(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０２（５２株）、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０３（５３株）、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０４（５７株）で寄託されたハイブリッド細胞が産生する下記式（１）
【化１】
0004660956.tif 000008
（式中、Ｙ−ＣＨ2−は、アミノ酸残基、ペプチド残基、蛋白質残基を示す。）で示されるマイケル付加体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項２】
下記式（１）
【化２】
0004660956.tif 000009
（式中、Ｙ−ＣＨ2−は、アミノ酸残基、ペプチド残基、蛋白質残基を示す。）で示されるマイケル付加体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０２（５２株）、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０３（５３株）、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０４（５７株）で寄託されたハイブリッド細胞。
【請求項３】
請求項２記載のハイブリッド細胞を培養して培養液中から、下記式（１）
【化３】
0004660956.tif 000010
（式中、Ｙ−ＣＨ2−は、アミノ酸残基、ペプチド残基、蛋白質残基を示す。）で示されるマイケル付加体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を取得することを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、モノクローナル抗体、ハイブリッド細胞及び前記のモノクローナル抗体の製造方法に関する。詳しくは、特に、４−ヒドロキシ−２−ヘキセナール（略号：４−ＨＨＥ）と蛋白質との反応物に対する高い特異性を有するモノクローナル抗体とそのモノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞、前記のモノクローナル抗体の製造方法に関する。さらに詳しくは、アミノ酸、ペプチドあるいは蛋白質中のヒスチジン残基と４−ＨＨＥが反応して生じたマイケル付加体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体とそのモノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞およびモノクローナル抗体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内の脂質成分としては、トリグリセライド、リン脂質、コレステロールエステルあるいは遊離型脂肪酸などが知られている。特にこれらの化合物が高度不飽和脂肪酸残基を有する場合、生体に作用する様々な酸化ストレスによって、過酸化を受け易く、更に、二次酸化により生じた分解物が様々な病態に関与していることが最近明らかにされつつある。
前記高度不飽和脂肪酸としては、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、イコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などが代表的なものである。これらの高度不飽和脂肪酸残基を有する脂質化合物の過酸化分解物として、マロンジアルデヒド（略号：ＭＤＡ）、リノール酸やアラキドン酸に代表されるω−６系高度不飽和脂肪酸に由来する４−ヒドロキシ−２−ノネナール（略号：４−ＨＮＥ）、およびリノレン酸やイコサペンタエン酸等のω−３系高度不飽和脂肪酸に由来する４−ヒドロキシ−２−ヘキセナール（略号：４−ＨＨＥ）が知られている。
前記ＭＤＡは、血液中のリポプロテインの一種である低密度リポ蛋白質（略号：ＬＤＬ）と結合してＭＤＡ化低比重リポ蛋白質（略号：ＭＤＡ−ＬＤＬ）となることが知られている。このことから、ＭＤＡの検出を目的とした、ＭＤＡ−ＬＤＬを抗原として得たモノクローナル抗体、あるいは該モノクローナル抗体を用いたＭＤＡ−ＬＤＬの測定方法が知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：２１５−２１８，１９８８；特開平４−１７３０９６号公報）。
【０００３】
前記４−ＨＮＥについては、４−ＨＮＥの検出を目的とした、４−ＨＮＥで修飾したカギアナカサガイのヘモシアニンを抗原として得た４−ＨＮＥを認識するモノクローナル抗体、および該モノクローナル抗体を用いた４−ＨＮＥの測定方法が知られている（特開平８−１６８３９４号公報）。
一方、４−ＨＨＥは、生体中の蛋白質と反応し、４−ＨＨＥと蛋白質の複合体を生じることが報告されている（TOXICOLOGY LETTERS,第29巻,1985年,頁43-49）。
また、４−ＨＨＥと蛋白質の反応は、蛋白質の構成アミノ酸の１つであるヒスチジン、リジンあるいはシステイン側鎖と反応し、式（２）に示す５員環構造を有する化合物（即ち、マイケル付加体）を生ずるとされている。反応式を式（２）に示す。
【０００４】
【化３】
0004660956.tif 000002
【０００５】
式（２）中、Ｒ−ＣＨ2−ＸＨは蛋白質を示し、Ｘは、システイン、ヒスチジンあるいはリジン側鎖を示す。
イコサペンタエン酸やドコサヘキサエン酸等のω−３系高度不飽和脂肪酸と、リノール酸やアラキドン酸等のω−６系高度不飽和脂肪酸の両者に由来する生理活性物質、例えば、プロスタグランジンやロイコトリエンの作用は由来物質によって大きく異なる。また、これらの物質は血小板の抗凝固活性や抗血栓性等の作用等の臨床的に重要な作用を有する物質であることから、両高度不飽和脂肪酸の過酸化分解物を厳密に区別することは臨床上有用である。
したがって、４−ＨＨＥが蛋白質と反応してなるマイケル付加体構造を特異的に認識する抗血清を提供することは、生体内酸化ストレスの評価、或いはω−３系高度不飽和脂肪酸の過酸化等に関する生化学・医学的な研究に対して有用である。
そこで、発明者等は、鋭意検討した結果、４−ＨＨＥがアミノ酸、ペプチドあるいは蛋白質と反応してなるマイケル付加体構造を特異的に認識する抗血清を提供する方法を見いだして開示し、ω−３系高度不飽和脂肪酸の過酸化等に関する生化学・医学的な研究に対する有用性を評価するための技術を提供した。（特開平１１−０７１４００号公報）。
このように、生体の疾病との相関が注目されている酸化ストレスに関連して、該抗血清は非常に有用であるものの、抗血清（ポリクローナル）であり、免疫する動物個体に由来するロット間差が生じたりする等の問題もあり、４−ＨＨＥが蛋白質と反応してなるマイケル付加体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体の開発が要望されていた。しかしながら、４−ＨＨＥが蛋白質と反応して生じたマイケル付加体に対するモノクローナル抗体は未だ報告されていない。
そこで、本発明者らは、４−ＨＨＥと蛋白質の付加体に関して着目し、４−ＨＨＥが蛋白質と反応して生ずるマイケル付加体構造に対して認識特異性の高いモノクローナル抗体と、その製造方法の開発に取り組んだ。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第１の目的は、４−ＨＨＥと蛋白質の付加体に関して着目し、４−ＨＨＥが蛋白質と反応して生ずるマイケル付加体構造に対して認識特異性の高いモノクローナル抗体を提供することにある。
また、本発明の第２の目的は、前記の認識特異性の高いモノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞を提供することにある。
また、本発明の第３の目的は、前記の認識特異性の高いモノクローナル抗体の製造方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点に鑑み検討した結果、４−ＨＨＥで修飾した蛋白質を抗原として調製し、該抗原で免疫した恒温動物（ヒトを除く）から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリッド細胞を得て、その細胞が、４−ＨＨＥ−蛋白質複合体中の４−ＨＨＥ由来の次式（１）で示される、４−ＨＨＥが蛋白質中のヒスチジン残基と反応して生じたマイケル付加体構造を特定的に認識することの知見を得て、本発明を完成した。
【０００８】
本発明によれば、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０２（５２株）、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０３（５３株）、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０４（５７株）で寄託されたハイブリッド細胞が産生する下記式（１）
【０００９】
【化４】
0004660956.tif 000003
【００１０】
（式中、Ｙ−ＣＨ2−は、アミノ酸残基、ペプチド残基、蛋白質残基を示す。）で示されるマイケル付加体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体が提供される。
また本発明によれば、前記モノクローナル抗体を産生することができるハイブリッド細胞が提供される。
【００１１】
更に本発明によれば、前記ハイブリッド細胞を培養して培養液中から、上記式（１）で示されるマイケル付加体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を取得することを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法がて供される。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体は、下記式（１）
【００１６】
【化６】
0004660956.tif 000004
【００１７】
（式中、Ｙ−ＣＨ2−は、アミノ酸残基、ペプチド残基、蛋白質残基を示す。）で示されるマイケル付加体構造を特異的に認識する。
すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、４−ＨＨＥがアミノ酸、ペプチドあるいは蛋白質中のヒスチジン残基と反応して生ずる４−ＨＨＥ由来のマイケル付加体構造を特異的に認識することを特徴とする。
本発明のハイブリッド細胞は、４−ＨＨＥがアミノ酸、ペプチドあるいは蛋白質中のヒスチジン残基と反応して生ずる４−ＨＨＥ由来のマイケル付加体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生することを特徴とする、即ち、独立行政法人産業技術総合研究所（旧通商産業省工業技術院生命工学技術研究所）に平成１３年４月１６日に寄託した、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０２（５２株）、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０３（５３株）、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０４（５７株）である。
該ハイブリッド細胞の製造方法は、４−ＨＨＥがアミノ酸、ペプチドあるいは蛋白質中のヒスチジン残基と反応して生ずる４−ＨＨＥ由来のマイケル付加体構造を抗原として免疫された恒温動物（ヒトを除く）から得られる抗体産生細胞と、得られた抗体産生細胞と継代培養可能なマウスミエローマ細胞とをハイブリッドし、前記のモノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞を得る製造方法である。
【００１８】
本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、前記ハイブリッド細胞を培養して培養液中から４−ＨＨＥが蛋白質中のヒスチジン残基と反応して生ずる４−ＨＨＥ由来のマイケル付加体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を取得することを特徴とする。
本発明の前記モノクローナル抗体およびその製造方法において、４−ＨＨＥで修飾されるべき蛋白質がカギアナカサガイのヘモシアニン（略号：ＫＬＨ）であることが好ましい。
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体は、前記ハイブリッド細胞をスクリーニングし、このハイブリッド細胞が抗体を産生する環境下で大量培養し、培養物から取得することにより、製造される。
【００２０】
本発明のモノクローナル抗体の製造に用いることができる抗原は、蛋白質と４−ＨＨＥの反応物であればよく、蛋白質としては、例えば、ウシ血清アルブミン（略号：ＢＳＡ）、卵白アルブミン、リポプロテイン、カギアナカサガイのヘモシアニン（略号：ＫＬＨ）などが挙げられ、好ましくはＫＬＨが用いられる。
抗原を調製するための蛋白質と４−ＨＨＥの反応は、両者を緩衝液中で混合攪拌して実施することができる。例えば、前記蛋白質と４−ＨＨＥを緩衝液中で混合攪拌して得ることが可能である。用いる緩衝液としては、トリス、リン酸塩、炭酸塩などの緩衝液が挙げられる。その緩衝液としては、例えば１ｍＭ〜０．５Ｍ、好ましくは１０〜１００ｍＭのリン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液のｐＨは該反応が進行するｐＨであれば特に限定されないが、ｐＨ６〜１１、好ましくはｐＨ７〜９である。この反応過程は、蛋白質中のアミノ酸の減少率で検出することが可能である。アミノ酸の減少率は、例えば、反応前後の試料の４−ＨＨＥと反応していないアミノ酸をアミノ酸自動分析装置で測定することにより求めることができる。アミノ酸減少率としては、使用する蛋白質により異なるが、ヒスチジン減少率が１０％以上、好ましくは２０％以上減少することが望ましい。
このようなアミノ酸減少率となる反応条件は、例えば、２５〜４５℃で１〜７２時間が挙げられ、好ましくは３０〜４０℃で５〜４０時間である。
【００２１】
本発明で免疫される動物は恒温動物（ヒトを除く）が使用できる。該免疫動物としては、例えばマウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ニワトリ等であれば特に制限されないが、抗体産生細胞を融合するミエローマ細胞として通常マウス由来の細胞を使用する場合には、好ましくはマウスが使用される。免疫する方法は、通常の公知の免疫方法を用いることができる。例えば、７ないし３０日、特に１２ないし１６日間隔で２または３回の投与が好ましい。投与量は、免疫される動物により異なるが、例えば、約０．０５〜２ｍｇ／１回程度を目安とする。投与経路は皮下注射、皮内注射、腹膜腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射等を選択することができるが、好ましくは腹膜腔内、皮下もしくは筋肉内に注射して行う投与形態である。さらに好ましくは、前記投与経路を２ないし３組み合わせた投与経路、例えば、腹膜腔内注射、皮下注射および筋肉内注射全ての投与経路を組み合わせる投与形態である。なお、この場合、抗原は適当な緩衝液、例えばフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントの１種を含有するナトリウムリン酸緩衝液、生理食塩水等に溶解して用いることができるが、上記のようなアジュバントを使用しなくてもよい。ここで、アジュバントとは抗原と共に投与したとき、非特異的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。
【００２２】
次いで、上記の抗原を免疫した恒温動物（ヒトを除く）を７〜３０日間処置せずに放置した後、該恒温動物の血清を少量採取し、抗体価をウエスタンブロット法、凝集法、酵素免疫測定法、一元放射状免疫拡散法等から選ばれた測定法により測定する。より簡便には酵素免疫測定法により測定することが望ましい。抗体価が上昇してきたら、状況に応じて抗原の追加投与を適当回数行うこともできる。例えば、０．０１〜１ｍｇ、特に、０．０５〜０．５ｍｇの投与量で１もしくは２回の追加投与が行われる。最後の投与の１ないし３０日後、特に好ましくは１〜７日後に免疫した恒温動物から抗体を産生するリンパ球を含む組織を摘出する。摘出する組織は、抗体を産生するリンパ球を含む末梢リンパ系組織ならいずれでもよいが、好ましくは脾臓である。
【００２３】
得られた組織は、例えば、「単クローン抗体実験操作入門」（講談社サイエンティフィック 安藤民衛ら １９９１年）等に記載されている方法により、継体培養可能な細胞とするために、例えば、仙台ウイルスやポリエチレングリコール存在下、ある種のガン細胞と細胞融合させて、ハイブリッド細胞を得ることができる。ここで用いられるガン細胞は、同じ恒温動物（ヒトを除く）でも同種の恒温動物のガン細胞を用いることが望ましく、例えばマウスを免疫動物として得られた脾臓細胞と融合させる場合、マウスミエローマ細胞を用いることが好ましい。実際に用いられる細胞融合の方法としては、公知の技術（Ｊ ＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄ ３９：２８５−３０８，１９８０年）を用いることができる。例えば、免疫されたマウスから得られた脾臓とマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコール存在下で融合を行い、ハイブリッド細胞のみが生育可能であるＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）により選択的にハイブリッド細胞を増殖させ、ハイブリッド細胞がコロニーを形成した後、培養上清中の抗体をスクリーニングすることで目的の抗体を産生するハイブリッド細胞を得ることができる。
【００２４】
スクリーニングする方法としては、例えば、ウエスタンブロット法あるいは酵素免疫化学的測定法等が挙げられる。また、目的の抗体を産生するハイブリッド細胞は、限界希釈法を繰り返すことにより最終的に単一のハイブリッド細胞を得ることができる。さらには、これら目的の抗体を産生するハイブリッド細胞は抗体を産生する環境下で大量培養することにより抗体を容易に製造することができる。
【００２５】
さらに、これらの目的とする抗体を産生するハイブリッド細胞が産生した抗体は、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いる蛋白質分画、水性二層分配法、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等の蛋白質の一般的な生化学的分離方法を、単独もしくはいくつかの方法を組み合わせて使用することにより精製することができる。
【００２６】
本発明のモノクローナル抗体はヒトの４−ＨＨＥ修飾蛋白質の検出だけでなく、ヒト以外の異種の恒温動物、例えば、マウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ等の生体中に存在する４−ＨＨＥ修飾蛋白質の検出にも応用することができる。
【００２７】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体は、４−ＨＨＥと蛋白質中の構成アミノ酸であるヒスチジン側鎖が反応して生じた４−ＨＨＥ由来のマイケル付加体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体である。
また、本発明のハイブリッド細胞は、４−ＨＨＥと蛋白質中の構成アミノ酸であるヒスチジン側鎖が反応して生じた４−ＨＨＥ由来のマイケル付加体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する。また、本発明のモノクローナル抗体は、ω−３系高度不飽和脂肪酸の過酸化物等に由来する４−ヒドロキシ−２−ヘキセナールの生体に対する影響を明らかにするために非常に有用であり、臨床診断、臨床病理、分析等において利用することにより生体内での過酸化工程の知見が得られ、病巣等との関連性の調査手段として期待される。
【００２８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１
１．抗原の調製
１０ｍｇのカギアナカサガイのヘモシアニン（略語：ＫＬＨ）をガラスバイアルに秤量し、それに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）約８ｍＬを加えて溶解後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で１００ｍＭの濃度に調製した４−ヒドロキシ−２−ヘキセナール（略号：４−ＨＨＥ）溶液１００μＬを加え、さらに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて全量を１０ｍＬに調製した。この液を３７℃、２４時間インキュベートし、４−ＨＨＥとＫＬＨのコンジュゲート（以下、「ＨＨＥ−ＫＬＨ」と略す。）を得て、これを抗原とした。
【００２９】
２．免疫方法
ＨＨＥ−ＫＬＨ（１ｍｇ／ｍＬ）は等量のフロイントの完全アジュバントとよく混合してエマルジョンとし、これをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、オス、６〜８週齢）の腹腔内に１００μＬ免疫した。初回免疫から１０〜１４日後、抗原とフロイントの不完全アジュバントをよく混合してエマルジョンとして、１００μＬを１回追加免疫を行った。追加免疫から３週間後、抗原とリン酸緩衝生理食塩水（略号：ＰＢＳ）を混合して１００μＬを１回最終免疫を行った。なお、抗体価は、追加免疫の１週間後、マウス眼孔静脈から血液を採取し、得られた血清を用いて酵素免疫化学的方法で抗原に対する抗体が産生していることを確認した。酵素免疫化学的方法では、免疫したマウスから得られた血清と比較対照となる免疫前のマウスから得られた血清の間に比較的大きな抗体価の差異が見られ、抗体価の上昇が確認された。
【００３０】
３．抗体価の確認方法
抗体価は、ウシ血清アルブミン（略号：ＢＳＡ）の４−ＨＨＥ修飾物を固相とした酵素免疫測定法により確認した。すなわち、抗原の調製に記載した方法と同様にＢＳＡと４−ＨＨＥを反応させて、４−ＨＨＥとＢＳＡのコンジュゲート（以下、「ＨＨＥ−ＢＳＡ」と略す。）を得た。これを９６穴イムノプレートに物理吸着させ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−トリス緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、「ＴＴＢＳ」と略す。）で３回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、「ブロッキング液」と略す。）でブロッキングを行った。このプレートのウエルにマウスから得られた血清（１００μＬ／ウエル）を入れて、３７℃で１時間反応させた。ウエルを洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されているマウス抗体に対するウサギ抗体をＴＴＢＳで５０００倍希釈した液（１００μＬ／ウエル）（以下、「酵素標識抗体溶液」と略す。）を入れて、３７℃で１時間反応させた。ウエルを洗浄後、Ｏ−フェニレンジアミン（０．４ｍｇ／ｍＬ）および過酸化水素（０．００３％）を含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５）（１００μＬ／ウエル）（以下、「発色液」と略す。）を入れて室温で１５−２０分間反応させた。発色反応は１Ｍの硫酸（５０μＬ／ウエル）（以下、「反応停止液」と略す。）を入れることで停止し、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定して抗体価の確認を行った。
【００３１】
４．細胞融合
免疫したマウスからマウス脾臓を摘出し、よくほぐして脾細胞を得た。得られた脾細胞はＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した。この洗浄した脾細胞と同様にＲＰＭＩ−１６４０培地でよく洗浄したミエローマ細胞であるマウス６５３細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８，６５３：ＣＲＬ・１５８０）を細胞数が７：１の割合になるように混和し、培地に対して５０ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール１５４０溶液を徐々に加えて５分間混和した。これにＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて反応を停止させた後、５分間遠心分離して上清を廃棄した。これにＲＰＭＩ−１６４０培地を加えた後、５分間遠心分離を行い上清を廃棄した。この操作を２回繰り返して細胞を洗浄し、ハイブリッド細胞を調製した。
【００３２】
５．クローニング
前述の得られた細胞に３０ｍＬのＨＡＴ培地を加えて細胞を懸濁し、９６穴マイクロプレートの各ウエルに１００μＬずつ分注し、ＨＡＴ培地により選択的にハイブリッド細胞を増殖させた。融合から１０日後、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）でウエル中の１／２量の培養上清を置換した。この操作を２〜３回繰り返した。この培養上清を用いて酵素免疫化学的方法により抗体価を確認し、スクリーニングを行った。なお、抗体価の確認方法は、前述の抗体価の確認方法と同様であるが、試験に用いる試料を血清の代わりに得られた培養上清を用いた。スクリーニングにより抗体活性の確認されたウエルの細胞は限界希釈を行い培養し、最終的にはスクリーニングと限界希釈を繰り返すことにより４−ＨＨＥ修飾蛋白質に対して高い抗体活性を有し、且つ単一の細胞からなるクローン４株を得た。得られた４株のクローンのうち、抗体活性の強かった５２、５３および５７株のモノクローナル抗体についてマウスＩｇＧサブクラスの検討を行った。培養上清を試料としてマウスＩｇＧサブクラス検定キット（商品名：Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  ｋｉｔ、商品コード：ＲＰＮ２９，アマシャム社製）で抗体のサブクラスの検討を行ったところ、５２、５３および５７株のいずれもＩｇＧ１、κ（カッパー）鎖であった。この培養上清の一部を用いて抗体の精製について検討したところ、硫酸アンモニウムによる塩析、あるいはプロテインＡをリガントとするアフィニティークロマトグラフィーを常法通り行うことにより本発明のモノクローナル抗体を精製することができた。
【００３３】
実施例２
前記実施例１で得られた４株クローンから得られた４−ＨＨＥ修飾蛋白質を認識するモノクローナル抗体の内、５２、５３、５７株のモノクローナル抗体の反応特異性について確認を行った。該５２、５３および５７株は、独立行政法人産業技術総合研究所（旧通商産業省工業技術院生命工学技術研究所）に平成１３年４月１６日に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０２（５２株）、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０３（５３株）、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０４（５７株）として寄託されている。なお、検討に用いるモノクローナル抗体は、培養上清を希釈してそのまま用いた。
１．モノクローナル抗体の反応特異性の評価法−１
本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を酵素免疫測定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレートにウエル当たり１００μＬの蛋白質あるいはアルデヒド修飾蛋白質（４μｇ／ｍＬ）を加え、４℃で一昼夜静置してプレートに物理吸着させ、ウエル当たり３００μＬのＴＴＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ含有ＴＴＢＳもしくは蒸留水で４倍希釈したブロックエース（雪印社製）をウエル当たり３００μＬ加えてブロッキングした。このプレートを上記と同様にＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μＬのＴＴＢＳで希釈した本モノクローナル抗体溶液（１μｇ／ｍＬ）を加えて、３７℃で３時間インキュベートした。なお、コントロールとしてはＴＴＢＳのみを加えた。このプレートを上記と同様にＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μＬの酵素標識抗体溶液を加えて３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μＬの発色液を加えて室温で１５−２０分間インキュベートした。ウエル当たり５０μＬの反応停止液を加えた後、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定し、本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を評価した。
【００３４】
２．モノクローナル抗体の反応特異性評価法−２
本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を酵素免疫測定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレートに４−ＨＨＥ修飾ＢＳＡを加えてプレートに物理吸着させたプレートのウエルに、本発明によるモノクローナル抗体（１μg／ｍＬ）に各種濃度の４−ＨＨＥ誘導体等を加えたものを試料とする以外は前項に記載の方法と同様にして吸光度を測定し、本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を評価した。
【００３５】
３．モノクローナル抗体の反応特異性−１
種々のアルデヒドで修飾した特定の蛋白質に対する本発明のモノクローナル抗体の抗原抗体反応の特異性を評価した。すなわち、２−ヘキサナール、２−ヘキセナール、２−ノネナール、クロトンアルデヒド（略号：ＣＲＡ）、アクロレイン（略号：ＡＣＲ）、ＭＤＡ、４−ＨＮＥおよび４−ＨＨＥなどのアルデヒドを修飾したＢＳＡを用い、前記の「モノクローナル抗体の反応特異性評価法−１」の酵素免疫測定法により測定した。なお、ｎａｔｉｖｅは未修飾のＢＳＡそのものが固定化された場合を示す。
図１に、５２株由来のモノクローナル抗体を用いて得られた結果を示す。
なお、縦軸は各種アルデヒド、横軸は吸光度（Ｏ．Ｄ．）を示す。
図１からわかるように、本発明によるモノクローナル抗体は、４−ＨＨＥ以外のアルデヒドで修飾した蛋白質とは抗原抗体反応性を示さないことは明らかである。なおまた図には示していないが、５３および５７株由来のモノクローナル抗体を用いた場合も同様の結果が得られ、４−ＨＨＥ以外のアルデヒドで修飾した蛋白質とは抗原抗体反応性を示さないことは明らかである。
【００３６】
４．モノクローナル抗体の反応特異性−２
種々の２−ヒドロキシ−４−アルケナールを合成し、これらのアルデヒドで修飾した特定の蛋白質に対する本発明のモノクローナル抗体の抗原抗体反応の特異性を評価した。すなわち、２−ヒドロキシ−４−ペンテナール（略号：Ｃ５）、２−ヒドロキシ−４−ヘキセナール（略号：Ｃ６）、２−ヒドロキシ−４−ヘプテナール（略号：Ｃ７）、２−ヒドロキシ−４−オクテナール（略号：Ｃ８）、２−ヒドロキシ−４−ノネナール（略号：Ｃ９）、２−ヒドロキシ−４−デセナール（略号：Ｃ１０）のアルデヒドを修飾したＢＳＡを用い、前記の「モノクローナル抗体の反応特異性評価法−１」の酵素免疫測定法により測定した。なお、ｎａｔｉｖｅは未修飾のＢＳＡそのものが固定化された場合を示す。
図２に、５２株由来のモノクローナル抗体を用いて得られた結果を示す。
なお、縦軸は各種アルデヒド、横軸は吸光度（Ｏ．Ｄ．）を示す。
図２に示されるように、本発明によるモノクローナル抗体は、Ｃ６以外のアルデヒドで修飾した蛋白質とは抗原抗体反応性を示さない、すなわち４−ＨＨＥで修飾した蛋白質とは抗原抗体反応性を示さないことは明らかである。
また図には示していないが、５３および５７株由来のモノクローナル抗体を用いた場合も同様の結果が得られ、４−ＨＨＥ以外のアルデヒドで修飾した蛋白質とは抗原抗体反応性を示さないことは明らかである。
【００３７】
５．モノクローナル抗体の反応性−３
Ｎ−α−アセチルリジン（Ａｃ−Ｌｙｓ）、Ｎ−α−アセチルヒスチジン（Ａｃ−Ｈｉｓ）、Ｎ−α−アセチルシステイン（Ａｃ−Ｃｙｓ）と４−ＨＨＥとのマイケル付加体をそれぞれ合成した。得られたマイケル付加体である、ＨＨＥ−Ｌｙｓを次の式（３）、ＨＨＥ−Ｃｙｓを次の式（４）、ＨＨＥ−Ｈｉｓを次の式（５）にそれぞれ示す。
【００３８】
【化７】
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【００３９】
【化８】
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【００４０】
【化９】
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【００４１】
これらのマイケル付加体、並びにＮ−α−アセチルリジン（Ａｃ−Ｌｙｓ）、Ｎ−α−アセチルヒスチジン（Ａｃ−Ｈｉｓ）、Ｎ−α−アセチルシステイン（Ａｃ−Ｃｙｓ）について、本発明によるモノクローナル抗体との反応特異性を前記「モノクローナル抗体の反応特異性評価法−２」に準拠した競合酵素免疫測定法に従って評価した。
図３に、５２株由来のモノクローナル抗体を用いて得られた結果を示す。
なお、縦軸はそれぞれ競合物質の存在下における吸光度、横軸は競合物質の濃度を示す。図３から明らかなように、ＨＨＥ−Ｈｉｓのみが、本発明によるモノクローナル抗体と固相化された４−ＨＨＥ修飾ＢＳＡとの反応を阻害した。
また図には示していないが、５３および５７株由来のモノクローナル抗体を用いた場合も同様の結果が得られ、ＨＨＥ−Ｈｉｓのみが、本発明によるモノクローナル抗体と固相化された４−ＨＨＥ修飾ＢＳＡとの反応を阻害した。
【００４２】
実施例３
得られた４株クローンから得られた４−ＨＨＥ修飾蛋白質を認識するモノクローナル抗体の内、５２株のモノクローナル抗体を免疫組織染色応用にした。なお、検討に用いるモノクローナル抗体は、培養上清を希釈してそのまま用いた。染色に使用する組織としては、ヒト粥状動脈硬化病巣を用い、一般的に免疫組織染色に用いられる方法、例えば、「染色法のすべて」（医歯薬出版株式会社  １５５−１６５  １９８８年）に記載の方法に従って免疫組織染色を行った。図４は、免疫組織染色した顕微鏡写真（倍率１００倍）を示す。写真より明らかなようにヒト粥状動脈硬化病巣には本モノクローナル抗体で染色される部位が局在することが示された。（図４では、濃染部位が本発明のモノクローナル抗体の陽性部位であることを示している。）
なお図には示していないが、５３および５７株由来のモノクローナル抗体を用いた場合も同様の結果が得られ、ヒト粥状動脈硬化病巣には本モノクローナル抗体で染色される部位が局在することが示された。
【００４３】
以上の結果から、本発明の実施例１は、４−ＨＨＥと蛋白質中の構成アミノ酸であるヒスチジン側鎖が反応して生じた４−ＨＨＥ由来のマイケル付加体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体であることがわかる。
また、本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、前記のハイブリッド細胞を用いる方法であり、容易に特異的に認識するモノクローナル抗体が得られる方法であることがわかる。
したがって、本発明のモノクローナル抗体は、ω−３系高度不飽和脂肪酸の過酸化物等に由来する４−ヒドロキシ−２−ヘキセナールの生体に対する影響を明らかにするために非常に有用であり、臨床診断、臨床病理、分析等において利用することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】種々のアルデヒドをＢＳＡに修飾させた修飾物に対する本発明のモノクローナル抗体の反応性について、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示すグラフである。
【図２】２−ヒドロキシ−４−アルケナールをＢＳＡに修飾させた修飾物に対する本発明のモノクローナル抗体の反応性について、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示すグラフである。
【図３】本発明のモノクローナル抗体の認識部位について、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示すグラフである。
【図４】本発明のモノクローナル抗体を生体組織、粥状動脈硬化病巣に対して免疫組織染色した結果を示す顕微鏡写真（倍率１００倍）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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