(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主である細胞内において、前記宿主由来の野生型の第１のＤＮＡポリメラーゼと、前記第１のＤＮＡポリメラーゼの校正機能が破壊された第２のＤＮＡポリメラーゼとを共存させるステップであって、前記第１のＤＮＡポリメラーゼと、前記第２のＤＮＡポリメラーゼを合わせた量を１とした場合に、前記第２のＤＮＡポリメラーゼの相対濃度が０．２９よりも低くなるように共存させる、ステップ、を含む、次世代の細胞のゲノムＤＮＡに突然変異を誘発させる突然変異誘発方法。
【請求項２】
前記第１のＤＮＡポリメラーゼは、突然変異を生じにくい正常な野生型ＤＮＡポリメラーゼであり、前記第２のＤＮＡポリメラーゼは、突然変異を生じやすいミューテーターポリメラーゼであることを特徴とする請求項１記載の突然変異誘発方法。
【請求項３】
ＤＮＡポリメラーゼの校正機能が破壊される変異を、ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子に導入することにより、ミューテーターポリメラーゼをコードする遺伝子を作成し、作成された遺伝子を用いて前記第２のＤＮＡポリメラーゼを得ることを特徴とする請求項１記載の突然変異誘発方法。
【請求項４】
次世代細胞のゲノムＤＮＡに変異が誘発される宿主の細胞であって、
前記細胞には、前記宿主由来の野生型の第１のＤＮＡポリメラーゼと、前記第１のＤＮＡポリメラーゼの校正機能が破壊された第２のＤＮＡポリメラーゼとが細胞内で共存し、
前記第１のＤＮＡポリメラーゼと、前記第２のＤＮＡポリメラーゼを合わせた量を１とした場合に、前記第２のＤＮＡポリメラーゼの相対濃度が０．２９よりも低いことを特徴とする、細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、突然変異誘発方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、生物で突然変異を誘発し、産業上有用な突然変異体、変異代謝物、および変異遺伝子を獲得する方法と、この方法によって得られる突然変異体、その代謝物、およびその遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
産業上有用な突然変異体を獲得するためには、生物で突然変異を誘発する必要がある。突然変異とは、ＤＮＡ（deoxyribonucleic acid ）塩基配列の変化である。突然変異は、それが発生した個体に与える影響により、大きく次の３種類に分けられる。
（１）中立突然変異（neutral mutation）
この突然変異は、突然変異の大部分を占め、生物の成育にほとんど影響がない。
（２）有害突然変異（deleterious mutation）
この突然変異は、中立突然変異の次に多く、生物の成長を阻害する。有害突然変異には、生育に必須な遺伝子を破壊するような致死突然変異（lethal mutation ）も含まれる。微生物の場合、全突然変異に占める有害突然変異の割合は、１／１０〜１／１００と推測されている。
（３）有益突然変異（beneficial mutation）
この突然変異は、生物の育種に有益な突然変異であるが、その発生頻度は有害突然変異と比較して極めて低い。したがって、有益突然変異が導入された生物個体を得るためには、大きな生物集団と、長い時間が必要となる。また、生物の育種の十分な効果は、単一の突然変異だけで現れることはまれであり、複数の有益突然変異の蓄積が必要である。育種のための突然変異を誘発する方法としては、次に示すものが知られている。
（１）自然突然変異（spontaneous mutation）の利用
生物が通常の環境下で正常に生育しているときに発生する突然変異を、自然突然変異という。自然突然変異の主な原因は、ＤＮＡ複製時の誤りと、内在性の突然変異原物質（ヌクレオチドアナログ）であると考えられている（真木, 「自然突然変異と修復機構」, 細胞工学 Vol.13 No.8, pp.663-672, 1994）。
（２）放射線や突然変異原物質（mutagen ）による処理
紫外線やＸ線などの放射線処理、あるいはアルキル化剤のような人工的な突然変異原物質処理によって、ＤＮＡに損傷が生じる。その損傷は、ＤＮＡ複製の過程で突然変異に固定される。
（３）ＰＣＲ（polymerase chain reaction ）法の利用
ＰＣＲ法は、試験管内でＤＮＡを増幅するため、細胞内の突然変異抑制機構の一部が欠けており、高頻度に突然変異の誘発が可能である。また、遺伝子シャフリング法（Stemmer,“Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling”, Nature Vol.370, pp.389-391, Aug. 1994 ）と組み合わせることで、有害突然変異の蓄積を避け、複数の有益突然変異を遺伝子に蓄積することができる。
（４）ミューテーター（mutator ）の利用
ほとんどすべての生物では、突然変異抑制機構によって、自然突然変異の発生率が非常に低いレベルに保たれている。この突然変異抑制機構には、１０種類以上の遺伝子が関与した複数の段階が存在する。これらの遺伝子の１つあるいは複数が破壊された個体は、高い頻度で突然変異を発生するので、ミューテーターと呼ばれている。また、これらの遺伝子は、ミューテーター遺伝子と呼ばれている（真木, 「自然突然変異と修復機構」, 細胞工学 Vol.13 No.8, pp.663-672, 1994; Horst et. al.,“Escherichia coli mutator genes”, Trends in Microbiology Vol.7 No.1, pp.29-36, Jan. 1999）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述した従来の突然変異誘発方法には、次のような問題がある。
一般に、有害突然変異は、有益突然変異よりもはるかに高い頻度で発生する。
その結果、既存の方法で、生物の突然変異率を上昇させれば、有益突然変異の発生頻度も上昇するが、その有益な効果は、より高頻度に発生し蓄積する有害突然変異によって打ち消されてしまう。したがって、従来の方法では、有害突然変異の蓄積なしに、複数の有益突然変異を生物に誘発することは極めて困難である。
さらに、上述した育種のための突然変異誘発方法には、それぞれ、以下のような問題がある。
【０００４】
自然突然変異の発生頻度は極めて低く、例えば、大腸菌等では１０-10 突然変異（１塩基あたり１複製あたり）と推測されている（Drake, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol.88, pp.7160-7164, Aug. 1991）。この極めて低い突然変異発生頻度は、ほとんどすべての生物が持つ突然変異抑制機構によって成し遂げられている。このうち、有益な突然変異の割合は、全自然突然変異に対して数桁低いと考えられる。したがって、自然突然変異を利用した育種は、大きな生物集団と、長い時間を必要とするため、極めて効率が悪い。
【０００５】
また、放射線や突然変異原物質を用いる方法は、自然突然変異と比べて高い頻度で突然変異を発生させることが可能であるが、有効な線量で放射線を照射した細胞や、有効な濃度で突然変異原物質処理を施した細胞のほとんどが死滅する。
これは、ランダムに発生した突然変異の大部分が有害致死突然変異であるからである。また、この方法では、有害突然変異の蓄積なしに、複数の有益な突然変異を導入することは不可能である。なぜなら、有害突然変異は有益突然変異よりもはるかに高い頻度で発生するからである。
【０００６】
また、ＰＣＲ法では、数十ｋｂのＤＮＡ増幅が限界であり、一部の遺伝子を改良することは可能であるが、多くの遺伝子が関与した複雑な代謝物や生物個体そのものの高度な育種は、不可能である。
また、ミューテーターを利用すれば、突然変異を効率よく誘発できるが、基本的に、有害突然変異の蓄積を避けて、複数の有益突然変異を蓄積することは困難である。
【０００７】
このミューテーターを利用した方法に分類されるものに、ディスパリティ法がある（Furusawa and Doi, “Promotion of Evolution: Disparity in the Frequency of Strand-specific Misreading Between the Lagging and Leading DNA Strands Enhances Disproportionate Accumulation of Mutations”, J. Theor. Biol. 157, pp.127-133, 1992; Furusawa and Doi,“Asymmetrical DNA replication promotes evolution: disparity theory of evolution”, Genetica 103, pp.333-347, 1998）。
【０００８】
このディスパリティ法では、二本鎖ゲノムＤＮＡの一方の鎖に他方よりも多く点突然変異が導入される。これにより、ゲノムＤＮＡに１つの一方向性（unidirectional）の複製開始点（origin of replication ）が存在する生物において、有害突然変異の蓄積を避けて、複数の有益突然変異を蓄積することが可能である。
【０００９】
しかし、ほとんどすべての生物はこのようなゲノムＤＮＡの複製機構を持っていない。例えば、バクテリアである大腸菌等では、環状ゲノムＤＮＡに１つの両方向性（bidirectional ）の複製開始点を持つ（Kornberg and Baker, “DNA Replication ”, New York, Freeman, 1992 ）。また、真核生物は、複数の両方向性の複製開始点を持つ。ゲノムＤＮＡに両方向性の複製開始点があるとき、ディスパリティ法では、有害突然変異の蓄積を避けて、複数の有益突然変異を蓄積することはできない。
【００１０】
本発明の課題は、従来の突然変異誘発方法における有害突然変異の蓄積という欠点を克服し、産業上有用な突然変異体を迅速／簡便に創製するために、簡単な操作により、生物で突然変異を効率よく誘発する方法を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の突然変異誘発方法では、１つの細胞内に、忠実度（fidelity）の異なる２種類以上のＤＮＡポリメラーゼを共存させることにより、突然変異を誘発する。
【００１２】
忠実度とは、ＤＮＡ複製の正確さを意味する。忠実度が高いＤＮＡポリメラーゼは、突然変異を生じにくい正常なＤＮＡポリメラーゼに対応し、忠実度が低いＤＮＡポリメラーゼは、突然変異を生じやすいミューテーターポリメラーゼに対応する。このうち、ミューテーターポリメラーゼは、不正確なＤＮＡ複製を行うので、突然変異を促進して遺伝的多様性を生み出すことができ、正常なＤＮＡポリメラーゼは、正確なＤＮＡ複製を行うので、環境により良く適応した突然変異体の遺伝情報を維持することができる。
【００１３】
したがって、これらの２種類のＤＮＡポリメラーゼを１つの細胞内に共存させることで、突然変異を誘発するとともに、突然変異体の遺伝情報を維持することができる。このとき、所望の有益突然変異を誘発する適切なミューテーターポリメラーゼを用いれば、有害突然変異の蓄積を避けて、複数の有益突然変異を蓄積することができ、突然変異を効率よく誘発することが可能となる。
【００１４】
このような突然変異誘発方法を用いることで、産業上有用な突然変異体とその代謝物、およびその突然変異体をコードする遺伝子を、簡便かつ高頻度に獲得することが期待できる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しながら、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
効率の良い育種とは、高速な生物進化を実現することであると考えられる。高速な生物進化には、集団の大きな遺伝的多様性と同時に、有益な突然変異型の安定な増幅が必要である。安定な増幅は、正確なＤＮＡ複製によって達成される。一方で、遺伝的多様性を生み出す原動力は、ＤＮＡ複製のエラーによって生じる突然変異である。したがって、効率の良い生物進化（育種）の鍵は、ＤＮＡ複製機構に存在する。
【００１６】
そこで、生物の遺伝情報であるゲノムＤＮＡの複製機構（Kornberg and Baker, “DNA Replication ”, New York, Freeman, 1992 ）について、簡単に説明する。
１つの１本鎖ＤＮＡを鋳型として相補的な鎖を合成し、その結果、１つの２本鎖ＤＮＡを生じる酵素（ＤＮＡ複製を行う酵素）を、ＤＮＡポリメラーゼという。ＤＮＡ複製には、２つのＤＮＡポリメラーゼが必要である。なぜなら、リーディング鎖とラギング鎖の合成を同時に行わなければならないからである。
【００１７】
ＤＮＡ複製は、ＤＮＡ上の決まった位置から開始されるが、その位置を複製開始点という。例えば、バクテリアでは、通常、環状ゲノムＤＮＡに１つの両方向性の複製開始点を持つ。したがって、１つのゲノムＤＮＡ複製には、４つのＤＮＡポリメラーゼが同時に働く必要がある。
【００１８】
図１は、両方向性の複製開始点を１つだけ持つバクテリア型の環状ゲノムＤＮＡの複製を示す模式図である。図１において、“ｏｒｉ”は両方向性の複製開始点を表し、“ｔｅｒ”は複製の終結点を表す。また、黒丸１１はＤＮＡポリメラーゼを表している。この場合、ゲノムＤＮＡ１２に対して、４つのＤＮＡポリメラーゼ１１が同時に働くことにより、２つのゲノムＤＮＡ１３が生成される。
【００１９】
次に、忠実度の異なるＤＮＡポリメラーゼの共存機構について説明する。本実施形態においては、１つの細胞内に、忠実度の高い正常なＤＮＡポリメラーゼと、忠実度の低いミューテーターポリメラーゼを、共存させる機構が必要となる。
ＤＮＡポリメラーゼの忠実度制御において最も重要なものは、校正機能（proofreading function ）である（真木, 「自然突然変異と修復機構」, 細胞工学 Vol.13 No.8, pp.663-672, 1994）。この校正機能は、ＤＮＡ合成のときに、間違って取り込まれた、鋳型塩基と相補的でないヌクレオチドを、３’→５’エキソヌクレアーゼで取り除くことにより、ＤＮＡ合成の忠実度を上昇させる。
【００２０】
突然変異によって、この３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が低下または破壊された細胞はミューテーターとなり、その突然変異率は大きく上昇する（Echols, Lu, and Burgers,“Mutator strains of Escherichia coli, mutD and dnaQ, with defective exonucleolytic editing by DNA polymerase III holoenzyme”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol.80, pp.2189-2192, Apr. 1983;  真木, 「自然突然変異と修復機構」, 細胞工学 Vol.13 No.8, pp.663-672, 1994）。
【００２１】
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性による校正機能は、生物に普遍的に存在している突然変異抑制機構である。そして、この３’→５’エキソヌクレアーゼの活性中心と思われる部位は、高度に保存されている（Fijalkowska and Schaaper, “Mutants in the Exo I motif of Escherichia coli dnaQ: Defective proofreading and inviability due to error catastrophe”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol.93, pp.2856-2861, Apr. 1996; Taft-Benz and Shaaper, “ Mutational analysis of the 3'→5' proofreading exonuclease of Escherichia coli DNA polymerase III”, Nucleic Acids Research Vol.26 No.17, pp.4005-4011, 1998 ）。
【００２２】
例えば、グラム陰性バクテリア（Gram-negative bacteria）、グラム陽性バクテリア（Gram-positive bacteria）、および真核生物（Eucaryote ）のＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性中心と考えられる、ＥｘｏＩモチーフのアミノ酸配列は、以下のようになる。
0004647117.tif 000002
0004647117.tif 000003
これらの１９個のアミノ酸配列では、左から５番目および７番目の２つの酸性アミノ酸（アスパラギン酸Ｄおよびグルタミン酸Ｅ）が、種を越えて保存されていることが分かる。なお、これらのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋよりダウンロードした。
【００２３】
このような３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が破壊されるような突然変異を、ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子（ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子）に導入することにより、ミューテーターポリメラーゼをコードする遺伝子（ミューテーターポリメラーゼ遺伝子）を作成することができる。そして、作成された遺伝子を用いれば、ミューテーターポリメラーゼが得られる。
【００２４】
しかしながら、校正機能の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は、単一のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（ＰｏｌＣ，ＰＯＬ２，ＣＤＣ２等）にＤＮＡ合成活性と共にコードされる場合（真核生物やグラム陽性バクテリア等）と、ＤＮＡ合成活性をコードする遺伝子（ｄｎａＥ）とは異なる遺伝子（ｄｎａＱ）にコードされる場合（グラム陰性バクテリア等）がある（Kornberg and Baker, “DNA Replication ”, New York, Freeman, 1992 ）。
【００２５】
図２は、真核生物・グラム陽性バクテリア型のＤＮＡポリメラーゼの模式図である。真核生物・グラム陽性バクテリア型では、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性とＤＮＡ合成活性が、１つのタンパク質（ＰｏｌＣ等）の中に存在する。ＥｘｏＩ、ＥｘｏＩＩ、ＥｘｏＩＩＩは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性中心と考えられる、種を越えて保存されている、アミノ酸配列である。
【００２６】
これに対して、グラム陰性バクテリア型のＤＮＡポリメラーゼの模式図は、図３のようになる。グラム陰性バクテリア型では、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性とＤＮＡ合成活性が、２つのタンパク質（ＤｎａＱとＤｎａＥ）に分かれて存在する。
【００２７】
このように、生物種によって校正活性のコード方法が異なるため、１つの細胞内で忠実度の異なるＤＮＡポリメラーゼの共存を実現するためには、生物種により異なった方法を用いる必要がある。
まず、真核生物やグラム陽性バクテリアでは、図２に示したように、ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成活性と校正活性が１本のペプチド内に存在する。そこで、まず、ミューテーターポリメラーゼ遺伝子を作成するために、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（ＰｏｌＣ，ＰＯＬ２，ＣＤＣ２等）に、ＤＮＡ合成活性は正常であるが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性のみが破壊されるような突然変異を導入する。
【００２８】
３’→５’エキソヌクレアーゼの活性中心の一つであるExoIモチーフには、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性に重要な２つの酸性アミノ酸が存在する（Derbyshire et. al., EMBO J. 10, pp.17-24, Jan. 1991; Fijalkowska and Schaaper,“Mutants in the Exo I motif of Escherichia coli dnaQ: Defective proofreading and inviability due to error catastrophe”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol.93, pp.2856-2861, Apr. 1996 ）。これらの酸性アミノ酸は、上述の大腸菌ＤｎａＱタンパク質（Escherichia coli DnaQ ）の１２番目のアスパラギン酸（Ｄ）と１４番目のグルタミン酸（Ｅ）に相当する。
【００２９】
したがって、これらの２つの酸性アミノ酸のどちらか一方、あるいは両方を、異なったアミノ酸（例えば、アラニン等）に置換するような点突然変異を導入することで、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性のみが破壊されたミューテーターポリメラーゼを得ることができると考えられる。
【００３０】
こうして生成されたミューテーターポリメラーゼ遺伝子を、適当な量で発現できる、市販のベクターＤＮＡに連結し、野生型のポリメラーゼ遺伝子を持った宿主細胞に形質転換導入する。また、二倍体生物の場合、ミューテーターポリメラーゼ突然変異と野生型のヘテロ接合体を利用することも考えられる。
【００３１】
次に、グラム陰性バクテリアでは、図３に示したように、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ合成サブユニットと校正サブユニット（３’→５’エキソヌクレアーゼ）に分かれている。そのため、細胞内でミューテーターポリメラーゼを発生させるいくつかの方法が存在するが、主なものを以下に挙げる。
（１）校正サブユニットの発現量の調節
ＤＮＡ合成サブユニット（ＤｎａＥ）に校正サブユニット（ＤｎａＱ）が結合していれば、そのＤＮＡポリメラーゼは高い忠実度を持つ。しかし、校正サブユニットを欠くＤＮＡポリメラーゼは、ミューテーターポリメラーゼとなる。遺伝子工学的に校正サブユニットの発現量を低下させることで、校正サブユニットを持つ正常ポリメラーゼと、校正サブユニットを持たないミューテーターポリメラーゼを細胞内に作り出すことができる。
【００３２】
例えば、ｄｎａＱ遺伝子の５’−非翻訳領域には、転写開始配列（−１０と−３５配列）と翻訳開始配列（ＳＤ配列）が存在するが（Maki et. al., “Structure and expression of the dnaQ mutator and the RNase H genes of Escherichia coli: Overlap of the promoter regions ”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol.80, pp.7137-7141, Dec. 1983 ）、それらの配列にランダムな突然変異を導入することで、ｄｎａＱ遺伝子の発現量が低下した変異体を得ることができると考えられる。
（２）３’→５’エキソヌクレアーゼが欠損した校正サブユニットの共発現
ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成サブユニット（ＤｎａＥ）への結合能力は正常であるが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性のみが破壊されるような突然変異を、校正サブユニット（ＤｎａＱ）に導入する。この突然変異は、真核生物・グラム陽性バクテリア型の場合と同様に、３’→５’エキソヌクレアーゼの活性中心の一つであるＥｘｏＩモチーフに保存されている２つの酸性アミノ酸のどちらか一方、あるいは両方を、アラニン等に置換するような点突然変異が考えられる。
【００３３】
突然変異を導入した校正サブユニット遺伝子を、適当な量で発現できる、市販のベクターＤＮＡに連結し、野生型のポリメラーゼ遺伝子を持った宿主細胞に形質転換導入する。
次に、決定論的検証１（淘汰なしの場合）、決定論的検証２（淘汰ありの場合）、および確率論的検証（遺伝的アルゴリズム・シミュレーション）の３つの計算機実験（computer simulation）により、本発明の有効性について検証する。
「決定論的検証１（淘汰なしの場合）」
今後、本発明の突然変異誘発方法（１つの細胞内に、忠実度の異なるＤＮＡポリメラーゼを共存させて行う突然変異誘発方法）を、混在戦略（heterogeneous strategy）と呼ぶことにする。一方で、従来通りの、細胞内のＤＮＡポリメラーゼの忠実度が等しい突然変異誘発方法を、均質戦略（homogeneous strategy）と呼ぶことにする。
【００３４】
例として、バクテリア型の一倍体ゲノムＤＮＡ上に１つの両方向性の複製開始点が存在する２分裂生物集団において、高頻度に突然変異を誘発した場合の突然変異体の分布を検証する。
図４は、このような生物の細胞集団が淘汰なしの条件で増殖する場合の、混在戦略と均質戦略の突然変異体分布を示している。ここでは、簡単のために、発生した突然変異はゲノムＤＮＡの複製速度に影響を与えないものとした。
【００３５】
図４において、縦２本の平行線２１はゲノムＤＮＡを表し、菱形２２は両方向性の複製開始点を表し、白丸２３は正常なＤＮＡポリメラーゼを表し、黒丸２４はミューテーターポリメラーゼを表し、横棒２５は突然変異を表している。また、Ｆ０、Ｆ１、Ｆ２、およびＦ３は、それぞれ、第０世代、第１世代、第２世代、および第３世代を表している。
【００３６】
混在戦略では、ゲノム複製に関与する４つのＤＮＡポリメラーゼのうち、３つは忠実度の高い正常なポリメラーゼであり、突然変異を生じないものとする。そして、残りの１つがミューテーターポリメラーゼで、１回の合成当たり４つの突然変異を生じるものとする。このミューテーターポリメラーゼは、ＤＮＡ複製のときに、４ヶ所中ランダムな位置を占める。このとき、平均突然変異率は２（ゲノム当たり複製当たり）であるが、第３世代後においても、突然変異を全く持たない野生型が存在する。また、集団中に一度現れた突然変異型は、後の世代でも保存されていることが分かる。
【００３７】
一方、均質戦略では、ゲノム複製に関与する４つのＤＮＡポリメラーゼの忠実度はすべて等しく、１回の合成当たり１つの突然変異を生じる。したがって、平均突然変異率は２（ゲノム当たり複製当たり）となり、混在戦略のそれと等しい。しかしながら、均質戦略では、１つも突然変異を持たない野生型は、第１世代で消失する。また、集団中に現れた突然変異型は、その次の世代には確実に消失する。
【００３８】
ここで、細胞内に十分な数のＤＮＡポリメラーゼが存在するとき、ミューテーターポリメラーゼと正常ポリメラーゼの細胞内相対濃度を、それぞれｒと（１−ｒ）とする。このとき、二項分布より、娘ゲノムが２つの正常ポリメラーゼによって合成される期待値は（１−ｒ）2 となる。
【００３９】
したがって、無限に増殖する２分裂細胞集団において、２（１−ｒ）2 ＞１より、ｒ＜０．２９のとき、野生型および集団中に一度現れた突然変異型を、保障することができる。このｒの閾値（０．２９）は、ミューテーターポリメラーゼの突然変異率には依存しない。この結果は、ｒが閾値を超えない混在戦略生物集団では、一度獲得した最大適応度を失うことなく、多様性を拡大して、高速に進化できることを意味している。
「決定論的検証２（淘汰ありのとき）」
連続培養装置（例えば、ケモスタット）で連続培養されている十分に大きな細胞集団を考える。集団サイズを一定にするために淘汰が存在する。野生型は突然変異型よりも増殖速度が大きいものとして、連続培養を行い、各遺伝子型の濃度が平衡状態に達したときの野生型の相対濃度ｘを求める。ここで、ｘを求めるために、アイゲン方程式の近似解である次式を用いた（Eigen et. al.,“Molecular Quasi-Species ”, Journal of Physical Chemistry. Vol.92 No.24, pp.6881-6891, 1988 ）。
【００４０】
【数１】
0004647117.tif 000004
ここで、Ｑは野生型ゲノムが複製されるときの正確さ（忠実度の一例）に対応し、Ｗは野生型の複製速度を表し、Ｍは突然変異体の複製速度を表している。式（１）によれば、ゲノムサイズが十分に大いとき、閾値を越えない突然変異率で、ｘの良い近似を得ることができる。突然変異率の閾値とは、生物がその遺伝情報を維持して存在することが可能な突然変異率の最大値である（Eigen et. al.,“Molecular Quasi-Species ”, Journal of Physical Chemistry. Vol.92 No.24, pp.6881-6891, 1988 ）。混在戦略のときのＱは、次式により求めることができる。
【００４１】
【数２】
0004647117.tif 000005
ここで、ａはゲノム上に存在する両方向性の複製開始点の数を表し、ｒと（１−ｒ）は、それぞれ、ミューテーターポリメラーゼと正常ポリメラーゼの細胞内相対濃度を表し、ｍは平均突然変異率（ゲノム当たり複製当たり）を表す。正常ポリメラーゼの忠実度は非常に高いので（Drake, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol.88, pp.7160-7164, Aug. 1991）、その突然変異率はゼロとした。
【００４２】
生物集団が、一度獲得した最大適応度を失うことなく、できるだけ多様性を拡大して進化できる突然変異率の閾値ｍmax は、ｘ＝０のときの平均突然変異率ｍである。ｘ＝０のとき、式（１）をｍについて解くと、ｍmax は次式のようになる。
【００４３】
【数３】
0004647117.tif 000006
図５は、このような淘汰ありの条件で増殖する生物集団における、混在戦略と均質戦略の突然変異率の閾値ｍmax の変化を示している。ここでは、式（３）において、Ｗ＝１０、Ｍ＝１とおき、ａとｒを変化させてｍmax をプロットした。
【００４４】
図５において、従来法である均質戦略（ｒ＝１）のとき、ｍmax は約２．３である。一方、混在戦略（ｒ＜１）のときは、均質戦略と比べて、ｍmax をより大きく設定することができる。また、複製開始点の数ａが増加しても、ｒを減少させることで、ｍmax を増加させることができる。式（３）より、ｒ＜１−（Ｍ／Ｗ）1/2aのとき、ミューテーターポリメラーゼの突然変異率に関係なく、最も適応度が高い野生型を保障することができる。
【００４５】
この結果は、混在戦略が、均質戦略よりも効率よく、遺伝的多様性を拡大すると同時に、獲得したより高い適応度を持つ個体を保障しつつ、高速に進化できることを意味している。また、混在戦略の優れた進化能力は、複数の複製開始点が存在するゲノムＤＮＡを持つ生物においても発揮されることを示している。
「確率論的検証（遺伝的アルゴリズム・シミュレーション）」
混在戦略の進化能力を確率論的に検証するため、遺伝的アルゴリズム（genetic algorithm, GA ）を用いて関数最適化を行った。ＧＡは、突然変異と淘汰による生物進化を模倣して数学問題を解くためのコンピュータプログラムである（Holland,“Adaptation in Natural and Artificial Systems”, Ann Arbor, MI: Univ. of Michigan Press, 1975; Goldberg, “Genetic Algorithms in Search, Optimization, and Machine Learning”, Reading, MA, Addison-Wesley, 1989; Forrest, “Genetic Algorithms: Principles of Natural Selection Applied to Computation”, Science Vol.261, pp.872-878, Aug. 1993）。
【００４６】
ここで用いた集団は、バクテリア型の一倍体ゲノムを持つ単細胞個体から構成され、各個体は１６ビットの２進数配列ゲノム（Gray code ）を持つ。この配列は、中央に両方向性の複製開始点を持つ２本鎖ＤＮＡのように、ポリメラーゼによって複製される。
【００４７】
また、ミューテーターポリメラーゼと正常ポリメラーゼの細胞内相対濃度は、それぞれｒと（１−ｒ）とし、正常ポリメラーゼの忠実度は非常に高いので、その突然変異率はゼロとした。集団個体の平均突然変異率をｍ（ゲノム当たり複製当たり）とすると、ミューテーターポリメラーゼの突然変異率は、ｍ／ｒ（ゲノム当たり複製当たり）となる。適応関数Ｆ（ｘ）は、複雑な適応地形になるように、サイン曲線を組み合わせて、次式のように定義した。
【００４８】
【数４】
0004647117.tif 000007
また、個体集団のサイズは１００個体に固定され、この個体集団は１世代で倍加した後、淘汰により、より高い適応度を持った個体が選抜されて、次世代に残される。
【００４９】
図６は、このようなＧＡを用いて関数最適化を行ったときの集団の平均適応度の変化を示している。ここでは、１００回の試行の平均を１００世代後の集団の平均適応度Ｆm とし、パラメータｒとｍを変化させたときのＦm の値をプロットした。
【００５０】
図６の結果によれば、均質戦略（ｒ＝１）のときの最大平均適応度は約０．５であるのに対して、混在戦略（ｒ＜１）のときの最大平均適応度は約０．８にまで到達した。この結果は、多重突然変異が必要な複雑な適応地形における進化において、混在戦略は均質戦略よりも優れていることを示している。
【００５１】
【実施例】
大腸菌を用いて、混在戦略におけるミューテーター細胞を作成し、２種類の薬剤に対する耐性変異体の出現数を調べることで、その突然変異誘発の効果を検証した。使用した２種類の薬剤はリファンピシンとナリジキ酸である。これらの薬剤の作用機構は異なるために、その薬剤耐性を獲得するには、少なくとも２つ以上の異なった遺伝子上の突然変異が必要となる（田中信男・中村昭太郎, 抗生物質大要  第４版, 東京大学出版会, pp.363-384, 1992）。
【００５２】
大腸菌ＭＧ１６５５株（American Type Culture Collectionより購入）の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡプライマーセットＱＢ１Ｆ（5'-aagtatggaagatctgcgtccgcgatagcgtaaaatag-3'：配列表の配列番号２０）とＱＨ１Ｒ（5'-caagttcgattcgaatcatgagtgaatagtggcggaac-3'：配列表の配列番号２１）を用いて、ｄｎａＱ構造遺伝子とその５’−遺伝子発現調節領域を含む１．１ｋｂのＤＮＡ断片をＰＣＲ法で増幅した。ＱＢ１ＦとＱＨ１Ｒの５’−側には、それぞれ、ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列が添付されているので、増幅したＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素消化した。
【００５３】
次に、制限酵素消化したＤＮＡ断片を、ｐＢＲ３２２ベクターＤＮＡ（宝酒造より購入）とｐＭＷ２１９ベクターＤＮＡ（ニッポンジーンより購入）のそれぞれのＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ（付着末端がＢｇｌＩＩと同じ）の制限酵素切断部位に連結して、生じたｄｎａＱプラスミドＤＮＡをそれぞれｐＤＱ１とｐＤＱ２と命名した。
【００５４】
次に、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社）を用いて、ＤｎａＱタンパク質の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性中心の１つと考えられる１２番目のアスパラギン酸（ＧＡＴ）がアラニン（ＧＣＴ）に置換するように、ｐＤＱ２上のｄｎａＱ遺伝子に変異を導入した。この変異をｄｎａＱ５５と命名し、生じたｄｎａＱ５５プラスミドをｐＤＱ３と命名した。
【００５５】
図７は、ｐＢＲ３２２およびｐＭＷ２１９と、それらに由来するプラスミドｐＤＱ１、ｐＤＱ２、およびｐＤＱ３の、細胞当たりのコピー数（Sambrook et. al., Molecular Cloning 2nd edition, BOOK 1,“Essential Features of Plasmids”, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ）を示している。
【００５６】
次に、ＭＧ１６５５株にｐＤＱ１を導入し、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）耐性形質転換体ＭＧ１６５５（ｐＤＱ１）を得た。さらに、ＭＧ１６５５（ｐＤＱ１）にｐＤＱ３を導入して、カナマイシン（２０μｇ／ｍＬ）耐性形質転換体ＭＧ１６５５（ｐＤＱ１、ｐＤＱ３）を得た。次に、ＭＧ１６５５株にｐＤＱ３を導入し、カナマイシン耐性形質転換体ＭＧ１６５５（ｐＤＱ３）を得ようと試みたが、得られなかった。
【００５７】
図７に示した各ｄｎａＱプラスミドの細胞当たりのコピー数と、染色体上には野生型ｄｎａＱ遺伝子が１コピーだけ存在することから、各ｄｎａＱプラスミドを持つＭＧ１６５５株のミューテーターポリメラーゼの細胞内相対比（細胞内相対濃度）を算出すると、図８のような結果が得られた。
【００５８】
また、ＭＧ１６５５株を３５℃のＬＢ（Luria-Bertani ）寒天平板培地で一晩培養し、生じたコロニーを５ｍＬのＬＢ液体培地に植え付け、さらに、３５℃で一晩振盪培養した培養液１ｍＬを、リファンピシン（１００μｇ／ｍＬ）とナリジキシン酸（３０μｇ／ｍＬ）を同時に含むＬＢ寒天平板培地に植え付け、３５℃で一日培養した。そして、リファンピシン・ナリジキシン酸耐性変異体の出現数を観測した。
【００５９】
同様に、ＭＧ１６５５（ｐＤＱ１、ｐＤＱ３）株を培養し（ただし、培地には５０μｇ／ｍＬのアンピシリンと２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）、リファンピシン・ナリジキシン酸耐性変異体の出現数を観測した。
さらに、大腸菌のミューテーターとして良く研究されているｍｕｔＤ５変異（Fowler et. al., “Mutational Specificity of a Conditional Esherichia coli Mutator, mutD5”, Molec. gen. Genet. 133, pp.179-191, 1974; Fijalkowska and Schaaper, “Mutants in the Exo I motif of Escherichia coli dnaQ: Defective proofreading and inviability due to error catastrophe”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol.93, pp.2856-2861, Apr. 1996 ）を持つＨＣ１０８株と、ｍｕｔＳ変異（Modrich, Annu. Rev. Genet. 25,“Mechanisms and biological effects of mismatch repair”, pp.229-253, 1991; Horst et. al.,“Escherichia coli mutator genes”, Trends in Microbiology Vol.7 No.1, pp.29-36, Jan. 1999; 梅津桂子, 「ミスマッチ修復の分子機構」, 細胞工学 Vol.13 No.8, pp.673-682, 1994）を持つＥＳ１３０１  ｍｕｔＳ株（Promega 社より購入）を同様に培養し、リファンピシン・ナリジキシン酸耐性変異体の出現数を観測した。
【００６０】
ｍｕｔＤ５変異を持つＨＣ１０８株は、ｐＫＯ３システム（Link et. al., “Methods for Generating Precise Deletions and Insertions in the Genome of Wild-Type Esherichia coli: Application to Open Reading Frame Characterization”, Jounal of Bacteriology Vol.179 No.20, pp.6228- 6237, Oct. 1997）を用いて、ＭＧ１６５５株のｄｎａＱ遺伝子をｍｕｔＤ５遺伝子に置換したものである。
【００６１】
図８のリファンピシン・ナリジキシン酸耐性変異体数は、これらの株における観測結果を示している。野生型のｄｎａＱ遺伝子を持つＭＧ１６５５株では、リファンピシン・ナリジキシン酸耐性変異体を得ることができなかった。これは、ＭＧ１６５５株の細胞内にはミューテーターポリメラーゼが存在していないので、突然変異の発生頻度が極めて低いためであると考えられる。
【００６２】
また、校正機能が破壊されたＨＣ１０８  ｍｕｔＤ５株でも、リファンピシン・ナリジキシン酸耐性変異体を得ることができなかった。これは、ＨＣ１０８  ｍｕｔＤ５株の細胞内ポリメラーゼのすべてがミューテーター型であり、その変異誘発が均質戦略に対応するので、有害変異の蓄積を避けて、目的の薬剤耐性変異を効率よく獲得することができなかったためと考えられる。
【００６３】
また、校正機能とは異なる変異抑制機構であるミスマッチ修復系が破壊されたＥＳ１３０１  ｍｕｔＳ株でも、リファンピシン・ナリジキシン酸耐性変異体を得ることができなかった。これは、ミスマッチ修復系が破壊されたミューテーターでは、突然変異が効率よく誘発されないことを示している。
【００６４】
一方、ＭＧ１６５５（ｐＤＱ１、ｐＤＱ３）株では、細胞内にミューテーターポリメラーゼが〜２０％存在し、混在戦略で突然変異が誘発されるが、リファンピシン・ナリジキシン酸耐性変異体を得ることができた。
しかし、細胞内にミューテーターポリメラーゼが〜８０％存在することになると予想される、混在戦略のＭＧ１６５５（ｐＤＱ３）株では、その形質転換体を得ることができなかった。これは、ミューテーターポリメラーゼの細胞内相対比が閾値を超えて高いために、野生型と集団中に現れた変異型の遺伝情報を維持できなかったためであると考えられる。
【００６５】
したがって、混在戦略で効率よく突然変異を誘発するためには、細胞内のミューテーターポリメラーゼが〜２０％程度存在するのが好ましいといえる。この結果は、上述の決定論的検証１で求めた条件“ｒ＜０．２９”とよく一致している。こうして、計算機実験と大腸菌を用いた実験により、本発明の突然変異誘発方法の有効性が確認できた。
【００６６】
【発明の効果】
本発明によれば、簡単な操作により、微生物や細胞、または生物個体の育種を行うことができる。これにより、従来の方法では得ることができなかったような、産業上有用な突然変異体やその遺伝子産物を効率よく得ることが期待できる。
【００６７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】バクテリア型の環状ゲノムＤＮＡの複製を示す図である。
【図２】真核生物・グラム陽性バクテリア型のＤＮＡポリメラーゼを示す図である。
【図３】グラム陰性バクテリア型のＤＮＡポリメラーゼを示す図である。
【図４】生物集団が淘汰なしの条件で増殖する場合の、混在戦略と均質戦略の突然変異体分布を示す図である。
【図５】生物集団が淘汰ありの条件で増殖する場合の、混在戦略と均質戦略の突然変異率の閾値の変化を示す図である。
【図６】遺伝的アルゴリズムを用いて関数最適化を行ったときの、集団の平均適応度の変化を示す図である。
【図７】ｄｎａＱプラスミドの細胞当たりのコピー数を示す図である。
【図８】ミューテーターポリメラーゼの細胞内相対比と、リファンピシン・ナリジキシン酸耐性変異体数を示す図である。
【符号の説明】
１１  ＤＮＡポリメラーゼ
１２、１３、２１  ゲノムＤＮＡ
２２  複製開始点
２３  正常なＤＮＡポリメラーゼ
２４  ミューテーターポリメラーゼ
２５  突然変異
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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