(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD4陽性細胞表面に存在する免疫複合体を含有するHIV感染症診断マーカーであって、
前記免疫複合体が、HIVウイルス表面糖蛋白質gp120、抗gp120抗体、宿主細胞表面CD4、及び宿主細胞表面ケモカインレセプターを含むことを特徴とするHIV感染症診断マーカー。
【請求項２】
CD4陽性細胞表面に存在する免疫複合体を含有するHIVウイルス生産量測定マーカーであって、
前記免疫複合体が、HIVウイルス表面糖蛋白質gp120、抗gp120抗体、宿主細胞表面CD4、及び宿主細胞表面ケモカインレセプターを含むことを特徴とするHIVウイルス生産量測定マーカー。
【請求項３】
CD4陽性細胞表面に存在する免疫複合体を含有するHIV感染症の病状推移の推定マーカーであって、
前記免疫複合体が、HIVウイルス表面糖蛋白質gp120、抗gp120抗体、宿主細胞表面CD4及び宿主細胞表面ケモカインレセプターを含むことを特徴とする病状推移の推定マーカー。
【請求項４】
前記病状が、末梢血中のCD4密度、又はAIDS関連疾患による症状であることを特徴とする請求項3に記載の病状推移の推定マーカー。
【請求項５】
CD4陽性細胞表面に存在する免疫複合体を含有するHIV感染症治療又はAIDS治療の選択マーカーであって、
前記免疫複合体が、HIVウイルス表面糖蛋白質gp120、抗gp120抗体、宿主細胞表面CD4及び宿主細胞表面ケモカインレセプターを含むことを特徴とするHIV感染症治療又はAIDS治療の選択マーカー。
【請求項６】
前記HIV感染症治療又はAIDS治療の内容が、抗HIV薬又はAIDS関連疾患予防・治療薬の投与の開始、中止、又は変更であることを特徴とする請求項5に記載のマーカー。
【請求項７】
CD4陽性細胞表面に存在する免疫複合体を含有する抗HIV薬の薬効の判定マーカーであって、
前記免疫複合体が、HIVウイルス表面糖蛋白質gp120、抗gp120抗体、宿主細胞表面CD4、及び宿主細胞表面ケモカインレセプターを含むことを特徴とする判定マーカー。
【請求項８】
前記CD4陽性細胞が、T細胞であることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載のマーカー。
【請求項９】
HIV感染症に罹患している脊椎動物において、抗HIV薬の薬効を判定する方法であって、
CD4陽性細胞表面に存在し、HIVウイルス表面糖蛋白質gp120、抗gp120抗体、宿主細胞表面CD4、及び宿主細胞表面ケモカインレセプターを含む免疫複合体を含有するHIVウイルス生産量測定マーカーを用いることを特徴とする薬効判定方法。
【請求項１０】
前記脊椎動物に対し、前記抗HIV薬を投与する前後における前記HIVウイルス生産量測定マーカーの量を比較することを特徴とする請求項9に記載の薬効判定方法。
【請求項１１】
HIV感染症に罹患している脊椎動物において、生体内のCD4陽性細胞数の減少を抑制する薬剤をスクリーニングする方法であって、
CD4陽性細胞表面に存在し、HIVウイルス表面糖蛋白質gp120、抗gp120抗体、宿主細胞表面CD4、及び宿主細胞表面ケモカインレセプターを含む免疫複合体を含有するHIVウイルス生産量測定マーカーを用いることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記脊椎動物に対し、抗HIV薬を投与する前後における前記HIVウイルス生産量測定マーカーの量を比較することを特徴とする請求項11に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
CD4陽性細胞と、HIVウイルスと、抗gp120抗体と、
を構成要素として含む細胞複合体であって、
前記CD4陽性細胞表面上で複合体を形成していることを特徴とする細胞複合体。
【請求項１４】
CD4陽性細胞表面に存在するCD4及びケモカインレセプターと、
HIVウイルス表面に存在する糖蛋白質gp120と、
抗gp120抗体と、
を含む免疫複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、CD4陽性細胞表面に存在する免疫複合体を含有するHIVウイルス生産量測定マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
HIV感染症は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）がT細胞に感染し、免疫系が徐々に破壊されていく進行性の疾患である。HIV感染症に罹患したほとんどの患者は、数年にわたって臨床的にも検査学的にもゆっくりと病態が進行し、後天性免疫不全症候群（acquired immunodeficiency syndrome: AIDS）を発症することが知られている。また、HIVウイルスは、遺伝子学的にHIV-1（human immunodeficiency virus type 1）とHIV-2（human immunodeficiency virus type 2）の２種類に大別されるが、特にHIV-1ウイルスは日本を含めた世界で最も流行している型である。
【０００３】
現在、HIV感染症の病態の進行と全般的な予後を示す、いくつかの重要な指標が見出され、それらは病状推移の把握及び治療法の決定に大切な役割を果たしている。その疾患の増悪の指標としては、免疫学的な異常（血中のCD4陽性T細胞数の減少、血中のCD4/CD8陽性T細胞数比の低下など）、ウイルス量の増加（血中のウイルス抗原量の増加、血中のウイルスコピー数の増加など）、又は臨床的な徴候（リンパ節腫脹、日和見感染症など）などがある。これらの指標のいくつかは、HIV感染症の病態を分類する方法として知られているCDC分類、Walter Reed分類、WHOステージ分類などにおいて使用されている。
【０００４】
しかし、HIV感染症の患者には、CD4数が200個/m3以下であってもAIDSを発症しない患者や、CD4数が200個/m3以上あってもAIDSを発症している患者が存在するため、CD4数の値でHIV感染症の病状推移を適切に推定することは難しく、治療方針を明確に定めることは困難であった。また、HIV-RNAの定量法が開発されたが、HIV-RNAの値は、HIV感染初期において血液中のHIV-RNA量が一過性に増加するが、その後一定の値に落ち着き、AIDS発症期に直前までその値が不変であるため、血液中のHIV-RNA量からHIV感染症の病状推移を推定することは困難であった。さらに、抗HIV薬の投与によって血中HIV-RNA量は検出感度以下で、ウイルス増殖を十分に抑制できていると判断される場合でも、実際にはリンパ節にてHIVウイルスの増殖を抑制させることが不十分で、薬剤耐性を有する変異ウイルスが出現し、治療が失敗に終わるケースが報告されている（例えば、非特許文献1〜3参照）。
【非特許文献１】Persaud, D., Zhou, Y., Siliciano, JM, and Siliciano, RF. Latency in Human Immunodeficiency Virus Type 1 Infection: No Easy Answers. J. Virol. 77, 1659-1663 (2003)
【非特許文献２】Zhang, L. et al. Quantifying residual HIV-1 replication in patients receiving combination antiretroviral therapy. N.Engl. J. Med. 340, 1605-1613 (1999)
【非特許文献３】Anton, PA. et al. Multiple measures of HIV burden in blood and tissue are correlated with each other but not with clinical parameters in aviremic subjects. AIDS. 17, 53-63 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上のような現状から、HIV感染症の病状推移を予測することや、選択した抗HIV療法の効果を判断することができる新しい方法を開発する必要があった。特に、リンパ節におけるHIVウイルス産性量を定量できる測定方法の開発が期待されていた。
【０００６】
そこで、本発明は、CD4陽性細胞表面に存在する免疫複合体を含有するHIVウイルス生産量測定マーカー及びその利用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
HIVウイルスは、HIVウイルス外殻の糖蛋白gp120が宿主細胞上のレセプター（viral receptors: VRs、以下「VRs」という）であるCD4及びケモカインレセプターの双方に結合することによって、宿主細胞へ侵入する。
【０００８】
生体内のCD4陽性T細胞の95％以上を構成する静止期CD4陽性T細胞（resting CD4+ T cells: rCD4、以下「rCD4」という）の細胞表面上には、CD4及びケモカインレセプター（CXCR4もしくはCCR5）からなるVRsが存在する。また、HIV-1ウイルス又はHIV-1ウイルス外殻の糖蛋白gp120をrCD4へ投与すると、rCD4表面上において、gp120がCD4及びケモカインレセプター(CXCR4)に結合し、複合体（gp120-VRs複合体）を形成する（図２を参照のこと）。
【０００９】
gp120は、HIVウイルス分子の中で最も免疫原性が高いタンパク質であり、HIV感染症患者は血中に抗gp120抗体を持つことが知られている。HIV-1感染症患者の体内では、この抗gp120抗体がrCD4表面上で形成されたgp120-VRs複合体に結合すると、直ちに細胞内へphagocytosisによって取り込まれると考えられていたが、発明者らは、これらが表面免疫複合体（surface immune-complex:sIC、以下「sIC」という）を形成し、この表面免疫複合体は、rCD4表面上において長期間（半減期＝4〜5日）安定に存在することを明らかにした（図3を参照のこと）。
【００１０】
本発明者らは、このように、HIV-1感染症患者の末梢血にはrCD4表面上にsICが特異的に存在し（以下、rCD4においてsICを細胞上に保持する細胞を「sIC+rCD4」という）、このsIC+rCD4がリンパ節で主に生成されることや、sIC+rCD4の末梢血中の密度はHIV-1感染症の患者の将来の病状推移及び抗HIV-1薬の薬効と関連があることなどを見出し、本発明の完成に至った。
【００１１】
すなわち、本発明にかかるHIV感染症診断マーカーは、CD4陽性細胞表面に存在する免疫複合体を含有するHIV感染症診断マーカーであって、前記免疫複合体が、HIVウイルス表面糖蛋白質gp120、抗gp120抗体、宿主細胞表面CD4、及び宿主細胞表面ケモカインレセプターを含むことを特徴とする。上記免疫複合体を含有するマーカーとして、HIVウイルス生産量測定マーカーであってもよい。
【００１２】
また、上記免疫複合体を含有するマーカーは、HIV感染症の病状推移の推定マーカーであってもよく、ここに前記病状が、末梢血中のCD4密度、又はAIDS関連疾患による症状であってもよい。
【００１３】
また、上記免疫複合体を含有するマーカーは、HIV感染症治療又はAIDS治療の選択マーカーであってもよく、ここに前記HIV感染症治療又はAIDS治療の内容が、抗HIV薬又はAIDS関連疾患予防・治療薬の投与の開始、中止、又は変更であってもよい。
【００１４】
また、上記免疫複合体を含有するマーカーは、CD4陽性細胞表面に存在する免疫複合体を含有する抗HIV薬の薬効の判定マーカーであってもよい。
【００１５】
なお、前記マーカーにおいて、前記CD4陽性細胞は、T細胞であることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明にかかる免疫複合体を含有するマーカーの利用方法は、HIV感染症に罹患している脊椎動物において、抗HIV薬の薬効を判定する方法であり、ここに、前記脊椎動物に対し、前記抗HIV薬を投与する前後における前記HIVウイルス生産量測定マーカーの量を比較してもよい。ここで、免疫複合体は、CD4陽性細胞表面に存在し、HIVウイルス表面糖蛋白質gp120、抗gp120抗体、宿主細胞表面CD4、及び宿主細胞表面ケモカインレセプターを含む。
【００１７】
また、本発明にかかる免疫複合体を含有するマーカーの利用方法は、HIV感染症に罹患している脊椎動物において、生体内のCD4陽性細胞数の減少を抑制する薬剤をスクリーニングする方法であって、前記脊椎動物に対し、前記抗HIV薬を投与する前後における前記HIVウイルス生産量測定マーカーの量を比較してもよい。ここで、免疫複合体は、CD4陽性細胞表面に存在し、HIVウイルス表面糖蛋白質gp120、抗gp120抗体、宿主細胞表面CD4、及び宿主細胞表面ケモカインレセプターを含む。
【００１８】
さらに、本発明にかかる細胞複合体は、CD4陽性細胞と、HIVウイルスと、抗gp120抗体とを構成要素として含む細胞複合体であって、前記CD4陽性細胞表面上で複合体を形成していることを特徴とする。
【００１９】
さらに、本発明にかかる免疫複合体は、CD4陽性細胞表面に存在するCD4及びケモカインレセプターと、HIVウイルス表面に存在する糖蛋白質gp120と、抗gp120抗体とを含め、免疫複合体を形成していることを特徴とする。
【００２０】
なお、本明細書において、sICは、表面免疫複合体を意味し、「免疫複合体」ともいう。また、本明細書において、sIC+CD4又はsIC+rCD4は、表面免疫複合体を保持するCD4陽性細胞又は静止期CD4陽性T細胞を意味し、「細胞複合体」ともいう。また、HIVウイルスは、HIV-1ウイルスとHIV-2ウイルスの両方を含む。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によって、CD4陽性細胞表面に存在する免疫複合体を含有するHIVウイルス生産量測定マーカー及びその利用方法を提供することができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００２３】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２４】
＝＝CD4陽性細胞表面に存在する免疫複合体及びその有用性＝＝＝
（１）HIVウイルス型
HIVウイルスは遺伝学的系統によりHIV-1（gag、pol、vif、vpr、env、tat、rev、nef、vpu）、HIV-2（vpx）に分類される。このように、HIVウイルスには異なる型が存在するが、HIVウイルスの宿主への感染の機序は同様であり、HIVウイルス外殻の糖蛋白gp120、CD4及びケモカインレセプターを必要とする。従って、本発明は、HIVウイルスの型を問わず実施することができる。
【００２５】
（２）HIV感染症診断マーカー
HIV-1感染症患者の末梢血には、表面免疫複合体を保持する静止期CD4陽性T細胞（sIC+rCD4）が存在する（図1-a、bを参照のこと）。一方、HIV-1非感染者の末梢血にはsIC+rCD4は存在しないこと（図1-a、bを参照のこと）から、免疫複合体（sIC）又は細胞複合体（sIC+rCD4又はsIC+CD4）は、HIV感染特異的に生じ、HIV感染症診断マーカーとして利用できる。
【００２６】
実際、ウエスタンブロット法による検査結果が陰性であっても、sIC+rCD4を測定するとHIV-1感染であると判断できる症例が、急性期のHIV-1感染症患者において4例あった（結果は図示していない）。従って、血液中の免疫複合体又は細胞複合体を測定すれば、より感度よく、早期にHIV感染症を診断することができる。なお、免疫複合体又は細胞複合体を用いたHIV感染症の診断は、粒子凝集反応（PA法）、ELISA法などの他の高感度のスクリーニング検査方法と組み合わせてもよい。
【００２７】
（３）HIVウイルス生産量測定マーカー
HIVウイルスがリンパ節において継続的に複製が行われていることは、現在まで様々な方法で明らかにされている（Pantaleo, G. et al. HIV infection is active and progressive in lymphoid tissue during the clinically latent stage of disease. Nature. 362, 355-358 (1993), Heath, SL. et al. Follicular dendritic cells and human immunodeficiency virus infectivity. Nature. 377, 740-744 (1995), Haase AT. Population biology of HIV-1 infection: viral and CD4+ T cell demographics and dynamics in lymphatic tissues. Annu. Rev. Immunol. 17, 625-656 (1999), Margolin, DH. et al. High frequency of virus-specific B lymphocytes in germinal centers of simian-human immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys. J. Virol. 76, 3965-3973 (2002)））。一方、発明者らは、強い抗HIV薬の存在下では、HIV-1ウイルスが末梢血中に存在しなくても、免疫複合体が末梢血中のrCD4上に存在することを見出した。このことは、HIVウイルスはリンパ節において継続的に複製が行われていることを支持すると同時に、細胞複合体（sIC+rCD4又はsIC+CD4）の生成場所は、リンパ節であることを強く示唆している。すなわち、リンパ節において、CD4陽性T細胞がHIVウイルスに暴露された結果、抗gp120抗体がこの複合体に結合し、最終的に表面免疫複合体（sIC）を保持する細胞複合体（sIC+rCD4又はsIC+CD4）が形成されると考えられる。このように、末梢血中の免疫複合体又は細胞複合体の量（例えば、末梢血中rCD4に対するsIC+rCD4の割合）は、de novoで合成されているHIVウイルス量を反映していると考えられるため、HIVウイルス生産量測定マーカーとして利用できる。
【００２８】
（４）病状推移の推定マーカー
HIV感染症において抗HIV薬を投与しない場合、一般に、1)感染初期（急性期）、2)無症候期、3)AIDS発症期という臨床経過をたどる（以下、「典型例」という）。具体的な病状は以下の通りである。
【００２９】
1）初感染したHIVウイルスは、急激に増殖する。患者には発熱、倦怠感、筋肉痛、リンパ節腫脹、発疹といったインフルエンザ様の症状がみられることがあるが、数週間で消失する。
【００３０】
2）急性症状消失後もウイルスは増殖を繰り返しているが、宿主の免疫応答により症状の無い平衡状態が長期間続くことが多い。この無症候期でもHIVウイルスは著しい速度（毎日100億個前後）で増殖しており、CD4陽性T細胞は次々とHIVウイルスに感染して、平均2.2日で死滅する。
【００３１】
3）ウイルスの増殖と宿主の免疫応答による平衡状態もやがて破綻し、血中ウイルス量（HIV RNA量）が増加し、CD4陽性T細胞数も減少（200〜250個/m3）し、免疫不全状態となって、AIDS（acquired immunodeficiency syndrome）を発症する。
【００３２】
一方、HIV感染症患者の中には、HIVウイルス初感染から10年以上経過しても、CD4数が350個/m3以上もあったり、病状の経過が極めて緩やかであったり、全く病状が変化しなかったりする患者がいる。このような患者は、Slow-progressor又は長期未発症者と呼ばれている（以下、「長期未発症例」という）。
【００３３】
以下の実施例に示す通り、典型例と長期未発症例におけるsIC+rCD4量を観察すると、長期未発症例では5800日前後から7800日までの間を経過観察してみたが、sIC+rCD4値は極めて低く、CD4値が高いレベルで保たれているのに対し、典型例では日数が経過するとsIC+rCD4値が上昇し、併せてCD4値が低下していた（図6を参照のこと）。
【００３４】
このように、末梢血におけるsIC+rCD4量は、典型例と長期未発症例において、顕著に異なる。従って、ある患者の免疫複合体又は細胞複合体の値（例えば、末梢血中rCD4に対するsIC+rCD4の割合）より、その患者がどのように病状推移するか、例えば、典型例であるか長期未発症例であるかを推定することができる。また、免疫複合体又は細胞複合体の密度が低い場合、CD4陽性T細胞数が多く、免疫複合体又は細胞複合体の密度が増加すると、その後CD4陽性T細胞数が低下する、というように、CD4陽性T細胞数の推移も推定できる。このように、免疫複合体又は細胞複合体の密度は、病状推移の推定マーカーとして利用できる。実際、血液中のCD4陽性T細胞数が200〜250個/m3へ減少すると、AIDSを発症しやすくなり、抗HIV薬の投与を始めることが考慮され始めるため、いつ頃CD4陽性リンパ球がそのような値になるかを予想できれば、例えば、CD4の血中濃度の定期検査の頻度を下げることができる。また、AIDS関連疾患（例えば、カリニ肺炎、非定型抗酸菌感染症）の予防薬等を予め投与する時期を判断することも可能になる。
【００３５】
（５）抗HIV薬の薬効判定マーカー
上述したように、免疫複合体又は細胞複合体の血中密度は、リンパ節で生産しているHIVウイルスの数を反映しているので、免疫複合体又は細胞複合体の血中密度は、HIV感染症の病態を精度よく把握することができる。従って、免疫複合体又は細胞複合体の血中密度の増減に基づけば、抗HIV薬の薬効をより正確に判断することができる。
【００３６】
現在、HIV感染症の治療として、抗HIV薬を3剤以上併用させている（HAART療法）が、実際、治療効果が高いと考えられているHAART（エファビレンツ（EFV）又はロピナビル（RPV）・リトナビル（RTV）配合剤を含有する3剤併用療法）をHIV-1感染症患者に投与すると、sIC+rCD4量が急激に低下した(図7を参照のこと)。一方、治療効果が弱いと考えられるHAARTを投与し続けると、sIC+rCD4量は徐々に低下した(図7を参照のこと)。このように、HIV感染症患者に抗HIV薬を投与する前後でsIC+rCD4量を比較することにより、投与した薬剤の薬効を判定することができる。すなわち、免疫複合体又は細胞複合体は、抗HIV薬の薬効判定マーカーとして利用できる。
【００３７】
具体的な薬効判定方法としては、脊椎動物において、抗HIV薬を投与する前後で、脊椎動物から血液を採取し、血液中の免疫複合体又は細胞複合体の量（例えば、末梢血中rCD4に対するsIC+rCD4の割合）を測定し、抗HIV薬を投与する前後での変化を比較する。例えば、抗HIV薬を投与後に、血液中の免疫複合体又は細胞複合体の量が急激に減少すれば、その抗HIV薬は強い効果があると判定し、血液中の免疫複合体又は細胞複合体の量が徐々に減少すれば、その抗HIV薬は弱い効果があると判定し、血液中の免疫複合体又は細胞複合体の量が増加すれば、その抗HIV薬は効果がないと判定する。
【００３８】
この応用として、本発明の免疫複合体又は細胞複合体は、抗HIV薬による治療を選択する上で有用なマーカーともなり得る。例えば、免疫複合体又は細胞複合体の血中濃度（例えば、末梢血中rCD4に対するsIC+rCD4の割合）が低いときは、CD4数が低くても、効果の弱い抗HIV薬を投与するだけで良い、という選択がなされるかもしれない。また、HIV感染症の治療として、HAARTを投与している間に、免疫複合体又は細胞複合体の血中濃度（例えば、末梢血中rCD4に対するsIC+rCD4の割合）が変化した場合、それに応じて、抗HIV薬を変更することもできる。例えば、抗HIV薬による効果が不十分で、免疫複合体又は細胞複合体の血中濃度が高いままの場合、より強い抗HIV薬の投与を考えることができる。
【００３９】
リンパ節で生産しているHIVウイルスの数を考慮に入れて抗HIV薬を選択する一つのメリットは、そこでのHIVウイルスの数を0にすることにより、変異HIVウイルスの出現を抑制することができる点にある。HIVウイルスは増殖速度が非常に早く、高頻度に変異を起こすウイルスである。そのため、薬剤耐性を有する変異ウイルスの出現を回避しながら治療をするためには、生体内においてHIVウイルスの産生を完全に抑制させることが効果的である。
【００４０】
（６）生体内のCD4陽性細胞数の減少を抑制する薬剤のスクリーニング方法
以下の実施例に示すように、HIV-1感染症患者から単離したsIC+rCD4をマクロファージと共に培養すると、rCD4はマクロファージに貧食されて破壊された（図5を参照のこと）。さらに、HIV-1感染症患者に抗HIV薬を投与して、血清HIV-RNA量を抑制されている状態で、その患者の脾臓を摘出すると、血液中のsIC+rCD4量が上昇した（結果は図示していない）。これらより、HIV感染症患者の生体内に存在するsIC+rCD4は、生体内を循環中に脾臓で（例えば、マクロファージの貪食のために）取り除かれてしまい、そのためにCD4陽性T細胞が減少し、免疫系のシステムの機能低下（例えば、CD4陽性T細胞によるB細胞、細胞障害性T細胞又はナチュラルキラー細胞（NK細胞）の活性化が働かなくなるために）が助長されることが示唆される。
【００４１】
また、HIV感染細胞に結合した抗gp120抗体のFC部分が、NK細胞のFcレセプターに結合すると、NK細胞による抗体依存性細胞媒介細胞障害（antibody-dependent cellular cytotoxicity: ADCC）が誘発される（Jewett, A., Cavalcanti, M., Giorgi, J., Bonavida, B. Concomitant killing in vitro of both gp120-coated CD4+ peripheral T lymphocytes and natural killer cell in the antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) system. J Immunol. 158, 5492-5500 (1997)）。従って、抗gp120抗体を有する免疫複合体又は細胞複合体は、NK細胞による障害を受ける可能性が考えられ、この障害反応によりCD4陽性T細胞が破壊されて免疫機構が働かなくなり、結果的に免疫不全が進行すると考えられる。
【００４２】
本発明の生体内のCD4陽性細胞数の減少を抑制する薬剤のスクリーニング方法は、生体内の免疫複合体又は細胞複合体の形成にかかわるいずれかの段階を阻害することによって、最終的にCD4陽性T細胞に対するNK細胞やマクロファージの攻撃を阻害する薬剤を選択するものである。
【実施例】
【００４３】
＜実施例1：CD4陽性細胞表面上の免疫複合体形成＞
（１）サンプルの調製
休止期CD4陽性T細胞（quiescent CD4+ T cells;qCD4）の単離：HIV-1非感染健常人から採血した末梢単核球からCD4+ T cell isolation kit II (Miltenyi Biotech)を用いて細胞を回収し、さらにマグネチックビーズで標識した抗CD25抗体及び抗CD69抗体と結合する細胞を除去しその細胞から、Percoll gradient (Pharmacia Biotech)を用いた密度勾配遠心法により、qCD4を回収した。
【００４４】
静止期CD4陽性T細胞（resting CD4+ T cells;rCD4）の単離：HIV-1感染者末梢単核球よりCD4+ T cell isolation kit II (Miltenyi Biotech)を用いて回収した細胞から、さらに抗CD25抗体及び抗CD69抗体と結合する細胞を除去し、rCD4とした。
【００４５】
なお、qCD4とrCD4は、上記の単離方法の違いによって区別している。従って、以下の実験は、どちらの細胞を用いてもよい。
【００４６】
（２）rCD4細胞表面上での免疫複合体の確認
HIV-1感染症患者から単離したrCD4細胞表面上で、上記免疫複合体が存在するかどうかを調べた。
【００４７】
まず、HIV-1感染症患者から単離した末梢血単核細胞（PBMC）に対し、2%FCS含有PBSで洗浄した後、1次抗体として、非希釈抗CD3 Per CP抗体（BD PharMingen）、非希釈抗CD4-APC抗体（BD PharMingen）、非希釈抗CD25-PE抗体（BD PharMingen）、又は非希釈抗CD69-PE抗体（BD PharMingen）を反応させ、次に、2次抗体として、50倍希釈ビオチン化F(ab’)2抗ヒトIgG抗体（Biosource）又は50倍希釈ビオチン化F(ab’)2抗ヒトIgM抗体（Biosource）を反応させ、最終的にストレプトアビジン-FITCを結合させた後、2％パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリー（FACSCalibur、Becton Dickinson）を用いて解析した。なお、免疫複合体陽性rCD4（sIC+rCD4）の検査には、HIV-1感染症でない健常人から採血した末梢血を必ず陰性コントロールとして用いた。
【００４８】
その結果、図1-aに示すように、陰性コントロールでは、rCD4細胞に免疫複合体が検出されないことがわかった。一方、慢性感染患者では、80％及び40％のrCD4細胞表面に、抗gp120 IgG及び抗gp120 IgMが検出され、急性感染患者では、それぞれ50％及び70％のrCD4細胞表面に、抗gp120 IgG抗体及び抗gp120 IgM抗体が検出された。図1-bはフローサイトメトリーの実際の結果を表わす。
【００４９】
また、図1-cに示すように、これらの抗gp120抗体は、rCD4細胞膜上のCD4と同じ局在を示した。なお、免疫染色法は、以下（3）に記載の方法に基づいて行った。
【００５０】
以上より、HIV-1感染者の末梢血rCD4上には免疫複合体が存在することが明らかになった。
【００５１】
（３）qCD4細胞表面上でのgp120の安定性
HIV-1Lai、HIV-1BaL及びHIV-1感染症患者の末梢血細胞より単離したR5-指向性株は、Rossio, JLらの文献（Rossio, JL. et al. Inactivation of human immunodeficiency virus type 1 infectivity with preservation of conformational and functional integrity of virion surface proteins. J. Virol. 72, 7992-8001 (1998)）に基づいてAldrich-2 (AT-2)により処理することで不活性化し、それらを用いて、qCD４細胞膜上におけるウイルス蛋白の安定性を調べた。
【００５２】
まず、上記の方法によって調製したqCD4を、gp120又はAT-2不活性化HIV-1ウイルスと4℃で30分間インキュベートし、十分に洗浄後、HIV-1感染症患者の血清を添加し30分間4℃でインキュベートし、qCD4表面上にgp120、CD4、CXCR4及び抗gp120抗体のsICを形成させた。次に、3重染色を行うために、0.5μg/mlヤギ抗CD4ポリクローナル抗体（R & D systems）、100倍希釈cy3結合抗ヤギIgG抗体二次抗体（Sigma）、20倍希釈ウサギ抗gp120抗血清（ABI）、50倍希釈Cy2結合抗ウサギIgG抗体（Dako）及び非希釈ビオチン化抗CXCR4抗体（R & D systems）、ストレプトアビジンQdot 605（Quantum Dot Corp.）を加え、4℃で30分間インキュベートした。次に、これらの細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定した。
【００５３】
なお、sICを観察する場合には、上記の方法によって単離したqCD4を、0.5μg/mlヤギ抗CD4ポリクローナル抗体（R & D systems）、100倍希釈抗cy3結合抗ヤギIgG抗体（Sigma）及び50倍希釈ビオチン化F(ab’)2抗ヒトIgG抗体（BioSource）、50倍希釈ストレプトアビジン化Qdot 605を加え、4℃で30分間インキュベートした。また、細胞表面と細胞内のVRsを同時に観察する場合には、細胞表面を上記のように染色後さらに細胞内の抗原を染色するために、Cytofix/Cytoperm kit (BD PharMingen)を用いて細胞膜に穴をあけた後、ヤギ抗CD4抗体（R & D systems）（二次抗体：cy3抗ヤギIgG抗体（Sigma））及びビオチン化抗CXCR4抗体（R & D systems）（二次抗体：ストレプトアビジンQdot 605 (Quantum Dot Corp.))を加え、4℃で30分間インキュベートした。最後に、共焦点顕微鏡（Zeiss LSM510システム、解像度は512×512ピクセル）で細胞の観察を行った。図２に示す通り、末梢血中のqCD4上にはCD4、CXCR4及びgp120が結合し複合体を形成して存在することが確認できた。なお、gp120IIIBとはHIV-1IIIB株由来精製gp120蛋白表わし、gp120BaLとはHIV-1BaL株由来精製gp120蛋白を表わし、HIV-1LaiとはHIV-1Lai株ウイルス濃縮液を表わす。
【００５４】
次に、時間経過とともに、これらの細胞表面上のgp120の量の変化を追うことにより、複合体の安定性を調べた。実験方法は、上記記載のようにgp120IIIBを用いqCD4細胞表面に免疫複合体を形成後、RPMI-メヂウム単独で、もしくは、10%HIV-1感染者血清存在下で細胞を培養し、図3に示した時間に細胞を回収し20倍希釈ウサギ抗gp120抗血清（ABI）、100倍希釈FITC結合抗ウサギIgG抗体（Jakson）で染色しフローサイトメトリーを用いて細胞表面のgp120量を解析した。また、一部の細胞は抗CD3抗体で刺激をして、刺激のgp120量に与える影響を調べた。
【００５５】
その結果、図3に示すように、細胞表面上のgp120の量は、gp120又はHIVウイルスを結合させた細胞膜上から、最初の20時間で約60％まで急激に消失したが、その後、消失はゆっくりになり、最終的に3〜4日後に約50％のgp120が細胞膜表面上に残ることがわかった。一方、コントロールとして抗CD3抗体を投与した場合、細胞表面上のgp120の量は、最初の20時間で約10％にまで急激に消失し、数日後にはほぼ完全に消失した。qCD4上のgp120の動態は患者血清の存在によりその細胞表面上に免疫複合体が形成された場合でも変化はなかった。
【００５６】
以上のことを、ウエスタンブロット法を用いて確認した。ウエスタンブロット法を行うために、まずgp120又はHIV-1を表面に付着させたqCD4を融解し、SDS-PAGEで分離を行った。次に、メンブレン（vinylidene difluoride）にトランスファーし、その後TBST5％スキムミルクでブロッキングした後に、抗ヒトIgG抗体（Dako）と反応させた。各タンパク質は、SuperSignal West Pico Chemiluminescent Kit(Pierce)を用いて検出し、Biomax-MRフィルムに感光させた。なお、タンパクのブロッティングには抗gp120抗体(ABI)、抗p24抗体(ABI)を使用している。
【００５７】
その結果、図4に示すように、36時間経っても約70％のgp120が細胞膜上に残っているのに対し、抗CD3抗体を投与した場合、36時間以内に90％のgp120が細胞膜表面から消失することがわかった。
【００５８】
このように、qCD４細胞膜上では、細胞上に付着したgp120はその受容体が非常にゆっくりと代謝されていることより、やはりその細胞上で非常に安定した複合体を形成することが明らかになった。
【００５９】
（４）CD4T細胞表面上の免疫複合体を介するマクロファージによるCD4T細胞の貧食作用及びNK細胞による抗体依存性細胞媒介細胞障害反応
1）各細胞の調製
CD4T細胞表面上の免疫複合体を介するマクロファージによるCD4T細胞の貧食作用及びNK細胞による抗体依存性細胞媒介細胞障害反応を調べるために、以下のように細胞の調製を行った。  
NK細胞及びマクロファージは、HIV-1非感染健常者末梢血から、NK細胞単離キットII（Miltenyi Biotech）及びマクロファージ単離キットII（Miltenyi Biotech）を用いて単離した。  
なお、qCD4の単離方法は上記（1）に記載した通りである。
【００６０】
2）マクロファージによる貧食反応
上記の方法によって単離したマクロファージを10％ヒト血清(BioWhittaker)を含有するX-Vivo-10(BioWhittaker)を加えて37℃で5日間培養した。5日後、Orange-CMTMR(5nM)(Molecular Probes)で標識した。  
gp120(250ng/ml)又はAT-2で処理したHIV-1ウイルスを加え細胞上に複合体を形成させたqCD4に、HIV-1感染症又はHIV-1非感染症血清を加えて37℃で1時間反応させた。次に、CFSEでこれらのqCD4を標識し後X-Vivo-10に浮遊させた後にガラス皿（Matsunami）に蒔いた。ここに標識した、自己由来のマクロファージを(qCD4:Orange-CMTMR標識マクロファージ＝5:1)添加した後、37℃で共培養することで自家貪食アッセイ（autologus phagocytosis assays）を実施した。  
同様に、同種貪食アッセイ（allogenic phagocytosis assays）の場合は、HIV-1感染者及び非感染者から単離したrCD4を、上記方法によって調製したマクロファージと共培養した。次に、自家、同種いずれのアッセイでも4％パラホルムアルデヒドで固定し、共焦点顕微鏡で観察した。qCD4もしくはrCD4を含むマクロファージの割合は、3次元画像を最初に構成しそのマクロファージ数約500個を解析して計算した。  
その結果、図5-a〜eに示す通り、免疫複合体を形成しているqCD4もしくはrCD4をマクロファージと共培養すると、CD4細胞はマクロファージに貧食されて破壊されることがわかった。
【００６１】
3）NK細胞による抗体依存性細胞媒介細胞障害反応
次に、このgp120(250ng/ml)又はAT-2で処理したHIV-1ウイルスを加え細胞上に複合体を形成させたqCD4に対して、CFSEで標識したNK細胞（3nM、10％血清（HIV-1感染症患者由来）で希釈）を入れ(qCD4:NK＝1:2)、48時間37℃で培養した。 次に、PIで染色（100μg/ml）し、フローサイトメトリーを用いて細胞障害の割合を測定した。  
その結果、図5f及び図5gに示す通り、免疫複合体を形成するqCD4をNK細胞と共に培養すると、qCD4はNK細胞による抗体依存性細胞媒介細胞障害反応により破壊されることがわかった。
【００６２】
＜実施例2：CD4細胞表面上の免疫複合体と臨床経過との関係＞
以下の実施例に示す典型例とは、抗HIV薬を投与しない状態で３年間経過を観察し、その間にCD4が200個/m3以下まで低下したことを確認したHIV-1感染症をいう。また、長期未発症例とは、血友病患者で非加熱製剤を介して感染したことが同定されているHIV-1患者で、抗HIV薬を投与しない状態で15年以上経過観察してCD4が350個/m3以上ある患者を示している。
【００６３】
（１）典型例及び長期未発症例におけるsIC+rCD4の推移
典型例及び長期未発症例において、HIV-1ウイルスコピー数、CD4数、（抗gp120 IgG抗体及び抗gp120 IgM抗体含有の）sIC+rCD4量を測定した。HIV-1ウイルスコピー数はRoche Amplicor Monitor assayで、CD4数（抗gp120 IgG抗体及び抗gp120 IgM抗体含有の）sIC+rCD4量は上記実施例1（2）に示す通りフローサイトメトリーを用いて測定した。
【００６４】
図6に示す通り、典型例（図6-b）では、日数が経つと共に（抗gp120 IgG抗体及び抗gp120 IgM抗体含有の）sIC+rCD4量が増加し、それと伴にCD4数が減少しているのに対し、長期未発症例（図6-a）では、日数が経過しても（抗gp120 IgG抗体及び抗gp120 IgM抗体含有の）sIC+rCD4量は相対的に少なく、かつCD4数も不変であった。なお、長期未発症例において、HCV治療の目的で一時的にインターフェロンα（IFN-α）の投与が行われているが、この投与によりHIV-RNA量は一過性に低下した。
【００６５】
また、図6-cは、3年の経過観察中に、CD4数が200個/m3以下まで低下し、HAARTを開始しなければならなくなった患者群（n=4）（グラフ左側）と、長期未発症例（n=10）（グラフ右側）の、末梢血中のrCD4に対するsIC+rCD4の割合を示す。
【００６６】
以上より、末梢血中rCD4に対するsIC+rCD4の割合が70％を超えるHIV-1感染者は、将来、CD4数が減少していくことが予想された。一方、末梢血中rCD4に対するsIC+rCD4の割合が低値の場合は、長期未発症例となる可能性が高いことが予想された。
【００６７】
（２）抗HIV薬投与におけるsIC+rCD4の推移
典型例に治療効果が弱いと考えられているHAART（エファビレンツ（EFV）又はロピナビル（RPV）・リトナビル（RTV）配合剤を含有しない3剤併用療法）（「弱い抗HIV薬」ともいう）をまず投与し、その後、治療効果が高いと考えられているHAART（エファビレンツ（EFV）又はロピナビル（RPV）・リトナビル（RTV）配合剤を含む3剤併用療法）（「強い抗HIV薬」ともいう）を投与した際の、HIV-1ウイルスコピー数、CD4数、（抗gp120 IgG抗体又は抗gp120 IgM抗体含有の）sIC+rCD4量の変動を測定した。HIV-1ウイルスコピー数はRoche Amplicor Monitor assayで、CD4数、sIC+rCD4量は上記実施例1（2）に示す通りフローサイトメトリーを用いて測定した。
【００６８】
図7に示す通り、治療効果が高いと考えられているHAARTを投与すると、sIC+rCD4量が急激に低下した。一方、治療効果が弱いと考えられるHAARTを投与し続けると、sIC+rCD4量は徐々に低下した。なお、抗gp120 IgG抗体含有のsIC+rCD4及び抗gp120 IgM抗体含有のsIC+rCD4は、共に同様の挙動を示した。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明の一実施例において、rCD4細胞表面上での免疫複合体を確認したグラフ及び図である。aは、sIC+rCD4の発現を、フローサイトメトリーを用いて調べた結果を示すグラフである。なお、Nは正常患者の末梢血、Aは急性HIV-1感染症患者の末梢血、CはHAART前の慢性HIV-1感染症患者の末梢血、「3年後」は、HAART後3年後の慢性HIV-1感染症患者又はHAART無しの慢性HIV-1感染症患者を示す。bは、実際のフローサイトメトリーの代表的な結果を示す図である。cは、rCD4細胞膜上の抗gp120抗体の局在を、免疫染色法を用いて確認した図である。白色は、抗gp120抗体及びCD4の二重染色部位である。
【図２】本発明の一実施例において、末梢血中のqCD4細胞表面上でのCD4、CXCR4及びgp120の複合体の形成を、免疫染色法で確認した図である。なお、gp120IIIBとはHIV-1IIIB株由来精製gp120蛋白を、gp120BaLとはHIV-1BaL株由来精製gp120蛋白を、HIV-1LaiとはHIV-1Lai株ウイルス濃縮液を表わす。
【図３】本発明の一実施例において、qCD4細胞表面上でのgp120の動態を、フローサイトメトリーを用いて調べた結果を示す図である。縦軸は、qCD4細胞表面上でのgp120の変化の割合を示す。○は培地を、△はHIV-1感染症患者の血清を添加した結果を示す。なお、□は抗CD3抗体を添加の結果を示す。
【図４】本発明の一実施例において、末梢血中のqCD4細胞表面上に結合したgp120の量を、ウエスタンブロット法を用いて測定した結果を示す図である。
【図５】本発明の一実施例において、CD4T細胞表面上の免疫複合体を介するマクロファージによるCD4T細胞の貧食作用及びNK細胞による抗体依存性細胞媒介細胞障害反応を調べた結果を示す図である。aは、マクロファージによる貧食反応を免疫染色法で確認した図である。左上は培地を、中上はgp120IIIBを、右上はgp120IIIB+HIV-1感染症患者の血清を、左下はHIV-1感染症患者の血清を、中下はHIV-1Laiを、右下はHIV-1Lai+HIV-1感染症患者の血清を添加した際に生じたマクロファージによる貪食反応を示す。白色はqCD4細胞、グレー色はマクロファージである。なお、図下に示した数字は、貪食反応が起きた割合（％）を表わす。bは、マクロファージによる貧食反応をグラフで表わしたものである。左から順に、培地、HIV-1感染症患者の血清、gp120IIIB、gp120IIIB+HIV-1感染症患者の血清、gp120IIIB+熱によって非活性化していないHIV-1感染症患者の血清、HIV-1Lai HIV-1Lai+HIV-1感染症患者の血清を添加した際に生じたマクロファージによる貪食反応を示す。また、1-2とは、マクロファージに含まれているqCD4の数が1〜2個であり、3-5とは、マクロファージに含まれているqCD4の数が3〜5個であり、6＞とは、マクロファージに含まれているqCD4の数が6個以上であることを示す。cは、マクロファージによる貧食反応をグラフで表わしたものである。左から順に、培地、HIV-1感染症患者の血清、gp120IIIB、gp120IIIB+健常人の血清、gp120IIIB+HIV-1感染症患者の血清の希釈を添加した際に生じたマクロファージによる貪食反応を示す。また、1-2、3-5、6＞は、上記bに示す通りである。dは、TUNEL法によるアポトーシスを示した図である。白色はqCD4細胞、グレー色はマクロファージである。なお、図下に示した数字は、アポトーシスがqCD4に起きた割合（％）を表わす。eは、3時間後及び7時間後における貪食反応を示したグラフである。左から順に、培地、HIV-1感染症患者の血清、gp120IIIB、gp120IIIB+健常人の血清、gp120IIIB、gp120IIIB+健常人の血清を添加した際に生じたマクロファージによる貪食反応を示す。fは、NK細胞による抗体依存性細胞媒介細胞障害反応を示したグラフである。左から順に、培地、HIV-1感染症患者の血清、gp120IIIB、HIV-1Lai、HIV-1BAL、gp120IIIB+HIV-1感染症患者の血清、HIV-1Lai+HIV-1感染症患者、HIV-1BAL +HIV-1感染症患者の血清を添加した際に生じたNK細胞による細胞障害反応を示す。gは、IL-15又はIL-2を添加した際の細胞障害反応を示したグラフである。左から順に、培地、gp120IIIB、gp120IIIB+HIV-1感染症患者の血清の希釈を添加した際に生じたNK細胞による細胞障害反応を示す。
【図６】本発明の一実施例における長期未発症例（a）及び典型例（b）におけるsIC+rCD4の推移を示す図である。また、cは、3年の経過観察中に、CD4数が200個/m3以下まで低下し、HAARTを開始しなければならなくなった患者群（n=4）（グラフ左側）と、長期未発症例（n=10）（グラフ右側）の、末梢血中rCD4に対するsIC+rCD4の割合を示す。
【図７】本発明の一実施例における抗HIV薬投与におけるsIC+rCD4の推移を示す図である。なお、各グラフは、異なるHIV-1感染症患者を対象に調査した結果を示している。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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