(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
約１ミクロン未満から１０００ミクロンまでのサイズ範囲の個々の小物体を初期場所から目的場所へ直接移動させる方法であって、前記小物体は、生細胞、小粒子、結晶、バクテリア、ウィルス、たんぱく質、重合体、巨大分子、イオン、および複数の生細胞からなる群のうちの一つであり、前記方法は、
ａ．一連のＮ＋１個の場所Ｌ０．．．ＬＮを定めること（ここで、Ｎは１以上の整数であり、Ｌ０は初期場所であり、ＬＮは目的場所である）、および
ｂ．０からＮ−１までのｉに対し、個々の小物体を場所Ｌｉから場所Ｌｉ＋１に連続的に直接移動させること、
を含み、
前記場所の少なくとも一つは、開放端を有するエンクロージャの配列を有する装置のエンクロージャによって定められ、前記移動は、個々の小物体を前記場所Ｌｉから前記場所Ｌｉ＋１に直接移動させるように、前記場所Ｌｉで個々の小物体に力を加えることによって達成されて成る方法。
【請求項２】
前記場所Ｌｉは前記場所Ｌｉ＋１に対して固定される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
場所Ｌｉから個々の小物体に斥力を加えることをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記斥力は物理的力、電気力、および／または磁気力からなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記斥力は前記場所Ｌｉでのエンクロージャからその開放端の外に向かう方向での流体の流動の結果である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記流体の流動は、場所Ｌｉの近傍からの流体の注入によって発生される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記エンクロージャは、個々の小物体を実質的に包囲するのに適切なサイズのものである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
装置中の第一場所から第二場所に流体中の約１ミクロン未満から１０００ミクロンまでのサイズ範囲の個々の小物体を移動させる方法であって、前記小物体は、生細胞、小粒子、結晶、バクテリア、ウィルス、たんぱく質、重合体、巨大分子、イオン、および複数の生細胞からなる群のうちの一つであり、前記方法は、
ａ．小物体を第一場所に局在化させる第一力を発生するように、前記装置中の第一場所に向かって流体を引き込むこと、および
ｂ．その後小物体を第二場所に局在化させる第二力を発生するように、前記装置中の第二場所に向かって流体を引き込むこと、
を含む方法。
【請求項９】
前記第一場所は前記第二場所に対して固定される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一場所に向かって流体を引き込むこと、および前記第二場所に向かって流体を引き込むことは、フロージェネレータによる流体の吸引によって実行される請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一力の大きさを低減して、小物体を第二場所に局在化させるのを助けることをさらに含む請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一力を除去して、小物体を第二場所に局在化させるのを助けることをさらに含む請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
流体を第一場所から注入して斥力を発生させ、小物体を第二場所に局在化させるのを助けることをさらに含む請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一場所および前記第二場所は、個々の小物体を実質的に包囲するのに適切なサイズのエンクロージャを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
第一場所および第二場所に向かう流体の引き込みは、それぞれの前記エンクロージャ内からの前記流体の吸引によって実行される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
個々の小物体のサイズは、約１０３ミクロンに等しいかまたはそれより小さい請求項１または８に記載の方法。
【請求項１７】
個々の小物体のサイズは、約１０２ミクロンに等しいかまたはそれより小さい請求項１または８に記載の方法。
【請求項１８】
個々の小物体は、細胞、結晶、バクテリア、ウィルス、たんぱく質、重合体、巨大分子、イオン、および原子からなる群から選択される請求項１または８に記載の方法。
【請求項１９】
小物体は細胞である請求項１または８に記載の方法。
【請求項２０】
前記流体は液体である請求項５または８に記載の方法。
【請求項２１】
前記液体は細胞培養液である請求項５または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記移動させることは、前記場所ＬｉとＬｉ＋１の間で個々の小物体に力を加えることによって達成される請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
場所Ｌｉ＋１から個々の小物体に引力を加えることをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記引力は物理的力、電気力、および／または磁気力からなる群から選択される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記引力は、前記場所Ｌｉ＋１でのエンクロージャの外へのエンクロージャの開放端に対向する方向での流体の流動の結果である請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記流体の流動は、場所Ｌｉ＋１の近傍からの流体の吸引によって発生される請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
約１ミクロン未満から１０００ミクロンまでのサイズ範囲の小物体を操作するための装置であって、前記小物体は、生細胞、小粒子、結晶、バクテリア、ウィルス、たんぱく質、重合体、巨大分子、イオン、および複数の生細胞からなる群のうちの一つであり、前記装置は、少なくとも第一場所および第二場所を含み、前記少なくとも第一場所および第二場所のそれぞれが少なくとも相互に対して固定された位置を有し、前記装置はさらに、前記少なくとも第一場所および第二場所のそれぞれに機能的に関連付けられたフロージェネレータを含み、前記フロージェネレータは、吸引モード、注入モードおよび非活動モードを含むモード群から選択されたモードに独立に設定可能である、装置。
【請求項２８】
前記吸引モードにおいて、前記フロージェネレータは、前記少なくとも第一場所および第二場所の前記それぞれ一つに小物体を局在化させる力を発生させるように構成されている請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
前記注入モードにおいて、前記フロージェネレータは、前記少なくとも第一場所および第二場所の前記それぞれ一つから小物体を斥ける力を発生させるように構成されている請求項２７に記載の装置。
【請求項３０】
前記少なくとも第一場所および第二場所は、一次元配列に配置される請求項２７に記載の装置。
【請求項３１】
前記装置は、二次元配列に配置された少なくとも四つの場所を含む請求項２７に記載の装置。
【請求項３２】
前記装置は、矩形の格子状配列に配置された少なくとも五つの場所を含む請求項２７に記載の装置。
【請求項３３】
前記装置は、六角形の格子状配列に配置された少なくとも七つの場所を含む請求項２７に記載の装置。
【請求項３４】
前記装置は、少なくとも１０個の場所を含む請求項２７に記載の装置。
【請求項３５】
前記少なくとも第一場所および第二場所の各々は、それぞれの前記フロージェネレータの流体入口の存在によって実質的に画定される請求項２７に記載の装置。
【請求項３６】
前記少なくとも第一場所および第二場所は、実質的に表面の陥凹である請求項２７に記載の装置。
【請求項３７】
前記少なくとも第一場所および第二場所は、実質的にエンクロージャの開口を含む請求項２７に記載の装置。
【請求項３８】
前記少なくとも第一エンクロージャおよび第二エンクロージャのうちの少なくとも二つの内部に、それぞれのフロージェネレータの流体入口が現われる請求項３７に記載の装置。
【請求項３９】
前記開口の各々のサイズは約１０３ミクロンに等しいかまたはそれより小さい請求項３７に記載の装置。
【請求項４０】
前記開口の各々のサイズは約１０２ミクロンに等しいかまたはそれより小さい請求項３７に記載の装置。
【請求項４１】
前記開口の各々のサイズは約１０１ミクロンに等しいかまたはそれより小さい請求項３７に記載の装置。
【請求項４２】
前記開口の各々のサイズは約１００ミクロンに等しいかまたはそれより小さい請求項３７に記載の装置。
【請求項４３】
前記第一場所および第二場所のうちの少なくとも一つが少なくとも二つのフロージェネレータに関連付けられ、前記少なくとも二つのフロージェネレータの各々が、吸引モード、注入モードおよび非活動モードを含むモード群から選択されたモードに独立に設定可能である請求項３７に記載の装置。
【請求項４４】
前記第一場所および第二場所のうちの少なくとも一つが少なくとも三つのフロージェネレータに関連付けられ、前記少なくとも三つのフロージェネレータの各々が、吸引モード、注入モードおよび非活動モードを含むモード群から選択されたモードに独立に設定可能である請求項３７に記載の装置。
【請求項４５】
前記第一場所および第二場所のいずれか二つの間の距離が１０００ミクロン以下である請求項２７に記載の装置。
【請求項４６】
前記第一場所および第二場所のいずれか二つの間の距離が１００ミクロン以下である請求項２７に記載の装置。
【請求項４７】
前記第一場所および第二場所のいずれか二つの間の距離が１０ミクロン以下である請求項２７に記載の装置。
【請求項４８】
前記第一場所および第二場所のいずれか二つの間の距離が１ミクロン以下である請求項２７に記載の装置。
【請求項４９】
前記第一場所および第二場所の少なくとも一つは、ベルヌーイ効果を使用して前記第一場所および第二場所の前記少なくとも一つから離れて細胞を浮遊させるように構成される請求項２７に記載の装置。
【請求項５０】
前記第一場所および第二場所の少なくとも一つに、細胞壁貫通ツールを備える請求項２７に記載の装置。
【請求項５１】
前記各々の前記細胞壁貫通ツールは、吸引モードに設定されたときに、機能的に前記場所に関連付けられるそれぞれの前記フロージェネレータによって発生する流動の実質的に反対方向を指す部材を含む請求項５０に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロマニピュレーションの分野に関し、さらに詳しくは、小物体、特に生細胞を物理的に操作するための方法および装置に関する。本発明はまた、生命科学の分野にも関連し、さらに詳しくは、細胞を個別に操作するための装置および方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学および医学の分野では、生細胞と、環境、物理的刺激、化学的刺激、および他の細胞のような外部要因との間の相互作用の結果を研究することが、しばしば重要である。そのような研究は、例えば医学的診断、薬剤開発、および基本的細胞の機能の理解のために重要であり、一般的に二つのタイプ、静的研究および動的研究に分類される。
【０００３】
静的研究では、細胞群を何であれ研究対象の刺激にさらし、特定の時間後に、細胞群の刺激に対する反応の大きさおよび性質を決定する。
【０００４】
動的研究では、単細胞または細胞群を何であれ研究対象の刺激にさらし、細胞または細胞群の刺激に対する反応の大きさおよび性質を、連続的にあるいは離散的に決定する。
【０００５】
しばしば静的および動的研究の両方が、キュベットまたはウェルアレイ内の巨視的規模の細胞の集団に対して実行される。細胞の集団の研究の一つの不利点は、結果が刺激の一次効果ではなく、二次効果を教示することである。すなわち、刺激自体の効果ではなく、むしろ刺激に対する他の細胞の反応に対する細胞の反応が検出される。そのような研究の別の不利点は、結果が細胞群に対する効果の分布を反映することである。この不利点は、均質な細胞集団を使用することによって部分的に克服される。均質な細胞群の研究は情報的に有益であるが、結果は必ずしも「現実」効果を表わさない。理論的には可能であるが、利用可能な技術を使用して要求される操作を行なうことは難しすぎ、個々の細胞の研究に適用した場合、速度が遅すぎる。
【０００６】
静的および動的研究は、フローサイトメトリを使用しても実行される。フローサイトメトリでは、刺激に対する細胞の反応が、媒質中を移動する単細胞について測定または検出され、細胞は測定後に廃棄される。フローサイトメトリは、個々の細胞の経時的研究も、二つ以上の特異的に選択された細胞の相互作用の研究も不能である。
【０００７】
フローサイトメトリの実施者は、最も洗練されたフローサイトメトリ技術を使用しても、細胞生物学、発達生物学、免疫学、腫瘍学、薬理学、およびウィルス学における多くの重大な問題を解決することができないことを認識している。複雑な生物学的問題の完全な理解には、個体として同時にまたは逐次的に研究される単細胞または複数の細胞の動的操作および研究が必要であることは、当業者には明白である。
【０００８】
したがって、単一の生細胞全体を個体として操作し、隔離し、研究する方法の必要性が幅広く認識されており、それを持つことは非常に有利であろう。
【発明の開示】
【０００９】
上記必要性は、単細胞のような個々の小物体の隔離および操作を可能にする、本発明によって満たされる。
【００１０】
本発明は、小物体（細胞のような）を一つの場所から別の場所に移し、こうして小物体の隔離および操作を可能にするための方法を提供することによって、先行技術の短所に対処することに成功している。本発明はまた、本発明の方法を実現するための装置をも提供する。
【００１１】
本発明の教示では、
ａ．一連のＮ＋１個の場所Ｌ０．．．ＬＮを定めること（ここで、Ｎは１以上の整数であり、Ｌ０は初期場所であり、ＬＮは目的場所である）、および
ｂ．０からＮ−１までのｉに対し、個々の小物体を場所Ｌｉから場所Ｌｉ＋１に連続的に移動させること、
によって、個々の小物体を初期場所から目的場所へ移動させる方法であって、小物体の移動は、個々の小物体を場所Ｌｉから場所Ｌｉ＋１に移動させるように、場所Ｌｉ＋１から個々の小物体に引力を加えることによって達成されて成る方法を提供する。
【００１２】
本発明の一実施形態では、場所Ｌｉの位置および／または向きを、場所Ｌｉ＋１の位置および／または向きに対して固定する。
【００１３】
本発明の一実施形態では、小物体の移動を助けるために、場所Ｌｉ＋１から引力を加える前、間、または後に、場所Ｌｉから個々の小物体に斥力を加える。
【００１４】
本発明の一特徴によると、引力または斥力の一方または両方を物理的力、電気力、および／または磁気力とすることができる。
【００１５】
本発明の好適な実施形態では、斥力は場所Ｌｉからの流体の流動の結果であり、該流体の流動は、場所Ｌｉの近傍からの流体の注入によって発生することが好ましい。
【００１６】
本発明の好適な実施形態では、引力は場所Ｌｉ＋１への流体の流動の結果であり、該流体の流動は、場所Ｌｉ＋１の近傍からの流体の吸引によって発生することが好ましい。
【００１７】
本発明の一特徴によると、場所Ｌｏ．．．ＬＮの少なくとも一つ（および好ましくは全て）は、個々の小物体（および好ましくは一度にわずか一個だけの小物体）を実質的に（部分的にまたは完全に）包囲するのに充分なサイズのエンクロージャを含む。
【００１８】
本発明の教示では、
ａ．小物体を第一場所に局在化させる第一力を発生するように、第一場所に向かって流体を引き込むこと、および
ｂ．その後小物体を第二場所に局在化させる第二力を発生するように、第二場所に向かって流体を引き込むこと、
によって、第一場所から第二場所に流体中の個々の小物体を移動させる方法をも提供する。
【００１９】
本発明の一実施形態では、第一場所の位置および／または向きを、第二場所の位置および／または向きに対して固定する。
【００２０】
本発明の一実施形態では、第一場所に向かって流体を引き込むこと、および第二場所に向かって流体を引き込むことを、フロージェネレータによる流体の吸引によって実行する。適切なフロージェネレータとしては、一つまたはそれ以上のポンプ、および弁を使用するシステム、ならびに類似物があるが、それらに限定されない。
【００２１】
本発明の一実施形態では、第二場所に向かって流体を引き込む前、間、または後に、第一力の大きさを低減して、小物体を第二場所に局在化させるのを助ける。
【００２２】
本発明の一実施形態では、第二場所に向かって流体を引き込む前、間、または後に、第一力を除去して、小物体を第二場所に局在化させるのを助ける。
【００２３】
本発明の一実施形態では、第二場所に向かって流体を引き込む前、間、または後に、流体を第一場所から注入して斥力を発生させ、小物体を第二場所に局在化させるのを助ける。
【００２４】
本発明の一実施形態では、第一場所および第二場所は、個々の小物体を（かつ好ましくは一度に一つだけの小物体を）実質的に（部分的にまたは完全に）包囲するのに充分なサイズのエンクロージャを含む。そのような実施形態では、第一場所および第二場所に向かう流体の引き込みは、それぞれのエンクロージャ内からの流体の吸引によって実行することが好ましい。
【００２５】
本発明の特定の実施形態に応じて、本発明の教示に従って操作される個々の小物体のサイズは、約１０３ミクロンに等しいかまたはそれより小さい、約１０２ミクロンに等しいかまたはそれより小さい、約１０１ミクロンに等しいかまたはそれより小さい、または約１００ミクロンに等しいかまたはそれより小さい程度の物体を含む。そのような物体として、結晶、バクテリア、ウィルス、たんぱく質、重合体、巨大分子、イオン、および原子があるが、特に細胞が挙げられる。
【００２６】
流体を使用する本発明の実施形態では、流体は液体、好ましくは細胞培養液であることが好ましい。
【００２７】
本発明の教示では、特に細胞培養液のような液体中に見出された個々の細胞を操作するように構成された細胞操作装置をも提供する。本発明の教示に係る細胞操作装置は、
ａ．少なくともＮ個の場所、および
ｂ．各々機能的に一つの場所に関連付けられて成る少なくとも二つのフロージェネレータ、
を含み、ここでＮは少なくとも２であり、ここでフロージェネレータの少なくとも二つは吸引モードおよび非活動モードを含むモード群から選択されたモードに独立に設定可能であり、かつ、ここで独立に設定可能なフロージェネレータの少なくとも二つは各々異なる場所に関連付けられる。本発明の装置の一実施形態は二つの場所を有し、二つの場所の各々は、機能的に関連付けられる、独立に設定可能なフロージェネレータを有する。
【００２８】
本発明の一実施形態では、Ｎ個の場所のうちの少なくとも一つの場所の位置および／または向きは、Ｎ個の場所のうちの別の一つの場所の位置および／または向きに対して固定される。本発明の好適な実施形態では、少なくともＮ個の場所の全部が、他の場所に対して固定された相対的位置および／または向きを有する。
【００２９】
本発明の一実施形態では、Ｎは少なくとも３であり、少なくともＮ個の場所のうちの少なくとも三つの場所は、一次元配列に配置される。一次元配列とは、Ｎ個の場所の各々が二つの他の場所としか隣接しないことを意味する。
【００３０】
本発明の一実施形態では、Ｎは少なくとも４であり、少なくとも四つの場所のうちの少なくとも四つは二次元配列に配置される。二次元配列とは、Ｎ個の場所のうちの少なくとも一つが、三つ以上の他の場所と隣接することを意味する。
【００３１】
本発明の一実施形態では、Ｎは少なくとも５であり、少なくとも五つの場所のうちの少なくとも五つは、矩形の格子状配列に配置される。矩形の格子状配列とは、Ｎ個の場所のうちの少なくとも一つが、四つの他の場所に隣接することを意味する。実質的に全ての「非境界」場所が四つの他の場所に隣接することが好ましい。
【００３２】
本発明の一実施形態では、Ｎは少なくとも７であり、少なくとも七つの場所のうちの少なくとも七つは、六角形の格子状配列に配置される。六角形の格子状配列とは、Ｎ個の場所のうちの少なくとも一つが、六つの他の場所に隣接することを意味する。実質的に全ての「非境界」場所が六つの他の場所に隣接することが好ましい。
【００３３】
本発明の様々な実施形態では、Ｎは少なくとも１０、１９、２４、３６、およびそれ以上である。
【００３４】
本発明の一実施形態では、フロージェネレータの少なくとも一つは、吸引モード、注入モード、および非活動モードを含むモード群から選択されたモードに独立に設定可能である。フロージェネレータの実質的に全部が、吸引モード、注入モード、および非活動モードを含むモード群から選択されたモードに独立に設定可能であることが好ましい。
【００３５】
本発明の一実施形態では、Ｎ個の場所のうちの少なくとも一つが少なくとも二つのフロージェネレータに関連付けられ、これらの少なくとも二つのフロージェネレータの各々が、吸引モードおよび非活動モード（好ましくは吸引モード、注入モード、および非活動モード）を含むモード群から選択されたモードに独立に設定可能である。
【００３６】
本発明の一実施形態では、Ｎ個の場所のうちの少なくとも一つが少なくとも三つのフロージェネレータに関連付けられ、これらの少なくとも三つのフロージェネレータの各々が、吸引モードおよび非活動モード（好ましくは吸引モード、注入モード、および非活動モード）を含むモード群から選択されたモードに独立に設定可能である。
【００３７】
本発明の一実施形態では、少なくともＮ個の場所のうちの少なくとも二つは、それぞれのフロージェネレータの入口の存在によって実質的に画定される。
【００３８】
本発明の一実施形態では、少なくともＮ個の場所のうちの少なくとも二つは、表面の陥凹によって実質的に画定される。
【００３９】
本発明の一実施形態では、少なくともＮ個の場所のうちの少なくとも二つは、実質的にエンクロージャへの開口である。各々のそのようなエンクロージャは、細胞（好ましくは一つだけの細胞）を実質的に（部分的にまたは完全に）包囲するのに充分なサイズである。好適な実施形態では、少なくとも二つのエンクロージャのうちの少なくとも二つの内部に、それぞれのフロージェネレータの入口が現われる。本発明の装置は、特に細胞を操作するように構成される。したがって、エンクロージャへの開口のサイズは、研究対象の細胞の、好ましくは一度に一つだけそのような細胞の流入を可能にするのに充分なサイズである。したがって、本発明の実施形態では、開口のおおよそのサイズは、約１０３ミクロンに等しいかまたはそれより小さい、約１０２ミクロンに等しいかまたはそれより小さい、約１０１ミクロンに等しいかまたはそれより小さい、および／または約１００ミクロンに等しいかまたはそれより小さい。
【００４０】
本発明の一実施形態では、（本発明の方法に従って）一つの場所と別の場所との間の細胞の効率的な移動を可能にするために、少なくとも一つの場所は、少なくとも一つの他の場所からの距離が１０００ミクロン以下であり、好ましくは実質的に各場所は、少なくとも一つの他の場所からの距離が１０００ミクロン以下である。
【００４１】
本発明の一実施形態では、（本発明の方法に従って）一つの場所と別の場所との間の細胞の効率的な移動を可能にするために、少なくとも一つの場所は、少なくとも一つの他の場所からの距離が１００ミクロン以下であり、好ましくは実質的に各場所は、少なくとも一つの他の場所からの距離が１００ミクロン以下である。
【００４２】
本発明の一実施形態では、（本発明の方法に従って）一つの場所と別の場所との間の細胞の効率的な移動を可能にするために、少なくとも一つの場所は、少なくとも一つの他の場所からの距離が１０ミクロン以下であり、好ましくは実質的に各場所は、少なくとも一つの他の場所からの距離が１０ミクロン以下である。
【００４３】
本発明の一実施形態では、（本発明の方法に従って）一つの場所と別の場所との間の細胞の効率的な移動を可能にするために、少なくとも一つの場所は、少なくとも一つの他の場所からの距離が１ミクロン以下であり、好ましくは実質的に各場所は、少なくとも一つの他の場所からの距離が１ミクロン以下である。
【００４４】
本発明の一実施形態では、場所の少なくとも一つは、以下で詳述するように、ベルヌーイ効果を使用してそれ自体の上に少し離れて細胞を浮遊させるように構成される。
【００４５】
本発明の一実施形態では、場所の少なくとも一つに、細胞壁貫通ツールを備える。本発明の一特徴によると、各々のそのような細胞壁貫通ツールは、吸引モードに設定されたときに、機能的に場所に関連付けられるフロージェネレータによって発生する流動の実質的に反対方向を指す部材（針、ワイヤ、および尖鋭化した突起を含むが、それらに限らない）である。以下で詳述するように、フロージェネレータが吸引モードに設定されたときに、細胞は、細胞壁の貫通を達成するのに充分な力で、細胞壁貫通ツールに向かって、かつその上まで引っ張られる。
【００４６】
本発明の教示に従って、ベルヌーイ効果を使用して液体中に細胞を個々に浮遊させることによって、細胞を研究する方法をも提供する。
【００４７】
本発明の教示に従って、液体中に細胞を浮遊させるための装置であって、ａ．開口および中心軸を有する実質的中空体と、ｂ．中空体内に現われ、液体を中空体内にかつ開口を通して中空体の中心軸に実質的に平行な第一流動に注入するように構成された、フロージェネレータの少なくとも一つの出口と、ｃ．中空体内に現われ、液体を開口を通してかつ中空体から外に中空体の中心軸に実質的に平行な第二流動で引き出すように構成された、フロージェネレータの少なくとも一つの入口とを含み、第一流動が第二流動より中心軸に近いように構成された装置を提供する。そのような細胞浮遊装置は、本発明の細胞操作装置に組み込むことができ、中空体は上述の通り、部分的に場所またはエンクロージャを画定する。
【００４８】
本発明の教示に従って、ａ．第一方向を指す細胞壁貫通ツールを液体中に浸漬し、そしてｂ．細胞の壁を貫通させるのに充分な担持の強度で、液体中の細胞が細胞壁貫通ツールに押し付けられて担持されるように、第一方向とは反対の第二方向から吸引を適用することによって、細胞壁を貫通する方法をも提供する。
【００４９】
本発明の教示に従って、ａ．開口を有する実質的中空体と、ｂ．中空体内に現われ、第一方向を有する流動で中空体から外に液体を引き出すように構成されたフロージェネレータの少なくとも一つの入口と、ｃ．第一方向とは実質的に反対の第二方向を指す細胞壁貫通ツールとを含む、細胞壁を貫通するための装置をも提供する。そのような細胞壁貫通装置は、本発明の細胞操作装置に組み込むことができ、中空体は、上述の通り、部分的に場所またはエンクロージャを画定する。
【００５０】
本発明の教示に従って、ａ．細胞群を提供し、ｂ．細胞群から各細胞を個々のエンクロージャ内に隔離し、ｃ．各隔離細胞を検査し、そして、ｄ．少なくとも一つの判断基準を満たす隔離細胞を選択することによって、細胞を選択するための方法をも提供する。本発明の一特徴によると、選択された細胞は、細胞群から分離される。
【００５１】
本発明の教示に従って、ａ．細胞含有生体液を提供し、ｂ．生体液中で処理対象の細胞を識別し、ｃ．処理対象の細胞と他の細胞とを区別し、そして、
ｄ．ｉ．処理対象の細胞を他の細胞から物理的に分離すること、および／または
ｉｉ．処理対象の細胞を直接操作すること、
のいずれかまたは両方を行ない、こうして生体液を処理することによって、細胞含有生体液を処理するための方法をも提供する。
【００５２】
本発明の一特徴によると、識別中に、各細胞は個々のエンクロージャ内で隔離される。
【００５３】
処理対象の細胞を直接操作する例として、処理対象の細胞を破壊すること（例えば物理的に、化学的に、放射線照射により）、処理対象の細胞を試薬にさらすこと（例えば内的または外的に、化学的試薬、生物学的試薬）、処理対象の細胞を放射エネルギ（例えば紫外、赤外、可視光、コヒーレント光、非コヒーレント光、マイクロ波）に曝露させること、および（例えば細胞に接種するように、またはその中から試料を取り出すように）処理対象の細胞の細胞壁を貫通することが挙げられるが、それらに限定されない。
【００５４】
処理可能な生体液の例として、リンパ液、血液、脳脊髄液、精液、唾液、骨液、骨髄、蝸牛液、腫瘍からの抽出液、卵巣液、羊水、および絨毛液が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５５】
本発明の一実施形態では、ｄの後に、生体液は生体（ヒトおよび非ヒトの両方）内に送り込まれる。
【００５６】
本発明の一実施形態では、生体液の提供は、生体（ヒトおよび非ヒトの両方）から生体液を採取するステップを含む。
【００５７】
本発明の一実施形態では、ｆ．ｄの後に生体液を生体（ヒトおよび非ヒトの両方）内に送り込み、生体液の提供は、生体液を生体から個々のエンクロージャへの流動に向かわせるステップを含む。
【００５８】
特に定義しない限り、本書で使用する科学技術用語は全て、通常の当業熟練者が一般的に理解しているのと同じ意味を有する。本書に記載するのと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を以下で述べる。本書で示す全ての出版物、特許出願、特許、および他の文献は、それらを丸ごと参照によってここに組み込む。衝突が発生する場合、定義を含め、本特許明細書が支配する。加えて、材料、方法、実施形態、および実施例は単なる例示であって、限定の意図は無い。
【００５９】
本発明の方法およびシステムの実現は、選択されたタスクまたはステップを手動的に、自動的に、またはそれらを組み合わせて実行または完遂することを含む。さらに、本発明の方法およびシステムの好適な実施形態の実際の計装および機器に応じて、幾つかの選択されたステップは、ハードウェアによって、またはいずれかのファームウェアのいずれかのオペレーティングシステム上のソフトウェアによって、またはそれらの組合せによって、実現することができる。例えば、ハードウェアとして、本発明の選択されたステップは、チップまたは回路として実現することができる。ソフトウェアとして、本発明の選択されたステップは、いずれかの適切なオペレーティングシステムを使用するコンピュータによって実行される、複数のソフトウェア命令として実現することができる。いずれの場合も、本発明の方法およびシステムの選択されたステップは、複数の命令を実行するためのコンピューティングプラットフォームのようなデータプロセッサによって実行される、と記述することができる。
【００６０】
図面の簡単な記述
本発明をここで、単なる例として添付の図面に関連して説明する。今から、特に図面について詳細に言及するに当たって、図示する細部は例であって、本発明の好適な実施形態の分かり易い説明だけが目的であり、本発明の原理および概念的態様の最も有用かつ分り易い説明であると信じられるものを提供するために提示することを強調しておく。これに関し、本発明の基本的な理解に必要である以上に詳細には本発明の構造的詳細を示そうと試みることはしない。図面に照らした説明は、本発明の幾つかの形態を実際にいかに具現することができるかを、当業者に明らかにするものである。
図１Ａ〜１Ｃは引力だけを使用して小物体を一つの場所から隣接場所へ移動させるための本発明の方法を示す。
図２Ａ〜２Ｃは引力および斥力を使用して小物体を一つの場所から隣接場所へ移動させるための本発明の方法を示す。
図３は一連の隣接場所への一連の連続的移動によって、小物体を一つの場所から非隣接場所へ移動させるための本発明の方法を示す。
図４は捕捉エンクロージャにより実現される、本発明の場所の略図である。
図５は本発明の場所の六角形マトリックスの略図である。
図６Ａは本発明の細胞操作装置の好適な実施形態の略図である。
図６Ｂおよび６Ｃは本発明の細胞操作プローブのプローブ先端の好適な実施形態の先端の略図である。
図６Ｄは細胞操作プローブのプローブ先端の代替実施形態の略図である。
図７Ａは単一導管を持つ細胞操作要素の好適な実施形態の略図の断面図である。
図７Ｂは単一導管および細胞止め子を持つ細胞操作要素の好適な実施形態の略図の断面図である。
図７Ｃは単一導管および導孔の隘路を持つ細胞操作要素の好適な実施形態の略図の断面図である。
図７Ｄは軸方向導管および一つの周方向導管を持つ細胞操作要素の好適な実施形態の略図の断面図である。
図７Ｅは二つの周方向導管を持つ細胞操作要素の好適な実施形態の略図の断面図である。
図７Ｆは細胞操作要素を通して試薬を導入するのに有用なポンプシステムを示す図である。
図７Ｇは細胞壁貫通ツールを持つ細胞操作要素の好適な実施形態の略図の断面図である。
図７Ｈは細胞壁貫通ツールを装備した軸方向導管を持つ細胞操作要素の好適な実施形態の略図の断面図である。
図７Ｉは引き込み可能な細胞壁貫通ツールを持つ細胞操作要素の好適な実施形態の略図の断面図である。
図８Ａは細胞操作プローブの好適な実施形態の斜視図である。
図８Ｂは細胞操作要素の好適な実施形態の略図の断面図である。
図９Ａ〜９Ｃはガラス管およびロッドから細胞操作要素を作製する方法を示す。
図１０Ａ〜１０Ｃはモジュール式細胞操作要素の斜視図である。
図１０Ｄはモジュール式細胞操作要素と共に使用して細胞操作プローブを作製するためのアセンブリプレートの斜視図である。
図１１Ａ〜１１Ｃは一つの細胞操作要素から隣接する細胞操作要素への細胞の移動を示す。
図１２は有機物のオンライン処理に適用される本発明の教示の略図である。
図１３Ａは細胞操作プローブからバイオチッププロセッサへの選択された細胞の移動を示す斜視図である。
図１３Ｂはバイオチッププロセッサから細胞操作プローブへの選択された細胞の移動を示す斜視図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
本発明は、特に生細胞のような個々の小物体の隔離および操作を可能にする方法および装置である。適切な変形により、本発明の一部の実施形態は、実施者が、生細胞のような個々の小物体を隔離し、操作し、観察し、研究することを可能にする。操作とは物理的に動かすことを意味するが、特に、化学的および物理的刺激を含むがそれらに限定されない、多くの異なるよく定義された刺激にさらすことを意味する。本発明の教示を使用して、複雑なマルチステップの実験は、生細胞のような単一の個々の小物体に再現可能に実行することができる。
【００６２】
本発明の装置および方法の原理および動作は、図面および関連する説明を参照することにより、いっそうよく理解することができる。
【００６３】
本発明の少なくとも一つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明の装置はその適用を、以下の説明に記載しあるいは図面に示すコンポーネントの構成および配置の詳細に限定されないことを理解されたい。また、本発明の方法はその適用を、以下の説明に記載しあるいは特定の実施形態によって例示される詳細に限定されないことをも理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、あるいは様々な方法で実施または実行することが可能である。また、本書で使用する専門用語および用語法は、説明を目的とするものであり、限定とみなすべきではないことをも理解されたい。
【００６４】
小物体を移動させる方法
本発明の第一態様は、小物体を第一場所から第二場所へ移動させるための方法であり、ここで場所の相互の相対位置は固定されることが好ましい。
【００６５】
小物体とは、１０３ミクロン未満、または１０２ミクロン未満、または１０１ミクロン未満、または１００ミクロン未満程度の寸法を有する物体を意味する。そのような物体は細胞を含むが、小粒子、結晶、バクテリア、ウィルス、たんぱく質、重合体、巨大分子、およびイオンをも含む。
【００６６】
図１に示す本発明の方法の最も単純な実施形態は、
ａ．小物体１０４を第一場所１０２に局在化させるために、第一場所１０２から小物体１０４に第一引力１００を加えること（図１Ａ）、および
ｂ．その後、第二場所１０８から小物体１０４に第二引力１０６を加えること（図１Ｂ）、
を含む。
【００６７】
当業者には明瞭である通り、そのような方法で、小物体１０４は第一場所１０２から第二場所１０８に移動する。同じく当業者には明瞭である通り、第一場所１０２および第二場所１０８の近接性および相対的空間配向は、小物体１０４の効率的な移動が可能となるように選択しなければならない。
【００６８】
小物体１０４の移動を促進するために、第一引力１００の強度は低減または除去することが好ましい。第一引力１００の低減または除去は、第二引力１０６を加える前、間、または後に行なわれる。本発明の方法の一部の実施形態では、第一引力は単に低減されるだけではなく、斥力に反転される。そのような場合、小物体はその後または同時に、第一場所１０２から跳ね返され、第二場所１０８に引き付けられる（図２）。
【００６９】
本発明の方法は、小物体が目的場所に到達するまで、一連の中間場所を通して小物体を移動させることによって、ある初期場所からある目的場所へのある小物体の移動に適用することが好ましい。好ましくは、場所の相互に相対的な位置は固定される。このプロセスを、小物体１０４が目的場所１１４に到達するまで、初期場所１１０から一連の三つの中間場所１１２ａ、１１２ｂ、および１１２ｃを通して小物体１０４を移動することによって、初期場所１１０から目的場所１１４へ小物体１０４を移動する場合について、図３に概略的に示す。任意の二つの場所の間の小物体１０４の移動は、上述した図１および図２に示す、第一場所１０２と第二場所１０８との間の移動と同様である。
【００７０】
本発明の方法を、三つ以上の場所があるシステムに適用する場合、任意の二つの場所は、隣接および非隣接の二つの方法で相互に関連付けられる。隣接場所とは、小物体を一段階で直接移動させることのできる場所である。非隣接場所とは、小物体を他の場所を介してのみ移動させることのできる場所である。図３で、場所１１０および場所１１２ｂは場所１１２ａに対し隣接状態である。しかし、場所１１０は場所１１２ｂに対し非隣接状態である。
【００７１】
様々な場所の物理的性質は、それぞれの引力および実現される場合には斥力の性質と同様、操作対象の小物体のサイズおよび性質に依存する。
【００７２】
引力および斥力は、物理的力、電気力、磁気力、またはそれらの任意の組合せとすることができる。電気力は、表面を帯電させることによって形成されるものを含むことができるが、イオン結合または水素結合のような化学由来とすることもできる。好ましくは、引力および斥力は、ガスまたは液体のような物理的媒体の流動によって実現される。引力が物理的媒質の流動によって発生する場合、場所に関連付けられる引力は一般的に、場所またはその直近を通過する流体の吸引によって実現される。斥力が物理的媒質の流動によって発生する場合、場所に関連付けられる斥力は一般的に、場所またはその直近を通過する流体の注入によって実現される。
【００７３】
上述の通り、場所の物理的性質は、操作対象の小物体のサイズおよび性質、ならびに物体を操作するために加えられる力の性質によって決定される。本発明の一部の実施形態では、場所は例えば、単にそれぞれの引力の近接性によって画定される表面上の領域である。他の実施形態では、指定場所は表面上のくぼみまたは凹部である。
【００７４】
特に細胞の操作に適した本発明の好適な実施形態では、場所は、細胞のような小物体を実質的に物理的に（部分的にまたは完全に）包含するように構成された、捕捉用エンクロージャ（例えばチャンバまたは管）である。図４の断面図に概略的に示すそのような好適な実施形態では、捕捉用エンクロージャ１１６は開口１１８を備え、そこを通してそれぞれの引力または斥力が加えられ、かつそこを通して小物体１２０が捕捉用エンクロージャ１１６内に出入りする。開口１１８の寸法は、一度に一個の小物体１２０だけが捕捉用エンクロージャ１１６に入ることができ、ひとたび最初の小物体１２０が入ると、他の小物体、例えば１２２が捕捉用エンクロージャ１１６に入るのは阻止されるようにすることが好ましい。開口１１８の形状は一般的に重要ではなく、任意の形状に、例えば方形、円形、または六角形に形成することができる。
【００７５】
細胞は通常、液体培地中に見られる。したがって、細胞の操作を目的とする本発明の実施形態の場合、引力は、吸引モードで動作するフロージェネレータ１２４を使用して実現することが好ましい。同様に、そのような実施形態では、斥力は、注入モードで動作するフロージェネレータ１２４を使用して実現することが好ましい。フロージェネレータ１２４の入口／出口は、引力および斥力が開口１１８を介して作用するような方法で、捕捉用エンクロージャ１１６に取り付けることが好ましい。図４では、フロージェネレータ１２４の入口／出口は、捕捉用エンクロージャ１１６の内部に現われる導管１２６を介して、捕捉用エンクロージャ１１６に取り付けられる。
【００７６】
フロージェネレータとは、流体に所望の方向の流動を発生させる装置または他の手段を意味する。フロージェネレータの一例はポンプ、または複数のポンプである。一部の実施形態では、フロージェネレータは弁および類似物を含む。
【００７７】
細胞の操作を目的とする本発明の実施形態の場合、好適に使用される流体は、液体培地、特に細胞培養液である。多くの様々な細胞培養液が当業者には周知である。本発明の教示を実現するのに有用な細胞培養液の例として、ダルベッコの基礎培地、ハンクの培地、ならびに米国特許第６６９２９６１号、米国特許第６６８９５９４号、米国特許第６６８６１９０号、米国特許第６６７３５９１号、米国特許第６６７０１８４号、米国特許第６６７０１８０号、米国特許第６６６７０３４号、米国特許第６６６０５０１号、米国特許第６６４９４０８号、米国特許第６６４２０５０号、米国特許第６６３５４４８号、米国特許第６６２７４２６号、米国特許第６６１０５１６号、米国特許第６５９３１４０号、米国特許第６５８９７６５号、米国特許第６５８８５８６号、米国特許第６５６９４２２号、米国特許第６５５５３６５号、米国特許第６５４４７８８号、米国特許第６５２８２８６号、米国特許第６５１１４３０号、米国特許第６５０６５９８号、米国特許第６４９２１６３号、米国特許第６４９２１４８号、米国特許第６４８９１４４号、米国特許第６４７９２５２号、米国特許第６４６８７８８号、米国特許第６４６５２０５号、米国特許第６４６５０００号、米国特許第６４５５３１０号、米国特許第６４１３７４６号、米国特許第６４１３７４４号、米国特許第６４１０３０９号、米国特許第６４０３３６９号、米国特許第６３８３８１０号、米国特許第６３７８５２７号、米国特許第６３７２４９４号、米国特許第６３４４３５４号、米国特許第６３４２３８４号、米国特許第６３３８９６４号、米国特許第６３３３１９２号、および米国特許第６３２９１９５号にリストされたものが挙げられるが、それらに限定されない。
【００７８】
本発明に従って小物体を操作するときに、所望の時間の長さだけ所定の場所に小物体を保持することが、しばしば有利である。所定の場所における小物体の保持は、多くの様々な方法で実現することができる。所定の場所に小物体を保持する一つの好適な方法は、関連引力を連続的に加えることによるものである。図４で、そのような方法は、フロージェネレータ１２４を吸引モードで連続的に作動させることによって実現される。小物体を所定の位置に保持するそのような方法の使用は一般的に、引力によってフロージェネレータ１２４内に吸引される小物体１２０に対する物理的障害物である、「止め子」の存在に依存する。図４では、止め子は、小物体１２０のサイズに対して実質的に小さい寸法の導管１２６である。
【００７９】
所定の場所に小物体を保持する別の好適な方法は、小物体の性質および場所の形状に依存して、小物体が場所から浮遊するのを防止することによる。図４では、そのような方法は、フロージェネレータ１２４を引力および斥力のどちらも加えられないモードである非活動モードに設定することによって実現される。開口１１８の小さいサイズおよび捕捉用エンクロージャ１１６内部の流れの欠如のため、小物体１２０は捕捉用エンクロージャ１１６によって画定される場所に捕捉されたままになる。
【００８０】
本発明の一実施形態では、場所は、どの場所もせいぜい二つの隣接場所を持つだけであることを意味すると理解される、一次元配列に配設される。一次元配列の例として、場所の直線配列、場所の湾曲配置、および場所の円形配置が挙げられる。
【００８１】
本発明の別の実施形態では、場所は、少なくとも一つの所定の場所が三つ以上の隣接場所を持つことを意味すると理解される、二次元配列に配設される。二次元配列として、Ｙ字形およびＸ字形配列が挙げられる。本発明の二次元配列は、複数の場所の規則的な配置である、マトリックス配置であることが好ましい。場所の一つの好適なマトリックス配置は、実質的に縁部以外の各場所が四つの隣接場所を有する、方形格子である。場所の別の好適なマトリックス配置は、実質的に縁部以外の各場所が六つの隣接場所を有する、六角格子である。図５に、各場所１２８が円形断面を有する、場所１２８の六角形マトリックスを示す。
【００８２】
単純にするために、場所の配列をここでは実質的に平面として図示しかつ記載することに注意することが重要である。つまり、場所または群としての場所への開口は、実質的に平面を画定する。これは単に説明を単純にするためにのみ行なうものである。本発明の一部の実施形態では、本発明の方法を実現する場所のマトリックスは非平面とすることができる。
【００８３】
細胞操作装置
細胞の操作の場合、本発明の方法は、本発明の細胞操作装置を使用して実現することが好ましく、該細胞操作装置は本発明の少なくとも二つの（しかし好ましくは複数の）細胞操作要素を含み、該少なくとも二つ（または複数）の細胞操作要素は、本発明の細胞操作プローブを画定する。
【００８４】
本発明の装置を実現する好適な実施形態および現在知られている最良の態様を、中でも特に図６を参照しながら、以下で記載する。図６に示しかつ以下に記載する細胞操作装置１３０は、本書で単に例示の目的で記載する、液体培地中の細胞を操作するのに適した特定の具体的装置である。
【００８５】
装置１３０の中心的コンポーネントであり、プローブ端１３４および突合せ端１３６を有する細胞操作プローブ１３２が、図６Ａに示されている。プローブ端１３４の周囲にはバイアル１３８がある。細胞操作プローブ１３２は、複数の結束された細胞操作要素から形成される。各細胞操作要素には、一つ、二つ、三つ、またはもっと多数の独立に制御可能なポンプ１４２が機能的に関連付けられる。各ポンプ１４２は、細胞操作プローブ１３２の突合せ端１３６を通して、それぞれの細胞操作要素に接続される。分かり易くするために、限定された個数のポンプ１４２および細胞操作要素との接続が図６Ａに示されている。ポンプ１４２の作動を制御するのは、ユーザ入力インタフェース１４６からのコマンドを受け取り、例えば必要な計算を実行しあるいは特定のポンプ１４２を作動させることによって受け取ったコマンドを実行し、かつユーザ出力インタフェース１４８を使用して情報を表示するのに必要なハードウェアおよびソフトウェアを持つ、実質的にプログラム可能なコンピュータである中央制御装置１４４である。装置１３０には、それに限定されないが顕微鏡レンズを装備したＣＣＤカメラのような、観察用コンポーネント１５０も設けられる。図６Ａの観察用コンポーネント１５０は、中央制御装置１４４に機能的に関連付けられる。観察用コンポーネント１５０は、中央制御装置１４４からコマンドを受け取り、特に細胞操作プローブ１３２のプローブ端１３４で操作される細胞の、取得画像に対応するデータを返す。中央制御装置１４４は、観察用コンポーネント１５０から受け取ったデータを表示し、かつデータをユーザが理解可能な形でユーザ出力インタフェース１４８を介して表示するように構成される。中央制御装置１４４は、観察用コンポーネント１５０から受け取った映像データを「解釈し」かつ解釈されたデータに反応するように、画像処理機能付きに構成することが好ましい。
【００８６】
図６Ｂに、細胞操作プローブ１３２のプローブ端１３４の拡大図を、バイアル１３８無しで示す。各々が細胞操作要素の一部である複数の六角形の捕捉用エンクロージャ１４０は、細胞１４２がその中に捕捉された状態で示される。捕捉用エンクロージャ１４０はマトリックス１４５状に配列される。隔離要素の半円形隔離入口１４６、および廃棄物要素の半円形廃棄物入口１４８が、マトリックス１４５の外周に配置される。マトリックス１４５の中心には、多細胞反応要素の多細胞反応エンクロージャ１５１がある。
【００８７】
図６Ｃに、細胞操作プローブ１３２のプローブ端１３４がバイアル１３８付きで拡大図で示される。バイアル１３８内に現われているのは試料入口１５２、流体入口１５４、およびバイアル試薬入口１５６である。各々のそのような入口は、プローブ端１３４へのそれぞれ試料、流体、または試薬の導入を可能とするために、それぞれのポンプ１５８、１６０、および１６２に機能的に関連付けられる。ポンプ１５８、１６０、および１６２は、中央制御装置１４４によって独立に制御される。
【００８８】
細胞操作要素
上述した通り、細胞操作プローブ１３２は実質的に複数の個別細胞操作要素から形成される。細胞操作要素は多くのバリエーションがあり、それらの一部について以下で述べる。
【００８９】
細胞操作要素の型
本発明の装置を実現するのに好適な一つの単純な細胞操作要素は、表面のくぼみであり、くぼみの底には、二つのモードつまり（引力を発生する）吸引モードおよび非活動モードを有する、機能的に関連付けられたフロージェネレータの入口がある。フロージェネレータが吸引モードに設定されると、細胞は、発生する吸引によって引き付けられ、関連するくぼみに保持される。ポンプが非活動モードに設定されると、保持された細胞は浮遊して離れることができる。隣接くぼみに機能的に関連付けられたポンプが吸引モードに設定されると、細胞は本発明の方法に従ってその隣接くぼみの方向に浮遊し、そこに保持される。そのような細胞操作要素は作成および作動が簡単であり、そのような細胞操作要素の配列から作られた細胞操作プローブは本発明の方法を効果的に実現するが、選択された細胞だけを試薬のような刺激にさらすことが難しいので、そのような細胞操作プローブの実用性は限定される。下記参照。
【００９０】
細胞の操作を目的とする本発明の実施形態の場合、細胞操作要素は、図４に示すような開口付きの捕捉用エンクロージャを持つことが、一般的に好ましい。捕捉用エンクロージャは、そこに保持された細胞を実質的に物理的に（部分的にまたは完全に）包含しながら、開口が捕捉用エンクロージャに出入りする細胞のアクセスを提供するように構成される。そのような方法で、捕捉用エンクロージャ内の細胞は隔離され、試薬のような刺激への細胞の選択的曝露が可能になる。捕捉用エンクロージャを有する細胞操作要素に関連付けられるフロージェネレータの入口／出口は、捕捉用エンクロージャ内に有利に現われる。一部の実施形態では、そのようなフロージェネレータは二つのモード、つまり吸引モードおよび非活動モードだけを有する。好適な実施形態では、そのような捕捉用エンクロージャは、フロージェネレータが力を加えない（例えば非活動モードに設定された）ときに、保持された細胞が捕捉用エンクロージャ内に維持されるように構成または形成される。捕捉用エンクロージャがそのように構成される場合、関連フロージェネレータは少なくとも三つのモード、つまり（引力を発生する）吸引モード、（斥力を発生する）注入モード、および非活動モードを有することが好ましい。フロージェネレータが吸引モードに設定されると、流体は捕捉用エンクロージャからそれぞれの導管を介して引き込まれ、引力を発生して、近傍の細胞を捕捉用エンクロージャに引き込む。フロージェネレータが非活動モードに設定されると、保持された細胞は捕捉用エンクロージャ内に留まる。フロージェネレータが注入モードに設定されると、流体は、それぞれの導管を通して捕捉用エンクロージャに注入され、斥力を発生して、保持された細胞を捕捉用エンクロージャから排出する。
【００９１】
捕捉用エンクロージャおよび細胞操作要素の開口は、保持されかつ操作される細胞に近い寸法を有することが、一般的に好ましい。当業者には周知の通り、様々なサイズの細胞が存在する。植物の細胞は一般的に大きく、１０１から１０２ミクロンの間の直径を有する。動物の細胞は一般的に、１０−１から１０１ミクロンの間の直径を有する。バクテリアは一般的に小さく、１０−１から１０−２ミクロンの間の直径を有する。したがって、捕捉用エンクロージャへの開口の寸法は、本発明の特定の装置で研究される細胞のサイズによって決定することが好ましい。
【００９２】
単一の導管ポンプに関連付けられる細胞操作要素
捕捉用エンクロージャを実現する単純な細胞操作要素１６４を、図７Ａに概略的に示す。細胞操作要素１６４は実質的に、導管ポンプ（図示せず）に機能的に関連付けられる管１６６であり、該導管ポンプは吸引モード、注入モード、および非活動モードで作動可能である。細胞操作要素１６４で、管１６６の端部は開口１７０として働き、管１６６の導孔は捕捉用エンクロージャ１４０として働く。管１６６の導孔はまた、機能的に関連付けられた導管ポンプから流体を輸送して、本発明の教示に従って細胞を引き付けたり跳ね返すための導管１７４としても働く。
【００９３】
細胞操作要素は、細胞操作要素内部の細胞の侵入の程度を制限する物理的障害物である細胞止め子を有することが、しばしば好ましい。特定の実施形態に応じて、細胞止め子は、機能的に関連付けられた捕捉用エンクロージャ内に細胞を引き込むことのできる距離を制限する隘路、突起、または他の物理的構造的特徴である。
【００９４】
細胞止め子を組み込んだ好適な細胞操作要素１７６を図７Ｂに示す。細胞操作要素１７６は、細胞操作要素１７６に細胞止め子１７８も設けられている以外は、細胞操作要素１６４と同様である。細胞止め子１７８は、開口１７０を通して流入した細胞が細胞止め子１７８と接触するまで侵入するように、管１６６の導孔を遮る。細胞操作要素１７６の捕捉用エンクロージャ１４０は、管１６６の内部表面および細胞止め子１７８によって画定される。細胞止め子１７８と管１６６との間の容積は、流体を機能的に関連付けられた導管ポンプから輸送して、本発明の教示に従って細胞を引き付けたり跳ね返すための単一導管１７４として働く。一部の実施形態では、導管１７４は環状断面を有することに注意することが重要である。他の実施形態では、導管１７４は細胞止め子１７８の周りに配列された複数の個別流路から作られる。そのような実施形態では、全ての個別流路が単一の導管ポンプから流体を輸送することが好ましい。
【００９５】
細胞止め子を組み込んだ追加の細胞操作要素１８０を図７Ｃに示す。細胞操作要素１８０では、細胞止め子の機能は、開口１７０を通して流入する細胞が隘路１８１の先に侵入することができない程度に、管１６６の導孔を隘路化１８１することによって実行される。したがって、細胞操作要素１８０の捕捉用エンクロージャ１４０は、管１６６の内部表面および管１６６の導孔の隘路化１８１によって画定される。細胞操作要素１６４の場合のように、管１６６の導孔は、機能的に関連付けられた導管ポンプからの流体用の導管１７４として働く。
【００９６】
細胞操作要素１６４、１７６、および１８０は全て、実質的に同様の方法で操作される。中央制御装置１４４は機能的に関連付けられた導管ポンプを吸引モードに設定し、導管１７４を通して引力を発生させて開口１７０の近傍にある細胞を引き付け、開口１７０を通して細胞操作要素１６４、１７６、または１８０内に流入させ、かつ捕捉用エンクロージャ１４０内に捕捉する。細胞操作要素１６４を使用する場合、細胞が開口１７０に流入すると、中央制御装置１４４は機能的に関連付けられた導管ポンプを非活動モードに設定して、細胞が管１６６の導孔内の奥まで侵入し過ぎること、およびその結果細胞の損失を防止する。したがって、一般的に１６４のような細胞操作要素は、観察用コンポーネント１５０の観察下で使用することが好ましい。対照的に、細胞操作要素１７６または１８０の開口１７０に流入する細胞は、機能的に関連付けられた細胞止め子１７８または隘路１８１とそれぞれ接触し、したがって捕捉用エンクロージャ１４０内に保持された状態に維持される。
【００９７】
細胞操作要素１６４、１７６、または１８０の捕捉用エンクロージャ１４０から細胞を排出させたい場合、中央制御装置１４４はそれぞれの機能的に関連付けられた導管ポンプを注入モードに設定する。流体は導管１７４を通して強制的に押し込まれ、保持された細胞は捕捉用エンクロージャ１４０から開口１７０を通して外に押し出される。
【００９８】
複数の導管ポンプと機能的に関連付けられた細胞操作要素
本発明の装置を使用して実行できる細胞操作の型の柔軟性を高めるために、二つ以上の導管を有し、かつ二つ以上の独立に制御可能な導管ポンプと機能的に関連付けられた、細胞操作要素を使用することがしばしば有利である。
【００９９】
図７Ｄに示す細胞操作要素１８２は、二つ以上の導管を有し、かつ二つ以上の独立に制御可能な導管ポンプと機能的に関連付けられる。捕捉用エンクロージャ１４０が管１６６の内部表面および細胞止め子１８４によって画定されるという点で、細胞操作要素１８２は細胞操作要素１７６と関係する。さらに、管１６６と細胞止め子１８４との間の容積は、機能的に関連付けられた第一導管ポンプからの流体用の第一外周導管１７４として働く。しかし、細胞操作要素１８２は、細胞止め子１８４が実質的に中空管であることを特徴とする。細胞止め子１８４の導孔は、独立に制御されかつ作動する第二導管ポンプから流体を輸送する、第二の軸方向流体導管１８６として働く。
【０１００】
二つ以上の独立に制御可能な導管ポンプに機能的に関連付けられた追加の好適な細胞操作要素が、図７Ｅに示す１８８である。捕捉用エンクロージャ１４０が管１６６の内部表面および細胞止め子１７８によって画定されるという点で、細胞操作要素１８８は細胞操作要素１７６に関係する。しかし、細胞操作要素１８８では、管１６６と細胞止め子１７８との間の容積は、環状断面を持たず、むしろ管１０６の周囲に見られる少なくとも二つの異なる導管、つまり第一周辺導管１７４および第二周辺導管１８６から形成される。第一周辺導管１７４は第一導管ポンプに機能的に関連付けられる。第二周辺導管１８６は、独立に制御可能な第二導管ポンプに機能的に関連付けられる。
【０１０１】
細胞操作要素１８８の変形には、三つ以上（例えば三つ、四つ、五つ、六つ、またはそれより多く）の導管（特に周辺導管）が備えられ、そのような導管の各々が独立に制御可能な導管ポンプに関連付けられることに注意することが重要である。
【０１０２】
二つの独立に制御可能なポンプに機能的に関連付けられた細胞操作要素に細胞を装填する場合、機能的に関連付けられた第一導管ポンプおよび／または第二導管ポンプは、中央制御装置１４４によって吸引モードに設定される。関連導管ポンプが一つしか使用されない場合、もう一つの関連導管ポンプは非活動モードに設定される。同様に、細胞操作要素１８２の捕捉用エンクロージャ１４０からの細胞の排出は、機能的に関連付けられた第一導管ポンプおよび／または第二導管ポンプが中央制御装置１４４によって注入モードに設定されたときに、実行される。関連導管ポンプが一つしか使用されない場合、もう一つの関連導管ポンプは非活動モードに設定される。
【０１０３】
二つまたはそれ以上の独立に制御可能な導管ポンプに機能的に関連付けられた細胞操作要素を使用して、実現することのできる有用な機能は、それぞれの捕捉用エンクロージャ１４０に保持された細胞の洗浄である。細胞操作要素１８８の場合、中央制御装置１４４は一つの機能的に関連付けられた導管ポンプを吸引モードに設定し、もう一つの機能的に関連付けられた導管ポンプを注入モードに設定する。液体は一つの導管から別の導管に流れ、こうして捕捉用エンクロージャ１４０内に保持された細胞を洗浄する。細胞操作要素１８２の場合、中央制御装置１４４は、周辺導管１７４に機能的に関連付けられた第一導管ポンプを注入モードに設定し、かつ軸方向導管１８６に機能的に関連付けられた第二導管ポンプを吸引モードに設定する。液体は一つの導管から他の導管に流れ、こうして捕捉用エンクロージャ１４０内に保持された細胞を洗浄する。
【０１０４】
細胞操作要素１８２を使用して実行することのできる有用な機能は、捕捉用エンクロージャ１４０に保持された細胞を開口１７０から少し離して浮遊させることである。浮遊機能を実行するために、中央制御装置１４４は、軸方向導管１８６に機能的に関連付けられた導管ポンプを注入モードに設定する一方、周辺導管１７４に機能的に関連付けられた導管ポンプを吸引モードに設定する。結果的に生じるベルヌーイ効果は、当初捕捉用エンクロージャ１４０内に捕捉されていた細胞を開口１７０の上に浮遊させる。浮遊機能は、細胞を一時的に捕捉用エンクロージャ１４０から取り出して、細胞が捕捉用エンクロージャ１４０内に収容されているときには難しいタスクである、多くの方向からの細胞の障害物の無い邪魔されない検査を可能にする。上述の通り、浮遊機能は一般的に、少なくとも一つの軸方向導管および少なくとも一つの周辺導管を有する、適切に構成された細胞操作要素により実行することができる。一つの周辺導管しか無い場合、その周辺導管は実質的に環状であることが好ましい。二つ以上の周辺導管がある場合、周辺導管は軸方向導管を中心に左右対称に配置されることが好ましい。
【０１０５】
二つまたはそれ以上の独立に制御可能な導管ポンプに機能的に関連付けられた、１８２または１８８のような細胞操作要素を使用して実現できる追加の有用な機能は、捕捉用エンクロージャ１４０に保持された細胞を試薬に選択的に曝露させることである。細胞を試薬に選択的に曝露させる機能について、細胞操作要素１８８に関連して本書で論じる。一実施形態では、曝露は、細胞操作要素１８８に機能的に関連付けられた二つの導管ポンプのうちの一つに、試薬を提供することによって実行される。細胞を試薬に選択的に曝露させることを希望する場合、上述した細胞の洗浄と同様のプロセスに従う。試薬を提供された関連導管ポンプを注入モードに設定して、捕捉用エンクロージャ１４０に試薬を導入させ、こうしてそこに保持された細胞に接触させる。並行して、第二の関連導管ポンプを吸引モードに設定し、試薬を運び去り、開口１７０を通して試薬が外に漏出するのを防止する。そのような実現の不利点は、試薬を提供された導管ポンプが、他の機能を実行するために使用できないことである。
【０１０６】
細胞の選択的曝露はまた、各々が独立に制御可能な導管ポンプに機能的に関連付けられた、三つの導管を備えた細胞操作要素内でも達成することができる。ここで一つの導管は試薬提供専用であり、他の二つの導管は他の機能の実行専用である。
【０１０７】
好適な実施形態では、試薬への細胞の選択的曝露を実現する場合、細胞操作要素は、図７Ｆに示すように、三つのポンプに機能的に関連付けられる。図７Ｆには、導管１７４が第一導管ポンプ１９０と機能的に関連付けられ、導管１８６が第二導管ポンプ１９２と機能的に関連付けられた、細胞操作要素１８８が示されている。導管１７４を第一導管ポンプ１９０と接続する流体管路に、試薬注入ポンプ１９４がある。上述した細胞洗浄機能の場合と同様に、細胞を試薬に曝露させたいとき、中央制御装置１４４は第一導管ポンプ１９０を注入モードに設定し、第二導管ポンプ１９２を吸引モードに設定する。さらに、中央制御装置１４４は試薬注入ポンプ１９４を注入モードに設定し、容器１９６から試薬を第一導管ポンプ１９０の導管１７４に向かう流れに流入させる。試薬は導管１７４を通して輸送され、捕捉用エンクロージャ１４０内に保持された細胞を試薬に曝露させる。次いで試薬は、試薬を引き込んで試薬が開口１７０から外に漏出するのを防止する、第二導管ポンプ１９２の作動によって導管１８６を通して汲み出される。
【０１０８】
細胞壁を貫通するためのツールを有する細胞操作要素
一つまたはそれより多い試薬を細胞に直接導入し、あるいは細胞の内部から試料を抽出することができることは、しばしば有利である。このために、本発明の好適な実施形態では、細胞操作要素は、細胞壁を貫通するように構成されたツールを備える。そのようなツールは、例えばガラスまたは金属製の例えば先の尖った固体である。そのようなツールは、本発明に係る引力が加えられたときに、細胞がツールに対して引っ張られ、その結果細胞壁が貫通されるように、細胞操作要素の捕捉用エンクロージャ内に配置することが好ましい。
【０１０９】
図７Ｇに、細胞壁貫通ツール２００を有する、細胞操作要素１８８に類似した細胞操作要素１９８を示す。細胞壁貫通ツール２００は、細胞止め子１７８内部のステンレス鋼ワイヤである。細胞の壁を貫通するために、細胞は捕捉用エンクロージャ１４０内に運ばれる。導管１７４および１８６に機能的に関連付けられた導管ポンプは、吸引モードに設定される。結果的に生じる引力は、細胞を細胞壁貫通ツール２００上に引っ張り、したがって細胞壁を貫通する。貫通後の細胞の解放は、結果的に生じる導管１７４および１８６中の液体の流動が貫通された細胞を細胞壁貫通ツール２００から押し離すように、機能的に関連付けられた導管ポンプを注入モードに設定することによって達成される。
【０１１０】
ひとたび細胞壁が貫通されると、貫通された細胞に試薬が注入され、あるいは貫通された細胞の中身が試料採取されることが有利である。好適な実施形態では、細胞壁貫通ツールは、導管を通して試薬を注入したり細胞の中身を試料採取するために、独立に制御可能なポンプに機能的に関連付けられた導管を有する。
【０１１１】
図７Ｈには、細胞壁貫通ツール２０４を有する、細胞操作要素１８２と同様の細胞操作要素２０２が示されている。細胞壁貫通ツール２０４は、実質的に中空の細胞止め子１８４の尖端である。細胞の壁を貫通するために、細胞は捕捉用エンクロージャ１４０内に運ばれる。周辺導管１７４に機能的に関連付けられた導管ポンプは吸引モードに設定され、結果的に生じる液体の流動は細胞を細胞壁貫通ツール２０４上に引っ張り、細胞壁を貫通する。細胞の内部から試料を抽出したい場合、軸方向導管１８６に機能的に関連付けられた導管ポンプは、吸引モードに設定される。試料を細胞に注入したい場合、軸方向導管１８６に機能的に関連付けられた導管ポンプは、注入モードに設定される。細胞操作要素１９８について述べたように、貫通後の細胞の解放は、結果的に生じる液体の流動が貫通された細胞を細胞壁貫通ツール２０４から押し離すように、周辺導管１７４に機能的に関連付けられた導管ポンプを注入モードに設定することによって達成される。
【０１１２】
貫通された細胞を細胞壁貫通ツールから解放するための代替的方法は、図７Ｉに示すように、細胞操作要素２０６に引き込み可能な細胞壁貫通ツール２０８を設けることによる。細胞操作要素２０６は、ステンレス鋼ワイヤである細胞壁貫通ツール２０８が導孔１８６内に通されること以外は、細胞操作要素１８２と同様である。細胞の壁を貫通するために、細胞は捕捉用エンクロージャ１４０内に運ばれる。導管１７４および１８６に機能的に関連付けられたポンプは、吸引モードに設定される。結果的に生じる引力は細胞を細胞壁貫通ツール２０８上に引っ張り、こうして細胞壁を貫通する。貫通後の細胞の解放は、細胞壁貫通ツール２０８を貫通された細胞から導孔１８６を通して引き抜くことによって達成される。
【０１１３】
多細胞反応要素
多細胞反応要素は実質的に、上述した標準細胞操作要素のように一個だけの細胞ではなく、少なくとも二個の細胞を受け入れるのに両方とも充分な大きさである、開口および多細胞反応エンクロージャ１５０を有する細胞操作要素であり、そのうちの多細胞反応エンクロージャ１５０だけが図６Ｂに示されている。多細胞反応要素は実質的に、（特に導管の個数および配置に関連して）上述したいずれかの型の要素とすることができ、かつ少なくとも一つの独立に制御可能な導管ポンプに機能的に関連付けられる。
【０１１４】
多細胞反応要素は、二個以上の細胞を一箇所に隔離する場を提供して、二個以上の細胞の相互作用を可能にする。多細胞反応要素の動作は、上述した細胞操作要素の動作と同様である。図６Ｂに示すように、各々別個の捕捉用エンクロージャ１４０内に隔離された少なくとも二個の細胞１４２が、本発明の方法に従って、捕捉用エンクロージャ１４０に隣接する多細胞反応エンクロージャ１５０に移動する。少なくとも二個の細胞１４２はそれぞれの捕捉用エンクロージャ１４０から追い出され、その間に多細胞反応要素に機能的に関連付けられた導管ポンプは吸引モードに設定される。結果的に生じる力は、追い出された細胞を多細胞反応エンクロージャ１５０内に引き込む。多細胞反応エンクロージャ１５０の内部で、少なくとも二個の細胞１４２は相互に作用する。希望する場合、上述および下述の通り、試薬を添加する。細胞の相互作用が完了すると、少なくとも二個の細胞１４２は多細胞反応エンクロージャ１５０から追い出される。少なくとも二個の細胞１４２は、通常通りに廃棄するかまたは捕捉用エンクロージャ１４０内に再隔離することができる。
【０１１５】
重要なことは、好適な実施形態では、本発明の細胞操作プローブに一つ以上の多細胞反応要素が設けられることである。
【０１１６】
試料導入要素
図６Ｄで、マトリックス１４５の中央に現われるのは、試料導入要素１６３の出口である。試料導入要素は実質的に、入口ポンプ（図示せず）に機能的に関連付けられた管である。本発明の装置を使用して操作される細胞を含む試料は、試料導入要素１６３を通して導入される。
【０１１７】
隔離要素
隔離要素は実質的に、これらの二つの要素の意図される用途の違いに起因する著しい構造上の相違を持つ多細胞反応要素であり、そのうちの実質的に半円形の隔離入口１４６だけが図６Ｂに図示されている。隔離要素は主に、本発明の装置の使用者が、必ずしも後で細胞を個別に操作することを意図することなく、比較的多数の細胞を濃縮する場所を提供するように意図されている。例えば、特定の細胞を大群の細胞から選別することができ、特定の細胞だけを選択して隔離要素の隔離エンクロージャに移送する。本発明の方法に従うか、または何らかの他のやり方で、隔離エンクロージャから特定の細胞を除去する。したがって、隔離要素の一部である隔離エンクロージャは一般的に、比較的大量の流体および多数の細胞を受け入れるのに充分大きい。最小限、隔離要素は、吸引モードで動作するように構成された隔離ポンプに機能的に関連付けられる。隔離ポンプが動作すると、細胞は隔離要素の隔離エンクロージャに引き込まれる。一部の実施形態では、隔離要素は、注入モードでも動作するように構成された隔離ポンプに機能的に関連付けられる。隔離ポンプが注入モードで動作すると、隔離エンクロージャ内に捕捉された細胞は、プローブ先端１３４の近傍に追い返される。隔離要素の隔離エンクロージャは、ダイヤフラムまたは他の弁状構造の特徴を備えることが好ましい。使用者は、針を備えたシリンジ（または他の適切な装置）を使用して、隔離エンクロージャ内に隔離された細胞および流体を抜き出すことができる。
【０１１８】
重要なことは、好適な実施形態では、本発明の細胞操作プローブに一つ以上の隔離要素が設けられることである。
【０１１９】
廃棄物要素
廃棄物要素は実質的に、吸引モードで動作可能な廃棄物ポンプに機能的に関連付けられた管状要素であり、そのうちの実質的に半円形の廃棄物入口１４８だけが図６Ｂに図示されている。廃棄物要素の機能は、望ましくない物質または不必要な物質を、細胞操作プローブ１３２のプローブ端１３４の近傍から、特にマトリックス１４５から除去することである。機能的に関連付けられた廃棄物ポンプが作動すると、細胞、流体、細胞片、および類似物は、廃棄物要素の廃棄物入口１４８を介して引き出されて廃棄される。
【０１２０】
細胞操作プローブ
本発明の細胞操作プローブは、上述の通り、少なくとも二つの、しかし好ましくは多数の個別細胞操作要素から構成される。細胞操作要素は、細胞操作要素への開口が相互に機能的に近接するように、つまり、細胞が本発明の方法に従って第一細胞操作要素から隣接細胞操作要素に移動することができるような距離および配向に、配設される。細胞操作プローブは、試料導入要素、廃棄物要素、隔離要素、および／または多細胞反応要素をも備えることが好ましいが、必ずしもそうする必要は無い。
【０１２１】
一部の実施形態では、細胞操作プローブは均質とすることができる。つまり全てのコンポーネント細胞操作要素が実質的に同じである。他の実施形態では、細胞操作プローブは異質である。つまり、細胞操作プローブは多種多様な細胞操作要素を含む。異質細胞操作プローブを形成する細胞操作要素間の相違は潜在的に、捕捉用エンクロージャの形状（特に捕捉用エンクロージャのサイズまたは開口のサイズ）、導管の個数、および導管の配置を含む。細胞操作プローブは潜在的に、上述した細胞操作要素の型の一部または全部を含むが、潜在的に、本書では論じないが生じ得る型の細胞操作要素も含まれる。異質細胞操作プローブの利用については下述する。
【０１２２】
好適な実施形態では、細胞操作プローブは細胞操作要素の束である。図８Ａに、細胞操作プローブ１３２を示す。図８Ｂに、細胞操作要素１７６と同様のコンポーネント細胞操作要素２１０を断面図で示す。図６Ａおよび図８Ａに示すように、細胞操作プローブ１３２はプローブ端１３４および突合せ端１３６を有する。図８Ａに示すように、概して、細胞操作プローブ１３２の突合せ端１３６で、個々の細胞操作要素２１０の端部は、容易な保守ならびに導管および細胞操作要素の機能的に関連付けられたポンプおよび類似物への容易な取り付けを可能にするために、比較的大きい（〜１０３ミクロン、１０００ないし２０００ミクロン）。該して、細胞操作プローブ１３２のプローブ端１３４では、個々の細胞操作要素２１０の端部はそれぞれの開口１４０のマトリックス１４５を形成し、操作対象の細胞の使用法およびサイズによって決定される寸法を有し、それは一般的にかなり小さいミクロン規模である（図６Ｂ）。例えば、細胞の操作用の開口のサイズは、１０−１ないし１０２ミクロンの間程度である。したがって、一般的な細胞操作要素２１０および一般的な細胞操作プローブ１３２は両方とも、図８に示すように、突合せ端１３６からプローブ端１３４に向かって徐々に大きさが減少する。
【０１２３】
観察用コンポーネント
本発明の装置は、操作される個々の細胞を実際に観察することなく操作するために使用することができるが、一般的に細胞を観察することは好ましい。観察は、例えば操作用の細胞を選択するため、形態学的研究のため、生物学的プロセスを直接観察するため、かつ所望の操作が所望する通りに実行されることを確認するために有用である。したがって、本発明の装置１３０は、図６Ａに示すように観察用コンポーネント１５０を機能的に設けることが好ましい。
【０１２４】
多くの異なる型の観察コンポーネントを本発明の装置に有用に結合することができるが、観察コンポーネントは光学検査装置であることが好ましい。１０−１ミクロン程度の大きさの生細胞を観察するのに適した倍率を有する光学またはＣＣＤ顕微鏡のような光学検査装置は公知であり、市販されている。
【０１２５】
当業者には公知の通り、光学またはＣＣＤ顕微鏡は、研究対象物の形態学的および形態計測的特徴付けには最も効果的である。したがって、装置１３０のような本発明の装置に、蛍光の検出に適した観察コンポーネントを設けることは有利である。バイタル蛍光パラメータ（蛍光強度、偏光、エネルギ伝達）の測定が、生細胞について重要な情報を提供することは、当業者には公知である。
【０１２６】
中央処理装置
複雑な実験の実行を可能にするために１３０のような本発明の装置に、図６Ａに示すように中央制御装置１４４を設けることが好ましい。１４４のような典型的な中央処理装置は、ユーザ入力インタフェース１４６を介してユーザからコマンドを受け取り、ポンプ１４２、観察用コンポーネント１５０、および他のコンポーネントを必要に応じて作動させる。当業者には明白である通り、中央制御装置１４４はプログラム可能なコンピュータを使用して有利に実現することができる。
【０１２７】
本書で述べた通り、中央制御装置１４４はまた、細胞操作プローブ１３２を使用して細胞を捕捉し、移動し、観察し、その他操作するために、ポンプ１４２および本発明の装置１３０の他のコンポーネントの作動の正確なシーケンスを決定するためにも使用される。
【０１２８】
好適な実施形態では、中央制御装置１４４は、各細胞がさらされた実験および条件の記録を格納するためにも使用される。下記参照。
【０１２９】
細胞の様々な状態の識別、検査、および決定は、人間のオペレータが本発明の装置の観察コンポーネントによって生成される映像出力を見ながら、実行することができるが、これらの機能の一部または全部を中央制御装置によって実行することが好ましい。細胞の場所および様々な形態を識別するのに有用な自動画像解析は周知であり、画像解析の熟練者が中央制御装置を使用して、本発明の装置の文脈で実現することができる。
【０１３０】
中央制御装置から要求され、あるいはそれにより可能になる多くの他の機能は公知または明白であり、ここでは列挙したり記載しない。
【０１３１】
細胞操作装置の作製
当業者が本発明の細胞操作プローブの作製を可能にする、利用可能な多くの技術がある。
【０１３２】
本発明の細胞操作プローブを作製するための一つの好適な方法は、セラミック粉末を使用する自由造形製造（ＦＦＭ）である。当業者には公知の通り、自由造形製造では、細胞操作プローブのような部品は、「積み上げ方式」でセラミック粉末の層を重ねるように順次送り出すことによって作製される。例えば米国特許第６３７６１４８号、米国特許第６２３８６１４号、米国特許第６２２８４３７号、米国特許第６０６６２８５号、米国特許第６１１７６１２号、米国特許第６０４６４２６号、米国特許第５０５９２６６号、米国特許第５２０４０５５号、または米国特許第６２０６６７２号を参照されたい。ＦＦＭの最新技術の概要は、米国特許第６３７６１４８号に見ることができ、それが本書に完全に記載されているかのごとく、あらゆる目的のために参照によってそれをここに組み込む。セラミック粉末を使用する場合、できるだけ小径のセラミック粉末を、例えば１０ナノメートルの直径のセラミック粉末を使用することが一般的に好ましいことに留意することが重要である。自由造形製造法を使用して本発明の細胞操作プローブのような複雑な構造を作製することは、当業者には公知であるので、これについては本書ではこれ以上論じない。
【０１３３】
細胞操作プローブ１３２のような細胞操作プローブは商業的供給者、例えばＴＥＧＳ  Ｌｔｄ．（ロシア、サラトフ）から購入することができる。
【０１３４】
細胞操作プローブ１３２のような細胞操作プローブを作製するための好適な方法は、多数のガラス管およびロッドを結束することによる。一般的に言うと、好適な方法は、三つのステップを含む。第一ステップで、ガラスロッドおよび管を適切な方法でひとまとめに結束して、初期細胞操作要素または好ましくは初期細胞操作プローブを組み立てる。管およびロッドの直径は、細胞操作プローブの突合せ端へのポンプまたは類似物のその後の取り付けが簡単になるように選択する。第二ステップで、ガラスロッドを融合する。第三ステップで、細胞操作プローブのプローブ端が形成されるように、ガラスロッドおよび管の束の一端を、ガラス工芸技術の熟練者には公知の通常の方法で引き伸ばす。そのような方法で、細胞操作プローブのプローブ端のサイズは、チャネルおよび導管を閉塞することなく低減され、図８Ａに示すように細胞操作プローブが生成される。
【０１３５】
個々の細胞操作要素の作製においてガラス管およびロッドを使用する方法は、図９に関連してさらに詳述する。ガラス管およびロッドを調整して細胞操作プローブを作製する方法の範囲は複数の細胞操作要素の作製を含み、本書の開示を学ぶと当業者には明白である。
【０１３６】
図９Ａは、細胞操作要素の組み立てに使用される七本のガラスロッド２１２ａ、２１２ｂ、２１２ｃ、２１２ｄ、２１２ｅ、２１２ｆ、および２１２ｇの束の上面図であり、図９Ｂは面Ａ−Ａにおける束の縦断面図である。七本のガラスロッド２１２の束は、初期細胞操作要素２１３とみなすことができる。図９Ｂでは、中央のガラスロッド２１２ｇの端がガラスロッド２１２ｅおよび２１２ｃの端より低くなっていることが分かる。実際には、六本のガラスロッド２１２ａないし２１２ｆの全ての端は同じ高さである。ガラスロッド２１２ａないし２１２ｆの側面および奥まったガラスロッド２１２ｇの上端によって画定される初期細胞操作要素２１３の容積は、最終的に形成される細胞操作要素の捕捉用エンクロージャに対応する。奥まったガラスロッド２１２ｇは、最終的に形成される細胞操作要素の細胞止め子に対応する。七本のガラスロッド２１２の間の間隙容量は、最終的に形成される細胞操作要素の単数または複数の導管になる六つの流路に対応する。
【０１３７】
図９Ａおよび９Ｂに示しかつ上述した七本のガラスロッド２１２の使用は、図７Ｂの１７６、図７Ｅの１８８、図７Ｇの１９８、および図７Ｉの２０６のような細胞操作要素の作成を可能にするが、１９８のような細胞操作要素の作製には、中心軸を通ってステンレス鋼ワイヤを有するガラスロッドがガラスロッド２１２ｇに取って代わることができる。１７６のような単一導管の細胞操作要素と、１８８、１９８、または２０６のような複数導管の細胞操作要素との間の区別は一般的に、初期細胞操作要素２１３においては必ずしも明瞭ではないことに注目することは重要である。むしろ、初期細胞操作要素（または初期細胞操作プローブ）が引き伸ばされた後で、最終的に形成される細胞操作要素の厳密な性質は、機能的に関連付けられた導管ポンプが流路にどのように取り付けられるかによって決定される。六本全ての流路が単一の導管ポンプに接続される場合には、１８８のように一本の導管を有する細胞操作要素が形成される。二本の隣接する流路が一つの導管ポンプに接続される一方、対向する対の流路が第二導管ポンプに接続される場合には、１８８、１９８、または２０６のような二つの周辺導管を有する細胞操作要素が形成される。
【０１３８】
図９Ｃに、図７Ｄの１８２、図７Ｈの２０２、または図７Ｉの２０６のような細胞操作要素の作製の方法を示す。本書で直前に記載しかつ図９Ａおよび図９Ｂに示した方法と同様に、六本のガラスロッド２１２ａ、２１２ｂ、２１２ｃ、２１２ｄ、２１２ｅ、および２１２ｆは、ガラス管２１４の周りに配設される。ガラス管２１４の端はガラスロッド２１２の端より低いので、ガラスロッド２１２ａないし２１２ｆの側面および奥まったガラス管２１４の頂端によって画定される容積は、最終的に形成される細胞操作要素の捕捉用エンクロージャに対応する。奥まったガラス管２１４の頂端は、最終的に形成される細胞操作要素の細胞止め子に対応する。六本のガラスロッド２１２と奥まったガラス管２１４との間の間隙容量は、潜在的に最終的に形成される細胞操作要素の導管になる六本の流路に対応する。奥まったガラス管２１４の中空導孔は、最終的に形成される細胞操作要素における軸方向導管に対応する。細胞操作要素２０２の細胞壁貫通ツール２０４を形成するために、奥まったガラス管２１４の端は尖鋭化される。
【０１３９】
初期細胞操作プローブを形成するために初期細胞操作プローブの代わりに、七本以上のガラスロッドおよび管をひとまとめに結束することは、本書の記述を学ぶと当業者には明瞭である。また、ここで、他の種類の細胞操作要素、または廃棄物要素もしくは隔離要素のような、細胞操作プローブを作製するための他の要素は、本書で上述したのと同様の仕方で作製することができることは本書の記述を読むと当業者には明瞭である。
【０１４０】
上述の通り、ひとたび初期細胞操作要素または初期細胞操作プローブを作製するガラスロッドおよび管を適切な仕方でひとまとめに結束した後、ロッドおよび管を融合させる。その後、初期細胞操作要素または初期細胞操作プローブの適切な端を引き出して、図８Ａに示す形状にし、細胞操作要素または細胞操作プローブをそれぞれ形成する。
【０１４１】
代替実施形態では、モジュール式細胞操作要素を作成しかつ組み立てて、細胞操作プローブを作成する。図１０に、モジュール式細胞操作要素の例を示す。
【０１４２】
図１０Ａに、二つの導管２１８および２２０を持つ単純なモジュール式細胞操作要素２１６の一実施形態を示す。細胞操作要素２１６の水平断面は実質的に方形である。同様の細胞操作要素の他の実施形態は潜在的に非方形断面を持つことに留意することは重要である。導管２１８および２２０は上述した導管と同様に機能する。細胞操作要素２１６の限定ではない例示的寸法は高さ１０００ミクロン、幅２０ミクロン、奥行き２０ミクロンである。細胞操作要素２１６の頂部は陥凹し、上述したようにくぼみまたは捕捉用エンクロージャとして役立つウェル状エンクロージャ２２２を形成する。ウェル状エンクロージャ２２２の限定ではない例示的奥行は１０ミクロンである。２１６のようなモジュール式細胞操作要素と一緒に使用するために、他の型の要素、特に細胞操作要素を考えることができる。そのような他の型の要素の例として、図１０Ｂに示す三本の導管２１８、２２０、および２２６を持つモジュール式細胞操作要素２２４、ならびに図１０Ｃに示す二本の導管２１８および２２０および細胞壁貫通ツール２３０を持つモジュール式細胞操作要素２２８が挙げられる。
【０１４３】
２１６、２２４、および２２８のようなモジュール式細胞操作要素からの細胞操作プローブの組み立ては、図１０Ｄに示すアセンブリプレート２３２を提供することによって行なわれる。アセンブリプレート２３２は、導管２１８、２２０、および２２６、またはモジュール式細胞操作要素２１６、２２４、および２２８の細胞壁貫通ツール２３０の導管の底部開口に嵌めこまれる、複数のピンコネクタトリプレット２３４を有するモノリシック構造である。アセンブリプレート２２４の底で、各ピンコネクタ２２６は、機能的に関連付けられた導管ポンプ（図示せず）につながる流体管路（図示せず）に接続される。したがって、複数のモジュール式細胞操作要素２１６をアセンブリプレート２２４上に正確に並べて配置することができ、したがって流体を導管２１８および２２０内に流動させる機能的に関連付けられた導管ポンプがもたらされる。
【０１４４】
モジュール式細胞操作要素を含め、モジュール式細胞操作要素を使用して、細胞操作プローブを実現するために必要な様々なコンポーネントは、市販の供給者から、例えばＴＥＧＳ  Ｌｔｄ．（ロシア、サラトフ）から購入することができる。
【０１４５】
ひとたび細胞操作プローブが作製されると、市販のコンポーネントからの本発明の装置の組み立ては、本書の記載を学んだ上で、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１４６】
中央制御装置を実現するための適切なコンピュータ、ソフトウェア、および関連周辺機器は、ＩＢＭ社（米国ニューヨーク州アーモンク）から入手可能である。必要な独自の、または専用のソフトウェアは、コンピュータプログラミングの分野の熟練者が書くことができる。
【０１４７】
観察コンポーネントを実現するための適切なＣＣＤ顕微鏡は、例えばハイロックス社（日本国東京都杉並区）から入手可能である。
【０１４８】
本発明を実現するのに適したフロージェネレータおよび周辺機器は、例えばＧｅＳＩＭ（ドイツ、Ｇｒｏｓｓｅｒｋｍａｎｎｓｄｏｒｆ）またはＦｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国カリフォルニア州サンフランシスコ）から入手可能である。
【０１４９】
実験を構築するのに使用されるステップ
液体培地（特に細胞培養液）中に見られる個々の細胞を操作するように設計された、図６に示す１３０のような装置は、多くの新規かつ有用な実験の実行を可能にする。実験は、一連の一つまたはそれ以上のステップ（操作または機能とも呼ばれる）を実行することによって行なわれる。様々な実験のための有用な基礎単位である少数の標準的ステップを、図６に示す装置１３０に関連して、かつ特に図６Ｂに関連して以下で詳述する。特に明記しない限り、例えば以下では、全ての細胞操作要素は、図７Ｆに示すような試薬入口システムを持つ、図７Ｄに示す細胞操作要素１８２と同様であることを想定している。
【０１５０】
有用なステップ、操作、および機能は、捕捉用エンクロージャ内に細胞を装填して隔離すること、細胞を洗浄すること、観察のために細胞を浮遊させること、細胞壁に貫通すること（例えば試料を取り出すため、または試薬を接種するため）、細胞を試薬に曝露させること、細胞を他の細胞と相互作用させること、細胞を選択すること、細胞を選別すること、および細胞の型を他の細胞から分離することを含む。
【０１５１】
細胞の装填および隔離
必ずしもそうでなくてもよいが一般的には、実験の第一ステップは、細胞を装置１３０の捕捉用エンクロージャ１４０内に装填することである。
【０１５２】
試料入口ポンプ１５８は、作動して試料入口１５２を通して細胞操作プローブ１３２のプローブ端１３４のマトリックス１４５上に細胞含有液の試料を装填するように（図６Ｃ）、中央制御装置１４４からコマンドを受け取る。図６Ｄに示す細胞操作プローブ１４５の変形を使用する代替実施形態では、細胞含有試料は試料導入要素１６３を通して導入され、マトリックス１４５に流出する。
【０１５３】
細胞１４２を装填したい全ての捕捉用エンクロージャ１４０に対し、機能的に関連付けられた第一導管ポンプ１９０および第二導管ポンプ１９２は、中央制御装置１４４によって吸引モードに設定される。それぞれの開口１７０に近接する細胞１４２は、それぞれの捕捉用エンクロージャ１４０に引き込まれ、それぞれの細胞止め子１８４と接触するまで捕捉用エンクロージャ１４０に引き込まれる。
【０１５４】
特定の時間後、細胞が全ての所望の捕捉用エンクロージャ１４０内に捕捉されたと推定されるときに、関連付けられた第一導管ポンプ１９０および第二導管ポンプ１９２は中央制御装置１４４によって非活動モードに設定される。観察用コンポーネント１５０は、全ての捕捉用エンクロージャ１４０を検査して細胞１４２がその中に捕捉されているかどうかを確認するように、中央制御要素１４４からコマンドを受け取る。空の捕捉用エンクロージャ１４０の第一導管ポンプ１９０および第二導管ポンプ１９２は、全ての所望の捕捉用エンクロージャ１４０が細胞１４２を保持するまで、再び吸引モードに設定される。
【０１５５】
ひとたび細胞１４２が全ての所望の捕捉用エンクロージャ１４０に保持されると、廃棄物要素に機能的に関連付けられた廃棄物ポンプは、中央制御装置１４４によって吸引モードに設定される。捕捉用エンクロージャ１４０に捕捉されなかった余剰細胞および液体は、廃棄物要素の入口１４８を通して除去されて廃棄される。その後、中央制御装置１４４によって流体入口ポンプ１６０が起動し、流体入口１５４を介してマトリックス１４５上に適切な細胞培養液を送り出す。
【０１５６】
一実施形態では、細胞１４２は実質的に全ての捕捉用エンクロージャ１４０に捕捉されることが望ましい。そのような実施形態では、すべての捕捉用エンクロージャ１４０に関連付けられる第一導管ポンプ１９０および第二導管ポンプ１９２は吸引モードに設定され、その結果として細胞１４２をそれぞれの捕捉用エンクロージャ１４０に引き込む。
【０１５７】
異なる実施形態では、細胞１４２の移動に対し最大限の柔軟性を維持することが望ましい。そのような実施形態では、第一ステップで、非隣接捕捉用エンクロージャ１４０だけに関連付けられる第一導管ポンプ１９０および第二導管ポンプ１９２が吸引モードに設定される。その後のステップで、各細胞１４２がマトリックス１４５の全ての捕捉用エンクロージャ１４０への自由経路を有するので、細胞は捕捉用エンクロージャの間を非常に容易に移動し移送することができる。下記参照。
【０１５８】
細胞観察
本発明の一実施形態では、捕捉用エンクロージャ１４０内の細胞１４２を、それぞれの開口１７０を通して観察する。別の実施形態では、捕捉用エンクロージャ１４０の壁が透明であり、その中に保持された細胞１４２はそこを通して観察される。
【０１５９】
好適な実施形態では、細胞操作要素が、深部細胞の流入を可能にするのに十分な深さの導管または捕捉用エンクロージャを備える場合、各々捕捉用エンクロージャ１４０内の一個だけまたは少数個だけの細胞１４２がそれぞれの開口に近接し続けるように、観察されない細胞１４２が細胞操作要素内部に引き込まれる。その場合、観察は、それぞれの開口１７０に近接する細胞１４２のみに対して実行される。
【０１６０】
上述したように（細胞操作要素１８２のように）ベルヌーイ効果を使用して、捕捉用エンクロージャの上に細胞１４２を浮遊させるのに適した細胞操作要素の捕捉用エンクロージャ１４０に細胞１４２が保持される場合には、観察対象の細胞１４２を観察のために浮遊させることが最も好ましい。中央制御装置１４４は、軸方向導管１８６に機能的に関連付けられた導管ポンプを注入モードに設定する一方、一つまたはそれ以上の周辺導管１７４に機能的に関連付けられた導管ポンプは、吸引モードに設定される。上述の通り、捕捉用エンクロージャ１４０に捕捉された細胞１４２は捕捉用エンクロージャ１４０から持ち上げられ、その上に浮遊する。そのような方法で観察対象の細胞１４２を浮遊させる利点は多種多様である。細胞１４２は、細胞１４２に照準した非コヒーレント光および／またはコヒーレント光を使用して、選択的にかつ強く照明することができる。光の散乱および影は除去される。重要なことは、光の強度が高ければ高いほど、小さいカメラの絞りを使用することができ、被写界深度が高くなり、より鮮明な画像の記録を導くことである。さらに、照明の強度は、コントラストを最大にし、かつ観察可能な詳細を最大限にするように選択することができる。
【０１６１】
細胞１４２を検査した後、関連する第一導管ポンプ１９０および第二導管ポンプ１９２を両方とも吸引モードに設定し、細胞１４２を捕捉用エンクロージャ１４０に戻すことができる。その後、必要ならば、追加の細胞を検査することができる。
【０１６２】
バイアル試薬入口を通しての試薬の添加
細胞を試薬に曝露させる一つの方法は、バイアル試薬入口１５６を介するものである。中央制御装置１４４はバイアル試薬入口ポンプ１６２を作動させて、ある量の試薬をバイアル試薬入口１５６からマトリックス１４５上に送り出す。しかし、捕捉用エンクロージャ１４０に保持された細胞１４２がこのように送り出された試薬と接触するために、試薬を捕捉用エンクロージャ１４０内に運び込まなければならない。
【０１６３】
捕捉用エンクロージャ内の全ての細胞を試薬に曝露させようとする場合（例えば試薬が栄養素または蛍光マーカである場合）、全ての捕捉用エンクロージャ１４０に関連付けられた一方または両方の導管ポンプ１９０および１９２が吸引モードに設定され、ある量の試薬を各捕捉用エンクロージャ１４０に引き込む。
【０１６４】
しかし、特定の細胞１４２だけを所定の試薬に曝露させようとする場合、特定の細胞１４２のそれぞれの捕捉用エンクロージャ１４０のみに機能的に関連付けられた一方または両方の導管ポンプ１９０および１９２が吸引モードに設定される。
【０１６５】
細胞操作コンポーネントを介しての試薬の添加
上述の通り、所定の捕捉用エンクロージャ１４０が二つの独立に制御可能な導管ポンプ１９０および１９２に機能的に関連付けられるという事実は、一つの機能的に関連付けられた導管ポンプを使用して洗浄液を注入すると同時に、もう一つの導管ポンプを使用して洗浄液を抽出することによって、捕捉用エンクロージャ１４０または捕捉用エンクロージャ１４０内に保持された細胞１４２の「洗浄」を可能にする。
【０１６６】
上述の通り、捕捉用エンクロージャ１４０が、図７Ｆに示すように試薬注入ポンプ１９４と一緒に二つの独立に制御可能な導管ポンプ１９０および１９２に機能的に関連付けられるという事実は、捕捉用エンクロージャ１４０内の細胞１４２の試薬への選択的な曝露を可能にする。試薬注入ポンプ１９４は、注入モードに設定された第一導管ポンプ１９０によって発生する流動に、所望の量の試薬を添加するように設定される。導管１７４からの流体の流動は試薬を捕捉用エンクロージャ１４０に運び、こうして細胞１４２を試薬に曝露させる。捕捉用エンクロージャ１４０からの試薬の漏出を防止するために、第二導管ポンプ１９２は吸引モードに設定され、試薬および他の流体をエンクロージャ１４０から能動的に除去する。
【０１６７】
異なる捕捉用エンクロージャへの細胞の移動
隣接する捕捉用エンクロージャ間の一連の移送による、捕捉用エンクロージャ１４０に保持された細胞１４２の別の捕捉用エンクロージャへの移動は、本発明の方法に従って実行され、上述した説明から明白である。そのような移動を図１１に概略的に示す。
【０１６８】
細胞１４２は、図１１Ａの細胞操作要素２３６の捕捉用エンクロージャ内に保持される。
【０１６９】
図１１Ａに示すように、細胞操作要素２３６に機能的に関連付けられた導管ポンプは注入モードに設定され、隣接細胞操作要素２３８に機能的に関連付けられた導管ポンプは吸引モードに設定される。矢印２４０で示すように、細胞操作要素２３６から隣接する細胞操作要素２３８への液体の流動が生じる。
【０１７０】
図１１Ｂに示すように、液体の流動２４０によって発生する力は、細胞１４２を細胞操作要素２３６から追い出し、細胞１４２を隣接細胞操作要素２３８に向かって搬送する。
【０１７１】
図１１Ｃに示すように、細胞１４２は最終的に、隣接する細胞操作要素２３８の捕捉用エンクロージャ内に搬送される。
【０１７２】
細胞は、本発明の方法に従って、かつ本書および図３に記載するように、一連の占有されていない隣接エンクロージャによって画定される経路に沿って、いずれかの捕捉用エンクロージャからいずれかの他の占有されていない捕捉用エンクロージャに移動する。個々の細胞を一つの捕捉用エンクロージャからいずれかの他の捕捉用エンクロージャに移動させる能力は、多くの有用な実験の実行を可能にする。
【０１７３】
例えば、同様の細胞を一連の試薬に曝露させるが、曝露の順序または細胞が所定の試薬に曝露される時間の長さを変える効果を比較することが望ましい場合がある。そのような実験を実行するために、細胞は捕捉用エンクロージャに装填される。細胞は順次、特定の試薬を備えた異なる捕捉用エンクロージャに移送され、その中で必要に応じて試薬に曝露される。
【０１７４】
また、二つの異なる種類の細胞の相互作用を研究することもしばしば求められる。第一の型の細胞は、捕捉用エンクロージャに、好ましくは占有されていない捕捉用エンクロージャに装填される。第二の型の細胞は他の捕捉用エンクロージャに、好ましくは占有されていない捕捉用エンクロージャに装填される。各型の細胞は、上述したように、多細胞反応エンクロージャ１５１に移送される。適切なサイズの捕捉用エンクロージャを条件とする別の実施形態では、第一細胞は、第二細胞にすでに占有された捕捉用エンクロージャに移動する。観察用コンポーネント１５０は、相互作用を観察するために使用される。希望する場合、二つの細胞は多細胞反応エンクロージャ１５１から排出され、別の対の細胞が研究のためその中に装填される。
【０１７５】
また、さらなる研究用に特定の型の細胞を集めるために、捕捉用エンクロージャに保持された単数または複数の特定の細胞を隔離要素に移動させることもしばしば求められる。各々の個別細胞は、細胞が隔離要素の隔離入口１４６に隣接する捕捉用エンクロージャ１４０内に配置されるまで、一つの捕捉用エンクロージャから隣接する捕捉用エンクロージャへ、一連の捕捉用エンクロージャを介して移送される。細胞が捕捉用エンクロージャ１４０から排出される間に、隔離要素に機能的に関連付けられた導管ポンプが起動され、細胞１４２を隔離入口１４６を介して隔離要素内に引き込む。
【０１７６】
同様に、特定の細胞１４２を捕捉用エンクロージャから廃棄することも求められることがある。細胞１４２が廃棄物入口１４８の近傍に配置されるまで、細胞１４２は、一つの捕捉用エンクロージャ１４０から隣接する捕捉用エンクロージャ１４０へ移送される。細胞１４２が捕捉用エンクロージャ１４０から排出される間に、廃棄物要素と機能的に関連付けられたポンプが起動され、細胞１４２を廃棄物入口１４８を介して引き込む。
【０１７７】
本発明のほとんどの実施形態で、装置１３０は、多くのポンプの同時作動が可能であり、したがって操作および機能を同時に実行するように構成される。したがって、本発明の一実施形態では、多数の細胞が、１３０のような本発明の一つの装置を使用して、個別に同時に操作される。したがって、本発明の別の実施形態では、多数の細胞−細胞相互作用が、１３０のような本発明の一つの装置を使用して同時に実行される。別の実施形態では、多数の個々の細胞の多数の特定の処理および操作が、１３０のような本発明の一つの装置を使用して同時に実行される。別の実施形態では、多くの細胞が、希望する通りに、第一の捕捉用エンクロージャから別の捕捉用エンクロージャに同時に移動する。各ステップで一つまたはそれ以上の細胞１４２が一つの捕捉用エンクロージャ１４０から別の捕捉用エンクロージャに移送される、一連の最適なステップを計算するアルゴリズムの作成は、十分にコンピュータプログラミングの分野の熟練者の能力の範囲内である。そのようなアルゴリズムは、本発明の装置１３０の中央制御装置１４４で容易に実現される。ひとたび一連の最適なステップが見つかると、中央制御装置１４４は、計算された一連のステップに従って適切な動作が実行されて、細胞１４２が必要に応じて再配置されかつ再構成されるように、様々な導管ポンプを設定する。
【０１７８】
いつでも任意の瞬間に、細胞操作プローブ１３２の捕捉用エンクロージャ１４０内の全ての細胞１４２の場所が、中央制御装置１４４に記録されることが好ましい。中央制御装置１４４はまた、いずれかの任意の細胞が受けた操作も記録することが好ましい。そのような方法で、データを容易に解析することができる。
【０１７９】
例示的実験
当業者は、上記の本発明の説明を熟読することにより、本発明の装置を構築し、かつこれまでは不可能であった大量の実験、操作、および研究を計画することができ、それらはこれまで得られなかった科学的情報をもたらす。簡単にするために、以下では、実験、操作、および研究という用語を相互に同義的に使用する。本発明の教示によって可能になる個々の細胞の操作は、バルク研究（例えばキュベットまたはマイクロプレートを使用する）、フロースルーサイトメトリ研究、または静的サイトメトリ研究に比較して、研究対象の現象の生物学的意味を理解するためのずっと多くの情報をもたらす。
【０１８０】
本発明の好適な実施形態では、実時間高処理量の研究のために特定の細胞を選択する。下述するものを含めて、本発明の教示を使用して実行される研究の一部は、これまでは手動で実行されてきたことに留意することは重要である。しかし、本発明の教示は、そのような研究を、高度熟練者が手動で実行するのではなく、自動的に多くの細胞に同時に実行することを初めて可能にするものであることに留意することが重要である。
【０１８１】
本発明の追加の利点は、選択された細胞を比較的長い期間、様々な環境に維持することができ、多くの様々な実験に単細胞を使用することが可能になることである。例えば、本発明の装置を使用して、多数の細胞が刺激にさらされ、特定の方法で刺激に反応する細胞が、例えば細胞操作プローブの捕捉用エンクロージャ内に隔離され、あるいは上述したように隔離要素に移動することにより隔離される。その後、隔離された細胞の他の刺激に対する反応を研究することができる。要するに、珍しい特性またはその他の興味深い特性を有する細胞がひとたび識別されると、本発明の教示を使用して該細胞を隔離しかつさらに操作し、それによって関連細胞の下位群に調査を絞り込み、調査時間を短縮し、かつ貴重な資源を節約する。さらに、そのような調査は細胞単位で行なわれるので、例えば診断精度を向上するためのより優れかつより正確なデータが得られる。
【０１８２】
本発明の教示はまた、細胞を選別するため、または大集団の細胞から特定の細胞を選択するために使用することもできる。そのような手順は、望まない細胞の選択的除去、または他の細胞の中から低い割合で発見される所望の細胞の収穫、当業界で公知の方法を使用して実行できない活動を含む。一群の多数の細胞の中から病理を示す細胞だけを識別して隔離し、隔離された細胞を何らかの方法で処理し（例えば試薬に曝露させる）、かつこうして処理された細胞を元の群に戻すことによって、単細胞治療を実行することができる。格別興味深い細胞群として、例えば血中のリンパ球、ヒト白血病Ｔ細胞株、リンパ節細胞、腫瘍細胞、および他の代表的群がある。
【０１８３】
生体（ヒトおよび非ヒトの両方の哺乳類のような）から取った生細胞に適用する場合、本発明の教示は、個々の細胞の操作または正常な細胞の中からの異常細胞（特に有害な異常細胞）の除去を含め、それらに限らない手順による、生体（ヒトおよび非ヒトの両方の哺乳類のような）からの生体液の処理を可能にする。そのような処理は、リンパ液、血液、脳脊髄液、精液、唾液、骨液、骨髄、蝸牛液、腫瘍特に悪性腫瘍からの抽出液、卵巣液、羊水、および絨毛液を含め、それらに限らず、生体液中の粒子（特に細胞）の選択的操作の形態を考慮することができる。一実施形態では、そのような処理は「オフライン」で、すなわち生体（ヒトおよび非ヒトの両方）から生体液の試料を取り出し、流体を本発明の装置で処理し（例えば細胞を選択または操作し）、処理した流体を生体に戻すことによって、実行することができる。好適な実施形態では、そのような処理は「オンライン」で、すなわち生体から本発明の装置に入力ラインを直接取り付け、かつ処理した流体を生体に戻すことによって、実行される。入力ライン２４３が生体２４５から本発明の装置２４７に取り付けられた、本発明に係る生体の「オンライン」処理を図１２に示す。装置２４７で、所望の処理が実行され、処理された流体は装置２４７から、出力ライン２４９を介して生体２４５に戻される。そのような実施形態では、装置２４７の中央制御装置は、例えば自動画像解析を使用することによって、細胞を自動的に検出しかつ処理するように構成することが有利である。
【０１８４】
本発明の教示を使用して実行される別の実験は、中空貫通ツールを備えた細胞操作要素の捕捉用エンクロージャに研究対象の細胞を装填することを含む。上述の通り細胞壁を貫通され、貫通された細胞に、中空貫通ツールの導管を通して注入される第一試薬を接種する。こうして準備された細胞を、上述した方法で第二試薬に曝露させる。次いで、接種された細胞の反応を観察する。
【０１８５】
別の関連実験は、卵子の改善された受精（改善形のＩＶＦ）を含む。生育可能な卵子を含む液体試料を、本発明の細胞操作プローブに装填する。中空貫通ツールを備えた捕捉用エンクロージャ内に卵子を保存する。卵子の壁を貫通し、精子をそこから卵子内に注入させる。各々の個別卵子を貫通ツールから解放するが、捕捉用エンクロージャの内部に保持する。細胞分裂および発育を観察し、受精に成功し明らかに発育可能な卵子だけを、子宮に移すために隔離要素に移動させる。
【０１８６】
本発明の装置はまた、細胞を異なる装置、例えばＷＯ０３／０３５８２４として公開されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ２００１／ＩＬ００００９９２に記載されたバイオチッププロセッサに、移送するために使用することもできる。細胞は装填され、選択、選別、ならびに試薬および他の刺激への曝露を含め、上述した操作を受ける。希望する場合、図１３Ａに示すように、バイオチッププロセッサ２４２（または、Ｎｕｎｃ３８４ウェルプレートなどのマイクロウェルプレートのような類似物）の流路（図示せず）または表面に、細胞操作プローブ１３２を接触、近接、または何らかの形で物理的に接続させる。単数または複数の特定の細胞を、細胞操作プローブ１３２の選択された捕捉用エンクロージャ２４４および２４６から、バイオチッププロセッサ２４２の識別可能な場所２４８および２５０に沈積させる。次いでバイオチッププロセッサ２４２は、選択された細胞を通常の方法で、ＷＯ０３／０３５８２４に記載されているように、処理するために使用される。そのような方法で、本発明の教示を使用して識別されかつ隔離された選択細胞は、成長させ増殖させることができる。本発明の別の実施形態では、このプロセスを逆転して、本発明の細胞操作プローブ１３２に、バイオチッププロセッサ２４２（または、Ｎｕｎｃ３８４ウェルプレートなどのマイクロウェルプレートのような類似物）からの細胞を装填させる。細胞操作プローブ１３２をバイオチッププロセッサ２４２の表面に近接させる（図１３Ｂ）。関連導管ポンプが吸引モードに設定され、バイオチッププロセッサ２４２からの細胞１４２が細胞操作プローブ１３２の捕捉用エンクロージャに装填される。二つの先進的な研究方法を容易に結合する能力は、実験から生み出される重要な成果を指数関数的に増大させる。二つの研究方法がフォーマット準拠である場合、すなわち、細胞操作プローブ１３２の捕捉用エンクロージャの個数、および好ましくは幾何学的構成がバイオチッププロセッサ２４２の識別可能な場所（２４８および２５０のような）と実質的に同様または同一でさえある場合、そのような結合は格別に有利である。
【０１８７】
分かりやすくするため別個の実施態様で説明されている本発明のいくつもの特徴は、組み合わせて単一の実施態様にして提供することもできることは分かるであろう。逆に簡略化するため単一の実施態様で説明されている本発明の各種特徴は、別個に又は適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０１８８】
本発明を、その具体的実施態様とともに説明してきたが、多くの変形と変更が当業技術者には明らかであることは明白である。したがって、本発明は、本願の特許請求の範囲の精神と広い範囲内に入っているこのような変形と変更をすべて含むものである。
【０１８９】
本明細書に記載のすべての刊行物、特許及び特許願は、あたかも、個々の刊行物、特許又は特許願各々が、本願に具体的にかつ個々に参照して示されているように、本願に援用するものである。さらに、本願における任意の文献の引用もしくは確認は、このような文献が本発明に対する従来技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】引力だけを使用して小物体を一つの場所から隣接場所へ移動させるための本発明の方法を示す。
【図２】引力および斥力を使用して小物体を一つの場所から隣接場所へ移動させるための本発明の方法を示す。
【図３】一連の隣接場所への一連の連続的移動によって、小物体を一つの場所から非隣接場所へ移動させるための本発明の方法を示す。
【図４】捕捉エンクロージャにより実現される、本発明の場所の略図である。
【図５】本発明の場所の六角形マトリックスの略図である。
【図６Ａ】本発明の細胞操作装置の好適な実施形態の略図である。
【図６Ｂ】本発明の細胞操作プローブのプローブ先端の好適な実施形態の先端の略図である。
【図６Ｃ】本発明の細胞操作プローブのプローブ先端の好適な実施形態の先端の略図である。
【図６Ｄ】細胞操作プローブのプローブ先端の代替実施形態の略図である。
【図７Ａ−Ｄ】図７Ａは単一導管を持つ細胞操作要素の好適な実施形態の略図の断面図である。図７Ｂは単一導管および細胞止め子を持つ細胞操作要素の好適な実施形態の略図の断面図である。図７Ｃは単一導管および導孔の隘路を持つ細胞操作要素の好適な実施形態の略図の断面図である。図７Ｄは軸方向導管および一つの周方向導管を持つ細胞操作要素の好適な実施形態の略図の断面図である。
【図７Ｅ−Ｆ】図７Ｅは二つの周方向導管を持つ細胞操作要素の好適な実施形態の略図の断面図である。図７Ｆは細胞操作要素を通して試薬を導入するのに有用なポンプシステムを示す図である。
【図７Ｇ−Ｉ】図７Ｇは細胞壁貫通ツールを持つ細胞操作要素の好適な実施形態の略図の断面図である。図７Ｈは細胞壁貫通ツールを装備した軸方向導管を持つ細胞操作要素の好適な実施形態の略図の断面図である。図７Ｉは引き込み可能な細胞壁貫通ツールを持つ細胞操作要素の好適な実施形態の略図の断面図である。
【図８Ａ】細胞操作プローブの好適な実施形態の斜視図である。
【図８Ｂ】細胞操作要素の好適な実施形態の略図の断面図である。
【図９】ガラス管およびロッドから細胞操作要素を作製する方法を示す。
【図１０Ａ】モジュール式細胞操作要素の斜視図である。
【図１０Ｂ】モジュール式細胞操作要素の斜視図である。
【図１０Ｃ】モジュール式細胞操作要素の斜視図である。
【図１０Ｄ】モジュール式細胞操作要素と共に使用して細胞操作プローブを作製するためのアセンブリプレートの斜視図である。
【図１１Ａ】一つの細胞操作要素から隣接する細胞操作要素への細胞の移動を示す。
【図１１Ｂ】一つの細胞操作要素から隣接する細胞操作要素への細胞の移動を示す。
【図１１Ｃ】一つの細胞操作要素から隣接する細胞操作要素への細胞の移動を示す。
【図１２】有機物のオンライン処理に適用される本発明の教示の略図である。
【図１３Ａ】細胞操作プローブからバイオチッププロセッサへの選択された細胞の移動を示す斜視図である。
【図１３Ｂ】バイオチッププロセッサから細胞操作プローブへの選択された細胞の移動を示す斜視図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ−Ｄ】
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【図７Ｅ−Ｆ】
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【図７Ｇ−Ｉ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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