(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清および蛋白質非含有培地中での増殖に適応された哺乳動物細胞株の取得方法であって、
Ｉ．細胞株生存率が８０〜１００％の間であり、標準培地から細胞生存率が０％に低下する臨界蛋白質濃度まで連続的蛋白質濃度減少を伴う培地中で細胞が増殖される第１段階、及び
ＩＩ．第１段階において、一旦臨界蛋白質濃度が前以て決定された後、臨界蛋白質濃度に達する前の細胞増殖が可能で、かつそれが血清及び蛋白質非含有培地まで蛋白質濃度を緩徐に減少させる開始地点とできる蛋白質濃度を臨界前蛋白質濃度とし、臨界前蛋白質濃度より低い蛋白質濃度での細胞の培養が、最初の標準細胞培地での継代培養と同じ細胞生存率及び集団倍加時間で増殖することができる時に、細胞が再度、非臨界段階に達したとみなして、蛋白質非含有培地（０ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度）中に細胞を直接播種する工程から構成される第２段階
を含み、かつ、前記哺乳動物細胞株が、組換えポリペプチドもしくは組換え蛋白質をコードする配列を含む組換えＮＳＯ細胞株である、ことを特徴とする哺乳動物細胞株の取得方法。
【請求項２】
請求項１記載の哺乳動物細胞株の取得方法であって、第１段階が、
ｉ．最初の蛋白質濃度をもつ標準細胞培地を使用する６ウェルの培養プレート中の３ウェルに組換え細胞株を播種し、細胞密度を１〜５×１０5細胞／ｍＬの範囲内にし、４８時間後に、上清の半分を新鮮な蛋白質非含有培地により置き換え、それにより出発状態の５０％の最終蛋白質濃度にする工程、
ｉｉ．４８時間毎に、上清を出発状態の５０％の蛋白質濃度をもつ新鮮な培地により完全に置き換える工程、
ｉｉｉ．細胞をこの蛋白質濃度下で集密状態まで増殖させる工程、
ｉｖ．工程ｉｉｉ．からの細胞を出発状態の５０％の蛋白質濃度をもつ培地中１〜５×１０5細胞／ｍＬの範囲内の密度で少なくとも３ウェルに播種し、４８時間後に、上清の半分を新鮮な蛋白質非含有培地により置き換え、それにより前の状態の５０％の最終蛋白質濃度にする工程、
ｖ．４８時間毎に、上清を前の状態の５０％の蛋白質濃度をもつ新鮮な培地により完全に置き換える工程、
ｖｉ．細胞をこの蛋白質濃度下で集密状態まで増殖させる工程、
ｖｉｉ．工程ｉｖ〜ｖｉと同じ工程を繰り返し、各サイクル中に、前のサイクルの濃度の５０％まで蛋白質濃度を減少させ、細胞死をもたらす臨界蛋白質濃度に到達するまでこの方法を繰り返す工程
により構成される、ことを特徴とする上記方法。
【請求項３】
請求項１または２記載の哺乳動物細胞株の取得方法であって、第２段階が、
ｖｉｉｉ．  ２〜６×１０5細胞／ｍＬの範囲内の密度で少なくとも３ウェル中に臨界前蛋白質濃度中に増殖する、８０％以上の生存率を伴う細胞培養物からの細胞を播種し、細胞を臨界前蛋白質濃度中で増殖し、４８時間後に上清の２５％を新鮮な蛋白質非含有培地により置き換え、これによりそれを臨界前蛋白質濃度の７５％の最終蛋白質濃度にする工程、
ｉｘ．  ４８時間毎に上清を臨界前蛋白質濃度の７５％の蛋白質濃度をもつ新鮮な培地により完全に置き換える工程、
ｘ．  細胞をこの蛋白質濃度下で集密状態まで増殖させる工程、
ｘｉ．  工程ｘからの細胞を臨界前蛋白質濃度の７５％の蛋白質濃度をもつ培地中に２〜６×１０5細胞／ｍＬの範囲内の密度で少なくとも３ウェル中に播種し、４８時間後に上清の２５％を新鮮な蛋白質非含有培地により置き換え、これによりそれを前の状態の７５％の最終蛋白質濃度にする工程、
ｘｉｉ．  ４８時間毎に上清を前の状態の７５％の蛋白質濃度をもつ新鮮な培地により完全に置き換える工程、
ｘｉｉｉ．  細胞をこの蛋白質濃度下で集密状態まで増殖させる工程、
ｘｉｖ．工程ｘｉ〜ｘｉｉｉと同じ工程を繰り返し、各サイクル中、蛋白質濃度を前のサイクルの濃度の７５％まで減少させ、次にこの操作を、細胞が最初の標準細胞培養での継代培養と同じ細胞生存率及び集団倍加時間で増殖することができる時に、細胞が再度、非臨界段階に到達したとみなして、蛋白質非含有培地（０ｍｇ／ｍＬの蛋白質濃度）中に細胞を直接播種する工程
により構成される、ことを特徴とする上記方法。
【請求項４】
細胞が最初に播種される血清および蛋白質含有培地が５％〜１０％の間の胎児ウシ血清を含んで成る請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
組換えポリペプチドもしくは組換え蛋白質をコードする配列が組換え抗体もしくはその断片をコードする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
血清および蛋白質非含有培地中での増殖に適応され、かつ、抗体ＥＧＦ−Ｒ  ｈＲ３をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法により得られる組換えＮＳＯ細胞株。
【請求項７】
請求項６記載の組換えＮＳＯ細胞株を血清及び蛋白質非含有培地で培養することを特徴とする抗体ＥＧＦ−Ｒ  ｈＲ３の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジー、特に２段階適応方法による、血清−および蛋白質−非含有培地に適応された安定な細胞クローンを回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物細胞のインビトロの培養の開発以来、それらがもたらす多数の製品の診断的および治療的可能性のために、これらの細胞の大規模な生産の需要が増加した。これらの有用な物質にはモノクロナール抗体、ヒト成長ホルモン、リンホカイン、エリスロポイエチン、血液凝固因子および組織プラスミノーゲン活性化物質が含まれる。
【０００３】
異なる疾患の治療およびインビボ診断のための組換えモノクロナール抗体（ｒＭａｂ）の使用は多数の場合、高用量の処置の使用を意味する。この事実が非常に高い純度をもつ大量の問題のｒＭａｂの生産を必要にさせる。
【０００４】
癌および自己免疫疾患の治療および診断における可能な使用を伴う幾つかの組換えモノクロナール抗体が分子免疫学センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）においてＮＳＯ骨髄腫細胞中に発現されてきた。特許文献１は前記受容体を発現する腫瘍の診断および治療に有用な表皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）に対するキメラおよびヒト化抗体の獲得につき記載している（特許文献１参照）。特許文献２は乾癬を罹患する患者の診断および治療に有用な抗−ＣＤ６モノクロナール抗体につき記載している（特許文献２参照）。Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ等はＩＯＲ−Ｔ３ａと呼ばれる抗−ＣＤ３モノクロナール抗体を報告した（非特許文献１参照）。
【０００５】
蛋白質非含有培養状態については、様々な技術が開発されてきた。従って、蛋白質非含有条件下で細胞増殖を可能にする、具体的に定義された完全に蛋白質非含有培地が開発されてきた。
【０００６】
特許文献３は蛋白質非含有条件下における組換え蛋白質の発現につき記載している（特許文献３参照）。
【０００７】
特許文献４は宿主細胞の産生能力を増加するために非イオン性界面活性剤もしくはシクロデキストリンを添加することによるＣＨＯ細胞中の第ＶＩＩＩ因子の産生のための蛋白質非含有培地の使用につき記載している（特許文献４参照）。これらの添加剤の効果を増強するために、例えばブチレートおよびリチウムの添加が推奨されている。
【０００８】
特許文献５はその遊離アミノ酸含量が蛋白質の総重量の１５％未満であり、そのペプチドが４４ｋＤ未満の分子量を有するグルタミン含有蛋白質加水分解物を含有する培地中での細胞培養につき記載している（特許文献５参照）。細胞培養のための培地としては、それにはとりわけ、胎児コウシ血清、ゲンタマイシンおよびメルカプト−エタノールが蛋白質加水分解物に加えて添加されている基礎培地として、合成の最少の培地が使用される。血液因子の組換え産生のためのこの血清含有培地の使用は言及されなかった。
【０００９】
特許文献６は蛋白質非含有条件下で付着性細胞の増殖を可能にする特別な合成表面につき記載している（特許文献６参照）。
【００１０】
細胞増殖を刺激するために、ヒトインスリンを過剰発現するＣＨＯ細胞が、インスリンがそれに共有結合される人工的基質上で増殖された（非特許文献２参照）。
【００１１】
Ｒｅｉｔｅｒ等は、担体上の高密度の血清含有培地中で最初に増殖されたｒ−ＣＨＯ細胞の固定化および、細胞培養上澄み液中への蛋白質の連続的放出が認められる産生相中の、蛋白質非含有培地中での固定化細胞のその後の潅流培養につき記載している（非特許文献３参照）。そこで、細胞は蛋白質非含有培地中に１０世代未満維持された。
【００１２】
連続細胞株、とりわけＶＥＲＯ細胞に対する、蛋白質非含有条件下の大規模細胞培養物の有効な調製の先行方法が記載されている（特許文献７参照）。そこでは細胞が最初のアンプルから工業的な大規模の１２００リットルまでの血清および蛋白質非含有条件下で増殖される。
【００１３】
当初、血清含有条件下で増殖された細胞を蛋白質非含有培地に適応させることは通常、長時間を要する、むしろ面倒な過程であり、更に、発現蛋白質の収率および組換えＣＨＯ細胞の産生率は血清含有条件に比較して蛋白質非含有培地中への適応後に著しく低下することが繰り返し認められた（非特許文献４参照）。これは変化した培養条件による組換えクローンの不安定性もしくは増殖低下の結果である。安定な最初のクローンの使用にもかかわらず、変化された発酵条件のために大部分の細胞は繰り返して、減少した発現を伴う細胞もしくは非産生細胞になり、それが産生過程中に産生細胞を駆逐し、それにより発酵細胞の培養体は最終的に、大部分、非産生細胞もしくは低い発現を有するような細胞から成る。
【特許文献１】米国特許第５，８９１，９９６号明細書
【特許文献２】国際公開第９７／１９１１１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９７／０５２４０号パンフレット
【特許文献４】特開平２−６９６００１号公報
【特許文献５】国際公開第９６／２６２６６号パンフレット
【特許文献６】米国特許第５，３９３，６６８号明細書
【特許文献７】国際公開第９６／１５２３１号パンフレット
【非特許文献１】Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ９  Ｎｏ．５，１９９９
【非特許文献２】Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  ＰＮＡＳ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：３５９８−３６０１
【非特許文献３】Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２４７−２５３
【非特許文献４】Ｐａｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：６９１−６５８
【発明の開示】
【００１４】
本発明において、血清および蛋白質非含有培地に適応された安定な細胞株を開発する方法が確立された。この方法に従って、幾つかのクローンが蛋白質非含有培地中で単離された。
蛋白質非含有培地への細胞株の２段階の適応
本方法は血清を補助添加されたもしくは血清非含有培地から蛋白質非含有培地への適応の直接的方法を実施することができない哺乳動物の細胞株を含んで成る。
【００１５】
本発明の方法は蛋白質非含有培地（ＰＦＭ）への細胞株の適応中の２段階の過程から成る。
【００１６】
非臨界段階と考えられる第１段階：蛋白質含量の減少が細胞生存率の喪失を伴わずに起り、蛋白質濃度の各段階における集団倍加時間の重大な減少はない。非臨界段階は通常５〜０．５ｍｇ／ｍＬの間の培地中蛋白質濃度で認められ、培養物は最初の培地中とほとんど同様な増殖速度を示す。
【００１７】
この第１段階は８０〜１００％の間の細胞株生存率を伴って開始し、細胞は、細胞生存率が０％に低下する臨界蛋白質濃度まで、連続的な蛋白質濃度減少を伴う培地中で増殖される。この蛋白質濃度が次の段階の出発点である。
【００１８】
臨界段階と考えられる第２段階：この段階においては、細胞生存率および細胞の集団倍加時間の減少がおこり、蛋白質濃度の１段階からもう１つの段階に適応するために時間がよりかかるであろう。適応過程中にバイパスできない培地中の臨界蛋白質濃度が存在する。これらの臨界蛋白質濃度は各組換え細胞株に特異的であるが、通常、０．６ｍｇ／ｍＬ未満である。細胞が一旦これらの臨界蛋白質濃度で最初の生存率および増殖速度を回復した後は、より低い蛋白質濃度をもつ（ｆｏｌｌｏｗ）条件に継代培養することができる。
【００１９】
一旦臨界蛋白質濃度が固定されると、細胞の増殖を支持する閉じられた（ｃｌｏｓｅｄ）より高い蛋白質濃度が臨界前蛋白質濃度と考えられる。臨界前蛋白質濃度から出発して、それは細胞が最初の生存率および増殖速度を回復するまで緩徐に低下される。
【００２０】
臨界段階において蛋白質濃度を減少させる段階の選択される組み合わせは、次の関係：
Ｖａｄａｐｔ．＝Δ蛋白質濃度／ΔＴａｄａｐｔ．
として計算される、この段階における総適応時間および適応速度（Ｖａｄａｐｔ．）を決定するであろう。しかし、この段階の組み合わせは臨界濃度を含む各蛋白質濃度に対する適応に要する時間に対しては影響をもたないであろう。非臨界段階の最後および臨界蛋白質濃度を決定するためには、毎回蛋白質濃度を２倍に減少することにより、所望の蛋白質非含有培地中の細胞培養物の連続的希釈による、段階的適応を実施することが必要である（表１）。この減少は血清濃度の減少もしくは異なるレベルの何か蛋白質濃度の高い血清代用物を基礎培地に補助添加することにより実施することができる。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
適応法を開始する前に、細胞は通常細胞を培養するために使用される標準培地中でＴ−フラスコ中で８０％を超える生存率を伴って維持されなければならない。
【００２３】
適応法は下記の段階に従って段階毎に実施される。
【００２４】
ｉ．標準細胞培地（最初の蛋白質濃度をもつ）を使用する組換え細胞株で６−ウェルの培養プレート中の３ウェルに播種する。細胞密度は１〜５×１０５細胞／ｍＬの範囲内になければならない。４８時間後に、上澄み液の半分を新鮮な、蛋白質非含有培地により置き換え、それにより出発状態の５０％の最終蛋白質濃度を与える。
【００２５】
ｉｉ．４８時間毎に、上澄み液を出発状態の５０％の蛋白質濃度をもつ新鮮な培地により完全に置き換える。
【００２６】
ｉｉｉ．細胞をこの蛋白質濃度下で集密状態まで増殖させる。
【００２７】
ｉｖ．段階ｉｉｉ．からの細胞を出発状態の５０％の蛋白質濃度をもつ培地中１〜５×１０５細胞／ｍＬの範囲内の密度で少なくとも３ウェルに播種する。４８時間後に、上澄み液の半分を新鮮な、蛋白質非含有培地により置き換え、それにより前の状態の５０％の最終蛋白質濃度を与える。
【００２８】
ｖ．４８時間毎に、上澄み液を前の状態の５０％の蛋白質濃度をもつ新鮮な培地により完全に置き換える。
【００２９】
ｖｉ．．細胞をこの蛋白質濃度下で集密状態まで増殖させる。
【００３０】
ｖｉｉ．（ｉｖ）〜（ｖｉ）の段階を繰り返し、各サイクル中蛋白質濃度を前のサイクルの濃度の５０％まで減少させる。細胞死をもたらす蛋白質濃度に到達するまでこの方法を繰り返す。
【００３１】
ｖｉｉｉ．２〜６×１０５細胞／ｍＬの範囲内の密度で、少なくとも３ウェル中に、臨界前蛋白質濃度中に増殖する、８０％以上の生存率を伴う細胞培養物からの細胞を播種する。細胞は臨界前蛋白質濃度中で増殖し、４８時間後に上澄み液の２５％を新鮮な、蛋白質非含有培地により置き換え、これによりそれを臨界前蛋白質濃度の７５％の最終蛋白質濃度にさせる。
【００３２】
ｉｘ．４８時間毎に上澄み液を臨界前蛋白質濃度の７５％の蛋白質濃度をもつ新鮮な培地により完全に置き換える。
【００３３】
ｘ．細胞をこの蛋白質濃度下で集密状態まで増殖させる。
ｘｉ．段階（ｘ）からの細胞を臨界前蛋白質濃度の７５％の蛋白質濃度をもつ培地中に２〜６×１０５細胞／ｍＬの範囲内の密度で少なくとも３ウェル中に播種する。４８時間後に上澄み液の２５％を新鮮な、蛋白質非含有培地により置き換え、これによりそれを前段階の濃度の７５％の最終蛋白質濃度にさせる。
【００３４】
ｘｉｉ．４８時間毎に上澄み液を段階（ｘ）の濃度の７５％の蛋白質濃度をもつ新鮮な培地により完全に置き換える。
【００３５】
ｘｉｉｉ．細胞をこの蛋白質濃度下で集密状態まで増殖させる。
ｘｉｖ．（ｘｉ）〜（ｘｉｉｉ）の段階を繰り返し、各サイクル中、蛋白質濃度を前のサイクルの濃度の７５％まで減少させ、次にこの方法を、細胞生存率のあらゆる喪失および集団倍加時間の減少を引き起こさない蛋白質濃度に到達するまで繰り返す。細胞をより低い蛋白質濃度をもつ培地に移し、それらは細胞生存率のあらゆる喪失および第１継代培養前の集団培養時間の減少を伴わずに増殖することができる時に、細胞は再度、非臨界段階に到達したと考えられ、蛋白質非含有培地（０ｍｇ／ｍＬの蛋白質濃度）中にそれを直接播種する。
【００３６】
本発明の方法において、最初の培地は５〜１０％の間の範囲の胎児コウシ血清を含有する。
【００３７】
蛋白質非含有培地中での増殖に適応された哺乳動物の細胞株は骨髄腫、特にＮＳＯ細胞である。
【００３８】
本発明はまた、ポリペプチドもしくは組換え蛋白質でトランスフェクトされたＮＳＯ細胞株を使用する時、特にそれらが組換え抗体もしくはその断片をエンコードする配列でトランスフェクトされる時に有用であることができると考えられる。蛋白質非含有培地中で増殖する本発明の方法により修飾される哺乳動物の細胞株も開示される。
【００３９】
本発明の異なる態様において、蛋白質非含有培地中で増殖する抗−ＥＧＦ受容体ｈＲ３、抗−ＣＤ６  Ｔ１ｈＴ、抗−ＣＤ３  Ｔ３Ｑ抗体もしくはそれらの断片から成る群から選択されるヒト化もしくはキメラ抗体を発現するあらゆる哺乳動物の細胞株、従ってこの細胞株により分泌される抗体が開示される。
【００４０】
本発明の方法により得られる細胞株は少なくとも４０世代に対して蛋白質非含有培地中で安定に増殖する。
【実施例１】
【００４１】
蛋白質非含有培地への組換え細胞株ｈＲ３の適応。
ヒト化抗−ＥＧＦヒト受容体ｈＲ３モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖を発現するためのベクター構造をもつ骨髄腫ＮＳＯ細胞株のトランスフェクションにより、組換え細胞株ｈＲ３を得た。この細胞株の蛋白質非含有培地への適応は培地の蛋白質含量の２段階の減少により前記の方法に従って実施した。
【００４２】
これらの細胞を１０％のＦＢＳを補助添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。蛋白質濃度が０．１５ｍｇ／ｍＬである時にＲＰＭＩ−１６４０蛋白質非含有培地に蛋白質到達補助添加剤のＮｕｔｒｉｄｏｍａ  ＮＳ（Ｂｏｈｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｎｎ）を添加することによりＦＢＳを置き換えた。最初の培地中の蛋白質含量の減少をＲＦＨＭ−ＩＩ蛋白質非含有培地（Ｇｉｂｃｏ）による連続希釈により実施した。
【００４３】
図１および２はそれぞれ、臨界濃度および適応速度Ｖａｄａｐｔ．の計算の結果を示す。
【実施例２】
【００４４】
組換え細胞株Ｔ１ｈＴの蛋白質非含有培地への適応。
組換え細胞株Ｔ１ｈＴをエピトープＴ抑制法によりヒト化された抗−ヒトＣＤ６モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖を発現するためのベクター構造をもつ骨髄腫ＮＳＯ細胞株のトランスフェクションにより得た。
【００４５】
蛋白質／非含有培地へのこの細胞株の適応を培地の蛋白質含量の２段階減少によりポイント２に記載された方法に従って実施した。
【００４６】
これらの細胞は最初に１０％のＦＢＳを補助添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。蛋白質含量の減少はＧｉｂｃｏからのＰＦＨＭ−ＩＩ蛋白質非含有培地による最初の培地の連続的希釈により実施した。
【００４７】
臨界濃度および適応速度Ｖａｄａｐｔ．の計算結果はそれぞれ、図３および４に示す。
【実施例３】
【００４８】
組換え細胞株Ｔ３Ｑの蛋白質非含有培地への適応。
組換え細胞株Ｔ３Ｑを、ヒトリンパ球上のＣＤ３受容体を認識するヒト化モノクロナール抗体Ｔ３Ｑの軽鎖および重鎖を発現するためのベクトル構造をもつ骨髄腫ＮＳＯ細胞株のトランスフェクションにより得た。
【００４９】
蛋白質／非含有培地へのこの細胞株の適応を培地の蛋白質含量の２段階減少によりポイント２に記載された方法に従って実施した。
【００５０】
これらの細胞を最初に１０％のＦＢＳを補助添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。蛋白質含量の減少をＧｉｂｃｏからのＲＦＨＭ−ＩＩ蛋白質非含有培地中への連続希釈により実施した。
【００５１】
臨界濃度および適応速度Ｖａｄａｐｔ．の計算の結果を図５および６それぞれに示す。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】蛋白質濃度の逆数の自然対数との、各蛋白質濃度にｈＲ３細胞を適応するために要する（生存率および倍加時間の回復までの）時間の関係。ｈ−Ｒ３細胞株の臨界濃度値：−０．３２および０．１１ｍｇ／ｍＬの総蛋白質濃度。
【図２】ｈ−Ｒ３細胞株の蛋白質濃度の逆数の自然対数との、適応法の開始からの総合時間の関係。臨界段階中のｈ−Ｒ３細胞株の適応速度の値−０．００５３ｍｇ／日。
【図３】蛋白質濃度の逆数の自然対数との、各蛋白質濃度にＴ１ｈＴ細胞を適応させるために要する（生存率および倍加時間を回復するまでの）時間の関係。Ｔ１ｈＴ細胞株の臨界濃度の値−０．１２および０．０１ｍｇ／ｍＬの総蛋白質濃度。
【図４】Ｔ１ｈＴ細胞株の蛋白質濃度の逆数の自然対数との、適応法の開始からの総時間の関係。Ｔ１ｈＴ細胞株の適応速度の値−０．００１４ｍｇ／日。
【図５】蛋白質濃度の逆数の自然対数との、各蛋白質濃度にＴ３Ｑ細胞を適応させるために要する（生存率および倍加時間を回復するまでの）時間の関係。Ｔ３Ｑ細胞株の臨界濃度の値−０．６３ｍｇ／ｍＬの総蛋白質濃度。
【図６】Ｔ３Ｑ細胞株の蛋白質濃度の逆数の自然対数との、適応法の開始からの総時間の関係。Ｔ３Ｑ細胞株の適応速度の値−０．００１７２ｍｇ／日。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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