(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料中の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の複数のアイソフォームを検出する方法であって、
（ａ）固体担体上に固定化された捕獲試薬と共に生物学的試料をインキュベートして、捕獲試薬にＶＥＧＦの複数のアイソフォームを結合させるステップであって、該捕獲試薬は、ＶＥＧＦに結合するポリクローナル抗体とヒトＶＥＧＦのＣ末端アミノ酸残基１１１−１６５に特異的に結合するモノクローナル抗体を含んでなる混合物を含むステップと、
（ｂ）固定化された捕獲試薬に結合したＶＥＧＦを、ＶＥＧＦのＮ末端アミノ酸残基１−１１０と結合する検出可能抗体に該結合ＶＥＧＦを接触させることによって、検出するステップ、
を含んで成る方法。
【請求項２】
生物学的試料がヒトから単離される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒトが血管性の、糖尿病の、又は癌の患者である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
生物学的試料が血漿、血清又は尿である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
固体担体がマイクロタイタープレートである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）のインキュベーションのｐＨが６．０から９．５である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｐＨが６．０から７．０である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ｐＨが６．０から６．５である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ｐＨが６．３４から６．３６である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）のインキュベーションの温度が０℃から４０℃である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記温度が３６℃から３８℃である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）のインキュベーションが０．５から３．０時間である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記インキュベーションが３時間である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）のインキュベーションが一晩である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
（ｃ）  （ｂ）で検出されたＶＥＧＦの量を測定し、該量は標準曲線を使って定量することをさらに含んで成る請求項１から１４のいずれか一つの方法。
【請求項１６】
捕獲試薬が、０．８：１から１．２：１のモノクローナル抗体：ポリクローナル抗体の重量比で固定化される請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
モノクローナル抗体：ポリクローナル抗体の重量比が１：１である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
固定化されたモノクローナル抗体の量が０．４μｇ／ｍｌであり、固定化されたポリクローナル抗体の量が０．４μｇ／ｍｌである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
検出可能抗体が直接検出可能である請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
検出可能抗体がビオチン化されるか又は蛍光定量試薬により増幅される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
捕獲試薬モノクローナル抗体がＡＴＣＣ受領番号ＨＢ  ＰＴＡ−３４９９であるハイブリドーマまたはその継代から産生されるＭＡｂ  ３．５Ｆ８である請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
捕獲試薬ポリクローナル抗体がウサギ又はヤギポリクローナル抗体である請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
捕獲試薬ポリクローナル抗体がアフィニティー精製される請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
捕獲試薬モノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体である請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
検出可能抗体がモノクローナル抗体である請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
検出可能モノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
検出可能モノクローナル抗体がＡＴＣＣ受領番号ＨＢ１０７０９のハイブリドーマまたはその継代から産生されるＭＡｂ  Ａ４．６．１である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
生物学的試料中の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の複数のアイソフォームを検出するためのイムノアッセイキットであって、
（ａ）捕獲試薬として、ＶＥＧＦに結合するポリクローナル抗体とヒトＶＥＧＦのＣ末端アミノ酸残基１１１−１６５に特異的に結合するモノクローナル抗体とを含んで成る混合物、及び
（ｂ）検出試薬として、ＶＥＧＦのＮ末端アミノ酸残基１−１１０に結合する検出可能抗体、
を含んで成るキット。
【請求項２９】
抗原標準として精製ＶＥＧＦを更に含んでなる請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
検出可能抗体が蛍光的に標識される請求項２８に記載のキット。
【請求項３１】
捕獲試薬モノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体である請求項２８に記載のキット。
【請求項３２】
捕獲試薬ポリクローナル抗体がウサギ又はヤギポリクローナル抗体である請求項２８に記載のキット。
【請求項３３】
捕獲試薬ポリクローナル抗体がアフィニティー精製される請求項２８に記載のキット。
【請求項３４】
検出可能抗体がモノクローナル抗体である請求項２８に記載のキット。
【請求項３５】
捕獲試薬モノクローナル抗体がＡＴＣＣ受領番号ＨＢ  ＰＴＡ−３４９９のハイブリドーマまたはその継代から産生されるＭＡｂ  ３．５Ｆ８である請求項３１に記載のキット。
【請求項３６】
検出可能モノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体である請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
検出可能モノクローナル抗体がＡＴＣＣ受領番号ＨＢ１０７０９のハイブリドーマまたはその継代から産生されるＭＡｂ  Ａ４．６．１である請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
捕獲試薬が、０．８：１から１．２：１のモノクローナル抗体：ポリクローナル抗体の重量比で固定化される請求項２８から３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３９】
固体担体がマイクロタイタープレートである請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
モノクローナル抗体：ポリクローナル抗体の重量比が１：１である請求項３８に記載のキット。
【請求項４１】
固定化されたモノクローナル抗体の量が０．４μｇ／ｍｌであり、固定化されたポリクローナル抗体の量が０．４μｇ／ｍｌである請求項３８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は癌、心血管性又は他の症状を持つ患者に対する診断上及び予後の方法として用いることが可能なＶＥＧＦ検出のためのイムノアッセイに関する。
【０００２】
（関連技術の説明）
現在では、血管形成は種々の疾患の病因に関係することが明確に確立されている。これらには固形腫瘍、増殖性網膜症又は加齢関連性斑変性(ＡＭＤ)などの眼球内新生血管症候群、慢性関節リウマチ、及び乾癬が含まれる（Folkman等, J. Biol. Chem., 267：10931-10934(1992)；Klagsbrun等, Annu. Rev. Physiol., 53：217-239(1991)；及びGarner A. Vascular diseases. In:Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach. Garner A. Klintworth GK, Eds., 2nd Edition(Marcel Dekker, NY,1994) 1625-1710頁。）固形腫瘍の場合、新血管新生により、腫瘍細胞が正常細胞と比較して成長有利性と増殖自律性を獲得する。従って、腫瘍部位の微小血管密度と乳癌並びに幾つかの他の腫瘍における患者の生存率との間には相関関係が見出されている（Weidner等, N. Engl. J. Med. 324：1-6(1991)；Horak等, Lancet, 340：1120-1124(1992)；及びMacchiarini.等, Lancet, 340：145-146(1992)）。
【０００３】
血管形成の正の調節因子の探索により、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ-α、ＴＧＦ-β、ＨＧＦ、ＴＮＦ-α、アンジオゲニン、ＩＬ-８等を含む多くの候補薬が得られている（Folkman等、上掲、及びKlagsbrun等, 上掲）。これまでに同定されている負の調節因子には、トロンボスポンジン(Good等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87：6624-6628(1990))、プロラクチンの１６-キロダルトンのＮ-末端フラグメント(Clapp等, Endocrinology, 133：1292-1299(1993))、アンギオスタチン(O'Reilly等, Cell, 79：315-328(1994))及びエンドスタチンが含まれる（O'Reilly等, Cell, 88：277-285(1996)）。
最近の数年間にわたってなされた研究で、正常及び異常な血管新生の調節における血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の重要な役割が確立されている（Ferrara等, Endocr. Rev., 18：4-25(1997)）。一つのＶＥＧＦ対立遺伝子さえ喪失すると胎児死亡に至るという知見は、血管系の発達と分化におけるこの因子が担っている代替できない役割を示している（Ferrara等, 上掲）。
【０００４】
さらに、ＶＥＧＦは腫瘍及び眼内疾患に関連した新血管新生の重要なメディエーターであることが示されている（Ferrara等, 上掲）。ＶＥＧＦｍＲＮＡは検査した多くのヒト腫瘍で過剰発現している（Berkman等, J. Clin. Invest., 91：153-159(1993)；Brown等, Human Pathol., 26：89-91(1995)；Brown等, Cancer Res., 53：4727-4735(1993)；Mattern等, Brit. J. Cancer, 73：931-934(1996)；及びDvorak等, Am. J. Pathol., 146：1029-1039(1995)）。また、眼の流体中のＶＥＧＦの濃度は、糖尿病及び他の虚血関連網膜症を有する患者における血管の活性増殖の存在と高い相関関係がある（Aiello等, N. Engl. J. Med., 331：1480-1487(1994)）。さらに、急性黄斑変性症（ＡＭＤ）の影響を受けている患者の脈絡膜新生血管膜にＶＥＧＦが局在化していることが研究により示されている（Lopez等, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 37：855-868(1996)）。
【０００５】
ＶＥＧＦは分子量４５ｋＤのヘパリン結合成長因子である（Plouet等, EMBO J.8:3801 (1989);Neufeld等, Prog. Growth Factor Res. 5:89 (1994)）。同一のサブユニットで構成される二量体の糖タンパク質である。ＶＥＧＦは単一の遺伝子でコードされるが、インヴィボにおいて少なくとも５つのアイソフォームがｍＲＮＡの選択的スプライシングにより存在する。これらのアイソフォーム、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６は、各々１２１、１４５、１６５、１８９及び２０６のアミノ酸を含む（Leung等, Science 246:1306 (1989);Houck等, Mol. Endocrinol. 5:1806 (1991);Tischer等, J. Biol. Chem. 266:11947 (1991);Neufeld等, The FASEB Journal 13:9-22 (1999)）。ＶＥＧＦのアイソフォームはヘパリンに対して異なる親和性を示す；ＶＥＧＦ１２１はヘパリンに弱く結合するが、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６は増大した親和性でヘパリンと結合する。ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１６５は分泌され、両アイソフォームは血流中に見いだされる。これに対し、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６は多くが細胞外マトリックス中のプロテオグリカンを含むヘパリン硫酸塩と結合して見いだされる（Houck等, J. Biol. Chem. 267:26301 (1992);Park等, Mol. Biol. Cell 4:1317 (1993)）。５つのアイソフォームのうち、ＶＥＧＦ１６５は多くの細胞及び組織において最も大量に発現される変異体である。
【０００６】
ＶＥＧＦに対する５つのレセプターが同定された：全てシグナル伝達系チロシンキナーゼであるＶＥＧＦＲ−１（ＦＬＴ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ/ＦＬＫ−１）及びＶＥＧＦＲ−３、選択的にＶＥＧＦ１６５に結合するアクセサリーアイソフォーム特異的レセプターであるＮｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１及びＮｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−２である（de Vries等, Science 255:989 (1992);Terman等, Biochem. Biophys. Res. Commu. 187:1579 (1992);Millauer等, Cell 72:835 (1993);Neufeld等, 上掲）。ＶＥＧＦ生物学におけるこれらのレセプターの種々の役割が、多くのグループにより活発に研究されている。
ＶＥＧＦは組織で生産され、生物学的な効果を発揮するために血液循環系へ入る必要はなく、むしろパラ分泌レギュレーターとして局所的に働く。このことから、循環するＶＥＧＦの重要性及びそのようなＶＥＧＦが正常な生物学、病理学上如何なる役割を演ずるのかという疑問が生ずる。Yang等のJ. Pharm. Exp. Ther. 284:103 (1998)の記載による最近の研究により、循環系からのｒｈＶＥＧＦ１６５のクリアランスが非常に速いことが見いだされ、このことは循環中の内在性ＶＥＧＦは、おそらくＶＥＧＦの継続的な合成の結果であることを示唆する。さらに、幾つかの研究により循環するＶＥＧＦのレベルと全組織腫瘍量との関連づけが試みられ、潜在的な予後マーカーとしてのＶＥＧＦレベルが示唆された（Ferrari及びScagliotti Eur. J. Cancer 32A:2368 (1996);Gasparini等, J. Natl. Cancer Inst. 89:139 (1997);Kohn Cancer 80:2219(1997);Baccala等, Urology 51:327 (1998);Fujisaki等, Am. J. Gastroenterol. 93:249 (1998)）。明らかに、ＶＥＧＦを正確に測定する能力が、血管開存性の維持、月経周期、虚血、糖尿病及び癌などの多くの生物学的過程におけるその潜在的な役割を理解するために重要となるだろう。
【０００７】
検出不可能なレベルから高レベルに及ぶ、正常人及び疾患患者における広範囲に変動する内在性ＶＥＧＦの濃度が文献上報告される。ＶＥＧＦ１６５/１６５はタンパク分解的に３つのアイソフォームに切断される：１６５/１１０のヘテロ二量体、１１０/１１０のホモ二量体、及び５５アミノ酸のＣ−末端フラグメントである（Keyt等, J. Biol. Chem. 271:7788-7795 (1996);Keck等, Arch. Biochem. Biophys.344:103-113 (1997)）。
内在性ＶＥＧＦレベルを測定する能力は感度が高く特異性の高いアッセイの利用性に依存する。ＶＥＧＦに関して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡｓ、エライザ）に基づく比色定量、化学発光法、及び蛍光定量が報告された。Houck等, 上掲 (1992);Yeo等, Clin. Chem. 38:71 (1992);Kondo等, Biochim. Biophys. Acta 1221:211 (1994);Baker等, Obstet. Gynecol. 86:815 (1995);Hanatani等, Biosci.Biotechnol. Biochem. 59:1958 (1995);Leith 及びMichelson Cell Prolif. 28:415 (1995);Shifren等, J. Clin. Endocrinol. Metab. 81:3112 (1996);Takano等, Cancer Res. 56:2185 (1996);Toi等, Cancer 77:1101 (1996);Brekken等, Cancer Res. 58:1952 (1998);Obermair等, Br. J. Cancer 77:1870-1874 (1998);Webb等, Clin. Sci. 94:395-404 (1998)。血漿及び尿試料中の少量の薬剤及び他の抗原性構成物の定量において同様のエライザが首尾良く適用され、抽出のステップを含まず、従って実施するのは容易である。
【０００８】
Houck等, 上掲(1992)には、ng/mlの感度も持つと思われる比色定量エライザについて記述されているが、明らかに内在性ＶＥＧＦレベルを検出するのに十分な感度ではない。Yeo等, 上掲(1992)には、２サイト時間分解（two-site time-resolved）蛍光定量アッセイについて記述されているが、正常な血清中にＶＥＧＦは検出されなかった（Yeo等, Cancer Res. 53:2912 (1993)）。Baker等, 上掲(1995)によると、本蛍光定量アッセイの変法を用いたところ、妊娠中の女性の血漿中に検出可能なレベルのＶＥＧＦが報告され、子癇前症の女性ではより高いレベルで観察された。放射免疫アッセイを用いたAnthony等, Ann. Clin. Biochem. 34:276 (1997)の報告により、妊娠中の女性において同様のデータが報告された。Hanatani等, 上掲(1995)は循環しているＶＥＧＦを測定できる化学発光エライザ法を開発し、３０人の正常な個体（男性及び女性）の血清中に8-36 pg/mlのＶＥＧＦ量を報告している。Brekken等, 上掲(1998)には、ＶＥＧＦのみ又はＶＥＧＦ：Ｆｌｋ−１複合体の何れかに対し結合選択性を持つ抗体を用いたエライザアッセイについて記述されている。
ＶＥＧＦ検出のためのエライザアッセイキットは、R&D Systems(Abingdon. U.K.)から市販されている。R&D VEGF ELISAキットがサンドイッチアッセイに使用され、モノクローナル抗体が標的ＶＥＧＦ抗原を捕獲するために、ポリクローナル抗体が当該ＶＥＧＦを検出するために用いられたWebb等, 上掲(1998)。R&D ELISAキットを使用した検出結果がタンパク分解性の過程の存在又はＶＥＧＦの分解又は他の血清タンパク質の妨害により影響を受けるかどうかは明らかではない（Obermair等, 上掲(1998)）。
【０００９】
また、Keyt等, J. Biol. Chem. 271:7788-7795 (1996);Keyt等, J. Biol. Chem. 271:5638 (1996);及びShifren等, 上掲(1996)は、二重モノクロール抗体対に基づく比色性エライザを開発した。本エライザは癌患者において上昇したＶＥＧＦレベルを検出することはできるが、正常個体における内在性のＶＥＧＦレベルを測定するために必要とされる感度には欠ける。Rodriguez等, J. Immunol. Methods 219:45 (1998)には、ニート(neat)な血漿又は血清中での10 pg/mlＶＥＧＦの感度を示す２サイト蛍光定量ＶＥＧＦエライザについて記述された。しかし、本蛍光定量アッセイは、完全に無傷の１６５/１６５及び１６５/１１０ＶＥＧＦ種の検出のみ可能である。
従って、動物モデル又は患者の生物学的試料において、既存のエライザより高度なＶＥＧＦの測定可能レベルを検出し、全てのＶＥＧＦアイソフォームを測定できる診断及び予後のアッセイを開発する必要がある。
【００１０】
（発明の概要）
複数サイト抗体−サンドイッチエライザ法及び抗原としてのＶＥＧＦのためのキットを、生物学的試料中のＶＥＧＦを検出するために開発し、診断／予後の指標として使用した。現在用いられているＶＥＧＦエライザと比較すると、本アッセイは高感度であり、循環血液中の内在性ＶＥＧＦのアイソフォームのほとんどを検出することができる。
特に、本発明は生物学的試料、好ましくは血管性の、糖尿病の、又は癌の患者からの試料中のＶＥＧＦの検出方法であって：
（a）固体担体に固定化されたプレミックス捕獲試薬と生物学的試料を接触及びインキュベートさせ、捕獲試薬はヒトＶＥＧＦに対するポリクローナル及びモノクローナル抗体で、前記モノクローナル抗体はヒトＶＥＧＦのＣ-末端（残基111-165）に特異的に結合し；
（b）固定化された捕獲試薬から生物学的試料を分離し；
（c）ＶＥＧＦのＫＤＲ及びＦＬＴ１レセプター結合ドメインと結合する検出可能抗体と、固定化された捕獲試薬を接触させ；及び
（d）検出可能抗体に対する検出手段を用いて捕獲試薬に結合されるＶＥＧＦのレベルを測定する：ステップを含んで成る方法を提供する。
好ましくは、捕獲試薬は、ポリクローナル抗体に対するモノクローナル抗体の重量比が約0.8：1から1.2：1で固定化される。さらに好ましくは、ポリクローナル抗体に対するモノクローナル抗体の重量比が約1：1である。
【００１１】
他の面では、本発明は生物学的試料中のＶＥＧＦを検出するためのイムノアッセイキットであって：
（a）捕獲試薬として、ポリクローナル抗体に対するモノクロール抗体の重量比が約0.8：1から1.2：1でプレミックスされたヒトＶＥＧＦに対するポリクローナル及びモノクローナル抗体であって、モノクローナル抗体がヒトＶＥＧＦのＣ-末端（残基111-165）に特異的に結合するポリクローナル及びモノクローナル抗体；及び
（b）検出試薬として、ＶＥＧＦのＫＤＲ及びＦＬＴ１レセプター結合ドメインと結合する検出可能抗体を含んで成るキットを提供する。
本アッセイは捕獲試薬としてポリクローナル／モノクローナル抗体混合物を用いる点、及び捕獲モノクローナル抗体はＶＥＧＦのＣ−末端部分に結合する点においてユニークである。既に開示されているＶＥＧＦエライザの多くは、捕獲／検出のための二重モノクローナル抗体対、又は捕獲試薬としてのモノクローナル抗体及び検出のためのポリクローナル抗体のいずれかに基づいている。ポリクローナル抗体が捕獲抗体として単独で使用される場合、アッセイの全ての感度は失われてしまう。ＶＥＧＦのＣ−末端に結合するモノクローナル捕獲抗体の能力は、１６５/１６５、１６５/１１０、及び１１０/１１０を含む全ての内在性ＶＥＧＦ分子がここで記述されるアッセイにより検出され得ることを確実にする。さらに、本発明の検出抗体は、ＶＥＧＦの生物学的に活性な領域、即ちＶＥＧＦのＫＤＲ及びＦＬＴ１レセプター結合ドメインに結合し、検出されたＶＥＧＦ分子が、例えば血中で循環する可溶性ＶＥＧＦレセプターなどに阻害されることから免れることを保証する。従って、ここで記述されるアッセイは、おそらく生物学的に活性を有する循環中のＶＥＧＦ分子のより正確な測定を提供する。
【００１２】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
Ａ．定義
ここで用いられる「ＶＥＧＦ」という用語は、Leung等, Science 246:1306 (1989), Hock等, Mol. Endocrin. 5:1806 (1991)及びNeufeld等, 上掲中に記述されているような１６５−アミノ酸の血管内皮細胞成長因子、及び関連する１２１−、１４５−、１８９−、及び２０６−アミノ酸の血管内皮細胞成長因子、並びにこれらの成長因子の天然に生じる対立遺伝子及び処理された形態を示す。
「検出する」という用語は、標的分子の定性的及び定量的測定の両方を含む最も広い意味で用いられる。ある側面において、ここで記述されている検出方法は、生物学的試料中のＶＥＧＦの単なる存在を同定するために使用される。他の面において、本方法は試料中のＶＥＧＦが検出可能なレベルかどうかをテストするために使用される。さらに他の面において、本方法は試料中のＶＥＧＦの量を定量化し、さらに異なる試料中のＶＥＧＦレベルと比較するために使用され得る。
「生物学的試料」という用語は、何れかの動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトからの身体試料を示す。最も好ましくは、そのような生物学的試料は、血管性、糖尿病性、又は癌の患者に由来する。そのような試料には、血清、血漿、ガラス体液、リンパ液、関節液、卵胞液、精液、羊膜液、ミルク、全血、尿、脊髄液、唾液、痰、涙、汗、粘液、及び組織培養液、並びにホモジナイズされた組織などの組織抽出物、及び細胞抽出物等の生物学的体液を含む。ここでの好ましい生物学的試料は血清、血漿又は尿である。
【００１３】
「捕獲試薬」という用語は、捕獲試薬−標的分子の分子複合体が試料の残りの部分から分離されるような適切な条件下で、試料中の標的分子と結合し及び捕獲する能力を持つ試薬のことを指す。典型的には、捕獲試薬は固定化されているか又は固定化可能である。サンドイッチイムノアッセイにおいて、捕獲試薬は、好ましくは標的抗原に対する抗体又は異なる抗体の混合物である。
「検出可能抗体」という用語は、検出方法により増幅された標識を通じ直接的に、又は例えば標識される他の抗体を通じて間接的に検出可能な抗体を指す。直接標識のためには、典型的には、抗体はある方法により検出される成分と結合される。好ましい検出可能抗体はビオチン化抗体である。
「検出手段」という用語は、ここに開示のエライザ中の検出可能抗体の存在を検出するために使用される成分又は技術を指し、マイクロタイタープレート上に捕獲された標識などの固定化された標識を増幅する検出試薬を含む。好ましくは、検出手段はアビジン又はストレプタビジンなどの蛍光定量的検出試薬である。
【００１４】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多価抗体、多特異的抗体、及び所望の結合特異性を発揮する限りは抗体断片を含む。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対応する。更に、異なる決定基(エピトープ)に対応する異なる抗体を典型的に含む通常の（ポリクローナル）抗体とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対応する。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の性質を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature 256:495 (1975）に掲載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、又は組換えＤＮＡ法(例えば米国特許第４８１６５６７号を参照のこと)によって作ることができる。また、「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson 等, Nature 352:624-628 (1991)及びMarks等, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離してもよい。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分は他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体（イムノグロブリン）、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号;及び Morrison 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))。
【００１５】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分においてヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変性領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト（ドナー抗体）の高頻度可変性領域の残基によって置換されたヒトイムノグロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒトイムノグロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、ドナー抗体にも見出されない残基を含んでもよい。これらの変更は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全ての高頻度可変領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒトイムノグロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、イムノグロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトのイムノグロブリンの少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細については、Jones 等, Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann 等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００１６】
治療目的で「哺乳動物」と言うときは、ヒト、家畜及び農場家畜、及び動物園の動物、運動用の動物、愛玩用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ等々を含む哺乳動物として分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは哺乳動物はヒトである。
「癌」、「癌性」及び「悪性の」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、メラノーマ、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌及び肝細胞癌などの肝臓癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎細胞癌やウィルムス癌腫などの腎臓癌、メラノーマ、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。ここにおける治療のために好ましい癌は、乳癌、大腸癌、肺癌、及びメラノーマである。
【００１７】
「血管性の」及び「心血管性の」という語法は、相互交換可能に使用され、血管形成及び／又は心血管新生を刺激する徴候、及び血管形成及び／又は心血管新生を阻害する徴候を持つ患者を記述する。このような疾患には、例えば、アテローム性動脈硬化、高血圧、炎症性脈管炎、レーノー病及びレーノー現象、動脈瘤、及び動脈再狭窄などの動脈の病気；血栓静脈炎、リンパ管炎、及びリンパ浮腫などの静脈及びリンパ管の疾患；及び他の血管疾患、例えば、末梢血管病、血管腫瘍、血管腫(毛細管及び海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫及びリンパ管肉腫、腫瘍血管形成などの癌、創傷、火傷、及び他に損傷を被った組織などの外傷、移植固定、瘢痕化、虚血再潅流傷害、慢性関節リュウマチ、脳血管の病気、急性腎不全などの腎臓病、及び骨粗鬆症が含まれる。また、狭心症、急性心筋梗塞などの心筋梗塞、心肥大、及びうっ血性心不全（ＣＨＦ）などの心不全も含まれる。
「糖尿病」という用語は、インスリンの不適当な生産又は利用を含む糖質代謝の進行性疾患を示し、高血糖及び糖尿により特徴付けられる。この用語は、例えば、Ｉ型及びＩＩ型及びインスリン耐性糖尿病、例えば、メンデンホール症候群、ウェルナー症候群、妖精症（leprechaunism）糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、及び他の脂肪萎縮など全ての形態の糖尿病を含む。
「アフィニティー精製された」という用語は、アフィニティークロマトグラフィーカラムを通して溶出することにより物質を精製することを示す。
【００１８】
Ｂ．本発明の実施態様
ここに記述されるアッセイは以下のステップを利用する複数サイトイムノアッセイである。
第一のステップ
ここでのアッセイの第一ステップにおいて、生物学的試料は、固定化された捕獲（又はコート）試薬と接触され、共にインキュベートされるが、捕獲試薬はＶＥＧＦに対して誘導された抗−ＶＥＧＦモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体である。これらの抗体は何らかの動物種に由来するが、好ましくは、モノクローナル抗体はマウス又はラットモノクローナル抗体で、さらに好ましくはマウスで、最も好ましくはMAb 3.5F8(Rodriguez等, 上掲（1998)）であって、ポリクローナル抗体は抗−ウサギ又は抗−ヤギ抗体、さらに好ましくは抗−ウサギである。さらに、ポリクローナル抗体は、好ましくは、バックグラウンドを減少させるためにアフィニティー精製されたものである。従って、特定の好ましい実施態様において固定化されたモノクローナル抗体はマウスモノクローナル抗体で、最も好ましくはMAb 3.5F8、及び固定化されたポリクローナル抗体がアフィニティー精製ウサギ抗体である。固定化された捕獲試薬は、それらが固定化される前に共に混合される。通常、固定化は、アッセイ手順前に、水に不溶なマトリクスもしくは表面への吸着（米国特許第３，７２０，７６０号）又は非共有結合性もしくは共有結合性の共役により（例えば、米国特許第３，６４５，８５２号又はRotmans等, J. Immuno. Methods 57:87-98 (1983)中に記述されるように、硝酸及び還元剤などの試薬による担体の事前の活性化を伴う又は伴わない、グルタルアルデヒド又はカルボジイミドのクロスリンクを用いて）、或いはアッセイの後、例えば、免疫沈降法などの方法により、捕獲試薬を不溶化することにより達成される。
【００１９】
固定化に使用される固相は、実質的に水に不溶性でイムノメトリック（immunometric）アッセイにおいて有用な不活性な担体又はキャリアの何れかで、例えば、表面、粒子、多孔性マトリクスなどの形態の担体を含む。通常使用される担体の例には、小さなシート、セファデックス、塩化ビニル、プラスチックビーズ、及びポリエチレン製、ポリプロピレン製、ポリスチレン製のアッセイプレート又は試験管、及び９６−ウェルマイクロプレートを含む同等なもの、並びにろ紙、アガロース、クロスリンクデキストラン、及び他の多糖類などの粒子性物質が含まれる。あるいは、臭化シアンにより活性化された糖質などの反応性を有する水に不溶なマトリクス、及び米国特許第３，９６９，２８７号；３，６９１，０１６号；４，１９５，１２８号；４，２４７，６４２号；４，２２９，５３７号；及び４，３３０，４４０号中に記述される反応性基質は、捕獲試薬の固定化に適切に用いられる。好ましい実施態様において、固定化される捕獲試薬はマイクロタイタープレート上にコートされ、特に、使用されるのに好ましい固相は、一度に幾つもの試料を分析するために使用し得るマルチウェルマイクロタイタープレートである。最も好ましくは、Nune Maxisorb又はImmulonとして販売されるようなマイクロテスト９６−ウェルエライザプレートである。
【００２０】
固相は、上述したようにプレミックスされた捕獲試薬でコートされ、非共有結合又は共有結合的相互作用又は所望の物理的な結合により連結される。吸着のための技術には、米国特許第４，３７６，１１０号及びこの中の引用文献中に記述されるものが含まれる。共有結合の場合、プレート又はその他の固相は、室温で１時間など当該技術分野において周知の条件下で捕獲試薬と共にクロスリンク剤とインキュベートされる。
一般に、プレミックスされた捕獲試薬を固相基質へ吸着させるために用いられるクロスリンク剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシニミジルプロピオン酸）などのジスクシニミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１．８−オクタンなどの二官能性マレイミドを含む。メチル−３−[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミド酸塩などの誘導体薬剤は、光の存在下においてクロスリンクを形成することができる光活性化可能中間体を産生する。
【００２１】
９６−ウェルプレートが利用される場合、それらは好ましくは捕獲試薬の混合物でコートされる（典型的には、0.05Ｍ 炭酸ナトリウムなどのバッファー中で、少なくとも約１０時間、より好ましくは少なくとも一晩、約4-20℃で、より好ましくは約4-8℃、及び約8-12のｐＨ、より好ましくは約9-10及び最も好ましくは約9.6におけるインキュベーションにより希釈される）。さらに短いコート時間（1-2時間）が望ましい場合、ニトロセルロースフィルターの底面を有する９６−ウェルプレート（Millipore MULTISCREENTM）を使用するか又は３７℃でコートすることができる。プレートは、アッセイ自体に先んじて長期間積み重ねて保存し、コートされていてもよく、その後、アッセイは手動、半自動、又はロボットを使用することによる自動的な形式で幾つかの試料に対し同時に実施され得る。
次に、典型的には、コートされたプレートは、フリーなリガンドのプレートウェル上の過剰な部位に対する不要な結合を防ぐために、結合部位に非特異的に結合させ、飽和させるブロッキング剤で処理される。この目的に対し適当なブロッキング剤の例には、例えば、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、卵アルブミン、カゼイン、及び脱脂ミルクなどが含まれる。典型的には、ブロッキング処理は外界温度の条件下で1-4時間、好ましくは約1.5から３時間行われる。
【００２２】
コート及びブロッキングの後、適切に希釈されたＶＥＧＦ標準物質（精製ＶＥＧＦ）又は分析される生物学的試料は固定化相へ添加される。好ましい希釈率は、体積にして約5-15％で、好ましくは約10％である。この目的に対する希釈のために使用されてもよいバッファーは、（a）0.5 % BSA, 0.05 % TWEEN20TM界面活性剤（P20), 0.05 % PROCLINTM300抗生物質, 5 mM EDTA, 0.25 % Chaps界面活性剤, 0.2 % β-ガンマグロブリン, 及び0.35 M NaClを含むPBS；(b)0.5 % BSA, 0.05 % P20, 及び0.05 % PROCLINTM300 を含むPBSでpH7；(c)0.5 % BSA, 0.05 % P20, 0.05 % PROCLINTM300, 5 mM EDTA, 及び0.35 M NaClを含むPBSでpH6.35；(d)0.5 % BSA, 0.05 % P20, 0.05 % PROCLINTM300, 5 mM EDTA, 0.2 % β-ガンマグロブリン, 及び0.35 M NaClを含むPBS；及び(e)0.5 % BSA, 0.05 % P20, 0.05 % PROCLINTM300, 5 mM EDTA, 0.25 % Chaps,  及び0.35 M NaClを含むPBS、を含む。バッファー(c)は、各標準物質相互間を最も良好に区別する他、最大のシグナル−対−ノイズ比を持つため、ここでのアッセイに対して好ましいバッファーである。PROCLINTM300は保存剤として作用し、TWEEN20TMは非特異的な結合を除去するために界面活性剤として作用する。バッファー(c)に添加されたEDTA及び塩は、バッファー(b)を含む他のバッファーよりもバックグラウンドを減少させるように作用する。
【００２３】
捕獲試薬（ポリクローナル抗体に対するモノクローナル抗体の比）の重量比は、好ましくは約0.8：1から約1.2：1であり、より好ましくは約1：1である。用いられる捕獲試薬の量は、ＶＥＧＦ標準物質と比較して良好なシグナルを与えるのには十分な量であるが、試料中の予想される内在性のＶＥＧＦレベルの最大量に比較して過剰なモル濃度ではない。十分な感度を得るためには、添加される生物学的試料の量は、固定化された捕獲試薬が、試料の適切な希釈後の生物学的試料中に予測される遊離のＶＥＧＦの最大モル濃度より過剰なモル濃度であるのが好ましい。この予測レベルは、主として、分析される特定の生物学的試料中の遊離ＶＥＧＦの濃度レベルと患者の臨床症状との間における何かの既知の相関に依存する。従って、例えば、癌患者は、彼らの血清中にかなり高い最大予想濃度の遊離ＶＥＧＦを有するのに対し、正常な子供又は成人は、より低いレベルの遊離ＶＥＧＦをその血清中に有することが文献上既知の事項に基づいて予想されるであろう。
しかし、過剰な捕獲試薬が存在する場合、捕獲試薬は、結合されたＶＥＧＦに対し、生物学的試料中に存在する抗−ＶＥＧＦと競合し、不正確な結果を生む。従って、一般に、捕獲試薬の濃度は、生物学的試料の必要な希釈を考慮にいれたＶＥＧＦの対象の濃度範囲により決定され、捕獲試薬の最終濃度は、一般に対象の範囲においてアッセイ感度を最大にするために経験的に決定されるであろう。しかしながら、一般的な指針として、過剰モル濃度は、試料の適当な希釈の後、生物学的試料中の遊離ＶＥＧＦの予想される最大モル濃度の約１０倍未満で適当である。最も好ましくは、固定化されたモノクローナル抗体の量は約0.4μg/mlあり、固定化されたポリクローナル抗体の量は、約0.4μg/mlである。
【００２４】
試料及び固定化された捕獲試薬のインキュベーション条件は、アッセイの感度を最大にし、解離を最小にするように選択される。好ましくは、インキュベーションは、約0℃から約40℃の範囲内であり、好ましくは、例えば室温に比べより変動せずより低い変異係数を得るために、約36℃から38℃で、完全に一定の温度で達成される。インキュベーションの時間は、第一に温度に依存し、感度の悪いアッセイを避けるために一般に約１０時間を超えない。好ましくは、インキュベーション時間は、約0.5から３時間であり、より好ましくは遊離ＶＥＧＦの捕獲試薬に対する結合を最大にするために36-38℃で1.5-3時間である。生物学的体液中でタンパク質分解酵素がＶＥＧＦを分解することを妨げるために、タンパク質分解酵素阻害剤が添加される場合、インキュベーションの持続時間はさらに長くてもよい。
この段階で、インキュベーション混合物のpHは、通常、約6-9.5の範囲内であり、好ましくは約6-7の範囲内、より好ましくは6.0-6.5の範囲内、最も好ましくはアッセイ（エライザ）希釈液のpHが6.35±0.1である。pH4-5のように酸性pHはＶＥＧＦの回収率を減少させた。インキュベーションバッファーのpHは、捕獲されるべきＶＥＧＦに対する捕獲試薬の特異的な結合の有意なレベルを維持するために選択される。このステップ間、種々のバッファーが所望のpHを達成及び維持するために使用されるが、それらにはホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス塩酸塩又はトリスリン酸塩、酢酸塩、バルビタール、及び類似のものが含まれる。使用される特定のバッファーが、本発明にとって重要というわけではないが、個々のアッセイにおいて使用されるバッファーがその他のバッファーより好ましいほうがよい。
【００２５】
第二のステップ
ここでのアッセイ方法の第二のステップにおいて、生物学的試料は、捕獲されなかったＶＥＧＦを除去するために、固定化された捕獲試薬から分離（好ましくは洗浄により）される。一般に、洗浄のために用いられる溶液は、考慮すべき事項により決定されるpHを持つバッファー（洗浄バッファー）であり、約6-9の好ましいpHの範囲を持つインキュベーションのステップのための上述のバッファーである。洗浄は３回又はそれ以上行われる。一般に、洗浄温度は、冷蔵庫の温度レベルから中程度の温度範囲であり、アッセイの期間中維持される一定温度であって、典型的には約0-40℃、より好ましくは約4-30℃である。例えば、洗浄バッファーは洗浄前に貯蔵庫内4℃の氷中に置かれ、プレート洗浄機がこのステップで利用され得る。また、捕獲されたＶＥＧＦが後のステップにおいてある程度解離することに懸念がある場合は、結合したばかりのＶＥＧＦが捕獲試薬に共有結合的に接着されることを可能にするために、クロスリンク剤又は他に適する薬剤がこの段階で添加されてもよい。
【００２６】
第三のステップ
次のステップでは、正確な温度及び使用される検出手段に主として依存する二物質を接触させるための時間を用いて、固定化された捕獲試薬を検出可能抗体に接触させるが、好ましくは約20-40℃の温度、より好ましくは約36-38℃でにて行う。例えば、４−メチルアンベリフェリル−β−ガラクトシド(MUG)及びストレプタビジン-β-ガラクトシダーゼが検出手段として使用される場合、好ましくは、シグナルを最大に増幅させるために、接触は一晩行われる（例えば、約15-17時間又はそれ以上）。検出可能抗体がポリクローナル又はモノクローナル抗体の場合、好ましくは検出抗体はモノクローナル抗体であり、好ましくはマウス、最も好ましくはMAb A4.6.1である。また、好ましい検出可能抗体は直接検出可能であり、好ましくは蛍光定量的な標識を持つ。蛍光定量的な標識は従来の比色定量的な標識に比べてより高感度である。より好ましくは検出可能抗体はビオチン化され、検出手段はアビジン又はストレプタビジン-β-ガラクトシダーゼ及びMUGである。
好ましくは、予想される遊離ＶＥＧＦの最大濃度（上述）に対して過剰モル濃度の抗体が、洗浄後、プレートへ添加される。この抗体（直接的又は間接的に検出可能である）は、如何なる抗体も使用可能であるが、好ましくはポリクローナル抗体である。抗体の親和性は、少量の遊離ＶＥＧＦが検出されるべく十分に高くなくてはならないが、ＶＥＧＦが捕獲試薬から引き離されるほど高くはない。
【００２７】
第四のステップ
アッセイ方法の最終ステップにおいて、この時点で捕獲試薬に結合されている遊離ＶＥＧＦのレベルは検出可能抗体に対する検出手段を用いて測定される。生物学的試料が血管性、糖尿病、又は癌の患者由来である場合、好ましくは、測定のステップは、、上述の３つステップの結果生じる反応を、正常個体と比較してＶＥＧＦのレベルを決定するための標準曲線と比較することを含む。
【００２８】
抗体産生
一般に、ＶＥＧＦに対するポリクローナル抗体は、ＶＥＧＦとアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより、動物に産生される。免疫化されている種において免疫原性であるタンパク質、例えばスカシガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する結合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する結合)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ、を使用して、ＶＥＧＦ又は標的となるアミノ酸配列を含む断片を結合させることが有用である。ここでＲとＲ１は異なったアルキル基である。
コート抗体又は検出可能抗体として使用される抗体は、マウス、霊長類、ウサギ目の動物、ヤギ、ウサギ、ラット、チキン、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ又はブタなど何れか都合の良い脊椎動物から得られる。また、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)；Neuberger等, Nature 312:604 (1984)；Takeda等, Nature 314:452 (1985)；１９９８年１０月１５日発行の国際公開第９８/４５３３１号、並びに上述中に示される更なる文献中に記述されているように、キメラ又はヒト化抗体も使用され得る。
【００２９】
動物を、例えば、1mg又は1μｇのコンジュゲート（それぞれウサギ又はマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、免疫原性コンジュゲート又はその誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、不完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、血清が抗−ＶＥＧＦ力価についてアッセイされる。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、ＶＥＧＦのコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なったクロスリンク剤を介してコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。また、コンジュゲートはタンパク融合体として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。ポリクローナル抗体の生産方法は、Davis等によるMicrobiology, 3rd Edition, (Harper & Row, New York, New York,1980)などの多くの免疫学のテキスト本に記述されている。
モノクローナル抗体は、免疫化された動物から脾臓を回収し、定法により細胞を不死化し、例えば、ミエローマ細胞との融合又はエプステインバーウィルスの形質転換より調製され、所望の抗体を発現するクローンをスクリーニングする。Kofler及びMilstein, Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)を参照のこと。モノクローナル抗体、又はFab又は(Fab)2断片などのモノクローナル抗体の抗原結合領域は、二者択一的に組換え法により生産される。
好適な抗体の例には、目的のタンパク質に対して既知のＲＩＡｓにおいて既に利用されているもの、例えば本明細書の冒頭に記載した参考文献に記載されているようなＶＥＧＦに対する抗体が含まれる。
【００３０】
検出
固定化された捕獲試薬に添加される抗体は、直接標識されるか、又は過剰の一次抗体を洗い流した後、一次抗体の動物種のIgGに対して作製された標識化二次抗体の過剰なモル濃度を添加することにより間接的に検出されるであろう。後者の間接的アッセイの場合、一次抗体に対する標識化抗血清が、標識化された抗体をインサイツで生じるように試料に添加される。
一次又は二次抗体の何れかに使用される標識は遊離のＶＥＧＦの抗体への結合を干渉しない任意の検出可能な機能性を有する。適切な標識の例には、イムノアッセイにおける使用に関し既知の多くの標識であって、蛍光色素、化学発光、及び放射活性標識などの直接検出される成分、並びに、酵素など、検出されるべく反応し又は誘導体化された成分などが含まれる。このような標識の例は、放射性同位体である32P, 14C, 125I, 3H及び131I、希土類キレートなどのフルオロフォアー、又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、アンベリフェロン（umbelliferone）、例えばホタルルシフェラーゼ及びバクテリアルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）などのルシフェラーゼ、ルシフェリン、2.3-ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース-６-ホスフェートデヒドロゲナーゼなどのサッカライドオキシダーゼ、HRPなどの色素前駆体を酸化するためにハイドロジェンペルオキシドを使用する酵素とカップルされるウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなどのヘテロサイクリックオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプタビジン、MUGと共に用いるビオチン／ストレプタビジン-β-ガラクトシダーゼ、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカル、及び類似物質などである。上で述べたように、蛍光定量的検出が好ましい。
【００３１】
これらの標識を共有結合的にタンパク質又はポリペプチドと結合させるためには、従来の方法が利用できる。例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビス-イミデート、ビス-ジアゾ化ベンジジン、及びその類似物質などのカップリング剤が、上述の蛍光性、化学発光性、及び酵素的な標識で抗体をタグ化するのに用いられる。例えば、米国特許３，９４０，４７５号（蛍光定量法）及び３，６４５，０９０号（酵素法）；Hunter等, Nature 144:945 (1962)；David等, Biochemistry 13:1014-1021 (1974)；Pain等, J. Immunol. Methods 40:219-230 (1981)；及びNygren J. Histochem. and Cytochem. 30:407-412 (1982)を参照のこと。ここでの好ましい標識は、8 pg/ml濃度に対する増幅性及び感度を増大させる蛍光性を有し、さらに好ましくはシグナルを増幅するためのビオチン並びにストレプタビジン-β-ガラクトシダーゼ及びMUGである。
酵素を含むこのような標識の抗体への結合は、イムノアッセイ技術分野における当業者にとって、標準的な操作可能な方法である。例えば、O'Sullivan等, "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay", in Methods in Enzymology, ed. J.J.Langone 及びH. Van Vunakis, Vol.73 (Academic Press, New York, New York, 1981), pp147-166を参照のこと。
最終的な標識化抗体を添加した後、結合した抗体の量は、結合していない過剰な標識化抗体を洗浄により除去した後、標識に適した検出方法を用いて付着した標識の量を測定し、測定量を生物学的試料中の遊離ＶＥＧＦの量を関係づけることにより決定される。例えば、酵素法の場合、発色及び測定された呈色の量は、ＶＥＧＦの存在量の直接的な測定値となる。特に、HRPが標識である場合、呈色は、490nmの吸収における基質OPDを利用して検出される。
一例では、非標識一次抗体に対して作製された酵素標識二次抗体が固定化相から洗浄された後、呈色又は化学発光は酵素の基質と共に固定化された捕獲試薬とインキュベートすることにより発色され測定される。その後、遊離ＶＥＧＦ濃度の量は、平行して行われる標準物質ＶＥＧＦによる呈色又は化学発光と比較することにより計算される。
【００３２】
キット
都合上、本発明のアッセイ方法はキットの形式で提供され得る。このようなキットは以下の基本的な成分を含んだ組合せで包装される：
（a）ポリクローナル抗体に対するモノクロール抗体の重量比が0.8：1から1.2：1で、ヒトＶＥＧＦ分子に対するポリクローナル及びモノクローナル抗体で構成され、モノクローナル抗体がＶＥＧＦ分子のＣ-末端に特異的に結合する捕獲試薬；及び
（b）ＶＥＧＦのＫＤＲ及びＦＬＴ１レセプター結合ドメインと結合する検出可能抗体（標識化又は非標識化）で構成される検出試薬。
これらの基本成分は上述部分にて定義されている。
好ましくは、キットはさらに捕獲試薬のための固体担体を含み、分離された成分として提供されか又は既に捕獲試薬が固定化されている。それ故、キット中の捕獲抗体は固体担体上に固定化され、又はキットに含まれるか若しくはキットとは別に提供されるような担体上に固定化される。好ましくは、捕獲試薬はマイクロタイタープレート上にコートされる。検出可能試薬は、直接検出される標識化抗体、又は異なる動物種で産生された非標識抗体に対する標識抗体により検出される非標識抗体である。標識が酵素である場合、通常、キットは基質と酵素に必要とされるコファクター含み、標識は検出可能な発色団を提供する色素前駆体のフルオロフォアーである。検出試薬が非標識の場合、キットはさらに、非標識抗体に対して作製された標識化抗体などの検出可能抗体に対する検出手段を含み、好ましくは蛍光定量的検出形式である。
【００３３】
好ましい特定の実施態様において、キット中のポリクローナル抗体に対するモノクローナル抗体の重量比は、約1：1であり、検出可能抗体はビオチン化マウスモノクローナル抗体、モノクローナル抗体はマウス又はラットであって、より好ましくはマウス、最も好ましくはMAb 3.5F8であり、ポリクローナル抗体はアフィニティー精製され、さらに好ましくはヤギ又はウサギ由来であって、最も好ましくはウサギであり、マウスモノクローナル抗体の量は0.4μg/mlであり、ウサギポリクローナル抗体の量は0.4μg/mlである。好ましくは、本キット中の捕獲試薬は固定化されている。また、好ましくは検出抗体はMAb A4.6.1である。
また、キットは典型的にはアッセイを実施するための説明書を含み、及び／又は抗原標準物質としてのＶＥＧＦ（例えば、精製ＶＥＧＦ、好ましくは組換体として生産されたＶＥＧＦ）、並びに安定化剤などの他の添加剤、洗浄及びインキュベーションバッファー、及びこれらと同種のものを含む。
ＶＥＧＦに対する標準物質の例は、Genentech, Inc., South San Francisco. Californiaから入手可能な哺乳類細胞中で生産された組換体ヒトＶＥＧＦである。
キットの構成成分は、アッセイの感度を実質的に最大化する試薬溶液濃度を提供するために適当に変動させた種々の試薬の相対量により、予め決定された量比で提供されるであろう。特に、試薬は、通常は凍結乾燥され、賦形剤を含み、溶解後、テスト試料と混合するために適切な濃度を有する試薬溶液を提供する乾燥粉末として提供される。
【００３４】
以下の実施例は、当該発明を実施するために現在知られている一実施態様を例示することが意図されるものであるが、本発明はこれらの実施例に限定されると見なされるものではない。全ての公開され及び特許化された引用文献は、ここに明らかに出典明示により取り込まれる。
実施例１
２．材料及び方法
２．１．試薬
大腸菌内で発現され精製された組換体ヒトＶＥＧＦ１６５（ｒｈＶＥＧＦ）（Genentech, South San Francisco, CA）は、標準物質及びコントロールとして使用された（以下で明示されるようにエライザの希釈液中に調製され、−70℃にて保存される）。ストレプタビジン-β-ガラクトシダーゼ（Strep-β-gal）はBoehringer Mannheim, W. Germanyから購入された；MUGはSigma, St Louis, MOから購入された。ジメチルスルホキシド（DMSO）はSigmaから購入された。
２．２．ＶＥＧＦに対する抗体
ｒｈＶＥＧＦ１６５に対する抗体はKim等, Growth Factors, 7:53 (1992)中に記述されるように調製された。簡単に述べると、BALB/cマウスはキーホールリンペットヘモシアニンが結合されたｒｈＶＥＧＦ１６５の10 mg投与量で腹腔内に過剰免疫された。脾臓細胞はマウスミエローマ細胞株と融合され、ハイブリドーマを含むウェル由来の培養上清は、エライザによりｒｈＶＥＧＦ１６５に対するMAbsの存在についてスクリーニングされた。ポジティブなハイブリドーマが限界希釈法を用いて２回クローニングされた。本エライザで用いられたモノクローナル抗体はKim等, 上掲中において性質決定されていた。捕獲抗体の一つであるMAb 3.5F8はアミノ酸残基111-165で13 pMのKdを持つヘパリン結合ドメインの近くに結合すると考えられる。Rodriguez等, 上掲(1998)。
【００３５】
他のコート抗体として使用されるウサギポリクローナル抗体(PAb)は、標準的な手法を用いてウサギにＶＥＧＦを注射することにより作製され、ポリクローナル抗体を捕獲するためにＶＥＧＦが結合されたアフィニティーカラムに通し、試料中のイムノグロブリンを除去することにより精製された。所望の抗体以外の分子は洗浄され、結合された抗体は0.2 M グリシン, pH2で溶出され、その後pHが中和された後、4℃で一晩、PBS中で透析され、抗体を含む溶出液は複数サイトアッセイに使用された。
検出抗体であるMAb A4.6.1は86 pMのKdでｒｈＶＥＧＦと結合する。幾つかの証拠により、このMAbはＫＤＲレセプター結合領域の近くでｒｈＶＥＧＦと結合することが示唆される（Kim等, 上掲 (1992)）。
２．３．MAb A4.6.1のビオチン化
MAb A4.6.1は、以下の方法に従いビオチニルアミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（Biotin-X-NHS）（Reserch Organics. Cleveland. OH）でビオチン化された。MAb A4.6.1は、100 mM NaHCO3, pH8.5に対して一晩2-8℃で透析された。ビオチン：MAbの割合を1：10（w/w）で使用し、DMSO中の5 mg/ml Biotin-X-NHS溶液の全60μlを、MAb（透析後2-10 mg/mlの濃度に調製された）に添加した。この混合物は、外界温度下で穏やかに撹拌しながら２時間インキュベートし、反応は5μlのエタノールアミンを添加することで停止した。コンジュゲーション後、抗体は2-8℃で穏やかに撹拌しながらPBSに対して大規模に透析され、PBSは２時間毎に計3回交換した。
【００３６】
２．４．複数サイトＶＥＧＦエライザ
上述の２つのMAb、3.5F8（コート）とビオチン化A4.6.1（検出）及び１つのPAb（コート）は、特異的かつ高感度なＶＥＧＦエライザを開発するために使用された。本エライザにおいて、MAb 3.5F8及びアフィニティー精製のPAb各々100 μl／ウェルが共に混合され、MaxiSorpTM96-ウェルマイクロプレート（Nunc. Roskilde, Denmark）に0.05 M 炭酸ナトリウム, pH9.6中、各0.4 μg/mlの濃度で添加された。2-8℃において24-74時間のインキュベーションの後、コートされたプレートはBIOTEK EL304TMプレート洗浄機（Biotek Instruments, Winooski, VT）を用い400μlのエライザ洗浄バッファー（0.05%TWEEN-20TM界面活性剤を含むPBS）で3回洗浄され、200μl／ウェルのエライザブロッキング希釈液（0.5% BSA, 0.05% TWEEN-20TM,  及び0.05% PROCLINTM300抗生物質を含むPBS, pH7.2）で撹拌しながら外界温度下にて1-3時間ブロッキングされた。ブロッキングの後、再度400μlのエライザ洗浄バッファーでプレートが３回洗浄された。その後、100μl／ウェルの標準物質、試料、又はコントロールが二組のウェルに添加され、1.5-2時間、37℃で撹拌しながらインキュベーションされた。ヒト血漿中のｒｈＶＥＧＦ１６５定量について、標準曲線はエライザ希釈液（0.5% BSA, 0.05% TWEEN-20TM,  0.05% PROCLINTM300, 5 mM EDTA, 及び0.35 M NaCl, pH6.3±0.1を含むPBS）中で調製された。標準曲線は128 pg/mlを2 pg/mlまで1：2に連続的に希釈したものであった。試料／標準物質のインキュベーション後、プレートは400μlのエライザ洗浄バッファーで6回洗浄され、エライザ希釈液で1：200の比で至適濃度に新しく希釈されたMAb A4.6.1−ビオチン、100μl／ウェルがプレートへ添加された。撹拌しながら37℃で1.5-2時間インキュベーション後、プレートは上述のように6回洗浄され、エライザ希釈液で1：40Kに希釈されたstrept-β-galの100μl／ウェルがプレートに添加された。撹拌しながら37℃で45-60分間インキュベーション後、プレートは上述のように6回洗浄され、1 mM MgCl2を含みpH7.3±.01の0.1 M NaPO4溶液で340μg/mlに新しく希釈されたMUG/DMSO（1/100）の100μl/mlがプレートに添加された。基質との反応は、遮光状態（プレートはホイルで包まれた）で撹拌しながら37℃で15-17時間インキュベートされた。反応は150μl/ウェルの0.15 M グリシン、pH10.5±0.1を添加することにより停止された。ウェル内の含有物の蛍光単位（FSU）は、360 nmの励起及び460 nmの発光フィルターを用いてCYTOFLUOR 4000TM蛍光プレートリーダー(PerSeptive Biosystems, Framingham, MA)で読み取られた。4変数曲線適合プログラムは標準曲線を作成するのに使用され、それにより試料及びコントロールの濃度が補間された。150μlのグリシンが添加された後、FSUの読みは、室温にて少なくとも30分間安定であった。
【００３７】
２．５．ヒト血漿試料
ヒト血漿中のＶＥＧＦを正確に測定する能力が、幾つかのアプローチを用いて評価された。アッセイ感度及び性能における血漿の影響はｒｈＶＥＧＦ１６５を用いて評価された。ｒｈＶＥＧＦ１６５の既知の量は、個々の血漿試料に添加され、回収されたパーセントが以下のように決定された：（１）対応する試料から決定される試料中の内在性ＶＥＧＦの量は、試料中で測定されたＶＥＧＦの全量から差し引かれた。（２）次に、「回収された」ＶＥＧＦの値は試料中に添加されたＶＥＧＦの量で除され、100倍された。また、個々のヒト血漿に添加されたｒｈＶＥＧＦ１６５の希釈直線性も評価された。これらの研究において、ｒｈＶＥＧＦ１６５添加の後、各血漿試料はエライザ希釈液で1：10に希釈され、次いでエライザ希釈液で連続的に1：2に希釈された。高マトリクス及び低マトリクス（標準）コントロールは、ニート（neat）ヒトEDTA血漿（凍結標品）中で調製された。それらは、エライザ希釈液中で最終濃度10%の血漿となるように、1/10に希釈された。
内在性のＶＥＧＦレベルは個々のヒト血漿試料で測定された。正常で健常な個人の血液は、15％K3EDTAのバキュテイナーチューブ（Becton Dickenson, San Jose,CA）に引き込まれた。チューブは2000 x gで20分間遠心され、血漿が回収される。血漿試料は、アッセイに使用するためエライザ希釈液で1：10に希釈された。また、選択された試料における内在性ＶＥＧＦの希釈直線性も上述のように評価された。
【００３８】
３．結果
３．１  試料安定性
ニートヒトEDTA血漿の安定性が、３回の凍結−解凍のサイクルに対して検討された。ドライアイスで処理された血漿は、凍結するため温水中で穏やかに混合された。以下の表１は、凍結−解凍処理後のＶＥＧＦの定量について有意な影響はないことを示す。従って、ヒトＥＤＴＡ血漿は３回の凍結−解凍サイクルに対して安定である。
【００３９】
0004620312.tif 000002
【００４０】
３．２  検出の限界
ここでは複数サイトＶＥＧＦエライザにおいて、ブランクについておおよそ２０回の複製であって、1，2，4及び8 pg/mlの標準をアッセイした。検出限界は、その測定された平均ＦＳＵ応答値から２の標準偏差を差引いた値が、ブランクの蛍光発光（460  nm）の平均ＦＳＵ応答値に２の標準偏差を加えた値よりも大きくなる、分析物（ＶＥＧＦ）濃度によって決定した。表２の結果は、検出限界がエライザ希釈液中で8 pg/mlであることを示す。血漿試料は、マトリクスの干渉を最小にするために、典型的には1：10での希釈であるため、80 pg/mlまたは1.6pM程度のＶＥＧＦを元の試料中において測定することができる。
【００４１】
0004620312.tif 000003
【００４２】
３．３  抗−ＶＥＧＦ PAbのテスト及び調製
同一のウサギではあるが異なる採血に由来する、ｒｈＶＥＧＦに対する精製されたウサギポリクローナル抗体の２つ異なる標品を、アッセイ中、モノクローナル抗体としてMAb 3.5F8を用い、各タイプの抗体を0.4μg/ml濃度で用いて比較した。Ｆｉｇ．１に示される結果は、両抗体とも使用に適することを示す。
ウサギポリクローナル抗体の溶出は、まずグリシンで行い、その後グアニジンで行い、得られた抗体はここで示す好ましい条件で用いられた。Ｆｉｇ．２及びＦｉｇ．３の結果は、２つの溶出方法に有意な差が見られないことを示す。しかし、グリシン溶出は、僅かにより感度に優れるようにみえる。正常ヒトＥＤＴＡ血漿試料、並びに高マトリクス及び低マトリクスコントロールの比較は両試料において同様な定量化を示す。グアニジンのピークはグリシンのピークに比べ、より強くＶＥＧＦに結合される。
【００４３】
0004620312.tif 000004
【００４４】
３．４  堅牢性／耐久性
相互アッセイ（Inter-assay）及び内部アッセイ（Intra-assay）の正確さが、ANOVA統計分析によって低マトリクスおよび高マトリクスコントロールに対して評価された。マトリクスコントロールは、アッセイ範囲内に入る低濃度及び高濃度のｒｈＶＥＧＦをニートヒトＥＤＴＡ血漿中にスパイクすることにより調製された。相互アッセイの可変性（ＣＶ）は11-17%の範囲に及び、また、内部アッセイの可変性は8-14%の範囲に及ぶ。データは表４にまとめる。
【００４５】
0004620312.tif 000005
0004620312.tif 000006
【００４６】
３．５  フック効果
過去の幾つかの試料において、試料の希釈の増大に伴い、測定されるＶＥＦＧの増加に関する非直線性が示された。従って、フック効果（１サイト及び２サイトエライザの並行比較）についてここで示す複数サイトエライザをテストした。ｒｈＶＥＧＦは、16 ng/mlから1 pg/mlまでアッセイバッファーで希釈した。結果（ＦＩＧ．３に示す）はＶＥＧＦの定量において有意な低下は起こらないことを示す。しかし、わずかな低下及びプラトー化効果が、512 pg/mlから前方に向かって見られる。ここに開示の複数サイトエライザで使用される試料の希釈は、128 pg/ml以下の濃度を生じさせるため、フック効果は影響しない。
【００４７】
３．６  コートの最大化
コートの最大化を決定する方法は、PAb又はMAb 3.5F8のコート濃度が変動すること以外は、上述の方法と同一であった。特に、Ｆｉｇ．４では、ポリクローナル抗体の濃度（1μg/ml）を一定に保ちながらMAb 3.5F8の濃度を0.4から4μg/mlで変動させ、Ｆｉｇ．５及び表５では、MAb 3.5F8の濃度（0.4μg/ml）を一定に保ちながら、ポリクローナル抗体の濃度を0.4から4μg/mlで変動させた。
他のコート抗体が一定濃度で、MAb 3.5F8及びPAbの0.1及び0.4μg/mlの濃度は、低コントロール及び高コントロールに対するVEGFの定量において実質的に同一である一方、コート濃度（例えば、0.4μg/ml）の上限は、ＶＥＧＦが捕獲されるより優れたチャンスに対して好ましい。PAb及びMAb 3.5F8の1μg/ml濃度は、各場合において測定されるＶＥＧＦの量を増加させる一方、そのような濃度は、高いバックグラウンドも与える。従って、結果は、両捕獲試薬に対する好ましい濃度が約0.4μg/mlであることを示す。
【００４８】
0004620312.tif 000007
【００４９】
３．７  複数サイトＶＥＧＦエライザのｐＨプロフィール
アッセイバッファーのｐＨの変化が正常ヒトＥＤＴＡ血漿中のＶＥＧＦの回収を増加させるのか又は減少させるのか決定するために、ｐＨのプロフィールが実施された。ｐＨの変化は、結合タンパク質又は他の複合体を解離させるが、その場合、MAb A4.6.1の検出を妨害するであろう。
アッセイのｐＨプロフィールを調べる方法は、試料のインキュベーション及びビオチンのインキュベーションに関しアッセイバッファーが水酸化ナトリウム又は塩酸を用いて調製され、その結果pH4から9の範囲のアッセイバッファーが生じるということを除いて、上述の方法の項で記述された方法と同様であった。標準曲線、低マトリクス及び高マトリクス、及び４つの正常ヒトＥＤＴＡ血漿試料が、これらの変動するｐＨを持つアッセイバッファーを用いて行われた希釈から評価された。
Ｆｉｇ．６及び表６の結果は、pH4及び5においてＶＥＧＦは回収されなかったことを示す。しかし、pH6から9では、測定可能な範囲においてアッセイコントロールに対し良好なＶＥＧＦ血漿の回収率が明らかになった。アッセイバッファーのｐＨを6から9に変動させた結果、ＶＥＧＦの定量における有意な差は存在しなかった。しかし、好ましいアッセイバッファーは約6.35±.01のｐＨを持つバッファーの１つであり、その結果、ＶＥＧＦの結合が最大となり、アッセイの全ての希釈段階に対して妥当である。
【００５０】
0004620312.tif 000008
【００５１】
３．８  希釈直線性
約85pg/mlのｒｈＶＥＧＦが、ニートヒトＥＤＴＡ血漿にスパイクされ、1/10, 1/20, 1/40,及び1/80に連続的に希釈され、解析された。結果は、表７及びＦｉｇ．７において、ＥＤＴＡ血漿中にスパイクされたｒｈＶＥＧＦが、予想される濃度に対して0.996の相関係数を持つ直線的な相関を示したことを表す。逐次の連続的な希釈に対して決定される希釈濃度値と補正値の差の割合（％）は、表７に示すように19％±7.5の値を超えなかった。
【００５２】
0004620312.tif 000009
【００５３】
３．９  ヒト血漿中のＶＥＧＦの定量における正確さ
内在性のＶＥＧＦレベルは、幾人かの健康な個人から新しく収集された血漿について測定された。個々のヒトＥＤＴＡ血漿試料は、標準曲線のアッセイ範囲に入るように、最も低い、低い、中濃度及び高い濃度のｒｈＶＥＧＦでスパイクされた。内在性のＶＥＧＦ濃度が決定され、標的のスパイクに対して比較するために測定濃度から差引かれた。表８の結果は、高い濃度、中濃度の濃度、低い濃度、及び更に低い濃度のスパイクについて、各々、平均の％回収率が99％、113％、106％及び118％であったことを示す。
【００５４】
0004620312.tif 000010
【００５５】
３．１０  正常ラットＥＤＴＡ血漿中のＶＥＧＦの定量における正確さ
個々の及び２匹がプールされたオスのラットＥＤＴＡ血漿試料は、標準曲線のアッセイ範囲に入るように、低い、中濃度及び高い濃度のｒｈＶＥＧＦでスパイクされた。内在性のＶＥＧＦ濃度が決定され、標的のスパイク（希釈コントロール）に対して比較するために測定濃度から差引かれた。その後、スパイクは、希釈直線性を決定するためにエライザ希釈液で1：2に希釈された。表９の結果は、高い濃度、中濃度の濃度及び6.25 pg/mlを超える低い濃度のスパイクについて、平均パーセント回収率は、84％から103％の範囲であることを示す。
【００５６】
0004620312.tif 000011
【００５７】
３．１１  エライザ希釈液中の正常ラットＥＤＴＡ血漿の直線性
ラットＥＤＴＡ血漿（２匹のプールされたオス及び１個体）は、希釈直線性に関して試験された。ニート血漿試料は、低い（20 pg/ml）、中濃度（44 pg/ml）及び高い濃度（98 pg/ml）のｒｈＶＥＧＦでスパイクされ、エライザ希釈液中で1/10, 1/20, 1/40及び1/80に連続的に希釈された。表１０及びＦｉｇｓ．８Ａ−８Ｃの結果は、8から128 pg/mlのアッセイ範囲内における最小1/20希釈に従い、正常ラット血漿試料は直線的に希釈されることを示す。
【００５８】
0004620312.tif 000012
【００５９】
３．１２  正常ヨークシャー豚ＥＤＴＡ血漿中のＶＥＧＦの定量における正確さ
８頭のヨークシャー豚ＥＤＴＡ血漿試料（４頭のオスと４頭のメス）は、標準曲線のアッセイ範囲に入るように、低い、中濃度及び高い濃度のｒｈＶＥＧＦでスパイクされた。内在性のＶＥＧＦ濃度が決定され、標的のスパイク（希釈コントロール）に対して比較するために測定濃度から差引かれた。その後、スパイクは、希釈直線性を決定するためにエライザ希釈液で1/10, 1/20, 1/40, 1/80に希釈された。その結果、Ｆｉｇ．９Ａ（メス）及びＦｉｇ．９Ｂ（オス）、及び表１１において、8から128 pg/mlのアッセイ範囲内における最小1/20希釈に従い、正常ラット血漿試料は直線的に希釈されることを示す。
【００６０】
0004620312.tif 000013
【００６１】
３．１３  ３種類のエライザを用いた種々の形態のＶＥＧＦの検出
本実験は、ここに開示の複数サイトエライザが全ての形態のＶＥＧＦを測定できるかどうかを決定するために計画された。Ｆｉｇ．１０Ａ、１０Ｂ及び１０Ｃは、各々ＶＥＧＦに対する単一サイト、２サイト、及び複数サイトエライザの比較を示す。これらのグラフを比較することにより、ここに開示の複数サイトアッセイより多くのＶＥＧＦ変異体を捕獲できることが理解される。
【００６２】
３．１４  ２サイト、複数サイト、又はコートとしてPAbを用いた検出
コート抗体としてPAb及びMAb 3.5F8を用いたここに開示の複数サイトエライザが、正常ヒト試料中のＶＥＧＦ量を評価するためにコート抗体としてMAb 3.5F8又はPAbのみを用いたエライザと比較された。その結果、表１２に示すように、pg/mlで検出されたＶＥＧＦの量は、PAb単独又はMAb 3.5F8単独のアッセイに対してより、複数サイトアッセイに対する値の方が高かったことを示す。
【００６３】
0004620312.tif 000014
0004620312.tif 000015
【００６４】
３．１５  ２サイト及び複数サイトエライザを用いた、正常ヒト血漿及び正常ヒト血清におけるＶＥＧＦレベルの比較
正常ヒトドナー由来の血漿及び血清試料が、捕獲抗体としてMAb 3.5F8及び検出抗体としてPAb A4.6.1を用いた２サイトエライザ、及びPAb及びMAbを用いたここに開示の複数サイトアッセイ及び方法の項で記述された方法を用いたここに開示の複数サイトエライザにより分析された。血漿及び血清に関して各々Ｆｉｇ．１１Ａ及びＦｉｇ．１１Ｂにおいて要約されるように、結果は、ここに開示の複数サイトアッセイは、２サイトアッセイに比べて両タイプ試料中におけるより多くのＶＥＧＦを検出すること示す。
【００６５】
３．１６  単一サイト、２サイト及び複数サイトエライザを用いた、正常及び心臓病患者におけるＶＥＧＦレベルの比較
ｔ−ＰＡ変異体であるTNKの有効性を評価するためにGenentech, Incが後援する臨床試験に登録された正常ヒトドナー及び心臓疾患を持つドナーに由来する試料が、コート及び検出試薬としてMAb 3.5F8を用いた単一サイトエライザ、及び捕獲抗体としてMAb 3.5F8及び検出抗体としてMAb A4.6.1を用いた２サイトエライザ、及びPAb及びMAbを用いたここに開示の複数サイトアッセイ及び方法の項で記述された方法により分析された。Ｆｉｇ．１２は、全３アッセイを用いた心臓病患者における血漿ＶＥＦＧの量を示し、Ｆｉｇ．１３及び表１３は、２サイト及び複数サイトアッセイを用いた正常ヒト及び心臓病患者におけるＶＥＦＧの量を、ＶＥＦＧの平均量、標準偏差、％ＣＶ及びs.e.mによりまとめる。
【００６６】
0004620312.tif 000016
【００６７】
３．１７  ２サイト及び複数サイトエライザを用いた、肺癌患者における血清ＶＥＧＦレベルの比較
非小細胞肺癌腫患者由来の試料が、捕獲抗体としてMAb 3.5F8及び検出抗体としてMAb A4.6.1を用いた２サイトエライザ、及びPAb及びMAbを用いたここに開示の複数サイトアッセイ及び方法の項で記述された方法により分析された。Ｆｉｇ．１４に示されるように、結果は、ここに開示の複数サイトアッセイは、２サイトアッセイに比べて肺癌試料中においてより多くのＶＥＧＦを検出することを示す。
【００６８】
３．１８  糖尿病における血清ＶＥＧＦレベル
正常ヒト及びNIDDM(Ｉ型の糖尿病)及びIDDM(ＩＩ型糖尿病)患者における血清試料が、２サイトエライザ（コートとしてMAb 3.5F8及び検出試薬としてMAb A4.6.1）を用いて上述したように測定された。Ｆｉｇ．１５は、NIDDM及びIDDM患者における血清ＶＥＧＦレベルは、本アッセイを用いた場合正常患者よりも高かったことを示す。他の病気の患者において、複数サイトアッセイは２サイトアッセイより多くのＶＥＧＦを検出するので、ここに開示の複数サイトアッセイは糖尿病患者において上昇したレベルを検出するのに適しているということが期待されるであろう。
【００６９】
３．１９  複数サイトアッセイにおけるDNaseに対するPAbの特異性とＶＥＧＦに対するPAbの特異性との対比
２サイト及び複数サイトエライザが正常ヒト血漿試料について上述された方法で実施された。さらに、複数サイトアッセイはコートとしてＶＥＧＦに対するPAb以外にDNaseに対するPAbを用いて実施された。全てのアッセイにおいて0.4μg/mlの濃度であった。Ｆｉｇ．１６及び表１４は、複数サイトＶＥＧＦアッセイにより検出されたＶＥＧＦは特異的であることを示す。DNaseに対するPAb及びMAb 3.5F8を用いたエライザからの結果は、1.04の傾きを持ち（Ｆｉｇ．１６）、捕獲試薬としてMAb 3.5F8のみを用いたエライザの結果とほぼ同一の結果を示す。
【００７０】
0004620312.tif 000017
【００７１】
３．２０  好ましいアッセイ及び結果の要約
0004620312.tif 000018
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【００７２】
４．考察
成長、妊娠及び老年の期間又は病態生理学的な状態の正常個人において、ＶＥＧＦのレベル及び循環中の形態について知られていることはほとんどない。ここでは、ＶＥＧＦの種々のアイソタイプ及びヒト血漿中のそれらの濃度を測定可能な感度の良い、ハイスループットアッセイの開発及び性質決定について述べられる。本アッセイは正常個人及び種々の病態の両者におけるＶＥＧＦレベルを測定するための重要なツールを示す。
ここに開示の複数サイトＶＥＧＦ エライザは165/165、165/110、121/121及び110/110のＶＥＧＦ変異体を同等にうまく測定することができる。本アッセイに関して、より高い血漿ＶＥＧＦが正常ドナーにおいて検出された（192±68 pg/ml, n=50）。同様に、18人の心血管性患者において、正常ドナーより顕著に高い血漿ＶＥＧＦが検出された（279±157 pg/ml, n=18, p＜0.001）。Ｆｉｇ．１３を参照のこと。実際に、モノクローナル抗体MAb 3.5F8と不適当なタンパク質に対する抗体との組合せでは、MAb 3.5F8単独の場合以上のいかなる付加的なシグナルも生じさせなかった。無傷のＶＥＧＦ以外に他ＶＥＧＦ変異体及びアイソタイプが正常ドナー及び心血管性患者の循環血管系に存在することが結論付けられる。ＶＥＧＦのレセプター結合ドメインが結合のためにアクセス可能であることを示す能力は、循環中のＶＥＧＦの生物学的活性を理解するために意図されるいずれかのアッセイにとって重要な性質である。
【００７３】
エライザが正常個人における内在性ＶＥＧＦレベルを検出できるように、strep-β-gal/MUGなどの蛍光定量的な基質が、検出システムにおける使用に対して好ましい。本基質の使用及び最良のエライザ希釈液を決定することにより、より低いバックグラウンド吸光度を示す結果となり、アッセイ感度の増大を達成するために好ましい。
ここで記述された複数サイトエライザは、捕獲及び検出に使用される抗体の選択に依存して高い特異性を示す。コート抗体の一つであるMAb3.5F8は、ＶＥＧＦのヘパリン結合領域（残基111-165）の近くに結合し、他のコート抗体であるウサギポリクローナル抗体は、ＶＥＧＦに結合する。検出抗体であるMAb A4.6.1は、当該分子のKDRレセプター結合領域（残基1-110）に結合し、ＶＥＧＦに対する特異的なエライザを創り出す。
本複数サイトエライザの特異性は、ＶＥＧＦの生物学がより良く理解されるために重要となるであろう。Keyt等、上掲(p7788)中には、本研究で調べられた異なるＶＥＧＦ変異体が、インヴィトロにおいて種々の生物活性を有することが示された。また、アッセイの特異性に関する知見は、臨床データを評価し、検査室間でデータを比較することにおいて非常に重要となる。
【００７４】
発表された報告（Kondo等, 上掲 (1994);Takano等, 上掲(1996);Rodriguez等, 上掲）には、血清ＶＥＧＦレベルは癌患者において上昇していることが記述されている。固体腫瘍の進行における血管形成が一般的な現象であり、ＶＥＧＦの発現、腫瘍血管形成因子が様々な起源の広範な腫瘍細胞において観察されることを考慮すると、循環するＶＥＧＦのレベルを測定することは、固体腫瘍の広い領域に対する非浸潤性の診断マーカーとしての可能性を持つ。
結論として、ＶＥＧＦの多くの分子形態を測定する感度の良いエライザが開発された。本発明によると、モノクローナル抗体であるＣ-末端に特異的な抗体、及びポリクローナル抗体であるＶＥＧＦ全体に特異的な抗体であって好ましくはアフィニティー精製された、抗体がヒトＶＥＧＦに対して動物において作製された。これら２つの抗体は、マイクロタイタープレートなどの固体支持体上にコート抗体（固定化された捕獲試薬）として使用される。ヒトＶＥＧＦのKDR及びFLT1結合ドメイン領域に対して特異的であれば、検出のために使用される抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれかであり得る。
ここに記述されるような正確で感度の良いエライザは、様々な疾病の状態におけるＶＥＧＦレベルをを理解するの手助けとして重要であると判断される。正常個人及び病態生理学的な疾病状態の両者におけるＶＥＧＦのレベルとドミナントなアイソフォームの双方を十分に理解することは、正常及び病的な血管形成におけるＶＥＧＦの役割に関する知見を高めるであろう。
【００７５】
本発明はその特定の実施態様と関連して記述されたが、更なる変形が可能であり、当該出願は、一般に本発明の本質に従い、本発明が属する技術の範囲内の既知の又は慣行内で生じ、上述に示す本質的な特徴に対して適用され、添付の請求の範囲に従うような本開示からの逸脱を含む、本発明の如何なる変更、使用、又は適応をも網羅することが意図されることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【ＦＩＧ．１】ＦＩＧ．１は、ｒｈＶＥＧＦに対するアフィニティー精製されたウサギポリクローナル抗体の２つの異なる標品の比較を示す。四角は好ましい抗体を示し、丸は異なる採血（bleed）からの同じの抗体を表す。
【ＦＩＧ．２】ＦＩＧ．２は、ＶＥＧＦに対するアフィニティー精製されたウサギポリクローナル抗体のグアニジン溶出を用いた場合とグリシン溶出を用いた場合における、エライザの比較をここに示す。
【ＦＩＧ．３】ＦＩＧ．３は、３つの異なるＶＥＧＦエライザに対する典型的な標準曲線と、生じ得るフック効果との比較を示し、丸はコート及び検出試薬としてMAb 3.5F8のみを用いる１サイトアッセイ、四角はコートとしてMAb 3.5F8を、及び検出試薬としてMAb A4.6.1を用いる２サイトアッセイ、及びコートとしてMAb 3.5F及びアフィニティー精製されたポリクローナル抗体を、菱形は検出試薬としてMAb A4.6.1を用いる複数サイトアッセイを示す。
【ＦＩＧ．４】ＦＩＧ．４は、エライザにおいて0.4（丸）、1（四角）、2（菱形）、又は4（三角）μg/mlのモノクローナル抗体及び1μg/mlのアフィニティー精製されたポリクローナル抗体を使用する、モノクローナル抗体MAb 3.5F8コートの最大化を示す。
【ＦＩＧ．５】ＦＩＧ．５は、エライザにおいて0（丸）、0.1（四角）、0.4（菱形）、1（三角）、2（破線の逆三角）、又は4（実線の逆三角）μg/mlのアフィニティー精製されたポリクローナル抗体及び0.4μg/ml MAb 3.5F8を使用する、ウサギポリクローナル抗体の最大化を示す。
【ＦＩＧ．６】ＦＩＧ．６は、複数サイトＶＥＧＦエライザにおけるｐＨの影響をここに示し、丸はｐＨ４、四角はｐＨ５、菱形はｐＨ６、三角はｐＨ７、半線の菱形はｐＨ８、及び逆三角はｐＨ９を表す。
【ＦＩＧ．７】ＦＩＧ．７は、複数サイトＶＥＧＦエライザにおいて、ｒｈＶＥＧＦでスパイクされた６つの正常ヒトＥＤＴＡ血漿試料の希釈直線性について示す。
【ＦＩＧ．８】ＦＩＧ．８Ａ−８Ｃは、ｒｈＶＥＧＦでスパイクされた正常ラットＥＤＴＡ血漿試料の直線性を示すが、Ｆｉｇ．８Ａは高濃度スパイク示し、ＦＩＧ８Ｂは中濃度スパイクを示し、Ｆｉｇ．８Ｃは低濃度℃スパイクを示す。また、丸はラットのプール１、四角はラットのプール２、菱形はラット１である。
【ＦＩＧ．９】ＦＩＧ９Ａ−９Ｂは、各々、ｒｈＶＥＧＦでスパイクされた４頭のメス及び４頭のオスのヨークシャー豚ＥＤＴＡ血漿試料の直線性を示す。
【ＦＩＧ．１０】ＦＩＧ１０Ａ−１０Ｂは、１６５／１６５（丸）、１６５／１１０（四角）、１２１/１２１（菱形）、及び１１０／１１０（三角）のＶＥＧＦ形態に対する３つの異なるエライザアッセイの特異性を示す。Ｆｉｇ．１０Ａは、コート及び検出抗体としてMAb 3.5F8を用いた単一サイトエライザの特異性を示し、Ｆｉｇ．１０Ｂは、コートとしてMAb 3.5F8を、検出抗体としてMAb A4.6.1を用いた２サイト蛍光定量的ＶＥＧＦエライザアッセイの特異性を示し、Ｆｉｇ．１０Ｃは、コート抗体としてMAb 3.5F8とPAbを、検出抗体としてMAb A4.6.1を用いたここに開示の複数サイトＶＥＧＦエライザの特異性を示す。
【ＦＩＧ．１１】ＦＩＧ１１Ａ−１１Ｂは、各々、コート試薬としてMAb 3.5F8のみを用いた２サイトエライザと、コート試薬としてPAb及びMAb 3.5F8の両方を用いたここに開示の複数サイトエライザにより検出された正常ヒト血漿ＶＥＧＦ、及び血清ＶＥＧＦを示す。
【ＦＩＧ．１２】ＦＩＧ．１２は、ＦＩＧ．１０の説明文中で記述される全３種類のアッセイを用いて心臓病患者の血漿ＶＥＧＦの量を示すが、丸は単一サイトアッセイを表し、四角は２サイトアッセイを表し、三角は複数サイトアッセイを表す。
【ＦＩＧ．１３】ＦＩＧ．１３は、コートとしてMAb 3.5F8、検出抗体としてMAb A4.6.1を用いた２サイトアッセイ、又はコートとしてMAb 3.5F8及びアフィニティー精製されたポリクローナル抗体、検出抗体としてMAb A4.6.1を用いたここに開示の複数サイトアッセイを使用した、正常ドナー及び心血管性患者の血漿ＶＥＧＦレベルを示すが、Ｎは患者数である。
【ＦＩＧ．１４】ＦＩＧ．１４は、コート試薬としてMAb 3.5F8のみを用いた２サイトエライザ、及びコート試薬としてPAb及びMAb 3.5F8の両方を用いたここに開示の複数サイトエライザにより検出された肺癌患者由来の血清ＶＥＧＦを示す。
【ＦＩＧ．１５】ＦＩＧ．１５は、コートとしてMAb 3.5F8及び検出抗体としてMAb A4.6.1を用いた、正常ドナー及び糖尿病患者（非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）及びインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ））の血清ＶＥＧＦレベルを示す。
【ＦＩＧ．１６】ＦＩＧ．１６Ａ及び１６Ｂは、ここに開示の複数サイトアッセイにおいて、コート試薬の一つとしてのDNaseに対するアフィニティー精製ポリクローナル抗体と、ＶＥＧＦに対するアフィニティー精製ポリクローナル抗体を比較するグラフを、ヒト血漿に対するコート試薬としてMAb 3.5F8を用いた２サイトアッセイを比較して示す。Ｆｉｇ．１６Ａはコート試薬としてMAb 3.5F8を用いた２サイトエライザ（Ｘ軸）により測定された血漿ＶＥＧＦと、コート試薬としてMAb 3.5F8及びDNaseに対するポリクローナル抗体による複数サイトアッセイ（黒丸）、及びコート試薬としてMAb 3.5F8及びDNaseに対するポリクローナル抗体による複数サイトアッセイ（白丸）により測定された血漿ＶＥＧＦとの相関を示す。Ｆｉｇ．１６Ｂは、２サイトエライザ（黒丸）、コート試薬としてMAb 3.5F8とDNaseに対するポリクローナル抗体を用いた複数サイトエライザ（黒菱形）、及びコート試薬としてMAb 3.5F8とＶＥＧＦに対するPAbを用いたここで述べる複数サイトアッセイ（黒四角）の標準曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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