(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において腫瘍応答を生成するために十分な量で、zvegf3アンタゴニストを薬学上許容される送達ベヒクルと組み合わせて含んでなる組成物において、当該zvegf3アンタゴニストが抗zvegf3抗体である、哺乳動物における肝細胞癌を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
肝細胞癌内の癌細胞の増殖を減少するために十分な量で、zvegf3アンタゴニストを薬学上許容される送達ベヒクルと組み合わせて含んでなる組成物において、当該zvegf3アンタゴニストが抗zvegf3抗体である、癌細胞の増殖を減少するための医薬組成物。
【請求項３】
前記抗zvegf3抗体が２つのポリペプチド鎖を有する二量体タンパク質に特異的に結合し、前記ポリペプチド鎖の各々が下記の残基から成る群から選択されるアミノ酸残基の配列から成る、請求項１又は２に記載の医薬組成物:
配列番号2の残基230〜345;
配列番号2の残基231〜345;
配列番号2の残基232〜345;
配列番号2の残基233〜345;
配列番号2の残基234〜345;
配列番号2の残基235〜345;
配列番号2の残基236〜345;
配列番号2の残基237〜345;
配列番号2の残基238〜345;
配列番号2の残基239〜345;および
配列番号2の残基240〜345。
【請求項４】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体がIgG抗体である請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
zvegf3アンタゴニストである抗zvegf3抗体の、哺乳動物における肝細胞癌を治療する薬剤の製造における使用。
【請求項７】
薬剤が静脈内注入のために処方される請求項６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
肝細胞癌または肝癌は一次肝臓癌の最も普通のタイプである。それは、慢性B型肝炎が風土病であるアフリカおよび東南アジアにおいて、特に普通である (そして死亡の重要な症例である) 。
【０００２】
肝細胞癌 (HCC) の精確な病因学は未知である。腫瘍は悪性肝細胞から構成されている。B型肝炎の発生率との強い相関が存在し、そして宿主ゲノム中へのウイルスDNAの組込みは悪性形質転換に導くと考えられる。また、慢性C型肝炎の感染はHCCに関係するが、C型肝炎ウイルス (RNAウイルス) は宿主ゲノム中に組込まれない。C型肝炎における線維素生成 (肝硬変) は、腫瘍形成においてある役割を演ずることがある。また、HCCはヘモクロマトーシスの主要な合併症である。HCCの他の危険因子は、環境トキシン (例えば、アフラトキシン) 、アルコール中毒症、家族歴および男性であることを包含する。
【０００３】
HCCの徴候および症状は、右上腹における痛み、組織塊の存在または腹の膨張、体重の減少、食欲の減少、および充満、弱さまたは疲労の感じ、悪心および嘔吐、黄疸および発熱を包含する。血清α-フェトプロテインおよびデス-g-カルボキシ-プロトロンビンは診断マーカーである。追加の診断法は超音波、CT走査、磁気共鳴映像法、肝動脈造影、およびバイオプシーを包含する。
【０００４】
HCCの現在の治療はわずかに制限された成功を達成しただけである。外科手術は最も満足すべきものであり、小さい、局在化した腫瘍を有する患者の生存を延長することができる。また、より進行したHCCの治療は、化学療法および/または放射線治療を包含する。また、肝臓移植は多少の成功をもって使用されてきている。しかしながら、これらの治療の成功は初期診断に大きく依存する。
【０００５】
HCCの他の報告された治療は下記を包含する: 高周波切除 (Livraghi 他、Radiology 210: 655-61、1999; Curley 他、Ann. Surg. 230: 1-8、1999); レーザーまたはマイクロ波療法; 経皮エタノール注入 (Livraghi 他、前掲; Tanaka他、Cancer 82: 78-85、1998); 凍結外科手術 (ZhouおよびTang、Semin. Surg. Oncol. 14: 171-174、1998); 例えば、125I-リピオドール (Lau 他、Lancet 353(9155); 797-801、199) 、5-フルオロデオキシウリジンまたはジクロロメトトレキセート (Ensminger 他、Cancer Treat Rep. 65: 393-400、1981) を使用する、肝動脈注入; 例えば、ビスクロロエチルニトロソ尿素 (Dakhil 他、Cancer 50: 631-635、1982) またはヨウ素化油およびドキソルビジン塩酸塩 (Choi 他、Radiology 182: 709-713、1992) を使用する、薬物塞栓療法; 免疫療法 (Takayama 他、Lancet 356(9232); 802-807、2000); およびシスプラチン化学療法と放射線との組み合わせ(Epstein 他、Cancer 67: 896-900、1991) 。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、哺乳動物における肝細胞癌を治療する材料および方法に関する。
本発明の1つの面において、本発明は、肝細胞癌を有する哺乳動物にzvegf3アンタゴニストを薬学上許容される送達ベヒクルと組み合わせて含んでなる組成物を、前記哺乳動物において腫瘍応答を生成するために十分な量で、投与することを含んでなり、ここでzvegf3アンタゴニストは抗zvegf3抗体、分裂促進的に不活性なレセプター結合性zvegf3変異型ポリペプチド、および阻害性ポリヌクレオチドから成る群から選択される、哺乳動物における肝細胞癌を治療する方法を提供する。1つの態様において、腫瘍応答は完全な応答、部分的応答、または進行時間の短縮として測定される。他の態様において、zvegf3アンタゴニストは抗zvegf3抗体および阻害性ポリヌクレオチドから成る群から選択される。それ以上の態様において、アンタゴニストは抗zvegf3抗体である。
【０００７】
関係する態様において、抗体はモノクローナル抗体、例えば、IgGモノクローナル抗体である。本発明の他の態様において、zvegf3アンタゴニストは2つのポリペプチド鎖を有する二量体タンパク質に特異的に結合する抗体であり、前記ポリペプチド鎖の各々は下記の残基から成る郡から選択されるアミノ酸残基の配列から成る: 配列番号2の残基230〜345; 配列番号2の残基231〜345; 配列番号2の残基232〜345; 配列番号2の残基233〜345; 配列番号2の残基234〜345; 配列番号2の残基235〜345; 配列番号2の残基236〜345; 配列番号2の残基237〜345; 配列番号2の残基238〜345; 配列番号2の残基239〜345; および配列番号2の残基240〜345。追加の態様において、zvegf3アンタゴニストを静脈内注入により投与する。
【０００８】
本発明の第2の面において、肝細胞癌を有する哺乳動物にzvegf3アンタゴニストを薬学上許容される送達ベヒクルと組み合わせて含んでなる組成物を、前記肝細胞癌内の癌細胞の増殖を減少するために十分な量で、投与することを含んでなり、ここでzvegf3アンタゴニストは抗zvegf3抗体、分裂促進的に不活性なレセプター結合性zvegf3変異型ポリペプチド、および阻害性ポリヌクレオチドから成る群から選択される、癌細胞の増殖を減少する方法が提供される。1つの態様において、zvegf3アンタゴニストは抗zvegf3抗体および阻害性ポリヌクレオチドから成る群から選択される。それ以上の態様において、アンタゴニストは抗zvegf3抗体である。
【０００９】
関係する態様において、抗体はモノクローナル抗体、例えば、IgGモノクローナル抗体である。本発明の他の態様において、zvegf3アンタゴニストは2つのポリペプチド鎖を有する二量体タンパク質に特異的に結合する抗体であり、前記ポリペプチド鎖の各々は下記の残基から成る郡から選択されるアミノ酸残基の配列から成る: 配列番号2の残基230〜345; 配列番号2の残基231〜345; 配列番号2の残基232〜345; 配列番号2の残基233〜345; 配列番号2の残基234〜345; 配列番号2の残基235〜345; 配列番号2の残基236〜345; 配列番号2の残基237〜345; 配列番号2の残基238〜345; 配列番号2の残基239〜345; および配列番号2の残基240〜345。追加の態様において、zvegf3アンタゴニストを静脈内注入により投与する。
【００１０】
本発明の第3の面において、zvegf3アンタゴニストが抗zvegf3抗体、分裂促進的に不活性なレセプター結合性zvegf3変異型ポリペプチド、および阻害性ポリヌクレオチドから成る群から選択される、哺乳動物における肝細胞癌を治療する薬剤の製造におけるzvegf3の使用が提供される。1つの態様において、薬剤は静脈内注入のために処方される。
【００１１】
本発明のこれらの面および他の面は、本発明の下記の詳細な説明および添付図面を参照すると、明らかになるであろう。図面において、
図1A〜図1Gは、配列番号2に示すアミノ酸配列のHopp/Woods親水性構造である。この構造は滑り6残基ウィンドウに基づく。埋没G、SおよびT残基および暴露H、YおよびW残基は無視した。図面において、これらの残基は小文字で示されている。
図2は、ヒト (配列番号2) およびマウス (配列番号4) アミノ酸配列のアラインメントである。
【００１２】
用語 「アンタゴニスト」 は、本明細書中において他の化合物の生物学的活性を減少させる化合物を示すために使用される。本発明において、 「zvegf3アンタゴニスト」 はターゲット細胞のレセプター仲介生物学的活性 (例えば、有糸分裂誘発活性) を減少させる化合物である。アンタゴニストは、細胞表面のレセプター上の結合部位についてzvegf3と競合することによって、zvegf3に結合し、細胞表面レセプターに対するzvegf3の結合を妨害することによって、そうでなければレセプター機能を妨害することによって、zvegf3の産生を減少させることによって、または他の手段により、それらの作用を発揮する。
【００１３】
用語 「癌」 または 「癌細胞」 は、本明細書中において、正常組織または組織細胞からそれを区別する特性を有する、新生物において見出される組織または細胞を示すために使用する。このような特性は下記を包含するが、これらに限定されない: 退生の程度、形状の不規則性、細胞輪郭の不明瞭さ、核の大きさ、核または細胞質の構造変化、他の表現型の変化、癌または前癌状態を示す細胞タンパク質の存在、有糸分裂数の増加、および転移する能力。 「癌」 に関する単語は、癌腫、肉腫、腫瘍、上皮腫、腺腫、白血病、リンパ腫、ポリープ、硬性癌、形質転換、新生物、およびその他を包含する。
【００１４】
「阻害性ポリヌクレオチド」 は、第2 (ターゲット) ポリヌクレオチドの発現 (転写または翻訳) を減少させまたは妨害するDNAまたはRNA分子である。阻害性ポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、および外部のガイド配列を包含する。さらに、用語 「阻害性ポリヌクレオチド」 は、実際の阻害種をコードするDNAおよびRNA分子、例えば、リボザイムをコードするDNA分子を包含する。
【００１５】
用語 「新形成」 は、細胞について言及するとき、特に増殖がコントロールされずかつ進行的であり、新生物を生ずる組織における、新しい、異常な増殖を行う細胞を示す。新形成細胞は、悪性、すなわち、侵襲性かつ転移性であるか、あるいは良性であることができる。
【００１６】
用語 「治療する」 または 「治療」 は、病理学的状態を好適に変更する治療的かつ予防的関与を示すために広く使用される。治療は、疾患の進行を緩和または逆転し、疾患の重症度を減少させ、疾患を予防または治癒させる手法を包含する。癌の場合において、治療は所定の期間にわたる生存率の増加または生存時間の増加、腫瘍塊の減少、腫瘍転移の減少、疾患の進行の停止、進行時間の減少、およびその他を包含する。
【００１７】
本発明は、zvegf3アンタゴニストを使用して患者における肝細胞癌を治療する方法を提供する。zvegf3は血小板由来増殖因子 (PDGF) および脈管内皮増殖因子 (VEGF) に構造的に関係するタンパク質である。また、このタンパク質は 「VEGF-R」 (WIPO公開WO 99/37671) と表示され、より最近において、 「PDGF-C」 と表示された(WO 00/18212; Li 他、Nat. Cell. Biol. 2: 302-309、2000; Cao 他、FASEB J. 16: 1575-1583、2002) 。zvegf3/PDGF-Cは、増殖因子のPDGF/VEGFファミリーに対して有意な相同性を有する多ドメインタンパク質である。ヒトおよびマウスzvegf3の代表的アミノ酸配列を、それぞれ、配列番号2および配列番号4に示す。これらのポリペプチドをコードするDNAを、それぞれ、配列番号1および配列番号3に示す。
【００１８】
用語 「zvegf3タンパク質」 は、本明細書中においてzvegf3ポリペプチドの増殖因子ドメイン (例えば、ヒトzvegf3 (配列番号2) またはマウスzvegf3 (配列番号4) の残基235〜345) を含んでなるタンパク質を示すために使用し、ここでこのタンパク質は細胞表面のPDGFα-レセプターサブユニットを発現する細胞に対して有糸分裂誘発性である。zvegf3はPDGFレセプターのααおよびββイソ型に結合することが見出された。zvegf3は、成熟タンパク質を解放するようにタンパク質分解的に活性化される前駆体として天然に産生されるホモダイマーのタンパク質、増殖因子ドメインの二量体である。本明細書において使用するとき、用語 「zvegf3タンパク質」 はin vivo で活性化可能である前駆体を包含する。この分野において知られている方法を使用して、zvegf3タンパク質を下に詳細に説明するように種々の形態でかつ融合タンパク質として製造することができ、ここで形態は初期メチオニンを含むか、あるいは含まない、グリコシル化または非グリコシル化、ペギミル化タンパク質を包含する。
【００１９】
zvegf3ポリペプチド鎖は、増殖因子のドメインおよびCUBドメインを含んでなる。増殖因子のドメインは、PDGFファミリーの 「システイン結節」 構造の特徴を示す、システイン残基およびβストランドの配置により特徴づけられる。CUBドメインは下記に対して相同性の配列を示す: ニューロピリン中のCUBドメイン (Takagi 他、Neuron 7: 295-307、1991; Soker 他、Cell 92: 735-745、1998) 、ヒト骨形態形成タンパク質-1 (Wozney 他、Science 242: 1528-1534、1988) 、ブタ精漿タンパク質およびウシ酸性精液 (Romero 他、Nat. Struct. Biol. 4: 783-788、1997) 、およびアフリカツメガエル (X. laevis) のトロイド (tolloid) 様タンパク質 (Lin 他、Dev. Growth Differ. 39：43-51、1997) 。
【００２０】
マウスおよびヒトzvegf3ポリペプチド配列のアラインメントを図2に示す。配列番号2に示すアミノ酸配列の分析において、残基1〜14が分泌タンパク質を形成することが示される。CUBドメインは残基46から残基163に延長する。プロペプチド様配列は残基164から残基234に延長し、そしてそのカルボキシル末端における2つの潜在的切断部位、残基231〜232における二塩基性部位および残基231〜234におけるフリン (furin) またはフリン様プロテアーゼのターゲット部位を包含する。増殖因子ドメインは残基235から残基345に延長する。当業者は認識するように、ドメイン境界は多少不正確であり、そして特定した位置から±5残基だけ変化することが期待される。潜在的タンパク質分解的切断部位は残基232および234に存在する。BHK細胞において産生される組換えzvegf3のプロセシングは、残基225と残基226との間で起こることが発見された。
【００２１】
シグナルペプチドの切断は、残基14 (±3残基) 後において起こることが予測される。この分析は、表1に示すように、ポリペプチド鎖を切断して複数のモノマー種を生成できることを示唆する。Arg-234後の切断は残基231〜234の引き続く除去を生じ、Gly-230のアミドへの変換が起こる可能性があることが期待される。Lys-232後の切断は残基231の引き続く除去を生じ、再びGly-230のアミドへの変換が起こる可能性があることが期待される。さらに、CUBドメインのカルボキシル末端において7残基までのドメイン間領域を含めることが好都合であることがある。ドメイン間領域をそのアミノ末端において同様な量だけトランケートすることができる。表1参照。当業者は、マウスおよび他の非ヒトzvegf3中の対応するドメインを配列アラインメントから決定することができる。
【００２２】
【表１】
0004709145.tif 000002
【００２３】
こうして、zvegf3は上に開示したzvegf3ポリペプチドを含んでなる種々のマルチマー形態で製造することができる。これらのzvegf3ポリペプチドは、zvegf315-345、zvegf346-345、zvegf3 226-345、およびzvegf3235-345を包含する。また、これらのポリペプチドの変異型および誘導体を本明細書に開示するように製造することができる。また、中間体の形態を製造することができる。例えば、増殖因子ドメインのポリペプチドは、アミノ末端残基として、配列番号2の残基226〜240を有することができる。
【００２４】
zvegf3タンパク質は、アミノ末端またはカルボキシル末端のエクステンション、例えば、アミノ末端のメチオニン残基、アフィニティータグ、またはターゲッティングポリペプチドを含んでなる融合タンパク質として製造することができる。例えば、zvegf3タンパク質は精製を促進するアフィニティータグをもつ融合物として製造することができる。原理的には、抗体または他の特異的結合性因子が入手可能である、任意のペプチドまたはタンパク質をアフィニティータグとして使用することができる。
【００２５】
アフィニティータグは、例えば、下記のものを包含する: ポリ-ヒスチジントラクト、プロテインA (Nilsson 他、ENBO J. 4: 1075、1985; Nilsson 他、Methods Enzymol. 193: 3、1991) 、グルタチオンSトランスフェラーゼ (SmithおよびJohnson、Gene 67: 31、1988) 、Glu‐Gluアフィニティータグ (Grussenmeyer 他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4、1985) 、サブスタンスP、FLAGペプチド (Hopp 他、Biotechnology 6: 1204-1210、1988) 、ストレプトアビジン結合性ペプチド、マルトース結合性タンパク質 (Guan 他、Gene 67: 21-30、1987) 、セルロース結合性タンパク質、チオレドキシン、ユビクイチン、Ｔ7ポリメラーゼ、または他の抗原エピトープまたは結合性ドメイン。
【００２６】
例えば、マルトース結合性タンパク質またはグルタチオンSトランスフェラーゼに対するzvegf3融合物を使用して、細菌の発現系における収率を改良することができる。これらの場合において、融合タンパク質の非zvegf3部分は使用前に通常除去されるであろう。2つのタンパク質間に特異的切断部位を提供することによって、融合タンパク質のzvegf3および非zvegf3部分の分離は促進される。このような方法はこの分野においてよく知られている。また、zvegf3をターゲッティングペプチド、例えば、抗体 (ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、それらの抗原結合性フラグメント、例えば、F(ab’)2およびFabフラグメント、一本鎖抗体、およびその他を包含する) またはターゲット組織に結合する他のペプチド部分に融合することができる。
【００２７】
変異型を配列番号2および配列番号4に示すzvegf3アミノ酸配列中で作って、zvegf3アンタゴニストとして作用する分裂促進的に不活性なレセプター結合性ポリペプチドを製造することができる。本明細書において使用するとき、用語 「分裂促進的に不活性な」 は、タンパク質が標準的有糸分裂アッセイにおいて野生型zvegf3対照に比較して統計的に有意な活性を示さないことを意味する。このような変異型は、アミノ酸置換、欠失、および挿入を包含する。いかなる理論にも拘束されたくないが、ヒトzvegf3 (配列番号2) の残基Arg 260〜Trp 271はPDGFレセプターに結合するタンパク質の能力を定めるループを形成すると考えられる。こうして、PDGFレセプターに対する結合はこの領域における突然変異によりブロックまたは増強できることが予測される。
【００２８】
さらに、配列番号2の残基Leu 311〜His 321は、レセプターの結合をブロックするように突然変異させることができるループ (ループ3) を形成することが予測される。この分子のこの領域を模倣するペプチドはアンタゴニストとして作用することができる。Li 他 (Cytokine & Growth Factor Rev. 14: 91-98、2003) は、2 CUBドメインのうちの1つのみがホモダイマー分子から除去されているzvegf3の部分的にプロセシングされた形態 ( 「ヘミ二量体」 と命名される) がPDGFレセプターに結合することができるが、レセプターの二量化をブロックすることができないことを開示している。
【００２９】
アミノ酸配列の変化の効果はコンピュータモデリング (例えば、Insight II(商標) ビューワーまたは同種のモデリングツール; MSI、カリフォルニア州サンディエゴ) により予測するか、あるいは結晶構造の分析 (例えば、Lapthorn 他、Nature 369: 455、1994) により決定することができ、そしてこの分野において認識されている突然変異誘発手法と活性アッセイとの組み合わせを使用してアッセイすることができる。代表的突然変異誘発手法は、例えば、位置指定突然変異誘発およびアラニン走査突然変異誘発を包含する (CunninghamおよびWells、Science 244: 1081-1085、1989; Bass 他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4498-4502、1991) 。
【００３０】
既知の方法、例えば、Reidhaar-OlsonおよびSauer (Science 241: 53-57、1988) またはBowieおよびSauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156、1989) が開示している方法を使用して、多アミノ酸置換を行い、試験することができる。使用できる他の方法は下記を包含する: ファージ展示 (例えば、Lowman 他、Biochem. 30: 10832-10837、1991; Ladner 他、米国特許第5,223,409号; Huse、WIPO公開WO 92/06204) 、領域指定突然変異誘発 (Derbyshire 他、Gene 46: 145、1986; Ner 他、DNA 7: 127、1988) 、およびDNAシャフリング (Stemmer、Nature 370: 389-391、1994およびStemmer、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751、1994) 。
【００３１】
生ずる突然変異体分子を分裂促進活性または他の性質 (例えば、レセプター結合性) について試験して、これらの機能に対して重大であるアミノ酸残基を同定する。突然変異誘発を高い体積または高い処理量のスクリーニング法と組み合わせて、zvegf3変異型ポリペプチドの生物学的活性、特に細胞増殖をモジューレートする生物学的活性を検出することができる。例えば、色素の組込みまたは3H-チミジンの組込みを測定する有糸分裂誘発アッセイを多数の試料について実施することができる。競合アッセイを使用して、アンタゴニスト活性を確認することができる。
【００３２】
慣用技術に従い遺伝子操作された宿主細胞中で、全長のポリペプチド、フラグメント、および融合タンパク質を包含するzvegf3タンパク質、ならびにアンタゴニスト変異型を産生することができる。適当な宿主細胞は、外因性DNAで形質転換またはトランスフェクトし、培養増殖することができる細胞型であり、そして細菌、真菌の細胞、および培養した高等真核細胞 (多細胞生物の培養した細胞を包含する) を包含する。クローニングしたDNA分子を操作しかつ外因性DNAを種々の宿主細胞中に組込む技術は、下記の文献に開示されている: Sambrook 他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989、およびAusubel他、Current Protocols in Molecular Biology、Green and Wiley and Sons、NY、1993。WO 00/34474参照。
【００３３】
一般に、zvegf3ポリペプチドをコードするDNA配列は、発現ベクター内における、その発現に必要な他の遺伝的要素、例えば、一般に転写プロモーターおよびターミネーターに作用可能に連鎖されている。また、ベクターは普通に1または2以上の選択可能なマーカーおよび1または2以上の複製起点を含有するが、当業者は認識するように、ある種の系内において、選択可能なマーカーを別々のベクター上に結合させ、そして宿主細胞ゲノム中への組込みことによって外因性DNAの複製を実施することができる。プロモーター、ターミネーター、選択可能なマーカー、ベクターおよび他の要素は当業者のレベルの範囲内の日常的設計事項である。多数のこのような要素は文献に記載されており、商業的供給会社を通して入手可能である。WO 00/34474参照。
【００３４】
また、Zvegf3タンパク質および変異型は天然に存在しないアミノ酸残基を含んでなることができる。天然に存在しないアミノ酸は限定されずに下記のものを包含する: トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノプロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシプロリン、N-メチルグリシン、アロ-トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、t-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、および4-フルオロフェニルアラニン。
【００３５】
天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に組込む、いくつかの方法が知られている。例えば、in vitro 系を使用することができ、ここで化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを使用してナンセンス突然変異を抑制する。アミノ酸を合成する方法およびtRNAをアミノアシル化する方法は、この分野において知られている。ナンセンス突然変異を含有するプラスミドの転写および翻訳は、大腸菌 (E. coli) S30抽出物および商業的に入手可能な酵素および他の試薬を含んでなる無細胞系において実施される。タンパク質はクロマトグラフィーにより精製される。
【００３６】
例えば、下記の文献を参照のこと：Robertson 他、J. Am. Chem. Soc. 113: 2722、1991; Ellman 他、Methods Enzymol. 202: 301、1991; Chung 他、Science 259: 806-809、1993; およびChung 他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145-10149、1993) 。第2方法において、転写は突然変異したmRNAおよび化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAのマイクロインジェクションによりクセノプス・オオサイト (Xenopus oocytes) 中で実施される (Turcatti 他、J. Biol. Chem. 271: 19991-1998、1996) 。
【００３７】
第3方法において、置換すべき天然のアミノ酸 (例えば、フェニルアラニン) の非存在下にかつ必要な天然に存在しない1種または2種以上のアミノ酸 (例えば、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニンまたは4-フルオロフェニルアラニン) の存在下に大腸菌 (E. coli) 細胞を培養する。天然に存在しないアミノ酸をその天然の対応物の代わりにタンパク質中に組込む。下記の文献を参照のこと: Koide 他、Biochem. 33: 7470-7476、1994。天然に存在するアミノ酸残基は、in vitro 化学的修飾により、天然に存在しない種に変換することができる。化学的修飾を位置指定突然変異誘発と組み合わせて、置換範囲をさらに拡張することができる (WynnおよびRichards、Protein Sci. 2: 395-403、1993) 。
【００３８】
また、この分野において知られている方法に従い化学的合成により、zvegf3ポリペプチド、それらのフラグメント、または変異型を製造することができる。このような方法は排除固相合成法、部分的固相法、フラグメント縮合法または古典的溶液合成法を包含する。例えば、下記の文献を参照のこと：Merrifield、J. Am. Chem. Soc. 85: 2149、1963; Stewart 他、Solid Phase Peptide Synthesis (第2版) 、Pierce Chemical Co.、イリノイ州ロックフォード、1984; BayerおよびRapp、Chem. Pept. Prot. 3: 3、1986; およびAtherton 他、Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach、IRL Press、Oxford、1989。
【００３９】
zvegf3およびその変異型は、慣用のタンパク質精製法、典型的にはクロマトグラフィー技術の組み合わせにより精製することができる。一般に、下記の文献を参照のこと: Affinity Chromatography: Principles & Methods、Pharmacia LKB Biotechnology、スウェーデン国ウップサラ、1988; およびScopes、Protein Purification: Principles and Practice、Springer-Verlag、New York、1994。ポリヒスチジンアフィニティータグ (典型的には約ヒスチジン残基) を含んでなるタンパク質は、ニッケルキレート樹脂上のアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。例えば、下記の文献を参照のこと：Houchuli 他、Bio/Technol. 6: 1321-1325、1988。
【００４０】
さらに、増殖因子ドメインそれ自体はpH 7.0〜8.0において25 mlのNaリン酸塩、0.25 MのNaCl中でニッケル樹脂に結合する。結合したタンパク質は、pH 5.0に低下するpH勾配またはイミダゾール勾配で溶離することができる。組換えzvegf3増殖因子ドメインは、強カチオン交換体上のクロマトグラフィーおよび引き続く強アニオン交換体を含んでなる縦列カラムアレイおよび引き続く直列の固定化された金属アフィニティーカラムの直列の組み合わせにより精製することができる。
【００４１】
また、PBS、pH 6〜8中で種々の色素マトリックス (例えば、BLUE 1、BLUE 2、ORANGE 1、ORANGE 3、およびRED 3、Lexton Scientific、カリフォルニア州シンガルヒル) に結合し、これから結合したタンパク質を20 mMのホウ酸緩衝液pH 8.8中の1〜2 MのNaClで溶離できることが発見された。RED 3から溶離されたタンパク質をRED 2 (Lexton Scientific) 上に通過させて残留する汚染物質を除去する。glu-gluタグを含んでなるタンパク質は、慣用手法に従いイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Grussenmeyer 他、前掲。マルトース結合性タンパク質の融合物は、この分野において知られている方法に従いアミロースカラムにより精製する。
【００４２】
下記においていっそう詳しく開示するように、トランスジェニックマウスの肝臓中のzvegf3の過剰発現は、星細胞の顕著な活性化および増殖に導いた。8週齢において、類洞周囲細胞外基質 (ECM) が蓄積し、これは22週齢において細静脈周囲ECM沈着に進行し、そして33週齢において線維バンディングおよび多分肝小結節の形成により特徴づけられる肝硬変の初期段階に進行した。より高齢の動物は、ヘマギオ内皮腫 (hemagioendothelioma) 、小結節性肝細胞過形成、および肝細胞腺腫を有することが見出された。これらの変化は、長期間にわたるzvegf3の過剰発現の結果である肝細胞癌の発生と一致する。
【００４３】
また、下に詳細に説明するように、ラットの肝星細胞をzvegf3増殖因子ドメインのタンパク質で刺激したとき、対照細胞と比較してTGF-βの産生がほぼ5倍増加した。TGF-βは、他の前線維増多遺伝子の発現を誘導できる肝性線維増多の重要なモジュレーターであると考えられる。それゆえ、zvegf3を過剰発現する動物において観察される効果は、zvegf3の直接的および間接的作用のためでであることがある。
【００４４】
Zvegf3は限定されずに下記のものを包含する: 抗zvegf3抗体 (中和性抗体を包含する) 、阻害性ポリヌクレオチド (アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、および外部ガイド配列) 、および他のペプチドおよび非ペプチド因子、例えば、小分子のインヒビターおよび分裂促進的に不活性なレセプター結合性zvegf3ポリペプチド。
【００４５】
Zvegf3アンタゴニストとして使用する抗体は、zvegf3タンパク質に特異的に結合し、そのようにすることによって、レセプターに対するzvegf3の結合を減少させまたは防止し、結局、zvegf3のレセプター仲介活性を減少させまたはブロックする。本明細書において使用するとき、用語 「抗体」 はポリクローナル抗体、アフィニティー精製したポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗原結合性フラグメント、例えば、F(ab’)2およびFabフラグメントを包含する。また、遺伝子操作された無傷の抗体またはフラグメント、例えば、キメラ抗体、Fvフラグメント、一本鎖抗体、およびその他、ならびに合成抗原結合性ペプチドおよびポリペプチドが包含される。
【００４６】
非ヒト抗体は、非ヒトCDRをヒトフレームワークにグラフトするか、あるいは全非ヒトドメインを組込む (必要に応じて暴露された残基の置換によりヒト様表面でそれらを「クローキング」する、ここで「ベニヤ化」抗体が生ずる) ことによってヒト化することができる。ある場合において、ヒト化抗体はヒト可変領域のフレームワークドメイン内に非ヒト残基を保持して、適切な結合特性を増強することができる。ヒト化抗体を通して、生物学的半減期を増加させことができ、そしてヒトに投与したときの悪い免疫反応の可能性は減少する。また、ヒト構造を有する抗体を産生するように遺伝的に変更されたマウスにおいて、モノクローナル抗体を産生することができる。一般に、IgGクラスの抗体は本発明において使用するために好ましい。
【００４７】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、この分野においてよく知られている。例えば、下記の文献を参照のこと：Cooligan 他、Current Protocols in Immunology、National Institute of Health、John Wiley and Sons, Inc.、1995; Sambrook 他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989; およびHurrell (編者) 、Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications、CRC Press, Inc.、フロリダ州ボカレイトン、1982。当業者にとって容易に明らかなように、種々の温血動物、例えば、ウマ、雌牛、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、およびラットにzvegf3ポリペプチドまたはそのフラグメントを接種することによって、ポリクローナル抗体を発生させることができる。
【００４８】
免疫原性ポリペプチドは、zvegf3ポリペプチド (例えば、配列番号2に示す) またはレセプターのエピトープ担持部分を含んでなるであろう。「エピトープ」は、抗体が結合できるタンパク質の領域である。例えば、下記の文献を参照のこと：Geysen 他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002、1984。エピトープは線状またはコンフォメーション的であることができ、後者はタンパク質のフォールディング時にエピトープを形成するタンパク質の不連続領域から構成されている。線状エピトープは一般に少なくとも6アミノ酸残基の長さである。
【００４９】
タンパク質配列の一部分を模倣する、比較的短い合成ペプチドは、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を日常的に誘発することができる。下記の文献を参照のこと: Sutcliffe 他、Science 219: 660-666、1983。免疫原性エピトープ担持ポリペプチドは、zvegf3ポリペプチドまたはレセプターの少なくとも6、よりしばしば15〜約30の連続的アミノ酸残基の配列を含有する。Zvegf3タンパク質またはレセプターのより大きい部分、すなわち、30〜50残基から全配列までを含んでなるポリペプチドが含められる。
【００５０】
エピトープ担持ポリペプチドのアミノ酸配列は水性溶媒中で実質的な溶解度を提供するように選択すること、すなわち、配列は比較的親水性の残基を含み、かつ疎水性残基を実質的に回避することが好ましい。図1A〜図1G参照。このような領域は、配列番号2の残基43〜48、96〜101、97〜102、260〜265、および330〜335を含む。前述したように、免疫原として多少より長いペプチド、例えば、配列番号2の80〜104、195〜225、299〜314、および299〜326を含んでなるペプチドを使用することが一般に好ましい。後者のペプチドは、カップリングを促進するために追加のN-末端のCys残基を使用して製造できる。
【００５１】
ポリペプチドの免疫原の免疫原性は、アジュバント、例えば、明礬 (水酸化アルミニウム) またはフロインド完全または不完全アジュバントを使用して増加することができる。また、免疫化に有効なポリペプチドは、融合ポリペプチド、例えば、zvegf3ポリペプチドまたはその一部分と免疫グロブリンポリペプチドまたはマルトース結合性タンパク質との融合物を包含する。ポリペプチドの一部分が 「ハプテン様」 である場合、このような部分は免疫化するために高分子担体 (例えば、キーホールリンペットヘモシアニン (KLH) 、ウシ血清アルブミン (BSA) 、または破傷風トキソイド) に好都合に接続または結合させることができる。
【００５２】
抗体を発生させまたは選択する別の技術は、ポリペプチド免疫原に対するリンパ球のin vitro 暴露、およびファージまたは同様なベクター中の抗体展示ライブラリーの選択 (例えば、固定化または標識化ポリペプチドを使用する) を包含する。このようなランダムペプチド展示ライブラリーを発生させまたはスクリーニングする技術はこの分野において知られており (例えば、Ladner 他、米国特許第5,223,409号; 米国特許第4,946,778号; 米国特許第5,403,484号; および米国特許第5,571,698号) 、そしてランダムペプチド展示ライブラリーおよびこのようなライブラリーをスクリーニングするキットは、例えば、下記の会社から商業的に入手可能である: Clontech Laboratories (カリフォルニア州パルアルト) 、Invitrogen Inc. (カリフォルニア州サンディエゴ) 、New England Biolabs, Inc. (マサチューセッツ州べバーリイ) 、およびPharmacia LKB Biotechnology, Inc. (ニュージャージー州パルシパニイ) 。ランダムペプチド展示ライブラリーは、本明細書に開示するzvegf3配列を使用してスクリーニングして、zvegf3に結合するタンパク質を同定することができる。
【００５３】
抗体がそれらの意図するターゲット (例えば、zvegf3タンパク質またはレセプター) に対照 (例えば、非zvegf3または非レセプター) ポリペプチドまたはタンパク質に対する結合アフィニティーよりも少なくとも10倍大きいアフィニティーで結合する場合、それらの抗体は特異的に結合性であると決定される。これに関して、「zvegf3ポリペプチド」は、関係する分子VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF、PDGF-A、およびPDGF-Bを包含するが、非ヒト種からのzvegf3ポリペプチドを排除する。zvegf3オーソログオーソログ間で期待されるアミノ酸配列の同一性のレベルが高いために、ヒトzvegf3に対して特異的な抗体はまた他の種からのzvegf3に結合することができる。
【００５４】
当業者は、例えば、スキャッチャード分析 (Scatchard G.、Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672、1949) により、抗体の結合アフィニティーを容易に決定することができる。特異的抗体をスクリーニングしかつ単離する方法は、この分野においてよく知られている。例えば、下記の文献を参照のこと：Paul (編者) 、Fundamental Immunology、Raven Press、1993; Getzoff 他、Adv. in Immunol. 43: 1-98、1988; Goding (編者) 、Monoclonal Antibodies : Principles and Practice、Academic Press Ltd.、1996; Benjamin 他、Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101、1984。
【００５５】
また、結合アフィニティーは商業的に入手可能なバイオセンサー計器 (BIACORE、Pharmacia Biosensor、ニュージャージー州ピスカタウェイ) を使用して決定することができ、ここでタンパク質をレセプターチップ上に固定化する。下記の文献を参照のこと: Karlsson、J. Immunol. Methods 145: 229-240、1991およびWells、J. Mol. Biol. 234: 554-563、1993。このシステムは、結合アフィニティーを計算できるオンレイト (on-rate) およびオフレイト (off-rate) の決定、および結合の化学量論の評価を可能とする。
【００５６】
特異性が異なる他の抗体を本質的に含まない抗体が製造されるとき、抗体は「単離された」と考える。単離された抗体を使用すると、zvegf3の特異的エピトープまたは部分、例えば、増殖因子ドメインのターゲッティングが促進される。
【００５７】
当業者に知られている種々のアッセイを利用して、zvegf3タンパク質またはレセプターに特異的に結合する抗体を検出することができる。典型的なアッセイは下記の文献に開示されている: Antibodies: A Laboratory Manual、HarlowおよびLane (編者) 、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1988。このようなアッセイの代表的例は下記を包含する: 同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、放射線免疫沈降法、酵素結合イムノソルベント検定法 (ELISA) 、ドットブロットまたはウェスタンブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ。
【００５８】
療法的適用のために、中和性抗体を使用することが一般に好ましい。本明細書において使用するとき、用語 「中和性抗体」 は、抗体を1000倍モルのアクセスで添加したとき、コグネイト抗原の生物学的活性を少なくとも50%阻害する抗体を意味する。当業者は認識するように、より大きい中和性抗体が時々望ましく、そして100倍または10倍モルのアクセスで50%の阻害を提供する抗体を好都合に使用することができる。
【００５９】
さらに、zvegf3アンタゴニストは、zvegf3遺伝子の転写を阻害し、これにより細胞の in vivo 活性化および/または増殖を阻害することができる、アンチセンスポリヌクレオチドを包含する。zvegf3をコードするポリヌクレオチド (例えば、配列番号1に記載するポリヌクレオチド) のセグメントに対して相補性であるポリヌクレオチドは、zvegf3をコードするmRNAに結合し、かつこのようなmRNAを阻害するように設計される。特異的ベクターおよび/またはプロモーターを使用する遺伝子治療アプローチ、例えば、下においていっそう詳細に開示するウイルスの送達系を使用して、アンチセンスポリヌクレオチドを特異的組織にターゲッティングすることができる。
【００６０】
また、本発明においてzvegf3アンタゴニストとして、リボザイムを使用できる。リボザイムは、触媒中心およびターゲットRNA結合性部分を含有するRNA分子である。この用語は、RNA酵素、自己スプライシングRNA、自己切断性RNA、およびこれらの触媒機能を実行する核酸分子を包含する。リボザイムは相補的塩基対合を通してRNA分子に選択的に結合し、触媒中心をターゲット配列に密接させる。次いでリボザイムはターゲットRNAを切断し、解放させ、その後リボザイムは追加の分子に結合し、それを切断することができる。リボザイムをコードする核酸分子は、「リボザイム遺伝子」と命名される。
【００６１】
リボザイムは、mRNA分子中のある種のターゲット配列に対して向けられたエンドヌクレアーゼ活性を発現するするように設計できる (例えば、下記の文献を参照のこと: DraperおよびMacejak、米国特許第5,496,698号; McSwiggen、米国特許第5,525,468号; Chowriraおよび; McSwiggen、米国特許第5,631,359号; RobertsonおよびGoldberg、米国特許第5,225,337号) 。調節要素がリボザイムをコードするヌクレオチド配列に作用可能に連鎖されている、発現ベクターを構築できる。
【００６２】
他のアプローチにおいて、zvegf3ポリペプチドをコードするmRNA分子のRNアーゼP仲介切断を促進できるRNA転写物の産生を調節要素が指令する、発現ベクターを構築できる。このアプローチによれば、内因的リボザイム、RNアーゼPを細胞内mRNAの特定の種に向けることができ、引き続いて特定の種が細胞のリボザイムにより切断される、外来性ガイド配列を構築できる (例えば、下記の文献を参照のこと: Altman 他、米国特許第5,168,053号; Yuan 他、Science 263: 1269、1994; Pace 他、WIPO公開WO 96/18733; George 他、WIPO公開WO 96/21731; およびWerner 他、WIPO公開WO 97/33991) 。
【００６３】
一般に、外来性ガイド配列は、zvegf3 mRNAに対して相補的である10〜15ヌクレオチド配列、および3’-NCCAヌクレオチド配列 (ここでNは好ましくはプリンである) を含んでなる。外来性ガイド配列の転写物は、mRNAと相補的外来性ガイド配列との間の塩基対の形成によりターゲテッドmRNAに結合し、こうして塩基対合領域の5’-側に位置するヌクレオチドにおいてRNアーゼPによるmRNAの切断を促進する。
【００６４】
zvegf3の増殖因子ドメインは、分子の活性 (PDGFレセプター結合性) 種であることが見出された。活性化のために、分子のN-末端部分を除去するタンパク質分解的プロセシングが必要である。こうして、このタンパク質分解的活性化のインヒビターを本発明においてzvegf3アンタゴニストとして使用することもできる。
【００６５】
薬学的使用のために、zvegf3アンタゴニストは、非経口的、特に静脈内または腹腔内、送達のために慣用法に従い処方される。一般に、医薬処方物はzvegf3アンタゴニストを薬学上許容される賦形剤、例えば、生理的食塩水、緩衝化生理的食塩水、5%のデキシトロース水溶液、5%のヒト血清アルブミン、またはその他と組み合わせて含むであろう。さらに、処方物は1種または2種以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、ウイルス表面上のタンパク質損失を防止するアルブミン、およびその他を含むことができる。既知の手法に従い、リポソームを担体として使用できる。処方法はこの分野においてよく知られており、そして、例えば、は下記の文献に開示されている: Remington: The Science and Practice of Pharmacy、Gennaro編、Mack Publishing Co.、ペンシルベニア州イーストン、第19版、1995。Zvegf3アンタゴニストは通常単位投与形態で処方され、包装される。典型的には、抗体は約1 mg/ml〜約10 mg/mlの濃度で処方されるであろう。
【００６６】
治療剤または組成物の「治療的有効量」は、統計的に有意な効果、例えば、統計的に有意な、所定の期間にわたる生存率の増加、生存時間の増加、腫瘍塊の減少、腫瘍転移の減少、疾患進行の減少、進行時間の減少、およびその他を生成する量である。正確な投与量は、許容された標準に従い、治療すべき症状の特質および重症度、患者の体質、およびその他を考慮して臨床医により決定されるであろう。投与量の決定は当業者のレベルの範囲内である。一般に、治療処方物は、有益な効果を達成するために必要な期間にわたって、通常数ヶ月まで投与されるであろう。投与は治療期間にわたって毎日または間欠的に実施される。通常、静脈内投与は、1または数時間の典型的な期間にわたる注入により実施されるであろう。また、持続放出性処方物を使用することができる。大きい負荷の投与量を初期に投与し、次いでより少ない、周期的、維持投与量を投与することができる。
【００６７】
他の分裂促進因子、例えば、肝細胞増殖因子 (HGF) 、脈管内皮増殖因子 (VEGF) 、およびインスリン様増殖因子 (IGF) は肝細胞癌の開始または進行に関係づけられた。したがって、zvegf3インヒビターをこれらの他の因子の1種または2種以上のインヒビターと組み合わせることが有利であることがある。
【００６８】
本発明において、zvegf3アンタゴニストは肝細胞癌の既知の療法、例えば、外科手術、化学療法、高周波切除、レーザーまたはマイクロ波療法、経皮的エタノール注入、凍結外科手術、免疫療法、またはそれらの組み合わせと組み合わせて投与することができる。例えば、zvegf3アンタゴニストは慣用の化学療法剤、例えば、下記と組み合わせて投与することができる: シスプラチン (Epstein 他、Cancer 67: 896-900、1991) 、ドキソルビジン塩酸塩 (Choi 他、Radiology 182: 709-713、1992) 、5-フルオロドキソルビジン (Ensminger 他、Cancer Treat Rep. 65: 393-400、1981) 、ジクロロメトトレキセート (Ensmiger 他、前掲) 、またはビスクロロエチルニトロソ尿素 (Dakhil 他、Cancer 50: 631-635、1982) 。
【００６９】
薬物塞栓療法 (例えば、Choi 他、前掲; Dakhil 他、前掲) または肝動脈注入 (例えば、Ensminger 他、前掲) により、化学療法の領域選択性を増強し、そして全身的毒性を減少することができる。多治療剤の投与は同時または順次であることができる。他の医学的症状の位置または存在のために切除不可能である小さい (<5 cm) 局在化腫瘍の治療において、薬物塞栓療法、凍結外科手術、経皮的エタノール注入、および高周波切除は特に重要である。
【００７０】
本発明のある態様において、zvegf3アンタゴニストの単独または他の療法と組み合わせた投与は腫瘍応答を生じさせるであろう。各プロトコルは腫瘍応答の評価を異なるように定めることがあるが、典型的なガイドラインは下記の文献において見出すことができる: Clinical Research Associates Manual、Southwest Oncology Group、CRAB、ワシントン州シアトル、1998年10月6日、最新情報1999年8月 (“CRA Manual”) 。CRA Manual (参照: Chapter 7、“Response Assessment”) によれば、腫瘍応答はすべての測定可能な病変または転移の減少または排除を意味する。
【００７１】
疾患が医学的写真またはX線、コンピュータ化軸方向断層撮影法 (CT) 、磁気共鳴映像法 (MRI) 、または触診により明瞭に定められる境界をもつ、二次元の測定可能な病変を含んでなる場合、疾患は一般に測定可能であると考える。評価可能な疾患は、疾患が一次元の測定可能な病変、明瞭に定められない境界をもつ塊、0.5 cmより小さい両方の直径をもつ病変、切断間の距離より小さい両方の直径をもつスキャン上の病変、2 cmより小さい直径をもつ触知可能な病変、または骨の疾患を含んでなることを意味する。評価不可能な疾患は、胸の滲出、腹水、および間接的証拠により証明される疾患を包含する。一般に、進行しなかった以前に照射した病変もまた評価不可能であると考える。
【００７２】
目的の状態についての基準は、充実腫瘍の応答を評価するためのプロトコルを必要とする。代表的基準は下記のものを包含する: (1) 完全な応答 (CR) 、これはすべての測定可能なかつ評価可能な疾患の完全な消失として定義される。新しい病変の非存在。疾患に関係する症候の非存在。評価不可能な疾患の証拠の非存在; (2) 部分的応答 (PR) 、これはすべての測定可能な病変の垂直直径の積の合計における基線からの50%の減少より大きいか、あるいはそれに等しいとして定義される。
【００７３】
評価可能な疾患の進行の非存在。新しい病変の非存在。少なくとも1つの測定可能な病変をもつ患者に適用される; (3) 進行、これは基線と同一の技術を使用して観察された最小合計にわたる測定可能な病変の積の合計の50%または10 cm2の増加、または評価可能な疾患の明瞭な悪化、または消失した病変の再出現、または新しい病変の出現、または死亡または悪化する症状のための評価に戻ることが不可能であること (特記しない限り、この癌に無関係である) として定義される行; (4) 安定なまたは非応答、これはCR、PR、または進行を満たさないとして定義される。 (参照: Clinical Research Associates Manual、前掲) 。
【００７４】
抗体は治療過程にわたって非経口的に、特に静脈内注入 (肝動脈注入を包含する) により投与することが好ましい。また、投与は腹腔内であることができる。一般に、抗体は約0.1〜約20 mg/kgの患者体重、通常約0.5〜約10 mg/kg、しばしば約1〜約5 mg/kgの範囲で投与される。これに関して、少なくとも12時間、好ましくは少なくとも4日間、より好ましくは14〜21日間までの循環半減期を有する抗体を使用することが好ましい。キメラ抗体およびヒト化抗体は、それぞれ、4日間までおよび14〜21日間までの循環半減期を有することが期待される。多数の場合において、大きい負荷投与量および引き続く治療期間にわたる周期的 (例えば、毎週の) 維持投与量を投与することが好ましいであろう。また、抗体は遅延放出送達系、ポンプ、および他の既知の連続的注入用送達系により送達することができる。投与養生法を変化させて、その薬物速度論に基づいて特定の抗体の必要な循環レベルを提供することができる。こうして、治療剤の必要な循環レベルが維持されるように、投与量を計算する。
【００７５】
実際の投与量および治療養生法は、癌の特質 (一次または転移性) 、腫瘍の数および大きさ、他の療法、および患者の特性を考慮して、医師により決定されるであろう。肝細胞癌の生命を脅かす特質にかんがみて、有意な副作用を伴う、大きい投与量が使用されることがある。
【００７６】
当業者は認識するように、同一原理は他のzvegf3アンタゴニストの使用のための指針となるであろう。所定のアンタゴニストについての投与養生法は、多数の因子、例えば、効力、薬物速度論、およびアンタゴニストの物理化学的特質により決定されるであろう。例えば、非ペプチドzvegf3アンタゴニストは腸内に投与できる。
【００７７】
治療用ポリヌクレオチド、例えば、アンチセンスポリヌクレオチドは、ウイルス送達系により患者または試験動物に送達することができる。この目的のために典型的なウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ関連ウイルス (AAV) を包含する。アデノウイルス、二本鎖DNAウイルスは、異種核酸の送達用に現在最もよく研究されている遺伝子転移ベクターである。概観については、下記の文献を参照のこと：Becker 他、Mol. Cell. Biol. 43: 161-189、1994; およびDouglasおよびCuriel、Science & Medicine 44-53、1977。アデノウイルス系はいくつかの利点を提供する。アデノウイルスは下記のことが可能である: (i) 比較的大きいDNAインサートを収容する; (ii) 高い力価に増殖する; (iii) 広い範囲の哺乳動物細胞型を感染させる; (iv) 多数の異なるプロモーター、例えば、ユビクイチン、組織特異的、および調節可能なプロモーターとともに使用する。アデノウイルスは血流中で安定であるので、静脈内注射により投与することができる。
【００７８】
アデノウイルスのゲノムの一部分を欠失させることによって、より大きいインサート (7 kbまで) の異種DNAを収容させることができる。健全な動物に静脈内投与するとき、アデノウイルスは主として肝臓をターゲットとする。アデノウイルス送達系がE1遺伝子を欠失しているとき、このウイルスは宿主細胞中で複製することができない。しかしながら、宿主の組織 (例えば、肝臓) は異種タンパク質を発現し、そしてそれをプロセシングする (シグナル配列が存在する場合、分泌する) 。
【００７９】
遺伝子を送達する別の方法は体から細胞を除去し、ベクターを細胞中に裸のDNAプラスミドとして導入することを含んでなる。次いで形質転換された細胞を体の中に再移植する。裸のDNAベクターをこの分野において知られている方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、DEAE、デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、遺伝子ガンの使用、またはDNAベクタートランスポーターの使用により宿主細胞の中に導入する。下記の文献を参照のこと: Wu 他、J. Biol. Chem. 263: 14621-14624、1988; Wu 他、J. Biol. Chem. 267: 963-967、1992; およびJohnstonおよびTang、Mol. Cell. Biol. 43: 353-365、1994。
【００８０】
Zvegf3アンタゴニストの活性は、zvegf3活性を測定するように設計されたアッセイ (細胞に基づくアッセイを含む) を使用して、in vitro で測定できる。このアッセイにおいて、アンタゴニストはzvegf3の作用を減少させるであろう。リガンド-レセプター の結合は、この分野においてよく知られている種々の方法、例えば、レセプター競合アッセイ(Bowen-PopeおよびRoss、Methods Enzymol. 109: 69-100、1985) により、可溶性レセプター、例えば、IgG融合タンパク質として産生されたレセプター (米国特許第5,750,375号) を使用してアッセイすることができる。
【００８１】
レセプター結合アッセイは、評価のために既知の細胞表面レセプターを含有する細胞系統について実施できる。レセプターは細胞中に自然に存在するか、あるいは遺伝子操作された細胞により発現される組換えレセプターであることができる。分裂促進活性は、既知のアッセイ、例えば、3H-チミジンの組込み (例えば、下記の文献に開示されている: RainesおよびRoss、Methods Enzymol. 109: 749-773、1985およびWahl 他、Mol. Cell. Biol. 8: 5016-5025、1988) 、色素組込みアッセイ (例えば、下記の文献に開示されている: Mosman、J. Immunol. Meth. 65: 55-63、1983およびRaz 他、Acta Trop. 68: 139-147、1997) または細胞数計測を使用して測定できる。
【００８２】
適当な有糸分裂誘発アッセイは下記の中への3H-チミジンの組込みを測定する: (1) 増殖する細胞をさらに刺激するzvegf3タンパク質の能力を探すために20%のコンフルエントの培養物、および (2) 接触誘導増殖阻害を克服するzvegf3タンパク質の能力を探すために48時間コンフルエンスに保持した休止細胞。適当な色素組込みアッセイは、ターゲット細胞中へのアラマー (Alamar) ブルー色素 (Raz 他、前掲) の組込みの測定を含む。また、下記の文献を参照のこと: Gospodarowicz 他、J. Cell. Biol. 70: 395-405、1976; EwtonおよびFlorini、Endocrinol. 106: 577-583、1980; およびGospodarowicz 他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7311-7315、1989。
【００８３】
zvegf3アンタゴニストの生物学的活性は、非ヒト動物において、外因性化合物の投与、zvegf3アンチセンスポリヌクレオチドの発現、およびノックアウト技術を使用する内因的zvegf3発現の抑制により研究することができる。ウイルス送達系 (上に開示した) を使用することができる。zvegf3アンタゴニストは、他のzvegf3アンタゴニストと組み合わせて、または他の化合物、例えば、他の増殖因子アンタゴニストと組み合わせて、個々に投与しまたは発現させることができる。試験動物をパラメーター、例えば、臨床的徴候、体重、血球数計測、臨床化学、組織病理学、腫瘍のサイズおよび進行、およびその他の変化についてモニターする。
【００８４】
肝細胞癌治療の評価において使用できる動物モデルは下記を包含する: トランスジェニックマウス (例えば、下記の文献を参照のこと: SinghおよびKuman、Rev. Med. Virol. 13. 243-253、2003) 、ラットにおけるジエチルニトロソアミンの潅流 (例えば、Wang 他、World J. Gastroenterol. 9: 930-935、2003; HemmingsおよびStrickland、Cellular Physiology and Biochemistry 12: 345-352、2002) 、腫瘍移植 (例えば、Qian 他、World J. Gastroenterol. 9: 94-98、2003) 、ラットの多器官発癌性モデル (Hideald 他、Japanese Journal of Cancer Research 93: 1299-1307、2002) および慢性ウイルス感染ウッドチャック (Tennant、Clin. Liver Dis. 5: 43-68、2001) 。
【実施例】
【００８５】
下記の非限定的実施例により、本発明をさらに例示する。
実施例１．
ヒト唾液腺ライブラリーをPCRによりzvegf3の全長のクローンについてスクリーニングした。このライブラリーは、ベクターpZP5x中で作られた9.6×105クローンを表す、配置されたライブラリーであった。ベクターpZP5xはベクターpZP-9 (アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (American Type Culture Collection、10801 University Blvd.、バージニア州マンナッサス) に受け入れ番号98668で寄託された) と同一であるが、Asp718とBamH1部位との間にメタロチオネインプロモーターの代わりにサイトメガロウイルスプロモーターを含有する。
【００８６】
こうして、プラスミドはSV40初期プロモーターの制御下にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、SV40ポリアデニル化部位、CMVプロモーターの制御下に問題の遺伝子を挿入するためのクローニング部位、およびヒト成長ホルモン (hGH) 遺伝子ポリアデニル化部位を含んでなる。オリゴヌクレオチドプライマーZC19,045 (配列番号6) およびZC19,047 (配列番号7) を60℃のアニリーング温度において35サイクル間使用するPCRにより、12,000コロニーの80プールを含有する作業プレートの各々をスクリーニングした。2つの強い陽性のプール58 (T-8 F1-F12) および77 (T-7 H1-H12) が存在した。次いで、同一条件を使用するPCRにより、トランスファープレート中の対応するプールをスクリーニングした。
【００８７】
トランスファーレベルにおいて、2つの陽性プールが得られた。陽性プールはT-7 H11およびT-8 F10であった。5’ RACE反応をトランスファープレートのプールについて実施し、そしてフラグメントを配列決定してzvegf3配列をチェックし、全長のクローンが存在するかどうかを決定した。PCRのために、オリゴヌクレオチドプライマーZC12,700 (配列番号8) およびZC19,045 (配列番号6) を61℃のアニリーング温度において5サイクル間、次いで55℃のアニリーング温度において30サイクル間使用した。配列決定はプールT-7 H11がフレームシフトを有することを示した。トランスファープレート8のプールF10配列は正しいように見え、したがってこのDNAプールをフィルターリフトにおいて使用した。
【００８８】
トランスファープレート8からのプールF10をプレートし、そしてナイロン膜 (Hybond-NTM; Amersham Corporation、イリノイ州アーリントンハイツ)を使用してフィルターをリフトした。5フィルターの各々上のほぼ1200コロニー/プレートを合計ほぼ6000コロニーについてリフトした。フィルターを配向のために熱い針でしるしをつけ、次いで0.5 M NaOHおよび1.5 M Tris-HCl、pH 7.2中で6分間変性した。次いでフィルターを1.5 M NaClおよび0.5 M Tris-HCl、pH 7.2中で6分間中和した。UV架橋剤 (Stratalinkr(商標)、Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ) を1200ジュールにおいて使用して、DNAをフィルターに添付した。フィルターを0.25×SSC、0.25% SDS、および1 mM EDTAから成る前洗浄緩衝液中で65℃において前洗浄した。
【００８９】
この溶液を合計3回45分にわたって交換し、細胞破片を除去した。フィルターを25 mlのハイブリダイゼーション溶液 (ExpressHybTM; Clontech Laboratories, Inc.、カリフォルニア州パルアルト) 中で65℃においてほぼ3時間プレハイブリダイゼーションした。zvegf3発現配列タグを含んでなるクローンをEcoRIおよびBglIIで消化し、次いでシリカゲル膜を含有するスピンカラム (QIAquickTM Gel Extraction Kit; Qiagen, Inc.、カリフォルニア州バレンシア) を使用してゲル精製することによって製造したほぼ400 bpのフラグメントを使用して、プローブを発生させた。このプローブを商業的に入手可能なキット (RediprimeTM II、Amersham Corp.、イリノイ州アーリントンハイツ) を使用するランダムプライミングにより32Pで放射線標識化し、プッシュカラムで精製した。
【００９０】
フィルターのハイブリダイゼーション溶液のために、ExpressHybTM溶液を使用した。ハイブリダイゼーションを65℃において一夜実施した。ブロットを65℃の溶液 (2×SSC、0.1% SDS) 中で2回すすぎ、次いで溶液1中で65℃において4回洗浄した。フィルターを-80℃において一夜フィルムに露出した。フィルター上に、14の陽性領域が存在した。85クローンを陽性領域から取り、オリゴヌクレオチドプライマーZC19,045 (配列番号6) およびZC19,047 (配列番号7) を60℃のアニリーング温度において使用するPCRによりスクリーニングした。13の陽性物が得られ、個々のクローンについてストリークした。24のコロニーを取り、前に記載したようにPCRによりチェックした。6つの陽性物が得られ、それらのうちの2つを配列決定した。両方の配列は同一であり、全長であった。この配列を配列番号1に示す。
【００９１】
実施例２．
PCRパネルをマウスzvegf3 DNAについてスクリーニングした。このパネルは、脳、骨髄、15日の胚、精巣、唾液腺、胎盤、15日の胚 (Clontech Laboratories) 、および17日の胚 (Clontech Laboratories) のライブラリーからの8つのcDNA試料を含有した。
【００９２】
PCR混合物はオリゴヌクレオチドプライマーZC21,222 (配列番号9) およびZC21,224 (配列番号10) を含有した。この反応は、EX TaqTM DNAポリメラーゼ (Pan Vera、ウィスコンシン州マディソン) + 抗体を使用して、66℃のアニリーング温度において2分のエクステンション時間で合計35サイクル間進行させた。DNA試料はPCRによりzvegf3について陽性であることが見出され、配列決定により確認され、15日の胚ライブラリーの全プールcDNA、マウス15日の胚 (Clontech Laboratories) および17日の胚 (両方はClontech Laboratoriesから入手した) 、マウス唾液腺ライブラリーの全プールcDNA、およびマウス精巣ライブラリーの全プールcDNAを含んでいた。マウス15日の胚ライブラリーの全プールcDNA、マウス15日の胚cDNA、およびマウス17日の胚cDNAのPCR生成物の各々からの約600 bpのフラグメントを配列決定した。マウス17日の胚cDNAおよびマウス15日の胚ライブラリーの全プールcDNA生成物からの配列は、フラグメントがマウスzvegf3 DNAであることを確証した。
【００９３】
マウス15日の胚ライブラリーを全長のzvegf3 DNAについてスクリーニングした。このライブラリーはpCMV-SPORT 2ベクター中の9.6×105クローンを表す配列されたライブラリーであった (Life Technologies、マリーランド州ガイサーバーグ) 。オリゴヌクレオチドプライマーZC21,223 (配列番号11) およびZC21,224 (配列番号10) を66℃のアニリーング温度において35サイクル間使用するPCRにより、各12,000コロニーの80プールを含有する作業プレートをスクリーニングした。18の陽性物が得られた。4つのプール (A2、A10、B2およびC4) からのフラグメントを配列決定した; すべてはzvegf3をコードすることが確証された。同一反応条件および作業プレートおよび源プレートからのプールを使用する追加のラウンドのスクリーニングにおいて、1つの陽性プール (5D) が同定された。
【００９４】
陽性コロニーをハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。もとの源プレート#5からのプール5Dを約250コロニー/プレートでプレートし、ナイロン膜  (Hybond-NTM; Amersham Corporation、イリノイ州アーリントンハイツ) に移した。5フィルターをほぼ1250コロニーについてリフトした。フィルターを配向のために熱い針でしるしをつけ、次いで0.5 M NaOHおよび1.5 M Tris-HCl、pH 7.2中で6分間変性した。次いでフィルターを1.5 M NaClおよび0.5 M Tris-HCl、pH 7.2中で6分間中和した。UV架橋剤 (Stratalinkr(商標)、Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ) を1200ジュールにおいて使用して、DNAをフィルターに添付した。
【００９５】
オリゴヌクレオチドプライマーZC21,223 (配列番号11) およびZC21,224 (配列番号10) 、およびマウス15日の胚鋳型を66℃のアニリーング温度において35サイクル間使用するPCRにより、プローブを発生させた。シリカゲル膜 (QIAquickTM Gel Extraction Kit; Qiagen, Inc.、カリフォルニア州バレンシア) を含有するスピンカラムを使用して、PCRフラグメントをゲル精製した。商業的に入手可能なキット (RediprimeTM II、Amersham Corp.、イリノイ州アーリントンハイツ) を製造業者の使用説明書に従い使用して、DNAを32Pで放射線標識化した。
【００９６】
商業的に入手可能なプッシュカラム (NucTrap(商標)カラム; Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ; 米国特許第5,336,412号参照) を使用して、プローブを精製した。フィルターを0.25×SSC、0.25% SDS、および1 mM EDTAから成る前洗浄緩衝液中で65℃において前洗浄した。この溶液を合計3回45分にわたって交換して、細胞破片を除去した。フィルターを25 mlのハイブリダイゼーション溶液 (ExpressHybTM; Clontech Laboratories, Inc.、カリフォルニア州パルアルト) 中で65℃において一夜プレハイブリダイゼーションし、次いで同一溶液中で65℃において一夜ハイブリダイゼーションした。
【００９７】
フィルターを2回65℃において前洗浄緩衝液 (0.25×SSC、0.25% SDS、および1 mM EDTA) 中ですすぎ、次いで前洗浄緩衝液中で65℃において2回洗浄した。フィルターを-80℃において2日間フィルムに露出した。フィルター上に、10の陽性領域が存在した。3クローンを陽性領域から取り、ストリークし、プライマーZC21,223 (配列番号11) およびZC21,334 (配列番号12) を66℃のアニリーング温度において使用するPCRにより、これらの3つの陽性物からの15の個々のコロニーをスクリーニングした。2の陽性物が回収され、配列決定した。両方の配列は同一であることが見出され、全長のマウスzvegf3 (配列番号4) をコードした。
【００９８】
アミノ酸配列はマウスおよびヒトzvegf3において高度に保存され、全体のアミノ酸配列の同一性は87%であった。分泌ペプチド、CUBドメイン、ドメイン間、および増殖因子ドメインは、それぞれ、82%、92%、79%および94%のアミノ酸の同一性を有する。
【００９９】
実施例３．
CMVプロモーターから下流の線状化pZMP11ベクター中で最適化t-PA分泌シグナル配列 (米国特許第5,641,655号) をコードする配列にzvegf3フラグメントを接続することによって、zvegf3の増殖因子ドメインのための哺乳動物細胞発現ベクターを構築した。プラスミドpZMP11は、CMV中間初期プロモーターを有する発現カセット、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の可変領域からのコンセンサスイントロン、コザック (Kozak) 配列、コーディング配列を挿入するための多重制限部位、停止コドン、およびヒト成長ホルモンターミネーターを含有する哺乳動物発現ベクターである。
【０１００】
また、このプラスミドは、ポリオウイルスからのIRES要素、トランスメンブランドメインのC-末端においてトランケートされたCD8の細胞外ドメインコーディング配列、大腸菌 (E. coli) 複製起点、SV40プロモーターを有する哺乳動物選択可能なマーカー発現ユニット、DHFR遺伝子、SV40ターミネーター、およびサッカロマイセス・セレビシエ (S. cerevisiae) 中の選択および複製に必要なURA3およびCEN-ARS配列を含有する。生ずるベクターをpZMP11/zv3GF-otPaと表示した。
【０１０１】
膜濾過した水中のポリカチオン脂質2,3-ジオレイルオキシ-N-[2-(スペルミンカルボキシアミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパニウム-トリフルオロアセテートおよび中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンの3:1 (w/w) リポソーム配合物(LipofectamineTM; Life Technologies) を使用するリポソーム仲介トランスフェクションにより、BHK 570細胞をpZMP11/zv3GF-otPaでトランスフェクトし、慣用手法に従い培養した。
【０１０２】
BHK細胞コンディショニングされた培地を20 mM MES、pH 5.5に調節した。カチオン交換樹脂のカラム (Poros(商標) HS 50; PerSeptive Biosystems 、マサチューセッツ州ファーミンガム) (直径2 cm、ベッド体積50 ml) を20 mM MES、150 mM NaCl、pH 5.5中で平衡化した。調節した培地をカラムに20 ml/分で送入した。負荷が完結したとき、カラムをまず20 mM MES、150 mM NaCl、pH 5.5中で洗浄し、次いで同一組成の緩衝液pH 6.0で洗浄した。いったん基線がゼロ吸収に戻ったとき、カラムを20 mM MES、1 mM NaCl、pH 6.0への10カラム体積の勾配で溶離した。zvegf3増殖因子ドメインは、進展する勾配間に25〜50 mSの導電率で溶離された。還元性SDS-PAGEは20 kDにおける明確なバンドを明らかにし、これはウェスタンブロッティングによりzvegf3として確認された。
【０１０３】
この物質をプールし、強いアニオン交換樹脂 (Poros(商標) HQ 50; PerSeptive Biosystems) および直列の固定化金属 (ニッケル) アフィニティーカラムを含んでなる縦列カラム配列に負荷するために調製した。このカラム系を20 mM MOPS緩衝液pH 7.0中で平衡化した。負荷の間に、zvegf3プールをMOPS平衡化緩衝液で1:10 (v/v) にインライン希釈した。負荷が完結したとき、基線吸収が得られるまで、カラム系列を20 mM MOPS pH 7.0で洗浄した。次いでニッケルカラムをアニオン交換体から分離し、150 mM NaClを含有する20 mM MOPS pH 7.0で洗浄した。次いで、最後の洗浄緩衝液と20 mM イミダゾールを含有する同一緩衝液pH 7.0との間の1カラム体積の勾配で、カラムを溶離した。zvegf3増殖因子ドメインを含有する画分をプールし、緩衝液交換のために5 kDカットオフ膜で濃縮し、PBS中で平衡化したサイズ排除カラム上で磨いた。
【０１０４】
実施例４．
zvegf3遺伝子を発現するトランスジェニック動物を作るために、成体の生殖能力のある雄 (スタッド) (B6C3f1、2〜8月齢 (Taconic Farms、ニューヨーク州ジャーマンタウン)) 、精管切除した雄 (ダッド) (B6D2f1、2〜8月齢 (Taconic Farms)) 、青春期直前の生殖能力のある雌 (ドナー) (B6C3f1、4〜5週齢 (Taconic Farms)) および成体の生殖能力のある雌 (レシピエント) (B6D2f1、2〜4月齢 (Taconic Farms)) を必要とする。
【０１０５】
ドナーを1週間順化させ、次いでほぼ8 IU/マウスの妊馬血清ゴナドトロピン (Sigma Chemical Co.、ミゾリー州セントルイス) を腹腔内注射し、そして46〜47時間後、8 IU/マウスのヒト絨毛性ゴナドトロピン (hCG (Sigma Chemical Co.)) を腹腔内注射して過剰排卵を誘発させる。ホルモン注射後、ドナーをスタッドと交配させる。一般に、排卵はhCG注射後13時間以内に起こる。交配後の朝における膣栓の存在により、排卵は確認される。
【０１０６】
外科用スコープ (Leica MZ12 Stereo Microscope、Leica、ドイツ国ウェッツラー) 下に、受精卵を収集する。輸卵管を収集し、そしてヒアルロニダーゼ (Sigma Chemical Co.) を含有する検尿スライドガラス中に卵を解放させる。卵をヒアルロニダーゼ中で1回洗浄し、5% CO2、5% O2、および90% N2と37℃においてインキュベートしたホイットン (Whitten’s) W640培地 (表2; すべての試薬はSigma Chemical Co. から入手可能である) 中で2回洗浄する。マイクロインジェクションまで、卵を37℃/5% CO2インキュベーター中に貯蔵する。
【０１０７】
【表２】
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【０１０８】
zvegf3 cDNAを発現ベクターpHB12-8中に挿入する。ラットインスリンIIイントロン (約200 bp) およびポリリンカー (Fse I/Pme I/Asc I) をNru I部位中に挿入することによって、p2999B4 (Palmiter 他、Mol. Cell. Biol. 13: 5266-5275、1993) からpHB12-8を誘導した。このベクターはマウスメタロチオネイン (MT-1) プロモーター (約750 bp) と、ヒト成長ホルモン (hGH) 非翻訳領域と、10 kbのMT-1 5’フランキング配列および7 kbのMT-1 3’フランキング配列でフランクされたポリアデニル化シグナル (約650 bp) とを含んでなる。cDNAをインスリンIIとhGH配列との間に挿入する。
【０１０９】
10〜20 μgのプラスミドDNAを線状化し、ゲル精製し、そして10 mM Tris pH 7.4、0.25 mM EDTA pH 8.0中に5〜10 ng/μlの最終濃度で再懸濁させる。
温かいCO2平衡化鉱油をオーバーレイした1滴のW640培地中に含有される収集した卵の中に、プラスミドDNAをマイクロインジェクトする。DNAを注射針の中に抜き出し (内径0.75 mm、外径1 mmのホウケイ酸塩ガラスの毛管から引く) 、個々の卵の中に注射する。各卵の一倍体前核の一方または両方の中に注射針を突き通す。
【０１１０】
数ピコリットルのDNAを前核の中に注入し、そして注射針を核小体と接触させないようにして抜き出す。すべての卵が注入されるまで、この手順を反復する。37℃/5% CO2インキュベーター中で前ガス処理したW640培地を使用して、首尾よくマイクロインジェクトされた卵を器官組織培養皿の中に移す。
【０１１１】
次の日に、2細胞胚を擬妊娠レシピエントの中に移す。レシピエントは精管切除ダッドとの交接後、交尾栓の存在により同定される。レシピエントを麻酔し、背面左側の毛を剃り、外科用顕微鏡に移す。胸郭、あん部、および後脚により輪郭される腹領域の中央において、膝と脾臓との中途において、皮膚および筋肉壁を通して小さい切開を形成する。生殖器官を体外に小さい外科用布上に出す。脂肪パッドを外科用布上に伸ばし、そして子供用止血小鉗子 (Roboz、マリーランド州ロックビレ) を脂肪パッドに取り付け、マウスの背面の上で左側を吊下げ、器官が滑って戻るのを防止する。
【０１１２】
鉱油および引き続いて交互するW640および気泡を含有する微細なトランスファーピペットを使用して、前日の注入からの12〜17の健康な2細胞胚をレシピエントの中に移す。膨潤した輸精管膨大部を突き止め、輸精管膨大部と嚢との間に輸卵管を保持し、輸卵管中のニックを嚢に密接させて28 gの針で作り、輸精管膨大部または嚢が断裂しないようにする。ピペットを輸卵管中のニックの中に移し、胚を吹込み、最初の気泡をピペットから逃がす。脂肪パッドをおだやかに腹膜の中に押込み、そして生殖器官を滑らせて入れる。腹腔壁を1本の縫合糸で閉じ、そして皮膚を創傷クリップで閉じる。マウスを37℃のスライド加温器上で最小4時間回復させる。
【０１１３】
レシピエントを対でケージに戻し、そして19〜21日間妊娠させる。出産後、19〜21日の分娩後の期間を離乳前に経過させる。離乳子畜を雌雄鑑別し、別々の6ケージに入れ、そして0.5 cmのバイオプシー (遺伝子型決定に使用する) をきれいなハサミで尾から切取る。
【０１１４】
商業的に入手可能なキット (DNeasyTM 96 Tissue Kit; Qiagen、カリフォルニア州バレンシア) を製造業者の使用説明書に従い使用して、尾の切取り物からゲノムDNAを調製する。トランスジェニックベクターのヒト成長ホルモン (hGH) 3’ UTR部分に対して設計されたプライマーを使用するPCRにより、ゲノムDNAを分析する。ヒト配列に対してユニークな領域 (ヒトおよびマウス成長ホルモン3’ UTR DNA配列のアラインメントから同定された) を使用すると、PCR反応がマウス配列を増幅しないことが保証される。
【０１１５】
プライマーZC17,251 (配列番号13) およびZC17,252 (配列番号14) は、hGHの368塩基対のフラグメントを増幅する。さらに、プライマーZC17,156 (配列番号15) およびZC17,157 (配列番号16) は、ベクター配列に対してハイブリダイゼーションし、cDNAインサートを増幅し、そしてhGHプライマーと一緒に使用することができる。これらの実験において、トランスジーンについて陽性である動物からのDNAは2つのバンド、すなわち、hGH 3’ UTRフラグメントに対応する368塩基対のバンドおよびcDNAインサートに対応する可変サイズのバンドを発生するであろう。
【０１１６】
いったん動物がトランスジェニック (TG) であることが確認されると、TG雌を野生型雄と一緒に配置するか、あるいはTG雄を1または2匹以上の野生型雌と一緒に配置することによって、同系交配系統に戻し交配させる。子が生まれ、離乳すると、雌雄鑑別物を分離し、そして遺伝子型決定のためにそれらの尾を切取る。
【０１１７】
生きている動物におけるトランスジーンの発現をチェックするために、部分的肝切除を実施する。剣状突起の真下の腹上部から外科用プレプを作る。無菌技術を使用して、胸骨下に小さい1.5〜2 cmの切開を作り、肝臓の左横小葉を体外に出す。4-0絹を使用して、下小葉の回りを結束して、それを体腔の外側に固定する。非外傷性クランプを使用して結束を保持すると同時に、吸収性デキソン (Dexon) (Amersham Cyanamid、ニュージャージー州ワイネ) の第2ループを第1結束に近接して配置する。デキソン結束の末端を切断し、そしてほぼ100 mgの切除した肝臓組織を無菌のペトリ皿の中に入れる。切除した肝臓切片を14 mlのポリプロピレン製丸底管に移し、液体窒素中で素早く凍結させ、ドライアイス上で貯蔵する。外科部位を縫合糸と創傷クリップで閉じ、そして手術後に動物のケージを37℃の加熱パッド上に24時間配置する。動物を手術後に毎日チェックし、そして外科手術後7〜10日に創傷クリップを除去する。
【０１１８】
RNA溶液ハイブリダイゼーションアッセイを使用するか、あるいは商業的に入手可能なPCR装置 (ABI PrismTM 7700; PE Applied Biosystems, Inc.、カリフォルニア州フォスターシティー) を製造業者の使用説明書に従いを使用する実時間PCRにより、各トランスジーンのmRNA発現レベルの分析を実施する。
【０１１９】
肝臓特異的アルブミン遺伝子エンハンサーおよび基本的プロモーター (「AEOプロモーター」と表示する) を使用して、アデノウイルスベクターを調製する。PALBdelta2L (Pinkert 他、Genes Devel. 1: 268-276、1987) からの2.2 kbのNotI/EcoRVフラグメントおよび850 bpのラットインスリンIIイントロン、FseI/PmeI/AscIポリリンカーおよびヒト成長ホルモンポリA配列を含んでなるNruI/NotI DNAセグメントを商業的に入手可能なファージミドベクター (pBluescrpt(商標) KS(+); Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ) 中に挿入することによって、アルブミンプロモーター構築物 (pAEOと表示する) を構築した。マイクロインジェクションのために、このプラスミドをNotIで消化して、発現カセットを遊離させる。
【０１２０】
上皮細胞特異的ケラチン遺伝子 (K14) プロモーター (Vassar 他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1563-1567、1989) を使用して、追加のアデノウイルスベクターを構築した。ZC20,180 (配列番号17) およびZC20,181 (配列番号18) を使用するPCRにより、全長のヒトzvegf3をコードする1038 bpのオープンリーディングフレームを増幅して、最適化イニシエイターコドンおよびフランキング5’ PmeIおよび3’ AscI部位を導入した。生ずるPmeI/AscIフラグメントをpKFO114のポリリンカー、下記を含んでなる基本的ケラチノサイト制限トランスジェニックベクターの中にサブクローニングした: ヒトケラチン14 (K14) プロモーター (Staggers 他、”Sequence of the promoter for the epidermal keratin gene, K14”、GenBank 受け入れ番号U11076、1994の配列に基づくヒトゲノムDNA [Clontech Laboratories, Inc.から入手した] から増幅した2.3 Kbのフラグメント)、次いで異種イントロン (pIRES1hyg (Clontech Laboratories, Inc.; 参照、 HuangおよびGorman、Nucleic Acids Res. 18: 937-947、1990) からの294 bpのBstXI/PstIフラグメント、PmeI/AscIポリリンカー、およびヒト成長ホルモン遺伝子ポリアデニル化シグナル (627 bpのSmaI/EcoRIフラグメント: 参照、Seeburg、DNA 1: 239-249、1982) 。
【０１２１】
トランスジーンインサートをプラスミド主鎖からNotI消化およびアガロースゲル精製により分離し、そしてB6C3F1Tacマウスおよび同系交配FVB/Ntacマウスの交配からの受精卵をマイクロインジェクトし、そして偽妊娠雌の中に移植した (下記の文献に本質的に記載されているようにして: Malik 他、Mol. Cell. Biol. 15: 2349-2358、1995) 。ヒト成長ホルモンポリAシグナルに対して特異的なプライマー (ZC17,252、配列番号14; およびZC17,251、配列番号13) を使用するゲノムテイルDNAについてのPCRにより368 bpの診断生成物を増幅することによって、トランスジェニック創始マウスを同定した。
【０１２２】
本質的に上に開示されているようにしてMT-1、K14およびAEOプロモーターを使用して、トランスジェニックマウスを発生させた。4匹のMT-1/zvegf3トランスジェニックマウスが発生した。1匹の動物 (雌) において、ほぼ800分子のzvegf3 mRNA/細胞が亜鉛誘導後に肝臓において産生された。この動物は拡大した肝臓および脾臓を有した。また、肝臓のシヌソイド細胞の増殖および延髄外造血が観察された。1匹のK14/zvegf3トランスジェニックマウス (雌) は、低いレベルの発現および低い体重、低いヘマトクリット、および低い血小板計数を示した。1匹の発現レベルが低いAEO/zvegf3トランスジェニックマウス (雄) は、肝臓シヌソイド細胞の増殖を示した。
【０１２３】
AEOプロモーターからの全長のzvegf3を過剰発現するN1トランスジェニックマウスおよび8、16、22および33週齢における非トランスジェニック同腹子対照からの肝臓について、組織学的分析を実施した。H & Eおよびトリクローム染色は、肝臓シヌソイド (星状) 細胞数の明確な増加および8週齢における類洞周囲細胞外基質 (ECM) 沈着の増加を示した。星細胞数の増加および類洞周囲ECMの量および厚さの増加ならびに16週までに多少の細静脈周囲のECM沈着が存在した。22週において、同様な変化が見られたが、細静脈周囲の線維増多 (steato fibrosis) が増加した。16および22週における変化に類似する変化が33週において観察されたが、多少の動物は線維のバンディング、および肝細胞が拡大しかつ空胞化して見える、多数の被包領域を有した。これらの領域は線維質組織の莢膜により囲まれる傾向があり、そしてこれらの領域内の肝細胞は正常であるように見えた。これらの変化は初期の肝硬変と一致した。
同様な変化は8週齢のN2マウスおよびほぼ32〜34週に殺した育種雄において見られた。
【０１２４】
実施例５．
5匹のAEOヒトzvegf3トランスジェニックマウス (N7世代) を殺し、剖検し、そして組織を10%の緩衝化ホルマリン中に収集した。免疫組織化学のために、追加の肝臓試料をカルノワ固定液および亜鉛トリス固定液中で固定した。5匹のマウスの各々についての個々の動物の報告を下に示す。
【０１２５】
動物No. 30054 (雄、53週齢) 
剖検において、肝臓は広汎的に大きく、膨潤して見え、丸いへりをもち、そして左横の小葉は明確な小結節状の外観を有した。微視的に、主要な結果は肝臓にあり、そしてシヌソイド細胞の増殖、小結節性過形成、および肝細胞性腺腫を包含した。さらに、肝細胞は、特に中央静脈の回りにおいて、空胞化し、そして多少軽度またはわずかの限局性単核細胞浸潤および胆管の過形成が存在した。また、肺、腎臓、膵臓、および唾液腺において、わずか〜中程度の単核細胞の浸潤が観察された。リンパ細網性過形成が胸腺、脾臓、および骨髄において観察され、後者は小結節の外観を有した。
【０１２６】
動物No. 30237 (雄、52週齢) 
剖検において、肝臓のより長い小葉は大きい嚢胞および多数の小結節を含有した。さらに、脾臓はその正常の大きさの2〜3倍であることが観察された。微視的に、肝臓は検査した最もひどく影響を受けた器官であった; 結果は中程度のシヌソイド細胞増殖、小結節/肝細胞の過形成、および重症の (広汎性) 脈管拡張を包含した。1切片は血栓症および凝固性壊死の領域を有し、後者は多分血栓症により引き起こされた梗塞を示した。脾臓は中程度のリンパ細網性過形成を有し、これは拡張しているという全体的観察と相関した。
【０１２７】
動物No. 30031 (雌、53週齢) 
剖検における全体的観察は、全体を通じて複数の小結節を含有する丸いへりをもつ、拡大した肝臓を包含した。右横および左横の小葉は特に顕著であり、そして右横小葉における血管は顕著であった。小さい中葉は黄褐色であり、そして脾臓はわずかに拡大して見えた。微視的に、肝臓の1切片は肝細胞性腺腫の領域を含有し、そして小結節性肝細胞過形成をもつ多数の領域が存在した。また、肝臓は中程度のシヌソイド細胞増殖、シヌソイド拡張、および限局性脈管拡張を有した。他の組織における結果は子宮の嚢胞性子宮内膜過形成; 肺 (気管支周囲) 、腎臓、膵臓、および唾液腺における単核細胞浸潤; および胸腺、脾臓およびリンパ節におけるリンパ細網性過形成を包含した。腎臓は軽度の糸球体症を有し、これは糸球体房状分岐および/または糸球体間質におけるヒアリン物質の増加として特徴づけられた。また、管の再生およびタンパク質物質で拡張した管の限局性領域が存在した。
【０１２８】
動物No. 30032 (雌、53週齢) 
剖検において、肝臓は淡色に見え、そして全体を通じて多数の小結節を含有した。微視的に、肝臓は全体的観察と相関する、変動する大きさの小結節性 (肝細胞性) 過形成の多数の領域を有した。また、肝臓は中程度のシヌソイド細胞増殖および単核細胞浸潤、および軽度またはわずかのシヌソイドおよび脈管の膨張を有し、いくつかは細静脈周囲における線維増多の証拠を有した。腎臓は中程度の糸球体症を有し、これは糸球体房状分岐および/または糸球体間質におけるヒアリン物質の増加として特徴づけられた。また、管の再生およびタンパク質物質で拡張した管の限局性領域が存在した。他の組織における結果は、子宮の嚢胞性子宮内膜過形成; 肺 (気管支周囲) 、腎臓、膵臓、および唾液腺における単核細胞浸潤; および脾臓およびリンパ節におけるリンパ細網性過形成を包含した。
【０１２９】
動物No. 30033 (雌、53週齢) 
剖検において、肝臓は拡大しているように観察され、顕著な血管、変動する大きさの多数の小結節、および限局性嚢胞形成を有した。右横小葉は狭いストークを介してその表面に結合する乳頭突起の塊を有し、そして尾小葉は膨潤しており、そして暗赤色であることが観察された。微視的に、肝臓は小結節性 (肝細胞性) 過形成および中程度のシヌソイド細胞増殖の多数の領域を有し、細静脈周囲の線維増多の限局性領域が存在した。この動物における他の結果は、肺 (気管支周囲) 、腎臓、膵臓、および唾液腺における単核細胞浸潤; および胸腺、脾臓およびリンパ節におけるリンパ細網性過形成を包含した。腎臓は中程度またはわずかの糸球体症を有し、これは前述の症状に類似したが、明らかな管の変化を欠如した。
【０１３０】
要約すると、すべての5匹の動物は微視的に検査した組織において同様な変化を有した。いっそう顕著な結果は肝臓において存在し、これらはこの構築物の表現型であった。シヌソイド細胞の数および過形成が中程度に増加し、これらは陽性に同定されないが、肝星細胞 (HSC) であると考えられた。免疫組織化学および特別の染色は、これらの細胞がアルファ平滑筋アクチン (HSC活性化のインジケーター) の証拠をもたないが、シヌソイド内コラーゲンの量の有意な増加が存在し、これはシリウス・レッド (Sirius Red) 染色により可視化された。
【０１３１】
いく匹かの動物において、細静脈周囲の線維増多の証拠が多少存在した。コラーゲン沈着の増加は肝細胞性過形成および小結節の形成を開始させ、および/またはそれらに寄与し、これらは引き続いていくつかの肝臓において観察された肝細胞性腺腫により代表される腫瘍形成を生じた。これらの動物から検査した残りの組織におけるすべての結果、例えば、種々の器官における単核細胞浸潤、リンパ系組織におけるリンパ細網性過形成、および腎臓変化は、個々の動物の健康の全体的低下を反映し、そしてトランスジーンに直接関係すると考えられなかった。いくつかの結果は、この齢におけるほとんどのマウス系統において共通する。
【０１３２】
実施例６．
2匹の雄のトランスジェニックマウス、N4世代を52週齢において殺し、剖検し、そして日常的フィジオスクリーンを構築した。微視的に、肝臓は主要なターゲット器官であり、毛細血管拡張、脈管拡張、シヌソイド細胞増殖、小結節性肝細胞過形成、およびシヌソイド線維増多を包含する多数の変化を有した。2匹の動物の少なくとも1匹において、肝臓はまた出血、梗塞、胆管過形成、嚢胞形成、およびリンパ系細胞浸潤の領域を有した。検査した残りの組織における微視的観察は、1年のマウスにおいて普通の偶発的結果であると考えられた。
【０１３３】
これらの2匹の動物における進行性肝線維増多は、脈管系の構築を崩壊し、血管の膨張およびシヌソイド内の毛細血管拡張により証明されるように、重症の高血圧症を引き起こした。毛細血管拡張領域における正常肝柔組織の広範な喪失のために、シヌソイド細胞増殖の重症度を評価することは困難であったが、肝細胞喪失の非存在下にこれらの細胞数が明らかに増加する領域が存在した。
【０１３４】
実施例７．
1匹の雄のトランスジェニックAEO/zvegf3マウス、N4世代を57週齢において殺し、剖検し、そして日常的フィジオスクリーンを構築した。剖検において、肝臓は奇形、暗色であり、そして小結節性であることが認められた。微視的に、肝臓は中程度の広汎性類洞周囲 (星状) 細胞過形成ならびに中程度のシヌソイド膨張、原始間葉状変化、脈管周囲線維増多、および小結節性肝細胞過形成の領域を有した。また、検査した切片の1または2以上において、嚢胞、肝細胞性腺腫、および限局性壊死領域が存在した。後者の結果は、多分線維増多および原始間葉状変化の領域に関連する梗塞領域を表すと考えられた。これらの変化のすべては進行性および慢性の肝線維増多に典型的であると考えられ、そしてこの構築物および週齢の他のトランスジェニックマウスにおいて観察される変化に類似した。この動物におけるすべての残りの顕微鏡観察は偶発的結果であり、そしてトランスジーンに無関係であると考えられた。
【０１３５】
実施例８．
4匹のAEO/zvegf3トランスジェニックマウス (N4) をほぼ62週齢において殺し、剖検し、そして組織を収集し、10% BNF (緩衝化中性ホルマリン) 中で保存した。剖検において、これらのマウスの各々における肝臓は拡大し、外観が線維質であることが観察された。すべての組織をトリミングし、プロセシングし、スライドガラスを調製し、そして切片を日常的顕微鏡検査のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。さらに、肝臓の切片をマッソントリクロームおよびシリウス・レッドで染色し、そして免疫組織化学 (IHC) を実施してα平滑筋アクチン、デスミン、およびI型コラーゲンを検出した。
【０１３６】
動物No. 24811-雄
最も顕著な微視的結果は肝臓中に存在し、主要なものは重症の広汎性シヌソイド細胞過形成/増殖であり、原始間葉状様細胞間質蓄積の多数の領域が存在し、前記蓄積は隣接する増殖性シヌソイド (多分星状) 細胞に外観が類似する、紡錘形細胞を取り囲むム酸性コ多糖様物質の蓄積として特徴づけられた。すべての血管、特に中央静脈の明らかな膨張、ならびにシヌソイド膨張および毛細血管拡張の多病巣性領域が存在した。しばしば、後者の変化は、これらの膨張領域の壁をライニングする、膨らんだ内皮様細胞の数の増加を伴った。
【０１３７】
切片内のいくつかの領域は線維増多の明らかな増加を示し、そして肝性小結節の形成を示唆し、後者はトリクロームおよびシリウス・レッド染色した切片においていっそう容易に見られた。免疫組織化学 (IHC) は、主としてシヌソイド膨張および内皮様細胞の増殖の領域に関連する、α平滑筋アクチン (SMアクチン) の染色の増加を証明し、そして血管形成の可能性を高度に示唆した。また、デスミンの相関する染色の増加が存在した。I型コラーゲンの染色は線維増多に密接に相関した; コラーゲンは考えられる肝性小結節の形成に関連する線維増多領域中に最も豊富に存在した。他の組織において、顕著な結果は肺における脈管周囲リンパ系過形成、一方の腎臓における皮質嚢胞、多病巣性リンパ系浸潤、および両方の腎臓における広汎性糸球体症を包含した。
【０１３８】
糸球体症は、糸球体全体の大きさの増加ならびに細胞充実性の増加により特徴づけられた。影響を受けた糸球体のいくつかは、タンパク質を表すと考えられる、変動する大きさの好酸球小滴を含有した。(これらの肺および腎臓における結果は老齢のマウスにおいて異常ではなく、そして多分肝臓の病理学に対して二次的であろう。) 腸間膜リンパ節は、線維の外観を有する細胞間質中に埋め込まれた紡錘形細胞から構成された、新生物で完全に置換されていた。この腫瘍は紡錘形細胞として診断され、そして偶発的結果と考えられ、トランスジーンに無関係であった。また、残りの組織において観察された、すべての微視的変化は偶発的結果と考えられた。
【０１３９】
動物No. 24957-雄
この動物における微視的結果は動物No. 24811において観察された結果に類似し、そして再び、最も顕著な結果は肝臓の中に存在した。しかしながら、主要な差は肝臓の2またはそれ以上の小葉におけるむしろ大きい新生物の存在であり、これらは顕著な膨張シヌソイドをライニングしまたはそこにおいて堆積する傾向がある、多数の膨らんだ内皮様細胞、および毛細血管拡張領域から構成されていることによって特徴づけられた。この腫瘍は血管内皮腫として診断された。また、新生物に関連する壊死、多分塞栓の限局性領域が存在した。
【０１４０】
原始間葉状領域の非存在を除外して、残りの肝臓は前述の変化に類似する変化、すなわち、シヌソイド細胞性過形成、小結節性肝細胞過形成、リンパ系浸潤、脈管膨張、および線維増多を有した。IHC染色切片において、SMアクチンおよびデスミンは新形成内で最も顕著であり、そして血管形成を反映すると考えられた。I型コラーゲンは腫瘍内で顕著ではなかったが、線維増多および小結節性過形成の領域において顕著であった。腎臓および肺における他の顕著な変化は、分布および発病度の両方において動物No. 24811において前述したものに類似した。また、残りの組織において観察された、すべての微視的変化は偶発的結果と考えられ、そしてトランスジーンと無関係であった。
【０１４１】
動物No. 26015-雄
この動物からの肝臓における微視的結果は、1つの小葉における大きい塊を除外して、動物No. 24811および24957において観察されたものに非常に類似した。この新生物は、梗塞による壊死の限局性領域をもつ膨張シヌソイドにより分離された、大きい空胞化肝細胞の帯から構成された、薄く被包された塊として特徴づけられた。この新生物は肝細胞性腺腫の特徴を示した。最小量のSMアクチン、デスミン、およびI型コラーゲンが腫瘍内に存在したが、これらのすべての3つは増加量で肝臓の他の切片中に存在し、後者の2つはシヌソイド細胞過形成および線維増多が増加した領域において最も顕著であった。また、腎臓および肺における微視的変化は2匹の前述の動物において観察された変化に類似した。残りの組織において観察された、すべての他の微視的変化は偶発的結果と考えられ、そしてトランスジーンと直接関係しなかった。
【０１４２】
動物No. 24819-雌
この動物からの検査した組織における微視的結果は、前述の3匹の雄マウスにおいて観察された変化に非常に類似した。肝臓は重度の広汎性シヌソイド過形成、線維増多、および肝細胞性小結節過形成ならびに脈管およびシヌソイドの膨張、胆管過形成、および原始間葉状様基質蓄積の限局性領域を有した。検査した肝臓の切片全体を通じて線維増多の量が増加し、これは肝細胞性小結節形成領域付近において最も顕著であった。また、デスミンおよびI型コラーゲンについての染色増加はこれらの領域において顕著であり、そして線維増多に密接に関連した。
【０１４３】
SMアクチンについての染色増加の限局性領域が多少存在したが、これらはシヌソイド膨張および毛細血管拡張の領域に主として関連し、そして多分血管形成を表した。また、腎臓および肺において観察された微視的変化は前述の変化に類似した。しかしながら、この動物における肺は、また、主として胸膜線維増多として特徴づけられる、中程度の慢性胸膜炎を有した。この後者の観察ならびに検査した残りの組織において観察された変化は偶発的結果と考えられ、そしてトランスジーンと無関係であった。
【０１４４】
これらの4匹のトランスジェニックマウスからの肝臓において観察された微視的変化は、慢性進行性線維増多の末期を表すことがある。肝性小結節および腫瘍の形成は、ヒトにおける肝性線維増多および肝硬変について記載したものに類似する。さらに、生ずる線維増多およびシヌソイド細胞の蓄積の脈管系に対する衝撃は、脈管およびシヌソイドの膨張ならびに脈管新生物の発生および関連する新形成の変化から明らかである。興味深いことには、α平滑筋アクチンについてのIHC染色の結果は、主として脈管形成的変化に関連するが、シヌソイド細胞または線維増多の領域に関連しないように見え、基質およびコラーゲン産生に関係する細胞がいっそう特殊化された細胞に分化し、これらの細胞がそれらのアクチンを喪失し、したがってもはや筋線維芽細胞と命名することができないことを示唆するであろう。
【０１４５】
実施例5〜8に開示したように、12匹の52〜62週齢のAEOヒトzvegf3トランスジェニックマウスを殺し、剖検した。剖検において、選択した組織を収集し、微視的評価のために肝臓の病理学に特別の注意を払ってプロセシングした。剖検において、これらの動物の各々からの肝臓は変動的に拡大し、膨潤し、奇形の、異常に暗色または淡色の線維増多性小結節性であり、および/または嚢胞を含有することが観察された。微視的に、肝臓における変動性であるが、首尾一貫した、顕著な結果はトランスジェニック構築物に対して表現型的であった。
【０１４６】
すべての動物中に存在しないが、下記の肝性変化の1または2以上が観察された: 類洞周囲 (星状) 細胞の数または過形成の増加、シヌソイドおよび脈管の膨張、毛細血管拡張、嚢胞形成、細静脈周囲およびシヌソイド内の線維増多、小結節性肝細胞過形成、および肝細胞性腺腫。粘液性基質中に埋め込まれた紡錘形細胞の存在により特徴づけられる原始間葉状変化は、線維増多および増殖性類洞周囲細胞に時々関連した。1匹の動物は、脈管およびシヌソイドの膨張領域に関連する、膨らんだ、内皮様細胞から構成された肝性腫瘍を有した。この腫瘍は血管内皮腫として特徴づけられ、そしてその形成は線維増多および関連する脈管変化に関係づけられると考えられた。小結節性過形成および腺腫形成の領域は、梗塞に寄与する壊死領域をしばしば有した。
【０１４７】
これらの高齢のトランスジェニックマウスからの肝臓において観察された全体的および相関する微視的変化は、慢性、進行性線維増多の末期において典型的であった。観測されたコラーゲン沈着および引き続く線維増多の漸進的増加はヒトにおける肝性線維増多および肝硬変に類似し、そして普通に小結節性肝細胞過形成および腫瘍形成、例えば、過形成から腺腫から癌腫への進行に寄与すると考えられる。
【０１４８】
実施例９．
アデノウイルスベクターを構築するために、それぞれ、5’および3’末端にPmeIおよびAscI部位を付加したプライマーを使用するPCRにより、ヒトzvegf3のタンパク質コーディング領域を増幅した。次のようにしてPCRプライマーZC20,180 (配列番号17) およびZC20,181 (配列番号18) をPCR反応において全長のzvegf3 cDNA鋳型とともに使用した: 95℃において5分間のインキュベーション; 次いで95℃において1分間、61℃において1分間、および72℃において1.5分間の15サイクル; 次いで72℃において7分間; 次いで4℃におけるソーク。反応生成物をTAE緩衝液 (0.04 M Tris-酢酸塩、0.001 M EDTA) 中で1.2%の低融点アガロースゲル上に負荷した。Zvegf3 PCR生成物をゲルから切除し、商業的に入手可能なキット (シリカゲル膜スピンカラムを含んでなる) (QIAquickTM PCR Purification Kitおよびゲルクリーンアップキット; Qiagen, Inc.) をキットの使用説明書に従い使用して精製した。
【０１４９】
次いでzvegf3生成物をPmeIおよびAscIで消化し、フェノール/クロロホルムで抽出し、EtOH沈降させ、そして20 mlのTE (Tris/EDTA pH 8) 中で再水和した。次いで1038 bpのzvegf3フラグメントをトランスジェニックベクターpTG12-8 (また、pHB12-8として知られている; 実施例4参照) のPmeI-AscI部位中に結合し、そしてエレクトロポレーションにより大腸菌 (E. coli) DH10BTMコンピテント細胞の中に形質転換した。プラスミドDNAミニプレプおよび引き続くPmeIおよびAscIを使用する消化により、zvegf3を含有するクローンを同定した。陽性クローンを配列決定して、構築物中に欠失または他の異常を存在しないことを保証した。zvegf3 cDNAの配列が確認された。
【０１５０】
商業的に入手可能なキット (Maxi Kit、Qiagen, Inc.) を使用してDNAを調製し、そしてPmeIおよびAscI酵素を使用してpTG12-8ベクターから1038 bpのzvegf3 cDNAを解放させた。cDNAを1%の低融点アガロースゲル上で単離し、ゲルから切除した。ゲルスライスを70℃において溶融し、DNAを等しい体積のTris緩衝化フェノールで2回抽出し、EtOHで沈降させた。DNAを10 μlのH2O中に再懸濁させた。
【０１５１】
zvegf3 cDNAを修飾されたpAdTrack-CMV (He T-C 他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2509-2514、1998) のEcoRV-AscI部位中にクローニングした。この構築物は緑色蛍光性タンパク質 (GFP) マーカー遺伝子を含有する。GFP発現を誘導するCMVプロモーターをSV40プロモーターで置換し、SV40ポリアデニル化シグナルをヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルで置換した。さらに、自然ポリリンカーをFseI、EcoRV、およびAscI部位で置換した。pAdTrack-CMVのこの修飾された形態をpZyTrackと命名した。商業的に入手可能なDNA結合およびスクリーニングキット (Fast LinkTMキット; Epicentre Technologies、ウィスコンシン州マディソン) を使用して、結合を実施した。
【０１５２】
ミニプレプDNAをFseIおよびAscIで消化することによって、zvegf3を含有するクローンを同定した。このプラスミドを線状化するために、ほぼ5 μgの生ずるpZyTrack zvegf3プラスミドをPmeIで消化した。ほぼ1 μgの線状化プラスミドを200 ngのスーパーコイルドpAdEasy (He 他、前掲) とともに大腸菌 (E. coli) BJ5183細胞 (He 他、前掲) 中に共形質転換した。商業的に入手可能なエレクトロポレーション装置 (Gene Pulser(商標); Bio-Rad Laboratories、カリフォルニア州ハーキュレス) を2.5 kV、200オームおよび25 μFaにおいて使用して、この共形質転換を実施した。
【０１５３】
25 μg/mlのカナマイシンを含有する4 LBプレート上に、全共形質転換混合物を配置した。最小コロニーを取り、LB/カナマイシン中で拡張し、そして標準DNAミニプレプ手順により組換えアデノウイルスDNAを同定した。FseIおよびAscIを使用する組換えアデノウイルスDNAの消化により、zvegf3インサートの存在が確認された。組換えアデノウイルスミニプレプDNAを大腸菌 (E. coli) DH10BTMコンピテント細胞中に形質転換し、そして商業的に入手可能なDNA精製キット (Qiagen, Inc.から入手した) をキットの使用説明書に従い使用してDNAを調製した。
【０１５４】
20〜30 UのPacIを含有する100 μlの反応体積中で37℃において3時間、ほぼ5 μgの組換えアデノウイルスDNAをPacI酵素 (New England Biolabs) で消化した。消化されたDNAを等しい体積のフェノール/クロロホルムで2回抽出し、エタノールで沈降させた。DNAペレットを10 μlの蒸留水中に再懸濁させた。前日に接種し、60〜70%のコンフルエンシーに増殖させたQBI-293A細胞 (Quantum Biotechnologies, Inc.、カナダ国ケベック州モントリオール) のT25フラスコをPacI消化DNAでトランスフェクトした。PacI消化DNAをHBS (150 mM NaCl、20 mM HEPES) で50 μlの全体積まで希釈した。別の管において、20 μlの1 mg/mlのN-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチル-アンモニウム塩 (DOTAP) (Boehringer Mannheim、ニュージャージー州インディアナポリス) をHBSで100 μlの全体積に希釈した。
【０１５５】
DNAをDOTAPに添加し、上下にピペッティングすることによっておだやかに混合し、室温において15分間放置した。培地を293A細胞から除去し、1 mMのピルビン酸ナトリウム、0.1 mMのMEM非必須アミノ酸、および25 mMのHEPES緩衝液 (Life Technologies、マリーランド州ガイサーバーグ、から入手した試薬) を含有する5 mlの無血清最小必須培地 (MEM) アルファで洗浄し、5 mlの無血清MEMを添加し、そして細胞を37℃に保持した。DNA/脂質混合物を細胞のフラスコに滴下し、おだやかに混合し、37℃において4時間インキュベートした。次いでDNA/脂質混合物を含有する培地を吸引除去し、5%のウシ血清アルブミンを含有する5 mlの完全MEMで置換した。トランスフェクトした細胞をGFP発現およびフォーカス (ウイルスのプラーク) についてモニターした。
【０１５６】
293A細胞を組換えアデノウイルスDNAでトランスフェクトしてから7日後、細胞はGFPを発現し、フォーカスを形成し始めた。粗製ウイルスライゼイトを細胞スクレーパーで収集して、すべての293A細胞を収集した。ライゼイトを50 mlの円錐形管に移した。細胞からウイルス粒子の大部分を解放させるために、3回の凍結/融解サイクルをドライアイス/エタノール浴および37℃の浴中で実施した。
【０１５７】
粗製ライゼイトを増幅 (Primary (1°) 増幅) して、zvegf3 rAdVライゼイトの作業素材を得た。ほぼコンフルエント (80〜90%) の293A細胞の10枚の10 cmプレートを20時間前に構成し、次いで200 μlの粗製rAdVライゼイトを各10 cmプレートに添加し、プレートを48〜72時間モニターして、白色光顕微鏡下に細胞変性効果 (CPE) および蛍光顕微鏡下にGFPの発現を探した。細胞のすべてがCPEを示したとき、この1°素材ライゼイトを収集し、そして前述したように、凍結/融解サイクルを実施した。
【０１５８】
zvegf3 rAdVの二次 (2°) 増幅を次のように実施した: 293A細胞が80〜90%のコンフルエントであるように、293A細胞の12枚の15 cm組織培養皿を調製した。20 mlの5% MEM培地以外はすべてを除去し、そして各皿に300〜500 μlの1°増幅rAdVライゼイトを接種した。48時間後、細胞はウイルス産生から溶解し、ライゼイトを250 mlのポリプロピレン製遠心びん中に収集し、rAdVを精製した。
【０１５９】
NP-40洗浄剤を0.5%の最終濃度で粗製ライゼイトのびんに添加して、すべての細胞を溶解した。びんを回転プラットホーム上に10分間配置して、びんが落下しないようにしてできるだけ速く攪拌した。20,000×Gで15分間遠心することによって、破片をペレット化した。上清を250 mlのポリプロピレン製遠心びんに移し、そして0.5体積の20%のPEG 8000/2.5 MのNaCl溶液を添加した。びんを氷上で一夜震蘯させた。びんを20,000×Gで15分間遠心し、そして上清を漂白溶液中に廃棄した。無菌の細胞スクレーパーを使用して、2つのびんから白色ウイルス/PEG沈降物を2.5 mlのPBS中に再懸濁させた。
【０１６０】
生ずるウイルス溶液を2 mlのマイクロ遠心管中に入れ、マイクロ遠心機中で14,000×Gにおいて10分間遠心して追加の細胞破片を除去した。2 mlのマイクロ遠心管からの上清を15 mlのポリプロピレン製スナップカップ管に移し、CsClで1.34 g/mlの密度に調節した。このウイルス溶液の体積を推定し、0.55 g/mlのCsClを添加した。CsClは溶解し、この溶液の1 mlは1.34 gであると秤量された。この溶液を3.2 mlのポリカーボネート製厚壁遠心管に移し、348,000×Gで25℃において3〜4時間回転した。このウイルスは白色バンドを形成した。幅広の孔のピペットを使用して、ウイルスのバンドを収集した。
【０１６１】
勾配から回収されたウイルスは大量のCsClを有し、これはウイルスを細胞上で使用する前に除去しなくてはならなかった。商業的に入手可能なイオン交換カラム (Sephadex(商標) G-25が充填されたPD-10カラム; Pharmacia Biotech.、ニュージャージー州ピスカタウェイ) を使用して、ウイルス調製物を脱塩した。このカラムを20 mlのPBSと平衡化した。ウイルスをカラム上に負荷し、カラムの中に展開させた。5 mlのPBSをカラムに添加し、8〜10滴の画分を収集した。各画分の1:50希釈物の光学密度を260 nmにおいて分光計で測定した。明らかな吸収ピークが画分7〜12の間に存在した。ピーク画分をプールし、1:25希釈物の光学密度(OD) を測定した。下記式を使用してODをウイルス濃度に変換した: （260 nmにおけるOD）(25)(1.1×1012) = ヴィリオン/ml。zvegf3 rAdVの1:25希釈物のODは0.145であり、4×1012ヴィリオン/mlのウイルス濃度が得られた。 
【０１６２】
ウイルスを貯蔵するために、グリセロールを精製したウイルスに15%の最終濃度に添加し、おだやかであるが、効果的に混合し、-80℃においてアリコートで貯蔵した。
Quantum Biotechnologies, Inc. (カナダ国モントリオール) が開発したプロトコルに従い、組換えウイルス感染を測定した。簡単に述べると、アッセイすべき各組換えウイルスについて2%の胎仔ウシ血清を含有するMEM中の1×104 293A細胞/ウェルを、2枚の96ウェルの組織培養プレートに播種した。24時間後、1×10-2から1×10-4への各ウイルスの10倍の希釈物を2%の胎仔ウシ血清を含有するMEM中で調製した。100 μlの各希釈物を20ウェルの各々の中に入れた。37℃において5日後、ウェルをCPEに対する陽性または陰性について読み、そしてプラーク形成単位 (pfu)/mlの値を計算した。
【０１６３】
前述のQuantum Biotechnologies, Inc.に従い、式TCID50を使用した。力価 (T) をプレートから決定し、ここでウイルスを10-2から10-4に希釈し、感染後に5日間読んだ。各希釈において、CPEについて陽性のウェル/ウェルの総数の比(R) を決定した。未希釈ウイルス試料の力価を計算するために: 係数、“T” = 1+D(S-0.5); ここで“S” は比 (R) の合計であり、そして“d” は希釈系列のLog 10であり、例えば、“d” は10倍の希釈系列について1に等しい。未希釈試料の力価はT = 10(1+F) = TCID50/mlである。TCID50/mlをpfu/mlに変換するために、力価 (T) についての計算において指数関数から0.7を減じた。
zvegf3アデノウイルスは1.8×1010 pfu/mlの力価を有した。
【０１６４】
実施例１０．
2匹のニュージーランド白ウサギをペプチドhuzvegf3-1 (配列番号2の残基80-104) 、huzvegf3-2 (配列番号2の残基299-314) 、huzvegf3-3 (配列番号2の残基299-326、N-末端のcys残基をもつ) 、またはhuzvegf3-4 (配列番号2の残基195-225、C-末端のcysをもつ) で免疫化することによって、ポリクローナル抗ペプチド抗体を調製した。Applied Biosystems 431A型ペプチド合成装置 (Applied Biosystems, Inc.、カリフォルニア州フォスターシティー) を製造業者のインストラクションに従い使用して、ペプチドを合成した。
【０１６５】
次いで、ペプチドhuzvegf3-1、huzvegf3-3、およびhuzvegf3-4をキャリヤータンパク質マレイミド活性化キーホールリンペットヘモシアニン (KLH) に対してシステイン残基を介して複合化した (Pierce Chemical Co.、イリノイ州ロックフォード) 。グルタルアルデヒドを使用して、ペプチドhuzvegf3-2をキャリヤータンパク質KLHに対して複合化した。各ウサギに完全フロイントアジュバント (Pierce Chemical Co.) 中の200 μgの複合化ペプチドを最初に腹腔内 (IP) 注入し、次いで3週毎に不完全フロインドアジュバント中の100 μgの複合化ペプチドをブースターIP注射した。第3のブースター注射後7〜10日に、動物から採血し、血清を収集した。
【０１６６】
10 mgのそれぞれのペプチド/gのCNBr-Sepharose(商標) を使用し、次いでPBS中で一夜透析して調製したCNBr-Sepharose(商標) 4Bペプチドカラム (Pharmacia Biotech.) を使用して、huzvegf3ペプチド特異的抗体をウサギ血清からアフィニティー精製した。抗体ターゲットとして1 μg/mlの適当なペプチドを使用するELISA力価チェックにより、ペプチド特異的huzvegf3抗体を特性決定した。huzvegf3-1ペプチド特異的抗体は、適当な抗体ターゲットに対するELISAにより、500 pg/mlのより低い検出限界 (LID) を有し、そしてELISAにより全長の組換えタンパク質 (MBP-融合物) を認識した。huzvegf3-2ペプチド特異的抗体はELISAにより1 ng/mlのLDDを有した。huzvegf3-3ペプチド特異的抗体はELISAにより50 pg/mlのLDDを有し、そしてウェスタンブロット分析により組換えタンパク質を認識した。huzvegf3-4ペプチド特異的抗体はELISAにより50 pg/mlのLDDを有し、そしてウェスタンブロット分析により組換えタンパク質を認識した。
【０１６７】
実施例１１．
大腸菌 (E. coli) マルトース結合性タンパク質 (MBP) に融合した全長のヒトzvegf3ポリペプチドで免疫化することによって、ウサギにおいて 「E2243」 と表示するポリクローナル抗血清を発生させ、融合タンパク質を使用してアフィニティー精製した。抗血清の特異性をウェスタンブロットフォーマットにおいて検査し、ここで種々のzvegf3タンパク質試料を還元し、アクリルアミドゲル上で電気泳動させた。使用したタンパク質次の通りであった: 組換えヒトzvegf3増殖因子ドメイン、組換えヒトzvegf3全長、およびMBPに融合した組換えヒトzvegf3全長、各々は13.9、41.7、および125 ng/レーンであった; および全長のヒトzvegf3を発現するHaCat細胞からのコンディショニングした培地。
【０１６８】
次いで電気泳動させたタンパク質をニトロセルロース膜に移し、2.5%の脱脂粉乳を含有する緩衝液中で一夜インキュベートすることによってブロックした。一次抗体 (E2243抗血清) を300 ng/mlに希釈し、ニトロセルロースブロットに添加し、次いでこれを室温において震蘯させながら1時間インキュベートした。次いでブロットをすすぎ、二次抗体 (西洋ワサビペルオキシダーゼに対して複合化した抗ウサギIgG) を添加し、そしてブロットを室温において震蘯させながら1時間インキュベートした。次いでブロットをすすぎ、商業的に入手可能な物質で展開し、フィルムに10秒間露出した。ウェスタンブロットは、E2243抗血清がコンディショニングした培地中で全長のzvegf3 (融合および未融合) のすべての試料を認識するが、単離されたzvegf3増殖因子ドメインの試料を認識しないことを示した。
【０１６９】
実施例１２．
BHK細胞系統中で産生された精製した、非タッグド組換えヒトzvegf3 GFD (huzvegf3-GFD-BHK) を使用して、ヒトzvegf3増殖因子ドメイン (GFD) タンパク質に対して特異的なマウスハイブリドーマ産生性モノクローナル抗体 (Mab) を発生させた。10匹のBALB/cマウスの各々に第1日において、完全フロイントアジュバント中で1:1 (v/v) に混合したhuzvegf3-GFD-BHKの20 μgを腹腔内注射した。各マウスに引き続いて第15、29、41、57、71、 89 および115日に完全フロイントアジュバント中で1:1 (v/v) に混合したhuzvegf3-GFD-BHKの10 μgを腹腔内注射した。
【０１７０】
第118日に、最高の抗huzvegf3抗体力価をもつ (ビオチニル化huzvegf3-GFD捕捉ELISAにおいて決定された; 下記を参照) 2匹のマウスの拡大したリンパ節からの脾細胞およびリンパ球を、本質的に下記の文献に記載されているようにして、X63-Ag8.653マウス骨髄腫細胞系統 (Kearney 他、J. Immunol. 123: 1548-1550、1979) と比2.76:1で融合した: Lane、J. Immunol. Methods 81: 223-228、1985。
【０１７１】
融合混合物を24枚の96ウェルのプレートの中にイスコーブ (Iscove) 変性ダルベッコ培地 (IMDM; Life Technology, Inc.、マリーランド州ガイサーバーグ) 中の1.2×105全細胞/ウェルの平均密度でプレートし、ここで前記培地は10%の胎児クローンI血清 (HyClone Laboratories, Inc.、ユタ州ローガン) 、10%のハイブリドーマクローニング補助物質 (BM Condimed(商標) H1; Roche Diagnastics Corp.、インジアナ州インジアナポリス) 、2 mMのL-グルタミン (Life Technology, Inc.) 、100 U/mlのペニシリンGナトリウム (Life Technology, Inc.) 、および100 μg/mlのストレプトマイシン硫酸 (Life Technology, Inc.) を含有した。第4日および第7日に、各ウェル中の培地内容物のほぼ1/4を吸引しかつ置換することによって、ウェルを供給した。この融合物をHH1と表示した。
【０１７２】
融合後の第9/10日に、ビオチニル化huzvegf3-GFD捕捉ELISAを使用して、IgGクラスの抗huzvegf3 mAbsを検出した。0.05 Mの炭酸塩/重炭酸塩緩衝液 (Sigma、ミゾリー州セントルイス) 中の1 μg/mlのヤギ抗マウスIgG (Kirkegaard & Perry Laboratories、マリーランド州ガイサーバーグ) で、プレート (Immulon(商標) II; Dynex Technologies、バージニア州チャンチリイ) のウェルを50 μl/ウェルにおいて被覆した。プレートを4℃において一夜インキュベートし、0.05%のポリオキシエチルソルビタンモノラウレート (ツイーン20) を含有するリン酸塩緩衝液 (PBST) で3回洗浄して非結合抗体を除去した。
【０１７３】
ウェルを1% (w/v) のウシ血清アルブミン (Sigma) を含有するPBST (PTB緩衝液) (200 μl/ウェル) で室温 (RT) において1時間ブロックし、次いで前述したように洗浄した。融合プレートからの培養上清を抗体被覆プレート上にレプリカプレートし (100 μl/ウェル) 、そしてRTにおいて1時間インキュベートした。スルホ-NHS-LC-ビオチン (Pierce Chemical Company、イリノイ州ロックフォード) を製造業者の使用説明書に従い使用して、ヒトzvegf3-GFDタンパク質をRTにおいて45分間ビオチニル化した。この反応を2 Mのグリシンで停止させた。ビオチニル化タンパク質をPTB緩衝液中で1 μg/mlに希釈した。プレートをPBSTで4回洗浄し、ビオチニル化huzvegf3-GHDを100 μl/ウェルで添加し、そしてプレートをRTにおいて1時間インキュベートした。
【０１７４】
次いでプレートをPBSTで4回洗浄し、そしてHRP複合化ストレプトアビジン (Pierce Chemical Company) をPTB緩衝液中で0.5 μg/mlに希釈し、プレートに100 μl/ウェルで添加した。プレートをRTにおいて1時間インキュベートし、次いでPBSTで5回洗浄した。TMB基質 (EIA色素源、カタログNo. R6R; Genetic Systems Corp.) を基質緩衝液 (Genetic Systems Corp.) 中で1:100に希釈し、プレートに100 μl/ウェルに添加した。プレートを暗所で室温において10〜15分間インキュベートした。100 μl/ウェルの1N H2SO4を添加して、発色を停止させた。ELISAプレートリーダー (Molecular Devises、カリフォルニア州サニーヴェイル) を使用して、光学密度を波長450 nm (L1) および650 nm (L2) において読んだ。最終のOD測定は式L1-L2により決定した。
【０１７５】
78のマスターウェルは、ビオチニル化huzvegf3-GFD捕捉できる抗体を含有した。ハイブリドーマ冷凍保存および追加の上清発生のために、これらのマスターウェルを拡張した。拡張したマスターウェル上清のELISA分析により、もとの78マスターウェルのうちの27はhuzvegf3-GFDに対して特異的な抗体を保持し、27のうちの20は抗原との有意な反応性を有した。
【０１７６】
表示したマスターウェルの6つを、1細胞/ウェルより小さい密度に限界希釈することによってクローニングした。細胞増殖の単一のフォーカスについてウェルを検査することによって、モノクローナル性を評価した。マスタースクリーンにおいて使用する同一アッセイにより、クローンを特異的抗体について試験した。最強のクローンの5〜6を簡単に拡張した。次いでこれらのクローンからの上清を連続希釈し、ELISAにより試験して、3つの最良の抗体産生クローンを同定した。検定されると、各マスターウェルからの最良のクローンを引き続いて再クローニングし、前述したようにアッセイした。
【０１７７】
第2ラウンドの最高力価を有するクローンの6つは、ハイブリドーマクローニング補助物質を含まない融合クローニング培地中の増殖に適合した。引き続いて、クローンの各々は、ダルベッコ変性イーグル培地+2.5%の胎児クローンI血清および種々の補助物質から本質的に成る産生培地処方物中の増殖に適合した。再び上清を連続希釈し、huzvegf3-GHDについてELISAにより試験して、最高力価および次の最高力価のクローン (それぞれ、一次および二次クローンと表示した) を同定した。次いでマウスハイブリドーマサブタイプ決定キット (カタログNo. 1183117; Roche Diagnastics Corp.) を使用して、各組のクローンにより産生されたMabをIgGサブクラスについて評価した。クローンHH1-24、-40、-57および-76のすべてはIgG1抗体を産生することが見出された。クローンHH1-58および-78はIgG2b抗体を産生した。すべての抗体はk軽鎖を有した。
【０１７８】
実施例１３．
組織の中へのブロモデオキシウリジン (BrdU) の組込みにより決定して、アデノウイルス的に送達されたzvegf3が細胞増殖を刺激するかどうかを試験するために、研究を実施した。
【０１７９】
マウス (雄、C57B1、7週齢) を3つのグループに分割した。第0日に、親またはzvegf3アデノウイルスをそれぞれ第1 (n = 11) および第2 (n = 12) グループに尾静脈を介して投与し、各マウスに約0.1 mlの体積で約1×1011粒子を投与した。第3グループ (n = 8) は処置しなかった。殺すほぼ24および12時間前に、3 mgの新しく調製したBrdU溶液を各マウスに2回腹腔内投与した。第2、4、6、8、および10日に、各処置グループからの2匹のマウスおよび1または2匹の未処置マウスを殺し、組織および血液を収集した。試料を完全血液算定 (CBC) および血清化学のために分析し、そしてマニュアルディファレンシャル血液および骨髄始原細胞分析のためにスライドガラスを調製した。1つの大腿骨、肺、心臓、胸腺、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、十二指腸、および腸間膜リンパ節を標準的組織学およびBrdU組込みの評価に付した。十二指腸の内層をBrdU組込みの対照として使用した。
【０１８０】
さらに、投与量のほぼ半分のzvegf3を投与した2匹のマウスおよび全投与量の親アデノウイルスを投与した1匹のマウスを第16日に殺し、前述したように分析した。
各マウスからの1片の肝臓をアデノウイルスのmRNAアッセイのために取って置いて、アデノウイルス調製物の発現の時間経過を検査した。
【０１８１】
第6日から開始して、いずれかのアデノウイルスで処置した動物の大部分は、未処置グループと比較して、視的に拡大した肝臓および脾臓を有した。zvegf3アデノウイルスで処置したマウスの肝臓は、親ウイルスで処置した動物よりもいっそう淡色に見える傾向があった。シヌソイド細胞の増殖は肝臓において観察された。視的検査は、これらの細胞が星細胞および/または線維芽細胞であることを示唆した。脾臓の色は両方のグループにおいて同一であった。zvegf3アデノウイルスを投与した動物の大部分はより淡色の大腿骨幹を有し、骨髄はより淡い色であった。
【０１８２】
末梢血CBCはzvegf3処置動物と親ウイルス処置動物との間に血小板数計測の差が起こりうるが、RBCまたはWBCにおいて差が存在しないことを示した。未処置および親ウイルス処置グループに比較して、zvegf3グループは第2、4、6、および8日において、血小板数はより低かったが、第10日においてそうではなかった。また、zvegf3グループにおける平均血小板体積 (個々の血小板の平均大きさ) はより大きくなる傾向があり、より大きい、未熟血小板集団個体数の相対的増加と一致する。
【０１８３】
BrdU標識化は、腎臓、主として髄質における、より少ない程度に皮質における細胞増殖の増加を示した。増殖する細胞は間質性細胞であるように見え、これらの細胞は包含された線維芽細胞および/または糸球体間質細胞を有することがある。
【０１８４】
実施例１４．
BHK細胞において産生されたヒトzvegf3増殖因子ドメインタンパク質を、星細胞におけるTGF-β産生を刺激する能力について試験した。ピルビン酸塩および10%の血清 (HyClone Laboratories, Inc.) を補充したDMEM増殖培地 (Life Technology, Inc.) 中の48ウェルの組織培養クラスター (Costar(商標); Corning、ニューヨーク州コーニング) 中に、ラット肝性星細胞 (ワシントン大学、Nelson Fausto博士から入手した) をプレートした。コンフルエンスにおいて、血清を0.1%のBSA (Fraction V; Sigma、ミゾリー州セントルイス) で置換することによって、この培地を無血清培地に交換した。
【０１８５】
48時間後、培地を交換し、同一無血清培地で置換し、zvegf3-GFDをウェル中に100 ng/mlに添加した。48時間後、コンディショニングされた培地を収集し、浮遊する細胞または破片を回転により除去した。商業的に入手可能なELISAキット (R & D Systems、ミネソタ州セントポール) を使用して、これらの培地中の全TGF-β1レベルを測定した。100 ng/mlのzvegf3-GFDで星細胞を刺激すると、BSA対照と比較してTGF-β産生がほぼ5倍増加した。
【０１８６】
前述の説明から明らかなように、本発明の特別の態様を例示の目的で記載してきたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱しないで種々の変更を行うことができる。したがって、本発明は添付された特許請求の範囲による以外限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１Ａ】図１Ａは、配列番号2に示すアミノ酸配列のHopp/Woods親水性構造である。この構造は滑り6残基ウィンドウに基づく。埋没G、SおよびT残基および暴露H、YおよびW残基は無視した。図面において、これらの残基は小文字で示されている。
【図１Ｂ】図１Ｂは、配列番号2に示すアミノ酸配列のHopp/Woods親水性構造である。この構造は滑り6残基ウィンドウに基づく。埋没G、SおよびT残基および暴露H、YおよびW残基は無視した。図面において、これらの残基は小文字で示されている。
【図１Ｃ】図１Ｃは、配列番号2に示すアミノ酸配列のHopp/Woods親水性構造である。この構造は滑り6残基ウィンドウに基づく。埋没G、SおよびT残基および暴露H、YおよびW残基は無視した。図面において、これらの残基は小文字で示されている。
【図１Ｄ】図１Ｄは、配列番号2に示すアミノ酸配列のHopp/Woods親水性構造である。この構造は滑り6残基ウィンドウに基づく。埋没G、SおよびT残基および暴露H、YおよびW残基は無視した。図面において、これらの残基は小文字で示されている。
【図１Ｅ】図１Ｅは、配列番号2に示すアミノ酸配列のHopp/Woods親水性構造である。この構造は滑り6残基ウィンドウに基づく。埋没G、SおよびT残基および暴露H、YおよびW残基は無視した。図面において、これらの残基は小文字で示されている。
【図１Ｆ】図１Ｆは、配列番号2に示すアミノ酸配列のHopp/Woods親水性構造である。この構造は滑り6残基ウィンドウに基づく。埋没G、SおよびT残基および暴露H、YおよびW残基は無視した。図面において、これらの残基は小文字で示されている。
【図１Ｇ】図１Ｇは、配列番号2に示すアミノ酸配列のHopp/Woods親水性構造である。この構造は滑り6残基ウィンドウに基づく。埋没G、SおよびT残基および暴露H、YおよびW残基は無視した。図面において、これらの残基は小文字で示されている。
【図２】図２は、ヒト (配列番号2) およびマウス (配列番号4) アミノ酸配列のアラインメントである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２】
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【配列表】
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