(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）メチル化シトシン又はシトシンが露出しているＤＮＡ断片混合物を調製する工程、
（２）前記工程で得られたＤＮＡ断片混合物を、抗メチル化シトシン抗体又は抗シトシン抗体と接触させ、前記抗体と反応して免疫複合体を形成したＤＮＡ断片群と、前記抗体と反応しなかったＤＮＡ断片群とに分離するか、あるいは、前記抗体に対して高親和性を示すＤＮＡ断片群と、前記抗体に対して低親和性を示すＤＮＡ断片群とに分離する工程、
（３）前記の各ＤＮＡ断片群に含まれるＤＮＡ断片の全部又は一部を同定する工程、及び（４）前記工程で同定されたＤＮＡ断片とそれぞれハイブリダイズ可能な核酸を基板上に配置する工程
を含み、
前記工程（１）で調製するメチル化シトシン又はシトシンが露出しているＤＮＡ断片混合物が、
（ａ）ゲノムＤＮＡを、認識部位のメチル化の有無に関係なく切断可能であって、しかも、メチル化シトシン又はシトシンを含む突出末端を生じさせる制限酵素で消化することによって得られる、前記突出末端にメチル化シトシン又はシトシンが露出しているＤＮＡ断片混合物であって、且つ、前記制限酵素でゲノムＤＮＡを消化する前に、一本鎖ＤＮＡを分解するヌクレアーゼで前記ゲノムＤＮＡが前処理されているＤＮＡ断片混合物であるか、あるいは、
（ｂ）ゲノムＤＮＡを断片化し、更に、その全長又は部分領域を一本鎖化することによって得られる、前記一本鎖化領域にメチル化シトシン又はシトシンが露出している一本鎖ＤＮＡ断片又は部分一本鎖ＤＮＡ断片の混合物であって、且つ、全長又は部分領域を一本鎖化する前に、一本鎖ＤＮＡを分解するヌクレアーゼで前記ゲノムＤＮＡ又は断片化ゲノムＤＮＡが前処理されているＤＮＡ断片混合物である
ことを特徴とする、ＤＮＡアレイの製造方法。
【請求項２】
前記工程（２）におけるＤＮＡ断片混合物と抗体との接触に際し、その少なくとも１つの抗原抗体反応を、抗原抗体反応における１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下において実施することにより、前記抗体と反応して免疫複合体を形成したＤＮＡ断片群として、前記抗体に２価結合で結合可能なＤＮＡ断片群と、前記抗体と反応しなかったＤＮＡ断片群として、前記抗体に１価結合で結合可能なＤＮＡ断片群とに分離する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記工程（２）におけるＤＮＡ断片混合物と抗体との接触に際し、その少なくとも１つの抗原抗体反応を、１価結合と２価結合との違いに基づいて、高親和性を示すＤＮＡ断片群と低親和性を示すＤＮＡ断片群とに分離することのできる条件下において実施することにより、高親和性を示すＤＮＡ断片群として、前記抗体に２価結合で結合可能なＤＮＡ断片群と、低親和性を示すＤＮＡ断片群として、前記抗体に１価結合で結合可能なＤＮＡ断片群とに分離する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
（１）分析対象ＤＮＡから、メチル化シトシン又はシトシンが露出しているＤＮＡ断片混合物を調製する工程、
（２）前記工程で得られたＤＮＡ断片混合物を、抗メチル化シトシン抗体又は抗シトシン抗体と接触させ、前記抗体と反応して免疫複合体を形成したＤＮＡ断片群と、前記抗体と反応しなかったＤＮＡ断片群とに分離するか、あるいは、前記抗体に対して高親和性を示すＤＮＡ断片群と、前記抗体に対して低親和性を示すＤＮＡ断片群とに分離する工程、及び
（３）前記の各ＤＮＡ断片群に含まれるＤＮＡ断片の全部又は一部をＤＮＡアレイで分析する工程
を含み、
前記工程（１）で調製するメチル化シトシン又はシトシンが露出しているＤＮＡ断片混合物が、
（ａ）ゲノムＤＮＡを、認識部位のメチル化の有無に関係なく切断可能であって、しかも、メチル化シトシン又はシトシンを含む突出末端を生じさせる制限酵素で消化することによって得られる、前記突出末端にメチル化シトシン又はシトシンが露出しているＤＮＡ断片混合物であって、且つ、前記制限酵素でゲノムＤＮＡを消化する前に、一本鎖ＤＮＡを分解するヌクレアーゼで前記ゲノムＤＮＡが前処理されているＤＮＡ断片混合物であるか、あるいは、
（ｂ）ゲノムＤＮＡを断片化し、更に、その全長又は部分領域を一本鎖化することによって得られる、前記一本鎖化領域にメチル化シトシン又はシトシンが露出している一本鎖ＤＮＡ断片又は部分一本鎖ＤＮＡ断片の混合物であって、且つ、全長又は部分領域を一本鎖化する前に、一本鎖ＤＮＡを分解するヌクレアーゼで前記ゲノムＤＮＡ又は断片化ゲノムＤＮＡが前処理されているＤＮＡ断片混合物である
ことを特徴とする、前記分析対象ＤＮＡのメチル化分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ修飾化（特にはＤＮＡメチル化）分析用ＤＮＡアレイ及びその製造方法並びにＤＮＡ修飾化（特にはＤＮＡメチル化）分析方法に関する。また、本発明は、ＤＮＡ断片の精製方法（取得方法）に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物が持つ遺伝情報はＤＮＡの中に集約されている。高等動物において、組織を構成する各細胞種間の塩基配列（遺伝情報）は同一であるが、細胞の表現型は各遺伝子の発現調節によって決定されており、ゲノムＤＮＡのメチル化はその場面で大きな役目を担っている。卵子および精子のＤＮＡは受精直後に一旦リセットされ、リプログラミングが行われる。個体は発生後も細胞の分裂に伴ってＤＮＡのメチル化状態を微妙に変化させており、個体老化との関連が注目されている。ゲノムのメチル化がこのように老化に伴って好ましくない方向へ変化すると、働くべき遺伝子が抑制されたり、逆に働いてはいけない遺伝子が発現してしまうといった、生物個体には好ましくない状態が生じてしまう。このようなＤＮＡの異常なメチル化は、がん細胞でも観察され、特にＣｐＧアイランドのメチル化亢進によるがん抑制遺伝子群の不活性化が高頻度に観察される。【０００３】
このように、ＤＮＡ鎖のメチル化は、がんをはじめとする様々な疾患の重要な指標であり、また遺伝子発現の制御に関係することから、例えば、細胞の分化の程度を把握するための指標ともなり、これまでにその測定方法が様々に検討されている。
一方、例えば、医療の現場においてＤＮＡメチル化を測定する場合には、迅速かつ正確に判定結果が得られることが求められている。しかしながら、このような観点からは従来の各方法は、必ずしも好ましい方法ではなかった。【０００４】
現在までに行われてきたＤＮＡのメチル化分析法、特に５−メチルシトシンの分析法には、例えば、
（１）試料ＤＮＡを酵素処理により単塩基にまで分解し、これをクロマトグラフィーやＥＬＩＳＡ法を応用して定量する方法、
（２）試料ＤＮＡ中のシトシン塩基を、亜硫酸水素イオン（bisulfite）などの薬剤処理によりウラシルに変化させ、メチル化ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする、あるいはメチル化していないＤＮＡに特異的にハイブリダイズするＰＣＲ用プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅産物の出現のあるなしにより、プライマーがハイブリダイズする領域のメチル化を分析する方法、
（３）前記（２）の方法と同様にして亜硫酸水素イオン処理したＤＮＡを用いて、そのＤＮＡ配列を直接シーケンシングする方法、又は
（４）亜硫酸水素イオン−ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single strand conformational polymorphism）法（非特許文献１）
が知られている。【０００５】
しかし、これらの分析法のいずれも、特定のシトシンのメチル化、あるいは、特定領域に含まれる複数のシトシンのメチル化を分析することを目的としており、ゲノムＤＮＡのメチル化の状態を網羅的に分析することはできなかった。【０００６】
これに対して、ゲノムＤＮＡ中のメチル化される可能性のある部位［以下、メチレーションサイト（methylation site）と称する。なお、実際にメチル化されているメチレーションサイトは、メチル化部位（methylated site）と称する］の網羅的な解析を可能とするＤＮＡアレイ（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、又はバイオチップ等の種々の別称があるが、本明細書ではこれらを総称してＤＮＡアレイと称する）が、特許文献１に開示されている。【０００７】
この特許文献１には、同じ認識部位を切断するメチル化感受性制限酵素（例えば、ＳｍａＩ）が存在するメチル化非感受性制限酵素（例えば、ＸｍａＩ）でゲノムＤＮＡを消化することにより得られる複数種類のＤＮＡ断片（あるいは、その塩基配列の一部を化学合成したオリゴヌクレオチドプローブ）を、それぞれ、基板上の異なる位置に固定したＤＮＡアレイと、それを用いたメチル化部位のメチル化検出方法とが開示されている。なお、メチル化非感受性制限酵素とは、認識部位のメチル化の有無に関係なく、認識部位を切断可能な制限酵素であり、メチル化感受性制限酵素とは、認識部位のメチル化の有無により、切断活性が影響される制限酵素である。【０００８】
前記検出方法では、（１）分析対象であるゲノムＤＮＡをメチル化感受性制限酵素（例えば、ＳｍａＩ；平滑末端を生じさせる制限酵素であり、認識配列中にメチル化シトシンを含む場合、その配列を切断することができない）で消化した後、（２）更に、同じ認識部位を切断する（但し、消化により出現する切断末端が異なる）メチル化非感受性制限酵素（例えば、ＸｍａＩ；５’突出末端を生じさせる制限酵素）で消化し、（３）続いて、両端が前記メチル化非感受性制限酵素による切断末端であるＤＮＡ断片のみを特異的に増幅した後、（４）増幅したＤＮＡ断片を、前記ＤＮＡアレイを用いて検出する。なお、前記工程（３）における特定ＤＮＡ断片（すなわち、両端が前記メチル化非感受性制限酵素による切断末端であるＤＮＡ断片）のみを特異的に増幅する手段としては、ＸｍａＩアダプターを連結させた後、前記アダプターの部分塩基配列を含むプライマーを用いるＰＣＲ法が開示されている。【０００９】
特許文献１に開示の前記検出方法では、メチル化感受性制限酵素（認識配列中にメチル化シトシンを含む場合、その配列を切断することができない）で消化した後、メチル化非感受性制限酵素で消化するため、前記メチル化非感受性制限酵素で切断される認識部位は、必ずメチル化シトシンを含む。従って、工程（３）で増幅されるＤＮＡ断片の両端は、いずれも、メチル化シトシンを含む認識部位、すなわち、メチル化されたメチレーションサイト（すなわち、メチル化部位）に由来しており、工程（４）において、メチル化部位に挟まれたＤＮＡ断片のみが検出される。【００１０】
このように、特許文献１に記載の検出方法では、両端のメチレーションサイトが両方ともメチル化されているＤＮＡ断片のみが検出可能であるが、片方のみがメチル化されているＤＮＡ断片を検出することはできないため、生体内で起き得る微妙なメチル化の変化を無視してしまう欠点がある。例えば、がん細胞では、通常はメチル化率が低いＣｐＧアイランドが高度にメチル化されてしまうことが高頻度に観察されるが、このように通常メチル化されていないＤＮＡ断片の微妙なメチル化の増加、すなわち、ＤＮＡ断片の片方のみがメチル化されるような場合の検出を行うことはできない。【００１１】
また、特許文献１に記載の検出方法では、２段階の制限酵素消化を実施するため、その消化処理に時間がかかる欠点がある。また、消化後のアダプター連結処理では、塩濃度が高いとライゲーション効率が低くなるため、消化後に脱塩濃縮処理を実施することが好ましいが、その操作も煩雑である。更に、ＤＮＡ増幅に一般的に使用されるＰＣＲでは、ＤＮＡ断片のサイズが異なる場合、通常、短いサイズのＤＮＡ断片が優先的に増幅されてしまうため、同じ効率で増幅を行うことが難しいという欠点がある。【００１２】
更に、特許文献１に記載のＤＮＡアレイは、メチル化非感受性制限酵素（例えば、ＸｍａＩ）でゲノムＤＮＡを消化することにより得られる複数種類のＤＮＡ断片又は化学合成したオリゴヌクレオチドプローブを、それぞれ、基板上の異なる位置に固定しただけであり、各ＤＮＡ断片又はオリゴヌクレオチドプローブには、特に特徴は見当たらない。【００１３】
【非特許文献１】エム・前川（Ｍ．Ｍａｅｋａｗａ）ら，「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」，（オランダ），１９９９年，２６２巻，ｐ．６７１−６７６
【特許文献１】特開２００３―３８１８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、本発明の課題は、従来技術のこれらの欠点を解消し、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）のメチレーションサイトの網羅的な解析を可能とするＤＮＡメチル化分析用ＤＮＡアレイ及びその製造方法並びにＤＮＡメチル化分析方法を提供することにある。本発明は、ＤＮＡにおけるシトシンのメチル化の分析に特に好ましく利用することができるが、それ以外の塩基における各種修飾の分析にも利用することができる。【００１５】
より具体的には、両端のメチレーションサイトが両方ともメチル化されているＤＮＡ断片だけでなく、片方のみがメチル化されているＤＮＡ断片、あるいは、両方ともメチル化されていないＤＮＡ断片を、複雑な操作を必要とすることなく、検出可能なＤＮＡアレイ及びＤＮＡメチル化分析方法を提供することにある。また、アレイ上に配置する各核酸を、両端のメチレーションサイトの状態に応じて適宜分類して配置可能な、ＤＮＡアレイ製造方法を提供することにある。更には、一本鎖領域（例えば、ステムループ構造、あるいは、核酸が二本鎖ＤＮＡに結合することにより形成される三本鎖構造）におけるメチレーションサイトのメチル化の状態を分析可能なＤＮＡメチル化分析方法及びＤＮＡアレイ製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記課題は、本発明による、
（１）修飾塩基（特にはメチル化シトシン）又は塩基（特にはシトシン）が露出しているＤＮＡ断片混合物を調製する工程（以下、調製工程と称する）、
（２）前記工程で得られたＤＮＡ断片混合物を、抗修飾塩基（特にはメチル化シトシン）抗体又は抗塩基（特にはシトシン）抗体と接触させ、前記抗体と反応して免疫複合体を形成したＤＮＡ断片群（以下、複合体形成ＤＮＡ断片群と称する）と、前記抗体と反応しなかったＤＮＡ断片群（以下、未反応ＤＮＡ断片群と称する）とに分離するか、あるいは、前記抗体に対して高親和性を示すＤＮＡ断片群（以下、高親和性ＤＮＡ断片群と称する）と、前記抗体に対して低親和性を示すＤＮＡ断片群（以下、低親和性ＤＮＡ断片群と称する）とに分離する工程（以下、抗体接触工程と称する）、
（３）前記の各ＤＮＡ断片群に含まれるＤＮＡ断片の全部又は一部を同定する工程（以下、同定工程と称する）、及び
（４）前記工程で同定されたＤＮＡ断片とそれぞれハイブリダイズ可能な核酸を基板上に配置する工程（以下、配置工程と称する）
を含むことを特徴とする、ＤＮＡアレイの製造方法により解決することができる。
【００１７】
本発明の製造方法の好ましい態様によれば、前記調製工程（１）で調製する修飾塩基又は塩基が露出しているＤＮＡ断片混合物が、
（ａ）ゲノムＤＮＡを、「認識部位の修飾（特にはメチル化）の有無に関係なく切断可能であって、しかも、修飾塩基（特にはメチル化シトシン）又は塩基（特にはシトシン）を含む突出末端を生じさせる制限酵素」で消化することによって得られる、前記突出末端に修飾塩基（特にはメチル化シトシン）又は塩基（特にはシトシン）が露出しているＤＮＡ断片混合物［以下、ＤＮＡ断片混合物（ａ）と称する］、
（ｂ）ゲノムＤＮＡを断片化し、更に、その全長又は部分領域を一本鎖化することによって得られる、前記一本鎖化領域に修飾塩基（特にはメチル化シトシン）又は塩基（特にはシトシン）が露出している一本鎖ＤＮＡ断片又は部分一本鎖ＤＮＡ断片の混合物［以下、ＤＮＡ断片混合物（ｂ）と称する］、あるいは、
（ｃ）一本鎖状態の領域を含み、その一本鎖領域に修飾塩基（特にはメチル化シトシン）又は塩基（特にはシトシン）が露出しているＤＮＡ断片混合物［以下、ＤＮＡ断片混合物（ｃ）と称する］
である。【００１８】
本発明の製造方法の別の好ましい態様によれば、前記ＤＮＡ断片混合物（ａ）において、前記制限酵素でゲノムＤＮＡを消化する前に、一本鎖ＤＮＡを分解するヌクレアーゼで前記ゲノムＤＮＡが前処理されている。
本発明の別の好ましい態様によれば、前記ＤＮＡ断片混合物（ｂ）において、全長又は部分領域を一本鎖化する前に、一本鎖ＤＮＡを分解するヌクレアーゼで前記ゲノムＤＮＡ又は断片化ゲノムＤＮＡが前処理されている。【００１９】
本発明の製造方法の別の好ましい態様によれば、前記抗体接触工程（２）におけるＤＮＡ断片混合物と抗体との接触に際し、その少なくとも１つの抗原抗体反応を、「抗原抗体反応における１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下」において実施することにより、（前記抗体と反応して免疫複合体を形成したＤＮＡ断片群としての）前記抗体に２価結合で結合可能なＤＮＡ断片群と、（前記抗体と反応しなかったＤＮＡ断片群としての）前記抗体に１価結合で結合可能なＤＮＡ断片群とに分離する。【００２０】
より具体的には、例えば、調製工程で得られたＤＮＡ断片混合物を、通常の抗原抗体反応の条件下で、抗メチル化シトシン抗体（又は抗シトシン抗体）と接触させることにより、免疫複合体を形成した状態の複合体形成ＤＮＡ断片群と、未反応ＤＮＡ断片群とに分離した後、前記免疫複合体を、「１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる抗原抗体反応条件下」におくことにより、（複合体形成ＤＮＡ断片群としての）両方の突出末端にメチル化シトシン（又はシトシン）が存在するＤＮＡ断片群と、（未反応ＤＮＡ断片群としての）一方の突出末端のみにメチル化シトシン（又はシトシン）が存在するＤＮＡ断片とに分離することができる。【００２１】
本発明の製造方法の別の好ましい態様によれば、前記抗体接触工程（２）におけるＤＮＡ断片混合物と抗体との接触に際し、その少なくとも１つの抗原抗体反応を、「１価結合と２価結合との違いに基づいて、高親和性を示すＤＮＡ断片群と低親和性を示すＤＮＡ断片群とに分離することのできる条件下」において実施することにより、（高親和性を示すＤＮＡ断片群としての）前記抗体に２価結合で結合可能なＤＮＡ断片群と、（低親和性を示すＤＮＡ断片群としての）前記抗体に１価結合で結合可能なＤＮＡ断片群とに分離する。【００２２】
また、本発明は、前記製造方法により得ることのできる、ＤＮＡアレイに関する。
また、本発明は、
（１）修飾塩基（特にはメチル化シトシン）又は塩基（特にはシトシン）を含む突出末端を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の突出末端に修飾塩基（特にはメチル化シトシン）が存在するＤＮＡ断片、
（２）修飾塩基（特にはメチル化シトシン）又は塩基（特にはシトシン）を含む突出末端を両端に有するＤＮＡ断片であって、一方の突出末端のみに修飾塩基（特にはメチル化シトシン）が存在するＤＮＡ断片、又は
（３）修飾塩基（特にはメチル化シトシン）又は塩基（特にはシトシン）を含む突出末端を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の突出末端のいずれにも修飾塩基（特にはメチル化シトシン）が存在しないＤＮＡ断片
のいずれか１つのＤＮＡ断片のみを含むことを特徴とする、ＤＮＡ断片群に関する。
また、本発明は、前記ＤＮＡ断片群に含まれるＤＮＡ断片の全部又は一部とそれぞれハイブリダイズ可能な核酸が基板上に配置されていることを特徴とする、ＤＮＡアレイに関する。【００２３】
また、本発明は、
（１）分析対象ＤＮＡから、修飾塩基（特にはメチル化シトシン）又は塩基（特にはシトシン）が露出しているＤＮＡ断片混合物を調製する工程（以下、調製工程と称する）、
（２）前記工程で得られたＤＮＡ断片混合物を、抗修飾塩基（特にはメチル化シトシン）抗体又は抗塩基（特にはシトシン）抗体と接触させ、前記抗体と反応して免疫複合体を形成したＤＮＡ断片群と、前記抗体と反応しなかったＤＮＡ断片群とに分離するか、あるいは、前記抗体に対して高親和性を示すＤＮＡ断片群と、前記抗体に対して低親和性を示すＤＮＡ断片群とに分離する工程（以下、抗体接触工程と称する）、及び
（３）前記の各ＤＮＡ断片群に含まれるＤＮＡ断片の全部又は一部を、ＤＮＡアレイで分析する工程（以下、分析工程と称する）
を含むことを特徴とする、前記分析対象ＤＮＡの修飾化（特にメチル化）分析方法に関する。【００２４】
更に、本発明は、突出末端を有する二本鎖ＤＮＡ断片と、前記突出末端に含まれる塩基に対する抗体とを接触させることを特徴とする、前記ＤＮＡ断片の精製方法に関する。【００２５】
本明細書において、「シトシン」とは、メチル化されていないシトシン、すなわち、非メチル化シトシンを意味する。また、「メチル化されたシトシン」とは、５−メチルシトシンを意味する。【００２６】
本明細書において、「抗メチル化シトシン抗体」とは、特に断らない限り、メチル化シトシンと特異的に反応するが、シトシンとは特異的に反応しない抗体を意味する。また、「抗シトシン抗体」とは、特に断らない限り、シトシンと特異的に反応するが、メチル化シトシンとは特異的に反応しない抗体を意味する。【００２７】
本明細書における用語「抗体」は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであることもでき、前記「抗体」には、狭義の抗体（すなわち、免疫グロブリン分子それ自体）が含まれるだけでなく、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖが含まれるものとする。【００２８】
本明細書において、「塩基」とは、天然又は化学合成を問わず、核酸（天然ＤＮＡ及びＲＮＡ並びにその人工的修飾体を含む）と水素結合を形成することができる塩基を意味し、例えば、シトシン、アデニン、グアニン、チミン、又はウラシルを挙げることができ、好ましくはシトシンである。また、「修飾塩基」とは、前記核酸に含まれることのできる修飾塩基を意味し、前記「修飾」としては、例えば、メチル化、酸化、二量体化、アルキル化を挙げることができ、好ましくはメチル化である。前記「修飾塩基」としては、例えば、メチル化シトシン、メチル化アデニン、メチル化グアニン、オキソグアニン（例えば、８−オキソグアニン）、ヒドロキシアデニン（例えば、２−ヒドロキシアデニン）、チミジンダイマー、アルキル化グアニンを挙げることができ、好ましくはメチル化シトシンである。例えば、オキソグアニン又はチミジンダイマーは、生物にとって望ましくない変化であり、本発明により、グアニンの酸化的修飾又はチミジンダイマー生成を分析することができる。また、アルキル化グアニンの有無は、変異誘起物質であるアルキル化剤による影響の指標として利用することができる。更に、８−オキソグアニン又は２−ヒドロキシアデニンは、活性酸素によるゲノム損傷により生じる修飾塩基であり、その有無を分析することにより、活性酸素の影響を分析することができる。【００２９】
以下、本発明のＤＮＡ修飾化分析用ＤＮＡアレイ及びその製造方法並びにＤＮＡ修飾化分析方法を、塩基及び修飾塩基がシトシン及びメチル化シトシンである場合を例にとって、ＤＮＡメチル化分析用ＤＮＡアレイ及びその製造方法並びにＤＮＡメチル化分析方法として説明するが、本発明は、塩基及び修飾塩基がシトシン及びメチル化シトシンである場合に限定されるものではなく、任意の塩基及び修飾塩基についても、当業者であれば、本明細書の開示及び技術常識に基づいて、同様に実施することが可能である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のメチル化分析方法によれば、各分析対象細胞におけるＤＮＡアレイ上のポジティブスポット及び／又はネガティブスポットの傾向（すなわち、数の大小）から、前記細胞のゲノムＤＮＡにおけるメチル化率を判定することができ、更には、ポジティブスポット及び／又はネガティブスポットのプロフィールから、その細胞の状態（例えば、がん細胞の悪性度、細胞の分化状態、疾病への罹患の有無）についても把握することができる。【００３１】
また、本発明の製造方法によれば、本発明のメチル化分析方法に用いることのできる、本発明のＤＮＡアレイを製造することができる。本発明の製造方法によれば、分析対象細胞に由来するゲノムＤＮＡを適当なメチル化非感受性制限酵素で消化して得られるＤＮＡ断片に関して、両端のメチレーションサイトが両方ともメチル化されているＤＮＡ断片、片方のみがメチル化されているＤＮＡ断片、及び／又は両方ともメチル化されていないＤＮＡ断片を区別して基板上に固定したＤＮＡアレイを製造することができる。これらのＤＮＡアレイを用いると、メチル化のわずかな変化、例えば、一方のメチレーションサイトのみがメチル化されるような変化も検出することができる。【００３２】
また、本発明によれば、一本鎖領域（例えば、ステムループ構造、あるいは、核酸が二本鎖ＤＮＡに結合することにより形成される三本鎖構造）におけるメチレーションサイトのメチル化の状態を分析することができる。これまで、このような一本鎖領域におけるメチル化状態を分析する方法が全く知られていなかっただけでなく、その課題すら認識されることはなかったが、本発明によれば、前記領域のメチル化状態を、複雑な操作を必要とすることなく、検出可能なＤＮＡアレイ及びＤＮＡメチル化分析方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】一分子の抗体が一方の抗原結合部位で二本鎖ＤＮＡと結合する１価結合の状態を示す模式図である。
【図２】一分子の抗体が２箇所の抗原結合部位で二本鎖ＤＮＡと結合する２価結合の状態を示す模式図である。
【図３】担体に固定された二分子の抗体がそれぞれ１箇所の抗原結合部位で二本鎖ＤＮＡと結合する２価結合の状態を示す模式図である。
【図４】二分子の抗体がそれぞれ１箇所の抗原結合部位で二本鎖ＤＮＡと結合している状態を示す模式図である。
【図５】ＭＯＮＩＣ法の各工程を模式的に示す説明図である。
【図６】MONIC-LoopTrap法の各工程を模式的に示す説明図である。
【図７】ＤＮＡ断片混合物からＭＯＮＩＣ法により分離取得した吸着画分に含まれるＤＮＡ断片を、電気泳動により分析した結果を示す図面である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
［１］本発明のＤＮＡアレイ及びその製造方法
本発明のＤＮＡアレイ製造方法は、調製工程、抗体接触工程、同定工程、及び配置工程を含む。
本発明のＤＮＡアレイ製造方法には、抗体接触工程で用いる抗体の特異性の違いにより、少なくとも１つのメチル化シトシンが露出しているＤＮＡ断片を分析可能なＤＮＡアレイ（以下、メチル化シトシン型アレイと称する）を得ることのできる製造方法（以下、メチル化シトシン型製造方法と称する）と、少なくとも１つのシトシンが露出しているＤＮＡ断片を分析可能なＤＮＡアレイ（以下、シトシン型アレイと称する）を得ることのできる製造方法（以下、シトシン型製造方法と称する）とが含まれる。
また、本発明のＤＮＡアレイ製造方法には、使用するＤＮＡ断片混合物の種類に応じて、前記ＤＮＡ断片混合物（ａ）又はＤＮＡ断片混合物（ｂ）を用いる態様［以下、修飾核酸免疫捕捉法（modified nuculeotide immunocapturing method; MONIC法）と称する］と、前記ＤＮＡ断片混合物（ｃ）を用いる態様［以下、修飾核酸免疫捕捉法・ループ型（modified nuculeotide
immunocapturing/loop-trap method; MONIC-Loop Trap法）と称する］とが含まれる。【００３５】
本発明の製造方法に含まれるメチル化シトシン型製造方法では、抗体接触工程で用いる抗体として、少なくとも抗メチル化シトシン抗体、すなわち、メチル化シトシンと特異的に反応するが、シトシンとは特異的に反応しない抗体を使用する。
一方、本発明の製造方法に含まれるシトシン型製造方法では、抗体接触工程で用いる抗体として、少なくとも抗シトシン抗体、すなわち、シトシンと特異的に反応するが、メチル化シトシンとは特異的に反応しない抗体を使用する。
なお、前記メチル化シトシン型製造方法又はシトシン型製造方法において、抗メチル化シトシン抗体及び抗シトシン抗体を組み合わせて使用することもできる。
以下、メチル化シトシン型製造方法及びメチル化シトシン型ＤＮＡアレイについて説明し、続いて、シトシン型製造方法及びシトシン型ＤＮＡアレイについて説明する。【００３６】
（１）メチル化シトシン型製造方法及びＤＮＡアレイ
本発明のメチル化シトシン型製造方法における調製工程では、適当なＤＮＡ材料から、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンが露出しているＤＮＡ断片混合物を調製する。
前記調製工程で用いるＤＮＡ材料としては、本発明のメチル化分析方法において分析対象とすることのできるＤＮＡ、すなわち、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む可能性のあるＤＮＡである限り、特に限定されるものではなく、例えば、細胞（例えば、動物細胞又は植物細胞）のゲノムＤＮＡ、あるいは、生体試料又はそれに由来する試料（例えば、血液、血漿、血清、尿、リンパ液、髄液、唾液、腹水、羊水、粘液、乳汁、胆汁、胃液、又は透析実施後の人工透析液など）に存在する遊離ＤＮＡ断片混合物を挙げることができる。【００３７】
細胞のゲノムＤＮＡを使用する場合には、前記細胞として、メチル化率の高い細胞を用いることが好ましい。メチル化シトシン型製造方法では、メチル化シトシンの有無に基づいて、ＤＮＡアレイに配置するＤＮＡ断片を選択するからである。メチル化率の高い細胞を用いることにより、調製工程で得られるＤＮＡ断片混合物中に含まれる、少なくとも１つのメチル化シトシンが露出しているＤＮＡ断片の比率を高めることができる。
メチル化率の高い細胞としては、正常細胞と比較してメチル化率が高い細胞、例えば、がん細胞、精子、又は植物の種子を挙げることができる。また、１種類の細胞のみを用いることもできるし、複数種類の細胞の混合物として使用することもできる。なお、正常細胞のメチル化率は、例えば、組織若しくは器官の種類、加齢、外部要因、個体発生段階、分化、又は脱分化などの条件に応じて変動があるため、ＤＮＡアレイの使用目的（特に分析対象細胞の種類）に応じて、調製工程で用いる細胞を適宜選択することが好ましい。【００３８】
メチル化シトシン型製造方法における調製工程において、ＤＮＡ材料として細胞のゲノムＤＮＡを使用する場合、そのゲノムＤＮＡから、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンが露出しているＤＮＡ断片混合物を調製する手段としては、例えば、
（ａ）認識部位のメチル化の有無に関係なく切断可能（すなわち、メチル化非感受性）であって、しかも、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む突出末端（以下、Ｃ含有突出末端と称する）を生じさせる制限酵素を用いて、ゲノムＤＮＡを消化する方法、又は
（ｂ）ゲノムＤＮＡを断片化し、更に、その全長又は部分領域を一本鎖化して、一本鎖ＤＮＡ断片又は部分一本鎖ＤＮＡ断片の混合物を調製する方法
など挙げることができる。【００３９】
調製工程において、Ｃ含有突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素を使用すると、ゲノムＤＮＡの断片化と同時に、制限酵素により生じる突出末端に、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを露出させることができる。
高等動物では、５’−ＣＧ−３’配列におけるＣ（シトシン）がメチル化されるため、前記ＣＧ配列を含む突出末端（以下、ＣＧ含有突出末端と称する）を生じさせるメチル化非感受性制限酵素を用いることが好ましい。このような制限酵素としては、例えば、表１に示す制限酵素を挙げることができる。表１において、下線で示すＣは、メチル化される可能性のあるシトシンを意味し、記号「：」は切断箇所を示す。なお、下線は付していないが、記号Ｙ又はＮで示す塩基がＣである場合、その塩基もメチル化される可能性がある。例えば、制限酵素ＢｓａＷＩでは、認識配列ＷＣＣＧＧＷのＷとＣとの間を切断し、５’−ＣＣＧＧ−３’配列からなる５’突出末端を生じさせる。また、制限酵素ＭｓｐＩでは、認識配列ＣＣＧＧのＣとＣとの間を切断し、５’−ＣＧ−３’配列からなる５’突出末端を生じさせる。なお、ＣＧ配列のすべてが突出末端として１本鎖上に露出する必要はなく、この配列中のうちの、メチル化される可能性のあるシトシンが最低限、１本鎖上にあればよい。【００４０】
【表１】
0004688792.tif 000002
【００４１】
また、植物では、５’−ＣＮＧ−３’配列におけるＣ（シトシン）がメチル化されるため、前記ＣＮＧ配列を含む突出末端（以下、ＣＮＧ含有突出末端と称する）を生じさせるメチル化非感受性制限酵素を用いることが好ましい。このような制限酵素としては、例えば、表２に示す制限酵素を挙げることができる。なお、表２において、下線で示すＣは、メチル化される可能性のあるシトシンを意味し、記号「：」は切断箇所を示す。なお、下線は付していないが、記号Ｙ又はＮで示す塩基がＣである場合、その塩基もメチル化される可能性がある。また、ＣＮＧ配列のすべてが突出末端として１本鎖上に露出する必要はなく、この配列中のうちの、メチル化される可能性のあるシトシンが最低限、１本鎖上にあればよい。【００４２】
【表２】
0004688792.tif 000003
【００４３】
Ｃ含有突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素を用いてＤＮＡ断片混合物を調製する場合、所望により、メチル化シトシンを含む突出末端を生じさせない制限酵素、例えば、Ｃ含有突出末端を生じさせない制限酵素（例えば、平滑末端を生じさせる制限酵素、又はＣを含まない突出末端を生じさせる制限酵素）を併用することができる。メチル化シトシンを含む突出末端を生じさせない制限酵素を併用した場合、前記酵素により新たな切断末端が生じるが、この末端は平滑末端であるか、あるいは、突出末端であってもメチル化シトシンを含まないので、Ｃ含有突出末端のメチル化分析に影響を与えない。【００４４】
調製工程において、ゲノムＤＮＡから一本鎖ＤＮＡ断片又は部分一本鎖ＤＮＡ断片の混合物を調製する場合には、ゲノムＤＮＡの断片化の工程と一本鎖化の工程の順序は、特に限定されるものではなく、いずれを先に実施することもできるし、あるいは、同時に実施することもできる。【００４５】
ゲノムＤＮＡを断片化する方法としては、例えば、制限酵素（平滑末端を生じさせる制限酵素及び突出末端を生じさせる制限酵素を含む）を使用する方法、物理的に切断する方法（例えば、超音波処理、紫外線照射、放射線照射、又は電子線照射）、又は化学的に切断する方法などを挙げることができる。【００４６】
ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡである場合と断片化ＤＮＡである場合とを含む）を一本鎖化する場合には、その全長にわたって一本鎖化することもできるし、その部分領域のみを一本鎖化することもできる。なお、本明細書における「一本鎖化」とは、二本鎖ＤＮＡの内、その一方の鎖の全長又は部分領域において、残る一方の鎖（すなわち、相補鎖）とハイブリダイズすることなく、塩基が露出している状態を意味し、例えば、完全な一本鎖ＤＮＡのみからなる構造が含まれることは勿論のこと、後述する三本鎖構造や、一塩基対又は複数塩基対におけるミスマッチによって一塩基又は複数塩基が露出した構造も含まれる。【００４７】
全長にわたって一本鎖化する場合には、例えば、熱変性処理又は変性剤処理などを挙げることができる。【００４８】
部分領域を一本鎖化する場合には、例えば、一本鎖化の対象ＤＮＡにおける一方の鎖にハイブリダイズ可能な核酸（例えば、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド。以下、一本鎖化用核酸と称する）を共存させる方法などを挙げることができる。一本鎖化の対象となる二本鎖ＤＮＡと、一本鎖化用核酸とを接触させると、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖の特定領域と一本鎖化用核酸とがハイブリダイズして二本鎖構造をとると共に、二本鎖ＤＮＡの残る一方の鎖の特定領域が一本鎖の状態になるため、三本鎖構造を形成させることができる。
前記一本鎖化用核酸は、一本鎖化の対象ＤＮＡにおいてメチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む領域を標的として、適宜設計することができ、１種類だけを単独で、あるいは、複数種類を同時に使用することができる。一本鎖化用核酸を用いると、特定領域のメチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを選択的に露出させることができるため、好ましい。【００４９】
なお、ＤＮＡ断片によっては、例えば、部分的にステムループ構造をとることにより、あるいは、核酸（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）が二本鎖ＤＮＡに結合して三本鎖構造をとることにより、特別な処理（例えば、一本鎖化用核酸の添加）を施すことなく、部分的に一本鎖化されている場合がある。このようなＤＮＡ断片をＤＮＡ材料として使用する場合には、特別な処理を施すことなく、そのまま、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンが露出しているＤＮＡ断片混合物として、次の抗体接触工程に用いることができる。また、部分的に一本鎖領域を有するＤＮＡとして、ゲノムＤＮＡを用いる場合には、適当な制限酵素を用いて断片化した後、次の抗体接触工程に用いることができる。前記制限酵素として、メチル化シトシンを含む突出末端を生じさせない制限酵素、例えば、Ｃ含有突出末端を生じさせない制限酵素（例えば、平滑末端を生じさせる制限酵素、又はＣを含まない突出末端を生じさせる制限酵素）を使用すると、制限酵素処理前のゲノムＤＮＡに始めから存在する一本鎖領域のメチル化分析に影響を与えない。更に、所望により、元から存在する一本鎖化領域に加え、人工的に一本鎖化領域（例えば、突出末端又は三本鎖構造）を更に形成させた状態で、次の抗体接触工程に用いることもできる。【００５０】
メチル化シトシン型製造方法における調製工程において、ＤＮＡ材料として生体試料又はそれに由来する試料中の遊離ＤＮＡ断片混合物を使用する場合、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンが露出しているＤＮＡ断片混合物を調製する手段としては、例えば、Ｃ含有突出末端（好ましくは、ＣＧ含有突出末端又はＣＮＧ含有突出末端）を生じさせるメチル化非感受性制限酵素を用いる方法、あるいは、一本鎖化用核酸を用いる方法を挙げることができる。また、遊離ＤＮＡ断片が全体的又は部分的に一本鎖化されている場合には、特別な処理を施すことなく、そのまま、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンが露出しているＤＮＡ断片混合物として、次の抗体接触工程に用いることができる。【００５１】
ＤＮＡ材料として生体試料又はそれに由来する試料中の遊離ＤＮＡ断片混合物を使用する場合、前記試料中に含まれる遊離ＤＮＡ断片の量が、以下の各工程を実施するには不充分であることがある。遊離ＤＮＡ断片量が不充分である場合には、ＤＮＡ増幅（例えば、ＰＣＲ）を行うことにより充分な量のＤＮＡ断片を確保することができる。例えば、前記試料中から精製した遊離ＤＮＡ断片混合物に適当なアダプターを連結させた後、前記アダプターに対するプライマーを使用してＤＮＡ増幅を実施することができる。【００５２】
メチル化シトシン型製造方法における抗体接触工程では、前記調製工程で得られたＤＮＡ断片混合物と、抗メチル化シトシン抗体とを接触させ、前記抗体と反応して免疫複合体を形成したＤＮＡ断片群（複合体形成ＤＮＡ断片群）と、前記抗体と反応しなかったＤＮＡ断片群（未反応ＤＮＡ断片群）とに分離することができる。【００５３】
抗メチル化シトシン抗体は、メチル化シトシンを抗原として使用し、常法により調製することができる（例えば、特開2004-347508号公報）し、あるいは、市販品［例えば、抗５−メチルシトシン・モノクローナル抗体；和光純薬工業株式会社（大阪）cat#01519721］を購入することもできる。例えば、キーホールリンペット・ヘモシアニンに５−メチルシチジンを結合したものを免疫源とし、マウスに投与することにより作製することができる。【００５４】
ＤＮＡ断片混合物と抗メチル化シトシン抗体との接触は、複合体形成ＤＮＡ断片群と未反応ＤＮＡ断片群とを分離することが可能な接触方法である限り、特に限定されるものではないが、例えば、抗メチル化シトシン抗体を適当な担体に担持させた状態で、ＤＮＡ断片混合物と接触させることにより、あるいは、抗メチル化シトシン抗体とＤＮＡ断片混合物とを接触させた後、複合体形成ＤＮＡ断片群を常法により精製することにより、これらを分離することができる。前者の具体的手法としては、例えば、抗メチル化シトシン抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、あるいは、遠心により分離可能な粒子又は磁性粒子上に担持させた抗メチル化シトシン抗体を用いた抗原抗体反応により、複合体形成ＤＮＡ断片群と未反応ＤＮＡ断片群とを分離することができる。後者の具体的手法としては、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧを担持させたカラム又は粒子（例えば、磁性粒子）を用いることにより、複合体形成ＤＮＡ断片群を精製することができる。【００５５】
調製工程で得られたメチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンが露出しているＤＮＡ断片混合物の内、メチル化シトシンが露出しているＤＮＡ断片は、抗メチル化シトシン抗体と免疫複合体を形成するため、複合体形成ＤＮＡ断片群として分離される。一方、メチル化シトシンが露出していないＤＮＡ断片は、抗メチル化シトシン抗体と反応しないため、未反応ＤＮＡ断片群として分離される。【００５６】
調製工程において、Ｃ含有突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素を用いてＤＮＡ断片混合物を調製した場合には、前記ＤＮＡ断片の両端はいずれもＣ含有突出末端である。抗メチル化シトシン抗体と接触させることにより分離した複合体形成ＤＮＡ断片群に含まれるＤＮＡ断片は、両端のメチレーションサイトが両方ともメチル化されている（すなわち、２つのＣ含有突出末端の両方にメチル化シトシンが存在する）ＤＮＡ断片である場合と、片方のみがメチル化されている（すなわち、２つのＣ含有突出末端の一方のみにメチル化シトシンが存在する）ＤＮＡ断片である場合とがある。【００５７】
この場合（すなわち、Ｃ含有突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素を用いてＤＮＡ断片混合物を調製した場合）、抗体接触工程におけるＤＮＡ断片混合物と抗メチル化シトシン抗体との接触を、以下に示す特定の条件下で実施することにより、両端のメチレーションサイトが両方ともメチル化されている（すなわち、２つのＣ含有突出末端の両方にメチル化シトシンが存在する）ＤＮＡ断片のみを含む複合体形成ＤＮＡ断片群と、未反応ＤＮＡ断片群とに分離することができる。【００５８】
抗原抗体反応においては、抗体の２価結合は、１価結合に比べて約１０３（Ｍ−１）倍も強い親和性を示すことが公知である［例えば、Ivan Roitt, Jonathan Brostoff, and David Male著、多田富雄監訳、免疫学イラストレイテッド（原書第５版）、２０００年２月１０日発行、南江堂、第１１０頁（原著名：IMMUNOLOGY,
FIFTH EDITION）］。ここで、２価結合とは、一分子の抗体、あるいは、１つの担体に固定されている二分子の抗体が、２箇所の抗原結合部位で抗原に結合することを意味し、１価結合とは、一分子の抗体が１箇所の抗原結合部位で抗原に結合することを意味する。【００５９】
この点について、図１〜図４に沿って更に説明する。図１〜図４は、両端に突出末端を有する一分子の二本鎖ＤＮＡ（１）と、一分子又は二分子の抗メチル化シトシン抗体（２）との結合の状態を示す模式図である。二本鎖ＤＮＡ（１）の突出末端に記載の黒丸（図１〜図４）はメチル化シトシンを意味し、白丸（図１）はシトシンを意味する。
図１〜図４に示すように、一分子の抗体（２）には２箇所の抗原結合部位が存在している。１価結合では、その内の一方の抗原結合部位で、抗原である二本鎖ＤＮＡ（１）と結合する（図１）。それに対して、２価結合では、一分子の抗体（２）がその２箇所の抗原結合部位を利用して一分子の抗原（１）に結合する（図２）か、あるいは、担体（３）に固定されている２分子の抗体（２）がそれぞれ１箇所の抗原結合部位を利用して一分子の抗原（１）に結合する（図３）。なお、図４では、二分子の抗体（２）がそれぞれの抗原結合部位１箇所を利用して一分子の抗原（１）に結合しているが、この場合の親和性は１価結合と同じであることが公知である。【００６０】
前述のように、２価結合と１価結合とでは親和性に差があるため、抗原抗体反応系における種々の条件を変化させることにより、１価結合を解離させると共に、２価結合を維持させることが可能である。抗原抗体間の結合は、例えば、静電気力による結合、水素結合、又は疎水結合などに基づくものであり、静電気力による結合は、例えば、塩濃度又はｐＨにより、水素結合は、例えば、尿素又はグアニジン塩酸濃度により、疎水結合は、例えば、ポリエチレングリコール濃度により、影響を受けることが知られている。【００６１】
例えば、抗原抗体反応系における塩（例えば、ＮａＣｌ）濃度に関して、２価結合は維持されるが、１価結合は排除される（なお、２価結合及び１価結合が混在し、その割合において１価結合よりも２価結合の方が優位である場合も含む）条件は、用いる抗体又は塩の種類により変化することがあるが、例えば、後述の実施例に示す実験系を用いることにより、使用抗体毎に塩濃度範囲を容易に決定することができる。
また、塩濃度以外にも親和性に影響を与えることのできる条件、例えば、尿素、グアニジン塩酸、若しくはポリエチレングリコール濃度、又はｐＨについても、同様にして、２価結合は維持されるが、１価結合は排除される条件を、使用抗体毎に容易に決定することができる。【００６２】
また、抗体接触工程において、抗メチル化シトシン抗体と抗シトシン抗体とを組み合わせて用いることにより、一方の末端におけるメチレーションサイト（シトシン）のみがメチル化されている（すなわち、２つのＣ含有突出末端の一方のみにメチル化シトシンが存在する）ＤＮＡ断片群を、複合体形成ＤＮＡ断片群として取得することができる。
すなわち、調製工程で得られたＤＮＡ断片混合物と、抗メチル化シトシン抗体とを接触させ、前記抗メチル化シトシン抗体と反応して免疫複合体を形成したＤＮＡ断片群（複合体形成ＤＮＡ断片群）と、前記抗メチル化シトシン抗体と反応しなかったＤＮＡ断片群（未反応ＤＮＡ断片群）とに分離し、続いて、得られた複合体形成ＤＮＡ断片群と抗シトシン抗体とを接触させ、前記抗シトシン抗体と反応して免疫複合体を形成したＤＮＡ断片群（複合体形成ＤＮＡ断片群）と、前記抗シトシン抗体と反応しなかったＤＮＡ断片群（未反応ＤＮＡ断片群）とに分離することにより、目的のＤＮＡ断片群を複合体形成ＤＮＡ断片群として取得することができる。なお、抗メチル化シトシン抗体と抗シトシン抗体の接触順序は、逆であっても構わない。
あるいは、抗メチル化シトシン抗体を用いて、通常の条件下で抗体接触工程を実施した後、抗原抗体反応における１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下で溶出することにより、一方の末端におけるメチレーションサイト（シトシン）のみがメチル化されているＤＮＡ断片群を取得することもできる。
なお、本明細書において「抗原抗体反応における通常の条件下」とは、抗原抗体反応で一般的に用いられる条件を意味し、特には、１価結合を維持可能な条件を意味する。【００６３】
これまで述べたように、抗体接触工程では、抗原抗体反応の実施条件を適宜選択することにより、あるいは、使用する抗体を適宜選択又は組み合わせることにより、ＤＮＡ断片における両端のＣ含有突出末端におけるシトシンのメチル化状態の異なるＤＮＡ断片群を取得することができる。
例えば、抗メチル化シトシン抗体を使用し、通常条件下で抗原抗体反応を実施することにより、少なくとも一方の末端におけるメチレーションサイト（シトシン）がメチル化されている（すなわち、２つのＣ含有突出末端の少なくとも一方にメチル化シトシンが存在する）ＤＮＡ断片群を、複合体形成ＤＮＡ断片群として取得することができる。
また、抗メチル化シトシン抗体を使用し、１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下で抗原抗体反応を実施することにより、両端のメチレーションサイト（シトシン）が両方ともメチル化されている（すなわち、２つのＣ含有突出末端の両方にメチル化シトシンが存在する）ＤＮＡ断片群を、複合体形成ＤＮＡ断片群として取得することができる。
更には、抗メチル化シトシン抗体及び抗シトシン抗体を組み合わせて使用し、１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下で抗原抗体反応を実施することにより、一方の末端におけるメチレーションサイト（シトシン）のみがメチル化されている（すなわち、２つのＣ含有突出末端の一方のみにメチル化シトシンが存在する）ＤＮＡ断片群を、複合体形成ＤＮＡ断片群として取得することができる。【００６４】
メチル化シトシン型製造方法における抗体接触工程では、これまで述べたとおり、複合体形成ＤＮＡ断片群と未反応ＤＮＡ断片群とに分離することもできるが、前記抗体に対して高親和性を示すＤＮＡ断片群（高親和性ＤＮＡ断片群）と、前記抗体に対して低親和性を示すＤＮＡ断片群（低親和性ＤＮＡ断片群）とに分離することができる。例えば、抗体固定化カラム（抗体アフィニティーカラム）を用いたアフィニティークロマトグラフィーでは、抗原と抗体とが親和性を提示することができる条件を有する移動層（例えば、免疫複合体を解離させるために一般的に用いられる特定の塩濃度の緩衝液）中に抗原混合物を溶解し、これを、抗体固定化担体中を移動させることにより、親和性の差を利用して分離する技術が周知である（日本生化学会編、続生化学実験講座５「免疫生化学実験法」（１９８６年）、東京化学同人、東京都文京区千石３丁目３６−７；Current Protocols in Immunology、WILEY社、8.2.1〜8.2.5）。【００６５】
本発明においても、例えば、用いる抗体及び担体、並びに分離対象のＤＮＡ混合物に応じて、クロマトグラフィーの条件（特に、親和性に関する条件）を適宜選択することにより、所望のＤＮＡ画分を得ることができる。適当な条件を有する移動層に、調製工程で得られたＤＮＡ断片混合物を溶解し、これを、抗メチル化シトシン抗体を固定化したアフィニティーカラム中を移動させることにより、例えば、（高親和性ＤＮＡ断片群としての）前記抗体に２価結合で結合可能なＤＮＡ断片群と、（低親和性ＤＮＡ断片群としての）前記抗体に１価結合で結合可能なＤＮＡ断片群とに分離することができる。【００６６】
親和性に影響を与える因子としては、例えば、共存化合物［例えば、塩（例えば、塩化ナトリウム）、グリセリン、ポリエチレングリコール、チオシアン酸塩（例えば、ナトリウム塩又はカリウム塩）、尿素、ハプテン］の種類又は濃度、ｐＨ等を挙げることができる。【００６７】
例えば、塩として塩化ナトリウムを用いる場合には、通常、０．０５〜３ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１５〜２ｍｏｌ／Ｌで実施することができる。グリセリンを用いる場合には、通常、０〜５０％、好ましくは０〜３０％で実施することができる。ポリエチレングリコールを用いる場合には、通常、０〜５０％、好ましくは０〜２０％で実施することができる。チオシアン酸塩を用いる場合には、通常、０〜３ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０〜１ｍｏｌ／Ｌで実施することができる。尿素を用いる場合には、通常、通常、０〜４ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０〜２ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０〜１ｍｏｌ／Ｌで実施することができる。ハプテン（抗メチル化シトシン抗体を用いる場合には、メチル化シトシン）を用いる場合には、通常、０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌで実施することができる。これらの共存化合物濃度は、一定濃度で実施することもできるし、あるいは、連続的（すなわち、グラジエント溶出）又は断続的（すなわち、ステップワイズ溶出）に変化させながら実施することもできる。【００６８】
また、ｐＨは、通常、ｐＨ２〜ｐＨ１１．５、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ９、より好ましくはｐＨ６〜ｐＨ８の範囲で実施することができる。また、ｐＨグラジエントにより実施することもでき、例えば、ｐＨ７．５（結合時のｐＨ）からｐＨ４までのグラジエント、あるいは、ｐＨ７．５（結合時のｐＨ）からｐＨ１１．５までのグラジエントにより実施することもできる。具体的には、例えば、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）／０．１５ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌから１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）／０．１５ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌまでのグラジエント、あるいは、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）／０．１５ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌから５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｎ−トリエタノールアミン（ｐＨ１１．５）／０．１５ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌにより実施することができる。【００６９】
メチル化シトシン型製造方法における同定工程では、前記抗体接触工程で得られた各ＤＮＡ断片群（好ましくは、複合体形成ＤＮＡ断片群）に含まれるＤＮＡ断片を同定する。前記同定工程では、少なくとも、続いて実施する配置工程で使用する核酸を調製することができる程度まで、各ＤＮＡ断片の情報を取得する。一般的には、前記核酸を設計可能な程度まで、各ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することが好ましく、常法に従って、各ＤＮＡ断片をクローニングした後、あるいは、ＤＮＡ断片群のまま直接、塩基配列を決定することができる。【００７０】
前記抗体接触工程を、抗原抗体反応における１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下で実施した場合、抗体接触工程で得られた複合体形成ＤＮＡ断片群には、両端のメチレーションサイトが両方ともメチル化されている（すなわち、２つのＣ含有突出末端の両方にメチル化シトシンが存在する）ＤＮＡ断片のみが含まれる（図２又は図３）。この場合、同定工程では、両端のメチレーションサイトが両方ともメチル化されているＤＮＡ断片の情報を取得することができる。
なお、前記特定条件における抗原抗体反応を、抗体を担体に固定せずに実施した場合には、２価結合を維持することができるのは図２に示す場合だけであるので、両端のメチレーションサイトが両方ともメチル化されており、しかも、塩基長が約４０ｂｐ（一分子の免疫グロブリンにおける２箇所の抗原結合部位間の距離に相当）であるＤＮＡ断片の情報のみを取得することができる。【００７１】
一方、通常の条件下で抗体接触工程を実施した場合、抗体接触工程で得られた複合体形成ＤＮＡ断片群には、両端のメチレーションサイトが両方ともメチル化されている（すなわち、２つのＣ含有突出末端の両方にメチル化シトシンが存在する）ＤＮＡ断片と、片方のみがメチル化されている（すなわち、２つのＣ含有突出末端の一方のみにメチル化シトシンが存在する）ＤＮＡ断片とが混在している。この状態のままで同定工程を実施した場合、各ＤＮＡ断片の情報を取得することができるが、各ＤＮＡ断片が、両端のメチレーションサイトが両方ともメチル化されているＤＮＡ断片であるか、あるいは、片方のみがメチル化されているＤＮＡ断片であるかは区別することができない。【００７２】
同定工程においても、２価結合と１価結合における親和性の差を利用すると、両端のメチレーションサイトが両方ともメチル化されているＤＮＡ断片と、片方のみがメチル化されているＤＮＡ断片とを分離し、片方のみがメチル化されているＤＮＡ断片の情報を取得することができる。例えば、通常の条件下で抗体接触工程を実施した後、抗原抗体反応における１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下で溶出するＤＮＡ断片を同定することにより、片方のみがメチル化されているＤＮＡ断片の情報を取得することができる。【００７３】
メチル化シトシン型製造方法における配置工程では、前記同定工程で同定されたＤＮＡ断片とそれぞれハイブリダイズ可能な核酸（例えば、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド）を基板上に配置する。
前記核酸は、同定工程で同定された各ＤＮＡ断片の情報に基づいて設計すること以外は、ＤＮＡアレイの製造に関する常法に従って、設計及び調製することができる。
例えば、基板上に配置する全ての核酸に関してＴｍを揃えることができる点で、各ＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて化学合成したオリゴヌクレオチドを用いることが好ましい。あるいは、前記同定工程でクローニングした各ＤＮＡ断片又はその部分断片を、そのまま、基板上に配置することもできる。更には、前記抗体接触工程で得られた複合体形成ＤＮＡ断片群に含まれるＤＮＡ断片をそのまま、あるいは、その増幅物を基板上に配置することもできる。
【００７４】
また、前記核酸は、ＤＮＡアレイの製造に関する常法に従って、基板上に配置することができる。基板上に核酸を配置する方法としては、例えば、基板上で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法、あるいは、予め調製した核酸を基板上にスポットし、共有結合又はイオン結合等により基板上に固定する方法などを挙げることができる。【００７５】
本発明のメチル化シトシン型製造方法により製造したＤＮＡアレイ、すなわち、本発明のメチル化シトシン型ＤＮＡアレイにおいては、調製工程で調製したＤＮＡ断片の内、特定領域にメチル化シトシンを含むＤＮＡ断片（すなわち、特定領域の少なくとも１つのシトシンがメチル化されているＤＮＡ断片）とハイブリダイズ可能な核酸が基板上に配置されている。なお、前記特定領域とは、例えば、Ｃ含有突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素を用いた場合には、両端のＣ含有突出末端であり、一本鎖化用核酸を用いた場合には、一本鎖化用核酸の標的領域であり、ステムループ構造を含むＤＮＡ断片である場合には、ループ領域である。【００７６】
より具体的には、Ｃ含有突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素を用いてＤＮＡ断片混合物を調製するメチル化シトシン型製造方法により製造したＤＮＡアレイでは、両端に位置するＣ含有突出末端の少なくとも一方にメチル化シトシンを含むＤＮＡ断片（すなわち、Ｃ含有突出末端の少なくとも一方において、少なくとも１つのシトシンがメチル化されているＤＮＡ断片）とハイブリダイズ可能な核酸が基板上に配置されている。特に、抗体接触工程におけるＤＮＡ断片混合物と抗メチル化シトシン抗体との接触を、抗原抗体反応における１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下で実施した場合には、両端に位置するＣ含有突出末端の両方にメチル化シトシンを含むＤＮＡ断片とハイブリダイズ可能な核酸が基板上に配置されている。また、抗メチル化シトシン抗体と抗シトシン抗体とを組み合わせて使用した場合、あるいは、通常の条件下で抗体接触工程を実施した後、抗原抗体反応における１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下で溶出するＤＮＡ断片を同定した場合には、両端のＣ含有突出末端の一方のみにメチル化シトシンを含むＤＮＡ断片とハイブリダイズ可能な核酸が基板上に配置されている。【００７７】
また、一本鎖化用核酸を用いてＤＮＡ断片混合物を調製するメチル化シトシン型製造方法により製造したＤＮＡアレイでは、一本鎖化した領域にメチル化シトシンを含むＤＮＡ断片（すなわち、一本鎖化した領域の少なくとも１つのシトシンがメチル化されているＤＮＡ断片）とハイブリダイズ可能な核酸が基板上に配置されている。特に、抗体接触工程におけるＤＮＡ断片混合物と抗メチル化シトシン抗体との接触を、抗原抗体反応における１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下で実施した場合には、一本鎖化した領域に２つ以上のメチル化シトシンを含むＤＮＡ断片とハイブリダイズ可能な核酸が基板上に配置されている。なお、一本鎖化用核酸を用いてＤＮＡ断片混合物を調製する場合には、両端に露出するメチル化シトシン又はシトシンの影響を受けないように、両端を平滑末端にする処理を実施することが好ましい。【００７８】
更に、本発明のメチル化シトシン型ＤＮＡアレイにおいては、後述のシトシン型ＤＮＡアレイで用いることのできる、特定領域にシトシンを含むＤＮＡ断片（すなわち、特定領域の少なくとも１つのシトシンがメチル化されていないＤＮＡ断片）とハイブリダイズ可能な核酸を基板上に配置することができる。本発明のＤＮＡアレイにおいて、特定領域にメチル化シトシンを含むＤＮＡ断片とハイブリダイズ可能な核酸と、特定領域にシトシンを含むＤＮＡ断片とハイブリダイズ可能な核酸とを、適宜分類して同時に基板上に配置すると、メチル化の程度が異なる複数のメチレーションサイトのメチル化について、一度に包括的に分析することができる。【００７９】
（２）シトシン型製造方法及びＤＮＡアレイ
本発明のシトシン型製造方法における調製工程では、適当なＤＮＡ材料から、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンが露出しているＤＮＡ断片混合物を調製する。
前記調製工程で用いるＤＮＡ材料としては、メチル化シトシン型製造方法における調製工程で先述したＤＮＡ材料を用いることができる。【００８０】
但し、細胞のゲノムＤＮＡを使用する場合には、前記細胞として、メチル化率の低い細胞を用いることが好ましい。シトシン型製造方法では、シトシンの有無に基づいて、ＤＮＡアレイに配置するＤＮＡ断片を選択するからである。メチル化率の低い細胞を用いることにより、調製工程で得られるＤＮＡ断片混合物中に含まれる、少なくとも１つのシトシンが露出しているＤＮＡ断片の比率を高めることができる。
メチル化率の低い細胞としては、例えば、正常細胞、ＥＳ細胞、又は組織幹細胞などを挙げることができる。また、１種類の細胞のみを用いることもできるし、複数種類の細胞の混合物として使用することもできる。【００８１】
シトシン型製造方法における調製工程において、ＤＮＡ材料から、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンが露出しているＤＮＡ断片混合物を調製する手段としては、メチル化シトシン型製造方法における調製工程で先述したＤＮＡ断片混合物の調製手段を用いることができ、メチル化シトシン型製造方法の調製工程における前記調製手段に関する説明（但し、Ｃ含有突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素に関する説明を除く）が、そのまま、シトシン型製造方法における調製工程にも当てはまる。【００８２】
シトシン型製造方法における調製工程において、Ｃ含有突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素を使用すると、ゲノムＤＮＡの断片化と同時に、制限酵素により生じる突出末端に、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを露出させることができる。【００８３】
高等動物では、５’−ＣＧ−３’配列におけるＣ（シトシン）がメチル化されるため、ＣＧ含有突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素を用いることが好ましい。なお、シトシン型製造方法では、シトシンの有無に基づいて、ＤＮＡアレイに配置するＤＮＡ断片を選択するため、Ｃ含有突出末端にメチル化されないシトシンが含まれると、全てのＤＮＡ断片にシトシンが存在するため、ＤＮＡ断片の選択ができない。このような制限酵素としては、表１に示すＢｓａＷＩ、ＢｓｏＢＩ、又はＸｍａＩを挙げることができ、好ましくない。高等動物で用いることのできる酵素としては、例えば、表１に示すＢｓｓＳＩ、ＭｓｐＩ、又はＴａｑＩを挙げることができる。【００８４】
また、植物では、５’−ＣＮＧ−３’配列におけるＣ（シトシン）がメチル化されるため、ＣＮＧ含有突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素を用いることが好ましい。このような制限酵素としては、例えば、表２に示す制限酵素を挙げることができる。なお、表２に示すＢｓａＷＩ又はＸｍａＩでは、表２に示すように、下線で示すメチル化される可能性のあるＣがそれぞれ２箇所存在する。これらの酵素を用いた場合、２箇所のＣが同時にメチル化されている場合に、抗シトシン抗体と反応することができなくなる。【００８５】
シトシン型製造方法における抗体接触工程では、前記調製工程で得られたＤＮＡ断片混合物と、抗シトシン抗体とを接触させ、前記抗体と反応して免疫複合体を形成したＤＮＡ断片群（複合体形成ＤＮＡ断片群）と、前記抗体と反応しなかったＤＮＡ断片群（未反応ＤＮＡ断片群）とに分離するか、あるいは、前記抗体に対して高親和性を示すＤＮＡ断片群（高親和性ＤＮＡ断片群）と、前記抗体に対して低親和性を示すＤＮＡ断片群（低親和性ＤＮＡ断片群）とに分離することができる。【００８６】
抗シトシン抗体は、シトシンを抗原として使用し、常法により調製することができるし、あるいは、市販品を購入することもできる。例えば、キーホールリンペット・ヘモシアニンにシチジンを結合したものを免疫源とし、マウスに投与することにより作製することができる。【００８７】
ＤＮＡ断片混合物と抗シトシン抗体との接触は、複合体形成ＤＮＡ断片群と未反応ＤＮＡ断片群とを分離することが可能な接触方法である限り、特に限定されるものではないが、例えば、抗シトシン抗体を適当な担体に担持させた状態で、ＤＮＡ断片混合物と接触させることにより、あるいは、抗シトシン抗体とＤＮＡ断片混合物とを接触させた後、複合体形成ＤＮＡ断片群を常法により精製することにより、これらを分離することができる。前者の具体的手法としては、例えば、抗シトシン抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、あるいは、遠心により分離可能な粒子又は磁性粒子上に担持させた抗シトシン抗体を用いた抗原抗体反応により、複合体形成ＤＮＡ断片群と未反応ＤＮＡ断片群とを分離することができる。後者の具体的手法としては、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧを担持させたカラム又は粒子（例えば、磁性粒子）を用いることにより、複合体形成ＤＮＡ断片群を精製することができる。【００８８】
調製工程で得られたメチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンが露出しているＤＮＡ断片混合物の内、シトシンが露出しているＤＮＡ断片は、抗シトシン抗体と免疫複合体を形成するため、複合体形成ＤＮＡ断片群として分離される。一方、シトシンが露出していないＤＮＡ断片は、抗シトシン抗体と反応しないため、未反応ＤＮＡ断片群として分離される。【００８９】
調製工程において、Ｃ含有突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素を用いてＤＮＡ断片混合物を調製した場合には、前記ＤＮＡ断片の両端はいずれもＣ含有突出末端である。抗シトシン抗体と接触させることにより分離した複合体形成ＤＮＡ断片群に含まれるＤＮＡ断片は、両端のメチレーションサイトが両方ともメチル化されていない（すなわち、２つのＣ含有突出末端の両方にシトシンが存在する）ＤＮＡ断片である場合と、片方のみがメチル化されていない（すなわち、２つのＣ含有突出末端の一方のみにシトシンが存在する）ＤＮＡ断片である場合とがある。【００９０】
この場合（すなわち、Ｃ含有突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素を用いてＤＮＡ断片混合物を調製した場合）、抗体接触工程におけるＤＮＡ断片混合物と抗シトシン抗体との接触を、所定の条件下で実施することにより、両端のメチレーションサイトが両方ともメチル化されていない（すなわち、２つのＣ含有突出末端の両方にシトシンが存在する）ＤＮＡ断片のみを含む複合体形成ＤＮＡ断片群と、未反応ＤＮＡ断片群とに分離することができる。
前記条件については、メチル化シトシン型製造方法の抗体接触工程で先述した、抗原抗体反応系において１価結合を解離させると共に、２価結合を維持させることが可能な条件に関する説明が、そのまま、シトシン型製造方法における前記条件に当てはまる。【００９１】
抗体接触工程では、抗原抗体反応の実施条件を適宜選択することにより、あるいは、使用する抗体を適宜選択又は組み合わせることにより、ＤＮＡ断片における両端のＣ含有突出末端におけるシトシンのメチル化状態の異なるＤＮＡ断片群を取得することができる。  例えば、抗シトシン抗体を使用し、通常条件下で抗原抗体反応を実施することにより、少なくとも一方の末端におけるメチレーションサイト（シトシン）がメチル化されていない（すなわち、２つのＣ含有突出末端の少なくとも一方にシトシンが存在する）ＤＮＡ断片群を、複合体形成ＤＮＡ断片群として取得することができる。
また、抗シトシン抗体を使用し、１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下で抗原抗体反応を実施することにより、両端のメチレーションサイト（シトシン）が両方ともメチル化されていない（すなわち、２つのＣ含有突出末端の両方にシトシンが存在する）ＤＮＡ断片群を、複合体形成ＤＮＡ断片群として取得することができる。
更には、抗シトシン抗体及び抗メチル化シトシン抗体を組み合わせて使用し、１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下で抗原抗体反応を実施することにより、一方の末端におけるメチレーションサイト（シトシン）のみがメチル化されていない（すなわち、２つのＣ含有突出末端の一方のみにシトシンが存在する）ＤＮＡ断片群を、複合体形成ＤＮＡ断片群として取得することができる。【００９２】
シトシン型製造方法における同定工程及び配置工程は、メチル化シトシン型製造方法における同定工程及び配置工程と同様にして実施することができる。すなわち、メチル化シトシン型製造方法における同定工程及び配置工程に関する説明が、そのまま、シトシン型製造方法における同定工程及び配置工程にも当てはまる。【００９３】
本発明のシトシン型製造方法により製造したＤＮＡアレイ、すなわち、本発明のシトシン型ＤＮＡアレイにおいては、調製工程で調製したＤＮＡ断片の内、特定領域にシトシンを含むＤＮＡ断片（すなわち、特定領域の少なくとも１つのシトシンがメチル化されていないＤＮＡ断片）とハイブリダイズ可能な核酸が基板上に配置されている。なお、前記特定領域とは、例えば、Ｃ含有突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素を用いた場合には、両端のＣ含有突出末端であり、一本鎖化用核酸を用いた場合には、一本鎖化用核酸の標的領域であり、ステムループ構造を含むＤＮＡ断片である場合には、ループ領域である。【００９４】
より具体的には、Ｃ含有突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素を用いてＤＮＡ断片混合物を調製するシトシン型製造方法により製造したＤＮＡアレイでは、両端に位置するＣ含有突出末端の少なくとも一方にシトシンを含むＤＮＡ断片（すなわち、Ｃ含有突出末端の少なくとも一方において、少なくとも１つのシトシンがメチル化されていないＤＮＡ断片）とハイブリダイズ可能な核酸が基板上に配置されている。特に、抗体接触工程におけるＤＮＡ断片混合物と抗シトシン抗体との接触を、抗原抗体反応における１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下で実施した場合には、両端に位置するＣ含有突出末端の両方にシトシンを含むＤＮＡ断片とハイブリダイズ可能な核酸が基板上に配置されている。また、抗シトシン抗体と抗メチル化シトシン抗体とを組み合わせて使用した場合、あるいは、通常の条件下で抗体接触工程を実施した後、抗原抗体反応における１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下で溶出するＤＮＡ断片を同定した場合、両端のＣ含有突出末端の一方のみにシトシンを含むＤＮＡ断片とハイブリダイズ可能な核酸が基板上に配置されている。【００９５】
また、一本鎖化用核酸を用いてＤＮＡ断片混合物を調製するシトシン型製造方法により製造したＤＮＡアレイでは、一本鎖化した領域にシトシンを含むＤＮＡ断片（すなわち、一本鎖化した領域の少なくとも１つのシトシンがメチル化されていないＤＮＡ断片）とハイブリダイズ可能な核酸が基板上に配置されている。特に、抗体接触工程におけるＤＮＡ断片混合物と抗シトシン抗体との接触を、抗原抗体反応における１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下で実施した場合には、一本鎖化した領域に２つ以上のシトシンを含むＤＮＡ断片とハイブリダイズ可能な核酸が基板上に配置されている。なお、一本鎖化用核酸を用いてＤＮＡ断片混合物を調製する場合には、両端に露出するメチル化シトシン又はシトシンの影響を受けないように、両端を平滑末端にする処理を実施することが好ましい。【００９６】
更に、本発明のシトシン型ＤＮＡアレイにおいては、先述のメチル化シトシン型ＤＮＡアレイで用いることのできる、特定領域にメチル化シトシンを含むＤＮＡ断片（すなわち、特定領域の少なくとも１つのシトシンがメチル化されているＤＮＡ断片）とハイブリダイズ可能な核酸を基板上に配置することができる。本発明のＤＮＡアレイにおいて、特定領域にメチル化シトシンを含むＤＮＡ断片とハイブリダイズ可能な核酸と、特定領域にシトシンを含むＤＮＡ断片とハイブリダイズ可能な核酸とを、適宜分類して同時に基板上に配置すると、メチル化の程度が異なる複数のメチレーションサイトのメチル化について、一度に包括的に分析することができる。【００９７】
（３）ＭＯＮＩＣ法
本発明のＤＮＡアレイ製造方法の一態様であるＭＯＮＩＣ法について、図５に沿って説明する。なお、以下の説明は、抗メチル化シトシン抗体を用いる態様（すなわち、メチル化シトシン型製造方法）を例にとって説明するが、抗シトシン抗体を用いても実施することが可能である。【００９８】
本発明のＭＯＮＩＣ法では、出発材料であるゲノムＤＮＡ（又はその断片）１を、突出末端を生じさせる制限酵素で消化する前に、一本鎖ＤＮＡを分解するヌクレアーゼで処理することができる（工程１）。一般に、生体試料から調製したゲノムＤＮＡ（又はその断片）１は、処理前から存在するか、あるいは、操作中の人為的要因に由来する一本鎖構造、例えば、ステムループ構造１ａ又は突出末端１ｂを含んでおり、前記工程１の操作を実施することにより、これらの一本鎖構造を含まない、両端が完全に平滑化されたＤＮＡ断片２ａ，２ｂの混合物を得ることができる。一本鎖ＤＮＡを分解するヌクレアーゼとしては、例えば、マングビーン（Mung Bean）ヌクレアーゼ又はＳ１ヌクレアーゼを使用することができる。【００９９】
次に、得られた平滑化ＤＮＡ断片混合物を、メチル化シトシン又はシトシンを含む突出末端を生じさせる制限酵素で消化することにより、突出末端にメチル化シトシン４又はシトシンが露出しているＤＮＡ断片３ａ，３ｂ，３ｃの混合物を得ることができる（工程２）。前記ＤＮＡ断片混合物には、両方の突出末端のいずれにもメチル化シトシンが存在しないＤＮＡ断片３ａ、一方の突出末端のみにメチル化シトシン４が存在するＤＮＡ断片３ｂ、及び両方の突出末端にメチル化シトシン４が存在するＤＮＡ断片３ｃが含まれる。【０１００】
次に、ＤＮＡ断片３ａ，３ｂ，３ｃの混合物を、抗メチル化シトシン抗体と接触させることにより、免疫複合体を形成するＤＮＡ断片群と、未反応のＤＮＡ断片群とに分離する（工程３）。例えば、抗メチル化シトシン抗体を担持させたカラムに、前記混合物を通過させることにより、例えば、前記ＤＮＡ断片３ｂ，３ｃを含むカラム吸着画分と、前記ＤＮＡ断片３ａを含むカラム非吸着画分とに分離することができる。カラムの条件を適宜選択することにより、それ以外の組合せ、例えば、ＤＮＡ断片３ｃを含むカラム吸着画分と、前記ＤＮＡ断片３ａ，３ｂを含むカラム非吸着画分とに分離することができる。【０１０１】
得られた各画分は、常法に基づいて、ＤＮＡ断片の分析を実施し、それに基づいてＤＮＡアレイを製造することができる。【０１０２】
本発明のＭＯＮＩＣ法では、ゲノムＤＮＡを、一本鎖ＤＮＡを分解するヌクレアーゼで処理するため、ステムループ構造を有するゲノムＤＮＡであっても、ステムループ構造上に存在するメチレーションサイトの影響を受けることなく、ＤＮＡ断片の突出末端（又は一本鎖化領域）のメチル化の状態に応じて、ＤＮＡ断片を分離することができる。【０１０３】
（４）MONIC-Loop Trap法
本発明のＤＮＡアレイ製造方法の一態様であるMONIC-Loop Trap法について、図６に沿って説明する。なお、以下の説明は、抗メチル化シトシン抗体を用いる態様（すなわち、メチル化シトシン型製造方法）を例にとって説明するが、抗シトシン抗体を用いても実施することが可能である。【０１０４】
本発明のMONIC-Loop Trap法では、出発材料であるゲノムＤＮＡ（又はその断片）１を、平滑末端を生じさせる制限酵素で消化する（工程１）。前記工程１の操作を実施することにより、ステムループ構造１ａを維持した状態で、両端が平滑末端であるＤＮＡ断片１２，１３，１４の混合物を得ることができる。前記ＤＮＡ断片混合物には、ステムループ構造を有するＤＮＡ断片と、ステムループ構造を有しないＤＮＡ断片１３とが含まれる。なお、ステムループ構造を有するＤＮＡ断片には、ループ領域にメチル化シトシン４が露出しているＤＮＡ断片１２と、ループ領域にメチル化シトシンが存在しないＤＮＡ断片１４とが含まれる。【０１０５】
次に、ＤＮＡ断片混合物を、抗メチル化シトシン抗体と接触させることにより、免疫複合体を形成するＤＮＡ断片群と、未反応のＤＮＡ断片群とに分離する（工程２）。例えば、抗メチル化シトシン抗体を担持させたカラムに、前記混合物を通過させることにより、例えば、前記ＤＮＡ断片１２を含むカラム吸着画分と、前記ＤＮＡ断片１３，１４を含むカラム非吸着画分とに分離することができる。
得られた各画分は、常法に基づいて、ＤＮＡ断片の分析を実施し、それに基づいて所望のＤＮＡアレイを製造することができる。【０１０６】
［２］本発明のメチル化分析方法
本発明のメチル化分析方法は、調製工程、抗体接触工程、及び分析工程を含む。本発明のメチル化分析方法では、本発明のＤＮＡアレイを用いることもできるし、それ以外のＤＮＡアレイを用いることもできる。
本発明のメチル化分析方法には、抗体接触工程で用いる抗体の特異性の違いにより、少なくとも１つのメチル化シトシンが露出しているＤＮＡ断片を分析可能な方法（以下、メチル化シトシン型分析方法と称する）と、少なくとも１つのシトシンが露出しているＤＮＡ断片を分析可能な方法（以下、シトシン型分析方法と称する）とが含まれる。【０１０７】
本発明のメチル化分析方法に含まれるメチル化シトシン型分析方法では、抗体接触工程で用いる抗体として、少なくとも抗メチル化シトシン抗体、すなわち、メチル化シトシンと特異的に反応するが、シトシンとは特異的に反応しない抗体を使用し、好ましくは、分析工程で用いるＤＮＡアレイとして、本発明のメチル化シトシン型ＤＮＡアレイを使用する。【０１０８】
一方、本発明のメチル化分析方法に含まれるシトシン型分析方法では、抗体接触工程で用いる抗体として、少なくとも抗シトシン抗体、すなわち、シトシンと特異的に反応するが、メチル化シトシンとは特異的に反応しない抗体を使用し、好ましくは、分析工程で用いるＤＮＡアレイとして、本発明のシトシン型ＤＮＡアレイを使用する。
なお、前記メチル化シトシン型分析方法又はシトシン型分析方法において、抗メチル化シトシン抗体及び抗シトシン抗体を組み合わせて使用することもできる。
以下、メチル化シトシン型分析方法について説明し、続いて、シトシン型分析方法について説明する。【０１０９】
（１）メチル化シトシン型分析方法
本発明のメチル化シトシン型分析方法における調製工程では、分析対象ＤＮＡから、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンが露出しているＤＮＡ断片混合物を調製する。
本発明のメチル化シトシン型分析方法において分析対象とすることのできるＤＮＡは、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む可能性のあるＤＮＡである限り、特に限定されるものではなく、例えば、細胞（例えば、動物細胞又は植物細胞）のゲノムＤＮＡ、あるいは、生体試料又はそれに由来する試料（例えば、血液、血漿、血清、尿、リンパ液、髄液、唾液、腹水、羊水、粘液、乳汁、胆汁、胃液、又は透析実施後の人工透析液など）に存在する遊離ＤＮＡ断片混合物を挙げることができる。【０１１０】
前記ＤＮＡ断片混合物を調製する手段としては、メチル化シトシン型製造方法における調製工程で先述したＤＮＡ断片混合物の調製手段を用いることができ、メチル化シトシン型製造方法の調製工程における前記調製手段に関する説明が、そのまま、メチル化シトシン型分析方法における調製工程にも当てはまる。【０１１１】
本発明のメチル化シトシン型分析方法における抗体接触工程では、前記調製工程で得られたＤＮＡ断片混合物と、抗メチル化シトシン抗体とを接触させ、前記抗体と反応して免疫複合体を形成したＤＮＡ断片群（複合体形成ＤＮＡ断片群）と、前記抗体と反応しなかったＤＮＡ断片群（未反応ＤＮＡ断片群）とに分離するか、あるいは、前記抗体に対して高親和性を示すＤＮＡ断片群（高親和性ＤＮＡ断片群）と、前記抗体に対して低親和性を示すＤＮＡ断片群（低親和性ＤＮＡ断片群）とに分離することができる。
メチル化シトシン型分析方法における抗体接触工程は、メチル化シトシン型製造方法における抗体接触工程と同様にして実施することができる。すなわち、メチル化シトシン型製造方法における抗体接触工程に関する説明が、そのまま、メチル化シトシン型分析方法における抗体接触工程にも当てはまる。【０１１２】
本発明のメチル化シトシン型分析方法における分析工程では、前記抗体接触工程で得られた複合体形成ＤＮＡ断片群に含まれるＤＮＡ断片及び／又は未反応ＤＮＡ断片群に含まれるＤＮＡ断片を、分析目的に応じて適宜選択可能なＤＮＡアレイで分析する。
メチル化シトシン型製造方法又はシトシン型製造方法における抗体接触工程において先述したとおり、ＤＮＡ断片群として、種々のＤＮＡ断片群、例えば、
少なくとも一方の末端におけるメチレーションサイト（シトシン）がメチル化されている（すなわち、２つのＣ含有突出末端の少なくとも一方にメチル化シトシンが存在する）ＤＮＡ断片群、
両端のメチレーションサイト（シトシン）が両方ともメチル化されている（すなわち、２つのＣ含有突出末端の両方にメチル化シトシンが存在する）ＤＮＡ断片群、
一方の末端におけるメチレーションサイト（シトシン）のみがメチル化されている（すなわち、２つのＣ含有突出末端の一方のみにメチル化シトシンが存在する）ＤＮＡ断片群、少なくとも一方の末端におけるメチレーションサイト（シトシン）がメチル化されていない（すなわち、２つのＣ含有突出末端の少なくとも一方にシトシンが存在する）ＤＮＡ断片群、
両端のメチレーションサイト（シトシン）が両方ともメチル化されていない（すなわち、２つのＣ含有突出末端の両方にシトシンが存在する）ＤＮＡ断片群、又は
一方の末端におけるメチレーションサイト（シトシン）のみがメチル化されていない（すなわち、２つのＣ含有突出末端の一方のみにシトシンが存在する）ＤＮＡ断片群
を取得することができる。本発明では、分析目的に応じて、これらのＤＮＡ断片群を適宜選択して使用することができる。【０１１３】
また、本発明のメチル化シトシン型分析方法で用いることのできるＤＮＡアレイとしては、例えば、本発明のメチル化シトシン型ＤＮＡアレイ若しくはシトシン型ＤＮＡアレイ、又は公知のＤＮＡアレイを用いることができる。公知のＤＮＡアレイとしては、例えば、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む突出末端（例えば、ＣＧ含有突出末端）を生じさせるメチル化非感受性制限酵素（例えば、ＸｍａＩ）でゲノムＤＮＡを消化することにより得られるＤＮＡ断片とハイブリダイズ可能な核酸を基板上に配置したＤＮＡアレイを挙げることができる。【０１１４】
前記複合体形成ＤＮＡ断片群に含まれるＤＮＡ断片は、ＤＮＡアレイによる分析に影響を与えない限り、免疫複合体を形成したままで、あるいは、抗メチル化シトシン抗体から分離した状態で、分析を実施することができる。一般的には、抗メチル化シトシン抗体は、適当な担体に担持させた状態で使用することが好ましい。【０１１５】
ＤＮＡアレイによる分析は、常法に従って実施することができる。例えば、被検試料である前記ＤＮＡ断片を、適当な標識物質（例えば、蛍光物質又は放射性物質）で予め標識した後、ＤＮＡアレイ上に配置した各核酸とハイブリダイズさせ、ＤＮＡアレイ上の各核酸と結合した標識化ＤＮＡ断片に由来する各シグナルを分析（測定又は検出）することにより、各核酸とハイブリダイズ可能なＤＮＡ断片の存在の有無を網羅的に確認することができる。あるいは、複合体形成ＤＮＡ断片群に含まれるＤＮＡ断片と、未反応ＤＮＡ断片群に含まれるＤＮＡ断片とを、それぞれ別々の標識物質で標識して、ＤＮＡアレイにかけることもできる。【０１１６】
本発明のメチル化シトシン型分析方法において、本発明のメチル化シトシン型ＤＮＡアレイを用いる場合には、例えば、抗体接触工程においてＤＮＡ断片混合物を抗メチル化シトシン抗体と接触させることにより、メチル化シトシンが露出しているＤＮＡ断片（複合体形成ＤＮＡ断片群）と、メチル化シトシンが露出していないＤＮＡ断片（未反応ＤＮＡ断片群）とを分離した後、メチル化シトシンが露出しているＤＮＡ断片のみを用いてＤＮＡアレイによる分析を行うことができる。この場合、分析対象細胞におけるゲノムＤＮＡのメチル化率が高い場合には、メチル化シトシンが露出しているＤＮＡ断片の割合が高くなるため、ＤＮＡアレイ上のポジティブスポットの数が多くなる（すなわち、ネガティブスポットの数が少なくなる）。それに対して、メチル化率が低い場合には、メチル化シトシンが露出しているＤＮＡ断片の割合が低くなるため、ポジティブスポットの数が少なくなる（すなわち、ネガティブスポットの数が多くなる）。
このように、各分析対象細胞におけるポジティブスポット及び／又はネガティブスポットの傾向（すなわち、数の大小）から、前記細胞のゲノムＤＮＡにおけるメチル化率を判定することができ、更には、ポジティブスポット及び／又はネガティブスポットのプロフィールから、その細胞の状態（例えば、がん細胞の悪性度、細胞の分化状態、疾病への罹患の有無）についても把握することができる。【０１１７】
また、本発明のメチル化シトシン型分析方法において、ＤＮＡアレイとして、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む突出末端（例えば、ＣＧ含有突出末端）を生じさせるメチル化非感受性制限酵素（例えば、ＸｍａＩ）でゲノムＤＮＡを消化することにより得られるＤＮＡ断片とハイブリダイズ可能な核酸を基板上に配置したＤＮＡアレイを用いる場合には、例えば、抗体接触工程においてＤＮＡ断片混合物を抗メチル化シトシン抗体と接触させることにより、メチル化シトシンが露出しているＤＮＡ断片（複合体形成ＤＮＡ断片群）と、メチル化シトシンが露出していないＤＮＡ断片（未反応ＤＮＡ断片群）とを分離した後、いずれか一方を前記ＤＮＡアレイにかけることにより、あるいは、前記分離後、別々の標識物質で標識し、両方を前記ＤＮＡアレイにかけることにより、メチル化の状態を把握することができる。なお、ＤＮＡアレイにかけるＤＮＡ断片量が不充分である場合には、予めＤＮＡ増幅（例えば、ＰＣＲ）を実施し、充分量のＤＮＡ断片量を確保してから、ＤＮＡアレイによる分析を実施することもできる。
なお、抗体接触工程を、通常の条件下で実施した後、抗原抗体反応における１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下で溶出させた場合、複合体形成ＤＮＡ断片群には、両端のメチレーションサイトが両方ともメチル化されているＤＮＡ断片のみが含まれ、溶出された未反応ＤＮＡ断片群には、片方のみがメチル化されているＤＮＡ断片のみが含まれる。これらのＤＮＡ断片群（いずれか一方又は両方）を前記ＤＮＡアレイにかけることによっても、メチル化の状態をより詳細に把握することができる。【０１１８】
これらの分析方法を用いると、細胞ごとにメチル化の状態を調べることが可能であり、あるいは、細胞種をマッピングすることができる。
例えば、ゲノムＤＮＡをＸｍａＩで消化したＤＮＡ断片のうちの多くは、細胞種毎にメチル化が変動しないＤＮＡであると考えられる。特に遺伝子領域でなく、パラサイト遺伝子などは、常に不活化されている必要性があると考えられる。がん細胞ではカラムに捕獲されるが、正常細胞では捕獲されないＤＮＡ断片か、あるいは逆で、正常細胞では捕獲されるが、がん細胞では捕獲されなくなるようなＤＮＡ断片に注目することが好ましい。【０１１９】
（２）シトシン型分析方法
本発明のシトシン型分析方法における調製工程では、分析対象ＤＮＡから、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンが露出しているＤＮＡ断片混合物を調製する。
本発明のシトシン型分析方法において分析対象とすることのできるＤＮＡは、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む可能性のあるＤＮＡである限り、特に限定されるものではなく、例えば、細胞（例えば、動物細胞又は植物細胞）のゲノムＤＮＡ、あるいは、生体試料又はそれに由来する試料（例えば、血液、血漿、血清、尿、リンパ液、髄液、唾液、腹水、羊水、粘液、乳汁、胆汁、胃液、又は透析実施後の人工透析液など）に存在する遊離ＤＮＡ断片混合物を挙げることができる。【０１２０】
前記ＤＮＡ断片混合物を調製する手段としては、メチル化シトシン型製造方法における調製工程で先述したＤＮＡ断片混合物の調製手段を用いることができ、メチル化シトシン型製造方法の調製工程における前記調製手段に関する説明が、そのまま、シトシン型分析方法における調製工程にも当てはまる。【０１２１】
本発明のシトシン型分析方法における抗体接触工程では、前記調製工程で得られたＤＮＡ断片混合物と、抗シトシン抗体とを接触させ、前記抗体と反応して免疫複合体を形成したＤＮＡ断片群（複合体形成ＤＮＡ断片群）と、前記抗体と反応しなかったＤＮＡ断片群（未反応ＤＮＡ断片群）とに分離するか、あるいは、前記抗体に対して高親和性を示すＤＮＡ断片群（高親和性ＤＮＡ断片群）と、前記抗体に対して低親和性を示すＤＮＡ断片群（低親和性ＤＮＡ断片群）とに分離することができる。
シトシン型分析方法における抗体接触工程は、シトシン型製造方法における抗体接触工程と同様にして実施することができる。すなわち、シトシン型製造方法における抗体接触工程に関する説明が、そのまま、シトシン型分析方法における抗体接触工程にも当てはまる。【０１２２】
本発明のシトシン型分析方法における分析工程では、前記抗体接触工程で得られた複合体形成ＤＮＡ断片群に含まれるＤＮＡ断片及び／又は未反応ＤＮＡ断片群に含まれるＤＮＡ断片を、分析目的に応じて適宜選択可能なＤＮＡアレイで分析する。
シトシン型分析方法における分析工程は、メチル化シトシン型分析方法における分析工程と同様にして実施することができ、メチル化シトシン型分析方法における分析工程に関する説明が、そのまま、シトシン型分析方法における分析工程にも当てはまる。【０１２３】
本発明のシトシン型分析方法において、本発明のシトシン型ＤＮＡアレイを用いる場合には、例えば、抗体接触工程においてＤＮＡ断片混合物を抗シトシン抗体と接触させることにより、シトシンが露出しているＤＮＡ断片（複合体形成ＤＮＡ断片群）と、シトシンが露出していないＤＮＡ断片（未反応ＤＮＡ断片群）とを分離した後、シトシンが露出しているＤＮＡ断片のみを用いてＤＮＡアレイによる分析を行うことができる。この場合、分析対象細胞におけるゲノムＤＮＡのメチル化率が高い場合には、シトシンが露出しているＤＮＡ断片の割合が低くなるため、ＤＮＡアレイ上のポジティブスポットの数が少なくなる（すなわち、ネガティブスポットの数が多くなる）。それに対して、メチル化率が低い場合には、シトシンが露出しているＤＮＡ断片の割合が高くなるため、ポジティブスポットの数が多くなる（すなわち、ネガティブスポットの数が少なくなる）。
このように、各分析対象細胞におけるポジティブスポット及び／又はネガティブスポットの傾向（すなわち、数の大小）から、前記細胞のゲノムＤＮＡにおけるメチル化率を判定することができ、更には、ポジティブスポット及び／又はネガティブスポットのプロフィールから、その細胞の状態（例えば、がん細胞の悪性度、細胞の分化状態、疾病への罹患の有無）についても把握することができる。【０１２４】
また、本発明のシトシン型分析方法において、ＤＮＡアレイとして、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む突出末端（例えば、ＣＧ含有突出末端）を生じさせるメチル化非感受性制限酵素（例えば、ＸｍａＩ）でゲノムＤＮＡを消化することにより得られるＤＮＡ断片とハイブリダイズ可能な核酸を基板上に配置したＤＮＡアレイを用いる場合には、例えば、抗体接触工程においてＤＮＡ断片混合物を抗シトシン抗体と接触させることにより、シトシンが露出しているＤＮＡ断片（複合体形成ＤＮＡ断片群）と、シトシンが露出していないＤＮＡ断片（未反応ＤＮＡ断片群）とを分離した後、いずれか一方を前記ＤＮＡアレイにかけることにより、あるいは、前記分離後、別々の標識物質で標識し、両方を前記ＤＮＡアレイにかけることにより、メチル化の状態を把握することができる。なお、ＤＮＡアレイにかけるＤＮＡ断片量が不充分である場合には、予めＤＮＡ増幅（例えば、ＰＣＲ）を実施し、充分量のＤＮＡ断片量を確保してから、ＤＮＡアレイによる分析を実施することもできる。
なお、抗体接触工程を、通常の条件下で実施した後、抗原抗体反応における１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下で溶出させた場合、複合体形成ＤＮＡ断片群には、両端のメチレーションサイトが両方ともメチル化されていないＤＮＡ断片のみが含まれ、溶出された未反応ＤＮＡ断片群には、片方のみがメチル化されていないＤＮＡ断片のみが含まれる。これらのＤＮＡ断片群（いずれか一方又は両方）を前記ＤＮＡアレイにかけることによっても、メチル化の状態をより詳細に把握することができる。【０１２５】
一例として、本発明のメチル化分析方法におけるメチル化シトシン型分析方法（メチル化シトシン型アレイを用いる態様）及びシトシン型分析方法（シトシン型アレイを用いる態様）の主な特徴を、表３に示す。
【表３】
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【０１２６】
［３］本発明のＤＮＡ精製方法
本発明のＤＮＡ精製方法では、突出末端を有する二本鎖ＤＮＡ断片を、前記突出末端に含まれる塩基に対する抗体を用いて取得する。本発明のＤＮＡ精製方法は、例えば、本発明の製造方法又は本発明のメチル化分析方法における抗体接触工程に利用することができる。【０１２７】
突出末端を有するＤＮＡ断片、例えば、制限酵素で消化して得られるＤＮＡ断片の公知の精製方法としては、例えば、ゲル電気泳動により分離した後、ゲルから溶出する方法が一般的である。しかしながら、この方法では、電気泳動を実施するため、必ずしも迅速にＤＮＡ断片を精製することはできなかった。【０１２８】
一方、ＤＮＡを構成する各塩基に対する抗体は公知であるが、それを用いて一本鎖ＤＮＡを分離する方法は公知であるものの、前記抗体を用いて、制限酵素で消化して得られるＤＮＡ断片を分離する試みは全く行われていなかった。この理由は、本発明者が推測するに、二本鎖ＤＮＡでは各塩基が主鎖の内側に位置するため、抗塩基抗体が塩基に結合することが妨げられること、また、制限酵素により生じる突出末端の塩基長は、通常、２〜４塩基であり、抗塩基抗体が突出末端の塩基に結合することは立体障害等から困難と考えられていたためと思われる。【０１２９】
本発明者は、本発明の製造方法における抗体接触工程に関する各種態様を検討していく過程において、ＤＮＡ断片の突出末端の塩基に注目し、それに対する抗体を用いることにより、前記ＤＮＡ断片を分離することが可能であることを見出した。このような短い突出末端における塩基に対して、立体障害等の影響を受けずに、抗原抗体反応が可能であることは、予想外の結果であった。【０１３０】
本発明のＤＮＡ精製方法を適用することのできる二本鎖ＤＮＡ断片は、突出末端を有する限り、特に限定されるものではなく、例えば、突出末端を生じさせる制限酵素で消化して得られるＤＮＡ断片、エキソヌクレアーゼで消化して得られるＤＮＡ断片、二種類の一本鎖ＤＮＡをハイブリダイズして得られる二本鎖ＤＮＡ断片などを挙げることができる。突出末端の塩基長は、特に限定されるものではないが、例えば、１０塩基以下であり、好ましくは制限酵素の消化により生じる突出末端の塩基長（通常、５塩基以下、好ましくは４塩基以下、より好ましくは３塩基以下、更に好ましくは２塩基以下）である。【０１３１】
突出末端に含まれる塩基としては、天然のＤＮＡに含まれる通常の塩基、例えば、シトシン、メチル化シトシン、アデニン、グアニン、又はチミン以外にも、酸化による化学修飾若しくは化学変換された塩基（例えば、グアニンのプリン環の８位が酸化された８−オキソグアニン）、あるいは、紫外線により架橋された塩基（例えば、チミジンダイマー）などを挙げることができる。突出末端に含まれる塩基に対する抗体としては、例えば、抗シトシン抗体、抗メチル化シトシン抗体、抗アデニン抗体、抗グアニン抗体、抗チミン抗体、抗８−オキソグアニン抗体、又は抗チミジンダイマー抗体などを挙げることができ、精製対象であるＤＮＡ断片の突出末端の塩基配列に応じて適宜選択することができる。
前記抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであることもでき、狭義の抗体（すなわち、免疫グロブリン分子それ自体）が含まれるだけでなく、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖを用いることができる。【０１３２】
精製対象であるＤＮＡ断片と抗塩基抗体との接触は、一般的な抗原抗体反応と同様にして実施することができる。前記接触を、抗原抗体反応における１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下で実施すると、両端が同一の突出末端であるＤＮＡ断片を、それ以外のＤＮＡと分離することができる。例えば、２種類以上の制限酵素を用いてＤＮＡ消化を行った場合、制限酵素の種類に応じた種々の突出末端を有するＤＮＡ断片混合物が得られるが、前記条件下で抗原抗体反応を実施すると、両端が同一の突出末端であるＤＮＡ断片を、それ以外のＤＮＡ断片（例えば、両端が異なる突出末端であるＤＮＡ断片）と分離することができる。【０１３３】
本発明のＤＮＡ精製方法によれば、例えば、ゲル電気泳動を実施することなく、突出末端に存在する特定塩基の有無を利用して、突出末端に前記塩基を含むＤＮＡ断片のみを精製することができる。
例えば、或るＤＮＡ断片をクローニングしたプラスミドから、２種類の制限酵素Ａ及びＢで前記ＤＮＡ断片を切り出し、精製した後、更に、前記ＤＮＡ断片（一端が制限酵素Ａによる突出末端であり、他端が制限酵素Ｂによる突出末端を有する）を第３の制限酵素Ｃで２つの小断片に切断した場合、制限酵素Ａ又はＢにより生じる塩基配列中の特定塩基の有無に基づいて、ゲル電気泳動を実施することなく、前記小断片の一方のみを取得することができる。
また、本発明のＤＮＡ精製方法を利用すると、突出末端に特定塩基を含むＤＮＡ断片（１種類のＤＮＡ断片である場合と、複数種類のＤＮＡ断片の混合物である場合とを含む）のみを増幅することもできる。以下、本発明のＤＮＡ精製方法を利用した本発明のＤＮＡ増幅方法について説明する。【０１３４】
本発明のＤＮＡ増幅方法では、例えば、ＤＮＡ試料を突出末端を生じる制限酵素で消化した後、抗体を用いて目的のＤＮＡのみを精製する。精製されたＤＮＡは突出末端を有しているため、ＤＮＡリガーゼにより、前記ＤＮＡを再結合し、高分子量のＤＮＡにすることができる。この場合、精製されたＤＮＡが１種類のＤＮＡ断片であっても、あるいは、複数種類のＤＮＡ断片の混合物であっても構わない。得られた高分子量ＤＮＡを適当なＤＮＡ増幅系により増幅した後、最初に使用した制限酵素で再び断片化することにより、先に抗体で精製したＤＮＡのみを選択的に増幅することができる。【０１３５】
前記ＤＮＡ増幅系としては、例えば、ＧｅｎｏｍｉＰｈｉを用いた増幅系（例えば、GenomiPhi DNA Amplification Kit, Cat. #25-6600-01; Amersham社）を挙げることができる。この増幅系は、５０ｋｂｐ以上で効率よくＤＮＡを増幅することができ、例えば、数ナノグラムのＤＮＡを数マイクログラムまで増幅することができる。また、ランダムプライマーを使用しているので、前記の抗体による精製で得られたＤＮＡの全てを一様に増幅することが可能である。このように、前記ＤＮＡ増幅系は、得られたＤＮＡを一度に全て増幅可能な方法であればいずれの方法でも良く、特にこの方法に限定されることはない。例えば、抗体で精製したＤＮＡにリンカーアダプターを接合（Ligate）し、前記リンカーアダプターに特異的に結合するオリゴＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅しても、同様な結果を得ることができる。【０１３６】
本発明のＤＮＡ増幅方法を用いると、ゲノムＤＮＡなどの、種々の遺伝子が含まれるＤＮＡをそのまま鋳型にしてＤＮＡ増幅を行うよりも、目的のＤＮＡを濃縮して増幅する方が高いＳ／Ｎ比を得ることができる。すなわち、これは、増幅したＤＮＡ中に目的のＤＮＡがどの位含まれているかの判定が容易であることを意味する。
現在のところ、鋳型ＤＮＡのシトシンのメチル化をそのまま反映したＤＮＡ増幅産物を得ることは実現されていない。しかし、本発明によれば、制限酵素消化で作出されたＤＮＡ両端の突出部分、すなわち、突出した１本鎖ＤＮＡ中のシトシンのメチル化を指標に前記抗体を用いて濃縮精製し、ＤＮＡ増幅を行うことができるので、結果的には前記メチル化ＤＮＡのみをＤＮＡ増幅することができる。
このように、検査対象とするＤＮＡ試料中に、突出した１本鎖ＤＮＡ中のシトシンがメチル化されていないＤＮＡ断片が多量に存在する場合であっても、突出した１本鎖ＤＮＡ中のシトシンがメチル化されているＤＮＡ断片を効率よくＤＮＡ増幅することが可能となる。【０１３７】
例えば、がんに罹患している患者では、がん組織から、がん特異的にメチル化されたＤＮＡ断片が血液中に微量流出している。しかし、がんに罹患していない正常な人であっても、血清中には数ナノグラム／ｍＬの正常細胞由来のＤＮＡ断片が流れている。従って、被験者ががんに罹患しているか否かを分析するためには、前記の正常細胞由来のＤＮＡ断片に埋没したがん由来の異常なメチル化ＤＮＡ断片を検出しなくてはならない。
本発明によれば、がん特異的にメチル化されたＤＮＡ断片を、先ず、抗体を用いて濃縮することができる。この濃縮精製されたＤＮＡ画分には、がん化によって異常なメチル化を受けたＤＮＡ断片が濃縮して存在することとなる。
【実施例】
【０１３８】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：メチル化シトシン型ＤＮＡアレイの製造》
（１）ＸｍａＩ消化ＤＮＡ画分の分離
ヒト正常繊維芽細胞であるＴＩＧ−１細胞［細胞集団倍化数（ＰＤＬ）２９〜３０］から、常法に従ってゲノムＤＮＡを抽出し、その０．５μｇを制限酵素ＸｍａＩ（１０Ｕ）で２時間消化した。得られたＤＮＡ消化断片を１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ＰＢ）／５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ／０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０（ｐＨ７．１５）１ｍＬで希釈し、制限酵素用緩衝液に含まれる還元剤を希釈した。これに抗５−メチルシトシン・マウスモノクローナル抗体（特開2004-347508号公報；又は第25回日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集、2002年11月25日発行、演題番号2P-0111、p.717）１０μｇを添加し、室温で５分間放置した。反応後、前記反応液をプロテインＡカラム［CIM
monolithic column Protein A HLD; BIA Separations d.o.o. (Slovenia) ;
http://www.monoliths.com/］に通し、１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＰＢ／０．１５ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ／０．０５％ツイーン２０（２．５ｍＬ）でカラムを２回洗浄し、非吸着ＤＮＡをカラムから洗浄除去した。次に、前記カラムに１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＰＢ／０．４ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ／０．０５％ツイーン２０（４ｍＬ）を通し、前記条件で解離するＤＮＡ断片をカラムから溶出させ、その画分を保存した（第１ＤＮＡ画分）。更に、同緩衝液（５ｍＬ）でカラムを洗浄した後、０．３ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）２ｍＬでカラムに吸着しているＤＮＡをすべて溶出した（第２ＤＮＡ画分）。【０１３９】
得られた各ＤＮＡ画分を定量したところ、第１ＤＮＡ画分は総量１６．７ｎｇであり、第２ＤＮＡ画分は総量７．２ｎｇであった。なお、前記実施例では１０μｇの抗体を使用したが、この抗体添加量を増やすことにより、ＤＮＡのカラムへの結合量を増加させ、ＤＮＡの回収率を改善することができる。また、カラム長を長くすることによっても回収率を高めることができる。【０１４０】
（２）ＤＮＡ断片の増幅及びクローニング並びにＤＮＡアレイの製造
前記実施例１（１）で得られた各画分に、３ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウムを１０分の１容量加え、２．５倍量のエタノールを加え、−２０℃で１時間放置し、遠心分離によりＤＮＡを回収する。沈殿したＤＮＡを常法により連結（ligate）して高分子量ＤＮＡとし、市販の増幅系（GenomiPhi DNA Amplification Kit, Cat.
#25-6600-01; Amersham社）を用いてＤＮＡ増幅を行う。増幅されたＤＮＡを再びＸｍａＩで切断し、これに含まれるＤＮＡ断片をそれぞれクローニングした後、各ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する。決定した塩基配列に基づいて、Ｔｍを考慮しながら、ＤＮＡアレイに配置するオリゴヌクレオチドを設計し、化学合成する。合成したオリゴヌクレオチドを常法に基づいて基板上に配置することにより、本発明のＤＮＡアレイを製造することができる。【０１４１】
《実施例２：ＭＯＮＩＣ法によるＤＮＡ断片の分離》
（１）ＤＮＡ断片混合物の調製
ヒトＢ細胞系がん細胞株（Burkitt
lymphoma Raji細胞；JCRB9012，JCRB細胞バンク）から常法に従ってゲノムＤＮＡを精製し、これを１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ／２５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ／０．５％ＳＤＳ（３０μＬ）に溶解した。このＤＮＡ溶液に、プロテイナーゼＫの５０％グリセリン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を、プロテイナーゼＫの終濃度が０．４ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、５５℃で２時間処理した。その後、反応液を常法に従ってフェノール／クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行った。得られたＤＮＡの内、３０μｇを緩衝液［３０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０），１０００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ，１ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸亜鉛，１０％グリセロール］に溶かし、それに１Ｕ／μｇＤＮＡの割合でマングビーン（Mung
Bean）ヌクレアーゼ（タカラバイオ社）を加えて３７℃にて３０分間処理した。この処理によりゲノムＤＮＡの１本鎖領域は除去され、完全平滑化される。【０１４２】
次に、反応液をＴＥ緩衝液［１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０），０．５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ］３００μＬで希釈後、タンパク質吸着フィルター（MicropureEZ；MILLIPORE社）にかけて短時間ろ過し、マングビーンヌクレアーゼを除去した。次に、回収したろ液を限外濾過膜（MicroconYM-5；MILLIPORE社）で１０μＬ程度まで濃縮した後、２Ｕｎｉｔ／１μｇＤＮＡの割合になるように制限酵素ＢｓａＪＩ（New
England Biolab社）を用いて６０℃で１時間半消化し、ＤＮＡを断片化した。【０１４３】
（２）ＤＮＡ断片の分離
得られたＤＮＡ断片混合物を、常法に従って、抗５−メチルシトシン抗体を担持させたアフィニティーカラムにかけ、所望のＤＮＡ画分を取得することができる。【０１４４】
《実施例３：MONIC-Loop Trap法によるＤＮＡ断片の分離》
磁気ビーズ（Dynabeads；Dynal biotech社）懸濁液５００μＬ（４×１０７個ビーズ含有）を１．５ｍＬチューブに入れ、ＰＢＳ［１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５），０．１５ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ］で数回洗浄した。実施例１で用いたのと同じ抗５−メチルシトシン・マウスモノクローナル抗体（clone 1-5GB4A5）４μｇ及び０．１％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加したＰＢＳ（５００μＬ）をビーズに加え、ローテーターを用いて室温で３０分間反応させた。マグネットでビーズを回収し、上清を除去した。
【０１４５】
実施例２で調製したゲノムＤＮＡを制限酵素ＡｌｕＩで消化したＤＮＡ断片（２μｇ）に、ＰＢＳを加えて５００μＬとし、これを回収したビーズに加えて、室温にて１時間反応させた。上清を除去後、集めたビーズにＰＢＳ５００μＬを加え、ローテーターで穏やかに転倒混和しながら１０分間洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した。溶出バッファー［１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５），０．１５ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ］５００μＬを加え、ビーズを穏やかに懸濁し、マグネットでビーズを集めて上清を吸着画分として回収した。比較のために、マングビーンヌクレアーゼ処理したＤＮＡを制限酵素ＡｌｕＩ（平滑末端を生じさせる制限酵素）で消化したものを、前記ビーズと接触させたところ、ビーズに捕捉されたＤＮＡ断片は認められなかった。
【０１４６】
《実施例４：磁気ビーズを用いるＭＯＮＩＣ法によるＤＮＡ断片の分離》
実施例２（１）で得られたＤＮＡ断片混合物（マグビーンヌクレアーゼ処理した後、制限酵素ＢｓａＪＩで消化したもの）について、実施例３に記載の手順に従って、マグネットビーズを用いる分離工程を実施することにより、吸着画分を取得した。吸着前のＤＮＡ断片混合物、及び得られた吸着画分をそれぞれ鋳型として、配列番号１（センスプライマー）及び配列番号２（リバースプライマー）で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーセットＡ、又は配列番号３（センスプライマー）及び配列番号４（リバースプライマー）で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーセットＢを用いてＰＣＲを実施した後、その増幅産物を８％アクリルアミドゲル電気泳動で分析した。【０１４７】
なお、前記プライマーセットＡ及びＢは、それぞれ、ヒトＥ−カドヘリン遺伝子のプロモーター領域の７０ｂｐ（−２３８番〜−１６９番の塩基からなる配列）及び５０ｂｐ（＋１１番〜＋６０番の塩基からなる配列）のＤＮＡ断片を増幅することができる。なお、前記塩基番号は、エキソン１の開始塩基を「＋１」と表記した場合の番号である。プライマーセットＡにより増幅される７０ｂｐのＤＮＡ断片は、両末端にＣｐＧ配列を含まないため、いずれの末端にもメチル化シトシンを含まない。一方、プライマーセットＢにより増幅される５０ｂｐのＤＮＡ断片は、両末端にＣｐＧ配列を含み、両方の末端にメチル化シトシンを含む。なお、前記ＣｐＧ配列がメチル化されていることは、本実施例で使用した細胞株におけるヒトＥ−カドヘリン遺伝子プロモーター領域が高度にメチル化されていることが既に報告されており、更に、別法によって、本発明者により予め確認済みである。【０１４８】
電気泳動の結果を図７に示す。図７において、レーン１及び２は、吸着前のＤＮＡ断片混合物を鋳型として用い、レーン３及び４は、吸着画分を鋳型として用いた結果である。また、レーン１及び３は、プライマーセットＡ（両端のＣｐＧ配列の合計：０個）を用い、レーン２及び４は、プライマーセットＢ（両端のＣｐＧ配列の合計：２個）を用いた結果である。【０１４９】
図７に示すとおり、吸着前のＤＮＡ断片混合物には、両端にメチル化シトシンを含まないＤＮＡ断片（７０ｂｐ）と、両端にメチル化シトシンを含むＤＮＡ断片（５０ｂｐ）とが含まれていた。一方、吸着画分には、両端にメチル化シトシンを含むＤＮＡ断片（５０ｂｐ）が含まれていたが、両端にメチル化シトシンを含まないＤＮＡ断片（７０ｂｐ）は含まれておらず、本発明方法により、両端にメチル化シトシンを含むＤＮＡ断片（５０ｂｐ）と、両端にメチル化シトシンを含まないＤＮＡ断片（７０ｂｐ）とを分離可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１５０】
本発明のＤＮＡアレイ及びメチル化分析方法は、ＤＮＡメチル化分析の用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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