(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
照射位置を制御しながら試料に繰り返しレーザーを照射し、そこで生成された試料のイオンを質量分析して、試料の位置情報とその位置における質量分析情報を得ることにより、質量分析情報の２次元像を得るレーザー照射質量分析装置において、
前記レーザーの照射位置を順次移動させるためにステージを移動する及び／又はレーザー光を走査する機構と、
前記機構により、前記レーザーの照射位置を順次移動させるごとに質量分析を行う計測・制御部とを備え、
該イオンの質量分析に、周波数駆動型イオントラップと飛行時間型質量分析装置を用いることを特徴とするレーザー照射質量分析装置。
【請求項２】
周波数駆動型イオントラップの駆動方式としてデジタル駆動方式を用いることを特徴とする請求項１に記載のレーザー照射質量分析装置。
【請求項３】
飛行時間型質量分析装置にマルチターン型飛行時間質量分析装置を用いることを特徴とする請求項１又は２に記載のレーザー照射質量分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザー光を試料に照射してイオン化を行うイオン源を備える質量分析装置、具体的には、レーザー脱離イオン化法（ＬＤＩ＝Laser Desorption /Ionization）やマトリクス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ＝Matrix Assisted Laser Desorption /Ionization）によるイオン源を備える質量分析装置に関する。これらの装置の典型的な応用例は、顕微質量分析装置や質量分析顕微鏡である。
【背景技術】
【０００２】
レーザー脱離イオン化法（ＬＤＩ）は、試料にレーザー光を照射し、レーザー光を吸収した物質の内部で電荷の移動を促進させてイオン化を行うものである。また、マトリクス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）は、レーザー光を吸収しにくい試料やタンパク質などレーザー光で損傷を受けやすい試料を分析するために、レーザー光を吸収し易くイオン化し易い物質をマトリクスとして試料に予め混合しておき、これにレーザー光を照射することで試料をイオン化するものである。特にＭＡＬＤＩを用いた質量分析装置は、分子量の大きな高分子化合物をあまり開裂させることなく分析することが可能であり、しかも微量分析にも好適であることから、近年、生命科学などの分野で広範に利用されている。なお、本明細書では、ＬＤＩやＭＡＬＤＩによるイオン源を備える質量分析装置を総称して、ＬＤＩ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳと記すこととする。
【０００３】
顕微質量分析装置及び質量分析顕微鏡は、異なる概念に基づいて製作されるものである。顕微質量分析装置は、顕微鏡にて光学的に試料の顕微像を観察し、その観察像で特定の質量分析位置を決定して、その箇所の質量分析を行うというもので、光学観察結果を用いて質量分析を行うとというものである。一方、質量分析顕微鏡は、質量分析により得られた信号を用いて試料の微細な２次元像を得るというもので、顕微鏡像の組織識別手段として質量分析の結果を用いるというものである。
いずれにせよ、上記ＬＤＩ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いる場合、照射レーザー光のスポット径を微小に絞ることにより、微小部分の質量分析を行うことができ、また、高解像度の質量分析顕微鏡像を得ることができる（非特許文献１、特許文献１）。
【０００４】
本出願では、これらをまとめて顕微質量分析装置と呼ぶ。
【０００５】
従来の顕微質量分析装置の構成の一例を図１に示す。オペレータはＣＣＤ１１又は接眼レンズで試料１２を観察し、観察像から質量分析箇所を決定する。そして、分析開始操作を行うことにより、レーザー光源１３からレーザーパルスが試料１２のその箇所に照射される。すなわち、観察光学系とレーザー照射光学系は、そのような位置関係となるように設定されている。
【０００６】
なお、観察時に１点だけを決め、質量分析はその点のみで行うこともあるし、観察時に広がりのある領域（単一領域又は複数に亘る領域）を決めておき、分析時にはその領域内でレーザー光を走査して、その領域内の試料の面分析を行うこともある。また、レーザー光の照射位置を線（直線、曲線）状に移動させ、ラインプロファイルをとる場合もある。
【０００７】
レーザー光が照射された箇所では試料がイオン化し、生成されたイオン１４がイオンガイド１５に導かれて質量分析部１６に入る。ここで質量分析を行うことにより、レーザー照射箇所の質量分析プロファイルを得ることができる。
【０００８】
図１には試料１２の分析箇所の正確な位置関係を観察することができる光学系を備えた装置の例を示したが、必ずしもきちんとした光学観察系がなくとも顕微質量分析は行うことができる。すなわち、目視或いは簡便な光学観察手段だけで試料へのレーザー照射位置を確認し、その後、ステージを移動させながら、或いはレーザー照射位置を移動させながら質量分析を行うことにより、２次元的な質量分析情報を得ることができる。すなわち、顕微質量分析を行うことができる。
【０００９】
質量分解能の高い質量分析を行おうとする場合、質量分析部１６には飛行時間型質量分析装置（Time Of Flight Mass Spectrometer＝ＴＯＦＭＳ）を用いることが望ましい。ＴＯＦＭＳでは、加速されたイオンが一定距離を飛行する時間がそのイオンの質量に依存することを利用して分析を行う。すなわち、イオンを所定の位置から一斉にスタートさせ、各イオンが所定の長さの空間を飛行して、検出器により検出される時間を測定する。試料に照射されるレーザー光は非常に短いパルス状とされているものの、それにより放出される多数のイオンの位置及び初速は必ずしも揃っていないため、従来は図１に示すような直交加速型ＴＯＦＭＳを用いていた。直交加速型ＴＯＦＭＳでは、生成されたイオン１４の飛行方向に対して直交する方向に加速電圧を印加することにより、検出器１７に対してはほぼ定まった位置からイオンの飛行をスタートさせる。なお、図１では反射型（リフレクトロン型）のＴＯＦＭＳを用いているが、これはもちろん一方向型（リニア型）のものでもよい。
【００１０】
【特許文献１】米国特許第5808300号公報
【特許文献２】特表2003-512702号公報
【非特許文献１】内藤康秀「生体試料を対象にした質量顕微鏡」, J. Mass Spectrom. Soc. Jpn., Vol. 53, No. 3, 2005, pp. 125-132.
【非特許文献２】豊田岐聡他「マルチターン飛行時間型質量分析計『MULTUM Linear plus』の開発」, J. Mass Spectrom. Soc. Jpn., Vol. 48, No. 5, 2000, pp. 312-317.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
イメージング質量分析や顕微質量分析では、生体組織や生体細胞内の成分の分析が大きな目的の一つとなっている。特に生体内試料のタンパク質や糖類の分析のニーズが大きい。このようなタンパク質や糖などの分析を行う際には、イオン化したイオンを衝突誘起型開裂法（Collision Induced Dissociation＝ＣＩＤ）などの方法で開裂させてフラグメントイオン（子イオン）を生成し、そのフラグメントイオンを分析するＭＳ／ＭＳ分析が有効である。このフラグメントの生成には、イオントラップ装置の利用がきわめて有効である。イオントラップを用いれば、単なるＭＳ／ＭＳばかりではなく、更に開裂を繰り返すＭＳnも可能となる。
【００１２】
イオントラップはそれ自身が質量分析機能を持つが、それだけでは高い質量分解能を得ることは難しい。そこで、ＭＳ／ＭＳ（ＭＳn）解析を行いつつ、分解能の高い質量分析を行うため、図２に示すように、イオントラップ２１の後段にＴＯＦＭＳ２２を配置することが有効である。図３に示すように、イオントラップ２１では、リング電極２１１に印加された高周波電圧によりイオンが内部空間に一旦蓄積され、２つのエンドキャップ電極２１２、２１３に印加された直流電圧により一斉に外部に排出される。この排出のタイミングを後段のＴＯＦＭＳ２２の飛行スタートのタイミングとすることにより、高い分解能の質量スペクトルを得ることができる。これは、ＭＳn分析ではない通常のＭＳ分析にも適用できる。
【００１３】
このようにイオントラップ２１とＴＯＦＭＳ２２を組み合わせることにより、効率の良いＭＳn分析を行うことができるとともに、通常のＭＳ分析とＭＳn分析を共に高い分解能で行うことができる。顕微質量分析装置ではないが、このようなイオントラップとＴＯＦＭＳを組み合わせた図２に示すようなレーザー質量分析装置は既に実現されている。
【００１４】
しかし、従来のこのような装置において、イオントラップ内にイオンを蓄積・排出する等のイオンの操作は、イオントラップのリング電極に印加する電圧を変化させることにより行われていた。この方式では、大きい質量を持つ（高い質量／電荷比を持つ）イオンをトラップするためには、高い電圧を有する高周波電圧をリング電極に印加する必要がある。しかし、高い高周波電圧を生成するためには大きな電源が必要となり、また、放電の問題も生ずる。そのため、従来のこのような装置では高い質量数のイオンはトラップすることができないという制約があった。
【００１５】
前記の通り、顕微質量分析やイメージング質量分析では生体試料に対する質量分析の要望が高まっているが、生体試料を分析する場合、試料をそのまま試料台に置いて分析することになる。この場合、酵素による消化なども行いにくいため、イオントラップにおいて高い質量数の試料を分析することが強く望まれている。
【００１６】
従来の装置ではこのようなイオントラップにおけるトラップ可能質量範囲の問題の他に、質量分解能の問題も存在する。従来のリニア型ＴＯＦＭＳやリフレクトロン型ＴＯＦＭＳでは、質量数の分解能は１００００程度であるが、タンパク質などでは数万以上の分子量をもつものも多数存在する。このため、生体組織や生体細胞内の成分を高い精度で質量分析する場合、従来の装置では十分な分析を行うことができないという問題がある。
【００１７】
本発明が解決しようとする課題は、これらの問題を解決した、特に生体試料を分析するに適したレーザー照射質量分析装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記課題を解決するために成された本発明は、照射位置を制御しながら試料に繰り返しレーザーを照射し、そこで生成された試料のイオンを質量分析して、試料の位置情報とその位置における質量分析情報を得ることにより、質量分析情報の２次元像を得るレーザー照射質量分析装置において、
前記レーザーの照射位置を順次移動させるためにステージを移動する及び／又はレーザー光を走査する機構と、
前記機構により、前記レーザーの照射位置を順次移動させるごとに質量分析を行う計測・制御部とを備え、
該イオンの質量分析に、周波数駆動型イオントラップと飛行時間型質量分析装置を用いることを特徴とする。
【００１９】
なお、この周波数駆動型イオントラップの駆動方式には、デジタル駆動方式を用いることが望ましい。
【００２０】
また、ここで用いる飛行時間型質量分析装置は、マルチターン型飛行時間質量分析装置とすることが望ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係るレーザー照射質量分析装置では周波数駆動型イオントラップを用いることから、高い質量数のイオンをトラップするために高周波電圧の電圧値を上げる必要がなく、その周波数のみを制御すればよい（具体的には、高い質量数ほど周波数を低くする）。このため、大きな高周波電源を用意する必要がなく、また放電の心配もないことから、容易に高分子量試料分析用の質量分析装置を作製することができる。このようなイオントラップの周波数制御には、デジタル駆動方式を用いるのが最も適している。
【００２２】
また、マルチターン型飛行時間質量分析装置を用いることにより質量分解能を飛躍的に高めることができ、高分子量の試料を更に、高分解能で分析することができるようになる。すなわち、タンパク質や糖類などの試料について、高精度で顕微質量分析やイメージ質量分析を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の一実施例である顕微質量分析装置を図４に示す。この顕微質量分析装置は、イオントラップにデジタル回路による周波数駆動方式のものを用い、飛行時間型質量分析装置としてリフレクトロン型のものを用いたものである。試料の観察、レーザー照射及び移動（走査）の部分は図１、図２に示した従来の装置と同様であるため説明を省略し、ここではレーザー照射で生成されたイオンの動きについて説明する。
【００２４】
照射箇所で発生した試料のイオンは、試料室と質量分析室の圧力差やイオンガイドの電界により質量分析室のイオントラップに導入される。このとき、イオントラップにおいても、イオンを導入し、内部空間に保持（トラップ）するための電圧が各電極に印加されている。前記の通り、本実施例ではこのイオントラップには周波数駆動型のものを使用し、図５(b)又は(c)に示すようなデジタル駆動回路を用いて生成した図５(a)に示すような波形を有する高周波電圧をリング電極に印加する。このデジタル駆動回路では、リング電極に印加する電圧の大きさは、２つのDC電源（DC P/S）の電圧V1、V2の大きさにより定められているが、その周波数は、各電圧の印加時間W1、W2を任意に設定することにより、自由に設定することができる。従って、図８に示すイオンの安定領域Ｓ条件をイオントラップ内で実現するために、従来のように高周波電圧の大きさで制御するのではなく、周波数を制御することにより行うことができる。
【００２５】
具体的には、従来の電圧制御方式では、高い質量数のイオンをトラップするためには高い電圧（高周波電圧）が必要であったが、周波数駆動方式のイオントラップでは、周波数を低くするほど高い質量数のイオンをトラップすることができる。高電圧の生成には前述のような問題があったが、周波数制御は図５(b)(c)等のような小型且つ安価なデジタル駆動回路により容易に行うことができるため、高質量数のイオンをトラップすることが可能となる。従って、試料として生体試料をそのまま用いた場合にも、タンパク質や糖類等の大きな分子量のイオンをそのままトラップすることができ、生体試料に関する豊富な情報を得ることができるようになる。
【００２６】
イオントラップにトラップされたイオンは、場合によってはＣＩＤによりフラグメント化が行われる。
【００２７】
イオントラップにトラップされているイオンは、２つのエンドキャップ電極の間に直流の高電圧を印加することにより一斉に引き出され、後段の飛行時間型質量分析装置に導入される。導入されたイオンは長い無電界飛行空間を自由飛行し、他端に設けられた反射器（リフレクトロン）により反射されて再び飛行空間を飛行して検出器に入る。イオントラップから放出された時刻と検出器により検出される時刻の間の飛行時間が各イオンの質量数に依存することから、検出器による検出時刻から検出されたイオンの質量数が求められる。
【００２８】
ここで、イオントラップの引き出し口（出口）から遠い位置にあるイオンはそこに到達するまでのより長い時間加速され、出口に近い位置にあるイオンは加速時間が短いため、イオントラップから引き出されたイオンは空間的・時間的なフォーカシングが行われる。このフォーカス点を後段のリフレクトロン型飛行時間質量分析装置の入口側のフォーカス点に一致させておくことにより、リフレクトロン型飛行時間質量分析装置の検出器においても時間フォーカスができるため、高い質量分解能を実現することができる。
【００２９】
本発明の別の実施例である顕微質量分析装置を図６に示す。この顕微質量分析装置は、イオントラップの駆動回路に前記実施例と同様、デジタル周波数駆動方式のものを用い、飛行時間型質量分析装置にはリフレクトロン型ではなくてマルチターン型のものを用いたものである（マルチターン型飛行時間質量分析装置については、非特許文献２参照）。図６の例では、マルチターン型飛行時間質量分析装置のイオン周回路は「８」字形となっているが、これは図７に示すような単純周回型でももちろん構わない。
【００３０】
前記実施例と同様の方法でイオントラップにトラップされ、引き出されたイオンは、マルチターン型飛行時間質量分析装置４１、５１に入り、そこに設けられたイオン周回路を所定回数周回する。この周回回数を多くすることにより、イオンの飛行距離はリニア型やリフレクトロン型よりもはるかに大きくなり、１０００００以上の高い質量分解能も十分実現可能となる。
【００３１】
マルチターン型飛行時間質量分析装置では、同じ質量数でもエネルギーの高いイオンは周回路の各コーナーに置かれた転向電極４２、５２の中心軌道よりも外側を通るため、飛行距離が長い。逆に、エネルギーの低いイオンは内側の軌道を通るため、飛行距離は短い。そこで、各転向電極４２、５２に印加する電圧を適切に制御することにより、或る１点から出た同一質量数の複数のイオンは、それらのエネルギーの異なっていても周回路を１周した後にその点に同一時間に戻ってくるようにすることができる（時間的・空間的フォーカシング）。このフォーカス点を上記イオントラップ３１のフォーカス点に一致させることにより、イオントラップ３１からエネルギー分布をもって出射した多数のイオンも周回毎にフォーカスされ、高分解能の質量分析を行うことができるようになる。なお、イオンを検出器４３、５３へ送るためのガイド電極４４、５４もこのフォーカス点に一致させるようにする。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】従来の顕微質量分析装置の概略構成図。
【図２】従来のイオントラップを用いた顕微質量分析装置の主要部の概略構成図。
【図３】イオントラップの概略構成図(a)と、各電極に印加される電圧のイオン引き出し時点前後の変化の様子を示すグラフ(b)。
【図４】本発明の一実施例であるリフレクトロン型飛行時間質量分析装置を用いた顕微質量分析装置の主要部の概略構成図。
【図５】実施例の顕微質量分析装置のイオントラップのリング電極に印加される高周波電圧の波形図(a)、およびその高周波電圧を生成するためのデジタル駆動回路の構成例(b)、(c)。
【図６】本発明の別の実施例であるマルチターン型飛行時間質量分析装置を用いた顕微質量分析装置の主要部の概略構成図。
【図７】マルチターン型飛行時間質量分析装置の別のイオン周回路の例の概略構成図。
【図８】イオントラップ内におけるイオンの安定化領域を示すａ−ｑパラメータ図。
【符号の説明】
【００３３】
１１…ＣＣＤ
１２…試料
１３…レーザー光源
１４…イオン
１５…イオンガイド
１６…質量分析部
１７…検出器
２１…イオントラップ
２１１…リング電極
２１２、２１３…エンドキャップ電極
２２…リフレクトロン型飛行時間質量分析装置
３１…周波数駆動型イオントラップ
４１、５１…マルチターン型飛行時間質量分析装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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