(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
FSI-FSI、FSI-FSI-FSIII、FSN-FSI-FSI、又はFSN-FSI-FSI-FSIII（ここでFSIはフォリスタチン蛋白質由来のフォリスタチンドメインIを示し、FSIIIはフォリスタチン蛋白質由来のフォリスタチンドメインIIIを示し、FSNはフォリスタチン蛋白質由来のN末端ドメインを示し、各ドメイン間は直接またはリンカーポリペプチドで連結している）から選択されるいずれかのドメイン構造を含み、かつアクチビンの活性阻害と比較して、GDF-8の活性を選択的に阻害することを特徴とするフォリスタチン変異体ポリペプチド。
【請求項２】
さらにフォリスタチン蛋白質由来のフォリスタチンドメインIIIを含まない、請求項１に記載のフォリスタチン変異体ポリペプチド。
【請求項３】
さらにフォリスタチン蛋白質由来のＮ末端ドメインを含む、請求項１又は２に記載のフォリスタチン変異体ポリペプチド。
【請求項４】
フォリスタチン蛋白質由来のフォリスタチンドメインIが配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項１から３のいずれか１項に記載のフォリスタチン変異体ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号４の30〜166番目のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のフォリスタチン変異体ポリペプチド。
【請求項６】
フォリスタチン蛋白質由来のフォリスタチンのドメインのアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に他のポリペプチドが融合している、請求項１から５の何れか１項に記載のフォリスタチン変異体ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号６、８または１０のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号５、７または９の塩基配列を含む請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の形質転換細胞を培地中で培養し、該細胞で発現した請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチドを培地または該細胞中に蓄積させ、培地または該細胞から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造方法。
【請求項１３】
請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８または９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載のベクターを含有するアクチビンは阻害しないGDF-8選択的な阻害剤。
【請求項１４】
請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８または９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載のベクターを含有する医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８または９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載のベクターを有効成分として含有する、骨格筋増加剤。
【請求項１６】
請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８または９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載のベクターを有効成分として含有する、脂肪減少剤。
【請求項１７】
請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８または９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載のベクターを有効成分として含有する、悪液質またはII型糖尿病の治療剤または予防剤。
【請求項１８】
請求項８または９に記載のポリヌクレオチドを含む外来遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１９】
非ヒト動物に請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８または９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載のベクターを投与して、該非ヒト動物の筋肉を増加させる方法。
【請求項２０】
非ヒト動物に請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８または９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載のベクターを投与して、該非ヒト動物の脂肪を減少させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクチビンの活性の阻害と比較して、増殖／分化因子−８（growth/differentiation factor-8、GDF-8）の活性を選択的に阻害するフォリスタチン変異体ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
アクチビンは、トランスフォーミング増殖因子β（transforming growth factor-β、TGF-β）スーパーファミリーに属し、赤芽球系細胞分化誘導、下垂体からの卵胞刺激ホルモン（FSH）分泌およびFSHによる黄体形成の促進、神経細胞生存維持作用、インスリン産生促進作用など多機能性の成長・分化因子である。
【０００３】
増殖／分化因子−８（growth/differentiation factor-8、GDF-8）は、発生中および成体の骨格筋に特異的に発現している、アクチビンサブファミリーに属するTGF-βスーパーファミリーの一員として発見され（非特許文献１参照）、ミオスタチン（myostatin）とも呼ばれる。GDF-8は筋体積を負に制御する機能を持ち、GDF-8欠損マウスでは筋体積が野生型マウスの２〜３倍に増加する（非特許文献１参照）。
【０００４】
フォリスタチンはアクチビン（非特許文献２参照）およびGDF-8（非特許文献３参照）と強く結合（アクチビンに対する解離定数Kd = 540-680 pmol/L）し、それらの活性を中和する。また、フォリスタチンがインビボにおいてアクチビンおよびGDF-8の様々な生理活性の制御に直接的および間接的に関わっていることを示唆するデータが蓄積されている。フォリスタチンをオスモティックミニポンプによりマウスに連続投与すると、骨髄や脾臓の赤芽球前駆細胞の数が有意に減少し(非特許文献４参照)、骨格筋特異的なプロモーター支配下でフォリスタチンを発現するトランスジェニックマウスでは骨格筋量が顕著に増加する（非特許文献３参照）。
【０００５】
フォリスタチンのアミノ酸配列解析から、Ｎ末端側よりＮ末端ドメイン、フォリスタチンドメインI、フォリスタチンドメインII、フォリスタチンドメインIIIという４つのドメインからなることが明らかとされている（非特許文献５参照）。フォリスタチンドメインは、アクチビンやその他の増殖因子との結合に関与すると考えられている。
【０００６】
近年、GDF-8が様々な疾患に関与することを示唆する報告がなされている。Zimmersらはヌードマウス大腿部にGDF-8安定発現細胞を移植すると、骨格筋および脂肪の減少という悪液質の症状が誘導されることを示した（非特許文献６参照）。体重減少を伴うHIV感染者の筋肉中には、抗GDF-8抗体陽性のタンパク質が増加していることも報告されている（非特許文献７参照）。デュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデルマウスであるmdxマウスとGDF-8欠損マウスを交配して得られるマウスは、mdxマウスと比較して筋量・筋機能ともに改善していることなども報告されている（非特許文献８参照）。また、GDF-8欠損マウスでは、骨格筋の増加と共に脂肪量の減少が見られることや、糖尿病モデルマウスにおいてGDF-8遺伝子を欠損させることにより、脂肪蓄積およびグルコース代謝異常が抑制されることから、肥満やII型糖尿病の発症や病態悪化への関与も示唆されている（非特許文献９参照）。
【０００７】
以上から、GDF-8の活性を阻害することにより、これらのGDF-8が発症または病態の進行に寄与する疾患の治療を行うことができると考えられ、しかも、副作用軽減のためには、アクチビンの活性を阻害せず、GDF-8の活性を選択的に阻害することが好ましい。GDF-8の活性を阻害する物質としては、フォリスタチン（特許文献１および２参照）、抗GDF-8抗体（特許文献３参照）、GDF-8プロペプチド（特許文献４参照）、ドミナントネガティブGDF-8変異体（特許文献５および６参照）、GDF-8抗原（特許文献７、８および９参照）、GDF-8レセプターおよび抗GDF-8レセプター抗体（特許文献１０参照）、およびSmad2およびSmad3リン酸化阻害剤（特許文献１１参照）などが知られている。
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／０１５７１２６号明細書
【特許文献２】特表２００２−５０６０４４号公報
【特許文献３】米国特許第６０９６５０６号明細書
【特許文献４】国際公開第０２／０９６４１号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０１／５３３５０号パンフレット
【特許文献６】国際公開第００／４３７８１号パンフレット
【特許文献７】米国特許第６３６９２０１号明細書
【特許文献８】国際公開第０１／０５８２０号パンフレット
【特許文献９】国際公開第９９／４２５７３号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第０２／１０２１４号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第０２／０５５０７７号パンフレット
【非特許文献１】ネイチャー（Nature），（イギリス），１９９７年，第３８７巻，第６６２８号，ｐ．８３−９０
【非特許文献２】サイエンス（Science），（米国），１９９０年，第２４７巻，第４９４４号，ｐ．８３６−８３８
【非特許文献３】プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），（米国），２００１年，第９８巻，第１６号，ｐ．９３０６−９３１１
【非特許文献４】プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），（米国），１９９２年，第８９巻，第５号，ｐ．１５５３−１５５６
【非特許文献５】プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），（米国），１９８８年，第８５巻，第１２号，ｐ．４２１８−４２２２
【非特許文献６】サイエンス（Science），（米国），２００２年，第２９６巻，第５５７２号，ｐ．１４８６−１４８８
【非特許文献７】プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），（米国），１９９８年，第９５巻，第２５号，ｐ．１４９３８−１４９４３
【非特許文献８】アナルズ・オブ・ニューロロジー（Annals of Neurology），（米国），２００２年，第５２巻，第６号，ｐ．８３２−８３６
【非特許文献９】ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（The Journal of Clinical Investigation），（米国），２００２年，第１０９巻，第５号，ｐ．５９５−６０１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、下垂体FSH分泌、黄体成熟、赤芽球系分化誘導、インスリン分泌などの重要な機能を担っているアクチビンの活性は阻害せずに、悪液質、筋ジストロフィー、肥満およびII型糖尿病の発症およびあるいは病態悪化に寄与していることが示唆されているGDF-8の活性をアクチビンの活性の阻害と比較して選択的に阻害することができるフォリスタチンの変異体を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下の（１）から（２５）に関する。
（１）（ａ）フォリスタチンドメインIを含み、
（ｂ）式(Ｉ)：Ｃｙｓ−（Ｘ1）a−Ｃｙｓ−（Ｘ2）b−Ｃｙｓ−（Ｘ3）c−Ｃｙｓ−（Ｘ4）d−Ｃｙｓ−（Ｘ5）e−Ｃｙｓ−（Ｘ6）f−Ｃｙｓ−（Ｘ7）g−Ｃｙｓ−（Ｘ8）h−Ｃｙｓ−（Ｘ9）i−Ｃｙｓ（式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8およびＸ9は、それぞれ独立して同一または異なった、システイン以外の天然に存在するアミノ酸残基を表し、ａは２〜６、ｂは３〜７、ｃは７〜１１、ｄは０〜４、ｅは１〜６、ｆおよびｇは８〜１２、ｈは４〜８、ｉは１１〜１５の整数をそれぞれ表す。）で表されるアミノ酸配列であって、かつ配列番号２または配列番号２９のアミノ酸配列と50％以上の相同性を有する配列を含まず、かつ
（ｃ）アクチビンの活性の阻害と比較して、GDF-8の活性を選択的に阻害する、
ことを特徴とするフォリスタチン変異体ポリペプチド。
【００１１】
（２）  フォリスタチンドメインIを含み、フォリスタチンドメインIIを欠失した（１）に記載のフォリスタチン変異体ポリペプチド。
（３）  さらにフォリスタチンドメインIIIを含まない、（１）または（２）に記載のフォリスタチン変異体ポリペプチド。
（４）  ２つ以上のフォリスタチンドメインIを含む、（１）から（３）のいずれかに記載のフォリスタチン変異体ポリペプチド。
（５）  さらにＮ末端ドメインを含む、（１）から（４）のいずれかに記載のフォリスタチン変異体ポリペプチド。
（６）  FSI、FSI−FSI、FSI−FSI−FSIII、FSN−FSI、FSN−FSI−FSI、又はFSN−FSI−FSI−FSIII（ここでFSIはフォリスタチンドメインIを示し、FSIIIはフォリスタチンドメインIIIを示し、FSNはＮ末端ドメインを示し、各ドメイン間は直接またはリンカーポリペプチドで連結している）から選択されるいずれかのドメイン構造を含む（１）または（２）に記載のフォリスタチン変異体ポリペプチド。
【００１２】
（７）  フォリスタチンドメインIが配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドである（１）から（６）のいずれかに記載のフォリスタチン変異体ポリペプチド。
（８）  配列番号４の30〜166番目のアミノ酸配列を含む、（７）に記載のフォリスタチン変異体ポリペプチド。
（９）  フォリスタチンのドメインのアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に他のポリペプチドが融合している、（１）から（８）の何れかに記載のフォリスタチン変異体ポリペプチド。
（１０）  配列番号６、８または１０のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００１３】
（１１）  （１）から（１０）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（１２）  配列番号５、７または９の塩基配列を含む（１１）に記載のポリヌクレオチド。
（１３）  （１１）または（１２）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（１４）  （１３）に記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞。
（１５）  （１４）に記載の形質転換細胞を培地中で培養し、該細胞で発現した（１）から（１０）のいずれかに記載のポリペプチドを培地または該細胞中に蓄積させ、培地または該細胞から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造方法。
【００１４】
（１６）  （１）から（１０）のいずれかに記載のポリペプチド、（１１）または（１２）に記載のポリヌクレオチドまたは（１３）に記載のベクターを含有するアクチビンは阻害しないGDF-8選択的な阻害剤。
（１７）  （１）から（１０）のいずれかに記載のポリペプチド、（１１）または（１２）に記載のポリヌクレオチドまたは（１３）に記載のベクターを含有する医薬組成物。
（１８）  （１）から（１０）のいずれかに記載のポリペプチド、（１１）または（１２）に記載のポリヌクレオチドまたは（１３）に記載のベクターを有効成分として含有する、骨格筋増加剤。
（１９）  （１）から（１０）のいずれかに記載のポリペプチド、（１１）または（１２）に記載のポリヌクレオチドまたは（１３）に記載のベクターを有効成分として含有する、脂肪減少剤。
（２０）  （１）から（１０）のいずれかに記載のポリペプチド、（１１）または（１２）に記載のポリヌクレオチドまたは（１３）に記載のベクターを有効成分として含有する、筋萎縮症状の治療剤または予防剤。
【００１５】
（２１）  （１）から（１０）のいずれかに記載のポリペプチド、（１１）または（１２）に記載のポリヌクレオチドまたは（１３）に記載のベクターを有効成分として含有する、悪液質、筋萎縮を伴う疾患、II型糖尿病、肥満または後天性免疫不全症候群の治療剤または予防剤。
（２２）  筋萎縮を伴う疾患が、遺伝性の筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症またはパーキンソン病である（２１）に記載の治療剤または予防剤。
（２３）  （１１）または（１２）に記載のポリヌクレオチドを含む外来遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（２４）  非ヒト動物に（１）から（１０）のいずれかに記載のポリペプチド、（１１）または（１２）に記載のポリヌクレオチドまたは（１３）に記載のベクターを投与して、該非ヒト動物の筋肉を増加させる方法。
（２５）  非ヒト動物に（１）から（１０）のいずれかに記載のポリペプチド、（１１）または（１２）に記載のポリヌクレオチドまたは（１３）に記載のベクターを投与して、該非ヒト動物の脂肪を減少させる方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、アクチビンの活性の阻害と比較して、GDF-8の活性を選択的に阻害するフォリスタチン変異体ポリペプチドが提供される。該フォリスタチン変異体ポリペプチドは、骨格筋の増加および脂肪の減少に用いることができる。また、筋萎縮症状の治療、悪液質、筋萎縮を伴う疾患、II型糖尿病、肥満および後天性免疫不全症候群の治療に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
１．本発明のフォリスタチン変異体ポリペプチド
本発明における変異体を作製する場合の、元になるフォリスタチンはどの動物種のものでもよいが、哺乳類または鳥類のフォリスタチン、例えばヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ等のフォリスタチンが好ましく、特にヒトフォリスタチンが好ましい。また、mRNAのスプライシングの違いあるいは翻訳後のプロセシングにより、Ｃ末端のアミノ酸配列が異なる分子があるが、どれでもよい。具体的には、配列番号４の30〜344番目のアミノ酸配列からなるヒトフォリスタチン、NCBIの蛋白質データベース登録番号P47931のアミノ酸配列の30〜344番目の配列からなるマウスフォリスタチン、NCBIの蛋白質データベース登録番号NP 032072のアミノ酸配列の30〜343番目の配列からなるマウスフォリスタチン、NCBIの蛋白質データベース登録番号P21674のアミノ酸配列の30〜344番目の配列からなるラットフォリスタチン、NCBIの蛋白質データベース登録番号P50291のアミノ酸配列の30〜344番目の配列からなるウシフォリスタチン、NCBIの蛋白質データベース登録番号P10669のアミノ酸配列の30〜344番目の配列からなるブタフォリスタチン、NCBIの蛋白質データベース登録番号P31514のアミノ酸配列の30〜344番目の配列からなるヒツジフォリスタチン、NCBIの蛋白質データベース登録番号O62650のアミノ酸配列の30〜344番目の配列からなるウマフォリスタチン、NCBIの蛋白質データベース登録番号NP 990531のアミノ酸配列の29〜343番目の配列からなるニワトリフォリスタチン、これらのフォリスタチンのＣ末端の27アミノ酸または12アミノ酸が欠失した配列からなるポリペプチド、また、天然に存在する、これらのポリペプチドの遺伝子のアレル変異や１塩基多型の遺伝子がコードするポリペプチドがあげられる。
【００１８】
本発明において、フォリスタチンドメインは、フォリスタチン内に３回繰り返される、保存された10個のシステインを含む、Cys-(Xaa)4-Cys-(Xaa)5-Cys-(Xaa)9-10-Cys-(Xaa)1-2-Cys-(Xaa)3-Cys-(Xaa)9-10-Cys-(Xaa)10-Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)13-Cysで示される約70アミノ酸の配列（Xaaは任意のアミノ酸配列を表す）からなる領域をいい、Ｎ末端側から、それぞれ、フォリスタチンドメインI（以下、FSIと略す）、フォリスタチンドメインII（以下、FSIIと略す）およびフォリスタチンドメインIII（以下、FSIIIと略す）という。例えば、配列番号４で表されるヒトフォリスタチン前駆体のアミノ酸配列（当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号３に示す）において、95〜164番目の領域がFSI、168〜239番目の領域がFSII、245〜316番目の領域がFSIIIとなる。また、Ｎ末端ドメイン（以下、FSNと略す）は、フォリスタチンのＮ末端からFSIまでの領域をいい、例えば、配列番号４で表されるヒトフォリスタチン前駆体のアミノ酸配列において、30〜94番目の領域をいう。図１にヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ニワトリの各フォリスタチンのアミノ酸配列とFSN、FSI、FSII、FSIIIの各ドメインの位置、FSIおよびFSIIのコンセンサス配列を示した。
【００１９】
本発明のフォリスタチン変異体ポリペプチドは、アクチビンの活性の阻害と比較してGDF-8の活性を選択的に阻害するフォリスタチン変異体ポリペプチドであり、FSIを含み、式（Ｉ）：Ｃｙｓ−（Ｘ1）a−Ｃｙｓ−（Ｘ2）b−Ｃｙｓ−（Ｘ3）c−Ｃｙｓ−（Ｘ4）d−Ｃｙｓ−（Ｘ5）e−Ｃｙｓ−（Ｘ6）f−Ｃｙｓ−（Ｘ7）g−Ｃｙｓ−（Ｘ8）h−Ｃｙｓ−（Ｘ9）i−Ｃｙｓ（式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8およびＸ9は、それぞれ独立して同一または異なった、システイン以外の天然に存在するアミノ酸残基を表し、ａは２〜６、ｂは３〜７、ｃは７〜１１、ｄは０〜４、ｅは１〜６、ｆおよびｇは８〜１２、ｈは４〜８、ｉは１１〜１５の整数をそれぞれ表す。）で表されるアミノ酸配列であって、かつ配列番号２または配列番号２９のアミノ酸配列と50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは95％以上の相同性を有する配列（以下、FSII相同配列とよぶ）を含まない配列であることを特徴とする。ここで、「システイン以外の天然に存在するアミノ酸残基」とは、アスパラギン、アスパラギン酸、アラニン、アルギニン、イソロイシン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、リジンおよびロイシンのいずれかのアミノ酸残基を意味する。配列番号２のアミノ酸配列は、各哺乳類およびニワトリのフォリスタチンのFSIIのコンセンサスなアミノ酸配列である。配列番号２９のアミノ酸配列は、マウスのフォリスタチン関連遺伝子（follistatin related gene、FLRG）がコードするFLRGタンパク質の、２つあるフォリスタチンドメイン様の配列の２番目のフォリスタチンドメイン様の配列であり、配列番号２の配列と61％の相同性を有する。FSII相同配列には配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列も含まれる。FSII相同配列としては、例えば、上記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列において、（Ｘ1）aが配列番号２の２〜５位のアミノ酸配列または配列番号２９の２〜５位のアミノ酸配列、（Ｘ2）bが配列番号２の７〜１１位のアミノ酸配列または配列番号２９の７〜１１位のアミノ酸配列、（Ｘ3）cが配列番号２の１３〜２１位のアミノ酸配列または配列番号２９の１３〜２１位のアミノ酸配列、（Ｘ4）dが配列番号２の２３〜２４位のアミノ酸配列または配列番号２９の２３〜２４位のアミノ酸配列、（Ｘ5）eが配列番号２の２６〜２８位のアミノ酸配列または配列番号２９の２６〜２９位のアミノ酸配列、（Ｘ6）fが配列番号２の３０〜３９位のアミノ酸配列または配列番号２９の３１〜４０位のアミノ酸配列、（Ｘ7）gが配列番号２の４１〜５０位のアミノ酸配列または配列番号２９の４２〜５１位のアミノ酸配列、（Ｘ8）hが配列番号２の５２〜５７位のアミノ酸配列または配列番号２９の５３〜５８位のアミノ酸配列、（Ｘ9）iが配列番号２の５９〜７１位のアミノ酸配列または配列番号２９の６０〜７２位のアミノ酸配列である配列があげられる。
【００２０】
FSII相同配列を含まない配列であるフォリスタチン変異体としては、例えば、FSII全体を欠失させた変異体、FSIIの１つ以上のシステイン残基を含む一部の領域を欠失させた変異体、FSIIの１つ以上のシステイン残基を欠失または他のアミノ酸に置換した変異体、FSIIの内部に、FSII相同配列を含まない10アミノ酸以上のアミノ酸配列を挿入した変異体などがあげられる。FSIを含み、FSII相同配列を含まない配列であれば、FSIおよびFSII以外の領域のアミノ酸配列については、アミノ酸の欠失、付加、置換の位置、数は限定されない。アミノ酸の変異（即ち、アミノ酸の欠失、付加または置換）の数は好ましくは１〜５０個であり、より好ましくは１〜３０個であり、さらに好ましくは１〜２０個であり、さらに好ましくは１〜１０個であり、特に好ましくは１〜５個である。また、フォリスタチン変異体ポリペプチドが、アクチビンの活性の阻害と比較して、GDF-8の活性を選択的に阻害することができる限りは、FSIのアミノ酸配列においても、アミノ酸の欠失、付加または置換が存在してもよい。このようなFSIのアミノ酸配列におけるアミノ酸の変異の数は好ましくは１〜１０個であり、より好ましくは１〜８個であり、さらに好ましくは１〜５個である。本発明のフォリスタチン変異体ポリペプチドとしては、さらにFSIIIも欠失していることが好ましい。また、FSIの数は１つでもよいが、２つ以上含むことが好ましい。また、FSNを含んでもよい。
【００２１】
本発明のフォリスタチン変異体ポリペプチドとしては、FSI、FSI−FSI、FSI−FSI−FSIII、FSN−FSI、FSN−FSI−FSI、FSN−FSI−FSI−FSIII等のドメイン構造のポリペプチド、これらのポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に他のポリペプチドを融合させたポリペプチドがあげられる。各ドメイン間は直接または１〜50個、好ましくは１〜10個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸からなるリンカーポリペプチドでつながれる。リンカーポリペプチドのアミノ酸配列は、システインを含まなければいかなる配列でもよい。Ｎ末端またはＣ末端に融合させるポリペプチドの配列は、上記のFSII相同配列を含まなければ、いかなる配列でもよく、１アミノ酸でもよい。Ｎ末端またはＣ末端に融合させるポリペプチドとしては、イムノグロブリンの定常領域、プロテインＡ、プロテインＧ、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ、チオレドキシン、ポリヒスチジン、Ｓペプチド、FLAGペプチド、HAエピトープペプチド、mycエピトープペプチドなどをあげることができる。
【００２２】
FSIの配列としては、配列番号４の95〜164番目のアミノ酸配列、および各哺乳類およびニワトリのフォリスタチンのFSIのコンセンサス配列である配列番号１のアミノ酸配列をあげることができる。FSIIの配列としては、配列番号４の168〜239番目のアミノ酸配列、および各哺乳類およびニワトリのフォリスタチンのFSIIのコンセンサス配列である配列番号２のアミノ酸配列をあげることができる。FSNの配列としては、例えば配列番号４の１〜94番目のアミノ酸配列をあげることができる。FSIIIの配列としては、例えば配列番号４の245〜316番目のアミノ酸配列をあげることができる。
【００２３】
本発明のフォリスタチン変異体ポリペプチドの具体例としては、配列番号６、８または１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドをあげることができる。
以下に、本発明のフォリスタチン変異体の作製方法、活性評価方法およびその使用方法について説明する。
【００２４】
２．フォリスタチン変異体ポリペプチドの製造方法
（１）フォリスタチン変異体ポリペプチドをコードするDNAの構築
１．に記載した条件に基づき、アクチビンの活性の阻害と比較して、GDF-8を選択的に阻害するフォリスタチン変異体ポリペプチドの構造を設計し、該ポリペプチドをコードするDNAを以下のようにして構築する。
【００２５】
まず、フォリスタチン全体または設計したフォリスタチン変異体ポリペプチドの構成に必要なフォリスタチンの領域を含む部分断片をコードするDNAを取得する。各種哺乳類およびニワトリのフォリスタチンcDNAまたはゲノムDNAの塩基配列は公知であるので、これらの配列の情報をもとにしたプライマーを用い、各種哺乳類またはニワトリの精巣から単離したcDNAを鋳型としたPCRを行うことにより、該哺乳類またはニワトリのフォリスタチンcDNAの任意の部分断片を取得できる。また、精巣cDNAライブラリーのスクリーニングによりフォリスタチンcDNAをクローニングし、該cDNAを鋳型としてもよい。各種哺乳類およびニワトリのフォリスタチンcDNAまたはゲノムDNAの塩基配列としては、NCBIのヌクレオチドデータベース登録番号NM 013409（ヒトフォリスタチンcDNA）、NM 008046（マウスフォリスタチンcDNA）、NM 012561（ラットフォリスタチンcDNA）、NM 175801（ウシフォリスタチンcDNA）、M63123（ヒツジフォリスタチンcDNA）、AB010829（ウシフォリスタチンcDNA）、M19529（ブタフォリスタチンゲノムDNA）、NM 205200（ニワトリフォリスタチンcDNA）等に記載された塩基配列をあげることができる。取得したい領域の5'端の15〜30塩基の配列、および3'端の15〜30塩基の配列と相補的な配列を含むDNAを合成し、プライマーとする。PCRの両プライマーの5'端には、部分断片の連結やベクターへの挿入に用いるため、適当な制限酵素の認識配列を付加しておくのが好ましい。cDNAの調製やPCRは、Sambrook, J. and Russel, D. W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等の実験書の記載にしたがって、行うことができる。必要に応じて、得られたDNAを鋳型として同様の操作を行い、設計したフォリスタチン変異体ポリペプチドの構成に必要な領域をコードする該DNAの部分断片を取得する。
【００２６】
設計したフォリスタチン変異体ポリペプチドの構造に基づいて、得られた部分断片をフレームが合うように連結させ、必要に応じて、他のポリペプチドをコードするDNAと連結させたり、終止コドンをコード領域の3'端に付加したり、変異を導入することにより、該フォリスタチン変異体ポリペプチドをコードするDNAを構築することができる。
【００２７】
（３）で記述するように、形質転換細胞の培養時に、フォリスタチン変異体ポリペプチドを細胞外に分泌させる場合は、分泌蛋白質の前駆体のＮ末端に存在するシグナルペプチドを、設計したフォリスタチン変異体ポリペプチドのＮ末端に付加したポリペプチドをコードするDNAを構築する。シグナルペプチドとしては、例えば、フォリスタチンのシグナルペプチドを用いることができる。フォリスタチンのシグナルペプチドをコードするDNAは、上記のフォリスタチン変異体ポリペプチドの構成に必要なFSIを含むフォリスタチン断片をコードするDNAを取得する際に、フォリスタチンのシグナルペプチドを含むような断片を増幅することにより、取得することができる。
【００２８】
分泌させない場合は、設計したフォリスタチン変異体ポリペプチドのＮ末端がメチオニンでない場合には、フォリスタチン変異体ポリペプチドをコードする領域の前に開始コドン（atg）を付加する。
【００２９】
例えば、FSN-FSI-FSIというドメイン構造を有するフォリスタチン変異体ポリペプチドを分泌させる場合は、まずPCRで、シグナルペプチド-FSN-FSIを含む領域をコードするフォリスタチンcDNAの部分断片ＡおよびFSIを含む領域をコードするフォリスタチンcDNAの部分断片Ｂをそれぞれ取得する。得られたcDNA断片Ａの下流にcDNA断片Ｂを連結させることにより、シグナルペプチド-FSN-FSI-FSIというドメイン構造を有するフォリスタチン変異体ポリペプチドをコードするDNAを作製することができる。
【００３０】
また、FSN-FSI-FSI-FSIIIというドメイン構造を有するフォリスタチン変異体ポリペプチドを分泌させる場合は、PCRで、FSIIIを含む領域をコードするフォリスタチンcDNAの部分断片Ｃを取得し、上記のcDNA断片Ａの下流にcDNA断片Ｂを連結させ、その下流にさらにcDNA断片Ｃを連結させることにより、シグナルペプチド-FSN-FSI-FSI-FSIIIというドメイン構造を有するフォリスタチン変異体ポリペプチドをコードするDNAを作製することができる。
【００３１】
（２）フォリスタチン変異体発現ベクターの作製と宿主細胞への導入
（１）で作製したフォリスタチン変異体ポリペプチドをコードするDNAを宿主細胞に応じた適当な発現用ベクターに挿入して、フォリスタチン変異体発現ベクターを作製する。
宿主細胞としては、細菌等の原核生物、酵母等の真核微生物、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、フォリスタチン変異体ポリぺプチドを発現できるものであればいずれも用いることができるが、フォリスタチン変異体発現ベクターを導入した細胞（以下、形質転換細胞ともいう）が発現するフォリスタチン変異体ポリペプチドが正しい高次構造を保ち、GDF-8特異的な阻害活性を保持するためには、動物細胞や昆虫細胞などで発現させるのが好ましい。
【００３２】
フォリスタチン変異体ポリペプチドをコードするDNAを挿入する発現用ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、宿主細胞中で機能するプロモーターを含有しているものを用いることができる。また、大腸菌（Escherichia coli）を用いたベクターの調製のために、大腸菌用の内在性プロモーターを含む薬剤耐性遺伝子、大腸菌中での複製に必要な複製開始点を含むことが好ましい。大腸菌用の薬剤耐性遺伝子としては、大腸菌由来のアンピシリン耐性遺伝子（β-ラクタマーゼ遺伝子）、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等があげられる。大腸菌での複製に必要な複製開始点としては、pBR322の複製開始点、colE1の複製開始点等があげられる。
【００３３】
宿主細胞が、動物細胞の場合、フォリスタチン変異体ポリペプチドをコードするDNAを挿入する発現用ベクターとしては、動物細胞中で機能するプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを有するプラスミドがあげられる。
【００３４】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）のIE（immediate early）遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルスのロング・ターミナル・リピート（LTR）、ラウス肉腫ウイルスのLTR、単純ヘルペスウイルス（HSV）のチミジンキナーゼ（TK）遺伝子のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター、メタロチオネインのプロモーター等をあげることができる。上記プロモーターと共に、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサー等も用いることができる。プロモーターは、その下流にフォリスタチン変異体ポリペプチドをコードするDNAを挿入できる、適当な制限酵素サイトを有することが好ましい。
【００３５】
ポリアデニル化シグナルとしては、いかなるポリアデニル化シグナルも利用できるが、例えば、SV40初期遺伝子のポリアデニル化シグナル、ウサギβグロビン遺伝子のポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化シグナル等を用いることができる。
【００３６】
さらに動物細胞用の薬剤耐性遺伝子の発現ユニット（プロモーターの下流に薬剤耐性遺伝子とポリアデニル化シグナルを順に連結した構造）を有していてもよい。動物細胞用の薬剤耐性遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子等があげられる。プロモーターとポリアデニル化シグナルは上記のものを用いることができる。薬剤耐性遺伝子の発現ユニットを有する発現ベクターを用いた場合、薬剤存在下で形質転換細胞を培養することにより、一過的でなく安定発現する形質転換細胞を得ることができる。
【００３７】
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr）遺伝子の発現ユニットを含む発現用ベクターを用い、dhfr遺伝子を欠失している動物細胞を宿主細胞とし、メトトレキセート存在下で形質転換細胞を培養し、メトトレキセートの濃度を段階的に上昇させることにより、dhfr遺伝子と共に導入したフォリスタチン変異体ポリペプチドをコードするDNAのコピー数を増幅させ、フォリスタチン変異体ポリペプチドの発現量の高い形質転換細胞を得ることができる。
【００３８】
また、動物細胞での複製に必要な複製開始点を有していてもよい。複製開始点としては、SV40の複製開始点やエプスタイン・バー・ウイルスの複製開始点oriPを用いることができる。SV40の複製開始点を有するプラスミドベクターは、SV40のラージT抗原を発現する宿主細胞中ではコピー数が増加するため、目的の遺伝子を高発現させる上で好適である。oriPを含むベクターは、エプスタイン・バー・ウイルスのEBNA-1（Epstein-Barr virus nuclear antigen-1）を発現する宿主中では宿主の染色体に組み込まれず、染色体外に維持される。
【００３９】
以上のような、動物細胞の発現用ベクターとしては、pcDNA3〔インビトロジェン（Invitrogen）社製〕、pcDNA3.1(+)（インビトロジェン社製）、pSI〔キアゲン（QIAGEN）社製〕、pCI-neo（キアゲン社製）、pAGE107、pAGE103、pAMo〔J.Biol.Chem., 268, 22782 (1993)〕等をあげることができる。
【００４０】
（１）で作製したフォリスタチン変異体ポリペプチドをコードするDNAを、上記の動物細胞の発現用ベクターのプロモーターの下流に挿入して、フォリスタチン変異体ポリペプチド発現ベクターを作製する。
【００４１】
宿主細胞としては、サル腎臓細胞株COS-1（ATCC番号：CRL-1650）およびCOS-7（ATCC番号：CRL-1651）、チャイニーズハムスタ卵巣細胞株CHO-K1（ATCC番号：CCL-61）およびCHO/dhFr-（ATCC番号：CRL-9096）、ヒトＢリンパ球細胞株Namalwa（ATCC番号：CRL-1432）、ヒト腎臓細胞株HEK293（ATCC番号：CRL-1573）、ヒト子宮頸部上皮細胞株HeLa（ATCC番号：CCL-2）、マウス胎児細胞株NIH/3T3（ATCC番号：CRL-1658）等をあげることができる。
【００４２】
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕、Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等をあげることができる。また、市販のDNA導入試薬を用いることもできる。該DNA導入試薬として、トランスファスト（TransFast；プロメガ社製）、リポフェクトアミン2000（Lipofectamine 2000；インビトロジェン社製）、スーパーフェクト（SuperFect；キアゲン社製）、ポリフェクト（PolyFect；キアゲン社製）等をあげることができる。
【００４３】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、フォリスタチン変異体ポリペプチドを発現する昆虫細胞を得ることができる。
【００４４】
すなわち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現する昆虫細胞を得ることができる。
【００４５】
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392およびpVL1393（ともにファーミンジェン社製）、pBlueBac4.5（インビトロジェン社製）等をあげることができる。
【００４６】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヤガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 等を用いることができる。
【００４７】
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperda由来のSf9およびSf21（インビトロジェン社製）、Trichoplusia ni由来のHigh 5（インビトロジェン社製）、カイコ（Bombyx mori）由来のBm5（インビトロジェン社製）およびN4等の細胞株をあげることができる。
【００４８】
組換えウイルスを調製するための、トランスファーベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。
【００４９】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、発現ベクターは宿主原核生物中で自律複製可能であり、プロモーターおよびその下流にリボソーム結合配列およびフォリスタチン変異体ポリペプチドをコードするDNAを挿入するクローニングサイトを有するものを用いる。必ずしも必要ではないが、該クローニングサイトの直後に転写終結配列を配置する方が好ましい。また、形質転換体の選択のため、薬剤耐性遺伝子等のマーカーとなる遺伝子を発現する配列を含むようにする。リボソーム結合配列の下流のクローニングサイトにフォリスタチン変異体ポリペプチドをコードするDNAを挿入する。リボソーム結合配列と開始コドンとの間は適当な距離（例えば、大腸菌宿主のベクターの場合６〜18塩基）に調節されていることが好ましい。
【００５０】
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば大腸菌を宿主とした場合は、trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、T7プロモーター、PRプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター等をあげることができる。またtrpプロモーターを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、T7lacプロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。枯草菌を宿主とした場合は、枯草菌のファージであるSPO1やSPO2のプロモーター、PenPプロモーター等をあげることができる。
【００５１】
発現ベクターとしては、例えば、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（キアゲン社製）、pKYP200〔Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)〕、pTrS30〔大腸菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製〕、pGEX-5X-3（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）、pET14（ノバジェン社製）、pPROTet.E（クロンテック社製）pRSET A（インビトロジェン社製）等を例示することができる。
【００５２】
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp. D-0110等をあげることができる。
【００５３】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 69, 2110 (1972); Gene, 17, 107 (1982)〕、プロトプラスト法〔特開昭63-248394; Mol. Gen. Genet., 168, 111 (1979)〕等をあげることができる。
【００５４】
酵母を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターとしては、宿主酵母で転写を行なうプロモーター、転写の終止配列および酵母での形質転換マーカーとなる遺伝子、たとえば薬剤耐性遺伝子やTRP1、HIS3、LEU2等のアミノ酸合成系の遺伝子を発現できる配列を含有しているものが用いられる。また、発現ベクターの作製や維持を容易にするため、大腸菌内でも自律複製と遺伝子導入マーカーとなる薬剤耐性遺伝子を発現できるものが好ましい。
【００５５】
プロモーターとしては、酵母中で転写を行なえるものであればいずれのものを用いてもよく、例えばSaccharomyces cerevisiaeのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ADH1、ガラクトース代謝系遺伝子GAL1やGAL10等のプロモーター、酸性フォスファターゼ遺伝子PHO5プロモーター、フォスフォグリセレートキナーゼ遺伝子PGKプロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子GAPプロモーター、ヒートショック蛋白質遺伝子プロモーター、α接合因子遺伝子MFα1プロモーター、銅メタロチオネイン遺伝子CUP1プロモーター、Pichia pastorisのアルコールオキシダーゼ遺伝子AOX1のプロモーター等が用いられる。
【００５６】
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ピヒア属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Pichia pastoris等をあげることができる。
【００５７】
組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods Enzymol., 194, 182 (1991)〕、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 81, 4889 (1984)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriol., 153, 163 (1983)〕等をあげることができる。
【００５８】
（３）形質転換細胞の培養とフォリスタチン変異体ポリペプチドの精製
（２）で作製した形質転換細胞が大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物である場合、該細胞を培養する培地はは、該細胞が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。無機塩としては、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【００５９】
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養期間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。必要に応じて、培養期間中にアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００６０】
（２）で作製した形質転換細胞が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているRPMI 1640培地〔J. Am.  Med. Assoc., 199, 519 (1967)〕、イーグル（Eagle）のMEM培地〔Science, 122, 501 (1952)〕、ダルベッコ改変イーグル培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、199培地〔Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)〕、MEM培地、EX-CELL 301培地（JRHバイオサイエンシズ社製）またはこれら培地にウシ胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。培養は、通常pH６〜８、30〜40℃、５％CO2存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６１】
（２）で作製した形質転換細胞が昆虫細胞である場合、該細胞を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地（ファーミンジェン社製）、Sf-900 II SFM培地（インビトロジェン社製）、EX-CELL 400、EX-CELL 405（JRHバイオサイエンシズ社製）、グレースの昆虫培地〔Nature, 195, 788 (1962)〕等を用いることができる。培養条件はpH６〜７、培養温度は25〜30℃、培養時間は通常１〜５日間が好ましい。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６２】
フォリスタチン変異体ポリペプチドは、細胞外に分泌させても、分泌させずに細胞内に発現させてもよいが、細胞外に分泌させる方が好ましい。細胞外へ分泌させる場合は、（２）でフォリスタチン変異体ポリペプチドをコードするDNAとして、設計したフォリスタチン変異体ポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチドを付加したポリペプチドをコードするDNAを用いて発現ベクターを作製し、形質転換細胞を取得する。分泌時には、シグナルペプチドは切断されるため、培地中にはシグナルペプチドが除かれたフォリスタチン変異体ポリペプチドが蓄積する。
【００６３】
以上のように培養することにより、形質転換細胞を培養した培地または形質転換細胞中に、発現したフォリスタチン変異体ポリペプチドが蓄積する。該培地または該形質転換細胞から、以下のようにして、フォリスタチン変異体ポリペプチドを単離・精製することができる。
【００６４】
細胞外にフォリスタチン変異体ポリペプチドが分泌される場合には、培地を回収する。形質転換細胞が浮遊性の場合は、遠心分離やろ過により、培地と細胞を分離して培地を回収する。回収した培地から、硫酸化セルロファインカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、効率的に精製することができる。また、その他に通常のタンパク質の精製に用いられる精製方法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。また、フォリスタチンのFSIを特異的に認識する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによっても精製することができる。
【００６５】
また、フォリスタチン変異体ポリペプチドが、他のポリペプチドとの融合蛋白質である場合、融合させた他のポリペプチドと特異的に結合する物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、IgGの定常領域との融合蛋白質にした場合はプロテインAや抗IgG抗体を固定化したカラム、プロテインAとの融合蛋白質にした場合はIgGを固定化したカラム、FLAGペプチド、Sペプチド、HAエピトープペプチド、mycエピトープペプチドとの融合蛋白質にした場合は、それらのペプチドに対する抗体を固定化したカラム、ポリヒスチジンとの融合蛋白質にした場合は、ニッケルイオンを固定化したカラム、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合蛋白質にした場合は、グルタチオンを固定化したカラムをそれぞれ利用したアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００６６】
フォリスタチン変異体ポリペプチドが細胞内に発現した場合は、形質転換細胞を回収する。回収した細胞をプロテアーゼ阻害剤を含む適当な緩衝液中でホモジェナイザーや超音波処理等により破砕した後、遠心分離により上清を回収し、細胞溶解液を得る。得られた細胞溶解液から、培地からの単離・精製法と同様の手法により、フォリスタチン変異体ポリペプチドを単離・精製することができる。
【００６７】
また、公知の方法〔J. Biomolecular NMR, 6, 129、Science, 242, 1162 (1988)、J. Biochem., 110, 166 (1991)〕に準じて、in vitro転写・翻訳系を用いてフォリスタチン変異体ポリペプチドを生産することもできる。
【００６８】
精製したフォリスタチン変異体の分子量は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動〔SDS-PAGE; Nature, 227, 680 (1970)〕やウエスタンブロッティング法（Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 12 (1988)、Monoclonal Antibodies: Principales and Practice, Academic Press Limited (1996)）などで測定することができる。
【００６９】
３．本発明のフォリスタチン変異体のGDF-8選択的阻害の確認
本発明のフォリスタチン変異体ポリペプチドが「GDF-8の活性を選択的に阻害する」とは、「アクチビンの活性の阻害と比較して、GDF-8の活性を選択的に阻害する」ことを意味する。「アクチビンの活性の阻害と比較して、GDF-8の活性を選択的に阻害する」とは、請求項３に記載の方法で、同じ濃度のフォリスタチン変異体ポリペプチドについて、アクチビンの活性の阻害とGDF-8の活性の阻害を測定したときに、GDF-8の活性は50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上阻害するのに対し、アクチビンの活性の阻害は50％未満、好ましくは30％以下、より好ましくは10％以下であるか、さらに好ましくは阻害せず、アクチビンの活性の阻害と比較して、GDF-8の活性をより強く阻害することを意味する。
本発明のフォリスタチン変異体ポリペプチドは、アクチビンの活性の阻害と比較して、GDF-8の活性を選択的に阻害するフォリスタチン変異体ポリペプチドであり、アクチビンの活性は阻害せず、GDF-8の活性を選択的に阻害するものが好ましい。以下のように、本発明のフォリスタチン変異体ポリペプチドの活性（アクチビンの活性の阻害と比較してGDF-8の活性を選択的に阻害する活性）は、例えば、アクチビンおよびGDF-8が有する転写促進活性をレポーターアッセイにより測定することにより確認できる。
【００７０】
レポータープラスミド(CAGA)12-MLP-Luc〔EMBO J., 17, 3091 (1998)〕を導入した動物細胞を作製する。(CAGA)12-MLP-Lucは、CAGAボックスと呼ばれるアクチビンおよびGDF-8に対する応答配列（AGCCAGACA）を上流に12個挿入したアデノウイルスの主要後期プロモーターを有し、該プロモーターの下流にレポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を連結した構造を有する。レポータープラスミドの導入は、２に記載の方法で行うことができる。得られた形質転換細胞に、（ａ）GDF-8、（ｂ）アクチビン、（ｃ）フォリスタチン変異体ポリペプチド、（ｄ）GDF-8およびフォリスタチン変異体ポリペプチド、（ｅ）アクチビンおよびフォリスタチン変異体ポリペプチドをそれぞれ添加した場合、（ｆ）何も添加しない場合について、ルシフェラーゼ活性を測定する。形質転換細胞は、（ｆ）の何も添加しない場合と比較して、（ａ）GDF-8および（ｂ）アクチビンをそれぞれ添加した場合には、転写の活性化を受け、ルシフェラーゼ活性が上昇する。また、（ｃ）フォリスタチン変異体ポリペプチドを添加した場合にはルシフェラーゼ活性の上昇はみられない。本発明のフォリスタチン変異体ポリペプチドがGDF-8の活性を選択的に阻害することは、（I）（ａ）GDF-8を添加した場合と比較して、（ｄ）GDF-8およびフォリスタチン変異体ポリペプチドを添加した場合には、ルシフェラーゼ活性が低下し、（ｃ）フォリスタチン変異体ポリペプチドだけを添加した場合あるいは（ｅ）何も添加しない場合のルシフェラーゼ活性に近くなるのに対し、（II）（ａ）アクチビンを添加した場合と比較して、（ｄ）アクチビンおよびフォリスタチン変異体ポリペプチドを添加した場合には、ルシフェラーゼ活性の低下が見られないか、ルシフェラーゼ活性の低下が、GDF-8の場合の活性の低下よりも、明らかに弱いことにより確認できる。
【００７１】
４．本発明のフォリスタチン変異体ポリペプチドを含む医薬組成物
本発明のフォリスタチン変異体ポリペプチド、該ポリペプチドを投与した生体内で発現するための該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドを含むベクターは、アクチビンの活性の阻害と比較して、GDF-8の活性を選択的に阻害するので、GDF-8が発症あるいは進行に関与する症状や疾患の治療や予防に用いることができ、しかも、アクチビンの阻害による副作用が少ないことが期待される。このような症状や疾患としては、例えば、疾患や老化、寝たきり等に伴う骨格筋の減少や萎縮、皮下脂肪や内臓脂肪等の脂肪の増加、悪液質、筋萎縮を伴う疾患、II型糖尿病、肥満および後天性免疫不全症候群などをあげることができる。筋萎縮を伴う疾患としては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー等の遺伝性の筋ジストロフィー、および筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症およびパーキンソン病等の神経の変性により二次的に筋萎縮を呈する疾患等をあげることができる。
【００７２】
本発明のフォリスタチン変異体ポリペプチド、該ポリペプチドを投与した生体内で発現するための該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドを含むベクターは、GDF-8の選択的阻害剤、骨格筋増加剤、脂肪低下剤、筋萎縮症状の治療剤又は予防剤、ならびに悪液質、筋萎縮を伴う疾患、II型糖尿病、肥満または後天性免疫不全症候群の治療剤又は予防剤として単独で用いることも可能ではあるが、通常は各種の医薬製剤として提供するのが望ましい。また、それら医薬製剤は、動物または人に使用されるものである。
【００７３】
本発明に係わる医薬製剤は、上記の活性成分またはその薬理学的に許容される塩を単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種またはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
【００７４】
投与経路としては、予防または治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内などの非経口をあげることができるが、非経口が好ましい。
投与形態としては、例えば錠剤、注射剤などがあげられる。
【００７５】
経口投与に適当な例えば錠剤などは、乳糖、マンニットなどの賦形剤、澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
【００７６】
非経口投与に適当な製剤は好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体などを用いて注射用の溶液を調製する。また、これらの非経口剤においても経口剤で例示した賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤および希釈剤、防腐剤、フレーバー類などから選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
【００７７】
上記の活性成分またはその薬理学的に許容される塩は、上記の目的で用いる場合、通常、全身的または局所的に、経口または非経口の形で投与される。投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度などにより異なるが、通常経口の場合、成人１人あたり、１回につき0.01〜1000 mg、好ましくは0.05〜500 mgの範囲で、１日１回ないし数回投与する。静脈内投与などの非経口投与の場合、通常成人一人当り0.001〜1000 mg、好ましくは0.01〜300 mgを一日一回ないし数回投与するか、または１日１〜24時間の範囲で静脈内に持続投与する。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。
【００７８】
また、GDF-8の選択的阻害剤、骨格筋増加剤、脂肪低下剤、筋萎縮症状の治療剤又は予防剤、悪液質、筋萎縮を伴う疾患、II型糖尿病、肥満または後天性免疫不全症候群の治療剤又は予防剤の有効成分としてDNAやRNAなどの核酸を利用する遺伝子治療剤の場合には、該DNAまたはRNAを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、上記に記載した常法に従って製剤化、処方および投与する方法、あるいは非ウイルス遺伝子移入法により投与する方法を使用することができる。
【００７９】
組換えウイルスベクターは、以下に記載の方法に従い作製することができる。
有効成分として使用するDNA（以下、対象DNAとも称する）の断片を調製する。該DNA断片をウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイルスベクターを造成する。
【００８０】
RNAウイルスベクターの場合には、対象DNAに相同なRNA断片を調製し、それらをウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイルスを造成する。RNA断片は、２本鎖のほか、ウイルスベクターの種類に応じて、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のどちらか一方の鎖を選択する。例えば、レトロウイルスベクターの場合は、センス鎖に相同なRNAを、センスウイルスベクターの場合には、アンチセンス鎖に相同なRNAを選択する。
【００８１】
該組換えウイルスベクターを、該ベクターに適合したパッケージング細胞に導入する。パッケージング細胞としては、ウイルスのパッケージングに必要な蛋白質をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠損している組換えウイルスベクターの該欠損する蛋白質を補給できる細胞であればいかなるものでもよい。例えば、ヒト腎臓由来のHEK293細胞、マウス繊維芽細胞NIH3T3などを用いることができる。パッケージング細胞で補給する蛋白質としては、レトロウイルスベクターの場合はマウスレトロウイルス由来のgag、pol、envなど、レンチウイルスベクターの場合はHIV由来のgag、pol、env、vpr、vpu、vif、tat、rev、nefなど、アデノウイルスベクターの場合はアデノウイルス由来のE1A、E1Bなど、アデノ随伴ウイルスの場合はRep（p5、p19、p40）、Vp（Cap）などの蛋白質があげられる。
ウイルスベクターとしては、上記パッケージング細胞において組換えウイルスが生産でき、標的細胞で対象DNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。プラスミドベクターとしてはMFG〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6733 (1995)〕、pBabePuro〔Nucleic Acids Res., 18, 3587 (1990)〕、LL-CG、CL-CG、CS-CG、CLG〔J. Virol., 72, 8150 (1998)〕、pAdex1〔Nucleic Acids Res., 23, 3816 (1995)〕などが用いられる。プロモーターとしては、ヒト組織中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）のIE（immediate early）遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、SRαプロモーターなどをあげることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００８２】
パッケージング細胞への組換えウイルスベクターの導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕などをあげることができる。
【００８３】
また、上記組換えウイルスベクターの投与方法としては、上記の方法に加え、リポソームデリバリーを用いる直接的イン・ビボ(in vivo)遺伝子移入と組み合わせることにより、患者の癌組織にウイルスベクターを指向させるようにすることもできる。すなわち、適当なサイズの対象DNAを、アデノウイルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン−コンジュゲート抗体と組み合わせてコンプレックスを作製し、得られたコンプレックスをアデノウイルスベクターに結合させることにより、ウイルスベクターを調製することができる。該ウイルスベクターは安定に標的細胞に到達し、エンドソームにより細胞内に取り込まれ、細胞内で分解され効率的に遺伝子を発現させることができる。
【００８４】
本発明においては、対象DNAを発現するベクターは非ウイルス遺伝子移入法によっても病巣に輸送することができる。
当該分野で公知の非ウイルス遺伝子移入法には、リン酸カルシウム共沈法〔Virology, 52, 456 (1973); Science, 209, 1414 (1980)〕、マイクロインジェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77, 5399 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77, 7380 (1980); Cell, 27, 223 (1981); Nature, 294, 92 (1981)〕、リポソームを介した膜融合−介在移入法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA，84, 7413 (1987); Biochemistry, 28, 9508 (1989); J. Biol. Chem., 264, 12126 (1989); Hum. Gene Ther., 3, 267 (1992); Science, 249, 1285 (1990); Circulation, 83, 2007 (1992)〕あるいは直接DNA取り込みおよび受容体を介したDNA移入法〔Science, 247, 1465 (1990); J. Biol. Chem., 266, 14338 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87, 3655 (1991); J. Biol. Chem., 264, 16985 (1989); BioTechniques, 11, 474 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87, 3410 (1990); Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88, 4255 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87, 4033 (1990); Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88, 8850 (1991); Hum. Gene Ther., 3, 147 (1991)〕などをあげることができる。
【００８５】
リポソームを介した膜融合−介在移入法ではリポソーム調製物を標的とする組織に直接投与することにより、当該組織の局所的な遺伝子の取り込みおよび発現が可能である。DNAを患者の癌組織に直接標的化するには、直接DNA取り込み技術が好ましい。受容体を介したDNA移入は、例えば、ポリリジンを介して、蛋白質リガンドにDNA(通常、共有的に閉環したスーパーコイル化プラスミドの形態をとる)をコンジュゲートすることによって行う。リガンドは、標的細胞または組織の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択する。当該リガンド−DNAコンジュゲートは、所望により、血管に直接注射することができ、受容体結合およびDNA−蛋白質コンプレックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。DNAの細胞内破壊を防止するために、アデノウイルスを同時感染させて、エンドソーム機能を崩壊させることもできる。
【００８６】
５．  本発明のフォリスタチン変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む外来遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物
本発明のフォリスタチン変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む外来遺伝子を非ヒト哺乳動物に導入することにより、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製することができる。上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物においては、本発明のフォリスタチン変異体ポリペプチドが過剰発現しており、好ましくは骨格筋量が増大していることを特徴とする。当該トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、骨格筋の形成機構の研究や、骨格筋の異常を伴う疾患の研究の際に使用するモデル動物として有用である。
【００８７】
本明細書で言う「非ヒト哺乳動物」の具体例としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはサルなどが挙げられ、好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギなどのげっ歯類動物であり、最も好ましくは、マウスである。
【００８８】
以下、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作出方法について説明する。
（１）導入遺伝子の調製
本発明のフォリスタチン変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡを対象動物に導入する際には、導入の対象動物の細胞内で当該ＤＮＡを発現させうるプロモーターの下流に当該ＤＮＡを連結した遺伝子構築物を用いるのが一般に有利である。導入させる遺伝子は、常法により、例えば、下記の通り調製することができる。
【００８９】
導入させる遺伝子の全長相補ＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製し、次いで該ＤＮＡ断片、または全長相補ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
【００９０】
動物へ導入させる遺伝子の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。これらの中でも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく、大腸菌由来のプラスミドが特に好ましい。
【００９１】
本発明で用いるプロモーターの具体例は本明細書中上記した通りである。本発明で用いる発現ベクターは、トランスジェニック哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウィルス由来、各種哺乳動物および鳥類由来の各遺伝子に含まれる同機能を有する配列を用いて遺伝子発現を操作することができる。好ましくは、シミアンウィルスのSV40ターミネターなどがよく用いられる。その他、目的遺伝子をさらに高発現させる目的で、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核生物遺伝子のイントロンの一部をプロモーター領域の5’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の3’下流 に連結することも目的により可能である。
【００９２】
（２）トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、フォリスタチン変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡを対象動物に導入することによって作製できる。具体的には、該遺伝子を対象となる非ヒト哺乳動物の受精卵、胚性幹細胞、体細胞、精子、未受精卵へ導入することによって、目的とするフォリスタチン変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡが胚芽細胞を含むすべての細胞の染色体上に組み込まれたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることによって作出できる。受精卵、胚性幹細胞、体細胞、精子、未受精卵における該遺伝子の導入は、対象非ヒト哺乳動物の胚芽細胞および体細胞を含む全ての細胞の染色体上に存在するように確保されることが好ましい。遺伝子導入後の作出動物の胚芽細胞において該導入遺伝子が存在することは、作出動物の子孫がその胚芽細胞および体細胞の全てに該導入遺伝子を有することを意味する。
【００９３】
個体の選択は、導入遺伝子産物の発現を蛋白質あるいはｍＲＮＡレベルで確認することによって行うことができる。選択された個体の遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫は、該導入遺伝子産物を有する。導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該遺伝子を安定に保持し、また、該遺伝子を有することを確認して、通常の飼育環境で繁殖継代することができる。
【００９４】
受精卵あるいは胚性幹細胞への遺伝子導入によるトランスジェニック動物の作製は、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版、Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング, ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社 (1995)、発生工学実験マニュアル, トランスジェニック・マウスの作り方, 講談社 (1987)等に記載された方法を用い、哺乳類動物細胞への遺伝子導入と核移植によるトランスジェニック動物の作製は、Cibelliら（Science, 280, 1256, 1998）、Schniekeら（Science, 278, 2130, 1997)、Baguisiら（Nature Biotechnology, 17, 456, 1999）等によって報告された方法を用い、精子への遺伝子導入によるトランスジェニック動物の作製は、Perryら（Science, 284, 1180, 1999) やWakayamaら（Nature Biotechnology, 16, 639, 1998)によって報告された方法を用い、未受精卵への遺伝子導入と体外受精によるトランスジェニック動物の作製は、Chanら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 14028, 1998) によって報告された方法を用いて行うことができる。
【００９５】
６．家畜の改良への応用
本発明のフォリスタチン変異体ポリペプチド、該ポリペプチドを投与した生体内で発現するための該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドを含むベクターをウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ等の非ヒト動物に投与することにより、該非ヒト動物の骨格筋を増加させ、脂肪を低下させることができる。また、５に記載した方法と同様にして、本発明のフォリスタチン変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を作製することにより、、該非ヒト動物の骨格筋を増加させ、脂肪を低下させることができる。特に非ヒト動物が家畜である場合、以上のようにして肉の量が多く、脂肪の少ない家畜を作製することができるので、肉の生産量を増加でき、また脂肪の少ない良質肉の生産をすることができる。また骨格筋の増加から、家畜の労働力を改良することができる。
以下、本発明の実施例を示すが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
【実施例】
【００９６】
実施例１：フォリスタチン変異体ポリペプチド発現ベクターの作製
ヒト精巣cDNAライブラリー〔クロンテック（Clontech）社製〕から、ブタフォリスタチン前駆体cDNAをプローブとしたハイブリダイゼーションによりクローン化された、ヒトフォリスタチン前駆体cDNA〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 4218, (1988)〕を、プラスミドpUC19（宝酒造社製）中のEcoRI部位とXbaI部位の間に挿入し、フォリスタチン変異体用の鋳型pUC19/FSを作製した。
【００９７】
0.2 mmol/l dNTPs、1 mmol/l塩化マグネシウムを含む反応液に、フォリスタチン変異体用の鋳型を100 ng、そしてプライマーとして、配列番号11および配列番号12に示した塩基配列を有する合成DNA〔ジェンセット（Genset）社製〕をそれぞれ10 pmolずつ加え、さらに2.5単位のTaqポリメラーゼ（TaKaRa Ex Taq；宝酒造社製）を添加して、合計25μlとし、PCRを行った。反応条件は、94℃ 30秒間、74℃ 15秒間、72℃ 30秒間のサイクルを3サイクル、94℃ 30秒間、70℃ 15秒間、72℃ 30秒間のサイクルを3サイクル、94℃ 30秒間、66℃ 15秒間、72℃ 30秒間のサイクルを3サイクル、94℃ 30秒間、62℃ 15秒間、72℃ 30秒間のサイクルを3サイクル、94℃ 30秒間、58℃ 15秒間、72℃ 30秒間のサイクルを3サイクル、94℃ 30秒間、54℃ 15秒間、72℃ 30秒間のサイクルを12サイクル、その後、72℃ 10分間を1サイクルで行った。該反応液を１％アガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.25kbの遺伝子増幅断片Aを回収した（図２）。遺伝子増幅断片Aがコードするアミノ酸配列には、配列番号４の95〜168番目の配列が含まれ、ヒトフォリスタチンのFSIを含む。
【００９８】
プライマーとして、配列番号13および配列番号14に示した塩基配列を有する合成DNA（ジェンセット社製）をそれぞれ10 pmolずつ用いて、上記の遺伝子増幅断片Aと同様の条件でPCRを行い、反応液を1％アガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.6kbの遺伝子増幅断片Bを回収した（図３）。遺伝子増幅断片Bがコードするアミノ酸配列には、配列番号４の1〜166番目の配列が含まれ、ヒトフォリスタチンのFSNおよびFSIを含む。
【００９９】
得られた遺伝子増幅断片AおよびBをそれぞれ、pGEM-T Easy TAクローニングキット〔プロメガ（Promega）社製〕を用いて添付の説明書に従って、pGEM-T Easyベクターに連結し、図２および図３に示すプラスミドpGEM-T Easy (A)およびpGEM-T Easy (B)を得た。
【０１００】
次にプラスミドpGEM-T Easy (B)を制限酵素EcoRI（宝酒造社製）およびHindIII（宝酒造社製）で切断して得られる増幅断片Bを含む約0.59kbのEcoRI-HindIII断片(B)およびプラスミドpBluescript SK (-)〔ストラタジーン（Stratagene）社製〕をEcoRIおよびHindIIIで切断して得られる約2.95kbのEcoRI-HindIII断片を連結し、図４に示すプラスミドpBluescript SK (-) (B)を調製した。
【０１０１】
次に、プラスミドpGEM-T Easy (A)を制限酵素HindIIIおよびSalI（宝酒造社製）で切断して得られる増幅断片Aを含む約0.27kbのHindIII-SalI断片(A)、およびプラスミドpBluescript SK (-) (B)をHindIIIおよびSalIで切断して得られる約3.54kbのHind III-Sal I断片(B)を連結し、図５に示すプラスミドpBluescript SK (-) (A+B)を調製した。
【０１０２】
次に、プラスミドpBluescript SK (-) (A+B)を制限酵素EcoRIおよびSpeI（宝酒造社製）で切断して得られる増幅断片AおよびBを含む約0.84kbのEco RI-Spe I断片(A+B)、および動物細胞発現用プラスミドpcDNA3（インビトロジェン社製）をEcoRIおよびXbaI（宝酒造社製）で切断して得られる約5.4kbのEcoRI-XbaI断片を連結し、図６に示したフォリスタチン変異体ポリペプチド発現ベクターpcDNA3 (A+B)を得た。pcDNA3 (A+B)に含まれるフォリスタチン変異体ポリペプチドをコードする領域の塩基配列を配列番号15に、該ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号16に示す。配列番号16の１から29番目のアミノ酸配列はシグナルペプチドであり、ポリぺプチドの分泌時には切断される。したがって、pcDNA3 (A+B)を導入した動物細胞は配列番号６のアミノ酸配列からなるフォリスタチン変異体ポリペプチド（以下、FS1-1とよぶ）を分泌する。FS1-1はヒトフォリスタチンのFSNおよび２つのFSIを含むが、FSIIおよびFSIIIは欠失しているフォリスタチン変異体ポリペプチドである。
【０１０３】
また、pBluescript SK (-) (B)をEcoRIおよびXhoIで切断して得られる、増幅断片Bを含む約0.6 kbのEcoRI-XhoI断片および、動物細胞発現用プラスミドpcDNA3をEcoRIおよびXhoIで切断して得られる約5.4kbのEcoRI-XhoI断片を連結し、図７に示すフォリスタチン変異体ポリペプチド発現ベクターpcDNA3 (B)を得た。pcDNA3 (B)に含まれるフォリスタチン変異体ポリペプチドをコードする領域の塩基配列を配列番号17に、該ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号18に示す。配列番号18の１から29番目のアミノ酸配列はシグナルペプチドであり、ポリぺプチドの分泌時には切断される。したがって、pcDNA3 (B)を導入した動物細胞は配列番号８のアミノ酸配列からなるフォリスタチン変異体ポリペプチド（以下、FS1とよぶ）を分泌する。FS1はヒトフォリスタチンのFSNおよび１つのFSIを含むが、FSIIおよびFSIIIは欠失しているフォリスタチン変異体ポリペプチドである。
【０１０４】
また、フォリスタチン変異体用の鋳型をEcoRIで切断して得られるヒトフォリスタチン前駆体cDNAを含む約1.1 kbのEcoRI断片をプラスミドpBluescript SK (-)のEcoRI部位に挿入し、図８に示すpBluescript SK (-) /FSを得た。得られたプラスミドpBluescript SK (-) /FSを、EcoRVおよびXhoIで切断して得られる約0.4 kbのEcoRV-XhoI断片Cおよび、プラスミドpBluescript SK (-) (A+B)をEcoRVおよびXhoIで切断して得られる約3.8 kbのEcoRV-XhoI断片を連結し、図９に示すプラスミドpBluescript SK (-) (A+B+C)を調製した。
【０１０５】
次に、pBluescript SK (-) (A+B+C)をEcoRIおよびXhoIで切断して得られる、約1.2 kbのEcoRI-XhoI断片および、動物細胞発現用プラスミドpcDNA3をEcoRIおよびXhoIで切断して得られる約5.4kbのEcoRI-XhoI断片を連結し、図１０に示すフォリスタチン変異体ポリペプチド発現ベクターpcDNA3 (A+B+C)を得た。pcDNA3 (A+B+C)に含まれるフォリスタチン変異体ポリペプチドをコードする領域の塩基配列を配列番号19に、該ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号20に示す。配列番号20のの１から29番目のアミノ酸配列はシグナルペプチドであり、ポリぺプチドの分泌時には切断される。したがって、pcDNA3 (A+B+C)を導入した動物細胞は配列番号10のアミノ酸配列からなるフォリスタチン変異体ポリペプチド（以下、FS1-1-3とよぶ）を分泌する。FS1-1-3はヒトフォリスタチンのFSNおよび２つのFSIおよびFS3のほぼ全体を含むが、FSIIは欠失しているフォリスタチン変異体ポリペプチドである。
【０１０６】
また、マウスFLRG cDNA 〔J. Biol. Chem., 275, 40788 (2000)〕を鋳型とし、プライマーとして、配列番号21および配列番号22に示した塩基配列を有する合成DNA（ジェンセット社製）をそれぞれ10 pmolずつ用いて、上記の遺伝子増幅断片Aと同様の条件でPCRを行い、反応液を1％アガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.3kbの遺伝子増幅断片Dを回収した（図１１）。該遺伝子増幅断片がコードするアミノ酸配列には、マウスFLRGの（NCBI蛋白質データベース：登録番号BAB32663）の165〜256番目のアミノ酸配列を含み、マウスFLRGのFSII様ドメイン（NCBI蛋白質データベース：登録番号BAB32663の169〜241番目の領域）が含まれる。図１４に示すように、マウスFLRGのFSII様ドメインはマウスフォリスタチンのFSIIとアミノ酸配列で56％（41/73）の相同性を、配列番号２のアミノ酸配列とは61.6％（45/73）の相同性を有する。
【０１０７】
得られた遺伝子増幅断片DをEcoRIで切断し、pBluescript SK (-)のEcoRI部位に挿入し、図１１に示すpBluescript SK (-) (D)を得た。得られたプラスミドpBluescript SK (-) (D)をEcoRVおよびXhoIで切断して得られる約0.3 kbのEcoRV-XhoI断片、およびプラスミドpBluescript SK (-) (A+B)をEcoRVおよびXhoIで切断して得られる約3.8 kbのEcoRV-XhoI断片を連結し、図１２に示すプラスミドpBluescript SK (-) (A+B+D)を調製した。
【０１０８】
次に、pBluescript SK (-) (A+B+D)をEcoRIおよびXhoIで切断して得られる、約1.1 kbのEcoRI-XhoI断片および、動物細胞発現用プラスミドpcDNA3をEcoRIおよびXhoIで切断して得られる約5.4kbのEcoRI-XhoI断片を連結し、図１３に示すフォリスタチン変異体ポリペプチド発現ベクターpcDNA3 (A+B+D)を得た。pcDNA3 (A+B+D)に含まれるフォリスタチン変異体ポリペプチドをコードする領域の塩基配列を配列番号23に、該ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号24に示す。配列番号24の１から29番目のアミノ酸配列はシグナルペプチドであり、ポリぺプチドの分泌時には切断される。したがって、pcDNA3 (A+B+D)を導入した動物細胞は配列番号25のアミノ酸配列からなるフォリスタチン変異体ポリペプチド（以下、FS1-1-2'とよぶ）を分泌する。FS1-1-2'はヒトフォリスタチンのFSNおよび２つのFSIを含み、FSIIの代わりにマウスFLRGのFSII様ドメインを含むフォリスタチン変異体ポリペプチドである。
【０１０９】
実施例２：フォリスタチン変異体ポリペプチドの動物細胞を用いた発現と精製
（１）COS-7細胞への発現ベクターの導入と培養
実施例1で得られたフォリスタチン変異体ポリペプチド発現ベクターpcDNA3 (A+B)、pcDNA3 (B)、pcDNA3 (A+B+C)、pcDNA3 (A+B+D)を用いてフォリスタチン変異体ポリペプチドの動物細胞での発現を以下のようにして行った。
【０１１０】
1×106細胞のCOS-7（ATCC CRL-1651）細胞あたり20μgのプラスミドpcDNA3 (A+B)をエレクトロポレーション法（Cytotechnology, 3, 133 (1990)）により導入した後、ウシ胎児血清（FCS）を10％添加したダルベッコ改変イーグル培地〔DMEM；シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）社製〕10 mlに懸濁し、10 cm径細胞培養ディッシュ〔コーニング（Corning）社製〕に播種した。5％ CO2インキュベーター内で37℃、24時間培養した後、10 mlのDMEMへ培地交換し、3日間培養した。細胞培養ディッシュ６枚で上記の培養を行い、培養上清約60 mlを回収した。pcDNA3 (B)、pcDNA3 (A+B+C)およびpcDNA3 (A+B+D)についても同様にCOS-7細胞に導入して培養を行い、それぞれ培養上清約60mlを回収した。
【０１１１】
（２）フォリスタチン変異体ポリペプチドの精製と検出
（１）で得られた４種類のフォリスタチン変異体ポリペプチドそれぞれを発現するCOS-7細胞の約60 mlの培養上清を20 mmol/L Tris-HCl (pH7.2), 0.3 mol/L NaCl, 0.03％ 3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート（CHAPS）で平衡化した2 mlの硫酸化セルロファインカラム（生化学工業社製）に通塔した。その後、計20 mlの20 mmmol/L Tris-HCl (pH7.2), 0.3 mol/L NaCl, 0.03％ CHAPS、続いて計6 mlの20 mmmol/L Tris-HCl (pH7.2), 0.5 mol/L NaCl, 0.03％ CHAPSでカラムを洗浄した。その後、計10mlの20mmmol/L Tris-HCl (pH7.2), 1.0mol/L NaCl, 0.03％ CHAPSを用いて吸着タンパク質をカラムから溶出させた。この溶出液をウルトラフリー-15（Ultrafree-15）遠心式フィルターユニット（バイオマックス-10メンブレン装着ユニット；ミリポア社製）を用いて添付の説明書に従って濃縮し、200μlのフォリスタチン変異体ポリペプチド溶液を得た。
【０１１２】
ヒトフォリスタチンのFSIの部分配列である、配列番号26のアミノ酸配列からなるペプチドを化学合成し、このペプチドを抗原として、常法〔Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)〕に従ってウサギを免役し、抗体価の上昇したウサギから血清を採取し、ウサギ抗フォリスタチンポリクローナル抗体とした。該抗体のクラスはIgGであった。
【０１１３】
得られた各フォリスタチン変異体ポリペプチドを公知の方法〔Nature, 227, 680 (1970)〕に従ってSDS-PAGEに供した。泳動タンパク質を膜（Immobilon P；Millipore社製）に転写し、5％スキムミルク（ナカライテスク社製）で膜をブロッキングした後、ウサギ抗フォリスタチンポリクローナル抗体と反応させた。検出は、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ラット抗ウサギIgG抗体〔ケミコン（Chemicon）社製〕および化学発光試薬（ECL検出試薬；アマシャム・バイオサイエンシズ社製）を用いて行った。各フォリスタチン変異体ポリペプチドとも、ウサギ抗フォリスタチンポリクローナル抗体により検出された。
【０１１４】
図１５にFS1-1のウェスタンブロット解析を示した。FS1-1は254個のアミノ酸からなり、推定分子量は約27kDである。一方、ウエスタンブロット解析で得られた分子量は31kD、33kD、37kDである。FS1-1には糖鎖付加サイトがあることから、糖鎖の付加によって分子量が大きくなったものと考えられる。
【０１１５】
実施例３：レポーターアッセイによるフォリスタチン変異体ポリペプチドのアクチビンおよびGDF-8機能阻害活性の検定
HEK293細胞（ATCC番号：CRL-1573）を24ウェルプレートに5×104細胞／ウェルで播種し、10％FCS、ペニシリン（100単位/ml）およびストレプトマイシン（100μg/ml）を添加した高グルコース含有DMEM培地（シグマーアルドリッチ社製）（以下、血清含有DMEM培地とする）1 ml中で24時間培養した。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、レポータープラスミド(CAGA)12-MLP-Luc〔EMBO J., 17, 3091 (1998)〕（3μg／ウェル）および内部標準プラスミドCMV-β-gal（1μg／ウェル）をトランスフェクションした。トランスフェクションはプラスミドとカチオン性リポソーム（Transfast；プロメガ社製）の混合液を添加した血清不含DMEM培地（200μl）中で、細胞を2時間37℃で培養することにより行った。さらに血清含有DMEM培地（1 ml）を添加し、37℃で24時間培養した。
【０１１６】
細胞をPBSで洗浄した後、（ａ）アクチビン（10 ng/ml）、（ｂ）GDF-8（15 ng/ml）、（ｃ）アクチビン（10 ng/ml）とフォリスタチン（100 ng/ml）、（ｄ）GDF-8（15 ng/ml）とフォリスタチン（100 ng/ml）、（ｅ）アクチビン（10 ng/ml）とフォリスタチン変異体ポリペプチドFS1-1溶液5μl、もしくは（ｆ）GDF-8（15 ng/ml）とフォリスタチン変異体ポリペプチドFS1-1溶液5μlをそれぞれ含む血清不含DMEM培地200μl／ウェルを添加し、37℃で24時間培養した。PBSで洗浄した後、細胞溶解用緩衝液〔1％(v/v)トリトンX-100、15 mmol/l MgSO4、4 mmol/lエチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-４酢酸、1 mmol/l DL-ジチオスレイトール、25 mmol/lグリシルグリシン、pH 7.0〕を100μl／ウェル添加し、0℃で15分間放置し、細胞溶解液を調製した。細胞溶解液50μlをルシフェラーゼアッセイ用緩衝液〔0.24 mmol/l ルシフェリン、1.4 mmol/l ATP、4.8 mmol/l KH2PO4、4.8 mmol/l MgCl2、pH 7.4〕105μlと混合し、発光量をルミノメータ〔マイクロルーマット（MicroLumat）LP98P；ベルトルード（BERTHOLD）社製〕を用いて測定した。反応開始から20秒間の相対光度（RLU）値を積算し、ルシフェラーゼ活性とした。続いて細胞溶解液35μlをβ−ガラクトシダーゼアッセイ用緩衝液〔1.6 mg/ml o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシド、60 mmol/l Na2HPO4、40 mmol/l NaH2PO4、10 mmol/l KCl、1 mmol/l MgCl2、50 mmol/lβ−メルカプトエタノール〕235μlと混合し、吸光度（OD）を吸光度計〔マイクロプレートリーダー・ベンチマーク（Microplate Reader Benchmark）；バイオラッド（BIO-RAD）社製〕を用いて測定した。以下の式によって与えられる値を標準化ルシフェラーゼ活性とし、転写促進活性の指標とした。
標準化ルシフェラーゼ活性  ＝  RLU／OD
【０１１７】
測定結果を図１６に示す。フォリスタチンは、アクチビンおよびGDF-8による標準化ルシフェラーゼ活性の上昇をいずれも100％阻害した。一方、フォリスタチン変異体ポリペプチドは、GDF-8による標準化ルシフェラーゼ活性の上昇を86％阻害したのに対して、アクチビンによる標準化ルシフェラーゼ活性の上昇を17％しか阻害しなかった。
【０１１８】
フォリスタチン変異体ポリペプチドFS1、FS1-1-3およびFS1-1-2'についても、上記のFS1-1と同様なアッセイを行った。その結果、図１７および図１８に示すように、FS1、FS1-1-3はFS1-1と同様に、GDF-8による標準化ルシフェラーゼ活性の上昇をほぼ完全に阻害したのに対して、アクチビンによる標準化ルシフェラーゼ活性の上昇はほとんど阻害しなかった。ただし、FS1はFS1-1よりも、またFS1-1-3はFS1よりも、アクチビンによる標準化ルシフェラーゼ活性の上昇を阻害する程度がやや強く、３種類の中ではFS1-1が最も選択的にGDF-8の活性を阻害することがわかった。したがって、選択的にGDF-8の活性を阻害するためには、フォリスタチン変異体ポリペプチドにおいて、FSIの数は２個以上ある方がよく、FSIIだけでなくFSIIIも欠失している方が好ましいことがわかった。また、FS1-1-2'はGDF-8による標準化ルシフェラーゼ活性の上昇だけでなく、アクチビンによる標準化ルシフェラーゼ活性の上昇も阻害した。したがって、選択的にGDF-8の活性を阻害するためには、フォリスタチン変異体ポリペプチドにおいて、FSIIおよびFSII様ドメインを有しないことが好ましいことがわかった。
【０１１９】
実施例４：フォリスタチン変異体ポリペプチドを過剰発現させたマウスの骨格筋量の増大および脂肪量の減少
実施例１で作製したpcDNA3 (A+B)をEcoRIおよびSacIで切断して得られる、フォリスタチン変異体ポリペプチドFS1-1をコードするDNAを含むEcoRI-SacI断片を、ベクターpSP72（プロメガ社製）のEcoRI部位およびSacI部位の間に挿入した。得られたプラスミドをEcoRIおよびSmaIで切断して得られる、フォリスタチン変異体ポリペプチドFS1-1をコードするDNAを含むEcoRI-SacI断片を、MDAF2ベクター〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 9306 (2001)〕のミオシン軽鎖のプロモーターの下流に存在するEcoRI部位およびSacI部位の間に挿入し、プラスミドMDAF2-FS1-1を得た。
【０１２０】
MDAF2-FS1-1の約3.7 kbpのClaI断片を単離し、BDF1マウスの受精卵221個に顕微注入した。状態の良好な受精卵をレシピエントマウスに移植し、自然出産させ、33匹の産仔を得た。ゲノムDNA中にMDAF2-FS1-1由来のDNAが導入されていることが確認されたトランスジェニックマウスの系統を維持した。該トランスジェニックマウスは、ミオシン軽鎖のプロモーターによりフォリスタチン変異体ポリペプチドFS1-1を骨格筋特異的に過剰発現する。このようにして得られたトランスジェニックマウスでは、骨格筋の明らかな増加が観察された。例として、14週齢のオスのトランスジェニックマウスと野生型マウスの大胸筋、大殿筋、上腕二頭筋を採取し、重量を測定した結果を図１９に示す。野生型マウスと比較してトランスジェニックマウスでは、測定した全ての骨格筋の重量が増加していた。
さらに、このようにして得られたトランスジェニックマウスの、皮下脂肪および内臓脂肪の量を測定し、フォリスタチン変異体ポリペプチドがこれらの脂肪量に与える影響を調べた。皮下脂肪としては鼠径部の皮下脂肪、内臓脂肪としては腎臓周囲の脂肪、それぞれの重量を測定し、体重に対する割合（％）を量の指標とした。その結果、トランスジェニックマウスでは、皮下脂肪量および内臓脂肪量ともに、野生型マウスと比較して著しく減少していることがわかった。例として、図２０に12週齢のメスのトランスジェニックマウスおよび12週齢のメスの野生型マウスそれぞれの、体重に対する皮下脂肪量（％）および内臓脂肪量（％）を示した。野生型マウスは３匹の平均値を示した。また、オスのトランスジェニックマウスでも同様に、皮下脂肪量および内臓脂肪量の著しい減少が見られた。なお、トランスジェニックマウスでは、骨格筋の増加と脂肪の減少以外の異常は観察されなかった。
【０１２１】
実施例５：フォリスタチン変異体ポリペプチドとイムノグロブリン定常領域との融合蛋白質によるGDF-8特異的な機能阻害
（１）フォリスタチン変異体ポリペプチドとイムノグロブリン定常領域との融合蛋白質の発現ベクターの作製
フォリスタチン変異体ポリペプチドFS1およびFS1-1それぞれとイムノグロブリンの定常領域との融合蛋白質の発現ベクターを以下のようにして作製した。
実施例１で作製したpGEM-T Easy (B)を鋳型にして、プライマーとして配列番号27および28に示した塩基配列を有する合成DNA（ジェンセット社製）をそれぞれ10 pmolずつ用いて、実施例１の遺伝子増幅断片Aと同様の条件でPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、5'端にKpnIサイト、3'端にBamHIサイトがそれぞれ付加されたFS1をコードする増幅断片を回収した。得られた増幅断片をKpnIおよびBamHIで切断し、CD5-IgG1ベクター〔Cell, 61, 1303 (1990)〕を制限酵素KpnIおよびBamHIで切断して得られるヒトIgG1定常領域をコードするゲノム配列を含むKpnI-BamHI断片と連結し、FS1のC末端にヒトIgG1の定常領域が融合した融合蛋白質（以下、FS1-Fcとよぶ）発現プラスミドpcDNA3 FS1-Fcを作製した。CD5-IgG1ベクターでは、ベクターpcDNA3のプロモーターの下流のXhoIサイト−XbaIサイト間にヒトIgG1定常領域をコードする配列が挿入されているので、pcDNA3 FS1-Fcは、pcDNA3のプロモーターの下流に、FS1-Fcをコードする配列が挿入された構造を有する。
【０１２２】
実施例１で作製したpBluscript (A+B)をEcoRIおよびEcoRVで切断して得られるFS1-1をコードする配列を含む断片を、ベクターpSP72（プロメガ社製）のEcoRIサイト−SmaIサイト間に挿入した。得られたプラスミドをEcoRIおよびBamHIで切断して得られるFS1-1をコードする配列を含む断片を、pBluescript SK(-)のEcoRIサイト−bamHIサイト間に挿入した。得られたプラスミドをKpnIKpnIおよびBamHIで切断して得られるFS1-1をコードする配列を含む断片を、CD5-IgG1ベクターを制限酵素KpnIおよびBamHIで切断して得られるヒトIgG1定常領域をコードするゲノム配列を含むKpnI-BamHI断片と連結し、FS1-1のC末端にヒトIgG1の定常領域が融合した融合蛋白質（以下、FS1-1-Fcとよぶ）発現プラスミドpcDNA3 FS1-1-Fcを作製した。pcDNA3 FS1-1-Fcは、pcDNA3のプロモーターの下流に、FS1-1-Fcをコードする配列が挿入された構造を有する。
【０１２３】
（２）CHO-K1細胞への発現ベクターの導入と培養
CHO-K1（ATCC番号：CCL-61）細胞にpcDNA3 FS1-FcまたはpcDNA3 FS1-1-Fcそれぞれをリポソーム試薬Transfast（プロメガ社製）を用いて導入した後、安定に導入した遺伝子が組み込まれたシングルクローンを得た。それぞれのシングルクローンをFCSを10％添加したαMEM培地10 mlに懸濁し、10 cm径細胞培養ディッシュに播種した。5％ CO2インキュベーター内で37℃、コンフルエントになるまで培養した後、EX-CELL 301培地（JRHバイオサイエンシズ社製）へ培地交換して、細胞培養ディッシュ６枚で１週間培養し、培養上清約60 mlを回収した。
【０１２４】
（３）FS1-FcおよびFS1-1-Fcの精製
（２）で得られたFS1-Fc、FS1-1-Fcそれぞれを発現するCHO-K1細胞の培養上清に1/10量のヘパリンセルロファイン（生化学工業社製）を加えて、室温で２時間混合し、蛋白質を吸着させた。ヘパリンセルロファインを洗浄バッファー〔20 mmmol/L Tris-HCl (pH7.4), 0.15 mol/L NaCl〕で洗浄後、溶出バッファー〔20 mmmol/L Tris-HCl (pH7.4), 1.5 mol/L NaCl〕を用いて吸着蛋白質を溶出させた。得られた溶出液から、イムノグロブリンの定常領域と特異的に結合するプロテインＡ固定化レジンを用いて、常法に従って、FS1-Fc溶液およびFS1-1-Fc溶液それぞれを得た。
【０１２５】
（４）FS1-FcおよびFS1-1-FcのアクチビンおよびGDF-8機能阻害活性の検定
（ａ）緩衝液のみ、（ｂ）FS1-Fc（20 μg/ml）（ｃ）アクチビン（15 ng/ml）、（ｄ）アクチビン（15 ng/ml）とFS1-Fc（20 μg/ml）、（ｅ）GDF-8（15 ng/ml）、（ｆ）GDF-8（15 ng/ml）とFS1-Fc（10 μg/ml）および（ｇ）GDF-8（15 ng/ml）とFS1-Fc（20 μg/ml）それぞれの条件で、実施例３と同様にしてレポーターアッセイにより、FS1-FcのアクチビンおよびGDF-8機能阻害活性の検定を行った。図２１に示すように、FS1-FcはGDF-8による標準化ルシフェラーゼ活性の上昇をほぼ完全に阻害したのに対して、アクチビンによる標準化ルシフェラーゼ活性の上昇はほとんど阻害しなかった。
【０１２６】
同様にして、（ａ）緩衝液のみ、（ｂ）FS1-1-Fc（20 μg/ml）（ｃ）アクチビン（15 ng/ml）、（ｄ）アクチビン（15 ng/ml）とFS1-1-Fc（20 μg/ml）、（ｅ）GDF-8（15 ng/ml）、および（ｆ）GDF-8（15 ng/ml）とFS1-Fc（20 μg/ml）それぞれの条件で、FS1-1-FcのアクチビンおよびGDF-8機能阻害活性の検定を行った。図２２に示すように、FS1-1-FcはGDF-8による標準化ルシフェラーゼ活性の上昇をほぼ完全に阻害したのに対して、アクチビンによる標準化ルシフェラーゼ活性の上昇はほとんど阻害しなかった。
【０１２７】
以上から、フォリスタチン変異体ポリペプチドとイムノグロブリンの定常領域の融合蛋白質であるFS1-FcおよびFS1-1-Fcは、FS1およびFS1-1と同様に、選択的にGDF-8の活性を阻害できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１はヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ニワトリの各フォリスタチンのアミノ酸配列の比較、およびFSIとFSIIのコンセンサス配列を示す。FSN、FSI、FSIIおよびFSIIIの各ドメインに相当する領域を上の線で、各フォリスタチンドメインで保存されているシステイン残基を点で示した。
【図２】図２はプラスミドpGEM-T Easy (A)の造成工程を示す。
【図３】図３はプラスミドpGEM-T Easy (B)の造成工程を示す。
【図４】図４はプラスミドpBluescript SK (-) (B)の造成工程を示す。
【図５】図５はプラスミドpBluescript SK (-) (A+B)の造成工程を示す。
【図６】図６はプラスミドpcDNA3 (A+B)の造成工程を示す。
【図７】図７はプラスミドpcDNA3 (B)の造成工程を示す。
【図８】図８はプラスミドpBluescript SK(-)/FSの造成工程を示す。
【図９】図９はプラスミドpBluescript SK(-) (A+B+C)の造成工程を示す。
【図１０】図９はプラスミドpcDNA3 (A+B+C)の造成工程を示す。
【図１１】図１１はプラスミドpBluescript SK (-) (D)の造成工程を示す。
【図１２】図１２はプラスミドpcDNA3 (A+B+D)の造成工程を示す。
【図１３】図１３はプラスミドpcDNA3 (A+B+D)の造成工程を示す。
【図１４】図１４はマウスフォリスタチンのFSIIとマウスFLRGのFSII様ドメインのアミノ酸配列の比較を示す。一致するアミノ酸は｜を示した。
【図１５】図１５はFS1-1のウエスタンブロッティングによる検出を示す。
【図１６】図１６はFS1-1のアクチビンおよびGDF-8の活性の阻害を測定するレポーターアッセイの結果を示す。
【図１７】図１７は各種フォリスタチン変異体のアクチビンの活性の阻害を測定するレポーターアッセイの結果を示す。＋で示したポリペプチドをそれぞれ添加した。
【図１８】図１８は各種フォリスタチン変異体のGDF-8の活性の阻害を測定するレポーターアッセイの結果を示す。＋で示したポリペプチドをそれぞれ添加した。
【図１９】図１９はFS1-1遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの各種骨格筋の量の増大を示す。
【図２０】図２０はFS1-1遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの、体重に対する皮下脂肪および腎臓の内臓脂肪それぞれの重量の割合の減少を示す。
【図２１】図２１はFS1-FcのアクチビンおよびGDF-8の活性の阻害を測定するレポーターアッセイの結果を示す。
【図２２】図２２はFS1-1-FcのアクチビンおよびGDF-8の活性の阻害を測定するレポーターアッセイの結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１２９】
SEQUENCE LISTING
<110>  Techno Network Shikoku Co., Ltd.
<110>  Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
<120>  follistatin mutant polypeptide
<130>  A41939A
<150>  JP 2004-120023
<151>  2004-04-15
<160>  29 
<170>  PatentIn version 3.2
<210>  1
<211>  70
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  follistatin domain I consensus sequence
<220>
<221>  misc feature
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa is Glu or Asp
<220>
<221>  misc feature
<222>  (13)..(13)
<223>  Xaa is Arg or Lys
<220>
<221>  misc feature
<222>  (69)..(69)
<223>  Xaa is Lys or Arg
<220>
<223>  Inventor: Tsuchida, Kunihiro; Murakami, Tatsuya
<400>  1
Cys Xaa Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Xaa Met Asn Lys 
1               5                   10                  15
Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr 
20                  25                  30
Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu 
35                  40                  45
Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val 
50                  55                  60
Gln Tyr Gln Gly Xaa Cys 
65                  70
<210>  2
<211>  72
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  follistatin domain II consensus sequence
<220>
<221>  misc feature
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid except cysteine
<220>
<221>  misc feature
<222>  (33)..(33)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid except cysteine
<220>
<221>  misc feature
<222>  (35)..(35)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid except cysteine
<220>
<221>  misc feature
<222>  (38)..(38)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid except cysteine
<220>
<221>  misc feature
<222>  (45)..(45)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid except cysteine
<220>
<221>  misc feature
<222>  (48)..(48)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid except cysteine
<400>  2
Cys Arg Asp Val Xaa Cys Pro Gly Ser Ser Thr Cys Val Val Asp Gln 
1               5                   10                  15
Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro 
20                  25                  30
Xaa Ser Xaa Glu Gln Xaa Leu Cys Gly Asn Asp Gly Xaa Thr Tyr Xaa 
35                  40                  45
Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile 
50                  55                  60
Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys 
65                  70
<210>  3
<211>  1035
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(1035)
<220>
<221>  sig peptide
<222>  (1)..(87)
<400>  3
atg gtc cgc gcg agg cac cag ccg ggt ggg ctt tgc ctc ctg ctg ctg       48
Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu 
1               5                   10                  15
ctg ctc tgc cag ttc atg gag gac cgc agt gcc cag gct ggg aac tgc       96
Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys 
20                  25                  30
tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg tac aag acc      144
Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr 
35                  40                  45
gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg agc acc tcg      192
Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser 
50                  55                  60
tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag tgg atg att      240
Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile 
65                  70                  75                  80
ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa acg tgt gag      288
Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu 
85                  90                  95
aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac      336
Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn 
100                 105                 110 
aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag      384
Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys 
115                 120                 125 
ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca      432
Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala 
130                 135                 140 
ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac      480
Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr 
145                 150                 155                 160 
caa ggc aga tgt aaa aag act tgt cgg gat gtt ttc tgt cca ggc agc      528
Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser 
165                 170                 175 
tcc aca tgt gtg gtg gac cag acc aat aat gcc tac tgt gtg acc tgt      576
Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys 
180                 185                 190 
aat cgg att tgc cca gag cct gct tcc tct gag caa tat ctc tgt ggg      624
Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly 
195                 200                 205 
aat gat gga gtc acc tac tcc agt gcc tgc cac ctg aga aag gct acc      672
Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr 
210                 215                 220 
tgc ctg ctg ggc aga tct att gga tta gcc tat gag gga aag tgt atc      720
Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys Ile 
225                 230                 235                 240 
aaa gca aag tcc tgt gaa gat atc cag tgc act ggt ggg aaa aaa tgt      768
Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys 
245                 250                 255 
tta tgg gat ttc aag gtt ggg aga ggc cgg tgt tcc ctc tgt gat gag      816
Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu 
260                 265                 270 
ctg tgc cct gac agt aag tcg gat gag cct gtc tgt gcc agt gac aat      864
Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn 
275                 280                 285 
gcc act tat gcc agc gag tgt gcc atg aag gaa gct gcc tgc tcc tca      912
Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser 
290                 295                 300 
ggt gtg cta ctg gaa gta aag cac tcc gga tct tgc aac tcc att tcg      960
Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser 
305                 310                 315                 320 
gaa gac acc gag gaa gag gag gaa gat gaa gac cag gac tac agc ttt     1008
Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe 
325                 330                 335 
cct ata tct tct att cta gag tgg taa                                 1035
Pro Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp 
340 
<210>  4
<211>  344
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  SIGNAL
<222>  (1)..(29)
<400>  4
Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu 
1               5                   10                  15
Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys 
20                  25                  30
Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr 
35                  40                  45
Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser 
50                  55                  60
Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile 
65                  70                  75                  80
Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu 
85                  90                  95
Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn 
100                 105                 110 
Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys 
115                 120                 125 
Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala 
130                 135                 140 
Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr 
145                 150                 155                 160 
Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser 
165                 170                 175 
Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys 
180                 185                 190 
Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly 
195                 200                 205 
Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr 
210                 215                 220 
Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys Ile 
225                 230                 235                 240 
Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys 
245                 250                 255 
Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu 
260                 265                 270 
Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn 
275                 280                 285 
Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser 
290                 295                 300 
Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser 
305                 310                 315                 320 
Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe 
325                 330                 335 
Pro Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp 
340 
<210>  5
<211>  678
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  FS-1-1
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(678)
<400>  5
ggg aac tgc tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg       48
Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu 
1               5                   10                  15
tac aag acc gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg       96
Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu 
20                  25                  30
agc acc tcg tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag      144
Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys 
35                  40                  45
tgg atg att ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa      192
Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu 
50                  55                  60
acg tgt gag aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac      240
Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn 
65                  70                  75                  80
aag aag aac aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc      288
Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile 
85                  90                  95
acc tgg aag ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat      336
Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn 
100                 105                 110 
gaa tgt gca ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa      384
Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu 
115                 120                 125 
gtc cag tac caa ggc aga tgt aaa aag ctt tgt gag aac gtg gac tgt      432
Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys 
130                 135                 140 
gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac aaa ccc cgc tgc      480
Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys 
145                 150                 155                 160 
gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag ggt cca gtc tgc      528
Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys 
165                 170                 175 
ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca ctc cta aag gca      576
Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala 
180                 185                 190 
aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac caa ggc aga tgt      624
Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys 
195                 200                 205 
aaa aag act tgt gaa gat atc tcg agg caa tca cta gag ggc cct att      672
Lys Lys Thr Cys Glu Asp Ile Ser Arg Gln Ser Leu Glu Gly Pro Ile 
210                 215                 220 
cta tag                                                              678
Leu 
225 
<210>  6
<211>  225
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  FS-1-1
<400>  6
Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu 
1               5                   10                  15
Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu 
20                  25                  30
Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys 
35                  40                  45
Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu 
50                  55                  60
Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn 
65                  70                  75                  80
Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile 
85                  90                  95
Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn 
100                 105                 110 
Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu 
115                 120                 125 
Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys 
130                 135                 140 
Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys 
145                 150                 155                 160 
Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys 
165                 170                 175 
Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala 
180                 185                 190 
Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys 
195                 200                 205 
Lys Lys Thr Cys Glu Asp Ile Ser Arg Gln Ser Leu Glu Gly Pro Ile 
210                 215                 220 
Leu 
225 
<210>  7
<211>  480
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  FS-1
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(480)
<400>  7
ggg aac tgc tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg       48
Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu 
1               5                   10                  15
tac aag acc gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg       96
Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu 
20                  25                  30
agc acc tcg tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag      144
Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys 
35                  40                  45
tgg atg att ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa      192
Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu 
50                  55                  60
acg tgt gag aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac      240
Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn 
65                  70                  75                  80
aag aag aac aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc      288
Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile 
85                  90                  95
acc tgg aag ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat      336
Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn 
100                 105                 110 
gaa tgt gca ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa      384
Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu 
115                 120                 125 
gtc cag tac caa ggc aga tgt aaa aag ctt atc gat acc gtc gac ctc      432
Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Ile Asp Thr Val Asp Leu 
130                 135                 140 
gag cat gca tct aga ggg ccc tat tct ata gtg tca cct aaa tgc tag      480
Glu His Ala Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys 
145                 150                 155 
<210>  8
<211>  159
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  FS-1
<400>  8
Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu 
1               5                   10                  15
Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu 
20                  25                  30
Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys 
35                  40                  45
Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu 
50                  55                  60
Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn 
65                  70                  75                  80
Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile 
85                  90                  95
Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn 
100                 105                 110 
Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu 
115                 120                 125 
Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Ile Asp Thr Val Asp Leu 
130                 135                 140 
Glu His Ala Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys 
145                 150                 155 
<210>  9
<211>  936
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  FS-1-1-3
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(936)
<400>  9
ggg aac tgc tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg       48
Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu 
1               5                   10                  15
tac aag acc gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg       96
Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu 
20                  25                  30
agc acc tcg tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag      144
Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys 
35                  40                  45
tgg atg att ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa      192
Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu 
50                  55                  60
acg tgt gag aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac      240
Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn 
65                  70                  75                  80
aag aag aac aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc      288
Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile 
85                  90                  95
acc tgg aag ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat      336
Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn 
100                 105                 110 
gaa tgt gca ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa      384
Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu 
115                 120                 125 
gtc cag tac caa ggc aga tgt aaa aag ctt tgt gag aac gtg gac tgt      432
Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys 
130                 135                 140 
gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac aaa ccc cgc tgc      480
Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys 
145                 150                 155                 160 
gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag ggt cca gtc tgc      528
Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys 
165                 170                 175 
ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca ctc cta aag gca      576
Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala 
180                 185                 190 
aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac caa ggc aga tgt      624
Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys 
195                 200                 205 
aaa aag act tgt gaa gat atc cag tgc act ggt ggg aaa aaa tgt tta      672
Lys Lys Thr Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys Leu 
210                 215                 220 
tgg gat ttc aag gtt ggg aga ggc cgg tgt tcc ctc tgt gat gag ctg      720
Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu Leu 
225                 230                 235                 240 
tgc cct gac agt aag tcg gat gag cct gtc tgt gcc agt gac aat gcc      768
Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn Ala 
245                 250                 255 
act tat gcc agc gag tgt gcc atg aag gaa gct gcc tgc tcc tca ggt      816
Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser Gly 
260                 265                 270 
gtg cta ctg gaa gta aag cac tcc gga tct tgc aac tcc att tcg gaa      864
Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser Glu 
275                 280                 285 
gac acc gag gaa gag gag gaa gat gaa gac cag gac tac agc ttt cct      912
Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe Pro 
290                 295                 300 
ata tct tct att cta gag tgg taa                                      936
Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp 
305                 310 
<210>  10
<211>  311
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  FS-1-1-3
<400>  10
Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu 
1               5                   10                  15
Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu 
20                  25                  30
Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys 
35                  40                  45
Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu 
50                  55                  60
Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn 
65                  70                  75                  80
Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile 
85                  90                  95
Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn 
100                 105                 110 
Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu 
115                 120                 125 
Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys 
130                 135                 140 
Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys 
145                 150                 155                 160 
Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys 
165                 170                 175 
Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala 
180                 185                 190 
Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys 
195                 200                 205 
Lys Lys Thr Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys Leu 
210                 215                 220 
Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu Leu 
225                 230                 235                 240 
Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn Ala 
245                 250                 255 
Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser Gly 
260                 265                 270 
Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser Glu 
275                 280                 285 
Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe Pro 
290                 295                 300 
Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp 
305                 310 
<210>  11
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer for fragment A
<400>  11
gcaagctttg tgagaacgtg gactgtg                                         27
<210>  12
<211>  37
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer for fragment A
<400>  12
gcctcgagat atcttcacaa gtctttttac atctgcc                              37
<210>  13
<211>  29
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer for fragment B
<400>  13
cggaattcat ggtccgcgcg aggcaccag                                       29
<210>  14
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer for fragment B
<400>  14
cgaagctttt tacatctgcc ttgg                                            24
<210>  15
<211>  765
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  FS-1-1 with signal peptide
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(765)
<220>
<221>  sig peptide
<222>  (1)..(87)
<400>  15
atg gtc cgc gcg agg cac cag ccg ggt ggg ctt tgc ctc ctg ctg ctg       48
Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu 
1               5                   10                  15
ctg ctc tgc cag ttc atg gag gac cgc agt gcc cag gct ggg aac tgc       96
Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys 
20                  25                  30
tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg tac aag acc      144
Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr 
35                  40                  45
gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg agc acc tcg      192
Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser 
50                  55                  60
tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag tgg atg att      240
Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile 
65                  70                  75                  80
ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa acg tgt gag      288
Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu 
85                  90                  95
aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac      336
Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn 
100                 105                 110 
aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag      384
Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys 
115                 120                 125 
ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca      432
Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala 
130                 135                 140 
ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac      480
Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr 
145                 150                 155                 160 
caa ggc aga tgt aaa aag ctt tgt gag aac gtg gac tgt gga cct ggg      528
Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly 
165                 170                 175 
aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc      576
Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala 
180                 185                 190 
ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag ggt cca gtc tgc ggg ctg gat      624
Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp 
195                 200                 205 
ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca ctc cta aag gca aga tgt aaa      672
Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys 
210                 215                 220 
gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac caa ggc aga tgt aaa aag act      720
Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr 
225                 230                 235                 240 
tgt gaa gat atc tcg agg caa tca cta gag ggc cct att cta tag          765
Cys Glu Asp Ile Ser Arg Gln Ser Leu Glu Gly Pro Ile Leu 
245                 250 
<210>  16
<211>  254
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  FS-1-1 with signal peptide
<220>
<221>  SIGNAL
<222>  (1)..(29)
<400>  16
Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu 
1               5                   10                  15
Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys 
20                  25                  30
Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr 
35                  40                  45
Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser 
50                  55                  60
Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile 
65                  70                  75                  80
Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu 
85                  90                  95
Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn 
100                 105                 110 
Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys 
115                 120                 125 
Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala 
130                 135                 140 
Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr 
145                 150                 155                 160 
Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly 
165                 170                 175 
Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala 
180                 185                 190 
Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp 
195                 200                 205 
Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys 
210                 215                 220 
Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr 
225                 230                 235                 240 
Cys Glu Asp Ile Ser Arg Gln Ser Leu Glu Gly Pro Ile Leu 
245                 250 
<210>  17
<211>  567
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  FS-1 with signal peptide
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(567)
<220>
<221>  sig peptide
<222>  (1)..(87)
<400>  17
atg gtc cgc gcg agg cac cag ccg ggt ggg ctt tgc ctc ctg ctg ctg       48
Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu 
1               5                   10                  15
ctg ctc tgc cag ttc atg gag gac cgc agt gcc cag gct ggg aac tgc       96
Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys 
20                  25                  30
tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg tac aag acc      144
Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr 
35                  40                  45
gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg agc acc tcg      192
Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser 
50                  55                  60
tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag tgg atg att      240
Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile 
65                  70                  75                  80
ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa acg tgt gag      288
Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu 
85                  90                  95
aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac      336
Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn 
100                 105                 110 
aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag      384
Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys 
115                 120                 125 
ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca      432
Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala 
130                 135                 140 
ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac      480
Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr 
145                 150                 155                 160 
caa ggc aga tgt aaa aag ctt atc gat acc gtc gac ctc gag cat gca      528
Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Ile Asp Thr Val Asp Leu Glu His Ala 
165                 170                 175 
tct aga ggg ccc tat tct ata gtg tca cct aaa tgc tag                  567
Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys 
180                 185 
<210>  18
<211>  188
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  FS-1 with signal peptide
<220>
<221>  SIGNAL
<222>  (1)..(29)
<400>  18
Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu 
1               5                   10                  15
Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys 
20                  25                  30
Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr 
35                  40                  45
Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser 
50                  55                  60
Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile 
65                  70                  75                  80
Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu 
85                  90                  95
Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn 
100                 105                 110 
Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys 
115                 120                 125 
Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala 
130                 135                 140 
Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr 
145                 150                 155                 160 
Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Ile Asp Thr Val Asp Leu Glu His Ala 
165                 170                 175 
Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys 
180                 185 
<210>  19
<211>  1023
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  FS-1-1-3 with signal peptide
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(1023)
<220>
<221>  sig peptide
<222>  (1)..(87)
<400>  19
atg gtc cgc gcg agg cac cag ccg ggt ggg ctt tgc ctc ctg ctg ctg       48
Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu 
1               5                   10                  15
ctg ctc tgc cag ttc atg gag gac cgc agt gcc cag gct ggg aac tgc       96
Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys 
20                  25                  30
tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg tac aag acc      144
Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr 
35                  40                  45
gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg agc acc tcg      192
Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser 
50                  55                  60
tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag tgg atg att      240
Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile 
65                  70                  75                  80
ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa acg tgt gag      288
Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu 
85                  90                  95
aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac      336
Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn 
100                 105                 110 
aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag      384
Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys 
115                 120                 125 
ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca      432
Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala 
130                 135                 140 
ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac      480
Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr 
145                 150                 155                 160 
caa ggc aga tgt aaa aag ctt tgt gag aac gtg gac tgt gga cct ggg      528
Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly 
165                 170                 175 
aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc      576
Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala 
180                 185                 190 
ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag ggt cca gtc tgc ggg ctg gat      624
Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp 
195                 200                 205 
ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca ctc cta aag gca aga tgt aaa      672
Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys 
210                 215                 220 
gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac caa ggc aga tgt aaa aag act      720
Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr 
225                 230                 235                 240 
tgt gaa gat atc cag tgc act ggt ggg aaa aaa tgt tta tgg gat ttc      768
Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe 
245                 250                 255 
aag gtt ggg aga ggc cgg tgt tcc ctc tgt gat gag ctg tgc cct gac      816
Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp 
260                 265                 270 
agt aag tcg gat gag cct gtc tgt gcc agt gac aat gcc act tat gcc      864
Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala 
275                 280                 285 
agc gag tgt gcc atg aag gaa gct gcc tgc tcc tca ggt gtg cta ctg      912
Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser Gly Val Leu Leu 
290                 295                 300 
gaa gta aag cac tcc gga tct tgc aac tcc att tcg gaa gac acc gag      960
Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser Glu Asp Thr Glu 
305                 310                 315                 320 
gaa gag gag gaa gat gaa gac cag gac tac agc ttt cct ata tct tct     1008
Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe Pro Ile Ser Ser 
325                 330                 335 
att cta gag tgg taa                                                 1023
Ile Leu Glu Trp 
340 
<210>  20
<211>  340
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  FS-1-1-3 with signal peptide
<220>
<221>  SIGNAL
<222>  (1)..(29)
<400>  20
Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu 
1               5                   10                  15
Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys 
20                  25                  30
Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr 
35                  40                  45
Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser 
50                  55                  60
Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile 
65                  70                  75                  80
Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu 
85                  90                  95
Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn 
100                 105                 110 
Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys 
115                 120                 125 
Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala 
130                 135                 140 
Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr 
145                 150                 155                 160 
Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly 
165                 170                 175 
Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala 
180                 185                 190 
Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp 
195                 200                 205 
Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys 
210                 215                 220 
Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr 
225                 230                 235                 240 
Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe 
245                 250                 255 
Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp 
260                 265                 270 
Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala 
275                 280                 285 
Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser Gly Val Leu Leu 
290                 295                 300 
Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser Glu Asp Thr Glu 
305                 310                 315                 320 
Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe Pro Ile Ser Ser 
325                 330                 335 
Ile Leu Glu Trp 
340 
<210>  21
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer for fragment D
<400>  21
ccggaattct gtcaaaagtc ttgc                                            24
<210>  22
<211>  39
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer for fragment D
<400>  22
ccggaattcc tcgagtcaca cgaagttctc ttcctcctc                            39
<210>  23
<211>  1017
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  FS-1-1-2' with signal peptide
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(1017)
<220>
<221>  sig peptide
<222>  (1)..(87)
<400>  23
atg gtc cgc gcg agg cac cag ccg ggt ggg ctt tgc ctc ctg ctg ctg       48
Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu 
1               5                   10                  15
ctg ctc tgc cag ttc atg gag gac cgc agt gcc cag gct ggg aac tgc       96
Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys 
20                  25                  30
tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg tac aag acc      144
Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr 
35                  40                  45
gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg agc acc tcg      192
Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser 
50                  55                  60
tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag tgg atg att      240
Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile 
65                  70                  75                  80
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Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu 
85                  90                  95
aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac      336
Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn 
100                 105                 110 
aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag      384
Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys 
115                 120                 125 
ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca      432
Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala 
130                 135                 140 
ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac      480
Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr 
145                 150                 155                 160 
caa ggc aga tgt aaa aag ctt tgt gag aac gtg gac tgt gga cct ggg      528
Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly 
165                 170                 175 
aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc      576
Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala 
180                 185                 190 
ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag ggt cca gtc tgc ggg ctg gat      624
Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp 
195                 200                 205 
ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca ctc cta aag gca aga tgt aaa      672
Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys 
210                 215                 220 
gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac caa ggc aga tgt aaa aag act      720
Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr 
225                 230                 235                 240 
tgt gaa gat atc gaa ttc tgt caa aag tct tgc gct cag gta gtg tgc      768
Cys Glu Asp Ile Glu Phe Cys Gln Lys Ser Cys Ala Gln Val Val Cys 
245                 250                 255 
ccg cgt ccc cag tcg tgc ctt gtg gat cag acc ggc agc gca cac tgc      816
Pro Arg Pro Gln Ser Cys Leu Val Asp Gln Thr Gly Ser Ala His Cys 
260                 265                 270 
gtg gtg tgt cgc gct gcg ccc tgc cca gta cct tcc aac ccc ggc caa      864
Val Val Cys Arg Ala Ala Pro Cys Pro Val Pro Ser Asn Pro Gly Gln 
275                 280                 285 
gaa ctc tgt ggc aac aac aac gtt acc tac atc tcg tcg tgt cac ctg      912
Glu Leu Cys Gly Asn Asn Asn Val Thr Tyr Ile Ser Ser Cys His Leu 
290                 295                 300 
cgc cag gcc act tgc ttc ctg ggc cgc tcc att ggg gtt cgg cac cca      960
Arg Gln Ala Thr Cys Phe Leu Gly Arg Ser Ile Gly Val Arg His Pro 
305                 310                 315                 320 
ggc atc tgc aca ggt ggc ccc aaa gta cca gca gag gag gaa gag aac     1008
Gly Ile Cys Thr Gly Gly Pro Lys Val Pro Ala Glu Glu Glu Glu Asn 
325                 330                 335 
ttc gtg tga                                                         1017
Phe Val 
<210>  24
<211>  338
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  FS-1-1-2' with signal peptide
<220>
<221>  SIGNAL
<222>  (1)..(29)
<400>  24
Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu 
1               5                   10                  15
Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys 
20                  25                  30
Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr 
35                  40                  45
Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser 
50                  55                  60
Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile 
65                  70                  75                  80
Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu 
85                  90                  95
Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn 
100                 105                 110 
Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys 
115                 120                 125 
Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala 
130                 135                 140 
Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr 
145                 150                 155                 160 
Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly 
165                 170                 175 
Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala 
180                 185                 190 
Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp 
195                 200                 205 
Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys 
210                 215                 220 
Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr 
225                 230                 235                 240 
Cys Glu Asp Ile Glu Phe Cys Gln Lys Ser Cys Ala Gln Val Val Cys 
245                 250                 255 
Pro Arg Pro Gln Ser Cys Leu Val Asp Gln Thr Gly Ser Ala His Cys 
260                 265                 270 
Val Val Cys Arg Ala Ala Pro Cys Pro Val Pro Ser Asn Pro Gly Gln 
275                 280                 285 
Glu Leu Cys Gly Asn Asn Asn Val Thr Tyr Ile Ser Ser Cys His Leu 
290                 295                 300 
Arg Gln Ala Thr Cys Phe Leu Gly Arg Ser Ile Gly Val Arg His Pro 
305                 310                 315                 320 
Gly Ile Cys Thr Gly Gly Pro Lys Val Pro Ala Glu Glu Glu Glu Asn 
325                 330                 335 
Phe Val 
<210>  25
<211>  309
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  FS-1-1-2'
<400>  25
Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu 
1               5                   10                  15
Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu 
20                  25                  30
Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys 
35                  40                  45
Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu 
50                  55                  60
Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn 
65                  70                  75                  80
Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile 
85                  90                  95
Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn 
100                 105                 110 
Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu 
115                 120                 125 
Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys 
130                 135                 140 
Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys 
145                 150                 155                 160 
Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys 
165                 170                 175 
Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala 
180                 185                 190 
Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys 
195                 200                 205 
Lys Lys Thr Cys Glu Asp Ile Glu Phe Cys Gln Lys Ser Cys Ala Gln 
210                 215                 220 
Val Val Cys Pro Arg Pro Gln Ser Cys Leu Val Asp Gln Thr Gly Ser 
225                 230                 235                 240 
Ala His Cys Val Val Cys Arg Ala Ala Pro Cys Pro Val Pro Ser Asn 
245                 250                 255 
Pro Gly Gln Glu Leu Cys Gly Asn Asn Asn Val Thr Tyr Ile Ser Ser 
260                 265                 270 
Cys His Leu Arg Gln Ala Thr Cys Phe Leu Gly Arg Ser Ile Gly Val 
275                 280                 285 
Arg His Pro Gly Ile Cys Thr Gly Gly Pro Lys Val Pro Ala Glu Glu 
290                 295                 300 
Glu Glu Asn Phe Val 
305 
<210>  26
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  26
Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg 
1               5                   10
<210>  27
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer for FS1-Fc
<400>  27
aagggtacca tggtccgcgc gaggcaccag                                      30
<210>  28
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer for FS1-Fc
<400>  28
tcgggatcca cgcagcgggg tttgtt                                          26
<210>  29
<211>  73
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  29
Cys Ala Gln Val Val Cys Pro Arg Pro Gln Ser Cys Leu Val Asp Gln 
1               5                   10                  15
Thr Gly Ser Ala His Cys Val Val Cys Arg Ala Ala Pro Cys Pro Val 
20                  25                  30
Pro Ser Asn Pro Gly Gln Glu Leu Cys Gly Asn Asn Asn Val Thr Tyr 
35                  40                  45
Ile Ser Ser Cys His Leu Arg Gln Ala Thr Cys Phe Leu Gly Arg Ser 
50                  55                  60
Ile Gly Val Arg His Pro Gly Ile Cys 
65                  70
【図１】
0004688483.tif 000002
【図２】
0004688483.tif 000003
【図３】
0004688483.tif 000004
【図４】
0004688483.tif 000005
【図５】
0004688483.tif 000006
【図６】
0004688483.tif 000007
【図７】
0004688483.tif 000008
【図８】
0004688483.tif 000009
【図９】
0004688483.tif 000010
【図１０】
0004688483.tif 000011
【図１１】
0004688483.tif 000012
【図１２】
0004688483.tif 000013
【図１３】
0004688483.tif 000014
【図１４】
0004688483.tif 000015
【図１６】
0004688483.tif 000016
【図１７】
0004688483.tif 000017
【図１８】
0004688483.tif 000018
【図１９】
0004688483.tif 000019
【図２０】
0004688483.tif 000020
【図２１】
0004688483.tif 000021
【図２２】
0004688483.tif 000022
【図１５】
0004688483.tif 000023