(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉａ
【化１】
0004620810.tif 000024
（式中、
ｘが１であり、そして
ｑ＝ｒ＝１そしてｓ＝ｔ＝０、又は
ｒ＝ｓ＝１そしてｑ＝ｔ＝０、又は
ｑ＝ｒ＝ｓ＝１そしてｔ＝０であり、
Ｒ2は水素、ヒドロキシル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、ハロゲン、アジド又はアミノであり、
Ｂは互いに独立してアデニン、シトシン、チミン、グアニン、ウラシル及びイノシンか
らなる群より選択される天然塩基、又はプリン、２,６−ジアミノプリン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ4,Ｎ4−エタノシトシン、Ｎ6,Ｎ6−エタノ−２,６−ジアミノプリン、シュードイソシトシン、５−メチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−(Ｃ3〜Ｃ6)−アルキニルウラシル及び５−(Ｃ3〜Ｃ6)−アルキニルシトシンからなる群より選択される非天然塩基であり、そして
「湾曲した括弧」はＲ2及び隣接する置換基が２′位及び３′位であるか、又は逆に３′位及び２′位であり得るこを示しており、
Ｎｕは式IIａ又はIIｂ
【化２】
0004620810.tif 000025
（式中、
Ｒ2及びＢは上で定義した通りであり、
Ｕはヒドロキシル、メルカプト、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ  6〜Ｃ20−アリール、Ｃ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ8−アルキル、ＮＨＲ3又はＮＲ3Ｒ4であり、そして
Ｒ3はＣ1〜Ｃ18−アルキル又はＣ1〜Ｃ4−アルコキシ−Ｃ1〜Ｃ4−アルキルであり、そして
Ｒ4はＣ1〜Ｃ18−アルキルであるか、又は
Ｒ3及びＲ4はそれらを担持する窒素原子と共に５〜６員の複素環式環であり、この環  はさらにＯ、Ｓ、Ｎからなる系列からの別のヘテロ原子を含むことがあり、
Ｖはオキシ、チオ又はイミノであり、
Ｗはオキソ又はチオキソであり、
Ｙはオキシ、チオ、メチレン又はイミノである）の基であり、
ｍは０〜２０であり、
ｏは０〜２０であり、
Ｄは式III
【化３】
0004620810.tif 000026
（式中、Ｂは上で定義した通りである）の基であり、
ｎは０〜２０であり、
ｐは０〜２０であり、
Ｌｉ1及びＬｉ2は各々、互いに独立して式Ｖ
〔(Ｖ′)−(Ｇ)−(Ｇ′)〕ε                (Ｖ)
（式中、互いに独立して
εは１〜５であり、
Ｖ′は酸素、ＮＨ、単結合又は式VI
【化４】
0004620810.tif 000027
（式中、Ｕ、Ｖ、Ｗ及びＹは上で定義した通りである）の基であり、
Ｇはアルカンジイルが場合により、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシル、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ6〜Ｃ14−アリール、又はＣ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ18−アルキルで置換されることがあるＣ1〜Ｃ12−アルカンジイル、Ｃ6〜Ｃ14−アリール−ジ−Ｃ1〜Ｃ12−アルカンジイル、又はδが１〜１１であることができる式(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)δ ＣＨ2ＣＨ2の基；又は単結合であり、そして
Ｇ′はオキシ、チオ、イミノ、−Ｃ(Ｏ)−、−Ｃ(Ｏ)ＮＨ−、単結合又は式VI（式中、Ｕ、Ｖ、Ｗ及びＹは上で定義した通りである）の基である）の基であり、そして
Ｆ及びＦ′は単結合により連結しており、そして／又は
オリゴマーの細胞内摂取に有利である末端基であって、−Ｏ−(ＣＨ2)x−ＣＨ3（式中ｘは６〜１８の整数）、−Ｏ−(ＣＨ2)n−ＣＨ＝ＣＨ−(ＣＨ2)m−ＣＨ3（式中ｎ及びｍは互いに独立して６〜１２の整数）、−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)4−(ＣＨ2)9−ＣＨ3、−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)8−(ＣＨ2)13−ＣＨ3及び−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)7−(ＣＨ2)15−ＣＨ3からなる群より選択される親油性基、コレステリルであるステロイド残基、ビタミンＥ、ビタミンＡ及びビタミンＤからなる群より選択されるビタミン残基、胆汁酸、葉酸及び２−（Ｎ−アルキル−Ｎ−アルコキシアミノ）−アントラキノンからなる群より選択される天然担体系を使用する他のコンジュゲート基、マンノースとＥＧＦ（上皮細胞増殖因子）、ブラジキニン及びＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドのレセプターを介したエンドサイト−シスに導く適切な受容体のペプチドとのコンジュゲートである基であるか、又は
ＤＮＡプローブの標識として役立つ末端基であって、ダンシル、フルオレッセインおよびクマリン誘導体からなる群より選択されるフルオレッセン基、アクリジン誘導体である化学ルミネッセント基、ＥＬＩＳＡにより識別できるジゴキシゲニン系リンカー、ビオチン／アビダジン系により識別しうるビオチン基、又はアクリジニウム活性エステルと反応して化学ルミネッセンスプローブを与えるアミノアルキルリンカーである基であるか、又は
オリゴマーの標的核酸とのハイブリッド形成において、結合、架橋又は開裂により前記核酸を攻撃する末端基であって、アクリジン、プソラレン、フェナントリジン、ナフトキノン、ダウノマイシン及びクロロエチルアミノアリールコンジュゲートからなる群より選択される基であるか、又は
ＦはＲ0−(Ａ)k−Ｖ−であり、そして
Ｆ′は−(Ｑ)l−Ｒ1であり、
（式中、
Ｒ0は水素、Ｃ1〜Ｃ18−アルカノイル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシカルボニル、Ｃ3〜Ｃ8−シクロアルカノイル、Ｃ7〜Ｃ15−アロイル、Ｃ3〜Ｃ13−ヘテロアロイルであるか、又は
オリゴマーの細胞内摂取に有利である基であって、−Ｏ−(ＣＨ2)x−ＣＨ3（式中ｘは６〜１８の整数）、−Ｏ−(ＣＨ2)n−ＣＨ＝ＣＨ−(ＣＨ2)m−ＣＨ3（式中ｎ及びｍは互いに独立して６〜１２の整数）、−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)4−(ＣＨ2)9−ＣＨ3、−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)8−(ＣＨ2)13−ＣＨ3及び−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)7−(ＣＨ2)15−ＣＨ3からな
る群より選択される親油性基、コレステリルであるステロイド残基、ビタミンＥ、ビタミンＡ及びビタミンＤからなる群より選択されるビタミン残基、胆汁酸、葉酸及び２−（Ｎ−アルキル−Ｎ−アルコキシアミノ）−アントラキノンからなる群より選択される天然担体系を使用する他のコンジュゲート基、マンノースとＥＧＦ（上皮細胞増殖因子）、ブラジキニン及びＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドのレセプターを介したエンドサイト−シスに導く適切な受容体のペプチドとのコンジュゲートである基であるか、又は
ＤＮＡプローブの標識として役立つ基であって、ダンシル、フルオレッセインおよびクマリン誘導体からなる群より選択されるフルオレッセン基、アクリジン誘導体である化学ルミネッセント基、ＥＬＩＳＡにより識別できるジゴキシゲニン系リンカー、ビオチン／アビダジン系により識別しうるビオチン基、又はアクリジニウム活性エステルと反応して化学ルミネッセンスプローブを与えるアミノアルキルリンカーである前記標識基であるか、又は
オリゴマーの標的核酸とのハイブリッド形成において、結合、架橋又は開裂により前記核酸を攻撃する基であって、アクリジン、プソラレン、フェナントリジン、ナフトキノン、ダウノマイシン及びクロロエチルアミノアリールコンジュゲートからなる群より選択される基であるか、又は
ｋが０の場合、Ｒ0は水素又はＶと一緒に式VII
【化５】
0004620810.tif 000028
（式中、Ｚ及びＺ′は、互いに独立して、ヒドロキシル、メルカプト、Ｃ1〜Ｃ22−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、Ｃ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ1〜Ｃ22−アルキルチオ、ＮＨＲ3、ＮＲ3Ｒ4であるか、
オリゴマーの細胞内摂取に有利である基であって、−Ｏ−(ＣＨ2)x−ＣＨ3（式中ｘは６〜１８の整数）、−Ｏ−(ＣＨ2)n−ＣＨ＝ＣＨ−(ＣＨ2)m−ＣＨ3（式中ｎ及びｍは互いに独立して６〜１２の整数）、−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)4−(ＣＨ2)9−ＣＨ3、−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)8−(ＣＨ2)13−ＣＨ3及び−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)7−(ＣＨ2)15−ＣＨ3からなる群より選択される親油性基、コレステリルであるステロイド残基、ビタミンＥ、ビタミンＡ及びビタミンＤからなる群より選択されるビタミン残基、胆汁酸、葉酸及び２−（Ｎ−アルキル−Ｎ−アルコキシアミノ）−アントラキノンからなる群より選択される天然担体系を使用する他のコンジュゲート基、マンノースとＥＧＦ（上皮細胞増殖因子）、ブラジキニン及びＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドのレセプターを介したエンドサイト−シスに導く適切な受容体のペプチドとのコンジュゲートである基であるか、又は
ＤＮＡプローブの標識として役立つ基であって、ダンシル、フルオレッセインおよびクマリン誘導体からなる群より選択されるフルオレッセン基、アクリジン誘導体である化学ルミネッセント基、ＥＬＩＳＡにより識別できるジゴキシゲニン系リンカー、ビオチン／アビダジン系により識別しうるビオチン基、又はアクリジニウム活性エステルと反応して化学ルミネッセンスプローブを与えるアミノアルキルリンカーである前記標識基であるか、又は
オリゴマーの標的核酸とのハイブリッド形成において、結合、架橋又は開裂により前記核酸を攻撃する基であって、アクリジン、プソラレン、フェナントリジン、ナフトキノン、ダウノマイシン及びクロロエチルアミノアリールコンジュゲートからなる群より選択される基である、そしてこの場合Ｒ3、Ｒ4、Ｖ及びＷは上で定義した通りである）の基であり、
Ｒ1は水素又はＱ0であり、そしてこの場合、１が０であり、ｔが０、ｓが１、そしてＬ
ｉ1がＶ′＝結合、Ｇ＝結合、ε＝ｌ、及びＧ′＝オキシ、チオ又はイミノである式Ｖの構造、又はＵ＝Ｚである式VIの基であるとき、Ｒ1は常に水素であり、
Ａ及びＱは、互いに独立して、グリシン、ロイシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンからなる群より選択される天然又は非天然のアミノ酸の残基であり、
Ｑ0はヒドロキシル、ＯＲ′、ＮＨ2、ＮＨＲ′′であり、この場合Ｒ′＝Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、そしてＲ′′＝Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ1〜Ｃ18−アミノアルキル、Ｃ1〜Ｃ18−ヒドロキシアルキルであり、
Ｖは上で定義した通りであり、
ｋは０〜１０であり、
ｌは０〜１０である）、
但し
ａ）ｔが０、ｓが１、そしてＬｉ1がＶ′＝式VIの化合物、Ｇ＝Ｃ2〜Ｃ12アルキレン及びＧ′＝ＣＯである(Ｖ′)−(Ｇ)−(Ｇ′)である場合、Ｆ′＝−(Ｑ)l−Ｒ1において、ｌは０〜１０そしてＲ1はＱ0であり、
ｂ）ｓ＝ｔ＝０の場合、Ｌｉ2は単結合である
ことを条件とし、そして
各ヌクレオチドはそのＤ又はＬ配置であることができ、そして塩基はα又はβ位であることができる）
のポリアミド−オリゴヌクレオチド誘導体又はその生理的に許容される塩。
【請求項２】
塩基がβ位である請求項１記載のポリアミド−オリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項３】
各々の場合、１つのヌクレオチド塩基を持つＰＮＡ単位又はＤＮＡ単位を適当に誘導体化された支持体の上又は生長するオリゴマー鎖の上に連続縮合させることからなる請求項１又は２記載のポリアミド−オリゴヌクレオチド誘導体の製造方法。
【請求項４】
請求項１又は２記載のポリアミド−オリゴヌクレオチド誘導体を含み、ウィルスによって引き起こされる病気又はインテグリンもしくは細胞間接着レセプターにより影響される病気の治療のため、癌の治療のため又は再狭窄を予防するための医薬。
【請求項５】
プライマーとして使用するための３′−ヒドロキシル基を持つヌクレオチド単位が少なくとも１つの末端に位置する請求項１又は２記載のポリアミド−オリゴヌクレオチド誘導体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は貴重な物理学的、生物学的及び薬理学的性質を有する新規なポリアミド−オリゴヌクレオチド誘導体に関する。それらの適用は遺伝子発現（アンチセンス・オリゴヌクレオチド、リボザイム（ribozymes）、センス・オリゴヌクレオチド及び三重鎖形成オリゴヌクレオチド）の阻害剤として、核酸検出用プローブとして、そして分子生物学における助剤としての使用に係わる。
【０００２】
オリゴヌクレオチドは遺伝子発現の阻害剤(G. Zon, pharmaceutical Research 5, 539 (1988); J. S. Cohen, Topics in Molecular and Structural Biology 12 (1989) Macmillan Press; C. Helene and J.J. Toulme, Biochimica et Biophysica Acta 1049, 99 (1990); E. Uhlmann and A. Peyman, Chemical Reviews 90, 543 (1990)）としてますます増大する適用が見出されつつある。アンチセンス・オリゴヌクレオチドはその塩基配列が阻害されるｍＲＮＡのそれと相補的である核酸断片である。この標的ｍＲＮＡは細胞、ウィルス又は他の病原性起源であることができる。適当な細胞性標的配列は、例えば、レセプター、細胞接着蛋白質、酵素、免疫調節剤、サイトカイン（cytokines）、生長因子、イオンチャンネル又はオンコ遺伝子のそれである。アンチセンス・オリゴヌクレオチドによるウィルス複製の阻害は、例えばＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウィルス）、ＨＳＶ−１及び−２（単純ヘルペスウィルスＩ型及びII型）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウィルス）及びインフルエンザウィルスについて記述されている。これはウィルス核酸と相補的であるオリゴヌクレオチドの使用を必要とする。センス・オリゴヌクレオチドは、対照的に、例えば核酸結合蛋白質又は核酸処理酵素を結合し（捕獲し）、それによりその生物活性を阻害するような配列を持つように設計されている（C. Helene and J.J. Toulme, Biochimica et Biophysica Acta 1049, 99 (1990)）。ここに挙げることができるウィルス標的は、例えば逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及びトランスアクティベーター蛋白質である。三重鎖形成オリゴヌクレオチドは一般に標的となるＤＮＡを持ち、そしてそれに結合した後、三重らせん構造を形成する。一般にｍＲＮＡのプロセッシング（スプライシング等）又はその蛋白質への翻訳又は複製はアンチセンス・オリゴヌクレオチドにより阻害されるが、ＤＮＡの転写又は複製は三重鎖形成オリゴヌクレオチドにより阻害される（C. Helene and J.J. Toulme, Biochim. Acta 1049 (1990) 99-125; E. Uhlmann and A. Peyman, Chemical Reviews 90, 543 (1990)）。しかしながら、第一のハイブリッド形成において一本鎖核酸をアンチセンス・オリゴヌクレオチドと結合させて二本鎖を形成し、次いで三重鎖形成オリゴヌクレオチドとの第二のハイブリッド形成において、三重鎖構造を形成することも可能である。アンチセンス及び三重鎖結合領域はこの場合、２つの別々のオリゴヌクレオチド又は１つのオリゴヌクレオチドに適合させることができる。合成オリゴヌクレオチドの別の適用は、いわゆるリボザイムであり、この物はそのリボヌクレアーゼ活性のため標的ＲＮＡを破壊する（J.J. Rossi and N. Sarver, TIBTECH (1990) 8, 179; Castanetto et al., Critical Rev. Eukar. Gene Expr. (1992) 2, 331)。
【０００３】
本発明の化合物はアプタマー（aptamer）という意味で治療に使用することもできる。アプタマーは高い親和力で蛋白質に結合するオリゴマー性核酸又はそれらのアナログである。このアプタマーは無作為の混合物からインビトロ選択により見出され（Famulok and Szostak (1992) Angew. Chem. 104, 1001-1011）、そしてこれはトロンビン結合アプタマーの場合首尾よく達成された（Bock et al. (1992) Nature 355, 564-566）。このための方法はアプタマーの塩基配列をオリゴヌクレオチド混合物の選別により決定し、次いでこの塩基配列をポリアミド−オリゴヌクレオチド類似体に移すような手順であることができる。他の可能性としては、同定を容易にするため、分子の別の非結合部分によりアプタマーの結合領域をコード化することである（Brenner and Lerner (1992) PNAS 89, 5381-5383）。
【０００４】
ＤＮＡ診断においては、適当に標識された核酸断片が、検出される核酸に特異的ハイブリッド形成するためのいわゆるＤＮＡプローブとして使用される。この二本鎖の特異的形成は、この場合標識により追跡するが、この標識は非放射性であるのが好ましい。このようにして遺伝的、悪性又はウイルス疾患又は他の病原により引き起こされる病気を見つけ出すことが可能である。
【０００５】
天然に存在する形態のオリゴヌクレオチドは大部分の上述の適用に対する適合性が乏しいか又は全くない。それらは特定の必要条件を満足するように化学的に変更されなければならない。オリゴヌクレオチドが生物系において、例えばウイルス複製を阻害するため使用可能であるためには、それらは次の必要条件を満足しなければならない。
１．  それらはインビボ条件下、すなわち血清中又は細胞内のいずれにおいても十分に高い安定性を持たなければならない。
２．  それらの性質は細胞膜及び核膜を通過し得るようなものでなければならない。
３．  生理的条件下において、それらは阻害作用を発揮するためそれらの標的核酸と塩基特異的な様式で結合しなければならない。
【０００６】
要点１〜３はＤＮＡプローブにとって必要条件ではない。しかしながら、これらのオリゴヌクレオチドは例えば蛍光、化学ルミネッセンス、比色法又は特異染色により検出され得るように誘導体化されなければならない(Beck and Koester, Anal. Chem. 62, 2258 (1990)）。オリゴヌクレオチドの化学的変更は通常リン酸主鎖、リボース単位又はヌクレオチド塩基の適当な変更により行われる（J.S. Cohen, topics in Molecular and Struct ural Biology 12 (1989) Macmillan Press; E. Uhlmann and A. Peyman, Chemical Reviews 90, 543 (1990)）。もう一つのしばしば使用される方法は５′−ヒドキシル基を適当なリン酸化試薬と反応させることによりオリゴヌクレオチド５′−結合体を作ることである。一方で、すべてのヌクレオチド間リン酸残基が変更されると、しばしばオリゴヌクレオチドの性質に激烈な変化が起こる。例えば、ホスホン酸メチル体の水性媒質中の溶解度は大きく減少し、一方全ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドはしばしば非配列特異的な様式で作用する。
【０００７】
最近において、相補的標的配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）と天然オリゴヌクレオチドより高い親和力で結合するポリアミド核酸誘導体が報告されている（Michael Egholm, Peter E. Nielsen, Rolf H. Berg and Ole Buchardt, Science 1991, 254, 1497-1500; WO 92/20702; M. Egholm et al. Nature (1993) 365, 566-568; P. Nielsen, (1994) Bioconjugate Chem. 5, 3-7）。これらのいわゆるペプチド又はポリアミド核酸（ＰＮＡ）は、デオキシリボースリン酸骨格がポリアミドオリゴマーで置き換えられたＤＮＡ類似化合物である。これらの化合物は天然のオリゴヌクレオチドに比べて血清中で極めて安定であるという利点を持つ。しかしながら、一方でそれらは次のような不利な性質を持つ。
(１)  細胞に摂取される量は零か又は検出不可能である。しかしながら、アンチセンス又は三重鎖形成オリゴヌクレオチド細胞内でのみそれらの活性を発揮することができるから、ＰＮＡそれ自体はインビボにおける遺伝子発現の阻害に不適当である。
(２)  ＰＮＡは水溶液中で、換言すれば生理的条件下においても凝集する傾向がある。従って水性緩衝液中の溶解度は低く、そしてそれらは相補的配列とのハイブリッド形成に使用できない。
【０００８】
(３)  その上、ＰＮＡはオリゴマーの精製に使用される種々の材料例えば RSephadex(Pharmacia社製）又は Bond ElutR(Varian社製）に対する高い親和力を有し、そのためＰＮＡはしばしば不十分な収率でしか単離できないことがある。
(４)  もう一つのＰＮＡの重大な欠点は、それらが相補的核酸と明白な配向で結合しないことである。従って、配列特異性は天然オリゴヌクレオチドと比較して減少する。天然の核酸は一般に相補的アミノ酸と逆平行配向でハイブリッド形成するが、ＰＮＡは逆平行及び平行配向の両方で結合することができる。
(５)  ＷＯ ９２／２０７０２はオリゴヌクレオチド−ＰＮＡ結合体、(Ｔ)7(５′−Ｌ−Ｎ）(ｔ)6−Ａｌａ（図２５；置換シート）について述べており、この場合(Ｔ)7は天然のヘプタチミジレート・オリゴヌクレオチドであって、このものはその５′−Ｏ−ホスフェート及び４−ヒドロキシ酪酸(Ｌ)を介してＰＮＡ−ヘキサチミジレート(ｔ)7の第一アミノ基(Ｎ)及びアラニン（Ａｌａ）に結合している。この化合物の合成についても又は性質についても何も記述されていない。
(６)  ＰＮＡは細胞培養実験においてマイクロモルの範囲で極めて強い細胞毒性を示す。
【０００９】
塩基対を形成する核酸鎖の配向は次のように定義される（Egholm et al.; Nature 365 (1993) 566-568を参照）。
Ａ）
５′------３′  ＤＮＡ  ａｐ  二重鎖  ａｐ＝逆平行
３′------５′  ＤＮＡ
Ｂ）
５′------３′  ＤＮＡ  ｐ  二重鎖  ｐ＝平行
５′------３′  ＤＮＡ
Ｃ）
５′------３′  ＤＮＡ  ａｐ  二重鎖（ＤＮＡ・ＰＮＡ）
Ｃ  ------Ｎ    ＰＮＡ
Ｄ）
５′------３′  ＤＮＡ  ｐ  二重鎖（ＤＮＡ・ＰＮＡ）
Ｎ  ------Ｃ    ＰＮＡ
Ｅ）
Ｃ  ------Ｎ    ＰＮＡ
５′------３′  ＤＮＡ（Ｐｕ）  ａｐ・ａｐ  三重鎖（DNA・DNA・PNA）
３′------５′  ＤＮＡ  Ｐｕ＝プリン−リッチ鎖
Ｆ）
Ｎ  ------Ｃ    ＰＮＡ
５′------３′  ＤＮＡ（Ｐｕ）  ａｐ・ｐ  三重鎖（DNA・DNA・PNA）
３′------５′  ＤＮＡ
Ｇ）
Ｎ  ------Ｃ    ＰＮＡ
５′------３′  ＤＮＡ（Ｐｕ）  ａｐ・ｐ  三重鎖（PNA・DNA・PNA）
Ｃ  ------Ｎ    ＰＮＡ
Ｈ）
Ｃ  ------Ｎ    ＰＮＡ
５′------３′  ＤＮＡ（Ｐｕ）  ａｐ・ａｐ  三重鎖（PNA・DNA・DNA）
Ｃ  ------Ｎ′  ＰＮＡ
Ｉ）
Ｎ  ------Ｃ    ＰＮＡ
５′------３′  ＤＮＡ（Ｐｕ）  ｐ・ｐ  三重鎖（DNA・DNA・PNA）
Ｎ  ------Ｃ′  ＰＮＡ
Ｋ）
Ｃ  ------Ｎ    ＰＮＡ
５′------３′  ＤＮＡ（Ｐｕ）  ｐ・ａｐ  三重鎖（DNA・DNA・PNA）
Ｎ  ------Ｃ    ＰＮＡ
上表において
５′はオリゴヌクレオチドの５′末端を意味し、
３′はオリゴヌクレオチドの３′末端を意味し、
ＮはＰＮＡのアミノ末端を意味し、
ＣはＰＮＡのカルボキシル末端を意味する。
【００１０】
ケースＡ）〜Ｄ）は原理的にアンチセンス・オリゴマーにとって可能である配向の型の例である。ケースＥ）〜Ｆ）は一本鎖又は二本鎖核酸の三重鎖形成の可能性を示している。その上ＰＮＡ又はＤＮＡ一本鎖の２つについて一緒に結合させることも可能である。例えば、Ｅ）においてはＰＮＡのＮ末端をＤＮＡの５′末端に結合させることができ、又はＦ）においてはＰＮＡのＣ末端をＤＮＡの５′末端に結合させることができる。
従って、上述の欠点が除かれたポリアミド−オリゴヌクレオチド誘導体を作ることが本発明の目的であった。
【００１１】
本発明は式Ｉ
F〔(DNA-Li)q(PNA-Li)r(DNA-Li)s(PNA)t〕xF′     (Ｉ)
（式中、
ｑ、ｒ、ｓ、ｔは互いに独立して０又は１であり、この場合２つ以上の隣接するｑ、ｒ、ｓ及びｔの合計≧２であり、
ｘは１〜２０、好ましくは１〜５、特に好ましくは１であり、
ＤＮＡはＤＮＡ又はＲＮＡのような核酸又はそれらの既知の誘導体であり、
ＬｉはＤＮＡ及びＰＮＡの間の共有結合であり、この場合前記共有結合は結合又はＣ、Ｎ、Ｏ又はＳからなる系列からの少なくとも１つの原子を持つ有機基からなり、
ＰＮＡはチミンと異なる少なくとも１つのヌクレオチド塩基を含むポリアミド構造であり、そして
Ｆ及びＦ′は末端基であり、そして／又は共有結合により一緒に結合している（環状化合物））
のポリアミド−オリゴヌクレオチド誘導体、及びその生理的に許容される塩に関する。
【００１２】
その上、特に式Ｉ
（式中、ｘは１であり、そして同時に
ｑ＝ｒ＝１そしてｓ＝ｔ＝０、又は
ｒ＝ｓ＝１そしてｑ＝ｔ＝０、又は
ｑ＝ｒ＝ｓ＝１そしてｔ＝０、又は
ｒ＝ｓ＝ｔ＝１そしてｑ＝０である）のポリアミド−オリゴヌクレオチド誘導体を挙げることができる。
【００１３】
好ましい化合物は式Ｉａ及びＩｂ
【化７】
0004620810.tif 000002
を持ち、式中
ｘは１〜２０であり、この場合ｘ＞１のとき、ｒ＝ｓ＝１そして同時に、ｑ＝ｔ＝０及びｏ＝ｎ＝０〜５であり、
ｑ、ｒ、ｓ、ｔは互いに独立して０又は１であり、この場合２つ以上の隣接するｑ、ｒ、ｓ及びｔの合計≧２であり、
Ｒ2は水素、ヒドロキシル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、好ましくはＣ1〜Ｃ6−アルコキシ、ハロゲン例えばＦ又はＣｌ、好ましくはＦ、アジド又はアミノであり、
Ｂは互いに独立してヌクレオチド化学における通常の塩基、例えばアデニン、シトシン、チミン、グアニン、ウラシル、イノシンのような天然塩基、又は例えばプリン、２,６−ジアミノプリン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ4,Ｎ4−エタノシトシン、Ｎ6,Ｎ6−エタノ−２,６−ジアミノプリン、シュードイソシトシン、５−メチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−(Ｃ3〜Ｃ6)−アルキニルウラシル、５−(Ｃ3〜Ｃ6)−アルキニルシトシンのような非天然塩基、又はそれらのプロドラッグ形態であり、そして
「湾曲した括弧」はＲ2及び隣接する置換基が２′位及び３′位であるか、又は逆に３′位及び２′位であり得るこを示しており、
【００１４】
Ｎｕは式IIａ又はIIｂ
【化８】
0004620810.tif 000003
（式中、
Ｒ2及びＢは上で定義した通りであり、
Ｕはヒドロキシル、メルカプト、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、好ましくはＣ1〜Ｃ8−アルキル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、好ましくはＣ1〜Ｃ8−アルコキシ、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、好ましくはＣ1〜Ｃ12−アリール、Ｃ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ8−アルキル、好ましくはＣ6−アリール−Ｃ1〜Ｃ4−アルキル、ＮＨＲ3又はＮＲ3Ｒ4であり、そして
Ｒ3はＣ1〜Ｃ18−アルキル又はＣ1〜Ｃ4−アルコキシ−Ｃ1〜Ｃ4−アルキル、好ましくはＣ1〜Ｃ8−アルキル又はＣ1〜Ｃ4−アルコキシ−Ｃ1〜Ｃ4−アルキル、特に好ましくはＣ1〜Ｃ4−アルキル又はメトキシエチルであり、そして
Ｒ4はＣ1〜Ｃ18−アルキル、好ましくはＣ1〜Ｃ8−アルキルそして特に好ましくはＣ1〜Ｃ4−アルキルであるか、又は
Ｒ3及びＲ4はそれらを担持する窒素原子と共に５〜６員の複素環式環であり、この環は例えばモルホリンのようにさらにＯ、Ｓ、Ｎからなる系列からの別のヘテロ原子を含むことがあり、
Ｖはオキシ、チオ又はイミノであり、
Ｗはオキソ又はチオキソであり、
Ｙはオキシ、チオ、メチレン又はイミノである）の基であり、
ｍは０〜２０であり、
ｏは０〜２０であり、
【００１５】
Ｄは式III
【化９】
0004620810.tif 000004
（式中、Ｂは上で定義した通りである）の基であり、
【００１６】
Ｄ′は式IV
【化１０】
0004620810.tif 000005
（式中、Ｂは上で定義した通りである）の基であり、
ｎは０〜２０であり、
ｐは０〜２０であり、
Ｌｉ1、Ｌｉ2、Ｌｉ3及びＬｉ4は各々、互いに独立して式Ｖ
〔(Ｖ′)−(Ｇ)−(Ｇ′)〕ε                 (Ｖ)
（式中、互いに独立して
εは１〜５、好ましくは１〜２であり、
【００１７】
Ｖ′は酸素、ＮＨ、単結合又は式VI
【化１１】
0004620810.tif 000006
（式中、
Ｕ、Ｖ、Ｗ及びＹは上で定義した通りである）の基であり、
Ｇはアルカンジイルが場合により、ハロゲン、好ましくはＦ又は塩素、アミノ、ヒドロキシル、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、好ましくはＣ1〜Ｃ6−アルキル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、好ましくはＣ1〜Ｃ6−アルコキシ、Ｃ6〜Ｃ14−アリール、好ましくはＣ6−アリール、又はＣ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、好ましくはＣ6−アリール−Ｃ1〜Ｃ4−アルキルで置換されることがあるＣ1〜Ｃ12−アルカンジイル、好ましくはＣ1〜Ｃ6−アルカンジイル、Ｃ6〜Ｃ14−アリール−ジ−Ｃ1〜Ｃ12−アルカンジイル、好ましくはＣ6−アリール−ジ−Ｃ1〜Ｃ4−アルカンジイル、又はδが１〜１１、好ましくは１〜７であることができる式(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)δ ＣＨ2ＣＨ2の基；又は単結合であり、そして
Ｇ′はオキシ、チオ、イミノ、−Ｃ(Ｏ)−、−Ｃ(Ｏ)ＮＨ−、単結合又は式VI（式中、Ｕ、Ｖ、Ｗ及びＹは上で定義した通りである）の基である）の基であり、そして
Ｆ及びＦ′は単結合により連結しており（環状化合物）、そして／又は
ＦはＲ0−(Ａ)k−Ｖ−であり、そして
Ｆ′は式Ｉａにおいては−(Ｑ)l−Ｒ1、そして式ＩｂにおいてはＶ1−(Ａ)l−Ｒ1であり、
上の式において、
Ｒ0は水素、Ｃ1〜Ｃ18−アルカノイル、好ましくはＣ8〜Ｃ18−アルカノイル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシカルボニル、Ｃ3〜Ｃ8−シクロアルカノイル、Ｃ7〜Ｃ15−アロイル、Ｃ3〜Ｃ13−ヘテロアロイル、又はオリゴマーの細胞内摂取に有利であるか、又はＤＮＡプローブの標識として役立つか、又はオリゴマーの標的核酸とのハイブリッド形成において、結合、架橋又は開裂により前記核酸を攻撃する基であるか、又は
【００１８】
ｋが０の場合、Ｒ0は水素又はＶと一緒に式VII
【化１２】
0004620810.tif 000007
（式中、Ｚ及びＺ′は、互いに独立して、ヒドロキシル、メルカプト、Ｃ1〜Ｃ22−アルコキシ、好ましくはＣ12〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、好ましくはＣ12〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、好ましくはＣ6〜Ｃ16−アリール、Ｃ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、好ましくはＣ6−アリール−Ｃ1〜Ｃ4−アルキル、Ｃ1〜Ｃ22−アルキルチオ、好ましくはＣ12〜Ｃ18−アルキルチオ、ＮＨＲ3、ＮＲ3Ｒ4、又はオリゴマーの細胞内摂取に有利であるか、又はＤＮＡプローブの標識として役立つか、又はオリゴマーの標的核酸とのハイブリッド形成において、結合、架橋又は開裂により前記核酸を攻撃する基であり、そしてこの場合Ｒ3、Ｒ4、Ｖ及びＷは上で定義した通りである）、
Ｒ1は水素又はＱ0であり、この場合、同時にｌが０であり、そして式Ｉａにおいてｔが０、ｓが１、そしてＬｉ1がＶ′＝結合、Ｇ＝結合、ε＝ｌ、及びＧ′＝オキシ、チオ、イミノである式Ｖの構造、又はＵ＝Ｚである式VIの基であるか、又は式Ｉｂにおいてｑが１又はｑ＝ｒ＝０、そしてＦ′＝Ｖ1−(Ａ)l−Ｒ1においてＶ1＝Ｖであるとき、Ｒ1は常に水素のみであり、
Ａ及びＱは、互いに独立して、天然又は非天然のアミノ酸、好ましくはグリシン、ロイシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンからなる系列からのアミノ酸の残基であり、
Ｑ0はヒドロキシル、ＯＲ′、ＮＨ2、ＮＨＲ′′であり、この場合Ｒ′＝Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、好ましくはＣ12〜Ｃ18−アルキル、そしてＲ′′＝Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、好ましくはＣ12〜Ｃ18−アルキル、Ｃ1〜Ｃ18−アミノアルキル、好ましくはＣ12〜Ｃ18−アミノアルキル、Ｃ1〜Ｃ18−ヒドロキシアルキル、好ましくはＣ12〜Ｃ18−ヒドロキシアルキルであり、
Ｖは上で定義した通りであり、
Ｖ1は単結合又はＶであり、この場合ｑ＝０そしてｒ＝１の式ＩｂにおけるＦ′においてのみ、Ｖ1は常に単結合であり、
ｋは０〜１０であり、
ｌは０〜１０であり、
但し
ａ）  式Ｉａの化合物において、ｔが０、ｓが１、そしてＬｉ1がＶ′＝式VIの化合物、Ｇ＝Ｃ2〜Ｃ12アルキレン及びＧ′＝ＣＯである(Ｖ′)−(Ｇ)−(Ｇ′)である場合、Ｆ′＝−(Ｑ)l−Ｒ1において、ｌは０〜１０そしてＲ1はＱ0であり、
ｂ）  式Ｉａの化合物において、ｓ＝ｔ＝０の場合、Ｌｉ2は単結合であり、
ｃ）  式Ｉｂの化合物において、ｔが０、そしてｓが１の場合、Ｌｉ3は単結合であり、
ｄ）  式Ｉｂの化合物において、ｓ＝ｔ＝０の場合、Ｌｉ4は単結合である
ことを条件とし、そして
各ヌクレオチドはそのＤ又はＬ配置であることができ、そして塩基はα又はβ位であることができる。
【００１９】
式Ｉａ及びＩｂの特に好ましい化合物は、塩基がβ位で糖の上に位置し、ｘが１であり、そして
ｑ＝ｒ＝１、ｓ＝ｔ＝０、又は
ｒ＝ｓ＝１、ｑ＝ｔ＝０、又は
ｑ＝ｒ＝ｓ＝１、ｔ＝０、又は
ｒ＝ｓ＝ｔ＝１、ｑ＝０
である化合物である。
特に好ましいオリゴマーはＶ′、Ｖ、Ｙ及びＷがチオ、オキシ、オキソ又はヒドロキシルの意味を持つ式Ｉａ及びＩｂを持ち、これらはその上、Ｒ2が水素の場合、極めて特に好ましい。
【００２０】
Ｌｉ1、Ｌｉ4が
ａ）  Ｖ′＝酸素又は式VIの化合物、Ｇ＝Ｃ1〜Ｃ10−アルキレン、Ｇ′＝−ＣＯＮＨ−である式Ｖの化合物、
ｂ）  Ｇ、Ｖ′は結合、そしてＧ′は式VIの化合物であり、好ましくはＵ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｙ＝酸素又はＵ＝Ｗ＝Ｙ＝酸素及びＶ＝イミノである式Ｖの化合物
であり、Ｌｉ2、Ｌｉ3が
ａ）  Ｖ′＝イミノ、Ｇ＝Ｃ1〜Ｃ10−アルキレン、そしてＧ′＝式VIの化合物である式Ｖの化合物、
ｂ）  Ｖ′＝イミノであり、そしてＧとＧ′が単結合である式Ｖの化合物、
ｃ）  Ｖ′＝イミノ、Ｇ＝Ｃ1〜Ｃ10−アルキレン、そしてＧ′＝Ｖであり、好ましくはＵ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｙ＝酸素である式Ｖの化合物
である、ε＝１の式Ｉａ及びＩｂのオリゴマーも特に好ましい。
【００２１】
極めて特に好ましいのは、Ｖ′、Ｖ、Ｙ及びＷがチオ、オキシ、オキソ又はヒドロキシルの意味を持ち、Ｒ2が水素であり、Ｌｉ1がＶ′＝式VI（式中、Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｙ＝酸素である）の化合物である−Ｖ′−〔ＣＨ2〕nＣ(Ｏ)ＮＨ−の意味を持つか、又はＬｉ2がｎ＝２〜５であり、そしてＧ′がＵ、Ｖ、Ｗ及びＹ＝酸素である式IVを持つ−ＨＮ−〔ＣＨ2〕n(Ｇ′)−の意味を持つ式Ｉａ及びＩｂのオリゴマーである。
【００２２】
その上好ましい式Ｉａ及びＩｂのオリゴマーは、Ｖ′、Ｖ、Ｙ及びＷがチオ、オキシ、オキソ又はヒドロキシルの意味を持ち、Ｒ2が水素であり、Ｌｉ1が−Ｏ−〔ＣＨ2〕nＣ(Ｏ)ＮＨ−の意味を持つか又はＬｉ2が−ＨＮ−〔ＣＨ2〕n(Ｇ′)−の意味を持つそれであり、この場合ｎは２〜５であり、そしてＧ′はＵ、Ｖ、Ｗ及びＹ＝酸素、そしてｑ＝０そしてｒ＝ｓ＝ｔ＝１である式VIを持つ。
その上好ましいのは、式Ｉａ及びＩｂにおいて湾曲した括弧がＲ2が３′位にある（式IIｂ参照）ことを意味するオリゴマーである。この場合好ましい塩基はアデニンである。
【００２３】
本発明はα−及びβ−Ｄ−及びＬ−リボフラノシド、α−及びβ−Ｄ−及びＬ−デオキシリボフラノシドならびに相当する炭素環式５員環類似体に限定することなくまた異なった糖ビルディングブロック、例えば拡張した環式糖、収縮した環式糖、非環式糖、架橋環式糖または糖誘導体の他の適当な種類の糖にも適用する。本発明は式Ｉの例によって示すリン酸残基の誘導体に限定することなく、また既知のデホスホ誘導体に関する。
【００２４】
このオリゴヌクレオチド部分（式ＩのＮＤＡ）は巾広い多種の方法で天然構造から修飾することができる。すなわち、それ自体公知の方法で誘導する修飾の例としては
ａ）  リン酸架橋の修飾
その例としてはホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ボランノホスフェート、ホスフェートメチルエステル、ホスフェートエチルエステル、フェニルホスホネートである。
リン酸ブリッジの好ましい修飾はホスホロチオエート、ホスホロジチオエート及びメチルホスホネートである。
ｂ）  リン酸架橋の置換
その例としては、フォルムアセタール、３′−チオフォルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム、メチレンジメチルヒドラゾ、ジメチレンスルフォン、シリル基である。フォルムアセタール及び３′−チオフォルムアセタールによる置換が好ましい。
ｃ）  糖の修飾
その例としては、α−アノメリックシュガー、２′−Ｏ−メチルリボーズ、２′−Ｏ−ブチルリボーズ、２′−Ｏ−アリルリボーズ、２′−フルオロ−２′−デオキシリボーズ、２′−アミノ−２′−デオキシリボーズ、α−アラビノフラノース、炭素環式糖類似体である。好ましい修飾は２′−Ｏ−メチルリボーズ及び２′−Ｏ−ｎ−ブチルリボーズによるものである。
【００２５】
ｄ）  ワトソン−クリック塩基対の特異性を変えない塩基の修飾
その例としては、５−プロピニル−２′−デオキシウリジン、５−プロピニル−２′−デオキシシチジン、５−ヘキシニル−２′−デオキシウリジン、５−ヘキシニル−２′−デオキシシチジン、５−フルオロ−２′−デオキシシチジン、５−フルオロ−２′−デオキシウリジン、５−ヒドロキシメチル−２′−デオキシウリジン、５−メチル−２′−デオキシシチジン、５−ブロモ−２′−デオキシシチジンである。好ましい修飾は５−プロピニル−２′−デオキシウリジン、５−ヘキシニル−２′−デオキシウリジン、５−ヘキシニル−２′−デオキシシチジン及び５−プロピニル−２′−デオキシシチジンである。
ｅ）  ３′−３′及び５′−５′の逆位
〔例えば M. Koga 等による J. Org. Chem. 56 (1991) 3757〕
【００２６】
ｆ）  ５′−及び３′−ホスフェートならびに５′−及び３′−チオホスフェート
細胞内取込みを支持する基の例としては種々な親油性基：
例えば−Ｏ−(ＣＨ2)x−ＣＨ3（式中ｘは６〜１８の整数）、
−Ｏ−(ＣＨ2)n−ＣＨ＝ＣＨ−(ＣＨ2)m−ＣＨ3（式中ｎ及びｍは互いに独立して６〜１２の整数）、−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)4−(ＣＨ2)9−ＣＨ3、
−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)8−(ＣＨ2)13−ＣＨ3及び−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)7−(ＣＨ2)15−ＣＨ3
であり、またコレステリルのようなステロイド残基またはビタミンＥ、ビタミンＡ又はビタミンＤのようなビタミン残基、及び胆汁酸、葉酸、２−（Ｎ−アルキル−Ｎ−アルコキシアミノ）−アントラキノンの様な天然担体系を使用する他のコンジュゲート及びマンノースと例えばＥＧＦ（上皮細胞増殖因子）、ブラジキニン及びＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）のようなオリゴヌクレオチドのレセプターを介したエンドサイト−シスに導く適切な受容体のペプチドとのコンジュゲート、標識基とはフルオレッセン基、例えばダンシル（＝１−ジメチルアミノナフタレン−５−スルフォニル）、フルオレッセインまたはクマリン誘導体又は化学ルミネッセント基、例えばアクリジン誘導体、及びＥＬＩＳＡにより識別できるジゴキシゲニン系、又はビオチン／アビダジン系により識別しうるビオチン基又は識別出来るリポーター基と共に更に誘導体化しうる官能基を有する他のリンカー、例えばアクリジニウム活性エステルと反応して化学ルミネッセンスプローブを与えるアミノアルキルリンカーである。
【００２７】
代表的標識基は
【化１３】
0004620810.tif 000008
【００２８】
【化１４】
0004620810.tif 000009
核酸と結合するか又は挿入するか、及び／又は解裂するかまたは架橋結合するオリゴヌクレオチド類似体、例えば、アクリジン、プソラレン、フェナントリジン、ナフトキノン、ダウノマイシンまたはクロロエチルアミノアリールコンジュゲートを含む。
【００２９】
代表的な挿入及び架橋基は
【化１５】
0004620810.tif 000010
【００３０】
【化１６】
0004620810.tif 000011
【００３１】
【化１７】
0004620810.tif 000012
【００３２】
ＮＲ3Ｒ4の基（式中、Ｒ3及びＲ4はそれらが結合している窒素原子と共に、５員〜６員の複素環を形成し、さらにもう一個のヘテロ原子を有する）の例としてはモルホリニル及びイミダゾリル基がある。
ポリアミド部分（式ＩのＰＮＡ）はチミンとは異なる少なくとも一個のヌクレオチド塩基を含むアミド構造よりなる。この種のポリアミド構造は例えば下記ビルディングブロックａ）〜ｈ）よりなり、好ましくはａ）ではｆが１〜４、好ましくは１又は２及びｇは０〜３、好ましくは０〜２である。
【００３３】
【化１８】
0004620810.tif 000013
【００３４】
【化１９】
0004620810.tif 000014
【００３５】
ＰＮＡに対する末端基は、“弱酸に不安定であるアミノ保護基を使用するＰＮＡ合成”（ＤＥ−Ｐ ４４ ０８ ５３１.１，ＨＯＥ ９４／Ｆ ０６０）及び“塩基に不安定なアミノ保護基を使用するＰＮＡ合成”（ＤＥ−Ｐ ４４ ０８ ５３３.８，ＨＯＥ ９４／Ｆ ０５９）と題する同時提出の出願に記載されている。
好ましいポリアミド構造はａ）の構造よりなる。後者は特にｆが１の時好ましい。
【００３６】
式Ｉのポリアミド−オリゴヌクレオチド誘導体の製造は溶液中でオリゴヌクレオチドの合成と同じように行うか、場合により自動合成装置を使用して固相上で行うのが好ましい。式Ｉのオリゴマーは１個のＰＮＡ単位または１個のＤＮＡ単位と１個のヌクレオチド塩基を適切に誘導した支持体又は成長オリゴマー鎖上で連続的縮合によって組立てることができる。しかしながら、生成物の集積はフラグメント方式で行い、フラグメントをポリアミド又はオリゴヌクレオチド構造として先合成し、それらをリンクして式Ｉのポリアミド−オリゴヌクレオチドにする。しかしながら、ＰＮＡと、ヌクレオチドよりなるビルディングブロックを使用することもまた可能であり、好ましくはダイマーをヌクレオチド化学又はペプチド化学の方法で組立て、ポリアミド−オリゴヌクレオチド誘導体を得る。
オリゴヌクレオチド部分の組立ては、当該分野の技術者に知られた、例えばトリエステル法、Ｈ−リン酸法、ホスホロアミダイト法好ましくはCaruthersの標準ホスホロアミダイト化学（M.D. Matteucci 及び M.H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981)）の方法で行い、ポリアミド部分は当該部分の技術者に知られたペプチド化学の方法により合成することができる。もしも、オリゴヌクレオチド部分とポリアミド部分を別々に合成しないで続いてリンクするならば、オリゴヌクレオチド構造とポリアミド構造を組立てるのに使用する方法は互いに両立できるものでなければならず、これに関してはポリアミド部分を合成する好ましい態様が“弱酸に不安定であるアミノ保護基を用うるＰＮＡ合成”（ＤＥ−Ｐ ４４ ０８ ５３１.１，ＨＯＥ ９４／Ｆ ０６０）と題する同時出願の明細書に記載されている。
【００３７】
ｑ、ｒ、ｓおよびｔが１か０かによって、その合成はオリゴヌクレオチド側で出発するか又はポリアミド側で出発することになる。オリゴヌクレオチド部分が３′及び／又は５′の末端で修飾される式Ｉの化合物の合成は修飾に関するＥＰ−Ａ ０ ５５２ ７６６（ＨＯＥ ９２／Ｆ ０１２）に記載の方法により行われる。（ＤＮＡに対する合成スキームと比較）。式Ｉの化合物の合成はポリアミド部分に関して“弱酸に不安定であるアミノ保護基を用いるＰＮＡ合成”と題する同時出願した（ＤＥ−Ｐ ４４ ０８ ５３１.１，ＨＯＥ ９４／Ｆ ０６０）明細書に記載された方法により行われる。（ＰＮＡに対する合成スキーム比較）
【００３８】
ＤＮＡに対する合成スキーム
【化２０】
0004620810.tif 000015
【００３９】
ＰＮＡに対する合成スキーム
【化２１】
0004620810.tif 000016
上記において：
ＰＧ    保護基、好ましくは弱酸に不安定な保護基；
Ｎｕ′  環外アミノ基を適当な保護基により保護したヌクレオチド単位；
Ｎｕ′−active  ヌクレオチド化学で慣用の活性化誘導体
(Ｎｕ′−活性)  例えば、ホスホアミダイト、ホスホジエステル又はＨ−ホスホネート；
Ａ′、Ｂ′及びＱ′は場合により保護されたＡ、Ｂ及びＱの型である。
【００４０】
式ＩのＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの合成スキーム
F〔(DNA-Li)q(PNA-Li)r(DNA-Li)s(PNA)t〕xF′    (Ｉ)
（ｑ＝ｒ＝ｓ＝ｔ＝１、そしてｘ＝１）
合成の要約は下記の通りである。
【化２２】
0004620810.tif 000017
リンカービルディングブロックの結合はもし適切な連結がＰＮＡ又はＤＮＡビルディングブロック内に存在するならば、省くことができる。
【００４１】
明瞭にするために式ＩのＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに対する合成スキームを示し、ハイブリッドオリゴマー（式中ｑ＝ｒ＝ｓ＝ｔ＝１、そしてｘ＝１）の製造を例により説明する。最初に末端基Ｆを公知の方法で合成し、そして固相合成の場合にはポリマーの保持体に結合させる（工程１）。保護基ＰＧの離脱後、（工程２）、好ましくは弱酸性媒体中離脱後ポリアミドビルディングブロックをＰＮＡ部分の所望の長さと結合させる（工程３）。ＤＮＡ部分への連結としてリンカーユニットを結合することもできる（工程４）。ヌクレオチド構造の接合はヌクレオチドビルディングブロックの連続的縮合により行い（工程５）、好ましくは公知のホスホアミダイト法により行う。ＤＮＡをＰＮＡに連結できるようにするリンカーを縮合した後（工程６）、次にポリアミド構造を組立てる。ＰＮＡをＤＮＡに連結できるようにするリンカーの導入、もう一つのＤＮＡ構造の接合（工程７）及び末端基Ｆの最終結合（工程８）によりハイブリッド分子〔F-DNA-Li-PNA-Li-DNA-Li-PNA-F′〕が得られる。リンカービルディングブロックはこの場合またヌクレオチド塩基を含む。ハイブリッドF-DNA-Li-PNA-Li-F′（ｑ＝ｒ＝１、ｓ＝ｔ＝０）を合成するには、例えば第一工程１〜５を行い、そして工程８で合成を完結する。
【００４２】
ハイブリッドF-PNA-Li-DNA-F′（ｒ＝ｓ＝１、ｑ＝ｔ＝０）、を合成するには第一工程１〜２を行い、さらに工程５〜６を行い、次いで工程３を行い工程８で合成を完結する。
ハイブリッドF-PNA-Li-DNA-F′（ｒ＝ｓ＝ｔ＝１、ｑ＝０）を合成するには、工程１〜６から合成を開始する。工程３の繰返しの後に工程８で合成は完結する。
もしも、式Ｉのｘが＞１ならば、場合により工程２〜７を繰り返さねばならない。ポリマー鎖の組立後、ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは固相合成の場合支持体から切り離さなければならないが、場合により塩基上の保護基、アミノ酸側鎖及び末端基は離脱せねばならない。
【００４３】
しかしながら、ＰＮＡ部分とＤＮＡ部分は公知の方法で別々に合成することができ、また、続いて少なくとも一成分を適切に活性化することにより一緒に結合することができる。ＰＮＡ部分の活性化は好ましくは例えば活性エステル又はイソチオシアネートのようなカルボン酸基を介して行い、これは次いでＤＮＡ部分の反応基、好ましくはアミノ基と反応する。ＤＮＡ部分の活性化はそれ自体公知のシアノーゲンブロマイド縮合法の型で行い、その際活性化リン酸官能基がＰＮＡ部分の反応基、好ましくはアミノ基と反応する。
【００４４】
驚くべきことに、式Ｉａ及びＩｂのオリゴマーは純粋なＰＮＡと比較して非常に増大した細胞内取り込みを有する。この改良した細胞内取り込みが非常に重大であるのは、アンチセンスオリゴマー又は三重鎖形成オリゴマーはこれらが細胞により効果的に取込まれた場合にのみ作用することができるからである。これらのハイブリッド形成作用も同様に純粋なＰＮＡの場合よりも一層有利であるが、これは優先的に逆平行性二重鎖形成になるからである。正常なオリゴヌクレオチドと比較すると、これらは生物学活性の増加を表わす改良されたヌクレアーゼ安定性を有する。相補的ヌクレイン酸への結合親和力は例えば、ホスホチオエート又はメチルホスホネートのような他のヌクレアーゼ−安定オリゴヌクレオチドより一層良い。本発明による化合物の結合親和性は血清条件下で急速に分解する、天然のオリゴヌクレオチドと比較して少なくとも同等か通常より良好である。結合親和力の増加はＰＮＡ部分の長さに依存する。純粋なＰＮＡは細胞培養実験において＞５μＭ濃度で有力な細胞毒効果を示した。一方、本発明の化合物は細胞を損傷しなかった。その上、式Ｉの化合物がＰＮＡ部分及びＤＮＡ部分の塩基配列により特異的遺伝子の表現、例えば細胞培養において、また動物モデルの選択された例における酵素、レセプター又は成長因子を阻害することが分った。
【００４５】
ＰＮＡ／ＤＮＡオリゴマー及びＰＮＡ／ＲＮＡオリゴマーのさらなる利点は細胞エンドヌクレアーゼ、例えばＲＮａｓｅ Ｈ及びＲＮａｓｅ Ｌを刺激することの可能性を含む。ＰＮＡに対して、本発明のＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、デオキシリボヌクレオチドユニットを有し、相補的標的ＲＮＡに結合後は細胞ＲＮａｓｅＨの誘導のため配列特異的方法で後者を解裂することができる。
本発明のオリゴマーの特定の態様はＰＮＡ部分と２′,５′−リンクのオリゴアデニレート部分よりなるものであり、好ましくはテトラアデニレート又はそのコルディセピン類似体でありこれは細胞ＲＮａｓｅ Ｌを活性化する。
【００４６】
本発明は医薬の治療上活性な成分として、式Ｉの化合物の使用に関する。治療上活性なポリアミド−オリゴヌクレオチド誘導体とは、一般にアンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、アプタメラ（aptamer）又はリボザイム、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。
本発明の医薬はビールス、例えばＨＩＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、インフルエンザ、ＶＳＶ、肝炎Ｂ又はパピロマビールスによって惹起した疾病を治療するのに使用することができる。
【００４７】
本発明によるアンチセンスポリアミド−オリゴヌクレオチド誘導体は、例えば下記塩基配列を有する標的に対して有効である。これら配列におけるＰＮＡ部分及びＤＮＡ部分の長さと位置は最適の性質を得るために適切に変更することができる。
ａ）  ＨＩＶに対しては、例えば
5′−ACACCCAATTCTGAAAATGG−3′         (Ｉ)    又は
5′−AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA−3′         (II)    又は
5′−GTCGACACCCAATTCTGAAAATGGATAA−3′ (III)   又は
5′−GCTATGTCGACACCCAATTCTGAAA−3′    (IV)    又は
5′−TCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTCCTGCCA   (VI)    又は
ｂ）  ＨＳＶ−１に対しては、例えば
5′−GCGGGGCTCCATGGGGGTCG−3′         (VII)
【００４８】
本発明の医薬は癌の治療にも適当である。これに関連して、癌の進展又は癌の成長に原因となる標的に向けられる、例えばポリアミド−オリゴヌクレオチド配列を使用することができる。このような標的の例は下記の通りである。
１）  ヌクレアーオンコプロティン例えば c-myc、N-myc、c-myb、 c-fos、 c-fos/jun、 PCNA、p120
２）  細胞質／膜連合オンコプロティン、例えば EJ-ras、 c-Ha-ras、 N-ras、 rrg、 bcl-2、 cdc-2、 c-raf-1、 c-mos、 c-src、 c-abl
３）  細胞レセプター、例えば EGFレセプター、c-erbA、 レチノイドレセプター、蛋白キナーゼ調節サブユニット、c-fms
４）  サイトカイン、成長因子、細胞外マトリックス、例えば CSF-1、 IL-6、 IL-1a、 IL-1b、 IL-2、 IL-4、 bFGF、 ミエロブラスチン、フィブロネクチン
【００４９】
このような標的に活性である本発明の式Ｉのアンチセンスポリアミド−オリゴヌクレオチドは例えば下記塩基配列を有する。
ａ）  c-Ha-rasに対して、例えば
5′−CAGCTGCAACCCAGC−3′         (VIII)
ｃ）  c-myc、例えば
5′−GGCTGCTGGAGCGGGGCACAC−3′   (IX)
5′−AACGTTGAGGGGCAT−3′         (Ｘ)
ｄ）  c-myb、例えば
5′−GTGCCGGGGTCTTCGGGC−3′      (XI)
ｅ）  c-fos、例えば
5′−GGAGAACATCATGGTCGAAAG−3′   (XII)
5′−CCCGAGAACATCATGGTCGAAG−3′  (XIII)
5′−GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG−3′    (XIV)
ｆ）  p120、例えば
5′−CACCCGCCTTGGCCTCCCAC−3′    (XV)
ｇ）  EGFレセプター、例えば
5′−GGGACTCCGGCGCAGCGC−3′      (XVI)
5′−GGCAAACTTTCTTTTCCTCC−3′    (XVII)
ｈ）  p53腫瘍抑制剤、例えば
5′−GGGAAGGAGGAGGATGAGG−3′     (XVIII)
5′−GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG−3′   (XIX)
【００５０】
本発明の医薬は、例えばインテグリン又は細胞間接着レセプター、例えば VLA-4、VLA-2、ICAM、VCAM 又は ELAM によって影響される疾病の治療に更に適している。
このような標的に活性である本発明のアンチセンスポリアミド−オリゴヌクレオチド誘導体は、例えば下記塩基配列を有する。
ａ）  VLA-4、例えば
5′−GCAGTAAGCATCCATATC−3′      (XX)  又は
ｂ）  ICAM、例えば
5′−CCCCCACCACTTCCCCTCTC−3′    (XXI)
5′−CTCCCCCACCACTTCCCCTC−3′    (XXII)
5′−GCTGGGAGCCATAGCGAGG−3′     (XXIII)
ｃ）  ELAM-1、例えば
5′−ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG−3′   (XXIV)
5′−CAATCAATGACTTCAAGAGTTC−3′  (XXV)
【００５１】
本発明の医薬はまた例えば再狭窄を予防するのに適している。これに関して、使用することのできるポリアミド−オリゴヌクレオチド配列の例は増殖（同じ細胞の増殖）又は移動（ある種の病的な過程や症候）の原因となる標的に向けられたものである。このような標的の例としては次のものがある。
１）  ヌクレアートランスアクチベーター蛋白質及びサイクリン、例えば、c-myc、c-myb、 c-fos、 c-fos/jun、 サイクリン及び cdc2キナーゼ
２）  ミトゲン又は成長因子、例えば、PDGF、 bFGF、 EGF、 HB-EGF 及び TGF-β
３）  細胞レセプター、例えば、bFGFレセプター、 EGFレセプター及び PDGFレセプター。
【００５２】
このような標的に活性である本発明のアンチセンスポリアミド−オリゴヌクレオチドは、例えば下記塩基配列を有する。
ａ）  c-myb
5′−GTGTCGGGGTCTCCGGGC−3′      (XXVI)
ｂ）  c-myc
5′−CACGTTGAGGGGCAT−3′         (XXVII)
ｃ）  cdc2 キナーゼ
5′−GTCTTCCATAGTTACTCA−3′      (XXVIII)
ｄ）  PCNA（ラットの増殖細胞ヌクレアー抗原）
5′−GATCAGGCGTGCCTCAAA−3′      (XXIX)
【００５３】
本願の医薬は経口的に投与しうる剤型、例えば、錠剤、被覆錠剤、ハード又はソフトゼンチンカプセル、溶液、エマルジョン、又は懸濁液の形態で使用することができる。場合により蛋白質のようなさらに別の成分を含むリポゾーム中の医薬の封入も同様に適当な投与形態である。本願の医薬は例えば坐剤の剤型で直腸的に投与することができるし、又は注射溶液の剤形で非経口的に投与することができる。医薬製剤を製造するには、これらの化合物を治療的に不活性な有機又は無機の賦形剤を使用することができる。錠剤、コーティングを施した錠剤、及びハードゼラチンカプセルのための賦形薬の例としては乳糖、コーンスターチ、もしくはこれらの誘導体、タルク及びステアリン酸又はそれらの塩である。溶液を調製するのに適当な賦形剤は水、ポリオール、蔗糖、転化糖及びブドウ糖である。注射溶液に適した賦形剤は水、アルコール、ポリオール、グリコール及び植物油である。坐薬に適した賦形剤は植物油、硬化油、ワックス、脂肪及び半液体ポリオールである。医薬製剤は、また、保存剤、溶剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、矯味矯嗅剤、疹透圧を変えるための塩、緩衝液コーティング剤、抗酸化剤及び使用するとすれば他の治療上活性な物質を含有させることができる。
【００５４】
好ましい投与形体は局所適用、例えばカテーテル又は注射を使用しての局所応用である。注射用としてはアンチセンスポリアミド−オリゴヌクレオチド誘導体は液体溶液、好ましくは生理的許容しうる緩衝液、例えばハンク液又はリンゲル溶液に処方する。このアンチセンスポリアミド−オリゴヌクレオチドはまた固体形態にも処方でき、使用前に溶解または懸濁することができる。全身的投与で好ましい投与量は体重kg及び１日当り０.０１mg〜約５０mgである。
本発明の式Ｉの化合物は、特に、ＨＯＥ ９２／Ｆ ４０６（ＥＰ−Ａ ０ ６０２ ５２４）で記載されている遺伝子プローブ及び一般的な分子生物学における助成物という意味で、一般にＤＮＡプローブ又はＤＮＡ診断のプライマーとして広く使用することができる。
【００５５】
ＤＮＡプローブと呼ばれ、またはハイブリッド形成プローブとも呼ばれる遺伝子プローブは特殊な遺伝子の配列特異的識別という目的に対するＤＮＡ診断に大きな役割を演じている。遺伝子プローブは一般に認識配列と適当な標識基（ラベル）より構成する。相補的遺伝子プローブを使用してのハイブリッド形成により分析サンプルの標的配列の決定の特異性は認識配列とその化学構造によって決定する。ＰＮＡは自然構造のオリゴヌクレオチドと比較して利点を有し、それはＰＮＡが標的配列に対して高い親和性を有するからである。しかしながら、そのハイブリッド形成の特異性は、ＰＮＡが自然のＤＮＡに対比して一本鎖核酸に平行にも逆平行性配位でも結合することができるので減少するのである。本発明によるＰＮＡ／ＤＮＡオリゴマーは同様に増加した結合親和性を示すが、所望の逆平行性配位で極めて優先的に結合する。
【００５６】
遺伝子プローブにおいてＰＮＡ部分とＤＮＡ部分の適切な選択によって分化変異能に有用な効果を持つことがさらに可能となる、何故ならばＰＮＡ部分における塩基誤対合がＤＮＡ部分における塩基誤対合よりもハイブリッドの融点を一層降下させるからである。これは突然変異が発生する時点で、分化変異に関し特に重要であり、例えばプロトオンコジーン（protooncogene）が相当するオンコジーン（oncogene)(病理状態）への移行する場合に重要である。病理状態か無病理状態かを一層良く識別することの利点をＤＮＡ部分に遊離３′−ヒドロキシ基を有する限り本発明のＰＮＡ／ＤＮＡオリゴマーのプライマー性質の型で使用することができる。このようなＰＮＡｓはポリメラーゼに対し、プライマー機能を有しない。驚くべきことに、ＰＮＡ／ＤＮＡオリゴマーの末端におけるヌクレオシドユニットの１個でも例えばＤＮＡポリメラーゼ（クレノウフラグメント）を使用してＤＮＡポリメラーゼ反応を開始するのに十分であるということを見出した。種々なポリメラーゼをＰＮＡ／ＤＮＡプライマーの特徴及びそのプライマーが配列を特異的方法でハイブリッド形成する鋳型の性質によって使用することができる。これらのポリメラーゼは一般に商業的に入手しうる、例えば標識ポリメラーゼ、クレノウポリメラーゼ又は逆転写酵素である。
【００５７】
天然オリゴヌクレオチドプライマーの使用との比較による他の利点はＰＮＡ／ＤＮＡプライマーを用いてコピーした核酸鎖及び５′位にＰＮＡ部分を含む核酸鎖は５′−エキソヌクレアーゼに安定であるということである。従ってＰＮＡ−含有鎖を攻撃することなく５′−エキソヌクレアーゼにより反応混合物中のすべての天然ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を退化させることができる。
【００５８】
ＰＮＡ／ＤＮＡオリゴマーの他の利点はＰＮＡ自身では不可能である。ＤＮＡ部分の他の生化学反応をさせるのに用いることができることである。このような反応の例は３′−ターミナルトランスフェラーゼの有する３′−テーリング、ＤＮＡ二本鎖域の限定酵素による消化及びリガーゼ反応である。例えば、遊離３′−ヒドロキシル基を有する（ＰＮＡ）−（ＤＮＡ）−ＯＨオリゴマーをＤＮＡリガーゼの存在下に天然源の相補性ＤＮＡ補助配列にハイブリッド形成後、５′位にヌクレオシド５′−リン酸塩を含む第二のｐ−（ＤＮＡ）−（ＰＮＡ）オリゴマーにリンクすることができる。
（ＤＮＡ）−（ＰＮＡ）−（ＤＮＡ）オリゴマーを更に遺伝子の中に組入れることができ、これは現在ＰＮＡを使用しては出来ないのである。
【００５９】
ＰＮＡ／ＤＮＡコオリゴマーへの標識基の結合は、オリゴヌクレオチドあるいはペプチドに対し記載されているそれ自体既知の方法で行う。標識基の性質は巾広く且つ使用する試験種類に準じて変えることができる。遺伝子プローブ試験の既知の態様は、ハイブリッド形成保護試験、エネルギー転移試験及びキッシングプローブ試験である。ＰＮＡ／ＤＮＡオリゴマーは特に鎖置換試験（Strand replacement assay）に適している。多くの場合、磁気粒子により過剰遺伝子プローブから形成されるハイブリッドを除去するのに便利である。本発明によるＰＮＡ／ＤＮＡ遺伝子プローブは従来のＤＮＡプローブの安定性より一層高いものである。
【００６０】
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）及びリガーゼ反応（ＬＣＲ）は本発明のオリゴマーがプライマーとして同様に使用できる標的増幅のための技術である。ＰＮＡ／ＤＮＡオリゴマーは特にクリスマスツリー原理（Christmas tree principle）上の遺伝子プローブとして有利に使用することができ、その理由はこの場合ＰＮＡ／ＤＮＡプローブを対応するＤＮＡプローブよりも一層短かくできるからである。
【００６１】
【実施例】
アミノ酸を表示する略語はEuroj. J. Biochem. 138, 9 (1984)に記載のペプチドケミストリーに慣用の３文字記号に対応し、その他の使用した略語は下に記す。
Ａｅｇ    Ｎ−（２−アミノエチル）グリシル，−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＯ−
Ａｅｇ(ａMeOBz)    Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（Ｎ6−（４−メトキシベンゾイル）−９−アデノシルアセチル）−グリシル
Ａｅｇ(ｃBz）    Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（Ｎ4−ベンゾイル−１−シトシルアセチル）−グリシル
Ａｅｇ(ｃMeOBz)    Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（Ｎ4−（４−メトキシベンゾイル）−１−シトシルアセチル）−グリシル
Ａｅｇ(ｃtBuBz)    Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（Ｎ4−（４−ｔ−ブチルベンゾイル−１−シトシルアセチル）−グリシル
Ａｅｇ(ｇiBu)    Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（Ｎ2−ノソブタノイル−９−グアノシルアセチル）−グリシル
Ａｅｇ(ｇ2-Ac.4-Dpc)    Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（Ｎ2−アセチル−Ｏ4−ジフェニルカルバモイル−９−グアノシル）グリシル
Ａｅｇ(ｔ)    Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（（１−チミニル）アセチル）−グリシル
Ｂｎｐｅｏｃ    ２,２−〔ビス（４−ニトロフェニル）〕−エトキシカルボニル）
Ｂｏｃ    ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＢＯＩ    ２−（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）−１,３−ジメチル−イミダゾリジニウムヘキサフルオロホスフェート
ＢＯＰ    ベンゾトリアゾリル−１−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＢｒｏＰ    ブロモ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
【００６２】
ＢＳＡ    Ｎ,Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド
Ｂｕｔ    ｔ−ブチル
Ｂｚ      ベンゾイル
Ｂｚｌ    ベンジル
Ｃｌ−Ｚ  ４−クロロベンジルオキシカルボニル
ＣＰＧ    強制細孔ガラス
ＤＢＵ    １,８−ジアザビシクロ〔５.４.０〕ウンデカン−７−エン
ＤＣＭ    ジクロロメタン
Ｄｄｚ    ２−(３,５−ジメトキシフェニル)−２−プロピルオキシカルボニルＤＭＦ    ジメチルホルムアミド
Ｄｍｔ    ジ−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル
Ｄｎｐｅｏｃ    ２−（２,４−ジニトロフェニル）−エトキシカルボニル
Ｄｐｃ    ジフェニルカルバモイル
ＦＡＭ    フルオレセイン残基
Ｆｍ      ９−フルオレニルメチル
Ｆｍｏｃ  ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
Ｈ−Ａｅｇ−ＯＨ    Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン
ＨＡＰｙＵ    Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−ビス−（テトラメチレン）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
【００６３】
ＨＡＴＵ    Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵ    Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢｔ    １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＯＮＳｕ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＨＯＯｂｔ  ３−ヒドロキシ−４−オキソ−３,４−ジヒドロベンゾトリアジンｉＢｕ      イソブタノイル
ＭｅＯＢｚ  ４−メトキシベンゾイル
Ｍｍｔ      ４−メトキシトリフェニルメチル
Ｍｏｚ      ４−メトキシベンジルオキシカルボニル
ＭＳＮＴ    ２−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−1,2,4−トリアゾール
Ｍｔｔ      （４−メチルフェニル）ジフェニルメチル
ＮＢＡ      ニトロベンジルアルコール
ＮＭＰ      Ｎ−メチルピロリジン
【００６４】
Ｏｂｇ    Ｎ−（４−オキシブチル）グリシル，−Ｏ−(ＣＨ2)4−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＯ−
Ｏｂｇ(ｔ)    Ｎ−（４−オキシブチル）−Ｎ−（（１−チミニル）アセチル）−グリシル
Ｏｅｇ    Ｎ−（２−オキシエチル）グリシル，−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＯ−
Ｏｅｇ(ｔ)    Ｎ−（２−オキシエチル）−Ｎ−（（１−チミニル）アセチル）−グリシル
Ｏｐｅｇ    Ｎ−（５−オキシペンチル）グリシル，−Ｏ−(ＣＨ2)5−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＯ−
Ｏｐｅｇ(ｔ)    Ｎ−（５−オキシペンチル）−Ｎ−（（１−チミニル）アセチル）−グリシル
Ｏｐｒｇ    Ｎ−（３−オキシプロピル）グリシル，−Ｏ−(ＣＨ2)3−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＯ−
Ｏｐｒｇ(ｔ)    Ｎ−（３−オキシプロピル）−Ｎ−（（１−チミニル）アセチル）−グリシル
Ｐｉｘｙｌ    ９−（９−フェニル）キサンテニル
ＰｙＢＯＰ    ベンゾトリアゾリル−１−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＰｙＢｒｏＰ    ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＴＡＰｉｐＵ    Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−ビス（ペンタメチレン）ウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＢＴＵ    Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
【００６５】
ｔＢｕ      ｔ−ブチル
ｔＢｕＢｚ  ４−ｔ−ブチルベンゾイル
ＴＤＢＴＵ  Ｏ−(３,４−ジヒドロ−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジン−３−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＤＯ      ２,５−ジフェニル−２,３−ジヒドロ−３−オキソ−４−ヒドロキシチオフェンジオキサイド
Ｔｅｇ      Ｎ−（２−チオエチル）グリシル，−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＯ−
Ｔｅｇ(ｔ)  Ｎ−（２−チオエチル）−Ｎ−（（１−チミニル）アセチル）−グリシル
ＴＦＡ      トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ      テトラヒドロフラン
ＴＮＴＵ    Ｏ−（５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシミド）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＯＴＵ    Ｏ−〔（シアノ（エトキシカルボニル）メチレン）−アミノ〕−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＰＴＵ    Ｏ−（１,２−ジヒドロ−２−オキソ−１−ピリジル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
Ｔｒｔ      トリチル
ＴＳＴＵ    Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
Ｚ          ベンジルオキシカルボニル
ＭＳ(ES+）  エレクトロスプレー質量スペクトル（陽イオン）
ＭＳ(ES-）  エレクトロスプレー質量スペクトル（陰イオン）
ＭＳ(ＤＣＩ)    化学的イオン化脱離質量スペクトル
ＭＳ（ＦＡＢ）  高速原子衝撃質量スペクトル
【００６６】
実施例１
１−ヒドロキシ−６−（（４−メトキシフェニル）−ジフェニルメチルアミノ）−ヘキサン
Ｍｍｔ−ｈｅｘ
６−アミノ−１−ヘキサノール（１ｇ；８.５５ミリモル）を無水ピリジン（７ml）に溶解し、そしてトリエチルアミン（０.２ml）を加えた。この溶液に無水ピリジン（９ml）中の（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルクロライド溶液（２.５ｇ；８.１２ミリモル）を４５分間かけて加えた。この反応溶液を２２℃で３０分間さらに撹拌し、メタノール（３ml）を加えて反応を停止した。この溶液をロータリーエバポレーターで濃縮し、そして得られた残分をトルエンと共に３回共蒸発させピリジンを除去した。この得られた残分を酢酸エチルに溶解し、そしてこの溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶液、水及び飽和塩化カリウム溶液で逐次洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過しそして真空濃縮させた。粗生成物をヘプタン：酢酸エチル：トリエチルアミン（４９.５：４９.５：１）を用いシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。収量は１.６４ｇであった。
ＭＳ（ＦＡＢ，ＮＢＡ／ＬｉＣｌ）３９６.３（Ｍ＋Ｌｉ)+，３９０.３（Ｍ＋Ｈ)+，２７３.２（Ｍｍｔ)+
Ｒf ０.４４（ヘプタン：酢酸エチル＝１：１）
【００６７】
実施例２
６−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）−１−ヘキシルヘミスクシネート
Ｍｍｔ−ｈｅｘ−ｓｕｃｃ
１−ヒドロキシ−６−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）ヘキサン（１.００ｇ；２.５７ミリモル）を無水ピリジン（１０ml）に溶解した。この溶液に無水コハク酸（０.２５７ｇ；２.５７ミリモル）及び４−ジメチルアミノピリジン（３１.３mg；０.２５７ミリモル）を加えた。２２℃で３時間撹拌の後、さらに無水コハク酸（２５.７mg；０.２５７ミリモル）及び４−ジメチルアミノピリジン（６２.６mg；０.５６ミリモル）を加え、そしてこの溶液を５０℃で６時間加熱した。さらに２２℃で１６時間保持した後に、この混合物を濃縮し、その残分を酢酸エチル中に取り、そして得られた溶液を氷冷した５％濃度の水性クエン酸で洗浄した。有機相を乾燥させた後（Ｎａ2ＳＯ4）、この溶液をロータリーエバポレーターで濃縮させた。５０％ＣＨ2Ｃｌ2：酢酸エチル中の１％トリエチルアミンを用い、そして次いで５％メタノール：ジクロロメタン中の１％トリエチルアミンを用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより得られた残分を精製して無色の油状物として所望の化合物を得た。
ＭＳ（ＥＳ-）９７８.０（２Ｍ−Ｈ)-，４８８.３（Ｍ−Ｈ)-
Ｒf ０.３０（ＣＨ2Ｃｌ2：酢酸エチル＝１：１）
【００６８】
実施例３
６−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）−１−ヘキシルスクシニルアミド−テンタゲル
（Ｍｍｔ−ｈｅｘ−ｓｕｃｃ−Tentagel）
テンタゲル（TentagelR）(Rapp重合体）のアミノ体（０.５ｇ；０.１１ミリモルアミノ基）を４−エチルモルホリン（０.１ml）及びＤＭＦ（５ml）中で１０分間膨潤させた。次にＤＭＦ（３ml）中の６−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）−１−ヘキシルヘミスクシネート（９７.４mg；０.１６５ミリモル）、４−エチルモルホリン（１５.９mg；０.１３８ミリモル；１７.４ml）及びＴＢＴＵ（５２.９mg；０.１６５ミリモル）の溶液を加え、そしてその懸濁液を２２℃で１６時間振とうさせた。誘導されたテンタゲル支持体を濾過しそしてＤＭＦ（３×３ml）、ＣＨ2Ｃｌ2（３×１ml）及びジエチルエーテル（３×１ml）で順次洗浄し、乾燥させた。未反応アミノ基をＴＨＦ（１ml）中無水酢酸／ルチジン／１−メチル−イミダゾールで１時間処理することにより遮断した。完成した支持体をＣＨ2Ｃｌ2（３×１ml）及びジエチルエーテル（３×１ml）で洗浄しそして真空乾燥させた。導入されたモノメトキシトリチル基にもとづきローディングは１６８ミリモル-1であった。
【００６９】
実施例４
６−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）−１−ヘキシルスクシニルアミドプロピル−強制細孔ガラス
（Ｍｍｔ−ｈｅｘ−ｓｕｃｃ−ＣＰＧ）
ＤＭＦ（３ml）中のアミノプロピル−ＣＰＧ（FluKaより入手)(５５０オングストローム；１.０ｇ）及び６−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）−１−ヘキシルヘミスクシネート（４８.７mg；０.０８２ミリモル）、４−エチルモルホリン（７.６ml）及びＴＢＴＵ（２６.４mg；０.０８２ミリモル）から出発して、実施例３と同様に調製した。Ｍｍｔ−ｈｅｘ−ｓｕｃｃ−ＣＰＧのローディングは９１ミリモルｇ-1であった。
【００７０】
実施例５
Ｎ−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）エチル−Ｎ−（Ｎ4−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−１−シトシルアセチル）グリシン
（Ｍｍｔ−Ａｅｇ(ｃtBuBz)−ＯＨ）
Ｎ−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）エチル−Ｎ−（Ｎ4−ｔ−ブチルベンゾイル）−１−シトシルアセチル）−グリシンメチルエステル１.６３ｇ（２.２８ミリモル）をジオキサン１０mlと水１mlの混合物に溶解し、そして０℃で撹拌しながら１Ｎ ＮａＯＨ ４.５６mlを滴下しながら加えた。２時間後、pHを１Ｎ ＫＨＳＯ4の滴下添加により５に調整し、沈殿した塩を濾過しそして少量のジオキサンで洗浄した。合わせた濾液を真空蒸発させ、そしてその残分をメタノール及びジクロロメタンと共に２回共蒸発させた。このようにして得られた粗生成物をジクロロメタン中２〜１０％のメタノールの勾配及び１％トリエチルアミンを用いたシリカゲル上のクロマトグラフィーにより精製した。
この生成物を含む画分を合わせて真空濃縮した。未だ残っている過剰なトリエチルアミンをピリジンと次にトルエンと共に共蒸発させて除去した。生成物０.８３１ｇがほとんど白色の泡状物として得られた。
エレクトロスプレーＭＳ（陰イオン）７００.７（Ｍ−Ｈ)-
Ｒf ０.２８（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９：１），０.６３（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／７：３）
【００７１】
実施例６
Ｎ−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）エチル−Ｎ−（（１−チミニル）アセチル）グリシン
（Ｍｍｔ−Ａｅｇ(ｔ))−ＯＨ
上記反応より得られた生成物をジオキサン１０mlと水２mlの混合物に溶解し、その溶液を０℃に冷却し、そして１Ｎの水酸化ナトリウム溶液をpHが１１になるまで滴下添加した。２時間の反応時間後、反応は完了しそして２Ｎ ＫＨＳＯ4溶液を注意深く添加しながら得られた溶液のpHを５に調整した。この溶液を酢酸エチルで３回抽出し、そして合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させそして真空濃縮させた。このように得られた粗生成物をジクロロメタン中で５〜１０％のメタノールの勾配及び１％トリメチルアミンを用いてシリカゲル上のクロマトグラフィーにより精製した。この生成物を含む画分を合わせ真空濃縮した。未だ残っている過剰のトリエチルアミンをピリジンとそして次にトルエンと共に共蒸発させて除去した。無色の泡状物として生成物１.０６５ｇが得られた。
エレクトロスプレーＭＳ（陰イオン）１１１２.０（２Ｍ−Ｈ)-，５５５.３（Ｍ−Ｈ)-
Ｒf ０.２８（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／８：２）
【００７２】
実施例７
Ｎ−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）エチル−Ｎ−（Ｎ2−イソブタノイル−９−グアノシルアセチル）グリシン
（Ｍｍｔ−Ａｅｇ(ｇiBu)−ＯＨ
Ｎ−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）エチル−Ｎ−（Ｎ2−イソブタノイル−９−グアノシルアセチル）グリシンメチルエステル（１.１５ｇ；１.７２ミリモル）をジオキサン（１０ml）に溶解し、そして０℃で１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１０.３２ml）を５回に分け２時間半にわたり滴下添加した。さらに室温で２時間反応させた後に、２Ｍ硫化水素ナトリウム水溶液を滴下添加してこの溶液のpHを５に調整した。沈殿した塩を濾過し少量のジオキサンで洗浄した。合わせた濾液を真空下に蒸発乾固し、そしてこの残分を２回各々エタノールと１：１のジクロロメタン：メタノールと共に共蒸発させた。ジクロロメタン（１％トリエチルアミン含有）中で１０〜２０％のメタノールの勾配で溶出することによりシリカゲル上のクロマトグラフィーにより精製した。生成物が白い泡状物として得られた。
収量：１.２２９ｇ
ＥＳＭＳ（陰イオン）：６５０.３（Ｍ−Ｈ)-
Ｒf ０.２５（ジクロロメタン／メタノール／８：２）
【００７３】
実施例８
Ｎ−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）エチル−Ｎ−（Ｎ6−（４−メトキシベンゾイル）−９−アデノシルアセチル）グリシン
（Ｍｍｔ−Ａｅｇ(ａMeOBz)−ＯＨ
Ｎ−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）エチル−Ｎ−（Ｎ6−（４−メトキシベンゾイル）−９−アデノシルアセチル）グリシンメチルエステル（１.７０ｇ；２.３８ミリモル）をジオキサン（１０ml）に溶解し、そして０℃で１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１０.３２ml）を５回に分けて２時間半にわたり滴下添加した。さらに室温で２時間反応させた後に、２Ｍ硫化水素ナトリウム水溶液を滴下添加してこの溶液のpHを５に調整した。沈殿した塩を濾過し少量のジオキサンで洗浄した。合わせた濾液を真空下に蒸発乾固させてそしてこの残分を２回各々エタノールと１：１のジクロロメタン：メタノールと共に共蒸発させた。ジクロロメタン（１％トリエチルアミン含有）中で１０〜２０％のメタノールの勾配で溶出することによりシリカゲル上のクロマトグラフィーにより精製した。白い泡状物として生成物が得られた。
収量：１.６１９ｇ
ＥＳＭＳ（陰イオン）：６９８.３（Ｍ−Ｈ)-
Ｒf ０.１０（ジクロロメタン：メタノール／８：２）
【００７４】
実施例９
Ｎ−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルオキシ）エチル−Ｎ−（（１−チミニル）アセチル）グリシン
（Ｍｍｔ−Ｏｅｇ(ｔ)−ＯＨ）
Ｎ−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルオキシ）エチルグリシン０.５ｇ（１.２８ミリモル）をＤＭＦ １０mlに懸濁させ、そしてＢＳＡ ０.４７ml（１.９２ミリモル）を滴下添加した。次いでトリエチルアミン０.７ml（５.１ミリモル）とクロロカルボキシメチルチミン０.２６ｇ（１.２８ミリモル）を続けて添加した。反応混合物を室温で４時間撹拌し次いでさらにクロロカルボキシメチルチミン６５mg（０.３２ミリモル）を加え、そしてこの混合液を１６時間撹拌した。溶媒を真空で除去し、そして粗生成物をジクロロメタン中で５〜１５％のメタノールの勾配と１％トリエチルアミンを用いてシリカゲルコラム上で精製した。生成物を含む画分を合わせて真空濃縮した。得られた茶色の油状物を少量のジクロロメタンに溶解し、そしてジエチルエーテルを加えて生成物を沈殿させた。ほとんど白色の粉末として生成物が得られた。
収量：０.２１９ｇ
エレクトロスプレーＭＳ（陰イオン）５５６.３（Ｍ−Ｈ)-
Ｒf ０.５４（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／８：２）
【００７５】
実施例１０
４−ニトロフェニル４−（４,４′−ジメトキシトリチルオキシ）ブチレート
Ｄｍｔ−ｂｕｔ−ＮＰＥ
４−ヒドロ酪酸のナトリウム塩（１.２６ｇ；１０ミリモル）を無水ピリジン（３０ml）に溶解し、そして４,４′−ジメトキシトリチルクロライド（３.３９ｇ；３.０５ミリモル）を加えた。１６時間後に４−ニトロフェノール（１.３９ｇ；１０ミリモル）とＮ,Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２.０６ｇ；１０ミリモル）を加え、そしてこの混合物を２２℃でさらに４８時間撹拌した。沈殿したジシクロヘキシルウレアを濾過しジクロロメタンで洗浄した。この溶液を濃縮しそして得られた残分をトルエンと共に２回共蒸発させた。この残分をシリカゲルコラム（石油エーテル中１０〜５０％酢酸エチル及び１％トリエチルアミン）上で精製した。所望の化合物を淡黄色の油状物として得た。
収量：２.６９４ｇ
ＭＳ（ＦＡＢ，ＭｅＯＨ／ＮＢＡ／ＬｉＣｌ）５３４.２（Ｍ＋Ｌｉ)+，５２７.２Ｍ+
Ｒf ０.３４（石油エーテル：酢酸エチル＝７５：２５）
【００７６】
実施例１１
Ｈ−Ｏｐｒｇ(ｔ)−ＯＨ
チミニル酢酸３.６８ｇを乾燥ＤＭＦ ２０mlに溶解し、そしてＴＯＴＵ ６.６５ｇ及びトリエチルアミン２.７７mlを加えた。この混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで（３−ヒドロキシプロピル）グリシン５.３２ｇ、水２０ml、ＤＭＦ ２０ml及びトリエチルアミン５.５４mlからなる溶液にゆっくりと滴下添加した。この混合物を室温で１時間撹拌しそして次いで真空ロータリーエバポレーター中で濃縮した。残分を水中に取り、１Ｎ塩酸でpHを１.５に調整しそして酢酸エチルで抽出した。飽和重炭酸ナトリウム溶液で水相をpH５に調整しそしてロータリーエバポレーターで濃縮した。この残分をエタノール２５０mlと混合し、それにより沈殿した塩化ナトリウムを吸引濾過した。濾液を濃縮しそして得られた粗生成物を１％トリエチルアミン、次いでジクロロエタン／メタノール／酢酸エチル １０：４：１の添加及び１％トリエチルアミンを添加したジクロロメタン／メタノール／酢酸エチル １０：２：１を用いてシリカゲル上で精製した。生成物を含む画分を合わせロータリーエバポレーター中で真空濃縮した。
収量：３.２ｇ
Ｒf ０.１５（ジクロロメタン／メタノール／酢酸エチル １０：２：１＋１％トリエチルアミン）
ＭＳ（ＥＳ+）：３００.２（Ｍ＋Ｈ)+
【００７７】
実施例１２
Ｄｍｔ−Ｏｐｒｇ(ｔ)−ＯＨ
Ｈ−Ｏｐｒｇ(ｔ)−ＯＨ ３.２ｇをＤＭＦ ４０mlに溶解し、トリエチルアミン５.９３mlを加え、そして０℃でジクロロメタン４０ml中のＤｍｔ−Ｃｌ ７.２５ｇの溶液を２０分間にわたり滴加した。混合物を室温で２時間撹拌し、次いで沈殿したトリエチルアミンハイドロクロライドを濾過し、そして濾液をロータリーエバポレーター中で真空濃縮した。この残分をジクロロメタン中に取り、水で抽出し、そして有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させそしてロータリーエバポレーター中で真空濃縮させた。粗生成物を１％トリエチルアミンを添加したジクロロメタン／メタノール／酢酸エチル １０：２：１を用いてシリカゲル上で精製した。生成物を含む画分を合わせ、ロータリーエバポレーター中で真空濃縮させた。
収量：３.４６ｇ
Ｒf ０.２８（ジクロロメタン／メタノール／酢酸エチル １０：２：１＋１％トリエチルアミン）
ＭＳ（ＥＳ+）６０２.４（Ｍ＋Ｈ)+
【００７８】
実施例１３
Ｈ−Ｏｂｇ(ｔ)−ＯＨ
チミニル酢酸２.７６ｇを乾燥ＤＭＦ １５mlに溶解し、そしてＴＯＴＵ ４.９２ｇとトリエチルアミン２.０８mlを加えた。この混合物を室温で３０分間乾燥しそして次に(４−ヒドロキシブチル）グリシン４.４１ｇ、水１０ml、ＤＭＦ１０ml及びトリエチルアミン４.１６mlから成る溶液に徐々に滴下添加した。この混合物を室温で３時間撹拌し次いでロータリーエバポレーター中で真空濃縮した。この残分を水中に取り１Ｎ塩酸でpH１.５に調整しそして酢酸エチルで抽出した。水相を飽和重炭酸ナトリウム溶液でpH５に調整し、ロータリーエバポレーター中で濃縮した。得られた粗生成物を１％トリエチルアミンを添加したジクロロメタン／メタノール／酢酸エチル １０：２：１を用いてシリカゲル上で精製した。生成物を含む画分を合わせ、ロータリーエバポレーター中で真空濃縮した。
収量：３.７ｇ
Ｒf ０.１１（ジクロロメタン／メタノール／酢酸エチル １０：２：１＋１％トリエチルアミン）
ＭＳ（ＥＳ+）３１４.２（Ｍ＋Ｈ)+
【００７９】
実施例１４
Ｄｍｔ−Ｏｂｇ(ｔ)−ＯＨ
Ｈ−Ｏｂｇ(ｔ)−ＯＨ ３.６ｇをＤＭＦ ４０mlに溶解し、トリエチルアミン９.５mlを加え、そして０℃でジクロロメタン４０ml中のＤｍｔ−Ｃｌ １５.４ｇの溶液を１５分間にわたり滴下添加した。この混合物を室温で２時間撹拌し、さらにジクロロメタン４０mlを加え、次いで沈殿したトリエチルアミン塩酸塩を濾過し、その濾液をロータリーエバポレーター中で真空濃縮した。残分をジクロロメタン中に取り、水で抽出し、そして有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そしてロータリーエバポレーター中で真空濃縮した。粗生成物を１％トリエチルアミンを添加したジクロロメタン／メタノール／酢酸エチル １５：１：１を用いてシリカゲル上で精製した。生成物を含む画分を合わせロータリーエバポレーター中で真空濃縮させた。
収量：３.４５ｇ
Ｒf ０.２９（ジクロロメタン／メタノール／酢酸エチル １０：２：１＋１％トリエチルアミン）
ＭＳ（ＥＳ+＋ＬｉＣｌ）６２２.３（Ｍ＋Ｌｉ)+
【００８０】
実施例１５
Ｈ−Ｏｐｅｇ(ｔ)−ＯＨ
チミニル酢酸２.７６ｇを乾燥ＤＭＦ １５mlに溶解し、そしてＴＯＴＵ ４.９２ｇとトリエチルアミン２.０８mlを加えた。この混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで（５−ヒドロキシペンチル）グリシン４.８３ｇ、水１０ml、ＤＭＦ １０ml及びトリエチルアミン４.１６mlからなる溶液に徐々に滴下添加した。この混合物を室温で３時間撹拌し、次いでロータリーエバポレーター中で真空濃縮した。残分を水に取り、１Ｎ塩酸でpH１.５に調整しそして酢酸エチルで抽出した。水相を飽和重炭酸ナトリウム溶液でpH５に調整し、そしてロータリーエバポレーター中で濃縮した。粗生成物を１％トリエチルアミンを添加したジクロロメタン／メタノール／酢酸エチル １０：２：１を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含む画分を合わせてそしてロータリーエバポレーター中で真空濃縮した。
収量：３.３４ｇ
Ｒf ０.１９（ジクロロメタン／メタノール／酢酸エチル １０：２：１＋１％トリエチルアミン）
ＭＳ（ＤＣｌ）３２８.２（Ｍ＋Ｈ)+
【００８１】
実施例１６
Ｄｍｔ−Ｏｐｅｇ(ｔ)−ＯＨ
Ｈ−Ｏｐｅｇ(ｔ)−ＯＨ ３.２ｇをＤＭＦ ４０mlに溶解し、トリエチルアミン６.７７mlを加え、そして０℃でジクロロメタン４０ml中のＤｍｔ−Ｃｌ ９.９４ｇの溶液を１５分間にわたり滴下添加した。この混合物を室温で２時間撹拌し、さらにジクロロメタン４０mlを加え、次いで沈殿したトリエチルアミン塩酸塩を濾過し、濾液をロータリーエバポレーター中で真空濃縮した。残分をジクロロメタン中に取り、水で抽出し、そして有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そしてロータリーエバポレーター中で真空濃縮した。粗生成物を１％トリエチルアミンを添加したジクロロメタン／メタノール／酢酸エチル １５：１：１を用いてシリカゲル上で精製した。生成物を含む画分を合わせ、ロータリーエバポレーター中で真空濃縮した。
収量：３.６ｇ
Ｒf ０.２７（ジクロロメタン／メタノール／酢酸エチル １０：２：１＋１％トリエチルアミン）
ＭＳ（ＥＳ+＋ＬｉＣｌ）６３６.４（Ｍ＋Ｌｉ)+
【００８２】
実施例１７
5′-ATC GTC GTA TT-(but)-agtc-hex
ＤＮＡ配列は大文字で表し、ＰＮＡ配列は小文字で表したスキーム１の構造タイプXIIaの例）。ＰＮＡｓは、例えばEcosyn Ｄ−３００ ＤＮＡシンセサイザー（Eppendorf／Biotronik, Maintal製）又はＡＢＩ ３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザー（Applied Biosystems, Weiterstadt製）中で合成される。ＤＮＡ部分の合成は主に標準ホスホルアミダイト化学及び商業的に入手可能な合成サイクルで行われる。ＰＮＡ部分の合成にはペプチド合成の方法が下記に説明のようにＤＮＡ合成サイクルに近い。
【００８３】
【化２３】
0004620810.tif 000018
【００８４】
【化２４】
0004620810.tif 000019
【００８５】
【化２５】
0004620810.tif 000020
【００８６】
【化２６】
0004620810.tif 000021
【００８７】
実施例４からのＭｍｔ−ｈｅｘ−ｓｕｃｃ（ローディング９１μmol／ｇ）をロードしたＣＰＧ支持体３μmolを下記の試薬で逐次処理する。
ＰＮＡ部分（ａｇｔｃ−ｈｅｘ）の合成：
１. ジクロロメタン
２. ジクロロメタン中の３％トリクロロ酢酸
３．アセトニトリルabs.
４．アセトニトリル中の４−エチルモルホリンの３.５Ｍ溶液（中和）
５．アセトニトリル中の実施例５からの（Ｍｍｔ−Ａｅｇ(ｃtBuBz)−ＯＨ）の０.４Ｍ溶液：ＤＭＦ＝９：１／アセトニトリル中のＢｙＢＯＰの０.９Ｍ溶液／アセトニトリル中の４−エチルモルホリンの３.５Ｍ溶液（１０分間のカップリング時間）
【００８８】
６．工程５は４回反復
７．アセトニトリル
工程１〜７（以後ＰＮＡ反応サイクルと称する）を３回反復してＰＮＡ部分を組立てる。この時、各場合工程５で配列に応じて必要な実施例５〜８からのモノマービルディングブロックを用いる。
リンカーの接合（ａｇｔｃ−ｈｅｘ→(ｂｕｔ)−ａｇｔｃ−ｈｅｘ）：
８．上記の工程１〜４を反復
９．実施例１０からの４−ニトロフェニル４−（（４,４′−ジメトキシトリチルオキシ）ブチレート（１０５mg）及びＤＭＦ中のＮＥＭ ２ml中のヒドロキシベンゾトリアゾール（２７mg）で１５時間。
10．ＤＭＦで洗浄
11．アセトニトリルで洗浄
12．ジクロロメタン
【００８９】
ＤＮＡ部分の合成
((but)-agtc-hex→5′-ATC GTC GTA TT-(but)-agtc-hex：
13．アセトニトリルabs.
14．ジクロロメタン中の３％トリクロロ酢酸
15．アセトニトリルabs.
16．β−シアノエチル５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン３′−ジイソプロピルホスホルアミダイト１０μmol及びアセトニトリルabs ０.３ml中のテトラゾール５０μmol
17．アセトニトリル
18．４０％ルチジン含有のＴＨＦ中の２０％無水酢酸及び１０％ジメチルアミノピリジン
19．アセトニトリル
20．よう素（ＴＨＦ／水／ピリジン；７０：２０：５(容積比）中１.３ｇ）
工程１３〜２０（以後ＤＮＡ反応サイクルを称する）を１０回反復してヌクレオチド部分を組立てる。この時工程１６で各場合に配列に対応するβ−シアノエチル５′−Ｏ−ジメトキシトリチル（ヌクレオチド塩基）３′−ジイソプロピルホスホルアミダイトを用いる。
【００９０】
合成が完了後、工程１〜３に記載のようにジメトキシトリチル基を除去した。
オリゴマーの支持体を分解し、同時にアンモニアで１.５時間処理してβ−シアノエチル基を除去した。環外アミノ保護基を除去するため、アンモニア性溶液を５５℃で５時間保つ。5′-ATC GTC GTA TT-(but)-agtc-hexの得られた粗生成物の１８０ ＯＤ260をポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。BiogelRカラム（Biorad社製）上で脱塩し、これより高純度オリゴマー５０ ＯＤ260を得た。
【００９１】
実施例１８
5′-ATC GTC GTA TT-(Oeg(t))-agtc-hex
（スキーム２中の構造型Ｘａの例：Ｏｅｇ(ｔ)の説明は実施例９を参照）
工程５に記載の条件下で実施例１７に記載と同様に合成を実施したが、工程９ではｐ−ニトロフェニルＤｍｔ−ブチレートの代りに、実施例９からのリンカービルディングブロックＭｍｔ−Ｏｅｇ(ｔ)−ＯＨを結合した。5′-ATC GTC GTA TT-(Oeg(t))-agtc-hexの得られた粗生成物（２３５ ＯＤ260）１３５ ＯＤ260をポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。BiogelRカラム（Biorad社製）上で脱塩し、これより高純度オリゴマー２０ ＯＤ260を得た。
【００９２】
実施例１９
N-ggg g(5′NH-C)T CsCs As TGG GGsGs T（配列HSV-1に相補性）
（スキーム２中構造型XIの例；ｓはホスホロチオエート架橋を意味する；（５′ＮＨ−Ｃ）は５′−アミノシチジレート残基を意味する；Ｎはアミノ末端を意味する）
合成は、５′−Ｄｍｔ−チミジンがその３′末端を経て結合しているＣＰＧ支持体から出発して行われる。ＤＮＡ部分の合成は、まず実施例１７（工程１３〜２０）に記載されているとおり実施され、ホスホロチオエート（ｓ）の場合工程２０中酸化は、テトラエチルチウラムジサルファイド（ＴＥＴＤ；Applied Biosystems Inc. の使用者ビュレタン６５号）を使用して実施される。式VIIIｆのＤｍｔ保護５′−アミノ−５′−デオキシシチジレート３′−ホスホロアミデートビルディングブロックをリンカービルディングブロックとして使用する。次にＰＮＡビルディングブロックを実施例１７中工程１〜７と同様に縮合する。合成が完了して後、このオリゴマーを支持体から開裂し、同時に、アンモニアで１.５時間処理することによってβ−シアノエチル基を除く。環外アミノ保護基を除くために、アンモニア溶液を５５℃に５時間保つ。すぐ次に８０％強度の酢酸で２２℃において２時間処理することによってモノメトキシトリチル基を除く。生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、Biogel（登録商標）カラム（Bioradから）上脱塩する。
【００９３】
実施例２０
5′-GMeGMeG GCT CCA(Oeg(t))gg ggg t-hex
（スキーム２中構造型Ｘａの例；Ｍｅはメチルホスホネート架橋を意味する；Ｏｅｇ(ｔ)の説明については実施例９参照）
合成は、実施例１８と同様に行われるが、ＤＮＡ反応サイクル中適当な式VIIIｂのメチルホスホネートビルディングブロックを使用してメチルホスホネート架橋Ｍｅを組み入れる。
【００９４】
実施例２１
5′-Cs,sAs,sC GTs,sT,GAG(but)Ggg cat-hex(c-mycアンチセンス）
(スキーム１中構造型XIIａの例；ｓ,ｓはホスホジチオエート架橋を意味する)
合成は、実施例１７と同様に行われるが、ビルディングブロックVIIIｄを使用してジチオエート架橋を組み入れ、これらの部位における酸化（工程２０）はＴＥＴＤによって実施される。
【００９５】
実施例２２
N-cga g(5′NH-A)A CAT CA(Oeg(t))ggt cg-hex(c-fosアンチセンス）
（５′ＮＨ−Ａは５′−アミノ−５′−デオキシアデニレートを意味する；Ｏｅｇ(ｔ)の説明について実施例９参照）
合成は実施例１８中の記載と同様に行われ、ＤＮＡ合成の完了後、実施例１３と同様に第二のＰＮＡ部分の複合を可能にする５′アミノヌクレオチドの縮合を行なう。即ち、まず６回のＰＮＡサイクルを実施し、次に実施例９からのリンカービルディングブロックをカップリングさせる。次に最後のサイクル中式VIIIｆのビルディングブロックを使用して、７回のＤＮＡ合成サイクルを実施する。さらに４回のＰＮＡ合成サイクルを実施して後、支持体からの除去及びさらに処理を実施例１９に記載されているとおり実施する。
【００９６】
実施例２３
F-cga g(5′NH-A)A CAT CAT GGT sCsG-O-CH2CH(OH)CH2-O-C16H33
（５′ＮＨ−Ａは５′−アミノ−５′−デオキシアデニレート；ＦはＰＮＡのアミノ末端上フルオレセイン残基、そしてｓはホスホロチオエート架橋を意味する)
合成は、実施例１９中記載と同様に行われるが、グリセロールヘキサデシルエーテルが結合されるＣＰＧ支持体から出発する。１２回のＤＮＡ合成サイクルを実施して後、リンカービルディングブロックVIIIｆを縮合させる。４回のＰＮＡ合成サイクルを実施し、末端Ｍｍｔ基を除いて後、遊離アミノ基を３０倍過剰のフルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)と反応させることが可能である。
【００９７】
実施例２４
3′-CCC TCT T-5′-(PEG)(PEG)-(Oeg(t)tg tgg g-hex
（ＰＥＧはテトラエチレングリコールホスフェート残基を意味する）
ＰＮＡ部分について合成は、実施例１７中記載のとおりに行われる。６つのＰＮＡ単位が縮合されて後、実施例９からの（Ｍｍｔ−Ｏｅｇ(ｔ)−ＯＨ）がカップルされる。次にリンカーとして初めに式XVのテトラエチレングリコール誘導体がＤＮＡ合成サイクルに記載されるとおり２回縮合されて後、逆の配向（５′から３′へ）をもつＤＮＡ部分の合成が実施する。この目的で、各々の場合ヌクレオシド３′−ホスホルアミダイトの代わりに対応する式XIVのヌクレオシド５′−ホスホルアミダイト（市販されている）が、ＤＮＡ合成サイクル中工程１６において使用される。さらに脱保護及び処理が実施例１７に記載されるとおりに行われる。
【００９８】
実施例２５
N-ccc tct t-(C6-リンク)(PEG)-3′-AAG AGG G-5′
（ＰＥＧはテトラエチレングリコールホスフェート残基を意味する；Ｃ６−リンクは６−アミノヘキサノールホスフェート残基である）
合成は、実施例１７（ＤＮＡ合成サイクル）中記載と同様に行われるが、５′−Ｏ−サクシネート基を経て３′−Ｏ−Ｄｍｔ−デオキシグアノシンが結合されているＣＰＧ支持体から出発する。式XIVのビルディングブロックを使用して６つのＤＮＡ単位が縮合されて後、初めに式XVのテトラエチレングリコール誘導体が１回リンカーとして縮合されて後、式XVIのホスホルアミダイトをカップリングさせてＣ６−リンクを導入する。次に実施例１７（ＰＮＡ合成サイクル）中のようにＰＮＡ部分を合成する。さらに脱保護及び処理が実施例１９に記載されるとおり行われる。
【００９９】
実施例２６
5′-TTT TTT TTT(but)ttt ttt-hex
合成は、実施例１７中記載と同様に行われる。生成物が支持体から開裂され、脱保護される前に、支持体結合ＤＮＡ／ＰＮＡハイブリッドの半分を蛍光標識（実施例２９）のために取る。他の半分は、実施例１７中記載されるとおり脱保護、処理される。
【０１００】
実施例２７
（ＦＡＭはフルオレセイン残基である）
5′-FAM-TTT TTT TTT(but)ttt ttt-hex
実施例２６からの支持体結合ＤＮＡ／ＰＮＡを、実施例１６中Applicd Biosystemsからのフルオレセインホスホルアミダイトを使用して実施例１７中記載されるとおり工程１３〜２０を実施することによって蛍光標識する。
【０１０１】
実施例２８
5′-GGG GGG GGG(but)ttt ttt-hex
合成は、実施例１７中記載と同様に行われる。生成物が支持体から開裂され、脱保護される前に、支持体結合ＤＮＡ／ＰＮＡハイブリッドの半分を蛍光標識（実施例２９）のために取る。他の半分は、実施例１７中記載されるとおり脱保護、処理される。表題の化合物は、ホモプリンモチーフ5′-AAA AAA GGG GGG GGG-3′を含有するＤＮＡ二本鎖に高い親和性をもつトリプレックス形成オリゴヌクレオチドとして結合する。
【０１０２】
実施例２９
（ＦＡＭはフルオレセイン残基である）
5′-FAM-GGG GGG GGG(but)ttt ttt-hex
実施例２８からの支持体結合ＤＮＡ／ＰＮＡを、実施例１６中Applicd Biosystemsからのフルオレセインホスホルアミデートを使用して実施例１７中記載されるとおり工程１３〜２０を実施することによって蛍光標識する。
【０１０３】
実施例３０
ビオチン-GPheGPheA GAA cat ca t(5′NH-G)G(Ome)U(Ome)C(Ome)-G(Ome)-ビタミンＥ（c-fosアンチセンス）
（Ｎ(Ｏｍｅ）は２′−Ｏ−メトキシ基をもつヌクレオチド単位Ｎを意味し、Ｐｈｅはフェニルホスホネート架橋；５′−ＮＨ−Ｇは５′−アミノ−５′−デオキシグアニレートを意味する）
合成は、ビタミンＥを負荷したＣＰＧ（Mackellarら（1992）Nucleio Aeids Res, 20 (13), 3411〜17）から出発し、ＤＮＡ合成サイクルの後式VIIIｅのビルディングブロックを４回カップリングさせることによって実施例１７中の記載と同様に行われる。式VIIIｆの５′−アミノヌクレオチドビルディングブロックがカップリングされて後、ＰＮＡ合成サイクルの後６つのＰＮＡ単位を縮合させる。中和の後、既知の方法によりホスホルアミダイトをアミノ基にカップリングさせ、フェニルホスホネート架橋の場合には工程１６中式VIIIｃのビルディングブロックを使用して、ＤＮＡ合成サイクルを適当に繰り返してＤＮＡ部分を組み立てる。最後にGlen Researchからのビオチンホスホルアミダイトを使用して末端基をカップリングさせる。合成が完了して後、このオリゴマーを実施例１９中記載のとおりに脱保護し、８０％強度の酢酸で２２℃において２時間処理することによって末端のジメトキシトリチル基を除く。
【０１０４】
実施例３１
A CAT CA (Oeg(t))ggt cg-hex(c-fosアンチセンス）
（Ｏｅｇ(ｔ)の説明については実施例９参照）
合成は、実施例１８中記載と同様に行われる。この場合には、まず５回のＰＮＡ合成サイクルを実施し、次に実施例９からのリンカービルディングブロックＯｅｇ(ｔ)をカップリングする。その後、実施例１８中記載のとおりに支持体からの除去及びさらに処理を実施する。
【０１０５】
実施例３２
A TAA TG(Oeg(t))tct cg-hex(c-fosのための対照オリゴマー）
合成は、実施例１８中記載と同様に行われる。この場合には、まず５回のＰＮＡ合成サイクルを実施し、次に実施例９からのリンカービルディングブロックＯｅｇ(ｔ)をカップリングする。その後、実施例１８中記載のとおりに支持体からの除去及びさらに処理を実施する。
【０１０６】
実施例３３
a cat cat ggt cg-hex(c-fosアンチセンス）
この純ＰＮＡオリゴマーは、１２回のＰＮＡサイクルを実施したことを除いて、実施例１８と同様にして製造した。環外アミノ保護基の脱保護は、アンモニア溶液（５５℃で５時間）中実施する。すぐ次に８０％強度の酢酸で２２℃において２時間処理することによってモノメトキシトリチル基を除く。
【０１０７】
実施例３４
A(5-hexy-C)A(5-hexy-U)(5-hexy-C)A(Oeg(t))ggt cg-hex(c-fosアンチセンス）
（Ｏｅｇ(ｔ)の説明については実施例９参照；５−ｈｅｘｙ−Ｃは５−ヘキシルシチジンを意味し、５−ｈｅｘｙ−Ｕは５−ヘキシルウリジンを意味する）
合成は、実施例３１中記載と同様であるが、縮合反応中普通のピリミジンホスホルアミダイトの代わりに対応する５−ヘキシニルピリミジンヌクレオシドホスホルアミダイトを使用して行われる。
【０１０８】
実施例３５
（ＦＡＭはフルオレセイン残基である）
5′-FAM-TT(but)ttt ttt-hex
このＰＮＡ／ＤＮＡオリゴマーの合成は、２つのチミジレート単位が縮合されるのみであるが、実施例２７中記載と同様に行われる。
【０１０９】
実施例３６
taa tac gac tca cta(5′HN-T)
（５′−ＨＮ−Ｔは５′−アミノ−５′−デオキシチミジンを意味する）
１５のＰＮＡ単位及び１つのヌクレオシド単位よりなるこのＰＮＡ／ＤＮＡオリゴマーは、ＤＮＡポリメラーゼ反応のためのプライマーとして合成された。これはサクシネートとしてその３′−ヒドロキシル基を経て５′−モノメトキシトリチルアミノ−５′−デオキシチミジンが結合している固相支持体（アミノアルキル−ＣＰＧ）から出発することを伴う。ジクロロメタン中３％ＴＣＡでモノメエトキシトリチル基を除いて後、１５回のＰＮＡサイクルが実施される。環外アミノ保護基の脱保護は、アンモニア溶液（５５℃において５時間）中実施される。すぐ次に８０％強度の酢酸で２２℃において２時間処理することによってモノメトキシトリチル基を除く。遊離３′−ヒドロキシル基をもつＰＮＡ／ＤＮＡオリゴマー（ＤＮＡポリメラーゼのためのプライマーとして使用される（Klenow））が得られる。
【０１１０】
実施例３７
Ps-rA(2′5′)rA(2′5′)rA(2′5′)rA-スペーサー-(Oeg(t))tc ctc ctg cgg-hex
（Ｐｓは５′−チオホスフェートを意味する；スペーサーはトリエチレングリコールホスフェートを意味する；ｒＡはリボアデニレートである；（２′５′）はヌクレオチド間の結合がリボース中２′から５′へであることを意味する）
この化合物の合成は、初めに１４のＰＮＡ単位を縮合させることによって実施例１８中記載と同様に行われる。実施例９からのリンカービルディングブロックＭｍｔ−Ｏｅｇ(ｔ)−ＯＨが工程５中記載された条件下導入されて後３％ＴＣＡによりＭｍｔ基を除き、市販のＤｍｔ−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)3−Ｏ−Ｐ(−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＮ)Ｎ(ｉ−Ｃ3Ｈ7)3スペーサーホスホルアミダイト（Eurogentech, Brusselsから）の助けによって導入する。（２′５′）−結合テトラアデニレートは、市販のＮ6−ベンゾイル−５′−Ｏ−Ｄｍｔ−３′−Ｏ−第三ブチルジメチルシリルアデノシン２′−Ｏ−シアノエチルジイソプロピルアミノホスホルアミダイト（Milligen, Bedford, USA）を使用し、縮合時間を２×５分に延長して、実施例１７中記載されているように合成する。カップリング反応中テトラゾールの代わりにそれより強い活性化剤５−エチルチオテトラゾールを使用する。最後のＤｍｔ基を除いて後、ビス（β−シアノエチルオキシ）ジイソプロピルアミノホスフィンでこのオリゴマーを５′−ＯＨ基上ホスフィチル化する。ＴＥＴＤによる酸化及びアンモニアによる脱保護及びフルオライドによる脱シリル化の結果表題の化合物が得られ、これはRNaseLを刺激する。
【０１１１】
実施例３８
Ps-Co(2′5′)Co(2′5′)Co(2′5′)Co-スペーサー-(Oeg(t))tc ctc ctg cgg-hex
（Ｐｓは５′−チオホスフェートを意味する；スペーサーはトリエチレングリコールホスフェートを意味する；Ｃｏはコルジセピン（３′デオキシアデノシン）である；（２′５′はヌクレオチド間の結合が２′から５′へであることを意味する）
合成は、実施例３７と同様に実施されるが、Ｎ6−ベンゾイル−５′−Ｏ−Ｄｍｔ−３′−Ｏ−第三ブチルジメチルシリルアデノシン２′−Ｏ−シアノエチルジイソプロピルアミノホスホルアミダイトの代わりに、対応するＮ6−ベンゾイル−５′−Ｏ−Ｄｍｔ−コルジセピン２′−Ｏ−シアノエチルジイソプロピルアミノホスホルアミダイト（Chemogen, Konstanzから）を使用し、フルオライド処理を省略する。
【０１１２】
実施例３９
5′-GG GGG GGG(Oeg(t))ttt ttt ttt-hex
合成は、実施例９からのリンカービルディングブロックＭｍｔ−Ｏｅｇ(ｔ)−ＯＨの工程５中記載された条件下の縮合（これは後の８つのグアニレート残基の縮合を可能にする）による９つのＰＮＡカップリングに続いて、実施例１８中の記載と同様に行われる。得られるＰＮＡ／ＤＮＡオリゴマーは、高い親和性をもち逆平行の配向でトリプレックス形成オリゴヌクレオチドとして配列5′..AAAAAAAAAAGGGGGGGG..3′を有する二本鎖ＤＮＡに結合する。
【０１１３】
実施例４０
ＰＮＡ／ＤＮＡのハイブリッドの特性化
特性化は、ＨＰＬＣ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及び陰イオン電気スプレー質量分析（ＥＳ−ＭＳ）の助けによって行われる。生成物は、上述したようにして精製され、その後ＰＡＧＥ（２０％アクリルアミド、２％ビスアクリルアミド及び７Ｍの尿素）において単一のバンドを示す。ＨＰＬＣは、メルクからのＲＰ−１８逆相カラム（溶離剤Ａ：０.１％ＴＦＡと共に水、Ｂ：水／アセトニトリル＝１：４；線形勾配）上、又はDionexからのＰＡ−１００カラム（溶離剤Ａ：２０mM ＮａＯＨ及び２０mM ＮａＣｌ；Ｂ：２０mM ＮａＯＨ及び１.５Ｍ ＮａＣｌ；線形勾配）上行われる。ＥＳ−ＭＳの場合には、ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、酢酸アンモニウム沈殿又は他のメタセシスによってアンモニウム塩に変換される。試料導入は、５ ＯＤ260／mlのオリゴマーを含有するアセトニトリル／水（１：１）中溶液から行われる。この方法の精度は約±１.５ダルトンである。
【０１１４】
実施例４１
放射線標識の後の細胞取り込み及び安定性の定量
放射線標識：
一般的に適用可能な35Ｓによる標識は、元素硫黄−３５を使用するＤＮＡ部分の合成のためのＤＮＡ合成サイクル（実施例１７中工程２０）において少なくとも１回の酸化を実施することよりなる。遊離の５′−ヒドロキシル基を有するＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、それ自身既知の方法によってポリヌクレオチドキナーゼを用いて32Ｐ又は35Ｓで標識することができる。遊離の３′−ヒドロキシル基を有するＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、それ自身既知の方式で３′−末端トランスフェラーゼを用いて標識することができる。例えば、ＤＮＡ部分の５′−標識を次に記載する：実施例１７、１８又は２６からの遊離の５′−ヒドロキシル基をもつＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッド（５００ｐモル）を水４２５μｌに溶解し、この溶液を９０℃に加熱し、迅速に冷却する。次に１０×キナーゼバッファー５０μｌ及び32Ｐ−ガンマ−ＡＴＰ（６,０００ Ｃｌ／ｍモル）又は35Ｓ−ガンマ−ＡＴＰ ５０μｌを添加し、この混合物を３７℃において１時間インキュベートする。０.５Ｍ ＥＤＴＡ溶液を添加することによって反応を停止する。
脱塩はファルマシアからのＮＡＰＲを用いて行われる。
【０１１５】
細胞取り込みの定量：
Ｖｃｒｏ細胞をＤＭＥＭ、５％ＦＣＳ中、９６穴ミクロタイタープレート中で３７℃において２４時間インキュベートする。培地を除いて後、細胞を無血清ＤＭＥＭで２回洗う。放射活性標識オリゴマー（１０６cpm）を非標識オリゴマーで血清中１０mMの濃度に希釈し、それと共に細胞を３７℃においてインキュベートする。１、７及び２４時間後１５０μｌずつを取り出する（「上清１」と称する）。ミクロタイタープレートの穴中の細胞を新鮮な培地３００μｌで７回洗い、洗浄培地（「上清２」と称する）を合してシンチレーションカウンター中測定する。次にトリプシン溶液１００μｌを添加し、３０秒経過させ、上清を吸引して除く。それを３７℃において３分間インキュベートすることによって離す。離された１.５mlのEppendorf管に移し、２,０００rpmにおいて６分間遠心分離する（「上清３」）。上清１（５μｌ）、２及び５（０.５ml）を各々別々にシンチレーションカウンター中測定する。これから１００,０００細胞あたりオリゴマーの取り込み（ｐモル）を計算し、上清３は細胞結合オリゴマー画分を表し、上清１及び２の合計は非細胞結合オリゴマー画分を表す。
【０１１６】
結  果：
【表１】
0004620810.tif 000022
【０１１７】
細胞を含有する培地中オリゴマーの安定性の調査：
上清１（１０μｌ）を８０％ホルムアミド５μｌ（キシレンシアノール及びブロモフェノールブルーと共に）と混合し、９５℃に加熱し（５分間）、ポリアクリルアミドゲル（２０％アクリルアミド、７Ｍ炭素）上に負荷する。電場中このゲルを展開して後、ゲル上のバンドを「安定オリゴマー」、そして失われたバンドを「減成オリゴマー」と指定する。
実施例２６からのＰＮＡ／ＤＮＡオリゴマーは、２４時間のインキュベーション時間の後６９％安定である；ＤＮＡオリゴマーは３％安定である。
実施例３１からのＰＮＡ／ＤＮＡオリゴマーは、これらの条件下３２時間の半減期を有し、一方対応するＤＮＡオリゴヌクレオチドは約２時間の半減期を有する。
【０１１８】
実施例４２
蛍光標識による細胞取り込みの定量
１０％ＦＣＳを追加したDulbeccoのＭＥＭ中で５cmのペトリ皿中ＣＯＳ細胞を集密成長させる。細胞を無血清ＤＭＥＭで２回洗う。ペトリ皿の中央約１cm2の区域を無菌の針を使用して掻取る。この区域に調べるＰＮＡ／ＤＮＡオリゴマー溶液（０.１mM）を塗る。インキュベーションをＣＯ2雰囲気中３７℃において実施する。２、４及び１６時間後蛍光顕微鏡によって細胞を調べる。このためには、細胞を無血清ＤＭＥＭで４回洗い、ガラススライドで覆い、蛍光顕微鏡下又は位相差によって評価する。蛍光標識ＰＮＡ（ＤＮＡ部分なし）F-(but)-tttt ttt-hexをＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに対する比較として調べた。細胞がこのＰＮＡと共に２時間インキュベートされて後、細胞の＞９０％は著しい形態学的変化及び細胞死を示す。細胞の大部分は著しい空胞化を示す。血漿膜、サイトゾル及び核はＰＮＡの取り込みを示さない。このＤＮＡ／ＰＮＡオリゴマーと共にわずか２時間の細胞のインキュベーションの後細胞はＰＮＡ／ＤＮＡオリゴマーの点状の細胞内分布を示す。細胞は、長いインキュベーションの後でも細胞死を受けない。
【０１１９】
実施例４３
熔融温度の決定：
熔融温度は、ＨＰ ８４５２Ａダイオード配列分光光度計、ＨＰ ８９０９０Ａ Peltierエレメント及びＨＰ温度コントロールソフトウエアーRev. B5. 1 (Hewlett Packardから）を使用して決定される。測定は、バッファーとして１０mM ＨＥＰＥＳ及び１４０mM ＮａＣｌ（pH７.５）中０.５℃／分の段階で実施される。オリゴマー濃度はmlあたり０.５〜１ ＯＤ260である。
【０１２０】
実施例１７又は１８からの生成物についての結果（ＤＮＡの場合ＴM）
5′-ATC GTC GTA T(Oeg(t))a gtc-hex    ＴM＝５１.５℃
3′-TAG CAG CAT A A T CAG-5′         逆平行
5′-ATC GTC GTA T(Oeg(t))a gtc-hex    ＴM＜２０℃
5′-TAG CAG CAT A A T CAG-3′         平行
5′-ATC GTC GTA TT(but)a gtc-hex      ＴM＝５１.０℃
3′-TAG CAG CAT AA T CAG-5′          逆平行
5′-ATC GTC GTA TTA GTC-3′           ＴM＝５０.５℃
3′-TAG CAG CAT AAT CAG-5′           ＤＮＡ・ＤＮＡ逆平行
5′-ATC GTC GTA TT(but)a gtc-hex      ＴM＜２０℃
5′-TAG CAG CAT AA T CAG-3′          平行
【０１２１】
【表２】
0004620810.tif 000023
ＴＧＧ ＴＣＧは、すべてのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート形態にあるＤＮＡ部分を意味する。ｐ及びapの定義については５頁参照。
【０１２２】
実施例４４
抗ビールス活性の試験
種々の人病原性ヘルペスビールスに対する試験化合物の抗ビールス活性は、細胞培養試験系において調べる。この実験のために、さる腎臓細胞（Vero, ２×１０5／ml）を、９６穴ミクロタイタープレート中血清含有DulbeccoのＭＥＭ（５％うし胎児血清ＦＣＳ）中に接種し、３７℃及び５％ＣＯ2において２４時間インキュベートする。次に血清含有培地を吸引除去し、無血清Dulbecco ＭＥＭ（−ＦＣＳ）で２回洗浄する。試験物質は、あらかじめ水中６００μＭの濃度に希釈し、−１８℃において貯蔵する。試験のためDulbecco最低必須培地（ＭＥＭ）中希釈段階をさらに実施する。洗浄した細胞に無血清Dulbecco ＭＥＭ １００μｌと共に個々の試験物質希釈液を添加する。３７℃及び５％ＣＯ2において３時間インキュベーションの後、細胞を３日以内に細胞叢が全に破壊される濃度でヘルペスシンプレックスビールス１型（ＡＴＣＣ ＶＲ７３３，ＨＳＶ−１ Ｆ株）又はヘルペスシンプレックスビールス２型（ＡＴＣＣ ＶＲ７３４，ＨＳＶ−２ Ｇ株）に感染させる。感染濃度は、ＨＳＶ−１について穴あたり５００プラーク形成単位（ＰＦＵ）、そしてＨＳＶ−２について３５０ ＰＦＵ／穴である。そのとき試験混合物は、１００ Ｕ／mlのペニシリンＧ及び１００mg／リットルのストレプトマイシンが追加されたＭＥＭ中８０μＭ〜０.０４μＭの濃度で試験物質を含有する。すべての実験は、プレートあたり８回実施される対照を除いて、二重定量として実施される。試験混合物を３７℃及び５％ＣＯ2において１７時間インキュベートする。細胞毒性は、細胞培養物の顕微鏡検査によって２０時間の全インキュベーション時間の後決定される。最大耐用量は、生成物の最高濃度と定義され、それは上述した試験条件下では、尚顕微鏡で検出し得る細胞傷害を起こさない。その後ＦＣＳを最終濃度４％まで添加し、３７℃及び５％ＣＯ2において５５時間インキュベーションを継続する。そのとき非処理感染対照は、完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す。細胞培養物の顕微鏡検査の後、Finterの生体染色法（１９６６）に従って中性レッドで染色する。試験物質の抗ビールス活性は、ビールスによって起こされる細胞変性効果から細胞の３０〜６０％を保護するのに必要な最小阻害濃度と定義される。ＰＮＡ／ＤＮＡキメラの活性は、各々の場合対応するＤＮＡオリゴマー又はＰＮＡオリゴマーのものよりよい。
【０１２３】
実施例４５
生体内活性の定量：ラットにおけるｃ−Ｆｏｓ蛋白質発現の阻止
定量は、脊髄の注ぎかけによって記載（Sandkuehlerら（1991)：Proceedings of the VIth World Congress on Pain, Charlton及びWoolf編；Elsevier, Amsterdam；313〜318頁）のように行われる。バルビツレート麻酔Sprague-Dawleyラットの椎弓切除の後、アンチセンスオリゴマーを受けるようにシリコンから２室容器を形成させる。一方の室はアンチセンスＰＮＡ／ＤＮＡ誘導体を充たすが、他方の室は対照オリゴマーを充たす（各７５μＭの濃度）。各々の場合１時間後注ぎかけ液を交換し、後足の熱処理（５２℃）によってｃ−ｆｏｓ発現を刺激する。ｃ−ｆｏｓ発現の阻止は、適当な組織切片試料上免疫組織化学的に明らかにすることができる。実施例３１からのｃ−ｆｏｓアンチセンスオリゴヌクレオチドは、実施例３３からの対応するＤＮＡオリゴヌクレオチド及び対応するＰＮＡオリゴマーより大きいｃ−ｆｏｓ発現の阻止をもたらす。
【０１２４】
実施例４６
ＲＮａｓｅ Ｈ アッセイ
ＲＮａｓｅ Ｈ活性を決定するために、調べるＰＮＡ／ＤＮＡオリゴマーの１.３ ＯＤを、オートクレーブ処理水５０μｌに溶解した相補ＲＮＡ配列（標的配列）０.５ ＯＤと共に加熱し、８０℃において５分間ＤＥＰＣ（ジエチルピロカルボネート）で処理して後１５分以内に３７℃に冷却する。このことにより、両オリゴマーの初期の変性が生じ、それは冷却後、配列特異的に核酸二重鎖を形成する。
【０１２５】
アッセイのために、このＲＮＡ・ＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんを、ＲＮａｓｅ Ｈ １０×バッファー１０μｌ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）１μｌ及びＵＳＢから供給されるＲＮａｓｅ Ｈ ２μｌ（１０単位に相等）とインキュベートする。インキュベーション混合物を、オートクレーブ処理、ＤＥＰＣ処理水で１００μｌの所要の全容量まで調製する。試料を３７℃においてインキュベートする。動力学研究のために、０、２分、１０分及び１時間後に溶液２０μｌずつを取り出し、９５℃において５分間加熱し、分析まで−７０℃において凍結する。ＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈ開裂の研究はゲル電気泳動によって行われる。デオキシリボヌクレオチドビルディングブロックを含有するＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＲＮａｓｅを活性化し、相補ＲＮＡ鎖が開裂するが、ＰＮＡ／ＤＮＡオリゴマーは反応物から傷害されずに出てくることがわかる。ＰＮＡ／ＤＮＡの場合の開裂反応は、同じ長さ及び配列の対応するオリゴデオキシリボヌクレオチドの場合よりいくらかゆっくり行われる。
【０１２６】
実施例４７
ＲＮａｓｅ活性を持つＨｅＬａ細胞抽出物の調製
２′,５′−テトラアデニレート−ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体により細胞エンドヌクレアーゼＬの活性を刺激するためにＨｅＬａ細胞抽出物を調製した。この目的で、３５のびんに各々DulboccoのＭＥＭ（最低必須培地）及び１０％ＦＣＳ（うし胎児血清）を含有する培地２０mlを入れた。トリプシン処理の後細胞を採取することができる。１,０００rpmの遠心分離の後細胞採取物４mlを得る。このものを初めに水４mlで調整し、３分後、細胞を分解するためにバッファーＡ（ＨＥＰＥＳ ５.４８ｇ；ＫＣｌ １５.５ｇ；Ｍｇアセテート２.４８８ｇ；２−メルカプトエタノール１,２３２μｌ、水で１リットルに）４mlを添加する。次にこの溶液を、超遠心機中０℃において３０分間３０,０００rpm（約１００,０００ｇ）で遠心分離する。細胞抽出物８mlからの上清を取り出し、次の研究のため−２０℃において貯蔵する。
【０１２７】
実施例４８
ＲＮａｓｅ Ｌの活性化の研究
エンドヌクレアーゼについてこの抽出物の研究のために、初めにＲＮＡ標的配列０.３０ Ｄを個々のＰＮＡ／ＤＮＡオリゴマーと８０℃において５分間加熱して後、ハイブリッド形成のため３７℃に冷却する。この二重鎖を抽出物２０μｌ、グリセロール１.２μｌ及びＲＮａｓｅ Ｌバッファーと混合し、３７℃においてインキュベートする。そのとき全容量は７０μｌである。動力学研究のために、０、２０及び６０分の時間のピペットによって試料を取り出し、９５℃において５分間加熱して酵素を変性させる。試料をSpccdvac中凍結乾燥し、ゲル電気泳動によって分析する。ＰＮＡ−２′,５′−テトラアデニレート複合体及びテトラコルジセピン類縁体は細胞ＲＮａｓｅを活性化するが、テトラアデニレート部分のない対応する化合物はＲＮａｓｅを刺激しない。
【０１２８】
実施例４９
ＤＮＡポリメラーゼ反応
ＤＮＡポリメラーゼ反応のための鋳型として次の８１量体オリゴデオキシヌクレオチドを使用する：
5′-GCC CCA GGG AGA AGG CAA CTG GAC CGA AGG CGC TTG TGG AGA AGG AGT TCA TAG CTG GGC TCC CTA TAG TGA GTC GTA TTA-3′
ＰＮＡ／ＤＮＡプライマーの配列は次のとおりである：
H-taa tac gac tca cta(5NH-T)-OH-3′
配列5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3′の対応するオリゴデオキシヌクレオチドを対照プライマーとして使用する。１０×ＰＣＲバッファー（５００ｍ ＫＣｌ，１００mMトリス−ＨＣｌ，pH９，１％トライトンＸ−１００，１５mM ＭｇＣｌ2）５μｌ中プライマー（０.１５ｎモル）及び鋳型（０.１５ｎモル）を水３５μｌで希釈し、９５℃に加熱しそして冷却することによってハイブリッド形成させる。次に２mM ｄＮＴＰ混合物（ヌクレオシド５′−トリホスフェート１０μｌ及びＤＮＡポリメラーゼ（Klenow画分）３μｌを添加し、この混合物を２２℃及び３７℃において各々０.５時間インキュベートする。次に反応溶液を１０％ポリアクリルアミドゲル（１％ビスと共に）上分析する。ｐＢＲ３２２／ＨａｅIII消化物をマーカーとして負荷する。対照プライマーとの反応は、マーカーに対して予期された大きさを持つ二重鎖ＤＮＡフラグメントを示すが、ＰＮＡ／ＤＮＡプライマーからの生成物は、いくらか早く移動する。両方の場合共ゲル電気泳動において二重鎖は鋳型一重鎖よりかなり早く移動する。