(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホップの組織の冷水抽出物からなる抗アレルギー組成物であって、前記冷水の温度は０℃超１０℃以下であり、前記抽出物は有効成分としてケンフェロール配糖体を含む、抗アレルギー組成物。
【請求項２】
前記ホップは、ビール醸造用ホップである、請求項１記載の抗アレルギー組成物。
【請求項３】
前記組織は、茎、毬花又は葉である、請求項１又は２記載の抗アレルギー組成物。
【請求項４】
前記組織は、乾燥された苞の粉砕物である、請求項１又は２記載の抗アレルギー組成物。
【請求項５】
前記組織は、乾燥された毬花の粉砕物から、ルプリンの大きさ以下の粉砕物の少なくとも一部が除かれたものである、請求項１又は２記載の抗アレルギー組成物。
【請求項６】
前記乾燥された毬花の粉砕物は、乾燥された毬花の凍結物の粉砕物である、請求項５記載の抗アレルギー組成物。
【請求項７】
前記組織は、乾燥された毬花から、有機溶媒抽出又は超臨界流体抽出される物質の少なくとも一部が除かれたホップ残渣である、請求項１又は２記載の抗アレルギー組成物。
【請求項８】
前記ケンフェロール配糖体は、ケンフェロールルチノシド、アストラガリン及びケンフェロールマロニルグルコシドからなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項１〜７のいずれか一項記載の抗アレルギー組成物。
【請求項９】
前記フラボノール配糖体として、ケルセチンマロニルグルコシドを更に含有する、請求項８記載の抗アレルギー組成物。
【請求項１０】
前記冷水の温度が２℃〜８℃である、請求項１〜９のいずれか一項記載の抗アレルギー組成物。
【請求項１１】
前記冷水抽出物は、前記冷水によって前記ホップの組織を抽出した抽出液である、請求項１〜１０のいずれか一項記載の抗アレルギー組成物。
【請求項１２】
前記冷水抽出物は、前記抽出液に対してさらにケンフェロール配糖体を濃縮したものである、請求項１１記載の抗アレルギー組成物。
【請求項１３】
前記冷水抽出物は、前記抽出液に対してさらにヘキサン抽出及び酢酸エチル抽出を行い、ヘキサン抽出成分及び酢酸エチル抽出成分が除かれた抽出物である、請求項１１記載の抗アレルギー組成物。
【請求項１４】
前記冷水抽出物は、前記ヘキサン抽出成分及び酢酸エチル抽出成分が除かれた抽出物に対してさらにブタノール抽出を行ったブタノール抽出物である、請求項１３記載の抗アレルギー組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項記載の抗アレルギー組成物を有効成分とする抗アレルギー剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗アレルギー組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、茶葉の成分が生体の様々な生理活性を調節することが見出され、特に、カテキン等のポリフェノール類の抗酸化作用が注目されている（非特許文献１）。また、抗酸化剤として有効な成分が、ホップ苞の水溶性画分をゲル型合成吸着剤に吸着させることで得られることが報告されている（特許文献１）。
【特許文献１】特許第３４７７６２８号公報
【非特許文献１】Ｎｅｗ  Ｄｉｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｖｏ．１９，  ９  （２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ヒトは体内に侵入した異物（細菌、花粉、ダニなど；抗原ともいう）を排除するために、それに対抗する生体成分（抗体やリンパ球など）を産生して体を守るように働く免疫機能を備えている。ところが、時としてその免疫反応が過敏になるため、身体に有害となり種々の病気の原因となってしまうことがある。このような免疫機能障害による反応をアレルギーと言われ、即時型アレルギー（またはＩ〜ＩＩＩ型アレルギー）と遅延型アレルギー（またはＩＶ型アレルギー）とに分類されている。【０００４】
アレルギー反応の中、発症頻度が高いのは即時型であり、主として免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ抗体）が関与している。ＩｇＥは、体内に侵入した抗原に対して免疫細胞であるＢ細胞が産生するものであり、肥満細胞や好塩基球に作用して、これらの細胞からヒスタミンやセロトニンなど多数の活性物質を放出させ、種々のアレルギー症状を引き起こす。例えば、皮膚にかゆみを伴う発赤やふくれあがった発疹（蕁麻疹）が生じたり、鼻や目に炎症を起こしてかゆくなり鼻汁や涙の分泌が盛んになる。また、呼吸気道が詰まったり呼吸困難の発作を起こしたりする症状（気管支喘息）などが現れる。【０００５】
従来、使用される抗アレルギー組成物の多くは、即時型アレルギー反応によって引き起こされる症状を治療する目的で作用点が比較的明らかな薬剤である。このような薬剤として、例えば、平滑筋を弛緩させる鎮痙薬、毛細血管の透過性の亢進を抑制する交感神経興奮薬、ヒスタミン遊離抑制剤が挙げられるが、これらはいずれも対症的な治療薬であり、しかも、そのほとんどが化学合成医薬品であるため、副作用を生じないかに注意が必要であった。【０００６】
本発明はこのような従来技術の問題点を鑑みてなされたものであり、副作用を充分に低減することができ、人体や皮膚に緩和な抗アレルギー組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ヒト好塩基球細胞でヒスタミンの遊離を測定するスクリーニング系を用いて、種々の食品成分を添加してその効果を判定したところ、ホップから所定の方法により抽出した抽出物がヒスタミン遊離抑制作用、すなわち、抗アレルギー作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、ホップの組織の冷水抽出物からなる抗アレルギー組成物に関するものである。【０００９】
この抗アレルギー組成物はヒスタミン遊離抑制作用を有し、例えば、この抗アレルギー組成物をマウスに強制経口投与した後に、マウス耳介にマウス抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体を皮内投与し、その後、抗原としてDNP−HASを尾静脈に注射して、耳介厚増加量及び耳介浮腫率を求めると、顕著なアレルギー反応抑制効果が生じることが確認される。また、本発明の抗アレルギー組成物は天然物であるホップから抽出したものであり、抽出方法も特殊な有機溶媒を用いる必要はなく冷水で行うために、副作用を生じるおそれが少なく、人体や皮膚に緩和な抗アレルギー組成物として適用でき、抗アレルギー剤として使用できる。【００１０】
なお、上記特許文献１ではホップの苞から９５℃又は８０℃で熱水抽出物を得ているが、後述の実施例及び比較例に示されるように、このような熱水抽出物は抗アレルギー性をほとんど示さない。また、冷水抽出物を加熱しても抗アレルギー性が低下しないことから、熱水抽出物と冷水抽出物では有効成分が全く異なっていると考えられる。【００１１】
本発明の抗アレルギー組成物において、好適な抽出物を得るために、ホップはビール醸造用ホップを用いるとよく、ホップの組織としては、茎、毬花又は葉を使用できる。さらに、上記組織は、乾燥された毬花の粉砕物であって、ルプリンの大きさ以下の粉砕物の少なくとも一部が除かれたものであることが好ましく、乾燥された苞の粉砕物であればより好ましい。【００１２】
ビール等発泡性アルコール飲料の醸造で使用するホップは、茎や葉を除いた毬花を乾燥させ、粉砕後に篩分して篩を通過したものを固めてホップペレットとして使用するが、篩を通過しなかった粉砕物は廃棄されることになる。この廃棄される粉砕物は、ルプリンの大きさ以下の粉砕物の少なくとも一部が除かれたものであり、その大部分は苞であるため、これを原料として抗アレルギー組成物の抽出に用いれば産業廃棄物の減少に貢献し、ホップの苞を有効利用できる。【００１３】
さらに、上記の乾燥された毬花の粉砕物は、乾燥された毬花の凍結物の粉砕物であることが好ましい。乾燥された毬花を凍結後に粉砕すると、粉砕効率が増し、粉砕時に生じる熱の影響を受けにくくなるため、粉砕物に含まれる抗アレルギー組成物の抗アレルギー活性を安定的に維持できる。また、ルプリンの大きさ以下の粉砕物が容易に篩を通過するようになるため、ルプリンの大きさを越える粉砕物の純度が高まり、抗アレルギー組成物の純度も高めることができる。【００１４】
また、上記組織は、乾燥された毬花から、有機溶媒抽出又は超臨界流体抽出される物質の少なくとも一部が除かれたホップ残渣とすることができる。ビール等発泡性アルコール飲料の醸造で使用するホップ毬花は、ホップペレットとして使用する他に、ホップエキスの抽出のために使用されるが、ホップエキスを抽出した後に残るホップ残渣は廃棄されることになる。この廃棄されるホップ残渣は、有機溶媒抽出又は超臨界流体で抽出される物質の少なくとも一部が除かれたものであるため、これを原料として抗アレルギー組成物の抽出に用いれば産業廃棄物の減少に貢献できる。【００１５】
上記冷水抽出物は典型的にはフラボノイド配糖体を含有しており、冷水抽出物から分離されたフラボノイド配糖体は抗アレルギー組成物として機能し、抗アレルギー剤として使用できる。このフラボノイド配糖体はフラボノール配糖体であることが好ましく、フラボノール配糖体としてはケンフェロール配糖体を含有することが好ましい。ケンフェロール配糖体としては、ケンフェロールルチノシド、アストラガリン及びケンフェロールマロニルグルコシドからなる群より選ばれる少なくとも１つが挙げられ、抗アレルギー組成物は、フラボノール配糖体として、ケルセチンマロニルグルコシドを更に含有していてもよい。なお、フラボノールは以下の式（１）の構造を主核として有する化合物である。【００１６】
【化１】
0004709205.tif 000002
【００１７】
ケンフェロール配糖体は、以下の一般式（２）に示す骨格を有する。一般式（２）において、Ｒ１が水素原子でありＲ２がルチノース残基である場合がケンフェロールルチノシド、Ｒ１が水素原子でありＲ２がグルコース残基である場合がアストラガリン、Ｒ１が水素原子でありＲ２がマロニルグルコース残基である場合がケンフェロールマロニルグルコシド（アストラガリンマロン酸エステル）である。なお、一般式（２）において、Ｒ１及びＲ２がともに水素原子である場合がケンフェロールであり、Ｒ１がＯＨ基でありＲ２がマロニルグルコース残基である場合がケルセチンマロニルグルコシド（イソケルシトリンマロン酸エステル）である。【００１８】
【化２】
0004709205.tif 000003
【００１９】
フラボノール配糖体は経口摂取されると、消化管内で配糖体のまま吸収されるか、又は消化管内で加水分解され遊離型（アグリコン）となって吸収されると考えられる（臨床栄養  Vol.102, No3, 285 (2003)）。また、ケンフェロール（又はケルセチン）の母核を持つフラボノイド配糖体は加水分解され、アグリコンの状態で吸収されると考えられる。【００２０】
なお、上述した抗アレルギー組成物は、医薬品、化粧品又は飲食品の成分として利用できる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、肥満細胞や好塩基球からのヒスタミンやセロトニンなどの薬理的活性アミンの放出抑制作用に優れ、花粉症などのアレルギー疾患の予防又は症状の緩和に使用できる抗アレルギー組成物が提供される。本発明の抗アレルギー組成物は、天然植物由来であるため、副作用を十分なレベルに低減でき、人体や皮膚に緩和な抗アレルギー組成物となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ホップの葉（国産フラノ１８号）から水抽出したフラボノール画分のＨＰＬＣチャートである。
【図２】ホップペレット（チェコ産ザーツ種）から水抽出したフラボノール画分のＨＰＬＣチャートである。
【図３】実施例２及び比較例１〜２で得られたホップ抽出物のヒスタミン遊離抑制率（％）を示す図である。
【図４】実施例２及び比較例３〜５で得られたホップ抽出物のヒスタミン遊離抑制率（％）を示す図である。
【図５】実施例２の冷水抽出物と実施例２の冷水抽出物の熱処理物のヒスタミン遊離抑制率（％）を示す図である。
【図６】実施例２〜５の冷水抽出物のヒスタミン遊離抑制率（％）を示す図である。
【図７】蒸留水又はホップ冷水抽出液を強制経口投与したマウスについて、片側の耳介にマウスＩｇＥを、反対側に生理食塩水（ＰＳ）を皮内注射した後、抗原を注射してアレルギー反応を起こさせた場合の、それぞれの耳介の浮腫率を示す図である。
【図８】蒸留水、ホップペレット冷水抽出液、ホップ葉冷水抽出液又はフマル酸ケトチフェン水溶液を強制経口投与したマウスについて、片側の耳介にマウスＩｇＥを、反対側に生理食塩水（ＰＳ）を皮内注射した後、抗原を注射してアレルギー反応を起こさせた場合の、それぞれの耳介の浮腫率を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明に使用するホップは、ビール醸造のチェコ産ザーツ種、ドイツ産ハラタウ・トラディション種、国産フラノ１８号等のビール醸造用ホップ種が好適である。【００２４】
ホップの品種によってはフラボノールの含有比率が異なっており、抗アレルギー活性の高いホップ抽出物を得るため、チェコ産ザーツ種を使用することが好ましい。また、抽出に用いるホップ組織はホップの葉、毬花、もしくは茎のいずれでも良い。毬花あるいは濃縮ホップペレット加工時に得られるスペントホップもしくは炭酸ガス抽出（超臨界抽出）した残渣も使用可能である。【００２５】
このようなホップの組織から冷水で抽出したものが、本発明の抗アレルギー組成物であるが、ここで「冷水」とは室温以下の水を意味する。冷水の温度は０℃超５０℃以下が好ましく、通常は０超３０℃以下である。冷水の温度は０超１０℃以下がより好ましく、５±３℃（更には５±２℃）が更に好ましい。なお、抽出効率を上げ抽出時間を短縮するために、冷水には、少量のアルコール、好ましくはエタノールを１０重量％以下添加することができる。【００２６】
抽出する水が０℃以下の場合は凍結のため抽出が実質的に困難となり、冷水でない場合（例えば、５０℃を越す場合）は、抗アレルギー活性が顕著に減少するので使用に適さない。【００２７】
ホップの組織の冷水抽出は常法による。例えば、ホップペレットと水とを容器に入れ、適宜撹拌しながら所定時間静置する。こうして静置後に得られた液は、そのまま冷水抽出物として利用することも可能であるし、例えば、その液を遠心した後に生じる上清（以下「遠心上清」という。）を採取したものを冷水抽出物して利用することも可能である。更には静置後に得られた液又は遠心上清から水分を除去したものを冷水抽出物として利用することもできる。【００２８】
本発明の抗アレルギー組成物は、乾燥されたホップの苞の粉砕物の冷水抽出物を有効成分とすることが好ましく、また、乾燥されたホップの毬花の粉砕物からルプリンの大きさ以下の粉砕物の少なくとも一部が除かれたものの冷水抽出物を有効成分とすることが好ましい。冷水抽出に用いるこの乾燥毬花の粉砕物は、例えば、ホップの毬花を乾燥して乾燥毬花を得る乾燥工程と、乾燥毬花を粉砕して粉砕物を得る粉砕工程と、この粉砕物からルプリンの大きさ以下の粉砕物を取り除く選別工程と、を備える製造方法により得られる。【００２９】
乾燥工程では、ホップの毬花を１００℃以下の温度で乾燥させ、毬花を保存可能な程度にまで水分を除去できればよいが、５５℃以下の温度で水分含量を７〜９％まで乾燥することが好ましい。粉砕工程では、こうして得られる乾燥毬花を効率的に微粉状に粉砕できればよく、例えば、ピンミル、ハンマーミル、ボールミル等の粉砕機を用いればよい。選別工程では、乾燥毬花の粉砕物をふるいにかけ、例えば、長径が０．１ｍｍ以上の粉砕物を「ルプリンを超える大きさ」のものとして選別することができる。この場合において、篩を通過させない大きさを長径０．３ｍｍ以上とすることが好ましく、長径０．５ｍｍ以上とすることがより好ましい。乾燥毬花の粉砕物からルプリンの大きさ以下の粉砕物を取り除くには、例えば、目開き０．１、０．３又は０．５ｍｍのふるいで乾燥毬花の粉砕物をふるい分け、ふるいを通過しなかった粉砕物を回収すればよい。なお、乾燥毬花の粉砕物からルプリンの大きさ以下の粉砕物の少なくとも一部が除かれたものの冷水抽出は、上述した方法で抽出すればよい。【００３０】
さらに、本発明の抗アレルギー組成物を調製するために使用する乾燥されたホップの毬花の粉砕物は、乾燥された毬花の凍結物の粉砕物であることが好ましい。乾燥された毬花を凍結する方法は、特に制限されないが、−１０℃以下が好ましく、−３５℃以下であることがより好ましい。【００３１】
また、本発明の抗アレルギー組成物は、乾燥されたホップの毬花から、有機溶媒抽出又は超臨界流体抽出される物質の少なくとも一部が除かれたホップ残渣の冷水抽出物を有効成分とすることができる。有機溶媒抽出に用いる有機溶媒としては、例えば、アルコール又はヘキサンが挙げられ、炭素数１〜４の低級アルコールが好ましく、エタノールがより好ましい。超臨界流体抽出に用いる超臨界流体としては、例えば、二酸化炭素、水、メタン、エタン、エチレン、プロパン、ペンタン、メタノール、エタノールが挙げられ、二酸化炭素が好ましい。【００３２】
ホップの組織の冷水抽出物に対して更に分離作業を施してフラボノイド配糖体を得ると、その配糖体も抗アレルギー組成物として適用できる。分離の方法の好適例は以下の通りである。まず、冷水抽出物とヘキサンに接触させて水側に第１の抽出物を得るステップ（以下「第１ステップ」という。）を行い、次に、第１の抽出物を酢酸エチルに接触させて水側に第２の抽出物を得るステップ（以下「第２ステップ」という。）を実施する。更に、第２の抽出物を難水溶性アルコール（水と任意の割合で混合しないアルコールをいい、炭素数４〜５のアルカノールが好ましく、ブタノールが特に好ましい）に接触させて、その中に第３の抽出物を得るステップ（以下「第３ステップ」）を行ってフラボノイド配糖体を得る。【００３３】
第１ステップでは、目的とする有効成分（フラボノイド配糖体等）以外のホップ抽出物をヘキサン中に溶出させてそれを選択的に冷水抽出物から除去できる。冷水抽出物のヘキサンへの接触方法としては、例えば、上述の遠心上清及びヘキサンを分液ロートに入れた後、その分液ロートを振とうして冷水抽出物をヘキサンと接触させる方法が挙げられる。冷水抽出物をヘキサンと接触させた後に分液ロートを静置して、水層とヘキサン層とに分離させ、水層を第２ステップで用いる。【００３４】
第２ステップでは、第１ステップにおいて得られる第１の抽出物を酢酸エチルに接触させる。これにより、目的とする有効成分以外のホップ抽出物を更に酢酸エチル中に抽出できる。第１の抽出物の酢酸エチルへの接触方法としては、例えば、第１の抽出物及び酢酸エチルを分液ロートに入れた後、その分液ロートを振とうして第１の抽出物を酢酸エチルと接触させる方法が挙げられる。第１の抽出物を酢酸エチルと接触させた後に分液ロートを静置して、水層と酢酸エチル層とに分離させ、水層を第３ステップで用いる。【００３５】
第３ステップでは、第２ステップにおいて得られる第２の抽出物を難水溶性アルコールに接触させフラボノイド配糖体を得る。第２の抽出物の難水溶性アルコールへの接触方法としては、例えば、第２の抽出物及び難水溶性アルコールを分液ロートに入れた後、その分液ロートを振とうする方法が挙げられる。この後、分液ロートを静置すると、水層と難水溶性アルコール層とに分離するが、フラボノイド配糖体は難水溶性アルコール層中に含まれることになる。より多くのフラボノイド配糖体を得るために、第３ステップは複数回繰り返されてもよく、２〜４回繰り返すのが好ましい。【００３６】
なお、ホップの組織の冷水抽出物を、合成吸着剤（例えば合成吸着剤として、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−４、７及び１６（オルガノ社製、商品名）、活性炭、ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ；ポリフェノール吸着剤）が挙げられ、この中でもＸＡＤ−４が好ましく用いられる。）を充填したカラムに通すことによっても、フラボノイド配糖体を分離することができる。すなわち、ホップの組織の冷水抽出物を、合成吸着剤を充填したカラムに通し、その吸着成分を、例えば、水及びメタノールの混合溶媒に溶出させることでフラボノイド配糖体を得ることもできる。【００３７】
本発明の抗アレルギー組成物は、種々のアレルギー性疾患、例えば、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、血管性浮腫、アトピー性疾患、アレルギー性接触皮膚炎、花粉症、蕁麻疹等の予防又は症状の緩和に使用することができる。すなわち、抗アレルギー組成物としての機能を発揮する。【００３８】
本発明の抗アレルギー組成物は、ヒスタミン遊離抑制作用および耳介浮腫形成抑制作用を示すことから、特にアトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎や花粉症の予防または症状の緩和に好ましく使用できる。また、これらの疾患の予防や症状の緩和の目的で、医薬品として特にアトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎や花粉症の予防剤又は治療剤に製造することができる。【００３９】
更には、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎や花粉症の予防や症状の緩和の目的で、食品添加物として、特定保健用食品、特殊栄養食品、栄養補助食品、健康食品、機能性食品や病者用食品等の飲食物に配合することができ、化粧品添加物として、スキンケア製品、ファンデーションやメイクアップ製品等の化粧品に添加することができる。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明について実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、特に明記しない限り、「％」は「重量％」を表す。【００４１】
（実施例１）
ホップ葉からの冷水抽出：
ホップの葉（国産フラノ１８号）を刻み１０倍量（ｗ／ｖ）の水に浸して５℃にて一晩静置した後、７０００ｒｐｍで１５分遠心分離し、上清を回収して冷水抽出物を得た。【００４２】
冷水抽出物の同定：
上清を分液ロートに移し、ヘキサンを加えヘキサン移行成分を廃棄した。さらに、水層に酢酸エチルを加え、酢酸エチル移行成分を廃棄した。最後に水層にｎ−ブタノールを加えブタノール抽出操作を３回繰り返して得たブタノール層を合併し減圧濃縮してフラボノール画分（ホップの組織の冷水抽出物から分離されたフラボノイド配糖体）を得た。【００４３】
得たフラボノール画分を、まず、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。ＨＰＬＣによる分析は、Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ）を４０℃にて使用し、流速を０．２ｍＬ／分とした。移動相は、０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏを１液とし、アセトニトリルを２液とし、２液の割合を１０％〜５０％まで１６分間で変化させるリニアグラジェントとした。検出は３５０ｎｍのＵＶ検出器で行った。【００４４】
さらに、上記フラボノール画分の各ピークを分取用ＨＰＬＣで分離し、各ピークの成分を同定した。ＨＰＬＣによる分取用分離は、Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＳｕｎＦｉｒｅ）を４０℃にて使用し、流速を６ｍＬ／分とした。移動相は、１０％ＭｅＣＮを１０分間保持し、さらに１５０分間かけて６０％ＭｅＣＮまで変化させるリニアグラジェントとした。検出は３５０ｎｍのＵＶ検出器で行った。ＨＰＬＣの分析結果を図１に示す。【００４５】
図１に示すように、ホップの葉抽出物のフラボノール画分には主ピークが３つ存在し、これらは全てケンフェロール配糖体であることが同定された。詳しくは、図１の１で示すピークはケンフェロールルチノシド、２で示すピークはアストラガリン、３で示すピークはケンフェロールマロニルグルコシドであった。なお、ケルセチンマロニルグルコシド等のケルセチン配糖体は殆ど検出されなかった。【００４６】
（実施例２）
ホップペレットからの冷水抽出：
ホップペレット（チェコ産ザーツ種：タイプ９０）１ｋｇを蒸留水１０Ｌに入れ、５℃にて時々攪拌しペレット状態を消失させながら一晩静置した。７０００ｒｐｍで１５分遠心分離した後、上清を回収し、それをさらに濃縮して１５０ｇの冷水抽出物を得た。【００４７】
冷水抽出物の同定：
上清を実施例１と同様の方法で、ブタノール抽出成分を取得し、ＨＰＬＣで分析し、成分の同定を行った。ＨＰＬＣ分析の結果を図２に示す。図２に示すように、ホップペレット抽出物のフラボノール画分には主要ピークが３つ存在し、これらはケンフェロール配糖体（アストラガリン及びケンフェロールマロニルグルコシド）とケルセチンマロニルグルコシドであることが同定された。詳しくは、図２の１で示すピークはケンフェロールマロニルグルコシド、２で示すピークはアストラガリン、３で示すピークはケルセチンマロニルグルコシドであった。なお、図２の４で示すピークはルチン、５で示すピークはイソケルシトリン、６で示すピークはケンフェロールルチノシドであった。【００４８】
（比較例１）
ホップペレット（チェコ産ザーツ：タイプ９０）を１％（ｗ／ｗ）となるようにクロロホルム−メタノール溶液（クロロホルム：メタノール＝３：１）で抽出した。抽出はクロロホルム−メタノール溶液の沸点にて２時間行った。収率は約１５％であった。【００４９】
（比較例２）
ホップペレット（チェコ産ザーツ：タイプ９０）を１％（ｗ／ｗ）となるようにして煮沸水で２時間抽出を行った。収率は約２３％であった。【００５０】
ホップ抽出物のヒスタミン遊離抑制作用の確認：
実施例２及び比較例１〜２で得られたホップ抽出物を用いて、以下のようにしてヒスタミン遊離抑制作用の確認を行った。【００５１】
ヒト好塩基球株化細胞（ＫＵ８１２）を、１０％の５６℃にて３０分間不活性化した牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ）で、３７℃にて５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。細胞をＴｙｒｏｄｅ溶液で２回の洗浄を繰り返した後、Ｔｙｒｏｄｅ溶液に懸濁し、１．５ｍＬ容のチューブに２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように分注した。細胞懸濁液にそれぞれ表１に示した量の緩衝液、１０ｍＭのＣａＣｌ２、５０μＭのＡ２３１８７及び／又は被検サンプル（ホップ抽出物）を加え、３７℃にて２０分間ヒスタミン遊離反応をさせた後、氷中に５分間入れて反応を停止させた。【００５２】
【表１】
0004709205.tif 000004
【００５３】
その後４℃にて１０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を回収した。回収された上清から有機溶媒で遊離ヒスタミンを抽出し、ｏ−フタルアルデヒドと反応させ発生した蛍光を、波長３５０ｎｍの光で励起こした後波長４５０ｎｍにおいて蛍光強度を測定することによって、遊離ヒスタミンを定量した。また、細胞内総ヒスタミンは、同量の細胞懸濁液を氷中で１分間超音波破砕した後、４℃にて１００００ｒｐｍで３分間遠心分離して得た上清中のヒスタミン含量を測定することによって得た。ヒスタミン遊離抑制率（％）は、１００−｛（各サンプルの上清中のヒスタミン含量−自然遊離量）×１００／（Ａ２３１８７刺激によるヒスタミン遊離量−自然遊離量）｝の式で求めた。【００５４】
実施例２と同様の条件で得られたホップ冷水抽出物及び比較例１〜２で得られたホップ抽出物についてのヒスタミン遊離抑制率（％）を図３に示す。図３に示されるように、実施例２と同様の条件で得られたホップ冷水抽出物では非常に高い％のヒスタミン遊離抑制率が得られたが、クロロホルム−メタノール抽出物（比較例１）や熱水抽出物（比較例２）ではヒスタミン遊離抑制能が認められないことがわかった。【００５５】
（比較例３〜５）
ホップペレット（チェコ産ザーツ種：タイプ９０）１００ｇを蒸留水１Ｌに入れ、１５分間、３０分間、６０分間煮沸し、それを７０００ｒｐｍで１５分遠心分離した後、上清を回収し抽出物（熱水抽出物）とした。抽出を１５分行ったものが比較例３、３０分行ったものが比較例４、６０分行ったものが比較例５である。【００５６】
実施例２と同様の条件で得られた冷水抽出物と比較例３〜５の熱水抽出物を用いて上記と同様にしてヒスタミン遊離抑制率（％）を求めた。その結果を図４に示す（個々のデータを丸で平均値をバーで表す）。図４に示すように、熱水抽出物に比較して冷水抽出物のヒスタミン遊離抑制率は２〜３倍程度優れていた。【００５７】
比較例３〜５において低いヒスタミン遊離抑制率（％）が現れる理由が、加熱による失活によるのかどうかを確かめるために、以下の実験を行った。すなわち、実施例２と同様の条件で得られた冷水抽出物と、この熱処理物（１００℃３０分）について、上記と同様にしてヒスタミン遊離抑制率（％）を求めた。その結果を図５に示す（個々のデータを丸で平均値をバーで表す）。図５に示すように冷水抽出物は熱処理によっても活性を消失しない。したがって、比較例３〜５の熱水抽出物は実施例２の冷水抽出物と有効成分が異なっていることが結論できる。【００５８】
（実施例３〜５）
用いるホップの種類又は組織を変化させて実施例１又は２と同様にして冷水抽出物を得、上記と同様にしてヒスタミン遊離抑制率（％）を算出した。ドイツ産ハラタウ・トラディション種のペレットを用いたのが実施例３、国産フラノβのペレットを用いたのが実施例４、国産ホップの若葉の葉を用いたのが実施例５である。ヒスタミン遊離抑制率（％）の結果を図６に示す。なお、実施例２と同様のホップ（チェコ産ザーツ種のペレット）を用いたものについては、図６において実施例２と記載してある。図６に示すように、ホップ種としては、チェコ産ザーツ種、ドイツ産ハラタウ・トラディション種、国産フラノβが優れており、組織として葉も優れていることがわかった。【００５９】
（実施例６）
マウスＤＮＰ−ＨＳＡによる耳介浮腫におけるホップ水抽出物の抑制作用
６週齢のＩＣＲ系マウス（雄又は雌；日本チャールス・リバー）を、１ケージあたり４〜５匹とし、室温２４±２℃、湿度５５±１５％、１２時間ごとの明暗サイクル（明期８：００−２０：００）の条件下、飼育した。一週間以上の予備飼育後、試験に供した。試験群にはそれぞれホップペレット水抽出液、ホップ葉水抽出液、又はフマル酸ケトチフェン水溶液を、対照群には蒸留水をそれぞれ１０ｍＬ／ｋｇで強制経口投与した。ここで、ホップペレット水抽出液は、ホップペレット（チェコ産ザーツ種）を１０％（ｗ／ｗ）となるように蒸留水中に加え４℃で一晩抽出した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離しろ過することによって調製した。ホップ葉水抽出液は、乾燥ホップ葉（国産ホップ若葉）を１０％（ｗ／ｗ）となるように蒸留水中に加え４℃で一晩抽出した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ろ過することによって調製した。また、フマル酸ケトチフェン水溶液は、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように蒸留水に溶解することによって調製した。【００６０】
経口投与１時間後、マウスの片側の耳介に１０μｇ／ｍＬのマウス抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体（シグマ）を、反対側の耳介に生理食塩水（ＰＳ）をそれぞれ２０μＬずつ皮内注射した。皮内注射２４時間後、１ｍｇ／ｍＬのＤＮＰ−ＨＳＡ（抗原）を１００μＬずつ尾静脈より注射した。抗原投与前及び抗原投与３０分後の耳介の厚みをシックネスゲージで３回ずつ測定し、耳介浮腫率及び耳介厚増加量を求めた。各群間の有意差検定はｔ検定によって行った。なお、耳介浮腫率（％）は、（抗原投与３０分後の耳介厚平均値−抗原投与前の耳介厚平均値）×１００／抗原投与後の耳介厚平均値、の式で求め、耳介厚増加量（ｍｍ）は、抗原投与３０分後の耳介厚平均値−抗原投与前の耳介厚平均値、の式で求めた。【００６１】
蒸留水及びホップ（チェコ産ザーツ種）水抽出液を経口投与されたマウスにおける耳介浮腫率を図７に示す（図７のＰＳは生理食塩水を意味する。）。蒸留水経口投与群では、ＩｇＥ抗体を皮内注射した耳介の耳介厚増加量は０．０８１±０．０１９ｍｍであり、耳介浮腫率は３１．１±６．４（％）であった。一方、ホップペレット水抽出液経口投与群ではＩｇＥ抗体を皮内注射した耳介の耳介厚増加量は０．０１９±０．０１０ｍｍであり、耳介浮腫率は９．７±３．２（％）であった。ホップペレット水抽出液投与群は、蒸留水投与群に比べて有意に耳介浮腫率を抑制した（ｐ＜０．０１）。これに対して、生理食塩水（ＰＳ）を皮内注射した耳介における耳介厚みの増加は、対照群及び試験群ともに認められなかった。【００６２】
また、蒸留水、ホップペレット水抽出液、ホップ葉水抽出液、又はフマル酸ケトチフェン水溶液を経口投与されたマウスにおける耳介浮腫率を図８に示す。蒸留水経口投与群では、ＩｇＥ抗体を皮内注射した耳介厚増加量は０．０８１±０．０２４ｍｍであり、耳介浮腫率は２２．９±６．８％であった。一方、ケミカルメディエーター遊離抑制薬であるフマル酸ケトチフェン水溶液投与群では、ＩｇＥ抗体を皮内注射した耳介厚増加量は０．０４５±０．０２０ｍｍであり、耳介浮腫率は１２．７±５．４％であった。フマル酸ケトチフェン水溶液投与群は蒸留水投与群に比べて有意に耳介浮腫率を抑制した（ｐ＜０．０５）。一方、ホップペレット水抽出液投与群及びホップ葉水抽出液投与群は、蒸留水投与群に対して統計上の有意差（棄却域５％）は認められなかったものの、耳介浮腫を抑制する傾向にあることが示唆された（ｐ値０．０８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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