(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板に、凹部状反応部を有し、かつ該反応部内に反応溶液及び反応溶液上に液状蒸発防止体を有してなるポリプロピレン製の反応容器であって、
前記液状蒸発防止体が、ミネラルオイル、シリコンオイル又はフッ素油のいずれかであり、
該液状蒸発防止体と凹部状反応部の内壁を形成する物質との接触角が、該反応溶液と凹部状反応部を形成する物質との接触角より低く、
該液状蒸発防止体と凹部状反応部を形成する物質との接触角が、１〜９°の範囲内であることを特徴とする反応容器。
【請求項２】
前記凹部状反応部の最大開口径が０．１〜３ｍｍの範囲内であり、かつ最大深さが０．１〜２．５ｍｍの範囲内であることを特徴とする請求項１記載の反応容器。
【請求項３】
前記液状蒸発防止体が不揮発性液体であることを特徴とする請求項１又は２に記載の反応容器。
【請求項４】
前記液状蒸発防止体の２０℃における粘度が、１００ｍＰａ・ｓ以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の反応容器。
【請求項５】
前記液状蒸発防止体の沸点が１８０℃以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の反応容器。
【請求項６】
同一基板に、凹部状試薬収容部を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の反応容器。
【請求項７】
さらに第二反応部を備えることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の反応容器。
【請求項８】
基板に凹部状反応部を有するポリプロピレン製の反応容器の凹部状反応部に反応溶液及び反応溶液上に液状蒸発防止体を供給する工程、該凹部状反応部内で反応を行う工程を有する反応方法であって、
前記液状蒸発防止体が、ミネラルオイル、シリコンオイル又はフッ素油のいずれかであり、
該液状蒸発防止体と凹部状反応部の内壁を形成する物質との接触角が、該反応溶液と凹部状反応部を形成する物質との接触角より低く、
該液状蒸発防止体と凹部状反応部を形成する物質との接触角が、１〜９°の範囲内であることを特徴とする反応方法。
【請求項９】
前記凹部状反応部の最大開口径が０．１〜３ｍｍの範囲内であり、かつ最大深さが０．１〜２．５ｍｍの範囲内であることを特徴とする請求項８に記載の反応方法。
【請求項１０】
前記液状蒸発防止体が不揮発性液体であることを特徴とする請求項８又は９に記載の反応方法。
【請求項１１】
前記液状蒸発防止体の２０℃における粘度が、１００ｍＰａ・ｓ以上であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれかに記載の反応方法。
【請求項１２】
前記液状蒸発防止体の沸点が１８０℃以上であることを特徴とする請求項８〜１１のいずれかに記載の反応方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学反応や抗原抗体反応による抗原の検出及びＤＮＡの検出等の生化学反応などに用いる反応容器及び反応方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化学反応やＤＮＡ反応、たんぱく質反応などの生化学反応をチップ上にて行うμ−Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ技術やＬａｂ−ｏｎ−Ｃｈｉｐ技術が研究され実現して
きており、今まで大型の実験装置や大量の試薬が必要であった反応実験が数ミリ角以下の
チップで少量の試薬で行えるようになってきている。
【０００３】
生化学反応の例としては、酵素反応によるＤＮＡ増幅反応や、既知の配列を有するプローブＤＮＡを用い、ハイブリダイゼーション法により検体ＤＮＡの配列を検出する方法、ＤＮＡの配列決定の中でもＳＮＰ（一塩基多型）の検出法などがある。
ＳＮＰの検出法としては、インベーダー法、タックマンＰＣＲ法をタイピング工程に用いる方法が知られている（特許文献１参照）。
【０００４】
一般的にＤＮＡを用いた検出反応には血液等を採取し抽出したものを用いるが、採取する血液等の試料を少量で済ませるため、検体ＤＮＡの調製法として、酵素反応によるＤＮＡ増幅反応を用いることが多い。
試料中に含まれる微量のＤＮＡを増加させる方法には種々の方法が知られているが、その代表的な方法として、ＰＣＲ増幅反応が知られている。この方法は、試料中の二本鎖ＤＮＡの変性工程（一本鎖に解離）、アニーリング工程（一本鎖ＤＮＡとプライマーを結合）、伸長工程（プライマーからＤＮＡを合成）から構成される３工程を１サイクルとし、このサイクルを繰り返して試料中のＤＮＡを増加させる方法である。変性工程は約９５℃、アニーリング工程は５０〜６０℃、伸長工程は６０〜８０℃で行われる。ＰＣＲ増幅反応はこの熱サイクルを繰り返すことにより行われる。１サイクルに要する時間はせいぜい数分程度であり、このサイクルを繰り返して必要量のＤＮＡを得る。
なお、ＰＣＲ反応の前には前処理として９５℃で数分〜５、６分加熱することもある。
【０００５】
ＳＮＰの検出法の一つであるインベーダー法は、二種類の非蛍光標識オリゴヌクレオチド（アレルプローブ、インベーダープローブ）、一種類の蛍光標識オリゴヌクレオチド（ＦＲＥＴプローブ）及びＤＮＡ構造に特異的なエンドヌクレアーゼ（クリベース）を使用する。アレルプローブは、鋳型ＤＮＡの配列とは無関係な配列（フラップ）を５’側に有し、３’側に鋳型ＤＮＡに特異的な相補配列を有するオリゴヌクレオチドで、その相補配列の５’側末端はＳＮＰ部位となっている。他方、インベーダープローブは、前記ＳＮＰ部位から鋳型ＤＮＡの３’側に相補的に結合するように設計されている。また、ＦＲＥＴプローブは蛍光標識を有するオリゴヌクレオチドで、その５’末端に蛍光標識（レポーター）を有し、その上流にはクエンチャーが結合している。そして、このレポーターから３’側の部位が自己ハイブリダイゼーションして二本鎖を構成しており、この二本鎖から３’末端側に、アレルプローブのフラップと相補的な配列である一本鎖の部位を有するものである。また、クリベースは、ヌクレオチドが三重に重なった部位を認識し、三重に重なったヌクレオチドの３’側を切断して遊離させる酵素である。
【０００６】
このインベーダー法においては、まず検査対象の鋳型ＤＮＡとアレルプローブをハイブリダイゼーションしたときに、ＳＮＰ部位にインベーダープローブの３’末端が侵入する。このため、このＳＮＰ部位で、鋳型ＤＮＡ、アレルプローブ及びインベーダープローブを重ね合わせて三重になる。このＳＮＰ部位の構造をクリベースが認識して、アレルプローブのフラップを切断・遊離させる。次に、アレルプローブ起源の前記遊離フラップはＦＲＥＴプローブとハイブリダイゼーションする。このハイブリダイゼーションによって、自己ハイブリダイゼーションの二本鎖とアレルプローブ起源の前記遊離フラップとの交点で三重となり、クリベースは再びこの構造を認識してＦＲＥＴプローブのレポーターを切断し、クエンチャーから開放される。そして、励起光を照射することにより、切断遊離されたレポーターの蛍光標識が蛍光発光する。仮にＳＮＰ部位の塩基がアレルプローブとマッチしないものであった場合、アレルプローブ起源のフラップは切断・遊離せず、したがって、蛍光発光率が著しく低いから、この蛍光強度の差を検出することによってＳＮＰを検査することができる。なお、励起光としては一般に紫外光又は可視光が利用されている。
また、これらの反応は約６３℃で数十分〜４時間程度インキュベートすることにより行われる。
【０００７】
なお、前述のインベーダー法や一般的なハイブリダイゼーション法では、検体ＤＮＡの前処理として９５℃で数分〜５、６分加熱することもある。
【０００８】
チップを用いて、これらの反応を行う場合、ＤＮＡの配列を決定する場合などは、スライドガラス上にプローブＤＮＡを固定し、その上でハイブリダイゼーション反応を行う方法が知られている。
また、チップ上に設けたウェルと呼ばれる微小な穴やくぼみが形成され反応場として用いることも知られている。ウェルは、半導体やガラスにエッチングで設けたり、穴のあいた板を積層することで形成されていた。
ウェルを用いる場合、試薬を基板上に固定する必要がなく、またＰＣＲ反応などにも適用できる。
【０００９】
ウェルタイプのものとしては、例えば、基板表面に多数のウェルが設けられている検出用基板が開示されている（特許文献２、３、４参照）。
また、内部に流路を設け、両端に開口部を有する、ＰＣＲ反応用の装置も知られている（特許文献５参照）。
【００１０】
上述のチップ、検出用基板のような反応容器では、各凹部の温度状態を目的の反応条件になるようにラバーヒーターやペルチェ素子などの温度制御可能な装置を備える反応装置により、各凹部に供給した反応試薬の加熱を行っている。
ここで、前述のウェルタイプのような、反応試薬が供給された凹部の開口部が開放状態の場合、反応試薬が外部に露出していることにより反応時の加熱により反応試薬が蒸発するのを防ぐため、反応液よりも比重の低いミネラルオイルなどの不揮発性液体を重層する手法がある。
また、化学分析分野や医学分野、農学分野において各種自動解析、例えば遺伝子解析の研究や臨床試験を行う反応容器として、解析に必要な各反応工程が１つの反応容器上で完結するような試薬キットが提供されている。ここで、試薬調製から反応、検出までを自動で連続的に行うために、反応場を開口部を有する凹部で形成し、反応液に不揮発性液体を重層する上述した手法が利用されている。
【００１１】
【特許文献１】特開２００２−３００８９４号公報
【特許文献２】ＷＯ２００３／０３１９７２号公報
【特許文献３】特開平０９−９９９３２号公報
【特許文献４】特開２００３−７０４５６号公報
【特許文献５】特許第２７５９０７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、上記従来の反応容器において、例えば生化学反応などの遺伝子解析や臨床試験では、試料や反応量が１μｌからせいぜい数百μｌ程度と微量で、効率の良い反応により短時間に解析する必要がある。そのため、試薬や試料は必要最低量とすることが望ましく、反応場がその容積に合わせて微小空間となるが、ミネラルオイルなどの不揮発性液体を反応液に重層した場合、蒸発防止に十分な量を重層すると反応場の容積を大きくする必要があり、また微小空間での反応には、わずかな蒸発損失も、その解析結果に大きく影響を及ぼしてしまうことがあった。
【００１３】
そこで、本発明は、微小空間を反応場とした際に、加熱反応による反応液の蒸発損失を防止して、必要な量の反応物や安定した解析結果を得ることができる反応容器とこの反応容器を利用した反応方法提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
請求項１の発明は、基板に、凹部状反応部を有し、かつ該反応部内に反応溶液及び反応溶液上に液状蒸発防止体を有してなるポリプロピレン製の反応容器であって、前記液状蒸発防止体が、ミネラルオイル、シリコンオイル又はフッ素油のいずれかであり、該液状蒸発防止体と凹部状反応部の内壁を形成する物質との接触角が、該反応溶液と凹部状反応部を形成する物質との接触角より低く、該液状蒸発防止体と凹部状反応部を形成する物質との接触角が、１〜９°の範囲内であることを特徴とする反応容器である。
【００１５】
請求項２の発明は、前記凹部状反応部の最大開口径が０．１〜３ｍｍの範囲内であり、かつ最大深さが０．１〜２．５ｍｍの範囲内であることを特徴とする請求項１記載の反応容器である。
【００１６】
請求項３の発明は、前記液状蒸発防止体が不揮発性液体であることを特徴とする請求項１又は２に記載の反応容器である。
【００１７】
請求項４の発明は、前記液状蒸発防止体の２０℃における粘度が、１００ｍＰａ・ｓ以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の反応容器である。
【００１８】
請求項５の発明は、前記液状蒸発防止体の沸点が１８０℃以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の反応容器である。
【００２０】
請求項６の発明は、同一基板に、凹部状試薬収容部を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の反応容器である。
【００２１】
請求項７の発明は、さらに第二反応部を備えることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の反応容器である。
【００２２】
請求項８の発明は、基板に凹部状反応部を有するポリプロピレン製の反応容器の凹部状反応部に反応溶液及び反応溶液上に液状蒸発防止体を供給する工程、該凹部状反応部内で反応を行う工程を有する反応方法であって、前記液状蒸発防止体が、ミネラルオイル、シリコンオイル又はフッ素油のいずれかであり、該液状蒸発防止体と凹部状反応部の内壁を形成する物質との接触角が、該反応溶液と凹部状反応部を形成する物質との接触角より低く、該液状蒸発防止体と凹部状反応部を形成する物質との接触角が、１〜９°の範囲内であることを特徴とする反応方法である。
【００２３】
請求項９の発明は、前記凹部状反応部の最大開口径が０．１〜３ｍｍの範囲内であり、かつ最大深さが０．１〜２．５ｍｍの範囲内であることを特徴とする請求項９記載の反応方法である。
【００２４】
請求項１０の発明は、前記液状蒸発防止体が不揮発性液体であることを特徴とする請求項８又は９に記載の反応方法である。
【００２５】
請求項１１の発明は、前記液状蒸発防止体の２０℃における粘度が、１００ｍＰａ・ｓ以上であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれかに記載の反応方法である。
【００２６】
請求項１２の発明は、前記液状蒸発防止体の沸点が１８０℃以上であることを特徴とする請求項８〜１１のいずれかに記載の反応方法である。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の反応容器によれば、蒸発防止体と前記反応容器内壁を形成する材質との接触角θが内容液の接触角よりも低く、１°≦θ≦９°である不揮発性液体を蒸発防止体として、微小容積の容器内に自由状態で収容する内容液に重層することにより、反応加熱時の蒸発損失を防止し、必要な量の反応生成物や正確な検出解析を行うことができる。また、微小容積の反応部においては、流体の比重の違いはあまり影響せず、界面張力が支配的になるため、反応容器内壁を形成する材質との接触角が低く、高粘度（η≧１００ｍＰａ・ｓ（２０℃））で流動性が低い不揮発性液体を用いる場合、不揮発性液体の比重が内容液よりも小さい必要はなく、高い蒸発防止効果を有するため、反応容器内壁に親水処理等の表面処理を施す必要がない。これにより、高い蒸発防止効果と共に、本発明の反応容器の製造において、工程の簡略化を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明は、基板に凹部状反応部を有する反応容器において、反応部内に反応溶液及び反応溶液上に液状蒸発防止体を有し、液状蒸発防止体と凹部状反応部の内壁を形成する物質との接触角が、該反応溶液と凹部状反応部を形成する物質との接触角より低く、液状蒸発防止体と凹部状反応部を形成する物質との接触角が、１〜９°の範囲内であることを特徴とするものである。
【００３０】
本発明に用いる基板は、反応系に悪影響を与えないものであればよい。また、反応を検出する際、基板下方より光学検出する場合は透明性が高い方が好ましい。
また、後述の反応液、液状蒸発防止体との接触角が前記範囲に入るようなものを選定することが重要である。
【００３１】
このようなものとして、例えば、ＰＰ（ポリプロピレン）やポリエチレン樹脂等のポリオレフィン樹脂を好適に使用できるものである。また、用途に応じてポリメチルアクリレートやポリメチルメタクリレート等のアクリル系樹脂や、ＰＣ（ポリカーボネート）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のポリエステル樹脂、シクロオレフィン系ポリマー、メチルペンテン系樹脂、フッ素ポリマー、シリコーン樹脂などを用いることができる。
特にポリプロピレン系の樹脂を用いることが好ましい。
【００３２】
また、このような合成樹脂を用いて基板を作成すれば、耐熱性、耐薬品性、成形加工性などに優れているため好ましい。さらに、２種類以上の樹脂を接合して用いてもよい。この場合、それぞれの樹脂の特徴を活かして基板を作成することにより、試薬及び試料等の特性に応じた多様な基板とすることが可能となり、用途ごとに使い分けることができる。例えば、基板の上半分と下半分とで材料を分けたりすることも可能となる。また、後述の試薬収容部や凹形状反応部など部分ごとに材料を分けることもできる。
なお、基板の素材としてガラスを用いてもよい。
【００３３】
また、基材の厚みは０．０５〜５ｍｍの範囲内であることが好ましい。さらに好ましくは０．５〜１．５ｍｍの範囲内である。
この範囲より薄いと強度が低下し、この範囲より厚いと取り扱い性等の点で好ましくない。
【００３４】
凹形状の反応部は、基板がプラスチック、合成樹脂系であれば切削加工、成型加工により形成することができる。ガラスであれば切削加工、エッチング加工により形成することができる。また、反応部は複数有することができ、目的に応じて適宜設定できる。
凹形状の反応部の開口径は０．１〜３ｍｍの範囲内、深さが０．１〜２.５ｍｍ範囲内であることが好ましい。前述のようにライフサイエンス分野では、微量試薬を用いて厳密な温度制御を行うことが多く、効率的に反応を行うためには、前記範囲内であることが好ましい。
また、反応部内には予め、反応に必要な試薬を収容しておいても良い。
【００３５】
なお、凹形状の反応部には、後述するように、反応液、液状蒸発防止体を収容する。通常、液状蒸発防止体は、反応液より比重が軽くないと反応液を覆うことができないが、微小空間においては、流体の比重の違いはあまり影響せず界面張力が支配的になる。そのため、本発明では液状蒸発防止体の接触角が低いほど容器内壁へのぬれ性がよいため、反応容器の容積が微小容積であるほど内容液表面を効率よく覆うことができる。
【００３６】
また、凹形状は特に限定するものではないが、底部が平坦でありウェル開口部から底部まで壁面が傾斜している円錐台形形状であることが好ましい。底部が平坦でありウェル開口部から底部まで壁面が傾斜している円錐台形状であれば、下方からの光学的な検出に有利である。例えば反応部内に蛍光物質を下方から紫外線を照射し、同じく下方から蛍光を検出する場合、球状やその他複雑な形状であると、蛍光物質の励起源である紫外線が屈折、散乱して蛍光物質に照射される量が減少してしまう。また生じた蛍光も屈折、散乱し、検出する蛍光強度の低下、誤検出などの原因となってしまう。また、反応部底部と基材裏面との間の透過率７０％以上の材質で形成し、照射励起光の屈折・偏向を防止することが望ましい。さらに、反応液の供給時に気泡を巻き込むことを抑制できる。
なお、それ以外にも、開口部が円形または多角形で、断面が半球形状、Ｕ字形状、三角形状、四角形状になっているものでもかまわない。また、開口部が多角形で断面が台形形状でもかまわない。
【００３７】
また、前記反応部は、図９（ｂ）に示すような基板をくりぬいた形状にしてもよいし、図９（ａ）に示すように基板裏面が反応部の形状に沿って基板下方向に凸形状になっていても良い。
【００３８】
また、反応部上に保護フィルムを設けても良い。保護フィルムを設けることにより、ごみ、汚染物質などによる汚染を防ぐことができる。
保護フィルムとしてはフィルム状のものを用いることができる。このようなものとしては、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン等のポリオレフィンフィルム、ポリメチルアクリレート、ポリメチルメタクリレート等のアクリル系フィルム、ポリスチレンフィルム、ポリアセタールフィルム、ポリアミドフィルム、ポリアクリロニトリルフィルム、ポリカーボネートフィルム、シクロオレフィン系フィルム、シリコン樹脂系フィルム、フッ素系樹脂フィルムなどが挙げられる。
また、アルミニウムなどの金属箔や、金属箔と前述の樹脂フィルムの積層フィルムを用いても良い。
【００３９】
これらの保護フィルムは、接着剤を用いて貼り合わせることができる。接着剤としては、耐熱性の硬化性接着剤を用いることができる。
また、ヒートシールにより貼り合わせてもかまわない。反応部内に予め試薬を収容しておく場合、ヒートシールであれば、試薬への接着剤の影響を考慮しなくても良いので好ましい。
【００４０】
ヒートシールの条件は、温度１４０℃〜２２０℃、圧力１ｋｇ〜３ｋｇ、時間０．３秒〜２．０の範囲内で、加圧しながら貼り合わせることが好ましい。温度、圧力、時間がこれ以上であると基材が変形を起こしやすくなる。また、これ以下の温度、圧力、時間であるると貼り合わせが困難である。また、温度を上げる場合は、内容物の熱劣化を考慮して時間を短くするとよい。
【００４１】
保護フィルムは使用する前に剥がす必要があるため、易剥離性であることが好ましい。
【００４２】
また、例えば図８に示すように開口部周囲に凸部を設けても良い。凸部を設けることにより、保護フィルム材を貼り合わせやすくできる。特にヒートシールにより貼り合わせる場合、加熱する部分が、基材全体ではなく、凸部のところだけでよいので、反応部内に予め試薬を収容しておく場合、試薬への熱的な影響を低減することができる。
また、剥離する際も、接点が開口部を除いた基材全体ではなく、凸部上だけであるので剥離が容易にできる。
【００４３】
このような凸部としては、幅は０．１〜２ｍｍ、好ましくは０．３〜０．７ｍｍの範囲内であることが好ましい。この範囲より小さいと、凸部でヒートシールすることができず、この範囲より大きいと、基材、内容物への影響（ダメージ）が大きくなってしまう。
また、凸部を設けることにより反応部の容量を増やしてもよい。その場合、反応部の強度とヒートシール適性を考慮して、凸部を例えば図８（ｂ）に示すように２段階に形成してもよい。すなわち、強度を出すためにある程度の厚みを持たせた凸部を設け、その上に幅の小さい凸部を設ける２段階構造にすることにより強度とヒートシール適性を両立させてもよい。
また、凸部同士を凸部と同じ高さで連結させても良い。そのようにすることで、剥離する際に、引っ掛かりがなくスムーズに剥離ができる。
【００４４】
凹部状反応部への反応液の供給時に気泡を巻き込むことを防止するために、反応容器内部において、内容液との親和性を高めるように表面処理を行う方が好ましい。表面処理としては、例えばプラズマ処理、コロナ放電処理、あるいはオゾンガスなどの酸化性薬品による表面処理などである。また、反応凹部底面からの光学検出を行わない場合、サンドブラストなどの物理的処理を行うこともできる。
なお、溶液が水系の場合、表面処理は親水処理であることが好ましい。具体的には水との接触角が７０°以下、好ましくは４０°以下がよい。
また、接触角の測定は、公知の接触角計を用いて測定する。また、ウェル内の接触角の測定は困難であるため、同様の表面状態である基板の表面を用いて測定しても良い。
【００４５】
本発明では凹部状反応部に反応液を入れ、反応を行う。
反応液としては、目的の反応を行うために必要なものを用いればよい。
【００４６】
凹部状反応部では、化学、生化学などの反応を行う。通常これらの反応は加熱して行われる。
そのため、反応液上には液状の蒸発防止体を有する。
微小容積の反応容器内に供給された内容液において、反応加熱による蒸発損失を防止し安定在籍させるためには、効率良く内容液表面を蒸発防止体で覆う必要がある。
液状蒸発防止体は、凹部状反応部の内壁を形成する物質との接触角が、反応溶液と凹部状反応部を形成する物質との接触角より低いものである必要がある。
また、液状蒸発防止体と凹部状反応部を形成する物質との接触角が、１〜９°の範囲内である必要がある。
容器内壁に対する蒸発防止体の接触角が低いほど、蒸発防止体が容器内壁に広がりやすいため、少量で内容液表面を効率よく覆うことができる。蒸発防止体の接触角が限りなく０°に近づくと、内容液を覆いながら容器内壁に在籍するが、蒸発防止体が容器内壁をつたい易くなり蒸発防止体を容器凹部に留めるのが困難になる。
【００４７】
微小容積の反応部においては、流体の比重の違いはあまり影響せず、界面張力が支配的になるため、反応容器内壁を形成する材質との接触角が低く、高粘度（η≧１００ｍＰａ・ｓ（２０℃））で流動性が低い不揮発性液体を用いる場合、不揮発性液体の比重が内容液よりも小さい必要はなく、高い蒸発防止効果を有するため、反応容器内壁に親水処理等の表面処理を施す必要がない。粘度ηが１００ｍＰａ・ｓよりも低い不揮発性液体においては、その比重が反応液よりも大きい場合、不揮発性液体の流動性が高いため重層した不揮発性液体と反応液が上下反転してしまい、反応容器内で重力に従い反応液表面が外部に露出してしまうため、蒸発を防止することができない。より好ましくは、分注などの操作性の観点から１００ｍＰａ・ｓ〜２００ｍＰ・ｓ（２０℃）の粘度である不揮発性液体を用いる。
【００４８】
蒸発防止体としては、ミネラルオイル、シリコンオイル、フッ素油から選ばれた、沸点が１８０℃以上の透明性を有する液体である。本発明の目的である微小容積での開放状態での反応においては、反応条件としてせいぜい１００℃前後までの加熱条件が想定される。したがって、不揮発性液体の沸点が１８０℃より低い場合、所望の蒸発防止効果を安定して得ることができない。
【００４９】
試薬収容部は、開口部を有する凹形状（ウェル形状）であることが好ましい。
試薬収容部は、複数設けることもでき、試薬収容部を複数設ける場合、大きさが異なっていても良い。試薬収容部の数は、目的に応じて適宜設定できる。
また、試薬収容部は、予め一つの試薬を入れておき、後から別の試薬を入れ、混合させる混合場として用いることもできる。
【００５０】
試薬収容部の凹形状としては、中でも半球状または円筒状で底部が半球状なものが好ましい。半球状であれば試薬を充填する際、試薬の飛び散り、気泡の混入を防げるものとなる。また収容した試薬を分取、回収の分取性、回収性に優れるものとなる。
窪みを有する試薬収容部の場合、窪みを除いた部分の底部が半球状になっていれば良い。窪みの底部も半球状になっていることが好ましい。微量試薬の液滴は収容されるとき、玉状で供給されるとすると、ちょうど試薬の液滴が半球状の窪みにはまり保持される構造になる。また、試薬の量が窪みの容量より大きい場合でも、半球状であれば、気泡の混入なく、試薬の一部が窪みに入り込み保持される。
なお、それ以外にも、開口部が円形または多角形で、断面が三角形状、四角形状、台形形状になっているものでもかまわない。
【００５１】
試薬収容部の容量は、１０〜３００μｌの範囲内であることが好ましい。特にＤＮＡを扱う生化学反応では、反応量が微量であり、用いる試薬は高価であることが多い。
そのため、反応に用いる試薬などは多くても数百μｌ程度になり、前述の範囲内であることが好ましい。また、数百μｌ以上の試薬を用いる場合は試薬収容部を２つ以上用いてもよい。
【００５２】
前記試薬収容部の開口径が１〜５０ｍｍの範囲内であることが好ましい。
試薬の量は、数百ｎｌ程度の極微量〜数百μｌ程度であり、また一般的な分注針や分注チップの径は数十μｍ〜数ｍｍ程度である、そのため、分注適性、目的容量を考慮すると、試薬収容部の開口径が１〜５０ｍｍの範囲内であることが好ましい。
【００５３】
また、深さは１〜５０ｍｍの範囲内であることが好ましい。
【００５４】
また、前記試薬収容部は、図９（ｂ）に示すような基板をくりぬいた形状にしてもよいし、図９（ａ）に示すように基板裏面が反応部の形状に沿って基板下方向に凸形状になっていても良い。
【００５５】
また、試薬収容部上に蓋材を設けても良い。蓋材を設けることにより、ごみ、汚染物質などによる汚染を防ぐことができる。
蓋材としてはフィルム状のものを用いることができる。このようなものとしては、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン等のポリオレフィンフィルム、ポリメチルアクリレート、ポリメチルメタクリレート等のアクリル系フィルム、ポリスチレンフィルム、ポリアセタールフィルム、ポリアミドフィルム、ポリアクリロニトリルフィルム、ポリカーボネートフィルム、シクロオレフィン系フィルム、シリコン樹脂系フィルム、フッ素系樹脂フィルムなどが挙げられる。
また、アルミニウムなどの金属箔や、金属箔と前述の樹脂フィルムの積層フィルムを用いても良い。
【００５６】
これらのフィルム状蓋材は、接着剤を用いて貼り合わせることができる。接着剤としては、耐熱性の硬化性接着剤を用いることができる。
また、ヒートシールにより貼り合わせてもかまわない。ヒートシールであれば、試薬への接着剤の影響を考慮しなくても良いので好ましい。
【００５７】
ヒートシールの条件は、温度１４０℃〜２２０℃、圧力１ｋｇ〜３ｋｇ、時間０．３秒〜２．０の範囲内で、加圧しながら貼り合わせることが好ましい。温度、圧力、時間がこれ以上であると基材が変形を起こしやすくなる。また、これ以下の温度、圧力、時間であるると貼り合わせが困難である。また、温度を上げる場合は、内容物の熱劣化を考慮して時間を短くするとよい。
【００５８】
また、蓋材を設けた場合、試薬の回収は、蓋材の上から注射器のような針状の回収具を用いて、突き刺し、回収しても良い。
【００５９】
なお、蓋材を突き刺して試薬を回収する場合は、蓋材は剥離する必要がない。
【００６０】
また、例えば図８に示すように開口部周囲に凸部を設けても良い。凸部を設けることにより、蓋材を貼り合わせやすくできる。
特にヒートシールにより貼り合わせる場合、加熱する部分が、基材全体ではなく、凸部のところだけでよいので、試薬収容部内の試薬への熱的な影響を低減することができる。
【００６１】
このような凸部としては、幅は０．１〜２ｍｍ、好ましくは０．３〜０．７ｍｍの範囲内であることが好ましい。この範囲より小さいと、凸部でヒートシールすることができず、この範囲より大きいと、基材、内容物への影響（ダメージ）が大きくなってしまう。
また、凸部を設けることにより収容部の容量を増やしてもよい。その場合、収容部の強度とヒートシール適性を考慮して、凸部を例えば図８（ｂ）に示すように２段階に形成してもよい。すなわち、強度を出すためにある程度の厚みを持たせた凸部を設け、その上に幅の小さい凸部を設ける２段階構造にすることにより強度とヒートシール適性を両立させてもよい。
【００６２】
試薬収容部における内容液の在籍安定化と内容液の回収効率向上を目的として、試薬収容部において、内容液との親和性を高めるように表面処理を行う方が好ましい。表面処理としては、例えばプラズマ処理、コロナ放電処理、あるいはオゾンガスなどの酸化性薬品による表面処理などである。また、サンドブラストなどの物理的処理を行うこともできる。
なお、溶液が水系の場合、表面処理は親水処理であることが好ましい。具体的には水との接触角が７０°以下、好ましくは４０°以下がよい。
また、接触角の測定は、公知の接触角計を用いて測定する。また、ウェル内の接触角の測定は困難であるため、同様の表面状態である基板の表面を用いて測定しても良い。
【００６３】
また、さらに第二反応部を設けても良い。
第二反応部としては、前述の凹形状の反応部と同様のものであっても良いし、開口部を有する空洞形状の反応部であってもよい。
【００６４】
開口部を有する空洞形状の反応部は、両端に基材を貫通する貫通孔を設け、基材の裏面に両貫通孔を接続する溝部を設ける。この溝部上に底部形成用フィルムを貼り合わせることにより、流路状反応部を形成してもよい。
この時、溝部の幅、高さはそれぞれ１ｍｍ〜５ｍｍの範囲内であることが好ましい。
【００６５】
前記溝部は両貫通孔を直線で結んでいても良いし、試薬や検査対象の蒸発を防ぐために屈曲した形状であっても良い。
【００６６】
底部形成用フィルムとしてはフィルム状のものを用いることができる。このようなものとしては、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン等のポリオレフィンフィルム、ポリメチルアクリレート、ポリメチルメタクリレート等のアクリル系フィルム、ポリスチレンフィルム、ポリアセタールフィルム、ポリアミドフィルム、ポリアクリロニトリルフィルム、ポリカーボネートフィルム、シクロオレフィン系フィルム、シリコン樹脂系フィルム、フッ素系樹脂フィルムなどが挙げられる。
また、アルミニウムなどの金属箔や、金属箔と前述の樹脂フィルムの積層フィルムを用いても良い。
【００６７】
底部形成用フィルムは接着剤を用いて貼り合わせることができる。また、ヒートシールにより貼り合わせても良い。ヒートシールであれば、反応部内への接着剤の影響を考慮しなくても良いので好ましい。
また、底部形成用フィルムは、一部溝部へ食い込む形状であれば好ましい。基材と底部形成用フィルムの間に隙間が生じず、試薬や検査対象の漏れがないものとなるからである。
【００６８】
また、例えば図６に示すように、貫通孔開口部は容量を増やすために基材から上部に突出した形状にしてもよい。
【００６９】
なお、第二反応部で反応を行う際にも反応液上に液状の蒸発防止体を配しても良い。
【００７０】
また、開口部には蓋材を設けてもよい。
【００７１】
また、その他の反応部を設けても良いが、熱の影響を考慮して位置設計することが重要である。
【００７２】
また、凹形状の反応部を用いる場合、反応部同士を接続する流路を設けてもよい。また凹形状反応部と試薬収容部、反応部、その他の反応部を接続する流路を設けてもよい。これら流路を形成することにより、連続した反応を行わせることが可能となる。
【００７３】
また、基板には、変形などを軽減するためにリブを設けてもよい。リブとしては、基板端部の下部及び／又は上部に幅０．１〜３ｍｍ、高さ０．１〜３ｍｍ程度のものを設ければよい。また、置いたときに安定するよう、支持用脚部を設けてもよい。
【００７４】
本発明では、様々な生化学系の反応用として用いることができ、例えば抗原抗体反応及びＤＮＡ反応の検出などに用いることができる。
具体的には、凹形状反応部に、後述の反応に用いる反応液を入れ、その上に前述の液状蒸発防止体を配し、反応を行う。なお、第二反応部を有する場合は、第二反応部でも同様に液状蒸発防止体を用いて反応を行っても良い。
【００７５】
抗原抗体反応による抗原検出の場合、例えば、予め各凹形状反応部内に抗原を含む試料を入れておき、後から検体として抗体を含む試薬を添加し、抗原または抗体のいずれかに標識物質を付けておくことで、反応の有無を検出できる。標識物質としては、蛍光物質などの発光物質が一般的に用いられる。なおこの場合、基板上に試薬収容部を設けて置き、検体を収容しておいてもよい。この場合、抗原、抗体を含む試薬を反応液とする。
【００７６】
ＤＮＡの検出の場合、例えば、予め凹形状反応部内に核酸プローブを用意しておく。その後、検体ＤＮＡを凹形状反応部に供給し、核酸プローブと検体ＤＮＡのハイブリダイゼーション反応により、ＤＮＡの検出を行うことができる。その際、検体ＤＮＡに標識物質を付けておけば、その標識物質の有無を検出することにより検出が可能となる。また、検体ＤＮＡは、血液等から抽出したＤＮＡをＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法などにより調製しておいたものを用いることができる。また、核酸プローブとして配列の異なる核酸を複数用意することで検出物質としての検体ＤＮＡがどのような配列であるかを検出することができる。なお、基板上に試薬収容部を設けて置き、検出物質を収容しておいてもよい。
この場合、核酸プローブ、検体ＤＮＡが反応液となる。
【００７７】
また、基板上に遺伝子増幅反応部を設けておき、チップ上で連続して、血液などから抽出したＤＮＡを遺伝子増幅反応により増幅させ、それを検体とし、反応部で核酸プローブとの反応の有無を検出してもよい。具体的には、例えば凹形状試薬収容部に検体として血液などから抽出したＤＮＡを収容しておき、分注動作により、遺伝子増幅反応部へ分注し、遺伝子増幅反応により調製した検体を凹形状の反応部へ分注すればよい。凹形状試薬収容部から遺伝子増幅反応部、凹形状反応部へは流路を用いて送液しても良い。
なお、ここでいう遺伝子とはＤＮＡ、ＲＮＡなどのことをいう。また遺伝子増幅反応方法としては前記ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法などがある。
【００７８】
また、一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）の解析にも用いることができる。なお、検体を検出するための試薬は複数あってもよく、検体が蛍光標識されていない場合には、試薬のひとつが標識されていればよい。
【００７９】
また、標識物質は、反応物に特有に作用するものを、反応後に加えることもできる。このようなものとしては、ＤＮＡの検出におけるインターカレーターなどがある。また、ここでいう標識物質とは間接的なものも含む。すなわち、蛍光物質などに結合する物質を標識物質として検体またはプローブ核酸などの検体を検出するための試薬に結合させておき、後から蛍光物質を加えても良い。
【００８０】
また、多段階反応を行ってＳＮＰまたはＤＮＡを検出してもよい。
例えば、インベーダー・アッセイ法（サードウェイブテクノロジーズ，Ｉｎｃ（米国ウィスコンシン州マディソン市）を用いても良い。これによりＳＮＰ解析の具現化を図ることが可能となる。
【００８１】
この場合、検体を検出するための試薬が複数種でもよく、予めウェル状反応部内に少なくとも１種の試薬を入れておき、その後、検体と試薬を同時または順次注入し、反応をおこなっても良い。
また、この場合、上記反応に用いる試薬を反応液とする。
【００８２】
また、ＰＣＲ反応を行っても良い。ＰＣＲ反応は、反応液として目的のＤＮＡ、ポリメラーゼ、プライマーミックス及びｄＮＴＰなどを含む溶液を凹状反応部にいれ、二本鎖ＤＮＡの変性工程（一本鎖に解離）、アニーリング工程（一本鎖ＤＮＡとプライマーを結合）、伸長工程（プライマーからＤＮＡを合成）から構成される３工程を１サイクルとした温度サイクルにかけることにより行うことができる。
【００８３】
また、検体を検出するための試薬はウェル状反応部内に固定してもよいし、固定させずに保持させておくだけでもよい。
【実施例】
【００８４】
＜実施例１＞
以下、図面に基づき一例について説明する。図２に示したものは、反応容器１の断面図である。図２において、反応容器１は、基材２に凹部状反応部３が形成されてなる。凹部状反応部３の開口径はφ３ｍｍ、底径はφ１ｍｍ、深さ１．８ｍｍ、底面５と側面との成す角４５．３°の多角形断面形状である。反応容器１（基材２）の材質はポリプロピレン樹脂であり、射出成形により凹部状反応部３を形成した。凹部状反応部３の内壁４および底面５には、Ｏ２を３％含むＨｅガスを用いて、大気圧近傍下にてプラズマ処理を施すことによって、水系の反応液との親和性を高めた。凹部状反応部内壁の接触角測定は困難であったため、凹部状反応部内壁の表面状態と同様の表面状態である同材質平面を用いて測定した値を接触角とした。５箇所測定した結果、得られた値の平均値は６１．３°であった。なお、用いた測定装置はＦＡＣＥ自動固体エナジー解析装置ＣＡ−ＶＥ型である。
この凹部状反応部３の開口部より、調製された水系の反応液６を分注し気泡をかまないように配置し、この反応液界面に接触して、蒸発防止体７を配置した。この蒸発防止体６として、ポリプロピレン基材に対する接触角θが７．７°、比重０．９７ｇ／ｍｌ、粘度５２ｍＰａ・ｓであるシリコンオイルを使用した。この反応容器を、ペルチェ素子による温度制御装置を使用して７５℃で１時間加熱し、反応させた。蒸発防止効果の確認として、凹部状反応部３の真上から写真撮影し、開口部面積のうち内容液が占める面積から加熱前を１００％として、加熱後の残量を算出した。
【００８５】
＜比較例１＞
上述した実施例１において、使用した蒸発防止体７以外は同様にして、蒸発防止体７として、ポリプロピレン基材に対する接触角θが１２．１°、比重０．８４ｇ／ｍｌ、粘度２４ｍＰａ・ｓであるミネラルオイルを使用した。
【００８６】
＜評価１＞
上記の加熱反応後、反応容器中の反応液の残量を測定した結果、実施例１では初期配置量の約９９％が残存していた。
一方、比較例１では、加熱１時間経過後の反応液残量を測定した結果、初期配置量の７６％しか残存していなかった。
【００８７】
＜実施例２＞
図２に示したものは、反応容器１の断面図である。図２において、反応容器１は、基材２に凹部状反応部３が形成されてなる。凹部状反応部３の開口径はφ３ｍｍ、底径はφ１ｍｍ、深さ１．８ｍｍ、底面５と側面との成す角４５．３°の多角形断面形状である。反応容器１（基材２）の材質はポリプロピレン樹脂であり、射出成形により凹部状反応部３を形成した。凹部状反応部内壁４および底面５には、Ｏ２を３％含むＨｅガスを用いて、大気圧近傍下にてプラズマ処理を施すことによって、水系の反応液との親和性を高めた。凹部状反応部内壁の接触角測定は困難であったため、凹部状反応部内壁の表面状態と同様の表面状態である同材質平面を用いて測定した値を接触角とした。５箇所測定した結果、得られた値の平均値は５８．２°であった。なお、用いた測定装置はＦＡＣＥ自動固体エナジー解析装置ＣＡ−ＶＥ型である。
この凹部状反応部３の開口部より、調製された水系の反応液６を分注し気泡をかまないように配置し、この反応液界面に接触して、蒸発防止体７を配置した。この蒸発防止体７として、ポリプロピレン基材に対する接触角θが８．７°、比重１．０６ｇ／ｍｌ、粘度２０４ｍＰａ・ｓであるシリコンオイルを使用した。この反応容器を、ペルチェ素子による温度制御装置を使用して７５℃で１時間加熱し、反応させた。蒸発防止効果の確認として、凹部状反応部３の真上から写真撮影し、開口部面積のうち内容液が占める面積から加熱前を１００％として、加熱後の残量を算出した。
【００８８】
＜比較例２＞
上述した実施例２において、使用した蒸発防止体７以外は同様にして、蒸発防止体７として、ポリプロピレン基材に対する接触角θが１５．２°、比重０．９９ｇ／ｍｌ、粘度２１３ｍＰａ・ｓであるシリコンオイルを使用した。
【００８９】
＜評価２＞
上記の加熱反応後、反応容器中の反応液の残量を測定した結果、実施例２では初期配置量の約９８％が残存していた。
一方、比較例２では、反応加熱１５分経過時点で反応液内部および表面に多数の気泡が発生し、蒸発防止体であるシリコンオイルにより覆われた反応液表面のシリコンオイル膜を破裂させ、反応液表面を外部に露出させた。加熱１時間経過後の反応液残量を測定した結果、初期配置量の４７％しか残存していなかった。
【００９０】
＜実施例３＞
図２に示したものは、反応容器１の断面図である。図２において、反応容器１は、基材２に凹部状反応部３が形成されてなる。凹部状反応部２の開口径はφ３ｍｍ、底径はφ１ｍｍ、深さ１．８ｍｍ、底面と側面との成す角４５．３°の多角形断面形状である。反応容器１（基材２）の材質はポリプロピレン樹脂であり、射出成形により凹部状反応部３を形成した。凹部状反応部内壁４および底面５には、水系の反応液との親和性を高めるための表面処理は施さない。凹部状反応部内壁の接触角測定は困難であったため、凹部状反応部内壁の表面状態と同様の表面状態である同材質平面を用いて測定した値を接触角とした。５箇所測定した結果、得られた値の平均値は９０．３°であった。なお、用いた測定装置はＦＡＣＥ自動固体エナジー解析装置ＣＡ−ＶＥ型である。
この凹部状反応部３の開口部より、調製された水系の反応液６を分注し気泡をかまないように配置し、この反応液界面に接触して、蒸発防止体７を配置した。この蒸発防止体７として、ポリプロピレン基材に対する接触角θが７．６°、比重１．８９ｇ／ｍｌ、粘度５６  ｍＰａ・ｓであるフッ素オイルを使用した。この反応容器を、ペルチェ素子による温度制御装置を使用して７５℃で１時間加熱し、反応させた。蒸発防止効果の確認として、凹部状反応部３の真上から写真撮影し、開口部面積のうち内容液が占める面積から加熱前を１００％として、加熱後の残量を算出した。
【００９１】
＜比較例３＞
上述した実施例３において、使用した蒸発防止体７以外は同様にして、蒸発防止体７として、ポリプロピレン基材に対する接触角θが７．７°、比重０．９７ｇ／ｍｌ、粘度５２ｍＰａ・ｓであるシリコンオイルを使用した。
【００９２】
＜評価３＞
上記の加熱反応後、反応容器中の反応液の残量を測定した結果、実施例３では初期配置量の１００％が残存していた。
一方、比較例３では、反応加熱１５分経過時点で反応液の減少が観察され、加熱１時間経過後の反応液残量を測定した結果、初期配置量の５３％しか残存していなかった。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】本発明の反応容器の一例を示す概略図である。
【図２】本発明の反応容器の凹部状反応部の一例を示す断面図である。
【図３】本発明の反応容器の一例を示す概略図である。
【図４】本発明の反応容器の一例を示す概略図である。
【図５】本発明の反応容器の一例を示す概略図である。
【図６】本発明の反応容器の一例を示す概略図である。
【図７】本発明の反応容器の一例を示す概略図である。
【図８】本発明の反応容器の凹部状反応部の一例を示す断面図である。
【図９】本発明の反応容器の凹部状反応部の一例を示す断面図である。
【符号の説明】
【００９４】
１      反応容器
２      基材
３      凹部状反応部
４      凹部状反応部内壁
５      凹部状反応部底面
６      反応液
７      液状蒸発防止体
８      試薬収容部
９      第二反応部
９ａ    貫通孔開口部突出部
９ｂ    底部形成用フィルム
１０    流路
【図１】
0004781144.tif 000002
【図２】
0004781144.tif 000003
【図３】
0004781144.tif 000004
【図４】
0004781144.tif 000005
【図５】
0004781144.tif 000006
【図６】
0004781144.tif 000007
【図７】
0004781144.tif 000008
【図８】
0004781144.tif 000009
【図９】
0004781144.tif 000010