(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、コリンに結合しないポリペプチドと、医薬的に許容できる担体又は希釈剤とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
肺炎連鎖球菌に暴露されたか又は感染した対象者において免疫反応を誘発するための医薬の製造のための医薬組成物の使用であって、前記医薬組成物が、コリンに結合しないＮ−末端コリン結合プロテインＡ切端形のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする使用。
【請求項３】
前記医薬が、防御免疫応答を誘導するものである請求項２に記載の使用。
【請求項４】
対象者における肺炎連鎖球菌による感染を防止するための医薬の製造のための医薬組成物の使用であって、前記医薬組成物が、コリンに結合しないＮ−末端コリン結合プロテインＡ切端形のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする使用。
【請求項５】
前記医薬組成物が、気道又は鼻咽頭に送達されるためのものである請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ポリペプチド及び医薬的に許容できるアジュバント又は担体を含むワクチンであって、前記ポリペプチドが、配列番号１又は３で規定されるアミノ酸配列からなり、コリンに結合しないことを特徴とするワクチン。
【請求項７】
ポリペプチドをコードする単離された核酸配列分子と、医薬的に許容できるアジュバント又は担体とを含むワクチンであって、前記ポリペプチドが、配列番号１又は３で規定されるアミノ酸配列からなり、コリンに結合しないことを特徴とするワクチン。
【請求項８】
肺炎連鎖球菌に暴露されたか又は感染した対象者を治療するための医薬の製造のための、請求項６又は７のいずれか１項に記載のワクチンの使用。
【請求項９】
肺炎連鎖球菌に暴露されたか又は感染した対象者における免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、医薬組成物の使用であって、前記医薬組成物が、配列番号１又は３で規定されるアミノ酸配列からなり、コリンに結合しないポリペプチドを有することを特徴とする使用。
【請求項１０】
対象者における肺炎連鎖球菌による感染防止のための医薬の製造のための医薬組成物の使用であって、前記医薬組成物が、配列番号１又は３で規定されるアミノ酸配列からなり、コリンに結合しないポリペプチドを含むことを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
一般に本発明は、Ｎ−末端コリン結合プロテインＡ切端形ポリペプチドに関する。本発明はまた、細菌感染（特に肺炎球菌）に対する防御を提供するかまたは防御抗体を誘発するワクチン、並びに診断および受動免疫療法で使用する前記ポリペプチドに対する抗体および拮抗物質に関する。前記ポリペプチドおよび／または前記ポリペプチドをコードする核酸は、肺炎球菌の細菌性付着因子の競合性抑制物質としてもまた有用である。本発明の最後の目的は、前記ポリペプチドを用いる治療法である。
【０００２】
従来技術
肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）は、侵襲性感染（例えば敗血症、髄膜炎、中耳炎および大葉性肺炎）の主要原因であるグラム陽性菌である（Tuomanen et al., NEJM 322:1280-1284(1995))。肺炎球菌は上下気道の細胞に強力に結合する。ほとんどの細菌のように、肺炎球菌のヒト細胞への付着は、真核細胞の炭水化物にレクチン様態様で結合する細菌表面蛋白質が表出されることによって達成される（D. Cundell & E. Tuomanen, Microb. Pathog. 17:361-374(1994)）。肺炎球菌は、無症候性態様とみなされる経過の１つである非炎症上皮と結合する。侵襲性疾患への変化は、ヒト細胞を活性化させてヒトの細胞上で利用可能なレセプターの数および型を変化させる炎症因子の局所産生を伴う（D. Cundell et al., Nature 377:435-438(1995))。この新しい設定で機会を与えられ、肺炎球菌はこれらの未調節レセプターの１つ、血小板活性化因子（ＰＡＦ）レセプターを利用しこれと嵌合するようである(Cundell et al., Nature 377:435-438(1995))。ＰＡＦレセプターが出現してから数分以内に、一挙に肺炎球菌の吸着および侵入が強化される。例えば、可溶性レセプター類似体による活性化細胞への細菌結合の抑制は、動物モデルでは疾患の進行を阻害する（I. Idanpaan-Heikkila, J. Infect. Dis. 176:704-712(1997))。これについて特に有効なものは、シアリン酸付加または非付加ラクト−Ｎ−ネオテトラオース含有可溶性炭水化物で、これは肺炎球菌のヒト細胞へのin vitro結合を防ぎ、肺でのin vivoコロニー形成を予防する。
【０００３】
コリン結合蛋白質：付着因子候補構造遺伝子：
肺炎球菌は、細胞壁のテイコイル酸またはリポテイコイル酸との非共有結合によって細菌表面と結合できる表面蛋白質類を産生する。肺炎連鎖球菌の表面は、ホスホリルコリンと非共有結合によって結合するコリン結合蛋白質（ＣＢＰ）類で修飾されている。ｃｂｐＡは、キメラ構造を示す７５ｋＤの表面露出コリン結合蛋白質である。固有のＮ−末端ドメインプロリン富裕領域とそれに続くコリン結合に必要な１０の反復領域で構成されるＣ−末端ドメインが存在する。
【０００４】
ｃｂｐＡは、真核細胞の表面に存在する糖共役物含有レセプターに対する付着因子（リガンド）である。ｃｂｐＡに欠損がある変異体は、幼獣ラットモデルの鼻咽頭コロニー形成で毒性の低下を示した。この結合は、テイコイル酸を修飾するコリン決定基を標的とし、同種類の蛋白質のそれぞれに存在する象徴部コリン結合ドメインによって仲介される。このコリン結合ドメインは自己溶解に関する実験でLopezらによって発見され完全に性状が明らかにされた（Ronda et al., Eur. J. Biochem. 164:621-624(1987)）。このドメインを含む他の蛋白質には、肺炎球菌ファージのオートリシンおよびその防御抗原、肺炎球菌表面蛋白質Ａ（ＰｓｐＡ）が含まれる（C. Ronda et al., Eur. J. Biochem. 164:621-624(1987); L.S. McDaniel et al., Microb. Pathog. 13:261-269(1992))。
【０００５】
同種類の他のものとＣ−末端を共有するが、ヒト細胞との結合活性がその固有のＮ−末端ドメインから生ずるｃｂｐＡは鼻咽頭領域でコロニーを形成することができない。コロニー形成過程と発症は第一のステップとしてヒト細胞への肺炎球菌の結合に依存するので、交差反応抗体またはこのドメインを模倣したペプチドの競合抑制によるＮ−末端ドメインの機能の妨害は疾患の阻止に極めて重要であろう。抗肺炎球菌ワクチンのためのコリン結合蛋白質については国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０７１９８号で考察されている（このＰＣＴ出願は参照により本明細書に含まれる）。肺炎連鎖球菌に対する現在のワクチンは、この菌の非常に一般的な２３の血清型の莢膜の精製炭水化物を利用するが、そのようなワクチンは５０％しか防御能をもたず（Shapiro et al., NJEM 325:1453(1991))、２才以下では免疫原性をもたない。さらに、多剤耐性微生物の感染では、治療用ペプチドはオプションとして治療に用いられるであろう。したがって、本発明は、防御ワクチンを提供することにより長い間希求されてきたものに応える。
【０００６】
発明が解決しようとする課題
本発明は、Ｎ−末端コリン結合プロテインＡ切端形のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。本ポリペプチドは、配列番号１、３−７または９−１１に示されるアミノ酸配列（そのフラグメント、変異体、変種、類似体または誘導体を含む）を含む。さらに、本発明は、その三次元構造を表示する配列番号２４に示すアミノ酸をもつＮ−末端コリン結合プロテインＡ切端形のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドおよびそのようなポリペプチドの製造方法を提供する。本単離ポリペプチドは、細菌感染、好ましくは肺炎球菌に対する動物およびヒトの免疫に適している。
本発明のまた別の目的は、レクチン活性をもちコリン結合活性をもたないＮ−末端コリン結合プロテインＡ切端形である。本発明はさらに免疫原性Ｎ−末端コリン結合プロテインＡ切端形またはそのフラグメントを提供する。
【０００７】
本発明はまた単離核酸、例えばリコンビナントＤＮＡもしくはクローン化遺伝子、またはその縮重変種、変異体、類似体、フラグメントに関する。これらは、本単離ポリペプチドをコードするか、または本ポリペプチドの活性を競合的に抑制する。その縮重物、変種、変異体、類似体またはフラグメントを含む本単離核酸は、好ましくは、配列番号１２、１４−１７、１９−２２または２３に示す配列を有する。本発明の別の実施態様では、リコンビナントＤＮＡ分子またはそのようなクローン化遺伝子の完全なＤＮＡ配列は発現制御配列に機能的に連結され、適切なホストに導入される。したがって本発明は、本発明をコードするＤＮＡ配列、より具体的には上記に示した配列から決定されたＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含むクローン化遺伝子またはリコンビナントＤＮＡ分子で形質転換した単細胞ホストを包含する。
【０００８】
本単離ポリペプチドに対する抗体には、自然な状態で生成された抗体および遺伝子組換えによって製造された抗体が含まれる。これらにはポリクローナル抗体および既知の遺伝子技術によって製造されるモノクローナル抗体の両方、並びに二特異性（キメラ）抗体が含まれ、さらに細菌の付着を調節する能力と一緒に診断的用途に適した他の機能も含む抗体、例えば競合剤（ただしこれに限定されない）も含まれる。
【０００９】
本発明のさらに別の目的は、細菌またはそのサブユニットの量または活性を制御するために哺乳類を処置し、侵襲性、偶発性、または特発性病状を治療し、またはそれらの不本意な結果を回避する方法を提供する。本発明は治療で使用する医薬組成物を提供する。これら医薬組成物は、本単離ポリペプチド、それらのサブユニットまたはそれらの結合相手を主成分とする。
最後に、本発明は医薬組成物、ワクチンおよび診断薬並びにそれらを使用する治療方法を提供する。
【００１０】
課題を解決する手段
本発明の目的は、Ｎ−末端コリン結合プロテインＡ切端形のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドである。本ポリペプチドは肺炎球菌の感染に対して動物を免疫する場合の使用に適している。これらのポリペプチドまたはそのフラグメントは、適切なアジュバントとともに製剤化される場合、肺炎球菌および交差反応性蛋白質をもつ他の細菌に対する防御用ワクチンとして用いることができる。
【００１１】
本発明は、Ｎ−末端コリン結合プロテインＡ切端形のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。ある実施態様では、本ポリペプチドは、配列番号１、３−５、７または９−１１のいずれかに示すアミノ酸配列（そのフラグメント、変異体、変種、類似体またはその誘導体を含む）を有する。別の実施態様では、本ポリペプチドはアミノ酸ＫＸＸＥ（配列番号６）を有する。
【００１２】
本発明は、図２に示すＮ−末端コリン結合プロテインＡ切端形のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。ある実施態様では、本ポリペプチドは図２に示す保存領域であるアミノ酸配列を有する。例えば、保存領域にはアミノ酸配列１５８から２１０；１５８から１７２；３００から３２１；３３１から３３９；３５５から３６５；３６７から３７４；３７９から３８９；４０９から４２７；および４３０から４４７が含まれるが、ただしこれらに限定されない。図２は、本発明に包含されるＣｂｐＡのＮ−末端領域の核酸およびアミノ酸配列の種々の血清型の相同性を示す。
【００１３】
さらに、本発明は、その三次元構造を表示する配列番号２４に示すアミノ酸配列をもつＮ−末端コリン結合プロテインＡ切端形のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。ある実施態様では、ポリペプチドはその類似体、フラグメント、変異体または変種である。包含される変種は図２に示されている。本発明はまた、図２に示す血清型４の約１６位から約４７５位のアミノ酸、または図２に示す血清型４に対応するアミノ酸を有するＮ−末端コリン結合プロテインＡ切端形のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。ある実施態様では三次元構造は天然の蛋白質に存在するものと一致する。
【００１４】
本ポリペプチドの製造方法は例えば以下のとおりである：ヒドロキシルアミンで完全長のコリン結合プロテインＡを切断する。この場合、ヒドロキシルアミンは、血清型Ｒ６ｘおよび血清型４の４７５位のアミノ酸アスパラギン（Ｎ）でコリン結合プロテインＡを切断するか、または図２に示す異なる血清型の場合は血清型Ｒ６ｘまたは血清型４に対応するアミノ酸で切断し、それによってＮ−末端コリン結合プロテインＡ切端形を生成する。コリン結合プロテインＡ切端形またはそのフラグメントを作製し、さらに天然の三次元構造（すなわち完全長のコリン結合プロテインＡの構造）を保持するまた別の方法も意図されており、当業者には明らかである。本ポリペプチドはその三次元構造を保持するので、単離されたポリペプチドは、動物およびヒトを細菌感染（好ましくは肺炎球菌）に対して免疫する場合の免疫原としての使用に適している。
【００１５】
コリン結合プロテインＡ（ＣｂｐＡ）の血清型４のアミノ酸配列を含むポリペプチドは以下のとおりである：
ENEGATQVPTSSNRANESQAEQGEQPKKLDSERDKARKEVEEYVKKIVGESY
AKSTKKRHTITVALVNELNNIKNEYLNKIVESTSESQLQILMMESRSKVDEAV
SKFEKDSSSSSSSDSSTKPEASDTAKPNKPTEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKD
QKEEDRRNYPTITYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKVKANEPRDEQKIKQAE
AEVESKQAEATRLKKIKTDREEAEEEAKRRADAKEQGKPKGRAKRGVPGEL
ATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSPSLKPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKE
EDRRNYPTNTYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAE
VESKKAEATRLEKIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKPAEQPQPAPAPKAE
KPAPAPKPEN(配列番号24)。
【００１６】
"ポリペプチドＲ２"は、以下の配列を有するコリン結合プロテインＡ（ＣｂｐＡ）血清型４のＮ−末端切端形（図１参照）の１６位から４４４位のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す：
ENEGATQVPTSSNRANESQAEQGEQPKKLDSERDKARKEVEEYVKKIVGESY
AKSTKKRHTITVALVNELNNIKNEYLNKIVESTSESQLQILMMESRSKVDEAV
SKFEKDSSSSSSSDSSTKPEASDTAKPNKPTEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKD
QKEEDRRNYPTITYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKVKANEPRDEQKIKQAE
AEVESKQAEATRLKKIKTDREEAEEEAKRRADAKEQGKPKGRAKRGVPGEL
ATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSPSLKPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKE
EDRRNYPTNTYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAE
VESKKAEATRLEKIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKPA(配列番号1)。
【００１７】
コリン結合プロテインＡ（ＣｂｐＡ）血清型４のＮ−末端切端形のポリペプチドＲ２をコードするＤＮＡ配列は以下のとおりである：
GAGAACGAGGGAGCTACCCAAGTACCCACTTCTTCTAATAGGGCAAATGA
AAGTCAGGCAGAACAAGGAGAACAACCTAAAAAACTCGATTCAGAACGA
GATAAGGCAAGGAAAGAGGTCGAGGAATATGTAAAAAAAATAGTGGGTG
AGAGCTATGCAAAATCAACTAAAAAGCGACATACAATTACTGTAGCTCTA
GTTAACGAGTTGAACAACATTAAGAACGAGTATTTGAATAAAATAGTTGA
ATCAACCTCAGAAAGCCAACTACAGATACTGATGATGGAGAGTCGATCAA
AAGTAGATGAAGCTGTGTCTAAGTTTGAAAAGGACTCATCTTCTTCGTCAA
GTTCAGACTCTTCCACTAAACCGGAAGCTTCAGATACAGCGAAGCCAAAC
AAGCCGACAGAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTG
AAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAA
CTACCCAACCATTACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCG
ATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGTGAAAGCTAA
CGAACCTCGAGACGAGCAAAAAATTAAGCAAGCAGAAGCGGAAGTTGAG
AGTAAACAAGCTGAGGCTACAAGGTTAAAAAAAATCAAGACAGATCGTG
AAGAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAGAGCAGATGCTAAAGAGCAAG
GTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTAGCAAC
ACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGTAGGTG
AAGAAACTCTTCCAAGCCCATCCCTGAAACCAGAAAAAAAGGTAGCAGA
AGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAAGCCGAGGATCAAAAA
GAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGAACT
TGAAATTGCTGAGTCCGATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAG
TAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCGAAACGAGGAAAAAGTTAAGCAAGC
AAAAGCGGAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAAA
ATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCAG
CAGAAGAAGATAAAGTTAAAGAAAAACCAGCTG(配列番号12)。
【００１８】
血清型４のＣｂｐＡのアミノ酸配列は以下のとおりである：
ENEGATQVPTSSNRANESQAEQGEQPKKLDSERDKARKEVEEYVKKIVGESY
AKSTKKRHTITVALVNELNNIKNEYLNKIVESTSESQLQILMMESRSKVDEAV
SKFEKDSSSSSSSDSSTKPEASDTAKPNKPTEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKD
QKEEDRRNYPTITYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKVKANEPRDEQKIKQAE
AEVESKQAEATRLKKIKTDREEAEEEAKRRADAKEQGKPKGRAKRGVPGEL
ATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSPSLKPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKE
EDRRNYPTNTYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAE
VESKKAEATRLEKIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKPAEQPQPAPAPKAE
KPAPAPKPENPAEQPKAEKPADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQPPKTEKPA
QPSTPKTGWKQENGMWYFYNTDGSMATGWLQNNGSWYYLNSNGAMATG
WLQNNGSWYYLNANGSMATGWLQNNGSWYYLNANGSMATGWLQYNGS
WYYLNANGSMATGWLQYNGSWYYLNANGDMATGWVKDGDTWYYLEAS
GAMKASQWFKVSDKWYYVNGSGALAVNTTVDGYGVNANGEWVN(配列番号2)。
【００１９】
血清型４のＣｂｐＡのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は以下のとおりである：
GAGAACGAGGGAGCTACCCAAGTACCCACTTCTTCTAATAGGGCAAATGA
AAGTCAGGCAGAACAAGGAGAACAACCTAAAAAACTCGATTCAGAACGA
GATAAGGCAAGGAAAGAGGTCGAGGAATATGTAAAAAAAATAGTGGGTG
AGAGCTATGCAAAATCAACTAAAAAGCGACATACAATTACTGTAGCTCTA
GTTAACGAGTTGAACAACATTAAGAACGAGTATTTGAATAAAATAGTTGA
ATCAACCTCAGAAAGCCAACTACAGATACTGATGATGGAGAGTCGATCAA
AAGTAGATGAAGCTGTGTCTAAGTTTGAAAAGGACTCATCTTCTTCGTCAA
GTTCAGACTCTTCCACTAAACCGGAAGCTTCAGATACAGCGAAGCCAAAC
AAGCCGACAGAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTG
AAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAA
CTACCCAACCATTACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCG
ATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGTGAAAGCTAA
CGAACCTCGAGACGAGCAAAAAATTAAGCAAGCAGAAGCGGAAGTTGAG
AGTAAACAAGCTGAGGCTACAAGGTTAAAAAAAATCAAGACAGATCGTG
AAGAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAGAGCAGATGCTAAAGAGCAAG
GTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTAGCAAC
ACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGTAGGTG
AAGAAACTCTTCCAAGCCCATCCCTGAAACCAGAAAAAAAGGTAGCAGA
AGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAAGCCGAGGATCAAAAA
GAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGAACT
TGAAATTGCTGAGTCCGATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGgCTTGAACTA
GTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCGAAACGAGGAAAAAGTTAAGCAAG
CAAAAGCGGAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAA
AATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCA
GCAGAAGAAGATAAAGTTAAAGAAAAACCAGCTGAACAACCACAACCAG
CGCCGGCTCCAAAAGCAGAAAAACCAGCTCCAGCTCCAAAACCAGAGAA
TCCAGCTGAACAACCAAAAGCAGAAAAACCAGCTGATCAACAAGCTGAA
GAAGACTATGCTCGTAGATCAGAAGAAGAATATAATCGCTTGACTCAACA
GCAACCGCCAAAAACTGAAAAACCAGCACAACCATCTACTCCAAAAACA
GGCTGGAAACAAGAAAACGGTATGTGGTACTTCTACAATACTGATGGTTC
AATGGCGACAGGATGGCTCCAAAACAAtGGCTCAtGGTAcTACcTCAACAG
CAATGGCGCTATGGCGACAGGATGGCTCCAAAACAATGGTTCATGGTACT
ATCTAAACGCTAATGGTTCAATGGCAACAGGATGGCTCCAAAACAATGGT
TCATGGTACTACCTAAACGCTAATGGTTCAATGGCGACAGGATGGCTCCA
ATACAATGGCTCATGGTACTACCTAAACGCTAATGGTTCAATGGCGACAG
GATGGCTCCAATACAATGGCTCATGGTACTACCTAAACGCTAATGGTGAT
ATGGCGACAGGTTGGGTGAAAGATGGAGATACCTGGTACTATCTTGAAGC
ATCAGGTGCTATGAAAGCAAGCCAATGGTTCAAAGTATCAGATAAATGGT
ACTATGTCAATGGCTCAGGTGCCCTTGCAGTCAACACAACTGTAGATGGC
TATGGAGTCAATGCCAATGGTGAATGGGTAAACTAA(配列番号13)。
【００２０】
"ポリペプチドＲ１"は、以下の配列を有するＮ−末端切端形／コリン結合プロテインＡ（ＣｂｐＡ）血清型４の１６位から３２１位のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す：
ENEGATQVPTSSNRANESQAEQGEQPKKLDSERDKARKEVEEYVKKIVGESY
AKSTKKRHTITVALVNELNNIKNEYLNKIVESTSESQLQILMMESRSKVDEAV
SKFEKDSSSSSSSDSSTKPEASDTAKPNKPTEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKD
QKEEDRRNYPTITYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKVKANEPRDEQKIKQAE
AEVESKQAEATRLKKIKTDREEAEEEAKRRADAKEQGKPKGRAKRGVPGEL
ATPDKKENDAKSSDSSVGEETL(配列番号3)。
【００２１】
ポリペプチドＲ１をコードするＤＮＡ配列は以下のとおりである：
GAGAACGAGGGAGCTACCCAAGTACCCACTTCTTCTAATAGGGCAAATGA
AAGTCAGGCAGAACAAGGAGAACAACCTAAAAAACTCGATTCAGAACGA
GATAAGGCAAGGAAAGAGGTCGAGGAATATGTAAAAAAAATAGTGGGTG
AGAGCTATGCAAAATCAACTAAAAAGCGACATACAATTACTGTAGCTCTA
GTTAACGAGTTGAACAACATTAAGAACGAGTATTTGAATAAAATAGTTGA
ATCAACCTCAGAAAGCCAACTACAGATACTGATGATGGAGAGTCGATCAA
AAGTAGATGAAGCTGTGTCTAAGTTTGAAAAGGACTCATCTTCTTCGTCAA
GTTCAGACTCTTCCACTAAACCGGAAGCTTCAGATACAGCGAAGCCAAAC
AAGCCGACAGAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTG
AAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAA
CTACCCAACCATTACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCG
ATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGTGAAAGCTAA
CGAACCTCGAGACGAGCAAAAAATTAAGCAAGCAGAAGCGGAAGTTGAG
AGTAAACAAGCTGAGGCTACAAGGTTAAAAAAAATCAAGACAGATCGTG
AAGAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAGAGCAGATGCTAAAGAGCAAG
GTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTAGCAAC
ACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGTAGGTG
AAGAAACTCTTC(配列番号14)。
【００２２】
"ポリペプチドＣ／Ｒ２"は、Ｒ２内に繰り返し領域Ｃを含むポリペプチドを指し、ここで繰り返し領域Ｃは、血清型４のＮ−末端コリン結合プロテインＡ（ＣｂｐＡ）の３２７位から４３３位のアミノ酸配列を有し、これは以下の配列をもつ：
KPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAESDVEVK
KAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAEVESKKAEATRLEKIKTDRKKAEEEAK
RKA(配列番号4)。
【００２３】
ポリペプチドＣ／Ｒ２のＤＮＡ配列は以下のとおりである：
AAACCAGAAAAAAAGGTAGCAGAAGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTA
AGAAAAAAGCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAAC
CAATACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGGAAG
TTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCG
AAACGAGGAAAAAGTTAAGCAAGCAAAAGCGGAAGTTGAGAGTAAAAAA
GCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAAAATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAG
AAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCA(配列番号15)。
【００２４】
"ポリペプチドＡ／Ｒ２"は、Ｒ２内に繰り返し領域Ａを含むポリペプチドを指し、ここで繰り返し領域Ａは、血清型４のＮ−末端コリン結合プロテインＡ（ＣｂｐＡ）の１５３位から２６９位のアミノ酸配列を有し、これは以下の配列をもつ：
TEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTITYKTLELEIAESDVEVK
KAELELVKVKANEPRDEQKIKQAEAEVESKQAEATRLKKIKTDREEAEEEAK
RRADA(配列番号5)。
図１に示すようにポリペプチドＲ２の領域ＡはＲ１内の領域Ａと同じである。
【００２５】
ポリペプチドＡ／Ｒ２をコードするＤＮＡ配列は以下のとおりである：
ACAGAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAA
GCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACC
CAACCATTACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTG
GAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGTGAAAGCTAACGAAC
CTCGAGACGAGCAAAAAATTAAGCAAGCAGAAGCGGAAGTTGAGAGTAA
ACAAGCTGAGGCTACAAGGTTAAAAAAAATCAAGACAGATCGTGAAGAA
GCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAGAGCAGATGCT(配列番号16)。
【００２６】
１つまたは２つ以上のアミノ酸残基の同一性または位置を変更もしくは改変して、例えば欠失、置換および付加のような変形を含むことができる。欠失は当該蛋白質に固有の全残基より残基の数が少ないものを含み、置換では、特定の１つまたは２つ以上の残基が他の残基で置き換えられ、付加では１つまたは２つ以上のアミノ酸残基が当該ポリペプチドの末端または中央部に付加される（図２参照）。これらの分子には以下が含まれる：選択した非哺乳類ホストによる発現に好ましいコドンの取り込み；制限エンドヌクレアーゼ酵素による切断用部位の提供；発現が容易なベクターの構築を促進する開始、末端または中間部ＤＮＡ付加配列の提供。特に、血清型４のアミノ酸置換の例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：１５４位のＥがＫで置換；１５５位のＰがＬで置換；１５６位のＧがＥで置換；１５７位のＥがＫで置換；１８１位のＫがＥで置換；１８２位のＤがＡで置換；１８７位のＲがＹ、ＨまたはＬで置換；１９４位のＩがＮで置換；２００位のＥがＤで置換；２０２位のＥがＤで置換；２０９位のＥがＫで置換；２１２位のＫがＥで置換；２１８位のＶがＬで置換；２２０位のＶがＫで置換；２２１位のＫがＥで置換；２２３位のＮがＤまたはＫで置換；２２５位のＰがＳ、ＴまたはＲで置換；２２７位のＤがＮで置換；２２８位のＥがＫで置換；２２９位のＱがＥ、ＧまたはＤで置換；２３０位のＫがＴで置換；２３２位のＫがＮで置換；２３５位のＥがＫで置換；２３６位のＡがＥで置換；２３７位のＥがＫで置換；２４０位のＳがＮで置換；２４１位のＫがＥで置換；２４２位のＱがＫで置換；２４９位のＫがＥで置換；２５０位のＫがＮで置換；２５７位のＥがＱまたはＫで置換；２６３位のＡがＬで置換；２６４位のＫがＥで置換；２６５位のＲがＮで置換；２６６位のＲがＩで置換；２６７位のＡがＫまたはＶで置換；２５８位のＤがＴで置換；２６９位のＡがＤで置換；２９１位のＡがＴ、Ｖ、Ｐ、ＧまたはＸで置換；２９４位のＧがＧ、ＡまたはＥで置換；２９５位のＶがＤまたはＡで置換；２９５位のＰがＬまたはＦで置換；２９９位のＬがＰまたはＱで置換；３２８位のＰがＳで置換；３２９位のＥがＧで置換；３４０位のＥがＡで置換；３４３位のＫがＥまたはＤで置換；３４７位のＥがＫで置換；３４９位のＤがＡで置換；３５４位のＲがＨで置換；３６６位のＥがＤで置換；３７５位のＥがＫで置換；３７８位のＫがＥで置換；３９０位のＥがＧで置換；３９１位のＰがＳで置換；３９３位のＮがＤで置換；３９７位のＶがＩで置換および４０８位のＫがＱで置換。
【００２７】
"ポリペプチドＲ２血清型Ｒ６ｘ"は、以下の配列を有するコリン結合プロテインＡ（ＣｂｐＡ）血清型Ｒ６ｘのＮ−末端切端形の１６位から４４４位のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す：
ENEGSTQAATSSNMAKTEHRKAAKQVVDEYIEKMLREIQLDRRKHTQNVAL
NIKLSAIKTKYLRELNVLEEKSKDELPSEIKAKLDAAFEKFKKDTLKPGEKVA
EAKKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAEFDVKVKEAELELVK
EEAKESRNEGTIKQAKEKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKADAKLK
EANVATSDQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSSSLK
SGKKVAEAEKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTNTYKTLDLEIAESDVKVKE
AELELVKEEAKEPRDEEKIKQAKAKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKR
KAAEEDKVKEKPA(配列番号7)。
【００２８】
ポリペプチドＲ２血清型Ｒ６ｘをコードするＤＮＡ配列は以下のとおりである：
GAAAACGAAGGAAGTACCCAAGCAGCCACTTCTTCTAATATGGCAAAGAC
AGAACATAGGAAAGCTGCTAAACAAGTCGTCGATGAATATATAGAAAAA
ATGTTGAGGGAGATTCAACTAGATAGAAGAAAACATACCCAAAATGTCGC
CTTAAACATAAAGTTGAGCGCAATTAAAACGAAGTATTTGCGTGAATTAA
ATGTTTTAGAAGAGAAGTCGAAAGATGAGTTGCCGTCAGAAATAAAAGCA
AAGTTAGACGCAGCTTTTGAGAAGTTTAAAAAAGATACATTGAAACCAGG
AGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAA
GCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCAATACTTA
CAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTTCGATGTGAAAGTTAAAGAAG
CGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAAGAAtCTCGAAACGAGGGC
ACAATTAAGCAAGCAAAAGAGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTA
CAAGGTTAGAAAACAtCAAGACAGAtCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCT
AAACGAAAAGCAGATGCTAAGTTGAAGGAAGCTAATGTAGCGACTTCAG
AtCAAGGTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTA
GCAACACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGT
AGGTGAAGAAACTCTTCCAAGCTCATCCCTGAAATCAGGAAAAAAGGTAG
CAGAAGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCA
AAAAGAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTG
ACCTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGAAAGTTAAAGAAGCGGAGCTTGAA
CTAGTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCGAGACGAGGAAAAAATTAAGC
AAGCAAAAGCGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGA
AAACATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAA
GCAGCAGAAGAAGATAAAGTTAAAGAAAAACCAGCTG(配列番号17)。
【００２９】
血清型Ｒ６ｘのＣｂｐＡのアミノ酸配列：
ENEGSTQAATSSNMAKTEHRKAAKQVVDEYIEKMLREIQLDRRKHTQNVAL
NIKLSAIKTKYLRELNVLEEKSKDELPSEIKAKLDAAFEKFKKDTLKPGEKVA
EAKKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAEFDVKVKEAELELVK
EEAKESRNEGTIKQAKEKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKADAKLK
EANVATSDQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSSSLK
SGKKVAEAEKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTNTYKTLDLEIAESDVKVKE
AELELVKEEAKEPRDEEKIKQAKAKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKR
KAAEEDKVKEKPAEQPQPAPATQPEKPAPKPEKPAEQPKAEKTDDQQAEEDY
ARRSEEEYNRLTQQQPPKTEKPAQPSTPKTGWKQENGMWYFYNTDGSMAT
GWLQNNGSWYYLNANGAMATGWLQNNGSWYYLNANGSMATGWLQNNG
SWYYLNANGAMATGWLQYNGSWYYLNSNGAMATGWLQYNGSWYYLNA
NGDMATGWLQNNGSWYYLNANGDMATGWLQYNGSWYYLNANGDMATG
WVKDGDTWYYLEASGAMKASQWFKVSDKWYYVNGSGALAVNTTVDGYG
VNANGEWVN(配列番号8)。
【００３０】
血清型Ｒ６ｘのＣｂｐＡのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列：
GAAAACGAAGGAAGTACCCAAGCAGCCACTTCTTCTAATATGGCAAAGAC
AGAACATAGGAAAGCTGCTAAACAAGTCGTCGATGAATATATAGAAAAA
ATGTTGAGGGAGATTCAACTAGATAGAAGAAAACATACCCAAAATGTCGC
CTTAAACATAAAGTTGAGCGCAATTAAAACGAAGTATTTGCGTGAATTAA
ATGTTTTAGAAGAGAAGTCGAAAGATGAGTTGCCGTCAGAAATAAAAGCA
AAGTTAGACGCAGCTTTTGAGAAGTTTAAAAAAGATACATTGAAACCAGG
AGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAA
GCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCAATACTTA
CAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTTCGATGTGAAAGTTAAAGAAG
CGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAAGAAtCTCGAAACGAGGGC
ACAATTAAGCAAGCAAAAGAGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTA
CAAGGTTAGAAAACAtCAAGACAGAtCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCT
AAACGAAAAGCAGATGCTAAGTTGAAGGAAGCTAATGTAGCGACTtCAGA
tCAAGGTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTAG
CAACACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGTA
GGTGAAGAAACTCTTCCAAGCTCATCCCTGAAATCAGGAAAAAAGGTAGC
AGAAGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAA
AAAGAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGA
CCTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGAAAGTTAAAGAAGCGGAGCTTGAAC
TAGTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCGAGACGAGGAAAAAATTAAGCA
AGCAAAAGCGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAA
AACATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAG
CAGCAGAAGAAGATAAAGTTAAAGAAAAACCAGCTGAACAACCACAACC
AGCGCCGGCTACTCAACCAGAAAAACCAGCTCCAAAACCAGAGAAGCCA
GCTGAACAACCAAAAGCAGAAAAAACAGATGATCAACAAGCTGAAGAAG
ACTATGCTCGTAGATCAGAAGAAGAATATAATCGCTTGACTCAACAGCAA
CCGCCAAAAACTGAAAAACCAGCACAACCATCTACTCCAAAAACAGGCT
GGAAACAAGAAAACGGTATGTGGTACTTCTACAATACTGATGGTTCAATG
GCAACAGGATGGCTCCAAAACAACGGTTCATGGTACTATCTAAACGCTAA
TGGTGCTATGGCGACAGGATGGCTCCAAAACAATGGTTCATGGTACTATC
TAAACGCTAATGGTTCAATGGCAACAGGATGGCTCCAAAACAATGGTTCA
TGGTACTACCTAAACGCTAATGGTGCTATGGCGACAGGATGGCTCCAATA
CAATGGTTCATGGTACTACCTAAACAGCAATGGCGCTATGGCGACAGGAT
GGCTCCAATACAATGGCTCATGGTACTACCTCAACGCTAATGGTGATATG
GCGACAGGATGGCTCCAAAACAACGGTTCATGGTACTACCTCAACGCTAA
TGGTGATATGGCGACAGGATGGCTCCAATACAACGGTTCATGGTATTACC
TCAACGCTAATGGTGATATGGCGACAGGTTGGGTGAAAGATGGAGATACC
TGGTACTATCTTGAAGCATCAGGTGCTATGAAAGCAAGCCAATGGTTCAA
AGTATCAGATAAATGGTACTATGTCAATGGCTCAGGTGCCCTTGCAGTCA
ACACAACTGTAGATGGCTATGGAGTCAATGCCAATGGTGAATGGGTAAAC
TAA(配列番号18)。
【００３１】
ポリペプチドＲ１血清型Ｒ６ｘは、以下の配列を有するコリン結合プロテインＡ（ＣｂｐＡ）血清型Ｒ６ｘのＮ−末端切端形／切端形の１６位から３２１位のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す：
ENEGSTQAATSSNMAKTEHRKAAKQVVDEYIEKMLREIQLDRRKHTQNVAL
NIKLSAIKTKYLRELNVLEEKSKDELPSEIKAKLDAAFEKFKKDTLKPGEKVA
EAKKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAEFDVKVKEAELELVK
EEAKESRNEGTIKQAKEKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKADAKLK
EANVATSDQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETL(配列番号9)。
【００３２】
ポリペプチドＲ１をコードするＤＮＡ配列は以下のとおりである：
GAAAACGAAGGAAGTACCCAAGCAGCCACTTCTTCTAATATGGCAAAGAC
AGAACATAGGAAAGCTGCTAAACAAGTCGTCGATGAATATATAGAAAAA
ATGTTGAGGGAGATTCAACTAGATAGAAGAAAACATACCCAAAATGTCGC
CTTAAACATAAAGTTGAGCGCAATTAAAACGAAGTATTTGCGTGAATTAA
ATGTTTTAGAAGAGAAGTCGAAAGATGAGTTGCCGTCAGAAATAAAAGCA
AAGTTAGACGCAGCTTTTGAGAAGTTTAAAAAAGATACATTGAAACCAGG
AGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAA
GCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCAATACTTA
CAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTTCGATGTGAAAGTTAAAGAAG
CGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAAGAATCTCGAAACGAGGG
CACAATTAAGCAAGCAAAAGAGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCT
ACAAGGTTAGAAAACAtCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAG
CTAAACGAAAAGCAGATGCTAAGTTGAAGGAAGCTAATGTAGCGACTTCA
GATCAAGGTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGC
TAGCAACACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGC
GTAGGTGAAGAAACTCTTC(配列番号19)。
【００３３】
"ポリペプチドＣ／Ｒ２血清型Ｒ６ｘ"は、以下の配列を有するコリン結合プロテインＡ（ＣｂｐＡ）血清型Ｒ６ｘのＮ−末端の３２７位から４３３位のアミノ酸配列を有する繰り返し領域ＣをＲ２内に含むポリペプチド（図２参照）を指す：
KSGKKVAEAEKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTNTYKTLDLEIAESDVKVK
EAELELVKEEAKEPRDEEKIKQAKAKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAK
RKA(配列番号10)。
【００３４】
ポリペプチドＣ／Ｒ２血清型Ｒ６ｘのＤＮＡ配列：
AAATCAGGAAAAAAGGTAGCAGAAGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTG
AGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAAC
CAATACTTACAAAACGCTTGACCTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGAAAG
TTAAAGAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCG
AGACGAGGAAAAAATTAAGCAAGCAAAAGCGAAAGTTGAGAGTAAAAAA
GCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAACATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAG
AAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCA(配列番号20)。
【００３５】
"ポリペプチドＡ／Ｒ２血清型Ｒ６ｘ"は、以下の配列を有するコリン結合プロテインＡ（ＣｂｐＡ）血清型Ｒ６ｘのＮ−末端の１５５位から２６５位のアミノ酸配列を有する繰り返し領域ＡをＲ２内に含むポリペプチド（図２参照）を指す：
PGEKVAEAKKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAEFDVKVKE
AELELVKEEAKESRNEGTIKQAKEKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKR
KADA(配列番号11)。
【００３６】
ポリペプチドＡ／Ｒ２血清型Ｒ６ｘをコードするＤＮＡ配列：
CCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGA
AAAAAGCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCAA
TACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTTCGATGTGAAAGTTA
AAGAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAAGAAtCTCGAAAC
GAGGGCACAATTAAGCAAGCAAAAGAGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTG
AGGCTACAAGGTTAGAAAACAtCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGA
AGAAGCTAAACGAAAAGCAGATGCT(配列番号21)。
【００３７】
本発明は単離ポリペプチドを目的とし、本単離ポリペプチドは、配列番号２２または２３に示すアミノ酸配列（そのフラグメント、変異体、変種、類似体または誘導体を含む）から成る。
SPSLKPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAESDV
EVKKAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAEVESKKAEATRLEKIKTDRKKAEE
EAKRKAAEEDKVKEKPA(配列番号22、血清型4、部位323-434)；または
PSSSLKSGKKVAEAEKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTNTYKTLDLEIAESD
VKVKEAELELVKEEAKEPRDEEKIKQAKAKVESKKAEATRLENIKTDRKKAE
EEAKRKAAEEDKVKEKRA（配列番号２３；血清型Ｒ６ｘ；３２２−４３４位）。
【００３８】
"ポリペプチドＢ／Ｒ２"は、図２に示すコリン結合プロテインＡ（ＣｂｐＡ）血清型４のＮ−末端切端形の２７０位から３２６位のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。"ポリペプチドＢ／Ｒ２血清型Ｒ６ｘ"は、図２に示すコリン結合プロテインＡ（ＣｂｐＡ）血清型Ｒ６ｘのＮ−末端切端形の２６４位から３２６位のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。本発明は、図１に示すように領域Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ＋Ｂ、Ｂ＋Ｃ、Ａ＋Ｃのアミノ酸配列を有するポリペプチドを意図する。
さらに本発明は、Ｎ−末端コリン結合プロテインＡ切端形のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供し、ここで本ポリペプチドはアミノ酸ＫＸＸＥ（配列番号６）を有する。
【００３９】
本発明は、図２に示したＮ−末端コリン結合プロテインＡ切端形のアミノ酸配列を含むポリペプチドを目的とする。ある実施態様では、本ポリペプチドは、図２に示す保存領域であるアミノ酸配列を有する。例えば、保存領域には１５８から１７２；３００から３２１；３３１から３３９；３５５から３６５；３６７から３７４；３７９から３８９；４０９から４２７；および４３０から４４７のアミノ酸配列が含まれるが、ただしこれらに限定されない。図２は、本発明に包含されるＣｂｐＡの種々の血清型のＮ−末端領域の核酸およびアミノ酸配列の相同性を示す。
【００４０】
本発明は、レクチン活性をもつがコリンには結合しない、Ｎ−末端コリン結合プロテインＡ切端形のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。ある実施態様では、本ポリペプチドは、配列番号１、３−５、７、または９−１１のいずれかに示すアミノ酸配列（そのフラグメント、変異体、変種、類似体誘導体を含む）を有する。
【００４１】
本明細書で用いられるように、"レクチン活性を有するポリペプチド"とは、炭水化物と非共有結合によって結合するポリペプチド、ペプチドまたは蛋白質を指す。本明細書で定義されるように、"付着（因子）"とは、細菌とヒト細胞との非共有結合、または十分に安定で洗浄に耐える分泌物を指す。本明細書で定義されるように、"ＬＮｎＴと結合"とは、アルブミンコントロール以上にラクト−Ｎ−ネオテトラオース被覆基材に結合することを意味する。
【００４２】
本発明は、Ｎ−末端コリン結合プロテインＡ切端形のアミノ酸配列を含む単離された免疫原性ポリペプチドを提供する。本発明が意図するところでは、本免疫原性ポリペプチドは、配列番号１、３−７、または９−１１のいずれかに示すアミノ酸配列（そのフラグメント、変異体、変種、類似体または誘導体を含む）を有する。本発明は、図２に示すＮ−末端コリン結合プロテインＡ切端形のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。ある実施態様では、本ポリペプチドは、図２に示す保存領域であるアミノ酸配列を有する。
本発明の目的は上記で説明したアミノ酸配列を含むポリペプチドの類似体である。類似体ポリペプチドには、場合によって前記のアミノ酸配列を含むポリペプチドのＮまたはＣＯＯＨ末端にＮ−末端メチオニンまたはＮ−末端ポリヒスチジンを結合させてもよい。
【００４３】
別の実施態様では、本発明は、前記のポリペプチドの蛋白分解消化生成物に由来するペプチドフラグメントを提供する。別の実施態様では、前記ポリペプチドの誘導体はそれに結合させた１つまたは２つ以上の化学分子部分を有する。別の実施態様では、この化学分子部分は水溶性ポリマーである。別の実施態様では、この化学分子部分はポリエチレングリコールである。別の実施態様では、この化学分子部分はモノ−、ジ−、トリ−またはテトラペジル化（tetrapegylated）されている。別の実施態様では、この化学分子部分はＮ−末端でモノペジル化されている。
【００４４】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の化合物への結合は、ＰＥＧは哺乳類で非常に毒性が低いので特に有用である（Carpenter et al.,(1971))。例えば、アデノシンデアミナーゼのＰＥＧアダクツは、米国で重篤な複合性免疫不全症候群の治療のためにヒトで使用することが承認された。ＰＥＧの結合によって得られる第二の利点は、異種化合物の免疫原性および抗原性を効果的に低下させるということである。例えば、ヒトの蛋白質のＰＥＧアダクツは、哺乳類の他の種で重篤な免疫反応を惹起するリスクをもたらさずに疾患の治療に有用であろう。本発明の化合物は、ミクロ被包化手段でドラッグデリバリーを実施して、この化合物またはこの化合物を産生する細胞に対するホストの免疫反応を低下または防止することができる。本発明の化合物はまた、膜（例えばリポソーム）内にミクロ被包化することによって輸送することができる。
【００４５】
蛋白質との直接反応に適した多くのＰＥＧ活性化形が報告された。蛋白質のアミノ基との反応のために有用なＰＥＧ試薬には、カルボン酸の活性エステルまたは炭酸塩誘導体、特に脱離基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、イミダゾールまたは１−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン−４−スルホネートであるものが含まれる。マレイミドまたはハロアセチル基を含むＰＥＧ誘導体が、蛋白質の遊離スルフヒドリルの改変に有用な試薬である。同様に、アミノヒドラジンまたはヒドラジド基を含むＰＥＧ試薬は、蛋白質中の炭水化物基の過ヨウ素酸酸化によって生成されるアルデヒドとの反応に有用である。
【００４６】
ある実施態様では、本明細書で開示するポリペプチドのアミノ酸残基は"Ｌ"異性体形であるのが好ましい。別の実施態様では、レクチン活性に関する所望の機能特性をポリペプチドが維持するかぎり、"Ｄ"異性体形の残基がＬ−アミノ酸残基のいずれかと置換される。ＮＨ2は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端の遊離カルボキシ基を指す。本明細書で用いられる略語は標準的ポリペプチド命名法に準ずる（J. Biol. Chem. 243:3552-59(1969)）。
本明細書では全てのアミノ酸残基配列は、その左から右の方向がアミノ末端からカルボキシ末端の通常の方向である式で示されことに留意されたい。さらにまた、アミノ酸残基配列の先頭または最後のダッシュ記号は、ペプチド結合または１つもしくは２つ以上のアミノ酸残基をもつ別の配列を示す。
【００４７】
合成ポリペプチド（固相、液相の周知の技術またはペプチド縮合技術、またはその任意の組合せを用いて製造される）は、天然または非天然アミノ酸を含むことができる。ペプチド合成に用いられるアミノ酸は、標準的なＢｏｃ（Ｎα−アミノ保護Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ酸樹脂（最初のメリーフィールドの固相法の標準的脱保護、中性化、共役および洗浄プロトコルを用いる（Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154(1963)))、または易塩基性Ｎα−アミノ保護９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸（最初Carpino & Han(J. Org. Chem. 37:3403-3409(1972)）が報告）であろう。したがって、本発明のポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸、Ｄ−およびＬ−アミノ酸の組合せ、および種々の"デザイナー"アミノ酸（例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、およびＮα−メチルアミノ酸など）を含み、特定の特性を伝達することができる。合成アミノ酸は、リジンの代わりにオルニチンを、フェニルアラニンの代わりにフルオロフェニルアラニンを、およびロイシンまたはイソロイシンの代わりにノルロイシンを含む。さらに、特定のアミノ酸を特定の共役工程に割り当てて、α−螺旋、β−ターン、β−シート、γ−ターンおよび環状ペプチドを生成することができる。
【００４８】
本発明の特徴の１つでは、本ポリペプチドは、特別なアミノ酸をＣ−末端に含むことができる。この特別なアミノ酸は、遊離グリシンまたはグリシン−アミド基を刺激するために、ＣＯ2ＨまたはＣＯＮＨ2側鎖のどちらかを含む。この特別な残基に関心をもつまた別の場合は、リンカーまたはビーズとの結合部から成る側鎖をもつＤまたはＬアミノ酸類似体としてであろう。ある実施態様では、この擬似−遊離Ｃ末端残基はＤまたはＬ型光学構造をもつであろう。別の実施態様では、ＤおよびＬ異性体のラセミ混合物を用いることができる。
【００４９】
さらに別の実施態様では、ピログルタメートが本ペプチドのＮ−末端残基として含まれる。ピログルタメートはエドマン分解による連続反応には馴染みにくいが、Ｎ−末端ピログルタメートを含むあるビーズ上のペプチドの５０％だけに置換を限定することによって、シークェンシングのためにビーズに十分な非ピログルタメートペプチドが残るであろう。Ｎ−末端にエドマン分解耐性残基を含むいずれのペプチドのシークェンシングにもこの技術を用いることができることは当業者には容易に理解されよう。所望の活性を示す個々のペプチドの性状を調べる他の方法は以下で詳細に述べる。封鎖Ｎ−末端基（例えばピログルタメート）を含むペプチドの比活性は、特定のＮ−末端基が５０％のペプチドに存在する場合は、完全に（１００％）封鎖されたペプチドの活性を非封鎖（０％）ペプチドと比較することによって容易に明らかにされるであろう。
【００５０】
さらに、本発明は、より厳密に規定された構造特性を有するペプチドの製造、およびペプチド模倣物の使用、さらに新規な特性を有するペプチドを製造するためにペプチド様結合（例えばエステル結合）を使用することを意図する。別の実施態様では、還元ペプチド結合（すなわちＲ1−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2）を包含するペプチドを生成できる。式中、Ｒ1およびＲ2はアミノ酸残基または配列である。還元ペプチド結合は、ジペプチドサブユニットとして導入してもよい。そのような分子はペプチド結合加水分解（例えばプロテアーゼ活性）に対して抵抗性をもつであろう。そのようなペプチドは、固有の機能および活性（例えば代謝性分解またはプロテアーゼ活性に対する抵抗性によるin vivoでの半減期の延長）をもつリガンドを提供するであろう。さらにまた、ある種の系では束縛（constrained)ペプチドは機能的活性の強化を示すことがよく知られている（Hruby, Life Sciences 31:189-199(1982); Hruby et al., Biochem. J. 268:249-262(1990)）。本発明は、他の全ての位置に任意の配列を取り込んでいる束縛ペプチドを製造する方法を提供する。
【００５１】
束縛ペプチド、環状ペプチドまたは剛直（regidized)ペプチドは、架橋形成処理後にペプチドを束縛、環状化または剛直化させるために架橋を形成することができる化学官能基を提供するアミノ酸またはアミノ酸類似体がペプチド配列内の少なくとも２箇所に挿入されることを条件として合成によって製造できる。環状化は、ターン誘発アミノ酸が取り込まれたときに促進される。ペプチドを架橋することができるアミノ酸の例はジスルフィドを形成するシステイン、ラクトーンまたはラクターゼを形成するアスパラギン酸、および遷移金属をキレートして架橋を形成するキレーター（例えばγ−カルボキシル−グルタミン酸（Ｇｌａ）（Bachem))である。保護γ−カルボキシルグルタミン酸は、Zee-Cheng & Olson(Biophys. Res. Commun. 94:1128-1132(1980)）が記載した合成を改変して製造できる。ペプチド配列が架橋を形成できる少なくとも２つのアミノ酸を含むペプチドは、例えばジスルフィド結合を形成するためにシステイン残基を酸化するか、またはキレートを形成するために金属イオンを付加して処理し、それによってペプチドを架橋して束縛、環状または剛直ペプチドを生成することができる。
【００５２】
本発明は、系統的に架橋を形成する方法を提供する。例えば、４つのシステイン残基がペプチド配列に取り込まれる場合は、異なる保護基を用いることができる（Hiskey, in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol.3, Gross and Meienhofer, eds., Academic Press: New York, pp.137-167(1981); Ponsanti et al., Tetrahedron 46:8255-8266(1990))。第一のシステイン対を脱保護しさらに酸化し、続いて第二のセットを脱保護し酸化することができる。このようにして、一定のジスルフィド架橋セットを形成できる。また別には、架橋が異なる化学的性状をもつことができるように、システイン対および照合アミノ酸類似体対を取り込ませることができる。
【００５３】
特定の構成モチーフを導入するために以下の非古典的アミノ酸をペプチドに取り込ませることができる：１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート（Kazmierski et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2275-2283(1991)）；（２Ｓ，３Ｓ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｓ，３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｒ，３Ｓ）−メチル−フェニルアラニンおよび（２Ｒ，３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン（Kazmierski & Hruby, Tetrahedron Lett. (1991)）；２−アミノテトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸（Landis, Ph.D.Thesis, University of Arizona(1989)）；ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート（Miyake et al., J. Takeda Res. Labs. 43:53-76(1989)）；β−カルボリン（ＤおよびＬ）（Kazmierski, Ph.D. Thesis, University of Arizona(1988))；ＨＩＣ（ヒスチジンイソキノリンカルボン酸）（Zechel et al., Int. J. Pep. Protein Res. 43(1991))；およびＨＩＣ（ヒスチジンサイクリックウレア）（Dharanipragada）。
【００５４】
以下のアミノ酸類似体およびペプチド模倣物をペプチドに導入して特異的な二次構造を誘発または促進することができる：ＬＬ−Ａｃｐ（ＬＬ−３−アミノ−２−プロペニドン−６−カルボン酸）、βターン誘発ジペプチド類似体（Kemp et al., J. Org. Chem. 50:5834-5838(1985))；βシート誘発類似体（Kemp et al., Tetrahedron Lett. 29:5081-5082(1988))；βターン誘発類似体（Kemp et al., Tetrahedron Lett. 29:5057-5060(1988))；α螺旋誘発類似体（Kemp et al., Tetrahedron Lett. 29:4935-4938(1988))；γターン誘発類似体（Kemp et al., J. Org. Chem. 54:109-115(1989))；および以下の参考文献によって提供される類似体（Nagai & Sato, Tetrahedron Lett. 26:647-650(1985); DiMaio et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. P.1687(1989))；Ｇｌｙ−Ａｌａターン類似体（Kahn et al., Tetrahedron Lett. 30:2317(1989)）；アミド結合同配体（Jones et al., Tetrahedron Lett. 29:3853-3856(1988)) ；テトラゾル（Zabrocki et al., J. Am. Chem. Soc. 110:5875-5880(1988)）；ＤＴＣ（Samanen et al., Int. J. Protein Pep. Res. 35:501-509(1990)）；および以下の参考文献によって開示される類似体（Olson et al., J. Am. Chem. Soi. 112:323-333(1990); Garvey et al., J. Org. Chem. 56:436(1990)）。βターンおよびβ張り出しの構成限定模倣並びにそれらを含むペプチドが米国特許第５４４００１３号（Kahn, 1995年8月8日）に記載されている。
【００５５】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドまたはペプチドの改変または誘導を提供する。ペプチドの改変は当業者には周知で、これには燐酸化、カルボキシメチル化およびアシル化が含まれる。改変は化学的または酵素的手段で実施できる。別の特徴では、糖化または脂肪アシル化ペプチド誘導体を製造できる。糖化または脂肪アシル化ペプチドの製造は当技術分野で周知である。脂肪アシルペプチド誘導体もまた製造できる。例えば、遊離アミノ基（Ｎ−末端またはリシル）はアシル化（例えばミリストイル化）できる。別の実施態様では、構造が（ＣＨ2）nＣＨ3の脂肪族側鎖を含むアミノ酸をペプチドに取り込ませることができる。本発明の使用に適したこのようなおよび他のペプチド−脂肪酸共役物は、英国特許ＧＢ−８８０９１６２．４号、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８９／００１６６号および参考文献５（上掲書）に開示されている。
【００５６】
突然変異は、ポリペプチドをコードする核酸で、特定のコドンを異なるアミノ酸のためのコドンに変化させて実施できる。一般にそのような変異は、もっとも少ないヌクレオチド変化を可能にさせることによって実施される。この種の置換変異は、生成される蛋白質のアミノ酸を非保存的態様で（すなわち、特定のサイズまたは性状を有するアミノ酸の群に属するアミノ酸から別の群に属するアミノ酸へとコドンを変化させることによる）変化させるか、または保存的態様で（すなわち、特定のサイズまたは性状を有するアミノ酸の群に属するアミノ酸から同じ群に属するアミノ酸へとコドンを変化させることによる）変化させて実施できる。一般にそのような保存的変化では、得られる蛋白質の構造および機能の変化は少ない。
【００５７】
非保存的変化は、得られる蛋白質の構造、活性または機能をより一層変化させる。本発明は、得られる蛋白質の活性または結合特性を顕著には変化させない保存的変化を含む配列を含むと考えられる。配列内のあるアミノ酸の置換は、当該アミノ酸が属するクラスの他のアミノ酸から選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。芳香環構造を含むアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンである。極性中性アミノ酸にはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。陽性荷電（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。陰性荷電（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。そのような変化は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または等電点によって決定されるように、見かけの分子量に影響を与えることはないであろう。
【００５８】
特に好ましい置換は以下のとおりである：
−Ａｒｇの代わりにＬｙｓおよびその逆で、陽性荷電は維持できる；
−Ａｓｐの代わりにＧｌｕおよびその逆で、陰性荷電は維持できる；
−Ｔｈｒの代わりにＳｅｒで、遊離−ＯＨは維持できる；さらに
−Ａｓｎの代わりにＧｌｎで遊離ＮＨ2は維持される。
【００５９】
合成ＤＮＡ配列は、類似体または"ムテイン"を発現させる遺伝子の簡便な構築を可能にする。蛋白質に非天然アミノ酸を位置特異的に取り込ませる一般的方法はNorenら（Science 244:182-188(1989))が記載した。この方法は非天然アミノ酸を含む類似体を作製するために用いることができる。
本発明にしたがえば、当技術分野内の通常の分子生物学、微生物学および遺伝子組換えＤＮＡ技術を用いることができる。そのような技術は文献に完全に説明されている。例えば以下を参照されたい：Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"(1989); "Current Protocols in Molecular Biology", Vol.I-III（R.M. Ausubel, ed.(1994)); "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Vol.I-III（J.E. Celis, ed.(1994)); "Current Protocols in Immunology", Vol.I-III（J.E. Coligan, ed.(1994)); "Oligonucleotide Synthesis",（M.J. Gait, ed.(1984)); "Nucleic Acid Hybridization"(B.D. Hames & S.J. Higgins, ed.(1985)); "Transcription and Translation"（B.D. Hames & S.J. Higgins, ed.(1984)); "Animal Cell Culture"（R.I. Freshney, ed.(1986)); "Immobilized Cells and Enzymes"（IRL Press, (1986)); B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning"(1984）。
【００６０】
別の実施態様では、ピログルタメートを本ペプチドのＮ−末端残基として含むことができる。ピログルタメートはエドマン分解による連続反応に馴染まないが、Ｎ−末端ピログルタメートをもつあるビーズ上のペプチドの５０％だけに置換を制限することによって、ビーズ上に十分な非ピログルタメートペプチドがシークェシングのために残るであろう。この技術はエドマン分解に耐性を有する残基をＮ−末端に取り込んでいるいずれのペプチドのシークェンシングにも用いることができることは、当業者には理解されよう。所望の活性を示す個々のペプチドの性状を調べる他の方法は以下で詳細に述べる。封鎖Ｎ−末端基（例えばピログルタメート）を含むペプチドの比活性は、当該個々のＮ−末端基がペプチドの５０％に存在する場合は、完全（１００％）封鎖ペプチドの活性を非封鎖（０％）ペプチドと比較することによって容易に明らかにされるであろう。
【００６１】
誘導用化学分子部分：誘導に適した化学分子部分は水溶性ポリマーから選択できる。選択するポリマーは、このポリマーを結合させる成分が水性環境下（例えば生理学的環境）下で沈澱しないように水溶性でなければならない。好ましくは、最終生成物を治療に使用するために、ポリマーは医薬的に許容できるものであろう。当業者は、ポリマー／成分結合物が治療に用いられるか否か、もしそうであるならば所望用量、循環時間、蛋白分解に対する抵抗性および他の事柄を考慮して所望のポリマーを選択できる。本成分については、これらは本明細書で開示するアッセイを用いて確認できる。
【００６２】
水溶性ポリマーは、例えばポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールから成る群から選ばれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが、水中での安定性のために製造に有利であろう。
【００６３】
ポリマーの分子量はいずれでもよく、さらにポリマーは分枝していても分枝してなくともよい。ポリエチレングリコールの場合、取り扱いおよび製造の容易さのために好ましい分子量は約２ｋＤａから約１００ｋＤａである（"約"という用語はポリエチレングリコールの製造で、いくつかの分子は前述の分子量より重く、いくつかの分子はそれより軽いことを示す）。所望の治療プロフィール（例えば所望される放出持続時間、生物学的活性に対する影響が有る場合はその影響、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または欠如および治療用蛋白質または類似体に対するポリエチレングリコールのその他の既知作用）にしたがって、他のサイズも用いることができる。
【００６４】
結合させるポリマー分子の数は多様で、機能に対する影響を当業者は確認することができる。同じまたは異なる化学分子部分（例えばポリマーで例えば異なる分子量のポリエチレングリコール）を用いて、モノ−、ジ−、トリ−またはいくつかの組合せの誘導体を製造できる。ポリマー分子の成分分子に対する割合は多様で、反応混合物中のそれらの割合にしたがうであろう。一般に、最適比（過剰な未反応成分およびポリマーが存在しない反応効率に関して）は、例えば所望される誘導の程度（例えばモノ、ジ、トリ、など）、選択されるポリマーの分子量、ポリマーが分枝しているか否か、さらに反応条件のような要件によって決定される。
【００６５】
ポリエチレングリコール分子（または他の化学分子部分）は、蛋白質の機能ドメインまたは抗原性ドメインに対する影響を考慮して成分に結合させなければならない。当業者が利用できる多数の結合方法がある。例えばＥＰ４０１３８４号（この文献は参照により本明細書に含まれる）はＧ−ＣＳＦへのＰＥＧのカップリングを述べ、Malikら（Exp. Hematol. 20:1028-1035(1992)）はトレシルクロリドを用いるＧＭ−ＣＳＦのペジル化を報告する。例えば、ポリエチレングリコールは、反応基（例えば遊離アミノまたはカルボキシル基）を介してアミノ酸残基と共有結合される。反応基は、活性化ポリエチレングリコール分子が結合する基である。遊離アミノ基をもつアミノ酸残基には、リジン残基およびＮ−末端アミノ酸残基が含まれる。遊離カルボキシル基をもつアミノ酸残基は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびＣ−末端アミノ酸残基が含まれる。スルフヒドリル基もまた、ポリエチレングリコール分子を結合させるための反応基として用いることができる。治療目的で好ましいものは、アミノ基での結合、例えばＮ−末端またはリジン基での結合である。
【００６６】
本発明は、Ｎ−末端コリン結合プロテインＡ切端形のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。本発明は、図２に示すＮ−末端コリン結合プロテインＡ切端形のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。ある実施態様では、本核酸は、配列番号１２、１４−１７、または１９−２１のいずれか（そのフラグメント、変異体、変種、類似体または誘導体を含む）に示されるものである。核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡである。さらに、単離核酸はＲＮＡ転写プロモーターに機能的に連結させることができる。本核酸をレクチン活性を競合的に抑制するために用いることも意図される。
【００６７】
"ベクター"とはレプリコン、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドで、それに別のＤＮＡセグメントを結合させて当該結合セグメントを複製させることができる。
"ＤＮＡ"とは、デオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）のポリマー形で、一本鎖形でも二本鎖螺旋のどちらかを指す。この用語は当該分子の一次および二次構造を指し、いずれの特定の三次構造にも限定されない。したがって、この用語にはとりわけ直鎖ＤＮＡ分子（例えば制限フラグメント）として見出される二本鎖ＤＮＡ、ウイルス、プラスミドおよび染色体が含まれる。具体的な二本鎖ＤＮＡ分子の構造を考察する場合、本明細書では配列は、非転写ＤＮＡ鎖（すなわちｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）の５'から３'方向での配列のみを示す通常の方法で記載される。
【００６８】
ＤＮＡ配列の転写および翻訳を発現コントロール配列が制御するとき、当該ＤＮＡ配列は、当該発現コントロール配列に"機能的に連結"されている。"機能的に連結"という用語は、発現されるべきＤＮＡ配列の前に適切な開始シグナル（例えばＡＴＧ）を有し、さらに当該発現制御配列の制御下で当該ＤＮＡ配列を発現させ、当該ＤＮＡ配列によってコードされる所望の生成物を産生させるために正確な読み枠を維持することを含む。リコンビナントＤＮＡ分子に挿入することを所望する遺伝子が適切な開始シグナルを含まない場合、そのような開始シグナルを当該遺伝子の前に挿入できる。
【００６９】
さらにまた本発明は、上記の核酸分子を含むベクターを提供する。プロモーターは細菌、酵母、昆虫または哺乳類のプロモーターであるか、またはそれらと同一のものであろう。さらに、ベクターはプラスミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌ファージ、または真核細胞ウイルスＤＮＡであろう。
蛋白質の発現に有用なものとして当技術分野で知られている他の多くのベクター骨格を用いることができる。そのようなベクターには、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ付随ウイルス（ＡＡＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、モロニーネズミ白血病ウイルス、ＤＮＡデリバリー系（すなわちリポソーム）、および発現プラスミドデリバリー系が含まれるが、ただしこれらに限定されない。さらに、あるクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルスまたはセムリキ森林ウイルスのようなウイルスに由来するＤＮＡエレメントを含む。そのようなベクターは市販品を入手するか、当技術分野で周知の方法によって記載の配列を組み立ててもよい。
【００７０】
本発明はまた、適切なホスト細胞のベクターを含むポリペプチド産生用ホストベクター系を提供する。適切なホスト細胞には、原核細胞または真核細胞、例えば細菌細胞（グラム陽性菌を含む）、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞および動物細胞が含まれるが、ただしこれらに限定されない。ホストとして、例えばマウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌｔｋ-細胞、Ｃｏｓ細胞（ただしこれらに限定されない）を含む多数の哺乳類細胞を用いることができる。
【００７１】
多様なホスト／発現ベクター組合せを本発明のＤＮＡ配列の発現に用いることができる。有用な発現ベクターは、例えば染色体セグメント、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列から成るであろう。適切なベクターには、ＳＶ４０の誘導体および既知の細菌プラスミド、例えば大腸菌（E. coli)プラスミドのｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、プラスミド、例えばＰＲ４；ファージＤＮＡ、例えば多数のファージλ誘導体、例えばＮＭ９８９および他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３および糸状一本鎖ファージＤＮＡ；酵母プラスミド、例えば２μプラスミドまたはその誘導体；真核細胞に有用なベクター、例えば昆虫または哺乳類細胞で有用なベクター；プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、例えばファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を利用するために改変されたプラスミドなどが含まれる。
【００７２】
多様な発現制御配列（当該配列に機能的に連結されたＤＮＡ配列の発現を制御する配列）のいずれもこれらのベクターで使用して、本発明のＤＮＡ配列を発現させることができる。そのような有用な発現制御配列には、例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマまたはアデノウイルスの初期または後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ＬＴＲ系、ファージλの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコート蛋白質の制御領域、３−ホスホグリシレートキナーゼまたは他の糖分解酵素のためのプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター（例えばＰｈｏ５）、酵母α−交配因子のプロモーター、原核もしくは真核細胞またはウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列、およびそれらの種々の組合せが含まれる。
【００７３】
多様な単細胞ホストもまた本発明のＤＮＡ配列の発現に有用である。これらのホストには周知の真核および原核細胞、例えば大腸菌株、シュードモナス、バチルス、ストレプトミセス、真菌（例えば酵母）、および動物細胞（例えばＣＨＯ、Ｒ１．１、Ｂ−ＷおよびＬ−Ｍ細胞、アフリカミドリザル腎細胞（例えばＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０およびＢＭＴ１０）、昆虫細胞（例えばＳｆ９）、ヒト細胞および組織培養の植物細胞が含まれる。
【００７４】
全てのベクター、発現制御配列およびホストの全てが本発明のＤＮＡ配列を発現するために等しく良好に機能するわけではないことは理解されよう。さらに同じ発現系に関して全てのホストが等しく良好に機能するわけではない。しかしながら、当業者は、煩雑な実験を行うことなく適切なベクター、発現コントロール配列およびホストを選択し、本発明の範囲から外れることなく所望の発現を達成できる。例えば、ベクターを選択する場合にはホストを考慮しなければならないが、それはベクターがその中で機能するからである。ベクターのコピー数、当該コピー数を制御する能力、当該ベクターによってコードされる他のいずれかの蛋白質の発現（例えば抗生物質マーカー）もまた考慮する。
【００７５】
発現制御配列を選択する場合、多様な要素が通常考慮される。これらには、例えば系の相対的な強さ、その制御性、および発現されるべき個々のＤＮＡ配列または遺伝子との適合性（特に潜在的二次構造に関して）が含まれる。適切な単細胞ホストは、例えば選択したベクターとそれらホストとの適合性、それらの分泌特性、それらの正確な蛋白質折り畳み能、およびそれらの醗酵要件の他に発現されるべきＤＮＡ配列によってコードされる生成物のホストに対する毒性、および発現生成物の精製の容易さを考慮して選択される。
【００７６】
本発明はさらにポリペプチドを製造する方法を提供する。本方法は、上記のホストベクター系を当該ポリペプチドの産生を許容する適切な条件下で増殖させ、さらにそのようにして製造されたポリペプチドを回収することを含む。
本発明はさらに、当該単離されたポリペプチドを特異的に認識または結合することができる抗体を提供する。当該抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。さらに当該抗体は、放射能を有するマーカー、比色測定マーカー、蛍光マーカー、または化学発光マーカーのいずれかである検出可能なマーカーで標識できる。標識抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。ある実施態様では、標識抗体は精製標識抗体である。抗体を標識する方法は当技術分野では周知である。
【００７７】
"抗体"という用語には、例えば天然に存在する抗体および天然には存在しない抗体の両方が含まれる。特に、"抗体"という用語にはポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体並びのそのフラグメントが含まれる。さらにまた、"抗体"という用語にはキメラ抗体および完全合成抗体並びにそのフラグメントが含まれる。そのような抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、単一鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００７８】
当技術分野で知られている種々の方法をポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体に対するポリクローナル抗体の製造に用いることができる（例えば以下を参照されたい：Antibodies--A Laboratory Manual, Harlow & Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York, 1988)。抗体を産生するためには、種々のホスト動物を切端系ＣｂｐＡまたはその誘導体（例えばフラグメントまたは融合蛋白質）を注射して免疫することができる。これらのホスト動物にはウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどが含まれる。ある実施態様では、ポリペプチドは免疫原性担体、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と共役させることができる。種々のアジュバントを用いてホストの種に応じて免疫学的反応を高めることができる。
【００７９】
モノクローナル抗体またはそのフラグメント、類似体もしくは誘導体の製造のためには、持続的細胞株の培養によって抗体分子を産生するいずれの技術も用いることができる（例えば以下を参照されたい：Antibodies--A Laboratory Manual, Harlow & Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York, 1988)。これらの技術には、最初にKohler & Milstein(Nature 256:495-497(1975)）が報告したハイブリドーマ技術の他に、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., Immunology Today 4:72(1983)）およびヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００８０】
本発明のさらに別の実施態様では、モノクローナル抗体は最近の技術（ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５）を用いて無菌動物で製造できる。本発明にしたがえば、ヒト抗体を用いることができ、ヒト抗体はヒトハイブリドーマを用いるか（Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026-2030(1983))、またはヒトＢ細胞をＥＢＶウイルスでin vitroで形質転換させて得ることができる（Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp.77-96(1985)）。実際、本発明にしたがえば、適切な生物活性をもつヒト抗体分子に由来する遺伝子と一緒に、ポリペプチドに対して特異的なマウス抗体分子の遺伝子をスプライシングする"キメラ抗体"の製造のために開発された技術（Morrison et al., J. Bacteriol. 159-870(1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608(1984); Takeda et al., Nature 314:452-454(1985))を用いることができ、そのような抗体は本発明の範囲に包含される。そのようなヒト抗体またはヒト化キメラ抗体は、免疫反応、特にアレルギー反応の誘発が外因性抗体よりもはるかに少ないので、ヒトの疾患（下記で述べる）の治療に使用する場合に好ましい。本発明のまた別の実施態様では、Ｆａｂ発現ライブラリー（Huse et al., Science 246:1275-1281(1989)）の構築のための技術を利用する。この技術は、ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体に対して所望の特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で容易な特定を可能にする。
【００８１】
抗体分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは既知の技術によって生成できる。例えば、そのようなフラグメントには、Ｆ（ａｂ'）2フラグメント（抗体分子のペプシン消化によって製造できる）；Ｆａｂ'フラグメント（Ｆ（ａｂ'）2フラグメントのジスルフィド架橋を還元して生成できる）；およびＦａｂフラグメント（抗体分子をパパインおよび還元剤で処理して製造できる）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００８２】
抗体の製造では、所望の抗体のためのスクリーニングは例えば以下のような当分野で既知の技術によって達成できる：放射能免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、"サンドイッチ"免疫アッセイ、免疫放射能測定アッセイ、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、in situ免疫アッセイ（例えばコロイド状金、酵素または放射性同位元素標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈殿反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなど。ある実施態様では、一次抗体は、二次抗体または試薬の一次抗体への結合を検出することによって検出される。また別の実施態様では、二次抗体は標識される。免疫アッセイで結合を検出する多くの手段が当分野で知られており、本発明の範囲内である。
【００８３】
in vivoでの検出のために抗体は例えば以下のようなもので標識される：酵素、発蛍光団、発色団、放射性同位元素、色素、コロイド状金、ラテックス粒子、および化学発光剤。また別には、抗体はin vivoでの検出のために例えば以下のようなもので標識される：放射性同位元素（好ましくはテクネチウムまたはヨウ素）、磁気共鳴シフト試薬（例えばガドリニウムおよびマンガン）、または放射能非透過試薬。
【００８４】
これらの実験で用いられる非常に一般的な標識は放射能元素、酵素、紫外線に暴露したとき蛍光を発する化学物質、およびその他のものである。多数の蛍光物質が知られており、標識として利用できる。これらには、例えばフルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡ青およびルシファー黄である。具体的な検出用物質は、ヤギで作製し、イソチオシアネートによってフルオレセインと共役させた抗ウサギ抗体である。ポリペプチドはまた放射性元素または酵素で標識できる。放射能標識は、現在利用可能な計測方法のいずれでも検出できる。好ましいアイソトープは、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、36Ｃｌ、51Ｃｒ、57Ｃｏ、58Ｃｏ、59Ｆｅ、90Ｙ、125Ｉ、131Ｉおよび186Ｒｃから選択できる。
【００８５】
酵素標識も同様に有用で、現在利用可能な比色法、分光測定法、蛍光スペクトル測定法、電流測定法、ガス圧測定法のいずれによっても検出できる。酵素は、選択した粒子と架橋分子（例えばカルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなど）との反応によって共役させる。これらの方法で用いることができる多くの酵素が知られており利用することができる。好ましいものは、ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼである。例えば、米国特許第３６５４０９０号、同３８５０７５２号、および同４０１６０４３号は代替標識物質および方法について開示している。
【００８６】
本発明の別の実施態様では、疑わしい標的細胞の予め定めた結合活性の有無または結合活性の能力を決定するために医療専門家が使用できる市販用テストキットが製造される。上記で述べた検査技術にしたがって、そのようなキットのある種類は少なくとも標識ポリペプチドまたはそれに対して特異的な結合パートナー（例えば当該ポリペプチドに特異的な抗体）および指示書（例えば"競合"、"サンドイッチ"、"ＤＡＳＰ"などの選択した方法にしたがう）を含む。このキットはまた周辺試薬（例えば緩衝液、安定剤など）を含む。
【００８７】
したがって、以下を含むテストキットは、予め定めた細菌の結合活性の存在、または当該活性に対する細胞の能力を表示するために製造できる：
（ａ）本発明のポリペプチドの直接または間接的結合によって得られる予め定めた量の少なくとも１つの標識した免疫化学反応性を有する成分またはそれに対して、検出可能な標識に対して特異的結合パートナー；
（ｂ）他の試薬；および
（ｃ）当該キットを使用するための指示書。
【００８８】
本発明は、以下を含む（ただしこれらに限定されない）拮抗薬または阻害剤を提供する：ペプチドフラグメント、模倣体、核酸分子、リボザイム、ポリペプチド、小分子、炭水化物分子、炭糖類、オリゴ糖、または抗体。肺炎球菌を競合的に封鎖または抑制する薬剤もまた本発明で意図される。本発明は、当該ポリペプチドを抑制する無機化合物、核酸分子、オリゴヌクレオチド、有機化合物、ペプチド、ペプチド模倣化合物または蛋白質を含む薬剤を提供する。
【００８９】
本発明は、配列番号：１、３−７、９−１１、２２および２３のいずれかに示すアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび医薬的に許容できるアジュバントまたは担体を含むワクチンを提供する。本ポリペプチドは、図２に示すＮ−末端コリン結合プロテインＡ切端形のアミノ酸配列を含むことができる。本発明は、図２に示す保存領域を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび医薬的に許容できるアジュバントまたは担体を含むワクチンを提供する。例えば、保存領域には、アミノ酸配列１５８から１７２；３００から３２１；３３１から３３９；３５５から３６５；３６７から３７４；３７９から３８９；４０９から４２７；および４３０から４４７が含まれるが、ただしこれらに限定されない。本発明は、本ポリペプチドをコードする単離核酸および医薬的に許容できるアジュバントまたは担体を含むワクチンを提供する。
【００９０】
グラム陽性細菌（特に肺炎球菌）に対する能動的免疫は、免疫誘発量の本ポリペプチドもしくはペプチド誘導体またはそのフラグメントおよびアジュバントによる免疫（ワクチン接種）によって誘発できる。この場合、本ポリペプチドまたはその抗原性誘導体もしくはフラグメントが当該ワクチンの抗原性成分である。本発明のポリペプチドまたはその誘導体もしくはフラグメントは、ワクチンを製造するためにアジュバントとの混合物として製造される。好ましくは、ワクチンの抗原性成分として用いられる本発明のポリペプチドの誘導体またはフラグメントは付着因子である。より好ましくは、ワクチンの抗原性成分として用いられる本発明のポリペプチドの誘導体またはフラグメントは、グラム陽性細菌の全株または多くの株に共通の抗原であるか、または菌の近縁種と共通の抗原である。最も好ましくは、ワクチンの抗原性成分は、共通抗原である付着因子である。
【００９１】
本発明の核酸主剤ワクチンを含むベクターは、当分野で既知の方法（例えば核酸感染（トランスフェクション）、電気穿孔、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈澱、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーター（例えば以下を参照されたい：Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-967(1992); Wu & Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624(1988); Hartmut et al., カナダ特許出願2012311号（1990年3月15日出願))によって所望のホストに導入できる。
【００９２】
ワクチンはいずれの非経口的ルートで投与してもよい。これらのルートには、筋肉内、腹腔内、静脈内などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。ワクチン接種の所望の結果は抗原、したがって病原性生物に対する免疫反応を誘発することであるので、好ましくは、投与は、直接的（またウイルスベクターの標的への誘導または選択による）、または間接的（類リンパ組織（例えばリンパ節または脾臓）への投与）なものが所望される。免疫細胞は持続的に複製しているので、それらはレトロウイルス主剤核酸ワクチンに理想的な標的である（なぜならばレトロウイルスは複製細胞を必要とする）
【００９３】
受動免疫は、本発明のポリペプチドに対する抗血清、ポリクローナル抗体または中和モノクローナル抗体を対象患者に投与することによって、グラム陽性菌（好ましくは連鎖球菌、より好ましくは肺炎球菌）の感染が疑われる対象動物に付与される。受動免疫は長期の防御を付与しないので、受動免疫は、ワクチン接種を受けていない対象者の細菌感染の治療に有用なツールである。受動免疫は、利用可能なそれ以外の治療がないので抗生物質耐性グラム陽性細菌株の治療に特に重要である。好ましくは、受動免疫療法のために投与される抗体は自系抗体である。例えば、対象者がヒトの場合は、抗体に対する免疫反応を可能性を最小限にするために、抗体は好ましくはヒト由来または"ヒト化"されている。本発明の能動ワクチンもしくは受動ワクチン、または付着因子の投与は、グラム陽性菌（好ましくは連鎖球菌、より好ましくは肺炎球菌）の感染から対象動物を防御するために用いることができる。
【００９４】
本発明は、ある量の本発明のポリペプチドおよび医薬的に許容できる担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
例えば、肺炎球菌の粘膜面への付着を予防するそのような医薬組成物は、レクチンドメインに対する抗体および／または可溶性の過剰なレクチンドメイン蛋白質を含むことができる。どちらかのメカニズムによって付着を封鎖して、感染の最初のステップを阻害し、それによってコロニー形成を減少させる。これによって順次ヒトからヒトへの伝達を減少させ、症状の進展を予防する。
【００９５】
本発明は、肺炎球菌に暴露されたかまたは感染した対象者に免疫反応を誘発する方法を提供する。この方法は、対象者にある量の医薬組成物を投与し、それによって免疫反応を誘発することを含む。
本発明は、対象者で肺炎球菌による感染を予防する方法を提供する。この方法は、対象者に肺炎球菌の付着を防御するために有効な量の医薬組成物を投与し、それによって肺炎球菌による感染を予防することを含む。
【００９６】
本発明は、対象者で肺炎球菌による感染を予防する方法を提供する。この方法は、対象者に抗体および医薬的に許容できる担体または希釈剤を含むある量の医薬組成物を投与し、それによって肺炎球菌による感染を予防することを含む。
本発明は、肺炎球菌に暴露されたかまたは感染した対象者を治療する方法を提供する。この方法は、治療的に有効な量の本発明のワクチンを対象者に投与し、それによって対象者を治療することを含む。
【００９７】
本発明は、肺炎球菌に暴露されたかまたは感染した対象者でホスト細胞のコロニー形成を抑制する方法を提供する。この方法は、配列番号１、３−５、７または９−１１のいずれかに示すアミノ酸配列から成るポリペプチドを含むある量の医薬組成物を対象者に投与し、それによって免疫反応を誘発することを含む。コロニー形成を阻害する治療用ペプチドは呼吸系粘膜によって輸送される。医薬組成物は図２に示すアミノ酸配列から成るポリペプチドを含む。
【００９８】
本明細書で用いられるように、"医薬組成物"とは、例えば肺炎球菌のコロニー形成を予防する治療効果または利益を付与する本発明のポリペプチド生成物の治療的に有効な量と一緒に適切な希釈剤、保存料、安定剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体をその中に含むものを意味する。本明細書で用いられるように、"治療的に有効な量"とは、ある条件および投与計画について治療効果を提供する量を指す。そのような組成物は液体、または凍結乾燥製剤、またはそうでなければ乾燥製剤で、種々の緩衝成分（例えばトリスＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度、表面への吸収を防ぐアルブミンまたはゼラチンのような添加剤、洗剤（例えばトウィーン２０、トウィーン８０、プルロニックＦ６８、胆汁酸塩）、可溶化剤（例えばグリセロール、ポリエチレングリセロール）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存料（例えばチメロサル、ベンジルアルコール、パラベン）、膨張剤または張度調節剤（例えばラクトース、マンニトール）、ポリマー（例えばポリエチレングリコール）の蛋白質への共有結合、金属イオンとの錯塩化、またはポリマー化合物（例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなど）の粒子化調製物またはリポソーム、ミクロ乳剤、ミセル、単層もしくは多層小胞、赤血球ゴーストまたはスフェロプラストへの当該材料の取り込みを含む。
【００９９】
そのような組成物は、治療剤の生理的状態、可溶性、安定性、in vivo遊離速度、in vivoクリアランス速度に影響を与えるであろう。組成物の選択は、治療活性を有する蛋白質の物理的および化学的特性に左右されるであろう。例えば、活性物質の膜結合形に由来する生成物は洗剤含有製剤を必要とする。制御または持続放出組成物は親油性デポット（例えば脂肪酸、ワックス、油）製剤を含む。さらに本発明が意図するものは、ポリマー（例えばポロキサマーまたはポロキサミン）および、組織特異的レセプター、リガンドまたは抗原に対して誘導した抗体に結合させた活性物質または組織特異的レセプターのリガンドに結合させた活性物質で被覆した粒子化組成物である。ある実施態様では、本発明の組成物は、、保護皮膜、プロテアーゼ抑制物質、または種々の投与経路（非経口、経肺、経鼻、および経口投与を含む）のための浸透強化物質をもつ粒子化形を含む。
【０１００】
さらに、本明細書で用いられるように、"医薬的に許容できる担体"は当業者には周知で、０．０１−０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍの燐酸緩衝液または０．８％食塩水を含む。さらに、そのような医薬的に許容できる担体は水溶液または非水性溶液、懸濁液および乳液であろう。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えばオリーブ油）、注射用有機エステル（例えばオレイン酸エチル）である。水性担体には水、アルコール水溶液、乳液または懸濁液（食塩水および緩衝媒体を含む）が含まれる。非経口賦形剤には塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキスロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液または固定油が含まれる。静脈内賦形剤には、水分栄養補充液、電解質補充液（例えばリンゲルデキストロースを主剤とするもの）などが含まれる。保存料および他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、照合剤、不活性ガスなど）もまた含まれる。
【０１０１】
"アジュバント"は、抗原に対する免疫反応を強化する化合物または混合物を指す。アジュバントは、抗原をゆっくりと放出する組織デポットとして、または免疫反応を非特異的に強化する類リンパ系活性化物質として機能することができる（Hood et al., Immunology, Second Ed., Benjamin/Cummings:Menlo Park, California, p.384(1984)）。アジュバントを含まない抗原単独による初回チャレンジは、しばしば液性または細胞性免疫反応を誘発することができない。アジュバントにはフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、 サポニン、鉱物ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、界面活性剤（例えばリゾレシチン）、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジュバント（例えばＢＣＧ（baccile Galmette-Guerin)およびコリネバクテリウム＝パルブム（Corynebacterium parvum))が含まれるが、ただしこれらに限定されない。好ましくはアジュバントは医薬的に許容できるものである。
【０１０２】
制御放出組成物または持続放出組成物は、親油性デポット（例えば脂肪酸、ワックス、油）としての製剤を含む。さらに本発明に含まれるものは、ポリマー（例えばポロキサマーまたはポロキサミン）および化合物で被覆した粒子化組成物であるが、当該化合物は、組織特異的レセプター、リガンドもしくは抗原に対して誘導した抗体と共役されているか、または組織特異的レセプターのリガンドと共役されている。本発明の組成物の他の実施態様では、防御皮膜、プロテアーゼ抑制物質または種々の投与ルート（非経口、経鼻および経口ルートを含む）のための浸透強化物質を有する粒子化形を含む。
【０１０３】
投与したとき、化合物はしばしば粘膜表面または循環系から迅速に除去され、したがって薬理活性は比較的短時間である。結果として、治療効果を維持するために、生物活性物質の比較的大量の投与量を何度も投与する必要がある。水溶性ポリマー（例えばポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンまたはポリプロリン）の共有結合による化合物の改変が、対応する未改変化合物よりも静脈注射後実質的により長時間の血中半減期を示すことが知られている。（Abuchowski et al., (1981); Newmark et al., (1982); Katre et al., (1987))。そのような改変はまた、水溶液中での化合物の可溶性を高め、凝集を防止し、化合物の物理的および化学的安定性を強化し、さらに化合物の免疫原性および反応性を極めて低下させる。結果として、未改変化合物の場合よりも投与回数の少ないまたは投与量の少ない当該ポリマー化合物アダクツの投与によって、所望のin vivo生物学的活性が達成できる。
【０１０４】
投与量：十分な量には約１μｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇが含まれるが、ただしこの量に限定されない。この量は１０ｍｇ／ｋｇであろう。医薬的に許容できる形態の組成物は医薬的に許容できる担体を含有する。上記に記載したように、本発明は、ベクター、ワクチン、ポリペプチド、核酸および抗体、抗抗体および、病原活性（例えばホスト細胞への付着）について肺炎球菌と競合する薬剤を含む医薬組成物を含む治療組成物を提供する。
【０１０５】
活性成分を含む治療用組成物の製造は当分野では周知である。典型的には、そのような組成物は、鼻咽頭に投与されるポリペプチドのエアロゾルとして、または液体溶液もしくは懸濁液のどちらかとして注射できるように製造できるが、注射の前の溶液、懸濁液、液状物に適した固形製剤もまた製造できる。調製物を乳化してもよい。治療のための活性成分はしばしば、医薬的に許容でき、活性成分と適合する賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せである。さらに、所望する場合は、組成物は微量の補助物質（例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤（これらは活性成分の有効性を高める）を含むことができる。
【０１０６】
活性成分は、医薬的に許容できる中性塩として治療用組成物に製剤化できる。医薬的に許容できる塩には酸付加塩（ポリペプチドまたは抗体分子の遊離アミノ基で形成される）および無機酸（例えば塩酸、リン酸）または有機酸（例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）で形成されるものが含まれる。遊離カルボキシル基から形成される塩も、例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または鉄のような無機塩基から、さらにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導できる。
【０１０７】
組成物の蛋白質、ＤＮＡ、ベクターの重量で少なくとも約７５％が"Ａ"（"Ａ"はただ１つの蛋白質、ＤＮＡ分子、ベクターなど）であるとき（ＡおよびＢが属する種の分類に応じて）、"Ａ"を含む組成物は実質的に"Ｂ"（"Ｂ"は１つまたは２つ以上の夾雑蛋白質、ＤＮＡ分子、ベクターなど）を含まない。好ましくは"Ａ"は、組成物中のＡ＋Ｂの物質の重量で少なくとも約９０％含まれ、最も好ましくは少なくとも重量で約９９％含まれる。
【０１０８】
本明細書では"治療的に有効な量"という語句は、少なくとも約１５％まで、好ましくは５０％まで、より好ましくは少なくとも９０％まで、もっとも好ましくはホストの活性、機能および反応における臨床的に有意な欠如を防止する。また別には治療的に有効な量は、ホストの臨床状態におけるに有意な改善をもたらすために十分である。本発明では、ホストの反応の欠如は持続的または伝播する細菌感染によって明白である。ホストの臨床状態におけるに有意な改善には、細菌負荷の減少、コロニーを形成したホスト細胞から細菌の除去、感染に伴う発熱または炎症の低下、または感染に伴う症状のいずれかの減少が含まれる。
【０１０９】
本発明にしたがえば、本発明の治療用組成物の成分は非経口的に、経粘膜的に（例えば経口、経鼻、経肺または経腸的）、経皮的に導入できる。好ましくは、投与は非経口的、例えば静脈注射、動脈内、筋肉内皮内、皮下、腹腔内、心室内、および頭蓋内を含むがただしこれらに限定されない。経口または肺投与は、粘膜免疫を活性化するために好ましい。なぜならば肺炎球菌は一般に鼻咽頭および肺粘膜でコロニーを形成するので、粘膜免疫は特に有効な防御処置である。本発明の治療用組成物に関して用いられる場合は、"単位投与量"という用語は、ヒトの１回分の投与量として物理的に分離したユニットを指し、各ユニットは、所望の治療効果を生じるために計算した予め定められた量の活性物質を必要な希釈剤（すなわち担体または賦形剤）と合わせて含有する。
【０１１０】
別の実施態様では、活性化合物は、賦形剤、特にリポソームとして輸送される（以下の文献を参照されたい：Langer, Science 249:1527-1533(1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of infectious Diesease and Cancer, Lopez-Berestein & Fidler(eds.), Liss, New York, pp.353-365(1989);Lopez-Berestein, 同書、pp.317-327; 全般的には同書を参照のこと）。
【０１１１】
さらに別の実施態様では、治療用化合物は制御放出系で輸送される。例えば、ポリペプチドは、静脈内輸液、埋め込み浸透圧ポンプ、経皮貼付薬、リポソーム、または他の投与態様を用いて投与できる。ある実施態様では、ポンプを用いることができる（以下の文献を参照されたい：Langer, 上掲書；Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201(1978);Buchwald et al., Surgery 88:507(1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574(1989))。別の実施態様では、ポリマー物質を用いることができる（例えば以下の文献を参照されたい：Medical Applications of Controlled Release, Langer & Wise, eds., CRC Press, Boca Raton, Florida(1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen & Ball, eds., Wiley, New York(1984); Ranger & Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61(1983); Levy et al., Science 228:190(1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351(1989); Howard et al., Neurosurg. 71:105(1989)）。
【０１１２】
また別の実施態様では、制御放出系は治療標的（例えば脳）の近傍に静置し、したがって全身投与量の一部分のみを必要とするだけである（例えば以下の文献を参照されたい：Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, 上掲書、vol.2, pp.115-138(1984))。好ましくは、制御放出装置は、対象者の免疫活性化が不適切な部位または腫瘍の近傍に導入される。他の制御系はLangerによって概説されている（Science 249:1527-1533(1990))。
【０１１３】
上記で説明した活性成分の投与が細菌感染について有効な治療となる対象者はヒトであるが、対象はいずれの動物でもよい。したがって、当業者には容易に理解できるところであるが、本発明の方法および医薬組成物は、任意の動物、特に以下を含む哺乳類（ただしこれらに限定されない）に動物医療用途のために投与されるのに適している：家畜動物（例えばネコまたはイヌ、ただしこれらに限定されない）、牧畜動物（例えば、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジおよびブタ、ただしこれらに限定されない）、野性動物（原野かまたは動物園かにかかわらず）、研究用動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコなど）。
【０１１４】
本発明の治療方法および組成物では、活性成分の治療的に有効な量が提供される。治療的に有効な投与量は、当分野の医療従事者には、当技術分野で周知のように患者の特性（年令、体重、性別、状態、合併症、他の疾患など）を基にして容易に決定できる。さらにまた、日常的な検査を実施しながら、より具体的な情報が、多様な患者における多様な症状の治療について適切な投与レベルに関する情報が得られ、さらに当業者は、治療の内容、年令および患者の一般的状態を考慮しながら適切な投与量を確認することができる。
【０１１５】
一般には、静脈内注射または輸液のためには、投与量は腹腔内、筋肉内、または他の投与ルートより少ないであろう。投与計画は、循環半減期および用いられた剤形したがって変動するであろう。組成物は、剤形に適合する態様で治療的に有効な量で投与されるであろう。投与に必要な活性成分の正確な量は臨床医の判断にしたがい、各人に固有である。しかしながら、適切な投与量は約０．１から２０ｍｇ、好ましくは約０．５から約１０ｍｇ、より好ましくは１から数ｍｇの活性成分／ｋｇ体重／人／日で、投与経路によって左右される。投与開始および追加投与についての適切な計画もまた変動するが、典型的には開始投与に続いて、１時間またはそれ以上の間隔で反復投与がその後に続くか、または他の投与が実施される。また別には、血中で１０ナノモルから１０マイクロモル濃度を維持するために十分な連続静脈内輸液も意図される。
【０１１６】
他の化合物との投与：細菌感染の治療のために、細菌感染の治療に用いられる以下を含む（ただしこれらに限定されない）１つまたは２つ以上の医薬組成物と併用して、本発明の活性成分を投与することができる：（１）抗生物質；（２）細菌の付着を抑制する可溶性炭水化物；（３）細菌の付着を抑制する他の小分子；（４）細菌の代謝、輸送、形質転換を抑制する物質；（５）細菌溶解促進物質；または（６）抗細菌抗体または他の細菌抗原に対するワクチン。他の可能な活性成分には、抗炎症剤、例えばステロイドおよび非ステロイド抗炎症薬が含まれる。投与は同時でも（例えば本発明の活性成分および抗生物質の混合物の投与）、または連続的でよい。
【０１１７】
したがって、特定の実施態様では、治療組成物はさらに有効量の活性成分および１つまたは２つ以上の以下の活性成分を含むことができる：抗生物質、ステロイドなど。典型的な製剤は以下に示される：
静脈内製剤Ｉ：
成分                                ｍｇ／ｍｌ
セフォタキシム                      ２５０．０
ポリペプチド                        １０．０
デキストロースＵＳＰ                ４５．０
重亜硫酸ナトリウムＵＳＰ            ３．２
エディテート二ナトリウムＵＳＰ      ０．１
適量の注射用水を加えて調節          １．０ｍｌ
【０１１８】
静脈内製剤ＩＩ
成分                                ｍｇ／ｍｌ
アンピシリン                        ２５０．０
ポリペプチド                        １０．０
重亜硫酸ナトリウムＵＳＰ            ３．２
二ナトリウムエディテートＵＳＰ      ０．１
適量の注射用水を加えて調節          １．０ｍｌ
【０１１９】
静脈内製剤ＩＩＩ
成分                                ｍｇ／ｍｌ
ゲンタマイシン（硫酸塩として）      ４０．０
ポリペプチド                        １０．０
重亜硫酸ナトリウムＵＳＰ            ３．２
二ナトリウムエディテートＵＳＰ      ０．１
適量の注射用水を加えて調節          １．０ｍｌ
【０１２０】
静脈内製剤ＩＶ
成分                                ｍｇ／ｍｌ
ポリペプチド                        １０．０
デキストロースＵＳＰ                ４５．０
重亜硫酸ナトリウムＵＳＰ            ３．２
エディテート二ナトリウムＵＳＰ      ０．１
適量の注射用水を加えて調節          １．０ｍｌ
【０１２１】
静脈内製剤Ｖ
成分                                ｍｇ／ｍｌ
ポリペプチド拮抗物質                ５．０
重亜硫酸ナトリウムＵＳＰ            ３．２
二ナトリウムエディテートＵＳＰ      ０．１
適量の注射用水を加えて調節          １．０ｍｌ
【０１２２】
したがって、細菌のホスト細胞への細菌仲介結合によって生じる感染を減少または抑制することを所望するか、または当該細菌に対する抗体もしくはそのリガンドもしくは当該リガンドに対する抗体を所望する特定の事例では、ポリペプチドが、ホスト細胞と細菌の相互作用を阻害するために導入される。
【０１２３】
本明細書でさらに意図するものは、付着因子抑制剤としてレクチン活性をもつ本発明のポリペプチドまたはその誘導体の肺デリバリーである。付着因子抑制剤（またはその誘導体）が哺乳類の肺に輸送され、ここで細菌（すなわち連鎖球菌、好ましくは肺炎球菌）のホスト細胞への結合に干渉する。肺デリバリーのための蛋白質の調製に関する他の報告が当技術分野で見出される（Adjei et al., Pharmaceutical Research, 7:565-569(1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144(1990)（リュープロリドアセテート）；Braquet et al., J. Cardiovascular Pharmacology, 13(suppl.5):143-146(1989)(エンドセリン−１）；Hubbard et al., Annals Int. Med. Vol.III, pp.206-212(1989)（α１−アンチトリプシン）；Smith et al., J. Clin. Invest. 84:1145-1146(1989)(α１−プロテイナーゼ）；Oswein et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March,(1990)(リコンビナントヒト成長因子）；Debs et al., J. Immunol. 140:3482-3488(1988)（インターフェロン−γおよび腫瘍壊死因子α）；Platz et al., 米国特許第５２８４６５６号（顆粒球コロニー刺激因子))。薬剤の肺デリバリーのための方法および組成物が米国特許第５４５１５６９号（１９９５年９月１９日、Wong et al.)に記載されている。
【０１２４】
そのような装置の全てが付着因子抑制剤（またはその誘導体）の分散に適した製剤の使用を必要とする。典型的には、各製剤は使用する装置のタイプに固有で、治療に有用な通常の希釈剤、アジュバント、および／または担体以外に適切な噴射剤の使用を必要とする。さらにまた、リポソーム、マイクロカプセルまたはマイクロスフェア、封入複合体または他のタイプの担体も意図される。化学的に改変した付着因子抑制剤もまた、化学的改変のタイプまたは用いる装置のタイプにしたがって種々の剤形で製造できる。
【０１２５】
ネブライザー（ジェット式または超音波式のどちらか）と一緒に使用するために適した製剤は、典型的には付着因子抑制剤（またその誘導体）を含む。付着因子は溶液１ｍｌにつき約０．１から２５ｍｇの生物学的に活性な付着因子抑制剤の濃度で水に溶解される。製剤はまた緩衝液および単純糖（例えば付着因子抑制剤安定化および浸透圧の調節のため）を含むことができる。ネブライザー製剤はまた界面活性剤を含み、エアロゾルを形成する際の溶液の霧状化によって惹起される付着因子抑制剤の面誘発凝集を低下または防止することができる。
【０１２６】
用量計量吸入装置を使用する製剤は一般に、界面活性剤と一緒に噴射剤に懸濁させた付着因子抑制剤（またはその誘導体）を含む微細分割粉末を含む。噴射剤はこの目的のために使用されるいずれの一般的物質でもよい。例えばクロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボンまたはヒドロカーボン（トリクロロフルオロメタン、ジクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび１，１，１，２−テトラフルオロメタンを含む）またはその組合せである。適切な界面活性剤はソルビタントリオレエートおよびダイズレシチンである。オレイン酸もまた界面活性剤として有用である。
【０１２７】
液体エアロゾル製剤は、医薬的に許容できる希釈剤中に付着因子抑制剤および分散剤を含む。本発明の乾燥粉末エアロゾル製剤は、付着因子抑制剤の微細分割固形物および分散剤から成る。液体または乾燥粉末エアロゾル製剤のどちらかを用いて、製剤は噴霧化されなければならない。すなわち、噴霧化投与量が実際に鼻腔または肺の粘膜に到達したことを担保するために、製剤は液体または固形粒子に細分化されなければならない。"エアロゾル粒子"という用語は、経鼻投与または肺投与に適した（すなわち粘膜に到達する）液体粒子または固形粒子を指すために本明細書では使用される。他の考慮すべき事柄、例えばデリバリー装置の構築、製剤の追加成分、および粒子の性状も重要である。薬剤の肺投与の特徴は当分野で周知であるが、製剤化処理、噴霧化手段およびデリバリー装置の構築では当業者の極めて日常的な実験を必要とする。特定の実施態様では、物質の平均動的直径は、肺胞に薬剤粒子が到達することを担保するために５マイクロメートルまたはそれより小さいであろう（L.L. Wearley, Crit. Rev. in Ther. Drug Carrier Systems 8:333(1991)）。
【０１２８】
エアロゾルデリバリー系、例えば加圧用量計量吸入装置および乾燥粉末吸入装置は文献に開示され（S.P. Newman, Aerosols and the Lung, S.W. Clarke & D. Davia, eds., pp.197-22)、本発明で用いることができる。
また別の実施態様では、下記で詳細に考察するように、本発明のエアロゾル製剤は、付着因子抑制剤の他に他の治療的または薬理学的に活性な成分（例えば抗生物質、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤など（ただしこれらに限定されない))を含むことができる。
【０１２９】
液体エアロゾル製剤：本発明は、エアロゾル製剤および細菌感染（例えば連鎖球菌、特に肺炎球菌）に罹患している対象者の治療に使用する剤形を提供する。一般にそのような剤形は医薬的に許容できる希釈剤中に付着因子抑制剤を含む。医薬的に許容できる希釈剤には、滅菌水、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース溶液などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。個々の実施態様では、本発明または本発明の医薬製剤で使用できる希釈剤は、燐酸緩衝食塩水または緩衝食塩水溶液（一般にｐＨは７．０から８．０）、または水である。
【０１３０】
本発明の液体エアロゾル製剤は、任意の成分として医薬的に許容できる担体、希釈剤、可溶化剤または乳化剤、界面活性剤および賦形剤を含むことができる。製剤は担体を含むことができる。担体は  循環系に溶解でき、生理学的に許容できる巨大分子であるが、ここで生理学的に許容できるとは、当業者が治療計画の一部として患者に当該担体の注射を許容することを意味する。好ましくは、担体は、クリアランスに対して許容できる血中半減期をもち循環系で比較的安定である。そのような巨大分子にはダイズレシチン、オレイン酸およびソルビタントリオレエートが含まれるが、ただしこれらに限定されない。ソルビタントリオレエートが好ましい。
【０１３１】
本発明の製剤はまた、ｐＨ維持、溶液の安定化、または浸透圧の調節に有用な他の薬剤を含むことができる。例えばそのような薬剤には、塩（例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム）、炭水化物（例えばグルコース、ガラクトースまたはマンノース）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
本発明はさらに、付着因子抑制剤および治療的に有効な別の薬剤（例えば抗生物質、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤など）を含む液体エアロゾル製剤を意図する。
【０１３２】
エアロゾル乾燥粉末製剤：本エアロゾル製剤は、付着因子抑制剤および分散剤の微細分割粉末形を含む乾燥粉末製剤として製造することもまた意図される
粉末吸入装置から配分される製剤は、付着因子抑制剤（または誘導体）を含有する微細分割乾燥粉末を含み、さらに、粉末を装置から分散させやすくするために、膨張剤、例えばラクトース、ソルビトール、ショ糖またはマンニトールを例えば製剤重量の５０から９０％の量で含むことができる。付着因子抑制剤（または誘導体）は、末端の肺への最も効果的なデリバリーのために最も有利なようには平均粒子サイズが１０ｍｍ（またはミクロン）未満、最も好ましくは０．５から５ｍｍの粒子化形で製造されるべきである。別の実施態様では、乾燥粉末製剤は微細分割乾燥粉末を含むことができ、当該微細分割乾燥粉末は、付着因子抑制剤、分散剤さらにまた膨張剤を含む。本製剤との併用に有用な膨張剤には、ラクトース、ソルビトール、ショ糖、またはマンニトールのような薬剤が含まれる。当該膨張剤の量は、装置から粉末を配分しやすくする量である。
本発明はさらに、付着因子抑制剤および治療的に有効な別の薬剤（例えば抗生物質、ステロイド、非ステロイド系抗炎症剤など）を含む乾燥粉末製剤を意図する。
【０１３３】
本明細書で用いようとするものは経口用剤形で、当該剤形は一般的に成書に記載されている（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990(Mack Publishing Co. Easton PA 18042), Chapter89：本文献は参照により本明細書に含まれる）。固形剤形には、錠剤、カプセル、ピル、トローチまたはロゼンジ、カシェーまたはペレットが含まれる。さらにまたリポソーム小胞または類蛋白質小胞も本組成物の製剤化に用いることができる（例えば類蛋白質マイクロスフェアは米国特許第４９２５６３７号に報告されている）。リポソーム被包化を用いてもよく、リポソームは種々のポリマーで誘導できる（例えば米国特許第５０１３５５６号）。可能な治療用固形剤形については成書に記載されている（K. Marshall, in: Modern Pharmaceutics, G.S. Banker & C.T. Rhodes, eds., Chapter 10, 1979：この文献は参照により本明細書に含まれる）。一般には、当該製剤は本成分（またはその化学的改変形）および不活性成分を含み、不活性成分は胃内環境を保護し、生物学的活性物質を腸内に遊離させる。
【０１３４】
さらにまた特に意図されるものは上記の誘導成分の経口用剤形である。誘導体の経口デリバリーが有効であるように、当該成分は化学的に改変できる。一般に、意図される化学改変は少なくとも１つの分子部分を成分分子自体に結合させるものである。この場合、当該分子部分は（ａ）蛋白分解の抑制；および（ｂ）胃または腸から血流への取り込みを可能にする。さらに所望されることは、成分の全体的な安定性の増加および体内循環時間の増加である。そのような分子部分には、ポリエチレングリコール、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリンが含まれる（Abuchowski & Davis, 1981, "Soluble Polymer-Enzyme Adducts", In:Enzymes as Drugs, Hocenberg & Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, pp.367-383;Newmark, et al., J. Appl. Biochem. 4:185-189(1982))。使用できる他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソレンおよびポリ−１，３，６−チオキソケンである。医薬用途で好ましいものは、上記で示したようにポリエチレングリコール分子部分である。
【０１３５】
当該成分（誘導体）の場合、放出の場所は胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）または大腸であろう。当業者には胃で溶解せず十二指腸または小腸の他の場所で放出される製剤が利用可能である。好ましくは、放出による胃環境の有害な作用は、当該蛋白質（または誘導体）の保護によって、または胃環境より先（例えば小腸）で生物学的活性物質を放出することによって回避されるであろう。
【０１３６】
胃酸に対する完全な耐性を担保するために、少なくともｐＨ５．０では非透過性の被覆が必要である。腸溶皮として用いられるより一般的な不活性成分の例は、セルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、ユードラジット（Eudragit）Ｌ３０Ｄ、アクォテリック（Aquateric)、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、ユードラジットＬ、ユードラジットＳ、およびシェラック（Shellac)である。これらの被覆は混合フィルムとして用いることができる。
【０１３７】
被覆または被覆混合物は錠剤にも用いることができるが、これは胃からの保護を意図していない。これには糖被覆、または錠剤を飲み込みやすくする被覆が含まれる。カプセルには、乾燥治療薬（すなわち粉末）デリバリー用の硬質殻（例えばゼラチン）、液状剤形用に軟質ゼラチン殻を用いることができる。カシェーの殻材料は厚手の澱粉または他の食用紙であろう。ピル、ロゼンジ、型抜き錠剤または粉薬錠剤の場合、湿潤集積技術を用いることができる。
【０１３８】
ペプチド治療薬は、粒子サイズ約１ｍｍの微細マルチ微粒子として顆粒またはペレット状製剤中に含ませることができる。カプセル投与用物質の製剤化は、粉末、軽度圧縮プラグまたは錠剤として実施してもよい。治療薬は圧縮によって製造してもよい。
着色剤および香料を含むことができる。例えば、本蛋白質（または誘導体）を製剤化し（例えばリポソームまたはミクロスフェア小胞）、続いて食用生成物（例えば着色剤および香料を含む冷飲料に混合することができる。
【０１３９】
治療薬を不活性物質で希釈またはその容積を増加させることができる。これらの希釈剤には、炭水化物、特にマンニトール、ａ−ラクトース、ラクトース無水物、セルロース、ショ糖、改変デキストランおよび澱粉が含まれる。ある種の無機塩もまた充填剤として用いることができる。これら充填剤には、三燐酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムが含まれる。いくつかの市販希釈剤はファストフロ（Fast-Flo）、エムデックス（Emdex)、ＳＴＡ−Ｒｘ１５００、エムコンプレス（Emcompress）、およびアビセル（Avicell)である。
【０１４０】
崩壊剤は、固形剤形の治療薬製剤に含ませることができる。崩壊剤として用いられる物質には、澱粉（澱粉を基剤とする市販の崩壊剤エクスプロタブ（Explotab）を含む）が含まれる。ナトリウム澱粉グリコレート、アンバーライト、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸カルボキシメチルセルロース、天然スポンジおよびベントナイトも全て用いることができる。
【０１４１】
崩壊剤の別の形態は不溶性陽イオン交換樹脂である。粉末ゴムを崩壊剤および結合剤として用いることができる。さらにこれら結合剤には、寒天、カラヤ、トラガカントゴムのような粉末ゴムが含まれる。アルギン酸およびそのナトリウム塩もまた崩壊剤として有用である。結合剤は治療薬を一緒に保持して硬質錠剤を形成することができる。結合剤はアラビアゴム、トラガカントゴム、澱粉およびゼラチンのような天然生成物由来に物質を含む。その他のものにはメチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が含まれる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は両方ともアルコール溶液中で用いて、治療薬を顆粒化することができる。
【０１４２】
減摩剤を治療薬製剤に含有させ製剤化工程中の粘着を防止することができる。潤滑剤も治療薬と金型壁との間の層として用いることができる。これら潤滑剤には、ステアリン酸（マグネシウム塩およびカルシウム塩を含む）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、液体パラフィン、植物油およびワックスが含まれる。可溶性潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、カルボワックス４０００および６０００もまた用いることができる。
製剤化時の薬剤の流れ特性を改善し、圧縮時の再配合を促進する滑り剤を添加してもよい。滑り剤には澱粉、タルク、発熱シリカ、水和シリコアルミネートが含まれる。
【０１４３】
治療薬を水性環境に溶解させやすくするために、湿潤剤として界面活性剤を添加できる。界面活性剤には、陰イオン洗剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルナトリウムスルホスクシネートおよびジオクチルナトリウムスルホネート）が含まれる。陽イオン洗剤を用いてもよい。これには塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムが含まれる。界面活性剤として製剤に含むことができる可能な非イオン性洗剤は、ラウロマクロゴル４００、ポリオキシ４０ステアレート、ポリオキシエチレン水和ひまし油１０、５０および６０、グリセロールモノステアレート、ポリソルベート４０、６０、６５および８０、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、単独または種々の割合の混合物として蛋白質またはその誘導体製剤中に含まれるであろう。
本ポリペプチド（または誘導体）の取り込みを強化しえる添加物は、例えば脂肪酸のオレイン酸、リノール酸、リノレン酸である。
【０１４４】
肺デリバリー：さらにまた本明細書で意図されるものは、本ポリペプチド（またはその誘導体）の肺デリバリーである。本ポリペプチド（または誘導体）は、吸入時に哺乳類の肺に輸送され、肺胞の粘膜表面を被覆する。これに関する他の報告には以下が含まれる：Adjei et al., Pharmaceutical Research, 7:565-569(1990); Adjei et al., International J. Pharmaceutics, 6:135-144(1990)(リュープロリドアセテート）；Braquet et al., J. Cardiovascular Pharmacology 13(suppl.5):143-146(1989)（エンドテリン−１）；Hubbard et al., Annals of Internal Medicine, vol.III, pp.206-212(1989)（ａ１−アンチトリプシン）；Smith et al., J. Clin. Invest. 84:1145-1146(1989)(ａ１−プロテイナーゼ）；Oswein et al., 1990, "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March,(リコンビナントヒト成長ホルモン）；Debs et al., J. Immunol. 140:3482-3488(1988)（インターフェロン−γおよび腫瘍壊死因子α）およびPlatz et al., 米国特許第５２８４６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）。全身的作用のための薬剤の肺デリバリーのための方法および組成物は米国特許第５４５１５６９号（1995年9月19日、Wong et al.)に記載されている。
【０１４５】
本発明の実施で使用することを意図されるものは、治療用生成物の肺デリバリーのための広範囲の機械装置で、これら装置にはネブライザー、用量計量吸入装置、および粉末吸入装置が含まれる（ただしこれらに限定されない）が、これらすべては当業者には周知である。
ネブライザー（ジェット式または超音波式のどちらか）と一緒に使用するために適した製剤は、典型的には溶液１ｍｌ当たり約０．１から２５ｍｇの濃度で生物学的に活性な蛋白質を水に溶解したポリペプチド（または誘導体）を含むであろう。製剤はまた緩衝液および単純糖（例えば蛋白質安定化および浸透圧の調節のために）を含むことができる。ネブライザー製剤はまた界面活性剤を含み、エアロゾル形成時の溶液の霧状化によって生じる表面誘発凝集を低下または防止することができる。
【０１４６】
一般に用量計量吸入装置と一緒に使用する製剤は、界面活性剤の補助を得て噴射薬に懸濁させたポリペプチド（または誘導体）を含有する微細分割粉末を含むであろう。噴射薬は、この目的に用いられる一般的な物質のいずれでもよく、例えばクロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、またはヒドロカーボンで、これらにはトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および１，１，１，２−テトラフルオロエタン、またはその組合せが含まれる。適切な界面活性剤にはソルビタントリオレエートおよびダイズレシチンが含まれる。オレイン酸もまた界面活性剤として有用であろう。
【０１４７】
粉末吸入装置から投与される製剤は、ポリペプチド（または誘導体）含有微細分割乾燥粉末を含むであろう。当該製剤はまた、装置から粉末を分散させやすくするために、増量剤、例えばラクトース、ソルビトール、ショ糖またはマンニトールを製剤の重量で約５０から９０％含むことができる。本蛋白質（または誘導体）は、もっとも有利には、末端の肺へのもっとも効果的なデリバリーのために平均粒子サイズが１０ｍｍ（またはミクロン）未満、最も好ましくは０．５から５ｍｍの粒状形で製造されるべきである。
【０１４８】
経鼻デリバリー：
本ポリペプチド（または誘導体）の経鼻または鼻咽頭デリバリーもまた意図される。経鼻デリバリーは、治療薬を鼻に投与した後、直接上気道粘膜に本ポリペプチドを運搬することを可能にし、直接肺に本生成物を投与する必要がない。経鼻デリバリー用製剤にはデキストランまたはシクロデキストランを含有する製剤が含まれる。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様をより完全に説明するために提示されるが、本発明の範囲を限定するものと解してはならない。
【０１４９】
実施例
実験の詳細な説明
実施例１：コリン結合プロテインＡ（ＣｂｐＡ）のペプチド切端形
ＣｂｐＡ（血清型４）の切端Ｎ−末端フラグメントを含むポリペプチドを作製した。ＰＣＲプライマーＳＪ５３３およびＳＪ５３７で完全長のＣｂｐＡを増幅させ、誘導したＣｂｐＡのＮ−末端アミノ酸配列を基にしてプライマーをデザインした。５'前進プライマーＳＪ５３３は、５'ＧＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡ（Ａ，Ｇ）ＡＡ（Ｃ，Ｔ）ＧＡ（Ａ，Ｇ）ＧＧ３'であった。ＸＥＮＥＧのアミノ酸配列からデザインしたこの縮重プライマーにＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩ制限部位の両方並びにＡＴＧ開始コドンを取り込ませた。３'逆プライマーＳＪ５３７は５'ＧＣＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＴＴＴＡＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧＣ３'であった。このプライマーには、クローニング用ＳａｌＩ制限部位およびＣｂｐＡ由来の天然の終止コドンを取り込ませた。このプライマーはタイプ４およびＲ６ｘ配列の両方を基にしている。
【０１５０】
ＰＣＲ生成物は、鋳型としてゲノムＤＮＡからプライマーＳＪ５３３およびＳＪ５３７を用い、ハイフィデリティー酵素（Boehringer Mannheim)を使用しアニーリング温度５０℃で３０サイクル増幅させて作製した。生じたＰＣＲ生成物をＱＩＡクィックＰＣＲ精製キット（Qiagen, Inc)を用いて精製し、続いてＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限酵素で消化し、さらにＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＳｍａＩ制限酵素で消化したｐＱＥ３０発現ベクター（Qiagen, Inc)でクローニングした。
【０１５１】
ポリペプチドＲ２：
第二の繰り返し領域の末端の天然に存在するＰｖｕＩＩ部位、すなわち図１に示すＣ領域（４型の配列の核酸１２２８）を利用して、遺伝子の５'部分のみを含むＣｂｐＡ遺伝子の切端形を作製した。切端形クローンを作製するために、完全長クローンＰＭＩ５８０（４型）またはＰＭＩ５８１（Ｒ６ｘ）をＰｖｕＩＩおよびＸｂａＩを用いてデザインし、生じたフラグメントを発現ベクターｐＱＥ３０に連結し、適切なホストを形質転換した。蛋白質を発現させ精製した。この事例では、発現ベクターによって利用された終止コドンは挿入物の下流にあり、したがって発現された蛋白質は、クローニング部位の５'末端の追加核酸のために挿入物の予想サイズよりも大きい。ポリペプチドＲ２のアミノ酸配列は配列番号１に示されている。
【０１５２】
ポリペプチドＲ１：
同様な方法を用いて、ＣｂｐＡのＮ−末端領域内の最初の繰り返し領域のみ（すなわちポリペプチドＲ１のＡ領域）を発現させた。２つのアミノリピートの間の天然に存在するＸｍｎＩ部位（４型配列の核酸８５６）を用いた。ＣｂｐＡ完全長クローンＰＭＩ５８０をＸｍｎＩおよびＡａｔＩＩで消化した。ベクターｐＱＥ３０をＡａｔＩＩおよびＳｍａＩで消化した。もう一度この２つのサイズのフラグメントを連結して大腸菌を形質転換し、挿入物についてクローンをスクリーニングした。１つの陽性クローンを選別し、リコンビナント蛋白質を当該菌株から精製した。
全てのポリペプチドを発現させ、キア（Qia)発現システム（Qiagen）で大腸菌およびｐＱＥ３０ベクターを用いて精製した。抗ヒスチジン抗体および蛋白特異抗体の両方を用いＨｉｓ貼付蛋白質のアミノ末端がホストおよびウェスタン分析によって検出される。
【０１５３】
Ｒ１およびＲ２の精製：
リコンビナント蛋白質の大腸菌からの産生を誘発し精製するために、単一コロニーをリコンビナントプラスミドを含む平板培養細菌から選別し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む６ｍｌのＬＢ緩衝液中で３７℃で一晩増殖させた。この６．０ｍｌの培養液を上記の濃度の抗生物質を含む１ＬのＬＢに加えた。培養を３７℃でＡ600＝−０．４００まで震盪した。１Ｍの１ＰＴＧを１Ｌの培養に最終濃度１ｍＭで加えた。続いて培養を３７℃で３−４時間震盪した。１Ｌの培養をモデルＪ−６Ｂ遠心器で４０００ｒｐｍで１５分回転させた。上清を捨てペレットを−２０℃に保存した。
【０１５４】
１Ｌのペレットを２５ｍｌの５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭトリス、６ＭＧｕＣｌ、３００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０（緩衝液Ａ）に再懸濁させた。この混合物を室温で３０分遠心し、ビブラセルソニケーター（VibraCell Sonicator)(Sonics and Materials, Inc., Danbury, CT）でマイクロチップを用いて２回３０秒間５０％キューティサイクル（Cuty Cycle）でアウトプット設定７で超音波処理した。混合物を５分、１０ＫでＪＡ２０ローターで遠心し、上清を除去し廃棄した。上清をグラディフラク（GradiFrac)システム（Pharmacia Biotech, Upsala, Sweden)に結合させた１０ｍｌのタロン（Talon)(Clonetech, Palo Alto, CA)樹脂カラムにロードした。このカラムを１００ｍｌの緩衝液Ａで平衡させ、さらに２００ｍｌのこの緩衝液で洗浄した。最終目標緩衝液として１００％の５０ｍＭＮａＨ2ＰＯ4、８Ｍウレア、２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０（緩衝液）を用いて容積基準ｐＨ勾配を総容積１００ｍｌで流した。約３０％緩衝液Ｂ溶出ピークで溶出した蛋白質を集めて一緒にした。
【０１５５】
再折り畳みのために、２ＬのＰＢＳで室温で約３時間、１４０００の分子量カットオフの透析チューブを用いて透析を実施した。続いてサンプルを２ＬのＰＢＳで４℃で一晩透析した。セントリプレップ（Centriprep）−３０スピンカラムによる蛋白質濃縮中に回転減速および再回転時にＰＢＳを添加することによって追加の緩衝液交換を実施した。蛋白質濃度をＢＣＡ蛋白質アッセイで決定し、さらに純度はクマシー染色４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて可視化した（図３）。
【０１５６】
実施例２：ポリペプチドＲ１およびＲ２のレクチン活性
ＬＮｎｔは真核細胞上に存在する肺炎球菌のためのレセプターの炭水化物類似体である。ＣｂｐＡ欠損肺炎球菌変異体は真核細胞または固定した糖のどちらにも付着することができず、ＣｂｐＡは付着リガンドであることが示された。ＣｂｐＡはモジュール蛋白質で以下の２つの領域に分割される：Ｎ−末端の機能性ドメインおよびＣ−末端コリン結合ドメイン（図１）。完全なＣｂｐＡの活性が固有のＮ−末端（Ｒ２によってモデル化）またはそのフラグメント（Ｒ１によってモデル化）に局在しているか否かを決定するために、ポリペプチドＲ１およびＲ２を生物学的活性について分析した。コリン結合ドメイン（ＣＢＤ）の非存在下でＮ−末端ドメインだけ（Ｒ２）がレクチン結合生物学的活性をもつのか否かを調べた。これは完全長ＣｂｐＡおよびポリペプチドＲ２（プロリン富裕領域のＰｖｕＩＩ部位を越えるＣＢＤ領域を失った切端形）を用いて調べた。
【０１５７】
アッセイでは、ＣｂｐＡによって認識されることが知られている以下の糖共役物で組織培養穴（ウェル）で被覆した：ＬＮｎｔ−アルブミン、３'シアリルラクトース−アルブミンおよび陰性コントロールアルブミン。続いてプレートをアルブミンで封鎖し洗浄し、完全長ＣｂｐＡポリペプチドＲ２またはポリペプチドＲ１のどちらかを１５分加え（０．８μｇ／ｍｌ）、続いて洗浄せずにフルオレセイン標識Ｒ６肺炎球菌を３０分加え、洗浄して付着細菌を目でみて数えた。
【０１５８】
ペプチドを添加していない場合のＲ６の炭水化物との結合は陽性コントロールで、これを１００％とした（表１）。３つの別々の実験で、ＣｂｐＡ完全長またはポリペプチドＲ２は、肺炎球菌と表面に被覆したＬＮｎｔとの結合を競合的に抑制した。ＣｂｐＡ完全長はコントロールの７１．６４％および６３％を抑制し、ポリペプチドＲ２はコントロールの６５％、５３％および７４％を抑制した。ＣｂｐＡおよびＲ２の同等な活性は、コリン結合ドメインはＣｂｐＡのＬＮｎｔレクチン活性に必要ではなく、さらにＲ２はＬＮｎｔレクチンの候補物質であることを示している。
【０１５９】
ＬＮｎｔとの結合と対照的に、肺炎球菌の３'シアリルラクトースへの結合は、完全長ＣｂｐＡ（７４％および６６％）と比較してＲ２によって抑制されなかった（７９％および１０１％）。これは、ＣＢＤが除かれたときシアリン酸認識活性は失われることを示している。対照的に、Ｒ１はシアリン酸の認識で活性を有するように思われ、この特性はＣｂｐＡと共有されるが、明らかにＲ２で隠蔽されている。このことは、ポリペプチドの機能的ドメインへの折り畳みはポリペプチドの組成および長さによって影響を受けることを示している。わずかな配列の変化が他の株で発見された（図２参照）。Ｒ１とＲ２との間で高い相同性が与えられる場合、Ｒ１およびＲ２の両方がレクチン活性に必要とされるか、またはそれらは両方ともわずかに異なる特性をもつレクチン（±シアリン酸）であるということがさらに可能である。
【０１６０】
表１  精製糖共役物とＲ６肺炎球菌との結合のＣｂｐＡ可溶形による抑制
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Ｎ＝３  ＬＮｎｔ実験、各３ウェル
Ｎ＝２  シアリルラクトース実験、各３ウェル
【０１６１】
レクチン活性は細胞結合活性と相関する：
ヒト細胞は、炭水化物（糖蛋白質および糖脂質）を含む表面分子をもち、細菌は、非常に異なる蛋白質または脂質の骨組みにかかわらずこの炭水化物によってこれら糖共役物と結合する。したがって、in vitroでレクチン活性を有するポリペプチドをもつ細菌は、ヒトの細胞表面に付着することができる。in vitroレクチン活性と細胞結合作用との間の正比例関係は肺炎球菌について知られている。例えば、ＬＮｎｔは、ＴＮＦ活性化Ａ５４９ヒト肺細胞との肺炎球菌の結合を競合的に抑制し、in vivoで肺炎の進行を阻止する。ＣｂｐＡ切端形のレクチン活性は細胞結合活性を反映するということを確認するために、ＣｂｐＡおよび切端形を肺炎球菌と肺細胞との結合の抑制についてテストした（表２）。完全長ＣｂｐＡおよびポリペプチドＲ２は、肺炎球菌の肺細胞への付着をコントロールに対してそれぞれ５８％および６３％抑制した。ポリペプチドＲ１は有効ではなく、Ｒ２のＬｎＮＴ結合活性が必要とするものを示唆し、肺炎球菌の肺細胞との結合を説明する。
【０１６２】
表２
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Ｎ＝２  各々２又は３ウェルの実験
【０１６３】
ＬＮｎｔレクチン活性はＲ２に依存する：
ＣｂｐＡのＮ−末端領域は、各々約１１０アミノ酸の２つの繰り返しを含んでいる（図１参照、ポリペプチド２内の領域ＡおよびＣ）。この２つのドメインの生物活性に対する相対的寄与を調べるために、ドメインＡのみを含むＲ１をＲ２および完全長ＣｂｐＡと比較した。付着アッセイでテストしたとき、ポリペプチドＲ１はＬＮｎｔへの付着を全く抑制しなかった（野性型の９１、９２および１１２％）。しかしながら、ポリペプチドＲ１はシアリルラクトースへの結合に関してはある程度の抑制を示した（コントロールの６８および４０％）。これは、ポリペプチドＲ２はＬＮｎｔレクチン活性に必要で、Ｒ２はＬＮｎｔレクチンドメインの候補物質であることを示している。対照的にＲ１はシアリン酸の認識で活性を有するようである。
【０１６４】
ＣｂｐＡのＮ−末端ドメインに対する抗体は細胞結合を阻止する：
ＣｂｐＡのＮ−末端ドメインが細胞と結合するならば、Ｎ−末端ドメイン活性に関する干渉は、細胞または精製糖共役物と細菌の結合を防止または逆行させるであろう。そのような干渉メカニズムの１つは抗体である。
【０１６５】
表３  抗ＣｂｐＡ  Ｒ２抗体によるＬＮｎＴ被覆表面へのＲ６肺炎球菌の結合抑制
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未希釈の５μｌのウサギ抗体＋５μｌの２×１０7  Ｒ６ｘを室温で３０分予備保温、続いてＬＮｎｔ被覆ウェルに加えて付着アッセイ。別個の２実験を示す。
【０１６６】
ＣｂｐＡ（Ｒ２）のリコンビナントＮ−末端ドメインに対して作製した抗血清を肺炎球菌のＬＮｎｔへの付着を阻止する能力についてテストした。ウサギのポリクローナル抗ＣｂｐＡ抗血清（５μｌ）＋５μｌの２ｘ１０7標識細菌を室温で３０分保温した。この混合物を固定ＬＮｎｔ上に３０分重層し、続いて３回ＰＢＳで洗浄して未結合細菌を除去した。プレートに結合した細菌を顕微鏡で数え、結果を平均値＋６ウェルの標準偏差として示す。表３に示した結果は、Ｒ２に対して作製した抗血清は肺炎球菌のＬＮｎｔへの結合を阻止することを明示している。図５は、肺炎球菌Ｒ６ｘのＬＮｎｔモデルレセプターへの結合抑制について免疫前と抗ＣｂｐＡＲ２抗体の定量曲線を示している。７０％以上の肺炎球菌の付着が、１：１００および１：２００の希釈で抗Ｒ２によって阻止された。さらに１：４００の希釈では活性が失われるということはこの作用の特異性を示している。
【０１６７】
表３および図５で示した抗血清を製造するために用いたＣｂｐＡは血清型４のＣｂｐＡであった。付着抑制アッセイで用いた肺炎球菌Ｒ６ｘ株は血清型２に由来している。異種血清型の細菌の付着を阻止する抗体の能力は、活性型を越える交差防御活性を示している。そのような活性は効果的なワクチン免疫のために極めて望ましい。
【０１６８】
ＣｂｐＡのＮ−末端の天然の構造に対する抗体の活性：
ＣｂｐＡは、Rosenowらが記載したように、その天然のホスト、肺炎球菌からコリンアフィニティーカラムで精製できる。また別には、ポリヒスチジンタグは、転写される蛋白質がいくつかのヒスチジン残基によって伸長されるように、当該遺伝子の末端の操作で付加できる。これらの残基は完全長ポリペプチドのニッケル親和性マトリックス精製を容易にし、この完全長ポリペプチドは、より短い切端形と異なり天然の三次元構造の保持に有利である。特に肺炎球菌だけでなく大腸菌または他のホスト細菌からこれら生化学的手段によって精製されたＣｂｐＡは、その天然の三次元構造を保持する。免疫原として用いた場合、自然の状態で折り畳まれたＣｂｐＡは、折り畳みが異なる可能性がある切端形による免疫で誘発される抗体とは潜在的に異なる抗体を産生する。同様に、治療薬として用いられるＣｂｐＡは、付着を阻止するその能力が改善された切端形とは異なる三次元構造を有するであろう。これらを斟酌するならば、その天然の三次元構造で折り畳むことを可能にする完全長蛋白質としてＣｂｐＡを生成し、続いて生化学的にＣ−末端（ＣＢＤ）を切断するのが有利であろう。例えば、ヒドロキシルアミンによる処置は、コリン結合プロテインＡの血清型Ｒ６ｘおよび血清型４のアミノ酸４７５位でＣｂｐＡを切断し、Ｎ−末端およびＣ−末端を分離させるであろう。その結果Ｎ−末端フラグメントは治療薬または免疫原として適切である。
【０１６９】
また別には、天然のＣｂｐＡは免疫原として用いることができ、活性な構造に対する抗血清が得られる。この混合物中の生物活性を有する抗Ｎ−末端抗体は吸収によりＢＤに対する抗体を除去することによって濃縮することができる。そのような抗体は２００μｌの血清を１ｘ１０8のＣｂｐＡ不完全細菌と一緒に室温で１時間保温して調製した。この変異体のその他のコリン結合蛋白質は抗ＣＢＤ抗体で吸収して除去し、遠心して細菌を除去することによって抗血清から除かれた。
吸収抗ＣｂｐＡ抗体の生物活性を明示させるために、ＬＮｎｔモデルレセプターへの肺炎球菌の付着を阻止する吸収抗血清の能力を調べた。Ｒ６ｘ肺炎球菌を１：６００の希釈の抗血清と保温し、ＬＮｎｔアルブミンで被覆したウェルに添加した。
【０１７０】
表４  吸収抗ＣｂｐＡ抗血清は付着を阻害する
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【０１７１】
これらの結果は、その天然の構造をもつＣｂｐ／ＡのＮ−末端ドメインに対する抗体は付着を強力に阻止することを示している。この活性は、図５の切端形の活性よりはるかに高い（後者は１：６００の希釈で活性を示さなかった）。吸収抗ＣｂｐＡ抗血清のこの活性は、図５の力価測定実験でもまた明瞭に示された。肺炎球菌タイプ４のＬＮｎｔ被覆ウェルに対するベースライン付着は三角記号で示されている。肺炎球菌と未吸収（四角記号）または吸収（ダイヤ型記号）抗血清との種々の希釈での予備保温によって、得られる付着が減少することが示された。両抗血清が同様な付着の減少を示すという事実は、ＣｂｐＡに対する抗体の阻止活性の大半はＮ−末端に存在することを示している（すなわち、吸収によるコリン結合ドメインに対する抗体の除去は生物活性を減少させない）。
【０１７２】
実施例３：抗Ｒ２抗血清による受動防御：
ウサギ免疫血清の作製：
ポリペプチドＲ２（ＣｂｐＡ切端形）およびＣｂｐＡに対するウサギ免疫血清をコバンス（Covance)(Denver, PA)で作製した。免疫前血清を採集した後、ニュージランド白色ウサギを、フロイントの完全アジュバント中の２５０μｇのＲ２（両方のアミノ末端繰り返しを含む、上記の調製物４８３：５８）で免疫した。２１日目にフロイントの不完全アジュバント中の１２５μｇのＲ２でウサギを追加免疫し３１日目に採血した。第二のウサギは精製ＣｂｐＡで同様に免疫した。
【０１７３】
マウスの受動防御：
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（５匹／群）の腹腔に滅菌ＰＢＳ中の（免疫前および３１日目免疫血清）１００μｌの１：２希釈のウサギ抗Ｒ２血清または免疫前血清を投与し受動免疫を施した。血清投与後１時間で、マウスを１６００ＣＦＵの肺炎連鎖球菌血清型６Ｂ（ＳＰ３１７株）で攻撃した。マウスを１４日間生存についてモニターした。ポリペプチドＲ２に対して作製したウサギ免疫血清で免疫したマウスの８０％が攻撃に対して生存した（図４）。免疫前ウサギ血清で免疫したマウスは全て７日目までに死亡した。
この結果は、ＣｂｐＡに特異的な抗体は全身的肺炎球菌感染に対して防御作用を有することを示している。さらにこの結果は、コリン結合領域は防御に不要であることを示している。なぜならば、防御のためには、切端蛋白質であるポリペプチドＲ２（保存コリン結合繰り返しを欠く）に特異的な抗体で十分であるからである。さらに、ＣｂｐＡ血清型４に対して誘導された血清は血清型６Ｂによる攻撃に対して防御作用を示した。
【０１７４】
実施例４：抗Ｒ１抗血清による能動防御：
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（１０匹／群）の腹腔にＣｂｐＡ切端形蛋白質Ｒ１（５０μｌのＰＢＳ中の１５μｇ、および５０μｌのフロイントの完全アジュバント）を投与し受動免疫を施した。１０匹のシャム免疫マウス群にはＰＢＳおよびアジュバントを投与した。第二の免疫は４週間後に、１５μｇの蛋白質をフロイントの不完全アジュバントとともに腹腔に投与して実施した（シャム免疫群はＰＢＳおよびフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）を投与）。免疫反応の分析のために３、６、および９週目に血液を採取した（眼窩後方採血）。１０匹のＣｂｐＡ免疫マウスから９週目に集めた血清の抗ＣｂｐＡ切端形のＥＬＩＳＡ終末点力価は４０９６０００であった。シャム免疫マウスから得た血清では抗体は検出されなかった。マウスを１０週目に５６０ＣＦＵの肺炎連鎖球菌血清型６Ｂ（ＳＰＳＪ２ｐ株、P. Flynn（St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN）から提供）で攻撃した。マウスを１４日間生存についてモニターした。ＣｂｐＡ切端形蛋白質Ｒ１で免疫したマウスの８０％が攻撃に対して生存した。全てのシャム免疫マウスは８日目までに死亡した（図７）。
【０１７５】
この結果は、ＣｂｐＡのリコンビナントフラグメントは、肺炎球菌の全身感染および致死に対して防御することができる特異的抗体の産生を誘発することを示している。さらにこの結果は、免疫原は切端蛋白質Ｒ１であるので、コリン結合領域は防御に不要であることを示している。さらにこの結果は、防御反応を誘発するためにはただ１回のアミノ末端繰り返しで十分であることを提唱している。リコンビナント肺炎球菌蛋白質が血清型４のＤＮＡ配列を基に作製され、血清型６Ｂ単離株による攻撃に続いて防御が認められたので、交差防御もまた明らかである。
【０１７６】
実施例５：幼獣ラットの鼻咽頭コロニー形成の予防：
ＣｂｐＡのＮ−末端ドメインは、in vitroで肺炎球菌の付着を競合的に抑制した。この活性を有するペプチドの治療的有用性を明らかにするために、幼獣ラットに切端形ペプチドを投与し、続いて肺炎球菌で攻撃して鼻咽頭のコロニー形成を調べた。
０．８μｇのポリペプチドＲ２またはＲ１を含む１０μｌのＰＢＳ、または蛋白質を含まない１０μｌのＰＢＳをラットに経鼻的に投与した。１５分後に、３型肺炎球菌（ＳＩＩＩ株）（１ｘ１０5ｃｆｅｒを含む１０μｌ）を経鼻的に導入した。競合的に肺炎球菌の付着およびコロニー形成を抑制するポリペプチドの能力を決定するために、鼻洗浄を７２時間に実施し、各群につき４匹の動物の各々について回収肺炎球菌数を定量した。ＳＩＩＩのみを与えられたラットは１０μｌにつき２２００、６５００、６９００および８７００（平均６０７５）コロニーを示した。切端形Ｒ２で処理した動物は、最大の減少（３６００、３５００、２５００、２１００）を示し、平均は１０μｌにつき２９２５の細菌（コントロールの４８％）であった。切端形Ｒ１で処置した動物もまたコロニー形成の減少を示し（５０００、４８００、３５００、１６００）、平均は３７２５（コントロールの６１％）であった。
この実験は、動物の治療実験デザインにおける本発明のペプチドの動物への投与で、その後の肺炎球菌の攻撃から動物を防御することができることを示した。
【０１７７】
考察：
これらの実験が示すように、ポリペプチドＲ２は：１）ワクチン抗原として投与されるとき、防御抗体を誘発し、ワクチン製剤として好ましい組成であり；２）ペプチドとして気道および／または鼻咽頭レセプターに輸送されるとき、肺炎球菌の付着を競合的に防止し、コロニー形成および侵襲性症状に対して予防薬および治療薬として好ましい組成物である。さらにまた、ＣｂｐＡ切端形は、ＣＢＤのないレクチンとして機能する。２つの炭水化物が認識される：図１の両方のＮ−末端繰り返し（ＡおよびＣ）を含むペプチドによってＬＮｎｔが、さらに最もＮ−末端側のＮ−末端のただ１つの繰り返しのみ（Ａ）を含むペプチドによってシアリン酸が認識される。Ｎ−末端繰り返しポリペプチドＲ１およびＲ２を含む切端形は細胞培養アッセイで同様にレクチン活性を示す。
【０１７８】
ポリペプチドＲ２活性の重要な特性には以下が含まれる：１）精製糖共役物レセプター類似体、肺細胞および動物モデルの認識についてポリペプチドＲ２および完全長ＣｂｐＡの生物活性の完全な相関関係。相関関係はまた、それらに対する抗体についても明らかである。２）４型由来菌および他の血清型（例えば６Ｂおよび２）を用いたin vitroアッセイの菌との間の交差防御。これは有用なワクチン、予防薬および治療薬には重要なことである。
【０１７９】
本発明は詳細に説明され、さらに種々の具体的な材料、方法および実施例を参考に詳述してきたが、本発明は特定の材料、材料の組合せ、およびその目的のために選択された方法に限定されないことは理解されよう。当業者には理解されるところであるが、多数の変型が暗示されている。同様に本発明の開示に関して本明細書に引用した一切の文献は参照により本明細書に含まれる。
【０１８０】
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、コリン結合プロテインＡ（ＣｂｐＡ）、リコンビナント切端形Ｒ１（図２に示すＣｂｐＡのＮ−末端の約アミノ酸１６からアミノ酸３２１）、およびＲ２（図２に示すＣｂｐＡのＮ−末端の約アミノ酸１６からアミノ酸４４４）を模式的に示している。ドメインＡは、図２に示すＣｂｐＡアミノ酸配列のＮ−末端の約アミノ酸１５３からアミノ酸３２１である。ドメインＢは、図２に示すＣｂｐＡアミノ酸配列のＮ−末端の約アミノ酸２７０からアミノ酸３２６である。Ｃは、図２に示すＣｂｐＡアミノ酸配列のＮ−末端の約アミノ酸３２７からアミノ酸４３３である。
【図２】  図２Ａ−Ｂは、ＣｂｐＡのＮ−末端領域の核酸およびアミノ酸配列の多様な血清型における相同性の比較である。
【図３】  図３は、リコンビナントＲ１およびＲ２の発現および精製を示す。
【図４】  図４は、マウスので受動的防御の結果である。リコンビナントＲ２に対する免疫血清は肺炎連鎖球菌による致死性攻撃からマウスを防御した。
【図５】  図５は、ＬＮｎＴ−ＨＳＡ被覆プレートへのＲ６ｘ付着に対する抗Ｒ２抗体の力価測定を示す。
【図６】  図６は、ＬＮｎＴ−ＨＳＡ被覆プレートへの肺炎球菌吸着を阻止する活性について抗ＣｂｐＡ抗体および吸収抗ＣｂｐＡ抗体の力価を測定したものである。
【図７】  図７は、マウスでの能動的防御の結果を示す。リコンビナントＲ１に対する免疫血清は肺炎連鎖球菌による致死性攻撃からマウスを防御した（攻撃は血清型６Ｂで５６０ｃｆｕ）。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図２Ｂ−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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