(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Trichoderma reesei キシラナーゼII(ＸｙｎII)のアミノ酸Ｔ２およびＴ２８をシステインに変更し、Ｋ５８をアルギニンに変更し、そしてアスパラギン酸を当該酵素のＣ末端に付加(＋１９１Ｄ)することにより、該アミノ酸Ｔ２ＣとＴ２８Ｃとの間にジスルフィド架橋、および該アミノ酸Ｋ５８Ｒと＋１９１Ｄとの間に塩橋を形成している改変Trichoderma reesei キシラナーゼII(ＸｙｎII)(番号付けは、Trichoderma reesei キシラナーゼII(ＸｙｎII)のアミノ酸番号に基づく)。
【請求項２】
Trichoderma reesei キシラナーゼII(ＸｙｎII)のアミノ酸Ｔ２およびＴ２８をシステインに変更し、Ｋ５８をアルギニンに変更し、そしてアスパラギン酸を当該酵素のＣ末端に付加(＋１９１Ｄ)することで、アミノ酸Ｔ２ＣおよびＴ２８Ｃとの間にジスルフィド架橋、およびアミノ酸Ｋ５８Ｒと＋１９１Ｄとの間に塩橋を形成させることを含む、Trichoderma reesei キシラナーゼII(ＸｙｎII)の熱安定性およびｐＨ安定性を改変する方法(番号付けは、Trichoderma reesei キシラナーゼ(ＸｙｎII)のアミノ酸番号に基づく)。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明はタンパク質工学に関し、特にファミリーＧ／１１キシラナーゼおよび該酵素をコードする遺伝子に関する。具体的には、本発明はエンド−１,４−β−キシラナーゼ(EC 3.2.1.8)をコードするTrichoderma reesei ＸＹＮII遺伝子に関する。本発明は部位特異的突然変異誘発を用い、酵素の特性を向上させ、それを用いる工業条件に適合させ得る方法を記載する。キシラナーゼの熱活性および熱安定性を向上させ、またそのｐＨ領域を広域化するのに、タンパク質工学を用いることができる。
【０００２】
【発明の技術背景】
キシラナーゼはβ−１,４−連結キシロピラノシド鎖を加水分解する糖加水分解酵素である。キシラナーゼは少なくとも百種の異なる生物に見出されている。これらは、他の糖加水分解酵素と共に、４０以上の異なる酵素ファミリーを含むスーパーファミリーを形成する(HenrissatおよびBairoch、1993)。ファミリー１１(以前は、Ｇ)キシラナーゼは、それらの遺伝子配列、タンパク質の立体構造および触媒作用の類似性により規定される。このファミリーのメンバーに共通の特徴は、高い遺伝子相同性、約２０ｋＤａの大きさ、および二重置換触媒機構である(Tenkanen等、1992 ; Wakarchuk等、1994)。
【０００３】
ファミリー１１キシラナーゼは、２つの大きいβ−シートを形成するβ−ストランド、および１つのα−ヘリックスから主に形成される。これらは、部分的に閉じた(partly-closed)右手に似る構造を形成し、そのβ−シートはＡ−およびＢ−シートと呼ばる(ToerroenenおよびRouvinen、1997)。このファミリー１１キシラナーゼは、構造が安定で、タンパク質分解酵素活性に対して感受性ではないために、特に産業上の応用に関心がある。更に、キシラナーゼは工業規模において経済的に製造できる。Trichoderma reeseiは、キシラナーゼIおよびII(ＸｙｎIおよびＸｙｎII)が最も特徴的な３つの異なるキシラナーゼを産生すると知られている(Tenkanen等、1992)。ＸｙｎIは１９ｋＤａの大きさであり、ＸｙｎIIと比較して等電点および最適ｐＨが低い(ｐＩ５.５、ｐＨ３〜４)。ＸｙｎIIは２０ｋＤａの大きさであり、ｐＩは９.０、および最適ｐＨは５.０〜５.５である(ToerroenenおよびRouvinen、1995)。
【０００４】
キシラナーゼの最も重要な産業上の応用は、パルプ漂白、織物繊維改変、および動物給餌におけるその消化を改良するバイオマス改変である(Prade、1996)。これら全ての応用に共通する事項(nominator)は、この酵素が直面する過酷な条件である。高温および多くのキシラナーゼの最適ｐＨと実質的に異なるｐＨにより産業上の応用に現在使用できるキシラナーゼの効果的な利用性が減じられている。
【０００５】
給餌応用において、この酵素は給餌調製の間、高温状態に短時間(例えば、９０℃にて２〜５分)直面する。しかし、この酵素の事実上の触媒活性には、低温(例えば、〜３７℃)を要する。それ故、この酵素は高温において不可逆的に不活性化されるべきではない上に、比較的低温において活性でなければならない。
【０００６】
パルプ漂白において、アルカリ洗浄由来の物質は高温(＞８０℃)および高ｐＨ(＞１０)である。商業的に利用できるキシラナーゼで、これらの条件において残存するものはない。現在利用できるキシラナーゼを用いてパルプを処理するには、パルプを冷却し、アルカリ性ｐＨを中性化しなければならない。これはコスト高になることを意味する。キシラナーゼを安定にし、高温および高ｐＨの変性効果に対して耐性にするために、タンパク質工学が用いられている(これは時折、成功している)。
【０００７】
幾らかの熱安定、好アルカリ性および好酸性キシラナーゼが、好熱性生物から発見され、クローニングされた(Bodie等、1995; Fukunaga等、1998)。しかし、これらの酵素を経済的な量で生産することは、多くの場合困難であることが明らかにされている。従って、それ自体は熱安定でないT. reeseiキシラナーゼIIが低コストで大量に生産できるため、工業的に使用される。新規キシラナーゼを単離する、または生産過程を開発する代わりに、現在用いられているキシラナーゼを巧みに処理することにより、過酷な条件に対してより安定化させることができる。
【０００８】
Bacillus circulansキシラナーゼの安定性が、該タンパク質のＮ末端をＣ末端に結合させること、およびα−ヘリックスのＮ末端部分を隣接するβ−ストランドに結合させることによって、ジスルフィド架橋により向上された(Wakarchuk等、1994)。また、Campbell等(1995)は、熱安定性を増大させるために分子間および分子内ジスルフィド結合により、Bacillus circulansキシラナーゼを改変した。他方、T. reeseiキシラナーゼIIの安定性はＮ末端領域を好熱性キシラナーゼの対応部分に変更することにより向上された(Sung等、1998)。この酵素の活性領域は、熱安定性の向上に加え、アルカリ性ｐＨ側に広がった。また、Bacillus pumilusキシラナーゼの安定性を増大させるため、単一点突然変異誘発も用いられている(Arase等、1993)。安定性に対する突然変異誘発の影響が、他の多くの酵素について研究されている。好熱性および中温性酵素の構造を比較することで、情報が豊富に得られた(Vogt等、1997)。また、好熱性キシラナーゼの構造情報によって、キシラナーゼの熱安定性に影響を及ぼす因子に関する情報が得られている(Gruber等、1998；Harris等、1997)。
【０００９】
【発明の概要】
本発明はファミリー１１(以前は、Ｇ)糖加水分解酵素に属するキシラナーゼに関する。本発明はキシラナーゼの熱安定性、熱活性を変更するように改変したキシラナーゼ、および／またはそれらのｐＨ領域を広域化したキシラナーゼを提供する。
【００１０】
Trichoderma reeseiキシラナーゼ構造における種々の改変は、本発明に記載の以下の変更：
(１）Ｎ末端領域をジスルフィド架橋(例えば、Ｔ２ＣとＴ２８Ｃ；Ｐ５ＣとＮ１９Ｃ；Ｔ７ＣとＳ１６Ｃ；Ｎ１０ＣとＮ２９Ｃの突然変異の組みにより形成される架橋)によって、該タンパク質本体に結合させることによって、当該酵素の安定性を増大させ、
(２）アルギニン５８(野生型酵素中のリシン５８をアルギニンに変更した(Ｋ５８Ｒ))と塩橋を形成する付加したアスパラギン酸(＋１９１Ｄ)により伸張することによって、Ｃ末端を安定化し、
(３）α−へリックスをジスルフィド架橋により該酵素本体(例えば、Ｌ１０５ＣおよびＱ１６２Ｃ)に結合させることによって、当該酵素の安定性を増大させ、
(４）種々の位置(Ｎ１１Ｄ、Ｔ２６Ｒ、Ｇ３０Ｈ、Ｎ６７Ｒ、Ｎ９７Ｒ、Ａ１３２Ｒ、Ｎ１５７Ｒ、Ａ１６０Ｒ、Ｔ１６５Ｎ、Ｍ１６９Ｈ、Ｓ１８６Ｒ)に点突然変異を誘発し、キシラナーゼの安定性を向上させること
を単独または組み合わせることのいずれかによって行なう。
【００１１】
具体的には、本発明はアミノ酸Ｔ２およびＴ２８をシステインに変更し、Ｋ５８をアルギニンに変更し、そしてアスパラギン酸を該酵素のＣ末端に付加(＋１９１Ｄ)することで、アミノ酸Ｔ２ＣとＴ２８Ｃとの間にジスルフィド架橋、およびアミノ酸Ｋ５８Ｒと+１９１Ｄとの間に塩橋を形成させた改変Trichoderma reeseiキシラナーゼを提供する。
【００１２】
【本発明の詳しい説明】
細菌、酵母および菌類由来のファミリーＧ／１１キシラナーゼは、共通の分子構造を有する。そのようなキシラナーゼの例としては、以下：
Aspergillus niger XynA
Aspergillus kawachii XynC
Aspergillus tubigensis XynA
Bacillus circulans XynA
Bacillus pumilus XynA
Bacillus subtilis XynA
Neocallimastix patriciarum XynA
Streptomyces lividans XynB
Streptomyces lividans XynC
Streptomyces thermoviolaceus XynII
Thermomonospora fusca XynA
Trichoderma harzianum Xyn
Trichoderma reesei XynI、Trichoderma reesei XynII
Trichoderma viride Xyn
がある。
【００１３】
本発明は、以下の共通する特徴を有するファミリーＧ／１１のキシラナーゼを扱う。
【００１４】
（ｉ）Ｎ末端配列が二重の層になったβ−シート(ファミリー１１キシラナーゼにおける、Ａ−およびＢ−シート、(Gruber等、1998))の一部であり、第一のβ−ストランド(T. reesei ＸｙｎIIにおける、アミノ酸５〜１０)、またはそのＮ末端がジスルフィド架橋により隣接するβ−ストランド(T. reesei ＸｙｎIIにおける、アミノ酸１３〜１９)、若しくは他の隣接する領域と結合できる酵素。
【００１５】
（ii）Ｃ末端ペプチド鎖が大きいβ−シートの一部であるβ−ストランド(T. reesei ＸｙｎIIにおけるアミノ酸１８３〜１９０)を形成し、そのＣ末端領域がジスルフィド架橋により隣接するβ−ストランドに、または塩橋により該酵素本体に結合できる酵素。
【００１６】
（iii）触媒性キャニオン(canyon)に関して、酵素構造の反対側にα−へリックスを有し、該α−へリックスまたは隣接する領域がジスルフィド架橋によって、該タンパク質本体により密接に結合できる酵素。
【００１７】
T. reeseiキシラナーゼIIが上記特性を有し、該酵素において、熱安定性、ｐＨ安定性および熱活性は、これらの特性に基づいて改変できる。以下の変更を、T. reeseiのキシラナーゼ遺伝子(ＸＹＮII)に対して行なった。
【００１８】
１．部位特異的突然変異誘発により、ジスルフィド架橋をＮ末端領域に形成させる：
*スレオニン２および２８をシステインに変更することにより、それら(Ｔ２ＣとＴ２８Ｃ)の間にジスルフィド架橋を形成させる。
*プロリン５およびアスパラギン１９をシステインに変更することにより、それら(Ｐ５ＣとＮ１９Ｃ)の間にジスルフィド架橋を形成させる。
*スレオニン７およびセリン１６をシステインに変更することにより、それら(Ｔ７ＣとＳ１６Ｃ)の間にジスルフィド架橋を形成させる。
*アスパラギン１０およびアスパラギン２９をシステインに変更することにより、それら(Ｎ１０ＣとＮ２９Ｃ)の間にジスルフィド架橋を形成させる。
【００１９】
２．部位特異的突然変異により、組換え的変更として、キシラナーゼのＣ末端に対し、１つのアミノ酸(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸)を加えることで、Ｃ末端から該酵素本体に対する塩橋を形成させ、Ｃ末端を該酵素本体に更に密接に結合させる。適切な場合、塩橋が形成するように、該タンパク質本体に適当なアミノ酸置換を行なうことができる。
*アスパラギン酸(＋１９１Ｄ)をＣ末端セリン(Ｓ１９０)に付加する。これにより、野生型リシンをアルギニンに置換(Ｋ５８Ｒ)したアルギニン５８と塩橋を形成させる。
【００２０】
３．部位特異的突然変異により、α−へリックスを介する該Ｃ末端部分またはα−ヘリックスに近接する領域に、少なくとも１つのジスルフィド架橋を形成させ、当該酵素を安定にする。
*ロイシン１０５およびグルタミン１６２をシステインに変更し、それら(Ｌ１０５ＣとＱ１６２Ｃ)の間にジスルフィド架橋を形成させる。
【００２１】
４．部位特異的突然変異誘発による点突然変異: Ｎ１１Ｄ、Ｔ２６Ｒ、Ｇ３０Ｈ、Ｎ６７Ｒ、Ｎ９７Ｒ、Ａ１３２Ｒ、Ｎ１５７Ｒ、Ａ１６０Ｒ、Ｔ１６５Ｎ、Ｍ１６９Ｈ、Ｓ１８６Ｒが、T. reeseiキシラナーゼIIの安定性を増大させる。
【００２２】
【本発明の方法】
突然変異および組換えＸＹＮII遺伝子の産生は、以下の基本手順により行なった。
【００２３】
１．発現ベクターおよび酵素産生
ベクターｐＫＫｔａｃ(ＶＴＴ、フィンランド、エスポー)またはベクターｐＡＬＫ１４３(ＲＯＡＬ、フィンランド、ラジャメキ(Rajamaeki))を用い、大腸菌株ＸＬI-ＢｌｕｅまたはＲｖ３０８において、T. reeseiキシラナーゼIIを産生した。T. reesei ＸＹＮII遺伝子は、T. resseiのｃＤＮＡからＰＣＲによりベクターｐＫＫｔａｃ(ＩＰＴＧによる発現誘導)に、直接クローニングした。その代わりとして、T. reesei ＸＹＮII遺伝子を含有するプラスミドｐＡＬＫ１４３を用いた。ベクターｐＫＫｔａｃのペクチン酸リアーゼ(ｐｅｌＢ)シグナル配列およびベクターｐＡＬＫ１４３のアミラーゼシグナル配列により、両ベクターは培地中にキシラナーゼを分泌する。
【００２４】
２．部位特異的突然変異誘発および組換えＸＹＮII遺伝子の生産
本発明の実施例において用いた突然変異T. ressei ＸＹＮII遺伝子の産生は、以下のように行なった：変更コドンに対する配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により、突然変異を誘発した。用いたオリゴヌクレオチドの例としては、図１並びに配列１〜１２として添付する配列表がある。プライマー(所望の突然変異を含む)を用いるＰＣＲは、クイックチェンジ法(Quick Change method)(ストラタジーン(Stratagene)、オランダ、レウゼン(Leusden)、ウェストバーグ(Westburg))および遺伝的に既知の方法によって行った。Pfu Turbo(ストラタジーン、米国、カルフォルニア、ラ・ホーヤ)をＤＡＮポリメラーゼとして用いた。クローニングした大腸菌株を、レマゾ−ルブリリアントブルー(Rhemazol Brilliant Blue)にカップリングされたキシラン(ビーチウッド(birchwood)キシラン：シグマ(Sigma)、ドイツ、シュタインハイム)を含むプレート上にて培養した。キシラナーゼ活性はコロニー周辺のハローとして見ることができた(Biely等、1985)。
【００２５】
３．キシラナーゼ活性の決定
酵素試料のキシラナーゼ活性は、加水分解したキシラン繊維から分離された還元糖の量を測定することで決定した。還元糖は５０ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液中にてＤＮＳ法(Bailey等、1992)により測定した。標準的な活性決定はｐＨ５および５０℃にて行なった。
【００２６】
４．酵素の安定性の決定
キシラナーゼの安定性は、種々の温度にて改変した酵素の半減期を測定することにより試験した。酵素を５５℃または６５℃にて様々な時間インキュベートし、残基活性を上述のように測定した。様々な温度にて、酵素を１０分間インキュベートし、次いでＤＮＳ法により残基活性を測定することによって、高温における安定性もまた測定した。ｐＨ依存性のキシラナーゼ活性は、様々なｐＨ値において酵素活性を決定することによって測定した。酵素の最適温度は、様々な温度(１０分、ｐＨ５)にて活性を測定することにより決定した。突然変異型酵素の特性を野生型 T. reesei ＸＹＮII酵素と比較した。
【００２７】
【突然変異の実施例】
実施例１
三重突然変異(Ｔ２Ｃ、Ｔ２８ＣとＫ５８Ｒ)および組換え的変更(＋１９１Ｄ)を、上述の方法を用いてT. reesei ＸｙｎII中に生成させた。突然変異型酵素をＹ５と称する。該突然変異型酵素を大腸菌中において発現させ、培養培地としてルリアブロース(Luria Broth)を用いて振とうフラスコ中３７℃にて、この大腸菌を培養した。培養後、この細胞を遠心分離により除去し、培地中に分泌されたキシラナーゼを、上述のように様々な条件において特徴づけした。図２には、突然変異型Ｙ５(Ｔ２Ｃ、Ｔ２８Ｃ、Ｋ５８Ｒ、＋１９１Ｄ)および野生型酵素(T. reesei ＸｙｎII)を様々な温度においてビーチウッドキシランと共に１０分間インキュベートし、遊離した還元糖の相対量を、ＤＮＳ法を用いて測定した場合の酵素活性に対する温度効果を示す。該突然変異体はキシラナーゼの最適温度が約１５℃高まった。
【００２８】
実施例２
実施例１に記載の三重突然変異キシラナーゼ(Ｔ２Ｃ、Ｔ２８Ｃ、Ｋ５８Ｒ、＋１９１Ｄ)を、クエン酸−リン酸緩衝液中５０℃にて、１％ビーチウッドキシラン中、様々なｐＨ値において１０分間インキュベートした。図３は突然変異型および野生型キシラナーゼについて放出された還元糖の相対量を示す。この突然変異は酵素のｐＨ依存性活性を、わずかにアルカリ性側へ広げた。この突然変異型酵素は、ｐＨ７〜８において野生型酵素よりも、より活性(突然変異型酵素の活性はｐＨ８(５０℃)において約２０％高かった)であった。
【００２９】
実施例３
上記三重突然変異(Ｔ２Ｃ、Ｔ２８Ｃ、Ｋ５８Ｒ、＋１９１Ｄ)および野生型酵素を様々な温度にて１０分間インキュベートした。インキュベート後、この試料を冷却し、残基活性を標準的な条件にて決定した。野生型酵素を、予め５５〜６０℃にて完全にインキュベートした。この突然変異型酵素は、６５℃においてさえ、その活性の約５０％が残存していた(図４)。以下に示す表１において、５５℃および６５℃における突然変異型(Ｙ５)および野生型キシラナーゼの半減期(Ｔ１／２)を示す。
【表１】
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【００３０】
実施例４
上述の方法を用いて、ジスルフィド架橋(Ｌ１０５ＣおよびＱ１６２Ｃ)を形成させ、α−ヘリックスのＣ末端を隣接するβ−ストランドに結合させた。この酵素を大腸菌中に産生させ、その特性を決定した。図５では、種々の温度にて、野生型酵素と比較した突然変異型酵素の不活性化を示す。５５℃における突然変異型酵素の安定性は、野生型酵素に対して約２０倍に増大し、それにより半減期は５分(野生型酵素)から約１.５時間(突然変異型酵素)に増大した。
【００３１】
【文献】
Arase, A., Yomo, T., Urabe, I., Hata, Y., Katsube, Y. & Okada, H. (1993)。ランダム突然変異誘発によるキシラナーゼの安定化。FEBS Letters 316,123-7。
Bailey, J. M., Biely, P. & Poutanen, K. (1992)。キシラナーゼ活性の検定法の研究室内試験。J. Biotech. 23,257-270。
Biely, P., Mislovicova, D. & Toman, R. (1985)。エンド-1,4-β-キシラナーゼおよびエンド-1,4-β-グルカナーゼ検定についての可溶性色素基質。Analytical Biochemistry 144,142-6。
Bodie, E., Cuevas, W. A. & Koljonen, M. (1995)。米国特許第5,437,992号。
Campbell, R.L., Rose, D.R., Sung, W.L., Yaguchi, M. & Wakarchuck, W. (1995)。米国特許第5,405,769号。
Fukunaga, N., Iwasaki, Y., Kono. S., Kita, Y. & Izumi, Y. (1998)。米国特許第5,736,384号。
Gruber, K., Klintschar, G., Hayn, M., Schlacher, A., Steiner. W. & Kratky, C. (1998)。Thermomyces lanuginosus由来の好熱性キシラナーゼ：高分解Ｘ線構造およびモデリング研究。Biochemistry 37,13475-13485。
Harris, G. W., Pickersgill, R. W., Connerton, I., Debeire, P., Touzel, J. P, Breton, C. & Perez, S. (1997)。産業的に関連のある好熱性キシラナーゼの特性についての構造的基礎。Proteins 29,77-86。
Henrissat, B. & Bairoch, A. (1993)。アミノ酸配列の類似性に基づく糖加水分解酵素分類における新規ファミリー。Biochemical Journal 293,781-8。
Prade, R. A. (1996)。キシラナーゼ：生物学から生物工学へ。Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13,101-31。
Sung, W. L., Yaguchi, M., Ishikawa, K., Huang, F., Wood, M. & Zahab, D. M. (1998)。米国特許第5,759,840号。
Tenkanen, M, Puls, J. & Poutanen, K. (1992)。Trichoderma reeseiの２つの主要キシラナーゼ。Enzyme Microb. Technol. 14,566-574。
Toerroenen, A. & Rouvinen, J. (1995)。Trichoderma reesei由来の２つの主要なエンド-1,4-キシラナーゼの構造比較。Biochemistry 34,847-56。
Toerroenen, A. & Rouvinen, J. (1997)。低分子量エンド-1,4-β-キシラナーゼの構造および機能特性。Journal of Biotechnology 57,137-49。
Wakarchuk, W. W., Sung, W. L., Campbell, R. L., Cunningham, A., Watson, D. C. & Yaguchi, M. (1994)。ジスルフィド結合の導入によるバシラスシークランス(Bacillus circulans)キシラナーゼの熱安定性。Protein Engineering 7,1379-86。
Vogt, G, Woell, S. & Argos, P. (1997)。タンパク質の熱安定性、水素結合およびイオン対。Journal of Molecular Biology 269,631-43。
【図面の簡単な説明】
【図１】  キシラナーゼの突然変異誘発(下線のコドン変更)に用いたオリゴヌクレオチドの組みである。また、この配列は添付する配列表中、配列１〜１２としても提供する。
【図２】  T. reesei ＸｙｎIIの最適温度における突然変異Ｔ２Ｃ、Ｔ２８Ｃ、Ｋ５８Ｒおよび＋１９１Ｄの効果を示すグラフである（ＷＴは野生型酵素であり、Ｙ５は突然変異型T. reesei ＸｙｎIIである）。
【図３】  T. reesei ＸｙｎIIのｐＨ依存性活性における突然変異Ｔ２Ｃ、Ｔ２８Ｃ、Ｋ５８Ｒおよび＋１９１Ｄの効果を示すグラフである（ＷＴおよびＹ５は図２と同様である）。
【図４】  種々の温度についてのT. reesei ＸｙｎIIの不活性化における突然変異Ｔ２Ｃ、Ｔ２８Ｃ、Ｋ５８Ｒおよび＋１９１Ｄの効果を示すグラフである（ＷＴおよびＹ５は図２と同様である）。
【図５】  種々の温度についてのT. reesei ＸｙｎIIの不活性化における突然変異Ｑ１６２ＣおよびＬ１０５Ｃの効果を示すグラフである（W.t.は野生型酵素である）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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