(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示される野生型還元酵素のアミノ酸配列において、少なくとも下記a)からｆ）の６箇所のアミノ酸置換を有することを特徴とする改変型還元酵素。
ａ）１２番目のアミノ酸がグリシンに置換、
ｂ）４２番目のアミノ酸がロイシンもしくはイソロイシンに置換、
ｃ）６７番目のアミノ酸がアルギニンに置換、
ｄ）１２５番目のアミノ酸がメチオニンに置換、
ｅ）１７３番目のアミノ酸がプロリンに置換、
ｆ）３２７番目のアミノ酸がバリンに置換。
【請求項２】
さらにｇ）３番目のアミノ酸がセリンに置換され、かつｈ）４番目のアミノ酸がロイシンに置換されている請求項１に記載の改変型還元酵素。
【請求項３】
Ｃ末端にさらにオリゴペプチドＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓが付加されている請求項１または２に記載の改変型還元酵素。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載の改変型還元酵素が有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号２４のポリヌクレオチドを有する請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号２５のポリヌクレオチドを有する請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
宿主細胞内において機能可能なプロモーターと請求項４乃至６のいずれかに記載のポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項４乃至６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを有することを特徴とするベクター。
【請求項９】
配列番号２６のヌクレオチド配列を有することを特徴とするｐＨＡＲ１ベクター。
【請求項１０】
配列番号２７のヌクレオチド配列を有することを特徴とするｐＨＡＲ２ベクター。
【請求項１１】
請求項４乃至７のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は請求項８乃至１０のいずれかに記載のベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
【請求項１２】
宿主細胞が微生物であることを特徴とする請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項１３】
宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項１２に記載の形質転換体。
【請求項１４】
請求項４乃至７のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は請求項８乃至１０のいずれかに記載のベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法。
【請求項１５】
ｍ−クロロフェナシルクロライドに、請求項１乃至３のいずれかに記載の改変型還元酵素もしくはそれを産生する微生物、または請求項１１乃至１３のいずれかに記載の形質転換体もしくはそれらの処理物を作用させることを特徴とする１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールの製造方法。
【請求項１６】
４−クロロ−３−オキソ酪酸エステルに、請求項１乃至３のいずれかに記載の改変型還元酵素もしくはそれを産生する微生物、または請求項１１乃至１３のいずれかに記載の形質転換体もしくはそれらの処理物を作用させることを特徴とする４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【請求項１７】
Ｎ−Ｂｏｃ−ピロリジノンに、請求項１乃至３のいずれかに記載の改変型還元酵素もしくはそれを産生する微生物、または請求項１１乃至１３のいずれかに記載の形質転換体もしくはそれらの処理物を作用させることを特徴とするＮ−Ｂｏｃ−ピロリジノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、還元反応に利用可能な改変型還元酵素及びその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
還元酵素は、医農薬の有効成分となる化合物やその中間体、特に光学活性化合物等を製造する為の有機合成反応に利用されている（特許文献１：特開2000-184881号公報）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
光学活性化合物の工業的製造に適した還元酵素を提供する。
【０００４】
【特許文献１】特開2000-184881号公報
【課題を解決するための手段】
【０００５】
即ち、本発明は、
１．  配列番号１で示される野生型還元酵素のアミノ酸配列において、少なくとも下記a)からｆ）の６箇所のアミノ酸置換を有することを特徴とする改変型還元酵素（以下、本発明還元酵素と記すこともある）。
ａ）１２番目のアミノ酸がグリシンに置換、
ｂ）４２番目のアミノ酸がロイシンもしくはイソロイシンに置換、
ｃ）６７番目のアミノ酸がアルギニンに置換、
ｄ）１２５番目のアミノ酸がメチオニンに置換、
ｅ）１７３番目のアミノ酸がプロリンに置換、
ｆ）３２７番目のアミノ酸がバリンに置換、
２．  さらにｇ）３番目のアミノ酸がセリンに置換され、かつｈ）４番目のアミノ酸がロイシンに置換されている請求項１に記載の改変型還元酵素、
３．  Ｃ末端にさらにオリゴペプチドＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓが付加されている前記第１または２項に記載の改変型還元酵素、
４．  前記１項乃至３項のいずれかに記載の改変型還元酵素が有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、本発明ポリヌクレオチドと記すこともある）、
５．  配列番号２４で示される前記第４項に記載のポリヌクレオチド、
６．  配列番号２５で示される前記第４項に記載のポリヌクレオチド、
７．  宿主細胞内において機能可能なプロモーターと前記４項乃至６項のいずれかに記載のポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなることを特徴とするポリヌクレオチド、
８．  前記４項乃至６項のいずれかに記載のポリヌクレオチドを有することを特徴とするベクター、
９．  配列番号２６のヌクレオチド配列を有することを特徴とするｐＨＡＲ１ベクター、
１０．  配列番号２７のヌクレオチド配列を有することを特徴とするｐＨＡＲ２ベクター、
１１．  前記４項乃至７項のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は前記８項乃至１０項のいずれかに記載のベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体、
１２．  宿主細胞が微生物であることを特徴とする前記１１項に記載の形質転換体、
１３．  宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前記１２項に記載の形質転換体、
１４．  前記４項乃至７項のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は前記８項乃至１０項のいずれかに記載のベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法、
１５．  ケトン化合物又はアルデヒド化合物に、前記１項乃至３項のいずれかに記載の改変型還元酵素もしくはそれを産生する微生物、または前記９項乃至１１項のいずれかに記載の形質転換体もしくはそれらの処理物を作用させることを特徴とするアルコール化合物の製造方法、
１６．  ケトン化合物がｍ−クロロフェナシルクロライドであり、アルコール化合物が１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールであることを特徴とする前記１５項に記載のアルコールの製造方法、
１７．  ケトン化合物が４−クロロ−３−オキソ酪酸エステルであり、アルコール化合物が４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルであることを特徴とする前記１５項に記載のアルコール化合物の製造方法、
１８.  ケトン化合物がＮ−Ｂｏｃ−ピロリジノンであり、アルコールがＮ−Ｂｏｃ−ピロリジノールであることを特徴とする前記１５項に記載のアルコール化合物の製造方法、等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ケトン化合物又はアルデヒド化合物からアルコール化合物を製造するために優れた改変型還元酵素等が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
まず、本発明における改変型還元酵素について説明する。
【０００８】
配列番号１で示される野生型還元酵素のアミノ酸配列とは、３４８個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、ロドコッカス（Rhodococcus）属（好ましくは、ロドコッカス  エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis））に属する微生物由来の還元酵素である。当該還元酵素及び本発明還元酵素の還元酵素活性（即ち、基質を還元する能力）は、これらのタンパク質を、例えば、ｍ−クロロフェナシルクロライド、ＮＡＤＨと混合して３０℃で保温し、遊離するＮＡＤ＋量を反応液の３４０ｎｍにおける吸光度を指標に定量することにより測定することができる。
【０００９】
尚、ロドコッカス（Rhodococcus）属（好ましくは、ロドコッカス  エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis））に属する微生物は、天然から分離してもよいし、菌株保存機関等から購入してもよい。
【００１０】
天然から分離する場合、まず、土壌を野外から採取する。採取された土壌を滅菌水で懸濁させた後、当該懸濁液を、例えば、PY培地（Bacto Peptoneを５ｇ/L、Yeast Extractを５ｇ/Lの割合で水に溶解した後、ｐHを７．０に調整）等の微生物分離用固体培地上に塗布し、これを２５℃で培養し、数日後に生えてきた菌の独立したコロニーを切り取り、新しい、例えば、PY培地等の微生物分離用固体培地に移植し、これをさらに２５℃で培養する。生育してきた菌について、SNEATH, (P.H.A.), MAIR, (N.S.) SHARPE, (M.E.) and HOLT, (J.G.):Bergey's manual of Systematic Bacteriorogy. Vol.2. 1984, Williams and Wilkins, Baltimore.等に記載される方法等に従って、ロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物であるかを同定することにより、ロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物を選抜すればよい。
【００１１】
つぎに、選抜されたロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物から、当該微生物のｍ−クロロフェナシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを生産する能力の有無を、例えば、後述の実施例に記載されるような方法に従って確認することにより、本発明に用いられるロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物を選抜すればよい。
【００１２】
このように選抜されたロドコッカス（Rhodococcus）に属する微生物のうち、ロドコッカス  エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）ST-10株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９１の寄託番号が付与されている（原寄託日：平成１５年２月１２日）。菌学的性状は次のとおり。
１．コロニー形態（３０℃、４８時間）
（１）細胞形態：かん菌、０．６×１.０〜２．０μｍ
（２）グラム染色性：陽性
（３）胞子の有無：無
（４）運動性の有無：有
２．Nutrient Agar上でのコロニー形態
コロニーの色：黄色
コロニーの形状：円形
コロニーの周縁：全縁滑らか
コロニーの隆起：低凸状
３．生理学的性質
カタラーゼ：陽性
オキシダーゼ：陰性
ＯＦテスト：陽性/陰性
４．１６ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列
ロドコッカス  エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）ST-10株からＰＣＲにより１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列約５００ｂｐを増幅し、塩基配列を解析した。得られた１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列を使って、ＢＬＡＳＴによる相同性検索を行った結果、相同率９９．６％で、ロドコッカス  エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）基準株の１６ＳリボゾームＤＮＡに対し、最も高い相同性を示した。
【００１３】
以上の菌学的性質により、本菌はロドコッカス  エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）と同定された。
【００１４】
本発明還元酵素としては、具体的には例えば、（i）配列表の配列番号２４のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列からなる発明還元酵素、（ii）配列表の配列番号２５のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列からなる本発明還元酵素等を挙げることができる。その他に、配列番号１の野生型還元酵素遺伝子のアミノ酸配列において、前記ａ）からｆ）のアミノ酸置換に加えて、さらにｇ）３番目のアミノ酸がセリンに置換され、かつｈ）４番目のアミノ酸がロイシンに置換されている改変型還元酵素が例示される。さらには、前記のアミノ酸配列のＣ末端にさらにオリゴペプチドＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓが付加されている改変型還元酵素も例示される。
【００１５】
本発明還元酵素は、例えば、後述の本発明ポリヌクレオチド又は後述の本発明ベクター等が宿主細胞に導入されてなる形質転換体（即ち、本発明形質転換体）を培養することにより製造することができる。
【００１６】
当該形質転換体を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。
【００１７】
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００１８】
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Corn Steep Liquor）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００１９】
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
【００２０】
尚、あらかじめ培地中に原料となる基質を少量添加しておくと、本発明に関する形質転換体の能力を高めることができる。添加する基質の量は、通常0.001％程度以上、好ましくは0.1〜1％程度がよい。
【００２１】
さらに、tacプロモーター、trcプロモーター及びlacプロモーター等のアロラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと本発明ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなる遺伝子が導入されてなる形質転換体の場合には、本発明還元酵素の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、isopropyl thio-β-D-galactoside（IPTG）を培地中に少量加えることもできる。
【００２２】
後述の本発明ポリヌクレオチド又は後述の本発明ベクター等が宿主細胞に導入されてなる形質転換体（即ち、本発明形質転換体）の培養は、一般微生物における通常の方法に準じて行い、固体培養、液体培養（旋回式振とう培養、往復式振とう培養、ジャーファーメンター（JarFermenter）培養、タンク培養等）等が可能である。特に、ジャーファーメンターを用いる場合、無菌空気を導入する必要があり、通常、培養液量の約０．１〜約２倍／分の通気条件を用いる。培養温度及び培地のｐＨは、微生物が生育する範囲から適宜選ぶことができ、例えば、約15℃〜約40℃の培養温度にて、ｐＨが約６〜約８の培地で培養することが好ましい。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通常約１日間〜約５日間が望ましい。温度シフト型やIPTG誘導型等の誘導型のプロモーターを有する発現ベクターを用いた場合には、誘導時間は１日間以内が好ましく、通常数時間である。
【００２３】
後述の本発明ポリヌクレオチド又は後述の本発明ベクター等が宿主細胞に導入されてなる形質転換体（即ち、本発明形質転換体）の培養物から本発明還元酵素を精製する方法としては、通常のタンパク質の精製において使用される方法を適用することができ、例えば、次のような方法を挙げることができる。
【００２４】
まず、当該形質転換体の培養物から遠心分離等により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルター濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、本発明還元酵素を精製することができる。
【００２５】
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名、いずれもアマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
【００２６】
尚、本発明還元酵素を含む画分を選抜するには、例えば、ｍ−クロロフェナシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを生産する能力を指標にして選抜すればよい。
【００２７】
次いで、本発明ポリヌクレオチドについて説明する。
本発明ポリヌクレオチドは、天然に存在する改変型遺伝子であってもよく、又は天然の野生型遺伝子に変異を導入（部位特異的変異導入法、突然変異処理等）することにより作出された改変型遺伝子であってもよい。上記のような改変型遺伝子及び野生型遺伝子を検索する場合には、例えば、ｍ−クロロフェナシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを生産する能力を有する微生物を対象にすればよく、例えば、ロドコッカス（Rhodococcus）属（好ましくは、ロドコッカス  エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis））に属する微生物をその対象として挙げることができる。
【００２８】
本発明還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（即ち、本発明ポリヌクレオチド）を取得するには、まず、野生型還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（即ち、野生型遺伝子）を取得するとよい。ここで、野生型遺伝子とは、配列番号２に示される塩基配列を有する遺伝子であり、例えば、J.Ｓambrook、E.F.Fritsch、T.Maniatis著；モレキュラー  クローニング  第２版(Molecular Cloning 2nd edition)、コールドスプリング  ハーバー  ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)発行、１９８９年、等に記載される通常の遺伝子工学的手法に準じてロドコッカス  エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis））に属する微生物から取得することができる。即ち、ロドコッカス  エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis））に属する微生物から「新  細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）に記載された方法に準じてｃＤＮＡライブラリーを調製し、調製されたｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ又は配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本還元酵素遺伝子を調製する。
【００２９】
野生型遺伝子に部位特異的変異を導入することによって、本発明ポリヌクレオチドを調製することができる。部位特異的変異導入法としては、例えば、 Olfert Landt ら（Gene 96 125-128 1990）、Smithら（Genetic Engineering 3 1 Setlow,J.and Hollaender,A Plenum:New York）、Vlasukら（Experimental Manipulation of Gene Expression,Inouye,M.:Academic Press,New York）、Hos.N.Huntら（Gene 77 51 1989）の方法やMutan-Express Km（宝酒造社製）やTaKaRa  La  PCR  in vitro Mutagenesis Kit（宝酒造社製）の市販キットの利用等があげられる。このようにして、例えば、配列番号１の野生型酵素のアミノ酸配列において６つのアミノ酸変異（12 Gly, 42 Val,67 Arg,125 Met, 173 Pro, 327 Val）が導入されている配列番号２３で示されるアミノ酸配列を有する変異型酵素を得ることができる。
【００３０】
例えば、Olfert Landtら（Gene 96 125-128 1990）の方法を用いて、配列番号２３で示されるアミノ酸配列においてその４２番目のアミノ酸がロイシンで置換されているアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる本発明ポリヌクレオチドを調製するには、まず、配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなる改変型還元酵素の遺伝子が組み込まれたベクターＤＮＡを、例えばJ.Sambrook、E.F.Fritsch、T.Maniatis著；モレキュラー  クローニング  第２版(Molecular Cloning 2nd edition)、コールドスプリング  ハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)発行、１９８９年、等に記載される方法に準じて調製する。次いで、得られたベクターＤＮＡを鋳型にして、例えば、配列番号２３で示されるアミノ酸配列における４２番目のアミノ酸がロイシンに置換されているアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを片側のプライマーとして用い、適切な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをもう一方の側のプライマーとして用いて、ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅を行うとよい。ここで、ＰＣＲ反応の条件としては、例えば、９４℃にて５分間保温した後、９４℃にて１分間、次いで５０℃にて２分間、さらに７５℃にて３分間保温する処理を２０サイクル行い、最後に７５℃で８分間保温する。このようにして増幅されたＤＮＡ断片を、精製した後、改変型還元酵素の遺伝子が組み込まれたベクターＤＮＡと適切な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを加え、ＰＣＲ法により、ＤＮＡ断片の増幅を行うとよい。このようにして得られたＤＮＡ断片を、適切な制限酵素、例えば制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、同様の制限酵素消化を行った改変型還元酵素の遺伝子を含むベクターＤＮＡとライゲーション反応を行うことにより、目的とする本発明ポリヌクレオチドを得ることができる。
【００３１】
尚、他のポジションが他のアミノ酸で置換されている場合も上記方法に準じた方法により、目的とする本発明ポリヌクレオチドを得ることができる。
【００３２】
また、本発明ポリヌクレオチドは、例えば、微生物又はファージ由来のベクターに挿入されたＤＮＡライブラリーに本発明ポリヌクレオチドが有する塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有する約１５塩基程度以上の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして後述する条件にてハイブリダイズさせ、当該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出することによっても取得することができる。
【００３３】
染色体ＤＮＡ又はＤＮＡライブラリーにプローブをハイブリダイズさせる方法としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを挙げることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択することができる。
【００３４】
使用されるライブラリーがプラスミドベクターを用いて作製されている場合にはコロニーハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、ライブラリーのＤＮＡを宿主微生物に導入することにより形質転換体を取得し、得られた形質転換体を希釈した後、当該希釈物を寒天培地上にまき、コロニーが現われるまで培養する。
【００３５】
使用されるライブラリーがファージベクターを用いて作製されている場合にはプラークハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、宿主微生物とライブラリーのファージとを感染可能な条件下で混合し、さらに軟寒天培地と混合した後、当該混合物を寒天培地上にまき、プラークが現われるまで培養する。
【００３６】
次いで、いずれのハイブリダイゼーションの場合にも、前記の培養を行った寒天培地上にメンブレンを置き、形質転換体又はファージを当該メンブレンに吸着・転写させる。このメンブレンをアルカリ処理した後、中和処理し、次いでＤＮＡを当該メンブレンに固定する処理を行う。より具体的には、例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、前記寒天培地上にニトロセルロースメンブレン又はナイロンメンブレン（例えば、Hybond-N+（アマシャム社登録商標））を置き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンに吸着・転写させる。次に、当該メンブレンをアルカリ溶液（例えば１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム）に約３分間浸してファージ粒子を溶解させることによりファージＤＮＡをメンブレン上に溶出させた後、中和溶液（例えば、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス−塩酸緩衝溶液ｐＨ７．５）に約５分間浸す。次いで当該メンブレンを洗浄液（例えば、０．３Ｍ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５）で約５分間洗った後、例えば、約８０℃で約９０分間加熱することによりファージＤＮＡをメンブレンに固定する。
【００３７】
このように調製されたメンブレンを用いて、上記ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition（1989）」 Cold Spring Harbor Laboratory Press等の記載に準じて行うことができる。
【００３８】
プローブに用いられるＤＮＡは、放射性同位元素により標識されたものや、蛍光色素で標識されたものであってもよい。
【００３９】
プローブに用いられるＤＮＡを放射性同位元素により標識する方法としては、例えば、Random Primer Labeling Kit（宝酒造社製）等を利用することにより、ＰＣＲ反応液中のｄＣＴＰを（α−32Ｐ）ｄＣＴＰに替えて、プローブに用いられるＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行う方法が挙げられる。
【００４０】
また、プローブに用いられるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には、例えば、アマシャム製のECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System等を用いることができる。
【００４１】
ハイブリダイゼーションは、例えば、以下の通りに行うことができる。
４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含みドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｌ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション液（好ましくは９００ｍMの塩化ナトリウム、９０ｍMのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｌ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション液）を上記のようにして作製したメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、当該プレハイブリダイゼーション液に前記メンブレンを浸して４２〜６５℃で１〜４時間保温する。
【００４２】
次いで、例えば、４５０〜９００ｍMの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ＳＤＳを０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポロビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液（好ましくは、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液）と前述の方法で調製して得られたプローブ（メンブレン１ｃｍ2当たり１．０×１０4〜２．０×１０6cpm相当量）とを混合した溶液をメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、当該ハイブリダイゼーション溶液に浸し４２〜６５℃で１２〜２０時間保温する。
【００４３】
当該ハイブリダイゼーション後、メンブレンを取り出し、１５〜３００ｍＭの塩化ナトリウム１．５〜３０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．１〜１．０重量％のＳＤＳ等を含む４２〜６５℃の洗浄液（好ましくは１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム及び１．０重量％のＳＤＳを含む６５℃の洗浄液）等を用いて洗浄する。洗浄したメンブレンを２xSSC（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム）で軽くすすいだ後、乾燥する。このメンブレンを例えばオートラジオグラフィー等に供してメンブレン上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするＤＮＡのメンブレン上の位置に相当するクローンを元の寒天培地上で特定し、これを釣菌することにより、当該ＤＮＡを有するクローンを単離する。
【００４４】
このようにして得られるクローンを培養して得られる培養菌体から本発明ポリヌクレオチドを調製することができる。
【００４５】
上記のようにして調製された本発明ポリヌクレオチドを「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして本発明ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、pUC119（宝酒造社製）、pTV118N（宝酒造社製）、pBluescriptII （東洋紡社製）、ｐCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）、pTrc99A（Pharmacia社製）、ｐKK223-3（Pharmacia社製）等が挙げられる。
【００４６】
また、前述のＤＮＡの塩基配列は、F.Sanger, S.Nicklen, A.R.Coulson著、Proceeding of Natural Academy of Science U.S.A.(1977) 74: 5463-5467頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等の市販の試薬を用いてもよい。
【００４７】
上述のようにして得られるＤＮＡが、ｍ−クロロフェナシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを優先して生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードしていることの確認は、例えば、以下のようにして行うことができる。
【００４８】
まず上述のようにして得られるＤＮＡを後述のように、宿主細胞において機能可能なプロモーターの下流に接続されるようにベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。次いで当該形質転換体の培養物をｍ−クロロフェナシルクロライドに作用させる。反応生成物中の１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールの量を分析することにより、得られたＤＮＡがかかる能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードすることが確認できる。
【００４９】
本発明ポリヌクレオチドを宿主細胞で発現させるには、例えば、宿主細胞で機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する。
【００５０】
ここで、「機能可能な形で」とは、当該ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させた際に、本発明ポリヌクレオチドが、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。プロモーターとしては、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーター、または、tacプロモーターもしくはtrcプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーター等をあげることができる。
【００５１】
一般的には、宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる遺伝子を下記のような基本ベクターに組み込んでなるベクターを宿主細胞に導入する。ここで「基本ベクター」としては、具体的には大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、ベクターpUC119(宝酒造社製)やファージミドpBluescriptII(Stratagene社製)等をあげることができる。出芽酵母を宿主細胞とする場合には、ベクターpGBT9、pGAD424、pACT2(Clontech社製)等をあげることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合には、pRc/RSV、pRc/CMV(Invitrogen社製)等のベクター、ウシパピローマウイルスベクターpBPV(アマシャムファルマシアバイオテク社製)もしくはEBウイルスベクターpCEP4(Invitrogen社製)等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイルス等のウイルス等をあげることができる。さらに、昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスをあげることができる。
【００５２】
自律複製起点を含むベクター、例えば、上記の酵母用ベクターpACT2や、ウシパピローマウイルスベクターpBPV、EBウイルスベクターpCEP4等を用いて本発明ベクターを構築すると、当該ベクターは宿主細胞に導入された際にエピソームとして細胞内に保持される。  尚、基本ベクターとして選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、当該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択することができる。
【００５３】
また本発明ベクターは、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドをさらに含有してもよい。このような本発明ベクターを用いることにより、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドをさらに保有する本発明形質転換体を作製することもできる。
【００５４】
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明ポリヌクレオチド又は本発明ベクター等を導入する宿主細胞としては、例えば、Escherichia属、Bacillus属、Corynebacterium属、Staphylococcus属、Streptomyces属、Saccharomyces属、Kluyveromyces属及びAspergillus属に属する微生物等があげられる。
【００５５】
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明ポリヌクレオチド又は本発明ベクター等を宿主細胞へ導入する方法は、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載される塩化カルシウム法や、「Methods in Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulser System」 Bio-Rad Laboratories, (1993)等に記載されるエレクトロポレーション法等をあげることができる。
【００５６】
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明ポリヌクレオチド又は本発明ベクター等が導入された形質転換体を選抜するには、例えば、前述のようなベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。
【００５７】
当該形質転換体が本発明ポリヌクレオチドを保有していることは、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
【００５８】
このようにして調製された本発明ポリヌクレオチドを用いて、前述の如く、通常の遺伝子工学的方法及び微生物培養方法等に準じ、本発明還元酵素を大量に製造し、取得することができる。
【００５９】
このようにして調製された本発明還元酵素を産生する本発明形質転換体又はその処理物は、基質を還元するバイオリアクターとして、例えば医農薬の有効生物となる化合物やその中間体、特に光学活性である化合物やその中間体等を製造する為の有機合成反応に利用することが可能である。
【００６０】
次に、本発明におけるアルコール化合物の製造方法について説明する。
ケトン化合物又はアルデヒド化合物としては、例えば、プロピオンアルデヒド、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−バレルアルデヒド、ｎ−ヘキシルアルデヒド、ｎ−ペプチルアルデヒド、ｎ−デシルアルデヒド、２−オキソプロピオンアルデヒド、トランス−シンナムアルデヒド、４−ブロモベンズアルデヒド、２−ニトロベンズアルデヒド、３−ニトロベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、４−クロロベンズアルデヒド、２−ペンタノン、２−ヘキサノン、２−ヘプタノン、２−オクタノン、２−ノナノン、３−ペンタノン、３−クロロ−２−ブタノン、tert−ブチルアセトアセテート、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、ヒドロキシアセトン、１，１−ジクロロアセトン、クロロアセトン、ジヒドロキシアセトン、１，１−ジクロロアセトン、メチル  ３−オキソブタノエート、エチル  ３−オキサブタノネート、エチル  ４−クロロアセトアセテート、メチル  ４−ブロモー３−オキサブタノエート、エチル  ４−ブロモ−３−オキサブタノエート、Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−３−ピロリジノン、イソプロピル  ４−シアノ−３−オキソブタノエート、エチル  ４−シアノ−３−オキソブタノエート、メチル  ４−シアノ−３−オキソブタノエート、メチル  ３−オキソペンタノエート、ｍ−クロロフェナシルクロライド、アセトフェノン、２’−ブロモアセトフェノン、３’−ブロモアセトフェノン、４’−ブロモアセトフェノン、２−クロロアセトフェノン、３’−クロロアセトフェノン、４’−クロロアセトフェノン、ベンジルアセトン、１−フェニル−２−ブタノン、ｍ−メトキシアセトフェノン、３，４−ジメトキシアセトフェノン、４’−メトキシアセトフェノン、２，３’−ジクロロアセトフェノン、３，４−ジメトキシフェニルアセトン、シクロペンタノン、Ｎ−ベンジルピロリジノン、Ｎ−Ｂｏｃ−ピロリジノン、４−アセチル安息香酸、D-(+)-グルコース等が挙げられる。
【００６１】
上記方法は、通常、水及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと記す。）の存在下に行うとよい。この際に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。当該緩衝水溶液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩及びこれらの混合物が挙げられる。
【００６２】
上記方法においては、水に加えて有機溶媒を共存させることもできる。共存させることができる有機溶媒としては、例えば、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロプルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、トルエン、ヘキサン、シクロへヘキサン、ヘプタン、イソオクタン等の炭化水素類、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド等の有機硫黄化合物、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類及びこれらの混合物が挙げられる。
【００６３】
本発明還元酵素は、有機溶媒、特に２−プロパノール存在下（例えば、２０％（ｖ/ｖ）、３０℃、２２時間反応）での活性が向上した改変型還元酵素である。当該還元酵素は、基質であるケトン化合物又はアルデヒド化合物の存在下であっても活性を高く保持でき、及び／または、高い基質濃度下で変換反応が可能であることから、工業的なアルコール化合物の製造において有利である。補酵素をリサイクルするための基質となりうる２−プロパノール等の有機溶媒から、当該還元酵素の失活を軽減することが可能となるために、２−プロパノール等の有機溶媒の存在下で優れた活性を示す。
本発明の改変還元酵素は、例えば、２０％（v／v）の２−プロパノールの存在下において３０℃で２２時間での還元反応を行った場合の還元酵素活性が、同様に還元反応を行った場合の野生型還元酵素の還元酵素活性よりも高く、有機溶媒耐性に優れる。
【００６４】
上記方法における反応は、例えば、水、ＮＡＤＨ、及びケトン化合物又はアルデヒド化合物を、本発明還元酵素あるいはそれを産生する形質転換体又はその処理物とともに、必要によりさらに有機溶媒等を含有した状態で、攪拌、振盪等により混合することにより行われる。
【００６５】
上記方法における反応時のｐＨは適宜選択することができるが、通常ｐＨ３〜１０の範囲である。また反応温度は適宜選択することができるが、原料及び生成物の安定性、反応速度の点から通常０〜６０℃の範囲である。
【００６６】
反応の終点は、例えば、反応液中のケトン化合物又はアルデヒド化合物の量を液体クロマトグラフィー等により追跡することにより決めることができる。
反応時間は適宜選択することができるが、通常、０．５時間から１０日間の範囲である。
【００６７】
反応液からのアルコールの回収は、一般に知られている方法を適宜選んで行えばよい。
例えば、反応液の有機溶媒抽出操作、濃縮操作等の後処理を、必要によりカラムクロマトグラフィー、蒸留等を組み合わせて、行うことにより精製する方法が挙げられる。
【００６８】
本発明還元酵素、それを産生する形質転換体又はその処理物は種々の形態で上記方法に用いることができる。
【００６９】
具体的な形態としては、例えば、本発明ポリヌクレオチドを保有する形質転換体の培養物、かかる形質転換体の処理物、無細胞抽出液、粗精製タンパク質、精製タンパク質等及びこれらの固定化物が挙げられる。ここで、形質転換体の処理物としては、例えば、凍結乾燥形質転換体、有機溶媒処理形質転換体、乾燥形質転換体、形質転換体摩砕物、形質転換体の自己消化物、形質転換体の超音波処理物、形質転換体抽出物、形質転換体のアルカリ処理物が挙げられる。また、固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に本発明還元酵素等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本発明還元酵素等を閉じ込める方法）が挙げられる。
【００７０】
尚、本発明ポリヌクレオチドを保有する形質転換体を用いた工業的な生産を考慮すれば、生形質転換体を用いるよりも当該形質転換体を死滅化させた処理物を用いる方法が製造設備の制限が少ないという点では好ましい。そのための死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、ケトン、シアン及び抗生物質）が挙げられる。一般的には、これらの殺菌法のうちできるだけ本発明還元酵素の酵素活性を失活させず、かつ反応系への残留、汚染などの影響が少ない処理方法を選択することが望ましい。
【００７１】
また、本発明のアルコール化合物の製造方法はＮＡＤＨの存在下に行われ、ケトン化合物又はアルデヒド化合物の還元反応の進行に伴い、当該ＮＡＤＨは酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ+と記す）に変換される。変換により生じたＮＡＤ+は、ＮＡＤ+を還元型（ＮＡＤＨ）に変換する能力を有するタンパク質により元のＮＡＤＨに戻すことができるので、上記方法の反応系内には、ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質を共存させることもできる。
【００７２】
ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質としては、例えば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等が挙げられる。
【００７３】
また、ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素である場合には、反応系内にグルコース等を共存させることにより当該タンパク質の活性が増強される場合もあり、例えば、反応液にこれらを加えてもよい。
【００７４】
また、当該タンパク質は、酵素そのものであってもよいし、また当該酵素をもつ微生物又は当該微生物の処理物の形態で反応系内に共存していてもよい。さらにまた、ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む形質転換体又はその処理物であってもよい。ここで処理物とは、前述にある「形質転換体の処理物」と同等なものを意味する。
【００７５】
さらに、本発明のアルコール化合物の製造方法では、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等のようなＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を同時に保有する形質転換体を用いて行うこともできる。
【００７６】
この形質転換体において、両者遺伝子を宿主細胞へ導入する方法としては、例えば、単一である、両者遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する方法、複製起源の異なる複数のベクターに両者遺伝子を別々に導入した組換ベクターにより宿主細胞を形質転換する方法等があげられる。さらに、一方の遺伝子または両者遺伝子を宿主細胞の染色体中に導入してもよい。
【００７７】
尚、単一である、両者遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する方法としては、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域をそれぞれの両者遺伝子に連結して組換ベクターを構築したり、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させるような組換ベクターを構築してもよい。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００７９】
実施例１  （野生型還元酵素の遺伝子の調製）
（１−１）プラスミドｐＥＡＲ１の調製
配列番号３(PAR207F：(５’−AAGAATTCAAGGAGATAAGGCCATGAAGGCCATCCAGTAC −３’)で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４(PAR207R：５’−TTTCTGCAGGCCTCACAGGCCAGGGACCACAACCGC −３’)で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、例えば、Appl.Microbiol.Biotechnol.（１９９９）５２：３８６−３９２等に記載される公知のプラスミドであるｐＵＡＲ（野生型還元酵素の遺伝子を保有するプラスミド、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１２７）を鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。
【００８０】
［反応液組成］
ｐＵＡＲ：5ng
dNTP：各0.2mM-mix
プライマー：各300nM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−buffer：5μl
MgSO４：1mM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ：1U
計50μl
【００８１】
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPTC-200 Thermal Cycler (ＭＪリサーチ)にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃(０．２５分間)-５５℃(０．５分間)-６８℃（２分間）のサイクルを３０回行なった。
【００８２】
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片に２種類の制限酵素（ＥｃｏＲI及びＰｓｔI）を加えることにより、当該ＤＮＡ断片を２重消化させた。次いで得られたＤＮＡ断片を精製した。
【００８３】
一方、ベクターｐＵＣ１１８（Pharmacia製）を２種類の制限酵素（ＥｃｏＲI及びＰｓｔI）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。
【００８４】
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）でライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて野生型還元酵素の遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＥＡＲ１と記すこともある。）を取り出した。
【００８５】
（１−２）プラスミドｐＥＡＲ２の調製
配列番号３(PAR207F：５’−AAGAATTCAAGGAGATAAGGCCATGAAGGCCATCCAGTAC −３’)で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５(PAR207RH：３’−TTTCTGCAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCGGACAGGCCAGGGACCACAACCGC−５’)で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、ｐＵＡＲ（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１２７）を鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。
【００８６】
［反応液組成］
ｐEAR1：１ng
dNTP：各0.2mM−mix
プライマー：各500nM
ＥｘＴａｑ−buffer：5μl
ＥｘＴａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）：5U
計100μl
【００８７】
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPTC-200 Thermal Cycler (ＭＪリサーチ)にセットし、９４℃（５分間）に加熱した後、９４℃(０．５分間)−５５℃(０．５分間)−７２℃（１分間）のサイクルを３０回行った。
【００８８】
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片に２種類の制限酵素（ＫｐｎI及びＰｓｔI）を加えることにより、当該ＤＮＡ断片を２重消化させた。次いで得られたＤＮＡ断片を精製した。
【００８９】
一方、プラスミドｐＥＡＲ１を２種類の制限酵素（ＫｐｎI及びＰｓｔI）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。
【００９０】
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて野生型還元酵素の遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＥＡＲ２と記すこともある。）を取り出した。
【００９１】
（１−３）プラスミドｐＥＡＲ２ｓの調製
プラスミドｐＥＡＲ２に制限酵素（EcoT14I）を加えることにより、当該ＤＮＡ断片を消化させた。次いで得られたＤＮＡ断片を精製した。
【００９２】
このようにして精製して得られたＤＮＡ断片を、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs社製）で平滑化した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでセルフライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用い、野生型還元酵素の遺伝子の一部欠如した遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＥＡＲ２ｓと記すこともある。）を取り出した。
【００９３】
実施例２  （プラスミドｐＥＡＲ２のランダム変異導入ライブラリーの調製）
配列番号６（RV-M：５’−GAGCGGATAACAATTTCACACAGG −３’）（宝酒造社製）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号７（M13-47：５’−CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC −３’）（宝酒造社製）で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、ｐＥＡＲ２を鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。
【００９４】
［反応液組成］
ｐEAR1：１ng
dATP：0.2mM
dTTP：１mM
dGTP：0.2mM
dCTP：１mM
プライマー：各30pmol
MgCl２：7mM
MnCl2 :0.5mM
KCｌ：50mM
Tris−HCl buffer (pH8.3)：10mM
Gelatin：0.01%(w／v)
Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス）：5U
計100μl
【００９５】
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPTC-200 Thermal Cycler (ＭＪリサーチ)にセットし、９４℃(１分間)-４５℃(１分間)-７２℃（１分間）のサイクルを３０回行なった。
【００９６】
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片に制限酵素（SfiI）を加えることにより、当該ＤＮＡ断片を消化させた。次いで得られたＤＮＡ断片を精製した。
【００９７】
一方、プラスミドｐＥＡＲ２sを制限酵素（SfiI）を加えることにより、当該ベクターを消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。
【００９８】
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてランダム変異の導入された野生型還元酵素の遺伝子を含有するランダム変異導入ライブラリーを取り出した。
【００９９】
実施例３  （有機溶媒耐性を有する形質転換大腸菌の選抜）
（３−１）  有機溶媒耐性（２０％イソプロパノール中で活性を示す）を有する形質転換大腸菌の一次選抜
実施例２で得られた形質転換体を０．４ｍＭのisopropyl−β−D−thiogalactopyranoside(ＩＰＴＧ)、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、0.01％(w／v)のZnCl２、10g／LのBacto-tryptone(Difco)、5g／LのBacto−yeast extract(Difco)、10g／LのNaCl及び15g／Lのアガロースを含有する滅菌寒天培地に接種し、これを３０℃で２４時間培養した。培養後、得られたコロニーをナイロン膜（BiodyneA, 日本ポール社製）に転写した後、そのナイロン膜を1mMのNAD＋、200μMのnitroblue tetrazolium、10μMの1−methoxy−5−methylphenazinium methylsulfate(同仁化学研究所社製)及び20％(v／v)の2-プロパノールを含む50mMの3−(N−morpholino)propanesulfonic acid(MOPS)バッファー中に室温で30分間浸した。その後、ナイロン膜を蒸留水で洗浄し、染色されたコロニー３２０種を選抜した。選抜された３２０のコロニー、プラスミドpEAR2にて形質転換されたJM109形質転換大腸菌（JM109(pEAR2)）、そして、プラスミドpEAR2ｓにて形質転換されたJM109形質転換大腸菌（JM109(pEAR2s)）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム）（１００μｌ）に接種し、これを３７℃で１８時間振盪培養した。
【０１００】
（３−２）  有機溶媒耐性（２０％イソプロパノール中で活性を示す）を有する形質転換大腸菌の二次選抜
（３−１）で一次選抜された３２０種の選抜コロニーのうち、40コロニーを０．４ｍＭのIPTG)、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、0.01％(w／v)のZnCl２、10g／LのBacto‐tryptone(Difco)、5g／LのBacto−yeast extract(Difco)、10g／LのNaClを含有する滅菌培地（１ml）に接種し、これを３７℃で２２時間培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（２００００×ｇ、５分、4℃）することにより、沈殿として湿菌体を回収した。回収された湿菌体に、最終濃度1mMとなるNAD＋を含む最終濃度50mMとなるMOPSバッファー０．４mlを加えた。次に、５％(w／v)のｍ−クロロフェナシルクロライドを含む２−プロパノール０.１ｍｌを加えた。これを３０℃で２２時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを１ｍｌ添加し、有機層を分取した。有機層はNa２SO4にて脱水処理を行った。当該有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析に供試した。このような分析を１６０種の一次選抜された全てのコロニーについて行った結果、クローンC38、C12、H23、E9を見出した。
【０１０１】
（含量分析条件）
カラム：Chiralcel  ＯＢ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
キャリアー溶媒：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝９：１（ｖ／ｖ）
流速：０.８ml／分
検出器：UV２６８nm
【０１０２】
実施例４  （多重改変型ポリヌクレオチドの作製）
（４−１）  ライゲーションによる改変型遺伝子の作製
実施例３（３−２）で二次選抜されたクローンC38、C12、H23、E9をそれぞれ１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（４ｍｌ）に接種し、これを３７℃で２２時間振盪培養した。培養後、得られたクローンC38、C12、H23、E9からそれぞれQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。クローンH23のプラスミドを精製した後、２種類の制限酵素（AccIとHindIII）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製し3384bpのＤＮＡ断片を得た。クローンC38のプラスミドを精製した後、２種類の制限酵素（AccIとKpnI）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製し280bpのＤＮＡ断片を得た。クローンE9のプラスミドを精製した後、２種類の制限酵素（KpnIとHindIII）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製し550bpのＤＮＡ断片を得た。このようにして精製して得られた３種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でE．coliＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用い、野生型還元酵素の遺伝子に変異が導入されたプラスミド（以下、プラスミドｐSarPと記すこともある。）を取り出した。
【０１０３】
（４−２）  部位特異的変異導入操作
配列番号８（PARSQ-R1：５’−CATTAGGCACCCCAGGCTTTACAC−３’）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１３（PAR-A125T-comp：５’−CTCATGATGAAGACGTCCGAGTGGC −３’）で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、ｐSarPを鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。また、配列番号１４（PAR-T373A-sens：５’−GCACCCGGCGCGATGGCCGAGTTCA−３’）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１５（PAR-T517C-comp：５’−CAACCGCGTACGGGCCTCCGCGAAG−３’）で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、ｐSarPを鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。
【０１０４】
［反応液組成］
ｐSarP：5ng
dNTP：各0.2mM−mix
プライマー：各300nM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−buffer：5μl
MgSO４：1mM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ：1U
計50μl
【０１０５】
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPTC−200 Thermal Cycler (ＭＪリサーチ)にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃(０．２５分間)−５５℃(０．５分間)−６８℃（２分間）のサイクルを３０回行なった。
【０１０６】
配列番号８（PARSQ-R1：５’−CATTAGGCACCCCAGGCTTTACAC−３’）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１３（PAR−A125T−comp：５’−CTCATGATGAAGACGTCCGAGTGGC−３’）で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、ｐSarPを鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った結果、262bpのDNA断片が得られた。また、配列番号１４（PAR−T373A−sens：５’−GCACCCGGCGCGATGGCCGAGTTCA−３’）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１５（PAR−T517C−comp：５’−CAACCGCGTACGGGCCTCCGCGAAG−３’）で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、ｐSarPを鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った結果、169bpのDNA断片が得られた。このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片をプライマーに用いて、ｐSarPを鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。
【０１０７】
［反応液組成］
ｐSarP：5ng
dNTP：各0.2mM−mix
プライマー：各300nM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−buffer：5μl
MgSO４：1mM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ：1U
計50μl
【０１０８】
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPTC−200 Thermal Cycler (ＭＪリサーチ)にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃(０．２５分間)−５５℃(０．５分間)−６８℃（２分間）のサイクルを３０回行なった。
【０１０９】
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片に２種類の制限酵素（ＥｃｏＲI及びBsiWI）を加えることにより、当該ＤＮＡ断片を２重消化させた。次いで得られた５３７ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
【０１１０】
一方、プラスミドｐSarPを２種類の制限酵素（ＥｃｏＲI及びBsiWI）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。
【０１１１】
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）でライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて改変型還元酵素の遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐSarAと記すこともある。）を取り出した。
【０１１２】
（４−２）で得られたプラスミドｐSarAをダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、９つのアミノ酸変異（12 Gly,20 Arg,42 Val,67 Arg,125 Met,163 Arg,173 Pro,275 Leu,327 Val）が導入されていることを確認した。
【０１１３】
実施例５  （変異型ポリヌクレオチドの作製：プラスミドｐSar２、ｐSar６、ｐSar８の構築）
【０１１４】
表１で示される塩基配列を有する組合わせのオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、プラスミドｐSarAを鋳型にして以下の反応液組成及び反応条件で第１ＰＣＲを行った。
【０１１５】
【表１】
0004745762.tif 000002
【０１１６】
［反応液組成］
ｐSarA：5ng
dNTP：各0.2mM−mix
プライマー：各300nM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−buffer：5μl
MgSO４：1mM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ：1U
計50μl
【０１１７】
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPTC−200 Thermal Cycler (ＭＪリサーチ)にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃(０．２５分間)−５５℃(０．５分間)−６８℃（２分間）のサイクルを３０回行った。
【０１１８】
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片と表２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、プラスミドｐSarAを鋳型にして以下の反応液組成及び反応条件で第２ＰＣＲを行った。
【０１１９】
【表２】
0004745762.tif 000003
【０１２０】
［反応液組成］
ｐSarA：5ng
dNTP：各0.2mM−mix
プライマー：各300nM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−buffer：5μl
MgSO４：1mM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ：1U
計50μl
【０１２１】
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPTC−200 Thermal Cycler (ＭＪリサーチ)にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃(０．２５分間)−５５℃(０．５分間)−６８℃（２分間）のサイクルを３０回行なった。
【０１２２】
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片に表３に示す２種類の制限酵素を加えることにより、当該ＤＮＡ断片を２重消化させた。次いで得られたＤＮＡ断片を精製した。
【０１２３】
一方、プラスミドｐSarAを表３に示す２種類の制限酵素を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。
【０１２４】
【表３】
0004745762.tif 000004
【０１２５】
このようにして精製して得られたそれぞれのプラスミドに対応する２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて改変型還元酵素の遺伝子を含有するそれぞれのプラスミドを取り出した。
【０１２６】
実施例７  （プラスミドｐSar２６８の構築、および、当該プラスミドを保有する形質転換体の調製）
プラスミドｐSar２を２種類の制限酵素（XhoＩ及びHindIIＩ）を加えることにより、プラスミドｐSarAを２重消化させた。次いで得られたベクター部分のＤＮＡ断片を精製した。
【０１２７】
また、プラスミドｐSar６を２種類の制限酵素（XhoＩ及びKpnＩ）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたインサート部分のＤＮＡ断片を精製した。
【０１２８】
一方、プラスミドｐSar８を２種類の制限酵素（KpnＩ及びHindIIＩ）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたインサート部分のＤＮＡ断片を精製した。
【０１２９】
このようにして精製して得られた３種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて改変型還元酵素の遺伝子を含有するプラスミドを取り出した（以下、プラスミドｐSar２６８と記すこともある。）。
【０１３０】
実施例８  （本発明ポリヌクレオチドを保有する形質転換体の調製）（プラスミドｐSar268の42番目のアミノ酸（Val）を別のアミノ酸に置換したプラスミドの構築）
配列番号１９（SatSar3: 5'-CTGCCACTCGGACNNKTTCATCATGAGC-3'）もしくは配列番号２０（SatSar3-2: 5'-CTGCCACTCGGACMHYTTCATCATGAGC-3'）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１２（PARSQ-F3: 5'-GCACCGAGACCGGGAGGATTG-3'）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、プラスミドｐSar２６８を鋳型にして以下の反応液組成及び反応条件で第１ＰＣＲを行った。
【０１３１】
［反応液組成］
ｐSar２６８：5ng
dNTP：各0.2mM−mix
プライマー：各300nM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−buffer：5μl
MgSO４：1mM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ：1U
計50μl
【０１３２】
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPTC−200 Thermal Cycler (ＭＪリサーチ)にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃(０．２５分間)−５８℃(０．５分間)−６８℃（０．５分間）のサイクルを３０回繰り返し、６５℃（５分間）ののち、４℃で保温した。
【０１３３】
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片と配列番号８（PARSQ-R1: 5'-CATTAGGCACCCCAGGCTTTACAC-3'）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、プラスミドｐSar２６８を鋳型にして以下の反応液組成及び反応条件で第２ＰＣＲを行った。
【０１３４】
［反応液組成］
ｐSar２６８：5ng
dNTP：各0.2mM−mix
プライマー：各300nM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−buffer：5μl
MgSO４：1mM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ：1U
計50μl
【０１３５】
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPTC−200 Thermal Cycler (ＭＪリサーチ)にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃(０．２５分間)−５８℃(０．５分間)−６８℃（０．５分間）のサイクルを３０回繰り返し、６５℃（５分間）ののち、４℃で保温した。
【０１３６】
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片に２種類の制限酵素（ＥｃｏＲI及びＸｈｏI）を加えることにより、当該ＤＮＡ断片を２重消化させた。次いで得られたＤＮＡ断片を精製した。
【０１３７】
一方、プラスミドｐSar２６８を２種類の制限酵素（ＥｃｏＲI及びＸｈｏI）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた後、carf intestineアルカリフォスファターゼ処理した。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。
【０１３８】
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）でライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。出現したシングルコロニーから、配列番号１９（SatSar3）を使用した反応については80個、配列番号２０（SatSar3-2）を使用した反応については24個それぞれランダムに選び、培養の後プラスミドを調製した。
【０１３９】
得られたプラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を確認し、４２番目のアミノ酸置換を調べたところ、４２番目のＶａｌがＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏに置換された置換体が得られたことを確認した。
なお、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析は、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）を用いて各プラスミドを鋳型としてシークエンス反応を行い、得られたＤＮＡの塩基配列をABI PRISM 310 Genetic Analyserで解析することにより行った。
【０１４０】
実施例９  （本発明還元酵素を用いた反応（その１））
実施例８で得られた形質転換体の中から５０クローンを選抜し、さらに、プラスミドｐSar２６８またはｐＲＡＥ２ｓでE.coli ＪＭ１０９株を形質転換したおのおの８クローンずつの形質転換体、合計６６クローンを０．４ｍＭのIPTG、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．０１％(w／v)のZnCl２、10g／LのBacto-tryptone(Difco)、5g／LのBacto−yeast extract(Difco)、10g／LのNaClを含有する滅菌培地（１ml）に接種し、これを３７℃で２２時間培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（２００００×ｇ、５分、4℃）することにより、沈澱として湿菌体を回収した。回収された湿菌体約10mｇに、１７．４％(v／v)の２−プロパノール、４％(w／v)のｍ−クロロフェナシルクロライド、１ｍＭのＮＡＤ＋含む５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌを添加した。これを３０℃で２２時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを１ｍｌ添加し、有機層を分取した。有機層はNa２SO４にて脱水処理を行なった。当該有機層を下記条件でガスクロマトグラフィーによる含量分析に供試した。(R)- １−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールとｍ−クロロフェナシルクロライドの合計ピーク面積に対する(R)- １−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールのピーク面積の割合を変換率として算出した。結果を表４に示す。このような分析を６６種のクローンについて行った結果、４２番目のアミノ酸がロイシンまたはイソロイシンに置換された変異体が有意に高い変換能を持つことを見出した。得られた４２番目のアミノ酸がロイシンまたはイソロイシンに置換された変異型Ｓａｒ２６８を有する形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて改変型還元酵素の遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれ取り出した（以下、プラスミドｐSar２６８Ｖ４２Ｌ、またはプラスミドｐSar２６８Ｖ４２Ｉと記すこともある。）。
【０１４１】
（含量分析条件）
カラム：CP-cyclodextrine-β-236 M-19, 0.25mm by 25m
カラム温度：１６０℃
インジェクション温度：２４０℃
ディテクション温度：２５０℃
キャリアーガス：ヘリウム（流量：0.4ml/min）
検出器：ＦＩＤ
【０１４２】
【表４．１】
0004745762.tif 000005
【０１４３】
【表４．２】
0004745762.tif 000006
【０１４４】
【表４．３】
0004745762.tif 000007
【０１４５】
実施例１０  （改変型還元酵素をコードする遺伝子の５’末端配列と開始コドン前の１６残基を特定の遺伝子配列に置換したベクターの構築、および、当該ベクターを保有する形質転換体の調製（その２））（ｐHARｎ、ｐHAR1、またはｐHAR2の構築）
改変型還元酵素をコードする遺伝子の５’末端配列と開始コドン前の１６残基を特定の遺伝子配列に置換したベクターを構築するため、配列番号２１（PARHE-S：5'-ATGAAATCATTACAATATACGAGAATCGGCGCG-3'）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２２（PARHE-A：5'-ATGAGACTCTCCAGTCAAATTGTTATCCGCTCAC-3'）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをＴ４ polynucleotide kinase(New England Biolabs)にてリン酸化した後、これらのオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、プラスミドｐSar２６８、ｐSar２６８Ｖ４２Ｌ、またはｐSar２６８Ｖ４２Ｉを鋳型にして以下の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。
【０１４６】
［反応液組成］
テンプレートＤＮＡ：5ng
dNTP：各0.2mM−mix
プライマー：各300nM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−buffer：5μl
MgSO４：1mM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ：1U
計50μl
【０１４７】
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPTC−200 Thermal Cycler (ＭＪリサーチ)にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃(０．２５分間)−５８℃(０．５分間)−６８℃（４分間）のサイクルを３０回繰り返し、６５℃（５分間）ののち、４℃で保温した。
【０１４８】
3種類のＰＣＲ反応液を用いて、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）でそれぞれライゲーションした後、制限酵素ＤｐｎＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製）にて制限酵素処理した。得られた処理液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。プレート上に出現したシングルコロニーをかき取り、このコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．０１％(w／v)のZnCl２、10g／LのBacto-tryptone(Difco)、5g／LのBacto−yeast extract(Difco)、10g／LのNaClを含有する滅菌培地（２ml）に接種し、これを３７℃で２２時間培養した。培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。
【０１４９】
得られた3種類のプラスミドの塩基配列を確認し、-16番目から-１番目の塩基配列がＧＡＣＴＧＧＡＧＡＧＴＣＴＣＡＴであり、また、1番目から18番目の塩基配列がＡＴＧＡＡＡＴＣＡＴＴＡＣＡＡＴＡＴであることを確認した。また、４２番目のアミノ酸置換を調べたところ、プラスミドｐSar２６８を鋳型にしたものには置換は認められず、ｐSar２６８Ｖ４２Ｌを鋳型にしたものにでは４２番目のＶａｌがＬｅｕに、ｐSar２６８Ｖ４２Ｉを鋳型にしたものでは４２番目のＶａｌがＩｌｅに置換される変異が導入されたプラスミドが得られたことを確認した（以下、それぞれプラスミドｐＨＡＲｎ、プラスミドｐＨＡＲ１、または、ｐＨＡＲ２と記すこともある。）。
なお、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析は、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）を用いて各プラスミドを鋳型としてシークエンス反応を行い、得られたＤＮＡの塩基配列をABI PRISM 310 Genetic Analyserで解析することにより行った。
【０１５０】
実施例１１  （本発明還元酵素を用いた反応（その２））
実施例７、１０で得られた４種類の形質転換体を０．４ｍＭのIPTG、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．０１％(w／v)のZnCl２、10g／LのBacto-tryptone(Difco)、5g／LのBacto−yeast extract(Difco)、10g／LのNaClを含有する滅菌培地（１ml）に接種し、これを３７℃で２２時間培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（２００００×ｇ、５分、4℃）することにより、沈澱として湿菌体を回収した。回収された湿菌体約10mｇに、２１．８％(v／v)の２−プロパノール、５％(w／v)のｍ−クロロフェナシルクロライド、１ｍＭのＮＡＤ＋含む５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌを添加した。これを３０℃で２２時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを１ｍｌ添加し、有機層を分取した。有機層はNa２SO４にて脱水処理を行なった。当該有機層を下記条件でガスクロマトグラフィーによる含量分析に供試した。(R)- １−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールとｍ−クロロフェナシルクロライドの合計ピーク面積に対する(R)- １−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールのピーク面積の割合を変換率として算出した。結果を表５に示す。
【０１５１】
（含量分析条件）
カラム：CP-cyclodextrine-β-236 M-19, 0.25mm by 25m
カラム温度：１６０℃
インジェクション温度：２４０℃
ディテクション温度：２５０℃
キャリアーガス：ヘリウム（流量：0.4ml/min）
検出器：ＦＩＤ
【０１５２】
【表５】
0004745762.tif 000008
【０１５３】
実施例１２  （本発明還元酵素を用いた反応（その３））(ｍ−クロロフェナシルクロライドを用いた反応)
２種類の形質転換体（JM109(pHAR1) 、JM109(pSar268)）を０．４ｍＭのIPTG、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、0.01％(w／v)のZnCl２、10g／LのBacto−tryptone(Difco)、5g／LのBacto−yeast extract(Difco)、10g／LのNaClを含有する滅菌培地（１００ml）に接種し、これを３７℃で２２時間培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（５０００×ｇ、１５分、4℃）することにより、沈澱として湿菌体を回収した。回収された湿菌体３０ｍｇに、２０％(v／v)の２−プロパノール、１ｍＭのＮＡＤ＋を含む５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌを添加したものに、ｍ−クロロフェナシルクロライドを１００、１２５、１５０、１７５、または、２００ｍｇ添加した。これを３０℃で２２時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを１ml添加し、有機層を分取した。有機層はNa２SO４にて脱水処理を行なった。当該有機層を下記条件でガスクロマトグラフィーによる含量分析に供試した。(R)- １−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールとｍ−クロロフェナシルクロライドの合計ピーク面積に対する(R)- １−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールのピーク面積の割合を変換率として算出した。結果を表６に示す。また、いずれの反応条件でも１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールの光学純度は９９％e.e.(R)以上であった。
【０１５４】
（含量分析条件）
カラム：CP-cyclodextrine-β-236 M-19, 0.25mm by 25m
カラム温度：１６０℃
インジェクション温度：２４０℃
ディテクション温度：２５０℃
キャリアーガス：ヘリウム（流量：0.4ml/min）
検出器：ＦＩＤ
保持時間：ｍ−クロロフェナシルクロライド；  8.5分
(S)- １−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノール；12.7分
(R)- １−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノール；13.1分
【０１５５】
【表６】
0004745762.tif 000009
【０１５６】
実施例１３  （本発明還元酵素を用いた反応（その４））(４−クロロ−３−オキソ酪酸エチルを用いた反応)
２種類の形質転換体（JM109(pHAR1) 、JM109(pSar268)）を０．４ｍＭのIPTG、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、1％(w／v)のZnCl２、10g／LのBacto−tryptone(Difco)、5g／LのBacto−yeast extract(Difco)、10g／LのNaClを含有する滅菌培地（１００ml）に接種し、これを３７℃で２２時間培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（５０００×ｇ、１５分、4℃）することにより、沈澱として湿菌体を回収した。回収された湿菌体３０ｍｇに、２０％(v／v)の２−プロパノール、１ｍＭのＮＡＤ＋を含む５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）０．２５ｍｌを添加したものに、さらに５０、７５、８７．５、または、１００μlの４−クロロ−３−オキソ酪酸エチルとｎ−オクタンを合計０．２５ｍｌとなるよう添加した。これを３０℃で２２時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを１ml添加し、有機層を分取した。有機層はNa２SO４にて脱水処理を行なった。当該有機層を下記条件でガスクロマトグラフィーによる含量分析に、液体クロマトグラフィーによる光学異性体分析に供試した。各形質転換体を用いて反応を行なった時のガスクロマトグラフィーによる結果から４−クロロ−３−オキソ酪酸エチルのモル変換率を算出した。結果を表７に示す。また、いずれの反応条件でも４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの光学純度は９９％e.e.(R)以上であった。
【０１５７】
（含量分析条件）
カラム：CP-cyclodextrine-β-236 M-19, 0.25mm by 25m
カラム温度：１２０℃
インジェクション温度：２４０℃
ディテクション温度：２５０℃
キャリアーガス：ヘリウム（流量：0.4ml/min）
検出器：ＦＩＤ
保持時間：４−クロロ−３−オキソ酪酸エチル；  ６．０分
４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル；８．４分
【０１５８】
（光学異性体分析条件）
カラム：Chiralcel  OB−H（ダイセル化学工業社製）
キャリアー溶媒：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝９：１（ｖ/ｖ）
流速：１．０ml/分
カラム温度：３０℃
検出器：UV２２０nm
保持時間：４−クロロ−３−オキソ酪酸エチル；１１．６分
(R)- ４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル；７．７分
(S)- ４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル；８．３分
【０１５９】
【表７】
0004745762.tif 000010
【０１６０】
実施例１４  （本発明還元酵素を用いた反応（その５））(N-Boc-ピロリジノンを用いた反応)
２種類の形質転換体（JM109(pHAR1) 、JM109(pSar268)）を０．４ｍＭのIPTG、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、1％(w／v)のZnCl２、10g／LのBacto−tryptone(Difco)、5g／LのBacto−yeast extract(Difco)、10g／LのNaClを含有する滅菌培地（１００ml）に接種し、これを３７℃で２２時間培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（５０００×ｇ、１５分、4℃）することにより、沈澱として湿菌体を回収した。回収された湿菌体３０ｍｇに、２０％(v／v)の２−プロパノール、１ｍＭのＮＡＤ＋を含む５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌを添加したものに、さらに５０、７５、１００、または１２５ｍｇのN-Boc-ピロリジノンを添加した。これを３０℃で２２時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを１ml添加し、有機層を分取した。有機層はNa２SO４にて脱水処理を行なった。当該有機層を下記条件で、液体クロマトグラフィーによる含量分析に供試した。各形質転換体を用いて反応を行なった時の液体クロマトグラフィーによる結果からN-Boc-ピロリジノンのモル変換率を算出した。結果を表８に示す。また、いずれの反応条件でもN-Boc-ピロリジノールの光学純度は９９％e.e.(S)以上であった。
【０１６１】
（含量分析および光学異性体分析条件）
カラム：Chiralcel  OB−H（ダイセル化学工業社製）
キャリアー溶媒：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝４：１（ｖ/ｖ）
流速：０．５ml/分
カラム温度：４０℃
検出器：UV２２０nm
保持時間：N-Boc-ピロリジノン；２０．１分
(R)- N-Boc-ピロリジノール；１３．４分
(S)- N-Boc-ピロリジノール；１１．９分
【０１６２】
【表８】
0004745762.tif 000011
【０１６３】
実施例１５  （本発明還元酵素の精製）
実施例８、１０に記載された方法で培養を行った形質転換体５種類を各々超音波破砕（２０ＫＨｚ、１５分、４℃）した後、遠心分離（１０００００xｇ、６０分、４℃）を行い、その上清を得る。得られた超遠心上清をイオン交換クロマトグラフィーカラム［DEAE-Sepharose CL-6B（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［カリウム−リン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）で平衡化したもの］に展着し、NaClを溶解したカリウム−リン酸バッファー（NaCｌ濃度０Ｍ→０．８Ｍの濃度勾配）を移動層として目的酵素を溶出する。溶出画分の酵素活性の測定はアセトフェノンを用いて行う。
【０１６４】
具体的には、溶出画分を含む０．０１ｍｌの溶出液に、アセトフェノン（０．３６５ｍｇ／ｍｌ）及びＮＡＤＨ（０．５４３ｍｇ／ｍｌ）を溶解したリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．０）０．９９ｍｌを加え、２５℃で保温し、３４０ｎｍの吸光度の減少を測定する。還元酵素活性のある画分を集め、当該画分に硫酸アンモニウムをその濃度が１．８Ｍになるまで徐々に加える。これを疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム［Butyl-Toyopearl 650（東ソー社製）］［１．８Ｍ硫酸アンモニウムを含むカリウム−リン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、硫酸アンモニウムを溶解したカリウム−リン酸バッファー（硫酸アンモニウム濃度１．８Ｍ→０Ｍの濃度勾配）を移動層として目的酵素を溶出する。還元酵素活性のある画分を集め、当該画分に硫酸アンモニウムをその濃度が１．８Ｍになるまで徐々に加える。これを疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム［Phenyl-Toyopearl 650（東ソー社製）］［１．８Ｍ硫酸アンモニウムを含むカリウム−リン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、硫酸アンモニウムを溶解したカリウム−リン酸バッファー（硫酸アンモニウム濃度１．８Ｍ→０Ｍの濃度勾配）を移動層として目的酵素を溶出する。還元酵素活性のある画分を集め、当該画分をCellulofine GC-700mカラム（生化学工業社製）［０．１ＭNaClを含むカリウム−リン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、０．１ＭNaClを含むカリウム−リン酸バッファーを移動層として目的酵素を溶出する。還元酵素活性のある画分を集め、当該画分をCellulofine GC-2000sfカラム（生化学工業社製）［０．１ＭNaClを含むカリウム−リン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、０．１ＭNaClを含むカリウム−リン酸バッファーを移動層として目的酵素を溶出させる。還元酵素活性のある画分を集め、精製還元酵素を得る。
【０１６５】
「配列表フリーテキスト」
配列番号１
野生型還元酵素のアミノ酸配列
配列番号２
野生型還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
配列番号３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３
変異型還元酵素のアミノ酸配列
配列番号２４
変異型還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
配列番号２５
変異型還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
配列番号２６
変異型還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
配列番号２７
変異型還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
【配列表】
0004745762000001.app