(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液血小板の凝集を濁度法、比濁法または電磁法により測定する方法において、反応混合物を第一の反応相において混合し、第一相に続く第二の反応相では全く混合せず、測定は、第二の反応相において実施する方法。
【請求項２】
混合は、撹拌、振盪、振動または超音波処理によって行われる請求項１記載の方法。
【請求項３】
生理学的に活性な血液血小板の凝集を測定する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
固定血液血小板の凝集を測定する請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
リストセチン補因子テストを実施する請求項４記載の方法。
【請求項６】
全血、多血小板血漿、希釈多血小板血漿、または精製血小板を測定サンプルとして使用する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
凝集反応を誘発するために必要な混合時間を測定する請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
血液血小板の血小板アクティベーターに対する感度を測定する請求項７記載の方法。
【請求項９】
血小板アクティベーターがリストセチン、コラーゲン、ＡＤＰ、エピネフリンまたはアラキドン酸である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法における凝集を連続撹拌下に同様に測定した値と比較する血小板凝集の安定性の測定方法。
【請求項１１】
混合相の前に、混合しないインキュベーション相を挿入する請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
混合相の前に初期の測定値を測定する請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
血液血小板および粒子の凝集を測定する請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
血液血小板の代わりに、他の細胞、膜小胞または人工粒子を使用する請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
複数の混合相および非混合相を連続する請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は血小板の凝集を測定する方法において、反応混合物を第一の反応相において混合し、第一相に続いて第二の反応相ではそれほど激しくは混合しないかまたは全く混合せず、測定は好ましくは第二の反応相で行う方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
血液は主として血漿、低分子量物質の溶液、およびタンパク質、ならびに細胞成分から構成され、その中で、赤血球、白血球およ血小板が大きな比率を占めている。
【０００３】
血小板は、インビボにおいて傷害に迅速に反応して創傷閉鎖の最初の工程を開始することをその主要な機能とする。それらは様々な因子によって活性化され、活性化の過程で、適切に名付けられているように「粘着性」になる。それらは、ついで損傷表面の両側ならびに相互間の両者で付着する。相互の付着は、それが能動的に起こった場合にはアグレゲーションと呼ばれ、それが受動的にすなわち生理学的活性なしに起こった場合にはアグルチネーションと呼ばれる。
【０００４】
とくに特許請求の範囲のほか以下の記載では、「凝集」の語を用いた場合は、血小板のアグレゲーションおよびアグルチネーションの両者を意味する。
【０００５】
凝集能力は、したがって、創傷閉鎖に重要である。それは多数の因子によって増強され、また減弱される。これらには、たとえば、疾患、手術、医薬の服用、および血小板の数が包含される。凝集傾向の増強は血栓を招き、凝集傾向の減弱は出血を招く可能性がある。
【０００６】
血小板の凝集性を検討するために O'Brian（J. Clin. Path., 1962, 15: 452-455）はその後の10年間に臨床診断に広く用いられるようになった血小板の凝集の測定方法を開発した（Bick R.L., Clinics in Laboratory Medicine, Thrombosis and Hemostasis for the clinical laboratory: II部，15巻，１，1-38）。その方法では、まず多血小板血漿（platelet-rich plasma）が調製される。アクティベーターは通常、混合物に添加され、絶えず撹拌しながら減衰が追跡される。凝集体の形成は減衰の低下によって定量的に追跡することができる。慣用の光度計には制御された撹拌機構および適当な評価モードがないので、測定には血小板凝集計と呼ばれる特殊な装置が使用される。
【０００７】
この方法の利点は、凝集が定量的および動的に測定されること、ならびに自動化が比較的容易なことである。欠点は、測定時に撹拌機構を有する特殊な装置が要求されることである。これらの装置、凝集計は高価であり、すべての臨床検査室に設置する価値はない。測定の数が限られていることが多いので、完全に自動化された装置が広く使用されることもなく、したがって操作も便利ではない。他方、高度に自動化された多数の自動分析装置が存在し、原理的には、光度測定装置で減衰の低下を測定できるが、必要な連続撹拌のオプションはない。
【０００８】
現在の技術水準によれば、血小板凝集の測定には連続撹拌が必要である。Bornによる研究（1963年）で既に示されているように凝集の速度は撹拌状態に大きく依存する。さらにこの方法の最近の総説論文献では撹拌の必要性は自明のものと想定されている（Yardumian D.A., J. Clin. Pathol. 39, 1986, 701-712; Bick R.L., Thrombosis and Hemostasis for the Clinical Laboratory, II部，15, 1995, 1-38）。
【０００９】
撹拌は多分、衝突の機会の増大により巨大凝集体と呼ばれるより大きな凝集塊がもたらすものと思われる。巨大凝集体は、凝集計における減衰の低下を招く血小板の凝集体である。それらは、減衰を変化させないかあるいは増大させることもある微小凝集体（Kitek A. & Bredding K., 1980, Thromb & Haemost 44, 3, 154-158）より明らかに大きい。２〜３個の血小板からなる微小凝集体は、撹拌を行わなくても生じる（Longmire K. & Frojmovic M. Biophys. J. 1990, 58(2): 299-307）。しかしながら、これらの微小凝集体は慣用の凝集計では見ることができない（Toghiら, Thromb Haemost 1996, 75(5): 38-43）。
【００１０】
巨大凝集体の形成はまた、フォンビルブラントリストセチン補因子テストにおいても、新鮮な多血小板血漿中での血小板の凝集ときわめて類似して進行する。リストセチン補因子テストでは固定血小板へのフォンビルブラントタンパク質とリストセチンを含む血漿の添加により凝集が誘発される（Weiss H.J.ら, 1973, J. Clin. Invest. 52, 2708-2716）。リストセチン補因子テストにおける撹拌を伴う濁度の測定もまた、主として巨大凝集体の形成を示すものである（Kitek A. & Breddin K., 1980, Thromb & Haemost 1980, 44, 3, 154-158; Toghiら, 1996, 75(5): 38-43）。
【００１１】
本発明は、したがって、血小板の凝集を連続的な撹拌を行わないでも測定可能にする測定方法を見いだすことの目的に基づくものであった。
【００１２】
【発明の開示】
この目的は、血小板好ましくは生理学的に活性化された血小板または固定血小板の反応混合物を第一の反応相において他の試験混合物成分と混合し、第一相に続く第二の反応相においてはそれほど激しくは混合せずまたは全く混合しないで血液血小板の凝集を測定する本発明の方法によって達成される。血小板の凝集は、好ましくは第一の反応に続く第二の反応相において測定される。さらに、本発明の好ましい実施態様は、特許請求の範囲の請求項２〜１７に詳細に記載される。
【００１３】
驚くべきことに、巨大凝集体の形成には連続的な撹拌は必ずしも必要ではなく、これに反し、巨大凝集体の形成の誘発には、血小板アクティベーターの添加後短時間の撹拌で十分であることが発見されたのである。。巨大凝集体の形成は誘発相後、単にブラウン拡散の作用のみによって起こる。
【００１４】
巨大凝集体の形成の誘発は様々なアクティベーターの使用により可能である（図１）。このようなアクティベーター、たとえばリストセチン、コラーゲン、ＡＤＰまたはエピネフリンは、血小板の凝集における分野の熟練者には十分に周知である。様々なアクティベーターの機能モードおよびそれらの受容体の要約は、たとえば Blockmans D.ら, 1955, Blood Review 9: 143-155 に見いだされる。ブラウン拡散による巨大凝集体の形成の反応速度は、異なるアクティベーターによって広範囲に変動する。一方、微小凝集体が他の微小凝集体または単一血小板と衝突する頻度は巨大凝集体の形成に重要である。他方、衝突が「有効」であること、一部は、活性化の状態、荷電状態、仮足のサイズおよび数、ならびに多数の他のパラメーターによって果たされることが重要である。以下アゴニストとも呼ばれるアクティベーターによりもたらされる活性化の進行は広範に変動するので、撹拌器の停止後、とくに巨大凝集体形成の結果が様々なアゴニストによって広く変動する理由は理解できる。撹拌の停止直後における活性化の状態は、以後の反応の進行程度に確実に重要なパラメーターである。
【００１５】
凝集の慣用的測定（連続的撹拌）および凝集の誘発測定（開始時のみの撹拌）はいずれも、血小板の活性化の測定に適当である。この目的では、たとえばアゴニストの濃度依存性および多血小板血漿の熟成の両者が検討されている。凝集の速度は、連続的な撹拌を行わないと低レベルである。しかしながら、アゴニストＡＤＰの濃度における変化および多血小板血漿の熟成（室温）に対する応答は、きわめて類似することが示されている（図７）。
【００１６】
驚くべきことに、撹拌は、巨大凝集体の形成を可能にするのみでなく、反対の反応、巨大凝集体の破壊にも関与することが見いだされた。通常、５〜１０分後である凝集反応の見かけ上の終点は実際、巨大凝集体の形成と破壊の間の平衡状態の可能性がある。これは、通常のｖＷＦ：ＲＣｏ（フォンビルブラントリストセチン補因子）テストにおける反応の大部分の完了後に撹拌を停止した場合から明らかになる。短時間後、大きな減衰の低下があることは、以下超凝集体と呼ぶ、とくに大きな巨大凝集体の形成を指示する（図２）。減衰の低下はきわめて穏やかに５０rpm（１分あたりの回転数）で撹拌した場合とほぼ同じ大きさであり、これは減衰の低下が、たとえば凝集体の沈降によってもたらされるのみではないことを明らかにする。ｖＷＦ：ＲＣｏテストにおける血小板はホルマリンで固定されていることから、遅延後に開始される生化学反応が凝集体の形成をもたらすことも妨げられる。
【００１７】
本発明との関連では、撹拌はまた、液体を混合するために熟練した研究者に知られている他の方法、たとえば撹拌、振盪、超音波処理または振動のような方法による混合を意味する。混合はまた、遠心分離アナライザーにおける揺動またはピペッターを通したポンプの作動もしくは反応容器内への試薬の強制添加による反応混合物の循環によっても影響を受けることがある。
【００１８】
本発明の方法において好ましい撹拌速度は２００〜２０００rpm、とくに好ましくは４００〜１２００rpm、とくにきわめて好ましくは４００〜８００rpmである。
【００１９】
超凝集体の形成は、比較的短時間（たとえば３０秒）後にはじめて誘発される（図３）。
【００２０】
純粋な拡散により可能になる超凝集体形成の速度および終点は、撹拌によってもたらされる凝集体形成のように、フォンビルブラント濃度依存性である（図４、標準ヒト血漿希釈液）。これは、反応混合物を短時間撹拌した（または他の方法で混合した）のち、それからはじめて減衰を測定するような、凝集体の測定方法を可能にする。数秒のきわめて短い撹拌時間ごとに、超凝集体の形成を誘発することができる（図５）。これらの短時間でもリストセチン補因子テストにおける濃度依存性があり、測定の精度は長い撹拌時間による場合に匹敵する（図６）。
【００２１】
これは、混合物の適切な再現性のある混合が行われ、ついで凝集体の形成が、たとえば濁度法または比濁法で測定されるすべての自動化アナライザーにリストセチン補因子テストおよび血小板凝集を適用することを可能にする。評価は速度論的にもしくは他の（たとえば開始および／または終末点）方法のいずれかまたは他の組み合わせ方法によっても可能である。
【００２２】
血小板凝集の安定性は、本発明の方法における凝集を連続的撹拌による同種の測定と比較することによって確立することもできる。不安定な凝集体では連続的撹拌による凝集体の形成に比較して、連続的撹拌を行わない場合は、比較的広範な凝集体の形成がある。同様に、全く撹拌を行わない場合の凝集体の形成と短時間もしくは連続的な撹拌を行った場合の凝集体の形成の比が重要な場合がある。この場合フロー過程の程度の様々な生理学的条件下における重要性については、活性化および凝集体形成ならびに血小板凝集体の安定性に関する付加的な重要な診断情報が得られる可能性がある。したがって、リストセチン補因子テストにおいて、フォンビルブラント因子、または他の血漿成分の安定な凝集体を形成する能力を検討することが可能である。
【００２３】
更なる可能性は、撹拌と撹拌を行わない交互の相による凝集体の産生および脱凝集を測定することである。これは、このような反応の動態について重要な情報を収集することを可能にする。
【００２４】
能動的な混合の期間は、主としてアッセイの性質に依存し、たとえば、血小板凝集の測定には１０〜６０秒であり、リストセチン補因子テストにおいては５〜６０秒であり、一般には総測定時間の５０％より短く、好ましくは総測定時間の１〜４０％、とくに好ましくは２〜２５％といわれている。
【００２５】
リストセチン補因子テストにおける凝集体の形成は生理学的に不活性な血小板で起こる。したがって、本発明の方法において、その表面の受容体分子が直接的または間接的にリガンドを介して血小板または他の粒子の凝集体形成を仲介する他の粒子を用いることも可能にする。
【００２６】
【実施例】
以下の実施例は本発明の単なる例示を意図するものであり、いかなる意味においても本発明を限定するものではない。
【００２７】
実施例１
アゴニストとしてリストセチンを用いる血小板凝集の測定（図１ａ）
１３５μｌの多血小板血漿を１５μｌのリストセチン溶液（１５mg／ml）と混合し、６００rpmで２０〜４０秒間撹拌した。撹拌器を停止したのち評価を行った。評価には凝集の最大速度（減衰低下のＶmax）を撹拌器の停止後に測定した
（Schreiner,W.ら, Comput.Biol.Med., Vol.21, No.6, 435-441, 1991）。
【００２８】
実施例２
アゴニストとしてコラーゲンを用いる血小板凝集の測定（図１ｂ）
１３５μｌの多血小板血漿を１５μｌのコラーゲン溶液（１５mg／ml）と混合して、６００rpmで２０〜４０秒間撹拌した。撹拌器を停止したのち評価を行った。評価には凝集の最大速度（減衰低下のＶmax）を撹拌器の停止後に測定した。
【００２９】
実施例３
アゴニストとしてエピネフリンを用いる血小板凝集の測定（図１ｃ）
１３５μｌの多血小板血漿を１５μｌのエピネフリン溶液（１５mg／ml）と混合し、６００rpmで２０〜４０秒間撹拌した。撹拌器を停止したのち評価を行った。評価には凝集の最大速度（減衰低下のＶmax）を撹拌器の停止後に測定した。
【００３０】
実施例４
アゴニストとしてＡＤＰを用いる血小板凝集の測定（図１ｄ）
１３５μｌの多血小板血漿を１５μｌのＡＤＰ溶液（１５mg／ml）と混合して、６００rpmで２０〜４０秒間撹拌した。撹拌器を停止したのち評価を行った。評価には凝集の最大速度（減衰低下のＶmax）を撹拌器の停止後に測定した。
【００３１】
実施例５
アゴニストとしてアラキドン酸を用いる血小板凝集の測定（図１ｅ）
１３５μｌの多血小板血漿を１５μｌのアラキドン酸溶液（１５mg／ml）と混合し、６００rpmで２０〜４０秒間撹拌した。撹拌器を停止したのち評価を行った。評価には凝集の最大速度（減衰低下のＶmax）を撹拌器の停止後に測定した。
【００３２】
実施例６
２００秒の撹拌時間後のフォンビルブラントリストセチン補因子活性の測定（図２）
２０μｌの血漿を２０μｌのイミダゾール緩衝液およびフォンビルブラント試薬（Dade Behring, Marburg, 約１.２×１０6 ホルマリン−固定血小板／μl，１.２mg／ml リストセチン）１５０μｌと混合し、６００rpmで２００秒間撹拌した。撹拌器を停止したのち評価を行った。評価には凝集の最大速度（減衰低下のＶmax）を撹拌器の停止後に測定した。
【００３３】
実施例７
３０秒の撹拌時間後のフォンビルブラントリストセチン補因子活性の測定（図３）
２０μｌの血漿を２０μｌのイミダゾール緩衝液およびフォンビルブラント試薬（Dade Behring, Marburg, 約１.２×１０6 ホルマリン−固定血小板／μl，１.２mg／ml リストセチン）１５０μｌと混合し、６００rpmで３０秒間撹拌した。撹拌器を停止したのち評価を行った。評価には凝集の最大速度（減衰低下のＶmax）を撹拌器の停止後に測定した。
【００３４】
実施例８
３０秒の撹拌時間後、標準ヒト血漿希釈液のフォンビルブラントリストセチン補因子活性の測定（図４）
２０μｌの血漿をイミダゾール緩衝液により様々なレベルに希釈し（１００％＝非希釈）、さらに２０μｌのイミダゾール緩衝液ならびにフォンビルブラント試薬（Dade Behring, Marburg, 約１.２×１０6 ホルマリン−固定血小板／μｌ，１.２mg／ml リストセチン）１５０μｌと混合し、６００rpmで３０秒間撹拌した。撹拌器を停止したのち評価を行った。評価には凝集の最大速度（減衰低下のＶmax）を撹拌器の停止後に測定した。
【００３５】
実施例９
５〜６０秒の撹拌時間後のフォンビルブラントリストセチン補因子活性の測定（図５）
４０μｌの血漿を１００μｌのフォンビルブラント試薬（Dade Behring, Marburg，約２.４×１０6 ホルマリン−固定血小板／μｌ，２.４mg／ml リストセチン）１００μｌと混合し、６００rpmで５、１０、２０、４５または６０秒間撹拌した。評価には凝集の最大速度（減衰低下のＶmax）を撹拌器の停止後に測定した。
【００３６】
実施例１０
５〜６０秒の撹拌時間後に、標準ヒト血漿希釈液でプロットした検量線の確立（図６）
４０μｌの標準ヒト血漿（約１００％ｖＷＦ）をイミダゾール緩衝液（５０、２５、１０、５、１％レベル）で希釈し、フォンビルブラント試薬（Dade Behring, Marburg, 約２.４×１０6 ホルマリン−固定血小板／μｌ，２.４mg／ml リストセチン）１００μｌと混合し、６００rpmで５、１０、２０、４５または６０秒間撹拌した。撹拌器を停止したのち評価を行った。評価には凝集の最大速度（減衰低下のＶmax）を撹拌器の停止後に測定した。
【００３７】
実施例１１
連続撹拌してまたはしないで血小板凝集のＡＤＰ濃度依存性の測定（図７ａ）
１３５μｌの多血小板血漿を１５μｌのＡＤＰ溶液（１０または２５μＭ）と混合して、６００rpmで２０秒間連続的にまたは２０秒間撹拌した。評価は混合後直ちに（連続的撹拌）または撹拌器の停止２０秒後に行った。評価には凝集の最大速度（減衰低下のＶmax）を測定した。
【００３８】
実施例１２
連続的に撹拌しまたはしないで、アゴニストとしてＡＤＰでの凝集による、多血小板血漿の室温保存による活性の喪失の測定（図７ｂ）
１３５μｌの多血小板血漿を１５μｌのＡＤＰ溶液（２００μＭ）と混合し、６００rpmで連続的にまたは２０秒間撹拌した。評価は混合後直ちに（連続的撹拌）または撹拌器の停止２０秒後に行った。評価には凝集の最大速度（減衰低下のＶmax）を測定した。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】リストセチン誘発血小板凝集の測定。
【図１ｂ】コラーゲン誘発血小板凝集の測定。
【図１ｃ】エピネフリン誘発血小板凝集の測定。
【図１ｄ】ＡＤＰ誘発血小板凝集の測定。
【図１ｅ】アラキドン酸誘発血小板凝集の測定。
【図２】２００秒の撹拌時間後のフォンビルブラントリストセチン補因子活性の測定。
【図３】３０秒の撹拌時間後のフォンビルブラントリストセチン補因子活性の測定。
【図４】３０秒の撹拌時間後の標準ヒト血漿希釈液のフォンビルブラントリストセチン補因子活性の測定。
【図５】５〜６０秒の撹拌時間後のフォンビルブラントリストセチン補因子活性の測定。
【図６】５〜６０秒の撹拌時間後の標準ヒト血漿希釈液でのプロットによる検量線の確立。
【図７】ａは連続撹拌してまたはしないで行った血小板凝集のＡＤＰ濃度依存性の測定、そしてｂは連続撹拌してまたはしないで行ったアゴニストとしてＡＤＰでの凝集による、多血小板血漿の室温保存における活性の喪失の測定。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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