(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えウイルスであって、該ウイルスは、
両側で最小プロモーターに連結された、ＶＥＧＦまたはＥＰＯ由来の二方向性の低酸素および／またはＨＩＦ応答性エレメント
を含み、ここで、一方の最小プロモーターは、該ウイルスの複製を調節する遺伝子の発現を制御し、ここで、該ウイルスは、該ウイルスの複製が低酸素の組織および細胞の細胞溶解、または活性なＨＩＦ経路を含む細胞および組織の細胞溶解を引き起こすという結果を伴って低酸素依存性の様式で選択的に複製する、
組換えウイルス。
【請求項２】
前記ウイルスが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ヘルペス様ウイルス、レトロウイルス、およびピコルナウイルスである、請求項１に記載の組換えウイルス。
【請求項３】
抗脈管形成性活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をさらに含み、ここで、該遺伝子は、最小プロモーターに連結された前記低酸素および／またはＨＩＦ応答性エレメントの調節制御下にある、請求項１に記載の組換えウイルス。
【請求項４】
低酸素依存性の様式で、低酸素腫瘍細胞において選択的に複製して細胞溶解を引き起こす、請求項１に記載の組換えウイルス。
【請求項５】
抗脈管形成性活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をさらに含み、ここで、該遺伝子は、最小プロモーターに連結された前記低酸素および／またはＨＩＦ応答性エレメントの調節制御下にある、請求項４に記載の組換えウイルス。
【請求項６】
前記遺伝子が、アンジオスタチン、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、エンドスタチン、ＰＦ４、ＢＡＩ１、ＩＬ４、ＡＤＡＭＴＳ、ＰＥＤＦ、またはそれらのフラグメントをコードする、請求項５に記載の組換えウイルス。
【請求項７】
前記ウイルスの複製を調節する遺伝子がＥ１Ａ遺伝子である、請求項２に記載の組換えウイルス。
【請求項８】
前記低酸素および／またはＨＩＦ応答性エレメントが、酸素正常状態未満で、少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導する、請求項１に記載の組換えウイルス。
【請求項９】
レポーター遺伝子に作動可能に連結された少なくとも１つの低酸素および／またはＨＩＦ応答性エレメントを含む、ベクターであって、ここで、該低酸素および／またはＨＩＦ応答性エレメントは、両側で最小プロモーターに連結された、ＶＥＧＦまたはＥＰＯ由来の二方向性の低酸素および／またはＨＩＦ応答性エレメントである、ベクター。
【請求項１０】
前記ＶＥＧＦまたはＥＰＯ由来の二方向性の低酸素および／またはＨＩＦ応答性エレメントが、２つの遺伝子の発現を二方向に駆動する、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
前記レポーター遺伝子が、比色アッセイによって検出可能である、請求項９に記載のベクター。
【請求項１２】
前記ベクターが、哺乳動物細胞株または非哺乳動物細胞株に、安定にかもしくは一過的にトランスフェクトされている、請求項９に記載のベクター。
【請求項１３】
前記ベクターが、哺乳動物腫瘍細胞株または非哺乳動物腫瘍細胞株に、安定にかもしくは一過的にトランスフェクトされている、請求項９に記載のベクター。
【請求項１４】
前記レポーター遺伝子が、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質である、請求項９に記載のベクター。
【請求項１５】
レポーター遺伝子に作動可能に連結された少なくとも１つの低酸素またはＨＩＦ応答性エレメントから構成されるベクターを含む、哺乳動物腫瘍細胞株であって、ここで、該低酸素またはＨＩＦ応答性エレメントは、両側で最小プロモーターに連結された、ＶＥＧＦまたはＥＰＯ由来の二方向性の低酸素および／またはＨＩＦ応答性エレメントである、哺乳動物腫瘍細胞株。
【請求項１６】
前記レポーター遺伝子が比色アッセイによって検出可能である、請求項１５に記載の哺乳動物腫瘍細胞株。
【請求項１７】
前記ベクターが、安定に形質転換されている、請求項１５に記載の哺乳動物腫瘍細胞株。
【請求項１８】
前記レポーター遺伝子がアルカリホスファターゼをコードする、請求項１５に記載の哺乳動物腫瘍細胞株。
【請求項１９】
脳腫瘍細胞株に由来する、請求項１５に記載の哺乳動物腫瘍細胞株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の援用）
本出願は、米国仮出願第６０／２３５，２８３号（２０００年９月２６日出願）に対して優先権を主張する。この米国仮出願は、本明細書と矛盾しない範囲までその全体が本願明細書において援用される。
【０００２】
（政府による資金提供の承認）
本発明は、少なくとも部分的には、助成金番号ＮＳ４１４０３の下での国立衛生研究所からの資金提供により、なされた。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、一般には、酸素分圧が、その特定の組織型において通常見出されるよりも少ない細胞または活性化ＨＩＦ（低酸素誘導因子）経路を有する細胞を選択的に標的とする、新規な組換えウイルスに関する。本発明はさらに、低酸素であるかまたは活性化ＨＩＦ経路を有する細胞および組織において、選択的に複製しかつ細胞溶解性である、ウイルスに関する。低酸素である細胞または組織を本発明の新規な組成物で処理する方法もまた、提供される。本発明はさらに、上記の低酸素誘導性経路を調節する合成物を同定するためのスクリーニングアッセイに関する。
【０００４】
（発明の背景）
ガンは、先進工業国の主要な死因のうちの１つである。米国において、ガンは全ての死亡の第２の主要な原因であって、毎年何十万もの死亡を計上する。ガンは、多くのレベルにおいて破壊的な疾患である。例えば、神経膠腫は脳腫瘍患者の主要な死因である。神経膠芽細胞腫患者は、１２ヵ月未満の平均生存時間を有する、そして、この予後は、ガンを治療するための方法における印象的な発達にもかかわらず、１９５９年（１０ヵ月）および１９３２年（６ヶ月〜９ヵ月）以降、大して変わっていない。
【０００５】
ガンは、手術、放射線療法、化学療法および免疫治療を含む様々な方法によって、治療され得る。これらの治療方法が一般に、ガン犠牲者の生存率を改善したが、ガンと戦うための改良された治療技術が明確に必要であるという事実は、そのままである。
【０００６】
ガンを治療するための再び甦った方法は、ウイルス療法（ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ）と称する。ウイルス療法（Ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ）は、一部の癌患者の腫瘍が、それらの患者がウイルス感染または予防接種を経験した後に退縮したということが発見されたときに、科学者の関心を初めて得た（Ｓｉｎｋｏｖｉｃｓ，Ｊ．およびＨｏｒｖａｒｔｈ，Ｊ．のレビュー［１９９３］Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３６：１９３−２１４、ならびにＡｌｅｍａｎｙらのレビュー［２０００］Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：７２３−７２７を参照のこと）。残念なことに、研究者がウイルス療法（ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ）と関連する毒性課題を発見したときには、この方法の最初の見込みは減弱し、そして、さらに、その治療は、制限された効力しか有さなかった。
【０００７】
現代の分子生物学の出現は、科学者に、ウイルス療法（ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ）の実現可能性を再評価させた。特に、ウイルス媒介性遺伝子治療は、現在、ウイルス療法（ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ）における再興された関心の中心焦点である。ウイルス媒介性遺伝子治療システムの設計の基礎をなしている分子ストラテジーは、腫瘍細胞成長を阻害する遺伝子（例えば、細胞周期またはアポトーシスの制御）、細胞を殺す遺伝子（自殺遺伝子）、または免疫応答を誘導する遺伝子（免疫治療）を送達することである。
【０００８】
２つの一般的なアプローチが、利用できる。１つの方法は、複製欠損性ウイルスベクターの使用を中心としている。ウイルス療法剤（ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）としての複製欠損性ベクターの使用は、２つの重大な課題に遭遇した：（１）低いインビボ形質導入効率（乏しい遺伝子送達しかもたらさない）および（２）正常組織に対して腫瘍を特異的に標的とすることができないこと。
【０００９】
ウイルス療法（ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ）に対する他のアプローチは、複製コンピテントウイルスの使用を必要とする。細胞溶解サイクルを有する複製コンピテントウイルスの使用は、腫瘍細胞を直接殺す（腫瘍崩壊）ためならびに遺伝子移入を増強し腫瘍細胞を特異的に標的とするための、実行可能なストラテジーとして出現した。様々な改変型神経弱毒化単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（神経毒性遺伝子（γ１３４．５）およびリボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子（ＵＬ３９）が欠失している）が、インビトロにおいてヒト腫瘍細胞のための腫瘍崩壊因子として、そして、インビボにおいてヒト脳腫瘍のマウスモデルにおける腫瘍崩壊因子として、機能する。例えば、Ｐａｒｋｅｒら、２０００  ＰＮＡＳ  ９７：２２０８−２２１３；米国特許第５，７２８，３７９号を参照のこと。フェーズ１臨床試験において、悪性神経膠腫の２１人の患者が、ＨＳＶ  Ｇ２０７の頭蓋内注射を受け、脳炎のいかなる徴候もＣＮＳ変化のいかなる徴候もなかった（Ｍａｒｋｅｒｔら、２０００  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：８６７−８７４）。
【００１０】
異なるストラテジーが、５５ｋＤａ  Ｅ１Ｂタンパク質の生成停止をもたらす欠失を有する腫瘍崩壊性複製コンピテントアデノウイルス（ｄｌ１５２０／ＯＮＹＸ−０１５）を利用する（Ｂｉｓｃｈｏｆｆら、１９９６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：３７３−３７６）（例えば、本願明細書に参考として援用される米国特許第６，０８０，５７８号および同第５，６７７，１７８号を参照のこと）。予備データは、このウイルスの複製が、欠損性ｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子を有する腫瘍細胞に制限されることを示唆した。しかし、より最近の所見は、ｐ５３遺伝子状態に関して野生型である細胞もまたこのウイルスの複製を支持し得ることを確立した（Ｒｏｔｈｍａｎｎら、１９９８  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９４７０−９４７８；ＧｏｏｄｒｕｎおよびＯｒｎｅｌｌｅｓ  １９９８  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９４７９−９４９０）。このウイルスは、肝臓に転移した卵巣癌および胃腸癌についてフェーズ１臨床試験において現在使用されており、かつ再発性かつ治療抵抗性の頭部・頚部癌についてフェーズ２臨床試験およびフェーズ３臨床試験において現在使われている。これまでの結果は、複製コンピテントアデノウイルスｄｌｌ５２０の注射が安全であり、この注射は、その病訴が主に軽微な等級１〜２であるインフルエンザ様症状である患者によって、充分に許容されることを明らかにした。（Ｋｉｍ［２０００］Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：６６６０−６６６９）。ヒトにおけるこれらの２つのウイルスシステムの低い毒性は、複製コンピテントウイルスが、腫瘍を有する患者を処置するための有望なアプローチであることを示唆する。近年、その複製が特定の腫瘍型に制限される腫瘍崩壊性ウイルスの設計が、現実になった。インビトロで、およびマウス前立腺癌モデルにおいてインビボで、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）陽性癌細胞に対して選択的細胞毒性を示すアデノウイルス（ＣＮ７０６）が、作製された（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、１９９７  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：２５５９−２５６３）。（例えば、本願明細書中に参考として援用される米国特許第５，８７１，７２６号および同第６，１９７，２９３号を参照のこと）。
【００１１】
複製コンピテントウイルスを利用するこの種のアプローチは有望であるが、それらは：（１）複数のウイルスが、腫瘍の遺伝子異質性に起因して、種々の腫瘍型について、そしておそらく個々の腫瘍について、作製されなければならない；（２）それらは、広範囲の組織に由来する腫瘍の選択的標的化を提供しない；（３）それらは、治療完了後にウイルスを除去するために厳格な抗ウイルス処置を必要とする可能性がある。
【００１２】
多数の米国特許が、低酸素誘導因子１、ウイルス媒介性遺伝子送達、組織特異的構築物、および関連する主題に関して発行されている。
【００１３】
Ｓｅｍｅｎｚａに対するいくつかの特許およびＳｅｍｅｎｚａらに対するいくつかの特許は、低酸素誘導因子１に関する。Ｓｅｍｅｎｚａに対する米国特許第６，２２２，０１８号は、ＨＩＦ−１結合部位を含む遺伝子における遺伝子発現を活性化可能であると特徴付けられた、実質的に精製された低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）を開示する。Ｓｅｍｅｎｚａに対する米国特許第６，１２４，１３１号は、実質的に精製された安定なヒト低酸素誘導因子１α、およびそれをコードするヌクレオチドを開示する。Ｓｅｍｅｎｚａに対する米国特許第５，８８２，９１４号は、低酸素誘導因子１をコードする核酸、ならびにその発現されたタンパク質の精製および特徴付けを開示する。
【００１４】
Ｓｅｍｅｎｚａに対する特許およびＳｅｍｅｎｚａらに対する特許は、精製ＨＩＦ−１、ＨＩＦ−１をコードする核酸、ＨＩＦ−１に結合する抗体、ＨＩＦ−１の変異体、およびこれらの生物学的分子すべての使用方法に言及する。これらの特許は、低酸素組織において選択的に複製してその低酸素組織を細胞溶解し抗血管新生因子を送達する能力を有する、組換えウイルスを記載していない。
【００１５】
Ｗｅｂｓｔｅｒらに対する米国特許第６，２１８，１７９号は、組織特異的低酸素調節性構築物を開示する。Ｗｅｂｓｔｅｒらは、低酸素状態に曝露された細胞に対する虚血性損傷を減少するための方法を記載する。Ｗｅｂｓｔｅｒらにおいて記載される虚血性損傷を減少するための構築物は、低酸素応答性エレメントと、治療遺伝子と、組織特異的プロモーターとを含む、キメラ遺伝子を含む。この治療遺伝子は、上記細胞に対する虚血性損傷を減少させるのにその治療遺伝子の発現が有効であるように、選択される。治療遺伝子の例は、一酸化窒素シンターゼ遺伝子、Ｂｃｌ−２遺伝子、スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子、およびカタラーゼ遺伝子である。Ｗｅｂｓｔｅｒらに対する米国特許第５，８３４，３０６号は、キメラ遺伝子を含む方法および組成物を開示する。上記キメラ遺伝子は、組織特異的プロモーターおよび低酸素応答性エンハンサーエレメント（これらは両方とも、選択された遺伝子に対して、作動可能に連結されている）を含む。
【００１６】
組換えアデノ随伴ビリオンおよびその使用方法が、Ｐｏｄｓａｋｏｆｆらに対する一連の特許に記載されている。Ｐｏｄｓａｋｏｆｆらに対する米国特許第６，２１１，１６３号は、組換えアデノ随伴ウイルスベクターを使用してＤＮＡを血流へと送達するための方法を開示する。本発明は、組換えアデノ随伴ビリオンが、種々の筋肉細胞型へと効率的に送達され、治療タンパク質の持続的産生を提供するという、発見に基づく。Ｐｏｄｓａｋｏｆｆらに対する米国特許第５，８５８，３５１号は、ＤＮＡ分子を筋肉細胞および筋肉組織へと送達するためのアデノ随伴ウイルスビリオンの使用を開示する。Ｐｏｄｓａｋｏｆｆらに対する米国特許第５，８４６，５２８号は、貧血の処置においてＤＮＡ分子を筋肉細胞および筋肉組織へと送達するための組換えアデノ随伴ウイルスビリオンを開示する。上記のＰｏｄｓａｋｏｆｆらの特許は、低酸素組織を腫瘍崩壊しかつ抗血管新生因子を提供する、組換えウイルスを記載しない。
【００１７】
低酸素誘導性因子１経路に関連する米国特許は、多くのストラテジーを記載する。Ｃｓｅｔｅらに対する米国特許第６，１８４，０３５号は、低酸素条件を使用することによって、骨格筋幹細胞もしくは骨格筋前駆細胞を、単離する方法、活性化させる方法、およびそれらの細胞からの分化を制御する方法を開示する。Ｃｓｅｔｅらに対する特許は、低酸素条件下で培養された成体骨格筋線維が、正常酸素レベル下で増殖された筋線維と比較して多い数の前駆細胞を生じるという、発見に関する。Ａｌｉｔａｌｏらに対する米国特許第６，１３０，０７１号は、精製され単離された脈管内皮増殖因子−Ｃシステイン欠失改変体を開示する。Ａｅｂｉｓｃｈｅｒらに対する米国特許第５，９５２，２２６号は、連続的にＥＰＯを放出する移植型デバイスを使用して、患者に対してＥＰＯを送達するためのデバイスおよび方法を開示する。Ａｅｂｉｓｃｈｅｒらの特許に記載されている発明は、低酸素条件下で高レベルのＥＰＯを発現するように操作された細胞を有する被験体に対して、ＥＰＯを提供することに関する。Ａｎｄｅｒｓｏｎらに対する米国特許第５，６８１，７０６号は、酸素欠乏に曝された哺乳動物細胞におけるＤＮＡ分子の酸素欠乏誘導をもたらす遺伝子調節エレメントを開示する。Ｒａｔｃｌｉｆｆｅらに対する米国特許第５，９４２，４３４号は、プロドラッグ活性化システム遺伝子またはサイトカイン遺伝子などのコード配列に作動可能に連結された低酸素応答性エレメントを含む、核酸構築物を開示する。これらの特許から理解されるように、低酸素誘導性経路が、一部の特定の状況において使用するために利用されたが、本出願人が知る限り、低酸素組織または活性化ＨＩＦ経路を有する組織において選択的に複製しかつその組織を細胞溶解しかつ補助治療をさらに送達する、組換えウイルスは、先行技術において記載されていない。
【００１８】
以下の米国特許は、それらが本明細書と矛盾していない程度まで、参考として本願明細書において明示的に援用される：米国特許第６，２２２，０１８号；米国特許第６，２１８，１７９号；米国特許第６，２１１，１６３号；米国特許第６，１８４，０３５号；米国特許第６，１３０，０７１号；米国特許第６，１２４，１３１号；米国特許第５，９５２，２２６号；米国特許第５，９４２，４３４号；米国特許第５，８８２，９１４号；米国特許第５，８５８，３５１号；米国特許第５，８４６，５２８号；米国特許第５，８３４，３０６号および米国特許第５，６８１，７０６号。
【００１９】
従って、広範な腫瘍の選択的標的化のための、治療的遺伝子送達アプローチと腫瘍崩壊機構とを組合わせるウイルス治療（ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）システムに関する必要性が存在する。
【００２０】
様々な特定の課題に、本発明の開発の間に遭遇した。ウイルスによる細胞の感染は、複雑な生化学プロセスである。腫瘍細胞が組換えアデノウイルスによって感染され得ることを示すことが、まず必要であった。次に、トランスフェクトされた腫瘍細胞株における構築物の低酸素誘導性発現が、実証されなければならなかった。このＨＩＦ活性化発現はまた、発現レベルプロフィールに対して適切なＯ２濃度を有さなければならなかった。遺伝子産物を二方向発現する低酸素誘導性構築物が、設計され、かつ補助治療の送達を含む本発明の実施形態について試験されなければならなかった。これらの初期の設計段階および試験段階の後、上記構築物を含む組換えウイルスが、トランスフェクトされた腫瘍細胞株において、Ｅ１Ａ遺伝子産物およびＥ１Ｂ遺伝子産物の発現について試験された。これらの発現研究は、一過性レポーター遺伝子アッセイにおいて観察される低酸素依存性調節が、ウイルスゲノムに関して維持されることを実証した。本発明における次の段階は、この組換えウイルスが低酸素依存性様式で腫瘍細胞を細胞溶解したことの実証を含んだ。最後に、本発明者らは、上記組換えウイルスが、モデル系において脳腫瘍へと送達されることを示した。最後に、これらの研究は、本発明の組換えウイルスをもたらした。
【００２１】
（発明の要旨）
本発明は、新規な組換えウイルスを含む組成物を提供し、この組換えウイルスは、低酸素細胞もしくは低酸素組織または活性化ＨＩＦ経路を有する細胞もしくは活性化ＨＩＦ経路を有する組織において選択的に複製する。本発明の新規な組成物は、１つまたは複数の低酸素応答性エレメントを有するように遺伝子操作された組換えウイルスを含み、その低酸素応答性エレメントは、そのウイルスの複製を調節もしくは調整する遺伝子または治療分子をコードする遺伝子に作動可能に連結された、プロモーターに作動可能に連結されている。低酸素誘導性経路におけるタンパク質または遺伝子と相互作用する因子についてスクリーニングするために有用な構築物もまた、本発明に包含される。
【００２２】
本発明の第一の実施形態は、低酸素細胞もしくは低酸素組織または活性化ＨＩＦ経路を有する細胞もしくは活性化ＨＩＦ経路を有する組織において選択的に複製する、組換え細胞溶解ウイルスを含む組成物に関する。本実施形態の新規組成物は、１つまたは複数の低酸素応答性エレメントを有するように遺伝子操作された組換えウイルスを含み、その低酸素応答性エレメントは、そのウイルスの複製を調節もしくは調整する遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターに作動可能に連結されており、そのウイルスは、細胞溶解サイクルを有する。本実施形態の新規な組換えウイルスは、低酸素細胞もしくは低酸素組織または活性化ＨＩＦ経路を有する細胞もしくは組織において、選択的に複製してそれらの細胞もしくは組織を細胞溶解する。細胞溶解サイクルを有するウイルスの例としては、細胞溶解性アデノウイルス（特に、アデノウイルス血清型５）；細胞溶解性ピコルナウイルス（例えば、ポリオウイルス）；ならびに細胞溶解性ヘルペスウイルスおよび細胞溶解性ヘルペス様ウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００２３】
本発明の第２の実施形態は、低酸素である細胞または活性化ＨＩＦ経路を有する細胞に対して遺伝子を選択的に送達する、低酸素ＨＩＦ依存性複製ウイルスを含む組成物に関する。本実施形態の組換えウイルスを含む組成物は、１つまたは複数の低酸素応答性エレメントを、そのウイルスの複製を調節もしくは調整する少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターに作動可能に連結された状態で有するように遺伝子操作されている。本実施形態の新規な組換えウイルスは、低酸素組織もしくは低酸素細胞（腫瘍を含む）を標的とし、この組織もしくは細胞において、このウイルスは選択的に複製して遺伝子を送達する。本実施形態に従って、抗新脈管形成活性を提供するさらなる遺伝子、またはレポーター遺伝子として作用するさらなる遺伝子、さもなければ低酸素組織もしくは低酸素細胞を調節するさらなる遺伝子が、本発明の新規な組換えウイルス中に含まれる。本発明の新規な組成物により送達され得る好ましい遺伝子の例は、新脈管形成阻害遺伝子（例えば、アンジオスタチン）である。
【００２４】
本発明の第３の実施形態は、低酸素細胞または活性化ＨＩＦ経路を有する細胞へと遺伝子を送達する、低酸素依存性の複製腫瘍崩壊ウイルスを含む組成物に関する。本実施形態の組換え細胞溶解ウイルスを含む組成物は、１つまたは複数の低酸素応答性エレメントを、そのウイルスの複製を調節もしくは調整する遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターに作動可能に連結された状態で有するように遺伝子操作されており、そのウイルスは、細胞溶解サイクルを有する。本実施形態の新規な組換えウイルスは、低酸素組織もしくは低酸素細胞（腫瘍を含む）を標的とし、この組織もしくは細胞において、このウイルスは選択的に複製して遺伝子を送達し、細胞溶解を引き起こす。本実施形態に従って、抗新脈管形成活性を提供するさらなる遺伝子、またはレポーター遺伝子として作用するさらなる遺伝子、さもなければ低酸素組織を調節するさらなる遺伝子が、本実施形態の新規な組換え細胞溶解ウイルス中に含まれ得る。本実施形態の組成物により送達され得る好ましい遺伝子の例は、新脈管形成阻害遺伝子（例えば、アンジオスタチン）である。
【００２５】
本発明の第４の実施形態は、低酸素により特徴付けられる状態もしくは疾患を処置するための方法に関する。本実施形態の好ましい局面は、癌を有する個体を処置するための方法に関し、この方法は、腫瘍細胞特異的溶解（腫瘍崩壊）を示しかつ補助治療を（抗血管新生因子の形態で）腫瘍微小環境へと送達する、組換え複製コンピテントアデノウイルスの投与を包含する。これは、低酸素条件下で抗血管新生因子（ＨＹＰＲＡ−Ａｄ）を発現する低酸素／ＨＩＦ依存性複製アデノウイルス（ＨＹＰＲ−Ａｄ）を含むウイルス構築物の投与を介して達成される。この方法において、本発明の新規な組成物は、ウイルス細胞溶解および抗血管新生因子発現の効果に起因して、低酸素腫瘍組織の破壊において相乗作用効果を有する。
【００２６】
本発明のこの実施形態の別の局面は、組織における低酸素／ＨＩＦ経路の活性化の誘導と、その後の本発明の組換えウイルスによる処置とに関する。特に、望ましくない組織（すなわち、脂肪または瘢痕）は、その望ましくない組織においてＨＩＦ経路を特異的に誘導する因子を用いて処置され得る。この因子による処置の後、その望ましくない組織は、本発明の組換えウイルスによる破壊に対して感受性である。
【００２７】
第５の実施形態において、本発明は、低酸素およびＨＩＦ経路を調節する化合物を同定するために有用な、組成物および方法に関する。レポーター遺伝子に作動可能に連結された低酸素／ＨＩＦ誘導性プロモーターを含むベクターを含む、安定にトランスフェクトされた細胞もしくは一過性トランスフェクトされた細胞が、試験化合物と接触させられ、そのレポーター遺伝子の発現についてアッセイされる。好ましい実施形態において、このＨＩＦ薬物開発アッセイは、多数の試験化合物について適切な高スループットアッセイである（すなわち、化合物ライブラリーを使用することによる）。化合物ライブラリーは、市販されているか、または当業者によって公知の手順を使用して合成され得る。本発明の薬物開発アッセイはまた、生物学的組織（すなわち、植物、真菌、細菌、および動物）の抽出物を試験するために使用され得る。
【００２８】
第６の実施形態において、本発明は、薬物開発アッセイに関する。レポーター遺伝子に作動可能に連結された低酸素誘導性プロモーターまたはＨＩＦ誘導体プロモーターを含むベクターが、そのベクターを含む腫瘍を生成するために使用される。そのベクターを含む腫瘍は、低酸素組織を破壊するために特異的に標的とするかまたは低酸素誘導性経路をインビボで破壊する、化学的因子もしくは生物学的因子の効力を評価するために使用される。
【００２９】
本発明のある局面においては、上記組換えウイルスは、非細胞溶解性である。
【００３０】
本発明はまた、低酸素以外の刺激（光（ＵＶ光、可視光）、放射線（Ｘ線）、ｐＨ、音（電波）、酸化還元状態、代謝状態、ホルモン応答、およびテロメア短縮など）に応答する遺伝子エレメントの使用も企図する。
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、低酸素応答性および／またはＨＩＦ応答性のエレメント／プロモーター構築物の制御下にウイルス複製にとって必須であるタンパク質を有するように遺伝子操作されたウイルスが、低酸素組織を選択的に標的としてその低酸素組織を細胞溶解するという、本発明者らの発見に基づいた。本発明者らは、その新規の組換えウイルスが、低酸素組織もしくは低酸素細胞に対して診断目的もしくは治療目的のために遺伝子を選択的に送達するようにさらに操作され得ることを、さらに発見した。
【００３２】
本発明は、低酸素細胞において選択的に複製する組換えウイルスを含む組成物を提供する。本発明の新規な組成物は、低酸素応答性エレメントを有するように遺伝子操作された組換えウイルスを含み、この低酸素応答性エレメントは、このウイルスの複製を調節もしくは調整する遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターに作動可能に連結されている。この組成物は、細胞溶解サイクルを有していても有していなくてもよい、組換えウイルスを含む。細胞溶解サイクルを有するウイルスが、好ましい。本発明の新規な組換えウイルスは、低酸素であるかまたはＨＩＦ経路が活性化している、任意の低酸素組織もしくは低酸素細胞を選択的に標的とする。低酸素である腫瘍または低酸素領域を有する腫瘍が、本発明の組成物にとっての好ましい標的である。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態は、腫瘍細胞特異的溶解（腫瘍崩壊）を示しかつ補助治療を抗血管新生因子の形態で腫瘍微小環境へと送達する、組換え複製コンピテントアデノウイルスに関する。これは、低酸素条件下で抗血管新生因子（ＨＹＰＲＡ−Ａｄ）を発現する低酸素依存性複製アデノウイルス（ＨＹＰＲ−Ａｄ）を含むウイルス構築物の投与を介して達成される。
【００３４】
本発明の別の好ましい実施形態は、低酸素である腫瘍を有する癌患者、活性化ＨＩＦ経路を有する腫瘍を有する癌患者、または低酸素領域／ＨＩＦ活性領域を有する腫瘍を有する癌患者を、本発明の組成物を投与することによって処置するための方法に関する。本発明の方法によって、種々の腫瘍を有する患者（ヒトおよび動物を含む）は、その腫瘍が低酸素であるかまたは低酸素領域を有する限りにおいては処置することが可能である。本実施形態の具体的方法は、化学療法技術もしくは放射線療法技術を用いて以前に処置されてそのような処置に対して抵抗性になった腫瘍を有する、癌患者に対する。そのような化学療法技術もしくは放射線療法技術は、非低酸素腫瘍組織を死滅もしくは破壊することによって、低酸素腫瘍組織の生存を許容することが公知である。従って、本発明の方法は、化学療法処置もしくは放射線療法処置を以前に受けたかまたは現在受けている患者を処置するために適している。
【００３５】
本明細書において使用される場合、用語「酸素正常状態」または「酸素正常状態の」とは、細胞または組織における正常な酸素レベルまたは正常な酸素圧レベルを指す。
【００３６】
本明細書において使用される場合、用語「低酸素（状態）」または「低酸素（状態）の」とは、細胞もしくは組織における通常見出されるものと比較して低い、酸素レベルまたは酸素圧レベルを指す。細胞または組織は、そのＯ２濃度がこれらの特定の細胞もしくは組織における正常酸素レベルよりも低い場合に、低酸素状態である。
【００３７】
本明細書において使用される場合、用語「腫瘍低酸素（状態）」または「低酸素腫瘍細胞」とは、正常組織と腫瘍組織との間における酸素レベルの生理学的差を指し、その酸素分圧は、その腫瘍組織においてその正常組織に対して低減している。
【００３８】
本明細書において使用される場合、用語「活性化ＨＩＦを有する細胞または活性化ＨＩＦを有する組織」とは、ＨＩＦ転写因子経路が構成的に活性である細胞もしくは組織、または外因性刺激もしくは外因性処理によってＨＩＦ転写経路が活性化された細胞もしくは組織を指す。多数の因子が、ＨＩＦ経路を活性化することについて当業者にとって公知であり、その因子としては、鉄キレート剤、コバルト、プロテオソームインヒビター、およびガルダナマイシン（ｇａｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３９】
本明細書において使用される場合、用語「腫瘍崩壊性」または「腫瘍崩壊」とは、癌細胞もしくは腫瘍細胞を溶解もしくは破壊する能力を指す。
【００４０】
本明細書において使用される場合、用語「細胞溶解性」または「細胞溶解」または「細胞溶解する」とは、細胞を溶解もしくは破壊する能力を指す。
【００４１】
本明細書において使用される場合、用語「抗脈管形成性（抗血管新生性）」または「抗新脈官形成（抗血管新生）」とは、新脈管形成を阻害する能力を指す。新脈管形成のインヒビターは、新脈管形成を調節するように直接的もしくは間接的に作用する、遺伝子であってもタンパク質であってもよい。新脈管形成のインヒビターとしては、アンジオスタチン、抗脈管形成ペプチド、抗脈管形成アンチセンスＤＮＡ、および当業者にとって公知である他の抗血管新生因子が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００４２】
本明細書において使用される場合、用語「抗腫瘍」または「抗癌」とは、腫瘍を破壊するかまたは腫瘍サイズもしくは癌増殖を低減させる能力を指す。
【００４３】
（薬物開発アッセイ）
一実施形態において、本発明は、タンパク質発現および／または遺伝子発現の低酸素誘導性経路媒介性誘導を調節する化合物を同定するための方法に関する。この方法において、レポーター遺伝子に作動可能に連結された低酸素誘導性プロモーターを含むベクターで安定にかもしくは一過的にトランスフェクトされた細胞株が、低酸素および／またはＨＩＦによって調節される遺伝子もしくは任意タンパク質の発現を調節する化合物を検出するために使用される。この方法の一局面において、レポーター遺伝子に作動可能に連結された低酸素誘導性プロモーターを含む細胞株が、そのレポーター遺伝子の発現を阻害する化合物を検出するために使用され得る。そのレポーター遺伝子の発現は、容易に（例えば、単純な比色アッセイによって）検出され得ることが、好ましい。他の技術（例えば、酵素アッセイまたは蛍光アッセイ）によって検出され得る他の遺伝子は、上記レポーター遺伝子として使用され得る。
【００４４】
本発明の薬物開発アッセイにおいて陽性であると試験で評価される化合物は、上記レポーター遺伝子の発現を調節する化合物である。例えば、細胞は、特定条件下で試験化合物とともにインキュベートされ、その化合物が存在しないこと以外は同じ条件下でインキュベートされた細胞と比較される。その試験化合物を伴うレポーター遺伝子の発現と、化合物なしのアッセイからのレポーター遺伝子発現との間での比較によって、その試験化合物が陽性であるか否かを決定可能である。化合物なし（または他の適切なコントロール）と比較してレポーター遺伝子発現レベルを変化させる試験化合物は、「陽性」であると試験で評価される。
【００４５】
本発明の薬物開発アッセイにおいて陽性であると試験で評価される材料は、種々の顕著な臨床状態（すなわち、癌、虚血など）に関連する低酸素／ＨＩＦ経路を調節するために有用である。
【００４６】
この実施形態の特定の局面において、その細胞株は、試験化合物と接触させられる前に、溶解されるかまたはさらに処理される。いずれの場合においても、その試験化合物が上記細胞もしくはその部分とともに、選択された期間インキュベートされた後に、その反応混合物が、レポーター遺伝子発現レベルについてアッセイされる。この実施形態の特に有用な局面において、そのレポーター遺伝子は、容易に検出可能であるタンパク質（例えば、単純な比色アッセイまたは他の手段（例えば、モノクローナル抗体検出）によって検出される反応を触媒する酵素）を発現する。本発明において有用なレポーター遺伝子の例としては、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、緑色蛍光タンパク質などが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００４７】
具体例において、アルカリホスファターゼ遺伝子に作動可能に連結された低酸素および／またはＨＩＦ誘導性プロモーターを含むベクターが、細胞株中に安定にかまたは一過的にトランスフェクトされる。このベクターを含む細胞株は、低酸素誘導性因子経路を活性化させる条件に供され、試験化合物と接触させられる。一般的には、試験化合物がアルカリホスファターゼ活性の発現を減少または増加させる場合に、その試験化合物は、低酸素誘導性経路および／またはＨＩＦ誘導性経路の調節因子として同定される。アルカリホスファターゼ活性の発現を調節する試験化合物は、「陽性」であると試験で評価され、さらに調査される。
【００４８】
本発明はまた、本発明の薬物開発アッセイにおいて陽性であると試験評価される化合物、およびその化合物を含む組成物に関する。
【００４９】
（ウイルス）
一般に、任意のウイルスが、本発明において使用され得る。適切なウイルスの選択は、種々の要因（例えば、処置される宿主）に依存する。例えば、ヒトの処置には、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓに感染し得かつＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓにおいて複製し得る、ウイルスが必要である。非ヒト被験体（例えば、他の哺乳動物）を処置するために使用され得るウイルスもまた、本発明の範囲内に包含される。好ましいウイルスは、細胞溶解サイクル（すなわち、細胞を溶解する能力）を有する。好ましい細胞溶解性ウイルスは、アデノウイルス科のウイルスである。アデノウイルス科に由来するウイルスの例としては、ｔｈｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ＆  Ａｎｔｉｓｅｒａ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａｓ  ＆  Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｓ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０，ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に記載されるような、アデノウイルス１型〜アデノウイルス４１型が挙げられるが、これらに限定はされない。本発明における使用のために適する他のウイルスとしては、パピローマウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス（例えば、ポリオウイルス）；ヘルペスウイルスおよびヘルペス様ウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）；ｔｈｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ＆  Ａｎｔｉｓｅｒａ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａｓ  ＆  Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｓ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０，ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに記載される他のウイルスが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００５０】
（組換えウイルス）
一般に、本発明の組換えウイルスは、低酸素条件下で選択的に複製するように遺伝子操作される。本発明の組換えウイルスは、酸素分圧に応答する遺伝子（すなわち、低酸素応答性エレメントを含む遺伝子、または低酸素誘導性エンハンサーモチーフ（ＨＲＥ）を含む遺伝子）を同定することによって、構築され得る。標準的な遺伝子操作方法を使用して、任意の適切なプロモーターがＨＲＥに連結され得、その後、これらは、ウイルス複製を調節もしくは調整する特定ウイルスの遺伝子に連結される。ウイルス複製を調節もしくは調整する種々の遺伝子および／またはその産物が、当業者にとって公知である。例えば、Ｅ１Ａ遺伝子産物は、アデノウイルス複製の開始のために必須である初期ウイルスタンパク質をコードすることが公知である。従って、アデノウイルスのこのＥ１Ａ遺伝子（または任意の構造的ホモログもしくは機能的ホモログ）が、低酸素応答性エレメント／プロモーターの制御下に配置されるように操作され得、それにより、低酸素条件下で選択的に複製する生物が生成され得る。
【００５１】
低酸素条件は、生理応答カスケードを開始して、解糖に関与する遺伝子、赤血球生成に関与する遺伝子、および新脈管形成に関与する遺伝子の誘導をもたらすことが公知である。ＨＩＦ−１タンパク質複合体（これは、２つの塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質であるＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−１βから構成されるヘテロダイマーである）は、標的遺伝子中に存在するシス作用性低酸素誘導性エンハンサーモチーフ（ＨＲＥ）に結合することによって、低酸素に対する転写応答を媒介する。ＨＩＦ−１に加えて、低酸素−１誘導性経路の他のメンバーとしては、ＨＩＦ−２およびＨＩＦ−３が挙げられる。エリスロポエチン（ＥＰＯ）遺伝子の３’隣接領域内に存在するＨＲＥおよびＶＥＧＦ遺伝子の５’隣接領域内に存在するＨＲＥは、長さが５０ｂｐ未満である。これらのＨＲＥは、高度に保存されたＨＩＦ−１結合部位と、低酸素誘導のために機能的に必須である他の遺伝子特異的シス作用性配列とを含む。ＥＰＯは、腎臓および肝臓において産生される低酸素応答性糖タンパク質ホルモンであり、ＥＰＯは、赤血球前駆（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ；ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）細胞上に発現されるそのレセプターに結合することによって、赤血球生成を刺激する。ＥＰＯおよびそのレセプターはまた、中枢神経系において、それぞれ、神経膠星状細胞およびニューロンによって発現される。この場合、ＥＰＯおよびそのレセプターは、パラクライン様式で作用し、かつ低酸素誘導性損傷に対してニューロンを保護するように機能すると、現在考えられている。ＶＥＧＦは、種々の細胞型において低酸素により誘導され、多数の腫瘍細胞型（神経膠腫を含む）によってもまた発現される。ＶＥＧＦは、新脈管形成の主要調節因子である。ＶＥＧＦは、脈管内皮細胞に特異的なマイトジェン活性を有する。この情報に基づいて、ＥＰＯおよびＶＥＧＦのＨＲＥが、低酸素応答性プロモーターの設計および試験のために選択された。
【００５２】
（遺伝子制御複製）
アデノウイルスは、分裂中の細胞および休止細胞の両方に感染するＤＮＡウイルスである。感染した休止細胞が細胞周期に再び入ることが、ウイルスＤＮＡ複製のため、最終的にはウイルスの子孫産生のために必要である。Ｅ１Ａ遺伝子産物の発現は、これらのウイルス機能のために必須であり、Ｅ１Ａ遺伝子領域を欠くアデノウイルスは、複製欠損性である。アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子は、構成的に活性なプロモーター領域から発現される最初の転写単位である。Ｅ１Ａ遺伝子産物は、広範な生物学的活性（細胞性転写およびウイルス転写の調節（Ｅ１Ｂ遺伝子転写誘導を含む）ならびに休止細胞におけるＤＮＡ合成の誘導が挙げられる）を示す。しかし、Ｅ１Ａによる細胞増殖制御の調節不全は、ｐ５３依存性機構およびｐ５３非依存性機構を介してアポトーシスを誘導し、最終的には、ウイルスの子孫産生を妨害する。野生型アデノウイルス感染の間におけるアポトーシスの防止は、アデノウイルスＥ１Ｂ遺伝子産物の発現により媒介される。Ｅ１Ｂ遺伝子は、２つのタンパク質（２１Ｋおよび５５Ｋ）をコードする。これらのタンパク質は、Ｅ１Ａ誘導性アポトーシスを阻害するように独立して機能する。Ｅ１Ｂ  ２１Ｋタンパク質は、Ｂｃｌ−２ファミリーのアポトーシス調節因子と配列および機能が相同性であり、Ｅ１Ａ誘導性アポトーシスおよび他の多くのアポトーシス刺激をブロックする。Ｅ１Ｂ  ２１Ｋ機能を欠くアデノウイルスによる細胞感染は、甚大な核ＤＮＡおよびウイルスＤＮＡの分解の出現（ｄｅｇ表現型）および細胞変性効果の増大（ｃｙｔ表現型）をもたらす。Ｅ１Ｂ  ５５Ｋは、アデノウイルスＥ４−ｏｒｆ６遺伝子産物と組み合わせて、ウイルス産生の間の２つの機能（ｐ５３と直接相互作用してｐ５３を不活化すること；その後、ウイルス産生の間にウイルス後期ｍＲＮＡの輸送を促進する一方で、ほとんどの細胞ｍＲＮＡの輸送を阻害すること）を有する。
【００５３】
本発明の組換えウイルスは、外因性因子（例えば、チミジンキナーゼ：これは、ウイルスをガンシクロビルに対して感受性にする）によるウイルス増殖終結を可能にする遺伝子を含むようにさらに操作され得る。さらに、組換えウイルスは、転写単位１つにつき２つの遺伝子を発現させるために内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が使用される場合には、発現される遺伝子の数が４つにまで増加するように、さらに操作され得る。本実施形態に従って、複数の遺伝子が、低酸素に応答して発現され得るか、またはＨＩＦ−１経路を活性化する条件下で発現され得る。
【００５４】
（腫瘍および低酸素）
腫瘍（固形腫瘍を含む）は、周囲の正常組織およびその腫瘍が由来する組織とは、生理学的に異なる（ＢｒｏｗｎおよびＧｉａｃｃｉａ，１９９８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：１４０８〜１４２６）。正常組織と癌腫瘍との間の組織脈管構造の基礎的差異は、腫瘍における乏しい酸素供給（すなわち、低酸素）という独特の生理学的特徴をもたらす。腫瘍血管は、（１）正常な脈管構造を含む組織に対する腫瘍細胞の浸潤プロセス、および（２）その腫瘍による脈管形成因子の放出の結果として、非常に異常である。固形腫瘍における血流は、しばしば遅く、正常な組織において観察されるよりも漏出しやすく、これは、腫瘍血管が異常で折れ曲がった性質であることに起因する。腫瘍血管新生についてのこれらの異常な特徴は、腫瘍組織の低酸素生理状態をもたらすと考えられる。大量の証拠によって、低酸素腫瘍は、放射線療法処置および化学療法処置に対して比較的抵抗性であることが示唆されている（例えば、Ｇｒａｙら、１９５３、Ｂｒ．Ｊ．Ｒａｄｉｏｌ．２６：６３８〜６４８；Ｔｅｉｃｈｅｒら、１９９０，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：３３３９〜３３４４；ＧｒａｕおよびＯｖｅｒｇａａｒｄ，１９９８，Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ．Ｏｎｃｏｌ．１３：３０１〜３０９を参照のこと）。
【００５５】
腫瘍における低酸素領域は、多くの固形腫瘍モデル系において生じることが示されている。例えば、Ｇｕｌｌｉｎｏ，Ｐ．Ｍ．ら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．７５：５２１〜５３６（１９７５）；Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｔ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．１３：５６９〜５７４（１９８７）；Ｊａｉｎ，Ｒ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６４１〜２６５８（１９８８）；Ｓｉｅｍａｎｎ，Ｄ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５８：２９６〜３００（１９８８）；Ｓｏｎｇ，Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：４４２〜４４６（１９８７）；Ｖａｕｐｅｌ，Ｐ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：３４９６〜３５０３（１９８７）；Ｖａｕｐｅｌ．，Ｐ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４１：２００８〜２０１３（１９８１）を参照のこと。腫瘍はまた、低酸素とは無関係に活性化ＨＩＦ経路を有し得る。フォン・ヒッペル−リンダウ症候群に関連する腫瘍（血液多形性神経膠芽細胞腫（ｈａｅｍｏｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）を包含する）、腎臓明細胞、膵臓癌腫、および内耳腫瘍が、例である。
【００５６】
低酸素組織を検出するための種々の方法が、当業者にとって利用可能であり、かつ公知である。例えば、Ｃｈａｐｍａｎ，Ｊ．Ｄ．「Ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｙｐｏｘｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ」Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．５４，Ｎｏ．１１，ｐｐ．２４４１〜２４４９（１９８４）；Ｃｈａｐｍａｎ，Ｊ．Ｄ．「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｈｙｐｏｘｉａ  ｂｙ  Ｉｎｖａｓｉｖｅ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ」Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ．Ｏｎｃｏｌ．２０．ｐｐ．１３〜１９（１９９１）；「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆ−１８−ｌａｂｅｌｅｄ  ｆｌｕｏｒｏｅｒｙｔｈｒｏｎｉｔｒｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ａｓ  ａ  ＰＥＴ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｈｙｐｏｘｉａ」Ｙａｎｇ  ＤＪ，Ｗａｌｌａｃｅ  Ｓ，Ｃｈｅｒｉｆ  Ａ，Ｌｉ  Ｃ，Ｇｒｅｔｚｅｒ  ＭＢ，Ｋｉｍ  ＥＥ，Ｐｏｄｏｌｏｆｆ  ＤＡ，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １９４：７９５〜８００，１９９５を参照のこと。米国特許第５，４１０，４９０号および米国特許第５，８４３，４０４号は、低酸素または低酸素組織を検出するための方法を開示し、本明細書により参考として援用される。これらの技術または当業者にとって公知である他の技術はいずれも、低酸素組織を同定するために使用され得る。
【００５７】
（新脈管形成）
腫瘍増殖の必須要素は、新脈管形成（既存の血管からの新規な血液供給の確立）である。腫瘍は、新生血管形成を開始するためには、止血に対する生理学的制御を破壊する必要がある。これは、腫瘍が直径約０．４ｍｍに到達した場合にその腫瘍による低酸素誘導性脈管形成因子の放出に誘発されるプロセスである。新脈管形成は、神経膠星状細胞腫および他の癌の悪性進行の間の段階的プロセスである。神経膠腫の発症において、新規な血管が、低悪性度の神経膠星状細胞腫において出現し、その後、未分化神経膠星状細胞腫において密度が増加する。未分化神経膠星状細胞腫から多形性神経膠芽細胞腫への移行の間に、広範囲の微小血管増殖が生じ、異常な血管をもたらす。低酸素は、神経膠星状細胞腫の進行の必須要素であり、その最終段階においては、壊死が生じる。血管分布および微小血管細胞増殖は、悪性神経膠星状細胞腫を、それよりも悪性度の低い神経膠星状細胞腫から診断するために使用される形態学的特徴であり、これらの特徴は、予後判定と相関する。
【００５８】
ヒト腫瘍（神経膠腫を含む）の脈管成分を標的とすると、特に有効な癌治療を提供する。なぜなら、ｉ）約１００個の腫瘍細胞が、各々の内皮細胞の死滅によって影響を受けると推測され；ｉｉ）内皮細胞は、腫瘍細胞の遺伝的不安定性を共有しないのでその処置に対して抵抗性になる可能性が低く；ｉｉｉ）腫瘍脈管構造に干渉するストラテジーが、動物モデルにおいて成功裡に使用されているからである。
【００５９】
種々の抗血管新生因子が、本発明の組換えウイルスの効果を増強するために使用され得る。これらのインヒビターのうちの１つであるアンジオスタチン（例えば、本明細書により全体が参考として援用される米国特許第６，０２４，６８８号およびＯ’Ｒｅｉｌｌｙら「Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ：Ａ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｔｈａｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ  ｏｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．ＬＩＸ，ｐｐ．４７１〜４８２（１９９４）を参照のこと）が、種々のマウスおよびヒトの異種移植腫瘍（神経膠腫、乳癌、前立腺癌、および肺癌が挙げられる）に対して有効に使用された。さらに、アンジオスタチンは、組み合わされる、内皮細胞に対する細胞傷害性効果によって、電離放射線の抗腫瘍効果を増強する。局所的補助治療として使用するためのアンジオスタチンの強力な抗腫瘍特性は、本発明の低酸素依存性腫瘍崩壊アデノウイルスによって送達され得る。
【００６０】
他の新脈管形成阻害分子としては、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）ファミリーのタンパク質のメンバーが挙げられる（例えば、ｄｅ  Ｆｒａｉｐｏｎｔら、２００１、Ｔｒｅｎｄｓ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７（９）：４０１〜４６７を参照のこと）。このファミリーのいくつかのメンバー（ＴＳＰ１およびＴＳＰ２）は、抗新脈管形成活性を有することが公知である。ＴＳＰの抗新脈管形成活性は、そのプロコラーゲンドメインおよび１型反復（ＴＳＲ）ドメインに局在化する。これは、このファミリーの他のメンバーは有さない特徴である。従って、本発明の組換えウイルスは、低酸素応答性エレメントの制御下にＴＳＰ遺伝子またはその部分を有するように操作され得る。その抗新脈管形成活性は、そのタンパク質のうちの小さな部分に局在化しているので、この抗新脈管形成活性をコードする核酸は、本発明において使用され得る。
【００６１】
本発明において使用され得るＴＳＲドメインを含有する他の新脈管形成阻害因子は、ＧＤ−Ａ１Ｆ（例えば、その全体が本明細書により参考として援用されるＰＣＴ／ＵＳ９５／０２６３４を参照のこと）、ＢＡＩ１、ＢＡＩ２、およびＢＡＩ３，ならびにＡＤＡＭＴＳファミリーのメンバー（ＡＤＡＭＴＳ−１、ＡＤＡＭＴＳ−４、およびＡＤＡＭＴＳ−８が挙げられるが、これらに限定はされない（例えば、その全体が本明細書により参考として援用される米国特許第６，０４６，０３１号を参照のこと））である。抗新脈管形成遺伝子の数は、増加しており、これらのうちのいずれもが、本発明において使用され得る。
【００６２】
本発明において使用され得る他の遺伝子としては、エンドスタチン（例えば、米国特許第６，１７４，８６１号および米国特許第５，８５４，２０５号を参照のこと）、血小板因子４（ＰＦ４）（例えば、米国特許第５，４８２，９２３号を参照のこと）、インターロイキン４（ＩＬ−４）（例えば、米国特許第５，３８２，４２７号および米国特許第４，９５８，００７号を参照のこと）、および色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）（例えば、米国特許第６，２８８，０２４号および米国特許第５，８４０，６８６号を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定はされない。上記の米国特許は、本明細書と矛盾しない程度まで、その全体が本明細書中に援用される。脳新脈管形成インヒビター（１、２、３）をコードする遺伝子、インターロイキン１２をコードする遺伝子、メタロプロテイナーゼの組織インヒビターをコードする遺伝子、プロラクチン（１０ｋＤフラグメント）をコードする遺伝子、ｂＦＧＦ可溶性レセプターをコードする遺伝子、トランスフォーミング増殖因子βをコードする遺伝子、インターフェロンαをコードする遺伝子、胎盤プロリフェリン関連タンパク質をコードする遺伝子、脈管内皮増殖因子レセプターのドミナントネガティブフラグメントをコードする遺伝子、またはそれらのフラグメントもまた、本発明において使用され得る。
【００６３】
（抗腫瘍因子）
抗腫瘍活性を示す種々の遺伝子、またはウイルスの抗腫瘍活性を増強する種々の遺伝子、または腫瘍に対する免疫応答を調節する種々の遺伝子が、本発明の新規なウイルス構築物中に組み込まれ得る。これらの抗腫瘍因子は、種々の機構により作動する。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｓｐ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓは、オンコトキシン（ｏｎｃｏｔｏｘｉｎ）という名前のタンパク質を有する。このタンパク質は、抗腫瘍活性を有する（本明細書により参考として援用される米国特許第５，９７７，０５８号）。このタンパク質などのタンパク質の遺伝子は、本発明の新規な組換えウイルス中に遺伝子操作され得、そのウイルスの抗腫瘍活性を増強し得る。抗腫瘍因子の他の例としては、当業者にとって公知である種々の腫瘍サプレッサー遺伝子が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００６４】
（他の因子）
他の因子が、治療目的のために本発明の組換えウイルスにより送達され得、それには、細胞増殖モジュレーター、細胞周期モジュレーター、細胞成長モジュレーター、細胞遊走モジュレーター、アポトーシスモジュレーター、免疫応答モジュレーター、転移モジュレーターが挙げられるが、これらに限定はされない。これらの因子もまた、当業者にとって公知である。
【００６５】
（他の障害）
低酸素性調節不全（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）またはＨＩＦ調節不全（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）は、多数の哺乳動物疾患と関連があり、その悪性疾患としては、関節炎、糖尿病性網膜症、虚血性心不全、発作、腫瘍、および妊娠障害（子癇前症および胎内発育遅延）が挙げられるが、これらに限定はされない。本発明は、そのような状態において治療遺伝子を送達するために利用され得る。さらに、本発明は、上記の状態を処置するための種々の治療因子を試験するためのレポーター系を含む、トランスジェニック動物を産生するために使用され得る。
【００６６】
（投与経路および投与量）
本発明の新規な組成物は、種々の経路（皮下経路、腹腔内経路、静脈内経路、異所性経路、エアロゾルを介する経路、および脳内経路が挙げられるが、これらに限定はされない）を介して投与され得る。投与経路は、当業者にとって公知である。
【００６７】
本発明の新規な組換えウイルスは、単回投与または複数回投与で投与され得、処置を必要とする個体における１つよりも多くの腫瘍が、同時に処置され得る。
【００６８】
詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示としてのみ提供されていることが、理解されるべきである。なぜなら、本発明の趣旨および範囲内にある種々の変更および改変が、詳細な説明および具体例から当業者にとって明らかになるからである。
【００６９】
（実施例）
（実施例１：アデノウイルスによる腫瘍細胞株の感染）
本実施例は、脳腫瘍細胞株が、アデノウイルスにより効率的に感染されることを示す。脳腫瘍の遺伝子治療処置のためのアデノウイルスの利用は、ウイルスの侵入に依存する。アデノウイルスによるヒト細胞の感染は、少なくとも２つのウイルスタンパク質とそれらの個々の細胞レセプターとの特異的相互作用を含む、多工程プロセスである。脳腫瘍は、組織学的および遺伝学的に不均質であり、従って、これらの腫瘍のほんの小さな部分集合だけがアデノウイルスにより感染され得ることが、可能である。このことを試験するために、８つのヒト神経膠腫細胞株（Ｄ２４７ＭＧ、Ｕ２５１ＭＧ、ＬＮ−２２９、ＬＮ−４６４、Ｕ８７ＭＧ、ＬＮ−Ｚ３０８、Ｔ９８Ｇ、Ｕ１３８ＭＧ）がアデノウイルスにより感染される能力を、構成的に活性な内因性ＬａｃＺレポーター遺伝子を含む複製欠損性アデノウイルス（ＡｄＬａｃＺ、ＵＮＣ−Ｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ、ＮＣ）を使用して試験した。未感染神経膠腫細胞およびＡｄＬａｃＺ感染２９３ヒト胚性腎臓細胞を、それぞれ、ネガティブコントロールおよびポジティブコントロールとして使用した。
【００７０】
同数の各々の細胞株を、感染の２４時間前に播種した。それらの細胞に、０．１〜５００の範囲の感染多重度（ＭＯＩ）でＡｄＬａｃＺを感染させたか、またはモック感染させた。感染の２４時間後に、細胞を、Ｘ−ｇａｌ基質を使用してβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）活性について組織学的に染色し、各ＭＯＩにおける感染（青色）細胞の数を、視覚的に定量した。その結果を、図１にまとめる。上記の８つの細胞株のうちの５つが、１００〜５００の範囲のＭＯＩにて７５％〜１００％の感染度を達成し、一方、残りの３つの細胞株（ＬＮ−Ｚ３０８、Ｔ９８Ｇ、Ｕ１３８ＭＧ）は、ＭＯＩ＝５００においてでさえ、より低い効率でしか（＜３０％）感染しなかった。ＡｄＬａｃＺウイルスに非常に高効率で感染した２９３細胞は、ＭＯＩ＝１にて５０％感染を達成し、ＭＯＩ＝５にて９５％よりも高い感染を達成した。
【００７１】
これらの結果は、脳腫瘍細胞株の大部分集団（約６０％よりも多く）が、アデノウイルスにより高頻度で感染され得ることを確証する。アデノウイルス感染に対するヒト癌細胞株の差次的な感受性は、他の細胞型（ヒト膀胱癌細胞株およびヒト結腸癌細胞株が挙げられる）における差次的な感受性と類似する。
【００７２】
（実施例２：腫瘍細胞株のアデノウイルス感染に対する低酸素の影響）
本実施例は、脳腫瘍細胞株のアデノウイルス感染が、低酸素により影響を受けないことを示す。ＨＹＰＲアデノウイルスの治療効力は、そのＨＹＰＲアデノウイルスが低酸素腫瘍細胞に効率的に感染する能力に依存する。２つの遺伝的および生物学的に異なる神経膠腫細胞株（Ｄ２４７ＭＧおよびＬＮ−２２９）における、酸素正常状態条件下と低酸素条件下とでのアデノウイルス感染レベルを、比較した。これらの細胞を、酸素正常状態（２０．８％  Ｏ２）条件下または低酸素（１％  Ｏ２）条件下で７２時間インキュベートし、その後、上記のような数種のＭＯＩにて複製欠損性ＡｄＬａｃＺウイルスに感染させた。それらの細胞を、感染の２４時間後にβ−ｇａｌ活性について組織学的に染色し、感染した（青色の）細胞の割合を、視覚的に定量した（表１）。感染細胞の割合は、飽和未満のＭＯＩでは低酸素条件下でわずかに低減した（Ｄ２４７ＭＧにおいて９％低減、ＬＮ２２９において２８％低減）。これは、ＬＮ−２２９についてはＭＯＩを２５０にまで増加させることによって克服され、酸素正常状態下および低酸素下において１００％感染した細胞が得られた。これらの実験は、細胞培養における低酸素条件下でのアデノウイルス感染は、酸素正常状態条件下と同様のレベルで生じることを実証する。従って、この効率によって、ウイルスの増加および増殖が可能になる。なぜなら、感染細胞各々は、１０３個〜１０４個までの新たなウイルス粒子を生じると推測されるからである。
【００７３】
表１：一視野当たりの青色細胞のパーセント
【００７４】
【化１】
0004709471.tif 000002
（実施例３：低酸素条件下でのアデノウイルスの複製および子孫産生）
本実施例は、ＡｄＬａｃＺ複製および子孫産生が、低酸素条件下で効率的であることを示す。低酸素細胞が高効率でのアデノウイルスの複製および子孫産生を許容しない可能性を、ＡｄＬａｃＺを使用して２９３細胞において試験した。上記２９３細胞は、ヒト胚性腎臓細胞株であり、複製欠損性ＡｄＬａｃＺにおいて欠失しているウイルス機能をトランスで相補し、ウイルス産生を可能にする。ウイルスを、酸素正常状態条件（２０．８％  Ｏ２）下および低酸素条件（１％  Ｏ２）下で増殖させたＡｄＬａｃＺ感染２９３細胞から収集した。その後、それらのウイルスを使用して、酸素正常状態下にて数種の異なるＭＯＩにてＤ２４７ＭＧ神経膠腫細胞株およびＬＮ−２２９神経膠腫細胞腫に感染させた。それらの細胞を、感染後２４時間目にβ−ｇａｌについて組織化学染色し、感染（青色）細胞のパーセンテージを視覚的に定量してウイルス力価の推定値として使用した。それらの結果を、表２にまとめる。感染（青色）細胞のパーセンテージは、ウイルスを低酸素２９３細胞において産生させた場合には約２０％減少したことが、見出された。これらの結果は、ウイルス産生が、低酸素２９３細胞においてほんのわずかにしか低減しないことを示唆する。
【００７５】
（表２）
【００７６】
【化２】
0004709471.tif 000003
まとめると、実施例１〜３に記載される実験は、大多数の神経膠腫細胞株を高効率でアデノウイルス感染させ得ること、およびアデノウイルスの感染、複製、および子孫産生は、低酸素条件によって劇的には変化しないことを、実証した。
【００７７】
（実施例４：低酸素応答性プロモーターの構築）
実施例４は、低酸素依存性および／またはＨＩＦ依存性の複製アデノウイルス（ＨＹＰＲ−Ａｄ’ｓ）の生成のために使用される、低酸素応答性プロモーターの設計および試験を記載する。このＨＹＰＲ（低酸素および／またはＨＩＦ調節性）シリーズの組換えアデノウイルスの構築には、
【００７８】
【化３】
0004709471.tif 000004
の低酸素／ＨＩＦ依存性調節が必要である。
市販の哺乳動物発現ベクター（ｐＢＩ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，図２）を、二方向性低酸素／ＨＩＦ応答性プロモーターの生成および試験のための基礎として使用した。このｐＢＩプラスミドは、テトラサイクリン応答性エレメントを含む。このテトラサイクリン応答性エレメントにより、２つの異種遺伝子の条件付き二方向性発現が可能になる。低酸素応答性エレメントを、いくつかの遺伝子において同定した。それらの低酸素応答性エレメントは、古典的エンハンサーエレメントとして機能するようであった。従って、これらのエレメントを、これらの構築物が２つの遺伝子の発現を同時調節するように二方向的に機能するように、選択した。
【００７９】
上記ＨＹＰＲウイルスの構築の第一段階は、低酸素／ＨＩＦ応答性プロモーターの選択であった。低酸素条件は、生理学的応答のカスケードを開始して、解糖に関与する遺伝子、赤血球生成に関与する遺伝子、および新脈管形成に関与する遺伝子の誘導をもたらすことが公知である。ＨＩＦ−１タンパク質複合体（これは、２つの塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質であるＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−１βから構成される、ヘテロダイマーである）は、標的遺伝子中に存在するシス作用性低酸素／ＨＩＦ誘導性エンハンサーモチーフ（ＨＲＥ）への結合によって、低酸素に対する転写応答を媒介する。低酸素活性化転写因子のファミリーの一部として、ＨＩＦ２およびＨＩＦ３もまた同定されており、これらは、ＨＩＦ１αと機能的に類似することが見出されている。エリスロポエチン（ＥＰＯ）遺伝子の３’隣接領域中に存在するＨＲＥおよびＶＥＧＦ遺伝子の５’隣接領域中に存在するＨＲＥは、長さが５０ｂｐ未満である。これらのＨＲＥは、高度に保存されたＨＩＦ−１結合部位と、低酸素／ＨＩＦ誘導のために機能的に必須である他の遺伝子特異的シス作用性配列とを含む。ＥＰＯは、低酸素に応答して腎臓および肝臓において産生される糖タンパク質ホルモンである。ＥＰＯは、赤血球前駆（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）細胞および赤血球前駆（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）細胞において発現されるそのレセプターに結合することにより、赤血球生成を刺激する。ＥＰＯおよびそのレセプターはまた、それぞれ神経膠星状細胞およびニューロンによって中枢神経系において発現され、それらは、パラクリン様式で作用して低酸素誘導性損傷からニューロンを保護するように機能すると、現在考えられている。ＶＥＧＦは、種々の細胞型において低酸素により誘導される。ＶＥＧＦはまた、多数の腫瘍細胞型（神経膠腫を含む）により発現される。ＶＥＧＦは、新脈管形成の主要な調節因子であり、脈管内皮細胞に特異的なマイトジェン活性を有する。この情報に基づいて、ＥＰＯのＨＲＥおよびＶＥＧＦのＨＲＥ（これらの配列は、公知である（Ｓｅｍｅｎｚａら，１９９８，Ｃｈｅｓｔ  １１４：４０Ｓ〜４５Ｓ））を、低酸素／ＨＩＦ応答性プロモーターの設計および試験のために選択した。
【００８０】
ＥＰＯ  ＨＲＥ配列（配列番号１：ＧＣＣＣＴＡＣＧＴＧ  ＣＴＧＴＣＴＣＡＣＡ  ＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴ  ＧＡＣ）およびＶＥＧＦ配列（配列番号２：ＣＣＡＣＡＧＴＧＣＡ  ＴＡＣＧＴＧＧＧＣＴ  ＣＣＡＡＣＡＧＧＴＣ  ＣＴＣＴＴ）を、ｐＢＩベクター中へのクローニングを容易にするためのさらなる配列とともに、標準的なオリゴヌクレオチド合成手順によって合成した。その後、これらのＨＲＥを使用して、実施例５においてベクターを構築した。
【００８１】
（実施例５：低酸素誘導性発現ベクターの生成）
現在利用可能なアデノウイルスベクターのサイズが大きなことおよびその独特のクローニング部位が限定されていることによって、ＨＹＰＲウイルスおよびＨＹＰＲＡウイルスの構築のために必要な複数のサブクローニング工程におけるそれらのベクターの有用性は制限される。従って、低酸素／ＨＩＦ依存性プロモーターの構築および試験と、その後のＥ１および抗脈管形成アンジオスタチン遺伝子のサブクローニングとは、改変型ｐＢＩ哺乳動物発現ベクターおよび改変型ｐＢＩ−ＧＬ哺乳動物発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，図２）を使用して実施した。その後、この改変型ｐＢＩプラスミド中に生じた遺伝子カセットを、組換えＨＹＰＲアデノウイルスおよび組換えＨＹＰＲＡアデノウイルスの構築のために使用する。
【００８２】
ｐＢＩベクターを使用して、二方向性テトラサイクリン（ｔｅｔ）応答性プロモーターから目的の２つの遺伝子を発現させ得る。このプロモーターは、２つの最小ＣＭＶにより挟まれた７コピーのｔｅｔ応答性エレメントを含む。上記ｐＢＩ−ＧＬベクターは、ルシフェラーゼと、ルシフェラーゼの調節下にあるＬａｃＺ／β−Ｇａｌレポーター遺伝子とを含む。上記のｐＢＩ哺乳動物発現ベクターおよびｐＢＩ−ＧＬ哺乳動物発現ベクターを改変して、そのｔｅｔ応答性エレメントを低酸素／ＨＩＦ応答性エレメント（ＨＲＥ）で置換した。ＸｈｏＩ認識部位を、部位特異的誘発（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）によって、ｐＢＩプラスミドおよびｐＢＩ−ＧＬプラスミドのｔｅｔ応答性エレメントの５’側および３’側に導入した。その後、そのｔｅｔ応答性エレメントを、ＸｈｏＩ消化によって除去した。ＶＥＧＦ遺伝子の５’隣接領域中のＨＲＥに広がるオリゴヌクレオチド、およびＥＰＯ遺伝子の３’隣接領域中のＨＲＥに広がるオリゴヌクレオチドを、合成し（実施例４を参照のこと）、コンカテマー化し、その後、改変型ｐＢＩ  ＴＥＴベクターおよび改変型ｐＢＩ−ＧＬ  ＴＥＴベクターのＸｈｏＩ部位中にタンデムに（ヘッド−テール方向に）クローニングした。５’方向および３’方向の両方に１〜６個のタンデムコピーのＶＥＧＦ  ＨＲＥまたはＥＰＯ  ＨＲＥを含む、ｐＢＩ−ＨＲＥと名づけた構築物およびｐＢＩ−ＧＬ−ＨＲＥと名づけた構築物を、作製した。
【００８３】
（実施例６：二方向性低酸素／ＨＩＦ誘導性レポーター遺伝子発現の試験）
上記のｐＢＩ−ＧＬ−ＨＲＥ構築物を、それらが低酸素および／またはＨＩＦに応答してルシフェラーゼレポーター遺伝子およびβ−ｇａｌレポーター遺伝子を二方向発現する能力について試験した。さらに、それらのレポーター遺伝子の基礎活性および低酸素特異的誘導に対する、コピー数および方向の影響についてもまた、試験した。最後に、ＥＰＯ  ＨＲＥに対して、ＶＥＧＦ  ＨＲＥの基礎活性および誘導能力を比較して、神経膠腫細胞株における最適な調節を付与する応答エレメントを決定した。
【００８４】
まず、低酸素条件に対して酸素正常状態条件下において、ＬＮ−２２９神経膠腫細胞株における２４種のｐＢＩＧＬ−ＨＲＥ構築物のレポーター遺伝子活性を試験した。上記の構築物を、ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、ＬＮ−２２９細胞中に一過性トランスフェクトした。それらの細胞を、トランスフェクション手順から一晩で取り出し、その後、酸素正常状態条件（２０．８％  ＣＯ２）下または低酸素条件（１％  ＣＯ２）下において４８時間インキュベートした。元のｐＢＩプラスミドおよびｐＢＩ−ＧＬプラスミドを、これらの実験についてのネガティブコントロールとして使用した。ルシフェラーゼ酵素活性およびβ−ｇａｌ酵素活性を、比色アッセイ（Ｔｒｏｐｉｘ  Ｄｕａｌ−Ｌｉｇｈｔ化学発光レポーター遺伝子アッセイシステム，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して測定した。その後、酵素活性を、改変型Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、細胞抽出物中の総タンパク質に対して正規化した。
【００８５】
ＬＮ−２２９細胞において得られたデータに基づいて、上記の２４種の構築物のうちの８種（ｐＢＩ−ＧＬ  ＶＥＧＦ−５Ｌ、ｐＢＩ−ＧＬ  ＶＥＧＦ−６Ｌ、ｐＢＩ−ＧＬ  ＶＥＧＦ−３Ｒ、ｐＢＩ−ＧＬ  ＶＥＧＦ−４Ｒ、ｐＢＩ−ＧＬ  ＶＥＧＦ−５Ｒ、およびｐＢＩ−ＧＬ  ＶＥＧＦ−６Ｒ、ならびにｐＢＩ−ＧＬ  ＥＰＯ−３ＬおよびｐＢＩ−ＧＬ  ＥＰＯ−６Ｌ）を、さらなる分析用に選択した。これらの８種の構築物は、酸素正常状態条件下で最低レベルのレポーター遺伝子活性を示し、低酸素に応答してレポーター遺伝子活性の最高の二方向性誘導を示した。ＬＮ−２２９細胞において得られた二方向性レポーター遺伝子活性のデータを確認して拡張するために、これらの８種の構築物を、酸素正常状態および低酸素（１％  ＣＯ２）において、他の２つの神経膠腫細胞株（Ｕ２５１ＭＧ、Ｕ１３８ＭＧ）においても試験した（図３）。
【００８６】
これらの結果は、上記のＶＥＧＦ  ＨＲＥおよびＥＰＯ  ＨＲＥが、上記のプラスミドにおいて低酸素条件下で二方向性遺伝子発現を誘導することを実証した。重要なことには、タンデムコピーが５’方向に向かっている場合または３’方向に向かっている場合（構築物の名前においてＬ  対  Ｒ）の両方において、高い誘導が示された。このことは、上記のレポーター遺伝子の二方向性誘導が、タンデムコピーの方向に依存しなかったことを示唆した。最後に、酸素正常状態条件下におけるこれらの構築物のバックグラウンド発現は、最小限であり、ｐＢＩ−ＧＬベクターに関して観察された発現よりも顕著には大きくなかった。
【００８７】
（実施例７：低酸素および／またはＨＩＦ応答性ウイルス）
組換えアデノウイルスを生成するために一般的に使用される２種類の方法は、哺乳動物細胞における相同組換えまたはアデノウイルスゲノム中へのＤＮＡフラグメントの直接連結のうちのいずれかを含む。最近、ｐＡｄＥａｓｙ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）と呼ばれる新たな系（Ｈｅ，Ｔ．Ｃ．ら［１９９８］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：２５０９〜１４）は、細菌において組換え手順が実施されることを可能にした。上記のｐＡｄＥａｓｙ系において、目的の遺伝子を、まず、ポリリンカーがアデノウイルス配列に挟まれているシャトルプラスミド中にクローニングする。これらの隣接アデノウイルス配列によって、Ｅ１ウイルス領域およびＥ３ウイルス領域以外のアデノウイルスゲノムをすべて含むアデノウイルスプラスミドとの相同組換えが可能である。その後、その組換え生成物を、２９３パッケージング細胞株（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中にトランスフェクトして、組換えアデノウイルスを生成する。本発明の状況においてｐＡｄＥａｓｙ系を確立するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する複製欠損性アデノウイルスを作製し、感染したＬＮ−２２９脳腫瘍細胞においてＧＦＰ発現を確認した。
【００８８】
（実施例８：ｐＡｄＥａｓｙ系を用いる複製コンピテント組換えアデノウイルスＨＹＰＲ−Ａｄの生成）
実施例８は、低酸素条件下および／またはＨＩＦ活性化条件下で選択的に複製する条件付き減弱化アデノウイルスの生成を記載する。この生成は、外因性低酸素／ＨＩＦ依存性プロモーター（最小ＣＭＶプロモーターに連結されたＨＲＥ）下にあるアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子を含む組換えアデノウイルスの構築による。
【００８９】
アデノウイルスは、分裂中の細胞および静止細胞の両方に感染する、ＤＮＡウイルスである。感染した静止細胞が細胞周期に再び入ることが、ウイルスＤＮＡの複製のために、そして最終的にはウイルスの子孫産生のために、必要である。Ｅ１Ａ遺伝子産物の発現は、これらのウイルス機能のために必須であり、Ｅ１Ａ遺伝子領域を欠くアデノウイルスは、複製欠損性である。アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子は、構成的に活性なプロモーター領域から発現される最初の転写単位である。Ｅ１Ａ遺伝子の生成物は、広範囲の生物学的活性（細胞転写およびウイルス転写の調節（Ｅ１Ｂ遺伝子転写の誘導を含む）および静止細胞におけるＤＮＡ合成の誘導が挙げられる）を示す。しかし、Ｅ１Ａによる細胞増殖制御の調節不全は、ｐ５３依存性機構およびｐ５３非依存性機構を介してアポトーシスを誘導し、最終的には、ウイルスの子孫産生を妨害する。野生型アデノウイルス感染の間のアポトーシスの防止は、アデノウイルスＥ１Ｂ遺伝子生成物の発現により媒介される。Ｅ１Ｂ遺伝子は、２つのタンパク質（２１Ｋおよび５５Ｋ）をコードする。これらのタンパク質は、独立して、Ｅ１Ａ誘導性アポトーシスを阻止するように機能する。Ｅ１Ｂ  ２１Ｋタンパク質は、Ｂｃｌ−２ファミリーのアポトーシス調節因子と配列および機能が相同であり、Ｅ１Ａ誘導性アポトーシスおよび他の多くのアポトーシス刺激をブロックする。Ｅ１Ｂ  ２１Ｋ機能を欠くアデノウイルスによる細胞感染は、多大な核ＤＮＡおよびウイルスＤＮＡの分解の出現（ｄｅｇ表現型）および細胞変性効果（ｃｙｔ表現型）の増強をもたらす。Ｅ１Ｂ  ５５Ｋは、アデノウイルスＥ４−ｏｒｆ６遺伝子生成物と組み合わせて、ウイルス生成の間に２つの機能（ｐ５３と直接相互作用してｐ５３を不活化すること；その後、ウイルス生成において、ほとんどの細胞ｍＲＮＡの輸送を阻害しながらウイルス後期ｍＲＮＡの輸送を促進すること）を有する。
【００９０】
Ｅ１Ｂ  ５５Ｋ機能を欠くアデノウイルス（例えば、ＯＮＹＸ−０１５）は、ｐ５３の機能的状態とは無関係に多くのヒト細胞において効率的にウイルス子孫を産生可能である。しかし、これらの変異体ウイルスは、ヒト細胞株部分集合において、劇的に減少したウイルス収量を示す。この変異体表現型は、Ｅ１Ｂ  ５５Ｋの後期ｍＲＮＡ輸送機能が存在しないことから主に生じ、その変異体ウイルスが利用し得る補償的経路を有し得る細胞株もあると、現在考えられている。ウイルス子孫の産生の間でのＥ１Ｂ遺伝子生成物の重要な役割に基づいて、この遺伝子を含む、ＨＹＰＲ−Ａｄ’ｓおよびＡｄ−ＣＭＶ−Ｅ１を生成し得る。このことは、Ｅ１欠失型アデノウイルスベクター中に、Ｅ１Ａ遺伝子が外因性低酸素誘導性プロモーターにより調節されるアデノウイルスＥ１ゲノム領域（Ｅ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂ遺伝子およびＩＸ遺伝子）を含むＤＮＡカセットを導入することにより、達成し得る（図６）。
【００９１】
アデノウイルス５型のゲノムＥ１領域のヌクレオチド５０１〜４１０５（Ｅ１Ａ遺伝子領域ならびにＥ１Ｂ転写単位およびＩＸ転写単位を含む）を、ｄｌ３０９ウイルス（Ｅ１遺伝子領域について野生型であるが、Ｅ３遺伝子領域中に置換を有して実験室用に安全にされている。これは、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡのＥ．Ｈａｒｌｏｗ博士から得た）から抽出したＤＮＡを使用して、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により増幅した。得られた３．６ｋｂの増幅ＤＮＡ生成物を、最小ＣＭＶプロモーターに結合した６つのＶＥＧＦ  ＨＲＥを含む低酸素／ＨＩＦ誘導性プロモーター（ｐＢＩ−ＶＥＧＦ−６Ｒに由来する）の下流にクローニングした。その後、そのＨＲＥ−ＣＭＶ−Ｅ１カセットを、アデノウイルスシャトルベクター（ｐＳｈｕｔｔｌｅ）中にサブクローニングした（図５）。組換え体を、カナマイシン耐性について選択し、組み換えを、複数の制限エンドヌクレアーゼ分析によって確認した。最終段階において、その組換えアデノウイルスプラスミドを、ＰａｃＩで線状化して逆方向末端反復を露出させ、その後、リポフェクトアミン試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して２９３パッケージング細胞株中にトランスフェクトした。得られたウイルス（ＨＹＰＲ−Ａｄ１）を、標準的プロトコルを使用して収集し、下記のように特徴付けた。比較のために、本発明者らはまた、構成的に活性なＣＭＶプロモーターによりＥ１領域が調節されるアデノウイルス（Ａｄ−ＣＭＶ−Ｅ１）を生成した。
【００９２】
（実施例９：低酸素条件下および酸素正常状態条件下での、トランスフェクト細胞における組換えウイルス遺伝子生成物の発現）
Ｅ１Ａウイルスタンパク質およびＥ１Ｂウイルスタンパク質は、２９３細胞ゲノムにおけるこれらの遺伝子の安定な組込みの結果として、ヒト２９３細胞において構成的に発現される。従って、２９３細胞は、これらのウイルスタンパク質の発現を確認するためには使用し得ない。組換えアデノウイルスからのこれらのタンパク質の発現を確認するために、Ｕ２５１ＭＧ細胞およびＬＮ−２９９細胞に、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｅ１およびＨＹＰＲ−Ａｄ１を感染させた。タンパク質発現は、モノクローナル抗アデノウイルス５型Ｅ１Ａ抗体、モノクローナル抗アデノウイルス５型Ｅ１Ｂ  ５５Ｋｄ抗体、およびモノクローナル抗アデノウイルス５型Ｅ１Ｂ  ２１Ｋｄ抗体を使用して、感染細胞のウェスタンブロッティングにより試験した。非感染細胞が、ネガティブコントロールの役割を果たした（図７Ａ〜図７Ｂ）。Ｅ１Ａが、ＨＹＲＰ−Ａｄ１において低酸素により活性化される。Ｅ１Ａは、他のウイルスプロモーター（初期Ｅ１Ｂ遺伝子調節を含む）の発現を活性化することが公知である。このことは、低酸素下でのＥ１Ｂ遺伝子生成物の発現増加を説明する。後期Ｅ１Ｂ遺伝子調節は、他の因子に関与し、感染後２日目〜３日目に酸素正常状態下でのＥ１Ｂ  ２１Ｋの発現増加を説明し得る。
【００９３】
これらの実験は、組換えアデノウイルスは、Ｅ１Ａ遺伝子生成物およびＥ１Ｂ遺伝子生成物を構成的に発現可能であった（Ａｄ−ＣＭＶ−Ｅ１）かまたは条件付きで発現可能であった（ＨＹＰＲ−Ａｄ１）ことを実証する。このことは、一過性レポーター遺伝子アッセイにおいて観察される低酸素依存性調節が、アデノウイルスゲノムに関して維持されることを実証する。
【００９４】
（実施例１０：低酸素依存性様式での腫瘍細胞の細胞溶解）
ＨＹＰＲ−Ａｄ１およびＡｄ−ＣＭＶ−Ｅ１がＬＮ−２２９神経膠腫細胞株において細胞溶解を誘導する能力を、漸増体積のこの２種のウイルスの感染によって決定した（図８Ａ〜図８Ｄ）。一方の細胞セットを、酸素正常状態条件（２０．８％  Ｏ２）下でインキュベートし、もう一方の細胞セットを、低酸素条件（１％  Ｏ２）下でインキュベートした。ネガティブコントロールとして、非感染ＬＮ２２９神経膠腫細胞を使用した。それらの細胞を、細胞変性効果（ＣＰＥ）の証拠について毎日一回試験した。感染のために飽和未満のウイルス濃度を使用することにより、経時的にＣＰＥの進行を追跡することが可能であった。これらの予備データは、６日間の酸素正常状態の後（示さない）または低酸素の後（図８Ａ）、モック感染したＬＮ−２２９細胞がコンフルエントであることを示す。少数の細胞が集合し、白色ハロに囲まれた黒い点のように見える。これらの細胞には、分裂中のものもあり、単層から剥離するものもある。これは、この細胞株がコンフルエンスに至った後の代表的な挙動である。Ａｄ−ＣＭＶ−Ｅ１に感染した細胞（図８Ｂ）は、ＣＰＥの明らかな徴候を示し、多くの細胞が集合して単層から剥離する。ＨＹＰＲ−Ａｄ１に感染して酸素正常状態下で維持された細胞の形態は、非感染細胞と類似しており、おそらく、集合した細胞がわずかに増加する（図８Ｃ）。対照的に、ＨＹＰＲ−Ａｄ１に感染して低酸素下で維持された細胞はほとんど（図８Ｄ）、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｅ１感染細胞と同様に細胞溶解した。ＨＹＰＲ−Ａｄ１は、低酸素条件下でＣＰＥを誘導するので、条件付き複製コンピテントであることを、これらの結果は示唆する。
【００９５】
（実施例１１：脳腫瘍への組換えウイルスの送達）
この節において記載される実験は、定位的技術によってヌードマウスに腫瘍細胞およびアデノウイルスを脳内注射することに関与する。９Ｌラット神経膠腫瘍細胞（５×１０４細胞、５μｌ体積）を、同系Ｆｉｓｈｅｒ  ３４４ラットの脳に定位移植した。１１日間後、ＬａｃＺを発現する複製欠損性アデノウイルス（１．８×１０１０粒子、２４μｌ体積）を、腫瘍細胞注射と同じ定位座標を使用して、不活性コロイド状炭素粒子（０．５μｌ）とともに腫瘍中に同時注射した。このラットを、ウイルス注射の２４時間後に屠殺し、脳を抽出し、連続切片化により分析した。その切片を処理してβ−ｇａｌ発現を検出した。ウイルスによりコードされる酵素を発現する細胞が、青色領域において目に見える。黒色の粒は、針跡に沿って沈着したコロイド状炭素粒子である。この切片により、針跡に沿っている腫瘍細胞のうちの６０％〜８０％が感染しており、ＬａｃＺタンパク質を発現することが、明らかになった。結果については、図９を参照のこと。
【００９６】
（実施例１２：低酸素誘導性アルカリホスファターゼ発現）
低酸素誘導性プロモーターの制御下にあるアルカリホスファターゼ遺伝子から構成されるプラスミド構築物を、ＬＮ２２９神経膠腫細胞中にトランスフェクトさせた。クローンを、４８ウェルプレートの個々のウェル中に配置し、酸素正常状態条件または低酸素条件のいずれかに暴露した。低酸素条件下でアルカリホスファターゼ発現について陽性であるとアッセイされかつ酸素正常状態条件下でアルカリホスファターゼ発現について陰性であるとアッセイされたクローンを、保持してさらに試験した。酸素正常状態条件および低酸素条件の両方で陽性であると試験評価されたクローンは、廃棄した。
【００９７】
（実施例１３：低酸素誘導性経路を調整する化合物の同定）
アルカリホスファターゼ遺伝子に作動可能に連結された低酸素／ＨＩＦ応答性プロモーターを含む発現可能なプラスミド構築物で形質転換されたＬＮ２２９神経膠腫細胞のクローンに由来する同数の細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに添加する。細胞を、３７℃で一晩インキュベートして接着させる。そのマイクロタイタープレートと、上記のレポーター構築物を含む細胞とを、望ましいＯ２濃度（すなわち、低酸素濃度または酸素正常状態濃度）に同時に平衡化させるか、または低酸素／ＨＩＦ応答性プロモーターにより駆動される遺伝子の転写を誘導することが既知である化合物で処理する。
【００９８】
その後、アッセイ緩衝液中に希釈した適量の試験化合物を、各ウェルに配置する。初期スクリーニングの間に、各ウェルは、コントロールウェル（化合物を含まないかまたは不活性化合物を含むかのいずれかである）以外は異なる試験化合物を有する。選択した時間のああと、その反応物を、アルカリホスファターゼ活性についてアッセイする。アルカリホスファターゼ活性は、眼で、または分光光度計により、検出し得る。低酸素応答性遺伝子を誘導する条件下でアルカリホスファターゼの発現レベルを減少または増加させる化合物を、低酸素／ＨＩＦ誘導性経路のモジュレーターとして分類する。
【００９９】
初期スクリーニングアッセイにおいて陽性であると試験評価された化合物を、アルカリホスファターゼ活性の発現レベルの５０％を阻害する化合物濃度（ＩＣ５０）を決定するために試験化合物の濃度を変化させること以外は上記と同じアッセイを実施することにより、さらに試験する。これらのアッセイにおいて５００μｍ未満のＩＣ５０を有する化合物が、好ましい。１００μｍ未満のＩＣ５０を有する化合物が、より好ましい。１０μｍ未満のＩＣ５０を有する化合物が、非常に好ましい。
【０１００】
（実施例１４：低酸素応答性遺伝子の発現を調整する化合物のインビボ評価）
実験腫瘍を、アルカリホスファターゼ遺伝子に作動可能に連結された低酸素応答性プロモーターを含む発現可能なプラスミド構築物で形質転換されたＬＮ２２９神経膠腫細胞のクローンに由来する細胞を配置することによって、免疫無防備状態のマウスにおいて増殖させる。腫瘍が特定サイズに達したときに、低酸素応答性遺伝子の誘導を調整することが示された化合物を、そのマウスに投与する。不活性化合物を、実験群の他のマウスにネガティブコントロールとして投与するか、またはネガティブコントロールとして、化合物を投与しない。
【０１０１】
所定の時間の後、その実験腫瘍をマウスから取り除く。これらの腫瘍の切片を、アルカリホスファターゼの発現についてアッセイする。コントロール腫瘍は、アルカリホスファターゼ発現の谷（ｐｏｃｋｅｔ）を示すが、上記腫瘍中の細胞の大部分は、ここでアルカリホスファターゼ発現を示す。低酸素応答性遺伝子の発現を調整する化合物で処理した実験腫瘍における、コントロール腫瘍において観察されるよりも高い割合の細胞によるアルカリホスファターゼ発現は、その化合物が、腫瘍細胞に到達可能であり、かつ低酸素応答性遺伝子転写を刺激するようにインビボで活性であることを、確認する。しかし、コントロール腫瘍において観察されるよりも低い割合の細胞によるアルカリホスファターゼ発現は、その化合物が、腫瘍細胞に到達可能であり、かつ低酸素応答性遺伝子転写を阻害するようにインビボで活性であることを、確認する。
【０１０２】
（実施例１５：免疫無防備状態のマウスにおける異種移植神経膠腫細胞増殖の減少）
ＬＮ２２９細胞を、ｎｕ／ｎｕマウスの左脇腹に皮下移植した。平均腫瘍体積［体積＝（長さ×幅２）／２］が７５ｍｍ３に達したとき（矢印）に、マウスを３つの群に分け、０．６６×１０８ｐｆｕのアデノウイルス（ＨＹＰＲ−Ａｄ１もしくはｄ１３０９）またはＰＢＳ（ビヒクル）を、毎日１回５日間注射した。この注射プロトコルの４９日間後、（ＰＢＳ注射腫瘍のサイズが大きいので）マウスを屠殺し、腫瘍を得た。ビヒクルマウスのうちの一匹は、未知の原因によって注射プロトコル終了直後に死亡した。ｄ１３０９マウスのうちの一匹は、眼の感染症に関連して過度に体重が減少したので、５７日目に屠殺した。本発明者らは、ＰＢＳを注射したＬＮ２２９腫瘍の増殖が、注射をしていないものと差がないことを見出した（データは示さない）。
【０１０３】
収集時点で、ＨＹＰＲ−Ａｄ１注射腫瘍（円形）の平均サイズは、ＰＢＳ注射腫瘍（四角形）の５．３分の１であった。ｄ１３０９注射腫瘍（菱形）は、ＰＢＳ注射腫瘍の３４分の１であった。ｄ１３−９注射腫瘍は、ＨＹＰＲ−Ａｄ１注射腫瘍の６．４分の１であった。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】  図１は、組換えアデノウイルスによる腫瘍細胞の感染を示す。パネルの上に示される種々の細胞株は、ＬａｃＺレポーターを含む組換えアデノウイルスに感染させられて、β−ｇａｌ活性について染色された。さらなる説明および実験の詳細については、実施例１を参照のこと。
【図２】  図２は、本発明の新規な組換えウイルスを構築するために使用されるプラスミドの概略図を示す。ＭＣＳとは、マルチクローニング部位を指す；ＴＥＴとは、テトラサイクリン応答性エレメントを指す；ＨＲＥとは、低酸素および／またはＨＩＦ応答性エレメントを指す；１〜６は、ＨＲＥの直列（タンデム)コピーの数を指す。さらなる説明および実験の詳細については、実施例４および５を参照のこと。
【図３Ａ】  図３Ａ〜図３Ｄは、トランスフェクトされた腫瘍細胞株における構築物の低酸素誘導性発現を示す。ＶＥＧＦ−３、ＶＥＧＦ−４、ＶＥＧＦ−５、ＶＥＧＦ−６またはＥＰＯ−３，ＥＰＯ−４，ＥＰＯ−５，ＥＰＯ−６とは、上記構築物における直列（タンデム)反復の数を指す（５’方向についてはＬ、３’方向についてはＲ）。図３Ａおよび図３Ｃは、構築物が低酸素に応答してルシフェラーゼを二方向発現する能力を示す；図３Ｂおよび図３Ｄは、構築物が低酸素に応答してβ−Ｇａｌを二方向発現する能力を示す。さらなる説明および実験の詳細については、実施例５を参照のこと。
【図３Ｂ】  図３Ａ〜図３Ｄは、トランスフェクトされた腫瘍細胞株における構築物の低酸素誘導性発現を示す。ＶＥＧＦ−３、ＶＥＧＦ−４、ＶＥＧＦ−５、ＶＥＧＦ−６またはＥＰＯ−３，ＥＰＯ−４，ＥＰＯ−５，ＥＰＯ−６とは、上記構築物における直列（タンデム)反復の数を指す（５’方向についてはＬ、３’方向についてはＲ）。図３Ａおよび図３Ｃは、構築物が低酸素に応答してルシフェラーゼを二方向発現する能力を示す；図３Ｂおよび図３Ｄは、構築物が低酸素に応答してβ−Ｇａｌを二方向発現する能力を示す。さらなる説明および実験の詳細については、実施例５を参照のこと。
【図３Ｃ】  図３Ａ〜図３Ｄは、トランスフェクトされた腫瘍細胞株における構築物の低酸素誘導性発現を示す。ＶＥＧＦ−３、ＶＥＧＦ−４、ＶＥＧＦ−５、ＶＥＧＦ−６またはＥＰＯ−３，ＥＰＯ−４，ＥＰＯ−５，ＥＰＯ−６とは、上記構築物における直列（タンデム)反復の数を指す（５’方向についてはＬ、３’方向についてはＲ）。図３Ａおよび図３Ｃは、構築物が低酸素に応答してルシフェラーゼを二方向発現する能力を示す；図３Ｂおよび図３Ｄは、構築物が低酸素に応答してβ−Ｇａｌを二方向発現する能力を示す。さらなる説明および実験の詳細については、実施例５を参照のこと。
【図３Ｄ】  図３Ａ〜図３Ｄは、トランスフェクトされた腫瘍細胞株における構築物の低酸素誘導性発現を示す。ＶＥＧＦ−３、ＶＥＧＦ−４、ＶＥＧＦ−５、ＶＥＧＦ−６またはＥＰＯ−３，ＥＰＯ−４，ＥＰＯ−５，ＥＰＯ−６とは、上記構築物における直列（タンデム)反復の数を指す（５’方向についてはＬ、３’方向についてはＲ）。図３Ａおよび図３Ｃは、構築物が低酸素に応答してルシフェラーゼを二方向発現する能力を示す；図３Ｂおよび図３Ｄは、構築物が低酸素に応答してβ−Ｇａｌを二方向発現する能力を示す。さらなる説明および実験の詳細については、実施例５を参照のこと。
【図４Ａ】  図４Ａ〜Ｂは、可変酸素分圧の下でのトランスフェクトされた腫瘍細胞株における構築物の低酸素誘導性発現を示す。ＶＥＧＦ−３、ＶＥＧＦ−４、ＶＥＧＦ−５、ＶＥＧＦ−６またはＥＰＯ−３，ＥＰＯ−４，ＥＰＯ−５，ＥＰＯ−６とは、上記構築物における直列（タンデム)反復の数を指す（Ｌは５’方向について、Ｒは３’方向について）。図４Ａは、構築物が可変酸素分圧に応答してルシフェラーゼを二方向発現する能力を示す；図４Ｂは、構築物が可変酸素分圧に応答してβ−Ｇａｌを二方向発現する能力を示す。さらなる説明および実験の詳細については、実施例５を参照のこと。
【図４Ｂ】  図４Ａ〜Ｂは、可変酸素分圧の下でのトランスフェクトされた腫瘍細胞株における構築物の低酸素誘導性発現を示す。ＶＥＧＦ−３、ＶＥＧＦ−４、ＶＥＧＦ−５、ＶＥＧＦ−６またはＥＰＯ−３，ＥＰＯ−４，ＥＰＯ−５，ＥＰＯ−６とは、上記構築物における直列（タンデム)反復の数を指す（Ｌは５’方向について、Ｒは３’方向について）。図４Ａは、構築物が可変酸素分圧に応答してルシフェラーゼを二方向発現する能力を示す；図４Ｂは、構築物が可変酸素分圧に応答してβ−Ｇａｌを二方向発現する能力を示す。さらなる説明および実験の詳細については、実施例５を参照のこと。
【図５】  図５は、組換えウイルスの構築についての模式的な概略を示す。さらなる説明および実験の詳細については、実施例６〜８を参照のこと。
【図６】  図６は、ｐＡｄＥａｓｙアデノウイルスベクター中にＥｌ遺伝子カセットをサブクローニングする概略図を示す。さらなる説明および実験の詳細については、実施例６〜８を参照のこと。
【図７】  図７Ａ〜図７Ｂは、トランスフェクトされた腫瘍細胞株（神経膠腫ＬＮ２２９）における組換えウイルス遺伝子産物の発現を、ウェスタンブロット分析によって示す。図７Ａにおいて、Ｕｎｉｎｆ．とは、非感染細胞株であり；ｄｌ３０９は、Ｅ１領域が野生型でありかつＥ３領域に変異を有するアデノウイルスに感染した、細胞株であり；ＣＭＶ−Ｅ１は、ＣＭＶ最小プロモーターとＥ１遺伝子とを含む、構築物である。図７Ｂにおいて、Ｕとは、非感染細胞を指し；Ｈとは、低酸素条件を指し、Ｎとは、酸素正常状態条件を指す。さらなる説明および実験の詳細については、実施例９を参照のこと。
【図８】  図８Ａ〜図８Ｄは、低酸素依存性様式での腫瘍細胞の細胞溶解を示す。図８Ａは、低酸素下における非感染細胞であり、図８Ｂは、酸素正常状態条件下におけるＡｄ−ＣＭＶ−Ｅ１感染細胞であり、図８Ｃは、酸素正常状態条件下でのＨＹＰＲ−Ａｄ１であり、図８Ｄは、低酸素下におけるＨＹＰＲ−Ａｄ１である。さらなる説明および実験の詳細については、実施例１０を参照のこと。
【図９】  図９は、脳腫瘍への組換えウイルスの送達を示す。移植されたラット神経膠腫細胞由来の神経膠腫切片が、ＬａｃＺ発現性複製欠損アデノウイルスに感染させられ、β−ｇａｌ発現について染色される。さらなる説明および実験の詳細については、実施例１１を参照のこと。
【図１０】  図１０Ａ〜図１０Ｂは、レポーター遺伝子であるアルカリホスファターゼに作動可能に連結されたプロモーターに作動可能に連結された低酸素応答性エレメントを有する構築物で安定にトランスフェクトされたヒト神経膠腫細胞株に由来するクローンにおける、アルカリホスファターゼ酵素活性についてのアッセイからの結果を示す。図１０Ａは、酸素正常状態条件に曝露された細胞を示し、図１０Ｂは、低酸素条件に暴露された細胞を示す。さらなる説明および実験の詳細については、実施例１２を参照のこと。
【図１１Ａ】  図１１Ａは、ＨＹＰＲ−Ａｄ１で処理された免疫無防備状態マウスにおける神経膠腫細胞の平均腫瘍体積を示すグラフである。図１１Ｂは、種々の処理に関する腫瘍のサイズおよび重量を示す。示される結果は、ＨＹＰＲ−Ａｄｌが、感染した低酸素腫瘍細胞の細胞溶解を特異的に引き起こすことによって腫瘍増殖を低減させることを示唆する。さらなる説明および実験の詳細については、実施例１５を参照のこと。
【図１１Ｂ】  図１１Ａは、ＨＹＰＲ−Ａｄ１で処理された免疫無防備状態マウスにおける神経膠腫細胞の平均腫瘍体積を示すグラフである。図１１Ｂは、種々の処理に関する腫瘍のサイズおよび重量を示す。示される結果は、ＨＹＰＲ−Ａｄｌが、感染した低酸素腫瘍細胞の細胞溶解を特異的に引き起こすことによって腫瘍増殖を低減させることを示唆する。さらなる説明および実験の詳細については、実施例１５を参照のこと。
【図１２】  図１２Ａおよび図１２Ｂは、低酸素の発現を調整する化合物のインビボ評価を示す。さらなる説明および実験の詳細については、実施例１４を参照のこと。
【図１】
0004709471.tif 000005
【図２】
0004709471.tif 000006
【図３Ａ】
0004709471.tif 000007
【図３Ｂ】
0004709471.tif 000008
【図３Ｃ】
0004709471.tif 000009
【図３Ｄ】
0004709471.tif 000010
【図４Ａ】
0004709471.tif 000011
【図４Ｂ】
0004709471.tif 000012
【図５】
0004709471.tif 000013
【図６】
0004709471.tif 000014
【図７】
0004709471.tif 000015
【図８】
0004709471.tif 000016
【図９】
0004709471.tif 000017
【図１０】
0004709471.tif 000018
【図１１Ａ】
0004709471.tif 000019
【図１１Ｂ】
0004709471.tif 000020
【図１２】
0004709471.tif 000021