(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すヒト好中球由来のＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ４７サブユニットのＰＸドメインにおいて、Ａｒｇ９０がＬｙｓ９０で置換されているＮＡＤＰＨ酸化酵素変異体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヒト好中球ＮＡＤＰＨ酸化酵素（ＮＡＤＰＨ  ｏｘｉｄａｓｅ）のｐ４７サブユニットに含まれるＰＸと呼ばれるドメイン（ｐ４７・ＰＸ）のＮＭＲ解析の手法により得られた３次元構造座標および化学シフトに関する。
又、本発明はＰＸドメインの変異体の同定、検索、評価又は設計に関する。
更に、本発明は、ヒト好中球ＮＡＤＰＨ酸化酵素のｐ４７・ＰＸの３次元構造座標を用いた、ＰＸドメイン結合物質の結合を促進又は阻害する化合物の同定、検索、評価又は設計に関する。
背景技術
種々の疾患に活性酸素（通常の酸素Ｏ２より活性化されている酸素を含む分子の総称）が広く関与していることが最近の研究から明らかになってきている。たとえば、浮腫、動脈硬化、炎症、発ガン、ガン転移、老化、アルコール依存症、アルツハイマー、糖尿病等に関与している可能性がある（編集  近藤元治、最新医学からのアプローチ４  「フリーラジカル」、第４８−５４頁、グロビュー社、１９９２）。従って、活性酸素の生成を抑えたり、活性酸素の分解を促進する作用を持つ物質は前記の種々の疾患に対する有効な治療薬となる。
スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）はスーパーオキシド（Ｏ２−）の不均化を行う酵素であり、次式に示されるような反応を触媒する。
２Ｏ２−  ＋  ２Ｈ＋  →  Ｈ２Ｏ２  ＋  Ｏ２
生成したＨ２Ｏ２も活性酸素の一種であるが、カタラーゼやペルオキシダーゼと呼ばれる酵素によって分解され無害化される。従って、ＳＯＤの投与が活性酸素が関与するような疾患の治療法として考えられる。しかし、ＳＯＤは蛋白質製剤であり、次のような欠点がある。即ち、蛋白質のために、投与法が問題になり、投与後も生体中で容易に分解される可能性がある。また、免疫反応を惹き起こす可能性もある。更に、生産、精製過程が複雑であり、製造コストが高くなる。
一方、ビタミンＣ類縁化合物、ビタミンＥ類縁化合物、カロテノイド類、尿酸、ポリフェノールなど、抗酸化剤と呼ばれる一群の低分子化合物がある。これらの摂取は活性酸素の生成を抑えて、老化の防止などに役立つ効果があると考えられている。
以上の方法は生じた活性酸素を減らす対処療法であるが、もっと積極的に不要な活性酸素の産生を抑制することは、前記のような各種の疾患に対する有効な予防法、又は治療法となる。
活性酸素は、種々の原因で生ずる。生理的には呼吸に伴ってミトコンドリア内部で作られる。また、好中球が細菌を貪食するときに発生する。非生理的には、光や紫外線などの照射によって生じる。また、喫煙などにより活性酸素またはその前駆体を摂取することもある。（編集  近藤元治、最新医学からのアプローチ４  「フリーラジカル」、第１４−２１頁、グロビュー社、１９９２）。
食細胞（好中球を含む）が放出するスーパーオキシド（Ｏ２−）が主要な活性酸素の発生源となっている場合がある。例えば、胃粘膜傷害や腎炎などのような炎症や炎症性疾患などにおいてみられる（編集：近藤元治、最新医学からのアプローチ４  「フリーラジカル」、第９２−９９頁、第１０８−１１１頁、グロビュー社、１９９２）。特に臨床的に重要なケースは、生体組織中で血流が止まってから再開通するときに生じる傷害であり、再灌流傷害という。これは再供給された酸素が活性化され、この活性酸素がリン脂質の過酸化反応を引き起こすことによる。これは脳や心筋などの梗塞時、あるいは臓器移植に関連する。（編集  近藤元治、最新医学からのアプローチ４  「フリーラジカル」、第７６−８３頁、グロビュー社、１９９２）。従って、好中球によるスーパーオキシドの産生を抑えることは、以上の傷害を抑えることに極めて有効であると考えられる。
ＮＡＤＰＨ酸化酵素は好中球のスーパーオキシド生成に関与する蛋白質複合体である。ＮＡＤＰＨ酸化酵素の遺伝的な欠損は慢性肉芽腫症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＣＧＤ）の原因となる。この遺伝性疾患は活性酸素を生成できないために、好中球の殺菌力が弱く、幼少時より感染を繰り返して死に至る（Ｓｅｇａｌ，Ａ．Ｗ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８３：１７８５−１７９３（１９８９））。これは生体感染防御におけるＮＡＤＰＨ酸化酵素の重要性を示している。
ＮＡＤＰＨ酸化酵素は、膜蛋白質成分と可溶性蛋白質成分からなる。膜蛋白質成分はフラボシトクロムｂ５５８と呼ばれ、ヘムを含むｐ２２サブユニットとＦＡＤを含むｇｐ９１からなる。フラボシトクロムｂ５５８はスーパーオキシド産生を触媒する酵素本体である。一方、可溶性蛋白質成分はｐ６７、ｐ４７、ｐ４０、Ｒａｃからなり、フラボシトクロムｂ５５８の酵素活性を調節する働きをしている。ｐ６７、ｐ４７、ｐ４０は、ＰＸドメイン、ＳＨ３ドメインなどを含むマルチドメインタンパク質である。ＲａｃはスモールＧＴＰ結合タンパク質の１種である。細胞内で生成したこれらの可溶性蛋白質成分は生体膜近傍に移行し、膜蛋白質成分に結合し、ＮＡＤＰＨ酸化酵素は活性化するものと考えられている（Ｓｕｍｉｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｉｔｏ，Ｔ．，Ｈａｔａ，Ｋ．，Ｍｉｚｕｋｉ，Ｋ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｒ．，Ｋａｇｅ，Ｙ．，Ｓａｋａｉ，Ｙ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｍ．，Ｔａｋｅｓｈｉｇｅ，Ｋ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ“Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ”（１９９７）２３５−２４５）。
従って、このＮＡＤＰＨ酸化酵素の機能を調節することができれば、好中球におけるスーパーオキシドの発生を抑えることが可能となる。
ＰＸドメインは、ヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼのｐ４７可溶性サブユニット中に同定された蛋白質ドメインである（配列番号１）（Ｐｏｎｔｉｎｇ，Ｃ．Ｐ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，５：２３５３−２３５７，（１９９６））。このドメインはｐ４７およびｐ４０サブユニットのアミノ酸配列の一部を用いて、データベース検索を行うことで得られた、約１３０残基程度のアミノ酸残基からなる保存配列である。最新のＰＸドメインを持つとされる蛋白質のリストとそのＰＸドメインを特徴づけるコンセンサス配列は、インターネット上でＳＭＡＲＴ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ＲｅｓｅａｒｃｈＴｏｏｌ）データベースとして公開されている（ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／）。
ＰＸドメインと思われるアミノ酸配列は多数の蛋白質に同定されており、ＮＡＤＰＨ酸化酵素のｐ４７サブユニットとｐ４０サブユニット以外に、ソーティングネキシン、タイプＩＩのフォスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、フォスフォリパーゼＤ（ＰＬＤ）、酵母のＢｅｍ蛋白質など、これまでに１００種類以上の蛋白質中に見い出されている。現在まで、ＰＸドメインは真核生物由来の蛋白質のみに存在し、細菌など原核生物由来の蛋白質には同定されていない。
ＰＸドメインはＳＨ３ドメインが結合すると予想されるプロリンリッチ配列を含んでいる。ＳＨ３ドメインは、Ｓｒｃと呼ばれる発ガンタンパク質のファミリーに共通した配列から同定されたタンパク質ドメインであり、約６０残基程度のアミノ酸配列である（配列番号２）。プロリンを多く含む疎水的な１０残基程度の長さのアミノ酸配列に結合する機能を持つ。
ＰＸドメインを含む蛋白質には、その分子内にＳＨ３ドメインを同時に持つものがある。例えば、本発明の実施例で用いたヒト好中球のＮＡＤＰＨ酸化酵素のｐ４７サブユニット、同じＮＡＤＰＨ酸化酵素のｐ４０サブユニット、酵母のＢｅｍ１ｐなどがある（図１）。同一分子内にＰＸドメインとＳＨ３ドメインが存在すると、これら２つのドメインが別々の分子にある場合に比べて、ドメイン間の結合が強められる可能性がある。また、ＰＸドメインとＳＨ３ドメインの結合により、同一タンパク質内の他のドメインの機能を間接的に調節することが可能となると考えられる。
真核生物由来の蛋白質中に広く見出されているＰＸドメインの構造・機能を明らかにすることは、ＰＸドメインをもつ蛋白質の構造・機能解析に役立つ。特に、ＮＡＤＰＨ酸化酵素のＰＸドメインの構造解析は、ＮＡＤＰＨ酸化酵素の機能の解明に直接役立つと考えられ、ひいては、ＮＡＤＰＨ酸化酵素によるスーパーオキシド生成機構の解明、スーパーオキシド生成を制御することによる各種疾患に対する治療法の提供などにも役立ち得る。
しかしながら、ＳＨ３とＰＸのプロリンリッチ配列を介して相互作用する可能性以外にはＰＸドメインの機能は明らかにされていない。ｐ４７中のＰＸドメインについても、ＮＡＤＰＨ酸化酵素の酵素活性調節に対して重要な役割を果たしていると推定されるが、他の蛋白質のＰＸドメインと同様に実際の機能は分かっていない。
また、ＰＸドメインを持つ蛋白質は多数あるが、それらの蛋白質の働きからＰＸドメインの機能を推定することは困難であった。
更に、これまでに３次元構造が明らかとなったＰＸドメインはなく、構造からＰＸドメインの機能を推定することも不可能であった。
ＮＡＤＰＨ酸化酵素自身の３次元構造についてもこれまでに明らかにされておらず、ＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性を調節できるような化合物を理論的に設計することは不可能であった。
発明の開示
本発明者らは、上記のような問題点を解決するために、ヒト好中球ＮＡＤＰＨ酸化酵素のｐ４７サブユニットに含まれるＰＸドメイン（ｐ４７・ＰＸ）の３次元構造座標をＮＭＲを用いて初めて明らかにした。
また、ｐ４７・ＰＸ中に見出されるＳＨ３が結合すると推定されるプロリンリッチ配列に、同じｐ４７サブユニットに含まれる２つのＳＨ３ドメインの内のＣ端側のＳＨ３ドメイン（以下、ｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）と呼ぶ）が結合することを見出した。この結合は特異的である。なぜなら、ｐ４７サブユニットに含まれるもう一方のＮ端側のＳＨ３ドメイン（以下、ｐ４７・ＳＨ３（Ｎ）と呼ぶ）は、ｐ４７・ＰＸとは相互作用しないからである。
更に、ｐ４７・ＰＸにリン脂質が結合すること及びその結合部位をも見出した。このことは次の意味を有する。例えば、ＮＡＤＰＨ酸化酵素の場合、上述のように、細胞膜に存在する酵素本体であるフラボシトクロムｂ５５８に、細胞内に存在する調節成分であるｐ４７等が細胞膜近傍に移行して結合することによってＮＡＤＰＨ酸化酵素が活性化することが知られていた。リン脂質が細胞膜の成分であることを考慮すると調節成分の細胞膜への移行、従ってＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性化はｐ４７・ＰＸの細胞膜のリン脂質への結合によると考えられる。
更に、ｐ４７・ＰＸに結合するリン脂質の結合を促進する化合物の同定または検索する方法を見出した。例えば、ＮＡＤＰＨ酸化酵素の場合、リン脂質の結合の促進はＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性を増加させることになる。
更に、ｐ４７・ＰＸに結合するリン脂質の結合を阻害する化合物の同定または検索する方法を見出した。例えば、ＮＡＤＰＨ酸化酵素の場合、リン脂質の結合の阻害はＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性を減少させることになる。
更に、ｐ４７・ＰＸにｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）が結合することで、ＰＸドメインの立体構造が変化することも見出した。ｐ４７・ＰＸにｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）が結合すると、ｐ４７・ＰＸとリン脂質の結合が弱められることを見出した。ＰＸドメインにおいて、ｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）が結合する領域とリン脂質が結合する領域とは３次元構造的に見て近接していることも見出した。
蛋白質ドメインは、切り出して単離しても、元の立体構造や機能を保持していることが知られているので、単離したＰＸドメインとＳＨ３ドメインとの相互作用や、単離したＰＸドメインとリン脂質の相互作用は、ｐ４７全長におけるＰＸドメインとＳＨ３ドメインやリン脂質との相互作用と実質的に同一であると見なすことができる。
即ち、本発明によって、ＰＸドメインの詳細な機能を知ることができ、その３次元構造座標を元にして、ＰＸドメインのアミノ酸残基を変化させることで、ＰＸドメインを持つ蛋白質の機能を改変することが可能となった。
また、ＰＸドメインの化学シフトを元にしてＰＸドメインに結合する物質、ＰＸドメインに結合する物質の結合を促進する化合物、ＰＸドメインに結合する物質の結合を阻害する化合物の同定、検索、評価又は設計などを可能にした。
また、その３次元構造座標を元にしてＰＸドメインに結合する物質の結合を促進する化合物、又はＰＸドメインに結合する物質の結合を阻害する化合物の同定、検索、評価又は設計などを可能にした。
また、その化学シフトと３次元構造の両者を組み合わせてＰＸドメインに結合する物質、ＰＸドメインに結合する物質の結合を促進する化合物、ＰＸドメインに結合する物質の結合を阻害する化合物の同定、検索、評価又は設計などを可能にした。
即ち、本発明は、ＰＸドメインを持つ蛋白質の機能を改変するためのＰＸドメインの変異体、ＰＸドメインに結合する物質の結合を促進する化合物、又はＰＸドメインに結合する物質の結合を阻害する化合物を同定、検索、評価又は設計するために用いる、ＰＸドメインの３次元構造座標を要旨とする。本明細書で用いる「ＰＸドメインに結合する物質」にはリン脂質及びＳＨ３ドメインを含む。
更に、本発明は、ＰＸドメインの変異体、ＰＸドメインに結合する物質の結合を促進又は阻害する化合物を同定、検索、評価又は設計するために用いる、上記の３次元構造座標の全部又はその一部を格納しているコンピューター用記憶媒体をも要旨とする。
更に、本発明は、ＰＸドメインの変異体、ＰＸドメインに結合する物質の結合を促進又は阻害する化合物を同定、検索、評価又は設計するための、上記の３次元構造座標の全部若しくはその一部、又は上記のコンピューター用記憶媒体の使用をも要旨とする。
更に、本発明は、上記の３次元構造座標の全部若しくはその一部、又は上記のコンピューター用記憶媒体を使用することを特徴とする、ＰＸドメインを持つ蛋白質の機能を改変するためにＰＸドメイン中に１個又は複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は化学的に修飾されたＰＸドメインの変異体を同定、検索、評価又は設計する方法をも要旨とする。
更に、本発明は、上記の３次元構造座標の全部若しくはその一部、又は上記のコンピューター用記憶媒体を使用することを特徴とする、ＰＸドメインに結合する物質の結合を促進する化合物を同定、検索、評価又は設計する方法をも要旨とする。
更に、本発明は、上記の３次元構造座標の全部若しくはその一部、又は上記のコンピューター用記憶媒体を使用することを特徴とする、ＰＸドメインに結合する物質の結合を阻害する化合物を同定、検索、評価又は設計する方法をも要旨とする。
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、蛋白質は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略号を用いて表される。また、特に明示しない限りペプチド及び蛋白質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように、又Ｎ末端が１番になるように表される。
Ａ又はＡｌａ：アラニン残基、      Ｄ又はＡｓｐ：アスパラギン酸残基、
Ｅ又はＧｌｕ：グルタミン酸残基、  Ｆ又はＰｈｅ：フェニルアラニン残基、
Ｇ又はＧｌｙ：グリシン残基、      Ｈ又はＨｉｓ：ヒスチジン残基、
Ｉ又はＩｌｅ：イソロイシン残基、  Ｋ又はＬｙｓ：リジン残基、
Ｌ又はＬｅｕ：ロイシン残基、      Ｍ又はＭｅｔ：メチオニン残基、
Ｎ又はＡｓｎ：アスパラギン残基、  Ｐ又はＰｒｏ：プロリン残基、
Ｑ又はＧｌｎ：グルタミン残基、    Ｒ又はＡｒｇ：アルギニン残基、
Ｓ又はＳｅｒ：セリン残基、        Ｔ又はＴｈｒ：スレオニン残基、
Ｖ又はＶａｌ：バリン残基、        Ｗ又はＴｒｐ：トリプトファン残基、
Ｙ又はＴｙｒ：チロシン残基、      Ｃ又はＣｙｓ：システイン残基。
発明の実施するための最良の形態
１．ＰＸドメイン
本発明に用いるＰＸドメインは好ましくは真核生物由来であり、更に好ましくは哺乳動物由来、更に好ましくはヒト由来、更に好ましくはＮＡＤＰＨ酸化酵素、特に好ましくはヒト好中球由来ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ４７サブユニット由来のものである。
しかしながら、後述するように、本発明の構造座標と実質的に同一の構造を持つドメインであれば、本発明に含まれる。
ＰＸドメインとは、ヒト好中球由来ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ４７サブユニット由来の場合、そのアミノ酸配列（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベース、ＮＣＦ１＿ＨＵＭＡＮ）における第１番目のメチオニンから第１２８番目のプロリンまでの領域、他の蛋白質由来の場合、これに対応する領域をいう。
ＰＸドメインの開始部位及び終了部位は本発明においては必ずしも厳密ではなく、その機能が保持されることを条件として、Ｎ末端及び／又はＣ末端に数アミノ酸残基いずれかの方向にずれたもの、あるいは、Ｎ末端及び／又はＣ末端に数残基のアミノ酸が付加したものも包含される。通常、このような一次構造上の僅かな差異は該ＰＸドメイン全体の立体構造に大きな影響を与えず、機能は保たれると考えられる。
後述の実施例では、ヒト好中球ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ４７サブユニット由来のＰＸドメインの場合、上記アミノ酸配列のＮ末端側にグリシン、及びセリンの２アミノ酸残基が付加されたものを用いている。ただし、残基番号は本来のＰＸドメインのＮ末端のメチオニンを１番とし、付加されたグリシンは第マイナス２番目、セリンは第マイナス１番目とした。
２．ＮＭＲによる構造解析
蛋白質の３次元構造を明らかにする手法としてはＸ線結晶構造解析、ＮＭＲ解析、電子顕微鏡解析などがあげられる。最も一般的に行われているのは、Ｘ線結晶構造解析の手法であるが、結晶化したタンパク質しか解析できない。特に、分子中にフレキシブルな部分があると結晶化できない可能性が高い。
一方、ＮＭＲを用いた解析方法は、蛋白質を結晶化することなく、溶液状態で測定できる利点がある。又、運動性に関する情報が得られる。
更に、他の分子を徐々に加えて化学シフトの変化を測定することで、他の分子との相互作用を迅速に調べることができる（荒田洋治、「タンパク質のＮＭＲ」共立出版、１９９６年；米国特許第５６９８４０１号、同第５８０４３９０号、同第５８９１６４３号、同第５９８９８２７号）。
通常、ＮＭＲの一回の測定には濃度０．５ｍＭ以上の蛋白質溶液を２００〜４００マイクロリットル必要とする。試料溶液のｐＨは酸性から弱アルカリ性（＜ｐＨ８）が好ましい。更に、必要に応じて、緩衝剤（リン酸塩、酢酸塩など）、塩（ＮａＣｌなど）、還元剤（ジチオスレイトールなど）、界面活性剤などを添加してもよい。
Ａ．ＮＭＲ化学シフト
このようにして調製した測定試料を用いて、ＮＭＲによる構造解析の手法により、本発明である、ｐ４７・ＰＸのＮＭＲの化学シフト（各原子のＮＭＲ測定における共鳴周波数を標準物質の共鳴周波数に対して相対的に示した値）が初めて得られる。得られた化学シフトを、当業者において一般的に用いられている蛋白質のＮＭＲの化学シフトの表記方法に従って示したものを表１に示す。
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表１において、各原子のＮＭＲの化学シフトを記述している。１列目は各原子の化学シフトの項目番号を、２列目は配列番号に対応したアミノ酸の番号を、３列目はアミノ酸残基等を、４列目はアミノ酸残基等における原子の区別を、５列目はアミノ酸残基等における原子の種類を、６列目はその原子の化学シフト（ｐｐｍ単位）を示している。８列目はその原子の化学シフトが、本表中において固有の記述であるか、化学シフトの多義性のため複数行にわたって記述されているかの分類である。化学シフトが固有の場合は１、多義的な場合には２が使用されている。なお、本表は当業者にとって一般的に用いられている表記法である米国ウィスコンシン大学のＢＭＲＢデータベースの形式ＮＭＲ−ＳＴＡＲファイル形式に従って記述してある。本表は、該形式ファイルから、化学シフトを記述した行のみを抜粋したものである。７列目はデータベースの形式に合わせるための記号であり、本発明においては特に意味のある記号ではなく、７列目はすべて「．」を使用した。
なお本発明が提供する化学シフトの表は、９５％  Ｈ２Ｏ−５％  ２Ｈ２Ｏ中でｐＨ  ５．５、２５度で、５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液中、５ｍＭ  ＤＴＴ存在化でｐ４７・ＰＸの濃度が０．６ｍＭで測定した時の値である。上述の測定条件は、必ずしも本発明の化学シフトにとって厳密に規定されたものでなく、測定装置、測定法、試料溶解に使用する溶媒、溶媒に含まれる塩や界面活性剤、測定温度等の条件をかえることにより測定して得た化学シフトでも、ＰＸドメインの化学シフトに実質的に一致するものについては、本発明に包含される。実質的に一致とは、対応する原子の化学シフトの差が、水素原子でおよそ０．１ｐｐｍ以下、１３−炭素でおよそ０．５ｐｐｍ以下、１５−窒素でおよそ０．５ｐｐｍ以下の範囲内である化学シフトを指す。
更に、ＰＸドメインの変異体のＮＭＲ化学シフトでも、本発明による化学シフトと実質的に一致するものは本発明の範囲である。
又、ＰＸドメイン配列の開始部位及び終了部位も必ずしも本発明にとって厳密に規定されたものでなく、Ｎ末端及び／又はＣ末端部分に別の蛋白質が結合しているもの、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１個又は複数個のアミノ酸残基が付加したものなど、ＰＸドメインのＮＭＲの化学シフトについて実質的な変化をもたらさないものについては本発明に包含される。
なお表１において６列目に記述されている化学シフトは、それぞれ、５列目に記述されている原子の種類により、当業者にとって一般的に用いられる、それぞれの原子のＮＭＲ化学シフトの校正法に従って定めた値を示している。即ち、６列目がＨの場合には、３−トリメチルシリルプロパン酸のメチル基の水素原子を０．００ｐｐｍとした時の値を記した。また、６列目がＣの場合には、１３−炭素の相対周波数（Ξ）と水素原子の相対周波数（Ξ）の比を３−トリメチルシリルプロパン酸のメチル基の水素原子の共鳴周波数に乗じた周波数を０．００ｐｐｍとした時の値を記した。また、６列目がＮの場合には、１５−窒素の相対周波数（Ξ）と水素原子の相対周波数（Ξ）の比を３−トリメチルシリルプロパン酸のメチル基の水素原子の共鳴周波数に乗じた周波数を０．００ｐｐｍとした時の値を記した。当業者にとって一般的に用いられる相対周波数の値は、水素原子について１００．００００００ＭＨｚ、１３−炭素について２５．１４４９５３０ＭＨｚ、１５−窒素について１０．１３２９１１８ＭＨｚである（Ｍａｒｋｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．ら（１９９８）．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ，１２巻，第１−２３頁，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ．Ｂｅｌｇｉｕｍ．）
Ｂ．構造座標
上に述べたようにして調製した測定試料を用いて、ＮＭＲによる構造解析の手法により、本発明である、ｐ４７・ＰＸの３次元構造座標（各原子の空間的な位置関係を示す値）が初めて得られる。得られた構造座標を、当業者において一般的に用いられている蛋白質の３次元の構造座標の表記方法に従って示したものを表２に示す。
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表２において、最終行を除いて、各原子の３次元座標を記述している。１列目のＡＴＯＭはこの行が原子座標の行であることを示し、２列目は、その原子の順番を、３列目はアミノ酸残基等における原子の区別を、４列目はアミノ酸残基等を、５列目は配列番号に対応したアミノ酸の番号を、６、７、８列目はその原子の座標（Å単位）を示している。最終行は、この表の終わりの行であることを示している。なお、本表は当業者にとって一般的に用いられている表記法であるプロテイン・データ・バンクの形式に従って記述している。９、１０列目はデータベースの形式に合わせるための数字であり、本発明においては特に意味のある数字ではなく、９列目はすべて１．００を、１０列目はすべて０．００を使用した。
得られたｐ４７・ＰＸの３次元構造座標を元に、蛋白質の構造を理解するのに当業者において一般的に用いられている表記方法であるリボン図を作成した（図２）。
図２から理解されるように、全体的な構造の特徴として、Ｎ端側の半分は３本鎖の逆平行βシート構造、Ｃ端側の半分は４本のαヘリックス構造からなり、βシート構造とαヘリックス構造に挟まれた分子中央の部分に疎水性コアがある。
ＳＨ３ドメインが相互作用すると考えられるプロリンリッチ配列（第７３番目のプロリンから第７８番目のプロリンまでの領域）は、両端が２本のαヘリックスに支えられて溶液中に突き出した形になっており、ＳＨ３ドメインと相互作用するのに好都合な配置にあると考えられる。
ＰＸドメインファミリーに共通して保存されているアミノ酸残基のほとんどは分子中央の疎水性コアに関与している。本発明におけるｐ４７・ＰＸにおける疎水性コアに関与しているアミノ酸残基は、Ｉｌｅ６、Ｉｌｅ９、Ｖａｌ２５、Ｔｙｒ２６、Ｐｈｅ２８、Ｖａｌ３０、Ｖａｌ４０、Ｉｌｅ４７、Ｐｈｅ５０、Ｈｉｓ５１、Ｌｅｕ５４、Ｉｌｅ７２、Ｌｅｕ９４、Ｔｙｒ９７、Ｃｙｓ９８、Ｌｅｕ１０１、Ｍｅｔ１０２、Ｌｅｕ１１４、Ｐｈｅ１１７、Ｐｈｅ１１８である。
しかし、保存されたアミノ酸残基の内、Ｐｈｅ１４、Ｔｙｒ２４、Ｐｈｅ４４、Ａｌａ８７、Ａｒｇ９０は分子表面にある深いクレフト構造の内部に突き出している。
ここで、野生型、変異体の別にかかわらずＰＸドメインの３次元構造のうち、本発明による３次元構造と実質的に一致するものは本発明の範囲である。実質的に一致とは、該構造の主要部分、具体的にはαヘリックスやβシート構造といった２次構造を形成している部分や、ＮＭＲ情報を等しく満たしている複数の座標において、局所的な重ね合わせが他の部分に比べ低い値となっている部分において、対応する部分の主鎖又はＣα炭素の部分の平均２乗偏差がおよそ２Å以下である構造を指す。又、各配列の開始部位及び終了部位も必ずしも本発明にとって厳密に規定されたものでなく、Ｎ末端及び／又はＣ末端部分に別の蛋白質が結合しているもの、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１個又は複数個のアミノ酸残基が付加したものなど、ＰＸドメインの構造について実質的な変化をもたらさないものについては本発明に包含される。
更に、本発明におけるヒト好中球由来のＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ４７・ＰＸの３次元構造座標を用いて、アミノ酸配列が相同である他のＮＡＤＰＨ酸化酵素由来のＰＸドメイン、及び他の蛋白質由来のＰＸドメインの３次元構造座標をホモロジーモデリング（中村春木、中井謙太、バイオテクノロジーのためのコンピューター入門、第１８６−２０４頁、コロナ社、１９９５）により導き出すことができる。アミノ酸配列の相同性がより高いほど、容易に目的の３次元構造座標を導き出すことができるが、アミノ酸配列の相同性が２０％未満になると導き出された３次元構造座標の信頼性は低下する。
なお、表２に示した構造座標は、ある任意の位置を３次元空間における原点として表記している。本発明の構造座標又は本発明の構造座標からホモロジーモデリングによって導き出した他の蛋白質由来のＰＸドメインの構造座標をコンピューターによる計算に用いる場合などにおいて、各原子の相対的な配置を変化させずに、３次元空間内で並進、回転などの数学的な移動操作を施した結果として得られる新たな構造座標も本発明の範囲である。
３．ＰＸドメインとＳＨドメインの相互作用
前述したように、ｐ４７・ＰＸ中にはＳＨ３ドメインが相互作用すると考えられているプロリンリッチ配列が存在し（第７３番目のプロリンから第７８番目のプロリンまでの領域）、本発明で明らかになったようにＳＨ３ドメインと相互作用しやすい構造となっている。
更に、実施例６で示したように、実際にこのプロリンリッチ配列部分にｐ４７サブユニットに含まれる２つのＳＨ３ドメインの内、Ｃ端側のＳＨ３ドメインが結合する。
既に、多数の蛋白質由来のＳＨ３について、その立体構造が明らかになっている（編集  西村善文・京極好正・稲垣冬彦・森川耿右「構造生物学のフロンティア」  蛋白質・核酸・酵素、第３５５−３６７頁、共立出版、１９９９）。
本実施例中で用いたｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）の立体構造は決定されていないが、ホモロジーモデリングの手法で容易に推定する事ができる。
なお、もう一つのｐ４７サブユニット中のＳＨ３ドメインであるＮ端側のＳＨ３（Ｎ）ドメインはｐ４７のＰＸドメインには結合しない。
本発明によって明らかになったＰＸドメインとＳＨ３ドメインについても、ＰＸドメインと相互作用する物質及び／又はＳＨ３ドメインと相互作用する物質を通じて、ＰＸドメインとＳＨ３ドメインの相互作用を制御することで、ＰＸドメインを有する蛋白質及び／又はＳＨ３ドメインが関与している各種疾患を治療することが可能となる。
また、ＰＸドメインのＳＨ３ドメイン結合部位に特異的に結合する化合物は、ＰＸドメインへのＳＨ３ドメインの結合を阻害することで、そのＰＸドメインを持つ蛋白質の機能を調節することができる。
例えば、ＮＡＤＰＨ酸化酵素の場合、ｐ４７・ＰＸに結合する低分子化合物を用いることで、ＮＡＤＰＨ酸化酵素の機能を調節し、好中球におけるスーパーオキシドの発生を抑えることが可能となる。即ち、ＰＸドメインに特異的に結合する低分子化合物は、スーパーオキシドが関与すると考えられる各種疾患の治療用化合物となりうる。
４．ＰＸドメインとリン脂質との相互作用
ＰＸドメインを持つ蛋白質は多数あるが、その中で、機能が判明しているのはＰＬＤとＰＩ３Ｋである。ＰＬＤ、ＰＩ３Ｋはリン脂質の分解や合成に関与する酵素であり、ＰＸドメインはこれらの酵素のリン酸、リン脂質の認識、結合に深く関与しているものと考えられている。
本発明者は、ｐ４７・ＰＸのＮＭＲ測定条件の検討においてリン酸緩衝液を使用すると、ある特定のアミノ酸残基（Ｉｌｅ９、Ｌｙｓ１６、Ｐｈｅ４４、Ｔｈｒ４５、Ａｌａ７７、Ｌｙｓ７９、Ｐｈｅ８１、Ａｓｐ８２、Ａｌａ８６、Ａｒｇ９０、Ｔｈｒ９３）の化学シフトが変化することを見い出した。特に、Ｔｈｒ４５のシフトが顕著であった。これらのアミノ酸残基の多くは前記ＰＸドメイン立体構造のクレフトの中に位置し、保存されたアルギニン残基（Ａｒｇ９０）の近くに存在している。
細胞内にあって、リン酸基をもつ低分子化合物の候補はいくつかあげられるが、ｐ４７は、ＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性化に伴い生体膜近傍に移行することが知られているので、ｐ４７・ＰＸに結合する化合物はリン脂質である可能性が高いと考えられた。
そこで次にリン酸残基を有するリン脂質とｐ４７・ＰＸとの結合を以下のような方法で調べた。ＰＸドメイン、またはＰＸドメインを含む蛋白質の水溶液を、リン脂質リポソームと混合した後、リン脂質リポソームと溶液を分離する。リン脂質リポソームは遠心、超遠心、又はろ過などの操作で溶液と分離することができる。分離したリン脂質リポソームを含む分画、または溶液の分画、またはその両者に含まれる蛋白質の量を測定する事により、リン脂質リポソームとＰＸドメイン、またはＰＸドメインを含む蛋白質の親和性を調べる。蛋白質の量の測定は、一般的には分光光度計による吸光度の測定、発色試薬による定量、ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析などにより行うことができる。
その結果、リン脂質がｐ４７・ＰＸに結合することを見出した。本発明におけるリン脂質には、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、これらはリン酸基の数と結合する位置による異性体が存在する）、ホスファチジン酸（ＰＡ）を含むが、これらに限定されるものではない。
さらにリン脂質を添加した場合のｐ４７・ＰＸの化学シフトの変化を測定することにより、リン脂質の結合部位はｐ４７・ＰＸの立体構造におけるクレフト部分であることを見出した。
ｐ４７・ＰＸのリン脂質への親和性は、リン脂質の種類によって異なる。ホスファチジルコリンやホスファチジルエタノールアミンに対しては結合しないが、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸に対しては中程度の親和性がある。ホスファチジルイノシトールリン酸に対して特に親和性が高い。
生体膜において、ホスファチジルイノシトールリン酸は、ホスファチジルイノシトールのリン酸化とその脱リン酸化によってその量や種類が動的に調節されている。従って、ｐ４７・ＰＸのリン脂質に対するこのような特異性が、ＰＸドメインの生体膜への結合を環境の変化に即応して変化させることを可能にすると考えられる。
これまでに、リン脂質に結合するドメインとして、ＰＨドメイン、ＰＴＢドメイン、Ｃ２ドメイン、ＦＹＶＥドメインが知られている。これらは全て、Ｘ線結晶構造解析やＮＭＲ構造解析によって既にその３次元構造が決定されており、リン脂質結合部位も同定されている（編集  西村善文・京極好正。稲垣冬彦・森川耿右「構造生物学のフロンティア」  蛋白質核酸酵素、共立出版、１９９９、及び、「イノシトールリン脂質群によるシグナリングの制御」、企画  竹縄忠臣、実験医学、１７、第１２０６−１２１８頁、羊土社、１９９９）。
ＰＨドメインは約１００アミノ酸残基からなるホスファチジルイノシトールリン酸に結合するドメインである。ホスファチジルイノシトール（４，５）二リン酸に特異性が高いとされているが、実際はかなり特異性が低い。ＰＴＢドメインは本来はリン酸化チロシンを含むペプチドに結合するドメインであるが、ＰＴＢのアミノ酸配列はＰＨのそれと似ていないにもかかわらず、立体構造は類似していることが明らかとなっている。実際、ＰＴＢドメインの一部は、ホスファチジルイノシトール（４，５）二リン酸やホスファチジルイノシトール４リン酸に結合することが報告されている。Ｃ２ドメインは約１３０アミノ酸残基からなるカルシウムイオン依存的にリン脂質への結合を制御するドメインである。ＦＹＶＥドメインは亜鉛を結合し約６０アミノ酸残基からなるドメインでホスファチジルイノシトール３リン酸に特異的に結合する。
いずれのドメインもそれを含む蛋白質が膜へ移行する際に、膜との相互作用部位の役割を果たしていると考えられている。
ある一つの蛋白質が複数のリン脂質結合ドメインを含むことがある。例えば、ＰＬＤ蛋白質はＰＨドメインとＰＸドメインを含む。タイプＩＩのＰＩ３Ｋ蛋白質はＣ２とＰＸドメインを含む。このような蛋白質が２つ以上のリン脂質結合ドメインを持つ理由は明らかとなっていないが、（１）１つのドメインだけでの脂質２重膜との親和性が十分ではなく、２つ以上のドメインの協力によって、その蛋白質の生体膜への移行が可能となる、（２）個々のリン脂質結合ドメインに対して異なる調節機構が存在することで、膜移行に関して多様な調節が行える、などの可能性が考えられる。
本発明により、ＰＸドメインもこれらのドメインと同様にリン脂質と結合することが明らかとなったが、このことから、ＰＸドメインが細胞膜中のリン脂質と結合することで、ＰＸドメインを含む蛋白質を生体膜近傍へ移行させる機能を持つことが推定される。ＮＡＤＰＨ酸化酵素の場合、細胞膜に存在する酵素本体であるフラボシトクロムｂ５５８に、細胞内に存在する調節成分であるｐ４７等が細胞膜近傍に移行して結合することによってＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性化が行なわれることが知られている。リン脂質が細胞膜の成分であることを考慮すると調節成分の細胞膜への移行、従ってＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性化はｐ４７・ＰＸの細胞膜のリン脂質への結合によると推定される。
本発明者はリン脂質との結合に関与すると考えられるＰＸドメインの特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸で置換し、リン脂質との結合を減少させたＰＸドメイン変異体を調製した（実施例１１）。さらに、同じ置換を完全長のｐ４７に導入し、好中球のＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性を、野生型のものと比較した（実施例１２）。その結果、変異体ｐ４７を有するＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性は、野生型のものと比べ相当減少することを確認した。これらのことはＰＸドメインが細胞膜中のリン脂質と結合することで、ＰＸドメインを含む蛋白質を生体膜近傍へ移行させる機能を持つという推定が正しいことを示すものである。
従って、ＰＸドメインとリン脂質の結合を促進し、あるいは阻害する化合物は、ＰＸドメインを含む蛋白質の機能、例えば酵素活性を調節することができる。実施例９に示したように、イノシトール１，４，５三リン酸は、ｐ４７・ＰＸのクレフト部分に結合することで、ｐ４７・ＰＸのリン脂質リポソームに対する結合を阻害することがわかった。図３は、ＰＸドメインの化学シフトを元に、イノシトール１、４、５三リン酸の結合により化学シフトが変化したアミノ酸残基を、その変化した量に応じて、表２で示した３次元構造座標を元にして作成した表面構造上に表示したものである。
例えば、ＮＡＤＰＨ酸化酵素の場合、ＰＸドメインとリン脂質の結合を阻害する化合物を用いることで、ＮＡＤＰＨ酸化酵素の機能を調節し、好中球におけるスーパーオキシドの発生を抑えることが可能となる。
最近、リン脂質、特にイノシトールリン脂質による細胞機能の調節や、病気との関連が注目されている（「脂質研究の新展開」、実験医学増刊、１４，羊土社、１９９６、及び「イノシトールリン脂質群によるシグナリングの制御」、実験医学、１７、第１１８６−１２１８頁、羊土社、１９９９、および「脂質の分子生物学と病態生化学」、蛋白質核酸酵素増刊、４４、共立出版、１９９９）。
リン脂質分子のヘッドグループ（リン脂質においてジアシルグリセロールを除いた部分を言う）が結合するｐ４７・ＰＸのアミノ酸残基は、立体構造上、ｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）が結合する部位の近くにある。また、実施例１０で示したようにｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）はｐ４７・ＰＸのリン脂質リポソームに対する結合を阻害する。したがって、ｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）のｐ４７・ＰＸドメインへの結合は、ｐ４７・ＰＸドメインのリン脂質に対する親和性の低下を引き起こして、生体膜に対する結合を調節すると考えられる。ｐ４７・ＰＸに対するＳＨ３ドメインの効果は特異的であり、例えばｐ４７・ＳＨ３（Ｎ）はｐ４７・ＰＸに結合せず、実施例６と同様の実験を行っても、ｐ４７・ＰＸのリン脂質に対する親和性は変化しない。
５．ＰＸドメインの変異体を作製するためのＰＸドメインの構造座標の使用
本発明によりＰＸドメインの３次元構造座標が明らかになり、ＰＸドメインとリン脂質との結合部位、及びＰＸドメインとＳＨ３ドメインとの結合部位も明かになった。
ＰＸドメインはそのＰＸドメインを持つ蛋白質の機能を制御していると考えられるので、これらのＰＸドメインの変異体を設計、作製することで、そのＰＸドメインを持つ蛋白質の機能を改変した変異体を理論的に設計することが可能となる。また、ＰＸドメインに結合するリン脂質の種類が変化したようなＰＸドメインの変異体を理論的に設計することも可能になる。更に、ＰＸドメインとの結合能が変化したＳＨ３ドメインの変異体に対して、正常な結合活性を持つようなＰＸドメインの変異体を理論的に設計することも可能となる。
本発明によるＰＸドメインの構造座標を、分子の３次元構造座標を表現するコンピューター・プログラムが動作するコンピューター又はそのコンピューターの記憶媒体に入力することで、ＰＸドメインとＳＨ３ドメイン、ＰＸドメインとリン脂質の３次元的な化学的相互作用の様式を詳細に表現することが可能になる。
コンピューターの記憶媒体としては、ＰＸドメインの構造座標をコンピューターの該プログラム上に導くことができるものであれば特に限定されるものではない。例えば、メモリと呼ばれる電気的な一時記憶媒体でも、フロッピーディスク、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、磁気テープなどの半永久的な記憶媒体でもよい。
また、本発明によるＰＸドメインの構造座標を、分子の３次元構造座標を表現するコンピューター・プログラムが動作するコンピューター又はその記憶媒体に入力して、視覚的検討及び／又はエネルギー計算をすることで、元のＰＸドメインに対してよりＳＨ３ドメイン及び／若しくはリン脂質に対する結合活性が強い、又はＳＨ３ドメイン及び／若しくはリン脂質に対する結合活性が弱いＰＸドメインの変異体を得るための、３次元空間における論理的設計が初めて可能になる。
蛋白質分子の３次元構造座標を表現するコンピューター・プログラムは多数市販されているが、これらプログラムは、一般に、分子の３次元構造座標の入力手段、該座標のコンピューター画面への視覚的表現、表現された分子内における各原子間の距離や結合角などを測定する手段、該座標の追加修正を行う手段などを提供する。
更に、分子の座標を元に分子の構造エネルギーを計算する手段、水分子などの溶媒分子を考慮して自由エネルギーを計算する手段を提供することができるように作成されたプログラムを用いることも可能である。モレキュラーシミュレーション社から市販されているコンピューター・プログラムであるＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩやＱＵＡＮＴＡは、該目的に好適なプログラムの例であるが、本発明はこれらのプログラムに限定されるものではない。
また、該プログラムは、通常シリコングラフィクス社やサンマイクロシステムズ社などから供給されているワークステーションと呼ばれるコンピューターに導入されて使用されるが、これらに限定されるものではない。
当業者は、該目的に適当なプログラムが作動するように調整されているコンピューターを用いて、本発明であるＰＸドメインの構造座標を、該コンピューター又はその記憶媒体に導入することによって、初めてＰＸドメインとＳＨ３ドメイン、又はＰＸドメインとリン脂質との結合様式を３次元空間での各原子の配置まで表現された状態で理解することができ、これによって、前述のようなＳＨ３ドメイン及び／又はリン脂質に対する結合能が変化したようなＰＸドメインの変異体、又はＳＨ３の変異体に対する結合活性の変化したＰＸドメインの変異体を得るために、３次元的で論理的にＰＸドメインの変異体を設計することが初めて可能になるのである。
代表的なＰＸドメインの変異体の設計方法の一つは、コンピューター又はその記憶媒体に本発明によるＰＸドメインの３次元構造座標を入力し、適当なプログラムを用いてコンピューター画面上に蛋白質の３次元構造を表示させ、視覚的な検討によって行う方法である。
まずＰＸドメイン及びＳＨ３ドメイン若しくはリン脂質の構造をコンピューターの画面上に表示させる。そして、ＰＸドメインのアミノ酸残基において、１個又は複数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入などの変異、又は化学的な修飾をコンピューター上で行い、その結果生じる相互作用の変化をコンピューターの画面上で観察する。この際、コンピューターの画面上に蛋白質の３次元構造を表記する場合において、シリコングラフィクス社から供給されているクリスタル・アイ（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｅｙｅｓ）眼鏡を用いた３次元の表記を用いたり、当業者において頻繁に用いられる立体視（Ｓｔｅｒｅｏ  ｖｉｅｗ）と呼ばれる右目と左目の視野に相当する２種の画面を同時に表記する方法を用いることで、３次元空間の理解が得られるやすくなるが、必ずしも３次元空間の表記を用いなくても視覚的な検討は可能である。また、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入などの変異、又は化学的な修飾によって変化する局部的な構造座標は、化学結合の正当性を保つように各原子の空間的な位置を決定することで得られる。この際、コンピューターに適当なコンフォメーションの候補群を表示させ、これらから選択してもよいし、エネルギー状態が低くなるような構造をコンピューターに計算させてもよい。そして、その中からＳＨ３ドメイン又はリン脂質との間に、より好ましい結合が生じるようなＰＸドメインの変異又は化学修飾を見いだしていく。
即ち、前述のようなＳＨ３ドメイン及び／又はリン脂質に対する結合能が変化したようなＰＸドメインの変異体、又はＳＨ３の変異体に対する結合活性の変化したＰＸドメインの変異体を設計するには、リン脂質の場合は、実施例９に示したリン脂質と相互作用するアミノ酸残基、即ち、Ｐｈｅ１４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ４３、Ｐｈｅ４４、Ａｌａ８７、Ａｒｇ９０、及びこれらのアミノ酸残基の近傍領域、又ＳＨ３ドメインの場合は実施例６に示したＳＨ３ドメインと相互作用するアミノ酸残基、即ちＡｒｇ７０、Ｉｌｅ７１、Ｉｌｅ７２、Ｐｒｏ７３、Ｈｉｓ７４、Ｌｅｕ７５、Ｐｒｏ７６、及びこれらのアミノ酸残基の近傍領域において、相互作用上において対応しているリン脂質又はＳＨ３ドメイン側の領域中にある原子との相互作用を大きく又は小さくするように変異を導入する。
ここに「その近傍領域」とは、該アミノ酸残基に対して、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などに関与する領域、具体的にはおよそ５Å以内にある領域をいう。本明細書の他の部分においても同様である。
更に、これ以外の部位に変異を導入するなどで、前述のようなＳＨ３ドメイン及び／又はリン脂質に対する結合能が変化したようなＰＸドメインの変異体、又はＳＨ３の変異体に対する結合活性の変化したＰＸドメインの変異体を設計する場合においても、本発明における構造座標を使用する限り本発明の範囲である。
この際、考慮されるべき非共有結合の相互作用は、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などがあり、これらを総合的に考慮して最終的な変異体の設計を行うことができる。
ＳＨ３ドメイン又はリン脂質との相互作用をより大きくするＰＸドメイン変異体につき先ず説明する。例えば、ＳＨ３ドメイン側のグルタミン酸、アスパラギン酸といった側鎖部分に負の電荷を持つアミノ酸残基の側鎖近傍には、近接する。ＰＸドメインのアミノ酸残基においてリジン、アルギニン、ヒスチジンといった正の電荷を持つアミノ酸残基の側鎖が配置されるように、又、その逆にＳＨ３ドメイン側にリジン、アルギニン、ヒスチジンといった側鎖部分に正の電荷を持つアミノ酸残基の側鎖近傍には、近接するＰＸドメインのアミノ酸残基においてグルタミン酸、アスパラギン酸といった負の電荷を持つアミノ酸残基の側鎖が配置されるように変異させる。
また、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンといった側鎖部分が疎水性の高いアミノ酸残基が主に集まって相互作用している部分においては、ＰＸドメインにおいてセリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミンといった親水性のアミノ酸残基やアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった荷電しているアミノ酸残基が存在している箇所を見つけだし、該アミノ酸残基を疎水性のアミノ酸残基で置き換え、疎水性相互作用が強まるようにする。
また、水素結合をする主鎖部分やセリン、チロシンなどのアミノ酸残基の側鎖部分には、新たな水素結合ができるように、対応するアミノ酸残基を変異させる。以上の変異においては、アミノ酸残基の側鎖や主鎖部分において、ファンデルワールス相互作用ができるだけ大きく、しかも各原子間で立体的な障害が生じないように注意する必要がある。更には、変異により新たな空隙部分ができないように、又既に空隙部分が存在する領域においては、その空隙部分をできるだけ充填するような変異を考慮することも必要である。このように、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などやその他の因子を、コンピューター画面上で視覚的に総合的に考慮して、最終的な変異体の設計を行うことができる。
リン脂質の負の電荷を持つリン酸基の近傍には、近接するＰＸドメインのアミノ酸残基においてリジン、アルギニン、ヒスチジンといった正の電荷を持つアミノ酸残基の側鎖が配置されるように変異させる。また、リン脂質のイノシトール骨格のアキシャル水素が集まっている部分は疎水性が高く、この部分の近傍においては、ＰＸドメインにおいてセリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミンといった親水性のアミノ酸残基やアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった荷電しているアミノ酸残基が存在している箇所を見つけだし、該アミノ酸残基を疎水性のアミノ酸残基で置き換え、疎水性相互作用が強まるようにする。また、イノシトール骨格やリン酸基の近傍では、新たな水素結合ができるように、ＰＸのアミノ酸残基を変異させる。以上の変異においては、アミノ酸残基の側鎖や主鎖部分において、ファンデルワールス相互作用ができるだけ大きく、しかも各原子間で立体的な障害が生じないように注意する必要がある。更には、変異により新たな空隙部分ができないように、又既に空隙部分が存在する領域においては、その空隙部分をできるだけ充填するような変異を考慮することも必要である。
これとは逆にＳＨ３ドメイン又はリン脂質との相互作用をより小さくするＰＸドメイン変異体については、以上の考察に準じて静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合相互作用などを小さくするようにＰＸドメインに変異を導入すればよい。このように、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などやその他の因子を、コンピューター画面上で視覚的に総合的に考慮して、最終的な変異体の設計を行うことができる。
設計の第二の方法は、ＳＨ３ドメイン又はリン脂質との結合を、コンピューターによってエネルギー計算を行うことにより評価して、上記の変異体の設計を行うものである。エネルギー計算は、当業者において一般的に行われる分子力場計算を行うコンピューター・プログラムを用いることによって達成できる。該目的に適したプログラムは、例えば蛋白質に最適化されたＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩのＤＩＳＣＯＶＥＲモジュールにあるＡＭＢＥＲの力場、ＣＶＦＦなどがあるが、これらに限定されるものではない。
更には、設計の第一の手法と第二の手法は厳密に区別されるものではなく、それぞれの手法を組み合わせて用いてもよい。即ち、視覚的検討により、より望ましい変異体であると予想されるものについて、第二の手法を用いて実際にエネルギーの計算を行い、その妥当性を評価していき、それを繰り返し行うことで更に優れた変異体を設計していくというものである。
以上のように、今まで３次元構造上の理論的な支持がない状態で試行錯誤で行われていた変異体の作製を、本発明の構造座標の使用により、３次元空間内の理論的な解析に基づいて行うことが可能になる。
第一及び第二の設計手法に用いるＰＸドメインのアミノ酸残基の構造座標は、本発明の明細書中に示した表２のヒト好中球ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ４７サブユニット由来のＰＸドメインの構造座標でも、又、これを元にしてアミノ酸配列の相同性の高い他の蛋白質由来のＰＸドメインのアミノ酸配列からコンピューターを用いた計算などにより新たに作成した構造座標でもよいし、更にはこれらの座標より、一部を抜き出したものでもよい。人に用いる医薬品として設計する場合においては、ヒト由来の蛋白質のＰＸドメインの構造座標を用いる方がより望ましい。また、用いられるＰＸドメインの構造座標は、全ての座標を用いる必要はない。変異体の設計においてはＰＸドメインとＳＨ３ドメイン、及び／又はＰＸドメインとリン脂質とが相互作用する部分に相当する領域が重要であり、これらの相互作用に関わるアミノ酸残基、又は必要に応じてその近傍のアミノ酸残基の座標を表２から選び出して用いることも可能である。また、該設計においてＰＸドメインの構造座標は、通常、３次元空間内に固定されて使用されるが、必ずしも固定される必要はなく、３次元空間の中での計算において、並進、回転や移動に伴い変化した構造座標は本発明の範囲である。
本発明により設計された変異体は、多くの方法によって調製され得る。例えば本発明を元にして、変異させることでより生物活性が上がると同定された部位において、対応するアミノ酸残基をコードしている該オリゴヌクレオチドの部位を、変異体に相当するオリゴヌクレオチドを化学的に合成して、配列に特異的なオリゴヌクレオチド切断酵素（制限酵素）を用いて天然型のオリゴヌクレオチドの部分と入れ替えることで、本発明を元にして設計された該変異体をコードするＤＮＡを得ることができる。得られた変異体ＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み、適当な宿主に導入し、組換え蛋白質として生産させることで前述のような変異体を得ることができる。このような調製方法は当業者においては一般的に行われている。（例えば、西郷薫、佐野弓子共訳、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳコンパクト版、分子生物学実験プロトコール、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、丸善株式会社  ：原著、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
また、蛋白質のアミノ酸残基を化学的に修飾することも当業者においては一般的に行われている（例えば、Ｈｉｒｓ，Ｃ．Ｈ．Ｗ．及びＴｉｍａｓｈｅｆｆ，Ｓ，Ｎ．，ｅｄｓ，（１９７７）．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，４７巻，第４０７−４９８頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．）。
ＰＸドメイン部分に変異を導入したＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ４７サブユニットのタンパク質もしくはそれを発現する遺伝子は例えば次の様に利用できる。ＰＸドメインの変異体を導入した細胞を用い、そのＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を指標とすることで、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を促進、或いは阻害する新規の薬物を効果的にスクリーニングすることができる。ただしＰＸドメインの変異体の利用は、必ずしもここであげた例に限るものではない。
６．ＰＸドメイン結合物質の結合を促進若しくは阻害する化合物作製のためのＰＸドメインの構造座標の使用
本発明が提供するＰＸドメインの構造座標の全て又は一部を、分子の３次元構造座標を表現するコンピューター・プログラムが動作するコンピューター又はそのコンピューターの記憶媒体に入力することで、ＰＸドメインと結合し、ＰＸドメインとＳＨ３ドメイン、及び／又はＰＸドメインとリン脂質の結合を促進若しくは阻害する化合物を同定、検索、評価又は設計することが可能になる。化合物は、天然物化合物、合成化合物のいずれでもよく、高分子化合物、低分子化合物のいずれでもよい。
促進物質は、ＰＸドメインに対するＳＨ３ドメインの結合を促進する場合、ＰＸドメインに結合して、ＰＸドメインの構造変化をもたらすことにより、ＰＸドメインとＳＨ３ドメインの結合を促進してもよいし、ＰＸドメインとＳＨ３ドメインの両方に結合することによりＰＸドメインとＳＨ３ドメインの結合を促進してもよい。
ＰＸドメインに対するリン脂質の結合を促進する場合、ＰＸドメインに結合して、ＰＸドメインの構造変化をもたらすことにより、ＰＸドメインとリン脂質の結合を促進してもよいし、ＰＸドメインとリン脂質の両方に結合することによりＰＸドメインとリン脂質の結合を促進してもよい。
阻害物質はＰＸドメインにおけるＳＨ３ドメインの結合する部分、若しくはその近傍に結合することによってＳＨ３ドメインのＰＸドメインへの結合を阻害してもよいし、ＰＸドメインにおけるリン脂質の結合する部分、若しくはその近傍に結合することによってリン脂質のＰＸドメインへの結合を阻害してもよい。また、それらの両方の結合を同時に阻害してもよい。
また、上述のように、ＰＸドメインにおけるＳＨ３ドメインの結合領域とリン脂質の結合領域は近接しており、ＰＸドメインとリン脂質の結合と、ＰＸドメインとＳＨ３ドメインの結合は、おたがいに拮抗している。
従って、促進物質はＰＸドメインにおけるリン脂質の結合する部分、若しくはその近傍に結合することによってリン脂質のＰＸドメインへの結合を阻害することによって、ＳＨ３ドメインのＰＸドメインへの結合を促進してもよい。
また、ＰＸドメインにおけるＳＨ３ドメインの結合する部分、若しくはその近傍に結合することによってＳＨ３ドメインのＰＸドメインへの結合を阻害することで、リン脂質のＰＸドメインへの結合を促進してもよい。
同様に、阻害物質はＰＸドメインにおけるＳＨ３ドメインの結合する部分、若しくはその近傍に結合することによってＰＸドメインの構造変化をもたらすことにより、リン脂質のＰＸドメインへの結合を阻害してもよい。
また、ＰＸドメインにおけるリン脂質の結合する部分、若しくはその近傍に結合することによってＰＸドメインの構造変化をもたらすことにより、ＳＨ３ドメインのＰＸドメインへの結合を阻害してもよい。
促進物質又は阻害物質の設計を行う際に用いられるコンピューターは、例えばシリコングラフィックス社によって供給されているワークステーションＩｎｄｉｇｏ２などが好適であるが、これに限定されるものではなく、適当なプログラムが動作するように調整されているコンピューターであればよい。
また、コンピューターの記憶媒体にも特に制限はない。設計に用いるプログラムは、例えばモレキュラーシミュレーション社から市販されているコンピューター・プログラムＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩを用いることで達成できる。特に、該目的のために特別に作成されたＬｕｄｉやＤＯＣＫといったプログラムを単独又は組み合わせて用いることで、より容易に同定、検索、評価又は設計することができる。更には、特開平６−３０９３８５や特開平７−１３３２３３に示されているような手法によっても、本発明によるＰＸドメインの構造座標を用いることで、初めて促進物質又は阻害物質の設計が行える。ただし、本発明はこれらのプログラムや手法に限定されるものではない。
促進物質又は阻害物質の設計には、概念的に２つの段階がある。最初の段階は、当業者においてリード化合物と称される薬物設計の出発点となる化合物を見つけだす段階である。次の段階は、そのリード化合物から出発してより活性が優れる、体内動態が優れる、毒性や副作用の少ないなど、医薬品としてより優れた性質を持つ化合物を見いだすリード化合物の最適化の過程である。
本発明が提供するＰＸドメインの構造座標を用いてリード化合物を見つけだす段階は、例えば複数の化合物の構造が入力してあるコンピューター中のデータベースを利用して、データベース中の化合物とＰＸドメインの３次元構造上の相互作用を逐次、視覚的方法によって選別する方法、又はコンピューターにより結合のエネルギーの大きさを逐次計算し、安定にＰＸドメインと結合する化合物をデータベースの中から探し出す方法などによって達成される。化合物の構造のデータベースは３次元構造座標が決定され入力されていることが望ましいが、低分子化合物の場合には、そのコンフォメーションは比較的自由に変化されうるし、各コンフォメーションの３次元構造座標を計算で導くことも比較的短時間で可能であるので、３次元構造座標のデータベースでなくてもよい。この場合は、低分子化合物の化学的な共有結合情報をデータベースに入力する。
具体的には、視覚的方法では、まずコンピューターの画面上にＰＸドメイン分子を、本発明である構造座標に従って表示する。この際、コンピューターの画面上に前述のようなクリスタル・アイを用いるなどの３次元表記をしてもよいが、必ずしも３次元表記を用いなくても視覚的な検討は可能である。次に、コンピューター上で化学的相互作用を考慮しながら、データベース中にある化合物とＰＸドメイン分子との結合を試み、該化合物がＰＸドメインとＳＨ３ドメインの結合、及び／又はＰＸドメインとリン脂質の結合を促進又は阻害するように働くことが可能かどうか、逐次評価していく。
促進物質を評価する場合には、該化合物はＰＸドメインに結合してＰＸドメインの構造変化をもたらし、その結果ＰＸドメインのＳＨ３ドメイン及び／又はリン脂質に対する結合能が強化されるような化合物を選択することが好ましい。
阻害物質を評価する場合には、該化合物のＰＸドメインへ結合する部位は、ＳＨ３ドメイン又はリン脂質のＰＸドメインへの結合するアミノ酸残基又はその近傍のアミノ酸残基に少なくとも１ヶ所は一致していることが望ましいが、結合が阻害されるのであれば、必ずしも一致している必要はない。即ち、阻害薬のＰＸドメインへの結合によってＰＸドメインとＳＨドメインとの結合及び／又はＰＸドメインとリン脂質との結合が立体的に阻害されるような化合物を選択することが好ましい。
また、該化合物がＰＸドメインとＳＨ３ドメイン、又はＰＸドメインとリン脂質の双方に同時に結合することによって、ＰＸドメインとＳＨ３ドメイン、又はＰＸドメインとリン脂質の結合を促進する場合、該化合物がＰＸドメインとＳＨ３ドメイン、又はＰＸドメインとリン脂質の結合を安定化するよう化合物を選択することが好ましい。
また、該化合物がＰＸドメインの構造変化をもたらして、ＰＸドメインとＳＨ３ドメイン、又はＰＸドメインとリン脂質の結合を阻害する場合、該化合物はＰＸドメインに結合してＰＸドメインの構造変化をもたらし、その結果ＰＸドメインのＳＨ３ドメイン及び／又はリン脂質に対する結合能が低下するような化合物を選択することが好ましい。
更に、該化合物がＰＸドメインに結合し、ＰＸドメインとリン脂質との結合を阻害してＰＸドメインとＳＨ３ドメインの結合を促進する場合は、該化合物がＰＸドメインに結合する際、リン脂質の結合は阻害するが、ＳＨ３ドメインの結合は阻害しないような化合物を選択すべきである。また、ＰＸドメインとＳＨ３ドメインとの結合を阻害してＰＸドメインとリン脂質の結合を促進する場合は、該化合物がＰＸドメインに結合する際、ＳＨ３ドメインの結合は阻害するが、リン脂質の結合は阻害しないような化合物を選択すべきである。
上述のように、該化合物が、ＰＸドメインとＳＨ３ドメイン及び／又はリン脂質の結合能を促進又は阻害するかどうかを評価するには、リン脂質の場合は、実施例９に示したリン脂質と相互作用するアミノ酸残基、即ち、Ｐｈｅ１４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ４３、Ｐｈｅ４４、Ａｌａ８７、Ａｒｇ９０、及びこれらのアミノ酸残基のその近傍領域において、又ＳＨ３ドメインの場合は実施例６に示したＳＨ３ドメインと相互作用するアミノ酸残基、即ちＡｒｇ７０、Ｉｌｅ７１、Ｉｌｅ７２、Ｐｒｏ７３、Ｈｉｓ７４、Ｌｅｕ７５、Ｐｒｏ７６、及びこれらのアミノ酸残基のその近傍領域において、ＰＸドメインと該化合物の間の化学的相互作用を、視覚的又はコンピューターによるエネルギー評価による検討を行うことで、より正確な予測が可能である。
更に、ＰＸドメインの立体構造の変化をもたらすことで、最終的にＰＸドメインとＳＨ３ドメイン又はリン脂質との結合を促進若しくは阻害する化合物を選択することを目的に、該化合物が、これ以外の部位でＰＸドメインに相互作用することを予測又は評価する場合においても、本発明における構造座標を使用する限り本発明の範囲である。
考慮すべき化学的相互作用は静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用などである。即ち、該化合物の３次元空間での構造が、その官能基群においてカルボキシル基、ニトロ基、ハロゲン基などの陰性電荷を帯びやすい基が、ＰＸドメインのリジン、アルギニン、ヒスチジンといった正電荷を持つアミノ酸残基に相互作用するように、アミノ基、イミノ基、グアニジル基などの陽性電荷を帯びやすい基が、ＰＸドメインのグルタミン酸、アスパラギン酸といった負電荷を持つアミノ酸残基に相互作用するように、脂肪族基や芳香族基といった疎水性の官能基が、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンといった疎水性のアミノ酸残基と相互作用するように、水酸基、アミド基などの水素結合に関与する基が、ＰＸドメインの主鎖や側鎖部分と水素結合ができるように、更には、該化合物とＰＸドメインの結合において立体的な障害が生じないように、又、更には、空隙部分がなるべくできないように空隙部分が充填され、ファンデルワールス相互作用が大きくなるようになど、相互作用に好ましい構造になっているかを総合的に考慮することである。これらは、該化合物とＳＨ３ドメイン及び／又はリン脂質との結合においても同様である。
このように、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などやその他の因子を、コンピューター画面上で視覚的に総合的に考慮して、最終的に該化合物がリード化合物として適当であるか否かの判断を行う。コンピューターによるエネルギー評価による方法では、分子力場計算を用いて化合物と、ＰＸドメインとの結合のエネルギーを求める。その計算をデータベースの中の各化合物に適用し、安定に結合できるリード化合物となりうる化合物を、このデータベースの中から求める。また、ＰＸドメインとＳＨ３ドメイン、又はＰＸドメインとリン脂質の複合体と該化合物が結合する場合は、これらの複合体と該化合物の結合エネルギーを求める。
分子力場計算に用いる力場は、プログラムＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩのＤＩＳＣＯＶＥＲモジュールにある、蛋白質に最適化されたＡＭＢＥＲの力場、ＣＶＦＦなどを利用できる。また、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩのＬｕｄｉなどコンピューター・プログラムによっては、蛋白質分子において相互作用するアミノ酸残基の３次元構造座標を与えると、自動的にリード化合物の候補を出力するものもあり、ＰＸドメインに適用することも可能である。
また、視覚的検討と、エネルギーを考慮した検討は厳密に区別されるものではなく、それぞれの手法を適宜に組み合わせて用いることも有用である。
次の段階である、本発明が提供するＰＸドメインの構造座標を用いてリード化合物の最適化を行う手法は、あらかじめＰＸドメインと結合するリード化合物が上記の方法で、又は別途に実験的に見いだされている場合に、そのリード化合物を更に優れた分子、例えば促進物質又は阻害物質として更に生物活性の高い化合物や、医薬品として経口投与を考えた場合に有利な構造を有する分子などへ最適化する目的で用いられる。リード化合物を実験的に見いだす手法としては、例えば当業者においてコンビナトリアル・ライブラリーとして知られている一連の化合物の中から選別されてもよいし、微生物などの培養液中から選別されてもよい。要するに、リード化合物とＰＸドメインの化学的結合の実態を明らかにすることによって初めて、リード化合物とＰＸドメインの相互作用において最適ではない相互作用部位を直接見いだし、その部位に最適な官能基を有する化合物を新たに設計することが可能となり、より最適化された化合物が設計できる。
初期の段階で、正確にリード化合物とＰＸドメインの結合様式の理解を得るためには、リード化合物とＰＸドメインの複合体の３次元構造をＮＭＲを用いて解析するか、該リード化合物とＰＸドメインの共結晶を作製し、Ｘ線結晶構造解析するなど、実験的にリード化合物とＰＸドメインの化学的相互作用の実態の詳細を明らかにする方法を利用することがより望ましいが、コンピューターによる視覚的検討やエネルギー計算によってリード化合物とＰＸドメインの化学的相互作用を理解してもよい。
コンピューターによる視覚的検討の場合は、まず、リード化合物の３次元構造座標と本発明が提供するＰＸドメインの構造座標を、分子の３次元構造座標を表現するコンピューター・プログラムが動作するコンピューター又はそのコンピューターの記憶媒体に入力して、コンピューター画面上でリード化合物とＰＸドメインの複合体モデルを表示する。この際、コンピューターの画面上に前述のようなクリスタル・アイを用いるなどの３次元表記をしてもよいが、必ずしも３次元表記を用いなくても視覚的な検討は可能である。そして、リード化合物がＰＸドメインと更に好ましく相互作用できるように、若しくは相互作用を保持させたまま、より体内動態の優れた化合物へと改変することが、論理的な化合物の設計である。
考慮すべき化学的相互作用はリード化合物を見つけだす場合と同様であり、最終的にリード化合物から、促進物質又は阻害物質としてより好ましい性質を持つ化合物を新たに設計する。
コンピューターによるエネルギー評価による方法では、分子力場計算を用いて、リード化合物から設計された新たな化合物とＰＸドメイン、又は該化合物とＰＸドメインとＳＨ３ドメインの複合体、又は該化合物とリン脂質の複合体との結合のエネルギーを求め、該設計の妥当性を判断する。更には、溶媒分子などもモデルに加え、分子動力学法を用いて自由エネルギーを求め、安定に結合できる化合物へ誘導する方法もある。分子力場計算に用いる力場は、プログラムＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩのＤＩＳＣＯＶＥＲモジュールにある、蛋白質に最適化されたＡＭＢＥＲの力場、ＣＶＦＦなどを利用できる。
また、視覚的検討と、エネルギー評価による方法を適宜に組み合わせて用いてもよい。
以上の手法において用いられるＰＸドメインのアミノ酸残基の構造座標は、本発明の明細書中に示した表２のヒト好中球ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ４７サブユニット由来のＰＸドメインの構造座標でも、これを元にして計算により作成した他の蛋白質由来のＰＸドメインの構造座標でもよい。人に用いる医薬品として設計する場合においては、ヒト由来の蛋白質のＰＸドメインの構造座標を用いる方がより望ましい。
以上の手法において設計された促進物質又は阻害物質については、その化合物に応じて、一般的に用いられている化学合成の手法を用いることで得ることができる。
７．ＰＸドメインの変異体を評価するためのＰＸドメインのＮＭＲ化学シフトの使用
本発明が提供するＰＸドメインのＮＭＲ化学シフトの全て又は一部を、ＰＸドメインの変異体のＮＭＲ化学シフトと比較することで、ＰＸドメインの変異体のＮＭＲ信号を帰属し、化学シフトを決定することが可能となる。ここでいうＮＭＲ信号の帰属とは、当業者により一般的に用いられる、２次元及び／又は３次元及び／又は４次元ＮＭＲ法によって観測された信号が、ＰＸドメインの変異体の、どの残基に属する原子または原子団から由来の信号であるかを、決定することである。
具体的には、本発明が提供する化学シフトの値を、一般的なＮＭＲスペクトルを表示し解析することのできるコンピューター・プログラムが動作するコンピューター又はそのコンピューターの記憶媒体に入力することで、ＰＸドメインについて当業者が一般的に用いるＮＭＲの測定を行ったときに、ＮＭＲスペクトルのどの位置に信号が観測されうるかを、事前に予測することが可能になる。
コンピューターの記憶媒体としては、ＰＸドメインの化学シフトをコンピューターの該プログラム上に導くことができるものであれば特に限定されるものではない。例えば、メモリと呼ばれる電気的な一時記憶媒体でも、フロッピーディスク、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、磁気テープなどの半永久的な記憶媒体でもよい。
アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）より提供されるコンピューター・プログラムＮＭＲＤＲＡＷは、該目的に好適なプログラムの例であるが、本発明はこれらのプログラムに限定されるものではない。
このようにして予測されたＮＭＲスペクトル上の信号の位置と、ＰＸドメインの変異体のＮＭＲのスペクトルを比較することで、ＮＭＲスペクトル上の信号を容易に帰属することが可能となる。ＰＸドメインの変異体のＮＭＲのスペクトルでは、通常、変異を導入したアミノ酸残基以外の残基の各原子の化学シフトは、変異を導入する前のＰＸドメインの対応するアミノ酸残基の各原子の化学シフトとほとんど差がない。したがって、まず変異を導入していない残基由来のＮＭＲ信号を帰属し、その後消去法により、帰属されないで残った残基のＮＭＲ信号が変異を導入したアミノ酸残基由来のＮＭＲ信号であることが、論理的に帰属できる。
更に、ＰＸドメインの変異体が、著しく立体構造を変化させたり、活性を損ないアグリゲーションを形成している場合は、変異を導入していないＰＸドメインの化学シフトと、分子の全体に拡がった非常に大きな化学シフト変化が観測される。したがって、本発明の提供するＰＸドメインの化学シフトを使用して、化学シフト変化を指標に、ＰＸドメインの変異体を選別・評価し、ＰＸドメインの変異体の設計の正否を判断することに有効である。
ただし、本発明が提供するＰＸドメインの化学シフトの使用は、これらの手法に限定されるものではない。
８．ＰＸドメインに結合する化合物を同定、検索または評価するためのＰＸドメインのＮＭＲ化学シフトの使用
本発明が提供するＰＸドメインのＮＭＲ化学シフトの全て又は一部を、任意の化合物を添加した状態で測定したＰＸドメインのＮＭＲ化学シフトと比較することで、ＰＸドメインと結合し、ＰＸドメインとリン脂質、及び／又はＰＸドメインとＳＨ３ドメインの結合を促進する化合物を同定、検索、又は評価することが可能になる。ある化合物の添加によりＰＸドメインのＮＭＲ化学シフトが変化することは、その化合物とＰＸドメインとの相互作用の結果に外ならないからである。
更に同様の方法により、ＰＸドメインと結合し、ＰＸドメインとリン脂質、及び／又はＰＸドメインとＳＨ３ドメインの結合を阻害する化合物を同定、検索、又は評価することが可能になる。
化合物は、天然物化合物、合成化合物のいずれでもよく、高分子化合物、低分子化合物のいずれでもよい。
上述のように、蛋白質のＮＭＲの化学シフトの変化から、他の分子との相互作用の有無を、迅速に知ることができる（荒田洋治、「タンパク質のＮＭＲ」共立出版、１９９６年；米国特許第５６９８４０１号、同第５８０４３９０号、同第５８９１６４３号、同第５９８９８２７号）。更に、本発明が提供するＰＸドメインのＮＭＲ化学シフトの全て又は一部を比較の対象として用いることで、化合物とＰＸドメインの相互作用がＰＸドメインのどのアミノ酸残基に特異的に起こっているのかを、より詳細に記述することが初めて可能となる。
ＰＸドメインに結合する化合物がＰＸドメインのどの部位に結合しているかどうかの評価は、化学シフトの変化を、上述したＰＸドメインの３次元構造座標と組み合わせて、コンピューターによる視覚的検討を行うことで、より詳細に行うことができる。
例えば、実施例９と図２で示したように、ある化合物がｐ４７・ＰＸのＴｙｒ２６、Ｐｈｅ４６、Ｐｈｅ８１、Ｇｌｙ８３、Ａｌａ８７、Ａｒｇ９０、Ｇｌｎ９１、Ｇｌｙ９２、Ｌｅｕ９４のアミノ酸残基のいずれかの残基のアミド窒素及び／又はアミドプロトンの化学シフト変化を起こしたならば、該化合物がイノシトール１，４，５三リン酸と同様に、ｐ４７・ＰＸのクレフト部分に結合しているということが、判別できる。
しかし、コンピューターによる視覚的検討の方法を用いなくとも、複数の化合物の化学シフト変化の生じたアミノ酸残基を比較検討することで、該化合物の分類・評価を行うことができる。
また、本発明が提供するＰＸドメインの構造座標を使用してコンピューター・プログラムにより合理的にＰＸドメインに結合する化合物を設計した場合、該化合物を添加した状態でＰＸドメインのＮＭＲ化学シフトの変化を分析することで、設計どおりに該化合物がＰＸドメインに結合しているかどうかがわかるため、化合物の設計の正否を判断することができる。
この方法は、該化合物がＰＸドメインとＰＸドメイン結合物質の結合を促進する物質と、阻害する物質の、両者について同様に有効である。また、当業者におけるリード化合物の発見の段階とリード化合物の最適化の段階の、いずれの段階でも同様に有効である。
ただし、本発明が提供するＰＸドメインの化学シフトの使用は、これらの手法に限定されるものではない。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、何らこれに限定されるものではない。
実施例１
ｐ４７・ＰＸドメインの製造
ｐ４７・ＰＸドメイン（ヒト好中球ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ４７サブユニットの第１番目のメチオニンから第１２８残基目のプロリンまでの１２８アミノ酸残基：配列番号１）をＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）との融合蛋白質として発現させるためのベクターを作製した。
即ち、配列番号３及び配列番号４に示したプライマーを用いて、配列番号５に示したＤＮＡ断片をヒト好中球ｍＲＮＡよりＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した。次にこのＤＮＡ断片をＧＳＴとの融合蛋白質として発現させるためにベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ切断部位に挿入し、発現プラスミドｐＧＥＸ−ｐ４７ＰＸを作製した。
このようにして作製したｐ４７・ＰＸの発現ベクターｐＧＥＸ−ｐ４７ＰＸを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。［１５Ｎ］塩化アンモニウム、又は［１３Ｃ］グルコースを唯一の窒素源、又は炭素源とする培地を用いることで、安定同位体でラベルされた蛋白質を調製した。
次に、発現させたｐ４７・ＰＸとＧＳＴとの融合蛋白質をグルタチオンカラムを用いて精製した。必要に応じて、トロンビン処理によってＧＳＴ蛋白質を切り離した。得られたｐ４７・ＰＸ蛋白質は強陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦａｓｔＦｌｏｗ、アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を用いて精製した。
実施例２
ＳＨ３（Ｃ）ドメインの製造
ｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）ドメイン（ヒト好中球ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ４７サブユニットの第２２３番目のグルタミン酸から第２８６残基目のアスパラギン酸までの６４アミノ酸残基：配列番号２）をＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）との融合蛋白質として発現させるためのベクターを作製した。
即ち、配列番号６及び配列番号７に示したプライマーを用いて、配列番号８に示したＤＮＡ断片をヒト好中球ｍＲＮＡよりＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。次にｐ４７・ＰＸドメインの場合と同様にしてｐＧＥＸ−２ＴのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ切断部位に挿入し、発現プラスミドｐＧＥＸ−ｐ４７ＳＨ３（Ｃ）を作製した。
このようにして作製したｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）の発現ベクターｐＧＥＸ−ｐ４７ＳＨ３（Ｃ）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。［１５Ｎ］塩化アンモニウム、又は［１３Ｃ］グルコースを唯一の窒素源、又は炭素源とする培地を用いることで、安定同位体でラベルされた蛋白質を調製した。
次に、発現させたｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）とＧＳＴとの融合蛋白質をグルタチオンカラムを用いて精製した。必要に応じて、トロンビン処理によってＧＳＴ蛋白質を切り離した。得られたｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）蛋白質は強陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦａｓｔＦｌｏｗ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した。
実施例３
ｐ４７・ＰＸドメイン変異体の製造
ｐ４７・ＰＸドメイン（ヒト好中球ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ４７サブユニットの第１番目のメチオニンから第１２８残基目のプロリンまでの１２８アミノ酸残基）の第９０番目のアミノ酸であるアルギニン残基をリジン残基に置換した変異体（配列番号９。以下「ｐ４７・ＰＸＲ９０Ｋ」と呼ぶ）をＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）との融合蛋白質として発現させるためのベクターを作製した。
即ち、配列番号３、配列番号４，配列番号１０及び配列番号１１に示したプライマーを用いて、発現プラスミドｐＧＥＸ−ｐ４７ＰＸに部位特異的変異を導入して、ＰＸドメインの変異体蛋白質の発現プラスミドｐＧＥＸ−ｐ４７ＰＸＲ９０Ｋを作製した。
このようにして作製したｐ４７・ＰＸＲ９０Ｋの発現ベクターｐＧＥＸ−ｐ４７ＰＸＲ９０Ｋを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。［１５Ｎ］塩化アンモニウム、又は［１３Ｃ］グルコースを唯一の窒素源、又は炭素源とする培地を用いることで、安定同位体でラベルされた蛋白質を調製した。
次に、発現させたｐ４７・ＰＸＲ９０ＫとＧＳＴとの融合蛋白質をグルタチオンカラムを用いて精製した。必要に応じて、トロンビン処理によってＧＳＴ蛋白質を切り離した。得られたｐ４７・ＰＸＲ９０Ｋ蛋白質は強陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦａｓｔＦｌｏｗ、アマシャムファルマシア  バイオテク社製）を用いて精製した。
実施例４
ｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）ドメイン変異体の製造
ｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）ドメイン（ヒト好中球ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ４７サブユニットの第２２３残基目のグルタミン酸から第２８６残基目のアスパラギン酸までの６４残基）の第４１番目のアミノ酸であるトリプトファン残基（ヒト好中球ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ４７サブユニットの第２６３残基目）をアルギニン残基に置換した変異体（配列番号１２。以下「ｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）Ｗ２６３Ｒ」と呼ぶ）をＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）との融合蛋白質として発現させるためのベクターを作製した。
即ち、配列番号６、配列番号７，配列番号１３及び配列番号１４に示したプライマーを用いて、発現プラスミドｐＧＥＸ−ｐ４７ＳＨ３（Ｃ）に部位特異的変異を導入して、ＳＨ３ドメインの変異体蛋白質の発現プラスミドｐＧＥＸ−ｐ４７ＳＨ３（Ｃ）Ｗ２６３Ｒを作製した。
このようにして作製したｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）Ｗ２６３Ｒの発現ベクターｐＧＥＸ−ｐ４７ＳＨ３（Ｃ）Ｗ２６３Ｒを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。［１５Ｎ］塩化アンモニウム、又は［１３Ｃ］グルコースを唯一の窒素源、又は炭素源とする培地を用いることで、安定同位体でラベルされた蛋白質を調製した。
次に、発現させたｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）Ｗ２６３ＲとＧＳＴとの融合蛋白質をグルタチオンカラムを用いて精製した。必要に応じて、トロンビン処理によってＧＳＴ蛋白質を切り離した。ｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）Ｗ２６３Ｒ変異体蛋白質は強陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦａｓｔＦｌｏｗ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した。
実施例５
ＮＭＲによるｐ４７・ＰＸの化学シフトと構造座標の測定
Ｎ末端にベクター由来の２アミノ酸残基（グリシン−セリン）が余分についた１３０アミノ酸残基のｐ４７・ＰＸをＮＭＲ解析に用いた。該蛋白質の計算分子量は１５，３０２である。
実施例１において発現・精製したｐ４７・ＰＸは測定用緩衝液｛５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）、５ｍＭ  ＤＴＴ、５％  Ｄ２Ｏ又は、１００％  Ｄ２Ｏ｝に約０．６ｍＭの濃度になるように溶解した。
測定は、ブルカー社製のＤＭＸ６００を用い、２５℃で測定した。ＮＭＲシグナルの帰属には、通常のトリプル共鳴の３次元ＮＭＲスペクトル（ＨＮＣＡ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＨＮＣＡＣＢ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＣＣＨ−ＣＯＳＹ、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ等）を用いた。立体構造決定のためのＮＯＥ情報は、１５Ｎあるいは１３Ｃ編集のＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣスペクトル（混合時間１００ミリ秒）を測定して解析した。立体構造決定のためのカップリング情報は２次元ＨＭＱＣ−Ｊ法を測定して解析した。得られた化学シフトは当業者にとって一般的に用いられる表記法であるＢＭＲＢデータベースの形式に従って表１に示した。
ＮＯＥおよび水素結合の情報から得られる１４３８個の距離制限情報とカップリング定数から得られる６０個の２面角制限情報を満たすような立体構造をＮＭＲ用立体構造決定プログラムＤＹＡＮＡ（チューリヒ工科大学（ＥＴＨ）、Ｋ．Ｗｕｔｈｒｉｃｈ研究室作製）を用いて２００個計算し、そのうち上記の制限情報を最も満たしているもの上位２０個を選択した。この２０個の構造をさらに、分子動力学シミュレーションプログラムＥＭＢＯＳＳ（蛋白工学研究所・中村春木研究室作製）を用いて制限付きのエネルギー最小化を行った。
得られた２０個の構造は、ＤＹＡＮＡの計算で、標的関数の値が４．４５〜５．１７の範囲であった。ＥＭＢＯＳＳで得られた２０個の最終構造のなかに、距離制限情報から０．５オングストローム以上の相違は存在しなかった。また、２面角制限情報から２度以上の相違も存在しない。
２０個の最終構造において、第４番目のスレオニンから第１２４残基目のアスパラギン酸までの１２１残基で、主鎖のＲＭＳＤの値は０．５５オングストロームであり、同じ領域の水素以外の全原子を含めると、１．２１オングストロームであった。
得られた構造座標は当業者にとって一般的に用いられている表記法であるプロテイン・データ・バンクの形式に従って表２に示した。
実施例６
ＰＸドメインのＳＨ３ドメインとの相互作用部位の解析
Ｎ末端にベクター由来の２アミノ酸残基（グリシン−セリン）が余分についた６６アミノ酸残基のｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）を相互作用部位の解析の実験に用いた。該蛋白質の計算分子量は７，３３２である。
まず、実施例２で作製した１５Ｎ又は１３Ｃでラベルされたｐ４７・ＰＸドメインを測定用緩衝液｛５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）、５ｍＭ  ジチオスレイトール、５％  Ｄ２Ｏ｝に約０．２ｍＭの濃度になるように溶解し、ｐ４７・ＰＸドメインのＮＭＲシグナル（化学シフト）を測定した（表１）。これに同じ緩衝液で透析したｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）を終濃度約０．４ｍＭ（２等量）となるまで滴定し、ｐ４７・ＰＸドメインのＮＭＲシグナルの変化をＤＭＸ６００を用いて測定した。
また、１５Ｎラベルしたｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）を測定用緩衝液｛２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５ｍＭ  ジチオスレイトール、５％  Ｄ２Ｏ｝に約０．２ｍＭの濃度になるように溶解した。次にｐ４７・ＰＸを終濃度約０．４ｍＭ（２等量）となるまで滴定し、ｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）ドメインのＮＭＲシグナルの変化をＤＭＸ６００を用いて測定した。
その結果、ＳＨ３ドメインの添加により、ＰＸドメインのプロリンリッチ配列部分に顕著な化学シフトの変化が観察され（第７０番目アルギニンから第７６番目のプロリン：配列番号１）、ｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）がｐ４７・ＰＸのプロリンリッチ配列に結合することが示された。
また、｛１Ｈ｝−１５Ｎ  ＮＯＥＳＹ測定から、プロリンリッチ配列及びその近傍の運動性が高いことがわかった。
実施例７
ｐ４７・ＰＸとリン脂質の結合
得られたｐ４７・ＰＸの立体構造には、正に荷電した直径約１０オングストロームのクレフトが存在する。このポケット内部には４４番目のフェニルアラニン残基、９０番目のアルギニン残基が露出している。この二つの残基は他の蛋白質のＰＸドメインの配列間でよく保存されている。このことから我々は、このポケットにリン脂質が結合するという仮説を立て、以下の実験を行った。
ｐ４７・ＰＸとリン脂質の結合はＰＨドメインでの実験例（Ｈａｒｌａｎ，Ｊ．Ｅ．，等，Ｎａｔｕｒｅ，３７１：１６８−１７１，（１９９４））に基づいて、リポソームと蛋白質最終濃度、緩衝液条件、遠心条件などを適宜改良して行った。
（１）リポソーム懸濁液の調製
ホスファチジルエタノールアミン単体、またはホスファチジルエタノールアミンに各種リン脂質（ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトール３リン酸、ホスファチジルイノシトール４リン酸、ホスファチジルイノシトール４，５二リン酸）を最終濃度５％となるように混合したものを、減圧乾固し、緩衝液｛２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ｝中で超音波処理をしてリポソーム懸濁液を調製した。
（２）結合実験
調製したリポソーム懸濁液を緩衝液｛２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ｝で最終濃度（５．０ｍｇ／ｍＬ）に希釈して、ｐ４７・ＰＸを最終濃度５μＭ（７５μｇ／ｍＬ）となるように加えて、室温で１５分間振盪した後、１００，０００ｇ、４５分間の超遠心によってリポソームを沈殿させた。上清に残った蛋白質量をＳＤＳ−ＰＡＧＥとＨＰＬＣ（逆相カラム）で分析した。リン脂質と結合したタンパク質（ｐ４７・ＰＸ）はリポソームとして超遠心によって沈殿する。測定は３回独立に行い平均値をとった。標準偏差と共に表３に示す。
その結果ｐ４７・ＰＸはホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）にはほとんど結合しない。ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトール３リン酸（ＰＩ（３）Ｐ）には、弱く結合した。ホスファチジルイノシトール４リン酸（ＰＩ（４）Ｐ）およびホスファチジン酸（ＰＡ）には中程度に結合し、ホスファチジルイノシトール４，５二リン酸（ＰＩ（４，５）Ｐ２）には最も強く結合した。これらの定量結果を表３に示した。
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実施例８
イノシトールまたはリン酸を含む可溶性低分子化合物によるｐ４７・ＰＸとリン脂質の結合阻害（ｐ４７・ＰＸとリン酸との相互作用の解析）
ｐ４７・ＰＸとホスファチジルイノシトール４，５二リン酸を含むリポソームの結合に対する可溶性低分子化合物の阻害活性を、実施例５の実験をもとに行った。
すなわち、実施例７の方法で調製したホスファチジルイノシトール４，５二リン酸を５％含むホスファチジルエタノールアミンのリポソーム懸濁液（最終濃度５．０ｍｇ／ｍＬ）に、ｐ４７・ＰＸドメインを最終濃度５μＭ（７５μｇ／ｍＬ）と下記の表４に記した濃度の可溶性低分子化合物を加えて、室温で１５分間振盪した後、１００，０００ｇ、４５分間の超遠心によってリポソームを沈殿させた。上清に残った蛋白質量をＨＰＬＣ（逆相カラム）で分析・定量し、それぞれの化合物の阻害活性を求めた。
その結果、イノシトール１，４，５三リン酸にｐ４７・ＰＸのリン脂質への結合に対する阻害活性が認められた。イノシトール、イノシトール１リン酸や、グリセロホスフォイノシトールには阻害活性は認められなかった。リン酸は、大過剰（１０ｍＭ）加えることで、弱い阻害活性を示した（表４）。このことから、ｐ４７・ＰＸへの結合に関し、リン脂質はイノシトール１，４，５三リン酸と拮抗することがわかる。
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実施例９
ｐ４７・ＰＸとイノシトール１，４，５三リン酸との相互作用の解析
ｐ４７・ＰＸと実施例８で阻害活性の見られたイノシトール１，４，５三リン酸との相互作用部位をＮＭＲにより調べた。
まず、１５Ｎラベルしたｐ４７・ＰＸ溶液｛蛋白質濃度約０．２ｍＭ、５ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）、５ｍＭ  ジチオスレイトール、５％  Ｄ２Ｏ｝に溶解し、ｐ４７・ＰＸのＮＭＲシグナルを測定した（表１）。次にこれにイノシトール１，４，５三リン酸を最終濃度が１．５ｍＭになるまで順次添加し、ｐ４７・ＰＸのＮＭＲシグナルの変化を測定した。
その結果、イノシトール１，４，５三リン酸の添加により、ＰＸドメインのクレフト部分（図２を参照）を構成するアミノ酸とその周辺のアミノ酸（Ｔｙｒ２６，Ｐｈｅ４４，Ｐｈｅ８１，Ｇｌｙ８３，Ａｌａ８７，Ａｒｇ９０，Ｇｌｎ９１，Ｇｌｙ９２，Ｌｅｕ９４）に化学シフトの変化が観察され、このクレフト部分がイノシトール１，４，５三リン酸結合部位であることが示された。
リン酸、あるいはフィチン酸（イノシトール六リン酸）でも、その親和性は低いものの、同様な結果が得られた。
実施例８で示したように、ｐ４７・ＰＸへの結合に関し、リン脂質はイノシトール１，４，５三リン酸と拮抗し、イノシトール１，４，５三リン酸はリン脂質のヘッドグループに相当するので、リン脂質もそのヘッドグループがｐ４７・ＰＸのクレフト部分に結合すると考えられる。
実施例１０
ｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）によるｐ４７・ＰＸとリン脂質の結合阻害
ｐ４７・ＰＸとホスファチジルイノシトール４，５二リン酸を含むリポソームの結合に対するｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）の阻害活性を、上記実施例８と同様に行った。
即ち、実施例７で調製したホスファチジルイノシトール４，５二リン酸（ＰＩ（４，５）Ｐ２）を５％含むホスファチジルエタノールアミンのリポソーム懸濁液（最終濃度５．０ｍｇ／ｍＬ）に、ｐ４７・ＰＸを最終濃度５μＭ（７５μｇ／ｍＬ）とｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）又はｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）Ｗ２６３Ｒを５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭの最終濃度となるように加えて、室温で１５分間振盪した後、１００，０００ｇ、４５分間の超遠心によってリポソームを沈殿させた。上清に残ったｐ４７・ＰＸの量をＨＰＬＣ（逆相カラム）で分析・定量し、野生型および変異体ｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）の阻害活性を求めた。
その結果、ｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）にｐ４７・ＰＸドメインのリン脂質結合に対する阻害活性が認められた。一方、ｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）Ｗ２６３Ｒには阻害活性は認められなかった（図４）。
実施例１１
ｐ４７・ＰＸの３次元構造座標に基づいた変異体のデザイン（リン脂質結合能を失ったアミノ酸置換体）
実施例９で示されたように、ｐ４７・ＰＸに存在するクレフトは、リン脂質のヘッドグループの結合部位である。このクレフトには多数のＰＸドメインの間で保存されているアルギニン残基（ｐ４７・ＰＸでは９０番目）が存在する。したがって、このアルギニン残基を他のアミノ酸に置換すれば、リン脂質に対する結合能が変化したＰＸドメインが得られると期待される。
アルギニン残基の正電荷がリン脂質のヘッドグループの負電荷の認識に重要であると考え、正電荷を無くしかつ長い側鎖を持つアミノ酸としてグルタミンを選び変異体を調製したが、溶解度が低く精製困難であった。そこで、リジン変異体を調製した。リジンはアルギニンと同様に正電荷を持つため、溶解度の問題は生じなかった。しかし、リジンはグアニジウム基の代わりにアミノ基を持つこと、側鎖の長さがメチレン基一つ分短い点が異なる。
実施例３で調製したｐ４７・ＰＸＲ９０Ｋとホスファチジルイノシトール４，５二リン酸を含むリポソームの結合実験を、実施例５と同様に行った。
即ち、実施例７で調製したホスファチジルイノシトール４，５二リン酸を５％含むホスファチジルエタノールアミンのリポソーム懸濁液（最終濃度５．０ｍｇ／ｍＬ）に、ｐ４７・ＰＸ、またはｐ４７・ＰＸＲ９０Ｋを最終濃度５μＭ（７５μｇ／ｍＬ）となるように加えて、室温で１５分間振盪した後、１００，０００ｇ、４５分間の超遠心によってリポソームを沈殿させた。上清、および沈澱に含まれるｐ４７・ＰＸ、またはｐ４７・ＰＸＲ９０Ｋの量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで定量した。
その結果、ｐ４７・ＰＸＲ９０Ｋのホスファチジルイノシトール４，５二リン酸に対する結合能は有意に低下していた。このことは、ＰＸドメインとリン脂質との結合にＰＸドメインの９０位のアルギニンが重要な役割を果たしていることを示す。
実施例１２
ＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性に及ぼすｐ４７変異の影響
さらに、Ｒ９０Ｋのアミノ酸置換を完全鎖長のｐ４７に導入し、セルフリー活性化系、及びホールセル活性化系を用いて、好中球のＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化におけるｐ４７のＲ９０Ｋ変異のアミノ酸置換の影響を調べた。
即ち、ヒト好中球膜、ｐ６７、Ｒａｃ、及びｐ４７（野生型あるいはＲ９０Ｋのアミノ酸置換体）をＮＡＤＰＨ存在下に、アラキドン酸で刺激しスーパーオキシド（Ｏ２−）の生成をシトクロムｃ還元法にて測定した（セルフリー活性化系）（Ａｋａｓａｋｉ，Ｔら、（１９９９）、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２７４巻、第１８０５５−１８０５９頁、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）。また、ｐ４７欠損Ｋ５６２培養細胞に、野生型ｐ４７あるいはＲ９０Ｋのアミノ酸置換をもつ変異体ｐ４７を遺伝子導入してステイブルトランスフォーマントを作製し、フォルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）刺激時のＯ２−産生をシトクロムｃ還元法にて測定した（ホールセル活性化系）（Ａｇｏ，Ｔら、（１９９９）、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２７４巻、第３３６４４−３３６５３頁、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
その結果、Ｒ９０Ｋのアミノ酸置換を導入したｐ４７は、ＮＡＤＰＨ酸化酵素によるスーパーオキシド（Ｏ２−）産生を野生型ｐ４７ほど誘導できないことがわかった。セルフリー活性化系では野生型の６０％、ホールセル活性化系では野生型の１０％であった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１はＰＸドメインを含むタンパク質の例を示す。
図２はＮＡＤＰＨ酸化酵素のｐ４７サブユニットのＰＸドメインの立体構造を示す。
図３はＩＰ３（イノシトール１、４、５三リン酸）の結合により、化学シフトが変化するアミノ酸残基をｐ４７・ＰＸドメインの表面構造上に表示した図である。
図４はｐ４７・ＰＸへのホスファジルノイシトール４，５二リン酸（ＰＩ（４、５）Ｐ２）の結合をｐ４７・ＳＨ３（Ｃ）が阻害することを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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