(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）被検物質の存在下、
配列番号：５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよく、かつキナーゼ活性を有するものであるアミノ酸配列を含むポリペプチドからなるＴＴＫプロテインキナーゼ、
配列番号：１に記載のアミノ酸配列の全長からなるTTK活性測定用基質、又は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の１０アミノ酸以上の部分配列からなるＴＴＫ活性測定用基質であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドからなるＴＴＫ活性測定用基質、及び
リン酸基供与体
をインキュベーションし、ＴＴＫ活性を測定する工程、並びに、
（Ｂ）被検物質非存在下のＴＴＫ活性と比較して、該活性を減少させる被検物質を選択する工程を含む、ＴＴＫ活性抑制作用を有する化合物又はその塩のスクリーニング方法。
【請求項２】
該ＴＴＫ活性測定用基質が、ビオチン、ビオチン誘導体、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ及びマイクロペルオキシダーゼからなる群から選ばれた一つで標識されたものである、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
該ＴＴＫプロテインキナーゼが、配列番号：７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよく、かつＴＴＫ活性を有するものであるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
該ＴＴＫプロテインキナーゼが、配列番号：９又は１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
該リン酸基供与体が、ＡＴＰである、請求項１〜４いずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
該リン酸基供与体が放射性標識されたものであり、該ＴＴＫ活性用基質に転移したリン酸基の放射能を測定することにより該ＴＴＫ活性を測定する、請求項１〜４いずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
リン酸化部位に特異的な抗体を使用することにより、該ＴＴＫ活性を免疫学的に測定する、請求項１〜５いずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＴＫ（ＴＴＫプロテインキナーゼ）活性抑制剤のスクリーニング方法に関する。より詳しくは、ＴＴＫプロテインキナーゼの新規基質であるｐ３８ＭＡＰＫ（p38 Mitogen-activated protein kinase）又はその断片を用いたスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質キナーゼとは、他のタンパク質分子にリン酸基を付加する（リン酸化する）酵素である。タンパク質キナーゼは、ＡＴＰからタンパク質分子内のアミノ酸残基にある水酸基にリン酸基を移し共有結合させる活性を有する。多くのタンパク質キナーゼはタンパク質分子中のセリンとスレオニンの水酸基に反応するもの（セリン／スレオニンキナーゼ）、チロシンの水酸基に反応するもの（チロシンキナーゼ）、これら３種類全てに反応するもの（二重特異性キナーゼ）がある。タンパク質キナーゼの活性は精密に調節されており、タンパク質キナーゼ自身もリン酸化によって調節を受けることもある。これらの調節は他の活性化（又は抑制）タンパク質や低分子化合物の結合、細胞内での局在変化等によって起きる。 キナーゼの機能異常は病気の原因になることも多い。
【０００３】
ＴＴＫプロテインキナーゼ（配列番号：７）は、基質となるタンパク質中のセリン、スレオニン及びチロシン残基をリン酸化する（例えば、非特許文献１参照）二重特異性キナーゼである。キナーゼ活性を発現するのに必要とされるキナーゼドメインとして配列番号：５が知られている（例えば、非特許文献１及び２参照）。内因性の基質として、Mad1（例えば、非特許文献３参照）、Spcl10p（Nuflp）（例えば、非特許文献４参照）、CHK2（例えば、非特許文献５参照）等が知られている。ＴＴＫ発現は、細胞増殖と相関し、そして細胞周期の制御において役割を果たす。また、特許文献１には、ＴＴＫが悪性卵巣癌で発現していること、ＴＴＫの発現量を測定する工程を含むスクリーニング方法が記載されている。また、特許文献２には、ＴＴＫ活性の検出による癌細胞の特定方法、腫瘍成長を抑制する薬剤の特定に関する出願であり、スクリーニング方法としてtau、cdc25及びそれらの部分ペプチドを基質として利用したＴＴＫ活性測定方法が記載されている。
【０００４】
しかし、従来報告されている基質では、試験管内の酵素アッセイ系において、非常に弱い活性しか示さないために、ＴＴＫ活性抑制剤のスクリーニング方法には使用することが困難な状態にあった。
【特許文献１】国際公開第０１／９４６２９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／０６８４４４号パンフレット
【非特許文献１】Millsら、J. Biol. Chem. (1992) 267, 16000-16006
【非特許文献２】Lindbergら、Oncogene (1993) 8, 351-359
【非特許文献３】Liuら、Mol. Biol. Cell. (2003) 14, 1638-51
【非特許文献４】Friedmanら、J. Biol. Chem. (2001) 276, 17958-17967
【非特許文献５】Weiら、J. Biol. Chem. (2005) 280, 7748-7757
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ＴＴＫプロテインキナーゼを用いた実験系において、新規基質を用いて、より効率的にＴＴＫ活性抑制剤をスクリーニングすることができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究の結果、セリン/スレオニンキナーゼ基質スクリーニングキット（セルシグナリングテクノロジー社）を用いて、癌関連遺伝子であるＴＴＫプロテインキナーゼの新規基質であるｐ３８ＭＡＰＫを見出した。該ｐ３８ＭＡＰＫは、公知のＴＴＫ活性測定用基質であるcdc25と比較して約４倍のＴＴＫ活性を示した。
さらに、本研究者らは該ｐ３８ＭＡＰＫを用いる際に、標識としてビオチン誘導体である15-([biotinoyl]amino)-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoic acid（ピアス社）を用いることにより、基質の溶解度を改善した。該ビオチン誘導体で標識された新規基質は、cdc25と比べて約５倍のＴＴＫ活性を示した。
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）（Ａ）被検物質の存在下、
ＴＴＫプロテインキナーゼ、
配列番号：１に記載のアミノ酸配列の全長又は部分配列であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含み、配列番号：３に記載のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよいポリペプチドからなるＴＴＫ活性測定用基質、及び
リン酸基供与体
をインキュベーションし、ＴＴＫ活性を測定する工程、並びに、
（Ｂ）被検物質非存在下のＴＴＫ活性と比較して、該活性を減少させる被検物質を選択する工程を含む、ＴＴＫ活性抑制作用を有する化合物又はその塩のスクリーニング方法、
（２）該ＴＴＫ活性測定用基質が、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の部分配列であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含み、配列番号：３に記載のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよいポリペプチドからなる、（１）記載のスクリーニング方法、
（３）該ＴＴＫ活性測定用基質が、ビオチン、ビオチン誘導体、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ及びマイクロペルオキシダーゼからなる群から選ばれた一つで標識されたものである、（１）又は（２）に記載のスクリーニング方法、
（４）該ＴＴＫプロテインキナーゼが、配列番号：５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよく、かつキナーゼ活性を有するものであるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである、（１）〜（３）いずれかに記載のスクリーニング方法、
（５）該ポリペプチドが、配列番号：７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよく、かつＴＴＫ活性を有するものであるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（４）記載のスクリーニング方法、
（６）該ポリペプチドが、配列番号：９又は１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（４）記載のスクリーニング方法、
（７）該リン酸基供与体が、ＡＴＰである、（１）〜（６）いずれかに記載のスクリーニング方法、
（８）該リン酸基供与体が放射性標識されたものであり、該ＴＴＫ活性用基質に転移したリン酸基の放射能を測定することにより該ＴＴＫ活性を測定する、（１）〜（７）いずれかに記載のスクリーニング方法、
（９）リン酸化部位に特異的な抗体を使用することにより、該ＴＴＫ活性を免疫学的に測定する、（１）〜（７）いずれかに記載のスクリーニング方法。、に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のスクリーニング方法によって、ＴＴＫ活性抑制剤を効率よくスクリーニングすることができる。なお、ＴＴＫ活性抑制剤は、癌、免疫疾患等の予防剤・治療剤として使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。以下に特に本明細書で用いられる用語について説明する。
【００１０】
「ＴＴＫプロテインキナーゼ」とは、配列番号：５記載のアミノ酸配列（配列番号：７記載のアミノ酸配列において５２５番目のTyrから７９１番目のValに相当する）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよく、かつキナーゼ活性を有するものであるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、例えば、配列番号：７記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよく、かつＴＴＫ活性を有するものであるアミノ酸配列からなるポリペプチド等が挙げられる。より詳しくは、配列番号：９又は１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド等が挙げられる。
【００１１】
本発明は新規ＴＴＫ活性測定用基質を用いることでＴＴＫプロテインキナーゼの活性を測定することである。そのため、ＴＴＫプロテインキナーゼは、ＴＴＫプロテインキナーゼ活性を有するポリペプチドであればよく、つまり、キナーゼ活性ドメインとして公知である配列番号：５記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよく、かつキナーゼ活性を有するものであるアミノ酸配列を含有するポリペプチドであればよい。ポリペプチドの全長や修飾基の付加、アミノ酸残基の改変等は必要に応じて適宜選択され、本明細書に記載の配列のみに限定されない。
【００１２】
また、以下の「タンパク質の製造方法」に記載のように、ＴＴＫプロテインキナーゼを単離・精製する際に、タンパク質単離・精製に利用されることが公知であるタグやペプチド等を用いることができる。該タグやペプチド等がＴＴＫプロテインキナーゼに付加したままでもＴＴＫプロテインキナーゼ活性に影響が少ない又は影響が無い場合には、該タグやペプチドが付加した状態でＴＴＫプロテインキナーゼを本発明のスクリーニング方法に利用することができる。例えば、実施例３において、本発明者らは、タンパク質の精製時に利用するＨｉｓタグ又はＧＳＴタグが付加したＴＴＫプロテインキナーゼを、ＴＴＫ活性測定に用いている。
【００１３】
本発明において「ＴＴＫプロテインキナーゼの活性」及び「ＴＴＫ活性」とは、スレオニン及び／又はセリン及び／又はチロシンのリン酸化を意味する。特に、ｐ３８ＭＡＰＫ（配列番号：１）における１８０番目のスレオニン及び／又は１８２番目のチロシンのリン酸化を意味する。ＴＴＫ活性は、本発明のスクリーニング方法に使用する測定方法を用いて測定することが可能である。該測定方法に関しては、後述する。
【００１４】
該ポリペプチドがキナーゼ活性を有するか否かは、例えば、ポリペプチド、ＴＴＫ活性測定用基質及びリン酸基供与体を接触させ、ＴＴＫ活性を測定し、同一の条件における野生型ＴＴＫプロテインキナーゼのＴＴＫ活性と比較することにより、調べることができる。公知のＴＴＫ活性測定用基質及びリン酸供与体を利用することができる。また、本発明記載の新規ＴＴＫ活性測定用基質を用いてもよい。具体的には、公知のＴＴＫ活性測定用基質又は本発明のＴＴＫ活性測定用基質を用いて、実施例３に記載の方法等に従ってＴＴＫ活性を測定・比較し、該ポリペプチドがキナーゼ活性を有するか否かを決定することができる。
【００１５】
本発明において使用される新規「ＴＴＫ活性測定用基質」とは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の全長又は部分配列であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含み、配列番号：３に記載のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよいポリペプチドを意味する。例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む配列番号：１に記載のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド等が挙げられる。また、市販されているnonphospho-ｐ３８ＭＡＰＫ断片（セルシグナリングテクノロジー社）を用いることもできる。
【００１６】
ｐ３８ＭＡＰＫ（配列番号：１）は、MKK３やMKK６によって１８０番目のスレオニン及び１８２番目のチロシンが共にリン酸化を受けることにより活性化することが知られている（J. Biol. Chem. 270(1995) 7420-7426）。そこで、本発明のＴＴＫ活性測定用基質として使用される「ｐ３８ＭＡＰＫ又はその断片」は、キナーゼによってリン酸化されることが知られている１８０番目のスレオニン及び１８２番目のチロシン、さらにその前後のポリペプチドを含む断片であればよい。詳しくは、配列番号：３記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドからなるｐ３８ＭＡＰＫ若しくはその断片又はそれらの誘導体を意味する。「ｐ３８ＭＡＰＫの断片」とは、配列番号：１記載のアミノ酸配列の一部を意味する。「ｐ３８ＭＡＰＫ又はその断片の誘導体」とは、配列番号：１記載のアミノ酸配列又はその一部において、修飾基を付加して得られた修飾ポリペプチド、アミノ酸残基を改変することにより得られたバリアントポリペプチド等が挙げられる。さらに詳しくは、例えば、配列番号：１記載のアミノ酸配列において、１位のＭｅｔから１７７位のＡｓｐまでのアミノ酸及び１８５位のＴｈｒから３６０位のＳｅｒまでのアミノ酸の、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよいアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００１７】
また、実施例３で得られた新規のＴＴＫ活性測定用基質であるｐ３８ＭＡＰＫペプチドはコア・シークエンスとして配列番号：３記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであることがキット添付の説明書に記載されている。また、通常、あるキナーゼの基質として働くためには、約１０アミノ酸以上は必要であり、かつ、該キナーゼによりリン酸化される部位及びその前後の配列を持つポリペプチドであればよいと考えられる。そのため、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、１０アミノ酸以上の配列であれば、ポリペプチドの長さは適宜選択され、本明細書に記載の配列のみに限定されない。詳しくは、配列番号：１記載のアミノ酸配列において、配列番号：３に記載のアミノ酸配列以外の部分の何れかを欠失した断片、例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列のN端側及び／又はＣ端側のアミノ酸が、５０〜１７５個、または１００〜１７５個、または１５０〜１７５個欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチド等が挙げられる。つまり、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含み、１０〜３６０アミノ酸残基からなる配列番号：１に記載のアミノ酸配列の断片、例えば、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む１０〜３６０個、または１０〜２６０個、または１０〜１６０個、または１０〜６０個のアミノ酸からなる配列番号：１に記載のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド等を意味する。
【００１８】
該ＴＴＫ活性測定用基質には、ラベルが付加していてもよい。ラベルとしては、ビオチン、ビオチン誘導体、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、マイクロペルオキシダーゼ等が挙げられる。好ましくは、ビオチン又はビオチン誘導体を用いることができる。ビオチン誘導体としては、例えば、15-([biotinoyl]amino)-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoic acid（ピアス社）等が挙げられる。
【００１９】
「リン酸基供与体」としては、ＡＴＰ及びその標識ラベル体等が挙げられる。該リン酸基供与体は、放射性標識（例えば、33P、32P、35S等）で標識されていてもよい。
【００２０】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されたアミノ酸配列」とは、例えば、（A）アミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（B）アミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（C）アミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（D）アミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、又は（E）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有す
るタンパク質が挙げられる。
【００２１】
上記「欠失」とは、１つ以上のアミノ酸残基が、それぞれ、参照アミノ酸配列（野生型タンパク質のアミノ酸配列）と比較した場合に存在していない、アミノ酸配列のいずれかにおける変化として規定される。
【００２２】
上記「挿入」又は「付加」とは、参照アミノ酸配列（野生型タンパク質のアミノ酸配列）と比較した場合に、それぞれ、１つ以上のアミノ酸残基の付加を生じた、アミノ酸配列中又はアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端における変化である。
【００２３】
上記「置換」とは、参照アミノ酸配列（野生型タンパク質のアミノ酸配列）と比較した場合に、それぞれ、異なるアミノ酸による１つ以上のアミノ酸の置換から生じる。
【００２４】
アミノ酸配列が欠失、付加、挿入又は置換されている場合、明細書中に各別の規定がある場合を除き、その欠失、付加、挿入又は置換の位置としては、特に限定されない。但し、本発明に使用されるＴＴＫプロテインキナーゼは、欠失、付加、挿入又は置換によっても、キナーゼ活性を有するポリペプチドである。例えば、配列番号：５、７及び９に記載のアミノ酸配列と少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％（約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はより上であり得る）、配列類似性又は配列同一性を有する部分ペプチドを挙げることができる。ポリペプチドのアミノ酸配列の欠失、付加、挿入又は置換は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。
【００２５】
ＴＴＫプロテインキナーゼ、ｐ３８ＭＡＰＫ、それらの断片及び誘導体は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）等に記載された方法等を用い、例えば、以下の方法により、作製することができる。
【００２６】
ヒトの脳、心臓、骨格筋、ひ臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、これら組織由来のヒト正常細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞より、常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製することによって、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを取得する。また、オリゴヌクレオチドをセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用い、これらＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを発現している細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことによっても、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを調製することができる。こうして得られたＤＮＡを適切な制限酵素で切断することにより、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。
【００２７】
さらに、アミノ酸配列に基づいて、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを化学合成することによって、調製することができる。ＤＮＡの化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２等を用いて行うことができる。
【００２８】
上記の方法で得られた目的のタンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡ（発現用プラスミド）を作製する。該発現用プラスミドを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、目的のタンパク質を生産する形質転換体を得ることができる。
【００２９】
宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、又は染色体中への組込みが可能で、目的のタンパク質をコードする遺伝子の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００３０】
（ｉ）細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合
目的のタンパク質の発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、目的のタンパク質、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれもロシュダイアグノスティックス社より市販）、pKK233-2（アマシャムバイオサイエンス社）、pSE280（インビトロジェン社）、pGEMEX-1〔プロメガ(Promega)社製〕、pQE-8（キアゲン(QIAGEN)社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200〔Agric. Biol. Chem., 48, 669(1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescript II SK+（ストラタジーン社製）、pBluescript II SK(-)（ストラタジーン社製）、pTrs30（FERM BP-5407）、pTrs32(FERM BP-5408)、pGHA2(FERM BP-400)、pGKA2(FERM B-6798)、pTerm2（特開平3-22979、US4686191、US4939094、US5160735）、pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)〕、pGEX（アマシャムバイオサイエンス社製）、p ETシステム（ノバジェン社製）、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pTrxFus（インビトロジェン社製）、pMAL-c2（New England Biolabs社製）、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pSTV28（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）等を例示することができる 。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ptrp）、lacプロモーター（Plac）、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等をあげることができる。またPtrpを２つ直列させたプロモーター（Ptrp x2）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。目的のタンパク質の遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli BL21(DE3)pLysS、Escherichia coli HMS174(DE3)、Escherichia coli HMS174(DE3)pLysS、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammmoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticumATCC14066、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp. D-0110等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-2483942）、Gene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。
【００３１】
（ｉｉ）酵母を宿主細胞として用いる場合
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を例示することができる。プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP 1プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius、Pichia pastoris等をあげることができる。組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods. Enzymol., 194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 1929 (1978)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriol., 153, 163(1983)〕、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)記載の方法等をあげることができる。
【００３２】
（ｉｉｉ）動物細胞を宿主細胞として用いる場合
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, ３, １３３ (１９９０)〕、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３〔J. Biochem., 101, 1307 (1987)〕、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ〔J. Biol. Chem., 268, 22782-22787 (1993)、別名ｐＡＭｏＰＲＳＡ（特開平05-336963）〕、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）、ｐＨＭ６、ｐＨＢ６（ロシュダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ（アマシャムバイオサイエンス社製）、ｐＥＴ−３、ｐＥＴ−１１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標）  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標）  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＵＣ１９、ｐＴｒｘＦｕｓ（インビトロジェン社製）、ｐＵＣ１１８、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ（ニューイングランドバイオラボ社製）等を例示することができる。使用されるベクターとしては、前記遺伝子を組み込んで動物細胞で発現できるベクターであればいずれでもよい。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケミア・ウイルス（Moloney Murine Leukemia Virus）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Long Terminal Repeat Promoter）、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、あるいはメタロチオネインのプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、BHK細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒトの細胞であるNamalwa細胞又はNamalwa KJM-1細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、HBT5637（特開昭63−299）、ヒト大腸癌細胞株等をあげることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、SP2/0、NSO等、ラット・ミエローマ細胞としてはYB2/0等、ヒト胎児腎臓細胞としてはHEK293(ATCC: CRL-1573)等、ヒト白血病細胞としてはBALL-1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはCOS-1、COS-7、ヒト大腸癌細胞株としてはHCT-15等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕、virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等をあげることができる。
【００３３】
（ｉｖ）植物細胞を宿主細胞として用いる場合
植物細胞又は植物個体を宿主として用いる場合には、公知の方法〔組織培養, 20 (1994)、組織培養, 21 (1995)、Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)〕に準じてタンパク質を生産することができる。発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１などを挿入することにより、遺伝子の発現効率をあげることもできる。
宿主細胞としては、ポテト、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、ニンジン、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）（特開昭59-140885、特開昭60-70080、WO94/00977）、エレクトロポレーション法（特開昭60-251887）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第2606856、特許第2517813）等をあげることができる。
【００３４】
（ｖ）昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル〔Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, NewYork (1992)〕、モレキュラー・バイオロジー ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Biology, A Laboratory Manual）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント１〜３８（Current Protocols in Molecular Biology）、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクター及びバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（すべてインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Trichoplusia niの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyx mori N4等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,7413 (1987)〕等をあげることができる。
また、動物細胞にＤＮＡを導入する方法と同様の方法を用いて、昆虫細胞にＤＮＡを導入することもでき、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。
【００３５】
（ｖi）培養方法
目的のタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する形質転換体が、大腸菌、酵母、動物細胞あるいは植物細胞等の細胞の場合、各種宿主に適した通常の培養方法に従って培養し、該タンパク質を産生・蓄積させ、形質転換体又は培養液より該タンパク質を回収することにより、該タンパク質を製造することができる。形質転換体が、動物個体又は植物個体の場合、各種宿主に適した通常の生育方法に従って飼育又は栽培し、該タンパク質を産生・蓄積させ、該動物個体又は植物個体より該タンパク質を回収することにより、該タンパク質を製造することができる。
宿主が動物個体の場合、例えば、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該組換え体ＤＮＡのコードする目的のタンパク質を該動物中に産生・蓄積させ、該動物個体中から該タンパク質を回収することにより、目的のタンパク質を製造することができる。動物個体中の産生・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、唾液、卵等を挙げることができる。
宿主が植物個体の場合、例えば、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該組換え体ＤＮＡのコードする目的のタンパク質を該植物個体中に産生・蓄積させ、植物個体中から該タンパク質を回収することにより、目的のタンパク質を製造することができる。
宿主が大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、例えば、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを保有する形質転換体を培地中で培養し、該組換え体ＤＮＡのコードする目的のタンパク質を培養液に産生・蓄積させ、該培養液から該タンパク質を回収することにより、目的のタンパク質を製造することができる。
【００３６】
目的のタンパク質の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物である場合、得られた形質転換体を培養する培地としては、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。宿主が大腸菌である形質転換体を培養する際の培地としては、例えば、バクトトリプトン、イーストエクストラクト及び塩化ナトリウムを含むＹＴ培地が好ましい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３７】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。遺伝子を導入した植物の細胞や器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)培地、ホワイト(White)培地、又はこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
目的のタンパク質製造用形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているRPMI1640培地〔The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)〕、EagleのMEM培地〔Science, 122,501 (1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)〕又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ2存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
目的のタンパク質製造用形質転換体が昆虫細胞である場合、該細胞を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Sf-900 II SFM培地（ギブコＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００ 、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ社製〕、Grace's InsectMedium〔Nature, 195, 788 (1962)〕等を用いることができる。
【００３８】
（ｖｉｉ）タンパク質の製造方法
目的のタンパク質製造用形質転換体の培養物から、目的のタンパク質を単離・精製するには、通常の酵素の単離・精製法を用いることができる。例えば、目的のタンパク質が目的のタンパク質製造用形質転換体の細胞外に該タンパク質が分泌される場合には、該培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。該可溶性画分から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、DIAION HPA-75 （三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、SP-Sepharose FF（アマシャムバイオサイエンス社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
目的のタンパク質が目的のタンパク質製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、DIAION HPA-75 （三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、SP-Sepharose FF（アマシャムバイオサイエンス社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
【００３９】
また、該タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該タンパク質を回収後、該タンパク質の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を、タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤の濃度がタンパク質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該タンパク質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
また、通常のタンパク質の精製方法〔J. Evan. Sadler ら：メソッド・イン・エンザイモロジー (Methods in Enzymology)，83,458〕に準じて精製できる。また、目的のタンパク質を他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性を持つ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる〔山川彰夫，実験医学，13, 469-474(1995)〕。例えば、ロウらの方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 86, 8227 (1989)、GenesDevelop., 4, 1288 （1990)〕に記載の方法に準じて、目的のタンパク質をプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００４０】
また、目的のタンパク質をＨｉｓタグ又はＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として生産し、金属キレート又は抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる〔Methods Enzymol., 326, 245 (2000)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288 （1990)〕。
更に、目的のタンパク質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。目的のタンパク質は、公知の方法〔J. Biomolecular NMR, 6, 129-134、Science, 242, 1162-1164、J.Biochem., 110, 166-168 (1991)〕に準じて、in vitro転写・翻訳系を用いてを生産することができる。
上記で取得されたタンパク質のアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても目的のタンパク質を製造することができる。また、アドバンスト・ケムテック（Advanced ChemTech ）社、パーキン・エルマー社、アマシャムバイオサイエンス社、プロテイン・テクノロジー・インストゥルメント（Protein Technology Instrument）社、シンセセル・ベガ（Synthecell−Vega）社、パーセプティブ（PerSeptive）社、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
精製した目的のタンパク質の構造解析は、タンパク質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。
【００４１】
「部分ペプチド」は、上記タンパク質の合成法に従って、あるいは目的のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
【００４２】
「誘導体」は、上記タンパク質の合成法に従って、あるいは目的タンパク質を用いて出願前周知技術である部位特異的変異誘発法等により製造することができる。
【００４３】
本発明は、ＴＴＫ活性抑制剤のスクリーニング方法に関する。該スクリーニング方法は、被検物質である化合物又はその塩の存在下、新規ＴＴＫ活性測定用基質であるｐ３８ＭＡＰＫを用いることにより、ＴＴＫプロテインキナーゼによる基質のスレオニン及び／又はチロシンのリン酸化を検出又は測定することを１つの特徴とする。例えば、被検物質である化合物又はその塩の存在下、ＴＴＫプロテインキナーゼによるｐ３８ＭＡＰＫ（配列番号：１）の１８０番目のスレオニン及び／又は１８２番目のチロシンのリン酸化を検出又は測定することによって本発明を利用することができる。ＴＴＫ活性に対する被検物質による影響は、被検物質の非存在下における活性を対照として調べるのが好適である。
【００４４】
また、本発明のスクリーニング方法は、ＴＴＫ活性抑制剤の候補化合物の薬理評価に用いることができる。
【００４５】
本発明のスクリーニング方法としては、具体的には、
（Ａ）被検物質の存在下、
ＴＴＫプロテインキナーゼ、
配列番号：１に記載のアミノ酸配列の全長又は部分配列であって、配列番号：３を含み、配列番号：３以外のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよいポリペプチドからなるＴＴＫ活性測定用基質、及び
リン酸基供与体
をインキュベーションし、ＴＴＫ活性を測定する工程、並びに、
（Ｂ）被検物質非存在下のＴＴＫ活性と比較して、該活性を減少させる被検物質を選択する工程を含む、ＴＴＫ活性抑制作用を有する化合物又はその塩のスクリーニング方法が挙げられる。
【００４６】
前記工程（Ａ）の「インキュベーション」は、ＴＴＫプロテインキナーゼ、ＴＴＫ活性測定用基質及びリン酸基供与体の、それぞれキナーゼ、基質、供与体としての本来の機能を妨げない溶液中において、被験物質、ポリペプチド、ＴＴＫ活性測定用基質及びリン酸基供与体とを混合し、適切な反応条件、例えば、適切な反応温度、反応時間の下、維持する（すなわち、反応させる）ことによって行われ得る。
【００４７】
前記「ポリペプチド、ＴＴＫ活性測定用基質及びリン酸基供与体の本来の機能を妨げない溶液」としては、例えば、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等の溶液が挙げられる。好ましくは、Ｔｒｉｓバッファーが挙げられる。
【００４８】
また、前記「適切な反応条件」としては、特に限定されないが、例えば、前記溶液中、ｐＨ５．０〜１０．０、好ましくは、ｐＨ６．５〜８．５、さらに好ましくは、ｐＨ７．０〜８．０、さらに好ましくはｐＨ７．５で、通常、１０℃から５０℃、好ましくは２０℃〜４０℃、より好ましくは２５℃〜３７℃、さらに好ましくは３０℃、通常、１分間〜２４時間、好ましくは３分間〜８時間、より好ましくは５分間〜３時間、さらに好ましくは１時間維持すること等が挙げられる。
【００４９】
前記被検物質としては、化合物又はその塩が挙げられる。なお、本明細書においては、前記化合物又はその塩は、低分子化合物、高分子化合物、ポリペプチド又はその誘導体、核酸又はその誘導体等を含む。かかる被検物質は、天然物質であってもよく、非天然物質であってもよい。ポリペプチドの誘導体としては、修飾基を付加して得られた修飾ポリペプチド、アミノ酸残基を改変することにより得られたバリアントポリペプチド等が挙げられる。また、核酸の誘導体としては、修飾基を付加して得られた修飾核酸、塩基を改変することにより得られたバリアント核酸、ペプチド核酸等が挙げられる。核酸としては、ＴＴＫプロテインキナーゼをコードする遺伝子に対するＲＮＡｉを誘発し得るｓｉＲＮＡ、アンチセンス鎖ＲＮＡ、リボザイム等も含まれる。
【００５０】
また、上記スクリーニング方法でＴＴＫ活性を測定する際、工程（Ａ）において、金属イオンを共にインキュベーションすることが好ましい。「金属イオン」としては、２価金属イオンが好ましく、例えば、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、 Co2+  等が挙げられる。特に、Mg2+及びMn2+が好ましい。
【００５１】
本発明において、ＴＴＫ活性を測定する方法としては、特に限定されず、当該分野において、一般的に、ＴＴＫ活性を測定する方法として知られている方法を使用することができる。例えば、（１）標識されたリン酸基供与体を使用する方法、（２）リン酸化部位に特異的な抗体を使用する方法等が挙げられる。
【００５２】
（１）標識されたリン酸基供与体を使用する方法は、検出可能なラベル、例えば、放射活性又は発色性ラベルで標識されたリン酸基供与体を使用し、リン酸基の基質への移行時に該標識を定量することによって行うことができる。
放射活性ラベルとしては、33P、32P、35S等が挙げられる。放射活性ラベルで標識されたリン酸基供与体を使用する場合、リン酸基を基質に移行させ、直接定量することができる。定量法としては、シンチレーション計数法又はオートラジオグラフィー法等が挙げられる。
【００５３】
（２）リン酸化部位に特異的な抗体を使用する方法は、ＴＴＫ活性測定用基質を、ポリペプチドによるリン酸化時に、特異的抗体によって認識し得るエピトープとして使用し、リン酸化を定量することによって行うことができる。
該方法に有用な抗体としては、例えば、Phospho-ｐ３８ＭＡＰＫ(Thr180)(Tyr182)(28B10)MAb（セルシグナリングテクノロジー社、カタログ番号9216）p-p38(Thr180/Tyr182)-R（サンタクルーズ社、カタログ番号 sc-23763-R）、rabbit anti-phospho-p38 MAPK (THR180/TYR182)（ケミコン社、カタログ番号 AB3828）等が挙げられる。また、該抗体は、ＴＴＫ活性測定用基質、例えばｐ３８ＭＡＰＫの１８０番目のスレオニン及び１８２番目のチロシンを含むペプチド断片を抗原として使用し、標準方法に従ってポリクローナル又はモノクローナル抗体を作製することによって得ることができる。かかる抗体は、慣用の酵素（例えば、ペルオキシダーゼ等）、蛍光色素、放射性物質、アビジン若しくはビオチン等で標識されていてもよい。定量法としては、当業者に公知の種々のアッセイ形式が存在する。例えば、Harlow及びLane，Anti bodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988に記載の方法を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等を挙げることができる。
【００５４】
その他、蛍光消光（Fluorescence Re sonance Energy Transfer、"FRET"）アッセイを使用してＴＴＫ活性を測定することもできる。ドナーを上記リン酸化部位に特異的な抗体に結合させ、アクセプターを、上記リン酸化部位を含まない部分を認識する抗体又は基質に付加されたタグを認識するタンパク質と結合させる。ドナー及びアクセプターの組み合わせとしては、ユウロピウム（Eu）とアロフィコシアニン（APC）、EuとCy5等が挙げられる。蛍光をフルオロメーター内で、励起波長及び発出波長で測定する。被検物質がＴＴＫ活性を調節（抑制または亢進）する作用を有する場合、試験物質の存在しない対照サンプルと比較して検出可能シグナルが変化する。例えば、被検物質がＴＴＫ活性抑制作用を有する場合、試験物質の存在しない対照サンプルと比較して検出可能シグナルが低下する。
【００５５】
上記方法により、種々の被験物質の存在下におけるポリペプチドのＴＴＫ活性を測定することによって、ＴＴＫ活性抑制能を有する物質を選抜するスクリーニングを行うことができる。例えば、被験物質下における活性が、被検物質非存在下における活性より有意な減少を示す物質を、ＴＴＫ抑制能を有する物質として選抜することができる。このように選抜された物質はＴＴＫ活性抑制剤の有効成分として使用され得る。
【００５６】
本発明は、新規ＴＴＫ活性測定用基質としてｐ３８ＭＡＰＫ及びその断片を使用するという特徴を持つスクリーニング方法に関するものであり、検出方法等は公知のものを利用することができるが、特に、莫大な数の化合物をアッセイするスクリーニング、特にハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）において有用である。本発明を実施すれば、効果的にＴＴＫ活性抑制剤の候補化合物を選択することができる。
【００５７】
本発明のスクリーニング方法により得られた化合物又はその塩は、ＴＴＫ活性の上昇に関連して発症する疾患に対する治療又は予防作用を発揮し得る。例えば、本発明のスクリニーング方法によれば、ＴＴＫ活性の上昇が関与して発症する癌、免疫疾患等に有効な治療剤又は予防剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。
【００５８】
上記「癌」としては、固形癌、血管腫、血管内皮腫、肉腫、カポシ肉腫及び造血器腫瘍等の種々の悪性新生物が例示され、大腸癌及び肝癌等が包含され、さらにこれら癌の転移をも包含する。
【００５９】
「免疫疾患」としては、例えば、アトピー、喘息、リウマチ、膠原病、アレルギー等が例示される。
【００６０】
また、前記スクリーニング方法により得られた化合物又はその塩により、ＴＴＫプロテインキナーゼに関連する疾患、例えば、ＴＴＫプロテインキナーゼが関与する癌、免疫疾患等の治療又は予防に用いるための医薬組成物が提供される。
【００６１】
上記医薬組成物は、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物又はその塩を有効成分として含有することに１つの特徴がある。したがって、該医薬組成物は、ＴＴＫプロテインキナーゼに関連して発症する疾患に対して、該酵素の活性の抑制を介して作用し得るという優れた効果を発揮する。例えば、本発明の医薬組成物は、癌、免疫疾患等、特に、ＴＴＫ活性に関連して発症する癌、免疫疾患等に対して、該酵素活性の抑制を介して作用し得るという優れた効果を発揮する。該医薬組成物を癌の治療又は予防に用いる場合は、通常の癌療法、例えば、放射線療法、化学療法、とりわけ腫瘍細胞を事前感応化するためのDNA劣化剤を施すのと同時に、又はその前でも使用できる。
【００６２】
上記医薬組成物中における前記化合物又はその塩の含有量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができ、治療上有効量であればよく、低分子化合物又は高分子化合物の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ、核酸又はその誘導体の場合、例えば、０．００００１〜１００ｍｇ、好ましくは、０．０００１〜１０ｍｇであることが望ましい。
【００６３】
上記医薬組成物は、前記化合物又はその塩を安定に保持し得る種々の助剤をさらに含有してもよい。具体的には、有効成分の送達対象となる部位に到達するまでの間に、有効成分が分解することを抑制する性質を呈する薬学的に許容されうる助剤、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等が挙げられる。
【００６４】
上記医薬組成物の投与形態は、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。前記投与形態としては、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、局所投与等が挙げられる。
【００６５】
また、上記医薬組成物の投与量も、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。投与としては、特に限定されないが、有効成分が、低分子化合物又は高分子化合物である場合、前記有効成分の量として、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、核酸又はその誘導体の場合、例えば、０．００００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の１回投与量となるように、１日につき、複数回、例えば、１〜３回投与すること等が挙げられる。
【００６６】
本発明を、下記実施例等により説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。また、以下の実施例において、遺伝子操作的手法として、特に断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載された方法を用いた。
【実施例１】
【００６７】
バキュロウイルス発現系を用いた組換えTTKの発現と精製
TTK発現ベクターを鋳型として、プライマー（配列番号：１１及び配列番号：１２）を用いたPCR反応によりDNA断片を増幅し、pCR-BluntII-TOPOベクター（インビトロジェン社）にクローニングした。得られたベクターをBamHI、XhoI制限酵素で切断し、TTKを含む断片をpFastBac HT Bベクター（インビトロジェン社）のBamHI、XhoI制限酵素切断部位に挿入した。得られたベクターとBac-to-Bac Baculovirus Expression System（インビトロジェン社）を用いて、大腸菌株DH10BACをトランスフォームした。LB/kanamycin/gentamicin/tetracyclin/X-gal/IPTGプレートで得られたコロニーを培養し、S.N.A.P. Midiprep（インビトロジェン社）のプロトコルに従って、組換えバクミドDNAを精製した。Bac-to-Bac Baculovirus Expression Systemのマニュアルに従って、得られた組換えバクミドDNAをSf9細胞（インビトロジェン社）に導入し、P1ウイルスを得た。次いで、P1ウイルスをSf9細胞に感染させてウイルスを増幅し、1.7x109 pfuのP2ウイルスを得た。Sf9細胞をSf-900II SFM培地（インビトロジェン社）中、27℃、135 rpmで培養し、2x106 cells/mlに増殖したところでP2ウイルスをMOI 1で添加した。引き続き72時間培養した後、500 x gで５分間遠心し培地を取り除いて細胞を回収した。次いで適量のPBS(-)を加えて細胞を洗浄、500 x gで5分間遠心し洗浄液を取り除いた。回収した細胞は精製操作を行うまで-80℃で凍結保存した。
【００６８】
以降の操作は4℃あるいは氷上で行った。解凍した細胞に培養量の1/10容の細胞破砕液（0.1mM Na3VO4、1mMNaF、 1xCompleteTM (EDTA free)（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を含むT-PER（ピアス社））を加え懸濁後、ローテーターで30分攪拌した。46,000 x gで15分間遠心した後、上清をポリプロピレン製チューブに回収し、1M イミダゾールを加えて15mMに調整した。この溶液を結合バッファー（20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, pH 7.5）で平衡化したHisTrap HP 1ml カラム（アマシャムバイオサイエンス社）に付した。次いでカラムを結合バッファーで洗浄し、溶出バッファー（20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 0.3M イミダゾール, pH 7.5）とのリニアグラジエントにより溶出を行った。TTKタンパク質を含むフラクションを回収し、分子量カットオフ10,000Daの遠心式濃縮器（Amicon Ultra、ミリポア社）で約2mlにまで濃縮した。これを20mM Tris-HCl 、pH7.5、0.15M NaCl、1mM DTTで平衡化したHiLoad 16/60 Superdex 200 pg（アマシャムバイオサイエンス社）に付し、TTKタンパク質を含むフラクションを回収した。精製の確認は、8% SDS-PAGE用均一ゲルを用いるSDS-PAGE（図１）と、HRP結合抗His抗体（His-probe HRP、サンタクルーズ社）を用いるWestern ブロットにより行った。Sf9細胞0.4L培養分から0.2 mgの6xHis-TTK(2-851)（TTK(2-851)は、配列番号：７記載のアミノ酸配列の２番目のアミノ酸から８５１番目のアミノ酸、つまり配列番号：９を意味する）を得た。
【実施例２】
【００６９】
大腸菌を用いた組換えGST-TTK(257-820)の発現と精製
TTK発現ベクターを鋳型として、プライマー(配列番号：１３及び配列番号：１４)を用いたPCR反応により、Asn257からAsn820領域のDNA断片を増幅した。PCR産物をEcoRI及びNotIで消化したのち、同酵素で消化したpGEX-4T-3(アマシャムバイオサイエンス社)ベクターに連結させた。塩基配列を確認した後、大腸菌株BL21(DE3)（タカラバイオ社）に形質導入した。100μg/mlアンピシリンを含むLB培地中OD600が0.4-0.7に達するまで37℃で振とう培養を行なった後、最終濃度0.1mMの IPTGを加えて発現誘導を行い、更に28℃で２時間培養した。7,700 x gで５分間遠心し培地を除去した後、適量のPBS(-)を加えて菌体を洗浄、再び7,700 x gで5分間遠心し集菌した。回収した菌体は精製操作を行うまで-80℃で凍結保存した。
【００７０】
以降の操作は4℃あるいは氷上で行った。菌体を解凍し培養量の1/10容の細胞破砕液（50mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 0.1M NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT, 0.1mM Na3VO4、1mMNaF、 1xCompleteTM (EDTA free))を加え、懸濁後、超音波処理した。次いで、11,000 x gで10分間遠心し、上清をポリプロピレン製チューブに回収した。結合バッファー（20mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 0.1M NaCl, 0.1mM Na3VO4, 1mM NaF）で平衡化したGlutathione Sepharose 4Bビーズ（アマシャムバイオサイエンス社）に得られた上清を加え、ローテーターで1時間攪拌した。Glutathione Sepharose 4Bビーズは、使用した細胞破砕液の1/10容を使用した。1,500 x gで1分遠心してビーズを沈め、上清を除去した。ビーズ体積の10倍容の結合バッファーでビーズを再検濁し、1,500 x gで1分遠心してビーズを沈め、上清を除去する操作を3回繰り返すことにより、ビーズを洗浄した。ビーズ体積の2倍容の溶出バッファー（20mM HEPES-NaOH, pH 8.0, 0.1M NaCl, 0.1mM Na3VO4, 1mM NaF, 10mM 還元型グルタチオン）を加え、ローテーターで10分攪拌した。1,500 x gで1分遠心してビーズを沈め、上清を回収した。再度ビーズ体積の2倍容の溶出バッファーをビーズに加え、ローテーターで10分攪拌後、1,500 x gで1分遠心してビーズを沈め、上清を回収した。精製の確認は、8% SDS-PAGE用均一ゲルを用いるSDS-PAGE（図2）と、H RP結合抗GST抗体（サンタクルーズ社）を用いるWestern ブロットにより行った。50ml培養分から56 μgのGST-TTK(257-820) （TTK(257-820)は、配列番号：７記載のアミノ酸配列の257番目のアミノ酸から820番目のアミノ酸、つまり配列番号：１０を意味する）を得た。
【実施例３】
【００７１】
TTKの基質探索
基質ペプチドおよび検出用一次抗体はSerine/Threonine Kinase Substrate Screening Kit（セルシグナリングテクノロジー社）を使用した。TTK（実施例１で得られた6xHis-TTK (2-851) (80μg/ml)、あるいは実施例２で得られたGST-TTK(257-820) (56μg/ml)) 2μl、10mM ATP 0.5μl、10mg/ml BSA 2.5μlおよび12.5μM 基質ペプチド溶液20μl（バッファー組成：25mM Tris-HCl, pH7.5, 5mM β-glycerophosphate, 2mM DTT, 0.1mM Na3VO4, 5mM MgCl2）をポリプロピレン製96穴マイクロタイタープレート中で混和した。１種類の基質ペプチドにつき、精製酵素存在下と非存在下（ネガティブコントロール）およびポジティブコントロール（酵素非存在下で基質ペプチドの代わりに対応するリン酸化ペプチドを用いる）の3ウェルを調製した。プレートにシールをし、室温下一晩インキュベートした。反応停止液（4% BSA, 100mM EDTA, 0.05% Tween20を含むTBS）を100μl加えて混和した後、100μlを96ウェルNeutrAvidinプレート（ピアス社）に移した。室温下30分インキュベート後、反応液を捨て、0. 05% Tween20を含むTBS（TBST） 100μlで洗浄した。同様の洗浄操作を3回繰り返した。一次抗体溶液100μlを加え、室温下2時間インキュベートした。反応液を捨て、TBST 100μlで洗浄した。同様の洗浄操作を3回繰り返した。DELFIA Europium-labeled Anti-rabbit IgG（パーキンエルマー社）の1000倍希釈液あるいはDELFIA Europium-label Anti-mouse IgG（パーキンエルマー社）の100倍希釈液を100μl加え、室温下1時間インキュベートした。抗体の希釈は0.2% BSA、0.01% Tween20を含むTBSで行った。反応液を捨て、TBST 100μlで洗浄した。同様の洗浄操作を5回繰り返した。DELFIA Enhancement Solution 100μlを加え、室温下5分インキュベート後、マルチラベルプレートリーダー（ARVO、パーキンエルマー社）で時間分解蛍光を測定した（励起波長340nm、蛍光波長615nm）。結果を図３〜図５に示す。酵素反応ウェルの測定値をネガティブコントロールおよびポジティブコントロールと比較し、有意なシグナルの増大を与えるペプチドを基質候補とした。擬陽性を避けるために、6xHis-TTK(2-851)を用いた場合とGST-TTK(257-820)を用いた場合の両方で有意なシグナルの増大を与えたペプチドを選別した。その結果、p44/42 MAPKペプチド（図４  PLATE2の19）、p38 MAPKペプチド（図５  PLATE3の10）、およびFKHR/FKHRL1ペプチド（図４  PLATE2の28）を基質候補として得た。
【実施例４】
【００７２】
基質候補ペプチドを用いたTTKキナーゼ活性の定量
実施例３で得られた3種類のペプチド及び公知基質であるcdc25ペプチドを基質としてTTKキナーゼ活性の定量を行った。アッセイバッファー12.5μl（組成：50mM Tris-HCl, pH7.5, 10mM β-glycerophosphate, 4mM DTT, 0.2mM Na3VO4、10mM MgCl2、2mg/ml BSA)、20μg/ml TTK（実施例１参照）2.5μl、50μM ペプチド（cdc25ビオチン化ペプチド（セルシグナリングテクノロジー社、カタログ番号900B）、p44/42 MAPKビオチン化ペプチド（セルシグナリングテクノロジー社、カタログ番号900B）、p38 MAPKビオチン化ペプチド（セルシグナリングテクノロジー社、カタログ番号900B）、FKHR/FKHR1ビオチン化ペプチド（セルシグナリングテクノロジー社、カタログ番号900B））5μl（溶媒：2.5%(v/v) DMSO）をポリプロピレン製96穴マイクロタイタープレート中で混和した。次いで0.2mM ATP（0.08mCi/ml [33P]γATPを含む）5μlを添加した。プレートにシールをし、室温下インキュベートした。0.5, 1, 1.5, 2時間後に反応停止液（組成：50mM Tris-HCl, pH7.5, 0.1M EDTA）を100μl加えて混和し、その内100μlを96ウェルNeutrAvidinプレート（ピアス社）に移した。室温下30分インキュベート後、反応液を捨て、TBST 100μlで洗浄した。同様の洗浄操作を4回繰り返した。液体シンチレーションカクテル溶液（MicroScint 20、パーキンエルマー社）100μlを加え、シールをして室温下一晩インキュベートした。マイクロプレートシンチレーションカウンター（TopCount、パーキンエルマー社）によりcpm値を測定し、相対的な反応速度を求めた。結果を図６に示す。cdc25ペプチド、p44/42 MAPKペプチド、p38 MAPKペプチド、FKHR/FKHR1ペプチドの順に182、52、694、87 cpm/hであり、p38 MAPKペプチドが最も高い反応速度を与えた。cdc25ペプチドと比較すると、3.8倍高い活性を示した。ビオチンの代わりに15-([biotinoyl]amino)-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoic acid（ピアス社、カタログ番号21330）を結合したp38 MAPKペプチド（図６中の(PEO4)p38）ではcdc25ペプチドの5.2倍となり、TTKキナーゼ活性測定のための非常に有用な基質となることが示された。
【実施例５】
【００７３】
p38 MAPKペプチドの合成
Fmoc-L-Ala-HMP Resin（Applied  Biosystems Inc.）0.25 mmolを出発原料としてペプチド自動合成装置（Applied  Biosystems社、ABI-431型）を用いたFmoc固相合成法を利用し、その後、フェノール、エタンジチオール及びチオアニソール含有95 vol% TFA水溶液で脱保護することによって、p38ＭＡＰＫペプチド約412 mgを得た。該ペプチドにつき逆相HPLC（カラム：YMC社製YMC-Pack, ODS-A, A-302, 150 x 4.6 mm I.D. 、移動相：0.1% TFA含有アセトニトリル／精製水混液、20% - 40%アセトニトリル直線濃度勾配、10分間、流速：1 mL/min、検出：220 nm）を行って純度検定したところ、約85％（保持時間：6.4 min）であった。
【００７４】
得られたペプチドのビオチン化は分子内に唯一存在するN末端のアミノ基を介して導入することにし、溶解性及びスペーサーの長さなどを考慮して15-([biotinyl]amino)-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoic acid, N-hydroxysuccinimidyl ester（NHS-PEO4-Biotin, Pierce社）をビオチン化試薬として選択した。上記ペプチド20 mg（10.9 オmol）をジメチルホルムアミド1 mLに溶解し、0.05 mol/Lリン酸緩衝液（pH 7.4）0.5 mLを加え混和した。NHS-PEO4-Biotin 12.8 mg（21.7 オmol）は、精製水1 mL及び0.05 mol/Lリン酸緩衝液（pH 7.4）0.5 mLに溶解した。これを上記ペプチド溶液に撹拌下に加え、さらに室温で2時間撹拌した。反応液0.3 mLにつき、逆相HPLC（カラム：YMC社製YMC-Pack, ODS-A, A-322, 150 x 10.0 mm I.D.、移動相：0.1% TFA含有アセトニトリル／精製水混液、20% - 40%アセトニトリル直線濃度勾配、10分間、流速：3 mL/min、検出：280 nm）を行ってビオチン化ペプチドと推定される画分を分取した。この操作を繰り返し10回行って反応液全量中のビオチン化ペプチド画分を分取してプールした。50ーC水浴中で減圧下にアセトニトリルを留去し、次いでガラスバイアル瓶に数mLずつ分注して凍結乾燥した。凍結乾燥物の一部をジメチルホルムアミドに溶解して逆相HPLC（カラム：YMC社製YMC-Pack, ODS-A, A-302, 150 x 4.6 mm I.D. 、移動相：0.1% TFA含有アセトニトリル／精製水混液、20% - 40%アセトニトリル直線濃度勾配、10分間、流速：1 mL/min、検出：220 nm）を行ったところ、単一のピーク（保持時間：8.8 min）を示した。さらに質量分析（Micromass社，Q-Tof Ultima API）で検定した結果、分子量（2308）から予測されるビオチン化ペプチド基質の1, 2及び3価イオン（[M+H]+ : 2309,  [M+2H]2+ : 1155, [M+3H]3+ : 770.3）がマススペクトル上に観察され、当該画分がbiotin(PEO4)-p38MAPKペプチドと確認された。
【実施例６】
【００７５】
p38 MAPKペプチドを用いたTTKキナーゼ活性抑制作用を有する化合物のスクリーニング
被検物質1.5μl（溶媒：10%(v/v) DMSO）、TTK溶液5μl（組成：4μg/ml TTK, 25mM Tris-HCl, pH7.5, 5mM β-glycerophosphate, 2mM DTT, 0.1mM Na3VO4, 5mM MgCl2, 1mg/ml BSA)、基質溶液5μl（組成：60μM p38 MAPKペプチド, 60μM ATP, 16μCi/ml 33P-γATP, 25mM Tris-HCl, pH7.5, 5mM β-glycerophosphate, 2mM DTT, 0.1mM Na3VO4, 5mM MgCl2, 1mg/ml BSA)をポリプロピレン製384穴マイクロタイタープレート中で混和し、恒温湿潤器に入れた。温度25℃、湿度95%で一晩静置した後、反応停止液（組成：25mM Tris-HCl, pH 7.5, 20mM EDTA, 0.01% TritonX-100, 1mg/ml BSA）50μlを加え混和した。ここから4μl抜き取り、384穴白色ローボリュームプレート（コーニング社）中で6.25mg/ml Streptavidin Coupled Polystyrene Imaging Beads（アマシャムバイオサイエンス社、溶媒：反応停止液）16μlと混和し、プレートにシールをして室温下1時間インキュベートした。プレートを遠心し（1000rpm、3分）ビーズを十分に沈降させた後、CCDイメージングシステム（LEADseeker、アマシャムバイオサイエンス社）によりIOD値を測定した。被検物質なしの場合のIOD値を基準に、被検物質の抑制活性を算定し、TTKキナーゼ活性抑制作用を示した化合物をTTK活性抑制剤の候補化合物として得た。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明のスクリーニング方法によって、ＴＴＫ活性抑制剤を効率よくスクリーニングすることができる。なお、該ＴＴＫ抑制剤は、癌疾患等の予防剤・治療剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】6xHis-TTKの精製のSDS-PAGE分析
【図２】GST-TTK(257-820)の精製のSDS-PAGE分析
【図３】Serine/Threonine Kinase Substrate Screening Kitを用いたTTKの基質探索A: 6xHis-TTKを用いた場合  B: GST-TTK(257-820)を用いた場合
【図４】図３の続き
【図５】図４の続き
【図６】種々の基質ペプチドを用いたTTKキナーゼ反応のタイムコース
【配列表フリーテキスト】
【００７８】
配列番号：１は、野生型ｐ３８ＭＡＰＫのアミノ酸配列を示す。
【００７９】
配列番号：２は、野生型ｐ３８ＭＡＰＫをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【００８０】
配列番号：３は、ｐ３８ＭＡＰＫのコア配列のアミノ酸配列を示す。
【００８１】
配列番号：４は、ｐ３８ＭＡＰＫのコア配列をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【００８２】
配列番号：５は、ＴＴＫプロテインキナーゼのキナーゼドメインのアミノ酸配列を示す。
【００８３】
配列番号：６は、ＴＴＫプロテインキナーゼのキナーゼドメインをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【００８４】
配列番号：７は、野生型ＴＴＫプロテインキナーゼのアミノ酸配列を示す。
【００８５】
配列番号：８は、野生型ＴＴＫプロテインキナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【００８６】
配列番号：９は、実施例３で使用した6xHis-TTK (2-851)のTTK(2-851)部分のアミノ酸配列を示す。
【００８７】
配列番号：１０は、実施例３で使用したGST-TTK(257-820)のTTK(257-820)部分のアミノ酸配列を示す。
【００８８】
配列番号：１１は、配列番号：８のＲＴ−ＰＣＲフォワードプライマーを示す。
【００８９】
配列番号：１２は、配列番号：８のＲＴ−ＰＣＲリバースプライマーを示す。
【００９０】
配列番号：１３は、配列番号：８のＲＴ−ＰＣＲフォワードプライマーを示す。
【００９１】
配列番号：１４は、配列番号：８のＲＴ−ＰＣＲリバースプライマーを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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