(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流動性組成物の液体フィラメントを水性媒体上に施用してフィラメントのマトリックス構造を形成することを含む、フィラメント状多孔性膜の製造方法であって、流動性組成物が、水性媒体または体液媒体に適度に溶解性であるものから完全に混和性であるものまでにわたる製薬上許容できる有機溶媒中に溶解または分散された製薬上許容できる生分解性の熱可塑性ポリマーを含み、このポリマーは水性媒体または体液媒体に不溶性である方法。
【請求項２】
熱可塑性ポリマーの濃度が、有機溶媒中で10〜50重量％である請求項１記載の方法。
【請求項３】
熱可塑性ポリマーが生物腐食性である請求項１記載の方法。
【請求項４】
熱可塑性ポリマーが、そのポリマー主鎖中に繰り返しの官能基単位を含み、この官能基単位は、ヒドロキシカルボン酸エステル、ポリカルボン酸とポリオールのエステル、アミノカルボン酸アミド、ポリカルボン酸とポリアミンのアミド、ウレタン、カーボネート、無水物、エステルアミド、ジオキサノン、アセタール、ケタール、ホスファゼンおよびそれらの任意の組合せから選択される請求項１記載の方法。
【請求項５】
熱可塑性ポリマーが、ラクチド、グリコライド、カプロラクトン、ヒドロキシブチレートおよび、シュウ酸、マロン酸およびコハク酸から選ばれるジカルボン酸とC2〜C6ジオールとのエステルからなる群より選択される少なくとも１つのモノマー単位、ならびに種々のモノマー単位のランダム、規則的またはブロックの分布を有するコポリマーまたはターポリマーとしてのそれらの任意の組合せから形成される請求項４記載の方法。
【請求項６】
熱可塑性ポリマーがポリ（DL-ラクチド-コ-グリコライド）である請求項５記載の方法。
【請求項７】
有機溶媒が、脂肪族および脂環式のアルコールおよびポリオール、脂肪族、脂環式および芳香族のエステル、脂肪族および脂環式のラクタム、脂肪族および脂環式のラクトン、脂肪族および脂環式のアミド、脂肪族および脂環式のカーボネート、脂肪族および脂環式の酸、脂肪族および脂環式のエーテル、脂肪族および脂環式のスルホキシドおよびスルホン、複素環式化合物ならびに脂肪族および脂環式のケトンからなる群より選択される請求項１記載の方法。
【請求項８】
有機溶媒がN-メチル-2-ピロリドンである請求項７記載の方法。
【請求項９】
流動性組成物が、液体フィラメントを有効に形成させる粘度を有する請求項１記載の方法。
【請求項１０】
流動性組成物が、1,000〜90,000センチポイズ（１〜90Pa.s）のブルックフィールド相対粘度を有する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
流動性組成物の液体フィラメントを施用する工程が、流動性組成物を、噴霧、霧状化、シャワー化、霧雨化、噴出、霧化およびエアロゾル化からなる群から選択された手段により実施される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
流動性組成物の液体フィラメントを施用する工程が、流動性組成物をエアロゾル化することを含む請求項11記載の方法。
【請求項１３】
水性媒体がヒドロゲルである請求項１記載の方法。
【請求項１４】
ヒドロゲルが寒天である請求項13記載の方法。
【請求項１５】
フィラメントのマトリックス構造、フィラメント間空間および２つの表面を含むフィラメント状多孔性膜であって、フィラメント間空間が１つの表面から他の表面へと伸びる細孔を規定し、細孔は、１つの表面から他の表面へ変化しない断面寸法を有し、フィラメントは、水性流体または体液に不溶性である製薬上許容できる生分解性の熱可塑性ポリマーを含むフィラメント状多孔性膜。
【請求項１６】
熱可塑性ポリマーが、そのポリマー主鎖中に繰り返しの官能基単位を含み、この官能基単位は、ヒドロキシカルボン酸エステル、ポリカルボン酸とポリオールのエステル、アミノカルボン酸アミド、ポリカルボン酸とポリアミンのアミド、ウレタン、カーボネート、無水物、エステルアミド、ジオキサノン、アセタール、ケタール、ホスファゼンおよびそれらの任意の組合せから選択される請求項15記載のフィラメント状多孔性膜。
【請求項１７】
熱可塑性ポリマーが、ラクチド、グリコライド、カプロラクトン、ヒドロキシブチレートおよび、シュウ酸、マロン酸およびコハク酸から選ばれるジカルボン酸とC2〜C6ジオールとのエステルからなる群より選択される少なくとも１つのモノマー単位、ならびに種々のモノマー単位のランダム、規則的またはブロックの分布を有するコポリマーまたはターポリマーとしてのそれらの任意の組合せから形成される請求項16記載のフィラメント状多孔性膜。
【請求項１８】
熱可塑性ポリマーがポリ（DL-ラクチド-コ-グリコライド）である請求項17記載のフィラメント状多孔性膜。
【請求項１９】
フィラメントが0.01〜４μmの直径を有する請求項15記載のフィラメント状多孔性膜。
【請求項２０】
フィラメントが１〜240μmの長さを有する請求項15記載のフィラメント状多孔性膜。
【請求項２１】
フィラメント状多孔性膜が10〜100μmの厚さを有する請求項15記載のフィラメント状多孔性膜。
【請求項２２】
フィラメント状多孔性膜が20〜50μmの厚さを有する請求項21記載のフィラメント状多孔性膜。
【請求項２３】
細孔が５〜30μmの断面寸法を有する請求項15記載のフィラメント状多孔性膜。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
生分解性の担体または足場上でイン  ビトロ(in vitro)で細胞を増殖させた後、組織の修復または置換を必要とするヒト細胞へ移植する能力からは、有意の利益が引出せる。そのような組織工学のために増殖することができる細胞としては、新しい骨のための骨芽細胞、軟骨のための軟骨細胞、皮膚組織のための繊維芽細胞および目のための網膜色素上皮細胞(RPE)が挙げられる。
【０００２】
組織工学のこの側面に関するいくつかの研究がすでに報告されている。例えば、ミコス(Mikos)らは、細胞付着および移植のための、ポリ（グリコール酸）が結合した繊維構造を報告した（ジャーナル  オブ  バイオメディカル  マテリアルズ  リサーチ(J. of Biomedical Materials Research), Vol. 27, 183-189 (1993)）。彼らの調製法は、ポリ（グリコール酸）の不織繊維網目組織とポリ（L-乳酸）(PLLA)との間の複合材の形成、次いでPLLAマトリックスの熱処理および選択的溶解を含む。他の研究者らは、そのような細胞増殖のためにポリマーの多孔性シートを開発した。そのような多孔性膜上での細胞の増殖が証明されたが、そのようなアプローチは困難である。
【０００３】
組織工学の課題は、ほとんどの細胞が付着、増殖および細胞相互作用のための特別な表面を持つ必要があることによって複雑にされる。さらに、ある細胞は明確に異なる基礎および先端の特徴を有し、極性の性質であるので、それらは、適当に配向されるときにのみ適当に機能する。
【０００４】
したがって、それらの細胞が移植されたときに適当に機能するようなやり方で、イン  ビトロ(in vitro)で細胞を発達させ、増殖させる技術が必要である。このために、生分解性ポリマーが、そのような細胞の発達および増殖のための足場または担体として働くことが必要とされる。この足場は、増殖する細胞が組織化し、特定の細胞機能、例えば細胞付着、増殖ならびに、明確な基礎および先端の特徴の維持を発達させることを可能にしなければならない。
【０００５】
発明の概要
これらの必要性は、イン  ビトロ(in vitro)の細胞培養のための生分解性の足場およびその足場を製造する方法を提供する本発明によって満たされる。特に、生分解性の足場は、組織化、細胞、特に、特別な細胞機能を有する細胞の組織化、適当な付着および増殖のための適当な担体を提供する。
【０００６】
一般に、本発明は、フィラメント状の多孔性薄膜からなる生分解性の足場に関する。本発明はまた、フィラメント状多孔性膜の製造方法および、細胞増殖および組織工学のための足場を提供するためにフィラメント状多孔性膜を使用する方法に関する。
【０００７】
フィラメント状多孔性膜は、細胞（特定の機能を有する細胞および空間的な配向を必要とする細胞を含む）が付着し、増殖し、組織化するための担体として働くことができる。膜は、２つの表面を有するマトリックス構造を有し、主としてフィラメントからなる。フィラメントは、マトリックス構造中に細孔を規定する。細孔は、細孔の断面寸法が実質的に変化せずに、１つの表面から他の表面へと伸びる。フィラメントは、製薬上許容できる生分解性の熱可塑性ポリマーからなり、このポリマーは、製薬上許容できる有機溶媒に実質的に可溶性であり、水性媒体および体液に実質的に不溶性である。
【０００８】
本発明の方法は、固体のフィラメント状多孔性膜が形成されるようなやり方で、流動性の熱可塑性ポリマー溶液の液体フィラメントを水性媒体上に施用することによって行う。ポリマー溶液の粘度を調節し、溶液の液滴または多数小体積を形成する任意の技術によりポリマー溶液を施用することによって、溶液の引き伸ばされた多数小体積、すなわち液体フィラメントを形成することができ、これにより、滑らかな非多孔性のシートよりは、固体のフィラメント状多孔性膜の形成がもたらされる。
【０００９】
本発明のフィラメント状多孔性膜を使用する方法としては、細胞培養法における細胞増殖のための足場として膜を使用する方法が挙げられる。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明のフィラメント状多孔性の生分解性膜は、細胞（特定の機能を有する細胞および／または空間的な配向を必要とする細胞を含む）の適当な付着、増殖および組織化のための担体として働くことができる足場を提供する。この膜は、製薬上許容できる生分解性の熱可塑性ポリマーのフィラメントで形成される。このフィラメントはマトリックスへと配置され、そのフィラメント間空間が細孔を構成する。これらの細孔は実質的に、上表面および下表面を含む膜全体にわたって均質に分布される。膜および膜の細孔を形成するフィラメントのマトリックス配置は、細胞（特定の細胞機能が保たれる細胞を含む）の増殖を可能にし、促進するのに有効である。本発明の膜は、細胞移植のための適当な生分解性の足場を提供する。
【００１１】
本発明のフィラメント状多孔性膜を形成する方法は、フィラメントの組立ておよび本発明の膜を構成するマトリックスへとそれを配置することを可能にする。この方法は、流動性組成物の液体フィラメントを水性媒体上へ施用して固体フィラメントを形成することを含む。フィラメントの密度および配置が、膜のマトリックス構造を提供する。
【００１２】
流動性組成物は、製薬上許容できる生分解性の熱可塑性ポリマーの、製薬上許容できる有機溶媒中の溶液または分散液である。生分解性の熱可塑性ポリマーは実質的に、水性媒体および体液に不溶性である。有機溶媒は、水性媒体にわずかに可溶性であるものから完全に可溶性のものまでにわたる。
【００１３】
流動性組成物は、流動性組成物を小さい多数の別々の体積の溶液または分散液へと変えることができる任意のプロセスによって、液体フィラメントへと変えられる。これらの方法としては、例えば噴霧、霧状化(misting)、シャワー化(showering)、霧雨のようにする(drizzling)、噴出、霧化(atomizing)またはエアロゾル化(aerosolizing)が挙げられる。液体フィラメントの好ましい形成方法はエアロゾル化である。液体フィラメントは、水性媒体、好ましくは、液体フィラメントがその表面上にのるような高い表面張力を有する水性媒体の表面に施用される。水性媒体の表面上の流動性組成物の液体フィラメントは、固体フィラメントへと変形し、フィラメントはフィラメント状膜を構成するマトリックスを提供するように配置される。
【００１４】
本発明を限定するつもりはないが、通常の環境下では、流動性組成物の液滴の水性表面との接触は、フィラメントよりはシートまたは粒子を形成すると思われる。しかしながら、流動性組成物の粘度を調節することによって液体フィラメントが形成され、シートまたは粒子の代わりに固体フィラメントへと変形する。この驚くべき結果の実際のメカニズムは完全に理解されているわけではないが、流動性組成物の粘度がある範囲内にあるときには施用プロセス中に、多数の小体積の流動性組成物が液体フィラメントへと形成される。これらの液体フィラメントは、水性表面に衝突し、凝固して、重なり合う多孔性膜の固体フィラメントを形成する。
【００１５】
定義
「生分解性」という語は、この特徴を有する物質、例えば熱可塑性ポリマーが、酵素の作用、加水分解作用および／または他の同様のメカニズムによって、ある時間にわたって分解することを意味し、生物腐食性(bioerodable)および生物吸収性(bioabsorbable)のような特徴を包含する。
【００１６】
「生物腐食性(bioerodible)」という語は、この特徴を有する物質、例えばマトリックスが、少なくとも部分的に、周囲の組織流体において見出される物質との接触または細胞作用により、ある時間にわたってその表面で腐食するかまたは分解することを意味する。
【００１７】
「生物吸収性(bioabsorbable)」という語は、この特徴を有する物質、例えば熱可塑性ポリマーマトリックスが、例えば細胞または組織によって、壊され、生体内に吸収されることを意味する。
【００１８】
「生物適合性」および「製薬上許容できる」という語は、これらの特徴を有する物質、例えば熱可塑性ポリマー、溶媒および得られるフィラメント状多孔性膜が、移植部位に実質的な炎症または壊死を引き起こさないことを意味する。
【００１９】
「流動性」という語は、この特徴を有する物質、例えば熱可塑性ポリマー溶液が、取り扱い可能であり、開口を通して運ぶことができ、かつ一定の形を維持できないことを意味する。流動性のものは、低粘度または水のようなコンシステンシーを有する処方物から、高粘度を有するもの、例えばペーストのような物質までを包含する。有利なことに、熱可塑性ポリマー処方物の流動性は、それが水性媒体上のでこぼこ、裂け目、割れ目および／または穴に適合することを可能にする。
【００２０】
「特別の細胞機能」は、細胞付着、細胞増殖および細胞分化の維持のような細胞機能を意味する。
【００２１】
「液体フィラメント」という語は、非球状の、ひものような、または引き伸ばされた体積の液体物質を意味する。流動性組成物の粘度が十分に高いかまたはさもなければある範囲内にあるときに、その長さは幅よりはるかに大きくなることができる。
【００２２】
「液体フィラメントを施用する」とは、液体フィラメントの任意の製造方法、例えば噴霧、霧状化(misting)、シャワー化(showering)、霧雨のようにする(drizzling)、噴出、霧化(atomizing)またはエアロゾル化を用いることを意味する。
【００２３】
熱可塑性ポリマー
本発明において有用な熱可塑性ポリマーは、生分解性である熱可塑性ポリマーを含む。熱可塑性ポリマーは実質的に水性媒体または体液媒体に不溶性であるが、水溶性の担体または溶媒に実質的に溶解して流動性組成物を形成することができる。流動性組成物と水性媒体との間の接触があると、流動性組成物中の熱可塑性ポリマー成分は凝固するかまたは沈殿して、固体物質を形成し、溶媒成分は水性媒体中へ消散する。これらの特徴を有する流動性組成物は一般に、米国特許第4,938,763号；第5,077,049号；第5,324,519号；第5,632,727号；第5,599,552号；第5,702,716号；5,487,897号；5,660,849号；第5,278,201号；第5,198,220号；第5,447,725号および第5,242,910号に記載されており、その開示は、参照することにより本明細書に組入れられる。
【００２４】
熱可塑性ポリマー溶液において使用するのに適当な熱可塑性ポリマーとしては一般に、先の特徴を有する任意のものを含む。適当な熱可塑性ポリマーは、ポリマー主鎖中に繰り返しの官能基単位を有するものを含み、例えば、これらに限定されることはないが、エステル（ヒドロキシカルボン酸から形成されるものおよび、ポリカルボン酸とポリオールから形成されるものを含む）、アミド（アミノカルボン酸から形成されるものおよび、ポリカルボン酸とポリアミンから形成されるものを含む）、ウレタン、カーボネート、無水物、エステルアミド、ジオキサノン、アセタール、ケタールおよびホスファゼンのような官能基単位が挙げられる。そのようなポリマーの構造的種類は、米国特許第4,938,763号；第5,077,049号；第5,324,519号；第5,632,727号；第5,599,552号；第5,702,716号；5,487,897号；5,660,849号；第5,278,201号；第5,198,220号；第5,447,725号および第5,242,910号に記載されており、その開示は、参照することにより本明細書に組入れられる。好ましい熱可塑性ポリマーは、その主鎖中に繰り返しのエステル単位を有する。特に好ましい熱可塑性ポリマーは、ラクチド、グリコライド(glycolide)、カプロラクトン、ヒドロキシブチレート、シュウ酸、マロン酸またはコハク酸から選ばれるジカルボン酸とC2〜C6ジオールとのエステルのようなモノマー単位から誘導されるものおよび、種々のモノマー単位のランダム、規則的またはブロックの分布を有するコポリマーまたはターポリマーとしてのそれらの任意の組合せである。
【００２５】
流動性組成物のブルックフィールド相対粘度測定は、熱可塑性ポリマーの濃度、熱可塑性ポリマーと溶媒との間の相互作用および熱可塑性ポリマー自体の分子量を示す。流動性組成物の相対粘度は、いかに容易に、またはいかにゆっくりとそれが流れるかを決定する。相対粘度はまた、流動性組成物が、合体して粒子またはシートを生じる球状液滴を形成するか、または合体して固体フィラメントを生じる引き伸ばされた液滴（液体フィラメント）を形成するかを決定する。一般に、流動性組成物のブルックフィールド相対粘度は、本発明のフィラメント膜を形成するために、約1,000〜約90,000センチポイズ(cps)（約１〜約90Pa.s）、好ましくは1,000〜約10,000cps（１〜10Pa.s）の範囲にある。
【００２６】
有機溶媒
流動性組成物において使用するのに適当な有機溶媒は、製薬上許容できるものであり、少なくとも部分的に熱可塑性ポリマーを溶解する。本発明に従えば、溶媒は、適度に溶けるから完全に混和するまでの範囲にわたる、水性媒体中の溶解性を有し、水、ヒドロゲル、寒天等のような水性媒体中に拡散することができる。
【００２７】
本発明のために適当な製薬上許容できる有機溶媒の種類としては、脂肪族および脂環式のアルコールおよびポリオール、脂肪族、脂環式および芳香族のエステル、脂肪族および脂環式のラクタム、脂肪族および脂環式のラクトン、脂肪族および脂環式のアミド、脂肪族および脂環式のカーボネート、脂肪族および脂環式の酸、脂肪族および脂環式のエーテル、脂肪族および脂環式のスルホキシドおよびスルホン、複素環式化合物ならびに脂肪族および脂環式のケトンが挙げられる。そのような有機溶媒の例は、米国特許第4,938,763号；第5,077,049号；第5,324,519号；第5,632,727号；第5,599,552号；第5,702,716号；5,487,897号；5,660,849号；第5,278,201号；第5,198,220号；第5,447,725号および第5,242,910号に開示されたものを含み、その開示は、参照することにより本明細書に組入れられる。詳細な例としては、N-メチル-2-ピロリドン(NMP)、2-ピロリドン、プロピレンカーボネート、エチレンカーボネート、ジメチルカーボネート、酢酸、乳酸、ヘプタン酸、酢酸2-エトキシエチル、酢酸エチル、酢酸メチル、乳酸エチル、酪酸エチル、マロン酸ジエチル、ジエチルグルトネート(glutonate)、クエン酸トリブチル、コハク酸ジエチル、トリブチリン(tributyrin)、ミリスチン酸イソプロピル、アジピン酸ジメチル、コハク酸ジメチル、シュウ酸ジメチル、クエン酸ジメチル、クエン酸トリエチル、クエン酸アセチルトリブチル、グリセリルトリアセテート、アセトン、メチルエチルケトン、2-エトキシエタノール、エチレングリコールジメチルエーテル、グリコフロール、グリセロールホルマール、1,3-ブチレングリコール、イソプロピリデングリコール、2,2-ジメチル-1,3-ジオキソロン-4-メタノール；ソルケタール(Solketal)、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルスルホン、テトラヒドロフラン、M-カプロラクトン、ブチロラクトン、カプロラクタム、例えばN,N-ジメチル-m-トルアミドおよび1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オンならびに有機溶媒の２種以上の任意の混合物が挙げられる。
【００２８】
溶媒の選択はまた、その蒸発速度および、それが流動性組成物からの熱可塑性ポリマーの凝固を促進する速度に依存する。蒸発速度は、液体フィラメント中のポリマー濃度に影響を及ぼし、ポリマー濃度が劇的に変化すると凝固の物理的形態を変える。一般に、有機溶媒は、液体フィラメント形成および固体フィラメントへの移行中に最小の蒸発しか生じないように選択される。凝固促進速度は、有機溶媒の水への溶解性に依存する。非常に可溶性の溶媒は凝固を急速に促進し、一方、わずかに可溶性の溶媒はゆっくりした速度で凝固を促進する。一般に、凝固速度は、フィラメント形成が生じることができるように適度である。
【００２９】
流動性組成物中の熱可塑性ポリマーの濃度はまた、フィラメントを形成する能力に影響する。一般に、この濃度は、溶媒1ml当たり熱可塑性ポリマー約0.01グラムからほぼ飽和濃度までの範囲にわたることができ、好ましくは1ml当たり約0.1グラム〜1ml当たり約2.0グラム、より好ましくは1ml当たり約0.1グラム〜1ml当たり約0.7グラムである。
【００３０】
フィラメント状多孔性膜の形成
一般に、本発明のフィラメント状多孔性膜は、流動性組成物を水性媒体と接触させることによって形成される。流動性組成物は水性媒体に、流動性組成物を液体フィラメントへと変える任意の技術によって施用することができる。例えば、流動性組成物は、噴霧、霧状化(misting)、シャワー化(showering)、霧雨のようにする(drizzling)、噴出、霧化(atomizing)またはエアロゾル化によって施用することができる。エアロゾル化が、好ましい施与方法である。というのは、それは、均質性および細孔径を最大にしながら、水性媒体へ施用される流動性組成物の量を最小にするからである。典型的には、流動性組成物をアトマイザーまたはスプレー  ガンの貯蔵器に入れ、不活性気体の圧力によってエアロゾル化する。エアロゾル流は、水性媒体に向かって進み、水性媒体と接触し、水性媒体の表面で液体フィラメントを形成する。水性媒体は好ましくは、流動性組成物の液体フィラメントが媒体中に沈まないがその表面にとどまるような、高表面張力、高密度および／または高粘度を有する。液体フィラメントを水性媒体に施用すると、熱可塑性ポリマーが固体へと凝固するにつれて、液体フィラメントは固体フィラメントへと変わる。その結果、凝固しているポリマーが固体としてフィラメント形態をとる。フィラメント状多孔性膜は、一般に約10μm〜約100μm、より好ましくは約20μm〜約50μmの厚さを有する。
【００３１】
フィラメント状多孔性膜の構造
フィラメント状多孔性膜のマトリックス構造は、最小で約1μmの大きさである細孔を規定する。細孔はまた、約1μm〜約30μm、好ましくは5μm〜10μmの大きさの範囲にある。フィラメントの直径は、約0.01〜4μm、好ましくは0.1〜2μmであり、長さは、約1〜240μm、好ましくは1〜100μmである。細孔は、細孔内に細胞を付着させ、増殖させるのに十分大きく、膜のフィラメント特性は、栄養培地が、一部、例えば基礎または先端部分のみだけというよりは、細胞のすべての表面に拡散し、これを浸すことを可能にする。
【００３２】
本発明の膜のマトリックス構造は、実質的に均質にマトリックス構造全体にわたって、１つの表面から他の表面へと伸びる細孔を有する２つの表面を有する。よって、マトリックス構造の細孔は、表面を通して連絡している。一般に、フィラメント状多孔性膜は、マトリックス構造全体にわたって約20％〜約90％、好ましくは約60％〜90％の範囲の多孔度を有する。
【００３３】
フィラメント状多孔性膜の使用
フィラメント状多孔性膜は、細胞増殖および組織工学、例えば細胞付着、細胞増殖および分化した細胞機能の維持を可能にする足場として使用することができる。例えば、フィラメント状多孔性膜は、配向した細胞、例えばRPEまたは骨芽細胞を培養するための足場として使用できる。そのような足場として使用されるフィラメント状多孔性膜は、直径0.1〜2ミクロンおよび長さ1〜100ミクロンのフィラメント寸法を有し、膜は、5〜10ミクロンの細孔径で60〜80％の多孔度を有する。
【００３４】
使用する場合には、膜は栄養培地、例えばダルベッコ (Dulbecco)の最小必須培地および生体組織から膜へ移された分化した細胞と合わせられる。細胞培養物をインキュベートすることによって、細胞が、膜全体のフィラメント間空間の細孔中に付着し、増殖し、繁殖することを可能にする。フィラメント状多孔性膜および分化した細胞からなるこの構成物は、患者への細胞移植のために使用することができる。この構成物は、分化した細胞の正確な移植およびあるいは正確な配向を促進する。熱可塑性ポリマーの分解が進むにつれて、適当な機能およびあるいは正確な配向を有する再生された分化細胞が、細胞機能およびあるいは配向に依存する細胞相互作用が再確立されるようにして、確立される。
【００３５】
種々の特定の好ましい実施態様および技術に関して本発明を記載してきた。しかしながら、本発明の意図および範囲内にあって多くの変更および変形がなされ得ることを理解すべきである。
【００３６】
実施例
実施例１
流動性熱可塑性ポリマー溶液の処方
ポリマーの50モル％がグリコライドである、熱可塑性コポリマーのポリ（DL-ラクチド-コ-グリコライド）(PLG)を、N-メチル-2-ピロリドン(NMP)に溶解した。固有粘度(IV)1.03dl/gを有するこのコポリマーは、バーミンガム  ポリマーズ社(Birmingham Polymers, Inc.)(BPI)から購入することができた。20gのコポリマーおよび80gのNMPをガラスびんに入れることによって調製したコポリマー溶液を最初に、スパチュラまたは木の棒で混合した。窒素でパージしたびんを１時間室温に保持した後、室温のシェーカーに入れた。ポリマーがすべて溶液になるまで（一般に24〜48時間）、内容物を振り混ぜた。
【００３７】
実施例２〜12
さらなるPLGのコポリマー、酸末端基を有するポリ（DL-ラクチド-コ-グリコライド）(PLG-H)およびポリ（DL-ラクチド-カプロラクトン）(PLC)を、実施例１に記載したのと同じ方法を用いて、NMPに溶解した。コポリマーの製造業者は、バーミンガム  ポリマーズ社(Birmingham Polymers, Inc.)(BPI)またはベーリンガー  インゲルハイム(Boehinger Ingelheim)(BI)であった。組成、固有粘度、製造業者および溶液濃度を表１にまとめる。
【００３８】
【表１】
0004686654.tif 000002
【００３９】
実施例13
実施例１の流動性組成物から膜を製造した。エアロゾル  アプリケーター（エア  ブラシ(Air Brush)、ベジャー  モデル(Badger Model) 150）を高圧ガス源（窒素ガス）に連結し、ユニットの中にアセトンを噴霧して約15〜30秒間清浄した。アセトン残留物を完全に除去した後、ポリマー処方を含む1ccのガラスびんをアプリケーターに付けた。エアロゾルユニットを、滅菌した精製寒天プレート上で作動させた。ユニットをプレートから約3〜6インチ（約7.62〜15.24cm）に保持して、寒天プレートから膜を吹き飛ばすのを避け、円形の動きで動かして平らな範囲を確保した。
【００４０】
15秒後に、エアロゾルユニットを止めた。膜厚を決定する作動時間は、膜の外観に基づく。すなわち、厚さが約50μmであるときには表面がつや消しにされ、平らであるように見えるが、厚さが約70μmを超えるときには光沢があるように見える。
【００４１】
ピペットを用いて、寒天プレートを約25mlの滅菌水で満たして、寒天表面上に膜を浮かべた後、回転させて水を膜の下に流れさせた。寒天プレートから膜を除くために、滅菌したピンセットによって、１片のテフロンを膜の下に置いた。テフロン片および膜をペトリ皿に移した。約25mlの滅菌水をペトリ皿に加え、テフロン片を除去した。15分後、すすぎ水を除去し、膜をさらに25mlの滅菌水で洗浄した。ペトリ皿から除去するために、テフロン片を膜の下に置いた。膜を、層流フード(laminar flow hood)中のテフロン片上で１晩乾燥させた。
【００４２】
膜を小片（約10x10mm）に切断し、ATRISORB（商標）ケースハウジングに入れ、窒素でパージした袋に入れた。膜片を、14kGy+/-10％でのガンマ線照射を用いて滅菌した。これは、膜当たり約1CFUの生物負荷量（bioburden level）での10-6無菌保証レベル(sterility assurance level)(SAL)に相当する。
【００４３】
デジタルカリパス(digital caliper)で測定した膜厚は、照射前では35〜60μm（平均43μm）で変動し、照射後には25〜50μm（平均35μm）で変動した。全体にわたって膜の取り扱い特性は非常に良好であった。
【００４４】
実施例13〜24
実施例13について記載した方法を用いて、実施例２〜12で製造した流動性組成物からさらに膜を製造した。表2は、膜特性の概要を含む。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
実施例25〜46
実施例１に記載したようにして、PLG、(PLG-H)およびポリ（DL-ラクチド）(PLA)の流動性組成物を製造した。ポリマーの組成、固有粘度、製造業者および溶液濃度を表３にまとめる。
【００４７】
【表３】
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【００４８】
実施例47〜68
実施例25〜46で製造した流動性組成物から膜を製造した。エアロゾル  アプリケーター（エア  ブラシ(Air Brush)、ベジャー  モデル(Badger Model) 150）を高圧ガス源（窒素ガス）に連結し、ユニットの中にアセトンを噴霧して約15〜30秒間清浄した。アセトン残留物を完全に除去した後、ポリマー処方を含む3ccのガラスびんをアプリケーターに付けた。エアロゾルユニットを、滅菌した精製寒天プレート上で作動させた。ユニットをプレートから約3〜6インチ（約7.62〜15.24cm）に保持して、寒天プレートから膜を吹き飛ばすのを避け、円形の動きを用いて平らな範囲を確保した。
【００４９】
ピペットを用いて、寒天プレートを約25mlの滅菌水で満たして、寒天表面上に膜を浮かべた後、回転させて水を膜の下に流れさせた。寒天プレートから膜を除くために、滅菌したピンセットによって、１片のテフロンを膜の下に置いた。テフロン片および膜をペトリ皿に移した。約25mlの滅菌水をペトリ皿に加え、テフロン片を除去した。15分後、すすぎ水を除去し、膜をさらに25mlの滅菌水で洗浄した。ペトリ皿から除去するために、テフロン片を膜の下に置いた。膜を、層流フード(laminar flow hood)中のテフロン片上で１晩乾燥させた。
【００５０】
膜の片をびんの中に入れ、-86℃で約１時間凍結させ、１晩凍結乾燥させて膜を完全に乾燥した。デジタルカリパスを用いて厚さを測定した。次に、走査電子顕微鏡(SEM)で見るために、膜を固定し、金で被覆した。膜の構造を特性決定し、表４に報告した。
【００５１】
ブルックフィールド相対粘度を、各流動性組成物について測定した。
【００５２】
【表４】
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【００５３】
実施例69〜77
ヒト骨芽細胞のイン  ビトロ(in vitro)増殖について、実施例13〜23からの膜を評価した。骨芽細胞を、10％子ウシ胎児血清および2mMのグルタミンを含む細胞増殖培地RPMI 1640中で３週間増殖させた。膜の臨床的取扱い特性ならびに骨芽細胞の付着および増殖を評価した。結果を表５にまとめる。
【００５４】
【表５】
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【００５５】
【表６】
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【００５６】
実施例78〜86
ヒト胎児網膜色素上皮球状体(Human Fetal Retinal Pigment Epithelial Sheroid)(HFRPE)のイン  ビトロ(in vitro)増殖について、実施例13〜23からの膜を評価した。HFRPE細胞のシートを分離し、ダルベッコ (Dulbecco)の最小必須培地の存在中で膜にゆるく付着させた。48〜72時間以内に、細胞は、ポリマー膜にしっかりと付着した。HFRPE細胞は増殖し、試験した膜の各片を覆った。細胞は、脱分化しなかったが、これは、膜が適当な付着構造を提供するという重要なことを示す。細胞は、多数の先端微絨毛を有する立方形の形態を有していた。HFRPE細胞は、その基礎側に細胞外マトリックス（コラーゲンタイプIV）を生成し、膜の細孔を満たした。すべての分離した細胞は着色され、サイトケラチンを発現した。イン  ビボ(in vivo)で、移植した膜は、ウサギの目になんら炎症の兆しもなく、２〜３週間以内に分解した。
【００５７】
【表７】
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【００５８】
【表８】
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【００５９】
実施例87：SEM写真
実施例13、15、18および23のようにして製造した膜をびんに入れ、-86℃で約１時間凍結させ、１晩凍結乾燥させて膜を完全に乾燥した。デジタルカリパスを用いて厚さを測定した。次に、走査電子顕微鏡(SEM)で見るために、膜を固定し、金で被覆した。各膜の構造を特性決定した。
【００６０】
実施例13からの膜を図１（2020ｘ)および図２（断面、2020ｘ)において見ることができる。膜は、互いに編み合わされて網のようなマトリックスを形成する、幅の変化する多数のフィラメントからなる。実施例23からの膜は、図３（2020ｘ)において見ることができる。また、実施例23の膜は、網のようなマトリックスを形成するフィラメントからなる。実施例23は、実施例13より大きいフィラメントを有するように思われる。両方の膜が、フィラメント間に10μmより大きいボイドスペース(void space)を有し、これは、細胞が付着し、増殖するのに最適の大きさである。
【００６１】
実施例15からの膜は、図４（1010ｘ)において見ることができる。この膜は、細胞増殖実験のためにはもろすぎ、１つの側では多孔性であるが、反対側では非多孔性であるように思われる。実施例18からの膜は、図５（2020ｘ)において見ることができる。この膜は、大体は滑らかでプレート様表面およびいくらかの非常に小さい細孔を有していた。実施例15も実施例18もポリマーの１つの側から他の側へ伸びる細孔を有していなかった。同様に、どちらの膜もフィラメント状ではなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、膜の走査電子顕微鏡写真であり、本発明の膜を説明するものである。
【図２】 図２は、膜の走査電子顕微鏡写真であり、本発明の膜を説明するものである。
【図３】 図３は、膜の走査電子顕微鏡写真であり、本発明の膜を説明するものである。
【図４】 図４は、膜の走査電子顕微鏡写真であり、本発明の他の種類の膜を説明するものである。
【図５】 図５は、膜の走査電子顕微鏡写真であり、本発明の他の種類の膜を説明するものである。
【図６】 図６は、膜の走査電子顕微鏡写真であり、本発明の他の種類の膜を説明するものである。
【図７】 図７は、膜の走査電子顕微鏡写真であり、本発明の他の種類の膜を説明するものである。
【図８】 図８は、膜の走査電子顕微鏡写真であり、本発明の膜を説明するものである。
【図９】 図９は、膜の走査電子顕微鏡写真であり、本発明の膜を説明するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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