(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
＊１，３−β−Ｄ−グルカナーゼの活性化という枠内での病原体又は捕食者からの植物の保護のためか、及び高レベルのオゾンへの植物の適応のための植物衛生品として、
＊雌ずいの成長又はやくの成熟、組織の膨張時の細胞壁の編成の制御の、器官離脱の制御のための、及び１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ、１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ及びキシログルカンエンドトランスグリコラーゼの活性化の枠内での植物細胞壁を強化するための生物肥料としての
ＤＰ４の１，４−β−Ｄ−マンヌロナンオリゴ糖の使用。
【請求項２】
キシログルカンエンドトランスグリコラーゼの活性化の枠内での生物肥料としての、ＤＰ４の１，４−β−Ｄ−マンヌロナンオリゴ糖の使用。
【請求項３】
組織の膨張時の細胞壁の編成の制御の枠内での、植物細胞壁を強化するための、ＤＰ４の１，４−β−Ｄ−マンヌロナンオリゴ糖の使用。
【請求項４】
請求項１に記載の１，４−β−Ｄ−マンヌロナンオリゴ糖で植物を処理することによって病原体又は捕食者に耐性であるか又は高レベルのオゾンに適応している植物を得るための方法。
【請求項５】
請求項１に記載の１，４−β−Ｄ−マンヌロナンオリゴ糖で植物を処理することによって器官離脱の、雌ずいの成長又はやくの成熟の段階が制御されている植物を得るための方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、植物衛生品及び／又は肥料としての、１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマー及び誘導したグリクロン酸オリゴ糖の使用に関する。
【０００２】
酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼは、植物における防御機構の標識物質である。病原体（細菌、真菌、ウイルス）への過剰感作により引き起こされる反応の間、植物は、「ＰＲ蛋白質」と呼ばれる特異的蛋白質の合成を誘導することにより反応する（Sintzi A. et al. (1993) Biochimie, 75, 687-706）。これらの蛋白質はその他の分子（サリチル酸など）と共に病因に結合して、病原体への耐性の発達に寄与する。これらの蛋白質は、生化学的性質及び生理学的機能に応じて複数の群に列挙される。それらは、以下の特徴を持つ：低分子量、組成（単量体が最も多い）、蛋白質分解への耐性、酸媒体又は極限温度での安定性、原形質膜又は小胞体膜との会合、及び壁面という位置。これらのＰＲ蛋白質のうち群２は、１，３−β−Ｄ−グルカン鎖を基質として認識する１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ酵素を構成要素とする。植物の防御におけるこれらの蛋白質の役割は、１，３−β−Ｄ−グルカン（1,3β-D-glucanes）に豊富な、病原体の壁を溶解する能力に基づいている（Boller T. (1993) In Mechanism of Plant Defences Responses. Fritig B. Legrand M. eds. Kluwer. Academic Publishers Dordrecht, 392-400）。
【０００３】
しかしこの酵素活性は、植物の防御に関与するだけではない。それは、実際には植物ホルモンによって調節することができ、それは植物の発育のある段階で誘導することができる。これに基づいて、酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼは、植物における成長及び／又は細胞分化の標識物質となっている。
【０００４】
この酵素は、多数のＰＲ蛋白質（蛋白質阻害物質、キチナーゼ、オスモチンをコードする遺伝子の発現を調節する蛋白質）と同様に、成長及び／又は細胞分化、あるいは環境への適応の過程に関連する。これらの蛋白質の中には、タバコモザイクが混入するタバコから単離される１，３−β−Ｄ−グルカナーゼに対する抗体によって認識されるものものある（Kauffmann et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3): 381-90）。
【０００５】
１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ又はこれらの蛋白質をコードする遺伝子の活性は、発芽、並びに花芽及び果実の発育の途中で誘導される（del Campillo E., Lewis L N. (1992) Plant Physiology 99, 1015-1020; Neale et al. (1990) Plant Cell 2, 7, 673-684）。詳細には、これらの反応は、異化的変化（内乳核、花粉管、茎部離層帯、花柄など）により、又は有糸分裂（やく、柱頭、茎の場合）の間、組織内で発生する。それらは、ホルモン（オーキシン、一般にサイトキニン、詳細にはアブシシン酸）に依存し、そして果実の成熟を制御するエチレン又は開花を制御するサリチル酸のような分子も誘導物質である。最後に、１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ酵素は、植物の低温及び高レベルのオゾンへの適応の機能が記録されている（Hincha et al. (1997) Plant Physiology 114, 1077-1083）。
【０００６】
酵素１，４−β−Ｄ−グルカナーゼは、植物の発育及び／又は細胞分化の標識物質である。この酵素は、β（１，４）で結合するグルカンの直鎖を基質として認識する。それは、セルロース、βグルカン（１，４）（１，６）、及びキシログルカンを加水分解することができる。こうしてそれは、成長過程での植物細胞壁の超微細構造の変化において、１つの役割を演じる。それの誘導及び／又は特異的遺伝子の誘導は、植物細胞壁の溶解、やく、果実、および花の離層帯の崩壊を含む工程で明らかにされている（Hayaschi T., Oshimi C. (1994) Plant Cell Physiology 35(3), 419-424; Brummel D. A. et al. (1997) Plant Biol. Mol. 33, 1, 97-195）。それは、エチレンにより、アビシシン酸又はオーキシンのようなホルモンにより制御される。
【０００７】
キシログルカンエンドトランスグリコラーゼ活性は、機械的圧迫、風、暗さ、及び熱衝撃のような環境刺激に反応して、植物細胞壁のキシログルカンの改変を誘導する（Xu et al. (1996) Plant J. 9(6), 879-89; Antosiewiez et al. (1997, 115(4), 1319-28)）。
【０００８】
本発明は、「１，４−β−Ｄ−グルクロンナン及び後者から誘導されるグリクロン酸オリゴ糖は、酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ及び／又は酵素１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、及び／又は酵素キシログルカンエンドトランスグリコラーゼを増幅する活性を有する」という事実の本発明者による実証に発し、これに基づいて、植物衛生的使用又は肥料という観点から使用され得る「惹起」化合物として記載する。
【０００９】
１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマーは、既に本発明の上述のものとは全体的に異なる使用分野（即ち食物、薬剤、ヒト又は家畜の治療、化粧品、あるいは水の精製（詳細にはゲル化剤、増粘剤、水和剤、安定剤、キレート剤、又は凝集剤として）の領域に加えてオリゴ糖の調製）に関係する、１９９２年３月３日のフランスの特許ＦＲ−Ｂ−２６８８２２２に記載されている。
【００１０】
本発明は、肥料（きゅう肥、生物学的肥料、又は生物肥料）及び植物衛生品の組成に含まれる「惹起物質」として用いられ得る化合物を提供するという目的を有する。
【００１１】
本発明の目的の１つは、詳細には環境への毒性がある炭汁及び硝酸塩を基にした市販製品に加える栄養素の刺激物質として、又はその市販品の代替物として、及び／あるいは植物の発育の１段階以上の調節物質として用いられ得る新しい生物肥料を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、詳細には環境への毒性がある殺虫剤に加える生物性又は非生物性ストレスの防御及び耐性反応の活性化物質として、又はその市販品の代替物として用いられ得る新しい植物衛生品を提供することである
【００１３】
本発明は、
＊酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを増幅する活性に関連する使用という枠内での植物衛生品として、
＊並びに／あるいは酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ、及び／又は１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、及び／又はキシログルカンエンドトランスグリコラーゼを増幅する活性に関連する使用という枠内での生物肥料としての、
−以下の式（Ｉ）：
【００１４】
【化３】
0004739622.tif 000002
【００１５】
（式中、ｎは約２５００という大きさになり得る整数であり、有利には約３００〜約２５００であり、ＲはＨ又はＣＯＣＨ3を表す）の１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマー、
−並びに／あるいは式（Ｉ）のポリマーから誘導され、糖単位の数が約３０未満、好ましくは２〜１５のβ（１−４）鎖グリクロン酸オリゴ糖、
−並びに／あるいは式（Ｉ）のポリマー又は上述のオリゴ糖誘導体に対応するエステル及び／又はエーテル、から選択される化合物の使用を対象として有する。
【００１６】
本発明の観点から処理され得る植物には、以下のものが挙げられる：つる、果樹、穀物、及び市販の園芸品、又はいずれか別の経済的関心のある植物。
【００１７】
本発明は、より詳細には病原体又は捕食者からの（特に細菌、ウイルス、真菌、昆虫、線虫からの）植物の保護、又は非生物性ストレスへの植物の適応（詳細には低温又は高レベルのオゾンへの適応）など、酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを増幅する活性に関連する使用という枠内での植物衛生品としての、上述のものから選択される化合物の上述の使用を対象として有する。
【００１８】
本発明は、より詳細には、植物衛生品としての、式（Ｉ）（式中、ｎは約３００〜約２５００の整数であり、ＲはＨを表す）の１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマーの使用を対象として有する。
【００１９】
本発明は、より詳細には、植物衛生品としての、式（Ｉ）（式中、ｎは約３００〜約２５００の整数であり、ＲはＨ又はＣＯＣＨ3を表し、ＣＯＣＨ3の重量％は好ましくは０〜３０．５である）の１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマーの使用も対象として有する。
【００２０】
本発明は、植物衛生品としての、ＤＰ（重合度）が３０未満、好ましくは２〜１５のβ（１−４）鎖グリクロン酸オリゴ糖（オリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナン、オリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナン、及びオリゴ１，４−β−Ｄ−グルロナンなど）の使用にも関する。
【００２１】
以下では、表現「重合度ｘ（ＤＰｘ）のオリゴ糖」は、同数ｘの糖単位で作られたオリゴ糖を意味するものと理解し、表現「平均重合度ｘ（平均ＤＰｘ）のオリゴ糖」は、平均がｘに対応する様々な数の糖単位で作られたオリゴ糖を意味するものと理解する。
【００２２】
植物衛生品として好ましいグリクロン酸オリゴ糖誘導体は、以下の：
−ＤＰ８及び平均ＤＰ８のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナン、
−ＤＰ４のオリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナン、
―ＤＰ４のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルロナン、から選択される。
【００２３】
本発明は、上述の病原体に耐性の植物、又は非生物性ストレス（特に低温、高レベルのオゾン）に適応する植物を得ることを考慮し、上記定義の１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマー及び／又はグリクロン酸オリゴ糖による植物の処理方法も対象として有する。
【００２４】
本発明は、酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ、及び／又は酵素１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、及び／又は酵素キシログルカンエンドトランスグリコラーゼを増幅する活性に関連する使用という枠内での生物肥料としての、上に列挙されたものから選択される化合物の使用にも関する。
【００２５】
本発明は、より詳細には、酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ及び／又は酵素１，４−β−Ｄ−グルカナーゼを増幅する活性に関連する使用という観点、特に植物の発育の１段階以上の制御（果実の熟成、器官離脱、雌ずいの成長、又はやくの成熟の制御など）という枠内での生物肥料としての、ＤＰが約３０未満、好ましくは２〜１５のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナンの上述の使用を対象として有する。
【００２６】
本発明は、更に詳細には、生物肥料としてのＤＰ８及び平均ＤＰ８のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナンの上述の使用を対象として有する。
【００２７】
本発明は、より詳細には、酵素キシログルカンエンドトランスグリコラーゼを増幅する活性に関連する使用という観点、特にある器官（胚軸、子葉、葉、花粉管、及び果実）の組織（維管束の部分又は柔組織）の膨張時の細胞壁の構成の制御という枠内での生物肥料、及び植物細胞壁を強化してそれらを環境刺激（風、熱又は水の衝撃、あるいは機械的圧迫など）に適応させる生物肥料として、ＤＰが約３０未満、好ましくは２〜１５のオリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナンの上述の使用を対象として有する。
【００２８】
本発明は、発育（果実の成熟、器官離脱、雌ずいの成長、又はやくの成熟など）の１段階以上が、時間に応じて制御できる植物を得ることを考慮し、上記定義のグリクロン酸オリゴ糖による植物の処理方法も対象として有する。
【００２９】
本発明は、組織の膨張時の細胞壁の構成が制御された植物、及び植物細胞壁が強化されてそれらを環境刺激（風、熱又は水の衝撃、あるいは機械的圧迫）に適応される植物を得ることを考慮し、上記定義のグリクロン酸オリゴ糖による植物の処理方法も対象として有する。
【００３０】
本発明は、
−上述の式（Ｉ）（式中、ｎは約３００〜約２５００の整数であり、ＲはＨ又はＣＯＣＨ3を表す）の１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマー、
−並びに／あるいは式（Ｉ）のポリマーから誘導される糖単位の数が約３０未満のβ（１−４）鎖グリクロン酸オリゴ糖、
−並びに／あるいは式（Ｉ）のポリマー又は上述のオリゴ糖誘導体に対応するエステル及び／又はエーテル、から選択される化合物を少なくとも１つ含むことを特徴とする植物衛生品及び／又は生物肥料にも関する。
【００３１】
本発明は、詳細には式（Ｉ）（式中、ｎは約３００〜約２５００の整数であり、ＲはＨを表す）の１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマーを少なくとも１つ含む植物衛生品を対象として有する。
【００３２】
本発明は、式（Ｉ）（式中、ｎは約３００〜約２５００の整数であり、ＲはＨ又はＣＯＣＨ3を表し、ＣＯＣＨ3の重量％は好ましくは０〜３０．５である）の１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマーを少なくとも１つ含む植物衛生品にも関する。
【００３３】
本発明は、ＤＰ（重合度）が３０未満、好ましくは２〜１５のβ（１−４）鎖グリクロン酸オリゴ糖（オリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナン、オリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナン、及びオリゴ１，４−β−Ｄ−グルロナンなど）を少なくとも１つ含む植物衛生品も対象として有する。
【００３４】
本発明は、より詳細には、以下の：
−ＤＰ８及び平均ＤＰ８のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナン、
−ＤＰ４のオリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナン、
―ＤＰ４のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルロナン、から選択されるグリクロン酸オリゴ糖誘導体を少なくとも１つ含む植物衛生品を対象として有する。
【００３５】
本発明は、より詳細には、ＤＰが約３０未満、好ましくは２〜１５のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナンを少なくとも１つ含む生物肥料、好ましくはＤＰ８及び平均ＤＰ８の１，４−β−Ｄ−グルクロナンを含む生物肥料に関する。
【００３６】
本発明は、更に詳細には、ＤＰが約３０未満、好ましくは２〜１５のオリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナンを少なくとも１つ含む生物肥料、好ましくはＤＰ４のオリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナンを含む生物肥料に関する。
【００３７】
本発明による１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマー及び誘導されたグリクロン酸オリゴ糖の調製、加えて酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ及び／又は酵素１，４−β−Ｄ−グルカナーゼを増幅する特性の実証についての以下の詳細な説明によって、本発明を更に説明する。
【００３８】
【実施例】
Ａ）ウロン酸ポリマー及び／又はそれらのオリゴ糖の調製
化学的突然変異及び／又は遺伝子操作により改変されている可能性がある（又はない）根圏（Rhyzobium, Sinorhyzobium Agrobacterium, Pseudonomas, Burkolderia etc.）から単離した細菌の菌株の発酵処理を用いて、１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマーを得た。
１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマーは、こうして種々の文献（Painter T. J., 1977, Preparation and periodate oxidation of C-6-oxycellulose: conformational interpretation of hamlacetal stability. Carbohy. Res. 55, 95-103; Chang P. S. and Robyt J. F., Oxidation of primary alchohol groups of naturally occurring polysaccharides with 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidine oxoammonium ion. J. Carbohydr. Chem., 15, 819-830; Isogai, A and Kato, Y., 1998, Preparation of polyuronic acid from cellulose by TEMPO-mediated oxidation, Cellulose, 5, 153-164）に記載される方法によるセルロースの選択的酸化から得ることができた。
必要に応じて、こうして得られたポリマーを、発酵時又は発酵後処理で化学的及び／又は酵素的手段により改変及び／又は分解した。
・１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマー
例示として、１９９２年３月３日のフランスの特許ＦＲ−Ｂ−２６８８２２２に記載のプロトコールに従って、Rhizobium melilotiの変異株の発酵により１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマーを得た。
・平均ＤＰ８の１，４−β−Ｄ−グルクロナンオリゴマー
これまでの自然なポリマー（即ち、Ｃ２及びＣ３にアセチル化されたグルクロン酸ユニットを少なくとも５０％含む）を、酵素的加水分解に供与した。酵素は、種々の供給源の（特にアワビの膵臓から抽出した、又は真菌源の）グルクロン酸分解酵素（Dantas L. et al., Carbohydr. Res., 265 (1994) 303-310）、又は細菌（Rhizobiaceaeの菌株など）の培地に存在するグルクロン酸分解酵素（Mivhaud P., et al., Int. J. Hiol. Macromol. 21 (1997) 3-9）であった。こうして得られたオリゴ糖の混合物を、基本的処理（ＮａＯＨ）で脱アシル化し、その後ＢｉｏＧｅｌ  Ｐ６カラムを用いたゲル透過クロマトグラフィーにより、重合度（ＤＰ）に基づいて分別した（Dantas L. et al., 上述）。
・ＤＰ４の１，４−β−Ｄ−マンヌロナン及び１，４−β−Ｄ−グルロナンオリゴマー
開始ポリマーは、マンヌロン酸（Ｍ）及びグルロン酸（Ｇ）の直鎖状共重合体のアルギン酸塩（ここでのＭ／Ｇ比及び配列様式は供給源に依存した）であった。そのアルギン酸塩は、調製されるオリゴマーの種類に基づいて選択した。加水分解は、酵素的方法（オリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナンではアワビ源のアルギン酸分解酵素（Heyraud A. et al., Carbohydr. Res., 291 (1996) 115-126）、オリゴ１，４−β−Ｄ−グルロナンでは細菌源のアルギン酸分解酵素（１９９７年３月１１日の特許ＦＲ９７０３２１８））で実施した。ゲル透過クロマトグラフィーでＤＰにより分離された異なるオリゴ糖は、その後上述のHeyraund et al.,による文献に記載の方法に従って、高速液体クロマトグラフィーでのイオンクロマトグラフィーにより、それらの構造に応じて精製した。
【００３９】
Ｂ）Rubusの原形質体で誘導された１，３−β−Ｄ−グルカナーゼの反応
実験条件：（１）Rubus fruticosus Lの細胞懸濁液からの原形質膜の調製；（２）「惹起物質」（１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマー及び１，４−β−Ｄ−ガラクツロナン（４００μg／Ｌ）ポリマー、平均ＤＰ８の１，４−β−Ｄ−グルクロナンオリゴマー、平均ＤＰ４の１，４−β−Ｄ−マンヌロナンオリゴマー、並びにＤＰ４の１，４−β−Ｄ−グルクロナンオリゴマー（５０nM））の存在下での２・１０6原形質体サンプルｎ個のインキュベーション（又はそれを行わない）；（３）２０分後に、処理の有無に関わらず原形質体を酵素抽出に供与した。酵素試験毎、及びインキュベーション期間毎に、蛋白質２μgを用いた。原形質体の生存性は、６時間の実験期間では９５％を維持した；用いたエバンスブルー生死判別試験は、原形質膜の完全性を証明した。
方法：活性（１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ）の測定は、加水分解時に放出される基質分解単位（substrate-reducing units）（ラミナリンからの分解６量体）の比色定量（colorimetric dosage）（フェリシアンテスト）に基づいた。発生した動力学（kinetics）を基にして曲線を描き、それの等式により酵素反応の速度を計算することができた。試料毎及び実験の「組」毎に、少なくとも２つの動力学が生じた。一般に、２つの独立した「組」の試料から８つの運動学（kinematics）が生じる。
結果：原形質体で惹起された酵素活性を、対照の活性への％として表した。結果を表１に要約する。
【００４０】
【表１】
0004739622.tif 000003
表１：「惹起物質」（（ａ）１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマー（４００μg／Ｌ）、（ｂ）平均ＤＰ８のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナン（５０nM）、（ｃ）１，４−β−Ｄ−ガラクツロナン（４００μg／Ｌ）、（ｄ）平均ＤＰ４のオリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナン（５０nM）、（ｅ）ＤＰ４のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナン（５０nM））により誘導された反応（１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ）の比較分析
【００４１】
酵素抽出を行わせる蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動分析を実行した。タバコモザイクが混入するタバコから単離された１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ（Ori et al. (1990) EMBO J., 9(11), 3429-36）を認識する血清でプリント（prints）上の蛋白質を標識することにより、ＰＲ蛋白質の存在を確認した。
ナノモル濃度で用いた平均ＤＰ８の１，４−β−Ｄ−グルクロナンオリゴマー及びポリグルクロナンは、植物の原形質体の１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ活性を２０分以内にそれぞれ１．５倍及び１．３倍に増幅させた。テストしたその他の製品のうち、ＤＰ４のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルロナンが最も効果的であった。
【００４２】
ｃ）Rubusの原形質体で誘導された１，４−β−Ｄ−グルカナーゼの反応
実験的惹起条件：上に報告したものと同等である。
方法：活性（１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ）の測定は、加水分解時に放出される基質分解単位（分解されたセロペンタオース）の上記の比色定量（フェリシアンテスト）に基づいた。
結果：結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】
0004739622.tif 000004
表２：「惹起物質」（（ａ）１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマー（４００μg／Ｌ）、（ｂ）平均ＤＰ８のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナン（５０nM）、（ｃ）１，４−β−Ｄ−ガラクツロナン（４００μg／Ｌ）、（ｄ）ＤＰ４のオリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナン（５０nM）、（ｅ）ＤＰ４のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナン（５０nM））により誘導された反応（１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ）の比較分析
【００４４】
ナノモル濃度で用いた平均ＤＰ８の１，４−β−Ｄ−グルクロナンオリゴマーは、植物の原形質体の１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ活性を２０分以内に１．２倍に増幅させた。
【００４５】
Ｄ）Rubusの原形質体で誘導されたキシログルカンエンドトランスグリコラーゼの反応
実験的惹起条件：トリス塩酸緩衝液（pH４．８）１ml中の２・１０6個の原形質体を、惹起物質（５０nM）又はホルモン（５０nM）（ＤＰ４のマンヌロナンオリゴマー、又はＤＰ８のグルクロナンオリゴマー、又はジベレリンＧＡ3）の存在下（又は非存在下）でインキュベートした。相互作用の２０、４０、６０、１００、及び１２０分後に、遠心分離により原形質体を回収し、その後酵素抽出に供与した。
方法：ＸＥＴ活性の測定は、マイクロタイトレーション用プレートのウェルにおいて４段階で実施した。段階１：受容体（即ち、ネオグリコプロテインＸＸＬＧ＝ＢＳＡ）の固定化。段階２：反応媒体（トリス塩酸緩衝液（pH７、２５mM）中のＤＩＧを標識したＸＥＴ酵素抽出用基質（蛋白質１μgと当量）、即ちＸＧ＝ＤＩＧ）の導入。段階３：ペルオキシダーゼ配列標識抗ＤＩＧ、ペルオキシダーゼ標識抗ペルオキシダーゼによる免疫標識。段階４：クエン酸−リン酸緩衝液（５０nM、pH５．５）でのペルオキシダーゼ活性の定量。
ペルオキシダーゼ活性は、４９２nmで測定した。実験条件毎に、少なくとも３つのペルオキシダーゼ活性曲線を描き、３つの原形質体懸濁液を用いて実験を実施した。ＸＥＴ活性は、９つのペルオキシダーゼ反応速度曲線からの線形回帰により推定された曲線の傾き（ΔＡ４９２）により測定した。
略語：
ＤＩＧ：ジゴキシゲニン
ＸＥＴ：キシログルカンエンドトランスグリコラーゼ、ＸＧ：キシログルカンポリマー、ＸＸＬＧ：非フコシル化キシログルカンオリゴマー
結果：結果を図１に示す。
ＤＰ４（ＭＡＮ）のマンヌロナンオリゴマーは、強力なＸＥＴ反応を誘導した（２０分以内に２．１２倍に増幅）；ＤＰ８のグルクロナンオリゴマー（ＧＬＵＣ）及びホルモン（ＧＡ３）は、効果が低かった（２０分以内にそれぞれ１．６２倍及び１．１２倍に増幅）。参照のＸＥＴ活性は、非惹起の原形質体（ＣＯＮＴＲＯＬ）のものであった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＸＥＴ活性をＹ軸に示し、時間をＸ軸に示している；「△」を用いた曲線は、ＤＰ４のマンヌロナンオリゴマー（ＭＡＮ）で得られた結果に対応し、「×」を用いた曲線は、ＤＰ８のグルクロナンオリゴマー（ＧＬＵＣ）で得られた結果に対応し、「○」を用いた曲線は、ホルモン（ＧＡ３）で得られた結果に対応し、「□」を用いた曲線は、対照で得られた結果に対応する。
【図１】
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