(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌、アルコールを含む消化管を損傷する薬物、放射線または苛性物質への不慮の曝露、感染、非潰瘍性消化不良、胃炎、消化性潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌、ＭＡＬＴリンパ腫、Ｍｅｎｅｔｉｅｒ症候群または胃食道逆流疾患を含むがその限りではない消化障害を治療するための放射線療法または化学療法によって生じる消化管の病変を治療するかまたは病変形成を抑制する医薬を調製するための、トレフォイルペプチドを発現する組換え非病原性かつ非侵襲性微生物の使用。
【請求項２】
消化管の損傷が、癌の処置のための放射線療法または化学療法によって生じる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
消化管が、口、食道、胃、大腸および小腸を含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
病変が、粘膜表面での病変である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記非病原性かつ非侵襲性微生物が、食品用菌株である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記非病原性かつ非侵襲性微生物が、グラム陽性菌株である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記菌株が、乳酸球菌種（Lactococcus species）かまたは乳酸桿菌種（Lactobacillus species）である、請求項５または６に記載の使用。
【請求項８】
前記菌株が、ラクトコッカス  ラクティス（Lactococcus lactis）である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記トレフォイルペプチドが、ＴＦＦ１である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質送達システムの分野に関する。さらに詳細には、本発明は、微生物、好ましくは菌株、好ましくは非病原性菌株、好ましくは非侵襲性菌株、好ましくは食品用菌株による、ｉｎ  ｖｉｖｏでのトレフォイルペプチドの分泌、上記システムを使用してトレフォイルペプチドを送達する方法、および消化管の炎症性障害を治療するための上記トレフォイルペプチド発現システムの使用に関する。
【０００２】
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓは、腸内で生存することができる非病原性グラム陽性乳酸菌である（Ｋｌｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。Ｌ．ｌａｃｔｉｓがこれらの環境の全てで代謝的にも活性であるかどうかは確かではない。
【０００３】
Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３ｂ）およびＲｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）により、ワクチン投与を考慮したＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓによる破傷風毒素フラグメントＣの発現が記載されている。さらに、インターロイキン−２またはインターロイキン−６のいずれかを、破傷風毒素フラグメントＣ（ＴＴＦＣ）と共に発現するように工作されたＬ．ｌａｃｔｉｓ細菌調製物をマウスに鼻腔内投与したとき、ＴＴＦＣのみを発現する菌株を同様に投与した後より１０倍を超える抗ＴＴＦＣが産生されることが証明された（国際特許出願第ＷＯ９７／１４８０６号）。以上の結果から、同時発現抗原に対する免疫応答を増強するための、サイトカイン−分泌性非侵襲性実験的細菌ワクチンベクターの使用が実現した。また、異種タンパク質フラグメントを細胞壁内に接着し、このような方法で、異種タンパク質フラグメントをＬ．ｌａｃｔｉｓ表面に表示し、より増強されたワクチン投与特性につながると考えられるアプローチが記載されている（ＷＯ９７０９４３７号、Ｓｔｅｉｄｌｅｒ，Ｒｅｍａｕｔ，Ｗｅｌｌｓ）。
【０００４】
トレフォイルペプチドは、上皮粘液細胞により分泌され、酸性環境で安定である。これらのペプチドは、粘膜の保護（上皮上のゲル形成）に寄与し、皮移動の刺激により損傷した粘膜の修復に関与すると考えられる（Ｐｌａｙｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。トレフォイルペプチドの産生は、胃潰瘍および大腸炎等の、損傷が起きた部位で局所的に増加する（Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ，１９９０）。Ｂａｂｙａｔｓｋｙら（１９９６）は、組換えトレフォイルペプチドを投与することにより、これらの場所の損傷が減少することを示した。粘膜の保護に重要な大抵の他のタンパク質（たとえば、上皮成長因子）と反対に、ほとんどの研究で、トレフォイルペプチドは、増殖をほとんどまたは全く引き起こさなかった（Ｐｌａｙｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）。このトレフォイルペプチドファミリーのメンバー３種がヒトで同定されており、当初、ｐＳ２（乳癌エストロゲン誘導可能遺伝子、０．Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，１９９３）、ＳＰ（鎮痙性ペプチド）およびＩＴＦ（腸トレフォイル因子）と呼ばれた。現在の命名法では、ｐＳ２はＴＦＦ１、ＳＰはＴＦＦ２、ＩＴＦはＴＦＦ３と改名されている（たとえば、Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９９参照）。本テキストを通して、この新しい呼称を使用する。
【０００５】
ヒト、マウスおよびラットの場合、ＴＦＦ１およびＴＦＦ２は主として胃内でみられ、ＴＦＦ３は主として十二指腸および結腸でみられる。Ｗｏｎｇ  ら（１９９９）は、トレフォイルペプチドに関する最近の概要を示している。この文献の内容を、参照により本開示に援用する。
【０００６】
ＴＦＦ１は、細胞表面受容体を介して作用すると考えられる（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）。
【０００７】
ＷＯ  ９７／３８７１２およびＷＯ  ９２／１４８３７には、口、食道、胃、大腸および小腸を含む消化管の障害および損傷を治療するため、ならびに消化管外にある組織の保護および治療のためのトレフォイルタンパク質またはトレフォイルペプチドの使用が記載されている。これらのタンパク質は、これらの部位の病変の治療または病変形成の抑制のいずれにも使用することができる。これらの病変は、癌を治療するための放射線療法または化学療法、消化管を損傷するアルコールを含む他の薬物、放射線または苛性物質への不慮の曝露、感染、化学物質、細菌または不明な原因による、非潰瘍性消化不良、胃炎、消化性潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌、ＭＡＬＴリンパ腫、Ｍｅｎｅｔｉｅｒ症候群、胃食道逆流疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎および急性大腸炎を含むがその限りではない消化障害に起因する可能性がある。
【０００８】
トレフォイルペプチドは、急性大腸炎の治療に特に有用である。
【０００９】
ＩＴＦは、ＥＧＦ（上皮成長因子）と併用して、消化管潰瘍の治療にも使用される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの実験で、ＥＧＦとＩＴＦとを併用した治療によって、ＥＧＦの増殖作用は増強せずに、ＥＧＦの創傷治癒活性が著明に上昇することが証明された（Ｃｈｉｎｅｒｙ  ａｎｄ  Ｐｌａｙｆｏｒｄ，１９９５）。
【００１０】
炎症性腸疾患は、ある範囲の胃腸炎症のグループ名である。このグループに属するものは、腸炎、大腸炎、それぞれ、十二指腸または結腸の粘膜の炎症である。クローン病（Ｃｒｏｈｎ′ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ  ｒｅｇｉｏｎａｌｉｓ）および潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ，ｃｏｌｉｔｉｓ  ｕｌｃｅｒｏｓａ）は密接に関連した、慢性および自然に再発する消化管の疾患である。疾患は、免疫学的に仲介され、また環境的原因および遺伝的原因を有する。Ｓａｒｔｏｒ（１９９５）は、炎症性腸疾患の異なる様相について記述している。クローン病は、たとえば、Ｈｅｒｆａｔｈ  ａｎｄ  Ｓａｒｔｏｒ  （１９９４）、Ｃｏｍｉｎｅｌｌｉら（１９９４）、およびＭａｃｌＤｅｒｍｏｔｔ（１９８９）により、詳細にわたって研究されている。
【００１１】
本発明の目的は、胃腸障害を治療するために、トレフォイルペプチドを送達する方法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、胃腸障害を治療するための医用組成物を提供することである。
【００１３】
さらに詳細には、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでトレフォイルペプチドを送達する微生物に関する。好ましくは、上記微生物は菌株であり、好ましくは非病原性菌株であり、好ましくは非侵襲性菌株であり、好ましくは食品用菌株であり、さらに好ましくは、グラム陽性菌株であり、最も好ましくは乳酸醗酵性菌株であり、好ましくはｉｎ  ｖｉｖｏでトレフォイルペプチドを発現する乳酸球菌種または乳酸桿菌種である。従って、本発明は、
【００１４】
【表１】
0004644401.tif 000002
0004644401.tif 000003
【００１５】
を含むリストから選択された乳酸球菌種または乳酸桿菌種または亜種のいずれにも応用できる。
【００１６】
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓが１つの異種抗原を送達する能力、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＩＬ−２およびＩＬ−６等の分子を産生する能力から、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓが、ｉｎ  ｖｉｖｏで他のタイプのペプチドまたはポリペプチドを送達するのに適した媒体であることは明らかではなかった。さらに、上記菌株により発現される上記トレフォイルペプチドが、消化管の炎症性疾患、たとえば、炎症性腸疾患または急性大腸炎に有益な作用を与えるかどうかは不明である。
【００１７】
従って、菌株が、消化管内に存在するとき、ｉｎ  ｖｉｖｏでトレフォイルペプチドを発現して、急性大腸炎の状態で治癒効果を発揮できることを本明細書の実施例のセクションで明らかにできることは驚きである。例として、コード領域マウスＴＦＦ１を含むＰＣＲフラグメントをクローニングした。プロモーターおよびｕｓｐ４５  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ分泌シグナル配列の調節下にあるこれらのＰＣＲクローンを含む組換えベクターを構築した。マウスＴＦＦ１トレフォイルペプチドを発現する形質転換Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ菌株を構築した。さらに、これらの細菌により産生された組換えｍＴＦＦ１は、意外なことに、炎症を起こした結腸の遠位部分に対して治癒効果を発揮することが、ｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデル系で証明された。
【００１８】
好ましい実施形態によれば、本発明は、特に、ｉｎ  ｖｉｖｏでトレフォイルペプチドを送達する菌株に関する。
【００１９】
別の好ましい実施形態によれば、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＦＦ１を送達する細菌に関する。
【００２０】
本発明が、トレフォイルペプチドの一部または変異形にも関することを理解すべきである。上記一部は、当業者に周知の方法によって生成することができる、生物学的に活性な部分を指す。これらの部分は、一般的に少なくとも１０個連続したアミノ酸、一般的に少なくとも２０個連続したアミノ酸、さらに一般的には少なくとも３０個連続したアミノ酸、通常は少なくとも４０個連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも５０個連続したアミノ酸を含む。上記変異形は、上述のトレフォイルペプチドと同じ生物学的活性を有する変異形を指す。
【００２１】
上述の本発明による菌株は、予想される障害の治療に有益なさらなる組換えタンパク質も発現する可能性があることも明白になるであろう。
【００２２】
さらに別の実施形態によれば、本発明は、上述のトレフォイルペプチドを発現する微生物を含む医用組成物に関する。
【００２３】
好ましくは、本発明による医用組成物は、粘膜表面に使用するのに適することが好都合である。
【００２４】
本発明による、本発明に従って使用するための、医用組成物は、微生物のほかに、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝溶液、安定剤または当業者に周知の他の物質も含んでもよい。このような物質は、無毒でなければならず、且つ有効成分の効果を妨げてはならない。担体または他の物質の精確な性質は、投与経路によって異なってもよい。当業者は、適当な溶液を申し分無く調製することができる。
【００２５】
別の実施形態によれば、本発明は、上述の微生物の投与を含む、トレフォイルペプチドを消化管に送達する方法に関する。
【００２６】
別の態様によれば、本発明は、トレフォイルペプチドを消化管に送達するための薬剤を製造するための、上述の微生物の使用にも関する。
【００２７】
別の実施形態によれば、本発明は、上述の微生物の微生物の投与を含む、胃および／または腸の疾患および／または障害の治療方法に関する。
【００２８】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＦＦ１トレフォイルペプチドを送達する微生物の投与を含む、胃および／または腸の疾患および／または障害の治療方法にも関する。
【００２９】
本発明による菌株により発現されるトレフォイルタンパク質は、これらの部位における病変の治療または胃腸の疾患および障害に起因する病変形成の抑制のいずれにも使用することができる。
【００３０】
「胃および／または腸の疾患および／または障害」という表現は、あらゆるタイプの胃、腸および胃腸の疾患および／または障害に関する。本発明の好ましい実施形態では、この表現は、急性の胃腸の炎症性疾患および障害に関する。これらの疾患は、化学物質、細菌または不明な原因による急性胃腸障害であることが好ましい。このグループに属するものは、それぞれ、十二指腸または結腸の粘膜の、クローン病および潰瘍性大腸炎炎症における急性の再発を含むがその限りではない、腸炎、大腸炎である。旅行者病もこれに含まれる。他の好ましい実施形態では、本発明の表現「胃および／または腸の疾患および／または障害」は、クローン病および潰瘍性大腸炎等の慢性および自然に再発する消化管の疾患に関する。
【００３１】
「胃および／または腸の疾患および／または障害」という表現は、粘膜表面における病変を含む疾患にも関する。従って、本発明の方法および医用組成物によって治療される疾患状態は、口、食道、胃、大腸および小腸を含む消化管の障害および損傷を含んでもよく、また、消化管外にある組織の保護および治療のためでもある。これらの病変は、癌を治療するための放射線療法または化学療法、消化管を損傷するアルコールを含む他の薬物、放射線または苛性物質への不慮の曝露、感染、化学物質、細菌または不明な原因による、非潰瘍性消化不良、胃炎、消化性潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌、ＭＡＬＴリンパ腫、Ｍｅｎｅｔｉｅｒ症候群、胃食道逆流疾患、およびクローン病がその限りではない消化障害に起因する可能性がある。
【００３２】
従って、本発明は、胃および／または腸の疾患および／または障害を治療するための医薬を調製するための、上述の微生物の使用に関する。
【００３３】
本発明は、急性の胃腸の炎症性疾患、急性大腸炎、クローン病の急性再発および潰瘍性大腸炎を治療するため、ならびにクローン病および潰瘍性大腸炎を含む、慢性および自然に再発する消化管の疾患を治療するための医薬を調製するための、上述の微生物の使用にも関する。
【００３４】
別の実施形態によれば、本発明は、胃および／または腸の疾患および障害に起因する病変の形成を抑制するための医薬を調製するための、上述の微生物の使用に関する。
【００３５】
微生物の投与は経口投与であってもよく、または治療すべき所望の場所に微生物を進入させることができる当技術分野で周知の他の方法、たとえば肛門投与、膣投与であってもよい。微生物は、培養液、すなわち、（少なくともｉｎ  ｖｉｔｒｏで）微生物の代謝活性を維持する物質を含む媒体に含まれた状態で、使用することが可能である。このような物質は、微生物の増殖を維持しないとしても、生存能力を維持する。このような物質は、グルコースおよびアミノ酸等のエネルギー源を含んでもよい。
【００３６】
微生物が投与される個体は、ヒトであってもよく、動物であってもよい。
【００３７】
治療状況では、すなわち、個体にポリペプチドを送達することの生物学的作用が、その個体に有益な場合には、投与は「治療有効量」であることが好ましく、これは、患者に利益を示すの十分である。このような利益は、少なくとも１症状の改善であってもよい。実際の投与量、投与速度および投与の時間的経過は、投与の目的、たとえば微生物投与の性質および重大性に照らして求められる生物学的作用によって異なり、ルーチンの最適化の課題である。治療法の指示、たとえば用量決定等は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内である。
【００３８】
本発明による微生物を含む組成物は、本発明に従って、単独で投与してもよく、他の治療法と組合せて、同時または逐次的のいずれで投与してもよい。
【００３９】
別の実施形態によれば、本発明は、上述の通り、適当なプロモーターおよび適当な細菌の分泌シグナル配列の調節下にある、トレフォイルポリペプチドコード配列を担持する組換えベクターを用いて微生物を形質転換することを含む、ｉｎ  ｖｉｖｏでトレフォイルペプチドを送達する微生物を作製する方法に関する。
【００４０】
上記細菌の分泌シグナル配列は、当技術分野で上記作用を実施することが知られている任意の配列であってもよい。Ｌ．ｌａｃｔｉｓの場合、上記分泌シグナルはｕｓｐ４５  Ｌ．ｌａｃｔｉｓ分泌シグナル配列であることが好ましい。上記プロモーター配列は、上記微生物で上記コード配列を発現させることが可能な任意のプロモーターであってもよい。実施例のセクションに示す例には、既知の誘導性Ｅ．ｃｏｌｉファージＴ７プロモーターおよびＬ．ｌａｃｔｉｓの既知の構成要素Ｐ１プロモーターなどが含まれる。
【００４１】
本発明は、適当なプロモーターおよび適当な分泌シグナル配列の調節下にあるトレフォイルペプチドコード配列の少なくとも一部を含む組換えベクターにも関する。上記組換えベクターを使用して、膜表面の損傷部位に対して治癒効果を発揮することができるトレフォイルペプチド配列の少なくとも一部を、ｉｎ  ｖｉｖｏで送達することができる。
【００４２】
本発明はさらに、配列番号１、２または４のいずれかによって表されるヌクレオチド配列を有する、上述の組換えベクターに関する。
【００４３】
以下の実施例は、例を挙げて本発明を説明するのに役立つに過ぎず、いかなる場合にも、本発明を限定するものと考えてはならない。
【００４４】
本書に記載の全ての資料を、参照により本明細書に援用する。
【００４５】
【実施例】
実施例１：マウスＴＴＦ１（ｍＴＴＦ１）のクローニングおよび発現
培地
ＧＭ１７は、０．５ｗ／ｖ％のグルコースをＭ１７（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ）に加えたものである。Ｍ９培地は、１リットル当たり以下のものを含む。Ｎａ2Ｐ０4  ６ｇ、ＫＨ2ＰＯ4  ３ｇ、ＮＨ4Ｃｌ  １ｇ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4  ２mmol、ＣａＣｌ2  ０．１mmolおよびＣａｓｉｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ）５ｇ。Ｍ９Ｂは、１リットル当たりＮａＨＣＯ3  ２．１ｇおよびＮａ2ＣＯ3  ２．６５ｇをＭ９に加えたものである。ＧＭ９Ｂは、０．５ｗ／ｖ％のグルコースをＭ９Ｂに加えたものである。ＬＭ９Ｂは、０．５ｗ／ｖ％の乳糖をＭ９Ｂに加えたものである。
【００４６】
該当する場合、抗生物質エリスロマイシン（Ｅｒ）またはクロラムフェニコール（Ｃｍ）は、それぞれ５μg／mlの最終濃度で、各培地に加えた。抗生物質の存在を示すのに使用した呼称は、たとえばＧＭ１７Ｅｒ、ＬＭ９ＢＣｍ等である。固体培地は１．２％の寒天を含有した。
【００４７】
組換えＤＮＡ技術
ＤＮＡ修飾酵素および制限エンドヌクレアーゼは、標準条件下、製造会社が推薦する緩衝液中で使用した。標準手順書に従って、ＤＮＡおよびタンパク質の一般的な分子クローニング技術および電気泳動法を実施した。グリシンの存在下で増殖させた細胞のエレクトロポレーションによって、Ｌ．ｌａｃｔｉｓを形質転換した。（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３ａ）。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔを使用して、通常通りに精製した。
【００４８】
ｍＴＦＦ１のＰＣＲ増幅
オリゴヌクレオチドプライマーｍＴＦＦ１ＳおよびｍＴＦＦ１Ａを使用して、ｍＴＦＦ１ｃＤＮＡを含むプラスミドに対してＰＣＲ反応を実施した（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，１９９３）。ｍＴＦＦ１Ｓプライマーは、シグナル配列の後の最初のヌクレオチドからｍＴＦＦ１のセンス鎖の最初の１８ヌクレオチドに相当する。ｍＴＦＦ１Ａプライマーは、停止コドンを含むｍＴＦＦ１のセンス鎖の最後の２６ヌクレオチドに相補的であり、特別のＳｐｅｌ制限部位を導入する。
【００４９】
【表２】
0004644401.tif 000004
ここで、ｍＴＦＦ１Ａ中のＡＣＴＡＧＴは、Ｓｐｅｌ部位を表す。
【００５０】
平滑末端を担持するＰＣＲ産物を与えるＶｅｎｔTM  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＵＳＡ）を使用して、ＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲ混合物は、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ２単位、Ｖｅｎｔ緩衝溶液（サーモポル（ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ））１０μl、ｄＸＴＰ  ４μl（最高０．５mM）、各プライマー５μl（０．５μＭ）、鋳型ＤＮＡ  １μl（５０ng）およびＨ2Ｏ  ７４μlで構成されていた。それぞれ、０、１、２、３、４および５mMに調整した、ＭｇＳＯ4の最終濃度が異なる６つの反応を準備した。ＰＣＲ増幅サイクルは以下の通りであった。Ｔ0：９４℃で３００秒、Ｔ1：９４℃で４５秒、Ｔ2：６０℃で３０、Ｔ3：７２℃で２０秒、Ｔ4：２０℃で１０秒。これらのＴ1からＴ3までのサイクルを３０回実施した。これらのプライマーを用いたＰＣＲ増幅は、シグナル配列が欠如し、且つ付加的なＳｐｅｌ制限部位を含む、成熟ｍＴＦＦ１の遺伝子を与える。ゲル電気泳動法で確認後、増幅されたフラグメントが、予期される長さの範囲のバンドとして出現する。ｍＴＦＦ１配列の５′末端は、フォワードプライマーに相補的な２つの可能な標的配列を含む。結果として、上述のプライマーを使用して、それぞれ、２０２塩基対および２０８塩基対の２つのフラグメントをｍＴＦＦ１  ｃＤＮＡから増幅することができる。これらのフラグメントは、アガロースゲル電気泳動法では解析できないと考えられる。
【００５１】
プラスミドの構築
ＰＣＲフラグメントをコードするｍＴＦＦ１トレフォイルペプチドのアクセプターとして、異なる２タイプのベクターを使用した。２種の親ベクター（ｐＴＲＥＸ１（Ｗｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，１９９６）から誘導されたｐＴ１ＮＸ、およびｐＬＥＴ２ＮＸ（Ｓｔｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９５）から誘導されたｐＬＥＴ２ＮＸ）の一次構造は、以下の共通エレメントを含む：プロモーター（Ｔ７またはＰ１）、究極的なアミノ酸残基をコードする配列（Ｓｔｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９５）と重複するＮａｅｌ制限部位を含むように修飾された、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ｕｓｐ４５分泌シグナル配列（ｖａｎ  Ａｓｓｅｌｄｏｎｋ  ｅｔ  ａｌ，１９９０および第０４５５２８０号のもとに発行された欧州特許出願）および下流のＳｐｅｌ制限部位。ｐＴ１ＮＸ由来のプラスミドは、エリスロマイシンに対する抵抗性を特定し、ｐＬＥＴ２ＮＸ由来のプラスミドは、クロラムフェニコールに対する抵抗性を特定する。ＤＮＡ溶液５０μl、Ｓｐｅｌ緩衝溶液１０μl、Ｓｐｅｌ  ５０単位、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＩＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＵＳＡ）１０単位、ｐＨ７．５に調整した０．５mM  ＡＴＰ、およびＨ2Ｏ  ３６μlを使用して、ＰＣＲフラグメントを３７℃で１時間処理した。精製ＤＮＡ  １０〜２０μl、Ｎａｅｌ緩衝溶液１０μl、Ｎａｅｌ  １０単位，Ｓｐｅｌ  ５０単位、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）１単位およびＨ2Ｏ  ７３〜６３μlを使用して、ベクターｐＴ１ＮＸを３７℃で１時間消化した。３０分間のインキュベーション後、Ｓｐｅｌ  ５０単位およびＮａｅｌ  １０単位を混合物に再度加えた。制限酵素を失活させ、フェノール／クロロホルム抽出で、混合物から抽出した。制限消化後、「マウスＴＦＦ１（ｍＴＦＦ1）のＰＣＲ増幅」のところで前述した、ｍＴＦＦ１由来のバンド（１９５ｂｐおよび２０１ｂｐのフラグメントを含む）およびベクター部分をアガロースゲルから切除した。「Ｒｅａｄｙ  Ｔｏ  Ｇｏ」Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＫ）を使用して、各ＰＣＲフラグメントとベクターとを１６℃で４５分間ライゲートした後、プロモーターの調節下あるｕｓｐ  ４５分泌シグナル配列へのインフレーム融合物としてｍＴＦＦ１シストロンを含む組換えプラスミドが得られた。
【００５２】
構成要素Ｌ．ｌａｃｔｉｓＰ１プロモーターを含むプラスミドｐＴ１ｍＴＦＦ１（図１ａ）は、ｐＴ１ＮＸの精製Ｎａｅｌ−Ｓｐｅｌベクター部分と、Ｓｐｅｌ切断して５′リン酸化したＰＣＲフラグメントとのライゲーションの結果生じた。
【００５３】
誘導可能なＥ．ｃｏｌｉファージＴ７プロモーターを含むプラスミドｐＬ２ｍＴＦＦ１ｖ１（図１ａ）は、ｐＬＥＴ２Ｎの精製Ｎａｅｌ−Ｓｐｅｌベクター部分と、Ｓｐｅｌ切断して５′リン酸化したＰＣＲフラグメントとのライゲーションの結果生じた。Ｔ７プロモーターは、たとえばプラスミドｐＩＬＰＯＬによりコードされる同族のＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって活性化できるに過ぎない。このプラスミドは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ菌株ＭＧ１８２０〔ｐＩＬＰＯＬ〕中に存在する（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９３ｃ）。
【００５４】
構造解析用に、プラスミドｐＴ１ｍＴＦＦ１をＬ．ｌａｃｔｉｓ菌株ＭＧ１３６３に形質転換した。ＧＭ１７Ｅｒプレートで細胞を増殖させた。ＧＭ１７Ｅｒ  ２．５ml中でコロニーを成長させ、プラスミドを単離した。分析用消化を用いて、ｐＴ１ＮＸベクター（ＤＮＡ（ｐＴ１ＮＸ）２μl、ＥｃｏＲＩ  ２０単位、Ｓｐｅｌ  ５０単位、Ｓｐｅｌ−緩衝溶液２μlおよびＨ2Ｏ  １５μl）と単離した組換えプラスミド（ＤＮＡ  ５μl、ＥｃｏＲＩ  ２０単位、Ｓｐｅｌ  ５０単位、Ｓｐｅｌ−緩衝溶液２μl、１０μg／mlのＲｎａｓｅ  Ａ原液０．２５μl、Ｈ2Ｏ  １２μl）の制限パターンを比較した。このプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＳｐｅｌで、３７℃にて１時間切断した。参照プラスミドの場合、９０７ｂｐおよび４９９９ｂｐの２つの線状フラグメントが予測される。ｐＴ１ｍＴＦＦ１の場合、４９９ｂｐおよび４９９９ｂｐの２つのバンドが予測される。アガロースゲル電気泳動およびＥｔＢｒ染色で可視化した、実験的に得られたフラグメントのサイズは、予測した長さと一致した。各組換えプラスミドから、１つの陽性培養をＧＭ１７Ｅｒプレート上で画線し、単離コロニーを得た。続いてコロニー１個をＧＭ１７Ｅｒ培地１００ml中に接種し、飽和するまで増殖させた。細胞を回収し、プラスミドを精製した。それらの物理的構造を、制限酵素分析およびアガロースゲル電気泳動法で検証した。さらに、配列分析で、ｍＴＦＦ１シストロンがｕｓｐ４５分泌リーダー配列とインフレームで完全にライゲートされたことが明らかにされた。ｐＴ１ｍＴＦＦ１は、成熟ｍＴＦＦ１の全コード配列を表す２０８ｂｐの挿入物を含む（「マウスＴＦＦ１（ｍＴＦＦ１）のＰＣＲ増幅」のところで前述）。
【００５５】
構造解析用に、プラスミドｐＬ２ｍＴＦＦ１ｖ１を菌株ＭＧ１８２０〔ｐＩＬＰＯＬ〕に形質転換した。ＧＭ１７Ｃｍプレートで細胞を増殖させた。ＧＭ１７Ｃｍ  ２．５ml中でコロニーを成長させ、プラスミドを単離した。分析用消化を用いて、ｐＬＥＴ２ＮＸベクター（ＤＮＡ（ｐＬＥＴ２ＮＸ）  ２μl、ＥｃｏＲＩ  ２０単位、Ｓｐｅｌ  ５０単位、Ｓｐｅｌ−緩衝溶液２μlおよびＨ2Ｏ  １５μl）と単離した組換えプラスミド（ＤＮＡ  ５μl、ＥｃｏＲＩ  ２０単位、Ｓｐｅｌ  ５０単位、Ｓｐｅｌ−緩衝溶液２μl、１０μg／mlのＲｎａｓｅ  Ａ原液０．２５μl、Ｈ2Ｏ  １２μl）の制限パターンを比較した。この組換えプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＳｐｅｌで、３７℃にて１時間切断した。参照プラスミドの場合、９０７ｂｐおよび４６５０ｂｐの２つの線状フラグメントが予測される。ｐＬ２ｍＴＦＦ１の場合、４９９ｂｐおよび４６５０ｂｐの２つのバンドが予測される。アガロースゲル電気泳動およびＥｔＢｒ染色で可視化した、実験的に得られたフラグメントのサイズは、予測した長さと一致した。組換えプラスミドから、１つの陽性培養をＧＭ１７Ｃｍプレート上で画線し、単離コロニーを得た。続いてコロニー１個をＧＭ１７Ｃｍ培地１００ml中に接種し、飽和するまで増殖させた。細胞を回収し、プラスミドを精製した。その物理的構造を、制限酵素分析およびアガロースゲル電気泳動法で検証した。さらに、配列分析で、ｍＴＦＦ１シストロンがｕｓｐ４５分泌リーダー配列とインフレームでライゲートされたことが明らかにされた。ｐＴ１ｍＴＦＦ１は、成熟ｍＴＦＦ１の全コード配列を表す２０８ｂｐの挿入物を含む（「マウスＴＦＦ１（ｍＴＦＦ１）のＰＣＲ増幅」のところで前述）。この分析はさらに、ｐＬ２ｍＴＦＦ１ｖ１が２０２ｂｐの挿入物を含むことを示した（従って、成熟ｍＴＦＦ１の最初の２個のアミノ末端アミノ酸残基が欠けている；「マウスＴＦＦ１（ｍＴＦＦ１）のＰＣＲ増幅」のところで前述）。組換えプラスミドの配列を図１ｂおよび１ｃに示す。公表された構成部分の配列から、これらの全配列を編集した。さらに、ＰＣＲフラグメント等の配列の関連セクションおよびライゲーション連結点を実験的に検証した。
【００５６】
形質転換Ｌ．ｌａｃｔｉｓにおけるタンパク質発現
上述の通りに構築したプラスミドを用いて、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ菌株を形質転換した。ｐＴ１ｍＴＦＦ１プラスミドの形質転換には、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ菌株ＭＧ１３６３（Ｇａｓｓｏｎ，１９８３）を使用した。ｐＬ２ｍＴＦＦ１ｖ１プラスミドの形質転換には、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ菌株ＭＧ１８２０（ｐＩＬＰＯＬ）（Ｍａｅｄａ  ａｎｄ  Ｇａｓｓｏｎ，１９８６）を使用した。
【００５７】
これらの形質転換Ｌ．ｌａｃｔｉｓ菌株によるタンパク質の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出した。
【００５８】
培養上澄分画を調製するために、ｐＴ１ｍＴＦＦ１プラスミドの場合はＧＭ１７Ｅｒ培地５ml中で、あるいはｐＬ２ｍＴＦＦ１ｖ１プラスミドの場合はＧＭ１７Ｃｍ培地５ml中で、細胞を２８℃にて２０時間増殖させた。培養を、ＧＭ１７Ｅｒ培地またはＧＭ１７Ｃｍ培地のいずれか５mlで、１／１００希釈し、２８℃にて３時間増殖させた。２８００rpmにて２０分間遠心分離することにより細胞を回収し、適切な培地、すなわち、ＭＧ１３６３細胞の場合にはＧＭ９ＢＥｒ、あるいはＭＧ１８２０〔ｐＩＬＰＯＬ〕細胞の場合にはＬＭ９ＢＣｍ  ５mlに再懸濁した。さらに５時間増殖させた後、細胞をペレット化させた。フェノール抽出およびエタノール沈降により、培地分画中に存在するタンパク質を除去した。
【００５９】
〔ｐｉＬＰＯＬ；ｐＬ２ｍＴＦＦ１ｖ１〕を用いて形質転換したＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＧ１８２０菌株および〔ｐＴＲＥＸ１；ｐＴ1ｍＴＦＦ１〕を用いて形質転換したＬ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３と比較して、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＧ１８２０対照菌株の培養上澄分画で発現したタンパク質を図２に示す。この図は、対照と比較したときの、ＭＧ１８２０〔ｐＬ２ｍＴＦＦ１ｖ１〕およびＭＧ１３６３〔ｐＴ1ｍＴＦＦ1〕における適切なサイズの特別のタンパク質バンド（やじりで示す）を示す。この図から確認できる通り、組換え遺伝子の発現はかなり低い。他の研究者は、胃および腸の損傷を修復するための治療に、劇的に高レベルで精製トレフォイルペプチドを使用する（たとえばＴｒａｎら（１９９９）は、毎日２．５ｍｇ／ｋｇ体重のレベルでヒト組換えＴＴＦ２の直腸内投与を５日間使用して、実験的に組み込んだラットにおける大腸炎（アルコールに溶解したジニトロベンゼンスルホン酸の結腸内投与）の炎症指数を減少させた）ため、確認されたｉｎ  ｖｉｖｏ結果は意外であった。
【００６０】
実施例２：ＭＧ１３６３〔ｐＴ1ｍＴＦＦ1〕のｉｎ  ｖｉｖｏ試験
胃内投与用細胞調製物
Ｌ．ｌａｃｔｉｓ菌株ＭＧ１３６３〔ｐＴＲＥＸ１〕、ＭＧ１３６３〔ｐＴ1ｍＴＦＦ1〕の形質転換体をＧＭ１７Ｅｒプレート上で画線し、２８℃にて一晩増殖させた。各場合に、コロニー１個を、ＧＭ１７Ｅｒ培地１５ml中、２８℃にて一晩増殖させた。上記細胞を−２０℃で保存するために、この培養に、１００％グリセロール１５mlを加えた。マウスを治療するために、毎日、必要量の細胞を接種することが可能であった。この目的を達成するために、ＧＭ１７Ｅｒ培地１０mlに培養を１／２００希釈した。３０℃にて最低限２０時間増殖させた後、２８００rpmで１５分間遠心分離することにより、細胞を回収した。次いで、抗生物質を含まないＭ９Ｂ  １mlに細胞を再懸濁した。
【００６１】
急性大腸炎マウスでのｉｎ  ｖｉｖｏ試験
これらのＬ．ｌａｃｔｉｓ細菌から発現されたトレフォイルペプチドの作用を、急性大腸炎罹患マウスで試験した。７日の間に、メスＢａｌｂ／ｃマウス２１匹に、飲料水に溶解した５％ＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）を投与した。この方式で、急性大腸炎を誘導した（Ｋｏｊｏｕｈａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）。治療のために、ＤＳＳ処理の１日から７日まで、細菌懸濁液１００μl（最低限１．１０8細胞）を使用して、胃カテーテルで、これらのマウスに経口的に毎日接種した。指示通りに、マウス６匹にＭＧ１３６３〔ｐＴＲＥＸ１〕細胞を接種し、マウス６匹に、ＭＧ１３６３〔ｐＴ1ｍＴＦＦ1〕細胞を接種し、マウス３匹には接種しなかった（ＤＳＳ対照）。大腸炎の誘導後８日に、マウスを屠殺し、免疫学的および組織学的に検査した。
【００６２】
血清の免疫学的試験で、処理マウスは、発現したタンパク質に対して免疫応答を示さないことがわかった。８日に瀉血したマウスから血清を採取した。この血清が、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ細胞の培地分画中に存在するタンパク質に対する抗体を含むかどうかを確認するために、ウエスタンブロッティングで分析した。使用した培地分画は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ菌株ＭＧ１３６３〔ｐＴＲＥＸ１〕およびＭＧ１３６３〔ｐＴ1ｍＴＦＦ1〕に由来するものであった。濃縮した（フェノール抽出およびエタノール沈降）培地分画１mlの等価物をＳＤＳ−ポリアクリルアミド（２０％）ゲル電気泳動法で分析した。ニトロセルロースフィルターにブロッティング後、フィルターを４グループのマウス血清溶液と共に１時間インキュベートした。ニトロセルロースブロッキング緩衝溶液（Ｂｌｏｔｔｏ：１０×ＰＢＳ  １００ml、１Ｍ  ＮａＣｌ  １５０ml、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ２ml、無脂肪粉乳２５ｇ、総用量１リットルまでの水）２０mlで、血清を５００倍希釈した。二次抗体として、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したヒツジ抗マウスＩｇＧを使用した。５００倍希釈した血清を使用して、シグナルは全く検出されなかった。
【００６３】
処理マウスの結腸に組織学的分析を実施した。結腸を長さ方向に切断し、遠位部分（肛門に最も近い）、中間部分および近位部分に３等分した。３．７％ホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）で一晩固定し、パラフィンブロック中での組織サンプルの立位を確実にしてパラフィン包埋した後、これらの結腸部分を組織学的に分析した。各組織サンプルから、サンプル全域にわたって一様に間隔があいた、厚さ３μmの平行な長軸方向の切片３つを作製した。これらの横断面をヘマトキシリン／エオシンで着色した。切片に得点をつける前に、スライド上のラベルを覆うことを意味する盲目様式で、組織学的分析を実施した。数グループのマウスから得られた切片を載せたスライドを無作為化してから検鏡した。次いで、表１に記載の症状の説明に従って、各スライドに組織学的得点を割り当てた（０から５までの範囲）。
【００６４】
各マウスおよび各結腸部分について、３切片の平均得点を算出した。結腸の遠位部分および中間部分では、上皮の損傷および浸潤からなる炎症が最も顕著であった。近位部分では、炎症はほとんど全く認められなかった。動物のグループ当たりの遠位結腸部分および中間結腸部分の両者について、平均組織学的得点を算出した。最終的な組織学的総得点は、別々の２つの得点の合計であり（総得点＝上皮損傷の得点＋浸潤の得点）、炎症の程度の尺度である。各グループのマウスに関する遠位結腸部分の組織学的総得点を図３に示す。
【００６５】
図３に示した結腸の遠位部分に関する組織学的得点から、トレフォイルペプチドを産生するＬ．ｌａｃｔｉｓ細胞をマウスに接種したとき、炎症が明らかに減少すると結論することができるであろう。〔ｐＴ１ｍＴＦＦ１〕形質転換Ｌ．ｌａｃｔｉｓ細胞を投与されたマウスは、６５％を超える炎症の顕著な減少を示す。
【００６６】
図３から分かるように、結腸の遠位部分における炎症性浸潤および上皮損傷は、ｍＴＦＦ１ポリペプチドを分泌する組換えＬ．ｌａｃｔｉｓ菌株の接種により著しく減少した。
【００６７】
以上の結果は、より大きいグループ（グループサイズ＝１０）およびより多くの対照群を含む、同様に実施された別の実験で確認された。図４は、健常な対照マウス（対照）、および記載の通りにＤＳＳを投与され、未治療のままである（ＤＳＳ）か、または指示通りにＭＧ１３６３、ＭＧ１３６３〔ｐＴ1ＴＲＥＸ１〕またはＭＧ１３６３〔ｐＴ1ｍＴＦＦ1〕で治療された（上述の通り）マウスの組織学的得点（上述の通りに得た）を示す。実験から、ＭＧ１３６３〔ｐＴ1ｍＴＦＦ1〕で治療したマウス群における、腸炎症の明白且つ顕著な減少がわかる。
【００６８】
後者の実験は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）（両者とも、当業者に周知のプロ炎症性サイトカイン類である）のレベルを決定することによっても評価した。マウス（ｎ＝１０）に、指示通りの菌株を接種した。対照＝健常マウス、ＤＳＳ＝飲料水に溶解した５％ＤＳＳを投与し、治療しなかったマウス。結腸を準備し、パンチ（直径＝４mm）を用いて、同じ表面を有する部分を単離した。各グループの組織サンプル上に、ＲＰＭＩ５００μl＋１０％ウシ胎仔血清を載せ、３７℃で一晩インキュベートした。上澄を回収し、ＥＬＩＳＡでサイトカイン含量を滴定した。各組織中のＩＬ−１βおよびＩＦＮ−γの量を図５に示す。結果から、ＭＧ１３６３〔ｐＴ１ｍＴＦＦ１〕で治療したマウス群における、これらのプロ炎症性サイトカイン類の明白な減少がわかる。
【００６９】
実施例３：ＭＧ１３６３〔ｐＴＩＴＦＦ１〕および精製ＴＦＦ１による治療の比較
プラスミドの構築
ｍＴＦＦ１形Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの発現の場合、プラスミドｐＰＩＣｍＴＦＦ１を構築した。このために、記述（マウスＴＦＦ１のＰＣＲ増幅）通りに、ｍＴＦＦ１遺伝子をＰＣＲ増幅した。このフラグメントを、ｐＰＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の誘導体の、露にされたＮａｅｌ制限部位でライゲートした。ライゲーション混合物をＥ．ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１に形質転換し、正確に組立てられたたクローンを、制限分析およびＤＮＡ配列決定（図１ｄの配列）で同定した。このようにして得られたプラスミドｐＰＩＣｍＴＦＦ１において、ｍＴＦＦ１配列をＳａｃｈａｒｏｍｕｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−接合因子プレプロ分泌シグナルとインフレームで融合させる。
【００７０】
ｍＴＦＦ１の発現および精製
Ｌｏｇｇｈｅ（１９９５）に記載の方法で、プラスミドｐＰＩＣｍＦＦ１をＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳＴ１１５に形質転換し、ｍＴＦＦ１単位がｈｉｓ４遺伝子座に組み込まれた陽性クローンを、ＰＣＲ同定によって選択した。これらの陽性クローンをメタノールで誘導し、培養上澄のタンパク質分析により、発現についてスクリーニングし、陰性対照（陰性）と比較したとき、６．５ｋＤａにおける特別のバンド（ＧＳＴ１１５：：ｐＰＩＣｍＴＦＦ1）の特に高い発現を示す１つのクローンを、さらなる研究のために維持した（図６、やじりで表示）。特別のタンパク質バンドは、タンパク質配列決定で、ｍＴＦＦ１と同定された。発現手順を最適化スケールアップし、１６リットル培養に最適化させ、培養上澄からｍＴＦＦ１を精製した。このために、メタノール誘導したＧＳＴ１  １５：：ｐＰＩＣｍＴＦＦ１上澄を接線濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｐｒｏｆｌｕｘ  Ｍ１２、カットオフ３０００Ｄａ）で濃縮し、ｐＨ７．４の０．０２Ｍリン酸緩衝溶液に透析した。イオン交換カラム（ＢｉｏｒａｄのＱ−カラム）を用いて、この濃縮物からｍＴＦＦ１を精製した。アイソクラティック塩勾配により、カラムからタンパク質を溶離した。このようにして得られたｍＴＦＦ１は９９％以上純粋であり、これをさらに濃縮した。最終調製物は、１６０ng／ml未満のＬＰＳを含有する。この量のＬＰＳは許容限界内であり、ｐＳ２タンパク質をさらなる実験で使用することができる。精製ｍＴＦＦ１をサイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５；  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で分析した後、ｍＴＦＦ１の７．５％は単量体形であると結論した（図７Ａ）。これは、精製ｍＴＦＦ１の還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥと非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認された（図７Ｂ）。
【００７１】
精製ＴＦＦ１の生物学的活性の評価
ＴＦＦ１タンパク質の周知の特徴は、このタンパク質をＣａｃｏ−２細胞単層に投与した後、Ｅ−カドヘリンの表面発現が著しく低下することである（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）。我々は、上述のｍＴＦＦ１調製物をＣａｃｏ−２単層に投与した後、Ｅ−カドヘリン表面発現が１０％低下することを示した。
【００７２】
ネズミ急性大腸炎の精製ｍＴＦＦ１による治療：
急性大腸炎を誘発するために、飲料水に溶解した６％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ、ＭＷ４００００）をマウスに７日間投与した（Ｋｏｊｏｕｈａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。実験に使用したマウスは齢が釣り合っており、同時にＤＳＳ投与を受けた。治療のために、−７日から０日までの、ＤＳＳ投与前（投与前群）、０日から７日までの、ＤＳＳ投与中（投与中群）、および７日から１４日までの、投与後（投与後群）に、ＰＢＳ  ２００μlに溶解したｍＴＴＦ１  ５０μgをマウスに投与した。ｍＴＦＦ１を送達する異なる経路を研究するために、各設定で、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、胃内接種および直腸投与によって、マウスに投与した。ＤＳＳを含まない飲料水を１日与えた後、８日にマウスを屠殺し（投与前群および投与中群）、また、ＤＳＳを含まない飲料水を７日与えた後、１４日にマウスを屠殺した（投与後群）。飲料水に溶解したＤＳＳを投与された、非治療対照群は、８日および１４日に屠殺した。全群、マウス９匹で構成されていた。図８に示す結果から、どの治療計画でも、統計学的に有意な改善が認められないことが明らかにわかる。改善が確認されていた（図３および４）ため、記載の発明は意外であった。これは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓによるＴＦＦ１の送達は、観察された治療効果に本質的に寄与することを意味する。
【００７３】
【表３】
0004644401.tif 000005
【００７４】
【表４】
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0004644401.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】  図１：使用したプラスミドの概要。
図１ａ：プラスミドｐＬ２ｍＴＦＦ１ｖ１、およびｐＴ１ｍＴＦＦ１の略地図。Ｔ７は、コリファージＴ７由来の主要後期プロモーターである。（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｆｆａｔｔ，１９８６）。Ｐ１は、Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ  ら（１９９５）に記載の乳酸球菌プロモーターであり、ｕｓｐ４５Ｓは、乳酸球菌Ｕｓｐ４５タンパク質由来の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメントであり（ｖａｎＡｓｓｅｌｄｏｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ，１９９０）、ｍＴＦＦ1は、ネズミＴＦＦ１の成熟部分をコードするＤＮＡフラグメントであり、ｍｔｆｆ１ｖ１は、切断型（アミノ末端アミノ酸残基２個が欠けている）成熟ネズミＴＦＦ１をコードするＤＮＡフラグメントであり、Ｃｍはクロラムフェニコール選択マーカーであり、Ｅｍはエリスロマイシン選択マーカーである。ｐＰＩＣｍＴＦＦ１について：ＰＰＭＦはプレプロＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−接合因子であり、ＡＯＸ１  ｐｒｏｍはアルコールオキシダーゼプロモーターであり、ＡＯＸ１  ｔｅｒｍはアルコールオキシダーゼターミネーターであり、ＨＩＳ４はヒスチドール（Ｈｉｓｔｉｄｏｌ）デヒドロゲナーゼ遺伝子であり、ＯｒｉはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ複製起点であり、ＡＯＸｆｒはアルコールオキシダーゼ遺伝子の３′フラグメントであり、ＡｍｐＲはアンピシリン耐性遺伝子であり、全ての構成成分は、ｐＰＩＣ９プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来する。
【図１ｂ】  図１ｂ：プラスミドｐＬ２ｍＴＦＦ１ｖ１のＤＮＡ配列（配列番号１）。
【図１ｃ】  図１ｃ：プラスミドｐＴ１ｍＴＦＦ１のＤＮＡ配列（配列番号２）。
【図１ｄ】  図１ｄ：プラスミドｐＰＩＣｍＴＦＦのＤＮＡ配列（配列番号３）。
【図２】  図２：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。異なるタンパク質画分は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＧ１８２０〔ｐＩＬＰＯＬ〕（対照）、ＭＧ１８２０〔ｐＩＬＰＯＬ；ｐＬ２ｍＴＦＦ１ｖ１〕、ＭＧ１３６３〔ｐＴＲＥＸ１〕またはＭＧ１３６３〔ｐＴ1ｍＴＦＦ1〕細胞の培地に由来する。左の２つのレーンは、分子量がｋＤａで与えられているマーカータンパク質を含む。クーマシーブルー染色を使用して、このタンパク質を可視化した。
【図３】  図３：結腸の遠位部分の組織学的得点の表示。左上のグラフ：上皮損傷（遠位部分結腸）。右上のグラフ：炎症性浸潤（遠位部分結腸）。下のグラフ：上の（遠位部分結腸）の組織学的得点の合計。
【図４】  図４：健常なマウス（対照）、あるいは治療しなかった（ＤＳＳ）かまたはＭＧ１３６３、ＭＧ１３６３〔ｐＴＲＥＸ１〕細胞またはＭＧ１３６３〔ｐＴ１ｍＴＦＦ１〕細胞で治療した後の急性ＤＳＳ大腸炎マウス結腸の遠位部分の組織学的得点の表示。
【図５】  図５：急性炎症結腸組織におけるプロ炎症性サイトカイン滴定。健常なマウス（対照）、あるいは治療しなかった（ＤＳＳ）かまたはＭＧ１３６３、ＭＧ１３６３〔ｐＴＲＥＸ１〕細胞またはＭＧ１３６３〔ｐＴ１ｍＴＦＦ１〕細胞で治療した後の急性ＤＳＳ大腸炎マウスの、遠位結腸におけるインターロイキン−１β（左）ならびに中間結腸および遠位結腸におけるインターフェロン−γ（右）。
【図６】  図６：選択されたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＧＳＴ１１５：：ｐＰＩＣｍＴＦＦ1）の培地由来のタンパク質分画および陰性対照のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。さらに、ｍＴＦＦ１の産生に使用されたｍＴＦＦ１プロデューサークローンを、やじりで示す。クーマシーブルー染色を使用して、このタンパク質を可視化した。
【図７】  図７Ａ：精製ｍＴＦＦ１（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のゲル濾過パターン。ｍＴＦＦ１タンパク質は２つのピークで溶離し、その大部分が、画分１４、１５、１６（ダイマー）および２０（モノマー）に存在する。これらの画分中のタンパク質の正体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでｍＴＦＦ１であることが証明された（挿入図）。クーマシーブルー染色を使用して、このタンパク質を可視化した。
図７Ｂ：精製ｍＴＦＦ１の還元下および非還元下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。左のレーンは、表示サイズのサイズマーカーである（クーマシーブリリアントブルー染色）。
【図８】  図８：急性ＤＳＳ誘発性大腸炎の組込み前（ｐｒｅ）、組込み中（ｄｕ）または組込み後（ｐｏ）、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）、経口接種（ｏｒａｌ）および直腸接種（ｒｅｃｔａｌ）接種によって治療したマウス結腸の遠位部分の組織学的得点の表示。ＤＳＳｄｕは、急性ＤＳＳ大腸炎を誘発するためにＰＢＳを投与したマウスの得点を表す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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