(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫不全ウイルスおよびサル免疫不全ウイルスに由来する単離されたDNAであって、下記（ａ）または（ｂ）に記載のDNA。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むDNA。
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列において１乃至５塩基が置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列を含むDNAであって、（ｉ）その真核生物細胞への導入および発現により、該細胞の培養上清から感染性のウイルスを回収することができ、かつ(ii)該ウイルスがカニクイザルにおいてCD4陽性リンパ球を減少させることができる、DNA。
【請求項２】
（ｂ）における真核生物細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載のDNA。
【請求項３】
（ｂ）において回収されるウイルスが10３TCID50/ml以上の力価を有する、請求項１に記載のDNA。
【請求項４】
請求項１に記載のDNAの転写産物の塩基配列をそのゲノムに含む、実質的に純粋なヒト免疫不全ウイルスおよびサル免疫不全ウイルスのキメラウイルス。
【請求項５】
請求項４に記載のキメラウイルスの製造方法であって、
（ａ）請求項１に記載のDNAを真核生物細胞へ導入し、発現させる工程、および
（ｂ）該細胞の培養上清からウイルスを回収する工程、を含む方法。
【請求項６】
真核生物細胞が哺乳動物細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項４に記載のキメラウイルスで感染された非ヒト霊長類。
【請求項８】
サルである、請求項７に記載の非ヒト霊長類。
【請求項９】
後天性免疫不全症候群の予防または治療に有効な薬剤を同定または評価するための、請求項７または８に記載の非ヒト霊長類の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、後天性免疫不全症候群（AIDS）の非ヒト霊長類モデルに関する。
【０００２】
【従来の技術】
AIDSは、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）が原因となり発症する疾患である。AIDSはHIVの感染後、数年から十数年の潜伏期を経て発症し、その後免疫機能が低下し、一般的に、発症後数年で患者は死に至る。エイズの免疫不全では、リンパ球の一種であるT細胞の減少をはじめ、B細胞、単球、マクロファージなどのその他の免疫系細胞の異常、サイトカイン産生の異常などが見られる。
【０００３】
AIDSの予防と治療には様々なアプローチがなされている。治療方法としては、種々の抗HIV薬（逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド同類体など）の開発により、現在ではHAART療法（highly active antiretroviral therapy、多剤併用抗HIV療法）がある程度の効果を示しトいる。HIV感染の予防としては、ワクチンの開発が国内外にて積極的に行われている(Fauci, A. S., and P. I. Fischinger. 1988. Public Health Rep. 103:230-236.、Fauci, A. S.et al., Ann Intern Med. 110:373-85.)。多くのワクチンは、HIVの表面部位に発現する主要中和サイトであるEnv領域を標的としているが、最近ではGagを標的としたワクチンの有用性も検討されている。
【０００４】
AIDSワクチンや治療薬の評価のためには、免疫機構や代謝系がヒトと近似である霊長類を用いたin vivoの評価系が確立されていなければならない。ヒトのAIDSウイルスであるHIVは、ポリオやその他のワクチン評価に汎用されているカニクイザル（Macaca fascicularis）やアカゲザル（Macaca mulatta）のようなMacaque属のサルには感染が成立しにくく、唯一チンパンジーにおいてのみ感染が成立するだけである(Alter, H. J.et al., 1984. Science. 226: 549-52.、Eichberg, J. W.et al., J Med Primatol. 14:317-26.、Saxinger, C.et al., AIDS Res Hum Retroviruses. 3:375-85.)。AIDSワクチン候補や薬剤の開発と研究には、より手軽なサルモデル系が必要である(Desrosiers, R. C., and N. L. Letvin. 1987. Rev, Infect. Dis. 9:438-446.、Fultz, P. N. 1993. Clin. Infect. Dis. 17:230-235.、Joag, S. V. 2000. Microbes. Infect. 2:223-9.、Letvin, N. L. 1992. Immunodefic. Rev. 3:247-260.、Lewis, A. D., and P. R. Johnson. 1995. Trends. biotechnol. 13:142-150.、Lu, Y. 1997. Crit. rev. Oncog. 8:273-291.、Nath, B. M.et al., 2000. Trends Microbiol. 8:426-431、Schultz, A. M., and S. L. Hu. 1993. AIDS. 7:S161-170.)。
【０００５】
Macaque属のサルに感染が成立するのは、サルのAIDSウイルスであるSimian Immunodeficiency Virus（SIV）数種のみであった(Chakrabarti, L.et al., Nature. 328:543-547.)。しかしながら、SIVはサルのウイルスであり、宿主免疫系の点においても、ヒトのモデルとはなり難い。
【０００６】
そこでSIVとHIVのキメラウイルスが注目されてきた。ヒトのワクチンの標的部位であるEnv領域はHIVとし、さらにサルに感染させるために他の主要部位をサルのSIVとしたキメラウイルスが作製された(Sakuragi, S.et al.,1992. J. Gen. Virol. 73:2983-2987.、Shibata, R.et al., 1991. J Virol. 65:3514-20.、Shibata, R.et al., 1990. J Virol. 64:5861-5868.)。SIVとHIVのキメラウイルス（Simian-Human Immunodeficiency Virus、SHIV）により、in vivo 系においてサルに感染が成立し、なおかつHIVのEnvに対する免疫反応やワクチンの評価ができるモデル系が目指された。また、ウイルス感染から発症までの霊長類のモデル系が完成すれば、ヒトにおけるHIVの病原性や病態、感染様式、免疫応答などの解明にも有用である。
【０００７】
しかしながら、これまでのキメラウイルスは感染は成立するものの、CD4陽性リンパ球の減少を主とするヒトのAIDS病態を発現できていなかった(Igarashi, T.et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses. 10:1021-1029.、Li, J.et al., J Acquir Immune Defic Syndr. 5:639-646.、Li, J. T.et al., 1995. J Virol. 69:7061-7.、Lu, Y.et al., 1996. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 12:99-106.、Miller, C. J. et al., 1997. J Virol. 71:1911-21.)。AIDSワクチンや薬剤の効力評価には、ヒトと同様なAIDS発症モデルが必要であるが、確立したモデル系は存在しなかった。
【０００８】
近年になり、病原性を示すキメラウイルスが作製されてきた(Dunn, C. S.et al., Virology. 223:351-61.、Harouse, J. M. et al., 1998. J Med Primatol. 27:81-6.、Joag, S. V.et al., 1997. J Virol. 71:4016-23.、Joag, S. V. et al., 1996. J Virol. 70:3189-97.、Joag, S. V.et al., 1998. J Med Primatol. 27:59-64.、Liu, Z. Q.et al.,1999. Virology. 260:295-307.、Luciw, P. A.et al., 1999. Virology. 263:112-27.、Luciw, P. A.et al., 1995. Proc Natl Acad Sci U S A. 92:7490-4.)。その中の一つとして、米国においてHIV-1 89.6株とSIV mac 239株のキメラウイルスとして、SHIV-89.6が作製された(Reimann, K. A.et al., 1996. J Virol. 70:3198-206.)。このキメラウイルスは、臨床分離HIV-1 Clade B株のenv領域を発現したキメラウイルスである。さらに、このSHIV-89.6をアカゲザルにて3代in vivo継代し、病原性を示すSHIV-89.6Pが得られた(Karlsson, G. B.et al., 1997.  J Virol. 71:4218-25.、Lu, Y.et al., 1998. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 19:6-18.、Reimann, K. A.et al., 1996. J Virol. 70:6922-8.)。
【０００９】
一方、本発明者らは、カニクイザルとキメラウイルスを用いたAIDS発症モデルを樹立した（Shinohara et al.,Journal of General Virology,80,1231-1240,1999）。しかしながら、このモデルで用いられる、SIVmac239、Clade B HIV-1/HXBc2およびHIV-1/89.6より構成される病原性キメラウイルスSHIV-C2/1株は、現在、サル血漿として供給されており、複数の遺伝子型のウイルスを含んでいる。このためこのモデルを利用してワクチン評価や抗HIV/AIDS物質の評価をする場合に、成績の安定性に問題があった。また、特に多クローンなウイルスでは、接種経路の違いや宿主側のサルの状態により感染効率が異なる可能性があり、この事から抗ウイルス作用に関する成績の解釈が、抗ウイルス物質の効果によるものか、あるいは宿主側のウイルスクローンの選択による感染効率の相違によるものか判断できないという問題点があった。
このため、病原性キメラウイルスSHIV-C2/1株を均一なクローンとして提供することが、優れたAIDS発症モデルの開発において望まれていた。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、病原性キメラウイルスSHIV-C2/1株を均一なクローンとして提供することにある。さらに、本発明は、この病原性キメラウイルスSHIV-C2/1株を利用した、AIDSの非ヒト霊長類実験モデルを提供することをも目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、まず、SHIV-C2/1株のウイルスクローンの作製を行なった。SHIV-C2/1株を感染させたM8166細胞（CD4陽性ヒトT細胞株）より全細胞DNAを抽出し、これを鋳型とし、プロウイルスゲノムを3分割するように設計した特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行なった。増幅した3断片を、pUC系プラスミドにクローニングし、さらに再構成することにより、プロウイルス型のDNAクローンを作製することに成功した。得られた分子クローンの塩基配列の決定を行なった結果、この遺伝子型はこれまで発表されたSHIVとは異なるユニークなものであった。本発明者らは、さらに、作成したウイルスDNAを、COS7細胞にトランスフェクションし、培養上清を採取してウイルス標品を調製した。この培養上清中のウイルス力価を測定した結果、サル血漿を遥かに上回る高い力価を示した。また、このウイルスは、M8166細胞等で良好に増殖し、合胞体を形成した。
【００１２】
次いで、本発明者らは、回収した均一なクローンウイルスを利用してサル実験モデルの作製を行なった。Macaque属サルの静脈または直腸に回収したクローンウイルスを接種し、その病原性を検証した結果、ウイルス接種によりサルへの感染が成立し、感染したサルはCD4陽性T細胞の枯渇を主とするAIDSの症状を示した。
【００１３】
即ち、本発明者らは、SHIV-C2/1株の均一なウイルスクローンを調製することに成功すると供に、該クローンを利用してAIDSの非ヒト霊長類実験モデルを作製することにも成功し、これにより本発明を完成するに至った。本発明は、より詳しくは、
（１）  ヒト免疫不全ウイルスおよびサル免疫不全ウイルスに由来する単離されたDNAであって、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNA、
（ａ）配列番号：２から１１に記載のアミノ酸配列からなる全てのタンパク質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含む、（ａ）に記載のDNA。
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列を含むDNAであって、（ｉ）その真核生物細胞への導入および発現により、該細胞の培養上清から感染性のウイルスを回収することができ、かつ(ii)該ウイルスがカニクイザルにおいてCD4陽性リンパ球を減少させることができる、DNA。
（２）  （ｃ）における真核生物細胞が哺乳動物細胞である、（１）に記載のDNA、
（３）  （ｃ）において回収されるウイルスが10３TCID50/ml以上の力価を有する、（１）に記載のDNA、
（４）  （１）から（３）のいずれかに記載のDNAの転写産物の塩基配列をそのゲノムに含む、実質的に純粋なヒト免疫不全ウイルスおよびサル免疫不全ウイルスのキメラウイルス、
（５）  （４）に記載のキメラウイルスの製造方法であって、
（ａ）（１）から（３）のいずれかに記載のDNAを真核生物細胞へ導入し、発現させる工程、および
（ｂ）該細胞の培養上清からウイルスを回収する工程、を含む方法、
（６）  真核生物細胞が哺乳動物細胞である、（５）に記載の方法、
（７）  （４）に記載のキメラウイルスで感染された非ヒト霊長類、
（８）  サルである、（７）に記載の非ヒト霊長類、
（９）  後天性免疫不全症候群の予防または治療に有効な薬剤を同定または評価するための、（７）または（８）に記載の非ヒト霊長類の使用、を提供するものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、ヒトとサルの免疫不全ウイルスのキメラウイルスSHIV-C2/1株由来の単離されたDNAを提供する。SHIV-C2/1株のゲノムDNAの塩基配列を配列番号：1に示す。該DNAがコードするgag、pol、vif、vpx、vpr、tat、rev、vpu、env、nefのアミノ酸配列を順に配列番号：2から11に示す。SHIV-C2/1のゲノムには、SHIV-C2/1のHIV-1由来の領域、特にenv遺伝子に親株 SHIV-89.6と比較して、多数の変異が存在する。このうち、Gagの1個所、Polの3個所、Tatの2個所、Envの16個所及びNefの1個所の変異は、アミノ酸置換を伴う。また、env遺伝子3'末端を含む140bpの欠失により、HIV-1 Env gp41 C末端がSIVmac239由来の同等領域に置換している。これら遺伝子変異は、SHIV-C2/1のMacaque属への適応に関与していると推定される。
【００１５】
また、SHIV-C2/1のゲノムのEnvには、病原性分子クローンSHIV-89.6P KB9 （Cayabyab, M.et al., 1999. J Virol. 73:976-84.）および他系統の病原性分子クローンSHIV-HXBc2P3.2（Shinohara, K.et al, 2000. A Pathogenic SHIV-C2/1-Cynomolgus Monkey Model for Evaluation of HIV Vaccine Candidates., p. 247-250.  XIII International AIDS conference., Basic Science, Clinical Science, Epidemiology, Prevention and Public Health, Durban, South Africa.）と共通の変異が認められた。第一は、C2領域のアスパラギン結合糖鎖の消失である。この部位はHIVウイルスレセプターCD4との結合に関与しており、ウイルスの細胞への結合などの相互作用に変化をもたらす可能性が考えられる。第二は、V3ループ内の連続する塩基性アミノ酸の一部の、全く極性の異なるアミノ酸への変化である。V3領域はコレセプターを介した宿主域の決定に大きく関与しており、極性変化を伴うアミノ酸変異は宿主域に影響を与える可能性が考えられる。
【００１６】
SHIV-C2/1において、アカゲザルで病原性を示すSHIV-89.6P KB9並びにブタオザルから得られたSHIV-HXBC2P3.2と共通の変異が認められたことは、これらの共通の遺伝子変異部位が病原性SHIVの遺伝子の特徴であり、不可欠なものであることを示す。さらに、この共通の変異以外に、SHIV-C2/1独自の変異が認められたことは、この独自の変異がカニクイザルに対する特異な変異である可能性を示すものである。
【００１７】
本発明は、SHIV-C2/1株を構成するこれら変異を有するタンパク質（配列番号：2から11）をコードする単離されたDNA（例えば、配列番号：1に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA）を含む。本発明において「単離されたDNA」とは、本来の環境（即ち、天然のウイルス）から人為的に取り出されたDNAまたはそのコピーを意味する。従って、「単離されたDNA」には、例えば、ベクターに組み込まれた形態のDNAが含まれる。
【００１８】
本発明のDNAは、配列番号：1に記載のSHIV-C2/1由来のゲノムDNAの塩基配列情報を基に設計したプライマーを利用し、SHIV-C2/1（カニクイザル血漿）の全DNAを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応を行なうことにより調製することができる（実施例１参照）。
【００１９】
本発明のDNAは、その真核生物細胞、好ましくはCOS7細胞などの哺乳動物細胞への導入および発現により、該細胞の培養上清から感染性のウイルスを回収することができる（実施例１参照）。本発明において回収される感染性のウイルスは、好ましくは10３TCID50/ml以上の力価を有し、さらに好ましくは10４TCID50/ml以上の力価を有し、最も好ましくは105TCID50/ml以上の力価を有する。驚くべきことに、COS7細胞の培養上清から回収されたウイルスの力価は、5×105TCID50/mlに達し、これは従来用いられてきたカニクイザル血漿材料のSHIV-C2/1株の力価6.6×10２TCID50/mlの約750倍に値する。また、この回収されたウイルスは、カニクイザルにおいてCD4陽性リンパ球を減少させることができる。
【００２０】
本発明のDNAには、このような特性を有する限り、SHIV-C2/1株の単離されたDNAの塩基配列（配列番号：１）において1もしくは複数の塩基が変異した塩基配列を有するDNAを含む。このようなDNAは、当業者であれば、例えば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などを利用して調製することができる。変異数は、上記本発明のDNAの特性を保持し得る限り特に制限はないが、人為的な変異の導入は、一般的には、50塩基以下であることが好ましく、30塩基以下（例えば、10塩基以下、5塩基以下）であることがより好ましいと考えられる。
【００２１】
また、本発明は、上記本発明のDNAの転写産物（RNA）の塩基配列をそのゲノム（ゲノムRNA）に含む、実質的に純粋なSHIV-C2/1株を提供する。本発明において「実質的に純粋なウイルス」とは、従来のサル血漿として供給されているSHIV-C2/1株のように複数の遺伝子型のウイルスを含まない、単一の遺伝子型のウイルスを意味する。本発明のSHIV-C2/1株の調製物は、上記したように本発明のDNAの真核生物細胞への導入及び発現により、その培養上清から均一なクローンとして回収することができ、サル血漿のウイルスと比較して高い力価を有する。
【００２２】
本発明のSHIV-C2/1株の調製物は、アカゲザルのみならず、カニクイザルにおいても感染性を有する。また、これらサルにおいてAIDSの症状（例えば、CD4陽性リンパ球の減少）を引き起こすことができる。このような特性から、本発明のSHIV-C2/1株の調製物は、AIDSの実験モデルの作製に好適に用いることができる。
【００２３】
本発明は、このようにSHIV-C2/1株の感染によりAIDSの症状を示す非ヒト霊長類実験モデルを提供する。本発明のAIDSの実験モデルは、好ましくはサルである。特に好ましくは、Macaque属に属するサル（例えば、カニクイザル、アカゲザル）である。本発明のAIDS実験モデルは、例えば、本発明のSHIV-C2/1株の調製物を実験モデル動物の静脈や直腸へ接種することにより作製することができる（実施例２参照）。このようにして作製されたAIDS実験モデルは、AIDSの予防や治療のための薬剤の同定や評価において好適に用いることができる。例えば、前もってワクチン候補を免疫した非ヒト霊長類に、本発明のウイルスを接種して、ワクチンの防御効果を見ることができる。また、本発明のウイルスは、静脈内接種でも直腸内接種でも、どちらの経路においても感染が成立することから、該ウイルスで感染された実験モデルは、粘膜ワクチンの評価にも用いることができ有用性が高い。また、AIDSの治療薬候補化合物を本発明のウイルスを感染させた実験モデルに投与して、その後のAIDS症状の改善を観察することにより、AIDS治療薬となりうる化合物を同定することも可能である。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００２５】
[実施例１]  SHIV-C2/1分子クローンの作製
（1）クローニング
SHIV-C2/1（カニクイザル血漿）（Shinohara et al.,Journal of General Virology,80,1231-1240,1999）を感染させたM8166細胞（CD4陽性ヒトT細胞株）よりグアニジン／セシウム超遠心法にて全DNAを分離・抽出後、フェノール／クロロホルム法にて精製した。このDNAを鋳型とし、Expand High Fidelity PCR SystemKit（Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA）を用い、（Pwo + Taq）DNAポリメラーゼ混合酵素にて、94℃2分を1サイクル、94℃15秒・50℃30秒・68℃5分を10サイクル、94℃15秒・50℃30秒・68℃5分20秒（20秒／サイクルで増加）を20サイクル、68℃7分を1サイクルの条件でPCRを行った。PCRプライマーは、プロウイルスゲノムを制限酵素Sse8387 IとSph Iにて３分割、5'および3'末端に人為的にNot IとEcoRIの制限酵素部位を加えた形になるように設計した（図１）。即ち、5' Not I - Sse8387 I 断片増幅用プライマーとしてフォワードプライマー「AAAAGCGGCCGCTGGAAGGGATTTATTACAGTGC／配列番号：１２」とリバースプライマー「CCAGTACTGTAATTCTTTTCCTTTT／配列番号：１３」を、Sse8387 I - Sph I断片増幅用プライマーとしてフォワードプライマー「CCCCGACCAATCCATACAACAC／配列番号：１４」とリバースプライマー「TTTGATAGAGAAGCTTGATGAGTC／配列番号：１５」を、Sph I - 3' EcoR I 断片増幅用プライマーとしてフォワードプライマー「GCATTGCAAGAAAGGCTGTAG／配列番号：１６」とリバースプライマー「GGCGGAATTCTGCTAGGGATTTTCCTGCTTCG／配列番号：１７」を用いた。
【００２６】
PCR産物は、それぞれ制限酵素Not I + Sse8387 I、Sse8387 I + Sph I、Sph I + EcoR Iにて消化後、アガロースゲルにて電気泳動、QIAquick Gel Extraction Kitを用いたシリカカラム法にて精製し、pUC-18を改変したプラスミドにクローニングした。  ゲノム3領域各々5クローン前後を配列決定し、先に決定していたSHIV-C2/1ゲノムの配列と一致するものを選抜し、それらを再構築してプロウイルス型（10,501bp）のクローンを作製した。これによりSHIV-C2/1のウイルスクローンSHIV-C2/1 KS661が得られた。
【００２７】
（2）ウイルスの回収
クローンDNAをCOS 7細胞（アフリカミドリザル腎臓由来の細胞株）にLIPOFECTAMINE PLUS Reagent（Life Technologies, Rockville, MD, USA）を用いたリポソーム法にてトランスフェクションし、3時間後に培地を10%牛胎児血清含有Dulbecco's Modified Eagle Medium（D-MEM）培地に交換し、48時間後に培養上清を採取した。これを1,200 回転で5分の遠心をした後、ウイルスを含む培養上清を回収し、0.45-μm孔のフィルターを通して細胞の破片を取り除き、ウイルスストックとした。このウイルスストックの感染力価を、M8166細胞を用いて測定し、TCID50で表した。その結果、カニクイザル血漿材料の力価である6.6 X102 TCID50/mlを遥かに上回る5 x 105 TCID50/mlの高力価を得た。また、クローンウイルスはM8166細胞で良好に増殖し、SHIV-C2/1血漿ウイルス感染細胞と同様の合胞体形成が観察できた。
【００２８】
[実施例２]  SHIV-C2/1 KS661の病原性の検証
実施例１により回収したウイルスを12、000TCID50、カニクイザル及びアカゲザルに静脈内接種した。接種後1日目より、麻酔したサルから経時的に抹消血（ヘパリンあるいはEDTA加）を採血し、通常3日おきに、3週目以降は週1回程度を継続して採血した。これを比重 1.070 のPercole に重層後、遠心分離してPBMCs（peripheral blood mononuclear cells、末梢血単核球）と血漿を分離した。
【００２９】
血漿よりウイルスRNAを抽出し、RT-PCRによりSIVmac239のgag領域を増殖し、その生成物の濃度より血漿中のウイルスRNAコピー数を算出した。血漿中のウイルスRNAはQIAamp Viral RNA Mini kit（QIAGEN, Valencia, CA）を利用して抽出・精製した。RNA量の算出は、SIVmac239のgag領域を標的としたプライマーとプローブを設計し、TaqManTMシステム（PE Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いて行った。ウイルスRNAは、TaqManTM EZ RT-PCR Kit（PE Biosystems）を用いて、増殖及び検出を行った。プライマー及び鋳型は以下のものを設計した。即ち、フォワードプライマーとして、「AATGCAGAGCCCCAAGAAGAC／配列番号：１８」を、リバースプライマーとして「GGACCAAGGCCTAAAAAACCC／配列番号：１９」を、プローブとして「 Fam-ACCATGTTATGGCCAAATGCCCAGAC-Tamra／配列番号：２０」を用いた。RT-PCR産物はABI7700（PE Biosystems）によって蛍光染色を行い、その量決定した。対照としてのSIVmac239のgag領域のRNAは、T7 プロモーターの下流にSIVmac239のgag領域を挿入したプラスミドpKS460を鋳型として、MEGAscriptTM（Ambion, Austin, Texas, USA）を用いて作製した。血漿中のウイルス量は、各3回ずつ測定をくり返した後、コントロールRNAにて作成した検量線より換算して求めた。
【００３０】
また、鋳型DNAやその他の混入DNAはDNAase Iにて処理し、精製したRNA中への混入率は0.1％以下であった。さらに測定時には105のコントロールRNAを常に用い、精度管理を行った。各測定においてRNAの回収率は安定していた。この測定系の感度は1,000コピー数/mlであった。この測定の結果、これらサルの血漿においてウイルスRNAの存在が検出された。このことから、これらサルがウイルス感染していることが判明した。
【００３１】
また、ウイルス感染後のカニクイザルがAIDSの症状を示すか否かの検討を行なった。具体的には、CD4陽性リンパ球及びCD8陽性リンパ球数の計測を以下の方法により行なった。FITC-CD3 mAb（Biosouce International Inc.,Camarillo, CA, USA）、PE-CD4 mAb（Becton Dickinson Immunocytometry System）、PerCP-CD8（Becton Dickinson Immunocytometry System）と採取全血50μlを、4℃にて15分間インキュベートした。その後、赤血球をFACS lysing solution（Becton Dickinson Immunocytometry System）を用いて4℃で15分間溶解し、50μlのFlow-CountTM（Beckman Coulter Inc., Hialeah, FL,USA）を添加した。染色細胞は1％のパラホルムアルデヒドにて固定後、FACScalber flow cytometry（Becton Dickinson Immunocytometry System）を用いて、ソフトウエアCellQuestにより解析した。その結果、ウイルス感染後のサルのCD4陽性リンパ球が減少することが確認された（図２）。
さらに、カニクイザルに1,500,000TCID50を直腸から接種した場合にも、CD4陽性リンパ球の減少を惹起できた。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によりSHIV-C2/1株の均一なウイルスクローンおよび該クローンを利用したAIDSの非ヒト霊長類実験モデルが提供された。COS7細胞の培養上清から回収されるSHIV-C2/1調製物は、均一で極めて高い力価を有するため、従来の血漿標品に代えて、AIDSの実験モデルの作製に好適に利用することができる。さらに、このようにして作製された実験モデルは、安定したAIDS感染の症状を示すため、抗HIVワクチンや抗HIV薬剤の開発と評価のために好適に用いることができる。
さらに、本発明のSHIV-C2/1クローンを基盤として用いれば、B以外のクレードのSHIVキメラウイルスを作製することも可能であり、全世界に分布する広範囲なHIVに対するワクチンの評価に必要な非ヒト霊長類モデルの確立に寄与することが期待できる。
【００３３】
【配列表】
0004709968.tif 000002
0004709968.tif 000003
0004709968.tif 000004
0004709968.tif 000005
0004709968.tif 000006
0004709968.tif 000007
0004709968.tif 000008
0004709968.tif 000009
0004709968.tif 000010
0004709968.tif 000011
0004709968.tif 000012
0004709968.tif 000013
0004709968.tif 000014
0004709968.tif 000015
0004709968.tif 000016
0004709968.tif 000017
0004709968.tif 000018
0004709968.tif 000019
0004709968.tif 000020
0004709968.tif 000021
0004709968.tif 000022
0004709968.tif 000023
0004709968.tif 000024
0004709968.tif 000025
0004709968.tif 000026
0004709968.tif 000027
0004709968.tif 000028
0004709968.tif 000029
0004709968.tif 000030
0004709968.tif 000031
0004709968.tif 000032
0004709968.tif 000033
0004709968.tif 000034
0004709968.tif 000035
0004709968.tif 000036
0004709968.tif 000037
0004709968.tif 000038
0004709968.tif 000039
0004709968.tif 000040
0004709968.tif 000041
0004709968.tif 000042
【図面の簡単な説明】
【図１】  M8166細胞からのSHIV-C2/1の分子クローニングを示す図である。
【図２】  SHIV-C2/1 KS661を接種したカニクイザルにおけるCD4陽性リンパ球数の減少を示す図である。
【図１】
0004709968.tif 000043
【図２】
0004709968.tif 000044