である：
Ａ）［２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−リボピラノシル］ヌクレオシド、特に［２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−リボピラノシル］−アデニン、−グアニン、−シトシン、−チミジン、−ウラシル、−キサンチンまたは−ヒポキサンチン、およびＮ−ベンゾイル−２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシル−ヌクレオシド、特に−アデニン、−グアニンまたは−シトシン、およびＮ−イソブチロイル−２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシル−ヌクレオシド、特に−アデニン、−グアニンまたは−シトシン、およびＯ6−（２−シアノエチル）−Ｎ2−イソブチロイル−２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシル−ヌクレオシド、特に−グアニン、およびＯ6−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ2−イソブチロイル−２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシル−ヌクレオシド、特に−グアニン；
Ｂ）β−リボピラノシル−ヌクレオシド、特にβ−リボピラノシル−アデニン、−グアニン、−シトシン、−チミジンまたは−ウラシル、−キサンチンまたは−ヒポキサンチン、およびＮ−ベンゾイル−、Ｎ−イソブチロイル−、Ｏ6−（２−シアノエチル）−またはＯ6−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ2−イソブチロイル−β−リボピラノシルヌクレオシド；
Ｃ）４′−ＤＭＴ−ペントピラノシルヌクレオシド、好ましくは４′−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、殊に４′−ＤＭＴ−リボピラノシル−アデニン、−グアニン、−シトシン、−チミジン、−ウラシル、−キサンチンまたは−ヒポキサンチン、およびＮ−ベンゾイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、特にＮ−ベンゾイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシル−アデニン、−グアニンまたは−シトシン、およびＮ−イソブチロイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、特にＮ−イソブチロイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシル−アデニン、−グアニンまたは−シトシン、およびＯ6−（２−シアノエチル）−Ｎ2−イソブチロイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、特にＯ6−（２−シアノエチル）−Ｎ2−イソブチロイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルグアニン、およびＯ6−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ2−イソブチロイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、特にＯ6−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ2−イソブチロイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルグアニン；
Ｄ）β−リボピラノシル−Ｎ，Ｎ′−ジベンゾイルアデノシンまたはβ−リボピラノシル−Ｎ，Ｎ′−ジベンゾイルグアノシン。
【００３３】
オリゴヌクレオチド合成に適した前駆物質は、たとえば以下のものである：４′−ＤＭＴ−ペントピラノシルヌクレオシド−２′−ホスフィタミド／−Ｈ−ホスホナート、好ましくは４′−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド−２′−ホスフィタミド／−Ｈ−ホスホナート、特に４′−ＤＭＴ−リボピラノシル−アデニン、−グアニン−、−シトシン−、−チミジン−、−キサンチン−、または−ヒポキサンチン−、または−ウラシル−２′−ホスフィタミド／−Ｈ−ホスホナート、およびＮ−ベンゾイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシル−アデニン−、−グアニン−または−シトシン−２′−ホスフィタミド／−Ｈ−ホスホナート、およびＮ−イソブチルロイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシル−アデニン−、−グアニン−または−シトシン−２′−ホスフィタミド／−Ｈ−ホスホナート、およびＯ6−（２−シアノエチル）−４′−ＤＭＴ−リボピラノシル−グアニン−、−キサンチン−、または−ヒポキサンチン−２′−ホスフィタミド／−Ｈ−ホスホナート、あるいはＯ6−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ2−イソブチロイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルグアニン；ならびに固体キャリヤーへの結合のためには、たとえば４′−ＤＭＴ−ペントピラノシルヌクレオシド−２′−スクシナート、好ましくは４′−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド−２′−スクシナート、特に４′−ＤＭＴ−リボピラノシル−アデニン、−グアニン−、−シトシン−、−チミジン−、−キサンチン−、−ヒポキサンチン−または−ウラシル−２′−スクシナート、およびＮ−ベンゾイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシル−アデニン−、−グアニン−または−シトシン−２′−スクシナート、およびＮ−イソブチルロイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシル−アデニン−、−グアニン−または−シトシン−２′−スクシナート、Ｏ−（２−シアノエチル）−４′−ＤＭＴ−リボピラノシル−グアニン−、−キサンチン−または−ヒポキサンチン−２′−スクシナート、およびＯ6−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ2−イソブチロイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルグアニン−２′−スクシナート。
【００３４】
本発明の他の対象は、式（Ｉ）または（ＩＩ）のペントピラノシルヌクレオシドの製造方法であって、保護されていないペントピラノシドから出発し
（ａ）第１工程でまずペントピラノシドの２′−、３′−または４′−位を保護し、そして好ましくは
（ｂ）第２工程で２′−、３′−または４′−位のうち他の位置を保護する
ことを特徴とする方法。
【００３５】
本発明方法は、引用した文献に記載される核酸塩基のみに限定されず、意外にも多数の天然および合成核酸塩基を用いて有効に実施できる。さらに、本発明方法が文献から既知の方法と比較して高い収率で、かつ時間を節約して（平均６０％）実施できるのは、特に予想外である。これは工業的利用にとって特に有利である。さらに、本発明方法を用いると、文献記載の方法に必要な精製工程、たとえばクロマトグラフィーによる中間精製が不必要であり、場合により反応をいわゆるワンポット反応として実施でき、これにより空間／時間収率が著しく高まる。
【００３６】
具体的態様において、２′−保護位置の場合、２′−位から３′−位への保護基の転移を行い、これは一般に塩基の存在下で、特にＮ−エチルジイソプロピルアミンおよび／またはトリエチルアミンの存在下で行われる。本発明によれば、この反応はワンポット反応と同じ反応器内で特に有利に行うことができる。
【００３７】
他の好ましい態様においては、ピラノシルヌクレオシドを、酸不安定性、塩基不安定性であるか、または金属触媒で除去できる保護基Ｓc1、Ｓc2、Ｓc1′またはＳc2′で保護する。保護基Ｓc1およびＳc1′は、好ましくは保護基Ｓc2およびＳc2′と異なる。
【００３８】
一般に前記の保護基はアシル基、好ましくはアセチル基、ベンゾイル基、ニトロベンゾイル基および／またはメトキシベンゾイル基、トリチル基、好ましくは４，４′−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基、あるいはβ−脱離性基、好ましくは式−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｒ18の基（Ｒ18はシアノ−もしくはｐ−ニトロフェニル基である）またはフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である。
【００３９】
２′−位または３′−位を、塩基不安定性であるかまたは金属触媒で除去できる保護基、好ましくはアシル基、特にアセチル基、ベンゾイル基、ニトロベンゾイル基および／またはメトキシベンゾイル基で保護する；ならびに／あるいは４′−位を、酸または塩基不安定性保護基、好ましくはトリチル基および／またはＦｍｏｃ基、特にＤＭＴ基で保護する。
【００４０】
文献から既知の方法と異なり、本発明方法は結果的にアセタール保護基、たとえばアセタールまたはケタールを用いずに行うことができる。これにより追加のクロマトグラフィーによる中間精製が避けられ、結果的に反応をワンポット反応として実施でき、予想外に高い空間／時間収率が得られる。
【００４１】
前記保護基を低温で導入するのが好ましい。これは、それらを予想外に選択的に導入できることを意味するからである。
【００４２】
たとえばベンゾイル基の導入は、ピリジン中またはピリジン／塩化メチレン混合物中において低温で、塩化ベンゾイルとの反応により行われる。ＤＭＴ基は、たとえば塩基、たとえばＮ−エチルジイソプロピルアミン（ヒューニッヒ塩基）、およびたとえばピリジン、塩化メチレン、またはピリジン／塩化メチレン混合物中において室温で、ＤＭＴＣｌとの反応により導入できる。
【００４３】
アシル化および／または２′−位から３′−位への転移（所望により実施）後であれば、反応生成物をクロマトグラフィーにより精製するのも有利である。トリチル化後の精製は本発明によれば不必要であり、これは特に有利である。
【００４４】
最終生成物を必要ならばさらに結晶化により精製できる。
本発明の他の目的は、リボピラノシルヌクレオシドの製造方法であって、
（ａ）保護された核酸塩基を保護されたリボピラノースと反応させ、
（ｂ）工程（ａ）からの生成物のリボピラノシル部分から保護基を開裂させ、そして
（ｃ）工程（ｂ）からの生成物を前記に詳述した方法により反応させる
方法である。
【００４５】
これに関連して、さらに時間および材料を消費するクロマトグラフィー工程を避けるために、アノマーとして純粋な保護されたペントピラノース、たとえばテトラベンゾイルペントピラノース、好ましくはβ−テトラベンゾイルリボピラノースを用いるだけでも有利である（Ｒ．Ｊｅａｎｌｏｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９４８，７０，４０５２）。
【００４６】
他の態様において、式（ＩＩ）においてＲ4′が（ＣnＨ2n）ＮＲ10′Ｒ11′を意味し、Ｒ10′Ｒ11′が前記の意味をもつ式（ＩＩＩ）の基を介して連結しているリンカーは下記の方法で有利に製造される：
（ａ）式（ＩＩ）において、Ｒ4′が（ＣnＨ2n）ＯＳc3または（ＣnＨ2n）Ｈａｌであり、ここでｎは前記の意味を有し、Ｓc3は保護基、好ましくはメシラート基、Ｈａｌは塩素または臭素である化合物を、アジドと、好ましくはＤＭＦ中で反応させ、
（ｂ）工程（ａ）からの反応生成物を、好ましくはトリフェニルホスフィンにより、たとえばピリジン中で還元し、次いで
（ｃ）工程（ｂ）からの反応生成物を適切なフタルイミド、たとえばＮ−エトキシカルボニルフタルイミドと反応させ、
（ｄ）工程（ｃ）からの反応生成物を適切な保護されたピラノース、たとえばリボーステトラベンゾエートと反応させ、最後に
（ｅ）保護基を、たとえばメシラートにより開裂させ、そして
（ｆ）さらに前記の工程を実施する。
【００４７】
さらに、リンカーとしてのインドール誘導体は、蛍光を発するという利点をもち、したがってごく少量の物質を検出することができるナノテクノロジー用途に特に好ましい。たとえばインドール−１−リボシドは既にＮ．Ｎ．Ｓｕｖｏｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ａｋｔｉｖｎ．Ｓｏｅｄｉｎ．，Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ  ＳＳＳＲ，１９６５，６０およびＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９６７，２３，４６５３に記載されている。しかし３−置換誘導体を製造するための類似方法はない。一般にそれらの製造は、保護されていない糖成分とインドリンのアミナール（ａｍｉｎａｌ）を形成し、次いでこれを酸化によりインドール−１−リボシドに変換することにより行われる。たとえばインドール−１−グルコシドおよび−１−アラビノシドの記載があり（Ｙ．Ｖ．Ｄｏｂｒｉｙｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｈｉｍ．−Ｆａｒｍ  Ｚｈ．１９７８，１２，３３）、それらの３−置換誘導体は通常はビールスマイヤー（Ｖｉｅｌｓｍｅｉｅｒ）反応により製造された。しかし、アミノエチル単位をインドールの３位に導入するためのこの経路は工業用としては複雑すぎる。
【００４８】
したがって他の好ましい態様においては、式（Ｉ）において、ＸおよびＹが互いに独立して、同一または異なり、それぞれ＝Ｃ（Ｒ16）−（Ｒ16はＨまたはＣnＨ2nである）であり、Ｚが＝Ｃ（Ｒ16）−（Ｒ16は（ＣnＨ2n）ＮＲ10Ｒ11である）であるリンカーが下記の方法で有利に製造される：
（ａ）適切なインドリン、たとえばＮ−フタロイルトリプタミンを、ピラノース、たとえばＤ−リボースと反応させてヌクレオシドトリオールにし、次いで
（ｂ）工程（ａ）からの生成物のピラノシル部分のヒドロキシル基を好ましくはアシル基で、たとえば無水酢酸により保護し、次いで
（ｃ）工程（ｂ）からの生成物を、たとえば２，３−ジクロロ−５，６−ジジシアノパラキノンにより酸化し、
（ｄ）工程（ｃ）からの生成物のピラノシル部分のヒドロキシル保護基を、たとえばメチラートにより開裂させ、最後に
（ｅ）既に前記に述べた工程を実施する。
【００４９】
ところがこの方法は、リボピラノースの場合に採用できるだけでなく、リボフラノースおよび２′−デオキシリボフラノースまたは２′−デオキシリボピラノースの場合にも採用できる。これは特に有利である。用いる糖のヌクレオシド化パートナーは、好ましくはトリプタミン、特にトリプタミンのＮ−アシル誘導体、殊にＮ−フタロイルトリプタミンである。
【００５０】
他の態様においては、４′−保護、好ましくは３′−，４′−保護ペントピラノシルヌクレオシドを他の工程でホスフィチル化するか、または固相に結合させる。
【００５１】
ホスフィチル化は、たとえば塩基（Ｎ−エチルジイソプロピルアミン）の存在下でモノアリルＮ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトにより、または三塩化リンおよびイミダゾールまたはテトラゾールにより、次いで塩基を添加して加水分解することにより実施できる。生成物は、第１の場合はホスホロアミダイト、第２の場合はＨ−ホスホナートである。固相、たとえば“長鎖アルキルアミノ−制御細孔ガラス”（ＣＰＧ、シグマ・ヘミー、ミューニッヒ）への本発明による保護されたペントピラノシルヌクレオシドの結合は、たとえばＥｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）の記載に従って実施できる。
【００５２】
得られた化合物は、たとえばペントピラノシル核酸の製造に使用できる。
したがって本発明の他の態様は、下記の工程を含むペントピラノシル核酸の製造方法である：
（ａ）第１工程で、保護されたペントピラノシルヌクレオシドを前記に従って固相に結合させ、
（ｂ）第２工程で、工程（ａ）により固相に結合させた３′−，４′−保護ペントピラノシルヌクレオシドを、ホスフィチル化３′−，４′−保護ペントピラノシルヌクレオシドの分、延長し、次いでたとえばヨウ素水溶液により酸化し、そして
（ｃ）同一または異なるホスフィチル化３′−，４′−保護ペントピラノシルヌクレオシドを用いて、目的のペントピラノシル核酸が存在するまで工程（ｂ）を繰り返す。
【００５３】
ホスホロアミダイトを用いる場合の結合試薬として、酸性活性化剤、たとえば塩酸ピリジニウム、特にベンゾイミダゾリウムトリフラートを、好ましくはアセトニトリル中での結晶化後、およびアセトニトリル溶解後に用いるのが適切である。これによれば、結合試薬としての５−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−テトラゾールと異なり、結合試薬ラインの閉塞や生成物の汚染が起きないからである。
【００５４】
Ｈ−ホスホナートを用いる場合は、アリールスルホニルクロリド、ジフェニルクロロホスホナート、ピバロイルクロリドまたはアダマンチルクロリドが結合試薬として特に適切である。
【００５５】
さらに、ピリミジン塩基、特にウラシルおよびチミンが開裂し、これによりオリゴヌクレオチドが分解するのを防ぐために、塩類、たとえば塩化ナトリウムを、オリゴヌクレオチド、特にｐ−ＮＡの保護基を除去するためのヒドラジン分解に添加することが有利である。アリルオキシ基は、好ましくはパラジウム［Ｐｄ（０）］錯体により、たとえばヒドラジン分解前に除去することが好ましい。
【００５６】
他の具体的態様においては、ペントフラノシルヌクレオシド、たとえば天然の形のアデノシン、グアノシン、シチジン、チミジンおよび／またはウラシルを工程（ａ）および／または工程（ｂ）に装入することができ、これによりたとえば混合ｐ−ＮＡ−ＤＮＡまたはｐ−ＮＡ−ＲＮＡが得られる。
【００５７】
他の具体的態様においては、追加工程で次式のアリルオキシリンカー：
Ｓc4ＮＨ（ＣnＨ2n）ＣＨ（ＯＰＳc5Ｓc6）ＣnＨ2nＳc7
（ＩＶ）
（式中、Ｓc4およびＳc7は、互いに独立して、同一または異なり、それぞれ、特にＦｍｏｃおよび／またはＤＭＴから選択される保護基であり、Ｓc5およびＳc6は、互いに独立して、同一または異なり、それぞれ、アリルオキシ基および／またはジイソプロピルアミノ基である）を装入することができる。ｎは前記の意味を有する。
【００５８】
特に好ましいアリルオキシリンカーは、（２−（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｏ1−ＤＭＴ−Ｏ2−アリルオキシジイソプロピルアミノホスフィニル−６−アミノ−１，２−ヘキサンジオール）である。
【００５９】
こうして、活性化できるリン化合物および酸不安定性保護基（たとえばＤＭＴ）の両方を含み、したがって自動オリゴヌクレオチド合成に容易に利用できる、アミノ末端リンカー（たとえばＰ．Ｓ．Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８９，１７，７１７９；Ｌ．Ｊ．Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，国際特許出願公開第ＷＯ８９０２４３９号参照）を、たとえばリシンから出発して数個の反応工程で合成できる。その全範囲を本発明においてはリシンベースのリンカーにより拡張できる。このリンカーにおいては、リン原子上に他の場合に一般的なシアノエチル基の代わりにアリルオキシ基を導入し、したがってＮｏｙｏｒｉオリゴヌクレオチド法（Ｒ．Ｎｏｙｏｒｉ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９０，１１２，１６９１−６）に有利に使用できる。
【００６０】
したがって本発明の他の対象は、本発明による少なくとも１つのペントピラノシルヌクレオシド、および適切ならば少なくとも１つのアリルオキシリンカーを含む、ペントピラノシル核酸でもある。
【００６１】
ｐ−ＮＡ、特にｐ−ＲＮＡは、互いに安定な二本鎖を形成し、一般にそれらの天然形のＤＭＴおよびＲＮＡとは対合しない。この特性により、ｐ−ＮＡは好ましい対合系となる。
【００６２】
そのような対合系は非共有相互作用の超分子系であり、これらは選択性、安定性および可逆性により識別でき、それらの特性は好ましくは熱力学的に、すなわち温度、ｐＨおよび濃度により影響される。そのような対合系は、たとえばそれらの選択性により、異なる金属クラスターを互いに一緒にして潜在的に新規な特性をもつクラスター集合体にする“分子接着剤”としても使用できる［たとえばＲ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９６，３８２，６０７−９；Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９６，３８２，６０９−１１参照］。したがって本発明のｐ−ＮＡは、ナノテクノロジーの分野で、たとえば新規材料、診断薬および療法薬、ならびにマイクロエレクトロニクス、フォトニクスまたはオプトエレクトロニクス構成部品の製造のために、ならびに分子種を制御下で一緒にして超分子単位にするために、たとえばタンパク質アセンブリーの（コンビニトリアル）合成のために用いるのにも適している［たとえばＡ．Ｌｏｍｂａｒｄｉ，Ｊ．Ｗ．Ｂｒｙｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．ＤｅＧｒａｄｏ，Ｂｉｏｍｏｌｅｋｕｌｓ（Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．），１９９７，４０，４９５−５０４］。ｐ−ＮＡは強い、かつ熱力学的に制御可能な対合系を形成するからである。したがって他の用途は、機能性の、好ましくは生物学的単位、たとえばタンパク質またはＤＮＡ／ＲＮＡセクションに、天然核酸に影響を及ぼさないｐ−ＮＡコードを付与できるので、特に診断薬および薬物開発の分野にある（たとえば国際特許出願公開第ＷＯ９３／２０２４２号参照）。
【００６３】
したがって本発明の他の対象は、薬物、療法薬、診断薬および／またはエレクトロニクス構成部品の製造のための、本発明による式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）のペントピラノシルヌクレオシドまたは本発明によるペントピラノシル核酸の使用である。
【００６４】
生体分子、たとえばＤＮＡまたはＲＮＡは、他の生体分子、たとえばＤＮＡまたはＲＮＡとの非共有結合に使用できる。ただし両生体分子が核酸塩基の相補的配列の結果として水素橋の形成により互いに結合できるセクションを含む場合である。このタイプの生体分子は、たとえばシグナル増幅のための分析システム、すなわち分析されるＤＮＡ分子の配列が、一方では固体支持体上に非共有ＤＮＡリンカーなどにより固定化され、他方ではシグナル増幅用の分枝ＤＮＡ分子（ｂＤＮＡ）に結合しているものに利用される（たとえばＳ．Ｕｒｄｅａ，Ｂｉｏｌ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９４，１２，９２６または米国特許第５，６２４，８０２号参照）。最後に記載したシステムの本質的な欠点は、現在それらはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸診断方法に対する感度に関する問題に直面しているという点にある（Ｋ．Ｍｕｌｌｉｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７，１５５，３３５）。これは特に、分析されるＤＮＡ分子への固体支持体の非共有結合が、分析されるＤＮＡ分子の非共有結合と同様に特異的に起きるのではなく、その結果、“配列認識”と“非共有結合”の機能の混合が起きるという事実が原因である。ＤＮＡまたはＲＮＡ対合プロセスを妨害しない直交対合系としてｐ−ＮＡを用いると、この問題が有利に解決され、その結果、この分析方法の感度を著しく高めることができる。
【００６５】
したがって本発明の他の対象は、本発明による式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）のペントピラノシルヌクレオシドまたは本発明によるペントピラノシル核酸および生体分子を含む結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の製造のための、本発明による式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）のペントピラノシルヌクレオシドまたは本発明によるペントピラノシル核酸の使用である。
【００６６】
本発明の意味における結合体は、ｐ−ＮＡと他の生体分子、好ましくはペプチド、タンパク質または核酸（たとえば抗体またはその機能性部分、あるいは天然形態のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）との共有結合ハイブリッドである。抗体の機能性部分は、たとえばＦｖフラグメント（Ｓｋｅｒｒａ  ＆  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０３８）、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５８７９）、またはＦａｂフラグメント（Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０４１）である。
【００６７】
本発明の意味における生体分子は、天然物質または天然物質から誘導された物質を意味すると理解される。
【００６８】
好ましい態様において、それらはこの場合、ｐ−ＲＮＡ／ＤＮＡまたはｐ−ＲＮＡ／ＲＮＡ結合体である。
【００６９】
結合体は、ある分子において“配列認識”と“非共有結合”の機能を理解しなければならない場合に用いるのが好ましい。本発明による結合体は互いに直交する２つの対合系を含むからである。
【００７０】
結合体の調製には、逐次法および集中法がいずれも適する。
逐次法では、たとえばｐ−ＲＮＡオリゴマーの自動合成を行った後、同一の合成装置で直接に−試薬および結合プロトコルを再調整した後−たとえばＤＮＡオリゴヌクレオチドをさらに合成する。この方法は、逆の順序でも実施できる。
【００７１】
集中法では、たとえばアミノ末端リンカーをもつｐ−ＲＮＡオリゴマーと、たとえばチオールリンカーをもつＤＮＡオリゴマーを、別個の操作で合成する。次いで、文献（Ｔ．Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，５，３１２）から既知のプロトコルに従って、ｐ−ＲＮＡオリゴマーのヨードアセチル化およびこれら２単位の結合を行うのが好ましい。
【００７２】
集中法は、それらの融通性のため特に好ましいことが分かった。
本発明の意味における結合体という用語は、いわゆるアレイも意味すると理解される。アレイは、固定化された認識種であり、これらは特に分析および診断において、被分析体の同時認識に際し重要な役割を果たす。一例はペプチドアレイ（Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６４，５５５）および核酸アレイ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９２，１３，１００８；Ｈｅｌｌｅｒ，米国特許第５，６３２，９５７号）である。認識種をコードオリゴヌクレオチドに結合させ、付随する相補鎖を固体キャリヤーの特定の位置に結合させることにより、これらのアレイのさらに高い融通性を達成できる。コード認識種を“アンチコード”固体キャリヤーに付与し、ハイブリダイゼーション条件を調整することにより、認識種は目的位置に非共有結合する。その結果、種々のタイプの認識種、たとえばＤＮＡセクション、抗体を、ハイブリダイゼーション条件により固体キャリヤー上に同時に配置するだけでよい（図３参照）。ただしこのための前提条件は、きわめて強い、選択的なコドンおよびアンチコドンであること−コードセクションを可能な限り短くするために−、かつ必要な天然核酸を妨害しないことである。ｐ−ＮＡ、好ましくはｐ−ＲＮＡは、このために特に有利に適する。
【００７３】
本発明の意味における“キャリヤー”という用語は、固体またはゼラチン状で存在する材料、特にチップ材料を意味すると理解される。適切なキャリヤー材料は、たとえばセラミック、金属、特に貴金属、ガラス、プラスチック、結晶質材料または、特に上記材料の薄層状キャリヤー、特に上記材料の薄層状キャリヤー、または（生体）分子フィラメント、たとえばセルロース、構造タンパク質である。
【００７４】
したがって本発明はまた、認識種、好ましくは天然ＤＮＡもしくはＲＮＡ鎖、またはタンパク質、特に抗体もしくは抗体の機能性部分をコードするための、本発明によるペントピラノシル核酸、好ましくはリボピラノシル核酸の使用に関する。次いでこれらを図３に従って、固体キャリヤー上の適切なコドンとハイブリダイズさせることができる。こうして、アレイの形のコドンを備えた固体キャリヤー上の目的位置に、新規な診断用として有用なアレイを、認識種の組合わせ（いずれも新規）を用いてハイブリダイゼーション条件を調整するだけで、常に構築できる。次いで被分析体、たとえば血清などの生物学的試料を付与すると、検出すべき種がアレイに特定のパターンで結合し、次いでこれを間接的に（たとえば認識種の蛍光標識による）、または直接に（たとえばコドンの結合点におけるインピーダンス測定による）記録する。次いで、コドンを含むキャリヤーのみが残るように適切な条件（温度、塩類、溶剤、電気泳動プロセス）により、ハイブリダイゼーションを解除する。次いでこれに再び他の認識種を装填し、たとえば同一被分析体について他の試料の測定のために用いる。このアレイフォーマットの認識種の配置（いずれも新規）および対合系としてのｐ−ＲＮＡの使用は、他の系、たとえば国際特許出願公開第ＷＯ９６／１３５２２号と比較して特に有利である（後記１６参照）。
【００７５】
したがって本発明の他の対象はまた、前記に既に詳述したように、特に前記のペントピラノシルヌクレオシドまたは本発明による結合体を含む診断薬に関する。
【００７６】
以下の図面および実施例は本発明をより詳細に記載するためのものであり、本発明を限定するものではない。
実施例
実施例１
１−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝チミンの合成
最初に４′−置換、次いで２′−置換、次いで転移反応：
【００７７】
【化１２】
0004674964.tif 000008
【００７８】
反応経路１
５１．６ｇ（２００ｍｍｏｌ）の１−（β−Ｄ−リボピラノシル）チミンＡを無水ピリジン６２０ｍｌにアルゴン雰囲気下で溶解し、７１．４ｍｌ（２．１当量）のＮ−エチルジイソプロピルアミンおよび１００ｇのモレキュラーシーブ（４Å）を添加し、混合物をＫＰＧ撹拌機で１５分間撹拌した。９２ｇ（２７２ｍｍｏｌ；１．３６当量）のジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴＣｌ）を２８０ｍｌ（固体ＮａＨＣＯ3から蒸留したばかり）のクロロホルムに溶解し、この溶液を上記トリオールに−６〜−５℃で３０分間かけて滴加した。この温度で１時間撹拌し、次いで室温（ＲＴ）で一夜撹拌し、さらにクロロホルム７０ｍｌ中における２５ｇ（７４ｍｍｏｌ；０．３７当量）のＤＭＴＣｌを添加した。混合物を室温に達するまで放置し、４時間撹拌した。
【００７９】
少量の試料を採取し、水性仕上げ処理し、１−｛４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝チミンの分析データを得るためにクロマトグラフィー処理した：
【００８０】
【化１３】
0004674964.tif 000009
【００８１】
反応混合物を２．４６ｇ（２０．５ｍｍｏｌ；０．１当量）の４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）で処理し、−６℃に冷却し、ピリジン３０ｍｌ中における２７．９ｍｌ（０．２４ｍｏｌ；１．２当量）の塩化ベンゾイル（ＢｚＣｌ）を−６〜−１℃で１５分かけて滴加し、混合物を１０分間撹拌した。反応を完結させるために、２５分の間隔をおいて、さらにそれぞれ２．８ｍｌ（２４ｍｍｏｌ；０．１２当量）のＢｚＣｌを冷却しながら添加し、最後に混合物を２０分間撹拌した。
【００８２】
４６０ｍｌの無水ピリジン、８４１ｍｌ（１１．２ｍｏｌ；５６当量）のｎ−プロパノール、４４ｇ（０．３１６ｍｏｌ；１．５８当量）のｐ−ニトロフェノール、２１．７ｇ（０．１８ｍｏｌ；０．９当量）のＤＭＡＰおよび１３６ｍｌ（０．８ｍｏｌ；４当量）のＮ−エチルジイソプロピルアミンを室温で添加し、混合物を６１〜６３℃で４８時間撹拌した。次いで混合物を室温に６０時間放置した。反応混合物を再び６１〜６３℃に２４時間加熱し、室温に冷却し、ロータベーパー（Ｒｏｔａｖｚｐｏｒ）で濃縮した。残留物を２ｌの酢酸エチルに装入し、モレキュラーシーブを濾別し、有機相をそれぞれ１ｌの水で３回抽出し、撹拌しながら１．２ｌの１０％濃度クエン酸で１回抽出した。有機相を再び分離し、１ｌの水で１回、最後に１ｌの飽和ＮａＨＣＯ3溶液で抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過および濃縮した（２２０ｇの残留物）。
【００８３】
予備精製のために残留物をまずシリカゲル６０（２０×１０ｃｍ）によりヘプタン／酢酸エチルの段階的濃度勾配（１：１から０：１）を用いて濾過し、次いでシリカゲル６０上でクロマトグラフィー処理した（３０×１０ｃｍ；ジクロロメタン／酢酸エチルの段階的濃度勾配、１：０から１：１）。
【００８４】
下記のものを得た：
４０ｇの非極性画分
５２．９ｇの１−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝チミンＢ
３４．５ｇの不純なＢ
３．４ｇの極性画分
不純な画分を再びクロマトグラフィー処理し（ＳＧ６０、４５×１０ｃｍ；ジクロロメタン／酢酸エチル、３：１）、さらに１１．３ｇのＢを得た。
【００８５】
全収率：６４．２ｇ（９７ｍｍｏｌ）のＢ、すなわち収率４８％。
1Ｈ−ＮＭＲは対応する。
実施例２
Ｎ4−ベンゾイル−１−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝シトシンの合成
最初に２′−置換、次いで４′−置換、次いで転移反応：
【００８６】
【化１４】
0004674964.tif 000010
【００８７】
反応経路２
すべてのバッチをＮ2雰囲気下で実施した。
Ｎ4−ベンゾイル−１−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）シトシン２：
５４．０ｇ（０．１５５ｍｍｏｌ）のＮ4−ベンゾイル−１−（β−Ｄ−リボピラノシル）シトシン１を８３０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）および１．５ｌのピリジン（両溶媒ともモレキュラーシーブ３Å上で乾燥および保存）に、１２４℃に加温しながら溶解した。２１０ｍｌのピリジンに溶解した２３．０ｇ（０．１６３ｍｏｌ；１．０５当量）のＢｚＣｌを、−５８〜−６３℃で３．５時間かけて滴加した。このバッチを冷却浴中で一夜撹拌した。９０．３ｇ（１．５ｍｏｌ；１０当量）のｎ−プロパノールを撹拌装入し、バッチを４０℃で高真空において濃縮した。１５０ｍｌのトルエンを２回添加して再濃縮することにより、残留ピリジンを除去した。１２４．３ｇの残留物を５００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、撹拌しながらそれぞれ３００ｍｌの半濃度（ｈａｌｆ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）ＮａＨＣＯ3溶液で２回抽出し、沈殿した固体を濾別し、乾燥させた：６０．７ｇの残留物。ＣＨ2Ｃｌ2相を濃縮した：２５．０ｇ。シリカゲル６０（４０×１０ｃｍ）上で濃度勾配（ＡｃＯＥｔ／イソヘキサン、４：１、次いで純ＡｃＯＥｔ、次いでＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ、１９：１から２：１）を用いる別個のクロマトグラフィーにより、下記のものを得た（ＴＬＣ（シリカゲル、ＡｃＯＥｔ））：
１６．８ｇの２′，４′−ジベンゾエート（２４％）  Ｒf０．５
１２．４ｇの１                        （２３％）  Ｒf０．０
３５．４ｇの２                        （５１％）  Ｒf０．１４
Ｎ4−ベンゾイル−１−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝シトシン３：
３５．４ｇ（７８ｍｍｏｌ）の２を３９０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2および１８０ｍｌのピリジン（両方とも無水）に溶解し、０．９４（７．８ｍｍｏｌ；０．１当量）のＤＭＡＰ、３４．６ｍｌ（２０３ｍｍｏｌ；２．６当量）のＮ−エチルジイソプロピルアミンおよび３３．１ｇ（９８ｍｍｏｌ；１．２５当量）のＤＭＴＣｌを添加し、混合物を室温で２時間撹拌した。
【００８８】
ＴＬＣ（シリカゲル、ＡｃＯＥｔ）：Ｒf０．６
ＣＨ2Ｃｌ2を３０℃でストリッピングし、残留物を６４０ｍｌのピリジン、９．３７（７８ｍｍｏｌ；１．０当量）のＤＭＡＰ、３２．５ｍｌｇ（２３４ｍｍｏｌ；３．０当量）のＥｔ3Ｎ、２１．７ｇ（１５６ｍｍｏｌ；２．０当量）のｐ−ニトロフェノールおよび９３．８ｇ（１．５６ｍｏｌ；２０当量）のｎ−プロパノールで処理し、６５℃で４２時間撹拌した。バッチを５０℃で高真空において濃縮し、それぞれ２５０ｍｌのトルエンで２回処理し、濃縮した。残留物を１ｌのＣＨ2Ｃｌ2に装入し、撹拌しながらそれぞれ５００ｍｌの希ＮａＨＣＯ3溶液で３回抽出し、有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、濃縮した：９２．５ｇの残留物。シリカゲル６０（５０×１０ｃｍ）上で濃度勾配（メチルｔ−ブチルエーテル／イソヘキサン、２：１から４：１、次いでメチルｔ−ブチルエーテル／ＡｃＯＥｔ、１：４、次いでＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ、１：１から１：３）を用いるクロマトグラフィーにより、４４．７ｇの生成物含有画分を得た。これを５４０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2／メチルｔ−ブチルエーテル（１：５）から再結晶した。再結晶物を再び３００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2／メチルｔ−ブチルエーテル（１：１）から再結晶した。
３：ＴＬＣ（シリカゲル、ＣＨＣｌ3／ｉ−ＰｒＯＨ  ４９：１）：Ｒf０．１４  下記のものを得た：３０．０ｇのＮ4−ベンゾイル−１−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝シトシン３：
すなわち２を基準として５１％の収率。1Ｈ−ＮＭＲは対応する。
実施例３
Ｎ6−ベンゾイル−９−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝アデニンの合成
最初に２′−置換、次いで４′−置換、次いで転移反応：
【００８９】
【化１５】
0004674964.tif 000011
【００９０】
反応経路３
９−（β−Ｄ−リボピラノシル）アデニン２：
６８．３７ｇ（１００ｍｍｏｌ）のＮ6−ベンゾイル−９−（２′，３′，４′−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）アデニン１を、室温で一夜、３００ｍｌのＮＨ3飽和ＭｅＯＨ中において撹拌し、結晶を濾別した：２３．５ｇ（８８％）の２。
ＴＬＣ（シリカゲル、ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ  ２：１）：Ｒf０．２３
【００９１】
【化１６】
0004674964.tif 000012
【００９２】
Ｎ6，Ｎ6−ジベンゾイル−９−（β−Ｄ−リボピラノシル）アデニン３：
１６．８ｇ（６２．９ｍｍｏｌ）の２をＮ2雰囲気下で５００ｍｌの無水ピリジンに懸濁し、−４〜−１０℃に冷却した。４０ｍｌ（１９９ｍｍｏｌ；５当量）のトリメチルクロロシランを２０分かけて滴加し、混合物を冷却しながら２．５時間撹拌した。
【００９３】
７３ｍｌのピリジンに溶解した３６．５ｍｌ（１９９ｍｍｏｌ；５当量）の塩化ベンゾイルを−１０〜−１５℃で２５分かけて添加し、冷却しながら１０分間、そして室温で２時間、撹拌した（ＴＬＣ検査（シリカゲル、ＡｃＯＥｔ／ヘプタン  １：１）：Ｒf０．５）。混合物を再び−１０℃に冷却し、１３６ｍｌのＨ2Ｏ（最高温度＋８℃）を流入させ、混合物を室温で一夜撹拌した。転化終了後、溶媒をストリッピングし、残留物をそれぞれ２００ｍｌのトルエンに２回装入し、再び蒸発させた。混合物をそれぞれ５００ｍｌのＥｔ2ＯおよびＨ2Ｏで処理し、２時間機械撹拌し、両相にわずかしか溶解しない生成物を濾別し、Ｅｔ2ＯおよびＨ2Ｏで洗浄し、Ｐ2Ｏ5で高真空中において乾燥させた：２３．８ｇ（８０％）の３。
ＴＬＣ（シリカゲル、ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ  ９：１）：Ｒf０．３５
【００９４】
【化１７】
0004674964.tif 000013
【００９５】
Ｎ6，Ｎ6−ジベンゾイル−９−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）アデニン４：
２６．４ｇ（５５．５ｍｍｏｌ）の３を、Ｎ2雰囲気下で５５０ｍｌの無水ＣＨ2Ｃｌ2および５５ｍｌのピリジン（それぞれモレキュラーシーブ上に保存）に溶解し、０．７３ｇ（５．５５ｍｍｏｌ；０．１当量）のＤＭＡＰで処理し、−８７〜−９０℃に冷却した。ピリジン１４ｍｌ中における８．５８ｇ（６１ｍｍｏｌ；１．１当量）のＢｚＣｌを１時間かけて滴加し、混合物を−７８℃に６０時間（週末）放置した。バッチを濃縮し、ピリジンを除去するためにそれぞれ１００ｍｌのトルエンで２回処理し、蒸発させた。シリカゲル６０（２０×１０ｃｍ）上で濃度勾配（ＡｃＯＥｔ／ヘプタン、１：１から９：１）を用いるクロマトグラフィーにより、２３．２ｇの４を得た。
４：ＴＬＣ（シリカゲル、ＡｃＯＥｔ）：Ｒf０．３４
Ｎ6−ベンゾイル−９−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝アデニン５：
２３．２ｇ（４０ｍｍｏｌ）の４を１６０ｍｌの無水ＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、次いで１４．９ｇ（５６ｍｍｏｌ；１．１当量）のＤＭＴＣｌおよび１７．７ｍｌ（１０４ｍｍｏｌ；２．６当量）のＮ−エチルジイソプロピルアミンで処理した。室温で２時間撹拌した後、さらに４．０ｇ（１１．８ｍｍｏｌ；０．３当量）のＤＭＴＣｌを添加し、混合物をさらに４０分間撹拌した。バッチをロータベーパー内で３５０〜５２０ミリバールおよび３５℃において濃縮した。
ＴＬＣ（シリカゲル、ＡｃＯＥｔ／ヘプタン  １：１）：Ｒf０．１８
残留物を２６０ｍｌの無水ピリジンに溶解し、次いで５１ｍｌ（６７９ｍｍｏｌ；１７当量）のｎ−プロパノール、１６．６ｍｌ（１２０ｍｍｏｌ；３当量）のＥｔ3Ｎ、１１．１ｇ（８０ｍｍｏｌ；２当量）のｐ−ニトロフェノールおよび５．３ｇ（４４ｍｍｏｌ；１．１当量）のＤＭＡＰで処理し、６０〜６３℃で２３時間撹拌した。次いでバッチを室温に２１時間保持した。反応混合物をロータベーパーで濃縮した。残留物をそれぞれ２００ｍｌのトルエンで２回処理し、濃縮し、ＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、水で３回抽出した。
【００９６】
シリカゲル６０（３０×１０ｃｍ）上で濃度勾配（ＡｃＯＥｔ／ヘプタン、１：２から１：０；次いでＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ、１：０から９：１）を用いるクロマトグラフィーにより、１３ｇの５を得た。
５：ＴＬＣ（シリカゲル、ＡｃＯＥｔ／ヘプタン、４：１）：Ｒf０．２
下記のものを得た：１３ｇのＮ6−ベンゾイル−９−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝アデニン５：
すなわち３を基準として３０％の収率。1Ｈ−ＮＭＲは対応する
文献から既知の方法と比較した時間節約：５０％。
実施例４
９−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝−２−Ｏ−アリル−２−Ｎ−イソブチロイルグアニンの合成
最初に３′−置換、次いで４′−置換：
【００９７】
【化１８】
0004674964.tif 000014
【００９８】
９−［３′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル］−２−Ｏ−アリル−２−Ｎ−イソブチロイルグアニンＢ
ＧトリオールＡ（３９３ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を４ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解した。この溶液をオルト安息香酸トリメチル（０．５２ｍｌ，３．０ｍｍｏｌ）およびショウノウスルホン酸（５８ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）で処理し、室温で１５時間撹拌した。次いで混合物を０℃に冷却し、アセトニトリル、水およびトリフルオロ酢酸（５０：５：１）混合物２ｍｌ（０℃に予冷）で処理した。混合物を１０分間撹拌し、真空中で溶媒を除去した。残留物をシリカゲル（２．３×２１ｃｍ）上でジクロロメタン／メタノール  １００：３を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。２５ｍｇ（５％）の４−Ｏ−ベンゾイル化合物、１３９ｍｇ（２８％）の混合画分および２０５ｍｇ（４１％）の目的とする３−Ｏ−ベンゾイル化合物Ｂを得た。
【００９９】
【化１９】
0004674964.tif 000015
【０１００】
９−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝−２−Ｏ−アリル−２−Ｎ−イソブチロイルグアニンＣ
ジオールＢ（１０１ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）を３．２ｍｌの乾燥ジクロロメタンに懸濁した。この懸濁液を１７１μｌ（１．０ｍｍｏｌ）のＮ−エチルジイソプロピルアミン、３２０μｌ（３．９６ｍｍｏｌ）のピリジンおよび１０２ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）のＤＭＴＣｌで処理し、室温で撹拌した。２４時間後、さらに１０２ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）のＤＭＴＣｌを添加し、混合物を再び２４時間撹拌した。次いでこれを３０ｍｌのジクロロメタンで希釈した。溶液を２０ｍｌの１０％濃度クエン酸水溶液および１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、真空中で濃縮した。残留物をシリカゲル（２．３×２０ｃｍ）上でジクロロメタン／メタノール  １００：１を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。３９ｍｇの既知の目的生成物Ｃ（２４％）を得た。
実施例５
ｐ−ＲＮＡリンカー系の合成
アミノ末端をもち、次いで機能性単位の連結に使用できるリンカーを製造することができる３つの方法を以下に記載する：
５．１  ウラシルベースのリンカー
ウラシルの５−位の修飾に基づく
ヒドロキシエチルウラシル２８は既知の方法で大規模に製造できる（Ｊ．Ｄ．Ｆｉｓｓｅｋｉｓ，Ａ．Ｍｙｌｅｓ，Ｇ．Ｂ．Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９６４，２９，２６７０）。ｇ−ブチロラクトン２５をギ酸メチルでホルミル化し、ナトリウム塩２６を反応させて尿素誘導体２７にし、これを環化してヒドロキシエチルウラシル２８を得た（反応経路４）。
【０１０１】
【化２０】
0004674964.tif 000016
【０１０２】
反応経路４：ヒドロキシエチル尿素２８の製造
【０１０３】
【化２１】
0004674964.tif 000017
【０１０４】
反応経路５：Ｎ−フタロイルアミノエチルウラシル３２の合成
ヒドロキシエチル尿素２８をピリジン中のメタンスルホニルクロリドでメシル化して、２９を得た（Ｊ．Ｄ．Ｆｉｓｓｅｋｉｓ，Ｆ．Ｓｗｅｅｔ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９７３，３８，２６４）。
【０１０５】
以下の工程を新たに発明した：ＤＭＦ中のナトリウムアジドと２９を反応させ、アジド３０を得た。これをピリジン中のトリフェニルホスフィンで還元して、アミノエチルウラシル３１を得た。３１のアミノ官能基を最後にＮ−エトキシカルボニルフタルイミドで保護した（反応経路５）。リボーステトラベンゾエート３３をＮ−フタロイルアミノエチルウラシル３２でヌクレオシド化して、リボーストリベンゾエート３４を良好な収率で得た。Ｈ−Ｃ（１′）およびＨ−Ｃ（２′）のカップリング定数Ｊ＝９．５Ｈｚから明らかに分かるように、ピラノース環のアノマー中心はβ立体配置をもつ。次いでＭｅＯＨ中のＮａＯＭｅでベンゾエート保護基を除去して、リンカートリオール３５を得た。３５と塩化ベンゾイルを−７８℃でピリジン／ジクロロメタン  １：１０中、ＤＭＡＰの存在下に反応させた。この方法で、目的とする２′−ベンゾエート３６（６４％）のほかに、２′，４′−ジベンゾイル化生成物（２２％）が得られ、これを採集し、３４から３５へのメタノリシスと同様にして再びトリオール３５に転化した。２′−ベンゾエート３６の４′−位を、ジクロロメタン中のヒューニッヒ塩基の存在下でジメトキシトリチルクロリドにより、９０％を超える収率でトリチル化した。４′−ＤＭＴ−２′−ベンゾエート３７から４′−ＤＭＴ−３′−ベンゾエート３８への転移は、ＤＭＡＰ、ｐ−ニトロフェノールおよびヒューニッヒ塩基の存在下に、ｎ−プロパノール／ピリジン  ５：２中で行われた。クロマトグラフィー後、３８を得た。最後に４′−ＤＭＴ−３′−ベンゾエート３８をヒューニッヒ塩基の存在下でＣｌＰ（ＯＡｌｌ）Ｎ（ｉＰｒ）2と反応させて、ホスホロアミダイト３９を得た（反応経路６）。これを、合成プロトコルの変更なしに自動オリゴヌクレオチド合成に使用できる。
【０１０６】
【化２２】
0004674964.tif 000018
【０１０７】
反応経路６：リンカーホスホロアミダイト３９の製造
方法：
ウラシルリンカー単位の合成
５−（２−アジドエチル）ウラシル（３０）
【０１０８】
【化２３】
0004674964.tif 000019
【０１０９】
１．方法
内部温度計および還流冷却器を備えた５００ｍｌの三つ口フラスコ内で、２６．０ｇ（０．１１ｍｏｌ）の２９を２５０ｍｌのＤＭＦに溶解し、混合物を１０．８ｇ（０．１６６ｍｏｌ）のナトリウムアジドで処理した。次いでこの懸濁液を６０℃で４時間撹拌した（ＴＬＣ検査、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ  ９：１）。ＤＭＦを留去し、残留物を１５０ｍｌの水と共に撹拌した。固体を濾別し、約５０ｍｌの水で洗浄し、デシケーター内で五酸化リン上、真空中において一夜乾燥させた。１４．２ｇ（７１％）の３０を融点２３０〜２３５℃（分解）の無色固体の形で得た。
【０１１０】
２．分析データ
５−（２−アジドエチル）ウラシル（３０）
融点２３０〜２３５℃（分解）
【０１１１】
【化２４】
0004674964.tif 000020
【０１１２】
５−（２−アミノエチル）ウラシル（３１）
【０１１３】
【化２５】
0004674964.tif 000021
【０１１４】
１．方法
内部温度計および還流冷却器を備えた２５０ｍｌの三つ口フラスコ内で、１４．２ｇ（７８．０ｍｍｏｌ）の３０を１７５ｍｌのピリジンに懸濁し、混合物を６１．４ｇ（２３４ｍｍｏｌ）のトリフェニルホスフィン2)で処理した。これを６０℃に５時間加熱し、室温で一夜撹拌した（ＴＬＣ検査、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ  ５：１）。４０ｍｌの２５％濃度アンモニア溶液を懸濁液に添加すると、透明になった。溶媒を回転蒸発器により真空中で除去した。残留物を室温で３０分間、２００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ  １：１中において撹拌し、沈殿を濾別し、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄した。デシケーター内で五酸化リン上、真空中において乾燥させた後、１０．０ｇ（８５％）の３１（融点２１４〜２２０℃）を得た。
【０１１５】
２．分析データ
５−（２−アミノエチル）ウラシル（３１）
融点２１４〜２２０℃、ガス発生、その前に焼結（プレシンタリング：ｐｒｅｓｉｎｔｅｒｉｎｇ）
【０１１６】
【化２６】
0004674964.tif 000022
【０１１７】
５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル（３２）
【０１１８】
【化２７】
0004674964.tif 000023
【０１１９】
１．方法
２５０ｍｌの丸底フラスコ内で、９．６ｇ（６１．８ｍｍｏｌ）の３１を１００ｍｌの水に懸濁し、６．６４ｇ（６２．６ｍｍｏｌ）のＮａ2ＣＯ3で処理した。室温で１５分間撹拌した後、１４．３ｇ（６５ｍｍｏｌ）のＮ−エトキシカルボニルフタルイミドを少量ずつ添加し、混合物を室温で３時間撹拌した（ＴＬＣ検査、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ  ５：１）。この時点では粘稠な白色懸濁液を、濃塩酸で慎重に1)ｐＨ４に調整し、白色沈殿を濾別した。水で洗浄した後、固体をデシケーター内で五酸化リン上、真空中において乾燥させた。これにより１６．０ｇ（９１％）の３２（融点３２４〜３２７℃）を得た。
【０１２０】
２．分析データ
５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル（３２）：
融点３２４〜３２７℃（分解）
【０１２１】
【化２８】
0004674964.tif 000024
【０１２２】
１−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル（３４）
【０１２３】
【化２９】
0004674964.tif 000025
【０１２４】
１．方法
アルゴン導入口、内部温度計および隔壁を備えた２５０ｍｌの三つ口フラスコ内で、７．００ｇ（２４ｍｍｏｌ）の３２および１３．６ｇ（２４ｍｍｏｌ）の３３を１２０ｍｌのアセトニトリルに懸濁した。まず１２．２ｍｌ（５０ｍｍｏｌ）のＢＳＡ、そして３０分間の撹拌後、さらに７ｍｌ（２８ｍｍｏｌ）のＢＳＡを注射器で添加した。４０℃に短時間加熱した後、反応混合物は透明になった。１３ｍｌ（７２ｍｍｏｌ）のＴＭＳＯＴｆを室温で注射器により添加した。１時間後、まだ生成物の形成はみられなかった（ＴＬＣ検査、ＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘプタン  １：１）。したがってさらに１３ｍｌ（７２ｍｍｏｌ）のＴＭＳＯＴｆを添加した。次いで反応混合物を５０℃に加熱した。５０℃で２．５時間撹拌した後（ＴＬＣ検査）、混合物を室温に冷却し、ＡｃＯＥｔ  ２５０ｍｌおよび飽和ＮａＨＣＯ3溶液１９０ｍｌの氷冷混合物に装入し、１０分間激しく撹拌しながら十分に抽出した。これを１００ｍｌのＮａＨＣＯ3溶液で再洗浄し、水相を１００ｍｌのＡｃＯＥｔで再抽出した。分離した有機相をＭｇＳＯ4で乾燥させ、溶媒を回転蒸発器により真空中で除去した。油ポンプ真空中で乾燥させた後、２０．９ｇの粗生成物が得られた。シリカゲル上でのクロマトグラフィー（高さ２５ｃｍ、直径５ｃｍ、ＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘプタン  １：１）により、ＴＬＣでみて均一な泡状生成物を得た。これをＥｔ2Ｏに浸漬した。濾過し、油ポンプ真空中で乾燥させると、１５ｇ（８６％）の３４が得られた。
【０１２５】
２．分析データ
１−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル（３４）：
融点１２４℃（焼結）
ＴＬＣ：ＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘプタン  １：１，Ｒf０．０９
【０１２６】
【化３０】
0004674964.tif 000026
【０１２７】
分析：
計算値Ｃ40Ｈ31Ｎ3Ｏ11（７２９．７０）：
Ｃ  ６５．８４，Ｈ  ４．２８，Ｎ  ５．７６；
実測値：                Ｃ  ６５．６３，Ｈ  ４．４６，Ｎ  ５．５３．
５−（２−フタルイミドエチル）−１−（β−Ｄ−リボピラノシル）ウラシル（３５）
【０１２８】
【化３１】
0004674964.tif 000027
【０１２９】
１．方法
１ｌの丸底フラスコ内で、１５ｇ（２０ｍｍｏｌ）の３４を５００ｍｌのＭｅＯＨに溶解し、３２４ｍｇ（６ｍｍｏｌ）のＮａＯＭｅで処理し、水を遮断して室温で一夜撹拌した（ＴＬＣ検査、ＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘプタン  １：１）。得られた懸濁液にｐＨ＜７になるまでアンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）ＩＲ−１２０を添加した。固体を加熱溶解し、上記イオン交換体から熱時濾別し、ＭｅＯＨで洗浄した。溶媒を除去した後、残留物をそれぞれ１５０ｍｌの水と２回、共蒸発させた。これにより９ｇの粗生成物が得られ、これを９０ｍｌのＭｅＯＨ中で１０分間加熱還流した。室温に冷却した後、混合物を６０ｍｌのＥｔ2Ｏで処理し、４℃で一夜保存した。濾過、Ｅｔ2Ｏ洗浄、および油ポンプ真空乾燥により、７．８ｇ（９３％）の３５を得た。
【０１３０】
２．分析データ
５−（２−フタルイミドエチル）−１−（β−Ｄ−リボピラノシル）ウラシル（３５）：
融点１３７℃（焼結:：ｓｉｎｔｅｒｉｎｇ）
【０１３１】
【化３２】
0004674964.tif 000028
【０１３２】
１−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル
加熱およびアルゴンフラッシした１ｌの四つ口フラスコ内で、１０．６ｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）の５−（２−フタルイミドエチル）−１−（β−Ｄ−リボピラノシル）ウラシルを２０ｍｌのピリジンに溶解し、２００ｍｌのジクロロメタンと混合した。混合物を−７０℃に冷却し、ピリジン５ｍｌおよびジクロロメタン２０ｍｌ中における塩化ベンゾイル３．８２ｍｌ（０．０３３ｍｍｏｌ）を冷却しながら徐々に滴加し、混合物を−７０℃で３５分間撹拌した。反応混合物を６００ｍｌの冷却した塩化アンモニウム溶液に注ぎ、水相を酢酸エチルで抽出した。有機相を合わせて水で洗浄し、真空中で乾燥および濃縮乾固した。シリカゲル上でのクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン  １：１）により、７．９ｇ（６０％）の１−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシルを得た。
ＴＬＣ：Ｒf０．２４（酢酸エチル／ヘプタン  ４：１）
【０１３３】
【化３３】
0004674964.tif 000029
【０１３４】
１−（２−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル
５．６ｇ（１０．７３ｍｍｏｌ）の１−（２−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシルを６０ｍｌのジクロロメタンに溶解し、４．７２ｇ（１３．９５ｍｍｏｌ）の４，４′−ジメトキシトリチルクロリドおよび２．４ｍｌ（１３．９５ｍｍｏｌ）のＮ−エチルジイソプロピルアミンで処理し、室温で２０分間撹拌した。反応混合物を１００ｍｌのジクロロメタンで希釈し、炭酸水素ナトリウム溶液および２０％クエン酸溶液で洗浄し、真空中で乾燥および濃縮乾固した。シリカゲル上でのクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン  １：１＋２％トリエチルアミン）により、７．７ｇ（８７％）の１−（２−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシルを得た。
ＴＬＣ：Ｒf０．５３（酢酸エチル／ヘプタン  １：１＋２％トリエチルアミン）
【０１３５】
【化３４】
0004674964.tif 000030
【０１３６】
１−（３−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル
３ｇ（３．６３ｍｍｏｌ）の１−（２−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル、１ｇ（７．２６ｍｍｏｌ）の４−ニトロフェノール、０．４４ｇ（３．６３ｍｍｏｌ）の４−（ジメチルアミノ）ピリジンおよび３．７５ｍｌ（２１．７８ｍｍｏｌ）のＮ−エチルジイソプロピルアミンを５．６ｍｌのイソプロパノールおよび２５ｍｌのピリジンに溶解し、６５℃に加熱し、６５℃で３日間撹拌した。溶液を真空中で濃縮乾固し、残留物を１５０ｍｌのジクロロメタンに溶解した。２０％クエン酸溶液および炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した後、溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させた。シリカゲル上でのクロマトグラフィー（酢酸エチル／ジクロロメタン／イソヘキサン  ２：１：１）により、２．２７ｇ（７６％）の１−（３−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシルを得た。
ＴＬＣ：Ｒf０．２７（酢酸エチル／イソヘキサン  ２：１＋１％トリエチルアミン）
【０１３７】
【化３５】
0004674964.tif 000031
【０１３８】
１−｛２′−Ｏ−［（アリルオキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル
８８ｍｇ（０．１１ｍｍｏｌ）の１−（３−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシルを５ｍｌのジクロロメタンに溶解し、７５μｌ（０．４４ｍｍｏｌ）のＮ−エチルジイソプロピルアミンおよび７０μｌ（０．３ｍｍｏｌ）のアリルオキシクロロ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンで処理し、室温で３時間撹拌した。さらに３５μｌ（０．１５ｍｍｏｌ）のアリルオキシクロロ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンを添加して反応を終了させた後、室温でさらに１時間撹拌し、反応混合物を真空中で濃縮した。シリカゲル上でのクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン：濃度勾配１：２から１：１そして２：１、それぞれの場合、＋２％トリエチルアミン）により、８５ｍｇ（７６％）の１−｛２′−Ｏ−［（アリルオキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシルを得た。
ＴＬＣ：Ｒf０．３６（酢酸エチル／ヘプタン  ２：１）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ）：選択した特徴的な位置：２．２８，２．５２（２ｄｄ，Ｊ＝５．０，１１．０Ｈｚ，２Ｈ，２Ｈ−５′），３．７９，３．７８（約２ｓ，１２Ｈ，ＯＭｅ），６．１４（１ｂｓ，１Ｈ，Ｈ−３′）．
31Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：１４９．８，１５０．６．
５．２  インドールベースのリンカー
Ｎ−フタロイルトリプタミンは、無水フタル酸とトリプタミンから文献記載に従って得られる（Ｋｕｅｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４３，１３，１９７８，２７３３−２７３５）。これをボラン−ＴＨＦで還元して、インドリンを得る（Ａ．Ｇｉａｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，１０１，２２０）。
【０１３９】
３−置換インドリンをまずリボースと反応させてヌクレオシドトリオールにし、次いで無水酢酸と反応させてトリアセテートを得る。この混合物を２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノパラキノンで酸化し、アセテートをナトリウムメトキシドで開裂させ、２′−位を選択的にベンゾイル化し、４′−位を選択的にＤＭ−トリチル化し、転移反応を行って、３′−ベンゾエートを得る。ホスホロアミダイトの形成を常法により行う。これには、合成プロトコルの変更なしに自動オリゴヌクレオチド合成法を採用できる。
方法
３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）インドリン
【０１４０】
【化３６】
0004674964.tif 000032
【０１４１】
５１．４ｇ（１７７ｍｍｏｌ）のフタロイルトリプタミンＡを３５４ｍｌの１Ｍボラン−ＴＨＦ溶液（２当量）に窒素雰囲気下で溶解し、０℃に冷却した。３５４ｍｌのトリフルオロ酢酸を０℃で徐々に滴加し（注意：ガス発生）、混合物を３０分間撹拌した（ＴＬＣ検査：ＥｔＯＡｃ）。次いで１７．３ｍｌの水を添加し、混合物を１０分間撹拌し、真空中で濃縮した。残留物を１０％濃度ＮａＯＨ溶液／ジクロロメタンに溶解し、有機相を分離し、ＮａＳＯ4で乾燥させ、真空中で濃縮した。残留物［５０．９ｇ］を熱エタノール（３ｌ）から再結晶した。４１．４ｇのＢを得た。融点１６１〜１６２℃。母液を真空中で濃縮し、残留物を再びエタノールから再結晶した。さらに３．２ｇのＢを得た。融点１５８〜１５９℃。全収率：４４．６ｇ（１５３ｍｍｏｌ）のＢ、すなわち８６％。
【０１４２】
【化３７】
0004674964.tif 000033
【０１４３】
３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）−１−（２′，３′，４′−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボピラノシル）インドール
【０１４４】
【化３８】
0004674964.tif 000034
【０１４５】
４５．２ｇ（１５５ｍｍｏｌ）のＡおよび２３．２ｇ（１５５ｍｍｏｌ；１．０当量）のＤ−リボースを７５０ｍｌの乾燥エタノールに懸濁し、窒素雰囲気下で４時間、加熱還流した（ＴＬＣ検査：ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ  １０：１）。室温に冷却した後、混合物を真空中で濃縮した。残留物を３００ｍｌのピリジンに溶解し、氷冷しながら１５５ｍｌの無水酢酸で処理した。１５分後、氷浴を取り除き、混合物を室温で１８時間撹拌した（ＴＬＣ検査：ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン  １：１）。この溶液を真空中で濃縮し、それぞれ３００ｍｌのトルエンで３回、共蒸発させた。得られた油を９００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、氷冷しながら３８．８ｇ（１７１ｍｍｏｌ；１．１当量）の２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノパラキノンで処理した。１５分後、氷浴を取り除き、混合物を室温で１．５時間撹拌した（ＴＬＣ検査：ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン  １：１）。析出した沈殿を吸引濾過し、ジクロロメタンで洗浄し、廃棄した。濾液を６００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄した。この間に析出した沈殿を再び吸引濾過し、ジクロロメタンで洗浄し、廃棄した。有機抽出液を合わせてＮａＳＯ4で乾燥させ、真空中で濃縮した。残留物（９０．９ｇ）をシリカゲル６０上でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した（１０×２５ｃｍ；ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン  ２：３）。
【０１４６】
下記のものを得た：２１．５ｇの純Ｂ；および４６．８３ｇの混合画分、これからフラッシュクロマトグラフィー後にさらに２０．４ｇの純Ｂが得られた。全収率：４１．９ｇ（７６ｍｍｏｌ）のＢ、すなわち４９％。
【０１４７】
【化３９】
0004674964.tif 000035
【０１４８】
３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）−１−β−Ｄ−リボピラノシルインドール
【０１４９】
【化４０】
0004674964.tif 000036
【０１５０】
４４．１ｇ（８０ｍｍｏｌ）のＡを窒素雰囲気下で４００ｍｌの無水メタノールに溶解した。混合物を氷冷しながら４．０ｍｌの３０％濃度ナトリウムメトキシドで処理し、次いで室温で１８時間撹拌した。析出した沈殿を吸引濾過し、冷エタノールで洗浄した。濾液を真空中で濃縮した。残留物をジクロロメタンに装入した。この溶液を飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄し、ＮａＳＯ4で乾燥させ、真空中で濃縮した。得られた残留物を反応溶液から析出した沈殿と一緒に熱エタノールから再結晶した。２２．６ｇのＢを得た。融点１９６〜１９８℃。母液を真空中で濃縮し、残留物を再び熱エタノールから再結晶した。さらに９．２ｇのＢを得た。融点１８８〜１９４℃。全収率：２５．８ｇのＢ、すなわち７６％。
【０１５１】
【化４１】
0004674964.tif 000037
【０１５２】
１−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）インドール
【０１５３】
【化４２】
0004674964.tif 000038
【０１５４】
１０．６ｇ（２５ｍｍｏｌ）のＡを窒素雰囲気下で２５０ｍｌの乾燥ジクロロメタンに装入した。この混合物を３０５ｍｇのＤＭＡＰ（２．５ｍｍｏｌ）および２０ｍｌのピリジンで処理した。これをすべてが溶解するまで加熱し、次いで−７８℃に冷却した。次いで８ｍｌのジクロロメタンに溶解した３．３５ｍｌの塩化ベンゾイル（２８．８ｍｍｏｌ）を１５分間かけて滴加した。さらに３０分後のＴＬＣ検査（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  ３：１）は、反応の終了を示した。４５分後、この冷溶液をそのまま、ひだ付きフィルターを通して２００ｍｌの飽和ＮＨ4Ｃｌ溶液に添加し、フィルター残留物をジクロロメタンで洗浄した。有機相を水で１回洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濃縮した。残留物をトルエンと２回、共蒸発させ、１０×２０ｃｍのシリカゲル上で、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  ３：１を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。８．１ｇ（６４％）のＢを得た。
【０１５５】
【化４３】
0004674964.tif 000039
【０１５６】
１−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝−３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）インドール
【０１５７】
【化４４】
0004674964.tif 000040
【０１５８】
８．９ｇ（１６．９ｍｍｏｌ）のＡを窒素雰囲気下で１３５ｍｌの乾燥ジクロロメタンに懸濁した。混合物を２０６ｍｇのＤＭＡＰ（１．６８ｍｍｏｌ）、５．８ｍｌのＮ−エチルジイソプロピルアミン（３３．７ｍｍｏｌ）および約１２ｍｌのピリジンで処理した（溶解し終るまで）。次いでこれを３４ｇのモレキュラーシーブ４Åで処理し、３０分間撹拌した。０℃に冷却した後、これを１１．４ｇのＤＭＴＣｌ（３３．７ｍｍｏｌ）で処理し、冷却浴を取り除いた後、７５分間撹拌した。次いでさらに１．９４ｇ（０．３４当量）、さらに４０分後に１．１４ｇ（０．２当量）、さらに６５分後に１．１４ｇ（０．２当量）のＤＭＴＣｌを添加した。４．２５時間後、反応が終了した。次いで混合物を２５．３ｍｌのｎ−プロパノール（２０当量）で処理し、さらに３０分間撹拌し、次いで慎重に濃縮した（泡立ち）。残留物を１００ｍｌのピリジンに溶解した。これを１．８５ｇのＤＭＡＰ（１５．１ｍｍｏｌ；０．９当量）、１３．０５ｍｌのＮ−エチルジイソプロピルアミン（１０１ｍｍｏｌ；６．０当量）、７１ｍｌのｎ−プロパノール（９４０ｍｍｏｌ；５６当量）および３．７４ｇのｐ−ニトロフェノール（２６．９ｍｍｏｌ；１．６当量）で処理した。この混合物を窒素下に７５〜８０℃で９６時間撹拌した。室温に冷却した後、混合物をセライト（Ｃｅｌｉｔｅ）で濾過し、濃縮した。残留物を９×１７ｃｍのシリカゲル上で、トルエン／ジエチルエーテル／トリエチルアミン  ９０：１０：１を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物含有画分（９．２５ｇ）をまずＥｔＯＡｃから再結晶し、次いでトルエン／メタノールから再沈殿させた。５．８６ｇのＢ（４２％）を得た。
【０１５９】
【化４５】
0004674964.tif 000041
【０１６０】
１−｛２′−Ｏ−（アリルオキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ）−３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝−３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）インドール（２種のジアステレオマー）
【０１６１】
【化４６】
0004674964.tif 000042
【０１６２】
１６５８ｇのアルコールＡ（２．０ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で１０ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解した。この溶液を１．０３ｍｌのＮ−エチルジイソプロピルアミン（６．０ｍｍｏｌ）および０．６３ｍｌのモノアリルｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（２．８ｍｍｏｌ）で処理し、室温で１時間撹拌した。次いで６１μｌ（０．８ｍｍｏｌ）のイソプロパノールの添加により、過剰のリン酸化試薬を分解した。１０分後、混合物を真空中で濃縮し、残留物を３．３×２１ｃｍのシリカゲル上で、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ／ＮＥｔ3（７５：２５：１）を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物含有画分を濃縮し、ＣＣｌ4に装入し、再び濃縮した。２．０４ｇのほとんど無色の泡状物（定量的）が得られた。これをそのままオリゴマー化に使用でき、−２０℃で何週間も保存できる。
シリカゲル上のＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン／ＮＥｔ3  ３３：６６：１）：０．４１
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ）：選択した特徴的な位置：
【０１６３】
【化４７】
0004674964.tif 000043
【０１６４】
５．３  リシンベースのリンカー
合成を反応経路７に示し、以下に詳述する。
【０１６５】
【化４８】
0004674964.tif 000044
【０１６６】
反応経路７：リシンベースリンカーの合成
６−アミノ−２（Ｓ）−ヒドロキシヘキサン酸（１）を、Ｌ−リシンから、文献により既知の方法でジアゾ化し、次いで加水分解することにより製造した（Ｋ．−Ｉ．Ａｋｅｔａ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１９７６，２４，６２１）。
２（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−６−アミノ−１，２−ヘキサンジオール（２）
３．４ｇのＬｉＢＨ4（１５６ｍｍｏｌ；４当量）を、アルゴン下で１００ｍｌの無水ＴＨＦに溶解する（発熱性）。約３０℃に冷却した後、３９．６ｍｌのＴＭＳＣｌ（３１２ｍｍｏｌ；８当量）を徐々に滴加すると（ガス発生）、沈殿が生じる。５．７４ｇの６−アミノ−２（Ｓ）−ヒドロキシヘキサン酸（１）（３９ｍｍｏｌ）をアルゴン向流中で少量ずつ添加し、ＴＬＣ（シリカゲル；ｉ−ＰｒＯＨ／濃ＮＨ4ＯＨ／水  ７：２：１；ニンヒドリン染色）がもはや出発物質を示さなくなるまで（約３時間）、混合物を６５℃に加熱する。混合物を氷冷しながら慎重に１２０ｍｌのメタノールで処理する（著しいガス発生）。溶媒を真空中で濃縮し、残留物をそれぞれ２００ｍｌのメタノールと３回、共蒸発させ、次いで１００ｍｌの無水ＤＭＦに溶解する。１６ｍｌのエチルジイソプロピルアミン（９３．６ｍｍｏｌ；２．４当量）を添加した後、混合物を０℃に冷却し、１２．１ｇのＦｍｏｃＣｌ（４６．８ｍｍｏｌ；１．２当量）少量ずつで処理する。１５分後、冷却浴を取り除き、出発物質が消費されるまで（約３時間；ＴＬＣ検査：シリカゲル；ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／ＨＯＡｃ／水  ６０：３０：３：５）、混合物を室温で撹拌する。反応溶液を６００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3溶液に添加する。沈殿を濾別し、２００ｍｌの水で洗浄し、５０℃で高真空下に、重量が一定になるまで乾燥させる（約６時間）。１３．９ｇの無色固体が得られ、これを酢酸エチル（４０ｍｌ）／ｎ−ヘキサン（３５ｍｌ）から再結晶する。収量：９．０５ｇ（６５％）。
【０１６７】
【化４９】
0004674964.tif 000045
【０１６８】
２（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｏ1−ＤＭＴ−６−アミノ−１，２−ヘキサンジオール（３）を国際特許出願公開第ＷＯ８９／０２４３９号に従ってＤＭ−トリチル化した。
２（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｏ1−ＤＭＴ−Ｏ2−アリルオキシジイソプロピルアミノホスフィニル−６−アミノ−１，２−ヘキサンジオール（４）
０．５１ｍｌのエチルジイソプロピルアミン（３．０ｍｍｏｌ；３当量）および０．３３ｍｌのクロロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノアリルオキシホスフィン（１．５ｍｍｏｌ；１．５当量）を、アルゴン下で、無水ジクロロメタン１０ｍｌ中における６７０ｍｇのアルコール（３）（１．０２ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。混合物を室温で２時間撹拌し、溶媒を真空中でストリッピングし、得られた残留物を３．２×１６ｃｍのシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製する（ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン／ＮＥｔ3  ２０：８０：１）。８３９ｇ（９７％）のわずかに黄色みを帯びた油が得られる。
ＴＬＣ：シリカゲル；ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン／ＮＥｔ3  ５０：５０：１；ＵＶ；Ｒf＝０．７７
【０１６９】
【化５０】
0004674964.tif 000046
【０１７０】
実施例６
結合試薬としてベンゾイミダゾリウムトリフラートを用いる配列４′−インドールリンカー−Ａ８−２′のｐ−ＲＮＡオリゴの合成
１０８ｍｇのインドールリンカーホスホロアミダイトおよび２４４ｍｇのＡ−ホスホロアミダイトを合成装置バイアル中へ秤量し、デシケーター内でＫＯＨ上に、２８．１ｍｇのＣＰＧ支持体を充填したカラム（Ａ単位を装填）と一緒に、高真空中に３時間放置する。これらのホスホロアミダイトは、アセトニトリル１ｍｌ（インドールリンカー）または２．５ｍｌ（Ａ−ホスホロアミダイト）に溶解され、数粒のモレキュラーシーブを添加し、デシケーター内でＫＯＨ上に密閉放置される。
【０１７１】
２００ｍｇのヨウ素を５０ｍｌのアセトニトリルに激しく撹拌しながら溶解する。すべてが溶解した後（視覚調節）、２３ｍｌの水および４．６ｍｌのｓｙｍ−コリジンを添加し、溶液を１回、十分に混合する。脱トリチル化には、ジクロロメタン中６％濃度のジクロロ酢酸溶液を用いる。キャッピング試薬（無水酢酸＋塩基）を購入し、オリゴヌクレオチド合成の常法に従って使用する。
【０１７２】
ベンゾイミダゾリウムトリフラートを熱アセトニトリルから再結晶し、乾燥させる。このほぼ無色の結晶を用いて、無水アセトニトリル中０．１Ｍ溶液を結合試薬として調製する。合成中、この溶液は常に透明さを保ち、合成装置配管の閉塞は起きない。
【０１７３】
エッペンドルフ・エコシン（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｅｃｏｓｙｎ）３００＋（ＤＭＴ−ｏｎｅ）における改変ＤＮＡ結合サイクル：
脱トリチル化    ７分
結合            １時間
キャッピング    １．５分
酸化            １分
２０ｍｇのテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウムを１．５ｍｌのジクロロメタンに溶解し、２０ｍｇの炭酸水素ジエチルアンモニウム、２０ｍｇのトリフェニルホスフィン、およびオリゴヌクレオチドを保有するガラス支持体を添加し、密閉し（パラフィルム）、バイアルを室温で５時間揺動する。次いでガラス支持体を分析用吸引フィルターにより吸引濾過し、ジクロロメタン、アセトンおよび水で洗浄する。
【０１７４】
０．１Ｍジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム溶液で支持体を懸濁し、室温に４５分間放置する。これを吸引濾過し、水、アセトン、エタノールおよびジクロロメタンで洗浄する。支持体を１．５ｍｌの２４％濃度ヒドラジン水和物溶液に懸濁し、４℃で２４〜３６時間振とうし、０．１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＢ緩衝液）で７ｍｌに希釈する。これをウォーターズ、セプ−パク（Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ）カートリッジにより、ヒドラジンを含有しなくなるまで洗浄する。これを５ｍｌの８０％濃度ギ酸溶液で処理し、３０分後に濃縮乾固する。残留物を水１０ｍｌに装入し、ジクロロメタンで抽出し、水相を濃縮し、次いでＨＰＬＣ処理する（ｔＲ＝３３分、０．１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液中のアセトニトリル濃度勾配）。常法により脱塩すると（ウォーターズ、セプ−パクカートリッジ）、オリゴヌクレオチドが得られる。
収率：１７．６ＯＤ
ＥＳＩ質量分析により証明された物質同一性：
Ｍ（計算値）＝３０８２Ｄ，（Ｍ＋２Ｈ）2+（実測値）＝１５４１．９Ｄ
実施例７
結合体の調製
１．逐次法
まず配列Ａ8のｐ−ＲＮＡオリゴマー、すなわちオクタマーを、エッペンドルフ・エコシンＤ３００＋により、実施例２の記載に従って調製する；その際下記の試薬を変更する：６％濃度ジクロロ酢酸の代わりに２％濃度トリクロロ酢酸、コリジン中のヨウ素の代わりにピリジン中のヨウ素、ベンゾイミダゾリウムトリフラート溶液の代わりにテトラゾール溶液。合成プログラム変更後、さらに配列ＧＡＴＴＣのＤＮＡオリゴマーを既知方法に従って合成する（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｔｈｅｓｉｓ，ＩＲＬプレス，英国オックスォード，１９８４）。脱アリル化、ヒドラジン分解、ＨＰＬＣおよび脱塩をｐ−ＲＮＡオリゴマーに関する記載（上記参照）に従って実施すると、目的とする結合体が得られる。
２．集中法
実施例２の記載に従って配列４′−インドールリンカー−Ａ8−２′のｐ−ＲＮＡオリゴマーを調製し、精製およびヨードアセチル化する。配列ＧＡＴＴＣ−チオールリンカーのＤＮＡオリゴマーを既知方法に従って合成し（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｔｈｅｓｉｓ，ＩＲＬプレス，英国オックスォード，１９８４）、精製する（３′−チオールリンカー、グレン・リサーチから：Ｎｏ．２０−２９３３）。これら２フラグメントを緩衝液中に放置すると（Ｔ．Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，５，３１２）、結合体が得られる。これを最後にＨＰＬＣにより精製する。
実施例８
アミノ修飾ｐ−ＲＮＡへのビオチン基の結合
まず、実施例６の記載に従って、配列ＴＡＧＧＣＡＡＴのｐ−ＲＮＡオリゴマーを合成し、仕上げ処理する。このオリゴマーは、ユーロジェネティック（Ｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃ）の５′−アミノ修飾剤５（２−（２−（４−モノメトキシトリチル）アミノエトキシ）エチル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト）により４′末端にアミノ基を備えている。このオリゴヌクレオチド（１７．４ＯＤ，０．１７５μｍｏｌ）を０．５ｍｌの塩基性緩衝液に装入し、ＤＭＦ（無水）１１４μｌ中における１．１４ｍｇ（２．５μｍｏｌ）のビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを溶解し、この溶液を室温に１時間放置する。得られた結合体を調製用ＨＰＬＣにより精製し、純粋な生成物をセパクで脱塩する。
収率８．６ＯＤ（４９％）
Ｍ（計算値）＝３０８０Ｄ，Ｍ（実測値）＝３０８０．４Ｄ
実施例９
シアニン−またはビオチン−標識ｐ−ＲＮＡオンラインの調製
まず各種のＡ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＩｎｄ（Ｉｎｄ＝核酸塩基としてのアミノエチルインドール）ホスホロアミダイトを既知の方法で調製した。シアニン（Ｃｙ３−ＣＥ）およびビオチンホスホロアミダイトはグレン・リサーチから入手した。
【０１７５】
それぞれ１５μｍｏｌを用いて、全自動固相合成を行った。１合成サイクルは下記の工程からなる：
（ａ）脱トリチル化：ＣＨ2Ｃｌ2中６％ＤＣＡ（ジクロロ酢酸）（７９ｍｌ）により５分間；
（ｂ）ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）、アセトニトリル（２０ｍｌ）による洗浄、次いでアルゴンによるフラッシング；
（ｃ）結合：樹脂を活性化剤（ＣＨ2Ｃｌ2中０．５Ｍピリジン・ＨＣｌ，０．２ｍｌ）で洗浄；比率１：１の活性化剤（０．７６ｍｌ）および対応するホスホロアミダイト（０．７６ｍｌ：８当量；アセトニトリル中０．１Ｍ）で３０分間の処理；
（ｄ）キャッピング：パーセプティブ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ）からのキャップＡ  ５０％（１０．５ｍｌ）およびキャップＢ  ５０％（１０．５ｍｌ）（キャップＡ：ＴＨＦ、ルチジン、無水酢酸；キャップＢ：１−メチル−イミダゾール、ＴＨＦ、ピリジン）；
（ｅ）酸化：１２０ｍｌのヨウ素溶液（４００ｍｇのヨウ素；１００ｍｌのアセトニトリル、４６ｍｌのＨ2Ｏおよび９．２ｍｌのｓｙｍ−コリジン中）で１分間；
（ｆ）洗浄：アセトニトリル（２２ｍｌ）による。
【０１７６】
その後のオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ精製を容易にするために、最後のＤＭＴ（ジメトキシトリチル）またはＭＭＴ（モノメトキシトリチル）保護基をビオチンモノマーから除去しなかった。修飾ホスホロアミダイトとの最後の結合の検出は、１％の樹脂を用いた合成後、トリチルカチオンのＵＶ（５０３ｎｍ）吸収により行う。
オリゴヌクレオチドの仕上げ処理：
アリルエーテル保護基は、ＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍｌ）中におけるテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（２７２ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（２７２ｍｇ）および炭酸水素ジエチルアンモニウムの溶液により、室温で５時間後に除去された。次いでガラス支持体をＣＨ2ＣＬ2（３０ｍｌ）、アセトン（３０ｍｌ）および水（３０ｍｌ）で洗浄する。パラジウム錯体残留物を除去するために、樹脂を０．１Ｍジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム水和物溶液ですすいだ。上記の洗浄操作を逆の順序でさらに１回行った。次いで樹脂を高真空中で１０分間乾燥させた。ガラス支持体からの除去工程と同時に脱ベンゾイル化を、２４％ヒドラジン水和物溶液（６ｍｌ）中、４℃で行った。ＲＰ１８（１８〜２５時間）のＨＰＬＣ検査後、活性化した（アセトニトリル、２０ｍｌ）ウォーターズ、セプ−パクカートリッジにより、オリゴヌクレオチド“トリチルＯＮ”をヒドラジンから遊離させた。ヒドラジンを０．１Ｍ  ＴＥＡＢ（３０ｍｌ）で洗い出した。次いでオリゴヌクレオチドをアセトニトリル／０．１Ｍ  ＴＥＡＢ（１０ｍｌ）で溶離した。次いで混合物をＨＰＬＣにより精製し（フラグメント配列の分離のため）、ＤＭＴ脱保護（３０ｍｌの８０％濃度ギ酸水溶液）を行った。最終脱塩（セプ−パクカートリッジによる；０．１Ｍ  ＴＥＡＢ緩衝液／アセトニトリル：１／１を使用）により、純粋なシアニン−またはビオチン−標識オリゴマーを得た。
【０１７７】
このオリゴ溶液のアリコートを用いて、ＥＳＩ−ＭＳを行った：
４′  Ｃｙ−ＡＩｎｄＴＴＣＣＴＡ  ２′：計算値Ｍ＝３０２６，実測値（Ｍ＋Ｈ）+＝３０２７
４′  ビオチン−ＴＡＧＧＣＡＡＩｎｄＴ  ２′：計算値Ｍ＝３０１４，実測値（Ｍ＋２Ｈ）2+ｍ／ｅ  １５０８および（Ｍ＋Ｈ）+ｍ／ｅ  ３０１５
これらのオリゴマーを保存のため凍結乾燥した。
実施例１０
Ｎ−（ヨードアセチルオキシ）スクシンイミドによるｐ−ＲＮＡのＮ−ヨードアセチル化
ｐ−ＲＮＡ配列：４′  ＡＧＧＣＡＩｎｄＴ  ２′、Ｍw＝２２６６．５６ｇ／ｍｏｌ（Ｉｎｄ＝インドール−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2−リンカー）
１当量のｐ−ＲＮＡを０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ８．４）に溶解し（１ｍｌ／３５０ｎｍｏｌ）、ＤＭＳＯ中のＮ−（ヨードアセチルオキシ）スクシンイミド溶液（４０μｌ／ｍｇ）で処理した。バッチをアルミニウム箔で遮光し、室温に３０〜９０分間放置した。
【０１７８】
反応の進行を分析用ＨＰＬＣで監視した。標準条件は以下のとおりである：
緩衝液Ａ：水中の０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液
緩衝液Ｂ：水：アセトニトリル（１：４）中の０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液
濃度勾配：１０％Ｂから出発して４０分で５０％Ｂ
カラム材料：１０μＭリクロスフェア（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒｅ、登録商標）１００  ＲＰ−１８、メルク・ダルムシュタット社から；２５０×４ｍｍ
出発物質の保持時間：１８．４分
この場合の生成物の保持時間：２３．１分
反応終了後、バッチの体積を水で４倍に希釈した。ウォーターズ、セプ−パクカートリッジＲＰ−１８（１５ＯＤ  ２ｇの充填より）を１０ｍｌのアセトニトリルで２回、１０ｍｌの水で２回、活性化し、前記オリゴを付与して沈み込ませ、塩類および試薬を除去するために、反応器を１０ｍｌの水で２回洗浄し、１０ｍｌの水で３回再洗浄し、まず５０：１の水：アセトニトリル１ｍｌで５回、次いで１：１の水：アセトニトリルで溶離した。生成物は１：１画分中にきわめて良好に溶出した。これらの画分を冷暗所で濃縮し、合わせて再濃縮した。
【０１７９】
収率を２６０ｎｍのＵＶ吸収分光測定により測定した。
質量分析：
配列：４′  ＡＧＧＣＡＩｎｄ（ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ2−Ｉ）Ｔ  ２′
計算質量：２４３４．５０ｇ／ｍｏｌ
実測質量ＭＨ22+：１２１７．９ｇ／ｍｏｌ＝２４３３ｇ／ｍｏｌ
実施例１１
配列ＣＹＳＫＶＧのペプチドへのｐ−ＲＮＡの結合：
ヨードアセチル化ｐ−ＲＮＡ（Ｍw＝２４３４．５０ｇ／ｍｏｌ）を緩衝液系に溶解し（１１４ｎｍｏｌ当たり１０００μｌ）、次いで緩衝液中のペプチド溶液（２ｍｏｌのＣＹＳＫＶＧペプチド；Ｍw＝６５５．７７３ｇ／ｍｏｌ；２０μｌの緩衝液中２２８ｎｍｏｌ）で処理した。
緩衝液系：リーデル−デ・ヘーン（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ）からのボラックス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を、１：１の比率で１０ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム塩溶液と混合し、ＨＣｌでｐＨ６．３に調整した。こうして５ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡを含有する溶液を得た。
【０１８０】
このバッチを転化終了まで室温で暗所に放置した。反応をＨＰＬＣ分析により監視した。
【０１８１】
標準条件は以下のとおりである：
緩衝液Ａ：水中の０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液
緩衝液Ｂ：水：アセトニトリル（１：４）中の０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液
濃度勾配：１０％Ｂから出発して４０分で５０％Ｂ
カラム材料：１０μＭリクロスフェア（登録商標）１００  ＲＰ−１８、メルク・ダルムシュタット社から；２５０×４
出発物質の保持時間：１７．６分
生成物の保持時間：１５．５分
反応終了後、バッチを直接にＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
（標準条件については前記参照）。
【０１８２】
画分を冷暗所で濃縮し、合わせて再濃縮した。残留物を水に装入し、脱塩した。ウォーターズ、セプ−パクカートリッジＲＰ−１８（１５ＯＤ  ２ｇの充填より）を１０ｍｌのアセトニトリルで２回、１０ｍｌの水で２回、活性化し、前記オリゴを付与して沈み込ませ、塩類を除去するために、反応器を１０ｍｌの水で２回洗浄し、１０ｍｌの水で３回再洗浄し、水：アセトニトリル  １：１で溶離した。生成物画分を濃縮し、合わせて再濃縮した。
【０１８３】
収率を２６０ｎｍのＵＶ吸収分光測定により測定した。収率は理論値の７０〜９５％に達した。
質量分析：
配列：４′  ＡＧＧＣＡＩｎｄ（ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ2−ＣＹＳＫＶＧ）Ｔ  ２′
計算質量：２９６２．３６ｇ／ｍｏｌ
実測質量ＭＨ22+：１４８２．０ｇ／ｍｏｌ＝２９６２ｇ／ｍｏｌ
実施例１２
ペプチドライブラリーへのｐ−ＲＮＡの結合
ヨードアセチル化ｐ−ＲＮＡ（Ｍw＝２４３４．５０ｇ／ｍｏｌ）を緩衝液系に溶解し（８３２ｎｍｏｌ当たり１３００μｌ）、次いで緩衝液中でペプチドライブラリー（ＣＫＲ−ＸＸ−ＯＨ；Ｘ＝Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ）溶液により処理した（８ｍｏｌ；平均分子質量Ｍm＝６７７．８２ｇ／ｍｏｌ；４．５ｍｇ＝２００μｌの緩衝液中６．６６μｍｏｌ）。
緩衝液系：リーデル−デ・ヘーンからのボラックス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を、１：１の比率で１０ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム塩溶液と混合し、ＨＣｌでｐＨ６．６に調整した。こうして５ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡを含有する溶液を得た。
【０１８４】
このバッチを転化終了まで室温で暗所に放置した。反応をＨＰＬＣ分析により監視した。この場合、出発物質は７０時間後に消失した。
【０１８５】
分析用ＨＰＬＣの標準条件は以下のとおりである：
緩衝液Ａ：水中の０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液
緩衝液Ｂ：水：アセトニトリル（１：４）中の０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液
濃度勾配：１０％Ｂから出発して４０分で５０％Ｂ
カラム材料：１０μＭリクロスフェア（登録商標）１００  ＲＰ−１８、メルク・ダルムシュタット社から；２５０×４
出発物質の保持時間：１８．８分
生成物の保持時間：１３．９分から３６．２分まで数ピーク
反応終了後、バッチの体積を水で４倍に希釈した。ウォーターズ、セプ−パクカートリッジＲＰ−１８（１５ＯＤ  ２ｇの充填より）を１０ｍｌのアセトニトリルで３回、１０ｍｌの水で３回、活性化し、前記オリゴを付与して沈み込ませ、塩類および過剰のペプチドを除去するために、反応器を１０ｍｌの水で２回洗浄し、カートリッジを１０ｍｌの水で３回再洗浄し、ＵＶ分光測定で生成物が溶出しなくなるまで水：アセトニトリル  １：１で溶離した。生成物画分を冷暗所で濃縮し、合わせて再濃縮した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  天然の形のＲＮＡ（左）およびｐ−ＮＡの形のＲＮＡ（右）の構造のセクションを示す。
【図２】  Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）によるｐ−リボ−（Ａ，Ｕ）−オリゴヌクレオチドの合成を模式的に示す。
【図３】  固体キャリヤーに固定化された認識構造体（アレイ）の配置を模式的に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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