(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ５ａＲに対するアンタゴニスト活性を有し、Ｃ５ａ受容体（Ｃ５ａ）に対するアゴニスト活性を有さない化合物であって、下記一般式：
0004686696.tif 000017
［式中、
Ａは、Ｈ、ＮＨ2、ＮＨアルキル、Ｎ（アルキル）2、ＮＨアリールまたは１〜６個の炭素原子のＮＨアシル基であり；
Ｂは、アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ナフチルまたはインドール基、またはＬ−フェニルアラニンの側鎖、もしくはホモフェニルアラニン、トリプトファン、ホモトリプトファン、チロシンおよびホモチロシンよりなる群から選ばれるＤ−アミノ酸の側鎖であり；
Ｃは、プロリン、アラニン、バリン、アスパルテート、グルタメート、グルタミン、アスパラギン、システインおよびメチオニンよりなる群から選ばれるＤ−、Ｌ−またはホモ−アミノ酸の側鎖であり；
Ｄは、シクロヘキシルアラニン、ホモシクロヘキシルアラニン、ロイシン、ノルロイシン、ホモロイシンおよびホモノルロイシンよりなる群から選ばれるＤ−アミノ酸の側鎖であり；
Ｅは、トリプトファンおよびホモトリプトファンよりなる群から選ばれるＤ−またはＬ−アミノ酸の側鎖であり；
Ｆは、アルギニンおよびホモアルギニンよりなる群から選ばれるＤ−またはＬ−アミノ酸の側鎖であり；
Ｘ1は、−（ＣＨ2）nＮＨ−または（ＣＨ2）n−Ｓ−、−（ＣＨ2）2Ｏ−、−（ＣＨ2）3Ｏ−、−（ＣＨ2）3−、−（ＣＨ2）4−または−ＣＨ2ＣＯＣＨＲＮＨ−（式中、Ｒは普通のまたは稀なアミノ酸の側鎖である）であり、そして
ｎは、１〜４の整数である］を有する化合物。
【請求項２】
ＦがＬ−アミノ酸の側鎖である、請求項１の化合物。
【請求項３】
ＦがＬ−アルギニンの側鎖である、請求項１の化合物。
【請求項４】
ｎが、２または３である、請求項１〜３のいずれかの化合物。
【請求項５】
Ａが、ＨまたはＮＨアセチルである、請求項１〜４のいずれかの化合物。
【請求項６】
Ｂが、インドール、インドールメチル、ベンジル、フェニル、ナフチル、ナフチルメチルまたはシナミル基である、請求項１〜５のいずれかの化合物。
【請求項７】
Ｂが、Ｌ−フェニルアラニンの側鎖である、請求項１〜５のいずれかの化合物。
【請求項８】
Ｃが、Ｄ−またはＬ−プロリン、バリン、またはメチオニンの側鎖である、請求項１〜７のいずれかの化合物。
【請求項９】
Ｃが、プロリンまたはメチオニンの側鎖である、請求項８の化合物。
【請求項１０】
Ｄが、Ｄ−シクロヘキシルアラニンの側鎖である、請求項１〜９のいずれかの化合物。
【請求項１１】
Ｅが、トリプトファンの側鎖である、請求項１〜１０のいずれかの化合物。
【請求項１２】
Ｆが、アルギニンの側鎖である、請求項１〜１１のいずれかの化合物。
【請求項１３】
Ｘ1が、オルニチン（（ＣＨ2）3ＮＨ−）またはリシン（（ＣＨ2）4ＮＨ−）である、請求項１〜１２のいずれかの化合物。
【請求項１４】
化合物１１（ＡｃＦ−［ＫＰｄＣｈａＷｒ］）、１２（ＡｃＦ−［ＯＰｄＣｈａＷｒ］）、１３（Ｆ−［ＸＰｄＣｈａＷＲ］）、１４（Ｆ［ＸＰｄＣｈａＷＲ］）、１５（Ｆ−［Ｘ2ＰｄＣｈａＷＲ］）、１６（Ｆ−［Ｘ2ＰｄＣｈａＷｒ］）、１７（ＡｃＦ−［ＯＰｄＣｈａＷＲ］）、１８（ＡｃＦ−［ＯＰｄＣｈａＷｒ］）、１９（［ＦＷＰｄＣｈａＷｒ］）、２０（ＡｃＦ−［ＫＭｄＣｈａＷｒ］）、２１（ＡｃＦ−［ＫＫｄＣｈａＷｒ］）、２２（ＡｃＦ−［ＸＰｄＣｈａＷｒ］）、２３（ＡｃＦ−［Ｘ2ＰｄＣｈａＷｒ］）、２４（ＡｃＫＦ−［ＯＰｄＣｈａＷｒ］）、２５（Ｆ−［ＯＰｄＣｈａＷｒ］）、２６（Ｆ−［ＫＰｄＣｈａＷｒ］）、２７（Ｆ−［ＯＰｄＣｈａＷＲ］）および２８（Ｆ−［ＫＰｄＣｈａＷＲ］）よりなる群から選ばれる、請求項１〜１３のいずれかの化合物、ここで
Ｘは（ＣＨ2）−ＮＨ2
Ｘ2は（ＣＨ2）2−ＮＨ2
ｄＣｈａはＤ−シクロヘキシルアラニン
を意味する。
【請求項１５】
構造：
0004686696.tif 000018
の化合物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物を、薬学的に許容される担体または賦形剤と共に含有する組成物。
【請求項１７】
医薬品製造における請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１８】
Ｃ５ａ受容体によって媒介される病的状態を処置するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１９】
炎症状態を処置するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項２０】
炎症状態が炎症性関節炎である、請求項１９の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、Ｇタンパク質結合受容体の調節能力を有する新規環状化合物に関する。本発明は、アゴニストとアンタゴニストの両方を提供する。好ましい態様において、本発明は、Ｃ５ａの環状ペプチド様および環状または非環状の非ペプチド様アゴニストまたはアンタゴニストを提供する。本発明の化合物は、強力かつ選択的であって、種々の炎症状態の処置に有用である。
発明の背景
ヒト補体の活性化は、感染および傷害に対する免疫防御に関与する血漿タンパク質の一つの系であり、多数の急性および慢性の疾患に関する病因に重要な役割を演じる。特に、Ｃ５ａタンパク質の補体は幅広く究明されてきた。総論については、Whaley（1987）およびSim（1993）を参照されたい。表１は、疾患におけるＣ５ａの役割についての概略である。
宿主防御において、血漿タンパク質の補体系は、伝染性微生物（バクテリア、ウイルス、寄生虫）、化学的または物理的傷害、放射能または腫瘍形成などの刺激に対して炎症や細胞免疫反応を起こす。補体は相互に関係するタンパク質分解の複雑な経路を通り活性化する。その経路において、多数の生物活性ペプチドが産生され、そのうちのいくつか（例えば、アナフィラトキシンＣ３ａおよびＣ５ａ）は、細胞成分と相互に作用して炎症性病的過程を伝播させる。補体活性化は、抗原抗体（Ａｇ／Ａｂ）結合後の古典的経路あるいは抗体非依存の別経路による。活性化が最終的にもたらす末端配列において、Ｃ５タンパク質がＣ５コンバターゼによってタンパク質分解開裂を受け、Ｃ５ａおよびＣ５ｂに分かれる。後者は、バクテリアのような標的細胞の膜に穴をあけて、漏洩、溶解、細胞死に導く「膜攻撃複合体」の集合を容易にする。活性化経路の各段階は、継続的に形成されるプロテアーゼによるタンパク質分解の段階的増幅を避けるために、厳密に調節される。もし、それらの調節機能が失効した場合、補体活性化が遅延し、自己免疫疾患におけるように炎症反応が引きおこされる。
補体系およびその活性化の特徴に関しては広く知られているが、機構的な細部に関してはあまり分かっていない。炎症反応における重要なそして非常に強力な媒介物質は、糖タンパク質血漿Ｃ５ａであり、肥満細胞、好中球、単核白血球、マクロファージ、非骨髄外細胞および血管内皮細胞上の特異的表面受容体と相互作用する（Gerard and Gerard,1994）。Ｃ５ａＲはＧタンパク質結合受容体で、７個の膜貫通ヘリックスを有する（Gerard and Gerard,1991）。この受容体は、ＧＴＰ結合タンパク質のロドプシンのスーパーファミリーの一つであるが、受容体とＧタンパク質が活性化の前に結合するロドプシン受容体とは相異する。
Ｇタンパク質結合受容体は人体に広く存在し、その８０％はすでに知られた細胞受容体型で成っており、非常に広範囲の内因性リガンドについて細胞膜を通じて情報伝達を媒介する。それらの受容体は、生理学上、病態生理学上プロセスの別の配置に関与する。このプロセスは、心血管に関連するプロセスに限らず、中枢神経系、末梢神経系、生殖、代謝性疾患、消化器疾患、免疫性炎症疾患、成長障害疾患およびその他の細胞調節や増殖性障害の疾患を含む。アゴニストとアンダゴニストの両方の薬剤は、Ｇタンパク質結合受容体の機能を選択的に調節し、重要な治療上の適用性を有する。
Ｃ５ａは現在知られている最も強力な走化性薬剤の一つで、好中球およびマクロファージを創傷部位に動員して部位の形態を変化させ、細胞外放出を減退させ；カルシウム動員、血管透過性（浮腫）、好中球粘着性を増大させ；平滑筋を収縮させ；炎症メディエータ（ヒスタミン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、プロスタグランジン、ロイコトリエンなどを含む）およびリソソーム酵素の放出を刺激し；酸素ラジカルの形成を促進し；抗体増殖を増大する（Gerard and Gerard,1994）。Ｃ５ａの過剰発現あるいは過小調節は次のような免疫炎症性状態の病因と関係する。すなわち、関節リューマチ、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、全身性エリテマトーデス、組織拒絶反応症、虚血性心疾患、再潅流障害、敗血症ショック、乾癬、歯肉炎、粥状動脈硬化症、アルツハイマー病、肺創傷疾患、体外透析後症候群など、および表１に概略を示す多数の状態がそれである。
0004686696.tif 000002
0004686696.tif 000003
Ｃ５ａの炎症作用を制限する新規の薬剤は、慢性炎症随伴疼痛、組織損傷を阻害する効能を有する。その理由によって、Ｃ５ａとその受容体との結合を防ぐ分子は、補体活性化によって起こされた慢性炎症疾患の処置に有用である。重要なのは、そのような化合物が補体媒介免疫メカニズムの究明に貴重な新しい見透しを提供することにある。
論点を変えて、Ｃ５ａ受容体あるいはその他のＧタンパク質結合受容体のアゴニストはまた、Ｇタンパク質結合受容体が薬物送達の認識部位に使用される場合か、あるいはそのような受容体が疼痛発作誘発点として、ヒトの免疫システムのある態様を刺激する、例えば癌、ウイルス、あるいは寄生虫感染症などの処置に使用される場合か、において治療効果を有することが判明するであろう。
Ｃ５ａのアゴニストまたはアンタゴニストを開発する一つのアプローチは、Ｃ５ａとその受容体であるＣ５ａＲおよびそれらの相互作用を示す三次元構造に関する知識を利用して、受容体に基づく設計を通じて行なうことである。受容体の構造はまだ知られていない。ヒトＣ５ａの溶液構造は、強い陽性で、３ＫＤａ炭水化物によってＡｓｎ６４でＮ−グルコシル化された７４アミノ酸ペプチドであると測定されており、本質的には４−αヘリックス線維束である。Ｃ−末端部（残基６５−７４、Ｃ５ａ６５−７４）が未組織化の状態で発見され（Zuiderweg et al,1989）、このＣ−末端における配座屈曲性が構造−機能研究を極端に解釈困難な状態にしてきた。
Ｃ５ａは高度に整ったＮ−末端コアドメインを有し（残基１−６４；Ｃ５ａ１−６４）、まとまった逆平行の４−αヘリックス線維束（残基４−１２、１８−２６、３２−３９、４６−６３）から成り、ループ（１３−１７、２７−３１、４０−４５）で連結され、さらに、３二硫化物化学結合（Ｃ２１−Ｃｙｓ４７、Ｃｙｓ−２２−Ｃｙｓ５４、Ｃｙｓ３４−Ｃｙｓ５５）によって固定されている。
Ｃ５ａ受容体すなわちＣ５ａＲの構造は知られてはいないが、ヒトの単球誘導Ｃ５ａＲのＣ５ａ結合サブユニットはクローン化され、透過膜α−ヘリックスを有するＧタンパク質結合受容体として同定された（Gerard and Gerard,1991）。Ｃ５ａとＣ５ａＲとの相互作用は多数の研究主題となっており、要するに、Ｃ５ａは２サイトメカニズムによって結合し、そのメカニズムにおいて、Ｃ５ａのＮ−末端コアドメインは受容体認知および結合に関連し、その一方で、Ｃ−末端は受容体活性化に大切な役割りを有することが示唆されている。このメカニズムの構成図を図１に示す。Ｃ−末端の「奏効」領域だけが情報伝達に必要なすべての情報資料を有し、受容体のらせん形領域において結合すると考えられている（Siciliano et al,1994;deMartino et al,1995）。
Ｃ５ａの陽性電荷らせん形領域にあるＮ−末端は、受容体認知および結合に重要な役割りを有し、Ｃ５ａＲサイト１の陽性電荷細胞外ドメインと結合し、その一方、Ｃ５ａのＣ末端「奏効」領域が受容体（サイト２）のらせん形領域と結合すると考えられており、情報伝達につなげる受容体活性化に重要な役割りを有する（Siciliano et al,1994）。
Ｃ５ａのＣ−末端の短いペプチド誘導体が多数発見され、Ｃ５ａのアゴニストであることが判明した（Kawai et al,1991;Kawai et al,1992;Kohl et al,Drapeau et al,1993;Ember et al,1992;Sanderson et al,1994;Sanderson et al,1995;Finch et al,1997;Tempero et al,1997;Konteatis et al,1994;DeMartino et al,1995）。それらのアゴニストのいくつかを下記の表２（化合物１−６）に示す。Ｃ５ａ受容体に対する単クローン抗体のような受容体におけるＣ５ａの活性化を阻害する高分子量ポリペプチドも知られている（Morgan et al,1992）。
小分子、Ｎ−メチルフェニルアラニン−リジン−プロリン−Ｄ−シクロヘキシルアラニン−トリプトファン−Ｄ−アルギニン（７、ＭｅＦ−Ｋ−Ｐ−ｄＣｈａ−Ｗ−Ｒ）は、Ｃ５ａ受容体の完全なアンタゴニストであり、分離細胞膜上（Konteatis et al,1994）または完全無傷の細胞上で試験してアゴニスト活性化を示さない。このヘキサペプチドは、アゴニストＮｍｅ−Ｆ−Ｋ−Ｐ−ｄＣhａ−Ｌ−ｒの構造によって開発されたもので、置換基のサイズを漸増（Ｃｈａ、Ｆ、Ｎｐｈ、Ｗ）させながらロイシン残基において分子が漸次置換された。これがアゴニスト活性化の減退に効果があった。受容体結合の測定がヒトの分離好中球膜上でなされ、その結果、アンタゴニストが受容体に対するＣ５ａの相対結合親和度のわずか０．０４％を有するにすぎないことが示された（Konteatis et al,1994）。これらの報告の重要な特徴は、アンタゴニスト７とＣ５ａ受容体との結合についての定義にある。これらの報告者は、Ｃ−末端アルギニンが受容体結合とアンタゴニスト活性化にとって重要であると述べている。このことはまた、Ｃ５ａのＣ−末端の小さいペプチド類似体によるアゴニスト活性化に関するすべての報告について同様である。しかしながら、アンタゴニスト７に関しては、報告者たちはさらに進んで、「Ｃ−末端カルボキシル酸はアンタゴニスト活性化および受容体結合にとってきわめて重要な必要物質である」と述べている。
彼らは、カルボキシル酸の必要性は、多分カルボキシル酸と受容体中におけるアルギニン（Ａｒｇ２０６）との特殊な相互作用の結果であろうと述べている（De Martins et al,1995）。この考えはアンタゴニスト７の類似体に対する受容体親和度が大きく減少したことを根拠としていて、その類似体においてＤ−アルギニン（ＮＨ2−ＣＨ−（ＣＯ2Ｈ）−（ＣＨ2）3ＮＨＣ（：ＮＨ）ＮＨ2）が、アグマチン（ＮＨ2−ＣＨ2−（ＣＨ2）3ＮＨＣ（：ＮＨ）ＮＨ2）によって置換された。要約すると、De Martino et alの主張は、Ｄ−アルギニンがそのグアニジュウム側鎖によって陰性電荷アミノ酸側鎖と、受容体中で相互作用を起こすことである。次いでアンタゴニスト７の陰性電荷Ｃ−末端カルボキシル酸と、受容体中の陽性電荷鎖残基との第二の相互作用が起こるとも考えられる。
我々はここにおいて、このヘキサペプチド７および種々の類似体の溶液構造を測定したところ、おどろくべきことに、実際には末端カルボキシル酸基がＣ５ａＲとの結合あるいはアンタゴニスト活性に必要ではなく、そのかわりに、これまでに認識されることのなかった異常な構造上の特徴、すなわち配座の回転がＣ５ａアンタゴニストあるいはアゴニストの結合および活性化に重要な役割りを果たすことを知った。ヘキサペプチドおよび種々の新しい構造的関連を有するアンタゴニストを、無傷の多形核白血球細胞（ＰＭＮ）を使用して、それらの受容体結合親和性およびアンタゴニスト活性の両方を調べた。得た結果から、Ｃ５ａのアンタゴニストまたはアゴニストとＣ５ａ受容体との結合にとって、特殊なこれまでに知られていない構造的必要条件があり、これは、Ｇタンパク質結合受容体ファミリーのリガンドに共通であると考えられている。我々がこの特殊な構造的必要条件を立証したことで、補体系およびＣ５ａに基づく薬剤について、改善された分子プローブを設計し開発することが可能となり、さらに、他のＧタンパク質結合受容体を標的とする小分子を設計することができる。情報伝達に極めて重要な役割りを有するこれらの受容体は、重要な薬剤標的として、ますます認識されるようになっている（G protein-coupled Receptors,IBC Biomedical Libraryseries,1996）。
かくして、我々が得た結果から制約構造鋳型を設計することができ、この鋳型によって疎水性基を疎水性配列に集めて、例えば、図１に示すＣ５ａ受容体の部位２でＧタンパク質結合受容体と相互作用させることができる。このような鋳型や枠組みは、環式または非環式であって、従来Ｃ５ａ受容体活性化またはその他のＧタンパク質結合受容体活性化の調節装置であることは示唆されていなかった。
発明の要旨
本発明は、Ｇタンパク質結合受容体の活性に対する環状および非環状調節物質を提供する。
第１観点によると、本発明は、Ｇタンパク質結合受容体のアンタゴニストであって、アゴニスト活性を有さない化合物を提供する。この化合物は、下記のような概略寸法の枠組みに適合する環状または制約された非環状の構造を有す。
0004686696.tif 000004
式中、数字は、アミノ酸やその類似体または誘導体のＣα炭素間の距離を意味し、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、隣接のアミノ酸やその類似体または誘導体上に必ずしもあるわけでない。
式中、重要なアミノ酸側鎖は、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤで表されるか、あるいは下記に定義される；
Ａは、普通のまたは稀な塩基性の電荷アミノ酸側鎖で、その位置で陽性電荷基を位置づけるのに働き、この中には、限定ではないが、下記の側鎖およびアルギニン側鎖の他の模倣体が含まれる。
0004686696.tif 000005
式中、Ｘは、ＮＣＮ、ＮＮＯ2、ＣＨＮＯ2またはＮＳＯ2ＮＨ2；
ｎは、１から４の整数；
Ｒは、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＮ、ＮＨ2またはＯＨ基；
Ｂは、普通のまたは稀な芳香族アミノ酸側鎖で、その位置で芳香族側鎖基を位置づけるのに働き、この中には、限定ではないが、インドール、インドールメチル、ベンジル、フェニル、ナフチル、ナフチルメチル、シナミル基またはこれらの芳香族基の他の誘導体が含まれる；
Ｃは、普通のまたは稀な疎水性のアミノ酸側鎖で、その位置でアルキル、芳香族または他の基を位置づけるのに働き、この中には、限定ではないが、Ｄ−またはＬ−シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、ロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはメチオニンが含まれる；
Ｄは、普通のまたは稀な芳香族アミノ酸側鎖で、その位置で芳香族側鎖基を位置づけるのに働き、次の構造を有す：
0004686696.tif 000006
式中、Ｚには、限定ではないが、インドール、インドールメチル、ベンジル、ベンゼン、ナフチル、ナフチルメチルまたはこれらの芳香族基の他の誘導体が含まれる。
Ｒは、Ｈ、アルキル、芳香族、アシルまたは芳香族アシルであり、限定ではないが、この中にメチル、エチル、プロピル、ブチル、−ＣＯ−ＣＨ2ＣＨ3、−ＣＯ−ＣＨ3、−ＣＯ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、−ＣＯ−ＣＨ2Ｐｈまたは−ＣＯ−Ｐｈが含まれる。
好ましくは、Ｇタンパク質結合受容体はＣ５ａ受容体である。
他の環状または制約された非環状分子は、本質的にペプチドまたは非ペプチドであり得て、Ｃ５ａ受容体または他のＧタンパク質結合受容体との相互作用についてＡ、Ｂ、ＣおよびＤなどの基を支持するものと同様に考え得る。
ひとつの実施態様において、化合物は、Ｃ５ａＲに対するアンタゴニスト活性を有し、Ｃ５ａアゴニスト活性はなく、次の式を有す：
0004686696.tif 000007
式中、Ａは、Ｈ、アルキル、アリール、ＮＨ2、ＮＨアルキル、Ｎ（アルキル）2、ＮＨアリールまたはＮＨアシル；ＯＨ、Ｏアルキル、Ｏアリールである；
Ｂは、アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ナフチルまたはインドール基、またはフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、トリプトファン、ホモトリプトファン、チロシンおよびホモチロシンよりなる群から選ばれるＤ−またはＬ−アミノ酸の側鎖である；
Ｃは、プロリン、アラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、グルタメート、グルタミン、アスパラギン、リシン、チロシン、フェニルアラニン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、トリプトファン、システインおよびメチオニンよりなる群から選ばれるＤ−、Ｌ−またはホモ−アミノ酸の側鎖である；
Ｄは、シクロヘキシルアラニン、ホモシクロヘキシルアラニン、ロイシン、ノルロイシン、ホモロイシン、ホモノルロイシンおよびトリプトファンよりなる群から選ばれるＤ−またはＬ−アミノ酸の側鎖である；
Ｅは、トリプトファンおよびホモトリプトファンよりなる群から選ばれるＤ−またはＬ−アミノ酸の側鎖である；
Ｆは、アルギニン、ホモアルギニン、リシンおよびホモリシンよりなる群から選ばれるＤ−またはＬ−アミノ酸の側鎖である；
Ｘ1は、−（ＣＨ2）nＮＨ−または（ＣＨ2）n−Ｓ−（式中、ｎは１から４の整数、好ましくは２または３）、−（ＣＨ2）2Ｏ−、−（ＣＨ2）3Ｏ−、−（ＣＨ2）3−、−（ＣＨ2）4−または−ＣＨ2ＣＯＣＨＲＮＨ−（式中、Ｒは普通のまたは稀なアミノ酸の側鎖）である。
本明細書の目的のために、用語“アルキル”は、炭素数１から６、好ましくは１から４の直鎖、分枝または環状の置換または非置換アルキル鎖を意味する。最も好ましくは、アルキル基はメチル基である。用語“アシル”は、炭素数１から６、好ましくは１から４の置換または非置換アシルを意味する。最も好ましくは、アシル基はアセチルである。用語“アリール”は、置換または非置換のホモ環状またはヘテロ環状のアリール基で、その環が好ましくは５または６員であるものを意味する。
“普通の”アミノ酸は、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパルテート、アスパラギン、グルタメート、グルタミン、システイン、メチオニン、アルギニン、リシン、プロリン、セリン、トレオニンおよびヒスチジンよりなる群から選ばれるＬ−アミノ酸を意味する。
“稀な”アミノ酸には、限定ではないが、Ｄ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、デヒドロアミノ酸、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン以外）、オルト−、メタ−またはパラ−アミノ安息香酸、オルニチン、シトルリン、ノルロイシン、γ−グルタミン酸、アミノ酪酸およびα、α−ジ置換アミノ酸が含まれる。
本明細書において、“含む”は、“中に含むが、それに限定されない”ことを意味し、“含んでいる”は、同等の意味であることが明白である。
第２の観点において、本発明はＧタンパク質結合受容体のアゴニストである化合物を提供し、この化合物は構造IIIを有する。
0004686696.tif 000008
式中、数字は、アミノ酸またはその類似体や誘導体のＣα炭素間の距離を意味し、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、必ずしも隣接のアミノ酸またはその類似体や誘導体上にない。
式中、Ｂは、非芳香族アミノ酸であり、好ましくは、アラニン、ロイシン、バリン、ノルロイシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、メチオニン、システイン、イソロイシン、セリンまたはトレオニンのＤ−またはＬ−型である。
Ａ、ＣおよびＤは上記の通りである。
好ましくは、化合物は構造IVである。
0004686696.tif 000009
式中、Ｅは、トリプトファンおよびホモトリプトファン以外のすべてのアミノ酸であり、例えば、アラニン、ロイシン、バリン、ノルロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、メチオニン、システイン、イソロイシン、セリン、トレオニンのＤ−またはＬ−型である。ＦおよびＸ1は、構造IIで定義した通りである。好ましくは、化合物はＣ５ａのアゴニストである。
第３観点において、本発明は、本発明の化合物および薬学的に許容される担体および賦形剤を含有する組成物を提供する。
本発明の組成物は、経口または非経口用に製剤されるが、経口が望ましい。本発明のほとんどの化合物は、全部ではないが、消化酵素の存在で安定である。この安定性は、当業者によく知られている日常的な方法で容易に試験できる。
望む経路で投与するための適当な製剤は、標準的な方法でつくられる。例えば、よく知られた教科書、Remington;The Science and Practice of Pharmacy,Vol.II,1995（19thedition）,A.R.Gennaro（ed）,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,or Australian Prescription Products Guide、Vol.1、1995（24thedition）J.Thomas（ed）,Australian Pharmaceutical Publishing Company Ltd,Victoria,Australiaを参照。
第４観点において、本発明は、Ｇタンパク質結合受容体が調節する病理的状態を処置する方法を提供する。この方法は、かかる処置を必要とする哺乳動物に本発明の化合物の有効量を投与する過程を含む。
好ましくは、Ｇタンパク質結合受容体が調節する状態は、Ｃ５ａ受容体が調節する状態であり、さらに好ましくはＣ５ａの過剰発現あるいは調節抑制が関与する。かかる状態には、限定でないが、リウマチ様関節炎、成人呼吸窮迫徴候（ＡＲＤＳ）、全身性エリマトーデス、組織移殖拒絶、虚血性心疾患、再灌流傷害、敗血症ショック、乾癬、歯肉炎、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー、肺損傷および体外透析後症状が含まれる。
本発明はいかなる意味でも特定の動物や種目の処置に限定されるものでないが、本発明の化合物はヒトの医学的処置に特に有用であり、また獣医学的処置に有用である。ネコやイヌのような家庭での動物、ウシやウマ、ヒツジなどの家畜、およびウシ科、ネコ科、イヌ科、有蹄類などを含む動物園の動物が対象となる。
化合物はいかなる適当な用量およびいかなる経路でも投与できる。経口投与が便利であり、受け入れやすいので好ましい。有効量は、個々の処置における処置対象の状態、年齢、体重、基礎的健康状態によって変る。これは、担当医師または獣医師の判断である。適切な用量は、本業界でよく知られた方法を用いて、試行錯誤の試みで容易に決定できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、Ｃ５ａのＧタンパク質結合受容体Ｃ５ａＲとの結合についての２部位モデルの図示である。黒棒はα−らせん領域を表し、白円筒は透過膜らせんを表す。部位１および２を図上に示す。
図２は、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積重プロットを示し、１０分後（開始時プロット）および続く２５、４０、５５、７０、１３０、１９０、２５０、３８５、５２０分後で、Ｄ2Ｏを含有するｄ6−ＤＭＳＯ中の７のＴｒｐ（８．１０ppm）およびＤ−Ｃｈａ（７．９０ppm）残基についてアミドＮＨ共鳴の時間依存性遅延を示す。
図３は、２４℃でｄ6−ＤＭＳＯ中の７の２０個の最低エネルギー最小化ＮＭＲ構造の骨格Ｃ、Ｎ、Ｏ原子を示す。
図４は、ｄ6−ＤＭＳＯ中のプロトンＮＭＲスペクトル由来の７の構造におけるＨ−結合の模式的図示である。
図５ａは、（ａ）受容体結合を示し、125Ｉ−Ｃ５ａのヒトＰＭＮとの結合の７（ｌ）；８（Δ）；９（←）；１２（○）による阻害を示す。
図５ｂは、Ｃ５ａアンタゴニスト効力をヒトＰＭＮからのミエロペルオキシダーゼＩ（ＭＰＯ）放出の７（□、ｎ＝９）および１２（←ｎ＝４）による阻害として示す。
図５ｃは、７、１５および１７のＣ５ａＲ結合およびアンタゴニスト効力を示す。
Ａ−Ｃは、ヒトＰＭＮにおけるミエロペルオキシダーゼ放出を阻害するＣ５ａアンタゴニストの濃度増加（上から下へ）の効果を示す（Ａ−Ｃ中、ｎ＝３）。
Ａ：０、０．１、０．３、１．０μMでの７（上から下へ）
Ｂ：０、０．１、０．０３、０．１μMでの１５（上から下へ）
Ｃ：０、０．０１、０．０３、０．１μMでの１７（上から下へ）
Ｄ：ＰＭＮ Ｃ５ｑＲ受容体についての比較親和性。125Ｉ−Ｃ５ａのヒトＰＭＮとの結合の７（上）、１５（中）、１７（下）による阻害。すべてのデータは、平均±ＳＥＭを示す。
図６は、環状Ｃ５ａアンタゴニストの受容体結合を示し、125Ｉ−Ｃ５ａのヒトＰＭＮとの結合の阻害で表す（ｎ＝５）。
図７は、７（淡、ＮＭＲ構造）および１２（濃、コンピュータのモデル化構造）の重ね合わせ構造を示す。ＰｈｅおよびＴｒｐ側鎖は、分かりやすくするために１２から除かれている。
図８は、ウィスターラットにおけるＣ５ａ誘発の好中球減少症の環状アンタゴニストF-［OPdChaWR］１mg/kg静注による阻害を示す。各群ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５はＣ５ａ処置群のみと比較、結果は平均±ＳＥＭで示す。
図９は、ウィスターラットにおける環状アンタゴニストF-［OPdChaWR］（０．０３−１０mg/kg、i.v.、リポポリサッカライド［ＬＰＳ］の１０分前）によるＬＰＳ誘発好中球減少症の阻害およびヘマトクリットの変化を示す。横軸：ＬＰＳ（１mg/kg、i.v.注射）後の時間。縦軸：ゼロ時間との比較におけるヘマトクリット値（Ａ）または循環の多形核（ＰＭＮ）白血球レベル（Ｂ）の変化百分率を示す。
図１０は、カラゲナン誘発ウィスターラット足蹠浮腫の環状アンタゴニスト（3D35）AcF-［OPdChaWr］（１mg/kg １回i.p.、カラゲナンの３０分前）による阻害を示す。各群４ラットからの結果、平均±ＳＥＭである。縦軸:浮腫容量の変化百分率。横軸:カラゲナン注入後の時間（分）。
本発明の詳細な説明
本発明は、下記の一般的方法、実施例および図面に従って参考としてのみ説明する。本明細書で使用する略号は次のとおりである。
ＢＯＰ            ベンゾトリアゾール−１−イルーオキシ−トリ−（ジメチルアミノ）−ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート
Ｄ−Ｃｈａ        Ｄ−シクロヘキシルアラニン
ＤＩＰＥＡ        ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ            ジメチルフォルマミド
ＤＭＳＯ          ジメチルスルフォキシド
ＨＢＴＵ          Ｏ−ベンゾトリアゾールＮ’，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；
ＬＰＳ            リポポリサッカライド
ＰＭＮ            多形核顆粒球
ＲＭＳＤ          二乗平均平方根偏差
ＲＰ−ＨＰＬＣ    逆相高性能液体クロマトグラフィー
ＴＦＡ            トリフルオロ酢酸；
本明細書を通じて、通常の三文字表記および一文字表記をアミノ酸に使用する。
一般的方法
保護されたアミノ酸および樹脂をNovabiohemから得た。ＴＦＡ、ＤＩＰＥＡおよびＤＭＦ（ペプチド合成等級）をAuspepから購入した。すべての他の材料は、特に断わらない限り試薬等級である。暫定的規模での逆相ＨＰＬＣ分離をVydac Ｃ１８逆相カラム（２．２×２５cm）で行い、そして分析逆相ＨＰＬＣ分離をWaters Delta−Pak PrepPak Ｃ１８逆相カラム（０．８×１０cm）で行った。これには、溶媒Ａ＝水/０．１％  ＴＦＡおよび溶媒Ｂ＝水１０％/アセトニトリル９０％、０．０９％  ＴＦＡの勾配混合物を用いた。ペプチドの分子量の測定は電子噴霧質量分析で３重四極質量分析計（PE SCIEX API III）により記録した。参照（Haviland et al,1995）。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルをBruker ARX ５００ MHzまたはVarian Unity ４００分析計で記録した。プロトン移行は２Ｄ  ＮＭＲ試験（DFCOSY,TOCSY,NOESY）で測定した。
非ペプチド化合物は、通常の有機化学的方法を用いて合成した。化合物は1Ｈ−ＮＭＲ分光および質量分析で調べた。
ペプチド合成
いくつかの代表的ペプチドを合成した。直線的ペプチド配列をマニュアル工程広範固相ペプチド合成によりＨＢＴＵ活性およびＤＩＥＡ in situ中性化で会合した。Ｂｏｃ化学をアミノ酸のＮα−保護のために用い、Ｂｏｃ基の除去のためにＴＦＡで１分間２回処理した。ペプチドを完全に脱保護し、開裂するために液体ＨＦ（１０ml；ｐ−クレゾール（１ml）；−５℃；１−２時間）で処理した。分析ＨＰＬＣ（勾配；０％  Ｂから５０％  Ｂ、４０分間以上）：７、Ｒｔ＝３２．０分、［Ｍ＋Ｈ］＋（計算）＝９００．５、［Ｍ＋Ｈ］＋（実測）＝９００．７；８、Ｒｔ＝３２．２分、［Ｍ＋Ｈ］＋（計算）＝８９９．６、［Ｍ＋Ｈ］＋（実測）＝８９９．７；９、Ｒｔ＝３０．０分、［Ｍ＋Ｈ］＋（計算）＝９００．５、［Ｍ＋Ｈ］＋（実測）＝９００．７；１０、Ｒｔ＝２３．８分、［Ｍ＋Ｈ］＋（計算）＝８６０．５、［Ｍ＋Ｈ］＋（実測）＝８６０．５。
ペプチドについての構造を下記表４に示す。
ａ）環１１の合成
本発明の広範な環状アンタゴニストの合成に使用される一般的方法を示す。例えば、環１１の場合、その直線的前駆体ペプチドはＦｍｏｃ化学で合成され、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｗａｎｇ樹脂上のＨＢＴＵ/ＤＩＥＡ活性を利用した。Ｆｍｏｃ基の除去は、５０％ピペリジン/ＤＭＦで１分間２回処理した。９５％  ＴＦＡ/２．５％  ＴＩＰＳ/２．５％  Ｈ2Ｏを用いて開裂および脱保護を行うと、Ｍｔｒ−保護ペプチドが得られ、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。保護された精製ペプチドの環化は、３eq  ＢＯＰおよび１０eq  ＤＩＥＡを１mMの濃度でＤＭＦ中１５時間攪拌して行い、得た環化産物をＴＦＡ中１Ｍ  ＴＭＳＢｒで完全に脱保護した。最終ＲＰ−ＨＰＬＣ精製により所望のペプチドを環化収率５０％で得た。Ｒｔ＝３７．７分、［Ｍ＋Ｈ］＋（計算）＝９１０．５、［Ｍ＋Ｈ］＋（実測）＝９１０．７。
ｂ）環１２の合成
開裂および完全脱保護ペプチドの環化を、１mM  ＤＭＦ溶液と３eq  ＢＯＰおよび塩基として１０eqピリジンを１５時間攪拌して行った。最終ＲＰ−ＨＰＬＣ精製により所望のペプチドを環化収率２２％で得た。Ｒｔ＝３７．３分、［Ｍ＋Ｈ］＋（計算）＝８９６．５、［Ｍ＋Ｈ］＋（実測）＝８９６．５。
ＮＭＲ構造決定
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを化合物７（７５０μl  ｄ６−ＤＭＳＯ中３mg、δ□２．５０）について溶媒対照で、Varian Unity ４００分光計により２４℃で記録した。２つの２次元１Ｈ−ＮＭＲ  NOESY（遅延時間２．０秒、混合時間５０−３００分）、DFQ−COSYおよびTOCSY（混合時間７５分）を純位相モードで行った。すべての実験について、データ収集時間＝０．１８６秒、スペクトル幅＝５５００Hz、複数点（ｔ１軸）＝１０２４。データは両軸において、ゼロ付加して、１０２４の実質点へFourier移行した。
ＮＭＲデータをSilicon Graphics Indy計算センターでのTRIADソフトウェアー（Tripos Assoc.）で処理した。２Ｄ  ＮＯＥ交差ピークを積分し、強（１．８−２．５Å）、中程度（２．３−３．５Å）および弱（３．３−５．０Å）に分類した。暫定的３次元構造を、Ｄiana２．８（６９距離制約、隣接残基について２７およびさらに離れるもの６を含む）を用いて重複２面角制約法（ＲＥＤＡＣ）で上限および下限距離ファイルから計算した。上限および下限距離をMARDIGRASで正確に計算した。この段階で、可能な水素結合についてペプチドを調べ、結合を距離制約として加えた。５０最低エネルギーＤiana構造を制約分子動力法（ＲＭＤ）および制約エネルギー最小化（ＲＥＭ）の対象とした。ＲＥＭは、最初に５０段階急勾配低下、次いで１００段階共役傾斜最小化法からなった。ＲＭＤは、構造の模擬加熱で行い、１psにつき３００Ｋ、次いで１psにつき５００Kで行った。温度を徐々に下げ、２ps以上で３００Ｋ最終的に２psにつき２００Ｋとした。ＲＥＭを再び５０段階急勾配低下、２００段階勾配、次いで３００段階Ｐowell最小化を行った。最終構造を調べて、骨格重原子（Ｎ、ＣαおよびＣ）を越える平均対の平方自乗平均差異を得る。５０構造中３０ですべての骨格原子（Ｏ、Ｎ、Ｃ）につき平方自乗平均＜０．５Åであった。
分子モデル
図７に示す環１２のモデルを７のＮＭＲ構造からつくった。これには、すべてのＮＭＲ制約をなくし、オルニチン側鎖をｄ−ＡｒｇのＣ−末カルボキシレートに融合してアミンを形成し、Ｐowell強制場（１０００繰り返し）を用いて最小化した。モデル構造を平方自乗平均０．２２４ÅのＮＭＲ構造に重ねた。
受容体結合アッセイ
新鮮ヒトＰＭＮを（Sanderson et al,1995）記載のように単離し、アッセイを行った。それには、緩衝液の５０mM  ＨＥＰＥＳ、１mM  ＣａＣｌ２、５mM  ＭｇＣｌ２、０．５％ウシ血清アルブミン、０．１％バシトラシンおよび１００μMフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を用いた。４℃でのアッセイにおいて、緩衝液、非標識ヒト組換えＣ５ａ（Sigma）またはペプチド、Hunter/Bolton標識125Ｉ−Ｃ５ａ（〜２０pM）（New England Nuclear,MA）およびＰＭＮ（０．２×１０６）を、Millipore Multiscreenアッセイプレート（ＨＶ０．４５）に順次加え、最終容量を２００μL/wellとした。６０分間４℃でインキュベートした後、サンプルを濾過しプレートを１回緩衝液で洗った。フィルターを乾燥し、パンチし、ＬＫＢガンマ計で計数した。非特異的結合を１mMペプチドまたは１００nM  Ｃ５ａで調べた。これは典型的に１０−１５％の全結合をもたらすものであった。
データ解析は非直線的回帰およびDunnett postテストで統計処理した。
ミエロペルオキシダーゼ放出
細胞を（Sanderson et al,1995）記載のように単離し、シトチャラシンＢとともにインキュベートした（５μg/mL、１５分間、３７℃）。０．１５％ゼラチンおよびペプチドを含むHank’s Balanced Salt溶液を９６ウエルプレート（全量１００μL/well）に加え、次いで２５μL細胞４×１０６/mL）を加えた。Ｃ５ａに拮抗する各ペプチドの能力を調べるために、細胞を５分間３７℃各ペプチドとともにインキュベートし、Ｃ５ａ（１００nM）を加え、さらに５分間インキュベートした。次いで、５０μLのリン酸ナトリウム（０．１Ｍ、ｐＨ６．８）を各ウエルに加え、プレートを室温に冷やし、等量のジメトオキシベンジジン（５．７mg/mL）とＨ2Ｏ2（０．５１％）からなる２５μLの新鮮混合物を各ウエルに加えた。反応を１０分で２％アジドナトリウムを加えて停止した。吸光度を４５０nmでBioscan ４５０ plate readerにより測定し、対照値（ペプチドなし）で修正し、非直線回帰で解析した。
抗炎症活性のインビボアッセイ
下記のよく知られたインビボアッセイ系を用いて、本発明の化合物の抗炎症活性が調べられる。すべてのアッセイデータの解析は、非直線回帰解析、Student’s t−テスト、分散分析を用いた。有意水準はｐ＜０．０５である。
（ａ）カラゲナン足蹠浮腫
麻酔（腹腔内、ケタミンおよびキシラジン）ウイスターラット（１５０−２００ｇ）またはマウスに滅菌空気（２０ml  １日、１０ml  ４日）を背中の皮下組織へ注射した。空洞を６日後に使用できる。カラゲナン（２ml、１％ w/w ０．９％塩類溶液）を空気ポーチに注入し、滲出液を１０時間後に採取した。試験化合物を６日後に毎日投与し、抗炎症作用を空気ポーチ滲出液中の細胞を示差計数して調べた。動物を注射後の適当な時に殺し、２ml ０．９％塩類溶液を用いて空洞を洗い、ヘパリンを入れた管に洗液を移し、細胞を血球計およびDiff−Quik染色細胞遠心製剤で計数した。
あるいは、通常のカラゲナン足蹠浮腫をウイスターマウスで、カラゲナンを足蹠に注射してつくり、２時間後に可視でき、４時間後に最大となる浮腫が生じた。試験化合物を炎症起剤の４０分前に与え、２および４時間後の足蹠をマイクロカリパスで測定した。参照、Fairlie,D.P.et al（1987）およびWalker and Whitehouse（1978）。
（ｂ）アジュバント関節炎
アジュバント関節炎をラット（３種）に、関節原性アジュバントを油状担体とともに（フロインドアジュバント）尾基部に接種して、微生物学的に（殺菌Mycobacterium tuberculosisを注射）または化学的に（アヴリジンで）起こした（参照Whitehouse,M.W.,Handbook of Animal Models for the Rheumatic Diseases,Eds.Greenwald,R.A.;Diamond,H.S.;Vol.1,pp.3-16,CRC Press）。
１３日以内に、アジュバント関節炎が、尾の局所的炎症および潰瘍、全４足蹠の腫脹、足蹠および耳の炎症性損傷および体重減少や発熱で表われる。これらの症状は、ヒトの炎症疾患ににており（Winter and Nuss,1966）、ヒトで効果を現すインドメサシンやシクロスポリンなどの薬剤により改善される（例えば、Ward and Cloud,1966）。１４日目での薬剤処置をしないと、関節炎ラットに足蹠の肥厚が生じ、血清中のアルブミンが低下し、急性相反応タンパク質が増加し、バルビテュレートによる睡眠時間の延長で表されるように生体異物の肝代謝を抑制した。
活性を調べるために、アルトリトゲン（日０）の接種１０−１３日後に化合物を４日間経口（１０mg／kg／日以下）または腹腔内投与した。足蹠の厚さおよび尾の容量のマイクロカリパス測定、および炎症損傷の観察によって調べたところ、炎症は前足および後足で認められないか、非常に減少していた。動物を１８日目に頚部切断で殺した。ただし、炎症徴候がなかった場合は、倫理委員会の特別の許可を得て観察を続けた。試験をずらして情報量を最大にし、化合物間の初期の比較を可能にした。この日常的なアッセイは、ヒトに用いられる抗炎症剤を同定するのに、よく受け入れられる。
実施例１ Ｃ５ａアゴニストの構造−活性の関係
強力なアゴニスト活性を有するペプチド配列の研究において構造−活性の関係を知るためにＣ５ａのＣ末残基に焦点を絞った。これらのペプチドの多くはＣ５ａに関する完全なアゴニストであるが、顕著な低い効力を有する（Sanderson et al,1994,1995;Finch et al,1997）。われわれの最初の構造−活性の研究は特に得るところが多かった。Ｃ５ａのデカペプチドＣ末（１、Ｃ５ａ６５−７４、ISHKDMQLGR）を２度１６５ＹおよびＨ６７F（例えば２）で変異を起こすと、アゴニスト強度に２桁の増加が見られた。これらの結果を表２に要約する。化合物２についてのRamachandranプロットおよび２Ｄ  ＮＭＲスペクトルの解析によると、特定の構造的特徴、すなわち残基６５−６９について捩れた“ヘリックス様”骨格配座および残基７１−７４についてβ−回転が活性の一因であるようであった。これらの結果は、Ｃ５ａ受容体に固く結合するための構造的要件にいくつかの洞察をもたらす。
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表２の化合物４、５および６は、いままで知られている最も高い親和性の小Ｃ５ａアゴニストであり、ヒト胎児動脈において２５％までのＣ５ａ効力、ヒトＰＭＮ酵素放出アッセイにおいて５％  Ｃ５ａ効力およびＰＭＮ  Ｃ５ａＲについて１％  Ｃ５ａ親和性を有する（Finch et al.,1997）。ＰＭＮ受容体について、これらの化合物は、文献にいままで発表されたいかなる小分子よりも最大１００−倍の高い明白な親和性を有する。
無傷ＰＭＮ細胞におけるＣ５ａについてのこれらアゴニスト類似体の“高”親和性（７０nM−６μM）からして、スパスモーゲン活性の発現およびヒトＰＭＮ細胞における酵素放出アッセイに相関するペプチドアゴニストの共通的局所的特徴を同定できた。この好ましい骨格配座はタイプII  β−回転である。
これらの小サイズのアゴニストペプチドは、その親和性、活性、バイオアベイラビリティを最適化するために、合成的修飾が可能であり、もって受容体活性化の構造的プローブとして有用である。
実施例２ Ｃ５ａアンタゴニストのＮＭＲ構造
２次元核磁気共鳴分光計を用いて、７の３次元構造を決定した。水中では認められるような構造がなかったが、ジメチルスルフォキシド中ではガンマ−回転構造が確認された。
２４℃におけるｄ６−ＤＭＳＯ中の７の１Ｄ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、表３に要約するようにアミドＮＨプロトンについて４つの別異の共鳴を示す。その分子内水素結合の関与をはっきりさすために、１０倍過剰のＤ2Ｏを溶液に加えて、重水素交換実験を行った。アミドＮＨ二重線の２つがすぐに消え、Ｎ末メチルアミンプロトンに起因する共鳴を伴った。しかし、他の２つのアミドＮＨ共鳴および約８．０５ppmでの広い共鳴は、最大６．５時間持続した（図２）。これらの３つの緩やかな交換プロトンは、Ｔｒｐおよびｄ−ＣｈａのアミドＮＨ、およびＬｙｓの側鎖に原因があり、緩やかな交換は水素結合に特徴的である。アミン割当の確認は、プロトン化アミンとε、δおよびγ  ＣＨ2プロトンとの間に認められる交差ピークのTOCSYスペクトルでなされる。アミドＮＨ化学的交換の温度依存試験（２０−６０℃）（Δδ/T＝２．５ppb/deg,dCha−NH;６ppb/deg,Trp−NH;６．５ppb,Lys−NH;８．７ppb,Arg−NH）でもって、分子内水素結合へのｄＣｈＡ−ＮＨのみの関与を疑問なく確認した。
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一連の２Ｄ  1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを７について２４℃でｄ６−ＤＭＳＯ中測定し、３次元構造を決定した。ＴＯＣＳＹおよびＤＦＱ−ＣＯＳＹ実験により、残基タイプを同定し、逐次割当をＮＯＥＳＹデータから行った。ＮＯＥＳＹデータから生じた一連の１００構造より、最低エネルギー構造の５０を制約分子動力法（２００Ｋ−５００Ｋ）にかけ、エネルギーを最小にした。根平均平方偏差（rmsd）＜０．５Å（骨格原子）をもつ一連の２０計算構造を図３で重ねると回転配座を明白に表した。
ＮＭＲ制約データ、３ＪＮＨ−ＣαＨ値、重水素交換および温度依存性データを組み合すと、図４に示すように、最大３水素結合により制約されたヘキサペプチド７が明確になる。この証拠は、ｄＣｈａ−ＮＨ....ＯＣ−Ｌｙｓ（２．７２Å，Ｎ−Ｈ..Ｏ  角  １５７°，Ｃ＝Ｏ...Ｈ  角  ８４°）由来の１つの分子内水素結合については非常に強く、逆γ−回転を確定する７員環を形成する。ｄＣｈａＮＨ−Ｏ−ＴｒｐＮＨ角は５６．４°である。重水素交換データおよびＮＭＲ制約データは、一緒に第２分子内水素結合Ｔｒｐ−ＮＨ....ＯＣ−Ｌｙｓ（３．３１Å，Ｎ−Ｈ..Ｏ  角  １５９°，ＣＯ...Ｈ  角  １３７．３°）、β−回転に特徴的な１０員環を形成する。φおよびψ角（φ2＝−５８．４°、ψ2＝６２．０°；φ＝９６．６°、ψ3＝１６．６°）は、タイプII  β−回転に適合する（Bandekar,1993;Hutchinson and Thornton,1994）。このβ−回転は、その中にγ−回転が存在することで歪められる。
われわれの知る限り、これは、β−回転内の残基間の分子内水素結合についての最初の例である。しかし、β−回転の“１０員環”内の１残基とその外側の１残基との水素結合については多くの例がある。（Bandekar,1993）。第３の水素結合（２．７６Å，Ｎ−Ｈ...Ｏ  角  １６０．３°）は、Ｌｙｓの側鎖アミンとＣ末カルボキシレートとの間にあり、ＮＭＲ制約データ、緩やかなＮＨ／ＮＤ交換およびＬｙｓ−ＮＨ...Ｔｒｐ−αＣＨ２間の弱いＮＯＥの検出により示唆された。これは、分子を回転配座中へさらに制約する。このようなイオン対の形成はジメチルスルホキシドなどの二極性の非プロトン溶媒に共通であり、疎水性タンパク質環境にも関係する。
ＮＭＲ溶媒構造を下記の実施例に記載した環状アンタゴニストのいくつかについて決定した。各例においてタイプII  β−回転が環状構造により保存され、安定化されることを示す。
直鎖ペプチド７中の制約βおよびγ回転は環状ペプチドに平行する。われわれはかって、アシジアシクラミド由来の環状オクタペプチド中で重複するβおよびγ回転を検出した（Abbenante et al,1996）。β−およびγ−回転の組み合せも環状のペンタおよびヘキサペプチド、特に代わりのＤ−およびＬ−アミノ酸を含有するペプチドで認められている（Marraud and Aubry 1996;Fairlie et al,1995;Kessler et al,1995;Stradley et al,1990）。例えば、タイプII  β−回転および逆γ−回転は、エンドテリン受容体について環状アンタゴニストｃ−（Ｄ−Glu−Ala−Ｄ−allo−Ile−Leu−Ｄ−Trp］（Ihara et al,1991;Coles et al,1993;Ihara et al,1992;Bean et al,1994）およびｃ−（Ｄ−Asp−Pro−Ｄ−Val−Leu−Ｄ−Trp）（Bean et al,1994）、および７つの膜透過ドメインを持つＧタンパク質結合受容体のロドプシンファミリーのメンバー（X.−M.Cheng et al,1994）内で同定されている。後者の場合、７におけるのと同様に、逆γ−回転が、プロリンを両側からはさむ残基（Asp−ＣＯ.....Val−ＮＨ，Lys−ＣＯ....ｄＣｈａ−ＮＨ）の間に形成する。
実施例３ インビトロでの構造と活性の関係
我々は、新規化合物と比較のためにヘキサペプチド７の受容体結合およびアンタゴニスト活性も調べた。Konteatis et al（1994）による従前の報告は、単離ＰＭＮ膜上受容体（ＩＣ50 ７０ｎＭ）とのＣ５ａ結合に競合する７の能力に関するものであったが、必ずしも生理学的に関係するものではなかった。未処理ＰＭＮ細胞を用い７とＣ５ａとの競合を調べ、これらの条件下、７の結合は受容体親和性が非常に低くＩＣ50１．８μＭであることを発見した。７はアゴニスト性を全く有さない完全アンタゴニストであることを確認した。これらの結果を図５ａおよび表４に要約する。我々のアッセイでは、未処理ＰＭＮにおけるＣ５ａＲに対する７の相対親和性（割合）は、単離ＰＭＮ膜について以前報告されたものに近似していた。
また我々が発見したことは、７がＣ５ａ（図５ｂ）とＣ末端Ｃ５ａ65-74のＣ末端アゴニストデカペプチド類似体４（YSFKPMPLaR）（Finch et al,1997）との両方に対しアンタゴニスト活性を示したことであり、７が受容体の部位２に作用することを示唆している。化合物７および４は、表４に示すように、未処理多形核白血球の受容体Ｃ５ａＲに対し同程度のμＭ親和性を有する。
表４のデータからの新規発見によると、結合親和性の対数と、これら部位２アンタゴニストについてのアンタゴニスト効力の対数との間に直線状の相関関係がある（化合物７-１２、表４）。この直線関係の重要性は次の通りである。受容体親和性とアンタゴニスト活性が正比例するので、受容体結合を測定する実験的により簡単なアプローチを使用して、これらの小化合物に対するアンタゴニスト活性が算出し得る。但し、アゴニスト活性の証明とはならない。
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従来の説によると、Ｃ５ａおよびアゴニストペプチドのＣ末端は、活性に重要である。受容体の陽性電荷Ａｒｇ２０６と相互作用するからである（DeMartino et al,1995）。Ｃ末端カルボン酸は活性に実に重要である（８対７）ことをここで確認したが、この効果の源はカルボン酸陰イオンとＬｙｓの陽性電荷アミン側鎖との間の水素結合によるものかもしれないとも考えられた。アミド（８）への変換は、受容体親和性およびアンタゴニスト活性を両方とも約１／５に確実に減少する。Ａｒｇ−Ｃαのキラリティを変えると（９対７）、活性が同程度減少し、かさの低いＬｅｕ残基（１０）でｄＣｈａを置換すると、受容体結合に不利に働く。しかし、効力は環状化合物１１および１２では回復し、これらの化合物にいてアミド結合がＣ末端で寛容され、７のカルボキシレートの利点が分子内水素結合と関係し得るという上記の構造解釈と一致する。１１および１２の共有アミド結合で７の水素結合を置換すると、より効果的に回転配座を安定化する。
図５Ｃは、化合物１５および１７について化合物７に比較して、ヒトＰＭＮにおけるインビトロでのＣ５ａＲ結合およびアンタゴニスト効力を示す。１５および１７は何れも、Ｃ５ａの作用および125Ｉ-Ｃ５ａと受容体との結合をｎＭ濃度で強力に阻害する（例えば４、Ｋb＝１．４ｎＭ）。環状の性質およびＮ末端フェニルアラニンでのアセチル化は何れも、典型的にペプチドが遭遇するタンパク質性分解を防ぐので、薬剤候補として非環状ペプチドより環状化合物が適している。結果を表５に示す。
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実施例４ Ｃ５ａの環状アンタゴニスト
これら環状アンタゴニストのいくつの例ならびにその明白な受容体結合親和性およびアンタゴニスト効力の例を、表４、５および６ならびに図５および６に示す。表ではアミノ酸の１文字表記を用いる。
0004686696.tif 000014
ａ  ｐＤ2／ＩＣ50；［125Ｉ］Ｃ５ａが未処理ＰＭＮに結合するのを５０％阻害するペプチド濃度。ＩＣ50は平均ｐＤ２値の逆対数である。
ｂ  ｐＤ2／ＩＣ50；ＰＭＮからＭＰＯを放出する要因となるＣ５ａ（１００ｎＭ）の能力を５０%阻害するペプチド濃度
Ｘ＝（ＣＨ2）-ＮＨ2
Ｘ2＝（ＣＨ2）2-ＮＨ2
ｐＤ２  値は平均±ＳＥで表わしている。
ｎ  行った実験数を示す。
＊  NMeFKPdChaWR（p<0.05）と比較した親和性／効力の有意な変化
＃  異性体の数を示す。
以下の結果となる：
（１）環状分子は明らかにより高い受容体親和性を有し、非環状（直鎖状）ペプチドよりも強力なアンタゴニストとなり得、
（２）生じ得る２つの環状ジアステレオマーの１つがＣ５ａ受容体への結合に一貫して好適であり、驚くべきことにそれは、直鎖状化合物で好適であるもの（Ｄ-アルギニン）に対し逆の立体配置（Ｌ-アルギニン）であり、
（３）この環は受容体結合に適当な環サイズを有し、
（４）対数（アンタゴニスト効力）と対数（受容体親和性）との間に仮直線の関係がある。
表５および表６は、数例のＣ５ａの環状アンタゴニストのＣ５ａ受容体親和性について記載しており、ヒトＰＭＮに対する結合能およびヒトＰＭＮに対するＣ５ａの阻害、結合を図６に示す。驚くことに、これらのデータによると、Ｌ-アルギニンが直鎖状化合物７と異なりＤ-アルギニンより好適である。７ではＤ-アルギニンが受容体に対しＬ-アルギニンより高い親和性を付与する。またデータから、ｎ＝２または３のときは巨大環の大きさが適当であり、ｎ＝１の場合は小環の大きさが適当であり、そして明らかに活性の低いｎ＝４の場合は大環の大きさが適当である。強固な制約環（constrained cycle）を要するのは、受容体と相互作用する結合側鎖残基、例えばＴｒｐ、ｄＣｈａ、ＡｒｇおよびＰｈｅを正確に位置付ける必要があるからであろう。
実施例５ アンタゴニスト構造のコンピューターモデル
図７では、環状アンタゴニスト１２のコンピューターモデル化構造と非環状アンタゴニスト７のＮＭＲ溶液構造との比較をしている。これら骨格構造は極めて類似しており、これら分子の受容体結合配座が同じ回転構造を有することを強く示唆する。化合物１２（１１よりも更に強力なアンタゴニスト）が、より短いリンカーも有し、回転を固定し、Ｐｈｅ、ｄＣｈａ、ＴｒｐおよびＡｒｇの主要側鎖に影響する配座空間を僅かに変化させる。環によるヘキサペプチド誘導体１２上の配座限界は、受容体結合親和性がＣ５ａの配座的に可動なデカペプチドＣ末端全体より１０4以上増加する要因である。（１、表２）。
部位２アンタゴニストについて結合親和性とアンタゴニスト効力との間には相関関係がある（化合物７-１２、表２）。従って、アンタゴニスト効力は部位２のみに生ずる変化に依存しているようである。このことは、いかなる提唱メカニズムに拘束されることを意図するものでないが、受容体の部位２の７により誘発される回転配座への配座的変化にアンタゴニズムのメカニズムが関係するためであると考える。
実施例６ 種々の細胞におけるＣ５ａＲの特性化
近年、他の型のＣ５ａＲについての情報はない。以前に我々は、アゴニストに対する機能性Ｃ５ａＲを含む種々の細胞の応答に関する顕著な相違を示した（Sanderson et al,1994,1995;Finch et al,1997）。このたび、我々が提供するのは、ヒト組換え体Ｃ５ａに関係する選択的なアゴニストおよびアンタゴニストの効力および作用を検討した結果の情報である。アゴニストの場合、組織または細胞の選択性により、機能的に異なる受容体が明らかにされ得る。ヒトＰＭＮ、Ｕ９３７細胞、または循環単球を使った結合アッセイを用い、Ｃ５ａＲに対する親和性を測定する。他のＣ５ａＲに対する選択性は特異な競合により確実となる。この併用のアプローチから、新規アゴニストまたはアンタゴニストの医薬的特性化ができ、種々の細胞におけるＣ５ａＲの有する機能による分類を為し得る。
実施例７（ａ） インビボでの好中球減少症およびＣ５ａ競合
化合物をＣ５ａ誘発性好中球減少症の急性モデルで評価した。図８に示されるように、一時的な好中球減少症はＣ５ａ静脈注射後５分間で最大、深在的となり、有効用量のＣ５ａで循環から９０％を超える循環好中球が消失する。好中球減少症は、血管内皮に循環好中球が一時的に接着することが原因である。実験データによると、Ｃ５ａ静脈注射による好中球減少症はＣ５ａアンタゴニストにより阻止される。例えば、２μｇのＣ５ａ静脈注射前にF-［OPdChaWR］、（１ｍｇ／ｋｇ）を投与すると、インビボではＣ５ａ誘発好中球減少症が抑えられる（図８）。
実施例７（ｂ） Ｃ５ａアンタゴニストによるリポポリサッカリド誘発性効果の阻害
ＬＰＳはラットにおける急性好中球減少症の原因である。ＬＰＳのこの効果がＣ５ａアンタゴニストにより阻止されるならば、Ｃ５ａはＬＰＳの急性効果に非常に重要なものである。図９に示した結果はこの仮説と一致した。Ｃ５ａアンタゴニストはＬＰＳ変化１０分前に注射された（ボーラス、静脈注射）。ラットを麻酔し、血液サンプル（０．３ｍｌ）をＰＭＮ測定のために採取した。ＰＭＮを単離し、定量する。結果から判るように、ＬＰＳ静脈注射前にF-［OPdChaWR］、（１ｍｇ／ｋｇ）を投与すると好中球減少症が抑えられる。
また結果は、Ｃ５ａアンタゴニストがＬＰＳによるヘマトクリットの増加を抑え、ＬＰＳによる血清の血管漏出も抑えることを示す。
これらの結果から、Ｃ５ａ受容体アンタゴニスト（例えば本発明中で記載したもの）が敗血症患者の治療に利用し得ることが分かる。血管内皮へのＰＭＮの接着を阻害する能力およびヘマトクリット値の減少により示されるようなＬＰＳに対する血管漏出を抑制する能力は、補体系を活性化する炎症刺激物（例えばエンドトキシンまたはＬＰＳ）に対する本発明化合物の強力な抗炎症性作用を示している。
実施例８ 環状Ｃ５ａアンタゴニストのインビボ活性
ラットの予備実験から判るように、表５に要約した環状アンタゴニストは、２０ｍｇ／ｋｇ未満で活性があり、カラゲナン誘発足蹠浮腫またはアジュバント誘発多発性関節炎の発症を抑制する抗炎症剤として作用する。中程度のアンタゴニストの最大効果用量は１０ｍｇ／ｋｇ以下である（腹膜内注射または経口投与の場合）。現在ヒトに使用されている多くの抗炎症剤は、最初にこのようなアッセイで評価され、さらに炎症ラットモデルでも活性がみられたものである。インビボでのこれら予備実験の効力から、Ｃ５ａアンタゴニストがヒトの炎症の病状に治療効果があることが分かる。
ラットのカラゲナン足蹠浮腫アッセイを用い、化合物AcF-［O-P-dCha-W-r］は、ＰＭＮのＣ５ａアンタゴニストとしてインビトロで１７の１／１００の活性しかないが、カラゲナン注射前３０分に１ｍｇ／ｋｇを腹膜内注射すると、インビボ活性を幾分有することが判った。足蹠の膨張を最大４．５時間まで測定した。図１０に示す結果によると、この弱いＣ５ａアンタゴニストでさえ１８０および２７０分後の浮腫の進行を有意に阻害する。この抗炎症性活性から、Ｃ５ａ受容体アンタゴニスト（例えば本発明で記載したもの）が、炎症性の刺激に続く血管漏出を含む疾患に治療的活性を有し得ることが分かる。
近年、生物学的活性タンパク質表面となるβ-およびγ-回転ペプチドを擬似する多くの試みがあり、ＲＧＤ（アルギニン-グリシン-アスパラギン酸）ペプチド、ソマトスタチンおよびオピオイドペプチドについて注目すべき擬似体が得られており、構造-活性の関係から誘導された数種を挙げることができる（例えば、Marraud and Aubry,1996;Fairlie et al,1995参照）。これら殆どの例は、ペプチドの環状化を通じて回転構造を維持する。他方、溶液中で事実上回転構造を有することが判明している短い非環状ペプチドは比較的少ない
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短い非環状ペプチドが、生物学的活性の要因となる小集団の回転構造を含み得る無数の溶液構造をとるものと通常されている。
本発明は、配座的に制約された回転を含有する分子について記載する。これらの分子は、ヒトＣ５ａが標的とするのと同じヒト細胞のＧタンパク質結合受容体と結合するように前もって構成されるものである。本発明は他のＧタンパク質結合受容体にも適用できる。
本発明化合物の主要な特徴は、前もって構成された配置であり、少なくとも３つの疎水性基および荷電基を隣接空間にもたらし、疎水性表面‘パッチ’を作成する。これらの結果から、Ｃ５ａのさらに強力な配座的制約小分子アンタゴニストを設計または開発できる。
上記した先行技術からすると驚くべきことであるが、優れた受容体結合またはアンタゴニスト活性を得るために、Ｃ末端カルボキシレートが本発明の化合物においては必要のないことが判明した。環状アンタゴニストは‘Ｃ末端’アルギニン位でアミド結合を有する。７のカルボキシレートを共有アミド結合で置換すると、必要とされる回転配座を効果的に安定化する。
環状および非ペプチドアンタゴニストは、薬剤としてペプチドよりも重要な利点を幾つか有する。本発明記載の環は、ヒトの血液または血漿において、またはヒトやラットの胃液において、またはペプシン、トリプシンおよびキモトリプシンのような消化酵素存在下で、３７℃で少なくとも数時間タンパク質分解性破壊に対し安定である。反対に、Ｌ-アミノ酸からなる短いペプチドは、これらの条件下では数分以内に構成アミノ酸に急速に分解する。２つ目の利点は、環状および非ペプチド分子が適用する制約単一配座である。一方、非環状もしくは直鎖状ペプチドは可動的でありすぎて、必要な受容体結合構造以外の数種の構造を溶液中で適用してしまう。３つ目に、本発明記載のような環状・非ペプチド化合物は、常により脂溶性であり、あまり経口投与できないペプチドよりも薬剤として薬理学的に生体利用性が高いことである。４つ目は、環状・非ペプチド分子の血漿中半減期が他のペプチドよりも常に長いことである。
本発明は明瞭かつ理解しやすいように詳細に記載しているが、ここに記載の実施態様および方法の種々の修飾および変更が本明細書に開示の発明概念の範囲から逸脱せずに為し得ることは、この分野の当業者には明らかである。
本明細書に引用した参考文献を次頁以下に挙げており、この引用により本明細書の一部とする。
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【図１】
0004686696.tif 000019
【図２】
0004686696.tif 000020
【図３】
0004686696.tif 000021
【図４】
0004686696.tif 000022
【図５ａ】
0004686696.tif 000023
【図５ｂ】
0004686696.tif 000024
【図５ｃ】
0004686696.tif 000025
【図６】
0004686696.tif 000026
【図７】
0004686696.tif 000027
【図８】
0004686696.tif 000028
【図９】
0004686696.tif 000029
【図１０】
0004686696.tif 000030