(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモグロビンと、カルボキシル基においてアミド結合によりヘモグロビンに化学結合した次式のＴＲＯＬＯＸ
【化３】
0004739530.tif 000014
とを含む、酸素輸送および抗酸化剤療法を目的とした、生物に投与するための化学的組成物。
【請求項２】
複合体のヘモグロビンが架橋されて、安定化４量体単位を形成している請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
複合体のヘモグロビンが少なくとも部分的にオリゴマー化されて、１２個までの安定化４量体単位からなるオリゴマーになっている請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
ＴＲＯＬＯＸに複合した安定化４量体ヘモグロビン単位と、ＴＲＯＬＯＸに複合した前記安定化ヘモグロビン単位２〜８個のオリゴマーとの混合物を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
ヘモグロビンがポリアルデヒド、グルタルアルデヒド、ジアスピリン化合物、ピリドキシル化合物またはトリメソイル化合物で架橋されている請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
ヘモグロビンが、多糖類の酸化的開環から誘導されるポリアルデヒドで架橋されている請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ポリアルデヒドがｏ−ラフィノースである請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ヘモグロビン−ＴＲＯＬＯＸ複合体が生体適合性ポリマーに結合している請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
生体適合性ポリマーがポリエチレングリコール、多糖類、ポリアミノ酸または不溶性支持体である請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
ヘモグロビンがヒトヘモグロビンである請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
抗酸化性を有し、哺乳類患者への投与に適するヘモグロビン組成物を調製する方法であって、間質不含有ヘモグロビンと請求項１に定義したＴＲＯＬＯＸとを、精製した間質不含有ヘモグロビンと化学的に反応させ、それらがアミド結合で連結した化学的複合体を形成することを含む方法。
【請求項１２】
ヘモグロビンとＴＲＯＬＯＸとの反応が活性化化合物の存在下で行われる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＴＲＯＬＯＸと複合させる前に、ヘモグロビンを架橋試薬と反応させることにより、４量体単位形に安定化させて２量体単位への解離を防止する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
架橋試薬がポリアルデヒドである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ポリアルデヒドがｏ−ラフィノースであって、ｏ−ラフィノースとの更なる反応によって、ヘモグロビンが更に少なくとも部分的にオリゴマー化される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ヘモグロビン−ＴＲＯＬＯＸ複合体を、続いて架橋試薬と反応させることによって、複合体のヘモグロビン部を架橋安定化させる請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
架橋試薬がｏ−ラフィノースである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
活性化化合物がカルボジイミドである請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
カルボジイミドが１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ヘモグロビンがヒトヘモグロビンである請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はヘモグロビン組成物に関し、より詳細には、酸素輸送および抗酸化剤療法を目的とした、生物に投与するためのヘモグロビン−抗酸化剤組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
組織への血流の一時的遮断は、失血を予防し、手術を容易にするために、心臓手術、あるいは器官の保存や移植等の多くの外科処置において、必要な手段である。心筋梗塞、血栓性発作、塞栓性血管閉塞、狭心症、末梢血管不全等の発症中にも、血管が遮断され得る。このような状況下での血液供給の不足は虚血を起こすが、虚血組織を血液や他の酸素運搬溶液で再灌流すると、それが逆転される。この酸素の再供給は組織の機能継続に肝要であるが、新たに導入した酸素は組織障害を起こす酸素誘導フリーラジカルの形成に寄与すると一般に認められている。導入酸素が有毒になる一つの機構は、キサンチンオキシダーゼによるスーパーオキシドへの変換によるものである。この酵素の濃度は虚血期間中に増加し得る。同時に、グルタチオン等の還元性解毒剤は激減する。これらの事象の結果として起こる組織障害は、再灌流傷害として知られており、血液の再灌流中に起こることが知られ、代用血液を用いた状況下でも起こることが予想されている。
【０００３】
一群の代用血液であるヘモグロビン系酸素運搬剤（ＨＢＯＣ）は、化学的に修飾された無細胞ヘモグロビンから成る。無細胞ヘモグロビンは、損傷性のおそれがある反応性酸素種のさらなる源を提供する。血液中のヘモグロビンは、正常には血液の赤血球細胞中に含まれ、体中を循環して酸素輸送能を発揮する。赤血球中のヘモグロビンは、血液が肺を循環するとき酸素と結合し、体組織に酸素を配送し、そこで酸素を放出して正常な代謝機能を営ませる。血液中のヘモグロビンの化学的挙動は、それが赤血球中に存在し、そこにはヘモグロビンの化学的挙動に影響する酵素等の他の多くの成分も含まれているために、抑制されている。ヘモグロビンを赤血球から抽出し、代用血液用に無細胞酸素輸送剤として使用できるように精製すると、他の赤血球成分のヘモグロビンに対する化学的影響およびその反対の影響は失われる。
【０００４】
これらの影響のひとつが、酸素−ヘモグロビン反応および有毒酸素種の発生に関係している。配位した酸素によるヘモグロビンの酸化はメトヘモグロビンを生成し、そこではヘム鉄がＦｅ（ＩＩＩ）状態に酸化され、酸素フリーラジカルである「スーパーオキシド」、すなわち・Ｏ２−が発生する。メトヘモグロビンは、酸素を結合し、輸送することができないので、目だった有用な機能を有していない。しかし、スーパーオキシドは、酸化性障害、内皮や内皮下組織を含む血管構成要素の傷害等の体内の多くの有害効果と関係している。赤血球では、これらの有毒酸素種を無害な副生物に変換するために、酵素が存在している。すなわち、メトヘモグロビンレダクターゼ酵素系が存在してメトヘモグロビンをヘモグロビンに還元する。スーパーオキシドディスムターゼおよびカタラーゼが存在して、これらは各々スーパーオキシドを過酸化水素に変換し、過酸化水素を水と分子状酸素に変換する。
【０００５】
赤血球外部のヘモグロビンは、これらの酸化副生物に対処するためのこのような酵素試薬を手近に持っていない。その結果、酸素輸送剤として無細胞ヘモグロビンを使用すると、ヘモグロビン自体と結合した、あるいは結合しつつある酸素から生じるスーパーオキシド等の有害な酸化生成物が過量に生成するおそれがある。同様にして、ＨＢＯＣ溶液中、または虚血組織に再導入された混合血液中に溶解する酸素は、反応性酸素種を生じ、前記の機構による再灌流傷害を引起すおそれがある。しかし、酸素供給を再び獲得しようとする要求が何よりも優先し、再灌流傷害や酸素ラジカル導入に伴う危険性は無視されてしまう。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、前記問題を克復するか、少なくとも弱めながら、酸素を供給することのできる新規なヘモグロビン組成物を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
ＨＢＯＣ等の合成または半合成酸素輸送物質の調製は、選択された抗酸化剤等の改善物質を結合する機会を提供する。したがって、本発明は、酸素輸送能を有し、以下の化合物から選択された１種または複数種の生体適合性抗酸化剤に化学結合した生体適合性酸素輸送性分子を含む化学的組成物を提供する
：非酵素性フェノール化合物、即ち次式で表わされる１個または複数個の基を有する化合物
【０００８】
【化５】
0004739530.tif 000002
【０００９】
（前記式においてｎは１〜３の整数であり、芳香環は更に置換され、かつ任意選択的に他の炭素環系または複素環系に融合するか、連結している）；ピラゾリン；カロチノイドおよびレチノイド化合物；キノン；ポリピロール；インドールおよびアミノインドール；プリン類縁体；アスコルビン酸；ステロイドおよびアルカロイド抗酸化剤。
【００１０】
本発明の複合体は、酸素輸送性分子と化学的に結合した近接部に抗酸化性官能基を提供する。したがって、酸素含有溶液の反応によって発生する反応性酸素種は、直ちに抗酸化剤機能の作用を受けることになるが、その酸素種が短寿命であり、遠くまで移動しないうちに障害を起こすので、これは極めて望ましい特徴である。修飾したヘモグロビンに基くＨＢＯＣを使用するとき、このことは特に重要である。何故ならば、修飾ヘモグロビンは浸出することが知られており、そのために抗酸化剤活性はＨＢＯＣが移動する任意の部位に輸送されると思われるからである。その上、酸素輸送剤と複合した酸化形の抗酸化剤部分は、生体内で更なる抗酸化剤活性を発現することのできる化学状態に還元され、そのような作用を更に発現するために、そうした複合体が体内でリサイクルされるようである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の抗酸化剤として使用される好ましいフェノール化合物は、プロブコールとそのエステル、ビス（１，１−メチルエチル）−４−［（１−エチルアミノ）メチルフェノールとその付加塩、５−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシベンジル）チアゾリジン−４−オン等のポリフェノール性および置換フェノール性抗酸化剤；（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニルチオ）アルカノール等のフェノールエーテル；ジ−ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキシフェニルチオ置換ヒドロキサム酸；クロマノール、ジヒドロベンゾフラノール等のクロマン系化合物；フラバノン、ジヒドロフラバノール等のフラバノイドやイソフラバノイド；没食子酸類；カテコールとカテコール誘導体；およびｐ−ヒドロキシ安息香酸、ジヒドロキシ安息香酸、２−（２，３−ジヒドロ−５−アセトキシ−４，６，７−トリメチル）ベンゾフラニル酢酸等のフェノール酸である。特に好ましいものはトコール、トコフェロール等のクロマノールであり、更に好ましいものは６−ヒドロキシクロマンカルボン酸、６−ヒドロキシクロマン−２−カルボニトリル等の６−ヒドロキシクロマンである。他の好ましいフェノール化合物は３，４−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ナフトピランである。
【００１２】
適当なピラゾリノンの例は、ノルフェナゾンおよび３−メチル−１−フェニルピラゾリン−５−オンである。
【００１３】
好ましいカロチノイドおよびレチノイド化合物は、ビタミンＡ、カロチン、リコペンおよびルテインである。
【００１４】
適当なキノン抗酸化剤化合物の中で好ましいものは、コエンザイムＱおよびプラストキノン等の様々な植物由来キノンである。
【００１５】
好ましいテトラピロール化合物の例は、ビリルビンである。
【００１６】
メラトニンは、本発明で使用される適当な好ましいインドール化合物の例である。
【００１７】
本発明で有用なプリン類縁体は、尿酸、アロプリノール、オキシプリノールを含む。
【００１８】
適当なステロイド抗酸化剤の中で好ましいものは、コハク酸メチルプレドニゾロンおよびティリラザド等のラザロイド（２１−アミノステロイド）である。
【００１９】
生体適合性抗酸化剤が酸素輸送性物質と複合化する化学は、選択した抗酸化剤上、および選択した酸素輸送剤上で利用できる化学基を考慮すれば、当分野の技術範囲にある。選択した複合化形式によって酸素輸送機能や抗酸化剤能が大きく損なわれることのないように、注意を払う必要がある。
【００２０】
酸素輸送性化合物は、ヘム部分への酸素の可逆的結合によって酸素を輸送するヘモグロビン、ヘム−アルブミン等のヘム−蛋白巨大分子か、または気体酸素を溶解し、溶液としてそれを配送するペルフルオロカーボンであってもよい。利用し得る酸素輸送性化合物の中で好ましいものは、ヘモグロビンである。
【００２１】
本発明の好ましい複合体に使用されるヘモグロビン種は、酸素輸送能を有する実質的に任意の生体適合性ヘモグロビンであってよい。ヘモグロビン種は、ヒト由来であっても動物由来であってもよい。したがって、哺乳動物赤血球、例えば古くなったヒト血液から、赤血球を溶解し、得られたヘモグロビンを当分野で既知の方法により分離、精製することによって、それを得ることができる。最高の生体適合性を実現するためには、得られるヘモグロビンは間質やエンドトキシンを含むべきでない。あるいは、当分野で既知の組換え法や細胞培養法によって、生来型または突然変異型のヘモグロビンを調製してもよい。天然または非天然突然変異のヘモグロビン種の使用も、本発明の範囲に含まれる。
【００２２】
本発明による特定の好ましい一群の酸素輸送剤−抗酸化剤複合体は、酸素輸送性化合物と、抗酸化性を有し、次式に示す一般式に対応する６−ヒドロキシクロマン化合物との化学的複合体である：
【００２３】
【化６】
0004739530.tif 000003
【００２４】
上記式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は各々独立にＨ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルおよび（ＣＨ２）ｎＸから選択され、ｎは０から２０の整数であり；Ｒ、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は各々独立にＨ、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｘおよび−（ＣＨ２）ｍＸから選択され、ｍは０から２０の整数であり；Ｘは選択された酸素輸送性化合物と結合するように選定される反応性官能基であって、その反応性によって酸素輸送性化合物をクロマン化合物に化学的に連結し；但し、クロマン化合物は少なくとも１個の官能基Ｘを含むものとする。
【００２５】
このような複合体において、酸素輸送性化合物は好ましくはヘモグロビン種等のヘム−蛋白巨大分子であり、クロマン上の官能基Ｘはその蛋白鎖のアミノ酸残基と反応し得る基である。基Ｘに対する適切な選択例は、ハロ、カルボキシ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、アジド、アゾ、アルデヒド、グァニジンおよびホスフェートである。
【００２６】
本発明による特に好ましい一群の複合体は、ヘモグロビン−クロマンカルボン酸複合体、即ち基ＸはＣＯＯＨであり、そのカルボキシル機能を用いてヘモグロビンに化学的に共有結合されたものである。その結合は、ヘモグロビンのグロビン鎖上の１級アミン基に直接なされてもよい。あるいは適当な化学的リンカーを用いてもよい。本発明のこの実施形態に使用されるクロマンカルボン酸は、生体内で形成されるスーパーオキシドや他の反応性酸素種を排掃することのできる生体許容性抗酸化剤であることが、多くの事例で知られている。本発明によれば、クロマンカルボン酸の抗酸化剤機能は、ヘモグロビン種と複合した後でも少なくとも実質的に損なわれず、実際のところ、複合によって、ヘモグロビンとクロマンカルボン酸との物理的混合物の抗酸化剤作用と比べ、増加するようであることが判明した。本発明のヘモグロビン複合体は酸素輸送能を保持している。
【００２７】
本発明に使用される好ましい形態のヘモグロビン種は、架橋ヘモグロビンであって、そこでは４量体ヘモグロビン単位が分子内で化学的に架橋され、ヘモグロビン２量体に解離するのを防止している。良く知られているように、天然のヘモグロビン４量体が２量体に解離するこの傾向は、血液の赤血球からヘモグロビンを抽出する場合のもうひとつの成り行きである。このような解離によって形成される分子量約３２０００ダルトンのヘモグロビン２量体は、腎臓からの排泄によって早々にその系から失われるので、解離を最少限にすべきである。このような解離から保護するために、グルタルアルデヒド、糖類や多糖類の酸化的開環で誘導されるようなポリアルデヒド、ジアスピリン化合物、ピリドキシル化合物、トリメソイル化合物等の様々な化学架橋剤を用いて、ヘモグロビンを分子内架橋する様々な方法が当分野で知られており、開示されている。本発明に使用されるヘモグロビンを、同一または数種の架橋試薬を用いて、２個以上のこのような４量体、好ましくは１２個までのこのような４量体を分子間連結することによりポリマー形態に重合してもよい。分子内で架橋され、分子間で連結されたヘモグロビンのこのような種を２種以上含有する混合物は、とりわけ望ましい。
【００２８】
本発明による他の一群の複合体では、クロマンカルボン酸を非架橋ヘモグロビンに結合し、次いで、分子内安定化４量体ヘモグロビン−抗酸化剤複合体を形成するために、複合体の架橋を企てるが、それを任意選択によってオリゴマーまたはポリマーのこのような複合体との混合物中で行ってもよい。このような処置に使用される架橋試薬は前記のもののいずれでもよいが、生じる生成物の組成が望ましいことから、酸化的に開環したラフィノース（以後「ｏ−ラフィノース」と呼ぶ）が好ましい。クロマンカルボン酸抗酸化剤との複合後に行うときのヘモグロビン架橋反応の条件は、ヘモグロビンだけの架橋に利用する条件と大差ない。
【００２９】
ヘモグロビンの架橋前にヘモグロビンをクロマンカルボン酸に複合するか、または架橋ヘモグロビンをクロマンカルボン酸に複合するいずれかの方法を用いて、任意の非架橋ヘモグロビンをクロマンカルボン酸で修飾してもよい。非架橋ヘモグロビンは酸素排掃作用を施すべき反応性酸素種を依然発生させることができ、またこの非架橋形態のヘモグロビンは架橋ヘモグロビンと比較して異なる生体分布性を有することが知られているので、これは有益なことである。非架橋ヘモグロビンを除去する既知の方法は、このような種の量を制御するためにも使用することができる。
【００３０】
ポリマー、例えば適当な官能基を有するポリエチレンオキシド（ＰＥＧ）、多糖類、ポリアミノ酸、蛋白質および不溶性支持体に複合したヘモグロビン、あるいはカプセル封入ヘモグロビンのような他の修飾形態のヘモグロビンと共に、本発明を使用することもできる。このような全てのヘモグロビン修飾形態が、本明細書に記述したように、それに結合した抗酸化剤分子の存在によって有益性を得ることができる。
【００３１】
本発明の複合体に使用され、前記化学式に対応するクロマンカルボン酸は、ビタミンＥカルボン酸誘導体、例えば４，８，１２−トリメチル−トリデシルや４，８，１２−トリメチル−３，７，１１−トリデカトリエニルのような、様々な可能な立体配置のいずれかを有し、基Ｒが１６炭素原子の枝分かれアルキル鎖である誘導体であってもよい。Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくともひとつがメチルで、Ｒ４が直接結合である化合物が好ましい。他の好ましい一群の化合物は、Ｒがメチルを表す前記の式の化合物である。
【００３２】
本発明に使用されるクロマンカルボン酸の中で最も好ましいものは、Ｔｒｏｌｏｘとして一般に知られる、次式の化学式の２，５，７，８−テトラメチル−２−カルボキシクロマン−６−オールである。
【００３３】
【化７】
0004739530.tif 000004
【００３４】
したがって、説明を容易にするために、特にＴｒｏｌｏｘの使用を参考として本発明を更に説明することにするが、これを制限とみなすべきではない。ビタミンＥより大きな水溶性を有するビタミンＥ類縁体であるＴｒｏｌｏｘは、抗酸化剤活性を有する。本発明のこの態様に従って、Ｔｒｏｌｏｘのヘモグロビンとの複合により、Ｔｒｏｌｏｘの溶解性が増加し、その結果、遊離Ｔｒｏｌｏｘの場合より高い有効な濃度が得られ、その抗酸化作用が増加することが判明した。複合による質量増加の結果として、Ｔｒｏｌｏｘの生体内での循環半減期も顕著に増加する。
【００３５】
Ｔｒｏｌｏｘと前述した任意の型のヘモグロビンとを、化学的に結合することができる。Ｔｒｏｌｏｘ残基のカルボキシル官能基は、適切な活性化によってヘモグロビンのグロビン鎖上の１級アミン基、例えばリジン残基と反応し、アミド共有結合を形成する。
【００３６】
Ｔｒｏｌｏｘとヘモグロビンとの反応は、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）や他のカルボジイミド（単独またはＮ−ヒドロキシスルホスクシン酸イミドのような他の活性化剤と併用して）、ウッドワード試薬Ｋのようなイソキサゾリウム誘導体、クロロホルメート、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール、Ｎ−カルボアルコキシジヒドロキノリン等の活性化化合物の使用によって促進される。Ｔｒｏｌｏｘは酸、酸誘導体、対称性無水物のいずれかの形態で使用される。ＥＤＣ等の活性化化合物は、先ずＴｒｏｌｏｘとの反応によりＴｒｏｌｏｘカルボキシル基を活性化し、次いでそれがヘモグロビンのアミノ基と反応すると共に、ＥＤＣ官能基を脱離させる。このような活性化化合物の使用によって、Ｔｒｏｌｏｘのヘモグロビン上への担持量が増加し、かつ、このような担持量の制御が改善される。Ｔｒｏｌｏｘや結合剤の溶解を促進するために、ヘモグロビン水溶液と組合せて、様々な溶媒を必要に応じて使用することができる。
【００３７】
ヘモグロビンをこのようなカルボジイミド化合物と反応させる条件および手順は、当分野の技術の中に十分含まれる。水溶液を用いて、室温で反応を行うのが適当である。
【００３８】
直接結合の代わりに化学的なスペーサーまたはリンカーを利用してもよく、その結果として、複合体は１個または複数個の非Ｔｒｏｌｏｘ分子が結合するヘモグロビンを含み、Ｔｒｏｌｏｘは非Ｔｒｏｌｏｘ化学残基に結合する。このようなリンカーの例は、官能化した糖類および多糖類、ポリリジン等のポリアミノ酸、ＰＥＧ誘導体、および様々な二官能性または多官能性リンカーを含む。このようなリンカーの使用は、ヘモグロビンとの結合１個当たり数個のＴｒｏｌｏｘ結合部位を提供し、それによってヘモグロビンのより少ない修飾でＴｒｏｌｏｘのより大きな担持量をもたらすことができる。それはまた、適当なリンカーの選択によって、複合体の性質（溶解性、活性等）の多様な改変を可能にする。
【００３９】
所望の場合はリンカーを介して、Ｔｒｏｌｏｘに結合するために使用されるグロビン鎖上の１個または複数個の基の詳細が、肝要であるとは思われない。その部位は、αグロビン鎖およびβグロビン鎖の一方または両方の上にあってもよい。化学的連結のために、リンカーを適切に選択し、適用し得る化学を用いることによって、アミノ基だけでなく、ヘモグロビン種の他の官能基、たとえばチオール、カルボキシレート、グァニジノ、イミダゾール、ヒドロキシル等も用いることができる。このような選択は当分野の技術の範囲に含まれる。
【００４０】
本発明の方法の好ましい特徴は、Ｔｒｏｌｏｘの全量を１回で添加する代わりに、所望の量を数回、例えば２〜５回に分けて逐次添加することである。このような逐次添加は、ヘモグロビンへのＴｒｏｌｏｘ担持量を増加させ、より大きな抗酸化剤活性を有する生成物を生じることが示された。
【００４１】
本発明に従ってヘモグロビンに複合するＴｒｏｌｏｘの好ましい量は、実際に抗酸化剤、ラジカル排掃機能を果たすに十分なＴｒｏｌｏｘを提供することに基いて決定されるが、ＨＢＯＣの酸素輸送能と酸素親和性を妨害するほどに多量ではない。複合体を作る反応溶液に添加する活性化物質および／またはＴｒｏｌｏｘの量を加減することによって、その量を加減することができる。ヘモグロビンとＴｒｏｌｏｘとの適当なこのような相対量は、約１から約１００、最も好ましくは約１０から約１００である。
【００４２】
前述のようにして複合体を調製した後、未変化の試薬および他の如何なる汚染物質も除くために、所望であれば生成物を入念に徹底的に精製する。クロマトグラフィー（サイズ排除、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティー、イオン交換等）、または透析／透析ろ過、限外ろ過または選択的沈殿、遠心分離、抽出または他の任意の分離形式を含む当分野で公知の他の方法によって、精製を行うことができる。複合体の保存は、封止された非酸化性条件下、４℃またはより高い冷蔵庫温度で、要求に応じて患者にすぐ投与できる水溶液として行うのが適切である。凍結乾燥粉末、凍結溶液等の代替的な保存条件も使用し得る。
【００４３】
次の非制限的な具体的実施例において、例示する目的のために、本発明を更に説明する。
【００４４】
【実施例】
実施例１  複合体の調製および特性決定
下記の表１に示した様々な条件下、結合剤として１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いて、Ｔｒｏｌｏｘ（ＴＸ）を一酸化炭素ヘモグロビン（ＣＯＨｂ）に複合する一連の実験を行った。各例において、ＥＤＣとＴｒｏｌｏｘ（ＴＸ）を室温で１０分、アセトニトリル中の等モル濃度で混合し、ＴＸ−ＥＤＣストック溶液（１．５５Ｍ）を調製した。複合反応の最終的なアセトニトリルおよびＴＸ−ＥＤＣの含量が表１に示したものとなるように、必要であればＨｂに添加する直前に、ＴＸ−ＥＤＣストック溶液をアセトニトリルで希釈した。全ての複合反応を４０〜５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液中、示したｐＨの値で行った。ＣＯガスの下２２℃で、２４時間まで反応混合物を維持した。試料をろ過し、分析する前にｐＨ７．４のリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。
【００４５】
【表１】
表１：Ｔｒｏｌｏｘ−Ｈｂ反応溶液の調製
0004739530.tif 000005
【００４６】
このようにして調製した複合体の特性を決定するために、逆相ＨＰＬＣを用いて複合体のグロビン鎖（元のままのか、または修飾した）を分離した。この過程中にヘムも分離する。グロビン鎖の分子量を決定するために、逆相ＨＰＬＣに結合したエレクトロスプレー質量分析（ＬＣＭＳ）を用いた（表２）。
【００４７】
【表２】
表２：様々なＴＸ−ＥＤＣ反応条件下での修飾グロビン鎖の分布
0004739530.tif 000006
【００４８】
通常、修飾した鎖は未修飾の鎖より後で流出した。ＬＣＭＳによって３種の主な修飾鎖が同定された（表３）。
【００４９】
【表３】
表３：Ｈｂ−ＴＸ複合体のグロビン鎖に対する計算質量および測定質量
0004739530.tif 000007
【００５０】
即ち、１分子のＴｒｏｌｏｘが結合したβ鎖（β（ＴＸ）１）と、１分子（α（ＴＸ）１）または２分子（α（ＴＸ）２）のＴｒｏｌｏｘが結合したα鎖である。質量はアミド結合複合体と一致する。Ｈｂをアセトニトリルだけで処理した対照反応は、グロビン鎖の修飾を全く示さなかった。
【００５１】
グロビン鎖修飾データを調べると、反応条件を適切に操作することによって制御が可能となることが明らかとなる。複合中のＴＸ対ヘモグロビンの比が、グロビン鎖修飾に最大の効果を及ぼす。１．５５ｍＭのＨｂで、ＴＸ：Ｈｂ比を１：１から１０：１、更に１００：１に増加すると、グロビン鎖修飾が反応１、３および５で各々１．５％から２４．０％、更に５０．５％に増加した。０．１５５ｍＭのＨｂで、ＴＸ：Ｈｂ比を１０：１から１００：１に増加すると、グロビン鎖修飾が反応２および４で各々２２．０％から７９．５％に増加した。１０：１のＴＸ：Ｈｂ比を用いたとき、反応物質濃度を増加させても効果がなく、反応２および３において０．１５５および１．５５ｍＭのＨｂで、各々２２．０および２４．０％の鎖修飾が起こった。１００：１のＴＸ：Ｈｂで、Ｈｂ濃度を０．１５５から１．５５ｍＭに増加させることによって、グロビン修飾が低下した（７９．５％から５０．５％に）。ＴＸ：Ｈｂを１００：１の一定に保って全反応物質を１０倍に希釈すると、反応時間を減少した場合（反応５対８）およびｐＨを６から７に増加した場合（反応８対９）と同様に、グロビン修飾のわずかな減少（反応６対７）が起きた。アセトニトリル含量を１０から１％（ｖ／ｖ）に低下させると、反応４および７においてグロビン修飾が各々７９．５および５９．４％になった。
【００５２】
実施例２  抗酸化剤活性の測定
血液をヘパリン処理試験管に採集した後、赤血球を遠心分離し、ｐＨ７．４のＰＢＳ１０容で３回洗浄した。最後の洗浄中に、赤血球を１０００Ｇで１０分間遠心分離し、しっかりと充填された細胞調製物を得た。ペルオキシルラジカルが介在する溶血試験をＭｉｋｉ等の変法（Ｍ．Ｍｉｋｉ，Ｈ．Ｔａｍａｉ，Ｍ．Ｍｉｎｏ，Ｙ．Ｙａｍａｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｅ．Ｎｉｋｉ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５８：３７３−３８０（１９８７））によって行った。ｐＨ７．４のＰＢＳ中新鮮な赤血球の３０％懸濁液、試験試料および３００ｍＭ  ２，２−アゾ−ビス（２−アミジノプロパン・二塩酸塩）（ＡＡＰＨ、ラジカル発生剤）の各等容を順に混合した。混合物はＣＯガス下で調製し、赤血球試験懸濁液中のヘモグロビン試験濃度は１２〜１３ｍｇ／ｍｌであった。混合物を３７℃に維持し、各分割液をＰＢＳ中で２０倍に希釈し、更に１０００Ｇで１０分間遠心分離した。赤血球溶解により放出されるＨｂの尺度として、上清液の吸光度をＴｅｎｔｏｒｉの方法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ７５：７０７（１９８１））に従って全ＨｂをＣＮ−ｍｅｔＨｂに変換後、５４０ｎｍで測定した。試験試料に添加したＨｂに対して、上清液Ｈｂ濃度を補正した。
【００５３】
２種の生成物に対する結果が、様々な生成物の時間に対する相対的赤血球溶解性のプロットである図１に図示されている。実施例１の表１において反応６（Ｈｂ−Ｔｒｏｌｏｘ  Ｂ）および反応７（Ｈｂ−Ｔｒｏｌｏｘ  Ａ）に対して述べたようにして、分析される生成物を調製した。複合体がない（ＡＡＰＨだけ）場合、インキュベーション期間にわたる上清中のＨｂ濃度の増加によって、赤血球の溶解が証明される。Ｈｂ−Ｔｒｏｌｏｘ複合体を含有する試験混合物中では、上清中のＨｂ濃度がこの期間にわたって同レベルまで増加せず、ラジカル発生剤の溶解効果に対する保護を示している。赤血球溶解物の吸光度を時間に対してプロットすることにより得られる曲線の下側の面積（ＡＵＣ）の比較によって、相対的保護性も決定した。ＡＵＣは、赤血球溶解の開始時期、割合および全期間によって決定される。ＡＵＣ値が低いほど、溶解に対する赤血球の保護が大きいことを示す。Ｈｂ−Ｔｒｏｌｏｘ  ＡおよびＢに対するＡＵＣは、対応する各対照反応用生成物（ＴＸ−ＥＤＣ無添加、表４）に対するものより顕著に低かった。
【００５４】
【表４】
表４：Ｈｂ−Ｔｒｏｌｏｘ複合体および対照による抗酸化剤保護度
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【００５５】
遊離Ｔｒｏｌｏｘ、遊離（対照）ヘモグロビン、および遊離Ｔｒｏｌｏｘとヘモグロビンの混合物の各存在下での、赤血球溶解に対するＡＵＣデータも示されている。Ｔｒｏｌｏｘ単独およびヘモグロビン単独はいずれも、同量のヘモグロビンおよび同濃度かそれより低い濃度のＴｒｏｌｏｘを結合形態で含有する対応するヘモグロビン−Ｔｒｏｌｏｘ複合体ほどには保護性を示さない。遊離Ｔｒｏｌｏｘとヘモグロビンの混合物は、同濃度のいずれかの化合物単独より大きな保護性を示すが、それでもなお、同量のヘモグロビンおよび同濃度かそれより低い濃度のＴｒｏｌｏｘを結合形態で含有する対応するヘモグロビン−Ｔｒｏｌｏｘ複合体ほどには保護性を示さない。複合体および混合物は同じヘモグロビン含量を有し、複合体は混合物と同量か、それより少ないＴｒｏｌｏｘを含有するので、複合体の方が活性が大きいことは、複合による全体としての抗酸化剤活性の増加によって示される相乗効果を示唆する。
【００５６】
実施例３  Ｔｒｏｌｏｘで修飾したヘモグロビンの重合
実施例１で調製したヘモグロビン−Ｔｒｏｌｏｘ複合体（Ｈｂ−Ｔｒｏｌｏｘ  ＡおよびＢ）を、ｐＨ６．８の５０ｍＭ  ビス−トリス緩衝液に対して透析した。水に溶解した３当量のｏ−ラフィノース（米国特許第５５３２３５２号、Ｐｌｉｕｒａ等）をヘモグロビン−Ｔｒｏｌｏｘ溶液に添加し、４２ｍｇ／ｍＬの最終ヘモグロビン濃度を得た。混合物を２２℃で２４時間、ＣＯガス下に維持した。溶液を酢酸ナトリウムについて３０ｍＭにし、ｏ−ラフィノース含量に対して２０当量の水性ジメチルアミンボランを添加した。２４時間後、溶液を水に対し、次いでｐＨ７．４のＰＢＳに対して透析した。解離性非変性条件下でのサイズ排除クロマトグラフィーは、分子内および分子間で架橋したヘモグロビン−Ｔｒｏｌｏｘ種の形成を示した（表５）。
【００５７】
【表５】
表５：ｏ−ラフィノースで重合したヘモグロビン−Ｔｒｏｌｏｘの分子量分布
0004739530.tif 000009
【００５８】
ｏ−ラフィノースによって架橋されていないＨｂ−Ｔｒｏｌｏｘは、用いたクロマトグラフィー条件下で３２ｋＤａのα−βグロビン２量体として溶出する。必要であれば、限外ろ過、クロマトグラフィー等の従来法によって、この非架橋Ｈｂ種を除去することができる。非架橋Ｈｂ種の量を制御する条件を最適化することは可能である。
【００５９】
実施例４  Ｔｒｏｌｏｘで重合したＨｂ複合体の調製
実施例１の方法を用いて、Ｔｒｏｌｏｘをｏ−ラフィノース架橋Ｈｂ（ポリＯＲ−Ｈｂ、米国特許第５５３２３５２号、Ｐｌｉｕｒａ等）に複合した。１００倍モル過剰のＴＸ−ＥＤＣを、ポリＯＲ−Ｈｂと１００ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液中、ｐＨ５、６および７で反応させた。全ての試料をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ  ＨＰＬＣ）によって分析した。ポリＯＲ−Ｈｂでは、ＴＸ−ＥＤＣとの反応前に、αおよびβ鎖がｏ−ラフィノースによって各々３３および９０％修飾されている（表６）。
【００６０】
【表６】
表６：ポリＯＲ−Ｈｂ−ＴＸ複合体のグロビン鎖の修飾
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＊対照反応で、ＴｒｏｌｏｘもＥＤＣも添加せず。
【００６１】
３点の異なるｐＨ値でＴＸ−ＥＤＣと反応させた後、αおよびβ鎖の修飾は各々６７〜７７％および９３〜９９％に増加し、数種の新しい修飾鎖がＲＰ  ＨＰＬＣにより観察された。これらのＴＸ修飾鎖の一部は、実施例１で同定したように、ＨｂとＴＸ−ＥＤＣとの反応後に観察したものに対応していた。
【００６２】
実施例５
ｉ）Ｔｒｏｌｏｘのｏ−ラフィノース重合ヘモグロビンとの複合：
Ｔｒｏｌｏｘの単回および多回添加
ｏ−ラフィノース重合ヘモグロビン（ポリＯＲ−Ｈｂ）を米国特許第５５３２３５２号、Ｐｌｉｕｒａ等に記載のように調製した。ｐＨ７．０の１２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液約５０ｍＬ中の０．５０ｇポリＯＲ−Ｈｂ溶液２種（反応ＡおよびＢ）に、アセトニトリル１ｍＬ中ＥＤＣ０．１４９ｇと室温で、１０〜２０分間予め反応させておいたＴｒｏｌｏｘ０．１９４ｇを各々添加した。反応Ｂには、同量のＴｒｏｌｏｘ／ＥＤＣを５および１９時間後にも添加し、合計３回添加した。反応Ａには、アセトニトリル１ｍＬ容を同じ各時間に添加した。両方の反応をＣＯガス下、２２℃で合計２７時間撹拌した。ろ過し、水、トリス緩衝０．５Ｍ  ＭｇＣｌ２およびｐＨ７．４のリン酸緩衝塩水に対して透析した後、試料を分析した。クロマトグラフィーでは遊離のＴｒｏｌｏｘを検出することができなかった。Ｔｒｏｌｏｘを添加せずにＥＤＣ単独との反応によって、対照生成物を調製した。
【００６３】
ｉｉ）溶解に対する赤血球の試験管内での保護
実施例２に記載した方法を用いて、２種の複合体の抗酸化剤活性を測定した。試料をＣＯで配位させ、赤血球試験懸濁液中の各複合体および対照の濃度を１２ｍｇ／ｍＬとした。両Ｔｒｏｌｏｘ複合体は、Ｔｒｏｌｏｘを含まない対応する対照より大きな保護性を示した。Ｔｒｏｌｏｘを３回添加した後に得た生成物が最大の保護性を示したが、Ｔｒｏｌｏｘを単回添加して得た生成物より、その生成物はＴｒｏｌｏｘにより広範に修飾されていることが逆相ＨＰＬＣ分析によって判明した。３回添加生成物のＡＵＣは対照の３％であったが、単回添加生成物のＡＵＣは対照の３３％であった。その結果は下の表７に提示されている。
【００６４】
【表７】
表７：ポリＯＲ−Ｈｂ−Ｔｘ複合体および対照による抗酸化剤保護度
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【００６５】
実施例６
ｉ）ｏ−ラフィノース重合ヘモグロビンのＴｒｏｌｏｘ複合体（ポリＯＲ−Ｈｂ−ＴＸ）の大規模調製
ｏ−ラフィノース重合ヘモグロビン（ポリＯＲ−Ｈｂ）を米国特許第５５３２３５２号、Ｐｌｉｕｒａ等に記載のように調製した。Ｔｒｏｌｏｘ４．０１ｇをアセトニトリル４０ｍＬ中ＥＤＣ３．０７ｇと室温で１０〜２０分間反応させた。この溶液をｐＨ７．０の１２６ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液２Ｌ中のポリＯＲ−Ｈｂ１８．９ｇに添加した。同量のＴｒｏｌｏｘ／ＥＤＣを３．５および２１時間後にも添加し、合計３回添加した。その反応をＣＯガス下、２２℃でプロセスの全期間にわたり撹拌した。合計２６時間の反応後、溶液をろ過し、水、リン酸緩衝塩水および乳酸加リンガー液に対して透析ろ過し、最終Ｈｂ濃度を７７ｍｇ／ｍＬとした。乳酸加リンガー液による透析ろ過の間、希釈ＮａＯＨでｐＨを７．２４に調整した。クロマトグラフィーでは遊離のＴｒｏｌｏｘを検出することができなかった。更に分析する前に、生成物の一部を酸素化した。
【００６６】
ｉｉ）溶解に対する赤血球の試験管内での保護
実施例１に記載した方法を用いて、ポリＯＲ−Ｈｂ−ＴＸの抗酸化剤活性を測定した。試験した生成物は、酸素およびＣＯ配位ポリＯＲ−Ｈｂ（ＴＸまたはＥＤＣによる処理をせず）、前述のような酸素化の前に保存したＣＯ配位生成物、および酸素化生成物を含んでいた。全ての生成物は、赤血球溶解試験懸濁液中１１．７ｍｇ／ｍＬで存在していた。その結果は下の表８に提示されている。これらの結果は、対照よりもＴｒｏｌｏｘ複合体の酸素化形および一酸化炭素形の両者によって、溶解に対する赤血球保護が改善されることを示す。
【００６７】
【表８】
表８：ポリＯＲ−Ｈｂ−Ｔｘおよび対照による抗酸化剤保護度
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【００６８】
実施例７
意識を有するラットにおいて１０％最高量を注入した後のポリＯＲ−Ｈｂ−ＴＸの血流力学的効果
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ種の雌ラット（２５０〜３５０ｇ）を実験日にイソフルランで麻酔した。右大腿の動脈および静脈にカニューレを挿入した。手術から１．５時間の回復後、代謝ケージ中の意識を有する動物に２種の溶液のいずれか、即ち、実施例６で調製した酸素化ポリＯＲ−Ｈｂ−ＴＸ、またはポリＯＲ−Ｈｂ（ＴＸ−ＥＤＣによる処理なし。溶液はいずれも乳酸加リンガー液中で７．７ｇ／ｄＬであった）を注入した。注入体積は動物の見積り血液体積の１０％に等しかった。基準値を決定するために注入前３０分と、注入中、および注入後２時間の間、平均動脈血圧（ＭＡＰ）および心拍数（ＨＲ）を記録した（図３および４）。４匹の動物を２群の各々で試験した。注入前の基準ＭＡＰは、１０１±４ｍｍＨｇ（ポリＯＲ−Ｈｂ）および１１０±３ｍｍＨｇ（ポリＯＲ−Ｈｂ−ＴＸ）であった。注入後のＭＡＰは、ポリＯＲ−ＨｂおよびポリＯＲ−Ｈｂ−ＴＸの各群で各々１４２±７および１５１±１ｍｍＨｇに有意（Ｐ＜０．０１）に増加した。２群間の増加量に有意の差はなかった（Ｐ＞０．０５）。注入前のＨＲは、ポリＯＲ−ＨｂおよびポリＯＲ−Ｈｂ−ＴＸの各群で各々４０７±１７および３９４±１７拍毎分（ｂｐｍ）であった。注入後のＨＲは、ポリＯＲ−ＨｂおよびポリＯＲ−Ｈｂ−ＴＸの各群で各々３４５±１６および３１６±１０ｂｐｍに有意（Ｐ＜０．０１）に減少した。２群間の増加量に有意の差はなかった（Ｐ＞０．０５）。Ｔｒｏｌｏｘの複合は、本研究のＨＢＯＣ、ポリＯＲ−Ｈｂの血流力学的性質を改変しなかった。
【００６９】
実施例８  デオキシ条件下での複合
ＨＢＯＣとしての使用により適当な、高いＰ５０を有する生成物を調製するために、Ｔｒｏｌｏｘをデオキシ条件下でポリＯＲ−Ｈｂに複合した。ポリＯＲ−ＨｂおよびＭＥＳ緩衝液を標準的な手段によって脱酸素化した。アセトニトリル４ｍＬ中、室温で１０〜２０分間、Ｔｒｏｌｏｘ０．７８ｇをＥＤＣ０．６０ｇと反応させた。この溶液をｐＨ７．０の１２０ｍＭ  ＭＥＳ２００ｍＬ中のポリＯＲ−Ｈｂ２．０４ｇに添加した。同じ溶液を４時間後および２１時間後の２回添加した。１回目の添加から２７時間後に、反応混合物をＣＯガスで充填し、ろ過し、濃縮し、更にＰＢＳに対して広範囲に透析した。出発物質ポリＯＲ−Ｈｂ、本実施例で調製した複合体および実施例６で調製した複合体の各Ｐ５０は、Ｈｅｍｏｘ−Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＴＣＳ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、サザンプトン、ペンシルバニア、米国）を用いた結果、３７℃で４１、４０および１６ｍｍＨｇであった。
【００７０】
実施例９  抗酸化剤活性の比較
実施例１に述べた方法を用いて、デオキシ条件下（実施例８）およびＣＯ条件下（実施例６）で調製した各ポリＯＲ−Ｈｂ−ＴＸ生成物の抗酸化剤活性を測定した。試料にＣＯを配位させ、赤血球試験懸濁液中の複合体および対照の濃度を１２ｍｇ／ｍＬとした。同濃度のポリＯＲ−Ｈｂ、ならびに試験溶液中での溶解限界の１倍および０．５倍に相当する２種のＴｒｏｌｏｘ単独溶液を評価した。両複合体は、ポリＯＲ−ＨｂおよびＴｒｏｌｏｘ対照より大きな保護性を示した。これを下の表９に示す。デオキシ条件下およびＣＯ条件下で調製した各生成物の保護性は同等であった。
【００７１】
【表９】
表９
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【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例２の結果のグラフ表示である。
【図２】  実施例２の結果のグラフ表示である。
【図３】  実施例７の結果のグラフ表示である。
【図４】  実施例７の結果のグラフ表示である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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