(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素原子数３０〜１２０の炭素原子のみからなるまたは該炭素原子以外に炭素原子数の１０％以下のヒドロキシル基もしくはオキソ基を含む閉殻構造の炭素化合物がポリマー鎖により被覆された微小粒子を有効成分とする活性酸素消去剤であって、
該微小粒子が、一般式（Ａ−１）：
【化２】
0004644430.tif 000008
［式中、Ｒ1は水素原子またはＣ1-6アルキル基を表し、Ｒ2およびＲ3は独立してＣ1-6アルキル基を表すか、またはＲ2およびＲ3は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、さらなる窒素原子１もしくは２個、酸素または硫黄原子１個を含んでいてもよい５もしくは６員の複素環を形成してもよく、
Ｘ′は−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、
ＬはＣ1-6アルキレンまたは原子価結合を表し、
Ｙは水素原子、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アセタール化ホルミル基またはホルミル（もしくはアルデヒド）基を表し、
ｍは１〜１０，０００の整数であり、
ｎは１０〜２０，０００の整数であり、そして
ｐ′は２〜６の整数である］で表されるブックコポリマーに由来し、かつ、ｍの反復単位のセグメントをコアとし、ｎの反復単位のセグメントをシェルとする構造物内に該炭素化合物が封入されたものであることを特徴とする、活性酸素消去剤。
【請求項２】
食品、医療または皮膚科学的もしくは化粧品の分野で使用するものである請求項１記載の活性酸素消去剤。
【請求項３】
炭素化合物が炭素原子のみからなるＣ30-120フラーレンである請求項１または２に記載の活性酸素消去剤。
【請求項４】
炭素化合物がＣ32フラーレン、Ｃ50フラーレン、Ｃ60フラーレン、Ｃ70フラーレン、Ｃ76フラーレン、Ｃ78フラーレン、Ｃ82フラーレン、Ｃ84フラーレン、Ｃ90フラーレン、Ｃ96フラーレンおよびＣ120フラーレンからなる群より選ばれる、請求項１または２に記載の活性酸素消去剤。
【請求項５】
炭素原子数３０〜１２０の炭素原子からのみからなるまたは該炭素原子以外に炭素原子数の１０％以下のヒドロキシル基もしくはオキソ基を含む閉殻構造の炭素化合物がポリマー鎖により被覆された微小粒子であって、
該微小粒子が、一般式（Ａ−１）：
【化２】
0004644430.tif 000009
［式中、Ｒ1は水素原子またはＣ1-6アルキル基を表し、Ｒ2およびＲ3は独立してＣ1-6アルキル基を表すか、またはＲ2およびＲ3は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、さらなる窒素原子１もしくは２個、酸素または硫黄原子１個を含んでいてもよい５もしくは６員の複素環を形成してもよく、
Ｘ′は−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、
ＬはＣ1-6アルキレンまたは原子価結合を表し、
Ｙは水素原子、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アセタール化ホルミル基またはホルミル（もしくはアルデヒド）基を表し、
ｍは１〜１０，０００の整数であり、
ｎは１０〜２０，０００の整数であり、そして
ｐ′は２〜６の整数である］で表されるブックコポリマーに由来し、かつ、ｍの反復単位のセグメントをコアとし、ｎの反復単位のセグメントをシェルとする構造物内に該炭素化合物が封入されたものであり、かつ該炭素化合物の閉殻構造内に常磁性金属の超微小粒子が内包されたものであることを特徴とする微小粒子の複合体。
【請求項６】
常磁性金属が、ガドリニウム、ユウロピウム、テルビウムおよびエルビウムからなる群より選ばれる元素に由来するものである請求項５に記載の微小粒子の複合体。
【請求項７】
炭素化合物が炭素原子のみからなるＣ30-120フラーレンである請求項５または６に記載の微小粒子の複合体。
【請求項８】
炭素化合物がＣ32フラーレン、Ｃ50フラーレン、Ｃ60フラーレン、Ｃ70フラーレン、Ｃ76フラーレン、Ｃ78フラーレン、Ｃ82フラーレン、Ｃ84フラーレン、Ｃ90フラーレン、Ｃ96フラーレンおよびＣ120フラーレンからなる群より選ばれる、請求項５または６に記載の微小粒子の複合体。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれかに記載の微小粒子の複合体を有効成分とする造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、黒鉛やダイヤモンドを除く、炭素原子数３０〜１２０からなる閉殻構造の炭素化合物がブロックコポリマーに由来する構造物（またはポリマーミセル）内に封入された微小粒子の複合体、該微小粒子にさらに金属の超微小粒子が内包されている微小粒子の複合体、並びにこれらの複合体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
炭素原子のみからなる閉殻構造をとるフラーレンおよびカーボンナノチューブは、それらの新奇な構造のため、多岐にわたる技術分野、例えば、医薬、体内診断、化粧品、等での使用が期待されている。
【０００３】
しかし、特に、これらの技術分野で例えば、フラーレンを使用するには、フラーレンが水に不溶性であるため一定の制限があった。そのため、フラーレンを可溶化するためにフラーレンの炭素原子にヒドロキシル基を導入した各種フラロールが提供されている（特許文献１参照。）。また、例えば、金属内包フラーレンまたはその塩の表面をスルホン基、ケトン基、アミノ基およびアルキル基からなる群より選ばれる官能基を有する多糖類で被覆したものも提供されている（特許文献２参照。）。
【０００４】
さらに、フルオロアルキル鎖が末端に付加されたアクリロイルモルホリンオリゴマーまたはＮ、Ｎ−ジメチルアクリルアミドオリゴマー等の水溶液中にフラーレンを加えて十分に攪拌すると、可溶化されたフラーレンの量が約１００μｇ／ｍｌとなる自己組織化物（自己アセンブリー）が得られることが報告されている（非特許文献１参照）。また、本発明者らはＣ60フラーレンを、親水性ポリマー鎖セグメントとしポリ（エチレングリコール）鎖を有し、かつ、機能性ポリマー鎖として第三級アミノ基を側鎖に担持する特定のブロックコポリマーの水溶液中に加え、十分に攪拌することにより、Ｃ60フラーレンを水に対して可溶化できることを報告した（非特許文献２参照。）。
【特許文献１】特開平７−０４８３０２号公報
【特許文献２】特開平８−１４３４７８号公報
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３，（２００３），１−３
【非特許文献２】第５２回（２００３年）高分子討論会 高分子学会予稿集  １１２頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の特許文献２および非特許文献１または２でも、フラーレンそれ自体の水に対する可溶化に一定の成功が得られている。例えば、非特許文献１によれば、フラーレンの可溶化量は従来、２１．０μｇ／ｍｌであったものを、フラーレンと上記のオリゴマーを室温で約５日間攪拌することにより約１００μｇ／ｍｌまでフラーレンの溶解度が著しく高まった自己組織化物が提供できると記載されている。しかし、このようなフラーレンの溶解度では必ずしも満足できるものでない。したがって、本願発明の目的は、安定な水溶液または分散液を提供できるとともに、水に対して、より高い溶解度を示す微小粒子、並びにそれらの製造方法および用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らと一部共通する研究者は、ＤＮＡ等の生体内標的への有力な送達手段として、ＤＮＡとポリエチレングリコール−ｂｌｏｃｋ−ポリ（２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレートのポリマーミセル複合体を提供した（Ｋ．  Ｋａｔａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９９９，３２，６８９２−６８９４参照）。
【０００７】
他方、上記のごとく本発明者らは、かかるブロックコポリマーとＣ６０フラーレンの複合体を水溶液中で形成することにより、該フラーレンが可溶化できることを見出した。さらに、改良された可溶化方法により形成される複合体は、より高い水溶性を示し、高濃度で安定に保持できる水性溶液を提供できるようになることを見出した。またさらに、このような改良された可溶化方法によれば、Ｃ６０フラーレンに限らず、広範な、炭素原子数３０〜１２０からなる閉殻構造の炭素化合物、並びに該炭素化合物が金属超微細粒子を内包する場合ですら、水に対する高い溶解度を示し、かつ、水性媒体中で安定に存在しうる微小粒子の複合体を提供できることを見出した。さらにまた、該炭素化合物のみが封入されたブロックコポリマーの構造物が、水性媒体中で活性酸素を強く消去する効果を有し、食品、医薬および化粧品の分野で都合よく使用できることも見出した。
【０００８】
したがって、本発明によれば、炭素原子数３０〜１２０の炭素原子から本質的になる閉殻構造の炭素化合物がポリマー鎖により被覆された微小粒子の複合体であって、
該微小粒子が、第三級アミノ基および／または第二級アミノ基を側鎖に担持した反復単位を含有するポリマー鎖セグメントおよびポリ（エチレングリコール）鎖セグメントを含んでなるブロックコポリマーに由来し、かつ、前者のセグメントをコアとし、後者のセグメントをシェルとする構造物内に該炭素化合物が封入されたものであることを特徴とする微小粒子の複合体、
が提供される。
【０００９】
また、別の態様の発明として、炭素原子数３０〜１２０の炭素原子から本質的になる閉殻構造の炭素化合物および第三級アミノ基および／または第二級アミノ基を側鎖に担持した反復単位を含有するポリマー鎖セグメントおよびポリ（エチレングリコール）鎖セグメントを含んでなるブロックコポリマーを双極性非プロトン性溶媒に溶解し、混合し、次いで分画分子量が１２０００〜１４０００である透析膜を介して水性溶媒に対して透析することにより、形成された該炭素化合物がブロックコポリマー由来の構造物内に封入された微小粒子を取得すること、を特徴とする上記微小粒子の複合体の製造方法、も提供される。
【００１０】
さらなる別の態様の発明として、上記微小粒子の複合体を有効成分とする活性酸素消去剤、も提供される。
【００１１】
さらなる別の態様の発明として、炭素原子数３０〜１２０の炭素原子から本質的になる閉殻構造の炭素化合物がポリマー鎖により被覆された微小粒子の複合体であって、
該微小粒子が、第三級アミノ基および／または第二級アミノ基を側鎖に担持した反復単位を含有するポリマー鎖セグメントおよびポリ（エチレングリコール）鎖セグメントを含んでなるブロックコポリマーに由来し、かつ、前者のセグメントをコアとし、後者のセグメントをシェルとする構造物内に該炭素化合物が封入されており、かつ該炭素化合物の閉殻構造内に金属元素もしくはそのイオン形態にある金属の超微小粒子が内包されているものであることを特徴とする微小粒子の複合体、も提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に従う、微小粒子の複合体は、調製後に一度凍結乾燥して粉末状にした場合であっても、極めて容易に水中に高濃度にて分散もしくは溶解し、透明もしくは均質で、かつ安定な溶液を形成しうる粉末状物を提供できる。
【００１３】
以下、本発明をより詳細に記述する。
【００１４】
本発明にいう、「炭素原子から本質的になる」とは、本発明の目的に沿う限り、炭素原子以外に炭素原子数の１０％以下、好ましくは５％以下、さらに好ましくは１％以下のヒドロキシル基、オキソ基、等を含んでいてもよいことを意味する。しかし、本発明にいう炭素化合物で特に好ましいのは、炭素原子のみからなる炭素化合物である。また、閉殻構造とは、限定されるものでないが、既知のフラーレン等がとり得る構造のほか炭素原子が密に詰まった網目構造や、一方向または二方向に湾曲していてもよい網目構造を意味し、例えば、国際公開（ＷＯ）第９３／１５７６８号パンフレットに記載されたものであることができる。これらの炭素化合物のうち、特に、それら自体公知のＣ６０，Ｃ８４，Ｃ３２，Ｃ５０，Ｃ６６，Ｃ７０，Ｃ７６，Ｃ７８，Ｃ９０，Ｃ９６およびＣ１２０フラーレンを好ましいものとして挙げることができる。
【００１５】
他方、かような炭素化合物を封入した構造物（またはポリマーミセル）を形成しうるブロックコポリマーは、親水性ポリマー鎖セグメントとして、ポリ（エチレングリコール）に由来するセグメントを含み、そして第三級アミノ基および／または第二級アミノ基を側鎖に担持した反復単位を含有するポリマー鎖セグメントとを含み、本発明の目的、例えば、Ｃ30〜Ｃ120フラーレンを効率よく水に対して可溶化しうるものであれば如何なる分子種であってもよい。しかし、好ましくは、一般式（Ａ）：
【００１６】
【化１】
0004644430.tif 000002
【００１７】
［式中、Ｒ１ａは水素原子またはＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ２ａおよびＲ３ａは独立してＣ１−６アルキル基を表すか、またはＲ２ａおよびＲ３ａは、それらが結合する窒素原子と一緒になって、さらなる窒素原子１もしくは２個、酸素または硫黄原子１個を含んでいてもよい５もしくは６員の複素環を形成してもよく、
Ｘは−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、そして
ｐは２〜６の整数である。］で表されるモノマーに由来するセグメントを含むことができる。
【００１８】
上記の定義において使用されるアルキル基等について、Ｃ１−６アルキル基は、炭素原子を１〜６個有する直鎖もしくは分岐アルキルであり、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ．−ブチル、ｔｅｒｔ．−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等を包含する。また、Ｒ２ａとＲ３ａが、それらが結合する窒素原子と一緒になって、５もしくは６員の複素環を形成する場合としては、
【００１９】
【化２】
0004644430.tif 000003
【００２０】
を挙げることができる。
【００２１】
上記の親水性ポリマー鎖セグメントと第三級アミノ基および／または第二級アミノ基を側鎖に担持した反復単位を含有するポリマー鎖セグメントは、それぞれのポリマーを予め用意しておき、それらを当該技術分野に周知の連結手段により連結することにより、本発明で使用するブロックコポリマー内に存在せしめることができる。また、本発明で使用するブロックコポリマーを提供しうる別法としては、いずれか一方のセグメントに相当するポリマーを用意しておき、そのポリマーの片末端にもう一方のセグメントを対応するモノマーから重合成長させることにより形成してもよい。限定されるものでないが、このような方法の代表的なものとしては、前記のＫａｔａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，に記載の方法が挙げられ、また、かような方法に従って得られる、下記一般式（Ａ−１）：
【００２２】
【化３】
0004644430.tif 000004
【００２３】
［式中、Ｒ1は水素原子またはＣ1-6アルキル基を表し、Ｒ2およびＲ3は独立してＣ1-6アルキル基を表すか、またはＲ2およびＲ3は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、さらなる窒素原子１もしくは２個、酸素または硫黄原子１個を含んでいてもよい５もしくは６員の複素環を形成してもよく、
Ｘ′は−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、そして
ｐ′は２〜６の整数であり；
ＬはＣ1-6アルキレンまたは原子価結合を表し、
Ｙは水素原子、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アセタール化ホルミル基またはホルミル（もしくはアルデヒド）基を表し、
ｍは１〜１０，０００の整数であり、
ｎは１０〜２０，０００の整数であり、そして
ｐ′は２〜６の整数である］
で表されるブロックコポリマーを、本発明で都合よく使用できる。
【００２４】
炭素化合物を封入した構造物（またはポリマーミセル）は、上記のようなブロックコポリマーにより該炭素化合物の表面が充分に被覆され、そして該炭素化合物を水に対して可溶化するように構成されている物体を意味する。限定されるものでないが、このような構造物は、炭素化合物をコアとして封入しうるようにブロックコポリマーの第三級アミノ基および／または第二級アミノ基を側鎖に担持した反復単位を含有するポリマー鎖セグメントで内部もしくは中心部を構成し、そしてポリ（エチレングリコール）鎖セグメントが外部を覆うように、水性媒体中でブロックコポリマー分子が会合した分子集合体であることが好ましい（なお、このような分子集合体を、本明細書では、ポリマーミセルとも称することもある。）。上記および本明細書において使用する、水性媒体は、水、水と混和しうる有機溶媒（例えば、エタノール、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、等）と水の混合溶液、水または該混合溶液に、さらに、緩衝剤および／または浸透圧調整剤を含んでいてもよい、溶液を意味することができる。
【００２５】
理論により拘束されるものでないが、上記の構造物における水溶性の高いポリ（エチレングリコール）鎖セグメントは水性媒体中で可動性が極めて高く、ブラシ状に構造物表面を覆うことができるので、仮に、非水溶性の炭素化合物を内部に封入した場合でも、構造物全体を水に対して強く可溶化できるものと理解される。
【００２６】
このような構造物からなる微小粒子の複合体は、例えば、非特許文献２に記載されているように、ブロックコポリマーを溶解した水溶液にフラーレンを加えて、極めて長時間に渡り攪拌することによるか、その他、炭素化合物とブロックコポリマーを、それらの両者を溶解しうる溶媒、例えば、塩化メチレン等に溶解した後、溶媒を留去し、次いで残留物を水に徐々に溶解していくような、一般的なポリマーミセルの調製に用いられている方法によっても得ることができる。しかし、これらの方法で得られるフラーレン等の炭素化合物を封入した微小粒子の複合体は、多くの場合、水に対する溶解度が限定されたもの（例えば、約１００μｇ／ｍｌ以下）しか得られなかった。
【００２７】
本発明者らは、さらにかような調製方法について検討したところ、一般的にはポリマーミセルの形成効率に劣るとされている方法に類似する、双極性非プロトン性溶媒にフラーレンを初めとする炭素化合物とブロックコポリマーを溶解させ、次いで、透析処理することにより取得できる微小粒子の複合体は、上記の方法により取得できる複合体に比べ、水に対して有意に高い溶解度（例えば、約５００μｇ／ｍｌ以上、例えば、約１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ）を示すことが確認できた。したがって、上述した、微小粒子の複合体の製造方法も本発明の一態様として提供される。
【００２８】
かかる製造方法において使用できる、双極性非プロトン性溶媒としては、上記のように高い溶解度を提供できるものであれば、種類を問うことなく使用できるが、好ましくは、ＤＭＦおよびＤＭＳＯを挙げることができる。まず、このような溶媒中にフラーレンを初めとする炭素化合物とブロックコポリマーと溶解させる。溶解させる順序は、炭素化合物、次いでブロックコポリマーを、その逆に、ブロックコポリマー、次いで炭素化合物を、それぞれ順に溶解させるか、あるいは両者を同時に溶解させてもよい。溶解に際し、必要に応じて溶媒の沸点まで加温してもよいが、室温で処理してもよい。また、溶解および混合する際に、溶液を超音波処理してもよい。こうして得られる溶液は必要に応じて、不溶物を濾過により除去した後、室温で一定時間（数時間ないし一晩）静置する。その後、所望の分画分子量の透析膜を介して、水、好ましくは蒸留水に対して透析する。透析は、通常、非処理溶液に対して約１０倍以上の水に対して２時間、３回以上行い、最後は終夜で透析する。また、分画分子量１２０００−１４０００の透析膜を使用するのが好ましく、さらに、透析膜は、使用前に蒸留水を用いて十分に膨潤させておくのがよい。上記の操作は、いずれも室温で実施できるが、必要により、冷却下（例えば、０〜５℃）、または加温下（４０〜８０℃）で行うこともできる。こうして、炭素化合物がポリマーミセル内に封入された微小粒子の複合体であって、室温、例えば２５℃の蒸留水に対する溶解度が、５００μｇ／ｍｌ以上の複合体が、効率よく得られる。炭素化合物およびブロックコポリマーの混合液中での濃度は、使用溶媒に溶解できる限り、限定されないが、通常、溶液の体積当り、炭素化合物は、０．００１ｗｔ％〜１０ｗｔ％  の範囲ないで、ブロックコポリマーは、０．００１ｗｔ％〜２ｗｔ％の範囲内で使用するのが好都合である。
【００２９】
このような炭素化合物のみが封入された微小粒子の複合体は、ブロックコポリマーの構造物内に封入されており、炭素化合物のみが封入されているに過ぎないが、水性媒体中で強い活性酸素の消去作用を示す。したがって、活性酸素が悪影響を及ぼす環境、特に、生体内外において、活性酸素消去剤として使用できる。具体的な使用対象としては、有機もしくは無機の抗酸化剤またはスーパーオキシドダーゼジスムターゼ（ＳＯＤ）等が有利に使用できる分野、食品の例えば、脂質の酸化劣化の防止、化粧品の例えば、老化防止用スキンケアー、または医薬における、例えば、制ガン剤等に使用できる。
【００３０】
上記の本発明の一態様として提供される微小粒子の複合体の製造方法によれば、上記の炭素化合物に代えて、金属の超微細粒子を内包した複合体を使用する場合であっても、水に対する高い溶解度または水性媒体中に安定に保持できる均質分散液を提供できる。
【００３１】
したがって、上述した、該炭素化合物の閉殻構造内に金属元素もしくはそのイオン形態にある金属の超微小粒子が内包されていることも特徴とする微小粒子の複合体、も別の態様の本発明として提供される。かような金属は、水性媒体に対して可溶化できることにより有用性が高まる技術分野、例えば、医療、診断、食品、の技術分野で使用されているものであれば、如何なるものであってもよい．したがって、疾病もしくは生体の何らかの器官の傷害の検診または診断において使用する造影剤として使用されている金属、例えば、ガドリニウム（Ｇｄ）、ユウロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）およびエルビウム（Ｅｒ）からなる群より選ばれる元素に由来する常磁性金属、その他、亜鉛、銅、マグネシウム、鉄、白金、等の酸化物を提供しうる元素に由来する金属、等が本発明にいう金属として使用される。これらの金属は、イオンの形態であることもできる。また、これらの金属は超微小粒子に状態で炭素化合物に内包されることができるが、超微小粒子とは、典型的には、上記のフラーレンに内包されうるサイズのものをいう。このような、金属が内包されたフラーレンは、一部は市販されており、それらをそのまま使用できるが、それ自体公知の方法、上記特許文献２に記載されているように、例えば、目的とする金属の酸化物を、グラファイトとともに、高温高圧下でレーザー蒸発させること等により得ることができる。
【００３２】
なお、該炭素化合物の閉殻構造内に金属元素もしくはそのイオン形態にある金属の超微小粒子が内包されていることも特徴とする微小粒子の複合体に関するブロックコポリマー等についての好ましい態様は、上述した、炭素化合物のみが封入された複合体に対するものと共通する。
【００３３】
こうして、例えば、常磁性金属元素を内包した炭素化合物をブロックコポリマーで形成される構造物（またはポリマーミセル）内に封入した微小粒子の複合体は、水性媒体中に高濃度で安定に保持できるので、血管内に投与して使用する造影剤として有用である。
【００３４】
以下、具体例を参照しながら本発明をさらに詳細に説明するが、本発明をこれらに限定することを意図するものでない。
＜ブロックコポリマーの製造例＞
【００３５】
【化４】
0004644430.tif 000005
【００３６】
アルゴン下２００ｍＬナスフラスコに溶媒として蒸留テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）５０ｍＬを入れ、開始剤として３，３′−ジエトキシ−１−プロパノール（Ｍｗ＝１４８、ｄ＝０．９４１）を１５７μＬ入れた。その後、カリウムナフタレン（Ｋ−Ｎａｐｈ（ｃ＝０．３６５６ｍｏｌ／Ｌ））を２．７３ｍＬ入れメタル化した。次にエチレンオキシド（ＥＯ（Ｍｗ＝４４、ｄ＝０．８８））５．６８ｍＬを入れた後水冷下で２日間撹拌した。２日後、少量をサンプリングし、ＧＰＣで解析を行った後、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＰＡＭＡ；ＭＷ＝１５７．２１）を４．２９ｍＬ入れ、氷冷下で３０分撹拌し、ＧＰＣでサンプリングを行った。最後にメタノールで反応を停止させた。
反応停止後、イソプロピルアルコール再沈、遠心分離を行い、ベンゼン凍結乾燥をし、回収した。
【００３７】
精製したポリマーの分子量はＰＥＧ／ＰＡＭＡ＝４，５００／５，５００であった。
＜複合体の製造例１＞  透析法による水中でのフラーレンの分散安定化
Ｃ60フラーレン：アセタール−ＰＥＧ−ＰＡＭＡブロックコポリマー（ＰＥＧ／ＰＡＭＡ＝４，５００／５，５００）の混合比（Ｆ：Ｐ）が１：０、１：０．５、１：１となるように溶媒ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２５ｍＬ中にフラーレン１ｍｇ、ブロックコポリマー１３．８ｍｇを加え（Ｆ：Ｐ＝１：１の場合）、６時間超音波処理を行った後、一晩静置した。その後、蒸留水で一晩膨潤させた分画分子量１２０００−１４０００の透析膜中に溶液を入れ、透析を行った（水交換３回）。こうして得られた３０ｍＬのフラーレン内包微小粒子の溶液の溶媒を凍結乾燥により除去し、その後蒸留水５ｍＬ加え、再分散させた。その後、再度ＤＬＳ測定を行った。
【００３８】
こうして濃縮後の溶液はフラーレン特有の黒褐色を呈した。ブロックコポリマー非存在下では濃縮によって濁度を生ずるものの、本発明に従う複合体では凍結乾燥後にも極めて容易に水中に分散溶解した。混合比がＦ：Ｐ＝１：１、１：０．５のものを再度ＤＬＳ測定を行ってみたところ、濃縮再分散を行う前よりはフォトンカウントが増加したが、以前測定した値に比べて十分なフォトンカウントを得ることができなかった。このようにこの条件で調製したフラーレン粒子は光散乱で検出できる粒径（およそ３ｎｍ）以下のほぼ分子状分散に近い形で分散している。
＜複合体の製造例２＞  バブリング蒸発法による水中でのＣ60フラーレンの分散安定化  フラーレン１ｍｇを塩化メチレン溶媒２５ｍＬに混ぜ、超音波をかけることで塩化メチレン中に溶解させた。その後、アセタール−ＰＥＧ−ＰＡＭＡブロックコポリマー（ＰＥＧ／ＰＡＭＡ＝４，５００／５，５００）１３９ｍｇを溶媒に入れ、超音波を２時間かけた後、一晩静置した。
【００３９】
このようにして調製した塩化メチレン溶液をアルゴンバブリングをしている蒸留水４０ｍＬに滴下していった。こうして調製した溶液は、実施例１に記載のものと同様に、淡黄色の透明溶液を与える微小粒子の複合体を提供した。得られた水中分散安定化フラーレン複合体の溶液のＤＬＳ測定を行った結果、粒径１７０ｎｍ程度のナノ粒子が形成されていることが確認できた。
＜複合体の製造例＞  高濃度フラーレン水溶液の製造例
Ｃ60フラーレン１００ｍｇを１５０ｍＬのＤＭＦ溶液に室温下で混合し、超音波処理を３時間施した。その後、溶液を０．４５μｍ（ミリポア社製）の疎水性フィルターで溶媒に不溶な物質を除去し、次いで溶媒に対してポリマー濃度が５ｍｇ／ｍｌになるようにアセタール−ＰＥＧ−ＰＡＭＡブロックコポリマー（ＰＥＧ／ＰＡＭＡ＝５，０００／５，９００）を加えて一晩静置した。その後、蒸留水に一晩膨潤させた分画分子量１２０００−１４０００の透析膜製のバッグに溶液を入れ、ＤＭＦ：蒸留水（１５０：２０００）２リットルに対して透析を行った（水交換：５回、２、４、６、８、１０時間目に交換、２４時間後に回収）。
【００４０】
その後、透析処理済の溶液を凍結乾燥し、粉末にした後、そのサンプルを４００μＬの蒸留水を用いて再溶解させ、ＵＶ−Ｖｉｓスペクトル測定を行い、フラーレンの吸光度から溶解度を算出したところ、２．９ｍｇ／ｍＬという高濃度でフラーレンを水中に可溶化することができた。
＜フラーレン封入微小粒子の複合体の活性酸素の消去作用の確認＞
スピントラップ剤である５，５−ジメチルー１−ピロリン  Ｎ−オキシド（ＤＭＰＯ）をＭｉｌｌｉＱで２倍希釈したものを３０μＬ、ＭｉｌｌｉＱで調製した１００ｍＭ  リン酸緩衝化溶液（ＰＢＳ）で調製した５ｍＭ  ヒポキサンチン（ＨＰＸ）を５０μＬ、９．６２５ｍＭ  ジエチレントリアミンーＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ"，Ｎ"−五酢酸（ＤＴＰＡ）を２０μＬサンプル（１．ＰＢＳ，２．フラーレン溶液）各５０μＬ，０．４Ｕ／ｍＬ  キサンチンオキシシダーゼ（ＸＯＤ）の５０ｍＬを順に容器に入れ、ＸＯＤ添加９０秒後にＥＳＲを用いてスペクトル測定を行った。
【００４１】
ＥＳＲスペクトル法の測定条件は、出力：９ｍＷ、中心磁場：３３９．９ｍＴ、掃引幅：±５ｍＴ，変調幅：７９μＴ、掃引時間：１分、増幅：６３０、応答時間（Ｔｉｍｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ：０．１秒であった。
【００４２】
サンプルとしてＰＢＳ、およびアセタール−ＰＥＧ−ＰＭＡＭＡブロックコポリマー（ＰＥＧ／ＰＡＭＡ＝５，０００／５，９００）のポリマーミセル封入フラーレン微小粒子溶液のＥＳＲスペクトログラムをそれぞれ，図１および図２に示す。これらのスペクルを積分し、面積を比較することにより活性酸素抑制効果を比較した。活性酸素抑制作用のないＰＢＳを用いたものを１００％としたとき、微小粒子溶液の面積は約３０％であった。
【００４３】
図３には、フラーレン濃度に対する活性酸素補足能をプロットした結果を示す。この結果から、ＩＣ５０ｆｕｌｌｅｒｅｅ＝３６１．７６μｇ／ｍｌであった。
＜ガドリニウム内包フラーレンとアセタール−ＰＥＧ−ＰＭＡＭＡブロックコポリマーの複合体の製造、および水緩和時間の測定＞
Ｇｄ内包Ｃ８２フラーレン（Ｇｄ＠Ｃ８２）１ｍｇをＤＭＦ１０ｍｇと混合し、３時間超音波処理を施した。その後、ＤＭＦに対して濃度が５ｍｇ／ｍｌになるようにアセタール−ＰＥＧ−ＰＭＡＭＡブロックコポリマー（ＰＥＧ／ＰＡＭＡ＝５，０００／５，９００）を入れ、１時間超音波処理を施した。次いで、一晩蒸留水中で膨順させた分画分子量１２０００−１４０００の透析膜製のバッグに上記処理液を入れ、蒸留水２リトルに対して透析を行った（水交換３回、２、５、１０時間目、そして２４時間後に回収した）。調製したサンプルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察結果を表す図面に代わる写真を図４に示す。
【００４４】
調製したａ）Ｇｄ＠Ｃ８２／ブロックコポリマーの複合体およびｂ）Ｃ６０／ブロックコポリマーの複合体をそれぞれＨ２Ｏ：Ｄ２Ｏ＝５０：５０の混合溶媒中に溶かし、サンプルを調製した。フラーレン濃度はＵＶ−Ｖｉｓスペクトルの吸光度より算出し、それぞれ（ａ）２３．３６×１０−３ｍＭ  および（ｂ）３１．９３×１０−３ｍＭであった。
【００４５】
緩和時間測定（Ｔ1測定）は、まず、Ｎｕｌｌ法を用いてＴ1  ｎｕｌｌポイントを求め、その値によってＴ1を推測し、測定条件をそれぞれ設定して測定した。
【００４６】
緩和時間短縮効果を表す指標が緩和度（または緩和能、ｒｅｌａｘｉｖｉｌｉｔｙ（Ｒ））であり、造影剤濃度をＣ（ｍ  ｍｏｌ／Ｌ）、造影前の縦緩和時間（つまり、溶媒の縦緩和時間）をＴ10、造影剤投与後の緩和時間（サンプル存在下での緩和時間）をＴ1Ρと
すると、Ｒは次式で定義される。
【００４７】
【数１】
0004644430.tif 000006
【００４８】
ここで、緩和時間の逆数である１／Ｔ1は緩和速度（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）と呼ばれ、その名のとおり緩和の速さを示す指標である。また、緩和度（Ｒ）は造影剤が組織に分布して単位濃度になった場合にどれだけ緩和速度が速くなるかを示している。すなわち、Ｒが大きければ大きいほど造影剤の緩和速度促進効果（緩和時間短縮効果）が大きいことを意味する。
【００４９】
それぞれのサンプルの濃度およびＴ1、使用溶媒の緩和時間を基に緩和度Ｒを算出し、比較検討を行った。結果を表１に示す。表１からＧｄ＠Ｃ82／ポリマーの複合体は有意にＲ値が高く、ＭＲＩ用造影剤として有望である。
【００５０】
【表１】
0004644430.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明に従う、フラーレンまたは金属内包フラーレンとブロックコポリマーとの微小粒子の複合体は、フラーレンを水可溶化しうるので、医薬、診断薬等の分野でのフラーレンの使用範囲を拡大できる。したがって、本発明は医薬製造業等で利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ＰＢＳのＥＳＲスペクトログラム。
【図２】本発明に従うフラーレン複合体の水溶液のＥＳＲスペクトログラム。
【図３】本発明に従うフラーレン複合体の水溶液のフラーレン濃度に対する活性酸素補足能をプロットしたグラフ。
【図４】本発明に従うＧｄ内包フラーレン複合体の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察結果を表す図面に代わる写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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