(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む、作動可能に連結された所望のヌクレオチド配列の発現を駆動することのできるＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号２に示すヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号３に示すヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号４に示すヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４のいずれかの完全長ヌクレオチド配列に少なくとも８０％配列同一性を有し、作動可能に連結された所望のヌクレオチド配列の発現を駆動することのできる、ＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４のいずれかの完全長ヌクレオチド配列に少なくとも９０％配列同一性を有し、作動可能に連結された所望のヌクレオチド配列の発現を駆動することのできる、ＤＮＡ。
【請求項７】
配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４のいずれかの完全長ヌクレオチド配列に少なくとも９５％配列同一性を有し、作動可能に連結された所望のヌクレオチド配列の発現を駆動することのできる、ＤＮＡ。
【請求項８】
配列番号１９に示すヌクレオチド配列を含む、請求項５ないし７のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項９】
配列番号２０に示すヌクレオチド配列を含む、請求項５ないし７のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
ケストルムイエローリーフカーリングウイルスから単離された完全長転写プロモーター領域を含む組換え体ＤＮＡ分子であって、当該プロモーター領域は配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む、組換え体ＤＮＡ分子。
【請求項１１】
所望のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、請求項１ないし９のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ分子。
【請求項１２】
所望のヌクレオチド配列がコード配列を含む、請求項１１に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
【請求項１３】
コード配列が望ましい表現型形質をコードする、請求項１２に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
【請求項１４】
コード配列が、当該コード配列で形質転換された細胞に陽性選択的優位性を付与するタンパク質をコードする、請求項１３に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
【請求項１５】
コード配列が、化合物を代謝することのできるものからなる当該コード配列で形質転換された細胞に代謝優位性を付与するタンパク質をコードする、請求項１３又は１４に記載の組換え体ＤＮＡ分子であって、当該化合物が、マンノース又はキシロースまたはそれらの誘導体又は前駆体、又はタンパク質の基質であるか、または当該コード配列で形質転換された細胞によって、そのような基質に代謝されることのできる、組換え体ＤＮＡ分子。
【請求項１６】
コード配列が、キシロイソメラーゼ、ホスホマンノ−イソメラーゼ、マンノース−６−フォスフェートイソメラーゼ、マンノース−１−フォスフェートイソメラーゼ、フォスフォマンノムターゼ、マンノースエピメラーゼ、マンノース又はキシロースフォスファターゼ、マンノース−６−フォスファターゼ、マンノース−１−フォスファターゼ及びマンノース又はキシロースパーミアーゼからなる群より選択される酵素をコードする、請求項１５に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
【請求項１７】
コード配列がフォスフォマンノイソメラーゼをコードする、請求項１６に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
【請求項１８】
コード領域が非翻訳である、請求項１２に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
【請求項１９】
非翻訳コード領域がウイルス遺伝子由来である、請求項１８に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
【請求項２０】
ウイルス遺伝子がＴＳＷＶ、特にＴＳＷＶ  ＮＰ遺伝子に由来する、請求項１９に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
【請求項２１】
コード配列がアンチセンス方向である、請求項１２に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
【請求項２２】
請求項１ないし９のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項１０ないし２１のいずれかに記載の組換え体ＤＮＡ分子を含む、ＤＮＡ発現ベクター。
【請求項２３】
所望のヌクレオチド配列に作動可能に連結された請求項１ないし９のいずれかに記載の第１のＤＮＡ、及び所望のヌクレオチド配列に作動可能に連結された請求項１ないし９のいずれかに記載の第２のＤＮＡを含む、ＤＮＡ発現ベクター。
【請求項２４】
ウイルスゲノムの発現を変化させることのできる、請求項２３に記載のＤＮＡ発現ベクター。
【請求項２５】
当該ウイルスゲノムまたはその一部のセンスＲＮＡフラグメントを細胞で発現することのできる第１のＤＮＡ、及び当該ウイルスゲノムまたはその一部のアンチセンスＲＮＡフラグメントを細胞で発現することのできる第２のＤＮＡを含む請求項２４に記載のＤＮＡ発現ベクターであって、当該センスＲＮＡフラグメント及び当該アンチセンスＲＮＡフラグメントが二本鎖ＲＮＡを形成することのできる、ベクター。
【請求項２６】
当該ウイルスが、トスポウイルス、ポティウイルス、ポテックスウイルス、トバモウイルス、ルテオウイルス、ククモウイルス、ブロモウイルス、クロステオルウイルス（closteorviruses)、トムブスウイルス及びフロウイルスからなる群より選択される、請求項２５に記載のＤＮＡ発現ベクター。
【請求項２７】
ウイルスコートタンパク質遺伝子、ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子、ウイルスレプリカーゼ遺伝子、またはウイルスムーブメントタンパク質遺伝子又はそれらの一部に由来するヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載のＤＮＡ発現ベクター。
【請求項２８】
当該ＤＮＡ配列が、トマト黄化えそ病ウイルス（ＴＳＷＶ）に由来する、請求項２７に記載のＤＮＡ発現ベクター。
【請求項２９】
当該ＤＮＡがヌクレオキャプシド遺伝子に由来する、請求項２８に記載のＤＮＡ発現ベクター。
【請求項３０】
請求項１ないし９のいずれかに記載のＤＮＡ、又は請求項１０ないし２１のいずれかに記載の組換え体ＤＮＡ分子、又は請求項２２ないし２９のいずれかに記載のＤＮＡ発現ベクターで、安定的に形質転換された宿主細胞。
【請求項３１】
宿主細胞が植物細胞である、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
請求項１ないし９のいずれかに記載のＤＮＡ、又は請求項１０ないし２１のいずれかに記載の組換え体ＤＮＡ分子、又は請求項２２ないし２９のいずれかに記載のＤＮＡ発現ベクターで、安定的に形質転換された植物及びその後代。
【請求項３３】
当該植物が、トウモロコシ、コムギ、ソルガム、ライムギ、エンバク、シバクサ、イネ、オオムギ、ダイズ、ワタ、タバコ、テンサイ及びナタネからなる群より選択される、請求項３２に記載の植物。
【請求項３４】
所望のヌクレオチド配列を発現させるための、請求項１ないし９のいずれかに記載のＤＮＡの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、植物の関連ヌクレオチド配列（associated nucleotide sequence）の転写のプロモーターとして機能する新規ＤＮＡ配列に関する。より具体的には、本発明は、所望の関連ヌクレオチド配列に構成的発現を付与する新規プロモーターに関する。
【０００２】
農業の分野では、人間の必要に従って植物を修飾する連続的な願望が存在する。これを達成するための一つの方法は、現代の遺伝子工学を使用することによる。例えば、植物に所望の遺伝子を導入することによって、該植物を特異的に修飾し、望ましい表現型形質を発現させる。このために、植物をプロモーター領域、コード領域及び終結領域を含むヘテロロガス遺伝子で最も普通に形質転換する。植物での発現のための、ヘテロロガス遺伝子を遺伝的に改変するとき、プロモーターの選択は重要なファクターである。特定の刺激に応答した、又は特定の細胞又は組織に限定されてのみ、ある種の遺伝子を発現させることが望ましい一方、別の遺伝子は構成的に、すなわちすべての時に植物にわたり、そしてほとんどの組織及び器官で発現させることがより望ましくあり得る。
【０００３】
過去に、カリフラワーモザイクウイルスからの３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）が、植物でのヘテロロガス遺伝子の構成的発現のために、広く使用された。しかし、別のプロモーターを使用することが望まれる機会が存在する。従って、本発明の主な目的は、植物での所望のヌクレオチド配列の発現のためのそのような代替的なプロモーターを提供することである。本発明はまた、本発明のプロモーターを含む、組換え体ＤＮＡ分子、発現ベクター及びトランスジェニック植物を提供する。
【０００４】
本発明はこうして：
関連ヌクレオチド配列の発現を駆動することのできるＤＮＡ配列であって、ここで、当該ＤＮＡ配列がケストルムイエローリーフカーリングウイルス（Cestrum yellow leaf curling virus, CmYLCV)のゲノムから得られ得るもの、を提供する。ＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーターから得られ得る、そして配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ配列が好ましい。
【０００５】
特に、ＤＮＡ配列を提供し、ここで
・当該ＤＮＡ配列は、配列番号２に示すヌクレオチド配列を含む
・当該ＤＮＡ配列は、配列番号３に示すヌクレオチド配列を含む
・当該ＤＮＡ配列は、配列番号４に示すヌクレオチド配列を含む
・当該ＤＮＡ配列は、配列番号５に示すヌクレオチド配列を含む
・当該ＤＮＡ配列は、配列番号６に示すヌクレオチド配列を含む
・当該ＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６のいずれかに、ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、とくにここで、前記のＤＮＡ配列は配列番号１９又は配列番号２０に示すヌクレオチド配列を含む。
【０００６】
本発明はさらに、配列番号１の、少なくとも５０ｎｔ、好ましくは約４００塩基と約６５０塩基の間の、より好ましくは約２００塩基と約４００塩基の間の、そして最も好ましくは約３５０塩基の長さの連続的範囲（consecutive stretch）を含む、ＤＮＡ配列を提供し、ここで当該ＤＮＡ配列は関連ヌクレオチド配列の発現を駆動することができる。
【０００７】
本発明の特定の実施態様では、少なくとも５０ｎｔの、好ましくは約４００塩基と約６５０塩基の間の、より好ましくは約２００塩基と約４００塩基の間の、そして最も好ましくは約３５０塩基の長さの、当該連続的範囲は、配列番号１の少なくとも５０ｎｔの、好ましくは約４００塩基と約６５０塩基の間の、より好ましくは約２００塩基と約４００塩基の間の、そして最も好ましくは約３５０塩基の長さの、対応する連続的範囲と、少なくとも７５％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、そして最も好ましくは、９５％配列同一性を有する。
【０００８】
本発明はさらに、ケストルムイエローリーフカーリングウイルスから単離される完全長転写物プロモーター領域を含む組換え体ＤＮＡ分子を提供する。加えて、本発明は、所望のヌクレオチド配列に作動可能に連結された本発明に従うＤＮＡ配列を含む、組換え体ＤＮＡ分子及びＤＮＡ発現カセットを提供する。本発明はまた、当該組換え体ＤＮＡ及び発現カセットをそれぞれ含む、ＤＮＡ発現ベクターを提供する。
【０００９】
特に、組換え体ＤＮＡ分子及びＤＮＡ発現カセットを提供し、ここで、所望のヌクレオチド配列はコード配列を含み、特にここで、
・該コード配列は、望まれる表現型形質をコードする
・該コード配列は、選択又はスクリーニングマーカー遺伝子をコードする
・該コード配列は、抗生物質抵抗性、ウイルス抵抗性、害虫抵抗性、病害抵抗性、又は他の有害生物に対する抵抗性、除草剤耐性、高栄養価、生産加工での高成績又は再生可能性の変化を付与するタンパク質をコードする
【００１０】
・該コード配列は、当該コード配列で形質転換された細胞に正の選択的優位性を付与するタンパク質をコードする
・該コード配列は、当該コード配列で形質転換された細胞に代謝優位性を付与するタンパク質であって、化合物を代謝することのできるものからなるものをコードし、ここで、当該化合物はマンノース又はキシロース又はそれらの誘導体又は前駆物質、又はタンパク質の基質であり、又は当該コード配列で形質転換された細胞によって、そのような基質に代謝されることができる
【００１１】
・当該コード配列は、キシロイソメラーゼ、フォスフォマンノ−イソメラーゼ、マンノース−６−フォスフェートイソメラーゼ、マンノース−１−フォスフェートイソメラーゼ、フォスフォマンノ−ムターゼ、マンノースエピメラーゼ、マンノース又はキシロースフォスファターゼ、マンノース−６−フォスファターゼ、マンノース−１−フォスファターゼ及びマンノース又はキシロースパーミアーゼをコードする
・該コード配列は、フォスフォマンノイソメラーゼをコードする
・該コード領域は非翻訳である
・該非翻訳コード領域は、ウイルス遺伝子由来の、特にＴＳＭＶ由来、より特にＴＳＷＶ  ＮＰ遺伝子由来である
・該コード配列は、商業的に有益な酵素、又は植物での代謝物をコードする
・該コード配列は、アンチセンス方向である。
【００１２】
本発明はまた、前記のＤＮＡ配列又は組換え体ＤＮＡ分子を含むＤＮＡ発現ベクターを提供する。本発明の特定の実施態様では、当該ＤＮＡ発現ベクターはｐＮＯＶ２８１９又はｐＮＯＶ２８１９である。さらに所望のヌクレオチド配列に作動可能に連結された本発明に従う第１のＤＮＡ配列、及び所望のヌクレオチド配列に作動可能に連結された本発明に従う第２のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ発現ベクターを提供する。本発明の特定の実施態様では、前記のＤＮＡ発現ベクターはウイルスゲノムの発現を変化させることができる。
【００１３】
なおより特定の実施態様では、前記のＤＮＡ発現ベクターは、当該ウイルスゲノムのセンスＲＮＡフラグメント又はその部分を細胞で発現することのできる第１のＤＮＡ配列及び当該ウイルスゲノムのアンチセンスＲＮＡフラグメント又はその部分を細胞で発現することのできる第２のＤＮＡ配列を含み、ここで、当該センスＲＮＡフラグメント及び当該アンチセンスＲＮＡフラグメントは二本鎖ＲＮＡを形成することができる。
【００１４】
前記のように発現ベクターを提供し、ここで
・当該ウイルスは、トスポウイルス、ポティウイルス、ポテックスウイルス、トバモウイルス、ルテオウイルス、ククモウイルス、ブロモウイルス、クロステオルウイルス（closteorviruses）、トンブスウイルス及びフロウイルスからなる群より選択される
・当該ＤＮＡ配列は、ウイルスコートタンパク質遺伝子、ウイルスヌクレオキャプシタンパク質遺伝子、ウイルスレプリカーゼ遺伝子、又はウイルスムーブメントタンパク質遺伝子又はそれらの部分から由来するヌクレオチド配列を含む
・当該ＤＮＡ配列は、トマト黄化えそ病ウイルス（ＴＳＷＶ）に由来する
・当該ＤＮＡはヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子に由来する
【００１５】
本発明はさらに、
本発明に従う、ＤＮＡ配列、組換え体ＤＮＡ分子又はＤＮＡ発現ベクターで安定的に形質転換された宿主細胞を提供する。特に、ここで
・該宿主細胞は細菌である
・該宿主細胞は植物細胞である
・該宿主細胞は、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、カンショ、スイートコーン、インゲンマメ、エンドウマメ、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロコッリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ペッパー、セルリー、カボチャ（squash,pumpkin)、アサ、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、プラム、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、ダイズ、トマト、ソルガム、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、ナタネ、クローバー、タバコ、ニンジン、ワタ、アルファルファ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、Arabidopsis thaliana、及び樹木植物、例えば、針葉樹、落葉樹、特にイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、キャベツ、カリフラワー、ペッパー、スカッシュ、メロン、ダイズ、トマト、テンサイ、ヒマワリ、又はワタ、イネ、トウモロコシ、コムギ、Sorghum bicolor、オーチャードグラス、テンサイ、及びダイズ細胞からなる群より選択される。
【００１６】
・該宿主細胞は双子葉植物からの植物細胞である
・該宿主細胞はダイズ、ワタ、タバコ、テンサイ及びナタネからなる群より選択される双子葉植物細胞である
・該宿主細胞は、単子葉植物からの植物細胞である
・該宿主細胞は、トウモロコシ、コムギ、ソルガム、ライムギ、エンバク、シバクサ(turf grass)、イネ、及びオオムギからなる群より選択される単子葉植物からの植物細胞である。
【００１７】
加えて、本発明に従う、ＤＮＡ配列、組換え体ＤＮＡ分子又はＤＮＡ発現ベクターで安定的に形質転換された、植物及び種子を含むその後代を提供する。特にここで、
・該植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、カンショ、スイートコーン、インゲンマメ、エンドウマメ、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ペッパー、セルリー、カボチャ（squiash,pumpkin)、アサ、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、プラム、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、ダイズ、トマト、ソルガム、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、ナタネ、クローバー、タバコ、ニンジン、ワタ、アルファルファ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、Arabidopsis thaliana、及び樹木植物、例えば、針葉樹、落葉樹、特にイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、キャベツ、カリフラワー、ペッパー、スカッシュ、メロン、ダイズ、トマト、テンサイ、ヒマワリ、又はワタ、イネ、トウモロコシ、コムギ、Sorghum bicolor、オーチャードグラス、テンサイ、及びダイズ細胞からなる群より選択される。
【００１８】
本発明はさらに、
・所望のヌクレオチド配列を発現する本発明に従うＤＮＡ配列の使用
・本発明に従うＤＮＡ配列を生産する方法であって、ここで該ＤＮＡがポリメラーゼ連鎖反応によって生産される、方法であって、ここで、使用される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが配列番号１の１５、１８、２０、２２、２４又はより多い塩基対の連続範囲を示すものを含むもの
を開示する。
【００１９】
明細書及び請求の範囲の明確そして矛盾のない理解を確保するために、以下の定義を提供する：
ＣｍＹＬＣＶ：ケストルムイエローリーフカーリングウイルス
ＤＮＡシャッフリング：ＤＮＡシャッフリングは、急速、容易、そして効率的に、好ましくは無作為に、ＤＮＡ分子に、再編制を導入するための方法、又は２又は３以上のＤＮＡ分子の間に、好ましくは無作為にＤＮＡ配列の交換を生じる、方法である。ＤＮＡシャッフリグから得られるＤＮＡ分子は、少なくとも１テンプレートＤＮＡ分子に由来する天然に存在しないＤＮＡ分子である、シャッフルされたＤＮＡ分子である。
【００２０】
発現：は、植物中で外生遺伝子又は導入遺伝子の転写及び／又は翻訳を意味する。アンチセンス構築物の場合、例えば、発現は、アンチセンスＤＮＡの転写のみを意味し得る。
機能的に同等な配列：は、ＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーター又はその部分に実質的に類似するプロモーター活性を有する、そしてストリンジェントハイブリダイゼーション条件で当該プロモーター配列とハイブリダイズする、ＤＮＡ配列を意味する。
【００２１】
遺伝子：は、コード配列及び関連調節配列であって、ここで該コード配列がＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、センスＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡに転写されるものを意味する。調節配列の例は、プロモーター配列、５’及び３’非翻訳配列及び終結配列である。存在し得るさらなるエレメント、例えば、イントロンが存在し得る。
【００２２】
所望の遺伝子：は植物に移入されたとき、外植物に望まれる特性、例えば、抗生物質抵抗性、ウイルス抵抗性、害虫抵抗性、病害抵抗性、又は他の有害生物への抵抗性、除草剤耐性、高栄養価、産業加工での高成績又は変化した再生可能性を付与する任意の遺伝子を意味する。「所望の遺伝子」はまた、該植物での商業的に有益な酵素又は代謝物の生産のために植物に移入されるものであり得る。
【００２３】
ここで使用する「ヘテロロガス」は、異なる天然又は合成起源を意味する。例えば宿主細胞は、非翻訳宿主細胞中に存在しない核酸配列で形質転換されているならば、その核酸配列は、その宿主細胞についてヘテロロガスであるという。形質転換核酸は、ヘテロロガスプロモーター、ヘテロロガスコード配列、又はヘテロロガス終結配列を含み得る。又は、該形質転換核酸は、完全にヘテロロガスであり得、又はヘトロロガス及び外生核酸配列の任意の可能な組み合わせを含み得る。
【００２４】
リーダー領域：転写開始部位及び翻訳開始部位の間の遺伝子の領域。
マーカー遺伝子：選択又はスクリーニング特性をコードする遺伝子を意味する。作動可能に連結され／と関連し：調節ＤＮＡ配列は、該調節ＤＮＡ配列が該コードＤＮＡ配列の発現に影響を及ぼすように、該２配列が位置するならば、ＲＮＡ又はタンパク質をコードするＤＮＡ配列と「作動可能に連結され」又は「と関連し」ているというものとする。
【００２５】
植物：は任意の植物、特に種子植物を意味する。
植物細胞：植物の構造及び生理学的単位であって、プロトプラスト及び細胞壁を含むもの。植物細胞は、単離単一細胞又は培養細胞の形態で、又はより高度に組織化された単位、例えば、植物組織又は植物器官の部分としての形態であり得る。
植物材料：は、葉、茎、根、花又は花部分、果実、花粉、花粉管、卵、胚のう、卵細胞、胞子体、胚、種子、挿し木、細胞又は組織培養物、又は任意の他の植物の部分又は産物を意味する。
【００２６】
プロモーター：は関連ＤＮＡ配列の転写を開始させるＤＮＡ配列を意味する。プロモーター領域は、また遺伝子発現のレギュレーターとして作用するエレメント、例えば、アクチベーター、エンハンサー、及び／又はレプレッサーを含み得、そして５’非翻訳リーダー配列の全部又は一部を含み得る。
組換え体ＤＮＡ分子：組換えＤＮＡ技術を使用してともに結合されているＤＮＡ配列の組み合わせ。
【００２７】
組換えＤＮＡ技術：記載されるようなＤＮＡ配列をともに結合するため使用される手法、例えば、Sambrook et al., 1989, COld Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載される。
スクリーニングマーカー遺伝子：発現が選択的優位性を形質転換細胞に付与しないが、発現が形質転換細胞を、非形質転換細胞から表現型的に明瞭ならしめる遺伝子を意味する。
【００２８】
選択マーカー遺伝子：は植物細胞での発現が、細胞に選択的優位性を与える遺伝子を意味する。選択マーカー遺伝子で形質転換された細胞によって保有される選択的優位性は、非形質転換細胞の成長と比較して、負の選択剤、例えば、抗生物質又は除草剤の存在下で、成長する能力のためであり得る。非形質転換細胞と比較して、形質転換細胞によって保有される選択的優位性はまた、養分、成長因子又はエネルギー源として添加された化合物を利用する、増強された、又は新規の能力のためであり得る。選択マーカー遺伝子はまた、選択剤の存在下での植物細胞における発現が、選択剤の不存在下と比較して、形質転換植物細胞に正の影響及び非形質転換植物細胞に負の影響、例えば、成長について有し、こうして形質転換植物細胞に正の選択的優位性を与える、遺伝子又は遺伝子の組み合わせを意味する。
【００２９】
配列同一性：ダイナミックプログラミングアルゴリズムに基づくコンピュータープログラムを使用して決定される配列同一性のパーセンテージ。本発明の範囲内で好ましいコンピュータープログラムは、クエリーがタンパク質又はＤＮＡであるかにかかわらず、すべての利用可能な配列データベースを探索するために設計された、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool)サーチプログラムを含む。このサーチツールのバージョンＢＬＡＳＴ２．０（Gapped BLAST)は、インターネット（currently http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上で公衆に利用可能とされた。それは帰納的アルゴリズムを使用し、それは、グローバルアラインメントに対して、ローカルを探し、従って単離された領域のみに共有される、配列間の関連性を検出することができる。ＢＬＡＳＴサーチに割り当てられるスコアは、良く定義された統計的解釈を有する。当該プログラムを好ましくは、デフォルト値に対して、所望のパラメーターセットで稼動させる。
【００３０】
形質転換：は細胞への核酸の導入を意味する。特に、それは所望の生物のゲノムへのＤＮＡ分子の安定的組みこみを意味する。
ＴＳＷＶ：トマト黄化えそ病ウイルス。
【００３１】
本発明は、ケストルムイエローリーフカーリングウイルス（ＣｍＹＬＣＶ）のゲノムから得られ得るＤＮＡ配列に関する。所望の関連ヌクレオチド配列の発現を駆動することのできる、ＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーターから得られ得るＤＮＡ配列が好ましい。その機能的及び／又は構造的同等物を含むＤＮＡ配列はまた本発明に含まれる。本発明はこうして、関連ヌクレオチド配列の転写のプロモーターとして機能するＤＮＡ配列に関する。該プロモーター領域はまた、遺伝子発現のレギュレーター、例えば、アクチベーター、エンハンサー及び／又はレプレッサーとして作用するエレメントを含み得、そして転写されたｍＲＮＡの５’非翻訳リーダー配列を含み得る。
【００３２】
本発明の好ましい実施態様では、当該ＤＮＡ配列は、関連ヌクレオチド配列に構成的発現を付与する。構成的発現は、所望のヌクレオチド配列がすべての時間で、そしてほとんどの組織及び器官で発現されることを意味する。トランジエント発現アッセイでＧＵＳ又はＣＡＴレポーター遺伝子と組み合わせて試験されるとき、本発明に従うＤＮＡ配列は、ＧＵＳ又はＣＡＴレポーター遺伝子の発現の高いレベルを付与する。こうして、本発明に従うＤＮＡ配列は、好ましくはコード配列である、所望の関連ヌクレオチド配列の高レベル発現に有用である。当業者は、所望の関連コード配列がセンス又はアンチセンス方向で発現できることを知っている。さらに、所望のコード配列は、形質転換されるべき植物について、ヘテロロガス又はホモロガス起源であり得る。ホモロガスコード配列の場合、本発明に従うＤＮＡ配列は、当該配列の異所性（ectopic)発現に有用である。本発明の特定の実施態様では、本発明に従うＤＮＡ配列の制御下の所望のコード配列の発現は、コサプレッションと呼ばれるプロセスによって、それ自身の発現及び該遺伝子のオリジナルコピーのそれを抑圧する。
【００３３】
本発明のプロモーターはケストルムイエローリーフカーリングウイルス（ＣｍＹＬＣＶ）ゲノムＤＮＡから得ることができ、それは例えば、感染したCestrum parqui植物から単離できる。ＣｍＹＬＣＶ感染したCestrum parqui植物を葉のモザイク及びクリンクル葉奇形によって同定する。このＤＮＡを次いで配列決定及び分析する。データベースの配列との配列比較は、ＣｍＹＬＣＶの該ゲノム構成がカリモウイルスファミリーの他のメンバーのひとつと関連することを示す。ＣｍＹＬＣＶは８つのオープンリーディングフレームを含む。ＣｍＹＬＣＶ遺伝子産物の配列比較は、遺伝子Ｉ産物が細胞間移動（intracellular movements）に関係することを示す：遺伝子Ａは未知機能の小タンパク質をコードし、遺伝子Ｂはアリマキ伝達因子をコードする；遺伝子Ｃはビリオン関連タンパク質をコードし；遺伝子ＩＶは主要なキャプシドタンパク質であり；遺伝子Ｖは逆転写酵素をコードしそして遺伝子ＶＩは完全長転写物においてウイルス遺伝子の転写をトランスに活性化する。いわゆるＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーターが特に興味深い。
【００３４】
当業者は、ＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーターの種々の領域を本発明に従って使用できることを知っている。本発明の特定の実施態様は、ＣｍｐＤプロモーターと呼ばれる、配列番号１に示すＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーター領域である。この配列は、３５０ｂｐのＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーター及び３２０ｂｐのＣｍＹＬＣＶ完全長転写物５’非翻訳リーダー配列を含む。この配列を、ＣｍＹＬＣＶゲノムＤＮＡを配列決定することによって取得する。それぞれプロモーター及びリーダー配列は、データベース中の配列ヘの比較によって同定する。ＣｍｐＥと呼ばれる、配列番号１の変異体であって、ここで該ＣｍＹＬＣＶ完全長転写物５’非翻訳リーダー配列が、３２０ｂｐの長さであるのに代えて、３１８ｂｐであるものを配列番号１９に示す。
【００３５】
本発明のある好ましい実施態様は、ＣｍｐＣプロモーターと呼ばれる、配列番号２に示すＤＮＡ配列である。ＣｍｐＣプロモーターは、配列番号１に示す配列のフラグメントであり、そして配列番号１の塩基５ないし３５０に対応する、３４６ｂｐのＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーターを含む。このＤＮＡ配列は、ケストルムイエローリーフカーリングウイルスからの又はケストルムイエローリーフカーリングウイルス感染したCestrum parqui植物からのゲノムＤＮＡでフォワードプライマーＣｍｐ１（配列番号１３）及びリバースプライマーＣｍｐＣ２（配列番号１４）を使用してＰＣＲによって得られ得る。ＣｍｐＣプロモーターの推定ＴＡＴＡボックスは配列番号２の塩基３０８ないし塩基３１５に位置する。ＣｍｐＣプロモーターは少なくとも３つの推定エンハンサー領域を含む。ヌクレオチド配列ＣＡＡＴを有するエンハンサー領域１は、配列番号２の塩基２３２ないし塩基２３５に位置し、そしてヌクレオチド配列ＣＡＡＴをまた有するエンハンサー領域２は、配列番号２の塩基２４３ないし塩基２４６に位置する。エンハンサー領域３は配列番号２の塩基２４６ないし塩基２５３に位置し、そしてヌクレオチド配列ＴＧＡＣＧＴＡＡを有する。
【００３６】
本発明のさらなる好ましい実施態様は、ＣｍｓｐＳプロモーターと呼ばれる、配列番号３に示されるＤＮＡである。ＣｍｐＳプロモーターはまた、配列番号１に示される配列のフラグメントであり、そして配列番号２の３４６ｂｐと、ＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーターのリーダー領域からのプラス５４ｂｐを含む。該リーダー領域は、転写されるがタンパク質に翻訳されない、コード領域に先行するヌクレオチド配列である。当業者は、リーダー領域が、遺伝子発現における重要な機能を有する調節エレメントを含むことができることを知っている。ＣｍｐＳプロモーターは、ケストルムイエローリーフカーリングウイルスからの又はケストルムイエローリーフカーリングウイルス感染したCestrum parqui植物からのゲノムＤＮＡでフォワードプライマーＣｍｐ１（配列番号１３）及びリバースプライマーＣｍｐＣ２（配列番号１５）を使用してＰＣＲによって得られ得る。ＣｍｐＳプロモーターは、リーダー領域の少なくとも２つの推定エンハンサー領域を含む。エンハンサー領域４（ＧＡＧＡＧＡ）は、配列番号３の塩基３５４ないし塩基３５９に位置し、そしてエンハンサー領域５（ＧＡＧＡＧＡＧＡ）は配列番号３の塩基３６８ないし塩基３７５に位置する。
【００３７】
本発明のなおさらなる好ましい実施態様は、ＣｍｐＬプロモーターと呼ばれる、配列番号４に示す配列である。先行するプロモーターとして、ＣｍｐＬプロモーターは、配列番号１に示す配列のフラグメントであり、そして配列番号２の３４６ｂｐと、ＣｍＹＬＣＶ完全長転写物５’非翻訳リーダー配列の２８８ｂｐを含む。ＣｍｐＬプロモーターは、ケストルムイエローリーフカーリングウイルスからの又はケストルムイエローリーフカーリングウイルス感染したCestrum parqui植物からのゲノムＤＮＡでフォワードプライマーＣｍｐ１（配列番号１３）及びリバースプライマーＣｍｐＬ２（配列番号１６）を使用してＰＣＲによって得られ得る。ＣｍｐＦと呼ばれる、配列番号４の変異体であって、ここでＣｍＹＬＣＶ完全長転写物５’非翻訳リーダー配列が、２８８ｂｐ長の代わりに２８６ｂｐであるものは、配列番号２０に示される。
【００３８】
当業者は、配列番号１、２、３、４、１９及び２０に示すヌクレオチド配列が、ホモロガス又はヘテロガスヌクレオチド配列でそれらの５’−及び３’末端で伸長できることを知っている。例えば、配列番号１、２、３、４、１９及び２０の５’末端を、配列番号６に示すヌクレオチドの全部又は一部によって伸長させることができる。配列番号６は、配列番号２、３、４及び２０の上流に天然に見出され、そしてＣｍＹＬＣＶのＯＲＦ  ＶＩの一部（配列番号６の塩基１ないし塩基１００）並びにＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーターの一部（配列番号６の塩基１０１ないし塩基１０４）を含む。同様に、配列番号２、３、４、及び２０の３’末端を、配列番号４及び２０の３’末端に天然に見出されるヌクレオチド配列を表す、そしてＣｍＹＬＣＶ完全長転写物リーダー配列の一部を含む、配列番号５に示すヌクレオチドのすべて又は一部によって伸張させることができる。
【００３９】
前記の様に、本発明のＤＮＡ配列を、例えば、ケストルムイエローリーフカーリングウイルスからの又はケストルムイエローリーフカーリングウイルス感染したCestrum parqui植物からのゲノムＤＮＡでＰＣＲによって、取得することができる。又は、本発明のＤＮＡ配列を、配列特異的プライマーを使用して、本発明のＤＮＡ配列のホモログを含むカリモウイルスファミリーの任意の他のウイルスから取得することができる。当業者は、配列番号１ないし配列番号６及び配列番号１９及び２０に示すヌクレオチド配列に基づいて、所望の任意のプライマー組み合わせを選択し、本発明に従って使用することのできる、種々の長さのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅できることを知っている。本発明はこうして、本発明に従って機能する、すなわち関連ヌクレオチド配列の発現を付与することができる、ＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーターに由来するフラグメントを含む。
【００４０】
これは、そのようなプロモーターフラグメントを生成し、それらを選択又はスクリーニングマーカー遺伝子に融合し、そして融合構築物をプロモーター活性の維持についてアッセイすることによって試験することができる。そのようなアッセイは当業者の通常の技術の範囲内である。本発明の好ましいＤＮＡフラグメントは、少なくとも約５０塩基の、好ましくは約４００塩基及び約６５０塩基の間の、より好ましくは約２００塩基及び約４００塩基の間の、そして最も好ましくは約３５０塩基の長さのものである。
【００４１】
当業者にとって、１又は２以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失、及び／又は置換を配列番号１、２、３、４、５、及び６又はその配列情報に由来するより長い又はより短いフラグメントのＤＮＡ配列に導入することができることは明白である。加えて、本発明の非修飾又は修飾ヌクレオチド配列を、本発明の配列をシャッフリングすることによって変異させることができる。本発明に従う変異体ＤＮＡ配列の機能について試験するために、所望の配列を、選択又はスクリーニングマーカー遺伝子に作動可能に連結し、そしてマーカー遺伝子の発現をプロトプラストでのトランジエント発現アッセイで、又は安定的に形質転換された植物で、試験する。当業者は、関連ヌクレオチド配列の発現を駆動することができるＤＮＡ配列を、モジュラーウェー（modular way)で確立することを知っている。従って、より短いＤＮＡフラグメントからの発現レベルは、最も長いフラグメントからのもと異なり得、そして互いに異なり得る。例えば、ダウンレギュレーション上流エレメントの欠失は、関連ヌクレオチオ配列の発現レベルの増加につながり、一方、アップレギューレーションエレメントの欠失は、関連ヌクレオチド配列の発現レベルを減少させる。当業者はまた発達特異的又は組織特異的エレメントの欠失が、関連ヌクレオチド配列の時間的又は位置的に変化した発現プロファイルにつながることを知っている。
【００４２】
本発明のプロモーターの機能的同等物、すなわち、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６のいずれかとストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、例えば、配列番号１９及び配列番号２０に示す配列もまた、本発明に含まれる。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、０．１％ＳＤＳを含むダブル強度（２Ｘ）シトレートバッファー塩水（ＳＳＣ）中で６５℃、好ましくは６０℃及び最も好ましくは５５℃の温度で、次いで同じ温度の支持のリンスであるがより低いＳＳＣ濃度を有するバッファーでのリンスによって、実施される。そのようなより低い濃度のバッファーは典型的には、０．１％  ＳＤＳを含む１０分の１強度ＳＳＣ（０．１ＸＳＳＣ）、好ましくは０．１％  ＳＳＣを含む０．２ＸＳＳＣ、そして最も好ましくは０．１％  ＳＤＳを含む半分強度ＳＳＣ（０．５ＸＳＳＣ）である。実際に、他の生物からのＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーターの全部又は一部に対する機能的同等物を、所望の生物、特に他のカリモウイルスから単離したゲノムＤＮＡと、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１９又は配列番号２０のいずれかをハイブリダイズさせることによって見出すことができる。
【００４３】
当業者は、他の生物中の相同配列を同定するための当業者に知られている多くの方法が存在するから、そのような配列を見出すことをいかに進めるべきか知っている。そのような新しく同定されたＤＮＡ分子を次いで、配列決定し、そして該配列を配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１９、又は配列番号２０のいずれかと比較し、そしてプロモーター活性について試験することができる。少なくとも５０ヌクレオチドの長さに渡る配列番号１、２、３、４、５又は６のいずれかのヌクレオチド配列に少なくとも７５％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、そして最も好ましくは９５％配列同一性を有するＤＮＡ分子は、本発明の範囲内である。配列同一性のパーセンテージはダイナミックプログラミングアルゴリズムに基づくコンピュータープログラムを使用して決定する。本発明の範囲内で好ましいコンピュータープログラムは、クエリーがタンパク質であるかＤＮＡであるかにかかわらず、利用可能な配列データベースのすべてを探索するために設計されたＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool)サーチプログラムを含む。このサーチツールのバージョンＢＬＡＳＴ２．０（Gapped BLAST)は、インターネット上で公衆に利用可能とされた（currently http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。それはグラーバルアラインメントに対して、ローカルを探す機能的アルゴリズムを使用し、従って単離領域のみを共有する配列間の関連性を検出することができる。ＢＬＡＳＴサーチで割り当てられるスコアーは、良く定義された統計的解釈を有する。当該プログラムは、好ましくはデフォルト値に対する至適パラメーターセットで稼動させる。
【００４４】
本発明のさらなる目的は、所望のヌクレオチド配列に作動可能に連結された本発明に従うＤＮＡ配列を含む組換え体ＤＮＡ分子を提供することである。所望のヌクレオチド配列は、例えば、タンパク質に転写されない、リボゾームＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、又は任意の他の型のＲＮＡをコードすることができる。本発明のさらなる好ましい実施態様では、所望のヌクレオチド配列は、タンパク質産物に翻訳される。プロモーター配列と関連しているヌクレオチド配列は、形質転換されるべき植物に関してホモロガス又はヘテロガス起源のものであり得る。該配列はまた、完全に又は部分的に合成であり得る。起源にかかわらず、関連ＤＮＡ配列は、それが連結されているプロモーターの発現特性に従って、形質転換植物中で発現する。該プロモーター配列と関連しているホモロガスヌクレオチド配列の場合では、本発明に従うプロモーターは、当該ホモロガス配列の異所性（Ectopic)発現に有用である。異所性発現は、プロモーター配列と関連しているヌクレオチド配列が、ここで当該配列がそれ自身のプロモーターの制御下で発現され得ない、組織及び器官及び／又は時間で発現されることを意味する。本発明の特定の実施態様では、プロモーター配列と関連しているヌクレオチド配列の発現は、コサプレッションといわれるプロセスによって、それ自身の発現及び遺伝子の本来のコピーのそれを抑圧する。
【００４５】
本発明の好ましい実施態様では、関連ヌクレオチド配列は、植物全体ですべての時間及びほとんどの組織及び器官で発現が望まれるタンパク質をコードし得る。そのようなヌクレオチド配列は、好ましくは、望まれる表現型的形質をそれで形質転換される植物に付与するタンパク質を好ましくはコードする。例は、抗生物質抵抗性、ウイルス抵抗性、害虫抵抗性、病害抵抗性、又は他の有害生物に対する抵抗性、除草剤耐性、高栄養価、産業加工の高い成績又は変化した再生可能性を付与するタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。関連ヌクレオチド配列はまた、植物での商業的に有益な酵素又は代謝物の生産のために、植物に移入されるものであり得る。選択又はスクリーニングマーカー遺伝子、すなわち選択又はスクリーニング形質をコードするコード領域に作動可能に連結される本発明のＤＮＡ配列を含む遺伝子はまた、本発明に含まれる。
【００４６】
選択又はスクリーニングマーカー遺伝子の例は、以下に記載する。ある種の標的種のために、種々の抗生物質又は除草剤選択マーカーが好ましくあり得る。形質転換にルーチンに使用する選択マーカーは、カナマイシン、パラモマイシン、ゲンチシン及び関連抗生物質への抵抗性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子（Vieira and Messing, 1982, Gene 19:259-268; Bevan et al., 1983, Nature 304:184-187)アミノグルコシド３’−アデニリルトランスフェラーゼをコードする、そしてストレプトマイシン又はスペクチノマイシンへの抵抗性を付与する、細菌ａａｄＡ遺伝子(Goldschmidt-Clermont, 1991, Nucl. Acids Res.19:4083-4089)、抗生物質ハイグロマイシンへの抵抗性を付与するｈｐｈ遺伝子（Blochlinger and Diffelmann, 1984, Mol. Cell. Biol. 4:2929-2931)、及びメトトレキセートへの抵抗性を付与する、ｄｈｆｒ遺伝子（Bourouis and Jarry, 1983, EMBO J. 2: 1099-1104)を含む。使用すべき他のマーカーは、除草剤ホスヒノスリシンへの抵抗性を付与する、ホスヒノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(White et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18: 1062; Spencer et al.1990, Theor. Appl. Genet. 79: 625-631)、グリフォサート抵抗性をコードする突然変異体ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子(Hinchee et al.,1988, Bio/Technology 6:915-922)、イミダゾリン又はスルフォニルウレア抵抗性を付与する突然変異体アセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子（Lee et al., 1988, EMBO J. 7:1241-1248)、アトラジンへの抵抗性を付与する突然変異体ｐｓｂＡ遺伝子(Smeda et al., 1993, Plant Physiol.103: 911-917)、又はEP0769059に記載される突然変異体プロポリフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を含む。形質転換細胞の同定はまた、スクリーニングマーカー遺伝子、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は形質転換細胞に表現型的に明瞭な形質を付与する任意の他のタンパク質をコードする遺伝子の発現を通して達成し得る。
【００４７】
陽性選択を生じる、選択マーカー、例えば、特許出願ＷＯ９３／０５１６３に記載されているフォスフォマンノースイソメラーゼ遺伝子、をまた使用し得る。陽性選択に使用される他の遺伝子は、ＷＯ９４／２０６２７に記載され、そしてキシロイソメラーゼ及びフォスフォマンノ−イソメラーゼ、例えば、マンノース−６−フォスフェートイソメラーゼ及びマンノース−１−フォスフェートイソメラーゼ；フォスフォマンノムターゼ；マンノースエピメラーゼ、例えば、炭水化物をマンノースに又はマンノースを炭水化物、例えばグルコース又はガラクトースに転換するもの；フォスファターゼ例えば、マンノースまたたキシロースフォスファターゼ、マンノース−６−フォスファターゼ及びマンノース−１−フォスファターゼ、及びマンノース又はその誘導体又は前駆体を細胞への輸送に関係するパーミアーゼをコードする。細胞ヘの化合物の毒性を減少させる物質は典型的には、グルコース誘導体、例えば、メチル−３−Ｏ−グルコース又はフロリジンである。形質転換された細胞は、集団中の非形質転換細胞を損傷又は死滅させることなく、そして抗生物質又は除草剤抵抗性遺伝子の同時導入なくして同定する。抗生物質又は除草剤抵抗性遺伝子の必要性を排除するという事実に加えて、ＷＯ９３／０５１６３に記載されるように、陽性選択方法はしばしば、伝統的陰性選択よりもより効率的である。
【００４８】
従って、本発明のプロモーターは、好ましくは以下の領域を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている：（ａ）化合物の代謝に関係するタンパク質をコードする、及び／又は（ｂ）タンパク質をコードしている遺伝子の活性を調節し、ここで該化合物はマンノース又はキシロース又はこれらの誘導体又は前駆体、又はタンパク質の基質であり、又はそのような基質を導入される形質転換細胞によって代謝されることができる。当該ヌクレオチド配列は、マンノース−６−フォスフェートイソメラーゼをコードし得、そして該化合物はマンノースであり得る。又は、該ヌクレオチド配列はリン糖酸イソメラーゼ、リン糖酸ムターゼ、例えば、フォスフォマンノムターゼ、フォスファターゼ、例えば、マンノース−６−フォスファターゼ、糖エピメラーゼ、糖パーメアーゼ、リン糖−パーミアーゼ又はキシロースイソメラーゼ、をコードし得、そして該化合物はマンノース、マンノース−６−フォスフェート、Ｄ−マンノースアミン又はキシロースであり得る。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様では、本発明のプロモーターは、フォスフォマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）をコードする、E. coli manA遺伝子のコード領域（Joersbo and Okkels, 1996, Plant Cell Reprts 16:219-221, Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19:798-803)、及びAgrobacterium thmefaciens T-ＤＮＡから得られるＮｏｓ（ノパリンシンターゼ）ターミネーター(Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet 1(6), 561-573(1982)）に作動可能に連結されている。当業者は、Ｎｏｓターミネーターが植物中で機能する任意の他のターミネーターと置換し得ることを知っている。本発明のプロモーターは、配列番号１ないし６及び１９ないし２０に記載される、ＣｍｐＤ、ＣｍｐＣ、ＣｍｐＳ、ＣｍｐＬ、ＣｍｐＢ、ＣｍｐＡ、ＣｍｐＥ又はＣｍｐＦプロモーター、又はそれらに由来する任意のプロモーターであってよい。本発明のなおより好ましい実施態様では、該プロモーターは、配列番号３に示すＣｍｐＳプロモーターである。
【００５０】
本発明のプロモーターをまた、使用して制御されるべきウイルスからの遺伝子のコード領域と本発明のプロモーターとに作動可能に連結することによってウイルスへ抵抗性又は耐性を提供し得る。マイナス鎖ウイルス、例えば、トマト黄化えそ病ウイルス（ＴＳＷＶ）のウイルス制御のために、該ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＰ）及びムーブメントタンパク質（ＭＰ）遺伝子配列を使用することができ、そしてウイルスのアルファ様スーパーグループに属するウイルス、例えば、ＴＭＶ及びＣＭＶのために、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ−ポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）及びムーブメントタンパク質（ＭＰ）遺伝子配列を使用することができる。ポティウイルスを含む、ウイルスのPicorna様スーパーグループに属するウイルスのために、任意のウイルス配列を本発明のプロモーターに作動可能に連結し得る。
【００５１】
最終的に、ＤＮＡウイルスを含む、すべての他のウイルスのために、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）又はレプリカーゼ関連遺伝子配列を使用し得る。ウイルス制御のためのそのような構築物は、ＷＯ００／６８３７４の実施例８及び実施例９に例示されるように構築することができる。ＷＯ００／６８３７４に開示されるプロモーターを本発明のプロモーターと置換することは当業者の通常の技術の範囲内である。ＷＯ００／６８３７４の教示に従って、当業者はまた、当該ウイルスへの抵抗性又は耐性を付与するために、前記のウイルス配列に作動可能に連結された本発明のプロモーターを含む構築物をいかにして調製するか知っている。
ＷＯ００／６８３７４に開示のように、トランスジェニック植物での二本鎖ウイルスＲＮＡを発現させる代わりに、ウイルスＲＮＡをまた、例えば、ＵＳ５５８３０２又は本発明の実施例１２及び１３に記載のように、非翻訳ＲＮＡプラスセンスウイルスＲＮＡ分子として発現させることができる。
【００５２】
本発明の目的はさらに、所望の関連ヌクレオチド配列に融合された本発明のＤＮＡ配列を含む組換え体発現ベクターを提供することである。これらのベクターでは、外来ＤＮＡをポリリンカー領域に挿入し、その結果これらの外生配列を、例えば、細菌又は植物起源であり得る、好適な宿主細胞中で発現させることができる。例えば、Agrobacterium tumafaciensバイナリーベクターｐＢＩＮ１９に由来するプラスミドｐＢＩ１０１は、ベータガラクトシダーゼ（ＧＵＳ）発現シグナルを使用するプロモーターのクローニング及び試験を可能とする(Jefferson et al., 1987, EMBP J 6: 3901-3907)。該ベクターのサイズは、１２．２ｋｂである。それは低コピーＲＫ２複製開始点を有し、そして細菌及び植物の両方でのカナマイシン抵抗性を付与する。本発明に従って使用することのできる当業者に知られる多くの他の発現ベクターが存在する。
【００５３】
本発明の組換え体ＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物を提供することは、本発明のさらなる目的である。本発明はこうして、植物細胞、そのような細胞に由来する植物、植物材料、該後代、及びそのような植物に由来する種子、及び以下に記載の形質転換方法のいずれかによって得られる改善された特性を有する農業産物に関する。本発明に従って形質転換された植物は、単子葉又は双子葉植物であり得、そしてイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、カンショ、スイートコーン、インゲンマメ、エンドウマメ、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ペッパー、セルリ、カボチャ(squash,pumpkin)、アサ、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、イチゴ、ブドウ、ラズベリ、ブラックベリ、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、ダイズ、トマト、ソルガム、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、ナタネ、クローバー、タバコ、ニンジン、ワタ、アルファルファ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、Arabidpsis thaliana、及び樹木植物、例えば、針葉樹及び落葉樹を含むがこれらに限定されない。
【００５４】
形質転換されるべき好ましい植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、キャベツ、カリフラワー、ペッパー、スカッシュ、メロン、ダイズ、トマト、テンサイ、ヒマワリ又はワタであるが、特にイネ、トウモロコシ、コムギ、Sorghum bicolor、オーチャードグラス、テンサイ及びダイズである。本発明の組換え体ＤＮＡ配列を、多くの周知の方法によって植物細胞に導入することができる。当業者はそのような方法の選択が形質転換の標的である植物の型、すなわち単子葉又は双子葉植物に依存し得ることを認識する。植物細胞を形質転換する好適な方法は、マイクロインジェクション（Crossway et al., 1986, Bio/Techniques 4:320-334)、エレクトロポレーション（Riggs and Bates, 1986, Proc. Natl.Acad. Sci.,USA 83:5602-5606)、アグロバクテリウム介在形質転換(Hichee et al., 1988, Bio Technology 6:915-922;EP0853675）、ディレクトジーントランスファー（Paszkowski et al., 1984, EMBO J.3:2717-2722)及びAgracetus, Inc., Madison,Wisconsin and Dupont, Inc.,Wilmington Delawareから入手可能な装置を使用するバリスチックパーティクアクセラレーション(例えば、米国特許番号4945050及びMacCabe et al.,1988, Bio/Technology 6:923-926参照）を含む。
【００５５】
形質転換されるべき細胞は、分化した葉細胞、胚形成細胞又は任意の他の型の細胞であり得る。プロトプラストの直接的形質転換において、外生遺伝物質のプロトプラストヘの取りこみは、化学物質又は電場の使用によって増強し得る。外生材料を次いで、核ゲノムに組み込み得る。以前の研究は双子葉タバコ植物で実行され、これは外来ＤＮＡが組み込まれそして後代植物ヘ送達されるという結果である（Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3:2712-2722;Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genet 199:169-177)。単子葉プロトプラスト、例えば、Triticum monococcum、Lolium mutiflorum(イタリアンライグラス）、トウモロコシ、及びブラックメキシカンスイートコーンをこの手法によって形質転換する。追加的な好ましい実施態様は、EP0292435、並びにEP0846771に開示されたトウモロコシのためのプロトプラスト形質転換方法である。
【００５６】
トウモロコシ形質転換のためにKoziel et al., 1993, Bio/Technology 11:194-200をまた参照されたい。イネの形質転換をプロトプラスト又はパーティクルボンバードメントを利用するディレクトジーントランスファーによって実施し得る。プロトプラスト介在形質転換はジャポニカ型及びインディカ型について記載されている(Zhang et al., 1988, Plant Cell Rep., 7:379-384; Shimamoto et al., 1989, Nature 338:274276; Datta et al.,1990, Bio/Technology 8:736-740)。前記の両方の型はまた、パーティクルボンバードメントを使用してルーチンに形質転換可能である（Christou et al., 1991, Bio/Technology 9:957-962)。特許出願番号EP0332581は、Pooideaeプロトプラストの、作成、形質転換及び再生のための技術を記載する。これらの技術は、Dactylis及びコムギを含むPooideae植物のすべての形質転換を可能とする。さらに、コムギ形質転換は特許出願EP0674715;及びWeeks et al.,1993(Plant Physiol.102:1077-1084）によって記載されている。こうして構築した植物発現ベクターを例えば、慣行の植物形質転換方法に従ってイネのカルスに導入し、そして根及び葉の分化をそれから誘導し、それから培養のために植木鉢に移植し、それによって形質転換イネを取得することができる。
本発明のＤＮＡ配列又はベクターでの形質転換から得られる植物は、所望のヌクレオチド配列を、植物全体で及びほとんどの組織及び器官で発現する。
【００５７】
前記のトランスジェニック植物に改変された遺伝的特性は、有性生殖又は栄養成長によって受け渡され、そしてこうして維持されそして後代植物において増殖することができる。一般に当該維持及び増殖は、特定の目的例えば、耕うん、播種又は収穫に適合させるために開発された既知の農業的方法の使用をもたらす。特殊なプロセス、例えば、水耕又は温室技術をまた、適用し得る。本発明に従うトランスジェニック植物の有利な遺伝的特性の使用は、さらに、改善された特性、例えば、有害生物、除草剤、又はストレスの耐性、高栄養価、高収量、又は倒伏又は脱粒に起因するロスの減少をもたらす改善された構造を有する植物の開発を目的とする植物育種をもたらすことができる。種々の育種ステップは、例えば交雑すべき系統の選抜、親系統の授粉の管理、又は適当な後代植物の選抜のような良く定義された人間の介入によって特徴付けられる。望まれる特性に依存して、種々の育種方法をとる。関連技術は当業界で周知であり、そして雑種形成、同系交配、戻し交雑、多系育種、変種ブレンド、種間交雑、異数性技術、等を含むがこれらに限定されない。
【００５８】
雑種形成技術はまた、植物の不稔化を含み、機械的、化学的又は生物学的手段によって雄性又は雌性不稔植物を得る。雄性不稔植物の異なる系統の花粉での他家授粉は、該雄性不稔性であるが雌性稔性の植物のゲノムが両方の親系統の特性を斉一に取得することを確保する。こうして、本発明に従うトランスジェニック植物は、例えば、慣行方法、例えば、除草剤又は農薬処理の有効性が増加している改善された植物系統の育種のために使用することができ、又はそれらの修飾された遺伝的特性のために当該方法を無しで済ますことを可能とする。又は、改善されたストレス耐性を有する新しい作物を取得することができる、それは、それらの最適化された遺伝的「装置」のために、比較的不利な発達条件に耐えることのできない産物よりも、よりよい品質の収穫産物を得る。
【００５９】
本発明のさらなる目的は、望まれる生物の所望のヌクレオチド配列を発現させるために使用することのできるＤＮＡ配列を提供することである。この生物は、細菌、植物又は所望の任意の他の生物であることができる。
さらに配列番号１ないし６の開示は、当業者にポリメラーゼ連鎖反応のためのオリゴヌクレオチドを設計することを可能とし、それらは、配列番号１、２、３、４、５、又は６の、１５及び好ましくは２０ないし３０又はより多い塩基対の任意の連続配列によって特徴付けられるヌクレオチド配列を含むテンプレートからのＤＮＡフラグメントを増幅することを試みる。当該ヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、又は６の１５及び好ましくは２０ないし３０又はより多い塩基対をあらわす、ヌクレオチドの配列を含む。そのようなオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを使用して実施されるポリメラーゼ連鎖反応及びそれらの増幅産物は、本発明のさらなる実施態様を構成する。
【００６０】
配列表の配列の簡単な記載
配列番号１  ＣｍｐＤ
配列番号２  ＣｍｐＣ
配列番号３  ＣｍｐＳ
配列番号４  ＣｍｐＬ
配列番号５  ＣｍｐＢ
配列番号６  ＣｍｐＡ
配列番号７  Ｓ１フォワードプライマー
配列番号８  Ｓ２リバースプライマー
配列番号９  ＧＵＳフォワードプライマー
配列番号１０  ＧＵＳリバースプライマー
【００６１】
配列番号１１  ＣＡＴフォワードプライマー
配列番号１２  ＣＡＴリバースプライマー
配列番号１３  Ｃｍｐ１フォワードプライマー
配列番号１４  ＣｍｐＣ２リバースプライマー
配列番号１５  ＣｍｐＳ２リバースプライマー
配列番号１６  ＣｍｐＬ２リバースプライマー
配列番号１７  ＰＡフォワードプライマー
配列番号１８  ＰＡリバースプライマー
配列番号１９  ＣｍｐＥ
配列番号２０  ＣｍｐＦ
【００６２】
配列番号２１  ＮＯＳターミネーターフォワードプライマー
配列番号２２  ＮＯＳターミネーターリバースプライマー
配列番号２３  ＴＳＷＶ  ＮＰ遺伝子フォワードプライマー
配列番号２４  ＴＳＷＶ  ＮＰ遺伝子リバースプライマー
配列番号２５  ＣｍＹＬＣＶプロモーターフォワードプライマー
配列番号２６  ＣｍＹＬＣＶプロモーターリバースプライマー
配列番号２７  ＡＧＬＩＮＫマルチクローニング部位
配列番号２８  ＢＩＧＬＩＮＫマルチクローニング部位
配列番号２９  Ｃｍｐｆ−Ｂプライマー
配列番号３０  ＣｍｐＳ−Ｂプライマー
【００６３】
配列番号３１  ｐＮＯＶ２８０４；バイナリーベクター、プロモーターを欠くＰＭＩ−ｎｏｓターミネーター発現カセットを含む
配列番号３２  ｐＮＯＶ３６０４；バイオリスチックによる形質転換のためのベクター、プロモーターを欠くＰＭＩ−ｎｏｓターミネーター発現カセットを含む配列番号３３  ＣｍｐＭｒリバースプライマー
配列番号３４  ＣｍｐＭｆフォワードプライマー
配列番号３５  ＣｍｐＭｒｓリバースプライマー
配列番号３６  ＣｍｐＭｆｓフォワードプライマー
配列番号３７  ｓｙｎＧＦＰＩ；イントロンを有する植物最適化ＧＦＰ遺伝子
配列番号３８  ＧＩＧ；イントロンを有するＧＵＳ遺伝子
配列番号３９  Ｃｍｐ−Ｃリバースプライマー
配列番号４０  ＣｍｐＳ−ｓｙｎＧＦＰＩ−ｎｏｓ発現カセット
【００６４】
配列番号４１  ＣｍｐＳ−ＧＩＧ−ｎｏｓ発現カセット
配列番号４２  ＣｍｐＣ−ｓｙｎＧＦＰＩ−ｎｏｓ発現カセット
配列番号４３  ＣｍｐＣ−ＧＩＧ−ｎｏｓ発現カセット
配列番号４４  ｐＮＯＶ２１１７ベクター
配列番号４５  ｐＮＯＶ４２００ベクター
配列番号４６  ＺｍＵｂｉ−ＧＦＰ−３５Ｓｔｅｒｍ発現カセット
配列番号４７  ＺｍＵｂｉ−ＧＩＧ−ｎｏｓ発現カセット
配列番号４８  Ｕｂｑ（Ａｔ）−ｓｙｎＧＦＰＩ−ｎｏｓ発現カセット
配列番号４９  Ｕｂｑ（Ａｔ）−ＧＩＧ−ｎｏｓ発現カセット
【００６５】
実施例
ここで使用する標準的組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、当業界で周知であり、そして例えば、Sambrook te al., 1989''Molecular Cloning'', Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 及びAusubel et al., 1994, ''Current protocols in molecular biology'', John Wiley and Sons, New Yorkに記載されている。
【００６６】
実施例１：ウイルスクローニング
１．ＤＮＡ抽出
ウイルスゲノムＤＮＡをケストルムイエローリーフカーリングウイルス感染したアツバヤコウボク(Cestrum parqui)植物から抽出する。５グラムの感染した葉を、粉砕バッファー（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ、２Ｍ  尿素）の３０ｍｌ中で、６０秒間最大スピードで、Brinkman Polytronホモゲナイザーにおいて、ＰＴ１０プローブで、そして４℃で、終夜Triton X-100（２％最終濃度）とともに穏やかに振とうしつつホモゲナイズする。ウイルスを低スピード遠心分離（Sorvall SS-34 ローターにおいて１０００００ｒｐｍで２０分間）によって粗ホモジネートから及び高スピード遠心分離（Beckman SW-28ローターで２７０００ｒｐｍで２時間）によって得られる上清から、スクロースクッション（３ｍｌの１５％スクロース）を経由して精製する。ペレット含有ウイルスを次いで、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２に再懸濁する。ＤＮアーゼＩ(Sigma)及びＲＮアーゼＡ(Sigma)をそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌの濃度まで添加する。３７℃で３０分後、反応を１０ｍＭまでのＥＤＴＡの添加によって停止させる。ウイルスＤＮＡをＣｍＹＬＣＶ粒子からプロテアーゼＫ（E.Merck, 0.5mg/ml最終濃度）で、６５℃で１５分間１％  ＳＤＳの存在下で処理することによって単離する。ウイルスＤＮＡを次いで、フェノール抽出及びエタノール沈降によって精製する。最終のエタノール沈殿物に含まれるウイルスＤＮＡを水に溶解する。
【００６７】
２．ＤＮＡ増幅及びクローニング
１００ナノグラムの取得したＤＮＡをテンプレートとして、１０μＭのそれぞれのプライマー、２５ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰ、５μｌのｐｆｕ反応バッファー（Straagene)及び２．５単位のpfu turbo ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene)を含む５０μＭ反応体積中でＰＣＲ増幅のために使用する。Ｓフォワードプライマー（gaccacaaacatcagaag、配列番号７）及びＳ２リバースプライマー（caaacttattgggtaatc、配列番号８）をＰＣＲ反応のために使用する。ＰＣＲのためのサイクリングパラメータは：１Ｘ（９４℃で１分間)；３０Ｘ（９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間）；１Ｘ（７２℃で１０分間）である。それぞれの単一ＤＮＡフラグメントをｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）Amp SK(+)プラスミド(Stratagene)において製造者の指示に従ってクローニングする。
【００６８】
実施例２：ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡウイルスクローンの配列決定を、ABI PRISM 377 ＤＮＡ シーケンサー(Perkin Elmer）及びABI PRISM dローダミンターミネーターサイクル配列決定キット（Perkin Elmer）を製造者の指示に従って使用し実行する。記載されたＳ１プライマー及びＳ２プライマー（実施例１）を反応物の配列決定のために使用し、並びにユニバーサルＭ１３−２０及びリバースプライマーを使用する。
【００６９】
実施例３：一過性（トランジエント）発現のためのプラスミドの構築
すべてのＰＣＲ反応を、実施例１に記載されるようにPfuポリメラーゼ(Stratagene)で実施する。
１．レポーター遺伝子増幅
ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子を増幅する。ＧＵＳ遺伝子増幅のために、ＧＵＳフォワード（cagggtaccactaaaacacc、配列番号９）及びＧＵＳリバース（aggggatccccaattcccc、配列番号１０）オリゴヌクレオチドを、アニーリング温度６０℃で使用する。ＣＡＴフォワード（aggggtaccatcgatatggag、配列番号１１）及びＣａｔリバース（ttaggatccgccctgccac、配列番号１２）オリゴヌクレオチドは６２℃でアニールする。フォワードプライマーはＫｐｎＩ認識部位を含み及びリバースのものはＢａｍＨＩ部位を含むように設計する。
【００７０】
２．ＣｍＹＬＣＶプロモーター増幅
３種の異なるプロモーターフラグメントを選択する。ＣｍｐＣ（配列番号２）、ＣｍｐＳ（配列番号３）、及びＣｍｐＬ（配列番号４）。Ｃｍｐ１フォワードプライマー（cttctagacaaagtggcagac、配列番号１３）を５２℃のアニーリング温度でのすべての３種の増幅のために使用する。それをオリジナル配列から修飾し（太字で示す（訳注；下線で示す））、ＸｂａＩ認識部位を含むようにする。ＣｍｐＣ２リバースプライマー（ttggtaccttaacaatgaggg、配列番号１４）をＣｍｐＣフラグメント増幅のために使用し、そしてＣｍｐＳ２リバースプライマー（ctacttctaggtaccttgctc、配列番号１５）をＣｍｐＳフラグメントのために使用する。それらの両方を修飾し、ＫｐｎＩ認識部位を含むようにする。ＣｍｐＬ２リバースプライマー（ttggtaccttaacaatgaggg、配列番号１６）をＣｍｐＬフラグメント増幅のために使用し、そしてそれを修飾し、ＣｌａＩ認識部位を含むようにする。
【００７１】
３．ポリアデニル化シグナル増幅
ポリアデニル化シグナルフラグメントをカリフラワーモザイクウイルス（ＣａｓＭＶ）感染性クローン(Franck et al., Cell 21(1),285-194,1980)から増幅する。ＰＡ（polyadenylation signal amplification)フォワード（ggggatccccagtctctctc、配列番号１７）及びＰＡリバース（gtgaattcgagctcggta、配列番号１８）オリゴヌクレオチドをＰＣＲのために使用し、そして６０℃でアニールする。フォワードプライマーを、ＢａｍＨＩ認識部位及びリバースのものはＥｃｏＲＩ部位を含むように設計する。
【００７２】
４．生産した構築物
・ｐＣｍｐＣＧ（ＣｍｐＣプロモーターフラグメント＋ＧＵＳ遺伝子＋ポリＡ）・ｐＣｍｐＳＧ（ＣｍｐＳプロモーターフラグメント＋ＧＵＳ遺伝子＋ポリＡ）・ｐＣｍｐＣＣ（ＣｍｐＣプロモーターフラグメント＋ＣＡＴ遺伝子＋ポリＡ）・ｐＣｍｐＳＣ（ＣｍｐＳプロモーターフラグメント＋ＣＡＴ遺伝子＋ポリＡ）・ｐＣｍｐＬＣ（ＣｍｐＬプロモーターフラグメント＋ＣＡＴ遺伝子＋ポリＡ）  プロモーターフラグメント、レポーター遺伝子及びポリアデニル化シグナルを含むカセットを、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで制限されたｐＵＣ１９ベクター（Stratagene)に挿入する。
【００７３】
５．比較のために使用する構築物
・ｐＣａｐＧ（Ｃａｐプロモーターフラグメント＋ＧＵＳ遺伝子＋ポリＡ）
・ｐＣａｐＳＧ（ＣａｐＳプロモーターフラグメント＋ＧＵＳ遺伝子＋ポリＡ）・ｐＣａｐＣ（Ｃａｐプロモーターフラグメント＋ＣＡＴ遺伝子＋ポリＡ）
これらの構築物に含まれたプロモーターフラグメントを、ＣａＭＶから取得する（Franck et al.,Cell 21(1),285-194,GenBank 受託番号V00141参照）。GUS、CAT及びポリＡフラグメントは、ＣｍＹＬＣＶ構築物のために使用されたこれらと同一である。ＣａｐはＴＡＴＡボックスからの塩基―２２７ないし塩基＋３３のフラグメントに対応し（ＣａＭＶゲノムの塩基７１７５ないし塩基７４３８、GenBank受託番号V00141参照）、及びＣａｐＳはＴＡＴＡボックスから塩基−２２７ないし塩基＋８２のフラグメントに対応する（ＣａＭＶゲノムの塩基７１７５ないし塩基７４８６、GenBank 受託番号V00141参照）。これらの位置はCmYLCVフラグメントのために選択されたものに近似的に対応する。
【００７４】
実施例４：トランジエント発現実験
１．懸濁培養及びプロトプラスト調製
Orychophragmus violaceus.懸濁培養を、１００ｍｇ／ｍｌ  イノシトール、２％  スクロース、及び０．１ｍｇ／ｍｌ  ２，４−Ｄを含む４０ｍｌのＭＳ培地（Murashige and Skoog,Physiol Plant 15,474-497, 1962)で維持する。プロトプラストを４ないし５日齢培養物から単離する。細胞壁を０．１％ペクトリアーゼＹ２３（Seishin Pharamaceutical Co Japan)、１％  セルラーゼ Onozuka R10(Yakult Honsha Co.,Japan)、０．４Ｍ  Ｄ−マンニトール、及び０．１％  ＭＥＳ、ｐＨ５．５中で１時間２６℃で消化する。プロトプラストを５０μｍシーブを経由して濾過し、エレクトロポレーション（ＥＰ）溶液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．２Ｍ  マンニトール、ｐＨ７．１）で２回洗浄する。
【００７５】
Nicotiana plumbaginifolia.植物をＲＰＭ２培地（Blonstein et al., Mol Gen Genet 211,252-259,1988)プラス７ｇ／ｌ  バクトアガー、ｐＨ５．６上で無菌的に維持する。プロトプラスト調製のために、葉を切断し、そして０．５％  ドリセラーゼ(Fluka)、０．２５ｍＭ  ＰＶＰ１０（ポリビニルピロリドンＭＷ１００００）、３．８５ｍＭ  ＣａＣｌ２、６ｍｇ／ｌ  ＮＡＡ、２ｍｇ／ｌ  ＢＡＰ、及び０．５Ｍ  スクロース、ｐＨ５．７の溶液中で２６℃で終夜インキュベートする。プロトプラストを１００μｍシーブを経由して濾過する。スクロース溶液（０．６Ｍ  スクロース、０．１％  ＭＥＳ、及び１５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ５．７９を、第１の精製ステップのためにプロトプラスト懸濁液に添加し、そして該懸濁液Ｗ５溶液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  グルコース；Menczel et al., Theor Appl Genet 59, 191-195, 1981)でオーバーレイする。プロトプラストを次いで、Ｗ５溶液で１回洗浄し、そして最終的にＥＰ溶液で洗浄する。
【００７６】
Oryza sativa.プロトプラストを、記載されたように(Datta et al., 1990,Bio/Technology 8:736-740)O.sativa cv.日本晴から確立した、形態形成性イネ懸濁液カルチャーから調製する。
【００７７】
２．トランジエント発現実験
ＥＰバッファーにおける２ｘ１０６Orychophragmus violaceusプロトプラストのエレクトロポレーションによるトランスフェクションを、プロトプラスト懸濁液の４ｍｍの距離を経由して９６０μＦコンデンサーを本殿させることによって実施する。コンデンサを４５０ボルトで負荷する。エレクトロポレーションを５−１０μｇのプラスミドＤＮＡの存在下で実施し、次いでプロトプラストを１６−２４時間２５℃で培養する。２ｘ１０６Nicotiana plubaginifoliaプロトプラストの０．３ｍｌ懸濁液におけるトランスフェクションを０．３ｍｌ  ＰＥＧ（４０％  ポリエチレングリコール６０００）及び５−１０μｇのプラスミドＤＮＡの存在下で実施する。プロトプラストを２５℃で１６−２４時間０．４ｍｌ  Ｋ３培地（Godall et al., Methods Enzymol 181, 148-161, 1990で培養し、そして収集の前に１０ｍｌ  Ｗ５バッファーで添加する。
タンパク質エキストラクトを、凍結及び融解の少なくとも３サイクルによって調製し、遠心分離によって清浄化する。
【００７８】
実施例５：ＣＡＴ及びＧＵＳアッセイ
ＣＡＴ遺伝子発現ダブル抗体サンドイッチ（ＤＡＳ）−ＥＬＩＳＡを、製造者の指示に従ってＣＡＴ  ＥＬＩＳＡキット（Boehringer)を使用して実施する。CAT活性をDynex MRXII装置で測定する。ＧＵＳアッセイのためのサンプルをＧＵＳバッファー（０．０５Ｍ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、０．１％  Sarkosyl)中に希釈する。反応を、等量のＧＵＳ反応バッファー（１００ｍｌ／ｌ  １０ｘＧＵＳバッファー、２００ｍｇ／ｌ  ＢＳＡ、７０５ｍｇ／ｌ  ４−メチルウムベリフェリル−グルクロナイド）の存在下で３７℃で実施し、２Ｍ  Ammediolで停止させる。活性をTitertek Fluoroskann IIで測定する。ＣＡＴ及びＧＵＳアッセイ結果の両方を標準クローン値に標準化する。１０の異なる実験から得られた結果は、種々のＣｍＹＬＣＶプロモーターフラグメントが高度に活性なプロモーターとして機能することを示す。
【００７９】
N. plumbaginifoliaプロトプラストトランジエント発現
【表１】
0004739634.tif 000002
【００８０】
【表２】
0004739634.tif 000003
【００８１】
O.violaceusプロトプラストトランジエント発現
【表３】
0004739634.tif 000004
【表４】
0004739634.tif 000005
【００８２】
O.sativa プロトプラストトランジエント発現
【表５】
0004739634.tif 000006
【００８３】
実施例６：植物再生及び形質転換のための溶液及び培地の調製
培養培地ＧＭ、ＣＩＭ及びＳＩＭは、Valvekens et al., (1988,Proc. Natl. Acad. Sci.USA.85:5536-5540)によって記載された培地である。
培養培地ＧＭは、Murashige and Skoog(1962, Physiol. Plant.15:473-497)のミネラル塩類、１．０ｍｇ／ｌ  チアミン(ストック１ｍｇ／ｍｌ）、０．５ｍｇ／ｌ  ピリドキシンＨＣｌ（ストック１ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｇ／ｌ  ニコチン酸（ストック１ｍｇ／ｍｌ）、０．５ｍｇ／ｌ  ２−（Ｎ−モロフォリノ）エタンスルフォン酸（ＭＥＳ）、１０ｇ／ｌ  スクロース、８ｇ／ｌアガーを含み、１Ｎ  ＫＯＨでｐＨを５．８に調節している。ＣＩＭはＢ５培地（Gamborg et al., 1968, Exp. Cell Res. 50:151-158)のミネラル塩類及びビタミン、０．５ｇ／ｌ  ２−（Ｎ−モロフォリノ）エタンスルフォン酸（ＭＥＳ）、２０ｇ／ｌグルコース、０．０５ｍｇ／ｌ  ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）（ストックＤＭＳＯ中の１０ｍｇ／ｍｌ）、０．０５ｍｇ／ｌ  カイネチン（ストックＤＭＳＯ中の５ｍｇ／ｍｌ）、ｐＨ５．８を含む。固体ＣＩＭ培地は、８ｇ／ｌ  アガーを含む。ＳＩＭはＢ５培地(Gamborg et al., 1968,前掲）のミネラル塩及びビタミン、０．５ｇ／ｌ  ２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルフォン酸（ＭＥＳ）、２０ｇ／ｌ  グルコース、５ｍｇ／ｌ  Ｎ６−（イソペンチル）アデニン（２Ｐｉ）（ストックＤＭＳＯ中の２０ｍｇ／ｍｌ）、０．１５ｍｇ／ｌ  インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）（ストックＤＭＳＯ中の１．５ｍｇ／ｍｌ）、８ｇ／ｌ  アガー、ｐＨ５．８を含む。ＳＩＭ  Ｖ７５０  Ｋ１００は、７５０ｍｇ／ｌ  バンコマイシン及び１００ｍｇ／ｌ  カナマイシンで補足されたＳＩＭ培地である。ＳＩＭ  Ｖ５００Ｋ１００は５００ｍｇ／ｌ  バンコマイシン及び１００ｍｇ／ｌ  カナマイシンで補足されたＳＩＭ培地である。ＧＭ  Ｋ５０は５０ｍｇ／ｌ  カナマイシンで補足されたＧＭ培地である。
【００８４】
培養培地をすべて、オートクレーブ（１２１℃２０分）で滅菌する。ビタミンを水に溶解し、そしてオートクレーブ前に培地に添加する。ホルモンをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解する。抗生物質を水に溶解し、濾過によって滅菌する（０．２２μｍ）。ホルモノ及び抗生物質を、オートクレーブ及び培地を６５℃に冷却後に添加する。すべての場合に、９ｃｍペトリ皿（Falcon,3025)を使用し、ただし通常１５ｃｍペトリ皿（Falcon,3025)へ注ぐ、ＧＭ及びＧＭ  Ｋ５０をのぞく。
固体培地を有するプレートを、濃縮を避けるために層流の利用の前に乾燥する。
【００８５】
実施例７：アラビドプシス系統及び成長条件
Arabidopsis thaliana種子エコタイプコロンビア（Ｃｏｌ−０）野生型をLehle seeds, USA(1102 South Industrial Blvd.Suite D, Round Rock TX 78681, USA)から購入する。植物を４部の砂、４部の園芸用土、及び１部のagrilitの混合物で２２℃でポットで１６／８時間明／暗期サイクルで成長させる。
【００８６】
実施例８：アグロバクテリウム菌株及び培養
ベクタープラスミドを、Walkerpeach and Veltenによって記載されたプロトコル（Plant Molecular Biology Manual, B1:1-19,1994.Eds.:S.B.Gelvin,R.A., Schilpercort, Kluvers Acad. Publishers.における''Agrobacterium-mediated gene transfer to plant cells: Cointegrate and binary vector systems''）に従って三元交配によってレシピエントAgrobacterium tumefaciens菌株ＬＢＡ４４０４(Clontech)に導入する。使用するMobilizing菌株は、コンジュゲーションプラスミドｐＲＫ２０１３を有するE.coli HB101(Ditta et al., 1980,グラム陰性細菌からの広宿主範囲ＤＮＡクローニング系。Rhizobium meliotiのgenebankの構築物、Proc. Natl.Acad. Sci.USA 77:7347-7351)である。根形質転換のために使用するアグロバクテリウムは、抗生物質なしで２８℃で２００ｒｐｍでＬＢ培地において増殖させる（Sambrook et al., 1989, ''Molecular Cloning'', Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY）。
【００８７】
実施例９：種子滅菌
種子を２ｍｌエッペンドルフ管中で７０％  ＥｔＯＨ／０．０５％  Tween20中に１分間置く。７０％ＥｔＯＨ／０．０５％Tween20をピペットで除去し、そして５％  ＮａＯＣｌ／０．０５％Tween20で１５分間交換する。種子を規則的に振とうする。溶液を無菌条件で除去しそして種子を滅菌、蒸留水中で３回それぞれ１０分間洗浄する。最後の洗浄後、種子を０．５−１ｍｌ水中に維持する。種子を直ちに使用し、又は４℃で２ないし３週間貯蔵することができる。滅菌種子（２０−３０）を、１５ｃｍペトリ皿中のＧＭ培地上にピンセットで移す。実生をグロースチャンバー中の垂直に置いたプレートで成長させる（２２℃；１６／８時間明／暗期サイクル）。
【００８８】
実施例１０：Arabidpsis thalianaの根外植体の形質転換
形質転換処理で、３週齢の実生の根を使用する。根は緑色又は褐色でないべきである。実生の緑色部分をメス及びピンセットで除去する。残りの根を収集し、そして、固体ＣＩＭ培地を有するプレートあたりおよそ５つの完全な根系を置く。根をプレートの表面上に穏やかに押し、培地との十分な接触を確保する。しかしそれらはアガー中に浸すべきではない。根をグロースチャンバー中で３日間インキュベートする（２２℃；１６／８時間明／暗期サイクル）。根を次いで滅菌ペトリ皿に、液体ＣＩＭ培地で湿らせた濾紙と移し、そしてメスで０．５−１ｃｍ断片に切断する。根外植体を次いで、１０ｍｌ液体ＣＩＭ培地を含む５０ｍｌ滅菌Falcon管に移す。これに、０．５ｍｌの終夜アグロバクテリウムカルチャー（ＯＤ０．６−１）を添加し、そして穏やかに振とうしつつ１−２分間インキュベートする。液体を滅菌金属篩（５０メッシュ、Sigma,S-0895)を経由して管から注ぎ、これをピンセットで保持する。根は通常その縁に近い管の壁に残る。次いで根外植体を濾紙と滅菌ペトリ皿に移し、そして簡単に吸い取り乾燥させ、過剰の液体を除く。根外植体を固体ＣＩＭ培地を有するプレート上に置き、そして薄明かり光（１．５−２ｋｌｕｘ）で２日間グロースチャンバー中でインキュベートする。アグロバクテリウムの過剰成長の薄い跡は、同時培養の期間の後、可視的であるべきである。根外植体を次いで、１０００ｍｇ／ｌ  バンコマイシンで補足した、２０ｍｌの液体ＣＩＭ培地を有する滅菌５０ｍｌFalcon管に移す。Falcon管を次いで、穏やかに撹拌し、アグロバクテリウムを除去する。液体を前記の様に管から注ぎ、そして外植体を濾紙上で簡単に吸い取り乾燥させる。外植体を次いで、SIM  V750  K１００培地を含むプレートに移す。
【００８９】
根は培地とよく接触しているべきである。外植体を１週間通常の条件でグロースチャンバーでインキュベートし、それからＳＩＭ  Ｖ５００  Ｋ１００培地に移し、そしてさらに１週間インキュベートする。次いで、バンコマイシンの量を２５０ｍｇ／ｌに減少させる。第１のシュートはＳＩＭ培地上での培養の第三週の末に出現するものとする。シュートを、０．３−０．５ｃｍ長のときに切除し、任意の残りのカルスを除去し、そしてシュートをＧＭ  Ｋ５０培地を含む１５ｃｍプレートに移す。プレート当たり最大３シュートを置く。より多いシュートを得るために、残りの根外植体を、追加的２週間にわたり、１２５ｍｇ／ｌ  バンコマイシン及び１００ｍｇ／ｌ  カナマイシンで補足した、新鮮ＳＩＭプレートに移す。発根したシュートを土壌に移し、種子を結実させることができる。発根しないシュートを、ＧＭ培地を含むMagentaジャー（ジャー当たり１株）に移し、インビトロで種子を生産させる。
個々のトランスジェニック植物からの種子を、２週間にわたり、グロースチャンバーにおけるＧＭ  Ｋ５０培地上で発芽させる。緑色本葉を形成しそして根系が分岐する、表現型的に正常のカナマイシン抵抗性実生を、さらなる分析のために選択する。
【００９０】
実施例１１：組織化学的β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）アッセイ
インビトロ成長した実生又は土壌で成長した植物をＧＵＳアッセイに使用する。実生全体又は切除した器官のいずれかをＧＵＳ染色溶液に浸す。ＧＵＳ染色溶液は１ｍＭ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロナイド（X-Gluc, Duchefa, 20mM ＤＭＳＯ中のストック）、１００ｍＭ  Ｎａ−リン酸バッファーｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、及び０．１％  Triton X100を含む。組織サンプルを３７℃で１−１６時間インキュベートする。必要ならば、サンプルを７０％ＥｔＯＨの数回の洗浄で清浄化し、クロロフィルを除去する。
【００９１】
実施例１２：タバコ形質転換ベクターｐＺＵ６２７の構築
すべてのＰＣＲ反応を製造者の指示に従ってPlatinum Pfx ＤＮＡポリメラーゼ(Life Technologies)で実施する。
【００９２】
１．ＮＯＳターミネーター増幅及びクローニング
ＮＯＳターミネーターをｐＢＩＮ１９（Bevan et al.,1984)から、ＮＯＳターミネーターフォワードプライマー（配列番号２１）及びＮＯＳターミネーターリバースプライマー（配列番号２２）を使用して増幅する。フォワードプライマーを修飾し、ＰｉｓｔＩ部位を含ませ、そしてリバースプライマーを修飾し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含ませる。ＮＯＳターミネーター増幅産物をＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてpBlurscript（Stratagene)の同じ部位にクローニングし、プラスミドPZU400Aを得る。
【００９３】
２．トマト黄化えそ病ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質（ＴＳＷＶ  ＮＰ）遺伝子の増幅及びクローニング
非翻訳ＴＳＷＶ  ＮＰ遺伝子を取得するために、修飾ＴＳＷＶ  ＮＰ遺伝子プライマーを使用し、ＴＳＷＶ  ＮＰ遺伝子を増幅する。ＴＳＷＶ  ＮＰ遺伝子フォワードプライマーは、ＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩ、開始及び停止コドンを導入する（配列番号２３）。リバースプライマーを修飾し、ＰｓｔＩ部位を導入する（配列番号２４）。増幅産物をＮＯＳターミネーターの上流に及び同じ方向でpZU400AのＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ部位にＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩフラグメントとしてクローニングする。得られたクローンｐＺＵ４００ｂにおいて、ＴＳＷＶ  ＮＰ遺伝子及びＮＯＳターミネーターの間のＰｓｔＩ部位を、製造者の指示に従って、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Life Technologies)処理を使用して除去する。ｐＺＵ４００Ｃと命名された、得られるクローンから、ＴＳＷＶ  ＮＰ遺伝子及びＮＯＳターミネーターを、シャトルベクターｐＺＯ１５６０のＳｐｈＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにＳｐｈＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてクローニングし、プラスミドｐＺＵ４００を得る。ｐＺＯ１５６０はpBluescript誘導体であり、ここに本来の多重クローニング部位は、ＡＧＬＩＮＫ多重クローニング部位によって置換されている（配列番号２７）。
【００９４】
３．ＣｍＹＬＣＶプロモーター増幅及びクローニング
ＣｍＹＬＣＶウイルスプロモーターを、ＣｍＹＬＣＶプロモーターフォワードプライマー（配列番号２５）及びＣｍＹＬＣＶプロモーターリバースプライマー（配列番号２６）を使用して増幅する。フォワードプライマーを修飾し、ＳｓｔＩ部位を含ませ、リバースプリマ−を修飾しＰｓｔＩ部位を含ませる。増幅されたＣｍＹＬＣＶウイルスプロモーターを、ｐＺＵ４００のＳｓｔＩ／ＰｓｔＩ部位に、ＴＳＷＶ−Ｎ遺伝子と同じ方向で、上流に、ＳｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメントとしてクローニングする。これは、クローンｐＺＵ６２５を生じ、それは、非翻訳ＴＳＷＶ  ＮＰ  ＲＮＡを生産するウイルス遺伝子カセットを含む。
【００９５】
４．pVictorHiNKへのウイルス遺伝子カセットのクローニング
ウイルス遺伝子カセットをpVictorHiNKベクターｐＺＵ４９４のAscI/PacI部位に、ｐＺＵ６２５からのＡｓｃＩ／ＰａｃＩフラグメントとしてクローニングする。これは、植物形質転換ベクターｐＺＵ６２７を生じる。ｐＶｉｃｔｏｒＨＩＮＫは、Pseudomonas aeruginosaプラスミドｐＶＳ１に由来する複製開始点（ＯＲＩ）を含むバイナリーベクターであり、それはA.tumefaciens において高度に安定であると知られる(Itoh et al., 1984.Plasmid 11:206-220;Itoh and Haas, 1985.Gene 36;27-36)。ｐＶＳ１  ＯＲＩはアグロバクテリウム中でのみ機能性であり、そして三元交配手法によってE.coliからA. tumefaciensにヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３によって移動することができる(Ditta et al., 1980.Proc.Natl. Acad.Sci.USA 77:7347-7351)。このバイナリベクターはまた、E.coliで機能性である、ｐＵＣ１９に由来する、ＣｏＩＥＩ複製開始点を含む(Yannisch-Perron et al., 1985.Gene 33:103-119)。
【００９６】
E.coli及びa.tmefaciens中での維持のために、このベクターは、トランスポゾンＴｎ７からの０．９３ｋｂ遺伝子によってコードされる、スペクトマイシン及びストレプトマイシンへの細菌性抵抗性遺伝子を含み（Fling et al., 1985.Nucl.Acid Res.13:7095)、それはE.coli及びA.tumefaciensでのベクターの維持のための選択マーカーとして機能する。該遺伝子を効率的な細菌での発現のためにｔａｃプロモーターに融合する（Amman et al., 1983.Gene 25:167-178)。１．９ｋｂ及び０．９ｋｂのライト及びレフトＴ−ＤＮＡボーダーフラグメントであって、それぞれ２４ｂｐボーダーリピートを含むものは、ノパリン型A.tumefaciens菌株ｐＴｉＩ３７のＴｉプラスミド（Yadev et al., 1982.Proc. Natl. Acad. Sci.USA.79:6322-6326)に由来する。次に、該ボーダー間のＴ−ＤＮＡ領域を、Ｍ１３に由来する配列を削除することによって修飾しそして、そのクローニング融通性を改良するために、ＢＩＧＬＩＮＫ多重クローニング部位（配列番号２８）を導入し、ｐＶｉｃｔｏｒＨｉＮＫを得る。
ＰＶｉｔｏｒＨＩＮＫは、植物形質転換プロセス中の形質転換体の選択のためのＮＰＴＩＩ遺伝子カセットを含む。この遺伝子カセットは、ＮＯＳプロモーター、ＮＰＴＩＩ遺伝子及びＮＯＳターミネーターを含み、A.tumegaciensから得られる。
【００９７】
実施例１３：植物形質転換及び抵抗性についてのスクリーニング
１．植物材料ヘのバイナリーベクターの形質転換
バイナリーベクターを植物材料へ移入する方法は、よく確立され、そして当業者に知られている。手法の変形が、例えば使用されるアグロバクテリウム菌株の違い、外植体材料の異なる起源、依存する再生系の相違、並びに使用される植物種としての品種のために存在する。バイナリーベクターｐＺＵ６２７を以下の手法に従って植物形質転換実験において使用する。ＰＺＵ６２７を、アクセプターagrobacterium tumefaciens 菌株へ三元交配によって移入させ、次いでアクセプター菌株への構築物の妥当な移入の確認のために共コンジュゲート体（ex-conjugants）のサザンブロット分析及び接種及び無菌的外植体材料の組換え体Agrobacterium tumefaciens菌株とのインキュベーション及び同時培養、適当な抗生物質を使用するAgrobacterium tumefaciens菌株の選択死滅、カナマイシンを含む選択培地上での成長による形質転換細胞の選択、プラントレットの土壌への移植、組みこみＴ−ＤＮＡのインタクト性についての、該植物の単離クロモソームＤＮＡのサザンブロット分析によるアッセイが続く。
【００９８】
２．ＴＳＷＶ感染に対する植物の抵抗性
形質転換植物を標準的隔離条件下でグリーンハウスで成長させ、病原体による任意の感染を防止する。４葉ステージで、植物を機械的接種によってＴＳＷＶで感染させる。ＴＳＷＶで全身的に感染した植物からの組織を、５体積の氷冷接種バッファー（１％  Ｎａ２ＳＯ３で補足した１０ｍＭ  リン酸バッファー）中で粉砕し、最初の２つの完全に伸長した新しい葉へのカーボランダム粉末の存在下でこすりつける。接種した植物を、接種後３週間の間、全身性発達について監視する。ｐＺＵ６２７配列を含む植物は、ＴＳＷＶ徴候を示さず、一方、非形質転換コントロール植物は接種７日以内に重度な全身性ＴＳＭＶ徴候を示す。抵抗性植物を自殖させ、そして種子を収穫する。後代植物を挿入された遺伝子の分離について分析し、そして次に前記のようにＴＳＷＶ感染に対する抵抗性について再スクリーニングする。
【００９９】
実施例１４：植物形質転換のためのＣｍｐＳ−ホスホマンノースイソメラーゼ−ｎｏｓ構築物の構築
ＣｍｐＳプロモーターを、Ｃｍｐｆ−Ｂ（cgcggatcctggcagacaaagtggcaga、配列番号２９）及びＣｍｐＳ−Ｂ（cgcggatcctacttctaggctacttg、配列番号３０）プライマーであってＢａｍＨＩ部位にフランキングであるものを使用してＰＣＲ増幅する。得られるＰＣＲフラグメントをpBluescriptKS（＋）のＢａｍＨＩ部位にクローニングしｐＮＯＶ４２１１を形成する。
【０１００】
Agrobacterium tumefaciensを介する形質転換のためのバイナリーベクターを作出するために、ＣｍｐＳプロモーターをｐＮＯＶ４２１１からＢａｍＨＩを使用して切除し、そしてＰＭＩ遺伝子の上流のＢａｍＨＩ消化したｐＮＯＶ２８０４に挿入し、そしてｐＮＯＶ２８０４（配列番号３１）と呼ばれるベクターを得る。ｐＮＯＶ２８０４（配列番号３１）はＶＳ１複製開始点、バックボーンの１コピーのアグロバクテリウムｖｉｒＧ遺伝子、及びプロモーターを欠くＰＭＩ−ｎｏｓターミネーター発現カセットであってＴ−ＤＮＡのレフト及びライトボーダーの間のものを有するバイナリーベクターである。ＰＭＩ（ホスホマンノースイソメラーゼ）はE.coli manA遺伝子のコード領域である（Joersbo and Okkels, 1996, Plant Cell Reports 16:219-221, Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19:798-803)。ｎｏｓ（ノパリンシンターゼ）ターミネーターはAgrobacterium tumefaciensＴ−ＤＮＡから得られる（Depicker et al., 1982, J.Mol.Appl. Genet.1(6),561-573）。ホスホマンノースイソメラーゼコード領域及びｎｏｓターミネーターをｐＮＯＶ２８０４の、それぞれｎｔ２９０ないしｎｔ１４６５及びｎｔ１５１６ないし１７８９に位置する（配列番号３１）。
【０１０１】
バイオリスチック形質転換のためのベクターを作出するために、ＣｍｐＳプロモーターをｐＮＯＶ４２１１からＢａｍＨＩを使用して切除し、そしてＢａｍＨＩ消化したｐＮＯＶ３６０４に挿入し（配列番号３２）、ｐＮＯＶ２８２０を形成し、こうしてＣｍｐＳプロモーターによって駆動されるＰＭＩ発現カセットを作出する。ｐＮＯＶ３６０４はバイオリスチックフラグメントを調製するためのベクターであり、そしてｐＵＣ１９に基づき、ＣｏｌＥＩ複製開始点及びアンシピリン抵抗性を付与するベータ−ラクトマンノース遺伝子を有する。ｐＮＯＶ２８０４のように、ｐＮＯＶ３６０４はまた、プロモーターを欠くＰＭＩ−ｎｏｓターミネーター発現カセット（前記参照）を含む。ホスホマンノースイソメラーゼコード領域及びｎｏｓターミネーターは、ｐＮＯＶ３６０４（配列番号３２）の、それぞれｎｔ４２ないしｎｔ１２１７及びｎｔ１２６８ないし１５４１に位置する。
バイナリーベクターｐＮＯＶ２８１９をAgrobacterium tumefaciens を介する形質転換のために使用し、そしてベクターｐＮＯＶ２８２０をバイオリスチック形質転換のために使用する。
【０１０２】
実施例１５：インプランタの安定的発現のためのＣｍｐＣ−ＧＵＳプラスミドの構築
１．バイナリーベクターの構築
ベクターｐＣａｍｂｉａ１３０２（Cambia, Canberra, Australia; Roberts,C.S., Rajagopal,S., Smith, L., Nguyen,T., Yang, W., Nugroho, S., Ravi, K.S.Cao, M.L., Vijayachandra, K., et al.植物の進歩した操作及び効率的な形質転換のためのモジュラーベクターの総括的セット。Rockfeller Foundation Meeting of the International Program on Rice Biotechnology, Malacca, Malaysia, September 15-19, 1997で提示された）を選択し、実験のために修飾する：ＧＦＰ遺伝子の前のＣａＭＶ  ３５ＳプロモーターをＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレアーゼで位置９７８８で及び位置１でＮｃｏＩエンドヌクレアーゼでの消化によって除去し、そして該ベクターを２つのコンパチブル末端でレレゲート（relegated)する。位置７６１３でのＸｈｏＩエンドヌクレアーゼで及び位置９４９４でのＢｓｔＸＩでの消化は、ハイグロマイシン遺伝子及びそれの前のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを切除する。３５Ｓプロモーター配列を該ベクターから排除し、ホモロジーに介在された遺伝子サイレンシングのあらゆるリスクを排除する。
１’プロモーター（Mengiste et al., Plant J, 1997, 12(4):945-948)によって駆動されるｂａｒ遺伝子を、選択マーカーとして位置９７３７のＥｃｏＲＩ部位に導入する。取得したベクターをｐＣａｍＢａｒと命名する。
【０１０３】
２．生産された構築物
実施例３に記載したカセットＣｍｐＣＧ及びＣａｐＧを、位置９７６４のＸｂａＩ部位及び位置９７３７のＥｃｏＲＩ部位の間でｐＣａｍＢａｒベクターに挿入し、それぞれｐＣａｍＢａｒＣｍｐＣＧ及びｐＣａｍＢａｒＣａｐＧプラスミドを取得する。２種の構築物を使用し、Agrobacterium tumefaciens細胞を形質転換する。
【０１０４】
実施例１６：Arabidopsis thalianaにおける安定的発現
１．植物生産及びトランスフェクション
Arabidopsis thaliana（コロンビア０）ｗｔ種子を播種し、暗黒で４℃で３日間低温処理し、発芽を斉一化し、そして成長ルームに移動する（２２℃／２４時間光）。開いていない芽（buds)の最大数を生産したとき、発芽した植物をインフィルトレートした。該インフィルトレーションを、Clugh and Bent, Plant J. 16:735-743,1987によって記載されたプロトコルに従って実施する。
【０１０５】
２．トランスジェニック植物の選択
Ｔ１世代種子から取得した実生を、ＢＡＳＴＡ除草剤（Pluess-Staufer AG/SA)(150mg/l)で５日ごとに３回スプレーすることによって選択する。２０のｐＣａｍＢａｒＣｍｐＣＧ及び９のｐＣａｍＢａｒＣａｐＧ抵抗性植物を、選択後に収集する。これらを記載した条件下で成長させ、Ｔ２世代種子を取得する。これらの種子は、ｗｔについて前記と同じ処理を経験し、Ｔ２実生はＢＡＳＴＡスプレーによって選択し、そして抵抗性突然変異体をＧＵＳ遺伝子発現について分析する。
【０１０６】
３．安定的に形質転換されたアラビドプシス植物における組織化学的ＧＵＳ発現
実施例１１に記載のように組織化学的ＧＵＳ染色をする。１５ｍｌ培養管中で、Ｘ−ｇｌｕｃ溶液中の形質転換実生の浸漬、１０分間１３０ｍＢａｒ圧の適用及び３７℃で終夜のインキュベーションによって分析を実施する。ｐＣａｍＢａｒＣｍｐＣＧで形質転換したアラビドプシス植物から得られた結果は、すべての栄養性器官でＣｍｐＣプロモーターによって駆動されるＧＵＳレポーター遺伝子の構成的発現を指摘している。
【０１０７】
４．安定的に形質転換されたアラビドプシス植物の定量的酵素的ＧＵＳアッセイＡ．サンプル調製
トランスジェニック系統当たり４植物及びこれらの植物のそれぞれあたり１葉を試験のために選択する。同じエッペンドルフ管に４葉を収集し、液体窒素で凍結し、そしてディスポーザルグラインダーで微粉末に粉砕する。これを１５０μｌ  ＧＵＳバッファー（０．０５Ｍ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、０．１％  Ｓａｒｋｏｓｙｌ）中に希釈し、３７℃で５分間インキュベートし、そして最大スピードで５分間ミクロ遠心分離で回転させる。上清を新しいエッペンドルフ管に移し、そしてこれらのサンプルを酵素的試験に使用する。これらの植物エキストラクト中のタンパク質を、標準としてＢＳＡを使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法に従って評価する（Bradford, M.M.Anal. Biochem.72:248-254,1976)。突然変異系統におけるプロモーター及びＧＵＳ遺伝子の存在を、テンプレートとして抽出したサンプルを使用してＰＣＲ分析によって確認する。
【０１０８】
Ｂ．蛍光ＧＵＳアッセイ
蛍光ＧＵＳアッセイを、実施例５に記載したようにする。ＧＵＳ遺伝子発現検出のために、サンプルをＧＵＳバッファーに希釈する。反応を、３７℃でＧＵＳ反応バッファーの等量の存在下で実施し、そして２Ｍ  Ａｍｍｅｄｉｏｌで停止させる。活性をTitertek Fluoroskan IIにおいて測定する。
ｐＣａｍＢａｒＣｍｐＣＧで形質転換された選択された系統の２０のうち１５、及びｐＣａｍＢａｒＣａｐＧで形質転換された９系統のうち８は、葉のＧＵＳ酵素的活性を示す。幾つかのＣｍｐＣＧ形質転換系統中の活性のレベルは、ＣａｐＧに匹敵する。しかし、結果は、遺伝子型の相違のために、異なるトランスジェニック系統について変わりうる（遺伝子座の数及び遺伝子座あたりの導入遺伝子挿入の数）。
【０１０９】
実施例１７：ＣｍｐＣプロモーター変異体の構築
すべてのＰＣＲ反応を、実施例１に記載したようにＰｆｕポリメラーゼ(Stratagene)で実施する。
１．ＤＮＡ増幅及びクローニング
２種の変異体である、ｐＣｍｐＣＧプラスミド（実施例３）のｐＣｍｐＭＧ及びｐＣｍｐＭｓＧを、生産する。前者はＣｍｐＣプロモーターの配列「ＧＴＧＧＴＣＣＣ」を欠失し、そして後者は配列「ＧＴＧＣＴＣＧＣ」に突然変異している。ｐＣｍｐＭＧを取得するために、３種ＰＣＲ産物を増幅する：
ＣｍｐＭ１  Ｃｍｐ１フォワードプライマー（実施例３、配列番号１３参照）、ＣｍｐＭｒリバースプライマー（ccatcgtggtatttggtattg、配列番号３３）及びテンプレートしてのｐＣｍｐＣＧプラスミドをテンプレートとして使用する。
【０１１０】
ＣｍｐＭ２  ＣｍｐＭｆフォワードプライマ（caataccaaataccacgatgg、配列番号３４）、ＣｍｐＣ２リバースプライマー（実施例３；配列番号１４参照）及びテンプレートとしてのｐＣｍｐＣＧプラスミドを使用する。
ＣｍｐＭ  Ｃｍｐ１フォワードプライマー、ＣｍｐＣ２リバースプライマー及びテンプレートとしての等モルの混合物のＣｍｐＭ１及びＣｍｐＭ２  ＰＣＲ産物を使用する。
【０１１１】
ｐＣｍｐＭｓＧを取得するために、３種のＰＣＲ産物を増幅する：
ＣｍｐＭｓ１  Ｃｍｐ１フォワードプライー、ＣｍｐＭｒｓリバースプライマー（cgtggtagcgagcactttggt、配列番号３５）及びテンプレートとしてのｐＣｍｐＣＧを使用する。
ＣｍｐＭｓ２  ＣｍｐＭｆｓフォワードプライマー（aagtgctcgctaccacgatgg、配列番号３６）、Ｃｍｐ２リバースプライマー及びテンプレートとしてのｐＣｍｐＣＧプラスミドを使用する
ＣｍｐｓＭ  Ｃｍｐ１フォワードプライマー、Ｃｍｐ２リバースプライマー及びテンプレートしての等モルの混合物のＣｍｐＭｓ１及びＣｍｐＭｓ２ＰＣＲ産物を使用する。
ｐＣｍｐＭＧ及びｐＣｍｐＭｓＧプラスミドを取得するために、もとのｐＣｍｐＣＧプラスミドをＸｂａＩ及びＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼで制限し、ＣｍｐＣフラグメントを排除し、そしてその代わりにＣｍｐＭ及びＣｍｐＭｓ  ＰＣＲ産物を挿入する。
【０１１２】
実施例１８：ｐＣｍｐＭ及びｐＣｍｐＭｓ構築物でのトランジエント発現実験
１．懸濁培養及びプロトプラスト調製
懸濁培養及びプロトプラストを実施例４に記載のように生産する。
２．ＧＵＳアッセイ
トランフェニクション及びタンパク質エキストラクト調製を、実施例４に記載のように実施し、そしてＧＵＳアッセイを実施例５に記載の用に実施する。
ＧＵＳアッセイ結果を、１０の異なる実験の平均から取得し、標準クローン値に標準化した。ＣｍｐＣＧ構築物中の「ＧＴＧＧＴＣＣＣ」配列の欠失は、ＧＵＳレポーター遺伝子の発現を、すべてのプロトプラスト種（以下参照）のＣｍｐＣからのＧＵＳレポーター遺伝子発現の約５０％に減少させる。「ＧＴＧＣＴＣＧＣ」突然変異によって誘導された効果は、植物種に依存する。O. violaceus及びO.sativaプロトプラストにおいて、ＧＵＳ遺伝子発現のレベルは、それぞれ６５．２％及び７３．６％へ減少している。N.plumbaginifoliaプロトプラストにおいて、ＣｍｐＭｓプロモーター活性はＣｍｐＭプロモーターに類似する。
【０１１３】
【表６】
0004739634.tif 000007
【表７】
0004739634.tif 000008
【表８】
0004739634.tif 000009
【０１１４】
実施例１９：ＧＦＰ又はＧＵＳレポーター遺伝子に作動可能に連結された５’−プロモーターフラグメントを含む植物形質転換ベクターの構築
１．プロモーター増幅及びクローニング
キメラ遺伝子を構築し、それは、イントロンを有する植物最適化ＧＦＰ（ｓｙｎＧＦＰＩ、配列番号３７）又はイントロンを有するＧＵＳレポーター遺伝子（ＧＩＧ；配列番号３８）配列に融合された、ＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーター（配列番号１）からのＤＮＡ配列を含む。ＧＩＧ遺伝子は、配列番号３８のｎｔ３８５ないしｎｔ５７６のSolanum tuberosumからのＳＴ−ＬＳ１イントロン（Dr. Stanton Gelvin, Purdue Universityから取得し、そしてNarasimhulu, et al 1996, Plant Cell, 8:876-886.に記載されている）を含む。ＳｙｎＧＦＰＩは、ＳＴ−ＬＳ１イントロンが導入されている（配列番号３７のｎｔ２７８ないしｎｔ４６５）植物最適化ＧＦＰ遺伝子である。プロモーターのために、ＣｍＹＬＣＶゲノムＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためのテンプレートとして使用する。遺伝子特異的プライマーを該ＤＮＡ配列を増幅するために設計する。ＣｍｐＣ（配列番号２）に対応する、遺伝子フラグメントを、Ｃｍｐｆ−Ｂフォワードプライマー（配列番号２９）をリバースプライマーとして５’ないし３’プライマー  cgcggattgctcccttaacaatgagg  （配列番号３９）と組み合わせて使用して単離する。ＣｍｐＳ（配列番号３）に対応する、遺伝子フラグメントを、Ｃｍｐｆ−Ｂ（配列番号２９）フォワードプライマーをＣｍｐＳ−Ｂリバースプライマー（配列番号３０）と組み合わせて使用して単離する。すべての３種のプライマーは、それらの５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素認識部位ＣＧＣＧＧＡを含む。すべてのＰＣＲ反応を製造者の推奨（Stratagene)に従ってＰｆｕポリメラーゼで実施する。サーモサイクラー（ＤＮＡ Engine, MJResearch, Inc. Waltham, MA USA)を使用し、プロモーターフラグメント増幅し、以下のＰＣＲ条件を使用する：[（９４℃：１０ｓ）：（９４℃：１０ｓ／５６℃：３０ｓ／７２℃：１ｍｉｎ）Ｘ２０]：（７２℃：１．５ｍ）]。ＢａｍＨＩでの制限消化に続いて、プロモーターフラグメントをｐＵＣに基づくベクターに、ＧＩＧ遺伝子又はｓｙｎＧＦＰＩ遺伝子とライゲートし、ｎｏｓターミネーターと作動可能に連結されたプロモーター−レポーター遺伝子融合物を作出する。
【０１１５】
２．生産したプロモーター−レポーターカセット
・ＣｍｐＳプロモーターフラグメント＋ｓｙｎＧＦＰＩ遺伝子＋ｎｏｓ（配列番号４０）
・ＣｍｐＳプロモーターフラグメント＋ＧＩＧ遺伝子＋ｎｏｓ（配列番号４１）・ＣｍｐＣプロモーターフラグメント＋ｓｙｎＧＦＰＩ遺伝子＋ｎｏｓ（配列番号４２）
・ＣｍｐＣプロモーターフラグメント＋ＧＩＧ遺伝子＋ｎｏｓ（配列番号４３）
【表９】
0004739634.tif 000010
【０１１６】
３．アグロバクテリウムバイナリーベクターヘのサブクローニング
プロモーターフラグメント、レポーター遺伝子及びｎｏｓターミネーターを含むプロモーター−レポーターカセット（配列番号４０ないし４３）を、トウモロコシのためにバイナリーベクターｐＮＯＶ２１１７及びトマト形質転換のためにバイナリーベクターｐＮＯＶ４２００に挿入する。ｐＮＯＶ２１１７（配列番号４４）は、ＶＳ１複製開始点、バックボーン中のアグロバクテリウムｖｉｒＧ遺伝子の１コピー、及びＴ−ＤＮＡのレフト及びライトボーダーの間のトウモロコシユビキチンプロモーター−ＰＭＩ遺伝子−ｎｏｓターミネーター発現カセットを有するバイナリーベクターである。ＰＭＩ（ホスホマンノースイソメラーゼ）はE.coliｍａｎＡ遺伝子のコード領域である（Joersbo and Okkels, 1996, Plant Cell Reports 16:219-221, Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports19:798-803)。ｎｏｓ（ノパリンシンターゼ）ターミネーターをAgrobacterium tumefaciensＴ−ＤＮＡから取得する（Depicker et al, 1982,J.Mol. Appl.Genet. 1(6),561-573)。トウモロコシユビキチンプロモーター、ホスホマンノースイソメラーゼコード領域及びｎｏｓターミネーターは、それぞれ、ｐＮＯＶ２１１７（配列番号４４）のｎｔ３１ないしｎｔ２０１２、ｎｔ２１０９ないしｎｔ３２１２及びｎｔ３２７３ないし３５２１に位置する。レポーター−プロモーターカセットを、ライトボーダーの近傍に挿入する。バイナリーベクター中の選択マーカー発現カセットは、レフトボーダーの近傍にある。
【０１１７】
トマト形質転換のために、ｐＮＯＶ４２００（配列番号４５）をバイナリーベクターとして使用し、これは、ＶＳ１複製開始点、バックボーン中の１コピーのアグロバクテリウムｖｉｒＧ遺伝子、及びハイグロマイシン選択マーカーカセットであってレフト及びライトボーダー配列の間であるものを含む。ハイグロマイシン選択マーカーカセットは、ハイグロマイシン抵抗性をコードする遺伝子に作動可能に連結された、アラビドプシスユビキチン３プロモーター（Ｕｂｑ３（Ａｔ）、Callis et al., J. Biol. Chem. 265:12486-12493(1990))（ここで「ＨＹＧ」と命名し、E.coliからの合成ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、特許：JP 1986085192-A1 30-APR-1986)及びｎｏｓターミネーター（Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1(6),561-573(1982)を含む。アラビドプシスユビキチンプロモーター、ＨＹＧ遺伝子及びｎｏｓターミネーターは、それぞれｐＮＯＶ４２００（配列番号４５）のｎｔ１６２ないしｎｔ１１４９４、ｎｔ１８９７ないしｎｔ２９３９及びｎｔ２９３９ないしｎｔ３２３６に位置する。レポーター−プロモーターカセット（配列番号４０ないし４３）をライトボーダーの近傍に挿入する。バイナリーベクターの選択マーカー発現カセットはレフトボーダーの近傍である。
バイナリーベクター構築物中の選択マーカー及びプロモーター−レポーターカセットの方向を、以下に示す。
【０１１８】
４．バイナリーベクター構築物：
・ＮＯＶ４２１５（ＲＢ  ＣｍｐＳプロモーターフラグメント＋ｓｙｎＧＦＰＩ遺伝子＋ｎｏｓ−ＺｍＵｂｉ＋ＰＭＩ遺伝子＋ｎｏｓＬＢ）
・ＮＯＶ４２１６（ＲＢ  ｎｏｓ＋ｓｙｎＧＦＰＩ遺伝子＋ＣｍｐＳプロモーターフラグメント−ＺｍＵｂｉ＋ＰＭＩ遺伝子＋ｎｏｓＬＢ）
・ＮＯＶ４２１７（ＲＢ  ＣｍｐＳプロモーターフラグメント＋ｓｙｎＧＦＰＩ遺伝子＋ｎｏｓ−Ｕｂｑ３（Ａｔ）＋ＨＹＧ遺伝子＋ｎｏｓＬＢ）
・ＮＯＶ４２２０（ＲＢ  ＣｍｐＳプロモーターフラグメント＋ＧＩＧ遺伝子＋ｎｏｓ−Ｕｂｑ３（Ａｔ）＋ＨＹＧ遺伝子＋ｎｏｓＬＢ）
・ＮＯＶ４２２４（ＲＢ  ＣｍｐＣプロモーターフラグメント＋ＧＩＧ遺伝子＋ｎｏｓ−ＺｍＵｂｉ＋ＨＹＧ遺伝子＋ｎｏｓＬＢ）
・ＮＯＶ４２２６（ＲＢ  ＣｍｐＣプロモーターフラグメント＋ｓｙｎＧＦＰＩ遺伝子＋ｎｏｓ−ＺｍＵｂｉ＋ＰＭＩ遺伝子＋ｎｏｓＬＢ）
【０１１９】
追加的カセットを、比較のために使用すべき既知のプロモーターと構築する。この目的のために、プロモーターカセット、ＺｍＵｂｉ−ＧＦＰ−３５Ｓｔｅｒｍ（配列番号４６）であって、ｓｙｎＧＦＰ及び３５Ｓターミネーター（３５Ｓｔｅｒｍ）に作動可能に連結された、トウモロコシユビキチンプロモーター（Christensen et al., Plant Molec. Biol. 12:619-632(1989))を含むものを構築し、そしてＧＩＧ遺伝子及びｎｏｓターミネーターに作動可能に連結されたトウモロコシユビキチンプロモーターを含むプロモーターカセット（ＮＯＶ３６１２、配列番号４７）をまた構築する  ＺｍＵｂｉプロモーター、ＧＦＰ遺伝子及び３５Ｓターミネーターは、配列番号４６のそれぞれｎｔ１ないしｎｔ２０１９、ｎｔ２０２０ないしｎｔ２７１５及びｎｔ２８７６ないしｎｔ２９４９に位置する。ＺｍＵｂｉプロモーター、ＧＩＧ遺伝子およびｎｏｓターミネーターは、配列番号４７のそれぞれ、ｎｔ１ないしｎｔ１９８２、ｎｔ２０１５ないしｎｔ４０１５およびｎｔ４０６９ないし４３４１に位置する。ＺｍＵｂｉ−ＧＩＧｎｏｓカセット（配列番号４７）をｐＵＣに基づくベクターにクローニングする。ＺｍＵｂｉ−ＧＦＰ−ｎｏｓカセット（配列番号４６）を前記の様に、トウモロコシ形質転換のためのｐＮＯＶ２１１７バイナリーベクターにクローニングする。
【０１２０】
ｓｙｎＧＦＰＩ及びｎｏｓターミネーターに作動可能に連結されたアラビドプシスユビキチン３プロモーター（Ｕｂｑ３（Ａｔ））（配列番号４８）及びＧＩＧ遺伝子及びｎｏｓターミネーターに作動可能に連結されたアラビドプシスユビキチン３プロモーター（配列番号４９）を構築する。該ユビキチン３プロモーター、ｓｙｎＧＦＰＩ及びｎｏｓターミネーターは、配列番号４８の、それぞれｎｔ１ないしｎｔ１３３２、ｎｔ１７３８ないしｎｔ２６５８及びｎｔ２６７０ないしｎｔ２９４３に位置する。ユビキチン３プロモーター、ＧＩＧ遺伝子およびｎｏｓターミネーターは、配列番号４９のそれぞれ、ｎｔ１ないしｎｔ１３３５、ｎｔ１７４６ないしｎｔ３７４６およびｎｔ３８００ないしｎｔ４０７２に位置する。前記の様に、プロモーターカセットを、トマト形質転換のためのハイグロマイン選択マーカーカセットを含むｐＮＯＶ４２００バイナリーベクターにクローニングする。バイナリーベクターにおける選択マーカー及びプロモーター−レポーターカセットの方向は以下に示す。
【０１２１】
５．バイナリーベクター構築物
・ＮＯＶ２１１０（ＲＢ  ＺｍＵｂｉプロモーター＋ｓｙｎＧＦＰ遺伝子＋３５Ｓｔｅｒｍ−ＺｍＵｂｉ＋ＰＭＩ遺伝子＋ｎｏｓ  ＬＢ）
・ＮＯＶ４２０９（ＲＢ  Ｕｂｑ３（Ａｔ）プロモーター＋ｓｙｎＧＦＩＰ遺伝子＋ｎｏｓ−Ｕｂｑ３（Ａｔ）＋ＨＹＧ遺伝子＋ｎｏｓ  ＬＢ）
・ＮＯＶ４２０８（ＲＢ  Ｕｂｑ３（Ａｔ）プロモーター＋ＧＵＳ−イントロン−ＧＵＳ遺伝子＋ｎｏｓ−Ｕｂｑ３（Ａｔ）＋ＨＹＧ遺伝子＋ｎｏｓ  ＬＢ）
【０１２２】
実施例２０：トウモロコシのアグロバクテリウム介在形質転換
未成熟トウモロコシ胚の形質転換を、Negrotto et al.,(2000)Plant Cell Reports 19:798-803に記載されたように本質的に実施する。この例のために、すべての培地構成成分は、前掲のNegrotto et alに記載された通りである。しかし、文献中の種々の培地構成成分を置換しうる。
【０１２３】
１．形質転換プラスミド及び選択マーカー
形質転換のために使用した遺伝子を、実施例１９に記載したようにトウモロコシ形質転換のために適当なベクターにクローニングする。使用されたベクターは、ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）遺伝子(Negrotto et al., (2000)Plant Cell Reports 19:798-803)を含む。
２．Agrobacterium tumefaciensの調製
植物形質転換プラスミドを含むアグロバクテリウム菌株ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１）を、ＹＥＰ（酵母エキストラクト（５ｇ／Ｌ）、ペプトン（１０ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（５ｇ／Ｌ）、１５ｇ／ｌ  アガー、ｐＨ６．８）固体培地上で２ないし４日間２８℃で成長させる。およそ０．８Ｘ１０９  アグロバクテリウムを、１００μＭ  アセトシリンゴン（Ａｓ）（Negrotto et al., (2000)Plant Cell Rep 19:798-803)で補足したＬＳ−ｉｎｆ培地において懸濁する。細菌をこの培地中で３０−６０分間予め誘導する。
【０１２４】
３．接種
Ａ１８８又は他のトウモロコシ遺伝子型からの未成熟胚を８−１２日齢雌穂から液体ＬＳ−ｉｎｆ＋１００μＭ  Ａｓに切除する。胚を新鮮感染培地で１回リンスする。アグロバクテリウム溶液を次いで添加し、そして胚を３０秒間撹拌し、５分間細菌を据えるに任せる。この胚を次いで、ＬＳＡ培地に胚盤側を上にして移し、そして暗黒で２ないし３日間培養する。次いで、ペトリプレートにつき２０と２５の間の胚を、セフォタキシム（２５０ｍｇ／ｌ）及び硝酸銀（１．６ｍｇ／ｌ）で補足したＬＳＤｃ培地に移し、そして暗黒で２８℃で１０日間培養する。
【０１２５】
４．形質転換細胞の選択及び形質転換植物の再生
肺形成性カルスを生産する未熟胚を、ＬＳＤ１Ｍ０．５Ｓ培地に移す。カルチャーをこの培地上で、３週でサブカルチャーステップとともに、６週間選択する。生存しているカルスをＬＳＤ１Ｍ０．５Ｓ培地又はバルクアップ又はＲｅｇ１培地のいずれかに移す。明条件（１６時間明／８時間暗期方式）での培養に続いて、緑色組織を次いで、成長調節物質のないＲｅｇ２培地に移し、そして１−２週間インキュベートする。プラントレットを、Ｒｅｇ培地を含むMagenta GA-7ボックス（Magenta Crop, Chicaggo III)に移し、そして明条件で成長させる。プロモーター−レポーターカセットについてＰＣＲ陽性である植物を、土壌に移し、グリーンハウスで成長させる。
【０１２６】
実施例２１：トマトの安定的形質転換
トマトの形質転換をMeissner et al., The Plant Journal 12:1465-1472,1997に記載されたように本質的に実施する。
１．形質転換プラスミド及び選択マーカー
形質転換のために使用した遺伝子を、実施例１９に記載したように、トマト形質転換に好適なバイナリーベクターにクローニングする。ベクターは、選択のためのハイグロマイシン抵抗性遺伝子を含む。
【０１２７】
２．Agrobacterium thmefaciensの調製
植物形質転換プラスミドを含むアグロバクテリウム菌株ＧＶ３１０１を、ＬＢ（酵母エキストラクト（５ｇ／Ｌ）、ペプトン（１０ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（５ｇ／Ｌ）、１５ｇ／Ｌ  アガー、ｐＨ６．８）液体培地上で２週間２２℃で成長させる。近似的に０．８Ｘ１０９アグロバクテリウムを、１００μＭ  アセトシリンゴンで補足した、ＫＣＭＳ接種培地（ＭＳ塩（４．３ｇ／ｌ）、Ｍｙｏ−Ｉｎｏｓｉｔｏｌ、チアミン（１.３μｇ／ｍｌ）、２，４−Ｄ（０．２μｇ／ｍｌ）、カイネチン  ０．１μｇ／ｍｌ及び３％  スクロース、ｐＨ５．５）において懸濁する。細菌をこの培地中で６０分間予め誘導する。
【０１２８】
３．種子滅菌及び発芽
トマトのＭｉｃｒｏ−Ｔｏｍ品種の種子（Meissner et al., The Plant Journal 12:1465-1472, 1997)及びＺＴＶ−８４０品種を、Ｔｗｅｅｎ２０と２０％  ブリーチ溶液に２０分間浸漬する。種子を次いで、滅菌水で３回洗浄し、そしてＴＳＧ培地（１／２ＭＳ塩、１％  スクロース、１％  ファイトアガー、ｐH５．８）上に、発芽のためにMagentaボックス（Magenta Crop, Chicago III)においておく。子葉を切除し、そして子葉軸（cotyledon petioles）を、発芽７ないし１０日後に５ｍｍセグメントに切断する。
【０１２９】
４．接種
７ないし１０日齢子葉及び子葉軸セグメントを、アグロバクテリウム接種に先立ち、タバコＢＹ−２フィーダー細胞プレート（MS塩、Ｍｙｏ−ｉｎｓｉｔｏｌ  ０．１ｍｇ／ｍｌ、カゼインヒドロライセート  ０．２ｍｇ／ｍｌ、チアミン−ＨＣｌ  １．３μｇ／ｍｌ、３％  スクロース、ｐＨ５．５）上で２４時間インキュベートする。
子葉を液体ＫＣＭＳアグロバクテリウム懸濁液に５分間浸す。２０と２５の間の子葉を次いで、胚軸側を上にして同じフィーダー細胞プレート上に移し、そして２ないし３日間暗黒下で培養する。
【０１３０】
５．形質転換した子葉及び子葉葉柄の選択及び形質転換植物の再生
子葉及び葉柄(petioles)セグメントを、明条件で、アグロバクテリウムでの接種２ないし３日後、選択培地ＴＳＭ−１（４．３ｇ／ｌ  ＭＳ塩、１ＸＢ５  ビタミン、２％  スクロース、１％  グルコース、１μｇ／ｍｌ  ゼアチン、０．０５μｇ／ｍｌ  ＩＡＡ，５μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシン、及び２５０μｇ／ｍｌ  カルベニシリン、ｐＨ５．８）に移す。胚形成性カルスを生産する子葉及び葉柄セグメントを、TRM培地（４．３ｇ／ｌ  ＭＳ塩、１ＸＭＳビタミン、２％  スクロース、１μｇ／ｍｌ  ゼアチン、５μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンおよび２５０μｇ／ｍｌ  カルベニシリン、ｐＨ５．８）に移す。プラントレットを形成する生存しているカルスをＴＲＭ培地（４．３ｇ／ｌ  ＭＳ塩、１ＸＭＳビタミン、２％  スクロース  ｐＨ５．８）を含むMagenta(Magenta Crop, Chicago III）に移し、そして明条件で成長させる。一次根形成後、形質転換体を土壌に移す。
【０１３１】
実施例２２：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）蛍光アッセイ
ｓｙｎＧＦＰ発現の検出のために、蛍光アッセイを実施する。安定的に形質転換されたトウモロコシ及びトマトのリーフディスクをドライアイスで凍結する。凍結組織を完全に磨砕し、そして３００μｌのＧＦＰ抽出バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ及び０．１％  Ｓａｒｃｏｓｙｌ）と混合する。エキストラクトを遠心分離によって葉残骸から分離し、透明底の９６ウェル黒色プレートへの移動が続く（Costar3615)。相対的蛍光単位（RFU)を、４６５ｎｍ励起および５１２ｎｍ放射でSpectra Fluor Plus Plate Reader によって測定する。ＧＦＰ活性をＢＣＡアッセイ（Pierceに従って）を使用して測定された総タンパク質に対して標準化する。
【０１３２】
実施例３２：安定に形質転換されたトウモロコシ及びトマト植物の発現分析
１．Zea maysトランスジェニックＴ０植物
GFP発現は、ＺｍＵｂｉプロモーター（ＮＯＶ２１１０）と比較して、ＣｍｐＳプロモーターの制御下で（ＮＯＶ４２１５、ＮＯＶ４２１６）、１０−２０倍より高い。これらの結果を、全部で９３Ｔ０植物を表す４２独立Ｔ０系統の葉サンプルから取得する。
【０１３３】
２．ＧＦＰ  Ｅｌｉｓａアッセイ
定量的サンドイッチイムノアッセイを緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の検出のために実施する。２種の商業的に入手可能なポリクローナル抗体を使用する。ヤギ抗ＧＦＰ  ＩＡＰ（Rockland,#600-1-1-215)をイムノアフィニティ精製し、そしてウサギ抗ＧＦＰ抗体(Torrey Pines Biolabs, #TP401）はタンパク質Ａ精製する。植物エキストラクト中のＧＦＰタンパク質をウサギ抗体によって固相マイクロタイターに捕捉する。次いで「サンドイッチ」を固相ウサギ抗体、ＧＦＰタンパク質、及びウェル中の第２のヤギ抗体の間に形成する。洗浄ステップ後、ここで非結合の第２抗体を除去し、結合抗体をアルカリフォスファターゼ標識した抗体を使用して検出する。酵素のための基質を転化し、そして呈色発生をそれぞれのウェルの吸光度を読むことによって測定する。読みを次いで、標準曲線に適合させ、吸光度に対するＧＦＰ濃度値をプロットする。
【０１３４】
【表１０】
0004739634.tif 000011
【０１３５】
２．Lycopersicon esculentumＴ０植物
ＣｍＹＬＣＶプロモーターのＣｍｐＳフラグメント（ＮＯＶ４２１７）は、アラビドプシス（ＮＯＶ４２０９）のＵｂｑ３プロモーターの発現レベルよりも(then)有意に高いｓｙｎＧＦＰ発現レベルという結果である。
【０１３６】
ｓｙｎＧＦＰレポーター遺伝子
結果を、ＮＯＶ４２１７カセットで形質転換した５独立的安定的形質転換カルス系統及びＮＯＶ４２０９カセットで形質転換した２独立的安定的形質転換カルス系統の、カルス及び一次シュートの顕微鏡観察法によってｓｙｎＧＦＰ蛍光の強度を評価することから取得する。
【０１３７】
【表１１】
0004739634.tif 000012
【０１３８】
Ｇｕｓ−イントロン−ＧＵＳレポーター遺伝子
毛ｋｋをＣｍｐＳプロモーター−レポーターカセットを含む１１独立的安定的形質転換カルス系統（系統ＮＯＶ４２２０−１ないしＮＯＶ４２２０−１１）のＧＵＳ染色の強度を評価することから取得する。ＣｍＹＬＣＶプロモーターのＣｍｐＣプロモーターフラグメントを含む２安定的形質転換カルス系統（ＮＯＶ４２２４−１、ＮＯＶ４２２４−２）を評価する。比較のために、アラビドプシスユビキチン３（Ｕｂｑ３）プロモーター（ＮＯＶ４２０８−１、ＮＯＶ４２０８−２）を含む２安定的形質転換カルス系統を評価する。
【０１３９】
【表１２】
0004739634.tif 000013
【０１４０】
【表１３】
0004739634.tif 000014
【０１４１】
実施例２４：トウモロコシのトランジエント発現実験
１．胚調製
Ａ１８８又は他の好適なトウモロコシ遺伝子型からの未成熟胚を８−１２日齢雌穂から液体２ＤＧ４＋０．５ｄ（１０ｇ／ｌ  マンノースで補足された、２０ｍｇ／ｌグルコースを含むように修飾されたDuncan's D培地 )に切除し、そして１ないし２日間培養する。
２．プラスモリシス
未成熟胚を１２％  スクロース溶液中で、ボンバードメントに先立ち３−４時間インキュベートする。胚をプレート上で８−１０ｍｍ円に配列する。
【０１４２】
３．ボンバードメント
トウモロコシ胚のParticle Bombardmentによるトランスフェクションを、記載されたように（Wright et al., 2001, Plant Cell Reports, In Press)６５０ｐｓｉで５μｇのプラスミドＤＮＡの存在下で実施する。「インプレス」文献の場合は引用しない。論文から詳細をここにとりあげる：
フラグメントＤＮＡをDupont Biolistics Manualに記載されたように金のマイクロキャリアー（＜１μｍ）に沈殿させる。遺伝子を、ＰＤＳ−１０００Ｈｅ iolistics装置を使用して標的組織細胞に送達する。装置のセッティングは、以下の通りである：ラプチュアディスクとマクロキャリアーの間は８ｍｍ、マクロキャリアーとストッピングスクリーンの間は１０ｍｍ及びストッピングスクリーンと標的の間は７ｃｍ。プレートを６５０ｐｓｉ−ラプチュアディスクを使用してＤＮＡコートした粒子で２回撃つ。ヘリウム爆風の衝撃波からの組織損傷を減少させるために、ステンレススチールメッシュであって、水平及び垂直に直線インチあたり２００の開口のもの（Mcmaster-Carr, New Brunswick, NJ）を、ストッピングスクリーンと標的の間に置く。胚を２５℃で４８時間プレート上で培養する。タンパク質エキストラクトをＧＵＳバッファー中で細胞を溶解させることによって調製し、そして遠心分離で清浄化する。
【０１４３】
実施例２５：ＧＵＳアッセイ
ＧＵＳ遺伝子発現の検出のために、組織化学的及び化学蛍光アッセイを実施する。
１．組織化学的β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）アッセイ
トウモロコシ胚及びトマトインビトロカルス系統をＧＵＳアッセイに使用する。胚全体又はカルスの小断片をＧＵＳ染色溶液に浸漬する。ＧＵＳ染色溶液は、１ｍＭ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロナイド（Ｘ−Ｇｌｕｃ, Duchefa, DMSO中の20mMストック）、１００ｍＭ  Ｎａ―フォスフェートバッファーｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、及び０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む。組織サンプルを１−１６時間３７℃でインキュベートする。必要ならば、サンプルを７０％  ＥｔＯＨで数回洗浄し、クロロフィルを除去する。
【０１４４】
２．β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）化学蛍光アッセイ
Ｇｕｓ発現の定量的アッセイのために、ＧＵＳ化学蛍光アッセイを、製造者の指示に従ってＧＵＳ−ＬｉｇｈｔＫｉｔ（Tropix. Inc)を使用して実施する。活性をＬｕｉｍｏｍｅｔｅｒで測定する。
構築物ｐＣｍｐＳ及びｐＣｍｐＭＧでのＧＵＳ結果（実施例１７）を、比較クローン値（ｐＮＯＶ３６１２、実施例１９）に対して標準化する。２つの異なる実験から取得した結果は、ＣｍＹＬＣＶプロモーターにおける８ｂｐ  欠失（ｐＣｍｐＭＧ、実施例１７）が、ｐＣｍｐＳと比較してＧＵＳレポーターの発現レベルに有意に影響を与えないことを示す。
【０１４５】
Z. mays胚におけるトランジエント発現
【表１４】
0004739634.tif 000015
【配列表】
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