(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
欠損組換えウイルスのゲノムと、欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて肝細胞集団であるコンピテント細胞集団に導入することを特徴とする欠損組換えウイルスの製造方法であって、該欠損組換えウイルスがアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択される欠損組換えウイルスである、欠損組換えウイルスの製造方法。
【請求項２】
バキュロウイルスが欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
バキュロウイルスが欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の一部を含み、残りの部分はコンピテント細胞により相補されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能が数種のバキュロウイルスにより導入されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
相補機能をもつバキュロウイルスとは異なる組換えバキュロウイルスと共に欠損組換えゲノムを細胞に導入することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
欠損組換えウイルスが欠損組換えアデノウイルスであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
欠損組換えゲノムを含むアデノウイルスの感染により前記ゲノムを細胞に導入することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
欠損組換えゲノムをトランスフェクションにより細胞に導入することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
組換えアデノウイルスのゲノムがＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１〜Ｌ５、ｐＩＸ及びＩＶａ２から選択される１種以上の機能を欠損しており、バキュロウイルスが欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
組換えアデノウイルスのゲノムがＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１〜Ｌ５、ｐＩＸ及びＩＶａ２から選択される１種以上の機能を欠損しており、バキュロウイルスが欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の一部を含み、残りの部分は１種以上の他のバキュロウイルス及び／又はコンピテント細胞により導入されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスがアデノウイルスのＥ１領域の全部又は一部を含み、Ｅ１領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムの相補を可能にすることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスがアデノウイルスのＥ２領域の全部又は一部を含み、Ｅ２領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムの相補を可能にすることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスがアデノウイルスのＥ４領域の全部又は一部を含み、Ｅ４領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムの相補を可能にすることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスがアデノウイルスのＥ１及びＥ４領域の全部又は一部を含み、Ｅ１及びＥ４領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムの相補を可能にすることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
組換えアデノウイルスのゲノムがアデノウイルスのコーディング領域全体を欠失しており、欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスがアデノウイルスゲノムのコーディング領域全体を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
バキュロウイルスがパッケージング領域を除き、アデノウイルスゲノムの全体を含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
バキュロウイルスがパッケージング領域とＩＴＲを除き、アデノウイルスゲノムの全体を含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
バキュロウイルスと欠損組換えウイルスのゲノムに存在する相補機能が組換えを生じる可能性のある相同ゾーンを含まないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
Ｅ１領域を欠く組換えアデノウイルスゲノムをコンピテント細胞に導入し、これらの細胞に同時又は非同時にＥ１領域を含むバキュロウイルスを感染させることを特徴とする請求項１８に記載の方法であって、バキュロウイルスに含まれるアデノウイルスＥ１領域と欠損組換えアデノウイルスのゲノムは組換えを起こすことができる相同ゾーンを含まないものである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｅ１及びＥ３領域を欠く組換えアデノウイルスゲノムをコンピテント細胞に導入し、これらの細胞に同時又は非同時にＥ１領域を含むバキュロウイルスを感染させることを特徴とする請求項１８に記載の方法であって、バキュロウイルスに含まれるアデノウイルスＥ１領域と欠損組換えアデノウイルスのゲノムは組換えを起こすことができる相同ゾーンを含まないものである請求１８に記載の方法。
【請求項２１】
バキュロウイルスがアデノウイルスＡｄ５の３９１〜３５１１フラグメントを含み、Ｅ１領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムがアデノウイルスＡｄ５の３９１〜３５１１フラグメントより大きい欠失をもつことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
バキュロウイルスがアデノウイルスＡｄ５の３９１〜３５１１フラグメントを含み、Ｅ１領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムがヌクレオチド３８３〜３５１２（両端を含む）をカバーする欠失をもつことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
バキュロウイルスに対して異種であるプロモーターの制御下におかれた、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択される欠損ウイルスの相補機能をコードする核酸をそのゲノムに挿入した組換えバキュロウイルス。
【請求項２４】
相補機能がアデノウイルスのＥ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｌ１〜Ｌ５、ｐＩＸ及びＩＶａ２領域単独又はその組み合わせによりコードされる機能の全部又は一部から選択されることを特徴とする請求項２３に記載のバキュロウイルス。
【請求項２５】
相補機能がＡＡＶのＲｅｐ及びＣａｐ領域単独又はその組み合わせによりコードされる機能の全部又は一部から選択されることを特徴とする請求項２３に記載のバキュロウイルス。
【請求項２６】
相補機能がレトロウイルスのｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ領域単独又はその組み合わせによりコードされる機能の全部又は一部から選択されることを特徴とする請求項２３に記載のバキュロウイルス。
【請求項２７】
相補機能をコードする核酸が血清型Ａｄ２又はＡｄ５のアデノウイルスのゲノムのフラグメントに対応するＤＮＡから構成されることを特徴とする請求項２３に記載のバキュロウイルス。
【請求項２８】
プロモーターが相補機能の発現に天然に関与するプロモーター領域により構成されることを特徴とする請求項２３に記載のバキュロウイルス。
【請求項２９】
プロモーターが調節又は非調節下の強力な細胞又はウイルスプロモーターであることを特徴とする請求項２３に記載のバキュロウイルス。
【請求項３０】
相補機能がアデノウイルスゲノムのＥ１領域又は少なくともＥ１ａ領域を含む前記領域の一部のみを含むことを特徴とする請求項２４に記載のバキュロウイルス。
【請求項３１】
相補機能がアデノウイルスゲノムのＥ４領域又は少なくともＯＲＦ３もしくはＯＲＦ６を含む前記領域の一部のみを含むことを特徴とする請求項２４に記載のバキュロウイルス。
【請求項３２】
アデノウイルスゲノムのコーディング領域全体を含むことを特徴とする請求項２４に記載のバキュロウイルス。
【請求項３３】
パッケージング領域を除き、完全アデノウイルスゲノムを含むことを特徴とする請求項３２に記載のバキュロウイルス。
【請求項３４】
ＡｃＮＰＶ株であることを特徴とする請求項２３に記載のバキュロウイルス。
【請求項３５】
核酸が多面体の遺伝子座又はｐ１０遺伝子座に導入されていることを特徴とする請求項２３に記載のバキュロウイルス。
【請求項３６】
核酸がコンピテント細胞で切除可能なカセットの形態で導入されていることを特徴とする請求項２３に記載のバキュロウイルス。
【請求項３７】
順方向に配置された部位特異的組換えを可能にする２つの配列に挟まれた少なくとも１個のＤＮＡ領域をそのゲノムに挿入した組換えバキュロウイルスであって、前記ＤＮＡ領域がコンピテント細胞で機能的な少なくとも１個の複製起点と、欠損組換えウイルスの相補機能をコードする核酸を含む前記バキュロウイルスであって、該欠損組換えウイルスがアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択される欠損組換えウイルスであって、かつ当該部位特異的組換えを可能にする配列がＰ１バクテリオファージのＬｏｘＰであり、かつ組換えがＣｒｅタンパク質の存在下に得られることを特徴とするバキュロウイルス。
【請求項３８】
順方向に配置された部位特異的組換えを可能にする２つの配列に挟まれた少なくとも１個のＤＮＡ領域をそのゲノムに挿入した組換えバキュロウイルスであって、前記ＤＮＡ領域がコンピテント細胞で機能的な少なくとも１個の複製起点と、欠損アデノウイルスのゲノムを含む前記バキュロウイルスであって、当該部位特異的組換えを可能にする配列がＰ１バクテリオファージのＬｏｘＰであり、かつ組換えがＣｒｅタンパク質の存在下に得られることを特徴とするバキュロウイルス。
【請求項３９】
欠損組換えアデノウイルスのゲノムが主にＩＴＲ領域と、パッケージング配列と、目的核酸を含むことを特徴とする請求項３８に記載のバキュロウイルス。
【請求項４０】
請求項３７に記載のバキュロウイルスと請求項３８に記載のバキュロウイルスをｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてコンピテント細胞集団に感染させ、部位特異的組換えを可能にするリコンビナーゼの存在下に前記細胞をおき、その後、生産されたアデノウイルスを回収することを特徴とする欠損組換えアデノウイルスの製造方法。
【請求項４１】
コンピテント細胞集団が肝細胞集団であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
コンピテント細胞集団が、ＨｕＨ７、Ｈｅｐ３Ｂ又はＨｅｐＧ２から選択されることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は組換えウイルスの製造方法に関する。本発明は前記方法を実施するために使用される構築物、産生細胞及びこうして製造されたウイルスにも関する。これらのウイルスはｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子クローニング及び／又は発現用ベクターとして使用可能である。
ウイルス起源ベクターは（組換えタンパク質の製造、スクリーニング試験の実施、遺伝子調節研究用等に）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又は（動物モデルの作出用又は治療アプローチで）ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子クローニング、導入及び発現に広く使用されている。これらのウイルスとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニアウイルスを特に挙げることができる。
アデノウイルス科は哺乳動物と鳥類に広く分布しており、正二十面体対称キャプシドをもつエンベロープなし２本鎖ＤＮＡウイルスの百種類以上の血清型を含む（Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｉｎ：Ｆｉｅｌｄｓ  ＢＮ，Ｋｎｉｐｅ  ＤＭ，Ｈｏｗｌｅｙ  ＰＭ編，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．第３版，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｉａ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９６：２１４９−２１７１）。アデノウイルスは安全性に加え、非常に広い細胞親和性をもつ。細胞周期が細胞分裂に依存するレトロウイルスとは異なり、活性分裂細胞だけでなく休止細胞にも感染することができ、そのゲノムはエピソーム形態で維持される。更に、高力価（１０11ｐｆｕ／ｍｌ）で生産され得る。これらの主要利点により、異種遺伝子のクローニング及び発現用ベクターとして選択されている。Ｃ亜属（特に２及び５型）のアデノウイルスとＣＡＶ−２型イヌアデノウイルスは分子生物学が最もよくわかっており、実用されているベクターに利用されている。
アデノウイルスは複製起点を含む各末端の１０３ｂｐの逆方向反復配列（ＩＴＲ）と、左側ＩＴＲの近傍に配置されたパッケージングシグナルを含む３６ｋｂの直鎖状ゲノムをもつ（Ｓｈｅｎｋ，Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｆｉｅｌｄｓ  ＢＮ，Ｋｎｉｐｅ  ＤＭ，Ｈｏｗｌｅｙ  ＰＭ編，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｉａ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９６：２１１１−２１４８）。ウイルス周期中に次の３群の遺伝子群が発現される。
−細胞遺伝子の調節に関与し、特に細胞のＳ期導入（Ｅ１Ａ）とアポトーシスの阻害（Ｅ１Ｂ）を可能にする極初期遺伝子（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４）。これらの遺伝子はメッセンジャーＲＮＡの転写、スプライシング又は輸送のレベルで初期又は後期ウイルス遺伝子の調節にも関与している（Ｅ１Ａ、Ｅ２Ａ、Ｅ４）。また、複製と免疫応答エスケープにも役割を果たす。
−後初期遺伝子（ｐＩＸ及びＩＶａ２）は後期遺伝子の転写の調節（ＩＶａ２）とビリオンの組立て（ｐＩＸ）に関係がある。
−後期遺伝子（Ｌ１〜Ｌ５）は強力なプロモーター（ＭＬＰ）から転写される。２８ｋｂの一次転写産物は交互スプライシングと５個のポリアデニル化部位の使用により、ウイルス粒子の組立て及び成熟に関与する種々の構造（コア、ペントン、ヘキソン）及び非構造タンパク質に対応する転写産物を生成することができる。
アデノウイルスベクターはｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子クローニング及び発現（Ｇｌｕｚｍａｎら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １１７２４，ｐ．１８７）、トランスジェニック動物の作出（ＷＯ９５／２２６１６）、遺伝子のｅｘ  ｖｉｖｏ細胞導入（ＷＯ９５／１４７８５；ＷＯ９５／０６１２０）又は遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞導入（特にＷＯ９３／１９１９１，ＷＯ９４／２４２９７，ＷＯ９４／０８０２６参照）に使用されている。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、比較的小寸法のＤＮＡをもつウイルスであり、これに感染する細胞のゲノムに比較的部位特異的に安定に組込まれる。アデノ随伴ウイルスは細胞増殖、形態又は分化に影響することなく広範な細胞に感染することができる。また、ヒトで疾病に関与しないと思われる。ＡＡＶのゲノムは既にクローニングされ、配列及び特性を決定されている。前記ゲノムは約４７００塩基を含み、ウイルスの複製起点として機能する約１４５塩基の逆方向反復領域（ＩＴＲ）各末端に含む。ゲノムの残余はパッケージング機能をもつ２つの主領域に分けられ、ゲノムの左側部分はウイルス複製とウイルス遺伝子の発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含み、ゲノムの右側部分はウイルスのキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含む。
ＡＡＶに由来するベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入に利用することは文献に記載されている（特にＷＯ９１／１８０８８；ＷＯ９３／０９２３９；米国特許第４，７９７，３６８号、５，１３９，９４１号、ヨーロッパ特許第４８８５２８号参照）。
レトロウイルスは分裂細胞に選択的に感染する組込みウイルスである。従って、例えば癌や再発狭窄症に適用するのに有利なベクターである。レトロウイルスのゲノムは主に２つのＬＴＲと、パッケージング配列と、３つのコーディング領域（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）を含む。組換えベクターの構築とそのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ使用については文献に広く記載されており、特にＢｒｅａｋｆｉｅｌｄら，Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ３（１９９１）２０３；ヨーロッパ特許第４５３２４２号及び１７８２２０号、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．７（１９８５）２３５；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３（１９８５）６８９等を参照されたい。
組換えベクターとして使用するために、種々の目的遺伝子を組込んだ種々のウイルス由来構築物が作製されている。これらの構築物はいずれもウイルスが感染細胞で自己複製できないようにウイルスゲノムを改変している。従って、従来技術に記載されている構築物は、複製に必須のゲノムの所定領域を欠損するウイルスである。特に、アデノウイルスについては、第１世代構築物はウイルス複製に必須のＥ１領域に欠失があり、このレベルに異種ＤＮＡ配列を挿入している（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ  １０１（１９９１）１９５；Ｇｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら，Ｇｅｎｅ  ５０（１９８６）１６１）。また、ベクターの性質を改良するために、アデノウイルスのゲノム内に他の欠失又は変異を形成することも提案されている。例えば、突然変異株ｔｓ１２５に感熱性点突然変異を導入し、Ｅ２領域によりコードされる７２ｋＤａのＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）を不活化している（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔら，１９７５）。この他、ウイルス複製及び／又は増殖に必須の別の領域であるＥ４領域の欠失を含むベクターもある。Ｅ１及びＥ４領域を欠失するアデノウイルスベクターは転写バックグラウンドノイズとウイルス遺伝子発現が非常に低い。このようなベクターは例えば国際出願ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９６／２２３７８に記載されている。また、ＩＶａ２遺伝子のレベルに変異をもつベクターも記載されている（ＷＯ９６／１００８８）。更に、ウイルス生産にシスで必要な領域（ＩＴＲ及びパッケージング配列）しか含まず、全コーディングウイルス配列を欠失する「最小アデノウイルス」又は「偽アデノウイルス」（又はＡｄΔ）と呼ばれるベクターも記載されている（ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９５／０２６９７）が、以下に説明するようにそれらの製造はまだ非常に困難である。
ＡＡＶについては、記載されているベクターは一般にコーディング領域Ｒｅｐ及びＣａｐを完全に除去し、目的核酸で置換している。
レトロウイルスに由来する組換えベクターでは、一般にｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を全部又は一部除去し、目的異種核酸配列で置換している。また、組換えレトロウイルスは転写活性を抑制するようにＬＴＲのレベルに変異を加えたり、ｇａｇ遺伝子の一部を含む拡張パッケージング配列にすることもできる（Ｂｅｎｄｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１（１９８７）１６３９）。
これらの種々の組換えウイルスは複製欠損性であるため、ゲノムの欠失機能をトランス相補できるように製造する必要がある。これらのウイルスの製造、特にトランス相補機能の導入を非常に困難にしているのはトランス相補に他ならない。
この点では２種のアプローチが開発されている。第１はパッケージング系と呼ばれるトランス相補系の構築である。第２はヘルパーアデノウイルス又はヘルパープラスミドの使用に基づく。
種々の欠損ウイルスパッケージング系が構築されている。これらの系はウイルスベクターに欠損する機能を生成することができる。一般に、これらの系はウイルスゲノムの欠失領域（例えばアデノウイルスではＥ１、Ｅ２及び／又はＥ４、レトロウイルスではｇａｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ、ＡＡＶではｒｅｐ及び／又はｃａｐ）をそのゲノムに組み込んでいる。
欠損アデノウイルスの製造用として知られている細胞系の１例は例えば、アデノウイルスのゲノムの一部を組み込んだ２９３系である。より詳細には、２９３系はアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）のゲノムの左側末端（約１１〜１２％）を含むヒト胎児腎細胞系であり、左側ＩＴＲ、パッケージング領域、Ｅ１ａとＥ１ｂを含むＥ１領域、ｐＩＸタンパク質をコードする領域及びｐＩＶａ２タンパク質をコードする領域の一部を含む。この系はＥ１領域を欠損即ちＥ１領域の全部又は一部を欠失する組換えアデノウイルスをトランス相補することができ、高力価をもつウイルスストックを生産することができる。この系は、感熱性Ｅ２突然変異を更に含むウイルスストックを許容温度（３２℃）で生産することもできる。Ｅ１領域を相補することが可能な他の細胞系としては、特にヒト肺癌細胞Ａ５４９（ＷＯ９４／２８１５２）やヒト網膜芽細胞（Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．（１９９６）２１５）に由来するものも記載されている。また、アデノウイルスの複数の機能をトランス相補することが可能な細胞系も記載されている。特に、Ｅ１及びＥ４領域を相補する系（Ｙｅｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１９９６）５５９；Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．２（１９９５）３２２；Ｋｒｏｕｇｌｉａｋら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．６（１９９５）１５７５）と、Ｅ１及びＥ２領域を相補する系（ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９５／２７０７１）を挙げることができる。
欠損レトロウイルスの製造用細胞系も種々のものが記載されており、一般にｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を発現することができる。このような系は例えばＰＡ３１７系（米国特許第４，８６１，７１９号）、ＰｓｉＣＲＩＰ系（ＷＯ９０／０２８０６）、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２系（ＷＯ８９／０７１５０）、ＢＯＳＣ系（ＷＯ９４／１９４７８）等である。目的核酸を含む組換えレトロウイルスを構築するためには、特にＬＴＲとパッケージング配列と目的核酸を含むプラスミドを構築した後、このプラスミドを使用して、プラスミドに欠失するレトロウイルス機能をトランス導入することが可能な上記のようなパッケージング系にトランスフェクトする。生成した組換えレトロウイルスをその後、慣用技術により精製する。
しかし、細胞系の使用にはいくつかの欠点がある。例えばこのような細胞系を工業規模で構築及び評価するのは困難であり、費用がかかり、制約がある。実際に、これらの系は安定で且つ工業的利用に適合できなければならない。更に、記載されている系は汚染性複製ウイルス（ＲＣＡ）の生産を避け難い。また、これらの系は現状では例えば上記最小アデノウイルスのような欠損度の非常に高いウイルスゲノムを工業的利用に十分にトランス相補することができない。実際に、アデノウイルスは空間時間的調節が非常に複雑な種々の転写単位から編成されるゲノムをもつ。細胞系から各転写単位を別々に構成的又は条件付きで発現させることにより全コーディングウイルス配列を欠失するアデノウイルスをトランス相補することはまだ十分に実施できていない。例えば細胞系から構成的に発現されているのは、Ｅ１、Ｅ４、ｐＩＸ領域及びＥ２によりコードされる３種のタンパク質（ｐｏｌ、ＤＢＰ及びｐ−ＴＰ）に対応するゲノムのごく一部に過ぎない。ゲノムの残余は２８ｋｂの一次転写産物から構造及び非構造タンパク質の全メッセンジャーを生産し、ゲノムの複製後に活性化される主要後期転写単位（ＭＬＴＵ）に対応する。しかし、最小アデノウイルスを作製するためには、これらの領域のトランス相補は不可欠である。これらの系から非常に高力価の組換えレトロウイルスを得ることはできない。
第２のアプローチは、相補機能を導入する構築物（プラスミド又はアデノウイルス）を欠損ウイルスゲノムと共にコトランスフェクトするものである。特に、欠損組換えＡＡＶは一般に、ヒト補助ウイルス（例えばアデノウイルス）に感染させた細胞系に、ＡＡＶの２つの逆方向反復領域（ＩＴＲ）で挟まれた目的核酸を含むプラスミドと、ＡＡＶの相補機能（ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）をもつプラスミドを同時トランスフェクトすることにより作製される。変異体は国際出願ＷＯ９５／１４７７１、ＷＯ９５／１３３６５、ＷＯ９５／１３３９２又はＷＯ９５／０６７４３に記載されている。ヘルパーアデノウイルスを使用する欠点は主に、アデノウイルスベクターとヘルパーアデノウイルスの組換えの危険が大きく、ウイルスストックの生産及び精製時にヘルパーの組換え体を分離しにくいという点にある。例えばＲｅｐ／ｃａｐプラスミド等のヘルパープラスミドを使用する欠点は、得られるトランスフェクションレベルが高力価のウイルスを生産するには不十分であるという点にある。
本願はこれらの欠点を解決することが可能な新規ウイルス製造システムに関する。本発明のシステムは相補機能を導入するためにバキュロウイルスを使用するものである。
本発明による製造システムは、樹立相補系を使用する必要がなく、ＲＣＡの問題がなく、高度欠損ゲノムをトランス相補できるという点が特に有利である。更に、本発明のシステムは所望ウイルスとバキュロウイルスにより感染可能な全細胞に適用可能であり、従って幅広い利用性を提供する。
従って、本発明の第１の目的は、欠損組換えウイルスのゲノムと、欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスをコンピテント細胞集団に導入することを特徴とする欠損組換えウイルスの製造方法にある。
従って、本発明の方法は相補機能を導入するためにバキュロウイルスを使用する。種々のアプローチが可能である。まず欠損組換えゲノムのトランス相補機能を発現しないコンピテント細胞を使用することができる。この場合には、欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な全機能を含むバキュロウイルス又は欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の１種以上を各々もつ数個のバキュロウイルスを使用することができる。欠損組換えゲノムの１種以上の機能を既にトランス相補することが可能なコンピテント細胞集団（パッケージング系）も使用できる。その場合には、使用する１種以上のバキュロウイルスは欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能のうちでコンピテント細胞によりまだトランス相補されていない機能のみを導入する。
上述のように、本発明のシステムは工業化（細胞系が不要、ＲＣＡを生産しない等）と応用性（全欠失型をもつ組換えウイルス、特に高度欠損組換えアデノウイルスの製造）に多数の利点がある。また、バキュロウイルスはヒト細胞で複製しないので、得られるウイルス調製物はバキュロウイルスに汚染されない。更に、バキュロウイルスはアデノウイルスとは系統分類的に非常に離れているため、両者間の組換え又はトランス相補の危険がない。従って、このシステムはＲＣＡのない欠損ウイルスの濃縮ストックを生産できるという利点がある。このシステムは欠損組換えアデノウイルスの製造に特に有利である。
バキュロウイルスは脊椎動物に固有のエンベロープ付き環状２本鎖ＤＮＡウイルスである。その典型例であるＡｃＮＰＶは１３３ｂｋのゲノムをもつ。このウイルスは２種の強力プロモーター［多面体（Ｐｈ）及びＰ１０］からの真核遺伝子の昆虫細胞発現ベクターとしてよく使用されている（ＫｉｎｇとＰｏｓｓｅｅ，Ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｃｈａｍｐａｍｎ  ＆  Ｈａｌｌ，１９９２）。ＡｃＮＰＶは所定の哺乳動物細胞に感染することができるが、ゲノムは転写も翻訳もされない。最近、Ｈｏｆｍａｎｎら（ＰＮＡＳ  ９２（１９９５）１００９９）は、ＬａｃＺ遺伝子を発現する精製組換えバキュロウイルスにより肝細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入できることを示している。１０００という高い感染多重度でも細胞毒性は報告されておらず、この論文に記載されているトランスフェクション効率はＭＯＩ１００で約５０％である。
本願出願人は、種々の細胞型に組換えバキュロウイルスを感染できることを示した。特に、本願出願人は、不死化胎児細胞等のヒト起源の細胞に組換えバキュロウイルスを感染できることを示した。本願出願人は、非常に高い導入効率（＞８０％）を得られることも示した。本願出願人は更に、アデノウイルスの相補機能をバキュロウイルスに導入し、コンピテント細胞集団でこれらの機能を発現できることも示した。従って本願出願人は、バキュロウイルスがウイルス相補機能の哺乳動物、特にヒト細胞導入及び発現に特に有利に使用可能な不活性ベクターであることを示すことができた。本発明のシステムの他の利点は、特に（ｉ）完全アデノウイルスゲノムを相補可能なクローニング能が高いことと、（ｉｉ）バキュロウイルス技術の前進である。
以下の文中では、ウイルスの相補機能をもつバキュロウイルスをヘルパーバキュロウイルスとも言う。ヘルパーバキュロウイルスはウイルスの相補のための種々の機能を含むことができる。
例えば、ヘルパーバキュロウイルスはアデノウイルスのＥ１領域を含むことができる。第１世代アデノウイルス即ちＥ３状態に関係なく（即ち欠損ＡｄΔＥ１，ΔＥ３、またはそうでない）、Ｅ１領域を欠損するアデノウイルス（ＡｄΔＥ１）の製造にはＢａｃｕｌｏ−Ｅ１を使用することができる。第１世代欠損組換えアデノウイルス（Ｅ１領域と場合によりＥ３を欠損）の製造は本発明の方法の特に有利な第１の適用である。上述のように、Ｅ１機能をトランス相補することが可能な種々の細胞系が文献に記載されている（２９３細胞、Ａ５４９細胞、９１１細胞等）。しかし、細胞系のゲノムに組み込まれたトランス相補機能をもつ領域と、製造しようとする組換えウイルスのＤＮＡの間には相同ゾーンが存在する。このため、製造中に種々の組換えイベントが生じ、複製ウイルス粒子、特にＥ１＋型のアデノウイルスを生成する恐れがある。例えば単純組換えイベント後に染色体が切れたり、二重組換えが生じることがある。これらの２種の変異の結果、細胞ゲノムに含まれるＥ１領域がアデノウイルスゲノム中の元の遺伝子座に再組み込みされる。更に、２９３系により製造される組換えベクターは力価が高い（＞１０12）ため、これらの組換えイベントが生じる確率は高い。従って、第１世代欠損組換えアデノウイルスベクターの多くのバッチは複製ウイルス粒子で汚染されていることが認められ、医薬用途に重大な欠点となっている。実際に、このような粒子が治療用組成物中に存在すると、ウイルス増殖と無制御の伝播をｉｎ  ｖｉｖｏ誘導し、炎症反応、組換え等の危険を伴う。従って、汚染したバッチはヒト治療に使用することができない。
本発明はこれらの欠点を解決することができる。実際に、本発明の方法の１実施態様によると、Ｅ１領域と場合によりＥ３を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムをコンピテント細胞に導入し、バキュロウイルスと欠損組換えアデノウイルスのゲノムに存在するアデノウイルスのＥ１領域が組換えを生じる恐れのある相同（オーバーラップ）ゾーンをもたないように、これらの細胞にＥ１領域をもつバキュロウイルスを同時に又は非同時に感染させる。従って、この実施態様によると、樹立細胞系を用いずにＲＣＡのない第１世代組換えアデノウイルスストックを迅速に生産することができる。更に、後述するように、こうして生産したＲＣＡのない組換えアデノウイルスストックは、コンピテント細胞にバキュロウイルスと共に同時インフェクトすることにより新規製造用出発材料として使用することができる。
ヘルパーバキュロウイルスは更にアデノウイルスのＥ２領域の全部又は一部、特にＥ２ａ及び／又はＥ２ｂ領域を含んでいてもよい。Ｅ２領域（Ａｄ−ΔＥ２）と場合によりＥ３領域（Ａｄ−ΔＥ２，ΔＥ３）を欠損するアデノウイルスをコンピテント細胞で製造するにはｂａｃｕｌｏ−Ｅ２を使用することができる。更に、アデノウイルスのＥ１領域を相補することが可能なコンピテント細胞でｂａｃｕｌｏ−Ｅ２を使用すると、Ｅ１及びＥ２領域（Ａｄ−ΔＥ１，ΔＥ２）と場合によりＥ３領域（Ａｄ−ΔＥ１，ΔＥ２，ΔＥ３）を欠損する組換えアデノウイルスを製造することができる。同様に、アデノウイルスのＥ１及びＥ４領域を相補することが可能なコンピテント細胞（例えばＩＧＲＰ２細胞）でｂａｃｕｌｏ−Ｅ２を使用すると、Ｅ１、Ｅ２及びＥ４領域（Ａｄ−ΔＥ１，ΔＥ２，ΔＥ４）と場合によりＥ３（Ａｄ−ΔＥ１，ΔＥ２，ΔＥ３，ΔＥ４）を欠損する組換えアデノウイルスを製造することができる。
ヘルパーバキュロウイルスは更にアデノウイルスのＥ４領域を（全部又は一部）含んでいてもよい。Ｅ４領域（Ａｄ−ΔＥ４）と場合によりＥ３領域（Ａｄ−ΔＥ４，ΔＥ３）を欠損するアデノウイルスをコンピテント細胞で製造するにはｂａｃｕｌｏ−Ｅ４を使用することができる。更に、アデノウイルスのＥ１領域を相補することが可能なコンピテント細胞でｂａｃｕｌｏ−Ｅ４を使用すると、Ｅ１及びＥ４領域（Ａｄ−ΔＥ１，ΔＥ４）と場合によりＥ３領域（Ａｄ−ΔＥ１，ΔＥ４，ΔＥ３）を欠損する組換えアデノウイルスを製造することができる。
ヘルパーバキュロウイルスは更にアデノウイルスのＥ１及びＥ４領域を（全部又は一部）含んでいてもよい。図１に示すように、Ｅ１及びＥ４領域（Ａｄ−ΔＥ１，ΔＥ４）と場合によりＥ３領域（Ａｄ−ΔＥ１，ΔＥ４，ΔＥ３）を欠損するアデノウイルスをコンピテント細胞で製造するにはｂａｃｕｌｏ−Ｅ１，Ｅ４を使用することができる。
更に、Ｅ１及びＥ４領域を欠損するウイルスを作製するためには、夫々Ｅ１機能とＥ４機能の全部又は一部を発現する２種のヘルパーバキュロウイルスを使用することもできる。
同様に、ヘルパーバキュロウイルスはＥ１、Ｅ２及びＥ４領域（全部又は一部）と、場合により後期遺伝子をもつ領域（Ｌ１〜Ｌ５）を含んでいてもよい。
ヘルパーバキュロウイルスは更にＡＡＶのＲｅｐ及び／又はＣａｐ領域を含んでいてもよい。例えば、ｂａｃｕｌｏ−Ｒｅｐ／Ｃａｐは全コーディングウイルス配列を欠失するＡＡＶゲノムを相補することができる（図５）。
バキュロウイルスは更にレトロウイルスのｇａｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ領域を含んでいてもよい。例えば、ｂａｃｕｌｏ−ｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖは全コーディングウイルス配列を欠失するレトロウイルスゲノムをコンピテント細胞系で相補することができる。ｇａｇ／ｐｏｌ領域を含むバキュロウイルスとｅｎｖ領域を含む第２のバキュロウイルスを使用することもできる。
一般に、欠損組換えウイルスのゲノムとバキュロウイルスに存在する相補領域はオーバーラップをもたないことが好ましい。こうすると、実際に組換えとＲＣＡの生成の危険が避けられる。これは第１世代アデノウイルス（Ａｄ−ΔＥ１）の生産に特に重要である。この場合には、バキュロウイルスに導入されるＥ１領域は、組換えゲノムと共通配列をもたないように規定される。このためには、例えば実施例に記載するように、バキュロウイルスに挿入される相補領域よりも大きい領域を組換えゲノムから除去することができる。これはアデノウイルスＡｄ−ΔＥ１，ΔＥ４の作製にも有利である。
このように、本発明の方法の特定実施態様では、欠損組換えウイルスのゲノムをコンピテント細胞に導入し、バキュロウイルスと欠損組換えウイルスのゲノムに存在する相補機能が組換えを生じる恐れのある相同ゾーンをもたないように、欠損ゲノムの相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスをこれらの細胞に同時又は非同時に感染させる。有利な態様では、ウイルスゲノムはＥ１領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムであり、バキュロウイルスはＥ１領域をトランス相補することが可能なアデノウイルスの領域をもつ。別の態様によると、ウイルスゲノムはＥ１及びＥ４領域を欠損する組換えアデノウイルスゲノムであり、バキュロウイルスは前記領域をトランス相補することが可能なアデノウイルスの２つの領域をもつか、又は夫々Ｅ１領域とＥ４領域をトランス相補することが可能なアデノウイルスの領域をもち、欠損アデノウイルスゲノムと相同ゾーンをもたない２種のバキュロウイルスを使用する。
特定実施態様によると、１個以上のヘルパーバキュロウイルスがアデノウイルスの全コーディング領域をもつ。より特定的な実施態様によると、アデノウイルスの全コーディング領域をもつ単一ヘルパーバキュロウイルスを使用する。従って、このようなヘルパーバキュロウイルスは最小組換えアデノウイルスをトランス相補するために使用可能である。このようなバキュロウイルスは実施例に示すように、パッケージング領域と場合によりＩＴＲ以外は特にアデノウイルスゲノム全体を含むことができる。
相補機能の作製
ヘルパーバキュロウイルスに導入する相補機能は種々の血清型ウイルスから得られる。
アデノウイルスについては、構造と性質が少しずつ異なるが、類似の遺伝子地図をもつ種々の血清型が実際に存在する。より詳細には、本発明によりバキュロウイルスを構築するために使用される相補機能はヒト又は動物起源のアデノウイルスに由来する。
ヒト起源のアデノウイルスについては、Ｃ亜属に分類されるものを好適例として挙げることができる。種々のヒトアデノウイルス血清型のうち、本発明の範囲では特に２又は５型（Ａｄ２又はＡｄ５）のアデノウイルスを使用すると好ましい。Ａ及びＢ亜属の７又は１２型アデノウイルスに由来する領域を使用することもできる。動物起源の種々のアデノウイルスのうちでは、イヌ起源のアデノウイルス、特に全アデノウイルスＣＡＶ２株［例えばマンハッタン株又はＡ２６／６１（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８００）］を使用すると好ましい。動物起源の他のアデノウイルスは、参考資料として本明細書の一部とする国際出願ＷＯ９４／２６９１４に特に記載されている。
本発明の１好適実施態様では、相補機能はＣ亜属のヒトアデノウイルスゲノムに由来する。アデノウイルスＡｄ２又はＡｄ５のゲノムに由来するものが特に好ましい。
種々の相補機能をもつ領域は当業者に公知の方法に従って酵素切断によりアデノウイルスゲノムから得られる。これらの領域は場合により修飾し、短縮したり、所定の調節エレメント（プロモーター、エンハンサー等）を異種エレメントで置換してもよい。一般に、これらの領域は次のように作製される。アデノウイルスのＤＮＡは塩化セシウム勾配遠心分離により精製するか、又は原核（ＷＯ９６／２５５０６）もしくは真核（ＷＯ９５／０３４００）プラスミドからｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られる。次にＤＮＡを適当な制限酵素で開裂し、得られたフラグメントから所望相補機能をもつものを同定及び選択する。使用する制限酵素の選択は所望の相補機能に依存する。次に、アデノウイルスゲノムの公表されている制限地図と配列に従う。例えば、Ｅ１領域はＥ１Ａプロモーターの下流にＥ１Ａ及びＥ１Ｂの全オープンリーディングフレームをもつフラグメントとして単離することができる。Ｅ４領域はオープンリーディングフレーム全体又はその一部のみ、好ましくはＯＲＦ３又はＯＲＦ６又はＯＲＦ−ＯＲＦ６／７をもつフラグメントとして単離することができる。
同様の方法を実施して組換えＡＡＶ及びレトロウイルスの相補領域を作製する。例えば、ＡＡＶのｒｅｐ及び／又はｃａｐ領域は種々のＡＡＶ血清型から単離したウイルスＤＮＡから酵素切断により得られる。ＡＡＶ−２が好ましい。レトロウイルスの場合には、ｇａｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ領域は同様に種々のレトロウイルス、例えば特にＭｏＭｕＬＶ（「モロニーマウス白血病ウイルス」、別称ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＶ（「モロニーマウス肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベー肉腫ウイルス」）、ＳＮＶ（「脾壊死ウイルス」）、ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）又はフレンドウイルス等のレトロウイルスから慣用分子生物学技術により得られる。
ヘルパーバキュロウイルスの構築
次に、相補領域をもつフラグメントをその操作（微細消化、ＰＣＲ、調節配列付加等）が可能なプラスミドベクター、例えば原核又は真核生物にサブクローニングする。その後、相補機能をコードする得られた最終フラグメントを慣用分子生物学技術によりヘルパーバキュロウイルスに導入する。詳細には、バキュロウイルスのゲノムのある領域に相同な２つの配列の間にフラグメントをクローニングした後、得られたフラグメント又はプラスミドをバキュロウイルスのゲノムと共に昆虫細胞（一般にはｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞Ｓｆ９及びＳｆ２１であるが、ｔｒｉｃｈｏｐｕｌｓｉａ  ｎｉ細胞Ｔｎ−３６８及びＨｉｇｈ−Ｆｉｖｅ（登録商標）ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（Ｇｉｂｃｏ）、又はバキュロウイルスに許容可能でその製造に使用可能な他の任意の昆虫細胞でもよい）に同時トランスフェクトする。プラスミド又はフラグメントとバキュロウイルスのゲノムの相同組換えにより所望の組換えバキュロウイルスが生成され、慣用方法により回収及び精製することができる（特にＫｉｎｇとＰｏｓｓｅｅ：ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ，１９９２参照）。組換えバキュロウイルスを構築するためには、シャトルベクターを含む種々のキットが市販されており、製造業者の指示に従って使用することができる。特に、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製品シャトルベクターｐＢＡＣ、ベクターｐＡｃ（Ｖｅｍｅら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１９８８）４７，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，米国）、ベクターｐＢｌｕｅ−Ｂａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はベクターｐＢＳＶ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使用することができる。こうして相補機能はバキュロウイルスの種々の部位に挿入することができ、特に多面体の遺伝子又は遺伝子ｐ１０の遺伝子座に挿入することができる。また、ＡｃＮＰＶ又はＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ（Ｍａｅｄａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５（１９８８）５９２）等の種々のバキュロウイルス株を使用することができる。他方、使用するバキュロウイルスを変異させ、その親和性を改善／変化させてもよい。実際に、（ｉ）ウイルスタンパク質と特異的リガンド（免疫グロブリンＬ鎖、ガストリン放出ペプチド）の融合により短縮するか又は（ｉｉ）異種ウイルス糖タンパク質［水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧ］との偽型の形成により拡大するように表面タンパク質を修飾することにより、ウイルスベクターの親和性を調節することができる［Ｌｉｕら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７０（４）（１９９６）２４９７；Ｍｉｃｈａｅｌら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２（１９９５）６６０］。最近では、ＨＩＶウイルスのｇｐ１２０に融合したバキュロウイルスの表面糖タンパク質（ｇｐ６４）はＣＤ４レセプターに固定できることが立証されている（Ｂｏｕｂｌｉｋら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３（１９９５）１０７９）。ｇｐ６４のこの修飾は昆虫細胞でバキュロウイルスの生存率に影響を与えない。ＶＳＶのＧを用いて同様に構築しても、バキュロウイルスの哺乳動物細胞親和性を改善し、従ってＨｕｈ７細胞や他の細胞系のトランスダクション効率を向上できると思われる。
ヘルパーバキュロウイルスでは、コンピテント細胞中で機能的な異種（即ちバキュロウイルスとは異なる起源の）プロモーターの制御下に相補機能をおくと有利である。実際に、バキュロウイルスのプロモーターから昆虫細胞以外の細胞で相補機能の十分な発現レベルは得られないと思われる。プロモーターはまずウイルスの相補機能の固有プロモーター（同種プロモーター）であり得る（アデノウイルスにはＥＡ１、Ｅ４、Ｅ２、ＭＬＰプロモーター、ＡＡＶにはＰ５又はＰ１９プロモーター、ＲＳＶにはＬＴＲのプロモーター等）。使用するコンピテント細胞中で機能的であれば別の起源の任意プロモーターを使用できる。この点では、例えばこの細胞で発現される遺伝子のプロモーター又は公知ユビキチンプロモーター（例えばＰＧＫ遺伝子のプロモーター、ＣＭＶの極初期プロモーター、ヘルペスウイルスのＴＫ遺伝子のプロモーター又はＲＳＶのＬＴＲのプロモーター）が挙げられる。調節プロモーターでもよく、例えばＭＭＴＶウイルスのプロモーター、例えばＧＲＥ５型のホルモン応答プロモーター又はテトラサイクリン（ＷＯ）により調節されるプロモーターが挙げられる。同種、強力ユビキチン又は誘導プロモーターが有利である。
従って、本発明の別の目的は、異種プロモーターの制御下におかれたウイルスの相補機能をコードする核酸をそのゲノムに挿入した組換えバキュロウイルスに関する。より詳細には、相補機能は前記ウイルスの生産に必要なタンパク質であり、そのコーディング領域は欠損ウイルスゲノム中で不活化（突然変異、欠失等）されている。アデノウイルスでは、相補機能は特にアデノウイルスのＥ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｌ１〜Ｌ５、ｐＩＸ及びＩＶａ２領域単独又はその組み合わせによりコードされる機能の全部又は一部から選択される。ＡＡＶでは、Ｒｅｐ及び／又はＣａｐ領域によりコードされる機能であり、レトロウイルスではｇａｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖである。核酸は選択された相補機能をコードする領域を含むウイルスゲノムの領域に対応するものが有利である。特に、血清型Ａｄ２もしくはＡｄ５のアデノウイルス、ＭｏＭＬＶ又はＡＡＶ−２のゲノムのフラグメントが挙げられる。核酸は選択される相補機能の発現に天然に関与するプロモーター領域も含むことが特に好ましい。
特定例として、本発明はアデノウイルスのＥ１領域の全部又は一部を含むバキュロウイルスに関する。より詳細には、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ又はＥ１ａとＥ１ｂ領域を含むバキュロウイルスである。アデノウイルスのＥ１領域はＡｄ５のヌクレオチド１０４（Ｅ１ａプロモーター）〜４０７０（ポリＡ  Ｅ１ｂ）のレベルに局在する。特に、Ｅ１ａプロモーターのＴＡＴＡボックスはヌクレオチド４７０のレベルに局在し、Ｅ１ａのＡＴＧコドンはヌクレオチド５６０のレベル、Ｅ１ｂストップコドンはヌクレオチド３５１１のレベルに局在する。厳密な例として３９１〜３５１１フラグメントを含むバキュロウイルスを挙げることができる。このヘルパーバキュロウイルスはこの３９１〜３５１１フラグメントよりも大きい欠失をもつＥ１領域欠損組換えアデノウイルスの製造に特に適している。特に、ＲＣＡがなく、３８３〜３５１２ヌクレオチド（両端を含む）の範囲のＥ１領域に欠失をもつ第１世代アデノウイルスの製造に適している。
本発明によるバキュロウイルスの別の特定例は例えばアデノウイルスのＥ１及びＥ４領域の全部又は一部を含む。アデノウイルスのＥ４領域はＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ３／４、ＯＲＦ６及びＯＲＦ６／７と呼ばれる７個のオープンリーディングフレームから構成される。これらの種々のＯＲＦによりコードされるタンパク質のうちでは、ＯＲＦ３とＯＲＦ６により生産されるタンパク質がウイルスの「複製」を可能にし、従って、完全に欠損する場合であってもＥ４領域を欠損するアデノウイルスのトランス相補を可能にすると思われる。従って、本発明のヘルパーバキュロウイルスはＥ４領域の全部又は少なくともＯＲＦ３もしくはＯＲＦ６フレームを含む一部のみを含むと有利である。Ｅ４領域の種々の部分は当業者に公知の方法により酵素切断により得られ、修飾してもよい。特に、オープンリーディングフレームＯＲＦ６はヌクレオチド３４１１５〜３３１２６に対応するＢｇｌＩＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントとしてＥ４領域から単離することができ、オープンリーディングフレームＯＲＦ６−ＯＲＦ６／７はＡｄ５のゲノムのヌクレオチド３４１１５〜３２４９０に対応するＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントとしてＥ４領域から単離することができる。バキュロウイルスは（例えばフラグメント３２８００〜３５８２６又は３２８１１〜３５６１４又は３２８１１〜３５６４０として）オープンリーディングフレームＯＲＦ１〜ＯＲＦ７全体を含んでいてもよい。当然のことながら、アデノウイルスゲノムの公表配列に基づいて他のフラグメントを決定することもできる。Ｅ４領域の短い単位をもつバキュロウイルスを使用すると、Ｅ４領域のより大きい欠失をもち、従って相同ゾーンのない欠損アデノウイルスゲノムのトランス相補が可能になり、組換えの可能性が全くなくなるので有利である。
第１の実施態様によると、相補機能をコードする核酸を発現カセットの形態でヘルパーバキュロウイルスに導入する。この実施態様は最も簡単に実施できる。極初期遺伝子を欠損する組換えアデノウイルスの製造と、欠損組換えレトロウイルス及びＡＡＶの製造に特に適している。
別の実施態様によると、相補機能をコードする核酸を切除可能なカセットの形態でヘルパーバキュロウイルスに導入し、コンピテント細胞で複製分子を生成する。細胞でカセットを複製すると、相補遺伝子のコピー数を増し、システムの生産レベルを改善できるという利点がある。この実施態様は、欠損度が高く、特に構造遺伝子を欠損する組換えアデノウイルスの製造に特に適している。特に、この実施態様は「最小」アデノウイルスの製造に特に適している。実際に、構造タンパク質の量は欠損度の高いアデノウイルス（最小アデノウイルス型）を高力価で生産するのを制限している要因である。この実施態様によると、トランス相補タンパク質、特に（Ｌ１〜Ｌ５領域によりコードされる）アデノウイルスの構造タンパクの細胞内レベルを最小アデノウイルスのトランス相補に適合可能なレベルまで大幅に増加することが初めて可能になった。
このように、本願出願人は、（エピソーム型）環状複製分子を生成するように、好ましくは誘導及び調節下に細胞で切除可能な異種領域を含む組換えバキュロウイルスを構築できることを示した。
切除は部位特異的組換えメカニズムにより実施すると有利であり、細胞内の複製は細胞分裂状態から独立した複製起源によりなし遂げられる。
より好ましくは、本発明の方法により使用される部位特異的組換えは、一般にリコンビナーゼと呼ばれる特定タンパク質の存在下に組換え可能な２種の特定配列により得られる。これらの特定配列は適当な向きに配置され、バキュロウイルス内で相補機能をコードする配列の両側に配置される。従って、本発明は部位特異的組換えを可能にする２種の配列により挟まれ、順方向に配置された少なくとも１個のＤＮＡ領域をそのゲノムに挿入した組換えバキュロウイルスにも関し、前記ＤＮＡ領域はコンピテント細胞で機能的な少なくとも１個の複製起点とウイルスの相補機能をコードする核酸を含む。
本発明の範囲で使用される組換えを可能にする配列は一般に５〜１００塩基対、より好ましくは５０塩基対未満を含む。これらの配列は種々の構造クラス、特にＰ１バクテリオファージのリコンビナーゼ又はトランスポゾンのリゾルベースのファミリーに分類できる。
バクテリオファージ１のインテグラーゼのファミリーに属するリコンビナーゼとしては、特にλファージのインテグラーゼ（Ｌａｎｄｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９７（１９７７）１１４７）、Ｐ２２及びＦ８０（Ｌｅｏｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（１９８５）４４６８）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＨＰ１（Ｈａｕｓｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１９９２）６８５９）、Ｐ１ファージのＣｒｅインテグラーゼ、プラスミドｐＳＡＭ２のインテグラーゼ（ＥＰ３５０３４１）又は酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのプラスミド２μｍのＦＬＰリコンビナーゼを挙げることができる。
Ｔｎ３トランスポゾンのファミリーに属するリコンビナーゼとしては、特にＴｎ３トランスポゾン又はｇｄ、Ｔｎ２１及びＴｎ５２２トランスポゾンのリゾルベース（Ｓｔａｒｋら，１９９２）、ｍｕバクテリオファージのＧｉｎインベルターゼ又はＲＰ４のｐａｒフラグメントのリゾルベースのようなプラスミドのリゾルベース（Ａｂｅｒｔら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２（１９９４）１３１）を挙げることができる。
好ましい実施態様によると、本発明の組換えバキュロウイルスにおいて部位特異的組換えを可能にする配列はバクテリオファージから誘導される。バクテリオファージの付着配列（ａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列）又は誘導配列がより好ましい。これらの配列は特にインテグラーゼと呼ばれるリコンビナーゼの存在下で相互に特異的に組換えが可能である。厳密な例としては、特にファージλ、Ｐ２２、Ｆ８０、Ｐ１、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＨＰ１又はプラスミドｐＳＡＭ２もしくは２μｍの付着配列を挙げることができる。
更に好ましくは、部位特異的組換えを可能にする配列は、Ｐ１ファージの組換え系である。Ｐ１ファージはｌｏｘ  Ｐ部位と呼ばれる３４塩基対のヌクレオチド配列を特異的に認識するＣｒｅと呼ばれるリコンビナーゼをもつ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０（１９８１）４６７）。この配列は８ｂｐの保存配列に分離された２個の１３ｂｐのパリンドローム配列から構成されている。ＬｏｘＰ配列又は誘導配列とＣｒｅリコンビナーゼを使用することにより部位特異的組換えを得ると有利である。
誘導配列なる用語は、適当なリコンビナーゼの存在下に特異的に組換えを行う能力を維持しながら、上記組換え配列の修飾により得られる配列を意味する。例えば、これらの配列の短縮フラグメントでもよいし、逆に他の配列（制限部位等）の付加により拡張したフラグメントでもよい。また、突然変異、特に点突然変異により得られる変異体でもよい。
従って、本発明の好ましい態様によると、部位特異的組換えを可能にする配列はＰ１バクテリオファージのＬｏｘＰ配列であり、組換えはＣｒｅタンパク質の存在下に得られる。この点では、組換えはコンピテント細胞とＣｒｅリコンビナーゼの直接接触又はコンピテント細胞におけるＣｒｅリコンビナーゼをコードする遺伝子の発現により得られる。対応する遺伝子の発現の誘導により細胞でＣｒｅリコンビナーゼを生産すると有利である。例えばリコンビナーゼをコードする遺伝子を誘導プロモーターの制御下におくか、又は調節可能な形態で構築すると有利である。この点では、ＣｒｅとＣｒｅの活性を調節することが可能なステロイドホルモン（エストラジオール、プロゲステロン等）の固定ドメインの融合を使用し、組換えイベントを誘導すると有利である（Ｍｅｔｚｇｅｒら，ＰＮＡＳ  ９２（１９９５）６９９１）。より一般には、リコンビナーゼの発現は調節下又は非調節下の任意強力プロモーターにより制御することができる。発現カセットは実施例に記載するようにコンピテント細胞にトランスフェクトしてもよいし、コンピテント細胞のゲノムに組み込んでもよい。
従って、このシステムはウイルス、特にアデノウイルスの高レベルの相補機能をコンピテント細胞で生成する複製分子を作製することができる。この種の構築物は高度欠損ゲノム、特に後期遺伝子を欠損するアデノウイルスゲノムの相補に特に適している。従って、本発明の特定構築物は、順方向に配置された２個のＬｏｘＰ配列に挟まれた少なくとも１個のＤＮＡ領域をそのゲノムに挿入したバキュロウイルスであり、前記ＤＮＡ領域はコンピテント細胞で機能的な少なくとも１個の複製起点と、アデノウイルスの相補機能をコードする核酸を含む。相補機能はＥ１、Ｅ２及びＥ４領域に存在する極初期遺伝子の全部又は一部を含むと有利である。より好ましくは、相補機能は極初期遺伝子と後初期遺伝子の全部又は一部を含む。好ましくは、相補機能は全コーディングウイルス配列を欠失する組換えアデノウイルスの相補を可能にする。特に、相補機能はＩＴＲとパッケージング領域を除くアデノウイルスゲノム全体から構成される。特定態様によると、相補機能はパッケージング領域を欠失する以外は完全なアデノウイルスゲノム（Ａｄ．Ｐｓｉ−）から構成される。このゲノムは特に、切除後にコンピテント細胞でゲノムの複製に利用されるＩＴＲを含む。
従って、エピソーム分子の複製をなし遂げるためには、エピソーム分子は使用するコンピテント細胞で機能する複製起点を含む。この複製起点は分子の大量増幅を可能にするアデノウイルスの固有ＩＴＲ配列から構成されることが好ましい。好ましくはコンピテント細胞で２０倍を越えるウイルスＤＮＡ増幅を可能にする別の複製起点でもよい。例えばＥＢＶウイルスの起点ＯｒｉＰ／ＥＢＮＡ１又はパピローマウイルスのＥ２領域を挙げることができる。当然のことながら、アデノウイルスのＩＴＲ配列は好ましい実施態様を構成する。
本発明の方法を実施するためには、一般に細胞生存率をさほど損なわずに大きな細胞集団に感染することが可能な感染多重度（ＭＯＩ）でヘルパーバキュロウイルスを使用する。一般に、感染多重度は特に１０〜１０００である。ＭＯＩは細胞１個当たりのウイルス粒子数に対応する。ＭＯＩは、使用するコンピテント細胞に応じて主に感染効率と毒性の２つの基準に基づいて当業者により容易に調整可能である。ヘルパーバキュロウイルスに使用するＭＯＩは２０〜５００が有利である。
ウイルスゲノムの導入
上述のように、本発明の方法はヘルパーバキュロウイルスと組換えウイルスゲノムをコンピテント細胞に導入するものである。この点では、欠損組換えアデノウイルスのゲノムを種々の方法でコンピテント細胞に導入することができる。
まず、有利にはＲＣＡを除去した精製欠損組換えアデノウイルスを利用できる。この場合には、コンピテント細胞に欠損組換えアデノウイルスとヘルパーバキュロウイルスを感染させる。組換えアデノウイルスの感染により、対応するゲノムをコンピテント細胞に導入することができ、その後、増幅及びパッケージングし、ＲＣＡを含まない高力価ストックを生成する。この実施態様は第１世代のウイルス（Ａｄ−ΔＥ１；Ａｄ−ΔＥ１，Ｅ３）を製造するのに特に有利である。実際に、これらのウイルスはＲＣＡの汚染なしに高力価で製造するのは難しい。本発明の方法によると、第１世代の欠損組換えアデノウイルスから出発し、Ｅ１領域を含むバキュロウイルスと共にコンピテント細胞に同時感染することにより、高品質の濃縮ストックを得ることが可能になった。この実施態様はそのゲノムの２又は３個の主要領域（特にＥ１、Ｅ２、Ｅ４）を欠損するウイルスの製造にも有利である。一般に、この実施態様はアデノウイルス感染効率が非常に高く（ＤＮＡトランスフェクション効率を上回る）、従って濃縮ストックを生成できるので有利である。この実施態様では、細胞生存率をさほど損なわずに大きい細胞集団に感染可能な感染多重度（ＭＯＩ）で組換えアデノウイルスと組換えバキュロウイルスを使用することができる。バキュロウイルスに使用するＭＯＩは上記の通りである（１０〜１０００）。アデノウイルスについては、１〜１０００が有利であり、好ましくは１〜５００、より好ましくは１〜１００である。アデノウイルスに使用するＭＯＩは選択する細胞型によっても異なる。ＭＯＩ範囲は例えば別個のマーカー遺伝子を含むバキュロウイルスとアデノウイルスを使用して感染効率と競合を測定することにより、当業者により容易に決定することができる。より好ましくは、アデノウイルスのＭＯＩは５０未満、例えば１〜２０である。
特に有利な実施態様によると、欠損組換えアデノウイルスのゲノムをＤＮＡとして導入する。この場合には、場合によりトランスフェクションを助長する物質（脂質、リン酸カルシウム等）の存在下でトランスフェクションによりゲノムを導入する。このように導入する組換えゲノムは種々の技術によりｉｎ  ｖｉｔｒｏ作製することができ、特に大腸菌（ＷＯ９６／２５５０６）又は酵母（ＷＯ９５／０３４００）で作製できる。この実施態様はＲＣＡのない第１世代の欠損組換えウイルスを製造するのに特に有用であり、その後、前記実施態様により高力価ストックを製造するために使用することができる。
別の組換えバキュロウイルスを使用することにより欠損組換えアデノウイルスのゲノムを導入することもできる。この実施態様によると、例えば上述のように欠損組換えアデノウイルスのゲノムを作製した後、コンピテント細胞で切除可能なカセットの形態でバキュロウイルスに導入する。この実施態様によると、欠損組換えアデノウイルスのゲノムをもつバキュロウイルスと（相補機能をもつ）１個以上のヘルパーバキュロウイルスの存在下にコンピテント細胞をおく。この実施態様は高度欠損組換えアデノウイルスの製造に特に有利である。このシステムによると、実際に高度欠損組換えゲノムと対応する相補機能をコンピテント細胞集団に同時に多量に導入することができる。
従って、この点では、本発明の方法は欠損組換えアデノウイルスのゲノムをもつバキュロウイルスと、相補機能をもつ１個以上のヘルパーバキュロウイルスをコンピテント細胞に同時感染するものである。この実施態様で使用するＭＯＩも、使用するバキュロウイルスの各々について１０〜１０００である。
従来技術では最小アデノウイルスの製造に、（１）ＩＴＲ間にクローニングし、固有制限部位により挟まれた導入遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）又は（２）導入遺伝子の５’に順方向にクローニングした右及び左ＩＴＲの２種の構築が実施されている（Ｆｉｓｈｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１７（１９９６）１１；Ｋｕｍａｒ−Ｓｉｎｇｈら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５（１９９６）９１３）。最小アデノウイルスは直鎖状（１）又は環状（２）ＤＮＡのトランスフェクションにより２９３細胞で生産されており、ミニゲノムの複製及びパッケージングに必要なウイルスタンパク質はヘルパーウイルス（ＡｄΔＥ１）によりトランス導入される。最小アデノウイルスは干渉欠損（ＩＤ）粒子として挙動し、連続継代中に漸進的に増幅される。この方法の使用による主な問題は、ヘルパーウイルスによるストックの汚染の原因となる２種の生成粒子の分離と、こうして得られる最小アデノウイルスの力価が非常に低い（１０8ｐｆｕ／ｍｌ未満）ことである。
本発明によると、アデノウイルスミニゲノムを送達するためのバキュロウイルスと、トランス相補機能全体（相補ゲノム）を導入するためのバキュロウイルスを使用することにより、最小アデノウイルスをを製造することが初めて可能になった。
組換えアデノウイルスゲノムはヘルパーバキュロウイルスについて記載したように、コンピテント細胞で部位特異的組換えを可能にする２つの配列の間でバキュロウイルスに導入すると有利である。
本発明は特に、ｌｏｘＰ／Ｃｒｅ系によりアデノウイルスミニゲノムを送達するためのバキュロウイルスと、同様にＣｒｅ／ｌｏｘＰ系によりトランス相補機能全体（相補ゲノム）を導入するためのバキュロウイルスを使用する最小アデノウイルスの製造システムに関する（図２〜４参照）。
別の実施態様によると、相補機能を送達するために使用する部位特異的組換えシステムは組換えアデノウイルスのゲノムを送達するために使用するシステムと異なる。特に、欠損アデノウイルスゲノムを送達するためにＬｏｘＰ／Ｃｒｅ系を使用し、相補機能を送達するためにＡｔｔＰ／ＡｔｔＢ系を使用することができる。
従って、本発明の方法は、全コーディングウイルス配列を欠失し、ＩＴＲとパッケージングシグナルのみを含むアデノウイルスベクター（最小アデノウイルス）を構築することができる。このベクターは理論的には３７ｋｂまでの外来配列を含むことができるが、実際のベクターのクローニング能は８．５ｋｂ以下である。従って、それらの全調節エレメント（プロモーター、エンハンサー、イントロン等）を使用してジストロフィン遺伝子（１４ｋｂ）等の大きい寸法の遺伝子をクローニングすることができ、標的組織で最適発現が得られる。更に、免疫原ウイルス配列が全く存在しないため、休止組織で導入遺伝子の発現期間を延ばすことができる。
欠損ＡＡＶ又はレトロウイルスのゲノムも上記方法によりウイルス、ゲノム又はプラスミドとして導入することができる。
コンピテント細胞
本発明の方法は種々の細胞で実施することができる。本発明の意味で「コンピテント細胞」とは、バキュロウイルスと製造しようとするウイルスの感染が可能であり、後者の生産ウイルス周期を可能にする細胞を意味する。細胞のこれらのウイルスの感染能は、大腸菌のＬａｃＺ遺伝子等のマーカー遺伝子を発現する組換えウイルスを使用することにより決定することができる。このような細胞としては哺乳動物細胞が好ましく、ヒト起源の細胞がより好ましい。使用するコンピテント細胞は休止細胞でも活性分裂細胞でもよく、樹立細胞系でも一次培養物でもよい。工業用途に適合可能な哺乳動物細胞、即ち病原性が認められず、培養可能であり、場合により適当な条件下で保存可能なものが有利である。使用する細胞は肝、筋、繊維芽、胚、神経、上皮（肺）又は眼（網膜）細胞が有利である。非限定的な例として、２９３細胞もしくは補助相補機能を含む任意誘導細胞（２９３Ｅ４、２９３Ｅ２ａ等）、Ａ５４９細胞、ＨｕＨ７細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ヒト網膜芽細胞（ＨＥＲ、９１１）、ＨｅＬＡ細胞、３Ｔ３細胞又はＫＢ細胞を挙げることができる。
本発明の方法を実施するためには、組換えウイルスのゲノムとバキュロウイルスを同時又は時間的に間をおいてコンピテント細胞集団に導入することができる。細胞を組換えゲノムとヘルパーバキュロウイルスに同時に接触させると有利である。複製分子をｉｎ  ｖｉｖｏ生成するシステムの場合には、リコンビナーゼを前以て、同時又は後で導入又は発現させる。
ウイルスが生産されると、一般に細胞が溶解する。従って、生産されたウイルスは細胞溶解後に公知精製法により回収することができる。その後、目的用途に応じて種々の方法でパックすることができる。また、場合によりコンピテント細胞に浸透しなかった微量のバキュロウイルス（ヘルパーバキュロウイルス又は組換えウイルスゲノムを導入するバキュロウイルス）によるウイルスストックの汚染の危険を避けるためには、次の方法を適用することができる。
−出願ＦＲ９６／０８１６４に記載の方法に従い、クロマトグラフィーによりアデノウイルスを精製することができる。この方法は場合により残留するバキュロウイルスからアデノウイルスを完全に分離することができる。
−有機溶剤（例えばエーテル、クロロホルム）を精製アデノウイルスストックに作用させてもよい。実際に、バキュロウイルスはエンベロープ（糖タンパクエンベロープ）をもつウイルスであるため、（そのエンベロープから脂質を抽出する）全有機溶剤に非常に感受性であるが、アデノウイルスはエンベロープをもたないので、同一溶剤の作用が全くない。
−ＣｓＣｌ勾配精製により場合により残留するバキュロウイルスと組換えウイルスを密度により分離することもできる。
これらの３種の方法は独立して使用してもよいし、併用してもよい。更に、当業者に公知の他の任意の方法も使用することができる。
ウイルスの使用
こうして製造したウイルスはｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子クローニング、導入及び発現に使用することができる。このような目的遺伝子は例えば酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン（例えばインターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ等）（ＦＲ９２０３１２０）、成長因子、神経伝達物質又はその前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子（例えばＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５等）、アポリポタンパク質（例えばＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ等）（ＷＯ９４／２５０７３）、ジストロフィン又はミニジストロフィン（ＷＯ９３／０６２２３）をコードする遺伝子、腫瘍抑制遺伝子（例えばｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｆ等）（ＷＯ９４／２４２９７）、因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ等の凝血関与因子をコードする遺伝子、自殺遺伝子（例えばチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ等）、更には天然又は人工免疫グロブリン（Ｆａｂ、ＳｃＦｖ等、ＷＯ９４／２９４４６）の全部又は一部等を挙げることができる。目的遺伝子は標的細胞で発現されると遺伝子の発現又は細胞ｍＲＮＡの転写を制御することが可能なアンチセンス遺伝子又は配列でもよい。このような配列はヨーロッパ特許第１４０３０８号に記載の方法に従い、例えば標的細胞で細胞ｍＲＮＡの相補的ＲＮＡに転写すると、そのタンパク質翻訳を阻止することができる。目的遺伝子はワクチン製造の目的では、免疫応答を生じることが可能な抗原性ペプチドをコードする遺伝子でもよい。このような遺伝子としては特に、エプスタイン−バールウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＥＰ１８５５７３）、疑狂犬病ウイルスの特異抗原ペプチド、又は腫瘍特異抗原ペプチド（ＥＰ２５９２１２）が挙げられる。遺伝子は目的産物をコードする任意ＤＮＡ（ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ等）であり得、場合により適当な発現シグナル（プロモーター、ターミネーター等）を含む。
これらのウイルスはこれらの組換えタンパク質の製造にｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用することができる。これらのタンパクの作用メカニズムを研究するため又は遺伝子発現もしくはプロモーター活性の調節を研究するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用することもできる。動物モデル又はトランスジェニック動物の作出のためにｉｎ  ｖｉｖｏで使用することもできる。遺伝子又は細胞治療アプローチで動物又はヒトに遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏ導入及び発現させるためにも使用することができる。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は単に例示であり、発明を限定するものではない。
図面の説明
図１：ｂａｃｕｌｏ−Ｅ１，Ｅ４を使用した第３世代欠損組換えアデノウイルス（Ｅ１及びＥ４機能を欠損）の製造スキーム。
図２〜４：欠損アデノウイルスゲノムを導入するための第１のバキュロウイルスと相補機能を導入するための第２のバキュロウイルスを使用した最小アデノウイルスの製造スキーム。
図５：ｂａｃｕｌｏ−Ｒｅｐ／Ｃａｐを使用したＲｅｐ及びＣａｐ機能を欠損する組換えＡＡＶの製造スキーム。
実施例
１．使用した細胞
本発明の範囲で使用する細胞はアデノウイルス、ＡＡＶ又はレトロウイルスとバキュロウイルスにより感染可能であり、治療目的の使用に適合可能な任意細胞系又は細胞集団に由来するものを利用できる。哺乳動物、特にヒト細胞が好ましい。特に以下の細胞を挙げることができる。
−２９３系細胞
２９３系はアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）のゲノムの左側末端（約１１〜１２％）を含むヒト胎児腎細胞系であり、左側ＩＴＲ、パッケージング領域、Ｅ１ａ，Ｅ１ｂを含むＥ１領域、ｐＩＸタンパク質をコードする領域及びｐＩＶａ２タンパク質をコードする領域の一部を含む（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）。この系はＥ１領域を欠損即ちＥ１領域の全部又は一部を欠失する組換えアデノウイルスをトランス相補することができ、高力価をもつウイルスストックを生産することができる。
−Ａ５４９系細胞
アデノウイルスのＥ１領域を相補する細胞をＡ５４９細胞から構築した（Ｉｍｌｅｒら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９６）７５）。これらの細胞は、誘導プロモーターの制御下におかれたＥ１領域から左側ＩＴＲを除去したフラグメントを含む。
−ＨＥＲ系細胞
ヒト胎児網膜細胞（ＨＥＲ）はアデノウイルスにより感染可能である（Ｂｙｒｄら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２（１９８８）４７７）。これらの細胞から作製したアデノウイルスパッケージング細胞は例えば国際出願ＷＯ９４／２８１５２又はＦａｌｌａｕｘらの論文（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９６）２１５）に記載されている。具体的には、ＨＥＲ細胞のゲノムに組み込まれたヌクレオチド７９〜ヌクレオチド５７８９のアデノウイルスＡｄ５のゲノムのＥ１領域を含む９１１系を挙げることができる。この細胞系はＥ１領域を欠損するウイルスを生産することができる。
−ＩＧＲＰ２細胞
ＩＧＲＰ２細胞は誘導プロモーターの制御下のＥ４領域の機能ユニットを組み込むことにより２９３細胞から得られる細胞である。これらの細胞はＥ１及びＥ４領域を欠損するウイルスを生産することができる（Ｙｅｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（１９９６）７０）。
−ＶＫ細胞
ＶＫ（ＶＫ２−２０及びＶＫ１０−９）細胞は誘導プロモーターの制御下のＥ４領域全体とｐＩＸタンパク質をコードする領域を組み込むことにより２９３細胞から得られる細胞である。これらの細胞はＥ１及びＥ４領域を欠損するウイルスを生産することができる（Ｋｒｏｕｇｌｉａｋら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６（１９９５）１５７５）。
−２９３Ｅ４細胞
２９３Ｅ４細胞はＥ４領域全体を組み込むことにより２９３細胞から得られる細胞である。これらの細胞はＥ１及びＥ４領域を欠損するウイルスを生産することができる（ＷＯ９５／０２６９７；Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９５）３２２）。
−Ｓｆ９及びＳｆ２１細胞は鱗翅目胚細胞である。これらの細胞は寄託菌（Ｎｏ．ＣＲＬ−１７１１  ＡＴＣＣ）とその培養条件で入手できる。市販品もある（Ｇｉｂｃｏ）。ＫｉｎｇとＰｏｓｓｅｅ：Ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｌｏｎｄｏｎ：Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ，１９９２も参照されたい。
−ヒト肝細胞
ＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂ及びＨｕＨ７細胞は肝細胞癌に由来するヒト細胞系である。これらの細胞は寄託菌から入手でき、その性質は例えば米国特許第４，３９３，１３３号及び４，３９３，１３３号に記載されている。
−ヒトＫＢ細胞系：ヒト上皮癌に由来し、ＡＴＣＣ（ＣＣＬ１７）及びその培養条件から入手可能である。
−ヒトＨｅｌａ細胞系：ヒト上皮癌に由来し、ＡＴＣＣ（ＣＣＬ２）及びその培養条件から入手可能である。
−Ｗ１６２細胞系：これらの細胞はアデノウイルスＡｄ２のＥ４領域をそのゲノムに組み込んだｖｅｒｏ細胞である。これらの細胞はＷｅｉｎｂｅｒｇら（ＰＮＡＳ８０（１９８３）５３８３）により記載されている。
２．ヒト細胞の組換えバキュロウイルス感染
本実施例はバキュロウイルスのヒト起源細胞への感染能に関する。
ＲＳＶのＬＴＲの制御下にＬａｃＺ遺伝子を発現する組換えバキュロウイルスの溶液の種々の希釈液をヒト細胞（特に２９３又はその誘導体）に感染させる。感染から４８時間後に青色細胞の出現が認められ、これらの細胞にバキュロウイルスを感染できることが判明する。
３．アデノウイルスのＥ１領域を発現するバキュロウイルスおよび対応する欠損アデノウイルスの構築
３−１  ２種のＥ１発現カセットのクローニング
プラスミドＡＥ２はオリゴヌクレオチド５’−ＴＣＣＴＴＧＣＡＴＴＴＧＧＧＴＡＡＣＡＧ−３’及び５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣＴＴＣ−３’を用いてｐＢＲＥ３１で実施したＰＣＲの産物をＰＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングすることにより得られ、このＰＣＲ産物はＡｄ５のヌクレオチド３１９８〜３５１１即ちＥ１Ｂ領域の３’末端を含む。プラスミドｐＢＲＥ１はほぼヌクレオチド１３００〜２３００を欠失するｐＢＲ３２２にクローニングしたＡｄ５のヌクレオチド１〜５７８８を含む。
プラスミドＡＥ３はｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＮｏｔＩ−ＫｐｎＩで消化し、ＰＣＲ産物を含むＡＥ２のＮｏｔＩ−ＫｐｎＩフラグメントをクローニングすることにより得られる。ＡＥ３はＡｄ５のヌクレオチド３１９８〜３５１１とそれに後続するＢＧＨのポリアデニル化部位を含む。
プラスミドＡＥ４はｐＢＲＥ１にＡＥ３のＢｇｌＩＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントをクローニングすることにより得られる。ＡＥ４は以下のＥ１発現カセットを含むプラスミドである。
−Ａｄ５のヌクレオチド１〜３５１１、即ち左側ＩＴＲ、パッケージング配列、Ｅ１Ａプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂプロモーター、Ｅ１Ｂ遺伝子、
−ｐＣＤＮＡ３に由来するウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）のポリＡ。
ｐＢＲＥ１をＢｓｔＮＩで消化した後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで消化して５’付着末端を平らにした後、ＸｂａＩで消化した。こうして作製したＡｄ５のヌクレオチド３９１〜１３３９を含むフラグメントをＳｍａＩ−ＸｖａＩ（非メチル化部位）で消化したｐｉｃ２０Ｈに導入し、プラスミドＡＥ５を作製した。
プラスミドＡＥ６はＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩで消化したＡＥ４にＡＥ５のＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩフラグメントをクローニングすることにより得られる。ＡＥ６は以下のＥ１発現カセットを含むプラスミドである。
−Ａｄ５のヌクレオチド３９１〜３５１１、即ちＥ１Ａの「短縮」プロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂプロモーター、Ｅ１Ｂ遺伝子、
−ｐＣＤＮＡ３に由来するウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）のポリＡ。
３−２  前記２種のＥ１カセットのバキュロウイルスクローニング
プラスミドＡＥ４及びＡＥ６の（付着５’末端ＳｐｈＩをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ消化により予め平滑にしておいた）ＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩフラグメントをプラスミドｐＡｃＳＧ２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶ部位間にクローニングする。こうして夫々プラスミドＡＥ１４及びＡＥ１５を作製する。いずれの場合も、多面体遺伝子の遺伝子座にＥ１領域を導入する。
プラスミドＡＥ１４及び１５をＡｃＮＰＶ株（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に由来するバキュロウイルスＢａｃｕｌｏＧｏｌｄのＤＮＡと共に昆虫細胞Ｓｆ９に同時トランスフェクトし、多面体の遺伝子の遺伝子座に組み込まれた２種のＥ１発現カセットをもつ対応する２種の組換えバキュロウイルスＢａｃＡＥ１４及びＢａｃＡＥ１５を作製する。
３−３  新規Ｅ１欠失をもつ組換えアデノウイルスのクローニング
プラスミドｐＣＯ１（ＷＯ９６／１００８８）をＢｓｔＸＩで消化した後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで消化して付着３’末端を除去した後、ＲｓａＩで消化した。こうして作製されたＡｄ５のヌクレオチド３５１３〜４６０７を含むフラグメントを、ＥｃｏＲＶで直鎖化してウシアルカリホスファターゼで消化しておいたｐＢＳ−ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に導入し、プラスミドＡＥ０を作製した。
プラスミドｐＭＡ３７は以下のフラグメントの連結により得られる。
−ｓａｃＢを含むｐＸＬ２７５６のＥｃｏＲＶ−ＮｓｉＩはそのＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩ部位を除去した逆選択遺伝子ＳａｃＢと、カナマイシン耐性遺伝子と、クローニング多重部位と、ＣｏｌＥ１複製起点をもつ。
−（アデノ配列を含む）ｐＣＯ１のＮｄｅＩ−ＮｓｉＩ。
−ｐＸＬ２７５６（カナマイシン耐性ベクター）のＳａｌＩ（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼにより平らにした付着５’末端）−ＡｓｅＩ。
従って、ｐＭＡ３７は、
−カナマイシン耐性遺伝子と、
−これを発現する細菌にスクロース感受性を付与するＳａｃＢ遺伝子と、
−Ａｄ５の１〜３８２配列（ＨｉｎｆＩ）とそれに続くＡｄ５の３４４６〜４４１５配列（ＮｓｉＩ）を含み、導入遺伝子は存在しない。
ＳａｌＩ−ＮｓｉＩで消化したｐＭＡ３７にＡＥ０のＸｈｏＩ−ＮｓｉＩフラグメントを導入することによりプラスミドＡＥ１１を構築した。従って、このプラスミドは、
−カナマイシン耐性遺伝子と、
−これを発現する細菌にスクロース感受性を付与するＳａｃＢ遺伝子と、
−Ａｄ５の１〜３８２配列（ＨｉｎｆＩ）とそれに続くＡｄ５の３５１３〜４４１５配列（ＮｓｉＩ）を含み、導入遺伝子は存在しない。
次に、プラスミドＡＥ１１から（目的導入遺伝子の挿入により）大腸菌で組換えにより組換えアデノウイルスの構築を可能にする自殺シャトルベクターを構築する。ＡＥ１１はプラスミドＡＥ６と相同の配列を含まない。プラスミドＡＥ１１及びＡＥ４は共通してＥ１Ａの上流にＡｄ５の１〜３８２配列（Ｈｉｎｆ）を含むが、これらの２種のプラスミド間でＥ１カセットの下流に相同は存在しない。従って、ＡＥ１１に存在するＥ１欠失（即ち３８２〜３５１３）をもつアデノとバキュロウイルスＢａｃＡＥ１４又はＢａｃＡＥ１５の間の相同組換えによりＲＣＡが発生する可能性はない。
３−４  第１世代組換えアデノウイルスの構築
まず、慣用技術に従ってＢａｃＡＥ１４又は１５のストックを調製する。次に、ＰａｃＩで消化したプラスミドｐＸＬ２８２２（プラスミドｐＸＬ２８２２は完全Ａｄ５からＥ１（３８２〜３４４６又は３８２〜３５１３）とＥ３（２８５９２〜３０４７０）を欠失し、カセットＣＭＶ−βＧａｌをもつ）５ｇをコンピテント細胞（例えばＨｕＨ７）にトランスフェクトし、同時又は非同時に、ＭＯＩ  １０〜１０００でＢａｃＡＥ１４又は１５を感染させる。細胞が溶解したら、トランスフェクション上清を回収し、その後、予め又は同時にＢａｃＡＥ１４又は１５（ＭＯＩ  １０〜１０００）を感染させた「新規」コンピテント細胞に加えてアデノウイルスＡｄ２８２２を増幅し、Ａｄ２８２２のストックが得られるまで同様に操作する。Ａｄ２８２２の増幅のモニターはこのウイルスにおけるｌａｃＺの存在によりできる。各増幅毎に上清をＷ１６２で疑似力価測定する。増幅時にウイルスのゲノムを分析し、その完全性を確認する。最後に、このストラテジーは、こうして製造したアデノウイルスストックにＲＣＡを生じる可能性がないという利点がある。この汚染の不在も確認する。
４．アデノウイルスのＥ１及びＥ４領域を発現するバキュロウイルスの構築
４−１  バキュロウイルスＥ１，Ｅ４（Ｂａｃ．Ｅ１−Ｅ４）の構築
以下のプロトコールを使用する。シャトルベクターｐＢａｃＰＡＫ８（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，米国）の多面体の遺伝子（Ｐｈ）の遺伝子座にＥ１及びＥ４領域を逆向きにクローニングし、ｐＢａｃＥ１−Ｅ４を得る。次に、慣用技術によりｐＢａｃＥ１−Ｅ４とバキュロウイルスＢａｃＰＡＫ６のＤＮＡをＳｆ９細胞にコトランスフェクトすることにより組換えバキュロウイルスを単離する（ＫｉｔｔｓとＰｏｓｓｅｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４（５）（１９９３）８１０）。次に、感染Ｓｆ９細胞からＰＣＲにより組換えバキュロウイルスのゲノム中のＥ１及びＥ４の存在を確認する。精製組換えバキュロウイルスを感染させたＨｕｈ７細胞へのＥ１及びＥ４の転写を細胞質ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより分析する。
バキュロウイルスＥ１−Ｅ４を構築するためには、Ｅ１をもつ種々のフラグメントを導入することができる。本実施例で使用するフラグメントはバキュロウイルス−Ｅ１の構築に関して実施例３に記載したものであり、適正なプロモーター（短縮Ｅ１ａプロモーター及びＥ１ｂプロモーター）に制御下のＥ１領域を含む。使用するＥ４フラグメントは以下の通りである。
−完全なＥ４をもつＭａｅＩＩ−ＭｓｃＩ  ３２７２０〜３５８３５フラグメント、
−ＯＲＦ６をもつＢｇｌＩＩ−ＰｖｕＩＩ  ３４１１５〜３３１２６フラグメント、
−ＯＲＦ６−ＯＲＦ６／７をもつＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩ  ３４１１５〜３２４９０フラグメント、
−ＯＲＦ３をもつＰｖｕＩＩ−ＡｌｕＩ  ３４８０１〜３３４３２９フラグメント。
これらのフラグメントはＥ４プロモーターの制御下においてもよいし、他のプロモーター、特にＨＳＶ−ＴＫ、ＣＭＶ又はＬＴＲ−ＲＳＶプロモーターの制御下においてもよい。
上記位置はデータベースから入手可能なアデノウイルスＡｄ５の公表配列に基づく。種々の血清型のアデノウイルスには多少の相違が存在する場合もあるが、これらの位置は一般に他の血清型、特にＡｄ２、Ａｄ７、Ａｄ１２及びＡｄＣＡＶ−２にも適用できる。
４−２  Ｂａｃ．Ｅ１−Ｅ４によるＡｄΔＥ１ΔＥ４−ＬａｃＺのトランス相補
アデノウイルスＡｄΔＥ１ΔＥ４−ＬａｃＺの生産は、実施例４−１で調製したバキュロウイルスＥ１，Ｅ４とＥ１及びＥ４を欠損するアデノウイルスゲノムをコンピテント細胞に導入することにより得られる（図１参照）。精製Ｂａｃ．Ｅ１−Ｅ４のトランス相補によるコンピテント細胞におけるＡｄΔＥ１ΔＥ４−ＬａｃＺの最適生産条件を分析する。Ｗ１６２系におけるβ−ガラクトシダーゼのトランスダクション単位（ｔ．ｄ．ｕ．）数としてＡｄΔＥ１ΔＥの力価を測定し、得られたトランスン相補効率をパッケージング系ＩＧＲＰ２の効率と比較する。
５．アデノウイルスのゲノムの全体を相補するバキュロウイルスの構築
１３ｋｂまでの配列に相当し得る数種のタンパク質を単一ウイルスから同時発現することは報告されている（ＢｅｌｙａｅｖとＲｏｙ，ＮＡＲ  ２１（１９９３）１２１９）が、バキュロウイルスの最大クローニング能は十分に実証されていない。本実施例は、パッケージングシグナルを欠失し（Ａｄ．Ｐｓｉ−）、２個のＬｏｘＰ部位で挟まれたアデノウイルス（ｌｏｘＰ−ＩＴＲ−ＩＴＲ〜Ｅ４−ｌｏｘＰ）のゲノムをバキュロウイルスにクローニングできることを立証する。Ｃｒｅリコンビナーゼを誘導的又は非誘導的（Ｃｒｅ又はＣｒｅ−ＥＲ系、実施例７参照）に発現するコンピテント細胞にこの組換えバキュロウイルスを感染させ、Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化させると、アデノウイルスゲノムの切除と環化が可能になる。以後、アデノウイルスゲノムは初期遺伝子の導入、複製、後期遺伝子の活性化が可能になるが、パッケージングはできないので最小アデノウイルスの製造用ヘルパーとして利用する（図２〜４参照）。このシステムでは、２種のバキュロウイルスのコインフェクションと、ｌｏｘＰ部位間の２回の組換えイベントの実施により最小アデノウイルスを製造する。このアプローチは、ヘルパーウイルスからアデノウイルス粒子を生成しないという利点がある。
ゲノムＡｄ．Ｐｓｉ−の構築は大腸菌で実施する。このために、アデノウイルスＡｄ５の完全ゲノムを原核クローニングベクターにクローニングし、ＩＴＲを結合する。酵素開裂と連結又は部位特異的突然変異誘発によりＰｓｉ配列を除去する。次に、アデノウイルスゲノムの両側に同じ向きにＬｏｘＰ配列を導入する。得られた構築物［ｌｏｘＰ−ＩＴＲ−ＩＴＲ，ΔＰｓｉ〜Ｅ４−ｌｏｘＰ］を次に、実施例３に記載したストラテジーに従ってバキュロウイルスとの組換えを可能にするシャトルベクターにクローニングする。その後、得られた組換えバキュロウイルスＢａｃＡｄ．Ｐｓｉ−を慣用方法により単離する。
６．切除可能な形態で欠損組換えアデノウイルスのゲノムを含むバキュロウイルスの構築
本実施例は欠損組換えアデノウイルスのゲノムをコンピテント細胞に導入することが可能なバキュロウイルスの構築に関する。より詳細には、組換えアデノウイルスはコーディング領域全体を欠損し、ＩＴＲ及びＰｓｉ領域のみを保存している（最小アデノウイルス又はＡｄΔ）。
６−１  大腸菌におけるミニゲノム（ＡｄΔ）の構築
プラスミドＰ［ｌｏｘＰ−（ＩＴＲ−ＩＴＲ−Ｐｓｉ−Ｐ．ＣＭＶ−ＬａｃＺ−ｐＡ）−ｌｏｘＰ］を構築する。このために、アデノウイルスのＩＴＲ配列のコピーを酵素切断により単離及び／又はＰＣＲにより増幅した後、アデノウイルスのシャトルベクターｐＧＹ６３に含まれるＩＴＲ−Ｐｓｉ配列の上流にクローニングする。このベクターはｐＣＯ１（ＷＯ９６／１００８８）に由来し、ＩＴＲ−Ｐｓｉ配列とｐＩＸをコードする遺伝子の間にクローニングしたＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化シグナル（ｐＡ）を末端にもつサイトメガロウイルスの極初期プロモーター（Ｐ．ＣＭＶ）の制御下のＬａｃＺ遺伝子をもつ。次に、（最小アデノウイルスのゲノムに対応する）このベクターの（ＩＴＲ−ＩＴＲ−Ｐｓｉ−Ｐ．ＣＭＶ−ＬａｃＺ−ｐＡ）領域を酵素切断により単離した後、プラスミドｐＢＳ２４６（Ｇｉｂｃｏ）のクローニング多重部位のＬｏｘＰ部位間にクローニングし、プラスミドｐ［ｌｏｘＰ−（ＩＴＲ−ＩＴＲ−Ｐｓｉ−Ｐ．ＣＭＶ−ＬａｃＺ−ｐＡ）−ｌｏｘＰ］を作製する。次に、Ｃｒｅリコンビナーゼ（ＡｄＣｒｅ）を発現するＡｄ．ΔＥ１ΔＥ４を感染させたＩＧＲＰ２系にこのプラスミドをトランスフェクトすることにより、環状ＤＮＡからアデノウイルスのミニゲノムを生産してパッケージングする能力を試験する。ＩＧＲＰ２系でトランスフェクション上清を数世代連続継代することにより、最小アデノウイルスを増幅する。その後、塩化セシウム勾配等密度遠心分離により精製し、Ｗ１６２系で偽滴定により定量する。当然のことながら、慣用分子生物学技術により、ＬａｃＺ遺伝子を他の任意の目的核酸に容易に置き換えることができる。
６−２  切除可能なミニゲノムのバキュロウイルスクローニング
２つのｌｏｘＰ部位に挟まれた上記ミニゲノムＡｄΔをもつ構築物をシャトルベクターｐＡｃＵＷ１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，米国）でバキュロウイルスのＰ１０遺伝子座にクローニングする。次に、バキュロウイルスＢａｃ．ＡｄΔを生産し、上記Ｓｆ９細胞で慣用同時トランスフェクション技術により単離し、Ｘ−Ｇａｌ染色後にプラーク表現型（白色）により選択する。従って、このバキュロウイルスは順方向に２つのｌｏｘＰ領域により挟まれた高度欠損アデノウイルスゲノムをもつ。
６−３  バキュロウイルスＢａｃＡｄＰｓｉ−のトランス相補によるＡｄΔの生産。
アデノウイルスゲノム全体のトランス相補機能をもつバキュロウイルスＢａｃＡｄ．Ｐｓｉ−（実施例５に記載）と、（上記）偽アデノウイルスのゲノムをもつバキュロウイルスＢａｃ．ＡｄΔをコンピテント細胞に同時にコンイフェクトする。培地にタンパク質を加えるか、又はＣｒｅを発現するプラスミドもしくはウイルス（バキュロウイルス）を細胞にトランスフェクトするか、又は（実施例７に記載するような）系のゲノムに安定に組み込んだカセットの発現によりＣｒｅリコンビナーゼを導入する。ＢａｃＡｄ．Ｐｓｉ−と上清をコインフェクトした細胞の培養上清の連続継代により最小アデノウイルスを増幅した後、上記技術により精製及び滴定する。この方法によるとＡｄΔを単独ウイルスとして得られるので、慣用技術によりこれを単離及び精製すればよい。更に、得られる力価は工業用途に適合可能である。
７．Ｃｒｅタンパク質を発現する系の構築
誘導的又は非誘導的にＣｒｅを発現する系を構築し、本発明のバキュロウイルス（例えばＢａｃ．ＡｄΔ及びＢａｃＡｄ．Ｐｓｉ−）におけるｌｏｘＰ部位間の組換え効率を増加すると共に、Ｃｒｅの発現を制御する。この構築物において、Ｃｒｅは誘導的又は非誘導的で好ましくは強力なユビキチンプロモーターの制御下に、エストラジオールレセプター（ＥＲ）結合ドメインとのＣ末端融合タンパク質として又は単独で発現される。より詳細には、使用するプロモーターはｐＧＲＥ５プロモーター、メタロチオニンプロモーター、ＳＶ４０プロモーター又はＨＳＶ−ＴＫ遺伝子のプロモーターである。
これらのＣｒｅ系を構築するために、Ｃｒｅ発現カセット（Ｃｒｅ又はＣｒｅ−ＥＲ）を含むプラスミドと、選択マーカー（Ｎｅｏ）のプラスミドの２種のプラスミドをコンピテント細胞にコトランスフェクトする。Ｇ４１８耐性クローンを選択し、これらのクローンにおけるＣｒｅの活性をプラスミドｐ（Ｐ．ＣＭＶ−ｌｏｘＰ−ＡＴＧ−ｓｔｏｐ−ｐＡ−ＬｏｘＰ−ＬａｃＺ）のコトランスフェクションにより試験する。このプラスミドは、３個のオープンリーディングフレームにおける一連のストップコドンと、２個のｌｏｘＰ部位に挟まれたＳＶ４０ウイルスの転写開始及びポリアデニル化シグナルをプロモーター（Ｐ．ＣＭＶ）とＬａｃＺの始点の間に導入することにより不活化したＬａｃＺ遺伝子を含む。次に、２個のｌｏｘＰ部位間の組換えにより誘導したβ−ガラクトシダーゼ活性によりインデューサー（エストラジオール）の存在下又は不在下でのクローンにおけるＣｒｅの発現を試験する。こうして上記プロモーター及びコンピテント細胞から融合タンパク質Ｃｒｅ−ＥＲ又はＣｒｅタンパク質単独を安定に発現する数個のクローンを選択する。これらのクローンは本発明によるウイルスの製造に使用可能である。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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