(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１の残基１１４におけるＭｅｔの代わりのＡｌａ；
ｂ）配列番号１の残基１１７におけるＴｈｒの代わりのＡｒｇ；
ｃ）配列番号１の残基１１８におけるＬｅｕの代わりのＧｌｙ；
ｄ）配列番号１の残基１７９におけるＰｒｏの代わりのＶａｌ；
ｅ）配列番号１の残基１８１におけるＴｈｒの代わりのＶａｌ；および
ｆ）配列番号１の残基１８８におけるＧｌｙの代わりのＬｅｕ
より成る群から選択される１個もしくはそれ以上のアミノ酸置換を有する、突然変異体のトウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼ。
【請求項２】
アミノ酸置換、配列番号１の残基１１７におけるＴｈｒの代わりのＡｒｇを有する、請求項１記載の突然変異体のトウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼ。
【請求項３】
以下のアミノ酸置換：
ａ）配列番号１の残基１１４におけるＭｅｔの代わりのＡｌａ；
ｂ）配列番号１の残基１１７におけるＴｈｒの代わりのＡｒｇ；
ｃ）配列番号１の残基１１８におけるＬｅｕの代わりのＧｌｙ；
ｄ）配列番号１の残基１７９におけるＰｒｏの代わりのＶａｌ；
ｅ）配列番号１の残基１８１におけるＴｈｒの代わりのＶａｌ；および
ｆ）配列番号１の残基１８８におけるＧｌｙの代わりのＬｅｕ
のそれぞれを含有する、請求項１記載の突然変異体のトウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼ。
【請求項４】
ａ）配列番号１の残基１１４におけるＭｅｔの代わりのＡｌａ；
ｂ）配列番号１の残基１１７におけるＴｈｒの代わりのＡｒｇ；
ｃ）配列番号１の残基１１８におけるＬｅｕの代わりのＧｌｙ；
ｄ）配列番号１の残基１７９におけるＰｒｏの代わりのＶａｌ；
ｅ）配列番号１の残基１８１におけるＴｈｒの代わりのＶａｌ；および
ｆ）配列番号１の残基１８８におけるＧｌｙの代わりのＬｅｕ
より成る群から選択される１個もしくはそれ以上のアミノ酸置換を有する突然変異体のトウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼをコードする核酸配列を発現可能な形態で含んで成るＤＮＡ発現構築物。
【請求項５】
突然変異体のトウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼが、以下のアミノ酸置換：
ａ）配列番号１の残基１１４におけるＭｅｔの代わりのＡｌａ；
ｂ）配列番号１の残基１１７におけるＴｈｒの代わりのＡｒｇ；
ｃ）配列番号１の残基１１８におけるＬｅｕの代わりのＧｌｙ；
ｄ）配列番号１の残基１７９におけるＰｒｏの代わりのＶａｌ；
ｅ）配列番号１の残基１８１におけるＴｈｒの代わりのＶａｌ；および
ｆ）配列番号１の残基１８８におけるＧｌｙの代わりのＬｅｕ
のそれぞれを含有する、請求項４記載のＤＮＡ発現構築物。
【請求項６】
ａ）配列番号１の残基１１４におけるＭｅｔの代わりのＡｌａ；
ｂ）配列番号１の残基１１７におけるＴｈｒの代わりのＡｒｇ；
ｃ）配列番号１の残基１１８におけるＬｅｕの代わりのＧｌｙ；
ｄ）配列番号１の残基１７９におけるＰｒｏの代わりのＶａｌ；
ｅ）配列番号１の残基１８１におけるＴｈｒの代わりのＶａｌ；および
ｆ）配列番号１の残基１８８におけるＧｌｙの代わりのＬｅｕ
より成る群から選択される１個もしくはそれ以上のアミノ酸置換を有する突然変異体のトウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼをコードする核酸配列を発現可能な形態で含んで成るＤＮＡ発現構築物で形質転換された細胞。
【請求項７】
原核生物細胞である、請求項６記載の細胞。
【請求項８】
真核生物細胞である、請求項６記載の細胞。
【請求項９】
植物細胞である、請求項８記載の細胞。
【請求項１０】
ａ）配列番号１の残基１１４におけるＭｅｔの代わりのＡｌａ；
ｂ）配列番号１の残基１１７におけるＴｈｒの代わりのＡｒｇ；
ｃ）配列番号１の残基１１８におけるＬｅｕの代わりのＧｌｙ；
ｄ）配列番号１の残基１７９におけるＰｒｏの代わりのＶａｌ；
ｅ）配列番号１の残基１８１におけるＴｈｒの代わりのＶａｌ；および
ｆ）配列番号１の残基１８８におけるＧｌｙの代わりのＬｅｕ
より成る群から選択される１個もしくはそれ以上のアミノ酸置換を有する突然変異体のトウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼをコードする核酸配列を発現するトランスジェニック植物。
【請求項１１】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）である、請求項１０記載のトランスジェニック植物。
【請求項１２】
突然変異体のトウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼが、以下のアミノ酸置換：
ａ）配列番号１の残基１１４におけるＭｅｔの代わりのＡｌａ；
ｂ）配列番号１の残基１１７におけるＴｈｒの代わりのＡｒｇ；
ｃ）配列番号１の残基１１８におけるＬｅｕの代わりのＧｌｙ；
ｄ）配列番号１の残基１７９におけるＰｒｏの代わりのＶａｌ；
ｅ）配列番号１の残基１８１におけるＴｈｒの代わりのＶａｌ；および
ｆ）配列番号１の残基１８８におけるＧｌｙの代わりのＬｅｕ
のそれぞれを含有する、請求項１０記載のトランスジェニック植物。
【請求項１３】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）である、請求項１２記載のトランスジェニック植物。
【請求項１４】
アミノ酸置換、配列番号１の残基１１７におけるＴｈｒの代わりのＡｒｇを有する突然変異体のトウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼをコードする核酸配列を発現可能な形態で含んで成るＤＮＡ発現構築物。
【請求項１５】
アミノ酸置換、配列番号１の残基１１７におけるＴｈｒの代わりのＡｒｇを有する突然変異体のトウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼをコードする核酸配列を発現可能な形態で含んで成るＤＮＡ発現構築物で形質転換された細胞。
【請求項１６】
原核生物である、請求項１５記載の細胞。
【請求項１７】
真核生物である、請求項１５記載の細胞。
【請求項１８】
植物細胞である、請求項１７記載の細胞。
【請求項１９】
アミノ酸置換、配列番号１の残基１１７におけるＴｈｒの代わりのＡｒｇを有する突然変異体のトウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼをコードする核酸配列を発現するトランスジェニック植物。
【請求項２０】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）である、請求項１９記載のトランスジェニック植物。
【請求項２１】
以下のアミノ酸置換：
ａ）配列番号１の残基１１４におけるＭｅｔの代わりのＡｌａ；
ｂ）配列番号１の残基１１７におけるＴｈｒの代わりのＡｒｇ；
ｃ）配列番号１の残基１１８におけるＬｅｕの代わりのＧｌｙ；
ｄ）配列番号１の残基１７９におけるＰｒｏの代わりのＶａｌ；
ｅ）配列番号１の残基１８１におけるＴｈｒの代わりのＶａｌ；および
ｆ）配列番号１の残基１８８におけるＧｌｙの代わりのＬｅｕ
のそれぞれを含有する突然変異体のトウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼをコードする核酸配列を発現可能な形態で含んで成るＤＮＡ発現構築物で形質転換された細胞。
【請求項２２】
原核生物である、請求項２１記載の細胞。
【請求項２３】
真核生物である、請求項２１記載の細胞。
【請求項２４】
植物細胞である、請求項２３記載の細胞。
【請求項２５】
配列番号１の残基１８１におけるＴｈｒの代わりのＰｈｅのアミノ酸置換を有する、突然変異体のトウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼ。
【請求項２６】
配列番号１の残基１８１におけるＴｈｒの代わりのＰｈｅのアミノ酸置換を有する突然変異体のトウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼをコードする核酸配列を発現可能な形態で含んで成る、ＤＮＡ発現構築物。
【請求項２７】
配列番号１の残基１８１におけるＴｈｒの代わりのＰｈｅのアミノ酸置換を有する突然変異体のトウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼをコードする核酸配列を発現可能な形態で含んで成るＤＮＡ発現構築物で形質転換された細胞。
【請求項２８】
原核生物細胞である、請求項２７記載の細胞。
【請求項２９】
真核生物細胞である、請求項２７記載の細胞。
【請求項３０】
植物細胞である、請求項２９記載の細胞。
【請求項３１】
配列番号１の残基１８１におけるＴｈｒの代わりのＰｈｅのアミノ酸置換を有する突然変異体のトウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼをコードする核酸配列を発現するトランスジェニック植物。
【請求項３２】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）である、請求項３１記載のトランスジェニック植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
高等植物における脂肪酸生合成は、最近、還元炭素の再生できる供給源としての植物油の可能な使用のため、増大された興味を引き寄せている。野生植物における脂肪酸の形態の多様性は、作物植物で見出されるものと広く匹敵する。これは、それらの鎖長、二重結合の数および位置、ならびに多様な他の官能基の位置および存在に反映される。
【０００２】
植物において、脂肪酸生合成は、緑色組織の葉緑体もしくは非光合成組織のプラスチド中で起こる。大部分の植物における一次産物は、飽和のパルミチン酸およびステアリン酸のアシルキャリヤータンパク質（ＡＣＰ）エステルである。不飽和脂肪酸、可溶性および内在性膜タンパク質の産生に、２つの型のデサチュラーゼ分子が関与する。デサチュラーゼは特定の基質の炭素鎖長に特異的であり、そして脂肪酸のカルボキシル端から数えることにより特定の炭素原子間に二重結合を導入し；例えば、Δ9デサチュラーゼはステアロイル−ＡＣＰに特異的であり、そして炭素９と１０との間に二重結合を導入する。農作物への、特徴的な鎖長の好みおよびこれらの分子の二重結合位置をもつデサチュラーゼのアイソフォームの導入および使用は、慣習的な植物油の物理特性および商業的用途を操作する方法を提供する。残念ながら、非本来の宿主植物へのアシル−ＡＣＰデサチュラーゼのアイソフォームの導入は、依然として、異常なモノエン類の効率的な産生につながらなくてはならない。
【０００３】
より多くのデサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子が同定される際に、多様な活性の多くが可溶性および膜の分類のデサチュラーゼをコードする比較的少ない普遍的な始原型（ａｒｃｈｅｔｙｐｅ）由来であることが明らかになってきている。可溶性のアシル−ＡＣＰデサチュラーゼの分子模型製作は、脂肪酸基質に対し非常に緊密な近接にある基質結合チャンネル内のアミノ酸残基を同定した。こうした残基は「接触残基」と称される。以前の研究は、接触残基（およびいくつかの場合においては他の残基）の改変がアシル−ＡＣＰデサチュラーゼの鎖長および二重結合の位置の特異性を変える可能性があることを示した。デサチュラーゼの鎖長の好みおよび二重結合位置を操作する能力は、一不飽和脂肪酸の豊富な植物油のような商業的に有用な製品の製造における改変されたデサチュラーゼの生成および使用に関して大きな潜在能力を有する。こうした植物油はヒトの栄養において重要であり、そして工業的化学物質の再生できる供給源として使用することができる。
【０００４】
（発明の要約）
本発明は脂肪酸デサチュラーゼの突然変異体の製造方法に関し、元のデサチュラーゼは１８炭素鎖の基質特異性を有し、生じられた突然変異体は、元のデサチュラーゼに関して１８より少ない炭素を含有する鎖をもつ脂肪酸基質に対する実質的に増大された活性を有する。該方法は、元のデサチュラーゼをコードする核酸配列中の１個もしくはそれ以上の突然変異を誘導すること、突然変異された核酸配列を不飽和脂肪酸の栄養要求体である細胞に形質転換すること、および減少された炭素鎖長の基質特異性をもつ突然変異体の脂肪酸デサチュラーゼを受容したレシピエント細胞について選択することを必要とする。好ましい一態様において、突然変異された核酸配列をＭＨ１３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換し、その後それを外因性の不飽和脂肪酸の非存在下で成長させて、所望の突然変異体を発現するレシピエントＭＨ１３細胞について選択する。
【０００５】
本発明の別の局面は製造される突然変異体である。トウゴマ（ｃａｓｔｏｒ）Δ9  １８：０−ＡＣＰデサチュラーゼの突然変異体が、特定の残基でのアミノ酸置換から生じる。これらの突然変異体は１６もしくはより少ない炭素鎖という変えられた基質特異性を有する。本発明の他の態様は、特定の脂肪酸産物の製造のための個別の細胞およびまたトランスジェニック植物における突然変異体のデサチュラーゼ分子の発現を包含する。
【０００６】
本発明の別の局面は、特異的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発によるタンパク質の機能を特異的に変える方法である。該方法は、突然変異される場合に機能を変えると予測されるタンパク質の候補のアミノ酸位置を同定することを必要とする。すべての他の候補の位置の無作為化と組み合わせのそれぞれの候補の位置でのアミノ酸の無作為化により生じられるタンパク質の突然変異体のライブラリーを生成させ、そして機能の所望の特定の変化を表す突然変異体をライブラリーから同定する。好ましい一態様において、候補のアミノ酸位置は方法の組み合わせにより同定され、いくつかの例は無作為突然変異誘発、タンパク質の構造分析およびタンパク質の配列分析である。変えるために該方法を使用することができる機能の例は、酵素機能、結合機能および構造的機能を包含する。本発明の方法は、トウゴマΔ9  １８：０−ＡＣＰデサチュラーゼの基質特異性の変化において、無作為突然変異誘発の方法に匹敵する。
【０００７】
（発明の詳細な記述）
本発明は、突然変異の導入前に１８炭素の鎖長の基質特異性を有する突然変異体のデサチュラーゼ分子の選択のための細菌選択系の使用に基づく。同定された突然変異体は、デサチュラーゼ分子の鎖長の基質特異性を低下させる突然変異を有する。該選択系で使用される好ましい細菌株、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＨ１３は、不飽和脂肪酸栄養要求体である。ＭＨ１３は、増殖するために外因性の不飽和脂肪酸を必要とする。１６もしくはより少ない炭素を含有する鎖をもつ脂肪酸基質に対する実質的な活性を有する機能的デサチュラーゼ酵素の導入が、この栄養要求性を補完し、外来性の不飽和脂肪酸の非存在下での該細菌の成長および増殖を見込む。１８炭素の鎖長の基質を特異的に利用するデサチュラーゼ酵素は、該細菌におけるこうした基質の低レベルにより栄養要求性を補完することができない。この観察結果は、１６炭素もしくは１４炭素の基質を利用することができる１８炭素特異的な脂肪酸デサチュラーゼの突然変異体を同定するための選択系として活用されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＨ１３は好ましい宿主細胞である一方、当業者は、他の宿主細胞型を使用することができることを認識するであろう。
【０００８】
本発明は脂肪酸デサチュラーゼの突然変異体の製造方法を提供し、該突然変異体は元の脂肪酸デサチュラーゼから減少された炭素鎖長の基質特異性を有することを特徴とする。該方法は、１８炭素鎖長の基質特異性をもつ脂肪酸デサチュラーゼをコードする核酸配列を必要とする。突然変異体を生じさせるため、脂肪酸デサチュラーゼをコードする核酸配列中で突然変異を誘導する。その後、突然変異された核酸配列を、突然変異された配列の発現に適切な条件下でＭＨ１３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換する。その後、形質転換されたＭＨ１３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を、補充された減少された（ｒｅｄｕｃｅｄ）脂肪酸の非存在下で成長する能力について選択する。形質転換されたＭＨ１３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の生存は、ＭＨ１３の脂肪酸の栄養要求性を補完する突然変異体の脂肪酸デサチュラーゼの獲得を示す。
【０００９】
上の選択アッセイにより同定される突然変異体の脂肪酸デサチュラーゼは、元のデサチュラーゼに関して、１８より少ない炭素を含有する鎖をもつ脂肪酸基質に対する活性の実質的な増大を有する。元のデサチュラーゼに関して基質特異性の実質的な増大は、宿主生物体内の突然変異体のデサチュラーゼによる脱飽和から生じる不飽和脂肪酸の蓄積を生じさせるものである。活性の実質的な増大は、突然変異を起こされない（ｎｏｎ−ｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄ）前駆体デサチュラーゼのものより最低３倍より大きいように定義される。好ましい一態様において、突然変異体のデサチュラーゼの活性の増大は、突然変異を起こされない前駆体デサチュラーゼより最低１０倍より大きい。
【００１０】
該方法は、１８炭素の鎖の基質特異性をもついずれかの脂肪酸デサチュラーゼの突然変異体を生じさせるのに適し、そのために核酸配列が利用可能である。該核酸配列の発現は成熟した脂肪酸デサチュラーゼの産生をもたらすはずである。該核酸配列は、野性型配列に対応することができるか、もしくは転写される産物のアミノ酸配列に影響を及ぼさない沈黙突然変異を有することができる。あるいは、使用される核酸配列は、そのアミノ酸配列が野性型から変動する（例えば、炭素鎖長の基質特異性に関して機能に変化をもたらさない保存的アミノ酸置換をもつ）機能的な脂肪酸デサチュラーゼをコードすることができる。こうした突然変異体のデサチュラーゼは、１種の突然変異体に数個の異なる機能的突然変異を組込む場合に望ましいことができる。
【００１１】
好ましい態様において、脂肪酸デサチュラーゼは植物の脂肪酸デサチュラーゼである。可溶性（アシル−ＡＣＰデサチュラーゼ）および内在性膜（アシル脂質デサチュラーゼ）の２つの型の植物の脂肪酸デサチュラーゼが存在し、その双方が本発明での使用に適する。以前の分子模型製作および構造機能研究は、Ｃａｈｏｏｎら、米国特許第５，７０５，３９１号明細書（１９９８）（その内容は引用により本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり、アシル−ＡＣＰデサチュラーゼの基質特異性に関与する領域を特徴づけた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現される場合、変異体のデサチュラーゼのアイソフォーム（例えば、１８：１  Δ9以外のモノエンを蓄積する種における異常な脂肪酸の蓄積の原因であると考えられるアイソフォーム）は、乏しい蓄積を示し、不安定であり、そしてΔ9  １８：０−ＡＣＰデサチュラーゼに比較してより低い特異的活性を有する。これの理由は未だ十分に理解されないが、しかし、最近の結果は、特定のアシル−ＡＣＰデサチュラーゼの活性を強化することができる「特異性因子」の存在を示唆する。これらの理由から、Δ9  １８：０−ＡＣＰデサチュラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を利用するインビトロ実験に最良に適する。
【００１２】
一態様において、ＭＨ１３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は外因性の植物フェレドキシンを有する。これは、植物型のフェレドキシン（例えばアラバエナ属（Ａｒａｂａｅｎａ）の植物性フェレドキシン）をコードする配列を含有する発現ベクターの導入、および生じる細菌への選択圧の適用により達成することができる。植物デサチュラーゼの酸化還元パートナー、植物型のフェレドキシンの存在は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における植物デサチュラーゼの機能を助長する。選択系中の植物型のフェレドキシンの存在は、より低い特異的活性をもつ突然変異体の選択を見込む一方、植物型のフェレドキシンの非存在下にＭＨ１３を補完する突然変異体は、比較的より高い特異的活性を有すると期待される。上述される選択系は、不均一な突然変異体の脂肪酸デサチュラーゼ分子の集団からの所望の基質特異性をもつ突然変異体の選択における使用に最も適切である。突然変異された核酸配列の集団を形質転換することにより、突然変異体のライブラリー全体を、ＭＨ１３の栄養要求性を補完する能力についてスクリーニングすることができる。
【００１３】
改変された脂肪酸デサチュラーゼタンパク質産物をもたらす潜在能力を有するいかなる型の突然変異も、核酸配列中で誘導することができる。基質と相互作用する残基へアミノ酸置換を導入するという論理に基づくアプローチは、論理的に正しいが、しかし非常に労働集約的である可能性があり；そして構造の情報が利用可能である場合にのみ適する。こうした方法は、可溶性デサチュラーゼの鎖長に、および膜分類の酵素のヒドロキシル基に対する二重結合の導入に成功裏に利用されている（Ｃａｈｏｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：４８７２−４８７７（１９９７）；Ｓｈａｎｋｌｉｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４９：６１１−６４１（１９９８））。後に続く例示の節に記述される実験は、タンパク質産物内の特定の位置（１個もしくは複数）でアミノ酸の無作為化を生じさせる特定の１つのコドンもしくは複数のコドンに特異的に標的を定める部位特異的突然変異誘発の一形態を立証する。これらの実験は、基質特異性に関与する付加的アミノ酸を同定する潜在能力を有する無作為突然変異誘発の利用もまた記述する。無作為突然変異誘発の使用は、どの残基が重要であるかについての推定にそれが頼らないため、おそらく最も強力な方法である。本方法は、アミノ酸接触残基である位置（結合チャンネル内で基質に最も近く配置される位置）、およびまた基質を直接接触することなく基質特異性に影響を及ぼす位置の置換突然変異を同定する能力を有する（Ｃａｈｏｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：４８７２−４８７７（１９９７））。
【００１４】
突然変異されれば、核酸配列をＭＨ１３細胞に形質転換する。形質転換は、好ましくは電気穿孔法により達成するが、しかし当業者に既知の代替法もまた使用することができる。形質転換後に、突然変異体の脂肪酸デサチュラーゼの存在について細胞を選択する。これは選択培地（例えば、外因性に供給される不飽和脂肪酸を欠く培地）上での成長により達成される。培地は固形もしくは液体のいずれかであることができる。数回の選択を使用すること、および／または必要とされる選択圧を変動もしくは増強することもまた、該方法により同定される突然変異体の数の増大において有用である。
【００１５】
本発明は、特徴的な基質の鎖長の好みをもつデサチュラーゼタンパク質の工作において有用である。こうしたアイソフォームは、細胞もしくは生物体（例えば農作物）中に導入される場合に、慣習的植物油の物理特性および商業的用途を操作するのに使用することができる。これらの工作されたデサチュラーゼを発現する細胞および生物体は、例えばヒトの栄養においてもしくは工業的化学物質として多くの潜在的用途を有する、一不飽和脂肪酸の豊富な植物油のような商業的に有用な製品の製造で有用である。
【００１６】
下の例示の節は、改変された基質特異性を有するトウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼの突然変異体を同定するのに上述された方法を使用した実験を詳述する。位置１１４、１１７、１１８、１７９、１８１もしくは１８８のアミノ酸置換、ならびに位置１１４および１８８の組み合わせられた置換をもたらすコーディング領域中の突然変異を、野性型と比較したこれらの突然変異体タンパク質の生じる変えられた特異性と一緒に記述する。全６個の位置でのアミノ酸置換の組み合わせを生じさせるトウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼのコーディング領域中の突然変異もまた同定され、コードされる突然変異体タンパク質はｃｏｍ２、ｃｏｍ３、ｃｏｍ４、ｃｏｍ９およびｃｏｍ１０と称される。図２は、アミノ酸置換、および多様な基質に対するこれらの突然変異体タンパク質の特異的活性を列挙する。
【００１７】
図２中に列挙される全５種の突然変異体タンパク質は、残存する４個の位置での多様な置換とともに、アミノ酸置換Ｔ１１７ＲおよびＧ１８８Ｌを有する。これら２種の突然変異が減少する鎖長の特異性のためのそれらのそれぞれの位置での至適の変化であるという事実は、それらがｃｏｍ２における変えられた特異性の主決定子であることがありそうであることを示唆する。突然変異のこの対を含有する数種の他の突然変異体はより低い特異的活性を有するという観察結果は、残存する４個の無作為化された部位の突然変異の組み合わせもまた突然変異体の特異的活性に影響を及ぼす可能性があることを示唆する。この保存は、置換Ｔ１１７ＲおよびＧ１１８Ｌが図２中の５種の突然変異体の基質特異性の変化の原因であることを示唆する。Ｔ１１７ＲおよびＧ１１８Ｌ置換の組み合わせをもつ突然変異体のデサチュラーゼは、１６もしくはより少ない炭素をもつ１種もしくはそれ以上の基質に対する高められた活性を有すると期待される。
【００１８】
本発明の別の局面は、図２に列挙される突然変異体タンパク質のアミノ酸置換の一サブセットを有する突然変異体のトウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼである。こうした突然変異体は、異なる基質に対する変えられた活性もまた有すると期待される。本発明は、いずれかの可能な組み合わせでのｃｏｍ２突然変異体のアミノ酸置換の１個と６個との間を有する突然変異体のトウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼタンパク質を包含する。好ましい一態様において、該組み合わせはｃｏｍ２突然変異体のアミノ酸置換の最低３個を包含する。好ましくは、これらのアミノ酸置換のうち２個はＴ１１７ＲおよびＧ１８８Ｌである。加えて、本発明は、いずれかの可能な組み合わせでの、それぞれｃｏｍ３突然変異体、ｃｏｍ４突然変異体、ｃｏｍ９突然変異体もしくはｃｏｍ１０突然変異体のアミノ酸置換のうち１個と６個との間を有する突然変異体のΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼタンパク質を包含することを意図している。好ましい一態様において、該組み合わせは突然変異体のアミノ酸置換のうち最低３個を包含する。好ましくは、これらの置換のうち２個はＴ１１７ＲおよびＧ１８８Ｌである。いずれかの他のアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失と組み合わせの、上に列挙されたアミノ酸置換およびその組み合わせを有する突然変異体もまた、本発明に包含される。これらの付加的置換、挿入もしくは欠失は沈黙である（例えば、酵素の機能に影響を及ぼさない）ことができるか、もしくは酵素機能をさらに変えることができる。
【００１９】
他のＡＣＰデサチュラーゼ、とりわけ１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼ、および好ましくはΔ9  １８：０−ＡＣＰデサチュラーゼ中の類似の位置で作成された、上に列挙されたアミノ酸置換は、開示されたデサチュラーゼ突然変異体におけると類似の効果をこれらのタンパク質における基質特異性に対して有すると予測される。
【００２０】
上述された突然変異体タンパク質をコードする核酸配列をＤＮＡ発現ベクター中に挿入することができ、それはその後、細胞中で突然変異体タンパク質を発現するのに使用することができる。原核生物および真核生物のいずれかもしくは双方の細胞中で機能する発現ベクターが存在し、かつ、当業者に既知である。適切な発現ベクターを、それらのコーディング配列の発現に適切な条件下で、原核生物細胞（例えば細菌）または真核生物細胞（例えば動物細胞もしくは植物細胞）のいずれかに導入する。突然変異体タンパク質を発現する植物細胞は、突然変異体タンパク質を発現しそしてデサチュラーゼの対応する脂肪酸産物を産生するトランスジェニック植物を生じさせるのに使用することができる。
【００２１】
本発明の別の局面は、特異的突然変異誘発によりタンパク質の機能を特異的に変える方法である。変えられるべきである特定の機能の決定に際して、突然変異される場合に機能を変えると予測されるタンパク質の候補のアミノ酸位置を同定する。候補の位置のいくつかの同定方法を下述する。タンパク質の突然変異体のライブラリーを、各突然変異体内のすべての他の候補の位置の無作為化とともに、それぞれの候補の位置でコードされるアミノ酸の無作為化により生じさせる。これは、一般に、各突然変異体内のすべての他の候補の位置の無作為化とともに、それぞれの候補の位置のコドンの同時の無作為化により、突然変異体タンパク質をコードする突然変異体の核酸配列のライブラリーを生成させることにより達成する。その後、機能の所望の変化を表す突然変異された核酸配列によりコードされる突然変異体タンパク質を、ライブラリーから同定する。
【００２２】
多種多様な機能がタンパク質により実施される。いくつかのタンパク質は反応を触媒する酵素として機能し（例えば異化、同化）、いくつかのタンパク質は結合タンパク質として機能し（例えばリガンド結合受容体、抗体、アダプタータンパク質）、いくつかのタンパク質は構造タンパク質として機能する（例えば細胞外マトリックスタンパク質）。本発明は、いずれかの所定のタンパク質のいずれかの所定の機能を変えるのに有用である。多くのタンパク質は１つ以上の機能を有するため、変えられるべきである特定の機能を最初に決定しなければならない。しばしば、多機能タンパク質の機能は相互に依存せず、該タンパク質の他の機能（１つもしくは複数）に影響を及ぼすことなく１つの機能を変えることを可能にする。他の場合には、機能は連結されるかもしくは互いに依存し、単一の機能の変化をより複雑にする。機能の変化は、本明細書で、機能のいずれかの指向された（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）変化を包含するとして広範に定義される。こうした変化は、機能の至適化（例えば、酵素の特異的活性を増大させること、結合タンパク質の結合親和性を増大させること、タンパク質の構造の完全性もしくは安定性を増大させること）、タンパク質の機能的特性を再指向（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）（例えば、酵素の基質特異性を改変すること、結合タンパク質の結合特異性を改変すること、タンパク質の構造的成分を改変すること）、および機能の低下（例えば廃すること）を制限なしに包含する。明示された機能の完全な変化は、機能の個々の成分の連続的変化により段階的に必ず達成することができ、一連の中間の突然変異体を生じさせ、全体の過程は最後の至適の突然変異体の生成において最高潮に達する。従って、本明細書に記述されるところのタンパク質の機能を変える方法は、至適化すること、既に変えられたタンパク質の機能を再指向することもしくは低下させることを包含することを意図している。
【００２３】
候補の位置は、機能に（直接にもしくは間接的にのいずれかで）関与する野性型タンパク質のアミノ酸の位置を包含する。重要なことには、機能への関与の表示は候補の位置の選択に必要とされる全部である。別個の突然変異が機能に対し有するもしくは有すると期待される方向は、候補の位置の同定において重要でない。例えば、別個に突然変異される場合に機能の低下をもたらす残基を候補として同定することができる。機能と直接関与するアミノ酸の例は、機能に関与する他の分子（例えば基質もしくはリガンド）と接触する残基、およびまた結合部位の概略を描くもしくはそれを定義する残基を制限なしに包含する。間接的関与を有するアミノ酸の例は、直接関与する残基に隣接するもしくはそれに近い残基のような、それらの直接関与する残基に影響する残基を制限なしに包含する。近接は一次配列に限定される必要はないが、しかし、二次もしくは三次構造の関係からであることができる。加えて、残基は、分子内もしくは分子間の複合体の形成により直接関与する残基近くに配置されることができる。間接的に関与するアミノ酸が有することができる影響は、立体効果、化学的効果もしくは組み合わせの効果であることができる。間接的に関与するアミノ酸は、機能に決定的に重要であるタンパク質構造の要素（例えば、タンパク質の必要なコンホメーション）の定義に関与する残基もまた包含する。
【００２４】
候補の位置は、野性型タンパク質の機能に（直接もしくは間接的に）有意に関与しないがしかし突然変異誘発により機能においてある役割（直接もしくは間接の）を引き受けるアミノ酸の位置もまた包含する。野性型という用語は、突然変異誘発前のタンパク質の元の配列を指すのに本明細書で使用し、該用語は既に変えられた配列を含める。以前に関与していない残基に、機能においてある役割を賦与する突然変異誘発は、その特定の位置での別のアミノ酸の置換を普遍的に必要とする。しかしながら、機能への新たな関与を、別の位置での突然変異誘発によりある位置に賦与することもまたできる。
【００２５】
タンパク質、変えられるべきであるタンパク質の機能、および機能に関与する残基に関してより多くの情報を有するほど、より生産的に機能の変化に取りかかることができる。タンパク質の候補のアミノ酸位置は、いずれかの数の手段により同定する。こうした手段は、制限なしに、関係するタンパク質との比較としばしば連結される、該タンパク質をコードする核酸配列の無作為突然変異誘発、タンパク質の構造分析、およびタンパク質の配列分析を包含する。候補の位置の同定方法は、天然に存在するタンパク質、あるいは該タンパク質の突然変異体のバージョンで実施することができる。加えて、関係するタンパク質の分析（例えば配列分析、構造分析、突然変異誘発）は、変えられるべき機能に関与することがありそうである目的のタンパク質内の類似の候補の位置を示すことができる。本明細書で使用されるところの関係するタンパク質という用語は、タンパク質の多様な異性体、タンパク質の多様な表現型（例えば同一のタンパク質の天然に存在する突然変異体）、およびその特定の機能が変えられるべきであるタンパク質に対する有意の相同性を有するいずれかの他のタンパク質もしくはそのフラグメントを包含する。
【００２６】
機能喪失突然変異体についてのスクリーニングと連結された無作為突然変異誘発は、野性型タンパク質の機能に決定的に重要であるアミノ酸位置を同定することができる。機能の獲得もしくは増強の突然変異体についてのスクリーニングと連結された無作為突然変異誘発は、これらの決定的に重要な位置、ならびに野性型の機能に最小限にのみ関与するがしかし突然変異誘発により増大された役割を獲得した位置を同定することができる。
【００２７】
タンパク質の構造分析もまた、それで候補の残基を同定する非常に強力なツールである。構造の情報は、Ｘ線結晶学、もしくは核磁気共鳴のような他の方法から得ることができる。しばしば、該機能を実施するタンパク質の構造（例えば、基質もしくは阻害剤に結合された酵素、またはリガンドに結合された結合タンパク質）は、機能に関与するアミノ酸位置に関するかなりの量の情報を提供する。
【００２８】
好ましくは、候補のアミノ酸位置を同定するために方法の組み合わせを使用する。好ましい一態様においては、可能な限り多くの候補の位置の同定を確実にするために、全部の利用可能な手段を使用する。
【００２９】
候補の位置を同定すれば、２０種の可能なアミノ酸の１種で無作為に置換された各突然変異体内のすべての候補の位置を有する突然変異体タンパク質のライブラリー。あるタンパク質内の特定の位置での２０種の可能なアミノ酸のうち１種のこの置換方法を、本明細書でアミノ酸の無作為化と称する。別個の特定のタンパク質内のそれぞれのかつすべての候補のコドンでコードされるアミノ酸の無作為化は、本明細書で、組み合わせの完全な位置の無作為化（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｆｕｌｌ  ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）と称する。組み合わせの完全な位置の無作為化から生じる突然変異体タンパク質のライブラリーは、すべての候補の位置内でコードされる２０種の可能なアミノ酸のうち１種を有するタンパク質の、突然変異されたコーディング配列の核酸ライブラリーを生成させることにより、最も容易に生じられる。この型の突然変異誘発は、それぞれの候補の位置で野性型残基ならびに他の１９種の残基のコドンの挿入を見込むため、これは最も広範な可能な突然変異の組み合わせを生じさせる。コドンの組み合わせの完全な位置の無作為化は、多様な方法により達成することができる。１つのこうした方法は、ＮＮＫもしくはＮＮＮで候補の位置のアミノ酸の全部のコドンを置き換えるオーバーラップ伸長ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ）の使用である。オーバーラップ伸長ＰＣＲの方法は、特定のコーディング配列中に最低９種の独立した突然変異を同時に導入するのに使用されている。
【００３０】
別の態様において、１種もしくはそれ以上の候補の位置の一サブセットが不完全に無作為化される一方、他の候補の位置が完全に無作為化される。すなわち、２０種より少ない可能なアミノ酸を、１種もしくはそれ以上の明示された候補の位置で導入して、突然変異誘発をより特異的に指図する。これは、他の候補の位置で全２０種のアミノ酸をコードするコドンを導入しつつ、アミノ酸の所望のサブセットをコードするコドンで、該タンパク質をコードする核酸配列の候補の位置のコドンのサブセットを無作為に置き換えることにより達成する。
【００３１】
ライブラリーを生成すれば、所望の変えられた機能を表す突然変異体タンパク質を同定する。これは、機能的選択方法を使用することにより最も効率的に達成される。突然変異された核酸配列は、好ましくは発現に適切な条件下での単細胞生物体への個別の導入により、別個に発現させる。発現されれば、所望の機能を表す突然変異体タンパク質をそれらの機能により選択することができる（例えば補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）アッセイ）。あるいは、生じられた突然変異体の集団を、所望の変えられた機能について（例えば迅速スクリーニング法により）スクリーニングすることができる。生じられた各突然変異体は、所望の変えられた機能について個々にアッセイすることもまたできる。
【００３２】
後に続く例示の節で詳述される実験は、トウゴマΔ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼの基質特異性および特異的活性を改変するために実施した。該タンパク質の構造分析を無作為突然変異誘発と組み合わせて、候補の残基を同定した。
【００３３】
無作為突然変異誘発を使用して、機能的アッセイによりデサチュラーゼの候補の残基を同定した。理論的には、この同定方法は、基質結合空間（ｃａｖｉｔｙ）の概略を描いても描かなくてもよい残基を同定する潜在能力を有し、それらは機能アッセイにより単に同定され、従って、機能に参画することがありそうな残基のこの同定方法は、構造が既知である酵素および構造が未知である酵素の双方に応用可能である。全部の関連する知識が、無作為化されるべき候補のアミノ酸位置の一覧の編集において包含されるべきである。
【００３４】
本発明の１つの顕著な特徴は、組み合わせの完全な位置の無作為化を、同定される全部の候補の位置で同時に実施することである。あるタンパク質の１機能を特別に変えるための特異的突然変異誘発への以前のアプローチは多段階アプローチを使用し、ここでは、１残基を突然変異し、該突然変異体を特徴づけ、そしてその後、その突然変異体を別の回の単一位置の突然変異誘発にかける。この標準的アプローチは、すぐ前の突然変異体産物からの特定の突然変異を持ち越す、それぞれのその後に生じられる突然変異体をもたらす。従って、同定されるそれぞれのその後の突然変異体は、それが生じられる突然変異体から受け継がれる特性により必ず束縛され、従って所望の機能を達成するために突然変異誘発がとることができる方向を制限する。本発明の方法は、この制限を除外することにより、所望の活性を立証するより広範な突然変異体を生じさせ、これから至適の突然変異体を選択することができる。
例示
節Ｉ：予備研究
突然変異誘発および選択のアプローチを使用して、基質特異性を改変する植物脂肪酸デサチュラーゼ中のアミノ酸置換突然変異を同定した。アシル−ＡＣＰデサチュラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現される場合に機能的に活性である。Δ9−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼは、適切な基質の欠如により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の脂肪酸プロフィルを変えることが不可能である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８８：２５７８−２５８２（１９９１）；Ｃａｈｏｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９４：４８７２−４８７７（１９９７））。しかしながら、１６：０の特異性をもつデサチュラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の脂肪酸プロフィルを変えることが示された。従って、１８：０デサチュラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異体ＭＨ１３（不飽和脂肪酸栄養要求体）を補完することができないが、しかし、１６もしくはより少ない炭素との特異性をもつデサチュラーゼはこの栄養要求性を補完することが可能である。従って、ＭＨ１３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を使用して、１６もしくは１４炭素の基質を利用することができる１８炭素のデサチュラーゼの突然変異体について、補完アッセイで選択した。
【００３５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における植物アシル−ＡＣＰデサチュラーゼの機能を助長するため、植物型フェレドキシン（植物デサチュラーゼの酸化還元パートナー）の遺伝子を含有する発現ベクターをＨＭ１３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換し、そして選択圧下で維持した。これらの細胞、ＭＨ１３（ｐＡＣＹＣ／ＬａｃＡｎＦｄ）を以下の実験で使用した。
【００３６】
トウゴマ−Δ9  １８：０−ＡＣＰデサチュラーゼを、ＭＨ１３細胞への導入前に、２つの型の突然変異誘発（部位特異的もしくは無作為突然変異誘発）の１つにかけた。部位特異的突然変異誘発でＰＣＲを使用して、トウゴマ−Δ9  １８：０−ＡＣＰデサチュラーゼのアミノ酸配列中の明記された残基に対応する標的を定められたコドンを無作為化した。Ｍｅｔ  １１４、Ｌｅｕ  １１８、Ｐｒｏ  １７９およびＧｌｙ  １８８に対応する標的コドンを、それぞれ独立した無作為化にかけた。これらの残基は基質結合空間に隣接して配置されるため、これらの位置でのアミノ酸置換は基質特異性に影響を及ぼすことが高度にありそうである。これらの突然変異誘発反応は４集団を生じ、各自が明示された突然変異部位で全２０種の潜在的アミノ酸より成る置換突然変異をもつコーディング配列のライブラリーを含んだ。無作為突然変異誘発は、単一遺伝子ＤＮＡシャッフリングにより、トウゴマ−Δ9  １８：０−ＡＣＰデサチュラーゼをコードする配列で実施した。
【００３７】
ＭＨ１３（ｐＡＣＹＣ／ＬａｃＡｎＦｄ）を、発現に適切な条件下で、突然変異された１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼの生じるライブラリーで形質転換し、そしてその後、外因性の不飽和脂肪酸の非存在下での成長により、不飽和脂肪酸の栄養要求性を補完する能力をもつ突然変異体の発現について選択した。選択的条件下で生存を賦与するためには、突然変異体のデサチュラーゼは、１６、１４もしくはより少ない炭素の変えられた基質の鎖長の特異性を必ず有するとみられる。部位特異的突然変異体の選択は、液体培地中もしくはアガープレート上のいずれかで実施した。無作為に生じられた突然変異体の選択はアガープレート上で実施した。液体培地中での成長は、最良の補完をもたらした突然変異について濃縮するために、数回の希釈および再成長を必要とした。部位特異的突然変異誘発での変法において、位置１７９および１１４（基質結合チャンネル内の２個の隣接する接触残基）のアミノ酸の全４００種の可能な組み合わせをコードするライブラリーから突然変異体を選択した。これは、位置１７９での全部の可能なアミノ酸をコードするライブラリーの読取り枠から制限フラグメントを摘出すること、および位置１１４について無作為化された同等のプラスミド集団にこのフラグメントを挿入することにより達成した。この方法を使用して突然変異体Ｍ１１４Ｉ−Ｇ１８８Ｌを選択した。選択されたデサチュラーゼのコーディング配列を配列決定して、脂肪酸の栄養要求性に補完を賦与した特定の突然変異を同定した。同定された突然変異体の基質特異性をインビトロ酵素アッセイにより決定した（Ｃａｈｏｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９４：４８７２−４８７７（１９９７））。
【００３８】
表１は、最初に同定された突然変異体、および賦与された変えられた鎖長の基質特異性を列挙する。
【００３９】
【表１】
0004660041.tif 000002
【００４０】
表１。突然変異誘発／選択により得られた突然変異。カッコ内の数字はｗｔトウゴマのトウゴマＤ９  １８：０−デサチュラーゼ活性に関して最も高められる鎖長の特異性を表す。既知の場合は特異性の比の倍数変化もまた示す。例えば、１６炭素に関する活性が１０倍増大し、かつ、１８：０に関する活性が１／５に減少した場合、１６：１８に対するｗｔに関しての特異性の「倍数変化は５０となるとみられる。
【００４１】
上の明示されたアミノ酸位置は、Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １５：４０８１−４０９２（１９９６）に定義されるような成熟したトウゴマ酵素に対応し、その配列を図１に列挙する。
【００４２】
構造に導かれる（もしくは指向される）突然変異誘発の使用は、１６もしくはより少ない炭素の脂肪酸の基質特異性をもつ７種の突然変異体の同定に有効であった一方、該方法は突然変異誘発のための標的残基の適切な選択に頼る。基質特異性に影響を及ぼす残基は、直接的および間接的の２つの広範な分類に分かれることが十分に文書で報告されている。従って、無作為突然変異誘発の選択は、より短いアシル鎖に対する増大された特異性をもたらす変化の偏りを含まない同定方法を提供する。この方法の使用で、５個のアミノ酸位置を同定し、構造に導かれる突然変異誘発のための標的であった部位で３個、ならびに２個の新しい部位（Ｔ１１７およびＴ１８１）を同定した。
【００４３】
トウワタ（Ｍｉｌｋｗｅｅｄ）およびドクサンタ（Ｄｏｘａｎｔｈａ）からの天然に存在する１６：０−ＡＣＰデサチュラーゼは、インビトロでアッセイされる場合に非常に乏しい活性を有する。（それぞれ３１および３ｎＭ／分／ｍｇ）。しかしながら、選択された突然変異体Ｇ１８８Ｌは、親の野性型トウゴマ−Δ9  １８：０−ＡＣＰデサチュラーゼのものにずっとより近い（１７５ｎＭ／分／ｍｇ）という活性を有する。
【００４４】
選択アッセイで同定される変えられた酵素が、植物中で発現される場合に異常な脂肪酸の蓄積をもたらすことができるかどうかを試験するために、発現を駆動させるナピン（ｎａｐｉｎ）プロモーターを使用して、Ｇ１８８Ｌ突然変異体をシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（ｆａｂ１バックグラウンド）に導入した。Ｇ１８８Ｌトランスジェニック体（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ）の第一世代（Ｔ１）は、導入されたデサチュラーゼにより改変されたおよそ１０％の脂肪酸を含有した種子を生じさせた。Ｔ１種子はヘテロ接合性であるため、所望の脂肪酸のレベルはホモ接合性のＴ２植物で増大することができると予期される。これらの結果は、トウゴマ−Δ9  １８：０−ＡＣＰデサチュラーゼ由来の突然変異体が油作物の今後の代謝工学に有用であることができることを示唆する。
節Ｉの材料および方法
細胞系。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）不飽和脂肪酸栄養要求体のＭＨ１３突然変異体（Ｈｅｎｒｙ，Ｍ．Ｆ．、Ｐｈ．Ｄ．論文、イリノイ大学、アーバナ  シャンペイン（Ｕｒｂａｎａ−Ｃｈａｍｐａｉｇｎ）（１９９２））は、細胞系ＤＣ３０８のｆａｄＲ：：Ｔｎ５突然変異体であり（Ｃｌａｒｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２：５８９７−５９０２（１９８３））、これは株ＲＳ３０６９（Ｓｉｍｏｎｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４２：６２１−６３２（１９８０））からファージＰ１形質導入により構築した。ＭＨ１３は、ｆａｂＡ中の温度感受性の損傷およびｆａｄＲのトランスポゾン中断により、全部の成長温度で外因性の不飽和脂肪酸を必要とする。アナバエナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）の植物性フェレドキシン（Ｆｄ）のコーディング配列を含有するｐＥＴ９ｄ発現プラスミド（Ｃｈｅｎｇら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１６：６１９−６３４（１９９５））からのＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＬａｃ３ｄの対応する部位に挿入して、プラスミドｐＬａｃＡｎＦｄを生じさせた。ｐＬａｃ３ｄは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、既に記述された（Ｃａｈｏｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：９３６−９３９（１９９６））とおり大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲＮＡポリメラーゼのｌａｃＵＶ５プロモーターで置き換えられていることを除き、ｐＥＴ３ｄに類似である。その後、ｐＬａｃＡｎＦｄからのＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ｐＡＣＹＣ１８４のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。その後、この構築物（ｐＡＣＹＣ／ＬａｃＡｎＦｄ）を、電気穿孔法によりＭＨ１３細胞に導入した。
補完分析／選択。ｐＡＣＹＣ／ＬａｃＡｎＦｄをもつ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＨ１３株を、アシル−ＡＣＰデサチュラーゼの発現のための宿主として使用した。これらの研究のために、野性型のコーディング配列および突然変異体の成熟したアシル−ＡＣＰデサチュラーゼをｐＬａｃ３ｄに挿入した。生じるプラスミド構築物で細胞を形質転換し、そしてその後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３５μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（４０μｇ／ｍｌ）選択を伴う、ルリア−ベルタニ（ＬＢ）培地を含有するプレート上もしくは液体培地中で成長させた。非選択的成長のため、２５０μｇ／ｍｌオレイン酸および２％（ｖ／ｖ）テルギトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）の最終濃度を含むテルギトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）ＮＰ−４０（シグマ（Ｓｉｇｍａ））中で可溶化された脂肪酸、オレイン酸をプレートに補充した。液体培地は、１００μｇ／ｍｌの最終濃度のオレイン酸（テルギトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）ＮＰ−４０中で可溶化された）を補充した。オレイン酸は、最初にエタノール中での１０００×ストック溶液として調製し、そして培地への添加前に溶融されたテルギトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）中で可溶化した。補完について試験するのに使用された培地は、添加されたオレイン酸を含まず、０．４ｍＭの濃度のＩＰＴＧ（アシル−ＡＣＰデサチュラーゼの発現を誘導するため）を含有した。
形質転換。形質転換は、ｐＡＣＹＣ／ＬａｃＡｎＦｄをもつコンピテントなＭＨ１３細胞の５０μｌアリコート、および所定のアシル−ＡＣＰデサチュラーゼの発現プラスミド０．１ないし０．５μｇを使用する電気穿孔法により実施した。電気穿孔法の後に、細胞を５００μｌのＫＢ培地に再懸濁し、そして３７℃で４５分ないし１時間振とう（２５０ｒｐｍ）した。その後、細胞を上述されたとおり培地上でプレート培養した。あるいは、形質転換された細胞の７５μｌのアリコートを、上述された濃度のＩＰＴＧおよび抗生物質を含有する２５ｍｌのＬＢ培地に添加した。その後、これらの細胞を振とうしながら３０°ないし３７℃で維持した。
【００４５】
カナマイシン（４０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（３５μｇ／ｍｌ）を含有しかつオレイン酸（１００μｇ／ｍｌ）および２％テルギトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）（ｖ／ｖ）を補充された低塩ＬＢ培地（１０ｍｇ／ｍｌバクト（Ｂａｃｔｏ）トリプトン、５ｍｇ／ｍｌ酵母抽出物、および５ｍｇ／ｍｌ塩化ナトリウム）中で、単一コロニーからの培養物を成長させることにより、電気コンピテントの（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＭＨ１３（ｐＡＣＹＣ／ＬａｃＡｎＦｄ）を調製した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の高効率電気形質転換のためのバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）のプロトコルに記述されるとおりに細胞を形質転換のため調製し、そして電気穿孔した。
突然変異誘発。２つの方法を突然変異誘発に使用した。第一は、トウゴマ−Δ9  １８：０−ＡＣＰデサチュラーゼのアミノ酸配列中の特定の位置の１個の標的残基を無作為化した。４個の標的残基、すなわちＭｅｔ  １１４、Ｌｅｕ  １１８、Ｐｒｏ  １７９およびＧｌｙ  １８８を選んだ。ＰＣＲを使用してＤＮＡの４集団を生成させた。各集団は、残基１１４、１１８、１７９もしくは１８８の無作為化されたコドンを含むトウゴマ−Δ9  １８：０−ＡＣＰデサチュラーゼをコードする配列より成った。４集団のそれぞれは、標的コドンの各位置で４種のヌクレオチドのそれぞれの等モルの比率を有するＤＮＡ産物を生じさせるＰＣＲ部位特異的突然変異誘発を使用して生成させた。４種の無作為化された産物のそれぞれについて、標的コドンに隣接する配列にハイブリダイズしかつ標的コドン配列の場所に無作為化されたコドンを含有したオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、プライマー集団は、置換コドン内の３個の位置で４種のヌクレオチド、Ｇ、Ａ、ＴおよびＣのそれぞれの等モルの比率を含有した。このプライマーを、該遺伝子の５’末端に相同なプライマーとともに使用して、２個のプライマー結合部位の間の遺伝子セグメントを増幅した。その後、４種のＰＣＲ反応産物のそれぞれのコーディング配列の残余を増幅するために、ＰＣＲを使用して、第二の重なり合うフラグメントを合成した。その後、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（Ｈｏら、Ｇｅｎｅ  ７７：５１−５９（１９８９））を使用して、該フラグメントをより大きな遺伝子フラグメントに組込んだ。無作為化された標的コドンを含有する遺伝子フラグメントをｐＬａｃ３に挿入した。
【００４６】
第二の突然変異誘発方法は、トウゴマ−Δ9  １８：０−ＡＣＰデサチュラーゼのコーディング領域をＤＮアーゼで消化すること、およびＰＣＲを使用して再集成すること（Ｗ．Ｐ．Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９１：１０７４７−１０７５１（１９９４））により、コーディング領域の配列中に無作為突然変異を導入した。コーディング領域全体をｐＬａｃ３に再挿入して、コーディング領域全体に無作為突然変異をもつｐＬａｃ３−トウゴマ−Δ9  １８：０−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子のライブラリーを作成した。
節ＩＩ：完全な位置の無作為化の他の方法との比較
単一位置の突然変異誘発
トウゴマΔ9−１８：０−デサチュラーゼ中の４個のアミノ酸位置、すなわち１１４、１１８、１７９および１８８を、基質特異性に参画することがありそうとして、構造分析（結晶構造モデルの検査による演繹的推論）により同定した。独立に、５個の位置、すなわち１１４、１１８、１７９、１１７および１８１を、基質特異性に参画することがありそうとして、無作為突然変異誘発により同定した。これは、一緒に、基質特異性に参画することがありそうとして、合計６個の位置、すなわち１１４、１１７、１１８、１７９、１８１、１８８を生じた。標的位置に挿入された２０種の可能なアミノ酸のどれが１４および１６炭素の基質で最高の活性をもつ突然変異体を産生することができるかを同定するために、一度にこれらの位置の１つの無作為化により突然変異体のライブラリーを生成させた。無作為化は、標的位置の全２０種の可能なアミノ酸の１つの挿入をもたらした。６個のライブラリーを生成させた（各標的位置につき１個）。これらのライブラリーをＭＨ１３細菌に導入して、１４もしくは１６炭素の鎖長の高められた基質特異性をもつ突然変異体について選択した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の脂肪酸栄養要求体ＭＨ１３の補完は、デサチュラーゼが１４もしくは１６炭素の鎖長（またはおそらくより少ない）に対する高められた基質特異性を有することを必要とする。選択的条件下で成長することが可能であったレシピエントコロニーを単離した。突然変異体のデサチュラーゼをコロニーの培養物の粗ライセートから精製し、そして、タンパク質のアッセイにより、選択された突然変異体について、１４および１６炭素の鎖長の基質に対する特異的活性を測定した。いくつかの突然変異体については、１８炭素の鎖長の基質の特異的活性を測定した。
【００４７】
２つの型の突然変異誘発から生じられた突然変異体を同定かつ比較した。表２は、各方法により同定された最も活性の突然変異体を列挙する。表３は、双方の形態の突然変異誘発から同定された、位置１１７の突然変異体および位置１８１の突然変異体の活性を比較する。標的位置の無作為化された突然変異体（完全な位置の無作為化）のライブラリーから同定された突然変異体は、１４および１６炭素の基質に対する最高の特異的活性を立証した。無作為突然変異誘発を１回のみ飽和させることにより生じられたライブラリーからの突然変異体の選択（Ｌ１１８Ｆ）は、完全な位置の無作為化により同定される最良の突然変異体を生じさせた。無作為突然変異誘発から生じた他の選択された突然変異体は、完全な位置の無作為化により生じられる突然変異体の速度より下の触媒速度を有した。これの理由は、使用された無作為突然変異誘発法が位置あたり４と７個の間のアミノ酸置換を生成させることのみができたことである。６個の位置に関して、これらの位置のうち５個で、完全な位置の無作為化により全１９種の置換が提供された場合により高い特異的活性をもつ突然変異体の酵素が得られ、そして第六の場合には同等な活性が得られた。これは、単一位置について試験されたより大きい数の置換が、特定の基質に対する特異的活性のより大きな増大の増大された見込みを助長したことを立証した。
表２。無作為点突然変異誘発および完全な位置の無作為化を使用するトウゴマΔ9−１８：０−デサチュラーゼの再改造
【００４８】
【表２】
0004660041.tif 000003
【００４９】
記号：1トウゴマΔ9−１８：０−デサチュラーゼ全体の無作為化された点突然変異誘発。2全２０種のアミノ酸をコードするコドンとの３２倍の縮重を与える、ＮＮＫをコードするプライマーを使用する完全な位置の無作為化。3リン画像形成定量とともに14Ｃ−銀化（ａｒｇｅｎｔａｔｉｏｎ）薄層クロマトグラフィーアッセイを使用して測定された特異的活性。4成熟したトウゴマの読取り枠に関するアミノ酸位置の部位。数字の定義については後に続く印刷物（ｓｈｅｅｔ）を参照されたい。5標準的な３文字形式での置換。6下線を付けられる、単一点突然変異誘発により達成できなかったアミノ酸置換。
【００５０】
【表３】
0004660041.tif 000004
【００５１】
記号：1リン画像形成定量とともに14Ｃ−銀化薄層クロマトグラフィーアッセイを使用して測定された特異的活性。2成熟したトウゴマの読取り枠に関するアミノ酸位置の部位。数字の定義については後に続く印刷物を参照されたい。3ＲＰＭ（トウゴマΔ9−１８：０−デサチュラーゼ全体の無作為化された点突然変異誘発）。4完全な位置の無作為化（全２０種のアミノ酸をコードするコドンとの３２倍の縮重を与える、ＮＮＫをコードするプライマーを使用する）。5下線を付けられる、単一点突然変異誘発により達成できなかったアミノ酸置換。
組み合わせの完全な位置の無作為化
１４および１６炭素の基質に対する高められた活性を有した突然変異体のデサチュラーゼタンパク質を生じさせるための努力において、同時に全６個の標的部位すなわち１１４、１１７、１１８、１７９、１７９および１８８を無作為化することにより、突然変異体のライブラリーを生成させた。この手順は組み合わせの完全な位置の無作為化と命名される。該ライブラリーをＭＨ１３に導入し、それをその後選択培地上でプレート培養した。選択培地上で成長した１９個のコロニーの一組のサンプルを拾った。プラスミドＤＮＡを各コロニーから単離し、そしてＭＨ１３を再形質転換するのに使用して、該プラスミドが改変されたデサチュラーゼをコードしたことを確認した。選択されたコロニーのそれぞれからのプラスミドを精製し、そしてコードされるそれぞれの選択された突然変異体のＤＮＡ配列を決定した。
【００５２】
ＤＮＡ配列の概念的翻訳（ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）は、全１９種の突然変異体が６個の標的部位でアミノ酸の別個の組み合わせを有したことを示した。全１９種の突然変異体のデサチュラーゼ酵素を産生させかつ精製し、そしてインビトロ酵素アッセイにかけた。図２は、産生された突然変異体の５種、および多様な基質に対するそれらの特異的活性を列挙する。試験された基質に対する最高の特異的活性を有する突然変異はｃｏｍ２であった。この突然変異体は、単一位置の突然変異体のいずれが有したよりも１４および１６炭素の基質に対しはるかにより高い特異的活性を有し、それぞれの基質に対する野性型の活性の７４および２３倍を表した（図３）。ｃｏｍ２中のアミノ酸置換の２種すなわちＴ１１７ＲおよびＧ１８８Ｌは、上述された独立した無作為化研究により、それらの位置について至適の置換であることが決定された。この相関は、ｃｏｍ２突然変異体の特異性の増大がこれら２残基での置換によることを示す。注目すべきことに、これらの変化のいずれも点突然変異誘発を介して入手可能でなかった。図２に示されるとおり、分析された１９種の組み合わせ突然変異体のうち５種が、これら２種の特定の突然変異すなわちＴ１１７ＲおよびＧ１８８Ｌを含有したが、しかし、他の４位置では異なる置換を含有した。これら５種の突然変異体は、２種の基質に対する特異的活性における多様な変化を表した。従って、位置１１４、１１８、１７９および１８１での置換は、位置１１７および１８８での変化の影響に対する甚大な効果を有した。従って、他の４部位での置換の組み合わせは、Ｔ１１７ＲおよびＧ１８８Ｌが活性に対して有した正の効果を強調することができたか、あるいは該効果を封鎖することができたかのいずれかであった。別個に基質特異性に影響を及ぼすのに最適に及ばないアミノ酸置換を包含する、基質特異性に影響を及ぼすとして同定される（例えば別個に置換される場合）全部の位置のアミノ酸の可能な組み合わせの数を増大させることは、至適の活性をもつ突然変異体を生じさせる。
【００５３】
事実、順に負の変化を引き起こすことなく正の変化を生じさせる突然変異の適応は、至適の性能を得るために非常に重要であることがありそうである。ある意味において、アミノ酸を構造中の分子の詰め木（ｓｈｉｍ）として見ることができ、構造を調節するのに使用することができる異なる大きさおよび特性の詰め木が多くなるほど、いずれかの特定の構造が至適の活性を有することができる見込みがより大きくなる。従って、タンパク質の特定の特性に影響を及ぼすことができる可能な限り多くの位置を同定すること、およびその後、適切なスクリーニング方法と連結された、それらの位置のそれぞれで可能な限り多くの組み合わせを提示することというアプローチは、至適の活性を有する突然変異体タンパク質を同定することができる。この実施例で突然変異された位置について、点突然変異誘発は限定された数のアミノ酸置換をもたらすことができた。すなわち、Ｍ１１４で６個；Ｔ１１７で５個；Ｌ１１８で５個；Ｐ１７９で６個；Ｔ１８１で６個；およびＧ１８８で５個。従って、全体の組み合わせの数は、６3×５3＝２７，０００個の独特の突然変異体となるとみられる。組み合わせの完全な位置の無作為化法においてのように全２０種の組み合わせが許される場合、その数は１９6＝４７，０４５，８８１種、もしくはそれから特定の特質について至適の突然変異体を選択する１７４２倍より多い組み合わせまで上昇するとみられる。わずかな変化がタンパク質の活性に劇的に影響を及ぼす可能性があるため、触媒作用の速度に影響を及ぼすことが示されるアミノ酸の位置のより少ないよりはむしろより多い突然変異をもたらす方法は、常に、より多くの制限的点突然変異誘発を使用する方法に等しいかもしくはより優れた結果を生み出すことができる。
節ＩＩの材料および方法は、別に下述されない限り、節Ｉに使用されたものと同一である。
完全な位置の無作為化。トウゴマ−Δ9  １８：０−ＡＣＰデサチュラーゼを、ＭＨ１３細胞への導入の前に突然変異誘発にかけた。トウゴマ−Δ9  １８：０−ＡＣＰデサチュラーゼのアミノ酸配列中の明記された残基に対応するコドンを含んで成る３残基を無作為化するために、部位特異的突然変異誘発でＰＣＲを使用した。Ｍｅｔ  １１４、Ｔｈｒ  １１７、Ｌｅｕ  １１８、Ｐｒｏ  １７９、Ｔｈｒ  １８１およびＧｌｙ  １８８に対応する標的コドンを、それぞれ、独立した無作為化にかけた。これらの残基は基質結合空間に隣接して配置されるため、これらの位置のアミノ酸置換が基質特異性に影響を及ぼすことが高度にありそうであると考えられる。これらの突然変異誘発反応は４集団を生じさせ、各１つは明示された突然変異部位で全２０種の潜在的なアミノ酸より成る置換突然変異をもつコーディング配列のライブラリーを含んだ。オーバーラップ伸長ＰＣＲによる位置１１７の全部の可能なアミノ酸置換の導入のための一例を図４に図解する。使用されたプライマーは、１：ＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧ−ＴＣＴＡＧＡＡＡＴ（読取り枠の５’端の唯一のＸｂａＩ部位に隣接する配列）；２：ＣＣＡＡＡＴＴＧＣＣＣＡＡＧＡＣＧＴＣＧＧＡＣ−ＴＴＧＣＡＣＣＴＧＴＴＴＣＡＴＣＣＣＧＡＡＣＴＣＣＡＴＣＣＡＡＭＮＮＡＴＴＣＡＧＣＡＴＴＧＴＴＴＧ（位置１１７についての非コーディング突然変異誘発性オリゴヌクレオチド）；３：ＧＡＡＡＣＡＧＧＴＧＣＡＡＧＴＣＣＧＡＣＧＴＣＴＴＧＧＧＣＡＡ（突然変異誘発性の１７７プライマーに対する重なり合いをもつ非突然変異誘発性のコーディング鎖プライマー）；４：ＧＴＴＴＴＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＴＣＣＴＧ（読取り枠の唯一のＳａｃＩＩ部位に隣接する非コーディング鎖プライマー）であった。プライマー１および４を使用するフラグメントａおよびｂのオーバーラップ伸長により、１種のＰＣＲフラグメントを生じさせた。このフラグメントをＸｂａＩおよびＳａｃＩＩにより制限し、そして野性型のトウゴマΔ9−１８：０−デサチュラーゼを含有するｐＬａｃ３に同等な部位に導入した。トウゴマΔ9−１８：０−デサチュラーゼの他の５個の位置は、位置１１７に使用された方法に同等な様式で独立に突然変異させた。
無作為点突然変異誘発。無作為突然変異誘発は、単一遺伝子ＤＮＡシャッフリング（Ｗ．Ｐ．Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９１：１０７４７−１０７５１（１９９４））により、トウゴマ−Δ9  １８：０−ＡＣＰデサチュラーゼをコードする配列で実施した。プライマー、すなわちコーディング鎖に対応するＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＴＣＴＡＧＡＡＡＴ、および非コーディング鎖に対応するＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＡＧＡＡＴＴＣＴＣを使用するＰＣＲにより、読取り枠を最初に増幅した。野性型のトウゴマの読取り枠からのおよそ５０〜２００ｂｐをＤＮアーゼＩで消化して、読取り枠内の無作為の位置でフラグメントを作成した。その後、プライマーなし（ｐｒｉｍｅｒｌｅｓｓ）ＰＣＲ、次いで５’および３’特異的プライマーを使用する完全な読取り枠の増幅により、遺伝子を集成した。この方法は、高頻度で主に点突然変異を組込んだ。ここで使用された突然変異誘発方法は任意に選ばれ、同等な結果を生じさせるためにいずれかの点突然変異誘発方法を使用することができた。
組み合わせの完全な位置の無作為化。組み合わせの６部位に特異的な完全な位置の無作為化のため、６個の標的コドンのそれぞれについてＮＮＫ（ここで、ＮはＧＡＴおよびＣの等モル混合物を指し、また、ＫはＧおよびＴの等モル混合物を指す）を含有するようプライマーを工作した。完全な読取り枠を集成し、そして図５に示されるとおりオーバーラップ伸長ＰＣＲにより増幅した。図に対応するプライマーは、１：ＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＴＣＴＡＧＡＡＡＴ（読取り枠の５’端の唯一のＸｂａＩ部位に隣接する配列）；２：ＴＴＧＡＴＡＡＧＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＧＴＴ（非突然変異誘発性の非コーディングプライマー）；３：ＡＡＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＣＴＴＡＴＣＡＡＡＣＡＮＮＫＣＴＧＡＡＴＮＮＫＮＮＫＧＡＴＧＧＡＧＴＴＣＧＧＧＡＴＧＡＡＡＣ（突然変異誘発性のコーディング鎖プライマー）；４：ＴＣＣＡＴＴＣＣＴＧＡＡＣＣＡＡＴＣＡＡＡＴＡＴＴＧ（非突然変異誘発性の非コーディング鎖プライマー）；５：ＴＴＧＡＴＴＧＧＴＴＣＡＧＧＡＡＴＧＧＡＴＮＮＫＣＧＧＮＮＫＧＡＡＡＡＣＡＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴ−ＴＮＮＫＴＴＣＡＴＣＴＡＴＡＣＡＴＣＡＴＴＣＣ（突然変異誘発性のコーディング鎖プライマー）；６：ＧＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＧＴＡＣＣＡＴＣＡＧＧＡＴＣＡ（ＫｐｎＩ部位に隣接する非コーディングの非突然変異誘発性プライマー）であった。図５に示されるとおり３種のフラグメントを最初に増幅した。それらを単離し、そしてＴ１１７の完全な位置の無作為化のため、上述されるようなオーバーラップ伸長ＰＣＲにより増幅した。ＸｂａＩおよびＫｐｎＩを使用して最後のフラグメントを制限し、そして野性型のトウゴマΔ9−１８：０−デサチュラーゼを含有するｐＬａｃ３中の同等の部位に導入した。
変えられた鎖長の特異性をもつ突然変異体のデサチュラーゼの選択。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での植物アシル−ＡＣＰデサチュラーゼの機能の決定を助長するため、植物型のフェレドキシン（植物デサチュラーゼの酸化還元パートナー）の遺伝子を含有する発現ベクターをＭＨ１３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換し、そして選択圧下で維持した。これらの細胞、ＭＨ１３（ｐＡＣＹＣ／ＬａｃＡｎＦｄ）を、後に続く実験で使用した。ＭＨ１３（ｐＡＣＹＣ／ＬａｃＡｎＦｄ）を、発現に適切な条件下で、突然変異された１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼの生じるライブラリーで形質転換した。これを達成するために、クローンをＸｂａＩおよびＫｐｎＩ、もしくはＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩのいずれかで制限し、そして成熟したトウゴマΔ9−デサチュラーゼの読取り枠を含有するプラスミドｐＬａｃ３の対応する部位に導入した。プラスミドｐＬａｃは、化学的誘導物質イソプロピルβ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を使用して誘導することができるＬａｃプロモーターを含有する。不飽和脂肪酸を欠く選択培地を使用して、不飽和脂肪酸の栄養要求性を補完する能力をもつ突然変異体を同定した。選択条件下で生存を賦与するためには、突然変異体のデサチュラーゼは、１６、１４もしくはより少ない炭素の変えられた基質の鎖長の特異性を必ず有するとみられる。部位特異的突然変異体の選択は、液体培地中もしくはアガープレート上のいずれかで実施した。無作為に生成された突然変異体の選択はアガープレート上で実施した。液体培地中での成長は、最良の補完をもたらした突然変異について濃縮するために、数回の希釈および再成長を必要とした。この様式で同定された全部の突然変異体のＤＮＡを単離し、そして突然変異体の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞系に再導入し、これを別の回の選択にかけて表現型を確認した。選択されたデサチュラーゼのＤＮＡを配列決定し、そして概念的に翻訳して、受けられた特定の突然変異を同定した。
酵素分析。デサチュラーゼ突然変異体の生化学的パラメータの決定のため、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩでの制限により読取り枠を摘出し、そしてプラスミドｐＬａｃ３の対応する部位に連結し、これは成熟したトウゴマΔ9−デサチュラーゼの読取り枠をＴ７ポリメラーゼプロモーターの制御下においた。発現のための細胞系ＢＬ２１ＤＥ３  ゴールド（Ｇｏｌｄ）（ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））中で該プラスミドを発現させた。細胞を０．５  ＯＤ６００まで成長させ、０．４ｍＭ  ＩＰＴＧの添加により誘導し、そして４時間後に収穫した。デサチュラーゼ酵素を抽出し、そしてポロス（Ｐｏｒｏｓ）２０ＣＭ媒体（パースペクティブ  バイオシステムズ（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を使用するＨＰＬＣ陽イオン交換クロマトグラフィーにより均一近く（９０％）まで精製した。精製されたデサチュラーゼは、適切な鎖長のＣｌ−14Ｃアシル−ＡＣＰを使用してアッセイした。基質および産物をメチルエステルに転化し、そして銀化薄層クロマトグラフィーおよびリン画像形成により分析した。多様な基質との特異的活性を計算した（Ｃａｈｏｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９４：４８７２−４８７７（１９９７））。
【図面の簡単な説明】
【図１】  発明にかかる、成熟したトウゴマ酵素のアミノ酸配列、および対応する核酸コーディング配列を列挙する。
【図２】  発明にかかる、組み合わせの位置の無作為化により生じられた５種の突然変異体、ならびに１４、１６および１８炭素の基質とのそれらのそれぞれの活性を列挙する表である。
【図３】  発明にかかる、単一位置の無作為化により得られる突然変異体および無作為突然変異誘発により得られる突然変異体と、組み合わせの位置の無作為化により生じられる突然変異体を比較する表である。
【図４】  発明にかかる、トウゴマΔ9  １８：０−ＡＣＰデサチュラーゼの部位１１７の完全な位置の無作為化に使用されるプライマーを具体的に説明する図である。
【図５】  発明にかかる、位置１１４、１１７、１１８、１７９、１８１および１８８の完全な位置の無作為化を伴うトウゴマΔ9  １８：０−ＡＣＰデサチュラーゼの組み合わせライブラリーの生成に使用されるプライマーを具体的に説明する図である。
【配列表】
0004660041.tif 000005
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0004660041.tif 000008
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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