(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列を有する単離ＤＮＡ分子。
【請求項２】
５’から３’の方向において、配列番号１の第一のスカフォード付着領域と、転写開始領域と、該転写開始領域の下流に位置し、かつ、該転写開始領域と機能上関連している少なくとも一の構造遺伝子と、配列番号１の第二のスカフォード付着領域とを含んでなるＤＮＡ構築物。
【請求項３】
該構造遺伝子の下流に位置し、該構造遺伝子と機能上関連し、該スカフォード付着領域の５’側に位置する停止配列を含んでなる請求項２に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４】
植物形質転換ベクターに担持されている請求項２および３のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項５】
植物形質転換ベクターがアグロバクテリウム・ツュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）である請求項４に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物を含有する植物細胞。
【請求項７】
双子葉植物、単子葉植物又は裸子植物である請求項６に記載の植物細胞。
【請求項８】
転写開始領域が植物細胞において機能できる請求項２〜５のいずれか１項に記載のヘテロＤＮＡ構築物を含む形質転換植物細胞を含む組換え植物。
【請求項９】
（ｉ）双子葉植物、
（ｉｉ）単子葉植物、又は
（ｉｉｉ）裸子植物
である請求項８に記載の組換え植物。
【請求項１０】
タバコ、ジャガイモ、大豆、ピーナッツ、綿、セイヨウアブラナおよび野菜類からなる群から選ばれる双子葉植物である請求項９に記載の組換え植物。
【請求項１１】
植物体を再生可能な植物細胞を準備するステップと、
該植物細胞を請求項２〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物により形質転換するステップと
を含む、細胞中で外来遺伝子の発現が増大している組換え植物細胞を作成する方法。
【請求項１２】
上記形質転換のステップが、上記のＤＮＡ構築物を担持する微粒子を上記植物細胞に打ち込むこと、又はアグロバクテリウム・ツュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）による形質転換によって実施される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記植物細胞が、植物体を再生可能な植物組識中に存在する請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）上記形質転換された植物細胞から苗条を再生させるステップ、
（ｉｉ）上記の形質転換された植物細胞から根を再生させるステップ、又は
（ｉｉｉ）上記の形質転換された植物細胞から植物体を再生させるステップ
をさらに含む請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
上記の植物細胞が
（ｉ）単子葉植物細胞、
（ｉｉ）双子葉植物細胞、又は
（ｉｉｉ）裸子植物細胞
である請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
上記の植物細胞がタバコ細胞である請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、USDA研究助成金９１−３７３０１−６３７７号および９２−３７３０１−７７１０号による米国政府の支援を得てなされたものである。したがって、米国政府は、本発明に一定の権利を所有する。
背景技術
細胞のタンパク性核「マトリックス」または「足場組み（以下、「スカフォード」（scaffold）という」は、クロマチン構造を決定する役割を果たしている。電子顕微鏡では、核ＤＮＡは間欠的にこのスカフォードに付着して、一連のループを形成することを示している（Zlatanova and Van Holds,J.Cell Sci,103:889（1992））。スカフォード付着領域（Scaffold Attachment Region;ＳＡＲ）は、ＡＴに富むゲノムのＤＮＡ配列で、特異的に核スカフォード成分と結合する。Boulikas,J.Cell.Biochem.52:14（1993）を参照されたい。これらの配列は、核スカフォードに付着することにより、クロマチンドメイン各々の境界を定めていると考えられている。転写と複製は核スカフォードにおいて行われると考えられている。
ＳＡＲが導入遺伝子の両側に含まれていると、安定的にトランスフェクトされた細胞系において発現度が導入遺伝子のコピー数に比例することが証明され、遺伝子の活性は染色体中の位置とは関係が無いことが示されている。（Bonifer et al.,EMBO J.9:2843（1990）;McKnight et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6943（1992）;Phi-Van et al.,Mol.Cell.Biol.10:2303（1990））。GUSレポーター遺伝子の両側に酵母ＳＡＲを配置すると、植物細胞中で導入遺伝子の発現が増進し、発現の変化も少なくなることが報告されている。Allen et al.,Plant Cell.5:603（1993）。しかしながら、異なる形質転換体ごとの変化が劇的に減少することはなかったし、多コピーの導入遺伝子を含む形質転換体で高い発現が見られることはなかった。
発明の概要
上記に鑑み本発明の第一の態様は、配列番号１のヌクレチオド配列を有する単離ＤＮＡ分子である。
本発明の他の態様は、転写開始領域と、構造遺伝子と、配列番号１のスカフォード付着領域とを含んでなるＤＮＡ構成物である。
本発明のさらに他の態様は、前述のＤＮＡ構成物を含有する形質転換された植物細胞と該形質転換された植物細胞を含んでなる組換え植物である。
本発明のさらに他の態様は、外来遺伝子の発現が増大されているトランスジェニック植物細胞を調製する方法である。この方法では、植物体を再生可能な植物細胞を、本発明のＤＮＡ構成物で形質転換することを含む。
本発明のさらに他の態様は、外来遺伝子の発現が増進している組換えタバコ植物細胞を調製する方法である。この方法では、タバコ植物細胞を本発明のＤＮＡ構成物で形質転換することを含む。
本発明のさらに他の態様は、転写開始領域と、構造遺伝子と、配列番号１のスカフォード付着領域とを含んでなるＤＮＡ構成物を担持する植物形質転換ベクターである。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の１１６７塩基対からなるタバコSAR（RB7 SAR）（配列番号１）と８３８塩基対からなる酵母SAR（ARS-1）とのSAR配列モチーフを比較する模式図である。A枠（A）、T枠（T）、ショウジョウバエのトポイソメラーゼII部位（Ｏ）、ARSコンセンサス配列（Ｒ）、およびＧ排除領域（G exclusion regions）（３０bpからなるATC帯）を黒い縞模様で表している。局所的にATに富む領域（＞２０bp）は斜線の多い枠（ＡＴ９５％領域）あるいは斜線の少ない枠（ＡＴ９０〜９５％領域）で示してある。
図２Aは、選択プラスミドpGHNC10の模式図である。図中NPTIIはTn5由来のnptIIであり、ocs Tはオクトピンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化部位／ターミネーターであり、矢印P1とP2はコピー数の評価に使用したPCRプライマーの位置を示してる。
図２Bは、コントロール発現プラスミドpGHNC12の模式図である。CaMV 35Sはカリフラワーモザイクウイルス３５Sプロモーターであり、GUSは大腸菌βグルクロニダーゼ遺伝子のコード領域であり、nos Tはノパリンシンターゼ（nos）遺伝子のポリアデニル化部位／ターミネーターであり、矢印P1とP2はコピー数の評価に使用したPCRプライマーの位置を示している。
図２Cは、（＋）SAR発現プラスミドpGHNC11の模式図である。CaMV 35Sはカリフラワーモザイクウイルス３５Sプロモーターであり、GUSは大腸菌βグルクロニダーゼ遺伝子のコード領域であり、nos Tはノパリンシンターゼ（nos）遺伝子のポリアデニル化部位／ターミネーターであり、Rb7 SARは配列番号１のタバコＳＡＲであり、矢印P1とP2はコピー数の評価に使用したPCRプライマーの位置を示している。
図３Ａは、RB7 SAR（+）プラスミドであるpGHNC11、および、SAR（-）コントロールプラスミドであるpGHNC12のＧＡＴＣ部位（垂直線）を示す制限地図である。CaMV 35Sから得られた５０１塩基対のプローブ断片を制限地図の下に示した。
図３Ｂは、選択されたRB7 SAR（+）系（左側）およびコントロールプラスミドpGHNC12（右側）のＤＮＡゲルブロットである。DpnI、DpnIIおよびSau3Aの消化産物を示している。矢印は１ｋｂマーカーから推定した分子量を示している。
図３Cは、選択されたSAR（-）コントロール系のＤＮＡゲルブロットである。Dpn I、DpnIIおよびSau3Aの消化産物を示している。矢印は推定した分子量を示している。
図４は、細胞系各々の遺伝子コピー数に対するGUS発現をプロットした図である。図中、白色の四角はRB7 SAR（＋）形質転換体、黒色の三角はコントロールを表している。
図５は、遺伝子コピー数に対するNPTタンパク質をプロットした図である。図中、白色の四角はRB7 SAR（＋）形質転換体、黒色の三角はコントロール系を表している。図６は、図４および図５のデータを総合して再プロットし、導入した遺伝子各々の発現度を比較した図である。白色の四角は二重RB7 SAR形質転換体、黒色の三角はコントロール系を表している。
発明の詳細な説明
本発明者らは、安定的に形質転換した細胞系において、タバコから単離したＳＡＲ（RB 7 SAR）（配列番号１）を導入遺伝子と併用すると、遺伝子１コピー当たりの平均発現量を１００倍以上増大させることを見出した。導入遺伝子のコピー数が比較的に少ない場合に、このタバコSAR効果が最大となることも見出された。
クロマチン組識のループドメインのモデルから、ＳＡＲは境界因子として作用し、凝縮クロマチン構造が拡散しないように限定して、隣接クロマチン中のシス調節因子の影響を阻止することが予想される。したがって、ゲノムの位置効果に起因して導入遺伝子の発現が変化するのであるならば、ＳＡＲによって横側から挟むことにより遺伝子１コピー当たりの発現を標準化して、形質転換体毎に変化することを少なくことができるはずである。遺伝子の総発現量は、遺伝子のコピー数に比例して変化しなければならない。動物細胞系の実験でも、この予想が支持されている。Grosveld et al.,Cell 51:975（1987;）;Stief et al.Nature 341:343（1989）:Bonifer et al.,EMBO J.9:2843（1990）:McKnight et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6943（1992）;Phi-Van et al.,Mol.Cell.Biol.10:2303（1999）.
近年、特に真菌類以上の高等植物系において、一以上の「遺伝子が発現しない（gene silencing）」現象が変化全体の一因となっていることが立証されるようになった。Assaad et al.,Plant Mol.Biol.22:1067（1993）;Finnegan and McElroy,Bio/Technology 12:883（1994）:Flavell,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3490（1994）.原則として、導入遺伝子の発現に対する位置効果は、ゲノムエンハンサーに距離が近いことやクロマチン凝縮の程度など挿入部位に初めから存在している特徴を反映し、一方では、導入遺伝子自身の相同性依存の相互作用によって遺伝子が発現しなくなり、染色体の位置によってこれら相互作用の重篤度が左右される。
一つの理論にのみに拘束されるつもりはないが、本発明者らは、コントロール形質転換体が大きく影響されるような条件下でも、遺伝子が発現しなくなる現象の重篤度を低下できることが、本発明のＳＡＲで見られるように大きなＳＡＲ効果が挙がることに反映されていると提案している。導入遺伝子が複数存在する場合には、相同性依存による遺伝子が発現しなくなる現象を考えなくてはならない。コピーを多数挿入する場合に起こる遺伝子が発現しなくなる現象は、真菌類以上の高等植物でよく知られていたが、最近に至りショウジョウバエでも起こることが報告されるようになった（Dorer and Henikoff,Cell 77:993（1994））。
本明細書では、形質転換体に複数のコピーを挿入することが多く記載されている。これは、本明細書で報告するＲＢ７ ＳＡＲ効果が形質転換のためにアグロバクテリウムベクターを用いている他の研究機関の報告内容と相違している理由の一つであるといえよう。四つの報告において、発現のわずかな増加と形質転換体毎の変化の減少とが報告されている。（Mlynarova et al.,Plant Cell 7:599（1995）;Mlynarova et al.,Plant Cell 6:417（1994）;Schoffl et al.,Transgenic Res.2:93（1993）;van der Geest et al.,Plant J.6:413（1994））.Breyne et al.,Plant Cell 4:463（1992）は、遺伝子の平均発現量が低下したことを報告している。ＤＮＡが媒介する直接的な形質転換では、単一のゲノム部位に多数の導入遺伝子コピーが組み込まれる複雑な遺伝子座がつくられることがしばしば起こる。単一の遺伝子座において相同性配列間で相互作用が発生すると、遺伝子が発現しなくなる頻度が上昇すると考えられ、したがって、本明細書の実施例で報告する形質転換体は、多数コピー現象が希にしか起こらないアグロバクテリウムベクターによる形質転換体よりも遺伝子が発現しなくなることに関し、強い影響を受けると予想され得る。
本発明は、植物（すなわち、維管束植物）を含む諸種生物の細胞を形質転換させるのに用いることができる。本明細書において用いる、植物とは、裸子植物と被子植物（すなわち、単子葉植物と双子葉植物）の両方を含む。本発明による形質転換を用いて、安定的に形質転換した細胞中で導入遺伝子の発現度を増進させることができる。
本明細書において用いる「機能上関連している」なる語は、単一のＤＮＡ分子上で相関連するＤＮＡ配列の機能が相互に影響しあうことを意味する。したがって、転写開始領域が構造遺伝子の発現に影響することができる場合（すなわち、構造遺伝子が、転写開始領域の転写制御下にある場合）、転写開始領域は構造遺伝子と機能上関連していることとなる。転写開始領域は構造遺伝子の「上流」にあり、反対に、構造遺伝子は転写開始領域の「下流」にあると言われている。
本発明のＤＮＡ構成物、すなわち「発現カセット」は、５’から３’転写方向に、第一のスカフォード付着領域と、転写開始領域と、該転写開始領域と機能上関連している構造遺伝子と、ＲＮＡポリメラーゼの停止シグナルを含む停止配列と、ポリアデニル化のためのポリアデニル化シグナル（例えば、nosターミネーター）と、第二のスカフォード付着領域とを含んでいることが好ましい。これらの領域はすべて、形質転換される細胞内で機能できるものでなければならない。停止領域は、転写開始領域やプロモーター領域と同じ遺伝子から得てもよいし、また別の遺伝子から得てもよい。前述した本発明のＤＮＡ構成物は、転写開始領域と機能上関連している構造遺伝子を一個含む場合もあるし、また一以上の構造遺伝子を含む場合もある。本発明の特定のＤＮＡ構成物は、５’から３’転写方向に、第一のスカフォード付着領域と、転写開始領域と、該転写開始領域と機能上関連している第一の構造遺伝子と、該転写開始領域と機能上関連している第二の構造遺伝子と、RNAポリメラーゼの停止シグナルを含む停止配列と、ポリアデニル化のためのポリアデニル化シグナル（例えば、nosターミネーター）と、第二のスカフォード付着領域とを含んでいる。
本発明の実施に用いられるスカフォード付着領域（すなわち、「ＳＡＲ」）は、本明細書で提供される配列番号１（RB7 SAR）のヌクレオチド配列を有する。RB7 SARは天然に存在するものから単離することができるし、また化学的に合成することもできる。
ＳＡＲは、方向に無関係に作用することが知られている。Poljak et al.,Nucleic Acids Res.22:4386（1994）.本発明の遺伝子構成物は、単一方向に直接反復（ダイレクトリピート）して（→→）、または反対方向に直接反復して（←←）、あるいは二つ間接反復のうちいずれか（→←または←→）に、方向付けられているRB7 SARを含有していてもよい。
転写開始領域はRNAポリメラーゼ結合部位を含んでいることが好ましいが、形質転換すべき宿主生物由来のものであってもよいし、また転写開始領域が宿主中で機能できる他の供給源から得てもよい。他の供給源としては、ノパリン（nopaline）、（オクトピン（octapine）、マンノピン（mannopine）を生合成するための転写開始領域、または他のオピン（opine）の転写開始領域などのアグロバクテリウムＴ−ＤＮＡ遺伝子、植物由来の転写開始領域、ウイルス（宿主に特異性を持つウイルスを含む）由来の転写開始領域、あるいは部分的または全て合成した転写開始領域が挙げられる。転写開始領域および転写終了領域は公知である。例えば、dGreve,J.Mol.Appl.Genet.1,499-511（1983）;Salomon et al.,EMBO J.3,141-146（1984）;Garfinkel et al.,Cell 27,143-153（1983）;およびBarker et al.,Plant Mol.Biol.2,235-350（1983）を参照されたい。
転写開始領域には、RNAポリメラーゼ結合部位の他に、例えば化学的または物理的抑制や誘導を調節（例えば、代謝産物や光の調節）したり、細胞の分化（植物の葉、根、種子などと関連する）によって調節することにより、転写を調節する領域を含んでいてもよい。したがって、転写開始領域またはこの領域の調節部分は、このように調節される遺伝子のうちの適当なものから得ることができる。例えば、１，５−リブローズビスリン酸カルボキシラーゼ遺伝子を光で誘導して、転写開始に使用することができる。ストレス、温度、損傷、病原菌の効果などによって誘導される他の遺伝子も知られている。
構造遺伝子は、タンパク質、ポリペプチドまたはその部分をコードしているＤＮＡセグメントからなり、恐らくはリボゾーム結合部位および／または翻訳開始コドンを含むが、転写開始領域は欠けている遺伝子の部分である。この語は、形質転換された細胞内で天然に見出される、導入された構造遺伝子のコピーにも適用する。構造遺伝子は、ヘテロ構造遺伝子といわれる場合には、この遺伝子が導入される細胞内で通常見出されない、あるいは機能上関連している転写開始領域と一緒には通常見出されないタンパク質をコードしていてもよい。植物類において発現するために、本発明の転写開始領域と機能上関連している遺伝子は、染色体遺伝子、ｃＤＮＡ、合成遺伝子、あるいはそれらの組み合せから得ることができる。どのような構造遺伝子でも使用可能である。植物細胞を形質転換させる場合、構造遺伝子は、グリホスフェート耐性など所望の特色を与える酵素、昆虫耐性を与えるバチルス・チュリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）のタンパク質などのタンパク質（またはその断片）、またはウイルス耐性を与える植物ウイルスタンパク質またはその断片をコードしていてもよい。
発現カセットは、少なくとも一の複製システムを持つＤＮＡ構成物中に備えられていてもよい。便宜上、Co1E1,pSC101,pACYC184などの大腸菌（Escherichia coli）中で機能する複製システムを持つのが普通である。こうすることにより、各々の操作を終えた後、各段階において、それによって得た構成物をクローニングし、配列を決定し、操作の正確性を測定することができる。大腸菌の複製システムに加え、またはその代わりに、例えば、Ｐ−１不和合性プラスミドの複製システムなどの、広域宿主に対する複製システムを用いてもよい。複製システムの他に、一以上の宿主に有用なマーカーを少なくとも一個存在させるか、あるいは宿主毎に異なるマーカーを存在させることが多い、すなわち、あるマーカーは原核宿主において選択に用いられ、またあるマーカーは真核細胞宿主、特に植物宿主において選択に用いられる。マーカーは、抗生物質、毒素、重金属などの殺生物剤に対する防護の役割を果たしたり、また、例えば、栄養要求株宿主に原栄養性の性質を付与することにより相補性を与えたり、新規化合物の生成により可視の表現型を提供したりする。本発明で用いる遺伝子の代表例としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴII）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ニトリラーゼおよびゲンタマイシン耐性遺伝子が挙げられる。植物宿主の選択では、好適なマーカーの例としてはインジゴ色を与えるβグルクロニダーゼ、可視光を与えるルシフェラーゼ、カナマイシン耐性またはＧ４１８耐性を与えるＮＰＴII、ハイグロマイシン耐性を与えるＨＰＴおよびグリホサート耐性を与える突然変異aroA遺伝子を挙げることができるが、これらの例に限定されることはない。
適当な複製システムを制限酵素で分割して、特定の構成物または断片を有効部位に挿入することにより、各種構成物、発現カセット、マーカーなどを含む各種断片を順次導入する。ＤＮＡ構成物はライゲーションしてクローニングした後、単離してさらに操作するのに用いることができる。これら技術はすべて文献に十分な例示がなされており、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,（2nd Ed.1989）（Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY）に詳細な例示を見出すことができる。
本発明のＤＮＡ構成物により植物組識を形質転換するために用いることができるベクターの例としては、非アグロバクテリウムベクター、特に衝撃ベクター（ballistic vector）並びにＤＮＡが媒介する形質転換に好適なベクターを挙げることができる。
細胞の衝撃による形質転換に好適である本発明のＤＮＡ構成物を担持する微粒子は、本発明により細胞を形質転換する場合にも有用である。微粒子を細胞中に打ち込んで、形質転換した細胞を作る。形質転換細胞が植物細胞である場合、当業者に公知の技術により形質転換した細胞から植物体を再生することができる。好適な衝撃による細胞形質転換法およびその装置のいずれを用いても本発明を実施することができる。典型的な装置と方法は、Stomp et al.,に付与された米国特許第5,122,466号およびSanford and Wolfに付与された米国特許第4,945,050号（本明細書で引用するすべての米国特許の開示は、引用することによりその全文を本明細書の一部をなすものとする）に開示されている。衝撃による形質転換法を用いる場合、発現カセットは形質転換される細胞中で複製可能なプラスミド中に組み入れる。このシステムで使用するのに好適な微粒子の例としては、１〜５μｍの金球体が挙げられる。沈殿などの好適技術によりＤＮＡ構成物を微粒子上に付着させる。当業者に公知であるアグロバクテリウム・ツュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を媒介して形質転換する方法は、本発明のＤＮＡ構成物により植物組識を形質転換するのに用いることができる。
植物細胞プロトプラストをＤＮＡが媒介して形質転換することにより、植物が本発明のＤＮＡ構成物より形質転換され、また、その後当業者に公知の方法により形質転換したプロトプラストから植物体を再生することもできる。
その後、器官形成または胚形成によるクローン増殖が可能な植物組識は何れも、本発明のベクターで形質転換することができる。本明細書に言う「器官形成」とは分裂組識中心から苗条（shoot）と根が順次に発育してゆく過程を指す。また本明細書に言う「胚形成」とは、体細胞あるいは配偶子の何れかから、苗条と根が定められた通りに一緒に（順次行うのでなく）発生してゆく過程を指す。選択される特定の組識は、形質転換する特定種に有効且つ至適なクローン増殖システムによって変更ことができる。典型的な組識標的としては、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、大胞子、カルス組識、存在する分裂組識（例えば、頂点分裂組識、腋芽や根端分裂組識、）および誘導された分裂組識（例えば、子葉分裂組識や胚軸分裂組識）が挙げられる。
本発明の植物は、各種の形態をとることができる。本発明の植物は、形質転換細胞と形質転換をしていない細胞とのキメラや、また、クローン化した形質転換体（例えば、細胞すべてが形質転換されて、発現カセットを含有している）であってもよい。さらにまた、形質転換した移植片と形質転換をしていない組識（例えば、柑橘種の形質転換していない接ぎ穂に接ぎ木された形質転換した根の台木）を含む植物であってもよい。形質転換した植物は、クローン増殖や古典的な交配技術によって増殖させることができる。例えば、第一世代（Ｔ１）の形質転換植物を自家受精させて、ホモ接合体の第二世代（Ｔ２）の形質転換植物を作り、古典的交配技術によりＴ２植物をさらに増殖させる。選択可能な優性マーカー（npt IIなど）を発現カセットと連結させて、交配を助けることもできる。
本発明の実施に使用できる植物の例としては、タバコ（Nicotiana tabacum）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）、ジャガイモ（Solanum tubersum）、大豆（glycine max）、ピーナッツ（Arachis hypogaea）、綿（Gossypium hirsutum）、ジャガイモ（Ipomoea batatus）、キャッサバ（Mahihot esculenta）、コーヒー（Cofea spp.）、ココナッツ（Cocos nucifera）、パイナップル（Ananas comosus）、ミカン類（Citrus spp）、ココア（Theobroma cacao）、茶（Camellia sinensis）、バナナ（Musa spp.）、アボカド（Persea americana）、イチジク（Ficus casica）、グァバ（Psidium quajava）、マンゴー（Mangifera indica）、オリーブ（Olea europaea）、パパイヤ（Carica papaya）、カシュー（Anacardium occidentale）、マカデミア（Macadamia integrifolia）、アーモンド（Prunus amygdalus）、テンサイ（Beta vulgaris）、トウモロコシ（Zeamays）、小麦、燕麦、ライ麦、大麦、米、野菜類、鑑賞植物類が挙げられるが、これらのみに限定されない。野菜類の例としては、トマト（Lycopersicon esculentum）、レタス（例えば、Lactuea sativa）、サヤインゲン（Phaseolus vulgaris）、ライマメ（Phaseolus limensis）、エンドウマメ（Pisum spp.）、およびキュウリ（C.sativus）、カンタロープ（C.cantalupensis）やマスクメロン（C.melo）などのCucumis属のものが挙げられる。鑑賞植物としては、ツツジ（Rhododendron spp.）、アジサイ（Macrophylla hydrangea）、ハイビスカス（Hibiscu rosasanensis）、バラ（Rosa spp.）、チューリップ（Tulipa spp.）、ラッパスイセン（Narcissus spp.）、ペチュニア（Petunia hybrida）、カーネーション（dianthus caryophyllus）、ポインセチア（Euphorbia pulcherima）および菊が挙げられる。本発明を実施するのに用いられる裸子植物としては、テーダマツ（Pinus taeda）、エリオットマツ（Pinus elliotii）、ポンデローサマツ（Pinus ponderosa）、コントルタマツ（Pinus contorta）およびモンテレーマツ（Pinus radiata）などのマツ類、ベイマツ（Pseudotsuga menziesii）、ベイツガ（tsuga canadensis）、ベイトウヒ（Picea glauca）、アカスギ（Sequoia sempervirens）、ヨーロッパモミ（Abies amabilis）、バルサモミ（Abies balsamea）などのモミ、およびベイスギ（Thuja plicata）やアラスカヒノキ（Chamaecyparis nootkatensis）などのヒマラヤスギを含む針葉樹が挙げられる。
次に掲げる実施例は本発明を説明するために開示したものであって、したがって、本発明を限定するように解釈してはならない。
例１
方法
１．プラスミド構成物
pRB7-6（Hall et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9320（1991））由来のクレノウで満たした平滑末端を持つ1.1kbのClaI/ScaI SAR断片（配列番号１）を用いて、GUSレポータープラスミドを調製した。ClaI/ScaI SAR断片を、pBluescript II SK＋（Stratagene）においてクレノウで満たした平滑末端を有するXbal部位に挿入して、プラスミドpGHNC1を得た。同様にして、1.1kbのClaI/ScaI SAR断片（配列番号１）をpBluescript II SK＋（Stratagene）において、クレノウで満たした平滑末端を有するXhoI部位に挿入して、プラスミドpGHNC4を得た。さらに、pGHNC4由来の1.1kbのApaI/HindIII断片を、pGHNC1のApaI/HindIII部位に挿入して、pGHNC5を得た。３５Ｓプロモーター／GUSリーディングフレーム／Nosターミネーターを含有するpBI221（Clonetech）由来の2.8kbのHindIII/EcoRI断片を、pGHNC5またはpBluescript II SK＋のHindIII/EcoRI部位に挿入して、それぞれpGHNC11（＋ＳＡＲ）とpGHNC12（−ＳＡＲ）を得た。
pUNK1（Herrera-Estrella et al.,IN:Gelvin et al.,（Eds.）,Plant Molecular Biology Manual,Kluwer Academic Publishers,Dordrecht,The Netherlands,pp.1-22（1988））由来のnosプロモーター／NPTリーディングフレーム／Ocsターミネーターを含有するHindIII/EcoRI断片を、pBluescript IIのSK＋のHindIII/EcoRＩ部位中にライゲーションして、選択プラスミド（pGHNC10）が作成された。
２．微小発射物による形質転換
ワシントン州立大学のG.Anから、タバコ細胞系NT-1の恵贈を受けた。懸濁培養物は、100mg/Lのイノシトール、1mg/LのチアミンHCl、180mg/LのKH2PO4、30g/Lのスクロース、および2mg/Lの2、4-ジクロロフェノキシ酢酸を添加してあるムラシゲ・スクーグ（Murashige and Skoog）塩（GIBCO Laboratories,Grand Island,NY）を含有する培地で増殖された。pHを5.7に調整してからオートクレーブで処理した。毎週一回、500ml容量の三角フラスコ中で新鮮な培地100mlに3mlの播種材料を添加することにより、細胞を継代培養した。フラスコは、光度47μmol m-2sec-1、27℃の条件下で、125rpmの回転シェーカー中に置かれた。初期対数増殖期である4日目の細胞を、微小発射物による衝撃（microprojectile bombardment）により形質転換した。50mlのアリコートを遠心分離し、ペレットを濃度が0.1g/mlとなるように新鮮な培地に再懸濁した。60mmペトリ皿の培地を0.8％の寒天で予め凝固させておいて、この培養基上に無菌レンズ紙（lens paper）を敷き、この上に0.5mlのアリコートを単層となるよう塗布した。塗布した細胞は、衝撃前3時間23℃で保持した。微小発射物による衝撃は、通常の1,500psiの破裂円盤バルブ（rupture disk valve）を備えたDupont PDS−1000粒子加速器を用い、サンプルを発射器から5.5cmの距離において行った。
細胞はバッチ単位で、「発現」プラスミドと「選択」プラスミドとの混合物を用いて共形質転換した。CaMV 35Sプロモーター（Benfey and Cua,Science 244:174（1989））により発現されたβ−グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子を発現の測定に用い、一方ノパリンシンターゼプロモーター（Depicker et al.,1982）により発現されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（nptII）を、安定して外来ＤＮＡを組み入れている細胞の選択に用いた。プラスミドはすべて、大腸菌DH5α株で増幅され、Quiagen plasmid maxiprep kit（Quiagen,Inc.Chatsworth,CA）を用いて単離した。共形質転換混合物は、ＧＵＳレポータープラスミドとntpII選択プラスミドとを、モル比4:1で含有していた。したがって、500ngの各ＳＡＲ形質転換混合物は、432ngのpGHNC11と68ngのpGHNC10からなり、一方、コントロール混合物は314ngのpGHNC12と68ngのpGHNC10を含有していた。（5μＬのTE緩衝液中の）各ＤＮＡ調製物を、50μＬのCaCl2（2.5M）および20μＬのスペルミジン（0.1Ｍ）と混合して、1.0μｍの金の微小発射物上に沈殿させた。
衝撃後、ペトリ皿をパラフィルムで密閉し、一定の光を当てながら27℃で24時間インキュベートした。その後、レンズ紙を用いて細胞を、1ml当たり100μgのカナマイシンを添加している培地を入れた新鮮なプレートに移した。約3週間以内にカナマイシン耐性をもつ単離した微小カルスが出現し始めたので、この微小カルスをカナマイシン培地を含む新鮮なプレートに移した。このプレート上で1週間増殖した後、1ｍｌ当たり50μgのカナマイシンを添加した1ｍｌのブロスを播種して、各カルスの懸濁培養を始めた。カルス確立後は、1ｍｌ当たり50μgのカナマイシンを添加した5mｌのブロスと3％（v/v）の播種材料との混液を用いて、毎週、懸濁培養物を移した。
３．遺伝子コピー数分析
前述の説明の通りに（Allen et al.,Plant Cell 5:603（1993））ＤＮＡを単離した。定量的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法により、すべての細胞系についてGUS遺伝子およびnptII遺伝子のコピー数を評価し、代表的な細胞系についてこの評価をゲノムサザン法により確認した。GUS遺伝子のコピー数分析についてのPCR法では、CaMV 35Sプロモーターに位置するプライマー（5’-TCAAGATGCC TCTGCCGACA-3’）（配列番号２）とGUS遺伝子の翻訳領域に位置するプライマー（5’-TCACGGGTTG GGGTTTCTAC-3’）（配列番号３）を用い、nptII遺伝子のコピー数分析についてのPCR法によるにおいては、nosプロモーター（5’-GGAACTGACA GAACCGCAAC-3’）（配列番号４）に位置するプライマーとnptII遺伝子の翻訳領域に位置するプライマー（5’-GGACAGGTCG GTCTTGACAA-3’）（配列番号５）を用いた。メーカーの指示に従って、Ampli wax beads（Perkin Elmer）を使用するホットスタートPCR法を用いた。下部混合物（25μＬ）には、0.8mMのdNTPs、６mMのMgCl2、0.4mMづつの各オリゴヌクレオチドプライマー、50mMのKCl、10mMのTris-HCl（pH8.8）を含有していた。上部混合物（75μＬ）は、50mMのKCl、10mMのTris-HCl（pH8.8）、2.5UのTaqポリメラーゼおよび100ngのゲノムＤＮＡを10μlのTEに溶解した溶液を含有していた。サイクルは各々、９４℃で２分、５０℃で２．５分および72℃で3分であった。72℃で７分行う最終伸長ステップ後に反応を完了させた。
GUSのコピー数分析およびnptIIのコピー数分析のいずれにおいても、PCRはサイクル18回に限定して、基質の消耗を避け、増幅産物はブロッティングおよび32Pで標識したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションを行って視覚化した。タバコＤＮＡ（Arumuganathan and Earle,1991）1C（5pg）当量当たりＧＵＳ遺伝子1〜150個が導入されるように、野生型ＮＴ−１ゲノムＤＮＡにpGHNC11（+SAR）から得たＤＮＡを連続希釈して、再構築標準品を調製した。標準品と未検試料の両方について同時にPCR反応を行った。同様にして、pGHNC10のＤＮＡの連続希釈を行い、1C当たりnptII遺伝子1〜40個が導入されるように、野生型NT−1ゲノムＤＮＡにpGHNC10から得たＤＮＡを連続希釈して、nptII復元標準品を調製した。ハイブリダイゼーションシグナルを、Ambis radioanalytiical scanner（Ambis,San Diego,CA）で定量化し、コピー数の最終評価を直線回帰分析によって計算した。
４．ＤＮＡゲルブロット分析
Murray et al.,Plant Mol.Biol.Rep.10:173（1992）の説明に従ってサザン法を実施した。アガロースゲルを0.5mg/mlのエチジウムブロミドで染色して、写真を撮影した。ゲルの頂部1/3を0.25NのHClで10分間処理した。その後、ゲルを15分間、150mM 3mMのNaOH、3mMのEDTA中で2回インキュベートし、さらに15分間、150mMのNaPO4中で2回インキュベートして、25mMピロ亜リン酸ナトリウムを用いるサザン法（Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,（2nd Ed.1989）Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY）により、Greenscreen Plus（New England Nuclear）にブロットした。2％のSDS、0.5％のBSA、1ｍＭのＥＤＴＡ、1ｍＭの1,10−フェナントロリン中でインキュベートしてブロッキングし、100mＭのNaPO4（pH7.8）、20mMのピロ亜リン酸ナトリウム、5mMのEDTA、1mM 1、10−フェナントロリン、0.1％SDS、10％デクストラン硫酸、500μg/mlのヘパリン硫酸、50μg/mlの酵母ＤＮＡ、50μg/mlの鰊精子でハイブリダイゼーションを行った。United States Biochemical Co.のRandom Prime ＤＮＡ Labeling kitによりプローブを調製した。洗浄条件は、室温下にて２ＸＳＳＣ、0.5％のSDSで5分間2回、室温下にて２ＸＳＳＣ、0.1％のSDSで15分間1回、室温下にて0.1ＸＳＳＣ、0.5％のSDSで15分間2回、および37℃にて0.1ＸＳＳＣ、0.5％のSDSで30分間2回であった。
５．NPTII分析およびGUS分析
NPTIIタンパク質分析を行うため、細胞を液体窒素中で粉砕して、100μlのTrisCl（0.15M,pH7.8）に懸濁した。混合物を遠心分離し、上澄み液を使ってメーカーの指示に従ってNPTIIエライザキット（5’-＞3’）によるエライザ分析を行った。
GUS蛍光強度分析を行うため、NPTIIとＤＮＡ抽出の際に説明したと同様にして凍結細胞を液体窒素中で粉砕した。このようにして得た粉末を、50mMのNaPO4（pH7.8）、10mMのβ−メルカプトエタノール、10mMのNa2EDTA、0.1％（w/v）のラウリルサーコシンナトリウム（sodium lauryl sarcosine）、および0.1％（w/v）のトリトンX−100を含有する600μlのGUS抽出緩衝液に再懸濁して、2回10秒間の超音波破砕した。抽出液は、不溶のポリビニルポリピロリドンで処理して澄明化し、遠心分離した。GUS活性は、メチルウンベリフェロングルクロニド（MUG）を基質として、Jefferson,Plant Mol.Biol.Rep.5:387（1987）;Jefferson et al.,EMBO J.6:3901（1987）が説明している蛍光強度分析法により測定した。総タンパク質は、BioRadタンパク質分析キット（BioRad Laboratories,Melville,N.Y.）を用いて測定したが、nmols  4-メチルウンベリフェロン（4-MU）として報告されているGUSの特異的活性のため、反応初速度からmin-1mgタンパク質-1が形成された。
６．一過性発現
Hall et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9320（1991）と同様の方法により、培養開始後4日目のNT−1懸濁培養物からエレクトロポレーション用プロトプラストを調製した。100mlの培養物を遠心分離（300×g、2分間）して細胞を採取し、100mlのマンニトール（0.4M）中で2回洗い、0.4Mのマンニトール、20mMのMES（pH5.5）、1％nのセルラーゼ（Onozuka RS）および0.1％のペクチダーゼY23（Onozuka）を含有する、等量のプロトプラスト形成溶液中に再懸濁した。その後懸濁液を150rpmで振とうしながら、25℃で30〜60分間インキュベートした。このようにして得たプロトプラストを、GH3.7ローターを備えたBeckman GPR遠心分離器により300×gで5分間遠心分離することによって、プロトプラスト緩衝液で2回洗った。この混液を0.4Mのマンニトールで希釈して、プロトプラストの濃度をml当たり4×106とした。このようにして得た懸濁液に等量の2×エレクトロポレーション緩衝液を添加希釈して、プロトプラストの最終濃度を1ml当たり2×106とした。2×エレクトロポレーション緩衝液には、273mMのNaCl、5.36mMのKcl、2.94mMのKH2PO4、0.4Mのマンニトール（pH5.6）を含有していた。
エレクトロポレーションの都度、80μgの切断された大腸菌担体ＤＮＡと被検体である20μgのプラスミドＤＮＡの混合物を使用した。1mlのプロトプラストをエレクトロポレーションキュベット（BRL）に添加し、ＤＮＡとTE緩衝液との100μLの混液と混合してから、氷上に5分間放置した。250V、1180μFでBRL Cell Poratorによりエレクトロポレーションを実施した。処理後直ちにキュベットを15分間氷上に置いた。その後、エレクトロポレーションされたプロトプラストのアリコート（400μl）を、0.4Mのマンニトールを添加した4mlの培地を入れた60mmペトリ皿に移した。各種の時間でインキュベートした後、4℃で5分間300×gの遠心分離によりプロトプラストを採取した。ペレット各々を600μlのGUS抽出緩衝液中に再懸濁して、ＧＵＳ活性を上述した蛍光法で分析した。
７．植物核スカフォードの単離と結合分析
前述した説明と同様にして、NT−1細胞の核および核スカフォードを単離した（Hall et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9320（1991）;Hall and Spiker,IN:Gelvin et al.,（Eds.）,Plant Molecular Biology Manual,Kluwer Academic Punlidhrtd,Dordrecht,pp.1-12（1994）。このようにして得た核輪状脂質（halos）を、70mMのNaCl、20mMのトリス（pH8.0）、20mMのKcl、0.1％のジギトニン、1％のチオジグリコール、50mMのスペルミン、0.5mM PMSFと2μg ml-1アプロチニンが添加されている125mMのスペルミジン（Hall et al.,1991;Hall and Spiker 1994）を含有する消化／結合緩衝液（Ｄ／ＢＢ、pH6.5）で2回洗った。その後、輪状脂質を、10mMのMgCl2を含む同一の緩衝液で洗った。さらに、0.5mMのPMSF、2μg ml-1のアプロチニン、10mMのフェナントロリンおよび10mMのMgCl2を含有するD／BB中で輪状脂質を4×106ml-1まで希釈し、500単位ml-1の各種制限酵素（New England Biolabs）を37℃で1時間消化した。さらに、新鮮な酵素を添加し、もう1時間インキュベートを続行した。各約8×105に相当するスカフォードを含有するスカフォードのアリコート（100μl）を2600×gで遠心分離し、上澄み液を捨て、0.5mMのPMSF、2μg ml-1のアプロチニンおよび10mMのMgCl2を含有するD／BB中にスカフォードペレットを再懸濁した。
結合分析を行うため、末端を33Pで標識してある断片を予め制限酵素（New England Biolabs）で消化しておいて、その4μmoleを適当な競合ＤＮＡと共にスカフォードアリコート100μlに添加し、しばしば混合しながら37℃で1時間インキュベートした。スカフォードアリコートを2600×gで遠心分離して、ペレット（スカフォードと結合したＤＮＡ断片を含有する）と非結合断片を含有する上澄み液とを分離した。ペレット部分は10mMのMgCl2を添加してある200μlのD／BBで洗浄して、0.5mg ml-1のプロテイナーゼKを添加した0.5%のSDSを含有する100μlのTE緩衝液（100%に相当）中に再懸濁し、室温で一晩インキュベートした。ペレット部分と上澄み液部分各々の等量（普通20％）を、1%アガロースゲルをTAE緩衝液に溶解した溶液（Sambrook et al.,1989）中で分離した。ゲルは7%トリクロロ酢酸で20分間処理し、濾紙上で乾燥した後、Ｘ線フィルムに暴露した。
例２
SARのモチーフとスカフォードの予想結合活性
ＳＡＲの配列は非常に変わり易いが、これまでに酵母と動物の配列を比較することによって大まかな輪郭のSARコンセンサス要素やモチーフが数個同定された（Dickinson et al.,Cell 70:631（1992）;Gasser and Laemmli,EMBO J.5:511（1986）;Mielk et al.,Biochem.29:7475（1990））。図1は、1186塩基対のタバコRB7 SAR（配列番号１）および838塩基対の酵母SAR配列（ARS-1,Allen et al.,Plant Cell 5:603（1993））中におけるこれらモチーフの一部の分布を示している。
図1において、A枠（A）は、コンセンサス配列AATAAAYAAA（Yはピリミジンである）と、8/10かそれ以上の一致と評価された。T枠（T）は、コンセンサス配列TTWTWTTWTT（WはAまたはTである）と、9/10かそれ以上の一致と評価された。ショウジョウバエのトポイソメラーゼII部位（O）は、コンセンサス配列GTNWAYATTNATNNGと、13/15かそれ以上の一致と評価された。ARSコンセンサス配列（WTTTATATTTW）は、（R）で表されている。G排除領域（30塩基対のATC帯）は黒い縞模様で表されている。局所的にATに富む領域（＞20bp）は斜線の多い枠（AT95%領域）と斜線の少ない枠（AT90〜95%）で示してある。
酵母SARはA枠とT枠を数個含有している。その上に、ARS共通要素1個、G排除領域または30bpからなるATC帯を2個、およびAT９０％を含有する20bp帯1個を有している。植物SAR（配列番号１）は、はるかに高い密度のAおよびT枠のモチーフ、AT富に富む帯、およびG排除領域ならびにショウジョウバエのトポイソメラーゼIIのコンセンサス配列に相同性を持つ要素3個を含有している。無作為にクローニングした植物ＳＡＲの総合研究（データ未発表）では、これらのモチーフのどれをとっても、in vitro分析において結合活性と密接な相関関係があることは、示されていない。しかしながら、結合活性は、SAR関連モチーフの全数や全般密度と弱い相関関係しかない。この分析と図1のデータから、配列番号１のSARは、酵母SAR（ARS−1）よりも遥かに強くスカフォード調製物と結びつくことが予想される。
例３
スカフォードの結合活性
RB7 SAR（配列番号１）は一貫して、タバコRB 7 SAR（配列番号１）の結合活性がARS−1 SARのそれに匹敵することを示した。非特異的な競合体（nonspecific competitor）として制限酵素処理された植物ゲノムＤＮＡを存在させながら、被検体であるSAR配列を含有し末端に標識を付けた制限断片を、タバコ核スカフォード調製物と混合した。プラスミドpGA−1は、酵母SAR（ARS-1）とTRP1を含有していて、EcoR1とHindIIIによって消化された。プラスミドｐＢ7−6は、配列番号１のＲＢ7タバコＳＡＲを含有していて、SpeIとXhoIによって消化された。結合条件下でタバコ核スカフォード調製物と共にインキュベートした後、遠心分離により結合と未結合のＤＮＡ断片を分離し、ＤＮＡを精製してからゲル分析を行った。
プラスミドpGA−1を用いる反応の度に、ペレットと上澄み液の同一%（20%）づつをとり、さらに同一%の未分画プローブのアリコートをとって、これらをアガロースゲル上に互いに隣接するレーンに泳動して、オートラジオグラフ法により視覚化した（結果は示さず）。また、%を1/10に下げて（2%）、ペレットと上澄み液画分をゲルにロードして、同一の方法を実施した。同一量の画分で比較すると、全シグナルのうち大部分が上澄み液画分中で観察されたが、低い程度ではあるが20%画分を使ったゲルで酵母SARによる結合を見分けることが出来た（結果は示さず）。より感度の高い分析では、酵母断片は結合するが、TRP1とベクター断片は結合しないことが明らかであって、SAR ＤＮＡと単離されたスカフォードとの関連が特異性を有することが確認された（結果は示さず）。
配列番号１のRB7タバコSARを含有するプラスミドpB7−6 Sca/C1aについても同様のオートラジオグラフィーゲルを調製した。上述の酵母SARを使って得た結果とは対照的に、遥かに大きな部分のタバコRB7 SARプローブがスカフォード画分と関連した（結果は示さず）。
既知のＳＡＲ以外の要素が、発現分析で用いた構成物がスカフォードと結合するのに貢献しているかも知れない可能性を検討した。上記の説明と同様のスカフォード結合分析を、CaMV 35Sプロモーターと、GUS遺伝子と、コントロールプラスミドpGHNC12のnosポリアデニル化シグナルとを含む断片を分離するように設計された制限消化産物を用いて実施した。これらの結合分析では、ゲルのレーンにペレット画分由来の材料を過大にロードした場合であっても、一律に否定的な結果となった（結果は示さず）。
これらの結果は、RB7 SAR（配列番号１）の結合活性は酵母SAR（ARS−1）よりも高いことを示している。
例４
RB7 SARは平均発限度を増大させる
前報の研究（Allen et al.,Plant Cell 5:603（1993））では、GUSレポーター遺伝子の両側を２コピーのイーストSARエレメント（ARS−1）で挟むと、安定した形質転換細胞系において平均GUS発現を12倍増大させることが証明された。本例において、Allen et al.,1993と同様に、構成物により、RB7 SAR（配列番号１）を用いて同一の細胞系を形質転換させた。共形質転換プロトコルを使用して、分析可能マーカーと選択可能マーカーとが物理的に結合するのを防止した（Allen et al.,1993）。使用した構成物は図2A、2Bおよび2Cに示す。被検体である適当なレポータープラスミドと選択プラスミドとを混合し、混合物を微小発射物と共に沈殿させ、前報の説明（Allen et al.,1993）と同様にしてタバコ懸濁培養細胞を入れたプレートに衝撃を与えて、形質転換を行った。カナマイシン耐性（Kmr）微小カルスを選択して、例1の説明と同様にしてカルスによる各々独立の懸濁培養細胞系を作成した。もとの微小カルスから得たセグメントを組識化学的に染色したところ、SARプラスミドで形質転換した細胞系は遥かに染色性が高いことが証明された（結果は示さず）。毎週植え継ぎを行って3週間増殖した後、懸濁細胞を採取した。各細胞系からＤＮＡを抽出して、サザン法分析と定量PCR分析を行い、さらにこの細胞集団の一部を使用して例１の説明と同様にして抽出可能GUS活性とNPTタンパク質濃度を測定した。導入遺伝子のコピー数評価と発現データを表1および2に示す。
表1および2はまた、KMr系についてGUS酵素活性として測定した、GUS遺伝子の平均発現度も示している。コントロールGUS活性は平均8nmol 4-MU min-1mg タンパク質-1で、アグロバクテリウムベクター中で同様の構成物で形質転換したタバコ組識で通常得られている1〜54nmol 4-MU min-1mg タンパク質-1の範囲に十分入っている（Frisch et al.,Plant J.7:503（1995）;Hobbs et al.,Plant Mol.Biol.21:17（1993）;Jefferson et al.,EMBO J.6:3901（1987））。Rb7 ＳＡＲがレポーター遺伝子の両側に含まれた場合、GUS活性はＳＡＲを欠いているコントロール構成物の平均約60倍高かった。この発現に対する効果は、前報で報告されている酵母SARの効果の約5倍高かった（Allen et al.,1993）。
表1および2は、また、GUS遺伝子とntpII遺伝子の平均コピー数を比較している。これらのデータは定量PCR法によって得たものである（Allen et al.,1993）。
上記各々の場合、例１で説明したように、プロモーターおよびコード領域の配列に対応するプライマーによって増幅を行った。増幅されたバンドにハイブリダイゼーションされた放射活性をカウントして適当なPCR産物を計算し、遺伝子のコピー数は、実験の都度平行して得られた標準曲線によりシグナルを比較して推計した。ＳＡＲによって両側を挟まれた構成物によって形質転換した細胞系では、コントロール構成物で形質転換した細胞系と比較して、35S::GUS遺伝子の平均コピー数が約２倍減少していた。この結果は、酵母SARを用いた前報の研究結果に類似している（Allen et al.,1993）。SAR含有細胞系においてGUS遺伝子のコピー数が少なかったのは、遺伝子コピー１個当たりの発現におけるRB７SARの平均効果が、６０倍増大した発現全体に対する効果よりも大きいことを意味する。表１および２に示す通り、RB７ SAR構成物で形質転換した細胞系の遺伝子のコピー１個当たりのGUS酵素活性は、ＳＡＲを欠く同じ構成物で形質転換した細胞系より平均約１４０倍高い。
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例５
一過性発現
染色体の取り込みに依存する効果と一般的な転写エンハンサー活性とを区別するため、ＳＡＲ構成物は一過性発現システムにおいて検討された。この種の分析は転写エンハンサーの研究に広く利用されている。一過的にトランスフェクトされたＤＮＡは、ヌクレオソーム中では不完全にしか組識化されず（Archer et al.,Science 255:1573（1992）;Weintraub Cell 42:705（1995））、発現細胞の極く少数しか安定的に形質転換されないという事実から、一過性の発現は大部分染色体の取り込みとは無関係に起こることが示唆される（Christou,Plant J.2:275（1992）;Davey et al.,Plant Mol.Biol.13:273（1989）;Paszkowski et al.,EMBO J.3:2717（1984）;およびSaul and Potrykus,Develop.Genet.11:176（1990））。植物ＳＡＲプラスミド（pGHNC11）をＮＴ−1プロトプラスト中にエレクトロポレーションして20時間後ＧＵＳ分析を行った。この時ＳＡＲを欠いているコントロールプラスミドでトランスフェクトしたものと比較して、ＧＵＳ遺伝子発現が2.7nmol -min-1-mg protein-1から7.27nmol -min-1-mg protein-1へと、約3倍の増進が観察された。これは例５で報告されているように、安定的に形質転換した細胞系では発現全体が約60倍、遺伝子１コピー当たりの発現が約140倍増大したのと、著しい対照をなしている。したがって、安定的に形質転換した細胞系におけるRB7エレメントの効果は、一過性転写分析における効果の20〜50倍であった。これらの結果はRB7エレメントが単に転写エンハンサーとしてのみ作用しているばかりではないことを示唆している。
例６
取り込みパターン
直接的な遺伝子転移法（Direct gene transfer procedure）は、複雑な取り込みパターンとなることがある（Christou Plant J.2:275（1992）;Koziel et al.,Bio／Technology 11:194（1993）;Miittlesten Scheid et al.,Mol.Gen.Genet.228:104（1991）;Paszkowski et al.,EMBO J.3:2717（1984）;Tomes et al.,Plant Mol.Biol.14:261（1990）;Wan and Lemaux,Plant Physiol.104:37（1994））。したがって、コントロール発現プラスミド（pGHNC12）またはRB7 SAR（+）発現プラスミド（pGHNC）のいずれかで形質転換した複数の細胞系を、35S::GUS::nosカセットの片側を切断するEcoRIとHindIIIで単離したゲノムＤＮＡを消化して、ＤＮＡゲルブロット解析を行った（例１による）。
ゲノムＤＮＡ（10μg）は、HindIII/EcoRIで消化し、0.85%アガロースゲル上で分画した。ＤＮＡはナイロン膜にブロットし、例１の説明と同様にしてプローブした。10μgのHindII/EcoRIを含むゲルレーンは、SAR（+）またはSAR（-）コントロールプラスミドで形質転換された各細胞系から得られたゲノムＤＮＡを消化した。コピー数復元ゲルレーンは、2.8kbの35S::GUS::nos Tの１Ｃ等量当たり40コピー、20コピー、10コピー、5コピー、1コピーおよび0コピーを添加してある、形質転換しない（コントロール）10μgのゲノムＤＮＡが含有されている。このコピー数復元ゲル層もプローブした。
35Sプロモーターの配列でプローブしたところ、親プラスミドの消化物が2.8kbのバーンド一本を形成していた（データは開示しない）。ゲノムＤＮＡ中へ組み込み後で、複雑なハイブリダイゼーションパターンが観察され、組み込み過程中に広範な再構成が行われたことを示していた。コントロール構成物の組み込みパターンは平均して、SARプラスミドに対するものよりも若干複雑であった。しかしながら、この差違はSARの細胞系がコピー数が少ないことの反映であるかもしれない。コピー数が似たようなものである場合には、SAR細胞系とコントロール細胞系の取り込みパターンにはっきりした相違はなかった。
ほどんとの形質転換体に、35S::GUS遺伝子を含有する無傷の2.8kb断片が観察され、ほどんとの細胞系には若干の再構成しない遺伝子コピーが含まれていることを示していた。しかしながら、回収した細胞系の約20〜30％には、無傷の35S::GUS遺伝子を示す2.8kbバンドが欠けていた。一般に、このバンドはコピー数全体が少ない細胞系にはなく、また一個のコピー復元標準品と同等以上のコピー数を持つバンドはほどんと無い。一般に発現度が非常に低い。これらの細胞系のほどんとは、プロモーター領域で再構成が起こっていて、このために活性が低下したのか、あるいは失活してしまったとかんがえられる。例外はSAR系37（37−11）で、PCR分析によると8コピーと評価され、またサザン法では複数のコピーを持つ高分子バンドが数個存在することを示していた。この細胞系はまた、GUS発現が高く（表2）、この場合再構成が遺伝子の機能に劇的な影響を与えないことを示していた。
制限酵素で処理していないＤＮＡサンプルのゲルブロットについてもプローブを行った（データは示さず）。各種のコピー数と発現度を代表できるようにサンプルを選択した。細胞系から各種のコピー数と発現度を代表できる未消化のＤＮＡ（5μg）を取り、0.6%アガロースゲル上で分画し、501bpのCaMV35Sプローブで分析した。高分子染色体ＤＮＡの位置は、エチジウムブロミド染色により測定した。未消化プラスミド（pGHNC11とpGNHC12）の位置を測定した。形質転換していない5μgのゲノムＤＮＡ中で、1C当たり30コピー、10コピー、3コピー、1コピーのCaMV 35S::GUS::nos Tを添加してあるゲル層もプローブした。
これら各々の場合、すべての検出可能のGUS配列は高分子染色体ＤＮＡと共に移動していて、形質転換の際に使用されたプラスミドと大きさが似ている染色体外エレメント上にGUS配列が保持されている可能性が否定された。コピー数全体が少ないあるいは多い系についても同様の結果を得た。
Chen et al.,Plant J.5:429（1994）は、直接的なＤＮＡ転移を受けた小麦細胞系の導入遺伝子がN−6−メチルアデニンを含有している場合が多いことを報告して、小麦細胞の形質転換と同時に、マイコプラズマ様生物などの内部寄生植物（endophyte）の形質転換も起こる可能性があることを指摘した。この可能性を排除するため、メチル化分析を行った。
細胞系から、GUS遺伝子コピー数と発現度が多様となるような高分子ＤＮＡを選択調製し、アイソシゾマーであるDpnI、DpnII、またはSau3Aにより消化した。DpnIはN−6−アデニンメチル化を必要とする。DpnIIはアデニンメチル化で阻害される。Sau3AはN−6−アデニンメチル化による影響は受けないが、シトシンメチル化によって阻害される。図3はSAR（+）プラスミドであるpGHNC11、および、SAR（-）コントロールプラスミドであるpGHNC12のGATC部位（垂直線）を示す制限地図である。CaMV 35Sプロモーター由来の501塩基対プローブは、制限地図の下に示してある。図3Bは選択されたSAR（＋）系のＤＮＡゲルブロットで、DpnI、DpnIIおよびSau3Aの消化産物を示している。分子量は1kbマーカー（BRL）から推定した（矢印）。Damメチラーゼ（＋）大腸菌株から産生したプラスミドpGHNC12のコントロール消化産物は、図の右側に示してある。図3Cは選択されたSAR（−）コントロール系のＤＮＡゲルブロットで、DpnI、DpnIIおよびSau3Aの消化産物を示している。分子量は矢印によって図の左側に示してある。
活性のためにN−6−アデニンメチル化を必要とするDpnIは、導入遺伝子ＤＮＡを切断しないが、形質転換に用いられた大腸菌プラスミドＤＮＡの同一配列を完全に消化する。DpnIIはアデニンメチル化で阻害される点でDpnＩとは異なるアイソシゾマーであり、プラスミドＤＮＡは切断しないが、すべての被検細胞系の導入遺伝子配列を分割する。もう一つのGATC分割アイソシゾマーであるSau3Aは、プラスミドＤＮＡを完全に消化するが、導入遺伝子ＤＮＡに対しては部分的な活性しか示さない。この酵素はGATC標的配列のＣ残基においてシトシンメチル化によって阻害される。植物ＤＮＡにおいて、シトシンメチル化は植物ＤＮＡ中のCGおよびCXG部位に優先的に起こるが（Gruenbaum et al.,Nature 292:860（1981））、しかしながらシトシン類の一部は非対称な位置でメチル化する場合もある（Meyer et al.,Embo J.13:2084（1994））。したがって、Sau3Aは導入遺伝子のＤＮＡを完全には分割できなかったのは、導入遺伝子のGATC部位の一部にシトシンメチル化が存在することに一致する。これらのデータを総合すると、形質転換した細胞系で導入遺伝子が複製される過程において、アデニンメチル化が消失して、植物特異性のパターンでシトシンメチル化が確立することが分かる。
例７
コピー数と発現度
例１の説明と同様にして、形質転換の8週間後、複数の導入遺伝子細胞系を用い、nmols 4−MUに作られたmin-1mg protein-1としてのGUSの特異的活性を蛍光定量法で、遺伝子コピー数をPCR法でそれぞれ測定した。
図4では、各細胞系のＧＵＳ発現と遺伝子コピー数をプロットされている。（白四角はRB7 SAR（+）形質転換細胞、黒三角はコントロール系である）。RB7 SARは導入遺伝子数が少ない（細胞1個当たり約20コピー以下）細胞系で最大の効果を挙げ、コピー数が多い系ではSARとコントロール構成物共に発現が低下していた。植物SARに対する刺激の程度は全般に非常に大きかったのであるが、コピー数に対する関係は、前報で報告された酵母由来の効果の低いSARを用いた実験結果とまったくよく似ていた（Allen et al.,Plant Cell 5:603（1993））。酵母SAR構成物の場合、20〜30個もの導入遺伝子コピーを持つ形質転換細胞で発現が増大した。本例においては、コピー数が約20個以下の場合にRB7 SARの効果が最もはっきりと認められた。
SAR構成物のコピー数が少ない三つの細胞系（11−12、11−13および11−13）もGUS発現の程度が低かったが、これは明らかにコピー数が少ないと発現度が高くなる（表2）という一般論に反する。これらの細胞系は無傷の2.8kbの35S::GUS::nos Tバンドを欠いている系であるので、再構成した導入遺伝子配列しか含有していなかったかも知れない。しかしながら、これらのデータは分析データ全体にはあまり影響しない。2.8kbのバンドを欠いているSAR系およびコントロール系のデータを除くと、平均GUS活性はSAR構成物含有系では574nmols 4−MU min-1mg protein-1で、コントロール系では10.4nmols 4−MU min-1mg protein-1で、55倍の差があった。データ全体の対応値は499および8.2nmols 4−MU min-1mg protein-1で、61倍の差であった。
例８
選択遺伝子の発現に対する共形質転換の効果
本データにおいては、配列番号１のRb7 SARは、導入遺伝子の存在数が少ない場合に発現を大幅に増大させ、導入遺伝子の存在数が大きいとSAR構成物とコントロール構成物両方の発現が低い値となる。これらのデータは、本ＳＡＲは転写を遮断する作用がなかったこと、および／または染色体位置効果以外のものに由来する変化が入遺伝子の発現に強く影響したことを示している。
ＳＡＲ含有レポータープラスミドと共に形質転換したことが、選択プラスミドにおいてNPTII遺伝子の発現を増進させたか、否かを判定するため、同じ細胞懸濁液から抽出液を取り、この抽出液中のNPTタンパク質濃度をエライザ分析により測定した。表2に示す通り、SAR含有ベクターと共に形質転換しても、すべての細胞系の平均NPTタンパク質量には何らの効果もなかった（1.1倍）。GUS分析に用いた導入遺伝子細胞系について、NPTIIタンパク質（pg/μg総タンパク質）はエライザ法で測定し、遺伝子コピー数はPCR法で測定した（図4参照）。図5はNPTタンパク質をコピー数に対してプロットした図（SAR（＋）形質転換細胞は白四角、コントロール系は黒三角）であり、NPTIIの発現がSAR構成物との共形質転換の影響を受けないことを示している。
NTPIIタンパク質の濃度は個々の形質転換体で、約100pg/μg細胞性タンパク質まで非常に広範囲に変化する。図4と5のGUSおよびNPTII発現データをプロットし直して導入遺伝子各々の発現度を比較した（図6）。白四角は二重SAR形質転換体を表し、黒三角はコントロール系を表している。GUS活性をNPTタンパク質濃度に対してプロットすると、NPTIIとGUSとは弱い相関関係しかないことが分かった。SAR系のほどんと全てのNPT値は、コントロール系の変化の範囲内に収まっていた。
これらの結果は、共形質転換は組み込みが同一の遺伝子座に起こることが多いが（Christou and Swain,Theor.Appl.Genet.79:337（1990）;Christou et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:7500（1989）;McCabe et al.,Bio/Technology 6:923（1988）;Christou,Plant J.2:275（1992）;Saul and Potrykus,Develop.Genet.11:176（1990））、共形質転換したプラスミド上の遺伝子はかなり独立して発現していることを示している。レポーターおよび選択プラスミドが密集した配列で組み込まれれば、GUSレポーター構成物上のSARが、NPTII遺伝子発現を刺激することもできたことであろう。このような効果が発生しなかったことは、これら二つのプラッスミドは通常は密集したパターンで組み込まれることはなく、また同一の染色体部位ではプラスミド配列により、ＳＡＲが他の遺伝子に影響することを阻止されていること意味している。
例９
形質転換したタバコの再生
懸濁細胞の形質転換実験（例１）に使用したものと同じRB7 SAR構成物を用い、微小発射物の衝撃（例１を参照されたい）によりタバコ（Nicotiana tabacum）を形質転換させた後、形質転換した植物を再生した。
二重RB7 SAR形質転換（SAR＋）から約50の植物を回収し、コントロール形質転換から約30の植物を回収した。一次形質転換体（成熟Ｔ0植物）をGUS組識化学染色により分析し、35S GUS導入遺伝子についてPCR分析した。一次形質転換体の予備データは次のことを示している。
（a）SAR＋プラスミドにより形質転換すると、形質転換体数が増加する。
（b）SAR＋一次形質転換体とコントロール一次形質転換体は、共に、35S−GUS遺伝子を含有するが（定量PCR分析により測定）、GUS発現を行わない（即ち、一次形質転換体が遺伝子を発現しない）同一数の植物が含まれている。
（c）GUS染色に対し陽性である形質転換体数に差違があるようには見えない。2種の形質転換体のGUS発現の大きさの絶対的な差に対して効果があるか、否かを判定するため、GUS活性の測定が進行中である。GUSの染色パターンを比較すると、SARで形質転換された植物は、葉片（leaf punches）中で多様な発現をすることが少ないことが示唆される。
実験形質転換体を野生型タバコ（Petite havana）親株と戻し交配させた。初期データは、SARを持たない導入遺伝子を含有するBC1植物は、SARを含有する形質転換体由来のBC1植物より5倍多い確率で遺伝子を発現しなくなることを示している（データは示さない）。これらの結果から、ＳＡＲは将来の世代の発現を安定化するようになることを示唆している。
例１０
Agrobacterium tumefaciensが媒介するセイヨアブラナ（Brassica napus）の形質転換
Agrobacterium tumefaciendが媒介する形質転換によってセイヨウアブラナ（canola）を形質転換した。Agrobacterium tumefaciendのZ707S株とLBA4404株を使用した。表3に示すように、２つの構造遺伝子（Ubl/Hpt遺伝子および35S/GUS遺伝子）を含み、かつ２つのRB7 SARで両側を挟むか、あるいはＳＡＲを持っていない構成物により、アグロバクテリウムの二つの株各々を形質転換した。また、これらから植物体を再生した。表3に、形質転換および再生の過程で得たデータ、並びにＴ0植物から得たＧＵＳ発現データを要約して掲げる。
形質転換効率に対する効果
アグロバクテリウムのZ707S株は、通常、LBA4404株よりも効率的にセイヨウアブラナを形質転換させることができる（表3のＳＡＲを含まないコントロールプラスミドの結果を参照。Z707S株とLBA4404株によるハイグロマイシン耐性カルスの形成数は42:2である）。ＳＡＲが導入遺伝子の両側を挟む場合、ハイグロマイシン耐性カルスの数に対して、Z707S株による効果はない（ＳＡＲがないZ707S株コントロールは42個、SAR+Z707Sは41個）。しかしながら、効率の悪いLBA4404株は，ＳＡＲが存在すると顕著に多くのヒグロマイシン耐性カルスを生成する（2個対15個）。これらの結果から、ＳＡＲはこれまでアグロバクテリウムによる形質転換に無反応であった作物植物を、アグロバクテリウムに媒介させて形質転換するのに好ましい効果があることを示している。
レポーター遺伝子の発現に対する効果
Ｔ0ＳＡＲ＋セイヨウアブラナは、平均でＳＡＲのないコントロールアブラナより33倍多くのＧＵＳ発現を行った。ＳＡＲ＋アブラナの最も高いＧＵＳ発現度は、ＳＡＲがないアブラナの最も高いＧＵＳ発現度の27倍であった。これらのアブラナをサザン法ブロッテングにより分析すると、遺伝子コピー数が高いことが分かる。アグロバクテリウムは通常遺伝子のコピー数が少ないので、これは驚くべきことである。
ＳＡＲ＋構成物、ＳＡＲなしの構成物共にコピー数が多かったので、この効果がＳＡＲに起因するとは考えられない。
このデータは次のことを示している。
（ａ）ＳＡＲによる効果は、アグロバクテリウム形質転換に影響を受けやすい。
（ｂ）ＳＡＲによる効果は、再生された導入遺伝子植物にも存在する。
（ｃ）ＳＡＲは、二つ遺伝子（この場合、Hpt選択可能マーカー遺伝子とGUSレポーター遺伝子）の両側を挟んでいると効果を発揮する。
（ｄ）RB7 SARは、タバコ以外の植物種で作用する。
上記の実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものと解釈してはならない。本発明は後述の請求項によって範囲が定められており、請求項の同等物は本発明の一部とする。
0004709334.tif 000006
配列表
（１）一般的情報：
（i）出願人：Tompson,William F.
Hall Jr.,Gerald
Spiker,Steven
Allen,George C.
（ii）発明の名称：植物核スカフォード付着領域及びトランスジェニック植物において遺伝子発現を増大させる方法
（iii）配列の数：５
（iv）連絡先：
（A）あて先：Kenneth D.Sibley;Bell,Steltzer,Park and Gibson
（B）街：Post Office Drawer 34009
（C）市：Charlotte
（D）州：North Carolina
（E）国：USA
（F）郵便番号：28234
（v）コンピュータ読みとり可能な形式：
（A）媒体：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：IBM PC互換機
（C）オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0,Version #1.30
（vi）代理人の情報：
（A）氏名：Sibley,Kenneth D.
（B）登録番号：31,665
（C）参照番号：5051-306
（ix）電子通信の情報：
（A）電話番号：919-420-2200
（B）ファックス番号：919-881-3175
（２）配列番号１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：1176塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（xi）配列：配列番号１
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（２）配列番号２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号２
0004709334.tif 000008
（２）配列番号３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号３
0004709334.tif 000009
（２）配列番号４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号４
0004709334.tif 000010
（２）配列番号５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号５
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【図１】
0004709334.tif 000012
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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