(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
厳重に調節されるプロモーターを含有するプラスミドであって、該プロモーターがグラム陰性細菌のペプチドグリカン結合リポタンパク質（ＰＡＬ）をコードする単離され精製されたＤＮＡ配列に機能し得るように連結されたものであり、かつ、該プロモーターがアラビノース誘導性プロモーターまたはＴ７プロモーターである、前記プラスミド。
【請求項２】
ＰＡＬがヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）（H. influenzae）のＰ６タンパク質である請求項１記載のプラスミド。
【請求項３】
プロモーターがアラビノース誘導性プロモーターである請求項１または２記載のプラスミド。
【請求項４】
プラスミドが図１に記載された制限地図ｐＰＸ４０２０で表される請求項１〜３のいずれかに記載のプラスミド。
【請求項５】
プロモーターがＴ７プロモーターである請求項１または２記載のプラスミド。
【請求項６】
プラスミドが図１に記載された制限地図ｐＰＸ４０１９で表される請求項５記載のプラスミド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかかに記載のプラスミドで形質転換、形質導入またはトランスフェクションした細菌宿主細胞。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかかに記載のプラスミドで細菌宿主細胞を形質転換、形質導入またはトランスフェクションする工程、及び
こうして得られた宿主細胞を、該宿主細胞により脂質化された形態の組換えＰＡＬの発現を可能にする条件下で培養することを含んでなる、脂質化された組換えＰＡＬの製造方法。
【請求項９】
ＰＡＬがヘモフィルス・インフルエンゼのＰ６タンパク質である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
脂質化された組換えＰＡＬを含んでなり、かつ、哺乳動物宿主において防御免疫応答を引き出す抗原性組成物の製造おける請求項１〜６のいずれかに記載のプラスミドの使用。
【請求項１１】
ＰＡＬがヘモフィルス・インフルエンゼのＰ６タンパク質である請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
１またはそれ以上の希釈剤または担体をさらに含んでなる請求項１０または１１記載の使用。
【請求項１３】
少なくとも一つのアジュバントをさらに含んでなる請求項１０〜１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
アジュバントが水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ＳｔｉｍｕｌｏｎTM ＱＳ−２１、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ、ＩＬ−１２、エシェリキア・コリ（E. coli）の非耐熱性毒素及び野生型または突然変異体コレラ毒素の少なくとも一つよりなる群から選択される請求項１３記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、グラム陰性細菌のペプチドグリカン結合タンパク質の脂質化された形態の発現及び抗原性組成物におけるこの組換えの脂質化されたタンパク質の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
グラム陰性細菌の細胞壁は、ペプチドグリカンとして知られている架橋された成分を含有する。多数のグラム陰性細菌は、ペプチドグリカンに共有結合的に結合しているタンパク質を生産する。そのようなタンパク質はペプチドグリカン結合リポタンパク質（ＰＡＬ）と呼ばれる。ＰＡＬは、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）（参考文献一覧表記載１）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）（２）、ヘモフィルス・デュクレイ（Haemophilus ducreyi）（３）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）（４）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）（５）、ブルセラ・アボルツス（Brucella abortus）（６）、シュードモナス・アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、クレブシエラ・エアロゲネス（Klebsiella aerogenes）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、プロテウス・ブルガリス（Proteus Vulgaris）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）（７）、アクチノバシラス・プレウロニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）（８）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）（９）、クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）（１０）及びクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）（１１）を包含する多数のグラム陰性細菌におけるｔｏｌ遺伝子座の一部として存在する。
【０００３】
他のＰＡＬ含有細菌は、ヘモフィルス・インフルエンゼ（H. influenzae）細菌である。ヘモフィルス・インフルエンゼ細菌は２群に分類される。既知の莢膜を有する株は、基準抗血清と莢膜との血清学反応により型が決定される。ａ−ｆ型が同定されている。基準抗血清のいずれとも反応することができない株は、型が決定できないとして知られている。
【０００４】
ヘモフィルス・インフルエンゼｂ型（Ｈｉｂ）は、米国における新生児髄膜炎及び他の侵襲性感染の最もよくある原因である（１２）。小児期髄膜炎の主要な発生は１〜５歳の年齢の間に起こる。Ｈｉｂによる髄膜炎の症例の６０％は、２歳未満の子どもにおいて起こる（１２）。
【０００５】
型の決定できないヘモフィルス・インフルエンゼ（ＮＴＨｉ）は、成人における肺炎、菌血症、髄膜炎、産褥性敗血症及び急性熱性気管気管支炎を包含する多数の疾患を引き起こすグラム陰性生物体である（１３）。ＮＴＨｉは、幼い子どもにおいて見られる中耳炎の全ての症例の２０〜４０％を引き起こすことが報告されている（１４，１５，１６）。感染は長く持続する免疫を与えないので、子どもは同じ生物体による複数の感染を体験する可能性がある。中耳炎の慢性または反復発生に対する現在の治療には、抗生物質の投与及び内耳に入れるためのチューブの挿入が包含される。ＮＴＨｉ株はまた、副鼻腔炎の主要な原因としても結びつけられている（１７）。さらに、ＮＴＨｉは新生児敗血症を引き起こす。
【０００６】
現在の莢膜に基づく抗原性組成物はＮＴＨｉに対して効果がない。これらの細菌の表面は非常に抗原性的に多様であることが示されており、主要な外膜タンパク質、Ｐ１及びＰ２は特に多様である（１８，１９）。ヒトにおいて、血清殺菌性抗体の存在は、感受性ＮＴＨｉ株により引き起こされる中耳炎からの防御と相関関係があることが報告されている（２０）。
【０００７】
ＮＴＨｉに対する抗原性組成物における含有物の候補は、アミノ酸レベルで非常に保存され、表面にさらされ（特に、外膜タンパク質）、殺菌性抗体を引き出し、そして全ての単離株に存在すべきである。以前の研究により、ＮＴＨｉのＰ６（ＰＢＯＭＰ−１及びＨｉＰＡＬとしても知られている）（２１）タンパク質はこれらの規準の全てを満たすことが示されている。精製された天然のタンパク質は、殺菌性抗体を引き出すことが示されており（２２，２３，２４，２５）、そして抗原性的に保存されている（２２，２３，２６，２７）。
【０００８】
Ｐ６遺伝子の遺伝子配列の評価により、それが耳のＮＴＨｉ単離株間で非常に保存されており、従ってタンパク質配列もまた非常に保存されていることが示されている。天然のＰ６は、アミノ末端のシステインで脂質で修飾されているリポタンパク質、より詳細にはＰＡＬである。このタンパク質は、ヘモフィルス・インフルエンゼにおいて比較的少量（全外膜タンパク質の１％未満）で存在し、天然の生物体からの有用な量の精製をかなり困難にしている。従って、抗原性組成物における成分としてのさらなる開発にはＰ６の組換えバージョンが必要とされる。
【０００９】
いくつかの研究所は、脂質化されたｒＰ６をエシェリキア・コリにおいて大量に発現することができなかった（２８，２９）。結果として、エシェリキア・コリにおいてＰ６を発現する初期の組換え構築物は、このタンパク質の脂質化されていないバージョンのみを発現することができた。これらのグループは、ヘモフィルス・インフルエンゼから精製された脂質化されたＰ６タンパク質はエシェリキア・コリから精製された脂質化されていないｒＰ６より免疫原性であるが、脂質化されたＰ６を発現するＤＮＡベクターを工学設計することは難しい（２８，２９）；すなわち、ヘモフィルス・インフルエンゼにより発現される天然のＰ６の低いレベルよりよくないと報告した。
【００１０】
脂質化されたｒＰ６を発現しようとする以前の試みは、ｔｒｃ、ｔａｑ、ｌａｃ及びＰL−Ｃ１８５７のような、厳重な転写調節下にないプロモーターに頼った。このいくぶん漏れやすい転写は、脂質化されたタンパク質の低レベルの発現に寄与するエシェリキア・コリに対する微妙な作用を引き起こすと理論化した。実験的証拠により、タンパク質のＮ末端に脂質を付加するシグナルペプチダーゼＩＩの能力は、プロセシングされたＰ６の低収量の原因ではないことが示された（データは示さない）。
【００１１】
ヘモフィルス・インフルエンゼのＰ６タンパク質はヘモフィルス疾患に対する抗原性組成物における含有物の主要な候補であるが（２０，２３，２４，２５，３０，３１）、ヘモフィルス・インフルエンゼから利用できる比較的少量のためにこのタンパク質の組換え発現を必須にしている。脂質化されたＰ６タンパク質を意味のある量で発現しようとする以前の努力は失敗している（２８，２９）。従って、研究者は、脂質化されていないＰ６の複数の形態の発現及び精製に集中している。
【００１２】
脂質化されていないｒＰ６により引き起こされる抗体反応は生物学的に機能性であり、髄膜炎から乳児ラットを防御すること（２８）及び殺菌性抗体を引き出すこと（２８，２９）ができたが、脂質化された天然のＰ６により引き出されるものより低い規模のものであった（２８）。
【００１３】
従って、グラム陰性細菌の脂質化されたＰＡＬを発現する宿主細胞−発現ベクター系を構築する必要性がある。特に、脂質化されたｒＰ６を発現する宿主細胞−発現ベクター系を構築する必要性があり、次にこれをヘモフィルス・インフルエンゼに対する抗原性組成物に含むことができる。
【００１４】
本発明の要約
従って、細菌宿主細胞においてグラム陰性細菌の脂質化されたＰＡＬを発現することができる遺伝子構築物を開発することが本発明の目的である。
【００１５】
細菌宿主細胞、特にエシェリキア・コリにおいて脂質化されたｒＰ６を発現することができる遺伝子構築物を開発することが本発明の特定の目的である。
【００１６】
ヘモフィルス・インフルエンゼにより引き起こされる疾患を防ぐために哺乳動物に投与する抗原性組成物にこの脂質化されたｒＰ６を含むことは本発明のさらなる目的である。
【００１７】
以下に説明するような本発明のこれら及び他の目的は、発現ベクターにおける厳重に調節されるプロモーターの使用によってＰＡＬの脂質化された形態を細菌細胞でクローニング及び発現することにより達成される。
【００１８】
本発明は、発現ベクターにおけるそのようなプロモーターの使用によって組換えヘモフィルス・インフルエンゼＰ６タンパク質の脂質化された形態を細菌細胞でクローニング及び発現することによって例示される。
【００１９】
詳細には、脂質化された組換えＰ６の発現のために、アラビノース誘導性プロモーターまたはＴ７プロモーターを含有するプラスミドを構築し、ここで、該プロモーターはＰ６タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離され精製されたＤＮＡ配列に操作可能に連結され、そして該プロモーターの制御下で、該ＤＮＡ配列は脂質化された形態で発現される。
【００２０】
次に、細菌宿主細胞をそのようなプラスミドで形質転換、形質導入またはトランスフェクションし、次いで宿主細胞による脂質化されたｒＰ６の発現を可能にする条件下で培養する。
【００２１】
本発明の別の態様として、脂質化されたｒＰ６は、ｂ型及び型の決定できないヘモフィルス・インフルエンゼの両方を包含する全ての病原性ヘモフィルス・インフルエンゼに対する抗原性組成物における免疫原として用いられる。
【００２２】
精製した場合に、組換えタンパク質は、いくつかの規準により脂質化されていることが示され、そして最も重要なことには、以前に用いられたＰ６の脂質化されていない形態よりさらに免疫原性である。
【００２３】
シグナルペプチダーゼＩＩによるアミノ末端のシステインの脂質修飾は、タンパク質をそれらの脂質化されていない形態より免疫原性にすることが示されている（２８，２９，３２）。これらの形態は、脂質化されたＰ６に対する免疫原性及び抗原性関連について評価されている。全て、天然の脂質化されたタンパク質に比較した場合に減少した免疫原性を示している。
【００２４】
これによりヒトを免疫するためにかなり低い用量を使用することができ、従って、脂質化されたｒＰ６を抗原性組成物における含有物のより商業上実用的な候補にする。これらの増加した力価により、より低いＰ６タンパク質用量をヒトにおいて使用することができ、これはこのタンパク質の製造における費用の節約を与える。
【００２５】
単離され精製された脂質化されたｒＰ６タンパク質は、哺乳動物宿主における防御免疫応答を引き出す抗原性組成物を調製するために用いられる。抗原性組成物は、１またはそれ以上のアジュバント、希釈剤または担体をさらに含んでなることができる。そのようなアジュバントの例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ＳｔｉｍｕｌｏｎTM ＱＳ−２１、ＭＰＬTM、ＩＬ−１２及びコレラ毒素が包含される。抗原性組成物は、ヘモフィルス・インフルエンゼにより引き起こされる疾患に対して宿主を防御するために十分な免疫原性量で哺乳動物宿主に投与される。
【００２６】
発明の詳細な記述
脂質化されたｒＰ６のような、脂質化されたＰＡＬの使用可能な量を発現することにおいて認められた困難を克服するために、厳重に調節されるプロモーター並びに細胞質及び細胞周辺プロテアーゼを欠いている宿主株の使用を伴う方法を考案した。
【００２７】
脂質化されたＰ６タンパク質を商業的使用のために意味のある量で発現しようとする以前の失敗した努力は全て、プロモーター配列を変えること及び／またはシグナルペプチダーゼＩＩにより認識されるシグナル配列に変化をもたらすことに頼った。
【００２８】
以下に説明するように、Ｔ７プロモーター（プラスミドｐＰＸ４０１９−実施例１）及びアラビノース誘導性プロモーター（プラスミドｐＰＸ４０２０−実施例２）の制御下でＰ６をコードするｐａｌ遺伝子を含有するプラスミドを構築した。代表的な細菌株及び培地を実施例３において記述する。Ｐ６特異的モノクローナル抗体でのウェスタンブロット分析、シグナル配列がないことを示したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での大きさによる分類及びクーマシー染色したゲルにおける発現レベルの目視により決定した場合に、ｐＰＸ４０１９及びｐＰＸ４０２０は両方とも、試験したエシェリキア・コリ株において脂質化されたＰ６タンパク質を発現する（実施例４及び図参照）。
【００２９】
プラスミドｐＰＸ４０２０は、エシェリキア・コリ株ＢＬ２１及びＢＬＲにおいて増加したレベルのｒＰ６タンパク質発現を示し、株ＢＬＲにおいて最高レベルであった。それ故、プラスミドｐＰＸ４０２０をさらなる研究のために選択した。脂質化されたｒＰ６を発現するエシェリキア・コリのより大量の増殖を宿主株ＢＬＲにおいて行った。後の実験は全てこの宿主−ベクター系を利用した。
【００３０】
好ましい態様として本明細書に記述するプラスミド構築物（ｐＰＸ４０２０）は、いくつかの独特な特徴を有するアラビノース誘導性プロモーター系を用いる：それは厳重に調節され、そしてアラビノースが全く存在せず、いくらかのグルコースが存在する場合にほとんど完全に不活性である。それはまた、増加するアラビノースを培養培地に加えるにつれて増加する誘導レベルを示す点においても調整可能である。非常にプロテアーゼ欠損性で組換え欠損性であるエシェリキア・コリのＢＬＲ株と組み合わせたこれらの因子は、脂質化されたＰ６タンパク質の有意な発現を与える。
【００３１】
脂質化されたｒＰ６のバッチ規模精製は、分画遠心分離、分画洗剤抽出及び陰イオン交換クロマトグラフィーを含む（実施例４参照）。
【００３２】
しかしながら、抗原性組成物における含有物の実用的候補となるためには、発現した脂質化されたｒＰ６は、容易に大規模にできる方法により精製されなければならない。ダイアフィルトレーションは、大規模精製に適当な方法である。脂質化されたｒＰ６はペプチドグリカンとしっかりと結合しているので脂質化されたｒＰ６を抽出するためのダイアフィルトレーション工程は複雑である。
【００３３】
実施例５において記述するように、脂質化されたｒＰ６の可溶化は、ヘモフィルスから得られる天然のタンパク質（Ｈｉ−Ｐ６）（３３）とほとんど同じように分画洗剤抽出により成し遂げられたが、遠心分離の代わりに接線フロー（tangential flow）ダイアフィルトレーションを用いた。ドデシルマルトシド、デオキシコール酸塩、ＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−０８、３−１２及び３−１４のような洗剤を全て試験し、０．２−１％（ｗ／ｖ）の範囲で使用した場合に脂質化されたｒＰ６を抽出するために許容できると判明した。脂質化されたｒＰ６はまた、６５℃でホウ酸ナトリウムバッファー、ｐＨ ９．５中で可溶化することもできた。洗剤選択の柔軟性は、脂質化されたｒＰ６を抽出するためにＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１２の使用を可能にした。従って、ＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１２の選択は、複数成分抗原性組成物を製造するために必要とされる成分の数をできる限り少なくする。天然のＨｉ Ｐ６は可溶化後に本質的に純粋な形態で得られるが、組換えタンパク質はいくつかのエシェリキア・コリタンパク質と一緒に可溶化される。これらのタンパク質の相対量を変えることができ、ある場合には最終抽出において使用する洗剤の選択によりほとんど除くことができる。脂質化されたｒＰ６は、陰イオン交換クロマトグラフィーによりあらゆる残っているエシェリキア・コリタンパク質から分離される（実施例６参照）。
【００３４】
ＰＡＬを抽出するこの方法は、清澄化及び抽出工程を１ユニット操作に合わせる。ただ一つの連続的ダイアフィルトレーション工程で生成物は細胞から抽出され、そしてそれは細胞残渣から分離される。さらに、ＰＡＬは半精製状態で抽出され、これは後のプロセシング工程を簡単にする。最後に、この工程は、唯一の必要条件が膜の表面積を細胞の量と比例して増やすことであるので、非常に基準化できる(scalable)。この抽出工程は、大規模抽出における使用には好ましくない方法である遠心分離の使用を回避する。抽出後に、脂質化されたｒＰ６は通常の技術により精製される。
【００３５】
脂質化されたｒＰ６の分析は、予想されるように、リポタンパク質としての組換えタンパク質の特性化と一致した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光法により決定した場合の分子の大きさは、精製された組換えタンパク質がそのアミノ酸配列のみから予想されるより大きいことを示す（実施例７参照）。表１に詳述するアミノ酸分析（実施例８参照）と合わせて、タンパク質の大きさは、シグナル配列が取り除かれており、タンパク質が成熟形態であることを示す。また、アミノ末端のアミノ酸分析により示されるように（実施例９参照）、ブロックされたアミノ末端の存在は、末端のシステイン残基の修飾が起こっていることも示す。総合すれば、これらの結果は、エシェリキア・コリにより認識されプロセシングされて脂質化されたＰ６をもたらすことが示されている（２３）シグナル配列が取り除かれていること及びここで精製された組換えＰ６がそのアミノ末端で脂質化されていることを示す。
【００３６】
以前の研究者等は、天然に存在するＮＴＨｉ感染後のＰ６に対する抗体レベルが疾患発生率と逆の相関関係を有することを示しており（３４，３５，３６）、Ｐ６に対する高い力価の製造をこの抗原を用いるあらゆる免疫プログラムの目標にしている。天然の脂質化されたＰ６タンパク質は非常に少量（外膜タンパク質の１％未満）で存在し（３３）、これは商業的に実用的な量の精製を最大でも不確かなものにする。
【００３７】
以前に発現された脂質化されていないｒＰ６より優れている脂質で修飾されたｒＰ６の重要な利点は、脂質修飾と関連する高められた免疫原性である。脂質化されていないｒＰ６は生物学的に活性の抗体を引き出すことができるが、これは天然の脂質化されたタンパク質より免疫原性が低いことが２つの報告により示されている（２８，２９）。
【００３８】
それに反して、以下の表２−４に示す動物免疫原性データ（実施例１０及び１１参照）は、組換えＰ６の脂質修飾がマウスモデルにおいてもこの抗原の免疫原性を高めることを示す。６週で相乗平均抗体力価（ＧＭＴ）の２−ｌｏｇまでの増加が完全に有意であり、ｒＰ６タンパク質の脂質化された形態を抗原性組成物における含有物の実用的候補にする。これは、脂質化されたｒＰ６が、試験した他の抗原により引き起こされる免疫応答を妨げなかったというこれらの実験における結果により増進される。
【００３９】
総合すれば、これらのデータは、脂質化されたｒＰ６がヘモフィルス・インフルエンゼに対する抗原性組成物における含有物のために実用的であるという考えを裏付ける。ＮＴＨｉからの脂質化されたｒＰ６を用いて以下に例示するが、Ｈｉｂからの脂質化されたｒＰ６もまた本発明の抗原性組成物における含有物に適している。
【００４０】
実施例１−３に詳述するものに加えて本発明の抗原性組成物において使用する脂質化されたｒＰ６タンパク質を発現させるために様々な細菌宿主細胞−ベクター系が使用に適している。
【００４１】
これらの発現系は、組換えの脂質化されたＰＡＬをコードする遺伝子を厳重に調節されるプロモーターの制御下に配置する。特定の条件下で、これらのプロモーターは組換えＰＡＬ ｍＲＮＡの生産をダウンレギュレーションするように働き、その結果として、組換えの脂質化されたＰＡＬの生産による宿主細胞に対するあらゆる有害な作用を軽減する（３７）。次に、この厳重な調節は、宿主細胞における最大にした組換えの脂質化されたＰＡＬ発現を与えるために特定の条件下で取り除くことができる。
【００４２】
（他の制御要素と一緒であることができる）これらの厳重に調節されるプロモーターには、アラビノース誘導性プロモーター（３８）、ｎｕｔＬ／Ｎ抗転写終結機能（３９，４０）またはＭｕ Ｃ（４１）による制御下であるように改変することができるＴ７プロモーター、抗ターミネーターと組み合わせたＰLプロモーター（４２）、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ及びＳＰ６プロモーター（４３）、コリシンプロモーター（４４）、ｔｅｔＡプロモーター／オペレーター（４５）、ラムノース及びリン酸プロモーター（４６）、ＬａｃＲ／Ｏ、ｔｅｔＲ／Ｏ及びＡｒａＣＩ１−１２調節要素（４７）、並びに反転可能な（invertible）プロモーター（４８）が包含されるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
ベクター系は、使用する宿主細胞と適合する。適当な宿主細胞には、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡまたはバクテリオファージＤＮＡで通常の技術により形質転換、トランスフェクションまたは形質導入される細菌が包含される。細菌宿主の例には、エシェリキア・コリ、バシラス・ズブチリス（B. subtilis）、サルモネラ（Salmonella）及びシゲラ（Shigella）が包含される。
【００４４】
そのようなベクターを構築するために、厳重な転写制御下のプロモーターを含有するプラスミドベクター中にｐａｌ ＤＮＡを挿入し、そしてプラスミドベクターを細菌宿主細胞中に挿入した場合に宿主細胞によりｐａｌ ＤＮＡを発現できるように、他の制御要素をベクター内の特定の部位に連結する。
【００４５】
使用する宿主細胞−ベクター系により、プラスミドを形質転換、形質導入またはトランスフェクションによって宿主細胞中に導入する。次に、宿主細胞による脂質化されたｒＰ６タンパク質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する。アラビノース誘導性プロモーターを有するプラスミドを含有する宿主細胞はＬ−アラビノースで誘導し、一方、Ｔ７プロモーターを有するプラスミドを含有する宿主細胞はＩＰＴＧで誘導する。
【００４６】
脂質化されたＰＡＬは、対応する細菌により引き起こされる疾患に対する防御を哺乳動物に与える抗原性組成物の製造において有用である。例えば、脂質化されたｒＰ６タンパク質は、ヘモフィルス・インフルエンゼにより引き起こされる疾患に対する防御を哺乳動物に与える抗原性組成物の製造において有用である。
【００４７】
これらの抗原性組成物は、脂質化されたｒＰ６タンパク質のような、単離され精製された脂質化されたＰＡＬを含んでなり、ここで、抗原性組成物は哺乳動物宿主において防御免疫応答を引き出す。多価の抗原性組成物は、脂質化されたｒＰ６を細菌性中耳炎の原因因子であるモラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）のＵｓｐＡ２タンパク質（引用することにより本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際出願第WO 98/28333号（４９）に記述されている）及びヘモフィルス・インフルエンゼの組換えの脂質化されたｒＰ４タンパク質（タンパク質「ｅ」としても知られている）（引用することにより本明細書に組み込まれる米国特許第5,601,831号（５０）に記述されている）と合わせることによるような、他のタンパク質を含むことにより提供される。
【００４８】
脂質化されたｒＰ６タンパク質のような、脂質化されたＰＡＬを含有する抗原性組成物は、注入可能な液状溶液または懸濁液を調製するために常法で免疫学的に許容しうる希釈剤または担体と混合することができる。そのような希釈剤または担体には、ＰＢＳ、生理的食塩水、緩衝等張溶液、リポソーム及びＩＳＣＯＭＳが包含されるが、これらに限定されるものではない。抗原性組成物により引き出される抗体のレベルは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ＳｔｉｍｕｌｏｎTM ＱＳ−２１（Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, MA）、ＭＰＬTM（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ；RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT）、ＩＬ−１２（Genentics Institute, Cambridge, MA）、エシェリキア・コリの非耐熱性毒素及びコレラ毒素（野生型または突然変異体形態のいずれか、例えば、ＰＣＴ国際出願第WO 00/18434号（５１）に従って、アミノ酸位置２９のグルタミン酸が別のアミノ酸、好ましくはヒスチジンで置換されている）のようなある種のアジュバントを用いることにより高めることができる。
【００４９】
本発明の抗原性組成物は、ヘモフィルス・インフルエンゼのようなグラム陰性細菌により引き起こされる疾患に対する防御のための能動免疫応答を誘導するために、ヒトへの皮下、皮内または筋肉内注入のような常法での注入、並びに経口、粘膜、鼻内または膣投与により投与される。投与する投薬量は、当業者に既知である手段により決定される。防御は、単一用量の抗原性組成物により与えられる可能性があり、または防御を維持するためのもっと後の時点でのブースター用量に加えて、いくつかの用量の投与を必要とする可能性がある。
【００５０】
本発明をよりよく理解できるように、以下の実施例を記載する。これらの実施例は例証の目的のためだけであり、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００５１】
実施例
Sambrook et al.（５２）に記述されているプロトコルに従って標準的な分子生物学技術を利用する。
【００５２】
実施例１
ｐａｌ遺伝子及びＴ７プロモーターを含有するプラスミドｐＰＸ４０１９の構築
図１に表すように、型の決定できないヘモフィルス・インフルエンゼ株Ｐ８６０２９５の染色体からのＰＣＲ増幅により天然のリポタンパク質シグナルペプチドを有するＰ６タンパク質をコードするｐａｌ遺伝子をクローン化した。遺伝子の５’末端で開始コドンを含むＮｄｅＩ制限部位（ＧＧＡＧＡＡＡＴＣＡＴＡＴＧＡＡＣＡＡＡＴＴＴＧ）（配列番号：１）及び終止コドンの３’の領域にＨｉｎｄＩＩＩ部位（ＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＧＡＡＡＴＡＣＴＡＡＧ）（配列番号：２）を生じる突然変異促進プライマーを用いて、ｐａｌ遺伝子を含有するＰＣＲフラグメントをｐＣＲＩＩ発現ベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）にクローン化し、制限分析によりスクリーニングした。得られたプラスミドは、Ｐ６のｐａｌ遺伝子を含有するＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント源として用い、これを発現ベクターｐＥＴ２７ｂ（Novagen, Madison, WI）のＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化した。この構築物の設計は、Ｐ６の遺伝子をＴ７プロモーターの制御下に配置し、そしてベクター中の共通リボソーム結合部位を利用する。最初のクローンは、制限分析により非許容エシェリキア・コリ宿主（ＤＨ５α）において同定した。単一のプラスミド単離株を選択し、ｐＰＸ４０１９として保存した。このプラスミドを用いて発現研究のために許容宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＬｙｓＳ）（Novagen）を形質転換した。
【００５３】
実施例２
ｐａｌ遺伝子及びアラビノース誘導性プロモーターを含有するプラスミドｐＰＸ４０２０の構築
厳重に調節されるアラビノース誘導性プロモーター（３８）の制御下にｐａｌ遺伝子を配置する第二のＰ６タンパク質発現プラスミドを構築した。このプラスミドは、ｐａｌ遺伝子及びｐＥＴ２７ｂからの共通リボソーム結合部位を含有するプラスミドｐＰＸ４０１９からのＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを同様に消化したプラスミドｐＢＡＤ１８−Ｃｍにサブクローン化することにより作製した（図１参照）。制限分析、続いて選択した候補に対する発現研究によりクローンをスクリーニングした。Ｐ６タンパク質を発現するｐＢＡＤ１８−Ｃｍ単離株の一つをｐＰＸ４０２０と称した。
【００５４】
実施例３
ｐＰＸ４０１９及びｐＰＸ４０２０からの脂質化されたｒＰ６の発現
異なる単離株、プラスミド構築物、エシェリキア・コリ宿主株及び誘導物質（ｐＰＸ４０１９にはＩＰＴＧ、ｐＰＸ４０２０にはＬ−アラビノース（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO））の濃度を比較する定性発現研究は全て、比較のために一致したバックグラウンドを与えるように同様に実施した。単一のコロニー単離株をＨｙＳｏｙTM培地、１％グルコース及びプラスミド選択のための適切な抗生物質（ｐＰＸ４０１９、１５μｇ／ｍｌカナマイシン；及びｐＰＸ４０２０、１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）中で３７℃で一晩増やした。これらの培養物をＨｙＳｏｙTM、１％グルコース及び抗生物質中でＯＤ600＝０．５に希釈し、３７℃でＯＤ600＝２−４まで増やし、誘導した。ＯＤ600＝１．０に相当するサンプルを誘導の直前の時点、誘導後２時間及び１８時間で取った。これらのサンプルを遠心分離し、細胞ペレットを１５０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー（ISS, Natick, MA）に再懸濁した。レーン当たり１５μｌのサンプルを載せてクーマシーブルー染色した１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから比較を行った。
プラスミドｐＰＸ４０１９から脂質化されたｒＰ６を発現するために使用したエシェリキア・コリ宿主細胞株：
ＤＨ５α−φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｄｅｏＲ ｒｅｃＡｌｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒk-，ｍk+）ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４λ- ｔｈｉ−１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１（Life Technologies, Rockville, MD）
ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｏｍｐＴ ｌｏｎ ｈｓｄＳB（ｒB- ｍB-）ｇａｌ ｄｃｍ（ＤＥ３）（Novagen）
プラスミドｐＰＸ４０２０から脂質化されたｒＰ６を発現するために使用したエシェリキア・コリ宿主細胞株：
ＤＨ５α−φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｄｅｏＲ ｒｅｃＡｌｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒk-，ｍk+）ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４λ- ｔｈｉ−１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１（Life Technologies）
ＢＬＲ−ｏｍｐＴ ｌｏｎ ｈｓｄＳB（ｒB- ｍB-）ｇａｌ ｄｃｍ Δ（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６：：Ｔｎ１０（ｔｅｔr）（Novagen）
ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｏｍｐＴ ｌｏｎ ｈｓｄＳB（ｒB- ｍB-）ｇａｌ ｄｃｍ（ＤＥ３）（Novagen）
Ｌ−ｒＰ６を発現するエシェリキア・コリＢＬＲ（ｐＰＸ４０２０）の増殖：
脂質化されたｒＰ６を発現する組換えエシェリキア・コリ細胞を以下に記述するように発酵槽において増やした。以下の材料を含有する増殖培地を調製し、発酵槽ではインサイチューで、そしてフラスコ増殖ではオートクレーブすることにより滅菌した。
【００５５】
【表１】
0004660043.tif 000002
【００５６】
【表２】
0004660043.tif 000003
【００５７】
【表３】
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【００５８】
溶液Ａ及び鉱物溶液を含有する滅菌した培地を振盪フラスコ中に等分し、１リットルの培地当たり２０ｍｌのＭＣＧを加えた。クロラムフェニコールを５０μｇ／ｍｌまで加えた。開始培養物に凍結ストックから２００−３００μｌのエシェリキア・コリＢＬＲ（ｐＰＸ４０２０）を接種した。通気しながら細胞を３０℃で１６時間増やした。上記のように補足した増殖培地を含有する１０リットルの発酵槽に上記の培養物を約０．２のＯＤ600まで接種した。
【００５９】
発酵槽制御パラメーターを以下のように設定した：
【００６０】
【表４】
0004660043.tif 000005
【００６１】
以下の溶液を試験パラメーターの制御のために使用し、使用の前に滅菌した：必要に応じて泡制御のためのＰＰＧ−２０００−２００ｍＬ、増殖中のｐＨ制御のための４０％水酸化アンモニウム−１Ｌ、持続した増殖のために−グルコースの減少によりｐＨが上昇し始めた場合に供給するための５０％グルコース−１Ｌ、誘導中のｐＨ制御のための４Ｎ酢酸−５００ｍＬ、２５％アラビノース溶液、（２５０ｇ／Ｌ）滅菌濾過した＋１％グリセロール−２５０ｍＬ（前もってオートクレーブした）。アラビノース／グリセロール溶液は、最後のグルコース添加後にグルコースの減少によりｐＨが上昇し始めた時に供給してタンパク質の生産を誘導するために使用した。アラビノース溶液は、オートクレーブしたグリセロールストックの添加前に濾過滅菌した。この溶液は、１０Ｌの発酵には１００ｍＬのグリセロール及び４００ｍＬの２５％アラビノース溶液を加えることにより作った。最終発酵槽濃度は、１０グラム／リットルのアラビノース及び１０ｍｌ／リットルのグリセロールを含有した。
【００６２】
発酵槽の接種後に、必要に応じて消泡剤（ＰＰＧ−２０００）と一緒に、塩基（水酸化ナトリウム）をｐＨ制御のために必要に応じて加えた。純粋な酸素を８００ｒｐｍで供給した。ｐＨが７．０より上に上昇した場合、９００ｍＬの５０％グルコースを培養物に供給した。ｐＨが７．１以上であった場合、さらに２００ｍＬの５０％グルコース溶液を加えた。これらの条件は、約５０のＯＤ600に到達するまで続けた。
【００６３】
約５０のＯＤ600に到達した後、ｐＨが再び７．０より上に上昇すると、ＬｒＰ６の発現を誘導するために５００ｍＬのアラビノース／グリセロール溶液を加えた。この時点で、さらなるｐＨ制御には酸を使用した。インキュベーションを誘導後３時間続け、次に１０ｍＬ／リットルの５００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液、ｐＨ８の添加後に培養物を集めた。培養培地は、脂質化されたｒＰ６の精製まで４℃で保存した。
【００６４】
実施例４
分画洗剤膜抽出による脂質化されたｒＰ６のバッチ規模分析精製
ｐＰＸ４０２０から発現した脂質化されたｒＰ６のバッチを後の実験に利用し、以下のように分画洗剤膜抽出により精製した：
１）エシェリキア・コリ膜画分の単離：発酵から得られた凍結細菌細胞ペレットを融解し、凍結細胞ペレットの重量の５倍に等しいバッファーの容量で１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡに懸濁した。細胞懸濁液をＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Newton, MA）１１０−Ｙミクロ流動化装置において均質化して細胞を溶解した。分画遠心分離（３００，０００ ｘ ｇで1時間）により細胞ライセートから膜を得た。溶解に使用した同じ容量のバッファーで膜を２回洗浄し、次にペレットとして凍結した。
【００６５】
２）エシェリキア・コリ膜からの脂質化されたｒＰ６の可溶化：Zlotnick et al（３３）及びGreen et al（２２）により記述されたものと同様の分画洗剤抽出を用いてエシェリキア・コリから脂質化されたＰ６を可溶化した。他に記載されない限り、全ての抽出は室温で３０分間実施した。全ての遠心分離は、異なって記載されない限り、ローターの温度を１０℃に制御してＢｅｃｋｍａｎ ４５Ｔｉローターを用いて４２，０００ｒｐｍで1時間実施した。エシェリキア・コリ膜を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＭｇＣｌ2に懸濁し、内膜成分を除くために１％（ｗ／ｖ）の最終濃度でＴｒｉｔｏｎTM Ｘ−１００（Calbiochem−Novabiochem International, San Diego, CA）で２回抽出した。得られた外膜ペレットを５０ｍＭ ＴｒｉｓTM ＨＣｌ、ｐＨ８、５ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡに懸濁し、これは脂質化されたｒＰ６の可溶化の前にこの後のペレットを懸濁するためにも使用した。次に外膜を１％ ＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１４で２回；１％ＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１４及び０．５Ｍ ＮａＣｌで２回；１％ Ｎ−ラウリルサルコシン、Ｎａ塩で２回；１％ ＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１４で順次抽出した。これらの抽出後に得られた最終ペレットを断続的に混合しながら１０ｍＭ ＴｒｉｓTM ＨＣｌ、ｐＨ８、１ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡ中０．２％ ＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１２で５５℃で４５分間抽出し、続いて少なくとも１時間遠心分離した。この最終抽出からの上清は脂質化されたｒＰ６を含有した。
【００６６】
３）脂質化されたｒＰ６の精製：上記のようにして得られた脂質化されたｒＰ６を含有する抽出物をＤＥＡＥファーストフロー（fast flow）樹脂（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）及び抽出に利用した同じ低イオン強度バッファーを利用して陰イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。可溶化した脂質化されたｒＰ６を約２０ｍＬのベッド容量を有するＤＥＡＥファーストフローカラムに吸着させた。カラムを０−０．２Ｍ ＮａＣｌ勾配で４０分にわたって展開し、０．２Ｍ ＮａＣｌで２０分のアイソクラチック溶出を続けた。脂質化されたｒＰ６は、展開のアイソクラチック相中に溶出した。他のタンパク質の大部分はカラムに吸着したままであり、後で１Ｍ ＮａＣｌで脱着させた。約１００ｍｇが２００ｇの細胞から精製された。
【００６７】
４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによる精製された脂質化されたｒＰ６の特性化：精製された脂質化されたｒＰ６の同質性をＬａｅｍｍｌｉバッファー系におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びそれに続く染色したゲルのレーザーデンシトメトリーにより評価した。粗抽出物及び陰イオン交換精製したプールの両方から約１０μｇのＬｒＰ６を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した（５３）。ゲルをクーマシーブルーで染色し、レーザーデンシトメーターで走査した。クーマシー染色したゲルのレーザーデンシトメトリー（図２Ａ、レーン２）により、プールした陰イオン交換画分における９８％より大きい同質性の単一ピークが示され、脂質化されたｒＰ６がほぼ同質まで精製されたことを示した。これらのサンプルにおける脂質化されたｒＰ６の同一性は、エシェリキア・コリの関連タンパク質に反応しない（データは示さない）、ヘモフィルス・インフルエンゼＰ６に特異的なモノクローナル抗体と同質性を決定するために用いた同じサンプルのウェスタンブロットとを反応させることにより確かめた。ウェスタンブロット分析の結果を図２Ｂに示す。脂質化されたｒＰ６のバンドは、粗抽出物（レーン１）またはプールした画分（レーン２）のいずれにおいてもＰ６特異的モノクローナル抗体と反応する唯一のバンドであった。これは、精製されたタンパク質が実際にＰ６であることを示した。いかなる分解産物も認められなかった。
【００６８】
実施例５
分画洗剤膜抽出を用いる脂質化されたｒＰ６の大規模精製
脂質化されたｒＰ６を発現するエシェリキア・コリ細胞の発酵培地を１０ｍＭ ＥＤＴＡに調整し、均質化の前に１０％湿重量細胞／容量以下に希釈した。次に細胞を高圧ミクロ流動化装置で溶解し、直交−フロー（cross-flow）膜濾過装置を用いて一連のバッファーで室温でダイアフィルトレーションした。膜を通した可溶化したタンパク質の効率のよい大量輸送を与える最小膜面積は約０．００２ｍ2／ｇ湿重量細胞であると決定された。膜の１０００ｋＤ分子量カットオフ等級未満のおおよその大きさの可溶化したタンパク質は透過物（permeate）と共に通過し、一方、より大きい分子及び可溶化していないタンパク質は保持された。ダイアフィルトレーション工程の順序は以下の通りであった：
（１）透過物によって細胞内及び細胞外混入物を除くために、溶解した発酵培地を保持物（retentate）の容量の３倍に等しい容量で１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／１ｍＭ ＥＤＴＡ／ｐＨ８．０（溶解バッファー）でダイアフィルトレーションした。
【００６９】
（２）内膜タンパク質を可溶化して除くためにライセートを１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／１ｍＭ ＭｇＣｌ2／０．２％ ＴｒｉｔｏｎTM Ｘ−１００で３回ダイアフィルトレーションした。Ｍｇ++イオンは外膜を安定させ、従って、外膜タンパク質はＴｒｉｔｏｎTM Ｘ−１００の存在下で可溶化されなかった。
【００７０】
（３）（脂質化されたｒＰ６ではなく）外膜タンパク質を可溶化して除くためにライセートを５０ｍＭ ＴｒｉｓTM／５ｍＭ ＥＤＴＡ／０．２％ ＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１４で３回ダイアフィルトレーションした。ＥＤＴＡは工程（２）からのＭｇ++イオンを封鎖するため並びにタンパク質分解を防ぐために役立つ。
【００７１】
（４）さらなるタンパク質を可溶化して除くためにライセートを５０ｍＭＴｒｉｓTM／５ｍＭ ＥＤＴＡ／０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．２％ ＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１４で３回ダイアフィルトレーションした。膜タンパク質と膜の間のあらゆるイオン性相互作用を破壊するためにこの工程ではバッファーにＮａＣｌを加えた。この工程は脂質化されたｒＰ６がＰＡＬであるので実施し、塩は膜／外膜タンパク質複合体から（脂質化されたｒＰ６ではなく）膜結合タンパク質を除くために役立つ。保持物中のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM濃度を下げるためにダイアフィルトレーションを３保持物容量の５０ｍＭ ＴｒｉｓTM／５ｍＭ ＥＤＴＡで続けた。
【００７２】
（５）（脂質化されたｒＰ６ではなく）さらなる膜結合タンパク質を除くためにライセートを５０ｍＭ ＴｒｉｓTM／５ｍＭ ＥＤＴＡ／０．２％ サルコシルで３回ダイアフィルトレーションし、次に保持物中のサルコシル濃度を下げるために５０ｍＭ ＴｒｉｓTM／５ｍＭ ＥＤＴＡで３回ダイアフィルトレーションした。
【００７３】
（６）（脂質化されたｒＰ６ではなく）さらなる膜結合タンパク質を除くためにライセートを１０ｍＭ リン酸塩／０．２％ ＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１２で３回ダイアフィルトレーションし、次に保持物中のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１２濃度を下げるために１０ｍＭリン酸ナトリウムで３回ダイアフィルトレーションした。
【００７４】
（７）ライセートをその最初の容量の２０％まで濃縮し、次に脂質化されたｒＰ６を可溶化するために５５℃で１０ｍＭリン酸ナトリウム／０．２％ ＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１２で３回ダイアフィルトレーションし、これを透過物によって集めた。濃縮工程は、透過物中の脂質化されたｒＰ６の濃度を上げるためにダイアフィルトレーションの前に実施した。保持物中のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１２濃度を下げるためにダイアフィルトレーションを５５℃で１０ｍＭリン酸ナトリウムでさらに３保持物容量にわたって続けた。この加熱工程は（上記の工程（４）におけるように）脂質化されたｒＰ６がＰＡＬであるので実施し、加熱は膜／膜タンパク質複合体から脂質化されたｒＰ６を取り除くために役立つ。最後に、ダイアフィルトレーションを５５℃で３保持物容量の１０ｍＭリン酸ナトリウムで終了した。
【００７５】
ダイアフィルトレーション工程中、膜を通る圧力は約１０ｐｓｉで保ち、そして直交流速は約１２０−１８０ｌｍｈで保った。全てのダイアフィルトレーション工程は、脂質化されたｒＰ６を可溶化するためにより高温で実施した最後の５５℃抽出工程を除いて室温で実施した。透過物フラックスは３０〜５０ｌｍｈの範囲であり、これは抽出工程が実用的であり且つ基準化できるために十分に高かった。
【００７６】
抽出中に、タンパク質の抽出に対する様々なダイアフィルトレーション工程の結果を評価するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析用に様々な時点でサンプルを取った。アルコールの添加によりサンプルを沈殿させ、遠心分離し、次にＳＤＳサンプル調製バッファー中に最初の容量の２０％で再可溶化した。このサンプル調製方法はサンプルを濃縮し、そしてサンプルのＴｒｉｔｏｎTM Ｘ−１００またはＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１２濃度を下げた。ＴｒｉｔｏｎTM Ｘ−１００またはＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１２は、サンプルへのＳＤＳの結合を妨げ、ゲル上のバンドの分解能を下げた。１０μｌの各サンプルをＮｏｖｅｘ １０％アクリルアミドゲル上に載せ、ゲルを１２５ボルトで６０−９０分間泳動した。
【００７７】
脂質化されたｒＰ６の抽出工程中に透過物の流れから取ったサンプルの典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図２及び３に示す。脂質化されたｒＰ６はこれらのゲル上で１５キロダルトン（ｋＤ）の所に泳動した。これらのゲルは、いくらかの混入するタンパク質が溶解バッファー及び様々な洗剤を含有するバッファーでのダイアフィルトレーション中に除かれたことを示す。これらのダイアフィルトレーション工程中に脂質化されたｒＰ６の損失はほとんどなかった。５５℃での最後のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１２ダイアフィルトレーション工程中に、脂質化されたｒＰ６は部分的に精製された状態で抽出された。５５℃で２回目のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１２ダイアフィルトレーション工程の最後で、透過物の流れに脂質化されたｒＰ６はほとんど存在しなかった。これは、可溶化した脂質化されたｒＰ６の大部分が透過物によって回収されたことを示唆した。他の実験により、ダイアフィルトレーション工程の完了後に脂質化されたｒＰ６はほとんど保持物中に可溶化されずに残っていないことが示されている。ＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１２／５５℃抽出物の１５ｋＤのバンドは、ウェスタン分析により脂質化されたｒＰ６であることが示された（データは示さない）。
【００７８】
脂質化されたｒＰ６の可溶化におけるＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１２の使用は、脂質化されたｒＰ６に加えていくつかのタンパク質を含有する抽出物をもたらした。この抽出物の同質性は、約７８％の脂質化されたｒＰ６であると決定された（図２、パネルＡ、レーン１）。これは最初の可溶化では高度の同質性であるが、可能であるならばＬｒＰ６をこれらのエシェリキア・コリタンパク質から分離することが所望された。これを実施例６において記述するように実施した。
【００７９】
実施例６
陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製された脂質化されたｒＰ６のさらなる精製
陰イオン交換クロマトグラフィーは、脂質化されていないｒＰ６を精製するためにうまく用いられているので、実施例５において記述した脂質化されたｒＰ６をさらに精製するために用いた。脂質化されたｒＰ６は、典型的に０．１Ｍ ＮａＣｌで溶出するｒＰ６よりしっかりとＤＥＡＥ樹脂に吸着する。０．２％ ＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM中の脂質化されたｒＰ６は、脱着が起こる前にバッファー中０．２ＭのＮａＣｌを必要とした。エシェリキア・コリタンパク質は、脂質化されたｒＰ６が溶出された後まで陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ）に吸着したままであった。
【００８０】
０．２％ ＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１２で抽出され、精製された脂質化されたｒＰ６の同質性及び同一性を図２に示す。精製された脂質化されたｒＰ６の同質性は、９８％より大きいと決定された（図２、パネルＡ、レーン２）。
【００８１】
実施例７
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析による分子量の決定
アラビノース誘導性プロモーターを有するｐＰＸ４０２０から発現した脂質化されたｒＰ６の分子量の正確な測定は、Finnigan Mat LasermatTM 2000線形（linear）質量分析器（Finnigan Mat, Ltd., San Jose, CA）を用いてマトリックス補助（Matrix Assisted）レーザー脱着／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分光法により実施した。LasermatTMは、サンプルをイオン化するためにマトリックス補助レーザー脱着（５４）の技術を、そして生成したイオンを分析するために飛行時間を用いる。サンプルのイオン化を高めるためにサンプルを３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ−ケイ皮酸（シナピン酸（sinapinic acid））のマトリックスに包埋した。０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含有する７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水に溶解した１μｌのマトリックス（１０ｍｇ／ｍｌ）と５−１０ｐｍｏｌの精製されたタンパク質を含有する１μｌのサンプルとを混合した。このサンプル及びマトリックス混合物の１μｌをサンプルスライド上に載せ、乾燥させ、そしてレーザーからのＵＶ光の短いパルスにより照射した。生成するタンパク質関連イオンは主に電荷状態ｚ＝＋１［Ｍ＋Ｈ］+及びｚ＝＋２［Ｍ＋２Ｈ］2+のものであるので、通常、タンパク質サンプルはこの方法において比較的単純なスペクトルを生じる。分子量１２，２３０．９のウシ心臓からのシトクロムＣ（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）を外部検定に用いた。
【００８２】
使用したサンプル中の脂質化されたｒＰ６の分子量は、１５，０７８であると決定された。予想される［Ｍ＋Ｈ］+分子イオンに加えて、脂質化されたｒＰ６の［Ｍ＋２Ｈ］2+分子イオンも認められた。Ｎ末端にトリパルミトイルシステイン残基を含有するＰ６の理論分子量は１５，０２４であり、そしてシグナルペプチダーゼＩＩによりプロセシングされていないＰ６の予測される分子量は１６，０１６．６６であり、一方、シグナルペプチダーゼＩＩにより切断された脂質化されていないＰ６の予測される分子量は１４，２３４．６６である。従って、これらの結果は、エシェリキア・コリによるｒＰ６の脂質化された形態の発現と一致する。
【００８３】
実施例８
アミノ酸組成分析
アミノ酸分析のための脂質化されたｒＰ６のサンプルをガラス管において下へ乾燥させ、続いて５％フェノール及び１％ ２−メルカプトエタノールを含有する１００μｌの６Ｎ ＨＣｌを用いて真空下で１１０℃で２２時間加水分解した。次にサンプルを真空下で乾燥させ、続いてサンプル希釈バッファーＮａ−Ｓ（Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA）に再可溶化した。アミノ酸組成を製造業者の説明書に従って３段階クエン酸Ｎａ勾配を用いてＢｅｃｋｍａｎモデル６３００アミノ酸分析器で決定した（５５）。トレオニン及びセリン残基は、破壊に関して補正しなかった。システイン及びトリプトファン残基は用いた方法により決定されなかったので、１４，１３２．４に等しい、システインを引いた脂質化されていないｒＰ６の理論分子量に基づいて脂質化されたｒＰ６のモル当たりの残基のモルとして結果を表した（脂質化されたｒＰ６はＴｒｐを含有しない）。結果を表１に示し、これは二重反復測定の平均を表す。結果は、ｐａｌ遺伝子のシグナル配列がエシェリキア・コリにより取り除かれているのと一致する。
【００８４】
【表５】
0004660043.tif 000006
【００８５】
実施例９
アミノ末端のアミノ酸配列分析
オンラインモデル１２０Ａ ＰＴＨ分析器（Applied Biosystems, Foster City, CA）を備えたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル４７７Ａタンパク質／ペプチドシーケンサーを用いてアミノ末端のタンパク質配列分析を実施した。各連続するアミノ末端の切断後に、生成するアニリノチアゾリノン誘導体を２５％トリフルオロ酢酸で６４℃で２０分間処理することによってより安定なフェニルチオヒダンチオン（ＰＴＨ）誘導体に転化した。ＰＴＨ誘導体は、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ ＰＴＨ Ｃ−１８カラム（粒度５μｍ、２．１ｍｍ ｉ．ｄ．ｘ２２ｃｍ ｌ．；Applied Biosystems）を製造業者により開発された改変された２溶媒勾配系と共に用いて逆相ＨＰＬＣによりＰＴＨ分析器で分離し、同定した（５６）。
【００８６】
脂質化されたｒＰ６（４００ｐｍｏｌｅｓ）をアミノ末端のアミノ酸配列分析に供した場合に、いかなる配列データも得ることができなかった。これは、アミノ末端のアミノ酸の第一級（または第二級）アミノ基が配列決定化学に利用できない、すなわち、ＬｒＰ６のアミノ末端の残基がブロックされていることを示唆した。配列データを生成できないことがいかなる装置の不調のためでもないことを立証するために、次に、４００ｐｍｏｌｅｓの脂質化されたｒＰ６及び２００ｐｍｏｌｅｓのβ−ラクトグロブリンの混合物をアミノ末端の配列分析に供するコントロール実験を実施した。β−ラクトグロブリンのアミノ末端の配列に相当する単一の配列が得られ、これは脂質化されたｒＰ６のアミノ末端の残基が本質的にブロックされていることを裏付けた。
【００８７】
実施例１０
脂質化されていないｒＰ６に比較した脂質化されたｒＰ６の免疫原性
精製された脂質化された組換えＰ６及び脂質化されていない組換えＰ６（２８）の相対的な免疫原性をＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおいて比較した。各５μｇ用量の各タンパク質を１００μｇのＡｌＰＯ4及び５０μｇの３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬTM）（Ribi Immunochemicals, Hamilton, MT）と混合し、マウスを０、４及び６週で皮下的に免疫するために用いた。血液サンプルを０、４、６及び８週で取った。マウスの他の群は、脂質化されていないｒＰ６または脂質化されたｒＰ６のいずれか及び細菌性中耳炎の原因因子であるモラクセラ・カタラーリスのＵｓｐＡ２タンパク質（４９）及び組換えの脂質化されたｒＰ４（５０）の混合物で免疫した。これらの混合物もまた上記のようにＡｌＰＯ4及びＭＰＬTMをアジュバントとした。
【００８８】
マウスから得られた抗血清をＰ６、Ｐ４またはＵｓｐＡ２タンパク質のいずれかに対する抗体に関してＥＬＩＳＡにより分析した。プールした血清または個々の動物のいずれかについてＥＬＩＳＡ力価を決定し（２２，２８）、次に相乗平均力価（ＧＭＴ）を得た。結果を表２及び３に示す。
【００８９】
【表６】
0004660043.tif 000007
【００９０】
【表７】
0004660043.tif 000008
【００９１】
脂質化されたｒＰ６は、ＭＰＬTM及びＡｌＰＯ4アジュバントと一緒に投与した場合に脂質化されていないｒＰ６より少なくとも１ ｌｏｇ免疫原性である。ｒＰ４及びＵｓｐＡ２と合わせた場合に、いかなる抗原性の競合も認められなかった。実際、脂質化されたｒＰ６に対する応答は、脂質化されていないｒＰ６に対する応答より約１．５ ｌｏｇまで大きく増加した。
【００９２】
ＵｓｐＡ２及びｒＰ４抗原に対する免疫応答の分析は、脂質化されたｒＰ６の添加が、脂質化されていないｒＰ６の添加と比較した場合にこれらの抗原に対する免疫応答を改変しなかったことを示す。いずれの抗原も、脂質化されたｒＰ４及びＵｓｐＡ２を一緒に混合した場合に見られる通常の免疫応答に対していかなる影響ももたなかった。これは、これらの抗原の適合性を実証した。
【００９３】
実施例１１
マウス抗血清の殺菌活性
脂質化されたｒＰ６及び脂質化されたｒＰ６／ｒＰ４混合物に対して導かれる抗血清の生物学的活性を、インビトロ殺菌アッセイを用いて実証した。このアッセイは、標的として型の決定できないヘモフィルス・インフルエンゼ株Ｐ８６１４５４を用いて以前に記述されたように実施した（２２，２８）。結果を表４に示す：
【００９４】
【表８】
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【００９５】
結果は、脂質化されたｒＰ６がこのアッセイにおいて生物学的に活性の抗体を引き出すことを示した。絶対的な力価は脂質化された抗血清及び脂質化されていない抗血清間で異ならなかったが、特に免疫前の血清はこのアッセイに使用した補体源で高度の非特異的致死を示したので、これは抗血清がこのアッセイ系において最大限に殺菌性のためである可能性がある。脂質化されたｒＰ６／ｒＰ４混合物もまた、脂質化されていないｒＰ６／ｒＰ４混合物で得られたものと同等の力価で殺菌性抗体を引き出した。このアッセイでは抗−ｒＰ４抗体と抗−ｒＰ６抗体の殺菌活性を区別することは可能でなかったが、ヘモフィルス抗原の混合物が型の決定できないヘモフィルス・インフルエンゼに対する非常に殺菌性の抗血清を引き出したことは明らかである。
【００９６】
【表９】
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【００９７】
【表１０】
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【００９８】
【表１１】
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【００９９】
【表１２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】型の決定できないヘモフィルス・インフルエンゼ株Ｐ８６０２９５の染色体からのＰＣＲ増幅による天然のリポタンパク質シグナルペプチドを有するＰ６タンパク質をコードするｐａｌ遺伝子のクローニングを示す。
【図２】脂質化されたｒＰ６の同質性及び同一性を示す。最初の抽出物（レーン１）及び陰イオン交換で精製された脂質化されたｒＰ６のプール（レーン２）における約１０μｇの脂質化されたｒＰ６を含有するサンプルを１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せた。Ｓと明示するレーンは、Ｂｉｏ−Ｒａｄからの事前に染色した低分子量基準を含有する。図２Ａは、クーマシー染色したゲルである。図２Ｂは、同様のゲルのウェスタン免疫ブロットである。
【図３】脂質化されたｒＰ６の精製からの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。脂質化されたｒＰ６の精製工程における段階のアリコートを４−２０％勾配ゲル系上で電気泳動した。レーン：１、溶解バッファーでのダイアフィルトレーションからの透過物；２、ＴｒｉｔｏｎTM Ｘ−１００でのダイアフィルトレーションからの透過物；３、ＴｒｉｓTM バッファーでのダイアフィルトレーションからの透過物；４、ＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１４でのダイアフィルトレーションからの透過物；５、ＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１４／０．５Ｍ ＮａＣｌでのダイアフィルトレーションからの透過物；６、ＴｒｉｓTM バッファーでのダイアフィルトレーションからの透過物；７、サルコシルでのダイアフィルトレーションからの透過物；８、Ｍａｒｋ １２基準；９、ＴｒｉｓTM バッファーでのダイアフィルトレーションからの透過物；１０、室温でＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１２でのダイアフィルトレーションからの透過物；１１、ＴｒｉｓTM バッファーでのダイアフィルトレーションからの透過物；１２、濃縮工程からの透過物；１３、５５℃でＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１２でのダイアフィルトレーションからの透過物；１４、５５℃でＴｒｉｓTM バッファーでのダイアフィルトレーションからの透過物；１５、５５℃でＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM ３−１２でのダイアフィルトレーションからの透過物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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