(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（I）〜（III）のいずれかを有するペプチド：
CX1X2XXXX6XXC      (I)
（式中、X1 は V または I であり、X2 は Fであり、X6 は Yであり、C はシステインであり、各 X は独立的にアミノ酸残基を表す)；
CX1X2XXXX6XX8X9X10C      (II)
（式中、X1 は V、T または R であり、X2 は F であり、X6 は Y であり、X8 は Y または T であり、X9 は L であり、X10 は V または M であり、X および C は上記と同じ意味を有す)；
CX1X2X3CXXXXCX8X9C        (III)
（式中、X1 は V または A であり、X2 は A、S、E、T、V または Q であり、X3 は Y であり、X8 は W であり、X9 は V、T、M、Y、G または F であり、X および C は上記と同じ意味を有す)；
ここで、該ペプチドはPSAに結合し、その酵素活性を増強する。
【請求項２】
式（Ｉ）を有し、X1 が V または I、X2 が F、X6 が Yである、請求項１のペプチド。
【請求項３】
式（I）を有し、X1 が V 、X2 が F 、X6 が Y であり、各 X が、T、S、D、Y、A、F、E、P、L よりなる群から独立的に選ばれるアミノ酸残基である、請求項１のペプチド。
【請求項４】
式（I）を有し、X1 が I 、X2 が F 、X6 が Y であり、各 X が、E、P、D、S、Y、G、F、I、L よりなる群から独立的に選ばれるアミノ酸残基である、請求項１のペプチド。
【請求項５】
式（II）を有し、X1 が V、X2 が F、X6 が Y、X8 が Y、X9 が L、X10 が V であり、X が、A、H、N、D よりなる群から選ばれるアミノ酸である、請求項１のペプチド。
【請求項６】
式（III）を有し、X1 が V、X2 が A または S、X3 が Y、X8 が W、X9 が V、Y または T、各 X が、L、F、E、W、G、S、I、H、D、G、L、Q、Y、V、A、M、K よりなる群から選ばれるアミノ酸である、請求項１のペプチド。
【請求項７】
式（III）を有し、X1 が V、X2 が A、X3 が Y である、請求項１のペプチド。
【請求項８】
下記よりなる群から選ばれるペプチド：
CVFTSDYAFC (配列番号 1)、CIFEPDYSYC (配列番号 3)、CVFDDLYSFC (配列番号 4)、CTFSVDYKYLMC (配列番号 5)、CVFAHNYDYLVC (配列番号 6)、CRFDKEYRTLVC (配列番号 7)、CVAYCIEHHCWTC (配列番号 11)、CVSYCDGLQCWMC (配列番号 12)、CVQYCIGGDCWFC (配列番号 17)、CVVYCDSMKCWTC (配列番号 18)、CVFDALYTFC (配列番号 21)、CIFDGFYILC (配列番号 23)。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかのペプチドを含む、PSA酵素活性の調節剤。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれかの少なくとも１つのペプチドおよび診断的に許容される担体および/または標識物質を含む診断組成物。
【請求項１１】
請求項１から８のいずれかの少なくとも１つのペプチドおよび薬学的に許容される担体および/または標識物質を含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１から８のいずれかのペプチドを製造する方法であって、固相 Merrifield-型ペプチド合成を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
哺乳動物における PSA 産生細胞依存性症状を処置するための、請求項１から８のいずれかのペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１４】
PSA の酵素活性の調節に基づく症状の処置用の医薬の調製のための、請求項１から８のいずれかのペプチドの使用。
【請求項１５】
良性および悪性の前立腺疾患および PSA 産生の他の組織から誘導される疾患についての PSA に基づく診断に使用される試薬の調製のための、請求項１から８のいずれかのペプチドの使用。
【請求項１６】
種々の分子形態の PSA の生化学的単離および精製の方法における、請求項１から８のいずれかのペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、前立腺特異抗原結合およびその酵素活性増加のための新規ペプチドリガンドに関する。本発明はまた、このペプチドの製造方法に関する。さらに、本発明は、ペプチドを含む医薬組成物および診断組成物、および医薬組成物および診断組成物の製造におけるペプチドの使用に関する。さらに、本発明は、医薬および診断薬、それらの製造、生化学的単離および精製方法に関する。
【０００２】
関連技術の説明
前立腺特異抗原 (PSA) は、上皮細胞の高度に特異的な生成物である(1)。PSA は 30 kD セリンプロテアーゼであり、その主要な生物機能は、精液塊の主な成分であるセメノゲリンのタンパク性分解による射精後に形成される精液ゲルの液化である(2)。精液中の PSA は遊離の PSA から主になり、この PSA には酵素的に活性な型およびタンパク質分解的に解裂または切開された型がある(3)。ヒト血清において、主要な免疫活性型の PSA は、PSA-a1-抗キモトリプシン複合体 (PSA-ACT) および遊離 PSA (PSA-F)である(4)。
【０００３】
血清 PSA の測定は、前立腺癌患者の検出および管理のために広くおこなわれており、この疾患スクリーニングのための使用が増加している。スクリーニングのために PSA を使用する主な問題は、良性の前立腺肥大による高い誤まった陽性率である。これは、全 PSA に対する PSA-ACT または 遊離 PSA の比率を検定することで減じ得る（4)。しかし、PSA の癌特異性の改善がさらに望ましい。このことは、PSA のマイナー変種についての特異的検定法を開発することで達成できよう。前立腺癌細胞はプロ酵素型の PSA を優先的に分泌する(5)。一方、切断された PSA は良性組織で形成されることが知られている(6)。従って、これらの型の PSA 検定法は臨床的に有用であり得るが、これらの型に特異的なモノクローナル抗体 (MAb) の開発が困難である。診断上の有用性がある他の検定法は PSA-α-2-マクログロブリン複合体 (PSA-A2M) についてのものである(7)。しかし、この複合体において抗体のような高分子量の結合物質は、阻害物質がプロテイナーゼを取り込むので、PSA に到達し得ない。すなわち、PSA-A2M 検定法は複合体の変性を必要とする(7)。PSA-A2M の直接的検定法の開発には、阻害物質に入り込み、PSA を特異的に認識する小さい結合物質を必要とするであろう。
【０００４】
PSA は、腫瘍成長を阻害して(8)、プラスミノーゲンからアンギオスタチンを生成せしめることが最近報告されている(9)。アンギオスタチンは腫瘍中の新血管形成を妨げることで腫瘍成長を阻害するので、アンギオスタチンの生成は腫瘍の発生を遅らす。従って、PSA の酵素活性を調節する物質は前立腺癌の治療に有用であり得る。
【０００５】
MAb は、癌の発見および治療に広く用いられている。しかし、大きいサイズの MAb は循環系から組織に分散する能力に限界がある。さらにマウス抗体はヒトで免疫原性であり、治療での用途は限られる。MAb はまた、循環において長いアベイラビリティを発揮することがあり、正常な組織において Fc 受容体と相互作用し、トキシンや放射性同位体が接着されると患者を危険におとすことがある(10)。このような問題は、小さい分子量の別の結合物質を使用することで解消できる。
【０００６】
特異的結合物質の開発における MAb についての他の方法は、ペプチド・ライブラリーおよびファージ・ディスプレイ法の使用である。PSA-結合ペプチドは、ポリソーム選択法により以前につくられているが(11)、このペプチドは PSA の酵素活性を調節せず、PSA についての検定法の部分として有用とされていない。Denmeade et al. が PSA のペプチド基質を、精液中の PSA の基質であるセメノゲリンの配列を基に開発した(12)。しかし、このペプチドは PSA に対する安定な結合を必要とする技法で適用できない。
【０００７】
上記の説明から分かるように、PSA と反応するいくつかのペプチドが開発されているが、これらのペプチドは PSA の酵素活性を調節するとはされておらず、また PSA の検出に用いて機能的でもない。
【０００８】
発明の要旨
本発明の目的は、先行技術の問題点を解決し、新規の PSA 結合化学物質を提供することである。特に、本発明は、PSA の血清中への放出を含む状態を処置および診断するのに、特に治療的および診断的に有用な新規のペプチドリガンドおよびその機能的等価物を提供することを目的とする。
【０００９】
他の目的は、酵素活性を調節し得る前立腺特異抗原の新規なペプチドリガンドを製造する方法を提供することである。
第３の目的は、PSA に結合し得る新規な化合物を含む医薬組成物および診断組成物を提供することである。
【００１０】
第４の目的は、新規な診断法および治療法を提供することである。
これらの目的および他の目的は、既知の結合物質や方法を越える利点とともに、下記の説明および請求項にしたがって本発明により達成できる。
【００１１】
本発明は、特殊な構造（特殊なアミノ酸配列またはモチーフ）を有する新規ペプチド群が遊離 PSA または PSA - A2M 複合体と選択的結合をなし、そしてその酵素活性を調節し得るとの知見に基づく。本発明のペプチドは、少なくとも１対のシステインを含む。このシステインは、少なくとも２つのアミノ酸で空間的に隔たり、少なくとも１対の該システイン間のジスルフィド結合を有する環状構造を形成し得る。システイン間のジスルフィド結合形成の結果として、ペプチドの主要鎖が曲がり、三次元立体配座をとる。これを、ペプチドと同様の生物活性を有するペプチド・アナログすなわちペプチド様化合物を開発するための基礎として使用できる。
【００１２】
新規ペプチドは、本発明の結合物質を表し、設計されたジスルフィド結合により立体配座的に拘束を受けていたペプチドのファージ・ディスプレイ・ライブラリーを使用することにより見出した。驚くべきことに、予想に全く反して、最も活性なペプチドが小さい分子量の色素産生性基質および天然のタンパク基質に対する PSA の酵素活性を高める。この PSA 活性の増加は、特に PSA 酵素活性の上昇を治療目的に使用するときに、多くの用途で用い得る。
【００１３】
さらに具体的に、本発明のペプチドリガンドおよびその機能的等価物は、請求項１から２３の特徴部分で述べた点を主要な特徴とする。
本発明の診断組成物は、請求項２６および２７の特徴部分で述べた点を主要な特徴とする。
本発明の医薬組成物は、請求項２８および２９の特徴部分で述べた点を主要な特徴とする。
【００１４】
本発明のペプチドリガンドの製造法は、請求項３０の特徴部分で述べた点を主要な特徴とする。
本発明の治療方法は、請求項３１および３２の特徴部分で述べた点を主要な特徴とする。
本発明のペプチドモチーフ、配列、ペプチド様化合物の使用は、請求項３３から４０の特徴部分で述べた点を主要な特徴とする。
【００１５】
本発明により非常な利点が得られる。本発明はまず、PSA の酵素活性を調節し、さらに特異的に高め得る PSA 結合リガンドを提供する。本発明のペプチドは、免疫ペプチド検定法またはクロマトグラフィー・マトリックスの部分として種々の形態の PSA と特異的に結合し得る。さらに、このペプチドは抗体で得られていない結合特異性を表す。本発明のペプチドおよび対応のペプチド様化合物は、PSA 分泌細胞依存性状態の処置のために医薬組成物として製剤できる。
【００１６】
Denmeade et al. が開発したペプチドは、細胞毒性薬物とコンジュゲートされて、プロドラッグを形成する。このプロドラッグは PSA により分解されて活性となる(13)。同様の方法で、PSA と安定な結合を示す本発明のペプチドは、細胞毒性薬物、遺伝子治療ベクター、造影物質を前立腺癌組織に選択的に運送するのに、なんらの活性化工程を要しないで用い得る。
次ぎに、本発明を詳細な説明および図面を参照して詳しく記述する。
【００１７】
図面の簡単な説明
図１は、GST-ペプチドの固定化 PSA との結合を示す。
図２は、GST-ペプチドの固定化 PSA との結合に対する Zn2+ の作用を示す。
図３は、GST-C-4 の固相 PSA との結合に対する PSA 溶液の作用を示す。
図４ａおよび４ｂは、それぞれ、GST-ペプチドの、PSA に関連する種々のプロテイナーゼおよび PSA-セルピン複合体との反応性を示す。
図５は、ゲルろ過による GST-C-4 の分別を示す。
【００１８】
図６は、GST ペプチドのプロ酵素型 PSA および活性 PSA との結合を示す。
図７は、化学合成ペプチドの、GST-C-4 の固相 PSA との結合に対する作用を示す。
図８は、GST-C-4 の PSA 酵素活性に対する作用を示す。
図９は、化学合成ペプチド C-4 の PSA 酵素活性に対する作用を示す。
図１０は、化学合成ペプチド C-4 および A-1 の、PSA の IGF-BP-3 へのタンパク分解活性に対する作用を示す。
【００１９】
図１１は、GST-C-4 と Zn2+ の PSA 酵素活性に対する併用効果を示す。
図１２は、化学合成ペプチド C-4 の、PSA - A2M 複合体の酵素活性に対する作用を示す。
図１３は、誘導ペプチド B2 の構造を示す。
図１４は、誘導ペプチド C4 の構造を示す。
図１５は、SKSKSKS-テイル化ペプチド C4 の PSA 酵素活性に対する作用を示す。
【００２０】
図１６は、ペプチド C4 の Eu-標識反応混合物のフラクション化を示す。
図１７は、図１６に示す C18 クロマトグラフィーの種々のフラクションの、PSA 酵素活性に対する作用を示す。
図１８は、テクネチウム標識の、C4-ペプチドの結合活性に対する作用を示す。
図１９は、ヨウ素化の、C4 ペプチドの PSA 結合活性に対する作用を示す。
図２０は、100 μM Zn2+ の存在下での B2 ペプチド アフィニティークロマトグラフィーによる精液血漿サンプルのフラクション化を示す。
【００２１】
図２１は、Zn2+ 不存在で上記図２０の精液血漿サンプルのフラクション化を示す。
図２２は、異なるｐＨ値での C4-ペプチドカラムからの PSA の溶出を示す。
図２３は、ペプチド B2 のアフィニティーカラムから得られた PSA-含有フラクションの、非還元条件下での SDS-PAGE 後のイムノブロット分析を示す。
図２４は、還元条件下での SDS-PAGE 後の対応する（参照、図２３）イムノブロット分析を示す。
図２５は、ペプチド B2 カラムによりフラクション化された精液の、非還元条件下での SDS-PAGE を示す。
【００２２】
図２６ａ−ｃは、A-1 (a)、B-2 (b)、C-4 (c) についてランダムコイルにおける CαH 化学シフト値と DMSO-d6 において実験的に測定された値との相違を示す。
図２７ａ−ｃは、DMSO-d6 におけるペプチド A-1、B-2、C-4 の有意の NOE-相関関係を示す。
図２８は、ペプチド A-1 の三次元構造を示す。
図２９は、ペプチド B-2 の三次元構造を示す。
図３０は、ペプチド C-4 の三次元構造を示す。
【００２３】
発明の詳細な説明
定義:
本発明の目的にとって、用語 "リガンド" は、ホルモンなどの大きいポリペプチド分子または細胞の表面に存在する結合ドメインに結合し得る化合物または化合物部分を表す。本ペプチドリガンドは、PSA に結合し、合成および天然の IGF-BP-3 基質に対するその酵素活性を調節、または多くの場合に増加すらする。本明細書において、"リガンド" を "結合物質" と同義的に使用する。
【００２４】
一般的に、リガンドは化学的化合物、例えばペプチドであって、生理的溶液に溶解し、あるいは水または血清に混合し得る。本リガンドの PSA との結合は、表面プラスモン共鳴法や免疫ペプチド検定法 (IFMA-検定法) などにより結合を測定または決定できる程度に、リガンドが PSA の結合ドメインに接着しているという点で "安定" (これに反し、例えば、酵素反応) であることを特徴とする。さらに、結合したリガンドは、生理的緩衝液で洗出または流出されない。本リガンドの結合強度は乳癌を標的とするのに使用されるペプチド剤の強度に匹敵する(14)。
【００２５】
本リガンドの PSA との結合は "選択的" である。この選択性は、遊離 PSA および PSA との複合体中のセリンプロテイナーゼ阻害剤に特異的である MAb がリガンドの PSA との結合を妨げるとの事実により表される。本リガンドは活性部位の周辺に位置する PSA の部位に結合するようであるが、これは単に理論であって、われわれはこれに拘束される意図はない。典型的には、本ペプチドおよび対応のペプチド様化合物は、"遊離" PSA またはα2-マクログロブリンとの複合体中の PSA と結合する。遊離 PSA は前立腺上皮細胞により合成され分泌される PSA の形態である。
【００２６】
"ペプチド" は、ペプチド骨格を形成するアミド結合により一緒に結合されたいくつかのアミノ酸のひとつの鎖を表す。一般的に、ペプチドは、10 kDa 以下の分子量の分子、すなわち約 90 以下のアミノ酸を含有する分子を含む。ペプチドは、約 6-30 アミノ酸単位からなるとき、"小ペプチド" といい得る。上記のように、本ペプチドは一般的にシステイン間のジスルフィド結合により形成される架橋を少なくともひとつ含む。ペプチドが複数対のシステインを含有していると、複数の架橋ができることがある。ジスルフィド結合に加え、ペプチド内に他の架橋が同様にでき得る。いくつかの例示的ペプチドの特異的な構造については、下記で詳細に説明する。
【００２７】
“ペプチド・アナログ" は、環付加、縮合反応、求核反応などの種々の化学反応によるペプチドの修飾を基にするペプチドの誘導体である。
【００２８】
“ペプチド様化合物" は、上記した元のペプチドに類似する化合物である。このものは、元のペプチドを形成するアミノ酸と異なる化学的建造体から作り得る。例えば、元のペプチドの主要な配列に基づいて、ベンゾラクタムやピペラジンを基とするアナログのような非ペプチド化合物を用い得る (15, 16)。ペプチド様化合物と元のペプチドとの類似は、構造的および機能的な類似性に基づく。すなわち、ペプチド様化合物は、元のペプチドとバイオ活性配座が似ており、本願の目的について、PSA 結合部位に関する結合活性が、その類似するペプチドのものと同様である。ペプチド様化合物は、元のペプチドに見られないアミノ酸（例えば、D-アミノ酸) からも作ることができ、また、アミド結合やエステル結合を形成する他の化合物からも作ることができる。合成ペプチド様化合物の例には、ポリ(エステルイミド)、ポリエステル、N-アルキルアミノ環状尿素、チオ尿素、ニ環状グアニジン、イミダゾール-ピリジノ-インドール、ヒダントイン、チオヒダントインがある(15, 16)。これらは、例えば、下記の基を含有する。フェニル、シクロペンチル、シクロペンタニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサニル、ナフチル、インダニル、フリル、チエニル、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピロゾリニル、ピラゾリジニル、ピリジル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、モルホリニル、ピペリジニル、ピラジニル、ピペラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾイル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソオキサゾリジニル、 イソチアゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、二環状環。
【００２９】
ペプチド様化合物は、ペプチドに構造的および機能的に等価であることを特徴とし得る。
一般的に、前立腺特異抗原 (PSA) についての新規な結合物質は、下記のいずれかを含む：
a. ペプチド骨格を形成するために一緒になって結合した少なくとも 6 アミノ酸、および１対のシステイン（このシステインは少なくとも２つのアミノ酸で空間的に隔たり、システインと中間アミノ酸とジスルフィド結合による環状構造を形成するジスルフィド結合で連結されている）を有するペプチド、または
b. ペプチドに類似の空間的配座を有するペプチド様化合物 (元のペプチドのバイオ活性配座に似る)。
該化合物の両者とも、遊離の前立腺特異抗原および PSA-A2M （上記に定義）に対して選択的結合を発揮する。
【００３０】
本発明の第１の好ましい実施態様において、新規の PSA 結合ペプチドリガンドは、下記式 (I) によるペプチド・モチーフの環状構造 (システイン間のジスルフィド結合) に基づく：
CX1X2XXXX6XXC      (I)
（式中、X1 は V または I であり、X2 は F、I、W または P であり、X6 は Y、N または L であり、C はシステインであり、各 X は独立的にアミノ酸残基を表す）。
【００３１】
特に、式 (I) において、X1 は V または I、X2 は F または I、X6 は Y または N である。X1 が V で、X2 が F であるとき、X6 は Y が好ましく、各 X は、T、S、D、Y、A、F、E、P、L よりなる群から独立的に選ばれるアミノ酸残基である。X1 が V で、X2 が I であるとき、X6 は N が好ましく、各 X は、Y、D、G、H、W、P、V よりなる群から独立的に選ばれるアミノ酸残基である。さらに、X1 が I で、X2 が F であるとき、X6 は Y または N が好ましく、各 X は、E、P、D、S、Y、G、F、I、L よりなる群から独立的に選ばれるアミノ酸残基である。
【００３２】
式 (I) のペプチドについての別の特に好ましい実施態様において、X1 は V または I であり、X2 は F、I、W または P であり、X5 は D または N であり、X6 は Y、N または L であり、X7 は A または N であり、X8 は F または Y であり、残りの構造単位は上記と同じ意味を有す。
【００３３】
ペプチドの例を配列番号で表示する: 表１における A-1 (配列番号 1)、A-2 (配列番号 2)、A-4 (配列番号 4)、Z-6 (配列番号 20)、Z-7 (配列番号 21)、Z-8 (配列番号 22)、Z-10 (配列番号 24)、および A-3 (配列番号 3)、Z-9(配列番号 23)。
【００３４】
表１．PSA-結合ペプチドのアミノ酸配列
【表１】
0004647882.tif 000002
一本鎖 DNA をファージクローンから、PSA について３回の選択後に精製した。ペプチド配列は、ファージゲノムの対応領域の DNA 配列から演繹した。いくつかのクローン中の共通残基を太字で示す。グルタチオン S-トランスフェラーゼ (GST) 融合タンパク質として発現されたペプチドをアステリスクで示す。
【００３５】
本発明の第２の好ましい実施態様において、新規の PSA 結合ペプチドリガンドは、下記式 (II) によるペプチド・モチーフの環状構造に基づく：
CX1X2XXXX6XX8X9X10C      (II)
（式中、X1 は V、T または R であり、X2 は F であり、X6 は Y であり、X8 は Y または T であり、X9 は L であり、X10 は V または M であり、X および C は上記と同じ意味を有す）。
【００３６】
好ましくは、式 (II) において、X1 は V、X2 は F、X6 は Y、X8 は Y、X9 は L、X10 は V であり、X は、A、H、N、D よりなる群から選ばれるアミノ酸である。好ましい配列を下記に配列番号で例示する: 表１における B-1 (配列番号 5)、B-2 (配列番号 6)、B-3 (配列番号 7)。
【００３７】
式 (II) の構造単位はまた、下記の意味を有する: X1 は V、T または R、X2 は F、X6 は Y、X7 は D または N、X8 は Y、T または A、X9 は L、X10 は V または M であり、他の単位は上記と同じ意味を有する。
【００３８】
本発明の第３の好ましい実施態様において、新規の PSA 結合ペプチドリガンドは、下記式 (III) によるペプチド・モチーフの環状構造に基づく：
CX1X2X3CXXXXCX8X9C        (III)
（式中、X1 は V または A であり、X2 は A、S、E、T、V または Q であり、X3 は Y であり、X8 は Y または W であり、X9 は V、T、M、Y、G または F であり、X および C は上記と同じ意味を有す）。
【００３９】
特に、式 (III) のペプチドモチーフまたは配列は下記のアミノ酸残基を含む：X1 は V、X2 は A または S、X3 は Y、X8 は Y または W、X9 は V、Y または T、各 X は、L、F、E、W、G、S、I、H、D、G、L、Q、Y、V、A、M、K よりなる群から選ばれるアミノ酸である。詳細に下記するように、PSA との強い結合は、CVAYC (配列番号 11) モチーフを含有するクローンで達成できる。すなわち、式（III）において、好ましくは、X1 が V、X2 が A、X3 が Y である。
【００４０】
X3 はまた、Y または F であり、X5 が E または Q であり得、残りの構造単位は上記、特に前パラグラフと同じ意味を有する。
式 (III) のペプチドは、表Ｉにおいて下記の配列番号で示す: 配列 C-1 (配列番号 8)、C-5 (配列番号 12)、Z-1 (配列番号 15)、Z-6 (配列番号 20)、Z-8 (配列番号 22)。
【００４１】
本発明の第４の好ましい実施態様において、新規の PSA 結合ペプチドリガンドは、下記式 (IV) によるペプチド・モチーフの環状構造に基づく：
CX1XX3CXXXCX7XXXC      (IV)
（式中、X1 は L であり、X3 は T または Y であり、X7 は R または W であり、X および C は上記と同じ意味を有する）。
【００４２】
好ましくは、X1 は L であり、X3 は T である。表１での対応配列は、D-1 (配列番号 13) および D-2 (配列番号 14) である。
【００４３】
本発明はまた、別の特徴を有する結合物質の開発のためにリード配列としての上記のモチーフの使用に関する。
【００４４】
本発明の他の目的は、表１に記載の配列に基づく新規の PSA 結合ペプチドリガンドを提供することである。ペプチド A-1 (配列番号 1) - A-4 (配列番号 4)、B-1 (配列番号 5) - B-3 (配列番号 7)、C-1 (配列番号 8) - C-5 (配列番号 12)、D-1 (配列番号 13) - D-2 (配列番号 14)を、下記の方法の項に記載のように単離した。ペプチド Z-1 (配列番号 15) - Z-11 (配列番号 25) を、A-、B-、C-、D-シリーズのペプチドと同様に単離した。ただし、ふるい分けに使用した緩衝液中に200 μM の ZnCl2 を含む。
【００４５】
ペプチド A1 (CVFTSNYAFC、配列番号 1)、B2 (CVFAHNYDYLVC、配列番号 6)、C4 (CVAYCIEHHCWTC、配列番号 11) は、特に強い結合を表した。それらの性質および構造をさらに詳細に調べた。検討結果を実施例４および５で示す。
【００４６】
実施例５で説明する構造分析によると、２ペプチド A-1 および B-2 (各々、一般式 I および II に対応する) は非常に類似の構造と類似あるいは同一の生物活性とを有する。A-1 ペプチド中の好ましい側鎖は、3 位のフェニルアラニン (Phe、F) および 7 位のチロシン (Tyr、Y) である。ペプチド B-2 での好ましいアミノ酸は、同じく 3 位のフェニルアラニン (Phe、F) および 7 位のチロシン (Tyr、Y) である。
【００４７】
配列 A-1 および B-2 において、剛性βターン（turn）が、3 位のフェニルアラニン (Phe、F) および 7 位のチロシン (Tyr、Y) の芳香族側鎖の位置を安定にする。その構造は、ペプチド A-1 において、4 位のトレオニン (Thr、T) のカルボニル酸素と 7 位のチロシン(Tyr、Y)のアミドの水素との水素結合により安定になる。ペプチド B-2 においては、4 位のアラニン (Ala、A) のカルボニル酸素と 7 位のチロシン(Tyr、Y)のアミドの水素との水素結合により安定になる。
【００４８】
ペプチド C-4 での好ましいアミノ酸は、4 位のチロシン (Tyr、Y) および 11 位のトリプトファン (Trp、W) である。この構造は２ジスルフィド橋により安定になる; 第１が部位 Cys1 と Cys13 の間、および第２が部位 Cys5 と Cys10 の間である。
【００４９】
しかし、注意すべきことに、表示の位置での好ましい上記アミノ酸に加えて、類似の構造を有し、式の関連代替表に記載された別のアミノ酸も所望の活性を発揮する。記載の位置は、ペプチドの全長から計算し、システインも数えた。このことは、例えば、ペプチド A-1 の 3 位の F が式Ｉの X2 に対応することを意味する。
【００５０】
得たデータに基づいて、式 I または II の本ペプチドの活性に類似する活性を有する本発明のペプチド様化合物は、10 − 12 構造単位を含み、特に 3 および 7 位で芳香族または脂環式の剛性基を有する基本構造を表し、その構造はβターンで剛性につくられる。7 位で構造単位に連結している側基は水素結合を提供する基をさらに有さなければならない。式 III の本ペプチドの活性に類似の活性を有する本発明のペプチド様化合物は、13 構造単位の基本構造を表し、これは夫々 1 と 13 および 5 と 10 位の細胞内橋により安定になる。さらに、4 と 11 位において、ペプチド様化合物は、芳香族または脂環式の剛性置換基 (側基)を表し、4 位の置換基はさらに酸官能基または水素結合能を提供する類似の基を有する。
【００５１】
ペプチド様化合物および実際のペプチドは、モチーフ (または対応する機能性パターン) が存在する限り、上記に開示のものよりも長い分子鎖を有することがある。
【００５２】
本発明はまた、ある量の新規 PSA 結合ペプチド量を含む診断組成物に関する。本発明ペプチドおよび診断的に許容される担体を含む診断組成物は、それ自体で、または検定法の固相マトリクスに固定されたペプチド・コンジュゲートとして、または標識ペプチド・トレーサー試薬として使用し得る。本発明の診断組成物は、種々の分子形態の PSA の測定を基にした検定法において用途がある。診断組成物は、活性成分を液相、好ましくは水相中に濃度 0.1 − 500 μg/l で含有する。組成物は Tween やポリソルベートなどの洗剤および安定化剤を含有し得る。他の成分の濃度は組成物の約 0 − 50 重量 % であり得る。
【００５３】
実施例４の結果からして、本ペプチドは、PSA の精製および種々の形態の遊離 PSA 間の分化に使用し得る。これらのペプチドが PSA に対する新規の結合特異性を保有しており、すなわち、無傷形態の遊離 PSA に特異的に結合するので、前立腺癌の改善された正確な検定法の開発に有用性を持ち得る。
【００５４】
本発明はまた、ある量の新規の PSA 結合ペプチドリガンドを含む医薬組成物に関する。本発明の新規の PSA 結合ペプチドは、全身的、局部的および/または局所的に使用でき、例えば、非経口的に、経静脈的に、皮下的に、筋肉内に、鼻腔内に、肺エアゾールで、デポ形態で投与できる。組成物は、標識試薬、造影試薬、薬物などの化学物や分子とペプチドとの組合せをも含み得る。
【００５５】
本発明はまた、PSA 発現細胞または PSA 発現細胞の近辺の細胞への遺伝子運送を調節するためにペプチドを使用することに関する。遺伝子運送の調節のためにペプチドを使用することは、一般的に参考文献 17 に記述されている。
【００５６】
静脈注入または注射に適した医薬組成物は特に好ましく、活性成分の濃度が一般的に約 0.1 − 500 g/l、好ましくは約 1 − 250 g/l である。過剰量が患者に負担とならなければ、幾分高い濃度 (例えば、約 20 − 200 g/l) が好ましい。その製剤は、凍結乾燥し、投与前に再構築するか、投与用溶液として貯蔵できる。溶液産物の pH は、約 5 から約 8 の範囲にあり、好ましくは生理的 pH の近辺である。溶液の浸透圧は、好ましい値が少なくとも 200 mosmol/l であって、塩化ナトリウムおよび／または糖、ポリオール、アミノ酸またはこれらの類似成分を用いて調整できる。組成物は、さらに薬学的に許容される賦形剤および安定剤、例えば、アルブミン、糖、種々のポリオールを含有し得る。これらの成分の量は、活性成分の約 0 − 50 重量 % の範囲で大きく変り得る。液体製剤は再構築なしに投与できるという追加の利点を提供する。
経口投与のために、本発明のペプチドの誘導体を調製するのが必要なことがある。
【００５７】
特に興味深い実施態様において、ペプチド (およびペプチド様化合物) を、細胞毒性薬物であるドキソルビシンやメトトレキセートなどの診断/治療化合物を含有するリポソーム・パッケージ中に組込む。ペプチドを包含するリポソームは参考文献 18、19 に開示されている。ペプチドのリポソーム表面へのカップリングは、その PSA 産生細胞への標的化を可能にする。
【００５８】
本発明はまた、良性および悪性の前立腺疾患および PSA を生成する他の組織に由来する疾患について PSA を基にする診断のための試薬を製造するのに新規の PSA 結合ペプチドを用いることを含む。
【００５９】
本発明はまた、本発明の使用を基にする症状の処置および標的化のために上記医薬組成物の製造に新規の PSA 結合ペプチドを用いることを含む。本発明はまた、PSA 酵素活性の調節を基にする症状の処置のために新規の PSA 結合ペプチドを用いることを含む。すなわち、一般的に、新規のペプチドおよび構造的かつ機能的に等価のペプチド様化合物 (= 活性成分) を医薬組成物で用いて、哺乳動物の癌や他の症状を処置できる。それには、有効量のペプチドまたはペプチド様化合物またはそれらの医療的に許容される酸、塩、誘導体を薬学的に許容される担体で投与する。薬学的に許容される担体との投与における用量は、１日当り体重 kg につき約 1 から約 1,000 μg であり得る。上記のように、組成物は、非経口的に、経静脈的に、皮下的に、筋肉内に、鼻腔内に、肺エアゾールで、デポ形態で投与できる。
【００６０】
本発明はまた、種々の形態の PSA の生化学的単離および精製法に新規の PSA 結合ペプチドを用いることに関する。
本発明はまた、標準的な固相 Merrifield ペプチド合成により、これらの PSA 結合ペプチドを製造する方法に関する。
【００６１】
本発明のペプチドは、そのままでまたは標識誘導体で、種々の分子形態の PSA についての定量検定法の部分として、PSA の活性を調節する化合物として、または PSA 産生細胞の標的化のために使用し得る。
【００６２】
さらに、これらのペプチドは、上記の目的のためにペプチド様化合物を設計するのにリード化合物として使用し得る。ペプチドはまた、上記のようにおよび実施例４で述べるように、種々の形態の PSA の生化学的単離および精製のためにカラムクロマトグラフィー・マトリクスで使用できる。さらに、本発明のモチーフを、他の特徴を有する結合物質の開発のためのリード配列として使用できる。
【００６３】
本ペプチドはまた、PSA 酵素活性および PSA 活性依存性状態を調節するために in vivo または in vitro でこれらのペプチドを用いる方法で使用できる。さらに、本発明のペプチドは、PSA 生化学的単離および精製の方法に使用できる。
【００６４】
本発明のペプチドはまた、PSA の IGF-BP-3 に対する活性を増加する。そして、PSA の天然基質に対する活性にも作用する。本ペプチドは、前立腺の病理および生理における PSA の生物機能の調節に有用であり得る。興味深いことに、この同定されたペプチドのいずれもが酵素活性を阻害しなかった。
【００６５】
PSA は、内皮細胞の増殖および侵入を阻害し [8, 1999 #626]、プラスミノーゲンをアンギオスタチンに対応の断片に分解する。このものは内皮細胞の成長および血管形成を阻害する(9)。本ペプチドは、PSA に結合し、その合成および天然の基質に対する酵素活性を増加する。このように、本ペプチドはまた、アンギオスタチンをつくり、癌進行に関連の血管成長を阻害する PSA の能力を増加する。
【００６６】
高い前立腺特異的発現からして、PSA は前立腺癌治療の有望な標的である。Denmeade et al. は、PSA により特異的に解裂されるペプチド基質を開発した (12)。このペプチドは細胞毒性薬物とコンジュゲートされて、プロドラッグを形成し、これが PSA により解裂されたときに活性となる(13)。同様に、本発明のペプチドを用いて、細胞毒性薬物、遺伝子治療ベクター、造影剤を前立腺癌組織に選択的に運送できる。小さいサイズのペプチドは前立腺組織に効率的に移行できる。特異的標的臓器の内皮へのペプチドの選択的回帰は、ファージ・ディスプレイにより、前に開発されていた (20)。同じく、本発明の PSA 結合ペプチドは、前立腺特異性によって PSA産生細胞に特異的に局在化される。
下記の非限定的実施例で本発明をさらに説明する。
【００６７】
実施例１．PSA 結合ファージの同定
種々の標的のための新規な結合物質を開発するのに便利な方法は、ランダムペプチドのライブラリーをスクリーニングすることである。ファージ・ディスプレイは、酵素、抗体、受容体を含む種々の標的タンパク質 (21) のための新規リガンドの選択にとって強力な方法である。ファージ・ディスプレイ・ライブラリーは、抗体によりディスプレイされたものと異なる結合特異性を保持する特異的リガンドを同定する方法を提供する。
【００６８】
ファージ・ディスプレイ・ライブラリー
fUSE 5-ファージにおけるファージ・ディスプレイ・ペプチド・ライブラリーが報告されている (21)。構造 CX8C、CX10C、CX3CX3CX3C、CX3CX4CX2C（C はシステイン、X は 20 天然アミノ酸のいずれか）を用いた。
【００６９】
抗体およびタンパク質
MAb 5E4 の開発は別個に報告される (Leinonen、作成中)。MAb H117 を Abbott Diagnostics (North Chicago, IL, USA) から、5A10 を EG&G-Wallac, Turku, Finland から入手した。抗ファージモノクローナル抗体を Dr. Petri Saviranta, University of Turku, Turku, Finland から贈呈を受けた。ポリクローナル抗 GST 抗体を Amersham Pharmacia Biotech から入手した。PSA をヒト精液から以前の発表 (3) のように精製した。HK2 を Dr. Janita Loevgren, University of Turku, Turku, Finland から贈呈を受けた。プロテイナーゼ、キモトリプシン、カテプシン G を Athens Research and Technology, Athens, GA, USA から入手した。トリプシンを報告 (22) のように精製した。カリクレインを Calbiochem, CA, USA から入手した。キモトリプシンおよびカテプシン G に対する抗体を Fitzgerald, MA, USA から入手した。ヒト血漿カリクレインに対する抗体を Calbiochem, CA, USA から入手した。トリプシンに対する抗体を報告 (23) のように調製した。抗-ACT および抗-API 抗体 を Dako, Glostrup, Denmark から入手した。
【００７０】
ファージペプチドの選択
ファージ・ディスプレイ・ペプチド・ライブラリーのスクリーニングを基本的に Koivunen et al.(21) に記載のように行った。簡単にいうと、遊離および複合の両 PSA を結合するモノクローナル抗体 5E4 で被覆されたミクロタイターウエル上に捕捉された PSA でもって、各ファージ・ライブラリーを選択的にスクリーンした(24)。10 g/L BSA を含有する TBS 緩衝液 (BSA-TBS) 中の 33 nM PSA を、MAb 5E4 で被覆されたウエル中で 1 時間インキュベートし、ついでウエルを洗って、非結合の PSA を除去した。一定量の各ファージ・ライブラリー (1011-1012 感染粒子) をウエルに加え、3 時間 22 ℃ でふるい分け第１ラウンド、1 時間第２ラウンドインキュベートした。ファージ溶液を取りだし、ウエルを 0.5% Tween 20 含有の TBS で洗った。ふるい分けを 200 μM ZnCl2 存在でも行った。結合ファージを 0.1 M グリシン緩衝液、pH 2.2 で溶出し、1 M Tris 塩基で中性とした。溶出ファージを E. coli K91 kan 細胞の感染により増殖し、ポリエチレングリコールでの沈降により精製した。選択および増殖の３ラウンド後に個々のファージクローン由来の一本鎖 DNA を調製し、配列決定をウイルス DNA の関連部分の配列決定により行った。配列決定は、ABI 310 Genetic analyzer および Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) で、プライマーとしてオリゴヌクレオチド5' CCCTCATAGTTAAGCGTAACG 3' を用いて行った。
【００７１】
PSA-結合ペプチドを単離するために、ファージタンパク質 III の N-末端に 10、12 または 13 のアミノ酸を含有する環状ジフルフィド拘束ペプチドを発現する４ファージ・ライブラリーをスクリーンした。各ライブラリーから単離されたペプチドは、固定の位置で処理されたシステインに加えて特徴的な共通アミノ酸を含有していた (表 1)。CX8C、CX10C、CX3CX4CX2C ライブラリーから誘導された大部分のペプチド (12 中 9) が X1 位にバリンを含有していた。加えるに、フェニルアラニンが CX8C および CX10C ライブラリーの X2 位にしばしば見られた。CX3CX4CX2C ライブラリー・ペプチドにおいて、X3 位がチロシンに、X9 位が V に優先されていた。ファージ IFMA (データは示さず）および GST-ペプチド IFMA において、CVAYC (配列番号 29) モチーフを含有するクローンが PSA に最も強い結合を示した(参照、図１、表１)。
【００７２】
図１は、種々の量の各 GST-ペプチドを、MAb 5E4 により捕捉された PSA 含有のウエルに加えた実験の結果を示す。洗浄後、GST-ペプチド結合を IFMA で、トレーサーとして Eu-標識抗 GST 抗体を用いて定量した。データを２ウエルからの平均値 ± 標準誤差 (SE) で示す。
【００７３】
チロシン残基が CX8C および CX10C ペプチドの X6 または X8 位で、および CX3CX4CX2C ペプチドの X8 位で富んでいた。ふるい分け緩衝液に Zn2+ を加えた後、いくつかの PSA 結合ペプチドを単離できた (表１、ペプチド Z-1 (配列番号 15) - Z-11 (配列番号 25))。これらのペプチドの大部分が Zn2+ なしで単離されたペプチドとして類似のモチーフを含有していた。
【００７４】
実施例２．ペプチドの特徴解明
選択されたペプチドを含有する GST 融合タンパク質の構築
一本鎖ファージ DNA を精製し、挿入領域を、融合 5 遺伝子III配列 (20) の上流プライマー (5'AGGCTCGAGGATCCTCGG CCGACGGGGCT 3')(配列番号 27)および下流プライマー (5'AGGTCTAGAATTCGCCCCAGC GGCCCC 3')(配列番号 28) で PCR により増幅した。増幅 DNA を、選択されたペプチドを GST 融合タンパク質として発現さすために、単離し、PGEX-2TK ベクター (Amersham Pharmacia Biotech, Helsinki, Finland) の BamH I と EcoR I 部位の間にサブクローンした。組換え体を DNA 配列決定により確認した。融合タンパク質を E. coli BL 21 細胞中で発現せしめ、報告(25)のようにグルタチオン・アフィニティークロマトグラフィー (Amersham Pharmacia Biotech) で精製した。融合タンパク質の精度を、PhastSystem (Amersham Pharmacia Biotech) 上の 12.5% 均質ゲルにおける SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。その PSA に対する結合能を免疫蛍光検定法 (IFMA)(下記参照)で測定した。
【００７５】
トロンビン解裂により GST 融合パートナーからペプチドが放出された。20 単位のトロンビン (Amersham Pharmacia Biotech) を、1 mg GST-C-4 とともに PBS 緩衝液中で 22 ℃で 12 時間インキュベートした。解裂された無傷の GST-C-4 融合タンパク質を Superdex 200 HR 10/30 カラムでのゲルろ過により分析した。これは、50 mM リン酸ナトリウムを用い、pH 7.4 で、150 mM NaCl を含有し流速 30 ml/h であった。吸収を 280 nm でモニターし、タンパク質含有フラクションの 0.5 ml 量を集め、下記のように GST-ペプチド IFMA で分析した。
【００７６】
免疫蛍光検定法 (IFMA)
IFMA に用いられる固相抗体をミクロタイターウエルに、濃度 5 μg/mL で TBS 中で 16 時間 22 ℃で被覆した。溶液を除去し、ウエルを 10 g/L ウシ血清アルブミン TBS 液で 3 時間 22 ℃で飽和した。トレーサーとして使用される抗体を、発表 (26) されているように Eu3+ キレートで標識した。検定緩衝液は 50 mM Tris-HCL、pH 7.7、150 mM NaCl、33.3 μM ウシ血清アルブミン、1 μM ウシグロブリンである。
【００７７】
個々のファージクローンの PSA との結合を IFMA (ファージ IFMA) で試験した。ファージ IFMA において、約 30 ng の PSA を MAb 5E4 被覆ウエルに 1 時間で加えた。洗った後 (緩衝液: 150 mM NaCl、7.7 mM NaN3、0.2 g/L Tween 20)、15 μL のファージおよび 200 μl の検定緩衝液を加えた。1 時間のインキュベーション後、ウエルを洗って、ファージの M13 被覆タンパク質を認識する 50 ng ユウロピウム標識抗ファージモノクローナル抗体を含有する 200 μl の検定緩衝液で満たした。60 分間インキュベーション後、ウエルを 4 回洗い、エンハンスメント溶液 (EG&G-Wallac) を加えた。蛍光を 1234 DELFIA Research 蛍光計 (EG&G-Wallac) で定量した。
【００７８】
GST-ペプチドの PSA との結合を、ファージペプチドの場合と類似の IFMA (GST-ペプチド IFMA) で測定した。ただし、GST に対する Eu3+-標識抗体を使用した。種々の量の GST-ペプチドまたは野生型 GST を、200 μL の検定緩衝液中の捕捉 PSA を含有するウエルに加え、1 時間インキュベートした。GST-ペプチドと PSA との結合に対する Zn2+ の作用を試験するために、種々の濃度の Zn2+ (1-200 μM) を緩衝液に GST-ペプチド および PSA のインキュベーション工程で加えた。競合試験において、GST-ペプチド (167 nM) または野生型 GST をまず増加量の PSA (0-333 nM) とともに 0.5% BSA-TBS 緩衝液中で 60 分間インキュベートし、ついで MAb 5E4 に捕捉された PSA を含有するウエルに加えた。1 時間インキュベーション後、ウエルを洗浄し、Eu3+-標識抗 GST 抗体を加えた。さらにインキュベーションと洗浄を行った後、結合の蛍光を上記のように測定した。キモトリプシン、カテプシン G、トリプシン、カリクレインなどの他のプロテイナーゼとの GST-ペプチドの結合を検査するときに、これらのプロテイナーゼをミクロタイターウエルに被覆されたその特異的抗体により捕捉した。組換え hK2 が、hK2 との結合が知られている MAb 5E4 (24) により捕捉した。PSA-ACT および PSA-α1-プロテアーゼ阻害剤 (PSA-API)(28) を含む PSA 複合体と GST-ペプチドとの結合を調べるために、各々 ACT および API に対する抗体により捕捉した。種々のプロテイナーゼまたは PSA 複合体を捕捉後、GST-ペプチド を加え、GST-ペプチド IFMA について上記のようにモニターした。
【００７９】
表面プラスモン共鳴
選択されたペプチドの PSA に対する結合速度を、BIAcore 2000(登録商標) 機器 (Biacore AB, Uppsala, Sweden) で PSA 上の表面プラスモン共鳴 (29) で調べた。PSA を固相に、MAb 5E4 (30) と同じエピトープに結合する MAb H117 により捕捉した。捕捉抗体は、5000 共鳴単位 (RU) のカップリングレベルを用いて、製造業者の指示にしたがい CM5 センサーチップに共有結合でカップリングせしめた。PSA を PBS 中 416 nM の PSA の注入、4 分間の接触時間 (5 μl/分)、60 分間の洗浄 (20 μl/分) で捕捉すると、500-600 RU 範囲のリガンドレベルを得た。各分析物 (GST-ペプチド) を種々の濃度で、1 分間 20 μl/分の流速で注入した。Zn2+ のペプチド・アフィニティーに対する作用を特徴解明するために、センサーグラムを一定量のペプチドについて Zn2+ の存在下、流動およびサンプル緩衝液 (0-30 μM) の両方において記録した。PSA-結合を化学的に活性化/非活性化ブランク表面または MAb H117 単独を非特異的相互作用として差し引いた。各測定後の再製を 10 mM HCl の 3 x 0.5 分間注入により行った。結合データを BIAEVALUATION ソフトウエアーで分析した。
【００８０】
GST 融合タンパク質から解裂されたペプチドの活性を競合試験で調べた。ゲルろ過による消化融合タンパク質のフラクション化後、MAb 5E4 により捕捉された PSA 含有のウエル中で 60 分間インキュベートした。ウエルを空にした後、GST-ペプチド (167 nM) を加え、1 時間インキュベートした。GST-ペプチドと PSA との結合に対する解裂ペプチドの作用を GST-ペプチド IFMA によりモニターした。
【００８１】
PSA 上のペプチド結合部位の特徴解明のために、PSA 上の種々のエピトープを認識するモノクローナル抗 PSA 抗体を用いた (30)。各 MAb (33 nM) を、MAb 5E4 に捕捉された PSA 含有のウエルでインキュベートした。洗浄後、167 nM GST-ペプチドを加え、結合を上記のように GST-ペプチド IFMA でモニターした。
【００８２】
種々の形態の遊離 PSA でのペプチドの再活性
プロ PSA および無傷 PSA での GST-ペプチドの再活性化を、活性 PSA (3) およびプロ PSA (31) を用いて比較した。100 ng のプロ PSA または無傷 PSA をミクロタイターウエル上に被覆された MAb 5E4 と反応せしめた。洗浄後、1 μg の各 GST-ペプチドを、固定 PSA 含有のウエルに加えた。GST-ペプチドの結合を、トレーサーとして Eu-標識抗-GST 抗体を用いる IFMA で定量した。
【００８３】
合成ペプチドの PSA との結合
ペプチド A1 および C4 を、fmoc-化学を用いる標準的固相 Merrifield ペプチド合成により合成した。PSA との結合についてペプチドを、合成ペプチドが対応の GST ペプチドと PSA との結合を阻害する能力を調べることにより、検定した。合成ペプチド (0 - 333 nM) および対応の GST ペプチド (167 nM) を、MAb 5E4 により捕捉された PSA とともに 1 時間インキュベートした。その後、ウエルを洗い、Eu3+-標識抗 GST 抗体を加えた。さらにインキュベーションおよび洗浄を行った後、結合蛍光を上記のように測定した。
【００８４】
GST 融合タンパク質を 4 ペプチドから構築した。これらのペプチドはファージ IFMA で最も強い結合を表す。うち、配列 CVAYCIEHHCWTC を有するペプチド C-4 (配列番号 11) が GST-ペプチド (図１、表２) として、およびファージ上で発現されたときに (データは示さず)、PSA に対する最強の結合を示した。
【００８５】
【表２】
0004647882.tif 000003
表２．GST-タンパク質の PSA との結合についての速度およびアフィニティー
GST-タンパク質の PSA との結合速度定数 (ka)、解離速度定数 (kd)、平衡解離定数 (KD) を表面プラスモン共鳴で測定した。示す値は、3 相違濃度の分析物（GST-ペプチド）の平均 ka、kd、KD である。
＊GST-ペプチド IFMA からのデータ。実験手法は図１の説明に記載。
＃PSA の酵素活性の半最大促進に必要なペプチド濃度。実験手法は図６の説明に記載。
【００８６】
別の 2 選択ペプチド、B-2 (配列番号 6) (CVFAHNYDYLVC) および A-1 (配列番号 1) (CVFTSDYAFC) は PSA に結合したが、効率が C-4 (配列番号 11) より低い。PSA との結合が知られているカチオン Zn2+ が検定緩衝液に含まれるとき、ペプチドの結合活性が増加した。Zn2+ は用量依存性作用を有し、結合応答における最大増加を濃度 200 μM で認めた (図 2)。試験結果を図２に示す。各 GST-ペプチドを PSA-含有ウエルで種々の濃度の Zn2+ の存在下でインキュベートした。GST-ペプチドの結合を IFMA で定量した。対照は Zn2+ 不存在での GST-ペプチドの結合を示す。データは２ウエルの平均 ± SE である。しかし、有効 Zn2+ 濃度は、緩衝液中の BSA が Zn2+ についていくつもの結合部位を含有しているので、より低い。GST 融合タンパク質としてつくられた第４ペプチド、D-1 (配列番号 13)(CLSTCAQSCRISC) は、PSA に結合の対応ファージを介しても PSA との有意の結合を示さなかった(データは示さず)。野生型 GST は、融合タンパク質の結合が挿入ペプチドにより仲介されたことを確認する PSA と結合しなかった。
【００８７】
PSA-結合ペプチドの特徴解明をさらに行った。ペプチドの固定 PSA との結合を 50% 低下するのに要する PSA 濃度(IC50) を検定した。これに関連して、図３についても述べる。GST-C-4 を増加濃度の PSA 液と 1 時間、予備インキュベートした。ついで、混合物のサンプルを、PSA が抗 PSA MAb により捕捉されているウエルに加えた。結合を IFMA で測定した。データは２ウエルの平均 ± SE である。ペプチド A-1 (配列番号 1) および B-2 (配列番号 6) の対応値は夫々 3.3 nM および 1 nM である(データは示さず）。過剰の遊離 PSA との GST-ペプチドの予備インキュベーションは固相 PSA との結合を阻害した。ペプチド C-4 (配列番号 11) の捕捉 PSA との結合が PSA 濃度 0.7 nM で 50 % 低下した。この結果は、選択されたペプチドが MAb 5E4 により捕捉された PSA のみでなく、溶液中の遊離 PSA にも結合することを確認した。
【００８８】
ペプチドの特異性を、抗体によりミクロタイターウエルに捕捉された種々のプロテイナーゼおよび PSA 複合体とペプチドの反応によって調べた。PSA、カリクレイン、カテプシン G、キモトリプシン、トリプシン-2、組換え hK2 を、各プロテイナーゼに対する抗体で被覆されたウエル上に捕捉した。GST-ペプチド結合を IFMA により測定した。得た結果を図４ａに示す。試験したプロテイナーゼのいずれも GST-ペプチドの有意の結合を示さなかった。PSA、PSA-ACT、PSA-APIを、夫々 PSA、ACT、API に対する抗体で被覆したウエル上に捕捉した。GST-ペプチドの PSA 複合体との結合を IFMA により測定した。得た結果を図４ｂに示す。ペプチドは、夫々 ACT および API に対する抗体により捕捉された PSA-ACT および PSA-API と結合しなかった。
【００８９】
ペプチドの PSA との結合速度およびアフィニティーを表面プラスモン共鳴により調べた。増加濃度の GST-ペプチドを、MAb H117 により捕捉された PSA 上に注入した。バックグラウンド補正センサーグラムを GST-ペプチドと PSA との単一部位相互作用に、相違する 3 GST-ペプチド濃度および速度式で合わせた：
d(GST-ペプチド:PSA)/dt = ka(GST-ペプチド) x (PSA) - kd(GST-ペプチド:PSA)
【００９０】
ペプチド A-1、B-2、C-4 の平均平衡解離定数 (KD) は、2.9 - 7.8 μM であった(表２)。Zn2+ は濃度 1-30 μM で結合および解離の両速度を低下した。アフィニティーは 3-7 倍増加した。kd が ka よりも大きく減少したからである(表３)。捕捉 MAb からの PSA の遅い解離はベースラインの低下をもたらし、結合定数をベースラインにつき補正した。ゲルろ過において、GST-C-4 は 4 ピークを示した (表４、図５)。
【００９１】
【表３】
0004647882.tif 000004
表３．GST-ペプチドの PSA との結合についての結合速度およびアフィニティーに対する Zn2+ の作用
GST-タンパク質の PSA との結合速度定数 (ka)、解離速度定数 (kd)、平衡解離定数 (KD) を表面プラスモン共鳴で測定した。
†検定は濃度 3.4 - 8.5μM での 3 単一点の平均に基づく。値に標準偏差を入れる。
＊検定は表示の Zn2+ の濃度 3.4 μM での単一点に基づく。値に標準誤差を入れる。
【００９２】
【表４】
0004647882.tif 000005
表４．異なる分子サイズ形態の GST-C-4 活性の比較
ゲルろ過において、GST-C-4 およびトロンビン解裂 GST-C-4 が夫々 4 および 2 のピークを表した。各ピークでのタンパク質 % を 280 nm の吸収で調べた。結合活性を GST-ペプチド IFMA 法から計算した。
＊トロンビン処置後に残る結合活性を意味する。
【００９３】
GST-C-4 またはトロンビン処置 GST-C-4 のフラクション化後、5 μl の各フラクションを、MAb 5E4 により捕捉された PSA を含有するウエル中で最初にインキュベートした。結合を GST-ペプチド IFMA で測定した。矢印は分子サイズ標準物の溶出 (669 kD、150 kD、43 kD、1.3 kD)を示す。
【００９４】
ピークの分子サイズは > 500 kD、100 kD、30 kD、約 3 kD であった。3 kD ピークを除きこれらすべてが PSA に結合した（表４、図５)。このことから、融合タンパク質が 30 kD モノマー、オリゴマー (約 100 kD) およびポリマーとして存在している。ポリマー融合タンパク質が PSA に最も強い結合を示し、タンパク質吸収に関して 280 nm での応答である。GST-C-4 のトロンビン処置が 30 kD および 3 kD 成分へのほとんど完全な解離を起こした。後者は GST 融合タンパク質からトロンビンにより解離された測定 31-残基長のペプチドよりなっていた。30 kD 成分は、非解離 GST-C-4 に比して GST-ペプチド IFMA における応答がわずか約 5% であった（表４)。
【００９５】
阻害試験において、3 kD ピークが GST-ペプチド の PSA との結合を約 30% 低下した(図５)。これはトロンビン解離ペプチドが PSA 結合活性を保持することを表す。クロス記号 (x) は、ペプチド解離型 GST-ペプチドにより誘導された GST-ペプチド の結合阻害を示す。遊離ペプチドを含有する各フラクション 200 μl を、MAb 5E4 により捕捉された PSA を含有するウエルで最初にインキュベートした。1 時間後、ウエルを空にし、GST-C-4 (167 nM) を加えた。1 時間インキュベーション後、GST-ペプチドの結合を GST-ペプチド IFMA により測定した。データを 2 ウエルの平均値で示す。
【００９６】
ペプチドの PSA に対する結合部位を決定するために、阻害実験を PSA 上の種々のエピトープとの MAb 結合で行った。複合された PSA 中においてセリンプロテイナーゼ阻害剤によりカバーされるエピトープ領域との抗体結合 (いわゆる遊離-特異的抗体) がペプチドの結合を最も強く阻害した (>80%)。PSA の活性部位から離れたエピトープとの MAb 結合が低程度の阻害を示した (表５)。
【００９７】
【表５】
0004647882.tif 000006
表５．抗 PSA MAb による GST-ペプチドの PSA との結合の阻害
PSA 上の 4 エピトープ基を表す PSA MAb を用いて、PSA との結合について GST-ペプチドと競合せしめた。MAb 5E4 が属する群６からの抗体を陰性対照として使用した。各 MAb (33.3 nM) をマイクロタイターウエル上に被覆の 5E4 に捕捉された PSA とともにインキュベートした。洗浄後、GST-ペプチドを加えた。GST-ペプチドの結合を IFMA で定量した。
GST-ペプチドの固相 PSA との結合の低下（%）
++ = > 80 %
+ = 60-80 %
- = 阻害なし
【００９８】
GST ペプチドは、活性 PSA に比して有意に低いプロ PSA との結合を示した。実験において、100 ng のプロ PSA または無傷の PSA が、ミクロタイターウエル上に被覆された MAb 5E4 と反応した。洗浄後、1 μg の各 GST-ペプチド（A-1 (配列番号 1)、B-2 (配列番号 6)、C-4 (配列番号 11)、表１) を、固定 PSA を含有するウエルに加えた。GST-ペプチドの結合を、トレーサーとして Eu-標識抗-GST 抗体を用いる IFMA により定量した。
【００９９】
プロ PSA との反応性は活性 PSA の 30 - 60 % であった (図６)。いずれかの型の PSA に優先的に結合する能力について 80 MAb を調べた後に、プロ PSA または無傷の PSA を優先的に認識する MAb は見つからなかった。従って、ペプチドは PSA についての新規の結合特異性を提供できる。
【０１００】
標準的固相 Merrifield ペプチド合成法により化学的に合成されたペプチドは、GST ペプチドの PSA との結合を効率的に阻害する（図７)。このことは、このペプチドが GST-ペプチドと同様に PSA と結合することを示す。化学的合成のペプチド C-4 (配列番号 11) (GACVAYCIEHHCWTCGA) は、20 倍のモル過剰で対応の GST-ペプチドの PSA との結合を約 70 ％ 阻害した。ペプチドの N-および C-末端にフランキング GA-モチーフ を欠く C-4 の短い誘導体は、GST-ペプチドの PSA との結合を効率的に阻害した（図７)。PSA を抗-PSA MAb によりミクロタイターウエル中で捕捉した。結合を IFMA で測定した。
【０１０１】
実施例３．PSA の酵素活性に対するペプチドの作用
PSA の酵素活性を、ペプチドのみの存在または Zn2+ とともに、キモトリプシン基質 S-2586 (MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA) (Chromogenix, Moelndal, Sweden)を用いて調べた。さらに、酵素活性を、標準的固相 Merrifield ペプチド合成法により合成されたペプチドの存在で、ビオチン-コンジュゲート型のペプチドを含む fmoc-化学を用いて調べた。PSA (333 nM) を 1-100 倍モル過剰の GST-ペプチドまたは 100 倍過剰の合成ペプチドとともに、0.5 g/L BSA を含有する pH 7.8 の TBS 緩衝液中 1 時間22℃ でインキュベートした。PSA の酵素活性に対する Zn2+ の作用を、1-200 μM の ZnCl2 を反応緩衝液に含めて調べた。PSA の酵素活性に対するペプチドと Zn2+ との組合せ作用を、PSA (333 nM) をペプチド (333 nM) とともに 1-200 μM Zn2+ 含有の緩衝液中で 1 時間インキュベートした。基質を最終濃度 0.2 mM まで加えた後、吸収を 5 分間隔で 2 時間、405 nm で Labsystems Multiskan MCC/340 光度計 (Labsystems, Helsinki, Finland) によりモニターした。対照として、PSA の酵素活性に対する野生型 GST の作用を調べた。
【０１０２】
キモトリプシン、カテプシン G、トリプシンの酵素活性に対するペプチドの作用を上記のように PSA について調べた。基質として、S-2586 をキモトリプシンおよびカテプシン G に、S-2222 (CO-Ile-Glu-(OR)-Gly-Arg-pNA) (Chromogenix) をトリプシンに用いた。
【０１０３】
高分子量タンパク質基質についての酵素活性に対するペプチドの作用を、PSA がインスリン様成長因子-結合タンパク質 3 (IGF-BP-3) (32) を単独でまたは合成ペプチド C-4 および A1 の存在下でタンパク分解的に解裂するのを用いて、調べた。基質の解裂程度を、タンパク分解的解裂による IGF-BP-3 免疫反応性をモニターして定量した。PSA (5 μg/mL) を IGF-BP-3 (70 ng/mL) とともに、16 時間 37 ℃ で、PSA に対して 100 倍モル過剰のペプチドでインキュベートし、発表 (33) のように、IGF-BP3 免疫反応性を IFMA で測定した。対照として、ペプチドを PSA および IGF-BP3 含有の反応混合物に、免疫検定法の開始直前に加え、IGF-BP-3 について IFMA でのペプチドの可能な干渉を定量した。
【０１０４】
α-2-マクログロブリン (A2M) との複合体中の PSA の酵素活性に対する化学的合成ペプチド C-4 の作用を、発表 (7) のように調製した精製 PSA-A2M 複合体を用いて分析した。A2M との複合体中 1 μg の PSA を、単独でまたは標準的固相 Merrifield 合成法により合成された 2.5 μg の ペプチド C4 (配列番号 11)(GACVAYCIEHHCWTCGA) とともに、1 時間 22 ℃ で、1 g/L の BSA を含有する 100 μL の TBS 緩衝液中でインキュベートした。10 μg のモノクローナル 抗体 4G10 を含めて、複合体から放出される PSA による活性を阻害した。対照として、1 μg の 遊離 PSA の酵素活性を測定した。酵素活性は、上記のように基質として S-2586 (Chromogenix) を用いてモニターした。
【０１０５】
PSA 酵素活性が GST-ペプチドにより有意に高められた。GST-C-4 が最も活性であり、色素基質に対する PSA 活性を約 5 倍強くした（図８)。この実験において、PSA (0.33 μM) を増加濃度の GST-C-4 (0-100 倍モル過剰) とともに、色素基質 S-2586 を加えた後 1 時間インキュベートし、吸収を 405 nm で測定して酵素活性をモニターした。データを 2 ウエルからの平均 ± SE で表す。
【０１０６】
作用は GST-ペプチド濃度に依存性であり、半最大促進をマイクロモル範囲の濃度で検出した（表２)。活性に影響する最小ペプチド濃度は、C-4 について 20 nM であり、A-1 および B-2 について 300 nM であった。野生型 GST は PSA の活性に影響を及ぼさなかった（データは示さず)。このペプチドは、キモトリプシン、カテプシン G、トリプシンを含む試験した他のプロテイナーゼの酵素活性に影響を及ぼさなかった（データは示さず)。標準的ペプチド合成法により調製されたペプチドは、同様に酵素活性を高めた（図９)。さらに、ビオチンコンジュゲートペプチド C-4 も非コンジュゲート型の C-4 と同様に酵素活性を高めた（図９)。図９において、試験した C-4 の誘導体には、N-および C-末端に GA-フランキング残基を有しまたは有さないペプチドおよびビオチンコンジュゲート形態の C-4 がある。PSA (0.33 μM) を化学的合成のペプチド (100 倍モル過剰) とともに、色素基質 S-2586 を加えた後 1 時間インキュベートし、吸収を 405 nm で測定して酵素活性をモニターした。
【０１０７】
高分子量タンパク質基質についての酵素活性に対するペプチドの作用を、PSA がインスリン様成長因子-結合タンパク質 3 (IGF-BP-3) を単独でまたは合成ペプチド C-4 (配列番号 11) および A-1 (配列番号 1) の存在下でタンパク分解的に解裂する能力を用いて調べた。この実験において、PSA (5 μg/mL) の TBS 緩衝液、pH 7.8 単独で、または 100 倍モル過剰のペプチドとともに、IGF-BP-3 (70 ng/mL) とともに 16 時間 37 ℃ でインキュベートし、無傷 IGF-BP-3 の濃度を IFMA で測定した。対照として、ペプチドを PSA および IGF-BP3 含有の反応混合物に、免疫検定法の開始直前に加え、IGF-BP-3 (BP-3+PSA+(C-4/A-1)として 0 時間標識)について IFMA でのペプチドの可能な干渉を定量した。PSA 単独が徐々に IGF-BP-3 を解裂し、免疫反応性が 30 % 低下した (図１０)。ペプチド C-4 および A-1 は、IGF-BP-3 についての PSA の活性を高め、IGF-BP-3 を約 70 % 解裂した。
【０１０８】
亜鉛が PSA の酵素活性を阻害することが知られているので、ペプチドと Zn2+ の組合せ作用を検査して、PSA の酵素活性に対する GST-ペプチドの作用の解明を行った。Zn2+ は、C-4 の増加作用を無効にし、用量依存的に PSA 活性を低下した。GST-C-4 と Zn2+ の酵素活性に対する作用を、PSA (0.33 μM) を同じモル濃度の GST-C-4 および種々の濃度の Zn2+ とともにインキュベートして調べた。色素基質 S-2586 の添加後、吸収を 405 nm で測定して反応をモニターした。対照は、ペプチドおよび Zn2+ の不存在での PSA 活性である。データを 2 ウエルの平均 ± SE で示す。Zn2+ 濃度 75 μM で、その活性が亜鉛およびペプチドの不存在での PSA 活性と類似であり、濃度 200 μM で酵素活性のほとんどすべての阻害を認めた（図１１)。
【０１０９】
複合体での PSA の酵素活性に対する化学的合成ペプチド C-4 の作用を、精製された PSA-A2M 複合体を用いて分析した。他のプロテイナーゼが A2M と結合後になお小分子量の基質を解裂し得ることが明らかにされている(34)。1 μg の PSA の A2M との複合体を、単独でまたは 50 倍モル過剰の化学的合成ペプチド C-4 (表１) とともに、 1 時間 22 ℃ で、1 g/L の BSA を含有する 100 μL の TBS 緩衝液中でインキュベートした。10 μg のモノクローナル抗体 4G10 を含み、複合体から放出された PSA による活性を阻害した。対照として、1 μg の 遊離 PSA の酵素活性を測定した。光学濃度を 405 nm で、基質として 0.2 mM S-2586 (MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA) (Chromogenix, Moelndal, Sweden) で測定して、酵素活性をモニターした。A2M との複合体中の PSA 酵素活性は、遊離 PSA に比して約 4 倍低下したが、有意の活性をなお検出できた（図１２)。すなわち、A2M との複合体中の PSA 活性部位は遮断されない。複合体から放出される PSA から活性が誘導され得るとの可能性を、遊離 PSA の活性を完全に阻害する MAb を含めることにより排除した（図１２)。C-4 ペプチドを加えた後、A2M-複合 PSA の酵素活性が約 2 倍高められたことは、このペプチドが、阻害剤により閉じ込められた PSA と結合することができ、遊離 PSA に対するのと同じ作用を A2M-複合 PSA に対して発揮することを表す（図１２)。
【０１１０】
本発明は最初に、PSA の酵素活性を特異的に高め得る PSA 結合リガンドを提供する。いくつかの PSA-結合ペプチドの同定を、ランダムファージ-ディスプレイペプチド・ライブラリーを用いて、モノクローナル抗体を介する結合 PSA でスクリーニングすることにより行った。PSA を最初にミクロタイターウエルに被覆したとき、PSA-結合ファージを単離できなかった。しかし、PSA をモノクローナル固相抗体に捕捉することにより、特異的 PSA 結合ファージを単離できた。PSA の捕捉に用いたモノクローナル抗体は、PSA の活性部位を遮断せず(27)、PSA-結合ファージの単離を容易にする。明らかに、プラスチック上への PSA の直接被覆がその構造を変え、バイオパニングにとって好ましくない方向に進める。
【０１１１】
いくつかの典型的なアミノ酸残基を、選択したペプチドペプチドの大部分で同定できた。アミノ酸配列 CVF または CVA を退行 CX8C、CX10C、CX3CX4CX2C ライブラリーから誘導された 12 ペプチドのうち 5 で、チロシンを 14 ペプチドのうち 12 で認めた。高いアフィニティーをもつペプチドは 4 システインを含有していた。このペプチドを発現し、GST 融合タンパク質として特徴を解明した。このタンパク質は結合アフィニティーおよび特異性についての研究を容易にする。融合タンパク質として発現されたとき、ペプチドはその結合活性を保持し、IFMA で測られる相対的アフィニティーはファージおよび融合タンパク質で類似であった。表面プラスモン共鳴実験によると、ペプチドが PSA にかなりのアフィニティーをもって結合していた (表２)。
【０１１２】
PSA が Zn2+ を結合することが知られ、選択されたペプチドが亜鉛フィンガータンパク質上の Zn2+ 結合部位に似る配列も含有する (35)。Zn2+ の存在で、GST-ペプチドの一定のアフィニティー定数が 3-7 倍増加し、PSA とペプチドとの結合における Zn2+ の関与を示唆した。アフィニティーの増加は、ペプチドと PSA との複合体の会合速度よりも解離速度における強い低下で説明できる。これは、PSA とペプチドのアミノ酸残基の間にキレートされた Zn2+ により仲介され得る。興味深いことに、Zn2+ は、他のセリンプロテイナーゼ、トリプシンとその小分子サイズ阻害剤との高いアフィニティー結合を仲介することが知られている (36)。他の可能性は、Zn2+ がペプチドの 3-D 構造を、Zn2+ が DNA-結合亜鉛フィンガータンパク質と相互作用するのと同じように安定にする。
【０１１３】
PSA-結合ペプチドは以前にポリソーム選択法により製造されている (11)。これらのペプチドは、環状というよりは直線状であり、本発明で単離されたペプチドと類似していない。さらに、これらのペプチドは、PSA の酵素活性に作用がなく、ビオチンとコンジュゲートしたとき、PSA との一貫した結合を示さなかった。本発明ペプチドのアフィニティーは、ファージ・ディスプレイ・ペプチドに明らかに典型的であるが (37)、ポリソーム選択法により開発されたペプチド (11)のものより低い。しかし、アフィニティーの相違は、測定法の相違により明らかにできる。
【０１１４】
ファージ・ディスプレイ・ペプチドをミクロタイターウエル壁の抗 PSA MAb に捕捉された PSA に対して選択した。捕捉に用いられた抗体は、酵素の立体配座に影響して PSA の酵素活性を高める(30)。このことはペプチド結合の増加に役立ち得た。しかし、PSA 溶液は GST-ペプチドの固相 PSA との結合を完全に阻害した。すなわち、捕捉抗体により誘導された立体配座の変化は GST-ペプチドの結合に必要でなかった。
【０１１５】
ペプチドを GST 融合タンパク質として発現さしたとき、3 分子サイズ形態を認めた：ポリマー、オリゴマー、モノマーである。ポリマーが PSA に最も強い結合を表し、オリゴマーもモノマーよりも強く結合した。この結果から、多価結合が結合性を高める。ファージ fUSE 5 が同じ配列のペプチド挿入物の 3 - 5 複製を発現するので、その結合も多価である (38)。GST-ペプチドの明白な多価結合にもかかわらず、GST 融合パートナーから解裂されたモノマータンパク質は、GST-ペプチドの PSA との結合を実質的に阻害した。
【０１１６】
ペプチドがキモトリプシンおよびカテプシン G に結合しなかったが、それらの酵素特異性は PSA のものと類似である。また、C-末端をアルギニンまたはリシン残基に解裂するトリプシンおよび hK2 のいずれにも結合しなかった。HK2 は、アミノ酸レベルで 79 % の同一性を示す PSA と構造的に密接に関係している。すなわち、本発明で選択されたペプチドは、PSA に高い特異性を示す。GST-ペプチドは、血清中で生じる PSA-セルピン複合体、すなわち PSA-ACT および PSA-API のいずれとも結合しなかった。ここでは、セルピンが PSA 上のペプチド結合領域を覆っている。ペプチド結合も、PSA-セルピン複合体中で覆われたエピトープを介して遊離 PSA と反応する抗体により遮断された。これらの MAb も酵素活性を阻害する (30)。PSA 上の他のエピトープとのいくつかの MAb 結合も、結合を阻害するが、程度が低い。これらのことを合わせて、結果は、ペプチドが PSA の活性部位に密接に結合することを示唆する。
【０１１７】
PSA は、その天然基質、セメノゲリン I のチロシンおよびロイシンに C-末端的に解裂する制限的キモトリプシン様酵素活性を有す (39)。しかし、PSA はキモトリプシンよりもこれらのアミノ酸をとりまく配列に依存的であり、そして好ましい P1 残基、チロシンおよびロイシンをとりまくいくつかの残基が基質の特異性および効率の決定に重要な役割を演じる (40)。PSA はまた、グルタミン後を解裂でき、この型のペプチド基質は、P1 でチロシンおよびロイシンを含有するものよりも PSA に特異的である(12)。ファージ・ディスプレイにより選択されたすべてのペプチドはチロシンおよびロイシンを含有し、しばしば、他のアミノ酸 (Y-S、Y-A、Y-D、L-V) と組合されてセメノゲリン I 中に解裂部位を形成する(39)。しかし、ペプチドは、セメノゲリン I 中の解裂部位に同じである 3 を越えるアミノ酸を含有していなかった。すべてのペプチドが 2 または 4 のシステインを含有していた。ペプチドはおそらく剛性ループを形成し、天然基質、セメノゲリン I がいかなるジスルフィド橋をも含有していない。
【０１１８】
調べた 4 GST-ペプチドのうち 3 が合成ペプチド基質 S-2586 に対する PSA の酵素活性を高め、その作用はアフィニティーに相関した。従って、ペプチドは、PSA の触媒的トリアド（三つ組）と相互作用しないようであり、むしろ立体配座を変える活性部位の近辺に結合し、合成基質にさらに接近し得る触媒的ポケットをつくる可能性がある。酵素活性に対する作用は、野生型 GST および GST-D-1 が作用を持たないので、ペプチド特異的である。 PSA の酵素活性を阻害する Zn2+ が用量依存的にペプチドの促進作用を逆転させた。
【０１１９】
実施例４．アフィニティークロマトグラフィーにおける PSA 結合ペプチドの標識化および使用
標識化ペプチドコンジュゲートの調製
ペプチドの合成を固相合成および fmoc-化学で行った。ビオチンを固相合成中にペプチドのアミノ末端に付着した。ペプチドの Eu-キレートでの標識化は Hemmilae et al., 1984 (41) に記載のとおりである。50-100 μg のペプチドを 3-10 倍モル過剰の Eu-キレートで標識した。Eu-標識後、ペプチドを逆相クロマトグラフィーで、NovaPak または Sep-Pak C18-カラム (Waters, MA, USA) を用いて精製した。カラムを 50 mM 酢酸トリエチルアンモニウム、pH 7 で平衡にし、アセトニトリルで勾配溶出した。99m-テクネチウム標識のために、ペプチドを最初に 0.2 M メルカプトエタノールで還元した。還元後、ペプチドの精製を、0.1 M リン酸緩衝液で平衡にした Sep-Pak C18 カラム、pH 7.5 により、そして溶出にアセトニトリルを用いて行った。テクネチウム・ヒドロキシルメチレン・ジリン酸塩 (HDP) 法を 99mTc でペプチド標識に使用した。20 μg の還元 C4-ペプチドを 3 mCi の 99mTc で標識した。標識後、ペプチドの精製を、0.1 M リン酸緩衝液で平衡にした Sep-Pak C18 カラム、pH 7.5 により、そして溶出にアセトニトリルを用いて行った。ペプチドをヨードゲン法 (42) によりヨード化した。
【０１２０】
PSA の酵素活性に対するペプチドの作用をモニターして検定するように、合成ペプチドをビオチンで PSA 結合活性の低下なしに標識できた (図９)。ペプチドの Eu 標識効率を増加するために、B2 (CVFAHNYDYLVC) および C4 (CVAYCIEHHCWTC) ペプチドに、セリンおよびリシンからなるアミノ末端のテイルを加えた。対応の B2-ペプチド誘導体の構造は、SKSKSKS-アミノカプロン酸 (aca)-CVFAHNYDYLVC であり、C4-ペプチド誘導体の構造は SKSKSKS-aca-CVAYCIEHHCWTC である。これらの誘導 B2 および C4 ペプチドの構造を、夫々図１３および１４に示す。
【０１２１】
図１５は、PSA の酵素活性に対する SKSKSKS-テイル化ペプチド C4 の作用を示す。PSA (0.33 μM) を非テイル化および SKSKSKS-テイル化 C4 (30 倍モル過剰) とともに 1 時間インキュベートし、ついで色素基質 S-2586 を加え、酵素活性を、405 nm で吸収を測定してモニターした。データを 2 ウエルの平均値 ± SE で表す。この結果によると、テイルの付加はペプチドの結合活性に影響を及ぼさなかった。
【０１２２】
Eu-標識後、ペプチドを C18 クロマトグラフィーで精製した。図１６は、50 μg C4 ペプチド含有の Eu-標識反応混合物の C18 Sep-Pak カラムでのフラクション化を示す。アセトニトリル (AcN) で勾配溶出した。流速は 0.5 mL/分であり、1 mL フラクションを採取した。比較のために、同じカラムでの非標識 C4 ペプチドの溶出曲線を示す。この結果によると、Eu-標識ペプチドを非標識ペプチドから C18 クロマトグラフィーで単離できる。
【０１２３】
図１７は、PSA の酵素活性に対する C18 クロマトグラフィー由来のフラクション（図１６）の作用を示す。PSA (0.33 μM) を、C4 の Eu-標識反応混合物の C18 クロマトグラフィーにより得たフラクション（図１６）の 100 μL アリコットとともに 1 時間インキュベートし、ついで、色素基質 S-2586 を加え、酵素活性を、405 nm で吸収を測定してモニターした。フラクション 26-28 は、PSA の酵素活性を大きく高めたので、Eu-標識 C4-ペプチドを含有していた (図１７)。対照として PSA 単独の酵素活性を測定した。Eu-標識 C4 の溶出位置を図１６中に矢印で示す。この結果からして、Eu-キレートをペプチドに、その PSA 結合活性に影響を及ぼさないで付着できる。
【０１２４】
図１８は、C4-ペプチドの結合活性に対するテクネチウム標識の作用を示す。PSA (0.33 μM) を Tc99m-標識 C4 (30 倍モル過剰) とともに 1 時間インキュベートし、ついで色素基質 S-2586 を加え、酵素活性を、405 nm で吸収を測定してモニターした。データを 2 ウエルの平均値 ± SE で表す。非標識 C4 の PSA に対する作用を比較のために示す。対照として、直線状 C4 (メルカプトエタノールによる還元)の PSA 活性に対する作用および PSA 活性単独を示す。この結果によると、C4-ペプチドのチオール-硫黄間のテクネチウム標識は結合を約 50 % 低下した。
【０１２５】
図１９は、C4 ペプチドの PSA 結合活性に対するヨード化の作用を示す。20 μg のペプチドをヨードゲン法によりヨード化した。ヨード化後、ペプチドを C18 Sep-Pak カラムで精製した。PSA (0.33 μM) を 125I-標識 C4 (30 倍モル過剰) とともに 1 時間インキュベートし、ついで、色素基質 S-2586 を加え、酵素活性を、405 nm で吸収を測定してモニターした。比較のために、非標識 C4 の PSA 活性に対する作用および PSA 単独の作用を示す。この結果によると、C4-ペプチド (CVAYCIEHHCWTC) のヨードゲン法による 125-ヨード化は、その結合活性をほとんど完全に破壊した。このことは、このペプチド中の単一の Tyr 残基が結合に重要であることを示唆する。
【０１２６】
これらの結果によると、種々の標識基が PSA 結合ペプチドに、その結合活性に影響を及ぼさないでカップルできる。特に、カップリングがアミノ末端または元のペプチド配列に加えられたテイルに関するときにできる。ペプチドのチオール基間の Tc99m をキレート後、C4 ペプチドは、その活性の約半分を保持した。
【０１２７】
アフィニティークロマトグラフィーでの PSA 結合ペプチド
ペプチド・アフィニティーゲルを、 ペプチド B2 および C4 リシン-セリン-テイル誘導体 (図１３および１４) を活性化 CH-Sepharose 4B (Amersham-Pharmacia Biotech) に製造業者の説明に従いカップリングすることにより調製した。カップリングは、カップリング部位の濃度に等しいモル濃度のペプチドを Sepharose で用いて行った。ペプチド・アフィニティークロマトグラフィーでは、カラムを Tris-緩衝液、pH 7.8 で、または 100 μM ZnCl2を含有する同じ緩衝液でカラムを平衡にした。サンプルに適用した後、カラムを Tris 緩衝液、pH 7.8 で洗浄した。カラムを、10 mM 酢酸アンモニウム、pH 6.5 および 10 mM 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 3.5 を用いて直線勾配的に pH を下げて溶出するか、溶出に pH 6 および 4 の緩衝液を段階勾配的に用いた。PSA のこれらのゲルへの結合を PSA 免疫検定法でモニターした。ペプチド・アフィニティーカラムから溶出された PSA の同定をさらに SDS-PAGE (43) およびイムノブロッティング法 (44) で調べた。イムノブロッティング試験において、SDS-PAGE で単離されたタンパク質が PVDF 膜に移行し、ポリクローナル抗-PSA 抗体 (Dako, Denmark)と免疫反応した。
【０１２８】
図２０は、B2 ペプチド・アフィニティークロマトグラフィーによる 100 μM Zn2+ の存在下での精液サンプルのフラクション化を示す。PSA は、精液から硫酸アンモニウムにより沈降せしめ、ついで平衡緩衝液に稀釈し、カラムに用いた。カラム洗浄後、PSA を勾配的に低下の pH で溶出した。流速は 0.5 mL/分であり、フラクション 1 mL を採取した。約 80 % の PSA がカラムに結合しており、pH を下げてこれを溶出した (図２０)。
【０１２９】
図２１で、Zn2+ を緩衝液から除外した以外は、図２０と同じ精液のフラクション化を示す。Zn2+ を除くと、ほぼ半分の精液 PSA がカラムに結合し、勾配的に低下の pH で溶出すると、2 つのピークを回復した (図２１)。また、精液を C4-ペプチド-Sepharose で Zn2+ の存在下でフラクション化すると、約 80 % の PSA がカラムに結合し、勾配的に低下の pH で、2 つのピークとして溶出した (図２２)。Zn を除くと、約 80 % の適用 PSA が非結合であった。
【０１３０】
B2-ペプチド・アフィニティークロマトグラフィーにより分離された PSA 形態の同定を SDS-PAGE およびイムノブロッティングにより、ポリクローナル抗-PSA 抗体を用いて調べた。図２３は、B2 ペプチド・アフィニティーカラムからのフラクション（図２０および２１）を含有する PSA の非還元状態での SDS-PAGE 後のイムノブロッティング分析を示す。サンプルは下記のとおり：レーン 1: MW-マーカー、レーン 2: 非結合 PSA; Zn2+ を含む (図２０のフラクション 4)、レーン 3: 非結合 PSA; Zn2+ を含まない (図２１のフラクション 4)、レーン 5: 結合 PSA; Zn2+ を含む (図２０のフラクション 24)、レーン 6: 結合 PSA; Zn2+ を含まない (図２１のフラクション 30)。
【０１３１】
図２４は、B2 ペプチド・アフィニティーカラムからのフラクション（図２０および２１）を含有する PSA の還元状態での SDS-PAGE 後のイムノブロッティング分析を示す。サンプルは下記のとおり：レーン 1: MW-マーカー、レーン 2: 非結合 PSA; Zn2+ を含む (図２０のフラクション 4)、レーン 3: 非結合 PSA; Zn2+ を含まない (図２１のフラクション 4)、レーン 5: 結合 PSA; Zn2+ を含む (図２０のフラクション 30)、レーン 6: 結合 PSA; Zn2+ を含まない (図２１のフラクション 30)。
【０１３２】
B2-ペプチド・カラムからのフラクションについて非還元状態でのイムノブロッティング分析において、MW 約 30 kD のバンドが PSA 免疫反応活性の非結合および結合フラクションで表れた (図２３)。これは 遊離 PSA のサイズに対応する。しかし、還元条件下での SDS-PAGE 後のイムノブロッティングにおいて、非結合 PSA を含有のフラクションで、分子量約 10 および 20 kD に対応するバンドが表れた(図２４)。このことは、タンパク質分解的に解裂または切断された PSA から誘導された PSA の断片のサイズに対応する。いくつかの無傷 PSA を PSA の非結合フラクション中に検出した (図２４)。PSA の結合型のみが還元状態で 30 kD バンドを含有し、無傷の PSA のみからなることを示した。
【０１３３】
SDS-PAGE 分析によっても、ペプチド・カラムを用いて、精液からの PSA を精製できる。図２５は、B2 ペプチド・カラムによりフラクション化された精液について還元状態での SDS-PAGE を示す。サンプルは下記のとおり: レーン 1、2、3: 非結合 PSA、レーン 4: MW マーカー、レーン 5、6、7: PSA の溶出は夫々 pH 6、5、4、レーン 8: 精液。この結果によると、PSA 結合ペプチド・カラムでの精液のフラクション化により汚染精液タンパク質の大部分を 1 工程のペプチド・アフィニティークロマトグラフィーで除去できた。
【０１３４】
これらの結果からして、これらのペプチドを、PSA の精製および種々の形態の遊離 PSA 分別に使用できる。これらのペプチドは、PSA について新規の結合特異性を保持しているので、すなわち、無傷型の遊離 PSA に特異的に結合するので、前立腺癌についての改善的正確性をもつ検定法の開発に有用であり得る。
【０１３５】
実施例５．セリンプロテアーゼ活性を調節する環状ペプチドについての配座的および生化学的分析
材料および方法
ペプチド合成：ペプチドを、PerSeptive 9050 Plus 自動ペプチド機、Fmoc法、カップリング試薬として TBTU/ DIPEA、および固相として 4-ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸リンカーを有する NovaSyn TGA (Novabiochem, Laeufelfingen, Switzerland) を用いて合成した。合成で使用した側鎖保護基は、Asn、Qln、His についてトリチル (Trt) であり、Glu、Asp について O-tert-ブチル (OtBu) であり、Tyr について t-ブチルオキシカルボニル (Boc) であり、Ser、Thr、Trp について tert-ブチル (tBu) であった。Cys についてはアセタミドメチル (Acm) および Trt 保護基を用いた。ペプチド A-1、B-2 およびこれらの改変について Cys(Acm) を Cys 位置 1: C(Acm)VFTSDYAFC(Trt) および C(Acm)VFAHNYDYLVC(Trt) で用い、ペプチド C-4 およびその改変について Cys(acm) を位置 2 および 3: C(Trt)VAYC(Acm)IEHHC(Acm)WTC(Trt) で用いた。樹脂からの 96 % TFA での解裂の際に、Acm-保護基が Cys-側鎖に残留する。1 システイン橋を有するヘッドからテイル環状 C-4 ペプチドの合成に Cys(trt) およびα-アリル Fmoc-グルタミン酸(Fmoc-Glu-Oall) を用いた。Fmoc-Glu-Oall を最初に樹脂上に側鎖カルボニル基を介して付着した。合成を Glu(7) から His(8) (元の配列中) NH2-HHCWTVAYCIE-Oall へ続けた。環化が樹脂上で解裂の前に起きた。
【０１３６】
ペプチドを、HPLC (Shimadzu, Japan) により C18 逆相カラムおよび溶出液としてアセトニトリル (ACN) (0.1 %TFA の H2O/0-60 % ACN 勾配溶液、60 分間) で精製し、MALDI-TOF 質量分析計 (Brueker, Germany) で確認し、純度を分析 HPLC、240 x 1.4 mm C18 カラム 0  60 % ACN で 30 分間測定した。
【０１３７】
ペプチドの環状化：システインを有するペプチド (Acm) をヨード化法で環状にした。凍結乾燥ペプチドを 50 % 酢酸 (AcOH) に濃度 2 mg / ml に溶解した。1 M HCl (0.1 ml/ mg のペプチド) を加え、すぐに 0.1 M ヨウ素の 50 % AcOH 溶液(5 eq./ Acm) を加えた。溶液を激しく室温で 30 から 40 分間攪拌した。反応を 0.1 M チオ硫酸ナトリウムで停止した。ろ過後 (0.45 μm)、ペプチドを上記のように HPLC で精製した。硫黄橋の形成を MALDI-TOF 質量分析計 (Brueker analytic GMBH, Karlsruhe, Germany) で確認した。
【０１３８】
ヘッドからテイルへの環状化を Glu のカルボニル基からの Oall 基の解裂で開始した。3 等量のパラジウム (Pd(PPh3)4 を ChCl3-AcOH-N-メチルモルホリン中にアルゴン下で溶解した。パラジウムを樹脂上に加え、2 時間、室温でアルゴン下攪拌した。インキュベーション後に樹脂を 0.5 % ジイソプロピル-エタノールアミン DIPEA の DMF 溶液および 0.5 % ジエチルチオカルバミン酸ナトリウムの DMF 溶液で洗い、触媒を除去した。アリル基の除去後、ヘッドからテイルへのペプチド結合を等モル濃度の 0.6 M HTBU と 0.9 M DIPEA の DMF 溶液で、2 時間、室温で攪拌して形成せしめた。カップリング後、樹脂を DMF、DCM で洗い、乾燥した。解裂後、ペプチドを HPLC で精製し、0.1 M (NH4)HCO3 に溶解した。空気酸化により硫黄橋が形成した。ペプチド結合および硫黄橋の形成を MALDI-TOF で確認した。
【０１３９】
PSA 活性の測定：PSA の活性に対する種々のペプチドの作用を、キモトリプシン基質 S-2586 (MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA) (Chromogenix, Moelndal, Sweden) を用いて調べた。77 pモル (2 μg) の PSA、基質、10 μモルの種々のペプチドを、Tris-緩衝液 (10 mM Tris、150 mM NaCl、pH 7.8) 中で 0.2 mM 濃度の基質とともに室温でインキュベートした。ペプチドを有さない PSA 反応物を基礎レベルの対照として使用した。反応物を 60 分インキュベーション後に 405 mm で Multiscan RC 光度計 (Labsystems, Finland) で測定した。ペプチドの作用を、60 分インキュベーション後の PSA 単独に対する PSA-ペプチド複合体の OD 値の比率として計算した。
【０１４０】
NMR 分光法：NMR サンプルを、精製および凍結乾燥ペプチドを 600 μl DMSO-d6 に 5-10 mM で溶解して調製した。サンプルの pH は調べなかった。すべてのスペクトルを 300 - 320 K で Brueker Avance 500 NMR 分光計 (Brueker 分析 GMBH, Karlsruhe, Germany) により、1H についての周波数 500 MHz で作動して記録した。すべての 1 次元試験を 5 つの異なる温度で範囲 300 K から 320 K で記録した。アミドプロトンの温度係数 (dδ/dT) を、これらの 5 温度での化学的シフトを分析して、計算した。すべての 2 次元試験を、スペクトルの性質および明瞭性に依存して、305 K または 310 K で記録した。すべての化学シフトを 2.50 ppm での DMSO ピークに関して報告する。
【０１４１】
すべての 2D 試験について、Brueker ソフトウエアー・ライブラリーからの標準的パルス・プログラムを使用した。TOCSY スペクトルを混合時間 80 ms で、TPPI 相サイクリングを持つ MLEVTP (45) 混合配列の手段により記録した。NOESY(48) スペクトルを主に、混合時間、A-1 につき 400 ms、B-2 につき 420 ms、C-4 につき 300 msで、TPPI 相サイクリングを用いて、記録した。種々の混合時間を調べ、最上のものをスペクトルの性質および明瞭性に基づき決定した。NOE-形成曲線は決定しなかった。いくつかの COSY (c) スペクトルも混合時間 30 分で記録した。データセットを相-シフト正弦ベル関数で処理した。典型的に、データを t1 および t2 の両者について 1024 の分解で記録した。
【０１４２】
構造計算：構造計算を DYANA ソウフトウエアー (46) で行った。NOE-強度を、A-1 における Tyr7 および Cys10 のβ-プロトンと Tyr7 の芳香族環プロトン、B-2 における Tyr7 の芳香族環プロトン、C-4 おける Trp11 の芳香族環プロトンに関して、大略目盛りつけした。NOE 相関を、強い (1.8 - 2.7 Å)、中程度 (1.8 - 3.5Å)、弱い (1.8 - 5.0Å) のいずれかに分類した。メチルについて 1.5 Å、メチレンプロトンについて 1.0 Å、チロシン環プロトンについて 2.0 Å のプソイド原子補正を、必要なときに (52)、加えた。二面角は、3-D 構造の変動 (52) により大きくは制限されていなかった。
【０１４３】
結果
NMR 測定から誘導される最も重要なデータは、アミドプロトンの連続的長期間の核 Overhauser 効果、CαH 配座シフト、温度係数であった。連続的 NH(i) / NH(i+1) NOE 交差ピークは常に、多かれ少なかれ回転された配座についての証拠である。アミドプロトン間の距離が、その間の二極接触から生じる NOE を観測することが可能である前に 3 Å 以下であるべきことが示唆されている。この理解は、この二極接触が主に右手のα配座から起きることである。観測された強い継続的 CαH(i) / NH(i+1) 交差ピークはβ-配座の証拠である。この両者が同じ残基に存在するとき、２つの配座間に動力学的な平衡が存在した。継続的 NH(i) / NH(i+1)、CαH(i) / NH(i+1)、残基内 CαH(i) / NH(i) NOE-相関の強さは、骨格構造の剛性または動力学的挙動の主要事象についての指標であった。
【０１４４】
DMSO-d6 などの強い水素結合-受容溶媒を用いると、ペプチドにおける溶媒曝露 NH 基のダウンフィールドシフトが起きる (50)。大部分の NH 化学シフトは、ランダムコイル化学シフトと同じ位置か、それからのダウンフィールドに存する。NH 化学シフトには顕著なアップフィールドシフトもある。NH 基の溶媒曝露は、NH 基の温度係数を測定して、検出した。検査したすべてのペプチドは、強い溶媒シールディングに特徴的な (Raghothama et al. 1996) NH 基または非常に低い△δ/△T-値 (<3 ppm/K) を示す基を有していた。また、説明することを要する対の中程度△δ/△T-値 (3-5 ppm/K) も認めた。各ペプチドについての NH 基の化学的シフトおよび△δ/△T-値を表６に示す。NH ピークの部分を広げて、溶媒-曝露 NH 基または配座波動および動力学的挙動 (52, 50)を表示した。すべての 3JNHCαH を広げることについて、よく検出できなかった。検出されたカップリング定数は常に 6.0 − 8.0 Hz の間にあり、構造について情報をさらには表さなかった。
【０１４５】
低い水溶性からして、(特に C-4) スペクトルを DMSO-d6 中で記録したが、顕著な H2O-ピークをすべてのスペクトルで認めた。これは特に CαH-ピーク領域に干渉し、CαH(i) / CαH(j) 交差ピークを通常認めなかった。第２の主要な散乱は t1-ノイズ (Wuethrich, 1986, 52) であった。これは、特に NH / NH 交差ピーク強度の決定を困難にする。
【０１４６】
本発明ペプチドの各々についてさらに詳細な研究を下記の章で説明する。すべての下記のデータでは、構造計算において配座拘束として NOE-データを使用した。
【０１４７】
ペプチドの配座
A-1:
すべての A-1 変化ペプチドの NMR-測定において、A-1-4（表 7) を、その均一の優れた生物活性からして使用した。Tyr7 (3.4 ppb) および特に Ala8 (1.8 ppb) のアミドプロトンについての温度係数は低く、溶媒から保護されていることを示す (表 6)。Tyr7 のアミドプロトンの低い 3.7 ppb/K (dδ/dT) (表 6) はβ-ターンの存在を表す。Tyr7 は残基 i+3 であり、Ser5 はII型β-ターンの位置 i+1 にある。これは、なぜ Ser5 がランダムコイル値に関して高いフィールドで CαH 化学シフトを有しているかを説明する。Asn6 と Tyr7 間の強い NH(i) / NH(i+1) および Asn6 と Tyr7 についての強い残基内 CαH(i) / NH(i) は型IIβ-ターンを表す。ターン残基 4-7 での配座はペプチド B-2 構造に似る。
【０１４８】
強い CαH(i) / NH(i+1) NOE-相関を残基 2 - 6 の間に認め、これはターン領域の外側の可能なβ-型/伸張構造を表している。CαH の化学シフトは残基 2-4 および 8-10 の間のランダムコイル値にほとんど等しい（表１)。残基 Ser5、Asn6、Tyr7 間でのみ CαH の化学シフトがペプチドのこの部分のβ-配座の出現を支持するアップフィールドを動かした (49, 51)。残基 Phe9 と Cys10 の間の中程度の NH(i) / NH(i+1) 相関は、α-配座隣接のジスルフィド橋の証拠である。
【０１４９】
NH についての比較的強いダウンフィールドシフトを、Val2 および Cys10 について検出した。これは、それらの溶媒曝露配座を表す。強いアップフィールドシフトのアミドプロトンを、溶媒シールディングを表す残基 4-9 について認めた (表 6)。
【０１５０】
B-2:
最初に、Tyr7 のアミドプロトンについての低い温度係数(0,7 ppm/K) に興味の焦点を絞った。その溶媒シールド構造を示している。これは、Tyr7 のアミドプロトンと通常的に骨格のカルボニル基との間の水素結合を表す。クラシカルβターンにおいて、ターン中の第４残基の温度係数は、ターン中の第１残基のカルボニルとの水素結合の形成によって下げられなければならない。また、Tyr9 NH に対する中程度の温度係数(4.0 ppm/K) を認めた。NH についての強いダウンフィールドを、溶媒曝露の配座を示す Val2 および Cys12 について検出した。強くアップフィールドにシフトされたアミドプロトンは、Asn6、Tyr7、Tyr9であって、その溶媒-シールディングを表す (表６)。
【０１５１】
NH(i) / NH(i+1) 相関関係について、残基 His5-Asn6 の間に強い関係を、Asn6-Tyr7 の間に弱い関係を認めた。このデータは残基 4 - 7 の間の 型 I β-ターンに適合する(52)。継続的 CαH(i) / NH(i+1) 相関関係についても、残基 1 - 4 および 9 - 12 の間に非常に強い関係を、残基 6 - 9 の間に中程度または弱い関係のみを検出した。これは、β-ターン領域の外側のβ-シート型構造を表す。さらに、Ala4 CβH3-プロトンと Tyr7 および Tyr9 アミドプロトンの間の弱い NOE-相関関係が型 I β-ターンを示す (52)。CαH のシフトがアップフィールドに強く、ターン領域を示す残基 5-8 (49)の間のランダムコイル値と異なる（図２６)。
【０１５２】
しかし、同時の強力または中程度の NH(i) / NH(i+1) および強力な CαH(i) / NH(i+1) NOE-相関関係は、配座変化の存在を示した。NH(i) / NH(i+1)-相関関係を、残基 7-8 および 8-9 (中程度)、9-10 および 11-12 (弱い) の間に認めた。さらに強力な残基内 CαH(i) / NH(i) 相関関係が Asp8 および Tyr9 についてのα-配座の存在示す。しかしペプチド環の長期間 NOE-相関関係が配座間の構造的類似性を示す。顕著な NH(i)-NH(j) NOE-相関関係を Val2-Val11 および Ala4-Tyr9 の間に認めた。
【０１５３】
C-4:
C-4 ペプチドは A-1 および B-2 ペプチドと 2 ジスルフィド橋で異なる。His9 のアミドプロトンについて非常に低い温度係数を、Tyr4、Trp11、Cys13 のアミドプロトンについて比較的低い温度係数を検出した。His9 のアミドプロトンは、β-ターンの存在を示す Ile6 のカルボニルと水素結合している。Cys5 と Cys10 の間のジスルフィド橋がこの部分のペプチドをさらに剛性にした。NH についての強力なダウンフィールドシフトを、Val2、Cys5、Ile6、Cys10 について、非常に強力なのを、溶媒-曝露された配座を示す Glu7 および Trp11 について検出した。強くアップフィールドシフトされたアミドプロトンは、溶媒-シールディングを示す Tyr4、His9、Cys13 であった（表６)。
【０１５４】
残基 Ile6 - His9 間のターン型を型IIβ-ターンと同定した。His8 - His9 間の強力な NH(i) / NH(i+1) 相関関係および His8 についての強力な残基内 CαH(i) / NH(i) 相関関係は型IIターンを示す。Glu7 NH についての非常に強力なダウンフィールドシフトが溶媒-曝露された配座を示す。これは型IIターンに特有である。NOE を、剛性ターンを示す Ile6 NH - Tyr9 NH 間に認めた。配座的不一致のみが、ターン領域で波動を示す Glu7 - His8 間の弱い NH(i) / NH(i+1) 相関関係であった。
【０１５５】
Glu7 および His8 についての CαH の化学的シフトが、ターン領域を示す強力なアップフィールドに移動された。強力な CαH(i) / NH(i+1) NOE-相関関係を、β-ターン領域の外側のβ-配座を示す残基 1 - 6 および 9 - 13 間で認めた。主な不一致は、Val2 - Ala3 間の比較的強力な NH(i) / NH(i+1) 相関関係、および骨格の動力学的挙動を示す Tyr4 - Cys5、Ile6 - Glu7、Trp11 - Thr12 間の弱い NH(i) / NH(i+1) 相関関係であった。
【０１５６】
いくらか顕著な中程度および長期的 NOE-相関関係を認めた。非常に明確な NOE-交差ピークを、Ala3 と Thr12 の CαHプロトン間および Tyr4 と Ile6 の側鎖プロトン間に検出した。Tyr4、Trp11、Cys13 のアミドプロトンの中程度の温度係数は、それぞれ Trp11、Tyr4、Val2 のカルボニル酸素との部分的水素結合の結果である。
【０１５７】
NMR-データが Cys1 - Cys13 および Cys5 - Cys10 間の橋形成を証明した。強力な NOE-交差ピークを残基 Cys5 および Cys10 中の CαH プロトン間で検出した。さらに、Cys5 および Cys10 中の CαH プロトンの化学シフトがダウンフィールドに移動したのは、興味深い (表６)。化学シフト値は、これらのプロトン近接の芳香族環の環カレント作用により説明できる(Wuethrich, 1986, 52)。同じ挙動を Ile6 および Trp11 のアミドプロトンについて検出できた。これらのシフトを誘発した芳香族環は、Trp11 のインドール環である。NOE を Ile6 HN  - Trp11 H5 間に認めた。
【０１５８】
修飾ペプチドの活性
1.1 以上の PSA-ペプチド/PSA 比を有するペプチドを活性、1.1 以下のものを不活性とした(表７)。
【０１５９】
下記の修飾は、ペプチド A-1、B-2、C-4 の活性に影響を及ぼさなかった。ペプチド A-1-4 および B-2-2 における負性電荷の移動 D → N および C-4-3 における E → Q 。ペプチド A-1 における電荷 F(9) → Y(9) (A-1-2) および A(8) → N(8) (A-1-3) は、活性に影響を及ぼさなかった。ペプチド B-2 において、活性が Y(9) → A(9)(B-2-3) の修飾とともに残存した。A-1 と B-2 の配列は、長さの相違にかかわらず互いに類似する。B-2 を 10 アミノ酸 (B-2-4) に短くすると、配列間の相違は、B-2-4 中の A(4)H(5) に対するに A-1-3 中の T(4)S(5) である。ペプチド C-4 における Y(4) → F(4) の修飾 (C-4-3) を持つペプチドは活性であった。
【０１６０】
下記の修飾は不活性であった：ペプチド A-1 における F(3) → Y(3)、およびペプチド A-1 および B-2 の両方における修飾 Y(7) → A(7)。ペプチド C-4 における修飾 Y(4) → A(4) および W(11) → A(11) は不活性であった。さらに、１システイン結合を有する 10 アミノ酸配列 C-4-4 およびペプチド結合表面による環化 C-4-6 は不活性であった。
【０１６１】
結論
３ペプチド A-1、B-2、C-4 の配列およびアミノ酸部位を表８に示す。２ペプチド A-1 および B-2 は類似の構造および同じ生物活性を示す。A-1 ペプチドにおける特に重要な側鎖は 3 位のフェニルアラニン (Phe) および 7 位のチロシン (Tyr) である。ペプチド B-2 における対応のアミノ酸は 3 位のフェニルアラニン (Phe) および 7 位のチロシン (Tyr) である。
【０１６２】
配列 A-1 および B-2 において、剛性β-ターンが 3 位のフェニルアラニン (Phe) および 7 位のチロシン (Tyr) の芳香族側鎖の位置を安定にする。この構造は、ペプチド A-1 において、4 位のトレオニン (Thr) のカルボニルと 7 位のチロシン (Tyr) のアミドの水素との水素結合により安定となる。この構造は、ペプチド B-2 において、4 位のアラニン (Ala) のカルボニルと 7 位のチロシン (Tyr) のアミドの水素との水素結合により安定となる。
【０１６３】
ペプチド C-4 の特に重要なアミノ酸は 4 位のチロシン(Tyr) および 11 位のトリプトファン (Trp) である。この構造は２ジスルフィド橋により安定となる：第１は位置 Cys1 と Cys13 の間、第２は位置 Cys5 と Cys10 の間。
【０１６４】
図 27a - 27c は、DMSO-d6 中のペプチド A-1、B-2、C-4 の有意の NOE-相関関係を示す。相対的交差ピーク強度を量積分から検査した。記号 s および m は残基内 dHαNH(i,i) の相対的に強いおよび中程度の強度を意味する。記号 * はなんらかの他の NOE により妨害された NOE 相関関係を意味する。“他の”相互作用として表示された NOE は、長期間主鎖-主鎖、側鎖-主鎖、側鎖-側鎖の相互作用を含む。
【０１６５】
図 28 はペプチド A-1 の三次元構造を、図 29 はペプチド B-2 の三次元構造を、図 30 はペプチド C-4 の三次元構造を示す。構造は、上記のデータおよび下記の表から計算した。
【０１６６】
表６．PSA-結合ペプチドの 1H 化学シフトおよびアミドプロトン温度係数
【表６】
0004647882.tif 000007
【０１６７】
表７．ペプチド A-1、B-2、C-4 およびこれらの修飾の活性。PSA-ペプチド/PSA 比 >1.1 のペプチドを活性とする。
【表７】
0004647882.tif 000008
【０１６８】
表８．
NMR 試験およびアミノ酸位置のための合成ペプチド
【表８】
0004647882.tif 000009
【０１６９】
参考文献
1.  Wang, MC, Valenzuela LA, Murphy GP, Chu TM. ヒト前立腺特異抗原の精製 Invest. Urol. 17, 1979, 159-163.
2.  Lilja, H, Oldbrink J, Rannevik G, Laurell C-B. 精嚢分泌タンパク質、およびヒト精液のゲル化および液化の際の反応 J. Clin. Invest 1987;80:281-285.
3.  Zhang, WM, Leinonen J, Kalkkinen N, Dowell B, Stenman UH. ヒト精液における前立腺特異抗原の異なる分子形態の精製および特徴解明 Clin Chem 1995;41:1567-73.
4.  Stenman, UH, Leinonen J, Alfthan H, Rannikko S, Tuhkanen K, Alfthan O. 前立腺特異抗原とα1-抗キモトリプシンの複合体が前立腺癌患者の血清における主要な形態の前立腺特異抗原である: 複合体の検定法が癌の臨床的感度を改善する Cancer Res 1991;51:222-6.
5.  Mikolajczyk, SD, Grauer LS, Millar LS, Hill TM, Kumar A, Rittenhouse HG, Wolfert RL, Saedi MS. PSAの前駆型(pPSA)が前立腺癌血清における遊離 PSA の成分である Urology 1997;50:710-4.
6.  Chen, Z, Chen H, Stamey TA. 良性前立腺過形成における前立腺特異抗原:精製および特徴解明 J Urol 1997;157:2166-70.
7.  Zhang, WM, Finne P, Leinonen J, Vesalainen S, Nordling S, Rannikko S, Stenman UH. 前立腺特異抗原とα2-マクログロブリンとの複合体の特徴解明と免疫測定 Clin Chem 1998;44:2471-9.
8.  Fortier, AH, Nelson BJ, Grella DK, Holaday JW. 前立腺特異抗原の抗脈管形成活性 J Natl Cancer Inst 1999;91:1635-40.
9.  Heidtmann, HH, Nettelbeck DM, Mingels A, Jager R, Welker HG, Kontermann RE. 前立腺特異抗原によるプラスミノーゲンのアンギオスタチン様断片の産生 Br J Cancer 1999;81:1269-73.
10.  Adams, GP, Schier R. 腫瘍標識のための改善単一鎖 Fv 分子の産生 J Immunol Methods 1999;231:249-60.
11.  Gersuk, GM, Corey MJ, Corey E, Stray JE, Kawasaki GH, Vessella RL. ポリソーム選択により同定された前立腺特異抗原に対する高親和性ペプチドリガンド Clin Invest Med 1997;20:119-26.
12.  Denmeade, SR, Lou W, Lovgren J, Malm J, Lilja H, Isaacs JT. 前立腺特異抗原のタンパク質分解活性の検定法のための特異的で効率的なペプチド基質 Cancer Res 1997;57:4924-30.
13.  Denmeade, SR, Nagy A, Gao J, Lilja H, Schally AV, Isaacs JT. 前立腺特異抗原によるドキソルビシン-ペプチドプロドラッグの酵素的活性化 Cancer Res 1998;58:2537-40.
14.  Arap, W, Pasqualini R, Ruoslahti E. マウスモデルにおける腫瘍血管系への標的化薬物の運送による癌治療 [参照、コメント] Science 1998;279:377-80.
15.  Nargund, RP, Patchett AA, Bach MA, Murphy MG, Smith RG. ペプチド様分泌性ホルモン。設計考察および治療的ポテンシャル J Med Chem 1998;41:3103-27.
16.  Houghten, RA, Pinilla C, Appel JR, Blondelle SE, Dooley CT, Eichler J, Nefzi A, Ostresh JM. 混合物を基とする合成複合ライブラリー J Med Chem 1999;42:3743-78.
17.  Harbottle, RP, Cooper RG, Hart SL, Ladhoff A, McKay T, Knight AM, Wagner E, Miller AD, Coutelle C. RGD-オリゴリシンペプチド: インテグリン仲介遺伝子運送のためのプロト型構築体 [参照、コメント] Hum Gene Ther 1998;9:1037-47.
18.  Zalipsky, S, Puntambekar B, Boulikas P, Engbers CM, Woodle MC. リポソーム表面移植片 PEG 鎖の末端へのペプチド接着: 長期循環型ラミニンペンタペプチドの調製 YIGSR. Bioconjug Chem 1995;6:705-8.
19.  Slepushkin, VA, Salem, II, Andreev SM, Dazin P, Duzgunes N. CD4 受容体から誘導されたペプチドによる HIV-1-感染細胞に対するリポソームの標的化 Biochem Biophys Res Commun 1996;227:827-33.
20.  Rajotte, D, Arap W, Hagedorn M, Koivunen E, Pasqualini R, Ruoslahti E. インビボ・ファージ・ディスプレイにより表される血管内皮の分子不均質 J Clin Invest 1998;102:430-7.
21.  Koivunen, E, Wang B, Dickinson CD, Ruoslahti E. 細胞接着のペプチド研究 Methods Enzymol 1994;245:346-69.
22.  Koivunen, E, Huhtala ML, Stenman UH. ヒト卵巣腫瘍関連トリプシン。シスト液からの精製および特徴解明、およびプロウロキナーゼのアクチベーターとしての同定 J Biol Chem 1989;264:14095-9.
23.  Itkonen, O, Koivunen E, Hurme M, Alfthan H, Schroder T, Stenman UH. トリプシノーゲン-1 および-2 についての時間分割免疫蛍光検定法が膵炎におけるトリプシノーゲン-2 の優先的高位を示す J Lab Clin Med 1990;115:712-8.
24.  Leinonen, J, Zhang W-M, Paus E, Stenman U-H. 前立腺特異抗原 (PSA) に対する 77 抗体 の、PSA のイソ酵素および複合体との反応性  Tumor Biol 1999;20:Suppl 1:28-34.
25.  Smith, DB, Johnson KS. グルタチオン S-トランスフェラーゼとの融合として Escherichia coli で発現されたポリペプチドの単一工程の精製 Gene 1988;67:31-40.
26.  Leinonen, J, Lovgren T, Vornanen T, Stenman UH. 前立腺特異抗原およびその 1-抗キモトリプシンとの複合体についての二重ラベル時間分割免疫蛍光検定法 Clin Chem 1993;39:2098-103.
27.  Leinonen, J, Leinimaa M, Zhang W-M, Piironen T, Pettersson K, Lilja H, Dowell B, Stenman U-H. 抗-PSA モノクローナル抗体の組換えヒトカリクレイン-2 との反応性  Tumor Biol 1999;20:Suppl 1:35-7.
28.  Zhang, W-M, Leinonen J, Stenman U-H. 前立腺特異抗原がα-1-プロテアーゼ阻害剤と複合体を形成しインビトロで解裂する Prostate 1997;33:87-96.
29.  Fisher, RJ, Fivash M. 生物分子相互作用の速度および結合親和性を測定するための表面プラスモン共鳴法 Curr Opin Biotechnol 1994;5:389-95.
30.  Stenman, UH, Paus E, Allard WJ, Andersson I, Andres C, Barnett TR, Becker C, Belenky A, Bellanger L, Pellegrino CM, Bormer OP, Davis G, Dowell B, Grauer LS, Jette DC, Karlsson B, Kreutz FT, van der Kwast TM, Lauren L, Leinimaa M, Leinonen J, Lilja H, Linton HJ, Nap M, Hilgers J, et al. TD-3 ワークショップについての要約報告: 前立腺特異抗原に対する 83 抗体の特徴解明  Tumour Biol 1999;20:1-12.
31.  Lovgren, J, Piironen T, Overmo C, Dowell B, Karp M, Pettersson K, Lilja H, Lundwall A. 組換え PSA および HK2 の製造およびその免疫性交差活性の分析 Biochem Biophys Res Commun 1995;213:888-95.
32.  Cohen, P, Graves HC, Peehl DM, Kamarei M, Giudice LC, Rosenfeld RG. 前立腺特異抗原 (PSA) は精液に見られるインスリン様成長因子に結合のタンパク質-3 プロテアーゼである J Clin Endocrinol Metab 1992;75:1046-53.
33.  Koistinen, H, Seppala M, Koistinen R. モノクローナル抗体での免疫蛍光検定法により血清および精液中に検出される種々の形態のインスリン様成長因子-結合タンパク質-3  Clin Chem 1994;40:531-6.
34.  Sottrup-Jensen, L. α-マクログロブリン: プロテイナーゼ複合体形成の構造、形、メカニズム J Biol Chem 1989;264:11539-42.
35.  Berg, JM, Shi Y. 直流通電の生物学: 亜鉛の役割についての拡大する評価 Science 1996;271:1081-5.
36.  Katz, BA, Clark JM, Finer-Moore JS, Jenkins TE, Johnson CR, Ross MJ, Luong C, Moore WR, Stroud RM. 強力な選択性亜鉛仲介セリンプロテアーゼ阻害剤の設計 Nature 1998;391:608-12.
37.  Feng, S, Kasahara C, Rickles RJ, Schreiber SL. ２クラスの Src ホモロジー 3 リガンドのプロリンに富むコアの外側での特異的相互作用 Proc Natl Acad Sci U S A 1995;92:12408-15.
38.  Scott, JK, Smith GP. エピトープを有するペプチドリガンドのライブラリーの探索 Science 1990;249:386-90.
39.  Lilja, H, Abrahamsson PA, Lundwall A. セメノゲリン、ヒト精液中の顕著なタンパク質。男性付属性腺および精子における密接関連タンパク質の主要構造および同定 J Biol Chem 1989;264:1894-900.
40.  Coombs, GS, Bergstrom RC, Pellequer JL, Baker SI, Navre M, Smith MM, Tainer JA, Madison EL, Corey DR. 前立腺特異抗原 (PSA) の基質特異性  Chem Biol 1998;5:475-488.
41.  Hemmilae, I., Dakubu, S., Mukkala, V.-M., Siitari, H. & Loewgren, T. (1984). 時間分割免疫蛍光検定法における標識としてのヨーロピウム Anal. Biochem., 137, 335-343.
42.  Karonen, S.L., Aronen, H., Liewendahl, K., Nikkinen, P., Mantyla, M. & Lindgren, J. (1988). 放射性ヨード化組換え組織プラスミノーゲン・アクチベーターによるヒト悪性腫瘍の場所 J Nucl Med, 29, 1194-9.
43.  Laemmli, U.K. (1970). バクテリオファージ T4 のヘッド会合時の構造タンパク質の解裂  Nature, 227, 680-5.
44.  Towbin, H., Staehelin, T. & Gordon, J. (1979). ポリアクリルアミド・ゲルからニトロセルロースシートへのタンパク質の電気泳動移行：手法といくつかの適用 Proc Natl Acad Sci U S A, 76, 4350-4.
45.  Bax, A., and Davis, D. G. (1985), MLEV-17 に基づく二元的ホモ核磁気移行分光法 J. Magn. Reson. 65, 355-360.
46.  Guentert, P., Mumenthaler, C., Wuethrich, K. (1997). 新プログラム DYANA での NMR 構造計算のためのねじれ角動力学 J. Mol. Biol. 273, 283-298.
47.  Hutchinson, G., Thornton, J., M., (1994). タンパク質におけるβ-ターン形成のポテンシャルについての総説 Protein Science, 3, 2207-2216.
48.  Jeener, J., Meier, B. H., Bachmann, P. and Ernst, R. R., (1979). 二元的 NMR 分光法による交換プロセスの研究 J. Chem. Phys., 71, (11), 4546-4553.
49.  Maynard, A., J., Sharman, G., J., Searle, M., S., (1998) 溶液中のβヘアピン安定性の起源：水中でのモデル・ペプチド支持体疎水性安定化のフォルディングの構造的熱力学的分析 J. Am. Chem. Soc., 120, 1996-2007.
50.  Raghothama, S., Chaddha, M., Balaram, P., (1996). 非環状ペプチドにおける配座遷移の NMR 分析。ヘリックス非フォルディングの研究についてのモデルシステム J. Phys. Chem. 100, 19666-19671.
51.  Wishart, D., S., Sykes, B., D., Richards, F., M., (1991), 核磁気共鳴化学シフトとタンパク質二次構造の関係 J. Mol. Biol. 222, 311-333.
52.  Wuethrich, K., (1986). タンパク質および核酸についての NMR Wiley-Interscience, New York。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、GST-ペプチドの固定化 PSA との結合を示す。
【図２】  図２は、GST-ペプチドの固定化 PSA との結合に対する Zn2+ の作用を示す。
【図３】  図３は、GST-C-4 の固相 PSA との結合に対する PSA 溶液の作用を示す。
【図４ａ】  図４ａは、それぞれ、GST-ペプチドの、PSA に関連する種々のプロテイナーゼおよび PSA-セルピン複合体との反応性を示す。
【図４ｂ】  図４ｂは、それぞれ、GST-ペプチドの、PSA に関連する種々のプロテイナーゼおよび PSA-セルピン複合体との反応性を示す。
【図５】  図５は、ゲルろ過による GST-C-4 の分別を示す。
【図６】  図６は、GST ペプチドのプロ酵素型 PSA および活性 PSA との結合を示す。
【図７】  図７は、化学合成ペプチドの、GST-C-4 の固相 PSA との結合に対する作用を示す。
【図８】  図８は、GST-C-4 の PSA 酵素活性に対する作用を示す。
【図９】  図９は、化学合成ペプチド C-4 の PSA 酵素活性に対する作用を示す。
【図１０】  図１０は、化学合成ペプチド C-4 および A-1 の、PSA の IGF-BP-3 へのタンパク分解活性に対する作用を示す。
【図１１】  図１１は、GST-C-4 と Zn2+ の PSA 酵素活性に対する併用効果を示す。
【図１２】  図１２は、化学合成ペプチド C-4 の、PSA - A2M 複合体の酵素活性に対する作用を示す。
【図１３】  図１３は、誘導ペプチド B2 の構造を示す。
【図１４】  図１４は、誘導ペプチド C4 の構造を示す。
【図１５】  図１５は、SKSKSKS-テイル化ペプチド C4 の PSA 酵素活性に対する作用を示す。
【図１６】  図１６は、ペプチド C4 の Eu-標識反応混合物のフラクション化を示す。
【図１７】  図１７は、図１６に示す C18 クロマトグラフィーの種々のフラクションの、PSA 酵素活性に対する作用を示す。
【図１８】  図１８は、テクネチウム標識の、C4-ペプチドの結合活性に対する作用を示す。
【図１９】  図１９は、ヨウ素化の、C4 ペプチドの PSA 結合活性に対する作用を示す。
【図２０】  図２０は、100 μM Zn2+ の存在下での B2 ペプチド アフィニティークロマトグラフィーによる精液血漿サンプルのフラクション化を示す。
【図２１】  図２１は、Zn2+ 不存在で上記図２０の精液血漿サンプルのフラクション化を示す。
【図２２】  図２２は、異なるｐＨ値での C4-ペプチドカラムからの PSA の溶出を示す。
【図２３】  図２３は、ペプチド B2 のアフィニティーカラムから得られた PSA-含有フラクションの、非還元条件下での SDS-PAGE 後のイムノブロット分析を示す。
【図２４】  図２４は、還元条件下での SDS-PAGE 後の対応する（参照、図２３）イムノブロット分析を示す。
【図２５】  図２５は、ペプチド B2 カラムによりフラクション化された精液の、非還元条件下での SDS-PAGE を示す。
【図２６】  図２６ａ−ｃは、A-1 (a)、B-2 (b)、C-4 (c) についてランダムコイルにおける CαH 化学シフト値と DMSO-d6 において実験的に測定された値との相違を示す。
【図２７】  図２７ａ−ｃは、DMSO-d6 におけるペプチド A-1、B-2、C-4 の有意の NOE-相関関係を示す。
【図２８】  図２８は、ペプチド A-1 の三次元構造を示す。
【図２９】  図２９は、ペプチド B-2 の三次元構造を示す。
【図３０】  図３０は、ペプチド C-4 の三次元構造を示す。
【配列表】
0004647882.tif 000010
0004647882.tif 000011
0004647882.tif 000012
0004647882.tif 000013
0004647882.tif 000014
0004647882.tif 000015
0004647882.tif 000016
0004647882.tif 000017
0004647882.tif 000018
0004647882.tif 000019
0004647882.tif 000020
【図１】
0004647882.tif 000021
【図２】
0004647882.tif 000022
【図３】
0004647882.tif 000023
【図４ａ】
0004647882.tif 000024
【図４ｂ】
0004647882.tif 000025
【図５】
0004647882.tif 000026
【図６】
0004647882.tif 000027
【図７】
0004647882.tif 000028
【図８】
0004647882.tif 000029
【図９】
0004647882.tif 000030
【図１０】
0004647882.tif 000031
【図１１】
0004647882.tif 000032
【図１２】
0004647882.tif 000033
【図１３】
0004647882.tif 000034
【図１４】
0004647882.tif 000035
【図１５】
0004647882.tif 000036
【図１６】
0004647882.tif 000037
【図１７】
0004647882.tif 000038
【図１８】
0004647882.tif 000039
【図１９】
0004647882.tif 000040
【図２０】
0004647882.tif 000041
【図２１】
0004647882.tif 000042
【図２２】
0004647882.tif 000043
【図２３】
0004647882.tif 000044
【図２４】
0004647882.tif 000045
【図２５】
0004647882.tif 000046
【図２６】
0004647882.tif 000047
【図２７ａ】
0004647882.tif 000048
【図２７ｂ】
0004647882.tif 000049
【図２７ｃ】
0004647882.tif 000050
【図２８】
0004647882.tif 000051
【図２９】
0004647882.tif 000052
【図３０】
0004647882.tif 000053