(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
RNA抽出法により成長休止期の毛包を含む動物皮膚から得られる水溶性画分であって、RNAからDNAへの逆転写反応を阻害する活性を有する前記画分を含む、逆転写反応阻害剤。
【請求項２】
RNA抽出法により成長休止期の毛包を含む動物皮膚から得られる水溶性画分であって、RNAからDNAへの逆転写反応を阻害する活性を有する前記画分を含む、逆転写酵素阻害剤。
【請求項３】
RNA抽出法により成長休止期の毛包を含む動物皮膚から得られる水溶性画分であって、逆転写酵素を有するウイルスの増殖を阻害する活性を有する前記画分を含む、ウイルス増殖阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物臓器から抽出した水溶性画分、その製造方法、逆転写反応阻害剤、逆転
写酵素阻害剤、ウイルス増殖阻害剤及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ウイルス、中でもHIV(エイズウイルス)やヒト成人T細胞白血病ウイルスのように
、その増殖のために一本鎖RNAからDNAを合成する（これを逆転写という）酵素を有するレ
トロウイルスは、逆転写酵素の阻害活性を示す薬剤により、その増殖が阻害されることが
知られていた。しかしながら、そのような活性を有する物質は多くは低分子化合物で一般
的毒性も強く、抗ウイルス活性を示す有効濃度においては、生体への悪影響も強く、副作
用のためにその有効濃度で用いることは困難であった。現在まで多くの研究にもかかわら
ず、決定的な抗HIV薬が存在しない事実が、この問題を何よりも雄弁に語っている。そこ
で、生体へは悪影響のない物質で、逆転写反応を阻害し、もってウイルス増殖を抑制する
物質の開発が待ち望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、その増殖のために一本鎖RNAからDNAを合成する逆転写反応を必要とするレト
ロウイルスの増殖を強く阻害し、生体への毒性の少ない物質とその製造方法を確立し、こ
れを含む医薬組成物を提供することを目的とする。
【０００４】
また本発明は、逆転写反応阻害物質とその製造方法を確立し、これを含む医薬組成物を
提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、動物の皮膚などの組織に
RNAからDNAへの逆転写反応を強く阻害する物質が含まれていることを見出し、これに注目
して、皮膚から当該物質をRNA及び／又は硫酸化多糖を含有する画分として選択的に抽出
することにより選択的に生産できることを見出した。さらに、本発明者らは、この物質が
休止期の毛包を含む皮膚に多く含まれていることを確認した。さらに、本発明者らは、こ
の物質がレトロウイルスであるHIVの増殖を強く阻害することを確認した。本発明はこの
ような知見に基づいて完成されたものである。
【０００６】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）  動物臓器から抽出した水溶性画分であって、RNAからDNAへの逆転写反応を阻害す
る活性、逆転写酵素を有するウイルスの増殖を阻害する活性及び／又はRNAと結合する活
性を有する前記画分。
（２）  水溶性画分がRNAを含む画分である、（１）記載の画分。
（３）  水溶性画分が硫酸化多糖を含む画分である、（１）記載の画分。
（４）  硫酸化多糖がヘパリン、またはヘパラン硫酸、またはコンドロイチン硫酸である
、（３）記載の画分。
（５）  動物臓器が皮膚である、（１）〜（４）のいずれかに記載の画分。
（６）  皮膚が成長休止期の毛包を含む、（５）記載の画分。
（７）  ウイルスがHIVウイルスである、（１）〜（６）のいずれかに記載の画分。
（８）  動物臓器から抽出したRNA及び／又は硫酸化多糖であって、RNAからDNAへの逆転
写反応を阻害する活性、逆転写酵素を有するウイルスの増殖を阻害する活性及び／又はRN
Aと結合する活性を有するRNA及び／又は硫酸化多糖。
（９）  RNAが2塩基〜10000塩基の分子量を有する、（８）記載のRNA。
（１０）  硫酸化多糖が２〜５００の糖からなる、（８）記載の硫酸化多糖。
（１１）  動物臓器が皮膚である、（８）〜（１０）のいずれかに記載のRNA及び／又は
硫酸化多糖。
（１２）  皮膚が成長休止期の毛包を含む、（１１）記載の画分。
（１３）  ウイルスがHIVウイルスである、（８）〜（１２）のいずれかに記載の画分。
（１４）  動物臓器から抽出した水溶性画分であって、RNAからDNAへの逆転写反応を阻害
する活性、逆転写酵素を有するウイルスの増殖を阻害する活性及び／又はRNAと結合する
活性を有する前記画分を製造する方法であって、動物臓器から水溶性画分を抽出する工程
を含む、前記の方法。
（１５）  動物臓器から抽出したRNA及び／又は硫酸化多糖であって、RNAからDNAへの逆
転写反応を阻害する活性、逆転写酵素を有するウイルスの増殖を阻害する活性及び／又は
RNAと結合する活性を有する前記RNA及び／又は硫酸化多糖を製造する方法であって、動物
臓器から総RNA及び／又は硫酸化多糖を抽出する工程を含む、前記の方法。
（１６）  動物臓器から抽出した水溶性画分であって、RNAからDNAへの逆転写反応を阻害
する活性を有する前記画分を含む、逆転写反応阻害剤。
（１７）  動物臓器から抽出した水溶性画分であって、RNAからDNAへの逆転写反応を阻害
する活性を有する前記画分を含む、逆転写酵素阻害剤。
（１８）  動物臓器から抽出した水溶性画分であって、逆転写酵素を有するウイルスの増
殖を阻害する活性を有する前記画分を含む、ウイルス増殖阻害剤。
（１９）  動物臓器から抽出した水溶性画分であって、RNAからDNAへの逆転写反応を阻害
する活性及び／又は逆転写酵素を有するウイルスの増殖を阻害する活性を有する前記画分
を含む、医薬組成物。
（２０）  動物臓器から抽出した水溶性画分であって、RNAと結合することによってRNAの
電気泳動上での移動度を下げる活性を有する前記画分。
（２１）  毛包が休止期の皮膚に含まれる物質であって、RNAと結合することによってRNA
in situ hybridizationを阻害する活性を有する前記画分。
（２２）  動物臓器から抽出したRNA及び／又は硫酸化多糖であって、RNAからDNAへの逆
転写反応を阻害する活性を有する前記RNA及び／又は硫酸化多糖を含む、逆転写反応阻害
剤。
（２３）  動物臓器から抽出したRNA及び／又は硫酸化多糖であって、RNAからDNAへの逆
転写反応を阻害する活性を有する前記RNA及び／又は硫酸化多糖を含む、逆転写酵素阻害
剤。
（２４）  動物臓器から抽出したRNA及び／又は硫酸化多糖であって、逆転写酵素を有す
るウイルスの増殖を阻害する活性を有する前記RNA及び／又は硫酸化多糖を含む、ウイル
ス増殖阻害剤。
（２５）  動物臓器から抽出したRNA及び／又は硫酸化多糖であって、RNAからDNAへの逆
転写反応を阻害する活性及び／又は逆転写酵素を有するウイルスの増殖を阻害する活性を
有する前記RNA及び／又は硫酸化多糖を含む、医薬組成物。
【０００７】
本発明の水溶性画分は、RNA及び／又は硫酸化多糖を含む画分（以下、「RNA及び／又は
硫酸化多糖画分」と記す）であるとよい。RNA画分は、総RNAであってもよいし、総RNAか
らmRNA（メッセンジャーRNA）を除去した画分であってもよい。本明細書において、「総R
NA」とは、動物組織や細胞に含まれるrRNA（リボゾームRNA）、tRNA（トランスファーRNA
）、mRNA、small RNA、micro RNAなどの混合物をいうが、これらに限定されず、その基本
構造がリボ核酸であれば良い。通常細胞内の総RNA の 80% 以上は rRNA であり、残りの
大部分は tRNA である。総RNAは、RNAに限らず、総RNA抽出法で調製される全てのもの、
すなわち硫酸化多糖なども含む可能性がある。また、RNA画分は、硫酸化多糖を含んでお
り、また、通常のRNA抽出法によって混入してくる程度の糖質、DNA、タンパク質、脂質、
その他低分子物質を少量含んでいてもよい。本明細書において、「硫酸化多糖」とは、生
体物質としての硫酸化グリコサミノグリカン(sulfated glycosaminoglycan)、すなわち、
ヘパラン硫酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸などと、
化学合成物としての硫酸化デキストラン、またこれらの類縁分子を含める。グリコサミノ
グリカンはウロン酸(或いはガラクトース)とヘキソサミンからなる基本の二糖構造が通常
40-100回繰り返してできる多糖で、それに種々の程度の硫酸化を受けて硫酸化グリコサミ
ノグリカンとなる。この基本二糖構成はコンドロイチン硫酸とデルマタン硫酸の場合（グ
ルクロン酸 / イズロン酸 → Nアセチルガラクトサミン）、ヘパラン硫酸とヘパリンの場
合には（グルクロン酸 / イズロン酸 → Nアセチルグルコサミン）、ケラタン硫酸の場合
には(ガラクトース → Nアセチルグルコサミン)である。グリコサミノグリカンの硫酸化
は、コンドロイチン硫酸の場合には通常規則的で各二糖あたり一個所の硫酸化を受け、ヘ
パラン硫酸の場合にはグリコサミノグリカン全体に不規則な分布の硫酸化を受ける。
【０００８】
本発明の水溶性画分及びRNA及び／又は硫酸化多糖は、RNAからDNAへの逆転写反応を阻
害する活性、逆転写酵素を有するウイルスの増殖を阻害する活性及び／又はRNAと結合す
る活性を有する。本明細書において、「逆転写反応」とは、RNAのヌクレオチド配列を相
補的なDNAとして写しとる反応をいう。「逆転写酵素」とは、RNAを鋳型にしてDNAを合成
する酵素をいう。逆転写酵素を有するウイルス（RNAウイルスのレトロウイルス科）には
、ヒトを宿主とする代表的なものとしては、レンチウイルス属ヒト免疫不全（エイズ）ウ
イルス-1  Human immunodeficiency virus 1（HIV-1）、デルタレトロウイルス属ヒトT細
胞白血病ウイルスHuman T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1)、Human T-lymphotropic viru
s 2 (HTLV-2)があげられる。さらに、各種動物を宿主とするものをあげると、レンチウイ
ルス属（Simian immunodeficiency virus (SIV)、Equine immunodeficiency virus (EIV)
、Bovine imuunodeficiency virus (BIV)、Feline immunodeficiency virus (FIV)）、ア
ルファレトロウイルス属（Rous sarcoma virus (RSV)、Avian leukosis virus（ALV））
、ベータレトロウイルス属（Mouse mammary tumor virus（MMTV））、ガンマレトロウイ
ルス属（Murine leukemia virus (MLV)、Feline leukemia virus (FeLV)）、デルタレト
ロウイルス属（Bovine leukemia virus（BLV））、イプシロンレトロウイルス属（Walley
e dermal sarcoma virus（WDSV））、スプマウイルス属（Chimpanzee foamy virus（CFV
））、などを例示することができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の水溶性画分又はRNA及び／又は硫酸化多糖により、RNAからDNAへの逆転写反応
を阻害することができる。また、本発明の水溶性画分により、逆転写を必須過程として宿
主細胞中で増殖するウイルスの増殖を阻害することができる。従って、本発明の水溶性画
分を医薬品として利用することができる。本発明の水溶性画分及びRNA及び／又は硫酸化
多糖は健康な生体由来のものであり、生体への毒性がないか、あるいは少ないと考えられ
るので、安全な医薬品として利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明の水溶性画分は、動物臓器に含まれるRNAを抽出する公知の方法で製造すること
ができる。
【００１２】
動物としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、トリ、モルモ
ットなどを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００１３】
臓器としては、皮膚、筋肉、骨、脳、脳下垂体、心臓、肺、脾臓、食道、胃、腸、肝臓
、膵臓、腎臓、血液などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００１４】
動物臓器に含まれるRNA及び／又は硫酸化多糖は以下の手順で抽出することができる。
動物の臓器の全て又は一部を採取し、必要により凍結した後、グアニジウム塩などの強力
なタンパク質変性剤を含む緩衝液（アイソジェン試薬など）を加えて、ホモジナイゼーシ
ョンする。その後、フェノール/クロロホルムなどの有機溶媒を加えて、遠心分離すると
、ホモジネートは水相、有機相及び中間相の３相に分離する。水相にはRNA及び硫酸化多
糖が存在し、ＤＮＡとタンパク質は中間相以下に存在する。従って、水相を採取してイソ
プロパノール（エタノールなどの他の沈殿剤でもよい）を加えてRNA及び硫酸化多糖を沈
殿させる。この沈殿より溶媒を完全に除去した後、RNaseフリーの蒸留水に溶解する。こ
のようにして、逆転写反応阻害物質を含むRNA及び／又は硫酸化多糖画分を分離する。
【００１５】
RNA及び／又は硫酸化多糖画分からmRNAを除去するには、以下のようにするとよい。総R
NA及び／又は硫酸化多糖を含む画分を、mRNAを精製する方法に供することにより、mRNAを
除去した画分を回収することができる。例として、mRNAの特徴である３’末端のpolyAテ
ールにハイブリダイズすることを特徴とするoligo dT配列を有する核酸を固定化したマイ
クロビーズ担体を、総RNAを含む水溶液と混合することにより、mRNAのマイクロビーズ表
面への特異的吸着を促す。その後、マイクロビーズを遠心分離により除去することにより
、残った水溶液中には、mRNAを全く含まない、あるいはわずかしか含まないRNA及び／又
は硫酸化多糖画分が残る。
【００１６】
逆転写反応を阻害する活性は、reverse transcriptase（逆転写酵素）の活性を測定す
る一般的な実験系に、適当な量の試料を加えることにより、測定することができる。たと
えば、mRNAを、任意のcDNAを組み込んだプラスミドベクターからin vitro転写反応によっ
て調製したり、mRNAを含む生物試料から抽出したりした後、このmRNAを鋳型として一定条
件下でreverse transcriptase酵素によってcDNAを合成させる。そして合成されたcDNAの
量を、放射性同位元素または別の方法によって定量的に測定することにより、reverse tr
anscriptase酵素の活性を測定することができる。この実験系に適当な量の試料を含有さ
せることにより、合成されるcDNAの量が減少する程度を測定することにより、阻害活性を
測定することができる。
【００１７】
逆転写酵素を有するウイルスの増殖を阻害する活性は、たとえばAdvanced Biotechnolo
gies Incorporated社(Columbia, Maryland, U.S.A.)のAnti-HIV-1 Fluorescent Cytoprol
iferation Assayによって、宿主細胞への細胞障害性を指標として測定することができる
。
RNAと結合する活性は以下のようにして測定することが出来る。標識RNAプローブを用意
する。RNAは任意の配列でよいが、例としてbeta-actin mRNAに相補的な配列を有するRNA
プローブがあげられる。標識としては放射性、非放射性いずれでも良いが、例としてDIG
ラベルがあげられる。用意した標識RNAプローブを単独、及び被測定試料と混合してから
アガロースゲル電気泳動を行う。泳動後のゲルをニトロセルロース膜にブロットし、この
膜上に転写された標識RNAを抗標識抗体で検出する。試料と混合した場合に標識RNAプロー
ブ本来の分子量よりも移動度の低い（高分子量の）シグナルが検出された場合、試料にRN
Aと結合する活性があることを示す。
【００１８】
本発明者らは、アイソジェン試薬（株式会社ニッポンジーン）を使ってRNA及び／又は
硫酸化多糖を含む水溶性画分（以下、「RNA画分」と略する）を調製・精製し、この画分
が逆転写阻害活性を有することを確認した（後述の実施例６）。さらに、アイソジェン試
薬で調製・精製したRNA画分をRNeasy mini（QIAGEN社）を使ってさらに精製したところ、
逆転写阻害活性が保持された（後述の実施例８）。
【００１９】
さらに本発明者らは、このアイソジェン試薬で調製・精製したRNA画分をヘパリチナー
ゼ及びヘパリナーゼ（生化学工業）を使って処理したところ、逆転写阻害活性が一部解除
された（後述の実施例８−２）。さらに本発明者らは、このアイソジェン試薬で調製・精
製したRNA画分の中に、ウロン酸が含まれることを化学分析により明らかにした。さらに
逆転写阻害活性とウロン酸量の間に相関があることを明らかにした（後述の実施例８−３
）。これらのことから、逆転写阻害活性物質の少なくとも一部が、ウロン酸を含む、ヘパ
リン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸などの硫酸化多糖である可能性がある。
【００２０】
本発明の水溶性画分、RNA及び硫酸化多糖は、逆転写反応阻害剤、逆転写酵素阻害剤及
びウイルス増殖阻害剤として利用することができる。
【００２１】
本発明の水溶性画分、RNA及び／又は硫酸化多糖は、医薬品として、ヒト、その他の動
物に投与してもよいし、実験用の試薬として用いてもよい。本発明の水溶性画分又はRNA
は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、他の逆転写反応阻害剤、逆転
写酵素阻害剤、ウイルス増殖阻害剤など）と組み合わせて使用してもよい。
【００２２】
本発明の水溶性画分、RNA及び／又は硫酸化多糖をヒトに投与する場合には、例えば、
有効成分（本発明の水溶性画分又はRNA又は硫酸化多糖）の量に換算して、１日あたり約0
.1〜9000 mg/kg（体重）、好ましくは１日あたり約1〜900 mg/kg（体重）の投与量で、１
回または数回に分けて経口投与するとよいが、その投与量や投与回数は、症状、年齢、投
与方法などにより適宜変更しうる。
【００２３】
本発明の水溶性画分、RNA及び／又は硫酸化多糖は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤
、シロップ剤などの製剤にして、経口投与してもよいし、注射剤、坐剤などの製剤にして
、腹腔内や静脈内への注射により非経口投与することもできる。製剤中の有効成分（本発
明の水溶性画分又はRNA）の含有率は、０．０００１〜９０重量％の間で変動させること
ができる。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などの形態をとる場合には、有効成
分を０．０１〜８０重量％含有させるのが好ましい。シロップ剤などの液剤の場合には、
有効成分を０．０１〜３０重量％含有させるのが好ましい。さらに、非経口投与する注射
剤の場合には、有効成分を０．０００１〜１０重量％含有させるのが好ましい。
【００２４】
後天性免疫不全症候群（以下、「AIDS」と記す）患者への本発明の水溶性画分、RNA及
び／又は硫酸化多糖の投与は、例えば、以下のようにして行うことができる。すなわち、
本発明の水溶性画分、RNA及び／又は硫酸化多糖を製造し、これを常法により滅菌処理し
、例えば1000 μg/mlの注射用溶液を調製する。この溶液を、患者静脈内に有効成分（本
発明の水溶性画分、RNA及び／又は硫酸化多糖）の投与量が体重１ kg当たり例えば10 mg
となるように、例えば輸液の形で点滴投与する。投与は、例えば２週間の間隔で４回繰り
返し、その後も、患者の血漿HIV-1 RNA濃度とCD4値（CD4+T細胞の数）、臨床症状を指標
とした治療効果の確認をしながら、適宜この治療を繰り返す。治療効果があり明らかな副
作用が見られない限り、治療を継続する。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を
説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００２６】
〔実施例１〕マウス皮膚からの逆転写阻害活性ＲＮＡ及び/又は硫酸化多糖画分の調製
C3H/Heマウス雄８週令（日本エスエルシー株式会社）の実験動物の背部体毛を抜毛した
後、通常の飼育条件下で、１８日、及び２２日飼育を継続した。飼育後、抜毛部分の皮膚
を採取した。この方法に従うと、１８日後にはほぼ全ての毛包が毛周期における成長期（
アナジェン）後期にあり、２２日後には休止期（テロジェン）にあることが一般的に知ら
れている。皮膚はそのままでも、凍結して皮膚試料としても良いし、固定後パラフィン包
埋して皮膚試料としても良いが、本例では採取後ただちにそのままRNA画分の調製に供し
た。
【００２７】
採取した皮膚試料から総RNAを抽出する方法としては、「株式会社ニッポンジーンRNA抽
出用試薬ISOGEN（アイソジェン）マニュアル」にほぼ従い、以下のように行った。アイソ
ジェン試薬は、フェノールとチオシアン酸グアニジンを含む均一な液体である。ここで、
総RNAを抽出する方法としては、特に限定されず如何なる総RNA抽出方法を用いても良い。
【００２８】
皮膚試料を採取し、直ちに液体窒素中で凍結した後、試料にアイソジェン試薬を加えて
ホモジナイゼーションした後、クロロフォルムを加えて遠心分離するとホモジネートは水
相、有機相及び中間相の３相に分離する。水相にはＲＮＡと硫酸化多糖の一部が存在し、
ＤＮＡとタンパク質は中間相以下に存在する。従って、水相を採取してイソプロパノール
を加えて総ＲＮＡを沈殿させる。
【００２９】
このプロセスを詳述すると、以下になる。皮膚組織400mgに対しアイソジェン試薬6mlを
加え、高速回転刃を有するポリトロンを用いて2秒x 5回処理することにより、組織を細切
した。この試料に対し1 mlのクロロフォルムを加え、ボルテックスミキサーで激しく攪拌
後、氷上で5分間放置した後、12000xgの遠心力で１５分間、４℃で遠心分離して、上相と
して分離される水相を採取した。この水相に対し、等量のクロロフォルムによる同様の操
作をさらに２度繰り返したのち、水相を別の遠心チューブに移し、半量のイソプロパノー
ルを加え混合後、室温で１０分間放置し、さらに12000xgの遠心力で１５分間、４℃で遠
心して、上清を捨て、沈殿としてRNAを得た。このRNA沈殿に７０％エタノールを1ml加え
、ピペッティングで攪拌後、-20℃で20分放置し、その後7500xgの遠心力で３０分間、４
℃で遠心分離して、沈殿として洗浄済みRNAを回収した。この沈殿より溶媒を完全に除去
した後、RNaseフリーの蒸留水に溶解した。このようにして、逆転写反応阻害物質を含むR
NA画分を分離した。
【００３０】
この方法に従い、毛包が成長周期のうち成長期後期（同調後18日目）及び休止期（同調
後22日目）に同調しているマウス皮膚から調製した総RNA（以下、それぞれ、「D18総RNA
」及び「D22総RNA」と記す）について、RNAとして一定量をとり、アガロースゲル電気泳
動にかけた結果を図１に示す。左レーンはD18総RNA、右レーンはD22総RNAである。図１の
結果より、リボゾーマルRNAの18Sと28Sサブユニットの存在を明瞭に確認することができ
、RNAとしての品質が高い物が得られたことが明らかである。
【００３１】
〔実施例２〕マウス皮膚mRNAの作製
〔実施例１〕で得られたマウス皮膚総RNAから、olgotex-dT30（タカラバイオ株式会社
）を用いてmRNAを精製した。
【００３２】
〔実施例３〕逆転写反応
〔実施例１〕で調製した総RNAまたは〔実施例２〕で調製したmRNAを鋳型として用い、O
ligo dT [（dT）12-18] をプライマーとして逆転写反応を行った。逆転写反応はInVitrog
en社のSuperScriptIIを用い、メーカー指定の条件に従って行った。この逆転写反応によ
って、様々なcDNAがプールされたcDNA溶液を得た。尚、逆転写酵素としては、特に限定さ
れず如何なる逆転写酵素を用いても良い。
【００３３】
〔実施例４〕ベータアクチンmRNA定量用鋳型cDNAの調製
〔実施例３〕で得られたcDNA溶液に含まれるcDNAを鋳型とし、beta-actinをコードする
遺伝子を特異的に増幅するプライマーを用いてPCRを行った。PCRはSTRATAGENE社のPfu pl
ymeraseを用い、メーカー推奨の条件で行った。
プライマーとしては、以下の配列のものを使用した。
プライマー配列；5'- ccgggacctgacggactacctcatgaagat -3'（配列番号１）
プライマー配列；5'- aatagtgatgacttggccgtcaggcagctc -3'（配列番号２）
【００３４】
PCR産物をアガロースゲル電気泳動にかけた結果を図２に示す（右レーン）。図２にお
いて左レーンは100bpラダーマーカーである。図２の結果より、PCR産物にbeta-actinをコ
ードするcDNAの存在を確認することができ、皮膚にbeta-actinが発現していることが示さ
れる。
【００３５】
〔実施例５〕マウス皮膚ＲＮＡから逆転写したcDNA溶液のPCR反応阻害活性有無の評価
本実施例においては、皮膚から抽出したRNA試料から逆転写して調製したcDNAの溶液中
に、定量的PCR反応を抑制する活性が存在するか否かを測定した。
＊実験：毛包が成長周期のうち成長期後期（同調後18日目）及び休止期（同調後22日目）
に同調しているマウス皮膚から調製した総RNA（以下、それぞれ、「D18総RNA」及び「D22
総RNA」と記す）について、一定量をとり、Oligo dT [（dT）12-18] をプライマーとして
逆転写反応を行った。逆転写反応はInVitrogen社のSuperScriptIIを用い、メーカー指定
の条件に従って行った。そして逆転写反応産物の中に含まれるbeta-actinのcDNAコピー数
をリアルタイム定量PCR法を用いて測定した。
・beta-actinのcDNA絶対数の陽性対照：リアルタイム定量PCR法で用いるオリゴヌクレオ
チドプライマーペアで増幅して得られたbeta-actinのcDNA断片（実施例４で調製したもの
）を、プラスミドベクターにクローン化したもの。これの希釈系列に対して同時にリアル
タイム定量PCR法による増幅反応を行い、検量線を作成し、測定試料中のbeta-actinのcDN
A の絶対コピー数を測定する。
この実験の結果、以下の測定値が得られた。
【００３６】
【表１】
0004686756.tif 000002
1.  上記において、＊１と＊２、＊３と＊４の値は近い。従って、これらD18cDNAとD22cD
NA  には、定量的PCR反応を阻害する活性はほぼ認められないと結論される。
【００３７】
〔実施例６〕マウス皮膚ＲＮＡ画分に存在する逆転写阻害物質の評価
本実施例においては、皮膚から抽出したRNA試料が逆転写反応の抑制活性を有するか否
かを測定した。
・実験：毛包が成長周期のうち成長期後期（同調後18日目）及び休止期（同調後22日目）
に同調しているマウス皮膚から調製したRNA（以下、それぞれ、「D18 RNA」及び「D22 RN
A」と記す）を、そのまま（総RNA）あるいはmRNAとして精製後に一定量をとり、Oligo dT
[（dT）12-18] をプライマーとして逆転写反応を行った。逆転写反応はInVitrogen社のS
uperScriptIIを用い、メーカー指定の条件に従って行った。そして逆転写反応産物の中に
含まれるbeta-actinのcDNAコピー数をリアルタイム定量PCR法を用いて測定した。
・beta-actinのcDNA絶対数の陽性対照：リアルタイム定量PCR法で用いるオリゴヌクレオ
チドプライマーペアで増幅して得られたbeta-actinのcDNA断片（実施例４で調製したもの
）を、プラスミドベクターにクローン化したもの。これの希釈系列に対して同時にリアル
タイム定量PCR法による増幅反応を行い、検量線を作成し、測定試料中のbeta-actinのcDN
A の絶対コピー数を測定する。
この実験の結果、以下の測定値が得られた。
【００３８】
【表２】
0004686756.tif 000003
1.  上記において、本来、＊１と＊２の値はほぼ一致するはずであり、実験誤差やmRNA含
量の推定誤差を考慮しても、数倍の範囲内に収まることが予測される。しかるに、D22RNA
ではその差は83倍にもなっている。
2.  上記において、＊５は本来、＊３と＊４の値の平均値にほぼ一致するはずである。し
かるに、総RNAでははるかに小さな値が出ている。mRNAではほぼ平均値となっている。
3.  この結果と、実施例５の実験でこれらRNAを逆転写して得られたcDNAを混合した場合
には、阻害活性が認められなかったことから、１）D22に逆転写阻害活性物質が含有され
ること、２）この物質は総RNAに含まれるが、mRNAではないこと、３）阻害活性は、D18に
比べてD22に強いこと、が示された。
【００３９】
【表３】
0004686756.tif 000004
1.  上記において、＊5は本来、＊2と＊3の値の平均値にほぼ一致するはずである。また
、＊6は本来、＊2と＊4の値の平均値にほぼ一致するはずである。しかるに、＊5も＊6も
、はるかに小さな値が出ており、D0、 D22のRNAに逆転写阻害活性物質が含まれることが
示される。D0、 D22 は共に毛包が休止期にあり、D18は成長期にある。この結果から、毛
包が休止期の皮膚には共通して逆転写阻害活性が強く含まれることがわかる。
【００４０】
〔実施例７〕マウス皮膚ＲＮＡ画分に存在する逆転写阻害物質の評価
本実施例においては、皮膚から抽出したRNA画分がbeta-actin以外の各種の遺伝子のmRN
Aの逆転写反応に対しても抑制活性を有するか否かを測定した。
・実験：毛包が成長周期のうち休止期（同調後22日目）に同調しているマウス皮膚から調
製した総RNAを、そのまま（総RNA）あるいはmRNAとして精製後に一定量をとり、Oligo dT
[（dT）12-18] をプライマーとして逆転写反応を行った。逆転写反応はInVitrogen社のS
uperScriptIIを用い、メーカー指定の条件に従って行った。そして逆転写反応産物の中に
含まれる下記の種々の遺伝子のcDNAコピー数をリアルタイム定量PCR法を用いて測定した
。
・各種遺伝子のcDNA絶対数の陽性対照：リアルタイム定量PCR法で用いるオリゴヌクレオ
チドプライマーペアで増幅して得られた各々のcDNA断片を、プラスミドベクターにクロー
ン化したもの。これの希釈系列に対して同時にリアルタイム定量PCR法による増幅反応を
行い、検量線を作成し、試料中の各々の遺伝子のcDNAの絶対コピー数を算定する。
FGF-1、FGF-6、FGF-7、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-16、FGF-18、FGF-
22、GAPDH、TGF-beta1、FGF-R2、FGF-R4
（FGF, fibroblast growth factor; FGF-R, FGF receptor; GAPDH, glyceraldehydes 3-p
hosphate-dehydrogenase; TGF-beta1, transforming growth factor-beta1）
【００４１】
この実験の結果、調べた15種の遺伝子の全ての測定において、実施例６表２のD22の列
と同様に、総RNA から精製したmRNA 1ngを逆転写して測定したcDNAコピー数に比べ、総RN
A 20 ngを逆転写して測定したcDNAコピー数は著しく小さな値を示した。このことから、
多種の遺伝子を用いた実験でも、逆転写を阻害する活性がD22総RNAに存在することが示さ
れた。
【００４２】
〔実施例８〕さらに精製したマウス皮膚RNA画分に存在する逆転写阻害物質の評価
実施例６で用いた総RNAは、アイソジェン試薬を用いてこの試薬の製造元のプロトコー
ルに従い精製したものであり、その原理は、強力なタンパク質変性剤を含む水溶液中で細
胞を溶かし、フェノール/クロロホルム抽出によってタンパク質を沈殿させるとき、溶液
を酸性にすることにより、DNA はフェノール/クロロホルム層に含まれ、 RNA が水層に残
ることを利用して、RNA を抽出・精製したものである。
【００４３】
本実施例では、実施例６で用いた総RNA試料を、別のRNA精製原理に基づき、さらに精製
して純度を高めた。すなわち、RNAが一定条件下でシリカゲルベースの膜に選択的に結合
するという性質を利用して、精製した。具体的には、実施例６で用いた総RNA試料を、QIA
GEN社製のRNeasy miniキットを用いて、同キットに付属の高濃度の塩を含む緩衝液と適切
な濃度のエタノールの存在下で、選択的に膜に吸着させた後、膜に結合した総RNAを水で
遊離させ、回収した。この総RNA（以下の表中では純化総RNAと称する）について、実施例
６と同様に、一定量をとり、Oligo dT [（dT）12-18] をプライマーとして逆転写反応を
行った。逆転写反応はInVitrogen社のSuperScriptIIを用い、メーカー指定の条件に従っ
て行った。そして逆転写反応産物の中に含まれるbeta-actinのcDNAコピー数をリアルタイ
ム定量PCR法を用いて測定した。その結果を以下の表に示す。
【００４４】
【表４】
0004686756.tif 000005
1.  上記において、本来、＊１と＊２、＊３と＊４の値はほぼ一致するはずであり、各種
誤差を考慮しても、数倍の範囲に収まることが予測される。しかるに、1:1混合ではその
差は46倍にもなっている。したがって逆転写阻害活性をもつ物質はアイソジェン試薬で得
た総RNAをRneasyで追加精製しても含まれることがわかる。このことから、水溶性画分に
含まれる逆転写阻害活性をもつ物質は、RNAであるか、RNAと挙動を共にする性質の強い物
質であることがわかる。
〔実施例８ー２〕マウス皮膚水溶性画分に存在する逆転写阻害物質の評価
上述の実施例で用いた休止期皮膚から得られる総RNAは、アイソジェン試薬を用いてこ
の試薬の製造元のプロトコールに従い精製したものであり、純度の高いRNAが得られると
されている。しかしながら、RNA以外の物質が含まれる可能性は否定できない。そこで本
実施例では、当該総RNAに、不純物として含まれる可能性のある硫酸化多糖が、逆転写阻
害活性に寄与しているか否かを評価する目的で、当該総RNAをこれら物質を特異的に分解
する酵素で処理した場合の影響を評価した。 
【００４５】
すなわち、休止期皮膚から得た総RNA（水溶性画分）を、硫酸化多糖であるヘパラン硫
酸とヘパリンを分解する酵素であるヘパリチナーゼ、ヘパリナーゼ混合物で処理した。こ
の試料をそのまま、あるいは、D18mRNAと混合後、Oligo dT [（dT）12-18] をプライマー
として逆転写反応を行った。逆転写反応はInVitrogen社のSuperScriptIIを用い、メーカ
ー指定の条件に従って行った。そして逆転写反応産物の中に含まれるbeta-actinのcDNAコ
ピー数をリアルタイム定量PCR法を用いて測定した。その結果を以下の表に示す。
【００４６】
【表５】
0004686756.tif 000006
上記において、休止期皮膚総RNAとして調製した水溶性画分をヘパリチナーゼ、ヘパリナ
ーゼで処理した場合、逆転写後のcDNA中のBeta-actinコピー数が増加することから、これ
らの酵素で分解される硫酸化多糖であるヘパラン硫酸、ヘパリンが、逆転写阻害活性の少
なくとも一部を担うことがわかる。
〔実施例８−３〕逆転写阻害物質の評価
上記実施例の結果から、休止期皮膚から得られる逆転写阻害活性の少なくとも一部は、
ヘパリンやヘパラン硫酸などの硫酸化多糖であることが示された。そこで本実施例では、
純粋なmRNAからの逆転写反応に各種硫酸化多糖を加え、その後逆転写反応を行い、合成さ
れたcDNAの量を定量することにより、これら硫酸化多糖が逆転写反応に与える効果を評価
した。
試験すべき硫酸化多糖の濃度決定にあたり、強い逆転写阻害活性を有するD0皮膚の水溶性
画分に含まれるウロン酸の定量を行ったところ、mRNA10 ng に対して130ngのヘパリンに
相当するウロン酸が含まれることが明かとなった。従って、この濃度の付近で効果を評価
した。
【００４７】
硫酸化多糖としてヘパリンまたはコンドロイチン硫酸Eを、各種濃度で1 ng のD0mRNAと
混合後、Oligo dT [（dT）12-18] をプライマーとして逆転写反応を行った。逆転写反応
はInVitrogen社のSuperScriptIIを用い、メーカー指定の条件に従って行った。そして逆
転写反応産物の中に含まれるbeta-actinのcDNAコピー数をリアルタイム定量PCR法を用い
て測定した。その結果を以下の表に示す。
【００４８】
【表６】
0004686756.tif 000007
上記において、ヘパリン、コンドロイチン硫酸Eを添加した場合、逆転写後のcDNA中のBet
a-actinコピー数が減少することから、これらの硫酸化多糖が強い逆転写阻害活性を有す
ることがわかる。
【００４９】
〔実施例８−４〕精製したマウス皮膚RNA画分による逆転写阻害の量依存性の評価
実施例６で用いた総RNAは、アイソジェン試薬を用いてこの試薬の製造元のプロトコー
ルに従い精製したものである。本実施例では、mRNAの有するpolyAがoligo dTに選択的に
結合するという性質を利用して、実施例６で用いた総RNAから、mRNAを除去した。具体的
には、実施例６で用いた総RNA試料を、Takara Bio 社製のOligotex-dT30 Super mRNA pur
ification kitを用いて、同キットに付属のoligo dT固定化担体に吸着させ、担体に結合
しなかった画分を回収した。そして、この画分が有する逆転写反応阻害活性の量依存性を
評価した。すなわち、このmRNA除去総RNAを各種濃度で共存させ、実施例６と同様に、Oli
go dT [（dT）12-18] をプライマーとして逆転写反応を行った。そして逆転写反応産物の
中に含まれるbeta-actinのcDNAコピー数をリアルタイム定量PCR法を用いて測定した。そ
の結果を以下の表に示す。
【００５０】
【表７】
0004686756.tif 000008
上記において、mRNA除去総RNAを添加した場合、量依存的に逆転写後のcDNA中のBeta-acti
nコピー数が減少することがわかる。
【００５１】
〔実施例９〕HIVウイルス増殖の抑制
本実施例においては、皮膚から総RNAとして調製した水溶性画分がHIVウイルス増殖の抑
制活性を有するか否かを測定した。
実験試料：毛包が成長周期のうち成長期後期（同調後18日目）及び休止期（同調後22日目
）に同調しているマウス皮膚から調製した総RNA。それぞれをD18の総RNA、D22の総RNAと
呼称する。各々試料について以下の５段階の希釈系列を作成した。希釈液は細胞培養液を
用いた。
希釈系列    一試験培養あたりRNA量（マイクロg）  試験あたり最終濃度（マイクロg/マ
イクロl）
1x             18                      0.18
0.3x            5.4                    0.054
0.1x            1.8                    0.018
0.03x           0.54                   0.0054
0.01x           0.18                   0.0018
使用ウイルス：HIV-1 strain IIIB (ABI社カタログ番号10-124-000)
宿主細胞：C8166-45 indicator cell line.
抗ウイルス活性測定用の細胞培養密度： 5 x 10e3 cell/culture
細胞培養液：RPMI 1640
陽性対照：感染させた細胞で試料添加なし
陰性対照：非感染細胞で試料添加なし
＊測定条件
抗ウイルス活性測定用の細胞培養：各試料・各濃度ごとに、１００ulの培養を４ replica
te。
宿主細胞にウイルスを感染させ試料を加えて７日間培養。
細胞培養はアッセイ中培養液を交換しない。
宿主細胞培養終了時に蛍光細胞増殖アッセイを行い、細胞増殖率を数値化。
この実験の結果、以下の測定値が得られた。
【００５２】
【表８】
0004686756.tif 000009
この結果から、試料D18の総RNAもD22の総RNAもHIVウイルスのホスト細胞中での増殖を強
く阻害する活性があることが示された。また、当該活性はD22の総RNA中により多く存在す
る事が示された。
〔実施例９−２〕HIVウイルスの増殖の抑制（ホスト細胞への感染成立後の増殖の抑制）
本実施例においては、HIVウイルスのホスト細胞への感染成立後の増殖を皮膚から抽出
した水溶液画分が抑制するか否かを測定した。
実験試料：毛包が成長周期のうち休止期（D0）のマウス皮膚から総RNA精製の方法に従っ
て調製した水溶液画分。
使用ウイルス：HIV-1 strain IIIB (ABI社カタログ番号10-124-000)
宿主細胞：C8166-45 indicator cell line.
抗ウイルス活性測定用の細胞培養密度： 5 x 10e3 cell/culture
細胞培養液：RPMI 1640
陽性対照：感染させた細胞で試料添加なし
陰性対照：非感染細胞で試料添加なし
＊測定条件
抗ウイルス活性測定用の細胞培養：各濃度ごとに、１００microliterの培養を４ replica
teした。
宿主細胞とウイルス浮遊液を混合して感染を成立させてから、ウイルス浮遊液を洗浄除去
し、細胞に新鮮な培養液を与え、その後試料を加えて７日間培養した。
細胞培養はアッセイ中培養液を交換しない。
宿主細胞培養終了時に蛍光細胞増殖アッセイを行い、細胞増殖率を数値化した。
この実験の結果、以下の測定値が得られた。
【００５３】
【表９】
0004686756.tif 000010
この結果から、HIVウイルスがホスト細胞への感染を成立させた後でも、休止期皮膚から
調整した水溶性画分はHIVウイルスのホスト細胞中での増殖を強く阻害する活性があるこ
とが示された。
【００５４】
〔実施例１０〕動物臓器から抽出した水溶性画分であって、RNAと結合することによってR
NAの電気泳動上での移動度を下げる活性を有する前記画分。
本実施例においては、RNAの電気泳動上での移動度を皮膚から抽出した水溶液画分が抑
制するか否かを測定した。
実験試料：毛包が成長周期のうち休止期（D0）のマウス皮膚から総RNA精製の方法に従っ
て調製した水溶液画分1 microgram。
標識RNA：DIG-labeled  beta-actin  cRNA 1 microgram
＊測定条件
標識RNAを休止期皮膚から調製した水溶液画分と混合し、アガロースゲル電気泳動した。
泳動終了後、メンブレンにブロットし、メンブレンをHRPO標識された抗DIG抗体でイムノ
ブロットし、シグナルを検出した。この実験の結果、次の結果が得られた。
【００５５】
標識RNA1 microgramのみをアガロースゲル上で電気泳動分離し、膜に転写した後に抗標識
抗体を用いて標識RNAを可視化すると、プローブの分子量に相当する移動度の場所にシグ
ナルが検出された。これに対して、標識RNA 1 microgramと、毛包休止期の皮膚から得た
総RNA1 microgramを混合してから、電気泳動分離した場合には、プローブの分子量よりも
高分子量の位置にもシグナルが検出された。この結果から、毛包が休止期にある皮膚から
調製した水溶液画分にはRNAと結合し、その泳動上での移動度を下げる活性があることが
示された。
【００５６】
〔実施例１１〕休止期毛包を含む皮膚に含まれる物質であって、RNAと結合することによ
ってRNA in situ hybridizationを阻害する活性を有する前記画分。
本実施例においては、組織切片上でのmRNAを検出するために用いられるcRNA probeとの
in situ hybridizationを阻害する物質が休止期毛包を含む皮膚に存在するか否かを測定
した。
組織試料：毛包が毛成長周期のうち休止期（D0）及び成長期(D8)の皮膚から作製した凍結
薄切切片。
RNAプローブ：DIG-labeled  beta-actin  cRNA
＊測定条件
DIG-labeled  beta-actin  cRNAプローブを調製し、毛包が成長周期のうち休止期（D0）
及び成長期(D8)の皮膚から作製した凍結薄切切片と常法に従ってin situ hybridization
を行った。その後、抗DIG抗体でシグナルを検出した。この実験の結果、次の結果が得ら
れた。
【００５７】
毛包が成長期にある皮膚では、内在的に発現しているbeta actin mRNAと特異的cRNAプロ
ーブのin situ hybridizationのシグナルが強く観察された。これと比較して、毛包が休
止期にある皮膚では、同じ条件でin situ hybridizationを行っても、シグナルはほとん
ど観察されなかった。この結果から、毛包が休止期にある皮膚では、毛包が成長期にある
皮膚に比べ、beta actin mRNAと特異的cRNAプローブのin situ hybridizationを阻害する
強い活性があることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明の水溶性画分、RNA及び硫酸化多糖は、逆転写反応阻害剤、逆転写酵素阻害剤又
はウイルス増殖阻害剤として、AIDSなどの疾患の予防・治療及び研究に用いることができ
る。本発明の水溶性画分、RNA及び硫酸化多糖は健康な生体由来のものであり、生体への
毒性がないか、あるいは少ないと考えられるので、安全な医薬品として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】実施例１で分離したRNA画分をアガロース電気泳動にかけて（図の上方から下方に向けて泳動）、エチジウムブロマイドでRNAを染色した結果を示す。D18は左レーン、D22は右レーン。リボゾーマルRNAの18Sと28Sサブユニットの存在を明瞭に確認することができる。
【図２】実施例４のPCR産物をアガロース電気泳動にかけて（図の上方から下方に向けて泳動）、エチジウムブロマイドでDNAを染色した結果を示す。遺伝子配列とプライマーデザインから予測されたとおりの位置に、バンドが観察される（右レーン）。左レーンは分子量マーカーで、100bpラダー。
【配列表フリーテキスト】
【００６０】
＜配列番号１＞
配列番号１は、実施例４で用いたプライマーの配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、実施例４で用いたプライマーの配列を示す。
【図１】
0004686756.tif 000011
【図２】
0004686756.tif 000012
【配列表】
0004686756000001.app