(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列よりなる、腫瘍抗原ペプチド。
【請求項２】
請求項１記載の腫瘍抗原ペプチドを有効成分として含有する、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤。
【請求項３】
請求項１記載の腫瘍抗原ペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４記載の組換えＤＮＡを発現させて得られるポリペプチド。
【請求項６】
請求項４記載の組換えＤＮＡまたは請求項５記載のポリペプチドを有効成分として含有してなる、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤。
【請求項７】
請求項１記載の腫瘍抗原ペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項８】
請求項１記載の腫瘍抗原ペプチド、請求項４記載の組換えＤＮＡ、あるいは請求項５記載のポリペプチドを有効成分として含有してなる腫瘍の治療剤又は予防剤。
【請求項９】
請求項１記載の腫瘍抗原ペプチドを含有してなる腫瘍の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＭＮ／ＣＡ９由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチドに関する。さらに詳しくは、本発明は、ＭＮ／ＣＡ９由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチドおよび機能的に同等の特性を有するその誘導体、これらの腫瘍抗原ペプチドおよびその誘導体をイン・ビボもしくはイン・ビトロで利用した腫瘍の治療剤、予防剤、または診断薬などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体による腫瘍の排除には、免疫系、特にＴ細胞が重要な役割を果たしていることが知られている。実際、ヒトの腫瘍局所には腫瘍細胞に対して傷害活性を示すリンパ球の浸潤が認められ（Arch.Surg.，126:200 ，1990）、メラノーマからは自己の腫瘍細胞を認識する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が比較的容易に分離されている（Immunol.Today ，8:385 ，1987、J.Immunol.，138:989 ，1987、Int.J.Cancer，52:52 ，1992等）。また、該ＣＴＬの移入によるメラノーマ治療の臨床結果からも、腫瘍排除におけるＴ細胞の重要性が示唆されている（J.Natl.Cancer.Inst. ，86:1159 ，1994）。
【０００３】
自己の腫瘍細胞を攻撃するＣＴＬが標的とする分子については長い間不明であったが、最近の免疫学および分子生物学の進歩により次第に明らかになってきた。すなわちＣＴＬは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いて、腫瘍抗原ペプチドと呼ばれるペプチドと主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ抗原（ＭＨＣクラスＩ抗原、ＨＬＡ抗原とも呼ばれる）との複合体を認識することにより、自己の腫瘍細胞を攻撃していることが明らかとなった。
【０００４】
腫瘍抗原ペプチドは、腫瘍に特有のタンパク質、すなわち腫瘍抗原タンパク質が細胞内で合成された後、プロテアソームにより細胞内で分解されることによって生成される。生成された腫瘍抗原ペプチドは、小胞体内でＭＨＣクラスＩ抗原（ＨＬＡ抗原）と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示される。この抗原提示された複合体を腫瘍特異的なＣＴＬが認識し、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍効果を示す。このような一連の作用の解明に伴い、腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドをいわゆる癌ワクチンとして利用することにより、腫瘍患者の体内の腫瘍特異的ＣＴＬを増強させる治療法が可能となった。
【０００５】
腫瘍抗原タンパク質としては、1991年にT.Boonらが初めてＭＡＧＥと名付けたタンパク質をヒトメラノーマ細胞から同定した（Science ，254:1643，1991）。その後、いくつかの腫瘍抗原タンパク質が、主にメラノーマ細胞から同定されている。メラノーマ抗原としては、メラノサイト組織特異的タンパク質であるｇｐ１００（J.Exp.Med.，179:1005，1994）、ＭＡＲＴ−１（Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91:3515 ，1994）、チロシナーゼ（J.Exp.Med.，178:489 ，1993）などのメラノソームタンパク質、メラノーマだけでなく各種癌細胞と正常精巣細胞に発現するMAGE関連タンパク質群（J.Exp.Med.，179:921 ，1994）、腫瘍特異的なアミノ酸変異を持つβ−カテニン（J.Exp.Med.，183:1185，1996）、ＣＤＫ４（Science ，269 ：1281，1995）などが同定されている。また、メラノーマ以外の腫瘍抗原タンパク質としては、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（J.Exp.Med.，181:2109，1995）、ｐ５３ (変異型) （Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93:14704，1996）などの癌遺伝子産物、ＣＥＡ（J.Natl.Cancer.Inst. ，87:982，1995）、ＰＳＡ（J.Natl.Cancer.Inst. ，89:293，1997）などの腫瘍マーカー、ＨＰＶ（J.Immunol.，154:5934，1995）、ＥＢＶ（Int.Immunol.，7:653 ，1995）などのウイルスタンパク質などが同定されている。これらについては、総説（Immunol.Today ，18:267，1997、J.Exp.Med.，183:725 ，1996、Curr.Opin.Immunol.，8:628 ，1996等）の記述に詳しい。
【０００６】
ＭＮ／ＣＡ９は、モノクロナール抗体Ｍ７５に認識される膜蛋白質として同定されたものであり（Virology 187:620-626,1992）、その遺伝子の塩基配列及び蛋白質のアミノ酸配列についても報告されている（Oncogene 9:2877−2888, 1994、NCBIデータベースAccession No. NP_001207）。ＭＮ／ＣＡ９は、モノクローナル抗体Ｇ２５０が認識する抗原と同一物質であることから、Ｇ２５０抗原とも呼ばれている。ＭＮ／ＣＡ９は、正常組識では胃や胆管の粘膜、小腸の増殖速度の高い細胞に発現が認められる。またＭＮ／ＣＡ９は、正常の腎臓組識では発現が認められないが、腎細胞癌の８割以上で発現が認められることから、腎細胞癌の腫瘍マーカーとして有用であると考えられている(Br. J. Cancer 81:741-746, 1999)。また近年、Vissersらは、ＭＮ／ＣＡ９のアミノ酸配列からHLA-A2.1拘束性にCTLを誘導する可能性のある抗原ペプチド配列を報告している（Cancer Res., 59:5554-5549, 1999）。しかしながら、日本人に最も多いHLAのタイプであるHLA-A24に拘束性の腫瘍抗原ペプチド配列の存在に関しては、これまで何ら報告されていなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＭＮ／ＣＡ９由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチドを提供することを目的とする。さらに詳しくは、本発明は、ＭＮ／ＣＡ９由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチドおよび機能的に同等の特性を有するその誘導体、これらの腫瘍抗原ペプチドおよびその誘導体をイン・ビボもしくはイン・ビトロで利用した腫瘍の治療剤、予防剤、または診断薬などを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＭＮ／ＣＡ９がHLA-A24抗原に結合して提示される腫瘍抗原ペプチド部分を有しているか否か、すなわちＭＮ／ＣＡ９由来のHLA-A24拘束性腫瘍抗原ペプチドが存在しているか否かについて、鋭意検討を行った。
すなわちまず、ＭＮ／ＣＡ９を高発現する細胞株を樹立し、この細胞株でマウスを免疫して得られた脾臓細胞より、最終的にＭＮ／ＣＡ９を特異的に認識するＣＴＬクローンを単離・樹立することに成功した。次に、このＭＮ／ＣＡ９特異的ＣＴＬクローンを用いて、当該ＣＴＬを特異的に認識するHLA-A24拘束性抗原ペプチドの同定を試みた。その結果、ＭＮ／ＣＡ９にはHLA-A24拘束性の腫瘍抗原ペプチド部分が存在していること、そして、Ala-Tyr-Glu-Gln-Leu-Leu-Ser-Arg-Leu（配列番号：２）で代表されるペプチドが腫瘍抗原ペプチドとしての高い活性を有していることを、初めて明らかにした。
【０００９】
本発明のＭＮ／ＣＡ９由来腫瘍抗原ペプチドは、日本人に最も多く、その約6割に発現が認められるHLAのタイプであるHLA-A24に抗原提示される腫瘍抗原ペプチドであるため、多くの患者に適用可能である。
さらに、従来の技術に記載したように、ＭＮ／ＣＡ９は、もともと腎細胞癌(Renal cell carcinoma：RCC)の８割以上で発現が認められるタンパクとして知られていたものである。腎細胞癌は、成人の腎臓の腫瘍の80〜90％を占めている。腎細胞癌の予後は不良で、5年生存率は約40〜60％である。現在、手術以外に有効な治療法が少なく、化学療法剤の治療効果は期待できないため、新しい治療法の開発が望まれている。この観点からも、本発明の腫瘍抗原ペプチドは有用であると考えられる。
本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
【００１０】
即ち本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）  配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３に記載のアミノ酸配列よりなる腫瘍抗原ペプチド、あるいは機能的に同等の特性を有するその誘導体、
（２）  配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３に記載のアミノ酸配列よりなる、前記（１）記載の腫瘍抗原ペプチド、
（３）  配列番号：２に記載のアミノ酸配列よりなる、前記（２）記載の腫瘍抗原ペプチド、
（４）  配列番号：４、配列番号：５又は配列番号：６に記載のアミノ酸配列よりなる、前記（１）記載の腫瘍抗原ペプチド誘導体、
（５）  配列番号：５に記載のアミノ酸配列よりなる、前記（４）記載の腫瘍抗原ペプチド誘導体、
（６）  前記（１）〜（５）いずれか記載の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体を有効成分として含有する、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、
（７）  前記（１）〜（５）いずれか記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体をコードするＤＮＡ、
（８）  配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードする、前記（７）記載のＤＮＡ、
（９）  前記（７）又は（８）記載のいずれかのＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ、
（１０）  前記（９）記載の組換えＤＮＡを発現させて得られるポリペプチド、
（１１）  前記（９）記載の組換えＤＮＡまたは前記（１０）記載のポリペプチドを有効成分として含有してなる、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、
（１２）  前記（１）〜（５）いずれか記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体に特異的に結合する抗体、
（１３）  ＨＬＡ−Ａ２４抗原と前記（１）〜（５）いずれか記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体の提示された抗原提示細胞、
（１４）  前記（１３）記載の抗原提示細胞を有効成分として含有してなる細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、
（１５）  ＨＬＡ−Ａ２４抗原と前記（１）〜（５）いずれか記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を認識する細胞傷害性Ｔ細胞、
（１６）  前記（１）〜（５）いずれか記載の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体、前記（９）記載の組換えＤＮＡ、前記（１０）記載のポリペプチド、前記（１３）記載の抗原提示細胞、あるいは前記（１５）記載の細胞傷害性Ｔ細胞を有効成分として含有してなる腫瘍の治療剤又は予防剤、ならびに
（１７）  前記（１）〜（５）いずれか記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を含有してなる腫瘍の診断薬。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の腫瘍抗原ペプチドとは、ＭＮ／ＣＡ９（Oncogene 9:2877−2888, 1994、NCBIデータベースAccession No. NP_001207）由来のアミノ酸配列である配列番号：１〜配列番号：３のいずれかに記載のアミノ酸配列よりなるペプチドを指す。好ましくは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列（Ala-Tyr-Glu-Gln-Leu-Leu-Ser-Arg-Leu）よりなるペプチドが挙げられる。
【００１２】
前記本発明の腫瘍抗原ペプチドは、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて合成することができる。合成方法としては、文献（ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis ），Interscience，New York，1966；ザ・プロテインズ（The Proteins），Vol 2 ，Academic Press Inc. ，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成，広川書店，1991）などに記載されている方法が挙げられる。
【００１３】
前記本発明の腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）により認識されるという特性を有するものである。当該腫瘍抗原ペプチドとしての特性は、例えば、 J.Immunol.,154,p2257,1995に記載の測定方法により調べることができる。具体的には、ＨＬＡ−Ａ２４抗原陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離し、イン・ビトロで本発明のペプチドを添加して刺激した場合に、該ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２４陽性細胞を特異的に認識するＣＴＬが誘導されることにより、測定することができる。ここでＣＴＬの誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示細胞に反応してＣＴＬが産生したIFN-γの量を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定することによって調べることができる。また、抗原ペプチド提示細胞に反応してＣＴＬが産生したTNF-αの量を、TNF-α感受性細胞株（例えばWEHI164S細胞）の生存率で測定することによっても、調べることができる（実施例参照）。
【００１４】
さらに、51Crで標識した抗原ペプチド提示細胞に対するＣＴＬの傷害性を測定する方法（51Crリリースアッセイ、Int.J.Cancer,58:p317,1994 ）によっても調べることができる。また、ＨＬＡ−Ａ２４のｃＤＮＡ（Cancer Res.,55:4248-4252 (1995)、Genbank Accession No.M64740）を発現する発現プラスミドを、例えばCOS-7細胞（ATCC No. CRL1651）やVA-13細胞（理化学研究所細胞銀行）に導入した細胞に対して本発明のペプチドをパルスし、この細胞に対して、前記で調製したＣＴＬなどを反応させ、該ＣＴＬが産生する種々のサイトカイン（例えばIFN-γやTNF-α）の量を測定することによっても、調べることができる。
以下、ここで述べたような測定法を「腫瘍抗原ペプチドの測定法」と称することもある。
【００１５】
本発明において「腫瘍抗原ペプチドと機能的に同等の特性を有する誘導体」（以下、腫瘍抗原ペプチド誘導体と略す場合がある）とは、本発明の腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸残基を改変した改変体であって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識され得るという腫瘍抗原ペプチドとしての特性を有するものをいう。すなわち、本発明の腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列に対して１または数個のアミノ酸残基を改変した改変体であって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識され得るという腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するものは全て、本発明の腫瘍抗原ペプチド誘導体の範疇に含まれる。
【００１６】
ここで、アミノ酸残基の「改変」とは、アミノ酸残基の置換、欠失、及び／又は付加（ペプチドのＮ末端、Ｃ末端へのアミノ酸の付加も含む）を意味し、好ましくはアミノ酸残基の置換が挙げられる。アミノ酸残基の置換に係る改変の場合、置換されるアミノ酸残基の数および位置は、腫瘍抗原ペプチドとしての活性が維持される限り任意である。
【００１７】
ところで、ＨＬＡ抗原に結合して提示される抗原ペプチドの配列には規則性（モチーフ）があり、ＨＬＡ−Ａ２４抗原の場合、８〜１１アミノ酸よりなるペプチドのうちのＮ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンであることが知られている（Immunogenetics,41:178,1995、J.Immunol., 152:p3913,1994、J.Immunol.,155:4307,1994）。より好ましくは、当該モチーフは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンまたはトリプトファンである。また、該モチーフ上とり得るアミノ酸に類似の性質を持つアミノ酸残基も許容される可能性がある。
【００１８】
従って、本発明の腫瘍抗原ペプチド誘導体には、これらモチーフ上アミノ酸の置換が可能な位置、すなわち第２位および／またはＣ末端のアミノ酸を他のアミノ酸に置換し、かつ腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するものが含まれる。好ましくは、第２位および／またはＣ末端のアミノ酸を前記モチーフ上置換が可能なアミノ酸に置換し、かつ腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有する腫瘍抗原ペプチド誘導体が挙げられる。ペプチドの長さは、ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合して提示されるという観点から、８〜１１アミノ酸程度が好ましい。
【００１９】
具体的には、配列番号：１〜配列番号：３のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸をフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンのいずれかに置換し、および／またはＣ末端のアミノ酸をフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンのいずれかに置換したアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するものが挙げられる。このような本発明の腫瘍抗原ペプチド誘導体の具体例としては、配列番号：４〜配列番号：６のいずれかに記載のアミノ酸配列よりなるペプチドが挙げられる。好ましくは、配列番号：５に記載のアミノ酸配列よりなるペプチドが挙げられる。
【００２０】
本発明の腫瘍抗原ペプチド誘導体は、本発明の腫瘍抗原ペプチドと同様に、候補となるペプチドを前記ペプチド合成法に基づき合成し、これを前記腫瘍抗原ペプチドの測定法に供することにより、腫瘍抗原ペプチドと機能的に同等の特性を有するか否かを同定することができる。
【００２１】
本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体は、後述の実施例にも記載のようにＣＴＬの誘導能を有するものであり、誘導されたＣＴＬは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍効果を発揮することができる。従って本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体は、腫瘍の治療剤または予防剤の有効成分とすることができる。本発明は、腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を有効成分として含有する腫瘍の治療剤または予防剤を提供する。本発明の腫瘍の治療剤または予防剤をＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＭＮ／ＣＡ９陽性の患者に投与すると、抗原提示細胞のＨＬＡ−Ａ２４抗原に腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体が提示され、提示されたＨＬＡ−Ａ２４抗原複合体特異的ＣＴＬが増殖して腫瘍細胞を破壊することができ、従って、腫瘍の治療または予防が可能となる。ＭＮ／ＣＡ９は腎細胞癌において高頻度に発現しているので、本発明の腫瘍の治療剤または予防剤は、特に腎癌に対して有効に使用される。
【００２２】
本発明の腫瘍の治療剤または予防剤は、細胞性免疫が効果的に成立するようにアジュバントとともに投与したり、粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献（Clin. Microbiol.Rev., 7:277-289, 1994)に記載のものなどが応用可能である。また、リポソーム製剤、直径数μm のビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤なども考えられる。投与方法としては、皮内投与、皮下投与、静脈注射などが考えられる。製剤中の本発明の腫瘍抗原ペプチドあるいはその誘導体の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは 0.001mg〜1000mg、より好ましくは0.1mg 〜10mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００２３】
本発明はまた、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体をコードするＤＮＡをも提供するものである。本発明のＤＮＡは、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体のアミノ酸配列に基き、当業者であれば容易に合成することができる。本発明のＤＮＡの好適な例としては、配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる。
このような本発明のＤＮＡは、本発明の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体を製造する際に有効に用いられる。さらに以下に述べるように、本発明のＤＮＡはＣＴＬの誘導（腫瘍の治療又は予防）においても有効に用いることができる。
【００２４】
すなわち近年、複数のＣＴＬエピトープを連結させた、いわゆる"ポリトープ"をコードするＤＮＡを、ＤＮＡワクチンに利用する手法が用いられている（例えば Journal of Immunology, 160,p1717,1998などを参照のこと）。従って、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体をコードするＤＮＡを少なくとも１種または２種以上連結させることにより、また場合によっては他の腫瘍抗原ペプチドをコードするＤＮＡも連結させることにより作製されたＤＮＡ（以下、当該連結されたＤＮＡを「組換えＤＮＡ」と称する）を、適当な発現ベクターに組み込むことにより、ＣＴＬの誘導剤（腫瘍の治療剤または予防剤）の有効成分とすることができる。また、前記の組換えＤＮＡを治療剤または予防剤として用いるのみならず、当該組換えＤＮＡを宿主細胞内で発現させて得られたポリペプチドも、腫瘍の治療剤または予防剤の有効成分とすることができる。
【００２５】
ここで「組換えＤＮＡ」は、ＤＮＡ合成および通常の遺伝子工学的手法に基づき、例えば Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に従い容易に作製することができる。また、この組換えＤＮＡの発現ベクターへの組み込みも、前記基本書等に従い行うことができる。
作製された本発明の組換えＤＮＡが、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識され得る腫瘍抗原ペプチドを生じるか否かは、例えば以下の方法により測定することができる。
【００２６】
すなわちまず、COS-7細胞（ATCC CRL1651）やVA-13細胞（理化学研究所細胞開発銀行）といった細胞に対し、候補となる組換えＤＮＡを有する発現プラスミドと、HLA-A24抗原をコードするcＤＮＡ（Cancer Res.,55:4248-4252(1995)、Genbank Accession No.M64740）を有する発現プラスミドとをダブルトランスフェクトする。該トランスフェクトは、例えばリポフェクトアミン試薬（GIBCO BRL社製）を用いたリポフェクチン法などにより行うことができる。その後、HLA-A24に拘束性のCTLを加えて作用させ、該CTLが反応して産生する種々のサイトカイン（例えばIFN-γ、TNF-α）の量を、例えばＥＬＩＳＡ法や TNF releaseアッセイ法などで測定することによって、候補ＤＮＡが活性を有するか否かを調べることができる。
【００２７】
本発明の組換えＤＮＡを腫瘍の治療剤または予防剤として適用する際には、以下の方法が使用され得る。
すなわち、本発明の組換えＤＮＡを細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊, 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等）のいずれの方法も適用することができる。
【００２８】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに本発明のＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００２９】
本発明の組換えＤＮＡを実際に医薬として作用させるには、当該ＤＮＡを直接体内に導入する in vivo法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外でＤＮＡを該細胞に導入しその細胞を体内に戻す ex vivo法がある（日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊, 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等）。in vivo法がより好ましい。
【００３０】
in vivo法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。 in vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明の組換えＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明の組換えＤＮＡを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
製剤中の本発明の組換えＤＮＡの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、0.0001mg〜100mg、好ましくは0.001mg〜10mgの本発明の組換えＤＮＡを、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００３１】
以上のような本発明の組換えＤＮＡの腫瘍患者への投与により、抗原提示細胞内で当該組換えＤＮＡに対応するポリペプチドが高発現する。その後、細胞内分解を受けて生じた個々の腫瘍抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療又は予防が達成される。本発明の組換えＤＮＡは、特に腎細胞癌の治療又は予防に有効である。
【００３２】
また、前記組換えＤＮＡを発現させることにより得られる「ポリペプチド」は、前記組換えＤＮＡを適当な発現ベクター（例えばｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ１など）に組み込みこんで作製された発現プラスミドを宿主細胞に導入して形質転換体を得、この形質転換体を適当な培地で培養することにより、発現・生産することができる。ここで宿主細胞としては、大腸菌などの原核生物、酵母のような単細胞真核生物、昆虫、動物などの多細胞真核生物の細胞などが挙げられる。また、宿主細胞への遺伝子導入法としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、電気パルス法などがある。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。また、当該ポリペプチドがＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識され得る腫瘍抗原ペプチドを生じるか否かは、例えばマクロファージなどの食細胞に本発明のポリペプチドを取り込ませて細胞内でペプチド断片を生じさせ、その後、該ペプチド断片とＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体に対してHLA-A24拘束性のＣＴＬを加えて作用させ、該ＣＴＬが反応して産生する種々のサイトカイン（例えばIFN-γやTNF-α）の量を測定することなどによって調べることができる。
【００３３】
本発明のポリペプチドを腫瘍の治療剤または予防剤として適用する際には、前記本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体と同様の投与形態、投与方法および投与量により、投与することができる。本発明のポリペプチドを腫瘍患者に投与すると、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々の腫瘍抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療又は予防が達成される。本発明のポリペプチドは、特に腎細胞癌の治療又は予防に有効である。
【００３４】
本発明はまた、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体に特異的に結合する抗体をも提供する。該抗体は、例えば、Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D.ら編, Cold Spring Harber Laboratory Press 出版 New York 1989などに記載の方法により容易に作製される。すなわち、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を用いて常法により適宜動物を免疫することにより、腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を認識する抗体、さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製できる。抗体の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、免疫学的診断等が挙げられる。免疫学的診断は、イムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。このような免疫学的診断は、特に腎細胞癌の診断において有効である。
【００３５】
本発明はまた、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体の提示された抗原提示細胞をも提供する。
後述の実施例において、本発明のペプチド刺激により強い細胞傷害活性が認められたが、これは、末梢血単核球中に、本発明のペプチドとHLA-A24抗原（マウスにおいてはH-2Kd抗原）との複合体の提示された抗原提示細胞が存在し、そして、この抗原提示細胞を特異的に認識するＣＴＬが誘導された結果に他ならない。このような、HLA-A24抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体の提示された抗原提示細胞は、以下に述べるような細胞療法（ＤＣ療法）において有効に用いられる。
【００３６】
細胞療法において用いられる抗原提示細胞は、腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、この細胞に本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を体外でパルスして、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を細胞表面に提示させることにより作製される。ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を提示可能なＨＬＡ−Ａ２４抗原を細胞表面に発現している細胞であれば特に限定されないが、抗原提示能が高いとされている樹状細胞が好ましい。
また、前記抗原提示能を有する細胞にパルスされるものとしては、前記のようなペプチドの形態のみならず、本発明の組換えＤＮＡまたはそのＲＮＡの形態であっても、本発明のポリペプチドの形態であっても良い。
【００３７】
本発明の抗原提示細胞は、例えば腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体、あるいは本発明のポリペプチドを体外でパルスしてＨＬＡ−Ａ２４抗原と前記ペプチドまたはその誘導体との複合体を作製することにより得られる(Cancer Immunol.Immunother.,46:82,1998、J.Immunol.,158:p1796,1997、Cancer Res.,59:p1184,1999）。樹状細胞を用いる場合は、例えば、腫瘍患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をGM-CSFおよびIL-4存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはポリペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
【００３８】
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明の組換えＤＮＡを導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、 Cancer Res.,56:p5672,1996や J.Immunol.,161: p5607,1998などを参考にして行うことができる。また、ＤＮＡのみならずＲＮＡの形態でも同様に抗原提示細胞を調製することができるが、この場合は、 J.Exp.Med., 184: p465,1996などを参考にして行うことができる。
【００３９】
本発明は、前記抗原提示細胞を有効成分として含有するＣＴＬの誘導剤（腫瘍の治療剤）をも提供するものである。該治療剤は、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。
また投与量は、前記文献記載の投与量が例示される。
前記治療剤を患者の体内に戻すことにより、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＭＮ／ＣＡ９陽性の患者の体内で効率良く特異的なＣＴＬが誘導され、腫瘍を治療することができる。本発明の抗原提示細胞は、特に腎細胞癌の治療に有効である。
【００４０】
本発明はさらに、HLA-A24抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体との複合体を認識するＣＴＬをも提供する。本発明のＣＴＬは、以下の養子免疫療法において有効に用いられる。
【００４１】
すなわちメラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養して、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159 、1994）。またマウスのメラノーマにおいては、脾細胞をイン・ビトロで腫瘍抗原ペプチドＴＲＰ−２で刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的なＣＴＬを増殖させ、該ＣＴＬをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（J.Exp.Med.,185:453,1997 ）。これは、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬをイン・ビトロで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体、あるいは本発明の組換えＤＮＡやポリペプチドを用いて、イン・ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的ＣＴＬを増やした後、このＣＴＬを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。
【００４２】
さらに本発明は、本発明のＣＴＬを有効成分として含有する腫瘍の治療剤も提供する。該治療剤は、ＣＴＬを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量としては、前記文献記載の投与量が例示される。
前記治療剤を患者の体内に戻すことにより、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＭＮ／ＣＡ９陽性の患者の体内でＣＴＬによる腫瘍細胞の傷害作用が促進され、腫瘍細胞を破壊することにより、腫瘍を治療することができる。本発明のＣＴＬは、特に腎細胞癌の治療に有効である。
【００４３】
本発明の腫瘍抗原ペプチドおよびその誘導体はまた、腫瘍を診断するための診断薬の有効成分とすることができる。すなわち、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体そのものを診断薬として用い、腫瘍が疑われる患者から得た試料（例えば血液、腫瘍組織など）中の抗体の存在を検出することにより、腫瘍の早期発見、再発、転移を診断することが可能である。また本発明の腫瘍抗原ペプチド等を有効成分とする医薬の適応可能な腫瘍患者の選択にも利用できる。具体的には、イムノブロット法、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、蛍光または発光測定法などを用いることにより、当該診断を行うことができる。本発明の診断薬は、特に腎細胞癌の診断において有効に用いられる。
【００４４】
さらに近年、抗原ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を用いて抗原特異的ＣＴＬを検出する新しい検出方法が確立された（Science,274:p94,1996）。本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体とＨＬＡ抗原との複合体を前記検出方法に供し、腫瘍抗原特異的ＣＴＬを検出することにより、腫瘍の早期発見、再発、転移を診断することができる。また本発明の腫瘍抗原ペプチド等を有効成分とする医薬の適応可能な腫瘍患者の選択や、当該医薬による治療効果の判定などにも利用できる。すなわち本発明においては、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を有効成分の一部として含有する、腫瘍の診断薬をも提供するものである。
具体的には、文献（Science,274:p94,1996）に記載の方法に従って蛍光標識したＨＬＡ抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体の４量体を作製し、これを用いて腫瘍が疑われる患者の末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的ＣＴＬをフローサイトメーターにより定量することにより、前記診断を行うことができる。
【００４５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００４６】
実施例１
ヒトMN/CA9高発現RenCa細胞株及びBALB3T3細胞株の樹立
ヒトMN/CA9 cDNA（Oncogene 9:2877−2888, 1994、NCBIデータベースAccession No. NP_001207）を、pBCMGSneoベクター（東京都立臨床医学総合研究所  烏山一先生より供与）に組込んだ。構築した発現ベクターをエレクトロポレーション法を用いて、腎癌由来細胞株であるRenCa細胞（J.Immunopharmacol.,7:417-436(1985)）、及びマウス胎児由来細胞株である BALB3T3細胞(理研細胞バンク RCB0005)に導入し、高発現細胞株を作製した。樹立した各細胞を、それぞれMN-RenCa及びMN-3T3と命名して以下の実験に使用した。なお、各細胞での導入したMN/CA9 cDNAの発現については、抗MN/CA9モノクローナル抗体（mAbG250(IgG2a)；Int.J.Cancer, 38; 489-494(1986)）を用いたFACS解析、及びMixed haemoadsorption assay(MHA)法で確認した。
【００４７】
実施例２
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）株の樹立及びその性状解析
マイトマイシンC(MMC)で処理したMN-RenCa細胞（1×105）とフロイントの不完全アジュバント(IFA)を乳化させ、これをBALB/cマウス（H-2Kd、4-6週令の雌、日本SLC）に2週間間隔で6回腹腔内投与することにより、免疫を行った。最終免疫操作１週間後、脾臓細胞を摘出・分散させた。この細胞分散液とマイトマイシン C(MMC)処理したMN-RenCa細胞を共培養（25cm2フラスコ内で培養、20ml RPMI1640(20% FBS, 50μM 2ME, 100IU/ml ペニシリン, 100mg/ml ストレプトマイシンを含む))することにより、in vitroにおける抗原再刺激を行った。1週間後、2 IU/mlのインターロイキン−２（IL-2）を加えた同様の培養液で1週間の培養を追加し、さらに放射線照射（50 Gy）したMN-3T3細胞（1×106）を加え培養を行い再刺激を行った。上記再刺激操作を1回/週行った。以上によりMN/CA 9抗原特異的バルク CTL株を作製し、 MN/CA 9-CTL/bulkと命名して以下の実験に使用した。
【００４８】
MN/CA9-CTL/bulkのMN/CA 9抗原特異的反応性は、以下のTNF release assay法を用いて検討した。まず、96穴プレートにMN-RenCa細胞またはRenCa細胞を各2×104個／穴植え込み、MN/CA 9-CTL/bulkを1×105個／穴となるように添加した。更に24時間培養した後、50μｌの培養上清液を回収し、これを腫瘍壊死因子-α（TNF-α）感受性細胞株である WEHI164S細胞（ATCC Cat.No.CRL-1751）4×103個／穴に加えた。その後、このWEHI164S細胞の生存率を、Cell Counting Kit（同仁化学）で検討することにより、MN/CA 9-CTL/bulkが産生した腫瘍壊死因子-α（TNF-α）量を間接的に評価した。 図１に、上記細胞株に対するMN/CA 9-CTL/bulkの反応性を示した。
図１の結果より、 MN/CA 9-CTL/bulkは、MN/CA9抗原を発現しないRenCa細胞には反応しないが、MN/CA 9抗原を高発現する MN-RenCa細胞に強く反応してTNF-αを産生することが示された。よってMN/CA 9-CTL/bulkはMN/CA 9抗原を特異的に認識するCTLであることが示された。
【００４９】
次に MN/CA 9-CTL/bulkの細胞表現系を確認するために、抗CD8抗体（CD8a(Ly-2)モノクローナル抗体；ベクトン ディキンソン）及び抗CD4抗体（GK1.5モノクローナル抗体；ベクトン ディキンソン）を用いたFACS解析を行った。図２にFACS解析の結果を示した。
図２の結果より、 MN/CA 9-CTL/bulkはCD8陽性、 CD4陰性のCTL細胞であることを確認した。
【００５０】
実施例３
MN/CA 9抗原特異的CTLクローンの樹立及びその性状解析
MN/CA 9-CTL/bulk株よりクローン化したCTLを得ること目的として、限界希釈法を用いてクローニングを行い、得られたクローンをMN/CA 9-CTL/cloneと命名して以下の実験に使用した。さらにこのクローンのCTL活性を検討するために、ラクトース デヒドロゲナーゼ（LDH） release cytotoxicity assay法（プロメガ）を用いて、 MN-3T3及びBALB3T3に対する反応性を、キットの添付書に従い検討した。反応性の検討結果を図３に示した。
図３の結果より、 MN/CA 9-CTL/cloneはMN/CA 9抗原を発現しないBALB3T3には反応性を示さなかったが、 MN/CA 9抗原を高発現するMN-3T3には細胞傷害性活性を示した。従って、樹立したクローンはbulkのCTLと同様にMN/CA 9抗原特異的細胞傷害活性有していることが明らかとなった。
【００５１】
実施例４
MN/CA 9-CTL/cloneがH-2Kd拘束性に認識するペプチドの同定
MN/CA 9-CTL/cloneがH-2Kd拘束性に認識するペプチドを同定するために、MN/CA 9タンパクアミノ酸配列中のマウスH-2Kd結合モチーフ（2番目のアミノ酸がチロシン（Y）又はフェニルアラニン（F）、 C末端のアミノ酸がロイシン（L）、イソロイシン（I）又はバリン（V）、なお当該マウスH-2Kd結合モチーフのうち2番目のアミノ酸:チロシン(Y)又はフェニルアラニン（F）、C末端のアミノ酸:ロイシン（L）又はイソロイシン（I）についてはHLA-A24結合モチーフに一致している）を有する配列を検索し、9アミノ酸よりなる3種の配列（ペプチドA:EYRALQLHL（配列番号：１）、ペプチドB:AYEQLLSRL（配列番号：２）、ペプチドC:RYFQYEGSL（配列番号：３）を選択した。なお、ペプチドAは MN/CA9のアミノ酸配列上の第219位〜227位の部分に該当し、ペプチドBは第288位〜296位の部分に該当し、ペプチドCは第323位〜331位の部分に該当するものである。これらのペプチドはBiogate社に依頼し、Fmoc法にて合成、精製を行った。
【００５２】
以下ペプチドBを例にとり、活性測定方法および結果を示す。
ペプチドＢをパルスしたBALB3T3細胞を標的細胞として、LDH release cytotoxicity assay法を用いて、 MN/CA 9-CTL/cloneがH-2Kd拘束性にペプチドＢを認識するか検討した。500μlのRPMI1640メディウムに懸濁した1×105個のBALB3T3に10μｌのペプチド溶液(1mg/ml)を加え、室温で15分静置後、20％FBSを有した500μlのRPMI1640メディウムを加え、さらに室温で45分静置した後、37℃でさらに1.5時間静置した。このパルスした細胞をRPMI1640メディウムで２回洗浄後、cytotoxicity assayにおける標的細胞として用いた。図４にペプチドBをパルスした細胞に対するMN/CA 9-CTL/cloneの細胞傷害性活性の結果を示した。
図４の結果より、 MN/CA 9-CTL/cloneがペプチドBをパルスしたBALB3T3細胞特異的に細胞傷害性を示すことが明らかとなった。
【００５３】
実施例５
MN/CA 9抗原ペプチドによるCTL誘導
ペプチドＢを用いて、マウスにおいてin vitroで抗原特異的なCTLが誘導可能であるかを検討した。
ペプチドＢ（100μg/マウス）とフロイントの不完全アジュバント (IFA)を乳化させ、これをBALB/cマウス（H-2Kd陽性、日本SLC）に１週間間隔で３回皮下投与することにより免疫を行った。最終免疫操作1週間後、脾臓細胞を摘出・分散させた。この細胞分散液（2×107細胞）とMMC処理したMN-RenCa細胞（1×106細胞）を共培養（25cm2フラスコ内で培養、20ml RPMI(20% FBS, 50μM 2-ME, 100IU/ml ペニシリン, 100mg/ml ストレプトマイシンを含む)）することにより、in vitroにおける抗原再刺激を行った。4日後、これらの細胞をエフェクターCTL細胞として、実施例２で用いたTNF release assay法を用いて検討した。標的細胞としては、実施例４で示したペプチドBをパルスした細胞を同様に用いた。ペプチドBを用いて誘導したエフェクター細胞のペプチド特異的細胞傷害性活性の結果を図５に示した。
【００５４】
図５の結果より、ペプチドBを用いてCTL誘導を行ったマウス由来のエフェクター細胞は、ペプチドBをパルスしたBALB3T3細胞特異的な細胞傷害性を示すことが明らかとなった。
【００５５】
以上の結果より、MN/CA 9抗原によりBALB/c（H-2Kd）マウスにおいて誘導されるCTLがペプチドBを認識すること、またこのペプチドを用いてCTL誘導が可能であることが明らかとなった。
【００５６】
配列表フリーテキスト
配列番号：４に記載のアミノ酸配列の第２番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンであり、第９番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである。
配列番号：５に記載のアミノ酸配列の第２番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンであり、第９番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである。
配列番号：６に記載のアミノ酸配列の第２番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンであり、第９番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである。
【００５７】
【発明の効果】
本発明により、 MN/CA9抗原由来のHLA-A24拘束性腫瘍抗原ペプチドおよび機能的に同等の特性を有するその誘導体、またはこれらの腫瘍抗原ペプチドおよびその誘導体を in vivoまたはin vitroで利用した腫瘍の治療剤、予防剤または診断薬などが提供される。本発明の腫瘍の治療剤または予防剤は、多くの患者に適用可能であり、さらに、発生頻度の高い腎細胞癌等に応用できるものであるため、抗腫瘍剤としての有用性が期待される。
【００５８】
【配列表】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、MN-RenCa細胞またはRenCa細胞に対するMN/CA9-CTL/bulkの反応性を示すグラフである。図中、黒塗りはTNF(100U)の結果を、斜線はMN/CA9-CTL/bulkとMN-RenCAの混合培養上清の結果を、横線はMN/CA9-CTL/bulkとRenCAの混合培養上清の結果を示す。
【図２】図２は、抗CD8抗体及び抗CD4抗体を用いてFACS解析を行った結果を示すグラフである。
【図３】図３は、MN-3T3及びBALB3T3に対するMN/CA 9-CTL/cloneの反応性を示すグラフである。図中、斜線はMN-3T3の結果を、黒塗りは3T3の結果を示す。また図中、E/T比は効果細胞（E）であるMN/CA9-CTL/cloneと標的細胞(T)であるMN-3T3又はBALB3T3の細胞数の比を示す。
【図４】図４は、ペプチドBをパルスしたBALB3T3細胞に対するMN/CA 9-CTL/cloneの細胞傷害性活性の結果を示すグラフである。図中、斜線はペプチドをパルスしたBALB3T3の結果を、黒塗りはBALB3T3の結果を示す。
【図５】図５は、ぺプチドBを用いて誘導したエフェクター細胞のペプチド特異的細胞傷害性活性の結果を示すグラフである。図中、黒塗りはペプチドをIFAエマルションで免疫し、in vitroでMN-RENCAで刺激したリンパ球の結果を、横線はペプチドなしのIFAエマルションで免疫し、in vitroでMN-RENCAで刺激したリンパ球の結果を、ドットはペプチドをIFAエマルションで免疫し、in vitroでRENCAで刺激したリンパ球の結果を、斜線はペプチドなしのIFAエマルションで免疫し、in vitroでRENCAで刺激したリンパ球の結果を示す。

【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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