(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レポーター遺伝子の上流にプロモーター、更にその上流にエンハンサー挿入用マルチプルクローニングサイトを組込んだエンハンサー活性測定用のレポータープラスミドであって、
前記プロモーターが、配列番号１に記載のα２ｕグロブリンプロモーターから調製され、かつ前記α２ｕグロブリンプロモーターのTATAボックスから上流へ向う９０〜３００塩基からなるプロモーターであり、
前記α２ｕグロブリンプロモーターのTATAボックスから上流へ向う塩基の数は、前記マルチプルクローニングサイトに挿入されるエンハンサーの種類に対応して選択される、レポータープラスミド。
【請求項２】
マルチプルクローニングサイトに、エストロゲンとエストロゲン受容体との結合体と結合する配列番号３に記載のエンハンサーを挿入してなる請求項１に記載のレポータープラスミド。
【請求項３】
前記プロモーターが、配列番号４または配列番号５に記載のプロモーターである請求項２に記載のレポータープラスミド。
【請求項４】
マルチプルクローニングサイトに、男性ホルモンと男性ホルモン受容体との結合体と結合する配列番号２に記載のエンハンサーを挿入してなる請求項１に記載のレポータープラスミド。
【請求項５】
前記プロモーターが、配列番号５に記載のプロモーターである請求項４に記載のレポータープラスミド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エンハンサー活性測定用プラスミドベクターに関し、更に詳述すれば、内分泌攪乱物質（いわゆる環境ホルモン等の化学物質）等のホルモン様作用濃度決定等に使用できるエンハンサー活性測定用プラスミドベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
自然環境中には産業由来の化学物質が存在し、この化学物質の一部は、ホルモン様活性があるため、自然環境中に棲息する生物（以下、環境生物という）や人の生体内に取り込まれた場合、環境生物や人の内分泌系を攪乱し、生殖障害等を引き起こすことが疑われ、大きな社会問題となっている。この問題に対応する方法として、内分泌攪乱作用が疑われている化学物質に関する環境生物や人への暴露の実態調査や内分泌攪乱作用メカニズムの解明とともに、化学物質の内分泌物質様活性を評価する方法の開発が急務となっている。
【０００３】
従来、化学物質の内分泌物質様活性を評価する方法、例えばホルモン受容体の一種であるエストロゲン受容体に対する内分泌物質様活性を評価する方法として、レポーター遺伝子アッセイがある。
【０００４】
この方法は、エストロゲン等のホルモンの生体内作用メカニズムを模擬した方法である。即ち、エストロゲン等のホルモンは培養細胞核内に移動し、ここでエストロゲン受容体に結合するが、この結合体は染色体遺伝子の特定塩基配列を認識してその特定塩基配列の遺伝子（エンハンサー）に結合し、その下流にある遺伝子の転写を引き起す。その結果それに対応するタンパク質が合成される。
【０００５】
レポーター遺伝子アッセイでは、培養細胞中に、ホルモン受容体を合成する発現遺伝子、及びホルモンとその受容体との結合体が特異的に結合する特定の塩基配列（エンハンサー）と、その下流に結合したプロモーターと、更にその下流に結合したレポーター遺伝子とを注入し、評価対象の化学物質に暴露させる。
【０００６】
レポーター遺伝子としては、タンパク質の合成量を発光量等で高感度に測定できるホタルルシフェラーゼ等の遺伝子等を用いている。
【０００７】
化学物質が細胞中で発現している受容体に結合しやすいものであれば、受容体と結合し、その結合体がエンハンサーの特定塩基配列に結合し、その結果、ルシフェラーゼ等のレポータータンパク質を発現する。このレポータータンパク質の発現量を、その発光量等を測定して求めることにより、前記化学物質のホルモン様の作用の程度を推定できる。
【０００８】
従来、このような目的で用いる市販エンハンサー活性測定用レポータープラスミドのプロモーターには、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＴＫ等が使用されている。図６は、従来のレポータープラスミドの一例を示すもので、ルシフェラーゼ、LacZ（β−ガラクトシダーゼ）等のレポーター遺伝子の上流にはＳＶ４０のプロモーター配列を配し、更にその上流にはエンハンサー配列を挿入するためのマルチプルクローニングサイトを配置してある。
【０００９】
しかし、これらのレポータープラスミドを用いてエストロゲン受容体レポーターアッセイを行う場合、バックグラウンドの発光量が大きく、例えばエストラジオール等のエストロゲンによる最大活性値はコントロールの５倍程度で光量差が小さく、このため測定値のばらつきも大きい。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、上記問題を解決するために種々検討しているうちに、ラットα2uグロブリン遺伝子プロモーターをレポータープラスミドのプロモーターとして用いると、上記問題を解決できること、特に、α2uグロブリンプロモーターのTATAボックスから上流に向う９０〜３００塩基がプロモーターとして有効であり、これを用いる場合は、転写活性化効率を低減させることなくバックグランドを低減させることができ、その結果コントロールに対する最大活性値を１０〜２０倍に向上できることを知得し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
従って、本発明の目的とするところは、高感度、高再現性のある測定値を得ることのできるレポータープラスミドを提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために本発明は、
〔１〕  レポーター遺伝子の上流にプロモーター、更にその上流にエンハンサー挿入用マルチプルクローニングサイトを組込んだレポータープラスミドにおいて、前記プロモーターがα2uグロブリンプロモーターであることを特徴とするレポータープラスミド。
【００１３】
〔２〕  プロモーターが、α2uグロブリンプロモーターのTATAボックスから上流へ向う９０〜３００塩基からなるプロモーターである〔１〕に記載のレポータープラスミド。
【００１４】
〔３〕  マルチプルクローニングサイトにエストロゲンとエストロゲン受容体との結合体と結合するエンハンサーを挿入してなる〔１〕又は〔２〕に記載のレポータープラスミド。
【００１５】
〔４〕  マルチプルクローニングサイトに男性ホルモンと男性ホルモン受容体との結合体と結合するエンハンサーを挿入してなる〔１〕又は〔２〕に記載のレポータープラスミド。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明のレポータープラスミドは、図１に示すように、レポーター遺伝子２の上流にプロモーター４、その上流にエンハンサー挿入用マルチプルクローニングサイト６を順次プラスミドに組み込んでなる。
【００１８】
レポーター遺伝子２は、化学物質や光等を用いてその存在量を高感度で検出することのできるタンパク質を発現するものであればいずれのものでも良い。具体的には、発光量を検出できるルシフェラーゼ、LacZ（β-ガラクトシダーゼ）等のレポータータンパク質を発現する遺伝子を例示できる。
【００１９】
本発明で使用するプロモーター４は、α2uグロブリンプロモーターである。プロモーターとして、α2uグロブリンプロモーターをそのまま用いても良いが、特にα2uグロブリンプロモーターのTATAボックスから上流へ向かって９０〜３００塩基までの部分が好ましく、より好ましくはTATAボックスから上流へ向かって１００〜１５０塩基までの部分である。この塩基部分を用いることにより、後述するように、このレポータープラスミドを用いて環境ホルモンのレポーター遺伝子アッセイ等を行う場合、転写活性化効率を低減させることなく測定系の化学発光バックグラウンドを大幅に減少させることができ、その結果コントロールに対する最大活性化倍率を１０〜２０倍向上できる。
【００２０】
α2uグロブリンプロモーターの塩基配列（配列番号１）は以下に示すものである。
【００２１】
【表１】
5'-GAACACCCACTGTTTTTCTTGGAAATATGCTTTGTGAAATGTATTAGTGAAAAAAATCAATCCATAGGAGATGAGATTGCCAAGTTGGAAAAGGGCAGGAACAATCCTTGGCTTCACATCAGTACATGAGAAAACATTCCAAAAAGCCTGAGGGAAGGAGGCCCATATGAGAAGGAAAAAAAAAACACTGGAACCCAGAGAGAGTATAAAGACGAGCAAAGTGCTGAAGGTGGAGTGTGGGCATCATCAGCAGAGAGAGATTGTCCCAACAGAGAGGCAATTCTATTCCCTACCAACATG-3'
マルチクローニングサイト６は、アッセイの対象とする化合物等に応答する受容体と化合物との結合体と結合するエンハンサーの挿入用である。マルチクローニングサイト６としては、具体的には、
5'-GGTACCGAGCTCTTACTCGTGCTAGCCCGGGCTCGAGATCTGCGATCTAAGTAAGCTT-3'
（配列番号７）を例示できる。
【００２２】
エンハンサーとしては、エストラジオール等の女性ホルモンやテストステロン等の男性ホルモンと結合する受容体とこれらホルモンとの結合体に結合するエンハンサーを例示できる。
【００２３】
上記レポータープラスミドの製造方法は、女性ホルモン活性をみる場合には市販のルシフェラーゼレポーターベクター（pGL3 basic vector、プロメガ社製等）のマルチクローニングサイトにエンハンサーとして女性ホルモン応答配列（ERE）を組込んだ後、ルシフェラーゼ遺伝子の開始コドンからEREの間にα2uグロブリンプロモータを組込むことによって作製することができる。
【００２４】
上記レポータープラスミドを用いてエストロゲンに対する環境ホルモンのレポーター遺伝子アッセイを行う場合は、上記レポータープラスミドと化学物質、女性ホルモン受容体を発現させるためのプラスミドを培養細胞に入れ、所定期間培養した後、ルシフェラーゼの発現量を発光量等として測定する。この発光量等の強弱により、化学物質のホルモン作用の強さの程度を推定する。
【００２５】
なお、受容体発現プラスミドは市販の哺乳動物細胞発現ベクター（pCI；プロメガ株式会社、pCDNA3.3；インビトロゲン社など）に各ホルモン受容体遺伝子を挿入することにより、容易に作製することが可能である。また、既にホルモン受容体を発現している細胞（女性ホルモン受容体を発現しているMCF-7細胞など）等ではホルモン受容体発現プラスミドの導入は省略可能である。
【００２６】
以下実施例により本発明を更に具体的に説明する。
【００２７】
【実施例】
実施例１
（女性ホルモン測定用レポータープラスミドの合成）
ERE（配列番号３）を合成した。市販レポータープラスミド（商品名 pGL3-ベーシックベクター、プロメガ社）１μｇを制限酵素Kpn IとSac Iとを用いて切断した後、上記のEREを組込みERE/pGL3-ベーシックベクターを作製した。
【００２８】
さらに、プラスミド（ERE/pGL3-ベーシックベクター）を制限酵素Nco Iと Xho Iで切断し、EREとルシフェラーゼの開始コドンの間にAUG100（配列番号４）を組込んだ。
【００２９】
上記AUG100を組込んだERE/pGL3-ベーシックベクター用いて大腸菌を形質転換した後、コロニーを培地で培養した。プラスミドの精製（GFXTM Micro Plasmid Prep Kit、アマシャムファルマシア社製又はプラスミド精製キット、キアゲン社製）を行って、ERE-AUG100-Luc+レポータープラスミドを得た。
【００３０】
（女性ホルモン受容体発現遺伝子及びレポータプラスミドを含む培養細胞の調製）
６０％-８０％ コンフルエントの細胞培養シャーレを準備した[遺伝子導入直前に５ｍｌ イーグル基礎培地(EMEM)で２回洗浄後、培地を除去しておく]。
【００３１】
女性ホルモン発現プラスミド（hER/pCI）２μｇとERE-AUG100-Luc+レポータープラスミド  ４μｇをEMEM３００μｌに加えた後、LipofectAMINE PLUS 試薬(GibcoBRL社)、６０μｌを添加し混和後、１５分間放置（Ａ液）した。同時に別の容器にてLipofectAMINE (GibcoBRL社) １２μｌとEMEM ３００μｌを混和後１５分間放置（Ｂ液）した。
（Ａ液）及び（Ｂ液）を混合後、EMEM ２．４ｍｌを加え、約３ｍｌのDNA調製液を調製した後、前述の細胞培養シャーレに加え３０分間放置した。次いで２０％牛胎児血清を含むEMEM ３ｍｌを添加後、一晩培養した。
【００３２】
（女性ホルモンの活性の検出方法）
細胞播種
上記のようにして調製した細胞を１ｘ１０５個／ｍｌ  になるように調製し、マイクロプレートに１００μｌずつ添加した（１００００個／ウエル）。
【００３３】
化学物質として天然型女性ホルモン（１７βエストラジオール、和光純薬）を、前記プレートに濃度を変えて添加し、ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。
【００３４】
インキュベータからプレートを取りだし、培地を捨てた後、リン酸緩衝液(10mM、pH７．２)でプレートを２回洗浄した。その後、細胞溶解剤（Cell Culture Lysis Reagent ５X、プロメガ社）を１５μｌ添加し、１０分間静置した後、発光基質[ルシフェラーゼ測定用キット、プロメガ（株）製]を加え、化学発光測定装置（LUMI star、BMG LabTecnologies社製）を用いて化学発光量を測定した。その結果を 図２（Ａ）に示した。
【００３５】
比較例１
市販のレポータープラスミドpGL3（プロメガ（株）社製）を用いる以外は実施例と同様にして化学発
光量を測定した。その結果を図２（Ｂ）に示した。
【００３６】
図２から明らかなように、本発明に係るレポータープラスミドによる場合は、従来のレポータープラスミドによる場合と比較し、転写活性倍率が４倍高くなっていることが解る。また測定バックグランドを図３に示した。
【００３７】
実施例１のバックグランドと、比較例１のバックグランドとを比較すると、実施例１のバックグランドの方が約１／４小さいことが解り、また測定値のばらつきも小さい。
【００３８】
実施例２
実施例１と同様に操作して、TATA上流のプロモーター塩基数１５０のAUG150（配列番号５）と、塩基数２００のAUG200（配列番号６）とのレポータープラスミドを調製した。これらのレポータプラスミドと、実施例１で調製したレポータープラスミドAUG100（配列番号４）とを用いて、実施例１と同様に操作してＥ２（１７βエストラジオール）の転写活性を求めた結果を図４に示した。
【００３９】
図４から、プロモーター塩基数はTATA上流の塩基数が１００程度の時に最も転写活性が高くなることが解る。
【００４０】
実施例３
実施例２と同様に操作して、TATA上流のプロモーター塩基数１００のAUG100（配列番号４）、１５０のAUG150（配列番号５）と、塩基数２００のAUG200（配列番号６）とのレポータープラスミドを調製した後、エンハンサーとして女性ホルモン応答配列ERE（配列番号３）の代わりに男性ホルモン応答配列ARE（配列番号２）を挿入した。これらのレポータプラスミドとを用いて、実施例２と同様に操作して男性ホルモンの一種であるＤＨＴ（ジヒドロテストステロン、和光純薬）の転写活性を求めた結果を図５に示した。
【００４１】
図５から、男性ホルモン作用をみる場合にはTATA上流のプロモーター塩基数が１５０程度の時に最も転写活性が高くなることが解る。
【００４２】
【発明の効果】
本発明においては、レポータープラスミド中に、プロモーターとしてα2uグロブリンプロモーターを用いているので、これをレポーター遺伝子アッセイに用いる場合、転写活性が高く、且つバックグランドが低い。
【００４３】
【配列表】
0004745563.tif 000002
0004745563.tif 000003
0004745563.tif 000004
0004745563.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のレポータープラスミドの一例を示す説明図である。
【図２】（Ａ）は実施例１で、（Ｂ）は比較例１で得られた転写活性化倍率とエストロゲン濃度との関係を示すグラフである。
【図３】実施例１と比較例１とのバックグラウンドの化学発光強度を示すグラフである。
【図４】本発明プラスミドにおいて、女性ホルモン作用検出時のプロモータ塩基数と転写活性の関係を示すグラフである。
【図５】本発明プラスミドにおいて、男性ホルモン作用検出時のプロモータ塩基数と転写活性の関係を示すグラフである。
【図６】従来のエンハンサー活性測定用レポータープラスミドを示す説明図である
【符号の説明】
２    レポーター遺伝子
４    プロモータ
６    マルチプルクローニングサイト
【図１】
0004745563.tif 000006
【図２】
0004745563.tif 000007
【図３】
0004745563.tif 000008
【図４】
0004745563.tif 000009
【図５】
0004745563.tif 000010
【図６】
0004745563.tif 000011