(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベースライン部分及び成長部分を具備するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）成長曲線の、アニーリング温度の変化を示すデータセットを修正するための、プロセッサを含んで成るコンピュータ又はＰＣＲ装置により実行する方法において、
前記プロセッサがＰＣＲ成長曲線のデータセットを受領する段階であって、前記データセットは、それぞれのデータポイントが座標値のペア（ｘ，ｙ）を具備するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスの複数のデータポイントを含んでおり、この場合に、ｘは、サイクル数を表し、ｙは、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積を表している、段階と、
前記プロセッサが前記曲線の第１部分に対する線形近似を算出する段階であって、前記第１部分は、前記ＰＣＲプロセスにおいてアニーリング温度の変化の起こるサイクル数（ＣＡＣ）以下のサイクル数を含む前記データセット内のデータポイントを含んでいる、段階と、
前記プロセッサが、前記曲線の前記第１部分の前記線形近似を使用し、第１のｘ値における第１のｙ値を推定する段階と、
前記プロセッサが、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスを前記データセットの第２部分とダブルシグモイド関数に適用して前記関数のパラメータを判定することにより、前記曲線の第２部分に対する近似を算出する段階であって、前記データセットの前記第２部分は、前記ＣＡＣを上回るサイクル数を具備するデータポイントを含んでいる、段階と、
前記プロセッサが、前記曲線の前記第２部分について算出された前記近似を使用し、前記第１のｘ値における第２のｙ値を推定する段階と、
前記プロセッサが前記第１及び第２のｙ値の間の差を判定する段階と、
前記プロセッサが、前記差を前記曲線の前記第１部分に対応する前記データポイントのそれぞれのｙ値から減算することにより、修正されたデータセットを生成する段階と、
を有する方法。
【請求項２】
前記第１のｘ値は、ｘ＝ＣＡＣ＋１である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１のｘ値は、ｘ＝ＣＡＣである請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記プロセッサが、前記修正済みのデータセットに対してＬＭ回帰プロセスを適用することにより、前記データ曲線の前記第１部分に対応する１つ又は複数のデータポイントが異常値スパイクであるかどうかを判定する段階と、
前記プロセッサが、前記修正済みのデータセットから前記識別されたスパイクのデータ値を除去又は置換する段階と、
を更に含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記線形近似を算出する段階は、前記プロセッサがロバスト線形回帰を前記曲線の前記第１部分に適用する段階を含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記ダブルシグモイド関数は、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１＋ｅｘｐ-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ-f(x-g)））という形態を有しており、算出する段階は、前記プロセッサが前記関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に判定する段階を含んでいる請求項１記載の方法。
【請求項７】
プロセッサを制御し、ベースライン部分及び成長部分を具備するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）成長曲線の、アニーリング温度の変化を示すデータセットを修正を補正するためのコードを含むコンピュータ可読媒体であって、
前記コードは、
前記プロセッサがＰＣＲ成長曲線のデータセットを受領する段階であって、前記データセットは、それぞれのデータポイントが座標値のペア（ｘ，ｙ）を具備するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスの複数のデータポイントを含んでおり、この場合に、ｘは、前記サイクル数を表し、ｙは、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積を表している、段階と、
前記プロセッサが前記曲線の第１部分に対する線形近似を算出する段階であって、前記第１部分は、前記ＰＣＲプロセスにおいてアニーリング温度の変化の起こるサイクル数（ＣＡＣ）以下のサイクル数を含む前記データセット内のデータポイントを含んでいる、段階と、
前記プロセッサが、前記曲線の前記第１部分の前記線形近似を使用し、第１のｘ値における第１のｙ値を推定する段階と、
前記プロセッサが、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスを前記データセットの第２部分とダブルシグモイド関数に適用して前記関数のパラメータを判定することにより、前記曲線の第２部分に対する近似を算出する段階であって、前記データセットの前記第２部分は、前記ＣＡＣを上回るサイクル数を具備するデータポイントを含んでいる、段階と、
前記プロセッサが、前記曲線の前記第２部分について算出された前記近似を使用し、前記第１のｘ値における第２のｙ値を推定する段階と、
前記プロセッサが前記第１及び第２のｙ値の間の差を判定する段階と、
前記プロセッサが、前記差を前記曲線の前記第１部分に対応する前記データポイントのそれぞれのｙ値から減算することにより、修正済みのデータセットを生成する段階と、
を実行するための命令を含む、コンピュータ可読媒体。
【請求項８】
前記コードは、
前記プロセッサが、前記修正済みのデータセットに対してＬＭ回帰プロセスを適用することにより、前記データ曲線の前記第１部分に対応する１つ又は複数のデータポイントが異常値スパイクであるかどうかを判定する段階と、
前記プロセッサが、前記修正済みのデータセットから前記識別されたスパイクのデータ値を除去又は置換する段階と、
を更に含む請求項７記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムにおいて、
ベースライン部分及び成長部分を具備するＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットを生成するＰＣＲ分析モジュールであって、前記データセットは、それぞれのデータポイントが座標値のペア（ｘ，ｙ）を具備する複数のデータポイントを含んでおり、この場合に、ｘは、サイクル数を表し、ｙは、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積を表している、ＰＣＲ分析モジュールと；
前記曲線の第１部分に対する線形近似を算出する段階であって、前記第１部分は、前記ＰＣＲプロセスにおいてアニーリング温度の変化の起こるサイクル数（ＣＡＣ）以下のサイクル数を含む前記データセット内のデータポイントを含んでいる、段階と、
前記曲線の前記第１部分の前記線形近似を使用し、第１のｘ値における第１のｙ値を推定する段階と、
Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスを前記データセットの第２部分とダブルシグモイド関数に適用して前記関数のパラメータを判定することにより、前記曲線の第２部分に対する近似を算出する段階であって、前記データセットの前記第２部分は、前記ＣＡＣを上回るサイクル数を具備するデータポイントを含んでいる、段階と、
前記曲線の前記第２部分について算出された前記近似を使用し、前記第１のｘ値における第２のｙ値を推定する段階と、
前記第１及び第２のｙ値の間の差を判定する段階と、
前記差を前記曲線の前記第１部分に対応する前記データポイントのそれぞれのｙ値から減算することにより、修正済みのデータセットを生成する段階と、
により、前記ＰＣＲデータセットを処理し、アニーリング温度の変化を示すデータセットを修正するべく適合されたインテリジェンスモジュールと；
を有するＰＣＲシステム。
【請求項１０】
前記インテリジェントモジュールは、
前記修正済みのデータセットに対してＬＭ回帰プロセスを適用することにより、前記データ曲線の前記第１部分に対応する１つ又は複数のデータポイントが異常値スパイクであるかどうかを判定し、且つ、
前記修正済みのデータセットから前記識別されたスパイクのデータ値を除去又は置換するべく、
適合されている請求項９記載のＰＣＲシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、シグモイド又は成長曲線を表すデータを処理するシステム及び方法に関するものであり、更に詳しくは、温度シフトを補正し、ＰＣＲ増幅曲線の特徴的なサイクル閾値（Ｃｙｃｌｅ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：Ｃｔ）又はエルボー値を判定するシステム及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）は、規定の核酸シーケンスを酵素によって合成又は増幅するin vitro方法である。この反応においては、通常、対立するストランドにハイブリダイズし、増幅対象の鋳型又は標的ＤＮＡ配列をはさむ２本のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。プライマーの伸長は熱安定性を有するＤＮＡポリメラーゼによって触媒する。鋳型の変性、プライマーのアニーリング、及びアニーリングされたプライマーのポリメラーゼによる伸長を伴う反復的な一連のサイクルの結果として、特定のＤＮＡフラグメントが指数的に蓄積される。通常、このプロセスにおいては、増幅プロセスの検出及び定量化を円滑に実行するべく、蛍光プローブ又はマーカーが使用されている。
【０００３】
図１には、代表的なリアルタイムのＰＣＲ曲線が示されており、代表的なＰＣＲプロセスにおける蛍光強度値がサイクル数に対してプロットされている。このケースにおいては、ＰＣＲプロセスのそれぞれのサイクルにおいて、ＰＣＲ産物の形成を監視している。増幅は、通常、増幅反応の際に蛍光信号を計測するコンポーネント及び装置を含むサーモサイクラー内において計測される。このようなサーモサイクラーの一例が、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒである（Ｃａｔ．  Ｎｏ．２０１１０４６８）。例えば、増幅産物は、標的核酸に結合された際にのみ蛍光信号を放出する蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブによるか、或いは、特定のケースにおいては、二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光染料により、検出される。
【０００４】
代表的なＰＣＲ曲線において、ベースライン領域の終点における遷移点（これは、一般に、エルボー値又はサイクル閾値（Ｃｔ）と呼ばれている）を識別することは、ＰＣＲ増幅プロセスの特性を理解するのに非常に有用である。Ｃｔ値は、ＰＣＲプロセスの効率の尺度として使用可能である。例えば、通常、分析対象であるすべての反応について定義済みの信号閾値を決定し、この閾値に到達するのに必要なサイクル数（Ｃｔ）を標的核酸及び標準又はハウスキーピング遺伝子などの基準核酸について判定する。標的核酸及び基準核酸について得られたＣｔ値に基づいて、標的分子の絶対的又は相対的な複写数を判定可能である（Ｇｉｂｓｏｎ他による「Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（６巻、９９５〜１００１頁）、Ｂｉｅｃｈｅ他による「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（５９巻、２７５９〜２７６５頁、１９９９年）、ＷＯ  ９７／４６７０７、ＷＯ  ９７／４６７１２、ＷＯ  ９７／４６７１４）。図１のベースライン領域（１５）の終点における領域２０内のエルボー値は、サイクル数３０の領域内に位置することになろう。
【０００５】
ＨＩＶ分析などのいくつかのＰＣＲ分析においては、通常、ＰＣＲ反応の際に、アニーリング温度の変化が存在している。この温度変化の結果、その温度変化の起こるサイクル数において蛍光信号のシフトが発生する。従って、正しいＣｔ値を算出するには、この信号の変化を補正することが必要である。温度変化が発生するサイクルは判明しており、ベースラインが完全にフラットであって、スパイクを有していない場合には、この温度シフトの補正は、容易なものとなろう。しかしながら、ベースラインは、多くの場合に、傾斜しており、且つ、任意の位置に信号スパイク（異常値）を含んでいる可能性がある。温度変化の位置においてスパイクが発生している場合には、ベースライン曲線の補正は、更に困難なものとなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、前述の及びその他の問題点を克服するシグモイドタイプ又は成長曲線などの曲線（特に、ＰＣＲ曲線）のエルボー値を判定するシステム及び方法を提供することが望ましい。特に、これらのシステム及び方法は、異常値などのアーチファクトに対して信頼性が高く且つ安定した方式によって温度ステップの補正を実装する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＰＣＲプロセスにおいて発生し得る温度シフトについてＰＣＲデータを補正することにより、ＰＣＲ増幅曲線のＣｔ判定を改善するシステム及び方法を提供する。
【０００８】
一態様によれば、ダブルシグモイド関数をＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスによって判定されたパラメータと共に使用することにより、温度シフト（これは、「ＣＡＣ」と呼ばれ、温度シフトの起こるサイクルである）の後の領域内の曲線の部分に対する近似を検出する。温度シフトの前の領域内の曲線の部分についてロバスト線形近似を判定する。線形近似とＬＭプロセスの両方を使用することにより、サイクルＣＡＣ又はＣＡＣ＋１における蛍光強度の値を判定し、これらの差を発生した温度変化の前の曲線の部分を表しているデータセットの部分から減算することにより、シフトについて補正されたデータセットを生成する。次いで、このシフトについて補正済みのデータセットを返却し、これを表示するか又は更なる処理のために使用可能である。
【０００９】
本発明の第１の態様においては、ベースライン部分及び成長部分を具備するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）成長曲線のデータセット内における温度ステップの変化を補正するためのコンピュータにより実行する方法が提供され、この方法は、ＰＣＲ成長曲線のデータセットを受領する段階であって、このデータセットは、それぞれのデータポイントが座標値のペア（ｘ，ｙ）を具備する動的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の複数のデータポイントを含んでおり、この場合に、ｘは、サイクル数を表し、ｙは、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積を表している、段階と；曲線の第１部分に対する線形近似を算出する段階であって、この第１部分は、ＰＣＲプロセス内においてアニーリング温度の変化の起こるサイクル数（ＣＡＣ）以下のサイクル数を含むデータセット内のデータポイントを含んでいる、段階と；曲線の第１部分の線形近似を使用し、第１のｘ値における第１のｙ値を推定する段階と；Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをデータセットの第２部分とダブルシグモイド関数に適用して関数のパラメータを判定することにより、曲線の第２部分に対する近似を算出する段階であって、このデータセットの第２部分は、ＣＡＣを上回るサイクル数を具備するデータポイントを含んでいる、段階と；曲線の第２部分について算出された近似を使用し、第１のｘ値における第２のｙ値を推定する段階と；第１及び第２のｙ値の間の差を判定する段階と；この差を曲線の第１部分に対応するデータポイントのそれぞれのｙ値から減算することにより、修正されたデータセットを生成する段階と；を有している。
【００１０】
本発明の第２の態様においては、プロセッサを制御し、ベースライン部分及び成長部分を具備するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）成長曲線のデータセット内の温度ステップの変化を補正するためのコードを含むコンピュータ可読媒体が提供され、このコードは、ＰＣＲ成長曲線のデータセットを受領する段階であって、このデータセットは、それぞれのデータポイントが座標値のペア（ｘ，ｙ）を具備する動的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスの複数のデータポイントを含んでおり、この場合に、ｘは、サイクル数を表し、ｙは、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積を表している、段階と；曲線の第１部分に対する線形近似を算出する段階であって、この第１部分は、ＰＣＲプロセス内においてアニーリング温度の変化の起こるサイクル数（ＣＡＣ）以下のサイクル数を含むデータセット内のデータポイントを含んでいる、段階と；曲線の第１部分の線形近似を使用して第１のｘ値における第１のｙ値を推定する段階と；Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをデータセットの第２部分とダブルシグモイド関数に適用して関数のパラメータを判定することにより、曲線の第２部分に対する近似を算出する段階であって、このデータセットの第２部分は、ＣＡＣを上回るサイクル数を具備するデータポイントを含んでいる、段階と；曲線の第２部分について算出された近似を使用し、第１のｘ値における第２のｙ値を推定する段階と；第１及び第２のｙ値の間の差を判定する段階と；この差を曲線の第１部分に対応するデータポイントのそれぞれのｙ値から減算することにより、修正されたデータセットを生成する段階と；を実行するための命令を含んでいる。
【００１１】
本発明の更に別の態様においては、動的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムが提供され、このシステムは、ベースライン部分及び成長部分を具備する動的なＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットを生成する動的なＰＣＲ分析モジュールであって、このデータセットは、それぞれのデータポイントが座標値のペア（ｘ，ｙ）を具備する複数のデータポイントを含んでおり、この場合に、ｘは、サイクル数を表し、ｙは、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積を表している、動的ＰＣＲ分析モジュールと；曲線の第１部分に対する線形近似を算出する段階であって、この第１部分は、ＰＣＲプロセスにおいてアニーリング温度の変化の起こるサイクル数（ＣＡＣ）以下のサイクル数を含むデータセット内のデータポイントを含んでいる、段階と、曲線の第１部分の線形近似を使用し、第１のｘ値における第１のｙ値を推定する段階と、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをデータセットの第２部分及びダブルシグモイド関数に適用して関数のパラメータを判定することにより、曲線の第２部分に対する近似を算出する段階であって、このデータセットの第２部分は、ＣＡＣを上回るサイクル数を具備するデータポイントを含んでいる、段階と、曲線の第２部分について算出された近似を使用し、第１のｘ値における第２のｙ値を推定する段階と、第１及び第２のｙ値の間の差を判定する段階と、この差を曲線の第１部分に対応するデータポイントのそれぞれのｙ値から減算することにより、修正されたデータセットを生成する段階と、により、ＰＣＲデータセットを処理し、データセット内の温度ステップの変化を補正するべく適合されたインテリジェンスモジュールと；を有している。
【００１２】
図面及び請求項を含む本明細書の残りの部分を参照することにより、本発明のその他の特徴及び利点について理解することができよう。以下、添付の図面との関連において、本発明の更なる特徴及び利点、並びに、本発明の様々な実施例の構造及び動作について詳細に説明する。尚、これらの添付図面においては、類似の参照符号により、同一又は機能的に類似した要素を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、ＰＣＲプロセスにおいて発生し得る温度シフトについてＰＣＲ増幅曲線を補正するためのシステム及び方法を提供する。温度シフトの一例が、この分析法の特定のサイクルにおけるアニーリング温度の制御された変化である。通常、この温度シフトは、ベースライン領域によって表されているプロセスの一部において発生する。この温度変化の結果、そのシフトの起こるサイクル数において、蛍光信号のシフトが発生する。本明細書においては、温度変化の起こるサイクルをＣＡＣ（Ｃｙｃｌｅ  ｏｆ  Ａｎｎｅａｌｉｎｇ  Ｃｈａｎｇｅ）と呼ぶこととする。特定の態様においては、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ回帰プロセスによって判定されたパラメータを有するダブルシグモイド関数を使用することにより、温度シフトの後の領域内の曲線の部分に対する近似を検出する。温度シフトの前の領域内の曲線の部分についてロバスト線形近似を判定する。線形近似及びＬＭプロセスの両方を使用してサイクルＣＡＣ＋１における蛍光強度の値を判定し、次いで、これらの値の差を発生した温度シフトの前の曲線の部分を表しているデータセットの部分から減算することにより、シフトについて補正されたデータセットを生成する。次いで、このシフトについて補正済みのデータセットが返され、これを表示するか又は更なる処理のために使用可能である。例えば、シフトについて補正済みのデータセットを使用することにより、ＰＣＲ分析のＣｔ値を判定可能である。又、補正済みのデータセットを処理することにより、ロバスト線形近似を判定するべく処理されたデータセットの部分内に存在し得るスパイクを除去することも可能である。
【００１４】
図１には、ＰＣＲプロセスの環境における増幅曲線１０の一例が示されている。図示のように、曲線１０は、ラグフェーズ領域１５と、指数フェーズ領域２５と、を含んでいる。ラグフェーズ領域１５は、一般に、ベースライン又はベースライン領域と呼ばれている。このような曲線１０は、ラグフェーズ領域と指数フェーズ領域をリンクしている関心の対象である遷移領域２０を含んでいる。領域２０は、一般に、エルボー又はエルボー領域と呼ばれている。エルボー領域は、通常、ベースラインの終点と、基礎となっているプロセスの成長又は増幅レートにおける遷移と、を定義している。領域２０内の特定の遷移ポイントを識別することは、基礎となっているプロセスの振る舞いを分析するのに有用であろう。代表的なＰＣＲ曲線において、エルボー値又はサイクル閾値（Ｃｔ）と呼ばれる遷移ポイントを識別することは、そのＰＣＲプロセスの効率特性を理解するのに非常に有用である。
【００１５】
同様のシグモイド又は成長曲線を提供可能なその他のプロセスは、バクテリアプロセス、酵素プロセス、及び結合プロセスを含んでいる。例えば、バクテリア増殖曲線においては、関心の対象である遷移ポイントは、ラグフェーズにおける時点θと呼ばれている。本発明に従って分析可能なデータ曲線を生成するその他の具体的なプロセスは、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）プロセス、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）プロセス、及びＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）プロセスを含んでいる。ＳＤＡ及びＮＡＳＢＡプロセスの例及びデータ曲線については、それぞれ、Ｗａｎｇ，Ｓｈａ−Ｓｈａ他による「Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＢＤ  ＰｒｏｂｅＴｅｃ  ＥＴ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、２００３年、４９（１０）、１５９９頁）と、Ｗｅｕｓｔｅｎ、Ｊｏｓ  Ｊ．Ａ．Ｍ．他による「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｌｏａｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ」（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２年、３０（６）、２６）を参照されたい。従って、本明細書の残りの部分においては、ＰＣＲ曲線に対するその適用可能性の観点から本発明の実施例及び態様について説明することとするが、本発明は、その他のプロセスに関係したデータ曲線にも適用可能であることを理解されたい。
【００１６】
図１に示されているように、代表的なＰＣＲ成長曲線のデータは、例えば、ｘ軸を規定するＰＣＲサイクル数と、ｙ軸を規定する蓄積されたポリヌクレオチドの成長のインジケータと、によるものなどの２次元座標系において表現可能である。蛍光マーカーの使用が、恐らくは、最も広範に使用されている標識の方式であることから、通常は、図１に示されているように、蓄積された成長のインジケータは、蛍光の強度値である。但し、使用する特定の標識及び／又は検出の方式に応じて、その他のインジケータを使用することも可能であることを理解されたい。発生量又は蓄積された信号成長のその他の有用なインジケータの例には、ルミネッセンス強度、化学ルミネッセンス強度、生物ルミネッセンス強度、燐光強度、電荷転送、電圧、電流、電力、エネルギー、温度、粘度、光散乱、放射性強度、反射率、透過率、及び吸収率が含まれている。サイクルの定義も、時間、プロセスサイクル、単位動作サイクル、及び再生サイクルを包含可能である。
【００１７】
図２Ａ及び図２Ｂは、サイクル１４におけるスパイクと共にサイクル１５における温度シフトを有するＰＣＲ曲線の一例を示しており、図２Ｂは、拡大図である。例えば、ＬＭ回帰プロセスなどの回帰プロセスを使用してＰＣＲデータセット全体を処理した場合には、データに対するダブルシグモイドの全体的なフィットは、図２Ｃ及び図２Ｄ（拡大図）に示されているような外観を有することになる。この図２Ｃ及び図２Ｄは、ダブルシグモイドが、データポイント全体に対してフィットしてはいるが、当然のことながら、アニーリング温度の変化が発生しているサイクルであるＣＡＣにおける不連続性を十分に処理することはできないことを示している。この例においては、ＣＡＣは、サイクル１５である。この代わりに、サイクル１６〜最終サイクルにおけるデータポイントをＬＭ回帰において使用した場合に結果的に得られる曲線フィットが、それぞれ、図２Ｅ及び図２Ｆに示されており、図２Ｆは、拡大図である。図２Ｆの曲線フィットは、データセット全体を使用した図２Ｄと比べて、ＣＡＣ＋１〜最終サイクルにおけるデータセットにおいて、格段に良好なものになっている。
【００１８】
全体的なプロセスの概要
本発明によれば、温度シフトを補正し、動的なＰＣＲ増幅曲線のエルボー値又はＣｔ値などのシングルシグモイド曲線の遷移値を判定するためのプロセスの一実施例１００について、図３を参照することにより、簡潔に説明可能である。段階１１０において、曲線を表す実験データセットを受領又は取得する。又、温度シフトの起こるサイクルについても識別する。通常、このサイクル値については、先験的に判明しており、例えば、データを供給する装置又は機器によって記録されている。図１には、プロットされたＰＣＲデータセットの一例が示されており、この場合に、ｙ軸及びｘ軸は、それぞれ、ＰＣＲ曲線における蛍光強度とサイクル数を表している。特定の態様においては、データセットは、連続しており、且つ、軸に沿って均等に離隔したデータを包含する必要がある。
【００１９】
本発明の典型的な実施例においては、本方法は、キーボード、マウス、及びこれらに類似したものなどのデータセットを入力するための入力装置；モニターなどの曲線の領域内の関心の対象である特定のポイントを表すための表示装置；ＣＰＵなどの本方法のそれぞれの段階を実行するのに必要な処理装置；モデムなどのネットワークインターフェイス；データセットを保存するためのデータストレージ装置；プロセッサ上において稼動するコンピュータコード；及びこれらに類似したものを含む（但し、これらに限定されない）従来のパーソナルコンピュータシステムを使用することによって実行可能である。又、本方法は、ＰＣＲ装置内で実行することも可能である。
【００２０】
図１５には、本発明によるシステムが示されている。この図は、ソフトウェア及びハードウェアリソース間における関係を示す概略的なブロックダイアグラムを示している。本システムは、サーモサイクラー内に配置可能な動的ＰＣＲ分析モジュールと、コンピュータシステムの一部であるインテリジェンスモジュールと、を有している。データセット（ＰＣＲデータセット）は、ネットワーク接続又は直接接続を介して分析モジュールからインテリジェンスモジュールに（又は、この逆方向に）転送される。データセットは、プロセッサ上において稼動していると共にインテリジェンスモジュールのストレージ装置内に保存されているコンピュータコードにより、図３に示されている方法に従って処理された後に、分析モジュールのストレージ装置に返送され、変更されたデータを表示装置上に表示可能である。特定の実施例においては、ＰＣＲデータ取得装置内にインテリジェントモジュールを実装することも可能である。
【００２１】
プロセス１００が、サーモサイクラーなどのＰＣＲデータ取得装置内に位置するインテリジェンスモジュール内で（例えば、プロセッサ実行命令として）実行されるケースにおいては、データの収集に伴って、データセットをリアルタイムでインテリジェンスモジュールに供給可能であり、或いは、メモリユニット又はバッファ内に保存し、実験が完了した後に、インテリジェンスモジュールに供給することも可能である。同様に、データセットは、取得装置に対するネットワーク接続（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、イントラネット、インターネットなど）又は直接接続（例えば、ＵＳＢやその他の直接的な有線又は無線接続）を介してデスクトップコンピュータシステムやその他のコンピュータシステムなどの別個のシステムに供給することも可能であり、或いは、ＣＤ、ＤＶＤ、フロッピー（登録商標）ディスク、又はこれらに類似したものなどの携帯型の媒体上において供給することも可能である。特定の態様においては、データセットは、座標値のペアを具備するデータポイント（又は、２次元ベクトル）を含んでいる。ＰＣＲデータの場合には、座標値のペアは、通常、サイクル数と蛍光強度値を表している。段階１１０においてデータセットの受領又は取得が完了した後に、データセットを分析することにより、例えば、分析における温度シフトについて補正し、ベースライン領域の終点を判定可能である。
【００２２】
段階１１５において、サイクル１〜サイクルＣＡＣにおけるデータポイントに基づいて、線形のロバスト近似を演算する。図４Ａは、温度シフトを有するＰＣＲデータセットのサイクル１〜サイクルＣＡＣにおけるデータセットの部分の線形近似の一例を示している。このロバスト線形近似を使用することにより、例えば、外挿により、ＣＡＣ＋１における蛍光レベルを推定する。段階１２０において、ＣＡＣ値の後の曲線の部分（例えば、曲線の増幅部分）の近似を算出する。この段階において、一実施例においては、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセス又はその他の回帰プロセスによって判定されたパラメータを有するダブルシグモイド関数を使用することにより、データセット内のサイクルＣＡＣ＋１〜最終サイクルにおけるデータセットの部分を表す曲線の近似を検出している。この近似は、異常値又はスパイクポイントが曲線フィットの品質に対して最小限の影響を具備しているため、「ロバスト」と呼ばれている。図４Ｂは、図４ＡのＰＣＲデータセットのＣＡＣ＋１サイクル〜最終サイクルにおけるデータセットの部分の近似の一例を示しており、この場合には、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ回帰プロセスを使用してダブルシグモイド関数のパラメータを判定することにより、近似を判定している。このダブルシグモイドの推定段階により、サイクルＣＡＣ＋１における蛍光レベルの推定値を返している。又、これにより、サイクルＣＡＣ＋１と最終サイクル間における曲線上に存在しているスパイクについてもデータを補正する。
【００２３】
段階１２５において、ロバスト線形回帰とロバストダブルシグモイド推定によって演算されたサイクルＣＡＣ＋１における蛍光レベルの差を算出することにより、温度シフトを判定する。そして、段階１２８の温度シフトの補正において、この値をサイクル１〜サイクルＣＡＣにおけるデータポイントから減算する。図４Ｃは、図４Ａ及び図４Ｂに示されているデータセットの温度シフトについて補正されたデータの一例を示している。
【００２４】
任意選択の段階１３０においては、シフトについて補正済みのデータを使用し、スパイク除去プロセス（例えば、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔスパイク除去プロセス）を実行することにより、残存している１つ又は複数のスパイク（特に、ステップ補正済みの曲線のベースライン領域内の１つ又は複数のスパイク）を検出及び補正している。後程詳述するように、図６は、ＰＣＲ又はその他の成長曲線を表すデータセット内のスパイクポイントを識別及び置換するためのプロセスフローを示している。
【００２５】
段階１３５において、シフト補正済みの修正されたデータセットが、例えば、図４Ｃに示されているように、表示又はその他の処理のために返される。次いで、段階１４０において、この正規化された曲線を処理することにより、Ｃｔ値を判定し、この結果（シフト補正済みのデータ及び／又はＣｔ値）を、例えば、分析を実行したシステム又は分析を要求した別個のシステムに対して返す。図３の分析を実行したシステムに結合されているモニター画面又はプリンタなどの表示装置によってグラフィカルな表示をレンダリングすることも可能であり、或いは、表示装置上においてレンダリングする別個のシステムに対してデータを供給することも可能である。Ｃｔ値は、シフト補正済みのデータセットを使用することにより、様々な方法によって判定可能である。例えば、一態様においては、米国特許出願第１１／３１６３１５号及び第１１／３４９５５０号を使用することにより、Ｃｔ値を判定可能である。
【００２６】
ロバスト線形回帰
温度の変化は、ＰＣＲ曲線のベースライン領域内において発生する。通常、ＰＣＲ曲線のベースライン領域は、ｆ（ｓ）＝ｓｌｏｐｅ・ｘ＋ｉｎｔｅｒｃｅｐｔという形態の線形関数によって近似可能であり、ここで、ｘは、サイクル数を表している。線形近似の変数ｓｌｏｐｅ及びｉｎｔｅｒｃｅｐｔの最良の値を検出するべく、一態様においては、ロバスト線形回帰を使用している。その他の回帰法又はフィット関数を使用することも可能であるが、スパイクなどのアーチファクトが回帰の品質に対して及ぼす影響を最小化するためには、その他の方法（例えば、最小二乗法）よりも、ロバスト線形フィットのほうが好ましい。
【００２７】
一態様によれば、ロバスト線形回帰においては、
【００２８】
【数１】
0004662911.tif 000002
【００２９】
の値を最小化しており、ｓｌｏｐｅの値が固定されている場合に、式（１）を最小化するｉｎｔｅｒｃｅｐｔの値は、次式のとおりである。
【００３０】
ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ＝ｍｅｄｉａｎ｛ｙi−ｓｌｏｐｅ・ｘi｝      （２）
【００３１】
この結果、次式の根としてｓｌｏｐｅの値を検出可能である。
【００３２】
【数２】
0004662911.tif 000003
【００３３】
ここで、ｓｇｎ（）は、次のように定義されたサイン関数である。
【００３４】
ｘ＞０の場合に、ｓｇｎ（ｘ）＝１
ｘ＝０の場合に、ｓｇｎ（ｘ）＝０
ｘ＜０の場合に、ｓｇｎ（ｘ）＝−１
【００３５】
式（２）を式（３）に代入することにより、１つの未知数を有する１つの式が得られる。特定の態様においては、この結果的に得られた式を二分法を使用して解いている。
【００３６】
二分法とは、インターバルを反復的に半分に分割し、根が存在しているサブインターバルを選択することによって機能する根検出アルゴリズムである。本発明のロバスト線形回帰においては、二分法を使用して次式を解いている。
【００３７】
【数３】
0004662911.tif 000004
【００３８】
ここで、ｘiは、サイクル数であり、ｙiは、サイクルｘiにおける蛍光レベルであり、Ｎ＝ＣＡＣである。二分法を使用することにより、式（４）を最小化するｓｌｏｐｅ変数の値を検出する（この変数は、ＰＣＲ曲線のベースラインのスロープを表しており、特定の態様においては、［−０．２；０．２］というインターバル内の値を取得する）。図５には、式（４）の関数の代表的な形状が示されている。
【００３９】
二分法は、線形で収束する。これは、低速ではあるが、対象のインターバルが根を含んでいる場合には、収束することが保証されている。一態様においては、初期収束インターバルを［−０．２；０．２］と定義し、二分アルゴリズムの１００回の反復を実行している。尚、更に小さな又は更に大きなインターバルを使用することも可能であり、且つ、更に多くの又は更に少ない反復を実行することも可能であることを理解されたい。
【００４０】
本発明の一態様に従って二分法を実行するためのＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ（商標）のコードの一例を次に提示する。
【００４１】
ａｂＶａｌｕｅ［ｄａｔａ＿］：＝Ｍｏｄｕｌｅ［｛｝，
ＲＳｕｍ［ｂ＿］：＝Ｓｕｍ［（ｄａｔａ［［ｉ，１］＊ｓｉｇｎ［（ｄａｔａ［［ｉ，２］］−ａ［ｂ］−ｂ  ｄａｔａ［［ｉ，１］］）］），｛ｉ，１，Ｌｅｎｇｔｈ［ｄａｔａ］｝］；
ａ［ｂ＿］：＝Ｍｅｄｉａｎ［Ｔａｂｌｅ［（ｄａｔａ［［ｉ，２］］−ｂ  ｄａｔａ［［ｉ，１］］），｛ｉ，１，Ｌｅｎｇｔｈ［ｄａｔａ］｝］］；
Ｌｘ＝−０．２；
Ｒｘ＝０．２：
ＲｓｕｍＬ＝ＲＳｕｍ［Ｌｘ］；
ＲｓｕｍＲ＝ＲＳｕｍ［Ｒｘ］；
Ｎｘ＝（Ｌｘ＋Ｒｘ）／２；
ＲｓｕｍＮｘ＝ＲＳｕｍ［Ｎｘ］；
Ｆｏｒ［ｉ＝１，ｉ≦１００，ｉ＋＋，
｛
Ｉｆ［ＲｓｕｍＬ＜０  ＆＆  ＲｓｕｍＮｘ＞０，Ｒｘ＝Ｎｘ］；
Ｉｆ［ＲｓｕｍＬ＜０  ＆＆  ＲｓｕｍＮｘ＜０，Ｌｘ＝Ｎｘ］；
Ｉｆ［ＲｓｕｍＬ＞０  ＆＆  ＲｓｕｍＮｘ＜０，Ｒｘ＝Ｎｘ］；
Ｉｆ［ＲｓｕｍＬ＞０  ＆＆  ＲｓｕｍＮｘ＞０，Ｌｘ＝Ｎｘ］；
ＲｓｕｍＬ＝ＲＳｕｍ［Ｌｘ］；
ＲｓｕｍＲ＝ＲＳｕｍ［Ｒｘ］；
Ｎｘ＝（Ｌｘ＋Ｒｘ）／２；
ＰＴ［［ｉ，１］］＝ｉ；
ＰＴ［［ｉ，２］］＝Ｌｘ；
ＰＴ［［ｉ，３］］＝Ｒｘ；
ＲｓｕｍＮｘ＝Ｒｓｕｍ［Ｎｘ］；
｝］
］
【００４２】
ＬＭ回帰プロセス
前述のように、図６は、ＰＣＲ又はその他の成長曲線を表すデータセット内のスパイクポイントを識別及び置換するためのプロセスフローを示している。図６の段階５０２〜段階５２４も、データセットの曲線を近似し、フィット関数のパラメータを判定するためのプロセスフローを示している。一実施例においては、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）法を使用することにより、サイクルＣＡＣ＋１〜最終サイクルの曲線ポイント上におけるデータセットのロバスト曲線近似を算出する。スパイクなどのアーチファクトが推定の品質に対して及ぼす影響を最小化するべく、ＬＭ回帰を使用してサイクルＣＡＣ＋１における蛍光レベルの推定値を演算する。ＬＭ法は、非線形回帰プロセスであり、これは、非線形関数とデータセット間の距離を最小化する反復的な技法である。このプロセスは、最急降下プロセスとＧａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎプロセスの組み合わせのように振舞い、現在の近似が十分にフィットしていない場合には、最急降下プロセスのように振舞うが（これは、低速であるが、相対的に高い信頼性を有する収束である）、現在の近似が正確になるに伴って、Ｇａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎプロセスのように振舞うことになる（これは、相対的に高速であるが、相対的に低い信頼性を有する収束である）。
【００４３】
一般的に、ＬＭ回帰法は、様々な入力を必要とすると共に出力を供給するアルゴリズムを含んでいる。一態様においては、入力は、処理の対象であるデータセットと、このデータへのフィットに使用される関数と、この関数のパラメータ又は変数の初期推定値と、を含んでいる。出力は、関数とデータセット間の距離を最小化する関数のパラメータの組を含んでいる。
【００４４】
一実施例においては、フィット関数は、次のようなダブルシグモイドの形態を有している。
【００４５】
ｆ（ｘ）＝ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１＋ｅｘｐ-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ-f(x-g)））      （５）
【００４６】
この式をフィット関数として選択した理由は、代表的なＰＣＲ曲線又はその他の成長曲線が有する様々な曲線形状にフィットするためのその柔軟性とその能力に基づいている。当業者であれば、必要に応じて、前述のフィット関数やその他のフィット関数の変形を使用可能であることを理解するであろう。
【００４７】
ダブルシグモイド式（１）は、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇという７つのパラメータを具備している。この式は、定数、スロープ、及びダブルシグモイドの和に分解可能である。ダブルシグモイド自体は、２つのシグモイドの乗算である。図７は、ダブルシグモイド式（５）の分解を示している。パラメータｄ、ｅ、ｆ、及びｇは、２つのシグモイドの形状を決定している。最終的な曲線に対するこれらの影響を示すために、次のシングルシグモイドを検討してみよう。
【００４８】
１／（１＋ｅｘｐ-d(x-e)）      （６）
【００４９】
ここで、パラメータｄは、曲線の「シャープネス」を決定しており、パラメータｅは、変曲点のｘ値を決定している。図８は、曲線に対するパラメータｄの影響と、変曲点のｘ値の位置に対するパラメータｅの影響と、を示している。次の表１は、ダブルシグモイド曲線に対するパラメータの影響を示している。
【００５０】
【表１】
0004662911.tif 000005
【００５１】
一態様においては、曲線が非現実的な形状を獲得することを防止するべく、ダブルシグモイド式の「シャープネス」パラメータｄ及びｆを制約する必要がある。従って、一態様においては、ｄ＜−１又はｄ＞１．１、或いは、ｆ＜−１又はｆ＞１．１におけるすべての反復を失敗と見なしている。その他の態様においては、パラメータｄ及びｆに対する異なる制約を使用可能である。
【００５２】
Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムは、反復的なアルゴリズムであるため、通常は、フィットのための関数のパラメータの初期推定値を必要としている。初期推定値が良好であればあるほど、近似も良好になり、アルゴリズムが局所的な最小値に向かって収束する可能性も低くなる。ダブルシグモイド関数の複雑性とＰＣＲ曲線又はその他の成長曲線の様々な形状に起因し、アルゴリズムが局所的な最小値に収束することを防止するには、多くの場合に、すべてのパラメータにおける１つの初期推定値だけでは、十分ではないであろう。従って、一態様においては、複数（例えば、３つ以上）の初期パラメータの組を入力し、最良の結果を保持している。一態様においては、使用している複数のパラメータの組にわたって、大部分のパラメータを一定に保持しており、複数のパラメータの組のそれぞれごとに異なってよいのは、パラメータｃ、ｄ、及びｆのみである。図９は、異なるパラメータの組における３つの曲線形状の例を示している。これらの３つのパラメータの組の選択は、ＰＣＲデータを表す曲線の３つの可能な異なる形状を示している。３つを上回る数のパラメータの組を処理して最良のものを保持することも可能であることを理解されたい。
【００５３】
図６に示されているように、段階５１０において、ＬＭ法の初期入力パラメータを識別している。これらのパラメータは、操作者が入力するか又は算出可能である。一態様によれば、これらのパラメータは、後述するように、段階５０２、５０４、及び５０６によって判定又は設定されている。
【００５４】
初期パラメータ（ａ）の算出
パラメータ（ａ）は、ベースラインの高さであり、この値は、初期パラメータのすべての組にわたって同一である。一態様においては、段階５０４において、データセットから、３番目に小さいｙ軸値（例えば、蛍光値）がパラメータ（ａ）に割り当てられている。この結果、安定した計算が可能である。当然のことながら、その他の態様においては、必要に応じて、最小のｙ軸値や２番目に小さい値などの任意のその他の蛍光値をパラメータ（ａ）に割り当て可能である。
【００５５】
初期パラメータ（ｂ）の算出
パラメータ（ｂ）は、ベースライン及びプラトーのスロープである。この値は、初期パラメータのすべての組にわたって同一である。理想的には、なんらのスロープも存在するべきではないことから、一態様においては、段階５０２において、０．０１という固定値を（ｂ）に対して割り当てている。その他の態様においては、例えば、０〜約０．５の範囲の値などの異なる値をパラメータ（ｂ）に対して割り当て可能である。一態様においては、値（ｂ）は、ＣＡＣ＋１〜ベースラインの終点のベースラインスロープを表している。
【００５６】
初期パラメータ（ｃ）の算出
パラメータ（ｃ）は、プラトーの高さ−ベースラインの高さを表しており、これは、ＡＦＩ（Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ）として表記される。一態様においては、最初のパラメータの組の場合に、ｃ＝ＡＦＩ＋２であり、最後の２つのパラメータの場合には、ｃ＝ＡＦＩである。これが図９に示されており、この場合には、最後の２つのパラメータの組の場合に、ｃ＝ＡＦＩであり、最初のパラメータの組の場合には、ｃ＝ＡＦＩ＋２である。この変化は、最初のパラメータの組によってモデル化された曲線の形状に起因するものであり、これは、プラトーを具備していない。
【００５７】
パラメータ（ｄ）及び（ｆ）の算出
パラメータ（ｄ）及び（ｆ）は、２つのシグモイドのシャープネスを定義している。これらのパラメータにおける曲線に基づいて近似を付与する方法は存在していないことから、一態様においては、段階５０２において、３つの代表的な固定値を使用している。その他の固定した又は固定されていない値をパラメータ（ｄ）及び／又は（ｆ）に使用することも可能であることを理解されたい。これらのペアは、遭遇するＰＣＲ曲線の大部分の共通的な形状をモデル化している。次の表２は、図６に示されているパラメータの異なる組における（ｄ）及び（ｆ）の値を示している。
【００５８】
【表２】
0004662911.tif 000006
【００５９】
パラメータ（ｅ）及び（ｇ）の算出
段階５０６において、パラメータ（ｅ）及び（ｇ）を判定している。パラメータ（ｅ）及び（ｇ）は、２つのシグモイドの変曲点を定義している。一態様においては、これらは、いずれも、すべての初期パラメータの組にわたって同一の値を有している。パラメータ（ｅ）及び（ｇ）は、同一又は異なる値を具備可能である。近似を検出するべく、一態様においては、強度の平均を上回る最初のポイントのｘ値を使用している（これは、例えば、蛍光であるが、スパイクではない）。この態様に従って（ｅ）及び（ｇ）の値を判定するプロセスが図１０に示されており、以下、これについて説明する。
【００６０】
図１０を参照すれば、まず、曲線の平均（例えば、蛍光強度）を判定している。次いで、平均を上回る最初のデータポイントを識別している。次いで、（ａ）そのポイントが、曲線の開始点の近傍（例えば、最初の５サイクル内）に位置していないかどうか、（ｂ）そのポイントが、曲線の終点の近傍（例えば、最後の５つのサイクル内）に位置していないかどうか、及び（ｃ）そのポイントの周り（例えば、その周りの２ポイントの半径内）の導関数が符号の変化を示していないかどうか（変化を示している場合には、そのポイントは、スパイクである可能性が高く、従って、拒絶する必要がある）を判定している。
【００６１】
次の表３は、一態様による図９に使用されている初期パラメータ値の例を示している。
【００６２】
【表３】
0004662911.tif 000007
【００６３】
再度図６を参照すれば、段階５１０において、すべてのパラメータが設定された後に、入力されたデータセット、関数、及びパラメータを使用してＬＭプロセス５２０を実行する。従来は、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法を使用することにより、非線形の最小二乗問題を解決している。従来のＬＭ法においては、曲線の近似とデータセット間の誤差の二乗の合計として定義されている距離の尺度を算出している。しかしながら、二乗の合計を最小化する場合には、異常値の距離が、スパイクではないデータポイントの距離を上回っているために、異常値に対して大きな重みが付与されることになり、この結果、しばしば、不適切な曲線や好ましくない曲線が得られることになってしまう。従って、本発明の一態様によれば、絶対誤差の合計を極小化することにより、近似とデータセット間の距離を演算している（この結果、この場合には、異常値に対して大きな重みが付与されない）。この態様においては、近似とデータ間の距離は、次式によって付与される。
【００６４】
距離＝Σ｜ｙdata−ｙapproximation｜      （７）
【００６５】
前述のように、一態様においては、段階５２２及び段階５２４に示されているように、複数（例えば、３つ）の初期パラメータの組のそれぞれを入力し、処理した後に、最良の結果を保持しており、この最良の結果は、式（７）における最も小さい又は最小の距離を提供するパラメータの組である。一態様においては、パラメータの大部分を複数のパラメータの組にわたって一定に保持しており、パラメータのそれぞれの組ごとに異なってよいのは、ｃ、ｄ、及びｆのみである。任意の数の初期パラメータの組を使用可能であることを理解されたい。
【００６６】
図１１は、本発明によるパラメータの組におけるＬＭプロセス５２０のプロセスフローを示している。前述のように、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法は、最急降下プロセス又はＧａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎプロセスのように動作可能である。この振る舞いは、減衰係数λによって左右される。λが大きいほど、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムは、最急降下プロセスのように振舞うことになる。一方、λが小さいほど、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムは、Ｇａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎプロセスのように振舞うことになる。一態様においては、λは、０．００１から始まっている。λは、０．０００００１〜約１．０などの任意のその他の値から始まることも可能であることを理解されたい。
【００６７】
前述のように、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法は、反復的な技法である。一態様によれば、図１１に示されているように、それぞれの反復において、次の各段階を実行している。
【００６８】
１．先行する近似のヘッセ行列（Ｈ）を算出する。
【００６９】
２．先行する近似の転置ヤコビ行列（ＪT）を算出する。
【００７０】
３．先行する近似の距離ベクトル（ｄ）を算出する。
【００７１】
４．現在の減衰係数λにより、次のようにヘッセ行列の対角項を増大させる。
【００７２】
Ｈaug＝Ｈλ      （４）
【００７３】
５．増大した式を次のように解く。
【００７４】
Ｈaugｘ＝ＪTｄ      （５）
【００７５】
６．増大した式の解ｘを関数のパラメータに追加する。
【００７６】
７．新しい近似及び曲線間の距離を算出する。
【００７７】
８．新しいパラメータの組を有する距離が、以前のパラメータの組を有する距離を下回っている場合には、・その反復は成功であると見なされ、・パラメータの新しい組を維持又は保存し、・減衰係数λを（例えば、係数１０だけ）減少させる。新しいパラメータの組を有する距離が、以前のパラメータの組を有する距離を上回っている場合には、・その反復は失敗であると見なされ、・パラメータの新しい組を破棄し、・減衰係数λを（例えば、係数１０だけ）増大させる。
【００７８】
一態様においては、図１１のＬＭプロセスは、次の基準の中の１つが実現されるまで反復される。
【００７９】
１．既定の反復回数Ｎだけ既に実行されている。この第１の基準は、アルゴリズムが無制限に反復されることを防止している。例えば、図１０に示されている一態様においては、既定の反復値Ｎは、１００である。アルゴリズムが収束可能である場合には、１００回の反復は、アルゴリズムが収束するのに十分なものであるはずである。一般に、Ｎは、１０未満〜１００超の範囲をとることができる。
【００８０】
２．２つの成功した反復間の距離の差が閾値（例えば、０．０００１）を下回っている。差が非常に小さくなった場合には、所望の精度が既に実現されており、解がそれ以上大幅に良好になることはないことから、反復を継続するのは無意味である。
【００８１】
３．減衰係数λが既定の値を超過している（例えば、１０20を上回っている）。λが非常に大きくなると、アルゴリズムは、現在の解よりも良好に収束することはなく、従って、反復を継続するのは無意味である。一般に、この規定値は、１０20を大幅に下回る又は上回るものであってよい。
【００８２】
実施例
成長曲線のサイクル１〜サイクルＣＡＣにおけるデータポイントにロバスト線形回帰を適用することにより、結果的に図１２に示されているプロットが得られる。温度シフト又はスパイクのいずれもが最終的な結果に影響を及ぼしておらず、曲線フィットの品質が非常に優れていることがわかる。次いで、ロバスト線形回帰とダブルシグモイドの両方を使用し、ＣＡＣ＋１（これは、この場合には、サイクル１６である）における蛍光信号の値を推定する。次いで、これらの値の間の差をステップの補正に使用する。尚、サイクルＣＡＣにおけるロバスト線形近似を推定し、ダブルシグモイドをＣＡＣ値に外挿することによって差を判定することも同様に有効であることに留意されたい。このデータセット内のサイクル１６におけるロバスト線形式の推定値は、次の通りである。
【００８３】
ｌｅｆｔ＝２．９１６６９
【００８４】
サイクル１６におけるロバストダブルシグモイドの推定値は、次の通りである。
【００８５】
ｒｉｇｈｔ＝２．１１５８２
【００８６】
従って、差は、次のとおりである。
【００８７】
ｄｉｆ＝ｌｅｆｔ−ｒｉｇｈｔ＝０．８００８６６
【００８８】
次いで、この差の値を、サイクル１〜ＣＡＣに対応したデータセットの部分の蛍光信号から減算する。図１３Ａ及び図１３Ｂには、ダブルシグモイドＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ曲線フィットと共に、調節後のデータセット全体が示されており、図１３Ｂは、拡大図である。次いで、一態様においては、ＬＭ法を使用することにより、サイクル１５における異常値を除去している。図１４には、サイクル１５に挿入された置換ポイントを有する最終的な曲線が示されている。この段階においては、アニーリング温度の変化に起因したスパイク及び蛍光強度の変化は補正されている。
【００８９】
結論
本発明の一態様によれば、ベースライン部分及び成長部分を具備するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）成長曲線のデータセット内の温度ステップの変化を補正するためのコンピュータ実装された方法が提供される。この方法は、通常、ＰＣＲ成長曲線のデータセットを受領する段階含んでおり、このデータセットは、それぞれのデータポイントが座標値のペア（ｘ，ｙ）を具備する動的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＲＣ）プロセスの複数のデータポイントを含んでおり、この場合に、ｘは、サイクル数を表し、ｙは、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積を表している。又、本方法は、通常、曲線の第１部分に対する線形近似を算出する段階であって、この第１部分は、ＰＣＲプロセスにおいてアニーリング温度の変化の起こるサイクル数（ＣＡＣ）以下のサイクル数を含むデータセット内のデータポイントを含んでいる、段階と、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをデータセットの第２部分とダブルシグモイド関数に適用して関数のパラメータを判定することにより、曲線の第２部分に対する近似を算出する段階であって、このデータセットの第２部分は、ＣＡＣを上回るサイクル数を具備するデータポイントを含んでいる、段階と、を含んでいる。又、本方法は、通常、曲線の第１部分の線形近似を使用し、第１のｘ値における第１のｙ値を推定する段階と、曲線の第２部分について演算された近似を使用し、第１のｘ値における第２のｙ値を推定する段階と、第１及び第２のｙ値の間の差を判定する段階と、この差を曲線の第１部分に対応するデータポイントにおけるそれぞれのｙ値から減算することにより、修正されたデーセットを生成する段階と、を含んでいる。特定の態様においては、第１のｘ値は、ＣＡＣである。その他の態様においては、第１のｘ値は、ＣＡＣ＋１である。別の実施例においては、ＣＡＣデータポイントは、データの第１部分内に含まれている。
【００９０】
特定の実施例においては、線形近似を算出する段階は、曲線の第１部分にロバスト線形回帰を適用する段階を含んでいる。特定の実施例においては、ロバスト線形回帰を適用する段階は、根検出法を適用する段階を含んでいる。更に別の特定の実施例においては、根検出法は、二分法である。
【００９１】
特定の実施例においては、本方法は、修正済みのデータセットに対してＭＬ回帰プロセスを適用し、識別されたスパイクのデータ値を修正済みのデータセットから除去又は置換することにより、データ曲線の第１部分に対応する１つ又は複数のデータポイントが異常値スパイクであるかどうかを判定する段階を更に含んでいる。更に別の特定の実施例においては、本方法は、修正済みのデータセットを使用することにより、サイクル閾値（Ｃｔ）を判定する段階を更に含んでいる。
【００９２】
別の実施例においては、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積は、蛍光強度値、ルミネッセンス強度値、化学ルミネッセンス強度値、燐光強度値、電荷転送値、生物ルミネッセンス強度値、又は吸収値の中の１つによって表されている。
【００９３】
特定の態様においては、ダブルシグモイド関数は、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１＋ｅｘｐ-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ-f(x-g)））という形態を有しており、算出する段階は、関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に判定する段階を含んでいる。
【００９４】
本発明の別の態様によれば、プロセッサを制御し、ベースライン部分及び成長部分を具備するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＲＣ）成長曲線のデータセット内の温度ステップの変化を補正するためのコードを含むコンピュータ可読媒体が提供される。このコードは、通常、ＰＣＲ成長曲線のデータセットを受領するための命令を含んでおり、このデータセットは、それぞれのデータポイントが座標値のペア（ｘ，ｙ）を具備する動的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスの複数のデータポイントを含んでおり、この場合に、ｘは、サイクル数を表し、ｙは、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積を表している。又、本コードは、通常、曲線の第１部分に対する線形近似を算出し（この第１部分は、ＰＣＲプロセスにおいてアニーリング温度の変化の起こるサイクル数（ＣＡＣ）以下のサイクル数を含むデータセット内のデータポイントを含んでいる）、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをデータセットの第２部分とダブルシグモイド関数に適用して関数のパラメータを判定することにより、曲線の第２部分に対する近似を算出する（このデータセットの第２部分は、ＣＡＣを上回るサイクル数を具備するデータポイントを含んでいる）ためのコードを含んでいる。又、本コードは、通常、曲線の第１部分の線形近似を使用して第１のｘ値における第１のｙ値を推定し、曲線の第２部分について演算された近似を使用して第１のｘ値における第２のｙ値を推定し、第１及び第２のｙ値の間の差を判定し、この差を曲線の第１部分に対応するデータポイントにおけるそれぞれのｙ値から減算することにより、修正済みのデータを生成するための命令を含んでいる。特定の態様においては、第１のｘ値は、ＣＡＣである。その他の態様においては、第１のｘ値は、ＣＡＣ＋１である。別の態様においては、ＣＡＣデータポイントは、データの第１部分内に含まれている。
【００９５】
特定の実施例においては、本コードは、修正済みのデータセットに対してＬＭ回帰プロセスを適用することにより、データ曲線の第１部分に対応する１つ又は複数のデータポイントが異常値スパイクであるかどうかを判定し、識別されたスパイクのデータ値を修正済みのデータセットから除去又は置換するための命令を更に含んでいる。
【００９６】
別の実施例において、線形近似を算出するための命令は、ロバスト線形回帰を曲線の第１部分に適用するための命令を含んでいる。特定の実施例においては、ロバスト線形回帰を適用するための命令は、根検出プロセスを適用するための命令を含んでいる。更に別の実施例においては、根検出プロセスは、二分法である。
【００９７】
特定の実施例においては、本コードは、修正済みのデータセットを使用してサイクル閾値（Ｃｔ）を判定するための命令を更に含んでいる。
【００９８】
別の実施例においては、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積は、蛍光強度値、ルミネッセンス強度値、化学ルミネッセンス強度値、燐光強度値、電荷転送値、生物ルミネッセンス強度値、又は吸収値の中の１つによって表されている。
【００９９】
更に別の実施例においては、ダブルシグモイド関数は、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１＋ｅｘｐ-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ-f(x-g)））という形態を有しており、算出する命令は、関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に判定するための命令を含んでいる。
【０１００】
本発明の更に別の態様によれば、動的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムが提供され、これは、通常、ベースライン部分及び成長部分を具備する動的ＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットを生成する動的ＰＣＲ分析モジュールであって、このデータセットは、それぞれのデータポイントが座標値のペア（ｘ，ｙ）を含む複数のデータポイントを含んでおり、この場合に、ｘは、サイクル数を表し、ｙは、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積を表している、動的ＰＣＲ分析モジュールと；曲線の第１部分に対する線形近似を算出し（この第１部分は、ＰＣＲプロセスにおいてアニーリング温度の変化の起こるサイクル数（ＣＡＣ）以下のサイクル数を含むデータセット内のデータポイントを含んでいる）、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをデータセットの第２部分とダブルシグモイド関数に適用して関数のパラメータを判定することにより、曲線の第２部分に対する近似を算出することによって（このデータセットの第２部分は、ＣＡＣを上回るサイクル数を具備するデータポイントを含んでいる）、ＰＣＲデータセットを処理し、データセット内の温度ステップの変化について補正するべく適合されたインテリジェンスモジュールと；を含んでいる。又、インテリジェンスモジュールは、通常、曲線の第１部分の線形近似を使用して第１のｘ値における第１のｙ値を推定し、曲線の第２部分について算出された近似を使用して第１のｘ値における第２のｙ値を推定し、第１及び第２のｙ値の間の差を判定し、この差を曲線の第１部分に対応するデータポイントのそれぞれのｙ値から減算することにより、修正済みのデータセットを生成するべく適合されている。特定の態様においては、第１のｘ値は、ＣＡＣである。その他の態様においては、第１のｘ値は、ＣＡＣ＋１である。別の態様においては、ＣＡＣデータポイントは、データの第１部分内に含まれている。
【０１０１】
動的ＰＣＲシステムの特定の実施例においては、動的ＰＣＲ分析モジュールは、動的サーモサイクラー装置内に存在しており、インテリジェンスモジュールは、分析モジュールに通信可能に結合されたプロセッサを含んでいる。その他の特定の実施例においては、インテリジェンスモジュールは、ネットワーク接続又は直接接続のいずれかを介して分析モジュールに結合されたコンピュータシステム内に存在するプロセッサを含んでいる。
【０１０２】
別の実施例においては、インテリジェンスモジュールは、修正済みのデータセットに対してＭＬ回帰プロセスを適用することにより、データ曲線の第１部分に対応する１つ又は複数のデータポイントが異常値スパイクであるかどうかを判定し、識別されたスパイクのデータ値を修正済みのデータセットから除去又は置換するべく適合されている。
【０１０３】
特定の実施例においては、線形近似を算出する段階は、曲線の第１部分に対してロバスト線形回帰を適用する段階を含んでいる。特定の実施例においては、ロバスト線形回帰を適用する段階は、根検出プロセスを適用する段階を含んでいる。更に別の特定の実施例においては、根検出プロセスは、二分法である。
【０１０４】
別の実施例においては、インテリジェンスモジュールは、修正済みのデータセットを使用することにより、サイクル閾値（Ｃｔ）を判定するべく適合されている。
【０１０５】
別の実施例においては、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積は、蛍光強度値、ルミネッセンス強度値、化学ルミネッセンス強度値、燐光強度値、電荷転送値、生物ルミネッセンス強度値、又は吸収値の中の１つによって表されている。
【０１０６】
特定の実施例においては、ダブルシグモイド関数は、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１＋ｅｘｐ-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ-f(x-g)））という形態を有しており、算出する段階は、関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に判定する段階を含んでいる。
【０１０７】
曲線近似及び回帰プロセスを含むＣｔ判定プロセスは、コンピュータシステムのプロセッサ上において稼動するコンピュータコードとして実装可能であることを理解されたい。このコードは、プロセッサを制御してＣｔ判定プロセスの様々な態様と段階を実装するための命令を含んでいる。このコードは、通常、ハードディスク、ＲＡＭ、或いは、ＣＤ、ＤＶＤなどの携帯型の媒体上に保存される。同様に、これらのプロセスは、プロセッサに結合されているメモリユニット内に保存されたプロセッサ実行命令を含むサーモサイクラーなどのＰＣＲ装置内で実行することも可能である。そのような命令を含むコードは、コード供給源に対するネットワーク接続又は直接接続を介して、或いは、周知のように、携帯型の媒体を使用することにより、ＰＣＲ装置ユニットにダウンロード可能である。
【０１０８】
当業者であれば、本発明の様々なプロセスは、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｆｏｒｔｒａｎ、ＶｉｓｕａｌＢａｓｉｃなどの様々なプログラミング言語、並びに、データの視覚化及び分析に有用な事前パッケージングされたルーチン、関数、及び手順を提供するＭａｔｈｅｍａｔｉｃａなどのアプリケーションを使用してコーディング可能であることを理解するであろう。後者の更なる例がＭＡＴＬＡＢ（登録商標）である。
【０１０９】
以上、一例として、特定の実施例の観点において本発明について説明したが、本発明は、開示された実施例に限定されるものではないことを理解されたい。逆に、本発明は、当業者には明らかな様々な変更及び類似の構成を包含することを意図するものである。例えば、複数の温度ステップの補正を実行する場合には、データセットの異なる部分に対して複数の回帰を実行可能である。例えば、ＰＣＲデータのベースライン部分内において２つの温度シフトが実行される場合には、サイクル１〜第１の変更のサイクルにおけるデータセットの部分に線形回帰を適用可能であり、第１の変更のサイクル〜第２の変更のサイクルにおけるデータセットの部分に第２の線形回帰を適用可能であり、且つ、第２の変更のサイクル〜最終サイクルにおけるデータセットに対してＬＭ法を適用可能である。従って、添付の請求項の範囲には、このようなあらゆる変更及び類似の構成を包含するべく、最も広範な解釈を付与することを要するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】ＰＣＲプロセスの環境における増幅曲線の一例を示している。
【図２−１】図２Ａはサイクル１４におけるスパイクと共にサイクル１５における温度シフトを有するＰＣＲ曲線の一例を示しており、図２Ｂは、拡大図である。
【図２−２】図２ＣはＰＣＲデータセットの全体を処理するべく使用されたＬＭ回帰プロセスの結果であるフィットを示しており、図２Ｄは、拡大図である。
【図２−３】図２Ｅはサイクル１６〜最終サイクルにおけるデータポイントをＬＭ回帰において使用した際に結果的に得られる曲線フィットを示しており、図２Ｆは、拡大図である。
【図３】温度シフトについて補正し、動的なＰＣＲ増幅曲線のエルボー値又はＣｔ値などのシングルシグモイド曲線の遷移値を判定するためのプロセスの一実施例を示している。
【図４Ａ】温度シフトを有するＰＣＲデータセットのサイクル１〜サイクルＣＡＣにおけるデータセットの部分の線形近似の一例を示している。
【図４Ｂ】図４ＡのＰＣＲデータセットのサイクルＣＡＣ＋１〜最終サイクルにおけるデータセットの部分の近似の一例を示しており、この場合には、本発明に従い、ＬＭ回帰プロセスを使用してダブルシグモイド関数のパラメータを判定することにより、近似を判定している。
【図４Ｃ】図４Ａ及び図４Ｂに示されているデータセットの温度シフトについて補正されたデータの一例を示している。
【図５】本発明の態様に従って二分法において使用される関数の代表的な形状を示している。
【図６Ａ】本発明の一実施例によるスパイクの識別及び置換プロセスの詳細なプロセスフローを示している。
【図６Ｂ】図６Ａのつづき。
【図６Ｃ】図６Ｂのつづき。
【図６Ｄ】図６Ｃのつづき。
【図６Ｅ】図６Ｄのつづき。
【図６Ｆ】図６Ｅのつづき。
【図７】パラメータａ〜ｇを含むダブルシグモイド式の分解を示している。パラメータａ〜ｇは、ダブルシグモイド曲線の形状と位置を定義している。
【図８】曲線に対するパラメータ（ｄ）と、変曲点のｘ値の位置に対する（ｅ）の影響を示している。図８の曲線は、いずれも、パラメータｄを除いて同一のパラメータ値を具備している。
【図９】異なるパラメータの組における３つの曲線形状の一例を示している。
【図１０Ａ】一態様に従ってダブルシグモイド式のパラメータ（ｅ）及び（ｇ）の値を判定するプロセスを示している。
【図１０Ｂ】図１０Ａのつづき。
【図１１Ａ】初期のパラメータの組におけるＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ回帰プロセスのプロセスフローを示している。
【図１１Ｂ】図１１Ａのつづき。
【図１１Ｃ】図１１Ｂのつづき。
【図１１Ｄ】図１１Ｃのつづき。
【図１２】サイクル１〜サイクルＣＡＣにおけるデータポイントにロバスト線形回帰を適用した結果を示している。
【図１３】図１３Ａは温度シフトを補正した後のＰＣＲデータセットの全体を示しており、図１３Ｂは、拡大図である。
【図１４】スパイクポイントを除去した後の最終的な曲線を示している。
【図１５】ソフトウェア及びハードウェアリソース間における関係を示す概略ブロックダイアグラムを示している。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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