(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳由来の塩基性タンパク質画分をヘパリン固定化カラムと接触させて担体に吸着しない画分を回収し、この画分を分画分子量１０〜５０ｋＤａの限外濾過膜で処理して透過液を回収することを特徴とする乳塩基性シスタチン含有画分の製造法。
【請求項２】
乳由来の塩基性タンパク質画分を加熱し、生じた沈殿を除去して上清を回収し、この上清にアルコールを添加し、生じた沈殿を除去して乳塩基性シスタチンを含む画分を回収した後、この画分をヘパリン固定化カラムと接触させて担体に吸着しない画分を回収し、この画分を分画分子量１０〜５０ｋＤａの限外濾過膜で処理して透過液を回収することを特徴とする乳塩基性シスタチン含有画分の製造法。
【請求項３】
請求項１又は２の製造法で乳塩基性シスタチン含有画分を製造した後、当該乳塩基性シスタチン含有画分をプロテアーゼで分解することを特徴とする乳塩基性シスタチン含有画分分解物の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、乳由来の塩基性タンパク質画分より乳塩基性シスタチン高含有画分を製造する方法に関する。
また、本発明は、得られた乳塩基性シスタチン高含有画分をプロテアーゼで分解することによって乳塩基性シスタチン高含有画分分解物を製造する方法に関する。
さらに、本発明は、これらの乳塩基性シスタチン高含有画分及び／又は乳塩基性シスタチン高含有画分分解物を配合し、必要に応じてカルシウム及び／又はビタミンを配合した骨粗鬆症等の各種骨疾患及びリウマチ等の骨関節疾患並びに歯周病の予防及び改善のための飲食品、医薬又は飼料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高齢化に伴い、骨粗鬆症、骨折及び腰痛等の各種骨疾患が増加している。骨組織においては、絶えず骨形成と骨吸収が営まれており、若い時には骨形成と骨吸収のバランスがとれているが、加齢に伴い種々の原因でそのバランスが骨吸収に傾く。これが、長期間続くと骨組織が脆くなり、骨粗鬆症、骨折及び腰痛等の各種骨疾患を生じることになる。この骨吸収に傾くアンカップリングを防ぐことができれば、各種骨疾患を予防できると考えられている。
従来より、各種骨疾患の予防及び治療の方法として、1)食事によるカルシウムの補給、2)軽い運動、3)日光浴、4)薬物投与等が行われてきた。食事によるカルシウムの補給には、炭酸カルシウム及びリン酸カルシウム等のカルシウム塩や牛骨粉、卵殻及び魚骨粉等の天然カルシウムが用いられている。軽い運動については、軽いランニングや散歩等が良いとされているが、体が弱っていると軽い運動もやっかいなものとなり、ましてや寝たきりの老人になると殆ど運動することができなくなる。３番目の日光浴は、活性化ビタミンＤ3 の補給という点では良いとされているが、これだけでは不十分である。最後の薬物投与においては、１α−ヒドロキシビタミンＤ3 、カルシトニン製剤等が骨粗鬆症の治療及び改善に有効であることが知られている。なお、リウマチ等の骨関節疾患や歯周病も、最終的には骨吸収が起こることから、骨吸収を抑えることによりこれらの改善ができるものと考えられている。
【０００３】
本発明者らは、このような各種骨疾患及び骨関節疾患並びに歯周病の予防及び治療に有効な物質を得るために、乳清タンパク質中の骨芽細胞増殖因子及び骨吸収防止因子並びに骨強化作用を有する画分の探索を続けてきた。すなわち、乳、特に乳清タンパク質を分画し、破骨細胞の骨吸収を抑制する作用を有する画分を分画することを試みた。その結果、乳清タンパク質中の水溶性画分を逆浸透膜や電気透析膜等で処理して脱塩することにより得られるタンパク質及びペプチド混合物に骨強化作用があることを見出した（特開平4-183371号公報) 。そして、このタンパク質及びペプチド混合物の水溶液をエタノール処理、加熱処理、加塩処理、限外濾過膜処理等をして得られる画分に骨強化作用があることを見出した (特開平5-176715号公報、特開平5-320066号公報) 。また、本発明者らは、乳中に微量存在する塩基性タンパク質に骨芽細胞におけるコラーゲン合成促進作用及び骨吸収防止作用があることを見出した（特開平7-207509号公報) 。
【０００４】
一方、シスタチンは、システインプロテアーゼインヒビターとして、活性中心にＳＨ基を持つシステインプロテアーゼのタンパク質分解活性を阻害する物質であり、動物組織、細胞、血液及び尿中に見出されている。また、シスタチンの有用な作用として、ウイルスの増殖阻害作用が確認されている(Biochem. Biophys. Res. Commun., vol.127, p.1072, 1985) 。近年、高齢化の進行に伴い、破骨細胞の骨吸収に起因する骨粗鬆症が急増している。現在、破骨細胞の骨吸収を抑える医薬として、カルシトニン製剤が知られている。しかし、このカルシトニン製剤は、医薬品として使用されるホルモン製剤であり、食品素材として使用することができる安全な物質については、検討がなされていないのが現状である。なお、動物組織、細胞、血液及び尿からは、食品素材として使用することができるシスタチンを大量に得るには至っていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、骨吸収抑制作用を有する塩基性タンパク質について、骨吸収抑制作用を有する活性本体の分離精製を試み、分離精製した物質を同定したところ、この物質が乳塩基性シスタチンであることを確認した。また、この乳塩基性シスタチンが、乳以外に由来する他の種やタイプのシスタチンに比べて、特異的に破骨細胞の骨吸収を抑制する作用があることも見出した（特願平11-89946号）。
このような現状から、食品素材として使用することができる乳塩基性シスタチンを大量に、しかも安価に製造する方法が求められている。そこで、本発明では、乳由来の塩基性タンパク質画分から塩基性シスタチン高含有画分を製造する方法を提供することを課題とする。
また、乳塩基性シスタチン高含有画分のプロテア−ゼ分解物にも骨吸収抑制作用があることが判っているので、本発明では、乳塩基性シスタチン高含有画分分解物を製造する方法を提供することも課題とする。
さらに、本発明では、乳塩基性シスタチン高含有画分や乳塩基性シスタチン高含有画分分解物を配合した、骨粗鬆症等の各種骨疾患及びリウマチ等の骨関節疾患並びに歯周病の予防及び改善のための飲食品、医薬又は飼料を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、乳由来の塩基性タンパク質画分を、必要に応じて、好ましくは80℃以上に加熱し、生じた沈殿を除去して上清を回収し、この上清にアルコールを好ましくは濃度70％となるように添加し、生じた沈殿を除去して乳塩基性シスタチン高含有画分を回収し、ヘパリン等の含硫酸基担体と接触させて担体に吸着しない画分を回収し、この画分を分画分子量10〜50kDa の限外濾過膜で処理して透過液を回収して、乳塩基性シスタチン高含有画分を製造することを特徴とする。
また、本発明は、上記の方法で製造された乳塩基性シスタチン高含有画分をさらにプロテアーゼで分解した乳塩基性シスタチン高含有画分分解物を製造することを特徴とする。
さらに、本発明は、上記の方法で製造された乳塩基性シスタチン高含有画分及び／又は乳塩基性シスタチン高含有画分分解物を配合し、さらに必要に応じてカルシウム及び／又はビタミンを配合した、骨粗鬆症等の各種骨疾患及びリウマチ等の骨関節疾患並びに歯周病の予防及び改善のための飲食品、医薬又は飼料を特徴とする。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明では、乳から安全で、しかも大量に、乳塩基性シスタチン高含有画分を製造することができる。乳としては、生乳、粉乳、脱脂粉乳及び還元乳等が用いられる。
また、本発明の乳塩基性シスタチン高含有画分分解物は、乳塩基性シスタチン高含有画分をトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼ等のプロテアーゼで限定分解したペプチド混合物である。
さらに、本発明は、このような乳塩基性シスタチン高含有画分及び／又は乳塩基性シスタチン高含有画分分解物を飲食品、医薬、飼料等に配合したものである。すなわち、牛乳、乳飲料、ジュース、ゼリー、ビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品に配合すれば良く、錠剤や粉末、あるいは歯磨き剤やうがい薬等の医薬としても良く、飼料に配合しても良い。
【０００８】
なお、本発明の骨粗鬆症等の各種骨疾患及びリウマチ等の骨関節疾患並びに歯周病の予防及び改善のための飲食品、医薬又は飼料には、吸収性の良好なカルシウムを配合することが望ましい。このような吸収性の良好なカルシウムとしては、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、乳酸カルシウム、卵殻、あるいは、乳由来のカルシウムを例示することができる。また、ビタミンＤやビタミンＫ等の骨形成に有効なビタミンを配合することが望ましい。これらのカルシウム及びビタミンは、乳塩基性シスタチンと作用機作が異なるため、骨形成に関して相乗的に効果がある。そして、乳塩基性シスタチンは、熱安定性が高く、食品加工上、極めて優れた性質を有するものである。
本発明においては、成人の場合、１日当たり１μg から100mg の乳塩基性シスタチン高含有画分及び／又は乳塩基性シスタチン高含有画分分解物を数回に分けて摂取すれば良い。このようにすることにより、骨粗鬆症等の各種骨疾患及びリウマチ等の骨関節疾患並びに歯周病を予防及び改善することができる。
次に、実施例を挙げて、本発明を詳しく説明する。
【０００９】
【実施例１】
スルホン化キトパール3,000gを充填し、脱イオン水で充分洗浄したカラムに脱脂乳10,000ｌを通液し、脱イオン水で充分カラムを洗浄した後、0.1 〜1.0M塩化ナトリウムの直線濃度勾配で溶出し、凍結乾燥して、乳由来の塩基性タンパク質画分の粉末を得た。この乳由来の塩基性タンパク質画分の粉末200gを濃度１％となるように酢酸緩衝液（pH５）で溶解してヘパリン固定化カラムに通液し、さらに酢酸緩衝液（pH５）20 lを通液して素通り画分40 lを得た。この画分を限外濾過膜処理（50kDa カット）して20倍に濃縮し、その際に得られた透過液を限外濾過膜処理（10kDa カット）して10倍に濃縮し、乳塩基性シスタチン高含有画分を得、これを凍結乾燥して乳塩基性シスタチン高含有画分の粉末60g を得た。なお、この画分中の乳塩基性シスタチン含量は1.8 ％であった。
【００１０】
【実施例２】
スルホン化キトパール3,000gを充填し、脱イオン水で充分洗浄したカラムに脱脂乳10,000ｌを通液し、脱イオン水で充分カラムを洗浄した後、0.1 〜1.0M塩化ナトリウムの直線濃度勾配で溶出し、凍結乾燥して、乳由来の塩基性タンパク質画分の粉末を得た。この乳由来の塩基性タンパク質画分の粉末２kgを５％濃度で溶解し、80℃、15分間加熱して遠心分離により上清を得た。この上清38kgを５℃に冷却した後、最終濃度40％となるようにエタノールを添加し、５℃で６時間後に遠心分離して沈殿を除去した。さらに、この上清に最終濃度70％となるようにエタノールを添加し、５℃で12時間後に遠心分離して乳塩基性シスタチン高含有画分240g（サンプルＡ）を得た。なお、この画分中の乳塩基性シスタチン含量は0.7 ％であった。
この乳塩基性シスタチン高含有画分200gを濃度１％となるように酢酸緩衝液（pH５）で溶解してヘパリン固定化カラムに通液し、さらに酢酸緩衝液（pH５）20 lを通液して素通り画分40 lを得た。この画分を限外濾過膜処理（50kDa カット）して20倍に濃縮し、その際に得られた透過液を限外濾過膜処理（10kDa カット）して10倍に濃縮し、乳塩基性シスタチン高含有画分を得、これを凍結乾燥して乳塩基性シスタチン高含有画分の粉末65g （サンプルＢ）を得た。なお、この画分中の乳塩基性シスタチン含量は2.2 ％であった。
【００１１】
【実施例３】
実施例２で得られた乳塩基性シスタチン高含有画分の粉末１g を水 100mlに懸濁し、最終濃度が１重量％となるようにパンクレアチンを加えて、37℃で５時間酵素処理した。そして、90℃で５分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥し、乳塩基性シスタチン高含有画分分解物0.91g （サンプルＣ）を得た。
【００１２】
【試験例１】
生後10〜20日齢のＩＣＲ系マウスの長管骨を摘出し、軟組織を除去した後、５％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ溶液中で長管骨を機械的に細切し、破骨細胞を含む全骨髄細胞を得た。この細胞について、約 200万細胞を５％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ溶液で象牙片の上にスポットした。数時間後、サンプルを添加した５％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ溶液を加えて、３日間培養し、破骨細胞の骨吸収活性を調べた。
骨吸収活性の評価は、培養後に象牙片上の細胞を剥がして、ヘマトキシリン染色し、PIASLA-555により画像解析して、骨吸収窩(pit) の数をカウントすることにより行った。
この結果、実施例２及び３で得られたサンプルＡ〜Ｃについて、それぞれ500ng/mlの濃度のサンプル溶液を調製し、骨吸収活性を調べた。すなわち、各サンプルを加えて細胞を培養した時の骨吸収窩(pit) の数をカウントし、サンプルを加えずに細胞を培養した時の骨吸収窩(pit) の数を100 ％として骨吸収活性を表し、表１に示した。
【００１３】
【表１】
─────────────────────
試験試料        骨吸収活性（％，±SD）
─────────────────────
サンプルＡ        81.3±3.9
サンプルＢ        70.4±5.6
サンプルＣ        61.5±3.2
─────────────────────
【００１４】
表１からみると、乳塩基性シスタチン高含有画分及び乳塩基性シスタチン高含有画分分解物に骨吸収活性を抑制する効果があることが判った。
但し、セタノール処理したサンプルＡは本発明方法であるサンプルＢ、Ｃほど骨吸収活性抑制効果はなかった。
【００１５】
【試験例２】
実施例２で得られたサンプルＢ及び実施例３で得られたサンプルＣについて、骨粗鬆症モデルラットを用いた動物実験を行った。
なお、ラットに投与した飼料の基本組成を表２に示す。
飼料中のカルシウム量とリン量は共に全ての群で飼料100g当たり300mg になるように、カルシウム：リン比を１：１とした。
【００１６】
【表２】
──────────────────────────
蔗糖                            50.0    （重量％）
カゼイン                        20.0
コーンスターチ                  15.0
セルロース                       5.0
トウモロコシ油                   5.0
ビタミン混合（コリン含む）       1.0
ミネラル混合（注１）             4.0
──────────────────────────
1)  炭酸カルシウムをカルシウム源とした。
【００１７】
表２に示した基本組成の飼料に、サンプルＢ又はＣを添加し、以下の試験食を調製した。
試験食１：表２に示した基本組成の飼料＋サンプルＢ（0.01mg／100g）
試験食２：表２に示した基本組成の飼料＋サンプルＣ（0.01mg／100g）
試験食３：表２に示した基本組成の飼料（ただし、カルシウム源として、炭酸カルシウムに代えて乳由来のカルシウム（特開平4-306622号公報）を使用）＋サンプルＢ（0.01mg／100g）
【００１８】
動物は、40週齢のＳＤ系雌性ラットを用いた。骨粗鬆症モデルラットは、１週間予備飼育した後に卵巣摘出手術を施し、低カルシウム食で２ケ月間飼育することにより作成した。その時、疑似手術を施し、卵巣を摘出しないラットも作成した。そして、１試験群７匹で群分けし、各試験食を１ケ月間投与した。なお、擬似手術を施し、卵巣を摘出しないラットを用いた群（シャム群）及び対照群には、表２に示した基本組成の飼料を投与した。
試験食投与後、各試験群のラットの大腿骨を摘出し、骨塩量測定装置で骨塩量を測定し、破断特性測定装置で骨強度を測定した。
試験結果を表３及び表４に示す。
【００１９】
【表３】
────────────────────────
試験群                  骨塩量  （mg，±SD）
────────────────────────
シャム群                  120.2 ± 3.9
対照群                     83.5 ± 4.9
試験食１投与群            104.7 ± 3.6
試験食２投与群            106.3 ± 4.1
試験食３投与群            111.3 ± 3.1
────────────────────────
【００２０】
表３に示したように、大腿骨の骨塩量は、対照群に比べて試験食投与群で統計的に有意に高い値を示した。このことから、サンプルＢ及びＣには骨吸収防止作用があることが判った。また、吸収性の良い乳由来のカルシウムを添加することにより、さらに作用が増強することが判った。
【００２１】
【表４】
──────────────────────
試験群                  骨破断力（106dyn）
─────────────────────
シャム群                   13.3 ± 3.6
対照群                      6.7 ± 2.3
試験食１投与群             10.4 ± 2.9
試験食２投与群             10.9 ± 2.4
試験食３投与群             11.9 ± 3.1
──────────────────────
【００２２】
表４に示したように、骨破断力は、対照群に比べて試験食投与群で統計的に有意に高い値を示した。このことから、サンプルＢ及びＣには骨強化作用があることが判った。また、吸収性の良い乳由来のカルシウムを添加することにより、さらに作用が増強することが判った。
【００２３】
【試験例３】
表５に示した基本組成の水溶液に、サンプルＢ（0.01mg／100g）及びビタミンＤ（200IU ）を添加して混合し、容器に充填した後、加熱滅菌して飲料（試験品）を製造した。
なお、サンプルＢに代えてアルブミン（0.01mg／100g）を添加した飲料（対照品）も同様に製造した。
【００２４】
【表５】
──────────────────────
結晶ブドウ糖            15.0  （重量％）
カルシウム               0.5
水                      74.5
──────────────────────
【００２５】
変形性関節症（関節の開裂の収縮）の患者16人を８人ずつ２群に分け、上記各飲料を１ヶ月間飲用してもらい、飲用前と飲用後の骨吸収の骨代謝マーカーである尿中デオキシピリジノリン量を測定した。また、問診により自覚症状を確認した。
試験結果を表６及び表７に示す。
【００２６】
【表６】
0004647750.tif 000002
【００２７】
表６に示すように、カルシウム及びビタミンを配合した対照品投与群でもデオキシピリジノリン量が減少したものの、試験品投与群ではさらに大きく減少した。このことから、サンプルＢにより、骨の破壊による骨吸収が極めてよく抑制されていることが判った。
【００２８】
【表７】
0004647750.tif 000003
【００２９】
表７に示すように、関節痛についても、各項目について痛みが軽減していることが判る。
【００３０】
【試験例４】
６週齢のゴールデンハムスターを１週間予備飼育した後、エーテル麻酔下でM1の歯頸部に滅菌した手術用縫合絹糸No４を５重に巻き付け、Keyes らの飼料（D #2000:Keyes,P.H. and Jordan:Archs. Oral.Biol,vol.9,pp.377-400,1964) で飼育することにより、歯周病を発病させた。ハムスター18匹を１試験群とし、サンプルＡ、Ｂ又はＣ10μｇを適当に希釈した試験液で、１日２回、口腔内を約10分間絶えず浸す処置を行った。なお、対照群は、蒸留水で処置を行った。処置開始４週間後に、2.5 ％グルタルアルデヒド溶液（pH7.4 ）を用いて約20分間固定灌流した後、下顎骨両側を摘出した。
歯槽骨減少量の評価は、2.5 ％グルタルアルデヒド溶液で固定した後、軟Ｘ線撮影を行った写真を画像解析装置（PIAS LA-555)で解析し、M1付近のエナメルセメント境と歯槽骨頂間の面積を計測して、歯槽骨減少量を評価した。
その試験結果を表８に示す。
【００３１】
【表８】
0004647750.tif 000004
【００３２】
表８によると、対照群に比べて試験群では明らかに歯槽骨減少量が有意に低く、かつこの効果は濃度依存的であった。このことから、乳塩基性シスタチン高含有画分及びその分解物は、歯槽骨の減少を抑制し、歯周病予防に効果的であることが判る。
【００３３】
【実施例４】
表９に示した組成で各成分を混合し、容器に充填した後、加熱滅菌して、骨粗鬆症等の各種骨疾患及びリウマチ等の骨関節疾患の予防及び改善用の飲料を製造した。
【００３４】
【表９】
────────────────────────
混合異性化糖                15.00 （重量％）
果汁                        10.00
クエン酸                     0.50
サンプルＢ                   0.01
香料                         0.10
カルシウム                   0.50
ビタミンＤ                 (200IU)
水                          73.89
───────────────────────
【００３５】
【実施例５】
表１０に示した組成で各成分を混合し、加圧成型して、骨粗鬆症等の各種骨疾患及びリウマチ等の骨関節疾患の予防及び改善用の錠剤を製造した。
【００３６】
【表１０】
────────────────────────
含水結晶ブドウ糖              93.5（重量％）
サンプルＢ                     0.1
カルシウム                     5.0
ビタミンＤ                  （200IU)
シュガーエステル               1.0
香料                           0.4
────────────────────────
【００３７】
【実施例６】
表１１に示した組成で各成分を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、骨粗鬆症等の各種骨疾患及びリウマチ等の各種骨関節疾患の予防及び改善用のゼリーを製造した。
【００３８】
【表１１】
────────────────────
果糖                20.00 （重量％）
グラニュー糖        15.00
水飴                 5.00
寒天                 1.00
サンプルＣ           0.01
香料                 0.10
カルシウム           0.10
水                  58.79
────────────────────
【００３９】
【実施例７】
表１２に示した組成で各成分を混合し、乳化温度85℃で、骨粗鬆症等の各種骨疾患及びリウマチ等の各種骨関節疾患の予防及び改善用のチーズを製造した。
【００４０】
【表１２】
─────────────────────
ゴーダチーズ            43.0（重量％）
チェダーチーズ          43.5
クエン酸ナトリウム       2.0
サンプルＣ               0.1
乳由来のカルシウム       1.0
水                      10.4
─────────────────────
【００４１】
【実施例８】
表１３に示した組成で各成分を混合し、骨粗鬆症等の各種骨疾患及びリウマチ等の骨関節疾患の予防及び改善用のイヌ飼育用飼料（ドッグフード）を製造した。
【００４２】
【表１３】
────────────────────
大豆粕                12.0  （重量％）
脱脂粉乳              14.0
大豆油                 4.0
コーン油               2.0
パーム油              27.9
トウモロコシ澱粉      15.0
小麦粉                 9.0
ふすま                 2.0
ビタミン混合物         9.0
ミネラル混合物         2.0
セルロース             3.0
サンプルＢ             0.1
────────────────────
【００４３】
【実施例９】
表１４に示した組成で各成分を混合し、クリームを調製した。そして、このクリームを容器に充填して、歯周病予防及び改善用の歯磨き剤を製造した。
【００４４】
【表１４】
──────────────────────────
グリセリン                 70.49    （重量％）
二酸化ケイ素               20.00
キサンタンガム              1.00
ミントフレーバー            1.00
二酸化チタン                0.70
フッ化ナトリウム            0.30
蒸留水                      6.50
サンプルＣ                  0.01
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【００４５】
【発明の効果】
本発明で得られる乳塩基性シスタチン高含有画分やこれをプロテアーゼで分解した乳塩基性シスタチン高含有画分分解物は、骨形成促進及び骨吸収抑制作用を有しているので、これらを飲食品、医薬及び飼料等に配合することによって、骨粗鬆症等の各種骨疾患及びリウマチ等の骨関節疾患並びに歯周病の予防及び改善に有効に利用し得る。