(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリノゲン含有溶液からフィブリノゲンを精製する方法であって、以下の工程：
（ａ）前記溶液をイオン交換マトリックスに、フィブリノゲンがマトリックスに結合するような条件下で適用する工程；
（ｂ）イオン交換マトリックスを、少なくとも一つのω-アミノ酸を含むバッファー溶液で洗浄する工程；および
（ｃ）マトリックスからフィブリノゲンを溶出する工程
を含む方法。
【請求項２】
（ｄ）溶出物からフィブリノゲンを回収する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
イオン交換カラムに適用する前に、フィブリノゲン含有溶液に少なくとも１つのω−アミノ酸を添加する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ω−アミノ酸が、カルボン酸とω−アミノ基との間の炭素鎖に少なくとも４つの炭素原子を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記鎖が直鎖または環状である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ω−アミノ酸が、４-アミノ酪酸、５-アミノペントイン酸、６-アミノヘキサン酸（ε-アミノカプロン酸(ＥＡＣＡ)）、７-アミノヘプタン酸、８-アミノオクタン酸、およびアルギニンから選択される直鎖ω−アミノ酸である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ω−アミノ酸が、トランス-４-アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸（トラネザミン酸）およびパラ-アミノメチル安息香酸から選択される環状ω−アミノ酸である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ω-アミノ酸がε-アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）である、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ω-アミノ酸が、５−５００ｍＭの濃度で抽出バッファー又はフィブリノゲン含有溶液中に存在する、請求項３ないし８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ω-アミノ酸が、５０−５００ｍＭの濃度でフィブリノゲン含有溶液中に存在する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ω-アミノ酸が、１００ｍＭの濃度でフィブリノゲン含有溶液中に存在する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
フィブリノゲン含有溶液が、イオン交換マトリックスに適用する前に、伝導度が１０．５ｍＳ／ｃｍ以下となるように希釈される、請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
イオン交換マトリックスを洗浄するために用いられるバッファーが、（i）５０ｍＭの濃度のトリス、（ii）２０ｍＭの濃度のω-アミノ酸、および９０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む、請求項１ないし１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
イオン交換マトリックスを洗浄するために用いられるバッファーが、８．０のｐＨを有する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
イオン交換マトリックスを洗浄するために用いられるバッファーが、１１．１ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する、請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１６】
フィブリノゲンを、１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのクエン酸塩、４５ｍＭのスクロース；および２００ｍＭから１．０Ｍの間の濃度のＮａＣｌを含む溶出バッファーにおいてマトリックスから溶出させる、請求項１ないし１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＮａＣｌが、４００−５００ｍＭの濃度である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
溶出バッファーが７．０のｐＨを有する、請求項１６または１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フィブリノゲンの精製方法に関する。ある態様では、本発明は、血漿画分Ｉ沈降物(plasma fraction I precipitate)からのフィブリノゲンの分離方法に関する。別の態様では、本発明は、イオン交換クロマトグラフィーを用いたフィブリノゲンの精製に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトフィブリノゲンの単離は、古典的な血漿分画方法によって行われてきた。フィブリノゲンは、エタノール（BlombackとBlomback, 1956）、硫酸アンモニウム（Takeda, 1996）、βアラニン／グリシン（JakobsenとKieruif, 1976）、ポリマー（ポリエチレングリコール）、および低イオン強度溶液（Holm,1985）を用いて、比較的高収量かつ均質に、血漿から沈降されている。
【０００３】
フィブリノゲン沈降物のさらなる精製は、イオン交換クロマトグラフィー条件（Stathakisら,1978）およびアフィニティークロマトグラフィー（Kuyasら,1990）により行うことができる。特定の不純物、例えば、フィブロネクチンは固定されたゼラチンで、プラスミノゲンは固定されたリシンで吸着排除することができる（Vuentoら,1979）。
【０００４】
沈降方法は、商用フィブリノゲンの製造に広く用いられている。クロマトグラフィー方法は、現在、代替法として、また、フィブリノゲン濃縮物の純度改善のために研究されている。
【０００５】
WO99/37680は、ヒト血液血漿中の別の血液タンパクからフィブリノゲンを大規模に分離する方法を記載している。この方法は、フィブリノゲン精製の出発物質としてヘパリン沈降ペーストの使用を含む。ヘパリン沈降ペーストは、第VIII因子（抗血友病因子、ＡＨＦ）の製造方法の副生成物である。
【０００６】
プラスミノゲンを含まないフィブリノゲンを製造する試み、または、プラスミノゲンそのものを精製する試みが、刊行物に広く公表されている。最も一般的な方法は、リシンが、プラスミノゲン分子の二つの“クリングル”の一方に結合するという能力を利用するものである。アフィニティークロマトグラフィー工程の利用は、1970年にDeutschとMertzにより公表された論文に最初に開示された。Baxter International Inc.は、この技術を利用している。この技術は、不安定化レベルのプラスミノゲン産物を含まないフィブリノゲン濃縮物の大規模製造に関する特許WO95/25748に開示されているように、フィブリノゲンからプラスミノゲンを除去する工程にリシン−セファロース物質を使用することを含む。科学文献に公表された他の技術は、リシンまたはε-アミノカプロン酸の結合を利用する。しかしながら、これらは、プラスミノゲン分子の可溶性を変更するために用いられる。希釈フィブリノゲン溶液にリシンを添加した後に、得られた溶液を７％エタノールの存在下で沈降させる。プラスミノゲンの除去は、この工程を繰り返して、９０％より高く、不純物の全体的除去をもたらす（Mosesson, 1962）。沈降方法は、商用フィブリノゲンの製造に広く用いられているが、Mosesson(1962)により公表された研究は、製造規模での実施にとって実際的なプロセスとは言えない、フィブリノゲンの希釈溶液を利用する。
【０００７】
イオン交換クロマトグラフィーとε-アミノカプロン酸を使用してｐＨまたはイオン強度に関わりなくプラスミノゲンを結合および溶出することは、クリングル含有タンパクの精製について記載したNovo Nordisk A/Sにより1994年に出願された特許（WO94/00483）に開示されている。この方法は、樹脂の選択としてＳ-セファロースを選択する。また、ゲル濾過とイオン交換クロマトグラフィーとの組合せも、プラスミノゲンを精製するために利用されている（Robbinsら,1965）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本願発明者らは、フィブリノゲンが、画分Ｉペースト(Fraction I paste)からなる出発物質から精製された形態で回収されうることを見出した。この方法で回収されたフィブリノゲンは、不安定化レベルのプラスミノゲンおよびその他のプロテアーゼを含んでいない。また、この方法で回収されたフィブリノゲンは、フィブリングルー(glue)の形成におけるフィブリンポリマーの架橋を増強するために必要とされる第XIII因子も含む。さらに、この方法で得られたフィブリノゲンの収量は、ヘパリン沈降ペーストのような他の出発物質を用いる方法で得られる量よりも予想外に高い。
【０００９】
また本発明者等は、イオン交換カラムからフィブリノゲンを回収するための改善された方法を開発した。これは、少なくとも一つのω-アミノ酸を、カラムに添加されたフィブリノゲン含有物質に、あるいは、フィブリノゲンを溶出する前にカラムを洗浄するために用いる溶液に、添加することを含む。
【００１０】
ここで、用語「画分Ｉ沈降物(Fraction I precipitate)」とは、解凍されており、かつ、寒冷沈降物が遠心により除かれた凍結血漿を指す。次いで、得られた寒冷上清(cryosupernatant)をエタノールと混合して、画分Ｉを沈降させる。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
従って、第一の態様では、本発明は、フィブリノゲンを精製する方法を提供し、この方法は、フィブリノゲンが抽出バッファーに可溶化されるように、画分Ｉ沈降物と抽出バッファーとを混合することにより、画分Ｉ沈降物からフィブリノゲンを抽出することを含む。ここで前記抽出バッファーは、少なくとも０．１Ｍの濃度で塩を、そして少なくとも１０ＩＵ／ｍｌの濃度でヘパリンを含む。
【００１２】
第一の態様の好ましい実施態様では、塩の濃度が、少なくとも０．２Ｍ、より好ましくは少なくとも０．４Ｍ、さらに好ましくは約０．８Ｍである。
【００１３】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、抽出バッファーは、塩化物、リン酸塩および酢酸塩からなる群から選択される少なくとも一つの塩を含み、より好ましくはＮａＣｌを含む。
【００１４】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、抽出バッファーが、約２０ｍＭの濃度でクエン酸三ナトリウム(Tri-sodium citrate)も含む。
【００１５】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、抽出バッファーが、少なくとも一つのω-アミノ酸をさらに含む。好ましくは、少なくとも一つのω-アミノ酸が、少なくとも５ｍＭの濃度で抽出バッファーに存在する。
【００１６】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、抽出バッファーが、少なくとも約１ＩＵ／ｍｌの濃度でアンチトロンビンIII（ＡＴIII）を含む。
【００１７】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、抽出バッファーが、約２０ｍＭの濃度でクエン酸三ナトリウム、約０．８Ｍの濃度でＮａＣｌ、約６０ＩＵ／ｍｌの濃度でヘパリン、そして、約５ｍＭの濃度で少なくとも一つのω-アミノ酸を含む。好ましくは、抽出バッファーは、約７．３のｐＨを有する。
【００１８】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、フィブリノゲンの抽出は約３７℃で行われる。好ましくは、抽出は、少なくとも６０分間、さらに好ましくは少なくとも９０分間行われる。
【００１９】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、抽出されたフィブリノゲン溶液を水酸化アルミニウムとインキュベートし、遠心して沈降物を取り除く工程をさらに含む。
【００２０】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、グリシン塩水（Ｇｌｙ／ＮａＣｌ）バッファーの添加により、抽出されたフィブリノゲン溶液からフィブリノゲンを沈降させる工程をさらに含む。好ましくは、Ｇｌｙ／ＮａＣｌバッファーは、約２．１Ｍの濃度でグリシン、約２０ｍＭの濃度でクエン酸Ｎａ、約３．６Ｍの濃度で塩化ナトリウム、および約２．４ｍＭの濃度でＣａＣｌ2を含む。
【００２１】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、約１００ｍＭの濃度のＮａＣｌ、約１．１Ｍの濃度のＣａＣｌ2、約１０ｍＭの濃度のクエン酸Ｎａ、約１０ｍＭの濃度のトリス、および約４５ｍＭの濃度のスクロースを含み、好ましくは約６．９のｐＨのバッファーに、フィブリノゲン沈降物を可溶化する工程をさらに含む。
【００２２】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、以下の工程：
−イオン交換マトリックスに、抽出したフィブリノゲン溶液を、フィブリノゲンがイオン交換マトリックスに結合するような条件下で添加する工程、
−マトリックスからフィブリノゲンを溶出する工程；および
−任意に溶出物からフィブリノゲンを回収する工程
をさらに含む。
【００２３】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、マトリックスからフィブリノゲンを溶出する前に、少なくとも一つのω-アミノ酸を含むバッファーでイオン交換マトリックスを洗浄することをさらに含む。好ましくは、洗浄バッファーは、少なくとも５ｍＭの濃度で少なくとも一つのω-アミノ酸を含む。
【００２４】
さらに好ましい実施態様では、洗浄バッファーは、（i）約５０ｍＭの濃度のトリス、(ii)約２０ｍＭの濃度の少なくとも一つのω-アミノ酸、および約９０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む。好ましくは、バッファーは、約８．０のｐＨを有する。好ましくは、バッファーは、約１１．１ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する。
【００２５】
第二の態様では、本発明は、以下の工程
（ａ）フィブリノゲンが、少なくとも０．１Ｍの濃度の塩を含む抽出バッファーに可溶化されるように、画分Ｉ沈降物を抽出バッファーと混合して、画分Ｉ沈降物からフィブリノゲンを抽出する工程；
（ｂ）フィブリノゲンを沈降させる工程；および
（ｃ）少なくとも１００ｍＭの濃度で少なくとも一つのω-アミノ酸を含む溶液にフィブリノゲンを可溶化させる工程
を含む、フィブリノゲンを精製する方法を提供する。
【００２６】
第二の態様の好ましい態様では、抽出バッファーの塩の濃度は、少なくとも０．２Ｍ、さらに好ましくは少なくとも０．４Ｍ、さらに好ましくは０．８Ｍである。
【００２７】
第二の態様のさらに好ましい実施態様では、抽出バッファーは、塩化物、リン酸塩および酢酸塩からなる群から選択される少なくとも一つの塩を含み、より好ましくはＮａＣｌを含む。
【００２８】
好ましくは、抽出バッファーは、約２０ｍＭの濃度でクエン酸三ナトリウムも含む。
【００２９】
第二の態様の好ましい実施態様では、抽出バッファーは、さらに少なくとも１０ＩＵ／ｍｌ、さらに好ましくは約６０ＩＵ／ｍｌの濃度でヘパリンをさらに含む。
【００３０】
第二の態様のさらに好ましい実施態様では、抽出バッファーは、少なくとも一つのω-アミノ酸をさらに含む。好ましくは、少なくとも一つのω-アミノ酸は、少なくとも５ｍＭの濃度で抽出バッファーに存在する。
【００３１】
第二の態様のさらに好ましい実施態様では、抽出バッファーは、約２０ｍＭの濃度のクエン酸Ｎａ、約０．８Ｍの濃度のＮａＣｌ、および約６０ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンを含む。好ましくは、抽出バッファーは、約７．３のｐＨを有する。
【００３２】
第二の態様のさらに好ましい実施態様では、フィブリノゲンを、グリシン塩水（Ｇｌｙ／ＮａＣｌ）バッファーの添加により、工程（ｂ）で沈降させる。好ましくは、Ｇｌｙ／ＮａＣｌバッファーは、約２．１Ｍの濃度でグリシン、約２０ｍＭの濃度でクエン酸Ｎａ、約３．６Ｍの濃度で塩化ナトリウム、および約２．４ｍＭの濃度でＣａＣｌ2を含む。
【００３３】
第二の態様のさらに好ましい実施態様では、フィブリノゲン沈降物を、約１００ｍＭの濃度のＮａＣｌ、約１．１Ｍの濃度のＣａＣｌ2、約１０ｍＭの濃度のクエン酸Ｎａ、約１０ｍＭの濃度のトリス、および約４５ｍＭの濃度のスクロースを含むバッファーを用いて、工程（ｃ）で可溶化させる。好ましくは、このバッファーは、約６．９のｐＨを有する。
【００３４】
第二の態様のさらに好ましい実施態様では、以下の工程：
（ｄ）イオン交換マトリックスに、工程（ｃ）のフィブリノゲン溶液を、フィブリノゲンが前記マトリックスに結合するような条件下で添加する工程、
（ｅ）マトリックスからフィブリノゲンを溶出する工程；および
（ｆ）任意に溶出物からフィブリノゲンを回収する工程
をさらに含む。
【００３５】
第二の態様の好ましい実施態様では、マトリックスからフィブリノゲンを溶出する前に、少なくとも一つのω-アミノ酸を含むバッファーでイオン交換マトリックスを洗浄することをさらに含む。好ましくは、洗浄バッファーは、少なくとも５ｍＭの濃度で少なくとも一つのω-アミノ酸を含む。
【００３６】
第二の態様のさらに好ましい実施態様では、洗浄バッファーは、（i）約５０ｍＭの濃度のトリス、(ii)約２０ｍＭの濃度の少なくとも一つのω-アミノ酸、および約９０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む。好ましくは、バッファーは、約８．０のｐＨを有する。好ましくは、バッファーは、約１１．１ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する。
【００３７】
第二の態様のさらに好ましい実施態様では、フィブリノゲン含有溶液（好ましくはω-アミノ酸を含む）は、イオン交換マトリックスに添加される前に、伝導度が１０．５ｍＳ／ｃｍ以下となるように希釈する。
【００３８】
第二の態様のさらに好ましい実施態様では、フィブリノゲンを、約１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのクエン酸塩、４５ｍＭのスクロース；および２００ｍＭから１．０Ｍ、好ましくは約４００ｍＭの濃度のＮａＣｌを含むバッファーに、マトリックスから溶出する。好ましくはバッファーは、約７．０のｐＨを有する。
【００３９】
第三の態様では、本発明は、以下の工程
（ａ）少なくとも５ｍＭの濃度の少なくとも一つのω-アミノ酸を含む抽出バッファーにフィブリノゲンが溶解されるように、フィブリノゲン含有物質を抽出バッファーと混合することにより前記物質からフィブリノゲンを抽出する工程；
（ｂ）イオン交換マトリックスに、工程（ａ）で得られた抽出バッファーを、フィブリノゲンが前記マトリックスに結合するような条件下で添加する工程；
（ｃ）前記マトリックスからフィブリノゲンを溶出する工程；および
（ｄ）任意にフィブリノゲンを溶出物から回収する工程
を含む、フィブリノゲンを精製する方法を提供する。
【００４０】
第三の態様の好ましい実施態様では、工程（ｂ）の後に、少なくとも一つのω-アミノ酸を含む溶液で、イオン交換マトリックスを洗浄することをさらに含む。
【００４１】
第四の態様では、本発明は、フィブリノゲン含有溶液からフィブリノゲンを精製する方法を提供するものであって、この方法は、以下の工程：
（ａ）前記溶液をイオン交換マトリックスに、フィブリノゲンがマトリックスに結合するような条件下で適用する工程；
（ｂ）イオン交換マトリックスを、少なくとも一つのω-アミノ酸を含む溶液で洗浄する工程；
（ｃ）マトリックスからフィブリノゲンを溶出する工程；および
（ｄ）任意に溶出物からフィブリノゲンを回収する工程
を含む。
【００４２】
第四の態様の好ましい実施態様では、イオン交換マトリックスに添加する前に、溶液に少なくとも一つのω-アミノ酸を添加することをさらに含む。
【００４３】
本発明の第三および第四の態様では、フィブリノゲン含有物質は、フィブリノゲンを含む血漿から誘導されたあらゆる物質とすることができる。かかる溶液の例は、これらに限定されるわけではないが、血漿（抗凝固化血漿を含む）、または血漿画分を含む。好ましい実施態様では、ヘパリン沈降ペーストであり、これは第VIII因子の製造方法の副生成物である。ヘパリン沈降ペーストを塩溶液で可溶化して、高い比活性のフィブリノゲン調製物を得てもよい。ヘパリンを用いて寒冷沈降物抽出物からフィブリノゲンを沈降させる方法は、Winkelmanら,1989に記載されており、この全内容を参照としてここに含める。また、フィブリノゲン含有物質は、好ましくは本発明の第一または第二の態様の方法に従って、画分１沈降物から抽出される。
【００４４】
第三または第四の態様のさらに好ましい実施態様では、ω-アミノ酸は、５−５００ｍＭ、好ましくは５０−５００ｍＭ、さらに好ましくは約１００ｍＭの濃度で抽出バッファー中に存在する。
【００４５】
第三または第四の態様のさらに好ましい実施態様では、フィブリノゲン含有溶液（好ましくはω-アミノ酸を含む）は、イオン交換マトリックスに適用する前に、伝導度が１０．５ｍＳ／ｃｍ以下となるように希釈される。
【００４６】
第三または第四の態様のさらに好ましい実施態様では、イオン交換マトリックスを洗浄するために用いられるバッファーは、（i）約５０ｍＭの濃度のトリス、（ii）約２０ｍＭの濃度のω-アミノ酸、および約９０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む。好ましくはバッファーは、約８．０のｐＨを有する。好ましくは、バッファーは、約１１．１ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する。
【００４７】
第三または第四の態様のさらに好ましい実施態様では、フィブリノゲンを、約１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのクエン酸塩、４５ｍＭのスクロース；および２００ｍＭから１．０Ｍ、好ましくは約４００−５００ｍＭの濃度のＮａＣｌを含むバッファーにマトリックスから溶出させる。好ましくは、バッファーは約７．０のｐＨを有する。
【００４８】
本発明の第一、第二、第三または第四の態様の好ましい実施態様では、ω-アミノ酸は、カルボン酸とω-アミノ基との間の炭素鎖に少なくとも４つの炭素原子を含む。適切な直鎖ω-アミノ酸の例は、４-アミノ酪酸、５-アミノペントイン酸、６-アミノヘキサン酸（ε-アミノカプロン酸(ＥＡＣＡ)）、７-アミノヘプタン酸、８-アミノオクタン酸、およびアルギニンである。環状ω-アミノ酸の例は、トランス-４-アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸（トラネザミン酸）およびパラ-アミノメチル安息香酸である。特に好ましい実施態様では、ω-アミノ酸は、ＥＡＣＡである。
【００４９】
イオン交換マトリックスは、当該技術分野で公知であり、あらゆる適切なマトリックスを本発明において用いることができる。好ましいマトリックスは、MacroPrep HQ樹脂（BioRad, カタログ番号１５６−００４１）である。さらに好ましい実施態様では、イオン交換マトリックスはカラムに充填される。
【００５０】
当業者であれば、第三および第四の態様の方法は、不安定化レベルのプラスミノゲンとその他のプロテアーゼを含まないフィブリノゲンの大規模な製造のためのアフィニティークロマトグラフィーに代わる方法を提供する可能性を有することを理解できるであろう。かかる態様の方法は、高い回収量（約７５％）で、生物学的流体から、不安定化レベルのプラスミノゲンおよびその他のプロテアーゼを含まないフィブリノゲンを単離するための、イオン交換クロマトグラフィーを用いる唯一の処理工程のみを必要とする。血液タンパクからフィブリノゲンを精製するこの新規方法の使用は、純度と安定性の両方に優れた産物をもたらす、より簡単な製造方法を実現する可能性を有する。
【００５１】
本発明の技術は、フィブリノゲンの製造と、フィブリンシーラント製品におけるフィブリノゲンの使用の両方に関して、多くの利点を与える。フィブリノゲン成分からプラスミノゲンを除去することは、フィブリノゲン成分とフィブリングルーの所望の安定性を得るために、ヒト、動物、または合成由来の阻害剤を添加する必要がないという自由度を製造者に与える。阻害剤の添加は、別の問題を生じることがあり、これは、最終的産物からプラスミノゲンを除去することによって妨げられる。
【００５２】
最後に、イオン交換樹脂の製造コストは、アフィニティークロマトグラフィー法で用いられるリシン-セファロースまたは固定化リシン樹脂のコストよりもはるかに経済的である。
【００５３】
本明細書を通して、用語“含む”、またはその変形は、記載された要素(element)、全体(integer)または工程(step)、あるいは要素、全体または工程の群を含むが、他の要素、全体または工程、あるいは要素、全体または工程の群を排除しないことを意味するものと解する。
【００５４】
ここで使用する略号：
ＴＰ               全タンパク
ＣＰ               凝固可能タンパク
ＦＸIII            第ＸIII因子
ＦII               第II因子
Plasm.             プラスミノゲン
ＦＮ               フィブロネクチン
ＡＴIII            アンチトロンビンIII
Ｆ１Ｐ             画分１ペースト
ＳＦＰ             可溶化画分１ペースト
ＡＳＦＰ           アルヒドロゲル(Alhydrogel)吸収可溶化画分１ペースト
ＧＡＳＦＰ         溶解Ｇｌｙ／ＮａＣｌ沈降可溶化画分１ペースト
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ    ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
Ｇｌｙ／ＮａＣｌ   グリシン／塩
ＳＤ               溶媒／界面活性剤
εＡＣＡ           エプシロンアミノカプロン酸
ＴＮＢＰ           トリ-Ｎ-ブチルホスファート
Ａｌ（ＯＨ）3      水酸化アルミニウム
ＲＴ               室温
ＰＥＴ             血漿処理技術
ＩＥＸ             イオン交換
ＳＨＰ             可溶化ヘパリンペースト上清
【００５５】
【実施例】
実施例１：画分Ｉ沈降物からのフィブリノゲンの抽出
1.1 物質と方法
1.1.1  ヘパリンペースト抽出方法
画分Ｉペーストを、特に言及しない限り、１ｇ：８．３３ｇのヘパリンペースト抽出バッファーの比率で抽出した。この抽出は、室温で２時間行った。
1.1.2  ヘパリンペースト抽出バッファー
０．４Ｍ ＮａＣｌ
５ｍＭ εＡＣＡ
２０ｍＭ クエン酸Ｎａ
ｐＨ７．３
【００５６】
1.1.3  アルヒドロゲル(Alhydrogel)吸着
アルヒドロゲルとしても知られる、２％水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）3溶液を、１０．８％の濃度で、可溶化したヘパリンペースト上清（ＳＨＰ）に加えた。この混合物を、室温で１５分間攪拌しながらインキュベートし、１０分間遠心し、ペレットを捨てた。
1.1.4  Gly／NaCl沈降
アルヒドロゲル上清（ＡＳＦＰ）およびGly／NaClバッファーを３０℃±３℃まで熱した。次いで、この上清を、４．５分間にわたって、１：２．０５の比率でGly／NaClバッファーに加えた。次いで、上清を攪拌しながら２０分間３０℃でインキュベートした後に、１０分間５０１０ｇで遠心した。この上清を捨て、沈降物を、画分Ｉペーストからのフィブリノゲンの抽出後に得られた上清の量の１／３に相当する量のバッファーＤを用いて可溶化した。この沈降物を、可溶化の間、室温で攪拌してもよい。
【００５７】
1.1.5  Gly／NaClバッファー
２．１Ｍ グリシン
２０ｍＭ クエン酸Ｎａ
３．６Ｍ ＮａＣｌ
２．４ｍＭ ＣａＣｌ2
【００５８】
1.1.6  バッファーＤ
１００ｍＭ ＮａＣｌ
１．１ｍＭ ＣａＣｌ2
１０ｍＭ クエン酸Ｎａ
１０ｍＭ トリス
４５ｍＭ スクロース
ｐＨ６．９
【００５９】
1.1.7  溶媒界面活性剤処理
溶媒界面活性剤処理を、可溶化したGly／NaCl沈降物（ＧＡＳＦＰ）に、１％のポリソルバート８０および０．３％のＴＮＢＰを加えることによって実施した。
1.1.8  湿熱処理
溶媒界面活性剤処理したフィブリノゲンを、濃縮スクロース／グリシンバッファーを用いて１／１５に希釈して、約１ｍｇ／ｍＬのタンパク、６０％スクロース、および１Ｍグリシンの終濃度とした。得られた産物を６０℃まで熱し、１０時間９インキュベートした。
1.1.9  イオン交換クロマトグラフィー
湿熱処理したフィブリノゲンを、平衡化したアニオン交換樹脂に添加した。樹脂を洗浄した後に、産物を、塩含有バッファーを用いて溶出した。
1.1.10  ３７℃での安定性
処理過程において、サンプルをウォーターバスにて３７℃でインキュベートし、サンプルを取り出し、規則的な時間間隔で凍結した。サンプルの安定性を、還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。安定性は、フィブリノゲンのαサブユニットの分解をゲル上に肉眼で観察できない最後の時点として定量的に評価した。
【００６０】
1.1.11  抽出１工程
画分１ペーストを、産物から新たに得た。６ｇを、ヘパリンペースト抽出バッファーを用いて直ちに抽出した。可溶化した画分１ペーストを分注し、アッセイまで−８０℃で凍結貯蔵した。
1.1.12  抽出２工程
画分１ペーストを、産物から新たに得た。１２ｇを、ヘパリンペースト抽出バッファーを用いて直ちに抽出した。このペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。沈降物を、バッファーＤに可溶化した。サンプルを各段階で得て、アッセイまで−８０℃で凍結した。残りの画分１ペーストを、−８０℃で貯蔵した。
1.1.13  抽出３（凍結ペースト）工程
画分１ペースト（３０ｇ）を３７℃で解凍し、ヘパリンペースト抽出バッファーを用いて抽出した。可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。このGly／NaCl沈降物をバッファーＤを用いて可溶化した。εＡＣＡを、０ｍＭ、２０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭおよび５００ｍＭの濃度で、可溶化したGly／NaCl沈降物のサンプルに添加した。このサンプルを３７℃で安定性について評価した。
可溶化したGly／NaCl沈降物を、ＳＤで処理し、MacroPrep HQイオン交換カラムに添加した。画分を回収し、３７℃で安定性について評価した。
【００６１】
1.1.14  抽出４工程
画分１ペーストを、産物から新たに得た。４０ｇを、ヘパリンペースト抽出バッファーを用いて直ちに抽出した。抽出から２時間後に、画分１ペーストは完全には可溶化されなかった。この物質を遠心*し、この上清（可溶化した画分１ペースト＃１）をＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。このGly／NaCl沈降物を、バッファーＤを用いて可溶化した。εＡＣＡを、０ｍＭ、２０ｍＭ、１２５ｍＭ、２５０ｍＭおよび５００ｍＭの濃度で、可溶化したGly／NaCl沈降物の２セットのサンプルに添加した。一方のグループのサンプルは、３７℃で直ちにインキュベートし、経時的に安定性についてアッセイした。他方のグループのサンプルを、−８０℃で６０時間凍結貯蔵し、解凍し、次いで、安定性に関して３７℃でインキュベートした。残りの可溶化したGly／NaCl沈降物をＳＤ処理し、イオン交換カラムに添加した。
＊非可溶化画分１物質（１４．１３ｇ）を、０．８ＭのNaClを含有するヘパリンペースト抽出バッファーに再抽出した。可溶化画分１物質（＃２）を分注し、−８０℃で凍結貯蔵した。
【００６２】
1.1.15  抽出バッファーに対するATIIIの添加
画分１ペーストを、産物から得て、半分を４℃で、そして他方の半分を−８０℃で、４．５日間貯蔵した。この実験では、抽出を、１ＩＵ／ｍＬのATIIIを含むまたは含まないバッファーに、４℃（新鮮ペースト）および−８０℃（凍結ペースト）を用いて行った。標準抽出バッファーに対するさらなる変化は、０．８Ｍへの塩濃度の増加であった。
画分１ペースト（６ｇ）を、以下の各条件の下に抽出した：
（１）新鮮なペーストを、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３に抽出。
（２）新鮮なペーストを、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、ｐＨ７．３に抽出。
（３）凍結ペーストを３７℃で解凍し、次いで、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３に抽出。
（４）凍結ペーストを３７℃で解凍し、次いで、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、ｐＨ７．３に抽出、
可溶化した画分１ペーストを、アルヒドロゲル吸着させ、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。沈降物を半分に分けた。半分の沈降物を−８０℃に貯蔵し、他の半分をバッファーＤを用いて可溶化した。可溶化沈降物を再び半分に分け、０ εＡＣＡまたは２５０ｍＭのεＡＣＡを添加した。このサンプルを３７℃で安定性について評価した。
凍結Gly／NaCl pptを、３７℃で解凍し、バッファーＤ＋１００ｍＭ εＡＣＡを用いて可溶化した（３０℃まで温めた）。可溶化を３０℃で行った。サンプルを３７℃で、安定性について評価した。
【００６３】
1.1.16  抽出バッファーへのヘパリンの添加
画分１ペーストを、４℃で３日間貯蔵した後に産物から得た。この実験では、４つの抽出を、２０ＩＵ／ｍＬまたは６０ＩＵ／ｍＬのヘパリンの存在下で１ＩＵ／ｍＬのATIIIを含むおよび含まないバッファーを用いて実施した。
画分１ペースト（６ｇ）を、以下の各条件下で抽出した。
（１）新鮮なペーストを、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、ｐＨ７．３に抽出。
（２）新鮮なペーストを、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、ｐＨ７．３に抽出。
（３）新鮮なペーストを、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、ｐＨ７．３に抽出。
（４）新鮮なペーストを、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、ｐＨ７．３に抽出。
可溶化画分１ペーストを、Ａｌ（ＯＨ）3を用いて処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。沈降物を半分に分けた。半分の沈降物を−８０℃に貯蔵し、他の半分をバッファーＤを用いて可溶化した。可溶化沈降物を再び半分に分け、０ εＡＣＡまたは２５０ｍＭのεＡＣＡを添加した。このサンプルを３７℃で安定性について評価した。
凍結ペレットの可溶化を、凍結Gly／NaCl沈降物中に、バッファーＤ＋１００ｍＭ εＡＣＡ（３０℃に温めた）を添加することによって実施した。可溶化を３０℃で行った。サンプルを、３７℃で安定性について評価した。
【００６４】
1.1.17  ペースト：バッファー比調査
調査I：
画分１ペーストを産物から新たに得た。１．５ｇ、３ｇ、４．５ｇ、６ｇ、７．５ｇ、および９ｇを、０．８ＭのNaClを含む５０ｇの抽出バッファーに可溶化した。サンプルを、全タンパクおよび凝固可能なタンパク用に取りわけた。残りの物質を捨てた。
調査II：
画分１ペースト（Batch #3715001253）を、産物から新たに得た。４．５ｇ、９ｇ、１３．５ｇ、１８ｇ、２２．５ｇおよび２７ｇを、０．８Ｍ NaCl、６０ＩＵ／ｍＬのヘパリンを含有する１５０ｍＬの抽出バッファーに、３７℃で９０分間可溶化した。サンプルを、全タンパクおよび凝固可能なタンパク用に取りわけた。
【００６５】
1.1.18  抽出温度調査
画分１ペーストを、産物から新たに得た。１８ｇを、室温で２時間、１５０ｍＬの２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３に抽出した。別の１８ｇを、３７℃で２時間、１５０ｍＬの２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３に抽出した。サンプルを、全タンパクおよび凝固可能なタンパクの抽出の間、３０分、６０分、９０分、および１２０分の時点で採取した。可溶化されたペーストを遠心し、別のサンプルを取り分けた。
【００６６】
1.1.19  製造規模抽出の調査
製造規模抽出Ｉ：
画分１ペーストを、産物から新たに得た。２０．０ｋｇを１ｇペースト：８．３３ｇバッファーの比率で、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬヘパリン、ｐＨ７．３に、ＰＥＴグループにより抽出した。抽出を、３７℃で９０分間実施した。
可溶化画分１ペーストを、アルヒドロゲル吸着処理し、Gly／NaCl沈降を実施した。沈降物を二つに分け、半分の沈降物を、１００ｍＭ εＡＣＡを含有するバッファーＤに可溶化し、他の半分を−８０℃で凍結させた。可溶化したGly／NaCl沈降物をＳＤで処理し、湿熱処理し、イオン交換カラムに添加した。溶出物を回収し、サンプル化し、−８０℃で凍結させた。
凍結ペレットの可溶化を、凍結させたGly／NaCl沈降物にバッファーＤ＋１００ｍＭ εＡＣＡ（３０℃に温めた）を添加することにより実施した。可溶化を３０℃で行った。このサンプルを、３７℃での安定性について評価した。
製造規模抽出II：
画分１ペーストを、産物から新たに得た。３０．０ｋｇを１ｇペースト：８．３３ｇバッファーの比率で、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬヘパリン、ｐＨ７．３に、ＰＥＴグループにより抽出した。抽出を、３７℃で９０分間実施した。サンプルを、全タンパクおよび凝固可能なタンパクのために取り分けた。
【００６７】
１．２ 結果
1.2.1  抽出１工程
画分１ペースト（６ｇ）を５０ｍＬの抽出バッファーに可溶化した。遠心後、５２．４７ｇの上清を回収し、ペレットを捨てた。
タンパクの特徴決定
可溶化画分１ペーストを、全タンパク、凝固可能なタンパク、第XIII因子、プラスミノゲンおよびフィブロネクチンについて、表１に記載したようにアッセイした。血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を表２に算出した。サイズ排除分析を、スーパーローズ６(Superose 6)を用いて実施し、その結果を表３に記載した。
【００６８】
表１
可溶化画分１ペーストのタンパクの特徴決定
【表１】
0004660048.tif 000002
【００６９】
可溶化画分１ペーストの特徴決定は、その約６５％が凝固可能なタンパクまたはフィブリノゲンである高レベルのタンパクが抽出されたことを示している。また、可溶化画分１ペーストは、高レベルの第XIII因子とプラスミノゲンを含有するが、低レベルのフィブロネクチンを含有していた。
【００７０】
表２
可溶化画分１ペーストからのフィブリノゲンの収量
【表２】
0004660048.tif 000003
【００７１】
可溶化画分１ペーストからのフィブリノゲンの収量は、可溶化ヘパリンペーストと比較して高く、血漿のキログラム当たり１．２２ｇのフィブリノゲンが抽出された。
【００７２】
表３
可溶化画分１ペーストのスーパーローズ６解析
【表３】
0004660048.tif 000004
【００７３】
可溶化画分１ペーストのスーパーローズ６解析は、低レベルの凝集を含むが、低分子量タンパクが存在する約６５％のフィブリノゲンモノマーを示した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果は、非還元条件下で高分子量タンパクの存在を示し、かつ、還元条件下で約４０−６０ｋＤａの間の三つの主なバンドを示した。このプロフィールは、フィブリノゲンに富んだ物質に特有である。
３７℃における安定性
可溶化画分１ペーストの安定性は、約２４時間であった。可溶化画分１ペーストサンプルは、３７℃で２４時間から３２時間の間のインキュベーションで凝固した。
【００７４】
1.2.2  抽出２工程
画分１ペースト（１２．０６ｇ）を、１００．５ｍＬの抽出バッファーに抽出し、遠心し、Ａｌ（ＯＨ）3吸着し、Gly／NaClで沈降させた。
タンパクの特徴決定
全てのサンプルを、全タンパク、凝固可能なタンパク、第XIII因子、第II因子、プラスミノゲンおよびフィブロネクチンについてアッセイし、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表４）。サイズ排除解析を、スーパーローズ６を用いて実施し、この結果を表５に記載した。
【００７５】
表４
特徴決定一覧
【表４】
0004660048.tif 000005
【００７６】
可溶化画分１ペーストの特徴決定は、その約７３％が凝固可能タンパクである高レベルのタンパクの抽出を示した。この結果は、抽出Ｉから得られたものと一致する。また、高レベルの第XIII因子とプラスミノゲン、並びに低レベルのフィブロネクチンも抽出された。血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量も、１．８３ｇ／ｋｇと高かった。
Ａｌ（ＯＨ）3吸着後には、可溶化画分１ペースト中に０．５３ＩＵ／ｍＬであることが観察された第II因子が検出されなかった。凝固可能タンパクは、７７％であることが観察され、FXIII、ブラスミノゲンおよびフィブロネクチンの濃度は比較的変化しなかった。血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量は、約２２％低減したが、これは、この段階で予想された結果である。
Gly／NaCl沈降は、フィブリノゲンの純度を９２％の凝固可能物まで増加させ、かつフィブロネクチンを無視できるレベルまで除いた。
【００７７】
表５
スーパーローズ６解析
【表５】
0004660048.tif 000006
【００７８】
サンプル処理におけるスーパーローズ解析は、Gly／NaCl沈降工程で、全領域の５９％から７４％へとフィブリノゲンピークの増大を伴うフィブリノゲンの精製を示した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
可溶化画分１ペーストのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、抽出１で生成されたものと非常に類似したタンパク組成を示した。また、処理サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析も、Gly／NaCl工程でフィブリノゲンの精製を示した。可溶化Gly／NaCl沈降サンプルは、還元条件下で分析した場合に、より少ない高分子量タンパクバンドを含み、非還元条件下で分析した場合に、２００ｋＤａ、１５０ｋＤａおよび５５ｋＤａのバンドの欠失を示した。
【００７９】
1.2.3  抽出３（凍結ペースト）工程
画分１ペースト（２１．１３ｇ）を１７６ｍＬの抽出バッファーで抽出し、遠心し、Ａｌ（ＯＨ）3吸着し、かつGly／NaCl沈降させた。Gly／NaClバッファーに産物を加えた際に、一部の産物が凝固した。可溶化Gly／NaCl沈降物をＳＤ処理し、イオン交換カラムに添加し、フィブリノゲンを塩含有バッファーに溶出した。
タンパク特徴決定
全てのサンプルを、全タンパク、凝固可能なタンパク、第XIII因子、第II因子、についてアッセイし、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表６）。サイズ排除解析を、スーパーローズ６を用いて実施し、この結果を表７に記載した。
【００８０】
表６
特徴決定一覧
【表６】
0004660048.tif 000007
【００８１】
可溶化画分１ペーストの特徴決定は、サンプルが解凍時に凝固したので実施しなかった。可溶化Gly／NaCl沈降物の一つのサンプルも解凍時に凝固し、結果として、この段階で第XIII因子レベルについて全くデータを入手できなかった。
分析されたサンプルは、先の抽出実験と類似のプロフィールを示した。凝固可能タンパクは、Ａｌ（ＯＨ）3吸着後約６０％であり、Gly／NaCl沈降後、８０％よりも高く増大した。第XIII因子は、Ａｌ（ＯＨ）3吸着後７ＩＵ／ｍＬで存在し、第II因子は、検出不可能であった。血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量は、Gly／NaCl沈降後、僅かに０．４ｇ／ｋｇと検出される低いものであった。ＧＡＳＦＰイオン交換カラムに添加して、プラスミノゲンからフィブリノゲンを精製した。
【００８２】
表７
スーパーローズ６解析
【表７】
0004660048.tif 000008
【００８３】
スーパーローズ６解析は、Ａｌ（ＯＨ）3段階で非常に高レベルの低分子量タンパクを示した。ここでも、Gly／NaCl沈降後に、全エリアの４０％から６０％へとフィブリノゲン含量の増大を伴ってフィブリノゲンの精製が見られた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
可溶化画分１ペーストの第一サンプルは、サンプルが解凍時に凝固したのでＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析しなかった。還元および非還元条件下における、Ａｌ（ＯＨ）3およびGly／NaCl段階後のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、フィブリノゲンの精製を示す。イオン交換カラム溶出の分析は、主なタンパク成分がフィブリノゲンであることを示した。
【００８４】
３７℃での安定性
可溶化画分１ペーストの第一のサンプル（２４時間）は、サンプルが解凍時に凝固したのでＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析しなかった。可溶化画分１ペースト安定性サンプルの残りは、３７℃で放置後２４時間から３２時間の間のいずれかで凝固した。Ａｌ（ＯＨ）3サンプルの解析は、２４時間の時点でフィブリノゲン分解の証拠を示した。
Gly／NaCl沈降後、フィブリノゲンは４４時間の時点で安定であったが、分解は１４４時間の時点で明らかだった（７２時間サンプルは見られなかった）。２００または５００ｍＭのεＡＣＡを、可溶化Gly／NaCl沈降物に添加したときに、フィブリノゲンは２４０時間よりも安定であった。
イオン交換カラムからの溶出後、フィブリノゲンは、εＡＣＡを全く添加せずに、少なくとも２０８時間（試験した最終時点）安定であった。
【００８５】
1.2.4  抽出４工程
新鮮な画分１ペースト（４０．０ｇ）を、３３３ｍＬの抽出バッファーで抽出し、遠心し、Ａｌ（ＯＨ）3吸着し、かつGly／NaCl沈降させた。εＡＣＡを、０ｍＭ、２０ｍＭ、１２５ｍＭ、２５０ｍＭおよび５００ｍＭの濃度で可溶化Gly／NaCl沈降物の２セットのサンプルに添加した。一方のグループのサンプルを、３７℃で直ちにインキュベートし、経時的に安定性を評価した。他方のグループのサンプルを−８０℃で６０時間凍結貯蔵し、解凍し、安定性について３７℃でインキュベートした。可溶化Gly／NaCl沈降物をＳＤ処理し、イオン交換カラムに添加し、フィブリノゲンを塩含有バッファーに溶出した。
タンパク特徴決定
全てのサンプルを、全タンパク、凝固可能なタンパク、第XIII因子、第II因子、およびフィブロネクチンについてアッセイし、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を表８に算出した。第一の抽出後に残ったペレットを、０．８ＭのＮａＣｌを含有するバッファーで再抽出した。このサンプルのタンパク特徴決定および血漿ｋｇ当たりの収量を、表９に記載した。スーパーローズ６解析は行わなかった。
【００８６】
表８
特徴決定一覧
【表８】
0004660048.tif 000009
【００８７】
処理サンプルの特徴決定は、新鮮な画分１ペーストの先の抽出と一致する結果を示した。約６８％の凝固可能なタンパクを、画分１ペーストから抽出した。Ａｌ（ＯＨ）3処理は、第II因子を検出できないレベルまで低減し、Gly／NaCl沈降は凝固可能なタンパクを８９％まで増大させ、フィブロネクチンを無視できるレベルまで低減させた。可溶化画分１ペースト段階での血漿のｋｇ当たりのフィブリノゲンの収量は１．８５であったが、Ａｌ（ＯＨ）3処理およびGly／NaCl沈降後には１．３５に落ち、これはこれらの工程で予想されるものであった。イオン交換クロマトグラフィー工程での回収量は約７６％であった。
凍結ＧＡＳＦＰを解凍し、イオン交換カラムに添加した。溶出は凝固可能タンパクが高レベルであることを示し、低レベルのプラスミノゲンを含んでいた。ＧＡＳＦＰのプラスミノゲンのレベルは、試験しなかった。それゆえイオン交換段階でのプラスミノゲンの回収量は算出できなかった。しかしながら、溶出物中の８ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲンと＜０．２μｇ／ｍＬのプラスミノゲンは、６０ｍｇ／ｍＬの濃縮産物中において１．６μｇ／ｍＬ未満に匹敵する。この結果は、イオン交換カラムが産物からプラスミノゲンを除くのに効率的に作用していることを示唆する。
１４．１３ｇの画分１ペースト（抽出＃１後に残ったもの）を、１１７．７ｍＬのフィブリノゲン抽出バッファー（０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）に可溶化した。
【００８８】
表９
可溶化画分１ペースト＃２の特徴決定一覧
【表９】
0004660048.tif 000010
【００８９】
それゆえ、血漿ｋｇ当たりのフィブリノゲンの全収量は、可溶化画分１ペースト段階における血漿ｋｇ当たり１．８５＋０．７ｇ＝２．５ｇのフィブリノゲンとして算出できた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、全ての画分にフィブリノゲンの存在を示した。Gly／NaCl処理後には、いくつかのタンパクのバンドが、還元条件下で観察され、タンパクの特徴決定により見られたフィブリノゲン分子の精製を示している。
【００９０】
３７℃での安定性
可溶化Gly／NaCl沈降物は、ゼロおよび２０ｍＭのεＡＣＡをサンプルに添加した場合に６４時間安定であった。６４時間後、サンプルは凝固した。１２５ｍＭのεＡＣＡの添加により、サンプルは７２時間安定であったが、分子の分解は１００時間の時点で明らかであった。
２５０ｍＭおよび５００ｍＭのεＡＣＡの添加は、可溶化Gly／NaCl沈降物の安定性を１２４時間より増大させ、最終的なサンプルをとった。
ゼロまたは２０ｍＭのεＡＣＡを添加し、安定化試験を開始する前に−８０℃で６０時間凍結させた可溶化Gly／NaClサンプルは、可溶化非凍結沈降物よりも安定性が低いことが観察された。ゼロまたは２０ｍＭのεＡＣＡを添加すると、非凍結サンプルの６４時間と比べて、サンプルは２４時間安定であったが、その後、凝固した。しかしながら、１２５ｍＭ、２５０ｍＭ、および５００ｍＭのεＡＣＡの添加は、＞９６時間、最終時点までフィブリノゲンの安定性を増大させ、非凍結サンプルで見られた１２４時間から顕著に異なるものではなかった。かくして、フィブリノゲンは、少なくとも１２５ｍＭのεＡＣＡの添加だけで−８０℃で安定であった。
イオン交換溶出の安定性の解析は、εＡＣＡを添加することなく＞１７０時間であることを示した。
【００９１】
1.2.5  抽出バッファーへのATIIIの添加
新鮮かつ凍結された画分１ペースト（６ｇ）を、５０ｍＬの抽出バッファー（±１ＩＵ／ｍＬ ATIII）で抽出し、遠心し、Ａｌ（ＯＨ）3吸着させ、Gly／NaCl沈降させた。この沈降物を半分に分けた。半分の沈降物を−８０℃に貯蔵し、他の半分をバッファーＤを用いて可溶化した。可溶化沈降物を再び半分に分け、０ εＡＣＡまたは２５０ｍＭ εＡＣＡを加えた。このサンプルを、３７℃で安定性について評価した。
【００９２】
タンパク特徴決定
抽出１
新鮮な画分１ペースト（６．０４ｇ）を、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３を含む５０．３４ｇのバッファーに抽出した。可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。
全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１０）。
【００９３】
表１０
特徴決定一覧
【表１０】
0004660048.tif 000011
【００９４】
全タンパクおよび凝固可能タンパクに関する処理サンプルの特徴決定は、先の結果と一致した。約６０％の凝固可能なタンパクが画分１ペーストから抽出され、これはGly／NaCl沈降段階後に８５％の凝固可能タンパクとなるまでに増大した。収量は、先の抽出よりも低く、血漿のキログラム当たりに０．８５ｇのフィブリノゲンが抽出された。
【００９５】
抽出２
新鮮な画分１ペースト（５．９８ｇ）を、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、１ＩＵ／ｍｌ ATIII、ｐＨ７．３を含む４９．８４ｇのバッファーに抽出した。可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。
全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１１）。
【００９６】
表１１
可溶化画分１ペーストの特徴決定一覧
【表１１】
0004660048.tif 000012
【００９７】
１ＩＵ／ｍＬ ATIIIを含有する抽出バッファーを用いて生成した処理サンプルの特徴決定は、ATIIIを含まない抽出バッファーと非常に類似していた。約６５％の凝固可能なタンパクが画分１ペーストから抽出され、これはGly／NaCl沈降段階後に８５％の凝固可能タンパクとなるまでに増大した。収量は、先の抽出よりも低く、血漿のキログラム当たり０．７４ｇのフィブリノゲンが抽出された。
【００９８】
抽出３
凍結画分１ペースト（６．０６ｇ）を、解凍し、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３を含む５０．５ｇのバッファーに抽出した。可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。
全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１２）。
【００９９】
表１２
可溶化画分１ペーストの特徴決定一覧
【表１２】
0004660048.tif 000013
【０１００】
凍結画分１ペーストの抽出後に生成された処理サンプルの特徴決定は、６７％の凝固可能なタンパクの抽出を示し、これは、Gly／NaCl沈降後に８４％にまで増大した。これらの凝固可能なタンパクの結果は、新鮮な、および凍結した、ペースト出発物質の間で一致していた。血漿のキログラム当たりの収量は、新鮮なペーストから抽出されるものよりも低く、血漿のキログラム当たりに０．６ｇ未満のフィブリノゲンが抽出された。
【０１０１】
抽出４
凍結画分１ペースト（６．０７ｇ）を、解凍し、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、ｐＨ７．３を含む５０．５９ｇのバッファーに抽出した。可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。
全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１３）。
【０１０２】
表１３
可溶化画分１ペーストの特徴決定一覧
【表１３】
0004660048.tif 000014
【０１０３】
１ＩＵ／ｍＬ ATIIIを含有するバッファー中の凍結画分１ペーストの抽出後に生成された処理サンプルの特徴決定は、先の抽出物±ATIIIから得られた結果と、凝固可能タンパクおよび収量に関して非常に類似した結果を示した。
３７℃での安定性
各抽出実験からの処理安定性サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を実施した。
新鮮（４℃）および凍結（−８０℃）ペーストからの、ATIIIを含む（＋）および含まない（−）バッファーに抽出した、可溶化画分１ペースト、Ａｌ（ＯＨ）3吸着、およびGly／NaCl沈降サンプルの安定性（時間）を以下の表１４に記載した。
【０１０４】
表１４
フィブリノゲンの安定性（時間）
【表１４】
0004660048.tif 000015
【０１０５】
凍結／解凍／可溶化ＧＡＳＦＰの分析
凍結Gly／NaCl沈降物を３７℃で解凍し、３０℃でバッファーＤ＋１００ｍＭ εＡＣＡを用いて可溶化した。この沈降物を、３０分以内に可溶化した。次いで、サンプルを、以下の表１５において全タンパクおよび凝固可能なタンパクについてアッセイし、および３７℃での安定性についてアッセイした。
【０１０６】
表１５
解凍および可溶化Gly／NaCl沈降物
【表１５】
0004660048.tif 000016
【０１０７】
タンパク特徴決定は、沈降物の凍結が、可溶化Gly／NaCl沈降物におけるフィブリノゲン／ｋｇ血漿の収量または凝固可能なタンパクのレベルに影響しないことを示した。
解凍した可溶化Gly／NaCl沈降物の安定性分析は、全ての抽出条件からのフィブリノゲンが１２０時間安定であることを示した。この結果は、非凍結Gly／NaCl沈降物安定性の結果と一致する。
【０１０８】
1.2.6  抽出バッファーへのヘパリンの添加
新鮮な画分１ペースト（６ｇ）を５０ｇの適切な抽出バッファーに抽出し、Ａｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。この沈降物を半分に分けた。半分の沈降物を−８０℃に貯蔵し、他の半分をバッファーＤを用いて可溶化した。可溶化沈降物を再び半分に分け、２５０ｍＭ εＡＣＡを一方の半分に加え、もう一方の半分にはεＡＣＡを全く加えなかった。このサンプルを、３７℃で安定性について評価した。
タンパク特徴決定
抽出１
新鮮な画分１ペースト（６．０ｇ）を、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、ｐＨ７．３を含む５０．０ｇの抽出バッファーに抽出した。可溶化画分１ペーストを、Ａｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。
全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１６）。
【０１０９】
表１６
特徴決定一覧
【表１６】
0004660048.tif 000017
【０１１０】
２０ＩＵ／ｍＬのヘパリンを含有するバッファーを用いた抽出から得られた処理サンプルの特徴決定は、元の抽出バッファーを用いて得られたものと非常に類似していた。凝固可能なタンパクは抽出後６７％であり、Gly／NaCl沈降後は８８％までに増加した。収量は高く、１．６７ｇのフィブリノゲンが血漿のキログラム当たりに抽出された。
【０１１１】
抽出２
新鮮な画分１ペースト（６．０２ｇ）を、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、ｐＨ７．３を含む５０．１７ｇのバッファーに抽出した。可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。
全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１７）。
【０１１２】
表１７
特徴決定一覧
【表１７】
0004660048.tif 000018
【０１１３】
６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリンを含有するバッファーを用いて抽出した画分１ペーストからの処理サンプルの特徴決定は、全タンパクおよび凝固可能タンパク、並びにフィブリノゲン収量に関して、元の抽出バッファーと非常に類似した結果を示した。
【０１１４】
抽出３
新鮮な画分１ペースト（６．０３ｇ）を、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、ｐＨ７．３を含む５０．２５ｇのバッファーに抽出した。可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。
全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１８）。
【０１１５】
表１８
特徴決定一覧
【表１８】
0004660048.tif 000019
【０１１６】
２０ＩＵ／ｍＬ ヘパリンおよびATIIIを含有するバッファーに抽出した画分１ペーストからの処理サンプルの特徴決定は、元の抽出バッファーを用いて得られたものと非常に類似した結果を示した。収量は低く、血漿のキログラム当たり１ｇのフィブリノゲンが抽出された。
【０１１７】
抽出４
新鮮な画分１ペースト（６．０１ｇ）を、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、ｐＨ７．３を含む５０．０９ｇのバッファーに抽出した。可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。
全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１９）。
【０１１８】
表１９
特徴決定一覧
【表１９】
0004660048.tif 000020
【０１１９】
再び、可溶化画分１ペーストからGly／NaCl沈降物までの全タンパクおよび凝固可能タンパクの特徴決定の結果は一致した。Gly／NaCl沈降段階での顕著な損失に注目すべきである。しかしながら、先の結果に基づけば、ヘパリンとATIIIの存在は、この工程での損失に寄与しないと考えられる。
【０１２０】
３７℃での安定性
新鮮ペーストからの、２０ＩＵ／ｍＬまたは６０ＩＵ／ｍＬのヘパリンを含み、かつATIIIを含む（＋）および含まない（−）バッファーに抽出した、可溶化画分１ペースト、Ａｌ（ＯＨ）3吸着、およびGly／NaCl沈降サンプルの安定性を以下の表２０に記載した。
【０１２１】
表２０
フィブリノゲンの安定性
【表２０】
0004660048.tif 000021
【０１２２】
抽出バッファーにおけるATIIIの存在は、３７℃において、サンプルの安定性を増大するように見えた。６０ＩＵ／ｍＬのヘパリンの存在は、この安定性を、２５０ｍＭのεＡＣＡを添加した後に得られるレベルにまでさらに増大させるように見えた。
【０１２３】
凍結／解凍／可溶化ＧＡＳＦＰの分析
凍結Gly／NaCl沈降物を３７℃で解凍し、３０℃でバッファーＤ＋１００ｍＭ εＡＣＡを用いて可溶化した。この沈降物を、３０分以内に可溶化した。次いで、サンプルを、以下の表２１において全タンパクおよび凝固可能なタンパクについてアッセイし、および３７℃での安定性についてアッセイした。
【０１２４】
表２１
解凍および可溶化Gly／NaCl沈降物
【表２１】
0004660048.tif 000022
【０１２５】
タンパク特徴決定は、沈降物の凍結が、可溶化Gly／NaCl沈降物における収量または凝固可能なタンパクのレベルに影響しないことを示した。抽出４のGly／NaCl沈降からの収量は低いが、これは、非凍結ＧＡＳＦＰに観察された低い収量と関連するものであった。
解凍した可溶化Gly／NaCl沈降物の安定性分析は、抽出１からのフィブリノゲンが少なくとも３６時間（最終時点）安定であり、抽出２が少なくとも７２時間（最終時点）安定であり、抽出３が少なくとも７２時間（最終時点）安定であり、そして抽出４が９６時間安定であることを示した。この結果は、非凍結Gly／NaCl沈降物安定性の結果と一致する。
【０１２６】
1.2.7  濃度調査
濃度調査１
１．５ｇ、３ｇ、４．５ｇ、６ｇ、７．５ｇ、および９ｇの新鮮な画分１ペーストを、０．８Ｍ ＮａＣｌを含有する抽出バッファー５０ｇに可溶化した。全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表２２）。
【０１２７】
表２２
可溶化画分１ペーストの特徴決定一覧
【表２２】
0004660048.tif 000023
【０１２８】
画分１ペーストとバッファーとの比率に関わらず、抽出した凝固可能タンパクのレベルは類似していた（図１参照）。
しかしながら、血漿のキログラム当たりに抽出されたフィブリノゲンの収量は、一致しなかった（図２参照）。
この実験における最大収量は、ペースト：バッファー比が１：１１．１の場合に得られた。２時間の抽出後には、１．５ｇ、３ｇおよび４．５ｇの画分１ペーストの抽出物が完全に可溶化されたが、６ｇ、７．５ｇおよび９ｇの画分１ペーストの抽出物は可溶化されなかったことに注意すべきである。これは、５０ｍＬバッファーにおける４．５ｇの画分１ペースト（１：１１．１）が、完全に抽出される場合に、最大レベルのフィブリノゲンが抽出されることを示唆し得る。ペーストと抽出バッファーとの比率が増すと、存在する全てのフィブリノゲンが抽出されるわけではない。あるいは、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量の差異は、出発物質の不均一性によるものかもしれない。
【０１２９】
濃度調査２
４．５ｇ、９ｇ、１３．５ｇ、１８ｇ、２２．５ｇおよび２７ｇを、０．８Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリンを含有する１５０ｍＬの抽出バッファーに、３７℃で９０分間可溶化した。
全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表２３）。
【０１３０】
表２３
可溶化画分１ペースト＃２の特徴決定一覧
【表２３】
0004660048.tif 000024
【０１３１】
この実験では、９０分の抽出時間の後に、全ての画分１ペーストサンプルが、完全に可溶化されたことに注意すべきである。
画分１ペーストとバッファーとの比率に関わらず、抽出した凝固可能タンパクのレベルは類似していた（表２３参照）。
血漿のキログラム当たりに抽出されたフィブリノゲンの収量も、ペーストとバッファーとの比率の範囲にわたって変化しなかった（図３）。これは、先の実験の一致した結果（図２）が、ヘパリンペーストの不均一な性質によるものであることを示唆する。さらに、このデータは、より高いペースト：バッファー比を最初の抽出に用いることができ、これはより少ない可溶化画分１ペースト量をもたらすことを示唆している。
【０１３２】
1.2.8  抽出温度の調査
新鮮な画分１ペースト（１８ｇ）を、１５０ｍＬのバッファー（２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）に、１ｇ：８．３３ｇバッファーの比率で、２時間、室温および３７℃で抽出した。抽出の間、サンプルを、３０分、６０分、９０分、および１２０分の時点で得た。可溶化ペーストを遠心し、別のサンプルを得た（１２５分）。
全てのサンプルを全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表２４）。
【０１３３】
表２４
可溶化画分１ペーストの特徴決定一覧
【表２４】
0004660048.tif 000025
【０１３４】
ＲＴおよび３７℃で抽出した全タンパクおよび凝固可能タンパクは経時的に変化しなかった（図４参照）。
しかしながら、収量の算出は、３７℃で抽出した画分１ペーストから抽出されたフィブリノゲンレベルが、室温であらゆる時点で抽出されたものよりも高いことを示した。また、画分１ペーストは、室温で２時間抽出した後では完全には可溶化されなかったが、３７℃で２時間抽出した後には完全に可溶化されていたことにも注意すべきである（図５参照）。
【０１３５】
1.2.9  製造規模の抽出
抽出１
新鮮な画分１ペースト（２０．０ｋｇ）を、３７℃で、９０分間、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、ｐＨ７．３のバッファーに、１ｇペースト：８．３３ｇバッファーの比率で抽出した。
可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaCl沈降を行った。この沈降物を二つに分け、半分の沈降物を１００ｍＭのεＡＣＡを含有するバッファーＤに可溶化し、他の半分を−８０℃で凍結させた。この可溶化したGly／NaCl沈降物の半分を、次いでＳＤで処理し、MacroPrepカラムに添加した。この溶出物を回収し、サンプル化し、−８０℃で凍結させた。他の半分をＳＤで処理し、湿熱処理し、MacroPrepカラムに添加した。溶出物を回収し、サンプル化し、−８０℃で凍結させた。この凍結させたGly／NaClペレットを解凍し、可溶化し（ＦＴＲ）、全タンパクおよび凝固可能タンパク用のサンプルとした。全てのサンプルを全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表２５）。
【０１３６】
表２５
特徴決定一覧
【表２５】
0004660048.tif 000026
【０１３７】
製造規模で抽出された画分１ペーストの特徴決定は、小さい実験規模で以前に抽出されたものと非常に類似した結果を示した。約６２％の凝固可能なタンパクが、この段階で、血漿のキログラム当たり１．７８ｇのフィブリノゲンの収量で抽出された。Gly／NaCl沈降後、凝固可能なタンパクは、予想通り８５％より多く増大した。（解凍および可溶化後の凍結Gly／NaCl沈降物の分析は、全タンパク、凝固可能タンパクまたは血漿のｋｇ当たりのフィブリノゲンの収量に全く損失を示さなかった。）カラムを溶出した物質も、凝固可能タンパクと収量において高かった。この溶出物のプラスミノゲンレベルは、０．６６μｇ／ｍＬで非常に低く、これはこの工程を経てプラスミノゲンレベルの１６０倍の低減に匹敵する。
湿熱処理し、イオン交換カラムに添加した可溶化Gly／NaCl沈降物は、湿熱処理の前後で凝固可能タンパクにおいて高かった。フィブリノゲンの損失は、湿熱処理工程で全く見られなかった。湿熱処理した物質は、イオン交換カラムからの溶出後、凝固可能タンパクにおいて高かったが、僅かに３０％だけのフィブリノゲンしか回収されなかった。プラスミノゲンレベルも、０．４２μｇ／ｍＬで低かった。ＧＡＳＦＰのイオン交換クロマトグラフィーおよび湿熱処理したＧＡＳＦＰの結果は、産物からプラスミノゲンを除去するのに有効に作用していることを示している。
【０１３８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
全てのサンプルが、還元条件下で４５から６６ｋＤａの間の主な３つのバンドにより見られるようなフィブリノゲンに富んでいた。
３７℃での安定性
サンプルの安定性は、先の知見と類似していた（安定性ゲルに関する補足を参照）。可溶化画分１ペーストは約１５時間安定であった。このサンプルは３７℃で３９時間以前に凝固した。Ａｌ（ＯＨ）3吸着後、フィブリノゲン分子は４８時間安定であった、そしてGly／NaCl沈降後は＞７０時間安定であった。イオン交換カラムから溶出後、湿熱処理および非湿熱処理のフィブリノゲンは、少なくとも１１３時間安定であった。
【０１３９】
抽出２
新鮮な画分１ペースト（３０．０ｋｇ）を、３７℃で、９０分間、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、ｐＨ７．３のバッファーに、１ｇペースト：８．３３ｇバッファーの比率で抽出した。
全タンパクおよび凝固可能タンパクを調べ、血漿のキログラム当たりの収量を以下の表２６に算出した。
【０１４０】
表２６
可溶化画分１ペーストの特徴決定一覧
【表２６】
0004660048.tif 000027
【０１４１】
この実験で抽出した画分１ペーストは、上記“濃度調査２”と題した箇所で用いたものと同じバッチのものである。小規模では、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの平均収量は１．１６であった。この実験規模の１０００倍以上の規模では、収量は１．４９ｇ／ｋｇ血漿であることが示された。これはさらに、画分１ペーストの不均一性の結果として、製造規模で期待される収量を象徴しないことを示唆する。
これら二つの製造規模の抽出の結果は、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの予期される収量が１．５−１．８ｇ／ｋｇであることを示す。
【０１４２】
1.2.10  フィブリノゲン精製のための出発物質としての画分１ペーストおよびヘパリンペーストの比較
この報告で説明した実験から得られたデータを、以下の表２７にまとめる。
【０１４３】
表２７
５０ｍＬのバッファーに対して６ｇのペーストの比率で抽出した
新鮮な画分１ペーストおよびヘパリンペーストからの収量の比較
【表２７】
0004660048.tif 000028
【０１４４】
画分１ペーストとヘパリンペーストの比較は、血漿のｋｇ当たりに生成されたフィブリノゲンの収量に顕著な増大を示した。
安定性に関する画分１ペーストとヘパリンペーストの比較は、両方の処理を介してフィブリノゲンの安定性が増すことを示した。最終的なフィブリノゲン濃度は、出発物質に関わりなく同様に安定であった。
【０１４５】
1.3  論評
フィブリノゲンを、小規模で画分１ペーストから最初に抽出した。ATIIIとヘパリンをバッファーに加える効果を評価し、かつ、抽出処理の温度の影響を評価するために実験した。結果は、抽出バッファーにおけるヘパリンの存在が、処理のこの段階およびその後の段階でフィブリノゲン分子の安定性を増加することを示した。同じ安定性は、可溶化Gly／NaCl段階で、少なくとも１２５ｍＭのεＡＣＡを添加することによっても得られた。
３７℃で抽出を行うことにより、フィブリノゲンの抽出率、および血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を増加することが示された。かくして、画分１ペーストについて推奨される抽出条件は、２０ｍＭ クエン酸三ナトリウム(Tri-sodium citrate)、０．８Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ εＡＣＡ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、ｐＨ７．３、３７℃で９０分間の抽出である。
【０１４６】
製造規模では、画分１ペーストの抽出は、研究規模の７５０倍より大きな規模で行った。これらの大規模な実験では、画分１ペーストは、最適化バッファー（ヘパリンを含有し、３７℃で実施）で抽出され、結果的な収量は１．７８ｇ／ｋｇ血漿および１．４９ｇ／ｋｇ血漿であった。同じバッチの画分１ペーストを、同一の抽出条件下で実験規模および製造規模の両方で抽出したところ、得られた収量はそれぞれ、１．１５ｇ／ｋｇおよび１．４９ｇ／ｋｇであった。可溶化画分１ペースト段階では血漿のキログラム当たり１．５ｇのフィブリノゲンという予想収量であったが、画分１ペーストからの収量は、ヘパリンペーストから抽出されたもの（０．４２ｇ／ｋｇ血漿）よりも顕著に高かった。
種々の画分１ペースト：抽出バッファー比は、４．５ｇ：５０ｍＬバッファー（１：１１．１の比）が最も高い収量／ｋｇ血漿を得るのに最適であるということを、最初の小規模の実験で示唆した。しかしながら、この規模の三倍で、改善された抽出バッファーを用いて行ったその後の実験では、最も高いペースト：バッファー比（１：５．５）であっても、全てのフィブリノゲンが抽出された。この結果は、ヘパリンペースト（１：８．３３）と比較して、より多くの量の画分１ペーストが、抽出バッファーに可溶化されうることを示唆しており、これはより小さい全抽出量とする。
【０１４７】
可溶化画分１ペーストのタンパク特徴決定は、可溶化ヘパリンペーストとの類似性と差異を示した。各出発物質から得られた凝固可能なタンパクの量は、約６５％で類似している。プラスミノゲンおよび第XIII因子のレベルは、ヘパリンペーストから抽出されたものよりも可溶化画分１ペーストでより高かったが、フィブロネクチンのレベルは顕著に低かった。可溶化画分１ペーストがヘパリンペースト法を用いてさらに処理される場合には、この物質は、後の精製工程で、ヘパリンペースト物質と同様に挙動した。アルヒドロゲル吸着は、第II因子を検出不能なレベルにまで低減し、これは３７℃でのフィブリノゲンの安定性の増大に関連する。Gly／NaCl沈降は、８０％より高い凝固可能タンパクまでにフィブリノゲンの精製をもたらし、かつフィブロネクチンの減少を無視できるレベルとした。イオン交換クロマトグラフィーは、溶出物中においてプラスミノゲンを無視できるレベルにまで低減し、かつ、フィブリノゲンの安定性を、ヘパリンペースト溶出物の安定性と同等な約１２０時間までに増大させることが示された。
画分１ペーストは別の産生処理の副生成物であるので、フィブリノゲン製造処理を開始する前の段階で産物を保持することが有利である。ヘパリンペースト、第VIII因子濃縮物の副生成物は、かつて抽出された凝固可能なタンパクの結果的なレベルに影響を与えることなく、−８０℃で１３ヶ月までの間凍結貯蔵することができる。
【０１４８】
出発物質としての凍結画分１ペーストの安定性は有望である。イオン交換カラムに関して処理した後では、産物は優れた安定性を示した（＞２０８時間）。後の実験では（セクション４．５）、凍結画分１ペーストを、ATIIIの存在下および不在下で抽出した。いずれのバッファーにおいても、凍結画分１ペーストの抽出後には操作上の問題はなく、ＳＦＰとＡＳＦＰの安定性は、先のまたは後の実験について観察されたものよりもはるかに高かった。
また、可溶化の前にGly／NaCl沈降段階でこの処理を用いる可能性を評価するために実験を行った。−８０℃で凍結され、その後解凍され、可溶化されたGly／NaClペレットの結果は、この実施時点が、凝固可能タンパクに関する品質、安定性、または収量を落とさないことを示した。
ここに示した結果は、画分Ｉペーストがフィブリノゲンの精製に適した出発物質であり、最終産物の収量をヘパリンペーストと比較して３倍に増加する可能性を有することを示す。
【０１４９】
実施例２：イオン交換クロマトグラフィーを用いたプラスミノゲンからのフィブリノゲンの分離
2.1  物質と方法
2.1.1  サンプル調製
Gly／NaCl沈降物を、Winklemanら,1989に記載された方法の修正を用いて寒冷沈降物から得た。最初に、凍結した可溶化Gly／NaCl沈降物（−８０℃）をウォーターバスで３０℃で解凍した。４０ｇの可溶化Gly／NaCl沈降物に、２．１９ｇのストック界面活性剤溶液と１３２ｍｇのＴＮＢＰとを加えた。このサンプルを、伝導度が１０．５ｍＳ／ｃｍ以下となるまで、サンプル希釈バッファー（２５ｍＭ Tris、ｐＨ８．０）を用いて希釈した。最後に、このサンプルを、０．８μｍの膜フィルターを通して濾過した。各サンプルを、それぞれを流し始める直前に調製した。サンプルを希釈しないと、多くの場合、大量の未結合ピークをもたらし、すなわち一部のフィブリノゲンが未結合物中に溶出されてしまう。
【０１５０】
2.1.2  MacroPrep HQ精製
以下のクロマトグラフィー条件を用いて、可溶化gly／NaClペーストを精製した：
ベッド高さ−約２０ｃｍ
カラム量−約１００ｍｌ
流速−１０ｍｌ／分（〜１１３ｃｍ／時間）
検出−ＵＶ＠２８０ｎｍ
クロマトグラフィー方法
平衡化：≧１．５ＣＶのＭＱバッファーおよび伝導度（カラム後）が９０−１１０％の場合調製したバッファー
充填サンプル
洗浄：６ＣＶのＭＱバッファー
溶出：ＭＥバッファー−バッファーＤ＆２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０
再生：２ＣＶの１Ｍ ＮａＣｌ
【０１５１】
2.2  結果
2.2.1  洗浄バッファー（ＭＱ-２５ｍＭ トリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を用いた精製
洗浄（ＭＱ）バッファーとして、２５ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０を用いて二重に流した。サンプルをMacroPrepカラムに充填し、回収した画分を分析した。結果は表２８に記載されている。
【０１５２】
表２８
ＭＱ-２５ｍＭ トリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０
【表２８】
0004660048.tif 000029
【０１５３】
フィブリノゲンの平均回収率は８２％であり、プラスミノゲンは１０％であった。これらの数値は、この方法に対するさらなる修正の成功を評価するベンチマークとして用いた。
【０１５４】
2.2.2  サンプルを充填するためのＥＡＣＡの添加
大規模製造では、全てのサンプルを、一回のイオン交換で処理できる訳ではなく、かくして、一部の希釈されたサンプルが室温で放置され、その他のサンプルが精製される。この間にサンプルが破壊されることが見出された。
１００ｍＭのεアミノカプロン酸、ＥＡＣＡ（未希釈の可溶化Gly／NaClペーストの量に対して）を、サンプルに添加することにより、０−１５時間から１５−２３時間へとサンプルの安定性が増加する。クロマトグラフィープロフィールに顕著な変化はなく、フィブリノゲンの回収率は９３％であった。
【０１５５】
2.2.3  洗浄（ＭＱ）バッファーへのＥＡＣＡおよびリシンの添加
以下の洗浄バッファーを精製プロトコルに用いた：(i)５０ｍＭ トリス、２０ｍＭ リシン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０および（ii）５０ｍＭ トリス、２０ｍＭ ＥＡＣＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０。サンプルを、Macroprepカラムを用いて精製し、回収した画分を比較した。結果は、以下の表２９に示されている。
【０１５６】
表２９
ＭＱバッファーへのＥＡＣＡおよびＬｙｓの添加
【表２９】
0004660048.tif 000030
【０１５７】
２０ｍＭ ＥＡＣＡと２５ｍＭ トリスのＭＱバッファーへの添加により、回収された画分の安定性は７１−９１時間に増加し、凝固可能タンパクの回収率は７１．３％であった。より長い安定性は、おそらくは、プラスミノゲンの除去によるものであろう。クロマトグラムの未結合領域は、低いＵＶ吸収を示した。
平均の凝固可能タンパク回収率は、２０ｍＭのリシンおよび２５ｍＭのトリスをＭＱバッファーに加えた場合に、５１．３％に減少した。クロマトグラフィープロフィールでは、洗浄工程中の吸収は、ＭＱを用いて得られるものよりも大きかった。かくして、ＭＱへのリシンとトリスの添加は、フィブリノゲンを未結合ピークに溶出させると仮定できる。回収された画分の安定性は、４８−７１時間の間であった。
これらの結果は、ＥＡＣＡの添加およびＭＱにおけるトリス濃度の増加が、凝固可能タンパクの回収率とカラム溶出物の安定性を増加したことを示す。
【０１５８】
2.2.4  ＭＱバッファー組成の変更
この実験の目的は、ＭＱバッファーへのリシンおよびＥＡＣＡの添加の有効性を調べ、かつ、サンプルへのＥＡＣＡの添加の効果を評価することである。表３０は、画分１の結果をまとめたものである。
【０１５９】
表３０
洗浄バッファー組成の変更の結果
【表３０】
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【０１６０】
これらの結果は、ＥＡＣＡをサンプルに添加せず、かつ、ＭＱ（２５ｍＭ トリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を洗浄バッファーとして用いた場合に、HPPC04およびHPPC06に関する画分１の平均タンパク回収率がそれぞれ７７％および７８％であったことを示している。安定性は、HPPC04について約２４時間であり、HPPC06について＜４７時間であった。
【０１６１】
２５ｍＭ トリスをＭＱバッファーに添加した場合、タンパク回収率はＭＱを用いて得られたものと類似していたが、回収した画分の安定性は６６時間まで増加した。
ＭＱバッファー（５０ｍＭ トリス、２０ｍＭ リシン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に対するリシンの添加では、HPPC06に関する画分１の平均タンパク回収率は４８％であり、安定性は＜４７時間であった。プラスミノゲン回収率は、１０．２％から０．５％未満に劇的に低下した。
【０１６２】
Macroprepカラムに充填する前にサンプルにＥＡＣＡを添加し、かつ、洗浄バッファーがリシンを含むＭＱである場合、タンパクおよびプラスミノゲンの回収率は、ＥＡＣＡをサンプルに添加しない場合に得られたものとほぼ同じであった。しかしながら、溶出物の安定性は、HPPC06について、＜４７時間から６８−９３時間に増加し、HPPC04については４１時間に増加した。
ＥＡＣＡをサンプルに加え、洗浄バッファーが５０ｍＭ トリス、２０ｍＭ ＥＡＣＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０である場合には、タンパク回収率は、ＭＱを用いた場合と類似していた。すなわち、HPPC04では６８％であり、HPPC06では７９％であった。顕著な差異は、回収された画分の安定性であった。安定性は、ＭＱバッファーを用いた場合の約２４時間と比較して１１３時間多かった。
これらの結果は、５０ｍＭ トリス、２０ｍＭ ＥＡＣＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０を含む洗浄バッファーが、良好な結果を与えたことを示す。特に、これらの回収された画分は、高いタンパク回収率、低いプラスミノゲン回収率、および長い安定性を有していた。
【０１６３】
2.2.5  個々におよびプールしたMacroPrep画分の安定性
予め、４つの画分をMacroPrep溶出物から回収した。回収率を増加させるために画分をプールできるか否かを調べるべく、以下の実験を設計した。回収した画分を、個別に、およびまるで一つの画分が回収されたかのような比率でプールして、安定性について調べた。
精製方法は、洗浄バッファーとして、５０ｍＭ Tris、２０ｍＭ ＥＡＣＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌの使用を含み、そして、ＥＡＣＡをMacroPrepカラムに充填する前にサンプルに加えた。結果を表３１に示す。
一般に、表３１は、最初の画分が後の画分よりも安定であることを示している。これは、恐らくは、後者の画分が、画分１よりも顕著に低く濃縮されているからであり、画分の組成によるものではない。これは、さらに、カラムから溶出されるのと同じ比率で画分をプーリングすることによって調べられた。
４つの画分がプールされた場合、安定性は画分１と同じであった。全部で４つの画分をプーリングすることにより、タンパクの回収率は、約２５％増加した。
【０１６４】
表３１−画分プーリングの結果
【表３１】
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サンプルＦ17 11ａ＆Ｆ17 11ｂは可溶化Gly／NaCl沈降物バッチNo.HPPC04を使用し、Ｆ19 11ａ＆Ｆ19 11ｂは可溶化Gly／NaCl沈降物バッチNo.HPPC06を使用した。
【０１６５】
2.2.6  溶出バッファーの変更
上記2.2.5に記載された結果は、MacroPrepカラムからの画分溶出をプールできることを示している。結合画分のプロフィールは、テーリングを伴う大きなピークを示し、次いで、カラムを１Ｍ ＮａＣｌで洗浄した場合に第二のピークを示した。第二のピークは、１Ｍ ＮａＣｌの高いイオン強度によるテーリングの圧縮である。単一のピークとしてフィブリノゲンを溶出するために、溶出バッファーのイオン強度を増加することが決められた。それゆえ、ＭＥバッファーにおけるＮａＣｌの濃度を、３００ｍＭから５００ｍＭ、７５０ｍＭおよび１Ｍまで増加した。結果を表３２に示す。
【０１６６】
表３２
ＭＥバッファーにおけるＮａＣｌ濃度の増加
【表３２】
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【０１６７】
溶出バッファーＭＥへの余分の２００ｍＭ ＮａＣｌの添加は、ほとんどテーリングを伴わずに、単一のピークにフィブリノゲンを溶出するのに十分であった。回収された画分の特徴決定の結果には顕著な差異がなかった。７５０ｍＭおよび１Ｍ ＮａＣｌを含むＭＥバッファーも作用するが、精製処理に以後の工程を必要とするため５００ｍＭを含むＭＥを用いるのが好ましい。
【０１６８】
2.2.7  カラム溶出物の安定性および回収率に対するサンプル中のＥＡＣＡの効果
この実験の目的は、１００または２００ｍＭのＥＡＣＡを含むサンプル（可溶化Gly／NaCl沈降物）からMacroPrepカラムを溶出した結合画分を比較することである。
結果は、タンパク回収率（９３．７％、９５．４％）、凝固可能タンパク（９６．０％、９９．２％）、プラスミノゲン（両方とも＜０．２μｇ／ｍｌ）、および安定性の結果（両方とも＞１日）が、両方のサンプルから回収された画分について同等であることを示した。言い換えると、同様の結果が、１００または２００ｍＭεＡＣＡを含む可溶化Gly／NaClサンプルについて得られた。
上記イオン交換クロマトグラフィー法を含む好ましいフィブリノゲン精製処理を図６に示した。
【０１６９】
当業者であれば、広く記載された本発明の精神または範囲から離れることなく、特定の実施態様に示された発明に対して、多くの変更および／または修正をなすことができることを理解するであろう。それゆえ、本発明の実施態様は、例示的であって制限的でないと考えるべきである。
【０１７０】
「参考文献」
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ペースト-バッファー比研究（I）で得られた凝固可能なフィブリノゲンの収量
【図２】  ペースト-バッファー比研究（１）で得られた全フィブリノゲンの収量
【図３】  ペースト-バッファー比研究（２）で得られた全フィブリノゲンの収量
【図４】  画分Ｉペーストの抽出中に経時的に得られた凝固可能なフィブリノゲンの収量
【図５】  画分Ｉペーストからのフィブリノゲンの抽出に対する温度の効果
【図６】  本発明の方法のイオン交換クロマトグラフィーを含む好ましいフィブリノゲン精製方法を図示するフローチャート
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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