(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
縁（６８）によって限定された前面（６２）と後面（６３）を有する本体と、少なくとも１つの入口（２，３，４と５）と少なくとも１つの出口（７と８）とから成る反応カードにおいて、前記入出口の一方（２，３，４と５）と他方（７と８）が少なくとも１つの反応路によって互いに接続され、各反応路が少なくとも１つの流体（７０，７１，７２）のための管路（６４）の配管網と複数の弁（１１から３５および／または６１）からなり；
それぞれの弁（１１から３５および／または６１）が可撓性フィルム（６７）によって構成され、流体が通過するように変形を可能にするか、流体の通過を阻止するように圧縮手段と連動することができ、前記フィルム（６７）が、弁（１１から３５および／または６１）に相当する管路全体の周縁部の溝（７４）で前記カード（１）の後面（６３）に固定され；
カード（１）がその両面（６２および／または６３）の少なくとも１つの面に露出した管路（６４）を備え、管路（６４）が１つまたは複数の流体の輸送のための小断面と反応室の役割を果たす大断面の２つの異なる断面を有し；前面（６２）または後面（６３）のそれぞれの面が少なくとも１つのフィルム（４８，４９，６５，６６および／または６７）によって限定される、反応カード（１）。
【請求項２】
カード（１）の本体は一体で、圧縮手段（７５）が前記カード（１）に取り付けられ、一体化されるか、あるいはカード（１）の使用を可能にする装置の一部を構成することを特徴とする請求項１に記載のカード。
【請求項３】
管路（６４）の小断面と大断面の比は１：１．０１と１：１０の間、好適には１：１．０１と１：３の間に含まれることを特徴とする請求項１または２に記載のカード。
【請求項４】
カード（１）の前面（６２）の部位の全体または一部で管路（６４）が露出し、弁が前記カード（１）の後面（６３）の部位に存在することを特徴とする請求項１から３のいずれか１つに記載のカード。
【請求項５】
カード（１）の前面（６２）がこの面（６２）に露出しているすべての管路（６４）の部位に唯一のフィルム（６５）を備え、前記カード（１）の後面（６３）は：
・弁（１１から３５および／または６１）の部位に少なくとも１つの可撓性フィルム（６７）、
・少なくとも１つの疎水性フィルム（４８および／または４９）、また場合によっては
・後面（６３）の部位に露出している管路（６４）の部位に少なくとも１つのフィルム（６６）、
を備えていることを特徴とする請求項１から４のいずれか１つに記載のカード。
【請求項６】
１つまたは複数の可撓性フィルム（６７）、および１つまたは複数のフィルム（６５および／または６６）が唯一かつ同一のフィルムを構成することを特徴とする請求項６に記載のカード。
【請求項７】
管路（６４）は、全体または一部が、カード（１）の中心部分に限定され、疎水性のフィルタ（４８と４９）に組み合わされた、封止フィルタ（５０から６０）が前記カード（１）の辺の少なくとも１つの部位に限定され、弁（１１から３５および／または６１）が管路（６４）と封止フィルタ（５０から６０）の間に位置づけられることを特徴とする、ほぼ平行四辺形である請求項１から６のいずれか１つに記載のカード。
【請求項８】
縁（６８）がカード（１）の流体（７０，７１と７２）の入口（２，３，４と５）と出口（７と８）の全体を含んでいることを特徴とする請求項１から７のいずれか１つに記載のカード。
【請求項９】
１つまたは複数の入口（２，３，４と５）が縁（６８）を構成する辺の１つの上に存在し、１つまたは複数の出口（７と８）がこの縁（６８）の他の辺の上に存在することを特徴とする、ほぼ平行四辺形である請求項８に記載のカード。
【請求項１０】
１つまたは複数の入口（２，３，４と５）が１つまたは複数の出口（７と８）が存在する辺と反対の辺の上に存在することを特徴とする請求項９に記載のカード。
【請求項１１】
１つまたは複数の入口（２，３，４と５）および１つまたは複数の出口（７と８）が縁（６８）を構成する２つの短辺の上に存在することを特徴とするほぼ長方形である請求項１０に記載のカード。
【請求項１２】
リガンドを遊離するために場合によってはあらかじめ処理された、生物溶液（７０）を試験するために、次の順序で各種の生物学的過程が実施されることを特徴とする請求項１から１１のいずれか１つに記載の反応カードの使用：
・リガンドの捕捉
・溶出液（７２）内に捕捉したリガンドの採取
・採取したリガンドと、リガンドの処理を可能にする構造的機能的構成成分との混合、および
・処理リガンドの定性的および／または定量的検出。
【請求項１３】
核酸を遊離するために場合によってはあらかじめ処理された、生物溶液（７０）を試験するために、次の順序で各種の生物学的過程が実施されることを特徴とする、請求項１から１１のいずれか１つに記載の反応カードの使用：
・核酸の捕捉
・溶出液（７２）内に捕捉した核酸を採取
・採取した核酸と、これらの核酸の増幅を可能にする構造的機能的構成成分との混合、および
・増幅核酸の定性的および／または定量的検出。
【請求項１４】
カード（１）内の新しい場所で、あるいは別の装置に移した後、これらのリガンドまたはこれらの増幅産生物の分析をもってなる最後の過程が実施されることを特徴とする請求項１２または１３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１５】
捕捉されたリガンドまたは核酸は採取の前に少なくとも１つの洗浄液（７１）にかけられることを特徴とする請求項１２から１４のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１６】
捕捉および場合によっては洗浄が、Ｎが１と１０の間に含まれる、Ｎ回つづけて実施されることを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
リガンドまたはアンプリコンの分析を可能にするカード（１）内の室または別の装置に移す前にリガンドの処理または核酸の増幅が検出されることを特徴とする、請求項１２または１３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１８】
試験される溶液の処理を可能にする装置の後に、これらのリガンドの存在の分析を可能にする装置の前に、このカード（１）が使用されることを特徴とする、請求項１２または１３のいずれか１つに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は化学および／または生物反応をうまく行わせるための反応カードに関するものである。本発明はまた拡散の精製と増幅、およびその検出のためにかかるカードの利用にも関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
現状技術は文書ＵＳ−Ａ−４，５８５，６２３によって構成され、化学試験または免疫化学試験を単一の場所で迅速に実現するための装置を対象とする。この装置は、小型化が可能であり、試薬を含む複数の管、標本を含む１本の管と、反応を受けるもっと小さな管とから成る。それぞれの管はピストンに組み合わされているので、装置をプログラム式自動機械の中に挿入することができる。
【０００３】
小型化は可能だとしても、この装置は比較的嵩高く、前記装置とピストンを作動させることを可能にする各種のロッドの位置を備えなければならない。くわえて、かかる装置ではただ１つの反応しか実施できず、複数の反応を実施しなければならないときは、複数の装置、ならびにそれらに適切な試薬と標本を充填するための時間を見込まなければならない。
【０００４】
文書ＷＯ−Ａ−９７／２７３２４はカセット内に導入する１つまたは複数の標本のために入口と出口を有する複数の反応を平行して実施するためのカセットに関するものである。カセットのいくつかの区域は特殊構造で（Ｂｕｒｓａｐａｋ室、ピストン弁、玉弁）、連続する内部または外部の力の作用で、管路を開いたまま、あるいは閉じたままにしておくことができる。Ｂｕｒｓａｐａｋ室は液体の進行を阻止することができる疎水性フィルタに組み合わされることがある。
【０００５】
しかしながら、この構造にはＢｕｒｓａｐａｋ室の弁の構造に大きな問題点がある。これらの室はすべてフィルムを備え、反応カードに取り付ける前に予備成形しなければならない。この予備成形によってそれぞれの閉じたＢｕｒｓａｐａｋ室を静止位置に保つことができる（図２Ａと２Ｂ）。この室の開放は反応カード内に含まれる流体の圧力増加などの、内部作用によって（図２Ｃ）、または予備成形フィルムに対するピストンその他の圧力による圧力増加などの、外部作用によって（図２Ｄと２Ｅ）可能になる。したがって、それぞれのフィルムのこの予備成形は前記反応カードに設置する前に実現しなければならない。かかるフィルムの製造、貯蔵および輸送コストは平坦なままのフィルムよりもはるかに高い。くわえて、そのように備えられた反応カードの製造、貯蔵および輸送も容易にはならない。最後に、これらのフィルムの凸型形状は損傷しやすく、前記カードを後に使用するときに漏洩または過誤を招くことがある。
【０００６】
文書ＷＯ−Ａ−９７／０２３５７の複雑性に関しては、上述のカセットと同等の核酸診断装置を開示している。また図２ｂはきわめて多数の部品で構成された弁を示している。
したがって、この装置はＷＯ−Ａ−９７／２７３２４と同様の問題点がある。
【０００７】
特許出願ＷＯ−Ａ−９９／３３５５９は標本内に存在する核酸などの、特殊成分の分離カートリッジまたはカードを提案している。このためいくつかの室と管路が含まれる。これらの室には出発のときから使用される液体全体（溶出液、洗浄液、など）が含まれる。流体運動の制御はカード内に不規則に配置された弁によって、および流体の存在検出器によって実現される。これらの弁は流体ダイオードのように作動し、流体を一方向に流すが、反対方向には流さない。このために、外部から移動させることができる磁気円盤を使用する。検出器は電気的に外部に、あるいはカード内部のマイクロプロセッサに接続される。
【０００８】
このタイプのカードはとくに複雑であり、このカードの本体は積み重ねられた複数の要素、ここでは流体ダイオードのサンドイッチで構成されている。くわえて、これらの各種の積み重ねられた要素の間の気密性を確保することが望ましい。カードはさらに検出器、電線、磁石で作動する流体ダイオード、さらにはマイクロプロセッサを備えている。したがって、製造コストは膨大になり、これらすべての電気、磁気部品は前記カードの内部作動に影響するおそれがある。したがって、かかるカードは微小流体学にもとづく技術には全く適していない。カードの中に液体が存在するので時間的に貯蔵が制限され、熟練した操作員がこれらの液体を導入しなければならない。したがって、使用の柔軟性がかなり制限される。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明によれば、これらの問題全体に答える反応カードが提案される。かかるカードはその検出および／または定量化に１つまたは複数のアンチリガンドの使用を必要とする、１つまたは複数のリガンドの生物学的分析を提案している。分析技術の１つの応用例は、その形式を問わず、直接または競争分析による免疫試験に関するものである。もう１つの応用例は、標的核酸を含む任意の採取から検出および／または定量化に必要な作業全体を含む核酸の検出および／または定量化に関するものである。これら各種の作業の中で、溶解、流動化、濃縮、精製、核酸の酵素増幅過程、例えば、ＤＮＡチップまたはマーカ付きのプローブを用いる交雑過程を含む検出過程を挙げることができる。特許出願ＷＯ−Ａ−９７／０２３５７または番号ＦＲ９９／００１１１で出願人が提出した特許出願は核酸の場合に必要な様々な過程を明らかにしている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
このため、本発明は縁によって限定された前面と後面を有する本体と、少なくとも１つの流体のための、少なくとも１つの反応路を構成する配管網によって互いに接続された、少なくとも１つの入口と少なくとも１つの出口とから成る反応カードにおいて、１つまたは複数の流体が弁によってカード内で導かれ；それぞれの弁が流体の通過を可能にするか、流体の通過を阻止するための圧縮手段と連動する可撓性フィルムによって構成され、フィルムが弁によって当該管路全体の周縁の補強部位で前記カードの後面に固定され；カードがその両面の少なくとも１つの面に露出した管路を備え、管路が１つまたは複数の流体の輸送のための小断面と反応室の役割を果たす大断面の２つの異なる断面を有し；前面または後面のそれぞれの面が少なくとも１つのフィルムによって限定される反応カードに関するものである。
【００１１】
特定の実施態様によれば、カード本体は一体で、圧縮手段は前記カードに取り付けられるか、一体化され、あるいはカードの実施を可能にする装置の一部を構成する。
特定の実施態様によれば、小断面と大断面の比は１：１．０１と１：１０の間、好適には１：１．０１と１：３の間に含まれる。
同じく特定の実施態様によれば、カードの前面の部位の全体または一部で管路が露出し、弁は前記カードの後面の部位に存在する。
さらに特定の実施態様によれば、カードの前面はこの面に露出しているすべての管路の部位で唯一のフィルムを備え、前記カード後面には：
・弁の部位に少なくとも１つの可撓性フィルム、
・少なくとも１つの疎水性フィルム、また場合によっては
・後面の部位に露出している管路の部位に少なくとも１つのフィルム、
を備えている。
特定の実施態様によれば、１つまたは複数の可撓性フィルムおよび１つまたは複数のフィルムが唯一かつ同一のフィルムを構成する。
【００１２】
別の特定の実施態様によれば、カードがほぼ平行四辺形であるとき、管路は、全体または一部が、カードの中心部分に限定され、疎水性の、封止フィルタは前記カードの辺の少なくとも１つの部位に限定され、弁は管路と封止フィルタの間に位置づけられる。
この最後の実施態様において、また好適には、縁はカードの流体出入り口全体を含んでいる。
【００１３】
カードの形がほぼ平行四辺形であるとき、１つまたは複数の入口は縁を構成する辺の１つの上に存在し、１つまたは複数の出口はこの縁の他の辺の上に存在する。
この最後の場合、また好適には、１つまたは複数の入口は、１つまたは複数の出口が存在する辺と反対の辺の上に存在する。
【００１４】
カードの形がほぼ長方形であるとき、１つまたは複数の入口および１つまたは複数の出口は縁を構成する２つの短辺の上に存在する。
【００１５】
本発明は、リガンドを遊離するために場合によってはあらかじめ処理された、生物溶液を試験するための、上述のような、反応カードの使用にも関するものであり、次の順序で各種の生物学的過程が実施される：
・リガンドの捕捉
・溶出液内に捕捉したリガンドを採取
・採取したリガンドと、リガンドの処理を可能にする構造的機能的構成成分との混合、および
・処理リガンドの定性的および／または定量的検出。
【００１６】
本発明は、核酸を遊離するために場合によってはあらかじめ処理された、生物溶液を試験するための、上述のような、反応カードの使用にも関するものであり、次の順序で各種の生物学的過程が実施される：
・核酸の捕捉
・溶出液内に捕捉した核酸を採取
・採取した核酸と、これらの核酸の増幅を可能にする構造的機能的構成成分との混合、および
・増幅核酸の定性的および／または定量的検出。
【００１７】
場合によっては、カード内の新しい場所で、あるいは別の装置に移した後、これらのリガンドまたはこれらの増幅産生物の分析をもってなる最後の過程が実施される。使用の特定の変型によれば、捕捉されたリガンドまたは核酸は採取の前に少なくとも１つの洗浄液にかけられる。
【００１８】
使用のもう１つの特定の変型によれば、リガンドまたはアンプリコンの分析を可能にするカード内の室または別の装置に移す前にリガンドの処理または核酸の増幅が検出される。
【００１９】
好適には、上述のすべての使用変型について、生物細胞を溶解し、核酸のようなリガンドを遊離するための装置などの、試験される溶液の処理を可能にする装置の後に、またＤＮＡチップのような、これらのリガンドの存在の分析を可能にする装置の前にこのカードが使用される。
【００２０】
構造的に、本発明によるカードは、一方は試験される溶液の前処理を実施する上流の、他方は処理済みの試験される溶液の後手段理を実施する下流の、同じくカードで構成することのできる２つの装置の間に挿入される。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明のその他の特徴と利点は、付属の図面を参照して、非制限的な例として示された下記の特定の実施態様の説明を読むことによっていっそう明らかになるだろう。
【００２２】
定義
リガンドはタンパク質または核酸の性質を持つことがあるいっさいの生物学的種、例えば、抗原、抗原の断片、抗体、抗体の断片、ハプテン、核酸、核酸の断片、ホルモン、ビタミン、ペプチドまたはポリペプチドを意味する。
【００２３】
前処理の例は、出願人による特許出願に記載されたような、細胞溶解で構成することができる：
・音波溶解に関する、１９９９年４月１日出願、ＦＲ９９／０４２８９
・磁気機械混合溶解に関する、１９９８年７月２３日優先出願、ＰＣＴ／ＦＲ９９／０１３０９
・電気式溶解に関する、１９９８年４月１０日優先出願、ＰＣＴ／ＦＲ９９／００８３０
・機械式溶解に関する、１９９７年９月２３日優先出願、ＰＣＴ／ＩＢ９８／０１４７５
【００２４】
後処理の一例は、バイオチップ手段による検出で構成できる。バイオチップとは、その上にリガンドが固定されたすべての固体媒体を意味し、とくにＤＮＡバイオチップは、その上に核酸が固定されたすべての固体媒体を意味する。リガンド固定方法は様々な仕方で実現可能であり、とくに吸着または共有原子価、例えば、写真平板技術または圧電システムによる現場合成、予備成形リガンドの毛管沈着などによって実現することができる。参考として、ＤＮＡチップに適用されたこれらのバイオチップの例は下記の刊行物に挙げられている：Ｇ．Ｒａｍｓａｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，ｐ４０−４４，１９９８；Ｆ．Ｇｉｎｏｔ，Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ，１０，ｐ１−１０，１９９７；Ｊ．Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，１（３），ｐ１８３−２００，１９９６；Ｔ．Ｌｉｖａｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（１５），ｐ２９１５−２９２１，１９９４；Ｊ．Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，ｐ５４１−５４６，１９９８または特許ＵＳ  ４９８１７８３（Ａｕｇｅｎｌｉｃｈｔ），ＵＳ  ５７００６３７（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ），ＵＳ  ５４４５９３４（Ｆｏｄｏｒ），ＵＳ  ５７４４３０５（Ｆｏｄｏｒ），ＵＳ  ５８０７５２２（Ｂｒｏｗｎ）。
【００２５】
後述の機能成分と組み合わせたときに増幅が可能になる構造成分は次のように定義するのが適切である：ヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドｄＮＴＰおよび／またはリボヌクレオチドＮＴＰ）、増幅したい特定領域を囲む少なくとも一対のプライマ、イオン（例えば、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ）および緩衝液（トリスなど）。
機能成分はｐＨ７．５のトリスなどの緩衝液、塩と、上述の構造成分と組み合わせたときに増幅反応を可能にするイオンの存在の下に少なくとも１つの、好適には２つまたは３つの酵素によって形成される。
アンプリコンは酵素増幅反応の産生物を意味するものとする。
【００２６】
反応カードの説明
本発明は図１の第１の実施態様に示した反応カード１に関するものである。この反応カードは縁、あるいは切断面６８によって互いに接続された前面６２と後面６３を含む長方形で構成される。したがって、この図には前面６２を構成する要素全体が実線で示されている。なお、いくつかの数の管路６４がこの面６２に開口している。これらの管路６４は前面６２に接着された透明フィルム６を介して区切られている。しかしながら、後述のもののごとく、必ずしも透明である必要はなく、半透明などであってもよい。しかしながら、透明であれば、カード１内に導入された試験される生物溶液６９またはその他いっさいの溶液７０，７１または７２の位置をもっとよく見ることができる。後面６３も透明フィルム６６を備え、管路６４を区切り、管路はこの後面６３の各所に露出している。これらのフィルム６５と６６はＢＯＰＰ（Ｂｉａｘｉａｌｌｙ  Ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ＰｏｌｙＰｒｏｐｙｌｅｎ）フィルムまたは同等の種類の他のフィルムで構成され、カード１の本体に溶接または接着され、この本体は輸送される溶液６９から７２およびそれが受ける反応に対して不活性である。
【００２７】
このフィルム６６はカード１の前面にわたって、あるいは前記カードの一部にわたって存在する。しかしながら、このフィルム６６はカード１本体の残りの部分と同じ材料で構成できる。
なお、後面６３はいくつかの弁を備え、図には１１から３５と６１で示されている；これらの弁１１から３５と６１は出願人の名義で１９９９年６月２２日に出願された特許出願ＦＲ９９／０８１１６に記載の弁に対応する。この文書の場合、弁１１から３５と６１全体は透明フィルム６７によって後面６３の外部に対して限定されている。フィルムは十分に柔軟な性質で、試験される溶液６９、処理済み溶液７０，洗浄液７１，溶出液７２などの通過を可能にする。シリコン膜またはＰＥ／ＰＥＴ（ＰｏｌｙＥｔｈｙｌｅｎ／ＰｏｌｙＥｔｈｙｌｅｎ  Ｔｅｔｒａｐｈｔａｌａｔｅ）複合フィルムによって構成することもできる。
【００２８】
なお、後面６３の部位に位置する透明フィルム６６と６７は単一かつ同一の透明フィルムで構成することができる。これによってカード１の製造を容易にすることができる。くわえて、前面６２に位置する透明フィルム６５、後面６３の部位に位置する透明フィルム６６と６７は単一かつ同一の透明フィルムで構成することができる、これによってこのように装備された、かかるカード１の製造をいっそう容易にすることができる。
【００２９】
この後面６３には複数の疎水性フィルタ４８と４９も存在し、その役割については後で述べる。事実、図１のカードのこの実施態様には２つの平行路がある。左の路と右の路は同じプロセスを実施することができる。しかしながら、実施したい反応の数に応じて、単一の路だけを、または複数の路、すなわち２を超える路を有することも可能である。
【００３０】
最後に、カード１の周囲に、より正確には２つの短辺上に、出入り口が存在し、互いにはっきりと分離されている。したがって、図１の上部に、明確に定義された４つの機能に対応する４つの入口が存在する。したがって、左から右に入口の機能を述べるならば、洗浄液７１の入口２，試験される溶液６９の入口３，溶出液７２の入口４、最後にカード１内部の圧力変動のための入口５が存在する。これらの入口２から５は、特定の数の管６４と第１と第２の弁１１と１２を介して入口玉弁６に接続されている。
【００３１】
反対に、カード１の反対側に２つの出口７と８がある。第１の出口、すなわち処理済み溶液７０の出口７は所定量の処理済み溶液７０を外部に排出して、その後に分析、あるいはその他いっさいの後処理を可能にする出口である。第２の出口はカード１の作動から発生したすべての生物残骸と液体全体のための出口である。出口７は外部に向かう出口玉弁９に組み合わされ、残骸の出口は残骸出口玉弁１０に組み合わされる。
【００３２】
上部の入口２から５と下部の出口７と８の２つの部分の他に、これら２つの端の部分の間にいくつかの数の管路、弁と室がある。先に述べたごとく、図１の左と右に分離された同一の２つの路も存在する。上の位置の第１の室は左の路の上では逆Ｃ字型、右の路の上ではＣ字型であり、大型で、溶液配合室３６を構成している。この室３６はその内部に溶出液配合室３７を備え、室３７の形状は類似しているが大きさが異なる。実際、溶液配合室３６の体積と溶出液配合室３７の体積の比は１：１から１０：１の間に、好適には１．５：１から４：１の間に含まれ、さらに好適には２：１である。
【００３３】
その下の位置にある分離室３８は、吸着または共有原子価による、場合によっては捕捉オリゴヌクレオチドで被覆された、磁気粒子などの、捕捉物の採取（この点に関しては特許ＵＳ−Ａ−４，６７２，０４０と５，７５０，３３８参照）、ならびに、混合後に、後から増幅したい拡散の分離による選択を可能にする。磁気粒子は磁気粒子タブレット３９の形でこの分離室３８内に存在する。
これらの磁気粒子のとくに興味深い実施態様は下記の番号で出願人が出願した特許出願に記載されている：
１９９６年５月２４日優先出願、ＰＣＴ／ＦＲ９７／００９１２
１９９８年１月６日優先出願、ＰＣＴ／ＦＲ９９／０００１１
【００３４】
これらの特許出願の最後のものは、それぞれが中間層で被覆された磁気核を有する感熱性の磁気粒子に関するものである。中間層自体は少なくとも１つの生物分子と相互作用することができるポリマーベースの外部層に覆われ、外部ポリマは感熱性で、１０から１００℃の間に、好適には２０から６０℃の間に含まれる所定の可溶性下限温度（ＬＣＳＴ）を有する。この外部層は核酸を結合する能力を有するポリマを発生するカチオンモノマから合成される。この中間層は、これらの核酸の増幅技術の阻害の問題を回避するために、核の帯磁を隔離する。タブレット状の磁気粒子は、例えば、文書ＥＰ−Ａ−０．８１１．６９４から成る先行技術にすでに記載されている。一般的タブレット製造は現状技術、例えば、ＵＳ−Ａ−４，６７８，８１２とＵＳ−Ａ−５，２７５，０１６にも明確に記載されている。上述のこの製造は、後述の他のタブレットの合成にも使用される。
【００３５】
下の位置にあるのは、後から増幅を可能にする構造成分の採取室である。この室４０も後から増幅を可能にする成分を有するタブレット４１を含んでいる。増幅を実現するための、タブレットの形の成分は、現状技術にすでに記載されている。下記の文書に情報を見出すことができる：例えば、特許ＵＳ−Ａ−５，０９８，８９３または論文“Ａｍｂｉａｎｔ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｔａｂｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｒｅａｇｅｎｔｓ”Ｒ．Ｒａｍａｎｕｊａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｆｏｃｕｓ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．３（１９９３），４７０−４７３。
【００３６】
また、下の位置に存在する増幅室４２は、上述の構造成分と組み合わされて、増幅の実施を実際に可能にする、酵素などの、機能成分を含むタブレット４３を有する。増幅を実現するためのタブレットの形の酵素は、すでに現状技術に開示されている。下記の文書に情報を見つけることができる：特許ＵＳ−Ａ−４，８９１，３１９、ＷＯ−Ａ−８７／００１９６，ＷＯ−Ａ−９５／３３４８８または論文“Ｅｘｔｒａｏｒｄｉｎａｒｙ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｄｒｉｅｄ  ｉｎ  ｔｒｅｈａｌｏｓｅ：ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｃ．Ｃｏｌａcｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９２，１００７−１０１１。
【００３７】
すべての増幅技術が使用可能である。例えば、核酸の増幅については、とくに次の技術が存在する：
特許ＵＳ−Ａ−４，６８３，１９５、ＵＳ−Ａ−４，６８３，２０２およびＵＳ−Ａ−４，８００，１５９に記載されたようなＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、
例えば特許出願ＥＰ−Ａ−０．２０１．１８４に記載のＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、
特許出願ＷＯ−Ａ−９０／０１０６９に記載のＲＣＲ（Ｒｅｐａｉｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、
・特許出願ＷＯ−Ａ−９０／０６９９５とともに３ＳＲ（Ｓｅｌｆ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）
・特許出願ＷＯ−Ａ−９１／０２８１８とともにＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
・特許ＵＳ−Ａ−５，１９４，３７０とともにＳＰＳＲ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）および
・特許ＵＳ−Ａ−５，３９９，４９１とともにＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
【００３８】
しかしながら、上述の室内で別の過程を実施することも可能である。例えば、これらのプライマは、標識付けのために追加の過程を実施することなしに、増幅産生物を後から検出することを可能にする蛍光マーカを必要に応じて含むことができる。例えば、かかるプライマは論文Ｄ．  Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｌｆ−ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１７）１９９９，８０４およびそれ以降、あるいは特許出願ＧＢ−Ａ２．３３８．３０１，ＷＯ−Ａ−９９／２９９０５およびＷＯ−Ａ−９９／６０１５７に記載されている。
【００３９】
増幅室４２の下に位置する標本採取室４４は増幅室４２内に存在する定量の処理済み溶液７０を二分することを可能にする。この標本採取室４４は実際前記処理済み溶液７０の所定の量を受納するためのものである。溶液７０の残りはつぎに前記カード１より下の位置であるが、処理済み溶液７０あるいは残物に組み合わされるかにかかわらず液体出口手段に対して上部に位置する収束室４７内に移される。収束室４７はしたがって、同一カード内で別の処理を受けなければならないか、その分析を可能にするために別の装置に移されなければならない増幅された溶液全体を含む単一の溶液を含んでいる。この単一の溶液は、カード１を構成する路全体、すなわち左の路と右の路に由来する。
【００４０】
収束室４７内に含まれる増幅生成物がその分析を可能にするために別の装置に移されたとき、それは出願人が１９９９年９月８日出願の出願ＰＣＴ／ＦＲ９９／０２１３７の図８から１１に記載のような、管を介して実施することができる。この別の装置は、高濃度捕捉プローブをその面の一方の上に例えば備えている媒体によって、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社によって開発されたＤＮＡチップ（“Ａｃｃｅｓｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  ＤＮＡ  ａｒｒａｙｓ”，Ｍ．Ｓｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４，６１０−６１４．“Ｌｉｇｈｔ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ａ．Ｃａｖｉａｎｉ  Ｐｅａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，５０２２−５０２６）、または固体媒体の上に固定された核酸を含む他のチップシステム、例えば、先に定義したＤＮＡチップで構成される。
【００４１】
標本採取室４４内に存在する分画はつぎに検出読取室に移される。この室４５内に存在するタブレットは検出手段４５ａを含んでいる。上述の現状技術の文書にもとづき、例えば、先の過程で得なければならないアンプリコンの全体または一部と相補的な標識付けした核酸を含むタブレット４５ａの製造が可能になる。
【００４２】
先に述べたごとく、標識付けしたプライマを介して増幅の際に標識付けを実施することもできる。この場合、もはやタブレット４５ａを有する必要はなく、そのときの室４５は単なる読取室になる。
この標識付け読取室４５は、入口にマーカ４５ａを下流に読取セル４６を備えている。この読取セル４６は増幅がきちんとなされたかを、例えば、蛍光測定によって、検出することができる。このような場合、それによってかかるカード１を使用する操作員または自動機械は収束室４７内に存在する処理済み溶液７０を増幅された配列の分析手段に移す必要があることを知ることができる、またこれらの手段はカード１に組み込むか、この機能にもっと適した別の装置に含めることもできる。
【００４３】
試験される溶液６９、処理済み溶液７０、洗浄液７１または溶出液７２を問わず、カード１内の溶液の運動はこれらの弁の下流に位置する疎水性フィルタを介して実現される。それぞれの疎水性フィルム４８または４９はフィルム４８については５０から５５で、フィルム４９については５６から６０で示した特定の数の封止フィルタを備えている。それらの使用については後に述べる。
【００４４】
弁の説明
出願人が１９９９年に出願した特許出願ＦＲ９９／０８１１６に記載のごとく、弁１１から３５と６１は一般的にプラスチック製の反応カード１本体内などの、固体媒体上のフィルムの溶接の問題に答えることができる。この発明は、本発明によるカード１にとくに有利な用途分野があり、例えば、前記カード１の本体は、特定の場所に、図１６に明示されたような、周辺形状の溝または補強７４を有し、限定された区域内に可撓性の透明フィルム６７の一部を受納し、図１では４枚の、前記フィルム６７とカード１の本体は溝７４の底に位置する溶接８４によって互いに一体化される。このため、溶接はカード１の上面にいっさいの変形を引き起こさず、したがって、前記カード１を使用し、分析を実施するために後から問題が発生することがない。これらの弁１１から３５および／または６１の操作は図１５と１６に示したごとく、適した寸法の電磁石またはジャッキの作用によって実現される。
【００４５】
カードの作動：
以下の説明において、弁１１から３５と６１に関する説明は、関係する路についての特記事項がないかぎり、左の路の弁１１から３５にだけ関連する。右の路の弁１１から３５と６１に関する一切の情報は、それが右の路の説明であることが明示される。他方で、弁１１から３５が閉じられるとき、前記弁１１から３５の外部孔と呼ばれる左の孔、あるいは内部孔と呼ばれる右の孔が閉じられる。右の路、また弁１１から３５と６１に関しても同様であるが、位置は逆になる。したがって、右の孔が前記１１から３５または６１の外部孔と呼ばれ、左の孔が内部孔と呼ばれる。
最後に、弁１１から３５と６１は通常開いた静止位置にある。液体または気体を問わず、流体の移動の際に、閉じている弁がこの流体を方向付ける。
【００４６】
第１の過程−試験される溶液の配合
この第１の過程において、構成要素全体の作動を詳細に説明する。以下については必ずしも当てはまらないが、概略機能は同じであり、以下の過程についてはこの第１の過程の情報を敷衍するのが容易であろう。
試験される溶液６９を矢印Ｆの方向にカード１内に導入する。溶液６９は入口３と開いている第１の弁１１の間の管路６４を流れる。このため、前記溶液６９は、その外部孔の部位で閉じている第２の弁１２の部位に通過することができ、それによってこの溶液６９が入口２に戻り前記溶液７０をそれ自体が開いている入口玉弁６に導く管路６４に流れるのが阻止される。この玉弁６から２つの管路６４が一方は左の路に、他方が右の路に向かっている。右の路に向かう管路は右の路の第２の弁１２の内部孔の閉鎖によって閉じられる。一方、左の路に向かう管路は、第３の弁１３と第七の弁１７が開いているので試験される溶液６９の通過を可能にする。この目的は図２のごとく前記溶液６９によって配合室３６を充填することであり、これによって第４の弁１４の内部孔と第８の弁１８の外部孔が閉じられ、右の路の第四の弁１４の外部孔にも当てはまる。
【００４７】
右の路の試験される溶液６９の配合室３６も充填しようとする場合、右の路の第４の弁１４の内部孔を閉じるのがよい、それによってこの弁１４の外部孔が開かれ、室３６の充填が可能になり、溶出液７２の配合室３７の充填はできなくなる。なお、中間弁６１の外部孔と右の路の第８の弁１８の外部孔も閉じた方がよい。
【００４８】
左の路の室３６の充填だけに戻ると、試験される溶液６９は入口３から前記溶液６９の封止フィルタ５１まですべての管路６４を充填することができるようになる。この封止フィルタ５１は第７の弁１７の外部孔の延長内に置かれる。それは第１の疎水性フィルタ４８の一部によって構成され、それによって気体の流体は通過できるが、液体の流体は通過できない。この疎水性フィルタを構成するのに有利な材料は、米国の会社ＧＥＬＭＡＮ  ＳＩＥＮＣＥＳ（ＵＳＡ）製の膜ＶＥＲＳＡＰＯＲ  ２００Ｒである。これが図２の配置である。このタイプのフィルタは、一度使用すると、再利用はできない。
【００４９】
つぎに、体積が１００μｌである配合室３６内に存在する溶液６９の体積を正確に配合するために、管路６４を清浄にする。このため、入口２から洗浄液７１を導入する。この場合、下記の弁を閉じる：
・第１の弁１１の内部孔
・第３の弁１３の内部孔
・第４の弁１４の内部孔
・第８の弁１８の内部孔
・第１４の弁２４の内部孔
・第１５の弁２５の内部孔
・右の路の第２の弁１２の内部孔
・右の路の第３の弁１３の内部孔
・右の路の第４の弁１４の内部孔
・右の路の第８の弁１８の内部孔
・右の路の第１４の弁２４の内部孔
・右の路の第１５の弁２５の内部孔。
【００５０】
洗浄が実施されると、管路６４内に存在する洗浄液７１を不活性気体、例えば、空気に代える。この場合、矢印Ｆ４にそって加圧空気を注入する。このとき閉じられた弁は、下記の特徴を除いて同一である：
・第１の弁１１の内部孔の再開
・第２の弁１２の内部孔の閉鎖
・右の路の第１の弁１１の内部孔の閉鎖
・右の路の第２の弁１２の内部孔の再開
この構成において、得られた結果は図３に示した。管路６４の部位に存在していた、試験される溶液６９はしたがって、矢印Ｆ６にそって残物出口８から排出された。くわえて、管路６４は清潔で、入口２と第２の弁１２の内部孔の間の管路６４部分だけが、後から使用される洗浄液７１を含んでいる。もちろん、このとき入口玉弁６と残物出口玉弁１０は開いている必要がある。
もちろん、この洗浄は繰り返して実施することができる。しかしながら、洗浄を実施せずにこの結果を得ることもできる。この場合、矢印Ｆ４にそって入口５から空気を導入して管路６４内に残った液６９を押し出すことだけが適切である。結果は同じであるが、唯一の相違は、入口２と第２の弁１２の外部孔の間に洗浄液がなく、第２の弁１２の内部孔と入口玉弁６の間の洗浄液７１が試験される溶液６９に代えられることである。したがって、この可能性は、可能ではあってもあまり有利ではない、なぜならカード１内に溶液６９が残って矢印Ｆ１にそって洗浄液７１を入れるとすぐに玉弁６を超えてしまうおそれがあるからである。
【００５１】
上述の２つの例において、この室３６内に存在する核酸を変性させることが可能である。このためには８０から１００℃の間に含まれる温度に加熱する。
【００５２】
第２の過程−試験される溶液内に含まれる核酸の分離
この第２の過程で、配合された室３６内に存在する試験される溶液６９は次の分離室３８に移される。したがって、室４７内に存在する試験される溶液６９は矢印Ｆ４にそって入口５から空気などの不活性流体を配管網６４内に導入して、分離室３８に向かって押される。このとき閉じられる弁は下記の通りである：
・第２の弁１２の内部孔
・第４の弁１４の内部孔
・第６の弁１６の孔の１つ
・第八の弁１８の内部孔
・第１１の弁２１の内部孔
・第１５の弁２５の外部孔
・右の路の第１の弁１１の内部孔
・右の路の第４の弁１４の外部孔
なお、上流または下流の別の弁の閉弁が同じ効果を持つならば、ある弁の閉弁は必須ではない。例えば、第６の弁１６は開けておくことができる。この場合、第５の弁１５の内部孔を閉じるのが適切であろう。
【００５３】
配合された溶液６９の移動は図４に明示したごとく得られ、前期室３８にそって中間位置にバイパス７３に接続された封止フィルタ５２がこの室３８との関連において存在することによって可能になる。このフィルタ５２は第１０の弁２０と関連づけられているので、前記溶液６９の下流に存在する空気はこの封止フィルタ５２から逃げることができる。溶液６９がバイパス７３を介して封止フィルタ５２に達したとき、前記溶液６９の前進が停止される。くわえて、この溶液６９の全量は前記バイパス７３の上流の前記室３８の体積を下回り、したがって、室３８の上流のこの部分の中に閉じこめられる。
なお、この位置で配合された溶液６９は、バイパスの下流に位置づけられた磁気粒子タブレット３９にまだ到達していない。
【００５４】
この位置で、前記試験される溶液６９の下流の定量の空気は閉じこめられるが大きな体積のままである。つぎに閉じこめられた圧縮空気をＦ４にそって空気を強制的に導入することができる。数回往復運動をすると、溶液６９は処理済み溶液７０と呼ばれるこの新しい溶液７０内に均質に存在する磁気粒子タブレット３９の溶解を可能にするが、処理済み溶液とよばれるのはその処理段階を問わず（磁気粒子、構造成分、機能成分、アンプリコン）使用されたベースとなる液体が試験される溶液６９になるときからである。くわえて、後述の洗浄液７１については、この洗浄液７１がその役割を果たして、排出すべき残物を含むときも、番号は変わらない。他方で、同じく後述の溶出液７２については、溶出液７２が構造成分、機能成分、アンプリコンなどを取り戻したとき、この液体は処理済み溶液７０と呼ばれる。
【００５５】
上述の、また以下に洗浄液７１および溶出液７２との関連においても説明される往復運動は、分離室３８の構成によって可能になる。すなわちこの室３８の体積は導入される試験される溶液６９の体積よりも大きいので、液体６９は閉じ込められた定量の空気を下流で取り囲む。このため、前記液体自体６９の推力によって、あるいは入口５の部位で過剰な空気を導入することによる空気圧の増加による、上流の圧力増加によって前記液体６９を押し、ついでこの推力を解除するとき、磁気粒子タブレット３９の部位で往復運動の実施が可能になる。この運動はこのようにして前記磁気粒子の懸濁または再懸濁を至適化する。
【００５６】
この点に関して、バイパス７３の上流の前記室３８の体積と前記バイパス７３の下流の前記室の体積の間に存在する比は１：２から１：５の間に含まれ、好適には１：３である。前記溶液７０の体積とこの溶液７０の下流の室３８の体積の間の比はほぼ等しいか未満である。この比が未満であるときは、例えば、１：２．５から１：６の間に含まれ、好適には１：３．５である。上述の比のために、図示した例において、配合室３６の全量は５０μｌなので、分離室３８は１５０μｌになる。
【００５７】
磁気粒子は核酸と特異的に結合する性質がある。このため、試験される溶液６９の混合物と磁気粒子タブレット３９を２５から６０℃の間に含めることができる温度、または温度サイクルにおく必要がある。つぎに、分離室の部位で、その前面６２および／または後面６３の部位でカードを区切っている透明フィルム６５および／または６６の少なくとも１つに対して粒子の磁気分離を実施する。磁気粒子の磁気分離は処理済み溶液７０がＦ６にそって排出される前に実施される。
場合によっては、処理済み溶液７０のこれらの配合過程と核酸の分離は分離室３８の体積を超える量の処理済み溶液７０の処理のために、Ｎが１と１０の間に含まれる、Ｎ回反復することができる。
【００５８】
つぎに、所望の核酸だけが保持されるように、磁気粒子を洗浄する。洗浄液７１が入口２からＦ１にそって導入されたとき、下記の弁を閉じる：
・第１の弁１１の孔の１つ
・第４の弁１４の内部孔
・第６の弁１６の孔の１つ
・第８の弁１８の内部孔
・第１２の弁２２の内部孔
・第１６の弁２６の孔の１つ
・右の路の相補的弁６１の孔の１つ
・右の路の第２の弁１２の内部孔
・右の路の第４の弁１４の外部孔
したがって、洗浄液は分離室３８内に移るが、そこで磁気粒子は磁化されたままである。この液体は封止フィルタによってその運動が停止され、ついで磁気分離が中断され、前記洗浄液７１が核酸を担持する磁気粒子をできるだけ洗浄できるように往復運動が実施される。
【００５９】
磁気粒子の磁気分離はＦ６にそって洗浄液７１が排出される前に再度実施される。もちろん閉じられる弁は、核酸が磁気粒子によって捕捉された試験される溶液７０の残部の排出の際に用いられたものと同一である。
【００６０】
第２の洗浄の実施のために洗浄液がＦ５にそって再導入されるとき、最初の洗浄の時と同じ弁が閉じられる、ただし第１２の弁２２の内部孔は開かれ、第１３の弁２３の内部孔が閉じられる。この配置において、導入された新しい洗浄液７１は第１２の弁２２に結合された封止フィルタ５４によってその運動が停止される。磁気分離は中断され、前記液７１が核酸を担持する磁気粒子をできるだけ洗浄できるように往復運動が実施される。
いったん洗浄が実施されると、管路６４内に存在する洗浄液７１を不活性気体流体、例えば、空気に代える。この場合、Ｆ４にそって加圧空気を注入する。このとき下記の特徴を除いて、閉じられる弁は同一である：
・第１の弁１１の内部孔の再開
・第２の弁１２の内部孔の閉鎖
・右の路の第１１の弁の内部孔の閉鎖
・右の路の第２の弁１２の内部孔の再開
もちろんこの過程は２つの洗浄過程の間で実現される。
汚れた洗浄液７１は、Ｆ６にそって出口玉弁１０を介してつねに排出されるので、もちろんこの洗浄は数回反復することができる。この場合、封止フィルタ５４と５５の間に別の封止フィルタを備えなければならない。
【００６１】
第３の過程−溶出液による磁気粒子の採取
この第３の過程において、試験される溶液７０はＦ６にそってほぼ完全に排出された。ただ、先の過程で捕捉されていた核酸だけが磁気粒子にひっかかって残こる。これらの磁気粒子はつねに存在するが、それはこの過程の目的である溶出液｛による｝磁気粒子の回収を待つ間にさらに磁気分離が実施されるからである。
あらかじめ、使用される溶出液７２を適切に配合する方がよい。この場合に必要な量は５０μｌである。したがって、処理済み溶液７０と溶出液７２の間には１：２の比がある。しかしながら、１：１と１：１０の間で変動する比が可能である。この過程は１から１０回反復可能なので、この比は１から１００になることがある。溶出液７２の量の配合は配合室３７内で実現される。
これを実施するために、Ｆ３にそって入口４から溶出液７２を導入する。つぎに前記液７２は管路６４を通って配合室３７を充填する。７２は封止フィルタ５０によって運動を停止される。
このとき閉じられる弁は下記の通りである：
・第２の弁１２の内部孔
・第３の弁１３の外部孔
・第６の弁１６の内部孔
・右の路の第２の弁１２の外部孔
この配置は図５に明示されている。
【００６２】
溶出液７２の配合が実施されると、液は管路６４内で不活性気体流体、例えば、空気に代えられる。この場合、Ｆ４にそって加圧空気を注入する。排出された溶出液７２は残物出口玉弁１０を介してＦ６にそって出口８からカード１を出る。このようにして、図６に示すごとく液体が配分されたカード１が得られる。このとき閉じられる弁は下記の通りである：
・第１の弁１１の孔の１つの閉鎖
・第２の弁１２の外部孔の再開
・第８の弁１８の内部孔の閉鎖
・第１４の弁２４の内部孔の閉鎖
・第１５の弁２５の内部孔の閉鎖
・第３の弁１３の外部孔の再開、しかし内部孔の閉鎖
・右の路の第３の弁１３の内部孔の閉鎖
・右の路の第４の弁１４の内部孔の閉鎖
・右の路の第８の弁１８の内部孔の閉鎖
・右の路の第１４の弁２４の内部孔の閉鎖
・右の路の第１５の弁２５の内部孔の閉鎖
【００６３】
配合された溶出液７２は室３７内に存在し、次の室、分離室３８に移される。したがって、室３６内に存在する前記液７２はＦ４にそって入口５から空気などの不活性流体を配管網６４内に導入することによって分離室３８内に押される。溶出液７２の運動は前記液体７２が封止フィルタ５５に達したときに停止する。この場合、閉じられる弁は次の通りである：
・第２の弁１２の内部孔
・第３の弁１３の外部孔
・第９の弁１９の外部孔
・第１４の弁２４の孔の１つ
・第１５の弁２５の外部孔
・右の路の第１の弁１１の内部孔
溶出液７２の移動の後のカード１の配置は図７に示されている。この位置において、前記溶出液７２は核酸に組み合わされた磁気粒子の採取を可能にする。この段階で試験される溶液７０とタブレット３９の磁気粒子との先に述べたような混合の実施が可能になる。
ｐＨ７．５でイオン力が弱いトリスのような緩衝液とすることができる溶出液７２は２５から６０℃の間の温度で保温することによって、磁気粒子から核酸の分離を可能にする。つぎに、再度磁気粒子単体を磁気分離し、核酸は前記液体７２内に懸濁したまま残る。
【００６４】
第４の過程−溶出液の輸送と増幅構成成分の採取
この第４の過程は図８に示されている。閉じられた弁は下記の通りである：
・第２の弁１２の内部孔
・第３の弁１３の外部孔
・第９の弁１９の外部孔
・第１４の弁２４の孔の１つ
・第１５の弁２５の内部孔
・第１８の弁２８の外部孔
・右の路の第１の弁１１の内部孔
この配置において、試験される溶液７０から抽出された核酸を含む溶出液７２は分離室３８から増幅を可能にする成分の採取室４０に輸送される。これはこの増幅を可能にする構造成分である。これらの成分は融合され、室４０の入口に存在するタブレット４１を形成するのでこの室４０に入ったときに溶出液７２がタブレット４１を迅速に溶解して成分を図８に示した位置までそれを随伴する。
【００６５】
この室４０の体積は１５０μｌで、溶出液７２の５０μｌに対する比は１：３になる。しかしながら、この比は１：２から１：５とすることもできる。この比は核酸を含有し、構造成分が充填された前記液体７２の移動を可能にするので、混合が容易になる。
輸送は溶出液７２の上流のカード１内部の圧力増加の作用によって行われる。この圧力増加はＦ４にそって空気またはその他いっさいの不活性気体流体を入口５から注入することによって実現される。
【００６６】
一方では核酸を、他方では増幅構造成分を含む液体７２は第１７の弁２７に組み合わされた封止フィルタ５６によって停止される。
この過程において、第１６の弁２６の内部孔と第１７の弁２７の内部孔は前記液体７２がこの室４０内に存在するときは閉鎖される。１から１５分の間、３０から６５℃の間に含まれる温度に保温する、それによって対応する核酸の上にプライマが固定できる。
つぎに温度を３７から４２℃の間に含まれる値に調節する。先に述べたごとく、この第４の過程から得られる液体は主として溶出液７２と、特定の条件で、増幅を可能にするのに適している構造成分とから成り、処理済み溶液または液７０と呼ばれる。
【００６７】
第５の過程−処理済み液の輸送と増幅機能成分の採取
この第５の過程は図９に明示されている。このとき閉じられる弁は下記の通りである：
・第２の弁１２の内部孔
・第３の弁１３の外部孔
・第９の弁１９の内部孔
・弁２０，２１，２２および／または２３の少なくとも１つの内部孔および／または第１４の弁２４の孔の１つ
・第１５の弁２５の内部孔
・第２４の弁３４の内部孔
・右の路の第１の弁１１の内部孔
この配置において、核酸と増幅を可能にするのに適した構造成分を含み、処理済み溶液７０と呼ばれる溶出液７２は増幅を可能にする構造成分の採取室４０からこの同じ増幅を可能にする機能成分の採取室４２に輸送される。前記処理済み溶液７０の移動は封止フィルタ５９によって停止される。
【００６８】
これらの機能成分は主として増幅を可能にする酵素を含んでいる。これらの酵素およびその他の成分の種類と数は選択した増幅技術に対応する。これらの構成成分は融合され、この室４０に入ったときに処理済み溶液７０がタブレット４３を迅速に溶解し、図９に示されたような位置までそれとともに成分を随伴するように室４２の入口に存在するタブレット４３を形成する。この位置は瞬間的な中間位置に過ぎない、なぜならＦ４にそった圧力はつぎに、もちろん、弁の別の配置に従って増幅の実現を可能にする構造および機能成分を含む溶出液７２の輸送を可能にするからである。
【００６９】
輸送は第４の過程と同一であり、したがって、処理済み液７０の上流でカード１内部の圧力増加の作用によって実施される。この圧力増加はＦ４にそって空気その他いっさいの不活性気体流体を入口５から注入することによって実現される。液体７０の体積と室４２の体積の間には１：３の同じ比があり、すでに述べた往復による混合の同じ効果が得られる。
この過程において、第１８の弁２８の内部孔と第１９の弁２９の内部孔は前記液体７０がこの室４２にあるときに閉じられる。ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、３ＳＲ、ＳＢＡ技術などの恒温増幅を実施しようとするときは３０から７５℃、好適には３７から４２℃の間に含まれる温度に３０から９０分間加熱する。ＰＣＲを実施するために３０から１００℃の温度範囲にとどまりながら数回温度を変化させて、連続数回の増幅サイクルを実現できるようにするのがよい。
【００７０】
なおこれら第４と第５の過程は単一の過程に組み合わせることができる。このときの唯一の条件は熱安定と呼ばれる、５０度以上の温度で安定の酵素を使用することである。
【００７１】
第６の過程−標本採取室内、検出読取室内および収束室内の処理済み溶液輸送
図１０から１２に示したこの第６の過程で、３つの連続する段階が起きる。これらの段階は次の通りである：
・処理済み溶液７０の第１の部分、すなわち増幅生成物を含む、あるいは含んでいないほぼ２０μｌを機能成分の採取室４２から標本採取室４４に輸送、これは図１０に対応する。
・機能成分の採取室４２からほぼ３０μｌの、前記液７０の残りに対応する処理済み液７０の第２の部分を収束室４７に向かって輸送する、これは図１１に対応する、および
・標本採取室４４から前記処理済み液７０のこの部分を検出読取室４５に向けて移動、これは図１２に対応する。
【００７２】
図１０によれば、閉じられた弁は下記の通りである：
・第２の弁１２の内部孔
・第３の弁１３の外部孔
・第９の弁１９の外部孔
・弁２０，２１，２２および／または２３の少なくとも１つの内部孔および／または第１４の弁２４の孔の１つ
・第１５の弁２５の内部孔
・第２１の弁３１の外部孔
・第２４の弁３４の内部孔
・右の路の第１の弁１１の内部孔
この移動は処理済み溶液７０のほぼ２０μｌの分画を正確に調合することができ、つぎに検出読取室４５内に輸送される。この段階で、液体７０は検出読取室４５の部位の封止フィルタ５７と収束室４７の下流の、封止フィルタ５９の存在によってその運動が停止される。
【００７３】
図１１によれば、閉じられた弁は前の段階と同一である。ただ次の相違がある：
・第２４の弁３４の内部孔の開放
・第２５の弁３５の内部孔の閉鎖
・右の路の第２４の弁３４の内部孔の閉鎖
・右の路の第２５の弁３５の内部孔の閉鎖
このため、室４４の対象とならない処理済み溶液７０の残りについて、収束室４７への輸送が可能になる。前記液体７０のこの部分は、第２５の弁３５に組み合わされた、封止フィルタ６０によってその運動が停止される。
【００７４】
図１２において、閉じられる弁は下記の通りである：
・第２の弁１２の内部孔
・第３の弁１３の外部孔
・第９の弁１９の外部孔
・弁２０，２１，２２および／または２３の少なくとも１つの内部孔および／または第１４の弁２４の孔の１つ
・第１５の弁２５の内部孔
・第２３の弁３３の孔の１つ
・右の路の第１の弁１１の内部孔
第１９の弁２９は開いている、そのため場合によっては標識付けしたアンプリコンを含む、標本採取室４４に先に含まれていた液体７０の検出読取室４５への輸送が可能になる。なお、この段階で、前記液体７０の分画は検出タブレット４５ａが存在する前記室４５の上流区域を通過する。かかるタブレット４５ａは、例えば、１９９８年６月１７日付優先権の下に、１９９９年６月１７日出願人が出願した特許出願ＰＣＴ／ＦＲ９９／０１４６９に記載のようなアンプリコン標識付け切断物質を含むことができる。
【００７５】
場合によっては標識付けされ切断されたアンプリコンを含む液体７０は移動を継続し、封止フィルタ５８によって室４５の下流部分で停止されるので読取セル４６の部位に前記液体７０が存在する。このセル４６の部位で、増幅が展開し、次の段階が実施されるように制御することが可能になる。この増幅の制御は読取セル４６の部位に固定された、捕捉プローブと呼ばれる、標識付けされていないオリゴヌクレオチドを介して実現される。これらのプローブは増幅、標識付け、切断しなければならない増幅産生物と交雑するのに適している。
【００７６】
別の実施態様によれば、標識付けされていないアンプリコンを含む液体７０はセル４６の部位で停止される。増幅制御は例えば、下記に記載の標識付けされていないアンプリコンの検出技術を用いる：
・同種の技術についての、特許出願ＷＯ−Ａ−９５／１３３９９、ＷＯ−Ａ−９７／３９００８またはＷＯ−Ａ−９９／６４４３２または特許ＵＳ−Ａ−５，２８３，１７４、ＵＳ−Ａ−５、６５６，２０７、ＵＳ−Ａ−５，６５８，７３７またはＵＳ−Ａ−５，９２８，８６２、および
・異質の技術については、特許出願ＷＯ−Ａ−９１／１９８１２または特許ＵＳ−Ａ−４，８８９，７９８またはＵＳ−Ａ−５，９９８，１３５
【００７７】
第７過程−収束室の溶出液の外部への輸送
収束室４７内に存在する処理済み溶液７０の分画はカード１の左の路から来る。しかしながら、増幅による他の特異的アンプリコンを含むか否かを問わず他の分画７０は前記カード１の右の路に由来して存在することもある。図１２の場合、閉じられる弁は同一であるが、反対の路の上にあり、そのとき右の路の封止フィルタ３５がこの分画が収束室４７に来るのを停止し、それによって右の路と左の路の前記分画の間の混合を阻止することを可能にする。
これら２つの路内の増幅はより多くのアンプリコンを得るために同一とすることも（同一プライマの使用）、得られた異なるアンプリコンに応じて複数の分析を実施することを可能にするために、異ならせることもできる（異なるプライマの使用）。
【００７８】
本発明による反応カード１に３つ以上の路を備えることも可能である。この場合、管路６４を入口玉弁６と出口玉弁９の近傍に適合させるのが適切である。したがって、すべての分画を室４７内に収束させることができるように、下の位置に別の封止フィルタと別の弁を有する必要がある。
【００７９】
セル４６の部位の読取が増幅がうまく進行したとことを証明するとき、それは開始の生物標本内に標的が存在することの証拠であり、収束室４７内に存在する１つまたは複数の分画はつぎに、図示されていないが、アンプリコンの識別と分析を可能にする、別の分析または反応カードに向かって輸送される。それは先に述べたごとく、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社が開発してＤＮＡチップなどを使用することができる。このときこの輸送は玉弁９を介して、Ｆ５にそって、出口７から行われる。
しかしながら、生物チップを反応カードと一体とすることもできる。さらに第６の過程を、増幅の実現の有無の制御なしに、収束室４７内への輸送に限定することもできる。最後に、この輸送は、収束室を通さずにＤＮＡチップ内で直接実施することもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の第１の実施態様による反応カードの前面から見た図である。
【図２】  前記カードが試験される溶液を受容して、カードの使用法が作動中の、同一の、しかし図１の一部の図である。
【図３】  前記カードが試験される溶液の量を正確に配合することを可能にする洗浄を受けた、カードの使用法が作動中の、図２と同一の図である。
【図４】  試験される溶液が溶液配合室から分離室の上流部分に移された、カードの使用法が作動中の、同一の、しかし図１の一部の図である。
【図５】  前記カードが溶出液を受容して、カードの使用法が作動中の、図２，３と同一の図である。
【図６】  前記カードが溶出液の量を正確に配合することを可能にする洗浄を受けた、カードの使用法が作動中の、図２、３，５と同一の図である。
【図７】  溶出液が分離室内にあって、核酸の採取を可能にする、カードの使用法が作動中の、同一の、しかし図１の一部の図である。
【図８】  核酸を含む溶出液が増幅の実現を可能にする構造成分の採取室内に移された、カードの使用法が作動中の、同一の、しかし図１の一部の図である。
【図９】  核酸と構造成分を含む溶出液が増幅の実現を可能にする機能成分の採取室内に移された、カードの使用法が作動中の、図８と同一の図である。
【図１０】  核酸と構造および機能成分を含む溶出液が、図１２に示した過程のために標本採取室内に部分的に移された、図８，９と同一の図である。
【図１１】  核酸と構造および機能成分を含む溶出液が、標本採取室内に移されずに、外部に出すために、収束室に移された、図８から１０と同一の図である。
【図１２】  標本採取室内に存在する溶出液が、検出、読み取り室内に移された、図８から１１と同一の図である。
【図１３】  図３のＡ−Ａにそった断面図である。
【図１４】  本発明の第二の実施態様による反応カードの前面から見た図である。
【図１５】  反応カードに組み合わされた複数の弁の透視図である。
【図１６】  図１５のＢ−Ｂにそった断面図である。
【符号の説明】
１．反応カード
２．洗浄液７１の入口
３．試験される溶液６９の入口
４．溶出液７２の入口
５．カード１内部の圧力変動のための入口
６．カード１入口玉弁
７．外部に向かう処理済み溶液７０の出口
８．残物出口
９．外部に向かう出口玉弁
１０．残物出口玉弁
１１．第１の弁
１２．第２の弁
１３．第３の弁
１４．第４の弁
１５．第５の弁
１６．第６の弁
１７．第７の弁
１８．第８の弁
１９．第９の弁
２０．第１０の弁
２１．第１１の弁
２２．第１２の弁
２３．第１３の弁
２４．第１４の弁
２５．第１５の弁
２６．第１６の弁
２７．第１７の弁
２８．第１８の弁
２９．第１９の弁
３０．第２０の弁
３１．第２１の弁
３２．第２２の弁
３３．第２３の弁
３４．第２４の弁
３５．第２５の弁
３６．試験される溶液の配合室
３７．溶出液の配合室
３８．分離室
３９．磁気粒子タブレット
４０．構造成分採取室
４１．増幅を可能にする構造成分タブレット
４２．増幅室
４３．増幅を可能にする機能成分タブレット
４４．標本採取室
４５．検出読取室
４５ａ．検出タブレット
４６．読取セル
４７．収束室
４８．第１の疎水性フィルタ
４９．第２の疎水性フィルタ
５０．室３７内の溶出液の所定の量の封止フィルタ
５１．室３６内の溶液７０の所定の量の封止フィルタ
５２．室３８内の試験される溶液７０の封止フィルタ
５３．室３８内の第１の洗浄液７１の封止フィルタ
５４．室３８内の第２の洗浄液７１の封止フィルタ
５５．室３８内の溶出液の封止フィルタ
５６．室４０内の成分を備えた標本の封止フィルタ
５７．読取室４６内の標本の封止フィルタ
５８．室４５内の標識付けされた標本の封止フィルタ
５９．室４２内の酵素を備えた標本の封止フィルタ
６０．室４７内の酵素を備えた標本の封止フィルタ
６１．清掃弁と呼ばれる右の路の相補的弁
６２．カード１の前面
６３．カード１の後面
６４．前面６２に開口する管路
６５．前面６２の部位で管路６４を仕切る透明フィルム
６６．後面６３の部位で管路６４を仕切る透明フィルムまたは壁
６７．後面６３で弁１１から３５を仕切る透明フィルム
６８．カード１の縁または区分
６９．試験される溶液
７０．洗浄液
７２．溶出液
７３．封止フィルタ５２から５５のための室３８のバイパス
７４．フィルム６７が溶接されているそれぞれの弁１１から３５と６１の補強または溝
７５．フィルム６７の圧縮手段または可撓性のキー
７６．気密閉鎖手段またはエラストマ製の駒
７７．開放手段または斜断面
７８．複数のキー７５で構成された帯状の薄片
７９．ピストン型作動器
８０．圧縮空気連結ゴム管
８１．支え
８２．カード１の斜断面
８３．薄板７８の固定手段
８４．溝７４の底に位置する周辺溶接
Ｆ１．洗浄液７１の入口
Ｆ２．試験される溶液７０の入口
Ｆ３．溶出液の入口
Ｆ４．カード１内部の圧力変動のための入口
Ｆ５．外部に向かう試験される溶液の出口
Ｆ６．残物出口
Ｆ７．作動手段７７の圧縮空気入口
Ｆ８．作動手段７７の圧縮空気出口
Ｆ９．作動手段７７の移動
Ｆ１０．キー７５の上下動
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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