(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）後記の第２の部分に連結した、成長ホルモンを含む第１の部分、及び
ｉｉ）成長ホルモン受容体の細胞外ドメインを含む第２の部分を含む融合タンパク質であって、
アゴニストである融合タンパク質。
【請求項２】
前記第２の部分が成長ホルモン受容体のカルボキシル末端ＳＤ−１００ドメインである、
請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記第１の部分が成長ホルモンであり、成長ホルモンのカルボキシル末端と、成長ホルモン受容体のカルボキシル末端ＳＤ１００ドメインのアミノ末端との間に連結が形成されている、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記成長ホルモン受容体のカルボキシル末端ＳＤ−１００ドメインのアミノ末端の１２６〜１２８番目の任意の残基で連結している、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記カルボキシル末端ＳＤ−１００細胞外ドメインのアミノ末端の１２７番目の残基で連結している、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記第１の部分が、ペプチドリンカーによって前記第２の部分に結合している、請求項１から５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ペプチドリンカーが５〜３０個のアミノ酸残基からなる、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記ペプチドリンカーが１０〜２０個のアミノ酸残基からなる、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記ペプチドリンカーがペプチドＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒの少なくとも１つのコピーを含む、請求項７又は８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ペプチドリンカーが前記ペプチドＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒの２つのコピーを含む、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ペプチドリンカーが前記ペプチドＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒの３つのコピーを含む、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ペプチドリンカーが前記ペプチドＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒの４つのコピーを含む、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１５】
前記ベクターが組換え発現に適応している、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
前記ベクターが原核生物遺伝子発現に適応している発現ベクターである、請求項１４又は１５に記載のベクター。
【請求項１７】
前記ベクターが真核生物遺伝子発現に適応している発現ベクターである、請求項１４又は１５に記載のベクター。
【請求項１８】
前記ベクターが、前記融合タンパク質の精製を容易にするための分泌シグナルを含む、請求項１４から１７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１９】
請求項１３に記載の核酸または請求項１４から１８のいずれか１項に記載のベクターにより形質転換またはトランスフェクトされた細胞。
【請求項２０】
前記細胞が真核細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
前記細胞が、真菌細胞、昆虫細胞、両生類細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞からなる群から選択される、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
前記細胞が原核細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２３】
前記細胞が大腸菌である、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
前記組成物がキャリア、賦形剤、および／または希釈剤をさらに含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
成長ホルモン欠損症、小児期および成体発症成長ホルモン欠損症、異化患者における筋肉疲労、ターナー症候群、腎不全、骨粗鬆症、及び糖尿病の治療用の薬物を製造するための請求項１から１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項２７】
ｉ）前記ポリペプチドの製造に資する条件下で、請求項１３に記載の核酸または請求項１５から１８のいずれか１項に記載のベクターにより形質転換またはトランスフェクトされた細胞を増殖させるステップと、
ｉｉ）前記細胞またはその増殖環境から前記ポリペプチドを精製するステップとを含む、
請求項１から１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、細胞表面受容体に結合する薬剤；前記薬剤の製造方法；前記薬剤を含む治療組成物；および新規の薬剤を同定するためのスクリーニング法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
生化学的機構および／または分子機構の受容体媒介活性を介した細胞間シグナル伝達および／または細胞内シグナル伝達は、細胞恒常性および／または組織恒常性の維持のための基本的過程である。典型的には、適切な生化学反応を起こすために状態と相互作用するリガンドは、アゴニストと知られており、生化学反応を防止するリガンド（すなわち、妨害物質）はアンタゴニストとして知られている。例えば、限定されないが、細胞表面成長因子はアゴニストとして作用し細胞表面に存在する受容体に結合するリガンドである。リガンド特異的な結合による受容体の活性化は、細胞内シグナル伝達カスケードの活性化を介した細胞増殖を促進し、特に、細胞周期特異的遺伝子を発現し、静止期の細胞を増殖するように活性化する。成長因子はまた、細胞分化を活性化することができる。
【０００３】
サイトカインと呼ばれる多数の成長因子群は、多種多様にわたる細胞機能に関連する。これらには、例として、免疫系の調整、エネルギー代謝の調節、ならびに成長および発達の制御が含まれるが、これらに限定されない。リンパ球によって分泌されたサイトカインを、リンホカインという（インターロイキンとしても知られる）。単球およびマクロファージによって分泌されるサイトカインをモノカインという。サイトカインはまた、内分泌腺（例えば、下垂体による成長ホルモン（ＧＨ））および脂肪細胞（例えば、レプチン）によって分泌される。サイトカインは、標的細胞上の細胞表面で発現する受容体を介してその効果を媒介する。
【０００４】
サイトカイン受容体ファミリーの受容体は、１つの膜貫通ドメインを有し、固有の酵素活性を欠く（１）。サイトカインの同族受容体への結合の際、受容体ホモ二量体またはヘテロ二量体形成またはオリゴマー形成のいずれかが起こる。受容体複合体が内在化（インターナライズ）され、Ｊａｋ／ＳｔａｔおよびＭａＰｋ経路を含む関連シグナル伝達カスケードの活性化によってシグナル伝達が起こる。内在化の後のリサイクルステップによって細胞内でさらに使用するための受容体分子が再生される。
【０００５】
受容体／リガンド相互作用研究は、受容体分子およびそのリガンドの構造の定義によって容易になった。Ｘ線結晶学およびコンピュータモデリングを含むいくつかのアプローチにより、リガンド：受容体結合の生物学の理解が非常に容易になった。
【０００６】
ＧＨおよび成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）への結合に関して、上記の例が記載されている。この例は、例示に過ぎず限定を意図するものではないが、受容体：リガンド複合体の結合、二量体形成、および内在化によるシグナル伝達カスケードを活性化するサイトカインの例である。
【０００７】
１つの成長ホルモン（ＧＨ）分子は２つの受容体分子に会合することが知られている（３〜６）。これは、ＧＨ上の２つの固有の受容体結合部位および２つの受容体の細胞外ドメイン上の共通の結合ポケットによって起こる。ＧＨ分子上の部位１は、部位２よりも親和性が高く、受容体の二量体形成は、ＧＨ上の部位１への１つの受容体結合およびその後の部位２への第２の受容体の使用が連続的に起こると考えられる。
【０００８】
ＧＨＲの細胞外ドメインは、２つの連結したドメインとして存在し、それぞれ約１００個のアミノ酸（ＳＤ−１００）、Ｃ末端ＳＤ−１００ドメインは細胞表面付近に存在し、Ｎ末端ＳＤ−１００ドメインは最も離れて存在する。これは、三量体ＧＨＲ−ＧＨ−ＧＨＲが形成されるホルモン結合が起こるこれら２つのドメインの高次構造の変化である（図５）。リガンドにより起動される受容体二量体形成はシグナル活性化の誘導（３）、Ｊａｋ２／Ｓｔａｔ５経路を含むリン酸化カスケードを誘発する（７）重要な事象であると提案される。共焦点顕微鏡および蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を使用して、リガンド結合後にＧＨＲが非常に迅速に内在化され、この内在化およびシグナル伝達が独立した機能であることが知られている（１６）。ＧＨＲ−ＧＨ−ＧＨＲ複合体の内在化後のリサイクルステップによって細胞内でさらに使用するための受容体分子が再生される。
【０００９】
シグナル伝達における受容体二量体形成の重要性は、多数の実験によって示されている。単量体ＧＨ−ＧＨＲ複合体を好む高濃度のＧＨはＧＨシグナルを阻害する（８）。受容体内二量体化ドメインの変異は、ＧＨ結合に影響を与えることなくシグナル伝達を阻害する（１０）。最も有力な証拠は、受容体の二量体形成を防止するための部位２で変異したＧＨ分子を使用した研究に由来する。これらのＧＨ変異体は、ＧＨ刺激細胞増殖（８、１１〜１４）、受容体二量体形成に関連する高次構造変化（１５）、およびＪａｋ−Ｓｔａｔシグナル伝達（１６）を遮断する。
【００１０】
米国特許５，８４９，５３５号は、部位２の結合を妨害する多数のアミノ酸置換を含むヒト成長ホルモンを記載している。Ｇ１２０での異なるアミノ酸の置換は、部位２結合を妨害する１つの変異であり、ｈＧＨ変異体はｈＧＨアンタゴニストとして作用する。
【００１１】
ｈＧＨおよびｈＧＨ変異体のインビボでの有効性を、一部はｈＧＨ受容体に対する親和性および循環由来のクリアランス速度によって同定する。腎臓は、約２５％の心拍出量を受ける比較的小さな器官である。腎臓は、主に組成物および体液の体積の調節に関連するいくつかの重要な機能を担う。腎臓は、毎日約１００リットルの血漿ならびに腎臓中および腎臓外の血流を濾過し、たった約１％が尿となる。腎臓を通過した約２０％の血漿がネフロンに濾過される。血液の流体静力学的圧力によって駆動する糸球体で濾過される。水および小分子は濾過されるが、血球および高分子（例えば、ポリペプチド）は糸球体フィルターを通過しない。
【００１２】
約７０ｋＤａの有効分子量を有するこれらのポリペプチドは、単に大きすぎて濾過されないので、糸球体濾過によってクリアランスされない。一定の低分子量のタンパク質は糸球体によって濾過され、尿中で見出される。例えば、成長ホルモン（ＧＨ）の分子量は２２．１ｋＤａであり、腎臓は、ヒトでは６０〜７０％まで（Ｂａｕｍａｎｎ、１９９１；Ｈａｆｆｎｅｒら、１９９４）、ラットでは６７％まで（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｍａａｃｋ、１９７７）のＧＨのクリアランスを担う。腎臓によって濾過される比較的低分子量のポリペプチドの他の例には、レプチン、エリスロポイエチン、およびＩＬ−６が含まれる。
【００１３】
Ｓｙｅｄら（１９９７）は、ヒルジンとアルブミンとが融合した抗凝固融合タンパク質を構築した。この融合タンパク質は、血漿の半減期の延長を示す一方で強力な抗トロンビン（抗凝固）活性が維持されている。これは、おそらく腎臓による糸球体濾過の減少に起因するようである。しかし、このストラテジーに関連する問題は、ヒルジンが外来タンパク質であり、強力な免疫応答を誘発することが知られていることである。ヒルジン融合タンパク質の分子量の増加により、異化半減期が０．７時間から４．６日に増加する。
【００１４】
タンパク質の有効分子量を増加させ、免疫原性が減少した産物を産生するためのさらなる方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）中でタンパク質をコートすることである。ＧＨのインビボ半減期は、「ペグ化」と呼ばれるタンパク質とポリエチレングリコールとのコンジュゲーションによって増加した（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５２、３５８２〜３５８６、１９７７を参照のこと）。ＰＥＧは、典型的には、エチレンオキシド単量体あたり３つの水分子を有する非免疫原性非荷電ポリマーと特徴付けられている。ＰＥＧは、ペグ化タンパク質の流体力学的耐性の増加により腎臓クリアランスを遅延させると考えられている（Ｍａｘｆｉｅｌｄら、Ｐｏｌｙｍｅｒ、１６、５０５〜５０９、１９７５）。米国特許第５，８４９，５３５号はまた、１つまたは複数のポリオール（ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）など）とコンジュゲートしたヒトＧＨ（ｈＧＨ）変異体を記載している。
【００１５】
生物活性を保持し、且つ免疫サイレントな分子が得られるペグ化の代替法を本明細書中に開示する。受容体の細胞外ドメインまたはその一部を含むキメラタンパク質が可変可動リンカー分子を介してその同族リガンドに連結して、天然のリガンドよりも明らかに高い分子量の薬剤が得られる。提供した実施例では、約５５ｋＤａの分子量の成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の一部にＧＨを融合し、グリコシル化した場合に有効分子量が約７５ｋＤａに増加する。これは、キメラの腎臓による濾過の防止に十分であり、分子が生物活性を保持していることが重要である。
【００１６】
成長ホルモンの長期作用形態を、小児期および成体発症成長ホルモン欠損症の治療に使用することができる。成長ホルモンは周知の同化作用を示し、成長ホルモンの長期作用形態を、ターナー症候群における成長の促進、腎不全、骨粗鬆症、および異化患者における筋肉疲労を含む異化作用による多数の病態の治療に使用することができる。現在、ウシソマトトロピンを使用して、雌ウシのミルクの生産量を増加させている。成長ホルモンの長期作用形態は、雌ウシのミルク生産量の増加に有効な処理である（Ｐｅｅｌら、１９８１）。
【００１７】
このストラテジーは、リガンド−受容体組み合わせに適用可能である（例えば、レプチン、エリスロポイエチン、およびＩＬ−６）。例えば、肥満症治療薬としてレプチンが試験されている（Ｍａｎｔｚｏｒｏｓ＆Ｆｌｉｅｒ、２０００）。レプチンの長期作用形態を使用して、肥満症、インスリン抵抗性、高脂血症、および高血圧を治療することができる。エリスロポイエチンは赤血球の大きさにおいて重要である。エリスロポイエチンの長期作用形態を使用して、特に腎不全に関連する貧血を治療することができる。
【００１８】
受容体の細胞質ドメインを欠く先端切断型(truncated)ＧＨ受容体は、ＧＨシグナル伝達のドミナントネガティブインヒビターとして作用する（９、１９）。先端切断型受容体は、内在化に不可欠な細胞質ドメインを欠くので、細胞表面上で高レベルで発現する（１６）。ＧＨの存在下では、先端切断型受容体は全長受容体とヘテロ二量体を形成し、細胞質ドメインを欠くのでシグナル伝達を遮断する。先端切断型受容体は内在化できないので、ＧＨ受容体複合体の内在化を防止するドミナントネガティブインヒビターとして作用する。
【００１９】
過剰な成長ホルモンに起因する末端肥大症および巨人症は、通常、下垂体腫瘍による。現在試験中の薬物は、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の分子構造の最近得られた知識を使用してデザインしたペグ化ＧＨアンタゴニストＢ２０３６である。不運なことに、ＧＨ作用の拮抗には内因性ＧＨレベルよりも１００倍高い薬物レベルの高レベルのＢ２０３６を必要とする。
【００２０】
Ｂ２０３６は、変異部位２を有するにもかかわらず、受容体二量体に結合し、理想的な様式でＧＨ中に内在化される。しかし、これはシグナル伝達に必要な高次構造の変化を誘発しない。高用量のアンタゴニストの必要性は、その内在化ならびに可溶性および膜結合受容体への結合の相違に関する。ペグ化アンタゴニストは膜結合受容体に有効に結合しないにもかかわらず、ペグ化により半減期が増加し、免疫原性が低下する。非ペグ化アンタゴニストは、迅速に内在化し、クリアランスされる。
【００２１】
細胞によって内在化されず、且つより低い容量で送達することができるアンタゴニストを得る必要がある。これによりより有効且つ強力なアンタゴニストが得られ、より有効且つ経済的な治療が得られる。
【００２２】
レプチン受容体（２８）およびエリスロポイエチン（ＥＰＯ）受容体（２９、３０）は、ＧＨＲと相当な構造相同性を共有し、シグナル伝達を誘発するために類似の二量体形成ステップが必要である。レプチンは食欲を抑え、レプチン耐性は肥満に関係する。レプチン受容体アンタゴニストにより、神経性食欲不振の治療法が得られる。過剰なＥＰＯにより、二次的に低酸素症（慢性肺疾患）を発症し得る赤血球増加症または、真性一次性赤血球増加症（過剰赤血球障害）を発症する。ＥＰＯアンタゴニストにより赤血球増加症の治療法が得られる。
【００２３】
受容体：リガンド結合のさらなる例は、その同族受容体のＩＬ−６活性化によって得られる。その同族受容体の現在のＩＬ−６活性化モデルは、ＩＬ−６が可溶性または膜結合ＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に結合すると規定されている。次いで、ＩＬ−６／ＩＬ−６複合体は、２つのｇｐ１３０分子およびシグナル伝達分子に関連する細胞質ドメインを含む２つのｇｐ１３０分子の二量体形成による四量体シグナルを使用する（Ｇｒｏｔｚｉｎｇｅｒら、１９９９）。天然には、ＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒは互いに高親和性結合部位を有する個別の分子として存在し、共有結合およびジスルフィド結合の形成によってシグナル伝達分子ｇｐ１３０と会合する。
【００２４】
本発明者らは、受容体輸送および２つのサイトカイン受容体ファミリーメンバーＧＨおよびレプチンの結合タンパク質生成を研究している（９、１６、２０、２１）。これらの２つのホルモンは、成体における身体組成の決定において基本的役割を果たす。レプチンおよびＧＨは共にエネルギー消費、食欲、および脂肪量の調節に重要である。レプチンおよびＧＨの生物活性を操作する能力は、両ホルモンの過剰および欠損治療について重要な治療結果を示す。
【００２５】
共焦点顕微鏡および蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を使用して、本発明者らは、リガンド結合後にＧＨ受容体が非常に迅速に内在化され、内在化およびシグナル伝達が独立した機能であることを示した（１６）。本発明者らの最近の研究は、ＧＨアンタゴニストであるペグビソマントは、変異部位２を有するにもかかわらず、受容体に量体に結合し、理想的な様式でＧＨ中に内在化するが、シグナル伝達に必要な高次構造の変化を誘発しないことを示す。本発明者らは、高用量のアンタゴニストの必要性は、その内在化ならびに可溶性および膜結合受容体への結合の相違に関することを証明した。ペグ化アンタゴニストは膜結合受容体に有効に結合せず、非ペグ化アンタゴニストは、迅速に内在化およびクリアランスされる。
【００２６】
本発明者らは、受容体の細胞質ドメインを欠く先端切断型ＧＨＲは、ＧＨシグナル伝達のドミナントネガティブアンタゴニストとして作用することができることを証明した（図５）（９、２０）。先端切断型受容体は、内在化に不可欠な細胞質ドメインを欠くので、細胞表面上で高レベルに発現する（１６）。先端切断型受容体は全長受容体とヘテロ二量体を形成し、細胞質ドメインを欠くのでシグナル伝達を遮断し、細胞表面上に過剰に存在するのでドミナントネガティブとして作用し、ＧＨ受容体複合体の内在化を防止する。
【００２７】
ＧＨのアンタゴニストの作製における先端切断型受容体の使用に関して２つの問題が存在する。膜中の先端切断型受容体は、細胞内で作製しなければならない。ＧＨＲはまた、タンパク質分解され、その後先端切断型受容体の大部分は循環によって失われる。
【００２８】
ＧＨを、そのＣ末端およびリンカーを介してＧＨＲのＣ末端ＳＤ−１００ドメインのＮ末端に結合させる。リンカーの長さの変化によって、部位１によるＧＨの細胞表面上での全長受容体を結合させる可動性を有する分子が定義される。次いで、受容体のＣ末端ＳＤ−１００ドメインを、三量体構造ＧＨＲ−ＧＨ−ＧＨＲｔｒ（式中、ＧＨＲｔｒはＣ末端ＳＤ−１００ドメインである）を完了させるために循環させる。この複合体はシグナル伝達も内在化もせず、ＧＨ作用を有効に拮抗する。大部分のＧＨがＧＨＲを介して切断されるので、低免疫原性および低クリアランスというさらなる利点を有する（２２）。
【００２９】
本発明者らはまた、レプチン受容体は多数のサイトカイン受容体が行うように（２）可溶性結合タンパク質（２１）を生成し、レプチン受容体の支配的末梢形態は先端切断型ＧＨＲと類似の先端切断型受容体である（２７、２８）。本発明者らの最近の研究により、先端切断型レプチン受容体はレプチンシグナル伝達を阻害することができることが証明された。エリスロポイエチン（ＥＰＯ）受容体は、ＧＨＲと非常に類似した結晶構造を共有し、ＥＰＯ受容体のＣ末端ＳＤ１００を有するＥＰＯキメラは、アンタゴニストとして機能する。
【００３０】
［発明の記述］
本発明によれば、受容体結合ドメインを含む第２の部分に連結した受容体のリガンド結合ドメインに結合することができる第１の部分を含み、前記受容体の活性を調整する結合剤が得られる。
【００３１】
本発明の１つの実施形態では、結合剤が前記受容体の活性に拮抗する。
【００３２】
本発明の別の実施形態では、結合剤が前記受容体の活性を作動する。
【００３３】
好ましくは、第１の部分はサイトカインまたはサイトカインの結合ドメインを含む。
【００３４】
さらにより好ましくは、第１の部分は、成長ホルモン；レプチン；エリスロポイエチン、プロラクチン；ＴＮＦ；インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１；ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５のｐ３５サブユニット；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；カルディオトロフィン１（ＣＴ−１）；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）；インターフェロン、ＩＦＮα、およびＩＦＮγから選択されるサイトカインまたはサイトカインの結合ドメインを含む。
【００３５】
好ましくは、第２の部分は少なくともサイトカインの同族受容体の一部または関連受容体の一部を含む。
【００３６】
好ましくは、第１の部分はＧＨである。
【００３７】
好ましくは、第２の部分はＧＨＲの１つの細胞外ドメインである。より好ましくは、第２の部分はＧＨＲのＣ末端ＳＤ−１００ドメインである。
【００３８】
別の実施形態では、前記第１の部分はＩＬ−６またはＩＬ−６の結合ドメインであり、前記第２の部分はｇｐ１３０の一部である。
【００３９】
本発明の実施形態により、その受容体に対する親和性が高く、先端切断型受容体が内在化できないのでサイトカインおよびその同族受容体のキメラである特異的受容体アンタゴニストが生成されるサイトカインが開発される。本発明の結合剤は、サイトカインのその受容体への結合により受容体−サイトカイン複合体の内在化が誘発されないという重要な利点を有する。これは、アンタゴニストの投薬量を最小にすることができることを意味する。
【００４０】
本発明の１つの実施形態では、結合剤は融合タンパク質である。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、第１の部分は、リンカーによって第２の部分に連結されている。リンカーは可動性を示し得る。
【００４２】
リンカーは、成長ホルモンを細胞表面で遊離した受容体に結合可能な受容体の細胞外ドメイン内の任意の残基に存在し得る。第１の部分はＧＨであり、第２の部分はＧＨＲの１つの細胞外ドメインであり、ＧＨおよびＧＨＲ中の任意のペプチド残基の間で結合可能である。好ましくは、ＧＨ分子のＣ末端付近の残基とＧＨＲのＮ末端付近の残基との間で結合している。より好ましくは、ＧＨ分子のＣ末端付近の残基とＣ末端ＳＤ−１００のＮ末端のＮ末端付近の残基との間で結合している。より好ましくは、ＧＨＲのＣ末端ＳＤ−１００のＮ末端の１２６〜１２８番目の任意の残基に結合している。本発明の１つの実施形態では、Ｃ末端ＳＤ−１００のＮ末端の１２７番目の残基に結合している。好ましくは、リンカーはペプチドである。
【００４３】
別のリンカーを使用して第１および第２の部分を連結することができることが当業者に明らかである。適切なリンカーは核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）；ペプチド核酸；化学的架橋剤（例えば、ポリオキシエチレン）であるが、これらは例示であり、限定することを意図するものではない。
【００４４】
ＧＨＲ−ＧＨ−ＧＨＲ複合体の結晶構造により、ＧＨのＣ末端（残基１９１）とＣ末端ＳＤ−１００のＮ末端（１２６〜１２８番目の残基）の間の距離は１０Åであることが明らかとなる。これにより、リンカーデザインに関して非常に貴重な情報が得られる。
【００４５】
好ましくは、リンカーは、５〜３０個のアミノ酸残基を含むポリペプチドである。より好ましくは、リンカーは、１０〜２０個のアミノ酸残基を含む。
【００４６】
より好ましくは、リンカーはペプチド、
ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（以後、「Ｇｌｙ４Ｓｅｒ」という）
の少なくとも１つのコピーを含む。
【００４７】
本発明の１つの実施形態では、リンカーの長さは１０個のアミノ酸であり、且つリンカーはＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーの２つのコピーを含む。本発明の別の実施形態では、リンカーの長さは１５個のアミノ酸であり、且つリンカーはＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーの３つのコピーを含む。本発明のさらに別の実施形態では、リンカーの長さは２０個のアミノ酸であり、且つリンカーはＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーの４つのコピーを含む。
【００４８】
本発明のさらなる態様によれば、ｉ）図４、５、８、９、および２１を含む群、
ｉｉ）上記の（ｉ）の配列とハイブリッド形成し、受容体拮抗活性を有する核酸、および
ｉｉｉ）上記の（ｉ）および（ｉｉ）で定義の配列に対する遺伝コードの結果として縮重する核酸配列からなる群から選択される、本発明の結合剤をコードする核酸配列を含む核酸分子が得られる。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態では、核酸は、ストリンジェントなハイブリッド条件下で図４、５、８、９、または２１に記載の配列にハイブリッド形成する。
【００５０】
ストリンジェントなハイブリッド形成／洗浄条件は当該分野で周知である。例えば、６０℃での０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後に適切な核酸ハイブリッドである。核酸配列が既知の場合、至適ハイブリッド形成条件を計算することができることが当該分野で周知である。例えば、ハイブリッド形成条件を、ハイブリッド形成される核酸のＧＣ含量によって決定することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」を参照のこと。特定の相同性を示す核酸分子間のハイブリッド形成の達成に必要なストリンジェンシー条件の一般的な計算式は以下である。
Ｔm＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ+］＋０．４１［％Ｇ＋Ｃ］−０．６３（％ホルムアミド）。
【００５１】
典型的には、ハイブリッド形成条件は、４〜６×ＳＳＰＥ（１リットルに溶解し、ｐＨを７．４に調整した２０×ＳＳＰＥは、１７５．３ｇ  ＮａＣｌ、８８．２ｇ  ＮａＨ2ＰＯ4Ｈ2Ｏ、および７．４ｇ  ＥＤＴＡを含む）；５〜１０×デンハルト溶液（５ｇ  Ｆｉｃｏｌｌ（タイプ４００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、５ｇポリビニルピロリドン、および５ｇウシ血清アルブミン／５００ｍｌを含む５０×デンハルト溶液）；１００μｇ〜１．０ｍｇ／ｍｌ超音波処理サケ／ニシンＤＮＡ；０．１〜１．０％ドデシル硫酸ナトリウム；任意選択的に４０〜６０％の脱イオンホルムアミドを使用する。ハイブリッド形成温度は、核酸標的配列のＧＣ含量に依存して変化するが、典型的には４２℃と６５℃との間である。
【００５２】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドが得られる。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態では、このようにしてコードされたポリペプチドを、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、または置換によって改変する。理想的には、前記改変により、受容体媒介細胞シグナル伝達の阻害または活性化に関してポリペプチドの拮抗または作動効果が増強される。
【００５４】
あるいはまたは好ましくは、改変には、組換えまたは合成形態のポリペプチドの産生における改変アミノ酸の使用が含まれる。
【００５５】
可変アミノ酸には、例として、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、Ｎ6−アセチルリジン、Ｎ6−メチルリジン、Ｎ6，Ｎ6−ジメチルリジン、Ｎ6，Ｎ6，Ｎ6−トリメチルリジン、シクロヘキシアラニン、Ｄ−アミノ酸、オルニチンが含まれるが、これらに限定されないことが当業者に明らかである。改変アミノ酸の組み込みにより、図２１を含むポリペプチドに対して有利な性質を付与することができる。例えば、改変アミノ酸の組み込みによりポリペプチドのその受容体に対する親和性を増加させることができるか、改変アミノ鎖により、ポリペプチドのインビボ安定性を増加させて、患者に投与するポリペプチドの有効量を減少させることが可能である。
【００５６】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の任意の前記態様または実施形態による結合剤をコードするＤＮＡ分子を含むベクターが得られる。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の結合剤の組換え製造手段によってベクターが得られる。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態では、ベクターは原核生物遺伝子発現に適応する発現ベクターである。
【００５９】
原核生物発現系は当該分野で周知であり、高レベルの構成的および誘導発現に適応するベクターを含む。組換えポリペプチドが細菌細胞に有毒である場合、誘導発現系は特に有利である。発現の誘導を、種々のインデューサーに反応するプロモーターによって厳密に制御される（例えば、ＩＰＴＧ誘導性）。細菌細胞を、誘導前の静止期まで増殖させることができる、それにより有毒ポリペプチドの有害性を減少させることができる。
【００６０】
さらに、一定のポリペプチドは、例えば、タンパク質の安定性または凝集の問題により組換え製造が困難であることも当該分野で周知である。天然および組換え細菌ポリペプチドの産生を容易にする遺伝子（例えば、細菌プロテアーゼ）が変異した遺伝子改変細菌株が利用可能であることが周知である。
【００６１】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ベクターは、真核生物発現に適応した発現ベクターである。
【００６２】
典型的には、適用には、例として、細胞／組織特異的発現を媒介する転写調節配列（プロモーター配列）の提供が含まれるが、これらに限定されない。これらのプロモーター配列は、細胞／組織特異的であるか、誘導可能であるか、構成的であり得る。
【００６３】
プロモーターは当該分野で認識された用語であり、明白にする目的で、これには、例示のみで限定しない以下の特徴が含まれる。エンハンサーエレメントは、しばしば遺伝子の転写阻害部位の５’末端で見出されるシス作用酢酸配列である（エンハンサーを、遺伝子配列の３’末端でも見出すことができるか、イントロン配列中に存在するので位置独立性である）。エンハンサーは、エンハンサーが連結する遺伝子の転写速度を増大させるように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサーエレメントに特異的に結合することが示されているトランス作用転写因子（ポリペプチド）に反応性を示す。転写因子の結合／活性（Ｄａｖｉｄ  Ｓ  ＬａｔｃｈｍａｎによるＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏを参照のこと）は、例えば、中間代謝産物（例えば、グルコース、脂質）、環境エフェクター（例えば、光、熱）が含まれるが、これらに限定されない多数の環境因子に反応性を示す。
【００６４】
プロモーターエレメントはまた、いわゆるＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位を選択するように機能するＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列を含む。これらの配列はまた、特に、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を容易にするように機能するポリペプチドに結合する。
【００６５】
適用には、真核細胞または原核細胞のいずれかでのベクターの維持を容易にする選択マーカーおよび自律複製配列の提供も含まれる。自立的に維持されたベクターを、エピソームベクターという。
【００６６】
ベクターコード遺伝子の発現を容易にする適用には、転写終結／ポリアデニル化配列の提供が含まれる。これにはまた、２シストロンまたは多シストロン発現カセット中に配列されたベクターコード遺伝子の発現を最大にするように機能する内部リボゾーム結合部位（ＩＲＥＳ）の提供が含まれる。
【００６７】
これらの適用は、当該分野で周知である。一般に、発現ベクター構築および組換えＤＮＡ技術の発現に関する有意数の公開文献が存在する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹおよびその参考文献；Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｆ、１９８７、「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、第ＩＩＩ巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  ＵＫ；「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９４を参照のこと。
【００６８】
本発明のなおさらなる態様では、
（ｉ）ポリペプチドの製造のための条件下で、本発明のベクターまたは核酸により形質転換またはトランスフェクトされた細胞を増殖させるステップと、
ｉｉ）前記細胞またはその増殖環境から前記ポリペプチドを精製するステップとを含む、本発明の結合剤ポリペプチドの調製方法が得られる。
【００６９】
本発明の好ましい方法では、ベクターは、結合剤ポリペプチドの生成を容易にするために分泌シグナルをコードするので、これを使用して組換えポリペプチドが得られる。
【００７０】
本発明のなおさらなる態様では、本発明のベクターまたは核酸により形質転換またはトランスフェクトした細胞が得られる。
【００７１】
好ましくは、細胞は真核細胞であり、真菌；昆虫（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）；両生類；植物；哺乳動物から選択される。
【００７２】
より好ましくは、細胞は原核細胞であり、大腸菌細胞である。
【００７３】
好ましくは、本発明の結合剤を、末端肥大症、巨人症、成長ホルモン欠損症、ターナー症候群、腎不全、骨粗鬆症、糖尿病、癌、肥満症、インスリン抵抗性、高脂血症、高血圧症（レプチンキメラ）、貧血症、自己免疫疾患および感染症、慢性関節リウマチを含む炎症性障害の治療用の薬物を製造するために使用する。
【００７４】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の結合剤を含む医薬組成物が得られる。好ましくは、医薬組成物には、キャリア、賦形剤、および／または希釈剤が含まれる。
【００７５】
本発明はまた、有効量の医薬組成物／薬物を被験体に投与するステップを含む、ヒトまたは動物被験体の治療法を提供する。
【００７６】
組成物／薬物を経口または鼻用スプレー、エアゾール、懸濁液、乳濁液、および／または点眼液の形態で得ることができることが当業者に明白である。あるいは、薬物を、錠剤形態で得ることができる。別の送達手段には、吸入または噴霧器が含まれる。
【００７７】
あるいはまたは好ましくは、薬物を直接注射によって送達させることができる。組成物／薬物を静脈内、筋肉内、皮下、または局所的に送達させることができることも考えられる。なおさらに、組成物／薬物を、経口または直腸投与することができる。
【００７８】
本発明はまた、本発明の任意の実施形態の結合剤を形成するステップを含む、腎臓での分子クリアランスを減少させる方法を提供する。
【００７９】
本発明の実施形態を、以下の図面を参照して例示のみを目的として記載する。
【００８０】
［材料と方法］
表３は、タンパク質構築物の定義に使用した名称を説明する。
【００８１】
ＧＨ：ＧＨＲ融合タンパク質の産生
６つの構築物（ＧＨＲのＣ２４１を含むか含まない３つの異なる長さのリンカー）を、Ｃ末端ポリＨｉｓ発現ベクターにクローン化する。従来の制限部位を使用した信頼性の高いプルーフリーディングＰｆｕを使用してヒトＧＨを増幅し、ベクターにクローン化する。Ｃ末端ＳＤ−１００ＧＨＲを同様に増幅し、従来の制限部位を使用してプライマー中でリンカーを構築してＣ末端ＧＨにクローン化する。次いで、構築物を完全に配列決定する。
【００８２】
ＧＨＲ−ＧＨ−ＧＨＲ複合体の結晶構造から、ＧＨのＣ末端（前記１９１）とＣ末端ＳＤ−１００ＧＨＲｎＮ末端（１２６〜１２８番目の残基）との間の距離は１０Ａである。１０〜２０前記の間のリンカーをデザインし、３つの構築物を、Ｇｌｙ4Ｓｅｒリンカーの２、３、または４コピーを含む１０、１５、または２０残基のいずれかのリンカーを使用して作製した。
【００８３】
タンパク質の精製
構築物を大腸菌（ＪＭ１０９）中で発現させ、タンパク質をイオン交換クロマトグラフィーによる第２の精製ステップを使用するＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ  Ｘｐｒｅｓｓシステムニッケルカラムで精製した。リポ多糖類は、細胞培養系で比較的短いインキュベーション時間を必要とするので、バイオアッセイを干渉しないはずである。必要ならば、キメラアンタゴニストを、ポリミキシンＢカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してさらに精製する。
【００８４】
アンタゴニスト活性のスクリーニング
確立されたバイオアッセイを使用して、アンタゴニスト活性をスクリーニングする（９）。全長ＧＨＲを発現する永久細胞株を、活性化Ｓｔａｔ５に結合するルシフェラーゼレポーターで一過性にトランスフェクトする（９）。２４時間後、アンタゴニストを含むまたはアンタゴニストを含まないＧＨで細胞を６時間刺激する。次いで、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定した（９）。
【００８５】
アゴニスト活性のスクリーニング
全長ＧＨＲを発現する永久細胞株を、活性化Ｓｔａｔ５に結合するルシフェラーゼレポーターで一過性にトランスフェクトする（９）。２４時間後、細胞をＧＨ／ＧＨＲで６時間刺激するまたは刺激しない。次いで、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定した（９）。
【００８６】
ＧＨｓｔｏｐを作製するための下垂体ｃＤＮＡ由来の下垂体ＧＨのＰＣＲ
全長ヒト成長ホルモンを、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  ＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲシステムを使用してヒト下垂体ｃＤＮＡから増幅した。各反応物は、以下からなる。全体赤５０μｌのプライマーＧＨＳ１−２３（正方向）およびＧＨＡ５７３ｎｏｔ（逆方向）を各１０μＭ，２００μＭ  ｄＮＴＰ、５μｌの伸長緩衝液＋塩化マグネシウム（１．５ｍＭ）、および０．６μｌの高信頼性酵素混合物。
【００８７】
サンプルを以下に示す。
１．ＧＨＳ１−２３およびＧＨＡ５７３ｎｏｔプライマーを使用した下垂体ｃＤＮＡ
２．アクチン特異的プライマーを使用した下垂体ｃＤＮＡ
３．アクチンについてのコントロールｃＤＮＡ
４．水コントロール
【００８８】
ＰＣＲ反応マスターミックス１
【表１】
0004660062.tif 000002
【００８９】
マスターミックス２（反応あたり）
１０×伸長高信頼性緩衝液（＋マグネシウム）（５μｌ）
滅菌蒸留水（１９．４μｌ）
伸長高信頼性伸長ポリメラーゼ（０．６μｌ）
２５μｌのマスターミックス２をマスターミックス１に添加し、鉱物油で重層する。
ＰＣＲを以下の方法で行った、
９４℃：２分間、
９４℃：３０秒間／５４℃：１分間／７２℃：１分間を３０サイクル
７２℃：１０分間。
【００９０】
５’ヌクレオチド（ＧＨＳ１−２３）は、成長ホルモン遺伝子の５’末端と配列相同性を示し、３’ヌクレオチド（ＧＨＡ５７３ｎｏｔ）は、２つの終止コドンと共にＮｏｔＩ部位を含む。ＰＣＲ反応により、全長ヒト成長ホルモンを含む５８８ｂｐのバンドが産生された（図２を参照のこと）。次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してフラグメントを精製し、ＴＯＰＯをｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、図１を参照のこと）にクローン化した。ライゲーション物を、塩化セシウム法によって大腸菌ＴＯＰＯワンショット細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。プラスミドミニ調製物を、陽性の形質転換体から産生し、ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩを使用した制限消化によってスクリーニングした。次いで、正確なインサートサイズのクローンを５’および３’がインサート領域に結合するＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎが販売しているベクター特異的プライマー（Ｘｐｒｅｓｓ正方向プライマーおよびｐＴｒｃＨｉｓ逆方向プライマー、表１を参照のこと）を使用して配列決定した。この構築物をｐＴｒｃＨｉｓＧＨｓｔｏｐと命名し、その後のクローニング反応のテンプレートとして使用した。
成長ホルモンプライマー「ＧＨＳ１−２３」の正方向プライマー
【化１】
0004660062.tif 000003
逆方向プライマーＧＨＡ５７３ｎｏｔ
【化２】
0004660062.tif 000004
【００９１】
ヒト肝臓ｃＤＮＡ由来のＧＨＲのＣ末端ＳＤ１００ドメインのＰＣＲ
ＧＨＲのＣ末端ＳＤ１００ドメイン（図３）を、先に記載のものと同一のＰＣＲ法を使用するが、プライマーＧＨＲＳ４７６（正方向）おおびＧＨＲＡ８３５Ｈ（逆方向）を使用してヒト肝臓ｃＤＮＡから増幅した（表１を参照のこと）。５’ヌクレオチドは、ＥｃｏＲＩ部位を含み、３’ヌクレオチドは２つの終止コドンおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。ＰＣＲ反応を行い、先に記載のように明澄化した。
【００９２】
サンプルは以下のとおりである。
１．ＧＨＲ４７６およびＧＨＲＡ８３５Ｈを使用する肝臓ｃＤＮＡ、
２．アクチン特異的プライマーを使用する肝臓ｃＤＮＡ、
３．コントロールｃＤＮＡ，
４．水コントロール。
【００９３】
ＰＣＲ反応マスターミックス１
【表２】
0004660062.tif 000005
【００９４】
マスターミックス２（反応あたり）
１０×伸長高信頼性緩衝液（＋ＭｇＣｌ2）（５μｌ）
滅菌蒸留水（１９．４μｌ）
伸長高信頼性伸長ポリメラーゼ（０．６μｌ）
２５μｌのマスターミックス２をマスターミックス１に添加し、鉱物油で重層する。
【００９５】
両ベクター、ｐＴｒｃＨｉｓＧＨｓｔｏｐ、およびＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩ制限酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した二重消化物に供した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用してきれいにし、消化ｐＴｒｃＨｉｓＧＨｓｔｏｐベクターを、アガロースゲル電気泳動によって分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用して精製した。ＧＨＲのＣ末端ＳＤ１００ドメインを含む消化ＰＣＲフラグメントを上記消化ベクターにライゲーションして、塩化カルシウム法によってＴＯＰＯワンショット細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。ライゲーション物を大腸菌ＴＯＰＯワンショット細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。プラスミドミニ調製物を陽性の形質転換体から産生し、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した制限消化物およびＧＨＳ１−２３およびＧＨＲＡ８３５Ｈプライマーを使用したＰＣＲスクリーニングによってスクリーニングした。次いで、正確なインサートサイズのクローンを、ｐＴｒｃＨｉｓ逆方向プライマーおよびＧＨｓｅｑＦプライマー（表１を参照のこと）を使用して配列決定した。このベクターをｐＴｒｃＨｉｓＧＨｓｔｏｐＧＨＲと呼び、ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ部位へのＧＨとＧＨＲとの間の種々の長さのリンカー領域の挿入用の伝達体として使用した。図４は、ｐＴｒｃＨｉｓＧＨｓｔｏｐＧＨＲの全インサート配列を示す。
【００９６】
この構築物により、ＧｈｓｔｏｐとＧＨｌｉｎｋＧＨＲとの間のＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ部位にリンカー分子を挿入可能である。
【００９７】
リンカー領域の挿入
４つのグリシン残基および１つのセリン残基（全部で２０残基）の４×反復配列から構成される初期リンカーを、オリゴヌクレオチドＧ４Ｓ４（正方向）およびＧ４ＣＯＭ４（逆方向）のアニーリングによって構築した（表１を参照のこと）。５’ヌクレオチドは、ＮｏｔＩ部位を含み、３’ヌクレオチドはＥｃｏＲＩ部位を含む。ベクターｐＴｒｃＨｉｓＧＨｓｔｏｐＧＨＲを、ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で二重消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してきれいにした。
【００９８】
【化３】
0004660062.tif 000006
【００９９】
リンカーインサートの調製
オリゴヌクレオチドＧ４Ｓ４およびＧ４ＣＯＭＳ４を、アニーリング緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に最終濃度０．１ｐｍｏｌ／μｌに再懸濁した。等量の各オリゴヌクレオチドを混合し、９５℃で２分間過熱し、１時間かけて冷却した。
【０１００】
次いで、オリゴヌクレオチド二重らせんを、ＮｏｔＩ／ＥｃＲＩ二重消化ベクターｐＴｒｃＨｉｓＧＨｓｔｏｐＧＨＲにライゲーションし、塩化カルシウム法によってＴＯＰＯワンショット細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。プラスミドミニ調製物を陽性の形質転換体から産生し、ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩを使用した制限消化物およびＧＨＳ１−２３およびＧＨＲＡ８３５Ｈプライマーを使用したＰＣＲスクリーニングによってスクリーニングした。次いで、正確なインサートサイズのクローンを、ｐＴｒｃＨｉｓ逆方向プライマーおよびＧＨｓｅｑＦプライマー（表１を参照のこと）を使用して配列決定した。このベクターをｐＴｒｃＨｉｓＧＨｌｉｎｋＧＨＲと呼んだ（図１を参照のこと）。
【０１０１】
ライゲーションプロセスにより、ＧＨｓｔｏｐ領域内ｎ３’終止コドンが除去されるので、全長ＧＨｌｉｎｋＧＨＲの転写が可能である。
【０１０２】
同一のストラテジーを使用して、ＳＤ１００ＮおよびＣ末端ドメインを組み込んだＧＨＲの全長細胞外ドメイン中でクローン化した。
【０１０３】
ＧＨＲの全長細胞外ドメイン（ＧＨＲｆｌｅｃ）の構築
ＧＨＲの全長細胞外ドメイン（ＳＤ１００ＮおよびＣ末端）を、ＧＨｓｔｏｐの作製について先に記載のものと同一のＰＣＲプロトコールにしたがって、プライマーＧＨＲＳ１ＥＣＯＲおよびＧＨＲＡ８３５Ｈ（表１を参照のこと）を使用して増幅させた。５’ヌクレオチド（ＧＨＲＳ１ＥＣＯＲ）は、ＥｃｏＲＩ部位を含み、３’ヌクレオチドはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。ＰＣＲ反応により全長細胞外ＧＨＲを含む７２６ｂｐのバンドが産生され（図７を参照のこと）、ＱｉａｑｕｉｃｋＰＣＲクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。両ベクターｐＴｒｃＨｉｓＧＨｌｉｎｋＧＨＲおよびＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩ制限酵素を使用した二重消化物に供した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲクリーンアップキットを使用してきれいにし、消化ベクターを、アガロースゲル電気泳動によって分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用して精製した。
【０１０４】
両ベクターｐＴｒｃＨｉｓＧＨｌｉｎｋＧＨＲおよびＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してきれいにした。次いで、消化ＰＣＲ産物を、消化ｐＴｒｃＨｉｓＧＨｌｉｎｋＧＨＲベクターにライゲーションし、塩化カルシウム法によってＴＯＰＯワンショット細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。陽性の形質転換体を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用した制限消化物ならびにプライマーＧＨＲＳ１ＥＣＯＲおよびＧＨＲＡ８３５Ｈを使用したＰＣＲによってスクリーニングした。正確なサイズのインサートを有するクローンを、ＧＨｓｅｑＦおよびベクター特異的プライマーｐＴｒｃＨｉｓ（逆方向）を使用して配列決定した。新規の構築物をｐＴｒｃＨｉｓＧＨｌｉｎｋＧＨＲｆｌｅｃと呼んだ。次いで、これを任意のさらなるリンカーインサートのテンプレートとして使用することができる。
【０１０５】
ｐＪＯＮＥＸ４へのＧＨｓｔｏｐおよびＧＨｌｉｎｋＧＨＲのクローニング
強力な転写リプレッサー（ｃＩ８５７）および熱誘導性プロモーター（ＰＬλ）の調節下に置くことによって細胞に潜在的に有害な誘導タンパク質を発現させるためにｐＪＯＮＥＸ４ベクター（図１を参照のこと）を構築した。ｐＪＯＮＥＸ４の構築は、他で記載されている（Ｊｏｎ  Ｒ．Ｓａｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１９巻、第１５号、４１２７〜４１３２、１９９１）。
【０１０６】
ＰＬλプロモーター領域を、ＥｃｏＲＩ部位中のｐＵＣ１９にクローン化し、１つのＥｃｏＲＩ部位がｐＪＯＮＥＸ４を産生するためのプロモーターの下流に残存するように操作した。転写を望む遺伝子をＰＬλプロモーターのＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ上流領域に挿入することができる。このベクターを使用して、温度感受性λリプレッサー（ｃＩ８５７）を特定する細菌に形質転換することができるので、３０℃未満の低温で、転写の読み取りはリプレッサータンパク質の存在によって阻止される。しかし、タンパク質発現の高温（４２℃）での誘導が進行する。主な目的は、親ベクターｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯ由来の全長ＧＨｓｔｏｐおよびＧＨｌｉｎｋＧＨＲについてそれぞれＰＣＲを行い、ｐＪＯＮＥＸ４中のＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にこれらのフラグメントをサブクローン化するためのプライマーを構築することである。
【０１０７】
５’ヌクレオチドであるＴｒｃＲＢＳｓａｃＦは、操作ＳａｃＩ制限部位、新規のリボゾーム結合部位、およびｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯベクター中に存在するＡＴＧ開始コドンを含む。２つの３’ヌクレオチドを使用して、それぞれその親ベクターｐＴｒｃＨｉｓ由来のＧＨｓｔｏｐおよびＧＨｌｉｎｋＧＨＲについてＰＣＲを行う。３’ヌクレオチドであるＴｒｃＨｉｎｄｒｅｖはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含み、これを使用して全長ＧＨｓｔｏｐ遺伝子についてＰＣＲを行う。他のヌクレオチドであるＧＨＲＡ８３５Ｈは既に記載されており、これを使用してＧＨｌｉｎｋＧＨＲについてＰＣＲを行う（表１を参照のこと）。
【０１０８】
ＴｒｃＲＢＳＳａｃＩｆ：
【化４】
0004660062.tif 000007
【０１０９】
ＴｒｃＨｉｎｄＩＩＩｒｅｖ：
【化５】
0004660062.tif 000008
【０１１０】
ＰＣＲ法
９６℃で２分間、
９４℃で３０秒間／５４℃で１分間／７２℃で１分間を３０サイクル
７２℃で１０分間
【０１１１】
ＰＣＲ反応；マスターミックス１
【表３】
0004660062.tif 000009
【０１１２】
マスターミックス２（反応あたり）
伸長高信頼性緩衝液（＋マグネシウム、最終１．５ｍＭ）（５μｌ）
伸長高信頼性伸長ポリメラーゼ（０．６μｌ）
滅菌蒸留水（１９．４μｌ）
２５μｌのマスターミックス２をマスターミックス１に添加し、鉱物油で重層する。
【０１１３】
ＰＣＲフラグメントおよびｐＪＯＮＥＸ４ベクターを共にＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを使用した二重制限消化物に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。次いで、消化ＰＣＲフラグメントを上記の消化ベクターにライゲーションし、エレクトロポレーション法によって大腸菌Ｍ７２（λ）細胞中で形質転換した。プラスミドミニプレップを陽性の形質転換体から産生し、ＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを使用した制限消化物ならびにＧｈｓｔｏｐのヌクレオチドＴｒｃＲＢＳｓａｃ１およびＴｒｃＨｉｎｄｒｅｖならびにＧＨｌｉｎｋＧＨＲのＴｒｃＲＢＳｓａｃＩおよびＧＨＲＡ８３５Ｈを使用したＰＣＲによってスクリーニングした。正確なサイズのクローンを、ＧＨＳ１−２３、ＧｈｓｅｑＦ、Ｘｐｒｅｓｓ正方向およびＧＨＡ５７３ｎｏｔを使用して配列決定した。
【０１１４】
ｐＴＺ１８Ｕ／ｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯ／ｐＪＯＮＥＸ４ベクターへの全長ＩＬ−６およびｇｐ１３０のクローニング
種々のベクターにおいてＩＬ−６／ｇｐ１３０キメラを得る。ｐＴＺ１８Ｕへのクローニングにより、インビトロ変異誘発が促進され、ｐＪＯＮＥＸ４およびｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯベクターを使用して、大腸菌中で組換えタンパク質を作製することができ、ニッケルカラムを使用してこれを精製することができる。
【０１１５】
クローニングは、Ｇｈｓｔｏｐ／ＧＨｌｉｎｋＧＨＲについて考案されたＴＡクローニングストラテジーを使用してｐＴｒｃＨｉｓにて行った。従ってキメラは制限部位ＢａｍＨ1／ＨｉｎｄＩＩＩを使用してｐＪｏｎｅｘおよびｐＴＺ１８Ｕ系サブクローン化する。
【０１１６】
これにより、ｐＪＯＮＥＸ中の上流ＲＢＳおよびＨｉｓ６タグが維持され、変異誘発実験のためにｐＴＺ１８Ｕ（同一の多クローニング部位を有する）に挿入可能である。
【０１１７】
このストラテジーは、別の制限部位ＳａｌＩ（またはＸｈｏＩ）と共にＮｏｔＩ部位を含む３’プライムヌクレオチドを使用したＩＬ−６（全長：以下の配列を参照のこと、図１）でのＴＡのクローン化である。したがって、このＳａｌＩ部位により、ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位へのｇｐ１３０遺伝子のクローニングが可能である（ＨｉｎｄＩＩＩはｐＴｒｃＨｉｓベクターの３’末端中に存在する）。次いで、リンカーを、ＮｏｔＩ／ＳａｌＩ部位に挿入することができる。
【０１１８】
一旦配列決定された構築物を、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを使用してｐＪｏｎｅｘおよびｐＴＺ１８Ｕベクターにサブクローン化する。
【０１１９】
ＩＭＡＧＥクローンまたはヒトリンパ球由来のｃＤＮＡ由来のＰＣＲによって、ＩＬ−６およびｇｐ１３０を増幅する。
【０１２０】
以下のプライマーを、図１１に示すＩＬ−６配列のｐＴｒｃＨｉｓへのＴＡクローニングに使用する。
【０１２１】
ｐＴｒｃＨｉｓへのＩＬ−６のクローニング用プライマー
正方向（５’ヌクレオチド）プライマー１
【化６】
0004660062.tif 000010
逆方向プライマー（３’ヌクレオチド：ＮｏｔＩ／ＳａｌＩおよび終止コドンを太字で示し、斜体および下線で示した配列は、配列をインフレームおよびＮｏｔＩ／ＳａｌＩ消化のオーバーハングとして保持し、終止コドンを組み込むためのインサート配列である）
【０１２２】
プライマー２
【化７】
0004660062.tif 000011
【０１２３】
次のステップは、ｇｐ１３０全長細胞外ドメインをサブクローン化することである（３２２〜２１１２ｂｐ；図１２を参照のこと）。ｇｐ１３０をＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化する。
【０１２４】
ｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯへの全長ｇｐ１３０クローニング用プライマー
正方向プライマー（５’ヌクレオチド：ＳａｌＩ部位を太字で示す）プライマー３
【化８】
0004660062.tif 000012
逆方向プライマー（ＨｉｎｄＩＩＩおよび終止コドンを太字で示す）プライマー４
【化９】
0004660062.tif 000013
【０１２５】
ステップ３は５’ＮｏｔＩ部位および３’ＳａｌＩ部位を含むリンカー二重らせん中でライゲーションを行うことである。
【０１２６】
リンカー二重らせん
Ｇ４Ｓ４Ｎｏｔ／ＳａｌＩ（ＮｏｔＩの５’オーバーハングおよびＳａｌＩの３’オーバーハングを太字で示す）プライマー７
【化１０】
0004660062.tif 000014
Ｇ４Ｓ４ｒｅｖ／Ｎｏｔ／ＳａｌＩ（ＮｏｔＩおよびＳａｌＩの５’オーバーハングを太字で示す）プライマー８
【化１１】
0004660062.tif 000015
【０１２７】
これにより全長構築物：ＩＬ−６／ｌｉｎｋ／ｇｐ１３０が得られる。次のステップは、ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にｇｐ１３０のドメイン欠失物をクローニングすることである。
【０１２８】
ｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯへのｇｐ１３０Ｄ１欠失用プライマー（ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位）
正方向プライマー（ＳａｌＩ部位を太字で示す）プライマー５
【化１２】
0004660062.tif 000016
逆方向プライマー（ＨｉｎｄＩＩＩおよび終止コドンを太字で示す）プライマー４
【化１３】
0004660062.tif 000017
【０１２９】
次のステップは、９２２ｂｐまでのｇｐ１３０先端切断型にクローニングすることである（これは、ｇｐ１３０の細胞外領域由来のドメイン１および２が欠失されている）。構築物ＩＬ−６／ｌｉｎｋ／ｇｐ１３０Ｄ１
【０１３０】
ｇｐ１３０クローニング用プライマー（９２２〜２１１２ｂｐフラグメント）正方向プライマー（ＳａｌＩ部位を太字で示す）プライマー６
【化１４】
0004660062.tif 000018
逆方向プライマー（ＨｉｎｄＩＩＩおよび終止コドンを太字で示す）プライマー４
【化１５】
0004660062.tif 000019
【０１３１】
エレクトロコンピテントＭ７２（λ）細胞の調製
Ｍ７２（λ）細胞を、５０ｍｌ  ＬＢ中、ｏ／ｎで増殖させた。１００ｍｌのこのｏ／ｎ培地を、３０℃の９００ｍｌＬＢにＯＤ６００が０．５〜０．６の間になるまで添加した。次いで、室温、４０００ｒｐｍで２０分間のＳｏｒｖａｌ  ＲＣ−３Ｂ遠心分離機を使用して、細胞を回収した。ペレットを再懸濁し、滅菌氷冷１０％（ｖ／ｖ）グリセロールの体積を、１０００ｍｌ、５００ｍｌ、２５０ｍｌに段階的に減少させて、４０００ｒｐｍ、４℃で２０分間再遠心分離した。最終的にペレットを１０００μｌの１０％（ｖ／ｖ）グリセロールに再懸濁し、１００μｌアリコートに分割し、液体窒素中で瞬間冷凍し、−８０℃で保存した。
【０１３２】
Ｍ７２細胞の形質転換
エレクトロコンピテントＭ７２（λ）細胞を氷上で解凍し、エレクトロポレーションキュベット（セル幅０．１ｃｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に入れ、１．８ＫＶでエレクトロポレーションを行った。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢプレート上で陽性の形質転換体を選択し、３０℃で一晩増殖させた。
【０１３３】
ｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯベクター由来の構築物発現の誘導
形質転換大腸菌ＴＯＰ１０細胞を、アンピシリン（最終１００μｇ／ｍｌ）を補足した１０ｍｌのＬＢ培地にて、２００ｒｐｍで震盪しながら３７℃で一晩増殖させた。翌日、５ｍｌの一晩培養物を使用して、アンピシリン（最終１００μｇ／ｍｌ）を補足した２５０ｍｌのＬＢ培地に播種し、ＯＤ６００＝０．６まで増殖させた。次いで、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧの添加によって培養物を誘導し、細胞をさらに５時間増殖させた。次いで、誘導細胞を室温で１３０００ｒｐｍの遠心分離によって回収し、ペレットを凍結するか溶解した。
【０１３４】
ｐＪＯＮＥＸベクター由来の構築物の発現の誘導
形質転換大腸菌Ｍ７２（λ）細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補足したＬＢ培地にて２０００ｒｐｍで撹拌しながら３０℃でｏ／ｎ増殖させた。翌日ｏ／ｎ培養物を使用して、新鮮なＬＢに播種し、細胞をＯＤ６００が約０．６に達するまで増殖させた。次いで、インキュベーターの温度を４２℃に調整し、同体積の加温前培地を添加して培地温度を４２℃にした。次いで、細胞を４２℃でさらに４〜５時間増殖させた後に回収した。
【０１３５】
固定金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による誘導タンパク質の精製
誘導細胞ペレットを２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、５００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．８）中に再懸濁し、最終濃度１００μｇ／ｍｌのニワトリ卵白リゾチームの添加によって溶解し、氷上で１５分間静置した。次いで、氷上に保持しながら細胞懸濁液を中程度の設定強度での１０秒で３回の破壊によって超音波処理した。次いで、不溶物質を、ＲＣ−３Ｂ遠心分離機における４０００×ｇ、４℃で２０分間の遠心分離によって除去した。
【０１３６】
次いで、明澄化細胞溶解物を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、５００ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．８）で平衡化したＰｒｏｂｏｎｄ樹脂カラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に適用した。カラムを２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、５００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．８）緩衝液で洗浄し、その後２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、５００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ６．０）で洗浄した。結合タンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、５００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ６．０）緩衝液に作製した勾配の５０ｍＭから５００ｍＭへの増加によって溶出した。１ｍｌの画分を回収し、ブラッドフォードタンパク質アッセイおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製をモニターした。目的のタンパク質を含む画分をプールし、１０００倍体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）に対してそれぞれ２、４、および６時間透析した。次いで、透析したタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  Ｙ−１０を使用して遠心分離した（必要な場合）。透析および遠心分離サンプルを、４℃でまたは凍結して保存するか、成長ホルモン活性についてのバイオアッセイに直接使用した。
【０１３７】
ｒＧＨおよび精製成長ホルモン構築物のバイオアッセイ
Ｈｅｋ２９３細胞を、全長ヒト成長ホルモン受容体で予め安定にトランスフェクトした。細胞を、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１％Ｌグルタミンを補足したダルベッコＭＥＭ／栄養Ｆ１２培地中で日常的に培養した。バイオアッセイに使用する細胞を、最初に超音波処理し、計数し、１２ウェルプレート中の成長培地に２×１０5細胞／ｍｌでプレートし、３７℃、５％ＣＯ2でｏ／ｎ増殖させた。翌日、細胞を富化培地（２／３ダルベッコＭＥＭ／Ｆ１２栄養培地、１／３ダルベッコ４．５ｇ／Ｌグルコース、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１％Ｌグルタミン）にプレートし、３７℃で６時間インキュベートした。製造者の説明書に従ってリン酸カルシウムトランスフェクション系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、レポーター遺伝子構築物でのトランスフェクションを完了した。細胞を３７℃、５％ＣＯ2で一晩静置した。翌日、細胞を、１００ｎｇ／μｌデキサメタゾンを補足した飢餓培地（１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１％Ｌグルタミンを補足したダルベッコＭＥＭ／Ｆ１２栄養培地）中で作製した５〜５０００ｎｇ／ｍｌの組換えタンパク質で攻撃誘発した。必要であれば、競合アッセイにおいて組換え野生型ＧＨを精製ＧＨｓｔｏｐまたはキメラタンパク質と混合した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で少なくとも５時間インキュベーション後、ルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼ活性をアッセイした。
【０１３８】
ルシフェラーゼ／βガラクトシダーゼアッセイ
製造者の説明書に従ってアッセイを行った。簡単に述べれば、１２ウェルプレートから培地を吸引し、細胞を１５０μｌのレポーター溶解緩衝液にて室温で２０分間溶解した。
【０１３９】
βガラクトシダーゼアッセイのために、２５μｌの各溶解物を９６ウェルプレートの２連のウェルに添加し、７５μｌのアッセイ緩衝液と混合した。プレートを黄色に発色するまで３７℃でインキュベートし、この時点でプレートを４２０ｎｍで読み取った。ルシフェラーゼアッセイのために、５０μｌの残存溶解物を照度計キュベットに添加し、５０μｌのルシフェラーゼ基質を添加した。テンプレートを１０秒間のボルテックスによって混合し、蛍光を、１５秒および６０秒間隔で測定した。
測定したルシフェラーゼ：βガラクトシダーゼ活性比の結果によってβガラクトシダーゼ発現について最終データを収集した。図１７は、精製ＧＨｓｔｏｐおよびＧＨｌｉｎｋＧＨＲを使用したレポーター遺伝子アッセイから得たデータを示す。
【０１４０】
ウェスタンブロッティング
精製物由来のサンプルを、還元または非還元条件下での１２％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる第１のサンプル分離およびＰＶＤＦ膜への移行によって成長ホルモン発現について日常的に分析した。次いで、膜を０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）を補足した４％（ｗ／ｖ）ミルクタンパク質のＰＢＳ溶液中でブロックした。次いで、膜を、１％（ｗ／ｖ）ミルクタンパク質のＰＢＳ−Ｔ溶液で２００００倍希釈した抗成長ホルモン（１０Ａ７、マウスＩｇＧ１）で探索した。短時間の洗浄後、膜を１％（ｗ／ｖ）ミルクタンパク質のＰＢＳ−Ｔで５０００倍希釈したヒツジ抗マウスＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で探索した。ＰＢＳ−Ｔでのさらなる洗浄後、特定のタンパク質バンドをＥＣＬウェスタンブロット検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して視覚化した。図１６は、ｐＪＯＮＥＸベクター系のいずれかのｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯで発現した誘導タンパク質のウェスタンブロットを示す。
【０１４１】
成長ホルモンのラジオイムノアッセイ
ラットポリクローナル抗体および標識モノクローナル抗体を使用するＮＥＴＲＩＡヒト成長ホルモンＩＲＭＡアッセイを使用して、ヒト成長ホルモンアッセイを行った。
【０１４２】
【表４】
0004660062.tif 000020
【０１４３】
インビボでの代謝クリアランス速度試験
スピローグ−ドーリーラットを麻酔し、大腿動脈および頸動脈にカニューレを移植した。２日後、静脈内または皮下注射によってＧＨまたはキメラを投与する。大腿カニューレを介して血液サンプルを採取し、キメラレベルをラジオイムノアッセイによって測定する（表２を参照のこと）。薬物動態学パラメータを、時間に対するホルモン濃度を適合する利用可能なコンピュータプログラムを使用して評価する。
【０１４４】
ルシフェラーゼ活性として測定したＧＨによるＧＨシグナル伝達の活性化、ネガティブコントロール精製、およびＣｈｉ１Ａ２（ＧＨＲに融合したＧＨ）
多数のキメラ構築物を作製した。部分精製キメラを、形質転換ＸＬブルー大腸菌から調製した。非形質転換ＸＬブルー大腸菌由来のタンパク質をニッケルカラムにて精製し、任意の非特異的アゴニストまたはアンタゴニスト作用を検出するためのネガティブコントロールとして使用した。全ての精製タンパク質を、グリセロール中で保存した。
【０１４５】
ネガティブコントロールおよびキメラ１Ａ２を、ＧＨと共にまたはＧＨを伴わずにインキュベートした。
【０１４６】
図１９は、成長ホルモン（ＧＨ）、ネガティブコントロール（Ｘｌブルー）、および部分精製アンタゴニスト（キメラ１Ａ２）によるＳｔａｔレポーター（ルシフェラーゼ活性）の誘導を比較するバイオアッセイの結果を示す。
【０１４７】
グラフは、予想されるＧＨの用量応答を示す。ネガティブコントロールとのインキュベーションにより、ルシフェラーゼ活性の誘導は認められなかったが、高濃度でバイオアッセイが部分的に阻害された（これは増加したグリセロール濃度の効果であり得る）。５００ｎｇ／ｍｌでは、のキメラ１Ａ２が完全にＧＨシグナル伝達を遮断したようである。
【０１４８】
［文献］
【表５−１】
0004660062.tif 000021
【表５−２】
0004660062.tif 000022
【表５−３】
0004660062.tif 000023
【表５−４】
0004660062.tif 000024
【表５−５】
0004660062.tif 000025
【表５−６】
0004660062.tif 000026
【図面の簡単な説明】
【図１】  （ａ）ｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯおよびその誘導体；（ｂ）ｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯ／ＧＨｓｔｏｐ；（ｃ）ｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯ／Ｇｈｓｔｏｐ／ＧＨＲ；（ｄ）ｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯ／ＧＨ／ｌｉｎｋ／ＧＨＲ；（ｅ）ｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯ／ＧＨ／ｌｉｎｋ／ｆｌｅｃＧＨＲｓｔｏｐ；（ｆ）ｐＪＯＮＥＸＧＨｓｔｏｐ；ｐＪＯＮＥＸＧＨｓｔｏｐｌｉｎｋＧＨＲの略図を示す。
【図２】  ５８８ｂｐのＰＣＲ増幅ＧＨフラグメントのｃＤＮＡ配列（３’ＮｏｔＩ部位および２つの終止コドンを、それぞれ太字および斜体で示す）を示す図である。
【図３】  ３９０ｂｐのＰＣＲ増幅ＧＨＲ  ＳＤ１００フラグメントのｃＤＮＡ配列（５’ＥｃｏＲＩおよび３’ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を太字で示し、３’終止コドンを斜体で示す）を示す図である。
【図４】  全長ＧＨｓｔｏｐＧＨＲ  ＳＤ１００構築物の核酸配列を示す図である。
【図５】  全長ＧＨｌｉｎｋＧＨＲ構築物の核酸配列を示す図である（ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を太字で示し、３’終止コドンを斜体で示す）。
【図６】  全長ＧＨｌｉｎｋＧＨＲのタンパク質配列（３４０アミノ酸）を示す図である。
【図７】  ＧＨＲの７６２ｂｐのＰＣＲ増幅全長細胞外ドメインの核酸配列（ＧＨＲｆｌｅｃ）を示す図である（５’ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を太字で示し、２つの３’終止コドンを斜体で示す）。
【図８】  ＧＨｌｉｎｋＧＨＲｆｌｅｃ構築物の全長核酸配列を示す図である（ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を太字で示し、３’終止コドンを斜体で示す）。
【図９】  オリゴヌクレオチドＴｒｃＲＢＳｓａｃＦおよびＧＨＲＡ８３５Ｈによって作製された１１５７ｂｐのＰＣＲフラグメントＧＨｌｉｎｋＧＨＲの核酸配列を示す図である（ＳａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩを太字で示し、新規のリボゾーム結合部位を太字および下線で示し、開始／終止コドンを斜体で示す）。
【図１０】  ヌクレオチドｐＴｒｃＲＢＳｓａｃＩおよびＴｒｃＨｉｎｄｒｅｖによって作製された７４０ｂｐのＰＣＲフラグメントＧＨｓｔｏｐの核酸配列を示す図である（ＳａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩを太字で示し、新規のリボゾーム結合部位を太字および下線で示し、開始／終止コドンを斜体で示す）。
【図１１】  ＧＨ／ＧＨＲ受容体キメラの完全なアミノ酸配列を示す図である（ＧＨ残基１〜１９１／リンカー／ＧＨＲ残基１２７〜２４６）。
【図１２Ａ】  ＩＬ−６の全長核酸配列を示す図である。
【図１２Ｂ】  ＩＬ−６のアミノ酸配列を示す図である。
【図１２】  ｇｐ１３０の全長核酸配列を示す図である。
【図１３】  ＩＬ−６／ｇｐ１３０融合ポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。
【図１４】  ｇｐ１３０ドメインＩ欠失の核酸配列を示す図である（６１６〜２１１２ｂｐ）。
【図１５】  ｇｐ１３０ドメイン９２２〜２１１２ｂｐの核酸配列を示す図である。
【図１６】  種々のベクターで形質転換された大腸菌によって発現した誘導タンパク質のウェスタンブロットを示す図である。
【図１７】  （ａ）はＧｈｓｔｏｐおよびＧＨｌｉｎｋＧＨＲについてのレポーター遺伝子アッセイのグラフであり、（ｂ）は（ａ）で示されたデータの定量を示す。
【図１８】  ＧＨ：ＧＨＲ相互作用およびＧＨＲとのＧＨ：ＧＨＲキメラの相互作用を示す図である。
【図１９】  ＧＨ／ＧＨＲキメラのインビトロアゴニスト活性を示す図である。
【図２０】  成長ホルモン（ＧＨ）、ネガティブコントロール（ＸＬブルー）、および部分精製アンタゴニスト（キメラ１Ａ２）によるＳｔａｔ５受容体の誘導（ルシフェラーゼ活性）を比較するバイオアッセイの結果を示す図である。
【図２１】  Ｃｈｉ１Ａ２キメラのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２２】  Ｃｈｉ１Ａ２キメラのタンパク質配列（３１１アミノ酸）を示す図である。
【図１ａ】
0004660062.tif 000027
【図１ｂ】
0004660062.tif 000028
【図１ｃ】
0004660062.tif 000029
【図１ｄ】
0004660062.tif 000030
【図１ｅ】
0004660062.tif 000031
【図１ｆ】
0004660062.tif 000032
【図１ｇ】
0004660062.tif 000033
【図２】
0004660062.tif 000034
【図３】
0004660062.tif 000035
【図４】
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【図５】
0004660062.tif 000037
【図６】
0004660062.tif 000038
【図７】
0004660062.tif 000039
【図８】
0004660062.tif 000040
【図９】
0004660062.tif 000041
【図１０】
0004660062.tif 000042
【図１１】
0004660062.tif 000043
【図１２】
0004660062.tif 000044
【図１３】
0004660062.tif 000045
【図１４】
0004660062.tif 000046
【図１５】
0004660062.tif 000047
【図１６】
0004660062.tif 000048
【図１７Ａ】
0004660062.tif 000049
【図１７Ｂ】
0004660062.tif 000050
【図１８】
0004660062.tif 000051
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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