(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７９３４として寄託されたＲＵ．ＭＢＩ．１９９７である微生物コンソーシア。
【請求項２】
請求項１記載の微生物コンソーシアを用いることを特徴とする多環芳香族化合物汚染環境の浄化法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発ガン性物質ベンゾピレンなどの多環芳香族化合物を分解することのできる微生物コンソーシア、及びそれを用いた環境の浄化法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多環芳香族化合物（polycyclic aromatic hydrocarbon）は石油の流出、化石燃料の不完全な燃焼や化学工業プロセスの副産物として、環境中に放出される（Cerniglia, C. E. 1992. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Biodegradation 3:351-364.）。多くの多環芳香族化合物が人体に悪影響を及ぼすことが知られているが、そのなかでも特にベンゾピレンは変異原性や発ガン性が高いことで知られている。物理化学的処理では、環境中の低濃度の多環芳香族化合物を選択的に除去することは不可能であるので、汚染された土壌などを他へ運搬するなどの非常にコストのかかる処置がとられる。一方、ベンゾピレンなど多環芳香族化合物を分解する微生物も知られており（Cerniglia, C. E. 1992. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Biodegradation 3:351-364.）、それらを用いた環境修復の研究も行われている（Boonchan, B., M. L. Britz, and G. A. Stanley. 2000. Degradation and Mineralization of High-Molecular-Weight Polycyclic Aromatic Hydrocarbons by Defined Fungal-Bacterial Cocultures. Appl. Environ. Microbiol. 66:1007-1019）。しかし、それら微生物の分解速度の遅さゆえに（Kanaly, R. A., and S. Harayama. 2000. Biodegradation of High-Molecular-Weight Polycyclic Aromatic Hydrocarbons by Bacteria. J. Bacteriol. 182:2059-2067.）、生物学的環境修復は実用に至っていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ベンゾピレンなどの多環芳香族化合物を速やかに分解することのできる微生物を得ることができれば、実用的な生物学的環境修復の方法を確立できる。本発明は、このような微生物を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、土壌中から多環芳香族化合物を速やかに分解することのできる微生物コンソーシアを見出し、この知見から本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の（１）〜（１０）の微生物を少なくとも１種含む微生物コンソーシアが、工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７９３４として寄託されたＲＵ．ＭＢＩ．１９９７である微生物コンソーシアである。
【０００５】
（１）配列番号１記載の塩基配列と95％以上相同な塩基配列で表される16S rRNA遺伝子を持つ微生物（以下「（１）の微生物」という）
（２）配列番号２記載の塩基配列と95％以上相同な塩基配列で表される16S rRNA遺伝子を持つ微生物（以下「（２）の微生物」という）
（３）配列番号３記載の塩基配列と95％以上相同な塩基配列で表される16S rRNA遺伝子を持つ微生物（以下「（３）の微生物」という）
【０００６】
（４）配列番号４記載の塩基配列と95％以上相同な塩基配列で表される16S rRNA遺伝子を持つ微生物（以下「（４）の微生物」という）
（５）配列番号５記載の塩基配列と95％以上相同な塩基配列で表される16S rRNA遺伝子を持つ微生物（以下「（５）の微生物」という）
（６）配列番号６記載の塩基配列と95％以上相同な塩基配列で表される16S rRNA遺伝子を持つ微生物（以下「（６）の微生物」という）
【０００７】
（７）配列番号７記載の塩基配列と95％以上相同な塩基配列で表される16S rRNA遺伝子を持つ微生物（以下「（７）の微生物」という）
（８）配列番号８記載の塩基配列と95％以上相同な塩基配列で表される16S rRNA遺伝子を持つ微生物（以下「（８）の微生物」という）
（９）配列番号９記載の塩基配列と95％以上相同な塩基配列で表される16S rRNA遺伝子を持つ微生物（以下「（９）の微生物」という）
【０００８】
（１０）配列番号１０記載の塩基配列と95％以上相同な塩基配列で表される16S rRNA遺伝子を持つ微生物（以下「（１０）の微生物」という）
また、本発明は上記の微生物コンソーシアを用いることを特徴とする多環芳香族化合物汚染環境の浄化法である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の微生物コンソーシアは、上記（１）〜（１０）の微生物を含むものである。（１）〜（１０）の微生物は、少なくとも１種含まれればよいが、6種以上含まれるのが好ましく、8種以上含まれるのが更に好ましく、１０種すべてが含まれるのが最も好ましい。
【００１０】
（１）〜（１０）の微生物の16S rRNAは、それぞれ配列番号１〜１０記載の塩基配列と95％以上相同であるが、97％以上相同であることが好ましく、100％相同であることが最も好ましい。
本発明の微生物コンソーシアの一例としては、RU.MBI.1997を挙げることができる。この微生物コンソーシアは、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM P-17934として寄託されている（寄託日：平成１２年６月３０日）。
【００１１】
本発明の微生物コンソーシアは、例えば、多環芳香族化合物に対する分解活性、及び／又は16S rRNA遺伝子の塩基配列を指標として、土壌サンプルなどをスクリーニングすることにより得ることができる。また、配列番号１〜１０記載の塩基配列と一定の相同性を示す16S rRNAを持つ微生物を混合して培養することによっても本発明の微生物コンソーシアを得ることができる。
【００１２】
本発明の微生物コンソーシアは、ベンゾピレンなどの多環芳香族化合物に対し分解能を持つので、このような化合物で汚染された環境の浄化に利用することができる。例えば、本発明の微生物コンソーシアを多環芳香族化合物によて汚染された土壌に添加することにより、この土壌を浄化することが可能である。この際、添加する微生物コンソーシアの量は、浄化能力を発揮できる範囲内であれば特に限定されないが、1mg protein /L以上であることが好ましく、10mg protein /L以上であることが更に好ましい。本発明の微生物コンソーシアの分解能は、軽油などの分解誘導因子が存在することによりはじめて発揮されるので、環境中に分解誘導因子が既に存在する場合を除き、分解誘導因子と共に環境中に添加される。添加する分解誘導因子は、微生物コンソーシアの分解能を発揮させ得る範囲内であれば特に限定されないが、分解誘導因子として軽油を用いるのであれば、浄化対象とする多環芳香族化合物の２倍（重量）以上とするのが好ましく、100倍〜200倍とするのが更に好ましい。
【００１３】
【実施例】
〔実施例１〕ベンゾピレン分解実験
ベンゾピレン分解能のある微生物コンソーシアを含む土壌（Kanaly, R., R. Bartha, S. Fogel, and M. Findlay. 1997. Biodegradation of [14C]benzo[a]pyrene added in crude oil to uncontaminated soil. Appl. Environ. Microbiol. 63:4511-4515.）1gを1% (w/v)の航空燃料（aviation fuel, Exxon, Texas）と80 mg/Lの[7-14C] ベンゾピレンを含むStanier's Basal Medium（SB培地）300 mlに植菌し、気相中の14CO2分圧が安定した時点で、10 mlの培養液を新しいSB培地に植え継いだ。これを繰り返し、濃度上昇速度が一定し達した時点のコンソーシア（培養液）を以下の実験に用いた。なお、SB培地の組成は、下表の通りである。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
300 mlのフラスコに、24.5 mlのSB培地、0.5 mlの培養液、10 mg/Lの[7-14C] ベンゾピレン、0.2% (w/v)のディーゼル油（Diesel oil, Exxon, Texas）を入れ、28℃、300 rpmで震盪した。発生する14CO2の分圧を以前に記した方法（Kanaly, R., R. Bartha, S. Fogel, and M. Findlay. 1997. Biodegradation of [14C]benzo[a]pyrene added in crude oil to uncontaminated soil. Appl. Environ. Microbiol. 63:4511-4515.）により測定した。結果を、図１に示す。
【００１６】
図１に示すように、約14日で最初に添加したベンゾピレン由来の14Cの７割程度がCO2として気化していた。また、この時培養液中のベンゾピレンはほとんど消失していた。ディーゼル油を加えないコントロール実験では、CO2として気化した14Cの割合は、１割以下であった。
【００１７】
〔実施例２〕ベンゾピレン分解コンソーシア構成菌の解析
実施例１のベンゾピレン分解実験において、培養液の一部を適時採り、Muyzerらの方法（Muyzer, G., E. C. de Waal, and A. G. Uitterlinden. 1993. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis [DGGE] of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 59:695-700.）に従って、コンソーシア構成菌の16S rRNAのDGGE解析を行った。結果を図２に示す。図中の左から８つのレーンは実施例１のコントロールに対応する。
【００１８】
〔実施例３〕コンソーシア構成菌の16S rRNA遺伝子の配列決定
DGGEによって分離された10本のバンドを含むゲルを切り出し、そのゲル中に含まれるDNAの塩基配列を決定した（配列番号１〜配列番号１０）。
これらの配列についてデータベース検索（Gen Bank）を行った結果、各配列は下表に示す微生物の配列と高い相同性を示した。
【００１９】
【表２】
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【００２０】
【発明の効果】
本発明は、微生物コンソーシアを利用する新規な環境浄化法を提供する。この浄化方法によれば、有害な多環芳香族化合物を環境中から速やかに分解除去することができる。
【００２１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】14CO2として排出された14Cの割合を示す図
【図２】コンソーシア構成菌のDGGE解析の結果を示す図
【図１】
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【図２】
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