(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体上に、軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞を播種し、播種後の多孔質体を培養液に入れ１００〜１０００Ｇの加速度を所定時間加え、その後は多孔質体に加速度を加えずに培養することを特徴とする軟骨組織再生用シートの作製方法。
【請求項２】
播種した軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞方向から生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体へ向けて加速度を加える請求項１に記載の軟骨組織再生用シートの作製方法。
【請求項３】
生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体方向から播種した軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞へ向けて加速度を加える請求項１に記載の軟骨組織再生用シートの作製方法。
【請求項４】
生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体が、Ｌ−乳酸，ＤＬ−乳酸，グリコール酸，ε−カプロラクトン，ポリリンゴ酸，キトサンのホモポリーマー又はコポリマーから選ばれる４０，０００〜５００，０００の分子量の異なる少なくとも１種以上のホモポリーマー又はコポリマーから成り、孔の直径が１〜５０μｍで、有孔率が５〜９５％を成し、厚さが５０〜５００μｍである請求項１ないし３の何れか１項に記載の軟骨組織再生用シートの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変形性関節症などの疾患や事故などにより受けた軟骨創傷を修復するために用いる軟骨組織再生用シートの作製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、機能障害や機能不全に陥った生体組織・臓器の再生を計る再生医療の実現が求められている。再生医療は、本来生体が持っている治癒能力では回復できなくなった生体組織を、細胞，生体材料及び細胞成長因子の三つを使って元の組織と同じような形態や機能を再び作り出す新たな医療技術である。【０００３】
生体組織を再生するための担体材料には、細胞を培養するための多孔質性や生体親和性や生体吸収性などの条件が要求され、従来ではポリ乳酸やポリグリコール酸や乳酸とグリコール酸との共重合体のような生体吸収性合成高分子、又はコラーゲンなどの天然高分子で調製した多孔質性担体材料が用いられていた（例えば、特許文献１及び特許文献２参照。）。【０００４】
他の組織と同様に軟骨の再生においても積極的な研究が行われており、変形性関節症などの疾患の治療に大きな期待が寄せられている。軟骨組織を再生するためにも、軟骨細胞あるいは軟骨細胞に分化する幹細胞が増殖するための足場として、また形成しようとする生体組織の支持体として多孔質性の担体材料が必要である。【０００５】
生体由来の天然高分子の多孔質性材料である例えばコラーゲンのスポンジやシートは、親水性があり細胞との相互作用が非常に優れており、細胞の播種が容易なものであるが、機械的強度が低く、また柔らかくて捩れ易いので臨床では取り扱い難いという問題点があった。そのため、生体吸収性合成高分子から成る担体材料が広く使用されている。【０００６】
一方、幹細胞をin vitroにおいて軟骨細胞へ分化させるには体内と同様な圧力が必要であることが知られており、幹細胞を常圧で培養しても細胞は増えるが変形してしまい再生に十分な量を得ることができず、更には長時間経つと軟骨細胞としての性質を失うこともある。また、一般的には遠心力により細胞凝集塊を作製して培養するペレット培養法が汎用されているが、一度に分化させられる細胞の数が低く効率が非常に悪いという問題点がある。【０００７】
従来では幹細胞を軟骨細胞に分化させるために特定圧力下で分化培養する方法や細胞塊を形成してのペレット培養法にて分化が行われている（例えば、特許文献３〜８参照。）。これは温度やガス濃度を適切に保つと同時に、歩行や運動などにより細胞が体内で受ける圧力と同様な圧力をかけながら培養液を供給し、細胞組織を三次元担体で培養する方式である。しかしながら、従来の加圧培養法は主に静水圧によるものであり、定期的な圧力変動を加えるにしても軟骨細胞の培養又は分化の間は圧力を加え続けていなければならず、管理，費用等の面で問題があった。【０００８】
また、従来の生体吸収性合成高分子から成る担体材料は、生体吸収性があり機械的強度に優れているものの疎水性が強く、特に軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞を播種することが極めて困難であった。このため有効な細胞の播種率が得られず、これら細胞を大量に支持担体に集積することができないので軟骨組織の再生効率が低く実用化が難しかった。これは特定圧力下での分化や培養でも同様であり、形成される軟骨細胞はその層が薄く播種効率が低いという欠点もあった。【０００９】
【特許文献１】特開２００３−１０３０８号公報
【特許文献２】特開２００４−１０５０４６号公報
【特許文献３】特開２００１−２３８６６３号公報
【特許文献４】特開２００２−３０６１５７号公報
【特許文献５】特開２００２−３１５５６６号公報
【特許文献６】特開２００３−１６９６６３号公報
【特許文献７】特開２００３−１８０３３１号公報
【特許文献８】特開２００３−２８９８５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで本発明は、従来のポリ乳酸やポリグリコール酸や乳酸とグリコール酸との共重合体のような生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体を用いた軟骨組織再生用シートにおいて、従来の加圧培養のような加圧による培養を行う必要が無く軟骨細胞を再分化又は軟骨細胞に分化する幹細胞を分化することができ、しかも細胞を効率良く支持担体に集積することが可能である軟骨組織再生用シートの作製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は前記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体上に、軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞を播種した後に特定の加速度を加えると、その後はいかなる加速度や圧力を加えなくても軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞を確実に軟骨へ分化でき、しかも高い播種効率で軟骨を培養可能であることを見出して本発明を完成したのである。【００１２】
即ち本発明は、生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体上に、軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞を播種し、播種後の多孔質体を培養液に入れ１００〜１０００Ｇの加速度を所定時間加え、その後は多孔質体に加速度を加えずに培養することを特徴とする軟骨組織再生用シートの作製方法であり、生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体としては、Ｌ−乳酸，ＤＬ−乳酸，グリコール酸，ε−カプロラクトン，ポリリンゴ酸，キトサンのホモポリーマー又はコポリマーから選ばれる４０,０００〜５００,０００の分子量の異なる少なくとも１種以上のホモポリーマー又はコポリマーから成り、孔の直径が１〜５０μｍで、有孔率が５〜９５％を成し、厚さが５０〜５００μｍであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る軟骨組織再生用シートの作製方法は、生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体上に、軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞を播種した後に特定の加速度を加えると、その後はいかなる加速度や圧力を加えなくても幹細胞を確実に軟骨へ分化でき、しかも高い播種効率で軟骨を培養可能な軟骨組織再生用シートを得ることができる軟骨組織再生用シートの作製方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明方法で作製した軟骨組織再生用シートと、遠心力を付与しないで作製した遠心力付与無しシートと、生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体を使用しない軟骨組織ペレットとの軟骨分化組織のＤＮＡ量を示す棒グラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明で用いる生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体は、Ｌ−乳酸，ＤＬ−乳酸，グリコール酸，ε−カプロラクトン，ポリリンゴ酸，キトサンのホモポリーマー又はコポリマーから選ばれる生体吸収性合成高分子を用いることが強度と生体への安全性の面から好ましい。【００１６】
また、多孔質体を構成する生体吸収性合成高分子の分子量が４０,０００〜５００,０００であることが好ましく、４０,０００未満では膜の固さが低下する傾向があり、５００,０００を超えると膜が硬くなり過ぎる傾向が生じてくる。多孔質体の孔の直径が１μｍ未満ではシートの柔軟性が乏しくなり、５０μｍを超えるとシート面が著しく粗造化して細胞の播種率が低下する傾向がある。【００１７】
多孔質体の有孔率は、５％未満では有孔性にした効果が認められず更にシートの柔軟性が劣り、９５％を超えるとシートが柔軟になり過ぎ臨床での操作が行い難くなる。また、多孔質体のシートの厚さが５０μｍ未満では薄く破れ易く操作性が低下し、５００μｍを超えるとシートが固くなり過ぎて操作性が低下する虞れが生じる。【００１８】
本発明で使用する軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞は、軟骨細胞を直接、又は間葉系幹細胞，間葉系細胞及び歯周靭帯細胞などの軟骨細胞に分化し得るか又はそれらの修復を促進し得る能力を有する幹細胞を採取することにより得る。採取する方法としては通常医科で行われている方法が特に限定されずに使用でき、例えば、骨盤（腸骨）や手足の長管（大腿骨，脛骨）の骨髄及び／又は骨膜，歯槽骨等の骨髄，口蓋又は歯槽骨等の骨膜等が挙げられる。中でも、採取の際、皮膚，筋肉の剥離切開が最小で済む簡易な手術で行うことが可能な歯槽骨等の骨髄，口蓋又は歯槽骨等の骨膜等を採取源とすることが好ましい。【００１９】
採取した軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞は、通法に従い組織培養用の培養容器で１〜２週間の間、増幅培養される。培養に用いられる培地としては、適宜の培地が使用できるが、例えば自己血清，ウシ胎児血清（FBS）を含有した細胞培養用のDMEM培地が好適に使用できる。このとき、特定の成長因子（例えば、bFGF）を作用させると、間葉系幹細胞は高い多分化能力を保ったまま増殖され軟骨の再生を促進でき、顕著な再生能力を有する。【００２０】
このように特定の成長因子の存在下で多分化能力を保ったまま超増幅培養された間葉系幹細胞をトリプシン処理により培養容器から剥離し、生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体上に播種する。【００２１】
次いで、軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞を播種したシート状の多孔質体を培養液に入れ、遠心分離機等により１００〜１０００Ｇ、好ましくは２００〜６００Ｇの加速度を所定時間加える。加速度を加えることによって以後加圧下で培養することなく軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞を確実に軟骨細胞へ分化させることが可能であり、更に加速度による高圧でシート状の多孔質体の内部に軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞を侵入させることができるので、その結果従来よりも厚く生体吸収性合成高分子との接着が良好な軟骨細胞の層を得ることができるのである。【００２２】
このとき、播種した軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞方向から生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体へ向けて加速度を加えてもよいし、生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体方向から播種した軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞へ向けて加速度を加えてもよいが、播種した軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞方向から生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体へ向けて加速度を加えた方がシート状の多孔質体の内部に細胞が侵入し易いので高い細胞の播種率を得ることができ好ましい。【００２３】
加速度を加える時間は、加速度の強さ，細胞の密度や使用する生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体の条件によって異なるが、３０秒から３０分間であることが好ましい。また、加速度を加える際の温度は一般の細胞培養温度に等しく特に制限はない。【００２４】
軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞を播種した生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体を入れた培養液ごと１００〜１０００Ｇの加速度を加えた後に、生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体を軟骨分化誘導に適した培地（例えば、文献：Science 284, 143-147, 1999記載の培地）を用いて常圧で３〜４週間培養し軟骨細胞を培養し、又は軟骨細胞へと分化させる。本発明方法においては、この培養時に加速度及び／又は圧力を加える必要はない。
【実施例】
【００２５】
以下，本発明を実施例により具体的に示すが，本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００２６】
１）腸骨からの骨髄液の採取
３名の人よりそれぞれ全身麻酔下にて腸骨より小宮式穿刺針を用いて骨髄液を陰圧下で採取した。その後、採取したそれぞれの骨髄液を10％FBS，DMEM培地で洗浄し、その洗浄液中でよく懸濁して骨髄液をほぐした後、３００Ｇで５分間遠心分離し、細胞を分離して約７×１０7個の有核細胞を得た。【００２７】
２）骨髄由来間葉系幹細胞の培養
骨髄液から採取した７×１０7の有核細胞を前記と同様のDMEM培地の７５ｃｍ2培養フラスコへ播種し、３７℃にて５％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培地を交換することによって非接着細胞を除去した。以後３日に１回培地を交換した。５日目からはbFGFを３ｎｇ／ｍｌの割合で培地に添加した。その結果、１０日前後でほぼ集密的にまで増殖した。この培養フラスコを（0.05％トリプシン＋0.2mM MEDTA）で５分間インキュベートして細胞を単離した。細胞数をCoulterカウンター（Z1シングル，コールター社製）で計測し、そして5,000細胞個／cm2の密度で細胞を10%FBS，DMEM培地の７５ｃｍ2培養フラスコへ播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的（コンフルエント）になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を間葉系細胞とした。【００２８】
３）生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体の作製
分子量230,000のポリ−Ｌ−乳酸と分子量250,000のＤＬ−乳酸／グリコール酸共重合体とを所定の割合で混合した高分子ブレンドをジオキサンに溶解させた後、凍結乾燥によって、孔の直径が平均２１μｍ，有孔率６０％，厚さ１００μｍの生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体を作製した。【００２９】
４）軟骨組織再生用シートの作製
生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体を直径８ｍｍに切断し、前記の間葉系細胞をその上に集密状態のまま播種した。遠心分離器（商品名：小型卓上遠心機，コクサン社製）により播種した間葉系細胞方向から生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体へ向けて略垂直に約３５２Ｇの加速度を３分間加えた（半径15cm，1500rpm）。その後、軟骨分化誘導培地（50μg/ml Ascorbic acid 2-phosphate, 100μg/ml Pyruvate, 4.5g/l D-(+)-glucose, 2mM L-glutamine, 10ng/ml TGF-β3, 10-7M Dexamethason, 1% ITS+を含有したMEM）にて３７℃，常圧下で４週間培養して軟骨組織再生用シートを作製した。
試料中の細胞数を把握するためにtotal DNAをMolecular Probe社製のPicoGreen dsDNA Quantitation kit (Molecular Probes, P-7589)を用いて測定した。上記に従って作製した軟骨組織再生用シートをPBSで洗浄後、パパイン溶液（300μg/ml Papain， 2 mM EDTA, 2 mM N-アセチルシステイン, 50 mM KPB (pH 6.5)を加え、６０℃で１時間インキュベートした。超音波破砕器（SONIX & MATERIALS Inc製，Vibra Cell-model 130で振幅目盛30, 10sec, on ice）で細胞を破砕して、抽出物をチューブに移し、これをDNA測定用試料とした。試料は使用時まで−３０℃で保存する。λDNA標準溶液（100μg/ml）をトリスEDTA溶液（TE）で順次希釈して検量線溶液を調整した。DNA測定用試料は、10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH7.5 (TE)で５倍及び１０倍希釈した溶液を用意して、任意で96ウェルプレート（Nunclon Surface, Nunc 137101）へ１ウェル当たり100μLを添加した。軽く撹拌し、５分後にEx/Em: 485/535nm（480/520nm）を測定し，λDNAの標準曲線から各試料中のDNA量を求めた結果を図１に黒塗り棒グラフで示した。【００３０】
５）軟骨シート比較例（遠心力付与無しシート）の作製
生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体を直径８ｍｍに切断し、前記の間葉系細胞をその上に集密状態のまま播種した。遠心力による圧力をかけることなく、軟骨分化誘導培地（50μg/ml Ascorbic acid 2-phosphate, 100μg/ml Pyruvate, 4.5g/l D-(+)-glucose, 2mM L-glutamine, 10ng/ml TGF-β3, 10-7M Dexamethason, 1% ITS+を含有したMEM）にて３７℃，常圧下で４週間培養して軟骨組織再生用シートの作製を作製した。
試料中の細胞数を把握するためにtotal DNAをMolecular Probe社製のPicoGreen dsDNA Quantitation kit (Molecular Probes, P-7589)を用いて測定した。上記に従って作製した軟骨組織再生用シートをPBSで洗浄後、パパイン溶液（300μg/ml Papain， 2 mM EDTA, 2 mM N-アセチルシステイン, 50 mM KPB (pH 6.5)を加え、６０℃で１時間インキュベートした。超音波破砕器（SONIX & MATERIALS Inc製， Vibra Cell-model 130で振幅目盛30, 10sec, on ice）で細胞を破砕して、抽出物をチューブに移し、これをDNA測定用試料とした。試料は使用時まで−３０℃で保存する。λDNA標準溶液（100μg/ml）をトリスEDTA溶液（TE）で順次希釈して検量線溶液を調整した。DNA測定用試料は、10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH7.5 (TE)で５倍及び１０倍希釈した溶液を用意して、任意で96ウェルプレート（Nunclon Surface, Nunc 137101）へ１ウェル当たり100μLを添加した。軽く撹拌し、５分後にEx/Em: 485/535nm（480/520nm）を測定し，λDNAの標準曲線から各試料中のDNA量を求めた結果を図１にハッチング棒グラフで示した。【００３１】
６）軟骨シート比較例（軟骨組織ペレット）の作製
前記の間葉系細胞を軟骨分化誘導培地（50μg/ml Ascorbic acid 2-phosphate, 100μg/ml Pyruvate, 4.5g/l D-(+)-glucose, 2mM L-glutamine, 10ng/ml TGF-β3, 10-7M Dexamethason, 1% ITS+を含有したMEM）中に懸濁して30万細胞/遠沈管になるように15 ml遠沈管に移した。遠心分離器（商品名：小型卓上遠心機，コクサン社製）により播種した間葉系細胞方向を遠沈管底面へ向けて略垂直に約３５２Ｇの加速度を３分間加えた（半径15cm，1500rpm）。その後、軟骨分化誘導培地（50μg/ml Ascorbic acid 2-phosphate, 100μg/ml Pyruvate, 4.5g/l D-(+)-glucose, 2mM L-glutamine, 10ng/ml TGF-β3, 10-7M Dexamethason, 1% ITS+を含有したMEM）にて３７℃，常圧下で４週間培養した。遠沈管内の細胞は播種後まもなく細胞塊を形成して、培養終了後には約１ｍｍ程度の軟骨組織ペレットが作製された。
試料中の細胞数を把握するためにtotal DNAをMolecular Probe社製のPicoGreen dsDNA Quantitation kit (Molecular Probes, P-7589)を用いて測定した。上記に従って作製した軟骨組織ペレットをPBSで洗浄後、パパイン溶液（300μg/ml Papain， 2 mM EDTA, 2 mM N-アセチルシステイン, 50 mM KPB (pH 6.5)を加え、６０℃で1時間インキュベートした。超音波破砕器（SONIX & MATERIALS Inc製， Vibra Cell-model 130で振幅目盛30, 10sec, on ice）で細胞を破砕して、抽出物をチューブに移し、これをDNA測定用試料とした。試料は使用時まで−３０℃で保存する。λDNA標準溶液（100μg/ml）をトリスEDTA溶液（TE）で順次希釈して検量線溶液を調整した。DNA測定用試料は、10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH7.5 (TE)で５倍及び１０倍希釈した溶液を用意して、任意で96ウェルプレート（Nunclon Surface, Nunc 137101）へ１ウェル当たり100μLを添加した。軽く撹拌し、５分後にEx/Em: 485/535nm（480/520nm）を測定し，λDNAの標準曲線から各試料中のDNA量を求めた結果を図１に白抜き棒グラフで示した。【００３２】
図１から、生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体上に、軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞を播種し、播種後の多孔質体を培養液に入れ１００〜１０００Ｇの加速度を所定時間加え、その後は多孔質体に加速度を加えずに培養した軟骨組織再生用シートには、加速度を加えない遠心力付与無しシートや生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体を使用しない軟骨組織ペレットに比べてDNA量が著しく多いので、軟骨組織の再生効率が優れていることが判る。【００３３】
また、本発明方法で作製した軟骨組織再生用シートをヌードマウスの背中の皮下に移植した。移植後７週の時点で検体を採収し、ヘマトオキシリンエオシン染色、safranin-O染色を行った。また、検体よりm-RNAを回収しRT-PCRにより関節軟骨組織に特有に見られるタイプ II コラーゲン，アグリカンの発現解析を行った。その結果、ヌードマウスの背中の皮下に移植した検体は表面光沢があり色が乳白色であることが観察された。また、ヘマトオキシリンエオシン染色とsafranin-O染色の結果では小窩内小円形細胞とSafranin-O染色性細胞外マトリックスが認められた。更に検体から抽出したm-RNA試料中にタイプ II コラーゲンやアグリカンを発現するm-RNAが検出同定された。これらのことから再生した組織が関節軟骨組織であることが確認できた。また、得られた軟骨組織再生用シートは軟骨細胞が高密集状態で表面及び表面から十分な深さに至るまで培養されていることも確認された。
【図１】
0004620110.tif 000002