(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血心臓組織において血管新生を促進するための医薬の製造における三次元的組織の使用であって、該虚血心臓組織を、繊維芽細胞と繊維芽細胞によって天然に分泌される結合組織タンパク質とを含んでなる三次元的組織と接触させ、該繊維芽細胞は生体適合性のある非生存材料からなる骨組みに接着して実質的に該骨組みを包み込んでおり、該骨組みが該繊維芽細胞によって架橋されている間質腔(interstitial space)を有する三次元的構造を形成している、上記使用。
【請求項２】
三次元的組織が、平滑筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、単球、白血球、プラズマ細胞、肥満細胞及び脂肪細胞からなる群より選択される少なくとも1つの細胞型をさらに含む、請求項１記載の使用。
【請求項３】
骨組みが生分解性材料からなる、請求項１記載の使用。
【請求項４】
生分解性材料が、ポリグリコール酸、腸線縫合糸、セルロース、ゼラチン、コラーゲン又はデキストランである、請求項３記載の使用。
【請求項５】
骨組みが非生分解性材料からなる、請求項１記載の使用。
【請求項６】
非生分解性材料が、ポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ニトロセルロース化合物又は綿である、請求項５記載の使用。
【請求項７】
骨組みが網状である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
三次元的組織が新鮮な培養物から直接得られる、請求項１記載の使用。
【請求項９】
三次元的組織が低温保存されていたものである、請求項１記載の使用。
【請求項１０】
三次元的組織が天然の細胞接着によって虚血心臓組織に接着する、請求項１記載の使用。
【請求項１１】
三次元的組織を、生分解性若しくは非生分解性の縫合糸、生物学的接着剤、合成接着剤、レーザー色素又はヒドロゲルを用いて虚血心臓組織に接着させる、請求項１記載の使用。
【請求項１２】
虚血組織が心外膜のものである、請求項１記載の使用。
【請求項１３】
虚血組織が心筋層のものである、請求項１記載の使用。
【請求項１４】
虚血組織が心内膜のものである、請求項１記載の使用。
【請求項１５】
虚血組織において血管形成を促進するための医薬の製造における三次元的組織の使用であって、該虚血組織を、繊維芽細胞と繊維芽細胞によって天然に分泌される結合組織タンパク質とを含んでなる三次元的組織に接触させ、該繊維芽細胞は生体適合性のある非生存材料からなる骨組みに接着して実質的に該骨組みを包み込んでおり、該骨組みが該繊維芽細胞によって架橋されている間質腔を有する三次元的構造を形成している、上記使用。
【請求項１６】
虚血組織が骨格筋、平滑筋、結合組織又は皮膚のうちの少なくとも1つである、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
三次元的組織が、平滑筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、単球、白血球、プラズマ細胞、肥満細胞及び脂肪細胞からなる群より選択される少なくとも1つの細胞型をさらに含む、請求項１５記載の使用。
【請求項１８】
三次元的組織を、生分解性若しくは非生分解性の縫合糸、生物学的接着剤、合成接着剤、レーザー色素又はヒドロゲルを用いて虚血組織に接着させることをさらに含む、請求項１５記載の使用。
【請求項１９】
繊維芽細胞の起源が胎児である、請求項１又は１５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
1. 緒言
本発明は、組織および器官における血管形成を促進するための方法に関する。該方法は特に、心臓および関連組織ないでの内皮形成および血管新生を促進する三次元的間質組織の移植または接着に関する。
【０００２】
2. 発明の背景
冠状動脈性心臓病は、今日、米国における死亡原因の最も多いものである（米国心臓協会（American Heart Association's）「1999年の心臓および発作の最新の統計（1999 Heart and Stroke Statistical Update)」）。この疾患は、他の心臓血管障害と同様に、動脈の狭窄化および重要な組織への不適切な血流を特徴とする。
【０００３】
疾患のある心臓またはその他の損傷を受けている心臓における血流を改善するための現在用いられている臨床的方法は、冠状バイパス手術、血管形成術、および動脈内膜切除術などの侵襲性外科的技術を含むものである。このような方法は、術中および術後の内在的な危険性が高く、心臓虚血に対する一時的な治療を提供するだけであることが多い。
【０００４】
心臓における外科的方法の予後を改善するための一つの試みにおいて、医者および研究者は、術中の血流を補うためのポンプの使用を試みてきた。しかし、このようなポンプは、術中の一時的な補助的装置として役立つだけであり、これを心臓の状態に対する治療の形態として用いることはできない。
【０００５】
心臓に新しい血管を形成するための組織を導入することが、冠状バイパス術および心臓の血流を改善するための他の外科的方法の一つの代替法、または少なくとも一つの改良法である。この点において、血管内皮増殖因子（VEGF）などの血管新生物質が、新規の血管の形成を促進するために用いられてきた。VEGFを用いて心臓組織における血管形成を促進する一つの試みは、患者の体内に直接このタンパク質を注入することであった。しかし、この試みは、ほとんど成功を収めなかった。
【０００６】
近年、心臓組織をターゲティングして、VEGFの産生をもたらすレトロウイルスベクターの注入によりVEGFを送達するために遺伝子治療的手法が用いられるようになった（Losordoら、1998、Circulation 98:2800-2804）。このin situ 法は、患者の血流および自覚症状を改善し、このことは、心臓組織における血管新生を促進するためのVEGFなどの増殖因子の局所的送達が特定の心臓の状態の処置において治療的価値を有しうることを示唆した。しかし、レトロウイルスを用いるこのような遺伝子治療技術には、内在的な危険性および安全性の懸念がある。さらに、遺伝子治療型の手法には、受容細胞に対するトランスフェクションレベルが低いこと、構築物の不安定性、およびトランスフェクトした細胞から所望の遺伝子産物が長期にわたり発現することなどの、多くの未解決の技術的な難問がある。
【０００７】
3. 発明の概要
本発明は、組織および器官における血管形成を促進するための方法に関する。該方法は特に、心臓および関連組織内での内皮形成および血管新生を促進するための三次元的間質組織の移植または接着に関する。
【０００８】
本発明は、限定はしないが、損傷を受けた心筋の修復および再生の促進、心臓手術（例えば、バイパス手術または心臓弁の入れ替え手術）の際の血管新生および回復の促進、吻合部位における血管形成の促進、および損傷を受けた骨格筋、平滑筋、または結合組織の血管新生および修復の促進を含む様々な用途を有している。
【０００９】
本発明は、三次元的間質組織構築物を糖尿病性足肢潰瘍を患っている患者の損傷部に埋め込むと、迅速な内皮形成および血管新生を誘導し、新規の毛細血管形成および損傷組織の炎症の低減をもたらすことができるという発見に部分的に基づいている。
【００１０】
三次元的間質組織移植片は、組織の再生および血管新生に重要であることが知られている様々な増殖因子、特に、血管内皮増殖因子（またはVEGFと称する）を分泌する(表II)。これらの生成物を、損傷を受けた心筋などの他の損傷を受けた組織に適用することは、その部位への新規の局所的血管供給を誘導し、組織の迅速な再構築を助長する。
【００１１】
三次元的間質組織移植片を用いて、「天然の」頸動脈バイパスの形成を促進することができ、頸動脈動脈内膜切除術（その過程の際に切除される小片の下流の血流により、ストーク(stoke)が起こる場合が多い）を補助し、またはその必要性を減らしうる。
【００１２】
4. 図面の簡単な説明
図面の簡単な説明については、後述する。
【００１３】
5. 発明の説明
本発明は、被検体、特にヒト被検体における、組織および器官における血管形成を促進するための方法に関する。該方法は特に、心臓および関連組織内での内皮形成および血管新生を促進するための作製された三次元的間質組織の埋め込みまたは接着に関する。
【００１４】
本発明は、限定はしないが、損傷を受けた心筋の修復および再生の促進、心臓手術（例えば、バイパス手術または心臓弁の入れ替え手術）の血管新生および回復の促進、接合部位における血管形成の促進、および損傷を受けた骨格筋、結合組織、または他の組織の血管新生および修復の促進を含む様々な用途を有する。
【００１５】
本発明は、三次元的間質組織を糖尿病性足肢潰瘍を患っている患者の損傷部に埋め込むと、迅速な内皮形成および血管形成を誘導し、新規の毛細血管形成および損傷組織の炎症の低減をもたらすことができるという発見に部分的に基づいている。
【００１６】
この三次元的間質組織は、三次元的基質または骨組み上で増殖させた間質細胞を含む。該間質細胞は、他の細胞および/または本明細書中に詳細に後述する成分を含有するまたは含有しない線維芽細胞を含むことが好ましい。特に、この他の細胞には、平滑筋細胞、心筋細胞、または骨格筋細胞が含まれうる。線維芽細胞および/または他の細胞は、胎児または成体に由来してよく、皮膚、心筋、平滑筋、骨格筋、肝臓、膵臓などの簡便な供給源に由来してよい。このような組織およびまたは器官は、適切な生検もしくは剖検によって入手できる。実際に、死体の組織を用いて、間質細胞および成分の豊富な供給が提供されうる。
【００１７】
当業者であれば血管新生因子を異なるレベルで放出する細胞を組み込むことにより、間質組織培養の血管新生活性を制御しうることは理解できるであろう。例えば、血管平滑筋細胞、好ましくは、大動脈平滑筋細胞がヒト真皮線維芽細胞より多くのVEGFを実質的に産生することは、公知である。従って、大動脈平滑筋細胞を繊維芽細胞に代えてまたは線維芽細胞に加えて用いることにより、血管新生活性の増大した三次元的間質組織を培養できる。
【００１８】
本発明の他の実施形態では、血管新生を誘導する特性が改善された遺伝子学的に操作した三次元的間質組織移植片を用いて、心臓または他の組織における新規の血管の形成を促進することができる。
【００１９】
5.1.  三次元的間質組織の調製
本発明の実施のために、間質細胞を三次元的骨組み上に接種し、増殖させ、間質組織を発達させた。その三次元的支持体の骨組みは次のようなものであればいかなる材料および/もしくは形状のものであってもよい：(a) 細胞が接着することができる(もしくは細胞が接着しうるように改変することができる)；および、(b) 細胞が1層以上の層に増殖しうる。あるいはまた、実質的に2次元的なシートもしくは膜を用いて細胞の単層培養ができる。
【００２０】
多様な材料を用い手骨組みを形成することができ、そのようなものとしては限定はされないが：ナイロン(ポリアミド)、ダクロン(ポリエステル)、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル化合物(例えば、ポリ塩化ビニル；PVC)、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE; テフロン(登録商標）)、サーマノックス（thermanox、TPX)、ニトロセルロース、綿、ポリグリコール酸(PGA)、腸線縫合糸、セルロース、ゼラチン、デキストラン、その他が挙げられる。これらの材料のどれでも網状に織って三次元的骨組みを作ることができる。ナイロン、ポリスチレンなどの特定の材料は細胞接着の基質としての性質に乏しい。これらの材料を三次元的支持骨組みとして用いる場合には、間質細胞の骨組みへの接着を増大させるために間質細胞の接種前に該骨組みを前処理しておくとよい。例えば、間質細胞の接種前にナイロンスクリーンを0.1Mの酢酸で処理し、ポリリジン、ウシ胎児血清、および/またはコラーゲン中でインキュベートしてナイロンコートすることができる。
【００２１】
三次元的間質組織を直接的にin vivoに埋め込む際には、生分解性のある材料、例えばPGA、腸線縫合糸材料、コラーゲン、ポリ乳酸、またはヒアルロン酸などを用いることが好ましい。例えば、これらの材料を、例えばコラーゲンスポンジ、またはコラーゲンゲルなどの三次元的骨組みに織りあげることができる。培養物が長期にわたって維持されるかもしくは低温保存される場合には、ナイロン、ダクロン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリビニル、テフロン、綿などの非分解性の材料が好ましい。本発明に用いることのできる便利なナイロン網はNitexであり、これは平均孔径が140μmでナイロン線維の直径の平均が90μmのナイロン濾過網である(#3-210/36、Tetko, Inc., N.Y.)。
【００２２】
線維芽細胞を含み、後述する他の細胞および成分を含むまたはこれらを含まない間質細胞を該骨組み上に接種する。これらの間質細胞は、皮膚、心臓、血管、骨格筋、肝臓、膵臓などの組織または器官に由来するものでよく、それらは生検(それが適切なものであれば)、または剖検時に得ることができる。事実、線維芽細胞およびその他の間質細胞は死体の器官の適切なものならばいかなるものからでも都合よく大量に得ることができる。既に説明したとおり、胎児線維芽細胞を用いて、「一般的な」三次元的間質組織を形成でき、接触する多種多様な細胞および/または組織の生育を助長する。しかし、心臓および/または特定の個体、その個体とは後に本発明の三次元的培養法での培養物中で増殖させた細胞および/または組織を受け取ることとなる個体であるが、それらに由来する間質細胞を三次元的骨組みに接種することによって「特異的な」間質組織を調製できる。
【００２３】
間質細胞は適切な器官もしくは組織を解離させることによって容易に単離することができる。この解離は、当業者には公知の技法を用いて容易に行いうる。例えば、組織または器官を機械的に解離する、ならびに/または隣接する細胞間の連結を脆弱化させるような消化酵素および/もしくはキレート剤によって処理し、細胞の破損をあまり起こすことなく個々の細胞の懸濁液へと該組織を分散させることができる。酵素的な解離は、組織を細片化しその細片化組織を任意の種々の消化酵素を単独でもしくは組み合わせて用いて処理することにより得ることができる。そのような酵素としては、限定はされないが、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、および/もしくはヒアルロニダーゼ、DNase、プロナーゼ、ジスパーゼ(dispase)などが挙げられる。機械的な破壊も種々の方法で行うことができ、そのようなものとしては限定はされないが、多数あるうちの少数ながら挙げるとすると、グラインダー、ブレンダー、ふるい、ホモゲナイザー、圧力セル、もしくはインソネーター（insonator）がある。組織解離技法の総説としては、Freshney 「動物細胞の培養 (Culture of Animal Cells)」,「基本技法マニュアル( A Manual of Basic Technique)」, 第2版, A.R.Liss, Inc., New York, 1987, 第9章, pp.107-126を参照のこと。
【００２４】
組織を個々の細胞の懸濁液とした後、その懸濁液を、線維芽細胞および/もしくはその他の間質細胞、ならびに/または成分を得るためのサブポピュレーションに分画する。これは細胞分離のための標準的な技法を用いて行うことができ、そのような方法としては、限定はされないが、特定の細胞型のクローニングおよび選択、望ましくない細胞の選択的破壊(負の選択)、混合集団中での細胞凝集能の差異に基づく分離、凍結融解手法、混合集団中での細胞の接着特性の相違、ろ過、従来法およびゾーン遠心法、遠心エルトリエーション(centrifugal elutriation: カウンターストリーミング遠心法（counter-streaming centrifugation）)、単位重力分離法(unit gravity separation)、向流分配法、電気泳動、および蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)が挙げられる。クローン選択と細胞分離技法に関する総説はFreshney 「動物細胞の培養(Culture of Animal Cells)」,「基本技法マニュアル(A Manual of Basic Technique)」, 第2版, A.R.Liss, Inc., New York, 1987, 第11および第12章, pp.107-126を参照せよ。
【００２５】
間質細胞の単離は、例えば、次のように行うことができる：新鮮な組織サンプルを十分に洗浄し、血清を除去するためにハンクス平衡塩類溶液(HBSS)中で細片化した。細片化組織を、新たに調製したトリプシンなどの分解酵素溶液中で1〜12時間インキュベートする。そのインキュベーションの後、分離した細胞を懸濁し、遠心してペレットとし、培養ディッシュ上にプレーティングする。全ての間質細胞が他の細胞より先に接着するので、適切な間質細胞を選択的に単離し増殖させることができる。次いで単離された間質細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、コンフルエントな培養物から採取して、三次元的骨組み上に接種することができる(米国特許第4,963,489号；Naughtonら, 1987, J. Med. 18 (3&4):219-250)。三次元的骨組みへの高濃度の間質細胞、例えば、１mL当たり約10６〜5 x 10７個の細胞を接種することで、より短時間での三次元的間質組織の確立をもたらすであろう。
【００２６】
線維芽細胞に加えて、培養物の長期にわたる増殖を支えるのに必要な三次元的間質組織を作るためにその他の細胞を加えることができる。例えば、疎性結合組織中に認められる他の細胞を、三次元的骨組み上の線維芽細胞と共に、もしくは線維芽細胞の替わりに接種することができる。そのような細胞としては限定はされないが、内皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、単球、脂肪細胞、平滑筋細胞、心筋細胞その他が挙げられる。このような細胞は線維芽細胞のない状態で三次元的骨組み上に接種することができる。これらの間質細胞は、皮膚、心臓、血管などの適切な組織もしくは器官から、上述の方法などの当業界では公知の方法を用いて容易に得ることができる。本発明の特定の1実施形態においては、線維芽細胞が骨組み上に接種される。
【００２７】
当業者であれば血管新生因子を異なるレベルの放出する細胞を組み込むことにより、間質組織培養物の血管新生活性を制御しうることは理解されよう。例えば、血管平滑筋細胞、好ましくは大動脈平滑筋細胞が、ヒト真皮線維芽細胞より多量のVEGFを実質的に産生することが公知である。従って、大動脈平滑筋細胞を線維芽細胞に代えてまたは線維芽細胞に加えて用いることにより、血管新生活性の増大した三次元的間質組織を培養できる。
【００２８】
また、培養細胞がin vivoでの移植もしくは埋め込みに用いられることとなるものである場合には、その患者自身の組織の間質細胞を得ることが好ましい。三次元的支持体骨組みの存在下での細胞増殖を、さらにタンパク質(例えば、コラーゲン、エラスチン線維、細網線維、糖蛋白質、グルコサミノグリカン(例えば、硫酸ヘパラン、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸など)、細胞性マトリクス、および/もしくはその他の材料をその骨組みに添加するか、または骨組みにコーティングすることによって増強することができる。
【００２９】
間質細胞を接種した後、三次元的骨組みを適切な栄養培地中でインキュベートしなければならない。多数の市販の培地、(例えばRPMI 1640、フィッシャー培地、イスコフ培地、マッコイ培地、および類似のものなどが使用に適している。増殖活性を最大にするためにインキュベーション時はずっと三次元的間質組織が培地中に懸濁されていることが重要である。さらに、消耗された培地を除去し、遊離の細胞を取り出し、新鮮な培地を添加して、定期的に栄養補給すべきである。インキュベーションの間、間質細胞はその骨組みの繊維に沿って直線的に増殖し、三次元的骨組みの開口部内への増殖が始まる前に、その骨組みを包み込む。
【００３０】
骨組みの開口部は間質細胞がその開口部をまたいで広がることができるような適切な大きさであるべきである。骨組みをまたいで広がる間質細胞の活発な増殖を維持することによって、間質細胞によってなされる成長因子の産生が増大し、それゆえに長期にわたる培養が実施可能となる。例えば、開口部が小さすぎれば、間質細胞は急速にコンフルエントとなるが、メッシュから出ていくことが容易ではなくなる；捕捉された細胞は接触阻害を示し、それは増殖を持続させ長期にわたる培養の維持に必要な適当な因子の産生が止まる可能性がある。開口部が大きすぎれば、間質細胞が開口部をまたいで広がることができなくなる可能性がある；このこともまた間質細胞の増殖を持続させ長期にわたる培養の維持に必要な適当な因子の産生を減少させうる。本明細書に例示したようなメッシュタイプの骨組みを用いる場合には、約140μm〜約220μmの範囲の開口部が満足できる作用を示すことがわかった。しかし、その骨組みの三次元構造および複雑性に応じて、他の大きさの開口部も同様に利用できる場合がある。事実、間質細胞が広がり長期間にわたって複製および増殖を継続させることのできる形態もしくは構造ならどんなものでも、本発明に利用できるであろう。
【００３１】
種々のタイプのコラーゲンを様々な比率でその骨組み上に蓄積させると、三次元的間質組織と接触する細胞の増殖に影響を及ぼしうる。適切な型のコラーゲンを生成する線維芽細胞を選択することによって、蓄積される細胞外マトリックス(ECM)タンパク質の割合を操作、もしくは増大させることができる。このことは、補体を活性化することができる適切なモノクローナル抗体のアイソタイプもしくはサブクラスを用いて行うことができ、それは特定のコラーゲンの型を決定するものである。これらの抗体および補体は、所望の型のコラーゲンを発現している線維芽細胞の負の選択に用いることができる。あるいはまた、骨組みに接種するために用いられる間質細胞を、所望の適切な型のコラーゲンを合成する細胞との混合物とすることができる。種々の型のコラーゲンの分布と起源を表Iに示す。
【００３２】
【表１】
0004709393.tif 000002
このように、本明細書で述べた三次元的培養系は種々の細胞型および組織の増殖に適したものであり、培養すべき組織および所望のコラーゲンの型によって三次元的骨組みへの接種に適切な間質細胞を選択することができる。
【００３３】
三次元的間質組織支持体のインキュベーション中に増殖した細胞が骨組みから遊離し得る。これらの遊離した細胞は培養容器の壁面に付着し、そこで増殖し続けコンフルエントな単層を形成する。このことは、例えば栄養補給の際に遊離した細胞を除去するか、もしくは三次元的間質組織を新たな培養容器に移すことによって防止もしくは最小限にとどめられるはずである。容器中にコンフルエントな単層が存在すれば三次元的培養中の細胞の増殖を止めてしまう可能性がある。コンフルエントな単層を除去するかもしくは間質組織を新しい容器中の新鮮な培地へ移すことで三次元的培養系の増殖能が回復するであろう。間質細胞の単層がコンフルエントの25%を超えた培養容器では、このような除去もしくは移動を行うべきである。あるいはまた、遊離した細胞の接着を防止するために攪拌するか、もしくは定期的に栄養を与える替わりに新鮮な培地が連続的にそのシステム内を流れるように設定することも可能であろう。その場合の流速は三次元的培養物の増殖を最大とし、かつ、その培養物から遊離した細胞を洗い流して除去することがかなうように調整して、遊離した細胞が容器の壁面に付着してコンフルエントとならないようにすることができる。いずれの場合も、将来的な使用のために遊離した間質細胞を集め、低温保存することができる。
【００３４】
5.2 遺伝子操作された三次元的間質組織の調製
遺伝子操作された三次元的間質組織は米国特許第5,785,964号に述べられている方法で調製することができ、この特許は本明細書中に参照により組み入れることとする。遺伝子操作された間質組織はin vivoで血管新生因子の持続的放出用の遺伝子送達ビヒクルとして作用することができる。
【００３５】
間質細胞が外来性遺伝子産物を発現するように遺伝子操作することができる。遺伝子操作できる間質細胞としては、限定はされないが、線維芽細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、間充織幹細胞、および内皮細胞などの疎性結合組織中に見出されるその他の細胞、マクロファージ、単球、脂肪細胞、周皮細胞、骨髄に見出される細網細胞、その他を挙げることができる。
【００３６】
細胞および組織を遺伝子操作し、広範な機能を加えることができる標的遺伝子産物を発現させることができるが、そのような機能としては、限定はされないが、その遺伝子操作した細胞および組織がin vivoに埋め込まれると血管新生を促進する機能を増強することが挙げられる。標的遺伝子産物は、酵素、ホルモン、サイトカイン、転写因子もしくはDNA結合タンパク質などの調節タンパク質、細胞表面タンパク質などの構造タンパク質などのペプチドもしくはタンパク質であってよく、または標的遺伝子産物はリボザイムもしくはアンチセンス分子などの核酸であってもよい。
【００３７】
好ましい実施形態においては、遺伝子操作された細胞に対して増強された特性を提供するような標的遺伝子産物としては、限定はされないが、細胞増殖を増強する遺伝子産物、例えば、血管内皮増殖因子(VEGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、上皮増殖因子(EGF)、およびトランスフォーミング成長因子(TGF)が挙げられる。別の好ましい1つの実施形態においては、細胞および組織を遺伝子操作して細胞の不死化をもたらす標的遺伝子産物（例えば、腫瘍遺伝子もしくはテロメラーゼ）を発現させる。また別の1つの実施形態においては、細胞を遺伝子操作して合図があれば自殺する自殺遺伝子産物（例えばチミジンキナーゼ）を発現させることができる。
【００３８】
別の好ましい1つの実施形態においては、細胞および組織を遺伝子操作し、低温保存性および乾燥に対する抵抗性などのin vitroでの防御機能を提供するような遺伝子産物（例えば、トレハロース）を発現させる(米国特許第4,891,319号、米国特許第5,290,765号、米国特許第5,693,788号)。本発明の細胞および組織はまた、遺伝子操作することによってin vivoでの防御機能を提供する遺伝子産物、例えばHLAエピトープ、主要組織適合性エピトープ、免疫グロブリンおよび受容体エピトープ、細胞接着分子のエピトープ、サイトカインおよびケモカインなどの、炎症性反応から細胞を防御するもの、および宿主免疫系による拒絶反応に対して防御するものなどを発現させることができる。
【００３９】
遺伝子操作によって標的遺伝子産物を本発明の細胞および組織で発現させるには多数の方法がある。標的遺伝子産物は遺伝子操作によって持続的に発現するように、または組織特異的もしくは刺激特異的な様式で発現するようにすることができる。本発明のこの態様においては、この標的遺伝子産物をコードする核酸配列は機能しうる形でプロモーターエレメントと連結することができ、それは構成的に活性なもの、組織特異的なもの、もしくは特定の刺激の存在によって誘導されるものである。
【００４０】
特定の1つの実施形態においては、標的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、剪断(shear)ストレスもしくは方向応応力に対して応答性の調節性プロモーターエレメントに機能しうる形で連結される。この場合には、そのプロモーターエレメントは血流を流すこと(剪断)ならびに心臓もしくは血管を通って流れる拍動性の血流の結果として誘導される方向応力によってスイッチが入る。
【００４１】
その他の調節性プロモーターエレメントの例としては、テトラサイクリン応答性エレメント、ニコチン応答性エレメント、インシュリン応答性エレメント、グルコース応答性エレメント、インターフェロン応答性エレメント、グルココルチコイド応答性エレメント、エストロゲン/プロゲステロン応答性エレメント、レチノイド酸応答性エレメント、ウイルストランスアクチベーター、SV40アデノウイルスの初期もしくは後期プロモーター、lac系、trp系、TAC系、TRC系、3-ホスホグリセリン酸のプロモーター、および酸性ホスファターゼのプロモーターを挙げることができる。さらに、人工の応答エレメントを構築することができ、それは、天然に存在するプロモーターおよびエンハンサーの分子的構成と類似の転写因子結合部位およびホルモン応答エレメントの多量体からなる(例えば、Herr,W. & Clarke, J. Cell(1986) 45(3):461-70)。そのような人工の複合性調節領域は、何らかの所望のシグナルに応答して、選択したプロモーター/エンハンサー結合部位に応じて特定の細胞型中で発現されるように設計できる。
【００４２】
5.3 血管形成の促進における三次元的間質組織の使用
本発明の三次元的間質組織は、限定はしないが、傷害された心筋の修復および再生の促進、心臓手術(例えば、バイパス手術または心臓弁の入れ替え術)の際の血管新生および回復の促進、吻合部位での血管形成の促進、および傷害を受けた骨格筋、平滑筋、または結合組織の血管新生および修復の促進を含む様々な用途に用いられる。このような用途においては、間質組織は、新たに培養して得た組織として、凍結保存された組織として、もしくは死滅した組織としてでも、用いることができる。
【００４３】
本発明の三次元的間質組織は、心外膜、心筋、および心内膜を含む心臓の様々な部位に接着させて、接着した領域での血管新生を促進させることができる。接着させる方法としては、限定はされないが、間質組織と心臓組織の間の直接的接着、生物学的接着剤、合成接着剤、レーザー色素、またはヒドロゲルが挙げられる。市販の多数の止血剤およびシーラントとしては、"SURGICAL"(酸化セルロース)、"ACTIFOAM"(コラーゲン)、"FIBRX"(光活性化フィブリンシーラント)、"BOHEAL"(フィブリンシーラント)、"FIBROCAPS"(乾燥粉末フィブリンシーラント)、多糖類ポリマーp-GLcNAc("SYVEC" パッチ；Marine Polymer Technologies)、Polymer 27CK (Protein Polymer Tech.)が挙げられる。患者の血液120mLから自己由来のフィブリンシーラントを手術室で1時間半で調製するための医療器具および装置も知られている(例えば、Vivostatシステム)。
【００４４】
直接的接着を用いる本発明の1つの実施形態においては、三次元的間質組織は心臓もしくは隣接する血管に置き、該産物は天然の細胞接着を介して接着する。この方法は糖尿病性足肢潰瘍を有する患者の創傷治癒の研究で用いられてきた。
【００４５】
好ましい1つの実施形態においては、三次元的間質組織は心臓もしくは隣接する血管に手術用接着剤、好ましくはフィブリン接着剤などの生物学的な接着剤を用いて接着させる。フィブリン接着剤を手術用接着剤として用いることはよく知られている。フィブリン接着剤の組成は既知であり(例えば米国特許第4,414,971号、第4,627,879号、および第5,290,552号を参照せよ)、フィブリンの由来を自己のものとすることができる(例えば米国特許第5,643,192号を参照せよ)。その接着剤の組成にはさらに別の成分、例えば1種以上の作用物質もしくは薬剤を含有するリポソームなどを含ませることもでき(例えば米国特許第4,359,049号および第5,605,541号を参照せよ)、接着剤を注射すること(例えば米国特許第4,874,368号を参照せよ)、もしくは噴霧すること(例えば米国特許第5,368,563号および第5,759,171号を参照せよ)ができる。フィブリン接着剤組成物を適用するためのキットも入手しうる(例えば米国特許第5,318,524号を参照せよ)。
【００４６】
別の1つの実施形態においては、レーザー色素を心臓および/もしくは血管壁、三次元的間質組織、またはその双方に適用し、適切な波長のレーザーを用いて活性化して組織に接着させる。好ましい実施形態においては、そのレーザー色素は組織の機能もしくは完全性に変化を与えない範囲の活性化周波数を有する。例えば、800nmの光は組織および赤血球を透過する。インドシアングリーン(ICG)をレーザー色素として用いると、組織を透過するレーザー波長を用いることができる。5mg/mLのICG溶液を三次元的間質組織(または標的部位)の表面上に塗布するとICGは組織のコラーゲンと結合する。ピーク強度が800nm近傍の光を照射するレーザーからの5msのパルスをレーザー色素の活性化に用いると、改変された表面に近接する組織のエラスチンと融合するコラーゲンの変性をもたらす。
【００４７】
別の1つの実施形態においては、三次元的間質組織はヒドロゲルを用いて心臓もしくは血管に接着させる。多数の天然および合成ポリマー材料が適切なヒドロゲルの組成物を構成するために十分なものとして用いられる。例えば、アルギン酸塩などのポリサッカリドを2価の陽イオンを用いて架橋させることができ、ポリホスファゼンおよびポリアクリレートはイオン的に架橋するか、もしくは紫外光による重合体化により架橋させる(米国特許第5,709,854号)。あるいはまた、2-オクチルシアノアクリレートなどの合成手術用接着剤("DERMABOND", Ethicon, Inc., Somerville, 米国ニュージャージー州)を三次元的間質組織の接着のために用いることができる。
【００４８】
本発明のまた別の1つの実施形態においては、三次元的間質組織は心臓もしくは血管に1つ以上の縫合を用いて固定されるが、そのような縫合としては、限定はされないが、5-O、6-O、および7-Oプロリン縫合糸(Ethicon社カタログ番号8713H, 8714H, および8701H)、またはその他の適切な非生物分解性もしくは生物分解性縫合材料、例えばポリグレカプロン(poliglecaprone)、ポリジオキサノン(polydioxanone)、もしくはポリグラクチン(polyglactin)などが挙げられる。縫合する際にはダブルアームの縫合針が典型的には用いられるが、それでなければならないというわけではない。
【００４９】
別の1つの実施形態においては、三次元的間質組織はバイオリアクターシステム中で増殖させ(例えば、米国特許第5,763,267号および第5,843,766号)、そのシステムでは、骨組みは作製される組織最終産物よりやや大きなものとなる。最終産物は足場となる材料のへり、１つの端、折り返し、もしくはタブが含まれており、それは生物学的/合成接着剤、レーザー色素、もしくはヒドロゲルを適用する部位として用いられる。また別の実施形態においては、その組み上げた骨格は、縫合もしくは微小縫合のための接着部として用いることができる。
【００５０】
三次元的間質組織は血管新生の促進、傷害を受けた心筋の修復および再生を促進するために埋め込むことができる。好ましい1つの実施形態においては、その三次元的間質組織は血管に適用され、詰まったもしくは血流を遮られた動脈を迂回するための新たな血管を形成させて心臓への血流を回復させる。別の1つの実施形態においては、三次元的間質組織は侵襲を最小限に抑えた方法を用いて心臓に直接適用される。この組織は、心筋梗塞後の心臓組織の壊死を最小限とするため、血管新生を促進して血流をもたらすために適用することができる。三次元的間質組織を心外膜もしくは心筋に接着させる際には、適用前に心膜を開いておく必要がある。しかし、心内膜への三次元的間質組織のパッチの接着はカテーテルもしくは類似の器具を心臓の心室へ挿入して間質パッチを心室の壁面に接着させることができる。接着させる部位が良好な血流を有し、血管新生を助長することができることが好ましい。
【００５１】
三次元的間質組織の血管新生活性はまた、吻合にも用いることができる。吻合とは、2つの中空の、もしくは管状の構造、または手術、外傷もしくは疾病によって2つ以上の別々の場所もしくは器官の間にできた開口部を手術によって結び合わせることと定義される(例えば、Stedman's Medical Dictionary, 第26版、Williams & Wilkins, Baltimore, 米国メリーランド州を参照せよ)。例えば、吻合部位は、冠状動脈バイパス術(CABG)時、腸切除、もしくは臓器移植時の血管移植の導入により生じる。CABG術では三次元的間質組織をバイパス移植片の接着部の下流の部位に置き、その部位への血流の回復にあたって血管形成を促進するが、すなわち、その部位の治癒を促進することに加えて結合部位からの動脈が追加的に形成されることを意味している。血管領域における例としては、限定はされないが、前毛細血管吻合(細動脈間)、リオラン吻合(中および左結腸動脈と結ばれている結腸の辺縁動脈)、門脈体静脈吻合(上-中/下直腸静脈；門脈-下大静脈)、終末吻合(動脈ら静脈への吻合)、および大静脈-肺動脈吻合(右肺動脈を上大静脈と吻合することによるチアノーゼ性心疾患の治療)を挙げることができる。
【００５２】
1つの実施形態においては、三次元的間質組織は、吻合部位を包み込み、その部位の治癒を促進する(すなわち、内皮形成)。別の1つの実施形態においては、三次元的間質組織の細胞を死滅させ(例えば、凍結および融解で)、その結果得られた産物をその部位に適用する(すなわち、"TRANSCYTE")。
【００５３】
本発明の範囲には、三次元的間質組織を含む血管新生を促進するためのキットおよびその組織を心臓もしくは血管に接着させるための方法をも含む。そのような接着方法としては、手術用接着剤、ヒドロゲル、微小縫合用のあらかじめロードされたプロリン針(preloaded prolene needle)が挙げられる。
【００５４】
6. 実施例：三次元的間質組織で促進される血管新生
この節では、線維芽細胞に基づく三次元的間質組織(「間質組織」)が内皮形成および血管形成を誘導しえたことを説明している。このような生物学的に活性な材料を提供することによって糖尿病性足肢潰瘍を有する患者の創傷部位における新たな末梢血管の形成を誘導し炎症を低減することが観察された。
【００５５】
三次元的間質組織の血管形成性については下記に広範な技法を用いて説明するが、そのような技法としては、ニワトリ漿尿膜アッセイ、ラット大動脈輪アッセイ、内皮細胞増殖刺激、化学運動性、走化性、アポトーシスの阻害、および虚血心臓組織における血管新生のin vivoでの誘導が挙げられる。これらのアッセイを総合すると、血管新生の際の個々の事象ならびにその過程全体をカバーする。
【００５６】
変性コラーゲンがヒト内皮細胞の接着に好適な基質であるということは既に確かめられているが、細胞外マトリックスに存在するフィブロネクチンも内皮細胞の増殖を刺激することが示された。マトリックス内に結合している増殖因子にはTGFβおよびHGFが含まれ、それらは新たな末梢血管形成および内皮形成を刺激することにおいて重要である。そのマトリックスはまた、ラミニン-1を含んでおり、それはYIGSRペプチドを介する初期の肥厚化を阻害する働きがある。これらのマトリックスタンパク質を、天然に分泌される増殖因子と組み合わせることにより、in vivoでの血管新生を誘導する生理学的溶液が得られる。
【００５７】
6.1 材料と方法
6.1.1. 三次元的間質組織による増殖因子の発現
間質組織による血管新生因子の発現を調べるための実験を行った。増殖因子の発現は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるmRNAの測定、および酵素結合免疫吸着法(ELISA)による遊離タンパク質の測定の双方により調べられた。
【００５８】
特定のメッセンジャーRNAを、ABI TaqMan法(Perkin-Elmer, Foster City, 米国カリフォルニア州)を用いて定量的RT-PCRで測定した。RNAを細胞からRapid RNA Purification Kit(Amresco, Solomon, 米国オハイオ州)を用いて抽出した。ランダムヘキサマープライマー(Sigma, St. Louis, 米国ミズーリ州)を用いSuperscript II(Life Technologies, Grand Island, 米国ニューヨーク州)により逆転写を行った。200ngの総RNAを含むcDNAのサンプルの増幅を経時的に検出し、40〜4,000,000/反応という5桁の範囲のコピー数を用いて、プラスミド由来の特異的mRNA配列の標準物の増幅と比較した。逆転写の精製及び効率は、PDGF B鎖、VEGF、もしくはTGFβ1のmRNA配列をRNA単離物に加え、収率をTaqMan法で測定した。対照のmRNA配列は、対応する配列を含むプラスミドをT7 ポリメラーゼ転写によって得た。数値はグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼを対照として用いて規準化した。
【００５９】
6.1.2. ニワトリ漿尿膜アッセイ
10日齢のニワトリ胚をMcIntyre Farms(Lake, 米国カリフォルニア州)から入手し、37℃でインキュベートした。卵は縦に置き、大きな血管を避けて標的領域に印を付けた。殻に2個の小さい穴を、空気嚢の真上、標的領域の上に針を用いて開けた。第1の穴に吸引を行い、CAMが印を付した領域から落ちるようにした。"DREMEL MOTO-TOLL"を用いて、標的領域から殻を除去し、窓("window")を作った。直径4mmの細胞サンプル(三次元的間質組織または対照)を大きな血管の近傍の膜上に置いたが、血管の上ではない。穴を透明接着テープで覆い、卵を37℃で72時間インキュベートして血管を成長させた。膜の処理を施した部分を取り、写真撮影し、メタノール中に固定した。サンプルのその領域の微細な血管分岐点の数を数えた。生検サンプルはメタノール中に固定し、断片をMasson's Trichromeで染色した。
【００６０】
6.1.3. 大動脈環アッセイ
大動脈環(aortic ring)アッセイでは内皮血管内層が微小血管を形成する能力を、血管新生を明らかにするために用いた。1〜2ヶ月齢のSprague Dawleyラットの雄から摘出した胸部大動脈を無血清MCDB131中に移した。大動脈周囲の線維脂肪組織を注意深く除去し、大動脈を8〜10回洗い、1mmの長さに切断した。1.5%アガロースゲルにウエルを開け、凝固フィブリノゲン溶液(1mLのフィブリノゲン中に20μL 50NIH ユニット/mLのウシトロンビンを含む液)で満たした。大動脈環はウエルの中央に置いた。凝固させた後、ディッシュを無血清MCDB131で洗い流した。培養物を37℃で5%CO２下で、3日毎に培地交換してインキュベートした。新たに形成された微小血管を3日目、7日目、および14日目に数えた。
【００６１】
6.1.4. 内皮細胞増殖アッセイ
内皮細胞の増殖は血管新生の不可欠な要素である。この活性を刺激する間質組織の能力については[３H]-チミジンの取り込みで測定することができる。HUVECの増殖に対する、種々の成長因子および濃縮した馴らし培地サンプルの影響を調べた。コンフルエントな培養物を取り出しHUVEC生育培地中に再懸濁して細胞の最終濃度を2.5 x 10４個/mLとした。24ウエルのプレートを接着因子溶液(Cell Applications, Inc.)で前処理し、細胞を1ウエルあたり1mLの細胞懸濁液で添加した。細胞が落ち着いて接着するまで置き、次いで線維芽細胞培養培地もしくは、単層もしくは三次元的線維芽細胞培養で馴らした培地を添加した内皮無血清培地(Endothelial Serum Free Medium、Cell Applications, Inc.)に転換した。2日目に1μCu/mLの[３Ｈ]-チミジンを添加した新鮮な無血清培地を適切な方法で細胞に与えた。3日目に培地を除去し、細胞をPBSで3回洗い、250μLの2.3% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を添加して細胞を可溶化した。30分後、SDS抽出物および1mLのPBS洗浄液をシンチレーションバイアルに移した。5mLの"SCINTIVERSE"(Fair Lawn, 米国ニュージャージー州)をバイアルに添加し、放射活性をBeckman LS6500 シンチレーションカウンター(Fullerton, 米国カリフォルニア州)を用いて測定した。
【００６２】
6.1.5. 内皮細胞化学運動性アッセイ
我々の三次元的間質組織の内皮細胞の遊走を刺激する能力について2つの方法で試験した。第1の方法は、方向性について規定しない細胞の運動性に対する刺激を測定する化学運動性アッセイである。第2は刺激源に対しての細胞の遊走を測定したものである。
【００６３】
内皮細胞はCytodex-2ビーズ上で増殖させた。このアッセイでは細胞のビーズからの遊離および培養プレートへの再接着を測定した。プレート上の細胞を染色し計数した。
【００６４】
6.1.6. 内皮細胞走化性アッセイ
細胞の遊走はNeuro Probe 48ウエルBoyden 走化性チャンバー(Nuero Probe, Inc.)を用いて内皮細胞走化性アッセイで分析した。Polycarbate膜フィルター(Poretics Corporation, 25 x 80 mm)を0.5M 酢酸中に一晩浸漬し、水で3回、1時間洗浄し、0.01%仔ウシ皮膚III型ゼラチン(Sigma, St. Louis, 米国ミズーリ州)の溶液中で12〜16時間インキュベートし、風乾させた。HUVECを取り、HUVEC増殖培地中に再懸濁して最終濃度を細胞数が1.0 x 10５個/mLとした。Boydenチャンバーは下記のとおり構築した：30μLのサンプルもしくは標準品を底部のウエルに添加し、ゼラチンをコートした膜をその上に置き、50μLの細胞懸濁液を上方のウエルに添加した。そのチャンバーを37℃で3時間インキュベートした。次いで膜をチャンバーから注意深く取り除き、細胞のある側をPBSで洗い、ワイパーブレードで横切って、遊走していない細胞を除去した。その膜をWright's Giemsa染色法で染色し、細胞数の計数もしくは染色の密度のいずれかを、20、10、5.0、および0ng/mLの精製VEGFを用いて作成した標準曲線に対して調べた。
【００６５】
6.1.7. インテグリンの誘導
αvβ3インテグリンは血管形成に重要な役割を果たし、それに対しての中和抗体は末梢血管形成を阻止することができることが示されている。このインテグリンはVEGFによって誘導され、内皮細胞の遊走に非常に重要な役割を果たしているものと考えられている。
【００６６】
インテグリンおよび細胞表面の受容体の存在は、Cytometry Research Services(San Diego, 米国カリフォルニア州)のFACStarでのフローサイトメトリーによって調べた。分析用に細胞を下記のとおり調製した：HUVECをトリプシン処理し、細胞を1 x 10６個/mLとなるように再懸濁した。250μLから500μLの細胞懸濁液をハンクス平衡塩類溶液(HBSS, GibcoBRL, Grand Island, 米国ニューヨーク州)で3回洗い、最後にハンクス平衡塩類溶液(HBSS)中に10% FBSを含む液に再懸濁した。その細胞を、HBSS中に10% FBSを含む液で1μg/mLに希釈した一次抗体と30分間インキュベートし、HBSS中に10% FBSを含む液で1μg/mLに希釈した二次抗体と30分間インキュベートし、HBSSで3回洗い、200μLの10% ホルマリン(Baxter, Deerfield, 米国イリノイ州)で細胞が10６個/mLの密度で固定した。
【００６７】
6.1.8. 内皮細胞アポトーシスの阻害
基底膜成長基質である"MATRIGEL"(Collaborative Research)上で単層として培養された内皮細胞は管内に癒合し、アポトーシスを起こすことが既に報告されている。しかし、"MATRIGEL"中に血管新生因子、例えばVEGFを含ませると、内皮細胞の増殖および形態を維持したが、そのことはVEGFの血管新生活性がアポトーシスを阻害したことを示唆している(例えば、Gotoら, 1993, Lab Invest. 69:508-517; およびHaralbopoulosら, 1994, Lab Invest. 71:575-582を参照せよ)。
【００６８】
本発明の三次元的間質組織の血管新生活性をさらに証明するため、アポトーシスの抑制を示すために、三次元的間質組織で馴らした増殖培地で"MATRIGEL"上で培養した内皮細胞に添加した。"MATRIGEL"を融解し、6ウエルの組織培養ディッシュである"TRANSWELL"(Costar, Boston, 米国マサチューセッツ州)中で製造者の使用説明書に従って固定させた。皮膚微小血管内皮細胞(DMEC)をその固定した"MATRIGEL"上に、線維芽細胞の単層培養もしくは三次元的間質組織で馴らした増殖培地下で細胞数が2.5 x 10５個/ウエルとなるように蒔き、既に報告されているとおり(例えばKuzuyaら, 1994, J. Cell Physiol. 161:267-276を参照せよ)、5% CO２環境下で37℃でインキュベートした。各培養のDMEC細胞を、その培養を10μg/mLのジ-1-アセチル-低密度リポタンパク質溶液中で2〜4時間(例えば、Voytaら, 1984, J. Cell Biol. 99:2034-2040を参照せよ)、および細胞の核を染色する"SYTOX"(Molecular Probes, Eugene, 米国オレゴン州)の溶液でインキュベートすることによって染色した。
【００６９】
6.1.9. ヒト糖尿病性の足部潰瘍での血流変化
培養した三次元的間質組織は創傷治癒に不可欠な健全な皮膚の構成成分を多数提供する。それらには、VEFGおよびトランスフォーミング成長因子-β(TGF-β)のような血管新生の重要なメディエーターが含まれる。レーザードップラー造影法を、三次元的間質組織で治療した足肢潰瘍の基部の微小血管性灌流の研究のために用い、これらの病変の治癒が血流の増加、それは血管形成を反映したものであろうが、その増加に伴うものであるのかどうかを調べるために用いた。
【００７０】
II型糖尿病の5例の患者で7個所の十分な厚みのある潰瘍を調べた。病変は全て少なくとも3ヶ月間、感染を示す臨床的証拠のない状態で存在したもので、調べた時点の前の2週間に従来法での治療にも関わらず潰瘍の大きさに変化の認められなかったものである。三次元的間質組織は毎週各潰瘍の基部に、合計8週間適用し、その後に従来法の治療を再開した。治療の直前および2、5、および8週間後に微小血管灌流をレーザードップラー造影(Moore Instruments, Aminster, 英国)を用いて調べた。
【００７１】
6.1.10. マウス心外膜移植片モデルにおける血管新生の促進
6.1.10.1. 動物
三次元的間質組織により刺激される血管新生を、重症複合免疫不全(SCID)マウス心外膜移植片モデルを使用してin vivoで検査した。マウスを３つのグループに分けた(すなわち、生存可能/低温保存三次元的間質組織移植片(「生存可能間質パッチ」)、非生存可能三次元的間質組織移植片(「非生存可能間質パッチ」)、および対照/偽(sham))。各グループは、２つの異なる時点(14日目および30日目)において少なくとも６匹の動物を有していた。米国食品医薬品局の適用規則に従って動物研究を行った。
【００７２】
6.1.10.2 動物管理
SCIDマウス(University of Arizona, Tucson, AZ)を、小型隔離ケージ(micro-isolator cage)中に１ケージにつき２匹、木屑の上で収容し、”TECH-LAD 4% マウス/ラット食餌”および水道水を随意与えた。マウスは、NIH ”Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”に従って、74°Ｆ±10°Ｆの制御温度、および50％±20％の湿度下において収容した。
【００７３】
6.1.10.3. 外科的処置
2.5％アベルチン(Avertin)の腹腔内注射により全身麻酔をかけて保った。滅菌状態を保ち、処置の間を通じて加温パッドを使用した。マウスの体重を量り、胸壁を剃り、用意した。仰臥姿勢で、気管切開を行い、小型の動物用人工呼吸器を使用して通気させた(一回呼吸量＝0.5 ml、速度＝120〜130回呼吸/分)。通気呼吸の間、胸部拡張/収縮を観察して挿管が適切であることを確認した。
【００７４】
全ての外科的処置は、手術用顕微鏡を使用して行った。左側開胸を行い、胸筋群(groups)を横断切断し、胸郭を露出させた。ハサミおよびブラントジセクションにより第４の肋間隙に入った。２本の6-0絹縫合糸(Ethicon)で、上部肋骨および下部肋骨の周囲を縫合して収縮させた。胸腺を上向きに収縮させ、滅菌綿棒を用いて左肺を陥没させた。次いで、右胸郭に圧力をかけて、心臓を左方向にずらした。
【００７５】
心外膜/心筋虚血損傷を起こすため、当業者に公知の標準的方法を採用して熱閉塞により、左心房の直下にある左側冠状動脈の冠状動脈閉塞を行った。閉塞によって、主に尖付近の左心室に非生存虚血組織領域が生じる。４mmの生存可能間質パッチまたは非生存可能間質パッチを、単一縫合を採用して、生存しているマウスの虚血性心外膜/心筋組織の表面上に縫合した。対照マウスに対しては、虚血損傷の部位に縫合のみを行った。移植後、最後の呼気作用(end expiration)において正圧により肺を再拡張した。6-0絹糸(Ethicon, Inc.)を使用して胸部空洞を層状に閉じ、動物を人工呼吸器から徐々に離脱させた。自発的呼吸が再開したあと、気管チューブを外し、首を閉じた。動物は完全に意識が戻るまで監督下にある設定を維持し、各動物の術後の全身の健康状態を毎日測定した。
【００７６】
外植前に、心エコー図を得て、心室壁の厚さを測り、閉塞前のものと比べた。14日目または30日目にマウスに再度麻酔をかけて、三次元的間質組織パッチを周囲組織とともに、および対照心臓組織を回収した。材料を回収した後、過剰量(150 mg/kg)のペントバルビタールを腹腔内で使用してマウスを安楽死させた。
【００７７】
6.1.10.4 分析
間質パッチ処置動物および対照におけるin vivo新血管形成を、３つの異なる分析(肉眼的形態、組織構造および組織化学)により検査した。
【００７８】
各グループの代表の心臓の「肉眼的形態」を検査して、虚血領域における組織生存率を出した。心臓の肉眼的形態は、各グループから得た１つの外植心臓に、染料テトラゾリウムレッド(2,3,5-塩化トリフェニルテトラゾリウム)(Sigma/Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO)を注射することにより検査した。テトラゾリウムレッドは、生存心臓組織と反応し、明赤色を発する。対照的に、非生存組織は、テトラゾリウムレッドとは反応せず、従って、非生存組織は青白色のままである。14日目および30日目の対照マウスおよび間質パッチ処置マウスから得た外植心臓は、主に左心室において、冠状動脈閉塞/心筋梗塞を誘発したことにより生じた非生存虚血心臓組織の領域を呈した。低出力および高出力(low and high power)で撮った画像は、青白い白色から認められる大面積の非生存心臓組織を示していた。対照では、虚血領域には、目に見える血管が全くなかった。
【００７９】
三次元的間質組織に依存した新血管の形成を、処置された心臓組織および対照心臓組織の切片の「組織構造的分析」により確認した。組織構造的分析のために、間質パッチ移植片および隣接する組織を切除し、”HISTOCHOICE”固定剤(Amresco Inc., Solon, OH)に入れ、光学顕微鏡用に処理した。間質組織パッチおよびその周辺組織を切片化し、スライドに載せ、ヘマトキシリンおよびエオシン(HおよびE)を使用して染色した。HおよびEを使用した組織染色法は、当業者に周知であり(例えば、Histology: A Text and Atlas, 第３版(Rossら編), 1-7頁に掲載；Williams and Wilkins, Baltimore, MD)、キットおよび試薬は販売業者(例えば、Sigma/Aldrich Chemical Co., St Louis, Mo.)から簡単に入手できる。
【００８０】
さらに、三次元的間質組織に依存した新血管形成を、「組織化学」により検証して、組織構造的切片における血管内皮細胞の存在および位置を特異的に同定した。間質パッチ移植片および周辺組織を切除し、スライドに載せ、GS-1を使用して組織化学的に染色した。GS-1は、内皮細胞の表面に主に結合する市販のレクチンである(Sigma/Aldrich Chemical Co.)。
【００８１】
6.1.11. ブタ心外膜移植モデルにおける血管新生の刺激
新血管のin vivo形成および間質で処置されパッチを貼付されたブタおよび対照における心室機能の評価を、肉眼的形態、組織構造および心エコー図分析により検査した。
【００８２】
成体家畜ブタにおいて、左側上行冠状動脈の第４から第５分岐点までを連結することにより、冠状動脈閉塞を形成した(例えば、Staubliら, J.を参照)。成体家畜ブタにおいて、左側上行冠状動脈の第４から第５分岐点までを連結することにより、冠状動脈閉塞を形成した(例えば、Staubliら, J. Cardiovasc. Pharmacol 6:829-832 (1984)；Galinanesら, Eur. Surg. Res. 19:246-253 (1987)を参照)。閉塞直後、処置ブタには、単一の２cm×２cm片の三次元的間質組織移植片を、心外膜の虚血領域に直接縫合した。三次元的間質組織は、ブタ心臓の心外膜に簡単に接着した。未処置対照ブタ(偽処置)には、冠状動脈閉塞を行ったが、三次元的間質組織移植片は施さなかった。
【００８３】
心電図検査により心筋梗塞の誘発を確認した。下部上行冠状動脈の閉塞前および閉塞後、ならびに閉塞後30日目に、処置動物および未処置対照動物の心電図(ECG)トレースを取った。心電図トレースを生成するための装置および方法は、当業者に周知である。
【００８４】
心室機能を心エコー図により評価した。心エコー図は、閉塞前、および心筋梗塞の誘発30日後に、標準的方法(例えば、Braunwald’s Heart Disease: a textbook of cardiovascular medicine, 第５版, Vol. 1, 第３章, 53-107頁を参照)により撮った。７mHzのプローブを有するAcuson 128XPコンピュータ処理音波検査システムを用いて画像を得た。
【００８５】
30日後、ブタを屠殺し、臨床視覚化(clinical visualization)および組織染色により新血管の発達について評価した。
【００８６】
6.2. 結果
6.2.1. 三次元的間質組織は血管新生性増殖因子を発現した
作製された三次元的間質組織は、様々な増殖因子を分泌した。その一部は、組織再生および血管新生において重要な役割を果たすことが知られている。繊維芽細胞に基づく三次元的間質組織により発現される血管新生性増殖因子を、表IIに示す。mRNAの細胞濃度は、解凍回収の24時間後に測定した。
【００８７】
【表２】
0004709393.tif 000003
6.2.2. 三次元的間質組織はヒナ絨毛尿膜およびラット大動脈において血管新生を刺激した
三次元的FBETは、CAMにおいて、対照と比べてより高い程度(微細な毛細管の発達および高い浸透性 (permeability)の形跡の両方を含む)で管発達を誘発した(図1A〜1D)。FBETで処理したCAMにおける毛細血管の発達はまた、組織構造によってもはっきりと認識できた。この種類の毛細管発達は、VEGF誘発型血管新生の特徴である。これは、管の直径がより大きく、浸透性の上昇がほとんどないかまたは全くない標準的なFGF刺激で見とめられるものとは異なっていた。CAMにおけるサンプル当たりの管の数を数えたところ、足場のみの効果と三次元的FBETの効果との間に統計学的に有意な差があった(図２)。三次元的組織は、CAMに置かれる前の抗VEGF中和抗体との前インキュベーションにより、血管新生活性が90％以上減少しており、FBETによるVEGF生成がその血管新生活性において重要であることを示した。ラット胸大動脈の大動脈輪(aortic ring)をFBETと同時培養した場合、形成される微細管の数が有意に増加した(図３)。FBETは、自然分泌比率で血管新生因子の組合せ(combination of angiogenic factors)を生じ、相乗効果を有するかもしれないと考えられる。
【００８８】
6.2.3. 三次元的間質組織は内皮細胞増殖を刺激した
三次元的間質組織調整培地は、上記6.1.4節に記載したように[3H]-チミジン取り込みにより測定したところ、ヒト内皮細胞増殖を刺激していた(図４)。培地の刺激活性は、用量に依存した。
【００８９】
6.2.4. 三次元的間質組織は内皮細胞ケモキネシスを刺激した
図５に示すように、内皮細胞と三次元的間質組織との同時培養は、ビーズからプレートへの細胞転移において著しい増加を生じ(p = 0.0003)、これはケモキネシスを示すものとして用いた。三次元的間質組織のこの刺激活性は、抗肝細胞増殖因子(HGF)中和抗体により約60％阻害され、このことは、HGFも関与することを示している。
【００９０】
6.2.5. 三次元的間質組織は内皮細胞化学走性を刺激した
三次元的間質組織で調整された培地はまた、細胞移動を用量依存的に刺激した(図６)。実際、間質組織は、VEGFと比較して、50 ng/Lでさえも、より高い化学走性を刺激した。抗VEGF抗体は、間質組織調整培地により刺激される細胞移動を50％阻害した。
【００９１】
6.2.6. 三次元的間質組織はインテグリンαvβ3発現を誘発した
内皮細胞の表面上のαvβ3インテグリンの存在を、三次元的間質組織で調整された培地での処理後のフローサイトメトリーにより分析した。培養したHUVECは、通常培養条件下でαvβ3インテグリンの実質的な表面発現を提示した。しかし、間質組織により調整された培地は、このインテグリンの発現の有意な増加を刺激した(図７)。
【００９２】
6.2.7. 三次元的間質組織はヒト皮膚微小血管細胞のアポトーシスを阻害した
ヒト皮膚微小血管細胞は、特定の特異的条件下(例えば、コラーゲンゲル上層(overlay)中、または「MATRIGEL」上)に置いた場合に、管を形成する。しかし、管は不安定で、約３日のうちに細胞のアポトーシスにより退化する。しかし、三次元的間質組織と同時培養した場合、「MATRIGEL」上の微小血管内皮細胞は、増殖しつづけ、アポトーシスは阻害された(図8Aおよび8B)。
【００９３】
単層培養皮膚繊維芽細胞から得た調整培地は、管を形成する細胞のアポトーシスおよび進行中のアポトーシスの阻害を示さなかった(図8A)。対照的に、三次元的繊維芽細胞培養から得た調整培地は、血管新生因子(bFGFおよびVEGFなど)について観察されるものと同様の細胞増殖および形態を維持した(図8B)。結果は、以下の２つの特徴を示す。すなわち１）三次元的培養物の調整培地は、血管新生因子の添加と同様に、「MATRIGEL」アッセイにおける細胞アポトーシスを阻害でき；三次元的間質組織はVEGFおよびHGFを生成および分泌し；従ってアポトーシスの阻害は、培地に分泌された血管新生因子に起因すると推定される。そして、２）単層において培養した同様の繊維芽細胞は、上記のような効果を生じず、三次元的培養物条件が活性の原因であることを実証している(つまり、血管新生因子発現/分泌は、単層の繊維芽細胞において不在であるか大幅に減少していた)。
【００９４】
6.2.7. 三次元的間質組織は、血管新生を刺激し、ヒト糖尿病足潰瘍(foot ulcer)における血流を上昇させた
三次元的間質組織で処置された糖尿病足潰瘍の基部(base)における血流は、８週間の処置の間に、任意の灌流単位で325 + 184(平均＋SD)から560 + 344のピークまで有意に上昇した(p < 0.001、繰返し測定ANOVA)。損傷のうち５つが12週間目までに治癒し、他の２つは大きさが著しく減少した。血流におけるこれらの変化は、新たに形成される肉芽組織における血管新生が、三次元的間質組織が提供する血管新生性増殖因子の持続的かつ適切な供給により向上することを示すものである。
【００９５】
同様に、間質組織での処置前および処置後に撮影した顕微鏡写真は、創傷床の迅速な血管新生、創傷組織の再造形、および処置後の炎症の減少を示した(図9A〜9D)。
【００９６】
6.2.8. 三次元的間質組織は虚血マウス心臓組織において血管新生を刺激した
間質パッチで処置されたマウスおよび対照における新血管のin vivo形成を、上記6.1.10節に記載したように３種類の分析(肉眼的形態、組織構造および組織化学)を採用して検査した。
【００９７】
6.2.8.1 肉眼的形態および病状結果
移植された動物に関して、間質パッチ移植された14日目および30日目の心臓から得られたデータは、生存可能および非生存可能間質パッチ移植片が天然の心臓組織の移植部位において良好に取り込まれることを実証した。さらに、虚血部位における生存可能間質パッチの適用は、虚血領域において、未処置対照動物では認められなかった目で観察できる多数の新血管の形成を生じた。例えば、拡大撮影した画像は、生存可能間質パッチ移植片を用いた移植領域において多数の血管の存在をはっきりと示す。移植領域における新血管形成はまた、非生存間質パッチ心臓においても観察された。しかし、形成された新血管の数は、非生存可能間質パッチで処置された動物よりも、生存可能間質パッチで処置されたマウスにおいて明らかに多いと思われた。
【００９８】
肉眼的形態的観察は、本発明の三次元的間質組織が心臓組織において血管新生を促進できることを実証するものである。
【００９９】
6.2.8.2. 組織構造的結果
正常かつ未処置のSCIDマウス心臓から得た切片の光学顕微鏡写真は、心筋層および心臓表面の最も外側の部分である心外膜の組織を示す。心筋層は、小動脈、毛細管および小静脈を含む。正常SCIDマウスと比較して、冠状動脈閉塞による心筋梗塞の誘発は、心外膜層に存在する検出可能な小静脈の数の劇的な減少をもたらした。
【０１００】
対照的に、間質パッチで処置した心臓から得た切片の光学顕微鏡写真は、心外膜層において形成された膨大な数の新血管、および心外膜/心筋層境界付近にある心筋層において小動脈の存在を示した。同様に、非生存可能間質パッチで処置された動物は、心外膜層における新血管形成の存在を示したが、生存間質パッチで処置された心臓よりもかなり程度は低かった。組織構造的結果は、本発明の三次元的間質組織が新血管形成を促進するという肉眼的形態観察を裏付ける。
【０１０１】
6.2.8.3. 組織化学的結果
間質パッチで処置された心臓の切片の光学顕微鏡写真は、心外膜において血管を裏打ちする血管内皮細胞、ならびに心筋層において小静脈および小動脈の存在を明らかにした。非生存可能間質パッチで処置された心臓においては、少数の微細血管新生を検出した。対照的に、対照心臓の心外膜における内皮被覆血管では染料はほとんど観察されなかった。上記結果は、本発明の三次元的間質組織が、血管新生をin vivoで刺激することを実証するものである。
【０１０２】
本発明は、本発明の個々の態様を説明することを意図した例示の実施形態の範囲に限定されない。実際に、当業者には、上記記載および添付の図面から、本明細書に示しかつ記載したもの以外の本発明の様々な改変が明らかになるであろう。このような改変は、添付の請求の範囲の範囲内にあるものとする。
【０１０３】
本明細書中で引用した文献は全て、参照によりその全体を援用する。
【０１０４】
6.2.9. 三次元的間質組織は虚血ブタ心臓組織において血管新生を刺激した
間質処置パッチブタおよび対照における新血管のin vivo形成および心室機能の評価を、上記6.1.11節に記載したように、肉眼的形態、組織構造および心エコー図分析により検査した。
【０１０５】
左側上行冠状動脈の閉塞は、心電図記録法によれば、虚血心臓組織の領域を生じさせた。心電図において、平均心拍を分析して、１つ以上のパラメータを形成する。STベクトルの大きさ(ST−VM)は、ST部分のオフセットを表し、心筋層における虚血の尺度として認識されることが多い。初期基準心拍(モニタ開始時)(STC-VM)と比較したSTの大きさの変化も計算した。QRSベクトル差(QRS-VD)は、初期ECGと比較したQRS群の変化を表し、モニタ開始時と比較したQRS群の形態における変化を反映する。QRS-VDパラメータは、いくつかの研究において、心筋梗塞の過程と結び付けられている。
【０１０６】
動脈連結(artery ligation)直後の心電図の読み取りは、ST部分の上昇を示し、心筋梗塞の形成を示している。未処置対照における30日後のECG読み取りは、同様のST部分を示したが、処置された動物におけるST部分はわずかにしか上昇していなかった。
【０１０７】
未処置対照ブタから得た心エコー図は、30日後に心室機能が減衰していることを示した(図10aおよび10b)。対照的に、三次元的間質組織で処置したブタから得た心エコー図は、30日目の心室機能が冠状動脈閉塞前に得た心エコー図のものとより近似していることを示した(図10dを図10aおよび10cと比較されたい)。上記結果は、三次元的間質組織で処置されたブタ心臓が、30日後に、未処置の心臓よりも良好な心室機能を保持したことを実証するものである。
【０１０８】
切除した心臓の肉眼的形態分析は、処置された心臓が、未処置の偽対照よりも、移植部位における癒着が少ないことを明らかにした。さらに、切除された心臓の厚い切片の組織構造的分析は、対照偽グループよりも処置動物において新血管の数が多いことを示し、心外膜上への三次元的間質組織の移植が虚血心臓組織における血管新生を刺激することを実証するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ〜Ｄは、ニワトリ絨毛尿膜（CAM）における、作製された間質組織により刺激された血管新生の顕微鏡写真を示している。図１Ａおよび１Ｂは、巨視的な視野であり、図１Ｃおよび１Ｄは組織像を示している。図１Ａは、骨格のみを示し、図１Ｃは、生存不可能な膜であることを示し、図１Ｂおよび１Ｄは、三次元的間質組織で処理した膜を示している。
【図２】  図２は、ニワトリ絨毛尿膜（CAM）の毛細血管形成における作製された間質組織の影響を表す棒グラフである。誤差棒は、95%の信頼区間を表す。
【図３】  図３は、ラット大動脈環アッセイにおける、作製された間質組織により刺激された血管形成を示す棒グラフである。
【図４】  図４は、ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）のin vitroでの作製された間質組織の馴らし培地(conditioned medium)による刺激後の増殖を示す棒グラフである。
【図５】  図５は、作製された間質組織による内皮細胞の運動性の刺激を示す棒グラフである。
【図６】  図６は、作製された間質組織による内皮細胞の走化性の刺激を示すグラフである（左図は、示した濃度における精製VEGFを用いた標準曲線を示している）。
【図７】  図７は、内皮細胞のインテグリンαｖβ3の、作製された間質組織による誘導を示すフローサイトメトリーの結果である。
【図８】  図８Ａおよび８Ｂは、作製された間質組織の存在下での「MATRIGEL」上で培養した内皮細胞のアポトーシスの阻害を示す顕微鏡写真である。細胞は、低密度リポタンパク質およびシトックス（sytox)を有しており、それらはアポトーシス細胞の核内に保持されていた。
【図９】  図９Ａ〜Ｄは、ヒト糖尿病性潰瘍の顕微鏡写真であり、作製された間質組織の刺激による損傷部の血管形成、組織の再構築、および炎症の低減を示している。図９Ａおよび９Ｃは、処理前の損傷部を示し、図９Ｂおよび９Ｄは、処理後の損傷部を示す。
【図１０】  図１０は、下方上行冠状動脈閉塞の前（aおよびc）と30日後(bおよびd)のブタの心臓の典型的な心電図である。処理していない対照（図１０aおよびb）；三次元的間質組織で処理した動物（図１０cおよびd）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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