(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）試験する生物内の、または試験の前に生物から切除しておいた、無傷の昆虫又はクモ類の脳組織における、神経活動の初期パターンを検出するステップと、
ｂ）化合物を脳組織に加え、生じる神経活動のパターンを検出するステップと、
ｃ）細胞内神経活動の初期パターンと生じた神経活動のパターンとを比較することにより、神経活動への化合物の薬理学的活性を調べるステップ
とを含む、化合物を薬理学的活性に関してスクリーニングする方法。
【請求項２】
前記神経活動をカルシウム振動のパターンとして検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）細胞内カルシウム濃度をモニターする方法、
ｂ）細胞内カルシウムの信号伝達経路の作用をモニターする方法、
ｃ）他の種類の信号伝達経路の作用をモニターする方法、または
ｄ）神経電位をモニターする方法
によって、前記神経活動のパターンを直接的に又は間接的に検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記神経活動のパターンを検出する方法が、検査する脳組織においてアポエクオリンを発現することを含む、請求項２または請求項３のａ）に記載の方法。
【請求項５】
前記アポエクオリンが遺伝子導入によって発現される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アポエクオリンがＧＡＬ４制御下でエクオリン遺伝子から誘導される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記アポエクオリンを発現する脳組織にセレンテラジンを加えることによって細胞内カルシウム濃度を検出する、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記神経活動のパターンの検出を、ＣＣＤカメラ、ルミノメーター、又は他の適当な光検出手段を用いて実施する、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
カルシウムと結合した場合にスペクトル応答を示す蛍光プローブの使用を含み、蛍光顕微鏡検査、フローサイトメトリー、又は蛍光分光法を用いて細胞内の遊離カルシウム濃度の変化を検出する、請求項３のａ）に記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光プローブが、グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のブルー又はシアン発光突然変異体、カルモジュリン、カルモジュリン結合ペプチドＭ１３、及び強調グリーン又はイエロー発光ＧＦＰのタンデム融合を含むいわゆるカメレオンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
電位差測定光学プローブの使用を含む、請求項３のｄ）に記載の方法。
【請求項１２】
生存生物に関して検出を実施する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
生物から切除した脳組織に関して検出を実施する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物の添加が、神経活動の一定期間の休止、活動パターンの変動、又はその両方を生じさせる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記変動が、観測される振動の振幅の増大／低減、又は周波数及び／もしくは波のパターンの変化である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物が作動的に働くか又は拮抗的に働くかを確認するための、請求項１４または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬理学的活性が治療作用に関連する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
試験する化合物に帰することができる治療作用が、カルシウムチャネル遮断薬；抗コリンエステラーゼ；呼吸鎖修飾因子；抗高血圧薬；抗パーキンソン病薬；抗アルツハイマー病薬；抗狭心症薬、および抗不整脈薬からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
薬理学的活性が有害作用又は毒性作用に関連する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
農薬に関するスクリーニングにおいて使用するための、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
環境毒性物質に関するスクリーニングにおいて使用するための、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記昆虫又はクモ類が、Ｄｉｃｔｙｏｐｔｅｒａ（網翅類、ゴキブリ）；Ｉｓｏｐｔｅｒａ（等翅類、シロアリ目）；Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ（直翅類、バッタ目）；Ｄｉｐｔｅｒａ（双翅類、ハエ目）；Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ（膜翅類、ハチ目）；Ａｎｏｐｌｕｒａ（吸蝨類、正脱翅類、シラミ目）；Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ（隠翅類、微翅類、ノミ目）；Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ（半翅類、有吻類、カメムシ目）；及びＡｃａｒｉ（ダニ目）からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記昆虫が双翅目からのものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
試験される昆虫又はクモ類の生物の脳組織における細胞内カルシウム振動のパターンを検出するステップと、
これを非突然変異体の昆虫又はクモ類の生物の神経組織における細胞内カルシウム振動のパターンと比較するステップ
とを含む、カルシウム信号伝達突然変異体生物を検出するための方法。
【請求項２５】
外因性遺伝子を発現する昆虫又はクモ類の生物の神経組織における細胞内カルシウム振動のパターンを検出するステップと、
前記パターンを、前記外因性遺伝子を発現しない昆虫またはクモ類の生物の神経組織における細胞内カルシウム振動のパターンと比較するステップ
とを含む、神経組織における細胞内カルシウム振動のパターンへの外因性遺伝子の影響を評価するための方法。
【請求項２６】
前記外因性遺伝子を発現する生物が、同等の内因性遺伝子に関して機能不全である、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、特に双翅類の脳組織に適したｉｎ  ｓｉｔｕでの昆虫脳組織アッセイ及びそのようなアッセイの使用に関する。
【０００２】
多細胞生物では、細胞の交通が分化された組織の様々な活動を調節するために必須である。すべての動物において、保存された細胞内第二メッセンジャー経路が存在する。これらのうちでカルシウムは重要な第二メッセンジャーである。神経細胞、筋肉及びその他の細胞では、１００ｎＭの典型的静止レベルからの細胞内カルシウム活性の変調が、多くの短期及び長期的プロセスを調節する。従って、カルシウムの測定は正常な機能と疾患状態の両方を理解するために極めて重要であり、カルシウム信号伝達を変調する薬剤は広い範囲の疾患を治療するうえで臨床的重要性を持つことが示されている。
【０００３】
本出願の発明者は、遺伝モデル生物、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）においてトランスジェニックエクオリン発現系の有用性を明らかにした；Ｒｏｓａｙら（１９９７）。
【０００４】
合成Ｐ因子トランスポゾンに基づき、ＧＡＬ４／ＵＡＳエンハンサートラップ系を使用して、本出願の発明者は、マルピーギ管の所定サブセットの細胞においてアポエクオリンを特異的に発現することが可能であり、新鮮切除した管組織をセレンテラジン中でインキュベートすると、十分に機能的エクオリンに還元できることを示した；Ｒｏｓａｙら（１９９７）。
【０００５】
本発明は、上述した手法を使用して細胞内カルシウム濃度の振動が無傷のショウジョウバエの脳で観察されるという発明者による予想外の発見に基づく。これらの振動は長期間であり、細胞型特異的、内因性で、強く且つ同調性であって、先例のない、本出願の発明者の知るかぎり最良の特徴の組合せである。この系におけるカルシウム振動は神経活動の振動を反映すると思われるので、神経活動をモニターすることができる他の手段も同じ基本的プロセスを明らかにすると予想できる。
【０００６】
主として完全な組織ではなく単一細胞に関して、例えば神経系の場合には培養した海馬ニューロン（Ｊａｆｆｅ，１９９４；Ｓｅｙｍｏｕｒ−Ｌａｕｒｅｎｔ，１９９５；Ｏｇｄｅｎ，１９９６）及び皮質ニューロン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９９３；ＷａｎｇとＧｒｕｅｎｓｔｅｉｎ，１９９７）に関してであるが、同様の周期のカルシウム振動が一部の脊椎動物系で認められた。脊椎動物末梢組織を代表するいくつかの細胞系、例えばオキシトシン、バソプレシン、アンギオテンシン−ＩＩ又はノルアドレナリンで処理した肝細胞は、ホルモン刺激下で５ｍＨｚの範囲で振動を示す（Ｗｏｏｄｓら、１９８６）。グルコースで処理した個々の膵ベータ細胞は、細胞質ナトリウム及びカルシウムの大きな振幅の振動を示す（Ｇｒａｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒら、１９８８；Ｇｒａｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒ，１９９６）。しかし、ニューロンではなく星状細胞に限定されると思われる海馬切片を除いて（Ｄａｎｉ，１９９５；Ｄｕｆｆｙ，１９９５）、ｉｎ  ｓｉｔｕで起こる同様の振動に関しては直接の証拠がほとんど存在しなかった。本出願の発明者は、昆虫神経系における同様の性質の振動に関する報告は全くないと認識している。
【０００７】
最初の局面では、本発明は、次の段階を含む、化合物を薬理学的活性に関してスクリーニングするｉｎ  ｓｉｔｕでの方法を提供する：
ａ）脳組織における神経活動の初期パターンを検出する；
ｂ）化合物を脳組織に加え、生じる神経活動のパターンを検出する；そして
ｃ）細胞内神経活動の初期パターンと生じた神経活動のパターンを比較することにより、神経活動への化合物の薬理学的作用を調べる。
【０００８】
本発明の利点は、本発明の方法が培養細胞ではなく無傷組織に関して実施され、特定の試薬が神経機能に及ぼしうる作用の本当の生理的な反映を論証可能に提供することである。ｉｎ  ｓｉｔｕは、試験する生体内に残存する組織あるいは試験の前に生物から切除しておいた組織に適用することと解釈される。
【０００９】
「神経活動」の語は、細胞内カルシウム濃度の変化に依存する、又はかかる変化を生じさせる、又は変化と平行して起こる、神経機能の測定可能なすべての局面を包含すると理解すべきである。通常は、「神経活動」は細胞内カルシウム振動のパターンとして検出しうる。
【００１０】
「薬理学的活性」の語は、生物にとって有益であるか否かに関わらず、すべての活性を含むと理解すべきである。従って、活性は治療活性に関連する場合も、あるいはその代わりに活性が生物にとって有害又は毒性である、例えば生物致死性である場合もありうる。
【００１１】
ショウジョウバエ脳組織に適用するとき、本アッセイは、薬理学的活性又は殺虫活性を持つ化学物質をスクリーニングするために直接使用することができる。神経活動の振動は、次のものを含むがそれらに限定されない広い範囲の方法によって直接又は間接的に検出しうる：ａ）トランスジェニックアポエクオリン；ｂ）細胞内カルシウム濃度をモニターする他の方法；ｃ）細胞内カルシウムの信号伝達経路の操作をモニターする他の方法；ｄ）他の種類の信号伝達経路の操作をモニターする方法；ｅ）神経電位をモニターする方法。
【００１２】
例えば蛍光プローブ（フラ−２、インド−１、キン−２など）はカルシウムに結合するときスペクトル応答を示し、蛍光顕微鏡検査、フローサイトメトリー及び蛍光分光法を用いて細胞内の遊離カルシウム濃度の変化を検出することが可能である。これらの蛍光指示薬の大部分は、非蛍光カルシウムキレート化物質、ＥＧＴＡ及びＢＡＰＴＡのバリエーションである（ＣｏｂｂｏｌｄとＲｉｎｋ，１９８７）。
【００１３】
「カメレオン」と呼ばれる新しい蛍光指示薬も使用でき、これらは補因子なしに遺伝的にコードされ、細胞内の特定位置に標的可能である。これらのいわゆる「カメレオン」は、グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のブルー又はシアン発光突然変異体、カルモジュリン、カルモジュリン結合ペプチドＭ１３、及び強調グリーン又はイエロー発光ＧＦＰのタンデム融合から成る。カルシウムの結合はＭ１３ドメインの周囲をカルモジュリンでおおい、隣接するＧＦＰ間の蛍光共鳴エネルギー転移を高める（Ｍｉｙａｗａｋｉら、１９９７）又は低下させる（Ｒｏｍｏｓｅｒら、１９９７）。
【００１４】
さらに、電位差測定光学プローブも使用できる。電位差測定光学プローブは細胞小器官及び細胞における膜電位を測定する。画像手法と組み合わせて、これらのプローブを用いて高い空間分解能とサンプリング頻度でニューロンに沿った及び細胞個体群間の膜電位の変動をマッピングすることができる（Ｒｏｈｒ＆Ｓａｌｚｂｅｒｇ，１９９４）。
【００１５】
非制限的な例として、本出願の発明者は、本文中で述べる方法のモデルとしてショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）を使用し、酵母転写因子、ＧＡＬ４の制御下でショウジョウバエの脳におけるアポエクオリンの発現により細胞内カルシウムレベルを検出した。
【００１６】
特定のクラスの細胞の視覚化のため、及びそれらの細胞を生存生物において操作する手段を提供するために、ショウジョウバエ  Ｐ［ＧＡＬ４］エンハンサートラップ系を使用する（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，１９９７）。ゲノム転写エンハンサーの近くに生じるＰ［ＧＡＬ４］トランスポゾンの挿入は、近接するエンハンサーを反映するパターンで酵母転写活性化因子ＧＡＬ４の発現を導く。
【００１７】
カルシウムリポーターであるエクオリンをＧＡＬ４制御下に置くことにより、本出願の発明者は、無傷ショウジョウバエ脳において非侵襲的且つ細胞型特異的に、振動するカルシウム濃度を検出することができる系を確立した。ここで述べるように、嗅覚に関連する学習と記憶及び配偶者選択に関する脳中枢、キノコ体において振動を検出した。キノコ体あるいは類似構造はすべての昆虫で認められる。原則として、いかなる細胞型においても振動活動に対して同じアプローチが適用できる。
【００１８】
検出は生存生物全体について実施することができる。セレンテラジンのような必要な試薬（エクオリン発現系のため）を加えることができるように頭部クチクラの小さな部分を切除する。比較的透過性及び／又は半透明のクチクラを有する突然変異体生物も使用しうる。その代わりに、脳組織を切除して、それにセレンテラジンのような試薬を加えてもよい。
【００１９】
ショウジョウバエの脳におけるエクオリン発現系の例に関しては、カルシウム振動はセレンテラジンの添加後すぐに検出可能となり、１時間以内に最大振幅に達し、１５時間以上にわたって持続しうる。検出は、ＣＣＤカメラ、ルミノメーター、又は適当な光検出系を用いて実施することができる。
【００２０】
ひとたび神経活動の初期パターン、例えば細胞内カルシウム振動が検出されれば、スクリーニングする化合物を加えて、神経活動へのその薬理学的作用を調べることができる。化合物は天然又は合成化合物を含みうる。
【００２１】
薬理学的活性は様々な方法で発現しうる。例えば、化合物は一定期間の神経活動の休止あるいは活動パターンの変動又はその両方を生じうる。そのような変動は、振動の振幅の増大／低減、ならびに認められる振動数及び／又は波のパターンの変化を含みうる。
【００２２】
神経活動の初期パターンが検出されるので、化合物が作動的に働くかあるいは拮抗的に働くかを確認することが可能となる。すなわち、化合物がその後神経活動の周波数／振幅／度合を上昇させるか低下させるかである。
【００２３】
当該方法は特に、脳の自然の神経活動を変動させうる又は変化させうる化合物のスクリーニングに適用できる。かかる変化はカルシウム動力学に対するスクリーニング化合物の直接の結果であるか、あるいは化合物がナトリウム又はカリウムチャネルのような異なる経路に影響を及ぼして、カルシウム動力学への二次的な又は結果的な作用を及ぼすと考えられる。
【００２４】
本文中で述べる方法は、昆虫神経系のような有害生物の神経系に対する潜在的殺虫性化合物の活性を調べることにより、農薬の開発に特に適用できる。
【００２５】
本文中で述べる方法はまた、新しい薬剤あるいは神経組織への薬理学的活性を持つことが示されている既存薬剤についての新しい適用の開発を導きうる。そのような薬剤は、カルシウムチャネル遮断薬、抗コリンエステラーゼ、呼吸性興奮薬、抗高血圧薬、抗パーキンソン病薬、抗アルツハイマー病薬、抗狭心症薬及び抗不整脈薬を含む。
【００２６】
当該アッセイはまた、神経活動を変動させる又は変化させる環境毒性物質、例えば作物、土壌又は圃場から流出する水中の殺虫薬に関するスクリーニングにも使用しうる。
【００２７】
昆虫の脳におけるカルシウム振動の発見はまたさらなる適用を導いた。
【００２８】
さらなる局面において本発明は、被験生物の脳組織における細胞内カルシウム振動のパターンを検出し、これを非突然変異体生物の神経組織における細胞内カルシウム振動のパターンと比較することを含む、カルシウム信号伝達突然変異体生物を検出するための方法を提供する。
【００２９】
かかる突然変異体は振動活性の異常を示すと考えられる。
【００３０】
そのような方法は、カルシウム動力学を変動させる、天然に起こる突然変異又は誘発突然変異をスクリーニングするために使用でき、またその産物が先に述べたクラスの薬剤についてあるいは農薬の開発において新しい標的となりうる新しい遺伝子の発見を導きうる。
【００３１】
さらなる局面では本発明はまた、外因性遺伝子を発現する生物の神経組織における細胞内カルシウム振動のパターンを検出し、当該パターンを、当該外因性遺伝子を発現しない生物の神経組織における細胞内カルシウム振動のパターンと比較することを含む、神経組織における細胞内カルシウム振動のパターンへの外因性遺伝子の作用を評価するための方法を提供する。
【００３２】
外因性遺伝子を一過性に発現させるか、あるいは生物の特定外因性遺伝子を遺伝子組み替えとすることができる。外因性遺伝子はいかなる由来のものでもよいが、特にヒト又は動物由来であり、神経系において外因性カルシウム信号伝達を変動させる又は変化させることを期待して選択することができる。その後化合物を、外来遺伝子の発現バックグラウンドにおけるカルシウム信号伝達への作用に関して試験することができる。
【００３３】
さらに上記の２つのアプローチを組み合わせることも可能であろう。例えば、特定遺伝子を潜在的に正常な神経機能に関連するものとしてヒトにおいて同定する。ショウジョウバエでは機能不全であるこの遺伝子に相当するものの、突然変異体ショウジョウバエを作製するか又は利用可能にする。次にヒト遺伝子を突然変異体ショウジョウバエにおいて発現し、化合物をヒト遺伝子発現のバックグラウンドにおけるカルシウム振動への作用に関して試験する。
【００３４】
ショウジョウバエ及びＧＡＬ４／ＵＡＳ発現系を用いたエクオリン遺伝子の発現に関して上記に例示したが、そのような手法は、脳における神経活動の内因性振動を示す他の生物、及び上述したような神経活動を検出する代替的手段（例えばカルシウム及び電位差測定染料）に容易に拡大することができる。
【００３５】
例えば、適当なトランスポゾンに基づく技術を使用して他の昆虫種にエクオリン遺伝子について遺伝子導入をすることができる。さらに細胞又は組織特異的プロモーターの制御下に、直接又はＧＡＬ４／ＵＡＳ系のような系を通して、又は遍在的且つ非選択的に、熱ショック、アクチン又は同様のプロモーターを使用することにより、アポエクオリンを遺伝子導入によって発現させることができる。
【００３６】
エクオリン遺伝子はまた、例えば昆虫におけるバキュロウイルスベクター系や脊椎動物系におけるアデノウイルス系のような病原菌を用いた一過性（非生殖細胞系）形質転換によっても発現することができる。
【００３７】
適当な生殖細胞系形質転換技術を用いて、例えばアポエクオリン発現構築物を受精卵母細胞に注入することによって、あるいは現在マウス及びヒツジにおいて常套的であるＥＳ細胞の形質転換によって、他の動物にエクオリン遺伝子について遺伝子導入することができる。
【００３８】
かかる一般的アプローチは、どのような昆虫、例えば病害虫とみなされる、その防除が必要な昆虫の神経組織にも拡大することができるであろう。そのような病害虫は、Ｄｉｃｔｙｏｐｔｅｒａ（ゴキブリ）；Ｉｓｏｐｔｅｒａ（シロアリ）；Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ（イナゴ、バッタ及びコオロギ）；Ｄｉｐｔｅｒａ（イエバエ、カ、ツェツェバエ、ガガンボ及びショウジョウバエ）；Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ（アリ、スズメバチ、ミツバチ、ハバチ、ヒメバチ及びタマバチ）；Ａｎｏｐｌｕｒａ（ハジラミ及び吸血シラミ）；Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ（ノミ）；Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ（カメムシ及びアリマキ）ならびにＡｃａｒｉ（マダニ及びダニ）のようなクモ類を含む。
【００３９】
下記の非制限的実施例を参照して本発明をさらに説明する。
【００４０】
（材料及び方法）
ｐＵＡＳＴ−エクオリンハエの作製
アポエクオリンｃＤＮＡをＳｍａＩとＰｓｔＩでの二重消化によってプラスミドｐＡＱ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．ＵＳＡから入手可能）から抽出し、同様に開裂したｐＢＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）に挿入した。ＮｏｔＩとＫｐｎＩで再開裂して、５つのＵＡＳＧ（ＧＡＬ−４結合）部位、ｈｓｐ７０  ＴＡＴＡボックス及び転写開始部位の下流で、同様に開裂したｐＵＡＳＴ形質転換ベクター（Ｂｒａｎｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，１９９３）に挿入した。生殖細胞系の形質転換ショウジョウバエを作製し、指示されている細胞遺伝学的位置（Ｒｏｓａｙら、１９９７）にトランスジーンを持つ、２つの機能的に等価の細胞系、ＵＡＳＧ−ａｅｑ３０ＤとＵＡＳＧ−ａｅｑ４９Ａを得た。染色体の起動を用いて、Ｘ染色体上、ＣｙＯ平均体染色体上及び第三染色体上に新たな挿入部を作製した（表１参照）。
【００４１】
ショウジョウバエ法
ここで述べるＰ｛ＧＡＬ４｝系統はＹａｎｇら（１９９５；表１）が述べたスクリーニングから生じたものである。ＧＡＬ４はショウジョウバエにおいて機能的な酵母転写因子である。その発現のパターンと時期は挿入するＰ［ＧＡＬ４］要素のゲノム環境に依存する。ＧＡＬ４を使用して、ＧＡＬ４応答性プロモーター、ＵＡＳＧに結合した第二リポーターの発現を促進することができる。
【００４２】
ヒドロキシ尿素の除去
ｄｅＢｅｌｌｅとＨｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（１９９４）に準じてＨＵ除去を実施した。新しく孵化した幼虫（幼虫孵化後３０±３０分）に、４時間パルスの５０ｍｇ／ｍｌＨＵを含む熱死滅酵母懸濁液を与えた。次に幼虫をＨＵを含まない標準培地に移した。対照昆虫には酵母だけを与えた。
【００４３】
ルミノメトリー
昆虫生理食塩水（Ｎａ＋、１３２ｍＭ；Ｋ＋、２０ｍＭ；Ｃａ２＋、２ｍＭ；Ｃｌ−、１５８ｍＭ；Ｍｇ２＋、８．５ｍＭ；Ｈ２ＰＯ４−、４．３ｍＭ；ＨＣＯ３−、１０．２ｍＭ；グルコース、５ｍＭ；ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整した）の下で脳を切除した。各々のルミノメーターの痕跡は、２．５μＭ  ｈｃｐ−セレンテラジン（Ｍｏｌｅｃｈｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含む上記培地１００μｌ中で自由に浮遊する１個の脳を表わす。Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｗａｌｌａｃ  ＬＢ９５０７ルミノメーターで発光を記録した。データは５−１５秒間を平均した。発光はｃｐｓ／１０で表わしている。ＧＡＬ４不在下での最大バックグラウンド発光は２００−４００ｃｐｓであった。
【００４４】
（実施例１）
ＭＢにおける内因性カルシウム振動
ショウジョウバエ キノコ体（ＭＢ）の種々の神経サブタイプはＰ｛ＧＡＬ４｝エンハンサートラップ系によって明らかにされる（Ｙａｎｇら、１９９５；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９８）。ここでは、本出願の発明者は、ＭＢ内でカルシウム感受性発光蛋白質、エクオリンの細胞質ゾル発現を促進するためにＰ｛ＧＡＬ４｝系を使用した（Ｒｏｓａｙら、１９９７）。エクオリン補因子、ｈｃｐ−セレンテラジンを与えた無傷成虫脳（１０３Ｙ−ａｅｑ４９Ａ；命名については表１参照）からの発光は、主としてＭＢ萼から生じる。
【００４５】
ＧＡＬ４指令ベータガラクトシダーゼ発現のパターンから予想されるパターンを有する活性エクオリンの細胞型特異的発現を、成虫キノコ体のケニヨン（Ｋｅｎｙｏｎ）細胞が明瞭に示される、Ｐ｛ＧＡＬ４｝系統１０３Ｙの環境で確認した。成虫脳（１０３Ｙ−ｌａｃＺ）のクリオスタット前頭断面におけるＧＡＬ４指令ベータガラクトシダーゼ活性は、対のキノコ体の萼及び細胞体を明らかにする。２．５μＭ  ｈｃｐ−セレンテラジンを含むシュナイダー培地（Ｓｉｇｍａ）にひたし、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｎｉｇｈｔ  Ｏｗｌ  ＣＣＤカメラ（ブルー）に３分間露出して、明るいフィールド画像のに二重焼き付けした、成虫脳全体におけるＧＡＬ４指令エクオリン活性は、萼を明瞭に示す。
【００４６】
図１ａは１０３Ｙ−ａｅｑ４９Ａ脳におけるエクオリン活性のルミノメーター痕跡を示す。頭部の莢膜から脳を切除し、２．５μＭ  ｈｃｐ−セレンテラジンを含む単純な昆虫生理食塩水（リンガー液）にひたした。分単位の平均周期でエクオリン活性の強い振動を認めた。アポエクオリン及びセレンテラジンからの活性エクオリンの形成に関して知られている時間依存性に一致して、振動は３０分までに最大振幅に達し、１５時間以上にわたって持続しうる。作用の振幅は、同調して振動する多くのＫＣの重なり合った発光を意味する。
【００４７】
上記の特徴を持つ振動が、ＫＣ発現に基づいて選択したいくつかのＰ｛ＧＡＬ４｝系統の環境において認められた（例えば図１ｂ、ｃ）。セレンテラジンを注入する頭部クチクラの小さなスリットを除いて手術外傷を受けていない、生体ハエにおいて振動を観察することができる（図１ｅ）。
【００４８】
いずれの脳においても、周期、振幅及び波形は数時間にわたって有効に一定なままでありうる。振動は、Ｐ｛ＧＡＬ４｝バックグラウンド及び雌雄に関わりなく、３２４±１３秒（ｎ＝８８）の平均周期で起こる。
【００４９】
下記に述べる実験は、Ｐ｛ＧＡＬ４｝系統３０Ｙ及び１１７Ｙの環境で実施した（図１ｂ、ｃ；Ｙａｎｇら、１９９５；Ｔｅｔｔａｍａｎｔｉら、１９９７；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９８）。どちらも大きな割合の成虫ＫＣを示し、一貫して高い振幅の振動を与える。いずれの場合も発現パターンは必ずしもキノコ体に限定されない。
【００５０】
（実施例２）
ヒドロキシ尿素の除去及び発育時期
ＫＣを選択的に除去しておいたＧＡＬ４−ａｅｑハエの試験によって、ＫＣ内で振動が起こることのさらなる証拠が提供された。各々のショウジョウバエ キノコ体の２０００−３０００ＫＣがちょうど４つの神経芽前駆細胞から生じ、胚形成中期からさなぎ後期まで持続的に活性なままである。幼虫の孵化直後に、他のすべての神経芽細胞（１本の線）は静止状態になり、ＫＣがヒドロキシ尿素（ＨＵ）のパルス供給によって除去されやすくなる。ＨＵ処理した動物は、９０％以上の正常ケニヨン細胞補体を欠いた健常成虫として生存し、その連合嗅覚学習能力が著しく損なわれる（ｄｅＢｅｌｌｅとＨｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，１９９４）。
【００５１】
３０Ｙ−ａｅｑ系統（ｎ＝８）について図１ｄに示すように、ＨＵ処理の効果は劇的である。１１７Ｙ−ａｅｑ系統についても同様の結果が得られた。
【００５２】
重要な割合の後期幼虫及びさなぎのＫＣがＧＡＬ４転写因子を強力に発現する１１７Ｙ−ａｅｑ系統において、振動開始の時期を検討した。囲蛹殻形成後（ＡＰＦ）５５時間から６９時間までに振動が初めて検出可能になり、その後継続して存在した（図１ｆとｇを比較のこと）。これは成虫特異的なキノコ体要素、アルファ及びベータ小葉の起始の時点と一致する。
【００５３】
（実施例３）
形質膜カルシウムチャネル
緩衝液の置き換え（図２ａ）あるいは１ｍＭ  ＥＧＴＡの添加（図示せず）によって、外部カルシウムの除去後振動は停止する。遊離体外カルシウムを加えると振動が回復する。コバルトは、ショウジョウバエ脳膜標本においてすべての電圧量ゲーティングカルシウムチャネルを遮断することが報告されている（Ｐｅｌｚｅｒら、１９８９）。ここでは１〜１０ｍＭの範囲で振動への段階的減少作用を持つことが認められる（図２ｂ）。
【００５４】
脊椎動物のＬ型カルシウムチャネルは、化学的に無関係な３つのクラスの化合物によって遮断される：フェニルアルキルアミン（例えばベラパミル）、１，４−ジヒドロピリジン（例えばニフェジピン）及びベンゾサイアゼピン（例えばジルチアゼム）で、各々がアルファ１（カルシウム伝導）サブユニット上の異なる部位に結合する。これに対し、ショウジョウバエ脳膜標本は、フェニルアルキルアミン（支配的であり、異例に高い親和性を持つ）及び１，４−ジヒドロピリジンに感受性のある独立したカルシウムチャネルを含むと思われる（例えばＰｅｌｔｚｅｒら、１９８９）。ジルチアゼムについてはごくわずかな特異的結合が検出される。ミツバチのＫＣは、比較的高い濃度のベラパミルとニフェジピンによって影響される（１００μＭ；Ｓｈａｆｅｒら、１９９４）カルシウム電流を示す。
【００５５】
本研究は、３つのクラスの薬剤すべてが他のショウジョウバエ系においてカルシウム電流を遮断するために使用される濃度（ＢｙｅｒｌｙとＬｅｕｎｇ，１９９８；Ｇｉｅｌｏｗら、１９９５；ＧｕとＳｉｎｇｈ，１９９５）又はそれ以下で振動振幅を有意に低下させる（図２ｃ−ｅ）ことを認めた。処理前と処理後に測定した振幅に基づいて作成した用量反応曲線は、ベラパミルについては３μＭ、ジルチアゼムについては１０μＭに近いＥＣ５０を示す（図２ｆ）。３つの薬剤のいずれも、振動周波数には一貫した作用を及ぼさなかった。
【００５６】
（実施例４）
カルシウムレベル振動への種々の薬剤の作用
ナトリウムチャネル
テトロドトキシン（ＴＴＸ）はショウジョウバエ電圧量ゲーティングナトリウムチャネルの強力な遮断薬であり、従って神経電気活動の遮断薬である。ミツバチＫＣはＴＴＸ感受性ナトリウム電流を示す（Ｓｈａｆｅｒら、１９９４）。ＴＴＸは、数サイクルの適用内で振動の停止を生じさせ（図３ａ）、その正確な時点は使用する濃度に依存する。介在期間後、再びＴＴＸ濃度に依存して、非常に高い相対的振幅の間隔を置いた一連のバーストの形態で振動が再開する。各バーストの最初のピークは特に高い。基線カルシウム濃度の持続的な上昇を伴って、ナトリウムチャネル開放物質である１μＭベラトリジンにより、振動が排除される（図３ｂ）。
【００５７】
カリウムチャネル
その相対的寄与が細胞環境に依存する、ショウジョウバエにおけるいくつかの電圧量活性化カリウム電流の同定には、薬理学的判定基準が使用されてきた。４−アミノピリジン（４−ＡＰ）は、培養したショウジョウバエ幼虫のＣＮＳニューロンにおいて（ＳｏｌｃとＡｌｄｒｉｃｈ，１９８８）、また培養ショウジョウバエ幼虫ＫＣ（ＷｒｉｇｈｔとＺｈｏｎｇ，１９９５）及び分離したミツバチ成虫ＫＣ（Ｓｈａｆｅｒら、１９９４）ではより適切に、迅速一過性電圧量ゲーティング電流（ＩＡ様）を遮断する。本研究では、４−ＡＰが用量依存的に振動の振幅を低減させることが認められる（図４ａ；ＥＣ５０〜３０μＭ）。同様に振動周期の用量依存的低減も認められる（図４ｅ）。
【００５８】
非ＩＡ様ショウジョウバエ カリウムチャネルはすべて、酢酸テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ；ＧｈｏとＭａｌｌｅｒｔ，１９８６；ＷｕとＧａｎｅｔｚｋｙ，１９９２）によって遮断されると思われる。本出願の発明者は、１００μＭ  ＴＥＡが振動を排除することを認めている（図４ｈ）。ＴＥＡに関するＥＣ５０は〜７０μＭである（図４ｂ）。遅延整流電圧量ゲーティング電流（ＩＫ様；ＳｉｎｇｈとＷｕ，１９８９；ＫｒａｌｉｚとＳｉｎｇｈ，１９９７；Ｋｒａｌｉｚら、１９９７）の遮断薬であるタクリンとキニジンは、振動の振幅と周波数の両方をより一層強力に低減させる（図４ｆ，ｇ；タクリンに関するＥＣ５０は約１μＭ、キニジンについては２μＭである）。ミツバチＫＣは、ＴＥＡに弱い感受性があるが、１００μＭキニジンによって遮断される、遅延整流器型電流を示す（Ｓｈａｆｅｒら、１９９４）。上記の３薬剤はそれぞれある程度他のイオンチャネル及び／又は他の神経学的に重要な分子を変調することができるので、これらの所見を４−ＡＰ及びシェーカー（Ｓｈａｋｅｒ）に関して下記に述べるように突然変異体試験によって追跡した。
【００５９】
シェーカー（Ｓｈ）遺伝子座は電圧量ゲーティングカリウムチャネルａサブユニットの４−ＡＰ感受性サブクラスを規定する。Ｓｈの生理的作用は、胚筋細胞、幼虫及びさなぎの筋におけるＡ型カリウム電流の異常、神経活動及びシナプス伝導における付随したある程度の欠損を含む（例えばＨａｕｇｌａｎｄとＷｕ，１９９０）。本出願の発明者はＳｈ５突然変異の影響を検討した。通常はＳｈ５バックグラウンドにおいて振動が起こったが（脳の３０％が全く振動を生じなかった）、Ｓｈ＋対照よりも４−ＡＰに対して１０倍感受性が低かった（図４ａ、ｄ）。
【００６０】
神経伝達物質及び修飾因子
他のいくつかの昆虫種における触角−糸球体管線維（ＡＧＴ−ＭＢ入力要素）はコリン作動性であり、培養したミツバチＫＣのカルシウム画像は、アルファ−ブンガロトキシンによって遮断されるアセチルコリン（ＡＣｈ）及びニコチンのレセプタの存在を明らかにした（ＢｉｃｋｅｒとＫｒｅｉｓｓｌ，１９９４）。ＡＣｈは振動の振幅を用量依存的且つ可逆的に漸次低減させる（図５ａ、ｂ）。ニコチンははるかに強力であり、１μＭで振動を完全に排除するのに十分であった（図５ｃ）。
【００６１】
ＫＣ樹状突起も、反復する外因性要因を通して阻害性のＧＡＢＡ（γアミノ酪酸）作動性入力を受ける（Ｂｉｃｋｅｒら、１９８５；Ｇｒｏｎｅｂｅｒｇ，１９８７）。１ｍＭ  ＧＡＢＡは振幅と周期の両方を上昇させる（図５ｄ）。ＧＡＢＡレセプタ拮抗物質であるピクロトキシンは反対の作用を持つ（図５ｅ）。
【００６２】
ｃＡＭＰ経路
アデニリルシクラーゼの活性化因子、フォルスコリンは、周期にはほとんど影響を及ぼさずに振動の振幅を低減する（図５ｆ）。しかし、１ｍＭジブチリルｃＡＭＰは無効であった。ルタバガ遺伝子は、キノコ体において高度に発現され、ショウジョウバエの学習と記憶における役割が明らかにされている（Ｈａｎら、１９９２）、カルシウム活性化アデニリルシクラーゼをコードする。ｒｕｔ１バックグラウンドにおける振動はフォルスコリンにほとんど感受性がなかった（図５ｇ）。
【００６３】
【表１】
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本発明のアッセイを使用したさらなる化合物／突然変異の試験
表２はカルシウム振動に影響を及ぼす他の化合物を列記している。これらは、いくつかの既知の殺虫薬ならびに臨床治療用のいくつかの化合物を含む。健忘症遺伝子は、その活性が、少なくとも部分的に、ｃＡＭＰ経路を変調すると考えられるペプチドをコードする。
【００６４】
【表２】
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略語：Ａ＝振幅、Ｆ＝周波数、Ｂ＝基線レベル、Ｄ＝低下、Ｉ＝上昇、ＡＣｈ＝アセチルコリン、Ｒ＝レセプタ
【００６５】
（参考文献）
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【００８１】
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【００８７】
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【００８９】
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【００９０】
＊Ｒｏｓａｙ，Ｐ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｓ．，Ｙｕ，Ｙ．，Ｓｏｚｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ｋ．とＤｏｗ，Ｊ．Ａ．Ｔ．（１９９７）ショウジョウバエ上皮における細胞型特異的カルシウム信号伝達。Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１０，１６８３−１６９２。
【００９１】
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【００９２】
＊Ｓｈａｆｅｒ，Ｓ．，Ｒｏｓｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．及びＭｅｎｚｅｌ，Ｒ．（１９９４）ミツバチのキノコ体からのケニヨン細胞のイオン電流。Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４，４６００−４６１２。
【００９３】
＊Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．とＷｕ，Ｃ−Ｆ．（１９８９）ショウジョウバエにおける４つのカリウム電流の完全な分離。Ｎｅｕｒｏｎ  ２，１３２５−１３２９。
【００９４】
＊Ｓｏｌｃ，Ｃ．Ｋ．とＡｌｄｒｉｃｈ，Ｒ．Ｗ．（１９８８）ショウジョウバエの幼虫ＣＮＳニューロンにおける電圧量ゲーティングカルシウムチャネル。Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８，２５５６−２５７０。
【００９５】
＊Ｔｅｔｔａｍａｎｔｉ，Ｍ．，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ｄ．，Ｅｎｄｏ，Ｋ．，Ｙａｎｇ，Ｍ．Ｙ．，Ｆｕｒｕｋｕｂｏ−Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｋ，Ｋａｉｓｅｒ，Ｋ．及びＲｅｉｃｈｅｒｔ，Ｈ．（１９９７）連合学習と記憶に関する脳中枢である、ショウジョウバエ キノコ体の初期発生。Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌ．２０７，２４２−２５２。
【００９６】
＊Ｗａｎｇ  ＸとＧｒｕｅｎｓｔｅｉｎ  ＥＩ（１９９７）皮質ニューロンにおける同調Ｃａ２＋振動の機序。Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ７６７（２）：２３９−２４９。
【００９７】
＊Ｗｏｏｄｓ，Ｎ．，Ｋ．Ｃｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎ及びＰ．Ｃｏｂｂｏｌｄ，１９８６。ホルモン刺激した肝細胞における細胞質遊離カルシウムの反復する一過性上昇：Ｎａｔｕｒｅ，３１９，６００−６０２。
【００９８】
＊Ｗｒｉｇｈｔ，Ｎ．Ｊ．とＺｈｏｎｇ，Ｙ．（１９９５）ｌａｃＺ発現によって同定した培養ショウジョウバエ キノコ体ニューロンにおけるＫ＋電流の特性付けとｃＡＭＰ依存性変調。Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５，１０２５−１０３４。
【００９９】
＊Ｗｕ，Ｃ−Ｆ．とＧｅｎｅｔｚｋｙ，Ｂ．（１９９２）ショウジョウバエにおけるイオンチャネルの神経形成試験。「イオンチャネル」第３巻より（Ｔ．Ｎａｒａｈａｓｈｉ編集）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６１−３１４。
【０１００】
＊Ｙａｎｇ，Ｍ．Ｙ．，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｄ．Ｊ．，Ｖｉｌｉｎｓｋｙ，Ｉ．，Ｓｔｒａｕｓｆｅｌｄ，Ｎ．Ｊ．及びＫａｉｓｅｒ，Ｋ．（１９９５）エンハンサートラップ発現パターンによるショウジョウバエ キノコ体の細別。Ｎｅｕｒｏｎ  １５，４５−５４。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ショウジョウバエのキノコ体におけるエクオリン活性のルミノメーター痕跡を示す。発光は、（ａ）セレンテラジン添加時から１０３Ｙ−ａｅｑの成虫脳；（ｂ）１１７Ｙ−ａｅｑ、成虫脳；（ｃ）３０Ｙ−ａｅｑ、成虫脳；（ｄ）３０Ｙ−ａｅｑ、ＨＵ切除成虫脳；（ｅ）１１７Ｙ−ａｅｑ、ハエ全身；（ｆ）１１７Ｙ−ａｅｑ、早期さなぎ脳；（ｇ）１１７Ｙ−ａｅｑ、後期さなぎ脳をｃｐｓ×１０−１で表わしている。
【図２】  図２はカルシウムチャネルの薬理学を示す。１１７Ｙ−ａｅｑ成虫脳の代表的痕跡である。水平線は５分間を表わす。（ａ）カルシウム不含のリンガー液、（ｂ）コバルト、（ｃ）ベラパミル、（ｄ）ニフェジピン及び（ｅ）ジルチアゼムの作用。（ｆ）Ｌ型カルシウムチャネルの化学的に独立した遮断薬である、ベラパミル（フェニルアルキルアミン）とジルチアゼム（ベンゾサイアゼピン）についての用量反応。
【図３】  図３は、電圧量ゲーティングナトリウムチャネルの修飾因子のカルシウム信号伝達への作用を示す。１１７ＡＹ−ａｅｑ成虫脳のａ）テトロドトキシン（ＴＴＸ）、ｂ）ベラトリジン処理の作用。ベラトリジンはナトリウムチャネル開放物質である。
【図４】  図４は、細胞質カルシウム振動への電圧量ゲーティングカリウム遮断薬の作用を示す１１７Ｙ−ａｅｑ成虫脳の代表的痕跡である。水平線は５分間を表わす。（ａ）４−ＡＰ、タクリン、（ｂ）ＴＥＡ、キニジン、（ｃ）４−ＡＰは迅速一過性ＩＡ（シェーカー様）電流の遮断薬である、（ｄ）シェーカー突然変異体（Ｓｈ５）は電圧量ゲーティングカリウムチャネルサブユニットの４−ＡＰ感受性サブクラスが欠如している、（ｅ）振動周期への４−ＡＰの作用、（ｆ）タクリン及び（ｇ）は遅延整流器のＩＫ電流を遮断する、（ｈ）ＴＥＡはＩＫと迅速カルシウム活性化電流、ＩＣＦの両方を遮断することが示されている。
【図５】  図５は、神経伝達物質レセプタ及びｃＡＭＰ第二メッセンジャー経路に関して活性な試薬のカルシウム信号伝達への作用を示す。１１７ＡＹ−ａｅｑ成虫脳の代表的痕跡である。水平線は５分間を表わす。アセチルコリンレセプタの薬理学：（ａ）アセチルコリンによる振動振幅の可逆的低減、（ｂ）アセチルコリンに関する用量反応、（ｃ）１μＭのニコチンは振動を完全に排除するのに十分である。カルシウム振動におけるＧＡＢＡ作動性ニューロンの役割：（ｄ）ＧＡＢＡは振幅と周期の両方を増大させる、（ｅ）ＧＡＢＡレセプタ拮抗物質であるピクロトキシンは反対の作用を持つ。ｃＡＭＰ第二メッセンジャー経路に関して活性な試薬のカルシウム伝達経路への作用：（ｆ）フォルスコリンは野生型環境では振動の振幅を低下させる、（ｇ）しかしルタバガ突然変異体の背景では（ｒｕｔ１）より有効でない。ルタバガ突然変異体はカルシウム活性化アデニリルシクラーゼを欠如している。
【図１ａ】
0004688293.tif 000004
【図１ｂ−１ｃ−１ｄ】
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【図１ｅ−１ｆ−１ｇ】
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【図２ａ−２ｂ】
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【図２ｃ−２ｄ】
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【図２ｅ−２ｆ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ−４ｄ】
0004688293.tif 000014
【図４ｅ−４ｆ】
0004688293.tif 000015
【図４ｇ−４ｈ】
0004688293.tif 000016
【図５ａ−５ｂ】
0004688293.tif 000017
【図５ｃ−５ｄ−５ｅ】
0004688293.tif 000018
【図５ｆ−５ｇ】
0004688293.tif 000019