(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの第一の貫通孔を設けた薄板と、第二の貫通孔を設けた保持プレートと、ウエルからなり、前記第一の貫通孔に保持した細胞の細胞電位を電極により測定するための細胞電気生理センサであって、前記薄板を第二の貫通孔の内部に保持し、この第二の貫通孔の上部に溶液または細胞を含んだ溶液を蓄積できるウエルを配置して保持プレートに当接し、前記ウエルの下部には溝が設けられており、前記ウエルを構成する内壁部にはこのウエルの上面から下面に向かって前記溝と連通し保持プレートにまで到達する第三の貫通孔を少なくとも一つ設けるとともに、この第三の貫通孔は前記第二の貫通孔に向かって開口している細胞電気生理センサ。
【請求項２】
ウエルの内壁部の保持プレート側の開口部の形状を薄板の外径よりも小さくした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項３】
ウエルの内壁部の保持プレート側の開口部に第二の貫通孔の内部へ突出した突出部を設けた請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項４】
薄板の外周部に枠体部を設け、この枠体部を保持プレートの第二の開口部に前記枠体部をウエル側となるように保持し、このウエルの突出部を前記枠体部によって構成されたキャビティの内部へ挿入した請求項３に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項５】
前記第三の貫通孔は、複数形成されている請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項６】
少なくとも一つの第一の貫通孔を設けた薄板と、第二の貫通孔を設けた保持プレートと、ウエルからなり、前記薄板を第二の貫通孔の内部に保持し、この第二の貫通孔の上部に溶液または細胞を含んだ溶液を蓄積できるウエルを配置して保持プレートに当接し、前記ウエルの下部には溝が設けられており、前記ウエルを構成する内壁部にはこのウエルの上面から下面に向かって前記溝と連通し保持プレートにまで到達する第三の貫通孔を少なくとも一つ設けるとともに、この第三の貫通孔は前記第二の貫通孔に向かって開口しており、前記第一の貫通孔に保持した細胞の細胞電位を電極により測定するための細胞電気生理センサを準備する工程と、ウエルの内部に第一の溶液を蓄積する工程と、第三の貫通孔の内部へ第二の溶液を投入する工程を少なくとも含む細胞電気生理現象の測定方法。
【請求項７】
ウエルの内部の第一の溶液を第二の溶液へ交換する請求項６に記載の細胞電気生理現象の測定方法。
【請求項８】
少なくとも一つの第一の貫通孔を設けた薄板と、第二の貫通孔を設けた保持プレートと、ウエルからなり、前記薄板を第二の貫通孔の内部に保持し、この第二の貫通孔の上部に溶液または細胞を含んだ溶液を蓄積できるウエルを配置して保持プレートに当接し、前記ウエルの下部には溝が設けられており、前記ウエルを構成する内壁部にはこのウエルの上面から下面に向かって前記溝と連通し保持プレートにまで到達する第三の貫通孔を少なくとも一つ設けるとともに、この第三の貫通孔は前記第二の貫通孔に向かって開口しており、前記第一の貫通孔に保持した細胞の細胞電位を電極により測定するための細胞電気生理センサを準備する工程と、
前記ウエルの内部に溶液を入れる工程と、
この溶液を前記第三の貫通孔から吸引する工程とを含む細胞電気生理現象の測定方法。
【請求項９】
前記細胞電気生理センサは、
前記第三の貫通孔を複数有するとともに、これらの第三の貫通孔の一方の開口部はそれぞれ前記第二の貫通孔に向かって開口し、
前記溶液を前記第三の貫通孔から吸引する工程では、前記複数の第三の貫通孔から前記溶液を吸引する請求項８に記載の細胞電気生理現象の測定方法。
【請求項１０】
前記細胞電気生理センサは、
前記第三の貫通孔を複数有するとともに、これらの第三の貫通孔の一方の開口部はそれぞれ前記第二の貫通孔に向かって開口し、
前記ウエルの内部に溶液を入れる工程では、この溶液を少なくともいずれかの前記第三の貫通孔から投入し、
前記溶液を前記第三の貫通孔から吸引する工程では、
前記溶液を投入する前記第三の貫通孔とは別の前記第三の貫通孔から前記溶液を吸引することを特徴とする請求項８に記載の細胞電気生理現象の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の薬剤に対する反応を測定するために用いられる細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、電気生理学におけるパッチクランプ法は、微細な先端を持つガラスマイクロピペットを用いて細胞膜に存在するイオンチャネルを測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。
【０００３】
しかし、一方でパッチクランプ法は測定技術に微細なガラスマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い能力を必要としているため、熟練作業者が必要であり、高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない。
【０００４】
このため、微細加工技術を利用した平板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要としない自動化システムに適している。例えば、２つの領域を分離するキャリアに穴を有し、このキャリアの上下に設置した電極によって電界を発生させることで細胞を穴に効率よく保持し、上下の電極間で電気的測定を行うことで細胞状態量測定の一つである電気生理的測定を可能にする技術が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
一方、細胞と接触しうる細胞作用剤を含有する溶液を連続的または間欠的に流すのに適した微小流体室と、この微小流体室中に保持された生細胞と、この生細胞に生じる細胞媒介細胞外効果を測定する手段を用意することで、前記微小流体室中に流した細胞作用剤の効果を測定する技術について開示している（例えば、特許文献２参照）。特に、この技術を用いると細胞の極周辺に細胞作用剤を供給、または排出をすることができ、細胞周辺の切り替えを迅速に行いたいときに有効である。
【特許文献１】特表２００２−５０８５１６号公報
【特許文献２】特許第２９９３９８２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前記従来の構成では、細胞周辺の溶液環境を迅速に交換するために、流体室は閉空間である必要があり、それぞれの細胞に合わせて、溶液の流動性、拡散係数、濃度等の種々の条件の溶液による細胞が発する電気生理的変化を高精度に測定したい場合、前記のような固定された閉空間では流体室の大きさを細胞の大きさによって変えることが困難である。
【０００７】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、種々の細胞に対しても高精度に効率よく電気生理現象を測定することができる細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記従来の課題を解決するために、本発明は、第一の貫通孔を設けた薄板と、第二の貫通孔を設けた保持プレートと、ウエルからなり、薄板を第二の貫通孔の内部に保持し、この第二の貫通孔の上部に溶液または細胞を含んだ溶液を蓄積できるウエルを保持プレートに当接し、ウエルを構成する内壁部に保持プレートにまで到達する第三の貫通孔を設けるとともに、この第三の貫通孔の一方の開口部は第二の貫通孔に向かって開口するように構成するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法は、ウエルの上部に開放空間を持ちながら、薄板の第一の貫通孔へ保持させた種々の細胞に対しても細胞の近傍へ確実に薬剤供給を行うことができる構成を実現することによって、より高精度で効率的な測定を実現することができる細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法を提供することができるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法について図面を用いて説明する。
【００１１】
図１は本発明の細胞電気生理センサの斜視図であり、図２は図１のＡ−Ａ部における断面図である。
【００１２】
図１および図２において、１は細胞電気生理センサであり、シリコンからなる薄板２と、樹脂からなる保持プレート４と、樹脂からなるウエル６とから構成しており、前記薄板２には少なくとも一つの第一の貫通孔３を１〜３μｍの直径で設けている。そして、この薄板２を保持プレート４の第二の貫通孔５の内部へ固定している。
【００１３】
さらに、ウエル６は保持プレート４の上部へ当接しているが、ウエル６または保持プレート４のいずれかが可視光透過性を有し、一方は不透明体であることが好ましい。これによって、ウエル６と保持プレート４は可視光透過性である面からレーザ光線を照射することによって、その接合面を溶着させて強固な接着面を形成することが容易に可能となる。
【００１４】
また、ウエル６の内壁部８の内部には上面から下面に向かって第三の貫通孔７を設けており、一方の端はウエル６の下部に設けられた溝９へ連通している。このように、ウエル６を保持プレート４へ密着させることによって、第三の貫通孔７は一方の開口部が、保持プレート４の第二の貫通孔５もしくは第一の貫通孔３へ向かって開口している形状としている。
【００１５】
以上のような構成によって、本実施の形態１における細胞電気生理センサは、後に述べるようにウエル６から細胞２３を含む溶液を投入しやすくなる。さらに、第三の貫通孔７から別の溶液を投入することもできることから、ウエル６の内部の溶液を効率よく他の溶液に交換することができる。
【００１６】
次に、本実施の形態１の細胞電気生理センサを用いて細胞の電気生理現象の測定を行う方法について述べる。
【００１７】
図３〜図７は本実施の形態１における細胞の電気生理現象の測定を行う手順について説明するための断面図である。また図８〜図１０は別の例の細胞電気生理センサを説明するための断面図であり、図１１〜図１３はさらに他の例の細胞電気生理センサを説明するための断面図である。
【００１８】
まず始めに、図３に示すようにウエル６の上部から第一の溶液２４を投入すると、図４に示すように第一の貫通孔３および保持プレート４の下部領域に第一の溶液２４が浸透し、それぞれの領域において第一の溶液２４は上部電極２７および下部電極２８と接触する。そして、この第一の溶液２４はＮａＣｌを含む電解液であるので、上部電極２７と下部電極２８の間には通常１〜１０ＭΩ程度の導通抵抗が発生する。
【００１９】
なお、保持プレート４の下部領域には第一の溶液２４とは別の溶液（例えば第三の溶液２６）をあらかじめ入れておいても良い。
【００２０】
一方、ウエル６から投入された第一の溶液２４はウエル６の内部に設けられた第三の貫通孔７側にも少し侵入するが、特に問題はない。
【００２１】
しかしながら、第一の貫通孔３の近傍に気泡が残っていると、先に述べた導通抵抗が確保できないことがあり、特に第三の貫通孔７の内部に空気が残っていると、後で第三の貫通孔７から別の溶液（例えば、第三の溶液２６）を投入すると第一の貫通孔３の近傍に気泡が発生してしまう。このようなことがないようにするためには、図７に示したように第一の溶液２４をウエル６から投入する際、第三の貫通孔７から吸引することによって、気泡が第一の貫通孔３の付近に残ることがなくなるとともに、第一の溶液２４は十分な量で第三の貫通孔７の内部を満たすことから、後で第三の貫通孔７に別の溶液を投入しても気泡の発生を防ぐことができる。
【００２２】
次に、図５に示すように細胞２３を含む第一の溶液２４をウエル６の内部へ投入し、その後、図６に示すように保持プレート４の下部を減圧すると、第一の溶液２４および細胞２３が第一の貫通孔３へ引き込まれる。ここで、第一の溶液２４は第一の貫通孔３を通過するが、細胞２３は第一の貫通孔３を通り抜けることができず、第一の貫通孔３の開口部付近で保持される。そして、この細胞２３が適度な密着度で第一の貫通孔３を塞ぐように保持されると、第一の溶液２４は電気的に保持プレート４の上下で分断され、上部電極２７と下部電極２８間では十分に高い抵抗値、例えば１００ＭΩ、好ましくは５００ＭΩ以上となる。
【００２３】
次に、図６に示したように上部電極２７と下部電極２８間に例えば１０ｍＶ程度の固定電圧を印加すると細胞２３の膜にかかる電位（膜電位）が固定され、この時の電流値を測定することで、細胞２３の内部に存在するイオンチャネルを流れる電流を測定することができる。
【００２４】
なお、このイオンチャネルを流れる電流を測定する詳細な手順については、従来の方法であるパッチクランプ法などで詳しく公開しているので、ここではその説明は省略する。
【００２５】
また、別の構成として、図８に示したように投入する箇所として第三の貫通孔７から投入することもできる。これによって、細胞２３は第一の貫通孔３の近傍へ確実に導入することができる。そして、図９に示すように保持プレート４の下部を減圧すると、第一の溶液２４および細胞２３が第一の貫通孔３へ引き込まれ、細胞２３は第一の貫通孔３を通り抜けることができず、第一の貫通孔３の開口部付近で保持される。この構成によって、少量の細胞２３であっても、確実に第一の貫通孔３を塞ぐように細胞２３を配置し、保持することができる。
【００２６】
次に、図１０に示すように第三の貫通孔７から第二の溶液２５を投入する。ここで、第三の貫通孔７の一方の開口部は第一の貫通孔３に向かって開口しているので、第一の貫通孔３付近の第一の溶液２４は速やかに第二の溶液２５へ交換することができる。
【００２７】
なお、第三の貫通孔７を複数形成してことが好ましい。これによって、一つの第三の貫通孔７から第二の溶液２５を投入し（矢印の方向）、他の第三の貫通孔７から吸引（矢印の方向）を行うことによって、第一の溶液２４から第二の溶液２５への迅速な溶液交換が可能となる。
【００２８】
そして、このような構成とすることによってイオンチャネルを流れる電流を測定しながら保持プレート４の上部領域において溶液の交換を速やかに行うと、第一の溶液２４には含まれないが第二の溶液２５の中に含まれる薬剤成分（例えば特定のイオンチャネルに対するチャネル阻害剤）によるイオンチャネル電流の変化を測定することで薬理効果判定が迅速に正確に行えるようになる。
【００２９】
さらに、本実施の形態１における細胞電気生理センサの他の例として、図１１に示すようにウエル６の下方の開口部１０の形状を薄板２の外径より小さくすることによって、第三の貫通孔７から投入された液体（例えば第二の溶液２５）は、より確実に薄板２の第一の貫通孔３の近傍の第一の溶液２４を速やかに交換することができる。
【００３０】
また、さらに他の例として、図１２に示すように薄板２を保持プレート４の第二の貫通孔５の下方に保持した場合、ウエル６の下方の開口部１０に第二の貫通孔５の内下方へ突出する突出部１１を設けておくことによって、より確実に第一の貫通孔３の近傍の溶液を速やかに交換することができる。
【００３１】
また、さらに他の例として、図１３に示すように薄板２の外周部に枠体１２を当接しており、この枠体１２を第二の貫通孔５の内部に設置するとともに、ウエル６の開口部１０に枠体１２の内下方へ突出する突出部１１を設けておくことによって、より確実に第一の貫通孔３の近傍の溶液を速やかに交換することができる。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
以上のように、本発明にかかる細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法は、高精度に効率良く細胞の電気生理現象の変化を測定できることから、例えば高速で薬理判定を行う、薬品スクリーニング等の測定器として用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの斜視図
【図２】同断面図
【図３】同センサを用いて細胞の電気生理現象の測定方法を説明するための断面図
【図４】同断面図
【図５】同断面図
【図６】同断面図
【図７】同断面図
【図８】別の例の細胞電気生理センサの断面図
【図９】同断面図
【図１０】同断面図
【図１１】同他の例の細胞電気生理センサの断面図
【図１２】同他の例の細胞電気生理センサの断面図
【図１３】同他の例の細胞電気生理センサの断面図
【符号の説明】
【００３４】
１  細胞電気生理センサ
２  薄板
３  第一の貫通孔
４  保持プレート
５  第二の貫通孔
６  ウエル
７  第三の貫通孔
８  内壁部
９  溝
１０  開口部
１１  突出部
１２  枠体
２３  細胞
２４  第一の溶液
２５  第二の溶液
２６  第三の溶液
２７  上部電極
２８  下部電極
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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