(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
喘息、肝硬変、炎症性腸疾患、関節炎、低血圧症、敗血症性もしくは外傷性ショック、慢性低血圧症、持続勃起症、虚血、低酸素症、虚血に起因する閉塞、又は神経疾患に罹患している被検体における酸化窒素の生産を減少させるための医薬の製造におけるキトサンの使用。
【請求項２】
キトサンが一部アセチル化されている、請求項１記載の使用。
【請求項３】
キトサンが完全にアセチル化されてキチンを形成している、請求項１記載の使用。
【請求項４】
キトサンが5から10の糖残基からなる多糖を含む、請求項３記載の使用。
【請求項５】
多糖が5糖残基の長さである、請求項４記載の使用。
【請求項６】
多糖が6糖残基の長さである、請求項４記載の使用。
【請求項７】
キトサンが5から10の糖残基からなる多糖を含む、請求項１記載の使用。
【請求項８】
多糖が5糖残基の長さである、請求項７記載の使用。
【請求項９】
多糖が6糖残基の長さである、請求項７記載の使用。
【請求項１０】
前記医薬が移植可能な器具の形態にある、請求項１記載の使用。
【請求項１１】
細胞内での酸化窒素の生産を減少させるのに十分な量のキトサンを含む組成物と細胞を接触させることからなる、細胞内での酸化窒素の生産を減少させるin vitroにおける方法であって、前記細胞がIFN-γおよびLPSによって活性化されたRAW264.7細胞である前記方法。
【請求項１２】
キトサンが一部アセチル化されている、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
キトサンが完全にアセチル化されてキチンを形成している、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
キトサンが5から10の糖残基からなる多糖を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
多糖が5糖残基の長さである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
多糖が6糖残基の長さである、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
キトサンが5から10の糖残基からなる多糖を含む、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞における酸化窒素の生産を減少させるのに有効な量のキトサンまたはその誘導体を細胞に接触させることにより、in vitroでの細胞による、または哺乳類における細胞による酸化窒素の生産を減少させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酸化窒素(ＮＯ)は、一連のさまざまな生物学的な現象、たとえば、炎症、敗血症性ショック、虚血および再灌流損傷の有害な結果、低血圧症、細胞の発生、およびアポトーシスと関連していると考えられている。生体内における組織の炎症は、しばしば、活性化したマクロファージの侵潤または存在によって特徴づけられ、その結果、活性化したマクロファージは炎症の過程における血管拡張の仲介物質であるＮＯを生産する。そこで、マクロファージのような細胞によるＮＯの生産を減少させることによって炎症を軽減することができる。
【０００３】
キトサンは、β-(1,4)-D-グルコサミンの酸可溶性ポリマーである。キチンは比較的溶けにくい、キトサンのアセチル化形態である。キチン、キトサン、およびその誘導体は、数多くの産業用途、たとえば、粘度調整剤、接着剤、クロマトグラフィーの担体、紙強化剤、凝集剤、食品添加物、薬品および化粧品の製造に利用されている。
【０００４】
本発明は、キトサンおよびその誘導体が細胞のＮＯの生産を阻害することができるという驚くべき結果に基づいている。キトサンはin vitroでラットのマクロファージによるＮＯの生産を促進するという報告がなされていたので(Pelusoら、Biomaterials 15:1215-1220, 1994)、この結果は予期しないものであった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
したがって、本発明は、ＮＯの生産の減少が望まれるような被検体（たとえば、マウス、哺乳類、またはヒト）を識別し、その被検体におけるＮＯの生産を減少させるのに十分な量のキトサンを含む組成物を被検体に投与することによって、被検体におけるＮＯの生産を減少させる方法を特徴とする。前記組成物は、局所的に（たとえば、関節炎をおこした関節のような被検体の炎症部位に）、全身的に（たとえば、静脈内）、または移植可能な器具の一部（たとえば、創傷用包帯のような外科的人工補装具、または組成物を徐放性にするための器具）として、適用することができる。ＮＯの生産が異常に高まった場合、またはＮＯの生産は正常であるが、その哺乳類にとってＮＯの生産レベルが正常値よりも低いほうが有利である場合に、ＮＯの生産を減少させることが望ましい。
【０００６】
本発明はまた、細胞内でのＮＯの生産を減少させるのに十分な量のキトサンを含む組成物と細胞を接触させることによって、細胞内でのＮＯの生産を減少させるための方法をも含む。
【０００７】
ここで用いられる、「キトサンを含む組成物」という用語は、(1)キトサン；(2)一部がアセチル化されたキトサン、完全にアセチル化されてキチンを形成するキトサン、および多糖（たとえば、５から10、または5あるいは６の糖残基からなるもの）と共有結合により結合したキトサンを含めたキトサンの誘導体；および(3)(1)または(2)またはその両方、および１以上の添加剤（たとえば、担体）または後述するような他の生物活性化合物を含む混合物を意味する。一般的にキトサンはキチンの脱アセチル化によって生産される。けれども、上記定義は、便宜上、キチンおよびキトサンの両方を包含する意味で用いる。
【０００８】
本発明の方法は、ＮＯの生産またはその結果としておこる生理的効果が望ましくないような疾病または症状を治療または予防するために用いることができる。このような疾病または症状については後述する。さらに、本発明の方法は、 キトサンまたはその誘導体の、炎症のようなさまざまな症状を治療する薬品としての有効性を試験またはスクリーニングするin vitroまたはin vivoの動物モデルに利用することができる。キチンまたはキトサンの有効なまたは有効でない誘導体のスクリーニングの成功例は、下の実施例に記載されている（たとえば、表１および２を参照されたい）。
【０００９】
本発明の他の特徴または利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、細胞のＮＯの生産によって仲介される症状または疾病の治療または予防のために、被検体にキトサンを含む組成物を投与することに関する。本発明を実施するためのさまざまな方法を以下に論じる。
【００１１】
この組成物によって治療可能な具体的な疾病または障害には、炎症性の疾病または障害、低血圧症、敗血症性または外傷性ショック、慢性低血圧症または持続勃起症が含まれる。そこで、本発明の方法においては、キトサンまたはその誘導体と共に血圧を上昇させる効果を有する、一定量の血管収縮薬をも投与することができる。好ましい血管収縮薬には、エピネフリン、ノルエピネフリン、バソプレシン、NG-モノメチル-L-アルギニン、NG-ニトロアルギニンメチルエステルおよびプロスタグランジンが含まれる。本発明の方法はまた、ＮＯに反応しておこる平滑筋細胞の弛緩を阻害するために用いることもできる。このように、一般的に、ＮＯの生産の阻害は、薬物治療における主要な活性成分として、またはステロイド、抗体、またはペプチドホルモンのような他の薬品の補助として、多くの治療上の効果をもたらす。さらに、本発明の組成物は、ＮＯの生産は正常であるが、その哺乳類にとってＮＯの生産レベルが正常値よりも低い方が有利である場合に投与することができる。たとえば、患者が脱水するので、腎小管における内皮の正常な血管拡張を減少させることが望ましい。
【００１２】
炎症には、ＮＯのような有毒な分子の放出を伴う細胞性免疫反応が含まれる。細胞性免疫反応は、たとえば、細菌および寄生虫のような感染性微生物を死滅させるため、およびがん性または感染した細胞を排除するために有益である。しかしながら、炎症は、喘息、肝硬変、炎症性腸疾患、および関節炎のように、慢性、自己免疫性、または有害になり得る。
【００１３】
ＮＯは虚血性の症状の有害な作用に関連していると考えられている。虚血または低酸素は、たとえば、心筋梗塞の結果として、またはバルーン血管形成の後に心臓に生じた場合に特に重大な問題となる。脳における虚血もまた重大であるが、一般に症状は発作を伴う。したがって、本発明の方法においてはさらに虚血を引き起こす閉塞を取り除くようにデザインされた薬物（たとえば、組織プラスミノーゲン活性化因子またはストレプトキナーゼ）をも投与することができる。
【００１４】
ＮＯはまた、活性な神経伝達物質である。ＮＯの過剰な生産または活性は神経学的な疾病、特に脳に影響を与える疾病を引き起こすことがある。したがって、本発明の方法に用いられる組成物の投与により神経学的な疾病を治療できる。血液脳関門の通過を促進するために、本組成物を静脈内投与する場合には、キトサンまたはその誘導体を、関門を通過することが知られている疎水性の成分またはタンパク質に共有結合によって結合させてもよい。あるいは、本組成物を頭蓋内または脳室内に投与してもよい。
【００１５】
キチンはカニまたはエビの殻を脱タンパクおよび脱石灰化することによって製造することができる（たとえば、米国特許第3,903,268号参照）。次いで、キチンを熱アルカリ溶液で脱アセチル化することによって、キトサンを得ることができる。別の方法では、キチンは、Actinomucor属に属するもののようなさまざまな真菌の種から単離することができる。さらに、キトサンおよびその誘導体は、 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO)のような公知の化学薬品販売者から入手することができる。
【００１６】
本発明の組成物はいかなる適当な経路によっても、たとえば、静脈内、動脈内、局所的に、注入により、腹腔内、胸膜腔内、経口、皮下、筋内、舌下、表皮内または直腸内に投与することができる。本発明の組成物は、液剤、懸濁剤、坐剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、軟膏剤、またはクリーム剤として製剤化できる。これらの組成物を調製するために、溶媒（たとえば、水または生理食塩水）、可溶化剤（たとえば、エタノール、Polysorbates、またはCremophor EL7）、等張性を与えるための試薬、保存剤、抗酸化剤、賦形剤（たとえば、ラクトース、でんぷん、結晶セルロース、マンニトール、マルトース、リン酸水素カルシウム、軽無水ケイ酸、または炭酸カルシウム）、結合剤（たとえば、でんぷん、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはアラビアゴム）、滑沢剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、または硬化油）、または安定化剤（たとえば、ラクトース、マンニトール、マルトース、ポリソルベート、マクロゴール、またはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油）を加えることができる。必要ならば、グリセリン、ジメチルアセトアミド、70%乳酸ナトリウム、界面活性剤、または、水酸化ナトリウム、エチレンジアミン、エタノールアミン、重炭酸ナトリウム、アルギニン、メグルミン(meglumine)、またはトリスアミノメタンのような塩基性物質を加えることができる。液剤、錠剤、顆粒剤またはカプセル剤のような製剤は、これらの成分を加えて成形することができる。
【００１７】
キトサンまたはその誘導体はまた、他の薬品を含む組成物に加えることもできる。たとえば、 Knapczykら、「キトサンを含む医薬品の剤形」（“Pharmaceutical Dosage Forms with Chitosan”）、 Skjak-Breakら編、「キチンおよびキトサン」(Chitin and Chitosan)中、Elsevier Applied Science、1998、pp665-669を参照されたい。この研究およびその他のもの、および下の実施例は、キトサンおよびその誘導体は許容度が高く、in vivoにおいて細胞毒性をもたないことを示しているかまたは示唆している。そこで、キトサンまたはその誘導体の投与量は、ほとんど毒性の心配をする必要なく、有効なレベルまで増加させることができる。
【００１８】
本発明の組成物の具体的な用量は、動物実験の結果およびさまざまな条件を考慮して決定される。さらに具体的な用量は明らかに、投与法；年齢、体重、性別、感受性、食べた食物、投与の間隔、組み合わせて投与される薬品のような被検体の条件；および、ＮＯに誘導された異常の原因、重大さ、および程度によって変化する。与えられた条件下での最適用量および投与頻度は、医学の専門家による前記の指針に基づく適切な投与量試験によって決定されなければならない。
【００１９】
一般的に、組成物をヒトの患者に投与する前に、キトサンまたはその誘導体を含む組成物、材料、または医療器具の有効性を試験することが有用である。たとえば、Minamiら、「大動物の診療へのキチンおよびキトサンの応用」(“Application of Chitin and Chitosan in Large Animal Practice”)、Brineら編、「キチンおよびキトサンの進歩」(Advances in Chitin and Chitosan)中、Elsevier Applied Science、New York、1992、pp61-69に記載される方法に従って、子ウシまたはウシを用いて、数多くの症状について治癒の促進または治療をおこなう能力に関して、キチン質組成物を試験することができる。小動物を用いる有効性の試験は、 Okamotoら、「小動物におけるキチンおよびキトサンの応用」(“Application of Chitin and Chitosan in Small Animals”)、Brineら編、「キチンおよびキトサンの進歩」(Advances in Chitin and Chitosan)中、Elsevier Applied Science、New York、1992、pp70-78；Johnsonら、「移植したキトサングルタメートに対するin vivo組織応答」(“In vivo Tissue Response to Implanted Chitosan Glutamate”)、Brineら編、「キチンおよびキトサンの進歩」(Advances in Chitin and Chitosan)中、Elsevier Applied Science、pp3-8、1992；またはSuら、Biomaterials 18:1169-1174, 1997に記載される方法で、同様に実施することができる。創傷治癒の研究のために、キトサンまたはその誘導体を外科的人工シートに成形した後、このシートを、たとえばヘルニアを閉じるため、または皮膚パッチと置き換えるために用いることができる。Suら、前掲；Austinら、Science 212:749-753, 1981；Suら、Biomaterials 20:61-68, 1999；およびKifuneら、「キチン人工皮膚（Beschitin W）の臨床への応用」(“Clinical Application of Chitin Aritificial Skin(Beschitin W)”)、Brineら編、「キチンおよびキトサンの進歩」(Advances in Chitin and Chitosan)中、Elsevier Applied Science、pp9-15、1992を参照されたい。別の方法では、キトサンまたはその誘導体を、治癒を促進または炎症を減少させるような縫合糸を製造するために用いることができる。たとえば、Tachibanaら、Jap. J. Surg. 18:533-539, 1988；およびBiaginiら、「創傷治癒のための生物材料」(“Biological Materials for Wound Healing”)、Brineら編、「キチンおよびキトサンの進歩」(Advances in Chitin and Chitosan)中、Elsevier Applied Science、pp16-24、1992を参照されたい。これらの試験法は、公知の方法または下の実施例に記載されたアッセイを用いて、影響を受けている部位の生体組織検査または移植した器具におけるＮＯの量を特異的に検出するために容易に修正することができる。
【００２０】
さらに詳細に記さなくとも、当業者であれば、上記の開示および下記の記載に基づいて、本発明を完全に利用することができると考えられる。以下の実施例は単に当業者が本発明をどのように実施するかを例示したに過ぎないものと解釈されるべきで、いかなる意味でも開示の他の部分を限定するものではない。本明細書中で引用したすべての文献を参照により本明細書に組み入れる。
【００２１】
【実施例】
以下の材料および方法を用いて、キトサンおよびその誘導体のＮＯ-阻害活性が見出された。
細胞培養：  NIH/3T3（マウス胚線維芽細胞、CCRC 60008）およびRAW264.7（マウス単球/マクロファージ、CCRC 60001）細胞系を、Culture Collection and Research Center(CCRC), Taiwanから入手した。両方の細胞系を、1.5g/L NaHCO3を含み、10%ウシ胎児血清(Hyclone, Logan, UT)を補ったDulbeccoの修正必須培地(DMEM、GIBCO BRL、Rockville、MD)中、37℃の5% CO2中でインキュベートして培養した。細胞培養物を、蛍光染色剤Hoechst 33258を用いてマイコプラズマの混入について試験した(Hayら、ATCC Quality Control Methods for Cell Lines, American Type Culture Collection, Manassas, VA, 1992, pp23-33)。本実施例に記載されたすべての培養物にはマイコプラズマが混入していなかった。
コラーゲン/キチン被覆ウェル  二つの混合物を調製した。Ｉ型コラーゲン（ラットの尾、Sigma, St.Louis, MO)の混合物を、0.1N酢酸に溶解させて、1mg/mlのコラーゲン溶液を作った。キチンを0.1N酢酸に加えて1mg/mlの混合物を作り、この混合物をLabsonic Uソニケーター(Braun Biotech International, Germany)を用いて3分間音波処理した。121℃で15分間加圧滅菌すると、キチン混合物は細かいワイヤー(Wires)のスラリーになった。マイクロタイター組織培養プレート(96-ウェル）をDulbeccoのCa2+およびMg2+を除いたリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS、GIBCO BRL)ですすいだ。次いで、５μlのコラーゲン溶液または異なる量のキチン混合物をそれぞれのウェルに加えた。次に、プレートをラミナーフローフード(laminar flow hood)中で空気乾燥させ、4℃で１週間まで保存した。
【００２２】
細胞毒性試験：  キチンの細胞毒性の実験のために、細胞を、異なる量のキチンまたはコラーゲンであらかじめ被覆した96-ウェル組織培養プレート中で、2000細胞/ウェルの密度で48時間インキュベートして継代培養した。キトサンの細胞毒性の実験のために、被覆した96-ウェル組織培養プレート中で細胞を一晩インキュベートして継代培養した。翌日、培地を捨てて、異なる量のキトサンを含む新鮮な培地と入れ替えた。次いで、培養物をさらに48時間インキュベートした。細胞毒性を、臭化3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム染料(MTT; Merck Co., Germany)を用い、Mosmann, J.Immunol. Methods 65:55-63, 1983に記載される方法に従って測定した。
【００２３】
亜硝酸の検出によるＮＯの生産の測定：  Griess試薬および標準として亜硝酸ナトリウムを用いて培地中の亜硝酸(NO2-)の蓄積を測定することによって酸化窒素(ＮＯ)の生産を間接的に定量した(Greenら、Anal. Biochem. 126:131-138, 1982；およびIgnarroら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8103-8107, 1993)。亜硝酸のアッセイのために、RAW264.7細胞を、被覆した96-ウェル組織培養プレート中、1×105細胞/ウェルで24時間インキュベートして継代培養した。培地を、100U/mのインターフェロン-γ(IFN-γ、組換えマウス；GIBCO BRL)および100ng/mlのリポ多糖(LPS、大腸菌(Escherichia coli)抗原型O128:B12; Sigma)を含み、フェノールレッドおよび血清を含まないDMEMに変えた。次にサンプルをRolloら、J. Leukoc. Biol. 60:397-404, 1996に記載される方法で試験した。
【００２４】
ＮＯの生産に対するキチンの効果を測定するために、細胞を直接キチンで被覆した96-ウェル組織培養プレートで継代培養した。一晩インキュベートした後、細胞はキチンで被覆したウェルの底に付着するようになった。培地を除いて、上記のようにIFN-γおよびLPSを補った培地に入れ替えた。48時間インキュベートした後に、上記のRolloらの方法に従って、50mlの培養上清を、同量の60mMスルファニルアミド(Sigma)を3N HClに溶かしたものおよび4mM N-1-ナフチルエチレンジアミン(Sigma)と順次混合した後、室温で5分間振とうした。亜硝酸の濃度を、マイクロプレートリーダー(MRX, Dynex Technologies, Inc., VA)を用いてサンプルの540nmでの吸光度を読みとることによって測定した。
【００２５】
他の化学物質：  キチン(分子量約450kDa)およびキトサン(分子量約150kDa、95%脱アセチル化）を、Sun-Chiu Chemical Co., Taiwanより入手した。グルコサミンおよびN-セチルグルコサミンを、Sigma Chemical Co.より購入した。キトビオース(chitobiose)(2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(2-アセトアミド-2-デオキシ-b-D-グルコピラノシル)-D-グルコピラノース)、キトトリオース、キトテトラオース、キトペントース、およびキトヘキソースを、Calbiochem Co.(La Jolla, CA)より購入した。
【００２６】
キチンおよびキトサンに関連していると考えられる細胞毒性を、マウス胚線維芽細胞NIH/3T3細胞およびマウス単球-マクロファージRAW264.7細胞の両方について評価した。異なる容量のキチンスラリー溶液を96-ウェル組織培養プレートに加えて空気乾燥した後、細胞を植えてそこに付着させた。48時間インキュベートした後、MTT染料を用いて細胞の成長をアッセイした。ウェルに1mg/mlのキチン混合物を1〜2μl加えた場合、キチンはRAW264.7の増殖を増加させた。NIH/3T3細胞の増殖はウェルに1μlを加えたときに増加した。それぞれの細胞型について、これらの投与量以上では、キチンは用量（ウェルあたり20μlまで加えた）に依存して細胞の増殖を阻害した。しかし、5μl/ウェルの用量でも、細胞の増殖は約10%減少したに過ぎず、これによって、下で用いられた実験条件では細胞の増殖は実質的に阻害されないことが示された。
【００２７】
キトサンは、培地中のキトサン濃度200μg/mlまでの用量では、NIH/3T3細胞に測定できる細胞毒性を示さなかった。低濃度のキトサン(0.32μg/ml)はRAW264.7細胞の増殖を促進するが、濃度8μg/ml以上のキトサンはRAW264.7細胞の増殖をわずかに阻害することも観察された。
【００２８】
マクロファージRAW264.7細胞は、IFN-γまたはLPSによってＮＯの生産を促進される(Rolloら、前掲）。けれども、キトサンは、IFN-γおよびLPSによって活性化されたRAW264.7細胞のＮＯの生産（亜硝酸として測定）を、200μg/mlまで用量に依存して抑制した。最も高い投与量(200μg/ml)において、ＮＯの生産は約85%減少した。同様に、5μl/ウェルのキチンを補った被覆組織培養プレート上で培養した場合、活性化したRAW264.7細胞のＮＯの生産は約52%減少した。ＮＯの阻害の結果を下の表１にまとめた。
【００２９】
【表１】
0004709343.tif 000002
【００３０】
表１からわかるように、コラーゲンで被覆したウェルは活性化したRAW264.7細胞のＮＯの生産に際だった影響を与えなかったのに対して、キチンおよび/またはキトサンはＮＯの生産を著しく減少させた。
【００３１】
キチンの誘導体またはキチンおよびキトサンのモノマーもまたＮＯの生産を減少させるかどうかを試験するために、活性化したRAW264.7細胞を、N-アセチルグルコサミン(NAGA；キチンポリマーの単量体単位）、グルコサミン（キトサンの単量体単位）、およびキチンのオリゴ糖誘導体の存在下で培養した。結果を下記の表２にまとめた。
【００３２】
【表２】
0004709343.tif 000003
【００３３】
表２からわかるように、キチンおよびキトサンモノマー、ならびにキチンの短い（1-3残基の）オリゴ糖誘導体は、活性化したRAW264.7細胞のＮＯの生産に実質的に影響を与えなかった。けれども、より長いオリゴ糖誘導体（キトペントースおよびキトヘキソース）は、ＮＯの生産を実質的に減少させ、キトヘキソースはキトペントースよりも一層強い阻害剤であった。グルコサミン、NAGA、およびすべての試験したキチンのオリゴ糖誘導体は上記の細胞毒性試験法を用いて測定したところ、RAW264.7細胞に対して細胞毒性を示さなかったことを記載しておく。
【００３４】
（その他の実施の形態）
本発明について、その詳細な説明と共に記載してきたが、上記の記載は例示を目的とするものであって、特許請求の範囲によって定義される発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、および変更は本発明の範囲に含まれる。