(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊性を持つＸＸＸＹ型の性染色体を有することを特徴とする複２倍体水棲動物。
【請求項２】
種の異なるゲノムＡＢを有する雑種第１代の水棲動物の非減数精子と非減数卵を受精させることにより、妊性を持つＸＸＸＹ型の性染色体を有する複２倍体水棲動物を作出することを特徴とする複２倍体水棲動物の育種法。
【請求項３】
ゲノムＡＡを有する水棲動物種ＡとゲノムＢＢを有する水生動物種Ｂの交雑卵の第２卵割を阻止して得られたＸＸＸＸもしくはＸＸＹＹの性染色体を有する第１代の複２倍体水棲動物が産生する卵と精子を受精させることにより、妊性を持つＸＸＸＹ型の性染色体を有する複２倍体水棲動物を作出することを特徴とする複２倍体水棲動物の育種法。
【請求項４】
閉鎖系に収容した多数の雑種第１代の水棲動物から雄の非減数精子と雌の非減数卵を選抜し、前記非減数精子を前記非減数卵に受精させることにより、妊性を持つＸＸＸＹ型の性染色体を有する複２倍体水棲動物を作出することを特徴とする複２倍体水棲動物の育種法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類、貝類、甲殻類などの複２倍体水棲動物、特に、雑種の次世代が遺伝的分離を起こすことなく安定して作出される複２倍体水棲動物とその育種法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
水棲動物、例えば魚類における種間あるいは属間の交雑では、受精が起こり、胚発生が開始される。しかし、この雑種のほとんどは致死となり、生存できても染色体の非相同性に基づく対合不全によって配偶子は形成されず、不妊となる。たとえ近縁種間の交雑で対合が可能となり妊性を有しても次世代で遺伝的な分離が起き、親よりも優れた特質（雑種強勢）が代を重ねるごとに減少してしまう。
【０００３】
図１１と図１２は、上記雑種の作出と雑種第１代同士の交配におけるゲノムの組合せを模式的に示す。なお、本発明に係る特許請求の範囲と明細書並びに図面において、各種（A種、B種）のゲノム（染色体）の総称はA，Bで表し、性染色体はX, Yで表す。また、A種、B種の各種のゲノムと、その性染色体を明らかにして表す場合、A種の染色体をAXもしくはAYと、B種の染色体をBXもしくはBYとそれぞれ表示する。また、魚類の場合、受精直前の卵は第２極体放出前であるので、減数卵といえどもゲノムAAを有する個体が産みだした卵はAAで、受精後第２極体を放出して初めて本来の減数卵（A）になる。第２極体放出阻止を除いて、減数卵は未受精であってもAとして扱う。
【０００４】
図１１において、雑種第１代の染色体は、AXBXあるいはAXBYとなり、母方のゲノムAと父方のゲノムBのゲノム構成いかんでは上記したように致死あるいは不妊となる。また、生存雑種で妊性を有する場合であっても、図１２に見られるように遺伝的分離を生じる。例えばF1雑種（AB）のゲノムA，Bを構成する染色体をそれぞれa1,a2,a3およびb1,b2,b3とすると、正常な減数分裂が可能な場合は、第１染色体についてはa1かb1のいずれか、第２染色体についてもa2かb2いずれか、第３染色体についても同様で、計８通りの組み合わせの染色体を持った配偶子が生ずる。従ってF2では６４通りの組み合わせが生じ、第１から第３の染色体毎に見るとa1a1あるいはb3b3等同種同士の染色体が２本組み合わされる場合が生じる。極端な場合はa1a1a2a2a3a3の様にA種の染色体のみに戻ってしまうことも考えられる。このように雑種の性質が、染色体毎（乗換えを考慮に入れると遺伝子毎）にA種もしくはB種に分離する。
【０００５】
種間あるいは属間雑種の致死性を回避するには、親種の組み合わせにもよるが染色体の倍数化処理を行えば良いと考えられている。倍数化処理、特に体細胞分裂阻止に基づく倍数化は、植物の分野では幅広く実用化されているが動物の分野では稀である。
【０００６】
水棲動物、特に魚類の分野における同質３倍体の作成技術に関しては、アユとヒラメについて特許文献がある（日本国特開平１０−１５０８８３号公報及び日本国特開平１０−３２７７０６号公報、以下、前者を特許文献１、後者を特許文献２という）。しかし、異質３倍体と異質４倍体（以下、複２倍体という）の場合、サケ・マス類で異質３倍体を得られたという報告がされているものの（例えば日本水産学会監修「水産増養殖と染色体操作」恒星社厚生閣刊、８７頁〜９２頁。以下、非特許文献１という）、複２倍体に関しては、特殊な例を除いて理論上の一般的な技術が提示されているに過ぎない（非特許文献１参照）。自然界でも、雌雄異体の水棲動物に関しては、自家受精可能な植物とは異なり複２倍体の存在が報告された例はない。
【０００７】
異質３倍体と複２倍体の魚を作出する手法を図１３に基づいて概略的に説明する。同図及び作出法は、上記非特許文献１に記載された図8-2及びその説明を元にしたものである。
【０００８】
異質３倍体を作出する場合、先ず、A種の卵（第２成熟分裂途中の卵で染色体AXAX）にB種の精子（染色体BXもしくはBY）を受精させた（図中第１ステップ）後に、温度ショックあるいは圧力を加えるなどして第２極体の放出を押さえる（図中第２ステップ）。第２極体の放出が押さえられた卵は、染色体が３倍体化（AAB）されており（図中第３ステップから第５ステップ）、最終的に異質３倍体魚（AXAXBXもしくはAXAXBY）となる。
【０００９】
異質４倍体（以下、複２倍体という）を作出する場合、A種の卵にB種の精子を受精後、第２極体の放出を押さえることなく、第５ステップで第１卵割を阻止あるいは抑制する（後述するように、実際には第１卵割は阻止されずに第２卵割が阻止されるのであることを本発明者は確認した）。この卵は染色体が４倍体化されており（AABB）、最終的に複２倍体魚となる。
【００１０】
複２倍体の作出を具体的に行った例として、ルソンメダカとハイナンメダカを交雑させたものがある（本水産学会誌  １９９３  ５９：３７３。以下、非特許文献２という）。この技術は、上記した非特許文献１に開示された手法をそのまま踏襲するのではなく、交雑種の非減数卵AXBX（極体放出前はAXAXBXBX）に、ガンマ線や紫外線あるいはＸ線を照射するなどして遺伝的に不活性化した精子を媒精させ、媒精卵の第２成熟分裂を阻止して複２倍体を得るものである。
【００１１】
この複２倍体は、AXAXBXBXの染色体を有し、姉妹染色体が相同染色体と同じように機能することで妊性を回復する。また複２倍体の産生卵を用いて雌性発生させる限り、後代の個体は遺伝的に均一で雄は出現しない。
【００１２】
異質３倍体は、種間あるいは属間雑種が抱える致死性の問題を解決できるものの、染色体がAXAXBXあるいはAXAXBYとなり、通常、減数分裂の際の染色体の対合不全によって不妊となる。このため、希望する特定の種間雑種を得たい場合、その都度、前記した手法を繰り返さなければならない。したがって、３倍体化の技術では、後代を自然交配によって産生することができず、増養殖への利用に制限を伴う。
【００１３】
複２倍体の水棲動物に関しては、理論上は可能とされながらも具体的に成功した例は、上記したものがあるに過ぎない。しかも、この成功例では、雌性発生によることから、作出される個体は全雌（AXAXBXBX）となる。また、上記図１３に示した理論上の例で作出される複２倍体は、AXAXBXBXの染色体を有する雌かAXAXBYBYの染色体を有する雄になるが、現在、この理論上の手法によって作出された複２倍体は報告されていない。このため、複２倍体の雄については、現実には存在せず、また理論上もAXAXBYBY型のものが予測されているに過ぎない。
【００１４】
こうしたことから、複２倍体に関する水棲動物の増養殖への利用技術は、異質３倍体よりも更に閉ざされた状態にある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、雑種の抱える致死性、不妊性をなくし、雑種強勢を後代でも維持でき、しかも通常の交配によって後代を安定的に作出可能で近親交配による近交弱勢を完全に排除できる、複２倍体水棲動物とその育種法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、上記した目的を達成するために、次の構成を備える。
【００１７】
すなわち、本発明は、種の異なるゲノムABを有する複２倍体水棲動物であって、妊性を持つXXXY型の性染色体を有する複２倍体水棲動物、である。
【００１８】
本発明が適用される動物は、魚類に限られるものではなく、貝類、甲殻類などの水棲動物全般、特に放流用や養殖用に種苗生産可能な水棲動物に適用可能である。例えば、ヒラメ、カレイ、タイ、マグロ、ブリ、マス、コイ、エビ、カニ、アワビ、カキ、アコヤガイ、ハマグリ、アサリ、ウニ、ナマコなどの種間あるいは属間雑種に適用できる。種あるいは属の組合せは、交雑可能な範囲に限定されるものではなく、たとえ致死性を有するものであっても倍数化によって生存性を回復可能な組合せを含む。
【００１９】
AXAXBXBYの染色体を有する複２倍体は、これまで現実にもまた文献的にも存在しないものであった。本発明者はこれを新たに作出し、産業上有益な種として提案するものである。妊性を有するか否かは、受精可能で且つその後の発生が順調に進行する配偶子が形成されるか否かによる。作出方法あるいは作出過程は、具体的に限定されるものではない。
【００２０】
本発明に係る複２倍体は、種の異なるゲノムABを有する雑種第１代の水棲動物の雄の非減数精子を、同じゲノムABを有する雑種第１代の水棲動物の雌の非減数卵に受精させることにより作出された、妊性を持つXXXY型の性染色体を有する複２倍体水棲動物である。この複２倍体の作出過程を図１に模式的に示す。
【００２１】
非減数精子とは、染色体構成が親個体の染色体構成と同じである精子をいう。例えば、AXBYの染色体を有する雄が減数精子を作る場合は、AXBYの染色体構成の精原細胞から、通常は倍数化と２度の分裂を行って、受精時には(A+B)/2Xもしくは(A+B)/2Yの染色体構成となる。非減数精子は、そうした倍数化、分裂に拘束されることなく、結果として受精時に親個体の染色体構成AXBYを保持している精子を意味する。
【００２２】
非減数卵とは、受精時（第２極体を放出した時）における染色体構成が親の染色体構成と同じ卵をいう。例えば、AXBXの染色体構成を有する雌は、AXBXの染色体構成の卵原細胞から通常は倍加と２度の極体放出を行って受精時には(A+B)/2Xの染色体構成となる。非減数卵は、そうした倍加、極体放出に拘束されることなく、結果として最終的に親の染色体構成AXBXを保持している卵を意味する。
【００２３】
雑種第１代の非減数卵AXBXに雑種第１代の非減数精子AXBYを受精させると、受精卵はAXAXBXBYの染色体構成となる。最終的に作出された個体は、全てAXAXBXBYの染色体を有する雄の複２倍体となる。
【００２４】
閉鎖系に多数の雑種第１代の水棲動物を収容し、成熟令に達した後、産卵期に雄個体の腹部を圧迫して放精の有無と、精子のDNA量測定により非減数精子であることを確認する。この雄を成熟した雌と同一の水槽に移し産卵を誘発する。得られた仔魚の細胞核当たりのDNA量を測定し仔が４倍体であればそれが複２倍体である可能性が極めて高い。非減数精子を産生する雄親は翌年以降繰り返し親魚として使用可能である。閉鎖系内での産卵によって生まれた仔魚の細胞核のDNA量や大きさに基づいて倍数性を確認し、それが４倍体であれば受精に係わった卵子および精子が共に非減数配偶子であることがわかる。産卵に係わった親魚を隔離することで、非減数配偶子を産生する親魚を選抜することができる。
【００２５】
また、本発明に係る複２倍体は、ゲノムAAを有する水棲動物A種とゲノムBBを有する水棲動物B種の交雑卵の第２卵割を阻止して得られたXXXXもしくはXXYYの性染色体を有する第１代の複２倍体水棲動物が産生する減数卵と減数精子を受精させることにより作出された、妊性を持つXXXY型の性染色体を有する複２倍体水棲動物である。
【００２６】
この複２倍体は、一旦、第１代の複２倍体を作出し、その減数卵に減数精子を受精させることによって第２代として作出される。図２にその過程を模式的に示す。
【００２７】
第１代の複２倍体を作出する際に行われる第２卵割阻止とは、これまで第１卵割阻止として認識されていた倍数化処理のメカニズムを訂正したものである。詳細は、実施例２において説明する。上記過程を経て作出される複２倍体は、全てXXXY型の性染色体を有する複２倍体となる。
【００２８】
また、本発明に係る複２倍体は、ゲノムBBを有する水棲動物種Bの同質４倍体をあらかじめ作出しておき、その精子をゲノムAAを有する水棲動物種Aの卵に受精させ、その後第２極体放出阻止を行って作出される、妊性を持つAXAXBXBYの染色体を有する複２倍体水棲動物である。その作出過程を図３に模式的に示す。
【００２９】
ゲノムBBを有する水棲動物種Bの同質４倍体の作出は、公知の手法を採用できる。ただし、同質４倍体を作出する際の受精卵の卵割阻止も、そのメカニズムは後述する第２実施例に示すように第２卵割の阻止である。
【００３０】
本作出過程を経て作出される複２倍体は、図３に示すようにAXAXBXBXまたはAXAXBXBYのいずれかの染色体を有する。一方の染色体AXAXBXBYを有する複２倍体が本発明の複２倍体に該当する。
【００３１】
また、本発明に係る複２倍体は、ゲノムAABを有するとともに妊性を持つ異質３倍体水棲動物の非減数卵AXAXBXに、ゲノムBBを有する水棲動物の減数精子BYを受精させることにより作出された、妊性を持つXXXY型の性染色体を有する複２倍体水棲動物である。
【００３２】
通常、異質３倍体は妊性を持たないが、本発明は妊性を持つ異質３倍体の非減数卵を使用して作成された複２倍体である。その作出過程を図４に模式的に示す。
非減数卵の意味及び選抜は、請求項２に係る発明と同じである。
異質３倍体を作出する際の第２極体放出阻止の技術は、圧力や温度を利用した従来の手法が採用される。
【００３３】
また、本発明に係る複２倍体は、ゲノムAAを有する水棲動物の第２極体放出前の卵AXAXにゲノムBBを有する水棲動物の精子BXまたはBYを受精させた後第２極体放出阻止を行い、マイクロインジェクション操作によりそれぞれBYまたはBX精子を受精させることにより作出された、妊性を持つXXXY型の性染色体を有する複２倍体水棲動物である。
【００３４】
この複２倍体は、受精をマイクロインジェクション操作によって直接的に行う点に特徴がある。
【００３５】
更に、本発明に係る複２倍体は、A種とB種の同質４倍体（AAAAとBBBB）が産生する卵AXAXと精子BXBYを受精させることにより作出された、妊性を持つXXXY型の性染色体を有する複２倍体水棲動物である。
【００３６】
この複２倍体は、一旦、同質４倍体系統を作出し、その卵と精子を用いて作出されたものである点に特徴がある。
【００３７】
更に、また本発明に係る育種法は、閉鎖系に収容した多数の雑種第１代の水棲動物から雄の非減数精子と雌の非減数卵を選抜し、上記非減数精子を上記非減数卵に受精させることにより、妊性を持つXXXY型の性染色体を有する複２倍体水棲動物を作出する点に特徴がある。
【００３８】
また、本発明に係る育種法は、AXAXBXBXの染色体を有する複２倍体水棲動物が産生する減数卵AXBXに、AXAXBXBYの染色体を有する複２倍体水棲動物の精子AXBXもしくはAXBYを受精させて、AXAXBXBYの染色体を有する雄とAXAXBXBXの染色体を有する雌の複２倍体を１：１の比率で作出する点に特徴がある。
【００３９】
本発明方法は、AXAXBXBYの染色体を有する複２倍体を用いてF3以降に、AXAXBXBXの染色体を有する複２倍体とAXAXBXBYの染色体を有する複２倍体が１：１の比率になるように作出する手法を示す。図５に本発明方法の作出過程を示す。
【００４０】
本発明方法は、XXXYの性染色体を有する複２倍体を得られれば、次世代以降には必ず雌雄１：１の比率で複２倍体を出現させることができることを示している。
【発明の効果】
【００４１】
本発明によれば、AABBの２つの種の染色体をそれぞれ２セットずつ有する複２倍体であるから、それぞれの種の染色体が対を成して対合が可能となり、妊性を回復することができる。
【００４２】
また、XXXY型の性染色体を有するので、非減数卵を産生する雑種F1の卵AXBXとの交配が可能となり、次代の複２倍体を自然交配によって安定的に作出することができる。
【００４３】
しかも、減数分裂の際には、同種の染色体が１セットずつ確実に配分されることになるため、第１代（F1）の形質を永久に維持することができる。
【００４４】
遺伝的分離がおきないため、異なる種のゲノムが必ず２セットずつ配分されることになり、近親交配を重ねても近交弱性の影響が表れない。  
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の一実施例に係る複２倍体の作出過程を示す説明図。
【図２】本発明の他の実施例に係る複２倍体の作出過程を示す説明図。
【図３】本発明の別の実施例に係る複２倍体の作出過程を示す説明図。
【図４】本発明の更に別の実施例に係る複２倍体の作出過程を示す説明図。
【図５】本発明に係る育種法を示す説明図。
【図６】実施例１のF1が産出した精子の相対DNA量を示すグラフで、親個体の相対DNA量を２としたときの値を示す。
【図７】実施例１のF2の赤血球細胞核の相対DNA量を示すグラフで、親個体の相対DNA量を２としたときの値を示す。
【図８】実施例２の水圧処理に伴う対照群と処理群の核の挙動を比較した図。
【図９】実施例２の水圧処理開始時間と倍率化の関係を示すグラフ。
【図１０】実施例２のニジマスとアマゴの複２倍体の核型を示す図で、上はニジマスとアマゴの雑種、下は交雑卵の第２卵割を阻止して作出した複２倍体でニジマスおよびアマゴの染色体がそれぞれ２セットになっているものを示す。
【図１１】雑種の作出過程を示す説明図。
【図１２】雑種第１代同士の交配における染色体の組合せを示す説明図。
【図１３】従来の異質３倍体と複２倍体の魚を作出する理論的な手法を示す説明図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
［実施例１］キンギョとニシキゴイの交雑による複２倍体。
発明者は、ニシキゴイのメスとキンギョのオスとを交雑させて妊性を持つXXXY型の性染色体を有する複２倍体魚の作出に成功した。
【００４７】
背景。
ニシキゴイには黄金、シルバーなどキンギョに見られない色彩の多様性がある。そこでキンギョにニシキゴイの色彩を導入したいとの要望がある。キンギョとコイは属間の関係にあるため、雑種は正常な配偶子形成ができない。しかし、雑種メスでは染色体が減数しない非減数卵を産生することがある。一方、雑種のオスでは非減数精子を産生することはできないとされてきたが、雑種F1を数多く調べた結果、非減数精子を産生するものが発見された。
雌は調べた７個体がいずれも非減数卵を産生していたが、雄は調べた１５個体いずれも不妊で、偶然に産卵に加わった雄を取り上げたところ非減数精子を産生していることが判明した。従って、キンギョとコイの雑種では雌は恒常的に非減数卵を産生すると思われるが、雄では極めて希と思われる。
【００４８】
手法。
コメット又はワキンとマゴイ又はニシキゴイとの間で交雑した。６ケ月後生殖腺を摘出し組織学的に配偶子形成を調べた。さらに、約３年後７個体について生殖巣を摘出し、ＧＳＩおよび配偶子の形成状況を調べた。正常に発生してきたものについては、父親の精子および子供の血球当たりの相対DNA量を測定した。子供については１年後性別を調べさらに子供間の遺伝的関係をウロコ移植およびDNAフィンガープリントによって検討した。
【００４９】
結果。
６ケ月令の雑種の生殖腺は対照に比べ明らかに異常であった。卵巣ではディプロテン期に入った卵母細胞はまったく認められないか、まばらに出現した。一方オスでは全ての生殖細胞が精原細胞の状態にとどまり、減数分裂に入るものは認められなかった。
しかし、ほぼ３才魚の生殖腺を調べた結果、メス４に対しオス３であった。雌雄共に生殖腺が発達し、ＧＳＩがメスで7.2〜10.0、オスで0.9〜2.9に達していた（表１）。
【００５０】
【表１】
0004705582.tif 000002
【００５１】
卵巣卵は充分に発達し、いずれの個体も産卵可能と判断された。一方オスでは精子の放出はまったく認められず、検鏡下でも精子は認められ得なかった。従って、オスは不妊と判断された。
【００５２】
メス１オス１のペアー６組を、新たに水を張ったコンクリート水槽に収容し水草を入れたところ、５組で産卵が認められた。しかし、１組を除いて、胚体形成は認められず未受精卵と判断された。一方、一組の卵は正常に発生し孵化後の生育も順調であった。このオスの精子の相対DNA量を測定したところ血球の相対DNA量を２としたときに、ほぼ２を示し（図６参照）、非減数精子と判断された。F2のDNA量は４にピークが認められ４倍体と判断された（図７参照）。
【００５３】
これらのF2は、全個体がオスで、外観が互いに類似し、ウロコ移植およびDNAフィンガープリントの結果、遺伝的に等しいクローンであることが判明した。生殖腺は１年後も未熟な状態にあり、成熟できることを確認することはできなかった。しかし、３才魚の中には精子を出すものが見出され、妊性のあることが確認できた。
【００５４】
この結果は、以下のことを示している。
キンギョとコイの雑種は、正常な配偶子を形成できないが、若い個体の卵巣では少数のディプロテン期に入った卵母細胞の出現が観察された。一方、従来の知見と同様オス減数分裂を行っている精巣を見出すことができなかった。３年魚では、しかし、殆どのメスが成熟し、オスにも排精するものが１個体確認できた。この精子は非減数精子であることがDNA量の測定より明らかになった。F1同士の交配により生じた子は４倍体でかつ全個体がオスでしかもクローンであった。この結果は、減数分裂前の生殖細胞の染色体が倍数化して複２倍体化したことを示唆している。
【００５５】
非減数配偶子は、生殖細胞が減数分裂に入るまえに偶然に染色体を倍数化させ、複製された姉妹染色体が相同染色体として振る舞い対合を可能にした結果である。配偶子は、雌雄共にキンギョとコイの染色体を１セットずつ有し、親と遺伝的に等しい。種を異にする性染色体XとYの間の対合は不可能であるため、オスのF1ではキンギョのX同士、コイのY同士で対合して減数するため、精子の性染色体は全てXYとなる。第２代（F2）の性染色体は、キンギョのXを２個、コイのXとYを１個ずつ有するXXXYとなった。このオスの精子は、XXもしくはXYとなるため、第３代（F3）以降は、雌雄が１：１で生じ、キンギョとコイの染色体を２セットずつ永久に推持する新種が出現する（請求項７の発明）。キンギョとコイの遺伝子が異なる対立遺伝子として働くため、兄妹交配を繰返しても近交弱勢は現れない。
【００５６】
［実施例２］
本実施例では、ニジマスとアマゴを交雑させて請求項３に係る発明の複２倍体を得る。
特許請求の範囲３に記載の複２倍体は、雑種の交雑卵の第２卵割を阻止して一旦第１代の複２倍体を得、その減数卵と減数精子を受精させて作出されたXXXY型の複２倍体である。発明者は、これまで４倍体を作出するのに第１卵割阻止として認識されていた倍数化処理のメカニズムが実際にはそうではなくて、第２卵割の阻止であることを見出した。これは、次の実験によって解明された。
【００５７】
ニジマスの受精卵もしくはニジマスとアマゴの交雑卵を１０度で培養し、５時間１５分後に６５０気圧の水圧を６分間処理し、その後１０度で飼育した。
処理直前および処理後一定時間毎に卵を固定し組織標本として核の挙動を追跡したところ、図８に見られるような結果が得られた。なお、ニジマスの受精卵を対照群とし、ニジマスとアマゴの交雑卵を処理群とする。
【００５８】
図８のIブロックは第１細胞周期（第１卵割が完了するまで）における核の挙動を、図８のIIブロックは第２細胞周期（対照が第２卵割を完了するまで）における核の挙動を、また図８のIIIブロックは第３細胞周期における核の挙動をそれぞれ示している。図iを除いて各ブロックの上段の図（Iブロックのa〜d、IIブロックのj〜n、IIIブロックのtとu）が対照群のものを、下段の図（Iブロックのe〜h、IIブロックのo〜s、IIIブロックのvとｗ）が水圧処理群のものを表している。Iブロックのiは水圧処理群のものを示す。
【００５９】
第１細胞周期（Iブロック）での核の挙動。
対照群について。
a：受精５時間１５分後の対照の前中期の核の像である。核膜がほぼ消失し染色体が見えている。染色体の両側に星状体が認められ、核膜を取り巻くように紡錘体が認められる。
b：受精５時間４５分後の対照の中期像である。染色体は、赤道板上に配列し、紡錘体が明瞭である。
c：受精６時間１５分後の対照の後期像である。染色体が両極方向へ分離を開始している。
d：受精６時間３０分後の対照の終期像である。分離した染色体が核を形成している。矢印は、第１卵割溝の像を示す。
水圧処理群について。
e：受精５時間１５分後、対照では前中期にあたる時期（上記a）に水圧処理をした直後の像。星状体及び中心体が消失している。
f：水圧処理１５分後の像である。星状体及び中心体が再生している。
g：水圧処理３０分後の像である。対照の図bより３０分遅れて正常な中期像を示す。
h：中期に続く正常な後期に入っている。
i：対照群の図dより３０分遅れで正常な終期に入った。両極で形成された娘核２個と中央に第１卵割溝が認められる（矢印参照）。
【００６０】
以上見てきたように、水圧処理によって一次的に紡錘体は消失する（図e）が、すぐに再生が起こり正常な第１卵割が起こることが分かる。
【００６１】
第２細胞周期（IIブロック）での核の挙動。
対照群について。
j〜n：対照の第２細胞周期のそれぞれ前期，前中期，中期，後期，終期の核を示す。図nでは第２卵割溝が下方に認められる。
水圧処理群について。
o：水圧処理胚の第２細胞周期の前期核を表す。対照のもの（図j）と変わらない。
p：水圧処理胚の前中期像を示す。本来２つ現れるべき星状体が１個しか現れていない。
q：水圧処理胚の中期像を示す。星状体が１個しか現れないため単極紡錘体が形成されている。
r：水圧処理胚の後期像を示す。単極紡錘体のため染色体は、対照のもの（図m）とは異なり、両極に分離することができない。
s：水圧処理胚の終期像を示す。染色体は両極へ分離できず、１個の核を形成している。第２卵割溝は形成されず２細胞のままである。対照の終期像に比べ核が大型となっているのが解る。
【００６２】
このように、第２細胞周期においては、水圧処理群のものは、正常な両極紡錘体が形成されず、単極紡錘体となり染色体の分離が起こらないと同時に第２卵割が阻止され、染色体が倍数化する。
【００６３】
第３細胞周期（IIIブロック）での核の挙動。
対照群について。
tとu：対照の第３細胞周期のそれぞれ中期像と後期像を示す。
水圧処理群について。
v，w：水圧処理胚の中期像と後期像を示す。第３細胞周期以降卵割は正常であるが核板が大型化しており染色体が倍数化していることが分かる。
【００６４】
このように、第３細胞周期では、処理胚も正常な卵割が起こるが、染色体が倍数化しているために、中期の核板が大きくなっている。
【００６５】
図８の結果によれば、ニジマスの受精卵と交雑卵の初期発生過程には差が見られなかった。対照群では処理開始直前の５時間１５分では大部分の卵が第１卵割の前中期にあり、５時間４５分で中期、６時間１５分で後期、６時間３０分では終期に入った。
【００６６】
一方、処理群では処理直後に紡錘体および星状体は完全に消失した。しかし、処理終了から３０分後には紡錘体の再生が起こり外見上正常な中期に入った。その後対照群に比べ約３０分遅れで後期、終期と正常に卵割が進行した。
【００６７】
対照群と処理群の間の顕著な差は、第２細胞周期で見られた。対照群では受精後９時間に第２卵割の中期に入り、各細胞に２極紡錘体を形成し赤道板上に染色体が配置されているのが観察された。これに対し処理群では、１０時間後に細胞毎に単極の紡錘体が１個存在し、各妨錘体は胚の中心側を向き紡錘糸の先に染色体が約１２０度の円弧を成して配列していた。終期には、１個の核しか形成されず、細胞質分裂も伴わなかった。終期の核のサイズは対照に比べ明らかに大型であった。
【００６８】
染色体の倍数化法として温度や水圧によって卵割を阻止する方法が広く採用されている。これらの物理的処理は、微小管を脱重合させ紡錘体を消失させることから、染色体の両極への移動が妨げられ、複製された染色体が分離できずに倍数化が起こると考えられてきた。したがって、第１卵割阻止法とも呼ばれている。
【００６９】
しかし、この考え方は明らかに誤りである。
水圧処理後まもなく紡錘体の再生が起こり、第１卵割は多少の遅れを伴うものの完結する。一方第２細胞周期で、処理群ではいずれの核も単極紡錘体を形成し１核を形成した。この核は、対照群と比べて明らかに大型であることから、すでに染色体の複製を伴っていたことは明らかである。第３細胞周期ではいずれの核も２極分裂を起こし、細胞分裂は正常に戻った。したがって、第１卵割中期における水圧処理は第２分裂を阻止するとするのが正しい。温度処理の場合にも水圧処理と基本的に同じであることが確かめられた。これらの結果は、卵割時の水圧処理は紡錘体というよりは中心体に影響を与えている可能性を示唆している。
【００７０】
図１３でいえば、第４ステップで水圧もしくは温度処理を加えると、第１卵割は正常に進行するが、第６ステップで両極紡鍾体が形成されずに単極紡錘体が形成され、染色体の分離が起こらず、卵割も伴わないため２つの細胞それぞれに４倍体の核が形成される。すなわち第２卵割が阻止され４倍体が形成されるのである。
【００７１】
水圧処理によるニジマスとアマゴの複２倍体の作出。
ニジマスとアマゴの交雑卵に対し、受精後４時間４５分から５時間４５分にわたって１５分毎に水圧処理を開始し、処理開始時の核のステージと倍化率の関係を求めた。さらに処理群に出現する２n−４nモザイク個体の染色体を分析し、２n細胞のゲノム構成を明らかにした。
【００７２】
処理開始時間と倍数化の関係を、図９に示す。
４時間４５分では第１卵割の前期、５時間１５分で前中期にあたり、５時間３０分から４５分にかけて中期であった。最大の倍数化率は５時間１５分に見られ、用いた卵の４０％近くが倍数化していた。核型分析の結果、これらは正４倍体であった。前記処理を開始したものに比べ中期の処理を開始したものは４倍体作出率が低下する傾向が認められた。
【００７３】
処理群に現れたニジマスとアマゴの複２倍体および，処理を行わなかった雑種２倍体の核型を図１０に示す。
【００７４】
処理開始時間と倍化率との関係を繰り返し調べてきたが、処理開始の適期は、中期よりも前中期にあると結論された。さらに中期と前期を比較すると、むしろ前期での処理の方が好結果をもたらした。水圧処理が単に紡錘体を破壊することによって倍数化が起こるのであれば、中期でも良いはずである。また、倍数化処理のメカニズムについての上記した結果から、物理的処理は紡錘体よりもむしろ中心体に影響を及ぼすことが示唆された。
【００７５】
中心体は、２個の中心子からなるが、細胞分裂に先立って２個の中心子は互いに分離し、それぞれがもう１個の中心子を出芽的に複製させる。娘中心子の形成は、分裂中期までつづくことが知られている。中心子もガンマチュブリンから成る微小管の一種であるが、成熟した中心子は水圧処理の影響を受けづらく、複製過程のものが影響を受けるとすると、水圧処理開始時間と倍数化の関係をよく説明できる。娘中心子の複製初期では水圧による破壊を受けても処理後再度複製が可能なため水圧処理の効果が薄れる。しかし、ある程度複製が進行すると再形成が不可能となり、中心子１個で第１分裂を完了させると思われる。
【００７６】
一方、分裂中期以降では中心子の複製が既に完了し、水圧による影響を受けにくいため再び倍化率が低下していくのであろう。複製中の中心子を破壊され複製に失敗した中心子は、第２細胞周期で改めて娘中心子を複製し、完全な１個の中心体を形成する。そのため単極紡錘体を形成するものと考えられる。
【００７７】
本発明に係る妊性を持つXXXY型の性染色体を有する複２倍体は、上記した実施例に示す手法を介して作出される複２倍体をも含む。例えば、妊性を持つ雑種３倍体水棲動物の非減数卵AXAXBXに染色体BBを有する水棲動物の減数精子BYを受精させて作出される複２倍体、あるいは染色体AAを有する水棲動物の卵AXAXに染色体BBを有する水棲動物の精子BXまたはBYを受精させマイクロインジェクション操作によってBYまたはBX受精させ第２極体放出を阻止させることにより作出される複２倍体、あるいは同質４倍体（AAAAとBBBB）が産生する卵AXAXと精子BXBYを受精させて作出される複２倍体、などである。
【００７８】
上記した実施例はいずれも魚類についてのものであるが、増養殖産業において共通する要素の多い貝類、甲殻類などを含む水棲動物全般にも同様に適用できる。水棲動物は、一般に、一個体の産生する卵が多量であることから、選別対象となる母集団の構成数が多くなり、目的とする受精卵や仔子などを同一の手法によって効率良く産生することができる。したがって、複２倍体を得るために魚類について適用された手法あるいは考え方はそのまま他の水棲動物にも適用可能である。
染色体操作が、魚類のみではなく貝類や甲殻類で有効であることを示すために、以下の２つの論文を提示する。
(1) Guo,X. and Allen,Jr.S.R. 1994 Viable tetraploids in the Pacific oyster(Crssostrea gigas Thunberg) poduced by inhibiting polar body 1 in eggs from triploids. Molecular Marine Biology Biotechnology, 3, 42-50.
(2) Li,F., Xiange,J., Zou,L., Wu,C. and Zhang,X. 2003 Optimization of triploid induction by heat shock in Chinese Shrimp Fenneropenaeus chinensis. Aquaculture, 219, 221-231.
【００７９】
いずれにしろ、本発明に係る複２倍体は自然界および理論上でも考えられることのなかった染色体構成の複２倍体であり、本発明者はこの複２倍体を作出することに成功した。これにより、次世代以降、複２倍体を自然交配によって安定的に供給でき、特に養殖分野における利用価値は図りしれないものがある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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