(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式（Ｉ）
【化１】
0004686720.tif 000003
で表される化合物を有効成分とするチロシナーゼ活性阻害剤。
【請求項２】
ラム酒粕から得られたものである請求項第１項記載のチロシナーゼ阻害活性剤。
【請求項３】
ラム酒粕を、スチレン系合成吸着剤処理、シリカゲルカラムクロマトグラフ処理、ゲルろ過処理および液体クロマトグラフ処理から選ばれる処理の２以上を組み合わせた精製処理により得られたものである請求項第１項または第２項記載のチロシナーゼ阻害活性剤。
【請求項４】
請求項第１項ないし第３項の何れかの項記載のチロシナーゼ阻害活性剤を含有する皮膚外用剤。
【請求項５】
請求項第１項ないし第３項の何れかの項記載のチロシナーゼ阻害活性剤を含有する美白化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシナーゼ活性阻害剤に関し、更に詳細には、メラニン生成に関係するチロシナーゼを効果的に阻害するチロシナーゼ阻害剤およびこれを利用する美白化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、皮膚の日焼けや、シミ、そばかす等を防ぐ目的で、数多くの美白化粧料が市販されている。これらの美白化粧料には、色素物質であるメラニンの生成を防ぐ成分が含まれているが、その多くは、メラニン生成の律速酵素であるチロシナーゼを阻害するチロシナーゼ活性阻害物質である。
【０００３】
このチロシナーゼ阻害物質の代表的なものとしては、コウジ酸やアルブチン等が知れている。このうち、コウジ酸は、コウジカビの培養発酵物中に生産されるものであり、そのチロシナーゼ阻害活性は高いが、経口摂取による発癌性の報告や、白血球減少作用等の副作用の報告もあり、安全性が十分に確保されているとは言い難いものである。また、アルブチンは、ウワウルシやコケモモの抽出物中から得ることができる化合物で、安全性はほぼ確認されているものであるが、そのチロシナーゼ阻害活性は、コウジ酸に比べ弱いという問題があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、優れた活性を有しながら安全性の高い、新しいチロシナーゼ活性阻害剤の開発が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検索を行った結果、ラム酒製造後の廃棄物であるラム酒粕は、チロシナーゼ阻害活性を有することを見出した。そして更に研究を進めたところ、このチロシナーゼ阻害活性を担う物質を見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、次の式（Ｉ）
【化３】
0004686720.tif 000002
で表される化合物を有効成分とするチロシナーゼ活性阻害剤である。
【０００７】
また本発明は、ラム酒粕を、スチレン系合成吸着剤処理、シリカゲルカラムクロマトグラフ処理、ゲルろ過処理および液体クロマトグラフ処理から選ばれる処理の２以上を組み合わせた精製処理に付すことを特徴とする上記式（Ｉ）で表される化合物の製造方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のチロシナーゼ活性阻害剤の有効成分である、化合物（Ｉ）は、例えば、広く使用されているアルブチンと比べ、より強いチロシナーゼ活性阻害作用を有する物質である。しかも、古くから食品として利用されているサトウキビから得られるものであるため、安全性も高いものである。
【０００９】
しかも、ラム酒粕という廃棄物中から得ることができるため、コストもきわめて低いものである。
【００１０】
従って、本発明のチロシナーゼ活性阻害剤は、美白成分として、皮膚外用剤、美白化粧料などに利用することができるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の、前記式（Ｉ）で得られる化合物は、インペラネン（Imperanene;4-hydroxy-［2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)ethenyl］-3-methoxy-benzenpropanol）と命名された公知化合物である。
【００１２】
過去にインペラネンのグルコース配糖体が黒糖から分離されているので、上記化合物は、サトウキビに由来するインペラネン配糖体がラムの製造中に加水分解されることにより生成され、ラム酒粕に含まれたと考えられる。
【００１３】
上記化合物（Ｉ）（インペラネン）は、その性質を考慮の上、適切な各種カラムクロマトグラフィーを組み合わせることにより、例えば、スチレン系合成吸着剤処理、シリカゲルカラムクロマトグラフ処理、ゲルろ過処理および液体クロマトグラフ処理から選ばれる処理の２以上を組み合わせた精製処理に付すことによりラム酒粕から分離取得することができる。このようなラム酒粕から化合物（Ｉ）を得るための具体的な手段の例を示せば次の通りである。
【００１４】
まず、ラム酒粕を遠心分離し、その上清をろ液として得る。このろ液を、スチレン系合成吸着剤に吸着させた後、適当な溶媒で溶出する。使用するスチレン系合成吸着剤としては、アンバーライト（Amberlite）ＸＡＤタイプ（ローム・アンド・ハース社製）や、ＨＰタイプ（三菱化成製）のものを挙げることができ、溶出溶媒としては、エタノール、メタノール等の低級アルコールやアセトン、あるいはこれと水との混合液を挙げることができる。
【００１５】
次いで、上記のようにして得られた画分のうち、チロシナーゼ阻害活性が強い画分を選択し、これをシリカゲルカラムに吸着させた後、適当な溶媒により溶出させる。このクロマトグラフ処理において、使用する溶媒としては、例えば、酢酸エチル−メタノール、クロロホルム−メタノール等の混合溶媒を挙げることができ、これらは段階的ないしはグラジュエントで混合比を変えたものを使用することが好ましい。
【００１６】
更に、上記シリカゲルカラム処理により得られた画分のうち、チロシナーゼ阻害活性が強い画分を選択し、これをゲルろ過する。このゲルろ過においては、トヨパール（TOYOPEARL）ＨＷタイプ（東ソー社製）、セファデックス（Sephadex）ＬＨタイプ（ファルマシア社製）等が使用され、また、溶媒としては、メタノール等の低級アルコールと水の混液が使用される
【００１７】
最後に、上記のゲルろ過処理により得られた画分のうち、チロシナーゼ阻害活性が強い画分を選択し、これを液体クロマトグラフにより処理する。この液体クロマトグラフにおいては、ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐタイプ（メルク社製）等の逆相系カラムが使用され、溶媒としては、メタノール等の低級アルコールと水の混液が使用される。
【００１８】
なお、本発明の化合物（Ｉ）は、ＯＤ４５０付近に吸収を有するので、各工程において紫外部の吸光度を測定することでモニターすることが可能である。
【００１９】
以上のようにして得られる本発明のチロシナーゼ活性阻害剤は、常法に従い、皮膚外用剤や美白化粧料に配合して使用することができる。
【００２０】
例えば、美白化粧料とする場合は、公知の化粧料基剤に、例えば、０.０００１ないし１０質量％程度配合し、常法に従って、化粧液、乳液、クリーム、ペーストとすればよい。
【実施例】
【００２１】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【００２２】
参  考  例  １
ヒト由来粗チロシナーゼによる阻害活性測定法
（１）粗チロシナーゼ溶液の調製
ヒト由来チロシナーゼは、悪性黒色腫由来の永代色素生産株ＨＭＶ−ＩＩから調製した。すなわち、ダルベッコ変法イーグル培地とハムＦ１２培地の等量混合培地（ＤＭＥＭ／Ｈｕｍ  Ｆ−１２）に１０％ウシ胎児血清を添加し、５％炭酸ガス濃度、３７℃にて継代および培養を行った。３×１０５個の密度で９０ｍｍデッシュに細胞を蒔き、これに１００μＭの終濃度のドーパを添加し、１０日間培養した。５日目および８日目に１００μＭの終濃度のドーパを含む培地で交換を行った。
【００２３】
培養細胞はトリプシン処理にて回収し、１×１０７個の細胞に対して１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ（−）を１ｍｌ加え、４℃下で６０分間超音波処理を行ない細胞を破壊した。この細胞破壊液は１２０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、さらに０.０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ６.８）を等量加え、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、そのうちの上清を粗チロシナーゼ溶液として用いた。
【００２４】
（２）チロシナーゼ阻害活性
チロシナーゼ阻害活性は９６穴マイクロプレートを用いて行った。各濃度に調製した試料溶液５０μｌと、１.５ｍｇ／ｍｌのｌ−ドーパ溶液４０μｌおよび０.０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ６.８）１００μｌを加え、攪拌後、３７℃で１０分間プレインキュベートを行ない、粗チロシナーゼ溶液５０μｌを加えて攪拌した。その後、３７℃で９０分間反応を行い、マイクロプレートリーダーにて４７０ｎｍの吸光度を測定した。
【００２５】
実  施  例  １
ラム酒粕からチロシナーゼ阻害物質の取得方法
材料には２００４年１１月２５日に、ヘリオス酒造株式会社にておこなったラム酒蒸留後に残るラム酒粕を原料として用いた。このラム酒粕は分離操作を行うまで冷凍にて保存した。
【００２６】
上記ラム酒粕８００ｍｌを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ，４℃，２０分）し、その上清を吸引ろ過（ＡＤＶＡＮＴＥＣ  Ｎｏ.５Ｂ）した。ろ液はＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−１１８０を充填したガラスカラム（１５０ｍｌ）に通液し、続けて精製水、２５％メタノール、５０％メタノールおよび１００％メタノールを各６００ｍｌ順次流した。
【００２７】
このうちの１００％メタノール溶出液をエバポレートにて濃縮し（収量１.０４ｇ）、シリカゲルカラム（Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−１００，カラム  ３００ｍｌ）に通液、吸着させた後、酢酸エチル−メタノールを、それらの混合比が１０：０、７：３、５：５、３：７および０：１０となるようにした溶出液各６００ｍｌで溶出し、それぞれの溶出液ごとに５つのフラクション（Ｆｒ１〜Ｆｒ５）に分画した。
【００２８】
このうちチロシナーゼ阻害活性の高かったＦｒ１（１６８ｍｇ）は、ＨＬＢカートリッジ（ウォータース社製）にて７０％メタノールで溶出される画分を得て、これを更にＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＨＷ‐４０Ｃを充填したガラスカラム（カラムサイズ１.２ｃｍ×８０ｃｍ）に通液、吸着させた後、６０％メタノール（１２０ｍｌ）と８０％メタノール（１２０ｍｌ）を用いるグラジュエントにて溶出した。溶出液は３ｇずつ分画し、紫外部の吸光度にて溶出物をモニターした。
【００２９】
このうち２５から２７本目にて溶出するピークのＦｒ１−５（１１ｍｇ）にチロシナーゼ阻害活性が認められたため、この画分をさらにＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ  ＲＰ−１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）にて４０％メタノールにて溶出した。分画は３ｇずつ行い、分離状況は紫外部の吸光度を測定することでモニターした。この結果、８０本付近のもっとも大きなピーク（Ｆｒ１−５−２，５.２ｍｇ）に強いチロシナーゼ阻害活性が認められた。
【００３０】
活性が認められたＦｒ１−５−２をＨＰＬＣにて分析した。ＨＰＬＣ条件は、カラムにＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＭＧ−５（４.６×２５０ｍｍ，野村化学）、溶出液に７０％メタノールから１００％メタノールの３０分直線グラジエント、流速０.７ｍｌ／ｍｉｎ、検出３００ｎｍとした。この結果、溶出時間６.５９ｍｉｎに単一ピークとしてチロシナーゼ阻害活性物質が得られ、同画分が単一成分として精製されたことを確認した。なお同化合物のラム酒粕に対する収率は６.５ｐｐｍと算出された。
【００３１】
実  施  例  ２
チロシナーゼ阻害活性物質の構造解析
実施例１で得たチロシナーゼ阻害活性物質について、ＵＶ−ＶＩＳスペクトル、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲやＨＭＱＣ、ＨＭＢＣなどの各種２次元ＮＭＲによるスペクトルとエレクトロスプレーイオン（ＥＳＩ）マススペクトルのデータを解析することにより構造を決定した。この結果分離化合物は既知化合物のインペラネン（ｉｍｐｅｒａｎｅｎｅ，分子量３３０，Ｃ１９Ｈ２２Ｏ５）であると同定された。
【００３２】
実  施  例  ３
分離化合物のヒトチロシナーゼ阻害活性
同定されたインペラネンはヒトチロシナーゼ阻害活性を、比較としてアルブチンおよびコウジ酸とともに測定した。その結果、インペラネンのＩＤ５０は、１.１１ｍＭと算出され、その値はコウジ酸の０.３５ｍＭに比較して弱い値であったが、アルブチンの１.４３ｍＭより強い活性が認められた。
【００３３】
なお、基質濃度と阻害剤の濃度をさまざまに変化させたときの吸光度値をグラフ化し、ラインウェーバー・バークプロットを作成したところ、得られた３本の回帰直線はＹ軸上に集約した。このことからインペラネンのチロシナーゼ活性阻害の機構は、基質であるドーパとの競争阻害であることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明で使用する化合物（Ｉ）（インペラネン）のヒトチロシナーゼの阻害活性は、アルブチンより強いものであった。
【００３５】
従って、本発明のチロシナーゼ阻害活性剤は、皮膚外用剤や美白化粧料の有効成分として有利に使用することができるものである。