(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）充填床を提供する疎水性ポリマー粒子及び第一溶媒をカラムに詰め；（ｂ）イオン荷電架橋ポリマー粒子プローブ及び第二溶媒を含む大分子プローブ混合物を充填床に導入し；（ｃ）１以上の極性有機溶媒及び水から選択されたものである第三の溶媒を充填床に通過させて充填床からイオン荷電架橋ポリマー粒子プローブを溶離させ、；及び（ｄ）イオン荷電架橋ポリマー粒子プローブについての溶離容積を測定することを含む、疎水性ポリマー粒子の充填床におけるクロマトグラフィーメディアパラメーターを測定する方法であって、クロマトグラフィーメディアパラメーターが、イオン荷電架橋ポリマー粒子プローブについての溶離容積に対応する排除容積である、方法。
【請求項２】
（ｉ）小分子プローブ及び第二溶媒を含む小分子プローブ混合物を充填床に導入し；（ｉｉ）充填床に第三溶媒を通過させ充填床から小分子プローブを溶離させ；（ｉｉｉ）小分子プローブの溶離容積を測定し；及び（ｉｖ）小分子プローブについての溶離容積からイオン荷電架橋ポリマー粒子プローブの溶離容積を差し引いて疎水性ポリマー粒子の細孔容積を測定することをさらに含み、クロマトグラフィーメディアパラメーターが細孔容積である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
疎水性ポリマー粒子が、１以上の有機コポリマー及び疎水性的に変性された無機ポリマーから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第一溶媒が、１以上の非極性有機溶媒、極性有機溶媒及び水から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第二溶媒が、１以上の非極性有機溶媒、極性有機溶媒及び水から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第三溶媒が、混合された水性‐有機溶媒の総重量を基準にして２から９９％の極性有機溶媒を含む混合された水性‐有機溶媒である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
イオン荷電架橋ポリマー粒子プローブが、０．０５から１ミクロンの粒径を有する、１以上のアニオン荷電エマルションション型ポリマー粒子、カチオン荷電エマルション型ポリマー粒子、アニオン荷電粉砕ポリマー粒子及びカチオン荷電粉砕ポリマー粒子から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
イオン荷電架橋ポリマー粒子プローブが、架橋ポリスチレンスルホネートである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
小分子プローブが、１以上の無機塩及び低分子量有機化合物から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
無機塩が、１以上の塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム及び塩化カルシウムから選択される請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、充填床における疎水性ポリマー粒子の排除容積及び細孔容積等のクロマトグラフィーメディアパラメーターを測定する改善された方法に関する。排除容積は、メディア及び高圧逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＣ）における固定相として使用される疎水性ポリマー基体（有機又は無機ポリマー）の性能特性を測定するに有用である。多孔度、圧縮率及び透過率（流れ抵抗）等のクロマトグラフィーメディアの特性は、生体分子の分離精製に求められるような高速クロマトグラフィー分取モードに使用されるポリマーを選定するのに重要である。
【０００２】
充填床におけるクロマトグラフィーメディアの排除容積を測定する現在の方法は、線状ポリスチレン又はポリエチレングリコール等の慣用の大分子「プローブ」又は「マーカー」物質の使用を包含するものである。これらのプローブ化合物は、クロマトグラフィー操作における（テトラヒドロフラン及びトルエン等の）非極性移動相の使用を必要とする；しかしながら非極性溶媒の使用は、しばしば毒性、可燃性及び（水性系との）非相溶性等の問題を提起する。サイズ排除クロマトグラフィーにおける疎水性ポリマー支持体の性能評価（空隙容積測定を含む）の検討は、Ｅ．ミーハンによるサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）カラムハンドブックの「ポリマー実験室でのサイズ排除クロマトグラフィー」３４９〜３６６ページ、アカデミックプレス（１９９９）でなされている。
【０００３】
本発明で解決しようとする課題は、非極性溶媒の使用を必要とせず、水性ベース溶媒系、例えば、２０％水性エタノール等の水‐アルコール混合物において使用されることのできる、クロマトグラフィーメディアパラメーターの改善された測定方法を提供することである。
【０００４】
本発明は、（ａ）充填床を提供する疎水性ポリマー粒子及び第一溶媒をカラムに詰め；（ｂ）イオン荷電架橋ポリマー粒子プローブ（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｉｏｎｉｃａｌｌｙ−ｃｈａｒｇｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｐｒｏｂｅ）及び第二溶媒を含む大分子プローブ混合物を充填床に導入し；（ｃ）１以上の極性有機溶媒及び水から選択されたものである第三の溶媒を充填床に通過させて充填床からイオン荷電架橋ポリマー粒子を溶離させ、；及び（ｄ）イオン荷電架橋ポリマー粒子プローブについての溶離容積を測定することを含む、疎水性ポリマー粒子の充填床におけるクロマトグラフィーメディアパラメーターを測定する方法であって、クロマトグラフィーメディアパラメーターが、イオン荷電架橋ポリマー粒子プローブについての溶離容積に対応する排除容積（ｅｘｃｌｕｄｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ）である、方法を提供する。
【０００５】
好ましい態様においては、上記方法のイオン荷電架橋ポリマー粒子プローブは、０．０５から１ミクロンの粒径を有する、１以上のアニオン荷電エマルション型ポリマー粒子、カチオン荷電エマルション型ポリマー粒子、アニオン荷電粉砕ポリマー粒子及びカチオン荷電粉砕ポリマー粒子から選択される。
【０００６】
別の態様においては、上記の方法は、更に（ｉ）小分子プローブ及び第二溶媒を含む小分子プローブ混合物を充填床に導入し；（ｉｉ）充填床に第三溶媒を通過させ充填床から小分子プローブを溶離させ；（ｉｉｉ）小分子プローブの溶離容積を測定し；及び（ｉｖ）小分子プローブについての溶離容積からイオン荷電架橋ポリマー粒子プローブの溶離容積を差し引いて疎水性ポリマー粒子の細孔容積を測定することをさらに含み、クロマトグラフィーメディアパラメーターが細孔容積である、を含むものである。
【０００７】
粒子間空隙容積（「排除容積」）及び他のクロマトグラフィーメディアの性能パラメーターの測定において、我々は、イオン荷電架橋ポリマー粒子をベースとした大分子プローブ（又はマーカー）の使用が、環境的に優しい極性有機溶媒及び水性ベース溶媒系を使用した迅速なそして効率的な測定を可能にすることを見出した。従来のプローブ物質に代わり上記の大分子プローブ粒子の使用は、（１）ポリマーマトリックスが評価されることに参入することから完全に排除され；（２）クロマトグラフィープロセスの過程で極性溶媒の使用を許し；及び（３）充填されたクロマトグラフィーカラムのポリマーマトリックスとプローブ物質との間の疎水性相互作用に寄与しないプローブ物質を提供する。
【０００８】
特に、イオン化可能な官能基（カルボキシレート、スルホネート又は第四級塩化アンモニウム等）を含有するエマルション型又は粉砕された架橋ポリスチレン粒子が、クロマトグラフィー用途における種々の疎水性固体メディア、特にマクロポーラスポリビニル芳香族ポリマーの評価における大分子プローブ物質として特に有用であることを我々は見出した。カルボキシレート及びスルフォネート官能基は、アニオン荷電プローブ粒子の代表であり、第四級アンモニウム官能基は、カチオン荷電プローブ粒子の代表的なものである。
【０００９】
この明細書を通して使用されるように、次の用語は明示的に断らない限り、指示された意味を有するであろう。
【００１０】
全ての引用されるパーセンテージは、特に断らない限り、関与するポリマー又は組成物の総重量を基準にした重量パーセント（％）で表される。用語「（メタ）アクリレート」又は「（メタ）アクリル」は、相当する酸、エステル、アミド、置換エステル又は置換アミド等の相当するアクリレート又はメタクリレート誘導体のいずれかを意味する。用語「コポリマー」は、位置異性体を含む２以上の異なるモノマーの単位を含有するポリマー組成物を意味する。ここでは、次の略語が使用される：ｇ＝グラム；ｐｐｍ＝重量／容積による百万分率、ｃｍ＝センチメートル、ｃｃ＝立方センチメートル、ｍｍ＝ミリメートル、ｍｌ＝ミリリッター、μｍ＝ミクロン、ｍｉｎ＝分。特に断らない限り、掲げられた範囲は、両端の値を含み及び組み合わせ可能とし及び温度は摂氏度(℃)である。
【００１１】
ここで、使用されているように、クロマトグラフィーメディアパラメーターには、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー又は逆相クロマトグラフィーを使用した生体分子の分離精製等の特定の末端用途における適性について疎水性ポリマー基体を特徴づけるために典型的に使用される特性が含まれている。クロマトグラフィー実施者にとって興味のある典型的なクロマトグラフィーメディア性能パラメーターには、例えば、圧縮率、透過率（流れ抵抗）、ポリマー細孔容積％（ポリマー床の多孔度％）、細孔容積、粒子間空隙容積（隙間容積又は排除容積％）、ポリマー固形分％(容積)、ポリマー多孔度（細孔容積／ポリマー容積）が挙げられる。
【００１２】
一般に、ポリマー基体の種々のクロマトグラフィーメディアを測定するためには、移動相（ポリマーマトリックスを通して分子の輸送に使用される溶媒）は、プローブ分子の適合性に関しては、ポリマー粒子の疎水性表面とプローブ分子との相互作用を最小化し、好ましくは除去されるよう選択されなければならない、そうでなければ、クロマトグラフィー性能パラメーター測定は、不正確及び不精密になり得る。線状ポリスチレン及びポリエチレングリコール等の慣用の大分子プローブ物質は、粒子間空隙容積の測定に使用され得る；しかしながらこれらの種類のプローブ物質は、プローブ物質及びポリマー表面間の疎水性相互作用を最小化するために非極性移動相（テトラヒドロフラン、ジクロロメタン及びトルエン等）の使用を必要とする。しかしながら、本発明の方法に使用されるプローブ物質は、非極性溶媒の使用を要求せず、広い範囲の極性有機溶媒及び水性ベース溶媒系、例えば、水又は２０％水性エタノールを使用することができ、従って、プローブ分子及び固定相（ポリマーマトリックス）間の疎水性相互作用を除去することができる。
【００１３】
本発明の方法の実施において、小分子及び大分子プローブ物質は、疎水性ポリマー粒子を含有する充填クロマトグラフィーカラムに、クロマトグラフィーメディアパラメーターの測定に必要とされる溶離時間についての情報を得るのに都合の良い如何なる仕様でも導入されることができる。例えば、小分子及び大分子プローブ混合物は、（ａ）充填カラムに同一の流れとして（即ち、同時に）添加され、（ｂ）交互様式で（お互いが重複しているそれぞれのプローブ混合物を、異なる時間において開始し及び終了する添加）、（ｃ）大分子プローブ混合物を最初に、引き続き小分子プローブ混合物の添加を行う）、又は（ｄ）小分子プローブ混合物を最初に、引き続き大分子プローブ混合物の添加を行う等であってよい。もし、疎水性ポリマーマトリックスのキャラクタリゼーションが、排除容積だけについて望まれるのであれば、大分子混合物だけがカラムにロードされ、溶離される必要がある。クロマトグラフィー分離の当業者であれば、必要とされるデータを得るために添加順序及び流速の選択は、条件範囲に従い変更され得ることが理解するであろう。
【００１４】
本発明の方法に有用な大分子プローブ物質には、０．０５から１ミクロンの粒径を有する、１以上のアニオン荷電エマルション型ポリマー粒子、カチオン荷電エマルション型ポリマー粒子、アニオン荷電粉砕ポリマー粒子及びカチオン荷電粉砕ポリマー粒子から選択されるイオン荷電架橋ポリマー粒子プローブが含まれる。好ましくは、粒子は０．１から０．９、より好ましくは０．１から０．５、最も好ましくは０．１から０．２μｍの範囲の粒径を有する。好適なイオン荷電架橋ポリマー粒子には、例えば、弱酸官能基（カルボキシレート基）、強酸官能基（スルホネート）又は第四級アンモニウムハライド官能基等のイオン化可能な官能基を有する架橋ポリスチレンが含まれる。ポリスチレンは典型的にはポリビニル芳香族又は脂肪族架橋モノマーで架橋されたものである。好適なポリビニル芳香族架橋剤には、例えば、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルナフタレン、ジビニルアントラセン及びジビニルキシレンが含まれる；好ましくは、架橋モノマーは、ジビニルベンゼンである。好ましい脂肪族架橋モノマーには、例えば、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレートが含まれる。架橋モノマーは、エマルション型又は粉砕イオン荷電架橋ポリマーの総重量を基準にして典型的には１から８０％、好ましくは１から５０％、より好ましくは２から２５％の量で使用される。
【００１５】
イオン荷電架橋ポリマーは、種々の塩形で使用されることができる：アンモニウム、アルカリ（ナトリウム及びカリウム等）又はアルカリ土類（カルシウム、マグネシウム）金属塩；好ましいイオン荷電架橋ポリマーは、少なくとも５０％中和（塩形）、好ましくは少なくとも７５％中和である。任意に、イオン荷電架橋ポリマーは、スルホン酸のような強酸を基準にするならば、遊離酸形でも使用され得る。
【００１６】
典型的なアニオン荷電架橋ポリマープローブ物質には、例えば、カルボン酸ナトリウム、スルホン酸ナトリウム又はスルホン酸ナトリウム基を含有する架橋ポリスチレン；好ましくは、アニオン荷電ポリマープローブ物質は、架橋ポリスチレンスルフォネートである。追加のアニオン荷電架橋ポリマープローブ物質には、例えば、その種々の塩形（ナトリウム、カリウム又はアンモニウム塩）の架橋ポリ（メタ）アクリル酸が含まれる。追加のアニオン荷電架橋ポリマープローブ物質には、例えば、１以上の次のコモノマーがポリマー中に導入されているスチレン又は（メタ）アクリル酸のコポリマーがあげられる：２‐アクリルアミド‐２‐メチル‐１‐プロパンスルホン酸、２‐メタクリルアミド‐２‐メチル‐１‐プロパンスルホン酸、３‐メタクリルアミド‐２‐ヒドロキシプロパンスルホン酸、アリルスルホン酸、メタアリルスルホン酸、アリルオキシベンゼンスルホン酸、メタアリルオキシベンゼンスルホン酸、２‐ヒドロキシ‐３‐(２‐プロペニルオキシ)プロパンスルホン酸、２‐メチル‐２‐プロパン‐１‐スルホン酸、スチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸、３‐スルホプロピルアクリレート、３‐スルホプロピルメタクリレート、スルホメチルアクリルアミド及びスルホメチルメタクリルアミド。
【００１７】
典型的な、カチオン荷電架橋ポリマープローブ物質には、例えば、架橋ポリビニルベンジルクロライドのアンモニウム塩；ポリ（３‐アクリルアミド‐プロピル‐トリメチルアンモニウムクロライド）、ポリ（３‐メタクリルアミド‐プロピル‐トリメチルアンモニウムクロライド）等の架橋ポリ（ジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド）のアンモニウム塩；及びポリ（２‐（Ｎ，Ｎ，Ｎ‐トリメチルアンモニウムクロライド）‐エチルメタクリレート）等の（メタ）アクリレートエステルのアンモニウム塩が含まれる。「アンモニウム」塩の用語に関し、アミン誘導体の第四級塩（トリアルキルアンモニウム等）及び酸塩（ジアルキルアンモニウムハイドロクロライド等）の双方が使用されることができることを意味する。
【００１８】
本発明の方法に有用な好適な「小分子」プローブ物質には、水溶性無機塩（例えば、アンモニウム、アルカリ及びアルカリ土類金属のハロゲン化物、硝酸塩、硫酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩等）及び低分子量有機分子（Ｃ１〜Ｃ２有機酸及びその塩、Ｃ１〜Ｃ３アルコール、アセトン、トルエン及びベンゼン等）が含まれる；好適な低分子量有機分子には、典型的に約２００より下の分子量を有するものが含まれる。典型的には、小分子プローブ物質は、塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム及び塩化カルシウムの１以上から選択される無機塩である。
【００１９】
本発明のプロセスに使用される溶媒系は、溶媒の使用目的に応じて変化させることができる。例えば、疎水性粒子でカラムを充填するときは、（第一溶媒として示された）溶媒は、１以上の非極性有機溶媒、極性有機溶媒及び水の混合物（混合された水性‐有機溶媒と称す）をはじめとする極性有機溶媒及び水を含むことができる。典型的な非極性有機溶媒には、例えば、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼン及びトルエンが含まれる。好適な極性有機溶媒としては、例えば、Ｃ１〜Ｃ３アルコール（メタノール、エタノール、ｎ‐プロパノール及びイソプロパノール）、Ｃ１〜Ｃ２有機酸（蟻酸、酢酸）、（Ｃ３−Ｃ４）ケトン（アセトン、メチルエチルケトン）及びアセトニトリル等の水溶性又は水混和性であるものが挙げられる。好ましくは、極性有機溶媒は、メタノール、エタノール、ｎ‐プロパノール及びイソプロパノールの１以上から選ばれる。典型的な混合された水性‐有機溶媒には、例えば、水の２から９９％極性有機溶媒、好ましくは５から５０％、より好ましくは（Ｃ１−Ｃ３）アルコールのような極性有機溶媒の１０から３０％のものが含まれる。好ましくは、第一溶媒は、水性ベース溶媒、即ち、水又は水性‐有機溶媒である。
【００２０】
充填床に大分子又は小分子プローブ混合物を充填するとき、プローブ混合物を調合するのに使用される溶媒（第二溶媒と称する）には、第一溶媒として上記した如何なる溶媒系も含むことができる。好ましくは、第二溶媒は、水性ベース溶媒、即ち、水又は混合された水性‐有機溶媒である。
【００２１】
大分子又は小分子プローブを充填床から溶離させるとき、溶離に使用される溶媒（第三溶媒と称する）は、上記したように混合された水性‐有機溶媒をはじめとする、１以上の極性溶媒及び水を含む。好ましくは、第三溶媒は水性ベース溶媒であり、即ち、水又は混合された水性‐有機溶媒である。
【００２２】
典型的には、本発明のプロセスに使用される第一及び第二溶媒は、都合よくは第三溶媒と同一であるが；しかし、それぞれの溶媒系は、他とは独立に選択されることができる。
【００２３】
上記したように、好適な水性ベース溶媒には水溶液及び混合された水性‐有機溶媒系が含まれる。ある極性溶媒の存在が、クロマトグラフィーカラムの充填及び操作過程で疎水性ポリマー粒子の改善された湿潤性を提供するので、好ましくは、水性ベース溶媒は、混合された水性‐有機溶媒系である。
【００２４】
混合された水性‐有機溶媒混合物における極性有機溶媒の濃度は、クロマトグラフィーメディアのキャラクタリゼーションに使用される小分子プローブの種類に応じて変化することができる。例えば、低分子量有機分子が小分子プローブとして使用されるとき、７５〜１００％極性有機溶媒が、充填カラムから小分子プローブを溶離させるのに使用されることができる。無機塩が小分子プローブとして使用されるとき、典型的には、混合された水性‐有機溶媒の総重量に基づいて０から（即ち、１００％水）から７５％まで、好ましくは５から５０％、より好ましくは１０から３０％の極性有機溶媒が、小分子プローブを溶離させるのに使用される。
【００２５】
水性ベース溶媒系が水であるとき、即ち、有機溶媒を含まないか又は少ししか含んでないとき、溶媒系は、任意に、例えば、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、ホウ酸塩及び酢酸塩等の緩衝剤のような水溶性塩を含有することができる。使用時に、これらの塩は、典型的に水性ベース溶媒系において５０ｐｐｍから５％、好ましくは１０００ｐｐｍから１％の濃度で存在する。
【００２６】
クロマトグラフィーカラムの流出液中におけるプローブ物質の存在を検出するに有用な好適な検出方法は、例えば、ＵＶ分光法、赤外分光法、伝導率法及び屈折率法が含まれる。選択される特定の方法は、検出されるプローブ粒子の種類に左右されるであろうし、小分子又は大分子プローブを検知するに十分である如何なる検出法でもあってよい。無機塩プローブの検出については、伝導率法及び屈折率法が好ましい。イオン荷電架橋ポリマー粒子プローブの検出については、ＵＶ分光法、屈折率法又は伝導率法が好ましい。
【００２７】
重合体粒子で充填されたクロマトグラフィーカラムは、四種の異なる「容積」を有するものとして表すことができる。
【００２８】
固定相粒子（ポリマービーズ又はポリマーマトリックス）の粒子間の液体容積は、隙間容積、粒子間空隙容積、空隙容積又は排除容積（Ｖ０）として知られる。
固定相の細孔内の液体容積は細孔容積（Ｖｉ）である。
固定相の固形分の容積はポリマー骨格容積（Ｖｇ）である。
充填床の全容積（Ｖｔ）は上記容積の合計に相当する：Ｖｔ  ＝Ｖ０＋Ｖｉ＋Ｖｇ
【００２９】
全ての分子は、大きさに関わり無くＶ０へのアクセスを有し、いずれの分子もＶｇへのアクセスを持たない。Ｖｉへのアクセスは分子の大きさ及びポリマーマトリックス中の細孔径に依存する。大分子（例えば、約２０，０００ダルトンより大の分子量）は、一般的に細孔径限界（そこでは、平均細孔径が典型的には約１００オングストローム単位未満である）のためにポリマーマトリックスの細孔に貫通することができず、大分子のアクセス可能容積は、典型的にはＶ０に等しい。中間サイズの分子（例えば、分子量が２，０００から１０，０００ダルトン）は部分的に細孔構造を貫通することができ，「見かけ」容積（溶離容積）は、Ｖ０と中間分子がアクセス可能なＶｉの部分との和に等しいであろう。小分子（約１，０００ダルトン未満の分子量を有するような）は、典型的にポリマーマトリックスに完全なアクセスを有し、対応する溶離容積はＶ０＋Ｖｉに等しい。カラムを通過する分子は、それらのアクセス可能な容積（又は「見かけ」容積）の順で出てくるであろう、又、後者は、対応する溶離容積として測定される。最大分子（例えば、大分子プローブ）は、最初にＶ０に等しい容積で溶離し、最小分子（例えば、無機塩又は小分子プローブ）は、Ｖ０＋Ｖｉに等しい容積で最後に溶離するであろう。
【００３０】
クロマトグラフイー目的での適切な疎水性ポリマーマトリックスの選択は、分離される物質の分子サイズ及び化学特性に依存する。大部分のポリマーマトリックスは、疎水性ポリマー粒子の細孔径分布に応じて、特定の分子量範囲内の標的分子を分別（分離）するだろう。疎水性ポリマーマトリックスの機能は、最大分子がクロマトグラフィーカラムから最初に溶離され、最小分子が最後に溶離される場合に、標的分子（例えば、生体分子）についてのサイズの増大に応じたアクセス可能性の連続的な減少を提供することである。
【００３１】
疎水性固体メディアの中で、クロマトグラフィーの用途用の基体として有用なものは、例えば；
（ａ）トリメチルシリル基、（Ｃ８〜Ｃ２０）アルキル基又は他の疎水性基で表面処理されたシリカ粒子に基づいたもの等の、疎水性的に改良されたシリカベースポリマー；
（ｂ）架橋したポリスチレンとポリジビニルベンゼンコポリマー等のポリビニル芳香族ポリマー；
（ｃ）アルキル（メタ）アクリレートコポリマー及びトリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレートコポリマー等のポリ（メタ）アクリレート又はアクリルベースコポリマーである。
【００３２】
「疎水性」とは、本来、実質的に非極性であるポリマーであり、即ち、それらは、極性、イオン化可能性又は水素結合官能性（後者は典型的な親水性の特性である）を少ししか又は全く含有しない。本発明の目的のためには、疎水性ポリマーは、また、表面が疎水性（水不溶性）官能基（フルオルカーボン又はアルキル基）で化学的に変性され又は被覆された、シリカ又は他の親水性基体等の、表面が疎水性的に変性された親水性ポリマー基体を含む。
【００３３】
クロマトグラフィー用途用の固定相として選ばれた疎水性ポリマー粒子は、典型的には１以上の有機コポリマー及び疎水性的に変性された無機ポリマーから選択されるポリマーに基づいている。好ましくは、有機コポリマーは、１以上のポリビニル芳香族コポリマー及びポリ（メタ）アクリレートコポリマーから選択される。疎水性的に変性された無機ポリマーが使用されるとき、疎水性ポリマーは典型的に１以上のシリカベース、アルミナベース及びゼオライトベースポリマーから典型的に選択される。
【００３４】
高性能逆相液体クロマトグラフィー、（たとえば直径が２から１００ｃｍのカラムで）による生体分子の分離精製に有用な疎水性ポリマーは、典型的には２から１５０μｍの平均粒径を有している。大規模吸着プロセス（直径が数メートルまでのカラム又は醗酵ブロス等）による生体分子の分離精製に有用な疎水性ポリマーは、典型的には１５０から６００μｍまでの平均粒径を有している。好ましくは、疎水性ポリマーは、２から１５０μｍ、より好ましくは５から１００μｍ、最も好ましくは１０から７５μｍの粒径を有する球状コポリマービーズである。特に好ましいのは、サスペンション重合により生成され、１グラム当たり２００から１５００平方メートル（ｍ２／ｇ）、好ましくは３００から１２００ｍ２／ｇの表面積を有するマクロポーラスポリマーである。そのマクロポーラスポリマーは、好ましくは米国特許第４、３８２、１２４号に記載されたもの、例えば、その多孔度がポローゲン（「相エキステンダー」又は「沈殿剤」として知られる）、即ちそのポリマーの非溶媒でそのモノマーの溶媒の存在下でサスペンション重合によりコポリマー重合中に導入されているものである。慣用のマクロポーラスポリマーは、米国特許第４、３８２、１２４号に従い調製されたもので、典型的には幅広い範囲における、ポロ−ゲン種、モノマー相に対するポローゲン濃度、モノマー種、架橋モノマー種、架橋剤濃度、重合開始剤及び開始剤濃度が包含される。
【００３５】
クロマトグラフィー分離の使用に好適なマクロポーラスポリマーの調製に用いられることができるポリビニル芳香族モノマーには、例えば、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルナフタレン、ジビニルアントラセン及びジビニルキシレンが含まれる；好ましくは、ポリビニル芳香族モノマーはジビニルベンゼンである。好適なマクロポーラスポリマーは、典型的には５０から１００％、好ましくは７５から９０％のポリビニル芳香族モノマー単位を含む。
【００３６】
クロマトグラフィー分離用の使用に好適なマクロポーラスコポリマーの調製に使用され得るモノ不飽和ビニル芳香族モノマーには、例えば、スチレン、α‐メチルスチレン、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル置換スチレン、ハロ置換スチレン（ジブロモスチレン及びトリブロモスチレン等）、ビニルナフタレン及びビニルアントラセンが含まれ；好ましくは、モノ不飽和ビニル芳香族モノマーは、１以上のスチレン及び（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル置換スチレンから選択される。好適な（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル置換スチレンの中には、例えば、エチルビニルベンゼン、ビニルトルエン、ジエチルスチレン、エチルメチルスチレン及びジメチルスチレンが含まれ；好ましくはモノ不飽和ビニル芳香族モノマーはエチルビニルベンゼンである。典型的には、好適なマクロポーラスポリマーは、０から５０％、好ましくは１０から２５％のモノ不飽和ビニル芳香族モノマー単位を含む。
【００３７】
クロマトグラフィー分離に有用な好ましいマクロポーラスポリマーには、ジビニルベンゼンコポリマー、スチレン‐ジビニルベンゼンコポリマー、ジビニルベンゼン‐エチルビニルベンゼンコポリマー及びスチレン‐エチルビニルベンゼン‐ジビニルベンゼンコポリマーが含まれる。最も好ましいのは、マクロポーラスジビニルベンゼン‐エチルビニルベンゼンコポリマー及びスチレン‐エチルビニルベンゼン‐ジビニルベンゼンコポリマーである。これらのマクロポーラスポリマーは、特に充填されたクロマトグラフィーカラム用途に有用であり、ポリマーの多孔度及び機械的強度は、長期化した使用で圧力の増大なしに高い処理量で生体分子の高性能分離精製をすることができる。
【００３８】
好適な疎水性ポリマー基体の調製に使用されることができるアクリルベースモノマーには、例えば、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル（メタ）アクリレートが含まれる。更に、アルキル（メタ）アクリレートモノマーは、ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート、窒素が１または２の（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基によって置換されているエチレン性不飽和（Ｃ３〜Ｃ６）カルボン酸のアミド、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド及び２‐（ジメチル‐アミノ）エチル（メタ）アクリレート等の官能化された（メタ）アクリレート誘導体と共重合されることができる。コモノマーとして使用されるとき、官能化（メタ）アクリレート誘導体は、ポリマーの総重量を基準にして典型的には５０％まで、好ましくは２０％未満が含まれる。
【００３９】
クロマトグラフィーメディアパラメーターの中でクロマトグラフィー実施者にとって関心があるのは、「透過率」又は「流れ抵抗」特性である。透過率（Ｋ）は、ダルシー法（Ｄａｒｃｙ’ｓ  Ｌａｗ）（式１）によりカラムに発生した背圧と関連づけられる：
【００４０】
【式１】
0004662659.tif 000002
【００４１】
ここで：μ＝粘度（ミリパスカル・秒又はセンチポイズ）
Ｖ＝線速度（ｃｍ／時）
ΔＰ＝圧力降下（バール）
ｄｐ＝ポリマーの平均粒径（ミクロン）
【００４２】
上記の変数の単位は、それらの一般的な形式で表現されている；式１を無次元数にするためには単位の変換が必要であると理解される。カラムクロマトグラフィー分離精製への適用にとって典型的な層流条件下で、カラム内の背圧は、また、カルマン‐コーゼニー（Ｃａｒｍａｎ‐Ｋｏｚｅｎｙ）式（式２）で表わされることができる：
【００４３】
【式２】
0004662659.tif 000003
【００４４】
ここで：ε＝粒子間空隙容量（ｃｃ／ｃｃ）
【００４５】
Ｇ．グイオコン、Ｓ．ゴーシャンシラジ及びＡ．カッティの「分取及び非線形クロマトグラフィーの基本」；アカデミックプレス（１９９４）及びＷ．Ｌ．マックカーベ、Ｊ．Ｃ．スミス及びＰ．ハリオットの「ケミカルエンジニアリングにおけるユニット操作」；マクロウヒル（１９８５）のような文献が、ダルシー法及びカルマン‐コーゼニー式（式１及び２）についての更なる一般的及び具体的詳細のために参照される。
【００４６】
式１と２を組み合わせることにより、クロマトグラフィーカラムにおける透過率（又は流れ抵抗）がポリマー樹脂床の粒子間空隙容積（即ち、ポリマー粒子間の容積）に関連することが示される；εは、ポリマー床の単位容積当たりの空隙容積として表される。この関係は、式３で表される。
【００４７】
【式３】
0004662659.tif 000004
【００４８】
ポリマーに特徴的な「流れ抵抗」値（透過率の逆数）は、ポリマーが中〜高圧条件下のメディアの下で如何に良好な特性を示すかの指標であり：低流れ抵抗は低圧縮率を表し、高流れ抵抗は不良な圧縮率を表す。
【００４９】
本発明の幾つかの態様は、次の実施例に詳細に述べられている。全ての比率，部及びパーセンテージは、特に断らない限り重量で表されており、使用される全ての試薬は、特に断らない限り市販の良質のものである。実施例及び表に使用される略語は相当する記述と共に下記に挙げられている。
ｖ／ｖ＝容積／容積
ｗ／ｖ＝重量／容積
ｎｍ＝ナノメートル
【００５０】
実施例１
本実施例は、ポリビニル芳香族マクロポーラスポリマーについてそれらの透過率特性、即ち、圧縮抵抗性の評価法を記載している。ポリマーがそれらの「流れ抵抗」又は１／Ｋ値（式３を参照）によって特徴付けられるためには、空隙容積の正確な測定が必要とされる。この場合、試験されるポリマーは、１．９ｃｃ／ｇの多孔度、０．６７ｃｃ／ｃｃの細孔容積、９４７ｍ２／ｇの表面積及び約３０μｍの平均粒径を有し、８０％のジビニルベンゼン及び２０％のエチルビニルベンゼンのポリマーであった。
【００５１】
工業用高圧液体クロマトグラフィーにおいては、直接樹脂に力（圧力）を及ぼすピストンがカラムに装備される。クロマトグラフィーサイクルを通して最大予期流れ圧力に等しいか又はより大きい圧力でピストンを床に圧縮させておくことが望ましい。ポリマーの透過率特性を試験するために、ポリマー樹脂は、プロクロム（ＰｒｏＣｈｒｏｍ、商標）ダイナミックアクシャルコンプレッションカラム（モデルＬＣ．５０）に充填され、最初に１０、それから６０バールの圧縮圧に設定されたピストンで圧縮された。以下詳述する。
【００５２】
およそ１００ｇの乾燥ポリマー樹脂（およそ５００ｍｌの湿潤樹脂に相当）は、７００ｍｌの２０％エタノール／水溶液（ｖ／ｖ）に加えられ、少なくとも２時間周囲温度で静置された。このポリマー試料は、撹拌されてスラリー状にされ、５ｃｍ（内径）×５４ｃｍ（長さ）プロクロムダイナミックアクシャルコンプレッションＬ．Ｃ．５０３１６Ｌステンレス鋼カラム（プロクロムＳ．Ａ社、フランス製）に流入された。ピストンアセンブリー（作動油圧に変換された外部空気圧によって運転される）が作動され変動圧をポリマー樹脂床に適用する。ピストンは、約１０バールの液圧を与えるよう最初に設定される；樹脂床はピストンがもはや動かなくなったとき充填されたと考えられる。床の高さは、それから測定され、４２１．９ｃｃの湿潤ポリマー（＝Ｖｔ  ＝Ｖ０＋Ｖｉ＋Ｖｇ）の総充填床容積に相当する２１．５ｃｍであった。２０％エタノール／水（ｖ／ｖ）溶液１０ｍｌの流体が床を平衡化するために３０分間樹脂床を通過させられた。
【００５３】
充填床における空隙の総容積（粒子内（Ｖｉ）及び粒子間（Ｖ０）空隙の合計）を測定するために、小分子プローブ混合物に相当する１％塩化ナトリウム（２０％水性エタノール中でのｗ／ｖ）２ｍｌが系内に注入（１０ｍｌ／分の流速）された。塩化ナトリウム（小分子プローブ）は、伝導率検知器により検出された；塩化ナトリウムの溶離時間は、３１．１分であり、それは３１１ｍｌ［＝Ｖｓｍ］の溶離容積に相当した。
【００５４】
粒子間（隙間又は排除）空隙容積（Ｖ０）だけを測定するため、大分子プローブ混合物に相当する０．１〜０．９μｍの架橋スルホン化ポリスチレン（エマルション型又は粉砕された）粒子１％を含有する２０％エタノール（水性）溶液が、１０ｍｌ／分で床を通して流れる２０％エタノール（水性）の流れに注入された。大分子プローブは２８０ｎｍに設定されたＵＶ分光光度計により検出された。大分子プローブの溶離時間は１３．７分であり、それは１３７ｍｌ［＝Ｖｌｍ］の溶離容積に相当した。
【００５５】
ポリマー固形分の計算容積［Ｖｇ］は：
［Ｖｔ−Ｖｓｍ］＝４２１．９−３１１＝１１０．９ｃｃであった。
ポリマー細孔の計算容積［Ｖｉ］は：
［Ｖｓｍ−Ｖｌｍ］＝１７４ｃｃであった。
隙間空隙の計算容積［Ｖ０］(排除容積)は：
［Ｖｔ−Ｖｉ−Ｖｇ］＝Ｖｌｍ＝１３７ｃｃであった。
ポリマー固形分容積計算％＝Ｖｇ／Ｖｔ＝１１０．９／４２１．９＝２６．３％
ポリマー細孔容積計算％(多孔度％)＝Ｖｉ／Ｖｔ＝１７４／４２１．９＝４１．２％
隙間容積計算％(空隙容積％)＝Ｖ０／Ｖｔ＝１７４／４２１．９＝３２．５％
ポリマーの計算多孔度＝Ｖｉ／(Ｖｉ＋Ｖｇ)＝１７４／(１７４＋１１０．９)＝０．６１ｃｃ／ｃｃ
【００５６】
上記プロセスが６０バール圧において繰り返され、次の結果を得た。
床（６０バール）の高さは１７．０ｃｍと測定され、３３３．６ｃｃ湿潤ポリマーの総充填床容積［＝Ｖｔ］に相当した。
塩化ナトリウムについての溶離時間は、２２．３分であり、２２３ｍｌの溶離容積［＝Ｖｓｍ］に相当した。
大分子プローブについての溶離時間は、７．４分であり、７４ｍｌの溶離容積［＝Ｖｌｍ］に相当した。
ポリマー固形分の計算容積［Ｖｇ］は：
［Ｖｔ−Ｖｓｍ］＝３３３．６−２２３＝１１０．６ｃｃであった。
ポリマー細孔の計算容積［Ｖｉ］は：
［Ｖｓｍ−Ｖｌｍ］＝１４９ｃｃであった。
隙間空隙の計算容積［Ｖ０］(排除容積)は：
［Ｖｔ−Ｖｉ−Ｖｇ］＝Ｖｌｍ＝７４ｃｃであった。
ポリマー固形分容積計算％＝Ｖｇ／Ｖｔ＝１１０．６／３３３．６＝３３．２％
ポリマー細孔容積計算％(多孔度％)＝Ｖｉ／Ｖｔ＝１４９／３３３．６＝４４．７％
隙間容積計算％(空隙容積％)＝Ｖ０／Ｖｔ＝７４／３３３．６＝２２．２％
ポリマーの計算多孔度＝Ｖｉ／(Ｖｉ＋Ｖｇ)＝１４９／(１４９＋１１０．６)＝０．５７ｃｃ／ｃｃ
【００５７】
上記で測定された種々のクロマトグラフィーポリマー特性は、式２及び３に基づいた計算に必要とされる「ε」の値を決定するために使用されることができる。クロマトグラフィー分離に使用されるポリマー支持体の信頼できる透過率及び圧縮性を提供するために、Ｖ０及びＶｉの正確な及び精密な値を得ることが重要である。当業者であるクロマトグラフィー実施者により認識されるように、（Ｖｔ、Ｖ０、Ｖｉ及びＶｇ）で表される容積は、「全クロマトグラフィーカラム系」容積の他の成分、即ち、「デッド（ｄｅａｄ）」容積、移動ライン容積及びカラムヘッド容積 ― 後者はクロマトグラフィーメディアパラメーターの測定過程で考慮されるものである―とは、独立であり、これらを除いたものである。