(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血の赤血球中のフォスファチジルセリンとフォスファチジルイノシトールの総量、及びフォスファチジルコリン量を測定し、それぞれのいずれか少なくとも一つの値が、正常値より低い場合を非アルコール性脂肪肝炎とすることを特徴とする非アルコール性脂肪肝炎の鑑別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリン脂質、リン脂質の脂肪酸組成を指標にした非アルコール性脂肪肝炎の鑑別法、リン脂質とその脂肪酸組成を指標にした非アルコール性脂肪肝炎治療薬の探索方法、並びに非アルコール性脂肪肝炎の治療薬に関する。【０００２】
（発明の背景）
食生活等、ライフスタイルの変化は肥満、糖尿病、高脂血症といった生活習慣病を増加させている。これら生活習慣病とその予備軍では脂肪肝が認められ、その頻度は約２０％と想定されている。これまで、非アルコール性の脂肪肝は予後が良好な疾患とされてきたが、近年、２−３％の頻度で肝実質への脂肪沈着とともに炎症性細胞の浸潤  肝実質の障害、線維化を介して肝硬変に至る非アルコール性脂肪肝炎（non-alcoholic  steatohepatitis：以下NASHと言う）の存在が明らかになってきた（非特許文献１）。本疾患はウイルス性、自己免疫性の肝疾患を除外したものであり、アルコール性肝疾患と類似の肝組織学的変化をとることを特徴にするが、通常の脂肪肝から肝障害、線維化に進展するかその原因であり問題視されている。これまでの報告からレプチン、TNF-αと言ったサイトカイン、過酸化脂質、遊離脂肪酸の関与が示唆されている。一方で、近年、NASHの背景にあるインスリン抵抗性、脂肪肝の発症には遊離脂肪酸増加が関与していること、特定の脂質が、細胞傷害性を持つこと、免疫系のT細胞受容体やG蛋白質共役型受容体（GPCR）のリガンドになることが報告されている。さらにミトコンドリアに多量に存在する脂質カルジオリピンの脂肪酸組成変化が電子伝達系の分子のエネルギー交換効率に影響を与えていることが知られている。特定の脂肪酸、複合脂質の脂肪酸組成変化は肝実質細胞障害の増加、炎症反応の惹起、ミトコンドリア機能の低下を介してNASHの原因となる可能性が高い。NASHは２つのステップを経て発症すると想定されている（2hit  theory）。（非特許文献２）まず、高インスリン血症等でtriacylglcyeride代謝に変調が生じて脂肪肝が発生する（1st  hit）がその状態に何らかの2nd  hitが加わることにより炎症反応の惹起、ミトコンドリア機能の低下、細胞の変性、線維化が生じると考えられている。しかし、2nd  hitについては酸化ストレス、脂肪酸の直接毒性、エンドトキシンが候補として挙げられているがその本体は不明である。
なお、NASHの背景因子である高インスリン、肥満では、赤血球のレオロジー変化や形態変化の視点から膜脂質成分に関するYounsi Mらの解析報告が知られている（非特許文献３）。しかし、NASH症例での脂肪酸組成の変化については報告があるが、脂質の機能単位である複合脂質毎の脂肪酸組成の比較解析は皆無であり、NASHの治療薬の探索手法につながる情報を得ることは困難であった。【０００３】
現在、NASHと脂肪肝の間の確定診断は肝生検であり、負担、リスクが高くルーチンには実施できない。早期に、NASHを診断し運動療法、栄養療法を開始するために末梢血等を用いた簡便なNASH鑑別方法が切望されている。NASH患者の末梢血で特異的に変動する脂質  脂質脂肪酸組成が発見できれば簡便な検査法として広く適用可能である。【０００４】
【非特許文献１】Gastroenterology  121;710-723
【非特許文献２】Gastroenterology  114：842-845
【非特許文献３】Metabolism  51:1261-1268
【非特許文献４】Am J Gastroenterol.;94(9):2467-74. （1999）
【発明の開示】
【０００５】
本発明の課題はNASH患者において特異的に出現する脂質、脂質の組成変動を利用した、NASH治療薬の評価方法と末梢血を利用したNASHの鑑別方法と治療薬剤の創出である。
NASHの原因は不明であり動物モデルが存在しないことから、本発明者は組織学的にNASHと判断できた（非特許文献４）患者２例と健常人４例で空腹時に採血を実施し、血漿と血球に分画し血漿中の各種脂質並びにその脂肪酸組成の変動を測定したところ、NASH患者では健常人に比べて顕著な血球中のフォスファチジルセリン/フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルコリン量の低下を見出した。さらにNASH患者では血球カルジオリピン中の脂肪酸における16:00,18:1n9、20:3n3の比率増加、22:5n3、22:6n3、20:4n6の比率減少が認められた。また同様の傾向が血球フォスファチジルコリンと血漿中ジアシルグリセライドでも観察され、この知見に基づいて本発明を完成するに到った。すなわち、本発明は末梢血を利用したNASHの鑑別方法、NASH治療薬の評価方法並びにＮＡＳＨ治療薬剤を提供する。
【０００６】
本発明は、末梢血のリン脂質及び/又はその脂肪酸組成を測定することを特徴とする非アルコール性脂肪肝炎の鑑別方法である。この発明において末梢血中のフォスファチジルセリン/フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルコリン量を測定し、それぞれのいずれか少なくとも一つの値が、正常値より低い場合を非アルコール性脂肪肝炎とする鑑別方法、またこの発明において末梢血が血球成分である鑑別方法である。
また本発明は、末梢血血球中のカルジオリピンにおける16:00、18:1n9、20:3n3脂肪酸いずれか一つの正常値に比べた増加を指標とするか、22:5n3、22:6n3、20:4n6脂肪酸のいずれか一つの正常値に比べたその低下を指標とする非アルコール性脂肪肝炎鑑別方法である。
【０００７】
また本発明は、末梢血血球中のフォスファチジルコリンにおける16:00、18:1n9、20:3n3脂肪酸いずれか一つの正常値に比べた増加を指標とするか、22:5n3、22:6n3、20:4n6脂肪酸いずれか一つの正常値に比べてのその低下を指標とする非アルコール性脂肪肝炎鑑別方法である。
また本発明は、血漿中のジアシルグリセライドにおける16:00、18:1n9、20:3n3脂肪酸いずれか少なくとも一つの正常値に比べてのその増加を指標とするか、20:5n3、22:6n3、20:4n6脂肪酸いずれか一つの正常値に比べてのその低下を指標とする非アルコール性脂肪肝炎鑑別方法である。なお、上記鑑別方法の少なくとも１つ以上を他の鑑別方法と組み合わせること特徴とすることもできる。
また発明は、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、マススペクトルグラフィーのいずれかを組み合わせ、患者末梢血サンプルからフォスファチジルセリン/フォスファチジルイノシトールもしくはフォスファチジルコリン量の正常値よりの低下、又はカルジオリピン、フォスファチジルコリン、ジアシルグリセライドの多価不飽和脂肪酸組成の16:00,18:1n9、20:3n3の脂肪酸組成の正常値に比較した増加、もしくは22:5n3、20:5n3、22:6n3、20:4n6の正常値に比較した低下を検出する非アルコール性脂肪肝炎診断臨床検査装置である。
【０００８】
また本発明は、被験薬を生体内投与により末梢血血球、血漿のフォスファチジルセリン/フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルコリン量、カルジオリピンの16:00、18:1n9、20:3n3、22:5n3、22:6n3、20:4n6の脂肪酸組成、フォスファチジルコリンの16:00、18:1n9、20:3n3、22:5n3、22:6n3、20:4n6の脂肪酸組成、ジアシルグリセライドの16:00、18:1n9、20:3n3、20:5n3、22:6n3、20:4n6の異常値の少なくとも１つ以上を正常値に回復させるものを選択することを特徴とする治療薬剤（好ましくは非アルコール性脂肪肝炎治療薬剤）の探索方法である。
ここで、フォスファチジルセリン/フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルコリンの合成と分解に関与する酵素の活性を指標にするのが好ましい。また、哺乳類細胞培養系でフォスファチジルセリン/フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルコリンの合成と分解に関与する酵素の変化を指標とするのが好ましい。また、哺乳類細胞培養系でフォスファチジルセリン/フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルコリンの合成と分解に関与する酵素の遺伝子発現変化を指標とするのが好ましい。また、複合脂質のアシル化交換反応に関わる酵素の活性を指標とするのが好ましい。又、カルジオリピン、フォスファチジルコリン、ジアシルグリセライドのアシル化交換反応に関わる酵素の活性を指標とするのが好ましい。
【０００９】
また本発明は、上記探索方法を用いて陽性と判断された、ホルモン、生態由来低分子蛋白、既存低分子薬剤、低分子化合物のいずれかの化合物を有効成分とする非アルコール性脂肪肝炎治療薬剤である。
また本発明は、生体内投与により末梢血血球、血漿のフォスファチジルセリン/フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルコリン量、カルジオリピンの16:00,18:1n9、20:3n3、22:5n3、22:6n3、20:4n6の脂肪酸組成、フォスファチジルコリンの16:00,18:1n9、203n3、22:5n3、22:6n3、20:4n6の脂肪酸組成、ジアシルグリセライドの16:00,18:1n9、20:3n3、20:5n3、22:6n3、20:4n6の異常値の少なくとも１つ以上を正常値に回復させる機能を有する化合物を有効成分とする非アルコール性脂肪肝炎治療薬剤である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の鑑別方法等に用いる末梢血のリン脂質とは、フォスファチジルセリン（Phosphatidylserine）、フォスファチジルイノシトール（Phosphatidylinositol）、フォスファチジルコリン（Phosphatidylcholine）、リゾフォスファチジルコリン（Lysophosphatidylcholine）、フォスファチジルエタノールアミン（Phosphatidylethanolamine）、スフィンゴミエリン(Sphingomyeline)、カルジオリピン（Cardiolipin）等の公知のものであり、現時点では測定方法が確立されたものをもっぱら本発明において用いるが、今後測定法方が確立されるものも含まれる。好ましいものとしてフォスファチジルセリンとフォスファチジルイノシトールを併せたもの（Phosphatidylserine/Inositol；つまり混合系）、フォスファチジルコリン、カルジオリピンがあげられる。上記のようにこれら末梢血のリン脂質の測定は、既に確立されたものを用いることができる。【００１１】
本発明の鑑別方法等に用いる末梢血のリン脂質における脂肪酸としては、リン脂質を構成する末梢種々の飽和、不飽和の脂肪酸（脂肪酸残基を脂肪酸として考える）が上げられる。また、これら脂肪酸の測定法も既に測定方法が確立されたものをもっぱら本発明において用いるが、今後測定法方が確立されるものも含まれる。対象とする脂肪酸としては例えばカルジオリピンの16:00、18:1n9、20:3n3、22:5n3、22:6n3、20:4n6の脂肪酸、フォスファチジルコリンの16:00、18:1n9、20:3n3、22:5n3、22:6n3、20:4n6の脂肪酸、ジアシルグリセライドの16:00、18:1n9、20:3n3、20:5n3、22:6n3、20:4n6の脂肪酸が上げられる。【００１２】
本発明の鑑別方法においては、上記リン脂質、及びもしくはこれらリン脂質における脂肪酸または末梢血中の脂肪酸を測定し、健常人（Normal）の値（正常値）との比較をするか、もしくは変化を評価することで鑑別する事ができる。
例えば、末梢血のリン脂質であるフォスファチジルセリンとフォスファチジルイノシトールの併せたもの（Phosphatidylserine/Inositol）及びフォスファチジルコリンを指標とした場合、正常値より低い場合がＮＡＳＨ患者と鑑定できる。この場合、全血を用いるより血球成分を用いる事が好ましい。
また、末梢血血球中のリン脂質であるカルジオリピンを指標とした場合、カルジオリピン中の16:00,18:1n9、20:3n3脂肪酸を測定しいずれかの値が正常値に比べた増加した場合、もしくはカルジオリピン中の22:5n3、22:6n3、20:4n6脂肪酸を測定しいずれかの値が正常値に比べて低下したにＮＡＳＨ患者と鑑定できる。
また、末梢血血球中のリン脂質であるフォスファチジルコリンを指標とした場合、フォスファチジルコリン中の16:00,18:1n9、20:3n3脂肪酸を測定しいずれかの値が正常値に比べた増加した場合、もしくはフォスファチジルコリン中の22:5n3、22:6n3、20:4n6脂肪酸を測定しいずれかの値が正常値に比べて低下したにＮＡＳＨ患者と鑑定できる。
また、末梢血血球中のリン脂質であるジアシルグリセリドを指標とした場合、ジアシルグリセリド中の16:00、18:1n9、20:3n3脂肪酸を測定しいずれかの値が正常値に比べた増加した場合、もしくはジアシルグリセリド中の20:5n3、22:6n3、20:4n6脂肪酸を測定しいずれかの値が正常値に比べて低下したにＮＡＳＨ患者と鑑定できる。
なお本発明においていずれかの鑑定方法を適宜組み合わせても構わない。
非アルコール性脂肪肝炎診断臨床検査装置は、上記の鑑定方法と公知の薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、マススペクトルグラフィーのいずれかを組み合わせ、患者末梢血サンプルから得られた全血、又は血球成分におけるフォスファチジルセリン/フォスファチジルイノシトールもしくはフォスファチジルコリン量の正常値よりの低下をあらかじめ得た健常人データーと比較したり、カルジオリピン、フォスファチジルコリン、ジアシルグリセライドの多価不飽和脂肪酸組成（脂質組成）の変動を測定し、これらの解析をコンピュータープログラム上で実施できる自動化した装置である。上記装置は公知の技術を組み合わせる事により製造できる。【００１３】
また本発明のＮＡＳＨ治療薬剤の探索方法は、上記鑑別方法により上記のリン脂質もしくは脂肪酸組成を変化する化合物をスクリーニングにより選別する事により達成する事ができる。例えば哺乳類細胞培養系で上記指標の変化を観察し、異常値の少なくとも１つ以上を正常値に回復させるものを探索すればよいが、例としてカルジオリピン、フォスファチジルコリン、ジアシルグリセライドのアシル化交換反応に関わる酵素の活性を指標として探索する事ができる。
この他の探索方法としては生体内投与により末梢血血球、血漿のフォスファチジルセリン/フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルコリン量、カルジオリピンの16:00,18:1n9、20:3n3、22:5n3、22:6n3、20:4n6の脂肪酸組成、フォスファチジルコリンの16:00,18:1n9、203n3、22:5n3、22:6n3、20:4n6の脂肪酸組成、ジアシルグリセライドの16:00,18:1n9、20:3n3、20:5n3、22:6n3、20:4n6の異常値の少なくとも１つ以上を正常値に回復させる機能の化合物をスクリーニングする事により目的の化合物を得る事ができる。
具体的には、哺乳類（人もしくはラットが望ましい）肝実質細胞を一般的な手法で24穴プレートで培養し各種薬物を添加し24時間培養し、培養終了後細胞膜のフォスファチジルセリン/フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルコリン量、さらにフォスファチジルセリン/フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルコリン、カルジオリピンの22:5n3、22:6n3、20:4n6を指標に目的の化合物（薬物）を選択することが可能である。
上記において同様の培養系で、培養終了後、肝実質細胞からRNAを抽出し、delta-5 デサチュラーゼ、delta-6 デサチュラーゼ、 エロンガーゼ、 オキシダーゼ、 アシル基転移酵素の発現量を指標に薬物をスクリーニングすることが可能である。具体的にはRT-PCRの一般的手法を用いてdelta-5 デサチュラーゼ、delta-6 デサチュラーゼ、 エロンガーゼ、 オキシダーゼ、lecithin:cholesterol acyltransferase、 lecithin retinol acyltransferase、 sn-glycerol 3- phosphate acyltransferase、 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase、 phosphocholine cytidylyltransferase、 phoshplipase A1、A2 などの遺伝子発現の変動を指標にすることができる。【００１４】
これらの探索方法により得られるＮＡＳＨ治療薬剤は例えばホルモン、生態由来低分子蛋白、既存低分子薬剤、低分子化合物が上げられる。
これらのＮＡＳＨ治療薬剤は病状に応じて適宜、用量、投与方法、剤形等を組み合わせて投与する事ができる。ここで剤形については公知技術を組み合わせて適宜決める事ができる。
またこれらの薬剤を他のNASHに治療効果がある薬剤、たとえばウルソデオキシコーリックアシヅド、ベタイン、メトホルミン、グリタゾン、フィブレート類、ビタミン類、抗酸化剤、抗炎症剤、抗糖尿病薬、高脂血症薬、抗肥満薬などと組み合わせて使うことが可能である。投与量として特に定めはないが、有効成分として１ｕｇから１００ｇを含有した薬剤の形態で与えれば良い。
本発明は、NASH患者の鑑別方法、鑑別装置、NASH治療薬の評価方法並びNASHの治療薬剤を提供する。
【実施例】
【００１５】
実施例１  NASHの脂質・脂肪酸解析方法
健常人4例とBrunt  E.M.らの報告（非特許文献４）に基づき肝生検によりNASHと確定診断した患者2例を対象とした。空腹時にEDTA入り試験管を用いて腕静脈から5ml採血した。試験管をよく攪拌後、赤血球（RBC）数を測定した。その後遠心分離（3000rpm、室温、5分）し、血漿を回収した。血漿は解析まで−80℃に凍結し保存した。チューブに残ったRBCのpelletは生理食塩水（EDTA入り）にてよく洗浄し、RBC１x109個分をはかりとり遠心分離（3000rpm、室温、5分）を行いRBCのpelletを得た。RBCは解析まで−80℃に凍結し保存した。血漿、RBCの脂質はFolchの方法にて抽出した。各脂質はまず薄層クロマトグラフィーにて展開した。脂質のSPOTをそれぞれ回収し３Nのメタノール／塩酸で窒素ガス封入下、100℃で４５分処理した。遊離した脂肪酸メチルエステルは０．０５％のbutylated  hydroxytoluene含有ヘキサンを用いて窒素ガス下で抽出した。脂肪酸メチルエステルはガスクロマトグラフィーで分離しFlame-ionization  detectorで各脂肪酸メチルエステル標品をもとに定量した。
結果を表１及び表２に示す。表から明らかなようにNASH患者では血球中のフォスファチジルセリン/フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルコリン量の低下が認められた。NASH患者では血球中カルジオリピンの16:00、18:1n9、20:3n3の増加、22:5n3、22:6n3、20:4n6の減少が認められた。同様の傾向が赤血球フォスファチジルコリンと血漿中ジアシルグリセライドでも観察されたことからこれらの指標を元にＮＡＳＨ患者の鑑別が可能となった。【００１６】
【表１】
0004682980.tif 000002
【００１７】
【表２】
0004682980.tif 000003
【００１８】
本発明の鑑別方法、鑑別装置により、ＮＡＳＨ患者の鑑別が可能となり、また本発明のＮＡＳＨ治療薬の探索方法により、ＮＡＳＨ治療薬の探索が可能となり有用である。