(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレーを製造するための、ペントピラノシルヌクレオシドまたはペントピラノシル核酸の使用であって、該ペントピラノシルヌクレオシドが、式（Ｉ）の化合物
【化１】
0004674965.tif 000028
［式中、
Ｒ１はＨ、ＯＨ、Ｈａｌ（式中、ＨａｌはＢｒまたはＣｌに等しい）または次式から選ばれる基、
【化２】
0004674965.tif 000029
または  −Ｏ−Ｐ［Ｎ（ｉ−Ｐｒ）２］−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）
（式中、ｉ−Ｐｒはイソプロピルに等しい）またはＯ−アシル基に等しく、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は互いに独立して同一かまたは異なり、それぞれＨ、Ｈａｌ（式中、ＨａｌはＢｒまたはＣｌに等しい）、ＮＲ５Ｒ６、ＯＲ７、ＳＲ８、＝Ｏ、ＣｎＨ２ｎ＋１（式中、ｎは１〜１２の整数である）、式−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｒ１８のβ脱離基（式中、Ｒ１８はシアノまたはｐ−ニトロフェニル基またはフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基に等しい）、または（ＣｎＨ２ｎ）ＮＲ１０Ｒ１１（式中、Ｒ１０Ｒ１１はＨ、ＣｎＨ２ｎ＋１に等しい）または下式の基によって結合されたＲ１０Ｒ１１であり、
【化３】
0004674965.tif 000030
式中、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は互いに独立して同一かまたは異なり、それぞれＨ、ＯＲ７（式中、Ｒ７は前記の意味を有する）またはＣｎＨ２ｎ＋１、またはＣｎＨ２ｎ−１（式中、ｎは前記の意味を有する）であり、そして
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は互いに独立して同一かまたは異なり、それぞれＨ、ＣｎＨ２ｎ＋１、またはＣｎＨ２ｎ−１（式中、ｎは前記の意味を有する）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９（式中、Ｒ９は直鎖または分枝鎖の、置換されていてもよいアルキルまたはアリール基に等しい）であり、
Ｘ、ＹおよびＺは互いに独立して同一かまたは異なり、それぞれ＝Ｎ−、＝Ｃ（Ｒ１６）−、または−Ｎ（Ｒ１７）−（式中、Ｒ１６およびＲ１７は互いに独立して同一かまたは異なり、それぞれＨまたはＣｎＨ２ｎ＋１または前記の意味を有する（ＣｎＨ２ｎ）ＮＲ１０Ｒ１１）であり、そして
Ｓｃ１およびＳｃ２は互いに独立して同一かまたは異なり、それぞれＨ、またはアシル、トリチルもしくはアリルオキシカルボニル基から選ばれる保護基である。］、
または式（ＩＩ）の化合物
【化４】
0004674965.tif 000031
［式中、
Ｒ１’はＨ、ＯＨ、Ｈａｌ（式中、ＨａｌはＢｒまたはＣｌに等しい）または次式から選ばれる基に等しく、
【化５】
0004674965.tif 000032
または  −Ｏ−Ｐ［Ｎ（ｉ−Ｐｒ）２］−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）
（式中、ｉ−Ｐｒはイソプロピル）またはＯ−アシル基に等しく、
Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は互いに独立して同一かまたは異なり、それぞれＨ、Ｈａｌ（式中、ＨａｌはＢｒまたはＣｌに等しい）、＝Ｏ、ＣｎＨ２ｎ＋１またはＣｎＨ２ｎ−１、式−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｒ１８のβ脱離基（式中、Ｒ１８はシアノまたはｐ−ニトロフェニル基またはフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基に等しい）または（ＣｎＨ２ｎ）ＮＲ１０’Ｒ１１’（式中、Ｒ１０’、Ｒ１１’は互いに独立して、前記のＲ１０またはＲ１１の意味を有する）であり、そして
Ｘ’は＝Ｎ−、＝Ｃ（Ｒ１６’）−または−Ｎ（Ｒ１７’）−（式中、Ｒ１６’およびＲ１７’は互いに独立して前記のＲ１６またはＲ１７の意味を有する）であり、そして
Ｓｃ１’およびＳｃ２’は前記のＳｃ１およびＳｃ２の意味を有する。］
であることを特徴とする、前記使用。
【請求項２】
該ペントピラノシルヌクレオシドが、リボ−、アラビノ−、リキソ−、および／またはキシロピラノシルヌクレオシドであることを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項３】
該ペントピラノシルヌクレオシドのペントピラノシル部分がＤまたはＬ配置にあることを特徴とする、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
用いられる該ペントピラノシルヌクレオシドが、ペントピラノシルプリン、−２，６−ジアミノプリン、−６−プリンチオール、−ピリジン、−ピリミジン、−アデノシン、−グアノシン、−イソグアノシン、−６−チオグアノシン、−キサンチン、−ヒポキサンチン、−チミジン、−シトシン、−イソシトシン、−インドール、−トリプタミン、−Ｎ−フタロイル−トリプタミン、−ウラシル、−カフェイン、−テオブロミン、−テオフィリン、−ベンゾトリアゾールまたは−アクリジンであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ２’、Ｒ３’および／またはＲ４’が、２−フタルイミドエチルもしくはアリルオキシ基または式−Ｎ［Ｃ（Ｏ）Ｒ９］２の基であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
【請求項６】
該ペントピラノシルヌクレオシドが、［２’，４’−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−リボピラノシル］ヌクレオシド、Ｎ−ベンゾイル−２’，４’−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、Ｎ−イソブチロイル−２’，４’−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、Ｏ６−（２−シアノエチル）−Ｎ２−イソブチロイル−２’，４’−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、Ｏ６−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ２−イソブチロイル−２’，４’−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、β−リボピラノシルヌクレオシド、Ｎ−ベンゾイル−、Ｎ−イソブチロイル−、Ｏ６−（２−シアノエチル）−またはＯ６−（２−（４−ニトリフェニル）エチル）−Ｎ２−イソブチロイル−β−リボピラノシルヌクレオシド；４’−ＤＭＴ−ペントピラノシルヌクレオシド、Ｎ−ベンゾイル−４’−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、Ｎ−イソブチロイル−４’−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、Ｏ６−（２−シアノエチル）−Ｎ２−イソブチロイル−４’−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、Ｏ６−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ２−イソブチロイル−４’−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、またはβ−リボピラノシル−Ｎ，Ｎ’−ジベンゾイルアデノシン、またはβ−リボピラノシル−Ｎ，Ｎ’−ジベンゾイルグアノシンであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
ペントピラノシルヌクレオシドまたはペントピラノシル核酸および生体分子を含む接合体の形態で、ペントピラノシルヌクレオシドまたはペントピラノシル核酸を使用することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項にしたがった使用に由来するペントピラノシルヌクレオシド若しくはペントピラノシル核酸、又は請求項７にしたがった使用に由来するペントピラノシルヌクレオシド若しくはペントピラノシル核酸および生体分子を含む接合体、を含むアレー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）のペントピラノシルヌクレオシド、
【０００２】
【化６】
0004674965.tif 000002
【０００３】
その調製および、とくに診断器具の形をなす電子コンポーネントを製造するためのその使用に関する。
【０００４】
ピラノシル核酸（ｐ−ＮＡｓ）は、天然のＲＮＡとは異性体である一般的構造様式をなし、その中でペントース単位がピラノース形態で存在して、Ｃ−２′位とＣ−４′位との間にリン酸ジエステル基によって反復結合されている（図１）。「核酸塩基」は本明細書では一般的な核酸塩基Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｃ、Ｇだけでなく、イソグアニン／イソシトシン対および２，６−ジアミノプリン／キサンチン対をも意味し、本発明の意図する範囲内ではさらに、他のプリン類およびピリミジン類をも意味する。ｐ−ＮＡｓ、すなわちリボースから誘導されるｐ−ＮＡｓはＥｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒらによって初めて述べられた（Ｐｉｔｓｃｈ，Ｓ．ら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９９３，７６，２１６１；Ｐｉｔｓｃｈ，Ｓ．ら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９９５，７８，１６２１；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９９６，１０８，１６１９−１６２３参照）。これらはもっぱらいわゆるＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対、すなわちプリン−ピリミジン対およびプリン−プリン対をなし、逆平行で、可逆的に「融解」する準線状で安定な二本鎖を形成する。キラリティーとは反対の意味のホモキラルｐ−ＲＮＡ鎖はさらに制御可能なように対になり、形成された二本鎖においては厳密に非らせん状である。超分子単位の構成に役立つこの特異性はリン酸リボピラノース主鎖の比較的低い柔軟性ならびに鎖軸に対する基準面の強い傾斜およびこれから生じる生成二本鎖の相互連鎖状塩基のスタッキング傾向に関連し、そして最後に主鎖の構造における２′，４′−シス−二置換リボピラノース環の関与に帰することができる。これら極めて良好な対合性は、超分子単位の構成に用いる場合にＤＮＡおよびＲＮＡと比べてｐ−ＮＡｓ対合系を好ましいものにする。該系は天然の核酸に対して直角の対合系を形成し、すなわち該系は天然の形で存在するＤＮＡｓおよびＲＮＡｓと対合せず、これが診断の分野でとくに重要である。
【０００５】
Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒら（１９９３，前出）は図２に示し、かつ後記するようなｐ−ＲＮＡをはじめて調製した。
【０００６】
この場合に、適当な保護核酸塩基を、ビス（トリメチルシリル）アセトアミドの作用および、たとえばトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートのようなルイス酸の作用によってテトラベンゾイルリボピラノースのアノマー混合物と反応させた（Ｈ．Ｖｏｒｂｒｕｅｇｇｅｎ，Ｋ．Ｋｒｏｌｉｋｉｅｗｉｃｚ，Ｂ．Ｂｅｎｎｕａ，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１９８１，１１４，１２３４に類似）。塩基の作用下（プリン類の場合にはＮａＯＨのＴＨＦ／メタノール／水溶液；ピリミジン類の場合には飽和アンモニアのメタノール溶液）で、糖からアシル保護基を除き、酸性触媒下ｐ−アニスアルデヒドジメチルアセタールを用いて生成物の３′位、４′位を保護した。ジアステレオマー混合物の２′位をアシル化し、３′，４′−メトキシベンジリデン保護２′−ベンゾエートを酸性処理、たとえばトリフルオロ酢酸のメタノール溶液によって脱アセチル化して、ジメトキシトリチルクロリドと反応させた。このベンゾエートの２′→３′への移行はｐ−ニトロフェノール／４−（ジ−メチルアミノ）ピリジン／トリエチルアミン／ピリジン／ｎ−プロパノールとの処理によって開始された。ほとんどすべての反応はカラムクロマトグラフィーによって精製した。この方法で合成された重要な単位のリボピラノースの４′−ＤＭＴ−３′−ベンゾイル−１′−核酸塩基誘導体は、次に部分ホスフィチル化させて、リンカーによって固相に結合させた。
【０００７】
次の自動オリゴヌクレオチド合成では、４′位のキャリヤー結合成分を反復して酸性で脱保護し、カップリング試薬、たとえばテトラゾール誘導体の作用下でホスホルアミダイトをカップリングさせ、依然として遊離の４′−酸素原子をアセチル化し、リン原子を整然と酸化してオリゴマー生成物を得た。次いで残留保護基を除き、生成物をＨＰＬＣによって精製および脱塩した。
【０００８】
しかしＥｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒらが述べた方法（１９９３、前出）は下記の欠点を示す。
１．核酸塩基とのヌクレオシド化反応に対する非アノーマーとして純粋なテトラベンゾイルペントピラノース類の使用（Ｈ．Ｇ．Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５５，７７，５３３７）は次の作業工程における厳密なクロマトグラフのカットの必要性から最終生成物の収率を減少させる。
２．１′位に核酸塩基を有するリボピラノース類から出発して保護３′−ベンゾエート類までの５つの反応段階の場合に、合成が極めて長引き、工業規模における実施はほとんど不可能である。頃合の経費に加えて、得られるモノマーの収量は低く，プリン単位のアデニンの場合には２９％、ピリミジン単位のウラシルの場合には２４％である。
３．オリゴヌクレオチドの合成の場合には、自動ｐ−ＲＮＡ合成におけるカップリング試薬として５−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−テトラゾールを使用する。テトラゾールのアセトニトリル溶液中のこの試薬の濃度がこの場合には非常に高いので５−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−テトラゾールが合成機の細いチュービング内に定期的に晶出し、したがって合成が早期に限界に達する。さらに、オリゴマーが５−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−テトラゾールで汚染されることが認められた。
４．ｐ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドの前記の精製、とくにヒドラジン溶液による塩基が不安定な保護基の除去は、オリゴマー中のチミジン画分が多い場合には必ずしも可能では無い。
【０００９】
生体分子、たとえばＤＮＡまたはＲＮＡは、別の生体分子、たとえばＤＮＡまたはＲＮＡとの非共有結合のために、もしも核酸塩基の相補的配列の結果として両生体分子が、水素架橋の形成によって相互に結合できる部分を含む場合には、使用することができる。この種の生体分子は、たとえばシグナル増幅分析システムにおいて用いられ、その場合には配列を分析すべきＤＮＡ分子は一方では固体支持体上の非共有ＤＮＡリンカーによって固定化させることができ、他方シグナル増幅枝分かれＤＮＡ分子（ｂＤＮＡ）に結合させることができる（たとえば、Ｓ．Ｕｒｄｅａ，Ｂｉｏｌ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９４，１２，９２６または米国特許第５，６２４，８０２号参照）。最後に述べたシステムの重要な欠点は、今日まで該システムが感度に関してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸診断法に影響されやすいということである（Ｋ．Ｍｕｌｌｉｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７，１５５，３３５）。これは、とくに、「配列認識」および「非共有結合」の両機能の混合が生じる結果として、分析すべきＤＮＡ分子に対する固体支持体の非共有結合ならびに分析すべきＤＮＡ分子の非共有結合が必ずしも明確に起こるとは限らないという事実に帰することができる。
【００１０】
したがって本発明の目的は、前記の欠点を無くすことができる新規生体分子およびその調製法を提供することにある。
【００１１】
前記分析法の感度を著しく向上させ得る結果として、ＤＮＡまたはＲＮＡ対合プロセスに介入しない直交対合システムとしてのｐ−ＮＡｓの使用が、この問題を有利に解決する。
【００１２】
したがって本発明の１つの主題は、電子コンポーネントを製造するための、好ましくはペントピラノシルヌクレオチドまたはペントピラノシル核酸および生体分子を含む接合体の形をなし、とくに診断器具の形をなすペントピラノシルヌクレオシドまたはペントピラノシル核酸の使用である。
【００１３】
本発明の意図の範囲内の接合体はｐ−ＮＡｓと他の生体分子、好ましくはペプチド、タンパク質もしくは核酸、たとえば抗体もしくはその機能性部分または自然の形態で存在するＤＮＡおよび／またはＲＮＡとの共有結合ハイブリッドである。抗体の機能性部分は、たとえばＦｖ断片（Ｓｋｅｒｒａ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，１０３８）、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ；Ｂｉｒｄら（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，４２３；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５８７９） またはＦａｂ断片（Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，１０４１）である。
【００１４】
本発明の意図の範囲内の生体分子は天然に存在する物質または天然に存在する物質から誘導される物質を意味するものと理解される。
【００１５】
好ましい態様では、それらは、この場合にはｐ−ＲＮＡ／ＤＮＡまたはｐ−ＲＮＡ／ＲＮＡ接合体である。
【００１６】
本発明による接合体は互いに直交する２つの対合系を含むので、「配列認識」および「非共有結合」の両機能を分子内に実現させなければならない場合に、接合体を用いるのが好ましい。
【００１７】
ｐ−ＮＡｓおよびとくにｐ−ＲＮＡｓは相互に安定な二本鎖を形成し、概して自然な形で存在するＤＮＡｓおよびＲＮＡｓとは対合しない。この性質がｐ−ＮＡｓを好ましい対合系にする。
【００１８】
該対合系は、選択性、安定性および可逆性によって識別される非共有相互作用の超分子系であり、そして熱力学的に、すなわち温度、ｐＨおよび濃度によってその性質は好ましく影響される。その選択性のために、該対合系を、たとえば潜在的に新規な性質を有するクラスター会合を得るために種々の金属クラスターを一緒にするための「分子接着剤」として用いることもできる［たとえばＲ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３８２，６０７−９；Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３８２，６０９−１１参照］。ｐ−ＮＡｓが強くて熱力学的に制御可能な対合系を形成するので、したがってｐ−ＮＡｓはナノテクノロジー分野における用途、たとえば新規物質、診断器具および治療薬、さらにミクロ電子的、光子的または光電子工学的コンポーネントの製造、およびたとえばタンパク質集合体の（連結）合成の場合のような超分子単位を得るための分子種の制御合体のために用いるのにも適している［たとえばＡ．Ｌｏｍｂａｒｄｉ，Ｊ．Ｗ．Ｂｒｙｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．ＤｅＧｒａｄｏ，Ｂｉｏｍｏｌｅｋｕｌｓ（Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．）１９９７，４０，４９５−５０４参照］。したがって、天然の核酸を妨害しないｐ−ＮＡコードを有する機能的、好ましくはタンパク質またはＤＮＡ／ＲＮＡ切片のような生物学的単位を付与する可能性のために、とくに別の用途が診断および薬剤発見の分野に現れる（たとえばＷＯ  ９３／２０２４２参照）。
【００１９】
接合体の調製には連続的および収束的方法がいずれも適切である。
連続法では、たとえば試薬およびカップリングプロトコルの再調整後、直接同じ合成機によるｐ−ＲＮＡオリゴマーの自動合成を行った後、さらにたとえばＤＮＡオリゴヌクレオチドが合成される。この方法は、逆の順序で行うこともできる。
【００２０】
収束法では、たとえばアミノ末端リンカーを有するｐ−ＲＮＡオリゴマーおよびたとえばチオールリンカーを有するＤＮＡオリゴマーが別々の操作で合成される。ｐ−ＲＮＡオリゴマーのヨードアセチル化および文献から公知のプロトコルによる該両単位のカップリング（Ｔ．Ｚｈｕら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１９９４，５，３１２）を行うことが好ましい。収束法はその柔軟性のためにとくに好ましいことが判明している。
【００２１】
本発明の意図の範囲内の接合体という用語は所謂アレイ（ａｒｒａｙ）を意味するとも理解される。アレイは、とくに分析および診断において分析物の同時定量に重要な役割を演じる固定化認識種の配列である。実例にはペプチドアレイ（Ｆｏｄｏｒら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９３，３６４，５５５）および核酸アレイ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９９２，１３，１００８；Ｈｅｌｌｅｒ，米国特許第５，６３２，９５７号）がある。これらアレイの高柔軟性は、認識種を解読オリゴヌクレオチドに結合させ、そして会合相補鎖を固体担体上のある位置に結合させることによって目的を達成することができる。コード化認識種を「非コード化」固体担体に適用しそしてハイブリッド化条件を調整することによって、認識種は所望の位置に非共有結合される。その結果、たとえばＤＮＡ切片、抗体のような種々の種類の認識種をハイブリッド化条件を用いて固体担体上に同時に配列させることだけができる（図３参照）。しかし、このための必要条件は、解読切片をできるだけ短く保つために極めて強くて選択的で、必要な天然の核酸を妨害しないコドンおよびアンチコドンである。ｐ−ＮＡｓ、好ましくはｐ−ＲＮＡｓはこのためにとくに有利に適する。
【００２２】
本発明の意図の範囲内の「担体」という用語は固体もしくはゼラチン状で存在する物質、とくにチップ物質を意味するものと理解される。適当な担体物質は、たとえばセラミック、金属、とくに貴金属、ガラス、プラスチック、担体（とくに前記物質）の結晶物質もしくは薄層、またはセルロース、構造タンパク質のような（生体）分子フィラメントである。
【００２３】
したがって本発明は、認識種、好ましくは天然のＤＮＡもしくはＲＮＡ鎖またはタンパク質、とくに抗体もしくは抗体の機能性部分をコード化するためのペントピラノシル核酸、好ましくはリボピラノシル核酸の使用に関する。これらはさらに図３により適当なコドンで固体担体上にハイブリッド化させることができる。こうして、常に新規な認識種の結合を用いてハイブリッド条件を調整するだけでアレイの形をなすコドンを備えている固体担体上の所望の位置に、新規で診断上有用なアレイを常に形成させることができる。次に分析物、たとえば血清等のような生物学的試料を適用する場合には、検知すべき種をあるパターンのアレイに結合させた後間接的（たとえば認識種の蛍光標識化により）または直接的（たとえばコドンの結合点のインピーダンス測定により）に記録を取る。ついで適当な条件（温度、塩類、溶剤、電気泳動法）によってハイブリッド形成を除去し、その結果再びコドンを有する担体のみが残留する。つぎにこれに再び他の認識種を装入して、たとえば他の試料の定量に同じ分析物を使用する。アレイフォーマット中の認識種と対向系としてのｐ−ＮＡｓの使用との常に新規な組合せは、その他の系と比較してとくに利点がある（たとえばＷＯ  ９６／１３５２２（下記１６参照）参照）。
【００２４】
好ましい態様において、ペントピラノシルヌクレオシドは式（Ｉ）の化合物
【００２５】
【化７】
0004674965.tif 000003
【００２６】
［式中、
Ｒ1はＨ、ＯＨ、Ｈａｌ（式中ＨａｌはＢｒまたはＣｌに等しい）または次式から選ばれる基に等しく、
【００２７】
【化８】
0004674965.tif 000004
【００２８】
式中、ｉ−Ｐｒはイソプロピルに等しく、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は互いに独立して、同一かまたは異なり、それぞれＨ、Ｈａｌ（式中、ＨａｌはＢｒまたはＣｌに等しい）、ＮＲ5Ｒ6、ＯＲ7、ＳＲ8、＝Ｏ、ＣnＨ2n+1（式中、ｎは１〜１２、好ましくは１〜８、とくに１〜４の整数である）、β脱離基、好ましくは式−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｒ18の基（式中、Ｒ18はシアノまたはｐ−ニトロフェニル基またはフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基に等しい）、または（ＣnＨ2n）ＮＲ10Ｒ11（式中、Ｒ10Ｒ11はＨ、ＣnＨ2n+1に等しい）または次式の基によって結合されたＲ10Ｒ11であり、
【００２９】
【化９】
0004674965.tif 000005
【００３０】
式中、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14およびＲ15は互いに独立して同一かまたは異なり、それぞれＨ、ＯＲ7（式中、Ｒ7は前記の意味を有する）またはＣnＨ2n+1、またはＣＨ2n-1（式中、ｎは前記の意味を有する）であり、そして
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は互いに独立して、同一かまたは異なり、それぞれＨ、ＣnＨ2n+1、またはＣnＨ2n-1（式中、ｎは前記の意味を有する）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ9（式中、Ｒ9は線状または分枝状で任意に置換されたアルキルまたはアリール、好ましくはフェニル基に等しい）であり、
Ｘ、ＹおよびＺは互いに独立して、同一かまたはまたは異なり、それぞれ＝Ｎ−、＝Ｃ（Ｒ16）−、または−Ｎ（Ｒ17）−（式中、Ｒ16およびＲ17は互いに独立して、同一かまたはまたは異なり、それぞれＨまたはＣnＨ2n+1または前記の意味を有する（ＣnＨ2n）ＮＲ10Ｒ11）であり、そして
Ｓc1およびＳc2は互いに独立して、同一かまたは異なり、それぞれＨまたは、アシル、トリチルもしくはアリルオキシカルボニル基、好ましくはベンゾイルもしくは４，４′−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基から選ばれる保護基である］、または式（ＩＩ）の化合物である：
【００３１】
【化１０】
0004674965.tif 000006
【００３２】
［式中、Ｒ1′はＨ、ＯＨ、Ｈａｌ（式中、ＨａｌはＢｒまたはＣｌに等しい）または次式から選ばれる基に等しく、
【００３３】
【化１１】
0004674965.tif 000007
【００３４】
式中、ｉ−Ｐｒはイソプロピルに等しく、
Ｒ2′、Ｒ3′およびＲ4′は互いに独立して、同一かまたは異なり、それぞれＨ、Ｈａｌ（式中、ＨａｌはＢｒまたはＣｌに等しい）、＝Ｏ、ＣnＨ2n+1またはＣnＨ2n-1、β脱離基、好ましくは式−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｒ18の基（式中、Ｒ18はシアノまたはｐ−ニトロフェニル基またはフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基に等しい）または（ＣnＨ2n）ＮＲ10′Ｒ11′（式中、Ｒ10′、Ｒ11′は互いに独立して、前記のＲ10またはＲ11の意味を有する）であり、そしてＸ′はそれぞれ＝Ｎ−、＝Ｃ（Ｒ16′）−または−Ｎ（Ｒ17′）−（式中、Ｒ16′およびＲ17′は互いに独立して前記のＲ16またはＲ17の意味を有する）であり、そしてＳc1′およびＳc2′は前記のＳc1およびＳc2の意味を有する。］
ペントピラノシルヌクレオシドは概してリボ−、アラビノ−、リキソ−、および／またはキシロピラノシルヌクレオシド、好ましくはリボピラノシルヌクレオシド（式中ペントピラノシル部分はＤ配置のみならずＬ配置にあることもできる）である。
【００３５】
慣例上、本発明によるペントピラノシルヌクレオシドはペントピラノシルプリン、−２，６−ジアミノプリン、−６−プリンチオール、−ピリジン、−ピリミジン、−アデノシン、−グアノシン、−イソグアノシン、−６−チオグアノシン、−キサンチン、−ヒポキサンチン、−チミジン、−シトシン、−イソシトシン、−インドール、−トリプタミン、−Ｎ−フタロイルトリプタミン、−ウラシル、−カフェイン、−テオブロミン、−テオフィリン、−ベンゾトリアゾールまたは−アクリジン、とくにペントピラノシルプリン、−ピリミジン、−アデノシン、−グアノシン、−チミジン、−シトシン、−トリプタミン、−Ｎ−フタロトリプタミンまたは−ウラシルである。
【００３６】
該化合物は、またリンカー、すなわち、たとえば天然の形で存在する核酸または変性核酸、たとえばＤＮＡ、ＲＮＡのみならずｐ−ＮＡｓ、好ましくはｐＲＮＡのように生体分子に共有結合させることができる官能基を有する化合物として用いることができるペントピラノシルヌクレオシドをも包含する。ｐ−ＮＡｓに対してはリンカーはまだ公知ではないので、これは驚くべきことである。
【００３７】
たとえば、該物質はペントピラノシルヌクレオシド（式中Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ2′、Ｒ3′および／またはＲ4′は２−フタルイミドエチルまたはアリルオキシ基である）を含む。本発明による好ましいリンカーは、たとえばウラシルの５位が好ましくは変性されているウラシル系リンカー、たとえばＮ−フタロイルアミノエチルウラシルのみならず、さらにインドール系リンカー、好ましくは、たとえばＮ−フタロイルトリプタミンのようなトリプタミン誘導体である。
【００３８】
驚くべきことに、本発明によって、より容易に処理可能なペントピラノシル−Ｎ，Ｎ−ジアシルヌクレオシド、好ましくはプリン、とくにアデノシン、グアノシンまたは６−チオグアノシンも利用でき、その核酸塩基は単純な方法で完全に脱保護させることができる。したがって本発明は、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ2′、Ｒ3′および／またはＲ4′が式−Ｎ［Ｃ（Ｏ）Ｒ9］2の基であるペントピラノシルヌクレオシド、とくにＮ6，Ｎ6−ジベンゾイル−９−（β−Ｄ−リボピラノシル）−アデノシンをも包含する。
【００３９】
さらに驚くべきことに、本発明が、保護基、好ましくは塩基または金属触媒によって除去可能な保護基、とくにアシル基、とくに好ましくはベンゾイル基を、ペントピラノシド部分の３′−酸素原子のみに有するペントピラノシルヌクレオシドを利用できることである。該化合物は、たとえば、別の保護基、好ましくは酸または塩基に不安定な保護基、とくにトリチル基、とくに好ましくはジメトキシトリチル基を、たとえば付加精製工程のような収量を低下させる追加の工程なしに、ペントピラノシド部分の４′−酸素原子に直接導入するための出発物質として役立つ。
【００４０】
さらに、本発明は、保護基、好ましくは酸または塩基に不安定な保護基、とくにトリチル基、とくに好ましくはジメトキシトリチル基を、ペントピラノシド部分の４′−酸素原子のみに有するペントピラノシルヌクレオシドを利用可能にする。該化合物は、たとえば別の保護基、好ましくは塩基または金属触媒で除去可能な保護基、とくにアシル基、とくに好ましくはベンゾイル基を、たとえば付加精製工程のような収量を低下させる追加の工程なしに、たとえばペントピラノシド部分の２′−酸素原子に直接導入するための出発物質としても役立つ。
【００４１】
概して、本発明によるペントピラノシドヌクレオシドは、収量を増大させ、したがってとくに有利な所謂１ポット反応で反応させることができる。
【００４２】
下記の化合物は本発明によるペントピラノシルヌクレオシドの好ましい例である。
Ａ）［２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイル）−β−リボピラノシル］ヌクレオシド、とくに［２′，４−ジ−Ｏ−ベンゾイル）−β−リボピラノシル］アデニン、−グアニン、−シトシン、−チミジン、−ウラシル、−キサンチンまたは−ヒポキサンチン、およびＮ−ベンゾイル−２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、とくに−アデニン、−グアニンまたは−シトシン、およびＮ−イソブチロイル−２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、とくに−アデニン、−グアニンまたは−シトシン、およびＯ6−（２−シアノエチル）−Ｎ2−イソブチロイル−２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、とくに−グアニン、およびＯ6−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ2−イソブチロイル−２，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、とくに−グアニン。
Ｂ）β−リボピラノシルヌクレオシド、とくにβ−リボピラノシルアデニン、−グアニン、−シトシン、−チミジンまたは−ウラシル、−キサンチンまたはヒポキサンチン、およびＮ−ベンゾイル−、Ｎ−イソブチロイル−、Ｏ6−（２−シアノエチル）−またはＯ6−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ2−イソブチロイル−β−リボピラノシルヌクレオシド。
Ｃ）４′−ＤＭＴ−ペントピラノシルヌクレオシド、好ましくは４′−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、とくに４′−ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン、−グアニン、−シトシン、−チミジン、−ウラシル、−キサンチンまたは−ヒポキサンチン、およびＮ−ベンゾイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、とくにＮ−ベンゾイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン、−グアニンまたは−シトシン、およびＮ−イソブチロイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、とくにＮ−イソブチロイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン、−グアニンまたは−シトシンおよびＯ6−（２−シアノエチル）−Ｎ2−イソブチロイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、とくにＯ6−（２−シアノエチル）−Ｎ2−イソブチロイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルグアニン、およびＯ6−２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ2−イソブチロイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、とくにＯ6−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ2−イソブチロイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルグアニン。
Ｄ）β−リボピラノシル−Ｎ，Ｎ′−ジベンゾイルアデノシンまたはβ−リボピラノシル−Ｎ，Ｎ′−ジベンゾイルグアノシン。
【００４３】
オリゴヌクレオチド合成に適する前駆物質、たとえば４′−ＤＭＴ−ペントピラノシルヌクレオシド−２′−ホスフィトアミド／−Ｈ−ホスホネート、好ましくは４′−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド−２′−ホスフィトアミド／−Ｈ−ホスホネート、とくに４′−ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−、−シトシン−、−チミジン−、−キサンチン−、−ヒポキサンチン−、または−ウラシル−２′−ホスフィトアミド／−Ｈ−ホスホネートおよびＮ−ベンゾイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−または−シトシン−２′−ホスフィトアミド／−Ｈ−ホスホネートおよびＮ−イソブチロイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−または−シトシン−２′−ホスフィトアミド／−Ｈ−ホスホネート、Ｏ6−（２−シアノエチル）−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルグアニン−、−キサンチン−、−ヒポキサンチン−２′−ホスフィトアミド／−Ｈ−ホスホネートまたはＯ6−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ2−イソブチロイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルグアニン、および固体担体とのカップリングに適する前駆物質、たとえば４′−ＤＭＴ−ペントピラノシルヌクレオシド−２′−スクシネート、好ましくは４′−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド−２′−スクシネート、とくに４′−ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−、−シトシン−、−チミジン−、−キサンチン−、−ヒポキサンチン−または−ウラシル−２′−スクシネートおよびＮ−ベンゾイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−または−シトシン−２′−スクシネートおよびＮ−イソブチロイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−または−シトシン−２′−スクシネート、Ｏ−（２−シアノエチル）−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルグアニン−スクシネートおよびＯ6−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ2−イソブチロイル−４′−ＤＭＴ−リボピラノシルグアニン−２′−スクシネート。
【００４４】
ペンタピラノシルヌクレオシドは、無保護ペントピラノシドから出発して下記のようにして本発明によりとくに有利に調製することができる。
（ａ）第１工程において、ペントピラノシドの２′位、３′位または４′位をまず保護し、そして好ましくは
（ｂ）第２工程では他の２′位、３′位または４′位を保護する。
【００４５】
この方法は引用文献に記載された核酸塩基に限定されないで、多数の天然および合成核酸塩基を用いて実施し、驚くべきほど好成績を収めることができる。さらに、本発明による方法が、高収量で、かつ文献により公知の方法と比べて平均で６０％の時間節約を伴って実施することができ、工業的用途に極めて有利であることはとりわけ驚くべきことである。さらに、本発明による方法を用いると、文献に記載されている方法では必要な精製工程、たとえばクロマトグラフィーによる中間精製は必ずしも必要では無く、したがって場合によっては反応を、空間／時間の歩留まりを大幅に向上させる所謂１ポット反応として行うこともできる。
【００４６】
特定態様において、２′−保護位置の場合に、２′位から３′位への保護基の転移が起こり、これは概して塩基、とくにＮ−エチルジイソプロピルアミノよび／またはトリエチルアミンの存在下で行われる。本発明によれば、この反応は１ポット反応として同じ反応容器でとくに有利に行うことができる。
【００４７】
別の好ましい態様では、ピラノシルヌクレオシドが、酸に不安定もしくは塩基に不安定であるかまたは金属触媒で除去可能な保護基Ｓc1、Ｓc2、Ｓc1′またはＳc2′によって保護され、好ましくは保護基Ｓc1およびＳc1′は保護基Ｓc2およびＳc2′とは異なる。
【００４８】
概して、前記保護基はアシル基、好ましくはアセチル、ベンゾイル、ニトロベンゾイルおよび／またはメトキシベンゾイル基、トリチル基、好ましくは４，４′−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基またはβ脱離基、好ましくは式−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｒ18の基（式中Ｒ18はシアノもしくはｐ−ニトロフェニル基またはフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基）である。
【００４９】
２′位または３′位を、塩基に不安定であるかまたは金属触媒で除去可能な保護基、好ましくはアシル基、とくにアセチル、ベンゾイル、ニトリベンゾイルおよび／またはメトキシベンゾイル基によって保護し、かつ／または４′位を、酸または塩基に不安定な保護基、好ましくはトリチルおよび／またはＦｍｏｃ基、とくにＤＭＴ基によって保護する場合には、とくに好ましい。
【００５０】
文献により公知の方法とは異なり、この方法は、アセタール類またはケタール類のようなアセタール保護基を用いずに処理し、付加クロマトグラフィー中間精製を省き、従って反応を空間／時間の驚くべきほど高歩留まりが得られる１ポット反応として行うことができる。
【００５１】
前記保護基は、この手段によって驚くほど選択的に導入できるので、低温で導入するのが好ましい。
【００５２】
したがって、たとえばベンゾイル基の導入は、ピリジン中またはピリジン／塩化メチレン混合物中のベンゾイルクロリドとの低温における反応によって行われる。ＤＭＴ基は、たとえば塩基、例えばＮ−エチルジイソプロピルアミン（Ｈｕｅｎｉｇ塩基）および例えばピリジン、塩化メチレンまたはピリジン／塩化メチレン混合物の存在下で室温におけるＤＭＴＣｌとの反応によって導入させることができる。
【００５３】
アシル化後および／または任意に行われる２′位から３′位への転移後に、反応生成物をクロマトグラフィーによって精製する場合には、それも有利である。とくに有利な本発明による方法によれば、トリチル化後の精製は必ずしも必要ではない。
【００５４】
必要ならば、最終生成物を結晶化によって補足的にさらに精製することができる。
【００５５】
リボピラノシルヌクレオシドの調製には、好ましくは最初に
（ａ）保護核酸塩基を保護リボピラノースと反応させ、ついで
（ｂ）工程（ａ）からの生成物のリボピラノシル部分から保護基を除去し、次に（ｃ）工程（ｂ）からの生成物をさきに詳細に示した方法によって反応させる。
【００５６】
これに関し、時間および材料を浪費する次のクロマトグラフィー工程を省くために、たとえばテトラベンゾイルペントピラノース類、好ましくはβ−テトラベンゾイルリボピラノース類のようなアノマーとして純粋な保護ペントピラノース類を使用することだけが有利である（Ｒ．Ｊｅａｎｌｏｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９４８，７０，４０５２）。
【００５７】
別の態様において、式（ＩＩ）（式中Ｒ4′は（ＣnＨ2n）ＮＲ10′Ｒ11′でありかつＲ10′Ｒ11′はすでに示した意味を有する式（ＩＩＩ）の基によって結合される）によるリンカーを下記の方法によって調製するのが有利である：
（ａ）式（ＩＩ）（式中Ｒ4′は（ＣnＨ2n）ＯＳc3または（ＣnＨ2n）Ｈａｌ（式中ｎはさきに示した意味を有し、Ｓc3は保護基、好ましくはメシレート基であり、Ｈａｌは塩素または臭素である）の化合物を、好ましくはＤＭＦ中でアジドと反応させ、ついで
（ｂ）（ａ）からの反応生成物を好ましくは、たとえばピリジン中でトリフェニルホスフィンで還元し、次に
（ｃ）（ｂ）からの反応生成物を適当なフタルイミド、たとえばＮ−エトキシカルボニルフタルイミドと反応させ、そして
（ｄ）（ｃ）からの反応生成物を適当な保護ピラノース、たとえばリボーステトラベンゾエートと反応させ、最後に
（ｅ）該保護基を、たとえばメチレートで除去し、そして
（ｆ）すでに述べたように以後の工程を行う。
【００５８】
さらに、リンカーとしてのインドール誘導体は蛍光発光能力の利点を有し、したがって極めて少量の物質を検知する物質であることができるナノテクノロジーの用途にとくに好ましい。たとえばインドール−１−リボシド類はすでにＮ．Ｎ．Ｓｕｖｏｒｏｖら，Ｂｉｏｌ．Ａｋｔｉｖｎ．Ｓｏｅｄｉｎ．，Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ  ＳＳＳＲ  １９６５，６０およびＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９６７，２３，４６５３に記載されている。しかし、３−置換誘導体を調製するための類似の方法はない。一般に、その調製は、無保護糖成分とインドリンのアミナール（ａｍｉｎａｌ）を生成させ、それをさらに酸化によってインドール−１−リボシドに転化させることによって行われる。たとえば、インドール−１−グルコシド類および−１−アラビノシド類はすでに記載があり（Ｙ．Ｖ．Ｄｏｂｒｉｙｎｉｎら，Ｋｈｉｍ．−Ｆａｒｍ  Ｚｈ．，１９７８，１２，３３）、その３−置換誘導体は通常Ｖｉｅｌｓｍｅｉｅｒ反応によって調製されている。しかし、アミノエチル単位をインドールの３位に導入するためのこの経路は工業的用途にはあまりにも複雑である。
【００５９】
別の好ましい態様では、したがって式（Ｉ）（式中ＸおよびＹは互いに独立して、同一かまたは異なり、それぞれ＝Ｃ（Ｒ16）（式中Ｒ16はＨまたはＣnＨ2nに等しい）およびＺ＝Ｃ（Ｒ16）−（式中Ｒ16は（ＣnＨ2n）ＮＲ10Ｒ11に等しい）である）によるリンカーをつぎの方法で調製するのが有利である：
（ａ）適当なインドリン、たとえばＮ−フタロイルトリプタミンをピラノース、たとえばＤ−リボースと反応させて、ヌクレオシドトリオールを得、ついで
（ｂ）（ａ）からの生成物のピラノシル部分のヒドロキシル基を好ましくは、たとえば無水酢酸によってアシル基で保護し、つぎに
（ｃ）（ｂ）からの生成物を、たとえば２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノパラキノンによって酸化し、そして
（ｄ）（ｃ）からの生成物のピラノシル部分のヒドロキシル保護基を、たとえばメチレートによって除去し、最後に
（ｅ）すでにさきに述べたように以後の工程を行う。
【００６０】
しかしこの方法はリボピラノース類の場合のみならずリボフラノース類および２′−デオキシリボフラノース類またはとくに有利な２′−デオキシリボピラノース類の場合にも用いることができない。用いられる糖のヌクレオシド化パートナーは好ましくはトリプタミン、とくにトリプタミンのＮ−アシル誘導体、とりわけＮ−フタロイルトリプタミンである。
【００６１】
別の態様では、４′−保護、好ましくは３′，４′−保護ペントピラノシルヌクレオシドを以後の工程でホスフィチル化するか、または固相に結合させる。
【００６２】
ホスフィチル化は、塩基たとえばＮ−エチルジイソプロピルアミンの存在下でモノアリルＮ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトによるか、または三塩化リンおよびイミダゾールもしくはテトラゾールにより、さらに塩基の付加を伴う次の加水分解によって行われる。第１の場合には、生成物がホスホルアミダイトであり、第２の場合にはＨ−ホスホネートである。本発明による保護ペントピラノシルヌクレオシドの、固相たとえば「長鎖アルキルアミノ制御ポアガラス（ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ  ａｌｋｙｌａｍｉｎｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）」（ＣＰＧ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｍｕｎｉｃｈ）に対する結合は、たとえばＥｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒら（１９９３）が述べたように行うことができる。
【００６３】
得られた化合物は、たとえばペントピラノシル核酸の調製に対して好ましくは下記のように役立つ：
（ａ）第１工程では、保護ペントピラノシルヌクレオシドをすでに述べたように固相に結合させ、そして
（ｂ）第２工程では、工程（ａ）によって固相に結合された３′−，４′−保護ペントピラノシルヌクレオシドをホスフィチル化３′−，４′−保護ペントピラノシルヌクレオシドによって伸長させた後、たとえばヨウ素水溶液で酸化し、そして
（ｃ）所望のペントピラノシル核酸が見られるまで、同一または異なるホスフィチル化３′−，４′−保護ペントピラノシルヌクレオシドを用いて工程（ｂ）を繰り返す。
【００６４】
ピリジニウム塩酸塩のような酸性賦活剤、好ましくはベンズイミダゾリウムトリフレートは、好ましくはアセトニトリル中で再結晶後およびアセトニトリルに溶解後にホスホルアミダイトを用いるときに、カップリング試薬としての５−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−テトラゾールと対比して、カップリング試薬として適当であり、カップリング試薬ラインの閉塞および生成物の汚染も起こらない。
【００６５】
アリールスルホニルクロリド、ジフェニルクロロホスフェート、ピバロイルクロリドまたはアダマントイルクロリドは、Ｈ−ホスホネート類を用いるときにカップリング試薬としてとくに適当である。
【００６６】
さらに、オリゴヌクレオチドを破壊するかもしれない開環からピリミジン塩基、とくにウラシルおよびチミンを保護することは、オリゴヌクレオチド、とくにｐ−ＮＡｓ，好ましくはｐ−ＲＮＡｓの保護基除去ヒドラジン分解に、塩化ナトリウムのような塩類を添加することによって有利である。アリルオキシ基は好ましくは、例えばヒドラジン分解前にパラジウム［Ｐｄ（Ｏ）］錯体によって除去することができる。
【００６７】
他の特定態様では、自然の形で存在するペントフラノシルヌクレオシド、例えばアデニン、グアノシン、シチジン、チミジンおよび／またはウラシルを工程（ａ）および／または工程（ｂ）に組み入れて、たとえば混合ｐ−ＮＡ−ＤＮＡまたはｐ−ＮＡ−ＲＮＡを生成させることもできる。
【００６８】
他の特定態様では、以後の工程に下式のアリルオキシリンカーを組み入れることができる。
【００６９】
【化１２】
0004674965.tif 000008
【００７０】
式中Ｓc4およびＳc7は互いに独立して同一かまたは異なり、それぞれとくにＦｍｏｃおよび／またはＤＭＴから選ばれる保護基であり、
Ｓc5およびＳc6は互いに独立して同一かまたは異なり、それぞれアリルオキシおよび／またはジイソプロピルアミノ基であり、ｎは先に述べた意味を有する。
とくに好ましいアリルオキシリンカーは（２−（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｏ1−ＤＭＴ−Ｏ2−アリルオキシジイソプロピルアミノホスフィニル−６−アミノ−１，２−ヘキサンジオール）である。
【００７１】
例えばリシンから出発して、僅かな反応工程で、賦活可能なリン化合物とＤＭＴのような酸に不安定な保護基との両者を有するアミノ末端リンカーを合成することができ、従って容易に自動オリゴヌクレオチド合成に用いることができる（たとえばＰ．Ｓ．Ｎｅｌｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９８９，１７，７１７９：Ｌ．Ｊ．Ａｒｎｏｌｄら，ＷＯ  ８９０２４３９参照）。本発明では、リシン系リンカーにより範囲が拡大され、他の慣用のリン原子のシアノエチル基の代わりにアリルオキシ基を導入し、従ってＮｏｙｏｒｉのオリゴヌクレオチド法に有利に使用できる（Ｒ．Ｎｏｙｏｒｉ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９０，１１２，１６９１−６）。
【００７２】
本発明の他の主題は、前記ペントピラノシルヌクレオシドまたは接合体の形をなすペントピラノシルヌクレオシドを含む電子コンポーネント、とくに診断器具の形をなす電子コンポーネント、およびさきに詳細に述べたようにペントピラノシルヌクレオシドまたはペントピラノシル核酸を生体分子と結合させる接合体の調製法にも関する。
【００７３】
下記の図面および実施例は本発明を詳細に説明するためのものであって、それを限定するためのものではない。
【００７４】
【実施例】
実施例１
１−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝チミンの合成
まず４′−置換、つぎに２′−置換、ついで移行反応：
【００７５】
【化１３】
0004674965.tif 000009
【００７６】
アルゴン雰囲気中で５１．６ｇ（２００ｍｍｏｌ）の１−（β−Ｄ−リボピラノシル）チミン  Ａを６２０ｍｌの無水ピリジンに溶解し、７１．４ｍｌ（２．１当量）のＮ−エチルジイソプロピルアミンおよび１００ｇのモレキュラーシーブ（４Å）を加えて、混合物をＫＰＧ撹拌機を用いて１５分間撹拌した。９２ｇ（２７２ｍｍｏｌ；１．３６当量）のジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴＣｌ）を２８０ｍｌ（固体のＮａＨＣＯ3から新たに蒸留した）のクロロホルムに溶解して、この溶液を該トリオール溶液に−６〜−５℃において３０分間で滴下した。この温度で１時間撹拌した後、室温（ＲＴ）で一夜間撹拌し、再び冷却し、さらに２５ｇ（７４ｍｍｏｌ；０．３７当量）のＤＭＴＣｌを７０ｍｌのクロロホルムに溶解して加えた。混合物をＲＴにして４時間撹拌した。
【００７７】
少量の試料をとり、水性の仕上げを行い、そして１−｛４′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝チミンの分析データを得るためにクロマトグラフィーにかけた。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.70 (bs, 2H, OH); 1.84 (d, 3H, Me); 2.90 (bs, 1 H, OH); 3.18, 3.30 (2m, 2H, H(5')), 3.62 (bs, 1H, H(3')); 3.70-3.82 (m, 8H, 2 OMe, H(4'), H(2')); 5.75 (d, J = 9.5 Hz,1H,H(1')), 6.85 (m, 4H, 芳香族H); 6.96 (m, 1H, 芳香族H), 7.20 (m, 9H, 芳香族H, H(6)), 8.70 (bs, 1H, H(3).)
反応混合物を２．４６ｇ（２０．５ｍｍｏｌ；０．１当量）の４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）で処理し、−６℃に冷却し、２７．９ｍｌ（０．２４ｍｏｌ；１．２当量）のベンゾイルクロリド（ＢｚＣｌ）を３０ｍｌのピリジンに溶解したものを−６〜−１℃において１５分間で滴下して、混合物を１０分間撹拌した。反応を完了させるために、さらに２５分間隔でそれぞれ２．８ｍｌ（２４ｍｍｏｌ；０．１２当量）のＢｚＣｌを冷却しながら加えて、最後に混合物を２０分間撹拌した。
【００７８】
ついで４６０ｍｌの無水ピリジン、８４１ｍｌ（１１．２ｍｏｌ；５６当量）のｎ−プロパノール、４４ｇ（０．３１６ｍｏｌ；１．５８当量）のｐ−ニトロフェノール、２１．７ｇ（０．１８ｍｏｌ；０．９当量）のＤＭＡＰおよび１３６ｍｌ（０．８ｍｏｌ；４当量）のＮ−エチルジイソプロピルアミンを室温で加えて、混合物を６１〜６３℃で４８時間撹拌した。次いで混合物をＲＴに６０時間放置した。反応混合物を再び６１〜６３℃に２４時間加熱し、ＲＴに冷却してＲｏｔａｖａｐｏｒで濃縮した。残留物を２ｌの酢酸エチルに溶解してモレキュラーシーブを濾過し、有機相をそれぞれ１ｌの水で３回抽出し、１０％濃度のクエン酸１．２ｌと撹拌して一度抽出し、有機相を再び分離して、１ｌの水および最後に１ｌのＮａＨＣＯ3飽和溶液で抽出した。硫酸ナトリウムを用いて有機相を乾燥し、濾過して濃縮した（残留物２２０ｇ）。
【００７９】
残留物はまず予備精製としてヘプタン／酢酸エチル（１：１から０．１）の段階勾配を用いてシリカゲル６０（２０×１０ｃｍ）で濾過し、ついでシリカゲル６０（３０×１０ｃｍ；段階勾配：ジクロロメタン／酢酸エチル、１：０から１：１）を用いてクロマトグラフィーを行った。
下記が得られた：
４０ｇ      非極性画分
５２．９ｇ  １−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝チミン  Ｂ  ３４．５ｇ  不純のＢ
３．４ｇ    極性画分
不純の画分は再びクロマトグラフィー（ＳＧ  ６０，４５×１０ｃｍ；ジクロロメタン／酢酸エチル、３：１）によりさらに１１．３ｇのＢを得た。
総収量：Ｂが６４．２ｇ（９７ｍｍｏｌ）、すなわち収率４８％。
1Ｈ−ＮＭＲが一致する。
【００８０】
実施例２
Ｎ4−ベンゾイル−１−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝シトシンの合成
まず２′−置換、次ぎに４′−置換、次いで移行反応：
【００８１】
【化１４】
0004674965.tif 000010
【００８２】
バッチはすべてＮ2雰囲気中で行った。
Ｎ4−ベンゾイル−１−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル］シトシン  ２：
５４．０ｇ（０．１５５ｍｏｌ）のＮ4−ベンゾイル−１−（β−Ｄ−リボピラノシル）シトシン  １を１２４℃に暖めながら８３０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）および１．５ｌのピリジン（両溶剤とも乾燥してモレキュラーシーブ３Å上に貯蔵した）に溶解した。２１０ｍｌのピリジンに溶解した２３．０ｇ（０．１６３ｍｏｌ；１．０５当量）のＢｚＣｌを−５８゜〜−６３℃で３．５時間の間に滴下した。バッチは冷却浴中で一夜間撹拌した。９０．３ｇ（１．５ｍｏｌ；１０当量）のｎ−プロパノールを撹拌して、バッチを４０℃において高真空で濃縮した。１５０ｍｌのトルエンの添加および濃縮を２回繰り返してピリジン残留物を除いた。１２４．３ｇの残留物を５００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、それぞれ３００ｍｌの中濃度のＮａＨＣＯ3溶液と２回撹拌して抽出し、沈殿した固形物を濾過して乾燥した。残留物  ６０．７ｇ。ＣＨ2Ｃｌ2相を濃縮した：２５．０ｇ。溶離勾配（ＡｃＯＥｔ／イソヘキサン，４：１、ついで純ＡｃＯＥｔ、ついでＡｃＯＥＴ／ＭｅＯＨ  １９：１から２：１）を用いてシリカゲル６０（４０×１０ｃｍ）を充填した分別クマトグラフィーによる収量（ＴＬＣ（シリカゲル、ＡｃＯＥＴ）：
１６．８ｇ    ２′，４′−ジベンゾエート  （２４％）    Ｒf  ０．５
１２．４ｇ    １                          （２３％）    Ｒf  ０．０
３５．４ｇ    ２                          （５１％）    Ｒf  ０．１４
Ｎ4−ベンゾイル−１−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝シトシン  ３：    ３９０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2および１８０ｍｌのピリジン（いずれも無水）中に３５．４ｇ（７８ｍｍｏｌ）の２を溶解し、０．９４ｇ（７．８ｍｍｏｌ；０．１当量）のＤＭＡＰ、３４．６ｍｌ（２０３ｍｍｏｌ；２．６当量）のＮ−エチルジイソプロピルアミンおよび３３．１ｇ（９８ｍｍｏｌ；１．２５当量）のＤＭＴＣｌを加えて、混合物をＲＴで２時間撹拌した。
ＴＬＣ（シリカゲル，ＡｃＯＥｔ）：Ｒf  ０．６。
３０℃でＣＨ2Ｃｌ2を留去し、残留物を６４０ｍｌのピリジン、９．３７ｇ（７８ｍｍｏｌ；１．０当量）のＤＭＡＰ、３２．５ｍｌ（２３４ｍｍｏｌ；３．０当量）のＥｔ3Ｎ、２１．７ｇ（１５６ｍｍｏｌ；２．０当量）のｐ−ニトロフェノールおよび９３．８ｇ（１．５６ｍｍｏｌ；２０当量）のｎ−プロパノールで処理して、６５℃で４２時間撹拌した。バッチを５０℃の高真空で濃縮し、それぞれ２５０ｍｌのトルエンで２回処理して濃縮した。残留物を１ｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、それぞれ５００ｍｌの稀ＮａＨＣＯ3溶液と撹拌することによって３回抽出して、有機相をＮａ2ＳＯ4を用いて乾燥して濃縮した：残留物  ９２．５ｇ。
溶離勾配（メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／イソヘキサン  ２：１から４：１、次いでメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／ＡｃＯＥｔ  １：４、次いでＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ  １：１から１：３）を用いシリカゲル６０（５０×１０ｃｍ）を充填剤としてクロマトグラフィーを行い、４４．７ｇの生成物含有画分を得、５４０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル  １：５から再結晶させた。結晶化物を３００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル  １：１から再び再結晶させた。
３：ＴＬＣ（シリカゲル，ＣＨＣｌ3／ｉ−ＰｒＯＨ  ４９：１）：Ｒf０．１４
下記のものが得られた：３０．０ｇのＮ4−ベンゾイル−１−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝シトシン  ３
すなわち２を基準にした収率は５１％。 1Ｈ−ＮＭＲが一致する。
【００８３】
実施例３
Ｎ6−ベンゾイル−９−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝アデニンの合成
まず２′−置換、ついで４′−置換、次いで移行反応：
【００８４】
【化１５】
0004674965.tif 000011
【００８５】
９−（β−Ｄ−リボピラノシル）アデニン  ２：
３００ｍｌのＮＨ3飽和ＭｅＯＨ中で６８．３７ｇ（１００ｍｍｏｌ）のＮ6−ベンゾイル−９−（２′，３′，４′−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）アデニン  １をＲＴで一夜間撹拌して、結晶化物を濾別した：２３．５ｇ（８８％）の２。
ＴＬＣ（シリカゲル，ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ  ２：１）：Ｒf  ０．２３。
1H-NMR (300 MHz, DMSO): 3.56-3.78 (m, 3H, H(4'), H(5')); 4.04 (m, 1H, H(3')); 4.23 (ddd, J = 2.5, 8, 9.5 Hz, H(2')), 4.89 (d, J = 6 Hz, 1H, OH), 5.07 (d, J = 7 Hz, 1H, OH), 5.12 (d, J = 4 Hz, 1H, OH), 5.63 (d, J = 9.5 Hz, 1H, H(1')), 7.22 (s, 2H, NH2), 8.14 (s, 1H, H(2)), 8.29 (s, 1H, H(8)).
13C-NMR (75 MHz, DMSO): 65.0 (t, C(5')); 66.6 (s, C(4')),
68.1 (s, C(3'), 71.1 (s, C(2')), 79.6 (s, C(1')); 118.6 (C(5)); 139.5 (s, C(8)), 149.9 (s, C(4)), 152.5(s, C(2)), 155.8 (s, C(6)).
Ｎ6，Ｎ6−ジベンゾイル−９−（β−Ｄ−リボピラノシル）アデニン  ３：
Ｎ2雰囲気中で１６．８ｇ（６２．９ｍｍｏｌ）の２を５００ｍｌの無水ピリジン中に懸濁させて−４〜−１０℃に冷却した。２０分間で４０ｍｌ（１９９ｍｍｏｌ；５当量）のトリメチルクロロシランを滴下して、混合物を冷却しながら２．５時間撹拌した。
【００８６】
７３ｍｌのピリジンに溶解した３６．５ｍｌ（１９９ｍｍｏｌ；５当量）のベンゾイルクロリドを−１０〜−１５℃において、２５分間で滴下し、冷却しながら１０分間及びＲＴで２時間撹拌した（ＴＬＣ検査（シリカゲル、ＡｃＯＥｔ／ヘプタン  １：１）：Ｒf  ０．５）。混合物を再び−１０℃に冷却し、１３６ｍｌのＨ2Ｏ（温度最高＋８℃）を注入して、混合物をＲＴで一夜間撹拌した。転化完了後、溶剤を留去し、残留物をそれぞれ２００ｍｌのトルエンに２回溶解して、再度蒸発させた。混合物をそれぞれ５００ｍｌのＥｔ2ＯおよびＨ2Ｏで処理して、機械的に２時間撹拌し両相中にごく僅か可溶の生成物を濾過し、Ｅｔ2ＯおよびＨ2Ｏで洗い、高真空下にＰ2Ｏ5で乾燥した：２３．８ｇ（８０％）の３。
ＴＬＣ（シリカゲル、ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ  ９：１）：Ｒf  ０．３５。
1H-NMR (300 MHz, DMSO): 3.60-3.80 (m, 3H, H(4'), H(5')); 4.06 (bs, 1H, H(3')); 4.30 (ddd, J = 2.5, 8, 9.5 Hz, H(2')), 4.93 (d, J = 6 Hz, 1H, OH), 5.20 (d, J = 4 Hz, 1H, OH), 5.25 (d, J = 4 Hz, 1H, OH), 5.77 (d, J = 9.5 Hz, 1H, H(1')), 7.47 (m, 4H, 芳香族H), 7.60 (m, 2H, 芳香族H), 7.78 (m, 4H, 芳香族H), 8.70 (s, 1H, H-C(2), 8.79 (s, 1H, H(8)).
13C-NMR (75 MHz, DMSO): 66.2 (t, C(5')); 66.5 (s, C(4')), 68.0 (s,C(3')), 71.0 (s, C(2')), 80.4 (s, C(1'));112.42 (C(5)); 126.9 (s, C(5')), 126.9, 128.9, 133.3,133.4 (芳香族. C), 146.0 (s, C(8)), 150.7 (s, C(4)),151.8 (s, C(2)), 153.3 (s, C(6)), 172.0 (s, C=O)).
Ｎ6，Ｎ6−ジベンゾイル−９−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）アデニン  ４：
Ｎ2雰囲気中で５５０ｍｌの無水ＣＨ2Ｃｌ2および５５ｍｌのピリジン（いずれの場合にもモレキュラーシーブ上に貯蔵する）中に２６．４ｇ（５５．５ｍｍｏｌ）の３を溶解して、０．７３ｇ（５．５５ｍｍｏｌ；０．１当量）のＤＭＡＰで処理して−８７〜−９０℃に冷却した。１４ｍｌのピリジン中の８．５８ｇ（６１ｍｍｏｌ；１．１当量）のＢｚＣｌを１時間で滴下して、混合物を６０時間（週末）−７８℃に放置した。バッチを濃縮し、それぞれ１００ｍｌのトルエンで２回処理し、ピリジンを除くために蒸発させた。溶離勾配（ＡｃＯＥｔ／ヘプタン、１：１から９：１）を用いシリカゲル６０（２０×１０ｃｍ）を充填剤とするクロマトグラフィーにより２３．２ｇの４を得た。
４：ＴＬＣ（シリカゲル、ＡｃＯＥｔ）：Ｒf  ０．３４。
Ｎ6−ベンゾイル−９−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝アデニン  ５：
２３．２ｇ（４０ｍｍｏｌ）の４を１６０ｍｌの無水ＣＨ2Ｃｌ2に溶解した後１４．９ｇ（５６ｍｍｏｌ；１．１当量）のＤＭＴＣｌおよび１７．７ｍｌ（１０４ｍｍｏｌ；２．６当量）のＮ−エチルジイソプロピルアミンで処理した。ＲＴで２時間撹拌後、さらに４．０ｇ（１１．８ｍｍｏｌ；０．３当量）のＤＭＴＣｌを加えて、混合物をさらに４０分間撹拌した。バッチをＲｏｔａｖａｐｏｒ中で３５０〜５２０ミリバ−ルおよび３５℃において濃縮した。
ＴＬＣ（シリカゲル、ＡｃＯＥｔ／ヘプタン  １：１）：Ｒf  ０．１８。
残留物を２６０ｍｌの無水ピリジンに溶解した後、５１ｍｌ（６７９ｍｍｏｌ；１７当量）のｎ−プロパノール、１６．６ｍｌ（１２０ｍｍｏｌ；３当量）のＥｔ3Ｎ、１１．１ｇ（８０ｍｍｏｌ；２当量）のｐ−ニトロフェノールおよび５．３ｇ（４４ｍｍｏｌ；１．１当量）のＤＭＡＰで処理して、６０〜６３℃で２３時間撹拌した。ついでバッチをＲＴで２１時間放置した。反応混合物をＲｏｔａｖａｐｏｒで濃縮した。残留物をそれぞれ２００ｍｌのトルエンで２回処理して濃縮し、ＣＨ2Ｃｌ2に溶解して水で３回抽出した。
溶離勾配（ＡｃＯＥｔ／ヘプタン、１：２から１：０；次いでＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ，１：０から９：１）を用い、シリカゲル６０を充填（３０×１０ｃｍ）してクロマトグラフィーを行い１３ｇの５を得た。
５：ＴＬＣ（シリカゲル、ＡｃＯＥｔ／ヘプタン  ４：１）：Ｒf  ０．２。
【００８７】
下記のものを得た：１３ｇのＮ6−ベンゾイル−９−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル−β−Ｄ−リボピラノシル｝アデニン  ５：
すなわち３を基準にして３０％の収率。1Ｈ−ＮＭＲが一致する。
公知の方法に比し時間節約：５０％。
【００８８】
実施例４
９−［３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−（（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル）−β−Ｄ−リボピラノシル］−２−Ｏ−アリル−２−Ｎ−イソブチロイルグアニンの合成
まず３′−置換、ついで４′−置換：
【００８９】
【化１６】
0004674965.tif 000012
【００９０】
９−［３′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル］−２−Ｏ−アリル−２−Ｎ−イソブチロイルグアニン  Ｂ
Ｇトリオール  Ａ（３９３ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を４ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解した。この溶液をトリメチルオルトベンゾエート（０．５２ｍｌ，３．０ｍｍｏｌ）およびショウノウスルホン酸（５８ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）で処理してＲＴで１５時間撹拌した。次いで混合物を０℃に冷却してアセトニトリル、水及びトリフルオロ酢酸（５０：５：１）の混合物（０℃に予冷した）２ｍｌで処理した。混合物を１０分間撹拌して溶剤を減圧除去した。残留物をジクロロメタン／メタノール  １００：３を用いシリカゲル（２．３×２１ｃｍ）を充填剤としてフラッシュクロマトグラフィーで精製した。２５ｍｇ（５％）の４−Ｏ−ベンゾイル化合物、１３９ｍｇ（２８％）の混合画分および２０５ｍｇ（４１％）の所望の３−Ｏ−ベンゾイル化合物  Ｂが得られた。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.12, 1.14 (2d, J = 7.0 Hz, 2 × 3 H, NHCOCHMe2), 2.78 (hep, J = 7 Hz, 1 H, NHCOCHMe2), 3.85 (dd, J = 6.0, 11.0 Hz, 1 H, H5'eq), 3.94 (app. T, J = 11.0 Hz, 1 H, H=5'ax), 4.12 (ddd, J = 2.5, 6.0, 11.0 Hz, 1 H, H-4'), 4.52 (dd, J = 3.5, 9.5 hz, 1 H, H-2'), 5.00 (dt, J = 1.5, 6.0 Hz, 2 H, All), 5.19 (dq, J = 1.5, 10.0 Hz, 1 H, All), 5.39 (dq, 1.5, 16.5 Hz, 1 H, All), 5.85 (bt, J = 3.0 Hz, 1 H, H3'), 5.97 (d, J = 9.5 Hz, 1 H, H-1'), 6.07 (ddd, J = 6.0, 10.0, 16.5 Hz, 1 H, All), 7.40-7.58 (m, 3 H, Bz), 8.10-8.16 (m, 2 H, Bz), 8.28 (s, 1 H, H-8).
９−［３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−（（４，４′−ジメチルオキシトリフェニル）メチル）−β−Ｄ−リボピラノシル］−２−Ｏ−アリル−２−Ｎ−イソブチロイルグアニン  Ｃ
ジオール  Ｂ（１０１ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）を３．２ｍｌの乾燥ジクロロメタン中に 懸濁させた。懸濁液を１７１μｌ（１．０ｍｍｏｌ）のＮ−エチルジイソプロピルアミン、３２０μｌ（３．９６ｍｍｏｌ）のピリジンおよび１０２ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）のＤＭＴＣｌで処理してＲＴで撹拌した。２４時間後、さらに１０２ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）のＤＭＴＣｌを加えて、混合物を再び２４時間撹拌した。ついでこれを３０ｍｌのジクロロメタンで希釈した。溶液を２０ｍｌの１０％濃度クエン酸水溶液および１０ｍｌの飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗い、ＭｇＳＯ4で乾燥して真空濃縮した。残留物をジクロロメタン／メタノール  １００：１を用いシリカゲルを充填して（２．３×２０ｃｍ）フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。３９ｍｇの公知で所望の生成物  Ｃ（２４％）が得られた。
【００９１】
実施例５
ｐ−ＲＮＡリンカー系の合成
アミノ末端基を有し、さらに官能性単位の結合に用いることができるリンカーを提供することができる３つの方法を下記に述べる。
５．１  ウラシル系リンカー
ウラシルの５位の変性に基づく。
【００９２】
ヒドロキシエチルウラシル  ２８は公知の方法によって大規模に調製することができる（Ｊ．Ｄ．Ｆｉｓｓｅｋｉｓ，Ａ．Ｍｙｌｅｓ，Ｇ．Ｂ．Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９６４，２９，２６７０）。ｇ−ブチロラクトン  ２５をギ酸メチルでホルミル化し、ナトリウム塩  ２６を反応させて尿素誘導体  ２７を得、これを環化してヒドロキシエチルウラシル  ２８を得た（系統図４）。
【００９３】
【化１７】
0004674965.tif 000013
【００９４】
【化１８】
0004674965.tif 000014
【００９５】
ヒドロキシエチルウラシル  ２８をメタンスルホニルクロリドのピリジン溶液でメシル化して２９を得た（Ｊ．Ｄ．Ｆｉｓｓｅｋｉｓ，Ｆ．Ｓｗｅｅｔ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７３，３８，２６４）。
【００９６】
下記の工程が新たに発明された。すなわち、アジドナトリウムのＤＭＦ溶液を用い、２９を反応させて、アジド  ３０を得、これをトリフェニルホスフィンのピリジン溶液で還元してアミノエチルウラシル  ３１を得た。３１中のアミノ官能基は最後にＮ−エトキシカルボニルフタルイミドで保護した（系統図５）。Ｎ−フタロイルアミノエチルウラシル  ３２によるリボーステトラベンゾエート  ３３のヌクレオシド化は良好な収率でリボーストリベンゾエート  ３４を得た。ピラノース環のアノマー中心はＨ−Ｃ（１′）とＨ−Ｃ（２′）の結合定数Ｊ＝９．５Ｈｚから明らかに分かるように、β配置を有する。次のＮａＯＭｅのＭｅＯＨ溶液によるベンゾエート保護基の除去によってリンカートリオール  ３５を得た。ＤＭＡＰの存在下、ピリジン／ジクロロメタン  １：１０中で−７８℃において３５をベンゾイルクロリドと反応させた。この方法では、所望の２′−ベンゾエート  ３６（６４％）以外に２′，４′−ジベンゾイル化生成物（２２％）が得られ、これを集めて３４の３５へのメタノリシスと同様に再びトリオール  ３５に転化させた。２′−ベンゾエート  ３６は、Ｈｕｅｎｉｇ塩基のジクロロメタン溶液の存在下で、ジメトキシトリチルクロリドを用いて９０％を上回る収率で４′位がトリチル化された。４′−ＤＭＴ−２′−ベンゾエート  ３７の４′−ＤＭＴ−３′−ベンゾエート  ３８への転位は、ｎ−プロパノール／ピリジン  ５：２中のＤＭＡＰ、ｐ−ニトロフェノールおよびＨｕｎｉｇ塩基の存在下で行われた。クロマトグラフィー後に３８が得られる。４′−ＤＭＴ−３′−ベンゾエート  ３８はＨｕｅｎｉｇ塩基の存在下で最後にＣｌＰ（ＯＡｌｌ）Ｎ（ｉＰｒ）2と反応させてホスホルアミダイト  ３９を得た（系統図６）。合成プロトコルを変えずにこれを自動オリゴヌクレオチド合成に用いることができる。
【００９７】
【化１９】
0004674965.tif 000015
【００９８】
方法：
ウラシル  リンカー単位の合成
５−（２−アジドエチル）ウラシル （３０）
【００９９】
【化２０】
0004674965.tif 000016
【０１００】
１．方法
内部温度計及び還流冷却器を備えた５００ｍｌ三つ口フラスコ内の２５０ｍｌのＤＭＦに２６．０ｇ（０．１１ｍｏｌ）の２９を溶解して、混合物を１０．８ｇ（０．１６６ｍｏｌ）のアジ化ナトリウムで処理した。懸濁液は次に６０℃で４時間撹拌した（ＴＬＣ検査、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ  ９：１）。ＤＭＦを留去して、残留物を１５０ｍｌの水と撹拌した。固形物を濾過し、約５０ｍｌの水で洗い、デシケーター内で一夜間真空にして五酸化リンで乾燥した。ｍ．ｐ．が２３０−２３５℃（分解を伴う）の無色の固体状の３０が１４．２ｇ（７１％）得られた。
【０１０１】
２．分析データ
５−（２−アジドエチル）ウラシル（３０）
ｍ．ｐ．    ２３０−２３５℃（分解を伴う）
TLC:CHCl3/MeOH 9:1, Rf 0.48
UV (MeOH):lmax 263.0 (7910).
IR (KBr):3209s, 3038s, 2139s, 1741s, 1671s,1452m, 1245m, 1210m
1H-NMR (300 MHz, d6-DMSO): 2.46 (t, 2H, J(CH2CH2N, CH2CH2N) =7.0, CH2CH2N); 3.40 (t, 2H, J(CH2CH2N,CH2CH2N) = 7.0 CH2CH2N); 7.36 (s, HC(6));11.00 (br. s, 2H, H-N(1), HN(3).
MS (ESI+):180.0 [M+H]..
５−（２−アミノエチル）ウラシル（３１）
【０１０２】
【化２１】
0004674965.tif 000017
【０１０３】
１．方法
内部温度計及び還流冷却器を備えた２５０ｍｌ三つ口フラスコ内の１７５ｍｌのピリジン中に１４．２ｇ（７８．０ｍｍｏｌ）の３０を懸濁させて、混合物を６１．４ｇ（２３４ｍｍｏｌ）のトリフェニルホスフィン2)で処理した。それを６０℃で５時間加熱して、室温で一夜間撹拌した（ＴＬＣ検査、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ  ５：１）。この懸濁液に２５％濃度のアンモニア溶液４０ｍｌを加えると透明になった。回転蒸発器で溶剤を真空除去した。残留物を２００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ  １：１中でＲＴにおいて３０分間撹拌して、沈殿を濾過してＣＨ2Ｃｌ2で洗った。デシケーター内で五酸化リン上で真空乾燥後、ｍ．ｐ．２１４−２２０℃の３１が１０．０ｇ（８５％）得られた。
【０１０４】
２．分析データ
５−（２−アミノエチル）ウラシル（３１）：
ｍ．ｐ．：２１４−２２０℃（ガスの発生、早期焼結を伴う）。
TLC:CHCl3/MeOH/HOAc/H2O 85:20:10:2, Rf 0.07
UV (MeOH):lmax 263.0 (6400).
IR (KBr):3430m, 3109s, 1628s, 1474m, 1394s, 1270s,1176w, 1103m, 1021m, 966m, 908m, 838m.
1H-NMR (300 MHz, d6-DMSO): 2.21 (t, 2H, J(CH2CH2N, CH2CH2N) =6.8, CH2CH2N); 2.59 (t, 2H, J(CH2CH2N,CH2CH2N) = 6.8 CH2CH2N); 5.90 (v. br. s, 4H,HN(1), HN(3), NH2); 7.19 (s, HC(6)).
MS (ESI-):153.9 [M-H].
５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル（３２）
【０１０５】
【化２２】
0004674965.tif 000018
【０１０６】
１．方法
２５０ｍｌ丸底フラスコ内の１００ｍｌの水中に９．６ｇ（６１．８ｍｍｏｌ）の３１を懸濁させて、６．６４ｇ（６２．６ｍｍｏｌ）のＮａ2ＣＯ3で処理した。ＲＴで１５分間撹拌後、１４．３ｇ（６５ｍｍｏｌ）のＮ−エトキシカルボニルフタルイミドを少量ずつ加えて、混合物をＲＴで３時間撹拌した（ＴＬＣ検査、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ  ５：１）。この新規の粘稠で白色の懸濁液を濃塩酸を用いて注意しながら1)ｐＨを４に調整して、白色沈殿を濾過した。水洗後、固形物を真空デシケーター内の五酸化リン上で乾燥した。これによりｍ．ｐ．３２４−３２７℃の３２が１６．０ｇ（９１％）得られた。
【０１０７】
２．分析データ
５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル（３２）：
Ｍ．ｐ．：３２４−３２７℃（分解を伴う）。
TLC:CHCl3/MeOH 5:1, Rf 0.51
UV (MeOH):lmax 263.0 (5825); l 298.0 (sh., 1380).
IR (KBr):3446m, 3216m, 1772m, 1721s, 1707s, 1670s, 1390m.
1H-NMR (300 MHz, d6-DMSO): 2.49 (t, 2H, J(CH2CH2N, CH2CH2N) = 6.0, CH2CH2N); 3.71 (t, 2H, J(CH2CH2N,CH2CH2N) = 6.0 CH2CH2N); 7.24 (s, HC(6));7.84 (mc, 4H, NPht); 10.76 (br, s, HN(1),HN(3)).
MS (ESI-):284.0 [M-H].
１−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル（３４）
【０１０８】
【化２３】
0004674965.tif 000019
【０１０９】
１．方法
アルゴン導入管、内部温度計及び隔壁を備えた２５０ｍｌ三つ口フラスコ内の１２０ｍｌのアセトニトリル中に７．００ｇ（２４ｍｍｏｌ）の３２および１３．６ｇ（２４ｍｍｏｌ）の３３を懸濁させた。まず１２．２ｇ（５０ｍｍｏｌ）のＢＳＡおよび３０分撹拌後にさらに７ｍｌ（２８ｍｍｏｌ）のＢＳＡをシリンジで加えた。しばらく４０℃に加熱後、反応混合物は透明になった。室温でシリンジを用いて１３ｍｌ（７２ｍｍｏｌ）のＴＭＳＯＴｆを加えた。１時間後には、生成物の生成がまだ認められなかった（ＴＬＣ検査、ＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘプタン  １：１）。それゆえさらに１３ｍｌ（７２ｍｍｏｌ）のＴＭＳＯＴｆを加えた。次いで反応混合物を５０℃に加熱した。５０℃で２．５時間撹拌後（ＴＬＣ検査）、混合物をＲＴに冷却して、［脱落］２５０ｍｌのＡｃＯＥｔおよび１９０ｍｌのＮａＨＣＯ3飽和溶液の氷冷混合物上に、１０分間撹拌して強力に抽出した。それを再び１００ｍｌのＮａＨＣＯ3溶液で洗い、水相を再び１００ｍｌのＡｃＯＥｔで抽出した。希薄有機相をＭｇＳＯ4を用いて乾燥し、回転蒸発器で溶剤を真空除去した。油ポンプの真空で乾燥後、２０．９ｇの粗製物を得た。シリカゲルを充填したクロマトグラフィー（ｈ＝２５ｃｍ、φ＝５ｃｍ、ＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘプタン  １：１）によって，ＴＬＣが同一の発泡生成物を得、それをＥｔ2Ｏを用いて分解させた。油ポンプの真空における濾過及び乾燥によって１５ｇ（８６％）の３４が得られた。
【０１１０】
２．分析データ
１−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル（３４）：
Ｍ．ｐ．：１２４℃（焼結）
ＴＬＣ：ＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘプタン１：１，Ｒf  ０．０９。
UV (MeOH):lmax 263.0 (11085): l 299.0 (sh., 1530)
IR (KBr):3238w, 3067w, 1772m, 1710s, 1452m, 1395m,1266s, 1110s, 1070m, 1026m.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 2.79 (mc, 2H, CH2CH2N); 3.96 (mc, 2H,CH2CH2N); 4.06 (dd, J(Heq-C(5'), HaxC(5')) =11.0, J(Heq-C(5'), HC(4')) = 6.0, Heq-C(5')); 4.12 (t, J(Hax-C(5'), HeqC(5')) = J(Hax-C(5'), H-C(4')) = 11.0, HaxC(5'));5.39 (dd, J(H-C(2'), H-C(1')) = 9.5,J(H-C(2'), H-C(3')) = 2.9 H-C(2')); 5.46(ddd, J(H-C(4'), Hax-C(5')) = 11.0, J(HC(4'), HeqC(5')) = 6.0, J(H-C(4'), H-C(3')) = 2.9, H-C(4')); 6.26 (y, J ≫ 2.6,H-C(3')); 6.36 (d, J(H-C(1'), H-C(2')) =9.5, H-C(1')); 7.24-7.40, 7.44-7.56,7.61-7.66, 7.72-7.80, 7.84-7.90,8.06-8.13 (6m, 16H, 3 Ph, H-C(6)); 7.70,7.82 (2 mc, 4H, NPht); 8.37 (s, HN(3)).
13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 21.19 (CH2CH2N); 36.33 (CH2CH2N);64.07 (C(5')); 66.81, 68.22 (C(4'),C(2')); 69.29 (C(3')); 78.59 (C(1'));112.42 (C(5)); 123.31, 132.05, 133.89 (6C,Pht); 128.33,128.47, 128.47, 128.83,128,86, 129.31, 129.83, 129.83,129.94,133.55, 133.62, 133.69 (18C, 3 Ph); 135.87(C(6));150.39, 162.78 (C(4)); 164.64,165.01, 165.41 (3C,O2CPh); 168.43 (2C,CO-Pht).
MS (ESI+):730.2 [M+H].
分析値：
Ｃ40Ｈ31Ｎ3Ｏ11（７２９．７０）：計算値：Ｃ  ６５．８４，Ｈ  ４．２８，Ｎ  ５．７６；実測値：Ｃ  ６５．６３，Ｈ  ４．４６，Ｎ  ５．５３．
５−（２−フタルイミドエチル）−１−（β−Ｄ−リボピラノシル）ウラシル（３５）
【０１１１】
【化２４】
0004674965.tif 000020
【０１１２】
１．方法
１ｌ丸底フラスコ内の５００ｍｌのＭｅＯＨ中に１５ｇ（２０ｍｍｏｌ）の３４を溶解し、３２４ｍｇ（６ｍｍｏｌ）のＮａＯＭｅで処理して、水を排除しながらＲＴで一夜間撹拌した（ＴＬＣ検査，ＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘプタン  １：１）。得られた懸濁液にｐＨが＜７になるまでＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ−１２０を加えた。熱を加えて固形物を溶解し、イオン交換器から熱濾過して、ＭｅＯＨで洗った。溶剤除去後、残留物をそれぞれ１５０ｍｌの水を用いて２回共沸させた。これで９ｇの粗製物を得、これを９０ｍｌのＭｅＯＨ中で１０分間環流下で加熱した。室温に冷却後、混合物を６０ｍｌのＥｔ2Ｏで処理して一夜間４℃に貯蔵した。濾過し、Ｅｔ2Ｏで洗いそして油ポンプの真空で乾燥して７．８ｇ（９３％）の３５を得た。
【０１１３】
２．分析データ
５−（２−フタルイミドエチル）−１−（β−Ｄ−リボピラノシル）ウラシル（３５）：
Ｍ．ｐ．：１３７℃（焼結）
TLC:CHCl3/MeOH 5:1, Rf 0.21.
UV (MeOH):lmax 263.0 (8575): l 299.0 (sh., 1545).
IR (KBr):3458s, 1772w, 1706s, 1400m, 1364m, 1304m, 1045m.
1H-NMR (300 MHz, d6-DMSO + 2 Tr. D2O: 2.55 (mc, 2H, CH2CH2N); 3.28-3.61 (m, 4H, HC(2'), H-C(4'), Heq-C(5'), HaxC(5')); 3.73 (mc, 2H, CH2CH2N); 3.93 (m, HC(3')); 5.50 (d, J(HC(1'), HC(2')) = 9.3, HC(1')); 7.41 (s, HC(6)); 7.84 (s, 4H, NPht).
13C-NMR (75 MHz, d6-DMSO): 25.63 (CH2CH2N); 36.62 (CH2CH2N); 64.95 (C(5')); 66.29 (C(4')); 67.37 (C(2')); 71.12 (C(3')); 79.34 (C(1'));110.39 (C(5)); 122.85, 131.54, 134.08 (6C,Pht); 137.92 (C(6)); 150.84 (C(2)); 163.18 (C(4)); 167.74 (2C, CO-Pht).
MS (ESI-):416.1 [M-H].
１−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル
加熱してアルゴンフラッシュした１ｌ四つ口フラスコ内の２０ｍｌのピリジン中に１０．６ｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）の５−（２−フタルイミドエチル）−１−（β−Ｄ−リボピラノシル）ウラシルを溶解して、２００ｍｌのジクロロメタンと混合した。混合物を−７０℃に冷却し、冷却しながら５ｍｌのピリジンおよび２０ｍｌのジクロロメタン中の３．８２ｍｌ（０．０３３ｍｍｏｌ）のベンゾイルクロリドを徐々に滴下して、混合物を−７０℃で３５分間撹拌した。反応混合物を６００ｍｌの冷塩化アンモニウム溶液に注入して、水相を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を水洗し、乾燥し、真空で濃縮乾燥した。シリカゲルを充填したクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン  １：１）により７．９ｇ（６０％）の１−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシルを得た。
ＴＬＣ：Ｒf  ０．２４（酢酸エチル／ヘプタン  ４：１）
1H-NMR (300 Mhz, d6-DMSO): 2.67 (mc, 2H, CH2CH2N); 3.66-3.98 (m, 5H, HC(4'), Heq-C(5'), HaxC(5'), CH2CH2N); 4.51 (t, 1H, HC(3')); 4.98 (dd, 1H, HC(2')); 6.12 (d, 1H, HC(1')); 7.19 (s, 1H, HC(6)); 7.29-7.92 (m, 9H, OBz, NPht).
１−（２−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル
５．６ｇ（１０．７３ｍｍｏｌ）の１−（２−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシルを６０ｍｌのジクロロメタンに溶解して、４．７２ｇ（１３．９５ｍｍｏｌ）の４，４′−ジメトキシトリチルクロリドおよび２．４ｍｌ（１３．９５ｍｍｏｌ）のＮ−エチルジイソプロピルアミンで処理してＲＴで２０分間撹拌した。反応混合物を１００ｍｌのジクロロメタンで希釈し、重炭酸ナトリウム溶液および２０％クエン酸溶液で洗い、乾燥し、さらに真空で濃縮乾燥した。シリカゲルを充填材とするクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン  １：１＋２％トリエチルアミン）により７．７ｇ（８７％）の１−（２−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシルを得た。
ＴＬＣ：Ｒf  ０．５３（酢酸エチル／ヘプタン  １：１＋２％トリエチルアミン）。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 2.64 (mc, 2H, CH2CH2N); 3.12 (mc, 1H, HC(4')); 3.59-3.63 and 3.72-3.92 (m, 5H, HC(3'), Heq-C(5'), HaxC(5'), CH2CH2N); 3.81 and 3.82 (s, 6H, CH3O); 4.70 (dd, 1H, HC(2')); 6.09 (d, 1H, HC(1')), 7.05 (s, 1H, HC(6)); 6.84-7.90 (m, 22H, ODmt, OBz, NPht).
１−（３−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル
３ｇ（３．６３ｍｍｏｌ）の１−（２−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル、１ｇ（７．２６ｍｍｏｌ）の４−ニトロフェノール、０．４４ｇ（３．６３ｍｍｏｌ）の４−（ジメチルアミノ）ピリジンおよび３．７５ｍｌ（２１．７８ｍｍｏｌ）のＮ−エチルジイソプロピルアミンを、５．６ｍｌのイソプロパノールおよび２５ｍｌのピリジンに溶解し、６５℃に加熱して、６５℃で３日間撹拌した。溶液を真空で濃縮乾燥して残留物を１５０ｍｌのジクロロメタンに溶解した。２０％クエン酸溶液および重炭酸ナトリウム溶液で洗った後、溶液を硫酸マグネシウムで乾燥した。シリカゲルを充填したクロマトグラフィー（酢酸エチル／ジクロロメタン／イソヘキサン  ２：１：１）により２．２７ｇ（７６％）の１−（３−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシルを得た。
ＴＬＣ：Ｒf  ０．２７（酢酸エチル／イソヘキサン  ２：１＋１％トリエチルアミン）。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 2.39 (mc, 2H, CH2CH2N); 2.53 (mc, 1H, Heq-C(5')); 3.30 (dd, 1H, HC(2')); 3.55 (mc, 1H, HaxC(5')); 3.69 (mc, 2H, CH2CH2N); 3.78 and 3.79 (s, 6H, CH3O); 3.79-3.87 (m, 1H, HC(4')); 5.74 (d, 1H, HC(1')); 5.77 (mc, 1H, HC(3')); 6.92 (s, 1H, HC(6)); 6.74-8.20 (m, 22H, ODmt, OBz, NPht).
１−｛２′−Ｏ−［（アリルオキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル
８８ｍｇ（０．１１ｍｍｏｌ）の１−（３−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシルを５ｍｌのジクロロメタンに溶解し、７５μｌ（０．４４ｍｍｏｌ）のＮ−エチルジイソプロピルアミンおよび７０μｌ（０．３ｍｍｏｌ）のアリルオキシクロロ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンで処理して、ＲＴで３時間撹拌した。反応を完結させるためにさらに３５μｌ（０．１５ｍｍｏｌ）のアリルオキシクロロ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンを加えた後、ＲＴでさらに１時間撹拌し、そして反応混合物を真空濃縮した。シリカゲルを充填したクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン：溶離勾配１：２から１：１から２：１、いずれの場合も２％トリエチルアミンを加える）により８５ｍｇ（７６％）の１−｛２′−Ｏ−［（アリルオキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシルを得た。
ＴＬＣ：Ｒf  ０．３６（酢酸エチル／ヘプタン  ２：１）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ）：選択特性位置：２．２８，２．５２（２  ｄｄ，Ｊ＝５．０，１１．０  Ｈｚ，２  Ｈ，２  Ｈ−５′），３．７９，３．７８（ａｐｐ．２  ｓ，１２  Ｈ，ＯＭｅ），６．１４（１  ｂｓ，１  Ｈ，Ｈ−３′）．
31Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：１４９．８，１５０．６
５．２  インドール系リンカー
前記のように無水フタル酸とトリプタミンからＮ−フタロイルトリプタミンが得られる（Ｋｕｅｈｎｅら  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４３，１３，１９７８，２７３３−２７３５）。これをボラン−ＴＨＦで還元してインドリンが得られる（Ａ．Ｇｉａｎｎｉｓら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９８９，１０１，２２０に類似）。
【０１１４】
３−置換インドリンはまずリボースと反応させてヌクレオシドトリオールを得、さらに無水酢酸と反応させてトリアセテートを得る。混合物を２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノパラキノンで酸化させ、アセテートをナトリウムメトキシドで分解して、２′位を選択的にベンゾイル化し、４′位を選択的にＤＭ−トリチル化し、そして移行反応を行って３′−ベンゾエートを得る。ホスホルアミダイトの生成は通常の方法で行う。合成プロトコルを変更せずにこれを自動オリゴヌクレオチド合成に用いることができる。
方法
３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）インドリン
【０１１５】
【化２５】
0004674965.tif 000021
【０１１６】
窒素雰囲気中で５１．４ｇ（１７７ｍｍｏｌ）のフタロイルトリプタミン  Ａを３５４ｍｌの１Ｍ  ボラン−ＴＨＦ溶液（２当量）に溶解して０℃に冷却した。０℃において３５４ｍｌのトリフルオロ酢酸を徐々に滴下（注意：ガスの発生）して、混合物を３０分間撹拌した（ＴＬＣ検査：ＥｔＯＡｃ）。次いで１７．３ｍｌの水を加えて混合物を１０分間撹拌し、真空濃縮した。残留物を１０％濃度ＮａＯＨ溶液／ジクロロメタンに溶解し、有機相を分離してＮａＳＯ4で乾燥し、濾過して真空濃縮した。残留物［５０．９ｇ］を熱エタノール（３ｌ）から再結晶させた。４１．４ｇのＢが得られた。ｍ．ｐ．１６１−１６２℃。母液を真空濃縮して残留物を再びエタノールから再結晶させた。さらに３．２ｇのＢが得られた。
ｍ．ｐ．１５８−１５９℃。
総収量：４４．６ｇ（１５３ｍｍｏｌ）のＢ。すなわち８６％。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.85-2.00, 2.14-2.28 (2 m, 2 x 1 H, CH2CH2NPhth), 2.70 (bs, 1 H, NH), 3.24-3.38, 3.66-3.86 (2 m, 5 H, CH2CH2NPhth, H-2a, H-2b, H-3), 6.62 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-7), 6.66-6.72 (m, 1 H, H-5), 6.99 (app t, J = 7.5 Hz, 1 H, H-6), 7.14 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-4), 7.64-7.74, 7.78-7.86 (2 m, 2 x 2 H, Phth).
13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): 32.70, 36.10 (2 t, C-2, CH2CH2NPhth), 39.62 (d, C-3), 53.04 (t, CH2NPhth), 109.65 (d, C-7), 118.74 (d, C-5), 123.25 (d, Phth), 123.92, 127.72 (2 d, C-4, C-6), 131.81 (s, C-3a), 132.14 (s, Phth), 133.99 (d, Phth), 151.26 (s, C-7a), 168.38 (s, C=O).
計算値: C: 73.96, H: 5.52, N: 9.58; 実測値: C: 73.89, H: 5.57, N: 9.55.MS (ES+): 293 (MH+, 100%)
３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）−１−（２′，３′，４′−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボピラノシル）インドール
【０１１７】
【化２６】
0004674965.tif 000022
【０１１８】
４５．２ｇ（１５５ｍｍｏｌ）のＡおよび２３．２ｇ（１５５ｍｍｏｌ；１．０当量）のＤ−リボースを７５０ｍｌの乾燥エタノール中に懸濁させて窒素雰囲気中で４時間還流下で加熱した（ＴＬＣ検査：ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ  １０：１）。ＲＴに冷却後、混合物を真空濃縮した。残留物を３００ｍｌのピリジンに溶解して、氷冷しながら１５５ｍｌの無水酢酸で処理した。１５分後、氷浴を除き混合物をＲＴで１８時間撹拌した（ＴＬＣ検査：ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン  １：１）。この溶液を真空濃縮して、それぞれ３００ｍｌのトルエンで３回共沸させた。得られた油を９００ｍｌのジクロロメタンに溶解して氷冷しながら３８．８ｇ（１７１ｍｍｏｌ；１．１当量）の２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノパラキノンで処理した。１５分後、氷浴を除き、混合物をＲＴで１．５時間撹拌した（ＴＬＣ検査：ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン  １：１）。沈殿を吸引濾過し、ジクロロメタンで洗って廃棄した。濾液を６００ｍｌのＮａＨＣＯ3飽和溶液で洗った。この間に沈殿した沈殿を再び吸引濾過し、ジクロロメタンで洗って廃棄した。有機抽出物を合わせてＮａ2ＳＯ4で乾燥して真空濃縮した。残留物（９０．９ｇ）をシリカゲルを充填したフラッシュクロマトグラフィー（１０×２５ｃｍ；ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン  ２：３）により精製した。
下記が得られた：２１．５ｇの純粋なＢおよび４６．８３ｇの混合画分（これを新たにクロマトグラフィーによりさらに２０．４ｇの純粋なＢを得た）。
総収量：４１．９ｇ（７６ｍｍｏｌ）のＢ．すなわち４９％。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.64, 1.98, 2.19 (3 s, 3 x 3 H, Ac), 3.06 (t, J = 8.0 Hz, 2 H, CH2CH2NPhth), 3.81-4.00 (m, 4 H, H-5'ax, H-5'eq, CH2NPhth), 5.13 (ddd, J = 2.5, 6.0, 10.5 Hz, 1 H, H-4'), 5.36(dd, J = 3.5, 9.5 Hz, 1 H, H-2'), 5.71(d, J = 9.5 Hz, 1 H, H-1'), 5.74(app t, J = 3.0 Hz, 1 H, H-3'), 7.02(s, 1 H, H-2), 7.04-7.10, 7.13-7.19 (2 m, 2 x 1 H, H-5, H-6), 7.33 (d, J = 8.0Hz, 1 H, H-7), 7.58-7.66, 7.72-7.80(2 m, 5 H, Phth, H-4).
13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): 20.23, 20.65, 20.87 (3 q, Ac), 24.41, 38.28 (2 t, CH2CH2), 63.53 (t, C-5'), 66.24, 68.00, 68.64 (3 d, C-2', C-3', C-4'), 80.33 (d, C-1'), 109.79 (d, C-7), 113.95 (s, C-3), 119.33, 120.39, 122.04, 122.47 (4 d, C-4, C-5, C-6, C-7), 123.18 (d, Phth), 128.70, 132.17 (2 s, C-3a, Phth), 133.87 (d, Phth), 136.78 (s, C-7a), 168.243, 168.77, 169.44, 169.87 (4 s, C=O).
計算値：Ｃ：６３．５０，Ｈ：５．１５，Ｎ：５．１１；実測値：Ｃ：６３．４８，Ｈ：５．１６，Ｎ：５．０５。
ＭＳ（ＥＳ+）：５６６（Ｍ＋ＮＨ4+，８２％），５４９（ＭＨ+，７４％），１１４（１００％）。
３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）−１−β−Ｄ−リボ−ピラノシル−インドール
【０１１９】
【化２７】
0004674965.tif 000023
【０１２０】
窒素雰囲気中で４４．１ｇ（８０ｍｍｏｌ）のＡを４００ｍｌの無水メタノールに溶解した。混合物を氷冷しながら４．０ｍｌの３０％濃度ナトリウムメトキシド溶液で処理した後、ＲＴで１８時間撹拌した。沈殿を吸引濾過して冷エタノールで洗った。濾液を真空濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解した。この溶液をＮａＨＣＯ3飽和溶液で洗い、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥して真空濃縮した。得られた残留物を、反応溶液から沈殿した沈殿ととも熱エタノールから再結晶させた。２２．６ｇのＢが得られた。ｍ．ｐ．１９６〜１９８℃。母液を真空濃縮して、残留物を再びエタノールから再結晶させた。さらに９．２ｇのＢが得られた。ｍ．ｐ．１８８〜１９４℃。
総収量：２５．８ｇのＢ。すなわち７６％。
1H=NMR (MeOD, 300 MHz): 3.09 (app. t, J = 7.0 Hz, 2 H, CH2CH2NPhth), 3.64-3.98 (m, 5 H, H-4', H-5'ax, H-5'eq, CH2NPhth), 4.05 (dd, J = 3.5, 9.5 Hz, 1 H, H-2'), 4.22 (app t, J = 3.0 Hz, 1 H, H-3'), 5.65 (d, J = 9.5 Hz, 1 H, H-1'), 6.95-7.05, 7.09-7.16 (2 m, 2 x 1 H, H-5, H-6), 7.25 (s, 1 H, H-2), 7.44 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-7), 7.60 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-4), 7.74-7.84 (m, 4 H, Phth).
13C-NMR (d6-DMSO, 75 MHz): 23.87, 37.79 (2 t, CH2CH2NPhth), 64.82 (t, C-5'), 66.74 (d, C-4'), 68.41 (d, C-2'), 71.42 (d, C-3'), 81.37 (d, C-1'), 110.42 (d, C-7), 111.05 (s, C-3), 118.17, 119.21, 121.36, 122.92, 123.80 (5 d, C-2, C-4, C-5, C-6, NPhth), 127.86, 131.59 (2 s, C-3a, Phth), 134.27 (d, Phth), 136.62 (s, C-7a), 167.72 (s, C=O).
MS(ES-): 457 (M+OH-+H2O, 49%), 439 (M+OH-, 100%), 421 (M-H+, 28%)
１−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）インドール
【０１２１】
【化２８】
0004674965.tif 000024
【０１２２】
窒素雰囲気中で１０．６ｇ（２５ｍｍｏｌ）のＡを２５０ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解した。混合物を３０５ｍｇのＤＭＡＰ（２．５ｍｍｏｌ）および２０ｍｌのピリジンで処理した。すべてが溶解状態になるまでこれを加熱した後−７８℃に冷却した。ここで８ｍｌのジクロロメタンに溶解した３．３５ｍｌのベンゾイルクロリド（２８．８ｍｍｏｌ）を１５分間で滴下した。さらに３０分後のＴＬＣ検査（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  ３：１）は反応の完了を示した。４５分後に該冷溶液を、折った濾紙を通して２００ｍｌのＮＨ4Ｃｌ飽和溶液に直接加え、濾紙残留物をジクロロメタンで洗った。有機相を一度水で洗い、ＭｇＳＯ4で乾燥して濃縮した。残留物をトルエンと２回共沸させ、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン３：１を用いシリカゲルを充填した（１０×２０ｃｍ）フラッシュクロマトグラフィーにより８．１ｇのＢ（６４％）を得た。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 2.45, 2.70 (2 bs, 2 x 1 H, OH), 3.04 (t, J = 8.0 Hz, 2 H, CH2CH2NPhth), 3.80-4.20 (m, 5 H, H-4', H-5'ax, H-5'eq, CH2NPhth), 4.63 (bs, 1 H, H-3'), 5.46 (dd, J = 3.5, 9.5 Hz, 1 H, H-2'), 6.03 (d, J = 9.5 Hz, 1 H, H-1'), 7.08-7.31 (m, 5 H, H-2, H-5, H-6, Bz-m-H), 7.41-7.48 (m, 1 H, H-Bz-p-H), 7.50 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-7), 7.64-7.79 (m, 7 H, Phth, H-4, Bz-o-H).
13C-NMR (d6-DMSO, 75 MHz): 24.40, 38.22 (2 t, CH2CH2NPhth), 65.95 (t, C-5'), 66.65 (d, C-4'), 69.55 (d, C-3'), 71.87 (d, C-2'), 79.57 (d, C-1'), 109.96 (d, C-7), 113.70 (s, C-3), 119.21, 120.21, 122.11, 122.41, 123.14, (5 d, C-2, C-4, C-5, C-6, NPhth), 128.28 (d, Bz), 128.58, 128.59, (2 s, C-3a, Bz), 129.62 (d, Phth), 132.05 (s, Phth), 133.81 (Bz), 136.97 (s, C-7a), 165.12, 168.29 (2 s, C=O).
MS(ES-): 525 (M-H+, 12%), 421 (M-PhCO+, 23%), 107 (100%).
１−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル−β−Ｄ−リボピラノシル｝−３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）インドール
【０１２３】
【化２９】
0004674965.tif 000025
【０１２４】
窒素雰囲気中で８．９ｇ（１６．９ｍｍｏｌ）のＡを１３５ｍｌの乾燥ジクロロメタン中に懸濁させた。混合物を２０６ｍｇのＤＭＡＰ（１．６８ｍｍｏｌ）、５．８ｍｌのＮ−エチルジイソプロピルアミン（３３．７ｍｍｏｌ）および約１２ｍｌのピリジンで処理した（溶解が完了するまで）。ここで３４ｇのモレキュラーシーブ４Åで処理して３０分撹拌した。０℃に冷却後、１１．４ｇのＤＭＴＣｌ（３３．７ｍｍｏｌ）で処理して冷却浴を除いた後７５分撹拌した。ついでさらに１．９４ｇ（０．３４当量）、及びさらに４０分後に１．１４ｇ（０．２当量）、およびさらに６５分後に１．１４ｇ（０．２当量）のＤＭＴＣｌを加えた。反応は４．２５時間後に完了した。次いで混合物を２５．３ｍｌのｎ−プロパノール（２０当量）で処理して、さらに３０分撹拌した後注意しながら濃縮した（泡発生）。残留物を１００ｍｌのピリジンに溶解した。それを１．８５ｇのＤＭＡＰ（１５．１ｍｍｏｌ；０．９当量）、１３．０５ｍｌのＮ−エチルジイソプロピルアミン（１０１ｍｍｏｌ；６．０当量）、７１ｍｌのｎ−プロパノール（９４０ｍｍｏｌ；５６当量）および３．７４ｇのｐ−ニトロフェノール（２６．９ｍｍｏｌ；１．６当量）で処理した。この混合物を窒素雰囲気中、７５〜８０℃で９６時間撹拌した。ＲＴに冷却後、混合物をセライトに通して濾過して濃縮した。残留物をトルエン／ジエチルエーテル／トリエチルアミン９０：１０：１を用いてシリカゲルを充填（９×１７ｃｍ）したフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。まず生成物含有画分（９．２５ｇ）をＥｔＯＡｃから再結晶させた後、トルエン／メタノールから再沈殿させた。５．８６ｇのＢ（４２％）が得られた。
1H-NMR (CDCl3, 300MHz): 2.64 (bs, 1 H, OH), 2.68 (dd, J = 5.0, 11.5 Hz, 1 H, H-5'eq), 2.94 (dd, J = 7.5, 16.0 Hz, 1 H, CH2CH2NPhth), 3.03 (dd, J = 8.0, 16.0 Hz, 1 H, CH2CH2NPhth), 3.67-3.74 (m, 1 H, H-5'ax), 3.69, 3.70 (2 s, 2 x 3 H, OMe), 3.85 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH2CH2NPhth), 3.94 (ddd, J = 3.0, 5.0, 10.5 Hz, 1 H, H-4'), 4.03 (dd, J = 3.5, 9.0 Hz, 1 H, H-2'), 5.51 (d, J = 9.0 Hz, 1 H, H-1'), 5.86 (bs, 1 H, H-3'), 6.68-7.66 (m, 25 H), 8.19-8.30 (m, 2 H).
13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): 24.16, 38.80 (2 t, CH2CH2NPhth), 55.25, 55.26 (2 q, Ome), 65.58 (t, C-5'), 68.29, 69.19, 73.83 (3 d, C-2', C-3', C-4'), 83.03 (d, C-1'), 87.31 (CAr3)110.03 (d, C-7), 113.37, 113.47 (2 d), 113.53 (s, C-3), 118.95, 120.20, 122.28, 122.31, 123.10, 127.07, 128.02, 128.08, 128.68 (9 d), 128.74 (s), 130.02, 130.19, 130.22 (3 d), 130.37, 131.95 (2 s), 133.40, 133.83 (2 d), 135.98, 136.14, 136.56, 145.12, 158.82, 166.76, 168.52 (7 s, C-7a, 2 COMe, 2 C=O).
１−｛２′Ｏ−（アリルオキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ）−３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝−３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）インドール  （２  ジアステレオオマー）
【０１２５】
【化３０】
0004674965.tif 000026
【０１２６】
１６５８ｍｇのアルコールＡ（２．０ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気中で１０ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解した。この溶液を１．０３ｍｌのＮ−エチルジイソプロピルアミン（６．０ｍｍｏｌ）および０．６３ｍｌのモノアリルｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（２．８ｍｍｏｌ）で処理しでＲＴで１時間撹拌した。つぎに６μｌ（０．８ｍｍｏｌ）のイソプロパノールを加えて、過剰のホスホリル化試薬を破壊した。１０分後、混合物を真空濃縮して残留物を、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ／ＮＥｔ3（７５：２５：１）を用いて、シリカゲルを充填（３．３×２１ｃｍ）したフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物含有画分を濃縮し、ＣＣｌ4に溶解して再び濃縮して２．０４ｇのほとんど無色の発泡体（定量的）を得、これはオリゴマー化に直接用いることができ、かつ数週間−２０℃に保つことができる。
ＴＬＣ：シリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン／ＮＥｔ3  ３３：６６：１）：０．４１
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００  ＭＨｚ）：選択特性位置：２．４２，２．５３，（２  ｄｄ，Ｊ＝５．０，１１．０  Ｈｚ，２  Ｈ，２  Ｈ−５′ｅｑ），３．７６，３．７７，３．７８，３．７９，（４  ｓ，４×３  Ｈ，ＯＭｅ），５．７０，５．７３（２  ｄ，Ｊ＝９．０  Ｈｚ，２  Ｈ，２  Ｈ−１′），６．１６，６．２９（２  ｂｓ，２  Ｈ，２  Ｈ−３′）．
31Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：１５０．６，１５１．０
５．３  リシン系リンカー
この合成を系統図７に示し、そして下記に詳細にのべる。
【０１２７】
【化３１】
0004674965.tif 000027
【０１２８】
文献から公知のようにＬ−リシンからジアゾ化及び続く加水分解によって６−アミノ−２（Ｓ）−ヒドロキシヘキサン酸（Ｉ）を調製した（Ｋ．−Ｉ．Ａｋｅｔａ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９７６，２４，６２１）。
２−（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−６−アミノ−１，２−ヘキサンジオール（２）
アルゴン雰囲気中で３．４ｇのＬｉＢＨ4（１５６ｍｍｏｌ；４当量）を１００ｍｌの無水ＴＨＦに溶解する（発熱！）。約３０℃に冷却後、３９．６ｍｌのＴＭＳＣｌ（３１２ｍｍｏｌ；８当量）を徐々に滴下すると（ガス発生！）、沈殿が生じる。アルゴン向流中に５．７４ｇの６−アミノ−２（Ｓ）−ヒドロキシヘキサン酸（１）（３９ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えて、ＴＬＣ（シリカゲル；ｉ−ＰｒＯＨ／濃ＮａＯＨ／水  ７：２：１；ニンヒドリンで着色）がもはや出発物質を認めなくなるまで（約３時間）、混合物を６５℃に加熱する。混合物は氷冷しながら注意して１２０ｍｌのメタノールで処理する（強いガス発生！）。溶剤を真空濃縮して、残留物をそれぞれ２００ｍｌのメタノールと３回共沸させた後１００ｍｌの無水ＤＭＦに溶解する。１６ｍｌのエチルジイソプロピルアミン（９３．３ｍｍｏｌ，２．４当量）の添加後、混合物を０℃に冷却して、１２．１ｇのＦｍｏｃＣｌ（４６．８ｍｍｏｌ，１．２当量）で少量ずつ処理する。１５分後、冷却浴を除き、出発物質が消費されるまで（約３時間；ＴＬＣ検査：シリカゲル；ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／ＨＯＡｃ／水  ６０：３０：３：５）、混合物をＲＴで撹拌する。反応溶液を６００ｍｌのＮａＨＣＯ3飽和溶液に加える。沈殿を濾過し、２００ｍｌの水で洗い、恒量になるまで（約６時間）高真空下５０℃で乾燥する。１３．９ｇの無色の固体が得られ、これを酢酸エチル（４０ｍｌ）／ｎ−ヘキサン（３５ｍｌ）から再結晶させる。収量：９．０５ｇ（６５％）。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 7.68, 7.51 (2 d, J = 8.0 Hz, 各場合2 H, Ar-H), 7.32 (t, J = 8.0 Hz, 2 H, Ar-H), 7.23 (dt, J = 1.6, 8.0 Hz, 2 H, Ar-H), 4.92 (bs, 1 H. NH), 4.32 (d, J = 7.0 Hz, 2 H, OCOCH2), 4.13 (bt, J = 7.0 Hz, OCOCH2CH), 3.64-3.58 (m, 1 H, H-1, H-1', H-2, H-6, H-6'), 3.54 (dd, J = 3.2, 11.0 Hz, 1 H, H-1, H-1', H-2, H-6, H-6'), 3.35 (dd, J = 7.4, 11.0 Hz, 1 H, H-1, H-1', H-2, H-6, H-6'), 3.16-3.06 (m, 2 H, H-1, H-1', H-2, H-6, H-6'), 3.0-2.0 (bs, 2 H, OH), 1.52-1.18 (m, 6 H, H-3, H-3', H-4, H-4', H-5, H-5').
２−（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｏ1−ＤＭＴ−６−アミノ−１，２−ヘキサンジオール（３）をＷＯ  ８９／０２４３９に従ってＤＭ−トリチル化した。
２−（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｏ1−ＤＭＴ−Ｏ2−アリルオキシジイソプロピルアミノホスフィニル−６−アミノ−１，２−ヘキサンジオール（４）
アルゴン雰囲気中で０．５１ｍｌのエチルジイソプロピルアミン（３．０ｍｍｏｌ，３当量）および０．３３ｍｌのクロロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノアリルオキシホスフィン（１．５ｍｍｏｌ，１．５当量）を、６７０ｍｇの該アルコール（３）（１．０２ｍｍｏｌ）の１０ｍｌ無水ジクロロメタン溶液に加える。混合物をＲＴで２時間撹拌し、溶剤を真空除去して、得た残留物を、シリカゲルを充填（３．２×１６ｃｍ）するフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン／ＮＥｔ3  ２０：８０：１）により精製する。８３９ｍｇ（９７％）のやや黄色味の油が得られる。
ＴＬＣ：シリカゲル；ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン／ＮＥｔ3  ５０：５０：１；ＵＶ；Ｒf＝０．７７．
1H=NMR (300 MHz, CDCl3): 7.70-6.68 (m, 21 H, Ar-H), 4.92-4.62 (m, 1 H. NH), 4.31 (d, J = 7.0 Hz, 2 H, OCOCH2), 4.13 (t, J = 7.0 Hz, 1 H, OCOCH2CH), 3.98-3.40 (m, 5 H), 3.77 (2 s, 各場合3 H, OMe), 3.16-2.86 (m, 4 H), 2.58 (t, J = 7.0 Hz, 1 H, CHCN), 2.38 (t, 1 H, CHCN), 1.80-1.20 (m, 6 H), 1.20, 1.18, 1.17, 1.16, 1.15, 1.13, 1.08, 1.06 (8 s, 12 H, NMe).
31P-NMR (300 MHz, CDCl3): 149.5, 149.0 (2 s)
実施例６
カップリング試薬としてベンズイミダゾリウムトリフレートを用いる配列４′−インドールリンカー−Ａ８−２′のｐ−ＲＮＡオリゴの合成
１０８ｍｇのインドールリンカー  ホスホルアミダイトおよび２４４ｍｇのＡ  ホスホルアミダイトを合成機バイアル中に秤取して、Ａ単位を充填した２８．１ｍｇのＣＰＧ支持体を充填したカラムとともにデシケーター内でＫＯＨの上に高真空で３時間置く。該ホスホルアミダイトは１ｍｌ（インドール  リンカーの場合）または２．５ｍｌ（Ａ  ホスホルアミダイトの場合）のアセトニトリルに溶解し、数粒のモレキュラーシーブを加えてデシケーター内でＫＯＨの上に密封して置く。
【０１２９】
激しく撹拌しながら２００ｍｇのヨウ素を５００ｍｌのアセトニトリルに溶解する。すべてが溶解し終わった後（視覚管理）、２３ｍｌの水および４．６ｍｌのｓｙｍ−コリジンを加えて、溶液を一旦十分に混合する。脱トリチル化には６％濃度ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液を使用する。キャッピング試薬（無水酢酸＋塩基）はオリゴヌクレオチド合成の場合に通例のように購入して使用する。
【０１３０】
ベンズイミダゾリウムトリフレートは熱アセトニトリルから再結晶させて、乾燥する。ほとんど無色の結晶を用い、カップリング試薬として０．１Ｍ無水アセトニトリル溶液を調製する。合成中、この溶液は常に透明を保ち、合成機のチュービングの閉塞を生じない。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｅｃｏｓｙｎ  ３００＋（ＤＭＴ−１）中の変性ＤＮＡのカップリングサイクル：
脱トリチル化          ７分
カップリング          １時間
キャッピング          １．５分
酸化                  １分
２０ｍｇのテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウムを１．５ｍｌのジクロロメタンに溶解して、２０ｍｇの重炭酸ジエチルアンモニウム、２０ｍｇのトリフェニルホスフィン及びオリゴヌクレオチドを有するガラス支持体を加えて密封し（Ｐａｒａｆｉｌｍ）、バイアルをＲＴで５時間振とうする。ついで分析用吸引濾過器を用いてガラス支持体を吸引濾過して、ジクロロメタン、アセトンおよび水で洗う。
【０１３１】
０．１ｍｏｌジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム水溶液を用いて支持体を懸濁させてＲＴに置く。それを吸引濾過して水、アセトン、エタノール及びジクロロメタンで洗う。支持体を１．５ｍｌの２４％濃度ヒドラジン水和物溶液中に懸濁させ、４℃で２４−３６時間振とうして、０．１ｍｏｌ重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＢ緩衝液）で７ｍｌに希釈する。これをＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ  カートリッジを用いてヒドラジンが無くなるまで洗った。これを５ｍｌの８０％濃度ギ酸溶液で処理して、３０分後濃縮乾燥させる。残留物を１０ｍｌの水に溶解して、ジクロロメタンで抽出し、水相を濃縮した後、ＨＰＬクロマトグラフィー（ｔＲ＝３３分，０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液中のアセトニトリルの勾配）によって精製する。通例の脱塩（Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ）でオリゴヌクレオチドを生成する。
収量：１７．６  ＯＤ
ＥＳＩ質量分光分析によって物質の同定が実証された：
Ｍ（計算値）＝３０８２  Ｄ，（Ｍ＋２Ｈ）2+（実測値）＝１５４１．９  Ｄ。
【０１３２】
実施例７
接合体の調製
１．連続法
実施例２に記載したように、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｅｃｏｓｙｎ  Ｄ３００＋によりまず配列Ａ８（すなわちオクタマー）のｐ−ＲＭＡオリゴマーを調製し、そして下記試薬を取り替える：すなわち２％濃度トリクロロ酢酸を６％濃度ジクロロ酢酸に替え、ヨウ素のピリジン溶液をヨウ素のコリジン溶液に替え、テトラゾール溶液をベンズイミダゾリウムトリフレート溶液に替える。合成プロトコルの変更後、さらに公知の方法（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ  １９８４）によって配列ＧＡＴＴＣのＤＮＡオリゴマーを合成する。ｐ−ＲＮＡオリゴマーについて述べたように（前記参照）、脱アリル化、ヒドラジン分解、ＨＰＬクロマトグラフィー及び脱塩を行い所望の接合体を得る。
２．収束法
実施例２に述べたように、配列４′−インドールリンカー−Ａ8−２′を有するｐ−ＲＮＡオリゴマーを調製し、精製し、そしてヨードアセチル化する。公知の方法（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ  １９８４）により配列ＧＡＴＴＣ−チオール  リンカーのＤＮＡオリゴマーを合成して、精製する（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈからの３′−チオールリンカー：Ｎ０．２０−２９３３）。２つの断片を緩衝液中に放置すると（Ｔ．Ｚｈｕら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ，Ｃｈｅｍ．１９９４，５，３１２）接合が得られ、最後にそれをＨＰＬＣによって精製する。
【０１３３】
実施例８
ビオチン基のアミノ変性ｐ−ＲＮＡへの接合：
最初に、実施例６に記載した方法と同様に、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（２−（２−（４−モノメトキシトリチル）アミノエトキシ）エチル−２−シアノエチル（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト）の５′−アミノ修飾因子５により４′−末端にアミノ基が付与される配列ＴＡＧＧＣＡＡＴのｐ−ＲＮＡオリゴマーを合成して精製する。オリゴヌクレオチド（１７．４  ＯＤ，０．１７５μｍｏｌ）を０．５ｍｌの塩基性緩衝液に溶解し、１．１４ｍｇ（２．５μｍｏｌ）のビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを１１４μｌのＤＭＦ（無水）に溶解して、溶液をＲＴに１時間放置した。得られた接合体を分取ＨＰＬＣによって精製し、精製物をＳｅｐａｋを用いて脱塩した。
収量：８．６  ＯＤ（４９％）
Ｍ（計算値）＝３０８０  Ｄ，Ｍ（実測値）＝３０８０．４  Ｄ。
【０１３４】
実施例９
シアニンまたはビオチン−標識化ｐ−ＲＮＡオンラインの調製
公知の方法によってまず種々のＡ，Ｔ，Ｇ，ＣおよびＩｎｄ（Ｉｎｄ＝核酸塩基としてのアミノエチルインドール）ホスホルアミダイトを調製した。シアニン（Ｃｙ３−ＣＥ）及びビオチンホスホルアミダイトはＧｌｅｎ  Ｒｓｅａｒｃｈから得た。
【０１３５】
それぞれ１５μｍｏｌを用いて完全自動固相合成を行った。１つの合成サイクルは下記工程からなる。
（ａ）脱トリチル化：６％ＤＣＡ（ジクロロ酢酸）のＣＨ2Ｃｌ2（７９ｍｌ）溶液で５分間；
（ｂ）ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ），アセトニトリル（２０ｍｌ）による洗浄についでアルゴンによるフラッシュ；
（ｃ）カップリング：賦活剤（０．５ｍピリジン塩酸塩のＣＨ2Ｃｌ2溶液、０．２ｍｌ）による樹脂の洗浄；比率１：１の賦活剤（０．７６ｍｌ）および対応するホスホルアミダイト（０．７６ｍｌ；８当量；０．１Ｍアセトニトリル溶液）による処理；
（ｄ）キャッピング：Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ（キャップＡ：ＴＨＦ，ルチジン，無水酢酸；キャップＢ：１−メチルイミダゾール，ＴＨＦ，ピリジン）から５０％キャップＡ（１０．５ｍｌ）およびキャップＢ（１０．５ｍｌ）により２分；（ｅ）酸化：１２０ｍｌのヨウ素溶液（アセトニトリル１００ｍｌ，水４６ｍｌおよびｓｙｍ−コリジン９．２ｍｌ中にヨウ素４００ｍｇ）により１分；
（ｆ）アセトニトリル（２２ｍｌ）による洗浄。
【０１３６】
オリゴヌクレオチドの次のＨＰＬＣ精製を容易にするために最後のＤＭＴ（ジメトキシトリチル）またはＭＭＴ（モノメトキシトリチル）保護基はビオチンまたはシアニンモノマーから除去しなかった。  変性ホスホルアラミダイツによる最後のカップリングの検知は、ＵＶ（５０３ｎｍ）中のトリチルカチオンの吸収によって１％の樹脂を用いる合成後に行った。
オリゴヌクレオチドの精製：
ＲＴ５時間後に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（２７２ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（２７２ｍｇ）および重炭酸ジエチルアンモニウムのＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍｌ）溶液を用いてアリルエーテル保護基を除いた。次にガラス支持体をＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍｌ）、アセトン（３０ｍｌ）および水（３０ｍｌ）で洗った。パラジウム錯体残留物を除くために、樹脂を０．１Ｍジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム水和物水溶液でリンスした。前記洗浄操作は再度逆順で行った。次に樹脂を１０分間高真空で乾燥した。ガラス支持体からの同時脱ベンゾイル化を伴う除去工程は４℃において２４％ヒドラジン水和物溶液（６ｍｌ）中で行った。ＲＰ１８のＨＰＬＣ検査（１８−２５時間）後、オリゴヌクレオチド「トリチル  ＯＮ」は活性化された（アセトニトリル、２０ｍｌ）Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジによってヒドラジンから遊離された。ヒドラジンをＴＥＡＢ  ０．１Ｍ（３０ｍｌ）で洗った。次いでオリゴヌクレオチドをアセトニトリル／ＴＥＡＢ，０．１Ｍ（１０ｍｌ）で溶離させた。次に混合物をＨＰＬＣによって精製（断片配列の分離のため）して、ＤＭＴの脱保護（３０ｍｌの８０％濃度ギ酸水溶液）を行った。最終の脱塩（ＴＥＡＢ緩衝液０．１Ｍ／アセトニトリル：１／１を用いるＳｅｐ−Ｐａｋによる）により純粋なシアニン−またはビオチン−標識化オリゴマーを得た。
【０１３７】
このオリゴ溶液の一部を用いてＥＳＩ−ＭＳを行った。
４′Ｃｙ−ＡＩｎｄＴＴＣＣＴＡ  ２′：計算値  Ｍ＝３０２６，
実測値  （Ｍ＋Ｈ）+＝３０２７．
４′  ビオチン−ＴＡＧＧＡＡＩｎｄＴ  ２′：計算値  Ｍ＝３０１４，
実測値（Ｍ＋２Ｈ）2+  ｍ／ｅ１５０８および（Ｍ＋Ｈ）+  ｍ／ｅ３０１５．オリゴは凍結乾燥して貯蔵した。
【０１３８】
実施例１０
Ｎ−（ヨードアセチルオキシ）スクシンイミドによるｐ−ＲＮＡのヨードアセチル化
ｐ−ＲＮＡ配列：４′ＡＧＧＣＡＩｎｄＴ  ２′  Ｍw＝２２６６．５６ ｇ／ｍｏｌ  （Ｉｎｄ＝インドール−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2−リンカー）
１当量のｐ−ＲＮＡを０．１ｍｏｌ重炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．４）に溶解（３５０ｍｍｏｌ当たり１ｍｌ）して、Ｎ−（ヨードアセチルオキシ）スクシンイミドのＤＭＳＯ溶液で処理（１ｍｇ当たり４０μｌ）した。バッチはアルミニウムフィルムで暗くして、３０−９０分間ＲＴに放置した。
【０１３９】
反応の進行は分析用ＨＰＬＣによってモニターした。標準条件は：
緩衝液Ａ：水中の０．１ｍｏｌ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液
緩衝液Ｂ：水：アセトニトリル  １：４中の０．１ｍｏｌ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液
勾配：１０％Ｂから出発して４０分間で５０％Ｂ
カラム物質：Ｍｅｒｃｋ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ  ＧｍｂＨ製１０μＭ  ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標）１００  ＲＰ−１８；２５０×４ｍｍ
出発物質の保持時間：１８．４分
この場合の生成物の保持時間：２３．１分
反応完了後、バッチを水で４倍の容量に希釈した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−ＰａｋカートリッジＲＰ−１８（充填の１５  ＯＤ  ２ｇから）を２×１０ｍｌのアセトニトリルおよび２×１０ｍｌの水で賦活して、オリゴを適用して浸漬させ、そして塩及び試薬を除くために反応容器を２×１０ｍｌの水で洗い、さらに３×１０ｍｌの水で再び洗い、そしてまず５×１ｍｌの５０：１の水：アセトニトリル、つぎに１：１の水：アセトニトリルで溶離させた。該１：１の画分で溶離された生成物は純度が極めてよかった。該画分を冷所および暗所で濃縮して、合わせて再び濃縮した。
【０１４０】
収量は２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収分光法により求めた。
質量分光分析：
配列：４′ＡＧＧＣＡＩｎｄ（ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ2−Ｉ）Ｔ  ２′計算値の質量：２４３４．５０ｇ／ｍｏｌ
実測値の質量ＭＨ22+：１２１７．９ｇ／ｍｏｌ＝２４３３ｇ／ｍｏｌ。
【０１４１】
実施例１１
配列ＣＹＳＫＶＧのペプチドへのｐ−ＲＮＡの接合
ヨードアセチル化ｐ−ＲＮＡ（Ｍｗ＝２４３４．５０ｇ／ｍｏｌ）を緩衝系（１１４ｎｍｏｌ当たり１０００μｌ）に溶解した後ペプチドの緩衝液溶液（２ｍｏｌのＣＹＳＫＶＧペプチド；Ｍｗ＝６５５．７７３ｇ／ｍｏｌ；緩衝液２０μｌ中に２２８ｎｍｏｌ）で処理した。
緩衝系：ホウ砂／ＨＣｌ緩衝液（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ製，ｐＨ８．０）を１０ｍｍｏｌのＥＤＴＡ二ナトリウム塩水溶液と１：１の比率で混合し、ＨＣｌを用いてｐＨを６．３に調節した。この方法によって５ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡを含有する溶液を得た。
【０１４２】
転化が完了するまでバッチをＲＴで暗所に放置した。反応はＨＰＬＣ分析によってモニターした。
【０１４３】
標準条件は：
緩衝系Ａ：水中の０．１ｍｏｌ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液
緩衝系Ｂ：水：アセトニトリル１：４中の０．１ｍｏｌ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液
勾配：１０％Ｂから出発して１０分間で５０％Ｂ
カラム物質：Ｍｅｒｃｋ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ  ＧｍｂＨ製１０μＭ  ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標）１００  ＲＰ−１８；２５０×４
出発物質の保持時間：１７．６分
生成物の保持時間：１５．５分
反応完了後、バッチは直接ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
（標準条件は前記と同様）。
【０１４４】
該画分は冷所および暗所で濃縮し、合わせて再び濃縮した。残留物は水に溶解して脱塩した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ  ＲＰ−１８（充填の１５  Ｄ  ２ｇから）を２×１０ｍｌのアセトニトリルおよび２×１０ｍｌの水で賦活し、オリゴを適用して浸漬させ、そして塩を除くために反応容器を２×１０ｍｌの水で洗い、再度３×１０ｍｌの水で洗い、そして水：アセトニトリル１：１で溶離させた。生成物の画分を濃縮し、合わせて再び濃縮した。
【０１４５】
収量は２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収分光分析で求めた。収量は理論値の７０−９５％に達した。
質量分光分析：
配列：４′ＡＧＧＣＡＩｎｄ（ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ2−ＣＹＳＫＶＧ）Ｔ  ２′
計算値の質量：２９６２．３６ｇ／ｍｏｌ
実測値の質量ＭＨ22+：１４８２．０ｇ／ｍｏｌ＝２９６２ｇ／ｍｏｌ。
【０１４６】
実施例１２
ペプチド  ライブラリ−へのｐ−ＲＮＡの接合
ヨードアセチル化ｐ−ＲＮＡ（Ｍｗ＝２４３４．５０ｇ／ｍｏｌ）を緩衝系に溶解（８３２ｎｍｏｌ当たり１３００μｌ）後、緩衝系（８ｍｏｌ；平均分子量Ｍｍ＝６７７．８２ｇ／ｍｏｌ；緩衝系２００μｌ中４．５ｍｇ＝６．６６μｍｏｌ）中でペプチド  ライブラリ−溶液（ＣＫＲ−ＸＸ−ＯＨ；Ｘ＝Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ）で処理した。
緩衝系：ホウ砂／ＨＣｌ緩衝液（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ製，ｐＨ８．０）を１０ｍｍｏｌのＥＤＴＡ二ナトリウム塩水溶液と１：１の比率で混合し、ＨＣｌを用いてｐＨを６．６に調節した。この方法によって５ｎＭのＮａ2ＥＤＴＡを含有する溶液が得られた。
【０１４７】
転化が完了するまで、バッチはＲＴで暗所に放置した。反応はＨＰＬＣ分析によってモニターした。この場合には出発物質が７０時間後に消失した。
【０１４８】
分析用ＨＰＬＣの標準条件は：
緩衝系Ａ：水中の０．１ｍｏｌ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液
緩衝系Ｂ：水：アセトニトリル１：４中の０．１ｍｏｌ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液
勾配：１０％Ｂから出発して４０分間で５０％Ｂ
カラム物質：Ｍｅｒｃｋ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ  ＧｍｂＨ製１０μＭのＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標）１００  ＲＰ−１８；２５０×４
出発物質の保持時間：１８．８分
生成物の保持時間：１３．９分〜３６．２分の間に数個のピーク
反応完了後、水を用いてバッチを４倍の容積に希釈した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ  ＲＰ−１８（充填の１５  ＯＤ  ２ｇから）を３×１０ｍｌのアセトニトリルおよび３×１０ｍｌの水で賦活して、オリゴを適用して浸漬させ、そして塩および過剰のペプチドを除くために、反応容器を２×１０ｍｌの水で再洗いし、カートリッジを３×１０ｍｌの水で再洗いし、そしてＵＶ分光分析によって生成物が溶離しなくなるまで、１：１の水：アセトニトリルで溶離させた。画分は冷所および暗所で濃縮し、合わせて再び濃縮した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、天然に存在する形のＲＮＡ（左側）とｐ−ＮＡの形のＲＮＡ（右側）の構造の一部を示す。
【図２】  図２は、Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒら（１９９３年）によるｐ−リボ−（Ａ，Ｕ）−オリゴヌクレオチドの合成法を図示する。
【図３】  図３は、固体担体上の固定化認識構造の配列（アレイ）を図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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