(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象物を画像化するための装置であって、アッセイ要素が自身を介して送達され得るプローブ；イオン電流を検出するためのセンサー；および前記イオン電流に応答して前記対象物に対する前記プローブの位置を制御するための手段を含んでおり、ここで前記制御手段は、前記プローブを対象物の表面に対して実質的に垂直に振動させるための手段、および前記イオン電流を調節するための手段を含んでいる、装置。
【請求項２】
前記プローブはマイクロピペットである、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記アッセイ要素は光である、請求項１または請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記プローブは光ファイバーを含む、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
レーザー光源をさらに含む、請求項３または請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記プローブは光により活性化され得る色素をその先端に含有する、請求項３〜５のいずれかに記載の装置。
【請求項７】
前記プローブの外側表面は、光の漏れを防止するために、例えば金属層でコーティングされる、請求項３〜６のいずれかに記載の装置。
【請求項８】
前記プローブは、検出可能な変化を生細胞の表面に生じさせる物質をアッセイ要素として含有する、請求項１または請求項２に記載の装置。
【請求項９】
前記物質は、蛍光、生物発光または化学発光を生じさせる、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記プローブは、生細胞に送達されたときに、細胞の内部における検出可能な変化を生じさせる物質をアッセイ要素として含有する、請求項１または請求項２に記載の装置。
【請求項１１】
対象物からのその距離がイオン電流に応答して維持されるプローブを使用するイオン伝導顕微鏡法によって液体環境中の対象物を画像化するための方法であって、前記プローブは、アッセイ要素を前記対象物に送達するための手段を含んでおり、該プローブが対象物の表面に対して実質的に垂直に振動させられ、かつ前記距離が前記イオン電流の調節によって制御される、方法。
【請求項１２】
前記プローブは、請求項２、４および６〜１０のいずれか一項に記載のプローブである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アッセイ要素は、請求項３、５、８、９および１０のいずれか一項に記載のアッセイ要素である、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
光を生じさせることを含み、前記距離が光の波長よりも短い、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記対象物は生細胞である、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、光学顕微鏡法および細胞研究におけるその使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
細胞は、動物または植物のいずれにせよ、生物の最も基本的な単位である。その構造および組織、ならびにその様々な構成要素がいかに機能しているかの研究は、集積された生物系に存在する複雑なプロセスについての有益な洞察をもたらす。これには、細胞サンプルの研究が、リアルタイムで非浸襲的に、そして細胞の機能性が保持されているように生理学的条件を模模倣する溶液中で行うことができる技術が必要である。
【０００３】
生細胞を調べるためには光学顕微鏡法（可視光を使用するもの）が広く適用されている。しかし、その分解能は回折によって約200nm〜250nmに制限されている。細胞をより詳細に研究するため、広く使用されている1つの方法が電子顕微鏡法である。この場合、10nmの分解能を有する像を得ることが可能であるが、そのサンプルは、画像化の前に固定処理する必要がある。従って、生細胞を研究するために電子顕微鏡を使用することができない。
【０００４】
別の高分解能技術としては、鋭いプローブ先端が試験中のサンプルの非常に近いところで走査される走査型プローブ顕微鏡法（SPM）を使用するものがある。走査の結果として生じる相互作用、即ちサンプルの化学的／物理的な性質は、サンプルに対する先端位置の関数としてプロットされ、この測定された相互作用のプロファイルが得られる。生物学的な画像化に広く適用されているSPMファミリーには、原子間力顕微鏡法（AFM）、走査型イオン伝導顕微鏡法（SICM）および走査型近接場光学顕微鏡法（SNOM）がある。
【０００５】
SNOMにおいて、通常の場合光は、波長以下の出口開口部を有する光ファイバープローブを伝わり、このプローブによりサンプル表面が走査される。先端とサンプルとの間の相互作用力により、先端とサンプルの間の間隔が、波長以下の開口部のサイズより小さく維持される。かかる装置により、その分解能が出口開口部のサイズおよび先端のサイズにそれぞれ依存する光学像およびトポグラフ像を同時に得ることができる。遠視野光学顕微鏡法の場合と同様、すべての造影機構をSNOMにおいて利用することができ、特に、蛍光標識を使用する化学的な画像化が可能である。しかし、より小さな開口部を有するプローブを製造することは容易である一方、液体中における先端−サンプルのより小さな間隔（＜60nm）を達成することは、プローブ−サンプルの距離を制御する信頼できる方法を得ることに問題があるために困難である。これは、フィードバック機構において使用されるプローブの振動が減衰するからである。
【０００６】
SICMにおいては、電解質で満たされたガラス製マイクロピペットにより、電解質溶液に浸されたサンプルの表面を走査する（Hansma他（1989）、Science、243：641〜3を参照のこと）。ピペット−サンプルの間隔は、ピペットの開口部を通って流れるイオン電流を制御することによって一定の値で維持される。この流れは、一方がピペットの内部にあり、もう一つがピペット外部の電解質溶液内にある2つの電極の間に生じる。電極間に加えられたバイアスのために、イオン電流のシグナルは、マイクロピペットの抵抗（Rρ）と、浴からマイクロピペット開口部までの収束経路に沿った抵抗であるアクセス抵抗（RAC）との組合せに依存している。Rρは先端の直径およびマイクロピペットのテーパ角度に依存し、一方、RACは、サンプルの電気化学的性質、形状およびプローブからの距離に対する複雑な依存性を示す。RACにより、ピペット−サンプルの間隔のためのイオン電流感度をもたらし、その距離を接触が生じないように維持することができる。
【０００７】
SICMを精密表面の非接触プロファイル化法として確立するために最適な先端−サンプルの間隔は、先端直径の1倍〜1/2倍である（Korchev他（1997）、J.Microsc.188：17〜23、およびBiophys.J.73：653〜8を参照のこと）。先端の出口はトポグラフ的な特徴および／またはサンプル表面上の孔を通って流れる局所的なイオン電流の像を得るために使用される。SICMを使用して達成され得る空間分解能は、先端の開口部のサイズに依存しており、典型的には50nm〜1.5μmの間である。これにより、相当の分解能が得られる。
【０００８】
（発明の開示）
固定処理されない生細胞の高分解能顕微鏡研究を行うことを目的として、複合的な走査型イオン伝導および走査型近接場光学顕微鏡を開発した。従って、本発明の１つの局面において、プローブ、該プローブを介してアッセイ要素が送達され得る；イオン電流を検出するためのセンサー；およびイオン電流に応答して対象物に対するプローブの位置を制御するための手段を含む装置に関する。別の局面において、走査型イオン伝導顕微鏡によって液体環境中の対象物を画像化するための方法であって、プローブはプローブと対象物との距離が液体中のイオン電流に対応して維持され、アッセイ要素を対象物に送達するための手段を含むものである方法に関する。
【０００９】
本発明は、部分的には、SICM技術とSNOM技術が互いに補完し（非接触型のプロファイル化法としてのSICM、およびサンプルに関する光学的情報および化学的情報の獲得技術としてのSNOM）、および両者が１つの実験装置に設置されれば効果的に使用されるであろう、ということを実現したものである。
【００１０】
この新規な装置の使用により、細胞表面の定量的で高分解能の特徴付け、ならびにトポグラフ像および光学像を同時に記録することが可能になる。この方法の1つの際立った特徴は、プローブとサンプルとの距離を液体（例えば、生理学的緩衝液）中において制御するための、信頼し得る方法にある。
【００１１】
この新しい方法は、生細胞（心筋細胞）の近接場像を初めて記録することによって実証された。装置の簡単な改変により、蛍光画像化および高分解能化が可能となる。
【００１２】
本発明により、細胞の機能的マッピングが可能になる。例えば、イオンチャンネルのマッピングが可能になる。
【００１３】
本発明により、顕微鏡の共焦点ボリューム中に細胞表面を保つためにプローブを使用することによって1回の走査で細胞表面を画像化することが可能である。生細胞を生物学的に画像化する場合、損傷を最小限にし、そしてSNOMにおいて使用される強い近接場光源の問題を克服するよう、光への暴露が制限されることがある。細胞は形状を変化させることがあるが、この表面共焦点法では、画像化は常に表面であるのでこれは問題とならない。
【００１４】
本発明の特徴はその簡便さである。例えば、既存の共焦点顕微鏡を、ピペットおよび好適なコンピューター制御を用いて容易に改良することができる。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
用語「アッセイ要素」は、観測位置に送達することができ、かつそれ自体で観測可能であるか、あるいは観測可能な応答を生じさせ得る任意の化学的実体または物理的実体を記載するために本明細書中で使用されている。例えば、アッセイ要素は光であり得る。例えば、レーザーを使って例えばコヒーレント光をプローブを介して細胞表面に導いてもよい。あるいは、レーザー光源と組み合わせて用いる場合に、プローブの先端に光により活性化され得る色素などの、インサイチュで光を発生する物質を含有させてもよい。プローブの外側表面を、光の漏れを防止するために、例えば、金属層でコーティングしてもよい。
【００１６】
好適なマイクロピペットの概略を図１に示す。マイクロピペットは、その先端に金属コーティング11を有するピペット本体10を含む。光源（示されず）からのレーザー光が光ファイバー12を介して届けられる。
【００１７】
このようにして、例えば、マイクロピペットに１または２以上の蛍光物質が満たされ、レーザーにより励起される。ある場合には、レーザーが顕微鏡の対物レンズに届き、対物レンズによりレーザーをピペットの先端に収束させることによる、局所的な光源を提供することができる。さらに、レーザー光が溶液内に侵入する深さが非常に小さくなるよう、色素を高濃度とする。色素は加圧下にあり、ピペットの外側にゆっくり漏れ、これにより光退色における様々な問題を回避する。これは、近接場における画像化を行うために使用することができる。この場合、金属コーティングは必要ない。
【００１８】
別の実施形態において、アッセイ要素は化学試薬であり、この化学試薬は直接的または間接的に作用し得る。直接的な作用を有する試薬の例には、蛍光、生物発光または化学発光を生じさせる試薬が含まれる。例えば、ATPおよびマグネシウムイオンの存在下でルシフェラーゼを作用させれば、568nmにピークを有する光をもたらすルシフェリンをマイクロピペットにより送達するようにしてもよい。マグネシウムを溶液中に提供し、そしてそれ以外のすべての試薬をピペット中に供給して、反応により局所的な光が得られるようにしてもよい。コーティングは、近接場光源を得るためには必要でない。試薬の素早い希釈、即ち、試薬がピペットから出るや否や、光がその先端で得られるということは、分解能がピペットの開口部によって決定されることを意味している。
【００１９】
他の好適な試薬には、pH、あるいは例えばCaの濃度、あるいは電位などの特定の特性の変化によって蛍光を変化させる分子が含まれる。適切な試薬を局所的に適用し、蛍光体を励起させることにより、この特性の局所的なプロービングが可能になり、例えば、チャンネルまたはプロトンポンプのマッピングが可能になる。
【００２０】
間接的に作用する試薬の例には、細胞に送達され、該試薬が細胞中に導入された結果細胞内部における変化を生じさせる試薬が含まれる。検出されるのはその変化である。この効果は、シグナルカスケードによって自然に増幅され得る。
【００２１】
より詳細には、ピペットはリガンドまたは薬物を含有してもよい。これは、細胞表面の受容体に作用または結合する。細胞内部におけるシグナル変換カスケードの結果として、二次メッセンジャーのレベル、例えば、細胞のカルシウムレベルが変化する。酵素が代謝回転し、多くの他の酵素などに作用する多くの生成物分子を生じさせ、その結果、1の結合事象が大きな変化をもたらすカスケードによって結合事象が増幅される。この自然に増幅されたシグナルが、例えば、蛍光色素（例えば、細胞内のカルシウムに結合し、カルシウム濃度を測定するために使用され得るfluor−3）を使用して検出される。カルシウムの大きな変化は、ピペットがその受容体上に存在するときに認めることができる。カルシウムは、細胞によって使用される最も一般的なメッセンジャーであるので、これは一般的な方法である。この方法は、受容体が存在しているかどうかを検出するために、蛍光標識された抗体を使用しなくてよい。抗体（特に、モノクローナル抗体）は、製造することが困難であり、細胞内で内在化されるという問題を有し得る。他の蛍光マーカーを、cAMPなどの細胞内の他の一般的なメッセンジャーのために使用することができる。
【００２２】
本発明を、生きている心筋細胞のSICM像およびSNOM像を同時に得ることを可能にするよう改変された既存のSICMシステムによって説明する。本発明の装置の有用性を説明するために、心筋細胞を選択したのは2つの主な理由による。第1に、心筋細胞は、2.1μm毎に周期的に存在し、外見の異なるマテリアル／横紋の明帯および暗帯から構成されていることから、研究の良好なモデル系である。第2に、そしてより重要なことに、心筋細胞は、血液を身体中へ循環させる極めて重要なポンプ活動を生じさせるために、同調して収縮する心筋の房室を構成している。心筋細胞のSICMを使用した研究は以前に行われている（Korchev他、上記）。
【００２３】
本明細書に示された実験により、走査型近接場光学顕微鏡法を使用して撮影された生細胞像がはじめて得られ、そして走査型イオン伝導顕微鏡法は、生細胞のSNOM画像化に対する信頼できる制御機構を提供することが示された。心筋細胞の像は、例えば、電子顕微鏡法で見出された像として広く知られている構造および大きさに匹敵するものであった。従来技術と比較して本発明の重要な利点は、細胞が固定処理されておらず、生きているということである。
【００２４】
簡便な複合型SICM−SNOM装置でも強力な研究用具であり得るが、簡単な改変を、その感度および分解能を改善するために行うことができる。最初に、より小さな、コーティングピペットを用いることにより、SICMおよびSNOMの両方の分解能を改善することができ、そしてサンプルのより近いところに近接場プローブを保持することによって光学シグナルのサイズを増大させることができる。例えば、高分解能のSNOMプローブは、画像化のためのマイクロピペットを力制御により空気中で先細りにし、コーティングすることによって作製することができる（Harootunian他、1986）。100nm未満の光学的分解能が得られた。このことは、SICM−SNOM用の、より大きな分解能を有する近接場プローブの製造が可能であることを示している。光を収集するためにより大きな開口数の対物レンズを使用することにより、光学的シグナルをさらに増大させることができる。これらの改善により、蛍光による画像化が可能になり、そして最小限のレーザー強度で作用させることによって光退色および光損傷における様々な問題もまた最小限に抑えられる。生細胞に対する光損傷は、固定処理された細胞よりも容易に生じる。従って、必要とされるレーザー出力を低下させることが、長時間にわたる多回走査を行うことができるようにするためには重要である。これらの改善を組み合わせることによって、生細胞について100nmよりも良好な分解能を有するSICM像およびSNOM像を同時に得ることが可能になる。
【００２５】
特に、コーティングされたマイクロピペットとサンプルとの距離を制御するためにイオン電流を使用することにより、光学像およびSICM像を同時に得ることが可能である。光学像は近接場において得られ、従って、これは、生細胞のSNOM画像化を行うために信頼できる方法であると考えられる。これが達成されたことは今回が初めてである。装置に対する簡単な改善により、蛍光画像化および高分解能化が得られるはずである。蛍光画像化との組合せにより、生細胞の表面における受容体およびチャンネルを画像化することができ、そして特定の刺激に応答した変化を追跡することが可能になる。生細胞をSICM−SNOMで画像化するこの新しい方法は、生物科学において広範囲に適用することができる。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態において、走査型イオン伝導顕微鏡法（SICM）の、周波数変調走査プロトコルが使用される。これは、SICMプローブを垂直方向（Z）に振動させて、この変調を顕微鏡のフィードバック制御に使用する手段を含み得る。
【００２７】
図2Aおよび図2Bには、サンプル23をその基部に有する容器22に入れられた電解質21内におけるマイクロピペット20が概略的に示されている（図2Bには点線でも示される）。電極24および25は、メーター26を含む回路によって接続され、（矢印により表される）フィードバック制御を提供する。図2Cには、サンプル−先端の間隔を関数とする先端電流が示されている。
【００２８】
従来のSICM顕微鏡では、非変調（IDC）イオン電流（図2Aおよび図2C）を、サンプル上のプローブの位置を制御するために使用している。この場合、プローブ／サンプルの相互作用によって生じるものではないマイクロピペット先端を通って流れるイオン電流の何らかの変化（イオン濃度の変化、マイクロピペット先端と水溶液中に混入している粒子との相互作用、電極電位の変動など）により影響が生じるか、あるいはサンプルおよびマイクロピペットの衝突が起こる。SICM操作の周波数変調モードでは、顕微鏡先端の動き（ΔZ）により、変調された電流（IMOD）が生じる。このIMODは、プローブがサンプルを探知したときにのみ生じ、顕微鏡のフィードバック制御のために使用される。図2Bおよび図2C（挿入図）を参照のこと。フィードバック制御には、例えば、周波数変調走査プロトコルが主に使用されている。これは、周波数変調走査プロトコルが、非変調法に対して下記のごとき多くの利点を有するからである：より大きなシグナル／ノイズ比；大きな安定性（電解質の大きな勾配において、そして大きなIDC変動を伴って操作できること）；より大きな走査速度；側方感度の増大。
【００２９】
典型的なSICMシステムは、すべてのSPMにおいて重要な役割を果たしている構成要素、すなわち、走査プローブ、圧電作動性走査エレメント、制御エレクトロニクスおよびコンピューターを含む。これらの構成要素は、例えば、Diaphot200（ニコン株式会社、日本国東京）などの倒立型顕微鏡に組み込み、およびその周囲に設置することができる。
【００３０】
下記の実施例により本発明を説明する。本発明が有用であることは、Lewis他（1999）、Applied Physics Letters、75（17）：2689〜91により間接的に示されている。これは、クロムエッチングの制御にAFMを用いている。
【００３１】
実施例1
SICMプローブを、レーザー型マイクロピペットプラー（モデルP−2000、Sutter Instrument Co.、San Rafael、CA、米国）を使用して、外径および内径がそれぞれ1.00mmおよび0.58mmであるホウケイ酸塩ガラス製マイクロキャピラリーを引き抜くことによって製造する。これにより、円錐テーパー長および先端直径が、それぞれ、200nm、400nmおよび1.0μmであるプローブが再現性よく容易に製造される。
【００３２】
サンプルに対するプローブの三次元的で高精度な動きは、SICMプローブが取り付けられている圧電移動ステージ（Tritor100、Piezosystem、Jena、ドイツ）を使用して達成される。このステージは、ｘ方向、ｙ方向およびz方向に100μmの範囲を有するので、30μm〜50μmまでの範囲である特徴を有する生物学的サンプルについて走査することが可能となる。ステージの動きを容易にする圧電セラミックス材を変形させるために必要な高電圧は、高電圧増幅器（Piezosystem、Jena、ドイツ）によって供給される。これらの増幅器は、制御エレクトロニクスによって生じる適切なシグナルに対する応答を増幅して、圧電移動ステージを駆動させ、サンプルに対する先端の位置を移動させる。顕微鏡のハードウエア面に連結されることに加えて、制御エレクトロニクスは、データ収集および画像分析を可能にするコンピューターに接続される。制御／データ収集用のハードウエアおよびソフトウエアは、East Coast Scientific（Cambridge、英国）によって製造されている。
【００３３】
ピペット−サンプルの間隔は、マイクロピペット内のAg/AgCl電極と、サンプルが浸されている電解質溶液内のAg/AgCl電極との間を流れるイオン電流をモニターすることによって一定の値で維持される。リン酸塩緩衝化生理食塩水（PBS）溶液を、マイクロピペットと心筋細胞の電気生理学的媒体との両方を満たすために使用して、その結果、濃度細胞電位および液体接合部電位が認められないようにする。イオン電流は、電極に加えられた50mVのDC電圧について測定される。イオン電流は、高インピーダンスの演算増幅器（OPA129、Bull Brown International、米国）によって増幅され、106Ωの抵抗における電圧シグナルに変換される。その後、このシグナルは制御エレクトロニクスに入力され、そこでフィードバック制御およびデータ収集のために使用される。
【００３４】
マイクロピペットは、SICMヘッドを含むために電流増幅器および圧電移動ステージと一緒に組み立てられている特別な特注ホルダー内に設置される。SICMヘッドは、そのすぐ下に配置されたサンプルに対するマイクロピペットのおよその垂直位置決のための倒立型顕微鏡のz移動器のアームに取り付けられる。サンプルは、顕微鏡ステージに置かれたペトリ皿内に含有される。マイクロピペットに対するサンプルの動きは、ステージのx移動制御、y移動制御によって達成される。サンプルに対するマイクロピペットの垂直位置をモニターするプロセス、およびサンプル上の目的領域の選択は、ビデオカメラ（JVC TK−1280E、ビクター株式会社、日本）を介してTVスクリーンで見ることができる。
【００３５】
SICMおよびSNOMの同時画像化を可能にするために改変を行った。波長が532nmのレーザー光（Laser2000 Ltd.、英国）を、多モードファイバー（FG−200−UCR；3M Specialty Optical Fibers、West Haven、米国）を介してマイクロピペット内に接続した。開口部の光を制限するために、100nm〜150nmのアルミニウムをピペットの壁面に蒸着した。散乱したレーザー光を、x60の長い作動距離の対物レンズによって集め、転送光学素子によってPMT（D−104−814、Photon Technology International、Surbiton、英国）に中継して、光学シグナルを記録した。ラスター走査時に、制御／データ収集用のハードウエアおよびソフトウエアを使用してサンプルの光学像およびトポグラフ像を同時に得るために、このシグナルを、ADCを介して、サンプルのz位置をも記録するデータ収集コンピューターに記録した。
【００３６】
成体ウサギの心筋細胞を、Jones他（1990）、Cardiovasc.Res.24：834〜842による記載に従って、低カルシウム溶液（NaCl：120、KCl：5.4、MgSO4：5、ピルビン酸塩：5、グルコール：20、タウリン：20、HEPES：10およびニトロ三酢酸：5（mmol/L）、100％のO2により事前に酸素化）、コラゲナーゼ酵素およびプロテアーゼ酵素を使用して単離した。細胞を室温において低カルシウム培体中のガラス製カバーガラス上で画像化した。
【００３７】
光学像およびSICM像を同時に記録した。1組の像を記録するのに約20分を要した。マイクロピペットは、測定されたイオン電流によって、約500nmの内径を有すると推定され、画像化に際して表面の約250nm上方で維持された。推定外径は1000nmであり、これにはガラスおよび金属コーティング部を含む。このことは、これらの像が、光の波長に匹敵し得る直径を有する開口部によって、サンプルからの光の波長よりも小さい近接場で記録されたことを意味している。
【００３８】
ウサギの生心筋細胞の表面の20x20μm走査は、筋節構造がSICM像およびSNOM像の両方で明瞭に視認できることを示していた。光学像は、走査プローブ技術を使用して予想されるように、細胞の表面でのみ得られるようであった。より大きな走査範囲において、光学像とSICM像との間に優れた対応性があった。推定された分解能は約500nmであった。
【００３９】
実施例2
本実施例は、顕微鏡マイクロピペットによる走査時における、イオン、アゴニストまたは他の因子の膜への局所的で非常に局在化された適用を再び例示する。パッチクランプマイクロピペットを用いて細胞の電気的応答をモニターした。この形態は図3に概略的に例示されている。
【００４０】
より詳細には、図3には、その先端が細胞32におけるイオンチャンネル31に隣接しているところの走査用マイクロピペット30が概略的に示されている。パッチクランプマイクロピペット33により、イオンチャンネル電流の記録が得られる。
【００４１】
本実施例により、ラット心筋細胞の筋線維鞘におけるATP調節K+チャンネル（KATPチャンネル）の分布を調べる。KATPチャンネルは、低酸素症または虚血などの代謝的ストレス時の心筋細胞の弛緩および保護における重要な役割を果たしている。細胞膜におけるその局在性についてはほとんど知られていない。実験条件を、細胞内溶液および細胞外溶液がK+イオンを含有しないように選び、そして細胞内ATP濃度を、KATPチャンネルの最大の活性化が得られるように低下させた。
【００４２】
測定の前に細胞を灌流して、細胞内および細胞外のK+をそれぞれCs+およびNa+で置換した。細胞内溶液はATPを含有しなかった。細胞を0mVでクランプ固定した。チャンネルのマッピングを行う前に、細胞外のNa+を短時間でK+で置換して、強いATP調節K+電流を観測するために細胞内ATPレベルが十分に低いことを確認した。このような条件のもとではあるが、ATPの存在下では、この電流は観測されない。顕微鏡マイクロピペットプローブは透過性イオン−K+（1M）を含有し、そしてそれによって細胞表面が走査されるので、K+イオンが、マイクロピペットの先端の下にある非常に局在化された領域に供給される。K+濃度が活性なイオンチャンネルの近くで増大すると、パッチクランプマイクロピペットにより、増大したＫ＋電流が記録される（図4）。点線はゼロ電流を表す。
【００４３】
観測されたイオン電流プロファイルはベル型形状であり、これは、マイクロピペット先端の周りのK+イオンの分布から予想される通りである。負電流の最大値は、走査用マイクロピペット先端がイオンチャンネルのちょうど真上に位置するときの走査用マイクロピペット先端の位置に対応し、マイクロピペット内のK+濃度に比例する。この電流値は、類似するイオン条件のもとで調べられた外側の外れたパッチで観測された単独のKATPチャンネル電流の振幅と非常に一致する（図4B）。この場合、浴のK+濃度は、走査用マイクロピペットによって供給されるK+濃度と等しい。
【００４４】
これらの手法により、2つの像（心筋細胞の表面に広がる単独のプロファイルとして示される像、図4Cおよび図4D）を同時に得ることができる。一方は、細胞表面のトポグラフ像である（図4C）。もう一方は、それぞれの点が、パッチクランプピペットによって測定されたイオン電流の値に対応するイオン電流像である（図4D）。これは、測定時刻における細胞表面における顕微鏡マイクロピペット先端の座標を使用してプロットされている。個々のイオンチャンネルの位置に対応する下に向いた2つの電流ピークが、図4Dにおいて明瞭に認められ、垂直な矢印は心筋細胞表面におけるオンチャンネルの位置を示している（図4C）。
【００４５】
活性なイオンチャンネルは、閉じている状態の時間もあり、短期間の測定では依然として容易に検出されないままであり得る。単独のチャンネルを検出する可能性を増大させるために、複数の走査プロファイル記録による同一チャンネルからの電流を得る。
【００４６】
数多くの電流像を分析することにより、KATPチャンネルは不均一に分布し、心筋細胞の筋線維鞘の局在化領域に集中していることが明らかにされた。これらの領域または「クラスター」はそれぞれ、他から2μm〜6μm離れており、10個までの活性なイオンチャンネルを含有している。「クラスター」内のイオンチャンネルは0.2μm〜1μm離れている。これらのKATPチャンネルは、比較的長い観測期間（40分以上）のときに筋線維鞘における同じ位置で記録され得る。さらに、活性なKATPチャンネルが、筋線維鞘の「ホタテガイ」様領域でのみ観測されたが、原形質膜の他のところ（例えば、細胞接触の領域）では観測されなかった。このことは、KATPチャンネルが、筋線維鞘の特定領域において、おそらくは細胞骨格により固定されており、そして非常に小さい側方移動性を有することを示唆している。この直接的な観測結果は、F−アクチン細胞骨格とKATPチャンネルとの間に何らかの結合が存在することを示す発表された結果（Yokoshiki他、Pflugers Arch.434〜203（1997）を参照のこと）と良く一致している。
【００４７】
本発明の技術は、心筋細胞における他のタイプのイオンチャンネルの分布を調べるために使用することができる。また、この方法は一般に、様々な種類の細胞の無傷の細胞膜におけるイオンチャンネルの機能的局在化を調べる際に適用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1は、本発明において使用され得るタイプのマイクロピペットを例示する。
【図２】  図2Aおよび図2Cは、非変調イオン電流を使用して、プローブ位置がいかにしてサンプルの上方で制御され得るかを例示する。
図2Bおよび図2Cは、本発明の好ましい実施形態の場合のように、フィードバック制御がいかにして使用され得るかを例示する。
【図３】  図3は、本発明における使用に好適な構成要素の別の形態を示す。
【図４】  図4は、ラット心筋細胞の筋線維鞘における単独のKATPチャンネルを検出した結果を示す。
【図１】
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【図３】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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