(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）で表されるグリセロールキナーゼ活性を有する親タンパク質を構成するアミノ酸配列において第２６８番目のシステイン残基がセリン又はアスパラギンに、あるいは、第１１１番目のシステイン残基がバリンに置換されたことを特徴とする改変タンパク質。
（ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなり、かつグリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸からなり、かつグリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡを作成し、該ＤＮＡを組み込んだ組換えプラスミドを宿主細胞へ導入し、得られた形質転換体を栄養培地にて培養し、改変タンパク質を採取することを特徴とする改変タンパク質の製造法。
【請求項３】
グリセロールキナーゼ活性を有する親タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡとして、以下の（ｃ）または（ｄ）に記載されたＤＮＡを含有することを特徴とする請求項２に記載の改変タンパク質の製造法。
（ｃ）配列表・配列番号２に記載された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）（ｃ）の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつグリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定性が向上したグリセロールキナーゼ改変体、該グリセロールキナーゼ改変体をコードする遺伝子、および該グリセロールキナーゼ改変体の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリセロールキナーゼ（ＥＣ ３.５.２.１０）は、グリセロールをマグネシウムとＡＴＰに依存したリン酸化反応によって、グリセロール−３−リン酸に変換する反応を触媒する酵素である。グリセロールキナーゼは、１９３７年にKalckarによって、肝臓内に発見された（例えば、比特許文献１参照）。その後、ラット肝、ハト肝、キャンディダ・ミコデルマ（Candida mycoderma）、セルロモナス・フラビゲナ（Cellulomonas flavigena）、サーマス・フラバス（Thermus flavus）などからの精製が報告され（例えば、非特許文献２〜５および特許文献１参照）、生物全般に広く存在することが知られている。また、ヒト、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サーマス・フラバス（Thermus flavus）などから遺伝子のクローニングが報告されている（例えば、非特許文献６〜９参照）。特に、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）において、該酵素は詳しく研究されており、１９６７年にHayashiらによって精製され（例えば、非特許文献１０参照）、１９８８年にそのクローニングが報告されている（例えば、非特許文献１０参照）。また、遺伝子調節の研究、アロステリック阻害剤による阻害の研究など、幅広い研究がなされている。
【０００３】
一方、グリセロールキナーゼは実用面において、臨床検査薬用原料酵素として利用されている。すなわち、試料中の中性脂肪（トリグリセリド）をリパーゼで加水分解し、生じたグリセロールを該酵素によってグリセロール−３−リン酸に変換する。このグリセロール−３−リン酸は、グリセロール−３−リン酸酸化酵素を用いて比色定量法や、グリセロール−３−リン酸脱水素酵素を用いた紫外部吸収定量法などにより血中の中性脂肪測定に利用されている。
【０００４】
近年の生化学検査用臨床検査薬は、溶液状態の検査薬が主流となっている。そのため、液状での高い安定性が求められるようになっている。また、一般に液状検査薬は、長期保存を可能にするために防腐剤が添加されている。防腐剤は、試薬を保存している間の微生物の増殖を抑制することを目的として試薬に添加される物質であるが、この防腐剤が酵素を不安定化することがあるため、防腐剤に対する耐性が高いことも含めて安定性が高いことが検査薬用酵素に要求される性質の一つとなっている。
【０００５】
これまで高い熱安定性を示す酵素が液状診断薬で優れた保存性を有するとの観点から、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）やサーマス・フラバス（Thermus flavus）など好熱性細菌由来のグリセロールキナーゼが汎用されてきた。しかし、これらのグリセロールキナーゼは、防腐剤に対する耐性が比較的低いという問題を有していた。
【０００６】
本発明者らは、防腐剤に対する高い耐性を有するセルロモナス・エスピーＪＣＭ２４７１株（Cellulomonas sp. JCM2471）由来の新規なグリセロールキナーゼを単離し、遺伝子組換え技術によって高純度な該グリセロールキナーゼを安価に大量供給することを可能にした。しかしながら、該グリセロールキナーゼは、上記の好熱性細菌由来グリセロールキナーゼに比べて熱安定性が低いという弱点を有していた（特許文献２参照）。
【０００７】
【特許文献１】特開昭５６−１２１４８４号公報
【非特許文献１】H.Kalckar著, 「Enzymologia」,1937年,第2巻,p47
【非特許文献２】C.Bublitzら著, 「J.Biol.Chem.」,1954年,第211巻,p951
【非特許文献３】E.P.Kennedy著, 「Methods Enzymol.」,1962年,第5巻,p476
【非特許文献４】H.U.Bergmeyerら著, 「Biochem.」,1961年,第333号,p471
【非特許文献５】H.S.Huangら著, 「J.Ferment.Bioeng.」,1997年,第83号,p328
【非特許文献６】C.A.Sargentら著, 「Hum.Mol.Genet.」,1994年,第3巻,p1317
【非特許文献７】C.Holmbergら著, 「J.Gen.Microbial.」,1990年,第136巻,p2367
【非特許文献８】P.Pavlikら著,「Curr.Genet.」,1993年,第24巻,p21
【非特許文献９】H.U.Huangら著, 「Boichim.Biochem,Acta」,1937年,第2巻,p47
【非特許文献１０】S.Hayashiら著, 「J.Biol.Chem.」,1967年,第242巻,p1030
【非特許文献１１】D,W.Pettigrewら著, 「J.Biol.Chem.」,1988年,第263巻,p135
【特許文献２】特開２００４−１２１２３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、高い熱安定性を有し、かつ防腐剤に対しても高い耐性を示すグリセロールキナーゼを提供し、該酵素の中性脂肪およびグリセロールの定量への利用を可能とすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、親タンパク質をタンパク質工学的に改変することにより、高い熱安定性かつ防腐剤耐性を有する改変型グリセロールキナーゼを得ることに成功し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち本発明は、以下のような構成からなるものである。
項１．グリセロールキナーゼ活性を有する親タンパク質を構成するアミノ酸配列中のシステイン残基が他のアミノ酸に置換されたことを特徴とする安定化された改変蛋白質。
項２．他のアミノ酸がセリン、アスパラギン、バリンの何れかであることを特徴とする項１記載の安定化された改変蛋白質。
項３．グリセロールキナーゼ活性を有する親タンパク質が以下の（ａ）または（ｂ）であることを特徴とする項１記載の安定化された改変タンパク質。
（ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなり、かつグリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸からなり、かつグリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質。
項４．グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質が配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有し、該アミノ酸配列中の第２６８番目および／または第１１１番目のシステイン残基が他のアミノ酸に置換されたことを特徴とする項１記載の安定化された改変タンパク質。
項５．グリセロールキナーゼ活性を有する親タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡ中のシステイン残基をコードする塩基を他のアミノ酸をコードする塩基で置換した改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡを作成し、該ＤＮＡを組み込んだ組換えプラスミドを宿主細胞へ導入し、得られた形質転換体を栄養培地にて培養し、改変タンパク質を採取することを特徴とする安定化された改変タンパク質の製造法。
項６．他のアミノ酸がセリンまたはアスパラギンであることを特徴とする項５記載の安定化された改変タンパク質の製造法。
項７．親タンパク質が項３記載の（ａ）または（ｂ）のグリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質であることを特徴とする項５記載の安定化された改変タンパク質の製造法。
項８．グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質が配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有し、該アミノ酸配列中の第２６８番目のシステイン残基をコードする塩基および／または第１１１番目のシステイン残基をコードする塩基が他のアミノ酸をコードする塩基に置換されたことを特徴とする項７記載の安定化された改変タンパク質の製造法。
項９．グリセロールキナーゼ活性を有する親タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡとして、以下の（ｃ）または（ｄ）に記載されたＤＮＡを含有することを特徴とする項７記載の安定化された改変タンパク質の製造法。
（ｃ）配列表・配列番号２に記載された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）（ｃ）の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつグリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【発明の効果】
【００１１】
本発明による改変型グリセロールキナーゼは、高い熱安定性且つ防腐剤に対しても高い耐性を有し、臨床検査薬用酵素として優れた改変型グリセロールキナーゼを供給することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明のグリセロールキナーゼ改変体は、グリセロールキナーゼ活性を有する親タンパク質を構成するアミノ酸配列中のシステインが他のアミノ酸に置換されることにより安定化された改変型タンパク質である。本発明における「安定化」とは、例えば改変体（ａ）と改変前の親タンパク質（ｂ）を各々適当な緩衝液中に溶解して、適用な温度で一定期間保存した後の残存活性率が（ａ）＞（ｂ）となるような状態をいう。
「適当な温度で一定期間保存」の条件は、生体分子を含有する診断薬などが実際に長期保存される温度として汎用される２℃〜１０℃の冷蔵条件下で６ヶ月以上の保存を選択する。時間がない場合は、例えば、「４０℃、７日間保存」、または、「５０℃、１５分間保存」などの加速（苛酷）試験の条件が選択される。さらに好ましくは、適当な濃度の防腐剤を含有する条件である。
「適当な緩衝液」は、グリセロールキナーゼが作用するpＨ範囲で十分な緩衝能を持つよう、その種類と濃度を選べば特に限定されないが、例えば、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、または、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）などが選択される。診断薬用途を想定して、緩衝液にはさらに界面活性剤、塩類、キレート剤、防腐剤などを含んでいてもよい。
保存におけるグリセロールキナーゼの濃度は、特に限定されないが、通常の診断試薬に使用される濃度を想定した０．２〜３０Ｕ／ｍｌが好ましく選択される。さらに好ましくは１〜１０Ｕ／ｍｌである。
【００１４】
本発明の一実施態様としては、グリセロールキナーゼ活性を有する親タンパク質を構成するアミノ酸配列中のシステイン残基が他のアミノ酸に置換されたことを特徴とする安定化された改変蛋白質である。好ましくは、置換される他のアミノ酸がセリンまたはアスパラギンである安定化された改変タンパク質である。
【００１５】
本発明の改変に使用する親タンパク質は、特に限定されるものではないが、例えば公知のバチルス属やサーマス属、セルロモナス属等に由来するグリセロールキナーゼなどを用いることができる。なお、親タンパク質は天然型である必要はない。
【００１６】
本発明では一例として、サーマス・フラバスＤＳＭ６７４のグリセロールキナーゼを親タンパク質として用いた。本発明者らのグループは、これまでに特開平１１−９２７９号公報に開示されるように、サーマス・フラバスＤＳＭ６７４より抽出した染色体ＤＮＡよりグリセロールキナーゼ遺伝子の単離に成功し、そのＤＮＡの全構造を決定し、本グリセロールキナーゼ遺伝子工学的手法によって形質転換体に高生産させることに成功し、高純度な酵素を安価に大量供給することを可能にしている（特許文献３参照。）。サーマス・フラバスＤＳＭ６７４のグリセロールキナーゼのアミノ酸配列を、配列表の配列番号１に示す。また、これらのアミノ配列をコードするＤＮＡ配列を、配列表の配列番号２に示す。但し、本発明は配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有するグリセロールキナーゼを親タンパク質として改変したものに限定されるものでなく、本願発明の酵素特性の本質である安定性が損なわれない範囲で、更に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたものであっても良い。具体例には、グリセロールキナーゼの精製を簡素化するためにアミノ酸配列のＮ末端側、又はＣ末端側にヒスチジンタグを付加したものが例示される他、グリセロールキナーゼ活性を有する他の蛋白質を親タンパク質として用いたものであってもよい。
本発明の好ましい一実施態様としては、配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列中の第２６８番目のシステイン残基が他のアミノ酸に置換されたことを特徴とする安定化された改変蛋白質である。または該改変タンパク質をコードするＤＮＡである。
【００１７】
【特許文献３】特開平１１−９２７９号公報
【００１８】
本発明の好ましい一実施態様としては、配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列中の第２６８番目のシステイン残基が他のアミノ酸に置換されたことを特徴とする安定化された改変蛋白質である。本発明の別の好ましい実施態様としては、配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列中の第１１１番目のシステイン残基が他のアミノ酸に置換されたことを特徴とする安定化された改変蛋白質である。
【００１９】
本願発明の別の実施態様は、グリセロールキナーゼ活性を有する親タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡ中のシステイン残基をコードする塩基を他のアミノ酸をコードする塩基で置換した改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡを作成し、該ＤＮＡを組み込んだ組換えプラスミドを宿主細胞へ導入し、得られた形質転換体を栄養培地にて培養し、改変タンパク質を採取することを特徴とする安定化された改変タンパク質の製造法。本発明の安定化されたグリセロールキナーゼの製造方法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit；Stratagene製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００２０】
作製された改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリー（Escherichia coli）を宿主微生物とする場合にはpBluescript，pUC18などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリー W3110、エシェリヒア・コリーC600、エシェリヒア・コリーJM109、エシェリヒア・コリーDH5αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイJM109；東洋紡績製）を用いても良い。
【００２１】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変タンパク質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコ−ス，シュークロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培養温度は菌が発育し、改変蛋白質を生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、改変タンパク質が最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し改変タンパク質を生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。
【００２２】
培養物中の改変タンパク質を生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には常法に従って改変タンパク質が培養液中に存在する場合は、濾過，遠心分離などにより、改変タンパク質含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変タンパク質が菌体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加して改変タンパク質を可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００２３】
この様にして得られた改変タンパク質含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、精製された改変タンパク質を得ることができる。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例中、グリセロールキナーゼの活性は、以下のように測定した。ＡＴＰはオリエンタル酵母社より購入した。牛血清アルブミンはシグマアルドリッチ社より購入した。グリセロール−３−リン酸酸化酵素（コード番号G3O-301）、ペルオキシダーゼ（コード番号PEO-301）は東洋紡績製を使用した。その他の試薬はナカライテスク社より購入したものを使用した。
【００２５】
<グリセロールキナーゼ活性測定法>
グリセロールを基質とし、グリセロール−３−リン酸の生成量によって測定した。０．１％４−アミノアンチピリン水溶液１０ｍｌ、０．１％フェノール溶液２０ｍｌ、２７．５Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．９）に２０Ｕ／ｍｌの濃度に溶解したグリセロール−３−リン酸酸化酵素４０ｍｌ、２０ｍＭＭｇＣｌ２と４０ｍＭＡＴＰを含む２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．９）１０ｍｌを加え、これを以下の測定のための原液とした。各反応は、この測定原液３ｍｌに酵素溶液０．１ｍｌと０．３Ｍグリセロール水溶液０．０５ｍｌを添加し、混和後、３７℃に制御された分光光度計で５００ｎｍの吸光度を３〜４分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度変化を求めた（ΔＯＤｔｅｓｔ）。盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液（０．２％牛血清アルブミンを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液，ｐＨ７．５）を０．１ｍｌ加え、上記同様に操作を行って１分間当りの吸光度変化を求めた（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。得られた吸光度変化量より下記計算式に基づきグリセロールキナーゼの酵素活性を算出した。尚、上記条件で１分間に１マイクロモルのグリセロールをリン酸化する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
計算式
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝{ΔOD/min(ΔODtest−ΔODblank）×3.15(ml)×希釈倍率}／{13.3×1/2×1.0(cm)×0.1(ml)}
3.15(ml)：反応混液液量
13.3：キノン色素を上記測定条件下で測定した時のミリモル吸光係数
1/2：酵素反応で生成した過酸化水素の１分子から形成するキノン色素が1/2分子であることによる係数
1.0cm：セルの光路長
0.1(ml)：酵素サンプル液量
【００２６】
実施例１  グリセロールキナーゼの発現プラスミドの構築
サーマス・フラバスＤＳＭ６７４由来グリセロールキナーゼの発現プラスミドｐＧＹＫ１２は、特開平１１−９２７９号公報記載の方法に従って構築した。本発現プラスミドのサイズは、約４．２Ｋｂｐで、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトに、ＤＳＭ６７４由来グリセロールキナーゼをコードする遺伝子をコードする挿入ＤＮＡ断片を含む。その塩基配列を配列表の配列番号２に、また該塩基配列から推定されるグリセロールキナーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【００２７】
実施例２  グリセロールキナーゼ改変体発現プラスミドの構築
グリセロールキナーゼ遺伝子を含む発現プラスミドｐＧＹＫ１２と、配列表の配列番号３記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行い、更に塩基配列を決定して、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６８番目のシステインがセリンに置換されたグリセロールキナーゼ改変体をコードする組換えプラスミド（ｐＧＹＫＭ１）を取得した。
ｐＧＹＫ１２と、配列表の配列番号４記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、上記と同様の操作により、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６８番目のシステインがアルギニンに置換されたグリセロールキナーゼ改変体をコードする組換えプラスミド（ｐＧＹＫＭ２）を取得した。
ｐＧＹＫ１２と、配列表の配列番号５記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、上記と同様の操作により、配列番号１記載のアミノ酸配列の１１１番目のシステインがバリンに置換されたグリセロールキナーゼ改変体をコードする組換えプラスミド（ｐＧＹＫＭ３）を取得した。
【００２８】
実施例３  グリセロールキナーゼ改変体の作製１
ｐＧＹＫＭ１、ｐＧＹＫＭ２、ｐＧＹＫＭ３の各組換えプラスミドで、グリセールキナーゼ欠損株であるエシェリヒア・コリＫＭ１株（特開平１１−９２７９号公報参照）を、ジーン・パルサー用いたエレクトロポレーション法によりを形質転換し、該形質転換体をそれぞれ取得した。
５０ｍｌのLB培地を５００ｍｌ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンをとイソプロピル−β−D−チオガラクトシドをそれぞれ終濃度が１００μｌ／ｍｌと１ｍＭになるように添加した。この培地に１００μｌ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で予め３７℃、１２時間培養したエシェリヒア・コリーＫＭ１(ｐＧＹＫＭ１)の培養液を１ｍｌ接種し、３７℃で１６時間通気攪拌培養を行った。培養終了より菌体を遠心分離により集菌し、０．２ｍＭメルカプトエタノールを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した後、フレンチプレスにて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。この改変体をＧＹＫＭ１と命名した。ｐＧＹＫＭ２、ｐＧＹＫＭ３の各組み換えプラスミドによるエシェリヒア・コリＫＭ１株形質転換体についても、上記方法と同様にして粗酵素標品を取得した。これらの改変体をそれぞれＧＹＫＭ２、ＧＹＫＭ３と命名した。
【００２９】
比較例１  野生型グリセロールキナーゼの作製１
比較例として、ｐＧＹＫ１２によりエシェリヒア・コリＫＭ１株を形質転換体し、実施例３の方法と同様にして該形質転換体を培養して、改変前の親タンパク質を取得した。
【００３０】
実施例４  グリセロールキナーゼ改変体の評価１
実施例３で取得したグリセロールキナーゼ改変体（ＧＹＫＭ１、ＧＹＫＭ２、ＧＹＫＭ３）および比較例１で取得した改変前のグリセロールキナーゼをそれぞれ、５０℃で１５分間保存した後の残存酵素活性率（％）を測定した。また、その結果を表１に示す。表１から判るように本発明のグリセロールキナーゼ改変体は、改変前の親タンパク質と比べて液状安定性が向上していることが確認された。
【００３１】
【表１】
0004816103.tif 000002
【００３２】
実施例５  グリセロールキナーゼ改変体の評価２
実施例３で取得したグリセロールキナーゼ改変体（ＧＹＫＭ１、ＧＹＫＭ２、ＧＹＫＭ３）および比較例１で取得した改変前のグリセロールキナーゼにそれぞれ、防腐剤として０．０５％プロクリン３００（シグマアルドリッチ社）を加えたものを、４℃で９日間保存した後の残存酵素活性率（％）を測定した。その結果を表２に示す。表２から判るように本発明のグリセロールキナーゼ改変体は、改変前の親タンパク質と比べて液状安定性が向上していることが確認された。
【００３３】
【表２】
0004816103.tif 000003
【００３４】
実施例６  グリセロールキナーゼ改変体の作製２
実施例３で取得したｐＧＹＫＭ１、ｐＧＹＫＭ２、によるエシェリヒア・コリＫＭ１株の各形質転換体を、１００μｌ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間前培養した後、２ｍｌを１００μｌ／ｍｌのアンピシリンと１ｍＭのイソプロピル−β−D−チオガラクトシドを含む２００ｍｌのTerrific brothを接種し、３５℃で２０時間通気攪拌培養を行った。それぞれの培養終了液より菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、５ｍＭのＭｇＣｌ２共存下で５７℃、１６時間の熱処理後、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析を行った。更にＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）により分離・精製し、ＧＹＫＣＳ２６８、ＧＹＫＣＮ２６８の各精製酵素標品を得た。本方法により得られた標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示した。
【００３５】
比較例２  野生型グリセロールキナーゼの作製２
比較例２で取得したｐＧＹＫ１２によるエシェリヒア・コリＫＭ１株の形質転換体を、実施例５の方法と同様にして培養および精製を行い、改変前の親タンパク質の精製酵素標品を取得した
【００３６】
実施例７  グリセロールキナーゼ改変体の評価３
実施例６で取得した各グリセロールキナーゼ改変体（ＧＹＫＭ１、ＧＹＫＭ２）および比較例２で取得した改変前のグリセロールキナーゼの各精製酵素標品をそれぞれ、０．１％（Ｗ／Ｖ）トリトンＸ−１００と防腐剤として０．０２％２−メチルイソチアゾロン（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）を含むＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中に５Ｕ／ｍｌになるように加え、９℃で１４日間保存した後の残存酵素活性率（％）を測定した。その結果を表３に示す。表３から判るように本発明のグリセロールキナーゼ改変体は、改変前と比べて安定性が向上していることが確認された。
【００３７】
【表３】
0004816103.tif 000004
【００３８】
実施例８
上記実施例４、５、７において、２℃〜１０℃の冷蔵条件下で６ヶ月以上の保存下でも、本発明のグリセロールキナーゼ改変体は、改変前と比べて安定性が向上していることが推定される。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明によって、グリセロールキナーゼ活性を有する蛋白質を蛋白工学的手法により改変し、安定性が改良されたザルコシンオキシダーゼ改変体を供給することが可能となった。本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼは、臨床検査薬用原料酵素として中性脂肪測定試薬に適用することで、該試薬の保存安定性を向上させることができる。
【配列表】
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