(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのポリヌクレオチドに対する同一性が少なくとも９５％である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドであって、血管内皮細胞増殖活性、ｃ−ｆｏｓプロモーターからの転写促進活性、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)プロモーターからの転写促進活性、および、血管新生活性からなる群から選択される活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ該ペプチドの発現ベクターを含有する、血管新生のための薬学的組成物。
【請求項２】
以下：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのポリヌクレオチドに対する同一性が少なくとも９５％である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドであって、血管内皮細胞増殖活性、ｃ−ｆｏｓプロモーターからの転写促進活性、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)プロモーターからの転写促進活性、および、血管新生活性からなる群から選択される活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ該ペプチドの発現ベクターを含有する、血管内皮細胞増殖のための薬学的組成物。
【請求項３】
以下：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｃ）（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのポリペプチドのアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
からなる群から選択されるポリペプチドを含有する血管新生のための薬学的組成物であって、ここで、前記ポリペプチドは、血管内皮細胞増殖活性、ｃ−ｆｏｓプロモーターからの転写促進活性、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)プロモーターからの転写促進活性、および血管新生活性からなる群から選択される活性を有する、薬学的組成物。
【請求項４】
以下：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｃ）（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのポリペプチドのアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
からなる群から選択されるポリペプチドを含有する血管内皮細胞増殖のための薬学的組成物であって、ここで、前記ポリペプチドは、血管内皮細胞増殖活性、ｃ−ｆｏｓプロモーターからの転写促進活性、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)プロモーターからの転写促進活性、および血管新生活性からなる群から選択される活性を有する、薬学的組成物。
【請求項５】
以下：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｃ）（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのポリペプチドのアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
からなる群から選択されるポリペプチドを含有するインスリン様増殖因子−１(ＩＧＦ−１)の産生増強のための薬学的組成物であって、ここで、前記ポリペプチドは、血管内皮細胞増殖活性、ｃ−ｆｏｓプロモーターからの転写促進活性、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)プロモーターからの転写促進活性、および血管新生活性からなる群から選択される活性を有する、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、血管内皮細胞増殖活性、ｃ−ｆｏｓプロモーターからの転写促進活性、ＶＥＧＦプロモーターからの転写促進活性、および／または血管新生活性を有する新規のポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】  血管新生を促進することによって、閉塞性動脈疾患、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、ならびに、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞などの虚血性心疾患・脳疾患を処置し得る（非特許文献１〜７）。【０００３】  危険な四肢の虚血は、毎年百万人当たり５００〜１０００人の割合で発生すると推定されている。これらの患者の大多数は、動脈閉塞が広い部位にわたっているために、手術あるいは経皮的な血管再生によって治療することができない。従って、血管新生のような新しい治療法が、このような患者の処置において重要になると考えられる。血管新生を促進するタンパク質としては、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）やＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）（特許文献１および特許文献２）等が公知である。しかし、ＶＥＧＦには、浮腫を起こしやすいという欠点がある。危険な四肢の虚血や心筋虚血を有する患者において、内因性のＶＥＧＦのレベルを上げるために遺伝子導入を行うという方法が研究されている。しかし、これらの患者に対するＶＥＧＦ治療は、治療に付随して、手足に浮腫を生じることがある。また、ＶＥＧＦは、虚血脳において血液脳関門の漏れも報告されている。また、ＨＧＦの投与により細胞の遊走能が上昇するが、そこに癌があれば転移を誘発する危険性もあるなどの欠点を有する。そこで、閉塞性動脈疾患、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、ならびに、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞などの虚血性心疾患・脳疾患の処置のための、新規ポリペプチドが求められている。
【特許文献１】特表平１０−５１０７１
【特許文献２】特表２００１−５１７０７５
【非特許文献１】血管新生療法−基礎と臨床−、内田康美・小塚裕編、真興交易株式会社医書出版部、１９９７年５月２５日
【非特許文献２】Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１７  ７７９−７８１，２００３
【非特許文献３】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９７，１１１４−１１２３，１９９８
【非特許文献４】Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，３４８，３７０−３７４，１９９６
【非特許文献５】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０５，１４９１−９６，２００２
【非特許文献６】Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７，４１７−４２７，２０００
【非特許文献７】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０９，４２４−４３１，２００４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  本発明は、血管内皮細胞増殖活性、ｃ−ｆｏｓプロモーターからの転写促進活性、ＶＥＧＦプロモーターからの転写促進活性、および／または血管新生活性を有する新規のポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することを課題とする。また、本発明は、これらポリペプチドおよび／またはポリペプチドを含む、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、末梢血管病、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、虚血性心疾患、および虚血性脳疾患からなる群から選択される疾患の処置のための薬学的組成物、ならびにこれら疾患の処置方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】  本発明は、血管内皮増殖促進因子は血管新生を促す可能性が高いという知見に基づき、新規のスクリーニング方法を用いることによって、新規のペプチドをコードする核酸を単離することによって完成された。【０００６】  したがって、本発明は、以下を提供する。
１．以下：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を含む、ポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドであって、ここで、前記ポリヌクレオチドは、血管内皮細胞増殖活性、ｃ−ｆｏｓプロモーターからの転写促進活性、ＶＥＧＦプロモーターからの転写促進活性、および血管新生活性からなる群から選択される活性を有するペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
２．配列番号１に記載の塩基配列を有する、項目１に記載のポリヌクレオチド。
３．配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする、項目１に記載のポリヌクレオチド。
４．血管新生活性を有するペプチドをコードする、項目１に記載のポリヌクレオチド。
５．血管内皮細胞増殖活性を有するペプチドをコードする、項目１に記載のポリヌクレオチド。
６．項目１に記載のポリヌクレオチドを含有する、血管新生のための薬学的組成物。
７．項目１に記載のポリヌクレオチドを含有する、血管内皮細胞増殖のための薬学的組成物。
８．項目１に記載のポリヌクレオチドを含有する、閉塞性動脈疾患、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、虚血性心疾患、および虚血性脳疾患からなる群から選択される疾患の処置のための薬学的組成物。
９．組織の血管新生を生じさせる方法であって、以下；
（１）血管新生を生じさせる組織を提供する工程；および
（２）該血管内皮細胞に項目１に記載のポリヌクレオチドを含む核酸を導入する工程、を包含する、方法。
１０．前記血管新生は、インビボ、エキソビボまたはインビトロで行われる、項目９に記載の方法。
１１．前記組織は、閉塞性動脈疾患、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、虚血性心疾患、および虚血性脳疾患からなる群から選択される疾患を含む状態にある、項目９に記載の方法。
１２．血管内皮細胞を増殖させる方法であって、以下；
（１）血管内皮細胞を提供する工程；および
（２）該血管内皮細胞に項目１に記載のポリヌクレオチドを含む核酸を導入する工程、を包含する、方法。
１３．前記血管内皮細胞の増殖は、インビボ、エキソビボまたはインビトロで行われる、項目１２に記載の方法。
１４．前記血管内皮細胞は、閉塞性動脈疾患、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、虚血性心疾患、および虚血性脳疾患からなる群から選択される疾患を含む組織中にある、項目１２に記載の方法。
１５．項目１に記載のポリヌクレオチドを含む、プラスミド。
１６．項目１に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子導入ベクター。
１７．血管内皮細胞を増殖させる方法であって、以下；
（１）血管内皮細胞を提供する工程；および
（２）該血管内皮細胞に項目１６に記載の遺伝子導入ベクターを接触させる工程、を包含する、方法。
１８．項目１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
１９．以下：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列またはそのフラグメントによってコードされるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、ポリペプチド、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチド；および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリペプチドのアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、からなる群から選択されるポリペプチドであって、ここで、前記ポリペプチドは、血管内皮細胞増殖活性、ｃ−ｆｏｓプロモーターからの転写促進活性、ＶＥＧＦプロモーターからの転写促進活性、および血管新生活性からなる群から選択される活性を有する、ポリペプチド。
２０．配列番号１に記載の塩基配列によってコードされる、項目１９に記載のポリペプチド。
２１．配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、項目１９に記載のポリペプチド。
２２．血管新生活性を有する、項目１９に記載のポリペプチド。
２３．血管内皮細胞増殖活性を有する、項目１９に記載のポリペプチド。
２４．項目１９に記載のポリペプチドを含有する、血管新生のための薬学的組成物。
２５．項目１９に記載のポリペプチドを含有する、血管内皮細胞増殖のための薬学的組成物。
２６．項目１９に記載のポリペプチドを含有する、閉塞性動脈疾患、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、虚血性心疾患、および虚血性脳疾患からなる群から選択される疾患の処置のための薬学的組成物。
２７．組織の血管新生を生じる方法であって、以下；
（１）血管新生する組織を提供する工程；および
（２）該血管内皮細胞に項目１９に記載のポリペプチドを接触させる工程、を包含する、方法。
２８．前記血管新生は、インビボ、エキソビボまたはインビトロで行われる、項目２７に記載の方法。
２９．前記組織は、閉塞性動脈疾患、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、虚血性心疾患、および虚血性脳疾患からなる群から選択される疾患を含む状態にある、項目２７に記載の方法。
３０．血管内皮細胞を増殖させる方法であって、以下；
（１）血管内皮細胞を提供する工程；および
（２）該血管内皮細胞に項目１８に記載のポリペプチドを接触させる工程、を包含する、方法。
３１．前記血管内皮細胞の増殖は、インビボ、エキソビボまたはインビトロで行われる、項目３０に記載の方法。
３２．前記血管内皮細胞は、閉塞性動脈疾患、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、虚血性心疾患、および虚血性脳疾患からなる群から選択される疾患を含む組織中にある、項目３０に記載の方法。
３３．項目１に記載のポリヌクレオチドを含む抗菌剤。
３４．項目１８または１９に記載のポリペプチドを含む抗菌剤。
３５．項目１に記載のポリヌクレオチドを含む、感染症を処置するための薬学的組成物。
３６．項目１８または１９に記載のポリペプチドを含む、感染症を処置するための薬学的組成物。
３７．項目１に記載のポリヌクレオチドを含む、ＩＧＦ産生増強のための組成物。
３８．項目１８または１９に記載のポリペプチドを含む、ＩＧＦ産生増強のための組成物。
【発明の効果】
【０００７】  本発明によって、血管内皮細胞増殖活性、ｃ−ｆｏｓプロモーターからの転写促進活性、ＶＥＧＦプロモーターからの転写促進活性、および血管新生活性の少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。【０００８】  さらに、本発明によって、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、末梢血管病、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、虚血性心疾患、および虚血性脳疾患からなる群から選択される疾患の処置方法、ならびに処置のための薬学的組成物もまた、提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】［図１］図１は、本発明の核酸の単離のスキームである。
［図２］図２は、本発明において単離された核酸のｃ−ｆｏｓプロモーターアッセイの結果を示す図である。
［図３］図３は、本発明において単離されたクローンｐ３７４３の、ｃ−ｆｏｓプロモーターアッセイおよびＶＥＧＦプロモーターアッセイの結果である。
［図４］図４は、ヒト大動脈内皮細胞およびヒト大動脈平滑筋細胞におけるＭＴＳアッセイの結果である。
［図５］図５は、血管新生活性測定の結果を示す写真である。
［図６］図６は、血管新生定量ソフトによる画像解析を示す図である。
［図７］図７は、本発明の候補配列を模式的に示した図である。
［図８］図８は、ｐ３７４３−ｆ１およびｐ３７４３−ｆ２のｃ−ｆｏｓプロモーターアッセイを示す結果である。
［図９］図９は、ヒト大動脈血管内皮細胞の増殖に対するＦ２ペプチドの影響（ＭＴＳアッセイ）を示す結果である。
［図１０］図１０は、種々の濃度のＦ２ペプチドの、内皮細胞増殖に対する影響を示す結果である。
［図１１］図１１は、種々の濃度のＦ２ペプチドの、内皮細胞増殖に対する影響を示す結果である。比較対照として、コントロールペプチドおよびＶＥＧＦの結果を示す。
［図１２］図１２は、Ｆ２ペプチドの、インビボでの血管新生促進活性を示す結果である。比較対照として、コントロールペプチドの結果を示す。
［図１３］図１３は、抗ＣＤ３１抗体を用いる免疫染色を用いて、Ｆ２ペプチドの、インビボでの血管新生促進活性を示す結果である。比較対照として、ネガティブコントロール、コントロールペプチド、およびＶＥＧＦの結果を示す。
［図１４］図１４は、種々の濃度のＦ２ペプチドと、種々の濃度のＬＬ−３７ペプチドとの、内皮細胞増殖に対する影響を示す結果である。
［図１５］図１５は、種々の濃度のＦ２ペプチドと、種々の濃度のＬＬ−３７ペプチドとの、血管新生促進活性を示す結果である。
［図１６］図１６は、種々の増殖因子をコードするｍＲＮＡ発現量に対する、Ｆ２ペプチドの影響を示す結果である。
配列表の説明【００１０】配列番号１：血管新生活性を有する新規ペプチドＦ２をコードする核酸配列
配列番号２：血管新生活性を有する新規ペプチドＦ２のアミノ酸配列
配列番号３：プラスミドｐ３７４３のインサート配列配列番号４：血管新生活性を有する新規ペプチドＦ１をコードする核酸配列
配列番号５：血管新生活性を有する新規ペプチドＦ１のアミノ酸配列
配列番号６：内皮細胞の遊走活性測定のためのコントロールペプチド
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】  以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞または形容詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。【００１２】  （用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。【００１３】  本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。また、本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の同一性とは、２以上の対比可能な配列の、互いに対する同一の配列（個々の核酸、アミノ酸など）の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて相同性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、相同性と類似性とは同じ数値を示す。【００１４】  本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて算出される。【００１５】  本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。【００１６】  本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。【００１７】  本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。【００１８】  本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。【００１９】  本明細書で使用される場合、「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」は互換可能に使用される。「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」としては、「ウイルスエンベロープベクター」および「リポソームベクター」が挙げられるが、これらに限定されない。【００２０】  本明細書で使用される場合、「ウイルスエンベロープベクター」とは、ウイルスエンベロープ中に外来遺伝子を封入したベクター、またはウイルスエンベロープ由来のタンパク質を含む成分中に外来遺伝子を封入したベクターをいう。遺伝子導入ベクターの調製のために使用されるウイルスとしては、野生型ウイルスであっても、組換え型ウイルスであってもよい。【００２１】  本発明において、ウイルスエンベロープまたはウイルスエンベロープ由来タンパク質の調製のために使用されるウイルスとしては、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、パラミクソウイルス科に属するウイルスが、より好ましくは、ＨＶＪ（センダイウイルス）が、用いられる。【００２２】  ウイルスエンベロープ由来タンパク質としては、例えば、ＨＶＪのＦタンパク質、ＨＮタンパク質、ＮＰタンパク質およびＭタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。���００２３】  本明細書で使用される場合、「リポソームベクター」とは、リポソーム中に外来遺伝子を封入したベクターをいう。リポソームベクターの調製のために使用される脂質としては、例えば、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノラミン）およびホスファチジルコリンなどの中性リン脂質、コレステロール、ホスファチジルセリンおよびホスファチジン酸などの負電荷リン脂質、ならびにＤＣ−コレステロール（ジメチルアミノエタンカルバモイルコレステロール）およびＤＯＴＡＰ（ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン）などの正電荷脂質が挙げられるが、これらに限定されない。【００２４】  本明細書で使用される場合、「リポソーム」とは、脂質二重膜の一種である。例えば、レシチンのようなリン脂質を５０％（重量比）以上の水に、そのリン脂質固有のゲル−液晶相転移温度以上で懸濁すると脂質二重層からなる、内部に水相を有する閉鎖小胞が形成される。この小胞をリポソームという。二分子膜が何枚もタマネギ状に重なった多重膜リポソーム（ＭＬＶ）と、膜が１枚のリポソームに大別される。後者はまた、ホスファチジルコリンのようなリン脂質のサスペンション（懸濁液）を、ミキサーで激しく攪拌して分散した後、超音波処理を行なうことによっても調製することが可能である。【００２５】  膜が１枚のリポソームはさらに、その粒子径によって小さな単膜リポソーム（ＳＵＶ）と大きな単膜リポソーム（ＬＵＶ）とに分類される。ＭＬＶは、脂質薄膜に水を加えて機械的振動を与えることにより調製される。ＳＵＶは、ＭＬＶを超音波するか、または脂質と界面活性剤の混合溶液から界面活性剤を透析などで除去するなどによって調製される。また、これ以外にも、（１）ＳＵＶの凍結融解を繰り返して、ＬＵＶを調製する方法、（２）酸性リン脂質でできたＳＵＶをＣａ２＋の存在下で融合させ、そしてこのＣａ２＋をＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）で除去することにより調製する方法、（３）脂質のエーテル溶液と水のエマルジョンからエーテルを留去しながら、相の転換を行ってＬＵＶなどを調製する方法（逆相蒸発法リポソーム；ＲＥＶ）が周知である。【００２６】  本明細書で使用される場合、「不活性化」とは、ゲノムを不活性化したウイルスをいう。この不活性化ウイルスは、複製欠損である。好ましくは、この不活性化は、ＵＶ処理またはアルキル化剤による処理によって、なされる。【００２７】  本明細書において、「ＨＶＪ」および「センダイウイルス」は、互換可能に用いられ得る。例えば、本明細書において「ＨＶＪのエンベロープ」と「センダイウイルスのエンベロープ」とは同一の意味を示す語句として用いられる。【００２８】  本明細書において「センダイウイルス」とは、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス属に属し、細胞融合作用をもつウイルスをいう。ウイルス粒子は、エンベロープをもち、直径１５０〜３００ｎｍの多形性を示す．ゲノムは、約１５５００塩基長のマイナス鎖ＲＮＡである。ＲＮＡポリメラーゼを持ち、熱に不安定で、ほとんどあらゆる種類の赤血球を凝集し、また溶
血性を示す。【００２９】  本明細書において、「ＨＡＵ」とは、ニワトリ赤血球０．５％を凝集可能なウイルスの活性をいい、１  ＨＡＵは、ほぼ２４００万ウイルス粒子に相当する（Ｏｋａｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｋｅｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４、２０９〜２１３、１９６１）。【００３０】  本明細書において使用する場合、「抗菌剤」とは、原核生物、真菌からなる群から選択される生物の増殖を、停止、抑制、および／または遅延させる作用を有する薬剤をいう。本発明の抗菌剤が対象とする原核生物としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓからなる群から選択される属等に属する原核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗菌剤が対象とする真菌細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｐｉｃｈｉａなどに属する酵母菌株、ならびにＮｅｕｒｏｓｐｏｒａに属する真菌からなる群から選択される属等に属する真菌が挙げられるが、これらに限定されない。【００３１】  本明細書において使用する場合、「感染症」とは、哺乳動物のような高等動物において、原核生物、真菌からなる群から選択される生物の増殖によって引き起こされる疾患をいう。【００３２】  本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは��Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。【００３３】  本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ  ａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：���  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。【００３４】  ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。【００３５】  本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。【００３６】  本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。【００３７】  約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１ＭＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。【００３８】  配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号１の核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭリン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；４２℃の温度で７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ  ＮａＣｌ；６０ｍＭクエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭリン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ；３０ｍＭクエン酸ナトリウム）；１％ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭリン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１５ｍＭクエン酸ナトリウム）；０．１％ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１に示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。【００３９】  本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列（他
の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする）と比較したときに、付加または欠失（すなわちギャップ）が含ま
れる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（８）：２４４４−２４４８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（２）：４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２）があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。【００４０】  （１）ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較；
（２）ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３）ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４）ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリー配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５）ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリ配列を６つの読み枠で変換したものを、６つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。【００４１】  ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）されると好ましい。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８参照のこと）。【００４２】  （遺伝子、タンパク質分子、核酸分子などの改変）
あるタンパク質分子において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。【００４３】  上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。【００４４】  あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。【００４５】  当該分野において、親水性指数もまた、改変設計において考慮され得る。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。【００４６】  本明細書において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、±２以内のもの同士、好ましくは±１以内のもの同士、より好ましくは±０．５以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。【００４７】  本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような改変体としては、基準となる核酸分子またはポリペプチドに対して、１または数個の置換、付加および／または欠失、あるいは１つ以上の置換、付加および／または欠失を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種において、もとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。【００４８】  本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ  Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。【００４９】  本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、短縮化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、ホスホリル化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。【００��０】  本明細書において使用される用語「ペプチドアナログ」または「ペプチド誘導体」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体が付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。【００５１】  本発明のポリペプチドがポリマーに結合している、化学修飾されたポリペプチド組成物は、本発明の範囲に包含される。このポリマーは、水溶性であり得、水溶性環境（例えば、生理学的環境）でこのタンパク質の沈澱を防止し得る。適切な水性ポリマーは、例えば、以下からなる群より選択され得る：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物に基づくポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール。この選択されたポリマーは、通常は改変され、単一の反応性基（例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド）を有し、その結果、重合度は制御され得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、そして、このポリマーは分枝状でも分枝状でなくてもよく、そしてこのようなポリマーの混合物はまた、使用され得る。この化学修飾された本発明のポリマーは、治療用途に決定付けられる場合、薬学的に受容可能なポリマーが使用するために選択される。【００５２】  このポリマーがアシル化反応によって改変される場合、このポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。あるいは、このポリマーが還元アルキル化によって改変される場合、このポリマーは単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。好ましい反応性アルデヒドは、ポリエチレングリコール、プロピオンアルデヒド（このプロピオンアルデヒドは、水溶性である）または、そのモノＣ１〜Ｃ１０の、アルコキシ誘導体もしくはアリールオキシ誘導体である（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号（これは、本明細書中で全体が参考として援用される）を参照のこと）。【００５３】  本発明のポリペプチドのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、例えば、以下の参考文献に記載されるような、当該分野で公知の、任意のペグ化反応によって実施され得る：Ｆｏｃｕｓｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３，４−１０（１９９２）；ＥＰ  ０  １５４  ３１６；およびＥＰ  ０  ４０１  ３８４（これらの各々は、本明細書中で、全体が参考として援用される）。好ましくは、このペグ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施される。本発明のポリペプチドのペグ化のための好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本明細書中で使用される場合、「ポリエチレングリコール」は、ＰＥＧの任意の形態の包含することを意味し、ここで、このＰＥＧは、他のタンパク質（例えば、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシポリエチレングリコールまたはモノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アリールオキシポリエチレングリコール）を誘導体するために使用される。【００５４】  本発明のポリペプチドの化学誘導体化を、生物学的に活性な物質を活性化したポリマー分子と反応させるのに使用される適切な条件下で、実施され得る。ペグ化した本発明のポリペプチドを調製するための方法は、一般に以下の工程を包含する：（ａ）ポリペプチドが１以上のＰＥＧ基に結合するような条件下で、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの、反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）とこのポリペプチドを反応させる工程および（ｂ）この反応生成物を得る工程。公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて、最適な反応条件またはアシル化反応を選択することは当業者に容易である。【００５５】  ペグ化された本発明のポリペプチドは、一般に、本明細書中に記載のポリペプチドを投与することによって、緩和または調節され得る状態を処置するために使用され得るが、しかし、本明細書中で開示された、化学誘導体化された本発明のポリペプチド分子は、それらの非誘導体分子と比較して、さらなる活性、増大された生物活性もしくは減少した生物活性、または他の特徴（例えば、増大された半減期または減少した半減期）を有し得る。本発明のポリペプチド、それらのフラグメント、改変体および誘導体は、単独で、併用して、または他の薬学的組成物を組み合わせて使用され得る。これらのサイトカイン、増殖因子、抗原、抗炎症剤および／または化学療法剤は、徴候を処置するのに適切である。【００５６】  同様に、「ポリヌクレオチドアナログ」、「核酸アナログ」は、ポリヌクレオチドまたは核酸とは異なる化合物であるが、ポリヌクレオチドまたは核酸と少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ポリヌクレオチドアナログまたは核酸アナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体が付加または置換されているものが含まれる。【００５７】  本明細書において使用される核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる���【００５８】  このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。【００５９】  本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。【００６０】  （遺伝子工学）
本発明において用いられる配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。【００６１】  本発明において用いられ得る原核細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴＴＭ４２ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。【００６２】  本発明において用いられ得る動物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）］、マウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＳＣＶ）に基づいたレトロウイルス型発現ベクター、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰなどが例示される。【００６３】  哺乳動物細胞での発現のための強力なプロモーターとしては、例えば、種々の天然のプロモーター（例えば、ＳＶ４０の初期プロモーター、アデノウイルスのＥ１Ａプロモーター、ヒト  サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーター、ヒト延長因子−１（ＥＦ−１）プロモーター、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ最小熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ）のプロモーター、ヒト  メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒト  ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ヒト  アクチンプロモーター）、および人工のプロモーター（例えば、ＳＲαプロモーター（ＳＶ４０初期プロモーターとＨＴＬＶのＬＴＲプロモーターの融合）、ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶ−ＩＥエンハンサーとニワトリ  アクチンプロモーターのハイブリッド）のような融合プロモーター）が周知であることから、これら周知のプロモーターまたはその改変体を用いることによって、組換え発現の発現量を容易に上昇させることができる。【００６４】  大腸菌を宿主細胞として使用する場合、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌およびファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ  ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。【００６５】  本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。【００６６】  本明細書におい��、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、ＮｅＷ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。【００６７】  また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。【００６８】  本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１が例示される。【００６９】  本明細書において使用される場合、動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト結腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−５Ｙ、マウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２Ａなどが例示される。【００７０】  本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法などが例示される。【００７１】  本明細書において、レトロウイルスの感染方法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  前出（特にＵｎｉｔｓ  ９．９−９．１４）などに記載されるように、当該分野において周知であり、例えば、トリプシナイズして胚性幹細胞を単一細胞懸濁物（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）にした後、ウイル���産生細胞（ｖｉｒｕｓ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）（パッケージング細胞株＝ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）の培養上清と一緒に１〜２時間共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）することにより、十分量の感染細胞を得ることができる。【００７２】  本明細書において使用されるゲノムまたは遺伝子座などを除去する方法において用いられる、Ｃｒｅ酵素の一過的発現、染色体上でのＤＮＡマッピングなどは、細胞工学別冊実験プロトコールシリーズ「ＦＩＳＨ実験プロトコール  ヒト・ゲノム解析から染色体・遺伝子診断まで」松原謙一、吉川  寛  監修  秀潤社（東京）などに記載されるように、当該分野において周知である。【００７３】  本明細書において使用される場合、「キット」とは、複数の容器、および製造業者の指示書を含み、そして各々の容器が、本発明の薬学的組成物、その他の薬剤、およびキャリアを含む製品をいう。【００７４】  本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」は、医薬または動物薬のような農薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、賦形剤および／または薬学的アジュバント。【００７５】  本発明の処置方法において使用される薬剤の種類および量は、本発明の方法によって得られた情報（例えば、疾患に関する情報）を元に、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、投与される被検体の部位の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明のモニタリング方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。疾患状態をモニタリングする頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）のモニタリングが挙げられる。１週間−１ヶ月に１回のモニタリングを、経過を見ながら施すことが好ましい。【００７６】  必要に応じて、本発明の治療では、２種類以上の薬剤が使用され得る。２種類以上の薬剤を使用する場合、類似の性質または由来の物質を使用してもよく、異なる性質または由来の薬剤を使用してもよい。このような２種類以上の薬剤を投与する方法のための疾患レベルに関する情報も、本発明の方法によって入手することができる。【００７７】  （好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。【００７８】  （ポリペプチドの製造方法）
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞などに由来する形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、本発明の培養物より本発明のポリペプチドを採取することにより、本発明に係るポリペプチドを製造することができる。【００７９】  本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、本発明の生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。【００８０】  炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。【００８１】  窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸または有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。【００８２】  無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。【００８３】  培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンまたはテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００８４】  プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。遺伝子を導入した細胞または器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。【００８５】  例えば、動物細胞を用いる場合、本発明の細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７））、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２））、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９））、１９９培地（Ｐｒｏｃｅ��ｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０））またはこれら培地にウシ胎児血清等を添加した培地等が用いられる。【００８６】  培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００８７】  本発明のポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離または精製するためには、当該分野で周知慣用の通常の酵素の単離または精製法を用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞外に本発明のポリペプチドが分泌される場合には、その培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。その可溶性画分から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。【００８８】  本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、その細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。その無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いることによって、精製標品を得ることができる。【００８９】  本発明のポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈澱画分より、通常の方法により本発明のポリペプチドを回収後、そのポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。この可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、本発明のポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製��品を得ることができる。【００９０】  また、通常のタンパク質の精製方法［Ｊ．Ｅｖａｎ．Ｓａｄｌｅｒら：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８］に準じて精製できる。また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる［山川彰夫，実験医学（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１３，４６９−４７４（１９９５）］。例えば、Ｌｏｗｅらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７−８２３１（１９８９）、ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。【００９１】  また、本発明のポリペプチドをＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］。このような融合タンパク質では、発現ベクターにおいて、タンパク質分解切断部位は、融合タンパク質の精製に続いて、融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にするために、融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入される。このような酵素およびこれらの同族の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７，３１〜４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。【００９２】  さらに、本発明のポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。本発明のポリペプチドは、公知の方法［Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ，６，１２９−１３４、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６−１６８（１９９１）］に準じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いてを生産することができる。【００９３】  本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。【００９４】  精製した本発明のポリペプチドの構造解析は、タンパク質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。本発明のポリペプチドの生理活性は、公知の測定法に準じて測定することができる。【００９５】  本発明において有用な可溶性ポリペプチドの産生もまた、当該分野で公知の種々の方法によって達成され得る。例えば、ポリペプチドは、エキソペプチダーゼ、エドマン分解またはその両方と組み合わせて特定のエンドペプチダーゼを使用することによるタンパク質分解によって、インタクトなポリペプチド分子から誘導され得る。このインタクトなポリペプチド分子は、従来の方法を使用して、その天然の供給源から精製され得る。あるいは、インタクトなポリペプチドは、ｃＤＮＡ、発現ベクターおよび組換え遺伝子発現のための周知技術を利用する組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。【００９６】  好ましくは、本発明において有用な可溶性ポリペプチドは、直接的に産生され、従って、出発材料としてのポリペプチド全体の必要性を排除する。これは、従来の化学合成技術によって達成され得るか、または周知の組換えＤＮＡ技術（ここで、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列のみが形質転換された宿主で発現される）によって達成され得る。例えば、所望の可溶性ポリペプチドをコードする遺伝子は、オリゴヌクレオチド合成機を使用する化学的手段によって合成され得る。このようなオリゴヌクレオチドは、所望の可溶性ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計される。所望のペプチドをコードする特定のＤＮＡ配列はまた、特定の制限エンドヌクレアーゼフラグメントの単離によってか、またはｃＤＮＡからの特定の領域のＰＣＲ合成によって、全長ＤＮＡ配列から誘導され得る。【００９７】  （変異型ポリペプチドの作製方法）
本発明のポリペプチドのアミノ酸の欠失、置換もしくは付加（融合を含む）は、周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。かかる１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）、ＰＣＴ  ＷＯ８５／００８１７（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）等に記載の方法に準じて調製することができる。【００９８】  （合成化学）
本明細書におけるペプチド、化学物質、低分子などの因子は、合成化学技術を用いて合成することができる。そのような合成化学技術は、当該分野において周知の技術を用いることができる。そのような周知技術としては、例えば、Ｆｉｅｓｅｒｓ’Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒＯｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）Ｔｓｅ−Ｌｏｋ  Ｈｏ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ（２００２）などを参照することができる。【００９９】  本発明の因子が化合物として利用される場合、塩形態で用いることができる。「塩」としては、製薬上許容される塩が好ましく、例えば無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノ−ルアミン、ジエタノ−ルアミン、トリエタノ−ルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩としては、塩酸、フッ化水素酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、過塩素酸、ヨウ化水素酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、マンデル酸、アスコルビン酸、乳酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。【０１００】  本発明の因子が化合物として利用される場合、水和物形態で用いることができる。「水和物」としては、薬理学的に許容される水和物が好ましく、また、含水塩も含まれ。具体的には、一水和物、二水和物、六水和物等が挙げられる。【０１０１】  （免疫化学）
本発明のポリペプチドを認識する抗体の作製もまた当該分野において周知である。例えば、ポリクローナル抗体の作製は、取得したポリペプチドの全長または部分断片精製標品、あるいは本発明のタンパク質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することにより行うことができる。【０１０２】  抗体を生産する場合、投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。その抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）またはウシチログロブリン等のキャリアタンパク質に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。その抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法［酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊  １９７６年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｖｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］等で確認する。【０１０３】  免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、その血清より、周知技術を用いてポリクローナル抗体を分離、精製することができる。モノクローナル抗体の作製もまた当該分野において周知である。抗体産性細胞の調製のために、まず、免疫に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として使用し、骨髄腫細胞との融合により、ハイブリドーマの作製を行う。その後、酵素免疫測定法になどより、本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。このようにして得たハイブリドーマから産生されたモノクローナル抗体は種々の目的に使用することができる。【０１０４】  このような抗体は、例えば、本発明のポリペプチドの免疫学的検出方法に使用することができ、本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの免疫学的検出法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法・蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等を挙げることができる。【０１０５】  また、本発明ポリペプチドの免疫学的定量方法にも使用することができる。本発明ポリペプチドの定量方法としては、液相中で本発明のポリペプチドと反応する抗体のうちエピトープが異なる２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、１２５Ｉ等の放射性同位体で標識した本発明のタンパク質と本発明のタンパク質を認識する抗体とを用いるラジオイムノアッセイ法等を挙げることができる。【０１０６】  本発明のポリペプチドのｍＲＮＡの定量方法もまた、当該分野において周知である。例えば、本発明のポリヌクレオチドあるいはＤＮＡより調製した上記オリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法により、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量をｍＲＮＡレベ��で定量することができる。このような技術は、当該分野において周知であり、本明細書において列挙した文献にも記載されている。【０１０７】  当該分野で公知の任意の方法によって、これらのポリヌクレオチドが得られ得、そしてこれらポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、決定され得る。例えば、抗体のヌクレオチド配列が公知である場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブルされ得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載されるように）、これは、手短に言えば、抗体をコードする配列の部分を含むオーバーラップするヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、ならびに次いでＰＣＲによるこの連結されたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。【０１０８】  抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源由来の核酸から作製することができる。ある抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが、その抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリーまたは抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡライブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））から、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するために、その配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、またはその特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得ることができる。ＰＣＲによって作製された増幅された核酸は、当該分野で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。【０１０９】  一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位指向性変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹおよびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を生成するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製し得る。【０１１０】  特定の実施形態において、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の��知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のようにフレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレームワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得るか、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域については、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そのアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。【０１１１】  さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。【０１１２】  単鎖抗体を製造する場合、単鎖抗体の産生に関する記載された公知の技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４（１９８９））が、利用され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結されれることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。【０１１３】  （抗体を産生する方法）
本発明の抗体は、抗体の合成のために当該分野で公知の任意の方法によって、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生され得る。【０１１４】  本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、その抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法としては、例えば、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開  ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開  ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクターにクローニングされ得る。【０１１５】  この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、次いで、このトランスフェクトされた細胞は、本発明の抗体を産生するために、従来技術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現についての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞中に同時発現され得る。【０１１６】  本発明の関連した局面において、薬学的組成物（例えば、ワクチン組成物）が、予防適用または治療適用のために提供される。このような組成物は、一般に、本発明の免疫原性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび免疫刺激剤（例えば、アジュバント）を含む。【０１１７】  本発明の抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準的な技術（例えば、親和性クロマトグラフィーまたは免疫沈降）によって、本発明のポリペプチドなどを単離するために用いられ得る。ある因子に特異的な抗体は、細胞からの天然の因子、そして宿主細胞において発現される組換え的に産生された因子の精製を容易にし得る。さらに、そのような抗体が、（例えば、細胞の溶解液または細胞上清における）本発明のタンパク質を検出するために用いられ、本発明のタンパク質の発現の存在の量およびパターンを評価し得る。このような抗体は、例えば、所定の処置レジメンの有効性を決定するために、臨床試験の手順の一部として組織におけるタンパク質レベルを診断的にモニターするために用いられ得る。検出は、抗体を検出可能物質に連結する（すなわち、物理的に連結する）ことにより容易になり得る。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；そして、適切な放射性物質の例としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられるがそれらに限定されない。【０１１８】  本発明の別の局面は、哺乳動物において、免疫応答を誘導するに十分な量のポリペプチドをこの哺乳動物に投与することにより本発明のポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法に関する。この量は、動物種、動物の大きさなどに依存するが、当業者により決定され得る。【０１１９】  （スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子（例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。スクリーニングは、インビトロ、インビボなど実在物質を用いた系を使用してもよく、インシリコ（コンピュータを用いた系）の系を用いて生成されたライブラリーを用いてもよい。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られた化合物もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。また本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。【０１２０】  １実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質または本発明のポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分に結合するか、またはこれらの活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチの任意のものを使用して得られ、これには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアクセス可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。【０１２１】  分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ３７：１２３３。【０１２２】  化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ、上記）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５〜ｌ８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９���）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ上記）において示され得る。【０１２３】  （薬学的組成物）
本発明のポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび遺伝子導入ベクター、アンチセンス核酸、ポリペプチド、ならびにポリペプチドに対する抗体は、血管内皮細胞増殖促進のため、ｃ−ｆｏｓプロモーターからの転写促進のため、ＶＥＧＦプロモーターからの転写促進のため、および血管新生促進のため、ならびに、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、末梢血管病、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、虚血性心疾患、および虚血性脳疾患の処置、予防、診断または予後のための薬学的組成物の成分としても使用することが可能である。【０１２４】  本明細書において薬剤の「有効量」とは、その薬剤が目的とする薬効が発揮することができる量をいう。本明細書において、そのような有効量のうち、最小の濃度を最小有効量ということがある。そのような最小有効量は、当該分野において周知であり、通常、薬剤の最小有効量は当業者によって決定されているか、または当業者は適宜決定することができる。そのような有効量の決定には、実際の投与のほか、動物モデルなどを用いることも可能である。本発明はまた、このような有効量を決定する際に有用である。【０１２５】  本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」は、医薬または動物薬のような農薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、賦形剤および／または農学的もしくは薬学的アジュバント。【０１２６】  本発明の処置方法において使用される薬剤の種類および量は、本発明の方法によって得られた情報（例えば、疾患に関する情報）を元に、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、投与される被検体の部位の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明のモニタリング方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。疾患状態をモニタリングする頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）のモニタリングが挙げられる。１週間−１ヶ月に１回のモニタリングを、経過を見ながら施すことが好ましい。【０１２７】  必要に応じて、本発明の治療では、２種類以上の薬剤が使用され得る。２種類以上の薬剤を使用する場合、類似の性質または由来の物質を使用してもよく、異なる性質または由来の薬剤を使用してもよい。このような２種類以上の薬剤を投与する方法のための疾患レベルに関する情報も、本発明の方法によって入手することができる。【０１２８】  本発明では、いったん類似の種類（例えば、ヒトに対するマウスなど）の生物、培養細胞、組織などに関し、ある特定の糖鎖構造の分析結果と、疾患レベルとが相関付けられた場合、対応する糖鎖構造の分析結果と、疾患レベルとが相関付けることができることは、当業者は容易に理解する。そのような事項は、例えば��動物培養細胞マニュアル、瀬野ら編著、共立出版、１９９３年などに記載され支持されており、本明細書においてこのすべての記載を援用する。【０１２９】  （遺伝子治療）
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５（１９９３）；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換えＤＮＡ技術は、ＡｕＳｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。【０１３０】  遺伝子治療に使用される核酸構築物は、周知の遺伝子導入ベクターを用いて局所的にまたは全身的にのいずれかで投与され得る。そのような核酸構築物がタンパク質のコード配列を包含する場合、そのタンパク質の発現は、内因性の哺乳類のプロモーターまたは異種のプロモーターの使用により誘導され得る。コード配列の発現は、構成的であり得るか、または調節され得る。【０１３１】  種々の周知の遺伝子導入ベクターを遺伝子治療のための組成物として使用する場合、ベクターの投与は、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）または生理食塩水などに懸濁したベクター懸濁液の局所（例えば、癌組織内、肝臓内、筋肉内および脳内など）への直接注入か、または血管内（例えば、動脈内、静脈内および門脈内）への投与によりなされる。【０１３２】  １つの実施態様において、遺伝子導入ベクターは、一般には、この遺伝子導入ベクターを単位用量注入可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で、薬学的に受容可能なキャリア（すなわち、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そして処方物の他の成分と適合性であるもの）とを混合することによって処方され得る。例えば、処方物は、好ましくは、酸化剤および遺伝子導入ベクターにとって有害であることが公知である他の化合物を含まない。【０１３３】  キャリアは、等張性および化学的安定性を増強する物質のような微量の添加物を適宜含む。このような物質は、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン）；単糖、二糖および他の炭水化物（セルロースまたはその誘導体、グルコ���ス、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例えば、ナトリウム）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート、ポロキサマー）、またはＰＥＧを含み得る。【０１３４】  遺伝子導入ベクターを含む薬学的組成物は、代表的には、単位または多用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルにおいて、水溶液として貯蔵され得る。【０１３５】  遺伝子導入ベクターを含む薬学的組成物は医療実施基準（ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）に一致した様式で、個々の患者の臨床状態（例えば、予防または処置されるべき状態）、遺伝子導入ベクターを含む組成物の送達部位、標的組織、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮しつつ処方され、そして投与される。【０１３６】  例えば、ヒトにＨＶＪ（センダイウイルス）エンベロープベクターを投与する場合、マウス一匹あたり、２０〜２０，０００ＨＡＵ相当の、好ましくは６０〜６，０００ＨＡＵ相当の、より好ましくは２００〜２，０００ＨＡＵ相当のエンベロープベクターが投与される。投与されるエンベロープベクター中に含有される外来遺伝子の量は、マウス一匹あたり、０．１〜１００μｇ、好ましくは０．３〜３０μｇ、より好ましくは１〜１０μｇである。【０１３７】  また、ヒトにＨＶＪ（センダイウイルス）エンベロープベクターを投与する場合、被験体あたり、４００〜４００，０００ＨＡＵ相当の、好ましくは１，２００〜１２０，０００ＨＡＵ相当の、より好ましくは４，０００〜４０，０００ＨＡＵ相当のエンベロープベクターが投与される。投与されるエンベロープベクター中に含有される外来遺伝子の量は、被験体あたり、２〜２，０００μｇ、好ましくは６〜６００μｇ、より好ましくは２０〜２００μｇである。【０１３８】  本発明のポリペプチドを、上記の遺伝子治療において用いる方法と同様にして、遺伝子導入ベクター中に入れ、そしてそのポリペプチドを所望の部位に送達することも可能である。【０１３９】  本発明のポリペプチドやポリヌクレオチドを疾病の治療に用いる場合には、例えば、骨格筋や心筋に直接注入する方法、ベクターに封入して導入する方法が考えられる。ベクターとしてはポリヌクレオチドの場合は、ウイルスベクター（アデノウイルスベクターやアデノ随伴ウイルスベクターなど）や非ウイルスベクター（リポソーム、ＨＶＪ−Ｅなど）によ
り直接注入や血管内投与によるターゲティングなどが可能である。またポリペプチドの場合は、ＨＶＪ−Ｅが好ましく、直接投与が効果的であると考えられる。またゼラチンハイドロ
ゲルやアテロコラーゲン、ポリ乳酸に封入して虚血部位の近く（筋肉中、脳内、皮下など）に埋め込み徐放化させる方法もある。【０１４０】  このような方法によって血管内皮細胞の増殖や遊走がおこり、管腔形成により血管が新生される。さらに血管平滑筋細胞の遊走により血管の補強が行われ、機能的な血管となって末梢にまで血液の供給が可能になる。これによって血管閉塞部位を周囲に側副血行路が生じ虚血部位への循環血液量が増強されるために、末梢血管病、虚血性心、脳疾患の治療が可能になる。【０１４１】  ＶＥＧＦを用いた遺伝子治療に関して、Ｉｓｎｅｒ，Ｊ．，ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｆｔｅｒ  ａｒｔｅｒｉａｌｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆｐｈＶＥＧＦ１６５  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｌｉｍｂ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３４８，３７０−３７４，（１９９６）；Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｉ．，ら、Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈＶＥＧＦ１６５ａｆｔｅｒｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｖｅｓｓｅｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｌｉｍｂ  ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９７，１１１４−１１２３，（１９９８）；およびＭａｃｈｅｎｓ，Ｈ−Ｇ．，ら、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ＶＥＧＦ１６５  ａｎｄ  ｓＶＥＧＦＲ−１  ｉｎ  ａ  ｒａｔｆｌａｐ  ｍｏｄｅｌ．Ｊ．ＳｕｒｇｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ  １１１，１３６−１４２，（２００３）が報告されている。【０１４２】  血管新生ペプチドとしては、Ｌｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．：ｐＲ３９，ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ  ６，４９−５５，（２０００）、およびＫｏｃｚｕｌｌａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．：Ａｎａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅｈｕｍａｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ＬＬ−３７／ｈＣＡＰ−１８．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１，１６６５−１６７２，（２００３）が報告されている。【０１４３】  動物モデルとしては、ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２，１６６７−１６７９，（１９９８）が報告されている。【０１４４】  また、マウスやラット或いはラビットの大腿動脈の１つを結紮して除去し、これにより虚血部位を作成し、遺伝子や蛋白の筋肉内投与による治療効果を組織染色にによる血管数、レーザードップラーによる血流量、血管造影などにより判定することによって、血管新生を検出することも可能である。【０１４５】  （本明細書において用いられる一般的技術）
本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当該分野の技術範囲内にある、糖鎖科学、マイクロフルイディクス、微細加工、有機化学、生化学、遺伝子工学、分子生物学、微生物学、遺伝学および関連する分野における周知慣用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献および本明細書において他の場所おいて引用した文献においても十分に説明されている。【０１４６】  微細加工については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．Ａ．（１９９６）．Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｚａｕｔ，Ｐ．Ｖ．（１９９６）．Ｍｉｃｒｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｍａｄｏｕ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ１  ５  Ｐｒｅｓｓ；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．（１９９７）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，＆  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。【０１４７】  本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法、糖鎖科学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ＮＹ，１０１５８（２０００）；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２３０、２４２、２４７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。【０１４８】  （処方）
本発明はまた、有効量の治療剤の被験体への投与による、疾患または障害（例えば、感染症）の処置および／または予防の方法を提供する。治療剤は、薬学的に受容可能なキャリア型（例えば、滅菌キャリア）と組み合せた、本発明の組成物を意味する。【０１４９】  治療剤を、個々の患者の臨床状態（特に、治療剤単独処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ＧＭＰ＝ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような考慮を行って決定される。【０１５０】  一般的提案として、用量当り、非経口的に投与される治療剤の合計薬学的有効量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、本発明の細胞生理活性物質について、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続投与する場合、代表的には、治療剤を約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（例えばミニポンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化するようである。【０１５１】  治療剤を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与し得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の処方補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。【０１５２】  本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療剤の適切な例は、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の処方補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。【０１５３】  本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療剤の適切な例は、適切なポリマー物質（例えば、成形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックス）、適切な疎水性物質（例えば、許容品質油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、および貧可溶性誘導体（例えば、貧可溶性塩）を包含する。【０１５４】  徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８��４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）、およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。【０１５５】  徐放性治療剤はまた、リポソームに包括された本発明の治療剤を包含する（一般に、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３１７−３２７頁および３５３−３６５（１９８９）を参照のこと）。治療剤を含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製され得る：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号ならびにＥＰ第１０２，３２４号。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）ユニラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選択された割合が、最適治療剤のために調整される。【０１５６】  なおさらなる実施態様において、本発明の治療剤は、ポンプにより送達される（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。【０１５７】  他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））による総説において議論される。【０１５８】  非経口投与のために、１つの実施態様において、一般に、治療剤は、それを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するものと、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化、および治療剤に対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。【０１５９】  一般に、治療剤を液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリ��、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書において有用である。【０１６０】  キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。【０１６１】  治療剤は、代表的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル中に処方される。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、塩が形成されることが理解される。【０１６２】  治療的投与に用いられるべき任意の薬剤は、有効成分としてのウイルス以外の生物・ウイルスを含まない状態、すなわち、無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンメンブラン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成される。一般に、治療剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置される。【０１６３】  治療剤は、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）治療剤水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥した治療剤を、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。【０１６４】  本発明はまた、本発明の治療剤の１つ以上の成分を満たした一つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。さらに、治療剤を他の治療用化合物と組み合わせて使用し得る。【０１６５】  本発明の治療剤は、単独または他の治療剤と組合わせて投与され得る。組合わせは、例えば、混合物として同時に；同時にまたは並行してだが別々に；あるいは経時的のいずれかで投��され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療用混合物として共に投与されるという提示、およびまた、組み合わされた薬剤が、別々にしかし同時に、例えば、同じ個体に別々の静脈ラインを通じて投与される手順を含む。「組み合わせて」の投与は、一番目、続いて二番目に与えられる化合物または薬剤のうち１つの別々の投与をさらに含む。【０１６６】  特定の実施態様において、本発明の薬学的組成物は、抗がん剤との組み合わせで投与される。【０１６７】  さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、他の治療レジメまたは予防レジメ（例えば、放射線治療）と組合わせて投与される。【０１６８】  以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【０１６９】  （実施例１：ウイルスエンベロープ由来のタンパク質を含む成分中に外来遺伝子を封入した遺伝子導入ベクターの調製および使用）
（ウイルスの調製）
ＨＶＪ、Ｚ株を、先に記載のように（Ｋａｎｅｄａ、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌｏｒｉｄａ，ｖｏｌ．３，ｐｐ．５０−５７（１９９４））差示的遠心分離により精製した。精製ＨＶＪを平衡化塩溶液（ＢＳＳ：１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中に再懸濁し、そしてウイルス力価を、５４０ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した。５４０ｎｍにおける光学的密度は、１５，０００血球凝集単位（ＨＡＵ）に対応し、融合活性と相関する。【０１７０】  （遺伝子導入ベクターの調製）
３．５６ｍｇホスファチジルコリンおよび０．４４ｍｇコレステロールの脂質混合物を、クロロホルム中に溶解し、そしてこの脂質溶液を、ロータリーエバポレーター中で蒸発させた（Ｕｃｈｉｄａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８０：１０−２０（１９７９））。乾燥脂質混合物を、０．８５％  ＮＰ−４０を含む２．０ｍｌの上記素通り画分からのタンパク質溶液（１．６ｍｇ）中にボルテックスにより完全に溶解した。次いで、この溶液を０．３Ｍスクロースおよび１ｍＭ  ＫＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して透析し、ＮＰ−４０を除去した。透析は、毎日緩衝液を交換して６日間実施した。この透析された溶液を、０．３Ｍ  スクロースおよび１ｍＭ  ＫＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．２）で平衡化したアガロースビーズ（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ａ−５０ｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）にアプライした。５４０ｎｍにおける光学的密度が１．５を超える画分を再構成融合粒子として集め、そして以下に記載のように１０ｍｇ脂質から調製された核酸充填リポソームと融合し、遺伝子導入ベクターを調製した。【０１７１】  （ヒトＨＥＫ２９３株由来のトランスフェクト細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子発現）
上記の方法で調製した遺伝子導入ベクターの遺伝子導入活性を確認するために、ヒトＨＥＫ２９３株およびルシフェラーゼ遺伝子を、以下のように用いた。【０１７２】  ｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ（７．４ｋｂ）を、ｐＧＥＭ−ｌｕｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）からのルシフェラーゼ遺伝子を、ｐｃＤＮＡ３（５．４ｋｂ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）中に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位でクローニングすることにより構築した。約４０μｇのｐＣＭＶ−ルシフェラーゼを含む遺伝子導入ベクターを、先に記載のように構築し、そしてこの遺伝子導入ベクター（約１．５×１０１１粒子／ｍｌ、ＤＮＡ濃度は約４０μｇ／ｍｌ）の１／１０量（１００μｌ）を、ヒト２９３細胞株（ヒト胎児腎臓：ＨＥＫ）由来の２×１０５細胞とインキュベートした。ＨＶＪリポソームを用いて、また同量のルシフェラーゼＤＮＡを２×１０５ＨＥＫ２９３細胞に導入した。導入２４時間後、細胞を回収し、そして他に記載のように（Ｓａｅｋｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，８：１９６５−１９７２（１９９７））、ルシフェラーゼ活性アッセイを確認した。【０１７３】  （実施例２：界面活性剤を用いる不活性化ＨＶＪエンベロープベクターの調製および使用）
（１：ＨＶＪの増殖）
ＨＶＪは鶏の受精卵への種ウイルスの接種により増殖されたものが一般に使用され得るが、サル、ヒトなどの培養細胞、培養組織へのウイルスの持続感染系（トリプシンなどの加水分解酵素を培養液中に添加）を利用して増殖させたもの、クローニングされたウイルスゲノムを培養細胞に感染させ持続感染をおこさせて増殖させたもの、全てが利用可能である。【０１７４】  本実施例において、ＨＶＪの増殖を以下のようにおこなった。【０１７５】  ＨＶＪの種ウイルスを、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ）の受精卵を使って増殖させ分離・精製したＨＶＪ（Ｚ種）を細胞保存用チューブに分注し、１０％  ＤＭＳＯを加えて液体窒素中に保存し、調製した。【０１７６】  受精直後のニワトリ卵を入荷し、インキュベーター（ＳＨＯＷＡ−ＦＵＲＡＮＫＩ  Ｐ−０３型；約３００鶏卵収容）にいれ、３６．５℃、湿度４０％以上の条件で１０〜１４日飼育した。暗室中で、検卵器（電球の光が口径約１．５ｃｍの窓を通して出るようになっているもの）を用いて、胚の生存及び気室と漿尿膜を確認し、漿尿膜の約５ｍｍ上方に鉛筆でウイルス注入箇所の記しをつけた（太い血管を除いた場所を選定する）。ポリペプトン溶液（１％ポリペプトン、０．２％  ＮａＣｌを混合し、１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整してオートクレーブ滅菌し、４℃保存したもの）で種ウイルス（液体窒素からとりだしたもの）を５００倍に希釈し、４℃においた。卵をイソジン及びアルコールで消毒し、ウイルス注入箇所に千枚通しで小孔をあけ、希釈した種ウイルス０．１ｍｌを２６ゲージの針付き１ｍｌシリンジを用いて、漿尿腔内に入るように注入した。溶かしたパラフィン（融点５０〜５２℃）をパスツールピペットを用いて孔の上に置きこれをふさいだ。卵をインキュベーターにいれ、３６．５℃、湿度４０％以上の条件で３日飼育した。次に、接種卵を一晩４℃においた。翌限卵の気室部分をピンセットで割り、１８ゲージの針を付けた１０ｍｌシリンジを漿尿膜の中にいれて、漿尿液を吸引し、滅菌ボトルに集め、４℃に保存した。【０１７７】  （２：ＨＶＪの精製）
ＨＶＪは、遠心分離による精製方法、カラムによる精製方法、または当該分野において公知のその他の精製方法によって、精製され得る。
（２．１：遠心分離による精製方法）
手短には、増殖させたウイルス液を回収し低速遠心で培養液や漿尿液中の組織・細胞片を除去した。その上清を高速遠心（２７，５００×ｇ、３０分間）とショ糖密度勾配（３０〜６０％ｗ／ｖ）を利用した超遠心（６２，８００×ｇ、９０分間）により精製した。精製の間にウイルスをできるだけ穏和に扱い、４℃で保存することに注意すべきである。【０１７８】  本実施例において、具体的には、以下の方法によってＨＶＪを精製した。【０１７９】  ＨＶＪ含有漿尿液（ＨＶＪ含有のニワトリ卵の漿尿液を集め４℃にて保存）の約１００ｍ１を広ロの駒込ピペットで５０ｍｌの遠心チューブ２本に入れ（Ｓａｅｋｉ，Ｙ．，およびＫａｎｅｄａ，Ｙ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（ＨＶＪ−ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ，ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｈａｎｄｂｏｏｋ（第２版）Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ編（Ａｃａｄｃｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ）第４巻、１２７〜１３５、１９９８を参照のこと）、低速遠心機で３０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し（ブレーキはオフ）、卵の組織片を除去した。【０１８０】  遠心後、上清を３５ｍｌ遠心チューブ４本（高速遠心用）に分注し、アングルローターで２７，０００ｇ，３０分遠心した（アクセル、ブレーキはオン）。上清を除き、沈殿にＢＳＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ；オートクレーブし、４℃保存）（ＢＳＳのかわりにＰＢＳでも可能）をチューブ当たり約５ｍｌ加え、そのまま４℃で一晩静置した。広ロの駒込ピペットでゆるやかにピペッティングして沈殿をほぐし１本のチューブに集め、同様にアングルローターで２７，０００ｇ、３０分遠心した。上清をのぞき沈殿にＢＳＳ約１０ｍｌを加え、同様に４℃で一晩静置した。広ロの駒込ピペットでゆるやかにピペッティングして沈殿をほぐし、低速遠心機で３０００ｒｐｍ，１０分、４℃で遠心し（ブレーキはオフ）、除ききれなかった組織片やウイルスの凝集塊をのぞいた。上清を新しい滅菌済みチューブに入れ精製ウイルスとして４℃で保存する。【０１８１】  このウイルス液０．１ｍｌにＢＳＳを０．９ｍｌ加え、分光光度計で５４０ｎｍの吸収を測定し、ウイルス力価を赤血球凝集活性（ＨＡＵ）に換算した。５４０ｎｍの吸収値１がほぼ１５，０００ＨＡＵに相当した。ＨＡＵは融合活性とほぼ比例すると考えられる。また実際にニワトリ赤血球液（０．５％）を用いて、赤血球凝集活性を測定してもよい（動物細胞利用実用化マニュアル、ＲＥＡＬＩＺＥ  ＩＮＣ．（内田、大石、古沢編集）Ｐ２５９〜２６８、１９８４を参照のこと）。【０１８２】  さらにショ糖密度勾配を用いたＨＶＪの精製も必要に応じて行い得る。具体的には、ウイルス懸濁液を６０％、３０％のショ糖溶液（オートクレーブ滅菌）を重層した遠心チューブにのせ、６２，８００×ｇで１２０分間密度勾配遠心を行う。遠心後、６０％ショ糖溶液層上にみられるバンドを回収する。回収したウイルス懸濁液をＢＳＳもしくはＰＢＳを外液として４℃で透析を一晩行い、ショ糖���除去する。すぐに使用しない場合は、ウイルス懸濁液にグリセロール（オートクレーブ滅菌）と０．５Ｍ  ＥＤＴＡ液（オートクレーブ滅菌）をそれぞれ最終濃度が１０％と２〜１０ｍＭになるように加えて−８０℃で穏やかに凍結し、最終的に液体窒素中で保存する（凍結保存はグリセロールと０．５Ｍ  ＥＤＴＡ液の代わりに１０ｍＭ  ＤＭＳＯでも可能）。
（２．２：カラムおよび限外濾過による精製方法）
遠心分離による精製方法に代えて、カラムによるＨＶＪの精製も本発明に適用可能である。【０１８３】  手短には、分子量カットオフが５０，０００のフィルターによる限外濾過による濃縮（約１０倍）とイオン交換クロマトグラフィー（０．３Ｍ〜１Ｍ  ＮａＣｌ）による溶出を用いて精製した。【０１８４】  具体的には、本実施例において、以下の方法を使用して、ＨＶＪをカラムによって精製した。【０１８５】  漿尿液を採集した後、８０μｍ〜１０μｍのメンブランフィルターにてろ過した。０．００６〜０．００８％  ＢＰＬ（最終濃度）を漿尿液に加え（４℃、１時間）、ＨＶＪを不活性化した。漿尿液を３７℃、２時間インキュベートすることによって、ＢＰＬを不活性化した。【０１８６】  ５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｅｅｄｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法により約１０倍濃縮した。緩衝液として、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２％マンニトール、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を用いた。ＨＡＵアッセイにより、ほぼ１００％のＨＶＪ回収率であり優れた結果がえられた。【０１８７】  ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテクＫＫ、Ｔｏｋｙｏ）によるカラムクロマトグラフィー法（緩衝液：２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２〜１Ｍ  ＮａＣｌ）でＨＶＪを精製した。４０〜５０％の回収率であり、純度は９９％以上であった。【０１８８】  ５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法によりＨＶＪの画分を濃縮した。【０１８９】  （３：ＨＶＪの不活性化）
ＨＶＪの不活性化が必要な場合、以下に記載するように、紫外線照射またはアルキル化剤処理により行った。【０１９０】  （３．１：紫外線照射法）
ＨＶＪ懸濁液１ｍｌを３０ｍｍ径のシャーレにとり、９９または１９８ミリジュール／ｃｍ２を照射した。ガンマー線照射も利用可能である（５〜２０グレイ）が完全な不活性化がおこらない。【０１９１】  （３．２：アルキル化剤による処理）
使用直前に、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ中に０．０１％  β−プロピオラクトンの調製をした。作業中は低温下に保ち素早く作業を行った。【０１９２】  精製直後のＨＶＪの懸濁液に最終０．０１％になるようにβ−プロピオラクトンを添加し、氷上で６０分間でインキュベートした。その後２時間、３７℃でインキュベートした。エッペンドルフチューブにチューブあたり１０，０００ＨＡＵ分ずつ分注し、１５，０００ｒｐｍ、１５分遠心し、沈殿を−２０℃で保存する。上記の不活性化法によらず、沈殿を−２０℃で保存せず、そのまま界面活性剤処理によりＤＮＡを取り込ませ、ベクターを作成することも可能である。【０１９３】  （４：ＨＶＪエンベロープベクターの作成）
保存してあったＨＶＪに外来ＤＮＡ２００〜８００μｇを含む溶液９２μｌを加えてピペッティングでよく懸濁した。この溶液は、−２０℃で、少なくとも３ヶ月保存可能である。ＨＶＪとの混合前にＤＮＡに硫酸プロタミンを添加すると、発現効率が２倍以上増強した。【０１９４】  この混合液を氷上に１分間置き、オクチルグルコシド（１０％）を８μｌ加えて１５秒氷上でチューブを振盪し、４５秒氷上に静置した。界面活性剤での処理時間は、１〜５分間が好ましい。オクチルグルコシド以外に、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）、ＮＰ−４０（ノニルフェノキシポリエトキシエタノール）などの界面活性剤も使用し得る。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ＮＰ−４０およびＣＨＡＰＳの好ましい最終濃度は、それぞれ、０．２４〜０．８０％、０．０４〜０．１２％および１．２〜２．０％である。【０１９５】  冷ＢＳＳを１ｍｌ添加し、すぐに１５，０００ｒｐｍで１５分遠心した。生じた沈殿にＰＢＳまたは生理食塩水などを３００μｌ加えて、ボルテックス、ピペッティングで懸濁した。懸濁液は直接遺伝子導入に使用することも、−２０℃で保存後に遺伝子導入に使用することも可能である。このＨＶＪエンベロープベクターは、少なくとも２ヶ月間の保存後、同程度の遺伝子導入効率を維持した。【０１９６】  （５：ＨＶＪエンベロープベクターによる細胞内への遺伝子導入）
（遺伝子導入方法）
１，０００ＨＡＵ分をエッペンドルフチューブにとり（３０μｌ）、硫酸プロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）５μ１を加えた。ＢＨＫ−２１細胞（前日に、ウェルあたり２００，０００個で、６つのウェルにまいたもの）の培地を交換し、１ウェルあたり０．５ｍｌの培地（１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ）を添加した。各ウェルに、上記のベクター（１，０００ＨＡＵ相当）と硫酸プロタミンの混合液を加え、プレートを前後左右にふってベクターと細胞を良く混ぜ合わせ、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーター中に１０分間放置した。【０１９７】  培地交換し、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーター中でオーバーナイト（１６ｈｒ〜２４ｈｒ）放置し、遺伝子発現を調べた。ルシフェラーゼ（ｐｃＬｕｃｉ；ＣＭＶプロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子）の場合は、Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５ｍｌで細胞を溶解し、その２０μｌ溶液中の活性をルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。グリーン蛍光タンパク質（ｐＣＭＶ−ＧＦＰＥ；Ｐｒｏｍｅｇａ）の場合は、そのまま蛍光顕微鏡で観察し、４００倍率で５〜８視野を観察し、蛍光を発する細胞の割合を算出した。【０１９８】  （実施例３：ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーからの血管内皮増殖因子をコードする遺伝子クローンｐ３７４３の単離および解析）
本発明を用いることによって、所望の機能的性質を有する目的遺伝子を分離することが可能である。その分離方法の実施形態の１つを模式的に図１に示す。【０１９９】  実際に、本明細書の実施例２で調製した遺伝子導入ベクターを使用して、血管内皮増殖因子をコードする遺伝子を単離した。なお、本実施例に例示される遺伝子の単離法には、本明細書の実施例２で調製した遺伝子導入ベクターのみならず、任意の「ウイルスエンベロープベクター」および「リポソームベクター」が使用可能である。【０２００】  ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリー（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社；ヒト心臓由来ｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターを有するプラスミドｐＳＰＯＲＴに連結したプラスミド）をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１２Ｓに導入し、そのＥ．ｃｏｌｉから、プラスミドを調製した。プラスミド２００μｇを、１００００ＨＡＵのＨＶＪ−Ｅ遺伝子導入ベクター（本発明の実施例２で調製した遺伝子導入ベクター、３×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅ）に封入した。宿主細胞として、ヒト大動脈内皮細胞ＨＥＡＣ（三光純薬）約５０００細胞を、９６ウェルマクロタイタープレートの各ウェルに培地とともに添加して、一晩培養した細胞を用いた。宿主細胞を含んだ各ウェルに対して、上記ＨＶＪ−Ｅの１００分の１量を添加し、３７℃  ３０分間放置した後、培地交換をした。【０２０１】  使用した培地は、血清濃度を１％とした低栄養状態のもので、この状態下で、１週間培養を行う。この条件下では、ＨＥＡＣの増殖は確認されなかった。【０２０２】  ２週間後、細胞増殖アッセイを行った。試薬として、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ９６（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、ミトコンドリアの酸化還元状態を試薬の色調の変化として捉えて、細胞増殖の指標とした。【０２０３】  最も色の濃いウェルは、最も活発に細胞増殖が行われた細胞が存在するウェルである。そこで、マイクロタイタープレート全体をプレートリーダーで読み取り、その細胞増殖を、コンピュータによりグラフ化した。このグラフから、最も増殖作用を示す２つのウェル内の細胞から、Ｑｉａｇｅｎ社のＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを用いて、核酸を調製した。調製した核酸には、プラスミドＤＮＡが含まれるので、これをコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５α；宝酒造）に熱ショック法を用いて導入した。【０２０４】  このＥ．ｃｏｌｉをアンピシリン含有プレート培地に播種し、コロニーを形成させた。１つのウェルより調製したＤＮＡから、約２０〜２００個のコロニーを得ることができた。各コロニーからプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を抽出し、制限酵素処理によって、プラスミド内の遺伝子フラグメントの存在を確認した。その結果、調製したプラスミドのうち、約６０〜７０％のプラスミドが、挿入物を有するプラスミドであった。【０２０５】  次に、Ｑｉａｇｅｎ社のＥｎｄｏ  Ｆｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔを用いて、プラスミドＤＮＡを精製し、その精製したプラスミドをＨＶＪ−Ｅに封入して、再度ＨＡＥＣ細胞に導入し、同様の細胞増殖実験を行った。この細胞増殖実験において、有意に高い細胞増殖を示したプラスミドが、血管内皮増殖因子をコードする核酸を含むことが予想される候補プラスミドである。【０２０６】  インサートをもつ９個のクローンをそれぞれＨＶＪ−Ｅに封入して２回目のスクリーニングを施行したところ、高い増殖作用を示す遺伝子が得られた。さらに新たに２つ得られ計３つの遺伝子が常に高いＨＡＥＣ増殖能を示した。この３つについては再検、再々検によってもＨＡＥＣ増殖能が確認された。増殖能をさらに確認するために、細胞増殖の最初期に活性化されるプロトオンコジーンｃ−ｆｏｓのプロモーターを用いたアッセイを行った。実際にはこのプロモーター下にルシフェラーゼを連結した遺伝子ｃ−ｆｏｓ−Ｌｕｃｉと候補遺伝子を１：１の重量比でウシ血管内皮細胞にリポフェクションによって導入し２４−４８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。プラスミドｃ−ｆｏｓ−Ｌｕｃｉは、ｃ−ｆｏｓの５’調節エンハンサー領域（−３５７〜−２７６）を２コピー、そして単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター（−２００〜７０）、およびルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドである（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２００２：２２：２３８−２４２）。図２に示すように、３つの遺伝子（ｐ３７４３、Ｍ３−１０−Ｇ０８、Ｍ３−１３−Ａ０６）はＨＧＦよりも高いルシフェラーゼ活性を示し、これら遺伝子産物によるｃ−ｆｏｓプロモーターの強力な活性化が示された。この中で最も高い活性を示したｐ３７４３についてＶＥＧＦプロモーターを連結したルシフェラーゼ遺伝子を用いて上述のようにプロモーターアッセイを行ったところ、図３の右の図のようにＶＥＧＦよりも高いＶＥＧＦプロモーターの活性化を示した。すなわちこの遺伝子産物によりＶＥＧＦの分泌が促進され、既知の血管新生遺伝子の活性化を行うことによる血管新生の可能性が示された。ちなみに図３の左のグラフにあるようにｐ３７４３はＶＥＧＦよりもｃ−ｆｏｓプロモーターの活性化能は高かった。次にｐ３７４３の細胞増殖能についてヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）とヒト血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）に対して調べたところ、図４のようにＨＡＥＣを宿主細胞として用いた場合、単離した核酸は、ＨＧＦよりも高い増殖能を有していた。しかし、ヒト血管平滑筋細胞を用いた場合は、ネガティブコントロールのＧＦＰと同様の活性であった。【０２０７】  （１．血管新生活性）
クラボウの血管新生キット（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，ＫＺ−１０００，倉敷紡績株式会社）を用いて管腔形成を調べた。対照として、ブランク、血管内皮細胞増殖因子−Ａタンパク質（ＶＥＧＦ−Ａ）、ｐＶＥＧＦプラスミド（血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝子を含むプラスミド）、ｐＳＰＯＲＴ１（血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝子を含まないプラスミド）を用いた。【０２０８】  血管新生専用培地（倉敷紡績（株）ＫＺ−１４００）中へ、ＶＥＧＦ−Ｅ（ＮＺ−７）１０ｎｇ／ｍｌを添加した培地へ、さらに抗ヒトＶＥＧＦ−Ａ中和抗体を０、２５０、５００、１０００ｎｇ／ｍｌの各濃度となるように添加して培養した。【０２０９】  抗ヒトＶＥＧＦ−Ａ中和抗体としては、Ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ、Ｈｕｍａｎ，Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｎｏ（２６５０３．１１１）（Ｒ＆Ｄ社製カタログＮｏ．ＭＡＢ２９３）を用いた。培養は３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて行った。培地は、培養４日目、７日目および９日目に同じ添加物を含有するものと交換した。培養開始１１日目に培地を除き、管腔染色キット（ＣＤ３１抗体染色用：倉敷紡績（株）ＫＺ−１２２５）を用いて以下の手順に従い染色した。【０２１０】  ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）染色１次抗体（マウス抗ヒトＣＤ３１抗体）をブロッキング液（１％−ＢＳＡを含むダルベッコ  リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））で４，０００倍希釈した。各ウェルにこの１次抗体溶液０．５ｍｌを添加し、６０分間３７℃でインキュベートした。インキュベート終了後、１ｍｌのブロッキング液で各ウエルを計３回洗浄した。【０２１１】  次いでブロッキング液で５００倍希釈した２次抗体溶液（ヤギ抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ複合体）０．５ｍｌを各ウエルに添加し、６０分間３７℃でインキュベートした後、１ｍｌの蒸留水で３回洗浄した。その間に、ＢＣＩＰ／ＮＢＴの錠剤２錠を蒸留水２０ｍｌに溶解し、ポアサイズ０．２μｍのフィルターで濾過して基質溶液を準備した。調製したＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液０．５ｍｌを各ウエルに添加し、管腔が深紫色になるまで（通常５〜１０分間）３７℃でインキュベートした。インキュベート終了後、蒸留水１ｍｌで、各ウエルを３回洗浄した後洗浄液を吸引除去し、自然乾燥するため静置した。乾燥後、顕微鏡下で各ウエルを観察した。【０２１２】  各ウエルを４０倍の顕微鏡で観察し、各ウエルの写真を撮影した。また、１ｍｍのスケールを４０倍に拡大した写真を撮影した（図５）。ＨＡＥＣに遺伝子導入をして、その上清を用いたところ、図５のように管腔形成がおこった。ｐ７７４２１は増殖活性のなかった心臓遺伝子ライブラリーの１遺伝子である。【０２１３】  得られた各画像を、以下の方法に従い血管新生定量ソフトウェア（ＫＳＷ−５０００Ｕ，倉敷紡績株式会社）を用い定量化した。様々な指標でコンピューター解析をして、このスケールをもとに各視野中に形成された管腔の面積（図６左欄）、長さ（図６右欄）、を測定した。その結果、図６のように形成管腔の面積、長さともｐ３７４３が有意に高かった。【０２１４】  （２．配列決定）
配列決定を行ったところ、癌抗原遺伝子として報告のあったＳＡＲＴ−２（塩基配列Ｎｏ．１−３９５８）のＣ末２２１個のアミノ酸よりなるポリペプチド断片（ＳＡＲＴ−２の塩基配列Ｎｏ．２３６４−３９５８；配列番号３）であった。このなかで蛋白をコードできる候補は２つあり、それらはＳＡＲＴ−２とインフレームであるｆ１（塩基配列Ｎｏ．２７６４−３０７３；配列番号４），ＳＡＲＴ−２とはフレームがずれているＦ２（塩基配列Ｎｏ．２６６０−２７５０；配列番号１）であったので、これら遺伝子断片をＰＣＲで増幅してＣＭＶプロモーターをもつ発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１につないだ（図７）。これら遺伝子の細胞増殖能をｃ−ｆｏｓプロモーターアッセイで行ったところ、ｆ１は活性がなく、Ｆ２はＶＥＧＦと同等の活性を有していた（図８）。なおＨＧＦとＶＥＧＦのｃ−ｆｏｓプロモーターアッセイ活性化能はほぼ同等であった。そこでＦ２ペプチドについて以下解析を進めた。【０２１５】  （実施例４：Ｆ２ペプチドの機能解析）
（１．ＭＴＳアッセイによるＨＥＡＣ細胞増殖能の解析）
Ｆ２ペプチドを合成し、その様々な量をＨＡＥＣと接触させ、増殖能をＭＴＳアッセイによって調べた。ＭＴＳアッセイとは、ＭＴＴアッセイの変法であって、培養中の生細胞によりテトラゾリウム塩（ＭＴＳ）を発色産物ホルマザンに還元する反応をベースにした生細胞の測定方法である。具体的には、以下のように行う。
・ＨＡＥＣを７５０細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した
・１００μｌ／ウェルの内皮細胞用培地（１％ＦＢＳ、ＥＧＦ添加なし）にそれぞれのサンプルを２μｌ／ウェルずつ添加した。毎日（６日目まで）２μｌ／ウェルを添加した（培地交換はしない）。
・１ウェルあたり、測定溶液（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社））を２０μｌ添加し、１００μｌの内皮細胞用培地と混合し、古い培地を吸引して除いた。測定溶液と細胞の混合溶液を１ウェルあたり１２０μｌ入れてＣＯ２インキュベーターで１〜５時間インキュベートした。
・プレートリーダーにて４９０ｎｍの吸光度を測定した。【０２１６】  サンプル群（各８ウェルずつ）は、以下のとおりである。
ＮＣ：１％  ＦＢＳを添加したＥＢＭ培地（内皮細胞用培地）のみ。他のサンプルは、この血清添加した培地に、各種ペプチドを添加した。
ＶＥＧＦ−Ａ：組換えＶＥＧＦ−Ａ（ＫＵＲＡＢＯ社）を、終濃度が１０ｎｇ／ｍｌになるように添加した。
Ｆ２−１：Ｆ２ペプチドを、終濃度が１ｎｇ／ｍｌになるように添加した。
Ｆ２−１０：Ｆ２ペプチドを、終濃度が１０ｎｇ／ｍｌになるように添加した。
Ｆ２−１００：Ｆ２ペプチドを、終濃度が１００ｎｇ／ｍｌになるように添加した。
Ｆ２−１０００：Ｆ２ペプチドを、終濃度が１０００ｎｇ／ｍｌになるように添加した。
その結果、図９に示すように、ＶＥＧＦ蛋白と同様に、用量依存的に、Ｆ２ペプチドの細胞増殖能を認めた。この結果は、Ｆ２ペプチドがＶＥＧＦよりも強いＨＥＡＣ増殖促進活性を有することを示す。Ｆ２ペプチドのアミノ酸配列は、
ＭＬＳＬＩＦＬＨＲＬＫＳＭＲＫＲＬＤＲＫＬＲＦＷＨＲＫＮＹＰ（配列番号２）の３０アミノ酸であり、正に荷電したヘリックスペプチドであり、天然には存在しない人工的活性ペプチドであることが明らかになった。このペプチドは、その構造自体も、さらにその活性の報告も全くない新規物質である。【０２１７】  （２．内皮細胞ＨＥＡＣの細胞遊走に対するＦ２ペプチドの影響）
ＨＥＡＣ内皮細胞の遊走を、改変したＢｏｙｄｅｎチャンバー（Ｒｉｋｉｔａｋｅ，Ｙら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２０，１００６−１０１２（２０００））を使用して、アッセイした。８μの孔をを有する、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含まないポリカーボネートメンブラン（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を、オーバーナイトで、０．１％ゼラチンでコートし、そしてリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄して、過剰のゼラチンコーティングを除去した。次に、１％のＦＢＳを補添した増殖因子を含まない２８μｌのＥＢＭ２培地を、下部のチャンバーに配置し、その下部チャンバーの上にメンブランを配置し、そして、１×１０６細胞／ｍｌの細胞を、ＶＥＧＦ−Ａ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｋｕｒａｂｏ、大阪）、Ｆ２ペプチド（１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ）、またはコントロールペプチド（１μｇ／ｍｌ；アミノ酸配列ＲＳＬＥＧＴＤＲＦＰＦＶＲＬＫＮＳＲＫＬＥＦＫＤＩＫＧＩＫＲ；配列番号６）のいずれかを含む、５０μｌのＥＢＭ２培地中に懸濁した。Ｂｏｙｄｅｎチャンバーを、３７℃で４時間インキュベーションした。インキュベーション後、メンブランを除去し、そして、メンブランの上側の細胞を、はがした。メンブランの下側の細胞を、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ（Ｓｙｓｍｅｘ、兵庫）で染色した。細胞数を、１００倍の視野下で、ランダムに選択した８視野について、計数した。【０２１８】  内皮細胞ＨＥＡＣを、Ｆ２ペプチドで処理した場合には、濃度依存的に（０．０１〜１μｇ／ｍｌ）、細胞遊走活性が顕著に増加した。結果を、図１０と以下の表１に示す。【０２１９】
0004705026.tif 000002
この内皮細胞の移動は、１μｇ／ｍｌのコントロールペプチドでは、観察されなかった（Ｃｔｒｌとして示す）。内皮細胞遊走に対するＦ２ペプチドの効果は、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）よりも大きかった。この結果は、Ｆ２ペプチドがＶＥＧＦよりも強いＨＥＡＣ細胞遊走促進活性を有することを示す。【０２２０】  （３．Ｆ２ペプチドのインビトロ血管新生活性の確認）
Ｆ２ペプチドによる処理によるインビトロでの血管新生促進を調べることによって、Ｆ２ペプチドの血管新生活性を確認した。血管形成活性の試験は、実施例３の１．血管新生活性の節に記載される方法に従い、ＶＥＧＦ−Ａ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆ２ペプチド（０．１，１，１０μｇ／ｍｌ）、およびコントロールペプチド（１，１０μｇ／ｍｌ）を用いて、行った。【０２２１】  Ｆ２ペプチドで処理をした場合は、組換えＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）またはコントロールペプチドで処理をした場合と比較して、より大きな血管形成が確認された。結果を、図１１と以下の表２に示す。【０２２２】
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この結果は、Ｆ２ペプチドがＶＥＧＦよりも強い血管新生促進活性を有することを示す。【０２２３】  （４．Ｆ２ペプチドのインビボ血管新生活性の確認）
Ｆ２ペプチドのインビボ血管新生促進活性を試験するために、マトリゲルプラグアッセイ（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｐｌｕｇ  ａｓｓａｙ；Ｒｉｋｉｔａｋｅ，Ｙら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２０，１００６−１０１２（２０００））を行った。増殖因子を枯渇したマトリゲル（０．５ｍｌ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を、ＶＥＧＦ−Ａ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆ２ペプチド（１μｇ／ｍｌ）、コントロールペプチド（１μｇ／ｍｌ）、または何も加えない状態（ネガティブコントロール）のいずれかとともに、４０Ｕ／ｍｌのヘパリン（Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ，東京）と混合した。次に、混合物を、オリエンタルバイオサイエンス社（京都）から得たＣ５７ＢＬ／６雌性マウスの皮下に注入した。７日後、マウスを屠殺し、プラグを回収して、メタノール中で固定した。免疫染色のために、切片を、抗ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）モノクローナル抗体（１：１００希釈、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と、４℃で、オーバーナイトでインキュベーションし、次に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ４８８二次抗体（１：１０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と、写真撮影前に２時間インキュベーションした。全ての実験プロトコールは、大阪大学大学院医学部動物委員会の承認を得た。【０２２４】  Ｆ２ペプチドを含むマトリゲルを受けたマウスでは、コントロールペプチドを含むマトリゲルを受けたマウスと比較して、インタクトな赤血球を含む新生された血管が多かった。結果を図１２に示す（１００倍）。【０２２５】  Ｆ２処置していない群と比較して、Ｆ２処置した群では、新生血管がより多く見られることを、抗ＣＤ３１抗体を用いる免疫染色によって確認した。結果を図１３に示す（１００倍）。上記で実証された結果とこれらのデータによって、Ｆ２ペプチドが、内皮細胞移動の増加、および内皮細胞のＦ２ペプチドを含むゲルへの侵入を誘導することが示された。【０２２６】  （実施例５：抗菌活性、血管新生活性、および動脈形成活性を有するペプチドＬＬ−３７と、Ｆ２ペプチドとの比較）
Ｆ２ペプチドと構造上相同であるタンパク質は、データベースサーチによって見出されなかった。構造分析の結果、Ｆ２ペプチドは、α−ヘリックス構造を形成することから、膜と相互作用し、そして抗菌活性を有することが示唆された。ＬＬ−３７ペプチドは、抗菌活性、血管新生活性、および動脈形成活性を有するペプチドであることが公知である。実際にＬＬ−３７ペプチドは、アルギニンに富み、そしてα−ヘリックス構造をとる点において、Ｆ２ペプチドと類似する。従って、Ｆ２ペプチドとＬＬ−３７との効果を比較した。その結果、ＭＴＳアッセイを用いる内皮細胞増殖アッセイにおいては、両ペプチドは、同程度の活性を示した。結果を、図１４と以下の表３に示す。【０２２７】
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しかしながら、血管形成活性に関しては、Ｆ２ペプチドは、ＬＬ−３７ペプチドよりも、１０μｇ／ｍｌの投与量において、高い活性を示した。結果を、図１５と以下の表４および表５に示す。【０２２８】
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【０２２９】
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【０２３０】  以前の研究によって、ＥＲＫ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ）およびホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ／Ａｋｔ（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ）活性が、ＬＬ−３７によって迅速に増加することが公知である。これに対して、Ｆ２ペプチドは、ＥＲＫ活性に対しても、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ活性に対しても、直接的な効果を有しなかった（データ示さず）。しかし、図１６と以下の表６に示すように、Ｆ２ペプチドは、７２時間の間、時間依存的にインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）のｍＲＮＡレベルを、強力かつ特異的にアップレギュレートした。【０２３１】
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【０２３２】  その一方で、Ｆ２ペプチドは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）、内皮細胞一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）、または結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）のいずれについても、そのｍＲＮＡレベルに影響しなかった。Ｆ２ペプチドによって誘導されたＩＧＦ−１発現の増加は、重要である。なぜなら、ＩＧＦ−１は、血管新生作用を有し、そして血管再構築に関与する広範なスペクトルを有する増殖因子として作用するからである。さらに、ＩＧＦ−１は、低酸素誘導性因子α、およびその下流のエフェクターであるＶＥＧＦを刺激し、それによって、血管新生を促進する。これらの結果は、Ｆ２がＩＧＦ−１による血管新生を誘導できることを示す。【０２３３】  以上の結果は、Ｆ２ペプチドの効果に持続性があることを示すものである。そのため、Ｆ２ペプチドは、臨床における血管新生治療に適切であり得る。Ｆ２ペプチドの二次的な効果としては：１）ＩＧＦ−１を介したＶＥＧＦ発現のアップレギュレーション；および、２）ＩＧＦ−１を介してＡｋｔを活性化し、その後に、ｅＮＯＳ活性化、または抗アポトーシス効果を生じ得る、それによって、さらに血管新生を促進する。さらに、ＩＧＦ−１はまた、筋発生および創傷治癒を刺激し、組織の修復をもたらすことができる。従って、Ｆ２ペプチドは、創傷治癒および組織修復においても、有用である。【０２３４】  （実施例６：単離した遺伝子クローンにコードされるポリペプチド、ポリヌクレオチドを用いる疾患の処置）
本願発明の組成物を用いて、被検体における血管新生を促進することができる。実施例２に従って、ＨＶＪエンベロープベクターにＦ２ペプチド発現ベクターを封入する。ＳＤラット（４００−５００ｇ；日本チャールズリバー社）に対しベントバルビタール・ナトリウム塩（０．１ｍｌ／１００ｍｇ）を腹腔内投与して麻酔し、保温して自動呼吸器により呼吸を確保する。ラットに左側開胸術を施し、ＨＶＪエンベロープベクター（２０μｌ）を３０Ｇの注射針を用いて、心尖に直接、慎重に注入する。【０２３５】  （試験例１：ＨＶＪエンベロープベクター感作ラット冠動脈内皮細胞のＦ２ペプチドの発現）
ＨＶＪエンベロープベクター（ベクター中のＦ２ペプチド発現ベクター濃度：１０μｇ／ｍｌ）を、ラット冠動脈内皮細胞（細胞数：１０８個）に感作し、Ｆ２ペプチドの産生量をＥＬＩＳＡ法で測定する。また、対照として、Ｆ２ペプチド発現ベクターを含まないエンベロープベクターを用いて、上記と同様な試験を行う。更に、非感作ラット冠動脈内皮細胞についてもＦ２ペプチド産生量を測定する（無処置群）。ＨＶＪエンベロープベクターを感作したラット冠動脈内皮細胞は高いレベルでＦ２ペプチドを産生し、分泌することを確認する。【０２３６】  （試験例２：内皮細胞の増殖に対するＦ２ペプチド発現ベクターの効果）ヒト内皮細胞にＨＶＪエンベロープベクターを感作し、外因的に添加したヒトＦ２ペプチドの存在下（１、１０及び１００ｎｇ／ｍｌ）又は非存在下に培養し、細胞数の増加率（％）を測定する。外因的に添加したＦ２ペプチドにより内皮細胞の増殖は促進されることを確認する。一方、ＨＶＪエンベロープベクター（濃度：１０μｇ／ｍｌ）を感作した内皮細胞を培養し、細胞数の増加を測定し、増加率（％）を求める。ＨＶＪエンベロープベクターを感作した内皮細胞の増加率が対照（発現ベクターを含まないＨＶＪエンベロープベクター）に比べて著しく高いことを確認する。更に、上記のＨＶＪエンベロープベクターを感作した内皮細胞の培養をウサギ抗ヒトＦペプチド抗体の存在下又は非存在下に行ない、細胞数の増加を測定し、増加率（％）を求める。【０２３７】  （試験例３：ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを直接注入したラット心筋における新生血管増生）
Ｆ２ペプチド発現プラスミドを含むＨＶＪエンベロープベクターを直接注入したラット心筋、ペプチド発現プラスミドを含まないＨＶＪエンベロープベクターを直接注入したラット心筋及び無処置のラット心筋をＨＥ染色、Ａｚａｎ染色し、検鏡して微小血管数を数える。Ｆ２ペプチド発現プラスミドを含むＨＶＪエンベロープベクターを注入したラット心筋では、ペプチド発現プラスミドを含まないＨＶＪエンベロープベクターを注入したラット心筋及び無処置のラット心筋と比較して、有意に微小血管数が増加することを確認する。【０２３８】  （試験例４：ＨＶＪエンベロープベクターを関節内に直接導入することによる関節軟骨の修復）
１０週齢のフィッシャーラットの大腿骨顆間部に直径１．８ｍｍのキルシュナー鋼線を用い軟骨下骨を貫く損傷を作製する。術後１週の時点で、実施例２のＨＶＪエンベロープベクター（１００μｌ／膝）を直接的に関節内へ導入する。コントロールとして、発現プラスミドを含まないＨＶＪエンベロープベクターを同量関節内に投与する。これらの遺伝子等の導入後１、３、４週でラットを屠殺し、組織学的に修復部位を観察する。Ｆ２ペプチド発現プラスミドを含むＨＶＪエンベロープベクターの関節内への投与後３週で修復組織に一部にトルイジンブルー染色にて染色されるプロテオグリカンの合成を認める軟骨様細胞の出現を確認する。【０２３９】  （実施例７：Ｆ２ペプチドによる抗菌活性の確認）
実施例５に示したように、Ｆ２は、その構造解析の結果から、抗菌活性を有することが予測された。そこで、Ｆ２が実際に抗菌活性を有することを確認する。【０２４０】  （抗菌活性の評価法）
抗菌活性を、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＮＣＣＬ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ  Ｍ７−Ａ３）に従って評価する。すなわち、マイクロタイタープレートを用いて、菌の増殖を阻害するペプチドの最小濃度を求める。細菌を、培地で１６時間培養した後、Ａ６００における吸光度を測定する。予め求めた濁度とｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ（ＣＦＵ）との相関から、規定のＣＦＵになるように培地で希釈する。各菌株を５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ（最終濃度）程度になるように添加する。各ペプチドの５ｍＭ水溶液、および培地を用いた１．６ｍＭ溶液を調製し、ここから段階希釈を行う。菌液５０μｌを分注したマイクロプレートに各濃度段階のペプチドを５０μｌずつ分注する（ペプチドの最終濃度は３．１μＭ〜８００μＭ）。ペプチド無添加のものをネガティブコントロールとする。プレートを３７℃で１８時間静置培養し、菌の増殖を阻害する最小濃度（最小発育阻止濃度：ＭＩＣ）を求める。結果として記載される濃度はＭＩＣ（μＭ）である。この方法に従って、Ｆ２ペプチドの抗菌活性を測定する。【０２４１】  以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０２４２】  血管新生活性を有する新規のペプチド、およびそのペプチドをコードする遺伝子を単離することによって、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、末梢血管病、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、虚血性心疾患、および虚血性脳疾患からなる群から選択される疾患の処置、予防、および予後のための新規の薬学的組成物が提供される。さらに、本発明のペプチドを含む抗菌組成物もまた提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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