(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの窒素源、第３ブタノール（ＴＢＡ）および／または第３アミルアルコール（ＴＡＡ）を含む培地の存在下に、空気または酸素の存在下に、Burkholderia cepacia CIP I-2052を培養し、培養物を回収する前記バクテリアの産生方法において、前記培地が、少なくとも１つのコバルト塩を含むことを特徴とする、産生方法。
【請求項２】
塩が、塩化物イオン、硫酸塩イオン、硝酸塩イオンおよびそれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
コバルト塩が、塩化コバルト・六水塩である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
塩が、培地中の最終濃度０．０１〜４ｍｇ／リットル、好ましくは０．０５〜０．１ｍｇ／リットルで導入される、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
第３ブタノールまたは第３アミルアルコールの濃度が０．００１〜１０ｇ／培地１リットルである、請求項１〜４のうちのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記バクテリアが、混合培養で使用される、請求項１〜５のうちのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
コバルトが、２価である、請求項１〜６のうちのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のうちのいずれか１項記載の方法により産生されたBurkholderia cepacia CIP I-2052を含む培養物。
【請求項９】
好気的条件下に請求項８記載の、あるいは請求項１〜７のうちのいずれか１項記載の方法により産生されたBurkholderia cepacia CIP I-2052の培養物を培養する、水性流出物中に含まれる第３ブタノールおよび／または第３アミルアルコールの分解方法。
【請求項１０】
第３ブタノールは、メチル第３ブチルエーテルとエチル第３ブチルエーテルとの分解産生質であり、また第３アミルアルコールは、第３アミルメチルエーテルの分解産生質であり、これらの分解は、好気的条件下にGordona terrae CIP I-1889とRhodococcus equi CIP I-2053とからなる群から選ばれる少なくとも１つのバクテリアによるものである、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物、ブルクホルデリア  セパシア（ Burkholderia cepacia ）(旧 シュードモナス  セパシア Pseudomonas cepacia) CIP I-2052の産生方法、産生された接種体、および例えばエーテル・燃料と呼ばれるエーテルの分解の際に産生されたアルコールが水性流出物中に含まれる場合、該アルコールを分解するための方法におけるその適用に関する。これらのエーテルは、次の通りである：以下において用語ＥＴＢＥで指定されるエチル第３(tert-)ブチルエーテル、以下において用語ＭＴＢＥで指定されるメチル第３ブチルエーテルまたは以下において用語ＴＡＭＥで指定される第３アミルメチルエーテルである。分解の際に産生されたアルコールは、以下において用語ＴＢＡで指定される第３ブタノールまたは以下において用語ＴＡＡで指定される第３アミルアルコールである。
【０００２】
本発明は、特に水処理産業に適用される。
【０００３】
【従来の技術】
先行技術は、文献「Transformation of carbon tetrachloride by Pseudomonas sp; strain KC under denitrification conditions」Appl. Environ. Microbiol; ５６巻、１１号、１９９０年１１月（１９９０−１１）、頁３２４０〜３２４６と、ヨーロッパ特許ＥＰ−０２３７００２ Ａ、フランス特許ＦＲ−２７３５４９７Ａおよびフランス特許ＦＲ−２７６６４７８とによって説明されている。
【０００４】
ＴＢＡおよびＴＡＡは、それぞれ、ＭＴＢＥおよびＥＴＢＥと、ＴＡＭＥの各々エーテルからの分解産生物である。これらエーテルは、オクタン価を高めるために、ガソリン中への添加剤として実際に使用されているか、あるいは使用されうるものである。例えばＭＴＢＥは１０〜１５％（ｖ／ｖ）の割合でガソリンに添加されるので、該エーテルの使用量は大量である。従って、帯水層（aquifier）中でのこれらエーテルの存在は、次第にしばしば留意されるものである（Andrews C., １９９８年、「MTBE-A Long-Term Threat to Ground Water Quality 」、Ground Water、３６：７０５−７０６）。従って、例えば、帯水層中でのこれらエーテル・燃料の微生物による、自由に使用できる限定された酸素への部分分解は、二次的汚染物質としてＴＢＡおよびＴＡＡの堆積をまねくおそれがある。
【０００５】
さらに、ＴＢＡおよびＴＡＡは、それら自体、オクタン価を高めるためにガソリン中への添加剤として使用されてよい。この場合、その使用は、第１汚染物質として環境中にその分散を誘発するものである。
【０００６】
飲料水の供給に役立つ薄層状帯水層の水中に、あるいは精製ステーションに到着する残留水中にＴＢＡまたはＴＡＡが存在するため、これらアルコールを分解することのできる特定の微生物の使用が必要とされる。該アルコールは、その分枝状構造により微生物分解に相対的に耐性である。
【０００７】
米国特許ＵＳ−４８５５０５１によれば、土から単離されたバクテリア、B. coagulants ATCC 53595、A. globiformis ATCC 53596およびP. stutzeri ATCC 53602は、無機系の最小培地に添加されたＴＢＡを分解することが可能である。さらに、米国特許ＵＳ５８１１０１０によれば、バクテリアconsortiaはＴＢＡを分解することが可能であるが、それらを構成する微生物は、特徴付けられていない。さらに、米国特許ＵＳ５８１４５１４によれば、プロパンで増殖する能力を有する種々のバクテリアは、ＴＢＡを分解する能力を有する。
【０００８】
本出願人は、炭素源として、および、ＴＢＡを二酸化炭素（無機元素含有状態）まで分解することによるエネルギー源として、ＴＢＡを使用する能力を有する好気的バクテリアBurkholderia cepacia CIP I-2052を単離した。このバクテリアは、Institut Pasteur collection (CNCM [Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, National Collection for Microorganism cultures], 25, rue du Docteur-Roux, F-75724 PARIS）に本出願人により寄託されている。本出願人のフランス特許出願ＦＲ−２７６６４７８によれば、このバクテリアは、炭素源として、および、ＥＴＢＥをＴＢＡの段階まで分解することによるエネルギー源として、ＥＴＢＥを使用することが可能なバクテリアと共に混合培養で使用されてよい。ついで、該ＴＢＡは、培地中に堆積する。これは、こうして産生されたＴＢＡに作用する能力をもったBurkholderia cepacia CIP I-2052の接種体の添加により、流出物中のＥＴＢＥの完全分解を行うことが可能になるからである。一般に、この基質に関するこれら微生物のインキュベーション期間は長く、例えばＴＢＡの約７００ｍｇ／リットルを分解させるために４００時間必要である。工業的スケールでは充分な量のバイオマスを産生することが必須であることが明らかになる。
【０００９】
【発明の開示】
本発明の目的は、バクテリアBurkholderia cepacia CIP I-2052の培地の改良について記載することである。この改良により、培地中に単独または混合物状でコバルト塩を添加することによって、炭素とエネルギーとの唯一の源として供給されるＴＢＡまたはＴＡＡの存在下に該バクテリアの増殖の大幅な改善が可能になる。
【００１０】
より正確には、本発明は、バクテリアBurkholderia cepacia CIP I-2052の産生方法に関する。この方法では、少なくとも１つの窒素源、第３ブタノール（ＴＢＡ）および／または第３アミルアルコール（ＴＡＡ）を含む培地の存在下に、かつ空気または酸素の存在下に、前記バクテリアを培養して、接種体を回収する。この方法は、前記培地が、少なくとも１つのコバルト塩を含むことを特徴とする。コバルトは、好ましくは二価形態で使用される。
【００１１】
本方法の特徴によれば、コバルト塩は、塩化物イオン、硫酸塩イオン、硝酸塩イオンおよびそれらの混合物からなる群から選ばれてよい。塩化コバルト・六水塩が、バクテリアによって産生されたバイオマスに関して大きな効果を有していたことが認められた。
【００１２】
本発明の別の実施態様によれば、バクテリアBurkholderia cepacia CIP I-2052は、ビタミンを添加した塩溶液含有培地に接種されてよい。該ビタミン添加塩溶液含有培地に、塩化コバルトが、単独または他の微量元素との混合物状で、培地中の最終濃度０．０１〜４ｍｇ／リットル、有利には０．０３〜２ｍｇ／リットル、好ましくは０．０５〜０．１ｍｇ／リットルで添加されている。これらの条件下に、Burkholderia cepacia CIP I-2052の炭素含有基質、すなわちＴＢＡまたはＴＡＡは、培地中に濃度０．００１〜１０ｇ／リットル、好ましくは０．２〜５ｇ／リットルで添加されてよい。
【００１３】
これらの条件下に、既に認められている細胞密度よりも高い細胞密度を有する接種体が産生される。その最終バイオマス濃度は、ＴＢＡの当初濃度１ｇ／リットルに対して、例えば乾燥重量で０．６ｇ／培養液１リットル程度である。こうして調製された接種体は、ＴＢＡまたはＴＡＡを含む流出物を処理するために単独で使用されてもよいし、ＥＴＢＥもしくはＭＴＢＥをＴＢＡに分解するか、またはＴＡＭＥをＴＡＡに分解するバクテリアを用いる混合培養で使用されてもよい。
【００１４】
さらに、こうして本発明による方法によって大量に産生されたこの接種体は、ＴＢＡまたはＴＡＡ、またはＴＢＡとＴＡＡとの混合物を含む水性流出物を精製するために直接使用することができる。より正確には、本発明は、水性流出物中に含まれるＴＢＡおよび／またはＴＡＡの分解方法に関する。この方法において、バクテリアBurkholderia cepacia CIP I-2052の産生方法によって産生された接種体が好気的条件下に使用される。
【００１５】
本出願人のフランス特許出願ＦＲ−９８／１６５２０によれば、ＴＢＡは、ゴルドナ  テルラエ（Gordona terrae） CIP I-1889またはロードコッカス  エクイ（Rhodococcus equi） CIP I-2053であってもよい少なくとも１つのバクテリアによる、水性流出物中に含まれるＭＴＢＥおよび／またはＥＴＢＥの好気的条件下での分解に由来するものであってよい。これらの同じバクテリアは好気的条件下にＴＡＭＥをＴＡＡに分解することもできる。
【００１６】
本発明は、本発明を説明する図面を検討して、より良く理解される。これら図面において、
・図１は、B. cepacia CIP I-2052によるＴＢＡの分解と、時間に応じて、微量元素溶液の存在下でのその増殖Ｐ（ｕｆｃ／ｍＬ）とを表す。
【００１７】
・図２は、B. cepacia CIP I-2052によるバイオマスの産生に関するいくつかの無機成分の添加効果を証明する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
［実施例１Ａおよび実施例１Ｂ（比較例）］
炭素源およびエネルギー源としてグルコース（５００ｍｇ／ｌ）が添加された塩溶液含有無機培地ＭＭ２に株B. cepacia CIP I-2052接種した。培地ＭＭ２は、次の組成を有した：
・ＫＨ２  ＰＯ４                  １．４ｇ
・Ｋ２  ＨＰＯ４                  １．７ｇ
・ＮａＮＯ３                    １．５ｇ
・ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ        ０．５ｇ
・ＣａＣｌ２  ・２Ｈ２  Ｏ        ０．０４ｇ
・ＦｅＣｌ３  ・６Ｈ２  Ｏ        ０．０１２ｇ
・ビタミン類の溶液                  １ｍｌ
・Ｈ２  Ｏ                    ｑ．ｓ．ｐ．１リットル
ビタミン類の溶液は、蒸留水１リットルに対して次の組成を有した：
・ビオチン                ２００ｍｇ
・リボフラビン              ５０ｍｇ
・ニコチン酸                ５０ｍｇ
・パントテン酸塩            ５０ｍｇ
・ｐ−アミノ安息香酸        ５０ｍｇ
・葉酸                      ２０ｍｇ
・チアミン                  １５ｍｇ
・シアノコバラミン            １．５ｍｇ
３０℃で２４時間のインキュベーション後に得られた培養物は、種々の濃度を有する炭素源およびエネルギー源としてＴＢＡ添加培地ＭＭ２を２００ｍｌ含むフラスコ内に接種するために用いられる。これらフラスコ内に、１０ｍｌ／ｌ（培地ＭＭ２）の割合で塩化コバルト・六水塩を含む微量元素溶液を添加した。比較例として、同じフラスコに微量元素溶液を添加しなかった。
【００１９】
微量元素溶液は、次の組成を有した：
・ニトリロトリ酢酸                                    １．５ｇ
・Ｆｅ（ＮＨ４  ）２  （ＳＯ４  ）２  ・６Ｈ２  Ｏ              ０．２ｇ
・Ｎａ２  ＳｅＯ３                                          ０．２ｇ
・ＣｏＣｌ２  ・６Ｈ２  Ｏ                                ０．１ｇ
・ＭｎＳＯ４  ・２Ｈ２  Ｏ                                ０．１ｇ
・Ｎａ２  ＭｏＯ４  ・２Ｈ２  Ｏ                                  ０．１ｇ
・ＺｎＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ                                ０．１ｇ
・ＡｌＣｌ３  ・６Ｈ２  Ｏ                                ０．０４ｇ
・ＮｉＣｌ２  ・６Ｈ２  Ｏ                                ０．０２５ｇ
・Ｈ３  ＢＯ３                                            ０．０１ｇ
・ＣｕＳＯ４  ・５Ｈ２  Ｏ                                ０．０１ｇ
ｑ．ｓ．ｐ．                                    蒸留水１リットル
各フラスコは、得られた３％（ｖ／ｖ）前培養物から接種され、ついで撹拌インキュベータにおいて３０℃でインキュベートされた。
【００２０】
これら種々のフラスコにおいて、ガスクロマトグラフィーにより残留ＴＢＡを分析するために、規則的な間隔でサンプルを採取した。さらに６００ｎｍの光学濃度を測定した。最後に、すべての当初ＴＢＡが消費された場合、ＴＢＡの無機化の程度を示す全有機炭素（ＴＯＣ）の測定を行った。
【００２１】
種々の培養物を用いて得られた結果を表１に示した。この表により、炭素源としてのＴＢＡの存在下にB. cepacia CIP I-2052の増殖に関する微量元素の添加の効果が示される。
【００２２】
【表１】
0004674657.tif 000002
【００２３】
Ｎ．Ｄ．：測定されなかった。
【００２４】
この表からわかるように、コバルトを含む微量元素溶液の添加により、例えば１０００ｍｇ／リットルの濃度まで供給ＴＢＡの完全分解を行って、必要なインキュベーション期間を大幅に短縮することが可能になった。さらに光学濃度の測定により示されるように、産生されたバイオマスは、非常に大量であった。従って、例えば数ｇ／リットルまでもの大量のＴＢＡを含む流出物の処理方法のための接種体を、より容易に調製することができる。
【００２５】
［実施例２］
ただ１つの炭素源として供給されるＴＢＡにおけるB. cepacia CIP I-2052株の増殖を、４リットルの発酵装置においてモニターした。
【００２６】
グルコースを含み（１ｇ／リットル）、かつ撹拌下に３０℃で微量元素（１％、ｖ／ｖ）が添加された培地ＭＭ２の２００ｍＬ上でのP. cepacia CIP I-2052の２４時間の接種体を作成した。
【００２７】
発酵装置の培地は、１％（ｖ／ｖ）の割合で実施例１に記載された微量元素溶液が添加された、実施例１に記載された培地ＭＭ２であった。発酵装置におけるＴＢＡの当初濃度は、３００ｍｇ／リットルであった。接種後、光学濃度は０．０５であった。カウンティングは、連続的希釈後に培地Ｌｕｒｉａ上に塗布されたコロニーをカウントすることにより行われ、２．９×１０６  ｕｆｃ．ｍＬ−１の当初細胞密度を示した。
【００２８】
バッチ式でのこの発酵の操作条件は、次の通りであった：
・温度＝３０℃
・通気＝４リットル／リットル
・ｐＨ＝６．８
ＴＢＡの分解の後に、培養上清におけるガスクロマトグラフィ分析を行った。さらに培地Ｌｕｒｉａ上に塗布されたコロニーをカウントすることにより、および、光学濃度の測定により、バクテリア生物群の変動をモニターした。
【００２９】
結果を、図１に示す。この図では、基質の連続的添加を、５０時間、７０時間および２１０時間で行った。
【００３０】
５０時間の培養後、当初供給された全ＴＢＡを消費した。従って、ＴＢＡの第１添加を、４５０ｍｇ／リットルの濃度で行った。次いで消費後に、４００ｍｇ／リットルの第２添加と、３８０ｍｇ／リットルの第３添加とを行った。
【００３１】
得られた最終生物群は、６００ｎｍ  での最終Ｄ．Ｏ．  ７．０について３．５×１０９  ｕｆｃ．ｍ／リットルであった。
【００３２】
従って、この実施例において、例えば無機担体上のような担体上で得られる、例えばバクテリア固定化の後に、汚染流出物の処理の目的で使用される接種体を容易に得ることが可能であるのが認められた。本出願人によってフランス特許出願ＦＲ−２７８７７８３に記載されている「生体フィルター」型を使用する場合には、処理すべき流出物をこのバクテリア固定化担体上に通過させた。
【００３３】
［実施例３］
炭素およびエネルギーの源としてグルコース（５００ｍｇ／リットル）が添加された、実施例１に記載されている塩溶液含有無機培地ＭＭ２に株B. cepacia CIP I-2052を接種した。この第１培養物は、ＴＢＡが添加され（７５０ｍｇ／リットル）、微量元素が添加されない培地ＭＭ２の２００ｍｌに接種するために使用される。この微量元素を添加しない前培養により、最終培養物中に微量元素の痕跡を持ち込まないように、培地中の無機元素を消費し尽くすことが可能になった。この痕跡により、得られた成果が損なわれることがある。
【００３４】
こうして３０℃で９６時間のインキュベーション後に得られた前培養物は、７５０ｍｇ／リットルの濃度で炭素およびエネルギーの源としてＴＢＡが添加された培地ＭＭ２を２００ｍｌ含むフラスコに接種するために使用される。フラスコの各々に、実施例１に記載されている微量元素溶液の組成に含まれる元素のうちの１つおよび１つのみを、溶液自体を使用する場合と同じ最終濃度で、添加した。
【００３５】
各フラスコは、得られた３％（ｖ／ｖ）の前培養物から接種され、ついで撹拌インキュベーション器において３０℃でインキュベートされた。
【００３６】
これら種々のフラスコにおいて、７２時間のインキュベーション後に６００ｎｍで光学濃度を測定した。
【００３７】
種々の培養物を用いて得られた結果を、図２に示す。
【００３８】
この図において認められるように、微量元素溶液を添加することは、実施例１および実施例２において注目されるポジティブな効果を生じた。塩化コバルトのみの添加を用いて得られる最終光学濃度は、実施例１に記載されている、微量元素溶液を用いて得られる光学濃度よりも約２倍高いので、培地中での最終濃度１ｍｇ／リットルでの塩化コバルト・六水塩の添加により、増殖に関する大きな効果が証明された。
【００３９】
［実施例４］
実施例３においてと同じ実験を行ったが、株B. cepacia CIP I-2052における炭素およびエネルギーの源としてＴＢＡを使用する代わりに、実施例３においてと同じ割合でＴＡＡを使用した。得られた結果を表２にまとめた。これらは、先行実施例において既に記載した結果と同一であった。
【００４０】
【表２】
0004674657.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、B. cepacia CIP I-2052によるＴＢＡの分解と、時間に応じて、微量元素溶液の存在下でのその増殖Ｐ（ｕｆｃ／ｍＬ）とを表すグラフである。
【図２】図２は、B. cepacia CIP I-2052によるバイオマスの産生に関するいくつかの無機成分の添加効果を示すグラフである。
【図１】
0004674657.tif 000004
【図２】
0004674657.tif 000005