(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）デンプンおよびデンプン誘導体から選ばれた出発物質の多糖を酸化的に開環せしめてアルデヒド基を有する酸化的に開環した多糖を製造すること、
（ｂ）ヘモグロビンと開環した多糖類との間にシッフ塩基結合を形成する条件下で、酸化的に開環した多糖をヘモグロビンと反応させて、酸化した多糖類を含有する初期のヘモグロビン−多糖結合体を生成すること、
（ｃ）該ヘモグロビン−多糖結合体を、所定のｐHの水溶液の制御された条件下に、初期のヘモグロビン−多糖結合体に比して平均分子量が小さい、分解した後続のヘモグロビン−多糖結合体が形成するまでの時間、維持することにより、酸化的に開環した多糖を分解させること、
（ｄ）平均分子量が小さい後続のヘモグロビン−多糖結合体を還元して還元されたヘモグロビン−多糖結合体を得ること、および
（ｅ）還元されたヘモグロビン−多糖結合体を回収すること
を特徴とするヘモグロビン−多糖結合体を製造する方法。
【請求項２】
平均分子量が小さい、後続のヘモグロビン−多糖結合体が、初期のヘモグロビン−多糖結合体に比して分子量分布が狭いものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
還元されたヘモグロビン−多糖結合体には、検出可能な未反応ヘモグロビンがなく、また、分子量が５００ｋＤａより大きい検出可能な結合体がない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
出発物質の多糖がヒドロキシエチルデンプンである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ヒドロキシエチルデンプンの分子量が７０〜１０００ｋDaである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ヒドロキシエチルデンプンの置換比が０．５〜０．７である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
還元されたヘモグロビン−ヒドロキシエチルデンプン結合体の、ヘモグロビンと酸化されたヒドロキシエチルデンプンとの質量比が０．２５：１〜５：１である、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ヘモグロビンと酸化された多糖との質量比が０．５：１〜３：１である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｃ）において、初期の結合体をｐＨ７．２〜１０の水溶液中に、１５〜３０℃の温度で維持することにより、初期の結合体の分子量を減少させる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
初期の結合体を水溶液中に４〜４８時間維持する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｃ）からの結合体の分子量が９０〜２００ｋDaである、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
還元工程（ｄ）が、シッフ塩基還元を行い、ほぼ同時にアルデヒド基を還元する単一段階の還元である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
還元をホウ素ベースの還元剤で実施する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ホウ素ベースの還元剤がジメチルアミンボランである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
還元工程（ｄ）を、シッフ塩基還元を実施する第１段階とアルデヒド基を還元する第２段階からなる２つの連続還元段階で行う、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ヘモグロビンが細胞培養で得られるものである、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ヘモグロビンが動物ヘモグロビンである、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ヘモグロビンがヒトヘモグロビンである、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ヘモグロビンがデオキシヘモグロビンである、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ヘモグロビンが炭素モノオキシヘモグロビンである、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ヘモグロビンが架橋体である、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
還元されたヘモグロビン−多糖結合体が３７℃で４〜５０ｍｍＨｇのＰ50を有する、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
還元されたヘモグロビン−多糖結合体が天然ヘモグロビンのＲおよびＴ状態の中間のＰ50を有する、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれかに記載の方法により製造したことを特徴とするヘモグロビン−多糖結合体。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法により製造したことを特徴とするヘモグロビン−多糖結合体。
【請求項２６】
請求項２〜２３のいずれかに記載の方法により製造したことを特徴とするヘモグロビン−多糖結合体。
【請求項２７】
ｐH７．２〜１０で分解した、酸化的に開環した多糖からなることを特徴とする、請求項２４〜２６のいずれかに記載のヘモグロビン−多糖結合体。
【請求項２８】
多糖がヒドロキシエチルデンプンである、請求項２７に記載のヘモグロビン−多糖結合体。
【請求項２９】
多糖が、分子量が７０〜１０００ｋDaのヒドロキシエチルデンプンである、請求項２７または２８に記載のヘモグロビン−多糖結合体。
【請求項３０】
ヒドロキシエチルデンプンの置換比が０．５〜０．７である、請求項２７〜２９のいずれかに記載のヘモグロビン−多糖結合体。
【請求項３１】
ヘモグロビンが細胞培養で得られるものである、請求項２７〜３０のいずれかに記載のヘモグロビン−多糖結合体。
【請求項３２】
ヘモグロビンが動物ヘモグロビンである、請求項２７〜３１のいずれかに記載のヘモグロビン−多糖結合体。
【請求項３３】
ヘモグロビンがヒトヘモグロビンである、請求項２７〜３１のいずれかに記載のヘモグロビン−多糖結合体。
【請求項３４】
ヘモグロビンがデオキシヘモグロビンである、請求項２７〜３３のいずれかに記載のヘモグロビン−多糖結合体。
【請求項３５】
ヘモグロビンが炭素モノオキシヘモグロビンである、請求項２７〜３３のいずれかに記載のヘモグロビン−多糖結合体。
【請求項３６】
ヘモグロビンが架橋体である、請求項２７〜３５のいずれかに記載のヘモグロビン−多糖結合体。
【請求項３７】
ヘモグロビン−多糖結合体が３７℃で４〜５０ｍｍＨｇのＰ50を有する、請求項２７〜３６のいずれかに記載のヘモグロビン−多糖結合体。
【請求項３８】
ヘモグロビン−多糖結合体が天然ヘモグロビンのＲおよびＴ状態の中間のＰ50を有する、請求項２７〜３７のいずれかに記載のヘモグロビン−多糖結合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、全血のサプリメントまたは全血の部分交換として患者に投与するための生体適合性の酸素担体に関する。より具体的には、本発明は、代用血液またはサプリメントとして哺乳類に投与するためのヘモグロビンベースの酸素担体（ＨＢＯＣ）およびその製法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
血液の天然の酸素運搬成分としてのヘモグロビンは、例えば水溶液として代用血液の基礎を形成する明らかな候補物質である。代用血液として機能する満足なヘモグロビン溶液を提供する試みに関して広く科学的研究が行われ、報告されてきた。しかし、赤血球外にあるヘモグロビンの化学特性は、例えば、酸素親和性に関して、赤血球内での特性と顕著に異なる。ヘモグロビンを代用血液として使用するのに適したものとする何らかの形のヘモグロビンの化学的修飾に対する必要性が長い間認識されており、非常に広く研究されてきた。
【０００３】
ヘモグロビンが４つのサブユニット、すなわち、それぞれがグロビンペプチド鎖を有するα−サブユニット２つとそれぞれがグロビンペプチド鎖を有するβ−サブユニット２つの四量体を含むことはよく知られている。この四量体の分子量は約６４キロダルトンであり、各サブユニットはほぼ等しい分子量を有している。希水溶液中の四量体ヘモグロビンは容易にα−β二量体に解離し、さらに、ある条件ではα−サブユニットモノマーおよびβ−サブユニットモノマーに解離する。二量体およびモノマーは体内の循環系に維持するには分子量が小さすぎ、腎臓で濾過されて、尿と共に排出される。その結果、このような生成物の体内での半減期は許容できない程短くなる。四量体の形を確実に維持するためのサブユニット間の化学結合（「分子内架橋」）の利点は既に認められている。また、２個以上の四量体ユニットを結合して分子量が６４キロダルトンを超えるヘモグロビンのオリゴマーおよびポリマーを形成すること（「分子間架橋」）も、多くの場合に望ましいことが認められている。
【０００４】
したがって、臨床的に使用するためのＨＢＯＣを開発するための１つの方法は、ヘモグロビンユニットを分子内架橋して、分子量約６４キロダルトンの安定した四量体とし、任意選択で、分子間架橋によりこれらの四量体をオリゴマー化して、このような四量体２〜６個のオリゴマーとすることであった。この目的で、ｏ−ラフィノースなどの酸化的に開環した糖（例えば、Ｈｓｉａの米国特許第４，８５７，６３６号およびＰｌｉｕｒａ他の米国特許第５，５３２，３５２号）、ジエチルマロンイミデート塩酸塩などの二官能性イミデート（Ｍｕｚｕｒの米国特許第３，９２５，３４４号）、ハロゲン化トリアジン、ジビニルスルホン、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドおよび他のジアルデヒド（Ｂｏｎｓｅｎ他の米国特許第４，００１，２００号）、ビス−ジアスピリンエステル（Ｔｙｅの米国特許第５，５２９，７１９号）、ビス−およびトリス−アシルホスフェート（Ｋｌｕｇｅｒ他の米国特許第５，２５０，６６５号）などを含めたさまざまな架橋試薬が提起されている。
【０００５】
臨床使用に適した分子量を有するＨＢＯＣを調製する別の方法は、ヘモグロビンを生体適合性の多糖と結合することであった。このような結合体は、架橋およびオリゴマー化したヘモグロビンと比べて、ＨＢＯＣ１単位当たりに必要なヘモグロビン量が少なく、したがって、調製が経済的であり、ヘモグロビンに関連する毒性が低減されるという利点を有しているはずである。ＨＢＯＣの調製においてコロイドをヘモグロビンに結合させることにより、コロイドのサイズ、その修飾の程度およびコロイドとヘモグロビンとの比を調整することによって、粘度やコロイド浸透圧などの流体特性を制御することもできる。これらの同じパラメータを使用して、生成物の最終的な分子量および血管での保持時間を調節することができる。
【０００６】
Ｗｏｎｇの米国特許第４，０６４，１１８号は、ヘモグロビンを、分子量約５ｋＤａ〜２０００ｋＤａのデキストランおよびヒドロエチルデンプンから選択した多糖物質と化学的に結合させることによる、代用血液または血液増量剤の調製を提起している。しかし、この特許では、デキストランを使用することしか例示していない。
【０００７】
Ｂａｌｄｗｉｎら、「Tetrahedron」37、pp1723-1726 (1981) 、「Synthesis of Polymer-Bound Hemoglobin Samples」は、デキストランおよびヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を化学的に修飾して、アルデヒド置換ポリマーを形成し、それに続くヘモグロビンとの反応により可溶性の、ポリマーに結合したヘモグロビンを形成することを記述している。そのように形成された生成物は酸素を結合することができたが、その酸素結合曲線はかなり左側に寄っており、酸素親和性が高すぎる（Ｐ50が低すぎる）ことが示唆されたため、代用血液として使用するには不適切であるとそれらの文献は報告している。
【０００８】
【発明の概要】
本発明の目的は、新規のＨＢＯＣを提供することである。
本発明の別の目的は、ＨＢＯＣとして有用な新規の多糖−ヘモグロビン結合体を提供することである。
本発明の別の目的は、ＨＢＯＣとして有用な新規の多糖−ヘモグロビン結合体を調製する方法を提供することである。
【０００９】
本発明の方法では、多糖を酸化的に開環した形で使用する。この酸化型では、糖のモノマーユニットの少なくとも一部が酸化されて、アルデヒド基となる。そのように形成された酸化多糖を、次いで、細胞外のヘモグロビンと反応させると、酸化多糖のアルデヒド基と反応するグロビン鎖の第一級アミン基を介して、ヘモグロビンはシッフ塩基結合により多糖と共有結合する。最初、非常に急速に、５００ｋＤａ以上の程度の分子量の非常に大きな分子種を実質的な量で含む、分子量分布の広い（１２８−＞５００ｋＤａ）生成物が形成される。
【００１０】
この生成物を水溶液中で適切な条件下に維持すると、制御された範囲で、比較的短時間（例えば、条件に依存して４〜４８時間）で、分子量分布がはるかに狭く、分子量がはるかに小さい（９０〜２００ｋＤａ）生成物に変換することができる。この生成物は、ヘモグロビンと多糖との間のシッフ塩基結合を還元して第二級アミン結合とした後、結合時のヘモグロビンのリガンド状態に依存して３７℃でＰ50＝４から５０ｍｍＨｇの範囲の酸素親和性などの特性を有するようになり、その結果、哺乳類に臨床的に使用するためのヘモグロビンベースの酸素担体の候補物質として非常に適したものとなる。変換の程度は、還元ステップを実施するタイミングにより制御することができる。さらに、得られた生成物は、存在する場合には解離されて腎障害を起こすことが疑われるαβ−二量体となる検出可能な未反応ヘモグロビンを含まず、また分子量が過度に大きな（約５００〜６００ｋＤａ）生成物を検出可能な量で含むことがない。
【００１１】
したがって、本発明の第１の態様によれば、ヘモグロビンベースの酸素担体として有用であり、５０％の酸素飽和を維持するのに必要な酸素環境の分圧として表される酸素親和性Ｐ50が３７℃で４〜５０ｍｍＨｇであり、検出可能な残留未結合ヘモグロビンを含まず、分子量が約５００ｋＤａを超える成分を検出可能な残留量で含むことのない多糖−ヘモグロビン結合体を提供し、この結合体は、ヘモグロビンを酸化された多糖と反応させて、高分子量の結合体複合体を形成し、この高分子量結合体複合体を、簡単な日常的な実験で容易に測定することができる適切なｐＨ値および２℃から約４５℃の温度の溶液中に保存することにより分解して、前記の多糖−ヘモグロビン結合体を形成することにより調製する。
【００１２】
本発明の別の態様では、ヘモグロビンのアミノ基からの第二級アミン結合を介して多糖のアルデヒド残基に共有結合したヘモグロビンからなる、酸素運搬体として有用な多糖−ヘモグロビン結合体を提供し、前記アルデヒド基は多糖の糖モノマーユニットの酸化的開環により形成する。
【００１３】
別の態様によれば、本発明は、アルデヒド基を有する酸化的に開環した多糖をヘモグロビンと反応させてそのシッフ塩基ベースの結合体を形成すること、結合体を、結合体の分子量低下を実施する条件下に維持すること、シッフ塩基結合を安定な第二級アミン結合に還元することによって結合体を安定させること、および検出可能な未結合ヘモグロビンの残留物を含まず、分子量が約５００〜６００ｋＤａより大きな検出可能な生成物の残留物を含まない、そのように形成された多糖−ヘモグロビン結合体の溶液を回収することよりなる、ヘモグロビンをベースとする酸素担体の調製する方法を提供する。
【００１４】
【好ましい実施態様の説明】
本出願に記載の見かけの分子量は、ｏ−ラフィノース重合ヘモグロビン（ｐｏｌｙＯＲ−Ｈｂ）の既に知られている標準分子量のゲルろ過クロマトグラフィの溶出時間との比較により誘導される。ヘモグロビン−コロイド結合体は、伸張コロイド鎖成分中に多量の捕捉水を含んでいると思われるので、ヘモグロビンに結合付加した分子のみを含有するこの結合体における実際の分子量は、見かけの分子量よりも少ない。しかしながら、それが、その結合体のｉｎ  ｖｉｖｏの保持時間を規定する見かけの分子量すなわち排除体積となるため、上記の分子量をここに記載の結合体を説明するのに用いる。
【００１５】
本発明の方法において使用されるヘモグロビンは、好ましくは赤血球に由来するヒトヘモグロビンである。しかしながら、本発明は、動物ヘモグロビン、特に牛ヘモグロビン、豚ヘモグロビンなど、および細胞培養で得られるヘモグロビンなどの血液代替物のベースを形成する他のタイプのヘモグロビンにも適用できる。ヒト患者への投与用の血液代替物のベースを形成するためには、ヒトヘモグロビンが、現在では好ましい選択となる。
【００１６】
ヘモグロビンは本発明に使用するために標準的な既知の方法により回収および調製することができる。したがって、赤血球細胞を溶解し、遠心分離や濾過などの標準的な方法により細胞片およびストロマをそこから除く。最も望ましい組成および諸特性の組合せを有する製品を生産するために、ヘモグロビン２〜２０重量％の濃度のヘモグロビン溶液を用いることが好ましい。最終精製は、クロマトグラフィにより適切に実施できる。Ｐｌｉｕｒａらの米国特許第５，４３９，５９１号に記載されている置換クロマトグラフィプロセスが、有益に用いられる。
【００１７】
ヘモグロビンは、通常デオキシヘモグロビンにより想定されるタイト（Ｔ）コンフォメーション、または、通常オキシヘモグロビンまたは炭素モノオキシヘモグロビンにより想定されるリラックス（Ｒ）コンフォメーションの状態で天然に存在し得る。Ｔ状態のコンフォメーションにおけるヘモグロビンの酸素親和性は、効果的な肺血管系における酸素結合および末梢組織における酸素脱離を可能にすることから、Ｔ状態ヘモグロビンの酸素結合特性が、より望ましい特徴である。したがって、本発明の方法においてデオキシヘモグロビンを用いることが好ましい。予め架橋した、またはしないヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）への結合後、デオキシヘモグロビンは、Ｔ配置の酸素結合特性を維持する。しかしながら、何らかの理由でＲ配置のヘモグロビンで開始することを選択した場合でも、本発明の好ましい方法は、ヘモグロビンを終始Ｒ配置に安定化する。ＲおよびＴ状態の混合ヘモグロビンは、ＨＥＳと反応して、ＲおよびＴ状態配置の中間の酸素結合性を持った生成物が得られる。
【００１８】
デオキシヘモグロビンを形成するためのヘモグロビンの脱酸素化は、既知の方法に従って、好ましくはヘモグロビン溶液を窒素などの非酸素化気体での処理に供することにより実施される。この方法においてデオキシヘモグロビンへの変換を完全に実施するために、十分に長い時間をかけて、窒素流による処理、およびその後適当な脱気処理を継続することが好ましい。
【００１９】
本発明に有用な多糖類は、確立された生体適合性のものを含み、反応性のアルデヒド基を形成するために酸化的開環ができる糖モノマー単位をもつものを含む。これらには、デンプンおよびデンプン誘導体、デキストラン、イヌリンなどが挙げられる。本発明に使用する多糖類は、ヒドロキシエチルデンプンおよびデキストランが好ましく、ＨＥＳが最も好ましい。
【００２０】
ヘモグロビンは、天然の非架橋体、または架橋した６４ｋＤａ四量体の安定化形、または６４−＜５００ｋＤａ付加体を含む架橋したオリゴマー体で、酸化されたヒドロキシエチルデンプンと反応させることができる。その架橋体で用いる場合、架橋および架橋オリゴマー化ヘモグロビンを調製するための好ましい架橋剤は、ラフィノースなど（即ち、ｏ−ラフィノース）のオリゴ糖の酸化的開環で誘導されるポリアルデヒドである。ｏ−ラフィノースの調製およびヘモグロビンとの反応のための好適な方法は、上記のＰｌｉｕｒａらの米国特許第５，５３２，３５２号に記載されており、その開示を参照により本明細書に組み込む。ｏ−ラフィノースは、本発明の実施形態に使用する好ましい架橋剤であるが、決してそれに限定されない。前記のものなど他の公知のＨｂ架橋剤、例えばＫｌｕｇｅｒらの米国特許第５，２５０，６６５号に記載のトリメソイルメチルリン酸エステル（ＴＭＭＰ）を満足のゆくように用いることができる。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態に使用される出発原料のヒドロキシエチルデンプンは、約７０から約１０００ｋＤａの分子量を持っていることが好適である。それは、種々のタイプおよび種類が市販されている。本発明に使用するそのタイプおよび種類は重要ではない。上記におおよそ設定したような分子量であれば、実質的には、現在市販されているいずれの種類のＨＥＳも出発原料として使用できる。置換比（即ち、グルコース単位に対するヒドロキシエチル基の数）が、約０．５から０．７のものが特に好適である。
【００２２】
本発明に使用するＨＥＳを調製するために、多数のアルデヒド基を形成するように酸化される。これは、種々の酸化法、好ましいものとして過ヨウ素酸塩（ナトリウムまたはカリウム）との反応により達成できる。この反応は、所望する酸化程度により選ばれる適当量の過ヨウ素酸ナトリウムを用いて、低温、例えば０〜５℃の水溶液中で実施できる。この反応は、約１〜４時間で終了する。望ましくない低分子量塩およびＨＥＳ成分を除去するために、限外濾過または透析を使用することができ、それによりＨｂに共役する酸化ＨＥＳの分子量範囲を制御する手段を提供する。酸化ＨＥＳは直接使用でき、または例えば凍結乾燥により好適に回収され、ヘモグロビンと結合するために水に再溶解される。
【００２３】
共役結合反応は、水溶液中で好適に実施される。ヘモグロビンは、Ｈｂおよび／またはオリゴマー化されたＨｂと任意に架橋することができる。例えば、それは一酸化炭素とリガンド的に結合することができる（ＣＯ−Ｈｂ）。ＣＯ−Ｈｂでは、最終生成物の低いＰ50値が得られ、デオキシＨｂでは高い値が得られる。Ｈｂと酸化ＨＥＳのモル比は、約０．２５：１から５：１の範囲のいずれかにできるが、おおよそ０．５：１〜３：１の範囲が好ましい。この反応は、アルカリ側のｐＨ、例えば７．５〜９．０の範囲、および室温で実施するのが最適である。
【００２４】
出発物質の多糖類の分子量にかかわらず、最初、例えば約１時間後に形成される反応生成物は、５００ｋＤａよりかなり大きな分子量の成分を有し、非常に高い分子量を持つことが分析により判明している。この最初の生成物にはまた、広い範囲の分子量生成物を含んでいる。生成物を水溶液中、好ましくはｐＨ約７．２〜１０の範囲で、室温またはそれに近い温度で（１５℃〜３０℃）、約４８時間まで保つことにより、生成物の分子量において制御された還元を行わせることができ、約５００，０００より大きな分子量の成分を含まない生成物および狭い分子量分布（例えば、主として１００〜２００ｋＤａの分子種を含有する）の生成物にすることができる。残存する３２ｋＤａの分子種はあったとしてもごくわずかである。３２ｋＤａの分子種の量はごく少量であるため、その除去のための特別な段階は必要としない。
【００２５】
そのようにして形成された結合体（複合体）は、ＨｂとＨＥＳ間の（可逆的）シッフ塩基結合を安定な第二級アミン結合に還元することにより、および未反応の如何なるアルデヒド基をも還元することにより安定化しなければならない。この還元は、単一段階で達成できるが、ここではシッフ塩基結合およびアルデヒド基を単一段階か、または異なる２つの段階で還元する。強力な還元剤は１段階で有効だが、より弱い還元剤では２段階工程を必要とする。
【００２６】
この還元段階は、その適切なタイミングで、最終生成物の分子量および分子量分布を制御する手段として好ましく用いられる。一旦還元が終了すると、生成物は安定化され、保存中は分子量または分子量分布において、さらに有意な変化が起こることはない。したがって、ある間隔をおいて反応生成物のサンプルを分析することにより、選ばれた特性で生成物を安定化する還元段階のタイミングをとることが可能になる。
【００２７】
ボランジメチルアミンは、還元剤として好ましい選択である。これは、単一段階で２つの還元反応を達成できるほど強力である。他の水溶性ボラン低級アルキルアミン還元剤には限定的ではなく、ボラン−ｔ−ブチルアミン、ボランアンモニア、ボランジメチルアミン、ボラントリメチルアミン、ボラントリエチルアミンおよびピリジンボランがあり、これらも使用できる。その他の有用な還元剤として、水素化ホウ素シアノナトリウムおよび水素化ホウ素ナトリウムが挙げられる。
【００２８】
結合中に形成されるシッフ塩基の還元および、残存する未反応のアルデヒド基すべての還元は、最適には水溶液中、２〜２５℃の温度範囲で、１０〜３６時間、好ましくは２４時間で実施する。好適には、反応混合物は、ｐＨ７〜１０、好ましくは８．０〜９．５に緩衝化される。イミンおよびアルデヒド基の総計に対する還元剤のモル比は、１：１から５：１の範囲であり、好ましくは、架橋を開始するのに加えたアルデヒド基に対する還元剤の化学量論に基づき１．５：１から３．５：１の範囲である。
【００２９】
デンプン分解残渣、ジメチルアミノボラン残渣、塩、緩衝剤残渣などの残存する低分子量生成物を除去するために、最終段階にダイアフィルトレーションを用いることが好ましい。次にＨＢＯＣを形成するために、生成物を好適な賦形剤と混合することができる。
【００３０】
このようにして調製された結合体は、ＨＢＯＣのベースとして使用するため抜群に好適な特徴を示す。生成物の狭い分子量範囲分布（ＭＷＤ１００〜２００ｋＤａ）と共に低い酸素親和性（Ｐ50＝２０〜５０ｍｍＨｇ）を示し、αβ−二量体、または約５００ｋＤａ以上の分子量への解離を促進する条件下では分子量３２ｋＤａの生成物を検出しない。
【００３１】
使用前の保存の間、自動酸化を防止するために、生成物から全酸素を除去することが好適である。脱酸素生成物は、酸素の導入を防止する条件下で、凍結またはより高い温度のいずれかで保存することができる。酸素は、投与前に導入できるか、もしくは生成物がｉｎ  ｖｉｖｏで酸素を捕捉することができる。一酸化炭素体は、同様の方法で保存でき、使用前に酸素化できる。生成物は、酸素化体で凍結保存するか、または自動酸化の程度が許容できなくなると思われるまで、より高い温度で保存することができる。
【００３２】
本発明を、以下の特定の非限定的な実施例において、例証目的のためにのみ説明する。
【００３３】
実施例１：酸化ヒドロキシエチルデンプンの調製
０．７のヒドロキシエチル置換度を有する４５０ｋＤａの重量平均分子量（ＭＷ）のヒドロキシエチルデンプン９．０ｇを９０ｍＬの水に溶解した。ＨＥＳ中に存在する隣接ジオールの１モルにつき過ヨウ素酸塩約０．３当量、０．６当量および１．２当量のそれぞれに相当する０．４９ｇ、０．９８ｇおよび１．９６ｇのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを、この溶液の各３０ｍＬのアリコートに個別に加えた。これらは、利用できるジオール基の約３０％、６０％および１００％を酸化するのに十分な量である。暗所で４℃にて４時間反応後、溶液を分子量１５ｋＤａのカットオフの膜を用いて、冷水に対して広範囲に亘り透析した。最終保持体を凍結乾燥で白色粉末とし、室温で保存した。別途に、透析された酸化ＨＥＳ溶液は、Ｈｂの結合用に直接利用することができた。２００ｋＤａの分子量（ＭＷ）および０．５の置換度をもつＨＥＳを酸化し、同様の方法で調製した。酸化ＨＥＳはまた、０．９％NaCl中に処方したＨＥＳの直接酸化により調製した。過ヨウ素酸塩の消費量と最終アルデヒド含量の測定により、用いた過ヨウ素酸塩の範囲では、全ての利用できるジオール基の完全酸化が不完全となり、酸化程度は、用いた過ヨウ素酸塩量を変えることにより容易に制御されていることが示された。
【００３４】
実施例２：種々の酸化ＨＥＳおよびＣＯ−ヘモグロビンとの結合体の調製
ＣＯ−Ｈｂと酸化ＨＥＳ（ＨＥＳ−ＣＨＯ）との種々の相対比での反応を調べた。酸化のための過ヨウ素酸塩当量は、ＨＥＳの隣接ジオールの予想含量に基づき算出された。一例として、実施例１に記載したように１．２当量の過ヨウ素酸塩を用いて調製した０．５４ｇの酸化４５０ｋＤａ  ＨＥＳを３．０ｍＬの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ８．１に溶解した。このＨＥＳ−ＣＨＯ溶液を次の比率で一酸化炭素化ヘモグロビン（ＣＯＨｂ、水中２００ｍｇ／ｍＬ）に加えた：０．７６ｍＬ  ＨＥＳ−ＣＨＯ：０．０４１ｍＬ  ＣＯＨｂ、０．７３：０．０７８および０．６１：０．１９５が、それぞれ約１０、２０および５０ｍｇ／ｍＬの最終Ｈｂ濃度を与える。反応は、２２〜２５℃、ｐＨ８で進行させ、サンプルを、分子量（ＭＷ）測定のために種々の時間で取り出し、ファルマシア（Pharmacia ）のスーパーデックス（Superdex）２００カラム（１×３０ｃｍ）を用いて、０．４ｍＬ／分における０．５Ｍ  ＭｇＣｌ2＋２５ｍＭトリスｐＨ７.２で溶出した。全て３つのＨＥＳ：ＣＯＨｂ比率において、Ｈｂは、最初の数時間で完全に修飾され、１２８ｋＤａよりも大きな分子量（ＭＷ）のポリＨｂ対照と同等の溶出時間をもち、カラムの排除限界を超えた範囲（＞５００ｋＤａポリＨｂ）の分子種が得られた。添付した図面の図１は、種々の時間で取り出しポリＨｂ対照と比較して（下部の曲線）、０．５：１のＨｂ：ＨＥＳ生成物（５０ｍｇＨｂ／ｍｌ）から導かれたクロマトグラムを示す。縦軸の点線は、３２ｋＤａの未修飾α−β二量体の溶出時間を表す。ヘモグロビンの４１４ｎｍでの特徴的吸光度は、溶出フラクションで追跡される。次の３０時間では、１２８ｋＤａの分子量（ＭＷ）をもつポリＨｂ対照と同等な溶出時間をもつ分子種を与え、検出し得る未修飾のＨｂが無く、カラムの排除限界を超える分子種も無いため、生成物の溶出時間は減少した。分子量（ＭＷ）展開パターンおよび最終生成物の分子量（ＭＷ）範囲は、０．６当量の過ヨウ素酸塩で酸化したＨＥＳの場合と同じく、全て３つのＨＥＳ：Ｈｂ比率において同様であった。ジオール１個につき０．３当量の過ヨウ素酸塩で酸化したＨＥＳを用いて調製した結合体は、典型的に未修飾のａ−ｂ二量体と共に溶出する重要な物質を含んでいた。それ故、未修飾二量体を含まない結合体を生成するためには、高レベルの酸化が好ましい。
【００３５】
最初の数時間で形成される結合体の平均分子量（ＭＷ）は、Ｈｂをより少なく用いる場合より低かった。同様の反応と結果は、実施例１に記載したように酸化２００ｋＤａ  ＨＥＳを用いて得られた。４５０ｋＤａのＨＥＳを用いた場合、２００ｋＤａのＨＥＳと比較して、最終生成物の平均分子量（ＭＷ）は高かった。添付図面の図２は、Ｈｂ：ＨＥＳ−ＣＨＯの比が、すべて１：１で示された各種酸化度における、ＨＥＳ２００／０．５（破線）およびＨＥＳ４５０／０．７（実線）に関するＨｂ＋ＨＥＳ−ＣＨＯの最終生成物のクロマトグラムを示す。
【００３６】
過ヨウ素酸塩酸化の７０ｋＤａ  ＨＥＳ（計算したジオールに対して０．３、０．６および１．２当量の過ヨウ素酸塩）を用いて得られたＨｂ−ＨＥＳ結合体はまた、結合の早期段階で高分子量種を形成し、次に低分子量種に転換する（図３）。低分子量種に変換するのに必要な時間と同じく、早期段階の結合体の平均分子量は、ＨＥＳ７０の酸化程度に依存した。４８時間の結合後、ポリＯＲ−Ｈｂ対照の３２ｋＤａ未修飾Ｈｂ成分と共に溶出するある物質は、ＨＥＳ酸化の一番低い程度（計算されたジオールにつき０．３当量の過ヨウ素酸塩）から誘導される結合体に残った。分析用カラムの排除限界において溶出する重要な物質は、最も高度に酸化されたＨＥＳ７０（計算されたジオールにつき１．２当量の過ヨウ素酸塩）を用いた４８時間の反応後に残っていた。カラム排除限界において溶出する未修飾ヘモグロビンの無い生成物と物質は、計算ジオールにつき０．６当量の過ヨウ素酸塩により酸化されたＨＥＳとの反応の４８時間以内に得られた。
【００３７】
実施例３：高分子量および低分子量Ｈｂ−ＨＥＳ結合体の同時大規模調製
分子量の異なる２つのＨｂ−ＨＥＳ結合体を単一反応から調製し、高分子量を有するその初期結合生成物の一部分を単離し、安定化する一方、残りの結合生成物を低分子量生成物へ転換させたのち安定化した。２種の生成物の物性およびｉｎ  ｖｉｖｏ特性を比較し、一方が他方よりも有利な性質を示すことを証明することができた。
【００３８】
９４４ｇのＨＥＳ（２００ｋＤａ、置換度＝０．５）を８ＬのＷＦＩに溶解し、４℃に冷却してから、３７０ｇのＮａＩＯ4 を加て、混合物を暗所で５．３時間攪拌した。全てのＮａＩＯ4 は、１時間未満で溶解した。混合物を濾過し（０．２μｍ）、次いで３０ｋＤａの再生セルロース膜を用いて１２容量の室温ＷＦＩ（注射用水）に対してダイアフィルトレーションした。その後、中空ファイバ膜を通してＮ2 と接触させて脱酸素化した。凍結乾燥サンプルは、１２８ｍｇ  ＨＥＳ−ＣＨＯ／ｍＬの最終濃度を呈した。１．２ＬのＣＯＨｂ（ＷＦＩ中２３．２ｇ／ｄＬ）を２．０Ｌの２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．１緩衝液に混合し、中空ファイバ膜を通してＯ2 にＮ2 と接触させて酸素化し、次いで脱酸素化した。４．５ｋｇのＨＥＳ−ＣＨＯ溶液（１２８ｇ／Ｌ）を脱酸素化したＨｂ（９．０ｇ／ｄＬの３．２Ｌ）と合わせて、混合物を脱酸素化条件のもとに維持した。結合体のＭＷＤは、ゲルろ過クロマトグラフィによりモニタした。
【００３９】
３時間かけて結合させた後、反応容量の半分をＮ2 下で分液漏斗に移し、５６ｍＬの３Ｍ  ＮａＯＡｃおよび１．７ＬのＷＦＩに溶解した１９６ｇのＤＭＢを加えた。最終ＤＭＢ：最初のアルデヒドの比は、１．５：１であった。混合物をＮ2 下で室温で２３時間維持したのち、ＣＯチャージとダイアフィルトレーションを行った。Ｈｂ−ＨＥＳの結合反応開始２９時間後に、混合物の他の半分をＮａＯＡｃおよびＤＭＢで同様に１７．５時間処理した。次に双方のＤＭＢ還元反応物に、ＣＯをチャージし、ＷＦＩ次にリンゲル乳酸液（各溶液に関して約１０容量）に対しダイアフィルトレーションを行った。ｐＨを、０．１ＮのＨＣｌで７．５〜７．６に調整した。双方の溶液を、コロイド浸透圧が８０〜１００ｍｍＨｇになるように濃縮した。生成物は、酸素化し、約３／４を無菌濾過のために除き、オキシ形態で包装した。それぞれの残量は、脱酸素化し、デオキシ形態で包装した。酸素化生成物は、−８０℃にて保存し、脱酸素化生成物は４℃にて保存した。初期段階の結合生成物の還元により得られた高分子量生成物は、以下ＨＩＭＷ  ＨＥＳ−Ｈｂというものとする。後期段階の結合生成物の還元により得られた低分子量生成物は、以下ＬＯＭＷ  ＨＥＳ−Ｈｂというものとする。ゲルろ過クロマトグラフィにより分析評価された分子量分布を、図４に示す。分子量分布は、４℃でも−８０℃でも４カ月に亘る保存で変化しなかった。
【００４０】
ＨＩＭＷ  ＨＥＳ−Ｈｂのコロイド浸透圧（ＣＯＰ）は、双方の生成物についてテストした種々の濃度において首尾一貫してＬＯＭＷ  ＨＥＳ−Ｈｂのそれよりも高かった（表１）。粘度は、それぞれＨＩＭＷ  ＨＥＳ−Ｈｂの６．５ｇ  Ｈｂ／ｄＬにおいて８．９ｃＳｔであり、ＬＯＭＷ  ＨＥＳ−Ｈｂの９．０ｇ  Ｈｂ／ｄＬにおいて３．０ｃＳｔであった。したがって、分子量分布において他者により調製されたＨＥＳ−Ｈｂおよびデキストラン−Ｈｂ結合体に匹敵するＨＩＭＷ  ＨＥＳ−Ｈｂは、ＬＯＭＷ  ＨＥＳ−Ｈｂよりも血液流体性およびレオロジー性においてより大きな変化を生じると予想されるコロイド性を有している。粘度や赤血球凝集反応などのレオロジー因子および血液凝固における高分子量ＨＥＳプラズマ成分の有害効果については、既に文献に記載されている（Ｔｒｅｉｂ等、Thrombosis and Haemostasis 74：1452〜6 (1995) ）。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
実施例４：最終Ｐ50のリガンド状態の影響
ＣＯＨｂ（水中５５ｍｇ／ｍＬ）を酸素次いで窒素へそれぞれ曝露して酸素化し、脱酸素化した。２００ｋＤａ  ＨＥＳは、実施例１に記載したように０．６当量の過ヨウ素酸塩を用いて酸化し、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳのｐＨ８．１において６０ｍｇ／ｍＬとし、脱気し、窒素で掃流した。この酸化ＨＥＳ溶液２．５ｍＬを脱酸素化Ｈｂ溶液の０．８ｍＬに加え、当初の未酸化２００ｋＤａ  ＨＥＳの１モルにつき１当量のＨｂを供した。窒素下２２〜２５℃で４８時間後、反応混合物を酢酸ナトリウム中０．３Ｍに調製し、次に当初のアルデヒド１モルにつき３当量のジメチルアミンボランを加えた。２４時間後、この溶液をＣＯガスでチャージし、乳酸リンゲル液に対し十分に透析した。同様の操作でＣＯリガンドを除去しないＣＯＨｂと０．６当量の過ヨウ素酸塩により酸化した２００ｋＤａのＨＥＳとを反応させた。酸素結合性を、３７℃でＨｅｍｏｘ分析器（ＴＣＳインストルメント、米国ペンシルヴァニア州サウスハンプトン）を用いて双方の生成物について測定した。脱酸素化Ｈｂの結合の結果は、最終Ｐ50が２６ｍｍＨｇとなった。ＣＯＨｂの結合の結果は、最終Ｐ50が４ｍｍＨｇとなった。双方の生成物は、非協同的であった。
【００４３】
実施例５：架橋ヘモグロビンの利用
実施例１に記載したように、個別の反応で２００ｋＤａのＨＥＳを０．３当量および０．６当量の過ヨウ素酸塩により酸化し、２７０ｍＭの重曹のｐＨ８．１で１２５ｍｇ／ｍＬとした。３．０ｍＬの各酸化ＨＥＳ溶液を、別々にトリメソイルトリス（メチルリン酸エステル）（ＴＭＭＰ）―架橋Ｈｂ（６４ｋＤａ架橋Ｈｂ、Ｋｌｕｇｅｒらの米国特許第５，２５０，６６５号、水中１２５ｍｇ／ｍＬ）の１．０ｍＬのアリコートに加え、同様にｏ―ラフィノース重合Ｈｂ（６４−＜５００ｋＤａ  Ｈｂポリマー、Ｐｌｉｕｒａらの米国特許第５，５３２，３５２号、１１７ｍｇ／ｍＬ）の１．０ｍＬのアリコートに加え、合計４種の反応に関して全ての場合、最初の未酸化２００ｋＤａ  ＨＥＳの１モルにつき１当量のＨｂを供した。２つのヘモグロビン生成物は、ＣＯ体であった。ＣＯガス下２２〜２５℃で反応３０時間後、酢酸ソーダを最終濃度０．３Ｍにするために加えた。次に、当初のアルデヒド１モルにつき３当量のジメチルアミンボランを加えた。２４時間後、この反応物を、ｐＨ７．４で水、次いで乳酸リンゲル液に対して透析した（１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）。次いで、酸素結合性は、３７℃でＨｅｍｏｘ分析器を用いて記録した。
【００４４】
全てのヘモグロビン類の分子量分布は、高値に移動した。ＨｂおよびＴＭＭＰ架橋Ｈｂで、全ての出発Ｈｂを修飾することは可能であり、４８時間以内には検出可能な溶媒容積物質（void volume material）（スーパーローズ１２、解離条件）は無かった。ポリＯＲ−Ｈｂ結合体は、有意な量の溶媒容積物質を含んでいた。即ち、Ｐ50ｓ（３７℃）は、ＨＥＳ＋ＣＯ−ＴＭ−Ｈｂが５〜７ｍｍＨｇ、ＨＥＳ＋ＣＯ−ポリＯＲ−Ｈｂが５〜７ｍｍＨｇであった。すべての生成物は、非協同的であった。
【００４５】
実施例６：反応時間と温度の変化
Ｈｂ−ＨＥＳ  ＭＷＤに対するより短い反応時間およびより低い温度（２２℃に対して１２℃）の効果は、小スケールで調べた。２００ｋＤａおよび４５０ｋＤａのＨＥＳの酸化体が用いられた。
【００４６】
脱酸素Ｈｂが用いられた。ＣＯＨｂ（７５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ８．１中、５０ｍｇ／ｍＬ）を、酸素次いで窒素に、それぞれ曝露することにより、酸素化し脱酸素化した。隣接ジオールの１モルにつき０．６当量または１．２当量の過ヨウ素酸塩を用いて２００または４５０ｋＤａのＨＥＳから誘導された酸化ＨＥＳを、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液のｐＨ８．１に溶解して最終濃度６０ｍｇ／ｍＬにし、溶液は脱気し、窒素で掃流した。０．２５３ｍＬのＨｂは、酸化２００ｋＤａのＨＥＳ溶液１．６ｍＬと合わせ、０．４９８ｍＬのＨｂを１．４ｍＬの酸化４５０ｋＤａのＨＥＳ溶液と合わせた、両方とも、当初の未酸化２００ｋＤａ、または４５０ｋＤａのＨＥＳの１モルにつき１当量のＨｂを供した。これらの溶液は、窒素下２２℃で反応させ、同一の溶液を調製し、１２℃で反応させた。実施例２に記載したように、ＭＷＤを種々の時点で測定した。クロマトグラフの特徴を図５に示す。
【００４７】
最終ＭＷＤは、両方の酸化ＨＥＳとも２２℃でより狭く、両方の温度ともより長い反応時間となった。４５０ｋＤａのＨＥＳ生成物（実線）の平均分子量は、より低い温度で分子量差が大きくなり、２００ｋＤａ誘導体（破線）の場合よりも大きくなった。反応は、より低い温度ではよりゆっくりと進行し、より高い温度での同様な反応時間と比較すると、より大きな平均分子量、且つより広範囲の分子量巾となった。
【００４８】
実施例７：スケールアップ
酸化ＨＥＳのデオキシＨｂに対する結合を、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のためにスケールアップした。
【００４９】
ＣＯＨｂを、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液のｐＨ８．１にて１２５ｍｇ／ｍＬとし、中空ファイバガス交換体を用いて、酸素次いで窒素と接触させてリガンドフリーにした。０．６当量の過ヨウ素酸塩を用いて実施例１のように調製した４７ｇの酸化２００ｋＤａ  ＨＥＳを２８０ｍＬの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ８．１に溶解し、次いで脱気し、窒素で掃流した。次に酸化ＨＥＳ溶液をデオキシＨｂに加えて、窒素下２２〜２５℃に維持し、ＭＷＤの過ヨウ素酸塩測定を定期的に行った。１６時間以内で、すべてのＨｂが修飾され、カラムの排除限界にて溶出した生成物は無かった（図６）。比較のために示した一番下の曲線は、酸化的に開環されたラフィノース（ポリＯＲ−Ｈｂ）で架橋したＨｂから誘導される。反応は、酢酸ソーダで０．４Ｍに調製され、当初のアルデヒドの１モルにつき約３当量のボランを表す３６ｇのジメチルアミンボランを加えた。２１時間後、反応混合物を酸素化し、乳酸リンゲル溶液に対して透析濾過し（１０ｋＤａのＭＷＣＯ）、ｐＨ７．４に調整した。生成物は、Ｐ５０（３７℃）＝２６ｍｍＨｇをもち、非協同的であった。ゲルろ過クロマトグラフィ流出液の低角度レーザー光散乱分析は、９０〜１２０ｋＤａの分子量を示した。遊離アルデヒドは検出されなかった。
【００５０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の分析は、Ｈｂ−ＨＥＳ生成物が広範囲な期間維持されることを示している。生成物の量は、乳酸リンゲル液にて３．０ｇＨｂ／ｄＬに調整され、全血液量の１０％当量を意識下のラットに注入し、血管保持時間が測定された。乳酸リンゲル液にて１０．０ｇ／ｄＬに調整し、ポリＯＲ−Ｈｂの等しい量で測定した５．１時間に比較して、半減期は６．０時間であった。
【００５１】
実施例８：Ｈｂと酸化デキストランとの結合および低分子量への転換
２つの酸化デキストラン（デキストラン鎖モノマーにつき２個のジオール）をジオール当たり０．４５または１．３６当量の過ヨウ素酸塩を用いて調製した。４℃の水４０ｍＬに溶解した２．０ｇのデキストラン（２６０ｋＤａ）の溶液を２．３９または７．１８ｇの過ヨウ素酸ナトリウム（それぞれ０．４５および１．３６当量）で処理した。暗所で４℃４時間攪拌後、溶液を透析し（１０ｋＤａ分子量カット）、凍結乾燥して白色粉末にした。１ｍＬの８０ｍＭ  ＨＥＰＥＳのｐＨ８．１緩衝液中の酸化デキストラン５０ｍｇと０．０６２ｍＬ  ＣＯＨｂ（２００ｍｇ／ｍＬ）と一緒にした。結合反応は解離するが非変性条件下で（０．５Ｍ  ＭｇＣｌ2 ＋２５ｍＭトリスｐＨ７．４）、ゲルろ過クロマトグラフィによりモニタする。ジオール当たり０．４５当量の過ヨウ素酸塩を用いてデキストランを酸化した生成物に関する結果は、図７に示し、ジオール当たり１．３６当量を用いた実験については図８に示す。とちらの反応でも、カラム排除量のところで主に溶出してくる高分子量種が初期に形成されたことを示した。高酸化デキストランから誘導される結合体は、低酸化デキストランを用いる場合よりもより迅速に低分子量種に転換する。コントロールのポリＯＲ−Ｈｂと、高酸化デキストラン結合体とが、後者が概して高分子量であることを除いて分子量分布が類似していることは、結合体が、多糖類のフラグメントで修飾されている重合した架橋Ｈｂ分子種により成り立っていることを示唆する。この配置はまた、ある条件下で得られる酸化ＨＥＳ結合体に関しても示唆される（図３）。
【００５２】
実施例９：低分子量（ＬＯＭＷ）および高分子量（ＨＩＭＷ）  Ｈｂ−ＨＥＳ結合体の血漿中半減期
オスのスプレーグドーリー（Sprague Dawley）ラットを食餌と水道水を自由に摂らせて１週間馴化した。実験当日、ラットをＫｅｔａｓｅｔ（塩酸ケタミン、６０ｍｇ／ｋｇ、筋内）およびＡｔｒａｖｅｔ（マレイン酸アセプロマジン、２．０ｍｇ／ｋｇ、筋内）で麻酔した。ヘパリン・生理食塩水（５０ＵＳＰ単位  ヘパリン／ｍＬ）を満たしたＰＥ５０管に連結した２．５〜３．５ｃｍのＰＥ１０管を用いて右大腿動脈および静脈にカニューレ挿入した。２本の３．５ｃｍのＰＥ１０を、大腿動脈を経由して下腹部大動脈へ、大腿静脈を経由して大静脈へと挿入した。２本のカニューレは、皮下を通して、首筋へと出した。手術の最後に手術部位を手術糸を用いて閉じた。この手術の最後に２本のカニューレを、ヘパリン−生理食塩水（５００ＵＳＰ単位／ｍＬ）で満たした。その後、動物に齧歯動物用固定ベルトと小型フィードスルースイベル（feed-through swivel ）をつけ個別にメタボリックケージに入れた。動物は手術から０．５〜１．５時間で麻酔から覚醒させ。全実験の間、メタボリックケージ内に収容した。覚醒期の後、静脈カニューレを自動注入ポンプに繋いだ。覚醒した動物を各々総血液量の１０％に相当する、対照溶液（乳酸化リンゲル溶液中１０ｇ／ｄＬのポリＯＲ−Ｈｂ、および同じものを血漿中４ｇ／ｄＬに希釈したもの）、または試験物（実施例２の生成物の低分子量（ＬＯＭＷ）および高分子量（ＨＩＭＷ）のＨＥＳ−Ｈｂを、乳酸化リンゲル溶液中５．０および３．５ｇＨｂ／ｄＬとしたもの）を、０．２ｍＬ／分の送達速度の注入に供した。血液サンプルは、注入終了後２０分（注入後０．３３時間）および１、３、６、１０、２２、２８、３４時間後に採取した。血漿は、遠心分離によって分離し、ゲルろ過クロマトグラフィによる分析まで−８０℃で保管した。総ヘモグロビンは、バックグラウンド補正した４１４ｎｍにおける吸光度より計算し、血液採取時間に対してプロットし、血漿中半減期は単一指数対応から導いた。血漿中半減期は、４および１０ｇ／ｄＬポリＯＲ−Ｈｂ、ＬＯＭＷおよびＨＩＭＷ  ＨＥＳ−Ｈｂ溶液に関して、各々、５．１、５．５、８．９、１５．６時間であった。
【００５３】
ＬＯＭＷと同様の分子量分布を持っている実施例７の生成物に関して得られた半減期を、ＬＯＭＷの半減期と比較すると、限られた実験データから示されるのは、酸化の程度がより高いＨＥＳから誘導された後者の生成物に関して得られた半減期がより長いということである。
【００５４】
実施例１０：血漿中Ｈｂ−ＨＥＳのｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性
実施例６で調製したＨｂ−ＨＥＳをラット血漿中１０倍に希釈した後、３７℃でインキュベートした。これは５〜１０％（容量／容量）の最高負荷投与をシミュレートする。４９時間にわたり混合物を解離するが非変性条件下（０．５Ｍ  ＭｇＣｌ2＋２５ｍＭトリスｐＨ７．４）でゲルろ過クロマトグラフィにより分析した。その結果を図９に示す。この時間では、生成物の分解を示す低分子量の分子種は検出されなかった。分析カラムの排除限界で溶出してくる高分子量分子種が、インキュベーションの最初の１時間内に現れた。これらの分子種は修飾されたヘモグロビンおよびラットのハプトグロビンの高分子量複合体に相当し、血漿中でインキュベートしたその他幾つかの重合化ヘモグロビン生成物を用いてなされた観察と一致する。
【００５５】
実施例１１：Ｈｂ−ＨＥＳ結合中の種々の分子量分子種の安定化
ジメチルアミンボラン（ＤＭＢ）還元を用いて、Ｈｂを酸化されたＨＥＳに結合させる際に生じる分子量変化を終結させた。４９０μＬの８０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．１）と合わせた２．０ｍＬのＣＯＨｂ（Ｈ2Ｏ中２００ｍｇ／ｍＬ）を脱酸素化した。６７４ｍｇのＮ2 負荷酸化したＨＥＳ（ＨＥＳ４５０／０．７、算定されたジオールにつき１．１０当量の過ヨウ素酸塩から前もって調製された）を、６．８ｍＬの脱気した８０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．１に溶解した。９５０μＬのＨｂ溶液を酸化ＨＥＳ溶液に加えて、最終Ｈｂ：ＨＥＳ（４５０ｋＤａ）比が１：１のものをつくった。３時間後、２ｍＬのこの反応混合物を、１５２ｍｇのＮ2 負荷ＤＭＢ（酸化ＨＥＳに関して算定された当初のアルデヒドにつき約３当量のＤＭＢを供する）を３５０μＬの４Ｍ  ＮａＯＡｃを加えた１．６ｍＬの脱気した水に溶解して新たに調製した溶液に加えた。このＨｂ−ＨＥＳ反応の２ｍＬのアリコートを６時間後同様に処理した。２２時間後、反応液をＣＯで充填し、４℃で７２時間かけて水に対してよくよく透析した。結合、還元および透析後の分子量分布を、解離するが非変性条件下（０．５Ｍ  ＭｇＣｌ2＋２５ｍＭトリスｐＨ７．４）ゲルろ過クロマトグラフィにより測定した。３時間の還元に供した生成物の結果は、図１０に、６時間の還元に供した生成物は、図１１に、非還元生成物に関しては図１２に示す。３時間および６時間において観察された生成物（双方とも高分子量結合体）の分子量分布は、室温２２時間の還元中においても、また４℃７２時間の透析中でも有意に変化しなかった。それ故、還元されなかったサンプルとは違い、当初のアルデヒドにつき３当量のＤＭＢでの還元は、Ｈｂ−ＨＥＳ結合体の低分子量変換を妨げた（図１０）。高分子量種の安定化は、実施例３に記載したように、当初のアルデヒド当たり、より少ない当量のＤＭＢを用いた場合にも見られた。この還元法は、結合反応中に展開する如何なる分子量分布をも安定化させるために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  前記実施例２の生成物の一連のクロマトグラムである。
【図２】  前記実施例２の生成物の一連のクロマトグラムである。
【図３】  前記実施例２の生成物の一連のクロマトグラムである。
【図４】  前記実施例３の生成物のゲルろ過クロマトグラフィ分析の図である。
【図５】  前記実施例６の生成物の同様の一連のクロマトグラムである。
【図６】  前記実施例７の生成物の同様の一連のクロマトグラムである。
【図７】  前記実施例８の生成物の同様の一連のクロマトグラムである。
【図８】  前記実施例８の生成物の同様の一連のクロマトグラムである。
【図９】  前記実施例１０の結果を示す同様の一連のクロマトグラムである。
【図１０】  前記実施例１１の生成物の同様の一連のクロマトグラムである。
【図１１】  前記実施例１１の生成物の同様の一連のクロマトグラムである。
【図１２】  前記実施例１１の生成物の同様の一連のクロマトグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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