(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）抗原；
（ｂ）免疫アジュバント活性を有するキラヤ・サポナリアサポニン；および、
（ｃ）少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド、
を含むワクチン組成物。
【請求項２】
サポニンが１以上の実質上純粋なサポニンである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
１以上の実質上純粋なサポニンがＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、ＱＳ−２１、ＱＳ−２１−Ｖ１またはＱＳ−２１−Ｖ２またはそれらの２以上の組合せである、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
実質上純粋なサポニンがＱＳ−２１である、請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドが修飾されている、請求項１−４いずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項６】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドが少なくとも１つのホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドで修飾されている、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、式 ５’Ｘ１ＣＧＸ２３’を有するＣｐＧモチーフ［ここで、少なくとも１つのヌクレオチドが連続するＣｐＧを分離し、そしてＸ１はアデニン、グアニン、またはチミンであり、そしてＸ２はシトシン、チミン、またはアデニンである］を含む、請求項１−６いずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項８】
ＣｐＧモチーフが
ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ
または
ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ
を含む、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
該組成物が抗原に対する免疫応答をさらに増大させる、請求項１−８いずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
該組成物がさらに抗原に対する抗体産生を増強する、請求項１−８いずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
該組成物が正の相乗作用で抗原に対する抗体の産生をさらに増強する、請求項１−８いずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
該組成物が細胞性免疫をさらに増強する、請求項１−８いずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
抗原が、蛋白、ペプチド、多糖類、脂質、糖脂質、燐脂質、または該蛋白もしくはペプチドをコードしている核酸を含む、請求項１−１２いずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
個体における抗原に対する免疫応答を増大させるために使用するための請求項１−１３いずれかに記載のワクチン組成物を含む医薬。
【請求項１５】
個体に、非経口、静脈内、筋肉内、または皮下により投与される請求項１４に記載の医薬。
【請求項１６】
（ａ）免疫アジュバント活性を有するキラヤ・サポナリアサポニン；および、
（ｂ）少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド、
を含み、ここで、免疫刺激性オリゴヌクレオチドがＤＮＡワクチンベクターの一部ではない、免疫アジュバント組成物、または、
（ａ）免疫アジュバント活性を有するキラヤ・サポナリアサポニン；および、
（ｂ）少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド、
を含み、ここで、サポニンが１以上の実質上純粋なＱＳ−７、ＱＳ−１７またはＱＳ−１８である、免疫アジュバント組成物、または、
（ａ）免疫アジュバント活性を有するキラヤ・サポナリアサポニン；および、
（ｂ）少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド、
を含み、ここで、免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、
ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ
または
ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ
を含む、免疫アジュバント組成物、または、
（ａ）免疫アジュバント活性を有し、化学的に修飾されているキラヤ・サポナリアサポニン；および、
（ｂ）少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド、
を含む、免疫アジュバント組成物。
【請求項１７】
（ａ）免疫アジュバント活性を有するキラヤ・サポナリアサポニン；および、
（ｂ）少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド、
を含み、ここで、免疫刺激性オリゴヌクレオチドがＤＮＡワクチンベクターの一部ではない、請求項１６に記載の免疫アジュバント組成物。
【請求項１８】
（ａ）免疫アジュバント活性を有するキラヤ・サポナリアサポニン；および、
（ｂ）少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド、
を含み、ここで、サポニンが１以上の実質上純粋なＱＳ−７、ＱＳ−１７またはＱＳ−１８である、請求項１６に記載の免疫アジュバント組成物。
【請求項１９】
（ａ）免疫アジュバント活性を有するキラヤ・サポナリアサポニン；および、
（ｂ）少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド、
を含み、ここで、免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、
ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ
または
ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ
を含む、請求項１６に記載の免疫アジュバント組成物。
【請求項２０】
（ａ）免疫アジュバント活性を有し、化学的に修飾されているキラヤ・サポナリアサポニン；および、
（ｂ）少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド、
を含む、請求項１６に記載の免疫アジュバント組成物。
【請求項２１】
サポニンが化学的に修飾されているサポニンである、請求項１７または１８に記載の免疫アジュバント組成物。
【請求項２２】
サポニンが請求項１、２、３、または４のいずれかに規定されるものである、請求項１７および１９−２１のいずれかに記載の免疫アジュバント組成物。
【請求項２３】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドが請求項７または８に規定されるものである、請求項１７、１８、２０−２２のいずれかに記載の免疫アジュバント組成物。
【請求項２４】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドが修飾されている請求項１７−２３のいずれかに記載の免疫アジュバント組成物。
【請求項２５】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドが少なくとも１つのホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドで修飾されている、請求項２４に記載の免疫アジュバント組成物。
【請求項２６】
ヒトに投与される場合、該組成物が投与された抗原に対するヒトの免疫応答を増大させるか、または、動物に投与される場合、該組成物が投与された抗原に対する動物の免疫応答を増大させる、請求項１６−２５いずれかに記載の免疫アジュバント組成物。
【請求項２７】
抗原が、蛋白、ペプチド、多糖類、脂質、糖脂質、燐脂質、または該蛋白もしくはペプチドをコードしている核酸を含む、請求項１６−２６いずれかに記載の免疫アジュバント組成物。
【請求項２８】
抗原が投与された個体において抗原に対する免疫応答を増大するために用いられる請求項１６−２７いずれかに記載の免疫アジュバント組成物を含む医薬。
【請求項２９】
個体に、非経口、静脈内、筋肉内、または皮下により投与される請求項２８に記載の医薬。
【請求項３０】
（ｉ）抗原、
（ｉｉ）免疫アジュバント活性を有するキラヤ・サポナリアサポニン、および、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド、
の、個体における該抗原に対する免疫応答を増大させるためのワクチン組成物の調製のための使用。
【請求項３１】
サポニンが請求項１、２、３、または４のいずれかに規定されるものである、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドが修飾されており、ワクチン組成物が、個体に、非経口、静脈内、筋肉内、または皮下により投与される請求項３０または３１に記載の使用。
【請求項３３】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドが少なくとも１つのホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドで修飾されている、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドが請求項７または８に規定されるものである、請求項３０−３３のいずれかに記載の使用。
【請求項３５】
抗原が、蛋白、ペプチド、多糖類、脂質、糖脂質、燐脂質、または該蛋白もしくはペプチドをコードしている核酸を含む、請求項３０−３４のいずれかに記載の使用。
【請求項３６】
ワクチン組成物が、抗原に対する抗体産生を増強するために用いられる請求項３０−３５いずれかに記載の使用。
【請求項３７】
ワクチン組成物が、正の相乗作用で抗体の産生をさらに増強するために用いられる、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
ワクチン組成物が、細胞性免疫をさらに増強する、請求項３０−３５いずれかに記載の使用。
【請求項３９】
（ｉ）免疫アジュバント活性を有するキラヤ・サポナリアサポニン、および、
（ｉｉ）少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドの、
抗原が投与された個体における抗原に対する免疫応答を増大させるための免疫アジュバント組成物を調製するための使用。
【請求項４０】
サポニンが請求項１、２、３、または４のいずれかに規定されるものである、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドが修飾されており、免疫アジュバント組成物が、個体に、非経口、静脈内、筋肉内、または皮下により投与される請求項３９または４０に記載の使用。
【請求項４２】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドが少なくとも１つのホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドで修飾されている、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、式 ５’Ｘ１ＣＧＸ２３’を有するＣｐＧモチーフ［ここで、少なくとも１つのヌクレオチドが連続するＣｐＧを分離し、そしてＸ１はアデニン、グアニン、またはチミンであり、そしてＸ２はシトシン、チミン、またはアデニンである］を含む、請求項３９−４２のいずれかに記載の使用。
【請求項４４】
ＣｐＧモチーフが
ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ
または
ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ
を含む、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
抗原が、蛋白、ペプチド、多糖類、脂質、糖脂質、燐脂質、または該蛋白もしくはペプチドをコードしている核酸を含む、請求項３９−４４のいずれかに記載の使用。
【請求項４６】
免疫アジュバント組成物が抗原の投与の２日以内に個体に投与されるものであり、免疫アジュバント組成物が、個体に、非経口、静脈内、筋肉内、または皮下により投与される請求項３９−４５いずれかに記載の使用。
【請求項４７】
免疫アジュバント組成物が抗原と同時に個体に投与される請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドが５−４０塩基長である、請求項１−１３のいずれかに記載のワクチン組成物、請求項１７−２７のいずれかに記載の免疫アジュバント組成物、請求項１４、１５、２８、または２９の何れかに記載の医薬、あるいは、請求項３０−４７のいずれかに記載の使用。
【請求項４９】
サポニンが化学的に修飾されたサポニンである請求項１−１３のいずれかに記載のワクチン組成物、または、請求項３０−４７のいずれかに記載の使用。
【請求項５０】
ヒトに投与される場合、該組成物が抗原に対するヒトの免疫応答を増大させるか、または、動物に投与される場合、該組成物が抗原に対する動物の免疫応答を増大させる、請求項１−１３のいずれかに記載のワクチン組成物、または、請求項３０−４７のいずれかに記載の使用。
【請求項５１】
個体がヒトである、請求項１４、１５、２８、または２９の何れかに記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫アジュバントおよびワクチンの分野におけるものである。本発明に係る組成物は、免疫を刺激し、細胞性免疫を増強し、そして抗体産生を増強する。
【０００２】
発明の背景
アジュバントサポニンは、南アメリカ産の樹木Ｑuillaja saponaria Ｍolinaの樹皮の水性抽出物から同定され精製された。分離可能であった22のサポニンのピークのうち、より支配的な精製サポニンが、ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、およびＱＳ−２１（各々、ＱＡ−７、ＱＡ−１７、ＱＡ−１８、およびＱＡ−２１としても知られる）として同定された。これらのサポニンは高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、低圧液体シリカクロマトグラフィー、および親水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＬＩＣ」）を包含する様々な方法によって実質上精製されている。実質上純粋なサポニンは、個体の免疫反応を増強するための免疫アジュバントとして有用であることが判明している（Ｋensil等、米国特許第５０５７５４０号；Ｋensil等、Ｊ. Ｉmmunol. １４８：２３５７（１９９１）；Ｍarciani等、Ｖaccine ９：８９（１９９１））。
【０００３】
近年、特定の配列部分またはモチーフ中の非メチル化シトシン−グアニン（「ＣｐＧ」）ジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが、インビトロにおいて幾つかのタイプの免疫細胞の強力な刺激物質であることが示された（Ｗeiner等、Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ９４：１０８３３（１９９７））。非メチル化ＣｐＧモチーフを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、免疫刺激反応を常に誘発しサイトカインを放出する、このオリゴヌクレオチド内のジヌクレオチドである。ＣｐＧモチーフは、Ｔヘルパー１（「Ｔｈ１」）サイトカインインターロイキン（「ＩＬ」）１２を包含する幾つかのサイトカインを産生することのできる、単球、マクロファージ、および樹状細胞を刺激することができる（Ｃarson等、Ｊ. Ｅxp. Ｍed. １８６：１６２１（１９９７））。この効果はナチュラルキラー細胞によるＩＦＮ−γ分泌の誘導を引き起こし、次いでこれがマクロファージを活性化し、Ｔヘルパー細胞免疫および分化の特徴である、免疫グロブリンイソタイプのＩｇＧ２ａへの切り替えを促進する（Ｃhu等、Ｊ. Ｅxp. Ｍed. １８６：１６２３（１９９７））。Ｋlinman等は、２個の５'プリン（ＧｐＡまたはＡｐＡ）および２個の３'ピリミジン（ＴｐＣまたはＴｐＴ）の隣接している非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドで構成されるＤＮＡモチーフが、インビトロおよびインビボの両方で、Ｂ細胞を最適に刺激してＩＬ−６およびＩＬ−１２を産生させ、そしてＣＤ４＋ Ｔ細胞を刺激してＩＬ−６およびＩＦＮ−γを産生させることを示した（Ｋlinman等、Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ９３：２８７９（１９９６））。Ｄavis等は、少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸は、対象の免疫反応に影響を及ぼし得ることを発見した（Ｄavis等、ＷＯ９８／４０１００、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４７０３）が、この内容は引用により本明細書の一部とする。
【０００４】
発明の要約
免疫は、或る種の微生物による感染に対する防御反応において重要な役割を演じることから、免疫を安全に誘導する他の新規なアジュバントの特性解明に対する必要性が存在する。このようなアジュバントは将来人間のワクチンに組み入れられる可能性があり得る。驚くべき事に、少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドおよびサポニンアジュバントの組み合わせが、いずれのアジュバント単独に比較しても強力な細胞性免疫の刺激物質であることが判明した。ワクチン接種に応答した抗体価（抗原特異的）は、サポニンまたはＣｐＧのいずれか単独と比較して、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド／サポニンアジュバント配合物を含むワクチンについて著しく高く、正の相乗的アジュバント効果を示した。総合すると、これらの結果は、少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびサポニンアジュバントを含む免疫アジュバント組成物は、免疫を誘導するワクチンのための候補アジュバント組成物であることを立証している。従って、本発明は、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、サポニンアジュバント、および抗原を含む新規なワクチン組成物を提供するものである。本発明に係るワクチン組成物および／または免疫アジュバント組成物を投与することによる、抗原に対する免疫反応を増大させる方法は、本明細書に記載する別の態様である。
【０００５】
図面の説明
図１は、ＣＴＬ誘導によって証明される、ＱＳ−２１およびＣｐＧオリゴヌクレオチド／ＱＳ−２１配合物による、細胞性免疫反応の増強を示すグラフを示している。
【０００６】
図２は、ＣＴＬ誘導によって証明される、ＱＳ−２１およびＣｐＧオリゴヌクレオチド／ＱＳ−２１配合物による、細胞性免疫反応の増強を示すグラフを示している。
【０００７】
図３は、増強された抗体産生、特にＴｈ１サイトカインにより影響を受けるＩｇＧ２ａのような抗体サブクラスの産生増強の棒グラフを示している。
【０００８】
図４は、０日目に最初の免疫を行った後、２１日目に採取したマウス血清において、様々な剤型および／または配合のＱＳ−２１およびＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いた、肺炎球菌１４型多糖類に対し特異的なＩｇＧ１力価の棒グラフを示している。
【０００９】
図５は、０日目に最初の免疫を行った後、２１日目に採取したマウス血清において、様々な剤型および／または配合のＱＳ−２１およびＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いた、肺炎球菌１４型多糖類に対し特異的なＩｇＧ２ａ力価の棒グラフを示している。
【００１０】
図６は、０日目に最初の免疫を行った後、２１日目に採取したマウス血清において、様々な剤型および／または配合のＱＳ−２１およびＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いた、肺炎球菌１４型多糖類に対し特異的なＩｇＧ３力価の棒グラフを示している。
【００１１】
図７は、最初の免疫の２８日後に行われた２回目の免疫の１４日後に採取したマウス血清において、様々な剤型および／または配合のＱＳ−２１およびＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いた、肺炎球菌１４型多糖類に対し特異的なＩｇＧ１力価の棒グラフを示している。
【００１２】
図８は、最初の免疫の２８日後に行われた２回目の免疫の１４日後に採取したマウス血清において、様々な剤型および／または配合のＱＳ−２１およびＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いた、肺炎球菌１４型多糖類に対し特異的なＩｇＧ２ａ力価の棒グラフを示している。
【００１３】
図９は、最初の免疫の２８日後に行われた２回目の免疫の１４日後に採取したマウス血清において、様々な剤型および／または配合のＱＳ−２１およびＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いた、肺炎球菌１４型多糖類に対し特異的なＩｇＧ３力価の棒グラフを示している。
【００１４】
好ましい態様の説明
本明細書中使用する「サポニン」という語は、水溶液において泡を生成し、殆どの場合溶血性を有し、そして免疫アジュバント活性を有する、グリコシド性トリテルペノイド化合物を包含する。本発明は、サポニン自体、並びに天然のおよび薬学上許容し得る塩および薬学上許容し得る誘導体を包含する。「サポニン」という語はさらに、生物学的に活性なそのフラグメントをも包含する。
【００１５】
本発明に係るサポニンは、樹木Ｑuillaja saponaria Ｍolinaから取得することができる（Ｄalsgaard、Ａcta Ｖeterinia Ｓcandinavica、６９：１（１９７８））。Ｄalsgaardによる記載のように製造された部分精製されたサポニンに富む抽出物（「Ｑｕｉｌ−Ａ」）はアジュバント活性を有する。このような抽出物はさらに分離することができる。分離可能であった２２のサポニンのピークのうち、より支配的な精製サポニンが、ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、およびＱＳ−２１（各々、ＱＡ−７、ＱＡ−１７、ＱＡ−１８、およびＱＡ−２１としても知られる）として同定された（Ｋensil等、米国特許第５０５７５４０号）。これらのサポニンは、ＨＰＬＣ、低圧液体シリカクロマトグラフィー、およびＨＩＬＩＣを包含する様々な方法によって実質上精製された。
【００１６】
Ｋensil等の米国特許第５０５７５４０号（これは引用によりその全内容を本明細書の一部とする）に記載のように、このようなサポニンのアジュバント活性は、当業者にとって既知の幾つかの方法のいずれかによって測定することができる。アジュバントを投与した時の特異的抗原に対する抗体の抗体価の増加を、アジュバント活性の基準として使用することができる（Ｂomford、Ｉnt. Ａrchs. Ａllergy Ａppl. Ｉmmun. ７７：４０９（１９８５））。簡潔に述べると、かかる試験の一つは、ＣＤ−１マウスに、アジュバントの可能性があるものを様々な量で混合した抗原（例えば、牛血清アルブミン（「ＢＳＡ」））を皮内注射することを含む。２週間後にこのマウスから血清を採取し、ＥＬＩＳＡによって抗ＢＳＡ抗体について検査する。
【００１７】
もう一つのこのような試験は、Ｃ５７ＢＬ／６またはＢａｌｂ／ｃのような純系マウスに、アジュバントの可能性のあるものを混合した、卵白アルブミン（「ＯＶＡ」）のような蛋白抗原、または肺炎球菌多糖類のような多糖類抗原を皮下経路で注射することを含む。１、２、または３回の免疫後にこのマウスから血清を採取し、ＥＬＩＳＡによって抗原特異的抗体（総免疫グロブリン）または特異的マウスＩｇＧサブクラス、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａについて検査する。もう一つのこのような方法は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＯＶＡを注射し、１、２、または３回の免疫後に脾臓を取得し、脾臓細胞を抗原で刺激し、次いでＯＶＡ−ペプチド−発現標的細胞の細胞溶解性(cytolytic)Ｔリンパ球活性（「殺滅」）について検定することを含む。これに代わる増殖的反応を、免疫された動物から取得した抗原刺激脾臓細胞による３Ｈ−チミジンの取り込みを測定することによるインビトロ検定で測定することもできる。
【００１８】
「ＱＳ−２１」は、メタノール／水（５８／４２、ｖ／ｖ）中の４０ｍＭ酢酸を用いるＶydacＣ４（粒子径５μｍ、３００Å孔、４.６ｍｍＩＤｘ２５ｃｍ長）上での逆相ＨＰＬＣで単一ピークを表す、ＱＳ−２１−Ｖ１およびＱＳ−２１−Ｖ２という成分の混合物を表すものである。さらに精製した成分について実施される実験を記述する場合、この画分は、特別にＱＳ−２１−Ｖ１およびＱＳ−２１−Ｖ２と称する。
【００１９】
Ｋensil等の米国特許第５５８３１１２号（これは引用によりその全内容を本明細書の一部とする）によれば、Ｑuillaja saponaria Ｍolinaのグルクロン酸上のカルボキシ基は、蛋白、ペプチド、または第一アミンを含む小分子とコンジュゲートすることができる。従って、本発明はＱuillaja saponaria Ｍolinaの粗製抽出物から取得し得る化学的に修飾されたサポニンアジュバントまたはその画分に関連するものであり、ここで、化学的に修飾されたサポニンまたはその画分は、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、ＱＳ−２１、ＱＳ−２１−Ｖ１、およびＱＳ−２１−Ｖ２のうち少なくとも一つを含み、そして、修飾されたサポニンはアジュバント活性を保持している。
【００２０】
「部分的に純粋な」という語は、天然の状態でサポニンに通常付随している化合物から部分的に分離されたサポニンを意味する。
【００２１】
「実質上純粋な」という語は、天然の状態でサポニンに通常付随している化合物を実質上含まず、そして一定の且つ再現性のあるクロマトグラフィー上の応答、溶離プロフィール、および生物活性を示すことを意味する。「実質上純粋な」という語は、他の化合物とサポニンとの人工的または合成の混合物を除外することを意図するものではない。
【００２２】
本発明はさらに、他の植物種から単離される免疫刺激性サポニンを使用することもできる。例えば、Ｄolichos lablab由来のサポニンがアジュバントとして有用であることが示されている（Ｋatayan等、Ｖaccine １７：２７３３（１９９９））。
【００２３】
「少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド」という語は、免疫系を活性化することが示されているオリゴヌクレオチドを意味する。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。「ＣｐＧモチーフ」とは、特定の配列内に１またはそれ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含む一区切りのＤＮＡである。ＣｐＧモチーフを含むこのオリゴヌクレオチドは、５−４０塩基対長という短さであってよい。ＣｐＧモチーフを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、モノマーまたは多量体の一部であってよい。これに代わりＣｐＧモチーフは、これもまたＤＮＡワクチンを表すベクターの配列の一部であってもよい。それは一本鎖または二本鎖であってよい。それは合成により製造し、またはプラスミド中で大規模に製造することができる。本発明の一つの態様は、式 ５'Ｘ１ＣＧＸ２３'［式中、少なくとも１個のヌクレオチドが連続するＣｐＧを分離し、そしてＸ１はアデニン、グアニン、またはチミンであり、そしてＸ２はシトシン、チミン、またはアデニンである］を有するＣｐＧモチーフを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドを包含する。好ましい態様において、ＣｐＧモチーフは、
ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ（「１７５８」としても知られる）
または
ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（「１８２６」としても知られる）を含む。
【００２４】
或る隣接する配列の部分に非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドモチーフを含んでいるＤＮＡは、インビトロで幾つかのタイプの免疫細胞の強力な刺激物質であることが判明している（Ｂallas等、Ｊ. Ｉmmunol. １５７：１８４０（１９９６）；Ｃowdrey等、Ｊ. Ｉmmunol. １５６：４５７０（１９９６）；Ｋrieg等、Ｎature ３７４：５４６（１９９５））。その隣接する配列に応じて、或るＣｐＧモチーフは、Ｂ細胞の反応に対してまたはＴ細胞の反応に対して、より免疫刺激性であり、そして或る種を専ら刺激し得る。体液性反応が望まれる場合には、非メチル化ＣｐＧモチーフを含む好ましい免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞の反応を専ら刺激するものとなるであろう。細胞性免疫が望まれる場合には、少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む好ましい免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞反応を促進することが知られているサイトカインの分泌を刺激するものとなるであろう。
【００２５】
本発明に係る免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、内因性エンドヌクレアーゼに対して該オリゴヌクレオチドを安定化するために、幾つかの方法で化学的に修飾することができる。例えば、このオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合以外を含んでいるかも知れず、その場合、該オリゴヌクレオチドの５'末端および／または３'末端のヌクレオチドが任意の数の非常套的塩基または化学原子団、例えば、モノチオリン酸修飾されたヌクレオチドに置換されている。少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも１個のかかるモノチオリン酸修飾されたヌクレオチドによって修飾されている。モノチオリン酸修飾された結合を有するオリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイト（Ａgrawal等、Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ８５：７０７９（１９８８））またはＨ−ホスホナート（Ｆroehler等、Ｔetrahedron Ｌett. ２７：５５７５（１９８６））といったような当分野で周知の方法を用いて製造することができる。その他の化学的修飾原子団の例は、アルキルホスホナート、ジチオリン酸、アルキルモノチオリン酸、ホスホロアミダート、２−Ｏ−メチル、カルバメート、アセトアミダート、カルボキシメチルエステル、カルボナート、およびホスファートトリエステルを包含する。これらの結合を有するオリゴヌクレオチドは、既知の方法に従って製造することができる（Ｇoodchild、Ｃhem. Ｒev. ９０：５４３（１９９０）；Ｕhlmann等、Ｃhem. Ｒev. ９０：５３４（１９９０）；およびＡgrawal等、Ｔrends Ｂiotechnol. １０：１５２（１９９２））。
【００２６】
本明細書中使用する「免疫アジュバント」という語は、個体に投与されまたはインビトロで試験される時、抗原が投与されている個体または試験系においてその抗原に対する免疫反応を増大させる化合物を指す。好ましくは、かかる個体は哺乳動物であり、より好ましくはその哺乳動物は人間であるが、本発明はそれに限定されることを意図していない。本発明に係るワクチンの有益な効果を経験し得る任意の動物が、本発明に従って処置され得る動物の範囲内にある。幾つかの抗原は、単独で投与される場合、免疫原性が弱い、即ち、誘導される抗体価または細胞性免疫反応が無いか、または弱い。免疫アジュバントは、抗体価および／または細胞性免疫を増大させることにより、個体の免疫反応を増強することができる。アジュバントの効果はまた、個体の免疫反応を達成するために有効な抗原の用量を低くすることもできる。
【００２７】
本発明の第一の態様では、サポニンアジュバントおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む免疫アジュバント組成物を投与することができる。より好ましくは、かかる免疫アジュバント組成物は、抗原が投与されている試験系または個体においてその抗原の免疫反応を増大させることができる。好ましくは、このサポニンアジュバントはＱuillaja saponaria Ｍolina由来のサポニンである。より好ましくは、このサポニンアジュバントは、Ｑuillaja saponaria Ｍolina由来の部分的に純粋なまたは実質上純粋なサポニンである。好ましくは、部分的に純粋なサポニンは、ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、および／またはＱＳ−２１を含み得、且つその他のサポニンを含んでいてよい。好ましくは、実質上純粋なサポニンアジュバントはＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、またはＱＳ−２１である。最も好ましくは、実質上純粋なサポニンアジュバントはＱＳ−２１である。これに代わり、該免疫アジュバント組成物は、１以上の実質上純粋なサポニンアジュバントを免疫刺激性オリゴヌクレオチドと共に含むことができる。さらに好ましい態様において、このサポニンアジュバントは、粗製のＱuillaja saponaria Ｍolina抽出物から取得できる化学的に修飾されたサポニンアジュバントまたはその画分［ここで、化学的に修飾されたサポニンまたはその画分は、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、ＱＳ−２１、ＱＳ−２１−Ｖ１、およびＱＳ−２１−Ｖ２のうち少なくとも１個を含み、そして、化学的に修飾されたサポニンはアジュバント活性を保持している］を包含し得る。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含んでいる。ＣｐＧジヌクレオチドは好ましくはモノマーまたは多量体である。ＣｐＧモチーフの別の好ましい態様は、ＤＮＡワクチンをも表す、ベクターの配列の一部としてである。免疫アジュバント組成物のさらに別の態様は、その免疫刺激性オリゴヌクレオチドが修飾されている、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを目的としている。特別な修飾は少なくとも１個のモノチオリン酸修飾されたヌクレオチドを含み得る。さらに、少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、式 ５'Ｘ１ＣＧＸ２３'を有するＣｐＧモチーフ［ここで、少なくとも１個のヌクレオチドが連続するＣｐＧを分離し、そしてＸ１はアデニン、グアニン、またはチミンであり、そしてＸ２はシトシン、チミン、またはアデニンである］を含む。ＣｐＧモチーフは、優先的に
ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ
または
ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ
であってよい。
【００２８】
第二の態様において、本発明は、抗原が投与される試験系または個体においてその抗原に対する免疫反応を増大させる方法であって、サポニンアジュバントおよびさらに免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む免疫アジュバント組成物の有効量を投与することを含む方法を目的としている。好ましくは、該サポニンアジュバントはＱuillaja saponaria Ｍolina由来のサポニンである。より好ましくは、該サポニンアジュバントはＱuillaja saponaria Ｍolina由来の部分的に純粋なまたは実質上純粋なサポニンである。この方法はさらに、１以上の実質上純粋なサポニンアジュバントおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む免疫アジュバント組成物を具体化することができる。実質上純粋なサポニンアジュバントは好ましくはＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、またはＱＳ−２１である。最も好ましくは、実質上純粋なサポニンアジュバントはＱＳ−２１である。さらに好ましい態様において、該サポニンアジュバントは、粗製のＱuillaja saponaria Ｍolina抽出物から取得できる化学的に修飾されたサポニンアジュバントまたはその画分［ここで、化学的に修飾されたサポニンまたはその画分は、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、ＱＳ−２１、ＱＳ−２１−Ｖ１、およびＱＳ−２１−Ｖ２のうち少なくとも１個を含み、そして、化学的に修飾されたサポニンはアジュバント活性を保持している］を包含し得る。本方法の好ましい態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含んでいる。ＣｐＧモチーフは好ましくはモノマーまたは多量体である。本方法のもう一つの好ましい態様は、ＤＮＡワクチンを表す、ベクターの配列の一部としてのＣｐＧモチーフを包含する。さらに別の態様は、その免疫刺激性オリゴヌクレオチドが少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含み、そしてさらにその免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、内因性エンドヌクレアーゼに対してこのオリゴヌクレオチドが安定化されるよう化学的に修飾されている、方法を目的としている。修飾は少なくとも１個のモノチオリン酸修飾されたヌクレオチドを含み得る。さらにこの方法は、式 ５'Ｘ１ＣＧＸ２３'を有するＣｐＧモチーフ［ここで、少なくとも１個のヌクレオチドが連続するＣｐＧを分離し、そしてＸ１はアデニン、グアニン、またはチミンであり、そしてＸ２はシトシン、チミン、またはアデニンである］を含む、少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドを部分的に目的とし得るものである。別の好ましい方法において、この非メチル化ＣｐＧモチーフは、
ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ
または
ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ
である。
【００２９】
本明細書中の「ワクチン組成物」という語は、免疫反応を生み出すことのできる組成物を指す。ワクチン組成物は、本発明によれば、個体において疾病に対する免疫を産む。本発明に係るサポニンおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチドの組み合わせは、個体に投与して任意の抗原に対する免疫反応を増強することができる。好ましくは、このワクチン組成物は免疫を刺激する。より好ましくは、このワクチン組成物は、抗原に対する抗体産生を増強し、そして抗原に対する細胞性免疫反応を増強する。
【００３０】
本発明に係るワクチン組成物は、正の相乗作用で抗原に対する抗体産生を増強することができる。本明細書に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびサポニンアジュバントの相乗的アジュバント効果は幾つかの方法で示すことができる。例えば、相乗的アジュバント効果は、最大予想免疫反応の増大として証明することができる。二つのアジュバントを合する時、相加的効果が予想できる。即ち、或るアジュバントが最適用量で使用された場合に「Ｘ」の抗体を産生し、別のアジュバントがやはり最適用量で使用された場合に「Ｙ」の抗体を産生するならば、これらの組み合わせは、もしその結果が相乗的ではなく相加的であるならば、「Ｘ＋Ｙ」を産生すると予想できる。「Ｘ＋Ｙ」よりかなり高い最大反応レベルは相乗効果であると考えられ、これは予想外のものである。相乗作用の第二の適応は、アジュバント効果の産生が通常予想されない用量で実質的なアジュバント効果が現れることである。相乗作用の第三の適応は、いずれかのアジュバント単独に対して予想されるよりも動力学的に早期に免疫反応が現れることである。
【００３１】
さらに、増強された免疫反応にとって好適な典型的抗原は、以下のもののいずれかに由来する抗原を包含する：ウイルス、例えば、インフルエンザ、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、狂犬病、麻疹、Ｂ型肝炎、または口蹄疫；細菌、例えば、炭疽、ジフテリア、ライム病、肺炎球菌、または結核；または原生動物、例えば、Ｂabeosis bovisまたはマラリア原虫。抗原は、好ましくは蛋白、ペプチド、多糖類、脂質、糖脂質、燐脂質、または抗原蛋白もしくは興味深いペプチドをコードしている核酸であってよい。抗原は、天然原料から精製され、固相合成によって合成され、または遺伝子工学手段によって取得することができる。
【００３２】
従って、第三の態様において、本発明はさらに、サポニンアジュバント、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、および抗原を含むワクチン組成物を包含する。該サポニンアジュバントはＱuillaja saponaria Ｍolina由来の部分的に純粋なまたは実質上純粋なサポニンであってよい。このワクチン組成物はさらに、１以上の部分的に純粋なまたは実質上純粋なサポニンアジュバント、少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧモチーフをさらに含んでいる免疫刺激性オリゴヌクレオチド、および抗原を含むことができる。好ましくは、部分的に純粋なサポニンアジュバントはＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、および／またはＱＳ−２１を含み、そして他のサポニンを含むことができる。好ましくは、実質上純粋なサポニンアジュバントはＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、またはＱＳ−２１である。さらに好ましい態様は、粗製のＱuillaja saponaria Ｍolina抽出物から取得できる化学的に修飾されたサポニンアジュバントまたはその画分［ここで、化学的に修飾されたサポニンまたはその画分は、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、ＱＳ−２１、ＱＳ−２１−Ｖ１、およびＱＳ−２１−Ｖ２のうち少なくとも１個を含み、そして、化学的に修飾されたサポニンはアジュバント活性を保持している］を包含する。最も好ましくは、このワクチン組成物中の部分的に純粋なまたは実質上純粋なサポニンアジュバントはＱＳ−２１である。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含んでいる。ＣｐＧモチーフは好ましくはモノマーまたは多量体である。ＣｐＧモチーフのもう一つの好ましい態様は、ＤＮＡワクチンをも表す、ベクターの配列の一部としてのＣｐＧモチーフである。本明細書に記載するワクチン組成物のさらに別の態様は、少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドが化学的修飾を含む、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを目的としている。より詳細には、この免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のモノチオリン酸修飾されたヌクレオチドで修飾されているかも知れない。さらに、このワクチン組成物中の、少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、式 ５'Ｘ１ＣＧＸ２３'を有するＣｐＧモチーフ［ここで、少なくとも１個のヌクレオチドが連続するＣｐＧを分離し、そしてＸ１はアデニン、グアニン、またはチミンであり、そしてＸ２はシトシン、チミン、またはアデニンである］を含む。本発明のこの態様に従う非メチル化ＣｐＧモチーフは、優先的に
ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ
または
ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ
を含む。
【００３３】
本発明の第四の態様は、個体において抗原に対する免疫を刺激する方法であって、抗原、部分的に純粋なまたは実質上純粋なサポニンアジュバント、および免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含むワクチン組成物の有効量を投与することを含む方法を包含する。この方法はさらに、１以上の部分的に純粋なまたは実質上純粋なサポニンアジュバント、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、および抗原を含むワクチン組成物を具体化するものである。好ましくは、部分的に純粋なサポニンアジュバントはＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、および／またはＱＳ−２１を含み、そして他のサポニンを含むことができる。好ましくは、実質上純粋なサポニンアジュバントはＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、またはＱＳ−２１を含む。最も好ましくは、この方法によれば、部分的に純粋なまたは実質上純粋なサポニンアジュバントはＱＳ−２１である。このサポニンアジュバントは、好ましくは、粗製のＱuillaja saponaria Ｍolina抽出物から取得できる化学的に修飾されたサポニンアジュバントまたはその画分［ここで、化学的に修飾されたサポニンまたはその画分は、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、ＱＳ−２１、ＱＳ−２１−Ｖ１、およびＱＳ−２１−Ｖ２のうち少なくとも１個を含み、そして、化学的に修飾されたサポニンはアジュバント活性を保持している］であってよい。好ましくは、本方法は、少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドをさらに含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドを投与することを含む。ここに記載のＣｐＧジヌクレオチドはモノマーまたは多量体である。本方法のもう一つの好ましい態様は、ＤＮＡワクチンをも表す、ベクターの配列の一部としてのＣｐＧモチーフを包含する。本明細書に開示する方法のさらに別の態様は、少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド［ここでこの免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、内因性エンドヌクレアーゼに対する安定性を増大させるため、化学的に修飾されているかも知れない］を目的としている。このような修飾は、少なくとも１個のモノチオリン酸修飾されたヌクレオチドを含むかも知れない。さらに、少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、式 ５'Ｘ１ＣＧＸ２３'を有するＣｐＧモチーフ［ここで、少なくとも１個のヌクレオチドが連続するＣｐＧを分離し、そしてＸ１はアデニン、グアニン、またはチミンであり、そしてＸ２はシトシン、チミン、またはアデニンである］を含み得る。もう一つの好ましい態様において、この非メチル化ＣｐＧモチーフは、
ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ
または
ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ
である。
【００３４】
該ワクチン組成物のためのその他の有用な方法は、或る抗原に対する抗体の産生を増強し、そして細胞性免疫を増強することを包含する。より好ましくは、このワクチン組成物は或る抗原に対する抗体の産生を増強し、そして細胞性免疫を増強する。最も好ましくは、このワクチン組成物は、正の相乗的方法で抗原に対する抗体の産生を増強する。
【００３５】
本発明に係る組成物の投与は、非経口的、静脈内、筋肉内、皮下、経鼻、経口、経粘膜、または他の任意の適当な手段によるものとすることができる。投与される用量は、年齢、体重、もし現在治療を受けているとすればその治療の種類、および投与された抗原の性質に依存し得る。初回投与の後、約４週間後に免疫原性反応を増強するためにブースター投与を行うことができる。さらなるブースター用量を投与することもできる。該組成物は、サポニン、オリゴヌクレオチド、および抗原の混合性剤の一回注射として、または短期間（即ち０−２日間）のうちに同一部位に別々の注射として投与することができる。
【００３６】
本発明に係る有効な組成物は、経口投与のためのカプセル剤、液体溶液、懸濁液またはエリキシル、または無菌液体剤型、例えば、溶液もしくは懸濁液のような剤型で使用することができる。好ましくは、許容し得る任意の不活性担体、例えば、食塩水、もしくはＰＢＳ、または本発明に係る組成物が本発明に係る用途にとって好適な溶解性を有する、任意の許容し得る担体を使用することができる。
【００３７】
実施例
ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＱＳ−２１を合した製剤が免疫アジュバントとして機能し得るかどうかを評価するために、良好に確立された動物モデルを使用した。簡潔に述べると、最近報告されたアジュバントＣｐＧモチーフとＱＳ−２１を比較するために実験を計画した。マウスにおけるＢ細胞リンパ腫イディオタイプ−ＫＬＨワクチンのためのアジュバントとしての働きを有することが報告されたＣｐＧ配列（例えば、１７５８）を選択した。一つの実験は、ＣｐＧモチーフが、単独またはＱＳ−２１と組み合わせた時にマウスにおけるＣＴＬ反応誘発の際、サブユニットワクチン、例えば、ＯＶＡのためのアジュバントとして働き得るかどうかを評価した。この仕事は、最適用量を決定するためのＣｐＧによる用量範囲実験を含んでいた。
【００３８】
アジュバントとしてのＣｐＧおよびＱＳ−２１の比較に加えて、ＣｐＧオリゴヌクレオチドがＱＳ−２１のアジュバント効果に影響を及ぼし得るかどうかを評価するため、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを最適用量以下のＱＳ−２１（例えば、１.２５μｇ）と合して第二の実験を実施した。
【００３９】
さらに、ＣｐＧおよびＱＳ−２１の組み合わせが抗体産生、特に抗原特異的抗体反応のイソタイププロフィールを増強し得るかどうかを判定するための実験を行った。
【００４０】
最後に、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびサポニンの組み合わせが正の相乗作用で抗体産生を増強するかどうかを判定するために一連の実験を実施した。この仕事は、肺炎球菌１４型多糖類およびＱＳ−２１およびＣｐＧオリゴヌクレオチドのワクチン製剤を使用し、０日目および２８日目に免疫した後の２１日目および４２日目にマウスから採取した特異的抗体価を評価した。マウスにおいて鶏卵ライソザイムのためのアジュバントとしての働きを有すると報告されている、別のＣｐＧ配列（例えば、１８２６）を選択した。
【００４１】
以下の供給者由来の材料を用いて実験を行った：ＯＶＡ、VI等級（Ｓigma）；肺炎球菌１４型多糖類（ＡＴＣＣ）；ＱＳ−２１（Ａquila）；モノチオリン酸修飾された配列１７５８ ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡおよびモノチオリン酸修飾された配列１８２６ ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴを含むＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｌife Ｔechnologies（Ｇibco））。
【００４２】
実施例１
ＱＳ−２１およびＣｐＧ／ＱＳ−２１により誘導されたＣＴＬ
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群当たり５匹、雌、８−１０週齢）を、１、１５、および２９日目に皮下経路により免疫した。ワクチンは、総体積０.２ｍＬのリン酸緩衝化食塩水に入れた、示された用量のアジュバントを加えたＯＶＡ抗原２５μｇであった。この実験に使用したＣｐＧモチーフは、配列
ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡ
を有するモノチオリン酸修飾されたオリゴヌクレオチド１７５８であった（Ｗeiner等、Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ９４：１０８３３（１９９７））。ＣＴＬ検定でエフェクター細胞として使用するため、脾臓細胞を４２日目に摘出した。これを、マイトマイシンＣで処理したＥ.Ｇ７−ＯＶＡ細胞で６日間インビトロで刺激し、次いで標準的51Ｃｒ放出ＣＴＬ検定に使用した。Ｅ.Ｇ７−ＯＶＡ細胞（51Ｃｒをロード）を標的細胞として使用した。ＥＬ４細胞（ＯＶＡによりトランスフェクトされていない）のバックグラウンド溶解(lysis)をＥ.Ｇ７−ＯＶＡ細胞の溶解から差し引き、抗原特異的溶解のパーセント（％）を得た。
【００４３】
図１に示すように、この結果は、アジュバント不在下、任意の用量のＣｐＧ、または１.２５μｇのＱＳ−２１（最適用量以下）では、溶解が観察されなかったことを示している。しかしながら、ＣｐＧと組み合わせた最適用量以下のＱＳ−２１は、著明なＣＴＬを誘導した。この結果は、通常このようなアジュバント効果を生み出すとは予想されない用量での実質的なアジュバント効果を示している。この、正の相乗効果は、より高いＣｐＧの用量（５０μｇ）で最も顕著であった。このアジュバント効果は、最適な１０μｇのＱＳ−２１対照で達成された効果に匹敵した。
【００４４】
実施例２
ＱＳ−２１およびＣｐＧ／ＱＳ−２１により誘導されたＣＴＬ
図１に記載のように免疫されたマウスの脾臓細胞をＣＴＬ検定に使用した。脾臓細胞はＣＴＬ検定に使用する前に、変性させたＯＶＡで６日間インビトロで刺激した。この検定は実施例１に記載のようにＥ.Ｇ７−ＯＶＡ細胞に対して実施した。
【００４５】
図２の結果から明らかなように、アジュバント不在下、任意の用量のＣｐＧ、または１.２５μｇのＱＳ−２１（最適用量以下）では、溶解が観察されなかった。しかしながら、ＣｐＧと組み合わせた最適用量以下のＱＳ−２１は、著明なＣＴＬを誘導した（最適な１０μｇのＱＳ−２１対照に匹敵する）。この結果は、最適用量以下では予想されないＣｐＧおよびＱＳ−２１の間の正の相乗作用を示すものである。
【００４６】
実施例３
抗原特異的血清ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ
実施例１に記載のように免疫されたマウスから４２日目に採取した血清上のＥＩＡにより、ＯＶＡに対する血清力価を決定した。ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの力価を個々のマウス（１群当たり５匹のマウス）について測定し、幾何平均力価としてプロットした。図３に示すように、ＩｇＧ１力価は、ＱＳ−２１のみ（１０μｇ用量）または１０もしくは５０μｇのいずれかと組み合わせたＱＳ−２１ １０μｇが投与された群で最も高かった（非アジュバント群のおよそ１０倍の増強）。ＩｇＧ２ａ反応は、１０または５０μｇ ＣｐＧと１０μｇ ＱＳ−２１（最適用量）の組み合わせ、および、５０μｇ ＣｐＧと１.２５μｇ ＱＳ−２１（最適用量以下）の組み合わせ以外では、いかなる群でも検出できなかった。ＩｇＧ２ａは、単独で使用した任意のＣｐＧ用量、単独で使用した任意のＱＳ−２１用量、または非アジュバント群において検出されなかった。
【００４７】
実施例４
肺炎球菌多糖類抗原に対してＱＳ−２１およびＱＳ−２１／ＣｐＧ
により誘導された抗体
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり５匹のマウス、雌、８−１０週齢）を、０日目のみ、または０および２８日目に皮下経路で免疫した。ワクチンは、総体積０.２ｍＬのリン酸緩衝化食塩水に入れた、示された用量のアジュバントを加えた肺炎球菌１４型多糖類０.５μｇであった。この実験に使用した免疫刺激性モチーフＣｐＧは、配列
ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ
を有するモノチオリン酸修飾されたオリゴヌクレオチド１８２６であった（Ｃhu等、Ｊ. Ｅxp. Ｍed. １８６：１６２３−１６３１（１９９７））。ＱＳ−２１は１.２５μｇまたは１０μｇの用量で使用した。ＣｐＧ ＯＤＮ １８２６は１０μｇの用量のみで使用した。
【００４８】
１回免疫を受けたマウス由来の血清を２１日目に採取した。２回の免疫を受けたマウス由来の血清は４２日目に採取した。１４型多糖類に対し特異的な抗体価をこの血清について決定した。ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ３を、各群のマウス由来の等用量の血清プールについて決定した。１回免疫を施した後、１０μｇ ＱＳ−２１／１０μｇ ＣｐＧの組み合わせのＩｇＧ１力価は、ＱＳ−２１のみの６６倍高く、ＣｐＧのみの４３倍高かった（図４）。１０μｇ ＱＳ−２１／ＣｐＧの組み合わせのＩｇＧ２ａ力価は、ＱＳ−２１のみまたはＣｐＧのみの１１倍高かった（図５）。１０μｇ ＱＳ−２１／ＣｐＧの組み合わせのＩｇＧ３力価は、ＱＳ−２１のみの８５倍高く、ＣｐＧのみの９５倍高かった（図６）。
【００４９】
２回の免疫の後、１０μｇ ＱＳ−２１／ＣｐＧの組み合わせのＩｇＧ１力価は、ＱＳ−２１のみの４６倍高く、ＣｐＧのみの４４４倍高かった（図７）。１０μｇ ＱＳ−２１／ＣｐＧの組み合わせのＩｇＧ２ａ力価は、ＱＳ−２１のみの４７６倍高く、ＣｐＧのみの１２７倍高かった（図５）。１０μｇ ＱＳ−２１／ＣｐＧの組み合わせのＩｇＧ３力価は、ＱＳ−２１のみの６７倍高く、ＣｐＧのみの２４３倍高かった（図９）。これらの力価の増強は、これが正の相乗効果であって、単にこれら二つのアジュバントを合した相加的アジュバント効果ではないことを示している。さらに、低用量のＱＳ−２１（１.２５μｇ）と１０μｇ ＣｐＧとの組み合わせは、２回の免疫の後にＩｇＧ１およびＩｇＧ３力価をも生み出し、これらは１.２５μｇ ＱＳ−２１単独、１０μｇ ＱＳ−２１単独、または１０μｇ ＣｐＧ単独により生み出される力価より高かった。
【００５０】
ここに本発明を詳細に記載してきたが、当業者にとっては、以下に開示する本発明の精神または範囲を逸脱することなく、多くの変更および修飾を施すことができるということが明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＣＴＬ誘導によって証明される、ＱＳ−２１およびＣｐＧオリゴヌクレオチド／ＱＳ−２１配合物による、細胞性免疫反応の増強を示すグラフを示している。
【図２】  図２は、ＣＴＬ誘導によって証明される、ＱＳ−２１およびＣｐＧオリゴヌクレオチド／ＱＳ−２１配合物による、細胞性免疫反応の増強を示すグラフを示している。
【図３】  図３は、増強された抗体産生、特にＴｈ１サイトカインにより影響を受けるＩｇＧ２ａのような抗体サブクラスの産生増強の棒グラフを示している。
【図４】  図４は、０日目に最初の免疫を行った後、２１日目に採取したマウス血清において、様々な剤型および／または配合のＱＳ−２１およびＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いた、肺炎球菌１４型多糖類に対し特異的なＩｇＧ１力価の棒グラフを示している。
【図５】  図５は、０日目に最初の免疫を行った後、２１日目に採取したマウス血清において、様々な剤型および／または配合のＱＳ−２１およびＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いた、肺炎球菌１４型多糖類に対し特異的なＩｇＧ２ａ力価の棒グラフを示している。
【図６】  図６は、０日目に最初の免疫を行った後、２１日目に採取したマウス血清において、様々な剤型および／または配合のＱＳ−２１およびＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いた、肺炎球菌１４型多糖類に対し特異的なＩｇＧ３力価の棒グラフを示している。
【図７】  図７は、最初の免疫の２８日後に行われた２回目の免疫の１４日後に採取したマウス血清において、様々な剤型および／または配合のＱＳ−２１およびＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いた、肺炎球菌１４型多糖類に対し特異的なＩｇＧ１力価の棒グラフを示している。
【図８】  図８は、最初の免疫の２８日後に行われた２回目の免疫の１４日後に採取したマウス血清において、様々な剤型および／または配合のＱＳ−２１およびＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いた、肺炎球菌１４型多糖類に対し特異的なＩｇＧ２ａ力価の棒グラフを示している。
【図９】  図９は、最初の免疫の２８日後に行われた２回目の免疫の１４日後に採取したマウス血清において、様々な剤型および／または配合のＱＳ−２１およびＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いた、肺炎球菌１４型多糖類に対し特異的なＩｇＧ３力価の棒グラフを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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