(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然に生じるヌクレオチドの核酸骨格構造から修飾を受けた核酸骨格構造を有する一以上のヌクレオチドを含むポリマーであって、前記修飾が、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）、及び２’−ハロゲンからなる群から選択される一以上のリボース基上の２’置換を含み、前記ポリマーの３’末端及び５’末端の両方が遮断性化学的修飾によりブロックされているポリマー。
【請求項２】
前記核酸が複数のヌクレオチドを含んでなるポリマーである、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
前記核酸が約２個から１００個のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載のポリマー。
【請求項４】
遮断性化学的修飾が、転化糖、転化ヌクレオチド(inverted nucleotide)、ジデオキシヌクレオチド、フルオレスセイン、ソラレン(psoralen)、アクリジン、ジニトロフェニル、メチルホスホネート、アルキル基、アルコール基、アリール基、３’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、３’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルチオリン酸、２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）チオリン酸、３’−Ｏ−アルキルチオリン酸、３’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）チオリン酸、ヘキサ−エチルオキシ−グリコール、コルジセピン(cordycepin)、シトシンアラバノシド、２’−メトキシ−エトキシヌクレオチド、ホスホルアミデート(phosphoramidates)、ペプチド結合、コレステロール、ビオチン、ローダミン、グリセリル、ブチル、ヘキサノール、ブタノールからなる群から選ばれた一以上の部分である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項５】
天然に生じるヌクレオチドの核酸骨格構造から修飾を受けた核酸骨格構造を有する一以上のヌクレオチドを含むポリマーであって、前記修飾が、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）、及び２’−ハロゲンからなる群から選択される一以上のリボース基上の２’置換を含み、前記ポリマーの３’末端及び５’末端の両方が遮断性化学的修飾によりブロックされているポリマーと、
薬学的に受容可能な担体と
を含んでなる医薬組成物。
【請求項６】
下記の一般的構造式を有するポリマー。
Ａ−（Ｂ）ｎ−Ｃ
式中、Ｂは２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）ヌクレオチド、３’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、３’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）ヌクレオチドからなる群から選ばれる少なくとも一のヌクレオチドであって、該ポリマーが、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）、及び２’−ハロゲンからなる群から選択される一以上のリボース基上の２’置換を含むヌクレオチドを含み、ｎは１から９８の整数、Ａは５’末端遮断性基、Ｃは３’末端遮断性基である。
【請求項７】
前記ポリマーがプロトン付加されている、請求項１に記載のポリマー。
【請求項８】
前記プロトン付加されているポリマーが水に溶解された場合、６以下のｐＨを有する、請求項７に記載のポリマー。
【請求項９】
前記２’−Ｏ−アルキル基が、２’−Ｏ−メチルである、請求項１に記載のポリマー。
【請求項１０】
前記２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）基が、２’−Ｏ−メトキシエトキシ基である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項１１】
前記２’−ハロゲンが、２’−フルオロである、請求項１に記載のポリマー。
【請求項１２】
前記核酸骨格構造が、２’−Ｏ−メトキシリボヌクレオチドで修飾され、３’末端及び５’末端が、ブタノールでブロックされている、請求項１に記載のポリマー。
【請求項１３】
前記ポリマーがプロトン付加されている、請求項５に記載の組成物。
【請求項１４】
前記プロトン付加されているポリマーが水に溶解された場合、６以下のｐＨを有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記２’−Ｏ−アルキル基が、２’−Ｏ−メチルである、請求項５に記載の組成物。
【請求項１６】
前記２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）基が、２’−Ｏ−メトキシエトキシ基である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項１７】
前記２’−ハロゲンが、２’−フルオロである、請求項５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記核酸骨格構造が、２’−Ｏ−メトキシリボヌクレオチドで修飾され、３’末端及び５’末端が、ブタノールでブロックされている、請求項５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、一般的に修飾された核酸の分野に関し、特に酸性条件において安定な核酸に関する。
【０００２】
［発明の背景］
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、疾患の治療に対する強力な新しいアプローチとして現れた。今日までの大半の研究は、抗ウイルス剤および抗癌剤としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に焦点を当てている（Wickstrom, F.,Ed., Prospects for Antisense Nucletc Acid Tharapy of Cancer and AIDS, New York: Wiley-Liss, 1991; Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., Antisense Research and Applications, Boca Raton: CRC Press, 1993, pp.154-182; Basserga, R and Denhardt, D. T., 1992, Antisense Strategies, New York: The New York Academy of Science, Vol. 660; Murray, J. A. H., Ed., Antisense RNA and DNA, New York: Wiley-Liss, 1993; Agrawal et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079-7083 (1988), Aamectik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 (1986)）。多数の多様な異なる化学物質が、そのようなin vivoの使用のためにアンチセンスオリゴヌクレオチドを構築するために使用されてきた。各場合における目的は、ヌクレアーゼに抵抗性がありin vivoで安定性を有し、かつ、適切なRNAまたはDNAに強固かつ選択的に結合して標的配列の発現を阻害するオリゴヌクレオチドを構築することにあった。ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンス治療を行う多くのグループにより好まれる骨格のデザインは、RＮaseHにより認識されることができるDNA類似体によるRNaseHに基づく機構に依存している。結果として、全体として2'-O-メチルRNAのようなRNaseＨにより認識されない基からなるオリゴヌクレオチドには限られた興味しかなかった。
【０００３】
2'-O-メチルRNAオリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼに対する安定性に関する関心についていえば、治療的使用への関心はさらに限定的である(Shibahara et al., Nucleic Acids Res. 17: 239, 1989)。事実、ホスホジエステル2'-O-メチルがエキソヌクレアーゼ活性に対する比較的に低い抵抗性しか有さないことから、2'-O-メチル(ホスホジエステル)誘導体はヌクレアーゼによる分解にDNAよりも抵抗性を有するが、DNAも2'-O-メチルRNAも、アンチセンスの適用に十分な安定性を維持しないという結論が導かれる(De Mesmaeker et al., Acc. Chem. Res. 28: 366-374 (1995))。
【０００４】
加えて、オリゴヌクレオチドの生物学的有効性の低さから、オリゴヌクレオチドの治療的使用は一般的に限定される。オリゴヌクレオチドの経口的有効性は、消化器官における酸分解、腸における酵素的切断、腸における低い吸収性、および肝臓の第一パス効果(first pass effect)により影響を受ける(Hughes et al., Pharmaceutical Research 12: 817, 1995)。核酸は、脱プリン化及びDNA又はRNAの骨格の切断を起こす酸性条件に感受性が高い。10分間室温pH1〜2（胃の平均pH）に核酸をさらすと、脱アミノ化が起こり、それにより脱アミノ化部位で核酸の加水分解が起こる。例えば、Crookeは、齧歯類において経口的に投与されたオリゴヌクレオチドの生物学的有用性が非常に限定的(5％以下)であることを報告した(S. Crooke, in Antisense Oligonucleotides and Antisense RNA: Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, B. Weiss, Ed., CRC Press, Boca Raton, FL, p. 17, 1997)。
【０００５】
生物学的有用性の高いアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび他の修飾された核酸配列に関する必要性がある。それゆえ、in vivoにおいて酸による分解に対してより抵抗性が高いが遺伝子発現を調整できる能力を保持する核酸配列に関する必要性がある。
【０００６】
［発明の概要］
本発明は、実質的に酸に対する抵抗性および実質的にヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を示し、in vivoおよびin vitroの両方において特異的に結合する、末端がブロック（遮断）された酸に対して安定性を有する核酸、例えば、末端がブロックされた2'修飾オリゴヌクレオチドまたは3'修飾オリゴヌクレオチドを提供する。これらの低毒性と、高い特異性および酸抵抗性を有する末端がブロックされた核酸は、疾患の治療のための改良された核酸構造を表す。3'及び/又は5'酸安定性、ヌクレアーゼ抵抗性末端は、本発明の修飾された核酸が特に経口投与形態で投与されたとき、治療的使用のための改良された生物学的有用性を有することができるという独特の特性を提供する。
【０００７】
ある実施例では、本発明は、末端がブロックされた酸安定性核酸の抗細菌剤としての治療的使用を提供する。特に、本発明の末端がブロックされた核酸は、ウイルス感染、細菌感染、炎症性疾患、癌、真菌感染等を含む疾患の治療又は予防に効果的である。実質的な酸抵抗性およびヌクレアーゼ抵抗性により、その標的配列に特異的に結合する能力を維持しながら生物学的有用性を増加させることができる。これらの核酸は、少なくとも1時間37℃でpH1〜12の範囲で安定である。さらに、これらの核酸は、同時に細菌感染を治療または予防するために追加的にプロトン付加(protonate)することができる。pH7.0以上では、オリゴヌクレオチドは安定であるが、一般的には同様な抗生物質の効果を有さない。それ故、本発明の修飾された核酸組成物は、好ましくは低いpHのキャリアー組成物を用いて製剤される。
【０００８】
本発明は、さらに、動物、特にヒトを含む哺乳動物の疾患治療のための医薬組成物として受容可能な医薬キャリアーと結合した、末端が修飾され、酸に対して安定な核酸分子の使用を提供する。
【０００９】
本発明は、また、実質的に酸抵抗性と実質的にヌクレアーゼ抵抗性を付与するために、核酸を化学的に修飾する方法を提供する。これにより得られる末端がブロックされた核酸は、遺伝子発現の調整により治療可能な疾患を有するヒトを含む動物の治療に使用することができる。
【００１０】
酸に対して安定な末端により、酸性環境（例えば、pH1〜2の胃）での修飾された核酸における安定性を改良して、in vivoで生物学的有用性が増加することが、本発明の核酸の有利な点である。
【００１１】
核酸がin vivoおよびin vitroで特異的に標的配列に結合することが、本発明の核酸の他の有利な点である。
【００１２】
末端がブロックされた核酸は、修飾された核酸により治療される被検対象に対して毒性がない点が、本発明の有利な点である。本発明の修飾された核酸、例えば、2'-修飾オリゴヌクレオチド及び3'修飾オリゴヌクレオチドは、通例、通常のポリ陰イオン性オリゴヌクレオチド治療的投与により引き起こされる副作用、例えば、血清及び他のタンパク質に対する結合の増大、血清トランスアミナーゼの刺激、血小板の総数の減少等を示さないことが、本発明の他の有利な点である。
【００１３】
酸に対して安定な末端により、マクロファージや好中球のリソソーム小胞の酸性環境における修飾された核酸の安定性が改良される点が、他の有利な点である。
【００１４】
本発明の修飾により、抗細菌剤としての使用のためのオリゴヌクレオチドを含む安定なプロトン付加された核酸の調整が可能になったことが、他の有利な点である。
【００１５】
本発明の核酸は帯電したリポソームにおける封入を容易に行うことができることがさらなる有利な点である。
【００１６】
核酸およびそのような核酸の低いpH製剤を、外科的手術用具の殺菌のような様々な抗細菌剤としての適用、ローション、石鹸などのような抗細菌性製品への使用に用いることができることが本発明の目的である。
【００１７】
本発明のこれらの目的および他の目的、利点、および特徴は、下記に充分記載されている核酸およびその使用に関する詳細を読むばすぐに当業者には明らかとなるであろう。
【００１８】
［好ましい態様の詳細な説明］
本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル、細胞系、動物の種類や属、構築物、および試薬に限定されないと理解されるべきであり、それらはもちろん変更可能である。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施態様のみを記載することを目的とするものであり、上述の特許請求の範囲によってのみ規定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００１９】
本明細書及び上述の特許請求の範囲で用いられるように、単数形の「ひとつの(a)」、「および(and)」、「その(the)」は、内容が明らかにそうでないと指示する場合を除いて、複数についての言及をも含むものと理解されるべきである。即ち、例えば、「細菌」という言及は、複数の細菌の種類を含み、「オリゴヌクレオチド」は、複数のオリゴヌクレオチドおよび当業者に公知のその等価物等を含む。
【００２０】
明らかにそうでないと定義する場合を除き、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野の通常の知識を有する者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載する方法、装置および材料と類似する又は等価の方法、装置および材料はいずれも、本発明の実施および試験に使用することができるが、好ましい方法、装置、材料は明細書中に記載されている。
【００２１】
記載した全ての出版物は、現在記載された発明に関して使用される、その出版物に記載された、例えば、細胞系、構築物、および方法を記載し開示する目的で、本明細書に参照することにより組み込まれる。上記および本文を通して議論された出版物は、本発明の出願日より前の開示として、充分提供される。本発明者が先の発明によりそのような開示に先行するために権利を与えらないとする承認として構成されるものは、本明細書にはない。
【００２２】
［定義］
本明細書において交換可能に使用されているように「核酸」および「核酸分子」という語は、ヌクレオチド、即ち、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはその両方を含む分子をいう。この語は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドのモノマーおよびポリマーを含み、ポリマーの場合、リボヌクレオチドおよび/又はデオキシリボヌクレオチド5'から3'結合により相互に連結している。しかしながら、結合は、例えば5'から2'結合を含む核酸を含む、核酸合成技術において公知の任意の結合を含む。核酸分子に使用されるヌクレオチドは、天然のものであってもよく、または天然の塩基対と塩基対を形成できる合成により製造された類似体でもよい。塩基対の関係を形成できる非天然の塩基の例は、一以上の炭素およびプリン及びの窒素原子が例えば酸素、硫黄、セレン、リンなどのようなヘテロ原子により置換されている、アザピリミジンおよびジアザピリミジン類似体、アサプリンおよびジアザプリン類似体、および他のヘテロ環状塩基類似体を含むが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書で使用されているように「オリゴヌクレオチド」の語は、約1〜100ヌクレオチド、より好ましくは1〜80ヌクレオチド、さらにより好ましくは約4〜約35ヌクレオチドかを含む核酸分子をいう。
【００２４】
本明細書で使用されているように「修飾されたオリゴヌクレオチド」および「修飾された核酸分子」の語は、核酸塩基、糖部分、内部ヌクレオシドリン酸結合、さらにジアミン、コレステリル又は他の親油性の基、又はこれらの部位における修飾物の組み合わせのような追加の置換を有する分子に加え、すべてまたは任意の天然の分子構造において分子レベルにおける１以上の化学的修飾を有するオリゴヌクレオチドを含む核酸をいう。化学的修飾は、天然の核酸に対して、（１）酸に対する高い安定性、（２）ヌクレアーゼに対する高い抵抗性、（３）細胞内への高い通過能を含む特徴を付与する。ヌクレオチド内リン酸結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホルアミド、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチルエステル、アセタミデート、カルボメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミド、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート架橋ホスホロチオエートおよび/又はスルホンヌクレオチド内結合、即ち3'-3'、5'-2'、または5'-5'結合、および（混合した骨格で修飾されたオリゴヌクレオチドを生じるために）それに類似する結合の組み合わせであってもよい。修飾は、（単一又は繰り返して）内部、又はオリゴヌクレオチド分子の末端であってもよく、反対側の鎖を切るか反対側の鎖または関連する酵素又は他のタンパク質を架橋するアミノ基と末端リボースの間、デオキシリボースとリン酸修飾との間の炭素残基の数を変えるコレステリル、ジアミン化合物のような内部ヌクレオシドリン酸結合の分子への追加でもよい。リボースジアルデヒドのような電気親和性の基は、タンパク質のようなリジン残基のεアミノ基と共有結合してもよい。オリゴマーにつながれたｎエチルマレイミドのような核親和性の基は、mRNAの5'末端または他の電子親和性の部分に付着してもよい。修飾されたオリゴヌクレオチドという語は、2'-置換リボヌクレオチドまたは2'-置換デオキシリボヌクレオチドの糖部分への修飾を含むオリゴヌクレオチドをも含み、これらのうち、任意のものが5'から3'架橋により相互に連結している。修飾されたオリゴヌクレオチドは、配列の標的特異性を維持したPNAまたはモルホリンで修飾した骨格をも含んでもよい。
【００２５】
本明細書で使用されているように「核酸骨格」という語は、分子における化学的部分と結合しているヌクレオチドの構造をいう。これは、化学的に結合しているヌクレオチドの任意および全ての手段から形成される構造をも含みうる。本明細書で使用されているように修飾された骨格は、ヌクレオチド間の化学的結合に対する修飾に加えて、糖構造に対する修飾のように安定性および親和性を高めるために使用されうる他の修飾を含む。例えば、デオキシリボースの塩基のa-アノマーを使用してもよいが、塩基は天然のb-アノマーに関し転化（inverted）されている。好ましい実施例では、糖部分の2'-OHまたは3'-OHが、例えば親和性を損なうことなく分解に対する抵抗性を付与する2'-R、2'-O-R、3'-O-R、2'-O-R-ORおよび3'-O-R-O-Rに変えられていてもよい。「R」基は、ヌクレオチド分子の構造的完全性を損なわない任意の化学的部分、例えば、アルキル基又は例えばフッ素または塩素のようなハロゲン分子でよい。
【００２６】
本明細書で交換可能に使用されている「酸性化」および「プロトン付加または酸性化」の語は、プロトン（または陽性水素イオン）が核酸のプロトン受容体部位に加えられる過程をいう。プロトン受容体部位は、核酸の塩基構造におけるアミン基およびホスホジエステル結合のリン酸を含む。pHの低下に従って、プロトン付加されたこれらの受容体部位の数は減少し、その結果、より高くプロトン付加または酸性化した核酸が生じる。
【００２７】
「プロトン付加または酸性化された核酸」の語は、1mlあたり約16A260の濃度で溶解された場合、生理学的なpHより低いpH、つまりpH約7より低いpHを有する核酸をいう。修飾された核酸、ヌクレアーゼ抵抗性核酸、およびアンチセンス核酸は、すべてこの定義に含まれる。一般的に、核酸は、核酸を酸性環境下にさらすこと、例えば、有機酸又は無機酸にさらすことによってプロトンを核酸の反応部位に加えることにより、プロトン付加または酸性化される。核酸のpHを減少する他の修飾が使用されてもよく、この語によって含まれることを意図している。
【００２８】
本明細書で使用されているように「末端がブロックされた」という語は、例えばヌクレアーゼの活性による、選択された核酸の分解を阻害する分子レベルにおいて化学的修飾を有する核酸をいう。この化学的修飾は、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドのコード領域のような核酸の必須の部分を保護するように位置する。末端のブロック（遮断）は、3'末端のブロックでも5'末端のブロックでもよい。例えば、3'末端のブロックは、それが核酸の必須の配列の3'であるならば、分子の3'のほとんどの部分であってもよく、3'末端の内部でもよい。
【００２９】
「実質的にヌクレアーゼに抵抗性」という語は、天然の核酸又は修飾されていない核酸と比べてヌクレアーゼ分解に対して抵抗性を有する核酸をいう。本発明の修飾された核酸は、修飾されていない対応する核酸に比べて、少なくとも1.25倍ヌクレアーゼ分解に対して抵抗性を有し、より好ましくは2倍、さらにより好ましくは5倍、最も好ましくは10倍修飾されていない対応する核酸に比べて抵抗性を有する。そのような実質的に抵抗性を有する核酸は、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、エチルホスホトリエステル、2'-O-メチルホスホロチオエート、3'-O-メチルホスホロチオエート、2'-O-メチル-p-エトキシリボヌクレオチド、3'-O-メチル-p-エトキシリボヌクレオチド、2'-O-アルキル、3'-アルキル、2'-O-アルキル-n(O-アルキル)、3'-O-アルキル-n(O-アルキル)、2'-フルオロ、3'-フルオロ、3'-デオキシエリスロペントフラノシル、3'-デオキシエリスロペントフラノシル、2'-O-メチルリボヌクレオシド、3'-O-メチルリボヌクレオシド、メチルカルボメート、メチルカルボネート、転化された(inverted)塩基（例えば転化されたT）、またはこれらの骨格のキメラ型のような修飾された骨格を有する核酸であるが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書で使用されるように「実質的に酸に抵抗性」という語は、修飾されていない核酸と比較して、酸の分解に対して抵抗性を有する核酸をいう。典型的には、核酸の相対的な酸抵抗性は、抵抗性の核酸の分解％をその修飾されていない対応する核酸（即ち、「普通の」骨格、塩基、およびホスホジエステル結合を有する対応する核酸）の分解％と比較することによって測定される。酸抵抗性である核酸は、修飾されていない対応する核酸よりも好ましくは約1.5倍酸に対する抵抗性を有し、少なくとも2倍酸に対して抵抗性を有し、より好ましくは少なくとも5倍抵抗性を有し、最も好ましくは10倍抵抗性を有する。
【００３１】
本明細書に使用されているように「LD50」という語は、全ての処理した実験動物うち50％の致死性を生じる活性を有する物質の量をいう。これは通常は経口、非経口等のような侵襲性投与をいうが、活性物質の局所投与のようなより侵襲性の低い投与方法を用いたときの有毒性にも適用される。
【００３２】
本明細書で使用される「アルキル」の語は、メチル、エチル、プロピル、tert-ブチル、n-ヘキシルのような分岐又は分岐していない1〜6個の炭素原子を含む飽和炭化水素鎖をいう。
【００３３】
「処置」および「治療」等の語は、本明細書では、一般的に所望の薬学的および/または生理学的効果を得ることを意味するために使用される。この効果は、完全に又は部分的にその疾患や症状  を防ぐことによる予防、および/または疾患から部分的又は完全に治療することによる治療であり、および/または疾患状況となる反対の効果である。本明細書で使用されるように「治療」は、ほ乳類、特にヒトにおける疾患の任意の治療を含み、
(a)疾患に係りやすいがまた疾患と診断されていない被検対象において疾患が生じるのを妨げること
(b)疾患を抑制すること、つまり、その進行を押さえること、または
(c)疾患を軽減すること、つまり、疾患が改善および/または退行することを含む。本発明は、一般的に、in vivoで内在性の遺伝子の発現を調整する核酸配列を投与することによって患者を治療することに関する。
【００３４】
「治療的に効果のある量」によって、非毒性であるが、所望の治療効果を付与するのに十分な化合物の量、この場合では、治療されるべき状況の疾患又は症状の軽減、改善の効果がある修飾された核酸の量が意味される。
【００３５】
［本発明全般］
本発明は、修飾されていない又は天然の核酸と比較して、少なくとも一の酸抵抗性、分子のエキソヌクレアーゼ感受性を減少するようエキソヌクレアーゼ抵抗性ブロックを有するよう修飾された核酸を提供する。特に、例えば2'-R、2'-O-R、または2'-O-R-O-Rのような糖部分の2'におけるH+を置換する化学的部分の追加は、分子の酸に対する安定性を高め、酸に対する感受性部分を酸安定性の構築物に変換する。図1〜5を参照。本発明の末端がブロックされた修飾モノマーの例は、図６に示されている。好ましくは、エキソヌクレアーゼ抵抗性ブロックは、オリゴヌクレオチドの3'又は好ましくは、3'末端及び5'末端の両方に加えられる。図7〜8を参照。分子の3'末端は、任意追加的に、2'または3'位置のいずれかの派生的な分子、および他方の位置の末端ブロック（例えば、ブチル又はブタノール）の両方を有する。例えば、3'-OR基と、分子の3'末端の2'-ORブロッキング基と、分子の5'末端のブチルブロッキング基を有する図8を参照。
【００３６】
結果として生じる本発明の末端がブロックされた核酸は、非毒性であり、酸抵抗性であり、エキソヌクレアーゼ抵抗性であり、エンドヌクレアーゼ抵抗性であり、そのRNA又はDNA標的に強固に結合する。それらは、様々なin vivoシステムにおいて優れたアンチセンス剤を提供し、良好な治療活性を有する。加えて、それらの分子は、プロトン付加されたとき安定であり、下記に述べる安定にプロトン付加されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの特性を有する。
【００３７】
本発明の核酸が本明細書に記載されるように修飾され、酸安定性を付与するとき、修飾は、以下に示すいくつかの望ましい性質を与える。
【００３８】
1.本発明のオリゴヌクレオチドは、胃腸やマクロファージや好中球で見られるリソソーム小胞で環境に安定である。
【００３９】
2.本発明のオリゴヌクレオチドは、pH1〜2にさらしても安定であり、そのオリゴヌクレオチドはプロトン付加される。
【００４０】
3.本発明のプロトン付加されたオリゴヌクレオチドは、以下を含むいくつかの独特の特性を有する。プロトン付加したオリゴヌクレオチドは優れた抗細菌剤であり、プロトン付加したオリゴヌクレオチドは、細胞によりよりよく取り込まれ、プロトン付加したオリゴヌクレオチドは容易に陰イオン性リポソームに封入され、プロトン付加したオリゴヌクレオチドは、ポリ陰イオン性オリゴヌクレオチドでin vivoではしばしば見られる有毒な効果、即ち、血液凝固遅延、血小板の数の減少、血清補体の活性化、血清トランスアミナーゼの増加等の引き金にはならない。特徴1〜3を生じる核酸の様々な修飾は（この記載を見ればすぐに当業者に予期できる）、本発明により含まれることを意図する。
【００４１】
本発明は、0.01〜7.0のpHに対する抵抗性を有するよう修飾され、その分子が胃腸のような酸性環境でその構造的完全性を保持できる核酸を含む。好ましい実施態様では、本発明の核酸は、37℃で0〜1より低いpHの溶液中でも重要な酸に対する耐性を示す2'-R、2'-O-R、3'-O-R、2'-O-R、2'-O-R-O-Rおよび3'-O-R-O-Rオリゴヌクレオチドである。5'、または3'と5'の酸安定性、エキソヌクレアーゼ抵抗性の導入に関連するこの第一の構成要素の酸安定性は、そのようなオリゴヌクレオチドにおいていくつかの独特の特性を与える。これらの低毒性、高い特異性、酸安定性、末端されたブロックされた2'-R、2'-O-R、3'-O-R、2'-O-R-O-Rおよび3'-O-R-O-Rオリゴヌクレオチドは、疾患の治療のための新規かつ改良されたオリゴヌクレオチド構造を表す。
【００４２】
典型的には、核酸の相対的なヌクレアーゼ耐性は、修飾核酸の消化率と、対応する非修飾核酸(「通常の」骨格、塩基、ホスホジエステル結合を有する対応する核酸)の消化率とを比較することによって測定できる。また分解率は、分析用HPLCを用いて核酸の完全な長さの損失を測定するか、他の適切な方法（染色法、オートラジオグラフィー法、蛍光分析法などを用いて核酸配列を視覚化したり、光学密度の変化を測定する） によって測定できる。分解率は通常、時間の関数として測定される。
【００４３】
非修飾核酸と修飾核酸の比較は、変化していない修飾核酸の量をやはり変化していない非修飾核酸の量に対して割合を計算して行なうことができる。たとえば、核酸をヌクレアーゼに15分間さらした後、非修飾核酸の25%が変化せず(75%が分解)、修飾核酸の50%が変化しなかった（50%が分解）場合、修飾核酸は非修飾核酸に比べて２倍(50%を25%で割った)のヌクレアーゼ分解耐性を有する。一般にヌクレアーゼ抵抗性が十分に高いとは、15分間ヌクレアーゼにさらした後、修飾核酸が対応する配列を有する非修飾核酸の約1.25倍のヌクレアーゼ耐性を有することを示し、少なくとも約1.5倍、好ましくは約1.75倍、さらに好ましくは、約10倍の耐性を有する。
【００４４】
核酸の酸分解率は、分析HPLCまたはHPCEを用いて測定するが、他の適切な方法(例えば、染色法、オートラジオグラフィー法、蛍光分析法などを用いて核酸配列を視覚化したり光学密度の変化を測定する) によって測定できる。分解率は通常、時間の関数として測定される。
【００４５】
非修飾核酸と修飾核酸の比較は、変化していない修飾核酸の量を変化していない非修飾核酸の量に対して割合を計算して行なうことができる。たとえば、核酸を低いpH環境に30分間さらした後、非修飾核酸の25%が変化せず(75%が分解)、修飾核酸の50%が変化しなかった（50%が分解）場合、修飾核酸は非修飾核酸に比べて２倍(50%を25%で割った)の酸分解耐性を有する。典型的には、酸耐性が十分に高いとは、37℃で30分間ｐH1.5〜4.5の酸にさらした後、修飾核酸が対応する配列を有する非修飾核酸の約1.25倍の酸耐性を有することを示し、少なくとも約1.5倍、好ましくは約1.75倍、さらに好ましくは5倍、さらに好ましくは約10倍の耐性を有する。
【００４６】
核酸の酸性化は、プロトン（又は陽性水素イオン）が核酸の反応部位に加えられる過程である。プロトン付加された反応部位の数が増えるほど、pHは減少し、核酸の細菌抑制活性は増加する。従って、本発明の核酸は、水に溶かされたとき、pH7からpH約1以下、又は好ましい実施態様では、pH6〜pH1、又はpH約5〜pH1より低いpHを与えるようプロトン付加または酸性化される。他の実施態様では、溶解された核酸は、pH4.5〜約1又はより好ましい実施態様では、pH3.0から約1またはさらに他のより好ましい実施態様ではpH2.0〜約1のpHを与える。
【００４７】
好ましい実施態様では、組成物の末端がブロックされた核酸は、さらに酸性化またはプロトン付加され、本発明の方法は、実質的にヌクレアーゼ抵抗性であり、実質的に酸抵抗性であり、好ましくは実質的にヌクレアーゼおよび酸の両方に抵抗性である。この実施態様は、1以上の結合により2'-ハロゲン、2'-O-メチル、2'-O-アルキル、2'-O-アルキル-n(O-アルキル)、3'-ハロゲン ,3'-O-アルキル-n(O-アルキル)、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、ホスホルアミデート結合、シロキサン結合、カルボネート結合、カルボキシメチルエステル結合、アセタミデート結合、カルバメート結合、チオエーテル結合、架橋ホスホラミデート結合、架橋メチレンリン酸結合、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホロジチオエート結合、モルホリン、架橋ホスホロチオエート架橋、スルホンヌクレオチド内結合、3'-3'結合、5'-2'結合、5'-5'結合、2'-デオキシエリスロペントフラノシル、2'-フルオロ、2'-O-アルキルヌクレオチド、2'-O-アルキル-n(O-アルキル)ホスホジエステル、モルホリノ結合、p-エトキシオリゴヌクレオチド、PNA結合、p-イソプロピルオリゴヌクレオチド、又はホスホラミデート、スルフィド結合、スルホキシド結合、スルホメート結合、スルファミド結合、フォルマセタル/ケタル結合、チオフォルマセタル結合、キラル亜リン酸結合、アミノアルキルホスホロチオアミデート結合、及び４つの残基結合、及び他の骨格修飾に完全に又は部分的に由来する核酸を含む。
【００４８】
この実施態様は、核酸を実質的に内在性ヌクレアーゼ活性に対して抵抗性にする他の修飾をも含む。核酸を抵抗性にする方法は、核酸を含むプリン又はピリミジン塩基を修飾することを含むが、それらに限定されない。例えば、塩基は、修飾塩基を含む核酸が実施的にヌクレアーゼに抵抗性を有するようメチル化されても、ヒロドキシメチル化されても、または他に置換されても（例えば、グリコシル化）よい。
【００４９】
好ましい実施態様では、核酸は、酸分解、エキソヌクレアーゼ分解、エンドヌクレアーゼ分解に実質的に抵抗性を有する骨格を有する。最も好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドは、2'-O-アルキル、2'-O-アルキル-n(O-アルキル)、3'-O-アルキル、または3'-O-アルキル-n-(O-アルキル)基でむらなく修飾される、すなわち、オリゴヌクレオチドの各塩基はO-アルキル又はO-アルキル-n(O-アルキル)修飾塩基である。
【００５０】
本発明の末端がブロックされた核酸は、好ましくは、上記に記載した核酸の調整に関して標的細胞に結合して入る能力が高められている。核酸および特にオリゴヌクレオチドは、一般的に、（細胞内の核酸配列を標的としたとき）細胞の遺伝子発現のアンチセンス又はアンチ遺伝子阻害剤として働くことで、または（細胞内のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を含む標的アミノ酸配列に関する場合）特異的な細胞タンパク質又はポリペプチドの機能を変えるよう働くことで生理学的応答を調整する。一方、本発明の核酸は、細菌の抗生物質耐性遺伝子を標的とする場合、細菌を普通の抗生物質に感受性にする。
【００５１】
他の実施態様では、本発明の核酸は、診断の目的で使用される。例えば、本発明の核酸は、本発明の核酸がサンプル中に存在する任意の相補的核酸配列とハイブリダイゼーションできる条件下で、本発明の核酸とサンプルの核酸を接触させることによって、相補的核酸を検出するためのプローブとして使用することができる。
【００５２】
ヌクレアーゼ抵抗性の骨格の並んだ核酸が評価された。結果として、本発明の好ましい実施態様は、5'-ブタノール-2'-O-アルキルRNA-ブタノール-3'または2'-O-アルキル-O-アルキルの化学的骨格構造を有する末端がブロックされた核酸である。本発明の特に好ましい実施態様は、水に溶解されたときpH3〜1である、5'-ブチル-2'-O-メチルRNA-ブタノール-3'、5'-ブチル-2'-O-アルキル-O-アルキルRNA-ブタノール-3'または2'-O-アルキル-O-アルキルRNAの化学的骨格構造を有するプロトン付加した/酸性化した核酸である。
【００５３】
核酸合成
核酸は、1μM以上から1mM以下のスケールで、標準のホスホラミジド化学と例えばStec et al., J. Am. Chem. Soc. 106: 6077-6089 (1984), Stoc et al., J. Org. Chem. 50(20): 3908-3913 (1985), Stec et al., J. Chromatog. 326: 263-280 (1985), LaPlanche et al., Nuc. Acad. Res. 14 (22): 9081-9093 (1986) およびFasman, Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 1989, CRC Press, Eoca Raton, FLのような公知技術を用いて、市販に購入されたDNA合成機で合成することができる。これらの文献は参照することにより本明細書に組み込まれるものとする。
【００５４】
核酸は、ホスホラミジド製造プロコトコルに従って、脱保護することができる。生成委されていないオリゴヌクレオチドは、真空下で乾燥するか、沈殿させた後乾燥される。オリゴヌクレオチドのナトリウム塩は、市販され入手可能なDNA-Mate(BarkosiganInc.)試薬または、例えばDowexといった市販され入手可能な交換樹脂のような普通の技術を用いて、またはナトリウム塩を添加した後、沈殿、濾過、またはゲル濾過等により調整することができる。
【００５５】
精製される核酸は、例えばWaters Protein Pak, PharmaciaのSourceQ等の市販され入手可能な逆相またはイオン交換クロマトグラフィーにかけられる。ピークの分画はまとめられ、サンプルは脱塩され、HamiltonのPRPまたはPolymer Labs PLRPのようなポリ（スチレン-ジビニルベンゼン）を基礎にするカラムによる逆相クロマトグラフィーにより濃縮される。
【００５６】
または、エタノール沈殿、濾過、またはゲル濾過を用いてもよく、続いて凍結乾燥またはSavantのSpeed Vacのような市販され入手可能な道具を用いて真空下において溶液を蒸発させる。任意選択的に、少量の核酸をポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により精製してもよい。
【００５７】
核酸の凍結乾燥又は乾燥された沈殿物は、発熱物質の含まれない無菌の生理食塩水（即ち0.85％食塩水）、無菌のSigma waterに溶解され、0.45ミクロンのGelmanフィルター（又は0.2ミクロンの発熱物質の含まれないフィルター）により濾過される。記載された核酸は、以下のきわめて多様な化学基または結合により部分的又は充分に置換されている。化学基または結合は、ホスホラミデート、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、2'-O-メチル、2'-修飾RNA、モルホリノ基、リン酸エステル、プロピン基、または上記の基または他の結合（またはそれらの類似体）の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
様々な標準的方法が、記載されている核酸を精製するのに使用される。手短に言えば、本発明の核酸は、市販され入手可能な逆相カラム（例えば、RAININ Instrument Co., Inc. instruction manual for the DYNAMAXR-300A, Pure-DNA逆相カラム, 1989またはその最新版を参照、この文献は参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）またはWaterのProteinPak又はPharmaciaのSourceQによりクロマトグラフィーによって精製することができる（一般的に、Warren and Valla, 1994, Methods in Molecular Biology, vol. 26;の"Analysis and Purification of Synthetic Nucleic Acid by High- Performance Liquid Chromatography"; Protocols for Nucleic Acid Conjugates, S. Agawal, Ed., Humana Press, Inc., Totowa, NJ; Aharon et al., 1993, J. Chrom. 698: 293-391; Milipore Technical Bulletin, 1992, Antisense DNA: Synthesis, Purification , and Analysisを参照）。ピーク分画は集められ、サンプルは濃縮され、アルコール（エタノール、ブタノール、イソプロパノール、およびそれらのアイソマーや混合物等）により脱塩され、沈殿され、逆相クロマトグラフィーにかけられるか又は濾過されるかゲル濾過される。
【００５９】
核酸は、とりわけ所望の核酸製造の間に製造された不完全な核酸生成物が実質的に含まれないように単離されたとき純粋であると考えられる。好ましくは、純粋な核酸は、オリゴヌクレオチドの抗細菌活性および/またはアンチセンス活性を阻害したり、さもなければマスクする汚染物をも実質的に含まない。精製されたヌクレオチドは、開示された方法の一つによりまたは当業者に公知の任意の方法により酸性化された後は、とりわけ余分のプロトン付加剤または酸性化剤を実質的に含まないよう単離されたプロトン付加または酸性化された核酸である。一般的に、核酸が、標的細胞に結合するかまたは標的細胞に入って目的の生理学的活性を調節する場合、核酸の有用性を下げる汚染物質を実質的に含まないと考えるべきである。
【００６０】
特定の実施態様では、本発明の核酸は、一部または全部が置換されたホスホロチオエート、ホスホネート、リン酸エステル、ホスホアミデート、2'-修飾RNA、3'-修飾RNA、ペプチド核酸、プロピン又はそれらの類似体のうち一以上を含む。
【００６１】
酸およびヌクレアーゼ抵抗性核酸
多くの核酸骨格が、低いpH（例えばpH1〜3）で安定ではなく、脱アミノ化を受けるが、骨格の数は、比較的pH4〜5で安定である。2'-O-アルキル、3'-O-アルキル、および2'-O-アルキル-n(O-アルキル)核酸が所望のpH2〜1で安定であることが発見されている。
【００６２】
一つの実施態様では、本発明は実質的にヌクレアーゼに抵抗性を有する核酸を含む。これは、ホスホロチオエート結合、2'-O-アルキル、2'-O-アルキル-n(O-アルキル)、2'-フルオロ、2'-デオキシエリスロペントフラノシル、p-エトキシ核酸、p-イソプロピル核酸、ホスホラミデート、キメラ結合、および他の骨格修飾に加え、核酸を実質的に内在するヌクレアーゼ活性に対して抵抗性にする他の修飾により完全に由来する核酸を含む。核酸をヌクレアーゼ抵抗性にする追加の方法は、核酸を含むプリンまたはピリミジン塩基の修飾を含むがこれらに限定されない。例えば塩基は、修飾塩基を含む核酸が実質的にヌクレアーゼ耐性をとなるよう、メチル化、ヒロドキシメチル化、またはその他の置換（例えば、グリコシル化）することができる。
【００６３】
2'-O-アルキル置換核酸は著しい酸安定性を示し、エンドヌクレアーゼ抵抗性を有するが、 3' エキソヌクレアーゼには反応しやすい。そこで、2'-O-アルキル置換核酸のエキソヌクレアーゼ抵抗性を強化するために、RNA配列の3'末端および/または5'末端に好ましくはエキソヌクレアーゼをブロックする機能を付着させる。たとえば、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチドをオリゴリボヌクレオチドのいずれかの末端に配置させる。加えて、１つ以上の塩基をオリゴリボヌクレオチドのいずれかの末端に配置させたり、例えばブタノール置換ヌクレオチドまたは化学基の様な一以上のアルキルをオリゴリボヌクレオチドの一以上のアルキルの末端に配置させることもできる。したがって、本発明の好ましい実施例として、以下の構造を有するプロトン付加または酸性化された核酸を含む。
【００６４】
A-B-C
【００６５】
「B」は、長さが約１〜約98塩基の2'-O-アルキル または 2'-O-アルキル-n (O-アルキル) オリゴリボヌクレオチドで、「A」および「C」は各5'末端、3'末端をブロックする基（例えば、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド（通常は6以下））、転化した(inverted)塩基結合、アルキル、アルケニル、アルキニル基、置換ヌクレオチドまたは2'-O-アルキル-n (O-アルキル)を示す。末端をブロックした化合物には転化した塩基結合、ジデオキシヌクレオチド、メチルホスフェート、アルキル基、アリール基、コルジセピン、シトシンアラビノシド、2'-メトキシ、エトキシヌクレオチド、ホスホラアミド、ペプチド結合、ジニトロフェニル基、ホスホロアミデート結合を有する2'-または 3'-O-メチル塩基、3'-O-メチル塩基、フルオレセイン、コレステロール、ビオチン、アクリジン、ローダミン、ソラレン、グリセリル、メチルホスホネート、ブチル、ブタノール、ヘキサノール、3'-O-アルキル基を含む。酵素抵抗性ブタノールブロッキング基は、C4スペーサーとも呼ばれるHO-CH2-CH2-CH2-CH2 (4-ヒドロキシブチル)構造を有するものが好ましく、ブチルブロッキング基のCH2-CH2-CH2-CH2.であればさらに好ましい。
【００６６】
本発明の核酸に使用されるもうひとつの化学修飾させたホスホジエステル類似体は、p-エトキシ核酸である。p-エトキシ核酸の化学的修飾は、これらのオリゴ糖が標的mRNAと結合するのを妨げないように、リン塩酸主鎖の非結合酸素原子へエチル基を付加してp-エトキシオリゴを合成する。
【００６７】
本発明における核酸の化学的修飾は、核酸に酸安定性およびヌクレアーゼ抵抗性を与える１つ以上のポリヌクレオチド結合の化学的組成の公知の変化を含むことができる。これらの修飾は、米国特許No. 5,863,536、No.5,837,835、No.5,726,297、No.5,684,143、No.5,631,135、No.5,599,922およびWO99/10541に記載されたようなホスホラアミデート結合、米国特許No.5,652,355に記載されたようなホスホロチオエート結合、米国特許No. 5,216,141に記載されたようなスルホキシド、スルホン結合群などの硫黄結合、米国特許No. 5,470,967に記載されたようなスルファメートまたはスルファミド結合、米国特許No. 5,264,562、No. 5,264,564に記載されたようなホルマアセタール/ケタル結合、米国特許No. 5,495,009に記載されたようなチオホルマアセタール結合、米国特許No.5,852,188に記載されたようなキラルホスホラス結合、米国特許No. 5,563,253、No. 5,536,821に記載さたようなアミノアルキルホスホロチオアミデート、米国特許No.5,750,669に記載されたような3'-3' または 5'-5'末端ヌクレオチド間結合、米国特許No.5,610,289、No.5,602,240、No.5,541,307、No.5,386,023、No.5,378,825に記載されたようなその他の糖間４残差結合基の単独又はその組み合わせを含んでもよい。これらの各特許は、本発明の酸安定性の末端がブロックされた核酸において任意選択的に見いだされる例示的な結合を記載するために、引用することにより本明細書に組み込まれる。本発明の核酸は、キメラ化ホスホラミド/ホスホジエステル分子など、これらの化学的修飾のいかなる組み合わせでも可能である。
【００６８】
プロトン付加または酸性化された核酸
合成および精製段階の間または後に、精製された核酸、部分的に精製された核酸、または精製されていない核酸を低いpHまたは酸性環境に置くと、プロトン付加または酸性化された先に示した末端がブロックされた核酸が生成されることがある。精製された核酸または未精製核酸は、ホスホリック酸、ニトリック酸、ヒドロクロリック酸を含むがこれに限定されない酸によりプロトン付加/酸化することが可能である。例えば、酸は溶液中で核酸と結合するか、又は核酸は酸性溶液に溶解する。過剰な酸は、クロマトグラフィー分析法または場合によっては乾燥除去することも可能である。
【００６９】
当業者に公知であるプロトン付加された核酸を生成するその他の手順も本発明の範囲と考えられる。本発明の核酸が一度プロトン付加されると、それらは他の望ましくない構成物、例えば、過剰な酸などとは分離される。当該技術に周知する当業者は、オリゴヌクレオチドを望ましくない物質から分離するための方法を数多く知っている。例えば、オリゴヌクレオチド溶液を、プロトン付加後にクロマトグラフィー分析法で分析する。好ましい実施例では、オリゴヌクレオチド溶液を、ポリスチレンジビニルベンゼン樹脂カラム（例えばHamiltonのPPP、あるいはPolymer LabのPLRP）へかける。
【００７０】
プロトン付加または酸性化された核酸は、直接使用することが可能であり、好ましい実施例では、沈殿、逆相のクロマトグラフィー、濾過、あるいはゲル濾過によって過剰な酸および塩を取り除いて精製する。プロトン付加または酸性化されたオリゴを、沈殿、凍結乾燥、溶媒の蒸発などによって濃縮することができる。本発明の手法で酸化された核酸製剤を、水や食塩水中で懸濁させると、典型的には、1) 酸性化の過程において使用された酸の量によって決まるプロトン付加/酸化のレベル、2) 核酸の濃度、に応じて ｐH1 〜4.5 までのpHを示す。また、水素イオンにより荷電された陽イオン交換カラムを用いてプロトン付加することもできる。
【００７１】
本発明のオリゴヌクレオチドの使用
本発明のオリゴヌクレオチドは様々な用途に有効である。例えば、これらのオリゴヌクレオチドは、生理学的プロセスを調節するのに有用である。オリゴヌクレオチドは、2重あるいは3重の化合物の生成に関わることが可能である。さらにそのような2重あるいは3重の化合物の形成に関わるオリゴヌクレオチドは特異性を有するので、例えばタンパク質、脂質、あるいは糖などの異なる化学物質の分子間化合物の形成よりも、より予想が容易である。
【００７２】
本発明のオリゴヌクレオチド間の2重あるいは3重構造の形成は、標的核酸の機能を阻害する可能性がある。そのような標的核酸としては、例えば、RNA あるいは DNA などがある。生理学的プロセスを調節する標的RNA および DNA には、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、ウイルスDNA、細菌DNA、mRNA、ヘテロ核RNA（「hnRNA」） などを含む。 あるいは、例として本発明の オリゴヌクレオチドは、タンパク質がその活動を行うために必要とする核酸に結合することが可能であり、タンパク質およびタンパク質と核酸の化合物の活動を調節することも可能である。
【００７３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、核酸との相互作用の能力に加えてタンパク質の活動を調節する有効な薬剤である。そのような調節は、例えば、アプタマーとして機能するオリゴヌクレオチドなど目的のタンパク質と相互作用するオリゴヌクレオチドを設計すると達成できる。当該技術に周知である当業者ならば、目的のタンパク質と相互作用するオリゴヌクレオチドを同定するスクリーニングプロトコルを認知しているであろう。例えば、1つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドの様々な異なる配列を含むライブラリーを作成することができる。 そして、そのライブラリーを目的のタンパク質に曝して、ライブラリーからのどのオリゴヌクレオチドと目的のタンパク質が相互作用するかを同定する。そのような暴露は、オリゴヌクレオチド と目的タンパク質の両方を溶液に浸出させるなどで実施できる。溶液から目的のタンパク質を抗体により抽出し、タンパク質と結合しているオリゴヌクレオチド類を、結合していないものから分離することができる。結合しているオリゴヌクレオチド配列は、通常の実験で簡単に特定できる。例えば、あるプロトコルでは、既知の配列の一部を、目的タンパク質と結合できるかどうか試験するため、オリゴヌクレオチドの両側に付着させることが可能である。そしてタンパク質-核酸化合物複合体の結合および抽出後に、PCRなど当該技術に周知する当業者に知られる様々な方法で、目的タンパク質と結合するオリゴヌクレオチドを増幅することもできる。
【００７４】
目的のタンパク質と相互作用するオリゴヌクレオチドを同定するもう１つの方法を容易に工夫することが可能である。例えば、目的のタンパク質か、オリゴヌクレオチド類のライブラリーのいずれかを、ビーズ、フィルターあるいはマイクロアレイのような固体の担体に結合させることも可能である。結合可能なタンパク質やオリゴヌクレオチド を、結合できないオリゴヌクレオチドやタンパク質へ暴露し、様々な手法で、所定のオリゴヌクレオチドを同定できる。例えば、結合できない化合物を標識化し、結合できる化合物をスクリーニングすることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドがフィルターと結合し、標識されたタンパク質をスクリーニングする場合、標識化されたタンパク質が結合するフィルター上の位置は、フィルターをフィルムに暴露させて同定することができる。このようなスクリーニング技術は、当該技術に周知する当業者が認知する多くのスクリーニングプロトコルに従って変更することができる。
【００７５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、治療的な用途に使用する以外にも、例えば美容的および診断的な用途にも有効である。本発明のオリゴヌクレオチドの、美容的用途には皮膚の視覚的アピールを高める局所的塗布が含まれる。例えば、オリゴヌクレオチドは皮膚の日焼け促進に有効であることが確認されている。Gilchrest et al., PCT出願WO 95/01773 を参照。この文献は参照することによって本明細書に組み込まれるものとする。加えて、現在は目立たないが将来何らかの形で目立つ可能性のある好ましくない皮膚上の痕跡または傷の皮膚上へ発生した場合も、本発明のオリゴヌクレオチドを使用して治療することができる。加えて、本発明のオリゴヌクレオチドは診断的用途にも適用できる。当該技術に周知する当業者は、例えばサンプル中の細菌核酸またはウイルス核酸などの検出にオリゴヌクレオチドを使用する多数の診断技術を認知するであろう。また、本発明のオリゴヌクレオチドはヌクレオチドミクロアレイのプローブとしても使用することができる。
【００７６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、抗ウイルス剤および抗細菌剤としても有効である。例えば、細菌またはウイルスの増殖や生存に重要な核酸またはタンパク質と相互作用するオリゴヌクレオチドをデザインすることが可能である。デザインしたオリゴヌクレオチドを、例えば、標的核酸又は標的タンパク質を増殖や生存に要求する細菌やウイルスによる感染症の治療に使用することができる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列に特異的でない抗菌効果を有するため、抗細菌剤として標的化されていないオリゴヌクレオチドを使用することができる
【００７７】
オリゴヌクレオチド類の標的の選択
本発明のオリゴヌクレオチドは、生体組織およおび細胞中の様々な分子を標的とすることができる。例えば、蛋白質をコードするｍRNA分子を標的物質とすることができる。その蛋白質が原因で疾患が発生した場合、その蛋白質のｍRNAを標的とするように設計した核酸は、その疾患の原因である蛋白質のレベルを下げるように指示するため、そのｍRNAの転写を抑制することにより、その疾患の症状を緩和できる。
【００７８】
多数のオリゴヌクレオチドは、転写開始位置またはその近くの領域に対する相補性を有して設計できる。ただし、ｍRNAまたはhnRNAの他の領域を標的とすることもできる。ある実施例では、転写されていないｍRNAの3 ′領域を標的とすることができる。もう１つの実施例では、オリゴヌクレオチドは、hnRNAのスプライシングドナーまたは受容体部位に対して相補的に働くことができる。当該技術に周知な当業者は、所定の標的に対してどのアンチセンス配列が有効であるかを認知することができるであろう。
【００７９】
本発明のオリゴヌクレオチドのもう１つの実施例は、代謝プロセスの調節である。例えば酵素など特定の蛋白質因子の活性は、適切なｍRNAの転写を低く調節することにより制御できる。この方法で調節可能な生体組織および細胞中のプロセスは本質的に無限である。本発明のオリゴヌクレオチドは、適切な標的が判明している場合、前述のどのような調節にも容易に適用することができる。
【００８０】
オリゴヌクレオチドのインビボ試験
本発明の１つ以上のオリゴヌクレオチドを疾患の治療的用途処置で使用する場合、適切な用量を複数の既知の手法で決定することができる。例えば、体重1kg当りの生物活性な最高許容用量（MTD）を、動物実験で決定することができる。一般に、試験する動物の少なくとも１種を哺乳動物とする。当該技術に周知する者は、ヒトを含む他の種の動物に対して有効量および避けるべき毒性量を容易に認知できるであろう。
加えて治療的用量は、感染症の重症度、またホストの種類やサイズなどの要素により変更可能である。本発明のオリゴヌクレオチドのLD50は、マウスの場合、４00 mg/Kg重以上であることが確認されている。本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい用量は、投与方法に依存するが、当該技術に周知する者は、本開示文書を読めば容易に認知することができるであろう。経口投与または塗布添付における用量の範囲の実施例は、10 μgから400 mg /日、好ましくは1 mgから200 mg/日である。
【００８１】
本発明に示されるオリゴヌクレオチドの治療的な用途を検討する場合、オリゴヌクレオチドを、経口、鼻腔内、直腸内、塗布、腹腔内、筋肉内、皮下、頭蓋内、皮下、経皮、気管内などの経路で投与し、好ましくは薬学上認められてる担体を用いて投与することが望ましい。
【００８２】
例えば、局所的疾患は局所添付の外用薬として設計された処方剤形で治療または予防することが好ましい。また、標的とする疾患が消化管中にある場合には、オリゴヌクレオチドを経口投与で製剤することができる。加えて、喘息などの肺部の疾患へは、非経口法で適切な剤形のオリゴヌクレオチドを吸入法によって肺へ直接的に投与し治療することができる。
【００８３】
適切に処方されたオリゴヌクレオチドを非経口で投与した場合、オリゴヌクレオチドは、腎臓、肝臓、脾臓、リンパ腺、副腎腺、大動脈、膵臓、骨髄、心臓および唾液腺において比較的高レベルで蓄積される可能性がある。また、オリゴヌクレオチドは、少量であるが、骨格筋、膀胱、胃、食道、十二指腸、脂肪、および気管に蓄積する傾向がある。さらに少量の濃度が、大脳皮質、脳幹、小脳、脊髄、軟骨、皮膚、甲状腺、および前立腺に一般に蓄積する可能性がある。（Crooke著、「Antisense Research and Applications」、1993年CRC Press出版、フロリダ州ボカ・ラトンを全般的に参照。）
【００８４】
医師および患者の見地からおよび一般の者にとっても好ましくない症状を有意に緩和または予防することが可能であることを認知するであろう。したがって、本文献で使用する「治療」、「治療的使用」、「医学的使用」という用語は、疾患状態または症状を治療する、又は如何なる形であれ疾患またはその他の望ましくない症状の進行を予防、抑制、遅延または改善させる本発明の請求項目に示されるオリゴヌクレオチドの任意および全ての方法を含むものとする。
【００８５】
好ましくは、動物をホストとする場合には、その特定の動物に対して適切なシーケンスを有する本発明のオリゴヌクレオチドを使用して適切な治療を行うことが可能である。標的種には、無脊椎動物、脊椎動物、鳥類、豚、山羊、羊、牛、犬、猫、特にヒトを含む哺乳類が含まれるが、それらに限られるものではない。
【００８６】
薬製剤及び投与
生体内使用が予期される場では、本発明のオリゴヌクレオチドはさまざまな生理担体分子を用いた定式化が可能である。例えばこのオリゴヌクレオチドは、脂質、陽イオン脂質、陰イオン脂質（プロトン付加又は酸性化オリゴヌクレオチドが望ましい）が結合したものといえるが、結果としてオリゴヌクレオチド及び脂質乳剤又はリポソーム懸濁（浮遊物）は、とりわけ生体内でのオリゴヌクレオチド半減期に効果的な増加が見られる。
【００８７】
本発明のオリゴヌクレオチドにプロトンを加えたり酸性化することにより、陽イオンリポゾーム（１９９７年、14(2):173206セラピューティック・ドラッグ・キャリアー・システムズ（治療薬担体組織）内クリティカル・レビューにおける、R.J.リー、L.フヮン共著「遺伝子組替えの脂質ベクトル体系」）に対し有利な点が多々あると見なされている陰イオン脂質カプセル包入が容易になる。とりわけ、陰イオンリポゾームは陽イオンリポゾームに比べ毒性が少ないとみられ、特異性がない生体摂取度もより低く、さらに陰イオンリポゾームは特定の細胞に対しての適正配位子に目標が定まることが可能である。
【００８８】
プロトン付加又は酸性化オリゴヌクレオチド使用に見合う陰イオン脂質の例に挙げられるのは、心臓脂質（カーディオリピン）、ジミリストイル、ジパルミトイル、又はジオレオイルホスファチジルコリン、又はホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン又はホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、リゾホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、コレストロール陰イオン形などだが、これだけに限らない。
【００８９】
陽イオン、陰イオン及び／あるいは中性脂質合成物またはリポゾームは、通常、国際公開WO90/14074号、WO91/16024号、WO91/17424号、更に米国特許第4897355号に記載されている。以下参照のこと。
【００９０】
核酸を脂質関連構成物に調合させることで、核酸は適正目標剤（例えば、特定の抗体またはレセプター）の核酸／脂質合成物結合により特定の細胞のタイプに目標が定まることが可能になる。
【００９１】
薬理担体との完全混合における本発明の核酸を含む薬理製剤は、従来の薬理合成技術に従って比較されうる。担体は、例えば静脈、口腔、局所、噴霧（局所あるいは吸入療法）、座剤、非経口あるいは脊髄の注射といった投与に望まれる製剤の形態により広範囲の形態をとっている。
【００９２】
口腔投薬形態における薬剤結合調合では、いかなる通常薬理媒体にも使用が可能である。例にあげると、水、グリコール、油、アルコール、調味剤、防腐剤、着色剤及び口腔液剤の場合に使われる物（例えば、懸濁液、エリキシル、溶剤）あるいは澱粉、砂糖、希釈液、顆粒剤、潤滑剤、つなぎ剤、分解物質及び口腔固形剤の場合使われるもの（例えば、粉、カプセル、錠剤）などである。錠剤及びカプセルは、投与が容易なため最も有利な口腔投与形態である。その場合、固体薬理担体が使われるのは明白である。希望により錠剤は標準技術による砂糖コーティングあるいは腸溶コーティングが可能である。
【００９３】
注射による非経口用投与には、水に解けるか又は可溶性の水溶解、更に薬理的に認められる形態で適正な塩溶解状態での核酸が含まれる。注射可能懸濁液の使用にも、適正な液体担体、懸濁剤、等浸透圧適合剤、防腐剤およびその類いが使われる。非経口投与が可能な製剤及び患者への投与に必要な調整をする実用法がこれで知られることになり、医学に熟達した者にとっては明白なことになる。例えば、ペンシルバニア州イーストンのマック出版社発行レミントン薬理科学１５版に詳細が記されているが、これは以下参照のこと。目下示された核酸は、核酸用に確立された最大許容容量（ＭＴＤ）以下の濃縮物で非経口投与がなされるべきである。
【００９４】
局所投与用では、担体（保菌者）がクリーム、化粧剤、ジェル、ローション、軟膏あるいは液体などの製剤によってかわる広範囲の形態をとることが可能である。局所担体の具体例としてはメチルセルロースが挙げられる。
【００９５】
アルコールは、エチルアルコールのような推進体中又は推進溶解状態中の核酸が液化懸濁化することにより調合される。局所用又は噴霧形態の薬理合成物には通常（核酸の）重量約0.01%から重量約40%まで、好ましくは重量約0.02%から重量約10%、そしてさらに好ましいのが重量約0.05％から重量5%を含むものになるが、それは使用される特定形態による。
【００９６】
座剤の調合は、核酸とテオブロミンオイル、カカオバター、グリセリン、ゼラチン又はポリオキエチレングリコールといった脂質媒体との混合によってなされる。
【００９７】
今示された酸安定と末端ブロック核酸は、実質上従来の治療投与に使われたいかなる方法によっても身体への投与が可能となる。さまざまな投与方法では、動物に対する対生体作用合成物の投与方法がよく知られている。これらの方法には、静脈、筋肉内あるいは気管内注射、鼻スプレー、吸入用噴霧及び口腔あるいは座剤投与が含まれるが、これだけに限らない。使用される特定の投与方法は疾患の部位にもより、また疾患の部位を決定し適正な投与方法を選ぶ熟練した医術の範囲内で行われるのが好ましい。
【００９８】
抗菌核酸の化粧品使用
本発明のプロトン付加又は酸性化した核酸は、ローション、クリーム、局所液剤といった化粧品での使用が可能である。この本発明の核酸は、例えばローション中の抗菌剤や化粧製剤中のバクテリアの増殖防止及び／あるいは増殖阻止をするための防腐剤の両方を兼ねたものとして使用できる。従ってこの核酸は、今まで知られたどんな化粧製剤でも使用が可能であり、その製剤調合は、付加陽子核酸の活性化を抑えるのに十分低いpH7.0かそれ以下に抑えることができる。又、この核酸が中に抗菌効果に十分なほど含まれている。望ましい重量は0.25%から10.0%の間だが、さらに重量0.5%から5.0%の間であればより望ましい。
【００９９】
この新薬を化粧品に調合すると、グリコール酸あるいはアルファヒドロキシ酸、ビタミンＡパルミチン酸塩（レチニルパルミチン酸塩）及び／あるいはビタミンＥアセテート（トコフェロールアセテート）といったそれ自体活性成分である多くの付加物のいずれもが含まれることになる。これらのものそれぞれには、重量約0.5%から重量約5%までの量があることが望ましい。加えてＰＡＢＡといったＵＶ（紫外線）吸収物質あるいは防止物質の使用が可能になる。
【０１００】
又、他の合成物には付加的に水分潤い効果のあるものを加えることが可能であり、調合性を改善するよう製剤することも可能である。このような合成物の例として、セルチルエステルワックス、ステアリルアルコール、セチルアルコール、グリセリン、メチルパラベン、プロピルパラベン、クオータニウム１５、湿潤剤、揮発メチルシロキサン流体、ポリジオルガノシロキサンーポリ酸素アルキレンが含まれているが、これだけに限らない。米国特許第5,153,230号及び第4,421,769号を参照のこと。両ナンバーとも以下参照。この合成物に洗浄効果を加えた方が望ましいならラウリル硫酸ナトリウムまたはカルボキシル基酸の金属塩といった薬品を加えることが可能である。
【０１０１】
本発明の核酸は、広範囲のバクテリアに対し優れた効力を持ち皮膚炎症も少なく化学的に安定していることから、局所抗アクネ製剤という点で特に有効である。オイルベース合成物がアクネ（ざ瘡）状態を悪化させる原因となることから、このような製剤は水性が望ましい。
【０１０２】
さまざまな不揮発性皮膚軟化剤が効能があり、以下の例が無制限にある。マックカチオン第２巻ファンクショナルマテリアル１９９２年北米版１３７ページ〜１６８ページでリストに挙げられている。全体は以下参照。更にＣＴＦＡコスメティック・イングリジェント・ハンドブック第二版（１９９２年）には皮膚コンディショニング剤についてのリストが５７２ページから５７５ページに載っている。皮膚防止に関しても５８０ページに載っており、全体については以下参照のこと。
【０１０３】
不揮発性皮膚軟化剤物質の中では、以下特に参照したいシリコン、炭化水素、エステルそしてその混合物に効能がある。
【０１０４】
シリコーン皮膚軟化剤の例としては、ポリアルキルシロキサン、環状ポリアルキルシロキサン及びポリアルキルアリールシロキサンが挙げられる。ここで有用なポリアルキルシロキサンとしては、例えば、２５℃において約０．５〜約１００，０００センチストークスの粘度を有するポリアルキルシロキサンが挙げられる。そのようなポリアルキルシロキサンは、一般式Ｒ3ＳｉＯ（Ｒ2ＳｉＯ）xＳｉＲ3 (式中、Ｒはアルキル基（Ｒは、好ましくはメチル基又はエチル基であり、もっと好ましくはメチル基である。)であり、ｘは０〜約５００の整数であり、所望の分子量を得るために選ばれる。）に対応する。市販のポリアルキルシロキサンとしては、ポリジメチルシロキサンが挙げられ、これはジメチコーン（ｄｉｍｔｈｉｃｏｎｅ）として知られており、限定的でない例としては、ゼネラルエレクトリック社の商標ビカシル（Ｖｉｃａｓｉｌ）シリーズ、ダウコーニング社の商標ダウコーニング２００シリーズが挙げられる。ここで、皮膚軟化剤として有用なポリジメチルシロキサンの具体例として、０．６５センチストークスの粘度と１００℃の沸点を有するダウコーニング２００液、１０センチストークスの粘度と２００℃を超える沸点を有するダウコーニング２２５液、それぞれ５０、３５０、１２，５００センチストークスの粘度と２００℃を超える沸点を有するダウコーニング２００液が挙げられる。ここで有用な環状ポリアルキルシロキサンとしては、一般式（ＳｉＲ2Ｏ）n（式中、Ｒはアルキル基（Ｒは、好ましくはメチル基又はエチル基であり、もっと好ましくはメチル基である。)であり、ｎは約３〜約８の整数、もっと好ましくは約３〜約７の整数、最も好ましくは約４〜６の整数である。)に対応するものを含む。Ｒがメチル基の場合、これらの物質は典型的にはシクロメチコーンとして言及される。市販のシクロメチコーンとしては、２．５センチストークスの粘度と１７２℃の沸点を有し、主としてシクロメチコーンテトラマー（即ち、ｎ＝４）を含むするダウコーニング２４４液、２．５センチストークスの粘度と１７８℃の沸点を有し、主としてシクロメチコーンペンタマー（即ち、ｎ＝５）を含むダウコーニング３４４液、４．２センチストークスの粘度と２０５℃の沸点を有し、主としてシクロメチコーンテトラマーとペンタマー（即ち、ｎ＝４とｎ＝５）の混合物を含むダウコーニング２４５液、４．５センチストークスの粘度と２１７℃の沸点を有し、主としてシクロメチコーンテトラマーとペンタマーとヘキサマー（即ち、ｎ＝４とｎ＝５とｎ＝６）の混合物を含むダウコーニング３４５液が挙げられる。また、トリメチルシロキシシリケートのような物質も有用であり、一般式（（ＣＨ2）3ＳｉＯ1/2）x（ＳｉＯ2）y）（式中、ｘは約１〜約５００の整数であり、ｙは約１〜約５００の整数である。）に対応するポリメリックな物質である。市販のトリメチルシロキシシリケートは、ダウコーニング５９３液としてジメチコーンとの混合物として売られる。また、ジメチコノル（ｄｉｍｅｔｈｉｃｏｎｏｌ）もここで有用であり、これは、末端水酸基を有するジメチルシリコーンである。これらの物質は、一般式Ｒ3ＳｉＯ（Ｒ2ＳｉＯ）xＳｉＲ2ＯＨとＨＯＲ2ＳｉＯ（Ｒ2ＳｉＯ）xＳｉＲ2ＯＨ（式中、Ｒはアルキル基（Ｒは、好ましくはメチル基又はエチル基であり、もっと好ましくはメチル基である。）を表し、ｘは約０〜約５００の整数であり、所望の分子量となるように選ばれる。）として表されることができる。市販のジメチコノルは、典型的にはジメチコーン又はシクロメチコーン（例えば、ダウコーニング１４０１液と１４０２液と１４０３液）の混合物として売られる。また、ここで有用なポリアルキルアリールシロキサンは、好ましくは約１５〜約６５センチストロークスの粘度を有するポリメチルフェニルシロキサンを有するものである。これらの物質は、例えば、ＳＦ１０７５メチルフェニル液（ゼネラルエレクトリック社により販売）及び５５６美容グレードフェニルトリメチコーン液（ダウコーニング社により販売）として市販されている。
【０１０５】
この中で有用な炭化水素は、約１０から約３０の炭素原子、より望ましい約１２から約２４の炭素原子、一番望ましい約１６から約２２の炭素原子のある直鎖、有枝鎖を含む。これらの炭化水素物質の無制限の例として、ドーデケン、スクアレン、コレステロール、５水素化ポリイソブチレン、ドコサン（C22炭化水素）、ヘキサデカン、イソヘキサデカン（商業的に入手可能な炭化水素、ニュージャージ州サウスプレインズフィールド、プレスパース社販売のペルメチル）が挙げられる。この中で有用な他の炭化水素物質には、パラフィンやＵＳＰ軽ミネラルオイル及び／又はＵＳＰ重ミネラルオイル（イリノイ州メルローズパーク、ウィトコ社から入手可能なクレアロール）といったミネラルオイルがある。
また、エステルも不揮発性軟化剤として有用であり、アルコールとポリオール（二以上の水酸基を有するアルコール）によりエステル化された一官能及び二官能脂肪酸のエステルを含む。ここで有用な種々なエステルは、好ましくは長鎖脂肪酸（即ち、炭素数１０〜４０の脂肪アルコールでエステル化される炭素数１０〜４０の脂肪酸）の長鎖エステルが挙げられる。ここで有用なエステルの限定的でない例としては、アジピン酸ジイソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、プロピオン酸ミリスチル、ジステアリン酸エチレングリコール、パルミチン酸２−エチルヘキシル、ネオペンタン酸イソデシル、安息香酸と炭素数１２〜１５のアルコールとのエステル、マレイン酸ジ−２−エチルヘキシル、パルミチン酸セチル、ミリスチン酸ミリスチル、ステアリン酸ステアリル、ステアリン酸セチル、ベヘニルベヘンラート（ｂｅｈｅｎｙｌ  ｂｅｈｅｎｒａｔｅ）及びこれらの混合物からなる一群から選ばれるエステルが挙げられる。
【０１０６】
殺菌剤中の抗バクテリア核酸
この本発明の核酸は又、殺菌剤としての使用が可能である。そして、生物静力学あるいは望ましくは生命破壊性の特性を持つ液体殺菌剤製剤として特に使われる。この殺菌剤溶液中には少なくとも十分な量の本発明の核酸が含まれており、生物静力学及び／あるいは生命破壊性の特性のある他の活性成分をも含む。例えばこの殺菌剤には、ジメチルベンジルドデシルアンモニウム塩化物、ジメチルベンジルデシルアンモニウム塩化物、ジメチルベンジルデシルアンモニウム臭化物、ジメチルベンジロクチルアンモニウム塩化物、さらにココサルキルベンジルアンモニウム塩化物等の四基アンモニウム合成物の適応濃縮物のある新薬核酸が含まれている。
【０１０７】
もう一つ別の例では、オリゴヘキサメチレンビグアニド塩及びビスビグアニド等の適合殺菌剤ビグアニジン合成物の使用が可能である。以下参考に、米国特許第５０３０６５９号を参照のこと。それには生命破壊性成分に加え、アルデヒド、フェノール誘導体、ハロゲンフェニル誘導体が含まれている。以下を参考に、米国特許第５７６７０５４号を参照のこと。このような活性成分のある他の合生物が医術で熟練した人間に認知され、又この本発明の核酸と共に使用される日は遠からず来る。
【０１０８】
示された活性成分合生物に加え、この本発明の殺菌剤製剤に含まれる合成物には他に代表的なものもあるが、それは望まれる調剤使用法によって変わる。とりわけ酸性化するものは、下の７にある殺菌剤溶液のpH範囲を守るための使用が可能である。核酸及び／または他の活性成分に適応した溶剤の使用が可能だが、水あるいは水混和製溶剤が望ましい。このような溶剤は、圧縮空気あるいはこのやり方を使う人が知るところの他の推進器を使い直ちに噴霧しなければならない。
【０１０９】
表面殺菌力のあるこの本発明の製剤は、病院、動物病院、歯科医科医院などといった医療関連施設において特に適応するものである。この新薬溶剤を外科器具に使用することは特に望ましい。これらの製剤は又、学校のような公共の場、公共輸送機間、レストラン、ホテル、クリーニング屋などに有用である。又この殺菌剤はトイレ、浴槽、台所回りの殺菌剤として家庭での使用にも適している。
【０１１０】
プロトン付加又は酸性化された核酸は、皮膚の殺菌溶剤としても使用が可能である。溶剤中のこの新薬ヌクレオチド酸にこのような合成物が含まれているため、局所使用にも適した溶剤といえる。殺菌剤としては即効乾燥という点で幅があるものの、その場合はヌクレオチド酸がエタノールベースであるかが望ましい。このような溶剤には同様に皮膚軟化剤が含まれているが、それはアルコールが皮膚を急激に乾燥させるからである。適応する皮膚軟化剤に含まれているものの例としては、ポリエチレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール、エリチリトル、ジプロピレングリコールそしてソルビト？ルのような多水酸基アルコールが挙げられるが、これだけに限られたものではない。皮膚軟化剤の量は0.1%から3.0%重量の範囲内にあるが、0.2%から1.5%重量範囲が望ましい。皮膚軟化剤重量が0.1%以下である場合は効果が弱まる可能性があり、3.0%以上だとべたついてしまうことがある。
【０１１１】
皮膚に対しての殺菌剤は、医療処置、廃棄物処理の後で手を殺菌することに特に有用であるし外科担当スタッフ及び患者に触れる手術台付近両方の殺菌のためには、外科医療の現場にも有用である。
【０１１２】
［実施例］
以下の実施例は、いかに本発明を製造し使用するかについて、完全な開示と記載を当業者に提供するために提示されている。そして、これらは、本発明者らがその発明であると考えるものの範囲を限定する意図はなく、また、本発明者らによって実施された実施例は、これら実施例が全てでも、また、これらのみでもない。使用されている数値（例えば、量、温度等）を獲得するためには努力が払われたが、ある種の実験誤差およびゆらぎがあることも考慮されなければならない。特に記載がない限り、部は、重量部を意味し、分子量は、重量平均分子量を意味し、温度は、摂氏温度を意味し、圧力は、大気圧またはその前後である。
【０１１３】
［例１  核酸の合成、精製およびプロトン付加または酸性化］
1μＭを越える範囲から１ｍＭを下回る範囲にかけて、市販のＤＮＡ合成機により市販のホスホルアミデート類を用い、当業者にとって公知の標準的ホスホルアミデート化学および手法により、核酸を合成した。このようなホスホルアミデート化学および手法は、例えば、Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077-6089(1984), Stec et al., J. Org. Chem. 50(20):3908-3913(1985), Stec et al.,  J. Chromatog. 326:263-280 (1985), LaPlanche et al., Nuc. Acid. Res. 14(22): 9081-9093(1986)およびFasman, Practical Handbook of Biochemitry and Molecular Biology, 1989, CRC Press, Boca Raton, FLに記載されており、これらは、本明細書の記載の一部としてここに引用する。
【０１１４】
核酸を、ホスホルアミデート製造者プロトコルによって脱保護化した。未精製の核酸を、真空乾燥し、または沈殿し乾燥した。市販のＤＮＡ−Ｍａｔｅ（Barkosigan社製）試薬もしくは例えばＤｏｗｅｘのような市販の交換樹脂による従来の手法用いて、またはナトリウム塩類を加えた後、沈殿し、ダイアろ過（diafiltration）もしくはゲルろ過等を経ることにより、核酸のナトリウム塩を調製した。
【０１１５】
各種の標準的な手法を用い、本文中に記載した核酸を精製／製造した。手短にいうと、市販の逆相[例えば、ＲＡＩＮＩＮ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．のＤＹＮＡＭＡＸ（登録商標）−３００Ａ、純粋ＤＮＡ逆相カラム用インストラクション・マニュアル１９８９年版のまたはその最新版を参照されたい。その内容は、本明細書の記載の一部としてここに引用する。]またはＷａｔｅｒｓ’  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐａｋ もしくはＰｈａｒｍａｃｉａ’ｓ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑといったイオン交換媒体(Warren and Vella, 1994, "Analysis and Purification of Syntehtic Nucleic Acids by High-Performance Liquid Chromatography", in Methods in Molecular Biology, vol. 26、Protocols for Nucleic Acid Conjugates, S. Agrawal, Ed. Humana Press, Inc., Totowa, NJ、Aharon et al., 1993, J. Chrom. 698:293-30、およびMillipore Technical Bulletin, 1992, Antisense DNA: Synthesis, Purification, and Analysisを概説として参照されたい。)クロマトグラフィーによって核酸を精製した。ピーク分画を合わせ、アルコール（エタノール、ブタノール、イソプロパノールおよびその異性体およびその混合物等）沈殿、逆相クロマトグラフィー、ダイアろ過、もしくはゲルろ過もしくはサイズ分離ろ過、またはこれらの濃縮/脱塩技法のいずれかのまたは全ての組み合わせにより、サンプルを濃縮し、脱塩した。
【０１１６】
次いで、または上記処理の間に、精製、部分的に精製されたまたは未精製核酸を低いｐＨまたは酸性雰囲気中にさらすことにより、記載された核酸がプロトン付加または酸性化された形態で生成する。リン酸、硝酸、塩酸または酢酸等を含むがこれらに限定されない酸によって、精製したまたは未精製核酸をプロトン付加または酸性化した。
【０１１７】
ＳＡＸ−精製核酸のプールされた分画（約２〜２５Ａ260／ｍｌ）をＰｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂ’のＰＬＲＰまたはＨａｍｉｌｔｏｎのＰＲＰ−１もしくはＰＲＰ−３のようなポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ベースのカラムに充填した。次いで、直ちに、過量の希薄酸(例えば、１００ｍＭのＨＣｌ)を溶出液が酸性となるまで加えた。そして、カラムを純水（塩または緩衝成分を含まない）で、溶出液の導電性が実質的にバックグランドレベルかつバックグランドｐＨとなるまで洗浄した。そして、核酸を適当な水性有機溶液で溶出し、市販の真空蒸発機によって乾燥した。あるいは、核酸を希薄酸に懸濁し、水を溶媒として上記したＰＲＰもしくは同様のポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ベースのカラムでクロマトグラフィーにかけ、またはサイズ分離ろ過カラムもしくはゲルろ過カラム（例えば、ＢｉｏＲａｄのＰ２またはＰ４）でクロマトグラフィーにかけた。その代わりに、脱塩した核酸をアルカリ塩溶液（例えば、０．４ＭのＮａＣｌとｐＨ１２の２５ｍＭのＮａＯＨ）に溶解し、ＰＲＰまたは同様のポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ベースのカラムにかけ、酸および引き続いて水により洗浄し、そして上記したように溶出しても良い。
【０１１８】
あるいは、核酸を、Ｈ+形式のカチオン交換カラムでクロマトグラフィーにかけ、収集し、上記したように乾燥させることもできる。
核酸はまた、例えばＨＣｌ（０．１Ｎ）といった酸を核酸溶液（約３００Ａ260／ｍｌ）に直接、溶液のｐＨがｐＨ１からｐＨ３になるまで加えることによっても酸性化される。酸性化された核酸は、ついでＢｉｏＲａｄのＰゲルカラムのような酸安定サイズ分離ろ過カラムにかけることができる。
【０１１９】
細菌実験に使用される核酸の凍結乾燥調製物を、無菌シグマ（Ｓｉｇｍａ）水のような発熱性のない、無菌の生理食塩水（すなわち、０．８５％食塩水）に溶解し、０．４５ミクロンゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ）フィルター（または、動物実験に先立って無菌０．２ミクロン無発熱性フィルター）でろ過した。
水または生理食塩水に懸濁する際は、核酸調製物は、典型的に、プロトン付加または酸性化の度合いによって１から４．５のｐＨを示した。これによって、酸性化工程でどれくらい酸が使用されたかが決定される。
【０１２０】
［例２  本発明に係るオリゴヌクレオチドの酸安定性］
３’末端と５’末端が転化した(inverted)Ｔブロック端部を持つ２’-Ｏ-メチルＡ、Ｃ、Ｇ、およびＵの１２ｍｅｒのホモポリマーを合成した。これらを、精製し、脱塩し、凍結乾燥し、そして３００Ａ260／ｍｌで無菌水に溶解した。サンプルを取り、０．１ＮのＨＣＬまたは１．０ＮのＨＣｌで各々ｐＨが約１及び０となるように１：４の割合で希釈し、ヒートブロックに３９℃で載置した。アリコートを０、２、４、２４時間で採取し、１：２０の比で０．０２５ＭのＮａＯＨおよび０．０３ＭのＮａＣｌ溶液に希釈し、アニオン交換カラム上で強力な変性条件下のＨＰＬＣ分析にかけるまで、−２０℃で保存した。
【０１２１】
【表１】
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【０１２２】
ｐＨ１の３９℃では、実質的になんの分解も起こらず、ｐＨ０の３９℃で２４時間経過後わずかな分解のみがあるといったことが了解される。
【０１２３】
［例３  本発明に係るオリゴヌクレオチドの酸安定性］
１４ｍｅｒのヘテロポリマー（配列番号１）を、通常のホスホジエステルＤＮＡ（Ｏ）、チオリン酸ＤＮＡ（Ｓ）、非ブロック２’-Ｏ-メチルＲＮＡ（２’ｏｍ）、５’末端と３’末端の両方においてブタノールで端部ブロック（遮断）され、３’末端と５’末端にブタノールブロック端部を持つ２’-Ｏ-メチルＲＮＡ（２’ｏｍ）、および六のチオリン酸ＤＮＡ塩基の両端に四つの２’-Ｏ-メチルチオリン酸塩基を持つチオリン酸・キメラ（ＳＤ）として合成した。これらを、精製し、脱塩し、凍結乾燥し、そして３００Ａ260／ｍｌで無菌水に溶解した。サンプルを取り、０．１ＮのＨＣｌで最終ｐＨが１．５となるように１：４の割合で希釈し、ヒートブロックに３９℃で載置した。アリコートを示された時間間隔で採取し、１：２０の比で０．０２５ＭのＮａＯＨおよび０．０３ＭのＮａＣｌ溶液に希釈し、アニオン交換カラム上で強力な変性条件下のＨＰＬＣ分析にかけた。当初、ブロック端部を持つ２’-Ｏ-メチルＲＮＡを除き、全てがＨＣｌの添加後直ちに曇りを生じた。加熱後直ちに、ホスホジエステルＤＮＡおよび非ブロック２’-Ｏ-メチルＲＮＡの両方が透明となった。チオリン酸結合を持つ二つのオリゴヌクレオチドが、約２時間経過するまで曇りを持ち、その後これらの分解に伴ってゆっくりと透明になり始めた。
【０１２４】
【表２】
0004688294.tif 000003
【０１２５】
２’-Ｏ-メチルオリゴヌクレオチドは、ブロック、非ブロックの両方ともが、対応するホスホジエステル、チオリン酸、または生物学的適合性を増大するものとしてＡｇｒａｗａｌらが提唱する２’-Ｏ-メチルチオリン酸構造よりもはるかに安定性がある。
【０１２６】
［例４  ヒト血清安定性に関する５’末端および３’末端の端部ブロックに関する検討］
１４ｍｅｒのヘテロポリマー（配列番号１）を、通常のホスホジエステルＤＮＡ、チオリン酸ＤＮＡ、非ブロック２’-Ｏ-メチルＲＮＡ、５’末端と３’末端の両方においてブタノールで端部ブロックされた２’-Ｏ-メチルＲＮＡとして合成した。これらを、精製し、脱塩し、凍結乾燥し、そして３００Ａ260／ｍｌで無菌水に溶解した。サンプルを取り、ヒト血清（Ｓｉｇｍａ、Ｈ２５２０）で希釈し、３９℃で養生した。アリコートを２および４日間で採取し、アニオン交換カラム上で強力な変性条件下のＨＰＬＣ分析にかける前に、希釈し、ろ過した。
【０１２７】
【表３】
0004688294.tif 000004
【０１２８】
［例５  本発明に係るオリゴヌクレオチドとホスホジエステルオリゴヌクレオチドの酸安定性の対比］
１４ｍｅｒのヘテロポリマー（配列番号１）を、３’-Ｏ-メチルホスホジエステル（ＡＳＭ-３’）および２’-Ｏ-プロパルギル
【化１】
0004688294.tif 000005
（ＡＳＭＰ）として合成した。１２ｍｅｒの２’-メトキシエトキシホモポリマーＡ（ＭＥＡ）も合成した。これらを、精製し、脱塩し、凍結乾燥し、そして３００Ａ260／ｍｌで無菌水に溶解した。サンプルを取り、０．１ＮのＨＣｌで最終ｐＨが約１．５となるように１：４の割合に希釈し、ヒートブロックに３９℃で載置した。アリコートを示された時間間隔で採取し、１：２０の比で０．０２５ＭのＮａＯＨおよび０．０３ＭのＮａＣｌ溶液に希釈した。サンプルをアニオン交換カラム上で強力な変性条件下のＨＰＬＣ分析にかけた。
【０１２９】
【表４】
0004688294.tif 000006
【０１３０】
＊注：３０分以内で大部分の吸収がＡＳＭ−Ｐから消失した。すなわち、９０％以上が消失した。メチルリン酸バックボーンを用いた同様の検討では、少なくとも２時間安定であったものの、２４時間以内に顕著な分解が見られた。
【０１３１】
［例６  本発明に係るオリゴヌクレオチドとホスホジエステルオリゴヌクレオチドの酸安定性の対比］
１４ｍｅｒのヘテロポリマー（配列番号１）を、ホスホジエステル（ＤＮＡ版）および２’-Ｏ-メチルホスホジエステル（２’-Ｏ-メチル）として合成した。単一のオリゴヌクレオチドとして各々のヌクレオチドは、同様な科学的バックボーンを共有する。すなわち、２’-Ｏ-メチルオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドは、糖部分に２’-Ｏ-メチル基を持っていた。これらを、精製し、脱塩し、凍結乾燥し、そして３００Ａ260／ｍｌで無菌水に溶解した。サンプルを取り、０．１ＮのＨＣｌで最終ｐＨが約１．５となるように１倍から４倍に希釈し、ヒートブロックに３９℃で載置した。アリコートを示された時間間隔で採取し、１：２０の比で０．０２５ＭのＮａＯＨおよび０．０３ＭのＮａＣｌ溶液に希釈した。サンプルを、アニオン交換カラム上で強力な変性条件下のＨＰＬＣ分析にかけた。
オリゴヌクレオチド分解の結果は、以下の通りであり、パーセンテージは、酸に晒した後になお存在するオリゴヌクレオチドを表す。
【０１３２】
【表５】
0004688294.tif 000007
【０１３３】
このように、糖部分の２’残基に、２’-Ｏ-メチル基のような２’-Ｏ-Ｒ基を付加すると、分子の安定性を顕著に増加させる（図１参照）。
【０１３４】
［例７  本発明に係るホモポリマーオリゴヌクレオチドおよびホスホジエステルオリゴヌクレオチドの酸安定性］
次に、改変オリゴヌクレオチドの酸安定効果潜在性を調べた。１４ｍｅｒへテロポリマー（配列番号２）を、ホスホジエステル（ＤＮＡ版）、２’−Ｏ−メチルホスホジエステル（２’−Ｏ−メチル）および２’メトキシエトキシホスホジエステルとして合成した。1つのオリゴヌクレオチドの夫々のヌクレオチドは同じ化学バックボーンを持つ。つまり２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドはすべて２’−Ｏ−メチル基を糖部分に持つ。これらのオリゴヌクレオチドを精製、脱塩、凍結凍結乾燥し、３００Ａ260／ｍｌで殺菌水に溶解した。サンプルを取り、最終ｐＨが、約１．５になるよう、１：４の割合で０．１ＮのＨＣｌに希釈し、３９℃のヒートブロックに設置した。アリコートを指定した時間で取りだし、１：２０の比で、０．０２５ＭのＮａＯＨおよび０．０３ＭのＮａＣｌに希釈し、サンプルを強度の変性条件下で、アニオン交換カラムにＨＰＬＣ分析にかけた。
オリゴヌクレオチド分解の結果を以下に示す。％は、酸に暴露した後にまだ存在しているオリゴヌクレオチドを示す。
【０１３５】
【表６】
0004688294.tif 000008
【０１３６】
つまり、２’−Ｏ−Ｒ基（例えば、２’−Ｏ−メチル基）、２’−Ｏ−Ｒ−Ｏ−Ｒ基（例えば、２’−Ｏ−メトキシエトキシ基）を糖の２’残基に加えると分子の安定性が著しく増加した（図２参照）。
【０１３７】
［例８  本発明に係るオリゴヌクレオチドおよびホスホジエステルオリゴヌクレオチドの酸安定性]
１４ｍｅｒへテロポリマー（配列番号１）を、ホスホジエステル（ＤＮＡ版）および２’−Ｏ−フッ素ホスホジエステル（２’−Ｆ）として合成した。１つのオリゴヌクレオチドの夫々のヌクレオチドは同じ化学的主鎖を持つ。すなわち、２’−Ｆオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドはすべて２■−Ｆ基を糖部分に持つ。それらを精製、脱塩、凍結乾燥
し、３００Ａ260／ｍｌで殺菌水に溶解した。サンプルを取り、最終ｐＨが、約１．５になるよう、１：４の割合で０．１Ｎ  ＨＣｌに希釈し、３９℃のヒートブロックに設置した。アリコートを指定した時間で取りだし、１：２０の比で、０．０２５ＭのＮａＯＨおよび０．０３ＭのＮａＣｌに希釈し、サンプルを強度の変性条件下で、アニオン交換カラム上でＨＰＬＣ分析をかけた。
オリゴヌクレオチド分解の結果を以下に示す。％は、酸に暴露した後にまだ存在しているオリゴヌクレオチドを示す。
【０１３８】
【表７】
0004688294.tif 000009
【０１３９】
このように、２’−Ｒ基、ここでは２’−Ｆ基を糖部分の２’残基に加えると分子の安定性が著しく増加した（図３参照）。
【０１４０】
［例９  本発明のオリゴヌクレオチドよび硫黄ＤＮＡ分子の酸安定性］
１４ｍｅｒへテロポリマー（配列番号１）を、硫黄ＤＮＡ版および２’−Ｏ−メチル硫黄ＲＮＡとして合成した。図４に両方の構成を示す。１つのオリゴヌクレオチドの夫々のヌクレオチドは同じ化学的主鎖を持つ。つまり２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドはすべて２’−Ｏ−メチル基化糖を持つ。１４ｍｅｒへテロポリマーは精製、脱塩、凍結乾燥し、３００Ａ260／ｍｌで殺菌水に溶解した。サンプルを取り、最終ｐＨが、約１．５になるよう、１：４の割合で０．１Ｎ  ＨＣｌに希釈し、３９℃のヒートブロックに設置した。アリコートを指定した時間で取りだし、１：２０の比で、０．０２５ＭのＮａＯＨおよび０．０３ＭのＮａＣｌに希釈し、サンプルを強度の変性条件下で、アニオン交換カラム上でＨＰＬＣ分析にかけた。
オリゴヌクレオチド分解の結果を以下に示す。％は、酸に暴露した後にまだ存在しているオリゴヌクレオチドを示す。
【０１４１】
【表８】
0004688294.tif 000010
【０１４２】
このように、２’−Ｏ−Ｒ基（例えば、２’−Ｏ−メチル基）、２’−Ｏ−Ｒ−Ｏ−Ｒ基（２’−Ｏ−メトキシエトキシ）を糖部分の２’残基に加えると硫黄ＤＮＡ分子の安定性が著しく増加した（図４参照）。
【０１４３】
［例１０  本発明のホスホルアミデートオリゴヌクレオチド類の酸安定性］
１４ｍｅｒ（１４量体）であるホスホルアミデート結合したヘテロポリマー（配列番号１）を、各ヌクレオチドについてプロトンまたは２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−メトキシエトキシを用いて合成する。単一のオリゴヌクレオチド中の各ヌクレオチドが骨格の同じ化学的特徴を共有していた。つまり２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチド類が２’−Ｏ−メチル基を糖部分に有しており、２’−Ｏ−メトキシエトキシオリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチドは２’−Ｏ−メトキシエトキシ基を糖部分に有している。１４ｍｅｒであるヘテロポリマーが合成され、精製され、脱塩され、親液化され、１ミリリットルあたり３００Ａ260で無菌水に溶解された。サンプルを取りだし、１対４に０．１ＮのＨＣｌによって希釈して、最終的なｐＨを約１．５として、３９℃のヒートブロックに入れた。指定した時間にアリコートを取って、０．０２５ＭのＮａＯＨと０．０３ＭのＮａＣｌへと１対２０に希釈した。強力な変性化条件下でアニオン交換カラムを用いて分析用ＨＰＬＣにサンプルをかけた。
オリゴヌクレオチドの結果の結果は、オリゴヌクレオチド類を表すパーセントが酸に対する露出のあとでも残り、次のようであった。
【０１４４】
【表９】
0004688294.tif 000011
【０１４５】
したがって、２’−Ｏ−Ｒ基（例えば、２’−Ｏ−メチル基）または２’−Ｏ−Ｒ−Ｏ−Ｒ基（例えば、メトキシエトキシ基）の糖基の２’残基への付加は、ホスホルアミデートＤＮＡ分子の安定性を相当程度増大させる（図５参照）。
【０１４６】
［例１１  ホスホジエステルオリゴヌクレオチド類に対する本発明のオリゴヌクレオチド類の酸安定性］
変更されたヌクレオチドと変更されていないヌクレオチドとの組み合わせを有するオリゴヌクレオチド類を合成した。配列ＣＧＴＧＴＣＡＧＧＡＧＡＡＣ（配列番号１）を有する１４ｍｅｒのヘテロポリマーを三つの形において合成した。デオキシリボースグアニン（ＤＮＡ  Ｇ類）を有するもの、２’−Ｏ−メチルグアニン類を有するもの、そして、２’−メトキシエトキシグアニン類を有するものである。各オリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルＡとＣとＵの塩基を有していて、全ての結合がチオリン酸塩(phosphorothioate)であった。これらのオリゴヌクレオチドは、精製され、脱塩され、親液化され、１ミリリットルあたり３００Ａ260で無菌水中に溶解された。サンプルを取りだし、１対４に０．１ＮのＨＣｌによって希釈して、最終的なｐＨを約１．５として、３９℃のヒートブロックに入れた。指定した時間にアリコートを取って、０．０２５ＭのＮａＯＨと０．０３ＭのＮａＣｌへと１対２０に希釈した。強力な変性化条件下でアニオン交換カラムを用いて分析用ＨＰＬＣにサンプルをかけた。
オリゴヌクレオチドの結果の結果は、オリゴヌクレオチド類を表すパーセントが酸に対する露出のあとでも残り、次のようであった。
【０１４７】
【表１０】
0004688294.tif 000012
したがって、２’−Ｏ−Ｒ基（例えば、２’−Ｏ−メチル基）または２’−Ｏ−Ｒ−Ｏ−Ｒ基（例えば、メトキシエトキシ基）の未修飾糖基の２’位置への付加は、チオリン酸オリゴヌクレオチド分子の安定性を相当程度増大させる（図５参照）。
【０１４８】
［例１２  皮膚通過の研究］
プロトン付加してないものとプロトン付加して末端保護がされた２’−Ｏ−メチルＲＮＡの皮膚を通って運搬される能力を比較するために、死体の皮膚を用いて研究を行った。インビトロのヒト死体皮膚モデルは、経皮吸収及び局所的に投与した薬剤の薬物動態の決定に役立つツールであることが証明されている。このモデルでは、特に設計した、典型的なインビボ状態に合うような温度と湿度に皮膚を保つことができる拡散チャンバーにヒトの死体皮膚を取り付けたものを用いる（Franz, J. Invest. Dermatol. 64:190-195, 1975）。ある有限の用量（５〜７ｍｇ／ｃｍ2）の処方をこの皮膚の外側表面に置いて、この皮膚の内側表面を浴しているレセプター溶液に現れる速度をモニターすることにより薬剤の吸収を測定する。全吸収と、吸収速度、スキン内の量を規定するデータをこのモデルにより正確に決定することができる。この方法は、インビボの経皮的吸収動態を正確に予測した歴史的前例を持つものである（Franz: "The finite dose technique is a valid in vitro model for the study of percutaneous adsorption in man." Skin: Drug Application and Evaluation of Environmental Hazards, Current Problems in Dermatology, vol. 7, G. Simon, et al., Z. Paster, Mr. Klingberg. M. Kaye, (Eds), Basel, Switzerland, S. Karger, 1978, pp. 58-68)）。
３人のドナーを評価した。適用した核酸類の濃度は、０．１０８μｇ／μＬであった。５μＬの各核酸を０．８ｃｍ2の皮膚の面積に塗布した。プロトン付加されていない形態に比べてプロトン付加をしたオリゴの場合には移動量は４００％大きかった。
【０１４９】
［例１３  細菌感染の皮膚に対する局所適用の効果］
フルンケル(furuncle)といわれるヒトの皮膚のはれものをプロトン付加または酸性化した核酸により処置した。フルンケルは、毛包に典型的に起源する局所的な化膿性感染症である。フルンケルは、丸く、柔らかい、膿がある皮膚部分であり、押すと破裂して白いキャップを形成するものである。しばしは、フルンケルは、毛包の最も深い部分における感染であることがある。フルンケルは、通常１０〜２５日で直るものである。フルンケルは、処置をしないと、完治する前に排膿する必要がある。これは、丁度２週以下で起こることが多い。もし、フルンケルが深い傷害であれば、簡単な手術によりフルンケルを開けて膿を排出することに加えて、細菌を除去するために全身的な抗生物質の処方が必要になるかもしれない。まとめると、フルンケルは、細菌の深い皮膚感染により引き起こされる痛みを伴った皮膚の腫れであり、処置をしなければ１０日で治癒することはないものである。
【０１５０】
プロトン付加または酸性化された核酸は、健康な３６歳の男性の背中にある１．５ｃｍフルンケルを処置するのに有効性を示した。８時間以内に、プロトン付加または酸性化した核酸は、迅速かつ劇的にフルンケルの痛みと腫れを押さえた。
【０１５１】
プロトン付加または酸性化をした核酸（ｐＨ１．５，ＡＣＧＣＧＣＣＡＴＴＡＴ、配列番号３）を、フルンケルが現れてから１日後に１．５ｃｍのフルンケルの処置に使用した。この核酸は、２’−Ｏ−メチル置換リボヌクオチド類を含み、ホスホジエステル結合し、５’と３’末端の両方において転換されたＴで末端遮断（ブロック）されたものであった。具体的には、１００μｌ（１８．９ｍＭ）のプロトン付加または酸性化された核酸を水に溶解し、１．５ｃｍのフルンケルを処置した。このフルンケルは、膨れて赤く出っ張っていた。２〜３ｍｍの膿胞があり、患者にとっては非常に痛いものであった。処置の８時間後には、フルンケルは、自発的に排出をし、約０．５ｃｍの大きさへと縮まって、同時に張れと赤みも減少した。患者の痛みも相当程度軽減された。５０μｌのプロトン付加または酸性化した核酸を２回目に適用した。
【０１５２】
最初の処置から１６時間後には、実質上、全く腫れも、痛みも、炎症もなかった。０．５ｃｍ未満の大きさの小さなピンク色の部分が元のフルンケルのあとにあるだけであった。プロトン付加または酸性化した核酸の最終的な適用は、感染から２４時間の後処置において、治癒過程をさらに加速させ続けた。フルンケルの痕跡は、第３回目の適用の後１日以内に完全に治癒した。
【０１５３】
まとめると、プロトン付加または酸性化した核酸は、水を担体として用いて、ブドウ球菌性のフルンケルの迅速な処置に非常に効果があった。プロトン付加または酸性化された核酸は、フルンケルの痛みと腫れを素早く解消するのに特に有効であった。
【０１５４】
［例１４  耳の感染症の局所的処置における有効性］
プロトン付加または酸性化された核酸は、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）により引き起こされたチンチラ(chinchillas)における外耳の皮膚の表皮性感染症を処置するのに非常に有効である。プロトン付加または酸性化された核酸による継続処置を受けたチンチラの感染耳については、治療を始めてから４日以内で完全に治癒した。
【０１５５】
チンチラの耳は、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）によって感染していた。特に、このチンチラの耳の表皮層の浸解は、水に耳を長時間曝すことによって引き起こされた。これは、チンチラの耳の耳管の表皮層において、シュードモナス感染のための環境が準備されるのに貢献している。洗い出された緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の懸濁液をコットン(cotton plegets)にしみ込ませて、チンチラの耳管に挿入した。４８時間後にこのコットンを取り除いた。
【０１５６】
チンチラの処置は、感染後第３日に開始された。チンチラは、このとき耳鏡で調べることにより、レベル３の重度であると判断された。これらのチンチラは、配列番号３のｐＨ１．５の４００μｌのプロトン付加または酸性化された核酸（水中で２．８ｍＭ）または賦形剤混合物（水とエタノールとプロピレングリコール）中の同一配列の４００μｌのプロトン付加または酸性化された核酸（２ｍＭ）による、毎日の局所的処方を受けた。この核酸は、２’−Ｏ−メチル置換リボヌクオチド類を含み、ホスホジエステル結合し、ブタノールにより５’末端と３’末端の両方において末端遮断されているものである。チンチラを毎日検査して、耳の炎症のひどさに基づき処置の有効性を評価した。
【０１５７】
プロトン付加または酸性化された核酸による処置の結果から、全ての処置されたチンチラの耳において耳の感染症の重篤性が有意に低下したことが耳鏡観察により分かった。プロトン付加または酸性化された核酸による３回の処置の後に相当の改善が生じた。
【０１５８】
チンチラは犠牲にされるか、またはさらに４，５日にわたって処置を継続した。処置を受けていない対照のチンチラは、この時間的フレームの中で何ら改善を見せなかった。むしろ逆に、プロトン付加または酸性化された核酸による継続的な処置を受けた全ての耳の炎症が感染後第７日目まで（すなわち、プロトン付加または酸性化された核酸による処置が始まってから４日後）に完全に治癒した。
【０１５９】
さらに、２種類の輸送媒体（水とエタノールとプロピレングリコールの混合物、および水）に溶解させたプロトン付加または酸性化された核酸の間で、治癒の進展に若干の差が見られた。耳鏡による観察では、耳の感染症と取り扱う上では、賦形剤混合物を使用した方が若干より効果的であるという結果がでている。
【０１６０】
結論として、プロトン付加または酸性化された核酸は、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）により引き起こされたチンチラの外耳の感染症を処置するのに有効であることが明らかになった。これは、この感染性細菌が天然に抗生物質に対する耐性を有することから、重要な発見である。
【０１６１】
［例１５  犬のStrep. pyogenes皮膚感染症の治療におけるプロトン付加または酸性化された核酸の有効性］
２歳の１３５ポンドのメスのニューファウンドランド犬は、腹部に創傷を有しており、Strep. pyogenes感染症を発症していた。その部位は腫れており、炎症を有し、さわると痛がった。Neosporin（登録商標、ワーナーランバート社）により３日間治療したが、改善のしるしは見えなかった。ホスホジエステル結合し、ｐＨ１．５で、５’末端と３’末端の両方においてブタノールにより端部遮断（ブロック）されており、配列番号３の配列を有する２’−Ｏ−メチル置換リボヌクレオチドにより１２時間の間隔をおいて２回処置を、この傷に直接行った。その結果、感染症は完全に消えており、腫れ、炎症、さわると痛がることはなくなった。
【０１６２】
［例１６  感染症の局所的シュードモナス火傷モデルにおけるプロトン付加または酸性化された核酸の有効性］
プロトン付加または酸性化された核酸は、免疫障害を持つマウスにおける局所的な皮膚感染症を処置するのに薬効を示している。火傷に先立って、マウスにシクロホスファミド（２００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）を投与して、その免疫システムを阻害した。３日後に火傷を負わせた。局所的にその火傷部位に緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）を１０９ＣＦＵの量だけ付与して、感染症を引き起こした。感染後４時間目と８時間目に核酸による処置を行った。この実験において用いた核酸は、ｐＨ１．５で、配列番号３の配列を有し、２’−Ｏ−メチル置換リボヌクオチド類を含んでなり、ホスホジエステル結合を有し、５’末端と３’末端の両方においてブタノールにより末端遮断してあった。９０％の処置された動物は生き残り、全身的なシュードモナス感染症は有していなかったが、対照動物の９０％が全身的な感染症を引き起こし、死亡した。プロトン付加または酸性化された核酸は、局所的な感染症を治療できた。さらに、核酸の局所的な使用により、シュードモナス菌からの感染が死に至る全身的な感染症を進展させることを押さえる。
【０１６３】
［例１７  全身シュードモナス菌火傷感染症におけるプロトン付加または酸性化された核酸の治療の有効性］
マウスに、皮膚火傷を起こした後、１０6または１０7ＣＦＵの緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）を皮下で処置した。感染の２時間後、酸性化された核酸による治療を開始した。40％の服用量は点滴にて投与され残りは皮下投与された。実験に使われた核酸は、pH1.5で、配列番号３であり、ホスホジエステル結合され、5'末端と3'末端の両方で末端をブタノールにて遮断（ブロック）された、2'-O-メチル置換リボヌクレオチドであった。処置は6時間後にこうり返された。2日目と3日目に1日2回の皮下注射が行われた。45匹の対照群の動物は１匹を残しすべて死亡したが、35匹の処置マウスのうち、94％が生き残り健康となった。これらの健康なマウスは屠殺され、敗血症の検査を行った。緑膿菌は脾臓、肝臓または血液の中から検出されなかった。
結論としてプロトン付加または酸性化された核酸は、放置しておくと致命的である、全身シュードモナス菌感染症の治療に94％効果的であった。
【０１６４】
［例１８  Ｂ細胞仲介性皮膚炎］
抗炎性オリゴヌクレアチド、OE-2aは配列がCGTGTCAGGAGAAC（SEQ ID No.1）は2'-O-メチル置換リボヌクレオチドを含み、5'および3'の両方で末端が転化T(inverted T)にて遮断（ブロック）されている。OE-2aはヒトPDE４遺伝子を対象とし、35mg/nl（7.7(モル）で、水に溶解され約pH2であり、これを37歳男性の重度の再発性アトピー性皮膚炎患者の治療に使用した。皮膚炎はOE-2aにより根絶された。また今後のアトピー性皮膚炎の再発も完全に排除された。37歳男性は、両前腕の内側が完全に隠れるほどの重度のアトピー性皮膚炎を起こしていた。アトピー性皮膚炎は慢性疾患であり、極度に掻痒の炎症性丘疹に特徴付けられる。炎症反応はBリンパ球によるIgEの過剰生産によって起こる。アトピー性皮膚炎の患者はPDE4のレベルが高いことが報告されている。PDE4を限定して対象にしたアンチセンスオリゴヌクレオチド、OE-2aを左前腕、2〜3インチの部分に塗布した。２番目のオリゴ、OE-1は同じ腕の違う部分に塗布した。OE-1はOE-2a同様の配列を持っているが、バクテリア遺伝子と同一源である。オリゴヌクレオチドは12時間おきに２回塗布された。
【０１６５】
OE-2aは塗布された患部の皮膚炎を治癒させることができた。OE-1は効果がなかった。患者は２回目の処置の前に、OE-2aによる処置から6時間後に掻痒感がなくなったことを報告している。
２番目の腕の処置はOE-2aのみで行われた。これも12時間おきに２回行われた。患者はすべての掻痒感が6時間以内になくなったと述べている。皮膚炎は２回目の処置から12時間以内に完全に治癒した。
この患者は、夏の暑さで発作が起こったものの、２月から１２月にかけ、アトピー性皮膚炎の再発はなかった。
【０１６６】
［例１９  Ｔ細胞仲介性皮膚炎］
約ｐＨ３の35mg/ml（7.7(モル）のOE-2aを、水を媒体として、ウルシ科の植物によるT細胞仲介性接触性皮膚炎の治療に使用した。皮膚炎は2回の処置で完全に治癒し、感染した患者のその他の部分の2次発疹の発生も防いだ。
女性患者は足の裏のいくつかの部分にウルシ科の植物によるかぶれを生じていた。患者はT細胞仲介による過敏症からくる掻痒感を訴えていた。接触性皮膚炎は、発赤、硬結および小嚢に特徴付けられる。抗炎性オリゴであるOE-2aを足の裏に塗布した。１２時間以内に患者は極度の掻痒感がなくなったことに気付いた。OE-2aの２度目の塗布により発赤、硬結および小嚢が消滅した。OE-2aの局所投与は足の裏から明白なウルシかぶれを取り除いただけでなく、この患者の足の裏以外の場所のウルシかぶれによる皮膚炎を防いだことは興味深い。
【０１６７】
［例２０  急性蕁麻疹びまん性反応］
ハチに複数箇所刺された後、約pH7の43.6mg/ml（7.7(モル）のOE-2aを数分以内に塗布することにより、直後また遅延タイプの過敏反応を防ぐことができた。
虫刺されによる重度の蕁麻疹およびびまん反応の病歴を持つ女性患者が腕をハチに複数箇所刺された。患者は極度の痛みでヒステリー症を起こしていた。OE-2aをただちに塗布した。5分以内に患者は落ちつきを取り戻し、痛みも消えた。驚くべきことに刺されてから5分以内にOE-2aの投与をすることにより、直後および遅延タイプの蕁麻疹およびびまん反応をすべて防ぐことができた。
【０１６８】
［例２１  化学物質誘発性皮膚炎］
OE-2aは、一般的な皮膚炎の治療に反応しなかった、化学物質によって誘発された接触性皮膚炎の治療に成功した。
５９歳女性患者がドライクリーニング溶液のついたタートルネックセーターに反応し首に接触性皮膚炎を起こした。患者は１か月間、皮膚科にてコルチゾン、抗生物質、および多種の局所薬を処方された。しかしそれらの処置は、一時的散発的な緩和にしかならず、掻痒および発赤は解消されなかった。今回患者はOE-2aによる局所治療をおこなった。掻痒および発赤は２回の処置で完全に消え、5か月間再発はない。
【０１６９】
［例２２  毒性−皮膚レベルと動物全体］
プロトン付加または酸性化された核酸の毒性を測定した。この初期的な研究に基づいて、プロトン付加または酸性化された核酸は毒性がないことが分かった。
【０１７０】
［方法］
４５匹の動物（マウス、オス、Ｃ５７  Ｂａｌｂ／ｃ）に対してプロトン付加または酸性化した核酸による処理を、皮下的、腹膜内注射により、または、局所的に行った。マウスはランダムに選別されたもので、実験の開始において約６週から８周齢であった（体重２５〜３０ｇ）。マウスは一箱に５匹入れて、食物と水が自由に得られるようにして環境的にコントロールされた部屋に保持した。
【０１７１】
１グループあたり５匹のマウスに、ｐＨ１．５の配列番号３のプロトン付加または酸性化された核酸または水を、１４日にわたって毎日注射した。この核酸は、５’末端と３’末端の両方においてブタノールで端部ブロック（遮断）され、ホスホジエステル結合された2'-O-methyl置換リボヌクレオチド類からなるものであった。処置は、皮下的、腹膜内注射により、または、局所的に行った（下記参照）。
【０１７２】
すべてのマウスは、処置期間中、生存と毒性に関して毎日観察した。最後の注射から２４時間後に剖検を行った。剖検の際には、体内のすべての窩洞と臓器の完全な試験を行った。選択された臓器については固定し、染色して、組織検査評価を行った。所見のまとめは次の通りである。
【０１７３】
［死亡と臨床的兆候］
試験の間、すべてのマウスは活発で、１００ｍｇ／ｋｇの用量においても、異常が見いだされるような臨床的兆候はなかった。本発明のオリゴヌクレオチド類のＬＤ50は、マウスの体重において４００ｍｇ／ｋｇ以上であることが分かった。
【０１７４】
［臨床上の化学的特徴］
試験された臨床上のあらゆる化学的パラメータの中で、肝臓の酵素（アルカリホスファターゼ、ＡＬＴ，ＡＳＴ）と全ビリルビンレベルについての異常はなかった。平均の血清アルカリホスファターゼ、ＡＬＴ、ＡＳＴのレベルは、ビヒクル（賦形剤）対照値に比べて有意な差は見られなく、中毒の証拠はなかった。間接的ビリルビン値および直接的ビリルビン値は、ビヒクルにより処置された対照の値と違わず、腎性または肝性の異常は見られなかった。
【０１７５】
［グロス剖検］
試験の間、最も高い核酸の用量においても、注射の部位において明らかな所見はなく、関連する局所的な炎症は見られなかった。いかなる臓器の拡大また剖検の可視的な所見はなかった。特に、１４日間連続しての１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量においても、対照の動物と比較して、脾臓、肝臓、腎臓の拡大はなかった。幾つかの異なる組織について作成したスライドの病理組織学的な試験によっても、処置した動物と対照の動物との間で差異は見られなかった。
【０１７６】
まとめると、主要な結果は次のようなものである。
（１）処置したグループと対象のグループの間で、いかなる酵素レベルの有意な増大もなかった。
（２）オリゴ類により処置されたどの動物にも大きな異常の兆候は見られなかった。
（３）試験の間すべての動物は健康であり、機敏であった。
（４）いかなる経路（皮下的、腹膜内注射、局所的）によっても似たような結果が得られた。
【０１７７】
本発明を特定の実施例について説明してきたが、当業者は種々の変更と均等物による置換を、本発明の精神と範囲をはずれることなく行いうることを理解しており、さらに、特定の状況、材料、組成、方法、処置ステップを、本発明の精神と範囲に合わせるために多くの改変を行いうる。全てのそのような改変は添付の本発明の請求の範囲にはいることが意図されている。
【図面の詳細な説明】
【図１】  図１は、2'-O-メチル基を有する本発明の核酸において使用される核酸の化学構造を示す。
【図２】  図２は、2'-メトキシエトキシ基を有する本発明の核酸において使用される核酸の化学構造を示す。
【図３】  図３は、2'-フッ素を有する本発明の核酸において使用される核酸の化学構造を示す。
【図４】  図４は、2'-O-メチル基を有する本発明の核酸において使用される硫黄核酸の化学構造を示す。
【図５】  図５は、2'-O-メチル基を有する本発明の核酸において使用されるホスホルアミデート(phosphoramidate)核酸の化学構造を示す。
【図６】  図６は、本発明の好ましい態様の二つのモノマーを示す。
【図７】  図７は、本発明の酸に対して安定な末端がブロックされたポリマーの一例を示す。
【図８】  図８は、本発明の酸に対して安定な末端がブロックされたポリマーの好ましい態様を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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