(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮｉｔＡの選択性を亢進する方法であって、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＮｉｔＡの第１６２残基をシステインで置換することを含む前記方法。
【請求項２】
亢進された選択性を有する改変ＮｉｔＡを産生する方法であって、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＮｉｔＡの第１６２残基がシステインで置換されているＮｉｔＡをコードする遺伝子で宿主微生物を形質転換すること、該形質転換宿主微生物を培養すること、および改変されたＮｉｔＡ産物を混合物あるいは精製形態で単離することから成る前記方法。
【請求項３】
ＮｉｔＡを用いてニトリル基を有する化合物を加水分解する方法であって、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＮｉｔＡの第１６２アミノ酸残基がシステインで置換されている、亢進された選択性を有する改変ＮｉｔＡを用いて加水分解を行うことを特徴とする前記方法。
【請求項４】
選択性を有する改変ＮｉｔＡであって、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＮｉｔＡの第１６２位にシステインアミノ酸残基を含むことを特徴とする前記改変ＮｉｔＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は選択性を高めた新しいニトリラーゼ、それらを得る方法および前記ニトリラーゼの用途に関する。
【０００２】
ニトリラーゼ
ニトリル基を対応するカルボン酸とアンモニウムイオンにする加水分解を触媒するのがニトリラーゼである（Ｆａｂｅｒ，Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、１９９２、ＩＳＢＮ３−５４０−５５７６２−８）。しかしながら、最終結果がニトリル基の加水分解で構成される、ニトリル基の対応するカルボン酸へのこの生物学的変換は２段階で実施することも可能であり、最初のステップはニトリルヒドラターゼでニトリルを対応するアミドに生物学的に変換することで構成され、第２のステップは得られたアミドをアミダーゼで対応するカルボン酸に加水分解することで構成される。
【０００３】
ニトリラーゼは最初に植物中で発見され（Ｔｈｉｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍａｈａｄｅｖａｎ、１９６４、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１０５：１３３−１４１）、その後、多くの代表的な土壌微生物相で単離された（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓｈｉｍｉｚｕ、１９９４、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２０：２１７−２２４）：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｃｏｃｕｓ、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａおよびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ。さらに最近になって、好熱性細菌中でニトリラーゼが特性分析された（Ｃｒａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４３：２３１３−２３２０）。ニトリラーゼは多様な基質特異性を有するが、それらの特異性によって３つのグループに分類することができる。すなわち脂肪族ニトリルに特異的なニトリラーゼ、芳香族ニトリルに特異的なもの、またはアリルアセトニトリルに特異的なものである（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２４７−２５１；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓｈｉｍｉｚｕ、１９９４、前出；Ｌｅｖｙ−Ｓｃｈｉｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｇｅｎｅ  １６１：１５−２０；Ｌａｙｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ  Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ５：４６７−４７４）。
【０００４】
ニトリラーゼは、多くの合成過程がニトリル基の加水分解を含むので生体触媒作用で価値がある（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．５７：３０２８−３０３２；Ｆａｂｅｒ，Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  ｅｄｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、１９９５；Ｌｅｖｙ−Ｓｃｉｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｇｅｎｅ  １６１：１５−２０；Ｃｏｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ  ２：２０７−２１６）：アジポニトリルのシアノ吉草酸塩またはアジピン酸塩への変換、ニコチン酸、アミノ安息香酸、トラネキサム酸の合成、マンデロニトリルのエナンチオ選択的加水分解。特に、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ８７５０のニトリラーゼ（本出願ではＮｉｔＢと呼ぶ）およびＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉのそれ（本出願ではＮｉｔＡと呼ぶ）はメチオニンのヒドロキシ類似体を得るために使用することができる（ＦＲ９４１１３０１、ＷＯ９６０９４０３、ＦＲ９６１３０７７）。
【０００５】
ニトリラーゼは、約３０％から始まって様々な同一度でアラインする一次構造を有する。いくつかのニトリラーゼの配列をアラインすると、ＮｉｔＢニトリラーゼの配列の位置１６３のシステイン残基を含むいくつかの残基の保存が明らかになる。この残基はニトリラーゼの反応メカニズムに含まれる（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２４７−２５１）。
【０００６】
本発明に関しては、基準配列はＮｉｔＢ配列であって、特定のアミノ酸位置の規定および表示はＮｉｔＢ一次配列に関して与えられる。添付の図１は当該技術の現状で述べられている１４種のニトリラーゼの配列であって、ＮｉｔＢを基準にそれに関して並べられ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのｐ＿Ａｔｈａｌｉａ１から４まで（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受理番号Ｐ３２９６１、Ｐ３２９６２、Ｐ４６０１０、Ｐ４６０１１）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍのｐ＿Ｔｏｂａｃｃｏ１と２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｄ６３３３１、Ｄ８３０７８）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ  Ｊ１のｂ＿ＲｈｏｄｏｃＪ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｄ１１４２５）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ  ＰＡ３４のｂ＿ＲｒｈｏｄｏｃＰＡ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｅ０９０２６）、Ｇｏｒｄｏｎａ  ｔｅｒｒａｅのｂ＿Ｇｔｅｒｒａｅ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｅ１２６１６）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ  Ｋ２２のｂ＿ＲｒｈｏｄｏｃＫ２２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｄ１２５８３）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｚａｅｎａｅのｂ＿Ｋｏｚａｅｎａｅ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受理番号Ｐ１００４５０）、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ＮＩ１のｂ＿ＣｔｅｓｔｏｓＮＩ１またはＮｉｔＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｌ３２５８９）、およびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＪＭ３のｂ＿ＡｆａｅｃａｌｉｓまたはＮｉｔＢ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受理番号Ｐ２０９６０）の配列を含む。ＮｉｔＢ配列のアミノ酸の番号がこの図に付され（下部の番号）、その番号付け（上部の番号）と一致する配列である。本出願の慣行によって、他のニトリラーゼの残基はこのシステイン残基および基準配列とするＮｉｔＢニトリラーゼの配列に関して番号付けされる。そのようなアラインメント、またはいずれかのアラインメントニトリラーゼ配列に基づいて、ＮｉｔＢアミノ酸の位置と性質により与えられる規定を使用して別のニトリラーゼ配列中の対応するアミノ酸の位置を識別することは当業者にとって容易である。
【０００７】
選択性の問題
ニトリラーゼの選択性は、ニトリラーゼの触媒するニトリルの加水分解によって放出されるカルボキシル機能を持たない化合物のパーセンテージとして規定される。それは相対的に少ないと言われてきたが、一定数のニトリラーゼと基質については観察される。このように、２−メトキシマンデロニトリルを２−メトキシマンデル酸にする加水分解はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＤＳＭ７１５５のニトリラーゼによって触媒され、２−メトキシマンデルアミドの同時生成につながる（Ｌａｙｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、前出）。同様に、本出願の実施例で説明するＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ＮＩ１のＮｉｔＡニトリラーゼによって触媒される２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリル（ＨＭＴＢＮ）の加水分解（Ｌｅｖｙ−Ｓｃｈｉｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５、前出）は２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミド（ＨＭＴＢＭ）の同時生成を伴なう。そのような酵素／−基質対を使用する生体触媒処理のケースでは、ニトリラーゼのその基質についての選択性の欠如はアミドの同時生成につながり、それは処理の収量が損失することを表わす。この収量損失はかなりの経済的衝撃を有し得る。加えて、この選択性欠如は反応産物を不純物汚染するアミドの存在につながる。その後にカルボン酸の精製が必要とされ、ここでもやはり処理に大きな経済的衝撃を与える。したがってニトリラーゼの所定の基質に関する選択性欠如はこのニトリラーゼとこの基質を使用する生体触媒処理の開発にとって障害となる。
【０００８】
酵素の選択性の低減は、この低減が基質に対する酵素の触媒活性の増大を伴なう場合に必要とされることもある。特に、最大の特異的活性酵素で害毒となる分子を急速に分解することが必要となる汚染除去の方法におけるケースである。このケースでは、酵素によって触媒される反応に由来する生成物の性質は基質の分解速度に対してあまり重要でない。
【０００９】
したがって、この選択性の向上の見地と低減の見地の両方で、ニトリラーゼの選択性を調整可能であることが特に大切である。
【００１０】
酵素活性の亢進
方向付けられた酵素の増進は、増進された特性を有する変異種を繰り返し選択することによって酵素を特定の機能に適合させることで構成される（Ａｒｎｏｌｄ  ａｎｄ  Ｖｏｌｋｏｖ、１９９９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５４−５９；Ｋｕｃｈｎｅｒ  ａｎｄ  Ａｒｎｏｌｄ、１９９７、Ｔｉｂｔｅｃｈ  １５：５２３−５３０）。これらの変異種は研究対象の酵素をコードする遺伝子に対する突然変異誘発（Ｓｋａｎｄａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：８８８９−８９８；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１）：化学的突然変異誘発（Ｓｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ、１９６９、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９：１−２９）、エラープローンＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１−１５）、組み合わせＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、前出；Ｓｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：６８１−６８３）、指向性突然変異誘発（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９９１、Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｍ．Ｊ．ＭｃＰＨＥＲＳＯＮ、ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ）、などによる突然変異誘発といったいくつかの技術によって作製することができる。
【００１１】
ＨＭＴＢＮ（２−アミノ−４−メチルチオブチロニトリル）に対するＮｉｔＢニトリラーゼの活性を増進するちう背景で、ＮｉｔＢの位置１６２の活性部位でシステイン残基をアスパラガニン残基で置き換える一点置換が研究対象のニトリラーゼの選択性の調整につながることに考案者らは気付いた。他方で、ＮｉｔＡニトリラーゼの配列の位置１６２にシステイン残基を導入することがまた別のそれの基質、ＡＭＴＢＮに対する選択性を増進することにつながり、したがってニトリラーゼの活性部位の領域の位置１６２は前記ニトリラーゼの選択性に含まれるキーとなる位置であり、本来のアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることで構成されるこの位置でのアミノ酸残基の変更がニトリラーゼの選択性の調整につながることに気付いた。
【００１２】
したがって本発明は、調整された選択性を備え、位置１６２に本来のアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を含むことを特徴とする改変ニトリラーゼに関する。
【００１３】
本発明によると、「改変ニトリラーゼ」という用語は本来のニトリラーゼに対して改変がなされたニトリラーゼを意味することを意図しており、その改変は位置１６２で本来のアミノ酸残基を別のアミノ酸で置き換えることで構成される。
【００１４】
本発明によると、「選択性の調整」という表現は本来のニトリラーゼの選択性とは異なる選択性を意味することを意図しており、特定すると本来のニトリラーゼに対して少なくとも０．５％異なり、少なくとも１％異なるのが好都合である。
【００１５】
都合がよければ残基１６２はシステイン、アラニン、バリン、アスパラギン、グルタミン、イソロイシンおよびセリンの中から選択されるアミノ酸で置き換えられるものであり、本来のニトリラーゼの残基１６２がシステイン、アラニン、バリン、アスパラギン、グルタミン、イソロイシンまたはセリンそれぞれと異なることは分かっている。
【００１６】
残基１６２はシステイン残基で置き換えられることが好ましい。
【００１７】
本発明の特定の実施形態によると、調整は選択性を増進させることから成る。
【００１８】
本発明の第２の特定の実施形態によると、調整は選択性を低減させることから成る。
【００１９】
本来の未調整ニトリラーゼは細菌、酵母、菌、植物または動物の起源の中から選択される。
【００２０】
バクテリアを起源とするニトリラーゼの中で、特に以下のニトリラーゼを記載することができる。すなわち、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ  Ｊ１のｂ＿ＲｈｏｄｏｃＪ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｄ１１４２５）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ  ＰＡ３４のｂ＿ＲｒｈｏｄｏｃＰＡ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｅ０９０２６）、Ｇｏｒｄｏｎａ  ｔｅｒｒａｅのｂ＿Ｇｔｅｒｒａｅ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｅ１２６１６）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ  Ｋ２２のｂ＿ＲｒｈｏｄｏｃＫ２２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｄ１２５８３）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｚａｅｎａｅのｂ＿Ｋｏｚａｅｎａｅ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受理番号Ｐ１００４５０）、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ＮＩ１のｂ＿ＣｔｅｓｔｏｓＮＩ１またはＮｉｔＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｌ３２５８９）、およびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＪＭ３のｂ＿ＡｆａｅｃａｌｉｓまたはＮｉｔＢ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受理番号Ｐ２０９６０）である。植物を起源とするニトリラーゼの中で、特に記載できるものは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのｐ＿Ａｔｈａｌｉａ１から４まで（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受理番号Ｐ３２９６１、Ｐ３２９６２、Ｐ４６０１０、Ｐ４６０１１）、およびＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍのｐ＿Ｔｏｂａｃｃｏ１および２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｄ６３３３１、Ｄ８３０７８）である。
【００２１】
その他を起源とするニトリラーゼの中で、特に記載できるものは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのもの（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受理番号Ｐ４０４４７およびＰ４０４４）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓのもの（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号ＡＦ０６９９８６）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのもの（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号ＡＦ０６９９８９）、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのもの（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号ＡＦ０６９９８７）およびＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓのもの（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号ＡＦ０６９９８８）である。
【００２２】
本発明のまた別の実施形態によると、本来のニトリラーゼはＤＮＡライブラリー、特にｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのスクリーニングによって得られるニトリラーゼであり、様々な供給源、特にニトリラーゼの無作為の突然変異と組換えを通じて、指向性の分子進化または土壌ないし他の生態系に由来するＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって得られるＤＮＡライブラリーから得られる。
【００２３】
本発明はまた、上記の改変ニトリラーゼをコードする核酸配列、特にＤＮＡ配列にも関する。
【００２４】
本発明の第１の実施形態によると、本発明による核酸配列は本来のニトリラーゼの核酸配列で構成され、それに関して位置１６２で本来の残基のコドンが本来のものと異なる残基をコードするコドン、特にアラニン、バリン、アスパラギン、グルタミン、イソロイシンまたはセリン残基をコードするコドンで置き換えられている。
【００２５】
本来の配列のコドンは前に規定した酵素の増進のために当業者が知っているあらゆる手段、特に指向性の突然変異誘発によって変更することができる。
【００２６】
本発明はまた、キメラ遺伝子ないし発現カセットにも関し、転写の方向で、ホスト有機体の中で機能するプロモーター調節配列、本発明による改変ニトリラーゼをコードする核酸配列および同じホスト有機体の中で機能するターミネーター調節配列を含む。
【００２７】
宿主微生物はすべての真核ないし原核生物を含み、それは分化していても未分化であってもよく、特定すると細菌、酵母、菌、植物細胞および植物体である。
【００２８】
それらは特にバクテリア、例えばＥ．ｃｏｌｉ、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓまたはＰｉｃｈｉａ属の酵母、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属の菌、バキュロウィルス、または植物細胞および植物体である。
【００２９】
本発明によると、「植物細胞」という用語は植物体に由来するあらゆる細胞を意味することを意図されており、カルスのような未分化組織、胚、植物体の一部、植物体または種子のような分化した組織から構成され得る。
【００３０】
本発明によると、「植物体」という用語は光合成を行ない得るすべての多細胞微生物を意味するように意図されており、特に単子葉ないし双子葉、さらに特定するとトウモロコシ、コムギ、アブラナ、ダイズ、イネ、サトウキビ、ビートの根、タバコ、ワタなどのような動物またはヒトの食料用に意図されるかまたはされていない作物植物である。
【００３１】
プロモーターおよびターミネーター調節要素は当業者にはよく知られており、宿主微生物によって決まる。
【００３２】
バクテリア内でのプロモーターである調節配列として、バクテリア内で自然に発現される遺伝子のあらゆるプロモーター調節配列、例えばＥ．ｃｏｌｉのトリプトファンオペロンのプロモーター（Ｄｅｎｅｆｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７、Ｇｅｎｅ  ５６：６１−７０）が使用可能である。
【００３３】
酵母内でのプロモーターである調節配列として、酵母内で自然に発現される遺伝子のあらゆるプロモーター調節配列、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｍｆα１遺伝子またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ遺伝子（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１３５−１３９）のプロモーターが使用可能である。
【００３４】
菌内でのプロモーターである調節配列として、菌内で自然に発現される遺伝子のあらゆるプロモーター調節配列、例えばＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ酸性ホスファターゼ遺伝子（Ｇｒａｅｓｓｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：７５３−７５６）のプロモーター配列またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子（Ｇｗｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１７：３３８−３４０）のプロモーター配列が使用可能である。
【００３５】
植物細胞および植物体内でのプロモーターである調節配列として、植物内で自然に発現される遺伝子のあらゆるプロモーター調節配列、特にバクテリア、ウィルスまたは植物を起源とするプロモーターが使用可能であり、例えばリブロースビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）小型サブユニット遺伝子のプロモーター、ヒストンプロモーター（ＥＰ０５０７６９８）、イネのアクチンプロモーター、または例えばカリフラワーモザイクウィルス（ＣＡＭＶ１９Ｓないし３５Ｓ）のプロモーターやタバコＰＲ−Ｉａのような病原によって誘導可能なプロモーターといった植物ウィルス遺伝子のプロモーターである。
【００３６】
細菌内でのターミネーターである調節配列として、細菌内で自然に発現されるあらゆるターミネーター調節配列、例えばＥ．ｃｏｌｉリボソームのＲＮＡオペロンのターミネーター調節配列（Ｄｅｎｅｆｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７、Ｇｅｎｅ  ５６：６１−７０）が使用可能である。
【００３７】
酵母内でのターミネーターである調節配列として、酵母内で自然に発現されるあらゆるターミネーター調節配列、例えばＳ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅのホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）のターミネーターまたはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓのラクターゼのターミネーター（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１３５−１３９）が使用可能である。
【００３８】
菌内でのターミネーターである調節配列として、菌内で自然に発現されるあらゆるターミネーター調節配列、例えばＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのピルビン酸キナーゼ遺伝子のターミネーター配列（Ｓｃｉｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｇｅｎｅ  １３０：２７１−２７５）が使用可能である。
【００３９】
植物細胞および植物体内でのターミネーターである調節配列として、植物内で自然に発現される遺伝子のあらゆるターミネーター調節配列、例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ｎｏｓターミネーターを例としたバクテリア起源、ＣａＭＶ  ３５Ｓターミネーターを例としたウィルス起源、ヒストンターミネーター（ＥＰ０６３３３１７）を例とした植物起源の遺伝子のターミネーターが使用可能である。
【００４０】
本発明はまた、上記で規定したようなキメラ遺伝子を含む形質転換したホスト有機体にも関し、特にそのゲノムの中に本発明によるキメラ遺伝子が安定に一体化された上記で規定した微生物。
【００４１】
本発明はまた、増進された選択性をもつ上記に規定の改変ニトリラーゼを生成する方法にも関し、前記方法は本発明による形質転換宿主微生物を培養し、適切なところで改変ニトリラーゼを混合物ないし精製された形で分離することで構成される。
【００４２】
本発明はまた、化合物を合成ないし分解するのに使用する方法の中の生体触媒反応に本発明による改変ニトリラーゼを使用することにも関する。
【００４３】
最後に、本発明はニトリラーゼの選択性を調整する方法に関し、前記方法は本来のニトリラーゼの残基１６２を本来のアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基で置き換えることを含む。都合がよければ、残基１６２は、本来の未改変ニトリラーゼをコードする核酸配列内に位置１６２の残基をコードする、本来のニトリラーゼの残基をコードするコドンとは異なるコドンを導入することによって置き換えられる。
【００４４】
前記調整方法を使用して得られるニトリラーゼは上記で規定したようなニトリラーゼであることが好ましい。
【００４５】
以下の実施例は、本発明の範囲を限定しようとするものではないが本発明を具体的に説明することを可能にする。
【００４６】
材料と方法
２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルに対するニトリラーゼの活性は次のようにして測定する。
【００４７】
６６０ｎｍでの吸光度（ＯＤ６６０）が判っている培養試料を採取して１００ｍＭリン酸バッファ、ｐＨ７．０で洗浄する。ＯＤ６６０から試料の乾燥重量を見積もり（１ＯＤ６６０ユニットは乾燥細胞０．３５ｍｇ／ｍｌの乾燥重量に相当する）、約１ｍｇのＤＣを１ｍｌの１００ｍＭリン酸バッファ、ｐＨ７．０にとって密閉した２ｍｌのチューブで３５℃にて１０分間インキュベートする。分析の開始時に反応混合液中で１００ｍＭの濃度となるよう、動力学は７８％でＨＭＴＢＮ溶液１７μｌを加えることによって開始する。撹拌しながら３５℃でインキュベートして反応させる。１５分毎に１００μｌの懸濁液試料を引き抜き、９００μｌの１００ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４、ｐＨ２．５を混合して反応を停止させる。遠心分離した後、以下に述べるようにしてＨＰＬＣによって上清を分析する。
【００４８】
溶離液は５０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４に希釈したＨＰＬＣ等級のアセトニトリル（０．９リットルの５０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４と０．１リットルのアセトニトリルを混合）で構成される。濾過されて脱ガスされたこの溶離液が流速１ｍｌ／分および１４０バールの圧力でカラムに浸透する。使用するカラムは５μｍ  Ｃ１８  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌカラム（ＩＮＴＥＲＣＨＩＭ，Ｒｅｆ．Ｎ５ＣＣ１８−２５Ｆ）で長さ２５０ｍｍ、直径４．６ｍｍである。注入する容量は５μｌであり、検出は波長２１５ｎｍにおける吸収を読み取ることによって実施される。これらの条件下で、ＨＭＴＢＭ、ＨＭＴＢＳ（２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸）およびＨＭＴＢＮ（２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタンアミド）のピークは９分、１１分および１５．８分というそれぞれの保持時間を有する。ＨＭＴＢＮ、ＨＭＴＢＭおよびＨＭＴＢＳの量はピークの面積測量および既知の組成の較正用混合液のピーク面積との比較から演繹される。
【００４９】
２−アミノ−４−チオブチロニトリルに対するニトリラーゼの活性は次のようにして測定する。
【００５０】
細胞ペレット（０．４から２０ｍｇの間のＤＣ）を２００ｍＭホウ酸バッファ、ｐＨ９．２に懸濁し、密閉２ｍｌチューブで３０℃にて１０分間インキュベートする。分析の開始時で反応混合液中の終濃度が５０ｍＭとなるようにＡＭＴＢＮの溶液を添加することによって動力学が開始される。撹拌しながら３０℃でインキュベートして反応させる。１５分毎に５０μｌの懸濁液試料を引き抜き、９５０μｌのＨＰＬＣ溶離液（下記の組成参照）と混合して反応を停止させる。遠心分離した後、以下に述べるようにしてＨＰＬＣによって上清を分析する。
【００５１】
溶離液は０．５％のＨ３ＰＯ４水溶液に希釈した１％のＨＰＬＣ等級のアセトニトリルで構成される。濾過されて脱ガスされたこの溶離液が１ｍｌ／分の流速でカラムに浸透する。使用するカラムは５μｍ  Ｃ１８  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌカラム（ＩＮＴＥＲＣＨＩＭ，Ｒｅｆ．Ｎ５ＣＣ１８−２５Ｆ）で長さ２５０ｍｍ、直径４．６ｍｍであり、４０℃の温度に維持される。注入される容量は２０μｌであり、検出は波長２１０ｎｍにおける吸収を読み取ることによって実施される。これらの条件下で、ＡＭＴＢＭ、ＡＭＴＢＳ（２−アミノ−４−メチルチオブタン酸）およびＡＭＴＢＮ（２−アミノ−４−メチルチオブタンアミド）のピークは４．０分、４．５分および５．０分というそれぞれの保持時間を有する。ＡＭＴＢＮ、ＡＭＴＢＭおよびＡＭＴＢＳの量はピークの面積測量および既知の組成の較正用混合液のピーク面積との比較から演繹される。
【００５２】
使用するその他の技術は当業者によく知られた分子生物学および微生物学の普遍的な技術であって、例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９８２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）によって述べられている。
【００５３】
実施例
実施例１：発現プラスミドｐＢＣＡＴ２９およびｐＢＣＡＴ４１の作製
図２はプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１のマップを表わす。カッコ内の部分はクローニングの間で除去された部分である。Ｐｔｒｐはトリプトファンプロモーター、ｎｉｔＢはニトリラーゼ遺伝子、ＴｒｒｎＢは転写ターミネーター、ｅｎｄ  ＲＯＰはＲＯＰタンパク質をコードする遺伝子（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８、Ｇｅｎｅ  ６８：１３９−１４９）の末端、ＯＲＩは複製起点、ＲＮＡＩ／ＩＩは複製に含まれるＲＮＡ（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、前出）、Ｔｃはテトラサイクリン耐性遺伝子である。
【００５４】
Ｐｔｒｐプロモーターを含む１．２７ｋｂ断片、λファージｃＩＩ遺伝子（ＲＢＳｃＩＩ）のリボソーム結合部位、およびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ８７５０のニトリラーゼ遺伝子（ｎｉｔＢ）が、プラスミドｐＲＰＡ６ＢＣＡＴ６（出願ＦＲ９６／１３０７７）からＥｃｏＲＩとＸｂａＩ制限酵素を使用して、同じ制限酵素で開環したベクターｐＸＬ６４２（ＣＩＰ出願番号０８／１９４，５８８に記載）にクローン化させるために抽出された。結果として得られたプラスミド、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１５を酵素ＳｔｕＩとＢｓｍＩで開環し、４．３ｋｂ断片をｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４（出願ＦＲ９６／１３０７７）から精製した１３６ｂｐのＳｔｕＩ−ＢｓｍＩ断片と連結してプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１９を作製した。ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１９を部分的に配列分析してニトリラーゼのＡｓｐ２７９残基のコドンがＡｓｎ２７９残基のコドンで置き換えられていることを確認した。その後、Ｐｔｒｐ：：ＲＢＳｃＩＩ：：ｎｉｔＢ融合体を含むｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１９の１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を同じ酵素で開環されたベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２８内にクローン化して６．２ｋｂプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２９を作製した。ベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２８は、アンピシリン耐性マーカーをテトラサイクリン耐性マーカーで置き換えるために、ｐＸＬ６４２（ＣＩＰ出願番号０８／１９４，５８８）の３．９ｋｂのＳｓｐＩ−ＳｃａＩ断片をｐＨＰ４５ΩＴｃ（Ｆｅｌｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７、Ｇｅｎｅ  ５２：１４７−１５４）の２．１ｋｂのＳｍａＩ断片と連結することによって得た。プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２９の複製起点に近いＮｄｅＩ部位の部分的ＮｄｅＩ切断とＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ切断）の作用による破壊でプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１を作製した。そのマップは図１に表わされる。プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１をＸｃｍ１切断および連結処理して０．５５ｂｐのＸｃｍ１断片を除去することによってプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ７２を作製した。
【００５５】
実施例２：ＮｉｔＢのシステイン１６２のアスパラギンとの置換
ｎｉｔＢ遺伝子のシステイン１６２のコドンは、プライマーＮｉｔＢ１６２（ＣＧＣＧＴＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＭＡＳＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣ、ここでＭ＝Ａ／ＣおよびＳ＝Ｇ／Ｃ）およびＳＲ（ＣＧＧＣＡＡＴＧＡＴＣＡＧＧＣＣＴＴＣＧＧＣ）を使用した部位特異的突然変異誘発によって変更した。
【００５６】
プライマーＮｉｔＢ１６２とＳＲ、マトリックスｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１、Ｐｗｏポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）および次のインキュベーションプログラムを使用してＰＣＲ反応によって内部の３６１断片を増幅した。すなわち９５℃で５分、（９５℃１分、５８℃１分、７２℃１分）５サイクル、（９５℃４５秒、５８℃３０秒、７２℃３０秒）３５サイクル、７２℃で５分である。
【００５７】
増幅した断片をアガロースゲルに移し、「ＱｉａＥｘ」キット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用して断片を抽出することによって精製した後、制限酵素ＳｔｕＩとＢａｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で３７℃にて供給者の推奨するバッファ中で１６時間ＤＮＡをインキュベートした。別の内部断片、４９８ｂｐをプライマーＰＣＲＡＦ１（出願ＦＲ９６／１３０７２に記載）およびＮｉｔＢ１（ＧＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＣＡＣＣＧＡＣＧＣ）を使用して同様の方式で増幅した。
【００５８】
増幅した断片をアガロースゲルに移し、「ＱｉａＥｘ」キット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用して断片を抽出することによって精製した後、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で３７℃にて供給者の推奨するバッファ中で１６時間ＤＮＡをインキュベートした。
【００５９】
ベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ７２を酵素ＮｄｅＩとＳｔｕＩで開環し、５．４３ｋｐをアガロースゲルで精製してＱｉａＥｘキットを使用して抽出した。
【００６０】
その後、以上に述べた３つの断片を連結し、連結反応混合物をエレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株に導入した。１．２６ｋｂの挿入物を有するプラスミドを選別するために、得られたクローンを酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで制限処理することによって分析した。ニトリラーゼ遺伝子のコドン１６２を含む領域の配列分析をした後、所望のコドン（ＴＧＣの代わりにＡＡＣ）を持っている２つのプラスミドを選別し、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ７５と命名した。
【００６１】
これらのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ４９６株に導入して菌株ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５２６と５２７を得た。ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ４９６株はＷ菌株（ＡＴＣＣ９６３７）に相当し、その中にプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３４が前もって導入されている。プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３４はプラスミドｐＸＬ２０３５（Ｌｅｖｙ−Ｓｃｈｉｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｇｅｎｅ  １６１：１５−２０）に相当し、その中にＰｔｒｐプロモーターの調節因子をコードするｔｒｐＲ遺伝子を持つ４７５ｂｐ断片が、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩの切断部位の間でクローン化されている。この断片をプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３０から抽出し、ベクターｐＳＬ３０１（Ｂｒｏｓｉｕｓ、１９８９、ＤＮＡ  ８：７５９−７７７）にクローニングすることによってプラスミドｐＲＰＧ９（Ｇｕｎｓａｌｕｓ  ａｎｄ  Ｙａｎｏｆｓｋｙ、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：７１１７−７１２１）から抽出されたｔｒｐＲ遺伝子およびそのプロモーターを持つ４３４ｂｐのＡａｔＩＩ−ＳｔｕＩ断片を作製した。
【００６２】
実施例３：ＨＭＴＢＮ加水分解の間でニトリラーゼの選択性に及ぼすＮｉｔＢのシステイン１６２の影響
ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５２６、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５２７およびＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ４９７株（プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１が前もって導入されたＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ４９６株に相当）を、出願ＦＲ９６／１３０７２の実施例５に述べた条件に次の変更を加えて培養した。その変更はすなわち、予備培養を８時間する点、０．４％のカサミン酸、１２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＭ９グルコース培地に１：５０で植菌する点である。
【００６３】
ＨＭＴＢＮのニトリラーゼ活性は、１ｍｌの反応液量に１ｍｇのＤＣを使用し、１００ｍＭのリン酸カリウムバッファ、ｐＨ７で洗浄した細胞ペレットに対し、前述したようにして測定した。菌株の選択性は２時間の加水分解の後に形成されたアミドのピークの面積をアミドと酸のピーク面積の合計と関連させて測定した。それはパーセンテージにより表わされ、結果は表１に示す。
【００６４】
【表１】
0004758580.tif 000002
【００６５】
これらの結果は、システイン１６２のアスパラギンとの置換がＨＭＴＢＮの加水分解に関するＮｉｔＢの選択性を変えることを示している。
【００６６】
実施例４：ＮｉｔＡのグルタミン１６２のシステインでの置換
ＮｉｔＡニトリラーゼのグルタミン１６２のコドンを、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した部位特異的突然変異誘発によってシステインコドンに変えた。
【００６７】
プライマーＮｉｔＡ１６３（ＧＣＡＴＧＴＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＧＴＣＣＣＣＣＡＡＧＡＴＴＣＣ）およびＮｉｔＡ１６２（ＧＧＡＡＴＣＴＴＧＧＧＧＧＡＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＣＡＴＧＣ）は供給者の推奨する条件下でプラスミドｐＸＬ２１５８のＤＮＡ（Ｌｅｖｙ−Ｓｃｈｉｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｇｅｎｅ  １６１：１５−２０）に対して使用した。
【００６８】
ＰＣＲ反応のインキュベーションプログラムは９５℃で３０秒、および１６サイクルの９５℃３０秒−５５℃１分−６８℃１２分を含む。ＤＮＡをＤｐｎＩで切断し、反応混合液１μｌでＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅを感染させた後、得られたクローンを酵素ＢｐｍＩを使用したプラスミド制限プロファイルによって分析した。導入した突然変異はＢｐｍＩ切断部位を変えるので、３つのＢｐｍＩ切断部位のうちの１つを消失した５つのクローンを選別した。それらが有するプラスミドを別々にＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ４９６株に導入してＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５７０およびＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５７４を得た。
【００６９】
実施例５：位置１６２でシステインによる置換をした後のＨＭＴＢＮの加水分解に関するＮｉｔＡ  Ｃ１６２の選択性増進
プラスミドｐＸＬ２１５８をＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ４９６株に導入してＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５７５を得た。前述した発現条件下でテトラサイクリンをアンピシリン１００μｇ／ｍｌに置き換えて菌株ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５７０からＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５７５までを培養した。これらの菌株のニトリラーゼ活性は反応液量１ｍｌに５ｍｇの細胞（ＯＤ６６０から算定した乾燥重量）を使用して前述のようにして１時間について分析した。選択性はアミドに相当するピーク面積の酸に相当するピーク面積に対する比率を計算することによって測定した。それをパーセンテージとして表わし、結果を表２に示す。
【００７０】
【表２】
0004758580.tif 000003
【００７１】
これらの結果は、ＮｉｔＡのグルタミン１６２をシステインで置き換えることがＨＭＴＢＮの加水分解に関する選択性の４倍の利得を可能にすることを示している。
【００７２】
実施例６：位置１６２でシステインによる置換をした後のＡＭＴＢＮの加水分解に関するＮｉｔＡの選択性増進
ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５７０およびＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５７５株を前述の発現条件下で培養した。これらの菌株のニトリラーゼ活性はホウ酸緩衝液、ｐＨ９．２中で２−アミノ−４−メチルチオブタンニトリルまたはＡＭＴＢＮ（Ｃ５Ｈ１０Ｎ２Ｓ）を基質として５０ｍＭで使用して測定した。ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５７０細胞１０ｍｇ（乾燥重量で表示）およびＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５７５細胞０．４ｍｇｍｇ（乾燥重量で表示）相当を反応液量１ｍｌ中で３０℃、２４時間で使用した。前述したようにＨＰＬＣによってＡＭＴＢＳおよびＡＭＴＢＡの生成を測定し、同様の方式で選択性を算出した。その結果を表３に示す。
【００７３】
【表３】
0004758580.tif 000004
【００７４】
これらの結果は、ＮｉｔＡのグルタミン１６２のシステインによる置換がＨＭＴＢＮ以外の基質、このケースではＡＭＴＢＮ、に対する選択性に４倍の利得を可能にすることを示している。
【００７５】
実施例８：ＮｉｔＢの位置１６２でのその他の置換およびＨＭＴＢＮへの選択性の損失
実施例２に述べた突然変異誘発から得たクローンに含まれるｎｉｔＢ遺伝子のコドン１６２を含む領域を配列分析することによって、位置１６２にＴＧＣの代わりにＣＡＧコドンを持ったクローンを識別することが可能であった。対応するプラスミドはｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ７８と命名され、ＮｉｔＢ  Ｑ１６２をコードするｎｉｔＢ挿入を持っており、そこではシステイン１６２がグルタミンで置換されている。これらのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ４９６株に導入し、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５３０および５３１株を得た。ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５３０、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５３１およびＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ４９７株を実施例３に述べた条件下で培養した。反応液量１ｍｌに１ｍｇのＤＣを使用し、出願ＦＲ９６／１３０７２の実施例４に述べたようにして、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７で洗浄した細胞ペレットについてＨＭＴＢＮに対するニトリラーゼ活性を測定した。菌株の選択性は、２時間の加水分解の後に形成されたアミドと酸の合計のモル量に対する形成されたアミドのモル量の関係で測定した。それをパーセンテージで表わし、その結果を表５に示す。
【００７６】
【表４】
0004758580.tif 000005
【００７７】
これらの結果は、システイン１６２の置換がＨＭＴＢＮの加水分解に関するＮｉｔＢの選択性を変えることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、１４種類のニトリラーゼのアラインメントを示す。
【図２】  図２は、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１のマップを示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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