(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カスケードプライミング（cascade priming）により刺激されている末梢血単核細胞（CAPRI細胞）を含む、ガン性疾患の治療をするための医薬組成物であって、
当該CAPRI細胞は下記の刺激方法：
−ガン患者由来の末梢血単核細胞（PBMC）がCD３抗体によって又は固定化されたCD３抗体により１次刺激を受け、
−上記ガン患者由来のナイーブＰＢＭＣが１次刺激を受けた前記PBMCに対して加えられ、当該ナイーブPBMCを刺激する目的のためにインキュベートされること
によって獲得でき、
前記PBMCの１次刺激及び／又は前記ナイーブPBMCの刺激はインターロイキン２及び／もしくはインターロイキン４及び／もしくはインターフェロンγの存在下で行われている、前記組成物。
【請求項２】
１次刺激を受けたPBMCのナイーブPBMCに対する比が、１：１０〜１０：１であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
１次刺激を受けたPBMCのナイーブPBMCに対する比が、１：１であることを特徴とする、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記CAPRI細胞が、皮内、静脈内及び／もしくは筋内及び／又は腫瘍の中もしくは周辺へ注射により投与されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記CAPRI細胞が、皮内及び静脈内への注射により投与されていることを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記CAPRI細胞が、０．５〜３０×１０６細胞／注射の投与量で投与されていることを特徴とする、請求項４又は５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記CAPRI細胞が、１〜２０×１０６細胞／注射の投与量で投与されていることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記CAPRI細胞が、CD３刺激されたリンパ球と一緒に投与されていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記CD３刺激されたリンパ球が、１〜２０×１０６細胞／注射の投与量で投与されていることを特徴とする、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記CD３刺激されたリンパ球が、皮内及び／又は筋内注射により投与されていることを特徴とする、請求項８又は９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記CD３刺激されたリンパ球が、CAPRI細胞とは異なる患者の体内の場所に投与されていることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
疾患の種類に適合する医薬又は放射線治療と一緒に用いられることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、ガン性疾患の治療をするための因子を提供する目的のために、「カスケードプライミング（cascade priming）」により刺激されている又は活性化されている末梢血単核細胞の使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
ナイーブ（刺激されていない）Tリンパ球の刺激は、ガン性疾患に対抗する目的のための免疫療法の範囲内での重要な出発点を構成する。ナイーブT細胞の至適活性化には、αβT細胞レセプター（TCR）の、共刺激シグナル（co−stimulation）と連動したMHCペプチド／抗原複合体（MHC＝主要組織適合性複合体）による特異的抗原性刺激が必要である。共刺激の不在は、T細胞の機能的失活をもたらす。共刺激シグナルは、抗原提示細胞（APC）によって供されるのが最良である。
【０００３】
APCは、TCRを介するT細胞の特異的活性化を増大することに実質上寄与する、多くの共刺激分子を備えている。活性化誘導補体分子は、Tリンパ球及びAPC上で膜タンパク質の形態において同定されてきた。Tリンパ球上のその膜タンパク質は、T細胞共レセプター（co−receptor）、例えば、CD４分子又はCD８分子、及び細胞内接着分子−１，２，３（ICAM−１，２，３）に細分化される。後者は、APC及びT細胞によって発現され、そして白血球機能抗原−１（LFA−１レセプターファミリーCD１１a／CD１８）（APC及びT細胞によっても発現される）との相互作用に至る。大部分のT細胞によって発現されるCD２分子は、CD５８（LFA−３）と反応する。T細胞及びAPCも接着分子LFA−１及びICAM−１を発現し、それらはAPCとT細胞との密着をするために非常に重要である。共刺激機能を有する他の分子が最近同定されてきた。それは例えば、CD２７／CD２７L（CD２８共刺激後にT細胞を増殖する）、SLAM（Cdw１５０、CD２ファミリーのメンバーであり、インターフェロン−γ（IFNγ）の生産を増大させ、そして記憶T細胞の増殖を促す）及びOX４０（CD１３４が２型のヘルパーT細胞（TH２）の反応性を高めTH１及びTH２の増殖を助ける）である。他の共刺激分子の詳細な機能については議論が続いているが、個々の免疫反応を理解するために、個々の免疫反応を解明することの重要性についての疑念はない（J．E．M．van leuwen ,L. Samelson,T cell antigen receptor signal transduction, Curr. Opin. Immunol. １１: pp.２４２〜２４８（１９９９））。
【０００４】
ガン細胞は、わずかにのみ共刺激分子を提供する。更に、ガン細胞は、MHC分子の発現を大幅に制限する傾向があり、そしてこのようにしてMHCによる腫瘍ペプチドの認識を妨げる。
【０００５】
ガン細胞の低刺激性に対抗するため、及び関連する腫瘍抗原に対してナイーブ（刺激されていない）Tリンパ球の刷り込み（imprinting）をするためにいくつかの戦略が開発されてきた。共刺激シグナルを改良するための多くの取り組みが、遺伝子工学の助け、例えば、T細胞を活性化する遺伝子を有する腫瘍細胞のトランスフェクションなど、を借りて行われてきた。更に、多くの取り組みは腫瘍ペプチドの単離及び同定のほうに向けられてきた。かかる腫瘍ペプチドは、T細胞に対してMHC腫瘍ペプチド複合体を効率的に提示できるようにするため、APCのローディング(loading)のために用いられている。この方法では、T細胞の活性化及びT細胞記憶の誘導が達成されることが目的になっている。抗原をロードされているAPCは、ナイーブT細胞を引き付けてそれらに腫瘍抗原に対する刷り込みをするために、医療研究センターにおいて患者に再注入されている。現在まで、APCの集中ローディングは、腫瘍ペプチド／抗原により又はガン細胞とのインキュベーションを介してのどちらかにより行われてきた。
【０００６】
これらの治療戦略の成功が非常に小幅である理由は、個別にあるいは組み合わさって生じうる主な４つの問題にある。その問題とは：１)各個体において強力な免疫反応を誘導する腫瘍抗原を同定することの困難さ；２)腫瘍抗原／ペプチドを提示する個々のMHC分子の提示喪失をよりもたらされる、腫瘍細胞上での選定の提示抗原の喪失；３）ガン細胞がサイトカインによってナイーブ細胞を不活性化する能力；４)共刺激シグナルの発生不十分；の問題である。
【０００７】
ガン性疾患の治療をするための他の戦略は、特に、WO９５／２０６４９に記載されている。in vitroで生じた免疫細胞を生産するための方法は、その中に記載されており、この方法において、末梢血単核細胞(PBMC)は、可溶性CD３抗体とインキュベートされ、そして上清はナイーブPBMCのインキュベーションのために用いられている。このようにして得られる免疫反応性細胞、主にヘルパーT細胞(CD４＋)及び細胞傷害性T細胞(CD８＋)からなるT細胞集団は、患者に再注射されている。
【０００８】
従って、ガン性疾患の治療をするための因子に対する要求が引き続いて存在している。
【発明の開示】
【０００９】
本発明により、カスケードプライミングによる刺激を受けているPBMC(いわゆるCAPRI細胞)は、ガン性疾患の治療をするための因子を提供する目的のために用いられて良い。
【００１０】
本発明により、患者のPBMC凝集体におけるナイーブT細胞は、in vitroで活性化されており且つそれら自身の腫瘍細胞に対する刷り込みがなされており；この方法において、PBMCは予め腫瘍抗原ローディングを受ける必要がなく有効となる。従って、このin vitro 刷り込みについて、腫瘍細胞を用いる必要がない、又は特異的腫瘍抗原／ペプチドを同定する必要はない。
【００１１】
カスケードプライミングの過程では、ナイーブPBMCは、Tリンパ球を刺激する因子により１次刺激を受け、そして１次刺激を受けてきたこれらのPBMCはナイーブPBMCに加えられ、その結果として、ナイーブPBMCが順に刺激され、そしてそれからもたらされるCAPRI細胞(「カスケードプライミングされた」細胞)は、本発明により、ガン性疾患の治療をするための因子を供する目的のために用いられて良い。
【００１２】
表現「Tリンパ球を刺激する因子」とは、CD３抗体、B７抗体、レクチン、カルシウムイオノフォア、同種異系細胞、異種細胞などを意味するものと解されるべきだ。１次刺激のためには、様々な因子が、それら自身で又は組み合わせて用いられて良い。１次刺激は、CD３抗体、詳細には固定化されたCD３抗体の使用により行われるのが好ましい。しかし、ナイーブPBMCの刺激、又はむしろPBMC凝集体におけるTリンパ球の刺激も、WO９９／５０３９３（これは出願人の所有物であり、そして出願明細書はこの点で参照される）に詳細に記載されている他の列挙された方法により達成されて良い。下記において、本発明は、CD３抗体によりもたらされる１次刺激の例の基づき、本発明が限定されることを意味せず、より詳細に記載されるだろう。
【００１３】
PBMC凝集体におけるTリンパ球の１次刺激は、CD３抗体と、インターロイキン２（IL−２）の逐次添加によって行うことができる（いわゆるIL−２補助段階）。４〜８時間になる１次刺激のためのインキュベーション時間の後、ナイーブPBMCが、刺激されたPBMCに対して（あるいはむしろPBMC凝集体における刺激されたTリンパ球に対して）加えられる。更なる１８〜２４時間以上のインキュベーション時間（いわゆる刷り込み段階）の後、ナイーブPBMCの刺激を終了させる。これにより、IL−２の添加を伴う細胞の調製品は、約３日間増殖されて良く、そして／又は本発明により用いられて良い（いわゆる増殖段階）。この更なるインキュベーションの間、１次刺激を既に受けている細胞の更なる連続刺激が行われ、その一方で、新たに加えられたナイーブPBMCが主に、第１段階で１次刺激を受けた細胞により刺激される。ナイーブPBMC量に対する１次刺激を受けたPBMCの数的な比は、原則的に、約１：１である。CAPRI細胞を生産するための方法及び脳に関連した疾患、障害及び異常を治療するためのその使用は、既にWO９９／５０３９３（これは出願人の所有物である）中で扱われている。
【００１４】
他の実施態様により、IL−２補助段階中及び／もしくは刷り込み段階中に、他のサイトカイン、例えば、IL−４及び／もしくはGMCSF（「IL−４CAPRI細胞」）又はインターフェロン（「IFNγCAPRI細胞」）が、このようにしてAPCによる他のペプチドの発現を達成するため、及び他のAPCもしくはT細胞亜集団の増殖を促すために加えられて良い。CAPRI細胞は、その後の増殖を伴う新たなラウンドのナイーブ細胞の刷り込みにおいて用いられて良い。
【００１５】
他の実施態様によれば、共培養された活性化されたPBMCの、ナイーブPMBC対する比は、１：１〜１：１０又は１０：１、即ち１００倍変化して良い。
【００１６】
他の実施態様によれば、同種異系（外来）免疫細胞もCAPRI細胞の生産において用いられて良い。１又は２つのHLAハプロタイプ（HLA＝ヒト主用組織適合性複合体）が一致する類縁個体においては、ナイーブT細胞と活性化されたAPCの間で免疫細胞の十分な協力が保証されうる。ハプロタイプが異なる場合、更なる刺激が生じうる（アロ刺激）。ハプロタイプのアロ刺激の違いは、かなり前に記載された（M.J. Sheehy, P.M. Sondel, M.L. Bach, R. Wank, F.H. Bach, HL−A LD（lymphocyte defined）typing: a rapid assay with primed lymphocytes, Science １８８:pp.１３０８〜１３１０（１９７５））。同種異系細胞と患者の腫瘍細胞との間にHLA制限溶解（HLA restricted lysis）のために十分なHLAの一致が存在するならば、非類縁個体の細胞も用いられて良い。ガン性疾患の治療において、下記の組合せが有利に用いられて良い。その組合せとは：
１）患者の活性化されたAPC＋同じHLA対立形質を示す個体のナイーブPBMC：生成される記憶エフェクター細胞は患者由来ではなく、それ故にそれらはアロCAPRI細胞である。これが最も多いに変異体を構成する。何故なら多くの場合に、患者のAPCが腫瘍ペプチドを最も良く提示するからである。
２）「抵抗性」の個体（例えば、ヒトパピローマウィルス、HPVに耐性の個体）由来のAPC(R.Wank, C. Thomssen, High risk of squamous cell carcinoma of the cervix for women with HLA−DQw３, Nature ３５２:pp.７２３〜７２５(１９９１))は、HPVによって誘導された子宮頸ガン患者のナイーブPBMCの刷り込みをする目的で用いられる：APCは外来(アロ)であり、生成される記憶エフェクター細胞は当該患者由来であり、それ故にそれらはアロ−APC−CAPRIである。
３）APC及び生成される記憶エフェクター細胞も外来(アロ)であり、それ故にそれらはアロ−アロ−CAPRI細胞である。このアロ−アロ−CAPRI細胞は、もし患者と同種異系供与者の両方が同じ発ガン性因子に接触しており、そして同種異系供与者がより優れた免疫反応を示していたなら、最適である。
【００１７】
同種異系CAPRIの組合せ又は半同種異系CAPRIの組合せの動力学は、「標準」CAPRI法のものと異ならない。
【００１８】
本発明の他の好適な実施態様においてCAPRI細胞は、CD３活性化細胞と組み合わせて又はIFNγの添加によりTH１集団の方向で分極された、もしくはIL−４の添加でTH２及びCD８＋T細胞集団の方向で分極化されたCD３活性化細胞と組合せて投与されている。
【００１９】
ある意味では、これには歴史的な理由がある。何故なら、CAPRI細胞の発明前にCD３活性化細胞のみが他の徴候の場合に用いられていたからである。CD３活性化細胞のみでの治療が、腫瘍再発生率を低くすることに関して有利な効果を有する (それは、可能性としてCD８＋T細胞の数が増加することが理由である) から（T..Takayamaら、Adoptive immunotherapy to lower postsurgical recurrence of hepatocellular carcinoma : a randomised traial , Lancet ３５６:pp. ８０２〜８０７（２０００））であり、これらの細胞はCAPRI細胞を補助する目的で投与されうる。加えて、CD３活性化細胞は、DE  １９８ １４ ７０１（これは出願人の所有物である）中に既に記載されているように、鬱病の患者において首尾良くに用いることができうる。これらの効果も化学療法又は放射線療法の否定的な結果に対抗することにおいて効果的に活用されうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
腫瘍細胞と戦う目的のためにCAPRI細胞の確認可能な効果を説明するための特別な理論に束縛される訳ではないが、以下に更に詳細に説明されている活性化機構が考察されるだろう。
【００２１】
カスケードプライミングによる刺激の過程において、免疫反応の誘導は、PBMC凝集体におけるナイーブT細胞の（CD３抗体による）全体的な活性化によって始まるということが考えられている。これらの活性化されたT細胞は、APC（単球／マクロファージ、樹状細胞、Bリンパ球）を活性化する多くのサイトカイン分泌する。これに対応して、活性化されたAPCは多数のサイトカインを分泌し、そして多大な程度まで、共刺激リガンドを発現する。しかし、更に有意なことは、APCによる内生又は外生起源のペプチドの一層効率的な提示である。かかるペプチドの場合、それは、ガン細胞によって生成されており且つ多大な程度までAPCによって提示されている腫瘍ペプチドが疑問となりうる。逐次付加されるナイーブ細胞の刺激は、１次刺激を受けてきた、即ち、ナイーブPBMC集団におけるTリンパ球（CD４＋ヘルパー細胞及びCD８＋キラー細胞）のαβTCRを介して非常に特異的な態様で１次刺激を受けてきたPBMCの活性化されたAPCによって専ら行われると考えられている。
【００２２】
カスケードプライミングの間に通過する様々な段階は、下記において更に詳細に調べられるだろう。
【００２３】
１）サイトカインを分泌するためのCD３誘導によるT細胞の活性化
固定化されたCD３抗体に対するTリンパ球の結合及びIL−２の添加により、αβTCRと連結する不変CD３ポリペプチドによるTリンパ球の活性化がもたらされる。活性化は、T細胞によるサイトカインの分泌も誘導する。この段階で、T細胞型の集団は、サイトカインの添加より影響を受けて増殖されうる。例えば、IL−４の添加によりTH２細胞の方向にその後の増殖が進みうる。この段階では、CD８＋T細胞の有意な増殖も観察されてうる。
【００２４】
２）APCの活性化
T細胞のサイトカインはAPCを活性化し、単球をマクロファージに分化させ、樹状細胞を成熟させる。様々に活性化されたT細胞によって生産されるサイトカインは、通常型のAPCに影響を与え、APC中で活性化されている種類の酵素サブユニットにも影響を与える。それに対応して、活性化されたAPCは、刷り込み段階においてナイーブ細胞の活性化を補助するサイトカインを分泌する。
【００２５】
３）刷り込み段階：APCによるMHCペプチド複合体の発現及び共刺激分子の発現
活性化されたAPCはサイトカインを分泌し、共刺激分子及びMHCペプチド複合体を、de novo及び／又はより高い濃度のどちらかで発現する。ナイーブPBMCは活性化されたPBMCに対して等量部(equal parts)で添加される。活性化されたAPCは、例えば、共刺激性B７分子CD８０／CD８６、接着分子及び他の共刺激性分子をMHCペプチド複合体と共に発現し、エフェクターT細胞及び記憶T細胞におけるαβTCRを介してT細胞の完全活性化をもたらす。新に添加されたナイーブPBMC分化由来の単球のいくつかは、生産するサイトカインによって及び／又は１）又は２)におけるように、活性化されたT細胞との接触よって分化し、樹状細胞を形成する。樹状細胞は、T細胞の記憶を誘導するのみならず、MHCペプチド複合体の提示によって、in vivo環境下でT細胞の記憶を回復するとも考えられる。
【００２６】
本発明によれば、ガン性疾患の治療をするための因子を供することとの関連において、カスケードプライミングを使用する利点は、従来の、全ての公知の活性化方法と比較して、そのリンパ球における特異性及び記憶の誘導の速さにある。カスケードプライミングは、PBMC凝集体におけるT細胞が細胞傷害性能力を完全に得るまでに２４時間しか要さず、それは腫瘍ペプチド／抗原が不明のままで良い。
【００２７】
PBMC凝集体において、CD３活性化T細胞のみの場合に比べて明らかに高まったCAPRI細胞の有効性を説明する場合、特に、活性化の方法により、重要性が異なる様々な免疫細胞亜集団が生じることが考えられる。例えば、FACS分析(蛍光活性化細胞ソーター)により、CD４＋T細胞(ヘルパー細胞)及びCD８＋T細胞(細胞傷害性細胞)の発生及びまたCD４５RO＋T細胞(記憶T細胞)の発生における量的差異を確認できうる。PBMCのCD３活性化により約２５％のCD４＋T細胞及び約５８％のCD８＋T細胞がもたらされ；その逆は、記憶の刷り込みの場合に認められ、５４％のCD４＋T細胞及び２９％のCD８＋T細胞がもたらされた。この場合の最も有意な特徴は、カスケードプライミングの過程でのCD４５RO＋記憶細胞の上昇である。わずか３％の、刺激を受けていない(ナイーブ)PBMCがCD４５RO＋表現型を示し；２９％がCD３刺激化細胞を示し；そして４９％がCAPRI細胞を示す。カスケードプライミングの過程でのこのような記憶細胞の増加は、腫瘍細胞との戦いに関連して非常に重要であり、その理由は、記憶エフェクター細胞は、それらの細胞傷害活性のために、共刺激を必要としない、又は非常に弱い共刺激を必要とするからである。記憶エフェクター細胞の更なる特徴は、MHC制限溶解のためのそれらの能力である。
【００２８】
例えば、CAPRI細胞は同種異系ガン細胞系統、即ち、別な、関係のない患者のガン細胞系統を、非常に特異的な態様で、又はむしろMHC制限態様で、同種異系ガン細胞系統及び細胞傷害性CAPRI細胞が共通のMHC抗原を示す条件下で、溶解することができる。
【００２９】
既に説明されたように、記憶フェクター細胞は、カスケードプライミングの助けにより、未知の感染症の同定されていないペプチドに対して得られて良い。発ガンにおける慢性感染症のまだ知られてない又は時として知られる正確な機能は、集中的な調査の対象である。発ガンにおいて、多くのウィルス、例えば、頸部ガンにおけるヒトパピローマウィルス(HPV)１６／１８などが、重要なファクターであることが知られている。たとえ免疫原性ペプチドが依然として同定できていなくとも、他のウィルスも同様に疑わしい。例えば、JCウィルス(大腸ガンにおける重要な発ガン性因子であるようだ)である。CAPRI細胞を投与することにより、患者において結腸直腸ガンの退行を達成することが可能であるが、JCウィルスペプチド又は腫瘍細胞の他のペプチドのどちらが、CAPRI細胞の溶解活性による攻撃の実際の標的を構成するのかは不明確なままである。
【００３０】
CAPRI細胞は、０．５〜３０×１０６細胞／注射の投与量で用いられて良い。注射される細胞の量は、患者の年齢、体重及び／又は可能性のある２次疾患に依存して適合されて良い。治療の期間を長くすることで、注射される細胞の量を適切に増加やす又は減らすことが可能である。原則として、注射ごとの細胞の量は成人の患者において、１〜２０×１０６細胞／注射である。
【００３１】
注射は様々な時間間隔、例えば、１〜数回／週、２、３週おきに、又は更により長い間隔で投与されて良い。
【００３２】
CAPRI細胞の注射は皮内、静脈内及び／又は筋内に投与されて良い。もしも腫瘍の大きさが直径０．５cmを超えなければ、当該CAPRI細胞は腫瘍の周囲に注射する代わりに腫瘍中に投与されても良い。投与は、皮内注射と静脈注射を組合せて行われるのが好ましい。
【００３３】
好適な実施態様によれば、CAPRI細胞に加えて、１〜１５×１０６細胞の範囲内の投与量でCD３活性化細胞が患者に投与されている。CD３活性化細胞は、CAPRI細胞とは異なる体内の場所に投与されて良い、又は皮内CAPRI浸潤部位の近傍に投与されて良い。投与は、好適には、皮内注射及び／又は筋内注射により行われている。
【００３４】
本発明により、CAPRI細胞の使用によるガン性疾患の治療は、様々な種類の治療法に加えて行われても良い。例えば、CD３活性化細胞との組合せが適切なCAPRI細胞は、化学療法の範囲内で投与されている常用の因子に加えて、ガン性疾患の治療をするための因子を供する目的で用いられて良い。更に、これらの細胞は、放射線治療に加えて投与されて良い。
【実施例】
【００３５】
１．CAPRI細胞を生産するための方法
１）CD３活性化段階(２〜４時間)の開始：
１０〜２０×１０６個のPBMC(Ficoll−Hypaque 勾配により分離された)を１０〜１２mlの体積の培養培地(例えば、RPMI１６４０など)中で懸濁し、１０％HyCloneウシ胎児血清を補足して、そして固定化された抗CD３モノクローナル抗体上に沈殿させた。HyClone血清は、いつでも自己血清に置換して良い。
【００３６】
２）IL−２補助段階(２〜３時間)：
CD３活性化の２〜４時間後、２０UのIL−２／mlを活性化の補助及びアポトーシスを防ぐ目的で添加する。
【００３７】
３）刷り込み段階(１８〜２４時間)：
IL−２補助の２〜３時間後、ナイーブPBMCの刷り込みをするためにAPCを十分に活性化する。即ち、補足培養培地中の１０〜２０×１０６個のナイーブPBMCを刺激されたPBMCに加える。
【００３８】
４）増殖段階(７２時間、任意)：
刷り込みが終了したPBMC(今やCAPRI細胞である)を計測して、２０UのIL−２／mlを補捉した培地中で、およそ０．２〜０．４×１０６細胞／mlの濃度で再懸濁した。
【００３９】
５）CAPRI細胞の収穫：
増殖の７２時間後、細胞を収穫して分別し、２〜３０×１０６／アンプルアリコートで凍結した、あるいは処理の範囲内ですぐに用いた。
【００４０】
カスケードプライミングの様々な段階及び他の変形版における同種異系細胞の使用は、基本方法を変えることなく使用されて良い。
【００４１】
CAPRI細胞及びCD３活性化細胞の生産の詳細をWO９９／５０３９３(それは出願人の所有物である)に記載している。
【００４２】
２．CAPRI細胞を治療投与する手順
CAPRI細胞を少体積(１ml)のPBS(リン酸緩衝塩類溶液)中で再懸濁し、そして好適に皮内及び静脈内に注射する。それらを、筋内に注射しても良く、又は加えて、もし腫瘍の大きさが直径０．５cmを超えていなければ、腫瘍の周辺に浸潤させても良い。適応症により、この手順をアリコート約０．５×１０６CAPRI細胞で始めるが、しかし１回の注射につき３０×１０６超えない細胞が投与されるべきである。もし、更に、CD３活性化細胞が投与されているなら、注射を１〜２０×１０６個の細胞で行う。投与を皮内及び／又は筋内注射により行う。
【００４３】
３．CAPRI細胞活性のin−vitro研究
A)  固形ガン細胞系統をCAPRI細胞によって２４以内で溶解させた。それで明らかになったことは、CAPRI細胞をガン細胞系統を破壊した後に再度用いて良いことである。CAPRI細胞は、最大で７回まで他のガン細胞系統に対して適用することができ、そしてガン細胞を同じ効率で他のガン細胞系統を破壊することができた。これに関連して、CAPRI細胞を補助する目的のためにサイトカインを用いなかった。試験したガン細胞系統は、黒色腫(１系統)、胸部のガン(９系統)、結腸ガン(３系統)、多形性膠芽腫(２系統)及びボーエノイド・バピュローシス(１系統)を起源とした。特にボーエノイド腫瘍の場合、CAPRI細胞(即ち、患者の活性化PBMCで刷り込みをされたナイーブPBMC)が、ボーエノイド腫瘍細胞系統の存在下で活性化されて刷り込まれたPBMC細胞に比べて優位であることが明らかになった。前者は溶解をできたが、それに対して後者は溶解をできなかった。このボーエノイド腫瘍細胞の組成はこの点で、特に注目であり、その理由は、この腫瘍細胞系統はおよそ３％のみの腫瘍細胞からなり、残りの９７％は繊維芽細胞からなるからである。CAPRI細胞の能力である、繊維芽細胞に「隠れた」ガン細胞を発見する能力は、転移性病巣がかなりの頻度で繊維芽細胞層によって覆われていることとの関係において、何より最も重要である。
【００４４】
CAPRI細胞とは対照的に、CD３で活性化されただけの細胞は、上に列挙した固形ガン細胞系統を破壊することができなかった。腫瘍生検体又はガン細胞系統の新鮮単一細胞懸濁の場合、後者はCD３活性化細胞による溶解に感受性であることを繰り返し示すことは以前より可能であったという指摘をされるに違いない。しかし、これらの腫瘍細胞の場合、それは、酵素処理によって予め傷害され且つ固形腫瘍系統を再生及び構築する機会がなかった単一細胞懸濁が疑問であった。
【００４５】
B）新鮮腫瘍生検体を起源として生成した９つの乳ガン細胞系統による関連研究において、MHCクラスII制限溶解が明らかになった。例えば、HLAクラスII対立形質DQB１★０２０１を有する供与者由来のCAPRI細胞は、同種異型ガン細胞系統（これもHLA−DQB１★０２０１を有する）及び他の細胞系を溶解し、同種異型乳ガン細胞系統も同様にDQB１★０２０１に陽性であった。HLA−DQB1★０６０３制限化CAPRI細胞の場合にも同じことが起こった。HLA−DQB1★０６０３陽性同種異型ガン細胞系統及び他のHLA−DQB1★０６０３型のガン細胞系統のみが溶解した。乳ガンの場合HLAクラスII制限溶解が優先的であったが、それでもなおこの場合HLAクラスＩ制限溶解も確認された。HLAクラスII分子を提示するものに対する抗体はガン細胞の溶解を完全に遮断し、その一方でHLAクラスＩ分子に対する抗体は、わずかにのみガン細胞の溶解を減らした。しかしながら、カスケードプライミングの後に、磁気ビーズ分離によってCD４＋、又はCD８＋免疫細胞を除去することにより、残りのCAPRI細胞の溶解活性の完全な喪失がもたらされた。対照的に、CD５６＋又はCD５７＋ナチュラルキラー細胞を除去することによる溶解活性に対する影響は実際上なかった。これは、CAPRI細胞はHLAクラスＩ制限溶解も行うが、主にHLAクラスII制限溶解を行うという結論を指す。CD４もしくはCD８に対して陽性であるが、CD５６もしくはCD５７に対して陰性であるナチュラルキラー細胞は、わずかに、CAPRI細胞の溶解活性に寄与する可能性がある。
【００４６】
４．In vivo研究
A)  CAPRI細胞のin vivoでの効果をアクセス可能な腫瘍による試験に基づき確認できた。以下の腫瘍を処理して試験した。その腫瘍は：黒色腫の患者１人、乳ガンの患者２人の皮膚転移、卵巣がん患者１人の皮膚転移及びボーエノイド腫瘍乳頭腫の患者１人、の腫瘍である。適用の方法は、もし腫瘍大きさが直径０．５cm未満であったならば、腫瘍の中及び周辺への直接注射であった。より大きな腫瘍において、例えば卵巣ガンの患者の５cm×８cmと測定される皮膚転移の場合、注射を腫瘍の縁部、即ち、増殖領域に行った。このような処理をした腫瘍の全てが、週１回又は週２回の注射の後、６〜８週で急速に後退した。この結果は、特にボーエノイド乳頭腫の患者の場合、注目に値する。何故なら、この患者は、Munich Universityの皮膚科病院においてレーザー手術及びクリームの局所適用による治療を１年以内に５回受けていたからだ。それにもかかわらず、CAPRI細胞を注射する以前は、腫瘍細胞が外陰部及び肛門部において再出現しつづけていた。現在、その患者は２年間に渡り腫瘍を伴っていない。
【００４７】
B)  CAPRI細胞のin vivoでの効果の研究範囲内で、肝臓転移(生検並びに超音波及びCTの両方によって検出された)を５つ示した乳ガン細胞患者を治療した。この患者に対して静脈内にCAPRI細胞を、１週につき２回の注射で２０×１０６以上、しかし３０×１０６を超えず投与した。この患者はCAPRI細胞による治療期間中は他の治療を受けなかった。最初に明らかな腫瘍後退の徴候が、８週後、超音波診断によって確認できた。転移性結腸癌の患者４人中４人において、CAPRI細胞による治療で有意に腫瘍の後退が導かれた。これら患者４人中２人が、かなりの副作用が理由によりそして／又は効果がないことが理由で、もはやどんな化学療法も受けていなかった。
【００４８】
C)  A)及びB)に記載した患者の場合、更なる医薬を投与しなかった又は従来の薬物療法を変えなかった。CAPRI細胞に加えて、CD３活性化細胞も用いた。
【００４９】
D)  上記のCAPRI細胞の効果を自己系統において達成した。しかし、カスケードプライミングの様々な段階において、同種異系(外来)細胞も用いて良い。これは、化学療法を受けている間に免疫細胞の大多数を失ったわずかかな患者にのみ行ってきた。同種異系細胞は時折CAPRI細胞の溶解活性を高めうる。例えば、活性化の第１段階のために患者の細胞を用いることが可能であり（「CAPRI細胞を生産する方法」、段階１及び２を参照のこと）、そして患者の自己活性化PBMCで刷り込みをするために同種異系ナイーブPBMC（アロCAPRI）を用いることも可能である。結腸直腸ガン患者がいるある家族において、その父親はガン性疾患を全く発症していないが、結腸でポリープが繰り返し出現している。その現象は周知のように、ガンの初期段階を告げうる。父親のAPC（アロAPC）を患者のナイーブ免疫細胞の刷り込みをする目的で用いることができた。この場合、父親のAPCを患者のナイーブPBMCの刷り込みに用いることができ、そしてこれにより記憶エフェクター細胞の形成がもたらされる（その結果は、患者のガン細胞系統に基づき試験できた）。このような特別な家族の状況では、アロ−アロ−CAPRI細胞をも誘導することができる。それは即ち、父親の活性化APCを父親のナイーブPBMCの刷り込みをするのに用いることができ、そしてこうして獲得した細胞を患者（息子）のガン細胞系統を溶解するのに用いることができる。患者のガン細胞系統に対するアロ―アロ―CAPRI細胞として用いられた父親のこれらCAPRI細胞は、患者の細胞、患者のAPC又はガン細胞のどちらとも全く接触しておらず、そしてかかるガン細胞から溶出したペプチドとさえも接触していないということが指摘されるに違いない。