(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド又はタンパク質の多様な集団を表示する、ペプチド又はタンパク質の発現ライブラリーのインビトロ製造法であって、該ペプチド又はタンパク質は、それら自身をコードするＤＮＡとの共有結合により、特異的に結合している、発現ライブラリーのインビトロ製造法であり、少なくとも以下の工程：
１）ｉ）アミノ酸配列とＤＮＡとの共有結合により、自らをコードするＤＮＡに特異的に結合するシス作用型のＤＮＡ結合タンパク質のアミノ酸配列を含む結合部分をコードするヌクレオチド配列と、
ｉｉ）表示用のアミノ酸配列を含み、かつ上記結合部分との連結部分のすくなくもその片側を含む表示部分をコードするヌクレオチド配列を含む、多様なＤＮＡ分子からなる遺伝子ライブラリーを調製する工程、
２）調製された遺伝子ライブラリーを発現させる工程、
を含む発現ライブラリーの製造方法であって、その工程の結果、ペプチド又はタンパク質の群が各々特異的に自らをコードするＤＮＡと共有結合により結合していることとなる、該製造方法。
【請求項２】
一つの宿主細胞又は生物体当たり、すくなくとも１コピーの単一ライブラリー・メンバーにより、遺伝子物質をインビトロ細胞系で発現する請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
遺伝子ライブラリーをインビトロかつ細胞フリーで発現する、請求項１に記載の製造法。
【請求項４】
シス作用型のＤＮＡ結合タンパク質が、バクテリオファージＰ２のＡタンパク質（Ｐ２Ａ）である請求項１に記載の製造法。
【請求項５】
増幅可能なＤＮＡ分子が有する、結合部分の結合のための少なくとも１つの部位の両側に隣接するＤＮＡにはハイブリッド化するが、結合部分の結合のための少なくとも１つの部位にはハイブリッド化しないミスマッチ・オリゴヌクレオチドの存在下で、当該発現を行わせる、請求項３又は４に記載の製造法。
【請求項６】
表示用のアミノ酸配列が最大４０個までのアミノ酸残基である請求項１−５のいずれか一つに記載の製造法。
【請求項７】
表示用のアミノ酸配列をクローニングにより発生させ、又はクローニングに由来するＤＮＡフラグメントで構成する請求項１−６のいずれか一つに記載の製造法。
【請求項８】
アミノ酸位置４５０にあるチロシンをフェニルアラニンで置換して修飾したＰ２Ａから、当該結合部分を誘導する請求項１に記載の製造法。
【請求項９】
特定の標的結合ペプチド又はタンパク質を同定する方法であって、ａ）標的分子と請求項１−８のいずれか一つに記載された方法で作製されたペプチド発現ライブラリーを接触させる工程、ｂ）該標的分子に結合するライブラリー・メンバーを選別し、単離する工程、及び、ｃ）該ライブラリー・メンバーから該標的分子に特異的に結合するペプチド又はタンパク質を単離する工程を含む、方法。
【請求項１０】
標的分子に特異的に結合するペプチド又はタンパク質を発現するＤＮＡを該ライブラリー・メンバーから単離することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
表示用のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドがＰＣＲによる増幅によって作製される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
シス作用型のＤＮＡ結合タンパク質がΦＸ１７４由来である請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ペプチドまたはタンパク質の多様な集団を示すインビトロ・ペプチドまたはタンパク質発現ライブラリの作製法、このように作製された発現ライブラリおよび望ましい特性を示すペプチドまたはタンパク質の同定にライブラリを使用することに関する。本発明はまた、ペプチドまたはタンパク質のコード領域を含み、および共有結合によってそれらの翻訳産物に特異的に結合する、特異的DNA配列にも関する。
図書館が検索可能な多様な刊行物を読者に提供するのと同じように、分子ライブラリも、選び出して検索してもよい参考分子バンクを提供する。そのようなライブラリは遺伝子材料、例えば、プラスミドまたはバクテリオファージ中のDNA配列の断片を含んでもよく、またはライブラリ中の遺伝子材料によってコードされるペプチドまたはタンパク質を発現してもよい。後者の場合、ライブラリの関連するメンバーが選択できるように、発現されたペプチドまたはタンパク質は、それをコードする遺伝子材料に必ず会合していなければならない。現在、これは異なる多くの方法で得られている。
まず、ペプチドは細胞、ウイルス、および胞子、特にバクテリオファージ、細菌、または酵母のような、遺伝子パッケージの外表面上に、ディスプレイ・タンパク質の融合部分として表示してもよい。特定のライブラリにおけるディスプレイ・タンパク質の不変部分は、それが遺伝子パッケージ、例えば、細胞またはビリオンの表面上に発現され、標的タンパク質またはペプチドを発現する遺伝子パッケージが回収されるように細胞またはビリオンに安定的に会合するという特徴を有するように選択される。
スミス＆スコット（Smith（1985）、Science、228、p1315〜6；Scott and Smith（1990）、Science、249、p386〜390）は、ビリオン表面上に暴露されたペプチドのランダム配列のディスプレイ・ベクターとしてのバクテリオファージFdの利用について記述した。ラドナー（Ladner）のUS-A-5223409は、細菌細胞またはバクテリオファージの外表面上に、可能性のある結合ドメインファミリーを発現する。多くの研究所の他の研究者も同様に、発現ライブラリの作製にそのような遺伝子パッケージを使用した。このような研究の多くは、取り扱いが丈夫で比較的容易な系であることが証明されたM13のような糸状ファージについて行われてきた。
しかし、この技術は、選択するために十分に多様な変種を産生するために十分大きいライブラリの作製には時間および労力を必要とする、というようになおも特定の欠点がある。さらに、これまで用いられた遺伝子パッケージは、コードされるタンパク質またはペプチドの発現、およびその後のスクリーニング工程での遺伝子パッケージの伸長が共に得られるよう、生存状態で維持しなければならない。さらに、表示されたポリペプチドは、生物からの排出物および生物上の適当な構造となる融合部分の集合に対して融和性でなければならない。同様に、タンパク質合成はインビボで起こるため、翻訳宿主によって得ることができるそれらの改変のみを表示配列に組み入れることができる。
スクリーニング・プロトコルの際に選択した遺伝子パッケージの伸長に関わる時間はまた、研究者にとって有意な時間の負担となる。さらに、現在用いられているインビボ・ペプチド・ディスプレイ・ライブラリでは、複製および発現を行うためにライブラリの遺伝子材料を宿主にトランスフェクトさせることが必要で、形質転換は、従って、発現ライブラリに存在する可能性があるメンバー数を減少させる非能率な技法であることが知られている。
より最近、インビボ発現ライブラリに関する上記のような限界のいくつかを克服したインビトロ発現ライブラリが記述されている。例えば、ライブラリの異なるメンバーにおいて異なるディスプレイ・ペプチドを有する正確に折り畳まれた完全なタンパク質およびそのコードmRNAがいずれもリボソームに結合したままである、ポリソーム・ディスプレイが記述されている。これは、タンパク質鎖が確実にリボソームを離れないように、そしてmRNAが確実にリボソームを離れないように（すなわち、停止コドンがなく、リボソームが安定化される）することによって得ることができる。そのような発現ライブラリは、例えば国際公開公報第92/02536号（コロラド大学評議会）、国際公開公報第93/03172号（大学研究法人）および国際公開公報第92/05058号（カワサキ（Kasawaki））に公表されているように、いくつかの特許出願の主題である。
ポリソーム・ライブラリにもいくつかの限界がある。RNAはRNAアーゼに対して非常に感受性が高く、このため取り扱いが難しい。リボソームの接着を保持するためには、マグネシウムイオンが持続的に存在する必要があるが、これはそれが常に存在しなければならないスクリーニングおよびその他の工程にとって問題となる。より重要なことは、翻訳後の全ての工程、特にスクリーニングおよび選択技法の際の工程は、ポリソーム：RNA結合を保持しなければならないため、強い試薬で行ってはならない。
提案されている異なるインビトロ発現ライブラリは、DNA結合タンパク質を使用することを含む。これらのタンパク質は、細菌またはその他の膜によって限界決定される生物において、DNA結合タンパク質の結合部位を含むプラスミドを用いて発現される。ポリペプチドおよびコードする核酸は、タンパク質がコードする核酸と一過性に会合するために、機能的に結合する。ライブラリ配列は、ディスプレイ部分の挿入によってDNAとの結合に影響を及ぼすことなくポリペプチドに導入され、融合タンパク質を生じる。そのようなライブラリは例えば、国際公開公報第93/08278号（アフィマックス・テクノロジーズNV）として公表される国際特許出願に記述されている。
そのようなインビトロ・ライブラリは、スクリーニングをインビトロで行ってもよいという長所を有するが、コードされた融合タンパク質は、自身がコードするDNAを独自に認識しないため（むしろDNA上にその結合部位が出現する場合は常にこれを認識して会合する）、少なくとも翻訳はインビボで行わなければならず、宿主細胞または微生物１個あたりのライブラリメンバーは１個に過ぎない。このため、ライブラリが得る複雑性はかなり制限される。このように、形質転換が不十分であることのような、インビボ発現ライブラリの制限のいくつかは、応用可能である。さらに、DNA結合タンパク質とDNA上のその接着部位との会合は共有結合ではなく、このため、ほんの30分という次数であるかも知れないが相互作用に関連したオフの時間が存在する。このように、翻訳後のスクリーニング工程の実施に要する時間は、できる限り短く維持しなければならず、オフの割合がさらに増加しないようにスクリーニング条件を選択しなければならない。このように先行技術の発現ライブラリでは、制限的限界がなおも存在する。
今では驚くべきことに、ライブラリ中の遺伝子材料の特異的翻訳産物がコードDNA配列に直接的にしかも共有結合するような、ペプチドまたはタンパク質発現ライブラリが作製される可能性があることが判明した。これによって次に、発現ライブラリの構築およびスクリーニングの際に、固有の制限がある細胞遺伝子パッケージを使用する必要がなくなる。この進歩によって、選択、DNA増幅および発現のサイクルによる、望ましいペプチドまたはタンパク質の迅速なスクリーニングが可能となる。DNA増幅は自己複製を含んでもよいが、これはその代わりに標準的な増幅技法、例えば下記で詳しく述べるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて簡便かつ迅速に行ってもよい。
本発明の共有結合DNA：タンパク質発現ライブラリは、自身のコードDNAと共有結合し、しかもディスプレイ用のペプチドまたはタンパク質のコード配列を含む、またはこれと重なり合う、もしくは隣接する、タンパク質またはその一部をコードする配列を含むことによって可能となる。発現されれば、DNA結合タンパク質およびディスプレイペプチドまたはタンパク質は、単一のポリペプチドを形成し、これはコードDNAと共有結合するようになる。そのような結合は、遺伝子材料およびその翻訳産物が互いに近づくことができる場合に限って、可能となると認識される。このように、遺伝子材料は、好ましくはタンパク質：DNA相互作用を妨害するペプチドまたはタンパク質を有効にコードする配列を欠失しているべきである。
さらに、下記の考察からも明らかとなるように、特定の状況では、DNA結合タンパク質はDNAを開裂し、それに対して付着するようになるであろう。これらの状況下では、ライブラリのDNA分子の構築およびそれらの中でのライブラリ配列の配置に応じて、DNA結合タンパク質は、DNA分子の残りからの断片の開裂のために、ライブラリ配列を含まないDNA断片と共有結合する可能性がある。しかし、ハイブリダイズ条件を用いれば、鋳型鎖は相補的な２つのコード鎖断片を保持し、このようにDNA結合タンパク質は、DNA：タンパク質の共有結合の中間型結合を通じてそのコードDNAに会合したままとなる。本明細書で用いる「直接的な」付着という語は、このような可能性を含むと解釈される。さらに、DNA結合タンパク質がそのコードDNA断片に付着している場合にも明白である。しかし、この可能性は、本明細書で用いられる「それらをコードするDNAと特異的に会合する」という語の中に含まれる。
このように、１つの局面から見ると、本発明は、ペプチドまたはタンパク質が蛋白：DNA共有結合を通じてそれらをコードするDNAと特異的に会合している、ペプチドまたはタンパク質の多様な集団を表示するペプチドまたはタンパク質発現ライブラリの作製法であって、少なくとも以下の工程：
1）配列がディスプレイ用のアミノ酸配列（ディスプレイ部分）および少なくとも結合部分に対する付着部位少なくとも１つをコードする、タンパク質：DNA共有結合を通じてコード配列に特異的に結合するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、DNA分子の増幅可能な遺伝子ライブラリを調製する工程、および
2）このようにして形成された遺伝子ライブラリを発現する工程、
を含む方法を提供する。
このように、それらの特異的コード遺伝子材料と共有結合する多数の異なる翻訳産物の作製が実現される可能性がある。この知見を、本明細書で記述するペプチドまたはタンパク質発現ライブラリの開発に用いた。ディスプレイ用のペプチドまたはタンパク質は、それをコードする遺伝子材料上に直接提示され、膜または細胞壁表面には表示されないため、このライブラリは、ペプチドを発現するために細胞または単細胞生物を用いたこれまでのインビボライブラリとは異なる。
さらに、一般に一価または多価ディスプレイが得られる可能性があり、この方法によって極めて高度なライブラリ多様性が発現される。さらに、望ましい特性を示すライブラリ・メンバーをコードする遺伝子材料のPCR増幅を行う場合、DNAは適当なプライマーを結合する際に自由に接近することが可能で、選択の際に用いられる材料から、またはペプチドもしくはタンパク質ライブラリ結合物の非遺伝子部分から、予め抽出または溶出する必要がないため、これは、ペプチドライブラリのそのメンバーのDNA上でインサイチューで行ってもよい。これによって、技法は有意に単純かつ迅速になる。さらに、増幅の前に遺伝子材料を標的結合細胞またはビリオンから溶出するために通常必要とされる、例えば、低いpHのような強い処置は不要である。
さらに、先行技術のインビトロ発現ライブラリとは対照的に、DNAとコードされるポリペプチドとの共有結合は、表示されたペプチドまたはタンパク質が、バクテリオファージ、DNA結合タンパク質：DNA相互作用、またはリボソームを破壊するようなイオン条件および溶媒によって、DNAから放出されないことを意味する。さらに、共有結合によって、より広範囲の温度、より長期間、および中間的な凍結工程で選択を行うことができるようになる。このように選択はおそらくより一層正確であると共により一層簡便である。
本明細書で用いる「該コード配列に特異的に結合する」という語は、アミノ酸配列が、単離されて一連の異なるDNA配列に導入された場合、そのコードDNAを独自に認識しないが、転写および翻訳によってそのコードするDNAから産生された場合にその自身のコード配列に結合することを意味する。この特異性は、下記のように多くの方法において得られる可能性がある。本明細書で引用しているように、「コードする」DNAとは、発現された場合にディスプレイ・タンパク質またはペプチドおよびDNA結合部分を含む翻訳産物を生じるDNA分子を意味すると解釈される。しかし、DNA結合部分が結合するDNA領域は、必ずしもディスプレイまたは結合部分をコードする領域内に存在しないが、同じDNA分子上に単に存在する。
インビトロでそれらをコードするDNA配列と相互作用するタンパク質は、本明細書において「シス作用型タンパク質」として知られ（シスタンパク質とも呼ぶ）、自身のDNA鋳型との共有結合を確立する。「偽シス作用型タンパク質」は、本明細書において適当な条件下で、シス様式で作用する（すなわち、それらのコードDNAに結合する）それらのタンパク質であると見なされる。
偽シスペプチドまたはタンパク質発現ライブラリは、適当な条件下でそれをコードするDNAと共有結合するDNA結合部分を使用することによって作製してもよい。例えば、これは、その中で各細胞が単一のライブラリメンバーのみをコードするDNAを含む、細胞または微生物の範囲内で翻訳工程を実施することによって得てもよい。
この場合、DNA結合部分は利用できる単一の認識および付着部位を有するに過ぎないため（DNAは１個以上のコピーが存在してもよい）、それはその自身のコードDNAに結合するであろう（偽シス作用）。このように、これはコードDNAと、共有結合を通じて付着した発現されたペプチドまたはタンパク質の間に機能的結合を提供する。本明細書で用いるように、「付着部位」は、共有結合の前にDNA結合部分が会合する認識部位を含む、すなわちこの語はDNA結合タンパク質の共有結合を得るために必要なヌクレオチド配列を指す。
このように、発明は、好ましい局面において、遺伝子材料の発現がインビボで行われ、選択的に１つ以上のコピーに存在する単一のライブラリメンバーが宿主細胞または生体あたりに発現される、上記で定義したようにペプチドまたはタンパク質発現ライブラリの作製法を提供する。
適当な偽シスタンパク質は、DNA上の特異的結合部位（付着部位）を認識し、その結果DNA：タンパク質の共有結合が起こるタンパク質である。実施例には、末端タンパク質、複製タンパク質および他のプライミングタンパク質が含まれる。さらに、既知のDNA共有結合タンパク質の機能的に同等な断片、変種または誘導体を用いてもよい。下記のようにシス結合タンパク質もまた、上記方法において用いてもよいと認識される。
真のシス作用型タンパク質は、インビトロ発現ライブラリを作製するために特定の長所を提供する。シス作用型タンパク質の例には、複製の開始に関係するタンパク質が含まれる。ローリングサークル型の複製は、異なる起源の環状複製単位、例えば一本鎖（ss）および二本鎖（ds）DNAファージ（ファン・マンスフィールドら（van Mansfield）（1984）、Adv. Exp. Med. Biol.、179、p221〜230；バース＆ヤンス（Baas and Jansz）（1988）、Cur. Topics. Microbiol. Immunol.、136、p31〜70）、ssDNAプラスミド（グルス＆エールリッヒ（Gruss and Ehrlich）（1989）、Microbiol. Rev.、53、p231〜241；ノビック（Novick）（1989）、Ann. Rev. Microbiol. 43、p537〜565）、ssDNA植物ウイルス（ステンガーら（Stenger）（1991）、PNAS、88、p8029〜8033；ソーンダースら（Saunders）（1991）、Nucl. Acids. Res.、19、p2325〜2330）、ssおよびdsDNA動物ウイルス（バーンズ（Berns）（1990）、Microbiol. Rev.、54、p316〜329；ダスグプタら（Dasgupta）（1992）、J. Mol. Biol. 228、p1〜6）およびdsDNAバクテリアプラスミド（カム（Kham）（1997）、Microbiol. Molec. Biol. Rev.、61（4）、p445〜455）において一般的に用いられる。調べた系において、開始タンパク質はニック閉鎖およびトポイソメラーゼ活性を有する。調べた最もよい系はss DNAファージφX174の系で、Aタンパク質は複製型のウイルス鎖におけるori部位にニックを入れ、開裂した鎖の5’末端と共有結合を形成する。その後3’末端は、5’ウイルス鎖を置換する宿主ポリメラーゼによって伸長し、複製の１ラウンド後、親のウイルス鎖を再度ライゲーションしてAタンパク質を子の鎖に移し、新しいラウンドの複製を開始させる（バース＆ヤンス（Baas and Jansz、1988、前記）。P2 Aタンパク質もまた、二次構造を欠失し、開裂鎖の5’末端に結合する部位でA遺伝子のコード領域におけるori部位を開裂することが判明した（リウ＆ハガード・ルンググイスト
0004644321.tif 000002
（1994）、Nucleic Acids. Res.、22、p5204〜5210）。
このシス作用は、インビボで作用すると報告されており、このように翻訳工程はインビボで行ってもよいが、細胞を破壊してディスプレイライブラリを産生する前では、細胞１個あたり１つ以上のライブラリメンバーが発現される。翻訳の際に画分化が起こること、またはシスタンパク質が細胞内を容易に拡散できないことが示唆されているものの、細胞または微生物に含まれる他のDNA分子上に他の適当な結合部位が存在するにもかかわらず、シスタンパク質にシス作用を示させるプロセスはわかっていない。
このように、より好ましい局面において、本発明は、該コード配列に特異的に結合する該アミノ酸配列が、シス作用型タンパク質またはその機能的に同等な断片、誘導体または変種に由来し、遺伝子材料の発現をインビボで行って、選択的に１つ以上のコピーに存在する少なくとも１つのライブラリメンバーが、宿主細胞または菌体１個あたりに発現される、本明細書で既に定義したようにペプチドまたはタンパク質発現ライブラリの作製法を提供する。
インビトロでシス作用を保持する適当なシス作用型タンパク質には、配列（好ましくは60％配列同一性を示す、より好ましくは70、80または90％）、構築および複製様式によって関連するP2Aを含む複製蛋白ファミリー；ファージ186からの同等タンパク質（シバプラサドら（Sivaprasad）、1990、J. Mol. Biol.、213、p449〜463）、HP1（エスポジトら（Esposito）、1996、Nucl. Acids. Res.、24、p2360〜2368）、ならびにPSP3（ブラスら（Bullas）、1991、Virology、185、p918〜921）およびその機能的同等断片、誘導体および変種が含まれる。インビボでシス作用型であるシス作用型タンパク質は、同様のローリングサークル複製特性およびP2Aに対する構築を示す。そのようなタンパク質には、例えば上記のφX174のAタンパク質が含まれる。適当な偽シスタンパク質は、例えば異なる微生物からの末端タンパク質のようなP2Aに関連している。
上記ライブラリを使用することによって、既知のインビボ発現ライブラリと比較して、必要とされる宿主細胞または微生物の数が減少するために、ライブラリの多様性が増加し、およびノイズ比に対するシグナルの減少が起こる。
シス作用タンパク質は常に、インビボでのみ作用すると想定され、インビトロでの対応する作用は示唆されておらず、観察されていない。しかし、意外にも翻訳がインビトロで行われる場合でもシス作用は保持されることが判明した。
認識されるように、この知見から無数の長所が得られる。最後に、共有結合の形成はこれまでに述べたように様々な長所を有する。さらに、コードされるタンパク質は、適当な結合部位を示すDNAの隣接鎖が存在するにもかかわらず、そのコードDNAを発見することができるため、ライブラリの調製全体およびそのスクリーニングはインビトロで行ってもよい。これは、作製およびスクリーニングに関係する時間と労力を根本的に短縮し、インビボライブラリについての多くの制限が回避される。例えば、発現、スクリーニングおよび増幅の１ラウンドあたり少なくとも12時間節約される。宿主細胞または微生物は完全に不要となる可能性があるため、ライブラリは、異なるメンバー1012個までを有してもよい。
インビトロ翻訳によって、多くの同時および翻訳後改変（翻訳工程の際または後に化学または酵素的に行ってもよい）が組み入れられるが、そのいくつかは翻訳がインビボで行われる場合、これまで可能でなかった。例えば、燐酸化、硫酸化、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化または異性化を行ってもよい。（これらの工程はまた、インビボで発現されたライブラリのメンバー上で実施し、次に放出してもよい。これらの反応は、改変の原因となる酵素を抽出物に加えることによってインビトロで行ってもよい。非天然のアミノ酸はまた、例えば、t-RNAを化学的に荷電することによって、または電荷t-RNA上のアミノ酸を修飾することによって導入してもよい。
このように、特に好ましい局面において、本発明は、該コード配列に特異的に結合する該アミノ酸配列がシス作用型タンパク質またはその機能的同等断片、誘導体、または変種に由来し、遺伝子材料の発現をインビトロで実施する、本明細書において既に定義したように、ペプチドまたはタンパク質発現ライブラリの作製法を提供する。
本明細書で用いるように、「機能的に同等な」断片、誘導体および変種は、本明細書で定義するように、例えば脱グリコシル化、またはグリコシル化によって化学修飾されたアミノ酸をまたは含む、もしくはさらに含むが、それにもかかわらず望ましい機能性を保持している、例えば、シスまたは偽シスDNA結合特性を示す、単一または複数のアミノ酸置換、付加および／または欠失によってアミノ酸配列を改変してもよい、天然のタンパク質に関連する、または由来するペプチドまたはタンパク質を定義する（例えば、シス作用型タンパク質）。便宜上、そのような誘導体または変種はそれらが由来する本来のタンパク質と80％または90％の配列同一性を有してもよい。機能的に同等な変種には、天然の生物学的変種（例えば、対立遺伝子変種または種間の地理的変種）および既知の技法を用いて調製した誘導体が含まれる。例えば、機能的に同等なペプチドまたはタンパク質は、化学合成、または核酸の部位指向変位誘発、ランダム変異誘発、もしくは酵素的開裂および／またはライゲーションの既知の技法によって組換え型のいずれかとして調製してもよい。
シス作用型タンパク質またはその断片、変種または誘導体は、下記により詳しく述べる偽シス作用型タンパク質に関して記述されている方法に従って、発明のライブラリを作製するために用いてもよいと認識される。
便宜上、発明の方法において用いられるシスタンパク質は、ファージP2 DNA複製開始系に由来する。P2 Aタンパク質は、それをコードするまさに同じDNA分子上のP2 A遺伝子内に位置する定義したイニシエータ配列を認識し、ニック部位の遊離の末端塩基の１つと共有結合を形成しながら、鎖の１つに特異的にニックを入れる。（リウ＆ハガード・ルンググイスト
0004644321.tif 000003
そのようなタンパク質・DNA複合体はペプチド・ディスプレイ目的のために用いることができる遺伝子抱合体となる。P2 A遺伝子の配列は報告されている（リウら（Liu）（1993）、J. Mol. Biol.、231、p361〜374）。
P2 Aタンパク質はアミノ酸の変化に耐えられることは知られており（例えばリウら（Liu）、1993、前記を参照のこと）、このように、ディスプレイ・ペプチドまたはタンパク質は機能を喪失することなく導入してもよい。Aのシス作用の特性によって、DNA鋳型（ディスプレイのための様々なハイブリッドAペプチドまたはタンパク質をコードする配列、A遺伝子を転写するための適当なプロモーター、およびP2Aが結合する部位を有する）のライブラリに細胞不含カップリング転写／翻訳工程を行うことによって、インビトロでのペプチドまたはタンパク質ライブラリ構築が可能となる。この結果、自身の鋳型DNAと共有結合するハイブリッドAペプチドまたはタンパク質が得られる。
ハイブリッドA：DNA抱合物は、標的に対する選別を行うことができる、または望ましい活性について試験することができる異なるハイブリッドAペプチドまたはタンパク質を表示する、インビトロ・ペプチドまたはタンパク質ライブラリを構成する。標的に結合する、または望ましい特性を示す特異的ハイブリッドA：DNA抱合体は必要であれば回収してもよく、その後遺伝子材料を例えばPCRによって増幅し、細胞不含抽出物においてカップリングした転写／翻訳工程を行ってもよい。次にこのサイクルを望ましい回数繰り返し、個々のハイブリッドA：DNAクローンを得てもよい。これは、適当な数のDNA配列が得られるまで、DNAシークエンシングによってモニターしてもよい。適当なスクリーニング技法を下記により詳しく記述する。
多様なペプチドまたはタンパク質集団を表示するペプチドまたはタンパク質発現ライブラリに関して本明細書で用いるように、「ペプチドまたはタンパク質」という語は、ライブラリの異なるメンバーにおいて変化しているディスプレイ配列（ディスプレイ部分）（コードするDNAに結合する配列内に含まれる、配列と重なり合う、または配列とは異なるものであってもよい）を少なくとも含み、適当な選択技法を通じて選択してもよい、アミノ酸配列を含むと解釈される。各発現ライブラリのメンバーはまた、発現されたポリペプチドの一部として、発現から得られたペプチドまたはタンパク質のそのコードDNA（結合部分）への付着の原因となる不変配列（配列の一部であっても全体であってもよい）を含む。結合およびディスプレイ部分は共に、必ず単一のペプチドまたはタンパク質上に発現される。
ディスプレイ部分がペプチド（および本明細書においてディスプレイ・タンパク質として呼ばれる）より大きい場合、タンパク質を骨格タンパク質として用いる場合のように、タンパク質の様々なアミノ酸部分は不変となる可能性があり、ライブラリ・メンバーはディスプレイ・タンパク質の特定の領域のみが異なる可能性が高い。
核酸分子が縮重および／または機能的同等配列を有する分子を含む、ディスプレイ部分および結合部分をコードする配列ならびに結合部分の付着部位を少なくとも１つ含む、発明のライブラリにおいて発現されるペプチドまたはタンパク質をコードするDNA配列は、発明のさらなる局面を形成する。機能的に同等な核酸分子には、断片、誘導体および変種、例えば本明細書において定義されるように、必要とされる機能性、例えばシス結合作用を有するペプチドまたはタンパク質をコードする実質的に相同な配列およびハイブリダイズ配列が含まれる。
「実質的に相同な」という語は、少なくとも60％、好ましくは少なくとも70、または80％の配列相同性を示す配列を意味する。発明の範囲内に含まれるハイブリダイズ配列は、非ストリンジェント条件下（室温で６×SSC／50％ホルムアミド）で結合し、低ストリンジェンシー（２×SSC、室温、より好ましくは２×SSC、42℃、またはより高ストリンジェンシー条件下、例えば２×SSC、65℃（SSC＝0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.2）で洗浄する配列と共に、コードの縮重のために上記条件下でハイブリダイズする配列である。
DNA配列（関連するコードされるタンパク質またはペプチドと共に）のライブラリを作製することによって、本発明はまた、DNAディスプレイ・ライブラリも提供すると認識される。このように、それらのディスプレイ・ペプチド／タンパク質またはDNA部分に基づいてメンバーを選択するために、双機能ライブラリが提供される。
発明は、P2 Aタンパク質および機能的に同等なその断片、誘導体、または変種を結合部分として用いて簡便に行われる。DNA結合部分の結合に関連するヌクレオチド配列についても、これは天然に起こる位置から移動していてもよいが、適した部位で提供されなければならない。例えばP2Aの場合、例えば配列GCGCCTCGGAGTCCTGTCAAにおける少なくとも配列TCGGAを、発現ライブラリのペプチドまたはタンパク質、DNA結合部分によって認識され、それと共有結合を形成するその機能的に同等な断片、誘導体または変種をコードするDNAの中に含めるべきである。便宜上、ディスプレイ部分をコードする配列はP2 Aタンパク質のN-末端をコードする配列に挿入、それと重なり合う、または隣接する。
ライブラリの作製に用いるDNA分子は、増幅および転写の双方の手段と共に提供してもよい。増幅手段に適したDNA分子には、複製起点、例えばこのようにインビトロで例えば細胞不含抽出物中で、または宿主細胞に存在する場合にはインビボで複製してもよい自己複製プラスミドを有する二本鎖DNAが含まれる。DNAが自己複製できない場合、これは適当な例において、複製起点を加えることによって克服してもよい。例えば、本明細書において記述する、P2Aのような特定のタンパク質は、自身の複製起点と結合する。タンパク質が起点から放出されなければ（本明細書において記述した変異体を用いる場合のように）、DNA結合部分遺伝子を含むDNA分子の複製が阻害される。これらの場合、第２の複製起点を含めてもよい。便宜上、ライブラリを作製するための核酸分子はベクター、プラスミド、または直鎖状DNAの形である。
または、DNAは、例えばDNAに、インビトロでの増幅を可能にする増幅反応、例えばPCRのためにプライマーを結合する適当な部位を提供することによって、適当な技術的介入を通じて増幅してもよい。明らかにそのような部位は、適当なプライマーを選択することによって増幅が容易になるように、いかなるDNA分子においてもほとんどの場合固有に存在するであろう。
転写手段には、プロモーター配列の項が含まれる。野生型遺伝子、もしくは縮重配列または機能的に同等なその断片、誘導体もしくは変種を使用する場合、プロモーターは構成的に存在していてもよい。そうでない場合、誘導可能な、または誘導できないプロモーターを含んでもよい。翻訳産物が転写を阻害する場合には（本明細書に記述のように変異体P2Aを使用する場合のように）、転写／翻訳工程の際に限って活性化される誘導可能なプロモーターを使用することが勧められる。または、そのような場合、これが誘導可能な方法で効率よく作用する場合、例えば適当な条件下での非常に低い転写によって（例えば、制御されたT7ポリメラーゼ遺伝子を含む細菌宿主におけるT7、または例えばウイルス感染による適当な時間でのプロモーターの供給によって）誘導できないプロモーターを用いてもよい。しかし、誘導できないプロモーターを用いる場合、ライブラリのスクリーニングの過程において、翻訳を細菌宿主において行う場合、誘導可能なポリメラーゼ遺伝子が細菌に存在しなければならないか、または感染によって誘導されなければならない。
適当な誘導可能プロモーターの例には、AraB、ラムダプロモーター（N4830-1のような温度感受性リプレッサーを発現する細胞において）、または有効なLACO配列と組み合わせたTACまたはLACプロモーターが含まれる。適した誘導できないプロモーターにはT7プロモーター、またはSP6、もしくはT3プロモーターが含まれる。プロモーターは発現すべきポリペプチドの上流に存在すべきであるが、プロモーターが直鎖状DNAの環状化によって下流に存在する場合、これを行ってもよい。
ライブラリの調製に用いられるDNA分子もまた、ディスプレイのために異なるペプチドまたはタンパク質のライブラリを得るために、多様なディスプレイ・ペプチドまたはタンパク質コード配列を必ず含まなければならない。そのような異なる配列は例えば、下記により詳しく述べるように、PCRにおけるランダム・プライマー配列を用いて文献（シュミット＆スケラ（Schmidt and Skerra）（1993）、Protein Engineering、６、p109〜122）に記述するように、例えば無作為化によって導入してもよい。ランダムプライマー配列は、市販のDNAシンセサイザーによる標準的な化学合成を用いて産生してもよく、または購入してもよい。または、特に非隣接アミノ酸に変化がある場合、メガプライマーを作製して、変異誘発によって変化させてもよい。
ライブラリの作製に必要な特徴を有するDNA分子は、発明のさらなる局面となる。
ライブラリの遺伝子材料の発現は、下記により詳しく述べるように実施してもよい。
さらなる局面から見ると、発明は、ペプチドまたはタンパク質が特にDNA：タンパク質共有結合を通じてそれらをコードするDNAに会合している、および該コード配列が該コード配列（結合部分）、ディスプレイのためのアミノ酸配列をコードする配列（ディスプレイ部分）、および結合部分に対する少なくとも１つの付着部分を含む、DNA分子上に存在する、ペプチドまたはタンパク質の多様な集団を示すインビトロ・ペプチドまたはタンパク質発現ライブラリを提供する。
上記から明らかなように、発明は、多くの異なるタイプのライブラリおよびその作製法を提供する。そのようなライブラリの作製法は当業者の範囲内であると思われるが、いくつかのタイプのライブラリおよびこれらの作製法を説明するために、シス作用型タンパク質の例としてP2Aをコードする遺伝子を用いることを特に参考にしながら以下を提供する。
ランダムまたは偽ランダム、部分的にランダムまたは分散変化を示すディスプレイのためのペプチドまたはタンパク質、およびライブラリのメンバーをコードする遺伝子材料の全てまたは一部を化学合成してもよく、様々な微生物からのゲノム／コード配列から導出してもよい。変化した領域は隣接していても、隣接していなくともよい。組合せライブラリ（変化した領域が隣接している場合）は、一般に考えられる数の順列によってアミノ酸20個未満を含む。したがって、より長いアミノ酸の枝では、隣接していない変化領域を使用することが適当である。このように、例えば、40残基のディスプレイ・ペプチドでは、これらのアミノ酸について作製される順列は13個に過ぎない。これは、全ての位置が変化しているライブラリと比較して、順列総数（ライブラリメンバー）を減少させる長所を有する。特定の残基が不変である配列を使用することによって、変化する骨格の中に含まれる、またはそれによって支持される特定の配列を有する骨格（不変）構造を提供する。
これらの骨格構造は、選択した残基での変化に基づいて、望ましい特性を示すタンパク質の変種を単離するためにライブラリを用いることができる、タンパク質に固有に存在してもよい。このように、例えば、酵素の特異性または熱安定性は、もとの酵素を骨格として用いると、変化させることができる。または、骨格配列は、隣接しないディスプレイ・ペプチドまたはタンパク質を提示するために、DNA結合部分に隣接して、またはその中に導入してもよい。骨格配列は、骨格配列が、コードされるペプチドまたはタンパク質とそのDNAとの共有結合を妨害しない限り、そのコードDNAに付着するペプチドまたはタンパク質の配列内のどこかで１つ以上の部位に存在してもよい。
先に言及したように、異なるライブラリ・メンバーをコードする遺伝子材料は、上記の順列を作製するためにプライマーの一部が変化している（プライマー配置を作製するために）プライマーを用いて作製してもよい。1012〜1014個までのライブラリ・メンバーをこのようにして作製してもよい。鋳型鎖の転写およびコード鎖とのP2Aとの結合を可能にするために、コード鎖を通じてそれらのコードDNAに結合するコードされる産物の場合（P2Aおよび機能的に同等なその断片、誘導体または変種）、産生および増幅（後者を行う場合）の結果である最終的な産物は、鋳型であってしかもコード鎖である必要がある。これは、例えば、ライブラリ配列を含み、さらに必要であればさらなる増幅ができるように鋳型鎖プライマー結合部位を含む鋳型鎖プライマーを利用することによって得てもよい。この部位は、さらにスクリーニング後の選択（および増幅）のために独自の同定子として用いてもよい。ライブラリ配列を含む一組の鋳型鎖を作製した後、鋳型鎖に結合する適したプライマーを用いて、ライブラリ配列を含むコード鎖を作製してもよい。
ライブラリ作製のための核酸分子の産生および／またはその増幅は、これらのプライマーを同時または連続的に組合せて用いることによって容易に行ってもよい。ライブラリの作製と同時に増幅を行う場合には、単一のプライマーを用いて一連の直鎖状増幅を実施し、その後第２のプライマーを使用する、または両反応を共に実施してもよい。プライマーは誘導体にした（例えば固定化部分によって）、ヌクレオチド塩基、またはPNAに由来するような適当な構成成分、またはその組合せを含んでもよい。
異なるライブラリメンバーをコードする核酸分子またはその可変部分はまたは、変異もしくはクローニングによって、選択的に増幅技法と組み合わせて作製してもよい。このように、例えば、最初のライブラリはクローニングによって作製して、最初の鋳型として用いてもよく、これをさらに、ライブラリ配列と共にプライマー配置を用いて、および／またはランダム変異誘発によって変化させてもよい。
発明の発現ライブラリを調製するために、核酸分子において第一義的に重要なことは、DNA結合部分をコードする領域である。先に述べたように、これには、DNA結合タンパク質、または機能的結合を形成するためにそのコードする遺伝子材料と共有結合を形成する、機能的に同等なその断片、誘導体、または変種が含まれる。宿主細胞または微生物あたり単一または多数のライブラリメンバーを用いて、翻訳段階をインビトロまたはインビボで実施するか否かによって、DNA結合部分は、シスまたは偽シス様式で作用してもよい。発明において使用するために適当なシス作用型のDNA結合部分の例は、P2Aタンパク質またはその機能的に同等な断片、誘導体または変種である。
DNAとの共有結合を得るために必要なDNA結合タンパク質の領域を少なくとも含む適当な断片は、ライブラリを形成するために用いられる核酸分子中に存在しなければならない。例えば、P2Aの場合、タンパク質をコードする遺伝子もしくは縮重配列または適当なDNA結合特性を有するその機能的に同等な断片、変種もしくは誘導体が存在するはずである。この遺伝子は結果的に発現されたペプチドまたはタンパク質がその機能的活性を保持する限り、すなわちなおDNAと共有結合を形成する限り、遺伝子の一部の付加または欠失によって変化してもよい。例えば、DNA上のペプチド／タンパク質結合部位（付着部位）は移動してもよく、またはさらなる結合部位を導入してもよい（例えば、野生型結合部位が変化、例えば突然変異のために機能的でない場合）。これは、用いられるDNA結合部分がさらにDNAのニックを起こす場合、それをコードするDNAに確実に結合したままとなるように、特に重要である。
さらに、ディスプレイ・ペプチドまたはタンパク質（ディスプレイ部分）をコードする領域は、一度発現されたディスプレイ部分がDNA結合部分と共有結合する限り、すなわち、同じ発現されたペプチドまたはタンパク質の一部である限り、DNA結合部分をコードする領域の内部、これに隣接して、またはその外側に挿入してもよい。これには、ディスプレイ部分をコードする領域の下流に停止コドンを移動させることを必要とするかも知れない。DNA上のタンパク質結合部位の配置に関しては、特にDNAコード鎖のニックが関係する場合、ディスプレイ部分がそれをコードするDNAに付着したままである、ディスプレイ部分をコードする領域の適当な配置によって確実にすべきである。これは、多くの異なる方法で行ってもよい。
ニックは、コード鎖上で起こり、DNA結合ペプチドまたはタンパク質（ディスプレイペプチドまたはタンパク質と結合した）は、ニックプロセスの際に作製された5’末端に共有結合する。このように、ディスプレイ部分をコードする遺伝子材料は、発現されたペプチドまたはタンパク質に共有結合したコード鎖の一部上に存在し、またはそれに会合したままで存在することを確保すべきである。翻訳後および選択の際に二本鎖の形でDNAが保持されている場合、鋳型鎖は双方のコード鎖がDNA結合部分と確実に会合するようにする。
または、環状DNAを翻訳に用いてもよく、その結果ニック後（非ハイブリダイズ条件下で）、ニック前の全コード鎖を含む直鎖状コード鎖が得られる。または、環状DNAもハイブリダイズ条件も使用しない場合、タンパク質付着部位およびライブラリ配列部位は、DNA結合部分がディスプレイ部分をコードするコード鎖の一部と共有結合するように選択すべきである。これは、付着部位の末端側をコードするカルボキシルでのディスプレイ部分コード領域の挿入によって行ってもよい（後者はまた、その天然での位置から逸脱してもよい）。これは天然に起こる付着部位、すなわち末端をコードするカルボキシルの下流での挿入によって最も容易に得られる。しかし、結合部位もまた上流にシフトしている場合、ディスプレイ部分をコードする領域をアミノ末端で導入してもよい。
必要であれば、結合部位は全コード領域の前にシフトしてもよい。ディスプレイ部分をコードする領域をアミノ末端で挿入する場合、転写を確実にするために、ライブラリ配列をプライマーによって導入する場合には、さらに少なくとも適当なプロモーターおよびライブラリ配列の前に開始コドンを含むメガプライマーを用いるべきである。
ライブラリ配列は、アミノまたはカルボキシ末端よりむしろ、例えばコード配列とハイブリダイズするが、非ハイブリダイズ部分にライブラリ配列をさらに含むプライマーを用いて環状DNAの増幅によって、コード領域内に挿入してもよい。そのようなプライマーを用いて伸長した後、適当なプライマーを選択して、二本鎖伸長産物の末端鎖（ハイブリダイゼーション後）が平滑である、または適当な制限エンドヌクレアーゼによる消化後、内部にライブラリ配列を挿入したDNA分子を産生するためにライゲーションが行われるようにオーバーハングを示す、ハイブリダイズ鎖を産生してもよい。
タンパク質を例えば骨格タンパク質として表示すべき場合、ディスプレイ・タンパク質はコード配列または関連部位に挿入すべきで、次にライブラリを作製するために特定の残基または領域で変化させると認識されるであろう。
さらに、ディスプレイ部分をコードする領域の配置は、コードされるペプチドまたはタンパク質、特にDNA結合部分の、その部位での挿入または置換に対する耐性によって決定するべきである。
発明の核酸分子はさらに、抗生物質耐性マーカーのようなさらなる特徴を含んでもよい。例えば、適当な形質転換体の特定および選択（その抗生物質耐性によって）が得られるように、増幅および／または翻訳／転写および／またはスクリーニングおよび／または単離工程が形質転換を含む場合、β-ラクタマーゼ遺伝子を含んでもよい。
分子は、核酸分子の存在または同一性が確認できるように、別のマーカーまたはリポーター分子を含んでもよい（例えば、放射標識ヌクレオチドまたはストレプトアビジン：ビオチンのような結合対の一方）。マーカーまたはリポーター分子もまた、核酸分子の固定化および／または精製のツールとして用いてもよく、例えば、ビオチン・マーカーの場合、ストレプトアビジン結合カラムを用いて分子を回収してもよい。さらに、ライブラリをコードする核酸分子は、細胞溶解物においておよび／または選択の際にDNAを安定化させるために、特に隣接配列において、非天然のヌクレオチドまたはメチル化塩基を含んでもよい。
便宜上、上記の方法において用いられるいかなるプライマーもまた、その伸長産物（ライブラリをコードする遺伝子材料）が後の工程でより容易に単離されるように、ビオチンのような固定化部分を付着させてもよい。さらに、適当であれば、プライマーは、得られた核酸分子、例えばプロモーター配列、終了配列、抗生物質耐性を付与するために必要な遺伝子の中に組み入れられる特徴を有してもよい。
ライブラリをコードする核酸分子を作製すれば、（i）遺伝子材料の増幅、（ii）転写および（iii）翻訳の工程によってライブラリを作製してもよいが、後者の２つの工程は通常カップリングされる。シスまたは偽シスDNA結合タンパク質機能を用いるか否かによって、これらの工程はインビトロまたはインビボで行ってもよい。シス結合タンパク質を使用する場合、各工程はインビトロまたはインビボのいずれで行ってもよい。偽シス結合タンパク質を用いる場合、増幅はインビトロまたはインビボで行ってもよいが、転写および翻訳はインビボで行わなければならない。
例えば、プライマーおよびPCRを用いて分子を産生する場合、ライブラリ用の遺伝子材料を産生する際に、増幅をインビトロで行ってもよい。またはもしくはさらに、核酸分子は、PCR、NASBA（3SRとしても知られる）（マレクら（Malek）（1994）、Methods Mol. Biol.、28、p253〜260；ゲビノガ＆オーレンシュレーガー（Gebinoga and Oehlenschlager）（1996）、Eur. J. Biochem.、235、p256〜261；およびエーリヒトら（Ehricht）（1997）、Eur. J. Biochem.、243、p358〜364、を参照のこと）、または直鎖増幅のような、従来のインビトロ増幅法によって増幅してもよい。または複製は、細胞不含抽出物を用いてインビトロで（例えば、クール（Kool）、1996、Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. USA、25、p1〜28を参照のこと）、または核酸分子を宿主細胞または微生物に、例えばトランスフェクションによって挿入した後、インビボで実施してもよい。
複製をインビトロで実施する場合、細胞不含抽出物を適切に選択すべきで、例えば、それはdNTPを含むべきである。必要であれば、トランスフェクションまたは複製の前に環状化を行ってもよい。さらに、下記に述べるように、複製の際に起こるDNA結合タンパク質の解離を防止するために、非解離性の変異体を必要としてもよい。核酸分子はその産生が変異によって起こるならば、宿主細胞または微生物中に既に存在してもよい。
ディスプレイ・ペプチドを発現するライブラリの産生は、形質転換細胞または微生物を増殖させることによってインビボで行ってもよい。この目的に適当な微生物には、細菌（大腸菌のような）、ウイルス、バクテリオファージ、および酵母のような細胞が含まれ、または原核細胞、真核細胞または古細菌を用いてもよい。次に、発現ライブラリを放出するために、細胞または微生物を溶解してタンパク質／ペプチド：DNA発現単位および／またはライブラリをコードする遺伝子材料を放出し、転写／翻訳の前に精製（例えば、プラスミドまたはミニ染色体）すべきである。しかし、本明細書で用いるように、「ライブラリ」という語は、インビボで作製された場合宿主細胞または微生物の中になおも含まれるライブラリメンバーの集団と共に、インビボで産生された、またはインビトロで作製された、放出後のライブラリメンバーを含むと解釈される。
インビトロでは、カップリングした転写／翻訳は、細胞不含抽出物において実施してもよい。これは便宜上、例えば大腸菌のような原核細胞または真核細胞からの細胞不含抽出物において行ってもよい（ネビン＆プラット（Nevin and Pratt）（1991）、FEBS、291、p259〜263）。原核細胞（例えば大腸菌S-30またはS-135）および真核細胞（例えば、小麦胚芽または網状赤血球）の細胞不含抽出物は市販されている（アマシャム／プロメガ社）。DNA分子の構築物およびニック・タンパク質がコードされているか否かに応じて、ディスプレイ部分がそのコードDNAと確実に会合し続けるように、翻訳前にDNAを環状化する必要があるかも知れない。
インビボまたはインビトロのいずれで行うにしても、誘導可能プロモーターを用いる場合には、転写プロセスを誘導すべきである。
特定のDNA-結合タンパク質（例えばP2A）の結合は、例えば付着部位の特性を変化させることによって、インビトロで改善してもよい。または、DNA結合タンパク質の結合および活性を増強するために、特異的共因子（例えば、特異的な宿主タンパク質）を必要としてもよい。好ましくは、付着部位は一本鎖であるべきである。これは異なる多くの方法において行うことができ、例えば、二本鎖DNAを用いて付着部位にループまたは開口部を導入してもよい。翻訳反応の際に、付着部位に隣接する両側のコード鎖とハイブリダイズするミスマッチオリゴヌクレオチドを含んでもよい。コード鎖上に付着部位を含む領域では、ミスマッチオリゴヌクレオチドの対応する部分はハイブリダイズすることができないため、この領域でコード鎖は有効に一本鎖となる。ミスマッチプライマーの使用は、発明の好ましい局面となる。
このミスマッチ領域は、付着領域の長さに応じて伸長してもよく、またはこの領域を超えて伸長してもよく、例えば10ヌクレオチドの領域にわたってミスマッチであってもよい。例えば、P2A接着部位の場合（配列5’-AGCGGCATCGCCGCGCCTCGGAGTCCTGTC-3’に存在するTCGGA）、ミスマッチ領域を下線で示す、3’-TCGCCGTAGCGGCGTAAGATTCTAGGACAG-5’のような配列を含むミスマッチオリゴヌクレオチドを用いてもよい。
または、付着部位で一本鎖領域を導入するために、ライブラリをコードする核酸材料の産生および／またはその増幅において、適当なプライマーを用いてもよい。これは、例えば、付着部位に対するミスマッチ領域を有するプライマーを用いて行ってもよい。付着部位がDNA結合部分のコード領域内にある場合、ミスマッチ配列は、DNAによってコードされるアミノ酸配列に影響を及ぼさないように選択すべきで、したがって、サイレント変化、すなわち第３位のコドンが変化しているが同じアミノ酸をコードする変化であるべきである。ミスマッチがコード鎖上の付着部位に対応する鋳型鎖に存在する場合、付着の改善が認められることは本発明者らによって発見された。
または付着部位がコード領域の末端に存在し、ミスマッチプライマーを用いる場合には、増幅の際に付着部位が回復するように、スクリーニング工程後に適当なプライマーを選択してもよい。
または、付着部位がDNAの末端で形成される場合、この領域における二本鎖DNAは、付着部位の全てまたは一部を含む5’伸長部を残す制限エンドヌクレアーゼで消化することによって一本鎖にしてもよい。例えば、酵素HgaIはHgaI認識部位からの5塩基5’オーバーハング5ヌクレオチドを残す。この領域が小さすぎる場合、増幅のためにプライマー（例えば、デオキシウリジン）に非天然塩基を組み込むことによって、より大きい領域を一本鎖にし、その後ウラシルDNAグリコシラーゼまたはT4エンドヌクレアーゼのようなDNA修復酵素を用いて、特異的エンドヌクレオチドを切除して一本鎖領域を残してもよい（ワトソン＆ベネット（Watson and Bennet）（1997）、BioTechniques、23、p858〜864）。
P2Aのようなシス結合タンパク質、またはその機能的に同等な断片、誘導体または変種を用いて発明を行う場合、DNA結合部分はそれをコードするDNAと共有結合するが、これはキネティック中間体を表し、複製が起これば、ペプチドまたはタンパク質はコード鎖を再度ライゲーションし、この鎖から解離して、無傷の接着部位を有するさらなるコード鎖へと移動する。インビトロでは複製は行われないかも知れないが、このトランスファーは、翻訳がインビボで行われる場合にはおそらく問題となる。
これを避けるために、解離しない変異体を用いてもよい。そのコードDNAに共有結合したままである改変した結合部分を発明の方法に使用することは、発明の好ましい局面となる。例えばP2Aの場合、Aタンパク質のアミノ酸450位のチロシンをフェニルアラニンに置換することを含むY450Fを用いてもよい。しかし、翻訳反応をインビトロで行う場合には、複製が起こらない限り（例えばdNTPが確実に存在しないようにすることによって）、野生型タンパク質はそれをコードするDNAと会合したままで、それによってスクリーニングを行うことができることに注意すべきである。
本明細書で記述のように作製したライブラリは、当技術分野の従来のインビボまたはインビトロ・ディスプレイ・ライブラリが用いられる、いかなる応用に用いてもよい。そのような使用は、文献に十分に記述されている。例えば、発明のライブラリを用いて、標的分子に特異的に結合するペプチドまたはタンパク質を同定してもよい。
異なる大きさのペプチドは、特定の立体的および荷電的特徴を有するドメインを産生するために適当な三次構造に配列してもよいことは、当技術分野で既知である。そのようなドメインはその特異的三次配列のために、特定の標的分子を特異的に認識または結合する可能性がある。そのようなペプチドの例には、タンパク質の結合領域および抗体の可変結合領域が含まれるが、これらに限定しない。明確な三次構造を有しない小ペプチドでも特異的標的結合特性を有する可能性がある。発明のライブラリによるディスプレイ用のペプチドはこのように、例えば固定された三次構造を有しない40個までのアミノ酸残基、例えば５個〜30個、好ましくは７〜20個、および最も好ましくはアミノ酸残基10〜15個であってもよく、または固定した三次構造を形成するより大きいペプチドであってもよい。
またはライブラリは、異なるライブラリメンバーの中で特定の残基のみが変化しているディスプレイ・タンパク質（DNA結合部分を含むポリペプチドの一部を形成する）を発現してもよい。例えば、明確な特異性を有するタンパク質、例えば、抗体または受容体は、ライブラリ中でいくつかの、例えばアミノ酸５〜30位、好ましくは７〜20位が変化しているライブラリに基づいて形成してもよく、変化した特異性を有するディスプレイ・タンパク質を選択してもよい。
標的分子は小さい化学化合物を含んでもよく、例えば、複素環または薬学的化合物、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは特異的に認識される特有の表面特徴を有する物質を含んでもよい。このように、例えば、診断アッセイ、例えばヒトの生体または試料、抽出物、もしくはそれに由来する材料中の生体分子または非生体分子の量を評価する臨床技法において、または他の非生体由来材料における生体材料または非生体材料の量を確認するアッセイにおいて利用される、特異的標的結合ペプチドまたはタンパク質を特定してもよい。
発明のライブラリはまた、例えば明確なアッセイにおいて特定の生化学活性を有する、適当な生化学、生物学、または構造特性を有する化合物を同定するスクリーニングプロトコルにおいても利用される。この方法によって、例えば薬学分野において利用される可能性がある酵素的、阻害または刺激性の特性を有するペプチドまたはタンパク質を同定してもよい。例えば、酵素活性は、化学蛍光、ヌクレアーゼ活性、ホスホトランスフェラーゼ活性、阻害等の生物活性の増加または減少をモニターすることによってスクリーニングしてもよい。既知の活性の骨格ポリペプチドを用いる場合、特性または活性が変化した変種をライブラリから選択してもよい。
ライブラリから一度同定されたそのようなペプチドまたはタンパク質は、特定の活性、例えば阻害剤、活性化剤、または特定の反応もしくは相互作用の触媒作用を有する化合物の調製に用いてもよい。
一般に、関係するペプチドまたはタンパク質は、（i）スクリーニング、（ii）単離および／および精製、（iii）展開、（iv）増幅、（v）再スクリーニング用のライブラリの調製（転写および翻訳を含む）、（vi）再スクリーニング（およびその後以下の工程（ii）〜（vi）を適当な回数多く繰り返す）、および（vii）関係する遺伝子材料の単離、という工程を含むプロトコルに従ってライブラリから同定される。しかし、工程（ii）および／または（iii）および／または（iv）は、適当であれば省略してもよい。
シス作用型または偽シス作用型タンパク質を用いるか否かによらず、スクリーニングおよび単離工程はインビトロで行わなければならない。シス作用型結合タンパク質またはそれらの機能的に同等な断片、誘導体、または変種を用いる場合、残る工程はインビトロまたはインビボで行ってもよい。偽シス作用型タンパク質またはそれらの機能的に同等な断片、誘導体、または変種を用いる場合、工程（v）の少なくとも一部、すなわち転写および翻訳はインビボで行わなければならない。
インビトロで行わなければならないスクリーニングには、本明細書において後により詳しく記述するように、関係するディスプレイ・ペプチドまたはタンパク質の同定に、アフィニティ結合、相分配、または酵素アッセイのような適当なアッセイを使用することが含まれる。相分配（例えば、ガルグら（Garg）（1994）、Biotech. Appl. Biochem.、20、p119〜215を参照のこと）は、ライブラリの変化の結果として有機相（例えばトライトンX-114）に分配するディスプレイ・ペプチド／タンパク質を同定する際に特に応用される。この方法は、有機相、例えば洗浄剤が、標的となるディスプレイ・ペプチドまたはタンパク質、例えば、抗体または抗原に対する適当な結合パートナーを有するよう改変されている場合、より一般的に応用可能となる。
変化した酵素特性の同定は、変化した物理特性、例えば、基質への結合またはこれまで近づけなかった部位の暴露、例えば、プロテアーゼ活性または燐酸化に依存する。
ディスプレイ・ペプチドまたはタンパク質の適当な結合パートナーへの結合は、適当な手段によって、例えばアフィニティ結合および溶出または酵素活性の存在、例えば反応産物の生成によって同定してもよい。このように、発明のライブラリは、発現されたペプチドまたはタンパク質が結合パートナーの一つである、結合パートナーの同定に用いてもよい。このように、発明のライブラリは二ハイブリッド系のような技法の完全なインビトロ代用法を提供することができる。そのような系では、各分子が結合対の一つを有する（酵素と基質のように）二つのハイブリッド分子を作製する。これらの結合パートナーが結合する際、融合タンパク質の他の機能的部分が形成される。融合タンパク質のこれらの機能的部分を適当に選択することによって、検出可能な相互作用を同定してもよい。
このタイプの系は、例えばフィールド＆ソング（Field and Song）（1989、Nature、340、p245〜246）によって記述されており、この中で、融合タンパク質はサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cervisiae）からのGAL4の異なる部分を含み、結合パートナーの結合によって形成されると、その成分が融合タンパク質上に発現され、その転写活性化活性が認められるようにGAL4を再構成する。このように、これは融合タンパク質の結合パートナー間の結合を表す。ギュリスら（Gyuris、1993、Cell、75、p791〜803）は、同様に転写活性化因子の成分の相補性について記述している。さらに、β-ガラクトシダーゼ欠失変異体を用いた相補性は、ロッシら（Rossi、1997、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、94、p8405〜8410）によって記述されている。第２の融合タンパク質がより複雑な物質であるが、上記の特徴、すなわち結合対の１つのパートナーおよび第１の融合タンパク質の機能的部分と相互作用する機能的部分、を有する相補性を得てもよい。この実施例は、クレバーら（Krebber、1997、J. Mol. Biol.、268、p607〜618）によって提供され、非感染性のファージが適当な結合パートナーを通じて融合タンパク質の結合によって感染性となる。アロンハイムら（Aronheim、1997、Mol. Cell. Biol.、17、p3094〜3102）は、本質的に核酸であり、機能的部分がそれに結合パートナーが結合する細胞膜に存在するタンパク質である結合パートナーを、第２の融合タンパク質同等物が有する系を記述している。
このように、発明のライブラリは結合相互作用に関与する第一の部分（ディスプレイ・ペプチドまたはタンパク質の全てまたは一部）および相補性に関与する第二の部分を有する融合タンパク質を発現してもよい。結合パートナーおよび相補性に必要な成分を有する第２の融合タンパク質（または適当な物質）は、ライブラリの一部を形成してもよく、またはライブラリに加えてもよい。融合タンパク質の１つまたは双方の結合パートナーは、ライブラリによって変化してもよい。
上記のように、発明の核酸分子の構築物に応じて、ハイブリダイズ条件下でスクリーニングを行う必要があるかもしれない。
ライブラリは、例えばシャペロン（例えば、hsp70）のような酵素を加えることによって、またはタンパク質ジスルフィド・イソメラーゼのような折り畳み改変剤、酸化剤、または細菌の細胞質もしくは翻訳抽出物の酸化活性を変化させる酵素を加えることによって、表示されたペプチドまたはタンパク質の折り畳みを調節することによって、スクリーニングの前に改変してもよい。さらに、両ホモオリゴマーおよびヘテロオリゴマータンパク質をスクリーニングしてもよい。例えば、シグナル認識粒子受容体（SR）は、SR-αおよびSR-βと呼ばれるサブユニットのヘテロダイマーであり、１つのみのサブユニットの変種を発現するライブラリを発現してもよい。次に、他のサブユニットとは無関係に、望ましい特性に関して、または他のサブユニットとの前回のヘテロダイマー形成に依存する特性に関して、変種をアッセイしてもよい。
ヘテロダイマー形成の古典的な例は、抗体の重鎖および軽鎖によって提供される。この場合、例えば１つの鎖のみがライブラリに存在し、他の鎖はアッセイの間に供給される。ポリペプチドの他に、金属、ポルフィリン、共因子、DNA、RNAおよびその他の分子は全て、表示されるペプチドまたはタンパク質の特性を変化させるために、スクリーニング工程で加えてもよい。
スクリーニングの後、関係するディスプレイペプチドまたはタンパク質をライブラリのプールから取り出さなければならず（単離）、選択的に精製する。特定の場合では、これは例えばアフィニティカラムを用いてスクリーニングの際に行われる。
選択したDNA分子の展開は、ライブラリにおいてより大きい程度に望ましい特性を示すさらなる変化を生じるために行ってもよい。これは、ガラクトシダーゼからフルコシダーゼを展開させるため（サングら（Zhang）（1997）、PNAS USA、94、p4504〜4509を参照のこと）または特異的な酵素機能を変化させるために（クラメリら（Crameri）（1997）、Nature Biotechnology、15、p436〜438；ユウ＆アーノルド（You and Arnold）（1996）、Protein Eng.、9、p77〜83を参照のこと）、先行技術において行われている。
展開は、当技術分野で既知の多くの技法の一つを用いて、ランダムな位置でのさらなる新規変異を化学的に導入することによって；細菌の変異株を用いて遺伝子的に（デグネン＆コックス（Degnen and Cox）（1974）、J. Bact.、117、p477〜487）、サプレッサーtRNAを用いてアミノ酸置換を導入する細菌株（マルキヴィッツら（Markiewicz）（1994）、J. Mol. Biol.、240、p421〜433）によって、限局コドン無作為化のような変異誘発PCR技法を用いて（コルマック＆ストルール（Cormack and Struhl）（1993）、Science、262、p244〜248）、またはPCR反応において用いられるポリメラーゼまたはNASBAにおける逆転写酵素の適合度を低くするために、標準的な方法の一つを用いて、行ってもよい。定められた位置で置換を導入するために、ミスマッチ・プライマーまたはメガプライマー・ライブラリを用いてもよい。異なる独立した変化を含む選択されたライブラリ・メンバーはまた、DNAシャッフル（ステマー（Stemmer）（1994）、Nature、370、p389〜391）またはより従来のクローニング法を用いて組換えを行うことができる。
単離後、またはこれを行う場合には展開後、選択したライブラリ・メンバーまたは展開したライブラリ・メンバーを増幅し（必要であれば）、ライブラリを作製するために上記の技法のいずれかを用いて再スクリーニングのためにライブラリを調製する。ペプチドまたはタンパク質がライブラリの遺伝子材料に結合した結果として、その後の工程、例えば形質転換に適した形で遺伝子材料を得るために、ベクターのような異なるDNA分子の中にコード領域を移動させる必要があるかも知れない。次に、選択した集団を安定化させるために適当な多くの回数、再スクリーニングを行ってもよく、選択的にスクリーニングのストリンジェンシーを増加させ、またはさらなる変化を導入する（例えば、インビトロ展開）。
スクリーニングが完了すれば、選択されたペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子材料を、例えばプラスミドまたはミニ染色体の精製によって単離してもよい。選択的に、選択されたライブラリメンバーは単離の前に、例えば形質転換および培養、またはPCRによって増幅してもよい。
上記から、発明のライブラリを作製およびスクリーニングするために様々な方法を用いてもよいことは明らかである。しかし、以下の図式が好ましい。より迅速かつ効率的なプロトコルが得られるように（既に記述したように）、シス結合タンパク質またはその機能的に同等な断片、誘導体、または変種を用いる場合、全ての工程をインビトロで行うべきである。そのような場合では、生きた微生物を必要としないため、全技法を自動化しやすいと認識される。さらに、微生物の生存率を確保するために選択される条件および技法を使用する必要がない。
好ましくは、発現ライブラリを作製するために用いられる遺伝子構築物は、DNA結合部分のカルボキシ末端でライブラリ配列とアニーリングしてこれを挿入するプライマー（ライブラリ配列と共に）を用いて構築される。これによって、P2Aと同様の挙動を示すDNA結合部分を用いる場合には、翻訳時のハイブリダイズ条件または翻訳前の環状化を必要としなくなる。
コードされるDNAから解離する傾向があるDNA結合タンパク質またはその機能的に同等な断片、変種、または誘導体を用いる場合、タンパク質、またはその断片、変種、または誘導体がこれに結合するが解離しない（このようにDNAとそのコード産物との間に機能的結合が維持される）ように、例えば本明細書に記述のY450FのようなDNA結合タンパク質を変異させることがさらに好ましい。その上、複製を行うためにさらなるori部位を必要としてもよい。構築物は誘導可能プロモーターをさらに含むべきである。
好ましくは、DNA結合部分はP2Aタンパク質または機能的に同等な断片、変種または誘導体に由来する。翻訳の間、ミスマッチオリゴヌクレオチドを使用することが望ましいかも知れない。単離されれば、選択された核酸配列の宿主細胞への最終的な形質転換のためには、少なくとも１つの抗生物質耐性マーカーが存在することが好ましい。
ライブラリの作製に、偽シス結合タンパク質またはその機能的に同等な断片、誘導体、または変種を使用する場合、遺伝子材料の増幅は、好ましくはPCRのような適当な技法を用いてインビトロで行う。メガプライマーの使用を防止するためおよびDNA鎖のニックが起こるイベント時の問題を防止するために、好ましい構築物は、DNA結合部分をコードする領域のカルボキシ末端でライブラリ配列が現れる構築物である。抗生物質耐性マーカーおよび誘導可能なプロモーターをコードする遺伝子の存在もまた好ましい。スクリーニングの際、増幅はインビトロで行うことが好ましい。
このように、発明のさらなる局面から見ると、発明は、本明細書において先に定義したようにペプチドまたはタンパク質発現ライブラリから望ましい特性を示すライブラリを同定および／または精製する方法であって、a）発明のライブラリをスクリーニングする工程およびb）適切なライブラリ・メンバーを選択および単離する工程を少なくとも含む方法を提供する。方法は、単離されたライブラリ・メンバーからペプチド、タンパク質またはコードするDNAを単離するさらなる工程によって、望ましい特性を示すペプチドまたはタンパク質、またはそれをコードするDNAの単離まで拡大してもよい。
望ましい特性が標的との結合能である場合、好ましくは精製型である標的分子を用いて、特異的標的結合ペプチドまたはタンパク質保有遺伝子抱合体を、多くの異なる方法によってライブラリから選択してもよい。便宜上、標的は固相支持体に結合させて、アフィニティマトリクスとして用いてもよい。数多くの固相支持体および分子を直接または間接的に、共有的にまたは非共有的に結合させる方法（例えば、ストレプトアビジン・ビオチン、またはIgG-タンパク質Aカップリングによって）は、当技術分野では周知であり、広く文献に記述されている。
このように、支持体を例えば、マイクロタイタープレート、試験管、ディップスティック、粒子、繊維、または毛細管の形で用いてもよい。支持体は例えば、ダイナールAS社（オスロ、ノルウェー、登録商標DYNABEADSとして販売される）が製造する超常磁性ビーズを含むと都合がよいかも知れない。
選択のために、発現ライブラリは固相支持体に付着させた標的に接触させてもよい。支持体を洗浄して、標的に結合しないライブラリ・メンバーを除去する、または用いる支持体に応じて適当に発現ライブラリから抽出してもよい。次に、必要であれば、遺伝子材料を後に増幅または単離するために、標的分子と固相支持体または標的分子とペプチド／タンパク質：DNA抱合体との結合の破壊によって、選択したペプチド／タンパク質：DNA抱合体を固相支持体から放出してもよい。または、増幅はペプチド／タンパク質:DNA共役結合に対する標的の破壊を行うことなく、または共役物から遺伝子材料を放出することなく、インサイチューで行ってもよい。
標的分子はまた、支持体の非存在下で遊離の試薬として用いてもよい。次に、結合していない抱合体を除去することによって、例えば、ライブラリの全てのメンバー上に存在し、標的分子に結合していない場合に限って近づくことができる、発現されたペプチドまたはタンパク質の領域に対して作製された抗体を用いることによって、選択を行ってもよい。または、標的分子は、標的とライブラリを混合した後、これを用いて標的および結合したペプチド／タンパク質：DNA抱合体が除去されるように、固定化の手段を提供してもよい。そのような固定化手段は例えば、カップリング対、例えば標的分子に結合させたストレプタビジン・ビオチンの１つのパートナー、および回収のために用いられる支持体に結合させたもう一方のパートナーを構成してもよい。
このように、なおさらなる局面から見ると、発明は、特異的な標的結合ペプチドまたはタンパク質を同定する方法であって、少なくともa）標的分子によって発明のライブラリをスクリーニングする工程およびb）該標的分子に結合したライブラリ・メンバーを選択および単離する工程、およびc）該標的分子に特異的に結合したペプチドまたはタンパク質を単離する工程、を含む方法を提供する。上記の工程b）の後で、標的分子と特異的に結合するペプチドまたはタンパク質を発現するDNAが単離される、特異的標的結合ペプチドまたはタンパク質をコードするDNAの単離法もまた、提供される。
望ましい特異性の標的結合ペプチドまたはタンパク質を得るために、スクリーニングおよび選択の１サイクル以上を必要としてもよい。
同様に、ライブラリをスクリーニングして、特定の機能的属性、例えば酵素活性を有するタンパク質またはペプチドを同定してもよい。
そのコードするDNAに付着した選択されたペプチドまたはタンパク質は、遺伝子材料からの分離によって単離してもよく、増幅してもよい遺伝子材料の転写および翻訳によって合成してもよく、またはそれをコードする適当なDNA配列のシークエンシング後化学的に合成してもよく、もしくはペプチドまたはタンパク質の直接シークエンシングによって合成してもよい。ペプチドまたはタンパク質の化学合成は、末端アミノ酸の官能基の一連の環状の選択的脱保護反応および選択的に保護されたアミノ酸残基のカップリングを行い、最後に全ての官能基の完全な脱保護を行うことを含む、当技術分野で周知の方法によって行ってもよい。合成は、溶液中または当技術分野で既知の適した固相を用いて固相支持体上で行ってもよい。
好ましくは、選択されたペプチドもしくはタンパク質の標的分子に対するアフィニティまたはペプチドもしくはタンパク質の活性が有意に影響を受けなければ、発現されたペプチドまたはタンパク質のディスプレイ部分のみを合成してもよい。選択的に、それはDNA結合部分の配列の一部または全体の産生によって、および／または発現されたペプチドまたはタンパク質の他の領域の産生によって、DNA結合部分を含むポリペプチドにおいて現れるため、ペプチドまたはタンパク質を産生することが必要である、または好ましいかも知れない。これは骨格ライブラリが作製された場合には特に当てはまる。
適当な標的結合ペプチド／タンパク質：DNA抱合体は、標的分子の有無を決定するための定性的または定量的アッセイにおいて用いるためにリポーター分子を含んでもよい。
このように、なおさらなる局面から見ると、発明は試料中の標的分子の有無をアッセイする方法であって、（a）該試料（例えば、生物試料、生物由来試料または非生物材料）を、（i）付着したコードするDNA、発明のライブラリから選択されたDNA部分と共に、該標的分子に選択的に結合することができるペプチドまたはタンパク質標的結合部分、（ii）リポーター部分を含む分子プローブと接触させる工程；および（b）標的結合プローブを直接または間接的に評価する工程、を含む方法を提供する。
アッセイで用いられる双機能性の分子プローブ（上記の（i）および（ii）を含む）は、発明のさらなる局面を形成する。
このアッセイ法において、特異的であって試料中に存在する標的と双機能化合物との結合の評価は直接、または間接であってもよい。直接または間接的な評価は診断アッセイの分野では周知である。そのような技法は、そのいずれかが検体として作用する、結合した（または非結合の）双機能化合物の分離を含んでもよい。標的分子：双機能化合物抱合体の評価は、定性的であってもよいが、より好ましくは定量的で、リポーター部分の直接または間接評価を含むであろう。
アッセイは、その中で第二の標的に対するプローブ上のリポーター部分が双機能化合物によって認識される、第一の標的と共に第二の標的の評価に向けて行ってもよい。このように、双機能化合物は、好ましくはさらなる標的を認識するプローブ、好ましくは分子プローブに向けられてもよいが、この場合上記の双機能化合物を加える前に、適した結合条件下でプローブがさらなる標的に結合することができる。
プローブを提供するために、特異的標的結合ペプチド／タンパク質：DNA抱合体を、関係する標的の試験試料中での有無が決定されるおよび／または定量されるように、リポーター部分に組み入れるまたは共役させてもよい。
双機能化合物におけるペプチドまたはタンパク質標的結合部分は、発現されたペプチドまたはタンパク質のアミノ酸残基の一部または全てを構成する標的結合領域のために標的に結合する。一般に、これは先に定義したようにディスプレイ部分の少なくとも一部に対応するであろう。
リポーター部分は、例えばその酵素特性、放射線放出、散乱または吸収特性、その磁性特性、または検出可能な作用を生じるために相補物質との協調または結合能、例えば酵素と相互作用してシグナル、ガス放出、光の放出、色の変化、混濁度、沈殿等を生じる能力のために、直接または間接的に検出することが可能ないかなる部分であってもよい。または、リポーター部分は、認識可能で、直接または間接的にシグナルを発するさらなる分子と結合してもよいペプチド／タンパク質：DNA抱合体のいかなる部分であってもよい。このように、例えば、遺伝子材料またはペプチド／タンパク質の特定の領域に向けて作製された抗体を用いてもよい。上記部分は、診断アッセイの分野において周知である。
発明の双機能化合物におけるリポーター部分は、ペプチド／タンパク質またはDNA部分に組み入れられる、または共役してもよい。このように、例としての放射標識アミノ酸またはヌクレオチドを、ペプチド／タンパク質、またはコードするDNAの構築に用いてもよく、ペプチド／タンパク質または核酸構造に組み入れられた放射線核種はリポーター部分として機能する。そのような標識した構成成分は親ライブラリの調製の際に、またはこれらを行うその後のスクリーニングまたは増幅工程の際に組み入れてもよい。
またはリポーター分子は直接または間接的に、ペプチドまたはタンパク質が結合することができる標的の有無を検出または測定することができる、ペプチド／タンパク質またはDNAと抱合させてもよい。そのようなリポーター分子には例えば、放射標識、化学標識、例えば発色団または蛍光体（例えばフルオレセインおよびローダミンのような色素）、またはフェリチン、ヘモシアニン、または金コロイドのような電子密度が高い試薬が含まれる。
または、リポーター分子は、酵素の存在が、適した物質、例えば基質との相互作用によって視覚化される酵素、例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼであってもよい。酵素活性は、それが結合する標的が例えば、酵素に対する受容体またはその基質である場合、ペプチドまたはタンパク質標的結合物質を含む、発現されたタンパク質またはペプチドが提供してもよい。ペプチドまたはタンパク質と酵素とのカップリングは、従来の技法、例えば、活性化アルカリフォスファターゼ（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ社）のような活性化酵素を用いて行ってもよい。
リポーター部分はまた、対の他の一方が、ペプチドまたはタンパク質が結合する標的の上、または非常に近位に存在するシグナル発生対、例えば蛍光化合物および消滅蛍光基質、の一部を形成してもよい。先に述べたように、ペプチド／タンパク質またはDNAもまた、その物質を認識するさらなる分子、例えばペプチド／タンパク質の標的結合領域、または選択的に認識の目的のため、もしくは特異的核酸モチーフに対して向けられたDNAの場合に、加えてもよい、標的結合に関係しないペプチドまたはタンパク質の領域、を形成してもよい配列の一部に対して作製された抗体、との会合または結合によって検出してもよい。このように、特異的標的結合領域は、標的の結合に関与しないペプチドまたはタンパク質の部分が、発現されたペプチドまたはタンパク質に対して、例えば骨格配列として構造的または機能的役割を果たしてもよい、またはリポーター部分として、または特異的標的結合領域をリポーター部分またはプローブのさらなる成分、例えば担体または巨大分子と結合させる連結基として機能してもよい、より大きいペプチドまたはタンパク質内に含まれてもよい。
発明に従って有用な双機能化合物は、リポーター分子を得られた適当なペプチドまたはタンパク質に、直接またはリンカー部分を通じて抱合させることによって産生することができる。一般に、これは、ペプチドまたはタンパク質上の選択的に活性化されたカルボキシルまたはアミン官能基による反応によるであろう。そのような抱合反応は当業化学者の能力範囲内である。
または、リポーター分子は、ペプチドまたはタンパク質の構築において適切に標識されたアミノ酸を利用することによって導入してもよい。
双機能プローブ化合物は、先に述べたような診断アッセイを含む、当技術分野で既知の様々な系において、関係する特異的標的を認識するために用いてもよい。
以下の実施例は、図面を参考にしながら説明するために述べている。
図１は、pEN21およびpEN24構築物の構築を示す、および
図２は、PCRによって生じた30塩基対のランダム領域を含むDNA分子の産生を示し、レーン１はマーカー（λ、HindIII）およびレーン２はPCR産物である。
例１：
インビトロ・ペプチド・ライブラリを発生させ、標的をパンする一般的な方法
材料：
Ａ．T7プロモータ、リボソーム結合部位、P2 A遺伝子及びT7ターミネータを含むプラスミド又はPCRフラグメント。このようなプラスミドに関しては、これまでにLiu及びHaggard-Ljungguist（1994, supra）の記述があり、オスロのバイオテクノロジーセンター（Bio）から入手することができる。
Ｂ．プラスミド又はフラグメントを補足する、下記の配列を含む一つのプライマー（ライブラリ・プライマー）
−T7プロモータ
−リボソーム結合部位
−最初のATG開始コドンに続く30個のランダム・ヌクレオチド（XXT/G）、又はそれに代えて、最初の開始コドン及びランダム配列に続く１個のシステイン・コドン（強制的ペプチド・ライブラリに対して）。
−P2 A遺伝子のコーディング配列を補足する、最初の開始コドンから川下方向へ約20個のヌクレオチド。
プライマーは個々の仕様に合わせて合成するか、又はBioから入手することができる。
Ｃ．T7プロモーター領域中の一つのPCRプライマー（Bio）。
Ｄ．T7ターミネター領域中の一つのPCRプライマー（左回りの）（Bio）。
Ｅ．固体支柱に結合した標的。これはビオチン化標的を使用し、これをストレプタビジン又はアビジンに固体支柱上で結合させると便利である。これに代わる方法として、アビジンに結合するペプチドが求められているのならば、アビジン自体を「標的」とすることができる。ミクロタイタ・ウェルに結合したストレプタビジン或いは磁性粒子又はアビジン樹脂に結合したストレプタビジンは、それぞれDynal社（ノルウェー）又はPromega社（米国）から購入することができる。
Ｆ．インビトロでカップリングさせた直線状鋳型の転写又は翻訳に使用するT7 S30抽出物は、Promega社（米国）から販売されている。
＊その他必要な材料は、分子生物学の技法で作業を行う者にとっては、全て標準的な材料である。
方法
１．Ａで述べたように、プラスミド又はPCRフラグメントから始め、Ｂで述べたライブラリ・プライマーを追加することにより、線状PCRを実施する。この反応を行うための正確な設定内容はプライマーにより異なるが、PCR又はサイクル配列に適用されるのと同じ考え方がここでも適用される。この方法により、PCRの有効性によって、1012−1013個の分子までのライブラリができる。次の段階におけるプライマーの競合を避けるために、残りのライブラリ・プライマーは、好ましくはこの時点において、Centricon-100カラム（Amicon社）を使用して除去しておくことが望ましい。
２．この材料をさらに増強するために、プライマーＣ及びＤを加え、５−７サイクルのPCRを実施する。これは５つの部分に分割されたライブラリ・プライマー拡張DNAを使用してPCRを実施する。
３．Promega社の説明書通りに、ライブラリから得られた分割材料の一つ（例えば５分の１）を、線状フラグメントのT7 RNAポリメラーゼ（Ｆ）を含むS30抽出物に加える。これを37℃で30−60分間インキュベートして反応させ、次に試験管を氷の上に置き反応を停止させた。
４．標的はビオチン−ストレプタビジン・システムで、固体支柱にこれを直接付着する。樹脂マトリックス又はストレプタビジン磁気ビーズにカップリングしたアビジンは、それぞれ、Promega社及びDynal社から市販されており入手することができる。
５．S30抽出物を、所望の結合用緩衝液（Sambrookら、Molecular Cloning: A laboratory manual, 第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press,［Cold Spring Harbor, N.Y.［1989］）の中で1：10に希釈し、S30抽出物のペプチド・ライブラリを標的に１−３時間（又は１晩）作用させる。結合剤以外の物質を1XPBS+0.5% Tween-20（Sigma社）で５分間洗浄し、これを５回繰り返して除去する。結合ペプチド−タンパク質A-DNA複合体を、所定の溶出剤、例えば、標的がアビジンでアビジンに結合可能なペプチドが求められている場合はビオチンで、標的から溶出する。複合体を標的から分離し、同時に遺伝子物質を非遺伝子物質から分離するには、沸騰dH2Oにより溶出することもできる。
６．溶出したDNAは、次ラウンドのPCRに移る前に濃縮する。濃縮方法としてはCentricon-100カラムを使用し、メーカーが推奨する方法で行うのが最も便利である。溶出DNAの最終取得量は50μlである。これに代わる方法として、複合体をPCRに掛ける前に、遺伝物質と非遺伝物質を分離しないで精製する方法がある。
７．新しい方法として、プライマーＣ及びＤを使用し、30−40サイクルのPCRを行うこともできる。
８．ステップ３からステップ７までの全手順を、更に４−５回繰り返す。
９．溶出及びPCRの最終サイクル終了後に個々のフラグメントを単離してその配列を調べる目的で、フラグメントをクローニングする必要がある。この操作は、最終PCRフラグメントをXba I及びBamH Iで消化し、これを同じ酵素で消化したベクターpET-3a（Novagene社）（Ａ）に結合することにより実施される。
10．次に、結合したベクターはE.coli.を形質転換させる。同じ配列のコピーは多数存在するので、形質転換の効率はあまり重要ではない。
11．個々のクローンを拾い上げ、標準プロトコルでプラスミドDNAを単離する。協力的に（他の結合剤と一緒に）のみ作用する結合剤を除去するために、最終ラウンドのS30抽出及び選択（ステップ３−７）を実施する。
12．最終PCRにおける生成物は変動領域上に配列し、コンセンサス配列が得られる。良好なコンセンサス配列を得るには、50個までのクローン配列が必要である。
13．このようにして求められたペプチド配列を合成し、その結合特性に関して、別個に試験を行った。
例２
ライブラリ集団は、任意配列塩基プライマーを使用し、Ａ遺伝子を増幅することにより得られる。線状プラスミドpEE709（充填後、NcoIサイトでpET8c=pET3dに挿入されたＡ遺伝子）に対する約3000の塩基対に対応する表示モジュールを下記の如く図式的に示す。
0004644321.tif 000004
上図において、Ａ遺伝子の挿入はGCC（第２コドン）で開始され、GCA（塩基3427-29）で終わる。
（LiuらによるDNA配列［1993, supra］を参照のこと）
例で使用したプライマーは、下記の通りである。
0004644321.tif 000005
１．ペプチド・ライブラリの発生
１組の任意配列塩基を有するDNAフラグメントの集団は、次のようにして得られる。
線状化（HindIII）プラスミドpEE709上で、ライブラリ・プラスミドＢにより、線状の増幅（又はプライマー拡張）が行われる。この反応混合物100μlには、0.3μgのプラスミドDNA（約6 x 1010個の分子又は0.1pモル）、５μgのライブラリ・プライマーDNA（約7 x 1013個の分子または125pモル）及び下記PCR反応に示される残余量の成分が含まれる。この混合物を、下記に示すように、５サイクルのPCRにかける。このライブラリ・プライマーは、好ましくは、Centricon-100を用いて除去する。このライブラリ・プライマーで拡張したDNA（ライブラリ）を希釈し、さらに100μl（最終体積）ずつ５つに分け、プライマーＣ及びＤを用いて有限回数（５サイクル）のPCRにかける。各反応混合物は、100μlの最終体積中に、0.6μgのライブラリ・プライマー拡張DNA、125pモルのプライマーＣ及びＤ、0.2mMの各dNTP、50mMのKCl、４mMのMgCl2、10mMのトリスHCl（25℃におけるpH9.0）、0.1%のTriton X-100及び2.5UのTag DNAポリメラーゼ（Promega社）を含んでいる。この混合物を熱サイクル装置（Perkin Elmer社モデルPCR1000）の中で、94℃で１分間、42℃で２分間及び72℃で３分間の熱サイクルに35回掛ける。PCRの生成物からプライマー（Centricon-100）を除去し、フェノール処理を行い、エタノールで沈殿させて精製する。この時点で、このライブラリは1012−1013個のDNA分子から成るものと考えられる。
ライブラリを使用する方法でこれに代わるものとして、単純にベクター・フラグメントDNAを、ライブラリ・プライマーＢ及びＤを使用してPCRサイクルに掛ける方法がある。
２．アビジン結合ペプチドのインビトロ翻訳及びスクリーニング
Ａ．Promega社のT7 S30とS30線状テンプレート抽出物を組み合わせて使用し、線状DNAテンプレートの共役転写又は共役翻訳を行わせる。Ａ遺伝子は、T7プロモーターφ10から来るT7 RNAポリメラーゼが原動力となって転写される。フェノール処理を行ってエタノールで沈殿させた５組のDNAライブラリの一つを、９μlの蒸留水中に再懸濁させる。この体積に、S30プロトコル（Promega社）の成分（線状テンプレート用として、５μlのアミノ酸混合物、20μlのS30前混合物、1μlのT7 S30及び15μlのS30）を添加し、最終体積を50μlに調節する。共役転写又は共役翻訳のプロセスを、37℃で60分間（又は必要な時間だけ）進行させる。
Ｂ．この反応混合物（50μl）を50μlのSoftLink Avidin Resin（Promega社）に加え、室温で２時間混合し、アビジン樹脂に結合しているペプチドをパンニングする。この樹脂を遠心分離（毎分10000回転で５分間）に掛けて小球化し、（20mMのNa2HPO4と100mMのNaClから成るpH7.5のPBSで５回）洗浄する。残留している可能性のあるアビジン結合剤を５mMのビオチンで溶出させ、又は1Aで述べたように、アビジン樹脂複合体全体をプライマーＣ及びＤとともに単にPCRに掛けるだけで溶出させる。PCRの生成物を遠心分離に掛けてアビジン樹脂から分離し、フェノールで処理し、エタノールで沈殿させてから、新しい共役転写又は共役翻訳及びパンニング・サイクルに掛ける。
ペプチドのディスプレー及びパンニングのサイクルは、予期されるペプチドの濃縮が達成されるまで、これを繰り返すことができる。Ａタンパク質に特有のポリクロナール抗体を使用して、パンニング中におけるタンパク質Ａ担体の存在及びその増大を監視することができる。第４ラウンドのパンニングが終了した後、最終PCR生成物を制限酵素Xbal及びBamHIで切断し、これをライゲーションにより、pET-3a（同じ酵素で切断）に挿入する。形質転換後、各コロニーを単離し、プラスミドを抽出して挿入部分の配列を決定し、このペプチドのアミノ酸配列を得る。
例３
例２に述べた方法でペプチドのライブラリを調製してスクリーニングする。但し、この場合には、翻訳（ステップ２）の前にこれを行う。DNA分子を精製し、次に、標準プロトコルに基づくメーカー指示に従い、T4 DNAリガーゼ（New England Biolabs社）で球形にする（Sambrook, 1989, supra参照）。
この場合、スクリーニングを行う間、ハイブリッド形成条件を維持する必要は無く、従って、ハイブリッド形成を、例えば１%のTriton X-100、0.5MのKOAc、又は１%のTriton X-100、350mMのNaCl、５%のグリセリン中で行うことができる。これらは、SRPレセプタのヘテロ二量体化のスクリーニングに適した条件である。或いは、ハイブリッド形成を１%のTriton X-100、２Mの尿素、100mMのNaCl、50mMのトリスHCl（pH7.5）、又は１%のTriton X-100、0.1%のSDS、100mMのNaCl、50mMのTris HCl（pH7.5）の中で行うこともできる。これは、抗体抗原反応のスクリーニングに適した条件である。
例４
P2 DNA複製開始タンパク質のインビトロ・シス作用の証明
実験１
P2 A遺伝子（pEE709; amp耐性遺伝子も担持している；Liu及びHaggard-Ljungquist, 1994, supra）を担持する２個のプラスミド及び６個のヒスチジン・ストレッチにＡのN-末端で融合したP2A遺伝子に関して、等量のDNAをS30-T7抽出物（米国Promega社）の中で共役転写／翻訳の反応を行わせた。ヒスチジン・ストレッチの存在により、Ａタンパク質はNi結合タンパク質へと形質転換した。従って、Ａタンパク質がS30-T7抽出物の中でシス型として行動する限り、His::A発現プラスミドpEE711は、Ni含有固形担体に対して選択的に結合すべきである。両プラスミドにおいて、Ａ遺伝子の構造転写は、ファージT7φ10プロモータの制御下にある。翻訳後、Niカラムへの結合度を測定した。
材料及び方法
pEE709及びpEE711のプラスミドDNA １μgを、それぞれ、共役転写／翻訳抽出物キット（20μlのS30プレミックス、５μlのアミノ酸混合物及び15μlの円形DNA用E.coli T7 S30抽出物系［米国Promega社］）に加えた。この転写／翻訳を、37℃で60分間進行させた。この抽出混合物を洗浄用緩衝液（Qiagen社; Buffer 11-50mMのリン酸ナトリウム；pH8.0、300mMのNaCl、20mMのイミダゾール、１mMのPMSF）で12倍に希釈し、これを非変性条件下でBuffer 1（50mMのリン酸ナトリウム; pH8.0、300mMのNaCl、20mMのイミダゾール）で平衡させたNi-NTA回転カラム（ドイツQiagen社）に加えてNi選別に掛けた。
メーカー（Ni-NTA Spinキット［ドイツ、Qiagen社、1994年春］のプロトコルを参照のこと）の推奨通り、600μlのBuffer 11で３回洗浄し、250μlのBuffer 111（50mMのリン酸ナトリウム; pH8.0、300mMのNaCl、250mMのイミダゾール）で２回溶出した。洗浄及び溶出の操作において、基準表の最高値2000rpmの速度でNiカラムを２分間回転させて遠心分離した。高効率セルJM109（米国Promega社）を溶出液の一部で形質転換させ、耐アンピシリン性のコロニーを数えた。個々のコロニーのプラスミドを単離し、アガロースゲル電気泳動法で、型の特徴を求めた。
溶出プラスミドの型分布（比率）を求めるために、プラスミドの存在量を、JM 109歪み計（Promega社）によるamp耐性の変化により測定した。プラスミドを抽出し、アガロースゲル電気泳動法による測定を行い、その後でコロニーを拾い、そのプラスミド型を分析した（その大きさにより区別した）。Niカラムによる選別を行わない場合についても、pEE711（His::A）のpEE709（A）に対する比率を求めた。
結果：
得られた結果を下表に示す。
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実験２
第２の実験において、２つの新しいプラスミド構造pEN21（amp耐性遺伝子を伴うＡ遺伝子構造、図１を参照のこと）及びpEN24（His::６つのヒスチジン残基の標識及び１つのカナマイシン耐性遺伝子を有するＡ遺伝子構造、図１を参照のこと）について、上記実験１と同じタイプの実験を行った。但し、下記の「材料及び方法」の項に示す修正を加えた。抗生物質に対する耐性の差から、バクテリアのコロニーと同様、個々のプラスミド型の直接計数が可能となる。
材料及び方法
pEN21及びpEN24は、pET21a及びpET24a（米国Novagen社）の派生品種である。pET21aとpET24aのベクターは、選択可能性マーカー（それぞれ、アンピシリン及びカナマイシンに対する耐性）が相違するだけである。pEN21及びpEN24は、Ａ遺伝子及びそのフランキング領域を切断する働きのあるpEE709及びpEE711のXbaI及びB1PIによる切断作用を抑制することにより、これらを調製した。pET21a及びpET24aは、同じ制限酵素を用いて切断した。これらをSpinBindカラム（FMC社）による電気泳動分析に掛けた後、Ａフラグメント及び新しいベクター・フラグメントをアガロースゲルから単離した。pEE709から得られたＡフラグメントをpET21aベクターの中へクローニングし、His-A-フラグメントをpET24aベクターの中へクローニングした。これらのプラスミドをS30抽出物の中で30分間インキュベートし、E.coli菌株BK 2118をエレクトロポーレーションにより変形させた後、これらのプラスミド型について、アンピシリン（pEN21）及びカナマイシン（pEN24）のプレートを使用して、その抗生物質に対する耐性の差を測定した。ここでは、20mMのイミダゾールではなく、１mMのイミダゾールを含むようにBuffer 11を修正し、プロテアーゼ阻害剤PMSFを省略した（Buffer 11*と呼称する）。Ni-NTA回転カラムを洗浄用緩衝液（Buffer11*、非変性条件）で平衡させた。
メーカーの推奨（Ni-NTA Spinキット［ドイツQiagen社、1994年春］のプロトコルを参照のこと）通り、洗浄は600μlのBuffer 11*で３回行い、溶出は250μlのBuffer 111で２回行った。等量のpEN21及びpEN24 DNAを含む、S30抽出物未曝露のプラスミド混合物を比較対照サンプルとしてNi選別を行った。
結果：
結果を下表に示す。
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S30抽出物を省略し、純粋のプラスミド混合物をNiカラムに掛けた場合には、濃厚化は起こらなかった。
結論：
全ての実験において期待されるように、Ni選別を行わない場合におけるHis:A/Aプラスミドの比率は約１であった。これと比較して、Ni選別後におけるHis::A/Aプラスミドの比率（約9.3及び3.4）は、His::Aプラスミドで、それぞれ約13及び７にまで濃厚化する。これらの数字がインビトロHis標識P2 Aの効率のよいシス作用を示しているかどうかを決めるには、これらの濃厚化値を、上記実験条件を使用して理論的に得られる濃厚化値と比較する必要がある。この実験値と理論値の比較を行うために、我々は溶離液流出部分の不特定背景を測定し、転写／翻訳反応で合成したHis::Aの量を推定した。
プラスミドをE.coliの溶菌液中で翻訳せずにニッケル・カラム選別に掛けて、サンプルに残る不特定背景を測定した。溶離液の３分の１がE.coli中で形質転換され、得られたコロニーを数えた。次に、使用されたE.coli細胞の形質転換効率測定値を使用して計算を行い、His標識P2 Aタンパク質の不存在下においても、この溶離液には0.3fモルの各プラスミドが含まれていることが分かった。
我々の標準的な反応において、約５fモル（3 x 109個の分子）のタンパク質Ａが合成されたことが推定される。全ての合成His::A分子が、それぞれコード化DNA分子に結合していると仮定することにより、得られた濃厚化率は（5+.3）/.3=18であると考えられる。２つの実験で得られた平均濃厚化率は、（13+7）/2=10であった。従って、P2 Aタンパク質がインビトロで効率的にシス作用を果たし得るとともに、そのN-末端に融合した６個のヒスチジンの伸長を表示し得ることを、これらの結果が意味しているものと我々は解釈する。本実験においては、翻訳効率が低いにも拘わらず、1012のメンバーを有するライブラリが得られるものと期待される。さらに追加の又はより激しい洗浄を行えば濃厚化率が改善し、これが本発明のライブラリ生産を助けることが期待される。
実験５
本発明におけるペプチド・ライブラリの発現に使用するDNA分子を調製した。
材料及び方法
下記のプライマーを使用し、Ａ遺伝子を線状プラスミドpEN21（図１及び例４を参照のこと）から増幅することにより、インビトロペプチド表示ライブラリの発現に使用するDNA分子を調製した。
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〔30の任意配列塩基及び例２のプライマーＢに対応する唯一のXbaIサイト（小文字）の領域を有する144ヌクレオチドであり、９５’ヌクレオチドが加わっている。〕
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〔プラスミドpEN21の川上領域を補足する40個の塩基プライマーであり、T7プロモーター及びT7プロモーターの川上領域の塩基であり、例２のプライマーＣに対応する。15 5’ヌクレオチドが追加されている。〕
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〔T7ターミネーターの川下配列を補足する21個の塩基プライマーであり、例２のプライマーＤに対応する。〕
Applied Biosystems 394 DNA/RNA合成装置の中でプライマーを合成し、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法でチェックした。このライブラリ・プライマーはランダム性を有するために、ゲル上で異質性を示した。
プライマーＢ及びＤを使用し、PCR反応（例２で述べたPCR反応に類似の反応）により、５μlのポリメラーゼ緩衝液（10倍量のVent pol緩衝液; New England Biolabs社）、50pモルのプライマーＢ、20pモルのプライマーＤ、10ngのDNAテンプレート（pEN21）、１μlのdNTPミックス（10mM; New England Biolabs社）、１μlのDeep Ventポリメラーゼ（New England Biolabs社）を使用して、ライブラリDNA分子を調製した。合計体積は50μl、ホットスタート94℃で５分間加熱し、55℃で30秒間アニール（後アニールは58℃で２分間）し、74℃で２分間（後重合は74℃で７分間）重合した。この反応を25ラウンド繰り返した。
プライマーＣを使用し、ライブラリ・プライマーＢの不存在下で、さらにこのライブラリを増幅させた（且つ、ヘテロデュープレックス分子を除去した）。この増幅ステップの前に精製を行って、プライマーＢを除去することを勧める。
結果：
Ａ遺伝子の5’末端で（開始コドンATGに続く）30個の塩基を任意配列させ、これを使用して約3000個の塩基対のDNA表示モジュールを調製した。ライブラリを構成するPCR製品を、図２に示す。
【図１】
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【図２】
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