(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなり、哺乳類により分泌されるグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２。
【請求項２】
前記哺乳類がヒトである、請求項１に記載の哺乳類により分泌されるグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２。
【請求項３】
請求項１に記載の哺乳類により分泌されるグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２のためのコード化核酸配列からなる核酸分子。
【請求項４】
配列表の配列番号１で示される核酸配列からなる、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項１または２に記載の、哺乳類により分泌されるグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２に対するポリクローンあるいはモノクローン抗体。
【請求項６】
制御配列に連結された、請求項３または４に記載の少なくとも１個の核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
請求項３または４に記載の核酸分子によって形質転換された細胞宿主。
【請求項８】
請求項６に記載のベクターによって形質転換された細胞宿主。
【請求項９】
請求項３または４に記載の核酸分子から調製したオリゴヌクレオチド・プローブであって、該核酸分子を特異的に認識するオリゴヌクレオチド・プローブ。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の触媒活性を抑制することができる生物学的に活性な化合物を識別するための方法であって、請求項７または８に記載の細胞宿主へ前記化合物を加え、脂肪酸およびリゾリン脂質の放出を測定することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１または２に記載のグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２に結合するｓＰＬＡ２レセプタに対する結合特性に関して生物学的に活性な化合物を識別するための方法であって、前記グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２を、前記化合物との競合結合測定に用いることを特徴とする方法。
【請求項１２】
細胞増殖、細胞遊走、細胞収縮あるいはアポトーシスを調節する生物学的に活性な化合物を識別するための方法であって、前記化合物が存在するか、あるいは存在しない状態で、請求項１または２に記載のグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２を細胞に加え、細胞増殖、細胞遊走、細胞収縮あるいはアポトーシスに関して前記細胞を分析することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新奇な哺乳類の分泌によるグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２をコード化するＤＮＡ及びペプチド配列に関し、特に、新奇なヒト分泌グループＩＩＩ（ｈＧＩＩＩ）ｓＰＬＡ２に関する。本発明は、また、この酵素を、種々の化合物をスクリーニングするための方法に使用することに関する。
【０００２】
近年、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２、ＥＣ３.１.１.４）が、細胞内の分泌酵素に関する上科を形成することが確認された。これらの酵素はすべて、ｓｎ−２位置において脂肪酸とリゾリン脂質（１−４）とを放出するグリセロリン酸脂質の加水分解の触媒作用を及ぼす。今日まで、八個の哺乳類の分泌によるホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２）がクローニングされ、グループＩ、ＩＩ、Ｖ及びＸに分類されている（２、４−９）。これらの酵素の各々の生物学的な役割は、未だ、明確に定義されてはいないが、哺乳類のｓＰＬＡ２は、脂質消化、細胞増殖、神経分泌、前炎症性脂質調停因子の放出、抗菌防衛、腫瘍及び炎症性の病気（３、４）を含む、種々の生理学的な、そして病態生理学的な機能に関係があるとされる。哺乳類の、これら八つのｓＰＬＡ２間の同一性の程度は、２３％と低い（８）が、分子質量値が低い（１４−１７ｋＤａ）、いくつかの二硫化物を含む、類似するＣａ２＋依存の触媒機構を持つ、そして全体的な三次元構造が良く保存されている（１０−１３）という共通点がある。
【０００３】
また、多数のｓＰＬＡ２は、脊椎動物、そしてヘビ及びミツバチ（１４、１５）等の無脊椎動物の両方からの毒物として表されている。哺乳類のｓＰＬＡ２に類似するヘビの毒酵素は、グループＩ及びＩＩに分類され、すべて、共通の触媒機構と非常に類似した三次元構造（１、１０−１３）を持つ。ヘビ毒ｓＰＬＡ２は、ほとんど神経毒素あるいは筋肉毒素であるが、細胞回遊や細胞増殖（１４、１６、１７）等の生理学的な作用を促進することもある。毒物ｓＰＬＡ２を配位子として用いて、異なるタイプのｓＰＬＡ２レセプタが識別されている（４）。これらのレセプタは、毒物ｓＰＬＡ２の毒性に関係しているようで、最近の研究は、哺乳類のｓＰＬＡ２が、標準的な内在性の配位子（４、１８、１９）であるという可能性を示唆している。無脊椎動物の毒物ｓＰＬＡ２も、二硫化物が豊富なタンパク質であるが、哺乳類及びヘビの毒ｓＰＬＡ２とは主要構造が別で、グループＩＩＩ及びＩＸ（２、４）に分類されている。ミツバチ、サソリ、クラゲ、そして海生カタツムリの毒（２０−２５）に見られ、グループＩＩＩハチ毒ｓＰＬＡ２は、最も良く研究された酵素である。このｓＰＬＡ２は、クローニング（２０）、そして、その三次元構造（１１）の決定により、触媒の部位が脊椎動物ｓＰＬＡ２（１３）のものと同様ではあるが、グループＩ及びＩＩのｓＰＬＡ２とは重要な違いがあることが明らかになった。興味深いことに、ハチ毒酵素に類似するｓＰＬＡ２は、トカゲの毒物（２６、２７）中にも発見された。このことは、グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２が、脊椎動物中にも存在し、同様に哺乳動物中にも生じるかもしれないということを示すものである。
【０００４】
これまでの３年間、核データベース内のｓＰＬＡ２同族体を組織的に検索することによって、出願者は、グループＩＩ及びＸ（６−８）に属する四つの新奇な哺乳類のｓＰＬＡ２をクローニングすることを可能にした。この同じ戦略を用いて、出願者は、ハチ毒グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２とかなりの同族関係を示すヒト・ゲノム配列を識別した。ここに、第一のヒト・グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２のクローン化、ゲノム構築、染色体マッピング、組織分布、そして異種発現について報告する。
【０００５】
本発明は、新奇な、哺乳類の分泌によるグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２に関する。特に、ＳＥＱＩＤ番号２の下にある配列リスト内のアミノ酸配列からなる、哺乳類が分泌するグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２に関する。さらに、この哺乳類の分泌によるグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２は、ヒト分泌グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２である。
【０００６】
本発明は、哺乳類の分泌によるグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２のための、あるいは哺乳類の分泌によるグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の分裂片のためのコード化核配列からなる核酸分子に関する。また、哺乳類の分泌によるグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２タンパク質の、あるいはこのタンパク質の分裂片のコードを決定する核酸分子に関する。このタンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤ番号２の下でアペンディックス内の配列リスト内に表されている。本発明は、特に、ＳＥＱＩＤ番号１の下でアペンディックス内の配列リスト内にある配列からなる核酸分子に関する。明らかに、本発明は、また、上記配列から、例えば、遺伝情報の縮退から得られる核酸配列に関する。そして、これらの核酸配列は、分泌グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の特徴及び特性を示すタンパク質のためのコードを決定する。
【０００７】
もう一つの本発明の目的は、本発明の分泌グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２に対向するポリクローンあるいはモノクローン抗体、これらの誘導体あるいは分裂片である。これらの抗体は、文献に記述された方法によって準備することができる。従来の技術によれば、ポリクローナル抗体は、上皮から抽出した、あるいはホストの遺伝学的な変化によって生成したタンパク質を動物へ注入し、次に抗血清を、そして例えば、親和性クロマトグラフィによって抗血清からの抗体を回収することによって形成する。モノクローン抗体は、本発明のレセプタを用いて予め免疫性を与えた動物からの骨髄腫細胞と脾臓細胞とを融合させることによって生成することができる。これらの抗体は、新しい分泌哺乳類グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２、あるいは他の哺乳動物内のこの酵素の同族体を調査する、または、異なる個体あるいは種の分泌グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２間の関係を研究するのに有用である。
【０００８】
本発明は、また、適合コントロール配列に有利に関連づけた、上記核酸の少なくとも一分子からなるベクターに関する。これには、本発明のグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の細胞ホスト内、あるいはその分裂片内での生成あるいは発現工程も関連がある。これらのベクターの調製、そして本発明のタンパク質ホスト内での生成あるいは発現は、専門家がよく知る分子生物学及び遺伝子工学技術によって行うことができる。
【０００９】
哺乳類の分泌によるグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２のためのコーディング核酸分子、あるいは本発明によるベクターは、また、動物を変化させて、遺伝子導入動物の系統を確立するために用いることもできる。用いるベクターは、それが転入されるホストの機能で選択するが、プラスミド等の、どのようなベクターであってもよい。したがって、本発明は、また、前処理に基づいて得た哺乳類の分泌グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２を発現する細胞ホストに関する。
【００１０】
本発明は、また、本発明による核酸分子から準備した核・プローブ及びオリゴヌクレオチド・プローブに関する。有利に標識したこれらのプローブは、他の個体あるいは種内の同様のグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２のハイブリダイゼーション検出に役立つ。従来の技術によれば、これらのプローブは、生物学的試料に接触させる。しかし、ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション、複製ハイブリダイゼーション（サザーンの技術）あるいは他の技術（ＤＮＡチップ）等の、異なるハイブリダイゼーション技術を用いることもできる。このようなプローブは、グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２のコーディング遺伝子内の同様な配列を素早く検出することを可能にするツールであり、これらのタンパク質の存在、起源及び保存の研究を可能にする。オリゴヌクレオチド・プローブは、例えば、他種の遺伝子を捜すために、あるいは診断の目的で、ＰＣＲ実験に有用である。
【００１１】
ｓＰＬＡ２は、通常の状態、そして（炎症性の病気、腫瘍、心臓及び脳の虚血などを含む）病理学的条件下における種々の組織内で発現し、無数の生理学的な、そして病理学的な役割に関与している。これらのタンパク質は、また、細胞増殖、細胞回遊、血管形成、細胞収縮、細胞消滅、神経分泌、血液凝集、脂質生成、脂質代謝（消化、皮膚脂質関門及び肺界面活性剤形成、リポ蛋白代謝など）、精子生成、受精及び胚形成に係わっている。また、ホスト防衛における役割をも演じ、ＨＩＶ−１のようなウイルス、そして種々のグラム陽性及びグラム陰性の菌種に対して抗ウイルス性及び抗菌性を持つ。急性肺傷害、急性呼吸困難症候群、クローン病、そしてｓＰＬＡ２が遺伝子サプレッサとして作用する種々のタイプの腫瘍等の種々の病理学的な状態に係わっている。
【００１２】
その結果、本発明は、抗炎症性を持つ生物学的に活性な化合物を識別するための方法にも有用である。または、より一般的に、上記のｓＰＬＡ２の生物学的作用を調整する化合物を識別するのための方法にも有用である。
【００１３】
選択した化合物が、リン脂質を割って脂肪酸及びリゾリン脂質を解放するｓＰＬＡ２の触媒活性を抑制することができるかどうかを、混合ミセル分析法、リポソーム分析法、天然の膜を用いるシステムにおいて、あるいはこの酵素を過剰発現する細胞全体で判定することによって、このような生物学的に活性な化合物を識別することができる。ｓＰＬＡ２触媒活性を抑制可能な化合物は、抗炎症性を持つかもしれないし、または、上記のｓＰＬＡ２の生物学的作用において、ｓＰＬＡ２の拮抗剤として作用するかもしれない。
【００１４】
例えば、潜在的な抗炎症活性に関する化合物のスクリーニングは、細胞源から均一に浄化した、あるいは組み換えて、または合成して生成した本発明の新奇なｓＰＬＡ２酵素で行うことができる。混合ミセル分析法、リポソーム分析法、あるいは天然膜を用いる分析システムにおいて、本発明のｓＰＬＡ２酵素へ、選択した化合物を加えて、ｓＰＬＡ２活性の抑制を分析することができる。択一的に、ｓＰＬＡ２を過剰発現する細胞全体に選択化合物を加え、これらの細胞を、脂肪酸あるいはリゾリン脂質の放出抑制について調べてもよい。この場合、通常の細胞とｓＰＬＡ２を過剰発現する細胞を、標識したアラキドン酸内で培養することができる。通常の細胞と、過剰発現する細胞の両方の分泌生成物の間のシグナルを測定し、ｓＰＬＡ２発現の基準を得る。それから、選択化合物を培養物に加え、その培養物を標識ラベルアラキドン酸内で増殖する。その化合物が存在する状態で、細胞内のシグナル（例えば、アラキドン酸の生成量）に違いがある場合、この化合物は、ｓＰＬＡ２活性を抑制する。そして潜在的に抗炎症性化合物であるかもしれない。
【００１５】
生物学的に活性な化合物は、また、本発明のグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２Ｓに結びつくｓＰＬＡ２レセプタへの結合特性の有無について、選択化合物をスクリーニングすることによって識別することもできる。これらのレセプタは、ＨＩＶ−１抗ウイルス性を含むｓＰＬＡ２のいくつかの生物学的作用に関与していそうなＮタイプ・レセプタの科を含む。例えば、放射能標識した、あるいは蛍光標識したｓＰＬＡ２を競合結合実験に用いて、ｓＰＬＡ２結合の抑制の有無について選択化合物をスクリーニングすることができる。
【００１６】
生物学的に活性な化合物は、また、上記のようなｓＰＬＡ２の生物学的効果の変調について、選択化合物をスクリーニングすることによって識別することができる。例えば、選択化合物がある状態で、あるいはない状態で、本発明のｓＰＬＡ２を細胞に加え、細胞増殖、細胞回遊、細胞収縮あるいは細胞消滅について、細胞を分析してもよい。
【００１７】
したがって、もう一つの本発明の局面は、概して、上記の方法によってまず識別した化合物の使用に関する。本発明の上記方法によって識別した化合物を治療的に有効な量だけ含む新奇な医薬調合物を、本発明のグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２に係わる病気あるいは疾患を治療するための方法に用いてもよい。
【００１８】
本発明の他の利点及び特性は、第一のヒト・グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２のクローン化、ゲノム構築、染色体マッピング、組織分布及び異種発現に関する次の例を、添付図面を参照しながら読むことによって明らかになる。
【００１９】
Ｉ．実験手順。
【００２０】
Ｉ．１  ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の分子クローン化。
【００２１】
国立生物工学センター（the National Center for Biotechnology）に保存された遺伝子データベースで、ｔＢＬＡＳＴｎ配列整合プログラム（２８）を用いてｓＰＬＡ２同族体を捜した結果、ハチ毒グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２へ同族関係があるいくつかの領域を含む１３３８９３ヌクレオチドのヒト・ゲノム配列（ＰＡＣクローンＤＪ４１２Ａ９、ジェンバンク（GenBank）目録番号ＡＣ００５００５）が識別できた。これは、この大きなゲノムのクローンが、新奇なヒト・グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２のためのコード化を行ういくつかのエキソン及びイントロンを持つ遺伝子を含むことを示唆している。ヒトｓＰＬＡ２遺伝子のエキソン・イントロンの境界を、ハチ毒ｓＰＬＡ２とエキソン・イントロンのコンセンサス配列（２９）とに整合させることによって推論し、推定ｃＤＮＡ配列を提供した。ヒト組織内の推定ｃＤＮＡ配列の存在を証明するために、異なるヒトｃＤＮＡに対して、Ｃａ２＋ 結合ループ及び新奇なｓＰＬＡ２の活性部位ドメインの両側を挟むプライマーで、第一セットのＲＴ−ＰＣＲ実験（図１のＲＴ−ＰＣＲ１）を行った（図１、センス及びアンチセンス・プライマーが、各々、ヌクレオチド４４５から４６８と、６５５から６７９へ対応する）。ヒト胎児の肺ｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ生成物は、推定ｃＤＮＡに対応する核酸配列を持つことが分かった。次に、この配列を用いて、前述した（７）ように、５’及び３’ＲＡＣＥ?ＰＣＲ実験によって、全ｃＤＮＡ配列をクローニングした。手短かに、ヒト胎児の肺ポリＡ＋ ＲＮＡ（２μｇ、クロンテク（Clontech））を逆転写し、二本鎖ｃＤＮＡを、一般的なプライマーＳＰ６及びＫＳに対する配列を含むアダプタに結合した。３’あるいは５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲに対して、各々、ＫＳプライマーと特定な正転あるいは逆転プライマーとを用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ生成物を、ｐＧＥＭ?Ｔイージー・ベクター（プロメガ（Promega））へサブクローニングし、そして内部 [32Ｐ]標識のオリゴヌクレオチド・プローブを用いて、コロニーをスクリーニングした。３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ実験によって、１４５８ヌクレオチド配列をクローニングした。この配列は、その３’端部に、３０４のアミノ酸からなる枠内伸長、終結コドン、そして推定ポリアデニル化部位を含む５４６のヌクレオチドからなる３’非翻訳領域を含む。ＥＳＴデータベースを検索することによって、ＥＳＴ配列（ジェンバンク ＡＩ２８２７８７）を識別した。そしてこのＥＳＴクローンの配列を完全に決定することによって、その５’端部においてゲノム・クローンと同一の１６６のヌクレオチドの配列と、２７のヌクレオチド・ポリＡ配列とを含む１９３のヌクレオチドの配列が明らかになった。アンチセンス・プライマー（図１のヌクレオチド５１８から５４５）で５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ実験を行い、１５８のヌクレオチドの配列のクローン化ができ、ＲＴ−ＰＣＲ１ＤＮＡ分裂片の５’端部配列を２０のアミノ酸残留物によって伸長した。この１５８のヌクレオチドの配列の枠内で、上流ゲノム配列内に、シグナル・ペプチド配列（３０）の特徴を示す１９のアミノ酸の配列が後に続く開始メチオニンを発見した。上記ＥＳＴ配列から生じた推定開始メチオニンの上流のプライマー���図１のヌクレオチド−２５４から−２２９）とアンチセンス・プライマー（図１のヌクレオチド２２０５から２２３６）とを、全長ｈＧＩＩＩ・ｃＤＮＡ・ｓＰＬＡ２（図１のＲＴ−ＰＣＲ２）を増幅するようにデザインして用いた。このＲＴ−ＰＣＲ実験は、校正Ｐｗｏ・ＤＮＡ重合酵素を用いて、同じヒト胎児の肺ｃＤＮＡに行い、１５３０のヌクレオチドの読み取り枠を含む２５６４のヌクレオチドのｃＤＮＡ分裂片をクローニングした。この長い読み取り枠が、ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２遺伝子の適切なスプライシングから生じることを確認するために、エキソン・トラップ実験を行った。この目的のために、推定ｈＧＩＩＩ遺伝子を含むゲノム分裂片を、エキスパンド長テンプレートＰＣＲシステム（Expand long template PCR system（Roche））、ヒトＰＡＣクローンＤＪ４１２Ａ９（センス及びアンチセンス・プライマーのための、各々、ヌクレオチド３６１４３−３６１７５と４３０６２−４３０９２）からデザインしたプライマー、そしてテンプレートとしてのヒト・ゲノムＤＮＡで増幅した。予想６.９５キロベース対のゲノム分裂片を増幅して、エキソン・トラップｐＥＴ０１ベクター（MoBiTech）内にサブクローニングし、部分的に配列決定し、その結果生じたプラスミドをＣＯＳ細胞内へ形質移入した。移入の３日後に、全ＲＮＡを準備し、オリゴｄＴで逆転写し、そしてｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２読み取り枠を両側で挟むプライマーでＰＣＲを行った。１５３０のヌクレオチドのＰＣＲ分裂片は、増幅して、ｐＧＥＭ?Ｔイージー・ベクター（プロメガ）内へクローニングすることによって、全長ｈＧＩＩＩ読み取り枠をコード化することが分かった。親エキソン・トラップ・ベクターで移入したＣＯＳ細胞からのｃＤＮＡの増幅は観察されなかった。
【００２２】
Ｉ．２  ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の組織分布の分析
【００２３】
ヒト・ノーザン・ブロット（クロンテク・カタログ番号７７８０−１）を、ＵＬＴＲＡＨｙｂハイブリダイゼーション・バッファ（アンビオン（Ambion）カタログ番号８６７０）内において７０℃で１８時間、ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２のヌクレオチド配列４４５から６７９（図１）に対応する [32Ｐ]標識リボプローブで精査した。高感度ストライプ化可能なアンチセンス・リボプローブを、ストリップＥＺＲＮＡアンビオン・キット（カタログ番号１３６０）を用いて合成した。ブロットを、７０℃ において０.１％ ＳＤＳ 内で、最終的な厳密度０.１Ｘ ＳＳＣ（３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、ｐＨ７.０）へ洗浄し、トランスクリーンＨＥ増感スクリーンを持つコダック・バイオマックスＭＳフィルムにさらした。
【００２４】
Ｉ．３  ＣＯＳ細胞内ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の組換え発現。
【００２５】
ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２のための全長ｃＤＮＡ配列コードを、発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶｎｅｏ（インビトロゲン（Invitrogen））内へサブクローニングし、そしてコンセンサス・コザック配列を、前述（６）のように、タンパク質発現を強調するために加えた。サブクローニング後に、ＤＮＡ構成物を配列決定し、そしてＤＥＡＥデキストラン（７）を用いてＣＯＳ細胞内へ一時的に移入した。移入５日後に、細胞媒体を採取し、陰イオン交換コラムで部分的に精製した。手短かに、ＣＯＳ細胞培養液（９ｍｌ）を、４℃でｐＨ８.０において、先に２５ｍＭトリス内で平衡させたＱセファロース・ファスト・フロー（ファーマシア（Pharmacia））の１０ｍｌコラムへ１ｍｌ／ｍｉｎでロードした。非結合タンパク質を取り除くために平衡バッファで洗浄した後に、溶解プログラムを開始した（平衡バッファで１０分、その後、４０分に渡って０から１ＭへＮａＣｌを線状に増加させた）。記述（８）のように、ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２酵素作用を、１−パルミトイル−２−（１０−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホメタノールによる蛍光定量分析法を用いて検出した。ｈＧＩＩＩを含む分割部分のたまりを、４℃での遠心性限外濾過法（ＹＭ−１０膜、アミコン（Amicon））によって約１０倍に濃縮した。そして濃縮物を−２０℃で保存した。この分析法を用いては、親発現ベクターで移入したＣＯＳ細胞からの培養液内に、ホスホリパーゼＡ２ 活性が全く検出されなかった。
【００２６】
Ｉ．４  ＰＬＡ２活性研究
【００２７】
ホスファチジルグリセロール（５０Ｃｉ／モルで１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール内の１−パルミトイル−２−（［９、１０［ 3Ｈ］）−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール）、そしてホスファチジルコリン（１−パルミトイル−２−（［９、１０［ 3Ｈ］）−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、５０Ｃｉ／モル）の単層小胞の加水分解の初速度を測定する研究を、記述（８）のように、Ｑセファロース浄化ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２を用いて行った。初速度を、生成物対時間曲線の直線部分における三つの時点から計算した。記述（８）のように、ホスファチジルコリンの加水分解のｐＨ速度分布を得た。リン脂質加水分解のＣａ２＋依存性は、１０μＭ、ＥＧＴＡ（Ｃａ２＋無し）で、あるいはＥＧＴＡ超過のＣａＣｌ２で（上記のように）の蛍光定量分析法によって維持され、１０から６５０μＭ のＣａ２＋を生じた。
【００２８】
ＩＩ．結果及び議論
【００２９】
ＩＩ．１  ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の分子クローン化
【００３０】
種々の毒物ｓＰＬＡ２を持つ哺乳類の核配列データベースをスクリーニングすることによって、ハチ毒グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２にいくつかの領域において同族関係を示す１３３８９３のヌクレオチドの大きなヒト・ゲノム分裂片を識別することができた。これは、ゲノム・クローンが、推定ヒト・グループＩＩＩ（ｈＧＩＩＩ）ｓＰＬＡ２のためのコード化を行ういくつかのエキソン及びイントロンを持つ完全な遺伝子を含むことを示唆した。第一セットのセンス及びアンチセンス・プライマーを、ハチ毒ｓＰＬＡ２に同種のゲノム配列からデザインし、脳、膵臓、脾臓、骨格筋及び胎児の肺からのヒトｃＤＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲ実験（図１ＡのＲＴ−ＰＣＲ１）のために用いた。ＤＮＡ分裂片を、胎児の肺ｃＤＮＡから増幅し、その配列が、ゲノムの配列から予期した接合エキソンに対応することが分かった。５’及び３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ実験、その後の、ヒト胎児の肺ｃＤＮＡに対する第二回目のＲＴ−ＰＣＲ実験（図１ＡのＲＴ−ＰＣＲ２）によって、１５３０のヌクレオチドの大きな読み取り枠を含む２５６４のヌクレオチドのｃＤＮＡ分裂片をクローニングした。（詳細については図１及び実験手順を参照）。ＥＳＴデータベースをスクリーニングすることによって、ポリＡ尾状部分を含む１９３のヌクレオチドの単一のヒトＥＳＴ配列（ジェンバンクＡＩ２８２７８７）を識別した。このことは、このＥＳＴ配列が、ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２・ ｍＲＮＡの３’端部に対応する（図１Ａ）ことを示唆する。２５６４のヌクレオチドｃＤＮＡ配列とＰＡＣゲノム配列との比較は、ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２遺伝子が、約７キロベースの対に及ぶ少なくとも七つのエキソン及び六つのイントロンから構成される（図１Ａ）ことを示した。エキソン・トラップ実験を行い、エキソン・イントロン構造、そして１５３０のヌクレオチドの完全なｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２読み取り枠の配列を確認した（実験手順を参照）。ヒト染色体２２（３１）の配列決定プログラムによって、ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２遺伝子を含むＰＡＣクローンＤＪ４１２Ａ９（ジェンバンク AC００５００５）を生成した。このことは、ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２遺伝子が、ジェネトン（Genethon）マーカＤ２２Ｓ１１５０とＤ２２Ｓ２７３との間のこの染色体にマッピングされることを意味する。したがって、ｈＧＩＩＩ遺伝子の位置は、ヒト・グループ ＩＢ 、ＩＩＡ 、ＩＩＤ 、Ｖ及びＸのｓＰＬＡ２（８、９）のための遺伝子の位置とは別である。
【００３１】
他の哺乳類のｓＰＬＡ２に同様で、ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の読み取り枠は、１９のアミノ酸（３０）のシグナル・ペプチドで始まる。このことは、新奇な酵素が分泌されることを示す。他の哺乳類のｓＰＬＡ２（１１７から１４８のアミノ酸）に比べ、ｈＧＩＩＩ読み取り枠は、五つの推定Ｎグリコシル化部位（図１Ｂ）を含む４９０のアミノ酸（計算分子量５５.３ｋＤａ、計算ｐＩ９.１）からなるかなり大きなタンパク質に対してコードを特定する。このタンパク質は、Ｎ及びＣ末端領域（各々、１３０及び２１９の残留物）によって両側が挾まれた中央のｓＰＬＡ２ドメイン（１４１の残留物）で構成されている。毒物グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２（図２）との整合に基づくと、ｓＰＬＡ２ドメインは、１４１のアミノ酸（計算分子量１６ｋＤａ、計算ｐＩ５.４）からなり、グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２に特定な１０のシステイン、そしてＣａ２＋ループ及び触媒部位のキー残留物を含むグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の典型的な特徴を表す。ｓＰＬＡ２ドメインは、図２の位置１５にあるハチ毒ｓＰＬＡ２には保存されない二つの推定Ｎグリコシル化部位を含む。しかし、それらの一つは、ハチ毒ｓＰＬＡ２におけるグリコシル化部位の僅か４残留物分下流に位置する。興味深いことに、ｈＧＩＩＩドメインは、脊椎動物から識別した毒物グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２により類似している。実に、アメリカドクトカゲ（２７）から浄化したイソ型ＰＡ?２及びＰＡ?５（各々４３及び４６％）では、同一性が高いレベルで、他方、ミツバチ、マルハナバチ、ミツバチ及びサソリ・パンヂナス・インペレータ（Pandinus imperator）（図２）からの毒物グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２では、低いレベルで観察される。
【００３２】
ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２遺伝子のｓＰＬＡ２ドメインを両側で挟むＮ及びＣ末端領域へのかなりの同族関係を持つタンパク質データベース項目は、全く見つけることができなかった。それらは、共に塩基であり（各々、Ｎ及びＣ末端領域に対する計算ｐＩが９.１及び１１.３）４及び８のシステインを含む。このことは、ｓＰＬＡ２ドメインとは別に折れることを示唆するのかもしれない。これらの二つのドメインの機能は、現在全く分かっていない。一つの可能性としては、これらのドメインが、細胞からの分泌物中、あるいはその後の、ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の成熟に関与しているのかもしれない。ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の成熟行程は、未だ明確に説明されていないが、Ｎ末端ドメインの端部における塩基ダブレットＫＲの存在（図１Ｂ）は、このドメインが、ゴルジ体（３２）内のサブチリシンのようなタンパク質コンバターゼによって裂かれる長いプロペプチドとして役立つことを示唆している。興味深いことに、ハチ毒ｓＰＬＡ２の成熟タンパク質配列は、アルギニン残留物（２０）によって先行される。ヒト・グループＸｓＰＬＡ２（６）内には、アルギニン・ダブレットで終わる短いプロペプチド配列が発見されている。Ｃ末端領域は、また、同様にタンパク質成熟に関与するかもしれない塩基ダブレットを含むいくつかの塩基残留物を含む。さらに、Ｃ末端のドメインは、多数のプロリンと、そしてパンヂナス・インペレータ毒物（２２）からのインペラトキシンＩ内に見られるものと同様なペンタペプチドＲＲＬＡＲとを含む。この点に関して、これまでのところ、パンヂナス・インペレータ毒物ｓＰＬＡ２（２２、２４）を除き、僅かに成熟タンパク質配列及び部分的なｃＤＮＡ配列が判定されただけなので（２０、２３、２５−２７）、いくつかの毒物グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２もまた、このように大きなＮ及びＣ末端領域を持つのかどうかは、未だ明確にされていない。第二の可能性としては、Ｎ及びＣ末端ドメインが、ｓＰＬＡ２の二量体化、細胞ターゲティング、あるいは多分ｓＰＬＡ２レセプタ（４）を含む細胞タンパク質との相互作用に係わっているのかもしれない。最後の可能性としては、これらのドメインには、ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２活性を統制する役割があるのかもしれない。Ｎ終端を触媒残留物に繋ぐ水素結合ネットワークを含むグループＩ及びＩＩｓＰＬＡ２とは異なり、ハチ毒ｓＰＬＡ２のＸ線構造は、Ｎ終端が活性部位構造（１１）の一部を形成しないことを示す。実に、Ｎ末端の溶解タンパク質として発現した組換えハチ毒ｓＰＬＡ２は、分裂溶解（cleaved fusion）あるいは天然酵素（３３）として同じ触媒活性を示す。これは、Ｎ末端伸長（そして多分、触媒部位（１１）の一部ではないＣ末端領域）の存在が、ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の触媒活性に干渉しないであろうことを示唆する。したがって、全長を持つ、あるいは部分的に裂かれたｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２は、触媒作用的に活性であるかもしれないし、Ｎ及びＣ末端ドメインは、ｈＧＩＩＩ酵素特性に寄与するかもしれない。ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２タンパク質の成熟行程と、これらの追加的なＮ及びＣ末端領域の役割とを説明するためには、さらなる研究が必要であることは明らかである。
【００３３】
ＩＩ．２  ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の組織分布
【００３４】
ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の組織分布を、高厳密度でヒト・ノーザン・ブロット（図３）へのハイブリダイゼーションを行うことによって分析した。ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２は、腎臓、心臓、肝臓及び骨格筋内に豊富な、また、胎盤及び末梢血液白血球により少ないレベルで存在する４．４キロベースの単一転写物として発現する。脳、結腸、胸腺、脾臓、小腸及び肺内では、発現はほとんど検出されなかった。ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の発現パターンは、他のヒトｓＰＬＡ２のそれとは異なる。このことは、この新奇な酵素が特定な機能を持つことを示唆する。顕著に、腎臓内では、ヒト・グループＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＤ、Ｖ及びＸ・ｓＰＬＡ２（６、９）に対するｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２が発現するが、以前は、この組織での発現の検出はなかった。他方、ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２は、心臓内でヒト・グループＩＩＡ及びＶ・ｓＰＬＡ２と共発現し、そして肝臓及び骨格筋内でヒト・グループＩＩＡ・ｓＰＬＡ２（６）と共発現する。
【００３５】
ＩＩ．３  ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の組換え発現及び酵素特性
【００３６】
ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２・ｃＤＮＡをＣＯＳ細胞内に一時的に形質移入したとき、ｓＰＬＡ２活性が培養液内に蓄積した。このことは、ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２・ｃＤＮＡが、分泌活性酵素に対するコードを特定することを示す。１ＭのＮａＣｌを含む高塩バッファで、細胞可溶化物内において細胞を洗浄した後に測定したＰＬＡ２ 活性のレベルは低かった。このことは、ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２が、しっかりと細胞表面に拘束されるのではなく、効率良く分泌されることを示唆する。ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２を、Ｑセファロース速流コラム上でクロマトグラフィによって部分的に精製し、そして溶離ｓＰＬＡ２部分を、酵素特性を分析するために用いた。
【００３７】
動的な特徴があるすべての哺乳類ｓＰＬＡ２（７、８、３４、３５）に類似して、ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２は、両性イオン性ホスファチジルコリン小胞（図示せず）に比較して、陰イオン性ホスファチジルグリセロール小胞上でかなり大きな活性（初期速度に比べて１１倍）がある。この速度の違いが、陰イオン性対両性イオン性の界面に縛られた酵素の割合の増加によるものであるのか、ホスファチジルグリセロール対ホスファチジルコリンに関する界面ＫＭの低い値によるものであるのか、あるいは両方であるのかどうかの判定には、大量の純粋なｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２を用いた研究がさらに必要である。図４Ａに示すように、ｈＧＩＩＩによるホスファチジルメタノール小胞の加水分解の速度は、Ｋｄが６±０.８μＭの場合、完全にＣａ２＋に依存している。ホスファチジルメタノール小胞上へのｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の作用に対する６μＭのＣａ２＋のためのＫｄは、他のｓＰＬＡ２について報告されているミリモル以下の値よりもずいぶん低い。しかしながら、この研究で測定したＫｄ値は、見かけの値である。ｓＰＬＡ２に対して、活性部位へ結合するリン脂質はＣａ２＋への依存性があるため、観察したＣａ２＋に対する見かけのＫｄは、リン脂質基質（３６）ための酵素活性部位の親和性に依存する。また、界面結合は、酵素活性部位への長い連鎖リン脂質の結合のための必要条件であるため、Ｃａ２＋に対するＫｄは、小胞界面への酵素の親和性によって調整される。この点に関して、ヒトグループＩＩＡ・ｓＰＬＡ２は、基質（３７、３８）のない状態で、ミリモルの親和性でＣａ２＋に結合するが、（界面及び活性部位への結合を支持する）ホスファチジルグリセロールが存在する状態では、Ｃａ２＋に対するＫｄは、低いミクロモルの範囲（３９）にある。多量の組換えｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２が利用可能であれば、基質のない状態で、Ｃａ２＋に対する酵素の親和性を測定するために分光学的な方法を用いることが可能である。図４Ｂに示すように、ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２は、ｐＨ８において、ホスファチジルコリン小胞上での活性が最適になる。ｈＧＩＩＩのｐＨに対する分布は、たいていのｓＰＬＡ２（１２）で類似する。ｐＨ８までの率の増加では、恐らく活性部位ヒスチジンの脱プロトン化の影響が表れる。これが、基質エステル・カルボニル・グループ（１３）への水分子の攻撃に対する一般的な塩基として機能する。
【００３８】
ＩＩ．４  結論
【００３９】
これまでの数年間で、分子生物学的アプローチによって、哺乳動物（５−９）内のｓＰＬＡ２の多様な存在が明らかになってきた。哺乳類のｓＰＬＡ２科は、グループＩ、五つのグループＩＩ、グループＶ及びグループＸ・ｓＰＬＡ２を含む、１４から１７のｋＤａの八つの要素からなる。また 、二つのｓＰＬＡ２のようなドメイン（４０、４１）を含む４６９の残留物の大きな分泌タンパク質からなるところの、内耳の細胞外平衡砂コンプレックスの主要なタンパク質、オトコニン９５も含む。これらすべてのｓＰＬＡ２は、保存主要構造を持ち、共通して種々の二硫化物を持つ。また、いくつかは同様のゲノム構築を持つ。これらのｓＰＬＡ２は、したがって、構造的に関係があり、タンパク質の同じセット内に分類できる酵素である。すなわち、Ｉ／ＩＩ／Ｖ／Ｘ・ｓＰＬＡ２コレクション。しかし、すべて別個の組織分布及び機能を持つことに注意すべきである。また、哺乳類ｓＰＬＡ２科は、Ｉ／ＩＩ／Ｖ／Ｘ・ｓＰＬＡ２コレクションに属さないヒト・グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２からなる。ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２は、上記ｓＰＬＡ２とは別個のｓＰＬＡ２一次配列を持ち、余分にＮ及びＣ末端領域を含み、そして異なるゲノム構築を持つ。これらのことは、哺乳動物が、グループＩ／ＩＩ／Ｖ／ＸコレクションのｓＰＬＡ２と、別個のグループＩＩＩのｓＰＬＡ２とを発現することができることを示す。興味深いことに、ヘビ毒物内に見られるｓＰＬＡ２はグループＩあるいはＩＩ酵素であるが、トカゲ毒物内に見られるｓＰＬＡ２がグループＩＩＩ（１５）に属するため、爬虫類で同じことを観察することができる。さらに、先に（１５）指摘したように、単一のヘビ種が、毒腺以外の種々の組織に存在する異なるグループからのいくつかのｓＰＬＡ２を発現する可能性が高い。最後に、これまで報告があった無脊椎動物の毒物内のほとんどのｓＰＬＡ２が、グループＩＩＩ酵素（２０、２２−２５）であるように思われるが、核データベースの精査は、無脊椎動物もまた、他の組織内において、グループＩ／ＩＩ／Ｖ／ＸコレクションからのｓＰＬＡ２を発現することを示している。要するに、脊椎動物及び無脊椎動物の両方が、グループＩ／ＩＩ／Ｖ／Ｘコレクションの、そしてグループＩＩＩの種々のｓＰＬＡ２を発現し、これらのｓＰＬＡ２が種々の組織に存在して特定の機能を果たすようである。最後に、哺乳動物内に見られる現在のｓＰＬＡ２に基づいて推測することは誘惑であるが、脊椎動物は、グループＩＩＩコレクションからではなく、グループＩ／ＩＩ／Ｖ／ＸコレクションからｓＰＬＡ２の多様性を生じさせることに「決めた」と思われる。しかしながら、哺乳動物内で一つ以上のグループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２が発現するのか、そして爬虫類及び無脊椎動物も自身のｓＰＬＡ２の多様性を生じる同じ「選択」をしたのかどうかの判定はこれからである。
【００４０】
結論として、明らかにグループＩＩＩに属する新奇なヒト・ｓＰＬＡ２をクローニングした。このｓＰＬＡ２は、既知の毒物グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２と比較して、別個の複数の構造的特徴を持つように思われる。このことは、ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２が、これらの毒物ｓＰＬＡ２（４）の構造的「同等物」ではない可能性を示唆する。その組織分布は、他のヒトｓＰＬＡ２とは重複しないようである。このことは、特定な機能を示唆するものである。私たちが行った初期調査では、心臓、腎臓、肝臓及び骨格筋内で、ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の強い発現が見られたが、通常の状態、そして病理学的条件下で、種々様々の組織、細胞タイプ及び細胞外液における大規模な分析を行うことによって、思いもよらないｓＰＬＡ２機能を強調することができるだろう。これまでのところ、多くの組織及び細胞内にｓＰＬＡ２が見いだされ、それらの機能は、徐々に明らかになっている。それらのいくつかは、炎症の効果的な媒介物であり、それらのレベルは、多数の炎症性の病気の間に、また、前炎症性サイトカイン及びエンドトキシン（３、４、９、４２）の接種後に高まる。ｓＰＬＡ２のレベルは、また、腫瘍内で増加するため、ｓＰＬＡ２が細胞増殖及び腫瘍（３、４、９）に寄与していると提案されている。ｓＰＬＡ２は、また、虚血（３、４３）後に増加するため、神経伝達（４４）にも役割があるのかもしれない。最後に、ｓＰＬＡ２ｓは、異なる菌種（４５−４８）に対してホスト防衛機構に関与していることは分かっていたが、最近、ハチ毒グループＩＩＩを含むｓＰＬＡ２が強力なヒト免疫不全ウイルス・タイプ１抑制因子（４９）であることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の遺伝子（Ａ）及びｃＤＮＡ核酸配列（Ｂ）の概略図である。Ａ．上に、ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２遺伝子のエキソン・イントロン構造を示し、そして下に、ＥＳＴ配列及び異なるｃＤＮＡ・ＰＣＲ生成物を示し、ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２・ｃＤＮＡ全長の配列を判定するために拡大した（パネルＢ）。エキソン及びイントロンは、各々、長方形及び直線で示している。ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２遺伝子のメチオニン開始コドン及び終結コドンは、エキソン１及び７に位置しており、ｓＰＬＡ２ドメインは、エキソン１から４によってコード化されている。Ｂ．コンセンサスｃＤＮＡ配列を示す。予測シグナル・ペプチド部分を四角で、そして、五つの推定Ｎグリコシル化部位を正方形で囲み、ｓＰＬＡ２ドメインに下線を引き、エキソン・イントロン境界を矢で示す。
【図２】  グループＩＩＩ・ｓＰＬＡ２のアミノ酸配列の配置を示す。成熟ｓＰＬＡ２タンパク質の配列である。ｓＰＬＡ２配列は（２０、２２、２３、２５−２７）からである。クラゲ及びメキシコ・ビード・トカゲのｓＰＬＡ２（２５、２６）については、部分的な配列のみを報告する。
【図３】  ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の組織分布のノーザン・ブロット分析（Northern blot analysis）を示す。異なるヒト成体組織からのポリＡ＋ ＲＮＡを２μｇ含む市販のノーザン・ブロットを、「実験手順」に記述したように、[32Ｐ]標識ｓＰＬＡ２ＲＮＡプローブで高度に厳密にハイブリッド化した。「sk. musc.」は、骨格筋。「small intest.」は、小腸。「PBL」は、末梢血液白血球。「kb」は、キロベース。ブロットは７日間さらした。
【図４】  ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２の酵素特性を示す。Ａ．Ｑセファロース（Q - Sepharose）浄化ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２による、１−パルミトイル−２−（１０−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホメタノール小胞の加水分解のＣａ２＋依存。Ｂ．Ｑセファロース浄化ｈＧＩＩＩ・ｓＰＬＡ２による、ホスファチジルコリン小胞の加水分解のｐＨ依存。
【参考文献】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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