(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の蛍光特性を有し、かつ単量体で存在する蛋白質。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質。
（ａ）配列番号３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、それぞれ配列番号３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の蛍光特性を有する蛋白質。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質。
（ａ）配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質；
（ｂ） 配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加 されたアミノ酸配列を有し、それぞれ配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の蛍光特性を有する蛋白質。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の蛍光特性を有し、かつ単量体で存在する蛋白質。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、それぞれ配列番号３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の蛍光特性を有する蛋白質。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質；
（ｂ） 配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加 されたアミノ酸配列を有し、それぞれ配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の蛍光特性を有する蛋白質。
【請求項７】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ配列番号２に記載の塩基配列がコードする蛋白質の蛍光特性を有する蛋白質であって、単量体で存在する蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項８】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡ。
（ａ）配列番号４、６、８又は１０に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号４、６、８又は１０に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつそれぞれ配列番号４、６、８又は１０に記載の塩基配列がコードする蛋白質の蛍光特性を有する蛋白質。
【請求項９】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡ。
（ａ）配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８又は３０に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ） 配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８又は３０に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する 塩基配列を有し、かつそれぞれ１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８又は３０に記載の塩基配列がコードする蛋白質の蛍光特性を有する蛋白質。
【請求項１０】
請求項４から９の何れかに記載のＤＮＡを有する組み換えベクター。
【請求項１１】
請求項４から９の何れかに記載のＤＮＡ又は請求項１０に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
【請求項１２】
請求項１から３の何れかに記載の蛍光蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛍光蛋白質。
【請求項１３】
他の蛋白質が細胞内に局在する蛋白質である、請求項１２に記載の融合蛋白質。
【請求項１４】
他の蛋白質が細胞内小器官に特異的な蛋白質である、請求項１２又は１３に記載の融合蛋白質。
【請求項１５】
他の蛋白質が蛍光蛋白質である、請求項１２に記載の融合蛋白質。
【請求項１６】
分子内ＦＲＥＴを生じる、請求項１５に記載の融合蛋白質。
【請求項１７】
請求項１２から１４の何れか１項に記載の融合蛋白質を細胞内で発現させることを特徴とする、細胞内における蛋白質の局在または動態を分析する方法。
【請求項１８】
請求項１から３の何れかに記載の蛍光蛋白質、請求項４から９の何れかに記載のＤＮＡ、請求項１０に記載の組み換えベクター、請求項１１に記載の形質転換体、又は請求項１２から１６の何れか１項に記載の融合蛋白質を含む、蛍光試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、単量体で存在する新規な蛍光蛋白質に関する。より詳細には、本発明は、クサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）由来の蛍光蛋白質に変異を導入することにより単量体化した新規な蛍光蛋白質及びその利用に関する。さらに本発明は、新規な色素蛋白質並びに蛍光蛋白質に関する。より詳細には、本発明は、コモンサンゴ（Ｍｏｎｔｉｐｏｒａ．ｓｐ）由来の新規な色素蛋白質及び蛍光蛋白質、並びにその利用に関する。
【背景技術】  クラゲのエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）は、生物系において多くの用途を有する。最近、ランダム突然変異誘発法および半合理的（ｓｅｍｉ−ｒａｔｉｏｎａｌ）突然変異誘発法に基づいて、色を変化させたり、折りたたみ特性を改善したり、輝度を高めたり、あるいはｐＨ感受性を改変したといった様々なＧＦＰ変異体が作製されている。遺伝子組み換え技術により他の蛋白質をＧＦＰ等の蛍光蛋白質に融合させて、それらの発現および輸送のモニタリングを行うことが行われている。
最もよく使用されるＧＦＰ変異体の一つとして黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）が挙げられる。ＹＦＰは、クラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）ＧＦＰ変異体の中でも最長波長の蛍光を示す。大部分のＹＦＰのεおよびΦは、それぞれ６０，０００〜１００，１００Ｍ−１ｃｍ−１および０．６〜０．８であり（Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９８）．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，５０９−５４４）、これらの値は、一般的な蛍光団（フルオレセインおよびローダミンなど）の値に匹敵する。従ってＹＦＰの絶対的輝度の改善は、ほぼ限界に達しつつある。
また、ＧＦＰ変異体の他の例として、シアン色蛍光蛋白質（ＣＦＰ）があり、ＥＣＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が知られている。また、イソギンチャク（Ｄｉｓｃｏｍａ  ｓｐ．）からは赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）も単離されており、ＤａｓＲｅｄが知られている。このように蛍光蛋白質は、緑色、黄色、シアン色、赤色の４種が次々と開発されスペクトルの範囲は大幅に広がっている。
先に本発明者らは、クサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）のｃＤＮＡライブラリーから、既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列に基づいて設計した好適なプライマーを用いて蛍光蛋白質遺伝子を増幅してクローニングすることに成功し、得られたクサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）由来の蛍光蛋白質の蛍光特性を調べた結果、当該蛍光蛋白質が所望の蛍光特性を有することを見出している（国際公開ＷＯ０３／５４１９１号公報）。
また、オワンクラゲ由来のＧＦＰホモログの中には、ストークスシフト（励起のピーク値と蛍光のピーク値の差）の大きいタイプのもの（ＧＦＰｕｖ、ｓａｐｐｈｉｒｅ）があるが、３８０ｎｍのＵＶ光で励起して緑色蛍光を取得するため、生物内での観察には毒性をもつＵＶ光の使用は適さない。赤色蛍光蛋白質についてはストークスシフトの大きなものは存在せず、蛍光観察においては、励起もしくは蛍光のどちらかを犠牲にしなければならないのが現状である、
【発明の開示】
国際公開ＷＯ０３／５４１９１号公報に記載されたイシサンゴ目のクサビライシより単離された蛍光蛋白質Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ（ＫＯ）は分子量測定の結果、７０ｋＤａ（アミノ酸配列から計算される分子量は２６ｋＤａ）を示し、通常は二量体を形成していると考えられる。近年、蛍光蛋白質をもちいて細胞や分子のラベルする需要が急速に高まっている。細胞をラベルする際には蛍光蛋白質が多量体を形成しようと、蛍光蛋白質自身は細胞質中に漂っているだけなので問題は起こらないが、分子をラベルする際には問題が生じてくる。例えば、ラベルしたい分子が多量体を形成する場合、ターゲット分子と蛍光蛋白質分子が互いに多量体を形成し合い、巨大なポリマーを形成してしまう可能性がある。また、どちらかの多量体形成が阻害された時には、その多量体形成できない分子が本来の性質を失うことになる。蛍光蛋白質を複数用いた分子内ＦＲＥＴ（蛍光エネルギー共鳴移動）のプローブにおいても同様に、多量体形成蛍光蛋白質同士を一本のペプチド鎖として発現させた場合に、互いが多量体形成をしあうためにＦＲＥＴの観測は困難となる。本発明は、上記した問題を解消することを解決すべき課題とするものであり、具体的には、多量体を形成することなく単量体で存在する新規な蛍光蛋白質を提供することを解決すべき課題とした。
また、蛍光蛋白質は低分子の蛍光物質に比して励起と蛍光のスペクトルがブロードである。そして、多くの蛍光蛋白質では励起スペクトルと蛍光スペクトルの重なりがあるため、励起のピーク値で励起して蛍光のピーク値で観測することが非常に困難である。本発明は、上記した問題点を解消した蛍光蛋白質を提供することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、励起のピーク値（吸収極大波長）と蛍光のピーク値（蛍光極大波長）の差（ストークスシフト）を大きくすることにより、最大の励起で最大の蛍光を得ることができることを特徴とする赤色又は橙色の蛍光蛋白質を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、国際公開ＷＯ０３／５４１９１号公報に記載された蛋白質ＫＯのアミノ酸配列から多量体形成界面を予測し、多量体形成界面のアミノ酸を置換し、なおかつ蛍光特性を保持するようＫＯの単量体化を行うことに成功した。さらに本発明者らは、得られた単量体蛍光蛋白質の蛍光特性を調べた結果、所望の蛍光特性を有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
さらに本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、材料としてコモンサンゴ（Ｍｏｎｔｉｐｏｒａ．ｓｐ）を用いて新規色素蛋白質をコードする遺伝子の単離を試み、色素蛋白質ＣＯＣＰを取得した。次いで、ＣＯＣＰ蛋白質の９４番目のヒスチジンをアスパラギンに、１４２番目のアスパラギンをセリンに、１５７番目のアスパラギンをアスパラギン酸に、２０１番目のリジンをアルギニンに、２０６番目のフェニルアラニンをセリンに置き換えることにより蛍光性を獲得した蛍光蛋白質ＣＯＣＰ−ＦＬを作成した。ＣＯＣＰ−ＦＬは５６０ｎｍに励起のピークを持ち、この励起によって蛍光スペクトルは６００ｎｍにピークした。さらに、本発明者者らは、上記ＣＯＣＰ−ＦＬの６１番目のセリンをフェニルアラニンに、９２番目のイソロイシンをトレオニンに、１２３番目のバリンをトレオニンに、１５８番目のフェニルアラニンをチロシンに、１９１番目のバリンをイソロイシンに、２１３番目のセリンをアラニンに置き換えることによりＣＯＣＰ−ＦＬとは異なる蛍光特性をもつ蛋白質ｋｅｉｍａ６１６を作成した。ｋｅｉｍａ６１６は、４４０ｎｍに励起のピークをもち、この励起によって蛍光スペクトルは６１６ｎｍにピークを持ち、ストークスシフトは１７６ｎｍと非常に大きな値であった。さらに、本発明者らは、Ｋｅｉｍａ６１６の６１番目のフェニルアラニンをメチオニンに、６２番目のグルタミンをシステインに置き換えることにより蛍光蛋白質Ｋｅｉｍａ５７０を作成した。このＫｅｉｍａ５７０はＫｅｉｍａ６１６と同様４４０ｎｍに励起のピークを持ち、この励起により５７０ｎｍの蛍光のピークを示し、ストークスシフトは１３０ｎｍと大きな値であった。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有し、かつ単量体で存在する蛋白質。
本発明の別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、それぞれ配列番号３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質；
（ｂ）配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、それぞれ配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有し、かつ単量体で存在する蛋白質。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、それぞれ配列番号３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質；
（ｂ）配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、それぞれ配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質：
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ配列番号２に記載の塩基配列がコードする蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質であって、単量体で存在する蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号４、６、８又は１０に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号４、６、８又は１０に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつそれぞれ配列番号４、６、８又は１０に記載の塩基配列がコードする蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８又は３０に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８又は３０に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつそれぞれ１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８又は３０に記載の塩基配列がコードする蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質。
さらにまた本発明によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す色素蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質。
本発明の別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号３９に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号３９に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有する蛋白質。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号４１、４３、４５又は４７に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号４１、４３、４５又は４７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有し、かつ１００ｎｍ以上のストークスシフトを有する蛋白質。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す色素蛋白質をコードするＤＮＡが提供される
（ａ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号３９に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号３９に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有する蛋白質。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号４１、４３、４５又は４７に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号４１、４３、４５又は４７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有し、かつ１００ｎｍ以上のストークスシフトを有する蛋白質。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号３８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号３８に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号４０に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号４０に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ蛍光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号４２、４４、４６又は４８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号４２、４４、４６又は４８に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ、蛍光特性を有し、１００ｎｍ以上のストークスシフトを有する蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明のＤＮＡを有する組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛍光蛋白質が提供される。好ましくは、他の蛋白質は細胞内に局在する蛋白質であり、さらに好ましくは、他の蛋白質は細胞内小器官に特異的な蛋白質である。好ましくは、他の蛋白質が蛍光蛋白質である。この場合、好ましくは、融合蛋白質は分子内ＦＲＥＴを生じることができる。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明の融合蛋白質を細胞内で発現させることを特徴とする、細胞内における蛋白質の局在または動態を分析する方法が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明の蛍光蛋白質、ＤＮＡ、組み換えベクター、形質転換体、又は融合蛋白質を含む、蛍光試薬キットが提供される。
【図面の簡単な説明】  図１は、ｍＫＯの吸収スペクトルを示す。
図２は、ｍＫＯの励起スペクトル（点線）及び蛍光スペクトル（実線）を示す。
図３は、超遠心による分子量測定の結果を示す。測定結果より分子量は２８ｋＤａであることが分かった。
図４は、ＨｅＬａ細胞でＫＯ（二量体）を用いてミトコンドリアをラベルした結果を示す。粒状になり正常なミトコンドリアの形態とは異なる。
図５は、ＨｅＬａ細胞でｍＫＯ（単量体）を用いてミトコンドリアをラベルした結果を示す。ひも状の正常なミトコンドリアの形態として観察される。
図６は、ＵＶ励起緑色蛍光変異体ｍＫＶＵ−１の吸収スペクトルを示す。
図７は、ＵＶ励起緑色蛍光変異体ｍＫＶＵ−１の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを示す
図８は、青色蛍光変異体ｍＫＵＶ−２の吸収スペクトルを示す。
図９は、青色蛍光変異体ｍＫＵＶ−２の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを示す
図１０は、緑色蛍光変異体ｍＫＯ−ＦＭ３２の吸収スペクトルを示す。
図１１は、緑色蛍光変異体ｍＫＯ−ＦＭ３２の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを示す
図１２は、赤色蛍光変異体ｍＫＯ−Ｆ９０の吸収スペクトルを示す。
図１３は、赤色蛍光変異体ｍＫＯ−Ｆ９０の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを示す
図１４は、ｍＫＯ時間経過変異体の５８０ｎｍの励起スペクトルを示す。
図１５は、ｍＫＯ時間経過変異体の５８０ｎｍの励起スペクトルを示す。
図１６は、ｍＫＯ時間経過変異体の蛍光スペクトルを示す。
図１７は、ｍＫＯ時間経過変異体の蛍光スペクトルを示す。
図１８は、ｍＫＯ時間経過変異体の蛍光スペクトルを示す。
図１９は、ｍＫＯ時間経過変異体の蛍光スペクトルを示す。
図２０は、ｍＫＯ時間経過変異体の蛍光スペクトルを示す。
図２１は、ｍＫＯ時間経過変異体の蛍光スペクトルを示す。
図２２は、ｍＫＯ時間経過変異体の蛍光スペクトルを示す。
図２３は、ｍＫＯの合成後２５時間まで５８０ｎｍの励起スペクトルを示す。
図２４は、ｍＫＯ時間経過変異体の合成後２５時間まで５８０ｎｍの励起スペクトルを示す。
図２５は、ｍＫＯ時間経過変異体の合成後２５時間まで５８０ｎｍの励起スペクトルを示す。
図２６は、ｍＫＯ時間経過変異体の合成後２５時間まで５８０ｎｍの励起スペクトルを示す。
図２７は、ｍＫＯ時間経過変異体の合成後２５時間まで５８０ｎｍの励起スペクトルを示す。
図２８は、ｍＫＯ時間経過変異体の合成後２５時間まで５８０ｎｍの励起スペクトルを示す。
図２９は、ｍＫＯ時間経過変異体について、緑蛍光の励起ピーク部分の５００ｎｍとオレンジ蛍光の励起ピークである５４８ｎｍの値の比のプロットを示す。
図３０は、ｍＫＯ−ＦＭ１４のＮ末端にＴａｕを連結した融合蛋白質遺伝子をＨｅＬａ−Ｓ３細胞に遺伝子導入して、イメージングを行った結果を示す。
図３１は、ｍＫＯ蛋白質に強い緑色光を照射し、照射前後の吸収スペクトルを測定した結果を示す。
図３２は、ｍＫＯ−ＦＭ１４蛋白質に強い緑色光を照射し、照射前後の吸収スペクトルを測定した結果を示す。
図３３は、ＢＤＮＦ−ｍＫＯ−ＦＭ１４発現遺伝子ベクターの導入後、約１２時間から２日間に細胞に発現した融合蛋白質を蛍光顕微鏡で検出し、強い緑色光を照射して、特定の領域のみオレンジ色蛍光を褪色させた結果を示す。
図３４は、ＢＤＮＦ−ｍＫＯ−ＦＭ１４発現遺伝子ベクターの導入後、約１２時間から２日間に細胞に発現した融合蛋白質を蛍光顕微鏡で検出し、色の変化から分子（ＢＤＮＦ−ｍＫＯ−ＦＭ１４）を追跡した結果を示す。
図３５は、分子内ＦＲＥＴを行うための蛍光蛋白質の模式図を示す。
図３６は、単量体蛍光蛋白質ｍＫＯと２量体蛍光蛋白質ＭｉＣｙの蛍光スペクトルと吸収スペクトルを示す。
図３７は、ＭｉＣｙ−ｌｉｎｋｅｒ−ｍＫＯを用いて、Ｃａｓｐａｓｅ３との反応前と反応後の反応液の蛍光スペクトルを４４０ｎｍで励起して測定した結果を示す。
図３８は、ＭｉＣｙ−ｌｉｎｋｅｒ−ｍＫＯを用いてｉｎ  ｖｉｖｏでＣａｓｐａｓｅ３の活性を測定した結果を示す。
図３９は、ＣＯＣＰの吸収スペクトルを示す。
図４０は、ＣＯＣＰのｐＨ感受性の測定結果を示す。
図４１は、Ｋｅｉｍａ６１６の励起スペクトルと蛍光スペクトルを示す。
図４２は、Ｋｅｉｍａ５７０の励起スペクトルと蛍光スペクトルを示す。
図４３は、Ｋｅｉｍａ６１６のｐＨ感受性の測定結果を示す。
図４４は、Ｋｅｉｍａ５７０のｐＨ感受性の測定結果を示す。
図４５は、ｃｍｋｅｉｍａ６２０の超遠心分子量測定の結果を示す。
図４６は、ｃｍｋｅｉｍａ６２０の吸収スペクトルを示す。
図４７は、ｍｋｅｉｍａ６２０の吸収スペクトルを示す。
図４８は、ｋｅｉｍａ６１６とＥＣＦＰの励起スペクトルと蛍光スペクトルを示す。
図４９は、Ｃａｓｐａｓｅ−３の活性測定に用いた蛋白質モチーフを示す。
図５０は、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏプロテアーゼ活性と相互相関を示す。リンカー部分にＤＥＶＤの配列を挿入したタンデム蛍光蛋白質のサンプルは３種ＥＣＦＰ−Ｋｅｉｍａ６１６、Ｋｅｉｍａ６１６−ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ−ｍＲＦＰ１（ｘ２）。  （上段）ｃａｓｐａｓｅ−３を加える前の自己相関、相互相関関数。  （中段）ｃａｓｐａｓｅ−３添加後の相互相関関数。  （下段）同添加後の蛍光強度。
図５１は、各融合蛋白モチーフにおけるＲｅｌａｔｉｖｅ  ａｍｐｌｉｔｕｄｅを示す。
図５２は、Ｃａｓｐａｓｅ−３によるペプチド鎖切断の検出（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。
図５３は、タンパク質間相互作用の検出に用いた融合蛋白質モチーフを示す。
図５４は、ＣａＣｌ２（＋）時のＥＣＦＰ−ＣａＭとＭ１３−Ｋｅｉｍａ６１６の蛍光相互相関関数を示す。
図５５は、ＣａＣｌ２（−）時のＥＣＦＰ−ＣａＭとＭ１３−Ｋｅｉｍａ６１６の蛍光相互相関関数を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明の蛋白質
（ｉ）本発明の第１の型の蛍光蛋白質
本発明の第１の型の蛍光蛋白質は、以下の（ａ）又は（ｂ）の何れかに示す蛋白質である。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有し、かつ単量体で存在する蛋白質。
本発明の蛍光蛋白質は、下記の特性を有することを特徴とする。
（１）励起極大波長が５４８ｎｍであり、蛍光極大波長は５５９ｎｍである；
（２）５４８ｎｍにおけるモル吸光係数が、５１６００である；
（３）量子収率が０．６である；及び
（４）蛍光特性のｐＨ感受性がｐＫａ＝５．０である
クサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）はサンゴの１種で、主に西部大西洋に生息し、群体の外形は多角形で触手が長く、全体が鮮やかなオレンジ色を呈することを特徴とする。
なお、本書中以下の実施例では、クサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）を出発材料として上記特性を有する本発明の蛍光蛋白質を取得したが、クサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）以外の蛍光を発するサンゴから本発明の蛍光蛋白質を取得することができる場合もあり、そのような蛍光蛋白質も本発明の範囲内である。
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
本明細書で言う「同等の蛍光特性」とは、同等の蛍光強度、同等の励起波長、同等の蛍光波長、同等のｐＨ感受性などを有することを意味する。
本発明の蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号１から３０に記載したアミノ酸配列並びに塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、それらを用いて上記した国際公開ＷＯ０３／５４１９１号公報に記載の蛍光蛋白質のｃＤＮＡクローンを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの一部の断片を上記したＰＣＲにより得た場合には、作製したＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の蛍光蛋白質を産生することができる。発現系での発現については本明細書中後記する。
さらに本発明によれば、上記した本発明の蛋白質（ｍＫＯ）の変異体蛋白質も提供される。具体的には、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、それぞれ配列番号３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質。
さらに別の具体例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質；
（ｂ）配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、それぞれ配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質。
（ｉｉ）本発明の第２の型の蛋白質
本発明の第２の型の蛋白質は、配列番号３７、３９、４１、４３、４５又は４７に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；並びに配列番号３７、３９、４１、４３、４５又は４７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、吸光特性又は蛍光特性を有する蛋白質である。配列番号４１、４３、４５又は４７に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のストークスシフト（吸収極大波長と蛍光極大波長の差）はそれぞれ１７６ｎｍ、１３０ｎｍ、１１８０ｎｍ、及び１８０ｎｍである。配列番号４１、４３、４５又は４７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有する蛋白質については、そのストークスシフトは１００ｎｍ以上、より好ましくは１２０ｎｍ以上になるものとする。
本発明の蛋白質は、下記の特性を有することを特徴とする。
（１）ＣＯＣＰ（アミノ酸配列を配列番号３７に示し、塩基配列を配列番号３８に示す）
励起極大波長（吸収極大波長）：５７６ｎｍ
５７６ｎｍにおけるモル吸光係数：６４０００
ｐＨ感受性：なし
（２）ＣＯＣＰ−ＦＬ（アミノ酸配列を配列番号３９に示し、塩基配列を配列番号４０に示す）
励起極大波長（吸収極大波長）：５６０ｎｍ
蛍光極大波長：６００ｎｍ
（３）ｋｅｉｍａ６１６（アミノ酸配列を配列番号４１に示し、塩基配列を配列番号４２に示す）
励起極大波長（吸収極大波長）：４４０ｎｍ
蛍光極大波長：６１６ｎｍ
ｐＨ感受性：ｐＨ７．５〜１０で蛍光強度は安定
（４）ｋｅｉｍａ５７０（アミノ酸配列を配列番号４３に示し、塩基配列を配列番号４４に示す）
励起極大波長（吸収極大波長）：４４０ｎｍ
蛍光極大波長：５７０ｎｍ
ｐＨ感受性：ｐＨ７．５〜１０で蛍光強度は安定
（５）ｃｍｋｅｉｍａ６２０（アミノ酸配列を配列番号４５に示し、塩基配列を配列番号４６に示す）
励起極大波長（吸収極大波長）：４４０ｎｍ
蛍光極大波長：６２０ｎｍ
（６）ｍｋｅｉｍａ６２０（アミノ酸配列を配列番号４７に示し、塩基配列を配列番号４８に示す）
励起極大波長（吸収極大波長）：４４０ｎｍ
蛍光極大波長：６２０ｎｍ
本明細書中の実施例においては、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡは、コモンサンゴ（Ｍｏｎｔｉｐｏｒａ．ｓｐ）を出発材料としてクローニングされた。コモンサンゴ（Ｍｏｎｔｉｐｏｒａ．ｓｐ）は、刺胞動物門花虫綱六放サンゴ亜綱イシサンゴ目ミドリイシ科に属するサンゴの１種であり、塊状や被覆状の群体を形成することが多い。なお、コモンサンゴ（Ｍｏｎｔｉｐｏｒａ．ｓｐ）以外の蛍光を発するサンゴから本発明の蛋白質を取得することができる場合もあり、そのような蛋白質も本発明の範囲内である。
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
本明細書において、「吸光特性を有する蛋白質」とは一定の波長の光を吸収できる性質を有する蛋白質を意味する。「配列番号３７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質」の吸光特性は、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の吸光特性と実質的に同一でもよいし、異なっていてもよい。吸光特性は、例えば、吸光強度、励起波長（吸収波長）、ｐＨ感受性などにより評価することができる。本発明の蛋白質のうち吸光特性を有し、蛍光を発しない色素蛋白質は、（１）ＦＲＥＴのアクセプター分子（エネルギー受容体）として用いたり、（２）照射した光のエネルギーを光以外のエネルギーに変換させるシステムの開発に利用したり、あるいは（３）蛋白質のアミノ酸配列に変異を導入して蛍光を発するように改変することなどに用いることができる。
本明細書において、「蛍光特性を有する蛋白質」とは、一定の波長の光で励起することにより蛍光を発することができる性質を有する蛋白質を意味する。「配列番号３９、４１、４３、４５又は４７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有する蛋白質」の蛍光特性はそれぞれ、配列番号３９、４１、４３、４５又は４７に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の蛍光特性と実質的に同一でもよいし、異なっていてもよい。蛍光特性は、例えば、蛍光強度、励起波長、蛍光波長、ｐＨ感受性などにより評価することができる。
本発明の色素蛋白質又は蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号３７、３９、４１、４３、４５又は４７に記載したアミノ酸配列並びに配列番号３８、４０、４２、４４、４６又は４８に記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、それらを用いてコモンサンゴ（Ｍｏｎｔｉｐｏｒａ  ｓｐ．）由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの一部の断片を上記したＰＣＲにより得た場合には、作製したＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の蛋白質を産生することができる。発現系での発現については本明細書中後記する。
（２）本発明のＤＮＡ
本発明によれば、本発明の第１の型の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが提供される。
本発明の第１の型の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの具体例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有し、かつ単量体で存在する蛋白質。
本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの更なる具体例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡもまた挙げられる。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ配列番号２に記載の塩基配列がコードする蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質であって、単量体で存在する蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
また、上記した（１）に記載した本発明の蛋白質（ｍＫＯ）の変異体蛋白質をコードするＤＮＡも本発明の範囲内である。
さらに本発明によれば、本発明の第２の型の蛋白質をコードするＤＮＡが提供される。
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの具体例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号３７、３９、４１、４３、４５又は４７に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号３７、３９、４１、４３、４５又は４７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、吸光特性又は蛍光特性を有する蛋白質。
本発明の色素蛋白質又は蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの更なる具体例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡもまた挙げられる。
（ａ）配列番号３８、４０、４２、４４、４６又は４８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号３８、４０、４２、４４、４６又は４８に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ吸光特性又は蛍光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
本明細書で言う「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から５０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個程度を意味する。
本発明のＤＮＡは、例えばホスホアミダイト法などにより合成することができるし、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造することもできる。本発明のＤＮＡ又はその断片の作製方法については、本明細書中上述した通りである。
また、所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮＡを構築することができる。このような公知の技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、並びにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）に記載されている。
（３）本発明の組み換えベクター
本発明のＤＮＡは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明のＤＮＡは、転写に必要な要素（例えば、プロモータ等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜することができる。
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・リケニホルミス  α  アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＢＡＮ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｇｅｎｅ）もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ｘｙｌｏｓｌｄａｓｅ  ｇｅｎｅ）のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰＲ若しくはＰＬプロモータ、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモータなどが挙げられる。
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性蛋白プロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ２−４ｃプロモータなどが挙げられる。
糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
また、本発明のＤＮＡは必要に応じて、例えばヒト成長ホルモンターミネータまたは真菌宿主についてはＴＰＩ１ターミネータ若しくはＡＤＨ３ターミネータのような適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）および翻訳エンハンサ配列（例えばアデノウイルス  ＶＡ  ＲＮＡをコードするもの）のような要素を有していてもよい。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
本発明のＤＮＡ、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
（４）本発明の形質転換体
本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明のＤＮＡまたは組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウ厶法等を挙げることができる。
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる（例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載）。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
上記の形質転換体は、導入されたＤＮＡ構築物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明の蛍光融合蛋白質を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
（５）本発明の蛍光蛋白質及びそれを含む融合蛍光蛋白質の利用
本発明は蛍光蛋白質を他の蛋白質と融合させることにより、融合蛍光蛋白質を構築することができる。
本発明の融合蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号１から３０に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、本発明の蛍光蛋白質の遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを構築するのに必要なＤＮＡ断片を作製することができる。また同様に、融合すべき蛋白質をコードするＤＮＡ断片も入手する。
次いで、これらのＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の融合蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の融合蛍光蛋白質を産生することができる。
本発明の蛍光蛋白質は、特に、標識としての利用価値が高い。即ち、本発明の蛍光蛋白質を被検アミノ酸配列との融合蛋白質として精製し、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、該融合蛋白質の分布を経時的に観察すれば、被検アミノ酸配列の細胞内におけるターゲッティング活性を検出することが可能である。
本発明の蛍光蛋白質を融合させる他の蛋白質（被検アミノ酸配列）の種類は特に限定されるものではないが、例えば、細胞内に局在する蛋白質、細胞内小器官に特異的な蛋白質、ターゲティングシグナル（例えば、核移行シグナル、ミトコンドリアプレ配列）等が好適である。なお、本発明の蛍光蛋白質は、マイクロインジェクション法などにより細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることも可能である。この場合には、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが発現可能に挿入されたベクターが宿主細胞に導入される。
また、本発明の蛍光蛋白質は、レポーター蛋白質としてプロモータ活性の測定に用いることも可能である。即ち、被検プロモータの下流に、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが配置されたベクターを構築し、これを宿主細胞に導入し、該細胞から発せられる本発明の蛍光蛋白質の蛍光を検出することにより、被検プロモータの活性を測定することが可能である。被検プロモータとしては、宿主細胞内で機能するものであれば、特に制限はない。
上記アミノ酸配列のターゲティング活性の検出やプロモータ活性の測定において用いられるベクターとしては、特に制限はないが、例えば、動物細胞用ベクターでは、「ｐＮＥＯ」（Ｐ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，ａｎｄ  Ｐ．Ｂｅｒｇ（１９８２）Ｊ．ＭＯｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７）、「ｐＣＡＧＧＳ」（Ｈ．Ｎｉｗａ，Ｋ．Ｙａｍａｍｕｒａ，ａｎｄ  Ｊ．Ｍｉｙａｚａｋｉ．Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−２００（１９９１））、「ｐＲｃ／ＣＭＶ」（インビトロゲン社製）、「ｐＣＤＭ８」（インビトロゲン社製）などが、酵母用ベクターでは、「ｐＲＳ３０３」，「ｐＲＳ３０４」，「ｐＲＳ３０５」，「ｐＲＳ３０６」，「ｐＲＳ３１３」，「ｐＲＳ３１４」，「ｐＲＳ３１５」，［ｐＲＳ３１６］（Ｒ．Ｓ．Ｓｉｋｏｒｓｋｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｈｉｅｔｅｒ（１９８９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２：１９−２７）、「ｐＲＳ４２３」，「ｐＲＳ４２４」，「ｐＲＳ４２５」，「ｐＲＳ４２６」（Ｔ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｍ．Ｄａｎｔｅ，Ｊ．Ｈ．Ｓｈｅｒｏ，ａｎｄ  Ｐ．Ｈｉｅｔｅｒ（１９９２）Ｇｅｎｅ  １１０：１１９−１２２）などが好適に用いられる。
また、使用可能な細胞の種類も特に限定されず、各種の動物細胞、例えば、Ｌ細胞、ＢａｌｂＣ−３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＲＫ（ｎｏｒｍａｌ  ｒａｔ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞、「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」などの酵母細胞や大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などを使用することができる。ベクターの宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム法やエレクトロポレーション法などの常法により行うことができる。
上記のようにして得た、本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質（蛋白質Ｘとする）とを融合させた融合蛍光蛋白質を細胞内で発現させ、発する蛍光をモニターすることにより、細胞内における蛋白質Ｘの局在や動態を分析することが可能になる。即ち、本発明の融合蛍光蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトした細胞を蛍光顕微鏡で観察することにより細胞内における蛋白質Ｘの局在や動態を可視化して分析することができる。
例えば、蛋白質Ｘとして細胞内オルガネラに特異的な蛋白質を利用することにより、核、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、分泌小胞、ペルオキソームなどの分布や動きを観察できる。
また、例えば、神経細胞の軸索、樹状突起などは発生途中の個体の中で著しく複雑な走向の変化を示すので、こういった部位を蛍光ラベルすることにより動的解析が可能になる。
本発明の蛍光蛋白質の蛍光は、生細胞のまま検出することが可能である。この検出は、例えば、蛍光顕微鏡（カールツァイス社アキシオフォト  フィルターセット  ０９）や画像解析装置（ＡＴＴＯ  デジタルイメージアナライザー）などを用いて行うことが可能である。
顕微鏡の種類は目的に応じて適宜選択できる。経時変化を追跡するなど頻回の観察を必要とする場合には、通常の落射型蛍光顕微鏡が好ましい。細胞内の詳細な局在を追及したい場合など、解像度を重視する場合は、共焦点レーザー顕微鏡の方が好ましい。顕微鏡システムとしては、細胞の生理状態を保ち、コンタミネーションを防止する観点から、倒立型顕微鏡が好ましい。正立顕微鏡を使用する場合、高倍率レンズを用いる際には水浸レンズを用いることができる。
フィルターセットは蛍光蛋白質の蛍光波長に応じて適切なものを選択できる。本発明の蛍光蛋白質は、励起極大波長が５４８ｎｍであり、蛍光極大波長が５５９ｎｍであることから、励起光５３０〜５５０ｎｍ、蛍光５５０〜６００ｎｍ程度のフィルターを使用することが好ましい。
また、蛍光顕微鏡を用いた生細胞での経時観察を行う場合には、短時間で撮影を行うべきなので、高感度冷却ＣＣＤカメラを使用する。冷却ＣＣＤカメラは、ＣＣＤを冷却することにより熱雑音を下げ、微弱な蛍光像を短時間露光で鮮明に撮影することができる。
また、分子間の相互作用を分析する手法の一つとして、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）が知られている。ＦＲＥＴでは、例えば、第一の蛍光蛋白質としてのシアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）で標識した第一の分子と、第二の蛍光蛋白質としての黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）で標識した第二の分子とを共存させることにより、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）をアクセプター分子として作用させ、シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）をドナー分子として作用させ、両者の間でＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）を生じさせることにより、第一の分子と第二の分子との間の相互作用を可視化することができる。即ち、ＦＲＥＴでは２種類の分子にそれぞれ異なる色素を導入し、エネルギーレベルの高い方の色素（ドナー分子）を選択的に励起し、その色素の蛍光を測定し、もう一方の色素（アクセプター分子）からの長波長蛍光も測定して、それらの蛍光変化量によって分子間の相互作用を可視化する。両方の色素が、２種類の分子の相互作用によって近接したときのみドナー分子の蛍光の減少とアクセプター分子の蛍光の増加が１波長励起２波長測光法により観測される。しかし、アクセプター分子に色素蛋白質を用いた場合は、両方の色素が、２種類の分子の相互作用によって近接したときのみドナー分子の蛍光の減少を生じ１波長励起１波長測光法により観測することができる。即ち、測定機器の簡易化が可能となる。
本発明の蛍光蛋白質及び色素蛋白質は、特に、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）におけるドナー分子及びアクセプター分子としての利用価値が高い。即ち、本発明の色素蛋白質と被験物質との融合体（第一の融合体）を作製する。次いで、該被験物質と相互作用する別の被験物質と別の蛍光蛋白質との融合体（第２の融合体）を作製する。そして、第一の融合体と第２の融合体とを相互作用させ、発する蛍光を分析することにより、上記２種類の被験物質間の相互作用を分析することができる。なお、本発明の色素蛋白質を用いたＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）は、試験管内で行ってもよいし、細胞内で行ってもよい。
さらにまた、本発明の蛍光蛋白質又は色素蛋白質の何れか１種以上をドナー蛋白質又はアクセプター蛋白質として使用することによって、分析物質の標的配列の両端にドナー蛍光蛋白質とアクセプター蛍光蛋白質が結合している構造を有する蛍光指示薬を作成することもできる。分析物質の該標的配列への結合又は作用の有無により、指示薬の立体構造が変化し、これにより蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の有無が生じさせることができる。
（６）本発明のキット
本発明によれば、本明細書に記載した蛍光蛋白質、融合蛍光蛋白質、ＤＮＡ、組み換えベクター又は形質転換体から選択される少なくとも１種以上を含むことを特徴とする、細胞内成分の局在の分析及び／又は生理活性物質の分析のためのキットが提供される。本発明のキットは、それ自体既知の通常用いられる材料及び手法で調製することができる。
蛍光蛋白質又はＤＮＡなどの試薬は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などを用いることができる。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】［実施例１］点変異導入による多量体形成阻害変異体の作製
ＫＯ−１のアミノ酸配列から多量体形成界面を予測し、多量体形成界面のアミノ酸を置換し、なおかつ蛍光特性を保持するようＫＯ−１の単量体化を行った。点変異導入はＫＯ−１を挿入した大腸菌発現ベクター（ｐＲＳＥＴＢ）（国際公開ＷＯ０３／５４１９１号公報に記載のＫＯ−１をコードするＤＮＡを有する発現ベクター）で点変異導入プライマーを用いて行った。具体的には鋳型プラスミドの片側鎖に複数の変異導入プライマーを同時にアニールさせ、ポリメラーゼで伸長させる。各プライマーにより伸長された各ＤＮＡ断片を同反応液中でＤＮＡリガーゼを用いてつなぎ、変異導入された部分以外が鋳型と相補的なものを得るという手法を行った。ＤＮＡリガーゼで各ＤＮＡ断片をつなぐ際にＤＮＡの末端にリン酸基を必要とするため、用いたプライマーは５’側のリン酸化を行った。
（１）プライマーの５’リン酸化
１００μＭ  プライマー                                                  ２μｌ
１０×Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ    ５μｌ
１００μＭ  ＡＴＰ                                                  ０．５μｌ
滅菌水                                                            ４１．５μｌ
Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（１０Ｕ／μｌ）        １μｌ
上記混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。ここでプライマーとしては、以下の配列番号３から１７に記載の塩基配列を有するプライマーを使用した。
Ｋ１１Ｒ，Ｆ１３Ｙ
0004709653.tif 000002
Ｖ２５Ｉ
0004709653.tif 000003
Ｋ３２Ｒ
0004709653.tif 000004
Ｓ５５Ａ
0004709653.tif 000005
Ｔ６２Ｖ
0004709653.tif 000006
Ｑ９６Ｅ
0004709653.tif 000007
Ｆ１０２Ｓ，Ａ１０４Ｓ
0004709653.tif 000008
Ｃ１１５Ｔ，Ｅ１１７Ｙ
0004709653.tif 000009
Ｖ１２３Ｔ
0004709653.tif 000010
Ｖ１３３Ｉ
0004709653.tif 000011
Ｓ１３９Ｖ
0004709653.tif 000012
Ｔ１５０Ａ，Ｃ１５１Ｓ
0004709653.tif 000013
Ｆ１６２Ｙ，Ａ１６６Ｅ
0004709653.tif 000014
Ｑ１９０Ｇ，Ｆ１９３Ｙ，Ｇ１９５Ｓ
0004709653.tif 000015
Ｃ２１７Ｓ
0004709653.tif 000016
（２）点変異導入ＰＣＲ
５’リン酸化プライマー                              ４μｌ
ｔｅｍｐｌａｔｅ（ＫＯ−ｐＲＳＥＴ  Ｂ）        １００ｎｇ
１０×ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ        ２．５μｌ
１０×ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ        ２．５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                              １μｌ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｐｆｕ）２．５Ｕ／μｌ        １μｌ
Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ    ４０Ｕ／μｌ    ０．５μｌ
滅菌水で計５０μｌとする。
プログラム：
サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ９７００を使用した。
１）６５℃  ５ｍｉｎ
２）９５℃  ２ｍｉｎ
３）９５℃  ２０ｓｅｃ
４）５２℃  ２０ｓｅｃ
５）６５℃  ８ｍｉｎ
上記の３）〜５）を２５サイクル繰り返す
６）７５℃  ７ｍｉｎ
７）４℃  ｈｏｌｄ
（３）Ｄｐｎ１処理
ＰＣＲ後のサンプルにＤｐｎ１を１μｌ加えて３７℃に１時間インキュベートしてテンプレートプラスミドを切断した。
（４）大腸菌への形質転換
Ｄｐｎ１処理後のサンプルを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換して変異導入後のＫＯ−１を発現させた。
（５）単量体化Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ（ｍＫＯ）のアミノ酸配列
変異導入後のＫＯ変異体の塩基配列を解析し、アミノ酸配列を決定した。その結果、１１番目のリジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）に、１３番目のフェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）に、２５番目のバリン（Ｖ）をイソロイシン（Ｉ）に、３２番目のリジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）に、５５番目のセリン（Ｓ）をアラニン（Ａ）に、６２番目のトレオニン（Ｔ）をバリン（Ｖ）に、９６番目のグルタミン（Ｑ）をグルタミン酸（Ｅ）に、１０２番目のフェニルアラニン（Ｆ）をセリン（Ｓ）に、１０４番目のアラニン（Ａ）をセリン（Ｓ）に、１１５番目のシステイン（Ｃ）をトレオニン（Ｔ）に、１１７番目のグルタミン酸（Ｅ）をチロシン（Ｙ）に、１２３番目のバリン（Ｖ）をトレオニン（Ｔ）に、１３３番目のバリン（Ｖ）をイソロイシン（Ｉ）に、１３９番目のセリン（Ｓ）をバリン（Ｖ）に、１５０番目のトレオニン（Ｔ）をアラニン（Ａ）に、１５１番目のシステイン（Ｃ）をセリン（Ｓ）に、１６２番目のフェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）に、１６６番目のアラニン（Ａ）をグルタミン酸（Ｅ）に、１９０番目のグルタミン（Ｑ）をグリシン（Ｇ）に、１９３番目のフェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）に、１９５番目のグリシン（Ｇ）をセリン（Ｓ）に、２１７番目のシステイン（Ｃ）をセリン（Ｓ）に置換されていた。さらにＫｏｚａｋ配列付加のため２番目のセリン（Ｓ）の前にバリン（Ｖ）を導入した。この変異体をｍＫＯとした。ｍＫＯのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に記載し、塩基配列を配列表の配列番号２に記載する。
大腸菌を用いてｍＫＯにＨｉｓ−Ｔａｇを付加した蛋白質を常法により発現させ、Ｎｉ−Ａｇａｒｏｓｅを用いて精製した。
［実施例２］蛍光特性の解析
実施例１で精製したｍＫＯ蛋白質の蛍光及び吸収スペクトルを以下の通り測定し、量子収率およびモル吸光係数を算出した。
２０μＭ蛍光蛋白、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５溶液を用いて吸収スペクトルを測定した。このスペクトルのピークの値よりモル吸光係数を計算した。ｍＫＯでは５４８ｎｍに吸収のピークが認められ、５００ｎｍにおける吸収が０．００２５となるように蛍光蛋白を上記の緩衝液で希釈して、５００ｎｍで励起した時の蛍光スペクトルと５９０ｎｍにおける蛍光による励起スペクトルを測定した。ＤｓＲｅｄ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を同様に５００ｎｍにおける吸収が０．００２５となるようにして蛍光スペクトルを測定し、ＤｓＲｅｄの量子収率を０．２９としてｍＫＯの量子収率を求めた。
結果を表１、図１及び図２に示す。表１には、国際公開ＷＯ０３／５４１９１号公報に記載のＫＯ蛋白質（二量体蛋白質）のデータも併記する。
0004709653.tif 000017
［実施例３］超遠心分析による分子量の測定
ｍＫＯ蛋白質溶液を１５０ｍＭ  ＫＣｌ，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４とした。ｍＫＯの分子量決定のため超遠心分析をおこなった。超遠心機ＸＬ−１（ベックマン・コールター）を用いて２５，０００ｒｐｍ、２２時間遠心して、ｍＫＯの吸収極大（５４８ｎｍ）付近の５４０ｎｍの吸収を測定した。その測定結果からｍＫＯの分子量は２８ｋＤａと計算された（図３）。これはアミノ酸配列から予測される２６ｋＤａとほぼ一致し、ｍＫＯが単量体として存在することが確認された。
［実施例４］ミトコンドリアへのターゲティング
ＫＯおよびｍＫＯのＮ末端に、Ｙｅａｓｔ由来のｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｏｘｉｄａｓｅサブユニット４のＮ末端１２アミノ酸（ＭＬＳＬＲＱＳＩＲＦＦＫ）を付加し、ＨｅＬａ細胞のミトコンドリアへのターゲティングを行い、ミトコンドリアのラベルを行った。ＫＯ（二量体）は正確にターゲティングされずに、ミトコンドリアが粒々に染色されているのが確認された（図４）。一方、ｍＫＯ（単量体）は正確にミトコンドリアにターゲティングされ、細長い糸状のミトコンドリアが観察され、単量体化による有効性が確認された（図５）。
［実施例５］蛍光特性の異なるｍＫＯの変異体の作製
（１）変異導入
ｍＫＯのアミノ酸を置換し、ｍＫＯとは異なった蛍光特性を持つ蛍光蛋白質の作製を行った。点変異導入はｍＫＯを挿入した大腸菌発現ベクター（ｐＲＳＥＴＲ）に点変異導入プライマーをもちいてＰＣＲをかけることにより行った。ＰＣＲに用いたプライマーは５’側のリン酸化を行った。
（ａ）プライマーの５’リン酸化
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ                                                ２μｌ
１０×Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ    ５μｌ
１００μＭ  ＡＴＰ                                                  ０．５μｌ
滅菌水                                                            ４１．５μｌ
Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（１０Ｕ／μｌ）        １μｌ
３７℃で３０分間インキュベートした。
（ｂ）点変異導入ＰＣＲ
５’リン酸化プライマー                                  ４μｌ
ｔｅｍｐｌａｔｅ（ｍＫＯ−ｐＲＳＥＴ  Ｂ）          １００ｎｇ
１０×ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ            ２．５μｌ
１０×ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ            ２．５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                  １μｌ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｐｆｕ）２．５Ｕ／μｌ            １μｌ
Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ    ４０Ｕ／μｌ        ０．５μｌ
滅菌水で計５０μｌとする。
プログラム
サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ９７００を使用した。
１）６５℃  ５ｍｉｎ
２）９５℃  ２ｍｉｎ
３）９５℃  ２０ｓｅｃ
４）５２℃  ２０ｓｅｃ
５）６５℃  ８ｍｉｎ
６）７５℃  ７ｍｉｎ
７）４℃  ｈｏｌｄ
３）〜５）を２５サイクル
（ｃ）Ｄｐｎ１処理
ＰＣＲ後のサンプルにＤｐｎ１を１μｌ加えて３７℃に１時間インキュベートしてテンプレートプラスミドを切断した。
（ｄ）大腸菌への形質転換
Ｄｐｎ１処理後のサンプルを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）に形質転換して変異導入後のｍＫＯを発現させ解析を行なった。
（２）ｍＫＯ変異体のアミノ酸置換部位および蛍光特性
蛍光測定には蛍光分光光度計Ｆ−２５００（ＨＩＴＡＣＨＩ）を使用した。吸収測定には分光光度計Ｕ−３３１０（ＨＩＴＡＣＨＩ）を使用した。
（ｉ）ＵＶ励起緑色蛍光変異体ｍＫＶＵ−１（アミノ酸配列を配列番号３に示し、塩基配列を配列番号４に示す）
ｍＫＯの７０番目のプロリン（Ｐ）をシステイン（Ｃ）に、１６０番目のバリン（Ｖ）をアスパラギン酸（Ｄ）に、１６２番目のメチオニン（Ｍ）をロイシン（Ｌ）に、１７６番目のフェニルアラニン（Ｆ）をメチオニン（Ｍ）にアミノ酸置換することにより、５０５ｎｍに蛍光ピークを持ち、３９８ｎｍに励起のピークを持つ緑色蛍光蛋白質となった（図６、７）。モル吸光係数は１００００で、蛍光の量子収率は０．２７となった。
（ｉｉ）青色蛍光変異体ｍＫＵＶ−２（アミノ酸配列を配列番号５に示し、塩基配列を配列番号６に示す）
ｍＫＯの６５番目のシステイン（Ｃ）をグリシン（Ｇ）に、７０番目のプロリン（Ｐ）をグリシン（Ｇ）に、１６０番目のバリン（Ｖ）をアスパラギン酸（Ｄ）に、１７６番目のフェニルアラニン（Ｆ）をメチオニン（Ｍ）にアミノ酸置換することにより、４６９ｎｍに蛍光ピークを持ち、３２２ｎｍに励起のピークを持つ青色蛍光蛋白質となった（図８、９）。モル吸光係数は１２５００で、蛍光の量子収率は０．２となった。
（ｉｉｉ）緑色蛍光変異体ｍＫＯ−ＦＭ３２（アミノ酸配列を配列番号７に示し、塩基配列を配列番号８に示す）
ｍＫＯの６５番目のシステイン（Ｃ）をアラニン（Ａ）に、７０番目のプロリン（Ｐ）をグリシン（Ｇ）にアミノ酸置換することにより、５０６ｎｍに蛍光ピークを持ち、４９３ｎｍに励起のピークを持つ緑色蛍光蛋白質となった（図１０、１１）。モル吸光係数は２７５００で、蛍光の量子収率は０．４４となった。
（ｉｖ）赤色蛍光変異体ｍＫＯ−Ｆ９０（アミノ酸配列を配列番号９に示し、塩基配列を配列番号１０に示す）
ｍＫＯの４１番目のメチオニン（Ｍ）をロイシン（Ｌ）に、４９番目のリジン（Ｋ）をグルタミン酸（Ｅ）に、６９番目のアルギニン（Ｒ）をリジン（Ｋ）に、１４５番目のセリン（Ｓ）をトリプトファン（Ｗ）に、１８５番目のリジン（Ｋ）をグルタミン酸（Ｅ）に、１８８番目のリジン（Ｋ）をグルタミン酸（Ｅ）に、１９２番目のセリン（Ｓ）をアスパラギン酸（Ｄ）にアミノ酸置換することにより、５８２ｎｍに蛍光ピークを持ち、５６４ｎｍに励起のピークを持つ赤色蛍光蛋白質となった（図１２、３）。モル吸光係数は２５０００で、蛍光の量子収率は０．０５となった。
［実施例６］緑色とオレンジ色の２蛍光を発するｍＫＯの変異体の作製（時間経過測定プローブおよび追跡プローブ）
ｍＫＯのアミノ酸を置換し、ｍＫＯとは異なった蛍光特性を持つ蛍光蛋白質の作製を行った。ｍＫＯは翻訳されてからすぐは緑の蛍光を放ち、その後オレンジ色の蛍光を放つようになる。しかし、緑色蛍光からオレンジ色蛍光への移行はすばやく完了するために、通常はほとんど見られない。そこで、いろいろな時間経過に伴って緑色蛍光とオレンジ色蛍光の比の異なる蛍光蛋白質を作製した。この変異体を使用することによって蛋白質発現からの時間を緑色蛍光とオレンジ色蛍光の比で測定することができる。また、この変異体は緑色蛍光とオレンジ色蛍光が独立しているために、オレンジ色蛍光のみを消光させることができた。つまり、オレンジ色蛍光のみを消光させて、オレンジ色蛍光の増加を測定すれば、時間経過測定のリセットも可能となる。さらに、同じくオレンジ色のみ任意の部分を消光して、緑色蛍光とオレンジ色蛍光の比で測定すれば消光した部分のラベルした分子や細胞などの挙動を測定することもできる。結果としてわかったことは７０番目のプロリン（Ｐ）をアミノ酸置換することにより、多様な、時間経過に伴って緑色蛍光とオレンジ色蛍光の比の異なる蛍光蛋白質を作製できることであった。
（１）変異導入
ｍＫＯのアミノ酸を置換し、ｍＫＯとは異なった蛍光特性を持つ蛍光蛋白質の作製を行った。点変異導入はｍＫＯを挿入した大腸菌発現ベクター（ｐＲＳＥＴＢ）に点変異導入プライマーをもちいてＰＣＲをかけることにより行った。ＰＣＲに用いたプライマーは５’側のリン酸化を行った。
（ａ）プライマーの５’リン酸化
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ                                                ２μｌ
１０×Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ    ５μｌ
１００μＭ  ＡＴＰ                                                  ０．５μｌ
滅菌水                                                            ４１．５μｌ
Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（１０Ｕ／μｌ）        １μｌ
３７℃で３０分間インキュベートした。
（ｂ）点変異導入ＰＣＲ
５’リン酸化プライマー                                ４μｌ
ｔｅｍｐｌａｔｅ（ｍＫＯ−ｐＲＳＥＴ  Ｂ）        １００ｎｇ
１０×ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ          ２．５μｌ
１０×ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ          ２．５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                １μｌ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｐｆｕ）２．５Ｕ／μｌ          １μｌ
Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ    ４０Ｕ／μｌ      ０．５μｌ
滅菌水で計５０μｌとする。
プログラム
サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ９７００を使用した。
１）６５℃  ５ｍｉｎ
２）９５℃  ２ｍｉｎ
３）９５℃  ２０ｓｅｃ
４）５２℃  ２０ｓｅｃ
５）６５℃  ８ｍｉｎ
６）７５℃  ７ｍｉｎ
７）４℃  ｈｏｌｄ
３）〜５）を２５サイクル
（ｃ）Ｄｐｎ１処理
ＰＣＲ後のサンプルにＤｐｎ１を１μｌ加えて３７℃に１時間インキュベートしてテンプレートプラスミドを切断した。
（ｄ）大腸菌への形質転換
Ｄｐｎ１処理後のサンプルを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）に形質転換して変異導入後のｍＫＯを発現させ解析を行なった。
（２）ｍＫＯ時間経過変異体の解析
作製されたｍＫＯの変異体は塩基配列の解析により、４９番目のリジン（Ｋ）をグルタミン酸（Ｅ）に、７０番目のプロリン（Ｐ）をグリシン（Ｇ）に、１８５番目のリジン（Ｋ）をグルタミン酸（Ｅ）に、１８８番目のリジン（Ｋ）をグルタミン酸（Ｅ）に、１９２番目のセリン（Ｓ）をアスパラギン酸（Ｄ）に、１９６番目のセリン（Ｓ）をグリシン（Ｇ）にアミノ酸置換されていた。このｍＫＯの変異体は時間経過に伴って緑色蛍光とオレンジ色蛍光の比の異なる蛍光蛋白質であった。このｍＫＯの変異体の７０番目のプロリン（Ｐ）をいろいろなアミノ酸に置換することにより、時間経過に伴う緑色蛍光とオレンジ色蛍光の比が変化する速度が変わった。
グリシン（Ｇ）に置換された変異体をｍＫＯ−ＦＭ９とした（アミノ酸配列を配列番号１１に示し、塩基配列を配列番号１２に示す）。
アラニン（Ａ）に置換された変異体をｍＫＯ−ＦＭ５とした（アミノ酸配列を配列番号１３に示し、塩基配列を配列番号１４に示す）。
セリン（Ｓ）に置換された変異体をｍＫＯ−ＦＭ３とした（アミノ酸配列を配列番号１５に示し、塩基配列を配列番号１６に示す）。
システイン（Ｃ）に置換された変異体をｍＫＯ−ＦＭ２０とした（アミノ酸配列を配列番号１７に示し、塩基配列を配列番号１８に示す）。
トレオニン（Ｔ）に置換された変異体をｍＫＯ−ＦＭ２４とした（アミノ酸配列を配列番号１９に示し、塩基配列を配列番号２０に示す）。
バリン（Ｖ）に置換された変異体をｍＫＯ−ＦＭ１４とした（アミノ酸配列を配列番号２１に示し、塩基配列を配列番号２２に示す）。
ロイシン（Ｌ）に置換された変異体をｍＫＯ−ＦＭ１９とした（アミノ酸配列を配列番号２３に示し、塩基配列を配列番号２４に示す）。
チロシン（Ｙ）に置換された変異体をｍＫＯ−ＦＭ２３とした（アミノ酸配列を配列番号２５に示し、塩基配列を配列番号２６に示す）。
グルタミン（Ｑ）に置換された変異体をｍＫＯ−ＦＭ２１とした（アミノ酸配列を配列番号２７に示し、塩基配列を配列番号２８に示す）。
アスパラギン（Ｎ）に置換された変異体をｍＫＯ−ＦＭ２５とした（アミノ酸配列を配列番号２９に示し、塩基配列を配列番号３０に示す）。
それぞれのｍＫＯ時間経過変異体の測定は大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）で発現させたリコンビナント蛍光蛋白質でおこなうか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスレーションシステムＰＵＲＥ  ＳＹＳＴＥＭ  ＣＬＡＳＳＩＣ  ＭＩＮＩ（ポストゲノム研究所）を使用した。大腸菌での測定は各変異体を発現させた培養プレートを３７℃に保温し、時間を追ってサンプリングして５８０ｎｍの励起スペクトルを測定した（図１４、１５）。その結果、緑蛍光の励起ピークである約５００ｎｍのピークにくらべ、オレンジ蛍光の励起ピークである５４８ｎｍのピークが時間により増加し、各変異体によってその増加率は違った。緑蛍光のピークは５０９ｎｍ、オレンジ蛍光のピークは５６０ｎｍであった（図１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２；それぞれカッコ内の波長で励起）。蛍光測定には蛍光分光光度計Ｆ−２５００（ＨＩＴＡＣＨＩ）を使用した。大腸菌内では新たな蛋白質が断続的に生産されるために、緑からオレンジへの推移に必要とされる時間が見かけ上長くなってしまう。そこで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスレーションシステムを使用することによって蛋白質の生産時間を限定し、より正確な時間に伴う緑からオレンジへの推移を測定した。蛋白質合成時間は１時間とした。その直後にＡＴＰなどのタンパク質合成に必要なエネルギー源をゲルろ過で除き、３７℃に保温して合成後２５時間まで５８０ｎｍの励起スペクトルを測定した（図２３、２４、２５、２６、２７、２８）。緑蛍光の励起ピーク部分の５００ｎｍとオレンジ蛍光の励起ピークである５４８ｎｍの値の比をプロットすると、これらが比較的にアミノ酸の側鎖が大きくなるに従い（Ｇ→Ａ→Ｓ→Ｃ→Ｔ→Ｖ→Ｐ）、オレンジ色蛍光成分への推移が速くなる傾向があることが分かった（図２９）。
ｍＫＯ−ＦＭ１４のＮ末端にＴａｕ（チューブリンなどに結合し微小管重合を促進し安定化させる蛋白質）を遺伝子的に繋いだ融合蛋白質遺伝子（アミノ酸配列を配列番号３１に示し、塩基配列を配列番号３２に示す）を動物細胞発現ベクターｐＣＤＮＡ３のＢａｍＨ１−Ｘｈｏ１サイトにサブクローニングした。作製したベクターをＰｏｌｙｆｅｃｔ（キアゲン）を用いてＨｅＬａ−Ｓ３細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入２３時間後に培養液からＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）溶液に置換してイメージングをおこなった。その結果、ＨｅＬａ−Ｓ３細胞がベクターを細胞内に取り込んだ時間差によって、緑色〜オレンジ色まで様々な色調の細胞が観察された。オレンジ色／緑色の比から細胞４と細胞５はベクターを早い時間に細胞内に取り込んで、つづいて細胞１、後に細胞２と細胞３がベクターを細胞内に取り込んでいることが確認できた（図３０）。顕微鏡ＩＸ−７０（ＯＬＹＭＰＵＳ）を用いた。緑色成分検出のために、励起フィルターは４７０ＤＦ３５（ＯＭＥＧＡ）、蛍光フィルターはＨＱ５２５／５０Ｍ（ＣＨＲＯＭＡ）、ダイクロイックミラーは５０５ＤＲＬＰ（ＯＭＥＧＡ）を用いた。オレンジ色成分検出のために、励起フィルターはＨＱ５００／４０Ｘ（ＣＨＲＯＭＡ）、蛍光フィルターはＯＧ５５０（ＯＭＥＧＡ）、ダイクロイックミラーはＱ５３０ＬＰ（ＣＨＲＯＭＡ）を用いた。
（３）ｍＫＯ時間経過変異体による分子の追跡
リコンビナントｍＫＯ−ＦＭ１４蛋白質に強い緑色光を照射して、リコンビナントｍＫＯ−ＦＭ１４蛋白質のオレンジ色蛍光成分のみを退色させることができるかを実験した。１００Ｗのキセノンランプに直接フィルターを装着して、強い緑色光をリコンビナントｍＫＯ−ＦＭ１４蛋白質に照射した。フィルターは５４６ＤＦ２０（ＯＭＥＧＡ）を使用した。コントロールとしてリコンビナントｍＫＯ蛋白質も同時に強い緑色光を照射して、照射前後の吸収スペクトルを測定し、５４８ｎｍの吸収値が低下するかを調べた。吸収測定には分光光度計Ｕ−３３１０（ＨＩＴＡＣＨＩ）を使用した。その結果、コントロールに用いたリコンビナントｍＫＯ蛋白質の５４８ｎｍの吸収値は変化しなかった。それに対してリコンビナントｍＫＯ−ＦＭ１４蛋白質の５４８ｎｍの吸収値は優位に低下した。しかし、緑色蛍光成分を発するのに必要である５００ｎｍの吸収ピークに変化はなかった（図３１、３２）。これは、ｍＫＯ−ＦＭ１４蛋白質に強い緑色光を照射することによって、オレンジ蛍光成分のみを無くす、もしくは低下させることができることを示す。また、ｍＫＯ−ＦＭ１４蛋白質またはｍＫＯ−ＦＭ１４蛋白質を付加したものが満たされた空間において、局所のみの強い緑色光照射によるオレンジ色蛍光の消光または低下により、オレンジ色蛍光シグナルと緑色蛍光シグナルの比を計算すれば、その部位をラベルすることができる。そこでｍＫＯ−ＦＭ１４のＮ末端にＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）を融合した融合蛋白質遺伝子（アミノ酸配列を配列番号３３に示し、塩基配列を配列番号３４に示す）をｐＥＧＦＰ−Ｎ１（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＥＧＦＰ部分を抜き出したものにサブクローニングした。ラット海馬のニューロンに発現させてイメージングを行なった。
ラット海馬のニューロンを用意した。妊娠ラット（１７−１９日目）の胎仔、あるいは生後１−３日目のラットの新生仔より顕微鏡下で海馬（約１０匹分）を摘出した。次いで海馬を消化酵素パパインで十数分間、加温処理を行い、さらにピペットを用いて機械的に分散させ神経細胞に富む海馬細胞懸濁液を得た。必要に応じてこの懸濁液を培地で希釈し、ポリーリジンなどの細胞接着基質をコーティングした直径３５ｍｍの培養皿の表面に播種した。播種密度２−４万細胞／ｃｍ２程度とし、これらの細胞を培養皿の表面に接着させ、牛胎仔血清およびＮ２−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（神経細胞用添加物）を含むイーグル培地を用いて高密度での初代培養を行なった。培養開始後６−７日目の細胞に対して３５ｍｍの培養皿１枚当たり２−４マイクログラムのＤＮＡをリン酸カルシウム法により３７度で３０分間、ＢＤＮＦ−ｍＫＯ−ＦＭ１４発現遺伝子ベクターの導入を行なった。この遺伝子導入の後、約１２時間から２日間に細胞に発現した蛍光タンパクを蛍光顕微鏡で検出し色の変化を追跡する実験に用いた。緑色蛍光シグナル励起には４９０ＤＦ２０（ＯＭＥＧＡ）に１０％減光フィルターを装着したものを、緑色蛍光シグナル検出フィルターは５３５ＤＦ３５（ＯＭＥＧＡ）を用いた。オレンジ色蛍光シグナル励起には５４６ＤＦ１０（ＯＭＥＧＡ）を、オレンジ色蛍光シグナル検出フィルターは５９５ＲＤＦ６０（ＯＭＥＧＡ）を用いた。ダイクロイックミラーは５０５ＤＲＬＰＸＲ（ＯＭＥＧＡ）を使用した。視野絞りを調節して、ラット海馬ニューロンのソーマ部分（細胞体）のみを、５５０ＤＦ３０（ＯＭＥＧＡ）を使用して強い緑色光でオレンジ色蛍光のみを退色させた。オレンジ蛍光シグナル／緑色蛍光シグナルの比（Ｒａｔｉｏ）から計算しソーマから神経突起へのＢＤＮＦ―ｍＫＯ−ＦＭ１４の移動を観察した（図３３、３４）。図３４の白矢印はＢＤＮＦ―ｍＫＯ−ＦＭ１４がソーマ部分から神経突起の先端へ向かって移動している様子を示す。
［実施例７］単量体蛍光蛋白質ｍＫＯと２量体（多量体）蛍光蛋白質ＭｉＣｙを用いたＣａｓｐａｓｅ３活性測定プローブ
分子内ＦＲＥＴを行う際は少なくとも一種は単量体であるべきである。（Ａ）単量体（白）と２量体（黒）の組み合わせ（図３５Ａ）。２量体（多量体）蛍光蛋白質ＭｉＣｙと単量体蛍光蛋白質ｍＫＯの組み合わせはこのパターンとなる。例えば、２量体（白）と２量体（黒）の組み合わせはポリマーのように連なってしまうことが考えられる（図３５Ｂ）。単量体蛍光蛋白質ｍＫＯと２量体蛍光蛋白質ＭｉＣｙはＭｉＣｙの蛍光スペクトルとｍＫＯの吸収スペクトルに重なりがあるため、両者を用いたＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動法）測定が可能である（図３６）。そこで、ＭｉＣｙとｍＫＯをＣａｓｐａｓｅ３の認識配列であるＤＥＶＤ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ）を含んだリンカーでつなぎ（アミノ酸配列を配列番号３５に示し、塩基配列を配列番号３６に示す）、Ｃａｓｐａｓｅ３の活性化に伴うリンカー配列の切断をＦＲＥＴにより測定した。
（１）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣａｓｐａｓｅ３活性測定
ＭｉＣｙ−ｌｉｎｋｅｒ−ｍＫＯの順に繋ぎ、大腸菌発現ベクターｐＲＳＥＴＢのＢａｍＨ１−ＥｃｏＲ１サイトにサブクローニングして大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）に発現させた。リンカーの配列はＧＧＳＧＧＤＥＶＤＧＴＧＧＳ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を用いた。これのコンストラクトをＭｉＣｙ−ＤＥＶＤ−ｍＫＯとした。発現したリコンビナント融合蛋白質はＮｉ−ＮＴＡアガロースで精製した。精製したリコンビナント融合蛋白質をセファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行い１５０ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４溶液にバッファー置換した。活性測定にはリコンビナントＡｃｔｉｖｅ−Ｃａｓｐａｓｅ３（ＭＢＬ：ＢＶ−１０８３−９）を用いた。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＣＨＡＰＳ、１０％  ｓｕｃｒｏｓｅ溶液中に各リコンビナント融合蛋白質を１ｍｇ／ｍｌになるようにして、リコンビナントＡｃｔｉｖｅ−Ｃａｓｐａｓｅ３を１ｕｎｉｔ加えて３０度で３時間反応させた。反応前と反応後の反応液の蛍光スペクトルを４４０ｎｍで励起して測定した。測定には蛍光分光光度計Ｆ−２５００（ＨＩＴＡＣＨＩ）を使用した。その結果、Ｃａｓｐａｓｅ３添加まえはＦＲＥＴがおこってｍＫＯの蛍光ピーク（５５９ｎｍ）が現れているが、添加後にはリンカーの切断によるＦＲＥＴの解消によりｍＫＯの蛍光ピーク（５５９ｎｍ）は消失し、ＭｉＣｙの蛍光ピーク（４９５ｎｍ）のみとなった（図３７）。
（２）ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣａｓｐａｓｅ３活性測定
ＭｉＣｙ−ＤＥＶＤ−ｍＫＯを動物細胞での発現ベクターｐＣＳ２＋のＢａｍＨ１−ＥｃｏＲ１サイトにサブクローニングした。作製したベクターをＰｏｌｙｆｅｃｔ（キアゲン）を用いてＨｅＬａ−Ｓ３細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入２４時間後に培養液から５００ｎｇ／ｍｌ抗Ｆａｓ抗体（ＣＨ−１１：ＭＢＬ）、１０μｇ／ｍｌサイクロヘキシミド、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）溶液に置換してアポトーシスを誘導し、Ｃａｓｐａｓｅ３活性測定のイメージングをおこなった。
顕微鏡はＩＸ−７０（ＯＬＹＭＰＵＳ）を用いた。励起フィルターは４４０ＡＦ２１（ＯＭＥＧＡ）、ダイクロイックミラーは４５５ＤＲＬＰ（ＯＭＥＧＡ）を用いた。蛍光シグナルの検出は４８０ＡＬＰ（ＯＭＥＧＡ）のフィルターを通してカラー３ＣＣＤカメラＡＳＨＵＲＡ（浜松ホトニクス）で行い、ＧｒｅｅｎチャンネルでＭｉＣｙの蛍光シグナルを、ＲｅｄチャンネルでｍＫＯの蛍光シグナルを検出した。その結果、ＨｅＬａ細胞でのアポトーシスに伴い、Ｃａｓｐａｓｅ３が活性化されて導入遺伝子の翻訳産物のリンカーが切断され、ＦＲＥＴが解消してＲｅｄチャンネルのシグナルが低下し、Ｇｒｅｅｎチャンネルのシグナルが上昇する現象が観察された。Ｒｅｄ／ＧｒｅｅｎのＲａｔｉｏ（比）はＣａｓｐａｓｅ３の活性化に伴い低下した。また、ＨｅＬａ細胞のアポトーシスによる形態変化も観察された（図３８）。
［実施例８］イシサンゴからの新規色素蛋白遺伝子の単離、新規蛍光蛋白の作製、及び特性解析
（１）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出
珊瑚より色素蛋白質の遺伝子の単離を行った。材料にはコモンサンゴ（Ｍｏｎｔｉｐｏｒａ．ｓｐ）を用いた。凍結したコモンサンゴを乳鉢で砕き、湿重量１グラムに”ＴＲＩｚｏｌ”（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を７．５ｍｌ加えてホモジナイズし、１５００×ｇで１０分間遠心した。上清にクロロホルム１．５ｍｌを加え、１５秒間攪拌した後、３分間静置した。７５００×ｇで１５分間遠心した。上清にイソプロパノール３．７５ｍｌを加え、１５秒間攪拌した後、１０分間静置した。１７０００×ｇで１０分間遠心した。上清を捨て７０％エタノールを６ｍｌ加えて１７０００×ｇで１０分間遠心した。上清を捨て、沈殿をＤＥＰＣ水２００μｌで溶解した。ＤＥＰＣ水で溶解したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを１００倍に希釈して、Ｏ．Ｄ．２６０とＯ．Ｄ．２８０の値を測定してＲＮＡ濃度を測った。５３μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。
（２）Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ４μｇを使用し、Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成キット”Ｒｅａｄｙ  Ｔｏ  Ｇｏ”（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によりｃＤＮＡ（３３μｌ）を合成した。
（３）Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲ
合成したＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ（３３μｌ）のうち３μｌを鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーのデザインは既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。
使用プライマー
0004709653.tif 000018
Ｉはイノシン、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、ＶはＡ，Ｃ又はＧ、ＤはＡ，Ｇ又はＴ  ＳはＣ又はＧ、ＨはＡ，Ｔ又はＣを示す。
ＰＣＲ反応液組成
テンプレート（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）        ３μｌ
Ｘ１０  ｔａｑバッファー                                  ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                    ４μｌ
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ１                                １μｌ
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ２                                １μｌ
ミリＱ                                                  ３５μｌ
ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／ｕｌ）                １μｌ
ＰＣＲ反応条件
９４℃  １分（ＰＡＤ）
９４℃  ３０秒（変性）
５２℃  ３０秒（鋳型へのプライマーのアニーリング）
７２℃  １分（プライマーの伸長）
上記３ステップを３５サイクル行った。
７２℃  ７分（最後の伸長）
４℃  保持
一回目のＰＣＲ反応で得られた増幅産物１μｌをテンプレートとして、もう一度同じ条件でＰＣＲを行った。アガロースゲル電気泳動で、３５０ｂｐを切り出し、精製した。
（４）サブクローニング及び塩基配列の決定
精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してそのＤＮＡ塩基配列が蛍光蛋白由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、５’−ＲＡＣＥ法および３’−ＲＡＣＥ法による遺伝子全長のクローニングを行った。
（５）５’−ＲＡＣＥ法
Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片の５’側の塩基配列を決定するために５’−ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて、５’−ＲＡＣＥ法を行った。鋳型として（１）で調整したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを５μｇ使用した。
ｄＣ−ｔａｉｌｅｄ  ｃＤＮＡの一回目の増幅には
0004709653.tif 000019
のプライマーを用いた。
Ｉはイノシンを示す。
二回目の増幅には
0004709653.tif 000020
のプライマーを用いた。ＰＣＲ反応条件等はキットのプロトコールに準じた。
アガロースゲル電気泳動で、増幅された３５０ｂｐのバンドを切り出し、精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。
（６）３’−ＲＡＣＥ法
Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片の３’側部分は、（４）の塩基配列決定で得られた情報を基に作製したプライマーとオリゴｄＴプライマーのＰＣＲで得た。鋳型として（２）で調整したｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを３μｌ使用した。
作成したプライマーは、
0004709653.tif 000021
ＰＣＲ反応液組成
テンプレート（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）      ３μｌ
Ｘ１０  ｔａｑバッファー                                ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                  ４μｌ
２０μＭ  ｐｒｉｍｅｒ７                                １μｌ
１０μＭ  オリゴｄＴｐｒｉｍｅｒ                        １μｌ
ミリＱ                                                ３５μｌ
ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）              １μｌ
ＰＣＲ反応条件
９４℃  １ｍｉｎ（ＰＡＤ）
９４℃  ３０ｓｅｃ（変性）
５２℃  ３０ｓｅｃ（鋳型へのプライマーのアニーリング）
７２℃  １ｍｉｎ（プライマーの伸長）
上記３ステップを３０サイクル行った。
７２℃  ７ｍｉｎ（最後の伸長）
４℃  保持
アガロースゲル電気泳動で、増幅された約６５０ｂｐのバンドを切り出し、精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。
（７）大腸菌での蛋白発現
得られた全長の塩基配列より、蛋白のＮ末端に相当する部分でプライマーを作製し、Ｃ末端側はオリゴｄＴプライマーを使用して、（２）で調整したＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。全アミノ酸配列および全塩基配列を配列表の配列番号３７及び３８に示す。配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をＣＯＣＰと称する。
使用プライマー
0004709653.tif 000022
ＰＣＲ反応液組成
テンプレート（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）        ３μｌ
Ｘ１０  ｐｙｒｏｂｅｓｔバッファー                        ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                    ４μｌ
１００ｕＭ  ｐｒｉｍｅｒ８                                １μｌ
１００ｕＭ  オリゴｄＴプライマー                          １μｌ
ミリＱ                                                  ３５μｌ
ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）      １μｌ
ＰＣＲ反応条件
９４℃  １ｍｉｎ（ＰＡＤ）
９４℃  ３０ｓｅｃ（変性）
５２℃  ３０ｓｅｃ（鋳型へのプライマーのアニーリング）
７２℃  １ｍｉｎ（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行った。
７２℃  ７ｍｉｎ（最後の伸長）
４℃  保持
アガロースゲルの電気泳動で、増幅された約８００ｂｐのバンドを切り出し、精製してｐＲＳＥＴ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングして、大腸菌株（ＪＭ１０９−ＤＥ３）で発現させた。発現蛋白はＮ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付くようにコンストラクトしたので発現蛋白はＮｉ−Ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。次に精製した蛋白の性質を解析した。
（８）光吸収特性の解析
２０μＭ色素蛋白、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９溶液を用いて吸収スペクトルを測定した。このスペクトルのピークの値よりモル吸光係数を計算した。コモンサンゴ由来色素蛋白（ＣＯＣＰ）では５７６ｎｍに吸収のピークが認められた（表２、図３９）。また、ｐＨ４〜１０で安定していた。（図４０）
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（９）色素蛋白質から蛍光蛋白質への改変
ＣＯＣＰは蛍光蛋白質ではない。しかしＣＯＣＰの１番目のメチオニンと２番目のセリンの間にバリンを挿入し、９４番目のヒスチジンをアスパラギンに、１４２番目のアスパラギンをセリンに、１５７番目のアスパラギンをアスパラギン酸に、２０２番目のリジンをアルギニンに、２０６番目のフェニルアラニンをセリンに置き換えることにより蛍光性を獲得した。この改変蛍光蛋白質をＣＯＣＰ−ＦＬとした（アミノ酸配列を配列番号３９に示し、塩基配列を配列番号４０に示す）。ＣＯＣＰ−ＦＬは５６０ｎｍに励起のピークを持つ。この励起によって蛍光スペクトルは６００ｎｍにピークを示す。
（１０）ストークスシフトの大きな赤色蛍光蛋白質の作製
ＣＯＣＰ−ＦＬの６２番目のセリンをフェニルアラニンに、９３番目のイソロイシンをトレオニンに、１２４番目のバリンをトレオニンに、１５９番目のフェニルアラニンをチロシンに、１９２番目のバリンをイソロイシンに、２１４番目のセリンをアラニンに置き換えることによりＣＯＣＰ−ＦＬとは異なる蛍光をもつ蛋白質を獲得した。この改変蛍光蛋白質をｋｅｉｍａ６１６（アミノ酸配列を配列番号４１に示し、塩基配列を配列番号４２に示す）とした。４４０ｎｍに励起のピークをもち、この励起によって蛍光スペクトルは６１６ｎｍにピークを持つ（図４１、表２）。ストークスシフトは１７６ｎｍと非常に大きな値である。従来の蛍光蛋白質に比べ励起波長域と蛍光波長域を大きくとることができ、蛍光測定時に効率よく測定できる。また、同時多色蛍光測定も可能である。同一励起波長をもつ蛍光色素を用いることによりレーザーなど単一波長での励起による二つの波長での測光ができる。いままでの蛍光蛋白では同じ励起スペクトルをもつ蛋白がないためできなかったことで、これらの蛋白を用いることで励起のちがいによる測定のぶれという問題を解決できる。
（１１）ストークスシフトの大きな橙色蛍光蛋白質の作製
Ｋｅｉｍａ６１６の６２番目のフェニルアラニンをメチオニンに、６３番目のグルタミンをシステインに置き換えることにより蛍光蛋白質を獲得した。この改変蛍光蛋白質をＫｅｉｍａ５７０（アミノ酸配列を配列番号４３に示し、塩基配列を配列番号４４に示す）とした。このＫｅｉｍａ５７０はＫｅｉｍａ６１６と同様４４０ｎｍに励起のピークを持ち、この励起により５７０ｎｍの蛍光のピークを示す（図４２）。ストークスシフトは１３０ｎｍと大きな値である。従来の蛍光蛋白質に比べ励起波長域と蛍光波長域を大きくとることができ、蛍光測定時に効率よく測定できる。また、同時多色蛍光測定も可能である。同一励起波長をもつ蛍光色素を用いることによりレーザーなど単一波長での励起による二つの波長での測光ができる。いままでの蛍光蛋白では同じ励起スペクトルをもつ蛋白がないためできなかったことで、これらの蛋白を用いることで励起のちがいによる測定のぶれという問題を解決できる。
（１２）ｐＨ感受性の測定
５０ｍＭの下記の緩衝液中で蛋白質（Ｋｅｉｍａ６１６及びＫｅｉｍａ５７０）の吸収スペクトルを測定した（図４３及び４４）。
各ｐＨの緩衝液は次の通り、
ｐＨ４、５、５．５  ：  酢酸バッファー
ｐＨ６  ：  リン酸バッファー
ｐＨ６．６  ：  ＭＯＰＳバッファー
ｐＨ７、７．５、８  ：  ＨＥＰＥＳバッファー
ｐＨ９、１０  ：  グリシンバッファー
ｐＨ７．５〜１０でピークの値は安定していた。（図４３及び図４４）
［実施例９］
（１）ストークスシフトの大きな単量体赤色蛍光蛋白質の作製
ｋｅｉｍ６１６の６１番目のロイシンをグルタミンに、９３番目のトレオニンをセリンに、１２４番目のトレオニンをグルタミン酸に、１８９番目のチロシンをアルギニンに、１９１番目のチロシンをグルタミン酸に置き換えることにより超遠心分子量測定により分子量３０．１ｋＤａの結果から、アミノ酸配列から予想されるおよそ２９ｋＤａとほぼ一致することから単量体となったｋｅｉｍａ６１６蛋白を獲得した。本改変蛍光蛋白質をｃｍｋｅｉｍａ６２０とした（図４５）（アミノ酸配列を配列表の配列番号４５に示し、塩基配列を配列番号４６に示す）。４４０ｎｍに励起のピークをもち、この励起によって蛍光スペクトルは６２０ｎｍにピークを持つ（図４６）。ストークスシフトは１８０ｎｍと非常に大きな値である。従来の蛍光蛋白質に比べ励起波長域と蛍光波長域を大きくとることができ、蛍光測定時に効率よく測定できる。また、同時多色蛍光測定も可能である。同一励起波長をもつ蛍光色素を用いることによりレーザーなど単一波長での励起による二つの波長での測光ができる。いままでの蛍光蛋白では同じ励起スペクトルをもつ蛋白がないため出来なかったことで、これらの蛋白を用いることで励起のちがいによる測定のぶれという問題を解決できる。また、全体の分子量をおさえ且つ蛍光蛋白質自身の間で多量体形成による相互作用がないため、ラベル分子の性質変化を最小限にとどめることができる。
（２）ストークスシフトの大きな単量体赤色蛍光蛋白質の改良
ｃｍｋｅｉｍ６１６の６２番目のフェニルアラニンをロイシンに置き換えることによりｃｍｋｅｉｍａ６２０のフォールディング効率が上昇したものを得た。本改変蛍光蛋白質をｍｋｅｉｍａ６２０とした（アミノ酸配列を配列表の配列番号４７に示し、塩基配列を配列番号４８に示す）。４４０ｎｍに励起のピークをもち、この励起によって蛍光スペクトルは６２０ｎｍにピークを持つ。ストークスシフトは１８０ｎｍと非常に大きな値である。ｃｍｋｅｉｍａ６２０よりも相対的な蛍光強度が高いため（図４６、４７）、単量体でもｋｅｉｍａ６１６と同様に十分使いやすくなっている。
［実施例１０］ストークスシフトの大きな蛋白質を用いた一波長励起二波長測光型蛍光相互相関分光法の測定系の開発
分子間相互作用を測定するための手法として、蛍光分子を利用した蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）がある。これは２つの蛍光分子をプローブとして用いることにより分子間相互作用をモニタリングできる。
現在用いられている２つの異なる蛍光分子を用いた２波長励起ＦＣＣＳ測定において相互相関の感度を下げる大きな要員として色収差による２波長の測定領域の重なりのずれがあげられる。Ｋｅｉｍａ６１６とＥＣＦＰのような一つの波長で励起できしかも蛍光が分離できる蛍光蛋白質の組み合わせを用いた一波長励起ＦＣＣＳではこれを回避する事ができるため、ＦＣＣＳ測定の感度の上昇が期待される（図４８）。また、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ）を回避できるため、ＦＣＣＳでの測定が簡便化され、蛋白質間相互作用のＦＣＣＳによる検出に適している。従ってストークスシフトが大きい蛍光蛋白質であるｋｅｉｍａ６１６を用いることによりＦＣＣＳによる蛋白質間相互作用の検出が簡便かつ強力なものになると思われる。
（１）Ｃａｓｐａｓｅ−３の活性検出
（ａ）蛍光相互相関測定における装置
蛍光相互相関測定にはＴＣＳ  ＳＰ２  ＳＯＢＳ（Ｌｅｉｃａ）とＦＣＣＳシステムを用いた。ＥＧＦＰ−（スペーサー）ＤＥＶＤ−ｍＲＦＰ１には、４５８ｎｍ  Ａｒｇｏｎ  ｉｏｎ  Ｌａｓｅｒと５９４ｎｍ  ＨｅＮｅ  Ｌａｓｅｒを用いて２波長励起を行なった。またＥＣＦＰとＫｅｉｍａ６１６の組み合わせの蛋白質には４５８ｎｍ  Ａｒｇｏｎ  Ｌａｓｅｒを用いた。受光用バンドパスフィルタはＥＧＦＰ：５００−５５０、ｍＲＦＰ１：６０７−６８３を、ＥＣＦＰ：４７０−５００、ｋｅｉｍａ６１６：５３５−５８５を用いた。
（ｂ）蛍光相互相関測定の解析
Ｃａｓｐａｓｅ−３により切断されるアミノ酸配列ＤＥＶＤをＥＧＦＰとｍＲＦＰの間、ｋｅｉｍａ６１６とＥＣＦＰの間に導入し（図４９）、リコンビナントＥＧＦＰ−ＤＥＶＤｍＲＦＰ１（ｘ２）（アミノ酸配列を配列表の配列番号４９に示し、塩基配列を配列番号５０に示す）、ＥＣＦＰ−（スペーサー）ＤＥＶＤ−ｋｅｉｍａ６１６（アミノ酸配列を配列表の配列番号５１に示し、塩基配列を配列番号５２に示す）、ｋｅｉｍａ６１６−（スペーサー）ＤＥＶＤ−ＥＣＦＰ（アミノ酸配列を配列表の配列番号５３に示し、塩基配列を配列番号５４に示す）を作製した。発現蛋白質はＮ末端にＨｉｓ−ｔａｇがつくようにコンストラクトしたので発現蛋白質はＮｉ−Ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製方法は付属のプロトコールに準じた。次にそれらの蛋白質を用いて相関作用を解析した。
相互相関の定量的な評価は、ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｍｐｌｉｔｕｄｅという相互相関関数の振幅（Ｇｃｒｏｓｓ（０））を自己相関関数の振幅（Ｇｌｏｗｅｒ（０））で割算した値を用いた。ＥＧＦＰ−ＤＥＶＤ−ｍＲＦＰ１（ｘ２）では、Ｇｃｒｏｓｓ（０）／Ｇｌｏｗｅｒ（０）は約０．４であった（図５１）。Ｃａｓｐａｓｅ−３の添加によりＧｃｒｏｓｓ（０）の減少が観られた（図５０）。
ＥＣＦＰとｋｅｉｍａ６１６の組み合わせではＧｃｒｏｓｓ（０）／Ｇｌｏｗｅｒ（０）は０．４であった（図５１）。Ｃａｓｐａｓｅ−３の添加によりＧｃｒｏｓｓ（０）の迅速な減少が見られた。Ｇｃｒｏｓｓ（０）の減少はＣａｓｐａｓｅ−３添加により蛍光相関が無くなっていることを示している。ＥＧＦＰ−ＤＥＶＤ−ｍＲＦＰよりもＥＣＦＰとＫｅｉｍａ６１６を組み合わせた蛋白質がより短時間で相関が無くなっておりこれにより後者の組み合わせがより蛍光相互相関法により簡便かつ迅速に蛋白質の相互作用を示すことが明らかになった。
（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる蛋白質間相互作用の解析
ｋｅｉｍａ６１６−ＤＥＶＤ−ＥＣＦＰをＣａｓｐａｓｅ−３で反応させるとｋｅｉｍａ６１６とＥＣＦＰの大きさのバンドが確認出来た。これらの蛋白質はＣａｓｐａｓｅ−３によってＤＥＶＤが切断されたことを意味する（図５２）。Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにおいても同様に反応後に２つのバンドが確認され、それぞれがｋｅｉｍａ６１６とＥＣＦＰであることが同定され、蛍光検出でもＣａｓｐａｓｅ−３の活性があることが検出できた（図５２）。
（２）カルモジュリンとの相互作用
（ａ）蛋白質の合成・発現
カルモジュリンにはＥＣＦＰを、Ｍ１３にはＫｅｉｍａ６１６を繋いだ（図５３）。ＥＣＦＰ−カルモジュリンのアミノ酸配列を配列番号５５に示し、塩基配列を配列番号５６に示す。また、Ｍ１３−Ｋｅｉｍａ６１６のアミノ酸配列を配列番号５７に示し、塩基配列を配列番号５８に示す。それらの融合蛋白質は大腸菌株（ＪＭ１０９−ＤＥ３）で発現させた。発現蛋白はＮ末端にＨｉｓ−ｔａｇがつくようにコンストラクトしたので発現蛋白はＮｉ−Ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製方法は付属のプロトコールに準じた。次にそれらの蛋白質を用いて相関作用を解析した。
（ｂ）蛍光相互相関測定における装置
蛍光相互相関測定にはＣｏｎｆｏＣｏｒ２（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）とＬＳＭ５１０  ｖｅｒｓｉｏｎ３．２を用いた。４５８ｎｍ  Ａｒｇｏｎ  ｉｏｎ  Ｌａｓｅｒを用いた。受光用バンドパスフィルタはＥＣＦＰ：４７５−５２５、Ｋｅｉｍａ６１６：ＬＰ６１０を用いた。
（ｃ）蛍光相互相関測定の解析
相互相関の定量的な評価は、ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｍｐｌｉｔｕｄｅという相互相関関数の振幅（Ｇｃｒｏｓｓ（０））を自己相関関数の振幅（Ｇｌｏｗｅｒ（０））で割算した値を用いた。ＥＧＴＡによりカルシウムイオンをキレートしたサンプルではＧｃｒｏｓｓ（０）／Ｇｌｏｗｅｒ（０）は約０．００５であった（図５４）。しかしカルシウムイオンの添加によりＧｃｒｏｓｓ（０）の値の上昇が確認できた（図５５）。この結果はカルシウム依存的な蛋白質の相互作用を検出したことを示している。これにより蛍光相互相関法により蛋白間相互作用が迅速且つ簡便に測定できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】  本発明により、単量体で存在することができる新規な蛍光蛋白質（ｍＫＯ）が提供されることになった。二量体の蛍光蛋白質ＫＯによるＨｅＬａ細胞でのミトコンドリアラベルにおいて、ミトコンドリアが粒々にラベルされ、本来のミトコンドリア像は得られない。しかし、単量体の蛍光蛋白質ｍＫＯでミトコンドリアをラベルした場合には正常な細長いひも状のミトコンドリア像が得られ、ダイナミックなミトコンドリアの動きも観察される。このような単量体化による有効性がミトコンドリア分子のラベルにより確認された。
また本発明の蛍光蛋白質（ｋｅｉｍａ６１６，ｋｅｉｍａ５７０）は、赤色、橙色の蛍光を放ち、励起のピークが４４０ｎｍ（青色）である。ストークスシフト（励起のピーク値と蛍光のピーク値の差）は従来の赤色蛍光蛋白質（ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ）では２０ｎｍ〜３０ｎｍであるのに対し、本発明の赤色蛍光蛋白質が１７６ｎｍ、橙色蛍光蛋白質が１３０ｎｍと非常に大きい。故に本発明の蛍光蛋白質は最大の励起で最大の蛍光を得ることができることを特徴とする。また、励起のピークが４４０ｎｍであるため、青緑蛍光蛋白質（ＣＦＰ）や緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との同時励起染色において両者の蛍光を非常に有効に取得することが可能である。さらに従来の赤色蛍光蛋白質の励起ピークが５６０ｎｍから５９０ｎｍであるのに対し、本発明の蛍光蛋白質は励起のピークが４４０ｎｍであるので、励起光を変えて従来の赤色蛍光蛋白質と同時に染色することも可能とした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【配列表】
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