(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の対立遺伝子を決定する方法であって、
（ｉ）被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型として、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンの塩基配列を含み、配列CACAAATGAAGCCCACAATGとTCACTCCCTTTTCCCTAGGGの間又は配列GCCCACAATGTTTGATAGTCとACCAACAGTATGTGTYCCC（YはC若しくはTである）の間の塩基配列を有する核酸断片を増幅するステップ、
（ｉｉ）増幅した核酸断片の塩基配列を決定するステップ、
（ｉｉｉ）決定した塩基配列と、既知の対立遺伝子の塩基配列を比較するステップ、
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ｉ）において、以下の（ａ）又は（ｂ）のプライマーセットを用いて増幅を行う、請求項１記載の方法。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるプライマー
（ｂ）配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるプライマー
【請求項３】
ステップ（ｉｉ）において、以下の（ｃ）のプライマーセットを用いて塩基配列を決定する、請求項１又は２記載の方法。
（ｃ）配列番号５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号６に示す塩基配列からなるプライマー
【請求項４】
ステップ（ｉ）で増幅された核酸断片を鋳型として、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅するステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型として以下の（ａ）のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅した後、該増幅された核酸断片を鋳型として以下の（ｂ）のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する、請求項４記載の方法。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるプライマー
（ｂ）配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるプライマー
【請求項６】
ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の対立遺伝子を決定する方法であって、
（ｉ）被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型として、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２エクソンの塩基配列を含み、配列TTTTCCACCTTYCTGCTCCT（YはC若しくはTである）とCCTGTTATCAATGGTAAGTGの間、又は配列TTTTCCACCTTYCTGCTCCT（YはC若しくはTである）とTCCAACTTTACCCCTGTTATCAAの間、又は配列TTTGCTTAGAGACATTGTGCとCCTGTTATCAATGGTAAGTGの間、又は配列TTTTCCACCTTYYTGCTCCT（YはC若しくはTである）とCCTGTTATCAATGGTAAGTGの間の塩基配列を有する核酸断片を増幅するステップ、
（ｉｉ）増幅した核酸断片の塩基配列を決定するステップ、
（ｉｉｉ）決定した塩基配列と、既知の対立遺伝子の塩基配列を比較するステップ、
を含む方法。
【請求項７】
ステップ（ｉ）において、以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかのプライマーセットを用いて増幅を行う、請求項６記載の方法。
（ｄ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
（ｅ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー
（ｆ）配列番号３５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
（ｇ）配列番号３６に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
【請求項８】
ステップ（ｉｉ）において、以下の（ｅ）又は（ｇ）のプライマーセットを用いて塩基配列を決定する、請求項６又は７記載の方法。
（ｅ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー
（ｇ）配列番号３６に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
【請求項９】
ステップ（ｉ）で増幅された核酸断片を鋳型として、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅するステップをさらに含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型として以下の（ｄ）のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅した後、該増幅された核酸断片を鋳型として以下の（ｅ）のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する、請求項９記載の方法。
（ｄ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
（ｅ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー
【請求項１１】
被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型として以下の（ｆ）のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅した後、該増幅された核酸断片を鋳型として以下の（ｇ）のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する、請求項９記載の方法。
（ｆ）配列番号３５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
（ｇ）配列番号３６に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
【請求項１２】
核酸断片の塩基配列を決定する前に、増幅した核酸断片をエキソヌクレアーゼＩ及びアルカリホスファターゼで処理するステップをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つのプライマーセットを含む、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅するためのプライマーセット。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるプライマー
（ｂ）配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるプライマー
【請求項１４】
以下の（ｃ）のプライマーセットを含む、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンの塩基配列を決定するためのプライマーセット。
（ｃ）配列番号５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号６に示す塩基配列からなるプライマー
【請求項１５】
請求項１３記載のプライマーセットを含む、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の対立遺伝子決定用キット。
【請求項１６】
さらに請求項１４記載のプライマーセットを含む、請求項１５記載の対立遺伝子決定用キット。
【請求項１７】
以下の（ｄ）〜（ｇ）の少なくとも１つのプライマーセットを含む、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅するためのプライマーセット。
（ｄ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
（ｅ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー
（ｆ）配列番号３５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
（ｇ）配列番号３６に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
【請求項１８】
以下の（ｅ）又は（ｇ）のプライマーセットを含む、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２エクソンの塩基配列を決定するためのプライマーセット。
（ｅ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー
（ｇ）配列番号３６に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
【請求項１９】
請求項１７記載のプライマーセットを含む、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の対立遺伝子決定用キット。
【請求項２０】
さらに請求項１８記載のプライマーセットを含む、請求項１９記載の対立遺伝子決定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシＢｏＬＡ−ＤＱＡの対立遺伝子決定方法、並びにそのためのプライマーセット及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
主要組織適合性遺伝子複合体（Major histocompatibity complex；ＭＨＣ）分子は、移植片や細菌、ウイルスなどの外来抗原ペプチドと結合してＴ細胞に提示する膜蛋白質である。ＭＨＣ分子はその構造と機能からクラスＩとクラスＩＩに大きく分けられる。【０００３】
ＭＨＣはマウスではＨ−２、ヒトではＨＬＡと呼ばれるのに対応して、ウシではＢｏＬＡ（Bovine Leukocyte Antigen）と称される。ＢｏＬＡ遺伝子領域は、第２３染色体上に位置し、ヒト、マウスと相同性の高い、クラスＩ、クラスＩＩ及びクラスＩＩＩ遺伝子を含んでいる。ＢｏＬＡクラスＩＩ遺伝子がヒトやマウスのそれと大きく異なる点は、少なくとも１５ｃＭの領域をはさんでクラスＩＩａとクラスＩＩｂの２つの亜領域に分断されていることである。クラスＩＩｂ亜領域にはＤＲとＤＱの各遺伝子亜領域がマップされている。一方、クラスＩＩａ領域には、ＭＨＣと抗原の結合を促進するＤＭＡとＤＭＢ、抗原のプロセシングに関与するＬＭＰ２とＬＭＰ７、トランスポーター遺伝子ＴＡＰ、およびタンパク質の発現と機能が不明なＤＯＡ、ＤＯＢ、ＤＩＢ、ＤＹＡ、ＤＹＢが同定されている。【０００４】
クラスＩＩｂのＤＲ遺伝子亜領域には、セントロメア側からＤＲＢ１−ＤＲＢ２−ＤＲＢ３−ＤＲＡの順に各遺伝子が位置しており、ＤＲＡによってコードされるα鎖とＤＲＢ３によってコードされるβ鎖から成るヘテロダイマーがＤＲ分子として細胞表面へ発現し、強い抗原提示能を誘導する。ＤＲＢ３がＢｏＬＡ遺伝子の中で最も機能的で多型性に富んでいて、１０４対立遺伝子が確認されている。一方、ＤＱ遺伝子領域には現在までにＤＱＡとＤＱＢ遺伝子が各５個ずつ同定されている。ＤＱＡとＤＱＢ遺伝子は、ハプロタイプによって数や構成が異なっていて、一つあるいは二つのＤＱ分子を形成し、弱いながらも抗原提示能を誘導すると考えられる（Schneider S., Roessli D.,及びExcoffier L.，A software for population genetics data analysis,  rlequin，Genetics and Biometry Laboratory, University of Geneva, Switzerland，2000年；Aida Y.，Characterization and Expression of Bovine MHC Class II Genes，Bulletin de la Societe Franco-Japonaise des Sciences Veterinaires，第6巻，p.17-24，1995年；Burke M.G., Stone R.T., 及びMuggli-Cockett N.E.，Nucleotide-sequence and northern analysis of a bovine major histocompatibility class II DR-beta-like cDNA，Animal genetics，第22巻，p.343-352，1991年；Fraser D.C., Craigmile S., Campbell J.D.M., Oliver R.A., Brown D.J., Russell G.C., Spooner R.L., 及びGlass E.J.，Functional expression of a cattle MHC class II DR-like antigen on mouse L-cells，Immunogenetics，第43巻，p.296-303，1996年参照）。【０００５】
ＢｏＬＡと疾患感受性の関連性についての研究は、ウシにおける免疫応答遺伝子の存在を証明する目的で始められた。はじめに、ヒト血清アルブミンに対する抗体産生能に遺伝的差異があることが発見された。ＢｏＬＡ−Ｗ１６を持つ個体は抗体産生能が高く乳房炎に易病性であり、ＢｏＬＡ−Ｗ２を持つ個体はヒト血清アルブミンに対して抗体産生能が低く、相対的に抵抗性であることが示された。このように、乳房炎を始めとして、ウシの疾患は経済形質に直接関わるものであることから、徐々にではあるがＢｏＬＡクラスＩおよびクラスＩＩと関連のある疾患が報告され始めている（間 陽子及び長岡 淑子，ウシMHC遺伝子，日本組織適合性学会誌，第3巻，p.213-225，1997年；間 陽子，疾患感受性を規定するウシMHCクラスII分子の構造と機能，動物遺伝研究誌，第26巻，p.1-12，1998年；間 陽子，ウシゲノム解析と抗病性〔1〕，農業および園芸，第76巻，p.1187-1194，2001年参照）。ＢｏＬＡとの関連性の解析が進展している疾患の一つにウシ白血病ウイルス（Bovine leukemia virus：ＢＬＶ）がある。ＢＬＶはヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１）と最も近縁のレトロウイルスで、Ｂリンパ腫である地方病性牛白血病（ＥＢＬ）を誘発する。ＢＬＶ感染牛は、未発症健康、持続性リンパ球増多症（ＰＬ）、さらに長い潜伏期の後白血病を発症するという、３つの病態を示す。ＢＬＶ感染牛の対立遺伝子を調査した結果、ＢｏＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子が地方病性牛白血病の感受性を規定している可能性が示された（間 陽子，ウシゲノム解析と抗病性〔2〕，農業および園芸，第76巻，p.1289-1294，2001年参照）。【０００６】
このように免疫応答及び疾患感受性に大きく関わるＢｏＬＡの対立遺伝子を決定するための方法は多数開発されている。中でもＤＲＢ３においては、ＰＣＲ−塩基配列に基づくタイピング（ＰＣＲ−ＳＢＴ）法が開発され、多数のサンプルの対立遺伝子を簡便、迅速かつ確実に決定できる方法として高い成果をあげている（特開２００１−１７８４９９号公報）。しかしながら、ＤＱの対立遺伝子を効率よく決定する方法は未だ開発されていない。例えば、ＢｏＬＡ−ＤＱＡをタイピングするために、ＤＱＡエクソン内に設計されたＰＣＲプライマーにより、ＤＱＡエクソン２を部分的に増幅し、ベクターにクローニングした後、塩基配列を決定し、その配列をもとに対立遺伝子の同定が行われているが、ＤＱＡ遺伝子にはＤＱＡ１、ＤＱＡ２、ＤＱＡ３、ＤＱＡ４及びＤＱＡ５が存在し、そしてプライマーの特異性の点から特定の遺伝子座のみを増幅することができず、対立遺伝子の決定には時間と労力がかかっていた（Ballingall KT., Luyai A., 及びMcKeever DJ.，Analysis of genetic diversity at the DQA loci in African cattle: evidence for a BoLA-DQA3 locus，Immunogenetics，第46(3)巻，p.237-244，1997年）。
【発明の開示】
【０００７】
そこで、本発明は、ＢｏＬＡ−ＤＱＡの対立遺伝子決定法を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１又はＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２エクソンを特異的に増幅し又は配列決定することが可能なプライマーセットを設計することに成功し、それを用いて、第２エクソンの塩基配列を特異的に増幅し、その増幅された核酸断片を配列決定することによって、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１及びＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の対立遺伝子を簡便かつ確実に決定することができるという知見を得、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（８）である。
【００１０】
（１）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の対立遺伝子を決定する方法であって、
（ｉ）被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型として、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅するステップ、
（ｉｉ）増幅した核酸断片の塩基配列を決定するステップ、
（ｉｉｉ）決定した塩基配列と、既知の対立遺伝子の塩基配列を比較するステップ、
を含む方法。
【００１１】
上記方法のステップ（ｉ）においては、以下の（ａ）又は（ｂ）のプライマーセットを用いて増幅を行うことができる：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるプライマー
（ｂ）配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるプライマー。
【００１２】
またステップ（ｉｉ）においては、以下の（ｃ）のプライマーセットを用いて塩基配列を決定することができる：
（ｃ）配列番号５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号６に示す塩基配列からなるプライマー。
【００１３】
上記方法は、ステップ（ｉ）で増幅された核酸断片を鋳型として、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅するステップをさらに含んでもよい。この場合には、例えば、被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型として以下の（ａ）のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅した後、該増幅された核酸断片を鋳型として以下の（ｂ）のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅することが好ましい：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるプライマー
（ｂ）配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるプライマー。
【００１４】
（２）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の対立遺伝子を決定する方法であって、
（ｉ）被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型として、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅するステップ、
（ｉｉ）増幅した核酸断片の塩基配列を決定するステップ、
（ｉｉｉ）決定した塩基配列と、既知の対立遺伝子の塩基配列を比較するステップ、
を含む方法。
【００１５】
上記方法のステップ（ｉ）においては、以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかのプライマーセットを用いて増幅を行うことができる：
（ｄ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
（ｅ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー
（ｆ）配列番号３５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
（ｇ）配列番号３６に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー。
【００１６】
またステップ（ｉｉ）においては、以下の（ｅ）又は（ｇ）のプライマーセットを用いて塩基配列を決定することができる：
（ｅ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー
（ｇ）配列番号３６に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー。
【００１７】
上記方法は、ステップ（ｉ）で増幅された核酸断片を鋳型として、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅するステップをさらに含んでもよい。この場合には、例えば、被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型として以下の（ｄ）のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅した後、該増幅された核酸断片を鋳型として以下の（ｅ）のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅することが好ましい：
（ｄ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
（ｅ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー。
【００１８】
また例えば、被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型として以下の（ｆ）のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅した後、該増幅された核酸断片を鋳型として以下の（ｇ）のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅することが好ましい：
（ｆ）配列番号３５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
（ｇ）配列番号３６に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー。
【００１９】
上記（１）及び（２）の方法において、核酸断片の塩基配列を決定する前に、増幅した核酸断片をエキソヌクレアーゼＩ及びアルカリホスファターゼで処理するステップをさらに行ってもよい。
【００２０】
（３）以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つのプライマーセットを含む、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅するためのプライマーセット：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるプライマー
（ｂ）配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるプライマー。
【００２１】
（４）以下の（ｃ）のプライマーセットを含む、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンの塩基配列を決定するためのプライマーセット：
（ｃ）配列番号５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号６に示す塩基配列からなるプライマー。
【００２２】
（５）上記（３）のプライマーセットを含む、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の対立遺伝子決定用キット
上記対立遺伝子決定用キットは、さらに上記（４）のプライマーセットを含んでもよい。
【００２３】
（６）以下の（ｄ）〜（ｇ）の少なくとも１つのプライマーセットを含む、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅するためのプライマーセット：
（ｄ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
（ｅ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー
（ｆ）配列番号３５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
（ｇ）配列番号３６に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー。
【００２４】
（７）以下の（ｅ）又は（ｇ）のプライマーセットを含む、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２エクソンの塩基配列を決定するためのプライマーセット：
（ｅ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー
（ｇ）配列番号３６に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー。
【００２５】
（８）上記（６）のプライマーセットを含む、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の対立遺伝子決定用キット
上記対立遺伝子決定用キットは、さらに上記（７）のプライマーセットを含んでもよい。
【００２６】
本発明により、ＢｏＬＡ−ＤＱＡの対立遺伝子決定法が提供される。該方法は、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１及びＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の対立遺伝子を簡便、迅速かつ確実に決定することができるため、ＭＨＣと疾患感受性の関連についての研究などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、本発明に係るウシＭＨＣ（ＢｏＬＡ）−ＤＱＡ１及びＤＱＡ２のＰＣＲ−ＳＢＴ法の概略を示す図である。矢印はプライマーの結合する位置を示す。
【図２】図２は、ウシＭＨＣ（ＢｏＬＡ）−ＤＱＡ１及びＤＱＡ２の第２イントロンの配列決定（Ａ）、ＤＱＡ１の第３イントロンの配列決定（Ｂ）、並びにＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によりＤＱＡ２の第２イントロンの配列決定（Ｃ）を行うための方法の概略を示す図である。矢印はプライマーの結合する位置を示す。また、図２の（Ｃ）におけるＨｉｎｄＩＩＩは、その部位でＨｉｎｄＩＩＩが認識したと考えられる部位を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子決定のためのＰＣＲ−ＳＢＴ法に使用したプライマーを示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子決定のためのＰＣＲ−ＳＢＴ法に使用したプライマーを示す図である。
【図４】図４は、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１のＰＣＲ−ＳＢＴ法に用いたプライマーの組み合わせを示す図である。
【図５】図５は、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１のＰＣＲ−ＳＢＴ法で増幅した対立遺伝子を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２対立遺伝子決定のためのＰＣＲ−ＳＢＴ法に使用したプライマーを示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２対立遺伝子決定のためのＰＣＲ−ＳＢＴ法に使用したプライマーを示す図である。
【図７】図７は、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２のＰＣＲ−ＳＢＴ法に用いたプライマーの組み合わせを示す図である。
【図８】図８は、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２のＰＣＲ−ＳＢＴ法で増幅した対立遺伝子を示す図である。
【図９】図９は、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１及びＤＱＡ２のイントロンのクローニングに用いたプライマーを示す図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第１エクソンと第２イントロンとの境界部分の配列を示す図である。Ｗ１は、データベース上の配列を示し、Ａ１００、ＷＫ１０及びＷＫ１５を配列決定した。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２イントロンと第２エクソンとの境界部分の配列を示す図である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンと第３イントロンとの境界配列及び第３イントロンと第３エクソンとの境界配列の配列を示す図である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第１エクソンと第２イントロンとの境界部分の配列を示す図である。ＳｈｅｅｐＤＱＡは、データベース上の配列を示し、Ｕ１、Ａ１００及びＭ１２を配列決定した。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２イントロンと第２エクソンとの境界部分の配列を示す図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＤＱＡ１についてＰＣＲ−ＳＢＴ法を行ったサンプル名と、使用したプライマーを示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＤＱＡ１についてＰＣＲ−ＳＢＴ法を行ったサンプル名と、使用したプライマーを示す図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ＤＱＡ１についてＰＣＲ−ＳＢＴ法を行ったサンプル名と、使用したプライマーを示す図である。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、ＤＱＡ１についてＰＣＲ−ＳＢＴ法を行ったサンプル名と、使用したプライマーを示す図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＤＱＡ２についてＰＣＲ−ＳＢＴ法を行ったサンプル名と、使用したプライマーを示す図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＤＱＡ２についてＰＣＲ−ＳＢＴ法を行ったサンプル名と、使用したプライマーを示す図である。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ＤＱＡ２についてＰＣＲ−ＳＢＴ法を行ったサンプル名と、使用したプライマーを示す図である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ワークショップ標準ＤＮＡの５２サンプルのタイピング結果を示す図である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ワークショップ標準ＤＮＡの５２サンプルのタイピング結果を示す図である。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ワークショップ標準ＤＮＡの５２サンプルのタイピング結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００４年４月１日に出願された日本国特許出願第２００４−１０９３８５号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。【００２９】
本発明は、ウシＭＨＣクラスＩＩ遺伝子領域におけるＢｏＬＡ−ＤＱＡ１及びＤＱＡ２の対立遺伝子の決定方法である。本発明の方法は、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１及びＤＱＡ２に存在する第１エクソンから第４エクソンのうち、最も対立遺伝子ごとの変異が大きい第２エクソンをＰＣＲ法によって特異的に増幅した後、配列決定し、対立遺伝子の多型を決定するという、ＰＣＲ−塩基配列に基づくタイピング法（ＰＣＲ−ＳＢＴ法）に基づくものである。また、対立遺伝子を確実に決定するために、特に図１に示すように、増幅反応を２回以上行うことによって特異的に第２エクソンを増幅した後（図１の（Ａ）及び（Ｂ））、第２エクソンのみを特異的に配列決定する（図１の（Ｃ））ことを含む。以上のようにして、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１及びＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の対立遺伝子を、簡便、迅速かつ確実に決定することができる。【００３０】
１．被験ウシからのＤＮＡ調製
本発明の方法では、対立遺伝子を決定しようとするウシ（被験ウシ）からゲノムＤＮＡを調製する。ゲノムＤＮＡの調製は、公知の方法、例えばフェノール／クロロホルム法、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）法などにより調製することができる。ゲノムＤＮＡを調製するためのキットも多数市販されており、例えばWizard Genomic DNA Purification Kit（Promega）などを使用することができる。【００３１】
被験ウシは、反芻類に属するウシ（Bos Taurus、Bos indicus）であればその種は特に限定されるものではない。例えば、エアーシア（Ayrshire）、ブリティッシュフリージアン（British Friesian）、デンマーク黒肢（Danish Black Pied）、デンマーク赤毛（Danish Red）、ヘレフォード（Hereford）、ホルスタインフリージアン（Holstein Friesian）、ジャージー（Jersey）、リムーザン（Limousin）、黒毛和種、日本短角などが挙げられる。【００３２】
２．第２エクソンの特異的増幅
最初に、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１又はＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２エクソンを増幅可能なプライマーを用いて、前項「１．被験ウシからのＤＮＡ調製」に記載のように調製したゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅反応を行い、第２エクソンの塩基配列を有する核酸断片を増幅する。【００３３】
ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１又はＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２エクソンを増幅可能なプライマーは、第２エクソンの全領域を増幅できることが好ましい。従って、図１の（Ａ）に示すように、第２エクソンの両側に位置するイントロンの配列に基づいてプライマーを設計することができる。あるいは、図１の（Ｂ）に示すように、イントロンとエクソンとの境界領域の配列に基づいてプライマーを設計することもできる。【００３４】
プライマーの設計手法は当技術分野で周知であり、本発明において使用可能なプライマーは、特異的なアニーリングが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリングが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有するように設計される。例えば、プライマーとしての機能を有する長さとしては、１０塩基以上が好ましく、さらに好ましくは１６〜５０塩基であり、さらに好ましくは２０〜３０塩基である。また設計の際には、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。Ｔｍとは、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度を意味し、鋳型となるＤＮＡとプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。Ｔｍの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウエアを利用することができる。【００３５】
本発明において使用可能な、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンを増幅することができるプライマーセットとしては、限定するものではないが、以下の（ａ）及び（ｂ）が挙げられる：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるプライマー
5’-CAC AAA TGA AGC CCA CAA TG-3’（配列番号１）
5’-CCC TAG GGA AAA GGG AGT GA-3’（配列番号２）。【００３６】
（ｂ）配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるプライマー
5’-GCC CAC AAT GTT TGA TAG TC-3’（配列番号３）
5’-GGG RAC ACA TAC TGT TGG T-3’（配列番号４）
（配列中、ＲはＡ又はＧを表す）。【００３７】
また、本発明において使用可能な、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２エクソンを増幅することができるプライマーセットとしては、限定するものではないが、以下の（ｄ）及び（ｅ）が挙げられる：
（ｄ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
5’-TTT TCC ACC TTY CTG CTC CT-3’（配列番号７）
5’-CAC TTA CCA TTG ATA ACA GG-3’（配列番号８）
（配列中、ＹはＣ又はＴを表す）。【００３８】
（ｅ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー
5’-TTT TCC ACC TTY CTG CTC CT-3’（配列番号７）
5’-TTG ATA ACA GGG GTA AAG TTG GA-3’（配列番号９）
（配列中、ＹはＣ又はＴを表す）。【００３９】
（ｆ）配列番号３５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
5’-TTT GCT TAG AGA CAT TGT GC-3’（配列番号３５）
5’-CAC TTA CCA TTG ATA ACA GG-3’（配列番号８）。【００４０】
（ｇ）配列番号３６に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
5’-TTT TCC ACC TTY YTG CTC CT-3’（配列番号３６）
5’-CAC TTA CCA TTG ATA ACA GG-3’（配列番号８）
（配列中、ＹはＣ又はＴを表す）。【００４１】
増幅反応は、特に限定されないが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal AMPlification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法等が挙げられる。増幅は、増幅産物が検出可能なレベルになるまで行う。【００４２】
例えば、ＰＣＲ法は、ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼにより、一対のプライマー間の塩基配列を合成するものである。ＰＣＲ法によれば、変性、アニーリング及び合成からなるサイクルを繰り返すことによって、核酸断片を指数関数的に増幅させることができる。ＰＣＲの最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。具体的には、上述したプライマー設計の際に考慮されるプライマーの融解温度（Ｔｍ）により、ＰＣＲの最適条件が異なる。【００４３】
従って、本発明の方法においては、上述のように設計したプライマーを用いて、被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型として、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１又はＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅する。【００４４】
また、増幅の特異性を高めるために、２組以上のプライマーを用いて２回以上増幅反応を行うことが好ましい。具体的には、最初に、図１の（Ａ）に示すように、被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型として、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１又はＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅する。次いで、図１の（Ｂ）に示すように、増幅された核酸断片を鋳型として、さらにＢｏＬＡ−ＤＱＡ１又はＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅する。このように２回以上増幅反応を行う場合には、各増幅反応で使用するプライマーを、同じ位置に設計してもよいし、あるいは図１に示すように、最初の増幅におけるプライマーの位置よりも内側に設計してもよい。【００４５】
ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の対立遺伝子を決定するために２回増幅反応を行う場合のプライマーセットの例としては、限定するものではないが、被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅反応において以下の（ａ）のプライマーセットを用い、増幅された核酸断片を鋳型とした増幅反応において以下の（ｂ）のプライマーセットを用いることができる：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるプライマー
（ｂ）配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるプライマー。【００４６】
ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の対立遺伝子を決定するために２回増幅反応を行う場合のプライマーセットの例としては、限定するものではないが、被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅反応において以下の（ｄ）のプライマーセットを用い、増幅された核酸断片を鋳型とした増幅反応において以下の（ｅ）のプライマーセットを用いることができる：
（ｄ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
（ｅ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー
また例えば、被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅反応において以下の（ｆ）のプライマーセットを用い、増幅された核酸断片を鋳型とした増幅反応において以下の（ｇ）のプライマーセットを用いることができる：
（ｆ）配列番号３５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
（ｇ）配列番号３６に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー。【００４７】
上述のようにして、被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型として、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１又はＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を特異的に増幅することができる。【００４８】
３．第２エクソンの配列決定と既知配列との比較
続いて、前項「２．第２エクソンの特異的増幅」に記載のようにして増幅した核酸断片の塩基配列を決定し、決定した塩基配列と、既知の対立遺伝子の塩基配列を比較する。これにより、被験ウシのＢｏＬＡ−ＤＱＡ１及びＢｏＬＡ−ＤＱＡ２がどのような対立遺伝子を有するかを決定することができる。【００４９】
配列決定法は当技術分野で周知であり、任意の方法を使用することができる。例えば限定されるものではないが、増幅した核酸断片をベクターにクローニングすることなく配列を決定することができるダイレクト・シーケンス法が挙げられる。かかる配列決定法は、市販のキット、例えばCEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）、BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ABI310（Applied Biosystems）などを用いて簡便に行うことができる。【００５０】
また、良好な実験結果を得るために、増幅した核酸断片をエキソヌクレアーゼＩ及びアルカリホスファターゼで処理した後に配列決定を行うことが好ましい。エキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）は大腸菌由来であることが好ましく、またアルカリホスファターゼはシュリンプ由来（ＳＡＰ）であることが好ましい。例えば限定されるものではないが、本発明においては、例えばＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（Amersham）を使用することができる。【００５１】
ダイレクト・シーケンス法を行う場合には、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１又はＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２エクソンを特異的に配列決定することが可能なプライマーを用いることが好ましい。【００５２】
本発明の方法において、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２エクソンの塩基配列を決定するために使用可能なプライマーとしては、限定するものではないが、以下の（ｃ）のプライマーセットが挙げられる：
（ｃ）配列番号５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号６に示す塩基配列からなるプライマー
5’-ACA ATG TTT GAT AGT CAA TTT C-3’（配列番号５）
5’-GGG RAC ACA TAC TGT TGG TAG-3’（配列番号６）
（配列中、ＲはＡ又はＧを表す）。【００５３】
また本発明の方法において、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２エクソンの塩基配列を決定するために使用可能なプライマーとしては、限定するものではないが、以下の（ｅ）又は（ｇ）のプライマーセットが挙げられる：
（ｅ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー
5’-TTT TCC ACC TTY CTG CTC CT-3’（配列番号７）
5’-TTG ATA ACA GGG GTA AAG TTG GA-3’（配列番号９）
（配列中、ＹはＣ又はＴを表す）。【００５４】
（ｇ）配列番号３６に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
5’-TTT TCC ACC TTY YTG CTC CT-3’（配列番号３６）
5’-CAC TTA CCA TTG ATA ACA GG-3’（配列番号８）
（配列中、ＹはＣ又はＴを表す）。【００５５】
核酸断片の塩基配列（すなわち第２エクソンの塩基配列）を決定した後、その塩基配列と、既知の対立遺伝子の塩基配列を比較する。ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１及びＢｏＬＡ−ＤＱＡ２についての対立遺伝子の情報は、例えばＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ 国際塩基配列データベース（インターネットサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html）、又はＢｏＬＡ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｗｅｂ ｓｉｔｅ（インターネットサイトhttp://www.projects.roslin.ac.uk/bola/bolahome.html）より入手することができる。ここで「既知の対立遺伝子」には、現在既に同定されている対立遺伝子だけではなく、今後解明される対立遺伝子であって、本発明の方法を実施する際に既知となっている対立遺伝子も含む。【００５６】
また、増幅された核酸断片をクローニングするか、又はエクソン内に２種類の対立遺伝子を選択的に増幅可能なプライマーを設計することにより、未知の対立遺伝子を同定することも可能となる。【００５７】
以上のようにして、被験ウシのＢｏＬＡ−ＤＱＡ１及びＢｏＬＡ−ＤＱＡ２がどの対立遺伝子を有するかを判別し、対立遺伝子を決定することができる。またＢｏＬＡ−ＤＱＡ１及びＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の新規な対立遺伝子を同定することもできる。これにより、例えば、特定の疾患に罹患したウシと正常ウシにおける対立遺伝子の決定及び比較によって、特定の疾患に関連する対立遺伝子を見出すことも容易になる。【００５８】
４．対立遺伝子決定用キット
本発明のキットは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１又はＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の対立遺伝子を決定するために用いることができ、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１又はＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を特異的に増幅することが可能なプライマーセットを少なくとも含むものである。また本発明のキットは、さらにＢｏＬＡ−ＤＱＡ１又はＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２エクソンの塩基配列を決定するためのプライマーセットを含んでもよい。【００５９】
ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の対立遺伝子決定を目的とする場合には、本発明のキットは、第２エクソンを増幅するためのプライマーセットとして、以下の（ａ）又は（ｂ）の少なくとも１つのプライマーセットを含むことが好ましく、また、（ａ）及び（ｂ）の両方のプライマーセットを含むことがさらに好ましい：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるプライマー
（ｂ）配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるプライマー。【００６０】
さらに本発明のキットは、第２エクソンを配列決定するためのプライマーセットとして、以下の（ｃ）のプライマーセットを含むことが好ましい：
（ｃ）配列番号５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号６に示す塩基配列からなるプライマー。【００６１】
また、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の対立遺伝子決定を目的とする場合には、本発明のキットは、第２エクソンを増幅するためのプライマーセットとして、以下の（ｄ）〜（ｇ）の少なくとも１つのプライマーセットを含むことが好ましく、また、（ｄ）及び（ｅ）の両方のプライマーセット、又は（ｆ）及び（ｇ）の両方のプライマーセットを含むことがさらに好ましい：
（ｄ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
（ｅ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー
（ｆ）配列番号３５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
（ｇ）配列番号３６に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー。【００６２】
さらに本発明のキットは、第２エクソンを配列決定するためのプライマーセットとして、以下の（ｅ）又は（ｇ）のプライマーセットを含むことが好ましい：
（ｅ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー
（ｇ）配列番号３６に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー。【００６３】
本発明のキットは、上記プライマーの他、さらに、反応液を構成するバッファー、ｄＮＴＰ混合物、酵素類（ポリメラーゼなど）などを含んでもよい。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例を用いて本方法をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【００６５】
〔実施例１〕ウシ材料からのゲノムＤＮＡの抽出
本実施例においては、家畜改良事業団から分与されたウシの末梢血（２００頭；Ｍシリーズ、図１２Ａ〜Ｄ及び１３Ａ〜Ｃ参照）、ＮＯＳＡＩ山形置賜家畜診療所から分与されたウシの末梢血、北村山診療所から分与されたウシの末梢血、及び第５回国際ＢｏＬＡワークショップにてタイピングされた標準ＤＮＡ５２サンプル（ＷＫシリーズ、図１２Ａ〜Ｄ及び１３Ａ〜Ｃ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。【００６６】
全血からのゲノムＤＮＡの抽出は、Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega）を使用した。３００μｌの血液に対し、９００μｌのCell Lysis Solutionを加え転倒攪拌し、１０分間室温で静置した。２０，４００×ｇ、４℃で２０秒間遠心後上清を除き、沈殿を３００μｌのNuclei Lysis Solutionで溶解した。１．５μｌの分解酵素（RNase A Solution）を加え３７℃で１時間反応した。１００μｌのProtein Precipitation Solutionを加え良く混合した後、２０，４００×ｇ、室温で３分間遠心した。３００μｌのイソプロパノールの入ったチューブに上清を加え混合した後、２０，４００×ｇ、４℃で１分間遠心しＤＮＡの沈殿を得た。７０％エタノール３００μｌで洗浄し、乾燥させた後、蒸留水５０ｍｌを加え４℃で一晩かけて溶解した。ＤＮＡの濃度は分光光度計により２６０ｎｍでの吸収量を測定することにより算出した。【００６７】
〔実施例２〕ＤＱＡ１第２イントロンの塩基配列決定
本実施例においては、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２エクソンを特異的に増幅できるプライマーを設計するため、図２の（Ａ）に示すようにＢｏＬＡ−ＤＱＡ１のｍＲＮＡ配列情報をもとに第１エクソン及び第２エクソンにプライマーを設計し、ＰＣＲ法を用いてＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第１〜第２エクソン間（以下、第２イントロン）を増幅し、クローニングして塩基配列を決定した。実験には、実施例１で調製した北村山診療所から分与されたウシの血液より単離したゲノムＤＮＡを用いた。【００６８】
（１）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２イントロンのＰＣＲ法による増幅
２００μＭの各ｄＮＴＰ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、３００ｎＭのプライマー、１ユニットのKOD-Plus-（TOYOBO）、及び５％ＤＭＳＯを含む５０μｌの×１ KOD-Plus-緩衝液にゲノム１１７ｎｇを溶解した。９４℃で４分間の変性処理後、９４℃で２０秒；６８℃で５分間の処理を１サイクルとして３５サイクルの処理を行い、６８℃で１０分間伸長させた。プライマーは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２イントロンをＰＣＲ法により特異的に増幅できるＤＱＡｅｘｏｎ１Ｆ及びＤＱＡ１ｅｘｏｎ２Ｒ４を用いた（配列番号２７及び２８；図９）。これによって、約１３００ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。【００６９】
（２）ＰＣＲ産物のクローニング
ＰＣＲ産物をエチヂウムブロマイド入り０．８％アガロースゲルで電気泳動し、目的バンドのみを切り出してMag Extractor（TOYOBO）でＤＮＡを精製した。さらにエタノール沈殿を行い、T4 Polynucleotide Kinase（TOYOBO）でリン酸化した。これを、pBluescript II SK(+)（Stratagene）をＥｃｏＲＶで消化した後仔ウシ小腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）処理したベクターにライゲーションし、コンピテントセルXL10 Gold（Stratagene）にトランスフォーメーションした。その後、アンピシリン、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（以下、ＩＰＴＧ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（以下、Ｘ−ｇａｌ）を加えたルリア−ベルターニ（以下、ＬＢ）プレートで培養し、カラーセレクションによってＤＮＡが挿入されたコロニーを選出して２ｍｌの２×ＹＴ培地（Molecular Cloning-A Laboratory Manual, second edition, Cold spring harbor laboratory press (1989), Vol.3, Appendix A.3）で培養した。これをアルカリ法でミニプレップし、Mag Extractor（TOYOBO）で精製した。【００７０】
（３）ダイレクト・シーケンス法
シーケンスプライマーとしてＴ３及びＴ７を用いた（配列番号２５及び２６；図９）。CEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）をシーケンス反応に用いた。プラスミドＤＮＡ１μｌ、及び滅菌水９μｌを混和し、９６℃、３分間処理をした後に２μｌの２ｐｍｏｌ／μｌプライマー、４μｌのDTCS Quick Start Mix（BECKMAN）、４μｌの2.5×Sequencing Buffer（Edge Biosystems）を混和し、９５℃で２０秒；５０℃で２０秒；６０℃で４分間の処理を１サイクルとして３５サイクルの処理を行った。シーケンスＰＣＲ産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー（BECKMAN COULTER）用のSample Loading Solution（BECKMAN）２０μｌに溶解し、CEQTM 2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER）でシーケンスを行った。決定された塩基配列からベクター部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、ＢＬＡＳＴを使用して第１エクソン又は第２エクソンの一部の配列を持つものを選び出し、その上流又は下流の配列を第２イントロンとした。【００７１】
第１エクソンと第２イントロンとの境界部分の配列を図１０Ａに、第２イントロンと第２エクソンとの境界部分の配列を図１０Ｂに示す。【００７２】
〔実施例３〕ＤＱＡ１第３イントロンの塩基配列決定
本実施例においては、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２エクソンを特異的に増幅できるプライマーを設計するため、図２の（Ｂ）に示すようにＢｏＬＡ−ＤＱＡ１のｍＲＮＡ配列情報をもとに第２エクソン及び第３エクソンにプライマーを設計し、ＰＣＲ法を用いてＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２〜第３エクソン間（以下、第３イントロン）を増幅し、ダイレクト・シーケンスによって塩基配列を決定した。ダイレクト・シーケンスで塩基配列が決定できなかったサンプルは、ＰＣＲ産物をクローニングして塩基配列を決定した。なお、実験には、実施例１で調製した北村山診療所から分与されたウシの血液より単離したゲノムＤＮＡを用いた。【００７３】
（１）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第３イントロンのＰＣＲ法による増幅
１２０μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び０．５ユニットのAmpliTaq Gold TM DNA伸長酵素（Applied Biosystems）、１μｌのゲノムを含む２５μｌのGene AmpR Gold緩衝液（Applied Biosystems）を９５℃で１０分間の変性処理後、９４℃で２０秒；６０℃で２０秒；７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして３５サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第３イントロンをＰＣＲ法により特異的に増幅できるＤＱＡ１−５２２Ｆ及びＤＱＡ１−１０９１Ｒを用いた（配列番号３２及び３３；図９）。これによって、約５７０ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。【００７４】
（２）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１  ２ｎｄＰＣＲ
１ｓｔＰＣＲ産物のうち１μｌを同条件の試薬２４μｌに混和し、１ｓｔＰＣＲと同条件で処理した。プライマーは、さらに内側を特異的に増幅できるＤＱＡ１−５２２Ｆ及びＤＱＡ１−１０８４Ｒを用いた（配列番号３２及び３４；図９）。これによって、約５６０ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。ＰＣＲ産物をエチヂウムブロマイド入り２％アガロースゲルで電気泳動をして、ＤＮＡが増幅されているか確認した。【００７５】
（３）ダイレクト・シーケンス法
シーケンスプライマーは、ＤＱＡ１−５２２Ｆ及びＤＱＡ１−１０８４Ｒを用いた（配列番号３２及び３４；図９）。CEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）をシーケンス反応に用いた。１μｌのＰＣＲ産物、２μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー、４μｌのDTCS Quick Start Mix（BECKMAN）、４μｌの2.5×Sequencing Buffer（Edge Biosystems）、及び滅菌水９μｌを混和し、９５℃で２０秒；５０℃で２０秒；６０℃で４分間の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理を行った。シーケンスＰＣＲ産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー（BECKMAN COULTER）用のSample Loading Solution（BECKMAN）２０μｌに溶解し、CEQTM 2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER）でシーケンスを行った。決定された塩基配列からプライマー部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、ＢＬＡＳＴを使用して第２エクソン又は第３エクソンの一部の配列を持つものを選び出し、その上流又は下流の配列を第３イントロンとした。【００７６】
（４）ＰＣＲ産物のクローニング
ＰＣＲ産物をSK-T vector（下記参照）にライゲーションした。これをコンピテントセルXL10 Gold（Stratagene）にトランスフォーメーションして、アンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−ｇａｌを加えたＬＢプレートで培養し、カラーセレクションによってＤＮＡが挿入されたコロニーを選出して２ｍｌの２×ＹＴ培地（Molecular Cloning-A Laboratory Manual、前掲）で培養した。これをアルカリ法でミニプレップし、Mag Extractor（TOYOBO）で精製した。SK-T vectorは、pBluescript II SK(+)（Stratagene）プラスミド１０μｇをＥｃｏＲＶで３７℃、一晩反応後、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、２ｍＭのｄＴＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、制限酵素反応産物、及び２ユニットのｒＴａｑ  ＤＮＡ伸長酵素（TOYOBO）を含む４０μｌの１×ｒＴａｑ緩衝液を７０℃、３時間反応させた。これを説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、SK-T vectorとした。【００７７】
（５）ダイレクト・シーケンス法
シーケンスプライマーとしてＴ３を用いた（配列番号２５；図９）。CEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）をシーケンス反応に用いた。プラスミドＤＮＡ１μｌ、及び滅菌水９μｌを混和し、９６℃、３分間処理をした後に２μｌの２ｐｍｏｌ／μｌプライマー、４μｌのDTCS Quick Start Mix（BECKMAN）、４μｌの2.5×Sequencing Buffer（Edge Biosystems）を混和し、９５℃で２０秒；５０℃で２０秒；６０℃で４分間の処理を１サイクルとして４０サイクルの処理を行った。シーケンスＰＣＲ産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー（BECKMAN COULTER）用のSample Loading Solution（BECKMAN）２０μｌに溶解し、CEQTM 2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER）でシーケンスを行った。決定された塩基配列からベクター部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、ＢＬＡＳＴを使用して第２エクソン又は第３エクソンの一部の配列を持つものを選び出し、その上流又は下流の配列を第３イントロンとした。【００７８】
第２エクソンと第３イントロンとの境界部分の配列、及び第３イントロンと第３エクソンとの境界部分の配列を図１０Ｃに示す。【００７９】
〔実施例４〕ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２エクソンの対立遺伝子の決定のためのプライマー設計
本実施例においては、実施例２及び３で配列決定したイントロン配列と、データベース上の配列に基づいて図１に示す方法でＤＱＡ１第２エクソンを特異的に増幅可能なＰＣＲプライマーを設計し（図３Ａ及びＢ）、これらのプライマーを組み合わせて７種類のＰＣＲプライマーセット、すなわちＤＱＡ１−１、−２、−３、−４、−５、−６及び−７を設計した（図３Ａ及びＢ）。なお、実験は、実施例１で調製した家畜改良事業団より分与されたウシ末梢血より精製したゲノム（Ｍシリーズ）を用いて行った。【００８０】
（１）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２エクソンの対立遺伝子の決定のための条件検討（ＤＱＡ１−１．１〜ＤＱＡ１−２．３）
ＤＱＡ１第２エクソンの９塩基下流には１塩基欠損を含む多型が存在するため、欠損を含む３種類の３’プライマーを設計した。サンプル１つにつき３回ＰＣＲを行い、アガロースゲル電気泳動でバンドが確認できたＰＣＲ産物をダイレクト・シーケンスし、塩基配列を決定した。【００８１】
（１．１）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１  １ｓｔＰＣＲ
１２０μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び０．５ユニットのAmpliTaq Gold TM DNA伸長酵素（Applied Biosystems）、１μｌのゲノムを含む２５μｌのGene AmpR Gold緩衝液（Applied Biosystems）を９５℃で１０分間の変性処理後、９５℃で１分間；図４に示したＴｍ値で３０秒、及び７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして図４に示したサイクル数の処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、図３Ａ及びＢに示したプライマーを図４に示した組み合わせで使用した。１サンプルごとに３種類のリバースプライマーを用いてＰＣＲ処理し、それぞれＰＣＲ産物をエチヂウムブロマイド入り２％アガロースゲルで電気泳動をして、ＤＮＡが増幅されているか確認した。バンドが確認できたＰＣＲ産物のみをダイレクト・シーケンス法に用いた。【００８２】
（１．２）ダイレクト・シーケンス法
シーケンスプライマーは、図３Ａ及びＢに示したプライマーを図４に示した組み合わせで用いた。CEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）をシーケンス反応に用いた。１μｌのＰＣＲ産物、２μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー、４μｌのDTCS Quick Start Mix（BECKMAN）、４μｌの2.5×Sequencing Buffer（Edge Biosystems）、及び滅菌水９μｌを混和し、９５℃で２０秒；図４に示したＴｍ値で２０秒；６０℃で４分間の処理を１サイクルとして図４に示したサイクル数の処理を行った。シーケンスＰＣＲ産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー（BECKMAN COULTER）用のSample Loading Solution（BECKMAN）２０μｌに溶解し、CEQTM 2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER）でシーケンスを行った。決定された塩基配列からプライマー部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、ＢＬＡＳＴを使用して対立遺伝子の塩基配列をデータベースに登録されている塩基配列と照合し、対立遺伝子を決定した。【００８３】
これらを用いてタイピングを行ったところ、ＤＱＡ１−２のプライマーセットを用いることにより、比較的良好なシーケンスを行うことができた（図５）。【００８４】
（２）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２エクソンの対立遺伝子の決定のための条件検討（ＤＱＡ１−３〜ＤＱＡ１−７）
１塩基欠損より下流に設計した３’プライマー（図３Ａ及びＢ）で１ｓｔＰＣＲを行い、１塩基欠損より上流に設計した３’プライマーで２ｎｄＰＣＲ及びダイレクト・シーケンスを行うことで、欠損のある対立遺伝子と欠損のない対立遺伝子を同時に増幅し、解析した。【００８５】
（２．１）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１  １ｓｔＰＣＲ
１２０μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び０．５ユニットのAmpliTaq Gold TM DNA伸長酵素（Applied Biosystems）、１μｌのゲノムを含む２５μｌのGene AmpR Gold緩衝液を９５℃で１０分間の変性処理後、９５℃で１分間；図４に示したＴｍ値で３０秒、及び７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして１５サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、図３Ａ及びＢに示したプライマーを図４に示した組み合わせで使用した。【００８６】
（２．２）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１  ２ｎｄＰＣＲ
１ｓｔＰＣＲ産物のうち１μｌを同条件の試薬２４μｌに混和し、９５℃で１０分間の変性処理後、９５℃で１分間；図４に示したＴｍ値で３０秒、及び７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして図４に示したサイクル数の処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、さらに内側を特異的に増幅できるよう、図３Ａ及びＢに示したプライマーを図４に示した組み合わせで用いた。ＰＣＲ産物をエチヂウムブロマイド入り２％アガロースゲルで電気泳動をして、ＤＮＡが増幅されているか確認した。【００８７】
（２．３）ダイレクト・シーケンス法
シーケンスプライマーは、図３に示したプライマーを図４に示した組み合わせで用いた。CEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）をシーケンス反応に用いた。１μｌのＰＣＲ産物、２μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー、４μｌのDTCS Quick Start Mix（BECKMAN）、４μｌの2.5×Sequencing Buffer（Edge Biosystems）、及び滅菌水９μｌを混和し、９５℃で２０秒；図４に示したＴｍ値で２０秒；６０℃で４分間の処理を１サイクルとして図４に示したサイクル数の処理を行った。シーケンスＰＣＲ産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー（BECKMAN COULTER）用のSample Loading Solution（BECKMAN）２０μｌに溶解し、CEQTM 2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER）でシーケンスを行った。決定された塩基配列からプライマー部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、ＢＬＡＳＴを使用して対立遺伝子の塩基配列をデータベースに登録されている塩基配列と照合し、対立遺伝子を決定した。【００８８】
結果を図５に示す。ＤＱＡ１−３は、ヘテロのシグナルが双方とも良好に得られ、対立遺伝子ごとの増幅しやすさは同じと考えられた。ＤＱＡ１−４は、ＷＫ１０、１５、３２及び３８以外はシーケンスすることができた。ＤＱＡ１−５においては、３’プライマーによるシーケンス結果が改善した。ＤＱＡ１−６は、３’及び５’の両側プライマーでシーケンス結果が良好であった。特に、ＤＱＡ１−７を用いてＰＣＲ−ＳＢＴを行ったところ、塩基配列の決定に十分なシグナルが得られるようになり、いずれの対立遺伝子も均等に増幅できた。【００８９】
（３）ＰＣＲ−ＳＢＴ法によるＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２エクソンの対立遺伝子の決定
上記（２）で良好な結果が得られたＤＱＡ１−７を用いたＰＣＲ法により増幅されたＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２エクソンの塩基配列をダイレクト・シーケンス法により決定後、塩基配列の相同性に基づいて対立遺伝子を決定した。【００９０】
（３．１）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１  １ｓｔＰＣＲ
１２０μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び１．２５ユニットのｒＴａｑ  ＤＮＡ伸長酵素（TOYOBO）、１μｌのゲノムを含む２５μｌの１×ｒＴａｑ緩衝液を９４℃で２分間の変性処理後、９４℃で２０秒；６０℃で２０秒、及び７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして１５サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２エクソンをＰＣＲ法により特異的に増幅できるＤＱＡ１ｉｎｔＬ２及びＤＱＡ１−６７７Ｒを用いた（配列番号１及び２；図３Ｂ）。これによって、４２６ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。【００９１】
（３．２）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１  ２ｎｄＰＣＲ
１ｓｔＰＣＲ産物のうち１μｌを１２０μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び０．５ユニットのAmpliTaq Gold TM DNA伸長酵素（Applied Biosystems）を含む２４μｌのGene AmpR Gold緩衝液を９５℃で１０分間の変性処理後、９４℃で２０秒；６０℃で２０秒、及び７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、さらに内側を特異的に増幅できるＤＱＡｉｎｔＬ３及びＤＱＡ１ｅｘ２ＲＥＶｖｅｒ２．１を用いた（配列番号３及び４；図３Ｂ）。これによって、３５５ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。ＰＣＲ産物をエチヂウムブロマイド入り２％アガロースゲルで電気泳動をして、ＤＮＡが増幅されているか確認した。【００９２】
（３．３）ダイレクト・シーケンス法
シーケンスプライマーとしてＤＱＡｉｎｔＬ３．１及びＤＱＡ１ｅｘ２ＲＥＶｖｅｒ１．１を用いた（配列番号５及び６；図３Ｂ）。CEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）をシーケンス反応に用いた。１μｌのＰＣＲ産物、２μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー、４μｌのDTCS Quick Start Mix（BECKMAN）、４μｌの2.5×Sequencing Buffer（Edge Biosystems）、及び滅菌水９μｌを混和し、９５℃で２０秒；５０℃で２０秒；６０℃で４分間の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理を行った。シーケンスＰＣＲ産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー（BECKMAN COULTER）用のSample Loading Solution（BECKMAN）２０μｌに溶解し、CEQTM 2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER）でシーケンスを行った。決定された塩基配列からプライマー部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、ＢＬＡＳＴを使用して対立遺伝子の塩基配列をデータベースに登録されている塩基配列と照合し、対立遺伝子を決定した。【００９３】
結果を図５に示す。ＤＱＡ１−７のプライマーセットを用いることにより、ウシゲノムＤＮＡから、ほぼ全ての対立遺伝子を決定することができた。【００９４】
〔実施例５〕ＤＱＡ２第２イントロンの塩基配列決定
（１）Ｌｏｎｇ−ＰＣＲ法によるＤＱＡ２第２イントロンの塩基配列決定
ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２エクソンを特異的に増幅できるプライマーを設計するため、図２の（Ａ）に示すように、既に公開されているＤＱＡ２ｍＲＮＡの配列情報をもとに第１エクソンと第２エクソンにプライマーを設計し、ＰＣＲ法を用いて、３頭のウシＤＮＡ（Ｕ１、Ａ１００及びＭ１２）のＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２イントロンを増幅し、クローニングして塩基配列を決定した。【００９５】
（１．１）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２イントロンのＰＣＲ法による増幅
１５０μＭの各ｄＮＴＰ、３００ｎＭのプライマー、１．５ユニットのＥｘＴａｑ（TaKaRa）を含む５０μｌの×１ＥｘＴａｑ緩衝液（TaKaRa）にゲノム１１７ｎｇを溶解した。９４℃で４分間の変性処理後、９４℃で２０秒；６８℃で２０秒；７２℃で５分間の処理を１サイクルとして４０サイクルの処理の後、７２℃で１０分間伸長させた。プライマーは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２イントロンをＰＣＲ法により特異的に増幅できるＤＱＡｅｘｏｎ１Ｆ及びＤＱＡ２ｅｘｏｎ２Ｒを用いた（配列番号２７及び２９；図９）。これによって、約４０００ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。【００９６】
（１．２）ＰＣＲ産物のクローニング
ＰＣＲ産物をエチヂウムブロマイド入り０．８％アガロースゲルで電気泳動し、目的バンドのみを切り出してMagExtractor（TOYOBO）でＤＮＡを精製した。４０μＭの各ｄＮＴＰ、５００μＭのＭｇＳＯ４、２．５ユニットのＫＯＤ（TOYOBO）と精製されたＤＮＡを含む１５０μｌの×１  ＫＯＤ緩衝液（最終濃度：１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ４）ＳＯ４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）を調製し、７２℃で２分間伸長させて、平滑末端にした。さらにエタノール沈殿を行い、T4 Polynucleotide Kinase（TOYOBO）でリン酸化した。これを、pBluescript II SK(+)（Stratagene）をＥｃｏＲＶで消化した後ＣＩＡＰ処理したベクターにライゲーションし、コンピテントセルXL10 Gold（Stratagene）にトランスフォーメーションして、アンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−ｇａｌを加えたＬＢプレートで培養し、カラーセレクションによってＤＮＡが挿入されたコロニーを選出して２ｍｌの２×ＹＴ培地（Molecular Cloning-A Laboratory Manual、前掲）で培養した。これをアルカリ法でミニプレップし、Mag Extractor（TOYOBO）で精製した。【００９７】
（１．３）ダイレクト・シーケンス法
シーケンスプライマーとしてＴ３及びＴ７を用いた（配列番号２５及び２６；図９）。CEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）をシーケンス反応に用いた。プラスミドＤＮＡ１μｌ、及び滅菌水９μｌを混和し、９６℃、３分間処理をした後に２μｌの２ｐｍｏｌ／μｌプライマー、４μｌのDTCS Quick Start Mix（BECKMAN）、４μｌの2.5×Sequencing Buffer（Edge Biosystems）を混和し、９５℃で２０秒；５０℃で２０秒；６０℃で４分間の処理を１サイクルとして３５サイクルの処理を行った。シーケンスＰＣＲ産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー（BECKMAN COULTER）用のSample Loading Solution（BECKMAN）２０μｌに溶解し、CEQTM 2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER）でシーケンスを行った。決定された塩基配列からベクター部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、ＢＬＡＳＴを使用して第１エクソン又は第２エクソンの一部の配列を持つものを選び出し、その上流又は下流の配列を第２イントロンとした。【００９８】
（２）Ｉｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲ法によるＤＱＡ２第２イントロンの塩基配列決定
Ｌｏｎｇ−ＰＣＲ法によって第２イントロンを増幅することができなかったサンプルの第２イントロンをＩｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲ法によって増幅した。【００９９】
（２．１）ゲノムＤＮＡの制限酵素処理
ゲノム溶液１μｌを説明書に従ってGenomiphi DNA Amplification Kit（Amersham Biosciences）で増幅し、これをゲノムＤＮＡとして以下の操作に用いた。３０〜２００ユニットのＨｉｎｄＩＩＩ、１０μｌのＤＮＡ溶液を含む２００μｌのMedium Buffer（TOYOBO）を３７℃で一昼夜処理し、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）で精製した。得られたサンプル溶液８μｌ、３５００ユニットのT4 DNA Ligase（TaKaRa）を含む５００μｌのT4 DNA Ligase Buffer（TaKaRa）を１６℃で一昼夜処理し、このうちの２０μｌを説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）で精製した。真空乾燥させた後に２０μｌの滅菌水に溶解し、一部を１０倍希釈して、説明書に従ってTempliphi 100 Amplification Kit（Amersham Biosciences）で増幅した。【０１００】
（２．２）Ｉｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲ
２００μＭの各ｄＮＴＰ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、３００ｎＭのプライマー、１ユニットのKOD-Plus-（TOYOBO）を含む５０μｌの×１KOD-Plus-緩衝液にＤＮＡ溶液１μｌを溶解した。９４℃で４分間の変性処理後、９４℃で２０秒；５５℃で３０秒；７２℃で５分の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理の後、７２℃で１０分間伸長させた。プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩで切断され、再びライゲーションすることで環状になったＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２エクソン〜第２イントロンをＰＣＲ法により特異的に増幅できるＤＱＡ２ｅｘｏｎ２Ｆ０５及びＤＱＡ２ｅｘｏｎ２Ｒ０１を用いた（配列番号３０及び３１；図９）。ＰＣＲ産物をエチヂウムブロマイド入り０．８％アガロースゲルで電気泳動し、産物の有無を確認した。これによって、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。【０１０１】
（２．３）Ｉｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲ産物のクローニング
ＰＣＲ産物を説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）で精製し、T4 Polynucleotide Kinase（TOYOBO）でリン酸化した。これを、pBluescript II SK(+)（Stratagene）をＥｃｏＲＶで消化した後ＣＩＡＰ処理したベクターにライゲーションし、コンピテントセルXL10 Gold（Stratagene）にトランスフォーメーションして、アンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−ｇａｌを加えたＬＢプレートで培養し、カラーセレクションによってＤＮＡが挿入されたコロニーを選出した。これを、アンピシリンを加えた別のＬＢプレートに植菌するとともに、コロニーダイレクトＰＣＲ法を行った。【０１０２】
（２．４）コロニーダイレクトＰＣＲと制限酵素切断によるＰＣＲ産物の確認
１５０μＭの各ｄＮＴＰ、４００ｎＭのプライマー、０．５ユニットのＥｘＴａｑ（TaKaRa）を含む２５μｌの×1Ex Taq緩衝液（TaKaRa）にコロニーを溶解した。９４℃で２分間の変性処理後、９４℃で２０秒；６０℃で３０秒；７２℃で１分３０秒の処理を１サイクルとして３５サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーはＴ３及びＴ７を用いた（配列番号２５及び２６；図９）。ＰＣＲ産物をエチヂウムブロマイド入り０．８％アガロースゲルで電気泳動し、バンドのサイズから挿入した約１０００ｂｐのＤＮＡ断片と同じ断片が得られたと考えられるＰＣＲ産物を０．９〜６ユニットのＨｉｎｄＩＩＩ、５μｌのＰＣＲ産物を含む１０μｌのMedium Buffer（TOYOBO）を３７℃で１時間３０分処理し、０．８％アガロースゲルで電気泳動してＤＮＡが切断されているものを選出し、対応するコロニーを２ｍｌの２×ＹＴ培地（Molecular Cloning-A Laboratory Manual、前掲）で培養した。これをアルカリ法でミニプレップし、Mag Extractor（TOYOBO）で精製した。【０１０３】
（２．５）ダイレクト・シーケンス法
シーケンスプライマーとしてＴ３及びＴ７を用いた（配列番号２５及び２６；図９）。CEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）をシーケンス反応に用いた。プラスミドＤＮＡ４μｌ、及び滅菌水６μｌを混和し、９６℃、３分間処理をした後に２μｌの２ｐｍｏｌ／μｌプライマー、４μｌのDTCS Quick Start Mix（BECKMAN）、４μｌの2.5×Sequencing Buffer（Edge Biosystems）を混和し、９５℃で２０秒；５５℃で２０秒；６０℃で４分間の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理を行った。シーケンスＰＣＲ産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー（BECKMAN COULTER）用のSample Loading Solution（BECKMAN）２０μｌに溶解し、CEQTM 2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER）でシーケンスを行った。決定された塩基配列からベクター部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、ＢＬＡＳＴを使用して第１エクソン又は第２エクソンの一部の配列を持つものを選び出し、その上流又は下流の配列を第２イントロンとした。【０１０４】
第１エクソンと第２イントロンとの境界部分の配列を図１１Ａに、また第２イントロンと第２エクソンとの境界部分の配列を図１１Ｂに示す。【０１０５】
〔実施例６〕ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２エクソンの対立遺伝子の決定のためのプライマー設計
（１）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２エクソンの対立遺伝子の決定のための条件検討（ＤＱＡ２−１〜ＤＱＡ２−５）
本実施例においては、実施例５で配列決定したイントロン配列と、データベース上の配列に基づいて図１に示す方法でＤＱＡ２第２エクソンを特異的に増幅可能なＰＣＲプライマーを設計し（図６Ａ及びＢ）、これらのプライマーを組み合わせて５種類のＰＣＲプライマーセット、ＤＱＡ２−１、−２、−３、−４、及び−５を設計した（図６Ａ及びＢ）。なお、実験は、実施例１で調製した家畜改良事業団より分与されたウシ末梢血より精製したゲノム（Ｍシリーズ）を用いて行った。【０１０６】
（１．１）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２  １ｓｔＰＣＲ
１２０μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び０．５ユニットのAmpliTaq Gold TM DNA伸長酵素（Applied Biosystems）、１μｌのゲノムを含む２５μｌのGene AmpR Gold緩衝液を９５℃で１０分間の変性処理後、９５℃で１分間；図７に示したＴｍ値で３０秒、及び７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして図７に示したサイクル数の処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、図６Ａ及びＢに示したプライマーを図７に示した組み合わせで使用した。【０１０７】
（１．２）ダイレクト・シーケンス法
シーケンスプライマーは、図６Ａ及びＢに示したプライマーを図７に示した組み合わせで用いた。CEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）をシーケンス反応に用いた。１μｌのＰＣＲ産物、２μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー、４μｌのDTCS Quick Start Mix（BECKMAN）、４μｌの2.5×Sequencing Buffer（Edge Biosystems）、及び滅菌水９μｌを混和し、９５℃で２０秒；図７に示したＴｍ値で２０秒；６０℃で４分間の処理を１サイクルとして図７に示したサイクル数の処理を行った。シーケンスＰＣＲ産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー（BECKMAN COULTER）用のSample Loading Solution（BECKMAN）２０μｌに溶解し、CEQTM 2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER）でシーケンスを行った。決定された塩基配列からプライマー部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、ＢＬＡＳＴを使用して対立遺伝子の塩基配列をデータベースに登録されている塩基配列と照合し、対立遺伝子を決定した。【０１０８】
結果を図８に示す。ＤＱＡ２−２を用いて３０サンプルをタイピングしたところ、５頭以外のサンプルは増幅できた。ＤＱＡ２−３は、ＤＱＡ２−２では増幅できなかった対立遺伝子を決定することができた。またＤＱＡ２−４は、ＤＱＡ２−３で増幅できなかったサンプルの対立遺伝子を決定することが出来た。またＤＱＡ２−５は、良好なシグナルを得ることができた。【０１０９】
（２）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２エクソンの対立遺伝子の決定のための条件検討（ＤＱＡ２−６）
（２．１）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２  １ｓｔＰＣＲ
１２０μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び０．５ユニットのAmpliTaq Gold TM DNA伸長酵素（Applied Biosystems）、１μｌのゲノムを含む２５μｌのGene AmpR Gold緩衝液を９５℃で１０分間の変性処理後、９５℃で１分間；５５℃で３０秒、及び７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして１５サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、図６Ａ及びＢに示したプライマーを図７に示した組み合わせで使用した。【０１１０】
（２．２）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２  ２ｎｄＰＣＲ
１ｓｔＰＣＲ産物のうち１μｌを同条件の試薬２４μｌに混和し、９５℃で１０分間の変性処理後、９５℃で１分間；６０℃で３０秒、及び７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、さらに内側を特異的に増幅できるよう、図６Ａ及びＢに示したプライマーを図７に示した組み合わせで用いた。ＰＣＲ産物をエチヂウムブロマイド入り２％アガロースゲルで電気泳動をして、ＤＮＡが増幅されているか確認した。【０１１１】
（２．３）ダイレクト・シーケンス法
シーケンスプライマーは、図７に示した組み合わせで用いた。CEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）をシーケンス反応に用いた。１μｌのＰＣＲ産物、２μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー、４μｌのDTCS Quick Start Mix（BECKMAN）、４μｌの2.5×Sequencing Buffer（Edge Biosystems）、及び滅菌水９μｌを混和し、９５℃で２０秒；図７に示したＴｍ値で２０秒；６０℃で４分間の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理を行った。シーケンスＰＣＲ産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー（BECKMAN COULTER）用のSample Loading Solution（BECKMAN）２０μｌに溶解し、CEQTM 2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER）でシーケンスを行った。決定された塩基配列からプライマー部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、ＢＬＡＳＴを使用して対立遺伝子の塩基配列をデータベースに登録されている塩基配列と照合し、対立遺伝子を決定した。【０１１２】
結果を図８に示す。ＤＱＡ２を特異的に増幅するために、ＤＱＡ２−６の条件でＰＣＲ−ＳＢＴを行ったところ、ＤＱＡ２のみを特異的かつ良好に増幅することが出来た（図８）。【０１１３】
（３）ＰＣＲ−ＳＢＴ法によるＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２エクソンの対立遺伝子の決定
上記（２）で良好な結果が得られたＤＱＡ２−６を用いたＰＣＲ法により増幅されたＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２エクソンの塩基配列をダイレクト・シーケンス法により決定後、塩基配列の相同性に基づいて対立遺伝子を決定した。【０１１４】
（３．１）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２  １ｓｔＰＣＲ
１２０μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び１．２５ユニットのrTaq  DNA伸長酵素（TOYOBO）、１μｌのゲノムを含む２５μｌの１×ｒＴａｑ緩衝液を９４℃で２分間の変性処理後、９４℃で２０秒；５５℃で２０秒、及び７２℃で２０秒の処理を１サイクルとして１５サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２エクソンをＰＣＲ法により特異的に増幅できるＤＱＡ２ｉｎｔＬ０６及びＱＡ００６を用いた（配列番号７及び８；図６Ｂ）。これによって、２９２ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。【０１１５】
（３．２）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２  ２ｎｄＰＣＲ
１ｓｔＰＣＲ産物のうち１μｌを１２０μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び０．５ユニットのAmpliTaq Gold TM DNA伸長酵素（Applied Biosystems）を含む２４μｌのGene AmpR Gold緩衝液を９５℃で１０分間の変性処理後、９４℃で１分間；６０℃で３０秒、及び７２℃で２０秒の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、さらに内側を特異的に増幅できるＤＱＡｉｎｔＬ０６及びＤＱＡ２ｅｘｏｎ２＜−１を用いた（配列番号７及び９；図６Ｂ）。これによって、２８３ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。ＰＣＲ産物をエチヂウムブロマイド入り２％アガロースゲルで電気泳動をして、ＤＮＡが増幅されているか確認した。【０１１６】
（３．３）ダイレクト・シーケンス法
シーケンスプライマーとしてＤＱＡ２ｉｎｔＬ０６及びＤＱＡ２ｅｘｏｎ２＜−１を用いた（配列番号７及び９；図６Ｂ）。CEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）をシーケンス反応に用いた。１μｌのＰＣＲ産物、２μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー、４μｌのDTCS Quick Start Mix（BECKMAN）、４μｌの2.5×Sequencing Buffer（Edge Biosystems）、及び滅菌水９μｌを混和し、９５℃で２０秒；５０℃で２０秒；６０℃で４分間の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理を行った。シーケンスＰＣＲ産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー（BECKMAN COULTER）用のSample Loading Solution（BECKMAN）２０μｌに溶解し、CEQTM 2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER）でシーケンスを行った。決定された塩基配列からプライマー部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、ＢＬＡＳＴを使用して対立遺伝子の塩基配列をデータベースに登録されている塩基配列と照合し、対立遺伝子を決定した。【０１１７】
（４）ＰＣＲ−ＳＢＴ法によるＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２エクソンの対立遺伝子の決定、及び増幅後の処理ステップの検討
新たに図６Ｂに示すプライマーセットＤＱＡ２−７を設計し、それを用いてＰＣＲ法によりＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２エクソンを増幅し、得られたＰＣＲ産物をＥＸＯＳＡＰにより処理した後、ダイレクト・シーケンス法により配列を決定し、塩基配列の相同性に基づいて対立遺伝子を決定した。【０１１８】
（４．１）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２  １ｓｔＰＣＲ
１５０μＭの各ｄＮＴＰ、４００ｎＭのプライマー、０．５ユニットのＥｘ  Ｔａｑ伸長酵素、１μｌのゲノムを含む２５μｌの１×Ｅｘ  Ｔａｑ緩衝液を９４℃で２分間の変性処理後、９４℃で２０秒；５６℃で２０秒、及び７２℃で２０秒の処理を１サイクルとして２０サイクルの処理の後、７２℃で５分間伸長させた。プライマーは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２イントロンをＰＣＲ法により特異的に増幅できるＤＱＡ２ｉｎｔｒｏｎ２Ｆ及びＱＡ００６を用いた（配列番号３５及び８；図６Ｂ）。これによって、２８３ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。【０１１９】
（４．２）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２  ２ｎｄＰＣＲ
１ｓｔＰＣＲ産物のうち１μｌを同条件の試薬２４μｌに混和し、９４℃で２分間の変性処理後、９４℃で２０秒；５６℃で２０秒、及び７２℃で２０秒の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理の後、７２℃で５分間伸長させた。プライマーは、さらに内側を特異的に増幅できるＤＱＡｉｎｔＬ０６ｖｅｒ２及びＱＡ００６を用いた（配列番号３６及び８；図６Ｂ）。これによって、２８３ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。ＰＣＲ産物をエチヂウムブロマイド入り２％アガロースゲルで電気泳動をして、ＤＮＡが増幅されているか確認した。【０１２０】
（４．３）ＰＣＲ産物の精製
２ｎｄＰＣＲ産物のうち５μｌとＥＸＯＳＡＰ（Amersham）２μｌを混和し、３７℃で１秒間；３７℃で１５分；８０℃で１秒間：８０℃で１５分のＥＸＯＳＡＰ処理を行った。なお、このＥＸＯＳＡＰは、大腸菌由来のエキソヌクレアーゼ（ＥｘｏＩ）及びシュリンプ由来アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）を含有するものである。このステップを行うことにより、余剰のプライマーが失活し、非常に良好な結果が得られる。【０１２１】
（４．４）ダイレクト・シーケンス法
シーケンスプライマーとしてＤＱＡ２ｉｎｔＬ０６ｖｅｒ２及びＱＡ００６を用いた（配列番号３６及び８；図６Ｂ）。CEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）をシーケンス反応に用いた。１μｌのＰＣＲ産物、２μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー、４μｌのDTCS Quick Start Mix（BECKMAN）、４μｌの2.5×Sequencing Buffer（Edge Biosystems）、及び滅菌水９μｌを混和し、９６℃で２０秒；５０℃で２０秒；６０℃で４分間の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理を行った。シーケンスＰＣＲ産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー（BECKMAN COULTER）用のSample Loading Solution（BECKMAN）２０μｌに溶解し、CEQTM 2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER）でシーケンスを行った。決定された塩基配列からプライマー部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、ＢＬＡＳＴを使用して対立遺伝子の塩基配列をデータベースに登録されている塩基配列と照合し、対立遺伝子を決定した。その結果を図８に示す。ＤＱＡ２−７のプライマーセットは、合計８種の対立遺伝子を決定することができた。【０１２２】
〔実施例７〕ワークショップの牛のＰＣＲ−ＳＢＴ法によるＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２エクソンの対立遺伝子の決定
実施例４で設計したプライマーを用いたＢｏＬＡ−ＤＱＡ１タイピング法を用いて第５回ＢｏＬＡワークショップにおいてＭＨＣハプロタイプの確認されている５２頭由来のＤＮＡサンプル（ＷＫシリーズ）のタイピングを行った（図１２Ａ〜Ｄ）。すなわち、図３Ａ及びＢに示したＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅されたＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２エクソンの塩基配列をダイレクト・シーケンス法により決定後、塩基配列の相同性に基づいて対立遺伝子を決定した。【０１２３】
（１）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１  １ｓｔＰＣＲ
１２０μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び１．２５ユニットのrTaq  DNA伸長酵素（TOYOBO）、１μｌのゲノムを含む２５μｌの1×rTaq緩衝液を９４℃で２分間の変性処理後、９４℃で２０秒；６０℃で２０秒、及び７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして１５サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２エクソンをＰＣＲ法により特異的に増幅できるＤＱＡ１ｉｎｔＬ２及びＤＱＡ１−６７７Ｒを用いた（配列番号１及び２；図３Ｂ）。これによって、４２６ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。【０１２４】
（２）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１  ２ｎｄＰＣＲ
１ｓｔＰＣＲ産物のうち１μｌを１２０μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び０．５ユニットのAmpliTaq Gold TM DNA伸長酵素（Applied Biosystems）を含む２４μｌのGene AmpR Gold緩衝液を９５℃で１０分間の変性処理後、９４℃で２０秒；６０℃で２０秒、及び７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、さらに内側を特異的に増幅できるＤＱＡｉｎｔＬ３及びＤＱＡ１ｅｘ２ＲＥＶｖｅｒ２．１を用いた（配列番号３及び４；図３Ｂ）。これによって、３５５ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。ＰＣＲ産物をエチヂウムブロマイド入り２％アガロースゲルで電気泳動をして、ＤＮＡが増幅されているか確認した。【０１２５】
（３）ダイレクト・シーケンス法
シーケンスプライマーとしてＤＱＡｉｎｔＬ３．１及びＤＱＡ１ｅｘ２ＲＥＶｖｅｒ１．１を用いた（配列番号５及び６；図３Ｂ）。CEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）をシーケンス反応に用いた。１μｌのＰＣＲ産物、２μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー、４μｌのDTCS Quick Start Mix（BECKMAN）、４μｌの2.5×Sequencing Buffer（Edge Biosystems）、及び滅菌水９μｌを混和し、９５℃で２０秒；５０℃で２０秒；６０℃で４分間の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理を行った。シーケンスＰＣＲ産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー（BECKMAN COULTER）用のSample Loading Solution（BECKMAN）２０μｌに溶解し、CEQTM 2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER）でシーケンスを行った。決定された塩基配列からプライマー部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、ＢＬＡＳＴを使用して対立遺伝子の塩基配列をデータベースに登録されている塩基配列と照合し、対立遺伝子を決定した。【０１２６】
その結果、全てのサンプルにおいてＤＱＡ１の増幅が確認できた（図１４Ａ〜Ｃ）。このうち１６サンプルがホモ、及び３６サンプルがヘテロであった。これにより、データベース上に登録された３１種類の対立遺伝子のうち１４種類が同定された。【０１２７】
〔実施例８〕ワークショップの牛のＰＣＲ−ＳＢＴ法によるＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２エクソンの対立遺伝子の決定
実施例６で設計したプライマーを用いたＢｏＬＡ−ＤＱＡ２タイピング法を用いて第５回国際ＢｏＬＡワークショップにてタイピングされた標準ＤＮＡ５２サンプルをＤＱＡ２−６又はＤＱＡ２−７の条件でＰＣＲ−ＳＢＴを行った（図１３Ａ〜Ｃ）。すなわち、図６Ａ及びＢに示したＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅されたＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２エクソンの塩基配列をダイレクト・シーケンス法により決定後、塩基配列の相同性に基づいて対立遺伝子を決定した。【０１２８】
（１）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２  １ｓｔＰＣＲ（ＤＱＡ２−６）
１２０μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び０．５ユニットのAmpliTaq Gold TM DNA伸長酵素（Applied Biosystems）、１μｌのゲノムを含む２５μｌのGene AmpR Gold緩衝液を９５℃で１０分間の変性処理後、９５℃で１分間；５５℃で３０秒、及び７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして１５サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２エクソンをＰＣＲ法により特異的に増幅できるＤＱＡ２ｉｎｔＬ０６及びＱＡ００６を用いた（配列番号７及び８；図６Ｂ）。これによって、２９２ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。【０１２９】
（２）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２  ２ｎｄＰＣＲ（ＤＱＡ２−６）
１ｓｔＰＣＲ産物のうち１μｌを同条件の試薬２４μｌに混和し、９５℃で１０分間の変性処理後、９５℃で１分間；６３℃で３０秒、及び７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして３５サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、さらに内側を特異的に増幅できるＤＱＡｉｎｔＬ０６及びＤＱＡ２ｅｘｏｎ２＜−１を用いた（配列番号７及び９；図６Ｂ）。これによって、２８３ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。ＰＣＲ産物をエチヂウムブロマイド入り２％アガロースゲルで電気泳動をして、ＤＮＡが増幅されているか確認した。【０１３０】
（３）ダイレクト・シーケンス法（ＤＱＡ２−６）
シーケンスプライマーとしてＤＱＡ２ｉｎｔＬ０６及びＤＱＡ２ｅｘｏｎ２＜−１を用いた（配列番号７及び９；図６Ｂ）。CEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）をシーケンス反応に用いた。１μｌのＰＣＲ産物、２μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー、４μｌのDTCS Quick Start Mix（BECKMAN）、４μｌの2.5×Sequencing Buffer（Edge Biosystems）、及び滅菌水９μｌを混和し、９５℃で２０秒；５０℃で２０秒；６０℃で４分間の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理を行った。シーケンスＰＣＲ産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー（BECKMAN COULTER）用のSample Loading Solution（BECKMAN）２０μｌに溶解し、CEQTM 2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER）でシーケンスを行った。決定された塩基配列からプライマー部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、ＢＬＡＳＴを使用して対立遺伝子の塩基配列をデータベースに登録されている塩基配列と照合し、対立遺伝子を決定した。【０１３１】
その結果、５２サンプル中４１サンプルにＤＱＡ２の増幅が認められ、そのうち２５サンプルがホモ、１６サンプルがヘテロであった（図１４Ａ〜Ｃ）。これにより、データベース上に登録されている１３種類の対立遺伝子のうち７種類が同定された。【０１３２】
（４）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２  １ｓｔＰＣＲ（ＤＱＡ２−７）
１５０μＭの各ｄＮＴＰ、４００ｎＭのプライマー、０．５ユニットのＥｘ  Ｔａｑ伸長酵素、１μｌのゲノムを含む２５μｌの１×Ｅｘ  Ｔａｑ緩衝液を９４℃で２分間の変性処理後、９４℃で２０秒；５６℃で２０秒、及び７２℃で２０秒の処理を１サイクルとして２０サイクルの処理の後、７２℃で５分間伸長させた。プライマーは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２イントロンをＰＣＲ法により特異的に増幅できるＤＱＡ２ｉｎｔｒｏｎ２Ｆ及びＱＡ００６を用いた（配列番号３５及び８；図６Ｂ）。これによって、２８３ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。【０１３３】
（５）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２  ２ｎｄＰＣＲ（ＤＱＡ２−７）
１ｓｔＰＣＲ産物のうち１μｌを同条件の試薬２４μｌに混和し、９４℃で２分間の変性処理後、９４℃で２０秒；５６℃で２０秒、及び７２℃で２０秒の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理の後、７２℃で５分間伸長させた。プライマーは、さらに内側を特異的に増幅できるＤＱＡｉｎｔＬ０６ｖｅｒ２及びＱＡ００６を用いた（配列番号３６及び８；図６Ｂ）。これによって、２８３ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。ＰＣＲ産物をエチヂウムブロマイド入り２％アガロースゲルで電気泳動をして、ＤＮＡが増幅されているか確認した。【０１３４】
（６）ＰＣＲ産物の精製（ＤＱＡ２−７）
２ｎｄＰＣＲ産物のうち５μｌとＥＸＯＳＡＰ（Amersham）２μｌを混和し、３７℃で１秒間；３７℃で１５分；８０℃で１秒間：８０℃で１５分のＥＸＯＳＡＰ処理を行った。なお、このＥＸＯＳＡＰは、大腸菌由来のエキソヌクレアーゼ（ＥｘｏＩ）及びシュリンプ由来アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）を含有するものである。このステップを行うことにより、余剰のプライマーが失活し、非常に良好な結果が得られる。【０１３５】
（７）ダイレクト・シーケンス法（ＤＱＡ２−７）
シーケンスプライマーとしてＤＱＡ２ｉｎｔＬ０６ｖｅｒ２及びＱＡ００６を用いた（配列番号３６及び８；図６Ｂ）。CEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）をシーケンス反応に用いた。１μｌのＰＣＲ産物、２μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー、４μｌのDTCS Quick Start Mix（BECKMAN）、４μｌの2.5×Sequencing Buffer（Edge Biosystems）、及び滅菌水９μｌを混和し、９６℃で２０秒；５０℃で２０秒；６０℃で４分間の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理を行った。シーケンスＰＣＲ産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー（BECKMAN COULTER）用のSample Loading Solution（BECKMAN）２０μｌに溶解し、CEQTM 2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER）でシーケンスを行った。決定された塩基配列からプライマー部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、ＢＬＡＳＴを使用して対立遺伝子の塩基配列をデータベースに登録されている塩基配列と照合し、対立遺伝子を決定した。【０１３６】
その結果、５２サンプル中４４サンプルにＤＱＡ２の増幅が認められ、そのうち２５サンプルがホモ、１９サンプルがヘテロであった（図１３Ａ〜Ｃ）。【０１３７】
〔実施例９〕ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２のＰＣＲ−ＳＢＴ法の精度確認
開発したタイピング方法の精度を確認するために、実施例８においてＤＱＡ２が増幅できなかったサンプルを既存の対立遺伝子決定法であるBallingallら(1997)の方法によってＰＣＲを行い、ＤＱＡ２が存在しないことを確認した。【０１３８】
（１）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２  １ｓｔＰＣＲ
２００μＭの各ｄＮＴＰ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び１ユニットのrTaq  DNA伸長酵素（TOYOBO）、１μｌのゲノムを含む５０μｌの１×ｒＴａｑ緩衝液を９４℃で２分間の変性処理後、９４℃で１分間；５５℃で３０秒、及び７２℃で１分間の処理を１サイクルとして１５サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１及びＤＱＡ２の第２エクソンをＰＣＲ法により特異的に増幅できるＱＡ００５及びＱＡ０１０を用いた（配列番号２１及び８；図６Ａ及びＢ）。【０１３９】
（２）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２  ２ｎｄＰＣＲ
１ｓｔＰＣＲ産物のうち２μｌを同条件の試薬４８μｌに混和し、９４℃で２分間の変性処理後、９４℃で１分間；５５℃で３０秒、及び７２℃で１分間の処理を１サイクルとして３５サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、ＤＱＡ２の第２エクソンのさらに内側を特異的に増幅できるＱＡ００５及びＱＡ００６を用いた（配列番号２１及び８；図６Ａ及びＢ）。これによって、２６３ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。ＰＣＲ産物をエチヂウムブロマイド入り２％アガロースゲルで電気泳動をして、ＤＮＡが増幅されているか確認した。【０１４０】
（３）ＰＣＲ産物のクローニング
ＰＣＲ産物を説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）で精製し、SK-T vector（実施例３参照）にライゲーションした。これをコンピテントセルXL10 Gold（Stratagene）にトランスフォーメーションして、アンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−ｇａｌを加えたＬＢプレートで培養し、カラーセレクションによってＤＮＡが挿入されたコロニーを選出した。これを、アンピシリンを加えた別のＬＢプレートに植菌するとともに、コロニーダイレクトＰＣＲ法を行った。【０１４１】
（４）コロニーダイレクトＰＣＲ
１２０μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び１ユニットのrTaq  DNA伸長酵素（TOYOBO）を含む２５μｌの1×rTaq緩衝液にコロニーを溶解した。９４℃で２分間の変性処理後、９４℃で２０秒；５５℃で３０秒；７２℃で３０秒の処理を１サイクルとして３５サイクルの処理の後、７２℃で２分間伸長させた。プライマーはＴ３及びＴ７を用いた（配列番号２５及び２６；図６Ｂ）。ＰＣＲ産物をエチヂウムブロマイド入り２％アガロースゲルで電気泳動し、バンドのサイズから挿入した２６３ｂｐのＤＮＡ断片と同じ断片が得られたと考えられるＰＣＲ産物をに対応するコロニーを２ｍｌの２×ＹＴ培地（Molecular Cloning-A Laboratory Manual、前掲）で培養した。これをアルカリ法でミニプレップし、Mag Extractor（TOYOBO）で精製した。【０１４２】
（５）ダイレクト・シーケンス法
シーケンスプライマーとしてＴ７を用いた（配列番号２５及び２６；図６Ｂ）。CEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）をシーケンス反応に用いた。プラスミドＤＮＡ１μｌ、及び滅菌水９μｌを混和し、９６℃、３分間処理をした後に２μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー、４μｌのDTCS Quick Start Mix（BECKMAN）、４μｌの2.5×Sequencing Buffer（Edge Biosystems）を混和し、９５℃で２０秒；５５℃で２０秒；６０℃で４分間の処理を１サイクルとして４０サイクルの処理を行った。シーケンスＰＣＲ産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー（BECKMAN COULTER）用のSample Loading Solution（BECKMAN）２０μｌに溶解し、CEQTM 2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER）でシーケンスを行った。決定された塩基配列からベクター部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、ＢＬＡＳＴを使用して増幅された対立遺伝子の塩基配列をデータベースに登録されている塩基配列と照合し、対立遺伝子を決定した。【０１４３】
ＤＱＡ２は、２ｎｄＰＣＲ産物の電気泳動像において増幅が確認できなかった１１サンプルのうち６サンプルをBallingallら(1997)の方法によってＰＣＲを行い、ＤＱＡ２が増幅されないことを確認した。また、ホモであると結論づけられた２５サンプルのうち９サンプルをBallingallら(1997)の方法によってＰＣＲし、産物をクローニングして塩基配列を決定した。これにより、対立遺伝子が１つであると証明した。【０１４４】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１４５】
本発明により、ＢｏＬＡ−ＤＱＡの対立遺伝子決定法が提供される。該方法は、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１及びＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の対立遺伝子を簡便、迅速かつ確実に決定することができるため、ＭＨＣと疾患感受性の関連についての研究などに有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１４６】
配列番号１〜３６：合成オリゴヌクレオチド
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【配列表】
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