(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者から採取された腫瘍組織の性質を判定する組織性質判定装置であって、
前記腫瘍組織から調製した試料に含まれる第１サイクリン依存性キナーゼ（第１ＣＤＫ）の活性値からなる第１データ及び前記第１ＣＤＫの発現量からなる第２データを取得するデータ取得手段と、
前記第１データ及び第２データより得られる第１ＣＤＫ比活性値に基づいて腫瘍組織の性質に関する情報を取得する解析手段と
を備えることを特徴とする組織性質判定装置。
【請求項２】
前記データ取得手段は、前記試料に含まれる第２サイクリン依存性キナーゼ（第２ＣＤＫ）の活性値からなる第３データ及び前記第２ＣＤＫの発現量からなる第４データを取得し、
前記解析手段が、第１ＣＤＫ比活性値と、前記第３データ及び第４データより得られる第２ＣＤＫ比活性値とに基づいて腫瘍組織の性質に関する情報を取得する請求項１に記載の組織性質判定装置。
【請求項３】
前記解析手段が、前記第１ＣＤＫ比活性値と前記第２ＣＤＫ比活性値との比を第１の閾値と比較することによって腫瘍組織の性質に関する情報を取得する請求項２に記載の組織性質判定装置。 
【請求項４】
前記第１サイクリン依存性キナーゼがＣＤＫ１であり、前記第２サイクリン依存性キナーゼがＣＤＫ２である請求項２又は請求項３に記載の組織性質判定装置。
【請求項５】
前記腫瘍組織の性質に関する情報が、腫瘍組織に含まれる細胞の増殖能又は悪性度に関する情報である請求項１〜４のいずれかに記載の組織性質判定装置。
【請求項６】
前記細胞の増殖能又は悪性度に関する情報が、治療方法の判定に用いられる情報である請求項５に記載の組織性質判定装置。
【請求項７】
前記腫瘍組織の性質に関する情報が、再発リスクに関する情報である請求項１〜４のいずれかに記載の組織性質判定装置。
【請求項８】
前記解析手段が、前記第１ＣＤＫ比活性値を第２の閾値と比較することによって腫瘍組織の性質に関する情報を取得する請求項１に記載の組織性質判定装置。
【請求項９】
前記データ取得手段は、前記試料に含まれるＣＤＫインヒビターの発現量を取得し、
前記解析手段が、前記第１ＣＤＫ比活性値と、前記ＣＤＫインヒビターの発現量とに基づいて、腫瘍組織の性質に関する情報を取得する請求項１に記載の組織性質判定装置。 
【請求項１０】
前記解析手段が、前記第１ＣＤＫ比活性値を第２の閾値と比較するとともに、前記ＣＤＫインヒビターの発現量を第３の閾値と比較することによって腫瘍組織の性質に関する情報を取得する請求項９に記載の組織性質判定装置。
【請求項１１】
前記腫瘍組織の性質が、刺激物質に対する感受性である請求項１、８、９又は１０に記載の組織性質判定装置。
【請求項１２】
前記刺激物質に対する感受性の情報が、抗癌剤の使用の判定に用いられる情報である請求項１１に記載の組織性質判定装置。
【請求項１３】
所定の基質を含む基質溶液と、前記試料とを接触させる第１接触手段をさらに備えており、
前記データ取得手段が、前記基質溶液が腫瘍組織に含まれる第１ＣＤＫと接触することによって生成される物質に付加された第１標識を検出することによって前記第１データを取得する請求項１〜１２のいずれかに記載の組織性質判定装置。
【請求項１４】
第１ＣＤＫの抗体を含む抗体溶液と、前記試料とを接触させる第２接触手段をさらに備えており、
前記データ取得手段が、前記抗体に付加された第２標識を検出することによって前記第２データを取得する請求項１〜１３のいずれかに記載の組織性質判定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組織性質判定装置に関する。さらに詳しくは、例えばヒトの組織の種々の性質を的確に判定することができ、癌の悪性度の判断及び／又は抗癌剤治療の有効性予測方法に好適に用いることができる組織性質判定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、癌診断として、血清中の腫瘍マーカーを調べる血清診断や、生検（バイオプシイ）による組織診、細胞診が知られているが、これらは信頼性が低いか、又は個々人の判断や医療機関の判定にバラツキがあることから、近年、診断医によるバラツキが少ない癌の画一的診断方法として、生体で発現されるタンパク質に基づく分子診断が検討されている。
【０００３】
例えば、特許文献１では、試料のＣＤＫ１及びＣＤＫ４の発現量、さらには必要に応じてｐ５３の突然変異状態を指標とする診断方法が提案されている。また、特許文献２では、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、サイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫインヒビター）の過剰発現を指標とする癌及び前癌状態の診断方法が提案されている。さらに、特許文献３には、ＣＤＫの活性値を蛍光を用いて測定する方法および、その方法を用いて癌を診断する方法が提案されている。
【０００４】
また、癌の治療方法の一つとして、抗癌剤治療方法があるが、その有効性を予測する方法として、例えば特許文献４には、培養癌細胞株の抗癌剤感受性と該細胞のインタクトな状態における遺伝子発現プロファイルに基づき抗癌剤適合性マーカー遺伝子を特定し、特定した抗癌剤適合性マーカー遺伝子と該遺伝子を利用した未知検体の抗癌剤適合性予測方法が開示されている。
【０００５】
【特許文献１】特表２００２−５０４６８３号公報
【特許文献２】特表２００２−５１９６８１号公報
【特許文献３】特開２００２−３３５９９７号公報
【特許文献４】特開２００３−３０４８８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記特許文献１から３には、試験対象物が癌またはその前段階であるか否かを判断することなどが記載されているが、癌の悪性度の判断、すなわち、予後の判断については全く記載されていない。
また前記特許文献４には、抗癌剤治療の有効性の予測の方法が記載されているが、この方法による抗癌剤治療の有効性の予測の精度は高いものとは言えない。
【０００７】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、癌の悪性度の判断、または、精度の高い抗癌剤治療の有効性の予測を行うために有用な、組織の性質に関する情報を取得することが可能な組織性質判定装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の組織性質判定装置は、癌患者から採取された腫瘍組織の性質を判定する組織性質判定装置であって、
前記腫瘍組織から調製した試料に含まれる第１サイクリン依存性キナーゼ（第１ＣＤＫ）の活性値からなる第１データ及び前記第１ＣＤＫの発現量からなる第２データを取得するデータ取得手段と、
前記第１データ及び第２データより得られる第１ＣＤＫ比活性値に基づいて腫瘍組織の性質に関する情報を取得する解析手段と
を備えることを特徴としている。
【０００９】
本発明の組織性質判定装置では、癌の悪性度の判断、または、精度の高い抗癌剤治療の有効性の予測を行うために有用な、組織の性質に関する情報を取得することが可能となる。
【００１０】
前記データ取得手段は、前記試料に含まれる第２サイクリン依存性キナーゼ（第２ＣＤＫ）の活性値からなる第３データ及び前記第２ＣＤＫの発現量からなる第４データを取得し、
前記解析手段が、第１ＣＤＫ比活性値と、前記第３データ及び第４データより得られる第２ＣＤＫ比活性値とに基づいて腫瘍組織の性質に関する情報を取得するように構成することができる。
【００１１】
前記解析手段が、前記第１ＣＤＫ比活性値と前記第２ＣＤＫ比活性値との比を第１の閾値と比較することによって腫瘍組織の性質に関する情報を取得するように構成することができる。
【００１５】
前記第１サイクリン依存性キナーゼをＣＤＫ１とし、前記第２サイクリン依存性キナーゼをＣＤＫ２とすることができる。
前記腫瘍組織の性質に関する情報を、腫瘍組織に含まれる細胞の増殖能又は悪性度に関する情報とすることができる。
前記細胞の増殖能又は悪性度に関する情報を、治療方法の判定に用いられる情報とすることができる。
前記腫瘍組織の性質に関する情報を、再発リスクに関する情報とすることができる。
前記解析手段が、前記第１ＣＤＫ比活性値を第２の閾値と比較することによって腫瘍組織の性質に関する情報を取得するように構成することができる。
【００１９】
前記データ取得手段は、前記試料に含まれるＣＤＫインヒビターの発現量を取得し、
前記解析手段が、前記第１ＣＤＫ比活性値と、前記ＣＤＫインヒビターの発現量とに基づいて、腫瘍組織の性質に関する情報を取得するように構成することができる。 
【００２０】
前記解析手段が、前記第１ＣＤＫ比活性値を第２の閾値と比較するとともに、前記ＣＤＫインヒビターの発現量を第３の閾値と比較することによって腫瘍組織の性質に関する情報を取得するように構成することができる。
前記腫瘍組織の性質を、刺激物質に対する感受性とすることができる。
前記刺激物質に対する感受性の情報を、抗癌剤の使用の判定に用いられる情報とすることができる。
【００２１】
所定の基質を含む基質溶液と、前記組織から調製した試料とを接触させる第１接触手段をさらに備えており、
前記データ取得手段が、前記基質溶液が腫瘍組織に含まれる第１ＣＤＫと接触することによって生成される物質に付加された第１標識を検出することによって前記第１データを取得するように構成することができる。
【００２２】
第１ＣＤＫの抗体を含む抗体溶液と、前記試料とを接触させる第２接触手段をさらに備えており、
前記データ取得手段が、前記抗体に付加された第２標識を検出することによって前記第２データを取得するように構成することができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の組織性質判定装置によれば、癌の悪性度の判断、または、精度の高い抗癌剤治療の有効性の予測を行うために有用な、組織の性質に関する情報を取得することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、添付図面を参照しつつ、本発明の組織性質判定装置（以下、単に判定装置ともいう）の実施の形態を詳細に説明する。
本実施の形態の判定装置は、ＣＤＫの発現量や活性値を測定し、得られた測定値に基づいて癌の悪性度（再発リスクの高さ）の判定や、抗癌剤の有効性（感受性）の判定を行うのに好適に用いることができるものであるが、当該判定装置の説明に先立って、まず、［１］哺乳動物組織（癌細胞を含む組織）の性質の判定方法、及び［２］抗癌剤治療の有効性予測方法（組織の、刺激物質に対する感受性の判定方法）について説明をする。
【００２８】
［１］哺乳動物組織の性質の判定方法
哺乳動物組織の性質を判定する判定方法は、哺乳動物組織の２種以上のサイクリン依存性キナーゼの発現量及び活性値を測定し、第１のサイクリン依存性キナーゼの活性値と発現量との比及び第２のサイクリン依存性キナーゼの活性値と発現量との比を含むＣＤＫプロファイルに基づいて、当該哺乳動物組織の性質を判定するものである。腫瘍細胞を含む組織にかかる判定方法を適用することにより、腫瘍細胞を含む組織の性質、癌の悪性度を診断することができる。なお、ＣＤＫプロファイルとは、ある組織が有する少なくとも１種類のＣＤＫの活性値と発現量との比（例えば比活性）及び／又は複数のＣＤＫの活性値、発現量より計算される数値（例えば、第１ＣＤＫの活性値と発現量との比（Ａ１）と、第２ＣＤＫの活性値と発現量との比（Ａ２）との比（例えば、Ａ１／Ａ２又はＡ２／Ａ１）など）を含む情報のことである。
【００２９】
前記判定方法が対象とする哺乳動物は特に限定されないが、ヒト、特に臨床状態、より具体的には癌についての状態の判定が求められているヒトに有用である。
前記判定方法が対象とする組織は、哺乳動物の生体組織、すなわち繊維性結合組織、軟骨組織、骨組織、血液、リンパ等の支持組織；上皮組織；筋組織；神経組織等であればよいが、特に個体としての調和を破り、増殖の制御機構に異常を来している腫瘍細胞を含む組織のように、病理的情報を得たい組織に好適である。例えば、乳、肺、肝臓、胃、大腸、膵臓、皮膚、子宮、精巣、卵巣、甲状腺、副甲状腺、リンパ系統、骨髄などの位置にできる腫瘍組織が好適な対象となる。
【００３０】
判定する哺乳動物組織の性質には、測定対象となる組織に含まれる細胞の増殖能、悪性度が含まれる。細胞の増殖能とは、細胞の増殖活性レベルで、増殖の制御機構に異常を来しているか否か（癌化の有無）、さらには異数倍体性などに関する情報が該当する。細胞の悪性度とは、具体的には、転移のしやすさ、再発のしやすさ、予後の悪さ等が挙げられる。
【００３１】
ここで、再発とは、悪性腫瘍を摘出するために臓器を部分切除した後、残存臓器に同じ悪性腫瘍が再現する場合、及び原発巣から腫瘍細胞が分離して遠隔組織（遠隔臓器）へ運ばれ、そこで自立的に増殖する場合（転移再発）をいう。一般に５年以内に再発が認められる場合に「再発しやすい」という。また、ステージ分類ではステージＩＩＩは再発率５０％であり、ステージＩＩ（再発率２０％）に比して再発しやすい。予後とは、疾病の経過及び終末を予知することで、５年又は１０年後の死亡率が高い程予後は悪く、例えばステージＩＩＩは死亡率５０％であり、ステージＩＩ（死亡率２０％）よりも予後が悪い。
【００３２】
サイクリン依存性キナーゼとは、サイクリンと結合して活性化される酵素群の総称であり、その種類に応じて、細胞周期の特定時期で機能している。また、ＣＤＫインヒビターとは、サイクリン・ＣＤＫ複合体に結合し、その活性を阻害する因子群の総称である。
【００３３】
ここで、細胞が増殖を開始し、ＤＮＡ複製、染色体の分配、核分裂、細胞質分裂などの事象を経て、２つの娘細胞となって出発点に戻るまでのサイクルである細胞周期は、図１６に示されるように、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期の４期に分けられる。Ｓ期はＤＮＡの複製期であり、Ｍ期は分裂期である。Ｇ１期は有糸分裂の完了からＤＮＡ合成の開始までの間で、Ｍ期に入るための準備点検期である。Ｇ１期にある臨界点（動物細胞ではＲ点）を過ぎると、細胞周期は始動し、通常途中で止まることなく、一巡する。Ｇ２期は、ＤＮＡ合成の終了から有糸分裂の開始の間である。細胞周期の主なチェックポイントは、Ｇ１期からＳ期にはいる直前、Ｇ２期から有糸分裂への入り口である。特にＧ１期チェックポイントはＳ期開始の引き金を引くため、重要である。Ｇ１期のある点を過ぎると、細胞は増殖シグナルがなくなっても、増殖を停止することなく、Ｓ→Ｇ２→Ｍ→Ｇ１と細胞周期を進行させるからである。尚、増殖を停止した細胞で、Ｇ１期のＤＮＡ含量をもった休止期（Ｇ０）があり、細胞周期からはずれた状態にある。増殖誘導により細胞周期内のＧ１期よりやや長い時間の後にＳ期へ進行することができる。
【００３４】
前記判定方法で用いられるサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、サイクリンＡ依存性キナーゼ、サイクリンＢ依存性キナーゼ、及びサイクリンＤ依存性キナーゼからなる群より選ばれることが好ましい。サイクリンＡ依存性キナーゼとは、サイクリンＡと結合して活性を示すＣＤＫのことで、現在判明しているところでは、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の双方をいう。またサイクリンＢ依存性キナーゼとはサイクリンＢと結合して活性を示すＣＤＫのことで、現在判明しているところではＣＤＫ１が該当する。サイクリンＤ依存性キナーゼとはサイクリンＤと結合して活性を示すＣＤＫのことで、現在判明しているところではＣＤＫ４及びＣＤＫ６の双方が該当する。
【００３５】
これらのＣＤＫは、現在判明しているところ、表１に示されるように、それぞれ対応するサイクリンと結合したサイクリン・ＣＤＫ複合体（以下、活性型ＣＤＫともいう）となって、表１に示されるような細胞周期の特定時期を活性化している。例えば、ＣＤＫ１はサイクリンＡ又はＢと、ＣＤＫ２はサイクリンＡ又はＥと、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６はサイクリンＤ１、Ｄ２、又はＤ３と結合して活性型となる。一方、ＣＤＫ活性は表１に示されるようなＣＤＫインヒビターによって活性が阻害されることもある。例えば、ｐ２１はＣＤＫ１，２を阻害、ｐ２７はＣＤＫ２，４，６を阻害、ｐ１６がＣＤＫ４，６を阻害する。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
前記ＣＤＫのうち、２種類以上のＣＤＫの発現量と活性値を測定し、各ＣＤＫにおけるこれらの比（すなわち、下記式で表されるＣＤＫ比活性又はその逆数）を求めて、ＣＤＫプロファイルを得る。ＣＤＫの比活性＝ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量  従って、ＣＤＫプロファイルとしては、具体的には、例えば、ＣＤＫ比活性を含むプロファイル（ＣＤＫ比活性プロファイル）やＣＤＫ比活性の逆数を含むプロファイル（ＣＤＫ比活性の逆数プロファイル）等が挙げられる。
【００３８】
ＣＤＫ活性値とは、特定のサイクリンと結合して、どれだけの基質（例えば、活性型ＣＤＫ１、活性型ＣＤＫ２はヒストンＨ１、活性型ＣＤＫ４及び活性型ＣＤＫ６はＲｂ（網膜芽細胞腫タンパク、Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ））をリン酸化するかというキナーゼ活性のレベル（単位をＵ（ユニット）で現す）をいい、従来より知られている酵素活性測定方法で測定することができる。具体的には、測定試料の細胞溶解液から活性型ＣＤＫを含む試料を調製し、３２Ｐ標識したＡＴＰ（γ−〔３２Ｐ〕−ＡＴＰ）を用いて、基質タンパク質に３２Ｐを取り込ませ、標識されたリン酸化基質の標識量を測定し、標準品で作成された検量線をもとに定量する方法がある。また放射性物質の標識を用いない方法としては、特開２００２−３３５９９７号公報に開示の方法が挙げられる。この方法は、測定試料の細胞可溶化液から、目的の活性型ＣＤＫを含む試料を調製し、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）と基質を反応させて、該基質タンパク質のセリン又はスレオニン残基にモノチオリン酸基を導入し、導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質又は標識酵素を結合させることによって基質タンパク質を標識し、標識されたチオリン酸基質の標識量（標識蛍光物質を用いた場合には蛍光量）を測定し、標準品で作成された検量線に基づいて定量する方法である。
【００３９】
活性測定に供する試料は、測定対象となる組織の可溶化液から目的のＣＤＫを特異的に採取することにより調製する。この場合、目的のＣＤＫに特異的な抗ＣＤＫ抗体を用いて調製してもよいし、特定のサイクリン依存性キナーゼ（例えばサイクリンＡ依存性キナーゼ、サイクリンＢ依存性キナーゼ、サイクリンＥ依存性キナーゼ）の活性測定の場合には、抗サイクリン抗体を用いて調製する。いずれの場合も活性型ＣＤＫ以外のＣＤＫが試料に含まれることになる。例えばサイクリン・ＣＤＫ複合体にＣＤＫインヒビターが結合した複合体も含まれる。また、抗ＣＤＫ抗体を用いた場合には、ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体などが含まれる。従って、活性値は、活性型、不活性型、各種競合反応が混在する状態下で、リン酸化された基質の単位（Ｕ）として測定される。
【００４０】
ＣＤＫ発現量とは、細胞可溶化液から測定される目的のＣＤＫ量（分子個数に対応する単位）であって、タンパク質混合物から目的のタンパク質量を測定する従来公知の方法で測定できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法等を使用してもよいし、特開２００３−１３０８７１号公報に開示の方法で測定することもできる。目的のタンパク質（ＣＤＫ）は、特異的抗体を用いて捕捉すればよい。例えば、抗ＣＤＫ１抗体を用いることにより、細胞内に存在するＣＤＫ１のすべて（ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体を含む）を捕捉できる。
【００４１】
従って、前記式により算出される比活性は、細胞に存在しているＣＤＫのうち、活性を示すＣＤＫの割合に相当し、判定対象である動物細胞の増殖状態に基づくＣＤＫ活性レベルといえる。このようにして求められるＣＤＫ比活性は、測定試料調製方法に依存しない。測定試料調製方法、特に生検材料から調製される測定試料（細胞可溶化液）は、実際に採取された組織中に含まれる非細胞性組織、例えば細胞外基質の多寡による影響を受けやすいことから、このような影響を控除した比活性又はその逆数を用いる意義は大きく、従来の単なる活性値と比べて、臨床的性格との相関性が高い。
【００４２】
２種類以上のＣＤＫ比活性又はその逆数を含むＣＤＫプロファイルを知ることにより、いずれのＣＤＫ活性が優位になっているかを知ることができ、これにより細胞周期のいずれの時期にある細胞割合がどの程度であるか、又はいずれの時期の細胞割合が優勢であるか等を知ることができる。
【００４３】
以下、ＣＤＫ比活性を含むＣＤＫ比活性プロファイルを中心に、哺乳動物組織（特に癌細胞を含む組織）の性質の判定方法を説明する。  比活性を測定するＣＤＫの種類は、知りたい性質の種類に応じて適宜選択すればよい。一般に、癌細胞は正常な増殖制御を逸脱して増殖が活発に行われていることから、Ｓ期、Ｇ２期にある細胞割合が多いと考えられ、このような場合に癌化していると考えられる。また、このような癌は、進行が早く、悪性であるといえる。さらに、異数媒体性は、異常なＭ期を経過したか、又はＭ期を経ずにＧ１期へ進んで、Ｓ期に入ったときに起ると考えられているため、Ｍ期に存在する細胞割合が少ないことも悪性であるといえる。従って、第１のサイクリン依存性キナーゼとしてＣＤＫ１、第２のサイクリン依存性キナーゼとしてＣＤＫ２を使用し、ＣＤＫ１比活性の大きさに従い群に分類し、類似したＣＤＫ１比活性を持つ群の中ではＣＤＫ２比活性値がＳ期の細胞比率を反映する値となる。Ｓ期にある細胞が多い場合、当該細胞が構成細胞となっている組織が臨床的に悪性、すなわち転移しやすい予後の悪い悪性の癌であると判定することができる。
【００４４】
なお、ＣＤＫの種類、判明している作用から、２種類以上のＣＤＫ比活性を含むＣＤＫ比活性プロファイルにより細胞周期の特定時期の存在割合を推測し、細胞の悪性度を判定してもよいし、予め対応する正常組織細胞を標準細胞として測定した２種類以上のＣＤＫの比活性プロファイルを求め、正常細胞との比較から悪性度を判定してもよい。  ＣＤＫ比活性プロファイルとして、２種類のサイクリン依存性キナーゼの比活性の比を採用することが好ましい。この場合、２種類のサイクリン依存性キナーゼの比活性の比を、該比に対応する所定の閾値と比較することにより、組織の性質を判定する。
【００４５】
前記判定方法で用いられる閾値は、測定対象の細胞の種類、判定項目により適宜決められる。閾値の設定は、対象となる項目に関する多数の細胞、個体のデータベースと、当該細胞のＣＤＫ比活性のデータベースとから、該当項目に対してボーダーとなる比活性の比の値を選択すればよい。例えば、癌の悪性度について病理医の判定が既知の複数の患者から採取された腫瘍細胞について、相関性があるとされる２種類のＣＤＫの比活性の比をそれぞれ求め、求められた比を小さい順に並べて集団を２等分できる中央値を閾値とすることができる。
【００４６】
［２］抗癌剤治療の有効性予測方法（組織の、刺激物質に対する感受性の判定方法）
抗癌剤治療の有効性予測方法は、患者から採取した腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータと、選択されたパラメータに対応する閾値とを比較する工程；及び前記比較工程の結果に基づいて、前記患者の抗癌剤治療の有効性を予測する工程を含んでいる。  前記予測方法で予測する治療の有効性には、術前療法、術後療法の双方が含まれる。術前療法では、原発巣が存在する状態で抗癌剤を投与し続けた結果、原発巣が縮小ないし消失する場合が有効となり、術後療法では、腫瘍の摘出手術を行なった後に抗癌剤を投与し続けた結果、再発しない場合が有効となる。術後療法では、目に見えない転移等に対して、抗癌剤が有効であるかどうかが再発の有無となって現れる。
【００４７】
前記予測方法に用いられる試料となる組織は、患者から採取した腫瘍細胞を含む組織である。術後療法の場合、癌の摘出手術によりこれらの組織を入手できるので、これを利用することができる。術前療法の場合には、患者の腫瘍組織から生検した組織（バイオプシー）などを用いることができる。
【００４８】
前記予測方法で用いられるサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）としては、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、サイクリンＡ依存性キナーゼ、サイクリンＢ依存性キナーゼ、及びサイクリンＤ依存性キナーゼ等が挙げられ、癌の種類、抗癌剤の種類に応じて適宜選択される。つまり、癌には種々の種類があり、各患者の癌細胞がもっている細胞周期に関連する性格が抗癌剤治療の有効性に大いに関係するからである。
【００４９】
癌の種類としては、乳癌、胃癌、大腸癌、食道癌、前立腺癌等が挙げられる。また、抗癌剤としては、乳癌に対しては、例えばＣＭＦ群（シクロフォスファミド、メトトレキシエート、フルオロウラシルの３剤を併用して投与する療法）、ドセタキセル、パクリタキセル等のタキサン系抗癌剤、ＣＥ（シクロフォスファミド、エピルビシンの２剤を併用して投与する療法）、ＡＣ（ドキソルビシン、シクロフォスファミドの２剤を併用して投与する療法）、ＣＡＦ（フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロフォスファミドの３剤を併用して投与する療法）、ＦＥＣ(フルオロウラシル、エピルビシン、シクロフォスファミドの３剤を併用して投与する療法)、トラスツズマブとパクリタキセルの２剤を併用して投与する療法、カペシタビン等が挙げられ、胃癌に対しては、例えばＦＡＭ（フルオロウラシル、ドキソルビシン、マイトマイシンＣの３剤を併用して投与する療法）、ＦＡＰ（フルオロウラシル、ドキソルビシン、シスプラチンの３剤を併用して投与する療法）、ＥＣＦ（エピルビシン、シスプラチン、フルオロウラシルの３剤を併用して投与する療法）、マイトマイシンＣとテガフールの２剤を併用して投与する療法、フルオロウラシルとカルムスチンの２剤を併用して投与する療法等が挙げられ、大腸癌に対しては、例えばフルオロウラシルとロイコボリンの２剤を併用して投与する療法、マイトマイシンとフルオロウラシルの２剤を併用して投与する療法等が挙げられ、卵巣癌に対しては、例えばＴＰ（パクリタキセル、シスプラチンの２剤を併用して投与する療法）、ＴＪ（パクリタキセル、カルボプラチンの２剤を併用して投与する療法）、ＣＰ（シクロフォスファミド、シスプラチンの２剤を併用して投与する療法）、ＣＪ（シクロフォスファミド、カルボプラチンの２剤を併用して投与する療法）等が挙げられる。
【００５０】
判定の指標とするのは、ＣＤＫの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比から選択される１つ又は２つのパラメータである。活性値と発現量との比は、ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量で示されるＣＤＫ比活性であってもよいし、ＣＤＫ発現量／ＣＤＫ活性値の値であってもよい。  前記パラメータを所定の閾値と比較することにより抗癌剤治療が有効か否か判定できる。ここで活性値、発現量、及び活性値と発現量との比から選択されるパラメータとは、抗癌剤の種類、癌の種類により適宜選択されるパラメータである。このパラメータは、過去に抗癌剤治療が行われ、その結果が判明している癌患者から抗癌剤治療の前に摘出されて保存されていた腫瘍細胞について、ＣＤＫの活性値と発現量を測定し、それぞれのパラメータについて、抗癌剤治療結果を解析し、抗癌剤治療結果と相関のあるパラメータを抗癌剤の有効性判定に用いるパラメータとして選択したものである。
【００５１】
閾値と比較するパラメータは、所定のＣＤＫにおける１つのパラメータであってもよいし、２つのパラメータの組合せであってもよい。２つのパラメータを選択する場合、それぞれにおけるパラメータをそれぞれの閾値と比較する。  判定の指標となるＣＤＫは、１種類であってもよいし（第１の有効性予測方法）、２種類以上であってもよい（第２の有効性予測方法）。
【００５２】
２種類以上のＣＤＫを採用する場合、複数のＣＤＫについて、それぞれにおけるパラメータをそれぞれの閾値と比較し、各キナーゼの比較結果の組み合わせにより、有効性を予測してもよい（第２−１の有効性予測方法）。この場合、閾値と比較するパラメータの種類は、複数のＣＤＫにおいて、同じ種類のパラメータ（例えば発現量）を用いてもよいし、異なる種類のパラメータ（例えば、一方のＣＤＫについては発現量を比較し、他方のＣＤＫについては活性値を比較する）を用いてもよい。
【００５３】
また、複数種類のＣＤＫを採用する場合において、まず第１の有効性予測方法で、第１のＣＤＫに基づいて予測し、第１の有効性予測方法で有効性が疑われると判定された腫瘍細胞に関して、第１のＣＤＫとは異なるＣＤＫについて、活性値、発現量、及び活性値と発現量との比から選択されるパラメータと、該パラメータに対応する閾値と比較することによって、有効性を予測してもよい（第２−２の有効性予測方法）。第２−２の有効性予測方法で、第１ＣＤＫと異なるＣＤＫは、１種類のＣＤＫ（第２ＣＤＫ）であってもよいし、複数種類のＣＤＫ（第３、第４・・・ＣＤＫ）を用いてもよい。複数種類のＣＤＫを用いる場合、それぞれのＣＤＫについて、各ＣＤＫの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータと、該パラメータに対応する閾値とを比較し、これらの比較結果の組み合わせに基づいて、前記患者の抗癌剤治療の有効性を予測する。
【００５４】
第２のＣＤＫについて、有効性の判定に用いるパラメータは、前述した群から選ばれる。パラメータは１つだけ選択してもよいし、２つのパラメータを選択して、それぞれの閾値と比較してもよい。また、異なるＣＤＫとして複数種類のＣＤＫ、すなわち第２、さらには第３、第４のＣＤＫについて測定する場合、判定に使用するパラメータは、全て同種のパラメータ（例えば発現量）を用いてもよいし、異なる種類のパラメータ（例えば、第２のＣＤＫは発現量とし、第３のＣＤＫは活性値とする等の組み合わせ）を用いてもよい。
【００５５】
前記第２の有効性予測方法は、予測の正答率を上げる点で有効である。さらに第２−２の予測方法により、第１の予測方法で有効であると判定されない場合であっても、抗癌剤治療が有効な場合が少なくないので、第２の有効性予測方法を採用する意義がある。  また、抗癌剤治療の効き方にも、さらに病状が悪化することを防止するレベルと、腫瘍を縮小させて、病状を快方に向かわせることができるレベルとに分類することができ、第２の有効性予測方法、特に第２−２の有効性予測方法により、抗癌剤治療の効き方のレベルを加味した予測を行なうこともできる。
【００５６】
前記予測方法は、ＣＤＫだけでなく、さらにサイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫインヒビター）の発現量を、対応する閾値と比較し、前記ＣＤＫの比較結果と、前記ＣＤＫインヒビターの比較結果との組み合わせに基づいて、前記患者の抗癌剤治療の有効性を予測してもよい（第３の有効性予測方法）。ＣＤＫインヒビターは、サイクリン・ＣＤＫ複合体に結合し、その活性を阻害する因子群で、ＩＮＫ４ファミリーとＣＩＰ／ＫＩＰファミリーに分類される。前記有効性予測方法では、ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーが好ましく用いられ、特にｐ２１が好ましく用いられる。ｐ２１は、細胞増殖サイクルにおけるＧ１期及びＧ２期チェックポイントの双方で進行を阻害するインヒビターで、損傷したＤＮＡの修復のための時間を与えることができる。
【００５７】
第３の有効性予測方法は、ＣＤＫを所定パラメータについて閾値と比較した結果と、ＣＤＫインヒビターの発現量を閾値と比較した結果の組み合わせに基づいて、抗癌剤治療の有効性を予測してもよいし、第１段階でＣＤＫを所定パラメータについて閾値と比較し、有効性を予測判定した（第１の有効性予測方法）後、有効であると判定されなかった腫瘍細胞について、第２段階でＣＤＫインヒビターの発現量を閾値と比較し、有効である可能性が高いものを選び出すようにしてもよい。
【００５８】
なお、ＣＭＦ投与群の治療有効性予測因子として、Ｈｅｒ２やｐ２１が報告されている。Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ（ＩＢＣＳＧ）のトライアルでは、Ｈｅｒ２が過剰発現している乳癌患者に対してＣＭＦ投与が無効であることが示され、ｐ２１に関しては、ｐ２１高発現患者群における無病生存率が、低発現患者群よりも有意に悪いことが報告されている。しかし、Ｈｅｒ２，ｐ２１ともにＣＭＦ療法に対する効果の低い患者群に予測する因子であり、積極的に治療効果のある患者群を予測する因子の報告例はない。一方、前記予測方法は、有効であることを積極的に示すもので、しかも閾値を厳格にすることで、１００％に近い有効性を期待できる場合を提示することができる。
【００５９】
前記予測方法において、閾値は、抗癌剤の種類、癌の種類により適宜設定される値である。具体的には所定の癌に対して所定の抗癌剤を投与した抗癌剤治療結果と上記のパラメータとの関係を、多くの抗癌剤治療結果について調べ、多数の抗癌剤治療結果と相関のあるパラメータに関して、その抗癌剤治療結果が有効であった場合を選択できるように設定された値である。好ましくは抗癌剤治療結果が全て有効であった場合のみを選択できるように閾値を設定する。このように、実際の臨床治療結果に基づいて閾値の設定が行われるため、確度の高い有効性の判定が可能となる。閾値の設定に用いる臨床治療結果の数を増加させることにより、有効性判定の確度を向上させることができる。なお、抗癌剤治療結果としては、所定の抗癌剤治療を続けることにより生じた腫瘍サイズの変化や、抗癌剤投与を５〜６年続けて再発の有無を調べた結果等があげられる。
【００６０】
なお、ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量（ＣＤＫ比活性）、又はＣＤＫ発現量／ＣＤＫ活性値で示される比は、細胞に存在しているＣＤＫのうち、活性を示すＣＤＫの割合に相当し、測定対象である腫瘍細胞が固有のものとして示す増殖状態に基づくＣＤＫ活性レベルといえ、測定に供する試料の調製方法に依存しない。測定試料調製方法、特に生検材料から調製される細胞可溶化液は、実際に採取された組織中に含まれる非細胞性組織、例えば細胞外基質の多寡による影響を受けやすい。従って、ＣＤＫ活性値と発現量との比を用いることにより、測定試料調製時に不可避の影響を控除することができ、タンパク質に着目した判定方法であっても、高精度に有効性を判定することができる。
【００６１】
ＣＤＫインヒビター発現量とは、細胞可溶化液から測定される目的のＣＤＫインヒビター量（分子個数に対応する単位）であって、タンパク質混合物から目的の蛋白質量を測定する従来公知の方法で測定できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法などを使用してもよい。目的の蛋白質（ＣＤＫインヒビター）は、特異的抗体を用いて捕捉すればよい。目的のタンパク質と特異的に結合できるものであれば、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。例えば、ｐ２１を捕捉する場合、抗ｐ２１モノクローナル抗体、抗ｐ２１ポリクローナル抗体のいずれも用いることができる。
【００６２】
つぎに、前述した［１］哺乳動物組織の性質の判定方法、及び［２］抗癌剤治療の有効性予測方法を好適に実施することができる、本発明の一実施の形態に係る判定装置について説明をする。
図１は本発明の一実施の形態に係る判定装置Ａの斜視説明図である。この判定装置Ａは、組織に含まれるサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の活性値及び発現量を測定し、得られた測定値に基づいて、ヒトの癌細胞の悪性度（再発リスクの高さ）の判定や、抗癌剤の有効性（感受性）の判定を行うものであり、装置本体部２０の前方部分に配設された検出部４、チップセット部１、第１試薬セット部５及び第２試薬セット部６、装置本体部２０の後方部分に配設された活性測定ユニット２、廃液を収容するための廃液槽７及びピペットを洗浄するためのピペット洗浄槽８、装置本体部２０の上方に配設されており、ピペットを３方向（Ｘ方向、Ｙ方向及びＺ方向）に移動させることができる分注機構部３、装置本体部２０の背部に配設された流体部９及び電子基板部１０、並びに前記検出部４及び電子基板部１０と通信可能に接続された制御手段であるパーソナルコンピュータ１２とで主に構成されている。また、本実施の形態の判定装置Ａには、純水タンク１３、洗浄液タンク１４、廃液タンク１５及び空圧源１１が設けられている。純水タンク１３には、測定終了時の流路洗浄用純水が貯留されており、配管２１により流体部９に接続されており、洗浄液タンク１４にはピペットを洗浄する洗浄液が貯留されており、配管２２によりピペット洗浄槽８に接続されており、さらに廃液を収容するための廃液タンク１５は配管２３により廃液槽７に接続されている。さらに、判定装置Ａには、生体試料から前記判定装置Ａで処理可能な検体を得るための可溶化装置Ｂが並設されている。
【００６３】
以下、前述した判定方法又は有効性予測方法の手順に概略従って、前記可溶化装置Ｂ及び判定装置Ａについて説明をする。
【００６４】
［可溶化装置］
可溶化装置Ｂは、判定装置Ａによる処理に先立って、患者から摘出した組織等の生体試料から、当該判定装置Ａで処理可能な液状の検体を調製するものであり、筐体部３０、この筐体部３０の前面上方に配置された操作部３１、前記生体試料を押し付けたり、すりつぶしたりするための一対のペッスル３４を備えた駆動部３２、及び前記生体試料が収容されるエッペンチューブ３５がセットされる検体セット部３３とで主に構成されている。
【００６５】
前記駆動部３２は、ペッスル３４を上下動させるとともに及び回転運動を与えることができ、これによりエッペンチューブ３５内に注入された生体試料が押し付けられたり、すりつぶされたりする。そして、前記筐体部３０内には、かかる駆動部３２の動作を制御する制御部（図示せず）が内蔵されている。
【００６６】
前記操作部３１には、操作ボタン３１ａ、運転ランプ３１ｂ、装置の状態やエラーメッセージ等を表示するための表示部３１ｃが配設されている。また、検体セット部３３内には、図示しない冷却手段が配設されており、当該検体セット部３３上面の凹所にセットされたエッペンチューブ内の生体試料を一定の温度に保っている。
可溶化装置Ｂにより可溶化され、さらに図示しない遠心分離機により遠心分離処理された生体試料の上澄み液は、所定の検体容器に採取されて判定装置Ａの第１試薬セット部５にセットされる。
【００６７】
［第１試薬セット部］
第１試薬セット部５内には、前記検体セット部３３と同様に図示しない冷却手段が配設されており、当該第１試薬セット部５上面の凹所にセットされるスクリューキャップ等の容器内の検体や、ＣＤＫ１抗原（キャリブレーション１）、ＣＤＫ２抗原（キャリブレーション２）等の各種抗原や、蛍光標識されたＣＤＫ１抗体、蛍光標識されたＣＤＫ２抗体等の各種蛍光標識化抗体等を一定の温度に保っている。本実施の形態では、縦５列、横４列、合計２０箇所の凹所が設けられており、最大２０個のスクリューキャップ等の容器をセットすることができるようになっている。
【００６８】
［第２試薬セット部］
前記第１試薬セット部５の隣りには、第２試薬セット部６が配設されている。この第２試薬セット部６には、前記第１試薬セット部５と同様に複数の凹所が形成されており、これら凹所内にバッファー、基質溶液、蛍光増強試薬等が入れられた、エッペンチューブやスクリューキャップ等の容器がセットされる。
また、判定装置Ａによる処理に先立って、チップセット部１にタンパク固相用チップがセットされるとともに、活性測定ユニット２にカラムがセットされる。
【００６９】
［チップセット部］
チップセット部１は、アルミニウム製のブロックからなっており、図２〜３に示されるように、上面にタンパク固相用チップ１２１を載置するための凹部１３２を有するとともに、底部に吸引口１３５を有している。より詳細には、チップセット部１は、上面に長方形の第１凹部１３２と、この第１凹部１３２の底部に同じく長方形の第２凹部１３３とを備えている。第１凹部１３２の底面には前記第２凹部１３３の周縁に長方形の枠状のゴム製弾性ガスケット１３７が配設されている。
【００７０】
前記第２凹部１３３は、その底部に、十字形の溝１３４と、底部中心に吸引口１３５とを備え、前記溝１３４の溝底は第２凹部１３３の周縁から中心に向かって深くなるように傾斜している。吸引口１３５は、外部の吸引ポンプ（図示せず）へ接続するために設けられたニップル１３６と連通している。そして、後に詳述するタンパク固相用チップ１２１は、第１凹部１３２の底面ガスケット１３７を介して水平に装填される。タンパク固相用チップ１２１の各ウェルにタンパク含有試料液が注入又は滴下された後、ニップル１３６に接続された図示しない吸引ポンプが作動する。
【００７１】
これにより、タンパク固相用チップ１２１が第１凹部１３２の底面へガスケット１３７を介して気密的に吸着されるとともに、各ウェル内の試料液が後述する多孔質膜を介して吸引され、測定目的のタンパクが当該多孔質膜に固相形成される。この場合、タンパク固相用チップ１２１を第１凹部１３２の底面に押し付けて固定する固定部材をチップセット部１に設けてもよい。
【００７２】
前記タンパク固相用チップ１２１は、図４〜８に示すように、多孔質膜１２２と、この多孔質膜１２２を挟持するための上テンプレート１０１及び下テンプレート１１１とで構成されている。このタンパク固相用チップ１２１が、サイクリン依存性キナーゼの抗体含む抗体溶液と、生体試料（検体）とを接触させる第２接触手段として機能する。
図４〜５に示されるように、長方形の板状の上テンプレート１０１には、マトリックス状に４行１０列に配列された４０個の長円形の貫通孔１０２が穿設されている。上テンプレート１０１の下面には、前記４０個の貫通孔１０２の周囲を一周する溝（凹部）１０４が形成されている。そして、この溝１０４により、その内側に長方形の多孔質膜設置領域１０３が区画される。また、溝１０４の底には８つの治具貫通孔１０５が穿設されている。
【００７３】
一方、長方形の板状の下テンプレート１１１には、前記上テンプレート１０１の貫通孔１０２に対応する位置にそれぞれマトリックス状に４行１０列に配列された４０個の長円形の貫通孔１１２が形成されている。貫通孔１１２は、貫通孔１０２と同じ形状及び断面積を有している。
【００７４】
下テンプレート１１１の上面には、４０個の貫通孔１１２の周囲を１周する畝状の凸部１１４が前記溝１０４に対応する位置に形成されている。そして、この凸部１１４によりその内側に長方形の多孔質膜設置領域１１３が区画される。また、下テンプレート１１１の周縁には６つの切り欠き部１１５が形成されている。なお、前記上テンプレート１０１及び下テンプレート１１１は、例えば塩化ビニル樹脂で作製することができる。
【００７５】
図８は前記タンパク固相用チップ１２１の断面を示しており、上テンプレート１０１と下テンプレート１１１とは、図に示されるように重ねられ、前記溝１０４に凸部１１４が離脱可能に圧入される。これにより、各貫通孔１０２と各貫通孔１１２とが互いに同軸となる。
そして、多孔性膜設置領域１０３と１１３との間に長方形状の疎水性多孔性膜１２２が装填され、前記凸部１１４の溝１０４への圧入により均一に圧縮される。これにより、多孔性膜１２２が各貫通孔１０２により水密的に区画され、貫通孔１０２の数だけのウェル（液溜め）が形成される。
【００７６】
［活性測定ユニット］
活性測定ユニット２は、図９〜１２に示すように、それぞれがカラム２０１及び流体マニホールド２１３を備えた複数の試料調製部２１１からなっており、ＣＤＫの活性値を測定するのに用いられる。
図９に示されるように、カラム２０１は、塩化ビニル樹脂で作製された円筒体からなっており、内部には、液体試料中の目的物質を単離するために用いる担体２０６を保持する担体保持器２０２と、この担体保持器２０２に液体試料を導入するための液体導入部２０３と、前記担体保持器２０２から液体試料を受け入れて貯留するための液体貯留部２０４とを有している。前記カラム２０１が、所定の基質を含む基質溶液と、生体試料（検体）とを接触させる第１接触手段を構成している。
【００７７】
カラム２０１の液体貯留部２０４は、外部から液体試料を注入又は採取可能な開口２０５を上部に備えている。担体２０６は、円柱形のモノリスシリカゲルからなっており、このモノリスシリカゲルは、粒子担体とは異なり、３次元ネットワーク状の骨格とその空隙が一体となった構造を有している。また、モノリスシリカゲルには、所定のＣＤＫ抗体が固定されている。担体２０６はカラム２０１の下部開口から担体保持部２０２に挿入され、Ｏリング２０７を介して固定用パイプ２０８によって弾性的に押圧されて支持される。なお、前記固定用パイプ２０８は、カラム２０１の下部開口から圧入され、固定用パイプ２０８とＯリング２０７の孔が液体導入部２０３を形成する。
【００７８】
また、カラム２０１の下端には当該カラム２０１を前記試料調製部２１１に装填して固定するための装填用フランジ２０９が形成されている。このフランジ２０９は、直径Ｄの円盤状のフランジの両側を幅Ｗ（Ｗ＜Ｄ）になるように平行に切り欠いて形成された長円形のフランジである。
図１０は試料調製部２１１の斜視図であり、同図に示されるように、試料調製部２１１は、Ｌ字形の支持プレート２１２を備え、この支持プレート２１２には流体マニホールド２１３と、シリンジポンプ２１４と、減速機付きステッピングモータ２１５とが固定されている。
【００７９】
ステッピングモータ２１５の出力軸にはスクリューシャフト２１６が接続されている。そして、このスクリューシャフト２１６に螺合する駆動アーム２１７がシリンジポンプ２１４のピストン２１８の先端に接続されている。ステッピングモータ２１５によりスクリューシャフト２１６が回転すると、ピストン２１８が上下運動するようになっている。シリンジポンプ２１４と流体マニホールド２１３とは、コネクタ２１９、２２０を介して送液チューブ２５０により接続されている。また、シリンジポンプ２１４は、コネクタ２２０ａを介して送液チューブ２２０ｂにより、流路を満たすための液体（洗浄液）が収容されているチャンバ２３４（図１３参照）と接続されている。
【００８０】
図１１〜１２に示されるように、流体マニホールド２１３は、前記カラム２０１の液体導入部２０３が接続されるカラム接続部２２１と、液体試料を受け入れる液体試料受入部２２２とを備えている。
流体マニホールド２１３は、内部に流路２２３を備え、下面に、液体試料受入部２２２と流路２２３との間を開閉する電磁バルブ２２４と、流路２２３とカラム接続部２２１との間を開閉する電磁バルブ２２５とを備えている。また、流体マニホールド２１３は、側面にコネクタ２２０を接続するためのコネクタ接続用ねじ穴２２６を有しており、このねじ穴２２６は流路２２３に接続されている。
【００８１】
図１３は試料調製部２１１の流体回路図であり、流体マニホールド２１３にシリンジポンプ２１４がコネクタ２２０を介して接続された状態を示している。そして、シリンジポンプ２１４には、電磁バルブ２３３を介してチャンバ２３４が接続され、当該チャンバ２３４には陽圧源２３５から陽圧が印加されている。
【００８２】
ここで、カラム２０１を流体マニホールド２１３に装填する方法を説明する。
図１１〜１２に示されるように、流体マニホールド２１３の上面には、カラム２０１の下端を受け入れるカラム受入用凹部２２７が形成され、この凹部２２７の底部の中心がカラム接続部に貫通するとともに底部の円周にＯリング２２８が装着されている。また、流体マニホールド２１３の上面には２枚の断面Ｌ字形押さえ板２２９、２３０がカラム装填用凹部２２７を中心として前記幅Ｗより広くＤより狭い間隔で平行に固定されている。
【００８３】
そこで、カラム２０１をカラム装填用凹部２２７に、フランジ２０９が押さえ板２２９、２３０の間を通るように装填し、時計方向又は反時計方向に９０度だけ回転させる。これによって、フランジ２０９の直径Ｄの部分が押さえ板２２９、２３０に係合するとともに、Ｏリング２２８の弾性によりフランジ２０９が押さえ板２２９、２３０により固定される。なお、カラム２０１を除去する場合には、カラム２０１を押さえながら、左右いずれかの方向に９０度だけ回転させればよい。
【００８４】
カラム２０１が試料調製部２１１の流体マニホールド２１３に装填されるとき、気泡混入を防止するため当該流体マニホールド２１３の凹部２２７は流体で満たされているが、カラム２０１の先端を凹部２２７に挿入するとその体積によって流体が溢れ出す。この液体が周辺へ流出することを防止するために、カラム装着用凹部２２７の周囲に溢れ液貯留凹部２３１が設けられており、溢れ液貯留凹部２３１の一部にピペットにより溢れ液を吸引排出するための溢れ液排出凹部２３２が設けられている。
各種の検体及び試薬は、ピペットを備えた分注機構部３によって、所定の箇所に、又は所定の箇所から注入又は吸引される。
ここで、液体試料受入部２２２に検体または試薬が注入された場合の動作について説明する。液体試料受入部２２２に検体または試薬が注入されると、まず電磁バルブ２２４が開き（電磁バルブ２２５と２３３は閉）、シリンジポンプ２１４が吸引動作をする。これによって、検体または試薬は、電磁バルブ２２４を通過し、シリンジポンプ２１４側に吸引される。次に、電磁バルブ２２４を閉じ、電磁バルブ２２５を開き、シリンジポンプ２１４が吐出動作をする。これによって、検体または試薬は、電磁バルブ２２５を通過し、カラム２０１中に送液される。
【００８５】
［分注機構部］
分注機構部３は、図１に示すように、ピペットＸ方向移動用のフレーム３５２と、ピペットＹ方向移動用のフレーム３５３と、ピペットＺ方向移動用のプレート３５４とを備えている。
フレーム３５２は、プレート３５４を矢印Ｘ方向に移動させるためのスクリューシャフト３５５と、プレート３５４を支持して摺動させるためのガイドバー３５６と、スクリューシャフト３５５を回転させるステッピングモータ３５７を備えている。
フレーム３５３は、フレーム３５２を矢印Ｙ方向に移動させるためのスクリューシャフト３５８と、フレーム３５２を支持して摺動させるためのガイドバー３５９と、スクリューシャフト３５８を回転させるステッピングモータ３６１とを備えている。
また、プレート３５４は、ピペット３６２を支持するアーム３６８を矢印Ｚ方向に移動させるためのスクリューシャフト３６７と、アーム３６８を支持して摺動させるためのガイドバー、スクリューシャフト３６７を回転させるステッピングモータ３７０とを備えている。
【００８６】
なお、本実施の形態では、分注機構部３が一対のピペット３６２を備えているので、同時に２つの検体容器に試薬等を注入したり、同時に２つの検体容器から内容物を吸引したりすることができ、測定処理を効率よく行うことができる。
【００８７】
［流体部］
装置本体部２０の背部には、図１に示すように、前記ピペット３６２、ピペット洗浄槽８及び各試料調製部２１１等に接続されて流体を操作する流体部９が配設されている。この流体部９は、図１３に示されるように、各試料調製部２１１の電磁バルブ２２４、２２５、保冷液チャンバからシリンジ２１４に液体を充填する際に流体を制御する電磁バルブ２３３、ピペット３６２による液体の吸引、吐出の際に流体を制御する電磁バルブ、廃液槽７におけるピペット３６２から廃棄される液体を吸引する際に流体を制御する電磁バルブ、及びピペット洗浄槽８においてピペット３６２を洗浄する際に流体を制御する電磁バルブを備えている。
【００８８】
［電子基板部］
また、装置本体部２０の背部には、各試料調製部２１１、ステッピングモータ３５７、３６１、３７０、流体部９等に駆動信号を供給するための電子基板部１０が配設されている。
【００８９】
［検出部］
検出部４は、タンパク固相用チップ１２１の多孔質膜１２２に捕捉されたタンパク量を反映する蛍光物質量および、リン酸基の量を反映する蛍光物質量を測定するものであり、前記タンパク固相用チップ１２１に励起光を照射し、発生する蛍光を検出し、検出した蛍光の強度に対応する大きさの電気信号を電子基板部１０に出力する。検出部４としては、一般に用いられている、光源部、照明系及び受光系からなるものを適宜採用することができる。
【００９０】
［制御手段］
制御手段であるパーソナルコンピュータ１２は、図１４に示すように、前記電子基板部１０に接続される制御部７７、この制御部７７にデータ等を入力するための入力部７８、及び分析結果等を表示する表示部７９を備えている。前記制御部７７が、本発明における解析手段、検量線を使用して蛍光強度から活性値を取得する第１（第２）活性値取得手段、及び検量線を使用して蛍光強度から発現量を取得する第１（第２）発現量取得手段を構成している。
【００９１】
前記制御部７７は、図１４に示されるように、ＣＰＵ９１ａと、ＲＯＭ９１ｂと、ＲＡＭ９１ｃと、入出力インターフェース９１ｄと、画像出力インターフェース９１ｅとを備えている。ＲＯＭ９１ｂには、オペレーティングシステム、装置の動作を制御するための制御プログラム、及び制御プログラムの実行に必要なデータが格納されている。ＣＰＵ９１ａは、制御プログラムをＲＡＭ９１ｃにロードし、又はＲＯＭ９１ｂから直接実行することが可能である。このようにしてＣＰＵ９１ａが処理した結果のデータは、入出力インターフェース９１ｄを通じて前記電子基板部１０に送信され、ＣＰＵ９１ａの処理に必要なデータは、前記電子基板部１０から入出力インターフェース９１ｄを通じて受信される。ＣＰＵ９１ａは制御プログラムを実行することにより、前記電子基板部１０の制御を行うことが可能となる。また、ＣＰＵ９１ａは、検出部４で得られた蛍光強度に基づいてサイクリン依存性キナーゼの発現量や活性値を取得し、取得した値に基づいて細胞に関する性質の情報を取得する役割を果たしている。そして、前記発現量や活性値を取得するために、前記ＲＡＭ９１ｃには、蛍光強度を発現量又は活性値に変換するための変換データである検量線が記憶されている。
【００９２】
図１５は、本実施の形態の判定装置Ａを制御する制御系のブロック図である。この制御系は、同図に示されるように、分注機構部３の各部を駆動するためのドライバー回路を有する電子基板部１０と、この電子基板部１０を制御するとともに検出部４からの検出結果を分析するための制御部７７、この制御部７７へデータ等を入力する入力部７８、及び制御部７７で分析された分析結果等を表示するための表示部７９から構成されるパーソナルコンピュータ１２とからなっている。
【００９３】
制御部７７は、電子基板部１０を制御することにより、当該電子基板部１０から各試料調製部２１１のステッピングモータ２１５を駆動するための駆動信号、第１試薬セット部５の温度調節をするための駆動信号、ステッピングモータ３５７、３６１、３７０を駆動するための駆動信号、及び流体部９にある電磁バルブを駆動するための駆動信号を出力する。また、制御部７７は、検出信号を検出部４から電子基板部１０を介して取り込む。
つぎに、本実施の形態に係る判定装置Ａを用いて細胞の性質を判定する方法について、ヒトの癌細胞の悪性度（再発リスクの高さ）及び抗癌剤の有効性（感受性）を判定する場合を例にとって説明をする。
【００９４】
（１）可溶化装置による前処理
判定装置Ａによる処理に先立って、可溶化装置Ｂを用いて癌患者から摘出した組織から液状の検体を採取する。その手順としては、まず、前記組織をピンセットを用いてエッペンチューブに投入する。ついで、このエッペンチューブを図１に示される可溶化装置Ｂの検体セット部３３にセットし、操作部３１のスタートボタンを押すと、ペッスル３４が所定位置まで下降し、エッペンチューブ内の組織を当該エッペンチューブの底部に押し付ける。
【００９５】
この状態で、界面活性剤およびタンパク質分解酵素阻害剤等を含有する緩衝液等の可溶化液を自動又はマニュアルでエッペンチューブ内に注入する。その後、ペッスル３４を回転させて前記組織をすりつぶす。所定時間経過後にペッスル３４の駆動を停止させ、さらに当該ペッスル３４を上方に移動させた後にエッペンチューブを検体セット部３３から取り出す。ついで、可溶化されたエッペンチューブ内の内容物を遠心分離機にかけ、得られる上澄み液を検体としてマニュアルで採取する。
【００９６】
（２）判定装置への検体等のセッティング
前記上澄み液を２つの検体容器に入れ、互いに異なる希釈倍率で希釈した後に、当該検体容器を第１試薬セット部５の所定位置にセットする。２つの検体のうち、一方は発現量測定用の検体であり、他方は活性値測定用の検体である。
また、前記タンパク固相用チップ１２１をチップセット部１にセットするとともに、８つのカラム２０１を活性測定ユニット２の試料調製部２１１にそれぞれにセットする。
【００９７】
（３）判定装置による処理の全体フロー
判定装置による処理の全体のフローを図１７に示す。なお、以下のフローチャート中の判断において、「Ｙｅｓ」および「Ｎｏ」を図示しない場合は、下がＹｅｓ、右（左）がＮｏである。また、以下に説明する処理は、全て制御部７７によって制御される処理である。
【００９８】
まず、電源が投入されると、測定登録を受け付ける処理が実行される（ステップＳ１）。この処理では、検体番号などの測定に関する情報の入力を受け付ける。
次に、予後予測モード（ヒトの癌細胞の悪性度（再発リスクの高さ）を判定するモード）及び抗癌剤感受性モード（抗癌剤の有効性（感受性）を判定するモード）のいずれかの測定モードの選択を受け付ける処理が実行される（ステップＳ２）。具体的には、パーソナルコンピュータ１２の表示部７９に、２つのモードの入力ボタンが表示される。オペレータは、希望するモードの入力ボタンをクリックする。なお、本例では、抗癌剤感受性モードにおいて、タキサン系抗癌剤の感受性を判定している。また、上記２つのモードに加えて、予後予測・抗癌剤感受性モードを選択できるようにしてもよい。
【００９９】
ついで、測定開始の指示を受け付けているか否かの判断をする（ステップＳ３）。ＹｅｓならステップＳ４へ、ＮｏならステップＳ８に進む。
つぎに第１試薬セット部５にセットした検体容器から検体を吸引し、吸引した検体に所定の処理を施すことによって、蛍光検出用の試料を調製する（ステップＳ４）。このステップの処理には、後に詳述する発現量測定用試料の調製処理と活性値測定用試料の調製処理とが含まれ、これら２つの処理は並行して実行される。
【０１００】
蛍光検出用の試料を含むタンパク固相用チップ１２１がセットされたチップセット部１を図１に示される位置から検出部４の中に移動させる（ステップＳ５）。
ついで、タンパク固相用チップ１２１の各ウェルに励起光を照射し、前記蛍光検出用の試料から放射される蛍光を検出する（ステップＳ６）。
【０１０１】
つぎに、パーソナルコンピュータ１２の制御部７７にて、蛍光強度を取得し、取得した蛍光強度から解析結果を出力する（ステップＳ７）。
判定装置をシャットダウンする指示を受け付けているか否かを判断する（ステップＳ８）。ＹｅｓならステップＳ９に進み、ＮｏならステップＳ１に戻る。
最後にシャットダウン処理をし、電源をオフにする（ステップＳ９）。
【０１０２】
（４）発現量測定用試料の調製処理
前記ステップＳ４における発現量測定用試料の調製処理のフローを図１８に示す。
まず、タンパク固相用チップの各ウェルに予め貯留している保存液を排出し、各ウェル内を洗浄する（ステップＳ１１）。洗浄は、分注機構部３のピペットを介して洗浄液を上方から各ウェルに注入し、ついでタンパク固相用チップの下方から陰圧により注入された洗浄液を多孔質膜を通して吸引することによって行う。以下の洗浄工程も同様である。
【０１０３】
つぎに、第１試薬セット部５にセットされた検体容器から発現量測定用の検体をピペットで吸引し、この検体を所定の複数のウェルに注入し、ついでこの検体をタンパク固相用チップの下方から陰圧により吸引する。これにより、タンパク固相用チップの多孔質膜にタンパク質が固相化される（ステップＳ１２）。
ついで、ステップＳ１１と同様にして前記所定のウェル内を洗浄液で洗浄する。これによって、タンパク質以外の成分をタンパク固相用チップの多孔質膜から取り除く（ステップＳ１３）。
【０１０４】
その後、ブロッキング液を前記所定のウェル内に注入し、１５分以上（例えば、３０分間）放置した後にウェル内に残っているブロッキング液を排出する（ステップＳ１４）。これにより、タンパク質が固相化されていない多孔質膜の部位に蛍光標識されたＣＤＫ１抗体（蛍光標識ＣＤＫ１抗体）、蛍光標識されたＣＤＫ２抗体（蛍光標識ＣＤＫ２抗体）、および蛍光標識されたＰ２１抗体（蛍光標識Ｐ２１抗体）が固相化するのを防止することができる。なお、蛍光標識ＣＤＫ１抗体、蛍光標識ＣＤＫ２抗体、および、蛍光標識Ｐ２１抗体としては、市販品を使用することができる。
つぎに、蛍光標識ＣＤＫ１抗体、蛍光標識ＣＤＫ２抗体及び蛍光標識Ｐ２１抗体をそれぞれ所定のウェルに注入する。その際、それぞれの蛍光標識抗体について、２つのウェルに注入する。２０〜３０分経過して、蛍光標識抗体と多孔質膜に固相化されたタンパク質（ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、またはＰ２１）との反応が終了した後に注入した蛍光標識を排出する（ステップＳ１５）。
最後に、ステップＳ１３と同様にして、前記所定のウェル内を洗浄液で洗浄する（ステップＳ１６）。
【０１０５】
（５）活性値測定用試料の調製処理
前記ステップＳ４における活性値測定用試料の調製処理のフローを図１９に示す。なお、この活性値測定用試料の調製処理においては、図１に示される活性測定ユニット２として、図中手前側に４つの試料調製部２１１を備え、図中奥側にも４つの試料調製部２１１を備えたものが用いられる。この活性測定ユニット２の各試料調製部２１１を、図中奥側の左から第１試料調製部（Ａｃ１）、第２試料調製部（Ａｃ２）、第３試料調製部（Ａｃ３）、第４試料調製部（Ａｃ４）とし、また、図中手前の左から第５試料調製部（Ａｃ５）、第６試料調製部（Ａｃ６）、第７試料調製部（Ａｃ７）、第８試料調製部（Ａｃ８）とする。
まず、第１〜第８試料調製部（Ａｃ１〜Ａｃ８）のそれぞれについて、液体試料受入部２２２に、分注機構部３のピペットで洗浄用の試薬であるバッファーを注入する。そして、第１〜第８試料調製部（Ａｃ１〜Ａｃ８）のそれぞれについて、シリンジポンプ２１４および電磁バルブ２２４，２２５が前述したように動作することにより、バッファーは、カラム２０１に送液される。全てのカラム２０１中の余剰バッファーは、分注機構部３のピペットで吸引して廃棄する（ステップＳ２１）。
【０１０６】
つぎに、免疫沈降（抗体とＣＤＫの反応）をさせる（ステップＳ２２）。まず、第１試薬セット部５にセットされた１つの検体容器から活性値測定用の検体１を一方のピペットで、活性値測定用の検体２を他方のピペットで吸引する。
そして、検体容器から吸引された活性値測定用の検体１は、図２０に示されるように、まず、第１試料調製部（Ａｃ１）の液体試料受入部２２２に注入される。そして、検体１は、シリンジポンプ２１４および電磁バルブ２２４，２２５が前述したように動作することにより、第１試料調製部（Ａｃ１）のカラム２０１に送液される。その際、ピストン２１８を上下に１．５往復（排出→吸引→排出）させることにより、検体１は、カラム２０１の担体２０６を１．５往復する。
一方、検体容器から吸引された活性値測定用の検体２は、まず、第５試料調製部（Ａｃ５）の液体試料受入部２２２に注入される。そして、検体２は、上記と同様に、第５試料調製部（Ａｃ５）のカラム２０１に送液される。
第１試料調製部（Ａｃ１）および第５試料調製部（Ａｃ５）のカラム２０１の担体２０６には、ＣＤＫ１の抗体もＣＤＫ２の抗体も固定されていない。従って、第１試料調製部（Ａｃ１）および第５試料調製部（Ａｃ５）では、ＣＤＫ１およびＣＤＫ２は固相化されず、第１試料調製部（Ａｃ１）のカラム２０１には、ＣＤＫ１およびＣＤＫ２を含む検体１が貯留され、第５試料調製部（Ａｃ５）のカラム２０１には、ＣＤＫ１およびＣＤＫ２を含む検体２が貯留される。
次に、第１試料調製部（Ａｃ１）のカラム２０１に貯留された検体１は、ピペットによって吸引され、第３試料調製部（Ａｃ３）の液体試料受入部２２２に注入される。そして、検体１は、上記と同様に、第３試料調製部（Ａｃ３）のカラム２０１に送液される。
一方、第５試料調製部（Ａｃ５）のカラム２０１に貯留された検体２は、ピペットによって吸引され、第４試料調製部（Ａｃ４）の液体試料受入部２２２に注入される。そして、検体２は、上記と同様に、第４試料調製部（Ａｃ４）のカラム２０１に送液される。
第３試料調製部（Ａｃ３）および第４試料調製部（Ａｃ４）のカラム２０１の担体２０６には、ＣＤＫ１の抗体が固定されている。従って、第３試料調製部（Ａｃ３）および第４試料調製部（Ａｃ４）では、ＣＤＫ１は固相化されるが、ＣＤＫ２は固相化されず、第３試料調製部（Ａｃ３）のカラム２０１には、ＣＤＫ１を含まずＣＤＫ２を含む検体１が貯留され、第４試料調製部（Ａｃ４）のカラム２０１には、ＣＤＫ１を含まずＣＤＫ２を含む検体２が貯留される。
【０１０７】
次に、第３試料調製部（Ａｃ３）のカラム２０１に貯留された検体１は、ピペットによって吸引され、第７試料調製部（Ａｃ７）の液体試料受入部２２２に注入される。そして、検体１は、上記と同様に、第７試料調製部（Ａｃ７）のカラム２０１に送液される。
一方、第４試料調製部（Ａｃ４）のカラム２０１に貯留された検体２は、ピペットによって吸引され、第８試料調製部（Ａｃ８）の液体試料受入部２２２に注入される。そして、検体２は、上記と同様に、第８試料調製部（Ａｃ８）のカラム２０１に送液される。
第７試料調製部（Ａｃ７）および第８試料調製部（Ａｃ８）のカラム２０１の担体２０６には、ＣＤＫ２の抗体が固定されている。従って、第７試料調製部（Ａｃ７）および第８試料調製部（Ａｃ８）では、ＣＤＫ２が固相化されるので、第７試料調製部（Ａｃ７）のカラム２０１には、ＣＤＫ１もＣＤＫ２も含まない検体１が貯留され、第８試料調製部（Ａｃ８）のカラム２０１には、ＣＤＫ１もＣＤＫ２も含まない検体２が貯留される。
第７試料調製部（Ａｃ７）および第８試料調製部（Ａｃ８）のカラム２０１に貯留された検体１および検体２は、それぞれピペットによって吸引され、廃液槽７に廃棄される。
そして、第１試料調製部（Ａｃ１）および第５試料調製部（Ａｃ５）は、バックグラウンドの活性測定用に、第３試料調製部（Ａｃ３）および第４試料調製部（Ａｃ４）は、ＣＤＫ１の活性測定用に、第７試料調製部（Ａｃ７）および第８試料調製部（Ａｃ８）は、ＣＤＫ２の活性測定用に使用される。
このように、カラム内に残った検体を他のカラムに注入することによって、少ない検体量で、バックグラウンド活性測定、ＣＤＫ１活性測定およびＣＤＫ２活性測定が可能となる。
【０１０８】
ついで、検体中の不要成分を洗浄して取り除くために、バッファー１をカラム２０１に送液する（ステップＳ２３）。
その後、前記バッファー１はステップＳ２５で実行される酵素反応に影響を与えることから、かかる酵素反応のためのコンディションを作ることを主目的に、バッファー２をカラム２０１に送液して、前記バッファー１の成分を洗い流す（ステップＳ２４）。
【０１０９】
つぎに、基質ＨｉｓｔｏｎＨ１とＡＴＰγＳを含む基質反応液をカラム２０１に注入し、ピストン２１９を５．５往復させる（ステップＳ２５）。カラム２０１中にカラム２０１の下側から押し出された液は、そのまま貯留される。このステップによって、ＣＤＫ１又はＣＤＫ２を酵素として、ＨｉｓｔｏｎＨ１にリン酸基が導入される。そして、このリン酸基の量は、ＣＤＫ１又はＣＤＫ２の酵素として働きの強さ（すなわち活性値）に左右されることから、前記リン酸基の量を測定することによって、ＣＤＫ１又はＣＤＫ２の活性値を求めることができる。なお、図２０に示される第１試料調製部（Ａｃ１）および第５試料調製部（Ａｃ５）を使用して求められるバックグラウンド活性値は、後述するように、バックグラウンド補正をするために用いられる。
【０１１０】
ついで、蛍光標識化試薬を、ピペットを用いてカラム２０１の上方より直接カラム２０１内に分注し、ＨｉｓｔｏｎＨ１に導入されたリン酸基に蛍光標識を結合させる（ステップＳ２６）。その際、ピペットが、所定の時間、カラム内の液体の吸入及び吐出を繰り返すことによりカラム２０１内の液体を撹拌する。
ステップＳ２６の開始から所定時間（例えば、２０分間）経過後に反応停止液を前記蛍光標識化試薬と同様にカラム２０１に直接分注する。そして、ステップＳ２６と同じく所定の時間、カラム内の液体の吸入及び吐出を繰り返すことによりカラム２０１内の液体を撹拌する（ステップＳ２７）。これにより、蛍光標識の結合が停止する。
【０１１１】
つぎに、第１試料調製部（Ａｃ１），第３試料調製部（Ａｃ３），第４試料調製部（Ａｃ４），第５試料調製部（Ａｃ５），第７試料調製部（Ａｃ７），および第８試料調製部（Ａｃ８）のカラム２０１内の液体を、それぞれ、タンパク固相用チップ１２１の６つのウェルに分注した後に当該タンパク固相用チップ１２１を下方から吸引する（ステップＳ２８）。これによって、蛍光標識が結合したリン酸基を有するＨｉｓｔｏｎＨ１がタンパク固相用チップ１２１の多孔質膜に固相化される。
ついで、前記発現量測定用試料の調製処理におけるステップＳ１１と同様にしてウェルの洗浄を行う（ステップＳ２９）。
最後に、蛍光を活性化させるために、蛍光増強試薬をウェルに分注し、排出する操作を６回繰り返す（ステップＳ３０）。
【０１１２】
（６）解析処理
図２１に示されるように、検出部で得られた蛍光強度から解析がなされ、その解析結果が出力される。
まず、制御部７７は、検出部４の受光系から電子基板部１０を介して、ＣＤＫ１の活性、ＣＤＫ１の発現、ＣＤＫ２の活性、ＣＤＫ２の発現、Ｐ２１の発現、バックグラウンドの活性、及びバックグラウンドの発現のそれぞれについて、２つずつ蛍光強度を取得する（ステップＳ３１）。
【０１１３】
ついで、制御部７７は、各項目について２つずつ得られた蛍光強度の平均値を算出する（ステップＳ３２）。
つぎに、ＣＤＫ１活性の蛍光強度（平均値）からバックグラウンド活性（平均値）を引くとともに、ＣＤＫ２活性の蛍光強度（平均値）からバックグラウンド活性（平均値）を引くことにより、ＣＤＫ１活性及びＣＤＫ２活性についてバックグラウンド補正を行う。ＣＤＫ１発現、ＣＤＫ２発現およびＰ２１発現についても同様にしてバックグラウンド補正を行う（ステップＳ３３）。
【０１１４】
ついで、それぞれの項目について、検量線を用いて発現量および活性値を取得する（ステップＳ３４）。なお、この検量線は、蛍光強度を発現量または活性値に変換するためのデータであり、試薬のロットが変更されたときに、発現量または活性値が既知である２種類以上の検体を用いて予め作成され、制御部７７のＲＡＭ９１ｃに記憶される。
つぎに、以下の式に従い、ＣＤＫ１比活性及びＣＤＫ２比活性を算出する（ステップＳ３５）。
ＣＤＫ１比活性＝ＣＤＫ１活性値／ＣＤＫ１発現量
ＣＤＫ２比活性＝ＣＤＫ２活性値／ＣＤＫ２発現量
また、以下の式に従いＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性との比を算出する（ステップＳ３６）。
ＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性との比＝ＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性
【０１１５】
ついで、前記ＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性との比が第１の閾値以上であるか否かが判断され（ステップＳ３７）、ＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性との比が第１の閾値以上の場合は、癌の再発リスクが高いと判定し、前記比が第１の閾値よりも小さい場合は、癌の再発リスクが低いと判定する。
そして、再発リスクの大きさを判定する根拠となるＣＤＫ１発現量、活性値、比活性、ＣＤＫ２発現量、活性値、比活性、ＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性との比を表示するとともに、再発リスクの判定結果を表示する（ステップＳ３８）。
図２２は図２１に示される解析処理の他の実施例のフローを示す図である。本例においては、ステップＳ４０において、タキサン系抗癌剤の感受性を判定している。
この実施例に示される解析処理において、ステップＳ３１からステップＳ３６は、図２１に示される解析処理と同じである。
ついで、前記ＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性との比が第２の閾値以上であるか否かが判断され（ステップＳ３９）、ＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性との比が第２の閾値以上の場合は、癌の再発リスクが高いと判定し、前記比が第２の閾値よりも小さい場合は、癌の再発リスクが低いと判定する。
ＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性との比が第２の閾値以上の場合は、前記ＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性との比が第３の閾値以上であるか否かが判断され（ステップＳ４０）、ＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性との比が第３の閾値以上の場合は、抗癌剤に対する感受性が高い、即ち抗癌剤が有効であると判定し、一方、ＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性との比が第３の閾値よりも小さい場合は、抗癌剤に対する感受性が中位であると判定する。なお、第３の閾値としては、第２の閾値よりも大きい値が使用される。また、第２の閾値としては、第１の閾値と同じ値を用いることが好ましい。
そして、以上の各判定をする根拠となるＣＤＫ１発現量、活性値、比活性、ＣＤＫ２発現量、活性値、比活性、ＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性との比を表示するとともに、再発リスクの判定結果又は感受性の判定結果を表示する（ステップＳ４１）。この判定結果としては、例えば、「再発リスクが低い」、「再発リスクが高く、抗癌剤感受性が高い」、および、「再発リスクが高く、抗癌剤感受性が中位」の３種類を表示することができる。
【０１１６】
（７）判定結果の利用例
図２２に示すステップＳ４１で表示された判定結果を医師がどのように利用するのかを図２３に示す。
患者に対して画像診断で乳癌の可能性を確認し、バイオプシーによる病理組織診または細胞診で癌を確定する。病理組織診の結果、癌が早期癌であると診断された場合は、癌組織の摘出手術を行い、摘出された組織に対して判定装置Ａによる組織性質の判定を行う。判定装置Ａによる組織性質の判定の結果、癌がローリスク群に属する（判定装置Ａに表示された判定結果が「再発リスクが低い」）と判明した場合は、医者により治療１（ホルモン療法剤の単独使用）が選択され、Ｔａｘａｎｅ（タキサン）系抗癌剤の使用が有効であるＴａｘａｎｅ（タキサン）感受性群（判定装置Ａに表示された判定結果が「再発リスクが高く、抗癌剤感受性が高い」）に属する場合は、治療２（ホルモン療法剤とタキサン系抗癌剤の併用）が選択される。なお、判定装置Ａに表示された判定結果が「再発リスクが高く、抗癌剤感受性が中位」の場合は、Ｔａｘａｎｅ（タキサン）が有効であるとは言い切れないため、医師の判断により、治療２（ホルモン療法剤とタキサン系抗癌剤の併用）または、治療３（ホルモン療法剤とＴａｘａｎｅ（タキサン）以外の化学抗癌剤の併用）が選択される。
【０１１７】
また、病理組織診において、進行癌であると診断された場合は、医者と患者とで術前化学療法（摘出手術前の化学抗癌剤治療）を行うか否かが検討される。術前化学療法を行う場合には、抗癌剤（Ｔａｘａｎｅ）に24時間浸漬したバイオプシーサンプルに対して判定装置Ａによる抗癌剤感受性の判定を行う。判定装置Ａに表示された判定結果が「抗癌剤感受性が高い」の場合は、治療２（ホルモン療法剤とタキサン系抗癌剤の併用）が選択される。なお、判定装置Ａに表示された判定結果が「抗癌剤感受性が中位」の場合は、Ｔａｘａｎｅ（タキサン）が有効であるとは言い切れないため、医師の判断により、治療２（ホルモン療法剤とタキサン系抗癌剤の併用）または、治療３（ホルモン療法剤とＴａｘａｎｅ（タキサン）以外の化学抗癌剤の併用）が選択される。このような術前化学療法を行うことにより、癌組織を抗癌剤で縮小させた後に摘出することができる。
【０１１８】
術前化学療法を行わない場合には、摘出手術が行われ、摘出された癌組織に対して判定装置Ａによる抗癌剤感受性の判定を行う。判定装置Ａに表示された判定結果が「抗癌剤感受性が高い」の場合は、治療２（ホルモン療法剤とタキサン系抗癌剤の併用）が選択される。なお、判定装置Ａに表示された判定結果が「抗癌剤感受性が中位」の場合は、Ｔａｘａｎｅ（タキサン）が有効であるとは言い切れないため、医師の判断により、治療２（ホルモン療法剤とタキサン系抗癌剤の併用）または、治療３（ホルモン療法剤とＴａｘａｎｅ（タキサン）以外の化学抗癌剤の併用）が選択される。
【０１１９】
図２４は、感受性の解析に関する他の実施例を示している。この例もタキサン系抗癌剤の感受性を判定しており、ＣＤＫ２比活性と閾値である「４００」との比較を行い（ステップＳ５０）、ＣＤＫ２比活性が４００以上である場合は、感受性が高いタイプＩと判定し、ＣＤＫ２比活性が４００未満である場合は、ｐ２１の発現量と閾値である「８」との比較を行う（ステップＳ５１）。ｐ２１の発現量が８以上のときは、感受性が低いタイプＩＩＩと判定し、ｐ２１の発現量が８未満のときは、感受性が中位であるタイプＩＩと判定する。なお、この実施例において、前記ＣＤＫ２比活性及びｐ２１の発現量の各閾値は、予め蓄積された患者データ等に基づいて設定することができる。
【０１２０】
図２５は、感受性の解析に関するさらに他の実施例を示している。この実施例では、サイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）Ｅの発現量と、ＣＤＫ２の比活性とに基づいて、ＣＥ（抗癌剤）の感受性を判定している。具体的には、ＣＤＫ２比活性とサイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）Ｅの発現量との比を所定の閾値と比較することによって、ＣＥ（抗癌剤）の感受性を判定している。なお、サイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）Ｅの発現量は、試薬を適宜変更することによって、ＣＤＫ１の発現量と同様にして測定することができる。
【０１２１】
図２６は、感受性の解析に関するさらに他の実施例を示している。この実施例では、ＣＤＫ１比活性を所定の閾値と比較することによって、ＣＭＦ（抗癌剤）の感受性を判定している。この例において、患者Ｎｏ．１〜１６は、摘出手術後ＣＭＦ（抗癌剤）の投与治療を受けた結果癌の再発が認められなかった患者であり、患者Ｎｏ．１７〜２５は、ＣＭＦ（抗癌剤）の投与治療にもかかわらず癌が再発した患者である。この場合、閾値（カットオフ値）として「９０」を設定すると、ＣＤＫ１比活性が９０以上の８例（Ｎｏ．１、６、９、１１〜１５）はいずれも再発しなかった例となるので、９０という閾値が適切であることが分かる。なお判定には、摘出されて冷凍保存されていた組織を用いた。
【０１２２】
図２７は図２１に示される解析処理のさらに他の実施例のフローを示す図である。この実施例に示される解析処理は、ステップＳ３１からステップＳ３６は、図２１に示される解析処理と同じである。この実施例に示される解析処理では、ステップＳ４２で、ステップＳ２で選択されたモードが、予後予測モードであるか、感受性モードであるかの判断をし、予後予測モードの場合は、前記ＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性との比が第４の閾値以上であるか否かが判断され（ステップＳ４３）、感受性モードの場合は、ＣＤＫ２比活性が第５の閾値以上であるか否かが判断される（ステップＳ４５）。
ステップＳ４３において、ＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性との比が第４の閾値以上の場合は、再発リスクが高いと判定し、前記比が第４の閾値よりも小さい場合は、再発リスクが低いと判定する。
そして、再発リスクが高いと判定された場合、感受性モードを実行するか否かを判断する処理が実行される（ステップＳ４４）。具体的には、パーソナルコンピュータ１２の表示部７９上に、感受性モードを実行するか、再発リスクの判定結果のみを表示するかを選択するためのボタンを表示し、オペレータからの入力を受け付ける処理が実行される。
ステップＳ４４において、感受性モードを実行すると判断された場合は、処理はステップＳ４５に進み、感受性モードを実行しない（再発リスクの判定結果のみを表示する）と判断された場合は、処理は、ステップＳ４８に進む。
また、ステップＳ４５において、ＣＤＫ２比活性が第５の閾値以上である場合は、感受性が高い、即ち抗癌剤が有効であると判定し、一方、ＣＤＫ２比活性が第５の閾値よりも小さい場合は、Ｐ２１発現量と第６の閾値との比較を行う（ステップＳ４６）。
そして、Ｐ２１発現量が第６の閾値よりも小さい場合は、感受性が低いと判定し、Ｐ２１発現量が第６の閾値以上である場合は、ＣＤＫ１比活性と第７の閾値との比較を行う（ステップＳ４７）。ＣＤＫ１比活性が第７の閾値よりも小さい場合は、感受性がやや低いと判定し、ＣＤＫ１比活性が第７の閾値以上である場合は、感受性が中位であると判定する。
そして、以上の各判定をする根拠となるＣＤＫ１発現量、活性値、比活性、ＣＤＫ２発現量、活性値、比活性、ＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性との比、及びＰ２１発現量を表示するとともに、選択されている選択モードに応じて、再発リスクの判定結果又は感受性の判定結果を表示する（ステップＳ４８）。
なお、第４から第７の閾値としては、ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００９８４７に記載されている閾値および特願２００５−１５８３７３に記載されている閾値を使用することができる。また、第４の閾値としては、前述した第１の閾値と同じ値を用いることが好ましい。
【０１２３】
図２８は図２７に示される解析処理の他の実施例のフローを示す図である。この実施例では、図１７におけるステップＳ１において、モードの選択を受け付ける処理は含まれず、ステップＳ６１において再発リスクの判定を行って、再発リスクが高いと判定された検体についてのみ、抗癌剤の感受性の判定（ステップＳ６２）が行われる。その他のステップについては、図２７と同様である。
なお、上記の実施形態においては、判定装置Ａは、再発リスクの判定および抗癌剤の感受性の判定が可能であるが、本発明はこれに限らず、いずれか一方のみが可能な判定装置に本発明を適用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】本発明の判定装置の一実施の形態の斜視説明図である。
【図２】図１に示される判定装置におけるチップセット部の上面図である。
【図３】図２のＡ−Ａ矢視断面図である。
【図４】図１に示される判定装置におけるチップセット部にセットされるタンパク固相用チップの上テンプレートの上面図である。
【図５】図４のＢ−Ｂ矢視断面図である。
【図６】図１に示される判定装置におけるチップセット部にセットされるタンパク固相用チップの下テンプレートの上面図である。
【図７】図６のＣ−Ｃ矢視断面図である．
【図８】図４の上テンプレートと図６の下テンプレートの組立断面図である。
【図９】図１に示される判定装置における活性測定ユニットの試料調製部のカラムの断面説明図である。
【図１０】図１に示される判定装置における活性測定ユニットの試料調製部の斜視図である。
【図１１】図１０に示される試料調製部の流体マニホールドの上面図である。
【図１２】図１１のＤ−Ｄ矢視断面図である。
【図１３】図１０に示される試料調製部の流体回路図である。
【図１４】制御手段のハードウェア構成を示すブロック図である。
【図１５】判定装置を制御する制御系を示すブロック図である。
【図１６】細胞周期を説明するための図である。
【図１７】判定装置による処理の全体フローを示す図である。
【図１８】発現量測定用試料の調製処理のフローを示す図である。
【図１９】活性値測定用試料の調製処理のフローを示す図である。
【図２０】本発明に係る測定方法おいて試薬等の利用例を示す説明図である、
【図２１】判定装置による解析処理の一例の全体フローを示す図である。
【図２２】判定装置による解析処理の他の例の全体フローを示す図である。
【図２３】本発明に係る測定方法おいて得られた判定結果の利用例を示す図である。
【図２４】感受性の解析に関する他の実施例を示す図である。
【図２５】感受性の解析に関するさらに他の実施例を示す図である。
【図２６】感受性の解析に関するさらに他の実施例を示す図である。
【図２７】判定装置による解析処理の他の例の全体フローを示す図である。
【図２８】判定装置による解析処理の他の例の全体フローを示す図である。
【符号の説明】
【０１２５】
１チップセット部
２活性測定ユニット
３分注機構部
４検出部
５第１試薬セット部
６第２試薬セット部
７廃液槽
８ピペット洗浄槽
９流体部
１０電子基板部
１１空圧源
１２パーソナルコンピュータ（制御手段）
１３純水タンク
１４洗浄液タンク
１５廃液タンク
２０装置本体部
３０筐体部
３１操作部
３２駆動部
３３検体セット部
３４ペッスル
７７制御部
７８入力部
７９表示部
Ａ判定装置
Ｂ可溶化装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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