(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のエノン還元活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドが挿入された組換えベクター。
【請求項４】
更にグルコース脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ホスホグルコン酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、またはグリセロール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入された、請求項３に記載の組換えベクター。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチド、または請求項３に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養する工程を含む請求項２に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項７】
請求項２に記載の蛋白質、該蛋白質を産生する微生物、および該微生物の処理物、からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質をα，β不飽和ケトンに作用させる工程を含む、α，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を選択的に還元する方法。
【請求項８】
該蛋白質を産生する微生物が、請求項６に記載の形質転換体である請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、α，β不飽和ケトン（エノン、enone）のα，β−不飽和結合の還元に有用な、新規なエノン還元酵素、該酵素をコードするDNA、該酵素の製造方法、該酵素ならびに該酵素に相同性を有する蛋白質を用いたα，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を選択的に還元する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ケトンは、有機合成における原料として極めて汎用性の高い化合物である。また、ケトンは、医薬品合成において重要な光学活性中間体である光学活性アルコール、光学活性アミンの原料としても重要な化合物である。これらのケトンの前駆体として、例えば、アルデヒドとケトンの縮合反応により得られるα，β−不飽和ケトンが有用である。
【０００３】
例えば、アセトアルデヒドと２−ブタノンを縮合することにより３−メチル−３−ペンテン−２−オン（3-methyl-3-penten-2-one; J. Amer. Chem. Soc., 81, 1117-1119 (1959)）を容易に調製することができる。
【０００４】
種々のケトンは、α，β−不飽和カルボニル化合物の、α，β−不飽和結合を選択的に還元することにより得ることができる。カルボニル基の還元反応を伴わずに、α，β−不飽和結合のみを選択的に還元する方法としては、Ni触媒やPd-C触媒を用いた水素添加反応などが知られている（「接触水素化反応」p135、東京化学同人 (1987)）。これらの方法は、反応を継続することによりカルボニル基も還元される、環境に対して負荷の大きい金属を触媒として利用する、高圧の水素を利用するなどの問題がある。カルボニル基の還元は、ケトンの収率の低下を意味している。
【０００５】
一方、生物学的な反応によってα，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を選択的に還元する方法としては、次のような生物を用いた方法が報告されている。
・植物細胞（J. Nat. Prod. 56, 1406-1409 (1993)）
・パン酵母（Tetrahedron Lett. 52, 5197-5200 (1978) , Bull. Chem. Soc. Jpn. 64, 3473-3475 (1991) , Tetrahedron Asym. 6, 2143-2144 (1995)他）
・カビ（J. Org. Chem. 47, 792-798 (1982)）
しかしこれらの方法では、カルボニル基の還元反応を伴う、反応性が低い、細胞の大量調製が困難など問題がある。また、これらの生物より各種のエノン還元酵素が報告されているが、それをコードする遺伝子をクローニングした報告はなく、これらの酵素を容易に、かつ、大量に調製することは困難であった。
【０００６】
この他にα，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素としては、以下のような酵素が報告されている。これらの酵素は、いずれも基質特異性が明らかにされていない、あるいはα，β−不飽和結合に対する選択的が低いといった理由により、工業的な利用には不向きである。
クロストリジウム・チオブチリカム（Clostridium tyrobutyricum）由来の２−エノエート還元酵素 (2-enoate reductase, E.C.1.3.1.31) （J. Biotechnol. 6, 13-29 (1987)）
クロストリジウム・クライベリ (Clostridium kluyveri) 由来のアクリロイル−CoA還元酵素 (acryloyl-CoA reductase) （Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366, 953-961 (1985) ）
パン酵母より精製されたエノン還元酵素ＹＥＲ−２（京都大学・河合ら、第4回生体触媒シンポジウム講演要旨集p58 (2001) ）
パン酵母より精製されたエノン還元酵素ＥＩ及びＥＩＩ（Eur. J. Biochem. 255, 271-278 (1998)）
タバコ（Nicotiana tabacum）細胞由来のエノン還元酵素（ベルベノン還元酵素（verberone reductaee, 別名ｐ９０）（J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1993, 1426-1427、Chem. Lett. 2000, 850-851）
タバコ（Nicotiana tabacum）細胞由来のエノン還元酵素であるカルボン還元酵素（別名、エノン還元酵素−Ｉ）（Phytochemistry 31, 2599-2603 (1992)）
タバコ（Nicotiana tabacum）細胞由来のエノン還元酵素であるエノン還元酵素−ＩＩ、ｐ４４、ｐ７４
植物の１種ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）やアスタシア・ロンガ（Astasia longa）から精製されたエノン還元酵素（Phytochemistry 49, 49-53 (1998)）
ラット肝臓より精製されたエノン還元酵素（Arch. Biochem. Biophys. 282, 183-187 (1990)）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、α，β−不飽和ケトンのα，β−不飽和結合を選択的に還元し、α，β−飽和ケトンを生成する酵素活性を有する新規なエノン還元酵素、該酵素をコードする遺伝子を提供することを課題とする。さらに、本発明は、該酵素並びに該酵素を生産する生物を利用してα，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を選択的に還元する方法の提供を課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、メチルビニルケトンから２−ブタノンを生成する酵素をスクリーニングした結果、クライベロマイセス・ラクティス (Kluyveromyces lactis) が目的とする活性を有することを見出した。次に、クライベロマイセス・ラクティスの菌体より目的とする活性を有する酵素を精製し、その性質を明らかにした。この酵素は、α，β−不飽和ケトンのα，β−不飽和結合をβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸依存的に選択的に還元すること、ケトンの還元活性を実質的に持たないことを確認した。更に本発明者らは、該酵素をコードする遺伝子をクローニングし、その構造を明らかにして、この遺伝子が新規な遺伝子であることを確認した。また、この遺伝子を異種の生物で高発現させて、α，β−不飽和ケトンのα，β−不飽和結合をNADPH依存的に還元する高い選択性と高い活性を併せ持つ形質転換株を得た。そしてこの酵素やそのホモログ、あるいはこれらを産生する細胞等によって、α，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合の選択的な還元が可能となることを見出し本発明を完成した。以下、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸はNADP、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドはNAD、そしてこれらの還元型をNADPHあるいはNADHと記載する。
【０００９】
すなわち本発明は、次のエノン還元酵素、該酵素をコードするDNA、該酵素の製造方法、該酵素ならびに該酵素に相同性を有する蛋白質を用いたα，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を選択的に還元する方法に関する。
〔１〕次の（Ａ）から（Ｃ）に示す理化学的性質を有するエノン還元酵素。
（Ａ）作用
NADPHを電子供与体として、α，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を還元し、対応する飽和炭化水素を生成する。
（Ｂ）基質特異性
(1)α，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を還元するが、実質的にケトンの還元活性は無い。
(2)電子供与体としては、NADHよりもNADPHに対して、有意に高い活性を有する。
(3)ケトンからβ位炭素の２つの置換基がともに水素でない基質に対しては実質的に作用しない。
(4)炭素−炭素２重結合が環状構造中に存在する基質に対しては実質的に作用しない。
（Ｃ）至適pH
pH ６．５−７．０
〔２〕更に次に示す理化学的性質（Ｄ）−（Ｅ）を有する〔１〕に記載のエノン還元酵素。
（Ｄ）至適温度
３７−４５℃
（Ｅ）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム −ポリアクリルアミドゲル電気泳動により約４３，０００。ゲル濾過により約４２，０００。
〔３〕クライベロマイセス（Kluyveromyces）属に由来する〔１〕に記載の新規エノン還元酵素。
〔４〕クライベロマイセス属に属し、〔１〕に記載のエノン還元酵素生産能を有する微生物を培養することを特徴とする〔１〕に記載のエノン還元酵素を取得する方法。
〔５〕クライベロマイセス属に属する微生物が、クライベロマイセス・ラクティス（Kluyveromayces lactis）である、〔４〕に記載の方法。
〔６〕下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のエノン還元活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
〔７〕〔６〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
〔８〕〔６〕に記載のポリヌクレオチドが挿入された組換えベクター。
〔９〕更にNADPを補酵素とする酸化還元反応を触媒することができる脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入された、〔８〕に記載の組換えベクター。
〔１０〕〔６〕に記載のポリヌクレオチド、または〔８〕に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換体。
〔１１〕〔１０〕に記載の形質転換体を培養する工程を含む〔７〕に記載の蛋白質の製造方法。
〔１２〕下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の、エノン還元活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：３、配列番号：５、および配列番号：７からなる群から選択されたいずれかに記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：４、配列番号：６、および配列番号：８からなる群から選択されたいずれかに記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：４、配列番号：６、および配列番号：８からなる群から選択されたいずれかに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：３、配列番号：５、および配列番号：７からなる群から選択されたいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：４、配列番号：６、および配列番号：８からなる群から選択されたいずれかに記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
〔１３〕〔１２〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
〔１４〕〔１２〕に記載のポリヌクレオチドが挿入された組換えベクター。
〔１５〕更にNADPを補酵素とする酸化還元反応を触媒することができる脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入された、〔１４〕に記載の組換えベクター。
〔１６〕〔１２〕に記載のポリヌクレオチド、または〔１４〕に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換体。
〔１７〕〔１６〕に記載の形質転換体を培養する工程を含む〔１３〕に記載の蛋白質の製造方法。
〔１８〕〔１〕に記載のエノン還元酵素、〔７〕に記載の蛋白質、〔１３〕に記載の蛋白質、該酵素または蛋白質を産生する微生物、および該微生物の処理物、からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質をα，β不飽和ケトンに作用させる工程を含む、α，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を選択的に還元する方法。
〔１９〕該酵素または蛋白質を産生する微生物が、〔１１〕および／または〔１６〕に記載の形質転換体である〔１８〕に記載の方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、次の（Ａ）−（Ｃ）に示す理化学的性質を有する酵素を提供する。
（Ａ）作用
NADPHを電子供与体として、α，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を還元し、対応する飽和炭化水素を生成する。
（Ｂ）基質特異性
(1)α，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を還元するが、実質的にケトンの還元活性は無い。
(2)電子供与体としては、NADHよりもNADPHに対して、有意に高い活性を有する。
(3)ケトンからβ位炭素の２つの置換基がともに水素でない基質に対しては実質的に作用しない。
(4)炭素−炭素２重結合が環状構造中に存在する基質に対しては実質的に作用しない。
（Ｃ）至適pH
pH ６．５−７．０
【００１１】
本発明のエノン還元酵素は、望ましくは更に次の理化学的的性質（Ｄ）−（Ｅ）を備える。
（Ｄ）至適温度
３７−４５℃
（Ｅ）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、SDS-PAGEと略す）により約４３，０００。ゲル濾過により約４２，０００。
【００１２】
本発明の酵素のNADPHに対する反応性がNADHに対する反応性に比較して有意に高いとは、少なくとも２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上高い活性を言う。NADPHとNADHに対する反応性は、実施例に示すような方法によって比較することができる。すなわち、同一のα，β−不飽和ケトンを基質とし、両者を用いてケトンを生成させる。このときに消費されるNADPH、あるいはNADHの量を比較すれば、反応性を比較することができる。
【００１３】
また本発明において、エノン還元酵素が実質的にケトンの還元活性が無いこと、あるいは、エノン還元酵素が基質に対して実質的に作用しないこととは、具体的には、メチルビニルケトンにおけるオレフィンに対する還元活性の１％以下であることを言う。
【００１４】
本発明の酵素は、該酵素を産生する微生物から通常の蛋白質の精製方法により、精製することができる。例えば、菌体を破砕後、プロタミン硫酸沈澱を行い、その遠心分離上清を硫酸アンモニウムを用いて塩析し、更に、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過などを組み合わせることにより、精製することができる。
【００１５】
本発明において、エノンに対する還元活性は、次のようにして確認することができる。本発明においてエノンとは、α，β不飽和ケトンを意味する。
エノンに対する還元活性測定法:
５０mM リン酸カリウム緩衝液（pH ６．５）、０．２mM NADPH、２０mM メチルビニルケトン及び酵素を合む反応液中３０℃で反応させ、NADPHの減少にともなう３４０ nmの吸光度の減少を測定する。１Uは、１分間に１μmolのNADPHの減少を触媒する酵素量とした。また、蛋白質の定量は、バイオラッド製蛋白質アッセイキットを用いた色素結合法により行った。
【００１６】
上記のような理化学的性状を持つエノン還元酵素は、たとえばクライベロマイセス属酵母の培養物より精製することができる。クライベロマイセス属酵母としては、クライベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）が特に本発明によるエノン還元酵素の産生能に優れる。本発明のエノン還元酵素を得るために利用することができるクライベロマイセス・ラクティスは、たとえば、ＩＦＯ ０４３３、ＩＦＯ １０１２、ＩＦＯ １２６７、ＩＦＯ １６７３、ＩＦＯ １９０３として財団法人発酵研究所より入手することができる。
【００１７】
上記微生物は、YM培地等の真菌の培養に用いられる一般的な培地で培養される。十分に増殖させた後に菌体を回収し、２−メルカプトエタノールやフェニルメタンフルホニルフルオリド等の還元剤やプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液から、蛋白質の溶解度による分画（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより精製することができる。たとえば、フェニル−セファロースを用いた疎水クロマトグラフィー、MonoQを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、フェニル−スーパーロースを用いた疎水クロマトグラフィー等を経て電気泳動的にほぼ単一バンドにまで精製することができる。
【００１８】
クライベロマイセス・ラクティスから精製することができる本発明によるエノン還元酵素は、上記理化学的性質（Ａ）−（Ｃ）、および（Ｄ）−（Ｅ）を有する。クライベロマイセス・ラクティスから精製することができる本発明によるエノン還元酵素は、公知のα，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素に対して、明らかに新規な酵素である。
【００１９】
たとえば、α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素としては、クロストリジウム・チオブチリカム（Clostridium tyrobutyricum）由来の２−エノエート還元酵素 (2-enoate reductase, E.C.1.3.1.31) が知られている。本酵素は、NADH依存的に（Ｅ）−２−メチル−２−ブテン酸を還元し、（Ｒ）−２−メチル酪酸を生成する（J. Biotechnol. 6, 13-29 (1987)）。また本酵素は、カルボニル残基がカルボン酸、アルデヒド、あるいはケト酸の場合に基質とするが、ケトン体に対する活性は報告されていない。更に、分子量は、ゲル濾過において８０万−９４万であり、本発明の酵素（SDS-PAGEで43,000、ゲル濾過で42,000）とは明確に異なる。
【００２０】
また、クロストリジウム・クライベリ (Clostridium kluyveri) 由来のアクリロイル−CoA還元酵素 (acryloyl-CoA reductase) がエチルビニルケトン還元活性を有することが報告されている（Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366, 953-961 (1985) ）が、本酵素は補酵素として還元型メチルビオローゲンを利用し、分子量はゲル濾過で28,400、SDS-PAGEで14,200であり本発明の酵素とは異なる。
【００２１】
また、パン酵母より複数のエノン還元酵素が精製され報告されている。京都大学の河合らは、パン酵母よりエノン還元酵素（ＹＥＲ−２）を精製し、酵素化学的性質を報告している（第4回生体触媒シンポジウム講演要旨集p58 (2001) ）。ＹＥＲ−２は、反応の至適pHが７．５であり本発明の酵素（至適pH６．５−７．０）とは明らかに異なる。Wannerらは、同じパン酵母より2種類のエノン還元酵素（ＥＩ及びＥＩＩ）の精製と性質を報告している（Eur. J. Biochem. 255, 271-278 (1998)）。ＥＩＩは補酵素としてNADHを利用し、ＥＩはSDS-PAGEにより34,000と37,000のサブニットからなる分子量75,000のヘテロダイマーであり、本発明の酵素とは異なる。
【００２２】
植物では、タバコ（Nicotiana tabacum）の細胞より多数のエノン還元酵素（ベルベノン還元酵素（別名ｐ９０）、カルボン還元酵素（別名、エノン還元酵素−Ｉ）、エノン還元酵素−ＩＩ、ｐ４４、ｐ７４）が精製され、その性質が報告されている。ベルベノン還元酵素 (verberone reductaee, ｐ９０) 、ｐ４４は環状のα，β−不飽和ケトンに対する活性を有すること（J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1993, 1426-1427、Chem. Lett. 2000, 850-851）から本発明の酵素とは異なる。カルボン (carbone) 還元酵素は補酵素としてNADHを利用すること（Phytochemistry 31, 2599-2603 (1992)）、エノン還元酵素−ＩＩは、α，β−不飽和ケトンのβ位炭素に水素を有さない化合物（ (R) -pulegone）も基質になること（Phytochemistry 31, 2599-2603 (1992)）、ｐ７４は分子量が74,000であることから、これらの酵素は明らかに本発明の酵素とは異なる。
【００２３】
また、植物の１種ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）やアスタシア・ロンガ（Astasia longa）からもエノン還元酵素が精製されている（Phytochemistry 49, 49-53 (1998)）が、これらの酵素はいずれも補酵素としてNADHを利用するため、本発明の酵素とは異なる。
【００２４】
また、動物ではラット肝臓よりエノン還元酵素が精製されている（Arch. Biochem. Biophys. 282, 183-187 (1990)）。この酵素は、分子量39,500のモノマー酵素だが、環状基質への反応性、β位２置換基質への反応性、至適pHなどが報告されていない。
【００２５】
本発明は、エノン還元酵素およびそのホモログをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明において、ポリヌクレオチドは、DNAやRNAのような天然に存在するポリヌクレオチドであることもできるし、人工的に合成されたヌクレオチド誘導体を含むポリヌクレオチドであっても良い。
【００２６】
本発明のエノン還元酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば配列番号：１に示す塩基配列を含む。配列番号：１に示す塩基配列は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を含む蛋白質をコードしており、このアミノ酸配列を含む蛋白質は、本発明によるエノン還元酵素の好ましい態様を構成する。
なお本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードすることができるあらゆる塩基配列を含む。１つのアミノ酸に対応するコドンは、1〜6存在することから、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNAは、配列番号：１のみとは限らず、配列番号：１に記載されるDNAと等価とみなすことができるDNAは複数存在する。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、エノン還元酵素活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む。当業者であれば、配列番号：１に記載のDNAに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol. 100, pp.448 (1983), Molecular Cloning 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することが可能である。
【００２８】
また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ、エノン還元酵素活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：１に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択したDNAをプローブDNAとし、たとえばECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（wash：42℃、0.5x SSCを含むprimary wash buffer）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
【００２９】
ストリンジェントな条件下で配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドには、配列番号：１と類似する塩基配列を含むものが含まれる。このようなポリヌクレオチドは、配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードしている可能性が高い。したがって当業者は、このようなポリヌクレオチドの中から、本明細書の記載に基づいて、エノン還元酵素活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを選択することができる。
【００３０】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%または８０%、より好ましくは９０%以上のホモロジーを有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む。蛋白質のホモロジー検索は、たとえばSWISS-PROT、PIRなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベースやDNA Databank of JAPAN(DDBJ)、EMBL、Gene-BankなどのDNAに関するデータベース、DNA配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、FASTA programやBLAST programなどを用いて、たとえば、インターネット上で行うことができる。配列番号：２に記載のアミノ酸配列を用いてSWISS-PROTを対象にBLAST programを用いてホモロジー検索を行った結果、既知の蛋白質の中でもっとも高いホモロジーを示したのは、Cochliobolus carbonum toxD proteinの36%(Identity)、54%(Positives)であった。本発明の60%以上のホモロジーとは、たとえば、BLAST programを用いたPositiveの相同性の値を示す。
【００３１】
このBLAST検索において、本発明のエノン還元酵素にホモロジーを有する機能未知の予想オープンリーディングフレーム（ORF）が見いだされた。具体的には、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のゲノム解析の結果より得られた3種類の予想ORFであり、それぞれYNN4、YL60、およびYCZ2と命名されている。これらの予想アミノ酸配列の本発明のエノン還元酵素に対するホモロジーは、54%, 51%, 53% (identity) , 69%, 68%, 69% (Positive) であった。これらの予想蛋白質が本発明のエノン還元酵素活性を有するか否かを明らかにするために、DDBJに登録されているDNA配列を基にプライマーを合成し、サッカロマイセス・セレビジエのゲノムDNAより予想ORF部分をPCRクローニングした。各ORFを発現ベクターに導入し、大腸菌を形質転換して得られた形質転換株を培養して、それぞれの蛋白質を発現させた結果、YNN4、YL60、およびYCZ2がいずれもエノン還元活性を有することを確認した。これらの結果は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上のホモロジーを有する蛋白質が、本発明のエノン還元活性を有すると推測するに十分な蓋然性があることを示している。YNN4、YL60、およびYCZ2の塩基配列、およびアミノ酸配列を、以下の配列番号に示した。これらのORFによってエノン還元酵素活性を有する蛋白質がもたらされることは知られていない。
0004688313.tif 000002
配列番号：３、配列番号：５、および配列番号：７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドに含まれる。またこれらのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列、配列番号：４、配列番号：６、および配列番号：８に記載されたアミノ酸配列をコードする全ての塩基配列からなるポリヌクレオチドは、本発明に含まれる。更に、配列番号：４、配列番号：６、および配列番号：８に記載されたアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、本発明に含まれる。
【００３２】
すなわち本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：４、配列番号：６、および配列番号：８に記載のアミノ酸配列のいずれかにおいて、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、エノン還元酵素活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む。このようなポリヌクレオチドは、先に述べたような方法に基づいて取得することができる。
また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：３、配列番号：５、および配列番号：７に記載の塩基配列のいずれかからなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ、エノン還元酵素活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：３、配列番号：５、および配列番号：７に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択したDNAをプローブDNAとし、たとえばECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（wash：42℃、0.5x SSCを含むprimary wash buffer）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
【００３３】
ストリンジェントな条件下で配列番号：３、配列番号：５、あるいは配列番号：７に記載の塩基配列からなるDNAとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドには、これらの塩基配列と類似する塩基配列を含むものが含まれる。このようなポリヌクレオチドは、配列番号：４、配列番号：６、あるいは配列番号：８のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードしている可能性が高い。
【００３４】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：４、配列番号：６、あるいは配列番号：８に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%または８０%、より好ましくは９０%以上のホモロジーを有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む。蛋白質のホモロジー検索は、既に述べたような方法によって行うことができる。
【００３５】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のエノン還元酵素の遺伝子工学的な製造に有用である。あるいは本発明のポリヌクレオチドによって、α，β−不飽和ケトンからのα，β―飽和ケトンの製造に有用なエノン還元酵素活性を有する微生物を遺伝子工学的に作り出すことができる。
【００３６】
本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有し、かつエノン還元酵素活性を有する蛋白質、及びそのホモログを含む。配列番号：２に示すアミノ酸配列を含む蛋白質は、本発明によるエノン還元酵素の好ましい態様を構成する。
【００３７】
本発明のエノン還元酵素のホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含む。当業者であれば、配列番号：１に記載のDNAに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりエノン還元酵素のホモログをコードするDNAを得ることができる。そのエノン還元酵素のホモログをコードするDNAを宿主に導入して発現させることにより、配列番号：２に記載のエノン還元酵素のホモログを得ることが可能である。
【００３８】
さらに、本発明のエノン還元酵素のホモログとは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%または８０%、より好ましくは９０%以上のホモロジーを有する蛋白質をいう。蛋白質のホモロジー検索は、たとえばSWISS-PROT、PIRなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベースやDNA Databank of JAPAN(DDBJ)、EMBL、Gene-BankなどのDNAに関するデータベース、DNA配列を元にした予想したアミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、FASTA programやBLAST programなどを用いて、たとえば、インターネット上で行うことができる。配列番号：２に記載のアミノ酸配列を用いてDDBJを対象にBLAST programを用いてホモロジー検索を行った結果、既知の蛋白質の中でもっとも高いホモロジーを示したのは、Cochliobolus carbonum toxD proteinの36%(Identity)、54%(Positives)であった。。本発明の６０％以上のホモロジーとは、たとえば、BLAST programを用いたPositiveの相同性の値を示す。
【００３９】
このBLAST検索において、本発明のエノン還元酵素にホモロジーを有する機能未知の予想オープンリーディングフレーム（ORF）が見いだされた。具体的には、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のゲノム解析の結果より得られた3種類の予想ORFであり、それぞれYNN4、YL60、およびYCZ2と命名されている。これらの予想アミノ酸配列の本発明のエノン還元酵素に対するホモロジーは、54%, 51%, 53% (identity) , 69%, 68%, 69% (Positive) であった。これらの予想蛋白質が本発明のエノン還元酵素活性を有するか否かを明らかにするために、DDBJに登録されているDNA配列を基にプライマーを合成し、サッカロマイセス・セレビジエのゲノムDNAより予想ORF部分をPCRクローニングした。各ORFを発現ベクターに導入し、大腸菌を形質転換して得られた形質転換株を培養して、それぞれの蛋白質を発現させた結果、YNN4、YL60、およびYCZ2がいずれもエノン還元活性を有することを確認した。これらの結果は、配列番号：２に６０％以上のホモロジーを有する蛋白質が、本発明のエノン還元活性を有すると推測するに十分な蓋然性があることを示している。
【００４０】
すなわち、配列番号：４、配列番号：６、および配列番号：８に記載のアミノ酸配列のいずれかからなるアミノ酸配列を含む蛋白質は、本発明のエノン還元酵素のホモログの好ましい態様を構成する。
【００４１】
本発明のエノン還元酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば、以下のような方法によって単離することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：１に記載された塩基配列に基づいて他の生物からPCRクローニングやハイブリダイズによって単離することもできる。配列番号：１に記載の塩基配列は、クライベロマイセス・ラクティスより単離された遺伝子のものである。配列番号：１に記載の塩基配列を利用してＰＣＲ用プライマーをデザインし、クライベロマイセス属酵母やサッカロマイセス属酵母等の微生物から、エノン還元酵素活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。たとえば、サッカロマイセス・セレビジエよりＰＣＲによって単離することができる配列番号：３、配列番号：５、並びに配列番号：７に記載された塩基配列を有するポリヌクレオチドが、本発明のエノン還元酵素活性を有する蛋白質をコードしていることは、既に述べたとおりである。あるいは、これらの塩基配列が明らかにされたポリヌクレオチドをプローブとして、この他の種に由来し、同様の酵素活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを単離することもできる。
【００４２】
また前記理化学的性質（Ａ）−（Ｃ）を有するエノン還元酵素を単離し、その構造的特徴をもとに、本発明のポリヌクレオチドを得ることもできる。本発明の酵素を精製後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析し、さらに、リジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの酵素により切断後、逆相液体クロマトグラフィーなどによりペプチド断片を精製後プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列を解析することにより複数のアミノ酸配列を決めることができる。
【００４３】
部分的なアミノ酸配列が明らかになれば、それをコードする塩基配列を推定することができる。推定された塩基配列、あるいは配列番号：１に示す塩基配列を元にPCR用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体DNAもしくは、cDNAライブラリーを鋳型として、PCRを行うことにより本発明のDNAの一部を得ることができる。
【００４４】
さらに、得られたDNA断片をプローブとして、酵素生産株の染色体DNAの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやcDNAライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明のDNAを得ることができる。
【００４５】
また、PCRにより得られたDNA断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のDNAの外側に伸長させるためのPCRプライマーを設計し、酵素生産株の染色体DNAを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応によりDNAを鋳型として逆PCRを行うことにより（Genetics 120, 621-623 (1988)）、また、RACE法（Rapid Amplification of cDNA End、「PCR実験マニュアル」p25-33, HBJ出版局）などにより本発明のDNAを得ることも可能である。
なお本発明のDNAは、以上のような方法によってクローニングされたゲノムDNA、あるいはcDNAの他、合成によって得ることもできる。
【００４６】
このようにして単離された、本発明によるエノン還元酵素をコードするDNAを公知の発現ベクターに挿入することにより、エノン還元酵素発現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明のエノン還元酵素を組換え体から得ることができる。
【００４７】
本発明の組換えベクターは、本発明のエノン還元酵素をコードするDNAとともにNADPを補酵素とする酸化反応を触媒する脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入された組換えベクターも含む。これらの脱水素酵素として、グルコース脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ホスホグルコン酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素などが挙げられる。これらの酵素は、本発明のエノン還元酵素の補酵素であるNADPHを、NADP+ から再生する際に利用することができる。
【００４８】
本発明においてNADPHを補酵素とするエノン還元酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、NADPHを補酵素とするエノン還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNAを含む組み換えベクターにより形質転換され、NADPHを補酵素とするエノン還元酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、たとえば以下のような微生物を示すことができる。
エシェリヒア(Escherichia)属
バチルス(Bacillus)属
シュードモナス(Pseudomonas)属
セラチア(Serratia)属
ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属
コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属
ストレプトコッカス(Streptococcus)属
ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス(Rhodococcus)属
ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス(Saccharomyces)属
クライベロマイセス(Kluyveromyces)属
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属
チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属
ヤロウイア(Yarrowia)属
トリコスポロン(Trichosporon)属
ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属
ピキア(Pichia)属
キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ(Neurospora)属
アスペルギルス(Aspergillus)属
セファロスポリウム(Cephalosporium)属
トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ
【００４９】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。微生物中などにおいて、本発明のNADP＋を補酵素とするエノン還元酵素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのDNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488 (1992)、などに詳細に記述されている。
【００５０】
例えばエシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとして、pBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、trc (lac、trpの融合)、λファージ PL、PRなどに由来するプロモーターなどが利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーターなどを用いることができる。これらの中で、市販のpSE420（Invitrogen製）のマルチクローニングサイトを一部改変したベクターpSE420D（特開2000-189170に記載）が好適に利用できる。
【００５１】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとしてapr(アルカリプロテアーゼ)、npr(中性プロテアーゼ)、amy(α−アミラーゼ)などが利用できる。
【００５２】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)などで宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む)pKT240などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子などが利用できる。
【００５３】
ブレビバクテリウム属特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
【００５４】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターが利用可能である。
【００５５】
ストレプトコッカス(Streptococcus)属においては、pHV1301(FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985)）などがプラスミドベクターとして利用可能である。
【００５６】
ラクトバチルス(Lactobacillus)属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J. Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００５７】
ロドコッカス(Rhodococcus)属においては、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)から単離されたプラスミドベクターが使用可能である (J. Gen. Microbiol. 138,1003 (1992) )。
【００５８】
ストレプトマイセス(Streptomyces)属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gene 103,97-99 (1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1995) )が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア(Streptomyces virginiae)においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53 (1997) ）。
【００５９】
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae) においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームDNAとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵素)、GAPDH(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)、PHO(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシダーゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノラーゼ)などのプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００６０】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390 (1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームDNAなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００６１】
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS (自律複製に関与する遺伝子)及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 (1987)）。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００６２】
チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces)においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ (Zygosaccharomyces rouxii)由来の pSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990)）などが利用可能である。
【００６３】
ピキア(Pichia)属においては、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 (PARS1、PARS2)などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能な AOX など強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)）。また、ピキア・アンガスタ(Pichia angusta、旧名ハンゼヌラ・ポリモルファ Hansenula polymorpha)において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (1991)）。また、メタノールなどで誘導される AOX（アルコールオキシダーゼ）、FDH(ギ酸脱水素酵素)のプロモーターなどが利用可能である。
【００６４】
キャンディダ(Candida)属においては、キャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・ウチルス (Candida utilis) などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ARSがクローニングされ（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)）、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平 08-173170）。
【００６５】
アスペルギルス(Aspergillus)属においては、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)）。
【００６６】
トリコデルマ(Trichoderma)属においては、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnology 7, 596-603 (1989)）。
【００６７】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。
【００６８】
また、上記の方法で得られる本発明のエノン還元酵素を発現する形質転換体は、本発明の酵素の製造や、以下に述べるα，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合の選択的還元によるα，β−飽和ケトンの製造に用いることができる。
【００６９】
すなわち本発明は、前記エノン還元酵素、該酵素または蛋白質を産生する微生物、および該微生物の処理物、からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質をα，β不飽和ケトンに作用させる工程を含む、α，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を選択的に還元する方法に関する。本発明の酵素、酵素を含む培養物、その処理物が反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることができる。
【００７０】
本発明の方法において、エノン還元酵素としては、配列番号：２に記載されたアミノ酸配列からなる蛋白質、そのホモログ、あるいは前記理化学的性質（Ａ）−（Ｃ）を有するエノン還元酵素を用いることができる。エノン還元酵素は、精製されたものの他、粗精製酵素として用いることもできる。更に本発明においては、エノン還元酵素として、エノン還元酵素の産生能を有する細胞を用いることもできる。本発明において使用するエノン還元酵素生産能を有する細胞は、NADPH依存性エノン還元酵素生産能を有するクライベロマイセス属に属するすべての菌株、突然変異株、変種、遺伝子操作技術の利用により作成された本発明の酵素生産能を獲得した形質転換体を含む。
【００７１】
なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。反応溶液は、基質や酵素反応に必要な補酵素であるNADPHを酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。本発明におけるエノン還元酵素を含む微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。
【００７２】
本発明におけるα，β−不飽和ケトンは限定されない。たとえば、次の一般式Ｉで表される化合物を、α，β−不飽和ケトンとして示すことができる。
【化１】
0004688313.tif 000003
（式中、R1は、置換または無置換のアルキル基、置換または無置換のアルケニル基、置換または無置換のアラルキル基、置換または無置換のアルコキシ基を示す。R2は水素もしくは、置換又は無置換の短鎖アルキル基を示，R3は、置換又は無置換の短鎖アルキル基を示す。）
より具体的には、メチルビニルケトン、エチルビニルケトン、３−ペンテン−２−オン、３−メチル−３−ペンテン−２−オン等が好適に用いられる。
【００７３】
更に、本発明の酵素、または、該酵素を産生する微生物もしくはその処理物をα−置換を有するα,β−不飽和ケトンに作用させることにより、光学活性な飽和ケトンの合成にも利用できる。
【００７４】
前記本発明によるケトン製造方法においては、NADPHの再生系を組み合わせることができる。エノン還元酵素による還元反応に付随して、NADPHからNADP+が生成する。NADP+からNADPHへの再生は、微生物の含有するNADP+からNADPHを再生する酵素（系）によって行うことができる。これらNADP＋還元能は、反応系にグルコースまたはエタノールを添加することにより、増強することが可能である。また、NADP+からNADPHを生成する能力を有する酵素、例えば、グルコース脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ホスホグルコン酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素などを含む微生物、その処理物、ならびに部分精製もしくは精製酵素を用いてNADPHの再生を行うことができる。例えば、上記グルコース脱水素酵素の場合には、グルコースからδ−グルコノラクトンへの変換を利用することにより、NADPHの再生が行われる。
【００７５】
これらのNADPH再生に必要な反応を構成する成分は、本発明によるケトンの製造のための反応系に添加、もしくは固定化したものを添加することができる。あるいはNADPHの交換が可能な膜を介して接触させることができる。
【００７６】
また、本発明のDNAを含む組換えベクターで形質転換した微生物を、生存した状態で前記ケトンの製造方法に利用する場合には、NADPH再生のための付加的な反応系を不要とできる場合がある。すなわち、NADPH再生活性の高い微生物を宿主として用いることにより、形質転換体を用いた還元反応において、NADPH再生用の酵素を添加することなく効率的な反応が行える。さらに、NADPH再生に利用可能なグルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などの遺伝子を、本発明のNADPH依存性エノン還元酵素をコードするDNAと同時に宿主に導入することによって、より効率的なNADPH再生酵素とNADPH依存性エノン還元酵素の発現、還元反応を行うことも可能である。これらの２つもしくはそれ以上の遺伝子の宿主への導入には、大腸菌においては不和合性をさけるために複製起源のことなる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組み換えベクターにより宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに両遺伝子を導入する方法、片方、もしくは、両方の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用することができる。
【００７７】
本発明におけるNADPH再生に利用可能なグルコース脱水素酵素として、バシラス・サブチルス（Bacillus subtilis）に由来するグルコース脱水素酵素を示すことができる。この酵素をコードする遺伝子は既に単離されている。あるいは既に明らかにされているその塩基配列に基づいて、PCRやハイブリダイズスクリーニングによって、当該微生物から取得することもできる。
【００７８】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００７９】
本発明の酵素を用いた還元反応は、水中で、あるいは水に溶解しにくい有機溶媒と水との２相中で実施することができる。水に溶解しにくい有機溶媒としては、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、n-ヘキサン、イソオクタンなどを用いることができる。あるいは、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の有機溶媒と水性媒体との混合系中で行うこともできる。
【００８０】
本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクター等を利用して行うことも可能である。特に、本反応の基質となるα,β−不飽和ケトンは水に対して難溶性の物が多いために、ポリプロピレンなどの疎水性の膜を介して本発明の酵素、本発明の酵素を含む微生物、その処理物を含む水相と基質α,β−不飽和ケトンを含む有機溶媒相を接触させ、反応させることにより基質及び生成物による阻害作用を低減させることができる。
【００８１】
本発明のエノン還元酵素による酵素反応は、以下の条件で行うことができる。
・反応温度：4-55℃、好ましくは10-45℃
・pH：4-9、好ましくは5.5-8、さらに好ましくはpH6.5-7.0
・基質濃度：0.01-90%、好ましくは0.1-20%
【００８２】
反応系には必要に応じて補酵素NADP＋またはNADPHを0.001 mM-100 mM、好ましくは、0.01-10 mM添加することができる。また、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ましい。
【００８３】
NADPH再生のために反応系に添加される化合物、例えばグルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくは2-プロパノール、グルタミン酸脱水素酵素を利用する場合のＬ−グルタミン酸、リンゴ酸脱水素酵素を利用する場合のＬ−リンゴ酸、等は、基質α，β−不飽和ケトンに対してモル比で0.1-20、好ましくは0.5-5倍過剰に添加することができる。NADPH再生用の酵素、例えばグルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）等は、本発明のNADPH依存性エノン還元酵素に比較して酵素活性で0.1-100倍、好ましくは0.5-20倍程度添加することができる。
【００８４】
本発明のα，β−不飽和ケトンの還元により生成するケトンの精製は、菌体、蛋白質の遠心分離、膜処理等による分離、溶媒抽出、蒸留、クロマトグラフィー等を適当に組み合わせることにより行うことができる。
【００８５】
これら各種合成反応に利用する本発明の酵素は、精製酵素に限定されず、部分精製酵素、本酵素を含む微生物菌体、その処理物も含まれる。なお本発明における処理物とは、菌体、精製酵素、あるいは部分精製酵素などを様々な方法で固定化処理したものを総称して示す用語である。
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８６】
【実施例】
［実施例１］（エノン還元酵素の精製）
クライベロマイセス・ラクティス ＩＦＯ １２６７株を１．２LのYM培地（グルコース２０g/L、酵母エキス３g/L、麦芽エキス３g/L、ペプトン５g/L、pH ６．０）で培養し、遠心分離により菌体を調製した。得られた湿菌体を５０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）、０．０２％２−メルカプトエタノール及び２mMフェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF）で澱懸し、ビードビーター（Biospec社製）により破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン硫酸を添加し、遠心分離により除核酸した上清を得た。その上清に硫安を３０％飽和になるまで添加し、３０％硫安を含む標準緩衝液（１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．５）、０．０１％ ２−メルカプトエタノール、１０％ グリセロール）で平衡化したフェニル−セファロースHP（２．６cm×１０cm）に添加し、硫安濃度を３０％−０％の勾配溶出を行った。
【００８７】
NADPH依存性のメチルビニルケトン還元活性は、勾配溶出部分に２つのピークがみられた。これらのピークのうち後方に溶出したピーク部分を回収し、限外濾過により濃縮した。
濃縮した酵素液を標準緩衝液に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したMonoQ（０．５ cm× ５cm）に添加した。標準緩衝液でカラムを洗浄した後、０−０．５M塩化ナトリウムの勾配溶出を行った。溶出した活性画分を回収し、限外濾過により濃縮した。
濃縮酵素液に硫安を３０％飽和添加し、３０％飽和硫安を含む標準緩衝液で平衡化したフェニル−スーパーロース（０．５cm×５cm）に添加した。同緩衝液で洗浄後、３０％−０％飽和硫安で勾配溶出を行った。溶出した活性画分を回収した。
【００８８】
フェニル−スーパーロースにより得られた活性画分を、SDS-PAGEにより解析した結果、単一バンドであった（図１）。精製酵素の比活性は約３１．７ U/mgであった。精製の要約を表１に示す。
【００８９】
【表１】
0004688313.tif 000004
【００９０】
［実施例２］（エノン還元酵素の分子量測定）
実施例１で得られた酵素のサブユニットの分子量をSDS-PAGEにより求めた結果、４．３万であった。また、スーパーデックスG200のゲルろ過カラムを用いて分子量を測定したところ、約４．２万であった。これらの結果より、本発明のエノン還元酵素はモノマー酵素と予想された。
【００９１】
［実施例３］（エノン還元酵素の至適pH ）
リン酸カリウム緩衝液、ブリットン・ロビンソンの広域緩衝液を用いてpHを変化させて、実施例１で得られた酵素のメチルビニルケトンの還元活性を調べ、最大活性を１００とした相対活性で表し、図２に示した。反応の至適pHは６．５−７．０であった。
【００９２】
［実施例４］（エノン還元酵素の至適温度）
実施例１で得られた酵素を標準反応条件のうち温度だけを変化させて、メチルビニルケトンの還元活性を測定し、最大活性を１００とした相対活性で表し、図３に示した。反応の至適温度は３７−４５℃であった。
【００９３】
［実施例５］（エノン還元酵素の基質特異性）
実施例１で得られた酵素を種々のエノン、ケトン、およびアルデヒドと反応させ、その還元反応の活性をメチルビニルケトンの還元を１００とした相対活性で表し、表２に示した。
【表２】
0004688313.tif 000005
【００９４】
［実施例６］（エノン還元酵素を用いた３−ペンタノンの合成）
２００mMリン酸カリウム緩衝液（pH ６．５）、４４mg NADH、エノン還元酵素１Ｕ、０．２％エチルビニルケトンを含む反応液中で、２５℃で終夜反応させた。生成した３−ペンタノンをガスクロマトグラフィーで定量し、出発原料であるエチルビニルケトンに対する収率を求めた。ガスクロマトグラフィーの条件は以下のとおりである。すなわち、Porapak PS（Waters、mesh  50-80、3.2mmｘ210cm）を用い、カラム温度を１３０℃とし、水素炎イオン化検出器（FID）を利用して分析した。その結果、反応の収率は１００％であった。
【００９５】
［実施例７］（エノン還元酵素の部分アミノ酸配列）
実施例１で得られた酵素を用いて、SDS−PAGEのゲルより、エノン還元酵素を含むゲル断片を切り出し、2回洗浄後、リジルエンドペプチダーゼを用いて、35℃で終夜イン・ゲル・ダイジェションを行った。消化したペプチドを逆相HPLC (東ソー製TSK gel ODS-80-Ts、２.０mm × ２５０mm) を用い、0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA) 中でアセトニトリルのグラジエント溶出によりペプチドを分離し、分取した。
【００９６】
分取したペプチドピーク２種を lep_64、lep_65とし、それぞれプロテインシーケンサー（Hewlett Packard G1005A Protein Sequencer System）によりアミノ酸配列の解析を行った。lep_64、lep_65のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：９，１０で示した。
【００９７】
配列番号：９：lep_64
Ser-Tyr-Gly-Ala-Asp-Asp-Val-Phe-Asp-Tyr-His-Asp
配列番号：１０：lep_65
Ile-Gly-Pro-Glu-Gly-Ser-Ile-Leu-Gly-Cys-Asp-Ile
【００９８】
［実施例８］（クライベロマイセス・ラクティスからの染色体DNAの精製）
クライベロマイセス・ラクティス ＩＦＯ １２６７株をYM培地で培養し、菌体を調製した。菌体からの染色体DNAの精製は、Meth. Cell Biol. 29, 39-44 (1975) に記載の方法により行った。
【００９９】
［実施例９］（エノン還元酵素遺伝子のコア領域のクローニング）
lep_64、lep_65のアミノ酸配列を元にそれぞれセンスプライマー、アンチセンスプライマーを計３種類合成した。それぞれの塩基配列を配列番号：１１(KR2-64U)、１２(KR2-65D)、１３(KR2-65E)に示した。
【０１００】
配列番号：１１：KR2-64U
TGRTARTCRAANACRTCRTC
配列番号：１２：KR2-65D
ATWGGHCCWGARGGHTCNAT
配列番号：１３：KR2-65E
ATWGGHCCNGARGGHAGYAT
【０１０１】
３種類のうち2種類の組み合わせでプライマーを選び、プライマーを各５０pmol、dNTP１０nmol、クライベロマイセス・ラクティス由来染色体DNA５０ng、AmpliTaq用緩衝液 (宝酒造製)、AmpliTaq２Ｕ (宝酒造製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（94℃、30秒)、アニール（45℃、30秒）、伸長（70℃、1分）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)を用いて行った。
【０１０２】
PCR反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、KR2-64UとKR2-65Dの組み合わせにおいて特異的と思われるバンドが検出できた。得られたDNA断片を、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収した。得られたDNA断片を、pT7Blue(R) Tベクター（Novagen社）とTakara Ligation Kitを用いて、ライゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換した。
【０１０３】
形質転換株をアンピシリン（５０μg/mL）を含むＬＢ培地（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム、以下、LB培地と略す）プレート上で生育させ、Blue/Whiteセレクション法により選別されたいくつかの白色のコロニーより市販のM13-21（TGTAAAACGACGGCCAGT（配列番号：２８））、M13-RP（CAGGAAACAGCTATGACC（配列番号：２９））プライマーを用いてコロニーダイレクトPCRを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的とするDNA断片が挿入されていると考えられるコロニーをアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養し、Flexi-Prep (ファルマシア製) によりプラスミドを精製し、pKLR2とした。
【０１０４】
精製したプラスミドを用いて、挿入DNAの塩基配列を解析した。DNA塩基配列の解析には、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS ready Reaction Kit (パーキンエルマー製)を用いてPCRを行い、DNAシーケンサーABI PRISMTM 310(パーキンエルマー製)により行った。決定されたコア領域の塩基配列を配列番号：１４として示した。
【０１０５】
［実施例１０］（エノン還元酵素遺伝子のコア領域周辺の塩基配列の解析）
クライベロマイセス・ラクティス由来染色体DNAを制限酵素HaeII、またはPstIで消化し、T4リガーゼを用いて16℃で終夜セルフ・ライゲーション反応により、各断片を環化させた。次に、プライマーKL2-5U（配列番号：１５）およびKL2-3D（配列番号：１６）を各１００pmol、環化DNAを２５ng、Ex-Taq用緩衝液 (宝酒造製)、Ex-Taq 2U (宝酒造製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（94℃、30秒） 、アニール（55℃、30秒）、伸長（72℃、7分）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)を用いて行った。PCR反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、５０００ｂｐあたりに特異的と思われるバンドが検出できた。このDNA断片をSephaglas BandPrep Kit(ファルマシア製)により精製し、塩基配列をプライマーウォーキング法により解析した。
用いたプライマーは、KL2-5U、KL2-3D、KL2-Sq1（配列番号：１７）、KL2-Sq2（配列番号：１８）、KL2-Sq3（配列番号：１９）の5種類。DNA塩基配列の解析には、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS ready Reaction Kit (パーキンエルマー製)を用いてPCRを行い、DNAシーケンサーABI PRISMTM 310 (パーキンエルマー製)により行った。その結果、エノン還元酵素のORF配列を決定することができた。決定したDNA配列は配列番号：１に、コードする蛋白質の配列は配列番号：２に示す。DNA配列からのORF検索、予想アミノ酸配列への翻訳などは、Genetyx-WIN（ソフトウェア開発株式会社製）を用いて行った。
配列番号：１５：KL2-5U
TCCGGTACCGACAACTGTACCAGCAATGTC
配列番号：１６：KL2-3D
ATCGGTACCTATACTAAGATTGTAACTGTTGC
配列番号：１７：KL2-Sq1
CCGGGTACCCTTTTAGGGTGA
配列番号：１８：KL2-Sq2
TCATGAAGCCACAGTTAAATTCG
配列番号：１９：KL2-Sq3
ATATTCATATGATGGATATCACCG
【０１０６】
［実施例１１］（エノン還元酵素遺伝子のクローニング）
エノン還元酵素の構造遺伝子配列を元にORFクローニング用のプライマーKLCR2-N（配列番号：２０）、KLCR2-C（配列番号：２１）を合成した。プライマーを各５０pmol、dNTP１０nmol、クライベロマイセス・ラクティス由来染色体DNA５０ng、Pfu Turbo-DNA polymerase用緩衝液 (STRATAGENE製)、Pfu Turbo-DNA polymerase 2.5 U (STRATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（95℃、2分30秒）、アニール（55℃、１分）、伸長（75℃、1分30秒）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)を用いて行った。配列番号：２０：KLCR2-N
CTGGAATTCTACCATGGCTTCAGTTCCAACCACTCAAAAAG
配列番号：２１：KLCR2-C
GACAAGCTTCTAGATTATAACCTGGCAACATACTTAACA
【０１０７】
PCR反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。
得られたDNA断片を、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収した。DNA断片を制限酵素NcoI、XbaIで2重消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Sepaglas BandPrep Kit(ファルマシア製)により精製した。得られたDNA断片を、NcoI、XbaIで2重消化したpSE420DとTakara Ligation Kitを用いて、ライゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換した。
【０１０８】
形質転換株をアンピシリン（５０μg/mL）を含むLB培地プレート上で生育させ、いくつかのコロニーよりKLCR2-N、KLCR2-Cプライマーを用いてコロニーダイレクトPCRを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的のサイズである事が確認できたコロニーよりプラスミドを精製し、挿入断片の塩基配列を解析した。目的とするエノン還元酵素遺伝子を持つプラスミドをpSE-KLR1 (図４) とした。
【０１０９】
［実施例１２］（組換えエノン還元酵素の大腸菌による生産）
エノン還元酵素を発現するプラスミドpSE-KLR1で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリンを含む液体LB培地で終夜30℃培養し、0.1mM IPTGを加え、さらに4時間培養を行った。
菌体を遠心分離により集菌した後、0.02% 2-メルカプトエタノール、2mM PMSF、10%グリセリンを含む50mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）を用いて3分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液中として回収し、種々の基質に対する活性を測定した。また該プラスミドを含まない大腸菌HB101株をLB培地で終夜培養し、0.1mM IPTG添加後さらに4時間培養した菌体を、同様に破砕して種々の基質に対する活性を測定した。結果を表３に示す。
【表３】
0004688313.tif 000006
【０１１０】
［実施例１３］（サッカロマイセス・セレビジエからの染色体DNAの精製）
サッカロマイセス・セレビジエ X2180-1B (Yeast Genetic Stock Center) をYM培地で培養し、菌体を調製した。菌体からの染色体DNAの精製は、Meth. Cell Biol. 29, 39-44 (1975) に記載の方法により行った。
【０１１１】
［実施例１４］（エノン還元酵素のホモログ YNN4 のクローニング）
DDBJに登録されている予想蛋白質YNN4 (SWISS-PROT Accession No., P53912) に対応するDNA配列 (DDBJ Accession No. Z46843) を基にPCR用プライマーYNN4-ATG1（配列番号：２２）、YNN-TAA1（配列番号：２３）を合成した。
【０１１２】
プライマーを各２５pmol、dNTP１０nmol、サッカロマイセス・セレビジエ由来染色体DNA５０ng、Pfu DNA polymerase用緩衝液 (STRATAGENE製)、Pfu DNA polymerase 2Ｕ (STRATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９５℃、４５秒）、アニール（５０℃、１分）、伸長（７５℃、６分）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)をPCRを行った結果、特異的な増幅産物が得られた。
増幅産物をフェノール処理後、制限酵素AflIII, XbaIで2重消化し、制限酵素NcoI, XbaIで2重消化したベクターpSE420DとTAKARA Ligation Kit によりライゲーションした。ライゲーションしたDNAにより大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン（５０mg/L）を含むＬＢ培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrepにより精製した。得られたプラスミドをpSE-YNN4とした。
【０１１３】
プラスミドの挿入DNA部分の塩基配列を解析し、その結果を配列番号：３に示した。得られた塩基配列は、DDBJに登録されたいる塩基配列と完全に一致した。配列番号：３の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号：４に示した。
配列番号：２２：YNN4-ATG1
CAAACATGTCTGCCTCGATTCCAGA
配列番号：２３：YNN4-TAA1
CAGTCTAGATTATTTCAAGACGGCAACCAAC
【０１１４】
［実施例１５］（エノン還元酵素のホモログ YL60 のクローニング）
DDBJに登録されている予想蛋白質YL60 (SWISS-PROT Accession No., P54007) に対応するDNA配列 (DDBJ Accession No. U22383) を基にPCR用プライマーYL60-ATG2（配列番号：２４）、YL60-TAA1（配列番号：２５）を合成した。
プライマーを各２５pmol、dNTP１０nmol、サッカロマイセス・セレビジエ由来染色体DNA５０ng、Pfu DNA polymerase用緩衝液 (STRATAGENE製)、Pfu DNA polymerase 2U (STRATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９５℃、４５秒）、アニール（５０℃、１分）、伸長（７５℃、６分）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)をPCRを行った結果、特異的な増幅産物が得られた。
【０１１５】
増幅産物をフェノール処理後、制限酵素NcoI, XbaIで2重消化し、制限酵素NcoI, XbaIで2重消化したベクターpSE420DとTAKARA Ligation Kit によりライゲーションした。
ライゲーションしたDNAにより大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン（５０mg/L）を含むＬＢ培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrepにより精製した。得られたプラスミドをpSE-YL60とした。
プラスミドの挿入DNA部分の塩基配列を解析し、その結果を配列番号：５に示した。得られた塩基配列は、DDBJに登録されている塩基配列と完全に一致した。配列番号：５の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号：６に示した。
【０１１６】
配列番号：２４：YL60-ATG2
CAACCATGGCTCAAGTTGCAATTCCAGAAACC
配列番号：２５：YL60-TAA1
GACTCTAGATTAGTTTAATACGGCAACGAGTTTTTCAC
【０１１７】
［実施例１６］（エノン還元酵素のホモログ YCZ2 のクローニング）
DDBJに登録されている予想蛋白質YCZ2 (SWISS-PROT Accession No., P25608) に対応するDNA配列 (DDBJ Accession No. X59720) を基にPCR用プライマーYCZ2-ATG1（配列番号：２６）、YCZ2-TAA1（配列番号：２７）を合成した。
プライマーを各２５pmol、dNTP１０nmol、サッカロマイセス・セレビジエ由来染色体DNA５０ng、Pfu DNA polymerase用緩衝液 (STRATAGENE製)、Pfu DNA polymerase 2 U (STRATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９５℃、４５秒）、アニール（５０℃、１分）、伸長（７５℃、６分）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)をPCRを行った結果、特異的な増幅産物が得られた。
【０１１８】
増幅産物をフェノール処理後、制限酵素BspHI, XbaIで2重消化し、制限酵素NcoI, XbaIで2重消化したベクターpSE420DとTAKARA Ligation Kit によりライゲーションした。
ライゲーションしたDNAにより大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン（５０mg/L）を含むＬＢ培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrepにより精製した。得られたプラスミドをpSE-YCZ2とした。
プラスミドの挿入DNA部分の塩基配列を解析し、その結果を配列番号：７に示した。得られた塩基配列は、1089位のAがCに置換していたが、アミノ酸は同じであった。塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号：８に示した。
配列番号：２６：YCZ2-ATG1
GAAATCATGAAAGCTGTCGTCATTGAA
配列番号：２７：YCZ2-TAA1
GTTTCTAGATTAGTTTAATACGGCAACKAGTTTTTCA
【０１１９】
［実施例１７］（エノン還元酵素のホモログ YNN4、YL60、およびYCZ2 の活性確認）
pSE-YNN4, pSE-YL60, pSE-YCZ2をそれぞれ含有する大腸菌JM109株をアンピシリンを含むLB培地で培養し、0.1 mM IPTGにより誘導を4時間行い、遠心分離により集菌菌体を得た。それぞれの菌体を菌体破砕液（50mM KPB pH 8.0、1mM EDTA、0.02% 2-ME、2mM PMSF、10% Glycerol）に懸濁し、超音波により菌体を破砕後、遠心分離により得られた上清を無細胞抽出液とした。
各無細胞抽出液を用いてエノン還元活性を測定した結果、0.268 U/mg-protein, 0.198 U/mg-protein, 0.133 U/mg-proteinの活性が得られ、本発明の酵素の3種類のホモログがいずれもエノン還元酵素活性を有することが確認された。
【０１２０】
【発明の効果】
α，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を選択的に還元することができる新規なエノン還元酵素が提供された。この酵素によって、医薬品の原料などに有用なケトンを酵素的に、製造することが可能となった。本発明のエノン還元酵素は、α，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合に対する選択性に優れる。したがって、目的とするケトンを高い収率で得ることができる。
【０１２１】
【配列表】
0004688313.tif 000007
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【図面の簡単な説明】
【図１】  SDS-PAGEにおけるパターンを示す写真である。レーン１は分子量マーカー、レーン２は実施例１で得られた酵素を示す。
【図２】  実施例１で得られた酵素のメチルビニルケトン還元活性のpH依存性を示す図である。
【図３】  実施例１で得られた酵素のメチルビニルケトン還元活性の温度依存性を示す図である。
【図４】  エノン還元酵素遺伝子を持つプラスミドpSE-KLR1を模式的に示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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