(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有し、かつプリマキンまたはその金属塩に耐性を有するエシェリヒア・コリに属する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−ヒスチジンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−ヒスチジンを採取することを特徴とする、Ｌ−ヒスチジンの製造法。
【請求項２】
エシェリヒア・コリＨ−９３４２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７５）またはエシェリヒア・コリＨ−９３４３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７６）を培地に培養し、培養物中にＬ−ヒスチジンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−ヒスチジンを採取することを特徴とする、Ｌ−ヒスチジンの製造法。
【請求項３】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有し、かつ１５０ｍｇ/Ｌのプリマキン二ナトリウム塩に耐性を有するエシェリヒア・コリ。
【請求項４】
エシェリヒア・コリＨ−９３４２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７５）およびエシェリヒア・コリＨ−９３４３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７６）から選ばれる微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、発酵法によるＬ−アミノ酸の工業的に効率の良い製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖から直接Ｌ−アミノ酸を生成蓄積させる直接発酵法としては、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、エシェリヒア属、セラチア属、アースロバクター属などの微生物の野生株から誘導した突然変異株を用いる方法が知られている。例えばＬ−アミノ酸生産性変異株としては、アミノ酸等の栄養要求性を有した菌株（特公昭５６-１００３７）、アミノ酸のアナログやビタミン等の耐性変異を有した菌株（特開昭５６-１３４９９３、特開昭６２-４４１９３）、栄養要求性変異とアミノ酸のアナログ耐性変異を共有した菌株（特開昭５０-３１０９３、特開昭５６-１３４９９３）、分解能の低下した菌株（特開昭６３-２７３４８７、特公昭５２-４８１９５）、あるいはアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素に基質親和性が減少した変異を有する菌株（特開平４-３３０２７５）等が知られている。
【０００３】
Ｌ−トリプトファンの製造においては、アミノキノリン誘導体またはフェノチアジン誘導体に対する耐性を付与することでアミノ酸生産性を向上させた例（特開平４−１１２７９５）が報告されている。
【０００４】
さらにアミノ酸の生合成に係わる遺伝子を含む組換え体ＤＮＡで形質転換された菌株を用いることで、アミノ酸の生産性を向上することができることも知られている（特開昭５８-８９３、特開昭６０-１２９９５、特開昭６０−２１０９９４、特開昭６０-３０６９３、特開昭６１-１９５６９５、特開昭６１−２７１９８１、特開平２-４５８、特開平２-４２９８８、特公平１−４２６７６、特公平５−１１９６０、特公平５−２６４６７）。
【０００５】
ＤＮＡジャイレース欠損株ではヒスチジン合成系に関与するオペロンの発現量が上昇すること[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 517 (1987)]、ＤＮＡジャイレース変異株ではHis-tRNAを含むいくつかのアミノ酸t-RNAレベルが低下していること[J. Mol. Biol., 66, 131 (1972)]が報告されているが、ＤＮＡジャイレース阻害剤耐性とアミノ酸生産性の関係についての報告はされていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本願発明の目的は、医薬品、化学品、食品および飼料添加物などとして有用なＬ−アミノ酸の工業的に効率のよい製造方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
即ち、本願発明は、以下の（１）〜（１４）に関する。
（１）  Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつＤＮＡジャイレース阻害剤に対する耐性を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該Ｌ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物から該Ｌ−アミノ酸を採取することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（２）  ＤＮＡジャイレース阻害剤が、ナリジキシン酸、オキソリン酸、クーママイシン、ノボビオシン、およびこれらの物質のアルカリ金属塩からなる群より選ばれるＤＮＡジャイレース阻害剤である、上記（１）のＬ−アミノ酸の製造法。
（３）  微生物がアミノキノリン誘導体に対する耐性を有する微生物である、上記（１）のＬ−アミノ酸の製造法。
【０００８】
（４）  アミノキノリン誘導体が、クロロキン、アモジアキン、ペンタキン、プリマキンおよびこれらの物質のアルカリ金属塩からなる群より選ばれるアミノキノリン誘導体である、上記（３）のＬ−アミノ酸の製造法。
（５）  Ｌ−アミノ酸がＬ−ヒスチジンである、上記（１）〜（４）いずれか１つに記載のＬ−アミノ酸の製造法。
（６）  微生物がセラチア属、コリネバクテリウム属、アースロバクター属、ミクロバクテリウム属、バチルス属、エシェリヒア属からなる群より選ばれる微生物である、上記（１）または（３）のＬ−アミノ酸の製造方法。
（７）  微生物がエシェリヒア・コリＨ−９３４２(ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７５)およびエシェリヒア・コリＨ−９３４３(ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７６)からなる群より選ばれる微生物である、上記（６）のＬ−アミノ酸の製造法。
（８）  Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつＤＮＡジャイレース阻害剤に対する耐性を有する微生物。
【０００９】
（９）  ＤＮＡジャイレース阻害剤が、ナリジキシン酸、オキソリン酸、クーママイシン、ノボビオシン、およびこれらの物質のアルカリ金属塩からなる群より選ばれるＤＮＡジャイレース阻害剤である、上記（８）の微生物。
【００１０】
（１０）  微生物がアミノキノリン誘導体に対する耐性を有する微生物である、上記（８）または（９）の微生物。
（１１）  アミノキノリン誘導体が、クロロキン、アモジアキン、ペンタキン、プリマキンおよびこれらの物質のアルカリ金属塩からなる群より選ばれるアミノキノリン誘導体である、上記（１０）の微生物。
（１２）  Ｌ−アミノ酸がＬ−ヒスチジンである、上記（８）の微生物。
（１３）  微生物がセラチア属、コリネバクテリウム属、アースロバクター属、ミクロバクテリウム属、バチルス属、エシェリヒア属からなる群より選ばれる微生物である、上記（８）〜（１２）いずれか１つに記載の微生物。
（１４）  エシェリヒア・コリＨ−９３４２(ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７５)およびエシェリヒア・コリＨ−９３４３(ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７６)から選ばれる微生物。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本願発明の微生物としては、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつＤＮＡジャイレース阻害剤に対する耐性を有する微生物であればいずれも用いることができる。また、該微生物がさらにアミノキノリン誘導体に対する耐性を有する微生物であればより好ましい。該微生物としては、例えば、セラチア属、コリネバクテリウム属、アースロバクター属、ミクロバクテリウム属、バチルス属、エシェリヒア属に属する微生物、例えばSerratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium mycetoides、Corynebacterium variabilis、Corynebacterium ammoniagenes、Arthrobacter crystallopoietes、Arthrobacter duodecadis、Arthrobacter ramosus、Arthrobacter sulfureus、Arthrobacter aurescens、Arthrobacter citreus、Arthrobacter globiformis、Microbacterium ammoniaphilum、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefacines、Escherichia coli等をあげることができる。
【００１２】
本願発明に用いられるＤＮＡジャイレース阻害剤は、細菌に存在するII型トポイソメラーゼの一種であるＤＮＡジャイレース(DNA gyrase)を阻害する物質であればいずれでも用いられる。例えば、ナリジキシン酸(nalidixic acid)、オキソリン酸(oxolinic acid)、クーママイシン(coumermycin)、ノボビオシン(novobiocin)などが用いられる。また、これら物質のアルカリ金属塩などの塩も用いられる。ここで、アルカリ金属はナトリウム、カリウム等のアルカリ金属であればいずれでも用いられる。
【００１３】
本願発明に用いられるアミノキノリン誘導体は、アミノキノリン骨格を有する物質であればいずれでも用いられる。例えば、クロロキン(chloroquine)、アモジアキン(amodiaquine)などの４-アミノキノリン誘導体や、ペンタキン(pentaquine)、プリマキン(primaquine)などの８-アミノキノリン誘導体などが用いられる。また、これら物質のアルカリ金属塩などの塩も用いられる。これら物質は、いずれも抗マラリア薬(antimalarial drugs)として知られている。ここで、アルカリ金属はナトリウム、カリウム等のアルカリ金属であればいずれでも用いられる。
【００１４】
本願発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物に紫外線照射やN-メチル-N′-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)などの突然変異誘発剤による通常の変異処理を施し、該変異株を親株が生育できないか、または生育が不良となる濃度のＤＮＡジャイレース阻害剤を含む寒天平板培地上で通常の条件下で培養し、生じたコロニーのうちで親株よりも生育が速いか、または大きなコロニーを生ずる株を選択することによりＤＮＡジャイレース阻害剤耐性株として取得することができる。
【００１５】
また、該ＤＮＡジャイレース阻害剤耐性株に突然変異処理を施し、該変異株を親株が生育できないか生育が不良となる濃度のアミノキノリン誘導体を含む寒天平板培地上で培養し、生じたコロニーのうちで親株よりも大きなコロニーを選択することにより、ＤＮＡジャイレース阻害剤耐性で、かつアミノキノリン誘導体耐性な株を取得することができる。
【００１６】
上記Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物として公知のＬ−アミノ酸生産能を有する微生物を用いても良いし、また公知の方法により新たに野生型株から取得しても良い。公知の方法としては上記の変異処理法の他にも、細胞融合法、形質導入法、その他の遺伝子組換え技法[いずれもMolecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）]等をあげることができる。
【００１７】
本願発明の微生物は、ＤＮＡジャイレース阻害剤に対する耐性、該耐性およびアミノキノリン誘導体に対する耐性を有する微生物を、通常の変異処理法を用いて取得した後、これら微生物にアミノ酸生産能を上記方法により付与することによっても取得することができる。
本願発明の微生物として、具体的にはエシェリヒア・コリＨ−９３４２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７５）、およびエシェリヒア・コリＨ−９３４３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７６）をあげることができる。
【００１８】
本願発明の微生物を用いたＬ−アミノ酸の生産は、通常の細菌培養法により実施することができる。
Ｌ−アミノ酸の生産に用いる培地としては、炭素源、窒素源、無機物、その他使用菌株の必要とする微量の栄養素を程よく含有するものならば、合成培地または天然培地いずれも使用可能である。
【００１９】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトース、糖蜜、セルロース加水分解物、粗糖加水分解物、澱粉加水分解物などの炭水化物、ピルビン酸、酢酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸などの有機酸、グリセリン、エタノールなどのアルコールなどが用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの各種無機塩類、有機酸のアンモニウム塩、アミン類、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物などが用いられる。
【００２０】
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウムなどが用いられる。
培養は、振盪培養または通気撹拌培養などの好気的条件下にて行われ、培養温度は２０〜４０℃で、好ましくは２８〜３７℃の範囲である。培地のｐＨはｐＨ５〜９の範囲で、好ましくは中性付近に保持する。培地のｐＨ調整は炭酸カルシウム、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、アンモニア、ｐＨ緩衝液などによって行う。通常１〜７日間の培養により、培養液中にＬ−アミノ酸が生成蓄積する。
【００２１】
培養終了後、培養液から菌体などの沈殿物を除去し、イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併用することにより、培養液からＬ−アミノ酸を回収することができる。
本願発明により製造することができるＬ−アミノ酸は特に限定されないが、例えばＬ−ヒスチジンがあげられる。
以下に本願発明の実施例を示すが、本願発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２２】
【実施例】
実施例１  ＤＮＡジャイレース阻害剤、またはＤＮＡジャイレース阻害剤およびアミノキノリン誘導体に対する耐性を有するＬ−ヒスチジン生産性変異株の取得ブタペスト条約に基いて平成１１年 ３月９日付けで、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６７３ として工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託されている、メチオニン要求性のエシェリヒア・コリＡＴＣＣ２１３１８より誘導した１，２，４−トリアゾールアラニンに対する耐性を有するＬ−ヒスチジン生産性変異株Ｈ−９３４０に、常法に従って、N-メチル-N′-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)による変異処理（０．２ｍｇ／ｍｌ、３０℃、３０分間）を施した後、ノボビオシン一ナトリウム塩を１ｇ／Ｌ含む寒天平板培地〔グルコース ０．２％、リン酸一カリウム ０．３％、リン酸二ナトリウム０．６％，硫酸マグネシウム ０．０１％、塩化ナトリウム ０．０５％，塩化アンモニウム ０．１％、 栄養要求物質（ＤＬ−メチオニン）５０ｍｇ／Ｌ、寒天 １．５％、ｐＨ７．２〕に塗布した。
【００２３】
該寒天平板培地を３０℃で２〜６日間培養し、生育してきた大きなコロニーを釣菌分離してＨ−９３４２を取得した。
さらに、NTGによる変異処理（０．２ｍｇ／ｍｌ、３０℃、３０分間）を施した後、プリマキン二ナトリウム塩を１５０ｍｇ／Ｌ含む寒天平板培地に塗布し、３０℃で２〜６日間培養し、生育してきた大きなコロニーを釣菌分離してＨ−９３４３を取得した。これら菌株はブタペスト条約に基いて平成１１年３月９日付けで、Ｈ−９３４２はＦＥＲＭ ＢＰ−６６７５ として、またＨ−９３４３はＦＥＲＭ ＢＰ−６６７６として工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託されている。
【００２４】
実施例２  プリマキンまたはノボビオシンを含む寒天平板培地での生育比較試験実施例１で取得した変異株Ｈ−９３４２、Ｈ−９３４３のプリマキンまたはノボビオシン含有寒天平板培地での生育を親株Ｈ−９３４０と比較した。
【００２５】
それぞれの変異株を取得した時と同濃度のプリマキン二ナトリウム塩またはノボビオシン一ナトリウム塩を含む上記寒天平板培地上に、天然培地で２４時間培養した各菌体を生理食塩水に懸濁して１〜１０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2になるように塗布し、３３℃、４日間培養した。
該培養による生育の可否を第１表に示した。
親株であるＨ−９３４０は、いずれの薬剤を含む寒天培地上でも全く生育できなかった。また、Ｈ−９３４２はプリマキン含有培地に生育できなかった。
【００２６】
【表１】
0004620231.tif 000002
【００２７】
実施例３  Ｌ−ヒスチジンの製造
実施例１で取得した変異株Ｈ−９３４２、Ｈ−９３４３、または親株Ｈ−９３４０を用いたＬ−ヒスチジンの製造を以下の方法で行った。
Ｈ−９３４０とそれぞれの変異株を、太型試験管中の種培地（グルコース ２％、糖蜜０．５％、コーンスチープリカー １％、硫安 １．２％、リン酸一カリウム ０．３％、硫酸マグネシウム ０．０１５％、ＤＬ−メチオニン ６００ｍｇ／Ｌ、アデニン １００ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム ３％、ｐＨ６．２）６ｍｌに接種して、３０℃で１２時間振盪培養した。
【００２８】
得られた種培養液０．１ｍｌを、それぞれ太型試験管中の生産培地（グルコース ６％、コーンスチープリカー １％、硫酸アンモニウム ２．４％、リン酸一カリウム ０．４％、硫酸マグネシウム ０．０１５％、チアミン塩酸塩 １０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム １０ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム ３％、ｐＨ６．５）５ｍｌに接種して、３０℃で４８時間振盪培養した。
【００２９】
培養後、培養液中のＬ−ヒスチジンの蓄積量を、高速液体クロマトグラフィー法により定量した。
結果を第２表に示した。
親株Ｈ−９３４０に比べ変異株Ｈ−９３４２のＬ−ヒスチジン生産性、ならびにＨ−９３４２に対するＨ−９３４３のＬ−ヒスチジン生産性は向上していた。
【００３０】
【表２】
0004620231.tif 000003
【００３１】
また、Ｈ−９３４３の種培養液１００ｍｌを、２Ｌの小型発酵槽中の発酵培地（グルコース ６％、コーンスチープリカー １％、硫酸アンモニウム ０．５％、リン酸一カリウム ０．４％、硫酸マグネシウム ０．０５％、塩化カルシウム１００ｍｇ／Ｌ 、ｐＨ６．５）６００ｍｌに植菌し、３０℃、撹拌数８００ｒｐｍ、通気量１Ｌ／分で培養した。培養中のｐＨ調整および窒素源の供給はアンモニア水で行い、ｐＨ６．５±０．２に維持した。グルコース、硫酸アンモニウム、リン酸一カリウムを適宜供給しつつ、７０時間培養した。
【００３２】
その結果、培養液中のＬ−ヒスチジン蓄積量は４６．５ｇ／Ｌであった。またＨ−９３４０を同様に培養した時のＬ−ヒスチジン蓄積量は２７．７ｇ／Ｌであった。
【００３３】
【発明の効果】
本願発明により、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつＤＮＡジャイレース阻害剤に対する耐性を有する微生物、またはＬ−アミノ酸生産能を有し、かつＤＮＡジャイレースおよびアミノキノリン誘導体に対する耐性を有する微生物を取得し、培地で培養することで、Ｌ−アミノ酸の生産性を向上させることができ、Ｌ−アミノ酸を工業的に効率よく、かつ安価に製造することができる。