(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒガンザクラの茎頂又は茎頂を含む植物組織を培養して多芽体を誘導し増殖させ、増殖した多芽体をシュート伸長培地で培養してシュートを伸長させ、次いで伸長したシュートを発根培地で培養して発根させることにより植物体を再生するヒガンザクラの組織培養による大量増殖法であって、前記多芽体を誘導し増殖させる工程がココナッツウォーターを含有する培地で行われるか、および／または前記伸長培地がココナッツウォーターを含有する、大量増殖法。
【請求項２】
ヒガンザクラの茎頂又は茎頂を含む植物組織を培養して多芽体を誘導し増殖させ、増殖した多芽体をシュート伸長培地で培養してシュートを伸長させ、次いで伸長したシュートを発根培地で培養して発根させることにより植物体を再生し、さらに再生した該植物体を順化前に低温処理するヒガンザクラの組織培養による大量増殖法。
【請求項３】
ヒガンザクラの茎頂を含む植物組織として腋芽又は頂芽を、ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、硫酸アデニン及びココナッツウォーターを含有するＷＰ固体培地又はその改変固体培地で培養して多芽体を誘導し増殖させる請求項１または２に記載の大量増殖法。
【請求項４】
ヒガンザクラの茎頂を、１−フェニル−３−（１,２,３−ティアディアゾール−５−ＹＬ）ウレア（チディアズロン）を含有する液体ＷＰ培地又はその改変培地で培養して多芽体を誘導し増殖させる請求項１または２に記載の大量増殖法。
【請求項５】
伸長培地として、ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、ココナッツウォーター及び硫酸アデニンを含有するＷＰ固体培地又はその改変固体培地を用いる請求項１から４のいずれかに記載の大量増殖法。
【請求項６】
発根培地として、ＷＰ液体培地又はその改変液体培地を用いる請求項１から５のいずれかに記載の大量増殖法。
【請求項７】
ヒガンザクラがエドヒガンまたはシダレザクラである請求項１から６のいずれかに記載の大量増殖法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サクラ属の組織培養による大量増殖法に関するものである。更に詳細には、サクラ属の茎頂又は茎頂を含む植物組織を培養して多芽体を誘導し増殖させ、増殖した多芽体をシュート伸長培地で培養してシュートを伸長させ、次いで伸長したシュートを発根培地で培養して発根させることにより植物体を再生し、望ましくは、再生した植物体を順化前に低温処理することにより順化後の成長を促進することを特徴とするサクラ属の組織培養による大量増殖法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
サクラ属は、日本全国で植栽され、人々に親しまれている日本花木の一つである。サクラ属の増殖は一般に挿し木、接ぎ木等により行われている。挿し木による増殖法は活着が悪く後の樹勢が弱いと言う欠点を有する。接ぎ木による増殖法は熟練と労力とを要すると言う難点がある。更に挿し木、接ぎ木と言った従来の方法では、老木からの増殖は困難であり、また羅病した親木から生産された挿し木苗や接ぎ木苗は、羅病している可能性が非常に高い。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
近年、組織培養技術の発達により、希少木、貴重老木の増殖が行われており、サクラ属においてもそのような技術の開発が期待されている。特に、羅病した親木からも、無感染菌を生産できる茎頂培養法の開発が望まれている。組織培養によるサクラの増殖法として、特開平８−６６１３４号公報には、サクラ（Prunus jamasakura Sied.）の外植片を培養して多芽体を誘導し、次いで発根させてサクラの植物体を作出する方法が提案されている。しかしながら、この組織培養法はサクラの効率的な大量増殖法と言い得るものではない。サクラ属の組織培養による効率的な大量増殖法は、未だ開発されておらず、早急な開発が望まれている。
従って、本発明の目的は、サクラ属の大量生産を可能にする効率的な大量増殖法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、サクラ属の茎頂又は茎頂を含む植物組織を培養して多芽体を誘導し増殖させ、増殖した多芽体をシュート伸長培地で培養してシュートを伸長させ、次いで伸長したシュートを発根培地で培養して発根させることにより植物体を再生し、望ましくは、再生した植物体を順化前に低温処理することにより順化後の成長を促進することを特徴するサクラ属の組織培養による大量増殖法である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明で対象とする植物はサクラ属であり、特にシダレザクラが好適な植物である。
本発明では、先ず、サクラ属の茎頂又は茎頂を含む植物組織を培養して多芽体を誘導し増殖させる。ここで茎頂とは、成長点あるいは成長点付近の組織を指し、多芽体とは、定芽及び／又は不定芽からなる植物組織を指す。
本発明では、茎頂自身を用いてもよく、また茎頂を含む植物組織を用いてもよい。茎頂を含む植物組織としては、茎頂を含む腋芽又は頂芽が挙げられる。これらの培養材料は、サクラ属の苗木又は成木から採取できる。採取した培養材料は、通常の方法に従って、エタノール及び次亜塩素酸ナトリウムあるいは過酸化水素水あるいは塩化水銀（昇汞水）で表面殺菌を行い、滅菌水で洗浄後に、培地中で培養する。特に茎頂は、通常、殺菌した頂芽から無菌条件下で摘出される。
培養に用いる基本培地としては、無機成分及び炭素源を必須成分とし、その他植物成長調節物質、ビタミン、アミノ酸を含有する培地が用いられる。無機成分としては、窒素、燐、カリウム、ナトリウム、カルシウム、硫黄、鉄、マンガン、亜鉛、沃素、硼素、モリブデン、塩素、コバルト等の元素を含む無機化合物が用いられる。炭素源としては、炭水化物、例えばショ糖、トレハロース、グルコース、マルトースが用いられる。また、ココナッツウォータ、酵母エキスを用いることもできる。植物成長調節物質としては、例えばオーキシン、サイトカイニン、ジベレリンが用いられる。オーキシンとしては、例えば３−インドール酢酸（ＩＡＡ）、３−インドール酪酸（ＩＢＡ）、α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）、4−クロロ−2−メチルフェノキシ酢酸、p−クロロフェノキシ酢酸、2,4,5−トリクロロフェノキシ酢酸等が挙げられ、サイトカイニンとしては、例えばベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、カイネチン、ゼアチン、6−（γ，γ−ジメチルアラミノ）プリン（2iP）、N−（2−クロロ−4−ピリド）−N’−フェニルウレア（CPPU）、1−フェニル−3−（１,２,３−ティアディアゾール−５−ＹＬ）ウレア（チディアズロン）、ジベレリンとしてはＧＡ3等が挙げられる。ビタミンとしては、例えばチアミン、ピリドキシン、ニコチン酸等が挙げられる。アミノ酸としては、例えばアデニン、グリシン、グルタミン酸、リジン等が挙げられる。
【０００６】
実際に培養する際に用いられる培地としては、植物組織培養に用いられる培地、例えばＭＳ培地(Murashige, T.(1962), Physiol. Plant. 15: 473 - 497)、Ｂ５培地(ＧＡmborg, O.L. (1968), Exp. Cell. Res. 50: 151 - 158)、ＷＰ培地(Lloyd, G. (1981), Int. Plant Prop. Soc. 30: 421 - 427)、ＢＴＭ培地(Chalupa, V. (1984) Biologia Plnt. (praha) 26: 374 - 377)等が挙げられる。また、培地固化剤としては、ゲルライト、寒天等が挙げられ、培地支持体としては、フロリアライト、バーミキュライト、パーライト、赤球土等が挙げられる。
本発明では、茎頂又は茎頂を含む植物組織を培養して多芽体を誘導し増殖させるための培地、増殖した多芽体を培養してシュートを伸長させるためのシュート伸長培地及び伸長したシュートを培養して発根させるための発根培地は、いずれも、特に、ＷＰ培地及びその改変培地が好ましい。本発明で改変培地とは、培地中の各種成分量を、ＷＰ培地中の成分量未満から約２０％の量に減少させた培地を指し、例えば各種成分量を１／３、１／２、２／３等に減少させた培地が挙げられる。
【０００７】
茎頂を含む植物組織として、腋芽あるいは頂芽を培養して、定芽及び／又は不定芽を多数有する多芽体の誘導及び増殖を促進するためには、ＢＡＰ、硫酸アデニン及びココナッツウォーターを含有するＷＰ固体培地又はその改変固体培地で培養するのが好ましく、更に、これらの成分に加えてＩＢＡを含有するのが好ましい。また、必要に応じてＧＡ3を加えるのが好ましい。ココナッツウォーターの構成成分は、通常、脂肪酸、アミノ酸、糖（グルコース、フラクトース、ショ糖）、サイトカイニン（ゼアチン、リボシルゼアチン、ジフェニル尿素）、ミオイノシトールである。特に、ＢＡＰを0.02〜2.2mg/l、好ましくは0.4〜1.0mg/l、ＩＢＡを0.1〜2.0mg/l、好ましくは0.1〜1.0mg/l、ＧＡ3を0.1〜4.0mg/l、好ましくは0.1〜2.0mg/l、硫酸アデニンを0.2〜4.0mg/l、好ましくは2.0mg/l、ココナッツウォーターを1〜20容量％、好ましくは10容量％含有するＷＰ固体培地またはその改変固体培地を用いることが好ましい。腋芽あるいは頂芽の培養は、15から30℃で、500から10,000ｌｕｘで、１から３ケ月間、静置培養するのが好ましい。
また、茎頂自身を培養して、定芽及び／又は不定芽を多数有する多芽体の誘導及び増殖を促進するためには、チディアズロンを含有するＷＰ液体培地またはその改変液体培地を用いることが好ましい。特に、チディアズロンを1.0〜4.0mg/l、好ましくは2.0mg/l含有するＷＰ液体培地またはその改変液体培地を用いることが好ましい。茎頂自身の培養は、15から30℃で、500から20,000ｌｕｘで、１から５ケ月間、回転又は旋回培養するのが好ましい。
【０００８】
次いで、誘導された多芽体をそのまま培養を継続することにより、効率よく多芽体を増殖させることができる。即ち、多芽体を増殖するための培地としては、腋芽あるいは頂芽を培養して、多芽体を誘導させた場合には、上記したＷＰ固体培地又はその改変固体培地でそのまま培養するのが好ましく、茎頂自身を培養して、多芽体を誘導させた場合には、上記したＷＰ液体培地またはその改変液体培地でそのまま培養するのが好ましい。
【０００９】
次いで、増殖した多芽体をシュート伸長培地に移植して培養することにより、多芽体から効率よくシュートを伸長させることができる。
シュート伸長培地としては、前記の無機成分及び炭素源、ビタミン、アミノ酸等を含有し、ＢＡＰ、硫酸アデニン及びココナッツウォーターを含有するＷＰ固体培地又はその改変固体培地で培養するのが好ましく、更に、これらの成分に加えてＩＢＡを含有するのが好ましい。また、必要に応じてＧＡ3を加えるのが好ましい。本発明では、ココナッツウォーターとともに硫酸アデニンを添加することにより、正常な葉の展開及びシュート伸長の促進が得られる。特に、ＢＡＰを0.02〜2.2mg/l、好ましくは0.4〜1.0mg/l、ＩＢＡを0.1〜2.0mg/l、好ましくは0.1〜0.5mg/l、ＧＡ3を0.1〜4.0mg/l、好ましくは0.1〜2.0mg/l、硫酸アデニンを0.2〜4.0mg/l、好ましくは2.0mg/l、ココナッツウォーターを1〜20容量％、好ましくは10容量％程度含有するＷＰ固体培地またはその改変固体培地が好ましい。シュートを伸長させるための培養は、15から30℃で、500から10,000ｌｕｘで、１から２ケ月間、静置培養するのが好ましい。
【００１０】
次いで、伸長したシュートを分割、あるいは分割せずに発根培地に移植して培養することにより、シュートを更に伸長させ、かつ発根させることができる。
発根培地としては、前記の無機成分及び炭素源、ビタミン、アミノ酸等を含有するＷＰ液体培地又はその改変培地が好ましい。特に、ＩＢＡを0.1〜5.0mg/l、好ましくは0.1〜2.0mg/l含有するＷＰ液体培地又はその改変培地が好ましい。本発明では、ＷＰ液体培地又はその改変培地を培地支持体に含侵させ、培地支持体上で培養するのが好ましい。培地支持体としては、フロリアライト、バーミキュライト、パーライト、赤玉土等の土を圧縮成型した培地支持体；スポンジ状の培地支持体、ロックウール製の培地支持体、多孔質の培地支持体などが挙げられる。発根させるための培養は、５から30℃で、０から5,000ｌｕｘで、１から３ケ月間、静置培養するのが好ましい。
かくして、サクラ属の植物体を大量に効率良く再生することができる。
【００１１】
次いで、再生した植物体を順化前に低温処理することにより、順化後の成長を促進することができる。
低温処理の温度としては0〜15℃、好ましくは5〜15℃であり、低温処理の期間は1〜3週間、好ましくは3週間が好ましい。このような低温処理に適したサクラ属は、特に低温感受性の種に属するものである。低温処理は、発根培地で培養し再生した植物体を、そのまま低温室にて、湿度50〜100％、好ましくは70〜100％で、０から5,000ｌｕｘで行われる。低温処理後に、通常の順化工程に付すことにより、サクラ属の植物を作出することができる。
【００１２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
（１）植物組織の調製
京都醍醐寺境内に植栽されている樹齢約１５０年生のシダレザクラ（通称：土牛の桜）から、材料を採取した。
【００１３】
シダレザクラは下記のような学名を持ち、ヒガンザクラ又はエドヒガンの園芸品種として知られている。
Prunus pendula Maximowicz in Bull.Acad.Sci.St.Petersb.29:98(1883) cv.Pendula；
Cerasus spachiana Lavallee ex Otto in Hambrug.ＧＡrt.u.Blumenz.35:57(1879)；
Prunus itosakura Sieb.in Verh.Batav.Genoot.12:68(1830)；
Prunus subhirtella var.pendula(Maxim.)Tanaka in Useful Pl.Jap.:620(1895)；
Prunus aequinoctialis var.pendula Miyoshi in Bot.Mag.Tokyo 34:164(1920)；
Prunus spachiana(Lavallee ex Otto)Kitamura in Act.Phytotax.Geobot.25:2(1971)。
【００１４】
シダレザクラの成木から茎頂を含む腋芽および頂芽を採取し、７０％エタノール中で３０秒、２％次亜塩素酸ナトリウム中で７分間表面殺菌を行い、滅菌水で数回洗浄後、滅菌濾紙上で風乾した。風乾後、寒天培地に植え付けた。茎頂は、殺菌した頂芽から無菌条件下で摘出した。
【００１５】
（２）茎頂からの多芽体形成
培地としては、ＷＰ培地にショ糖、トレハロースあるいはグルコースを各々30g/l及び植物成長調節物質としてＢＡＰを0〜4.4mg/l、ゼアチンを0〜4.4 mg/l、あるいはチディアズロンを0〜4.4mg/l添加し、塩化カリウムでｐＨを５．７に調整後、オートクレーブ（１２１℃、１．２ａｔｍ、２０分の条件）で殺菌して用いた。茎頂は、液体培地で培養した。培養は２６±２℃、２４時間日長（10,000lux）で行った。３ヶ月後の多芽体形成率の結果を表１に示した。
0004647804.tif 000002
【００１６】
ＢＡＰ、ゼアチンを添加した処理区では、全ての個体が褐変枯死した。これに対して、チディアズロン添加処理区では、表１の結果から明らかなように、培養２〜３ヶ月後には、展開した茎頂の基部より新しい芽の形成が始まり、茎頂は多芽体へと成長した。特に、チディアズロン2.0mg/lを添加することが効果的であった。
【００１７】
（３）腋芽からの多芽体形成
培地としては、ＷＰ培地に固化剤としてゲルライト3.0g/l、ショ糖、トレハロースあるいはグルコースを30g/l及び植物成長調節物質としてＩＢＡ0〜2.0mg/l、ＢＡＰを0〜2.2mg/l、ＧＡ3を0〜4.0mg/l、硫酸アデニンを0〜2.0mg/l、ココナッツウォーターを0〜20容量％添加し、前記同様にｐＨを５．７に調整後、殺菌して用いた。培養は２６±２℃、１６時間日長（3,000lux）で行った。３ヶ月後の多芽体形成率の結果を表２に示した。
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【００１８】
硫酸アデニン及びココナッツウォーター添加処理区では、表２の結果から明らかなように、褐変枯死が抑制された。特に、ＩＢＡ0.1mg/l、ＢＡＰ1.0mg/l、ＧＡ32.0mg/l、硫酸アデニン2.0mg/l及びココナッツウォーター10容量％を添加することが効果的であった。
（４）シュート伸長
（２）及び（３）で形成した多芽体をそのままシュート伸長培地に移植した。培地には、ゲルライト3.0g/l、トレハロース30g/l及びＩＢＡ0.1〜0.5mg/l、ＢＡＰを0.4〜1.0mg/l、ＧＡ3を1.0〜2.0mg/l、硫酸アデニンを2.0mg/l、ココナッツウォーターを5〜20容量％添加したＷＰ培地を、前記と同様にｐＨ５．７に調整し、殺菌して用いた。培養条件は、(2)と同じ条件である。1ヶ月後のシュート伸長の結果を表３に示した。
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【００１９】
表３の結果からも明らかなように、培養１ヶ月後には、多芽体からのシュート伸長が認められ、特にＩＢＡ0.1mg/l、ＢＡＰ1.0mg/l、ＧＡ32.0mg/l、硫酸アデニン2.0mg/l及びココナッツウォーター10容量％を添加することにより、奇形葉の形成を抑制する効果が認められた。
（５）発根
（４）で得られたシュートを一本ずつに切り分け、発根培地に移植した。培地には、ＩＢＡ0〜1.0mg/lを添加したＷＰ固体培地あるいはＩＢＡ0〜1.0mg/lを添加したＷＰ液体培地を培地支持体であるフロリアライトに含侵させ、この培地支持体上で培養した。前記同様にｐＨ5.7に調整し、殺菌して用いた。培養条件は、(2)と同じ条件である。１ヶ月後の結果を表４に示した。
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【００２０】
表４の結果からも明らかなように、培養１ヶ月後には、60％の個体で発根が観察され、特にＩＢＡ1.0mg/lを添加したＷＰ液体培地を培地支持体であるフロリアライトに含侵させ、この培地支持体上で培養した場合に効果的であった。
（６）低温処理及び順化
（５）で得られた再生植物体を順化前に低温処理を施した。植物体は無菌状態の培養容器に入れたまま低温室に搬入した。低温処理の条件は、表５の通りである。結果を表６に示した。
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【００２１】
表６の結果から明らかなように、低温処理を施した個体は、順化後も良好なシュート成長を示し、特に１週間毎に温度を５℃ずつ低下させ３週間の低温処理を施すか、あるいは10℃で３週間の低温処理を施すことが効果的であった。
【００２２】
【発明の効果】
本発明によれば、サクラ属の茎頂又は茎頂を含む植物組織を培養して多芽体を誘導し増殖させ、増殖した多芽体をシュート伸長培地で培養してシュートを伸長させ、次いで伸長したシュートを発根培地で培養して発根させることにより植物体を再生し、望ましくは、再生した植物体を順化前に低温処理することによりサクラ属の植物体を大量に再生することができる。本発明により、短期間に大量にサクラ属の植物体を生産することができ、サクラ属苗の大量生産、遺伝子研究等の可能性が高くなる。