(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドグルカナーゼ活性を有し、且つＮ末端がピログルタミン酸でないタンパク質が、ファミリー４５に属するセルラーゼであって、前記タンパク質を、Ｎ末端がピログルタミン酸であるタンパク質に改変することを特徴とする、界面活性剤存在下でのエンドグルカナーゼ活性の低下を抑制する方法。
【請求項２】
エンドグルカナーゼ活性を有し、且つＮ末端がピログルタミン酸でないタンパク質のＮ末端に、ピログルタミン酸、グルタミン酸、若しくはグルタミンを付加するか、又はピログルタミン酸、グルタミン酸、若しくはグルタミンをＮ末端に含むペプチドを付加することにより、タンパク質の改変を実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エンドグルカナーゼ活性を有し、且つＮ末端がピログルタミン酸でないタンパク質のＮ末端アミノ酸、又はＮ末端領域を、ピログルタミン酸、グルタミン酸、若しくはグルタミンで置換するか、又はピログルタミン酸、グルタミン酸、若しくはグルタミンをＮ末端に含むペプチドで置換することにより、タンパク質の改変を実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ファミリー４５に属するセルラーゼが、ＮＣＥ４又はＳＴＣＥ１である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
エンドグルカナーゼ活性を有し、且つアミノ酸改変によりＮ末端がピログルタミン酸に改変された、改変タンパク質であって、ファミリー４５に属するセルラーゼである、前記改変タンパク質。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法により得ることのできる、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
下記からなる群より選択され、Ｎ末端がピログルタミン酸である、タンパク質：
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号３８、又は配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号３８、又は配列番号４０で表されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ界面活性剤存在下で活性低下の少ないエンドグルカナーゼ活性を有する改変タンパク質、及び
（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号３８、又は配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ界面活性剤存在下で活性低下の少ないエンドグルカナーゼ活性を有する相同タンパク質。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記タンパク質のＮ末端のピログルタミン酸に対応するコドンが、ピログルタミン酸化可能なグルタミン酸又はグルタミンをコードするコドンである、前記ポリヌクレオチド。
【請求項９】
下記からなる群より選択され、下記塩基配列でコードされる成熟タンパク質のＮ末端のアミノ酸が、ピログルタミン酸化可能なグルタミン酸又はグルタミンである、ポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号３７、又は配列番号３９で表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号３７、又は配列番号３９で表わされる塩基配列において、１〜９０個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列を含み、且つ界面活性剤存在下で活性低下の少ないエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号３７、又は配列番号３９で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ界面活性剤存在下で活性低下の少ないエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターにより形質転換された、宿主細胞。
【請求項１２】
宿主が、酵母又は糸状菌である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
糸状菌が、フミコーラ属又はトリコデルマ属に属する微生物である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
糸状菌が、フミコーラ・インソレンス又はトリコデルマ・ビリデである、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する工程、及び前記培養によって得られる宿主細胞又はその培養物から請求項５〜７のいずれか一項に記載のタンパク質を採取する工程を含む、前記タンパク質の製造方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の製造方法で生産されたタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質（特には、ファミリー４５に属するエンドグルカナーゼ活性を有するセルラーゼ）のＮ末端をピログルタミン酸に改変し、界面活性剤存在下でエンドグルカナーゼ活性の低下が少ないセルラーゼに変換する方法及びそのセルラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロース系バイオマスは天然に最も多く存在する資源であるといわれている。よってこれを分解するセルラーゼ系を効率良く利用することは様々な分野で嘱望されている。この過程で、様々なセルラーゼが精製され、その特性が解明されてきた。更に、様々なセルラーゼがクローニングされ、その配列の相同性を解析し、ファミリー分類がなされるまでに到っている（非特許文献１参照）。
一方、セルラーゼはその特性を活かしてさまざまな産業分野で利用されているが、繊維加工分野での利用は重要である。例えば、セルロース含有繊維の肌ざわり及び／又は外観を改善するため、又は着色されたセルロース含有繊維に色の局所的な変化を提供する「ストーンウォッシュ」様外観を与える「バイオウオッシュ」のためにセルラーゼが使用されている。また、近年その強度や吸水性などの性質、更には環境汚染を起こしにくい製造法から注目を集めている木材パルプ由来の再生セルロース系繊維であるリヨセルを、製造工程で発生する織物表面の毛羽を除く加工にセルラーゼが用いられている。【０００３】
これまで、セルラーゼは複数の酵素の共同作用、即ちシナジー効果によりセルロースを分解するとされてきた。この複合酵素系のセルラーゼ群には、繊維強度を低下させるなど繊維加工分野では好ましくない性質を有する酵素系も含まれる。そこで、タンパク質分離技術や遺伝子工学的手法を用いて、これらセルラーゼ群から、繊維加工に適した酵素成分を分離し製造する試みがなされている。とりわけ、糸状菌のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属由来のセルラーゼについては研究が進み、フミコーラ属では、ＣＢＨ  Ｉ、ＥＧ  Ｖ（特許文献１参照）、ＮＣＥ２、ＮＣＥ４、ＮＣＥ５などが、トリコデルマ属では、ＣＢＨ  Ｉ、ＣＢＨ  ＩＩ、ＥＧ  ＩＩ、ＥＧ  ＩＩＩなどの成分が単離され、遺伝子操作によって過剰発現酵素やモノコンポーネント酵素などを調製することにより、各用途に適した特定セルラーゼ成分を多量に含むセルラーゼ調製物が製造されるようになってきた。更に、ＮＣＥ４（特許文献２参照）、ＮＣＥ５（特許文献３参照）、ＲＣＥ１（特許文献４参照）、ＳＴＣＥ１（国際出願第ＰＣＴ／ＪＰ２００４／１５７３３号明細書参照）などファミリー４５に属するセルラーゼが上述した分野において非常に有用であることも明らかとなっている。【０００４】
一方、セルラーゼを衣料用洗浄剤用途に用いる場合には、必要なセルラーゼ成分を量的に改善するだけでなく質的に改善することが望まれている。即ち、衣料用洗浄剤には各種界面活性剤が配合されているとともに、これを水に溶解した場合アルカリ性（ｐＨ１０〜１１）を示すことから、衣料用洗浄剤に配合されるセルラーゼの性質としてアルカリ条件下で各種界面活性剤に対して耐性を示すことが求められている。これまで、界面活性剤存在下での活性低下を抑制する例としては、Ｏｔｚｅｎ，Ｄ．Ｅ．らは、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来Ｃｅｌ４５の内部アミノ酸配列に変異を導入し、ｐＨ７の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸（ＬＡＳ）存在下での活性が約３．３倍に向上していると報告している（非特許文献２参照）。しかしながら、本変異により付与される界面活性剤存在下での活性低下の抑制は、Ｃｅｌ４５又はその相同体に限定され、Ｃｅｌ４５と相同性の低いファミリー４５に属するエンドグルカナーゼには適用できないことが明らかとなっている。【０００５】
【特許文献１】国際公開第９１／１７２４３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９８／０３６６７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０１／９０３７５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第００／２４８７９号パンフレット
【非特許文献１】Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ  Ｂ．，  Ｂａｉｒｏｃｈ  Ａ．  Ｕｐｄａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３１６：６９５−６９６（１９９６）
【非特許文献２】Ｄａｎｉｅｌ  Ｅ．  Ｏｔｚｅｎ，  Ｌａｒｓ  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，  Ｍａｒｔｉｎ  Ｓｃｈｕｌｅｉｎ．  Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  Ｃｅｌ４５  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ  ｉｎ  ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ８：１８７８−１８８７（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質、特には、ファミリー４５に属するエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を界面活性剤存在下で活性低下の少ないタンパク質に変換する方法、その方法に使用するベクター、界面活性剤存在下で活性の低下が少ないエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質、それをコードするポリヌクレオチドなどの提供を目的としている。更に、それらを用いることにより、衣料用洗浄用酵素として利用することのできるタンパク質を効率よく生産する微生物の提供を目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った。その結果、ファミリー４５に属するエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質のＮ末端側にピログルタミン酸（以下、ｐＱの略称を用いることがある）又はピログルタミン酸を含むペプチドを付加したタンパク質、すなわちＮ末端付加型セルラーゼが、その天然型セルラーゼと比較し、界面活性剤存在下でエンドグルカナーゼ活性が明らかに低下しないことを見出した。【０００８】
アニオン系界面活性剤存在下で高いエンドグルカナーゼ活性が保持されるという性質は、衣料用洗浄用酵素として特に有用であり、このようなセルラーゼに関する知見は今までに全くなかった。また、ピログルタミン酸又はピログルタミン酸を含むペプチドを付加することによって、界面活性剤存在下で、酵素に本来備わる機能の低下を防ぐことが可能であるとの知見もこれまでに報告されていなかった。【０００９】
本発明の別の態様としては、界面活性剤存在下で活性を低下させたくない全てのＮ末端アミノ基が保護されていないセルラーゼに、ピログルタミン酸又はピログルタミン酸を含むペプチドを付加することにより、界面活性剤存在下での活性の低下を抑制することが可能となる。ピログルタミン酸又はピログルタミン酸を含むペプチドを付加できるセルラーゼは特に限定されることはなく、例えば、ファミリー４５に属するセルラーゼが好ましい。【００１０】
従って、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）エンドグルカナーゼ活性を有し、且つＮ末端がピログルタミン酸でないタンパク質を、Ｎ末端がピログルタミン酸であるタンパク質に改変することを特徴とする、界面活性剤存在下でのエンドグルカナーゼ活性の低下を抑制する方法。
（２）エンドグルカナーゼ活性を有し、且つＮ末端がピログルタミン酸でないタンパク質のＮ末端に、ピログルタミン酸、若しくはピログルタミン酸化可能なアミノ酸、又はピログルタミン酸若しくはピログルタミン酸化可能なアミノ酸をＮ末端に含むペプチドを付加することにより、タンパク質の改変を実施する、前記（１）に記載の方法。
（３）エンドグルカナーゼ活性を有し、且つＮ末端がピログルタミン酸でないタンパク質のＮ末端アミノ酸、又はそれを含む領域を、ピログルタミン酸、若しくはピログルタミン酸化可能なアミノ酸、又はピログルタミン酸若しくはピログルタミン酸化可能なアミノ酸をＮ末端に含むペプチドで置換することにより、タンパク質の改変を実施する、前記（１）に記載の方法。
（４）エンドグルカナーゼ活性を有し、且つＮ末端がピログルタミン酸でないタンパク質が、ファミリー４５に属するセルラーゼである、前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の方法。
（５）エンドグルカナーゼ活性を有し、且つアミノ酸改変によりＮ末端がピログルタミン酸に改変された、改変タンパク質。
（６）前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の方法により得ることのできる、前記（５）に記載のタンパク質。
（７）下記からなる群より選択される、タンパク質：
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号３８、又は配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号３８、又は配列番号４０で表されるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ界面活性剤存在下で活性低下の少ないエンドグルカナーゼ活性を有する改変タンパク質、及び
（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号３８、又は配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、且つ界面活性剤存在下で活性低下の少ないエンドグルカナーゼ活性を有する相同タンパク質。
（８）前記（５）〜（７）のいずれか一つに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（９）下記からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号３７、又は配列番号３９で表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号３７、又は配列番号３９で表わされる塩基配列において、１個又は複数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列を含み、且つ界面活性剤存在下で活性低下の少ないエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号３７、又は配列番号３９で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ界面活性剤存在下で活性低下の少ないエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１０）前記（８）又は（９）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（１１）前記（１０）に記載の発現ベクターにより形質転換された、宿主細胞。
（１２）宿主が、酵母又は糸状菌である、前記（１１）に記載の宿主細胞。
（１３）糸状菌が、フミコーラ属又はトリコデルマ属に属する微生物である、前記（１２）に記載の宿主細胞。
（１４）糸状菌が、フミコーラ・インソレンス又はトリコデルマ・ビリデである、前記（１３）に記載の宿主細胞。
（１５）前記（１１）〜（１４）のいずれか一つに記載の宿主細胞を培養する工程、及び前記培養によって得られる宿主細胞又はその培養物から前記（５）〜（７）のいずれか一つに記載のタンパク質を採取する工程を含む、前記タンパク質の製造方法。
（１６）前記（１５）に記載の製造方法で生産されたタンパク質。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、衣料用洗浄用酵素として利用することのできる従来にない界面活性剤存在下でのエンドグルカナーゼ活性の低下が少ないセルラーゼを効率よく生産することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
ファミリー４５に属するエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質（以下、単に「ファミリー４５に属するセルラーゼ」と略記することもある）
ファミリー４５
本明細書における「ファミリー４５」とは、Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ  Ｂ．らによる糖質活性化酵素（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）の疎水性クラスター解析（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ）によりファミリー４５に分類されたものをいう［Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ  Ｂ．，Ｂａｉｒｏｃｈ  Ａ．  Ｕｐｄａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１６：６９５−６９６（１９９６）．］。【００１３】
エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質
本明細書における「エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質」とは、エンドグルカナーゼ活性を示す酵素、すなわちエンド−１，４−β−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）を意味し、前記酵素は、β−１，４−グルカンのβ−１，４−グルコピラノシル結合を加水分解する。【００１４】
界面活性剤
本明細書における「界面活性剤」とは、衣料用洗浄剤に配合される洗浄成分であり、アニオン系、カチオン系及びノニオン系界面活性剤に大別されるが、アニオン系界面活性剤が主に用いられている。本発明の好適な例としては、アニオン系界面活性剤として直鎖アルキルベンゼンスルホン酸（以下、単に「ＬＡＳ」と略記することもある）を挙げることができる。【００１５】
エンドグルカナーゼ（ＥＧＵ）活性
本明細書における「エンドグルカナーゼ（以下、単に「ＥＧＵ」と略記することもある）活性」とは、カルボキシメチルセルロース溶液の粘度低下を測定し、これを酵素活性として定量したものであり、実験の詳細は以下の通りである。
基質溶液として、カルボキシメチルセルロース（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ社製）を終濃度３．５％となるように、０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ１０．０）に溶解した。この基質溶液５ｍＬを４０℃で１０分間予め加温し、これに酵素溶液０．１５ｍＬを加え、良く攪拌し、４０℃で３０分間反応させた。この反応液を、４０℃に設定しておいたＲ型粘度計（東機産業ＲＥ１００）で粘度を測定した。酵素活性は、各反応条件下において、初期粘度を１／２に低下させる酵素量を１単位とした。アニオン系界面活性剤は、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸（和光純薬製）を用い、終濃度８００ｐｐｍとなるようカルボキシメチルセルロース溶液に添加した。【００１６】
界面活性剤存在下でのエンドグルカナーゼ活性の低下の抑制
本明細書における「界面活性剤存在下でのエンドグルカナーゼ活性の低下が少ない」とは、Ｎ末端が改変された本発明のタンパク質（Ｎ末端改変型タンパク質）と、その改変前のタンパク質（以下、改変前タンパク質と称する）とを、界面活性剤存在下におけるエンドグルカナーゼ活性を指標に比較した結果、エンドグルカナーゼ活性が改変前タンパク質に比べＮ末端改変型タンパク質の方が高いことを意味する。【００１７】
改変前タンパク質
本発明方法を適用することのできる改変前タンパク質は、エンドグルカナーゼ活性を有し、且つＮ末端がピログルタミン酸でないタンパク質である限り、特に限定されるものではないが、例えば、セルラーゼ（例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドラーゼ、又はβ−グルコシダーゼ）を挙げることができ、ファミリー４５に属するセルラーゼが好ましい。なお、前記改変前タンパク質は、少なくともエンドグルカナーゼ活性を有する限り、エンドグルカナーゼ活性のみを有するタンパク質であることもできるし、エンドグルカナーゼ活性に加え、別の酵素活性を有するタンパク質であることもできる。また、天然型タンパク質であることも、遺伝子工学的に改変したタンパク質であることもできる。【００１８】
ファミリー４５に属するセルラーゼの由来
このファミリー４５に属するセルラーゼは、慣用とされる遺伝子工学的手法、例えば、組換えＤＮＡ技術、ポリペプチド合成技術などによって作製することができるほか、天然から分離された菌株から取得することもできる。更に、天然から得られるファミリー４５に属するセルラーゼの変異体も含めることができる。
ファミリー４５に属するセルラーゼは、例えば、糸状菌類又は接合菌類などの微生物から得ることができる。糸状菌類としては、例えば、フミコーラ属（例えば、フミコーラ・インソレンス）、トリコデルマ属（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、スタフィロトリクム属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｒｉｃｈｕｍ）［例えば、スタフィロトリクム・ココスポラム（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｏｃｃｏｓｐｏｒｕｍ）］、ミリオコッカム属［例えば、ミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）］に属する微生物から得ることができる。具体的には、フミコーラ属由来のセルラーゼとしては、例えば、ＣＢＨ  Ｉ、ＥＧ  Ｖ、ＮＣＥ２、ＮＣＥ４、ＮＣＥ５などが、トリコデルマ属由来のセルラーゼとしては、例えば、ＣＢＨ  Ｉ、ＣＢＨ  ＩＩ、ＥＧ  ＩＩ、ＥＧ  ＩＩＩなどが、スタフィロトリクム属由来のセルラーゼとしては、例えば、ＳＴＣＥ１、ＳＴＣＥ３などが、ミリオコッカム属由来のセルラーゼとしては、例えば、ＭＴＥ１などが挙げられる。接合菌類としては、例えば、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）［例えば、リゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）］、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）［例えば、ムコール・サーシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）］、ファイコマイセス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）［例えば、ファイコマイセス・ニテンス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ  ｎｉｔｅｎｓ）］に属する微生物から得ることができる。具体的には、例えば、リゾプス・オリゼー由来のＲＣＥ  Ｉ、ＲＣＥ  ＩＩ、ＲＣＥ  ＩＩＩ、ムコール・サーシネロイデス由来のＭＣＥ  Ｉ、ＭＣＥ  ＩＩとファイコマイセス・ニテンス由来のＰＣＥ  Ｉがある（国際公開第００／２４８７９号パンフレット）。【００１９】
ピログルタミン酸又はピログルタミン酸を含むペプチド
本明細書において「ピログルタミン酸」とは、成熟タンパク質のＮ末端グルタミン又はグルタミン酸が環化され、ピログルタミン酸となったものを意味する。このピログルタミン酸は、Ｎ末端側アミノ基を提示しないことが特徴であり、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）又はインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）のどちらでもピログルタミン酸化が可能である。インビボにおいては、成熟Ｎ末端がグルタミン又はグルタミン酸になるように、成熟タンパク質を遺伝子工学的手法によりデザインした改変タンパク質をコードしたポリヌクレオチドを宿主内で発現させることにより、ピログルタミン酸化タンパク質が取得される。インビトロにおいては、蟻酸などの酸性溶液を用いて、Ｎ末端にグルタミン又はグルタミン酸を有するタンパク質を処理することによって、ピログルタミン酸化タンパク質を取得することができる。【００２０】
本明細書において「ペプチド」とは、１ないしは複数個のアミノ酸からなる、ペプチド結合により重合したアミノ酸群を意味する。従って、本明細書において「ピログルタミン酸を含むペプチド」とは、ピログルタミン酸をＮ末端アミノ酸とするペプチドを意味する。ピログルタミン酸を含むペプチドは、２〜複数個のアミノ酸からなり、例えば、２〜４０個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜２０個、更に好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個、更に特に好ましくは２〜４個のアミノ酸配列が架橋されているものである。ここでいうアミノ酸は当業者が使用できるものであれば、特に限定されるものではない。【００２１】
本発明方法において、改変前タンパク質を、Ｎ末端がピログルタミン酸であるタンパク質に改変する手段としては、前記タンパク質改変が可能である限り、特に限定されるものではないが、例えば、遺伝子工学的手法又は化学的手法を挙げることができる。【００２２】
遺伝子工学的手法によれば、例えば、適当なアミノ酸又はアミノ酸配列の遺伝子工学的な付加及び／又は置換により、改変前タンパク質の改変を行うことができる。
遺伝子工学的な付加を利用する態様では、改変前タンパク質（エンドグルカナーゼ活性を有し、且つＮ末端がピログルタミン酸でないタンパク質）のＮ末端に、ピログルタミン酸を遺伝子工学的に付加するか、あるいは、ピログルタミン酸をＮ末端に含むペプチドを遺伝子工学的に付加することにより、タンパク質の改変を実施することができる。
より具体的には、前記態様は、例えば、
（１）改変前タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端に、ピログルタミン酸化可能なアミノ酸（例えば、グルタミン酸又はグルタミン）をコードするポリヌクレオチド、あるいは、ピログルタミン酸化可能なアミノ酸をＮ末端に含むペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加する工程；
（２）前記工程（１）で得られたポリヌクレオチドを、Ｎ末端アミノ酸のピログルタミン酸化が可能な宿主で発現させる工程
を含むことができる。【００２３】
遺伝子工学的な置換を利用する態様では、改変前タンパク質のＮ末端アミノ酸、又はそれを含む領域を、ピログルタミン酸で遺伝子工学的に置換するか、あるいは、ピログルタミン酸をＮ末端に含むペプチドで遺伝子工学的に置換することにより、タンパク質の改変を実施することができる。
より具体的には、前記態様は、例えば、
（１）改変前タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端、又はそれを含む領域を、ピログルタミン酸化可能なアミノ酸（例えば、グルタミン酸又はグルタミン）をコードするポリヌクレオチド、あるいは、ピログルタミン酸化可能なアミノ酸をＮ末端に含むペプチドをコードするポリヌクレオチドで置換する工程；
（２）前記工程（１）で得られたポリヌクレオチドを、Ｎ末端アミノ酸のピログルタミン酸化が可能な宿主で発現させる工程
を含むことができる。【００２４】
一方、化学的手法によるタンパク質改変としては、例えば、
（ａ）改変前タンパク質のＮ末端に、化学的にピログルタミン酸（又はピログルタミン酸をＮ末端に含むペプチド）を直接付加する態様；
（ｂ）改変前タンパク質のＮ末端に、ピログルタミン酸化可能なアミノ酸（又はピログルタミン酸可能なアミノ酸をＮ末端に含むペプチド）を化学的に付加した後、そのＮ末端アミノ酸を化学的にピログルタミン酸化する態様；あるいは、
（ｃ）改変前タンパク質（但し、Ｎ末端がピログルタミン酸化可能なアミノ酸である場合）のＮ末端を化学的にピログルタミン酸化する態様
を挙げることができる。【００２５】
ファミリー４５に属するセルラーゼのＮ末端側に、ピログルタミン酸又はピログルタミン酸を含むペプチドを付加する方法
より具体的な改変方法について、ファミリー４５に属するセルラーゼを例にとって説明する。ファミリー４５に属するセルラーゼのＮ末端側に、ピログルタミン酸又はピログルタミン酸を含むペプチドを付加する方法は、遺伝子工学的手法を用いることにより得ることができる。一般的なセルラーゼの生産法としては、例えば糸状菌を用いて、目的とするセルラーゼをコードするポリヌクレオチドの翻訳領域を宿主で機能するプロモーター及びターミネーターの間に正しく連結し、この発現カセットを宿主に導入することによりなし得る。更に、宿主細胞で機能する分泌シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを付加し、宿主細胞に導入すると培地中に分泌されることから、目的とするセルラーゼを容易に回収することができる。このとき、分泌シグナル配列の直下に付加したいアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを付加することによりセルラーゼのＮ末端側へ所望のアミノ酸を付加することができる。更に、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基の修飾は、宿主の分泌シグナル配列を用いれば良く、例えばトリコデルマ・ビリデ由来のｃｂｈ１やｃｂｈ２、フミコーラ・インソレンス由来のＮＣＥ２やＮＣＥ５はＮ末端がピログルタミン酸化しているので、これらの分泌シグナル配列を用いて、それぞれトリコデルマ・ビリデやフミコーラ・インソレンスを用いて発現させることにより調製できる。本発明の好ましい態様によれば、以上のように調製されたファミリー４５に属するセルラーゼは、界面活性剤存在下で活性の低下が少ないという有利な性質を有している。【００２６】
また、別の態様によれば、当業者が実施可能な程度の範囲内で、全合成することによって得ることもできる。この場合、天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものであってもよい。【００２７】
本発明のタンパク質
本発明のタンパク質とは、エンドグルカナーゼ活性を有する改変前タンパク質のＮ末端をピログルタミン酸に改変したもの［例えば、ファミリー４５に属するセルラーゼを取得し、その成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸側に、ピログルタミン酸（ｐＱ）又はピログルタミン酸を含むペプチドを付加したもの］であって、界面活性剤存在下でエンドグルカナーゼ活性の低下が少ないものである。また、前述の方法によって得られ得る、界面活性剤存在下で活性の低下が少ないエンドグルカナーゼ活性を有する、タンパク質である。【００２８】
例えば、下記からなる群より選択される、タンパク質が含まれる：
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号３８、又は配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を含む、タンパク質、
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号３８、又は配列番号４０で表されるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ界面活性剤存在下で活性低下の少ないエンドグルカナーゼ活性を有する改変タンパク質、
（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号３８、又は配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、且つ界面活性剤存在下で活性低下の少ないエンドグルカナーゼ活性を有する相同タンパク質。【００２９】
配列番号２で表されるアミノ酸配列は、フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１株由来エンドグルカナーゼＮＣＥ４のＮ末端に、５アミノ酸からなるペプチド（Ｎ末端がピログルタミン酸）が付加されたＮ末端付加型ＮＣＥ４（実施例Ａ２参照）のアミノ酸配列である。
配列番号４で表されるアミノ酸配列は、スタフィロトリクム・ココスポラムＩＦＯ  ３１８１７株由来エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のＮ末端アミノ酸（Ａｌａ）を、４アミノ酸からなるペプチド（Ｎ末端がピログルタミン酸）で置換されたＮ末端置換型ＳＴＣＥ１（実施例Ｂ２参照）のアミノ酸配列である。
配列番号３８で表されるアミノ酸配列は、スタフィロトリクム・ココスポラムＩＦＯ  ３１８１７株由来エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のＮ末端に、ピログルタミン酸が付加されたピログルタミン酸付加型ＳＴＣＥ１（実施例Ｂ３参照）のアミノ酸配列である。
配列番号４０で表されるアミノ酸配列は、スタフィロトリクム・ココスポラムＩＦＯ  ３１８１７株由来エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のＮ末端に、４アミノ酸からなるペプチド（Ｎ末端がピログルタミン酸）が付加されたＮ末端付加型ＳＴＣＥ１（実施例Ｂ４参照）のアミノ酸配列である。【００３０】
本発明における「改変タンパク質」とは、配列番号２、配列番号４、配列番号３８、又は配列番号４０のアミノ酸配列において、１個又は複数個（例えば、１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ界面活性剤存在下で活性の低下が少ないエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質である。ここで、「欠失、置換、挿入、又は付加」などの改変に係るアミノ酸の数は、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜６個である。【００３１】
更に、改変タンパク質には、配列番号２、配列番号４、配列番号３８、又は配列番号４０で表わされるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸残基が、保存的置換されたアミノ酸配列を含み、且つ界面活性剤存在下で活性の低下が少ないエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を包含する。ここで、「保存的置換」とは、タンパク質の活性を実質的に改変しないように１個又は複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような保存的置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体的には、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。【００３２】
本発明における「相同タンパク質」とは、配列番号２、配列番号４、配列番号３８、又は配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と少なくとも８５％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性（配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、且つ界面活性剤存在下で活性低下の少ないエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質である。ここで示した相同性の数値は、当業者に公知の相同性検索プログラムであるＦＡＳＴＡ３〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４−２４４８（１９８８）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｅ−ｍａｉｌ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｊ．ｈｔｍｌ〕においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値（同一性；identity）を示す。【００３３】
先述したとおり、本発明のタンパク質の１つである「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質」において、Ｎ末端に付加された５アミノ酸からなるペプチドを除いた部分は、エンドグルカナーゼＮＣＥ４に由来する。また、本発明のタンパク質である「配列番号４、配列番号３８、又は配列番号４０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質」において、Ｎ末端のアミノ酸又はペプチドを除いた部分は、エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１に由来する。
エンドグルカナーゼＮＣＥ４及びＳＴＣＥ１は、ファミリー４５に属するエンドグルカナーゼであり、ファミリー４５に属する公知のエンドグルカナーゼとしては、例えば、フミコーラ属由来のＮＣＥ５（国際公開第０１／９０３７５号パンフレット）を挙げることができる。【００３４】
図１及び図２に、エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のアミノ酸配列［シグナルペプチド（配列番号４３）及び成熟タンパク質（配列番号４４）］、エンドグルカナーゼＮＣＥ４［シグナルペプチド（配列番号４５）及び成熟タンパク質（配列番号４６）］、及びＮＣＥ５［シグナルペプチド（配列番号４７）及び成熟タンパク質（配列番号４８）］の各アミノ酸配列を比較した結果を示す。
図１は前半部（Ｎ末端側）の結果を示し、図２は後半部（Ｃ末端側）の結果を示す。図１及び図２において、記号「＊」は、ＳＴＣＥ１と共通するアミノ酸であることを示す。【００３５】
図１及び図２に示すとおり、ファミリー４５に属するエンドグルカナーゼは、共通するドメインとして触媒領域（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）（１番〜２０７番）を有し、場合により、更に、リンカー領域（Ｌｉｎｋｅｒ）（２０８番〜２５８番）及び／又はセルロース結合領域（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ；ＣＢＤ）（２５９番〜２９５番）を有することがある。なお、各ドメインの後の括弧内に示す番号は、エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のアミノ酸配列（配列番号４４）におけるアミノ酸番号である。【００３６】
前記各領域の内、触媒領域及びセルロース結合領域では、各エンドグルカナーゼ間で多くの保存アミノ酸が認められるのに対して、リンカー領域では顕著な保存領域は認められない。保存アミノ酸を多く含む領域（例えば、触媒領域又はセルロース結合領域、特には触媒領域）、あるいは、その領域に含まれる共通アミノ酸は、エンドグルカナーゼ（例えば、ＳＴＣＥ１又はＮＣＥ４）の酵素活性に重要な領域又はアミノ酸と考えられるため、それ以外の領域又はアミノ酸においてアミノ酸改変（例えば、欠失、置換、挿入、及び／又は付加、特には保存的置換）を行うことにより、その酵素活性を維持した改変タンパク質又は相同タンパク質を、過度の実験を必要とすることなく、高い確率で取得することができる。【００３７】
また、保存アミノ酸を多く含む領域であっても、各エンドグルカナーゼ間で非共通のアミノ酸は、別のアミノ酸（好ましくは、保存的置換可能な類似アミノ酸）に改変してもその酵素活性を維持する可能性が高く、このようなアミノ酸改変を行うことによっても、その酵素活性を維持した改変タンパク質又は相同タンパク質を、過度の実験を必要とすることなく、高い確率で取得することができる。
なお、保存アミノ酸を多く含む領域における共通アミノ酸であっても、別のアミノ酸に改変してもその酵素活性が維持されることがあり、特に保存的置換可能な類似アミノ酸に改変した場合、その可能性は高くなる。本発明の改変タンパク質又は相同タンパク質には、エンドグルカナーゼ活性を有する限り、任意の領域、例えば、触媒領域、リンカー領域、又はセルロース結合領域に含まれるアミノ酸を改変したタンパク質が含まれる。【００３８】
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明によれば、配列番号２、配列番号４、配列番号３８、又は配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質、その改変タンパク質、及び相同タンパク質（以下、単に「本発明のタンパク質」という）をコードするポリヌクレオチドが提供される。タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定まり、よって、本発明のタンパク質をコードする種々の塩基配列を選択することができる。なお、本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれ、ＤＮＡが好ましい。【００３９】
例えば、下記からなる群より選択される、ポリヌクレオチドが含まれる：
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号３７、又は配列番号３９で表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号３７、又は配列番号３９で表わされる塩基配列において、１個又は複数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列を含み、且つ界面活性剤存在下で活性低下の少ないエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号３７、又は配列番号３９で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ界面活性剤存在下で活性低下の少ないエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。【００４０】
前記（ｂ）の塩基配列において、欠失、置換、挿入、又は付加されてもよい塩基の数は、具体的には１〜９０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１８個、更に好ましくは１〜９個である。【００４１】
ここで、前記（ｃ）における「ストリンジェントな条件下」とは、配列番号１、配列番号３、配列番号３７、又は配列番号３９で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドを用い、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング検出システム（アマシャム社製）の添付の操作方法に従って、４２℃で１時間のプレハイブリダイゼーションの後、前記ポリヌクレオチドを添加し、４２℃で１４〜１６時間のハイブリダイゼーションを行った後、０．４％ＳＤＳ及び６ｍｏｌ／Ｌ尿素添加０．５倍濃度のＳＳＣ（１倍濃度のＳＳＣ；１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸三ナトリウム、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）で４２℃にて２０分間の洗浄を２回繰り返し、次に５倍濃度のＳＳＣで室温にて５分間の洗浄を２回行う条件である。【００４２】
本発明によるポリヌクレオチドは、天然由来のものであっても、全合成したものであってもよく、また、天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものであってもよい。本発明によるポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、微生物のゲノミックライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば、部分アミノ酸配列の情報を基にして作製した適当なＤＮＡプローブを用いて、スクリーニングを行う方法などが挙げられる。【００４３】
本発明のタンパク質の生産
本発明のタンパク質は、それをコードするポリヌクレオチド断片を、宿主細胞内で複製可能且つ同遺伝子が発現可能な状態で含むポリヌクレオチド分子、特に発現ベクターの形態として宿主細胞の形質転換を行い、その宿主細胞において産生させることができる。【００４４】
よって、本発明においては、前記の本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド断片を、宿主微生物内で複製可能で、且つ、そのポリヌクレオチド断片がコードするタンパク質を発現可能な状態で含んでなる発現ベクターが提供される。【００４５】
本発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、本発現ベクターは、宿主微生物に導入されたとき、その宿主微生物のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明によるベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。【００４６】
本発明による発現ベクターは、これを実際に宿主微生物に導入して所望の活性を有するタンパク質を発現させるために、前記の本発明によるポリヌクレオチド断片の他に、その発現を制御するポリヌクレオチドや形質転換体を選択するための遺伝子マーカーなどを含んでいるのが望ましい。【００４７】
本発明に用いる発現を制御するポリヌクレオチドとしては、プロモーター、ターミネーター及び分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドなどの転写調節信号、翻訳調節信号がこれに含まれる。これらの制御するポリヌクレオチドの連結及びベクターへの挿入は、常法により行なうことができる。【００４８】
本発明に用いるプロモーターは宿主微生物において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種又は異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するポリヌクレオチドとして得ることができる。プロモーターとしては、大腸菌においては、例えば、ラクトースオペロン、トリプトファンオペロンなどのプロモーター、酵母では、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、酸性フォスファターゼ遺伝子、ガラクトース資化性遺伝子、グリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子などのプロモーター、カビとして、例えば、糸状菌ではα−アミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ遺伝子、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、グリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子などのプロモーターを選択することができる。【００４９】
また、シグナルペプチドは、宿主微生物において、タンパク質の分泌に寄与するものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種又は異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導されるポリヌクレオチドより得ることができる。【００５０】
また、本発明における遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。使用する宿主が細菌の場合は、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などであり、使用する宿主が酵母の場合は、例えば、トリプトファン生合成遺伝子（ｔｒｐＩ，ｔｒｐＣ）、ウラシル生合成遺伝子（ｕｒａ３）、ロイシン生合成遺伝子（ｌｅｕ２）、ヒスチジン生合成遺伝子（ｈｉｓ３）、使用する宿主がカビ、例えば、糸状菌の場合は、例えば、デストマイシン耐性遺伝子、硝酸資化遺伝子（ｎｉａＤ）、アルギニン生合成遺伝子（ａｒｇＢ）、ウラシル生合成遺伝子（ｐｙｒ４）、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、オーレオバシジン耐性遺伝子などが挙げられる。【００５１】
本発明によれば、この発現ベクターによって形質転換された微生物が提供される。この宿主−ベクター系は特に限定されず、例えば、大腸菌、放線菌、酵母、糸状菌などを用いた系、及びそれらを用いた他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。宿主として、酵母を用いる場合は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）に属する微生物などが、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。糸状菌を用いる場合には、いかなる糸状菌を用いてもよいが、好ましくは、フミコーラ属、トリコデルマ属、アスペルギルス属、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）に属する微生物であり、より好ましくは、フミコーラ属、又はトリコデルマ属が挙げられる。より具体的には、フミコーラ・インソレンス、フミコーラ・サーモイデア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ）、トリコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ロンジブラシアトウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、スタフィロトリクム・ココスポラム、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、フザリウム・オキシスポーラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、又はアクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）が挙げられるが、更により好ましくは、フミコーラ・インソレンス、又はトリコデルマ・ビリデが挙げられる。【００５２】
また、この発現ベクターによる微生物の形質転換も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。好ましい具体例としては、例えば、カルシウムイオン法、リチウムイオン法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法などのような常法を用いることができ、形質転換される宿主に応じて選択することができる。【００５３】
本発明においては、本発明の形質転換体を培養し、その培養物から所望とする本発明のタンパク質を得ることができる。本発明による形質転換体の培養は、常法に従って、培地、培養条件などを適宜選択することにより行うことができる。【００５４】
培地としては、本発明の形質転換体が同化し得る炭素源、資化し得る窒素源、無機塩類、各種ビタミン、グルタミン酸又はアスパラギンなどの各種アミノ酸、ヌクレオチドなどの微量栄養素、抗生物質などの選抜薬剤を添加することもできる。また、本発明の形質転換体の発育を助け、本発明のタンパク質の生産を促進するような有機物及び／又は無機物を適当に添加することができる。更に、必要に応じてその他の栄養物をほどよく含有する合成培地又は天然培地を使用することができる。【００５５】
培地に使用される炭素源及び窒素源としては、本発明の形質転換体の利用可能なものであれば何れの種類でも良い。同化し得る炭素源としては、例えばショ糖、澱粉、グリセリン、グルコース、フラクトース、マルトース、ラクトース、セルロース、セロビオース、デキストリン、動物油、植物油、又はそれらの加水分解物などの種々の炭水化物が利用できる。その濃度は通常、培地に対して０．１％〜５％であることが好ましい。資化し得る窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、脱脂大豆粉などの動植物体成分、浸出エキス類、コハク酸アンモニウム塩類、酒石酸アンモニウムなどの有機酸アンモニウム類、尿素、又はその他各種無機酸若しくは有機酸などの含窒素化合物も使用可能である。また、無機塩類としては、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸、硫酸又はその他のイオンを生成することのできる塩類が適宜使用できる。【００５６】
その他の成分として、例えば、酵母などの微生物の菌体、浸出液及び浸出エキスなど、また植物体の細末を含む培地であっても本発明の形質転換体の生育及び本発明のタンパク質の生産蓄積を妨げない限り何れをも適宜使用し得る。また、栄養要求性を示す変異株を培養する場合には、その栄養要求性を満足させ得る物質を培地に加えるが、この種の栄養素は、天然物を含む培地を使用する場合は、特に添加を必要としない場合がある。【００５７】
これらの培地組成、培地の液性、培養温度、攪拌速度、通気量などの培養条件は、使用する形質転換体及び外部の条件などに応じて好ましい結果が得られるように適宜調節、選択されることはいうまでもない。液体培養において、発泡があるときは、シリコン油、植物油、鉱物油、界面活性剤などの消泡剤を適宜使用することができる。【００５８】
このようにして得られた培養物に蓄積される本発明のタンパク質は、本発明の形質転換体内及び培養濾液中に含有されるので、培養物を遠心分離して培養物と形質転換体とに分離し、各々から本発明のタンパク質を採取することが可能である。【００５９】
培養濾液から本発明のタンパク質を採取するには、常法に従い、培養物から本発明のタンパク質を採取するのに用いられる手段を、単独若しくは任意の順序に組合せ又は反復して用いられる。すなわち、例えば、抽出濾過、遠心分離、透析、濃縮、乾燥、凍結、吸着、脱着、各種溶液に対する溶解度の差を利用した方法（例えば、沈殿、塩析、結晶化、再結晶、転溶、クロマトグラフィーなど）などの手段が用いられる。【００６０】
また、本発明の形質転換体内の培養物から、本発明のタンパク質を取得することができる。常法に従い、例えば、培養物から抽出（磨砕処理、加圧破砕など）、回収（濾過、遠心分離など）及び精製（塩析法、溶媒沈殿法など）などの手法が用いられる。【００６１】
得られた粗物質は、常法に従い、例えば、デキストラン、セルロース、アガロース、合成ポリマー、シリカゲルなどの担体を用いる各種カラムクロマトグラフィーにより精製することができる。上記に示した方法、又はこれらを適宜組み合わせることにより、本発明の形質転換体の培養物から所望とする純粋な本発明のタンパク質が得られる。【００６２】
従って、本発明の別の態様によれば、前記の本発明による新規タンパク質の製造方法が提供される。形質転換体の培養及びその条件は、使用する微生物についてのそれと本質的に同等であってよい。また、形質転換体を培養した後、目的のタンパク質を回収する方法は、この分野で慣用されているものを用いることができる。【００６３】
寄託菌株
本発明による発現ベクターｐＥＧＤ０１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７３）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［（旧）通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）］に、平成８年（１９９６年）７月１２日より国内寄託されたものであり、平成９年（１９９７年）６月１３日から国際寄託に移管されている。国際受託番号（国際受託番号に続く［］内は国内受託番号）は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７３［ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７２９］である。【００６４】
本発明による発現ベクターｐＭＫＤ０１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７４）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［（旧）通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）］に、平成８年（１９９６年）７月１２日より国内寄託されたものであり、平成９年（１９９７年）６月１３日から国際寄託に移管されている。国際受託番号（国際受託番号に続く［］内は国内受託番号）は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７４［ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７３０］である。【００６５】
プラスミドｐＣＢ１−Ｍ２ＸＲで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０４５）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［（旧）通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）］に、平成８年（１９９６年）９月９日より国内寄託されたものであり、平成９年（１９９７年）８月１１日から国際寄託に移管されている。国際受託番号（国際受託番号に続く［］内は国内受託番号）は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０４５［ＦＥＲＭ  Ｐ−１５８４０］である。
ここで、本発明によるプラスミドｐＣＢ１−Ｍ２は、後述する実施例に記載の方法から取得する以外の態様として、例えば、プラスミドｐＣＢ１−Ｍ２ＸＲを制限酵素ＸｂａＩで消化し、自己閉環することによっても得ることができる。【００６６】
本発明による発現ベクターの宿主となりうるフミコーラ・インソレンス  ＭＮ２００−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７７）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［（旧）通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）］に、平成８年（１９９６年）７月１５日より国内寄託されたものであり、平成９年（１９９７年）６月１３日から国際寄託に移管されている。国際受託番号（国際受託番号に続く［］内は国内受託番号）は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７７［ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７３６］である。【００６７】
本発明による発現ベクターの宿主となりうるトリコデルマ・ビリデ  ＭＣ３００−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０４７）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［（旧）通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）］に、平成８年（１９９６年）９月９日より国内寄託されたものであり、平成９年（１９９７年）８月１１日から国際寄託に移管されている。国際受託番号（国際受託番号に続く［］内は国内受託番号）は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０４７［ＦＥＲＭ  Ｐ−１５８４２］である。【００６８】
プラスミドｐＵＣ１１８−ＳＴＣＥｅｘで形質転換された大腸菌ＤＨ５α（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２７）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、平成１５年（２００３年）１２月１日に国内寄託されたものであり、平成１６年（２００４年）９月１５日から国際寄託に移管されている。国際受託番号（国際受託番号に続く［］内は国内受託番号）は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２７［ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６０２］である。なお、プラスミドｐＵＣ１１８−ＳＴＣＥｅｘは、プラスミドｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩ部位にＳＴＣＥ遺伝子を挿入したものである。このＢａｍＨＩ断片に含まれるエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１遺伝子は、イントロンを含み、配列番号５に表される配列を有する。
【実施例】
【００６９】
以下に本発明の実施例を示すが、これは単なる一例であって本発明を限定するものではなく、ここに例示しなかった多くの変法あるいは修飾手段のすべてを包括するものである。【００７０】
《実施例Ａ１：フミコーラ・インソレンス用Ｎ末端付加型セルラーゼ発現ベクター及び天然型セルラーゼ発現ベクターの構築》
（１）Ｎ末端付加型セルラーゼ発現ベクターｐＭＫＤ０１の構築
プラスミドｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）をＢａｍＨＩで消化し、得られる断片をＤＮＡブランチングキット（タカラバイオ社製）を用いて末端を平滑化した。これをＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて自己閉環させｐＵＣ１１８−ＢＮを得た。このｐＵＣ１１８ＢＮをＳｐｈＩで消化し、末端平滑化、自己閉環させ、ｐＵＣ１１８ＢＳＮを得た。次に、フミコーラ・インソレンス  ＭＮ２００−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７７）から、特開平８−１２６４９２号公報に記載の方法にしたがって、セルラーゼＮＣＥ２遺伝子の全長を含むＰｓｔＩ−ＸｂａＩ断片３．４ｋｂを得た。これを同様の制限酵素で消化しておいたｐＵＣ１１８ＢＳＮと連結し、ｐＵＣ１１８ＢＳＮ−ＰＸを得た。このｐＵＣ１１８ＢＳＮ−ＰＸに部位指定変異をスカルプターインビトロミュータジェネシスシステム（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて導入し、プラスミドｐＭ２１を構築した。変異導入用オリゴヌクレオチドＭＮＣ−０２及びＭＮＣ−０３を用いた。【００７１】
ＭＮＣ−０２：  ５’−ＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＡＣＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＴＧ−３’（配列番号６）
ＭＮＣ−０３：  ５’−ＴＣＣＧＣＣＧＴＴＣＴＧＡＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＧＧＣＧＣＧ−３’（配列番号７）【００７２】
このプラスミドｐＭ２１をＢａｍＨＩで消化し、これにフミコーラ・インソレンス  ＭＮ２００−１株由来セロビオハイドロラーゼ遺伝子（ＮＣＥ３）のＰＣＲ断片をＢａｍＨＩで消化したものを連結し、プラスミドｐＫＭ０４を得た。ＮＣＥ３のＰＣＲ断片は、以下のプライマーＭＫＡ−０５及びＭＫＡ−０６を用い、フミコーラ・インソレンス  ＭＮ２００−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７７）由来ゲノムＤＮＡ（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）を鋳型に増幅した。【００７３】
ＭＫＡ−０５：  ５’−ＧＣＣＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＧＧ−３’（配列番号８）
ＭＫＡ−０６：  ５’−ＴＧＡＴＣＧＴＣＧＡＧＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＴＴＴＡＣＡＧＧＣＡＣ−３’（配列番号９）【００７４】
前記プラスミドｐＫＭ０４に、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来ｔｒｐＣ遺伝子のプロモーター及びターミネーター（Ｍｕｌｌａｎｅｙ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９，３７−４５，１９８５）を用いて特開昭５９−１７５８８９号公報に記載されているデストマイシン耐性遺伝子をフミコーラ・インソレンスで発現可能にした遺伝子を作製した。これをＸｂａＩで消化しておいたプラスミドｐＫＭ０４と連結し、Ｎ末付加型セルラーゼ発現ベクターｐＭＫＤ０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７４）を構築した。このｐＭＫＤ０１は、ＮＣＥ２遺伝子の成熟タンパク質のＮ末端より下流１０ｂｐ、終止コドンより下流３ｂｐにＢａｍＨＩ認識配列を変異導入してあるので、所望のファミリー４５に属するセルラーゼのＮ末端に更に５アミノ酸残基が付加するような構成となる。【００７５】
【表１】
0004644603.tif 000002
【００７６】
（２）天然型セルラーゼ発現ベクターｐＪＤ０１の構築
前記（１）で得られたプラスミドｐＭ２１にオリゴヌクレオチドｐＭＮ−Ｂａｍを用いて部位特異的変異を導入し、変異導入プラスミドｐＭ２１−ｍ−Ａ１を得た。【００７７】
ｐＭＮ−Ｂａｍ：  ５’−ＧＧＴＣＡＡＡＣＡＡＧＴＣＴＧＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＡＡＧＴＴＣＴＴＣＣＴＴＡＣ−３’（配列番号１２）【００７８】
このｐＭ２１−ｍ−Ａ１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、得られる約１ｋｂの断片を回収した。次に、実施例Ａ１（１）により得られたｐＭＫＤ０１をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、約７ｋｂの断片を回収した。これらの断片を連結し、プラスミドｐＪＤ０１を得た。本ベクターは、ＮＣＥ２遺伝子の翻訳開始点より上流１５ｂｐ、終止コドンより下流３ｂｐにＢａｍＨＩ認識配列を変異導入してあるので、転写開始点から所望のファミリー４５に属するセルラーゼが発現するような構成となる。【００７９】
【表２】
0004644603.tif 000003
【００８０】
《実施例Ａ２：天然型ＮＣＥ４発現ベクター及びＮ末端付加型ＮＣＥ４発現ベクターの構築、並びにフミコーラ・インソレンスへの形質転換及び活性評価》
（１）発現ベクターの構築
天然型ＮＣＥ４発現ベクターとして、実施例Ａ１（２）により得られたｐＪＤ０１に、ＮＣＥ４遺伝子の翻訳領域全長を連結し、ｐＮ２ＥＸ−Ｎ４を構築した。
まず、ＮＣＥ４遺伝子の翻訳領域全長を、プライマーＮＣＥ４−Ｎｅ及びＮＣＥ４−Ｃｅの組み合わせで前記フミコーラ・インソレンス  ＭＮ２００−１株由来ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、得られる約０．９ｋｂｐのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化したものを調製した。これを同様の制限酵素で消化しておいたｐＪＤ０１と連結し、ｐＮ２ＥＸ−Ｎ４を構築した。【００８１】
ＮＣＥ４−Ｎｅ：  ５’−ＧＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧＣＧＴＴＣＣＴＣＣＣＣＴＣＴＣ−３’（配列番号１５）
ＮＣＥ４−Ｃｅ：  ５’−ＧＧＧＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＴＴＡＣＡＧＧＣＡＣＴＧＡＴＧＧ−３’（配列番号１６）【００８２】
Ｎ末端付加型ＮＣＥ４発現ベクターとして、実施例Ａ１（１）により得られたｐＭＫＤ０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７４）に、ＮＣＥ４遺伝子の分泌シグナル配列を除いた成熟タンパク質翻訳領域を連結し、ｐＥＧＤ０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７３）を構築した。まず、ＮＣＥ４遺伝子の成熟タンパク質翻訳領域をプライマーＮＣＥ４−Ｎｓ及びＮＣＥ４−Ｃｓの組み合わせで前記フミコーラ・インソレンス  ＭＮ２００−１株由来ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、得られる約０．８ｋｂｐのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化したものを調製した。これを同様の制限酵素で消化しておいたｐＭＫＤ０１と連結し、ｐＥＧＤ０１を構築した。【００８３】
ＮＣＥ４−Ｎｓ：  ５’−ＣＣＧＧＴＧＴＴＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＴＧＡＴＧＧＣＡＡＧ−３’（配列番号１７）
ＮＣＥ４−Ｃｓ：  ５’−ＴＡＡＧＧＣＣＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＡＣＡＧ−３’（配列番号１８）【００８４】
（２）天然型ＮＣＥ４及びＮ末端付加型ＮＣＥ４を有する形質転換体
フミコーラ・インソレンス  ＭＮ２００−１株をＳ培地（３．０％グルコース、２．０％酵母エキス、０．１％ポリペプトン、０．０３％塩化カルシウム、０．０３％硫酸マグネシウム、ｐＨ６．８）、３７℃で２４時間培養し、遠心分離により菌糸体を回収し、０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロースで洗浄した。これを３ｍｇ／ｍＬ  β−グルクロニダーゼ（シグマ社製）、１ｍｇ／ｍＬキチナーゼ及び１ｍｇ／ｍＬザイモリアーゼ２０Ｔ（生化学工業社製）を含む０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロース溶液に懸濁し、３０℃で６０〜９０分間緩やかに振とうし、プロトプラスト化した。得られたプロトプラストをろ過後、遠心分離により回収し、ＳＵＴＣ緩衝液（０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸、ｐＨ７．５）で洗浄し、再度ＳＵＴＣに懸濁したものプロトプラスト懸濁液とした。
１００μＬのプロトプラスト懸濁液に対し、１０μＬのＤＮＡ（ｐＥＧＤ０１又はｐＮ２ＥＸ−Ｎ４）溶液を加え、氷冷下で５分間静置し、４００μＬのＰＥＧ溶液（６０％ポリエチレングリコール４０００、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸、ｐＨ７．５）を加え、更に２０分間氷冷下で静置した。以上の処理をしたプロトプラスト懸濁液は、ＳＵＴＣ緩衝液で洗浄し、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含むＹＭＧ培地（１％グルコース、０．４％酵母エキス、０．２％麦芽エキス、１％寒天、ｐＨ６．８）にＹＭＧ軟寒天とともに重層し、３７℃で５日間培養し、生育したコロニーを形質転換体とした。【００８５】
（３）培養上澄中の天然型ＮＣＥ４及びＮ末端付加型ＮＣＥ４のＥＧＵ活性の比較
得られた形質転換体を国際公開第９８／０３６６７号パンフレットに準じて培養し、その培養上澄を得た。この培養上澄をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、約４３ｋＤａのＮＣＥ４のバンドが良好に検出される培養上澄を選抜した。この培養上澄のｐＨ１０及びｐＨ１０におけるＬＡＳ添加区のＥＧＵ活性を測定し、その低下の程度を比較した結果を表３に示す。表３はｐＨ１０のＥＧＵ活性を１００とし、その百分率で示した。【００８６】
【表３】
0004644603.tif 000004
【００８７】
その結果、Ｎ末端付加型ＮＣＥ４形質転換体から得られた培養上澄はＬＡＳ添加区での活性の減少が少なかった。ＬＡＳ添加区のＥＧＵ活性を比較すると、Ｎ末端付加型ＮＣＥ４は天然型ＮＣＥ４の２．１倍の活性を有することが判明した。このときフミコーラ・インソレンス  ＭＮ２００−１株のＥＧＵ活性は形質転換体の約４％であることから、これらのＥＧＵ活性はそのほとんどが導入された発現ベクターによって発現された組換え酵素に由来することが判明した。【００８８】
（４）天然型ＮＣＥ４及びＮ末端付加型ＮＣＥ４のＮ末端アミノ酸配列の解析
前記形質転換体の培養上澄をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、電気泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜（ミリポア社製Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＰＳＱ）に電気的に転写した。このブロットから約４３ｋＤａのＮＣＥ４のバンドを切り出した。これをプロテインシークエンサーＭｏｄｅｌ  ４９２（アプライドバイオシステムズ社製）に供し、アミノ酸配列を解読した。【００８９】
その結果、ｐＮ２ＥＸ−Ｎ４形質転換体から得られた天然型ＮＣＥ４は、国際公開第９８／０３６６７号パンフレットに記載されたフミコーラ・インソレンス  ＭＮ２００−１株由来のＮＣＥ４のＤＮＡ配列と一致することを確認した。
一方、同様の手法によりｐＥＧＤ０１形質転換体から得られたＮ末端付加型ＮＣＥ４はアミノ酸配列が解読できなかった。そこで、Ｐｆｕピログルタミン酸アミノペプチダーゼ（Ｐｆｕ  ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅ  ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ；タカラバイオ社製）を用いて修飾Ｎ末端を除去し、再度アミノ酸配列を解読した（配列番号２）。
これらの結果を基に、天然型ＮＣＥ４及びＮ末端付加型ＮＣＥ４のＮ末端アミノ酸及びその配列を比較するため、表４にまとめた。このことから構築した発現ベクターどおりのＮ末端アミノ酸配列を有するＮＣＥ４であることが明らかとなった。【００９０】
【表４】
0004644603.tif 000005
【００９１】
《実施例Ｂ１：トリコデルマ・ビリデ用Ｎ末端置換型セルラーゼ発現ベクター及び天然型セルラーゼ発現ベクターの構築》
（１）発現ベクターの構築
国際公開第９８／１１２３９号パンフレットに準じて得られるトリコデルマ・ビリデ  ＭＣ３００−１株由来ｃｂｈ１遺伝子の全長を含む７ｋｂのＰｓｔＩ断片からｃｂｈ１プロモーター領域を含む約３．１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片及びターミネーター領域を含む２．７ｋｂのＳａｌＩ断片をプラスミドｐＵＣ１１９にクローン化したもの（それぞれプラスミドｐＣＢ１−Ｈ４及びプラスミドｐＣＢ１−Ｓ１）を構築した。このプラスミドを保持する大腸菌ＪＭ１０９株にヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を感染させることにより一本鎖ＤＮＡを得た。これらを鋳型に、リン酸化したオリゴヌクレオチドＣＢｎ−Ｓｔｕ及びＣＢｃ−ＸｈｏをそれぞれプラスミドｐＣＢ１−Ｈ４及びプラスミドｐＣＢ１−Ｓ１にアニールさせ、スカルプターインビトロミュータジェネシスシステム（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて変異を導入し、それぞれからプラスミドｐＣＢ１Ｈ４−１９及びｐＣＢ１Ｓ１−１７を構築した。次に、プラスミドｐＣＢ１Ｈ４−１９をＸｂａＩ及びＸｈｏＩで消化し、得られる約６ｋｂの断片と、プラスミドｐＣＢ１Ｓ１−１７をＸｂａＩで消化後、ＸｈｏＩで部分的に消化し、得られる約１．２ｋｂの断片を連結し、ｐＣＢ１−Ｍを構築した。【００９２】
ＣＢｎ−Ｓｔｕ：  ５’−ＧＡＴＡＣＡＴＧＡＴＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＴＡＧＴＣＧＡＣＴＡＧＡＡＴＧＣ−３’（配列番号２１）
ＣＢｃ−Ｘｈｏ：  ５’−ＧＡＴＣＣＴＣＡＡＧＣＴＴＴＴＧＣＴＣＧＡＧＴＡＣＣＴＴＡＣＡＡＧＣＡＣ−３’（配列番号２２）【００９３】
次に、ｐＣＢ１−ＭをＳａｌＩで消化し、約２．７ｋｂの断片をプラスミドｐＵＣ１１９にクローン化し、プラスミドｐＣＢ１−ＳａｌＭを構築した。これを更に一本鎖ＤＮＡとし、リン酸化したオリゴヌクレオチドＣＢ１−ＳｍＳｐｈ、ＣＢ１−Ｂａｍ及びＣＢ１−Ｐｓｔをアニールさせ、スカルプターインビトロミュータジェネシスシステムを用いて変異を導入した。【００９４】
ＣＢ１−ＳｍＳｐｈ：  ５’−ＧＧＡＧＧＧＴＧＣＡＴＧＣＣＧＡＣＴＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＴＡＧＣＣ−３’（配列番号２３）
ＣＢ１−Ｂａｍ：  ５’−ＧＣＣＧＧＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＧＴＧＧＡＧＧ−３’（配列番号２４）
ＣＢ１−Ｐｓｔ：  ５’−ＧＣＴＣＧＡＧＴＡＣＣＴＴＡＣＴＧＣＡＧＧＣＡＣＴＧＡＧＡＧ−３’（配列番号２５）【００９５】
次に、プラスミドｐＵＣ１１８をＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ＤＮＡブランチングキットを用いて平滑化し、自己閉環し、プラスミドｐＵＣ１１８−ＳＢＮを構築した。このｐＵＣ１１８−ＳＢＮをＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩで消化し、同様の制限酵素で切り出される約１．４ｋｂのｃｂｈ１プロモーター断片をクローン化した。これをＳａｌＩで消化し、全ての変異が導入された約２．８ｋｂのｃｂｈ１翻訳領域及びターミネーター領域を連結し、ｐＣＢ１−Ｍ２を構築した。導入した変異は下図の通りである（ＢａｍＨＩの変異は示していない）。【００９６】
【表５】
0004644603.tif 000006
【００９７】
《実施例Ｂ２：Ｎ末端置換型ＳＴＣＥ１発現ベクター及び天然型ＳＴＣＥ１発現ベクターの構築、並びにトリコデルマ・ビリデへの形質転換及び活性評価》【００９８】
（１）発現ベクターの構築
天然型ＳＴＣＥ１発現ベクターとして、実施例Ｂ１により得られたプラスミドｐＣＢ１−Ｍ２に、ＳＴＣＥ１遺伝子の翻訳領域を連結し、ｐＣＢ−Ｓｔｅを構築した。
まず、ＳＴＣＥ１遺伝子の翻訳領域を、プライマーＳＴＣＥ１−ＴＮＥＲＶ及びＳＴＣＥ１−ＴＣＥＴ２２Ｉの組み合わせで、プラスミドｐＵＣ１１８−ＳＴＣＥｅｘ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２７）を鋳型にＰＣＲを用いて増幅し、得られる約１ｋｂｐのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶ及びＥｃｏＴ２２Ｉで消化したものを調製した。これをＳｔｕＩ及びＰｓｔＩで消化しておいたｐＣＢ１−Ｍ２と連結し、ｐＣＢ−Ｓｔｅを構築した。【００９９】
ＳＴＣＥ１−ＴＮＥＲＶ：  ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＧＣＧＣＡＴＣＡＴＧＣＧＴＴＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴＣ（配列番号３０）
ＳＴＣＥ１−ＴＣＥＴ２２Ｉ：  ＧＧＧＡＴＧＣＡＴＴＴＡＡＡＧＧＣＡＣＴＧＣＧＡＧＴＡＣＣＡＧＴＣ（配列番号３１）【０１００】
Ｎ末端置換型ＳＴＣＥ１発現ベクターとして、実施例Ｂ１により得られたプラスミドｐＣＢ１−Ｍ２に、ＳＴＣＥ１遺伝子の翻訳領域のうち分泌シグナル配列を除いた成熟タンパク質翻訳領域を連結し、ｐＣＢ−Ｓｔｓを構築した。
まず、ＳＴＣＥ１遺伝子の成熟タンパク質翻訳領域を、プライマーＳＴＣＥ１−ＴｍＮＳｐｈ及びＳＴＣＥ１−ＴＣＥＴ２２Ｉの組み合わせで、プラスミドｐＵＣ１１８−ＳＴＣＥｅｘ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２７）を鋳型にＰＣＲを用いて増幅し、得られる約１ｋｂｐのＰＣＲ産物をＳｐｈＩ及びＥｃｏＴ２２Ｉで消化したものを調製した。これをＳｐｈＩ及びＰｓｔＩで消化しておいたｐＣＢ１−Ｍ２と連結し、ｐＣＢ−Ｓｔｓを構築した。【０１０１】
ＳＴＣＥ１−ＴｍＮＳｐｈ：  ＧＧＧＧＣＡＴＧＣＧＡＴＧＧＣＡＡＧＴＣＧＡＣＣＣＧＣＴＡＣ（配列番号３２）【０１０２】
（２）トリコデルマ・ビリデｓｔｒａｉｎ２の作出
トリコデルマ・ビリデ  ＭＣ３００−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０４７）の１０９ＣＦＵ／ｍＬ程度の胞子懸濁液をＵＶ灯２灯を３０ｃｍの高さで点灯下、緩やかに混和しながら照射した。これを選択培地に塗布し、２８℃で７日間培養した。生育した株を選抜し、トリコデルマ・ビリデのウラシル要求株であるトリコデルマ・ビリデｓｔｒａｉｎ２を取得した。
この選択培地は、最少培地［０．２％リン酸２水素１カリウム、０．４％硫酸アンモニウム、０．０３％尿素、０．０３％硫酸マグネシウム７水和物、０．０３％塩化カルシウム、０．５％グルコース、２．５％寒天、０．０１％トレースエレメント（５ｍｇ硫酸鉄７水和物、１．５６ｍｇ硫酸マンガン７水和物、１．４ｍｇ硫酸亜鉛７水和物、２ｍｇ塩化コバルトを１Ｌの水に溶解したもの）］に１０μｇ／ｍＬのウリジン及び１ｍｇ／ｍＬの５−フルオロオロチン酸を添加したものである。【０１０３】
（３）天然型ＳＴＣＥ１及びＮ末端置換型ＳＴＣＥ１を有する形質転換体
実施例Ｂ２（１）により得られたｐＣＢ−Ｓｔｅ及びｐＣＢ−Ｓｔｓのトリコデルマ・ビリデへの形質転換は、実施例Ｂ２（２）により得られたトリコデルマ・ビリデｓｔｒａｉｎ２にニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）由来ｐｙｒ４遺伝子を含むマーカープラスミドｐＰＹＲ４とコトランスフォーメーション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）法で行い、最少培地で生育する株を形質転換体とした。
まず、トリコデルマ・ビリデｓｔｒａｉｎ２を、５０ｍＬの菌体形成培地（１％イーストエキス、１％モルトエキス、２％ポリペプトン、２．５％グルコース、０．１％リン酸水素２カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム７水和物、０．０００１％ウリジン（ｐＨ７．０））が分注された２００ｍＬの三角フラスコに植菌し、２８℃で２日間培養し、得られた菌体を遠心分離により回収し、０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロースで洗浄した。これを３ｍｇ／ｍＬ  β−グルクロニダーゼ（シグマ社製）、１ｍｇ／ｍＬキチナーゼ及び１ｍｇ／ｍＬザイモリアーゼ２０Ｔ（生化学工業社製）を含む０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロース溶液に懸濁し、３０℃で６０〜９０分間緩やかに振とうし、プロトプラスト化した。得られたプロトプラストをろ過後、遠心分離により回収し、ＳＵＴＣ緩衝液で洗浄し、ＳＵＴＥに懸濁したものをプロトプラスト懸濁液とした。
１００μＬのプロトプラスト懸濁液に対し、１０μＬのＤＮＡ（ｐＣＢ−Ｓｔｅ又はｐＣＢ−Ｓｔｓ）溶液を加え、氷冷下で５分間静置し、４００μＬのＰＥＧ溶液を加え、更に２０分間氷冷下で静置した。以上の処理をしたプロトプラスト懸濁液は、ＳＵＴＣ緩衝液で洗浄し、０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロースを含む最少培地に軟寒天とともに重層し、２８℃で５日間培養し、生育したコロニーを再度最少培地に移植し、ここで生育したコロニーを形質転換体とした。【０１０４】
（４）培養上澄中の天然型ＳＴＣＥ１及びＮ末端置換型ＳＴＣＥ１のＥＧＵ活性の比較
得られた形質転換体を国際公開第９８／１１２３９号パンフレットに準じて培養し、その培養上澄を得た。この培養上澄をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、約４５ｋＤａのＳＴＣＥ１のバンドが良好に検出される培養上澄を選抜した。この培養上澄のｐＨ１０及びｐＨ１０におけるＬＡＳ添加区のＥＧＵ活性を測定し、その低下の程度を比較した結果を表６に示す。表６はｐＨ１０のＥＧＵ活性を１００とし、その百分率で示した。【０１０５】
【表６】
0004644603.tif 000007
【０１０６】
その結果、ＬＡＳ添加区のＥＧＵ活性を比較すると、Ｎ末端置換型ＳＴＣＥ１は天然型ＳＴＣＥ１の約１．８倍の活性を有することが判明した。このときトリコデルマ・ビリデｓｔｒａｉｎ２のＥＧＵ活性は検出されないことから、これらのＥＧＵ活性は導入されたベクターによって発現された組換え酵素に由来することが判明した。【０１０７】
（５）天然型ＳＴＣＥ１及びＮ末端置換型ＳＴＣＥ１のＮ末端アミノ酸配列の解析
前記形質転換体の培養上澄を０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム溶液とし、同等のベッドボリューム（ＢＶ）のトヨパールブチル６５０Ｃ（東ソー社製）に吸着させ、３ＢＶの０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウムで非吸着成分を洗浄した。これを３ＢＶの０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウムで溶出し、ペリコンＸＬ（ｃｕｔ  ５０００，ミリポア社製）及びウルトラフリー１５（ｃｕｔ  ５０００，ミリポア社製）で濃縮し、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ５．８）、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム溶液とした。これをリソースＰＨＥ（６ｍＬ，アマシャムバイオサイエンス社製）の疎水クロマトグラフィーに供し、非吸着画分を回収した。この画分を濃縮し、ＰＤ−１０（アマシャムバイオサイエンス社製）で脱塩し、０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ７．５）溶液とし、リソースＱ（６ｍＬ，アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、非吸着画分を回収した。この画分は脱塩後、０．０５ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）溶液とし、リソースＳ（６ｍＬ，アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、非吸着画分を回収した。この画分を濃縮後、スーパーデックス７５ｐｇ（１６×６０ｍｍ，アマシャムバイオサイエンス社製）のゲルろ過に供し、分画分子量約４５０００の画分を回収した。本画分は、４５ｋＤａのバンドが単一に含まれていた。
精製画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、電気泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に電気的に転写した。このブロットから約４５ｋＤａのＳＴＣＥ１のバンドを切り出した。これをプロテインシークエンサーＭｏｄｅｌ  ４９２（アプライドバイオシステムズ社製）に供し、アミノ酸配列を解読した。
その結果、ｐＣＢ−Ｓｔｅ形質転換体から得られた天然型ＳＴＣＥ１は、スタフィロトリクム・ココスポラム  ＩＦＯ（現ＮＢＲＣ）  ３１８１７株由来のＳＴＣＥ１のＤＮＡ配列（配列番号５）と一致することを確認した。
一方、同様の手法によりＮ末端置換型ＳＴＣＥ１形質転換体から得られたＳＴＣＥ１はアミノ酸配列が解読できなかった。そこで、Ｐｆｕピログルタミン酸アミノペプチダーゼ（Ｐｆｕ  ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅ  ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ；タカラバイオ社製）を用いて修飾Ｎ末端を除去し、再度アミノ酸配列を解読した（配列番号４）。
これらの結果を基に、天然型ＳＴＣＥ１及びＮ末端置換型ＳＴＣＥ１のＮ末端アミノ酸及びその配列を比較するため、表７にまとめた。このことから構築した発現ベクター通りのＮ末端アミノ酸配列を有するＳＴＣＥ１であることが明らかとなった。【０１０８】
【表７】
0004644603.tif 000008
【０１０９】
（６）精製天然型ＳＴＣＥ１及び精製Ｎ末端置換型ＳＴＣＥ１のＥＧＵ活性の比較
実施例Ｂ２（５）により得られた精製された天然型ＳＴＣＥ１及びＮ末端置換型ＳＴＣＥ１のｐＨ１０又はｐＨ１０におけるＬＡＳ添加区のＥＧＵ活性を測定し、その低下の程度を比較した結果を表８に示す。表８はｐＨ１０のＥＧＵ活性を１００とし、その百分率で示した。【０１１０】
【表８】
0004644603.tif 000009
【０１１１】
その結果、ＬＡＳ添加区のＥＧＵ活性を比較すると、精製Ｎ末端置換型ＳＴＣＥ１は精製天然型ＳＴＣＥ１の約１．９倍に向上していた。【０１１２】
《実施例Ｂ３：ＳＴＣＥ１へのＮ末端付加配列の変更とベクターの構築、並びにトリコデルマ・ビリデへの形質転換及び活性評価》
（１）成熟Ｎ末端にピログルタミン酸のみを付加した発現ベクターの構築
ピログルタミン酸のみを付加したＳＴＣＥ１発現ベクターは、実施例Ｂ１により得られたプラスミドｐＣＢ１−Ｍ２にＳＴＣＥ１遺伝子のうち分泌シグナル配列を除いた成熟タンパク質翻訳領域を連結し、ｐＣＢ−Ｓｔｍ１１として構築した。
まず、ＳＴＣＥ１遺伝子の成熟タンパク質翻訳領域を、プライマーＳＴＣＥ−ＴｍＮＳｍａ及びＳＴＣＥ１−ＴＣＥＴ２２Ｉの組み合わせで、プラスミドｐＵＣ１１８−ＳＴＣＥｅｘ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２７）を鋳型にＰＣＲを用いて増幅し、得られる約１ｋｂｐのＰＣＲ産物をＳｍａＩ及びＥｃｏＴ２２Ｉで消化したものを調製した。これをＳｍａＩ及びＰｓｔＩで消化しておいたｐＣＢ１−Ｍ２と連結し、ｐＣＢ−Ｓｔｍ１１を構築した。以上のように構築されたベクターｐＣＢ−Ｓｔｍ１１を用いて形質転換されたトリコデルマ・ビリデは、ｐＱＡＤＧＫＳＴＲ（配列番号４１）のＮ末端アミノ酸配列［すなわち、天然型ＳＴＣＥ１のアミノ末端に１個のピログルタミン酸（ｐＱ）が付加した配列］を有するＳＴＣＥ１を生産する。【０１１３】
ＳＴＣＥ−ＴｍＮＳｍａ：ＧＧＣＣＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＣＣＧＡＴＧＧＣＡＡＧＴＣＧＡＣＣＣＧ（配列番号３５）【０１１４】
（２）ピログルタミン酸付加ＳＴＣＥ１のＥＧＵ活性比較
トリコデルマ・ビリデｓｔｒａｉｎ２へのｐＣＢ−Ｓｔｍ１１の形質転換は実施例Ｂ２（３）に従って行った。得られた形質転換体を国際公開第９８／１１２３９号パンフレットに準じて培養し、その培養上澄を得た。この培養上澄をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、約４５ｋＤａのＳＴＣＥ１のバンドが良好に検出される培養上澄を選抜した。この培養上澄のｐＨ１０及びｐＨ１０におけるＬＡＳ添加区のＥＧＵ活性を測定し、その低下の程度を実施例Ｂ２（４）の天然型ＳＴＣＥ１と比較した結果を表９に示す。表９はｐＨ１０のＥＧＵ活性を１００としてその百分率で示した。【０１１５】
【表９】
0004644603.tif 000010
その結果、ＬＡＳ添加区のＥＧＵ活性を比較すると、ピログルタミン酸付加ＳＴＣＥ１は天然型ＳＴＣＥ１の約１．６倍の活性を有すること判明した。【０１１６】
《実施例Ｂ４：ＳＴＣＥ１へのＮ末端付加配列の変更とベクターの構築、並びにトリコデルマ・ビリデへの形質転換及び活性評価》
（１）成熟Ｎ末端にピログルタミン酸を含む４アミノ酸を付加した発現ベクターの構築
ピログルタミン酸を含む４アミノ酸を付加したＳＴＣＥ１発現ベクターは、実施例Ｂ１により得られたプラスミドｐＣＢ１−Ｍ２にＳＴＣＥ１遺伝子のうち分泌シグナル配列を除いた成熟タンパク質翻訳領域を連結し、ｐＣＢ−Ｓｔｍ１２として構築した。
まず、ＳＴＣＥ１遺伝子の成熟タンパク質翻訳領域を、プライマーＳＴＣＥ−ＴｍＮＳｐｈ−２及びＳＴＣＥ１−ＴＣＥＴ２２Ｉの組み合わせで、プラスミドｐＵＣ１１８−ＳＴＣＥｅｘ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２７）を鋳型にＰＣＲを用いて増幅し、得られる約１ｋｂｐのＰＣＲ産物をＳｐｈＩ及びＥｃｏＴ２２Ｉで消化したものを調製した。これをＳｐｈＩ及びＰｓｔＩで消化しておいたｐＣＢ１−Ｍ２と連結し、ｐＣＢ−Ｓｔｍ１２を構築した。以上のように構築されたベクターｐＣＢ−Ｓｔｍ１２を用いて形質転換されたトリコデルマ・ビリデは、ｐＱＳＡＣＡＤＧＫＳＴＲ（配列番号４２）のＮ末端アミノ酸配列［すなわち、天然型ＳＴＣＥ１のアミノ末端に、４アミノ酸からなるペプチド（Ｎ末端がピログルタミン酸）が付加した配列］を有するＳＴＣＥ１を生産する。【０１１７】
ＳＴＣＥ−ＴｍＮＳｐｈ−２：ＧＧＧＣＡＴＧＣＧＣＣＧＡＴＧＧＣＡＡＧＴＣＧＡＣＣＣＧＣ（配列番号３６）【０１１８】
（２）ピログルタミン酸を含む４アミノ酸を付加したＳＴＣＥ１のＥＧＵ活性比較
トリコデルマ・ビリデｓｔｒａｉｎ２へのｐＣＢ−Ｓｔｍ１２の形質転換は実施例Ｂ２（３）に従って行った。得られた形質転換体を国際公開第９８／１１２３９号パンフレットに準じて培養し、その培養上澄を得た。この培養上澄をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、約４５ｋＤａのＳＴＣＥ１のバンドが良好に検出される培養上澄を選抜した。この培養上澄のｐＨ１０及びｐＨ１０におけるＬＡＳ添加区のＥＧＵ活性を測定し、その低下の程度を実施例Ｂ２（４）の天然型ＳＴＣＥ１と比較した結果を表１０に示す。表１０はｐＨ１０のＥＧＵ活性を１００としてその百分率で示した。【０１１９】
【表１０】
0004644603.tif 000011
その結果、ＬＡＳ添加区のＥＧＵ活性を比較すると、ピログルタミン酸を含む４アミノ酸付加型ＳＴＣＥ１は天然型ＳＴＣＥ１の約１．５倍の活性を有することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明のタンパク質は、天然型のセルラーゼと比較して、界面活性剤存在下でエンドグ
ルカナーゼ活性の低下が少ないことから、衣料用洗浄剤に配合した場合に有用である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のアミノ酸配列［シグナルペプチド（配列番号４３）及び成熟タンパク質（配列番号４４）］と、ファミリー４５に属する公知のエンドグルカナーゼであるＮＣＥ４［シグナルペプチド（配列番号４５）及び成熟タンパク質（配列番号４６）］及びＮＣＥ５［シグナルペプチド（配列番号４７）及び成熟タンパク質（配列番号４８）］の各アミノ酸配列とを比較した結果の内、そのＮ末端側配列に関する結果を示す説明図である。
【図２】図１に示す比較結果の内、そのＣ末端側配列に関する結果を示す説明図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１２２】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。配列番号６〜１０、１２〜１３、１５〜１８、２１〜２６、２８、３０〜３２、又は３５〜３６の配列で表される各塩基配列は、プライマーＭＮＣ−０２、プライマーＭＮＣ−０３、プライマーＭＫＡ−０５、プライマーＭＫＡ−０６、ｐＭＫＤ０１、プライマーｐＭＮ−Ｂａｍ、ｐＪＤ０１、プライマーＮＣＥ４−Ｎｅ、プライマーＮＣＥ４−Ｃｅ、プライマーＮＣＥ４−Ｎｓ、プライマーＮＣＥ４−Ｃｓ、プライマーＣＢｎ−Ｓｔｕ、プライマーＣＢｃ−Ｘｈｏ、プライマーＣＢ１−ＳｍＳｐｈ、プライマーＣＢ１−Ｂａｍ、プライマーＣＢ１−Ｐｓｔ、ｐＣＢ１−Ｍ２、ｐＣＢ１−Ｍ２、プライマーＳＴＣＥ１−ＴＮＥＲＶ、プライマーＳＴＣＥ１−ＴＣＥＴ２２Ｉ、プライマーＳＴＣＥ１−ＴｍＮＳｐｈ、プライマーＳＴＣＥ１−ＴｍＮＳｍａ、及びプライマーＳＴＣＥ１−ＴｍＮＳｐｈ−２であり、配列番号１１、１４、２７、又は２９の配列で表される各アミノ酸配列は、ｐＭＫＤ０１、ｐＪＤ０１、ｐＣＢ１−Ｍ２、及びｐＣＢ１−Ｍ２である。
【図１】
0004644603.tif 000012
【図２】
0004644603.tif 000013
【配列表】
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