(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
- CNCMに1999年2月24日に寄託された番号I-2130のエス・テルモフィラスS242株；
- CNCMに1999年2月24日に寄託された番号I-2129のエス・テルモフィラスS003株；
- CNCMに1999年2月24日に寄託された番号I-2131のエル・ガッセリL012株；
- CNCMに1999年2月24日に寄託された番号I-2132のエル・アシドフィルスL030株
から選択される少なくとも１つの乳酸菌株を培養することを含んでなる非鎮静性の抗不安剤の製造方法。
【請求項２】
非鎮静性の抗不安剤の製造に使用できる、
- CNCMに1999年2月24日に寄託された番号I-2130のエス・テルモフィラスS242株；
- CNCMに1999年2月24日に寄託された番号I-2129のエス・テルモフィラスS003株；
- CNCMに1999年2月24日に寄託された番号I-2131のエル・ガッセリL012株；
- CNCMに1999年2月24日に寄託された番号I-2132のエル・アシドフィルスL030株から選択される乳酸菌株。
【請求項３】
S242株及びS003株から選択される少なくとも１つのストレプトコッカス・テルモフィラス株を、1994年12月30日にCNCMに寄託された番号I-1520のエス・テルモフィラスS147株と組合わせることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
CNCMに1999年2月24日に寄託された番号I-2130のS242株及びCNCMに1999年2月24日に寄託された番号I-2129のS003株から選択される少なくとも１つのエス・テルモフィラス株を含んでなる乳酸発酵体。
【請求項５】
さらに、CNCMに1994年12月30日に寄託された番号I-1520のエス・テルモフィラスS147株を含んでなる請求項４に記載の乳酸発酵体。
【請求項６】
さらに、
- CNCMに1999年2月24日に寄託された番号I-2131のエル・ガッセリL012株；
- CNCMに1999年2月24日に寄託された番号I-2132のエル・アシドフィルスL030株
からなる群から選択される少なくとも１つの乳酸菌株を含んでなることを特徴とする、請求項４及び５のいずれかに記載の乳酸発酵体。
【請求項７】
請求項２に記載の少なくとも１つの乳酸菌株の培養物、又は請求項４〜６のいずれか１つに記載される乳酸発酵体の培養物から得ることができる非鎮静性の抗不安剤。
【請求項８】
請求項７に記載の非鎮静性抗不安剤を含んでなる食品又は補助食品。
【請求項９】
請求項２に記載の少なくとも１つの乳酸菌株、又は請求項４〜６のいずれか１つに記載の乳酸発酵体を用いてミルク又はミルクベースの培養基を発酵して得ることができることを特徴とする、請求項８に記載の食品又は補助食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、乳酸発酵の新規な株及び抗不安特性を付与された食品を製造するためのその使用に関する。
【０００２】
外部攻撃に対する身体の防御反応であるストレスは、特に神経系レベルで、生物学的混乱を引起こし、種々の病状を発現させる。これは、特に不安というかたちの心理学的レベルで直接現れ、かつ/又は高血圧、胃潰瘍などのように身体に現れるかたちをとる。それらは、頻繁に慢性症状に進行する。
ストレスの因果関係を治療するために、不安又は身体性の発現を伴うかどうかに関わらず、抗不安剤、特にベンゾジアゼピンがたびたび用いられている。しかし、これらの薬剤は迅速に嗜癖現象をもたらし、長期間の治療には適していないおそれがある。さらに、それらの抗不安作用は、特に、望ましくない副作用を引起こし得る鎮静特性を伴う。
【０００３】
ストレスに関連した病状に対する薬理学的な性質があると考えられる物質がミルクやミルク製品中に存在することが、幾つかの調査研究により明らかにされている。特に、CALPIS CO. AND GROUPE DANONE 名義のPCT出願WO 98/05343は、抗高血圧効果によって現れる抗ストレス性を有する剤を記載している。この剤は、ラクトバシラス属の乳酸菌、特にラクトバシラス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)を用いてミルクを発酵させて得られる。それは殺菌に耐性であり、通常の食餌環境で規則的かつ長期間使用できるストレスの末梢(体性)作用の予防及び/又は治療に関わる食品を製造するのに用いることができる。この剤の投与により生じる中枢的な効果、特に抗不安効果は、PCT出願WO 98/05343では立証されていない。
SOCIETE COOPERATIVE LAITIERE AGRICOLE D'ARTOIS ET DES FLANDRES, LA PROSPERITE FERMIERE名義のEP出願 95402697は、カゼインαs1のトリプシン加水分解によって生じるデカペプチドを記載している。このデカペプチド又はそれからなるトリプシン加水分解物の非経口投与は、ベンゾジアゼピンによるのと同じタイプの抗不安効果及び抗痙攣効果を誘発する。他方、この明細書は、経口で投与した場合のこの加水分解物の活性、及び抗ストレス特性を食品に付与するために加水分解物を食品に導入する可能性に関する情報を示していない。
【０００４】
ここに、発明者らは、ある乳酸菌株によって発酵された乳製品には、経口投与される際に、ベンゾジアゼピンの鎮静特性を有さずに抗不安型の抗ストレス効果を誘発し得る1以上の有効成分が存在することを立証した。
また、この発明の対象は、非鎮静性の抗不安剤を製造するための、新たに単離されかつ特徴付けられた上記の少なくとも1つの乳酸菌株の使用である。
この発明の対象は、
-  ブダペスト条約にしたがってCNCM (Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Parisに1999年2月24日に寄託された番号I-2130のストレプトコッカス・テルモフィラス(Streptococcus thermophilus) S242株;
-  ブダペスト条約にしたがってCNCM (Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Parisに1999年2月24日に寄託された番号I-2129のストレプトコッカス・テルモフィラス S003株;
-  ブダペスト条約にしたがってCNCM (Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Parisに1999年2月24日に寄託された番号I-2131のラクトバシラス・ガッセリ(Lactobacillus gasseri) L012株;
-  ブダペスト条約にしたがってCNCM (Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Parisに1999年2月24日に寄託された番号I-2132のラクトバシラス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus) L030株
からなる群から選択される乳酸菌株である。
【０００５】
また、この発明の対象は、非鎮静性の抗不安剤の製造に使用できる、新たに単離されかつ特徴付けられた上記乳酸菌株である。
この発明による乳酸菌株の特徴を以下の表１及び２に要約する。
【０００６】
【表１】
0004688298.tif 000002
【０００７】
【表２】
0004688298.tif 000003
【０００８】
この発明は、特に、S242株及びS003株から選択される少なくとも1つのストレプトコッカス・テルモフィラス株を、1994年12月30日にCNCMに寄託された番号 I-1520のエス・テルモフィラスS147株と組合わせた、非鎮静性の抗不安剤を製造するための使用に関する。
また、この発明は、本発明による少なくとも1つの株を、別の乳酸菌株と有利に組合わせることからなる乳酸発酵体(lactic ferment)に関する。
この発明による乳酸発酵体の好ましい具体例によれば、発酵体は、エス・テルモフィラスS147 株と有利に組合わさった、テルモフィラスS242株及び/又はエス・テルモフィラスS003株から少なくともなる。
この発明の対象は、上記のこの発明による少なくとも1つの乳酸菌株からなるか、又は該株の培養物から得られる非鎮静性の抗不安剤でもある。
【０００９】
この発明による非鎮静性の抗不安剤を製造するために、この発明による少なくとも1つの乳酸菌株が培養される。特に、エス・テルモフィラスS147株、及び任意のエル・ガッセリL012株及び/又はエル・アシドフィルスL030株と有利に組合わせたエス・テルモフィラスS424株及び/又はエス・テルモフィラスS003株から少なくともなる乳酸発酵体が、適当な媒体、つまり菌を成長させる少なくとも1つの基質からなる媒体で培養される。培養媒体は、ミルク又はミルクベースの媒体であることが好ましい。それは、特に、任意に半脱脂されているか、脱脂されている様々な種類の哺乳動物のミルク、例えばダイアフィルトレーション保持物質の限外ろ過物のような、これらのミルクの希釈物もしくは濃縮物から得られる製品、例えばミルクベースの食品用基体(base)、ヨーグルト用基体のようなミルクベースの媒体などから選択することができる。これらのミルクには、例えばラクトース、ミネラル、ビタミン、脂肪基質、あるいは親水性のミルク固形物、大豆タンパク質、植物抽出物などをさらに補充してもよい。
【００１０】
この媒体は、好ましくは107〜109菌/mlからなる、この発明による少なくとも1つの乳酸菌株からなる培養物で接種される。最適な培養条件は、関与する株又は株の混合物に応じて変化する。例えば、接種用の培養物がストレプトコッカス・テルモフィラスの株又は株の混合物からなる場合、培養は約24時間行われ、最適培養温度は30〜44℃であろう。接種用の培養物が、エル・アシドフィルス又はエル・ガッセリの株又は株の混合物からなる場合、培養は約16時間行われ、最適培養温度は37〜44℃であろう。接種用の培養物が少なくとも1つのストレプトコッカス・テルモフィラス株を少なくとも1つの エル・アシドフィルス又はエル・ガッセリ株と組合わせている場合、培養は16〜24 h行われ、最適培養温度は37〜44℃であろう。
こうして得られる菌の培養物は、この発明による非鎮静性の抗不安特性を有する。
【００１１】
この発明による非鎮静性の抗不安剤は、経口で投与した場合に活性である。これを規則的に投与することにより、数日後には活性を低下することなく、不安の解消がもたらされる。それは、嗜癖作用なしに、望ましくない副作用を現わすことなく、極めて長期間にわたって継続することができる。これらの特性、ならびに食品産業に通常使用される種に属する微生物及び食餌の使用にも意図される生の材料から得られるという事実により、それらは、食品又は補助食品(dietary supplement)の製造に関連して使用することができる。これを消費することによって、ストレスに関連した病状の治療又は予防の環境で、有用な作用が発揮される。
この発明の対象は、この発明による非鎮静性の抗不安剤からなる食品又は補助食品でもある。
【００１２】
これらの食品は、特にこの発明による少なくとも1つの乳酸菌株又は乳酸発酵体からなる製品であってもよい。それらは、特にミルク又はミルクベースの媒体を該発酵株で発酵させて得られる製品である。この発明による食品は、発酵されるいずれかの食品、又はこの発明による非鎮静性の抗不安剤からなる調製物に加えて製造してもよい。
全体群(この発明による1以上の菌株からなっていてもよい)が少なくとも105 CFU/mlのこの発明による乳酸菌を含む発酵乳の場合、本発明による食品の有用な作用は、一般に5 ml/日/体重kgの用量から現れ始める。しかし、実質的には、有害な副作用なしにより多量の用量を摂取することができる。
【００１３】
この発明は、この発明にしたがって得られる発酵乳製品の抗不安特性を例示する非限定的な実施例に言及する以下の追加的な記載により、さらに明らかに理解されるであろう。
実施例 1: 種々の試験乳製品の製造
以下の種々の実験に用いた株及び発酵体は、以下のとおりである:
-  エス・テルモフィラスS242 株
-  エス・テルモフィラスS147 株
-  エス・テルモフィラスS003 株
-  発酵体F042 (エス・テルモフィラスの3株S242、S147、S003を組合わせた発酵体)
-  エル・ガッセリL012 株
-  エル・アシドフィルスL030株。
【００１４】
製品の製造:
脂肪0%を含むUHTミルクを95℃で10分処理し、次いで発酵温度に応じて37℃又は44℃に冷却し、用いた株の活性な培養物で接種し、所望の調製物を得る。
個々に用いたエス・テルモフィラスS242、S147及びS003株での接種を、酵母自己溶解物を補充した殺菌ミルク 108〜109 CFU/mlを含む培養物について1% (v/v)の割合で行う(44℃で3h)。
発酵S042での接種は、108〜109 CFU/mlのS242、S147及びS003株の凍結濃縮混合物について30 g/100 lの割合で行う。培養は、44℃で行う。pHが約4.5に達したら、調製物を4℃に移し、使用中この温度で保存する。
個別の株によって発酵される製品中の発酵終了時の菌数は、ストレプトコッカス・テルモフィラス S242: 1.2×109 CFU/ml; ストレプトコッカス・テルモフィラス S147: 1.8×109 CFU/ml; ストレプトコッカス・テルモフィラス S003: 1.3×107 CFU/mlである。
【００１５】
F042混合物によって発酵される製品において、ストレプトコッカス・テルモフィラス(S242＋S147＋S003)濃度は、1.9×108 CFU/mlである。
エル・アシドフィルスL012及びL030株での接種は、中性のMRS培地に108〜109 CFU/mlを含む培養物について 3% (v/v)の割合で行われる(37℃で16 h)。培養は37℃で行う。pHが4.5〜5.9の値に達したら、調製物を4℃に移し、使用中この温度で保存する。
発酵体F042で発酵したミルクのろ過したホエーを、発酵乳500 mlを10 000 rpm (Sorval RC5B遠心分離、GSAローター)で15分2回遠心分離し、次いでセルロースニトレート製のNALGENEろ紙(HIGH-BINDING PROTEIN) 0.45μm、次いで0.22μmで上清をろ過して調製する。
【００１６】
実施例2: 3つの好熱性連鎖球菌の混合物に関する抗不安効果の評価
試験した生成物は以下のとおりである:
3S:  発酵体F042(3つの エス・テルモフィラスS242、S147、S003からなる)によって発酵したミルク
3S＋P:  発酵体F042＋トケイソウによって発酵したミルク
3ST:  発酵体F042により発酵し、次いで100バールでの均質化で30秒間73℃で熱処理(thermize)したミルク
L:  30秒130℃で殺菌した対照のミルク
抗不安効果は、J. P. PINEL 及び D. TREITによる手法 (PINEL及びTREIT, J. Comp. & Physiol. Psychol., 92, 708-712, 1978; TREITら、Pharmacol. Biochem. Behav., 15, 619-626, 1981)から開発した、条件付の防御隠蔽モデル(Conditioned Defensive Burying model)を用いて評価する。このモデルは、刺激ストレスの多い源から身を隠す、大部分のげっし目動物の自然な性質を用いている(TREIT, Pharmacol. Biochem. Behav., 22, 1, 47-52, 1985; MEERT 及びCOLPAERT, Psychopharmacology, 88, 445-450, 1986; CRAFTら、Pharmacol. Biochem. Behav., 30, 3, 775-780, 1988; TREIT, Pharmacol. Biochem. Behav., 36, 203-205, 1990)。
【００１７】
動  物
体重320〜340gのSPFウィスター/AFオスラット(IFFA-CREDO 繁殖センター、69 - St-Germain sur l'Arbresle, France)を72匹用いた。最初にラットを量り、印をつけ、F型ポリカーボネートケージ(48×27×20 cm, U.A.R., 91 - Epinay-Sur-Orge, France)で4群に分けた。22〜24℃の温度で空調した動物小屋に動物を入れた。ラットは、食料(M25ビスケット、Ets PIETREMENT, 77 - Provins, France)と飲料を自由に利用できた。ラットを12時間の光-暗所サイクルに付した(24 h〜12 h光)。
研究室条件で1週間慣らした後、72匹のラットを無作為に6群に分けた(n = 12)。種々の群のラットは全て同様に同一条件で扱った。
【００１８】
材  料
実験ケージ
底をおがくずで覆って厚さ5 cm以上にした44×28×18 cm寸法の透明なケージで慣れされ、試験した。側面の中央で、おがくずの2cm上のレベルに穴で電気プローブを接着させる。
電気プローブ
それは、寸法が7×2×0.5 cmのプレクシガラス製で、ワイヤー間の隙間が1 mmの銅プリント配線回路で被覆したプローブである。これは、ラットの肢の1つがプローブに載ったときにワイヤー間が簡単に接触し、それにより電流が流れるように選択した。
電気装置
プローブは、0〜8 mA の電気ショック発生を手動で誘発するように接続する (OPEN-SYSTEMS, 54 - Maxeville, France)。
一連の挙動の記録と評価
わずかに照明をした実験室で、ビデオカメラを1メートル離して組み立てたケージの前に置いた。カメラをビデオレコーダーとコントロールモニターに接続し、これらを電気ショック発生器の隣の部屋に置いた。
【００１９】
実験手法
実験は、二重盲デザイン(double blind design)にしたがって行った。
慣化
最初の試験の2日前のあいだ、ラットを動物小屋から実験室に移し、実験装置に先導して、電極不在下での扱いと装置のケージに慣れさせた。各群のラット4匹を20分装置に入れた。各群について慣化前におがくずを変え、5cmの均一な高さにならした。
【００２０】
実験
条件付の防御隠蔽試験は、暗所段階の最初の5時間に行う。その段階のあいだ、ラットはほぼ活性である。
電気プローブは、最初の試験の開始前にケージに挿入する。プローブと反対側の実験ケージにラットをそれぞれ入れる。
最初の試験のあいだ(試験1)、後肢を初めてプローブにのせている際に、強度の低い(2 mA)電気ショックを1回動物に加える。
電気ショックに続いて、各ラットの挙動を5分記録する。次の2つの試験(試験2及び3)のあいだ、不活性プローブ存在下の実験ケージに再度ラットを入れる。各ラットの後プローブを清潔にし、各ケージのラットについての試験期間前におがくずを変え、5 cmの均一な高さにならす。
【００２１】
生成物の投与
生成物L、3ST、3S及び3S＋Pは、胃内強制供与プローブを備えたシリンジ (HARVARD APPARATUS, 91 - Les Ulis, France)により5 ml/kgの用量で、毎日同時に経口投与した。隠蔽試験(第6日目に試験1及び第8日目に試験2)は、生成物の投与から6時間後に行った。
正の対照はジアゼパム(3 mg/kg)である。これは、1%でメチルセルロースの水溶液に懸濁し、同じ期間中に毎日経口投与した。試験の日には、隠蔽試験の1時間前にこれを投与した。
各ケージのラット4匹には、異なる生成物を与えた。
【００２２】
変  数
-  プローブについての隠蔽期間:ショック後の一連の身を隠す動作は、著しく一様である; ラットは電気プローブに対面し、後肢を迅速に交互に動かすことによって、その方向におがくずを送る;
-  プローブに関連した身もだえの動きの数: ラットはプローブから数センチメートルで止まり、首を伸ばして、鼻づらをプローブに近づける;
-  プローブへ接近した数: 3cm未満で離れているプローブ方向へのラットの頭部のあらゆる接近;
-  プローブに関連した跳躍の数:プローブへの接近又はそれとの接触に続くラットの慌しいあらゆる跳躍;
-  跳躍を伴うプローブへの接近の割合 = (跳躍数/接近数) × 100。
【００２３】
統計分析
データは、以下の変数についてオーダーを増して分類した: 隠蔽期間、身もだえの動きの数及び跳躍を伴う接近の割合。種々の変数内で、ランクは各データに帰しており、ランクの総数は各ラットの全体的なストレスのスコアとなる。
KRUSKAL-WALLIS試験は、群内の異類混交(heterogeneity)の存在を立証するために用いた。MANN-WHITNEY試験は、群DZP、3ST、3S及び3S＋Pを対照Lと比較するために行った。結果を、平均〜四分位数間偏差(低四分位数 − 上四分位数)として示す。
統計及びグラフの処理は、STATVIEW 4.1及び DELTAGRAPH PRO 3.5 ソフトウエアパッケージを用いて行った。
【００２４】
結  果
試験１の全体的なストレススコア
この試験結果を、図１に例証する。
図１の説明
L:    対照の殺菌ミルク
3ST:    発酵体 F042により発酵し、次いで熱処理したミルク
3S:    発酵体 F042により発酵したミルク
3S＋P:    発酵体F042 ＋ トケイソウで発酵したミルク
DZP:    ジアゼパム
Mann-Whitney試験:  * p＜ 0.05 vs. L, *** p＜ 0.005 vs. L 及び (T) 型(trend) vs. L (p＜ 0.07)
試験１のあいだ、生成物3Sと3S＋Pは、対照生成物 Lと比較して全体的なストレススコアを著しく低減する。
生成物3STは、対照の生成物Lとはあまり異ならない。ジアゼパムは、対照Lと比較して全体的なストレススコアを減少する傾向がある。
試験１のあいだ、ジアゼパムは別として、生成物は鎮静作用を示さなかった。
【００２５】
試験２の全体的なストレススコア
この試験結果を、図２に例証する。
図２の説明
L:    対照の殺菌ミルク
3ST:    発酵体 F042により発酵し、次いで熱処理したミルク
3S:    発酵体 F042により発酵したミルク
3S＋P:    発酵体F042 ＋ トケイソウで発酵したミルク
DZP:    ジアゼパム
Mann-Whitney試験 * p＜ 0.05 vs. L.
この試験のあいだ、生成物3Sと3S＋Pは、対照の生成物Lと比較して全体的なストレススコアを著しく減らす。
生成物3STとジアゼパムの作用は、生成物 Lとあまり異ならない。
【００２６】
結  論
試験１及び２のあいだ、生成物3Sと3S＋Pは、対照生成物 Lと比較して全体的なストレススコアを著しく減らす。生成物3STは、対照生成物と比較して、2つの試験のあいだストレスに対して活性を示さない。
試験1の6日前に3 mg/kg用量で 経口投与したジアゼパムは、対照と比較して全体的なストレススコアを減少する傾向を唯一示した。試験2のあいだ、それは、対照と統計的に異なる作用を示さない。これは、ベンゾジアゼピン群の生成物に特異的な常用癖現象である。
生成物3Sと3S＋Pは著しい抗ストレス活性を有するが、生成物3STの作用は対照の作用と異ならないことが結論付けられる。ジアゼパムを用いて認められた耐性の現象は、生成物3Sと3S＋Pでは認められない。これらの2つの生成物を用いると、鎮静の問題は現れなかった。
【００２７】
実施例 3: 種々の乳酸菌で発酵したミルクの抗不安作用
試験した生成物は、以下のとおりである:
SC008 1.1:   エス・テルモフィラスS242で発酵したミルク;
SC008 1.2:   エス・テルモフィラス S147で発酵したミルク;
3S:  発酵体 F042 (S242 ＋ S147 ＋ S003)で発酵したミルク;
SC008 1.5:  発酵体 F042で発酵したミルクのろ過したホエー;
L:  対照の殺菌ミルク(95℃ 10分);
SC008 1.8:      エル・ガッセリL012で発酵したミルク;
SC008 1.10:     エル・アシドフィルスL030で発酵したミルク;
SC008 1.12:     エス・テルモフィラスS003で発酵したミルク
試験は、体重260〜280gの158匹のSPF ウィスター/AF のオス(IFFA-CREDO繁殖センター、69 - St Germain sur Arbresles, France)について、実施例２に上記したプロトコルにしたがって行った。研究室条件で1週間慣らした後、ラットを無作為に13の処理群に分けた。種々の群のラットを同様に同一条件で扱った。
【００２８】
生成物の投与
生成物は全て、胃内強制供給プローブを備えたシリンジ(HARVARD APPARATUS, 91 - Les Ulis, France)を用いて用量5 ml/kgで同時に6日間毎日経口投与した。試験の日には、隠蔽試験の6時間前に生成物を投与した。
ジアゼパム(1日目と2日目に1 mg/kg、経口; 3及び4日目に2 mg/kg、経口ならびに5及び6日目に3 mg/kg、経口)を、1%でメチルセルロースの水溶液5ml容量に懸濁した。試験の日には、隠蔽試験の1時間前にそれを投与した。
干渉を避けるため、同じケージのラットには全て同じ生成物を与えた。
変  数
実施例2に上記した変数に加えて、鎮静作用に関し以下の変数を研究する:
-  身もだえの数: ラットは後肢で立って直立位置をとる;
-  ケージの一方から他方への通過の数。
【００２９】
結  果
全体的なストレススコア
生成物Lと比較すると、生成物SC008 1.1、3S、SC008 1.8、SC008 1.10、SC008 1.12及びジアゼパムは、全体的にかなり低いストレススコアを誘発する。
生成物SC008 1.2 とSC008 1.5により誘発されるストレススコアは、対照の生成物とあまり異ならない。結果を図３に示す。
図３の説明:
L:    対照の殺菌ミルク(95℃ 10分);
SC008 1.1:      エス・テルモフィラスS242で発酵したミルク;
SC008 1.2:      エス・テルモフィラスS147で発酵したミルク;
3S:     発酵体 F042 (S242 ＋ S147 ＋ S003)で発酵したミルク;
SC008 1.5:      発酵体 F042で発酵したミルクのろ過したホエー;
SC008 1.8:      エル・ガッセリL012で発酵したミルク;
SC008 1.10:     エル・アシドフィルスL030で発酵したミルク;
SC008 1.12:     エス・テルモフィラスS003で発酵したミルク;
DZP:      ジアゼパム
Mann-Whitney 試験:
*** p ＜ 0.005 vs.L.
【００３０】
生成物3S及びSC008 1.10の鎮静作用
対照生成物Lと比較した生成物3S 及び SC008 1.10の鎮静作用は、運動活性及び調査研究(exploratory)活性に基づいて評価する。
試験中の身もだえの数
異類混交は、生成物 3S、SC008 1.10 及び L を用いて得られる身もだえの数においてみとめられる(Kruskal-Wallis 試験: H(d.o.f. 2) = 6.170; p＜ 0.05)。生成物3Sは、対照生成物Lと比較して身もだえの数を有意に増す(Mann-Whitney 試験: U = 65; p＜ 0.05)。生成物 SC008 1.10は、対照生成物Lと比較して身もだえの数を増す傾向がある(Mann-Whitney試験: U = 73; p＜ 0.07)。
ケージの一方から他方への通過の数
生成物3S、SC008 1.10の場合と対照生成物Lの場合、ケージの一方から他方への通過の数に有意差は認められない(Krusdal-Wallis試験: H(d.o.f. 2) = 0.983: N. S.)。
【００３１】
結  論
実験条件下、全体的なストレスコアに基づけば、SC008 1.1、3S、SC008 1.8、SC008 1.10、SC008 1.12及びジアゼパムは、対照の生成物Lと比して著しい抗ストレス活性を示す。生成物SC008 1.2 及び SC008 1.5は、対照生成物Lと比較すると有意な抗ストレス活性を示さない。
運動活性と調査研究活性に基づき、対照Lと比較すると、抗ストレス活性を示す発酵ミルクでは鎮静作用が観察されなかった。
【００３２】
実施例4: 経口経路での生成物投与に関する最適期間の決定
試験生成物は以下のとおりである:
3S:     発酵体F042(S242 ＋ S147 ＋ S003)で発酵したミルク;
L:      対照の殺菌ミルク (95℃ 10分)。
試験は、体重260〜280gの72匹のSPF ウィスター/AFのオス(Iffa-Credo繁殖センター、69 - St Germain sur Arbresles, France)について、実施例2に上記したプロトコルにしたがって行った。研究室条件で1週間慣れさせた後、ラットを無作為に6処理群に分けた。種々のラット群を同様に同一条件下で扱った。
【００３３】
生成物の投与
生成物は、胃内強制供給プローブを備えたシリンジ(HARVARD APPARATUS, 91 - Les Ulis, France)を用いて用量5 ml/kgで、1、3及び6日目に毎日経口投与した。試験の日には、隠蔽試験の6時間前に生成物を投与した。
各ケージのラット4匹に同じ生成物を与えた。
結  果
全体的なストレススコア
試験前の3日間単一用量として又は毎日投与した際に、生成物3Sは、対照の生成物Lに統計的に等価な全体的なストレススコアを誘発する。
試験前の6日間毎日投与した際に、生成物3Sは全体的なストレススコアを誘導するが、これは生成物Lを用いて得られるよりもかなり少ない。
【００３４】
結果を図４に示す。
図４の説明:
L:      対照の殺菌ミルク(95℃ 10分)
3S:     発酵体 F042 (S242 ＋ S147 ＋ S003)により発酵したミルク
Mann-Whitney試験:
*** 0 ＜0.005 vs. L.
結  論
上記の実験条件下、生成物3Sを6日間毎日投与することは、対照の生成物Lと比較して有意な抗ストレス活性を示すのに必要である。
【００３５】
実施例5: 生成物の経口投与用最適時間の決定
試験生成物は以下のとおりである:
3S:     発酵体 F042 (S242 ＋ S147 ＋ S003)により発酵したミルク
L:      対照の殺菌ミルク(95℃ 10分)
試験は、体重260〜280gの108匹のSPF ウィスター/AF のオス(Iffa-Credo繁殖センター、69 - St Germain sur Arbresles, France)について、実施例２に上記したプロトコルにしたがって行った。研究室条件で１週間慣化した後、ラットを無作為に9処理群に分けた。種々の群のラットを同様に同一条件で扱った。
生成物の投与
試験に先立って、胃内強制供給プローブを供えたシリンジ(Harvard Apparatus, 91 - Les Ulis, France)を用いて、6日間毎日用量 5 ml/kg で生成物を経口投与した。この期間の最後に、最後の投与から1、3又は 6又は24時間後に隠蔽試験を行う。
ジアゼパム(1日目に1 mg/kg、経口; 3及び4日目に2 mg/kg、経口ならびに5及び6日目に 3 mg/kg、経口)を、1%でメチルセルロースの水溶液5mlの容量に投与する。最後の投与は、隠蔽試験の1時間前に行う。各場合の4匹のラット全てに、同じ生成物を与えた。
【００３６】
結  果
全体的なストレススコア
投与を試験の1時間前に行う場合、生成物3Sは、対照の生成物Lを用いて得られるのと等価な全体的なストレススコアを誘発する。ジアゼパムの全体的なストレススコアは、対照の生成物Lよりもかなり低い。
試験の3時間前に投与する場合、生成物3Sは、対照の生成物Lと統計的に異ならない全体的なストレススコアを誘発する。
投与を試験の6又は24時間前に行う場合、生成物3Sは、対照の生成物Lを用いて得られるよりもかなり低い全体的なストレススコアを示す。
1時間及び6時間目での結果を、図５及び６に示す。
図５及び６の説明:
L:      対照の殺菌ミルク(95℃ 10分)
3S:     発酵体F042 (S242 ＋ S147 ＋ S003)で発酵したミルク
DZP:    ジアゼパム
Mann-Whitney 試験:
** p ＜ 0.01 vs. L.
結  論
上記の実験条件下、全体的なストレススコアに基づけば、抗ストレス活性は、生成物3Sの投与から6及び24時間後にそれ自体発現する。
【００３７】
実施例6: 3S 混合物で発酵した生成物中のカゼインαs1のトリプシン加水分解から誘導されるデカペプチドについての研究
EP出願 95402697に記載されるデカペプチドの存在は、生成物3Sで調べた。分析は、C18における逆相HPLCにより行った(ペプチドの分離はその疎水性に基づく)。
分析は、以下の勾配を用いて、NUCLEOSIL C18-10μ"プレカラム" - 100 mm × 4.6 mm、次いで NUCLEOSIL C18-3μ分析カラム - 150 mm × 4.6 mmで行った:
A:      H2O 中TFA 0.1%
B:      H2O 90% CH3CN ＋ 10% TFA 0.1%
溶出は、以下の表３に示すように行う。
【００３８】
【表３】
0004688298.tif 000004
【００３９】
検出は、215 nmで行う。
これらの条件下、カラムに沈積したデカペプチドの保持時間は29分である。
試験サンプルの調製:
生成物 3S ＋ 20% CH3CN; 攪拌し、次いで20分10 000 rpmで遠心分離。
HPLCカラムにろ液100μlを注入する前に、可溶相を回収し、次いでGELMAN 0.45μ GHP-GF ろ紙(低タンパク質結合)でろ過する。
所望のデカペプチドの保持時間に相当するピークは、生成物3Sのろ液には見られらなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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