(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
９０％の脱アセチル化度および１〜５ｃＰの粘度を持つ水溶性キトサン、９５％の脱アセチル化度および２２ｃＰの粘度を持つ水不溶性キトサン、並びにその食品学的に許容される塩よりなる群から選ばれたいずれか一つまたは一つ以上の組み合わせである、抗菌、抗酸化、抗突然変異および抗癌活性の全部を持つ塩漬け用キトサン粉末。
【請求項２】
前記食品学的に許容される塩は塩酸塩、酢酸塩、クエン酸塩および乳酸塩よりなる群から選ばれたいずれか１種であることを特徴とする、請求項１に記載の塩漬け用キトサン粉末。
【請求項３】
請求項１または２に記載の塩漬け用キトサン粉末を塩漬け液の総重量に対して０．２〜１．０重量％含む塩漬け液。
【請求項４】
請求項３に記載の塩漬け液に蔬菜類を漬け込んで製造した塩漬け物。
【請求項５】
前記蔬菜類は白菜、若大根、大根、胡瓜、玉葱、大蒜および唐辛子よりなる群から選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする、請求項４に記載の塩漬け物。
【請求項６】
前記塩漬け物は塩漬け物の総重量に対して０．０５〜０．２５重量％のキトサンが含浸されたことを特徴とする、請求項４に記載の塩漬け物。
【請求項７】
請求項１または２に記載の塩漬け用キトサン粉末をキムチの総重量に対して０．０１〜１．５重量％含むキムチ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩漬け用キトサン粉末、これを用いた塩漬け物、およびこれを用いて製造したキムチに関する。
【背景技術】
【０００２】
キトサンは、カニ、ザリガニ、甲イカおよび海老の殻に入っているキチンを脱アセチル化して得た物質であって、（＋）電荷を持つ動物性食餌繊維である。キトサンの構造は、脱アセチル化度によってＮ−アセチル−グルコサミン（キチンの単分子）とグルコサミン（キトサンの単分子）との共重合体からなっている。キトサンは、老廃した細胞を活性化させて老化を抑制し、免疫力を強化させて疾病を予防し、生体の自然的な治癒能力を活性化させるうえ、生体リズムを調節するものと知られているが、そのメカニズムは、未だ完全には解明されていない。キトサンの効能としては、抗癌作用、抗菌作用、免疫強化作用、肝機能強化、コレステロール抑制、腸内有効菌増加、有害菌抑制、血圧調節効果、重金属および有害成分吸着排出、血糖値抑制、細胞活性化などが知られている。ところが、キトサンは、様々な生理活性を持つにも拘らず、その分子量が非常に大きく、われわれの身にはこれを分解する酵素が存在しないため、その応用幅が制限され、そのまま摂取した場合には大部分が体に吸収されず体外に排出されるという問題点がある。
【０００３】
一般に、甲殻類であるズワイガニ／ベニズワイガニ類は、慶尚北道の清浄海域で生産される代表的な特産物であって、韓国の全国生産量の３０％を専有している。キチンおよびキトサンは、生産基準年産１千億トンに達する資源であって、植物が生産するセルロースに匹敵する量である。よって、キトサンは、主に凝集剤として廃水処理に、または土壌改良剤として農業分野に用いられてきたが、近年では、生理的合成洗剤、医薬品、化粧品および食品などに応用されることにより、その適用範囲が拡大されている。ところが、高分子キトサンは、中性ｐＨ条件では水に対して不溶性であり、低濃度有機酸溶液に対しては可溶性であるが、渋い味と苦い味が強いので、食品に適用するには多少難しさがあった。また、キトサン製品は、輸入は年間１０％ずつ毎年増えているが、国内生産は２００３年以後退潮している実情である。
【０００４】
一方、キムチは、韓民族固有の伝統発酵食品であって、各種無機質とビタミンの供給源であり、摂取後には腸内の有効細菌の増殖を助ける健康食品として広く知られている。キムチは、大根、白菜および胡瓜などを塩漬けにして唐辛子、大蒜、ねぎ、生姜、塩辛などの薬味を混ぜ合わせた後、乳酸の生成によって熟成されて低温で発酵された製品であって、韓国人の食卓で欠かせないおかずである。キムチを漬けるのは蔬菜を長期間貯蔵するための手段であって、従来ではキムチを長期間貯蔵するために土の中にキムチ壷を埋めてキムチの保存期間を延長してきた。ところが、最近、住居環境の変化によってキムチ壷を土の中に埋められない場合が多く発生し、また、キムチを土の中に貯蔵するとしても、長期間経過すると、熟成したキムチの特有な匂いがする。したがって、キムチの固有な味を維持しながら長期間保存するための研究が盛んに行われている。このような研究の一環として、最近、キムチの天然添加剤としてキトサンを添加する方法が知られている。キトサンは弱酸に溶け、分子内に（＋）電荷を持っており、特に抗菌性が高いものと知られているため、天然保存剤として一般食品に多く使われている。
【０００５】
キトサンを用いてキムチの保存性を向上させるための先行技術としては、特許文献１および特許文献２の「酸敗遅延改良キムチの製造方法」、特許文献３の「保存性が延長されるキムチの製造方法」、特許文献４の「キトサンおよび鉱物質を含有したキムチの製造方法」、特許文献５の「キトサン含有黄土水性抽出液剤を用いたキムチの製造方法」、および特許文献６の「新鮮草を主材料としたキムチの製造方法」などがある。また、キムチの薬味にキトサンを適用した技術としては、特許文献７の「即席キムチの天然薬味組成物およびその製造方法」、特許文献８の「キチンキトサンキムチ」などがあり、製造したキムチ自体にキトサンを適用した技術としては、特許文献９の「キムチの熟成遅延方法」、特許文献１０の「酸敗遅延キムチ製造法」および特許文献１１の「キムチ新鮮度維持方法」などがある。
【０００６】
前述したようにキムチの保存性を向上させるための研究と、キムチの薬味およびキムチ自体にキトサンを適用した技術などが多様に開発されているが、最適の条件を使用するためにキトサンを規格化し、これをキムチに適用した技術に関する研究および開発は未だ全くない状態である。
【０００７】
したがって、規格化したキトサンを用いて特定の食品に対する誂え型キトサンが生産されると、食品保存期間を向上させて食品廃棄物を減少させ、食中毒などを予防して国民健康に寄与することができ、キトサンを添加した機能性キムチを生産して巨大なキムチ市場で競争力を確保することができるものと考えられる。
【特許文献１】韓国特許出願第１９９９−２３８４８号明細書
【特許文献２】韓国特許出願第１９９９−２３８４９号明細書
【特許文献３】韓国特許出願第１９９８−２０４５１号明細書
【特許文献４】韓国特許出願第１９９９−２５４１７号明細書
【特許文献５】韓国特許出願第２００３−２６７３１号明細書
【特許文献６】韓国特許出願第２００１−４２８６６号明細書
【特許文献７】韓国特許出願第１９９４−３４４６３号明細書
【特許文献８】韓国特許出願第１９９７−２４８７７号明細書
【特許文献９】韓国特許出願第１９９７−８１９９６号明細書
【特許文献１０】韓国特許出願第１９９６−３３３６２号明細書
【特許文献１１】韓国特許出願第１９９７−６６５５８号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、いろいろの生理活性を持つキトサンを規格化してこれをキムチに適用する研究を行う中で、脱アセチル化度および粘度の差異によるキトサンを規格化し、規格化されたキトサンを用いて製造したキムチがキトサン自体よりさらに優れた抗菌活性、抗酸化活性、抗突然変異効果および抗癌活性を有し、優れた貯蔵安定性および組織感を有することを確認し、本発明を完成した。
【０００９】
そこで、本発明は、脱アセチル化度および粘度の差異によって規格化された塩漬け用キトサン粉末、これを用いた塩漬け物、およびこれを用いて製造したキムチを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明のある観点によれば、５０〜９０％の脱アセチル化度および１〜１０ｃＰの粘度を持つ水溶性キトサン、６０〜１００％の脱アセチル化度および８〜８０ｃＰの粘度を持つ不溶性キトサン、並びにその食品学的に許容される塩よりなる群から選ばれたいずれか一つまたは一つ以上の組み合わせである、抗菌、抗酸化、抗突然変異および抗癌活性に優れた塩漬け用キトサン粉末を提供する。
【００１１】
前記水溶性キトサンまたは前記不溶性キトサンは、食品学的に許容される塩の形で使用することができ、塩としては食品学的に許容される遊離酸(free acid)によって形成された酸付加塩が有用である。遊離酸としては無機酸と有機酸を使用することができ、無機酸としては塩酸が好ましく、有機酸としては酢酸、クエン酸および乳酸などが好ましい。
【００１２】
前記塩漬け用キトサン粉末は、脱アセチル化度および粘度の異なる１２種の水溶性キトサン（Ｓ-１〜Ｓ-１２）と１１種の不溶性キトサン（ＮＳ-１〜ＮＳ-１１）に対して抗菌活性、抗酸化活性、抗突然変異効果および抗癌活性に優れた水溶性／不溶性キトサンを選別し、脱アセチル化度と粘度によって規格化したことを特徴とする。前記キトサンの中でも、５種の水溶性キトサン（Ｓ-２、Ｓ-９、Ｓ-１０、Ｓ-１１、Ｓ-１２）と６種の不溶性キトサン（ＮＳ-２、ＮＳ-５、ＮＳ-８、ＮＳ-９、ＮＳ-１０、ＮＳ-１１）は食品群別公示菌株に対して優れた抗菌活性を示し、Ｓ-７、Ｓ-１０およびＮＳ-８は優れた抗酸化活性および抗突然変異効果を示し、Ｓ-１０およびＮＳ-８は優れた抗癌効果を示す。したがって、本発明に係るキトサンは、５０〜９０％の脱アセチル化度および１〜１０ｃＰの粘度を持つ水溶性キトサンと６０〜１００％の脱アセチル化度および８〜８０ｃＰの粘度を持つ不溶性キトサンを選別し、脱アセチル化度と粘度によって規格化する。これらの中でも９０％の脱アセチル化度および３ｃＰの粘度を持つ水溶性キトサン（Ｓ-１０）と、９５％の脱アセチル化度および２２ｃＰの粘度を持つ不溶性キトサン（ＮＳ-８）が、最も優れた抗菌活性、抗酸化活性、抗突然変異効果および抗癌活性を示す。
【００１３】
また、本発明は、脱アセチル化度および粘度の差異によって規格化された塩漬け用キトサン粉末を含む塩漬け液を提供する。
【００１４】
前記塩漬け液は、キトサン粉末を塩漬け液の総重量に対して０．２〜１．０重量％で含むことが好ましい。もしキトサン粉末が０．２重量％未満であれば、キトサン粉末の含量があまり少なくて塩漬け物の貯蔵性および組織感を改善することが難しく、もしキトサン粉末が１．０重量％超過であれば、塩漬け物の貯蔵性および組織感がそれ以上向上しない。
【００１５】
また、本発明は、前記塩漬け液に蔬菜類を漬け込んで製造した塩漬け物を提供する。前記塩漬け物は、蔬菜類のみならず、果物、肉類および魚介類などを塩漬け液に漬け込んで製造した物質を総称し、蔬菜類としては、白菜、若大根、大根、胡瓜、玉葱、大蒜、唐辛子などを含む。前記塩漬け物は、塩漬け物の総重量に対して０．０５〜０．２５重量％のキトサンが含浸されたことが好ましい。
【００１６】
また、本発明は、前記塩漬け物を用いて製造したキムチを提供する。
【００１７】
また、本発明は、前記塩漬け用キトサン粉末をキムチの総重量に対して０．０１〜１．５重量％含むキムチを提供する。
【００１８】
本発明に係るキトサン粉末を含むキムチは、標準化キムチレシピを用いて製造することができる。
【００１９】
標準化方法によって製造されたキトサン含有キムチは、キトサン自体よりさらに優れた抗菌活性、抗酸化活性、抗突然変異効果および抗癌活性を示し、キトサンが、キムチの発酵がゆっくりなされるようにして適熟期への到達期間を長くすることにより、優れた貯蔵安全性を示す。また、キトサン含有キムチは、ロイコノストック属(Leuconostoc sp.)およびラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)乳酸菌の成長速度を抑制させて優れた貯蔵性および保存性を示す。また、植物性セルロースは陰（−）電荷の食餌繊維であるが、キトサンは陽（＋）電荷の食餌繊維であるため、キトサンが塩漬け物に適量含浸混入されると、陽性食餌繊維になってキムチの植物性セルロースの構造が緻密になるので、キムチの組織感を改善させ且つ食餌繊維自体の機能性を補完する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係る塩漬け用キトサン粉末は、抗菌活性、抗酸化活性、抗突然変異効果および抗癌活性に優れた水溶性／不溶性キトサンを選別して脱アセチル化度と粘度によって規格化した。これにより、これを用いて製造したキトサン含有キムチは、キトサン自体よりさらに優れた抗菌活性、抗酸化活性、抗突然変異効果および抗癌活性を示す。また、本発明のキトサン含有キムチは、キトサンが、キムチの発酵がゆっくりなされるようにして適熟期への到達期間を長くすることにより、優れた貯蔵安定性を示し、ロイコノストック属(Leuconostoc sp.)およびラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)乳酸菌の成長速度を抑制させて優れた貯蔵性および保存性を示し、キトサンが塩漬け物に適量含浸混入されると、陽性食餌繊維になってキムチの植物性セルロースの構造が緻密になるので、キムチの組織感を改善させ且つ食餌繊維自体の機能性を補完するという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示する。ところが、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【００２２】
実施例１：キトサンの製造
１−１．キトサンの製造
韓国東海で得たベニズワイガニの蟹殻を乾燥させた後、これを５％ＮａＯＨ水溶液に入れ、１００℃で５時間抽出して脱タンパク蟹殻を得た。前記脱タンパク蟹殻を５％ＨＣｌ水溶液に入れ、常温で５時間抽出して脱カルシウム化させてキチンを得た。その後、反応槽に４５％ＮａＯＨ水溶液を満たし、ここに、前記で得られたキチンを浸漬させた後、温度（８０℃、９０℃、１００℃、１１０℃）と時間（５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０時間）を変化させながら脱アセチル化反応によってキトサンを製造した。前記製造されたキトサンの脱アセチル化度と粘度を測定して表１に示した。脱アセチル化度はコロイド滴定法(pvsk titration method)を用いて測定し、粘度はキトサンを酢酸に溶かして０．５％のキトサン含有酢酸溶液を作り、２０℃の恒温槽で２時間保管した後、恒温の下で測定した。
【００２３】
【表１】
0004705137.tif 000002
【００２４】
表１に示すように、４５％ＮａＯＨ水溶液の温度と時間によってキトサンの脱アセチル化度と粘度が異なる。高温で長時間反応させると、脱アセチル化度が高くなるが、粘度は低くなり、反応時間を短くすると、粘度が高くなるが、脱アセチル化度は低くなる。また、低温で反応させると、脱アセチル化の時間が長くかかるが、粘度はゆっくり低下することが分かった。したがって、キトサンの規格は脱アセチル化度と粘度で表示する。
【００２５】
１−２．規格化されたキトサンの製造
前記１−１で製造したキトサンを規格化するために、脱アセチル化度と粘度の異なる１２種の水溶性キトサン（Ｓ-１〜Ｓ-１２）と１１種の不溶性キトサン（ＮＳ-１〜ＮＳ-１１）を準備し、これらを下記表２に示した。全てのキトサンは、プラスチック容器に入れて室温で保管しながら使用し、水溶性／不溶性キトサンの抗菌活性、抗酸化活性、抗突然変異効果および抗癌活性を下記実験例１〜４の方法で測定した。前記２３種の水溶性／不溶性キトサンのうち抗菌活性、抗酸化活性、抗突然変異効果および抗癌活性に優れたキトサンを選別して規格化した。
【００２６】
【表２】
0004705137.tif 000003
【００２７】
水溶性／不溶性キトサンの抗菌活性、抗酸化活性、抗突然変異効果および抗癌活性を測定した結果、５種の水溶性キトサン（Ｓ-２、Ｓ-９、Ｓ-１０、Ｓ-１１、Ｓ-１２）と６種の不溶性キトサン（ＮＳ-２、ＮＳ-５、ＮＳ-８、ＮＳ-９、ＮＳ-１０、ＮＳ-１１）は食品群別公示菌株に対して優れた抗菌活性を示し、Ｓ-７、Ｓ-１０およびＮＳ-８は優れた抗酸化活性および抗突然変異効果を示し、Ｓ-１０およびＮＳ-８は優れた抗癌効果を示すことが分かった。したがって、本発明に係るキトサンは、５０〜９０％の脱アセチル化度および１〜１０ｃＰの粘度を持つ水溶性キトサンと、６０〜１００％の脱アセチル化度および８〜８０ｃＰの粘度を持つ不溶性キトサンを選別し、脱アセチル化度と粘度によって規格化した。
【００２８】
実施例２：キトサン含有キムチの製造
２−１．キトサン材料
水溶性／不溶性キトサンのうち、抗菌活性、抗酸化活性、抗突然変異効果および抗癌活性に最も優れた水溶性キトサンＳ-１０（脱アセチル化度９０％、粘度３ｃＰ）と不溶性キトサンＮＳ-８（脱アセチル化度９５％、粘度２２ｃＰ）を４℃で保管しながら使用した。
【００２９】
２−２．キムチ材料
白菜は韓国の釜山フジョン市場、塩辛は清浄ひしこ液塩辛（（株）大商）、赤唐辛子粉はヨンヤン農協清潔赤唐辛子粉加工工場からそれぞれ購入して使用した。大根、ねぎ、大蒜および生姜は釜山フジョン市場からそれぞれ購入した。砂糖は白砂糖、塩は天日塩（（株）ゴセン）を使用した。
【００３０】
２−３．キムチの製造
キムチは、塩漬けにした白菜１００重量部に対して赤唐辛子粉３．５重量部、大蒜１．４重量部、生姜０．６重量部、塩辛２．２重量部、ねぎ２．０重量部、大根１３．０重量部、砂糖１．０重量部の割合で混合して標準化キムチのレシピを用いて製造した。
【００３１】
すなわち、天日塩で１０％塩漬け液を製造した後、ここに白菜を１０時間漬け込んだ。こうして塩漬けにした白菜を水道水で３回洗浄し、３時間水気を切った。副材料として水溶性キトサン（Ｓ-１０）粉末と不溶性キトサン（ＮＳ-８）粉末を、塩漬けにした白菜１００重量部に対して１重量部、０．５重量部の量で用いて薬味に混ぜ合わせた。大根とねぎを千切りにし、この千切り大根に、水に溶かした赤唐辛子粉を入れて混ぜ合わせた後、さらにひしこ液塩辛、大蒜および生姜をよく混ぜ合わせ、塩度はそれぞれの塩で調節してキムチを製造した。
【００３２】
実施例３：キトサン含有塩漬け液で漬けた白菜を用いたキムチの製造
不溶性キトサンＮＳ-８を酢酸に溶かして２％のキトサン溶液を製造した。前記キトサン溶液を用いてキトサン含量が塩漬け液の総重量に対して０．０５、０．１５、０．３、０．５％となるように添加した水に天日塩を加えて１０％の塩漬け液を製造した。前記キトサン含有塩漬け液に白菜を１０時間漬け込んだ。こうして塩漬けにした白菜を水道水で３回洗浄し、３時間水気を切った。その後、大根とねぎを千切りにし、この千切り大根に、水に溶かした赤唐辛子粉を入れて混ぜ合わせた後、さらにひしこ液塩辛、大蒜および生姜をよく混ぜ合わせ、塩度はそれぞれの塩で調節してキムチを製造した。
【００３３】
実施例４：塩漬けにした白菜をキトサン含有濯ぎ液で濯いでから使用したキムチの製造
不溶性キトサンＮＳ-８を酢酸に溶かして２％のキトサン溶液を製造した。前記キトサン溶液を用いてキトサン含量が濯ぎ液の総重量に対して０．１、０．２、０．３、０．５％となるように水を添加してキトサン含有濯ぎ液を製造した。天日塩で１０％塩漬け液を製造した後、この塩漬け液に白菜を１０時間漬け込んだ。こうして塩漬けにした白菜を水道水で２回洗浄し、最終濯ぎ過程で前記キトサン含有濯ぎ液によって３分間濯いだ後、３時間水気を切った。その後、大根とねぎを千切りにし、この千切り大根に、水に溶かした赤唐辛子粉を入れて混ぜ合わせた後、さらにひしこ液塩辛、大蒜および生姜を混ぜ合わせ、塩度はそれぞれの塩で調節してキムチを製造した。
【００３４】
実施例５：キトサン含有薬味を用いたキムチの製造
天日塩で１０％塩漬け液を製造した後、この塩漬け液に白菜を１０時間漬け込んだ。こうして塩漬けにした白菜を水道水で３回洗浄し、３時間水気を切った。水溶性キトサン（Ｓ-１０）粉末と不溶性キトサン（ＮＳ-８）粉末を１：１の重量比で混ぜた後、塩漬けにした白菜１００重量部に対して０．１．０．２５、０．５、１．５重量部のキトサンを副材料として用いて薬味に混ぜ合わせた。大根とねぎを千切りにし、この千切り大根に、水に溶かした赤唐辛子粉を入れて混ぜ合わせた後、さらにひしこ液塩辛、大蒜および生姜をよく混ぜ合わせ、塩度はそれぞれの塩で調節してキムチを製造した。
【００３５】
実験例１：抗菌活性の測定
水溶性／不溶性キトサンの抗菌活性を確認するために、下記の実験を行った。
【００３６】
１−１．菌株および培地
抗菌活性を検索するための病原性微生物および腐敗微生物としては、９種のグラム陰性菌と６種のグラム陽性菌を使用し、それらを下記表３に示した。
【００３７】
Listeria monocytogenes ATCC 19115、Staphylococcus aureus ATCC 29737、Bacillus subtilis ATCC 6633、Bacillus cereus ATCC 21366、Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila ATCC 7966、Pseudomonas fluorecens ATCC 21541、Proteus vulgaris ATCC 6059、Erwinia carotovora subsp. carotovora ATCC 15390、Lactobacillus curvatus ATCC 25601、Lactobacillus plantrarum ATCC 8014、Serratia marcescens ATCC 990、Escherichia coli ATCC 8739、Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802、およびVibrio vulnificus ATCC 27562は韓国微生物保存センター、Salmonella typhimurium ATCC 13311は遺伝子銀行から分譲を受けて使用した。
【００３８】
培養培地としてはトリプシン大豆ブロス(tryptic soy broth)（ＴＳＢ、Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）、ブレインハート注入液(Brain Heart Infusion)（ＢＨＩ、Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）、ＭＲＳ培養液（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）を使用し、キトサンの抗菌活性を検索するための培地としてはミュラーヒントン培養液(Muller Hinton broth)（ＭＨＢ、Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）を使用した。
【００３９】
【表３】
0004705137.tif 000004
【００４０】
１−２．キトサンの種類による抗菌活性
本実験に使用するために、水溶性キトサンは蒸留水に、不溶性キトサンは１％（ｖ／ｖ）酢酸に完全に溶かして１％（ｗ／ｖ）濃度でキトサン貯蔵溶液を製造した。
【００４１】
キトサンの抗菌活性の検索はペーパーディスク法(paper disc method)によって公示菌株に対する生育阻止環(clear zone)の形成の有無を調べて測定し、使用培地はＭＨＡに最終濃度が０．１％となるようにキトサン貯蔵溶液を添加して製造した。この際、不溶性キトサンのうちＮＳ-１、ＮＳ-３およびＮＳ-４キトサンは溶けないため、本実験に使用しなかった。本実験に使用したキトサン添加培地のｐＨは全て１Ｎ ＨＣｌと１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ５．９に補正した。公示菌株に対する０．１％水溶性キトサンの抗菌活性は表４に示し、公示菌株に対する０．１％不溶性キトサンの抗菌活性は表５に示した。
【００４２】
【表４】
0004705137.tif 000005
【００４３】
【表５】
0004705137.tif 000006
【００４４】
表４に示すように、０．１％水溶性キトサンの抗菌活性は、菌株によって様々であったが、Ｓ-１２が１５種の公示菌株のうち１３種の菌株に対して抗菌活性を示して１５種のキトサンの中でも抗菌スペクトルが最も広く、Ｓ-１０とＳ-１１も９種の菌株に対して抗菌活性を示した。また、Ｓ-２とＳ-９が８菌株に対して抗菌活性を示し、Ｓ-３およびＳ-４が７菌株に対して、Ｓ-１およびＳ-７が６菌株に対して、Ｓ-８が５菌株に対して、Ｓ-５およびＳ-６が４菌株に対してそれぞれ抗菌活性を示した。すなわち、キトサンの種類によってその抗菌活性の程度が様々であった。Proteus vulgarisは、全ての水溶性キトサンで成長が抑制され、Aeromonas hydrophila、Salmonella typhimurium、Erwinia carotovoraも大部分の水溶性キトサンで成長が抑制された。Bacillus cereusもＳ-８以外の全てのキトサンで成長が抑制された。
【００４５】
また、表５に示すように、０．１％不溶性キトサンは全ての公示菌株に対して抗菌活性を示した。また、同一の濃度で、キトサンの抗菌活性は水溶性キトサンより不溶性キトサンが著しく高かった。
【００４６】
１−３．病原性微生物および腐敗微生物に対するキトサンの成長抑制活性
高い抗菌活性を示す水溶性キトサンＳ-２、Ｓ-９、Ｓ-１０、Ｓ-１１、Ｓ-１２と、高い抗菌活性を示す不溶性キトサンＮＳ-２、ＮＳ-５、ＮＳ-８、ＮＳ-９、ＮＳ-１０、ＮＳ-１１を選別し、公示菌株１５種に対する成長抑制活性を調べた。
【００４７】
選別されたキトサンの抗菌力を調べるために、１％（ｗ／ｖ）キトサン貯蔵溶液をＭＨＢに添加し、最終濃度が水溶性キトサンは０．１％、不溶性キトサンは０．１％と０．０５％となるように調節した後で使用した。病原性微生物はＴＳＢで、乳酸菌はＭＲＳ培養液でそれぞれ２回継代培養させた公示菌株をキトサン添加培地に０．０５ｍＬ接種した後、３７℃で２４時間振とう培養し、しかる後に、ペプトン水を用いて適正希釈して生菌数（ｌｏｇ Ｎｏ．ＣＦＵ／ｍＬ）を測定した。乳酸菌はＭＲＳ寒天、Erwinia carotovora subsp. CarotovoraはＢＨＩ寒天、その他の腐敗微生物と病原性微生物はＴＳＡを用いて混釈平板法(pour plate method)によって生菌数を測定した。公示菌株に対する０．１％水溶性キトサンの成長抑制活性は表６に示し、公示菌株に対する０．１％不溶性キトサンの成長抑制活性は表７に示し、公示菌株に対する０．０５％不溶性キトサンの成長抑制活性は表８に示した。
【００４８】
【表６】
0004705137.tif 000007
【００４９】
【表７】
0004705137.tif 000008
【００５０】
【表８】
0004705137.tif 000009
【００５１】
表６に示すように、A. hydrophilaはＳ-１１とＳ-１２キトサン添加区で成長が観察されておらず、その他の３種のキトサンは対照区に比べて約４〜５ログサイクル程度成長が抑制された。選別したキトサンはE. carotovoraに対して強い抗菌活性を示したが、特にＳ-２、Ｓ-１０およびＳ-１１で成長が観察されておらず、Ｓ-９およびＳ-１２では約１０１ＣＦＵ／ｍＬを示して対照区に比べて約７ログサイクル程度成長が抑制された。P.fluorecens、V. parahaemolyticusおよびV. vulnificusは、対照区で１０８ＣＦＵ／ｍＬの菌株を示し、選別されたキトサンでは１０７ＣＦＵ／ｍＬの菌株を示して対照区に比べて約１ログサイクル程度低い菌株を示し、キトサンによる生育抑制効果は非常に低かった。B.subtilisはＳ-９以外の残りのキトサンで菌成長が観察されておらず、Ｓ-９でも１０１ＣＦＵ／ｍＬ以下の菌数を示した。また、B.cereusはＳ-９、Ｓ-１０、Ｓ-１２で１０１ＣＦＵ／ｍＬ以下の菌株を示し、Ｓ-２およびＳ-１１では菌成長が観察されていない。乳酸菌株であるL.curvatusは選別されたキトサンの全てで成長が観察されておらず、L. plantarumはＳ-１１以外の全てのキトサンで成長が観察されていないため、選別されたキトサンの乳酸菌株に対して強い成長抑制活性を示した。L.monocytogenesおよびS. aureusの場合、Ｓ-１２で菌成長が観察されておらず、残りのキトサンでは１０７〜１０８ＣＦＵ／ｍＬを示して対照区と類似の菌成長を示し、６種のグラム陽性菌のうちキトサンに対して最も低い成長抑制率を示した。上述したように、水溶性キトサンの抗菌活性はグラム陰性菌よりグラム陽性菌に対して高く、水溶性キトサンのうちＳ-１２キトサンが公示菌株に対して広い抗菌活性を示した。
【００５２】
また、表７に示すように、A.hydrophilaの場合、対照区は１０８ＣＦＵ／ｍＬを示し、ＮＳ-１１は１０５ＣＦＵ／ｍＬ、ＮＳ-２は１０４ＣＦＵ／ｍＬを示して対照区に比べて４〜５ログサイクル程度成長が抑制され、残りのキトサンでも約１０２〜１０３ＣＦＵ／ｍＬの菌数を示して５〜６ログサイクル程度の菌成長が抑制された。P.vulgarisとE.carotovoraは培養２４時間後にＮＳ-１０で１０２ＣＦＵ／ｍＬの菌成長を示し、ＮＳ-１０キトサン以外の残りのキトサンでは菌成長が観察されていない。V.vulificusはＮＳ-５で１０２ＣＦＵ／ｍＬの菌成長を示し、他のキトサンでは菌成長が観察されていない。L. monocytogenes、S. aureus、P. fluorecens、S. marcescens、E. coli、V. parahaemolyticus、B. subtilis、B. cereus、L. curvatus およびL. plantarumは、培養２４時間目に全てのキトサンで菌成長が観察されていない。上述したように、不溶性キトサンはグラム陽性菌とグラム陰性菌の全てで強い抗菌活性を示し、グラム陽性菌に対してさらに高い抗菌活性を示した。
【００５３】
A.hydrophilaの場合、水溶性キトサンであるＳ-１１、Ｓ-１２で菌成長が観察されておらず不溶性キトサンより優れた抗菌活性を示したが、本実験結果、全般的に同一の濃度で不溶性キトサンが水溶性キトサンに比べて広い抗菌スペクトルを示したうえ、高い菌成長抑制を示した。
【００５４】
不溶性キトサンの場合、０．１％濃度で高い抗菌活性を示したが、キトサンの種類による抗菌活性の差異が観察されておらず、公示菌株全てが６種のキトサンに対して成長抑制され、キトサンによる微生物の選別的抗菌活性差が観察されていない。
【００５５】
また、表８に示すように、S.typhymuriumの場合、ＮＳ-２、ＮＳ-５、ＮＳ-８で培養２４時間目に１０８ＣＦＵ／ｍＬを示して対照区と類似の菌株を示し、ＮＳ-１１では１０５ＣＦＵ／ｍＬの菌成長を示し、残りのキトサンでは菌成長が観察されていない。S.marcescensは、培養２４時間目に全てのキトサンで１０１〜１０２ＣＦＵ／ｍＬの菌数を示して対照区に比べて約６〜７ログサイクル程度成長が抑制されたが、キトサンの種類による成長抑制度の差は観察されていない。A.hydrophilaも、S.marcescensと同様に、キトサンの種類による成長抑制度の差は観察されていないが、対照区に比べて約４ログサイクル程度の菌数が減少して、キトサンの種類に関係なく高い成長抑制度を示した。グラム陽性菌の中でも、L.monocytogenesとS.aureusはＮ-２で、B.cereusはＮ-９とＮ-１０のキトサンで１０１ＣＦＵ／ｍＬ以下の菌成長を示しただけであり、他のキトサンでは菌成長が観察されていない。L.curvatusは１０１ＣＦＵ／ｍＬ以下または１０１ＣＦＵ／ｍＬ程度の菌成長を示し、L.plantarumはＮＳ-１１以外の残りのキトサンで１０１〜１０３ＣＦＵ／ｍＬの菌成長を示して、対照区に比べて菌成長が著しく抑制されたが、乳酸菌株の場合、他のグラム陽性菌に比べてキトサンの成長抑制効果は多少低い傾向を示した。公示菌株に対する０．５％不溶性キトサンの成長抑制効果はＮＳ-１１が最も高く、次はＮＳ-９が多少低い効果を示した。不溶性キトサンの公示菌株に対する成長抑制効果はグラム陰性菌よりグラム陽性菌で高く、グラム陽性菌ではキトサンの種類による成長抑制効果の差がなかったが、グラム陰性菌の場合にはキトサンの脱アセチル化度が高いほど成長抑制効果が高かった。
【００５６】
１−４．病原性微生物および腐敗微生物に対する最小成長阻害濃度（Minimum inhibitor concentration；ＭＩＣ）
高い抗菌活性を示す水溶性キトサンＳ-２、Ｓ-９、Ｓ-１０、Ｓ-１１、Ｓ-１２と、高い抗菌活性を示す不溶性キトサンＮＳ-２、ＮＳ-５、ＮＳ-８、ＮＳ-９、ＮＳ-１０、ＮＳ-１１を選別し、これらの１５種の公示菌株に対する最小成長阻害濃度を測定した。
【００５７】
水溶性キトサンと不溶性キトサンの公示菌株に対する最小成長阻害濃度を測定するために、寒天拡散法(agar diffusion method)を用い、公示菌株それぞれの成長適温で７２時間培養した後、最小成長阻害濃度を測定した。
【００５８】
水溶性キトサンのＭＩＣ測定結果は表９に示し、不溶性キトサンのＭＩＣ測定結果は表１０に示した。また、食品群別高抗菌活性度キトサン規格群は表１１に示した。
【００５９】
【表９】
0004705137.tif 000010
【００６０】
【表１０】
0004705137.tif 000011
【００６１】
【表１１】
0004705137.tif 000012
【００６２】
表９に示すように、公示菌株に対する水溶性キトサンのＭＩＣ範囲は０．０５〜０．８％、＞０．８％を示したが、乳酸菌株の場合、他の試験菌株に比べて低いＭＩＣを示した。L.curvatusの場合、Ｓ-２とＳ-１１で０．０５％のＭＩＣを示し、残りのキトサンでは０．０８％のＭＩＣを示した。L.plantarumはＳ-１０で最も高い０．１％のＭＩＣを示し、Ｓ-１２が０．０８％、Ｓ-２、Ｓ-９およびＳ-１１が０．０５％のＭＩＣを示した。B.cereusおよびB.subtilisのＭＩＣは０．１〜０．３％であって、キトサンの種類によって異なったが、B.subtilisのＭＩＣがB.cereusのＭＩＣより多少低かった。E.carotovoraの場合、Ｓ-１１とＳ-１２のＭＩＣは０．０８％であって、他のキトサンに比べて非常に低いＭＩＣを示し、E.carotovoraはグラム陰性菌の中で最も低いＭＩＣを示した。
【００６３】
また、表１０に示すように、公示菌株に対する不溶性キトサンのＭＩＣ範囲は、A.hydrophilaではＮＳ-２、ＮＳ-５、P.vulgarisではＮＳ-２、E.coliではＮＳ-５、Sal.typhimuriumではＮＳ-２、ＮＳ-５、ＮＳ-９、ＮＳ-１１が、＞０．１％のＭＩＣをそれぞれ示し、残りのキトサンのＭＩＣ範囲は０．０３〜０．１％であって、水溶性キトサンに比べて非常に低いＭＩＣ値を示した。グラム陽性菌のＭＩＣ範囲は０．０３〜０．０８％であって、公示菌株に対する不溶性キトサンのＭＩＣが大部分０．０５％を示した。これに対し、グラム陰性菌のＭＩＣ範囲は０．０５〜１％または＞１％であって、グラム陽性群に比べて広いＭＩＣ値を示し、グラム陰性菌に対する不溶性キトサンのＭＩＣは大部分０．０８％を示して、不溶性キトサンのＭＩＣもグラム陽性菌がグラム陰性菌より低かった。
【００６４】
また、表１１に示すように、５種の水溶性キトサン（Ｓ-２、Ｓ-９、Ｓ-１０、Ｓ-１１、Ｓ-１２）と６種の不溶性キトサン（ＮＳ-２、ＮＳ-５、ＮＳ-８、ＮＳ-９、ＮＳ-１０、ＮＳ-１１）は、食品群別公示菌株に対して優れた抗菌活性を示すので、食品保存期間を向上させて魚介類、肉類、蔬菜類に起因した腐敗および食中毒の予防に効果的である。
【００６５】
前記結果によれば、公示菌株に対するキトサンの抗菌活性に関連し、水溶性キトサンの場合には脱アセチル化度が６０％以上、不溶性キトサンの場合には脱アセチル化度が８９％以上のとき、非常に優れた抗菌活性を示した。また、選別されたキトサンの公示菌株に対する成長抑制活性および最小成長阻害濃度が水溶性キトサンより不溶性キトサンで高く、グラム陰性群よりはグラム陽性群に対してさらに高い効果を示した。
【００６６】
実験例２：抗酸化活性の測定
水溶性／不溶性キトサンの抗酸化活性を確認するために、下記の実験を行った。
【００６７】
２−１．ＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）消去効果
水溶性／不溶性キトサンのＤＰＰＨに対する電子供与能(electron donating ability)をＢｌｏｉｓ等による方法によって測定した。メタノールで希釈した水溶性／不溶性キトサン（１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを９６ウェルプレートに入れた後、６０μｍのＤＰＰＨ試液１００μＬを加え、室温で３０分間静置した後、５４０ｎｍで吸光度を測定した。
【００６８】
ＤＰＰＨ自由ラジカルに対する水溶性キトサンの抗酸化効果は図１に示し、ＤＰＰＨ自由ラジカルに対する不溶性キトサンの抗酸化効果は図２に示した。
【００６９】
図１および図２に示すように、水溶性キトサンＳ-９とＳ-１０は、１ｍｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ７９％と７４％のラジカル消去能を示し、０．５ｍｇ／ｍＬの低濃度でもそれぞれ７７％と７２％の高い抗酸化活性を示した。これらの２サンプル間の抗酸化活性が濃度によって大きくは異ならないことが分かった。ところが、Ｓ-４のサンプルは１ｍｇ／ｍＬの濃度では８３％の活性を示したが、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度では４８％の活性を示した。このような結果より、水溶性キトサンは抗酸化活性の変化が濃度に大きく影響されることが分かる。これに対し、不溶性キトサンは抗酸化活性の変化が濃度に大きく影響されず、４０〜５０％の抗酸化活性を示した。
【００７０】
２−２．セルラーシステムにおける抗酸化実験
１）細胞種類および試薬
ＬＬＣ−ＰＫ１(porcine renal epithelial cell)は、ＡＴＣＣ（Ｓｏｌｏｎ、ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）で、培養のためのＤＭＥＭ(Dulbecco's modified Eagal medium)とＦＢＳ(fetal bovine serum)はＩｎｖｉｔｏｇｅｎ ＣＯ．（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から購入して使用した。酸化的ストレスを誘導するために使用したＳＮＰは、Ｗａｋｏ（東京、日本）社の製品を、ＳＩＮ−１(3-morpholinosydnonimine)、ＡＡＰＨ[2,2'-Azobis(2-aminopropane)dihydrochloride]、ピロガロール(pyrogallol)、ＭＴＴ[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide]は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ＵＳＡ）社の製品を使用した。
【００７１】
２）細胞培養
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞は、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのフェニシリン−ストレプトマイシンと５％のＦＢＳが含有されたＤＭＥＭを用いて３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養した。培養された細胞は１週に２〜３回再給与し、培養６〜７日頃リン酸塩緩衝溶液（phosphate buffered saline；ＰＢＳ）で１次洗浄した後、０．０５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡで付着細胞を剥がして遠心分離した後、集積された細胞を培地に入れてピペットで細胞が均一に分散するようによく混合し、６〜７日毎に継代培養しながら実験に使用した。継代培養の際に、それぞれの通過回数(passage number)を記録し、通過回数が１０回以上のときは新しい細胞を培養して実験を行った。
【００７２】
３）細胞生存
細胞が集合(confluence)状態になると、９６ウェルプレートにウェル当たり１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬで植栽して２時間培養した後、酸化的ストレスを誘発するために、ペルオキシルラジカル（ＬＯＯ−）、ＯＮＯＯ−、ＮＯ、Ｏ２−の供与体であるＡＡＰＨ（１０ｍＭ）、ＳＩＮ−１（１ｍＭ）、ＳＮＰ（１．２ｍＭ）およびピロガロール（１．２ｍＭ）を添加して２４時間培養した。酸化的ストレスを誘発した後、Ｓ-１０およびＮＳ-８を濃度別（５０、１００、５００、１０００μｇ／ｍＬ）で処理して２４時間培養した後、１ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ溶液を各ウェルに注入して３７℃で４時間再培養した後、生成されたホルマザン結晶をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かして５４０ｎｍで吸光度を測定した（Ｍｏｓｍａｎｎ、１９８３）。
【００７３】
ＡＡＰＨを処理したＬＬＣ−ＰＫ１細胞に対する水溶性キトサン（Ｓ-１０）と不溶性キトサン（ＮＳ-８）の抗酸化活性を濃度別に示した結果は表１２のとおりであり、ＳＩＮ-１を処理したＬＬＣ−ＰＫ１細胞に対する水溶性キトサン（Ｓ-１０）と不溶性キトサン（ＮＳ-８）の抗酸化活性を濃度別に示した結果は表１３のとおりである。
【００７４】
【表１２】
0004705137.tif 000013
【００７５】
【表１３】
0004705137.tif 000014
【００７６】
表１２に示すように、ＡＡＰＨを処理したＬＬＣ−ＰＫ１細胞に対するスクリーニング過程を介して選択された、ＰＢＳに溶かした水溶性キトサン（Ｓ-１０）と１％酢酸に溶かした不溶性キトサン（ＮＳ-８）の抗酸化活性を濃度別に考察した結果、ＡＡＰＨのみを処理した対照区の細胞生存率は２３．６％であったが、Ｓ-１０とＮＳ-８をそれぞれ濃度別に処理した後の細胞生存率は濃度依存的に上昇し、水溶性キトサンの場合、１０００μｇ／ｍＬで６７．１％の細胞生存率を示し、対照区に比べて増加した。したがって、水溶性／不溶性キトサンはＡＡＰＨによるＬＬＣ−ＰＫ１細胞の酸化的ストレスに対して優れた改善効果を示し、特に水溶性キトサンが不溶性キトサンよりさらに優れた抗酸化活性を示した。
【００７７】
また、表１３に示すように、ＳＩＮ-１のみを処理した対照区は酸化的ストレスによる細胞損傷によって細胞生存率が２０．４％に減少したが、これに対し、Ｓ-１０およびＮＳ-８キトサンを濃度別に処理した後の細胞生存率は濃度依存的に増加して１０００μｇ／ｍＬ処理の際にそれぞれ７２．９％と６４．２％であった。これはＯＮＯＯ−に対する直接的な消去能を介して酸化的ストレスに対して改善効果を示したものと思われる。
【００７８】
実験例３：抗突然変異効果の測定
水溶性／不溶性キトサンおよびキトサン含有キムチの抗突然変異効果を確認するために、下記の実験を行った。
【００７９】
１−１．試薬および菌株
Ｄ−ビオチン、Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ（一水和物）、Ｄ−グルコース−６−ホスフェイト（モノナトリウム塩）、およびＮＡＤＰ（ナトリウム塩）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ＵＳＡ）から購入し、バクト栄養培養液（脱水した）とビテック寒天(Bitek agar)はＤｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＳＡ）から購入した。また、突然変異誘発源としては、直接突然変異源であるＭＮＮＧ(4-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)をＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ＵＳＡ）から購入して滅菌蒸留水に溶かして実験に使用し、間接突然変異源であるＡＦＢ１（アフラトキシンＢ１）をＳｉｇｍａ Ｃｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入してＤＭＳＯに溶かして使用した。
【００８０】
実験に使用した菌株は、Salmonella typhimurium TA100であって、米国カリフォルニア大学のＡｍｅｓ，Ｂ．Ｎ．博士から提供を受けて使用した。そして、これらの菌株は、実験直前にヒスチジン要求性、ディープラフ(deep rough)（ｒｆａ）突然変異、ｕｖｒＢ突然変異、Ｒ−因子などの遺伝形質を確認して使用した。
【００８１】
キムチ試料は、実施例２で製造したキトサン含有キムチの初期キムチと適熟期キムチ（ｐＨ４．３）を搾汁器（ミキサー）（ＮＵＣ、韓国）で搾汁して製造した汁液試料と２種のメタノール抽出物を使用した。汁液試料は、汁液の形で集めた後、４℃、９０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して採取した上澄み液をミリポアフィルター(Millipore filter)（０．２０μｍ）で濾過して除菌した後、試料として使用した。メタノール抽出物は、初期およびｐＨ４．３の適熟期まで発酵させたそれぞれのキトサンキムチを採取して凍結乾燥させた後、試料を磨砕して粉末に調製し、粉末試料に２０倍（ｗ／ｖ）のメタノールを添加して１２時間攪拌を２回繰り返し行って濾過した後、回転式真空濃縮器で濃縮して得た。抽出物はＤＭＳＯで希釈して実験に使用した。
【００８２】
１−２．直接突然変異源（ＭＮＮＧ）に対する抗突然変異効果
０．５ｍＬのリン酸緩衝液（直接突然変異源）に一晩培養した菌株（１〜２×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）０．１ｍＬ、希釈試料５０μＬおよび突然変異誘発物質５０μＬを氷浴中のキャップチューブ(cap tube)に添加して軽くボルテキシング(vortexing)し、３７℃で３０分間予備培養した。ここに４５℃のトップアガー（ヒスチジン／ビオチン溶液）２μＬを予備培養した各チューブに注ぎ、３秒間ボルテキシングして最小平板培地(minimal glucose agar plate)に塗抹し、３７℃で４８時間培養した後、復帰突然変異体(revertant)の数を計数した。突然変異抑制率(inhibition rate)は数式１によって計算した。Salmonella typhimurium TA100で直接突然変異源ＭＮＮＧ（０．４μｇ／ｐｌａｔｅ）によって誘発された突然変異に対する水溶性キトサンおよび不溶性キトサンの抗突然変異効果はそれぞれ表１４および表１５に示し、キトサン含有キムチのメタノール抽出物の抗突然変異効果は表１６および図３に示した。
【００８３】
抑制率（％）＝［（ａ−ｂ）／（ａ−ｃ）］×１０  ・・・（数式１）
ａ：突然変異源によって誘導された復帰突然変異数、
ｂ：試料を処理したときの復帰突然変異数、
ｃ：突然変異源と試料がない場合の自然復帰突然変異の数。
【００８４】
【表１４】
0004705137.tif 000015
【００８５】
【表１５】
0004705137.tif 000016
【００８６】
【表１６】
0004705137.tif 000017
【００８７】
表１４および表１５に示すように、水溶性キトサンは１．２５ｍｇ／ｐｌａｔｅの低濃度より２．５ｍｇ／ｐｌａｔｅの高濃度で抗突然変異効果が高かった。水溶性キトサンを２．５ｍｇ／ｐｌａｔｅの濃度で処理したとき、Ｓ-７は５５％の抗突然変異効果を示したが、これに対し、Ｓ-１０は添加濃度によって濃度依存的にさらに高い抗突然変異効果を示した。水溶性キトサンの中ではＳ-７とＳ-１０の抗突然変異効果が５５％と非常に高く、不溶性キトサンの中ではＮＳ-８が抑制率７０％であって抗突然変異効果が最も高かった。大部分の水溶性／不溶性キトサンは、濃度が増加するにつれて抗突然変異効果も有意に増加した。また、水溶性／不溶性キトサンは、脱アセチル化度が大きいほど、粘度が小さくなるほど抗突然変異効果が増加した。この実験は２３種のキトサンをスクリーニングする重要な根拠資料を提供している。
【００８８】
また、表１６および図３に示すように、不溶性キトサンＮＳ-８を１％添加したキムチを１．２５ｍｇ／ｐｌａｔｅの濃度で処理したとき、６４％の抗突然変異効果を示した。これは標準化キムチの抗突然変異効果（４１％）より高かった。また、キトサン含有キムチを２．５ｍｇ／ｐｌａｔｅの濃度で処理したとき、水溶性キトサンＳ-１０を１％添加したキムチと不溶性キトサンＮＳ-８を１％添加したキムチは７７％の最も高い抗突然変異効果を示した。これも標準化キムチの抗突然変異効果（５８％）より高かった。よって、水溶性／不溶性キトサン添加キムチは標準化キムチより高い抗突然変異効果を示すことが分かった。また、水溶性キトサンＳ-1０を添加したキムチに比べて不溶性キトサンＮＳ-８を添加したキムチが高い抗突然変異効果を示し、０．５％のキトサンを添加したキムチより１％のキトサンを添加したキムチが高い抗突然変異効果を示した。
【００８９】
１−３．間接突然変異源（ＭＮＮＧ）に対する抗突然変異効果
間接突然変異源を活性化させるために、ＭａｒｏｎとＡｍｅｓの方法によって、肝のミクロソーム酵素混合物(microsomal enzyme mixture)であるＳ９混合物を調製した。約２００ｇの雄性ＳＤ(Sprague-Dawley)ラットの肝酵素誘発のために、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）混合物であるＡｒｏｃｌｏｒ１２５４をトウモロコシ油１ｍＬ当たり２００ｍｇの濃度で希釈して１回腹腔注射し（５００ｍｇ／ｋｇ）、５日後に肝を摘出した。４℃の無菌状態で摘出した肝を０．１５Ｍ ＫＣｌで数回洗浄し、肝の重量の３倍量に相当する０．１５Ｍ ＫＣｌ溶液を加えて均質化器（Potter-Elvehjem apparatus、ＵＳＡ）で均質化した。これを９０００×ｇで１０分間遠心分離して上澄み液としてのＳ９分画を得た。その後、クリオチューブ(cryo tube)に１〜２ｍＬずつ分注してドライアイスで急速凍結した後、−１８０℃の液体窒素タンクに保管しながら実験に使用した。前記Ｓ９分画（１０％）をＭｇＣｌ−ＫＣｌ塩（２％）、１Ｍグルコース−６−ホスフェイト（０．５％）、１Ｍ ＮＡＤＰ（４％）、０．２Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）および滅菌数と混合してＳ９混合物を調製した。
【００９０】
リン酸緩衝液（直接突然変異源）の代わりにＳ９混合物（間接突然変異源）を使用した以外は、前記１−２の方法と同様にして実験した。Salmonella typhimurium TA100で間接突然変異源ＡＦＢ１（０．５μｇ／ｐｌａｔｅ）によって誘発された突然変異に対するキトサン含有キムチのメタノール抽出物の抗突然変異効果は表１７および図４に示した。
【００９１】
【表１７】
0004705137.tif 000018
【００９２】
表１７および図４に示すように、１．２５ｍｇ／ｐｌａｔｅの低濃度で不溶性キトサンＮＳ-８を０．５％添加したキムチは６７％の抑制率を示して抗突然変異効果が最も高かった。水溶性キトサンＳ-１０を１％添加したキムチは６３％の抑制率を示した。これは標準化キムチの抗突然変異効果（５３％）よりも高かった。キトサン添加キムチを２．５ｍｇ／ｐｌａｔｅの濃度で処理したとき、水溶性キトサンＳ-１０を０．５％添加したキムチは９２％の抑制率を示して抗突然変異効果が非常に大きかった。水溶性キトサンＳ-１０を１％添加したキムチは８７％の抑制率を示した。これは標準化キムチの抗突然変異効果（７７％）より高い。よって、水溶性／不溶性キトサンを添加したキムチは、間接突然変異源であるＡＦＢ１に対する抗突然変異効果においても、ＭＮＮＧにおける抗突然変異効果と類似な傾向を示した。
【００９３】
実験例４：抗体活性の測定
水溶性／不溶性キトサンおよびキトサン含有キムチの抗癌活性を確認するために、下記の実験を行った。
【００９４】
４−１．細胞培養
細胞培養のためにＲＰＭＩ１６４０、ＦＢＳ、０．０５％のトリプシン−０．０２％ＥＤＴＡおよび１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのフェニシリン−ストレプトマイシンは、ＧＩＢＣＯ社（ＵＳＡ）から購入して使用した。細胞培養には５％ＣＯ２培養器（Ｆｏｒｍａ、ｍｏｄｅｌ ＭＣ０９６、日本）を使用した。ＡＧＳヒト胃癌細胞(AGS human gastric adenocarcinoma cell)、ＨＴ−２９ヒト結腸癌細胞(HT-29 human colon adenocarcinoma cell)は韓国細胞株銀行（ソウル医大）から分譲を受けて培養しながら実験に使用した。
【００９５】
ＡＧＳヒト胃癌細胞およびＨＴ−２９ヒト結腸癌細胞は、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのフェニシリン−ストレプトマイシンと１０％のＦＢＳが含有されたＲＰＭＩ１６４０を用いて５％ＣＯ２培養器で培養した。培養されたそれぞれの癌細胞は、１週に２〜３回再給与し、６〜７日目にＰＢＳで洗浄した後、０．０５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡで付着細胞を剥がして遠心分離した後、集積された癌細胞を培地に入れてピペットで癌細胞が均一に分散するようによく混合し、７５ｍＬ細胞培養フラスコに１０ｍＬずつ一定の数を分割して注入し、６〜７日毎に継代培養しながら実験に使用した。継代培養の際にそれぞれの通過回数を記録し、通過回数が１０回以上のときは新しい癌細胞を液体窒素タンクから取り出して再び培養して実験した。
【００９６】
４−２．ＭＴＴアッセイ
前記培養された癌細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１８０μＬずつ分注し、試料を濃度別に２０μＬずつ添加した後、３７℃、５％培養器で７２時間培養した。ここに、リン酸生理食塩水に５ｍｇ／ｍＬの濃度で製造したＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）溶液２０μＬを添加し、同一の培養条件で４時間さらに培養した。１０分間２０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄み液を捨て、ＤＭＳＯ１５０μＬを加えた後、３０分間プレートを振とうした。この際、生成されたホルマザン結晶をＤＭＳＯに溶かしてＥＬＩＳＡリーダーによって５４０ｎｍで吸光度を測定した。細胞毒性率（％）は数式２で計算した。
【００９７】
細胞毒性率（％）＝［（対照区の吸光度−試料処理区の吸光度）／対照区の吸光度］×１００  ・・・(数式２)
【００９８】
水溶性キトサンのＡＧＳヒト胃癌細胞に対する成長抑制効果は表１８に示し、水溶性キトサンのＨＴ−２９ヒト結腸癌細胞に対する成長抑制効果は表１９に示し、不溶性キトサンのＨＴ−２９ヒト結腸癌細胞に対する成長抑制効果は表２０に示した。また、キトサン含有キムチのメタノール抽出物のＡＧＳヒト胃癌細胞に対する成長抑制効果は表２１に示し、キトサン含有キムチのメタノール抽出物のＨＴ−２９ヒト結腸癌細胞に対する成長抑制効果は表２２に示した。
【００９９】
【表１８】
0004705137.tif 000019
【０１００】
【表１９】
0004705137.tif 000020
【０１０１】
【表２０】
0004705137.tif 000021
【０１０２】
【表２１】
0004705137.tif 000022
【０１０３】
【表２２】
0004705137.tif 000023
【０１０４】
表１８に示すように、水溶性／不溶性キトサンのＡＧＳヒト胃癌細胞に対する抗癌効果は、５ｍｇ／ｍＬの高濃度でＳ-１０が最も高い抗癌効果を示し、濃度が増加するにつれて、抗癌効果も８〜８８％と急速に増加した。
【０１０５】
また、表１９および表２０に示すように、ＨＴ-２９ヒト結腸癌細胞においてもＡＧＳヒト胃癌細胞と同様の傾向を示して、１ｍｇ／ｍＬの低濃度のキトサンより５ｍｇ／ｍＬの高濃度のキトサンで高い抗癌効果を示した。水溶性キトサンＳ-７、Ｓ-８は４３〜４４％の最も高い抗癌効果を示し、不溶性キトサンＮＳ-８とＮＳ-９は８３％の非常に高い抗癌活性を示した。
【０１０６】
また、表２１に示すように、キトサン含有キムチのメタノール抽出物のＡＧＳヒト胃癌細胞に対する癌細胞成長抑制効果は、高濃度（２００μｇ／ｍＬ）で１％Ｓ-１０含有キムチと１％ＮＳ-８含有キムチの場合にそれぞれ６６％と８９％であって、標準化キムチ（３８％）より高い癌細胞成長抑制効果を示した。また、表２２に示すように、キトサン含有キムチのメタノール抽出物のＨＴ-２９ヒト結腸癌細胞に対する癌細胞成長抑制効果は、高濃度（２００μｇ／ｍＬ）で１％Ｓ-１０含有キムチと１％ＮＳ-８含有キムチの場合にそれぞれ４７％と６３％であって、標準化キムチ（３２％）より高い癌細胞成長抑制効果を示した。前述したように、不溶性キトサンを添加したキムチが水溶性キトサンを添加したキムチよりさらに優れた抗癌効果を示すことが分かる。
【０１０７】
実験例５：キトサン含有キムチの貯蔵安定性検証
本発明に係るキトサン含有キムチの貯蔵安定性を確認するために、キムチを４〜１５℃で発酵させながら５日毎に発酵特性を観察した。
【０１０８】
５−１．キムチ発酵中のｐＨおよび酸度の変化測定
試料は、実施例２〜５で製造したキトサン含有キムチを搾汁器（ＮＵＣ、韓国）で搾汁し、その汁液を使用した。ｐＨはｐＨメーター（Ｃｏｒｎｉｎｇ２２０、ＵＳＡ）によって室温で測定した。酸度は試料２０ｍＬを蒸留水で２０倍に希釈した後、ここから１０ｍＬを取ってＡＯＡＣ方法によって測定した。この際、０．１％フェノールフタレインを指示薬として１ｍＬ添加し、０．１Ｎ ＮａＯＨを滴定して、ピンク色を帯びる点を終末点とした。滴定値は数式３を用いて乳酸に換算し、含量％で表示した。
【０１０９】
乳酸（％）＝｛（０．１Ｎ ＮａＯＨのｍＬ×ＮａＯＨの規定濃度）／試料の重量（ｇ）｝×９・・・（数式３）
【０１１０】
１５℃で発酵された水溶性／不溶性キトサン含有キムチ（実施例２）のｐＨおよび酸度の変化は表２３に示し、４℃で発酵されたキトサン含有塩漬け液で漬けた白菜を用いて製造したキムチ（実施例３）のｐＨおよび酸度の変化は表２４に示し、４℃で発酵された塩で漬けた白菜をキトサン含有濯ぎ液で濯いでから製造したキムチ（実施例４）のｐＨおよび酸度の変化は表２５に示し、４℃で発酵されたキトサン含有薬味を用いて製造したキムチ（実施例５）のｐＨおよび酸度の変化は表２６に示した。
【０１１１】
【表２３】
0004705137.tif 000024
【０１１２】
【表２４】
0004705137.tif 000025
【０１１３】
【表２５】
0004705137.tif 000026
【０１１４】
【表２６】
0004705137.tif 000027
【０１１５】
表２３に示すように、キムチを作った直後のｐＨ変化を考察すると、不溶性キトサンを添加したキムチが著しく高いｐＨを維持した。発酵が進むにつれて、標準化キムチの発酵速度よりキトサンを添加したキムチの発酵速度が遅く、７日目のｐＨを比較すると、１％Ｓ-１０を添加したキムチのｐＨが３．９１であるが、標準化キムチのｐＨは３．７１と低かった。また、濃度が低いほどｐＨが低く、０．５％ＮＳ-８を添加したキムチのｐＨは３．７３であって標準化キムチとほぼ類似であった。４日目の適熟期を経て、キトサンを添加したキムチはさらに速く発酵が進み、発酵７日目になると、ｐＨは類似の値を示した。また、酸度の変化においても、最初は不溶性キトサン含有キムチの酸度が水溶性キトサン含有キムチの酸度より著しく低かったが、発酵が進むにつれて、酸度変化は類似であった。前述したように、発酵の初期にキトサンの添加によってキムチの発酵速度が遅くなるが、これはキトサンが初期発酵を抑制する効果のためであると思われる。
【０１１６】
また、表２４に示すように、白菜を漬け込む塩水におけるキトサン濃度が０．０５％、０．１５％、０．３％、０．５％に増加するにつれて、ｐＨの減少がゆっくりなされた。０．３％のキトサン含有塩漬け液で漬けた白菜を用いて製造したキムチの場合、発酵１５〜２５日目までｐＨ４．２〜４．４、酸度０．６〜０．７％を維持し、０．５％のキトサン含有塩漬け液で漬けた白菜を用いて製造したキムチの場合、３５日目になって初めて適熟期に到達し、３５日目になってもｐＨは４．０以下に減少しなかった。これは標準化キムチの発酵様相と比較するときに貯蔵性が増加し、可食期間が長くなることが分かる。これに対し、０．０５％および０．１５％のキトサン含有塩漬け液で漬けた白菜を用いて製造したキムチの場合は、標準化キムチと類似の時期に適熟期に到達した。
【０１１７】
また、表２５に示すように、塩で漬けた白菜をキトサン含有濯ぎ液で濯いでから製造したキムチも、１５日に適熟期に到達したことからみて、標準化キムチより貯蔵性が増加することが分かる。ところが、キトサン添加濃度間には差異を示していない。
【０１１８】
また、表２６に示すように、水溶性／不溶性キトサン含有（０．１、０．２５、１．５％）薬味を用いて製造したキムチは、１５日に適熟期に到達し、０．５％の水溶性／不溶性キトサンを含有した薬味を用いて製造したキムチは、標準化キムチと同様に１０日目に適熟期（ｐＨ４．３４）に到達したことを確認した。酸度もｐＨと類似の傾向を示し、水溶性／不溶性キトサン含有薬味を用いて製造したキムチが標準化キムチより増加した貯蔵性を示すことが分かる。ところが、キトサン添加濃度間には差異を示していない。
【０１１９】
前記ｐＨと酸度の変化を観察した結果、キトサン含有塩漬け液で漬けた白菜を用いて製造したキムチが、塩漬けにした白菜をキトサン含有濯ぎ液で濯いでから製造したキムチと水溶性／不溶性キトサン含有薬味を用いて製造したキムチと比較して最も優れた貯蔵性および保存性を示した。
【０１２０】
前述したように、キトサン含有キムチは、キトサンがキムチをゆっくり発酵させて、その貯蔵性および保存性を増加させる役割を果たすことにより、標準化キムチに比べて適熟期への到達期間が長くて発酵がゆっくり起るようにして、これにより貯蔵安定性に優れたことが分かる。
【０１２１】
５−２．キムチ発酵中の乳酸菌数の測定
実施例２〜５で製造したキトサン含有キムチがキムチ乳酸菌、すなわちロイコノストック属(Leuconostoc sp.)およびラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)の成長に及ぼす影響を観察した。
【０１２２】
キムチは、発酵初期にロイコノストック属(Leuconostoc sp.)乳酸菌が生成されながらキムチの味と風味を良くするうえ、雑菌である好気性細菌の繁殖を抑制させ、さっぱりした味を出すが、発酵が進むにつれて、酸っぱい味を出すラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)乳酸菌が増加し、ｐＨは減少し、酸度は増加する。
【０１２３】
キムチ発酵中の乳酸菌数は、平板計数法(plate count technique)を用いて測定した。キムチ発酵熟成中の微生物菌数の変化は、混合液１ｍＬを滅菌した蒸留水で段階的に１０１〜１０７まで希釈し、各希釈液中の０．１ｍＬずつを予め加熱融解して４３〜４５℃に冷却したＭＲＳ培地１０ｍＬに仕込んで混合した後、ペトリー皿に平板を作り、３７℃の培養器で４８時間培養して、現れたコロニー数を数えて乳酸菌数として測定した。培地は乳酸菌の分離に主に使われるＭＲＳ寒天培地を使用した。ＭＲＳ寒天培地の組成は表２７に示した。ラクトバチルス(Lactobacillus)培地は、ラクトバチルス選択培地（ＬＢＳ培地）にペディオコッカス(Pediococcus)の生育を抑制するために酢酸と酢酸ナトリウムを添加した改質ＬＢＳ寒天培地（ｍ−ＬＢＳ培地、表２８）を用いて３０℃で３日間平板培養した。ロイコノストック(Leuconostoc)選択培地として、フェニルエチルアルコールとスクロースを添加したフェニルエチルアルコールスクロース寒天培地（ＰＥＳ培地、表２９）を用いて２０℃で３日間平板培養した。
【０１２４】
キトサン含有キムチ（実施例２）の１５℃における発酵中のロイコノストック属(Leuconostoc sp.)およびラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)の数変化は図５に示し、キトサン含有塩漬け液で漬けた白菜を用いて製造したキムチ（実施例３）の４℃における発酵中のロイコノストック属(Leuconostoc sp.)およびラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)の数変化は図６に示し、塩漬けにした白菜をキトサン含有濯ぎ液で濯いでから製造したキムチ（実施例４）の４℃における発酵中のロイコノストック属(Leuconostoc sp.)およびラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)の数変化は図７に示し、キトサン含有薬味を用いて製造したキムチ（実施例５）の４℃における発酵中のロイコノストック属(Leuconostoc sp.)およびラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)の数変化は図８に示した。
【０１２５】
【表２７】
0004705137.tif 000028
【０１２６】
【表２８】
0004705137.tif 000029
【０１２７】
【表２９】
0004705137.tif 000030
【０１２８】
図５〜図８に示すように、本発明に係るキトサン含有キムチは、ロイコノストック属(Leuconostoc sp.)およびラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)乳酸菌の成長速度を抑制させて優れた貯蔵性および保存性を示すことが分かる。
【０１２９】
実験例６：キトサン含有キムチの組織感の測定
本発明に係るキトサン含有キムチの貯蔵期間中の組織感を確認するために、下記の実験を行った。
【０１３０】
３週および４週発酵した、実施例３で製造したキムチ（０．３％および０．５％キトサン含有塩漬け液を使用）を１０ｃｍ２ずつ切って試片として準備し、この試片の切断強度を測定して組織感を判断した。その結果は表３０に示した。
【０１３１】
【表３０】
0004705137.tif 000031
【０１３２】
表３０に示すように、本発明に係るキトサン含有キムチは標準化キムチより非常に優れた組織感を持つことが分かる。
【０１３３】
実験例７：キトサン含有塩漬け液で漬けた塩漬け白菜、およびこれを用いて製造したキムチのキトサン含量の測定
本発明に係るキトサン含有塩漬け液で漬けた塩漬け白菜、およびこれを用いて製造したキムチのキトサン含量を確認するために、下記の実験を行った。
【０１３４】
実施例３で０．３％および０．５％キトサン含有塩漬け液で漬けた塩漬け白菜、および前記塩漬け白菜を用いて製造したキムチのキトサン含量を測定した。その結果は表３１に示した。
【０１３５】
【表３１】
0004705137.tif 000032
【０１３６】
表３１に示すように、キトサン含有塩漬け液で漬けた塩漬け白菜およびこれを用いて製造したキムチは、塩漬け濃度によってキトサンが塩漬け白菜に含浸され、これによりキムチの組織感を改善させ、食餌繊維自体の機能性を補完する。すなわち、植物性セルロースは陰（−）電荷の食餌繊維であるが、キトサンは陽（＋）電荷の食餌繊維であるため、キトサンが塩漬け物に適量含浸混入されると、陽性食餌繊維になってキムチの植物性セルロースの構造が緻密になるので、キムチの組織感を改善させ且つ食餌繊維自体の機能性を補完するものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】ＤＰＰＨ自由ラジカルに対する水溶性キトサンの抗酸化効果を示す図である。
【図２】ＤＰＰＨ自由ラジカルに対する不溶性キトサンの抗酸化効果を示す図である。
【図３】Salmonella typhimurium TA100で直接突然変異源としてのＭＮＮＧ（０．４μｇ／ｐｌａｔｅ）によって誘発された突然変異に対するキトサン含有キムチのメタノール抽出物の抗突然変異効果を示す図である。
【図４】Salmonella typhimurium TA100で間接突然変異源としてのＡＦＢ１（０．５μｇ／ｐｌａｔｅ）によって誘発された突然変異に対するキトサン含有キムチのメタノール抽出物の抗突然変異効果を示す図である。
【図５】キトサン含有キムチ（実施例２）の１５℃での発酵中におけるロイコノストック属(Leuconostoc sp.)およびラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)の数の変化を示す図である。
【図６】キトサン含有塩漬け液で漬けた白菜を用いて製造したキムチ（実施例３）の４℃における発酵中のロイコノストック属(Leuconostoc sp.)およびラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)の数変化を示す図である。
【図７】塩漬けにしたキムチをキトサン含有濯ぎ液で濯いでから製造したキムチ（実施例４）の４℃における発酵中のロイコノストック属(Leuconostoc sp.)およびラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)の数変化を示す図である。
【図８】キトサン含有薬味を用いて製造したキムチ（実施例５）の４℃における発酵中のロイコノストック属(Leuconostoc sp.)およびラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)の数変化を示す図である。
【図１】
0004705137.tif 000033
【図２】
0004705137.tif 000034
【図３】
0004705137.tif 000035
【図４】
0004705137.tif 000036
【図５】
0004705137.tif 000037
【図６】
0004705137.tif 000038
【図７】
0004705137.tif 000039
【図８】
0004705137.tif 000040