(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つまたは３つのポリヌクレオチドプローブの組であって、前記プローブは、配列番号１もしくは２または配列番号１もしくは２に対して９０％より高い同一性を有するヌクレオチド配列、あるいはＴがＵによって置き換えられているそれらのＲＮＡ形態、あるいはそれらの相補形態に特異的にハイブリダイズし、前記プローブは少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有し、前記プローブ間には２５個以下のヌクレオチドが存在するものであって、配列番号２９および６８；３４および６９；３５および７３；５３および６９；５３および７２；５５および７３；５６および７３；８２および７３；３６、５６および７３；３６、８２および７３からなる群より選択される、Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の同定のためのポリヌクレオチドプローブの組。
【請求項２】
請求項１記載のポリヌクレオチドプローブの組を含んでなる、組成物。
【請求項３】
（ｉ）サンプル中のポリ核酸と、請求項１に記載したポリヌクレオチドプローブの組とをハイブリダイズさせる工程、
（ｉｉ）形成されたハイブリッドを検出する工程、ならびに
（ｉｉｉ）得られたシグナルを解釈し、サンプル中のＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）種の存在を推定する工程、
を含んでなる、サンプル中のＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）種の検出および／または同定のための方法。
【請求項４】
工程（ｉ）の前に、サンプル中のポリ核酸を遊離、単離および／または濃縮する工程をさらに含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
工程（ｉ）の前に、少なくとも１つのプライマー対で、１６Ｓ〜２３Ｓ  ｒＲＮＡスペーサー領域、あるいは標的配列を含んでなるフラグメント、または標的配列もしくはそのフラグメントを増幅する工程をさらに含み、該プライマー対が配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０または１１およびそれらの配列に対して９０％より高い同一性を有するヌクレオチド配列よりなる群から選択される順方向ポリヌクレオチド、ならびに配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１およびそれらの配列に対して９０％より高い同一性を有するヌクレオチド配列よりなる群から選択される逆方向ポリヌクレオチドの組み合わせよりなる、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
以下の成分：
・請求項１記載の２つまたは３つのポリヌクレオチドプローブの組
・ハイブリダイゼーション緩衝液、または前記緩衝液を生成するのに必要な成分
を含んでなる、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の検出および／または同定のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＩＴＳ（転写領域内部のスペーサー）領域から誘導される新規核酸配列を使用する、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはエンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）の特異的検出ならびに／あるいは同定のための方法に関する。
【０００２】
本発明はまた、生物学的サンプルにおいて、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはエンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）の特異的検出ならびに／あるいは同定のために使用すべき１６Ｓおよび２３Ｓリボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）またはｒＲＮＡ遺伝子間のＩＴＳ領域から誘導される前記新規の核酸配列に関する。
【０００３】
それはまた、サンプル中のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の前記スペーサー領域の増幅のために使用すべき核酸プライマーにも関する。
【０００４】
背景技術
エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属は、現在、２７種の記載された種を含む。ヒトの臨床的見地から、Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）は、最も重要な種であり：Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、およびＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）は一緒になって、すべての腸球菌院内感染のうち９５％を構成し、それぞれ８０〜９０％および５％〜１０％分布している。時折、Ｅ．カセリフラバス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）およびＥ．ガリナルム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）が単離される。
【０００５】
腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）は、先天的および後天的抗生物質耐性のため、処置が困難となっている感染の共通の原因として認識されることが多くなっている。
【０００６】
病院ならびに共同体内におけるＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の効果的な制御は、感染患者の早期診断を含む、言い換えれば、スクリーニングの工程を含むより積極的な手段を必要とする。
【０００７】
さらに、最近記載された種のいくつかは、同定のために現在まで使用されてきた表現型の特徴に適合しない。従って、より感受性の高い、かつより特異的なプローブおよび／またはプライマーを使用する検出ならびに／あるいは同定のより迅速な方法を提供する必要性および緊急性がある。
【０００８】
発明の概要
本発明の目的は、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の検出ならびに／あるいは同定のために使用することができるエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種のＩＴＳの特定の領域から誘導される新規核酸配列を提供することである。
【０００９】
従って、本発明は、配列番号１もしくは２、前記配列番号１もしくは２のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、前記配列番号１もしくは２の相補形態、または任意の相同物よりなる単離された核酸分子、およびエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の検出および／または同定のための標的としての前記核酸分子の使用を提供する。
【００１０】
本発明の１の態様は、標的として、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の１６Ｓ〜２３Ｓ  ｒＲＮＡスペーサー領域の特定の領域を有し、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはエンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）の検出ならびに／あるいは同定を可能にするプローブおよび／またはプライマーとしての使用のための新規のポリヌクレオチドに関する。
【００１１】
従って、本発明は、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはエンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）の検出ならびに／あるいは同定のための配列番号１もしくは２、または前記配列番号１もしくは２のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、あるいは前記配列番号１もしくは２の相補形態、あるいはその任意の相補配列、あるいはその少なくとも２０個の連続したヌクレオチドのフラグメントに特異的にハイブリダイズする単離された核酸分子を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様は、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはエンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）の検出ならびに／あるいは同定のためのプローブの組に関する。
【００１３】
本発明の別の態様は、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の１６Ｓ〜２３Ｓ  ｒＲＮＡスペーサー領域の特異的増幅を可能にするプライマーに関する。
【００１４】
本発明の目的は、本発明のいずれかの新規の配列、または本発明のプローブおよび／もしくはプライマーのいずれかの新規の組；あるいはそれらの組み合わせを含有する組成物である。
【００１５】
本発明の別の目的は、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはエンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）の検出ならびに／あるいは同定のために、前記プローブおよび／またはプライマーが使用されるキットである。
【００１６】
本発明の別の目的は、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはエンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）の検出ならびに／あるいは同定のための迅速かつ信頼できるハイブリダイゼーション方法である。
【００１７】
本発明の別の目的は、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはエンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）の検出ならびに／あるいは同定のためのリアルタイムＰＣＲに基づくハイブリダイゼーション方法である。
【００１８】
表の説明
表１：配列表。
表２：プライマー対。
表３：プローブの組。
表４：エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種
【００１９】
発明の詳細な記載
以下の説明は、以下に記載の本発明の異なる具体例において使用される用語および表現を例示するのに役立つ。
【００２０】
用語「スペーサー」および「ＩＴＳ」（転写領域内部のスペーサー）は、両方とも、１６Ｓと２３Ｓ  ｒＲＮＡとの間または１６Ｓと２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子との間の領域を指す省略形の用語である。
【００２１】
用語「プローブ」は、検出しようとする標的配列にハイブリダイズするにの十分相補的である配列を有する１本鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。
【００２２】
好ましくは、本発明のプローブは、検出しようとする配列の正確な相補体に７０％、８０％、９０％、または９５％よりも相同である。これらの標的配列は、ゲノムＤＮＡもしくは前駆体ＲＮＡ、またはそれらの増幅されたバージョンのいずれかである。
【００２３】
本発明のプローブは、対応するヌクレオチド配列を含む挿入物を含有する組換えプラスミドのクローニングによって、必要であれば、適切なヌクレアーゼを使用して、クローニングされたプラスミドから該配列を切り出し、例えば、分子量に従う分画によってそれらを回収することにより、形成することができる。
【００２４】
本発明に従うプローブはまた、化学的、例えば、従来のホスホトリエステル法によって合成することもできる。
【００２５】
本明細書で使用する用語「相補的」核酸は、核酸配列が、相互に完全な塩基対形成された二重螺旋を形成することを意味する。
【００２６】
用語「ポリ核酸」、「核酸」、および「ポリヌクレオチド」は、少なくとも５、１０、２０、３０、４０もしくは５０連続ヌクレオチドを含有する２本鎖または１本鎖ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかに対応する。１００ヌクレオチド長より短いポリ核酸は、「オリゴヌクレオチド」と称される。
【００２７】
それらはまた、イノシンなどの修飾されたヌクレオチドまたはそれらのハイブリダイゼーション特徴を本質的に変更しない修飾された基を含有するヌクレオチドを指す。
【００２８】
１本鎖のポリ核酸配列は、本発明においては、常に５’末端から３’末端までとして提示する。
【００２９】
それらはそのままの形、それらの相補形態、またはＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）で使用することができる。
【００３０】
用語「最も緊密な近傍」は、ＤＮＡ相同性について最も緊密に関連することが公知であるかまたは予想され、目的の生物体と区別されるべきタクソン（taxon）を意味する。
【００３１】
表現「タクソン特異的ハイブリダイゼーション」または「タクソン特異的プローブ」は、プローブが、それが設計されたタクソン由来のＤＮＡまたはＲＮＡにのみハイブリダイズし、他のタクソン由来のＤＮＡまたはＲＮＡにはハイブリダイズしないことを意味する。
【００３２】
タクソンという用語は、完全な属または属内のサブグループ、種または種内のサブタイプ（亜種、血清型、配列型（ｓｅｑｕｅｖａｒ）、生物型．．．）を指すことができる。
【００３３】
用語「特異的増幅」または「特異的プライマー」は、前記プライマーが、それらが設計されたこれらの生物体由来のスペーサー領域のみを増幅し、他の生物体由来のスペーサー領域は増幅しないという事実を指す。
【００３４】
用語「感受性」は、偽陰性の数を指し：即ち、検出すべき１００株のうち１株が見過ごされる場合、試験は（１００−１／１００）％＝９９％の感受性である。
【００３５】
用語「特異性」は、偽陽性の数を指し：即ち、検出された１００株に対し、２株は、試験が設計されていない生物体に属するように思われる場合、試験の特異性は（１００−２／１００）％＝９８％である。
【００３６】
「優先的」であるとして選択されるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、８０％を超える、好ましくは９０％を超えるおよび最も好ましくは９５％を超える感受性ならびに特異性を示す。
【００３７】
用語「固体支持体」は、ポリヌクレオチドプローブを結合させることができる任意の基体を指すことができるが、但し、それは、そのハイブリダイゼーション特性を保持し、そしてハイブリダイゼーションのバックグランドレベルは低いままである。通常、固体支持体は、マイクロタイタープレート、膜（例えば、ナイロンもしくはニトロセルロース）または微小球（ビーズ）である。膜への適用または固定化の前に、固定化を容易にするかまたはハイブリダイゼーション効率を改善するためには、核酸プローブを修飾することが簡便であり得る。そのような修飾は、ホモポリマーテーリング、脂肪族基、ＮＨ２基、ＳＨ基、カルボキシル基などの異なる反応基とのカップリング、またはビオチン、ハプテンもしくはタンパク質とのカップリングを包含し得る。
【００３８】
用語「標識された」は、標識された核酸の使用を指す。標識化は、サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら（１９８８）またはベジュ（Ｂｅｊ）ら（１９９０）によって例示されるような増幅のポリメラーゼ工程中に組み入れられた標識されたヌクレオチドの使用または標識されたプライマーの使用、または当業者に既知の他の任意の方法によって行うことができる。標識の性質は、同位体（３２Ｐ、３５Ｓなど）であってもまたは非同位体（ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光染料、ビオチン、酵素など）であってもよい。
【００３９】
用語「シグナル」は、一連の電磁波（例えば、蛍光）、または情報を担持する電流の変化を指す。シグナルは、直接目視することができるか、あるいは異なる手段またはデバイスによって可視化および／もしくは解釈可能にすることができる。
【００４０】
「サンプル」は、生物学的材料であってもよい。この生物学的材料は、感染したヒト、動物から直接、または培養もしくは富化後に、または食物、環境などから採取することができる。
【００４１】
生物学的材料は、例えば、任意の種類の喀出物、気管支洗浄物、血液、皮膚組織、生検、リンパ球血液培養材料、コロニーなどであってもよい。前記サンプルは、当該分野において公知である任意の技術に従って調製または抽出することができる。
【００４２】
本発明の意味において臨床的に関連性のあるエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種は、Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、Ｅ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．アビウム（Ｅ．ａｖｉｕｍ）、Ｅ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）、Ｅ．コルムバエ（Ｅ．ｃｏｌｕｍｂａｅ）、Ｅ．デュランス（Ｅ．ｄｕｒａｎｓ）、Ｅ．フラベセンス（Ｅ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、Ｅ．ヒラエ（Ｅ．ｈｉｒａｅ）、Ｅ．マロドラツス（Ｅ．ｍａｌｏｄｏｒａｔｕｓ）、Ｅ．ムンドチ（Ｅ．ｍｕｎｄｔｉｉ）、Ｅ．シュードアビウム（Ｅ．ｐｓｅｕｄｏａｖｉｕｍ）、Ｅ．ラフィノサス（Ｅ．ｒａｆｆｉｎｏｓｕｓ）、Ｅ．カセリフラバス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、Ｅ．ガリナルム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）である（表４）。
【００４３】
ＩＴＳは、いくつかのエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種について既に公知である。
【００４４】
さらなる研究では、異なるエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の全ゲノム配列決定により、それらの生物体が、それらのゲノムにおける５または６つのリボソームＲＮＡオペロンで含有することが示されている。
【００４５】
特に、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種内では、Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）株は、２つの異なるタイプのスペーサーを示し、Ｅ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株は、４つの異なるタイプを示す。
【００４６】
この極めて高い多様性によって発生する問題を解決するために、本発明は、すべてのエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、臨床的に関連するすべてのエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、より詳細にはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の検出ならびに／あるいは同定のための独特な標的配列を付与するその大きな利点について同定され、範囲設定されたＩＴＳの特定の領域を提供する。
【００４７】
実際、すべてのエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、臨床的に関連するすべてのエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種のすべてのタイプのスペーサーにおいて、本発明の標的配列が認められることを見出した。
【００４８】
ＩＴＳのこの特定の領域はまた、「標的領域」または「標的配列」とも呼ばれ、配列番号１もしくは配列番号２よりなる核酸配列、または配列番号１もしくは２に相同である核酸分子、それらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、あるいはそれらの相補形態として規定することができる。
【００４９】
用語「標的配列」は、任意のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種のＩＴＳにおいて見出されるすべての相同配列を含み、以後、前記相同配列はまた、本明細書において「相同物」と称する。次いで、相同性の程度は、７５％より高い、一般的に、８０％より高い、さらに９０％より高い。
【００５０】
本発明の体系において、次いで、「相同物」は、配列番号１もしくは２または任意のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種のＩＴＳ領域に位置するその任意のフラグメントに対する相同配列であり、配列番号１および２は、それぞれＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）およびＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株に由来する。
【００５１】
エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の検出ならびに／あるいは同定のために標的配列から設計されるプローブおよび／またはプライマーとしての使用のための新規のポリヌクレオチドもまた、本発明の目的である。
【００５２】
言い換えれば、本発明の目的は、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の検出ならびに／あるいは同定のために本発明の標的配列とハイブリダイズするプローブおよび／またはプライマーとしての使用のための新規のポリヌクレオチドに関する。
【００５３】
特に、本発明の目的は、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の検出ならびに／あるいは同定のための、配列番号１もしくは２、または前記配列番号１もしくは２のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、あるいは前記配列番号１もしくは２の相補形態、あるいはその少なくとも２０個の連続したヌクレオチドのフラグメント、あるいはそれらのいずれかの相同物に特異的にハイブリダイズする単離された核酸分子である。
【００５４】
好適なポリヌクレオチドプローブは、約５〜約５０塩基長、より好ましくは、約１０〜約２５ヌクレオチドの間であり、標的配列に十分に相同である。
【００５５】
配列番号３〜８４のポリヌクレオチドおよびそれらの任意の相同物は、プローブとして使用することができる。
【００５６】
好適なプローブは、配列番号２２〜２６、２８〜４３、４５〜６５および６７〜８４のポリヌクレオチド、ならびに相同物、特に配列番号２８〜３６、４５〜５８、６７〜８４のポリヌクレオチドである。
【００５７】
本発明の好適なプライマーは、本発明の標的配列の合成の開始点として作用することが可能である１本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドである。本発明のプライマーの長さおよび配列は、それらが、伸張産物の合成を誘導（ｐｒｉｍｅ）することが可能であるようなものでなければならない。
【００５８】
好ましくは、本発明のプライマーは、約５〜約５０ヌクレオチド長、好ましくは約１５〜約２５ヌクレオチド長である。その特定の長さならびに配列は、温度およびイオン強度などの使用条件に依存して選択されるべきである。
【００５９】
本発明の好適なプライマーは標的配列を増幅する。言い換えれば、本発明の好適なプライマーは、配列番号１もしくは配列番号２および／または相同物を増幅する。
【００６０】
本発明の好適なプライマーは、配列番号３〜１０および１２〜２０のポリヌクレオチド、ならびに相同物である。
【００６１】
増幅プライマーは、適切な増幅を保障するためには、対応するテンプレート配列に正確に一致する必要はないという事実が、参考文献（クウォク（Ｋｗｏｋ）ら、１９９０）に詳細に記載されている。
【００６２】
使用される増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、１９８８）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；ランドグレン（Ｌａｎｄｇｒｅｎ）ら、１９８８；ウー（Ｗｕ）＆ウォーレス（Ｗａｌｌａｃｅ）、１９８９；バーラーニ（Ｂａｒａｎｙ）、１９９１）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ；グアテリ（Ｇｕａｔｅｌｌｉ）ら、１９９０；コンプトン（Ｃｏｍｐｔｏｎ）、１９９１）、転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ；クウォホ（Ｋｗｏｈ）ら、１９８９）、鎖置換増幅（ＳＤＡ；ダック（Ｄｕｃｋ）、１９９０；ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、１９９２）もしくはＱβレプリカーゼによる増幅（リザーディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、１９８８；ローメリ（Ｌｏｍｅｌｉ）ら、１９８９）または当該分野において既知の核酸分子を増幅するための他の任意の適切な方法のいずれかであり得る。
【００６３】
プライマーまたはプローブとしての使用のための本発明の好適なポリヌクレオチドを表１に列挙する。
【００６４】
本発明のポリヌクレオチドは、１つもしくは数個のヌクレオチドのそれらの任意の代表的末端への付加または除去、あるいは前記配列内の１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの変更、あるいはそれらの両方の組み合わせによって、表１において特定されたいずれのポリヌクレオチド、またはそれらの相同物と配列が異なっていていもよいが、但し、次いで得られる等価物はなお、対応する修飾されていないポリヌクレオチドとして標的配列とハイブリダイズする。前記等価なポリヌクレオチドは、対応する修飾されていないポリヌクレオチドと少なくとも７５％相同性、好ましくは８０％を超える、より好ましくは８５％を超える相同性を共有する。
【００６５】
ポリヌクレオチドの等価物を使用する場合、対応する修飾されていないポリヌクレオチドと同じ特異性を得るために、ハイブリダイゼーション条件を修飾する必要があり得る。
【００６６】
結果として、ポリヌクレオチドを同じ条件下の組で使用すべき場合、従って、他のポリヌクレオチドの配列を修飾する必要があり得る。これらの修飾は、例えば、ヘイムズ  Ｂ（Ｈａｍｅｓ  Ｂ）およびヒギンズ  Ｓ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ）（編）：Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，１９８５などの当該分野において公知の原理に従って行うことができる。
【００６７】
本発明のポリヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブもまた、ホスホロチオエート（マツクラ（Ｍａｔｓｕｋｕｒａ）ら、１９８７）、アルキルホスホロチオエート（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、１９７９）またはペプチド核酸（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、１９９１；ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、１９９３）を含んでなり得るか、あるいは挿入剤（アッセライン（Ａｓｓｅｌｉｎｅ）ら、１９８４）などを含有し得る。
【００６８】
修飾されたプライマーまたはプローブは、要求される特異性および感受性を得るためにそれらが使用される条件に関する適応性を必要とする。しかし、ハイブリダイゼーションの結果は、修飾されていないポリヌクレオチドで得られる結果と本質的に同じものであるべきである。
【００６９】
これらの修飾の導入は、ハイブリダイゼーション動力学、ハイブリッド形成の可逆性、ポリヌクレオチド分子の生物学的安定性などのいくつかの特性に影響を及ぼすために有利であり得る。
【００７０】
本発明のプローブおよびプライマーは、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の検出ならびに／あるいは同定のための本発明の方法、また目的において使用される。
【００７１】
標的配列の検出および／または同定は、電気泳動方法、ハイブリダイゼーション方法もしくは配列決定方法を使用することによって実施することができる。
【００７２】
サンプル中の１種もしくはそれ以上のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の検出のための本発明の方法は、以下の工程：
・第１に、必要であれば、サンプル中に存在する核酸を、増幅および／またはハイブリダイゼーションに利用可能な状態にする。
・第２に、また必要であれば、核酸が存在するならば、以下に記載のように、１つもしくは別の標的増幅システムで増幅する。通常、増幅は、以後のハイブリダイゼーションシグナルを増強するのに必要である。しかし、いくつかのサンプル、またはいくつかの高感度シグナル増幅システムでは、増幅は必要ないかもしれない。
・第３に、サンプル中に存在する核酸または得られる増幅された産物をプローブと接触させ、ハイブリダイゼーションを進行させる。
・最後に、都合の良い、かつ適合性のある検出システムを使用して、ハイブリッドを検出する。
を含んでなる。観察されるハイブリダイゼーションシグナルまたはパターンから、１種もしくはいくつかの種のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の有無を推測することができる。
【００７３】
使用される増幅システムは、必要とされる特定のアプリケーションに依存して、多かれ少なかれ普遍的であり得る。
【００７４】
ｒＲＮＡスペーサーの保存されたフランキング領域（１６Ｓおよび２３Ｓ遺伝子）に位置する普遍的プライマーを使用することによって、腸球菌由来のすべてではないがほとんどの生物体のスペーサー領域が増幅される。
【００７５】
いくつかのアプリケーションでは、サンプル中に存在するすべての生物体ではないが、１種もしくはいくつかの種のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種を増幅することが適切であり得る。これは、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の標的領域に位置する特異的プライマーを使用して達成することができる。
【００７６】
特に、サンプル中のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、とりわけ、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはエンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）の検出ならびに／あるいは同定のための本発明の方法は、
（ｉ）必要であれば、サンプル中のポリ核酸を遊離、単離および／または濃縮する工程；
（ｉｉ）必要であれば、少なくとも１つの適切なプライマー対で、１６Ｓ〜２３Ｓ  ｒＲＮＡスペーサー領域、あるいは標的配列を含んでなるフラグメント、または標的配列もしくはそのフラグメントを増幅する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉ）または（ｉｉ）のポリ核酸と、標的配列（ここで、標的配列は、配列番号１もしくは２またはその相同物よりなる）、あるいはそれらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、あるいはそれらの相補形態、あるいはその少なくとも２０個の連続したヌクレオチドのフラグメントにハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせる工程、
（ｉｖ）形成されたハイブリッドを検出する工程、ならびに
（ｖ）得られるシグナルを解釈し、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の存在を推定し、および／またはサンプル中のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種を同定する工程、
を含んでなる。
【００７７】
好ましくは、本発明のプローブは、高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。
【００７８】
高いストリンジェンシー条件下では、相補的核酸ハイブリッドのみが形成される。従って、アッセイ条件のストリンジェンシーは、ハイブリッドを形成する２つの核酸鎖間に必要な相補性の量を決定する。ストリンジェンシーは、標的および非標的核酸により形成されるハイブリッド間の安定性の差異を最大にするために、選択される。
【００７９】
ハイブリダイゼーション条件は、本発明のポリヌクレオチドが標的配列に特異的にハイブリダイズする場合に得られるハイブリダイゼーションのシグナルが、前記ポリヌクレオチドが非特異的様式で標的配列にハイブリダイズする場合に得られるシグナルと異なるような方法で選択される。
【００８０】
実際には、例えば、標的に対する特異的ハイブリダイゼーションにより、標的配列に対する非特異的ハイブリダイゼーションと比較して、シグナルの強度が２倍、５倍、１０倍もしくはそれ以上の強度である（例えば、ＬｉＰＡシステム）場合、異なるシグナルが可視化され得る。
【００８１】
融解曲線解析において異なるピークが描かれる場合、例えば、リアルタイムＰＣＲ方法を使用する場合にも、異なるシグナルが可視化され得る。
【００８２】
本発明の任意の方法の増幅またはハイブリダイゼーション工程において言及されるフラグメントは、配列番号１または２あるいは任意の相同物の２０〜５０、２０〜８０もしくは２０〜１００連続ヌクレオチドを含んでなり得る。
【００８３】
１つの具体例では、サンプル中に潜在的に存在する標的配列の検出に極めて都合良く、かつ有利な技術は、リアルタイムＰＣＲである。
【００８４】
増幅されたＤＮＡの検出のための異なる形式、とりわけタックマン（ＴａｑＭａｎ）ＴＭプローブ、モレキュラー・ビーコンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）プローブ、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブが存在する。
【００８５】
タックマン（ＴａｑＭａｎ）ＴＭプローブに関して、１本鎖ハイブリダイゼーションプローブは２つの成分で標識される。蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従い、第１の成分、いわゆる蛍光剤を適切な波長の光で励起する場合、吸収されたエネルギーが第２の成分、いわゆる消光剤に移動する。ＰＣＲ反応のアニーリング工程中、ハイブリダイゼーションプローブは標的ＤＮＡに結合し、伸張相中、ポリメラーゼ、例えば、タック・ポリメラーゼ（Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって消化される。結果として、励起された蛍光成分および消光剤は、空間的に相互に離れており、従って、第１の成分の蛍光放射を測定することができる（ＥＰ  Ｂ  ０  ５４３  ９４２号および米国特許第５，２１０，０１５号明細書）。
【００８６】
モレキュラー・ビーコンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）プローブに関して、プローブもまた、第１の成分および消光剤で標識され、標識は、好ましくは、少なくとも部分的に自己相補的なプローブの異なる末端に位置する。プローブの２次構造の結果として、両方の成分は、溶液において空間的に近接する。適切な波長の光による励起後、第１の成分の蛍光放射を測定することができるように、標的核酸のハイブリダイゼーション後、両方の成分は相互に分離される（米国特許第５，１１８，８０１号明細書）。
【００８７】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ハイブリダイゼーションプローブ試験形式は、すべての種類の相同ハイブリダイゼーションアッセイに特に有用である（マシューズ，Ｊ．Ａ．（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｊ．Ａ．）およびクリッカ，Ｌ．Ｊ．（Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｊ．）、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １６９（１９８８）１−２５）。それは、同時に使用され、（増幅される）標的核酸の同じ鎖の隣接部位に相補的である２つの１本鎖ハイブリダイゼーションプローブを特徴とする。両方のプローブは、異なる蛍光成分で標識される。適切な波長の光で励起される場合、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従い、両方のハイブリダイゼーションプローブが検出しようとする標的分子の隣接位置に結合する場合にのみ、第２の成分の蛍光放射を測定することができるように、第１の成分は吸収されたエネルギーを第２の成分に伝達する。
【００８８】
標的配列に対してアニールされる場合、ハイブリダイゼーションプローブは、頭尾整列で相互に極めて近傍に位置しなければならない。通常、第１のプローブの標識された３’末端と第２のプローブの標識された５’末端との間の間隙はできるだけ小さく、とりわけ、約０〜２５塩基、好ましくは約１〜約５塩基よりなる。このことは、典型的に１０〜１００オングストロームであるＦＲＥＴ供与化合物およびＦＲＥＴ受容化合物の緊密な接近を可能にする。
【００８９】
あるいは、ＦＲＥＴ受容化合物の蛍光の増加をモニターするために、ハイブリダイゼーション事象の定量測定としてＦＲＥＴ供与化合物の蛍光減少をモニターすることも可能である。
【００９０】
リアルタイムＰＣＲの分野において公知のすべての検出形式の間で、ＦＲＥＴ−ハイブリダイゼーションプローブ形式は、高感度、正確かつ信頼できることが証明されている（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット；国際公開第９７／４６７１２号パンフレット；国際公開第９７／４６７１４号パンフレット）。なお、適切なＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ配列の設計は、時々、検出しようとする標的核酸配列の空間的特徴によって制限され得る。
【００９１】
２つのＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの使用に対する代替物として、蛍光標識プライマーおよびただ１つの標識されたポリヌクレオチドプローブを使用することも可能である（バーナード，Ｐ．Ｓ．（Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｐ．Ｓ．）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５（１９９８）１０１−７）。このことに関して、プライマーをＦＲＥＴ供与またはＦＲＥＴ受容化合物のいずれで標識するかを任意に選択することができる。
【００９２】
融解曲線解析のために、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（ハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）またはＦＲＥＴ−プローブ）を使用することもできる（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット；国際公開第９７／４６７１２号パンフレット；国際公開第９７／４６７１４号パンフレット）。そのようなアッセイでは、標的核酸は、最初に、適切な増幅プライマーにより典型的なＰＣＲ反応において増幅される。ハイブリダイゼーションプローブは、増幅反応中、常に存在し得るかまたはその後添加され得る。ＰＣＲ反応の完了後、サンプルの温度は連続して増加する。蛍光は、ハイブリダイゼーションプローブが標的ＤＮＡに結合する限り検出される。融解温度で、ハイブリダイゼーションプローブはそれらの標的から遊離し、蛍光シグナルはバックグランドレベルにまで直ちに減少する。この減少は、１次導関数（ａ  ｆｉｒｓｔ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）の負の値が計算できるように、適切な蛍光対温度−時間プロットでモニターされる。次いで、そのような関数の得られる最大値に対応する温度の値を、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの前記の対の決定された融解温度として採用する。
【００９３】
標的核酸内の点変異または多型は、標的核酸とＦＲＥＴプローブとの間の１００％未満の相補性を生じ、従って、融解温度の減少を生じる。このことは、ＦＲＥＴ−ハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）ハイブリダイゼーションによる配列変異体のプールの共通検出を可能にする一方、以後、前記プールの異なるメンバーは、融解曲線解析を実施することによって、識別され得る。
【００９４】
ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの代わりに、融解曲線解析のためにモレキュラー・ビーコンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）を代替的に使用してもよい。
【００９５】
リアルタイムＰＣＲおよび相同なリアルタイムＰＣＲ融解曲線解析の利用可能であるとき、サイバーグリーン（ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ）ＴＭＩなどの２本鎖ＤＮＡ結合染料か、または代替的に、異なるが類似の標的配列にハイブリダイズするように特異的に設計されたハイブリダイゼーションプローブのいずれかを使用して、特定のタイプの種または株の識別は可能になった。
【００９６】
第１の場合、作製された２本鎖ＰＣＲ産物の融解温度を決定しなければならない。なお、配列の変動が少ないとわずかな融解温度の差異しか生じないことから、少量の差異を効率的にモニターすることができないため、この方法は極めて限られた用途しか有さない。
【００９７】
あるいは、プローブ／標的核酸ハイブリッドの融解温度が決定されるような方法で、ハイブリダイゼーションプローブを使用してもよい。
【００９８】
ＡＢＩ／ＰｒｉｓｍＴＭ設備、特にライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）ＴＭ装置などの異なるリアルタイムＰＣＲプラットフォームが存在し、それらはすべて、光放射を測定すること、融解サイクル中の放射ピークを連続的にモニターすること、および標識されたプローブが増幅産物から分離する温度（融解ピーク）を可視化することよりなる同じ原理に基づく。プローブと標的との間のミスマッチは、融解の動力学に影響を及ぼし、目的のそれぞれの種に対して異なる融解ピークを生じるため、融解ピークデータは、特定の［プローブ：標的］配列の特徴である。
【００９９】
ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）ＴＭプラットフォームは、多くの利点、特に、時間を稼ぐことおよびハイブリダイゼーションプローブ（ハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ））、タックマン（ＴａｑＭａｎ）ＴＭプローブ、モレキュラー・ビーコンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）およびビプローブ（ｂｉｐｒｏｂｅ）（サイバー・グリーン（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ）Ｉ）などのいくつかの異なる配列特異的蛍光プローブ検出システムの可能な使用を付与する。
【０１００】
本発明の好適な方法では、頭部から尾部への方向で、数ヌクレオチド、一般に、０〜２５個、好ましくは、約１〜約５個のヌクレオチドによって間隔を置かれた、本発明の標的領域から誘導される２つの隣接するポリヌクレオチドプローブよりなるハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）システムが使用される。プローブの一方は、供与染料によって３’末端で標識され、他方は、５’末端で受容分子により標識され、（プライマーとして作用することを防止するために）３’末端でリン酸ブロックされる。供与染料は、一般にフルオレセインであり、受容分子は、一般にＬＣレッド（ＬＣ  Ｒｅｄ）６４０または７０５である。
【０１０１】
本発明の標的配列の検出は、内部標識ＰＣＲ鎖および対向鎖に位置する検出プローブによっても達成することができる。シグナルは、染料の空間的接近に依存し、標的の量に依存する。
【０１０２】
両プローブがそれらの標的配列にハイブリダイズされる場合、供与体の放射光は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって、受容体フルオロフォアに移動し、放射された蛍光（６４０または７０５ｎｍ）を検出することができる。放射された蛍光の強度は、標的ＤＮＡ、増幅の産物と平行して増加する。
【０１０３】
ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）プローブは、加水分解を必要とせず、従って、ＰＣＲ時間（アニーリング−伸張≦１２秒間）のさらなる延長を必要としない点で、タックマン（ＴａｑＭａｎ）ＴＭプローブよりも有利である。従って、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）の高速熱サイクルを利用し、わずか４５分間でＰＣＲプログラムを完了することが可能である。
【０１０４】
そして、このリアルタイムＰＣＲフラットフォームの極最近の世代は、単一反応においていくつかのプローブをモニターすることが可能であり、種レベルおよびより低い分類学的レベルでの異なる腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）の検出ならびに／あるいは同定を可能にする。
【０１０５】
さらに、タックマン（ＴａｑＭａｎ）技術のために設計された方法は、等価な結果を伴うハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）技術に容易に変換することができることが明らかにされている（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ８５巻（１２）１２４８〜１２５４頁、２０００年１２月）。
【０１０６】
従って、本発明の別の目的は、ハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）とも称される少なくとも２つのポリヌクレオチドプローブの組に関し、両方のハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）は、前記２つのハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）間が２５ヌクレオチド以下、好ましくは、１０ヌクレオチド以下、特に５ヌクレオチド以下で相互に隣接する同じ標的配列にハイブリダイズする。
【０１０７】
２つのハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）が存在する場合、２つのハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）の標的配列とのハイブリダイゼーションにおいて、供与体および受容体フルオロフォアが相互に０〜２５ヌクレオチド内、好ましくは、相互に０〜５ヌクレオチド内にあるように、一方は、受容体フルオロフォアで標識され、他方は、蛍光エネルギー移動対の供与体フルオロフォアで標識される。
【０１０８】
２を超えるハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）が存在する場合、ハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）の標的配列とのハイブリダイゼーションにおいて、供与体および受容体フルオロフォアが相互に０〜２５ヌクレオチド内、好ましくは、相互に０〜５ヌクレオチド内にあるように、いくつかは、受容体フルオロフォアで標識され、他方は、蛍光エネルギー移動対の供与体フルオロフォアで標識される。
【０１０９】
エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、臨床的に関連するエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種を検出および／または同定するために、少なくとも２つのポリヌクレオチドプローブの組を使用することができ、前記プローブは配列番号１もしくは配列番号２、または前記配列番号１もしくは２のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、または前記配列番号１もしくは２の相補形態、あるいは相補物にハイブリダイズし、ここで、前記プローブ間に２５以下のヌクレオチド、好ましくは５以下のヌクレオチドが存在する。
【０１１０】
本発明のプローブの組はまた、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれ以上のプローブよりなり、好ましくは、それは２〜５つのプローブ、より好ましくは３つのプローブよりなる。
【０１１１】
表３に列挙したプローブの組およびそれらの相同物は本発明の好適な組である。
【０１１２】
２つのポリヌクレオチドの組（一方はプライマーとしての使用のためであり、他方はプローブとしての使用のためである）も使用することができ、前記プライマーおよびプローブの両方は、配列番号１もしくは配列番号２、前記配列番号１もしくは２のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、前記配列番号１もしくは２の相補形態、または相補物よりなる標的配列にハイブリダイズし、ここで、前記プライマーおよび前記プローブ間に２５以下のヌクレオチド、好ましくは５以下のヌクレオチドが存在する。
【０１１３】
本発明の少なくとも２つのポリヌクレオチドの組は、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の検出ならびに／あるいは同定のための方法に使用される。
【０１１４】
サンプル中のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の検出および／または同定のための本発明の方法は：
（ｉ）必要であれば、サンプル中のポリ核酸を遊離、単離および／または濃縮する工程；
（ｉｉ）少なくとも１つの適切なプライマー対で、１６Ｓ〜２３Ｓ  ｒＲＮＡスペーサー領域、または標的配列、または標的配列を含んでなるスペーサーの部分、または標的配列の部分を増幅する工程；
（ｉｉｉ）ポリ核酸と標的配列にハイブリダイズする少なくとも２つのハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）の少なくとも１つの組とをハイブリダイズさせる工程であって、
ここで、標的配列は、配列番号１もしくは２、または前記配列番号のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、または前記配列番号の相補形態、あるいは任意の相補物、あるいはその少なくとも２０個の連続したヌクレオチドのフラグメントよりなる上記工程、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において形成されたハイブリッドを検出する工程、
（ｖ）工程（ｉｖ）において得られる特異なハイブリダイゼーションシグナルから、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の存在を推定し、またはサンプル中のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種を同定する工程、
を含んでなる。
【０１１５】
例えば、増幅工程において使用されるプライマー対は、配列番号３〜１１またはそれらの相同物よりなる順方向プライマー、および配列番号１２〜２１またはそれらの相同物よりなる逆方向プライマーの任意の組み合わせである。
【０１１６】
例えば、ハイブリダイゼーション工程において使用される２または３つのハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）の組は、配列番号２２〜２６、２８〜４３、４５〜６５もしくは６７〜８４またはそれらの相同物のポリヌクレオチドの間、好ましくは２８〜３６、４５〜５６もしくは６７〜８４またはそれらの相同物の間から選択される２または３つのハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）の任意の組み合わせであるが、但し、標的配列にハイブリダイズする場合の２つの前記ハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）間の間隙は、２５ヌクレオチド未満、好ましくは５ヌクレオチド未満である。
【０１１７】
好適な組を表３において言及する。
【０１１８】
ハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）システムの利点の１つは、該システムが、以下の分子概念に基づいて、変異、多型および他の変異核酸種を含む配列の変動の検出を可能にするという事実にある：ハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）の１つは強固に結合する「アンカープローブ」である一方、隣接する「センサープローブ」は配列の変動の領域に渡る。最終的なＰＣＲ産物の融解の間、配列の変更は、センサープローブの融解温度（Ｔｍ）の変化として、検出される。
【０１１９】
例えば、サンプルが配列番号１のみを含有する場合、前記配列番号１に特異的にハイブリダイズするハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）を使用することによって、単一の融解ピークが作製される。サンプル中に相同物も存在する場合、一般に、観察可能な温度シフトを誘導する１つのミスマッチした塩基が存在する限り、同じ２つのハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）を使用することによって、２つのピークが得られる。
【０１２０】
選択されたポリヌクレオチド、それらのＴｍおよびハイブリダイゼーション条件に依存して、増幅工程中に蛍光を測定することができ、次いで、増幅曲線を作成するか、または増幅工程後、融解曲線解析のために融解曲線を作成する。
【０１２１】
従って、得られるシグナルは、増幅曲線の形かまたは融解曲線の形で可視化することができ、それから、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の存在を推定するおよび／または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）のどの種が存在するかを推定することが可能である。
【０１２２】
特に、サンプル中のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の検出および／または同定のための方法はまた、
（ｉ）必要であれば、サンプル中のポリ核酸を遊離、単離および／または濃縮する工程；
（ｉｉ）標識されたプライマー対で、標的配列、またはその部分を増幅する工程；
（ｉｉｉ）ポリ核酸と、間に２５未満のヌクレオチドを伴って前記標識されたプライマーに隣接し、配列番号１もしくは２、または前記配列番号１もしくは２のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、または前記配列番号１もしくは２の相補形態、あるいは任意の相補物、あるいはその少なくとも２０個の連続したヌクレオチドのフラグメントにハイブリダイズする少なくとも１つのハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）とをハイブリダイズさせる工程、
（ｉｖ）形成されたハイブリッドを検出する工程、
（ｖ）工程（ｉｖ）において得られるシグナルから、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の存在を推定し、および／またはサンプル中のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種を同定する工程、
を含んでなる。
【０１２３】
ハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）システムを使用する本発明の方法を、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはエンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）の検出ならびに同定に適応し、他の種からＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）を区別することが可能である。
【０１２４】
次いで、増幅工程では、適切なプライマーは、配列番号１もしくは２、または前記配列番号１もしくは２のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、または前記配列番号１もしくは２の相補形態よりなる標的配列を特異的に増幅するプライマー対である。
【０１２５】
ハイブリダイゼーション工程では、ハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）は、配列番号１もしくは２、またはＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、または相補形態に特異的にハイブリダイズすべきである。
【０１２６】
従って、Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株は、融解曲線解析によって試験される他のすべての生物体から明白に識別することができる。
【０１２７】
関連のないシグナルは、非腸球菌（ｎｏｎ−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）またはヒトゲノムＤＮＡによって得られる。
【０１２８】
この特定の例で使用される好適なプライマー対は、配列番号３〜１１またはそれらの相同物の間で選択される順方向プライマーおよび配列番号１２〜２１またはそれらの相同物の間で選択される逆方向プライマーの任意の組み合わせである。
【０１２９】
表３に列挙されたハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）の組またはそれらの相同物は、本発明のハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）の好適な組である。３つのハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）のより好適な組は、配列番号３６または相同物および配列番号５６または相同物および配列番号７３または相同物よりなる。
【０１３０】
配列番号３６、５６および７３よりなるハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）の組は、高いストリンジェンシーでＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）を検出することが可能である。
【０１３１】
配列番号１〜配列番号８４およびそれらの任意の相同物に対応する表１に列挙した各ポリヌクレオチドは、プライマーおよび／またはプローブとして、本発明の任意の方法において、単独あるいは組み合わせて使用することができる。
【０１３２】
ハイブリダイゼーション方法にも基づく第２の具体例は、ライン・プローブ・アッセイ（Ｌｉｎｅ  Ｐｒｏｂｅ  Ａｓｓａｙ）技術である。ライン・プローブ・アッセイ（Ｌｉｎｅ  Ｐｒｏｂｅ  Ａｓｓａｙ）（ＬｉＰＡ）は、いくつかのポリヌクレオチドプローブ（陰性または陽性コントロールポリヌクレオチドを含む）が平衡ラインとして簡便に適用することができる膜ストリップを使用する逆ハイブリダイゼーション形式（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、１９８９）である。
【０１３３】
ストイフェル（Ｓｔｕｙｖｅｒ）ら（１９９３）および国際出願国際公開第９４／１２６７０号パンフレットに記載のＬｉＰＡ技術は、迅速かつ使い勝手がよいハイブリダイゼーション試験を提供する。結果は、増幅の開始後、４時間以内に読み取ることができる。通常、非同位体標識が増幅された産物に組み入れられる増幅、およびアルカリ変性後、増幅された産物は、膜上でプローブと接触され、約１〜１．５時間、ハイブリダイゼーションが行われる。従って、形成されるハイブリッドは、酵素的手順によって検出され、目に見える紫褐色の沈殿を生じる。ＬｉＰＡ形式は、市販のスキャニングデバイスと完全に適合性があり、従って、結果の自動的解釈を可能にする。それらのすべての利点は、ＬｉＰＡ形式を日常的設定での使用に対して信頼可能にする。
【０１３４】
ＬｉＰＡ形式は、種レベル、しかしまた、より高いまたはより低い分類学的レベルでの病原体の検出ならびに／あるいは同定のための有利な道具である。例えば、ＬｉＰＡストリップに対するプローブ形状構成は、それらが、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の完全な属を検出することができるか、あるいは属内の種（例えば、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはエンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）など）を同定することができるか、あるいは場合により、種内のサブタイプ（亜種、血清型、配列型（ｓｅｑｕｅｖａｒ）、生物型など、臨床的に関連するあらゆるもの）を検出することができるような様式で、選択することができる。
【０１３５】
多数のプローブによってハイブリダイゼーション結果を同時に作製する能力は、ＬｉＰＡ技術の別の利益である。多くの場合、プローブの特定の組み合わせによって得ることができる情報の量は、単一のプローブアッセイを使用することによって得られるデータよりも多い。従って、プローブの最適化された組は最大限の情報を可能にするため、膜ストリップに対するプローブの選択は最も重要である。
【０１３６】
これらのプローブは、異なる位置で膜ストリップに適用することができ、これらのプローブのうちの少なくとも１つが陽性である場合、結果は陽性と解釈される。あるいは、これらのプローブは、同じ位置に混合物として適用することができ、それによって、ストリップ上のラインの数が減少する。ストリップをより簡潔にし、ストリップ上のプローブの合成数を拡張することを可能にするために、この減少は簡便であり得る。
【０１３７】
実際的有益性の観点において、別の代替的アプローチは、次いで、さらに処理され、１つのポリヌクレオチド分子としてストリップに適用することができる変性プローブと称される２つもしくはそれ以上の異なるプローブを有するポリヌクレオチドの合成である。このアプローチは、ＬｉＰＡ−ストリップの製造手順をかなり簡単にする。例えば、ヌクレオチド配列ＡおよびＢを伴うプローブは、両方ともタクソンＸのすべての株を検出することが必要である。後者の代替物では、ヌクレオチド配列ＡＢを有するプローブを合成することができる。このプローブは、プローブＡおよびＢの組み合わされた特徴を有する。
【０１３８】
上記で言及した特性によって、ＬｉＰＡシステムは、ハイブリダイゼーション方法のための効率的な形式とみなすことができ、ここで、いくつかの生物体がサンプルにおいて同時に検出される必要がある。
【０１３９】
しかし、他の任意のハイブリダイゼーションアッセイでは、それによって、異なるプローブが同じハイブリダイゼーション下で使用され、上記で言及した検出および／または選択方法のための洗浄条件が使用され得ることが明らかであるべきである。例えば、標的核酸を固相支持体に固定化し、すべてが別に標識された異なるプローブの混合物を使用することが可能であり得、標的にハイブリダイズされたそれぞれのプローブに対して異なる検出シグナルを生じる。
【０１４０】
例として、ＬｉＰＡ形式を使用するサンプル中の１つもしくはそれ以上のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の検出のための従うべき手順を以下に概説する。
・第１に、必要であれば、サンプル中に存在する核酸を、増幅および／またはハイブリダイゼーションに利用可能な状態にする。
・第２に、核酸が存在するならば、以下に記載のように、１つもしくは別の標的増幅システムで増幅する。通常、増幅は、以後のハイブリダイゼーションシグナルを増強するのに必要である。
・第３に、サンプル中に存在する核酸または得られる増幅された産物を、目的の生物体の検出を可能にする１つもしくはそれ以上のプローブ（ＤＮＡ−、ＲＮＡ−、変性もしくは修飾されたプローブ）が固定化されたＬｉＰＡストリップと接触させ、ハイブリダイゼーションを進行させる。
・最後に、都合の良い、かつ適合性のある検出システムを使用してハイブリッドを検出する。観察されるハイブリダイゼーションシグナルまたはパターンから、特定の生物学的サンプルにおいてスクリーニングされた１種もしくはいくつかの生物体の有無を推測することができる。
【０１４１】
使用される増幅システムは、必要とされる特定のアプリケーションに依存して、多かれ少なかれ普遍的であり得る。
【０１４２】
ｒＲＮＡスペーサーの保存されたフランキング領域、即ち、１６Ｓおよび２３Ｓ遺伝子に位置する普遍的プライマーを使用することによって、腸球菌由来のすべてではないがほとんどの生物体のスペーサー領域が増幅される。
【０１４３】
いくつかのアプリケーションでは、サンプル中に存在するすべての生物体ではないが、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種をより特異的に増幅することが適切であり得る。
【０１４４】
サンプル中のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の検出ならびに／あるいは同定のための本発明の方法は、
（ｉ）必要であれば、サンプル中のポリ核酸を遊離、単離および／または濃縮する工程；
（ｉｉ）必要であれば、少なくとも１つの適切なプライマー対で、１６Ｓ〜２３Ｓ  ｒＲＮＡスペーサー領域、またはその部分を増幅する工程；
（ｉｉｉ）ポリ核酸と、配列番号１もしくは２、または前記配列番号１もしくは２のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、または前記配列番号１もしくは２の相補形態、あるいは任意の相同物、あるいはその少なくとも２０個の連続したヌクレオチドのフラグメントよりなる標的配列にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブとをハイブリダイズさせる工程、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において形成されたハイブリッドを検出する工程；
（ｖ）工程（ｉｖ）において得られる異なるハイブリダイゼーションシグナルからサンプル中に存在する微生物を同定する工程、
を含んでなる。
【０１４５】
増幅工程において言及されるＩＴＳの部分は、標的配列を含んでなるポリヌクレオチド、標的配列自体、配列番号１もしくは２、または前記配列番号１もしくは２のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、または前記配列番号１もしくは２の相補形態、あるいはその相同物、あるいはその少なくとも２０個の連続したヌクレオチドのフラグメントよりなる標的配列である。
【０１４６】
好ましくは、本発明は、上記の方法を提供し、ここで、少なくとも２種の微生物が同時に検出される。
【０１４７】
工程（ｉｉｉ）に記載のプローブの組は、本発明の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９個もしくはそれ以上のプローブ、またはその等価物を含んでなる。
【０１４８】
本発明の好適な具体例では、工程（ｉｉｉ）に記載のプローブの組は少なくとも２つのプローブを含んでなる。
【０１４９】
好適なプローブは配列番号１〜８４およびそれらの相同物のポリヌクレオチドである。
【０１５０】
本発明はまた、上記の方法を提供し、ここで、工程（ｉｉｉ）において特定されるプローブが、好ましくは１６Ｓ〜２３Ｓ  ｒＲＮＡスペーサー領域由来の少なくとも１つの他のプローブと組み合わされ、サンプル中に存在しやすい異なる病原性細菌の同時検出を可能にする。
【０１５１】
同じハイブリダイゼーション条件下で最適の品質を達成するために好ましいプローブが設計されて、その結果、それらを同時ハイブリダイゼーションのための組として使用することができ；このことにより、これらのプローブの利用可能性が著しく向上し、時間および労力が有意に節約される。
【０１５２】
本発明の任意のポリヌクレオチドを含有するキットもまた、本発明の目的である。
【０１５３】
本発明のキットは、以下の成分：
・配列番号１もしくは２よりなる標的配列、前記配列番号１もしくは２のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、前記配列番号１もしくは２の相補形態、またはそれらのいずれかの相同物にハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチド；
・ハイブリダイゼーション緩衝液、または前記緩衝液を生成するのに必要な成分
を含んでなる。
【０１５４】
好適なキットは、
・２５ヌクレオチド未満、好ましくは、５ヌクレオチド未満で相互に隣接し、配列番号１もしくは２よりなる標的配列、前記配列番号１もしくは２のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、前記配列番号１もしくは２の相補形態、またはそれらのいずれかの相同物にハイブリダイズする２つのハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）の少なくとも１つの組；
・ハイブリダイゼーション緩衝液、または前記緩衝液を生成するのに必要な成分
を含んでなる。
【０１５５】
【表１−１】
0004766878.tif 000002
【０１５６】
【表１−２】
0004766878.tif 000003
【０１５７】
【表２】
0004766878.tif 000004
【０１５８】
【表３】
0004766878.tif 000005
【０１５９】
【表４】
0004766878.tif 000006
【実施例】
【０１６０】
実施例において使用する方法は、センサーとして作用する配列番号３６および５６の２つのフルオレセイン標識プローブ、ならびにアンカーとしての配列番号７３のＬＣ−レッド（ＬＣ−Ｒｅｄ）標識プローブよりなるハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）システムを配列番号５および１８のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属プライマー対との組み合わせで使用する、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）、特に、Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の検出のための方法である。
【０１６１】
合計で、
・５６個のエンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）単離物、
・５０個のエンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）単離物、
・異なる微生物の５６個の株
よりなる１６２個の細菌単離物のコレクションを使用した。
【０１６２】
単離体が予想される結果を与えなかった場合、ｔ−ＲＮＡ  ＰＣＲ（ベインエコッテ，Ｍ．（Ｖａｎｅｅｃｈｏｕｔｔｅ，Ｍ．）ら、１９９８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（４８）１２７−１３９））によって再分類し、および／またはＡｐｉＳＴＲＥＰ（バイオメリエックス（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ））によって再分類した。
【０１６３】
器具は、リアルタイム蛍光ＰＣＲ検出を可能にする適切なソフトウェア（ＬＣ−ソフトウェア、バージョン３．５）を備えたライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）ＴＭ（バージョン１．２）である。
【０１６４】
実施例１：試験しようとするサンプルの調製
１／．純培養物由来のＤＮＡ
純培養物由来のＤＮＡを調製するために、異なる精製方法を使用することができる：
・リソスタフィン（５μｇ／μｌ）で１時間、３７℃での溶解およびＱＩＡａｍｐ血液ＤＮＡ単離キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））による精製
・ピッチャー（Ｐｉｔｃｈｅｒ）らの方法（１９８９）
・ＭａｇＮＡＰｕｒｅ器具上のＭａｇＮＡＰｕｒｅ  ＬＣ  ＤＮＡ単離キットＩＩＩ（細菌、真菌）。ＬＢプレートまたはスレート上Ｏ／Ｎで増殖させた細菌細胞を、−２０℃での保存のために１００〜１０００μｌ  ＴＥ  ｐＨ８に懸濁させた。製造者の推奨に従って、２μｌ〜２０μｌを抽出のために使用した。
・ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット（カタログ番号５１３０６−キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ））。リゾチームおよびリソスタフィンを使用して、培養物を酵素的に前処理した。
【０１６５】
２／．陽性血液培養ボトル由来のＤＮＡ
血液サンプルを通気血液培養ボトル（ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ  ＦＡ）に播種し、ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ  ３Ｄシステム（オルガノン・テクニカ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ））中、３７℃、陽性になるまでインキュベートした。暗緑色から黄色への色の変化によって、陽性をモニターした。
【０１６６】
血液培養物のアリコート（１．５ｍｌ）を、使用するまで−７０℃で凍結した。
【０１６７】
ゲノムＤＮＡを、ＭＰＬＣ  ＤＮＡ単離キットＩＩＩの包装挿入物に記載のように、調製した。オルガノン・テクニカ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ）血液培養ボトルについて推奨されているように、ＰＣＲの前に、溶出物を１０秒間、１４０００ｒｐｍで遠心分離して、抽出された炭素粒子をスピンダウンした。
【０１６８】
実施例２：ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）（ＬＣ）プロトコル
キットＬＣ−ファストスタート（ＬＣ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ）ＤＮＡマスター（Ｍａｓｔｅｒ）ハイブリダイゼーションプローブ（カタログ番号３００３２４８または２２３９２７２）の製造者の指示に従って：
・精製、濃縮、および阻害剤の非存在について、ＰＣＲに適切な任意のサンプル材料を使用することができる；
・プライマーは、それぞれ０．３〜１μＭの最終濃度であるべきである；
・それぞれ０．２μＭ、または２倍の最終濃度のハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）；
・ＭｇＣｌ２の濃度は最適化されるべきであり、１〜５ｍＭに変動し得る；
・そして、ネガティブコントロールを稼動させるべきである。
【０１６９】
増幅および融解条件を以下に記載する。ＬＣソフトウェアのバージョン３．５を使用した。定量設定はＦ２／ｂａｃｋ  Ｆ１（サンプル）であった。ベースラインの調整については、算術モードを使用した。クロスポイント（ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）（Ｃｔ）の計算は、２次最大微分（ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｍａｘｉｍｕｍ）に基づいた。融解ピークの計算方法は多項式法であった。ピーク面積を使用して、Ｔｍを計算した。
【０１７０】
【表５】
0004766878.tif 000007
【０１７１】
実施例３：精製されたＤＮＡ、包括性および交差反応性試験の結果
１／包括性
合計で、Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）として回収された４７個の単離物を試験した。すべて定量曲線（Ｃｔ範囲１５．５〜２８．４）を生成し、４４個は約５８℃の融解ピークを有した（Ｔｍ範囲５７．４℃〜５８．３℃、平均Ｔｍ＝５７．９℃）。
【０１７２】
Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）として回収された４７個の単離物のうち３個は、アッセイ中、Ｅ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）として反応し、約５３℃の融解ピークを生成した。これら３個の単離物の結果は、生化学的同定技術（アピ２０ストレップ（Ａｐｉ２０Ｓｔｒｅｐ）、バイオメリエックス（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ））およびｔＲＮＡ  ＰＣＲ解析を使用して確認した。
【０１７３】
Ｅ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）として回収された４０個の単離物のうち、３７個は定量曲線（Ｃｔ範囲１７．９〜２９．５）を生成し、そのうち３３個は約５３℃の融解ピークを生成した（Ｔｍ範囲５１．９℃〜５３．２℃、平均Ｔｍ＝５２．７℃）。
【０１７４】
残りの７つの単離物は、以下のように反応した：
・１個の単離物は二重ピーク（一方はＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）であり、一方はＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）である）を生じた。
・３個の単離物は、約５８℃の融解ピークを有するＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）として反応した。
・他の３つの単離物は、増幅曲線も融解曲線も与えなかったが、ゲル上では陽性として反応したため、それらはエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属するが、非Ｅ．ファエカリス（ｎｏｎ−Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）／非Ｅ．ファエシウム（ｎｏｎ−Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）単離物である可能性が最も高い。
【０１７５】
生化学的同定技術（アピ２０ストレップ（Ａｐｉ２０Ｓｔｒｅｐ）、バイオメリエックス（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ））およびｔＲＮＡ  ＰＣＲ解析を使用して、該矛盾の生じたサンプルを解析した。７個のすべてのサンプルについて、最初の同定は不正確であり、６個のサンプルについて、結果は、アッセイの結果に一致したことが示された。
【０１７６】
２／．交差反応性
５０を超える異なる細菌種について試験し（マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）など）、また若干の真菌についても試験した。試験した生物体のうち、アッセイにより定量曲線または融解ピークを生じたものは認められなかった。
【０１７７】
３／．結果：
包括性および交差確認試験の結果を以下にまとめる。すべてのＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）およびＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）単離物は適切に同定かつ識別され、交差反応は生じないと結論付けることができる。
【０１７８】
調査したすべてのＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）単離物が検出され（１００％の感受性）、研究した他のすべての単離物から明白に識別することができた。
【０１７９】
【表６】
0004766878.tif 000008
【０１８０】
実施例４：血液培養物の結果
４１個のすべての陽性血液培養物は陽性のＰＣＲを生じた。全体的に、陽性の血液培養ボトルについて、得られた最小Ｃｔ値は１８であり、最大Ｃｔ値は２５であった。Ｔｍ値は極めて類似しており、すべてのＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）単離物では５８℃に近く、Ｅ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）単離物では５３℃に近かった。
【０１８１】
１個を除くすべての血液培養物において、正確な病原体（Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）またはＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ））が同定された。Ｅ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）を含有していると思われた１個の陽性ボトルは増殖曲線を生成しなかったが、４５℃の融解ピークが観察され、Ｅ．デュランス（Ｅ．ｄｕｒａｎｓ）単離体の存在が示された。スペーサー領域を増幅する普遍的ＰＣＲ後のゲル上でのフラグメント長の解析では、Ｅ．デュランス（Ｅ．ｄｕｒａｎｓ）に典型的なパターンが生じ、Ｅ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ））とは明らかに異なった。
【０１８２】
以下の表にまとめたように、最終アッセイ組成は、以下のような方法で実施された：
・すべてのＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）またはＥ．ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）は検出され（Ｃｔおよび融解曲線）、他の腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）を含む他の生物体から識別される。
・試験された異なる多くの微生物由来の他の生物体、またはヒトＤＮＡとによって観察される交差反応は認められない。
【０１８３】
【表７】
0004766878.tif 000009
【配列表】
0004766878000001.app