(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列における４５〜１４７番又は１７７〜２４１番の領域のアミノ酸残基を有するポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を含む、大腸癌または肝臓癌診断剤。
【請求項２】
配列番号３０及び配列番号３１に示す塩基配列からなるプライマーを含む、大腸癌または肝臓癌診断剤。
【請求項３】
配列番号２の塩基配列を有する遺伝子断片を含むプローブを含む、大腸癌または肝臓癌診断剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＢＡＭＢＩタンパク質に対する抗体、その製造方法、それを含有する大腸癌及び肝臓癌の診断剤又は治療剤に関する。
【背景技術】  大腸癌の診断においては、ＣＥＡまたはＣＡ１９−９などの腫瘍マーカーが有効であると言われてきた。例えば、特開２０００−３２３４９９号は、血液成分から腫瘍マーカーを検出する腫瘍マーカー定量法を開示している。しかしながら、これらの腫瘍マーカーは、癌の存在と必ずしも関連して発現するとは限らず、また癌以外の要因でも異常値となることがあるため、信頼性が高いものではない。
また、大腸癌の発生にはＡＰＣ、ＲＡＳ、ｐ５３等の遺伝子が関係していることが判明している。しかしながら、大腸癌を特異的に検出する、実用性に耐える遺伝子診断法はまだ確立されていない。
更に、大腸癌治療のうち化学療法では癌遺伝子の転写阻害やＤＮＡ切断等の癌細胞に細胞毒性を持つアルキル化薬や代謝拮抗薬等が検討されてきたが、これらの薬剤は、癌細胞だけに選択的に作用せず、正常細胞にも影響を及ぼし、副作用の問題がある。
大腸癌は最も発症頻度の高い腫瘍の１種で、日本でも近年、患者が増加しており、今後さらに増加すると予想されている。そこで、本発明は、大腸癌を適確に診断、治療できる、診断薬および治療薬を提供することを課題としている。
【発明の開示】
大腸癌は、分子レベルでの発症機構が詳しく研究されており、Ｗｎｔシグナル伝達系、Ｋ−ｒａｓ、ｐ５３、ＴＧＦ−β等のシグナル伝達系における異常が高頻度に起きていることが知られている。特に、Ｗｎｔシグナル伝達系の異常は大腸癌発症の最も初期にみられ、大腸癌発症の鍵を握っていると考えられることから、本発明者らは、大腸癌におけるＷｎｔシグナル伝達系について検討することにより、新規な大腸癌の診断剤及び治療剤の開発を試みた。
Ｗｎｔシグナルは、細胞内シグナル伝達系で、例えば胚発生では、初期の体軸形成や原腸陥入に伴う細胞運動からその後の器官形成に至るまで、形づくりの多くの場面で多彩な働きをしている。さらに成体でも細胞の増殖・分化の制御に重要な役割を果たしており、Ｗｎｔシグナル伝達経路の制御機構が破綻することにより該経路が恒常的に活性化されることが、細胞の癌化に重要な働きを担っていることが明らかとなっている。Ｗｎｔシグナル伝達経路が活性化すると、β−カテニン（β−ｃａｔｅｎｉｎ）が細胞内に蓄積され、β−ｃａｔｅｎｉｎがＴＣＦ／ＬＥＦファミリーの転写因子と相互作用することで、サイクリンＤ（ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ）、ｃ−ｍｙｃなどの細胞増殖に重要な役割を果たす標的遺伝子の発現を活性化する。種々の腫瘍細胞において、β−ｃａｔｅｎｉｎの蓄積が観察される。Ｗｎｔシグナルが存在しないと、β−ｃａｔｅｎｉｎは、アキシン（Ａｘｉｎ）、ＧＳＫ−３β、及び腫瘍抑制ＡＰＣと相互作用し、β−ｃａｔｅｎｉｎはＧＳＫ−３βの作用でリン酸化され、細胞内で分解される。図１にＷｎｔシグナル伝達系の概要図を示している。
ところが、大腸癌では、Ｗｎｔシグナル伝達経路の構成因子ＡＰＣ、β−ｃａｔｅｎｉｎ、Ａｘｉｎに変異が生じることによりβ−ｃａｔｅｎｉｎの分解が低下している。さらに、Ａｘｉｎの変異は肝臓癌で、β−ｃａｔｅｎｉｎの変異は皮膚癌、肝臓癌、卵巣癌などでも見出されている。蓄積したβ−ｃａｔｅｎｉｎは転写因子ＴＣＦ／ＬＥＦと複合体を形成し標的遺伝子の転写を異常に活性化することにより細胞の癌化を引き起こすと考えられる。したがって、β−ｃａｔｅｎｉｎ／ＴＣＦ複合体の標的遺伝子を明らかにすることは、癌化の機構を明らかにするために極めて重要である。
そこで、本発明者らは、既に、β−ｃａｔｅｎｉｎに結合してＴＣＦ／ＬＥＦとの複合体形成を阻害することによりＷｎｔシグナル伝達経路を負に制御する新規因子を探索し、ＩＣＡＴ遺伝子を見出している（Ｔａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｖｏｌ．１４，ｐ．１７４１−１７４９）。
Ｗｎｔシグナル伝達経路の異常亢進が腫瘍の発症に重要であることから、Ｗｎｔシグナルを抑制するＩＣＡＴは腫瘍の発症を制御できる可能性があると期待されている。実際、本発明者らはアデノウイルスを用いてＩＣＡＴを癌細胞に発現して増殖抑制効果を検討することにより、ＩＣＡＴがＷｎｔシグナルに異常のある（ＡＰＣ、β−ｃａｔｅｎｉｎ、Ａｘｉｎの変異）大腸癌、肝癌の増殖を特異的に阻害することを見出している。他方、ＩＣＡＴは、正常細胞や他の機構で癌化した癌細胞には増殖抑制効果を示さない（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．６２，３３２２−３３２６）。つまり、ＩＣＡＴは、Ｗｎｔシグナル伝達経路の異常により亢進した転写活性化を抑制することで、大腸癌細胞の増殖を抑制していると考えられる。
ここで、Ｗｎｔシグナル系の相互作用を以下に表１としてまとめた。
0004705469.tif 000002
なお、本明細書中で、ＡＰＣはＡｄｅｎｏｍａｔｏｓｉｓ  Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  Ｃｏｌｉ遺伝子、ＤｓｈはＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ、ＧＳＫ−３βはグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３β）、ＴＣＦはＴ細胞特異的転写因子（Ｔ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）、ＦｚはＦｒｉｚｚｌｅｄホモログをそれぞれ意味する。
更に、本発明者らは、癌細胞の増殖に重要なＷｎｔシグナルによって転写活性化される遺伝子は、癌細胞の増殖を抑制するための標的遺伝子となりうると考え、Ｗｎｔシグナルを負に制御するＩＣＡＴを大腸癌細胞に作用させたときに転写が抑制される遺伝子の同定を試みた。そこで、Ｗｎｔシグナル伝達経路が恒常的に活性化されている大腸癌細胞株ＳＷ４８細胞をｃＤＮＡサブトラクションＤＮＡチップを用いてＩＣＡＴの作用で発現の低下する遺伝子を探索したところ、ＢＡＭＢＩ遺伝子が単離された。
ＢＡＭＢＩ（ＢＭＰ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｏｕｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＢＭＰ：Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、最初アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）から分離された推定２６０アミノ酸（ｈＢＡＭＢＩにつき配列番号１参照）からなる膜貫通型タンパク質で、細胞外ドメインがＴＧＦ−β受容体Ｉの細胞外ドメインと類似するが、ＴＧＦ−β受容体Ｉとは異なり細胞内領域にセリン／スレオニンキナーゼドメインは有していない。アフリカツメガエルの胚においては、ＢＭＰ４の発現に引き続いてＢＡＭＢＩの発現が起こり、ＢＡＭＢＩはＢＭＰ４により、その発現が制御されていると考えられている（Ｎａｔｕｒｅ  ４０１，４８０−４８５）。ヒトＢＡＭＢＩは、１９９６年にクローニングされた（「ＮＭＡ」と命名されていた：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６５，４６０−４６５，１９９６）。
また、ＢＡＭＢＩは、ＴＧＦ−β受容体Ｉとヘテロ二量体を形成し、更にＴＧＦ−β受容体ＩＩと相互作用し、正常な細胞中ではＴＧＦ−β受容体ＩとＴＧＦ−β受容体ＩＩが複合体を形成するところ、ＢＡＭＢＩが同複合体の形成を妨げることにより、ＴＧＦ−βシグナル伝達系を阻害すると考えられている（図２参照）。
ＴＧＦ−βは、多くの上皮細胞の増殖抑制に関与するというユニークな生物活性をもつサイトカインである。ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β受容体ＩＩに結合してＴＧＦ−β受容体ＩＩ分子内のセリン・スレオニンキナーゼ活性を亢進させ、該キナーゼによりＴＧＦ−β受容体Ｉがリン酸化される。リン酸化をうけたＴＧＦ−β受容体Ｉは、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３と結合して、リン酸化により活性の亢進したＴＧＦ−β受容体Ｉ分子内セリン・スレオニンキナーゼがＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３をリン酸化する。リン酸化を受けたＳｍａｄ２とＳｍａｄ３がＳｍａｄ４と複合体を形成して核内へ移行し、標的遺伝子の転写活性化を誘導する。多くの大腸癌細胞では、ＴＧＦ−β受容体ＩＩ、Ｓｍａｄ２および／またはＳｍａｄ４の変異が見出されており、これらの細胞では、ＴＧＦ−βによる増殖抑制がかからないことが分かっている。
ＴＧＦβシグナル伝達とＳｍａｄの関係を以下の表２にまとめる。
0004705469.tif 000003
そこで、本発明者らは、ＢＡＭＢＩに対する抗体、及びＢＡＭＢＩプライマーまたはプローブを作成することにより、大腸癌及び肝臓癌を検出し診断できることを見出し、更に、ＢＡＭＢＩに対する抗体及びＢＡＭＢＩをコードする遺伝子もとに作成したｓｉＲＮＡを用いることにより、大腸癌及び肝臓癌の治療ができることを見出し、本発明を完成させたものである。
したがって、本発明は、次に示すような抗体、抗体の製造方法、大腸癌または肝臓癌診断薬、大腸癌または肝臓癌治療薬等を提供する。
１．配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号１のアミノ配列に１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたポリペプチドを認識する抗体。
２．配列番号１のポリペプチドを特異的に認識する前記（１）に記載の抗体。
３．配列番号１のアミノ酸配列における連続する５０アミノ酸残基以上を有するポリペプチドを認識する前記（１）に記載の抗体。
４．配列番号１のアミノ酸配列における４５〜１４７番及び／又は１７７〜２４１番の領域のアミノ酸残基を有するポリペプチドを認識する前記（３）に記載の抗体。
５．モノクローナル抗体である前記（１）に記載の抗体。
６．前記（１）に記載の抗体を産生する形質転換細胞を培養する工程、および該細胞が産生する抗体を採取する工程を含む抗体の製造方法。
７．前記（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体を含む、大腸癌または肝臓癌診断剤。
８．前記（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体を含む、大腸癌または肝臓癌治療剤。
９．配列番号２の塩基配列を有する遺伝子の任意の１５塩基以上からなるプライマーを含む、大腸癌または肝臓癌診断剤。
１０．配列番号２の塩基配列を有する遺伝子断片を含むプローブを含む、大腸癌または肝臓癌診断剤。
１１．配列番号２の塩基配列を有する遺伝子の連続する１５〜３０塩基に対応し、かつＲＮＡ干渉を生ずる二重鎖ＲＮＡを含む、大腸癌または肝臓癌治療剤。
１２．上記の連続する１５〜３０塩基の配列が、ＣＣＡＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＴＡ（配列番号３）、ＣＡＧＡＴＧＣＴＣＴＣＣＣＧＴＴＴＧＣ（配列番号４）、またはＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡＴ（配列番号５）である、前記（１１）記載の大腸癌または肝臓癌治療剤。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｗｎｔシグナル伝達系の概要図である。
図２は、ＴＧＦβ受容体Ｉ及びＴＧＦβ受容体ＩＩとＢＡＭＢＩとの相互作用を示す概略図である。
図３は、ＴＣＦ−４ＤＮＡ結合領域の電気泳動移動度シフトアッセイの結果である。イントロン１に存在するＴＣＦ−４結合配列５カ所を合成し（ＴＢＥ１−５）放射能標識してＧＳＴ−ＴＣＦと結合するかどうかをゲルシフトアッセイにより検証した。その結果、ＴＢＥ１−５はＧＳＴ−ＴＣＦと特異的に結合し、ＧＳＴとは結合しないこと、反応液中に大過剰の非放射能標識ＴＢＥ１−５が存在するとＧＳＴ−ＴＣＦ４の結合が検出できなくなること、変異を導入したＴＢＥ１−５にはこのような効果がないことが確認された。
図４は、大腸癌細胞株ＳＷ４８細胞にアデノウイルスベクターを用い、ＩＣＡＴ、ＴＣＦ−４ドミナントネガティブ変異体を発現させ、ＲＮＡを抽出し、ＢＡＭＢＩやβ−ＡＣＴＩＮに対する特異的プライマーを用い準定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った結果であり、ＢＡＭＢＩの発現はβ−ｃａｔｅｎｉｎ−ＴＣＦを介した転写活性化によって抑制された。
図５は、β−ｃａｔｅｎｉｎ−ＴＣＦを介した転写活性化によるＢＡＭＢＩの発現変化について検討した結果である。左側は、ＳＷ４８細胞にアデノウイルスを用いてＩＣＡＴ、ＴＣＦ−４ドミナントネガティブ変異体を発現させ、抗ＢＡＭＢＩ−Ｎ末端抗体、抗α−Ｔｕｂｌｉｎ抗体を用いて、細胞抽出液のイムノブロッティングを行った結果である。また、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＢＡＭＢＩやＧ３ＰＤＨ特異的プローブを用いてノーザンブロットを行った。右側は、ＣＯＳ−１細胞にアデノウイルスを用いてβ−ｃａｔｅｎｉｎ−Ｓ３３Ｙを発現させ、細胞抽出液を調製し、抗ＢＡＮＢＩ−Ｎ末端抗体あるいは抗α−Ｔｕｂｌｉｎ抗体を用いたイミノブロッティングを行った結果である。
図６は、β−ｃａｔｅｎｉｎ−ＴＣＦ−を介したＢＡＭＢＩプロモーターの転写活性化について検討した結果である。ＢＡＭＢＩプロモーターのβ−ｃａｔｅｎｉｎを介した活性化に対するＴＣＦ−４とＩＣＡＴのドミナントネガティブ変異体の作用を検討した。ＣＯＳ−１細胞にルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＴＯＰ−ｔｋ−ｌｕｃｉｆａｒａｓｅまたは−５７５−ｌｕｃ）をトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性を測定した。
図７は、大腸癌におけるＢＡＭＢＩの発現について、抗β−ｃａｔｅｎｉｎ抗体、抗ＢＡＭＢＩ−Ｎ末端抗体とＣ末端抗体を用いてヒト大腸癌組織と周辺の非癌組織の二重染色を行って調べた結果である。
図８は、準定量的ＲＴ−ＰＣＲにより調べた大腸癌組織および肝臓癌組織におけるＢＡＭＢＩの発現を示す。準定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ＢＡＭＢＩとＡＸＩＮの発現量を調べた（Ｎ，非癌組織；Ｔ，癌組織）。
図９は、ＢＡＭＢＩはＴＧＦ−βによる増殖抑制効果の阻害を示す。図に示したプラスミドをＤＣ−１４５細胞にトランスフェクトし、ＴＧＦ−β存在下あるいは非存在下に４００μｇ／ｍｌジェネティシン含有培地で３週間培養しコロニーフォーメーションアッセイを行った結果である。
図１０は、ＢＡＭＢＩによるＴＧＦ−βを介した転写の活性化を示す。ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流にＰＡＩ−１プロモーターのＴＧＦ−β応答配列を含むｐ３ＴＰ−ｌｕｘレポーターを使い、ＤＵ１４５細胞におけるＴＧＦ−βを介した転写活性化へのＢＡＭＢＩ−ＧＦＰの作用を調べた結果である。
図１１は、抗ＢＡＭＢＩアミノ末端ラビットポリクローナル抗体（２００倍希釈）及び抗ＢＡＭＢＩマウスモノクローナル抗体６Ｇ（１０倍希釈、１００倍希釈）がＢＡＭＢＩタンパク質を認識することを実証する、ウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】１．ＢＡＭＢＩタンパク質を認識する抗体
本発明に係る「抗体」は、抗原であるＢＡＭＢＩタンパク質を認識する（あるいは結合し得る）抗体分子全体又はその断片を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。本明細書中、「ＢＡＭＢＩタンパク質」は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は配列番号１のアミノ配列に１または複数個（例えば、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、１〜２個から選択）のアミノ酸が欠失、置換または付加されたポリペプチド、又はこれらの断片（例えば、アミノ酸残基を１０〜７０個、２０〜６０個、３０〜５０個含む断片）を意味する。本発明の抗体は、抗体変異体を含む。「抗体変異体」とは、元の抗体から１またそれ以上（例えば、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、１〜２個から選択）のアミノ酸残基が改変された、抗体の変異体をいう。アミノ酸配列がどのように改変されたとしても元となった抗体と同様にＢＡＭＢＩタンパク質を特異的に認識することができれば、本発明の範囲内に含まれる。このような変異体は、抗体の重鎖若しくは軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、そして、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性または類似性を有するアミノ酸配列と１００％よりも少ない配列相同性、または類似性を有する。
また、本発明の抗体は、ヒト抗体、ヒト型化抗体、キメラ抗体、および抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ）を含む。上記「ヒト型化抗体」とはマウス等のヒトにとって異種の抗体を改変して、Ｈ鎖とＬ鎖の相補性決定部以外の一次構造をヒトの抗体の対応する一次構造で置き換えた抗体を言う。「キメラ抗体」とは、異種抗体由来のＦａｂ領域とＦｃ領域とを有する抗体を意味する。
本発明において、「抗体断片」とは、全長抗体の一部を指し、一般に、抗原結合領域または可変領域のことである。例えば、抗体断片にはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片が含まれる。抗体のパパイン消化により、Ｆａｂ断片と呼ばれる、それぞれ１つの抗原結合部位を有する２つの同じ抗原結合断片、及び、残りの容易に結晶化するために「Ｆｃ」と呼ばれる断片が生じる。また、ペプシン消化により２つの抗原結合部位を有し、抗原を交差結合し得るＦ（ａｂ’）２断片、及び、残りの別な断片（ｐＦｃ’と呼ばれる）が得られる。その他の断片としては、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片より形成された多特異性抗体が含まれる。
ここで、「Ｆｖ」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含む。この領域は１つの重鎖及び軽鎖の可変ドメインが非共有結合により強く連結されたダイマーである（ＶＨ−ＶＬダイマー）。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。６つのＣＤＲは、抗体に抗原結合部位を付与するものである。しかしながら、１つの可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、全結合部位よりは低い親和性ではあるが、抗原を認識し結合する能力を有する。
また、Ｆａｂ断片（Ｆ（ａｂ）とも呼ばれる）はさらに、軽鎖の定常ドメイン、及び、重鎖の細胞の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片はＦａｂ断片と、抗体のヒンジ領域からの１またはそれ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端由来の数個の残基を付加的に有する点で異なる。本発明の抗体は、種々の方法のいずれかによって製造することができる。
なお、本明細書において、上記のようなＢＡＭＢＩタンパク質に対する抗体を「抗ＢＡＭＢＩ抗体」と称する。
以下、抗ＢＡＭＢＩ抗体の調製方法について説明する。
（１）抗原の調整：
本発明の抗ＢＡＭＢＩ抗体の調製に用いる免疫原として、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは、配列番号１記載のポリペプチドの複数のアミノ酸を欠失、付加、置換させたポリペプチドを挙げることができる。もちろん、配列番号１のアミノ酸配列を有するｈＢＡＭＢＩタンパク質以外にも、他の種のＢＡＭＢＩタンパク質を免疫原として用いることもできる。更に、ＢＡＭＢＩのエピトープ部位が含まれた断片を用いることもでき、例えば、ｈＢＡＭＢＩのアミノ酸４５〜１４７番の領域とアミノ酸１７７〜２４１番の領域とを含む断片を挙げることができる。本発明の抗体の製造のために用いられる免疫原としては、マウス、ヒト等の細胞から精製された天然型のＢＡＭＢＩタンパク質でもよいし、遺伝子工学的に生産されたＢＡＢＭＩタンパク質又はその断片でもよい。また、本発明の抗体の製造にもちいる免疫原は、そのアミノ酸配列を指定することにより市販のタンパク質合成装置を用いて合成することもできる。
（２）モノクローナル抗体の作製
（ｉ）抗体産生細胞の採取
前記のようにして作製したタンパク質又はペプチドを抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１〜１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１〜１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１〜６０日後、好ましくは１〜１４日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
（ｉｉ）細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばＸ６３Ａｇ．８．６５３、ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、ＮＳＯ／１などのマウスミエローマ細胞株、ＹＢ２／０などのラットミエローマ細胞株が挙げられる。
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、１×１０６〜１×１０７個／ｍｌの抗体産生細胞と２×１０５〜２×１０６個／ｍｌのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比２：１〜３：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００〜６０００ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
（ｉｉｉ）ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に３×１０５個／ｗｅｌｌ程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、ＢＡＭＢＩタンパク質に反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によってスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行う。そして、最終的に、ＢＡＭＢＩタンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイブリドーマを樹立する。
（ｉｖ）モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％  ＣＯ２濃度）で７〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採取する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
（３）ＢＡＭＢＩタンパク質に対するポリクローナル抗体の作製
前記の通り調製された抗原を哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１〜１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１０〜１０００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６〜６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｕｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓｙ）又はＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。
次いで、抗血清中のポリクローナル抗体を、ＢＡＭＢＩタンパク質で固定されたアフィニティカラムにかけてＢＡＭＢＩタンパク質と反応する抗体（カラム吸着画分）を採取する。ＢＡＭＢＩタンパク質に対する抗血清中のポリクローナル抗体の反応性はＥＬＩＳＡ法などで測定することができる。
なお、ヒト型化抗体は、免疫原（抗原）をヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫し、既存の一般的な抗体産生方法によって取得することができる。用いるヒト型化抗体産生非ヒト哺乳動物、特にヒト型化抗体産生トランスジェニックマウスの作製方法は公知である（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）；特表平４−５０４３６５号公報；特表平７−５０９１３７号公報；国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報；Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；特表平６−５００２３３号公報等）。
２．大腸癌または肝臓ガン治療剤
さらに、抗ＢＡＭＢＩ抗体は、抗体医薬として用いることもできる。本発明の治療剤として用いる抗体としては、例えば、好ましくはヒトキメラ抗体またはヒト化抗体を用いることができる。本発明の治療剤は、抗ＢＡＭＢＩ抗体を有効成分として含有するもので、大腸癌または肝臓癌の治療（または予防）に有効である。本発明の治療剤は患者（ヒトあるいは非ヒト動物）に応じて、投与量、剤型、投与方法を適宜選択することが出来る。例えば、本発明の治療剤は、経口、非経口、局所その他の適当な経路で投与することができる。一般に有効成分である抗体の投与量は、１日あたり約１ｍｇから約３０００ｍｇ、好ましくは、５ｍｍｇから２０００ｍｇの間であるが、患者の体重および症状や個々の投与経路によって変動し得る。治療する患者の薬物に対する感受性の差異、薬剤の処方の仕方、投与期間および投与間隔によっても投与量に変動が生じてくるので、場合によっては前記範囲の下限より低い投与量が適当なこともある。
本発明の抗体は、単独または薬学的あるいは薬剤学的に許容される担体または希釈剤と共に投与することができ、またその投与は１回または数回に分けて行うことができる。より具体的に述べると、本発明の治療剤は、たとえば各種の薬剤学的に許容される不活性担体と併用して錠剤、カプセル、粉末剤、噴霧剤、水性懸濁液、注射液、エリキシル、シロップ等の形態とすることができる。これらの担体には、固体希釈剤または賦形剤、無菌水性媒体、各種の非毒性有機溶媒等が含まれる。一般に本発明の治療上有効な抗体は、上記のような形態で約５重量％から７０重量％の濃度範囲で投与される。経口投与の場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシンのような種々の賦形剤を、澱粉、アルギン酸やある種のケイ酸複塩のような種々の崩壊剤、ポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼラチン、アラビアゴムのような顆粒形成結合剤と共に使用することができる。また、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の滑沢剤も錠剤形成に非常に有効である。経口投与用として水性懸濁液および／またはエリキシルにしたい場合、必要であれば乳化剤および／または懸濁化剤も併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等、およびそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。非経口投与の場合、本発明の有効成分をゴマ油または落花生油のいずれかに溶解するか、あるいはプロピレングリコール水溶液に溶解した溶液を使用することができる。水溶液は必要に応じて適宜に緩衝し（好適にはｐＨ８以上）、液体希釈剤をまず等張にする必要がある。このような水溶液は静脈内注射に適し、油性溶液は関節内注射、筋肉注射および皮下注射に適する。
３．本発明の抗ＢＡＭＢＩ抗体を含有する診断剤
本発明の抗ＢＡＭＢＩ抗体、特にモノクローナル抗体は、ＢＡＭＢＩタンパク質の検出及び定量ができるので大腸癌又は肝臓癌の診断に用いることができる。この抗体を用いて大腸癌又は肝臓癌の診断をする方法は、例えば、（ａ）本発明のモノクローナル抗体またはその断片と試料とを反応させる工程；及び（ｂ）工程（１）で形成した抗原抗体複合体と、検出のための標識抗体とを反応させる工程を含む。本発明の診断剤を用いる診断方法は、抗体を用いるアッセイ、即ち免疫アッセイであれば、いずれの方法でもよく、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応又はウエスタンブロット法等が挙げられる。
本発明の検出及び／又は定量法に供される試料としては、血液、血清、血漿、リンパ球培養上清、尿、髄液、唾液、汗、腹水、羊水、又は細胞あるいは臓器の抽出液等、ＢＡＭＢＩタンパク質が含まれる可能性のある生体試料であれば特に限定されない。本発明の検出及び／又は定量法を酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫測定法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法により行うこともでき、サンドイッチ法の場合には固相化抗体及び標識抗体のうち少なくとも１種が本発明のモノクローナル抗体であればよい。
標識抗体とは、標識物質で標識された抗体を意味し、これらの標識抗体は、試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれる抗原（即ち、エボラウイルスの核タンパク質）を検出または定量するために用いることができる。本発明で用いることができる標識物質は、抗体にに物理的結合又は化学的結合等により結合させることによりそれらの存在を検出可能にするものであれば特に限定されない。標識物質の具体例としては、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジンあるいは放射性同位体等が挙げられ、より具体的には、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、または化学発光物質が挙げられる。標識物質と抗体との結合法は、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法又は過ヨウ素酸法等の公知の方法を用いることができる。
ここで、放射性同位体及び蛍光物質は単独で検出可能なシグナルをもたらすことができるが、酵素、化学発光物質、ビオチン及びアビジンは、単独では検出可能なシグナルをもたらすことができないため、さらに１種以上の他の物質と反応することにより検出可能なシグナルを生じる。例えば、酵素の場合には少なくとも基質が必要であり、酵素活性を測定する方法（比色法、蛍光法、生物発光法あるいは化学発光法等）に依存して種々の基質が用いられる。また、ビオチンの場合には少なくともアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的である。必要に応じてさらに該基質に依存する種々の発色物質が用いられる。
固定化抗体は、試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれる抗原を検出、定量、分離または精製するために用いることができる。抗体を固定化するのに使用できる不溶性担体としては、例えば、（１）ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂あるいはナイロン樹脂等からなるプラスチックや、ガラス等に代表されるような水に不溶性の物質からなるプレート、試験管若しくはチューブ等の内容積を有するもの、ビーズ、ボール、フィルター、あるいはメンブレン等、並びに（２）セルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体あるいは多孔性シリカ系担体等のようなアフィニティークロマトグラフィーに用いられる不溶性担体を挙げることができる。
４．本発明の抗ＢＡＭＢＩ抗体を用いる大腸癌又は肝臓癌診断用キット
本発明の診断用キットは、本発明の抗ＢＡＭＢＩ抗体、好ましくはモノクローナル抗体を含むものである。ここで用いる抗体は、上記した固定化抗体とや標識抗体でもよい。例えば、本発明の抗体を一次抗体として使用する場合、本発明のキットには、抗原抗体結合反応により形成された複合体を検出するための二次抗体を含めてもよい。本発明のキットには、該キットを効率的かつ簡便に利用できるようにするために、これら抗体以外に種々の補助剤を含めてもよい。補助剤としては、例えば固体状の二次抗体を溶解させるための溶解剤、不溶化担体を洗浄するために使用される洗浄剤、抗体の標識物質として酵素を使用した場合に酵素活性を測定するための基質、その反応停止剤などの免疫学的測定試薬のキットとして通常使用されるものが挙げられる。
本発明は、さらに、ＢＡＭＢＩをコードする遺伝子をもとに設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法等の核酸増幅法を用いて、ＢＡＭＢＩｍＲＮＡを検出することによる、大腸癌・肝臓癌の診断剤・診断方法、更には、ＢＡＭＢＩをコードする遺伝子の断片をもとに設計したプローブを含む診断剤・診断法を包含する。
本発明で用いるプライマーとしては、例えば、配列番号２記載の塩基配列中、連続する１５塩基以上、好ましくは、２０塩基以上５０塩基以下のプライマーを用いることができる。プライマーセットとして、好ましくは、フォワードプライマーとリバースプライマーの間の距離が５００塩基以下となるように設計することができる。必要に応じて、プライマーには、標的であるＢＡＭＢＩ遺伝子と相補的でない配列部分を含めることも可能であり、また、例えば、タグ配列を付加することもできる。
本発明で用いるプローブとしては、ＢＡＭＢＩに特徴的な配列を含むＢＡＭＢＩ遺伝子断片、好適には、塩基長５０〜１５０ｂｐのものを用いる。プローブは、例えば、放射性標識として３２Ｐで標識することができる。また、必要に応じ、プローブを蛍光標識、発光標識または酵素標識等することもできる。当業者であれば、用いた標識物質に適切な検出方法で、ＢＡＭＢＩ遺伝子を検出することができる。更に、プローブをビオチン化したものを用いることもでき、これをアビジン蛍光色素で処理し蛍光検出する方法も可能である。
５．二重鎖ＲＮＡを含有する大腸癌又は肝臓癌治療剤等
更に、本発明には、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、ＢＡＭＢＩのｍＲＮＡを特異的に分解することによる大腸癌または肝臓癌の治療剤が含まれる。特に好適には、２１〜２５塩基長のＲＮＡ干渉を生ずる二重鎖ＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）又はｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）が好ましく用いられ、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖ＲＮＡが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖ＲＮＡはＢＡＭＢＩの発現を抑えるリサーチツールとしても利用できる。このような二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ）の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表２００２−５１６０６２号；米国公開許第２００２／０８６３５６Ａ号；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４（２），Ｆｅｂ．，１８０−１８３；Ｇｅｎｅｓｉｓ，２６（４），Ａｐｒｉｌ，２４０−２４４；Ｎａｔｕｒｅ，Ｓｐｅ．２１，４０７：６８０２，３１９−２０；Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１６，（８），Ａｐｒ．１６，９４８−９５８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９９（８），１６  Ａｐｒ．，５５１５−５５２０；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６（５５６７），１９  Ａｐｒ．，５５０−５５３；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ａｐｒ．３０，９９：９，６０４７−６０５２；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０（５），Ｍａｙ，４９７−５００；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０（５），Ｍａｙ，５００−５０８；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｍａｙ  １５，３０：１０，ｅ４６等参照）。
更に、本発明の抗ＢＡＭＢＩ抗体は、大腸癌・肝臓癌細胞への薬物輸送システムとしても利用することができる。例えば、抗ＢＡＭＢＩ抗体に薬剤封入体を結合した、抗ＢＡＭＢＩ抗体−薬剤封入体複合体を用いることができる。薬剤としては、抗癌性低分子薬剤や、高分子毒素を使用でき、ＭＴＸ、アドリアマイシン、ジフテリアトキシン、リシン等を挙げ得ることができる。
【実施例】  以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。
［参考例１］
ｈＢＡＭＢＩ、β−ｃａｔｅｎｉｎ発現アデノウイルスベクター、ｈＢＡＭＢＩ発現ベクターの調製
（１）プラスミドと組換えウイルスの構築
ｈＢＡＭＢＩ−ルシフェラーゼレポータープラスミドの構築のため、プロモーター領域、エクソン、イントロンの全長を含むヒトＢＡＣクローンＲＰＣＩ−１３−４３Ｎ２４をＢＡＣＰＡＣ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓから購入した。最長の７．３ｋｂの構築物またはその欠失変異体構築物は、ｐＧＬ３−プロモーター・ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にある適当な制限酵素切断部位内にそれぞれのＤＮＡ断片をクローニングして作製した。
ＴＣＦ／ＬＥＦ結合配列の点変異体はＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて標準的なＰＣＲ法により作製した。プライマーは以下のものを使用した。（置換した塩基は下線で記載されている）：
0004705469.tif 000004
ｐＴＯＰ−ｔｋ−ルシフェラーゼとｐＦＯＰ−ｔｋ−ルシフェラーゼはＶ．Ｋｏｒｉｎｅｋ  ａｎｄ  Ｈ．Ｃｌｅｖｅｒｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）より提供を受けた。ｍｙｃタグを付加したＩｃａｔとＬａｃＺを導入したアデノウイルスは既述の方法で作製した（Ｓｅｋｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２，３３２２−３３２６（２００２））。３３位のセリンをチロシンに置換した安定型β−ｃａｔｅｎｉｎを発現するアデノウイルスベクターは、ｐＡｄｅｎｏＸＴＭ発現システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使い、製品添付のマニュアルに従って作製した。ＧＦＰ−融合全長ｈＢＡＭＢＩ発現ベクターであるｐＥＧＦＰ−Ｎ３−ｈＢＡＭＢＩはｐＥＧＦＰ−Ｎ３ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニングすることにより作製した。詳細には、ヒト大腸癌細胞ＳＷ４８より抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡに対し逆転写を行い、ｈＢＡＭＢＩのＯＲＦ全長を増幅するためのプライマー５’−ＣＡＴＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＧＣＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＡＣ−３’（配列番号１６）および５’−ＣＡＴＣＴＣＧＡＧＴＡＣＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＣＣＧＴＧＣ−３’（配列番号１７）を用いてＰＣＲにより増幅し、全長ｈＢＡＭＢＩを得た。該増幅産物には両末端にＥｃｏＲＩ切断部位とＸｈｏＩ切断部位が付加されているので、それらを制限酵素処理し、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩサイトに挿入し、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３−ｈＢＡＭＢＩを構築した。このｐＥＧＦＰ−Ｎ３−ｈＢＡＭＢＩ構築物はｈＢＡＭＢＩ遺伝子とＧＦＰ遺伝子がインフレームで連結されており、これをほ乳動物細胞で発現させると、カルボキシ末端にＧＦＰタンパク質の付加された全長ｈＢＡＭＢＩタンパク質を発現する。
ｈＢＡＭＢＩ（ｈＢＡＭＢＩＤＮ）のアミノ酸２０〜１３１番の欠損した欠失変異体についても同様にＧＦＰ発現ベクターを構築した。
［参考例２］
ＧＳＴ−ＴＣＦ４融合タンパク質の調製
電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）
ＧＳＴ−ＴＣＦ４融合タンパク質は、以下のプライマーを用いて、ヒトＴＣＦ４の２６５番〜４９６番のアミノ酸をコードする配列のＰＣＲ産物を用いて作製した：
0004705469.tif 000005
ＰＣＲ産物をｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングした。ＧＳＴ及びＧＳＴ−ＴＣＦ４は大腸菌ＤＨ−５α株から精製した。ＤＮＡ結合アッセイは既出の方法に従って行った（Ｔａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｖｏｌ．１４，ｐ．１７４１−１７４９）。
使用したプローブはそれぞれ以下のような組み合わせでアニーリングさせた：
0004705469.tif 000006
0004705469.tif 000007
変異型ｈＢＡＭＢＩ−ルシフェラーゼ構築物の作製に使用したオリゴヌクレオチドを、変異型競合分子として使用した。
［参考例３］
細胞及び病理サンプルの調製
全ての細胞は単層で適切な培地を用いて培養した。ＣＯＳ−１、ＤＵ−１４５、ＨｅｐＧ２、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ細胞はＤＭＥＭ培地（ＮＩＳＳＵＩ）、ＳＷ４８、ＳＷ４８０細胞はＬｅｉｂｏｖｉｔ’ｓ  Ｌ−１５培地（ＳＩＧＭＡ）、ＨＣＴ１１６細胞はＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地（ＳＩＧＭＡ）にそれぞれ１０％ウシ胎児血清（ＪＣＳ）を添加して培養した。全ての細胞は３７℃に設定したインキュベーター内で５％ＣＯ２保湿条件下で培養した。癌組織や対照の非癌組織サンプルは患者のインフォームドコンセントを得た上で、外科手術の際に摘出した。
［参考例４］
大腸癌細胞株ＳＷ４８にアデノウイルスベクターを用いてＩＣＡＴやＤＮ−ＴＣＦ４を発現させ、準定量的ＲＴ−ＰＣＲまたはイムノブロットによりｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量の変化を測定した。
更に、β−ｃａｔｅｎｉｎ  Ｓ３３Ｙは、β−ｃａｔｅｎｉｎの３３番目のセリン残基がチロシン残基に置換されたもので、活性型変異β−ｃａｔｅｎｉｎである。かかる変異は大腸癌細胞で認められている。これを２９３細胞にアデノウイルスを用いて発現させ、ＢＡＭＢＩの発現量を測定した。
（１）準定量的ＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いて抽出した。総ＲＮＡ（１レーンあたり２０μｇ）をホルムアルデヒド含有１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に転写した。対象の遺伝子特有の３２Ｐ−標識ｃＤＮＡプローブをハイブリダイズさせ、ＡＳ１５００（ＦＵＪＩ  ＦＩＬＭ）で検出した。図４に結果を示している。
（２）イムノブロッティング
イムノブロッティングは前述の方法で行った（Ｍａｔｓｕｍｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。そして、（１）ＩＣＡＴはＢＡＭＢＩの発現を抑制する、（２）ＴＣＦ４のドミナントネガティブ変異体（ＤＮ−ＴＣＦ４）もＢＡＭＢＩの発現を抑制する、さらに、（３）活性型変異β−ｃａｔｅｎｉｎの作用によりＢＡＭＢＩの発現は亢進する、ということを見出した。図５に結果を示す。
［参考例５］
＜ＢＡＭＢＩプロモーターの解析＞
ＢＡＭＢＩプロモーターをルシフェラーゼに連結したレポーター構築物を作成し、ルシフェラーゼアッセイによりプロモーター活性を測定した。
（１）ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ＢＡＭＢＩプロモーターのβ−ｃａｔｅｎｉｎを介した活性化に対するＴＣＦ−４とＩＣＡＴのドミナントネガティブ変異体の作用を、ＣＯＳ−１細胞にルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＴＯＰ−ｔｋ−ｌｕｃｉｆａｒａｓｅまたは−５７５−ｌｕｃ）をトランスフェクトしてルシフェラーゼ活性を測定することにより、検討した。
細胞はトランスフェクション１８時間前に１２ウェルディッシュに播いた。トランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ＰＬＵＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製品添付のプロトコルに従って行った。ルシフェラーゼアッセイはＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製品添付のプロトコル従って行った。
その結果、（１）ＢＡＭＢＩプロモーターはβ−ｃａｔｅｎｉｎ  Ｓ３３Ｙにより活性化され、ＤＣ−ＴＣＦ４およびＩＣＡＴにより不活性化されることが見出された。図６に結果を示す。
【実施例１】抗ＢＡＭＢＩ抗体による大腸癌の検出
（１）抗ＢＡＭＢＩ抗体の調製
Ｎ末端及びＣ末端に対する抗体は、ｈＢＡＭＢＩのアミノ酸４５〜１４７番の領域とアミノ酸１７７〜２４１番の領域をそれぞれ含むＧＳＴ融合タンパク質を大腸菌で発現させたものを、ウサギ（ニュージーランドホワイト種）に免疫し、免疫後の血清を抗原を用いアフィニティ精製することにより作製した。β−ｃａｔｅｎｉｎに対するマウスモノクローナル抗体は、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。α−ｔｕｂｕｌｉｎに対するマウスモノクローナル抗体はＯｎｃｏｇｅｎｅＴＭから購入した。
（２）抗ＢＡＭＢＩ抗体を用いた免疫組織化学法（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）
パラフィン包埋組織切片の免疫染色は標準の方法で行った。概略は、キシレンで切片の脱パラフィンを行い、特級エタノール／蒸留水により水和した。クエン酸バッファー（ｐＨ６．０）にスライドガラスをいれ、１５分間超音波処理してから、標識抗原とともに４℃で一晩、インキュベートした。染色パターンはＲＩＴＣ標識抗マウス抗体およびＦＩＴＣ標識抗ウサギ抗体を使ってそれぞれ可視化した。切片は共焦点顕微鏡で観察し写真撮影した。
その結果、ＢＡＭＢＩの発現は大腸癌で高く、正常部で低いことが見出された。図７に結果を示す。
【実施例２】（１）準定量的ＲＴ−ＰＣＲ
大腸癌１８症例、肝臓癌１０症例につきＲＴ−ＰＣＲでＢＡＭＢＩの発現を検討した。総ＲＮＡは癌組織と対照の非癌組織からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いて抽出した。第１鎖ｃＤＮＡはランダムヘキサマーとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って合成した。ＰＴＣ−２０００  Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてＰＣＲには、各種サンプルのｃＤＮＡ１μｌをそれぞれの反応で使用した。ＰＣＲに用いたプライマーは、以下の通りである：
0004705469.tif 000008
ＰＣＲ条件は最初の熱変性９４℃３分に続いて、９４℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃３０秒のサイクルを、ｈＢＡＭＢＩについては３０サイクル、Ａｘｉｎ２については３２サイクル、β−ＡＣＴＩＮについては２３サイクル実施した。全てのＰＣＲ反応は反応液２５μｌ、開始時の熱変性は９４℃３分間で行い、続いて９４℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃１分のサイクルで増幅反応を行った。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色で検出した。
その結果、大腸癌１８例中１３例で、肝臓癌では１０例中３例でＢＡＭＢＩの発現亢進がみられた。図８に結果を示す。
【実施例３】  前立腺癌Ｄｕ１４５（ＢＡＭＢＩの発現が低い）にＢＡＭＢＩを発現させＴＧＦ−β存在下または非存在下でフォーカスアッセイを行った。さらに得られたフォーカスをピックアップして培養し、ＴＧＦ−βによる転写活性化誘導の強度をルシフェラーゼアッセイにより測定した。
コロニー形成アッセイは次のように行った。ＤＵ１４５細胞は、播種１日前にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製品添付のプロトコルに従って、対象のプラスミドでトランスフェクトした。細胞（５×１０５細胞）は１０ｃｍディッシュに播き、４００ｍｇ／ｍｌＧ４１８（ＧＩＢＣＯ）で選択し、１ｎｇ／ｍｌＴＧＦ−β１添加または非添加の状態で培養した。培地交換とＴＧＦ−β１刺激は５日おきに行った。播種３週間後、コロニーは、メチレンブルーで染色するか、次の実験に用いるために単離した。
その結果、Ｄｕ１４５細胞の増殖はＴＧＦ−βの作用により強く抑制されたが、ＢＡＭＢＩを発現するとＴＧＦ−βによる増殖抑制が阻害されること、ＢＡＭＢＩを発現しているＤｕ１４５細胞はＴＧＦ−βシグナルに感受性が高く、標的遺伝子の転写活性化が亢進することが分かった。図９に結果を示す。
【実施例４】  ＢＡＭＢＩを高発現している大腸癌細胞Ａｌｅｘａｎｄｅｒと肝癌細胞株ＨｅｐＧ２にＢＡＭＢＩのＲＮＡｉを発現させルシフェラーゼアッセイを行った。
以下のｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドをｐＳＵＰＥＲ（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．）にサブクローニングして用いた：
0004705469.tif 000009
図１０に結果を示す。
その結果、ｓｈＲＮＡのＲＮＡｉによりＢＡＭＢＩの発現が低下した。ＢＡＭＢＩの発現が低下すると癌細胞はＴＧＦ−βシグナルへの感受性が増大して標的遺伝子の転写活性化が亢進することが示唆された。
【実施例５】  ２９３Ｔ細胞にｐＥＧＦＰ−Ｃ２（ＧＦＰ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３−ｈＢＡＭＢＩ（ＢＡＭＢＩ−ＧＦＰ）をトランスフェクションしたものからＬｙｓａｔｅを回収し、ウェスタンブロッティングを行った。各レーンにロードしたタンパク量は３０μｇに統一した。
抗体としては、抗ＢＡＭＢＩアミノ末端ラビットポリクローナル抗体（２００倍希釈）、抗ＢＡＭＢＩマウスモノクローナル抗体６Ｇ（１０倍希釈、１００倍希釈）を使用した。抗ＢＡＭＢＩアミノ末端ラビットポリクローナル抗体及び抗ＢＡＭＢＩマウスモノクローナル６Ｇは次のようにして作製した。
（抗ＢＡＭＢＩアミノ末端ラビットポリクローナル抗体の作製）
抗ＢＡＭＢＩ−Ｎ末抗体の作製にはＧＳＴ融合型ｈＢＡＭＢＩ  ａａ４５−１４７、抗ＢＡＭＢＩ−Ｃ末抗体の作製にはａａ１７７−２４１  ５００ｍｇをそれぞれＡＤＪＵＶＡＮＴ  ＣＯＭＰＬＥＴＥ  ＦＲＥＵＮＤ（ＤＩＦＣＯ）と混合し、それぞれ２匹ずつのニュージーランドホワイト種のウサギ皮内に注射することにより初回免疫を行った。その後、２週間おきに、抗ＢＡＭＢＩ−Ｎ末抗体の作製にはＧＳＴ融合型ｈＢＡＭＢＩ  ａａ４５−１４７，抗ＢＡＭＢＩ−Ｃ末抗体の作成にはａａ１７７−２４１  ２００ｍｇをそれぞれＡＤＪＵＶＡＮＴ  ＩＮＣＯＭＰＬＥＴＥ  ＦＲＥＵＮＤ（ＤＩＦＣＯ）と混合し、ウサギ皮内に注射することにより追加免疫を行った。約５回の追加免疫の後、ウサギの耳動脈から約５０ｍｌの血液を採血し、３７℃で２時間インキュベーションした後、４℃でオーバーナイトのインキュベーションを行った。翌日、３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心を行った後、上清を分注し、これを抗ＢＡＭＢＩ抗血清とした。抗血清は、まずＧＳＴとビーズを結合させた粒子を充填したカラムに通すことにより、ＧＳＴと結合する抗体を除去した。続いて、抗原をビーズに結合させた粒子を充填したカラムに通すことにより、抗原に特異的に結合する抗体をカラムに吸着させた。その後、吸着した抗体を溶出し、これを抗ＢＡＭＢＩポリクローナル抗体とした。
（抗ＢＡＭＢＩマウスモノクローナル６Ｇの作製）
＿ＢＡＬＢ／Ｃマウス３匹にＧＳＴ融合型ｈＢＡＭＢＩ  ａａ４５−１４７を、初回２００μｇ、以後２週間おきに５０μｇを２回、背部皮下に免疫した。アジュバントは、初回フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、以後フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）を抗原と１：１で混合して免疫した。尾静脈採血して血清を採取し、最も血清力価の高い個体について、最終免疫日から２５日後屠殺し脾臓細胞を採取した。ミエローマ細胞はＰ３Ｕ１（Ｐ３Ｘ６３  Ａｇ８Ｕ．１）を用い、脾細胞：ミエローマ細胞＝５：１で混合し、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ，５０％（Ｗ／Ｖ）（ＳＩＧＭＡ）を用いて細胞融合した。マイクロタイタープレート上に２×１０５個（脾細胞）／ｗｅｌｌでまき、ＨＡＴ  Ｍｅｄｉａ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×）Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（ＳＩＧＭＡ）により抗体産生ハイブリドーマを得た。スクリーニングは、融合後１１日目に、培養上清の一部を採集し、ＧＳＴあるいはＧＳＴ融合型ｈＢＡＭＢＩ  ａａ４５−１４７を固相化したＥＩＡプレートを用いてＥＬＩＳＡを行い、ＧＳＴ融合型ｈＢＡＭＢＩ  ａａ４５−１４７にのみ反応するｗｅｌｌを選択した。クローニングは限界希釈法により計３回行った。そして、最終的に、ＢＡＭＢＩタンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイブリドーマを樹立した。ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地中で２６日間培養し、その培養上清から抗ＢＡＭＢＩモノクローナル抗体を取得した。
ウエスタンブロッティングの結果を図１１に示す。図１１に示されるように、抗ＢＡＭＢＩマウスモノクローナル抗体６Ｇは、ＢＡＭＢＩタンパク質を特異的に認識したことが分かる。
【産業上の利用可能性】  本発明の抗ＢＡＭＢＩ抗体は、大腸癌又は肝臓癌治療剤の有効成分として利用することができる。また、本発明は、抗ＢＡＭＢＩ抗体、ＢＡＭＢＩ検出用プライマー、またはＢＡＭＢＩ検出用プローブを用いることで、従来的確な検出の困難であった大腸癌または肝臓癌の検出を可能とする実用上優れたものである。さらに、本発明は、ＢＡＭＢＩを発現するタイプの大腸癌であるかどうかを確認することができるので、ＢＡＭＢＩを抑制することによる治療方法が有効であるか否かの指標とすることができる。
本発明は、抗ＢＡＭＢＩ抗体、またはＢＡＭＢＩ遺伝子を基にした二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉を利用し、従来困難であった大腸癌または肝臓癌の治療を可能とするものである。特に、ＢＡＭＢＩにより、ＴＧＦ−βの増殖抑制効果が低下していた場合、本発明の治療剤により、増殖抑制効果の改善が期待できるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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