(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の非エンドトキシン性発熱物質を検出する方法であって、
単球含有試薬が濃縮されて、平底マイクロタイターウェルと比較してより大きな細胞間接触がもたらされるように成形された少なくとも１つのマイクロタイターウェルを含む第１検定系において単球含有試薬と試験される試料とを合わせる工程であって、該マイクロタイターウェルの表面はポリプロピレンコーティングを含むかまたは該マイクロタイターウェル全体がポリプロピレンから構成されており；
該単球含有試薬および該試料をインキュベートする工程であって、該試料が発熱物質を含む場合、該単球含有試薬がサイトカインまたは炎症反応の内因性メディエーターを産生する、工程；
該第１検定系の内容物を、該サイトカインまたは炎症反応の内因性メディエーターに対する抗体で処理された少なくとも１つの表面を含む第２検定系へ移す工程；および
該表面上の抗体に結合したサイトカインまたは内因性メディエーターの存在について該第２検定系を検定し、それによって、該表面に結合したサイトカインまたは内因性メディエーターの上昇したレベルにより、該試験される試料中の該発熱物質の存在が示される、工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記サイトカインが、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン１ｒａ（ＩＬ−１ｒａ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サイトカインがＩＬ−６である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記内因性メディエーターがエンドセリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が非経口投与用医療品である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記医療品が、血液製剤、透析溶液、ワクチンまたは血漿増量剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記マイクロタイターウェルが、開口頂部、該開口頂部から下方へ伸長する上方領域、および最も低い点の上方の位置から該最も低い点まで直径が先細りになる底壁を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記マイクロタイターウェルが、開口頂部、上端部および下端部を有する該開口頂部から下方へ伸長する上方領域、ならびに上端部および最も低い点を有する底部領域を含み、該底部領域が、該上方領域の下端部から伸長し、かつ底部領域の上端部から最も低い点に向かって、該上方領域よりも急激に直径が先細りになる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記マイクロタイターウェルの底壁が、非平面であるか、湾曲しているか、放物線状であるか、若しくは下方へ伸長しているか、または前記マイクロタイターウェルの側面が内側に傾斜している、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記検定系が比色酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射標識免疫学的検定または蛍光標識免疫学的検定である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記単球含有試薬が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または単球細胞株を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記単球細胞株がヒト単球細胞株を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記単球細胞株がＭＯＮＯＭＡＣ−６、ＴＨＰ−１または２８ＳＣである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記単球細胞株が、内因性ＣＤ１４およびトール様受容体を有する細胞株、あるいはＣＤ１４および／またはトール様受容体および／または炎症性もしくは発熱性メディエーターのレポーター遺伝子がトランスフェクトされた細胞株を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＢＭＣがヒトＰＢＭＣである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記単球含有試薬が、全血中での単球の細胞密度よりも高い細胞密度で前記検定系に存在する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約２５万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約５０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約６０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約７０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約８０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約９０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約１００万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約１１０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約１２０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項１１に記載の方法。
【請求項２６】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約１３０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項１１に記載の方法。
【請求項２７】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約１４０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項１１に記載の方法。
【請求項２８】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約１５０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項１１に記載の方法。
【請求項２９】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約１６０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項１１に記載の方法。
【請求項３０】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約１７０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項１１に記載の方法。
【請求項３１】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約１８０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項１１に記載の方法。
【請求項３２】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約１９０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項１１に記載の方法。
【請求項３３】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約２００万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項１１に記載の方法。
【請求項３４】
前記単球含有試薬が全血を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記全血がヒト全血を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
試料中の非エンドトキシン性発熱物質を検出する方法であって、
検定系において、単球含有試薬と試験される試料とを合わせる工程であって、該検定系は、（ｉ）該単球含有試薬が濃縮されて、平底マイクロタイターウェルと比較してより大きな細胞間接触がもたらされるように成形された少なくとも１つのマイクロタイターウェルであって、該マイクロタイターウェルの表面はポリプロピレンコーティングを含むかまたは該マイクロタイターウェル全体がポリプロピレンから構成されている、マイクロタイターウェルと、（ｉｉ）サイトカインまたは炎症反応の内因性メディエーターに対する抗体で処理された少なくとも１つの表面とを含む、工程；
該単球含有試薬および該試料をインキュベートする工程であって、該試料が発熱物質を含む場合、該単球含有試薬がサイトカインまたは炎症反応の内因性メディエーターを産生する、工程；および
該表面上の抗体に結合したサイトカインまたは内因性メディエーターの存在について該検定系を検定し、それによって、該表面に結合したサイトカインまたは内因性メディエーターの上昇したレベルにより、該試験される試料中の該発熱物質の存在が示される、工程
を含む、方法。
【請求項３７】
前記サイトカインが、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン１ｒａ（ＩＬ−１ｒａ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記サイトカインがＩＬ−６である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記内因性メディエーターがエンドセリンである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記試料が非経口投与用医療品である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記医療品が、血液製剤、透析溶液、ワクチンまたは血漿増量剤である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記マイクロタイターウェルが、開口頂部、該開口頂部から下方へ伸長する上方領域、および最も低い点の上方の位置から該最も低い点まで直径が先細りになる底壁を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記マイクロタイターウェルが、開口頂部、上端部および下端部を有する該開口頂部から下方へ伸長する上方領域、ならびに上端部および最も低い点を有する底部領域を含み、該底部領域が、該上方領域の下端部から伸長し、かつ底部領域の上端部から最も低い点に向かって、該上方領域よりも急激に直径が先細りになる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
前記マイクロタイターウェルの底壁が、非平面であるか、湾曲しているか、放物線状であるか、若しくは下方へ伸長しているか、または前記マイクロタイターウェルの側面が内側に傾斜している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記検定系が比色酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射標識免疫学的検定または蛍光標識免疫学的検定である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
前記単球含有試薬が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または単球細胞株を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４７】
前記単球細胞株がヒト単球細胞株を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記単球細胞株がＭＯＮＯＭＡＣ−６、ＴＨＰ−１または２８ＳＣである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＰＢＭＣがヒトＰＢＭＣである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記単球含有試薬が、全血中での単球の細胞密度よりも高い細胞密度で前記検定系に存在する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約２５万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約５０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約６０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約７０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約８０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項４６に記載の方法。
【請求項５６】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約９０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項４６に記載の方法。
【請求項５７】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約１００万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項４６に記載の方法。
【請求項５８】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約１１０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項４６に記載の方法。
【請求項５９】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約１２０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項４６に記載の方法。
【請求項６０】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約１３０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項４６に記載の方法。
【請求項６１】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約１４０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項４６に記載の方法。
【請求項６２】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約１５０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項４６に記載の方法。
【請求項６３】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約１６０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項４６に記載の方法。
【請求項６４】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約１７０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項４６に記載の方法。
【請求項６５】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約１８０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項４６に記載の方法。
【請求項６６】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約１９０万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項４６に記載の方法。
【請求項６７】
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくともまたは約２００万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在し、該細胞密度は、前記ウェル内の前記細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質が該ウェル中の試薬体積に存在する場合の最大細胞密度を超えない、請求項４６に記載の方法。
【請求項６８】
前記単球細胞株が、内因性ＣＤ１４およびトール様受容体を有する細胞株、あるいはＣＤ１４および／またはトール様受容体および／または炎症性もしくは発熱性メディエーターのレポーター遺伝子がトランスフェクトされた細胞株を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項６９】
前記単球含有試薬が全血を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項７０】
前記全血がヒト全血を含む、請求項６９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般的に、ポリプロピレンを含む少なくとも１つの表面を含む検定系において単球含有試薬とともに試料がインキュベートされる医療品中の非エンドトキシン性発熱物質を検出することがより優れて可能となる改良された単球活性化試験に関する。本発明はまた、ポリプロピレンを含む少なくとも１つの内面を有し、かつ単球含有試薬がウェル内で濃縮されて細胞間接触をより大きくするような形状を有する、少なくとも１つのマイクロタイターウェルを含むこれらの試験用の検定系にも関する。本発明はまた、試料中の非エンドトキシン性発熱物質の存在についての試験に使用することができる診断キットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
特定の化学物質または生物学的化合物は、ヒトまたは他の哺乳類の循環系と接触すると、炎症反応または炎症として知られる全身性反応を引き起こす。炎症反応は、感染および／または損傷から身体を保護する防衛機構であり；炎症は感染部位または損傷部位への血流を増大させ、それによって治癒プロセスで役立たせる上で必要となる液、タンパク質および白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ））が運ばれる。例えば、炎症反応と関連した１つの症状としては体温の上昇または発熱があり、これは、過熱状態の原因となる病原体に対する防衛機構として機能する。炎症反応は、発熱、悪寒、倦怠、頭痛、食欲喪失および筋硬直を含めた種々の「インフルエンザ様」症状と関連している可能性がある。発熱を引き起こす化学物質または生物学的化合物は、このような化合物が原因となり得る発熱反応を指して、「発熱物質」または「発熱性」化合物とこれまで呼ばれてきた。しかし、幾つかの化学物質または生物学的化合物は、一般的に炎症誘発性であり、それらによって引き起こされる炎症反応の一部として発熱を引き起こす場合もあれば、引き起こさない場合もある。
【０００３】
場合によっては、個体の感受性や、個体が曝露される発熱物質の種類および濃度によって、個体は、発熱物質への曝露後に、生命を脅かすショック様症状を発現する可能性がある。吸入、注射または注入が可能な医療品、ならびに膜または注入物質等の医療用具には、発熱原性の特定のリスクがある。栄養物質でさえ、発熱原性のリスクを示すことがある。医療品および栄養物質に含まれる発熱物質は、外因性発熱物質と呼ばれるが；一方で内因性発熱物質は、外因性発熱物質に対する個体の炎症反応を媒介する免疫系のメッセンジャー化合物である。産物自体またはその産物の副産物の発熱原性の性質に加えて、産物の汚染は、多くの場合、発熱原性の原因となり得る。産物の汚染による発熱原性は、細菌、ウイルス、菌類に由来する、あるいは宿主にさえも由来する発熱物質の多様な群の内のいずれか１種に起因し得る。産物が熱または化学的方法によって「滅菌」される場合であっても、この問題は続く可能性があり；一般的に見られる発熱性化合物、即ち細菌エンドトキシン（ほとんどグラム陰性菌の細胞壁由来のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）からなる）は、細菌の死滅後に残る可能性がある。従って、各種の医薬、栄養物質および非経口投与用医療品には、このような産物の安全性を確保するために発熱性物質試験が必要である。
【０００４】
通常、発熱物質として作用する化合物は、組織、細胞または体液との接触後の単球におけるプロスタグランジンおよび炎症誘発性サイトカイン等の内因性発熱物質の産生を刺激することによって作用する。これらの内因的に産生した発熱物質が、罹患した生体の炎症反応を媒介するものである。これらの内因性発熱物質の内で最も重要かつ周知のものは、サイトカインであるインターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ならびに低分子量脂質メディエーターであるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）である。これらの化合物は、ＥＬＩＳＡあるいは酵素結合免疫吸着検定法（ＩＬ−１、ＩＬ−６またはＴＮＦについて）ならびにＥＩＡあるいはエンザイム免疫学的検定（ＰＧＥ２について）によってルーチンで検定される。
【０００５】
発熱反応を回避し、かつ非経口的に投与される任意の薬物または医薬品の安全性を確保するために、発熱原性の汚染を調べて汚染菌によって汚染された個々のロットを同定する必要がある。大量生産の医薬品における発熱物質の汚染を調べるために、動物に基づく２種の薬局方収載の方法、即ちカブトガニアメーバ様細胞溶解物（ＬＡＬ）試験（細菌エンドトキシン試験法（ＢＥＴ）とも呼ばれる）およびウサギ発熱性物質試験が現在ルーチン的に使用されている。
【０００６】
そのウサギ試験は、統計学的に有意の数のウサギに試料化合物を注射することと、試験動物において誘発された体温の平均的上昇を調べることとからなるｉｎ−ｖｉｖｏ試験である。ウサギ試験は、非エンドトキシン性発熱物質を含む幅広い発熱原性の剤に反応するが、ウサギ試験の感度（ｎｇ／ｍＬのエンドトキシン）は他の発熱性物質試験（ＬＡＬ試験についてはｐｇ／ｍＬのエンドトキシン）よりも相対的に低い。更に、化合物に対する発熱反応の種間の相関性はせいぜい近似である。例えば、発熱反応を誘発する細菌エンドトキシンの投与量は、種間で１０，０００倍も異なることが記録されている。相対的な非感受性、不満足な定量的結果、ウサギの種間のばらつき、および動物試験に伴う倫理的問題によって、近年はウサギ試験が不都合なものになっている。
【０００７】
広範囲にわたる発熱物質を検出するウサギ試験とは対照的に、ＬＡＬ試験はエンドトキシンの発熱物質のみを検出する。細菌エンドトキシン、例えばグラム陰性菌の細胞壁由来のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）は、最もよく記載された発熱性化合物の内の１種である（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。それ故、費用および時間がかかるウサギ実験を、細菌エンドトキシンについての直接的なＬＡＬ試験に替えることが一般的に有用であると考えられた。この方法には明らかな限界がある。ＬＡＬ試験は、非常に感受性が高いｉｎ−ｖｉｔｒｏ試験であるが、グラム陰性菌からのエンドトキシンを検出するだけで、単球を更に刺激して発熱サイトカインを形成し得る特定の産物について疑陰性の結果をもたらす。また、ＬＡＬ試験は、例えば、試験物質の高タンパク質レベルによる、あるいはグルカンによる干渉の影響を受けやすい（非特許文献５；非特許文献６）。一方、カブトガニ試験は非常に感度が高いため、産物の質に関連しない不純物のために容易に偽陽性の結果となる傾向がある（非特許文献７）。
【０００８】
従って、高感度、高特異性ならびに広範囲にわたる発熱物質を検出する能力を特徴とする、非動物系の試験系が必要とされていた。この目的と、ヒトの炎症反応についての知識の向上とに伴い、ヒト単球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化に基づく試験系が開発された。約２０年前、研究者は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用して、発熱サイトカインの放出を調べることによってエンドトキシンを検出した（非特許文献８；非特許文献９）。それ以来、ヒトの末梢全血（ＷＢ）、ＰＢＭＣまたは単球細胞株（例えば、ＭＯＮＯＭＡＣ−６（ＭＭ６）（非特許文献１０）またはＴＨＰ−１（非特許文献１１）等を含む、ヒト単球の種々の材料や、発熱サイトカインである腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、ＩＬ−６、ＩＬ−１βおよび非発熱性代謝物のネオプテリン（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）を含む各種の放出物（ｒｅａｄｏｕｔ）を使用した幾つかの種々の試験系が開発されてきた。近年では、ヨーロッパの共同研究であるヒト研究、即ち最も著名な単球活性化試験の内の６つにおいて、上記細胞材料および放出物の種々の各併用が、各種濃度の純粋なエンドトキシンをスパイクされた医療品におけるエンドトキシンを検出する能力について評価された。
【０００９】
６つの試験の内の５つにおいて、細胞は、平底ウェルを有する９６ウェルポリスチレンプレートで培養された（非特許文献１６）。６番目の試験（非特許文献６；Ｆｅｎｎｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＬＴＥＸ，  １９９９；非特許文献１２に基づく）において、ほとんどの評価に底が円錘形のポリスチレン製のエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心チューブ（１．２ｍＬ）が使用され、研究の一部には、その研究に使用されたＥｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｐｙｒｏｇｅｎ  Ｔｅｓｔ（ＩＰＴ）キットの製造業者であるＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによってポリエチレンチューブから丸底のポリプロピレンチューブ（１．５ｍＬ）に取り替えられた。この取り替えが試験に対して重大な影響を及ぼしたとは報告されなかったが、その後、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓが低容量用Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）ＩＰＴを改良した際にポリプロピレンチューブ自体が平底ポリスチレン９６ウエルプレートに取り替えられた。この試験の単球の供給源は全血であり、放出物はＩＬ−１βであった。全血は、種々の濃度のエンドトキシンによってスパイクされた各種薬物とともにインキュベートされた。
【００１０】
ＣａｒｌｉｎおよびＶｉｉｔａｎｅｎは、各種非エンドトキシン性発熱物質、即ちジフテリアトキソイド、百日咳トキソイドおよび破傷風トキソイドを含むグラム陽性抗原およびグラム陰性抗原を含むワクチン、Ｉｎｆａｎｒｉｘの固有の発熱原性を評価するための単球活性化試験を開示し、その試験は単球の供給源としての全血またはＭＯＮＯＭＡＣ−６細胞ならびに放出物としてのＩＬ−６に基づくものである（非特許文献１７）。細胞は、開示されない組成物の無エンドトキシンエッペンドルフＢｉｏ−Ｐｕｒｅグレードチューブ中で低細胞密度で培養された。ワクチンの発熱原性は、その製造または保存の間のワクチンの汚染の結果ではなかった。ＨａｒｔｕｎｇおよびＷｅｎｄｅｌは、純粋な形態におけるエンドトキシン性発熱物質および非エンドトキシン性発熱物質、即ちサルモネラ・アボルトス−エクイ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｅｑｕｉ）に由来するＬＰＳ、ストレプトコッカス発熱物質に由来するストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）およびムラミルジペプチド（ＭＤＰ）を検出するための単球活性化試験を開示し、その試験は単球の供給源としての全血および好ましい放出物としてのＩＬ−１βに基づく（非特許文献１８；特許文献１）。細胞はポリプロピレンチューブ中で培養された。
【００１１】
Ｙａｍａｍｏｔｏ等は、エンドトキシン性発熱物質を検出するための単球活性化試験を開示しており、その試験は単球／単球細胞の供給源としての全血あるいは種々のヒト細胞株（好ましくは２８ＳＣ細胞株）由来の細胞、ならびに好ましい放出物としてのＩＬ−６に基づく（非特許文献１９）。エンドトキシン試験は、エンドトキシンと、非経口薬物、特にインターフェロンとの間の、その薬物がエンドトキシンの発熱原性の作用を増大させるというｉｎ  ｖｉｖｏでの相乗作用の可能性を予測すると言われている。細胞は、純粋形態のエンドトキシン、または純粋形態のエンドトキシンとヒトインターフェロンとの混合物のいずれかとともに培養された。細胞株の細胞は、平底ウェルを有するポリスチレン９６ウエルプレートで培養された。血液細胞は、材料の詳細が不明のチューブ中で培養された。
【００１２】
Ｎａｋａｇａｗａ等は、純粋形態のエンドトキシン性発熱物質および非エンドトキシン性発熱物質、即ち大腸菌Ｏ５５：Ｂ５由来のＬＰＳおよび黄色ブドウ球菌由来の不溶性ペプチドグリカン（ＰＧ）を検出するための単球活性化試験を説明しており、その試験は、単球の供給源としての全血またはＭＭ６−ＣＡ８細胞（ＭＯＮＯＭＡＣ−６のサブクローン）ならびに好ましい放出物としてのＩＬ−６に基づく（非特許文献２０）。ＭＭ６−ＣＡ８細胞は、ポリスチレン９６ウエルプレートで培養された。血液細胞はポリプロピレンチューブで培養され；使用量（血液が２２５μＬ、試験溶液が２５μＬ、生理食塩水が７５０μＬ）のために、標準的９６ウエルプレート（２５０μＬ／ウェル）の使用ができなかった。
【００１３】
最近は、各種供給源において、ポリプロピレンが発熱性物質試験で回避されるべきであることを示す。例えば、ポリプロピレンの表面が疎水性であるため、ＬＰＳのリピドＡ成分と関連した疎水性ドメインによってエンドトキシンがかかる表面上に吸着されるかもしれないことから、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓはポリプロピレンの回避を推奨している（非特許文献２１）。生物学的安全性試験の製造業者であるＨａｒｌａｎ  Ｓｅｒａ−Ｌａｂは、ポリプロピレンチューブがＬＡＬ検定に干渉する可能性があることを示している（非特許文献２２）。そして、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｎｕｒｓｅｓ  ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎならびにＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｒｅｎａｌ  Ｃａｒｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎは、ポリスチレンが通常、エンドトキシンを吸着しないため、エンドトキシン試験にはポリプロピレンを回避してポリスチレンを使用することを推奨した（ＥＤＴＮＡ／ＥＲＣＡ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）。
【特許文献１】米国特許第５，８９１，７２８号明細書
【非特許文献１】Ｍｏｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｂｅｈａｖ．  Ｒｅｖ．，  １９９３，  １７，  ２３７−２６９
【非特許文献２】Ｔｉｌｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｓｙｃｈｏｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  １９９４，  １９，  ２０９−２３２
【非特許文献３】Ｒｏｔｈｗｅｌｌ，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，  １９９４，  ８，  １−１０
【非特許文献４】Ｚｅｉｓｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｔｈ，Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９３，  ２８，  １０６−１０９
【非特許文献５】Ｒｏｓｌａｎｓｋｙ  ａｎｄ  Ｎｏｖｉｔｓｋｙ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １９９１，  ２９，  ２４７７
【非特許文献６】Ｆｅｎｎｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｔａｎｄ．，  １９９９，  １０１，  １３１
【非特許文献７】Ｆｕｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙａｋｕｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ，  １９９０，  １１０，  ３３２−３４０
【非特許文献８】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １９８４，  ２０，  ３２３
【非特許文献９】Ｄｕｆｆ  ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １９８２，  ５２，  ３２３
【非特許文献１０】Ｚｉｅｇｌｅｒ−Ｈｅｉｔｂｒｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  １９８８，  ４１，  ４５６
【非特許文献１１】Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  １９８０，  ２６，  １７１
【非特許文献１２】Ｈａｒｔｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｒｅｐｏｒｔ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＥＣＶＡＭ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ４３，  ２００１，  ２９，  ９９
【非特許文献１３】Ｐｏｏｌｅ  ａｎｄ  Ｇａｉｎｅｓ  Ｄａｓ，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ２００１，  ６，  ６３
【非特許文献１４】Ｐｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２００３，  ２７４，  ２０９
【非特許文献１５】Ｇａｉｎｅｓ  Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２００４，  ２８８，  １６５
【非特許文献１６】Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２００５，  ２９８，  １６１
【非特許文献１７】Ｃａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ｖｉｉｔａｎｅｎ,  Ｐｈａｒｍｅｕｒｏｐａ，  ２００３，  １５，  ３，  ４１８−４２３
【非特許文献１８】Ｈａｒｔｕｎｇ  ａｎｄ  Ｗｅｎｄｅｌ，  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，  １９９６，  ９，  ４，  ３５３−３５９
【非特許文献１９】Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．，  ２００３，  ５６，  ９３−１００
【非特許文献２０】Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２００２，  ９，  ３，  ５８８−５９７
【非特許文献２１】Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｅｎｄｏｓａｆｅ  Ｔｉｍｅｓ，  Ｓｅｐｔ．  ２００４
【非特許文献２２】Ｈａｒｌａｎ  Ｓｅｒａ−Ｌａｂ，  ２００４  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、高感度、高特異性ならびに医療品における広範囲にわたる発熱性の汚染物を検出する能力を特徴とする、非動物系の発熱性物質試験が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の要旨）
出願人らは、感度があり、医療品内に存在する発熱性の汚染物を検出するｉｎ−ｖｉｔｒｏ発熱物質試験を開発している。一般的に、本発明は、ポリプロピレンを含む少なくとも１つの表面を含む第１検定系において、単球、即ち単球含有試薬の形態のものと、試験される試料とを、単球が前記表面に接触するように合わせることによって、試料中の非エンドトキシン性発熱物質を検出する方法に関する。単球および試料は、インキュベーション中に単球がサイトカインまたは炎症反応の内因性メディエーターを産生するようにインキュベートされる。第１検定系の内容物は、サイトカインまたは炎症反応の内因性メディエーターまたはマーカーに対する抗体で処理された少なくとも１つの表面を含む第２検定系へ移される。第２検定系は、前記表面上の抗体に結合したサイトカインまたは内因性メディエーターの存在について検定される。この方法で使用する単球がＰＢＭＣまたは単球細胞株の細胞である場合、単球は高い細胞密度で検定系に存在する。
【００１６】
また、本発明は、ポリプロピレンを含む少なくとも１つの表面を含む第１検定系において、単球含有試薬としての全血と、試験される医療品とを、前記血液が前記表面と接触するように合わせることによって、非経口的投与医療品中の非エンドトキシン性発熱物質を検出する方法に関する。血液および医療品は、インキュベーション中に血液がサイトカインのＩＬ−６を産生するようにインキュベートされる。第１検定系の内容物は、ＩＬ−６に対する抗体で処理した少なくとも１つの表面を含む第２検定系に移される。第２検定系は、前記表面上の抗体に結合したＩＬ−６の存在について検定される。
【００１７】
更に、本発明は、ポリプロピレンを含む少なくとも１つの表面を含む検定系において単球と試験される試料とを単球が前記表面に接触するように合わせることによる非エンドトキシン性発熱物質試験に使用するための単球、即ち単球含有試薬の形態のものを培養する方法に関する。
【００１８】
また、本発明は、平底マイクロタイターのウェルに比べ単球含有試薬が濃縮されるように成形された少なくとも１つのマイクロタイターウェルを含み、前記ウェルの表面がポリプロピレンを含む検定系において、単球が前記表面と接触するように単球と試料とを合わせることによって、非エンドトキシン性発熱物質試験の一部として単球を培養する方法に関する。これらの培養方法に使用される単球が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または単球細胞株の細胞である場合、前記単球は、高い細胞密度で検定系に存在する。
【００１９】
また、本発明は、ポリプロピレンを含む少なくとも１つの表面と、ＩＬ−６に対する抗体で処理した少なくとも１つの表面とを含む検定系において、単球含有試薬としての全血と試験される医療品とを、血液がポリプロピレンを含む表面と接触するように合わせることによって、非経口投与医療品中の非エンドトキシン性発熱物質を検出し、そして表面上の抗体に結合したＩＬ−６の存在について検定系を検定する方法に関する。
【００２０】
本発明は更に、各ウェルに含有される培養培地が、平底マイクロタイターウェルに比べ濃縮されるように成形された複数のマイクロタイターウェルを含み、前記ウェルの表面がポリプロピレンを含むマイクロタイタープレートと、単球が前記ウェルの表面と接触するようにマイクロタイタープレートのウェルに含まれる低温保存された前記単球、即ち低温保存された単球含有試薬とを含む診断キットも提供する。前記キット中の単球が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または単球細胞株の細胞である場合、単球は、高い細胞密度で前記ウェルに存在する。
【００２１】
本発明はまた、非経口投与医療品中の非エンドトキシン性発熱物質を検出するための検定系、即ち各ウェルに含まれる培養培地が、平底マイクロタイターウェルに比べ濃縮されるように成形された複数のマイクロタイターウェルを含み、前記各ウェルの表面がポリプロピレンを含むマイクロタイタープレートと、血液がウェルの表面と接触するようにマイクロタイタープレートのウェルに含まれる低温保存された単球含有試薬としての低温保存された全血と、ＩＬ−６に対する抗体とを含む検定系を含む診断キットも提供する。
【００２２】
本発明の他の目的および特徴は、部分的には明らかであり、部分的には以下で示される。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
試料中の非エンドトキシン性発熱物質を検出する方法であって、
ポリプロピレンを含む少なくとも１つの表面を含む第１検定系において単球含有試薬と試験される試料とを合わせる工程であって、該単球含有試薬が、末梢血単核細胞または単球細胞株細胞を含み、該表面に接触し、高い細胞密度で該検定系に存在する、工程；
該単球含有試薬および該試料をインキュベートする工程であって、該単球含有試薬がサイトカインまたは炎症反応の内因性メディエーターを産生する、工程；
該第１検定系の内容物を、サイトカインまたは炎症反応の内因性メディエーターに対する抗体で処理された少なくとも１つの表面を含む第２検定系へ移す工程；および
該表面上の抗体に結合したサイトカインまたは内因性メディエーターの存在について該第２検定系を検定し、それによって、該表面に結合したサイトカインまたは内因性メディエーターの上昇したレベルにより該試験試料中の発熱物質の存在が示される、工程
を含む、方法。
（項目２）
非経口投与医療品中の非エンドトキシン性発熱物質を検出する方法であって、
ポリプロピレンを含む少なくとも１つの表面を含む第１検定系において単球含有試薬と試験される医療品とを合わせる工程であって、該単球含有試薬が全血を含み、かつ該表面と接触する、工程；
該単球含有試薬および該医療品をインキュベートする工程であって、該単球含有試薬がＩＬ−６を産生する、工程；
該第１検定系の内容物を、ＩＬ−６に対する抗体で処理した少なくとも１つの表面を含む第２検定系へ移す工程；および
該表面上の抗体に結合したＩＬ−６の存在について該第２検定系を検定する工程であって、それによって該表面に結合したＩＬ−６の上昇したレベルにより該試験医療品の発熱物質の存在が示される、工程
を含む、方法。
（項目３）
非経口投与医療品中の非エンドトキシン性発熱物質を検出する方法であって、
ポリプロピレンを含む少なくとも１つの表面と、ＩＬ−６に対する抗体で処理された少なくとも１つの表面とを含む検定系において、単球含有試薬と試験される医療品とを合わせる工程であって、該単球含有試薬が全血を含み、かつポリプロピレンを含む該表面と接触する、工程；および
該表面上の該抗体に結合したＩＬ−６の存在について該検定系を検定する工程であって、それによって、該表面に結合したＩＬ−６の上昇したレベルにより該試験医療品中の発熱物質の存在が示される、工程
を含む、方法。
（項目４）
非エンドトキシン性発熱物質検定に使用するための単球含有試薬内に含まれる細胞を培養する方法であって、
ポリプロピレンを含む少なくとも１つの表面の含む検定系において単球含有試薬と試験される試料とを合わせる工程であって、該単球含有試薬が末梢血単核細胞または単球細胞株の細胞を含み、該表面と接触し、そして高い細胞密度で該検定系に存在する、工程
を含む、方法。
（項目５）
平底マイクロタイターウェルと比較して前記単球含有試薬が濃縮されるように成形された少なくとも１つのマイクロタイターウェルを前記検定系が含み、該ウェルの少なくとも１つの表面がポリプロピレンを含み、そして該単球含有試薬が高い細胞密度でこのようなウェルに存在する、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記第１および第２の検定系の内の少なくとも１つが、少なくとも１つのマイクロタイターウェルを含み、かつ前記表面が前記マイクロタイターウェルの内側の少なくとも一部である、項目１または２に記載の方法。
（項目７）
前記検定系が少なくとも１つのマイクロタイターウェルを含み、かつ前記表面が前記マイクロタイターウェルの内側の少なくとも一部である、項目３または４に記載の方法。
（項目８）
平底マイクロタイターウェルと比較して前記単球含有試薬が濃縮されてより大きな細胞間接触がもたらされるように前記ウェルが成形される、項目５〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記マイクロタイターウェルが、開口頂部、該開口頂部から下方へ伸長する上方領域、および最も低い点の上方の位置から該最も低い点まで直径が先細りになる底壁を含む、項目５〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記マイクロタイターウェルが、開口頂部、上端部および下端部を有する該開口頂部から下方へ伸長する上方領域、ならびに上端部および最も低い点を有する底部領域を含み、該底部領域が、該上方領域の下端部から伸長し、かつ底部領域の上端部から最も低い点に向かって、上方領域よりも急激に直径が先細りになる、項目５〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記マイクロタイターウェルの底壁が、非平面であるか、湾曲しているか、放物線状であるか、若しくは下方へ伸長している、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記マイクロタイターウェルの側面が内側に傾斜している、項目５〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記検定系が、サイトカインに対する抗体で処理された少なくとも１つの表面を含み、かつ該抗体が適用された該表面が、該マイクロタイターウェルの内側の少なくとも一部である、項目５に記載の方法。
（項目１４）
前記抗体が前記炎症反応の内因性メディエーターに対する抗体である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記内因性メディエーターがエンドセリンである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記表面上の前記抗体に結合したサイトカインまたは内因性メディエーターの存在について前記検定系を検定する工程であって、それによって、該表面に結合したサイトカインまたは内因性メディエーターの上昇したレベルにより前記試験試料中の発熱物質の存在が示される、工程も更に含む、項目５に記載の方法。
（項目１７）
前記サイトカインが、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン１ｒａ（ＩＬ−１ｒａ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）からなる群から選択される、項目１、１３または１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記サイトカインがＩＬ−６である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記抗体がポリクローナル抗体である、項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記検定系が比色酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射標識免疫学的検定または蛍光標識免疫学的検定である、項目１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記単球細胞株がヒト単球細胞株を含む、項目１または４〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記単球細胞株がＭＯＮＯＭＡＣ−６、ＴＨＰ−１または２８ＳＣである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記単球細胞株が、内因性ＣＤ１４およびトール様受容体を有する細胞株、あるいはＣＤ１４および／またはトール様受容体および／または炎症性もしくは発熱性メディエーターのレポーター遺伝子がトランスフェクトされた細胞株を含む、項目１および４〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記試料が非経口投与医療品である、項目１および４〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記非経口投与医療品が、血液製剤、透析溶液、ワクチンおよび血漿増量剤からなる群から選択される、項目２、３および２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり少なくとも約２５万、５０万、６０万、７０万、８０万、９０万、１００万、１１０万、１２０万、１３０万、１４０万、１５０万、１６０万、１７０万、１８０万、１９０万または２００万個の細胞の細胞密度で前記検定系に存在する、項目１および４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記末梢血単核細胞がヒト末梢血単核細胞を含む、項目１および４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記単球含有試薬が希釈剤も更に含む、項目２、３、６〜１２、１９〜２１および２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記希釈剤がＲＰＭＩ培地である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記単球含有試薬が抗凝固剤も更に含む、項目２、３、６〜１２、１９〜２１、２６、２９および３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記全血がヒト全血を含む、項目２、３、６〜１２、１９〜２１、２６、および２９〜３１のいずれか１項の方法。
（項目３３）
前記単球含有試薬が、１ウェル当たり約１０万、２０万、２１万、２２万、２３万、２４万、２５万、２６万、２７万、２８万、２９万、３０万、３１万、３２万、３３万、３４万、３５万、３６万、３７万、３８万、３９万または４０万個超の末梢血単核細胞の細胞密度で前記検定系に存在する、項目２、３、６〜１２、１９〜２１、２６および２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
診断キットであって、
各ウェルに含まれる細胞が、平底マイクロタイターウェルと比較して濃縮されるように成形された複数のマイクロタイターウェルを含むマイクロタイタープレートであって、該ウェルの表面がポリプロピレンを含む、マイクロタイタープレート；および
該プレートの該ウェルに含まれる低温保存単球含有試薬であって、該単球含有試薬が低温保存末梢血単核細胞または低温保存単球細胞株の細胞を含み、該ウェルの表面と接触し、かつ高い細胞密度で該ウェルに存在する、低温保存単球含有試薬、
を含む、診断キット。
（項目３５）
非経口投与医療品中の非エンドトキシン性発熱物質を検出するための検定系であって、各ウェルに含まれる細胞が平底マイクロタイターウェルと比較して濃縮されるように成形された複数のマイクロタイターウェルを含むマイクロタイタープレートを含み、該ウェルの表面が、ポリプロピレンを含む、検定系；
該プレートのウェルに含まれる低温保存単球含有試薬であって、該単球含有試薬が、低温保存全血を含み、かつ該ウェルの表面と接触する、低温保存単球含有試薬；および
ＩＬ−６に対する抗体、を含む、診断キット。
（項目３６）
前記ウェルが、単球不透過性である障壁も更に含む、項目３４または３５に記載のキット。
（項目３７）
前記障壁が膜、格子、篩またはシフターを含む、項目３６に記載のキット。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
発熱物質は、血液単球（ならびに他の白血球）およびマクロファージを刺激して、サイトカイン（例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６）等を含む、炎症反応の数多くの内因性発熱メディエーターを産生および放出する。これらの発熱メディエーターが血行中に放出されることによって、罹患者の炎症反応につながる事象のカスケードが誘発される。本発明の単球活性化試験は、炎症反応のマーカーとしてのこれらの内因性発熱物質の測定に依拠する。本発明の好適な実施形態に従って、試料は、ポリプロピレンから成る表面を含む第１検定系中で高い細胞密度で存在する単球含有試薬と共にインキュベートされる。次いで、第１検定系の内容物は、抗サイトカイン抗体をコーティングした表面を含む第２検定系に移され、次いで第２の検定系は、抗体によって前記表面に結合したサイトカインの存在について検定される。
【００２４】
本発明の発熱物質試験を使用して、エンドトキシンだけでなく、非エンドトキシン性発熱物質、即ちグラム陽性菌（例えば黄色ブドウ球菌）またはそれらの成分（例えば、ムロペプチド、リポテイコ酸、エンテロトキシン、ストレプトリシン）、免疫刺激因子（例えば、フィトヘマグルチニンまたはホルボールエステル）が検出される。前記試験は、グラム陰性の細菌エンドトキシンに特異的な反応ではなく、多様な発熱物質に対する単球のサイトカイン反応を利用するため、本発明の試験によって幅広い発熱性剤を検出することができる。
【００２５】
本発明の発熱物質試験は、従来試験よりも、医療品の汚染されたロット中の非エンドトキシン性発熱物質の検出に効果的であることが示されている。本明細書の実施例によって、これらの従来試験が、Ｅｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）腹膜透析液、ヘモグロビンまたはデキストランの陽性対照試料を、同じ非経口投与薬の陰性対照試料から識別ができないことが示される。前記Ｅｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性対照試料は、非エンドトキシン性発熱物質に汚染された産物のロットから得られ；前記汚染されたロットはヒトにおける有害反応の原因となったが、エンドトキシン発熱物質についてのみ試験するＬＡＬ試験によって、発熱物質の存在については陰性を示した（Ｍａｒｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  ３６５（９４５９），  ５８８）。ヘモグロビン陽性対照試料もまた、非エンドトキシン性発熱物質で汚染された産物のロットから得られ；汚染されたロットはウサギにおける発熱反応の原因となったが、ＬＡＬ試験によって、発熱物質の存在については陰性であった。デキストラン陽性対照は、ヒトにおける発熱の原因となることが明らかになったもののＬＡＬ試験によって発熱物質の存在については陰性を示したデキストランの調製物であった。医療品中の非エンドトキシン汚染物質を検出する前記試験の能力は、汚染された医療品のロットを、患者に使用するためにそのロットを放出する前に同定することが可能になるため、大きな価値がある。既知の試験は、上記で考察したように、Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．によって開示される純粋な非エンドトキシンおよびエンドトキシン発熱物質、即ち黄色ブドウ球菌由来のペプチドグリカン（ＰＧ）および大腸菌由来のＬＰＳを検出する状況、あるいは産物のエンドトキシンによるスパイク、即ち上記のようなヒト研究の６つの試験における各種の薬物が種々の濃度のエンドトキシンでスパイクされる状況ではよく機能する。医療品がエンドトキシンで汚染されるならば、ＬＡＬ試験は効果的に機能する（Ｍａｓｃｏｌｉ，  Ｃ．Ｃ．，  Ｗｅａｒｙ，  Ｍ．Ｅ．，  Ｊ  Ｐａｒｅｎｔｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ａｓｓｏｃ．  ２００３，  ３３，  ８１；Ｍａｓｃｏｌｉ，  Ｃ．Ｃ．，  Ｗｅａｒｙ，  Ｍ．Ｅ．，  Ｐｒｏｇ  Ｃｉｌｎ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ．  ２００３，  ２９，  ３８７）。しかし、医療品が非エンドトキシン性発熱物質で汚染される場合、このような試験によって発熱物質を検出することはできない。特定の理論に束縛されることなく、発熱物質の「マスキング」をもたらし、非エンドトキシン汚染物質の検出を不可能にする医療品と、非エンドトキシン性発熱物質が相互作用すると考えられる。
【００２６】
本発明の発熱物質試験は、このマスキング効果に打ち勝つものであって、医療品中の非エンドトキシンの汚染物質を検出することができるものであり、例えば、ＰＢＭＣが丸底ポリプロピレンウェル内で高い細胞密度で培養される好ましい実施形態において、本発明の発熱物質試験は、Ｅｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）溶液およびデキストランの陽性対照試料と陰性対照試料とを区別することができた（図９参照）。試験した入手可能なキットのいずれも、Ｅｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）またはヘモグロビンの陽性対照と陰性対照とを区別することができなかった（図１〜８参照）。また、特定の理論に束縛されずに、細胞密度を高くすることによって、細胞間接触が大きくなる細胞が更に多くなると考えられる。細胞間接触が増加することによって、細胞間のコミュニケーションが更に促進され、それ故に発熱性の汚染物質に対する炎症反応が高まる。細胞は、サイトカイン等の可溶性メディエーターを介して、およびサイトカインも作用し得る細胞間接触を介して互いにコミュニケーションを行う。丸底ウェル、あるいは細胞が濃縮されるように一般的に成形されたウェルにおいては、平底ウェルよりも細胞間接触が大きくなる。そして、ポリプロピレンによって非エンドトキシン性発熱物質の生物学的利用能が増大すると考えられる。また、特定の理論に束縛されることなく、細胞培養において従来使用されるようなポリスチレンプレートの表面処理によって、その表面の疎水性が低下し、細胞の結合が更に可能になるが、その表面によって非エンドトキシン性発熱物質も結合され、中和されると考えられる。ポリプロピレンプレートは、表面処理を行わないため、ポリスチレンプレートよりも疎水性が高いままで、非エンドトキシン性発熱物質が中和される可能性が低くなる。
【００２７】
１．発熱物質試験の成分
上記の３つの要素である高い細胞密度、丸底（あるいは種々の適切な形状）およびポリプロピレンの幾つかの併用、即ち丸底ポリスチレンウェル中に高い細胞密度で存在するＰＢＭＣを特徴とする発熱物質試験によって、医療品中の非エンドトキシン汚染の改良された検出が可能となる。本発明の発熱物質試験を使用して、非エンドトキシンの汚染の存在について、血液製剤、非経口投与用医療品、透析物、ワクチン、静脈注射用溶液ならびに身体または体液に接触する任意の液を含む種々の医療品を試験することができる。
【００２８】
Ａ．サイトカインまたは炎症反応の内因性メディエーター
検出可能な単球含有試薬によって分泌される炎症反応のいずれの内因性メディエーターも、本発明の発熱物質試験に基づいて使用することができる。しかしながら、好ましくはサイトカインまたはエンドセリンマーカーが、本発明の方法による検出が容易であるため使用される。エンドトキシン性発熱物質または非エンドトキシン性発熱物質とともにインキュベートされた全血中の単球は、幾つかの種類のサイトカインを産生することが知られており、そのサイトカインとしては、炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６）、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１ｒａ、ＴＧＦ）、Ｔｈ１（ＩＬ−２、ＩＦＮ、ＩＬ−１２）、Ｔｈ２（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３）、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＰＧＥ２が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に使用される好ましいサイトカインマーカーとしては、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＰＧＥ２が挙げられる。ＩＬ−６が、本発明の検定に特に好ましいサイトカインマーカーである。ＩＬ−６は、比較的短いインキュベーション期間内で検出可能な量が産生されるものである。免疫反応性ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αと異なり、免疫反応性ＩＬ−６は細胞馴化培地／血液中に完全に多量に分泌され、それによってその完全な評価が可能になる。一方で、免疫反応性ＴＮＦαおよびＩＬ−１βは、ほとんど細胞内にとどまり、それによって、細胞透過性に影響を与える試験調製物が、試験において、ＩＬ−６ではなく、放出物としての（免疫反応性）ＴＮＦαまたはＩＬ−１βにより容易に干渉する可能性が高まる（図２および３参照）。しかし、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１βは、本発明におけるサイトカインマーカーとしても使用され得る。ＴＮＦ−αは、単球発熱物質反応において、ＩＬ−６より早期に産生される。従って、ＴＮＦ−αを検定する本発明の実施形態は、ＩＬ−６を検定する実施形態よりも短いインキュベーション時間（約１〜２時間）が使用されるものである。種々の発熱性の汚染は、細胞培養において種々のサイトカイン反応を誘発し得る。それ故、本発明は、それらのサイトカインの分泌の原因となる特定の発熱物質による汚染が医薬製品に起こる可能性が高い場合に、特定のサイトカインの形成を検出するように適合させることができる。
【００２９】
Ｂ．サイトカインまたは内因性メディエーターに対する抗体
一旦検定すべきサイトカインが決定されると、そのサイトカインに対する抗体を本発明に使用するために作製する必要がある。本明細書に参照により完全に組み込まれる米国特許第６，６９６，２６１号の実施例１で説明されるような、厳密な条件下で精製されるポリクローナル抗体は、発熱物質試験においてよく機能する。ポリクローナル抗体が分離される動物の血液は、本来の発熱物質が含まれないものであるため（健康な動物から採取される場合）、発熱物質が含まれない産物を得るための精製の間、発熱物質による原材料の汚染を明瞭に防止する必要がある。米国特許第６，６９６，２６１号の実施例１で説明されたように、発熱物質が含まれない緩衝液および固相をアフィニティクロマトグラフィーカラムにおいて使用して、発熱物質が含まれないポリクローナル抗体を得る。あるいは、ハイブリドーマ培養物由来のモノクローナル抗体を使用することができる。しかし、モノクローナル抗体を使用する際には、注意して、ハイブリドーマ細胞の培養物中に存在し得る任意の夾雑の発熱物質から抗体を分離する必要がある。
【００３０】
本発明に使用するために、サイトカインに対する抗体は、検定系における表面に適用される。マイクロタイターウェル等の検定系における表面上に抗体を結合するためのコーティング等の方法は、生化学的技術においてよく知られている。多くの検定系は商業的に入手可能であり、製造業者は、通常、前記系の表面上に抗体をコーティングするための材料および説明書を提供する。読み取りが容易であり、かつ試料の必要量が小さいため、ウェルの内面の一部が抗体によってコーティングされたマイクロタイターウェルが本発明の好ましい実施形態において使用される。完全に本発明の利益を利用するために、前記マイクロタイターウェルは、ウェルのアレイが自動免疫学的検定プレート読取装置で読み取られ得るように位置された同様のウェルのプレーナーアレイであるマイクロタイタープレートの一部であることが好ましい（本明細書に参照により組み込まれる米国特許第５，２８１，５４０号参照）。ＥＬＩＳＡプレートリーダー等の自動装置（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｉｎｃ．から入手可能なｔｈｅ  Ｕｌｔｒａｍａｒｋ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）によって、検定評価プロセスは自動化され、１試験当たりの費用が大きく低下する。所望により、マイクロタイターウェルプレートは、（もしそれ自体がまだ供給されていないならば）発熱物質が含まれない緩衝液で大量に洗浄することによって発熱物質が含まれないようにすることができる。本発明の特に好ましい実施形態において、抗ＩＬ−６ポリクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコーティングされる。しかし、他のイムノ診断試験のフォーマット（例えば、ディップスティックまたはビーズに抗体がコーティングされるもの）は、本発明の使用に許容され得る。
「捕捉」抗体に加えて、サイトカインの検定に使用される他の抗体および試薬は、本発明用のマイクロタイタープレート系を作製する際に添加してよい。例えば、捕捉抗体がマイクロタイタープレートに添加された後、プレートの残留結合部位を別のタンパク質で「遮断」することができる。遮断後、保護グレージング化合物とともに標識検出抗体（例えばビオチン化抗体または酵素標識抗体）をマイクロタイタープレートに添加することができる。従って、下記のように試料をマイクロタイターウェルでインキュベートする際、放出されたサイトカインは、試料のインキュベーション期間の間にウェルに結合して同時に検出抗体によって標識された捕捉抗体によって標識される。
【００３１】
Ｃ．単球含有試薬
本発明の発熱物質試験の第１段階として、単球含有試薬中に含有される細胞は、検定系において単球含有試薬と試験される試料とを合わせることによって培養される。本発明の単球含有試薬は、ＰＢＭＣ、単球細胞株の細胞、全血あるいは炎症誘発性剤および発熱性剤に対する反応の媒介に関与するトール様受容体（ＴＬＲ）を発現するか若しくは発現を行わせることができる細胞株（その受容体が誘導またはクローン形成された細胞が包含される）からなる群から選択される。好ましくは、単球細胞株は、ＭＯＮＯＭＡＣ−６（ＭＭ６）、ＴＨＰ−１および２８ＳＣからなる群から選択される。単球含有試薬中の単球は、好ましくは、試験される産物が投与されるべき同じ種に由来する単球である（即ち、医薬品についてはヒト；獣医学的産物についてはネコ、イヌ、ウマ等）。しかし、所望の発熱物質反応度を有する他の種に由来する単球も使用することができる。ある種の好ましい実施形態において、単球含有試薬はＰＢＭＣを含む。
【００３２】
本発明の一実施形態において、単球含有試薬は全血であって、検定系は、単球含有試薬が表面と接触するように、ポリプロピレンを含む少なくとも１つの表面を含む。
【００３３】
別の一実施形態において、単球含有試薬は高い細胞密度で存在するＰＢＭＣであって、検定系は、ＰＢＭＣと接触するポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレンまたは別の同様の材料を含む少なくとも１つの表面を含む。
【００３４】
単球含有試薬がＰＢＭＣまたは細胞株の細胞である場合、上記で詳細に説明したように、前記試薬は高い細胞密度で検定系に存在して、より大きな細胞間接触が促進される。ある実施形態において、単球含有試薬は、検定系に、１ウェル当たり少なくとも約１２万５千個の細胞の１ウェルあたりの細胞密度で、１ウェル当たり少なくとも約２５万、５０万、６０万、７０万、８０万、９０万、１００万、１１０万、１２０万、１３０万、１４０万、１５０万、１６０万、１７０万、１８０万、１９０万または２００万個の細胞の１ウェルあたりの細胞密度で存在する。当業者は、ウェル内の細胞を適切に維持するのに不十分な細胞栄養物質がウェル中の試薬体積に存在する場合、最大細胞密度を超過しているということを認識するであろう。
【００３５】
単球含有試薬が全血である場合、前記試薬は、ＰＢＭＣまたは細胞株の細胞より低い細胞密度で検定系に存在する。単球含有試薬が血液である、ある実施形態において、前記試薬は、検定系に、１ウェル当たり少なくとも約１０万個の末梢血単核細胞の細胞密度で、１ウェル当たり少なくとも約２０万個、２１万、２２万、２３万、２４万、２５万、２６万、２７万、２８万、２９万、３０万、３１万、３２万、３３万、３４万、３５万、３６万、３７万、３８万、３９万または４０万個のＰＢＭＣの細胞密度で存在する。特定の理論に束縛されることなく、単球はその自然的な環境において存在し、かつ発熱物質に対するその反応に影響を及ぼし得る全ての血清成分が溶液に存在するため、ＰＢＭＣまたは細胞株の細胞よりも低い細胞密度で全血を使用することができると考えられる。更に、単球含有試薬が全血を含む場合、発熱物質試験に使用される放出物はＩＬ−６である。
【００３６】
好ましくは、血液が単球含有試薬として使用される場合、血液は新しいものであるか、２４時間未満のもの、およびより好ましくは４時間未満のものである。また、全血が使用される場合、血液凝固を遅延または防止するために抗凝固剤を含むことができ；適切な抗凝固剤としては、クエン酸塩（例えば、終濃度が０．３８％）、ヘパリン（ヘパリン酸ナトリウム）またはフラグミン（低分子量ヘパリン）が挙げられる。抗凝固性の添加剤は、試験試料中の発熱物質に対する単球の反応に影響を及ぼすことなく使用することができる。また、全血は、適切な緩衝液または他の希釈剤（例えば、ＲＰＭＩ細胞培地または生理的食塩水）で希釈することができる。全血は、好ましくはインキュベーションにおける最終量の少なくとも５０％に、より好ましくは約５％〜約２５％に、そしてより好ましくは約２０％に希釈される（米国特許第６，６９６，２６１号の図１参照）。全血を希釈することによって、大部分のドナーのＩＬ−６応答曲線を、より広範囲の発熱物質汚染濃度の定量化に使用され得る小さい範囲内とすることができる（米国特許第６，６９６，２６１号の図３参照）。
【００３７】
２．２つの検定系
本発明のある実施形態において、単球含有試薬とともに行う試料のインキュベーションの工程と、単球含有試薬によって産生されたサイトカインの捕捉の工程とが２つの異なる検定容器系で行われるように、発熱性試験を２つの検定容器系で実施する。インキュベーション工程は、上記の培養工程の後に行い、単球含有試薬（例えばＰＢＭＣ）とともに行う試験試料のインキュベーションは、培養工程と同じ検定系において実施される。本発明の発熱物質試験に使用される最適インキュベーション時間は、検定条件、即ち検定されるサイトカインによって変化する。例えば、全血がエンドトキシンとともにインキュベートされ、かつ放出物がＩＬ−６である場合、インキュベーション後６時間で単球含有試薬によってほんのわずかなサイトカインが更に産生するが；インキュベーションの４時間後には、十分な量のＩＬ−６が試薬によって分泌されて発熱物質の汚染物の定量化が可能になる。全血が非エンドトキシン性発熱物質とともにインキュベートされ、かつ任意の放出物が使用される場合、インキュベーションの約１６〜２４時間後には十分な量のＩＬ−６が試薬によって分泌されて発熱物質の汚染物の定量化が可能になる。ＩＬ−６産生を検定する本発明の実施形態においては、約６〜約２４時間、より好ましくは約１２〜約２４時間、最も好ましくは約１６〜約２４時間のインキュベーション時間が好ましい。別のサイトカインを検定する場合、インキュベーション期間は、その特定のサイトカインの産生について最適化するべきである。このような最適化は当業者の能力の範囲内である。検定すべきサイトカインが単球によって放出されない場合は、凍結融解によって、あるいは抗体に対するリガンドの結合を阻害しない濃度でインキュベーション期間の終了の時点に洗浄剤を添加することによって、細胞を溶解することができる。
【００３８】
一旦インキュベーション工程が完了すると、検定系（第１検定系）の内容物、即ち単球含有試薬および試験試料が、サイトカインまたは炎症反応の内因性メディエーター（例えばエンドセリン）に対する抗体で処理した少なくとも１つの表面を含む第２検定系へ移される。第２検定系は、抗サイトカイン抗体または抗内因性メディエーター抗体をコーティングした表面上のサイトカインまたは内因性メディエーターの存在について検定される。好ましくは、抗体がコーティングされた表面が結合サイトカインについて検定される前の工程におけるあらゆる時点で、厳密な無菌条件が維持される。捕捉抗体でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートが本発明の実施形態として使用される場合、前記プレートを洗浄し、次いで酵素と結合した第２抗サイトカイン抗体をＥＬＩＳＡプレートに添加する（ただし、第２の標識された「検出」抗体は、グレージング前または第１検定系の内容物とともに、最初に前記プレートに添加した場合を除いて）。ＥＬＩＳＡプレートを再度洗浄し、次いでＥＬＩＳＡプレートに基質を添加して着色する。短いインキュベーション時間の後、反応を終了させ、次いで溶液の光学濃度をＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定する。このプロセスは、米国特許第６，６９６，２６１号の実施例２に更に記載される。あるいは、酵素によらない免疫学的検定手法を使用することができる。例えば、「サンドイッチ」免疫学的検定の第２抗体を、蛍光部分または放射性同位体によって標識することができる。洗浄後、ウェル内に存在する蛍光または放射線の量を検出することによって、ウェル内に捕捉されたサイトカインの量を定量することができる。幾つかの酵素に基づく検定系および酵素に基づかない検定系は、商業的に入手可能であり、本発明に使用するために当業者によって容易に改良され得る。
【００３９】
３．１つの検定系
本発明のある実施形態において、発熱性試験は、単球含有試薬とともに行う試料のインキュベーション工程と、単球含有試薬によって産生されたサイトカインの捕捉工程とが同一の容器系で行われるように、１つの検定容器系において実施される。検定系は、ポリプロピレンを含む少なくとも１つの表面と、サイトカインまたは炎症反応の内因性メディエーターに対する抗体で処理された少なくとも１つの表面とを含む。インキュベーション工程は、上記の培養工程の後で、培養工程と同じ検定系において実施される。上記の通り、２つの検定容器系の状況において、本発明の発熱物質試験に使用される最適インキュベーション時間は、検定条件、即ち検定されるサイトカインによって変化する。一般的に、２つの検定容器系に関して考察されるインキュベーション工程に関する教示は、同様に１つの検定容器系にもあてはまる。インキュベーション期間は、特定のサイトカインの産生について最適化されるべきであり、このような最適化は当業者の能力の範囲内である。検定すべきサイトカインが単球によって放出されない場合は、凍結融解によって、あるいは抗体に対するリガンドの結合を阻害しない濃度でインキュベーション期間の終了の時点に洗浄剤を添加することによって、細胞を溶解することができる。
【００４０】
一旦インキュベーション工程が完了すると、サイトカインまたは炎症反応の内因性メディエーター（例えばエンドセリン）に対する抗体で処理した少なくとも１つの表面を含む検定系は、抗サイトカイン抗体または抗内因性メディエーター抗体をコーティングした表面上のサイトカインまたは内因性メディエーターの存在について検定される。好ましくは、抗体がコーティングされた表面が結合サイトカインについて検定される前の工程におけるあらゆる時点で、厳密な無菌条件が維持される。一般的に、２つの検定容器系の検定工程に関する考察、即ちＥＬＩＳＡプレートおよび酵素によらない免疫学的検定手法の考察は、１つの検定容器系にもあてはまる。
【００４１】
一般的に、１つの検定容器系および２つの検定容器系は、区別なく使用される。
【００４２】
４．検定容器
本発明の検定系は、単球含有試薬に接触する少なくとも１つの表面を含む。本発明のある実施形態において、前記検定系は少なくとも１つのマイクロタイターウェルを含み、前記表面はマイクロタイターウェルの内側の少なくとも一部である。特定の一実施形態においては、マイクロタイターウェルの表面がポリプロピレンコーティングを含むか、若しくはマイクロタイターウェル全体がポリプロピレンから構成される。検定系がサイトカインまたは炎症反応の内因性メディエーターに対する抗体で処理された少なくとも１つの表面を含むある実施形態において、抗体が適用される表面は、マイクロタイターウェルの内側の少なくとも一部である。好ましくは、前記マイクロタイターウェルは、平底マイクロタイターウェルよりも単球含有試薬が濃縮されるように成形される。
【００４３】
ある実施形態において、マイクロタイターウェルは、開口頂部、開口頂部から下方へ伸長する上方領域、および最も低い点の上方の場所から最も低い点に向かって直径が先細りになる底壁を含む。
【００４４】
ある実施形態において、マイクロタイターウェルは、開口頂部、上端部および下端部を有する開口頂部から下方へ伸長する上方領域、ならびに上端部および最も低い先端を有する底部領域を含み、該底部領域は、上方領域の下端部から伸長し、かつ底部の上端部から最も低い先端に向かって、上方領域よりも急激に直径が先細りになる。
【００４５】
ある実施形態において、前記マイクロタイターウェルの底壁は、非平面であり、好ましくは湾曲しており、場合によっては放物線状である。ある種の特定の実施形態において、前記底壁が下方へ伸長しているか、若しくはマイクロタイターウェルの側面が内側に傾斜している。
【００４６】
５．診断キット
上記の実施形態のいずれか１つは、発熱物質試験を実施するための診断キットに組み込まれ得る。前記キットを使用して、グラム陽性菌（例えば黄色ブドウ球菌）またはそれらの成分（例えばムロペプチド、リポテイコ酸、エンテロトキシン、ストレプトリシン）、またはそれらの構成要素（例えばムロペプチド、リポタイコ酸、エンテロトキシン、ストレプトリジン）等を含む、種々の非エンドトキシン性発熱物質、ならびに血液製剤または他の非経口投与薬（例えば透析物、ワクチンおよび静脈注射用溶液）を含む、種々の医療品におけるエンドトキシン発熱物質を検出する。一般的に、このようなキットは、各ウェルに含まれる培養培地が平底マイクロタイターウェルよりも濃縮されるように成形された複数のマイクロタイターウェルを含むマイクロタイタープレートを含むものであって、前記ウェルはポリプロピレンを含む少なくとも１つの表面を含む。マイクロタイタープレートのウェルは、ウェルの表面と接触する低温保存された全血、低温保存された末梢血単核細胞または低温保存された単球細胞株細胞を含む低温保存された単球含有試薬を含む。ある実施形態において、マイクロタイタープレートのウェルはポリプロピレンを含む。低温保存された単球含有試薬が低温保存された末梢血単核細胞または低温保存された単球細胞株の細胞を含む場合、前記試薬は、高い細胞密度でウェルに存在する。また、単球含有試薬として低温保存された全血を含むキットは、ＩＬ−６が好ましい放出物である場合にＩＬ−６に対する抗体を含む。
【００４７】
特定の実施形態において、前記ウェルは、単球に対して不透過性の障壁を含む。前記障壁は、発熱性物質を含まない材料で構成された少なくとも１つの表面を含み、典型的には膜、格子、篩またはシフターである。前記障壁は好ましくは無菌である。マイクロタイタープレート用の適切な障壁の物質は、本技術分野で知られている。液に対して透過性を有する障壁によって、ウェルから除去することなく低温保存された細胞を洗浄することが可能になり；低温保存された細胞を浸して保存剤として作用するジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、それが試験を妨げないように除去することができる。試験試料は、障壁の上方で添加され、障壁を透過し、障壁の下で細胞と接触し、そして場合によっては潜在的にこれらの細胞を刺激してサイトカインを産生する。細胞によって放出されたサイトカインは、障壁の上方で培地中に拡散する。典型的には、障壁の上下の溶液は、その溶液を吸引することによって完全に混合される。その後、障壁の上方から得られたよく混合された培地の１つのアリコートが、サイトカインまたは炎症反応の内因性メディエーターの存在について検定される。
【００４８】
６．サイトカイン産生データの解釈
Ａ．標準曲線法
本発明の発熱物質試験において作製されたサイトカイン産生データを適切に解釈するために、ＵＳＰエンドトキシン標準品とともに単球含有試薬をインキュベートすることによってエンドトキシン標準曲線が作製される。この目的は、既知の発熱物質において認められた反応に関して試験試料について測定されたサイトカイン産生反応を定量することである。標準曲線は、標準的最良適合データ解析ソフトウェアを利用することによって、エンドトキシン標準品の有意に変化する濃度とともに作製される任意の統計学的に有意な数のデータ点から作製され得る。このような標準曲線を作製する方法は、一般的に本技術分野で知られている。出願人は、標準曲線を作製するために１０、４、１、０．２５、０．０６、０．０３および０ＥＵ／ｍＬのエンドトキシンのデータ点が適切であるが、同様の範囲にわたる任意の統計学的に有意の数の濃度であれば適切であるということを見出している。一旦標準曲線が作製されると、標準曲線を使用して非エンドトキシン当量濃度（エンドトキシン単位−当量で定量される）をサイトカイン反応から内挿することができる。全血に基づく単球含有試薬の反応はドナーによって大きく異なり得るため、単球含有試薬の特定のロットによって実施される各セットの検定について標準曲線を作製することが重要である。しかしながら、本発明の好ましいＥＬＩＳＡプレートの実施形態は非常に少量のヒト血液（約４０μＬ／ウェル）を利用するため、数百ウェルに対して単一単位の提供血液が使用され得る。ＵＳＰエンドトキシンを使用して作製される標準曲線は、エンドトキシン単位（ＥＵ：ＵＳＰ／ＦＤＡによって定義されるもので、ＷＨＯによって定義される国際単位であるＩＵと同じ）に関するデータの正規化に役立つものであり、それはエンドトキシン／発熱物質の汚染を表すための業界標準である。
【００４９】
Ｂ．基準ロット法
あるいは、本発明の発熱物質試験において作製されるサイトカイン産生データは、産物の試験ロットによって誘発されるサイトカイン反応を、産物の基準ロット、即ち汚染された基準ロットおよび汚されていない基準ロットによって誘発されたサイトカイン反応と比較することによって解釈することができる。第１に、医療品の２つの基準ロットが同定される。基準ロットは発熱物質が試験され、これらのロットによって誘発されるサイトカイン反応が測定される。次いで、試験ロットは発熱物質が試験され、これらのロットから誘発される反応が基準ロットの反応と比較される。一般的に、試験ロットは、汚染された基準ロットよりも誘発する反応が低く、かつ誘発する反応が汚染されていない基準ロットと同様である場合、汚染されていないとみなされる。各試験ロットは、一回または数回試験され得る。例えば、ある基準ロット法によれば、産物が、４人のドナーの内の４人または８人のドナーの内の７人において、汚染されていない基準ロットの２倍以下のＩＬ−６の放出を誘発した場合、それは汚染されていないとみなされた。その試験は、異なる４人のドナーの血液を使用して４つ組実施された。好ましい基準ロット法は、Ｇａｉｎｅｓ−Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）に記載されており、そこでは、試験試料には、基準よりも少ないＩＬ−６の放出を刺激することが必要とされる。その論文において、試験調製物には、異なる４人のドナーからＰＢＭＮＣによる試験にパスすることが必要とされる。試験調製物が４人のドナーの内の３人からのＰＢＭＮＣによる試験にパスする場合、第１の試験でＰＢＭＮＣを提供しなかった更なる４人のドナーからのＰＢＭＮＣによって試験を継続し、そして試験調製物には、異なる８人のドナーの内の７人からのＰＢＭＮＣによる試験にパスすることが必要とされる。
【００５０】
好都合なことに、本発明の単球活性化試験は、医療品（例えば血液製剤、静脈注射用溶液およびワクチン）中の非エンドトキシン性発熱物質を含む多種多様な発熱物質の存在を検出することがより優れて可能である。
【００５１】
定義
本明細書で使用される場合、「純粋な」エンドトキシン性発熱物質または非エンドトキシン性発熱物質あるいは「純粋形態」の発熱物質という用語は、結合したタンパク質を取り除いたエンドトキシンをいう。また、純粋なエンドトキシンは、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）としても知られている。
【００５２】
「単球含有試薬」という用語は、免疫系の単核白血球細胞の任意の溶液を意味する。好ましくは、これらの細胞は、試験中の産物が投与されることになっている生物に由来する（即ち、医薬についてはヒト、獣医学的産物についてはネコ、イヌ、ウマ等）。単球含有試薬の例としては、ヒト全血がある。
【００５３】
「検定系」という用語は、単球活性化試験に使用され得る任意の容器および表面を意味し、それには、細胞が試験試料とともに培養およびインキュベートされる容器、ならびに免疫学的検定に使用され得る結合抗体を有する容器および表面を意味する。好ましくは、免疫学的検定の実施に関して、このような容器は、ウェルにおける表面に結合した抗体を有するマイクロタイターウェルプレートであり、そこでは多数の比色酵素結合免疫学的検定を同時に実施することができ、そしてＥＬＩＳＡプレート読取装置によってそれを自動的に評価することができる。しかし、他の免疫学的検定系、特にコーティング表面が必ずしも容器の壁の一部である必要がないものが想定されている。例えば、抗体によってコーティングされたポリスチレンビーズまたはディップスティックを含むより大きな試験チューブを本発明において使用することができる。
【００５４】
「単球細胞株」という用語には、内因性ＣＤ１４および／またはトール様受容体（ＴＬＲ）を有する任意の細胞株、あるいはＣＤ１４および／またはＴＬＲおよび／または炎症性／発熱性のメディエーターのレポーター遺伝子でトランスフェクションされた任意の細胞株が包含される。細胞株は、単球に存在する「発熱物質受容体」の成分を有するかまたはそれによってトランスフェクションされたものであるならば、単球である必要はなく；これらの成分としては、ＴＬＲおよびＣＤ１４が挙げられる。例えば、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞は、すでに大部分のＴＬＲを有しており、そしてそれが有さないＴＬＲ（ＴＬＲ２およびＴＬＲ４）およびＣＤ１４によって安定してそれをトランスフェクションして、十分に単球様にして本発明の方法において機能させることができる。
【実施例】
【００５５】
（実施例１）
ＰＢＭＣの調製。Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ、番号１７−１４４０−０２）を使用する密度勾配遠心分離法によって、４時間齢以下のヒトのヘパリン化末梢血からＰＢＭＣを分離した。前記細胞を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ、番号１４１９０）によって２回洗浄し、最小必須培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉａ）（ＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ、番号１１０９０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、番号１５６３０）およびドナー自身の５μＬの熱失活させた血漿（即ち２％の終濃度）で再懸濁した。ＰＢＭＣを必要な細胞密度（１ｍＬ当たり８００万、４００万、２００万および１００万個のＰＢＭＣ）に希釈した。
【００５６】
細胞培養。以下のマイクロタイタープレート：Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、番号３７９０、番号３３５９で細胞培養を４つ組実施した。各ウェルに１００万、５０万、２５万または１３万個の細胞を含む１２５μＬの細胞懸濁液を添加し、その後１２５μＬの試験試料またはエンドトキシン標準品（０．００６４〜２０ＥＵ／ｍＬ）を添加した。前記２５０μＬの混合物をゆるやかに混合し、次いで３７±１℃、５％ＣＯ２および加湿空気でインキュベートした。培養時間は１６〜２４時間であった。その後、培養液のアリコートを得て、１：２および１：５０に希釈し、ＩＬ−６について検定した。
【００５７】
ＩＬ−６についてのＥＬＩＳＡ。２〜８℃のインキュベーションを終夜行うことによって、９６ウエルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４，  Ｄｙｎｅｘ、番号０１１−０１０−３８５５）を１５０μＬの３μｇ／ｍＬマウスモノクローナルＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、番号ＭＡＢ２０６、重炭酸塩緩衝液中に溶解されたもの、ｐＨ９．５）でコーティングした。３００μＬの洗浄緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で前記プレートを３回洗浄した。２００μＬのブロッキング溶液（０．０２  ｇ／Ｌ  ウシ血清アルブミン、フラクション  Ｖ、プロテアーゼフリー）を添加することによってプレート上の非特異的結合部位を遮断した。３００μＬの同じ洗浄緩衝液で前記プレートを再度３回洗浄し、次いで１００μＬの試料（既に試料希釈剤中で１：２および１：５０で希釈されたもの）または標準品（ＩＬ−６についての７．８〜１０００ｐｇ／ｍＬのＷＨＯ国際標準品（番号８９／５４８））を各ウェルに添加した。１００μＬの試料希釈剤を各未使用ウェルに添加した。プレートをシーラー（Ｆａｌｃｏｎ、番号３０７３）でカバーし、次いで１時間±５分間振りまぜながら（約３００ｒｐｍ）インキュベートした。
【００５８】
次いで前記プレートを吸引して、３００μＬの洗浄緩衝液で５回洗浄した。次いで、１００μＬの０．２μｇ／ｍＬビオチン化ヤギ抗ヒトＩＬ−６抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、番号ＢＡＦ２０６）を各ウェルに添加し、前記プレートをシーラーで再度カバーして、１時間±５分間振りまぜながら（約３００ｒｐｍ）インキュベートした。
【００５９】
次いで前記プレートを吸引して、３００μＬの洗浄緩衝液で５回洗浄した。次いで、１００μＬの０．０２μｇ／ｍＬアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、番号Ｓ０００−０５）を各ウェルに添加して、前記プレートをシーラーで再度カバーして、１時間±５分間振りまぜながら（約３００ｒｐｍ）インキュベートした。
【００６０】
次いでプレートを吸引して、３００μＬの洗浄緩衝液で５回洗浄した。次いで、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含むジエタノールアミン緩衝液中の２００μＬの１ｍｇ／ｍＬ  ｐＮＰＰを各ウェルに添加した。前記プレートをシーラーで再度カバーして、ＩＬ−６標準曲線（１０００ｐｇ／ｍＬ）の最大濃度が４０５ｎｍで約２．５から３．０の間の光学濃度を有するまで、室温で振りまぜながら（約３００ｒｐｍ）インキュベートし、その光学濃度を有する時点で、各ウェルに５０μＬの２ＭのＮａＯＨを添加することによって反応を停止した。４０５ｎｍに設定されたマイクロプレートリーダーを使用して、反応が停止して３０分以内に各ウェルの光学濃度を測定した。
【００６１】
図１は、エンドトキシン標準品（１ＥＵ／ｍＬ）およびＥｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性対照に対するＩＬ−６反応に対する細胞密度の作用を示す。Ｅｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性対照は、非エンドトキシン性発熱物質で汚染され、この薬物のこのロットのヒトのレシピエントにおける有害薬物反応の原因となったが、ＬＡＬ試験（Ｍａｒｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５））においては陰性反応であった。値は、４つの繰り返されたウェルの平均の平均値±標準誤差である。１ウェル当たり２５万〜１００万個のＰＢＭＣの細胞密度において、１ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン標準品に同様の反応が示された。陽性対照試料が最も検出されたのは１ウェル当たり１００万個の細胞の使用であり、次いで５０万個、その次に２５万個、更に１３万個の細胞の使用が続いた。
【００６２】
（実施例２−発熱物質試験の比較）
現在の水準の技術として本明細書に記載される方法を繰り返した。これらの方法のいずれにおいても、Ｅｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）透析溶液、ヘモグロビンおよび／またはデキストランについての陽性産物対照は、陰性産物対照と区別されなかった。
【００６３】
平底ウェルを含むポリスチレンマイクロタイタープレートおよびＩＬ−６放出物を使用して、Ｈｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）の検定をその中で記載された通りに繰り返した。単球含有試薬を低い細胞密度で使用したが、それはそれぞれ図２〜５における全血（１ウェル当たり７５０００個の細胞）、ＰＢＭＣ（１ウェル当たり１０万個の細胞）、ＭＯＮＯＭＡＣ６（１ウェル当たり２５万個の細胞）またはＴＨＰ−１（１ウェル当たり２５万個の細胞）であった。なお、ＩＬ−６は内因性発熱物質（ネオプテリンとは対照的）であり、本発明の方法においてより頑健性のある放出物であるため、図５ではネオプテリンの代わりにＩＬ−６放出物を使用したことに留意されたい。図６においては、単球含有試薬として低い細胞密度（１ウェル当たり２５万個の細胞）のＴＨＰ−１２Ａ９細胞を使用し、ＴＮＦが放出物であった。
【００６４】
単球含有試薬として１ｍＬ当たり１００万個のＭＯＮＯＭＡＣ−ＣＡ８クローン細胞、ＩＬ−６放出物および平底ウェルを有するポリスチレンマイクロタイタープレートを使用して、Ｎａｋａｇａｗａ等の検定をその中で記載される通りに繰り返した。図７を参照されたい。
【００６５】
単球含有試薬として１ｍＬ当たり１００万個の２８Ｃ細胞、ＩＬ−６放出物および平底ウェルを有するポリスチレンマイクロタイタープレートを使用して、Ｙａｍａｍｏｔｏ等の検定をその中で記載される通りに繰り返した。図８を参照されたい。しかしながら、インターフェロンγによってはエンドトキシン標準品に対する用量反応曲線を得ることができなかったため、インターフェロンγの代わりにカルシトリオール（１００ｎｇ／ｎＬ）で２８Ｃ細胞の刺激を行った。
【００６６】
（実施例３−本発明の発熱物質試験）
９６ウェル丸底ポリプロピレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ、番号３７９０、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，ＵＳＡ）で、２０％ヒト全血（４０μＬ＝約６万ＰＢＭＣ／ウェル＝約３０万ＰＢＭＣ／ｍＬ）の培養（２００μＬ）を４つ組実施した。１ウェル当たりの添加物は以下の通りであった：ＭＥＭ−ＨＥＰＥＳ（６０μＬ）、単一ドナーからの血液（４０μＬ）、ＭＥＭ−ＨＥＰＥＳと１：１で希釈したエンドトキシン標準品またはＥｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）試料（１００μＬ、即ちＥｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）溶液がウェル内に１：４の最終希釈度であった）。ウェルの含有物を穏やかにかきまぜる（ウェルをクロス汚染することなく）ことによって混合し、大気中５％のＣＯ２の雰囲気中で１６〜２４時間、３７℃で振動させずに（細胞の沈降を可能にするため）インキュベートした。組織培養インキュベーション終了時点で、ＥＬＩＳＡによるＩＬ−６の検定のために、各ウェルから透明な上澄液の１００μＬのアリコートを採取した。
【００６７】
デキストラン試料に使用した手順は、実施例１で上記されたものと同様であった。細胞の分離および培養は、細胞密度が１ウェル当たり４０万個の細胞であり、ＥＬＩＳＡで使用された試料希釈度が１：１０であったことを除いて同様であった。ＩＬ−６のＥＬＩＳＡは、Ｃｌｏｎｅ１６モノクローナル抗体（ＩＬ−６の捕捉用）でコーティングされたプレートと、検出抗体としての西洋ワサビペルオキシダーゼに結合するヒツジポリクローナル抗体とが使用されたという点で異なっていた。ＥＬＩＳＡは、Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ
ａｌ．，ｐａｐｅｒ（２００５）に記載されるように、全血／ＩＬ−６試験（ＮＩＢＳＣ）およびＰＢＭＣ／ＩＬ−６試験（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）において使用される。
【００６８】
図９は、Ｅｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陰性対照試料およびＥｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性対照試料について、ならびにデキストラン陰性対照試料およびデキストラン陽性対照試料についての比較結果を示す。本発明の発熱物質試験においては、これらの陽性対照と陰性対照との間が容易に区別し得ることを認めることができる。上記のプロトコルに従って、単一ドナーからの血液を用いて試験を４つ組実施した。値は、４つの繰り返されたウェルの平均の平均値±標準誤差である。
【００６９】
図１０は、Ｅｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陰性対照試料およびＥｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性対照試料についての比較結果を示す。本発明の発熱物質試験においては、これらの陽性対照と陰性対照との間が容易に区別し得ることを認めることができる。上記のプロトコルに従って、単一ドナーからの血液を用いて試験を４つ組実施した。値は、４つの繰り返されたウェルの平均の平均値±標準誤差である。なお、全血が単球含有試薬であり、丸底ポリプロピレンウェルが使用された場合、陰性Ｅｘｔｒａｎｅａｌ対照から陽性対照を区別するのに低い細胞密度で十分であったことに留意されたい。
【００７０】
（実施例４−本発明の発熱物質試験：単一ドナーにおけるポリプロピレンプレート対ポリスチレンプレートおよびＩＬ−６対ＩＬ−１βの比較結果）
１ウェル当たり１００万個の細胞の細胞密度が使用され、幾つかの試料がＩＬ−１β放出物に供され、幾つかの試料が平底ウェルを有するポリスチレンマイクロタイタープレートに配置されたことを除いて、試験試料を実施例１の方法に従って調製した。図１１Ａは、ポリプロピレンプレート内で実施された試験において陽性対照に対するＩＬ−６反応は陰性対照から明確に区別されたが、ポリスチレンプレートにおけるこれらについては区別されなかったことを示す。値は、４つの繰り返されたウェルの平均の平均値±標準誤差である。図１１Ｂは、ポリプロピレンプレート内で実施された試験において陽性対照に対するＩＬ−１β反応は陰性対照から明確に区別されたが、ポリスチレンプレートにおけるこれらについては区別されなかったことを示す。しかしながら、図１１Ｂにおける反応の大きさは、図１１Ａよりもはるかに小さく、これによりＩＬ−１βはＩＬ−６よりも劣った放出物であることが示された。値は、４つの繰り返されたウェルの平均の平均値±標準誤差である。
【００７１】
（実施例５−本発明の発熱物質試験：複数のドナーにおけるポリプロピレンプレート対ポリスチレンプレートの比較結果）
Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｐａｐｅｒ（２００５）に記載されるように、１ウェル当たり８８万および１００万個の細胞の細胞密度が使用され、３人のドナーが使用され、幾つかの試料が平底ウェルを有するポリスチレンマイクロタイタープレートに配置され、ＩＬ−６ＥＬＩＳＡが、Ｃｌｏｎｅ１６モノクローナル抗体でコーティングされたプレートと、検出抗体としての西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されたヒツジポリクローナル抗体とを使用したことを除いて、実施例１の方法に従って試験試料を調製した。図１２Ａおよび１２Ｂは、ドナーＡにおける１ウェル当たり８８万個の細胞のＰＢＭＣ細胞密度において、丸底ウェルを有するポリプロピレンマイクロタイタープレートと、平底ウェルを有するポリスチレンマイクロタイタープレートとについてのＩＬ−６反応をそれぞれ示す。ドナーＡにおいては、ポリスチレンプレートが使用された場合は発熱物質試験における陽性対照と陰性対照との間が区別されなかったが、ポリプロピレンプレートが使用された場合はこれらの対照の間で区別された。図１３Ａおよび１３Ｂは、ドナーＢにおける１ウェル当たり１００万個の細胞のＰＢＭＣ細胞密度において、丸底ウェルを有するポリプロピレンマイクロタイタープレートと、平底ウェルを有するポリスチレンマイクロタイタープレートとについてのＩＬ−６反応をそれぞれ示す。ドナーＢにおいては両方の発熱物質試験における陽性対照と陰性対照との間が区別されたものの、ポリプロピレンプレートを使用した場合は陽性対照に対するＩＬ−６反応は陰性対照の約６倍であったが、ポリスチレンプレートを使用した場合は陰性対照の約２倍だけであった。図１４Ａおよび１４Ｂは、ドナーＣにおける１ウェル当たり８８万個の細胞のＰＢＭＣ細胞密度において、丸底ウェルを有するポリプロピレンマイクロタイタープレートと、平底ウェルを有するポリスチレンマイクロタイタープレートとについてのＩＬ−６反応をそれぞれ示す。ドナーＢにおいては両方の発熱物質試験における陽性対照と陰性対照との間が区別されたものの、ポリプロピレンプレートを使用した場合の陽性対照に対するＩＬ−６反応は、ポリスチレンプレートの場合よりも約２倍大きかった。なお、ポリプロピレンにおけるＥｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性対照に対する反応は、ＬＰＳ標準品の最大用量、即ち０．４ＥＵ／ｍＬに対する反応を上回っているが、それに対してポリスチレンにおけるＥｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性対照に対する反応は、ＬＰＳ標準品の最小用量、即ち０．１ＥＵ／ｍＬに対する反応より小さいことに留意すべきである。
【００７２】
（実施例６−発熱物質試験の比較：ＩＰＴ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））
この試験を実施する際に使用される手順は、ＩＬ−１βおよびポリスチレンマイクロタイタープレートを使用する全血刺激の検定手順を使用するＥｎｄｏｓａｆｅ  （登録商標）−ＩＰＴ  ＩｎＶｉｔｒｏ  Ｐｙｒｏｇｅｎ  Ｔｅｓｔ説明書シート（Ｃｈａｒｌｅｓ
Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから商業的に入手可能（ＰＩＩＰＴ１０００２））に記載される。図１５は、ＩＰＴ試験においては、該キットがＬＰＳ標準品とグラム陽性菌由来のリポテイコ酸のキット陽性対照とに反応するがＥｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）およびヘモグロビンの陽性対照と陰性対照との間を区別することができなかったことを示す。
【００７３】
（実施例７−低温保存された細胞を使用する本発明の発熱物質試験）
血漿およびジメチルスルホキシド中（あるいは全血およびジメチルスルホキシド中）の細胞懸濁液（例えば１００万個のＰＢＭＣまたは単球細胞）を丸底２５０μＬウェルを有する９６ウェルポリプロピレンプレートの各ウェルに添加し、次いでそれを封止して低温保存する。
【００７４】
試験日に、プレートを解凍し、室温に戻し、封止を取り除き、９６ウェルインサートを適切な位置に確実に押し込む。前記インサートは、ポリプロピレンの壁と、液体ではなく細胞の通過に対する障壁である平底とを有する。
【００７５】
新しい培地をインサートに充填し、培地を上下に吸引して溶液を細胞障壁の上下で混合し、その後細胞障壁の上方で溶液を吸引して廃棄することによって、ＤＭＳＯを細胞から洗い流す。この洗浄工程を５回繰り返すことによって、ＤＭＳＯが本質的になくなるように細胞を洗浄し、次いで既知量の新しい培地中で保持する。
【００７６】
試験試料または標準品ならびにより新しい培地をインサートに添加し、次いで上下にこの溶液を吸引して細胞障壁の上下で溶液を混合することによって、試料または（発熱物質）標準品の中の発熱物質が細胞に到達することが可能になる。
【００７７】
加湿空気中の５％の二酸化炭素ガス中で、プレートを１６〜２４時間、３７±１℃でインキュベートする。インキュベーションの間、細胞沈降によって細胞が互いに接触することが可能になり、それによって発熱物質刺激ＩＬ−６放出が促進される。インキュベーション期間の終了の時点で、細胞障壁の上方の溶液を上下に吸引することによって細胞障壁の上下の溶液が完全に混合され、その後細胞馴化培地の１つのアリコートをＩＬ−６の検定用に採取する。
【００７８】
低温保存されたＰＢＭＣは、ドライアイスで世界中に容易に出荷することができるので有利である。ポリスチレンとは異なり、ポリプロピレンは、割れることなく液体窒素に耐える。到着した際には、提供されたプレートインサートとともに、試験用に準備するためにＰＢＭＣを解凍してＤＭＳＯがなくなるように洗浄することのみが必要である。１ウェル当たりの最適な数で細胞を出荷し、プレートインサートとともに細胞を使用することによって、改良された試験キットが最終使用者に提供される。従来のキットでは、細胞はチューブ内で出荷され、そして一旦解凍されると遠心分離によって洗浄しなければならず、それによって細胞がペレット化し、細胞を清浄な培地に分散させることができる。通常は、このようにして細胞を２回または３回洗浄する。次いで、細胞を計数して必要な細胞密度で再懸濁する必要があり、その後細胞をウェル内に分注することができる。細胞消失、活性化および細胞死を招き得る従来試験と比較して、本発明の発熱物質試験は労働集約的でなく、時間がかからず、そしてはるかに細胞を傷つけにくいものである。
【００７９】
本発明またはその好ましい実施形態の要素を導入する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「前記」は、１つ以上の要素があることを意味することが意図される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、包括的であり、そして一覧で示された要素以外の更なる要素があり得ることを意味することが意図される。本発明の範囲を逸脱することなく各種の変更を上記の方法および組成物において行うことができるため、上記の明細書に含まれる全ての内容は例証を示すものとして解釈されるものとし、限定的な意味で解釈されるものではないとすることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、丸底ウェルを有するポリプロピレンプレート上で末梢血単核細胞を用いて、放出物としてのＩＬ−６を用いて実施された単球活性化試験における、４つの異なる細胞密度（ウェルの２５０μＬ当たり１００万、５０万、２５万および１３万個のＰＢＭＣ）の試験試料に対するＩＬ−６反応を表すグラフである。ＩＬ−６反応は、エンドトキシン標準（１ｍＬ当たり１エンドトキシン単位）およびＥｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性対照（即ち、非エンドトキシン性発熱物質に汚染された１バッチのこの製品）に対するものである。
【図２】図２は、平底ウェルを有するポリスチレンプレート上で全血を用いて実施された単球活性化試験における、細胞密度が低い試験試料に対するＩＬ−６反応を示すグラフである。ＩＬ−６反応は、ＬＰＳ、Ｅｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陰性対照（即ち、この製品の清浄なバッチ）、Ｅｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性対照、ヘモグロビン（Ｈｂ）陰性対照（即ち、この製品の清浄なバッチ）およびヘモグロビン（Ｈｂ）陽性対照（即ち、非エンドトキシン性発熱物質に汚染された１バッチのこの製品）に対するものである。
【図３】図３は、平底ウェルを有するポリスチレンプレート上で末梢血単核細胞を用いて実施された単球活性化試験における、細胞密度が低い試験試料に対するＩＬ−６反応を示すグラフである。ＩＬ−６反応は、ＬＰＳ、Ｅｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性および陰性対照ならびにＨｂ陽性および陰性対照に対するものである。
【図４】図４は、平底ウェルを有するポリスチレンプレート上でＭＯＮＯＭＡＣ６細胞を用いて実施された単球活性化試験における、細胞密度が低い試験試料に対するＩＬ−６反応を示すグラフである。ＩＬ−６反応は、ＬＰＳ、Ｅｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性および陰性対照ならびにＨｂ陽性および陰性対照に対するものである。
【図５】図５は、平底ウェルを有するポリスチレンプレート上でＴＨＰ−１  ｃ細胞を用いて実施された単球活性化試験における、細胞密度が低い試験試料に対するＩＬ−６反応を表すグラフである。ＩＬ−６反応は、ＬＰＳ、Ｅｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性および陰性対照ならびにＨｂ陽性および陰性対照に対するものである。
【図６】図６は、平底ウェルを有するポリスチレンプレート上でＴＨＰ−１２Ａ９細胞を用いて実施された単球活性化試験における、細胞密度が低い試験試料に対するＴＮＦ−α反応を示すグラフである。ＴＮＦ−α反応は、ＬＰＳ、Ｅｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性および陰性対照ならびにＨｂ陽性および陰性対照に対するものである。
【図７】図７は、平底ウェルを有するポリスチレンプレート上でＭＯＮＯＭＡＣ６−ＣＡ８クローン細胞を用いて実施された単球活性化試験における、細胞密度が低い試験試料に対するＩＬ−６反応を示すグラフである。ＩＬ−６反応は、ＬＰＳ並びにＥｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性および陰性対照に対するものである。
【図８】図８は、平底ウェルを有するポリスチレンプレート上で２８ＳＣ細胞を用いて実施された単球活性化試験における、細胞密度が低い試験試料に対するＩＬ−６反応を示すグラフである。ＩＬ−６反応は、ＬＰＳならびにデキストラン陽性および陰性対照に対するものである。
【図９】図９は、丸底ウェルを有するポリプロピレンプレート上で末梢血単核細胞を用いて実施された単球活性化試験における、細胞密度が高い試験試料に対するＩＬ−６反応を示すグラフである。ＩＬ−６反応は、ＬＰＳ、Ｅｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性および陰性対照ならびにデキストラン陽性および陰性対照に対するものである。
【図１０】図１０は、丸底ウェルを有するポリプロピレンプレート上の全血を用いて実施された単球活性化試験における、細胞密度が低い試験試料に対するＩＬ−６反応を表すグラフである。ＩＬ−６反応は、ＬＰＳならびにＥｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性および陰性対照に対するものである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、末梢血単核細胞（１ウェル当たり１００万個の細胞）を用いて実施された単球活性化試験における、ポリプロピレンプレート（黒色カラム）およびポリスチレンプレート（灰色カラム）に対するＩＬ−６反応を表すグラフである。ＩＬ−６反応は、ＬＰＳ、Ｅｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性および陰性対照ならびにＨｂ陽性および陰性対照に対するものである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、末梢血単核細胞（１ウェル当たり１００万個の細胞）を用いて実施された単球活性化試験における、ポリプロピレンプレート（黒色カラム）およびポリスチレンプレート（灰色カラム）に対するＩＬ−１β反応を表すグラフである。ＩＬ−１β反応は、ＬＰＳ、Ｅｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性および陰性対照ならびにＨｂ陽性および陰性対照に対するものである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、丸底ウェルを有するポリプロピレンプレート上で末梢血単核細胞を用いて実施された単球活性化試験における、細胞密度が高い試験試料に対するＩＬ−６反応を示すグラフである。ＩＬ−６反応は、ＬＰＳならびにＥｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性および陰性対照に対するものである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、平底ウェルを有するポリスチレンプレート上で末梢血単核細胞を用いて実施された単球活性化試験における、細胞密度が低い試験試料に対するＩＬ−６反応を示すグラフである。ＩＬ−６反応は、ＬＰＳならびにＥｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性および陰性対照に対するものである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、丸底ウェルを有するポリプロピレンプレート上で末梢血単核細胞を用いて実施された単球活性化試験における、細胞密度が高い試験試料に対するＩＬ−６反応を示すグラフである。ＩＬ−６反応は、ＬＰＳならびにＥｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性および陰性対照に対するものである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、平底ウェルを有するポリスチレンプレート上で末梢血単核細胞を用いて実施された単球活性化試験における、細胞密度が高い試験試料に対するＩＬ−６反応を示すグラフである。ＩＬ−６反応は、ＬＰＳならびにＥｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性および陰性対照に対するものである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、丸底ウェルを有するポリプロピレンプレート上で末梢血単核細胞を用いて実施された単球活性化試験における、細胞密度が高い試験試料に対するＩＬ−６反応を示すグラフである。ＩＬ−６反応は、ＬＰＳならびにＥｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性および陰性対照に対するものである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、平底ウェルを有するポリスチレンプレート上で末梢血単核細胞を用いて実施された単球活性化試験における、細胞密度が高い試験試料に対するＩＬ−６反応を示すグラフである。ＩＬ−６反応は、ＬＰＳならびにＥｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性および陰性対照に対するものである。
【図１５】図１５は、平底ウェルを有するポリスチレンプレート上で全血を用いて実施された商業的に入手可能なＩＰＴ試験における、細胞密度が高い試験試料に対するＩＬ−１β反応を示すグラフである。ＩＬ−１β反応は、ＬＰＳ、Ｅｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）陽性および陰性対照、ヘモグロビン陽性および陰性対照、生理食塩水対照ならびにグラム陽性対照に対するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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