(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスベクターストックの製造方法であって、
（ａ）アデノウイルスベクターの増殖を可能にする細胞の培養物を用意すること、ここで、細胞は培地中にあり、
（ｂ）細胞の増殖を可能とする条件下で培養物を培養すること、
（ｃ）培地中の細胞密度が、培養物の増殖が定常期にあるときの培地で得られる細胞密度の約４０〜７０％である間、培養物中の培地の体積の少なくとも約２倍の量の新鮮培地を、培養物中に約１〜６時間灌流すること、
（ｄ）細胞の感染を可能にする条件下、培養物にアデノウイルスベクターを接触させること、
（ｅ）感染細胞を培養し、アデノウイルスベクターを複製させること、及び
（ｆ）感染細胞を回収し、アデノウイルスベクターストックを得ること、
を含む方法。
【請求項２】
培養物が、新鮮培地の灌流前に、又は培養物とアデノウイルスベクターとの接触の間に濃縮されない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｃ）における新鮮培地の灌流の前後での培養物がバッチ又はフェド−バッチ条件下に培養される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）における新鮮培地の灌流が完了した後、培地が培養物に添加されないか又は交換されない、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
培地中の細胞密度が、培養物の増殖が定常期にあるときの培地で得られる細胞密度の約６０〜７０％である間、培養物中の培地の体積の少なくとも約２倍の量の新鮮培地を、培養物中に灌流する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
細胞の回収時に産生される、アデノウイルスフォーカス形成ユニットに対するアデノウイルス粒子ユニットの比が約７０以下である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
培地中の細胞密度が、培養物の増殖が定常期にあるときの培地で得られる細胞密度の約４０〜７０％である間、培養物中の培地の体積の約３〜４倍の量の新鮮培地を、培養物中に灌流する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
細胞がミクロキャリア非含有懸濁培養で増殖される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
アデノウイルスベクターが複製欠損アデノウイルスベクターである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
細胞が、ヒト胎児腎細胞、ヒト胎児肺細胞、又はヒト胎児網膜芽細胞である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
定常期での培地中の細胞密度が約１．５〜９×１０６細胞／ｍｌである、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
感染時での培地中の細胞密度が約０．８〜４．２×１０６細胞／ｍｌである、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
培養物中への培地の灌流によって、培地の約９５％以上を新鮮培地で置換することを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
培養物とアデノウイルスベクターとの接触の間及び／又はその後、培地のｐＨを約６．９〜７．５に維持することを更に含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
培養物をアデノウイルスベクターに接触させるとき、培養物中の細胞の少なくとも約７５％が生存している、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
アデノウイルスベクターがアデノウイルス遺伝子トランスファーベクターである、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
培地が動物性タンパク質非含有培地である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、ウイルスベクターストックの製造に関する。
【０００２】
発明の背景
ウイルスベクターとしても知られる改変ウイルスは、研究的及び治療的遺伝子トランスファー適用のための便利なベクターシステムであることが知られており、アデノウイルスベクターシステムは、このような用途のために幾つかの利点を提供する。これらの利点のために、研究者らは、アデノウイルスベクターに基づく多数の遺伝子治療適用を開発した。このようなアデノウイルスベクターに基づく適用は、臨床試験及び承認された医学適用に入っているので、アデノウイルスベクターストックの効率的な大規模製造の必要性が増大しよう。
【０００３】
細胞培養物におけるウイルスストックの製造システムは、当業界公知である。従来技術の幾つかの参考文献は、細胞培養物におけるウイルスストックの製造のための一般的方法を教示する（例えば、米国特許第4,055,466号、第4,072,565号及び第4,080,258号参照）。種々のウイルスベクター及びその増殖を可能にする細胞タイプの間でのストック製造のバリエーションのために、一般化した方法はしばしば、ウイルスベクターストック、特に組換えウイルスベクターストックの大規模製造に適切ではないことがわかってきた。
【０００４】
より最近、研究者らは、特定のタイプのウイルスベクターに焦点をあてることによる組換えウイルスベクターストックの製造を研究した。例えば、昆虫細胞における組換えバキュロウイルスストックの製造に関するシステムが広範に研究された（例えば、Kamenら，Biotechnology and Bioengineering, 50(1), 36-48(1996)参照）。他の研究者らは、組換えレトロウイルスの製造システムを研究した（例えば、Le Douxら, Biotechnology and Bioengineering, 63(6), 664-652(1999)参照）。バッチ培養物におけるワクシニアウイルスの吸着速度及び複製速度も、以前に研究された（Chillakuruら, Biotechnol. Prog., 7,85-92(1991)参照）。
【０００５】
バキュロウイルス及び他の非アデノウイルスベクターストックを製造するために利用できる方法と比較して、アデノウイルスベクターストックの製造システムは、比較的殆ど知られていない。米国特許第5,994,134号は、血清ベースの培地中、高密度の細胞において、アデノウイルスを含むウイルスの製造のためのミクロキャリア（microcarrier）ベースのバイオリアクタープロセスの使用を教示する。血清ベースの培地及びミクロキャリアバイオリアクターに伴う制限が、この方法の適用性を制限する。Garnierら, Cytotechnology, 15,145-55(1994)は、感染後、単回又は二回の培地置換と組合わせて、種々の濃度で細胞に感染させることによって（典型的には、細胞増殖の中期〜後期対数期（mid to late log phase）の間、又は対数期と定常期との間）、組換えアデノウイルスベクターに感染した２９３細胞における高レベルの組換えタンパク質の製造方法を提供する。この研究を進めて、Coteら, Biotechnology and Bioengineering,59(5),567-75(1998)は、１×１０7細胞／ｍｌまでの細胞密度にて、アデノウイルスベクターに感染した２９３細胞における組換えタンパク質の製造を教示する。国際特許出願ＷＯ 00/32754は、このような周知の技術を用いる組換えアデノウイルスの製造に関する。
【０００６】
それ故、アデノウイルスベクターストックの製造のための代替方法の必要性が存在する。本発明はこのような方法を提供する。本発明のこの利点及び他の利点は、更なる発明の特徴と同様に、本明細書で提供される本発明の説明から明らかとなろう。
【０００７】
発明の簡単な概要
本発明は、アデノウイルスベクターストックの製造方法を提供する。本方法の工程は、アデノウイルスベクターの増殖を可能にする細胞の培養物を用意すること（ここで、細胞は培地中にある）、細胞の増殖を可能とする条件下で培養物を培養すること、培地中の細胞密度が、培養物の増殖が定常期にあるときの培地で得られる細胞密度の約４０〜７０％である間、培養物の培地の体積の少なくとも約２倍の量の新鮮培地を、培養物中に灌流すること、細胞の感染を可能にする条件下において培養物にアデノウイルスベクターを接触させること、感染細胞を培養し、アデノウイルスベクターを複製させること、及び感染細胞を回収し、アデノウイルスベクターストックを得ることを含む。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は、アデノウイルスベクターストックの製造方法を提供する。本方法の工程は、
（ａ）アデノウイルスベクターの増殖を可能にする細胞の培養物を用意すること、ここで、細胞は培地中にあり、
（ｂ）細胞の増殖を可能とする条件下で培養物を培養すること、
（ｃ）培地中の細胞密度が、培養物の増殖が定常期にあるときの培地で得られる細胞密度（“定常期密度”ともいう）の約４０〜７０％である間、培養物の培地の体積の少なくとも約２倍の量の新鮮培地を、培養物中に約１〜６時間灌流すること、
（ｄ）細胞の感染を可能にする条件下、培養物にアデノウイルスベクターを接触させること（好ましくは、工程（ｃ）における新鮮培地の灌流が実質的に完了した後、より好ましくは、完全に完了した後）、
（ｅ）感染細胞を培養し、アデノウイルスベクターを複製させること、及び
（ｆ）感染細胞を回収し、アデノウイルスベクターストックを得ること、
を含む。
【０００９】
細胞は、アデノウイルスベクターストックを製造するための任意の適切な種類の細胞でありうる。即ち、アデノウイルスベクター産生細胞として働きうるどの細胞も適切である。適切な細胞の例は、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞、ヒト胎児肺（ＨＥＬ）細胞、及びヒト胎児網膜芽（ＨＥＲ）細胞などの初代細胞株の細胞を含み、また、他の細胞（例えば、ＨＥＬＡ細胞又は培養組織細胞）も適切でありうる。好ましくは、細胞は、足場依存性細胞であるか、又はそれに由来するものであるが、懸濁培養で増殖する能力を有する。好適なＨＥＫ細胞は、２９３細胞であり、２９３細胞から誘導される細胞株由来の細胞である。好適なＨＥＬ細胞は、Ａ５４９細胞、及びその細胞株誘導体由来の細胞である。
【００１０】
好ましくは、細胞は、アデノウイルスゲノムのいくつかの部分の配列を欠損するアデノウイルスベクター、特に、米国特許第5,994,106号及び国際特許出願ＷＯ 95/34671に一般的に記載されるような複製欠損アデノウイルスベクターを補完できるように、アデノウイルスゲノムのいくつかの部分（例えば、１つ以上のヌクレオチド配列）に対応する、又はそれに由来するＤＮＡを含むように改変される。より好ましくは、細胞は、アデノウイルスベクターと補完性細胞との間の相同性組換えを防止しつつ、アデノウイルスベクターをそのように補完しうる。
【００１１】
好ましくは、改変細胞は、２９３細胞、Ａ５４９細胞又は改変ＨＥＲ細胞であるか、又はそれら由来である。特に、改変ＨＥＲ細胞は、アデノウイルスベクターストックを産生できる他の細胞に対し幾つかの利点を提供する。即ち、例えば、このような改変ＨＥＲ細胞は、高度にトランスフェクション可能であり、２９３細胞のようにかなり低い頻度の相同性組換えしか示さず、そしてアデノウイルスベクターに感染するとき、約３〜４日で細胞単層中でのプラークの出現を伴う（対して、例えば、２９３細胞では６〜１０日が伴われる）ことが望ましい。このように、このような改変ＨＥＲ細胞は、アデノウイルスベクターに感染するとき、例えば、２９３細胞よりもプラークアッセイのより速い実施を可能とする。より望ましくは、ＨＥＲ細胞は、他の細胞のタイプにおけるよりも高速でのアデノウイルスベクターの収量を伴い、より好ましくは、同様のアデノウイルスベクターに感染した２９３細胞で達成されるものの約２〜３倍の速さでアデノウイルスベクターの収量を伴う。適切な改変ＨＥＲ細胞の例は、Fallauxら, Human Gene Therapy, 7,215-222(1996)に記載の９１１細胞を含む。特に好適な改変ＨＥＲ細胞は、国際特許出願ＷＯ 97/00326に記載のＰＥＲ.Ｃ６細胞（Introgene,Inc.）である。
【００１２】
細胞は培養物を形成し、培養物は適切な培地中で維持される。細胞の培養物は、アデノウイルスベクターストックの製造のための任意の適切な培養物でありうる。ここで、灌流の前の培地体積の少なくとも約２倍の量の新鮮培地を培養物中に灌流できる。適切な培養の例は、灌流培養、支持体支持培養、ミクロキャリア支持培養、流体ベッド（fluid bed）培養、又は懸濁培養を含む。好ましくは、培養は、連続的灌流細胞培養などの灌流細胞培養、又はローラーボトル培養や懸濁バイオリアクター培養で使用される懸濁培養などの懸濁培養である。このような培養は、当業界周知であり、一般的に使用される。懸濁培養が特に好ましい。最も好ましくは、培養物中への新鮮培地の灌流の前後に、このような培養物が、バッチ（batch）様式又はフェド(fed)−バッチ様式で維持されるときである。
【００１３】
培養物は培地中に存在する。培地は、細胞を維持し、かつその中でアデノウイルスベクターの増殖を可能とする任意の適切な培地でありうる。本発明の実施での使用に適した培地の多数の例、及び改変培地もしくは新規の適切な培地を産生する原理は、当業界周知である。一般的には、培地は、分泌される細胞タンパク質、拡散性栄養素、アミノ酸、有機塩、無機塩、ビタミン、微量金属、糖、及び脂質、並びに恐らく、増殖促進物質（例えば、サイトカイン）などの他の化合物の選別を含むであろう。培地は、アデノウイルスベクターストックを産生するのに用いられる細胞タイプの増殖に適切であるべきであり、それ故、このような細胞が天然で成長する生理的溶液及び条件（例えば、ｐＨ）を模倣しよう。多数の市販の細胞及び培地の組合わせが利用でき、当業者は容易に、培養物のための望ましい条件を決定できよう。
【００１４】
非規定（undefined）培地と規定（defined）培地の両方が、本発明の文脈において適切な培地でありうる。非規定培地は、培地の特定の内容（例えば、タンパク質や栄養素の内容物や量）が知られていないか、又は規定の処方によって特定化されていない培地である。適切な非規定培地の例は、ウシ胎仔血清（例えば）（ＦＢＳ）などの動物血清をベースとする培地、又は代替の栄養源、例えば、肉、器官又は腺の酵素分解物を利用する培地、並びにミルク、又は小麦グルテンの加水分解物を利用する培地を含む。非規定培地を本発明の文脈で用いるとき、培地は無血清培地（ＳＦＭ）であるのが好ましい。ＳＦＭは血清を含まないが、動物由来成分、例えば、アルブミン、フェツイン、ホルモン、並びに器官抽出物などの“非規定”成分をなお含みうる。
【００１５】
より好ましくは、本発明の文脈で使用される培地は、規定培地である。規定培地は、培地の内容物が知られ、及び／又は特定の処方に設定されている培地である。規定培地は典型的には、特定の細胞タイプの必要性を満たすように処方される。規定培地の一例は、基礎培地である。基礎培地は一般的には、ビタミン、アミノ酸、有機塩、無機塩、及び緩衝剤からなる。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの更なる“規定”成分は、基礎培地を栄養的により複雑にするために加えられうる。適切な規定培地は、タンパク質非含有培地及びタンパク質含有培地を含む。好ましくは、規定培地を用いるとき、動物性タンパク質非含有培地が使用される。動物性タンパク質非含有培地は、タンパク質を含みうるが、動物起源のタンパク質を含まない。特に好適な培地は、組換えタンパク質及び増殖因子（例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）及びインスリン様成長因子（ＩＧＦ））、並びに脂質（例えば、タラ肝抽出物）及びコレステロールを含む動物性タンパク質非含有培地である。市販の好適な培地の例は、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ５２５（JRH Biosciences）である。このような培地にグルタミンが補充されていることも望ましい。
【００１６】
アデノウイルスベクター産生細胞の増殖と維持を可能とする培養物は、任意の適切な方法で製造できる。典型的には、培地に、生存凍結細胞培養物などの保存培養物に典型的に含まれる細胞を接種し、培養物を産生する。細胞含有培養物が凍結細胞培養物として含まれるならば、将来の使用のために培養物中で生存細胞の高いパーセンテージを維持するために適切な条件下、細胞を凍結に供するのが望ましい。将来の使用のために細胞を凍結する幾つかの方法は、当業界公知である。しかし、このような方法が、保存後使用のために、培養物中で生存細胞の高いパーセンテージを維持する能力は、広く変動する。生存細胞含有培地（例えば、細胞培養物）を保存する特に好ましい方法は、（ａ）生存細胞含有培地を提供すること、（ｂ）生存細胞含有培地の温度を、約４℃以上から約−４０℃まで、約１．５℃／分だけ低下させること、（ｃ）約１分以上の時間、生存細胞含有培地の温度を、約−４０℃に維持すること、（ｄ）生存細胞含有培地の温度を、温度約−１５０℃以下に低下させること（例えば、生存細胞含有培地を液体窒素（ＬＮ2）に浸すことによって）、及び（ｅ）生存細胞含有培地を、温度約−１５０℃以下に維持することを含む。好ましくは、培養物の温度は、約−１８０℃以下に下げられ、又はより一層好ましくは、約−１９５℃以下に下げられる。細胞培養物を約−４０℃に保つ時間は、約１分以上の任意の時間でありうる。細胞を保存するこの方法の使用により、細胞を凍結するためにＬＮ2に浸すことによる他のプロトコルに対し、保存の間、及び融解に際して、生存細胞のパーセンテージの保持が改良される。記載した方法の他の利点は、細胞生存率を保持するために、凍結プロセスの間、汚染の可能性のある、又は恐らく毒性の可能性さえある低温保護剤の添加が必要なく、エネルギーの添加又は減圧の使用も必要ないということである。
【００１７】
凍結細胞培養物が使用のために望まれるとき、それは、適切な温度で融解される。任意の適切な融解温度が使用でき、幾つかは当業界公知である。例えば、培養物を適当な容器に入れ、培養物が約３／４融解するまで（ここで、培養物の小部分はなお凍結している）、容器を急速震盪させながら、容器（及びその中の培養物）を３７℃でＨ2Ｏ浴に供することによって、細胞含有培養物を“急速融解”に供することができる。この時点で、培養物を、Ｈ2Ｏ浴から取り出し、培養物が完全に融解するまで、震盪を続ける。融解後には、凍結細胞培養物は、培養を続ける用意ができている。好ましくは、このような凍結細胞培養物は、新鮮培地を含む培養物又は新鮮培地からなる培養物のための接種物として使用される。
【００１８】
細胞による接種後、次いで培養物は、細胞の増殖を可能とする条件下で“培養(cultured)”又は培養(cultivated)される。アデノウイルスベクター産生細胞の増殖を可能とする培養物の培養の任意の適切な方法が、本発明の文脈で適切である。このような細胞の培養方法は、選択されるアデノウイルスベクター細胞のタイプに依存しよう。適切な培養方法は、当業界周知であり、典型的には、細胞の増殖に適切な範囲内にｐＨと温度を維持することを含む。培養の好適な温度は約３５〜４０℃であり、より好ましくは約３６〜３８℃、及び最適には約３７℃である。好ましくは、培養物のｐＨは約６〜８、より好ましくは約６．７〜７．８、及び最適には約６．９〜７．５に維持される。
【００１９】
培養物の接種から、及び培養物の培養の間、細胞の増殖は典型的には、５つのステージからなる特徴的なパターンに従う。第１ステージ、即ち遅滞期（lag phase）は、培養物を形成するための、細胞又は保存培養物の培地への導入で起こる。好ましくは、培地に接種するために使用される細胞又は保存培養物（即ち、接種物）は、遅滞期の長さを減少させるために、生存細胞の高パーセンテージ及び比較的新鮮な保存培地からなろう。
【００２０】
典型的には、遅滞期後、対数（又は指数）期が続くが、対数期では、細胞は最大限可能な増殖速度で分裂し、このようにして、培養物中の全生存細胞数を増大させる。細胞増殖速度は、増殖培地及び増殖条件（例えば、通気、ｐＨレベルなど）に依存する。増殖培地及び増殖条件は、対数期の間の細胞増殖を促進するように好ましくは最適化される。しかし、如何なる条件下でも、細胞増殖速度は、それ自体細胞タイプに依存する最大倍化時間を超えないであろう。指数期の間の細胞増殖速度は一定であるが、各細胞は僅かに異なる瞬間に分裂するので、増殖曲線は徐々に上昇する。対数期に減速期（decelerating phase）が続く。減速期では、培養物中の生存細胞の増加速度は減少する。減速期に定常期が続く。定常期では、培養物中の生存細胞の総計数がもはや増加しない。これは、細胞分裂の欠如、又は細胞分裂と細胞死の平衡比によって起こる効果である。定常期の前又はその間に細胞培養物が回収されなければ、培養物は第２減速期（ここで全生存細胞数が減少する）へと移り、次いで、指数死期（exponential death phase）が続く。細胞密度は、培養物の増殖サイクルを通して増大する。培地中の細胞濃度は、培養物を培養しながらモニターされうる。
【００２１】
細胞増殖速度及び上記増殖サイクルは、当業界周知の多数の技術によって測定できる。培養物中の全細胞数に焦点を当てる技術としては、培養物の重量の測定、培養物濁度の評価、培養物中の代謝活性の測定、電子工学的な細胞計測、培養物サンプルの顕微鏡による細胞計測、連続希釈を用いるプレート計測、膜フィルター計測、およびラジオアイソトープアッセイが挙げられる。これら及び他の原理に基づく、及びバイオリアクターでの使用に特に適した細胞密度を測定するための機械的システムは、例えば、Junkerら,Bioprocess Engineering, 10,195-207(1994)に総説されている。より最近では、マススペクトロメトリー及び他の進歩した分析技術が、同様に使用されている（例えば、Behrendtら,Cytotechnology, 14,157-65(1994)参照）。本発明の文脈において、細胞密度の評価を可能にする任意の技術が適切である。培養物の細胞密度は、分光学的に、又は血球計数器などの計測チャンバーを用いて測定できる。好ましくは、血球計数器が用いられる。簡潔には、血球計数器ベースの技術は、培養物のサンプルを採取すること、血球計数器の所定の空間における統計学的に有意な数の細胞を計測すること（及び必要に応じて、さらに試験すること）、及び簡単な数式を用いて、培養物中の細胞密度を測定することを含む。
【００２２】
細胞生存率はまた、当業界公知の多数の技術によって測定できる。好適な技術は、色素排除技術である。この技術は、指示色素を用いることにより、細胞膜の損傷を識別する。色素を吸収する細胞は染色されるため、非生存とみなされる。トリパンブルー、エリスロシン及びニグロシンなどの色素が通常使用される。好ましくは、トリパンブルーベースのアッセイが用いられる。このような方法を行うことの更なる詳細並びに他の細胞培養方法及び分析方法は、例えば、Lubiniecki, Large-Scale Mammalian Cell Culture Technology (Marcel Dekker, Inc., New York, 1990)、Kostaninovら, Trends in Biotechnol., 12,324-33(1994)、Methods in Cell Biology, 57, 19-30 (1998) 中の第2章のMather, “Making Informed Choices：Medium, Serum, and Serum-Free Medium,”、Freshney, Culture of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.,1987)、Harrison, General Techniques of Cell Culture (Cambridge Univ. Press 1997)，Animal Cell Culture Methods, Barnes and Mather（編）(1988)、及びBonariusら, Biotechnology and Bioengineering, 45, 524-35 (1995)において提供される。
【００２３】
細胞増殖が定常期にあるときの培地で得られるであろう細胞密度の約４０〜７０％（例えば、約４５〜７０％又はさらに約５０〜７０％）に、培地中の細胞密度がなるまで、培養物は培養される。培養物がこの範囲内の細胞密度である間に、その時（即ち、灌流の直前）の培養物中の培地の体積の少なくとも約２倍の量の新鮮培地が、約１〜６時間、培養物中に灌流される。短時間にわたってのこの高体積灌流は、“集中的な灌流（intense perfusion）”と言われうる。これは、新鮮培地を提供すること、及び集中的な灌流の開始前に培養物中に蓄積した使用済培地の相当量を除去することの両方に役立つ。より好ましくは、培養物の体積の約３〜４倍の量の新鮮培地が培養物中に灌流される。さらにより新鮮な培地が、培養物中に灌流されうるが、特に、新鮮培地による灌流に付随するコストの観点及び更なる培地による灌流によって生じるアデノウイルスベクターの有意な増大の欠如の観点から、培養物中の培地の体積の約３〜４倍の量が最適である。
【００２４】
培養物中への灌流とは、所定体積の培地が培養物中に加えられ、培養物中の細胞の有意なパーセンテージを除去することなく実質的に同一量の培地が培養物から除去されることを意味する。集中的な灌流は、任意の適切な技術によって行うことができる。典型的には、灌流能力をもったバイオリアクターを用い、このような灌流を成就する。連続的灌流培養の場合、新鮮培地の灌流が培養中ずっと行われている。しかし、培養物中の細胞密度が本明細書記載の値であるとき、新鮮培地が培養物中の培地の体積の少なくとも約２倍の量において培養物中に灌流されることを確保するために、連続的灌流速度は必要に応じて変更される。典型的には、連続的灌流培養の場合、培養物の灌流は、１日当たり培養物中の培地の約１〜４体積の速度で行う。連続培養は、培養物に新鮮培地を加えて、培養の間に細胞を維持するための適切な手段であるが、培養物から大量（例えば、約２０％超、５０％、６５％、又はなお一層高いパーセンテージ）の使用済培地を除去するのには有効ではない。
【００２５】
培養物中の培地の体積の少なくとも約２倍の灌流は、集中的な灌流が約１〜６時間で完了するように任意の適切な速度で行われうる。特に、適切な速度は、新鮮培地が、短い時間にわたって培養物に新鮮培地を提供するように十分に素早く加えられるが、培養物中の剪断速度により、剪断に起因する培養物中の生存細胞の大パーセンテージの喪失が起こらないように十分に遅い速度である。集中的な灌流の間の灌流速度は、培養物に培地を灌流させるために使用されるシステムのタイプに依存しよう（例えば、培地を灌流させるために使用されるポンプのタイプ）。幾つかの適切な灌流システムが公知であり、当業者は、使用される特定のシステムについて適切な速度を容易に決定できよう。好ましくは、集中的な灌流は、約２〜４時間、なお一層好ましくは約２〜３時間要するような速度で行われよう。集中的な灌流の間における培養物の灌流は、１時間当たり培養物中の培地の体積の約７０〜２００％の速度で行われる。より好ましくは、速度は、１時間当たり培養物中の培地の体積の約８０〜１５０％である。１０リットルバイオリアクター中での集中的な灌流工程の間では、１時間当たり培養物中の培地の約１．３体積の灌流速度が特に好適である。
【００２６】
培養物の体積の少なくとも約２倍の量の新鮮培地を培養物中に灌流することによって、アデノウイルスベクターとの接触前に、使用済培地の約６６％以上が培養物から除去される（そして新鮮培地で置換される）。例えば、培養物の体積の約３〜４倍に等しい量での新鮮培地の集中的な灌流により、培養物における使用済培地の９５％以上が除去される（そしてこのようにして新鮮培地で置換される）。培養物の培地の体積の少なくとも２倍での培養物の灌流による、培養物に少なくとも約６６％の新鮮培地を加えることの利点は、培養物中の細胞の栄養素“飢餓”、及び培養物中の生存細胞の、結果としてのより低いパーセンテージが避けられるということである。それ故、このようなレベルでの培地交換が好適である。幾らかの使用済培地が培養物中に残るが、培養物中のこのような低レベルの使用済培地は、アデノウイルスベクターによる感染中及び感染後において、アデノウイルスベクター収量に有意に影響を与えない。このように、アデノウイルスベクターと培養物との接触前において、連続的灌流技術又はより高レベルでの新鮮培地の灌流は、あまり望ましくない。
【００２７】
好ましくは、細胞密度が、定常期の培養物の密度の約４４〜約７０％（例えば、約４４〜６３％）である間、より好ましくは、定常期の培養物の密度の約５５〜７０％（約６０〜７０％）である間、より一層好ましくは、細胞密度が、定常期の培養物の密度の約６２〜６９％（例えば、約６５％）である間、新鮮培地が培養物中に灌流される。典型的には、このような密度は、培養物の指数期の中期〜後期の間に達成される。
【００２８】
定常期での培地中の細胞の実際の密度は、任意の適切な密度でありうる。任意の培養物の特定の定常期密度は、培養物の特定の成分に依存し（例えば、使用される細胞のタイプ及び培地）、培養物のタイプ及びサイズに顕著に依存しよう。典型的な定常期密度は、１〜９×１０6細胞／ｍｌでありうる。例えば、ＨＥＲ細胞培養物の１０リットルのフェド−バッチ又はバッチバイオリアクターの場合、定常期密度は典型的には、約１．５×１０6〜２．６×１０6細胞／ｍｌ、より典型的には、約１．５×１０6〜２×１０6細胞／ｍｌである。１０リットルの連続的灌流バイオリアクターの場合、定常期密度はしばしば、１０リットルの連続的灌流バイオリアクターにおいてＡ５４９細胞の場合で５〜６×１０6細胞／ｍｌのように、より高い。対照的に、１０リットルの連続的灌流バイオリアクター中で増殖した２９３細胞及び２９３由来細胞株の細胞、並びにＨＥＲ細胞株の場合、典型的な定常期細胞密度は、約７〜９×１０6細胞／ｍｌであろう。１０リットルのフェド・バッチ（fed batch）、バッチ、及び連続的灌流培養が好適なので、これらの細胞密度は、本発明の実施において好適な定常期細胞密度を表す。培養物が定常期にあるときの培地中の細胞数は、培養物の幾つかの部分を、定常期まで進行させることによって、又は実質的に類似する培養物を評価すること（定常期の培養物の密度が測定される）によって、決定できる。
【００２９】
集中的な灌流の間の培地中の細胞密度は典型的には、約０．８〜４．２×１０6細胞／ｍｌである。特に、１０リットルのフェド・バッチ及びバッチバイオリアクター中において、集中的な灌流の間の培地中の細胞密度は、典型的には０．８×１０6〜１．１×１０6細胞／ｍｌ、とりわけ約１．０×１０6〜１．１×１０6細胞／ｍｌである。１０リットルのフェド−バッチバイオリアクターにおいて、新鮮培地が培養物中に灌流される間の細胞密度は、約０．８×１０6〜１．４×１０6細胞／ｍｌ、とりわけ約１．１×１０6〜１．３×１０6細胞／ｍｌでありうる。１０リットルの連続的灌流バイオリアクターの場合、このような密度は、約２．４×１０6〜４．２×１０6細胞／ｍｌであろう。このような密度は、培養物中の培地の体積の少なくとも約２倍の量の新鮮培地が培養物中に灌流されるべき好適な密度を表す。
【００３０】
培養物中の培地の体積の少なくとも２倍の量の新鮮培地を培養物中に灌流させるときの細胞密度に到達する時間は、細胞増殖サイクルの間に使用されるベクター、細胞のタイプ、及び培養物のタイプに依存して変わろう。例えば、３×１０5細胞／ｍｌ未満の密度の凍結細胞で出発する場合、約６〜１０日の期間が、上記細胞密度を達成するために必要でありうる。培養物は、単一容器又は複数容器で増殖できる。例えば、培養物は、所望の細胞密度が達成されるまで、最初は複数のローラーボトルで増殖させることができ、次いで、分離された培養物は、１つのバイオリアクターなどの単一容器中、又は異なるバイオリアクター中に１つにまとめられうる。
【００３１】
細胞密度の直接測定又はモニターの他に、当業者は、アデノウイルスベクターストックを産生するために使用される細胞や培養物について、上記細胞密度に対応する時間又は兆候を測定できよう。即ち、例えば、最適のストック産生と関連した細胞密度に対応する時間は、特定のストックに対して決定され得、そして実質的に類似するストック（例えば、同じ細胞タイプや同じ培地）で本発明を実施する際に、培養物をアデノウイルスベクターと接触させるべきときの指標として選択されうる。利用できる別の技術は、培養物の増殖の間での１つ以上のサンプルポイントに基づく、増殖に関する数式（Monrodモデルなど）の使用である。いずれのタイプの技術又は他の同様な技術が、このような決定されたパラメーターの下で本発明を実施するために、機械的モニター技術又は他の技術と組み合わされうる。
【００３２】
上記細胞密度又は他の適切な指標の１つに到達し、かつ培養物中への新鮮培地の集中的な灌流が実質的に完了し、好ましくは完全に完了したとき、培養物を、細胞の感染を可能にする条件下、アデノウイルスベクターと接触させる。好ましくは、培養物とアデノウイルスベクターとのこのような接触は、培養物中への新鮮培地のこのような灌流の完了と非常に接近して行われ、理想的には、接触は、このような灌流の完了と同時に行われる。新鮮培地は培養物中に灌流されるので、培養物の密度は、このような新鮮培地の集中的な灌流によって有意には未変化のままであろう（理想的には、このような灌流の前後の培養物中の細胞密度は等しい）。それ故、培養物中への新鮮培地の灌流が適当であるときを示すために使用される上記細胞密度はまた、培養物をアデノウイルスベクターと接触させるべきときの細胞密度を示す。定常期密度の約４０〜７０％内の任意の適切な細胞密度が適切であり、細胞にアデノウイルスベクターを接触かつ感染させる好適な範囲は、集中的な灌流を行うための上記の好適な範囲と実質的に等しい。アデノウイルスベクターストックの産生に適切な特定の細胞タイプに好適な細胞密度は、特定の細胞タイプに基づいて、定常期密度の４０〜７０％の範囲内で幾分変わりうる。適切な密度は、アセンブルしたアデノウイルスベクター、特に活性／生存のアデノウイルスベクターの高収量の産生を可能とする。これは、典型的には定常期密度の７０％を十分に超えた細胞密度で細胞に感染することと関連した、感染細胞によるタンパク質の単なる生産とは対照的である。
【００３３】
アデノウイルスベクターは、いくつかの重要な部分において（必ずしも実質的ではないが）アデノウイルスのゲノム由来の、又はそれに基づく、細胞中で増殖できる任意のアデノウイルスベクターでありうる。アデノウイルスベクターは当業界公知であり、例えば、米国特許第5,559,099号、同第5,712,136号、同第5,731,190号、同第5,837,511号、同第5,846,782号、同第5,962,311号、同第5,965,541号、同第5,981,225号、同第5,994,106号、同第6,020,191号、並びにVirology, B. N. Fields et al.編, (第３版), Raven Press, Ltd., New York, 1996中、それぞれ第67章と第68章のThomas Shenk, "Adenoviridae and their Replication," 及びM. S. Horwitz, "Adenoviruses," にキャラクタライズされている。アデノウイルスベクターは、任意の適切な野生型のアデノウイルスベクターのゲノムに基づきうる。好ましくは、アデノウイルスベクターは、サブグループＣ、特に血清型５（Ａｄ５）の野生型アデノウイルスのゲノム由来である。
【００３４】
アデノウイルスベクターは複製欠損である。複製欠損アデノウイルスベクターは、当業界周知であり、例えば米国特許5,994,106及び上記参考文献に記載されている。アデノウイルスベクターは、米国特許5,851,806及び国際特許出願ＷＯ 95/34671に記載のものなどのマルチプル欠損アデノウイルスベクターである。複製欠損アデノウイルスベクターは、欠損ベクターにはない必須機能をトランスで提供する補完性細胞株又はヘルパーウイルスの存在を増殖に必要とする（Berker et al., J. Virol., 61, 1213-1220 (1987); Davidson et al., J. Virol., 61, 1226-1239 (1987); Mansour et al., Mol. Cell Biol., 6: 2684-2694 (1986)）。好ましくは、上記のように、複製欠損アデノウイルスベクターを増殖させるために使用される細胞は、補完性細胞株であり、それは、このような細胞が複製欠損アデノウイルスベクターに欠けている遺伝子産物を発現する能力に起因して、アデノウイルスベクターの複製を可能とする。
【００３５】
アデノウイルスベクターのいくつかは、アデノウイルス遺伝子トランスファーベクターでありうる。好ましくは、アデノウイルスベクターは、アデノウイルス遺伝子トランスファーベクターから本質的になり、より好ましくは、アデノウイルスベクターの全部がアデノウイルス遺伝子トランスファーベクターである。アデノウイルス遺伝子トランスファーベクターは、細胞環境中に１つ以上の外来遺伝子を導入できるアデノウイルスベクターであり、より好ましくは、１つ以上のこのような外来遺伝子を発現できるベクターである。アデノウイルス遺伝子トランスファーベクターの製造は当業界周知であり、例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed.), Cold Spring Harbor Press (1992), Watson et al., Recombinant DNA, (2d ed.), Scientific American Books (1992), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987), 及び上記参考文献の幾つかに記載されているものなどの標準的分子生物学技術を用いることを含む。好ましくは、外来遺伝子は、１つ以上の制御配列（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの、プロモーター及び／又はエンハンサー配列）、並びに終結及び／又はｍＲＮＡポリアデニル化（ポリＡ）コーディング配列を含む発現カセットの成分であり、発現可能なポリペプチド又はｍＲＮＡ（例えば、治療用タンパク質）をコードするであろう。
【００３６】
アデノウイルスベクターとの培養物の接触時に、及びその後に、アデノウイルスベクターは、細胞に感染することが可能となる。アデノウイルスベクター感染の条件は当業界周知であり、上記参考文献の幾つかに記載されている。アデノウイルスベクターの培養物との接触の間の培養物の温度は、好ましくは約３５〜４０℃、より好ましくは約３６〜３８℃、最適には約３７℃である。アデノウイルスベクターの培養物との接触の間のｐＨは、好ましくは約６．７〜７．８、より好ましくは約６．９〜７．５である。アデノウイルスベクターと培養物の接触は任意の適切な濃度（５×１０6細胞／ｍｌ又はなお一層高くまで、培地を濃縮することによってなど）で行われうるが、培養物を、このような接触前に細胞を濃縮すること無しに、アデノウイルスベクターと接触させうるし、好ましくは、接触させる。培養物中の細胞に対する、培養物と接触するアデノウイルスベクターの比（他には、感染多重度、即ちＭＯＩとしても知られる）は、望ましくは１を超え、より好ましくは約５以上である。
【００３７】
感染を可能にする条件下でのアデノウイルスベクターの接触は、アデノウイルスベクターによる細胞の感染の所望のレベルを可能とする任意の適切な時間で行われうる。感染のための時間は、少なくとも、使用されるウイルスの力価及び特定の細胞タイプ（細胞タイプの中には、高密度のレセプター（アデノウイルスが細胞に結合するために使用する）を有しうるものがあるため）並びにアデノウイルスベクターが利用できる表面積（それは、使用される培養物タイプ及び／又は細胞タイプの関数である）に依存しよう。更に、所望の時間は、用いるアデノウイルスベクターのタイプに影響されうる（例えば、ウイルスは、細胞に結合する能力に影響を与える、組換え操作により変化したコートタンパク質を有しうるし、又は化学的実体と結合しうる。）。当業者は、このような変数を考慮することによって、培養物のアデノウイルスベクターとの接触のための適当な時間を容易に決定できる。より長い時間（例えば、少なくとも約２、３、５、１０、１５、又は２４時間、あるいはより一層長い）も使用できるけれども、典型的には、約１時間の時間が、血清型５に基づくアデノウイルスベクターによる感染のための大部分の条件下では十分である。典型的には、細胞のアデノウイルスベクターとの接触の時間、及びこのような接触後の細胞の培養時間は、同時に起こる。培養物は濃縮されず、そして培養物のアデノウイルスベクターとの接触後、培地交換又は培養物の他の重要な改変が行われないからである。
【００３８】
培養物のアデノウイルスベクターとの接触の間には、培地交換は必要ではなく、好ましくは、感染前の培養物中への新鮮培地の灌流は、アデノウイルスベクターストックの製造プロセス中に使用される唯一の培地交換である。同様に、感染後、他の栄養サプリメント（例えば、グルコース）は加えないのが好ましい。培養物のアデノウイルスベクターとの接触の間又はその直後の培地交換により、培養物へのアデノウイルスベクターの導入後、培地から生存アデノウイルスベクターの非所望の除去が生じうる。しかし、培地交換が感染後に行われるならば、好ましくは、培地の１００％未満が交換され、より好ましくは、培地の約５０％以下が交換される。更に、上記のように、このような接触前及び／又はその間に細胞を濃縮すること無しに、細胞をアデノウイルスベクターと接触させうる。好ましくは、特に、アデノウイルスベクターストックの大規模製造の場合、培養物は、新鮮培地の灌流前において又は培養物のアデノウイルスベクターとの接触の間においてあまり濃縮されず、そして最も好ましくは全く濃縮されない。アデノウイルスベクターの製造の間、培養物を濃縮することを避けることは望ましい。濃縮プロセスは、大きく高価な装置（例えば、１０リットルの培養物を濃縮できる遠心分離機）及び集中的な労働の必要性があるからである。
【００３９】
細胞の感染を可能にする条件下における培養物のアデノウイルスベクターとの接触後、次いで、感染細胞は、アデノウイルスベクターストックの完全な産生まで培養される。接触前の細胞の培養と同様に、感染培養物は、細胞内のアデノウイルスベクターの増殖を可能にする任意の適切な条件下で培養されうる。好ましくは、培養物のｐＨは約６．５〜７．５に維持され、より好ましくは約６．９〜７．３に維持される。好ましくは、ｐＨ及び／又は他の条件は、細胞によるグルコース代謝を最適化するように維持され、一方、動物細胞は培養物中の乳酸の産生を減少させる。細胞培養物のｐＨは、任意の適切な方法、好ましくは、アデノウイルスベクターストックの生産を実質的に阻害しない方法で制御されうる。ｐＨを修飾する幾つかの適切な技術は当業界公知であり、緩衝液（例えば、重炭酸塩又はトリス緩衝液）の添加を含む。温度は、感染後にアデノウイルスベクターストックの生産に影響する別の因子である。アデノウイルスベクターストックの製造に適した任意の温度を使用できるが、好ましくは、約３５〜４０℃の温度、より好ましくは約３６〜３８℃（例えば、約３７℃）が使用される。培養物の適切な混合は、細胞増殖及びアデノウイルスベクター生産に重要でありうる別の条件である。考慮される他の因子は、酸素濃度、ＣＯ2灌流速度、濃度、培養物中の細胞の固定と流動速度、並びに細胞増殖と代謝速度に影響を与える特定の栄養素及び／又は中間体（例えば、グルタミン）のレベルを含む（例えば、 Ho et al., CRC Critical Reviews in Biotechnology, 4(2), 185-252 (1986); Kyung et al., Cytotechnology, 14, 183-90 (1994); Yoon et al., Biotechnology and Bioengineering, 44, 983-990 (1994); 及びOeggerli et al., Biotechnology and Bioengineering, 45, 54-62 (1995)参照）。培養物の感染後培養の文脈で考察したが、上記原理及び技術はまた、本明細書記載の培養物の感染前培養に適用できる。
【００４０】
培養物中の細胞が、定常期密度の約４０〜７０％の細胞密度に到達するとき、培養物は、栄養レベルに関して以下の状態にある：栄養レベルは、培養物中で生存細胞の高いパーセンテージ（例えば、約８５％以上）を維持するために十分高いが、培養物中の細胞の相当数（例えば、培養物中の細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約６６％、又は少なくとも約７５％）がＧ1抑制を受けることを引き起こすために十分に低い（特に、集中的な灌流前に如何なる培地の添加無しにこのような密度に到達するのが培養物にとって可能であるとき）。Ｇ1抑制の間、正常な細胞周期は停止し、培養物は本質的に同調培養になる（即ち、培養物中の細胞の相当部分が同時に細胞周期に入り、同様の時間と速度で増殖の状態を経験する）。同調培養は、細胞培養による、ウイルスベクターを含む生成物の生産に利点がある。同調培養を得るこの方法は、現在実施される他の技術（例えば、細胞を化学剤と接触させることによって、又は幾つかのＲＮＡベースウイルスとの感染によって、同調培養を得ること）とは区別できる。集中的な灌流及び付随する培地交換を通じて、新鮮培地中の栄養素により、細胞が、Ｇ1抑制を克服し、かつアデノウイルスベクターによる感染の間及びその後に同調培養を提供しうることが更に考えられる。この考えは、例えば、本明細書記載の範囲内での感染後培地交換が、下記のような速度が予測できる増殖レベルに減少する前に、培養物中の細胞の集団における短いが異常に急速な増殖と関連するという観察に基づかれる。所望ならば、培養が同調培養であることを確保するために、当業界公知の他の方法も使用できる。しかし、他のウイルスを含む場合、又は同調化剤が細胞に有害である場合には、このような技術の使用は望ましくない。
【００４１】
細胞は、上記条件下、感染細胞中でのアデノウイルスベクターの生産に適した任意の方法で培養できるが、大規模アデノウイルスベクターストックを製造するために、感染細胞培養物は、バイオリアクター（発酵槽ということもある）で培養するのが好ましい。適切な混合、及び好ましくは、培養物を培養するために最適のｐＨと温度条件とを確保すること、及び感染前に培養物の体積の少なくとも約２倍に等しい量の新鮮培地を、培養物中に灌流することを可能とする、任意の適切なバイオリアクターが使用できる。適切なバイオリアクターの例は、撹拌タンクバイオリアクター、バブルカラムバイオリアクター、エアリフト（air lift）バイオリアクター、流体ベッドバイオリアクター、パックドベッド（packed bed）バイオリアクター、ウェーブバイオリアクター、及び凝集細胞バイオリアクターを含む。好ましくは、バイオリアクターは、ミクロプロジェクタイル（microprojectile）ベースバイオリアクターではない。望ましくは、バイオリアクターは、培養中、剪断や乱流による細胞ダメージを防止する撹拌タンクバイオリアクターである。バイオリアクターは、灌流能力を有するバッチ、連続的、又はフェド−バッチバイオリアクターでありえ、好ましくは、培養物は、バッチ、フェド−バッチ、又は連続的培養条件下に維持される。例外は、アデノウイルスベクターによる感染前に、培地の体積の少なくとも約２倍に等しい体積の新鮮培地で、感染前に培地中に灌流することである。好ましくは、灌流培養が可能なバイオリアクターが、培養物中への新鮮培地の灌流の前後での細胞培養の間に、体積が変化可能のフェド−バッチ方法（当業界では、繰り返しフェド−バッチプロセス又は循環的なフェド−バッチ培養とも言われる）又はバッチ方法によって使用される。このような灌流及び感染の後に、バッチ条件は好ましくは回収まで維持される。あるいは、連続的灌流細胞培養条件は、細胞の初期の増殖の間及び／又は感染後において、バッチ条件の代わりに使用できる。好ましくは、培養物のアデノウイルスベクターとの接触前に行われる、培養物における培地体積の少なくとも２倍の灌流よりも有意に低い量で、新鮮培地が培養物中に灌流される場合は、そうである。
【００４２】
バイオリアクターは、適当なサイズのアデノウイルスベクターストックを産生するための任意の適切なサイズでありうる。大規模製造の場合、市販の１０リットルのバイオリアクター、又はより大きいバイオリアクターが好適である。ローラーボトル又は他の培養技術が感染前又は感染の間に使用される本発明の局面において、蠕動ポンプなどの任意の適切な技術によって、細胞はバイオリアクターに移されうる。
【００４３】
感染細胞を培養後、細胞を回収し、アデノウイルスベクターストックを製造する。アデノウイルスベクターを回収できる細胞の任意の回収方法を、本発明の文脈で使用でき、機械的／物理的及び化学的技術などの細胞回収の幾つかの技術は、当業界公知である。化学的回収において、細胞を溶解し、細胞成分とアデノウイルスベクターを放出させるために、化学剤、通常界面活性剤を培養物に加える。化学的技術は、細胞溶解溶液又は溶解緩衝液の使用を含む。その例は、ＰＢＳ溶液中のトリトンＸ−１００、トリス−ＨＣｌベース溶解溶液、及びポリソルベート８０／Bicaine緩衝液である。物理的技術は、標準的“凍結−融解”方法を含み、それでは、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で処理し、Ｃａ2+及びＭｇ2+を含まない緩衝化塩溶液（ＴＥＮ(40mM Tris-HCl, pH 7.5, 1mM EDTA, 150mM NaCl)）中でインキュベートし、ペレットにし、トリス緩衝液に再懸濁し、次いで、３回の凍結／融解サイクルに供し、細胞膜を溶解する。他の凍結−融解方法は、凍結−融解サイクルの前に、プロテアーゼ阻害剤、例えば、ロイペプチン、ペプスタチン、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を用いる。機械的技術は、例えば、連続的遠心分離、フレンチプレス、ミル、クロスフロー濾過、及び音波方法（好ましくは、クロスフロー濾過と組合わせて行う）を含む。好ましくは、もし使用されるならば、化学的技術を、機械的技術と組合わせる。細胞の回収後、溶解した細胞成分からアデノウイルスベクターを分離するために、好ましくは、更なる工程を行う。このような工程の例は、脂質除去（例えば、フレオン(Freon)添加、遠心分離、及びアデノウイルスベクターを含む水相の取り出し）、細胞残渣を除去するためのタンジェンシャル(tangential)フローダイアフィルトレーション、および塩化セシウムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーベースの分離を行うことによる可溶性抗原の除去を含む。好ましくは、方法は、捕捉カラム、精製カラム、及びサイズ排除／緩衝液交換カラムを含む、複数のクロマトグラフィー工程を含む。このような技術の多数の他の例及びそれらの改変は当業界公知であり、当業者は容易にアデノウイルスベクターを回収する適当な技術を選択できよう。
【００４４】
細胞の回収は、アデノウイルスベクターの所望のストックを入手するための任意の適切な時間で行われうる。好ましくは、培養中の細胞による生産の効率に対し均衡が図られた、ストック中のアデノウイルスベクターの最適の生産を確保する回収時間を選択する。当業者は容易にこのような決定を行うことができる。典型的には、回収は、感染後約２４〜４８時間以上（h.p.i.）で行われ、好ましくは、回収は、感染後約２４〜４８時間に行われよう。
【００４５】
アデノウイルスベクターストック製造の質は、感染時における細胞の生存率に依存する。それ故、培養物中の生存細胞のパーセンテージが、１０％の生存細胞のパーセンテージの喪失により、細胞が回収されるとき１細胞当たりのフォーカス形成ユニット（ＦＦＵ／細胞）の約８０％以上の喪失が起こるようなものであるとき、望ましくは、培養物をアデノウイルスベクターと接触させる。同様に、培養物中の生存細胞のパーセンテージが、２０％の生存細胞のパーセンテージの喪失により、細胞が回収されるときＦＦＵ／細胞の約９０％以上の喪失が起こるようなものであるとき、望ましくは、培養物をアデノウイルスベクターと接触させる。
【００４６】
好ましくは、感染前（特に、集中的な灌流の間、及びその直後）の培養物中の生存細胞のパーセンテージは、培養物中の全細胞の約７５％以上に維持される。より好ましくは、感染前の培養物中の生存細胞のパーセンテージは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上である。典型的には、大培養において、培養物中の生存細胞に関して維持可能な最大のパーセンテージは、約９５％であろう。細胞の生存率は、本明細書の他の個所で考察したものを含む、任意の適切な技術によってモニター及び／又は測定できる。
【００４７】
あるいは、又は更に、培養物中の生存細胞のパーセンテージが、１０％の生存細胞のパーセンテージの喪失により、１細胞当たりのフォーカス形成ユニット（ＦＦＵ）又はプラーク形成ユニット（ＰＦＵ）に対する１細胞当たりのアデノウイルス粒子ユニット（ＰＵ）（全ウイルスベクター粒子）の比において回収時に約８０％以上の増大が起こるようなものであるとき、培養物をアデノウイルスベクターと接触させうる。ＰＵは、全てのウイルス力価技術、又はウイルスベクター粒子の総数を測定するのに適した他の技術により測定できる。ＦＦＵは、感染細胞によって形成されたフォーカスの数を表し、標準的プロトコルを用いる光学顕微鏡の手段によって測定される。ＰＦＵは、標準的プラークアッセイによって、例えば、ホルマリンで固定した感染細胞をメチレンブルー溶液で染色することによって測定できる。他の（免疫）組織化学染色溶液及び固定化技術も使用できる。ＰＵ／ＦＦＵの比は、活性ウイルスベクターの生産効率の重要な指標である。ＰＵ／ＦＦＵのより低い比は、全ベクター生産に対する活性ベクターの高い比を示し、これは、ベクター生産に用いられたエネルギーにより効率的に、活性ベクターのストックが生じることを表す。好ましくは、ＰＵ／ＦＦＵは約１００以下であり、より好ましくは約８０以下（例えば、７０以下）、より一層好ましくは約６０以下である。
【００４８】
回収時における活性アデノウイルスベクターの喪失が、感染時の細胞生存率のパーセンテージにおけるこのような減少に起因していつ起こるかの決定は、実質的に同様の条件下で行われるサンプル培養物又は以前の培養物を研究し、培養物をアデノウイルスベクターと接触させるべきである時点を決定することによって決定できる。活性アデノウイルスベクターのパーセンテージは任意の適切な技術によって測定できる。このような技術の例は、標準的プラークアッセイを含む。アデノウイルスベクターがアデノウイルス遺伝子トランスファーベクターであるとき、外来遺伝子の発現又はその存在に関するアッセイを用いて、活性アデノウイルスベクターのパーセンテージを測定できる。全ウイルス力価は、当業者公知の任意の方法によって測定でき、その例は、米国特許4,861,719及び4,868,116に記載されている。
【００４９】
実施例
以下の実施例は本発明を更に説明するが、勿論、その範囲を限定するものとして決して解釈すべきではない。
【００５０】
実施例１
本実施例は、種々の細胞密度で培養物にアデノウイルスベクターを感染させるときに得られるアデノウイルスベクターの体積収量を示す。
ＰＥＲ.Ｃ６細胞(Introgene,Inc.)を、培養物に加えた４ｍＭグルタミンを有するＥｘ−Ｃｅｌｌ ５２５(JRH Biosciences,Inc.)中で培養した。ＰＥＲ.Ｃ６細胞培養物２Ｌを、５×１０5細胞／ｍｌ（ここで細胞生存率の平均パーセンテージは９０％を超えている）にて、３．５Ｌのバイオリアクターに播種した（０日目）。１日目と２日目に、新鮮培地７５０ｍｌを供給した。３日目に、新鮮培地６．５Ｌを添加した１０Ｌのバイオリアクターに培養物を移した。同様の培養物についての定常期は、約１．６×１０6細胞／ｍｌの細胞密度と一致すると見積もられた。６×１０5細胞／ｍｌ未満〜１×１０6細胞／ｍｌ超の範囲の種々の密度（定常期での培養物の密度の３７％未満〜６２％超）で、細胞培養物の３００ｍｌサンプルを採取した。
【００５１】
各サンプルを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。使用済培地を取り除き、細胞を新鮮培地３０ｍｌで再懸濁した。各サンプル中の生存細胞のパーセンテージは、８５〜９５％の範囲であると測定された。次いで、細胞を血清型５ベースのアデノウイルスベクター（ＭＯＩ＝５）と３７℃で１時間接触させた。１時間インキュベーション後、細胞を新鮮培地に再懸濁し、各サンプルについて最終体積３００ｍｌにした。各サンプルを１００ｍｌの部分サンプルに分割し、各部分サンプルを３７℃でローラーボトル培養物中で培養した。感染後４８時間で細胞を回収し、ＰＵ／ｍｌ、ＰＵ／細胞、及びＦＵ／ｍｌを測定し、平均ＰＵ／ＦＦＵ比（及び平均未満又は平均超の１標準偏差（ｓ.d.）まで）を計算した。分析した培養物を、感染時の培養物において培養物の定常期細胞密度のパーセンテージに基づき８群に分類した（＜３８％、３８〜４３％、４４〜４９％、５０〜５５％、５６〜６２％、６３％、７５％、及び１００％）。定常期での細胞密度＜３８％、６３％、７５％、及び１００％では、実験を２０回繰り返し、定常期での細胞密度４４〜４９％、５０〜５５％、及び５６〜６２％では２３回、定常期での細胞密度の３７〜４３％では４８回実験を繰り返した。結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
表１に反映された実験のこれらの結果は、培養物の細胞密度が、定常期細胞密度の約６０〜７０％、より好ましくは６３％であるとき、アデノウイルスベクターによる感染により、ＰＵ／ｍｌ及びＰＵ／細胞の最高のレベルが生じ、一方、ＦＦＵ／細胞の最高レベルは、定常期細胞密度の約５０〜５５％で感染させた培養物で得られたことを示す。細胞密度が、定常期密度の４０％未満、より詳細には３８％未満であるとき、アデノウイルスベクターに感染した培養物は、１細胞当たりのフォーカス形成ユニット及び粒子ユニットに関しずっと低い収量を示した（例えば、密度が、定常期密度の６３％であるとき感染した培養物で得られたレベルのそれぞれ、ほんの７．１％及び１２．１％）。細胞密度が、定常期細胞密度の約４０％未満、より詳細には約３８％未満であるとき感染した培養物はまた、より高い密度で感染した培養物で達成されたＰＵ／ＦＦＵ比より本質的に２倍以上高い、約１２０のＰＵ／ＦＦＵを示した。細胞密度が、定常期密度の７０％超、より詳細には７５％であるとき感染した培養物により、定常期細胞密度の約７０％以下、より詳細には６３％で感染した培養物に比べて、ＦＦＵ／細胞及びＰＵ／細胞の有意に低い産生を生じた（それぞれ、７５％及び７３％の減少）。これらの結果により、定常期細胞密度の４０％未満、より詳細には３８％未満、又は約７０％超、より詳細には約７５％以上の密度で感染した培養物は、細胞密度が定常期密度の約４０〜７０％であるときに感染した培養物に比べて、アデノウイルスベクターを産生する能力の有意な減少を示すことが示される。
【００５４】
ＦＦＵ／細胞の収量は、定常期細胞密度の約５０〜５５％で感染した培養物において最高であったが、一般的に、定常期密度の約４０〜７０％、特に４４〜６３％で感染した全ての培養物（即ち、４４０超）で高いレベル（即ち、約６００以上）にとどまった。定常期の４０％超、特に、４４〜４９％範囲内及び５０〜５５％範囲内、しかし定常期密度の約７０％以下、特に６３％の定常期密度のパーセンテージで感染した培養物の、より低いＦＦＵ／細胞収量は、このような培養物におけるフォーカス形成ユニットを産生する細胞の増加した数によって相殺された。例えば、この範囲内の培養物についてのＦＦＵ／細胞に、定常期密度のパーセンテージの中央の値（例えば、範囲４４〜４９％では、０．４７）を乗じると、一定の細胞密度で産生されるフォーカス形成ユニットの数の表示が得られる。定常期密度の約６０〜７０％、より詳細には６３％で感染した培養物の場合に産生された１細胞当たりのフォーカス形成ユニットの数は、定常期密度の約４０〜５０％、より詳細には４４〜４９％で感染した培養物で産生された数にほぼ等しい（ＦＦＵ／細胞×定常期細胞密度のパーセントは、それぞれ３２８〜３３０）。更に、定常期密度の約４０〜７０％、より詳細には４４％と６３％で感染した培養物の場合の１細胞当たりのフォーカス形成ユニットの数は、４４２以上であり、定常期密度の３８％未満で感染した培養物の場合の３７、及び７５％定常期密度で感染した培養物の場合の１２８と比較される（それぞれ、９２％及び７１％減少）。これらの計算の結果は、生存アデノウイルスベクターを産生するためには、定常期密度の約４０〜７０％、より詳細には４４〜６３％の範囲を超える細胞密度及びそれよりも小さな細胞密度で感染した培養物に比べて、定常期密度の約４０〜７０％、より詳細には４４〜６３％で感染した培養物が有効であることを示す。
【００５５】
定常期密度の４０％超、詳細には４４％〜定常期密度の約７０％、詳細には６３％の細胞密度の培養物のＰＵ／ＦＦＵ比は、比較的安定であったが（５２〜６１）、１細胞当たり及び１ｍｌ当たりの粒子ユニットの収量は、フォーカス形成ユニットの全生産のように、細胞密度が、定常期細胞密度の約７０％により近い、特に６３％であるとき感染した培養物でやや高い。定常期密度の６５％でアデノウイルスベクターに感染した培養物、及び定常期密度の６９％でアデノウイルスベクターに感染した培養物の場合に行われた後の実験は、定常期密度の６３％で感染した培養物で観察されたものと同様のＰＵ／ＦＦＵの収量を示した。これらの結果により、培養物内の細胞密度が、本発明によって提供される培養物定常期密度のパーセンテージ内であるときに細胞に感染するとき、アデノウイルスベクターの収量が改良されることが示される。
【００５６】
実施例２
本実施例は、アデノウイルスベクター産生に対する、感染での培養物中の生存細胞のパーセンテージの効果を示す。
ＰＥＲ.Ｃ６細胞を、ローラーボトル中、４ｍＭグルタミンを含むＥｘ−Ｃｅｌｌ  ５２５ 動物性タンパク質非含有培地中で培養した。細胞生存率を、各ランの間に測定した。細胞を、約１×１０6細胞／ｍｌの細胞密度及び約９０％の生存細胞のパーセンテージに増殖させた。細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、使用済培地を除去した。次いで、培養物を“飢餓させること”によって種々の生存率を得るために、培養物を種々の量の使用済培地に再懸濁した。次いで、細胞生存率を評価した。種々のパーセンテージの生存細胞を有する培養物中で、感染を可能にする条件下で、培養物を血清型５アデノウイルスベクターと１時間接触させた。培養物のいずれでも生存細胞の最大パーセンテージは約９５％であった。次いで、細胞を回収し、アデノウイルスベクターをクロマトグラフィーで精製した。種々の培養物で生じる粒子ユニット及びフォーカス形成ユニットを測定するために、アッセイを行った。感染での培養物における生存細胞のパーセンテージに基づき、分析された細胞を６群に分類した（即ち、７０〜７４％，７５〜７９％，８０〜８４％，８５〜９０％，及び９０％超の生存細胞)。各カテゴリーでのフォーカス形成ユニットに対する粒子ユニットの平均比を、表２に示す。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
第２セットの実験において、分析された細胞を６群の代わりに８群に分類したことを除いて、これらの実験を繰り返した。詳細には、生存細胞のパーセンテージが６０〜６４％及び６５〜６９％並びに上記生存細胞の他のパーセンテージであるときに、細胞に感染させた。この第２セットの実験の結果を表３に記載する。
【００５９】
【表３】
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【００６０】
表２及び表３で分かるように、培養物中の生存細胞のパーセンテージが７０〜７４％以下であるとき、培養物にアデノウイルスベクターを感染させることにより、このような培養物の場合ではＰＵ／ＦＦＵ比の有意な増大を生じた。例えば、第２セットの実験（その結果は、表３に記載する）で測定した培養物の場合のＰＵ／ＦＦＵの平均増加は、培養物中の生存細胞のパーセンテージが７５〜７９％であるとき感染した培養物から７４％であったが、第１セットの実験での培養物の場合、生存細胞のパーセンテージが７５〜７９％であるとき感染した培養物からのＰＵ／ＦＦＵの変化は７０〜７４％と比較すると、５００％超の増加であった。対照的に、培養物中の生存細胞のパーセンテージが７５％超であるとき感染した培養物の場合のＰＵ／ＦＦＵ範囲は比較的一定のままであった（５５〜３６）。平均ＦＦＵ／細胞も、生存細胞のパーセンテージがより低かった培養物では有意に減少した。詳細には、表２に反映した実験の場合、培養物中７０〜７４％生存細胞で感染した培養物の平均ＦＦＵ／細胞は、他の培養物の場合のそれぞれ２２、６０、２４４及び７１６に比較して、ほんの４．３であった（生存細胞のパーセンテージが７５〜７９％であるとき感染した培養物のＦＦＵ／細胞において８０％超の減少、及びパーセンテージが８０〜８４％であるとき感染した培養物から９０％超の減少）。これらの結果は、本発明が、ウイルスベクターストックを効率的に製造する方法を提供することを示す。
【００６１】
実施例３
本実施例は、アデノウイルスベクターの産生に対する、培養物中の新鮮培地アベイラビリティーの効果を示す。
ＰＥＲ.Ｃ６細胞を、体積１００ｍｌ／ローラーボトルのローラーボトルで培養し、最初の体積の１／１０まで遠心分離し、感染を可能にする条件下で、アデノウイルスベクター（血清型５のベースアデノウイルス遺伝子トランスファーベクター）に１時間感染させた（ＭＯＩ＝５）。感染は、５０％新鮮培地／５０％使用済培地の混合物中で１時間行った。感染後に、１００％新鮮培地、１００％使用済培地、又は最初の体積に対し９０％、７０％、５０％、若しくは３０％の新鮮培地の混合培地に、細胞を再懸濁した。細胞を培養し、４８ｈ.p.i.で回収し、ＰＵ／ｍｌを測定した。３０％新鮮培地を加えた場合を除いて、実験は３連で行った。これらの実験の結果を表４に記載する。
【００６２】
【表４】
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【００６３】
表４に示すように、感染後の培地交換は、回収での培養物中の粒子ユニットの産生に有意に影響を与える。平均すると、１００％新鮮培地に対し、９０％を加えることにおいて、有意な変化はなかった。感染後に７０％新鮮培地を添加すると、１００％新鮮培地の添加で得られるＰＵ／ｍｌの約８５％の収量を生じた。感染後に５０％新鮮培地を添加すると、１００％新鮮培地の添加で得られるＰＵ／ｍｌの約６９％の収量を生じた。加えた新鮮培地のパーセンテージがより低いと、１００％新鮮培地を加えたときと比較して、ＰＵ／ｍｌ値は有意に減少した。例えば、新鮮培地を加えなかったときには、１００％新鮮培地を加えたときのＰＵ／ｍｌと比較して、ほんの約１／４のＰＵ／ｍｌが得られた。
【００６４】
本実験の結果は、アデノウイルスベクターのより高い収量が、本発明に従って培養物中の新鮮培地のより高い濃度で得られうることを示す。
【００６５】
本明細書で引用した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が引用により含まれるように個々に、及び具体的に示され、本明細書にその全体が記載されているかのような程度まで、引用により本明細書に含まれるものである。本発明の説明の文脈において（特に、上記の特許請求の範囲の文脈において）、用語“ａ”及び“ａｎ”及び“ｔｈｅ”及び同様の指示語の使用は、本明細書で違うように記載されるか、文脈によって明確に否定されなければ、単数と複数の両方を包含するように解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書で違うように記載されていなければ、その範囲内にある各々の個別の値に個々に言及することの略記方法として役立つことが単に意図され、各々の個別の値は、それが本明細書に個々に記載されているかのように本明細書に含まれるものである。本明細書で提供される任意の、及び全ての例、又は例示的言語（例えば、“などの”）の使用は、本発明をより明瞭にすることを単に意図しており、請求項に係る発明の範囲を制限するものではない。本明細書中の如何なる言語も、請求項に記載されていない要素が本発明の実施に必須なものであることを示すものとして解釈されるべきではない。
【００６６】
上記は、全体として本発明の統合された説明であって、その特定の要素又は局面の単なる説明ではない。説明は、本発明を実施するのに本発明者らが知っている最良の形態を含む、本発明の“好適な実施態様”を記載する。勿論、上記説明を読むと、それらの好適な実施態様のバリエーションが当業者に明白となろう。本発明者らは、当業者が適宜このようなバリエーションを用いることを期待し、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されたものとは異なるように実施されることを意図する。それ故、本発明は、適用される法律によって許容されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載の主題の全ての改変及び均等物を含むものである。更に、本明細書で違うように記載されていないか、文脈によって違うように明瞭に否定されていなければ、その全ての可能なバリエーションにおける上記要素の任意の組合わせも可能である。