(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖を阻止または阻害する組成物であって、該組成物は、細胞におけるＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマー形成を防止または減少する薬剤を含み、前記薬剤が抗ＥｒｂＢ−２細胞外ドメイン抗体および抗ＥｒｂＢ−３抗体の組み合わせである、組成物。
【請求項２】
細胞増殖を阻止または阻害する組成物であって、抗ＥｒｂＢ−２細胞外ドメイン抗体および抗ＥｒｂＢ−３抗体の組み合わせである薬剤を含む、組成物。
【請求項３】
前記組み合わせが、細胞増殖を阻止または阻害する際、相乗効果を生む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗ＥｒｂＢ−２抗体が、抗体Ｎ１２である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗ＥｒｂＢ−３抗体が、抗体Ｈ３．１０５．５である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗ＥｒｂＢ−２細胞外ドメイン抗体および／または前記抗ＥｒｂＢ−３抗体がモノクローナル抗体である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体がヒト化されている、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
細胞におけるＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマー形成を防止または減少することで、細胞増殖を阻止または阻害する医薬を製造するための薬剤の使用であって、前記薬剤が、抗ＥｒｂＢ−２細胞外ドメイン抗体と抗ＥｒｂＢ−３抗体の組み合わせである、使用。
【請求項９】
細胞増殖を阻止または阻害する医薬を製造するための薬剤の使用であって、前記薬剤が、抗ＥｒｂＢ−２細胞外ドメイン抗体と抗ＥｒｂＢ−３抗体の組み合わせである、使用。
【請求項１０】
前記薬剤がインビトロで前記細胞に投与される、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１１】
前記組み合わせが、細胞増殖を阻止または阻害する際、相乗効果を生む、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１２】
前記抗ＥｒｂＢ−２抗体が、抗体Ｎ１２である、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１３】
前記抗ＥｒｂＢ−３抗体が、抗体Ｈ３．１０５．５である、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１４】
前記抗ＥｒｂＢ−２細胞外ドメイン抗体および／または前記抗ＥｒｂＢ−３抗体がモノクローナル抗体である、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１５】
前記モノクローナル抗体がヒト化されている、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１６】
前記細胞が癌細胞である、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１７】
前記細胞がヒト乳癌細胞である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記ヒト乳癌細胞が、ＳＫ−ＢＲ−３，ＭＤＡ−ＭＢ−４５３またはＢＴ−４７４である、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、癌処置または治療に適用可能な、細胞増殖を阻止するための方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
癌は、ヒトの主な致命的な疾患であり、ヒトの身体の正常な生理学的状態に影響を与える生理学的に制御されていない細胞増殖により引き起こされ、重篤な病理学的反応を引き起こし、しばしば死に至る。癌研究および処置に対する膨大な試みがなされてきたが、現在も、癌はいまだヒトの死の主な原因である。癌患者を処置するための、手術、放射線治療および化学治療を含む複数のアプローチがある。始めの２つの方法は、患者のガン細胞を完全に排除し得ず、後者のアプローチは、他の処置と共にかまたは他の処置なしで、ガン細胞の増殖を制御するために一般的に使用される。患者に使用される抗ガン化合物は、しばしば、ガン細胞の増殖の阻止を標的化するか、または分裂細胞を殺す。これらの化合物がガン細胞に対して毒性である場合、これらの化合物はまた、ヒトの生命に必要な正常な分裂細胞に重篤な影響を与え得る。従って、癌研究における主な傾向の１つは、正常な細胞増殖に影響を与えることなく、ガン細胞を特異的にブロックまたは殺す方法を見出すことである。これらはここで、癌患者のこのような処置のために要求される。
【０００３】
ＥｒｂＢは、クラス１レセプタータンパク質チロシンキナーゼである。ＥｒｂＢ媒介性細胞シグナル伝達は、胚発生および成体器官機能において重要な役割を果たす。細胞レベルにおいて、ＥｒｂＢレセプターは、細胞増殖、分化、移動、および細胞構造の再構築のためのシグナルを媒介することが示されている。構造的に類似した４つのＥｒｂＢメンバー、ＥｒｂＢ−１、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−４が存在する。上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、ＥｒｂＢ−１に結合するいくつかのリガンドの１つである。ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４もまた、いくつかのリガンド（ニューレグリン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）−１（ＮＲＧ−１）を含む）に結合する。現在のところ、ＥｒｂＢ−２に対するリガンドは同定されていない。しかし、ＥｒｂＢ−２は、ＥｒｂＢ−３、ＥｒｂＢ−４またはＥｒｂＢ−１に対するヘテロダイマーパートナーとして働き、そしてＮＲＧ−１活性化細胞シグナル伝達に大きく関与する。
【０００４】
遺伝子ターゲッティング実験を使用するインビボ研究において、実験により、ＥｒｂＢ−２の不活化から生じる発生の欠損は、ＮＲＧ−１−不活化動物において観察される欠損と類似しているということが示された。両方の動物は、神経性頭蓋神経節および心臓小柱発生における欠陥をしめす。さらに、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４遺伝子不活化マウスは、ＮＲＧ−１またはＥｒｂＢ−２ノックアウトマウスと類似しているかまたは重複している表現型を有する。
【０００５】
発生におけるこの役割に加えて、ヒトＥｒｂＢ−２遺伝子は頻繁に増幅され、そしてそのコードされたタンパク質は、様々なヒト癌において過剰発現される。ＥｒｂＢ−２についての初期の研究により、発癌点変異がＥｒｂＢ−２ホモダイマーの形成を生じ、これは次いで、細胞内ドメイン上のチロシン残基の有意なリン酸化を引き起こすことが発見された。ＥｒｂＢ−２を過剰発現しているヒト癌において対応する点変異は見出されていないが、ＥｒｂＢ−２のアップレギュレーションはホモダイマーの形成を生じ、これは次いで、細胞内ドメインのチロシンリン酸化を増加する。このプロセスは、細胞形質転換および／または増殖を誘発しするシグナルカスケードの開始であり、故に、腫瘍発生を開始すると仮定される。しかし、ＥｒｂＢ−２ホモダイマーが腫瘍発生のイニシエーションの原因であるという仮説と矛盾するする以下の証拠が存在する：ｉ）二量化および自己リン酸化を増強するように操作されるいくつかのＥｒｂＢ−２変異体は、細胞形質転換に対する効果を有さない；（ｉｉ）ＥｒｂＢ−２の細胞外ドメインに結合し、おそらくホモ二量化を促進する抗体は、ＥｒｂＢ−２発現ガン細胞増殖を促進するが、他はガン細胞増殖を阻害する。これらのデータは、ＥｒｂＢ−２のホモ二量化が、細胞増殖の促進または細胞形質転換に対して不十分であり、そしておそらく特定のダイマー配向またはコンフォメーションを含む他の条件が必要とされることを示している。
【０００６】
ＥｒｂＢ−２は、リガンド結合ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４レセプターに対するヘテロダイマーパートナーとして作用する。リガンドのＮＲＧ−１は、２つの独立したレセプター結合部位（一方はＥｒｂＢ−２またはＥｒｂＢ−４に対して高親和性を有する部位であり、他方は全てのＥｒｂＢメンバーに対して低いが非特異的な親和性を有する部位である）を有することが同定されている。従って、ＮＲＧ−１をＥｒｂＢ−３／４およびＥｒｂＢ−２を発現する細胞に暴露することにより、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３／４のヘテロダイマーが生じる。しかし、リガンドの非存在下において、ＥｒｂＢ−２が他のＥｒｂＢレセプターとの親和性を有するか否かは不明であり、そしてこのような相互作用が癌のイニシエーションに関与し得ることが可能である。全てのＥｒｂＢレセプターの中で、ＥｒｂＢ−３は独特である。なぜならｉ）ＥｒｂＢ−２は、ＥｒｂＢ−３と有利にヘテロダイマーを形成し；（ｉｉ）ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３でのＮＩＨ３Ｔ３細胞の同時トランスフェクションにより、ＥｒｂＢ−２のみとのトランスフェクションより高レベルの細胞形質転換が生じ；（ｉｉｉ）ＥｒｂＢ−２過剰発現に関連する乳癌細胞において、ＥｒｂＢ−３はまた高度に発現され；ｉｖ）ＥｒｂＢ−３はまた、ＥｒｂＢ−２トランスジェニックマウス由来のＥｒｂＢ−２過剰発現腫瘍細胞において過剰発現されるからである。
【０００７】
本発明者らは、ＥｒｂＢ、および細胞増殖および阻害におけるそれらの相互作用を研究した。重要なことに、ＥｒｂＢのホダイマーおよびヘテロダイマー形成は、細胞増殖、特にガン細胞において役割を果たし得ることが見出された。
【０００８】
（発明の開示）
本発明者らは、驚くべきことに、ＥｒｂＢ−２発現は、発癌性Ｒａｓ媒介細胞形質転換の阻害を引き起こすことを見出した。さらに、本発明者らは、ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマー形成は、特にガン細胞において、細胞増殖刺激を引き起こすことを見出した。
【０００９】
第１の局面において、本発明は、細胞増殖を阻止または阻害する方法を提供し、この方法は、細胞におけるＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−２ヘテロダイマー形成を防止または減少し、それにより細胞の増殖を阻止または阻害する工程を包含する。
【００１０】
好ましくは、この細胞はガン細胞であり、より好ましくは、ヒト乳癌細胞である。
【００１１】
本発明に従う方法を実施するための１つの様式は、適切な薬剤で細胞を処置することである。好ましくは、この薬剤は、ＥｒｂＢ−２またはＥｒｂＢ−３に結合し、そしてＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマー形成またはコンフォメーションをブロックするか妨げるかまたは妨害して細胞増殖の阻害を生じる分子から選択される。
【００１２】
１つの好ましい形態において、この薬剤は、抗ＥｒｂＢ−２細胞外ドメイン抗体と抗ＥｒｂＢ−３抗体の組み合わせである。このような組み合わせは、細胞増殖の阻止、阻害または抑制に対して付加的または相乗的な効果を生成することが見出されている。
【００１３】
抗ＥｒｂＢ−２抗体Ｎ１２と抗ＥｒｂＢ−３抗体Ｈ３．１０５．５の組み合わせは、本発明に特に適切であることが見出された。
【００１４】
ＥｒｂＢ−２二量化は、複数のメディエータ（例えば、ＥｒｂＢ−２細胞外ドメインと結合する高レベルのＥｒｂＢ−２発現抗体）により引き起こされ得る。ＥｒｂＢ−２活化細胞増殖の阻止は、発癌性Ｒａｓ活化細胞形質転換に勝り、ＥｒｂＢ−２二量化の治療法を示唆する。本発明者らは、ＥｒｂＢ−２は実際に、ＥｒｂＢ−３のような他のＥｒｂＢメンバーと相互作用することを見出した。さらに、ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３複合体形成は、リガンド（ニューレグリン１）刺激と無関係であることが見出された。ＥｒｂＢ−２発現細胞中のＥｒｂＢ−３の存在は、ＥｒｂＢ−２ホモダイマー活化細胞増殖の阻止を十分にブロックし得た。実際に、ＥｒｂＢ−３は、通常、ガン細胞増殖を可能にするＥｒｂＢ−２発現ガン細胞中で発現される。この発見は、ＥｒｂＢ−２と他の膜タンパク質との間の相互作用をブロックし得る分子は、ＥｒｂＢ−２ホモ二量化を助けるかまたは高めるということを示す。ネイティブのＥｒｂＢ−２は、ガン細胞中で過剰発現される主な形態であるため、この発見により、ＥｒｂＢ−２発現ガン細胞を保持する癌患者を処置するための新規の方法が開発され得る。
【００１５】
第２の局面において、本発明は癌治療の方法を提供し、この方法は、患者のガン細胞におけるＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマー形成を防止または減少し、それによりそのガン細胞の増殖を阻止または阻害する工程を包含する。
【００１６】
好ましくは、この細胞はガン細胞であり、好ましくは、ヒト乳癌細胞である。
【００１７】
好ましくは、この癌治療は、患者の正常細胞に実質的に悪影響を与えることなく、ガン細胞におけるＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマー形成を防止または減少し得る１つ以上の薬剤を投与する工程を包含する。この１つ以上の薬剤は、ガン細胞におけるＥｒｂＢ−２とＥｒｂＢ−３との相互作用を防止するかまたは減少することによって、作用し得る。
【００１８】
好ましくは、この薬剤は、ＥｒｂＢ−２またはＥｒｂＢ−３に結合し、そしてＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマー形成またはコンフォメーションをブロックするか妨げるかまたは妨害して、細胞増殖の阻害を生じる分子から選択される。
【００１９】
１つの好ましい形態において、この薬剤は、抗ＥｒｂＢ−２細胞外ドメイン抗体と抗ＥｒｂＢ−３抗体の組み合わせである。このような組み合わせは、細胞増殖の阻止、阻害または抑制に対して付加的または相乗的な効果を生成することが見出されている。
【００２０】
抗ＥｒｂＢ−２抗体Ｎ１２と抗ＥｒｂＢ−３抗体Ｈ３．１０５．５の組み合わせは、本発明に特に適切であることが見出された。
【００２１】
しかし、細胞における細胞増殖の阻止、阻害または抑制に対して付加的または相乗的な効果を生成することが見出されている。
【００２２】
しかし、細胞におけるＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマー形成を防止または低下する他の抗体が本発明に適切な候補であることが理解される。ヒトの臨床的な用途について、ヒト化抗体は、治療による合併症を最小化するためにより適切である。このような抗体を開発するための技術は周知であり、そして細胞におけるＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマー形成またはコンフォメーションをブロックするか妨げるかまたは妨害して、細胞増殖を阻止または阻害する適切な薬剤を開発するために用いられ得る。
【００２３】
好ましくは、この薬剤は、ガン細胞において高レベルのＥｒｂＢ−２発現を引き起こす１つ以上の化合物、抗体および他のリガンドのようなＥｒｂＢ−２細胞外ドメインと結合する化合物、ならびに細胞におけるＥｒｂＢ−３発現を防止または減少するか、または細胞におけるＥｒｂＢ−３とＥｒｂＢ−２との相互作用を妨げる化合物である。他の薬剤には、ＥｒｂＢ−２ホモ二量化を媒介または促進し得るか、あるいはＥｒｂＢ−２と他のＥｒｂＢ（例えば、ＥｒｂＢ−３）との間の相互作用を防止または減少し得る、タンパク質／ペプチドをコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡ発現構築物が挙げられる。これらの化合物は、抗ＥｒｂＢ−２抗体または抗ＥｒｂＢ−３抗体であり得る。ＤＮＡ構築物は、ＤＮＡトランスフェクション、ｃＤＮＡを保持するウイルスによる感染、または他のＤＮＡ送達方法またはシステムを含む、遺伝子治療法により送達され得る。
【００２４】
第３の局面において、本発明は、細胞におけるＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマー形成を防止または減少し、それにより癌治療のための医薬の製造において、細胞の増殖を阻止または阻害する薬剤の使用にある。
【００２５】
第４の局面に老いて、本発明は、ガン細胞におけるＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマー形成を防止または減少する１つ以上の化合物を含有する抗癌剤を提供する。
【００２６】
好ましくは、この細胞はガン細胞であり、より好ましくは、ヒト乳癌細胞である。
【００２７】
好ましくは、この薬剤は、ＥｒｂＢ−２またはＥｒｂＢ−３に結合し、そして細胞におけるＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマー形成またはコンフォメーションをブロックするか、防ぐかまたは防止する１つ以上の化合物を含有する。
【００２８】
１つの好ましい形態において、この薬剤は、抗ＥｒｂＢ−２細胞外ドメイン抗体と抗ＥｒｂＢ−３抗体の組み合わせを含む。より好ましくは、この抗体の組み合わせは、細胞増殖を阻止または阻害する際、相乗的な効果を生じる。
【００２９】
抗ＥｒｂＢ−２抗体Ｎ１２と抗ＥｒｂＢ−３抗体Ｈ３．１０５．５の組み合わせは、本発明に適切であることが見出された。
【００３０】
細胞におけるＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマーの形成を妨げるか、または低下する他の抗体は、本発明についての適切な候補であることが理解される。ヒトの臨床的使用のために、ヒト化抗体はより適切であり、治療の合併症を最小化する。このような抗体を開発するための技術は周知であり、そして細胞におけるＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマーの形成またはコンフォメーションをブロック、妨害または干渉して、細胞増殖を抑止または阻害する適切な薬剤を開発するために適用され得る。
【００３１】
第５の局面において、本発明は、抗癌薬剤としての適合性について薬剤を試験またはスクリーニングする方法に存在し、この方法は、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３を発現する細胞を、この薬剤に曝露する工程、および細胞におけるＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマーの程度を決定する工程を包含する。ここで、ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマーの減少および／または細胞の形質転換の阻害は、この薬剤の抗癌の潜在能力を示している。
【００３２】
本明細書にわたって、文脈が他を必要としない場合は、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のようなバリエーションは、記載される要素、整数または工程、あるいは要素、整数または工程の群を含むが、任意の他の要素、整数または工程、あるいは要素、整数または工程の群を排除しないと意味することが理解される。
【００３３】
本発明がより明確に理解されるために好ましい形態が、添付の図面に関して記載される。
【００３４】
（発明を実施するための形態）
（実験手順）
（材料）
ＮＩＨ３Ｔ３細胞株および乳癌細胞株、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３およびＢＴ−４７４を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入した。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭトランスフェクション試薬を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．より入手した。ＮＲＧ−１および抗体Ｎ１２およびＨ３．１０５．５を、Ｎｅｏ  Ｍｅｒｋｅｒｓより購入した。交差連結試薬ＢＳ３を、ＰＩＥＲＣＥ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙより得た。全長ヒトＥｒｂＢ−２  ｃＤＮＡをコードするＥｒｂＢ−２発現プラスミドｐＲＣ／ＣＭＶ−ＥｒｂＢ−２および全長ヒトＥｒｂＢ−３  ｃＤＮをコードするＥｒｂＢ−３発現プラスミドｐＣＭＶｎｅｏ−ＨＥＲ３は、Ｒｏｄｎｅｙ  Ｆｉｄｄｅｓ博士およびＲｏｇｅｒ  Ｄａｌｙ博士（Ｔｈｅ  Ｇａｒｖａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅｒｃｈ，Ｄａｒｌｉｎｇｈｕｒｓｔ，ＮＳＷ  ２０１０，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）より、親切にも提供された。ＥｒｂＢ−２（ＮＣＬ−ＣＢ１１およびＮＣＬ−ＰＣ１１）を認識する抗体を、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．より購入した。抗ＥｒｂＢ−３をＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより購入した。抗Ｓｈｃ、抗ホスホチロシン（組換えＲＣ２０：ＨＲＰＯ）を、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化２次抗体および強化化学発光（ＥＣＬ）試薬を、ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓより購入した。
【００３５】
（細胞培養および一過性のトランスフェクション）
ＮＩＨ３Ｔ３またはヒト乳癌細胞を、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）および選択抗生物質を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に、３７℃で５％ＣＯ2雰囲気下で維持した。ＮＩＨ３Ｔ３を、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３  ＤＮＡプラスミドで個別にか、または組合わせて、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ試薬を製造者の指示に従って使用して、トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、実験を開始した。増殖因子刺激の前に、細胞をＤＭＥＭ中で１８時間、飢餓させた。
【００３６】
（免疫沈降およびウエスタンブロット分析）
ＥｒｂＢレセプターおよび関連するタンパク質の分析のために、トランスフェクトされた細胞（１〜２×１０6）を、冷ＰＢＳで洗浄し、そして１ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭフッ化ナトリウム、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド、プロテアーゼインヒビター混液（氷上）（Ｂｏｅｒｉｎｇｈｅｒ））中に可溶化した。溶解物を、プロテインＡ（Ｓｉｇｍａ）またはプロテインＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと共に、４℃で６０分間、回転（ｏｒｂｉｔａｌ）ローター上でインキュベートし、その後１３０００ｇで、１５分間の遠心分離によって清澄化した。免疫沈降のために、細胞溶解物を特異的抗体と６０分間４℃でインキュベートした。免疫複合体を、プロテインＡまたはプロテインＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて収集し、そして溶解緩衝液で４度洗浄した。細胞溶解物または免疫沈降されたタンパク質を、サンプル緩衝液中で煮沸することによって可溶化し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。タンパク質を、ＰＶＤＦ膜に電気転移した。０．０２％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ中の５％のスキムミルクでの４℃で一晩のブロッキング後、膜を１次抗体、次いで２次抗体でそれぞれ室温で６０分間プローブした。タンパク質を、ペルオキシダーゼ結合体化２次抗体で、強化化学発光試薬（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を使用して可視化した。再プローブのために、ブロットされた膜を、１％ＳＤＳ、０．２％  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を用いて室温で２時間、振とうすることによって分離し、次いで、それぞれの抗体でプローブした。
【００３７】
（化学交差連結アッセイ）
交差連結アッセイおよび免疫沈降アッセイの前に、トランスフェクトされた細胞を、無血清培地（ＤＭＥＭ）で一晩、飢餓させた。次の日、その細胞を、無血清培地中の５０ｎＭ  ＮＲＧ−１（Ｎｅｏ  Ｍａｒｋｅｒｓ）で１０分間処理した。培養物を３回ＰＢＳで洗浄し、その後、室温で３０分間、細胞不浸透性交差連結試薬ＢＳ3（ＰＩＥＲＣＥ）（ＰＢＳ中、２ｍＭ）で処理した。次いで、交差連結反応を、１５分間室温で１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．５、０．９％  ＮａＣｌおよび０．１Ｍグリシンを用いて停止した。全細胞溶解物を、溶解緩衝液を用いて調製し、そして直ぐに、上記のような免疫沈降アッセイに供した。
【００３８】
（抗体媒介性細胞増殖阻害）
ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＢＴ４７４、ＭＣＦ−７およびＴ４７Ｄ細胞を、ＥｒｂＢ−２および／またはＥｒｂＢ−３に特異的な抗体で処理した。使用した抗ＥｒｂＢ−２抗体は、Ｎ１２であり、それは、ＥｒｂＢ−２を過剰発現する種々の癌細胞株の増殖を阻害すること既知である。使用した抗ＥｒｂＢ−３抗体は、Ｈ３．１０５．５であり、それは、ＥｒｂＢ−３を過剰発現する癌細胞株の増殖に影響しないことが報告されている（Ｎｅｏｍａｋｅｒｓカタログ）。両方の抗体は、同じアイソタイプの抗体であり（ＩｇＧ１）、そしてレセプターの細胞外領域を認識する。細胞を、９６ウェルプレートに、５０００細胞／ウエルの密度で播種し、そして、１６時間置いて接着させた。次いで抗体を、ウェルに添加し（Ｎ１２−１ｍｇ／ｍｌ；Ｈ３．１０５．２．５ｍｇ／ｍｌ、粗マウスＩｇＧ−５ｍｇ／ｍｌ）、そして培養物をさらに５日間インキュベートした。各ウェルの細胞の数を、製造者のプロトコルに従って、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ  ＡＱｕｅｏｕｓ増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して決定した。
【００３９】
（導入）
ＥｒｂＢは、クラス１レセプタータンパク質チロシンキナーゼである。ＥｒｂＢ媒介性細胞シグナル伝達は、胚の発生および成体器官機能において重要な役割を果たす。細胞レベルで、ＥｒｂＢレセプターは、細胞増殖、分化、移動および細胞構造再編成のためのシグナル伝達を媒介することが示された。４つの構造的に類似のＥｒｂＢメンバー、ＥｒｂＢ−１、２、３および４が存在する。上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、ＥｒｂＢ−１に結合するいくつかのリガンドの１つである。ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４はまた、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）を含むいくつかのリガンドを結合する。現在まで、ＥｒｂＢ−２に対するリガンドは、同定されていない。しかし、ＥｒｂＢ−２は、ＥｒｂＢ−３、ＥｒｂＢ−４またはＥｒｂＢ−１に対するヘテロダイマーパートナーとして作用し、そしてＮＲＧ１活性化細胞シグナル伝達において重要に関与する。
【００４０】
遺伝子標的化実験を使用するインビボ研究より、ＥｒｂＢ−２の不活化から生じる発生欠損は、ＮＲＧ１不活化動物において観察される欠損に類似であることが示される。両方の動物は、脳頭蓋神経節（ｎｅｕｒａｌ  ｃｒａｎｉａ  ｇａｎｇｌｉａ）および心臓小柱（ｈｅａｒｔ  ｔｒａｂｅｃｕｌａｅ）発生における欠損を示した。さらに、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４遺伝子不活化マウスは、ＮＲＧ−１またはＥｒｂＢ−２ノックアウトマウスに類似または重複する表現型を有する。このことは、ＥｒｂＢ−２が、インビボでのＮＲＧ−１活性化ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４シグナル伝達経路に関与することを強く示唆する。
【００４１】
発生におけるその役割に加えて、ヒトＥｒｂＢ−２遺伝子は、頻繁に増幅され、そしてそのコードされたタンパク質は、種々のヒト癌において過剰発現される。ＥｒｂＢ−２に関する初期の研究により、腫瘍形成性点変異が、ＥｒｂＢ−２ホモダイマーの形成を生じ、これが、その細胞内ドメインのチロシン残基の有意なリン酸化を順に生じることが解明された。対応する点変異が、ＥｒｂＢ−２過剰発現ヒト癌においては見出されてはいないが、ＥｒｂＢ−２の上方制御は、ホモダイマーの形成を生じ、これが、その細胞内ドメインのチロシンリン酸化を順に増加する。このプロセスは、細胞の形質転換および／または増殖を引き起こすシグナルカスケードの開始であり、従って腫瘍形成を開始すると仮定される。しかし、ＥｒｂＢ−２ホモダイマーが、腫瘍形成の開始の原因であるというこの仮説に矛盾する、以下の証拠が存在する：ｉ）二量体化および自己リン酸化が増強されるよう操作されたいくつかのＥｒｂＢ−２変異体は、細胞の形質転換に影響しない；ｉｉ）ＥｒｂＢ−２の細胞外ドメインに結合し、そしてホモ二量体化を優先的に促進する抗体は、ＥｒｂＢ−２発現癌細胞増殖促進を生じるが、他は、癌細胞増殖を阻害する。これらのデータより、ＥｒｂＢ−２のホモ二量体化が、細胞増殖促進および細胞形質転換に不十分であり、そして他の条件（おそらく特定のダイマー配向またはコンフォメーションを含む）が、必要とされることを示す。
【００４２】
ＥｒｂＢ−２は、リガンド結合ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４レセプターのヘテロダイマーパートナーとして作用する。リガンド、ＮＲＧ−１は、２つの独立したレセプター結合部位を有すると同定されている：１つは、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４に高い親和性を有し、そして他方は、すべてのＥｒｂＢメンバーに対して、低いが、非特異的な親和性を有する。従って、ＥｒｂＢ−３／４およびＥｒｂＢ−２を発現する細胞に対するＮＲＧ−１の曝露は、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３／４のヘテロダイマーを生じる。しかし、リガンドの非存在下において、ＥｒｂＢ−２が、他のＥｒｂＢレセプターとの親和性を有するか否かは、明白ではなく、そして、このような相互作用が、癌の開始に関与し得る可能性がある。以下の理由からある、すべてのＥｒｂＢレセプターの間で、ＥｒｂＢ−３は独特である：ｉ）ＥｒｂＢ−２は、ＥｒｂＢ−３とのヘテロダイマーを優先的に形成する；ｉｉ）ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３でのＮＩＨ３Ｔ３細胞の同時トランスフェクションは、ＥｒｂＢ−２単独でのトランスフェクションよりも高いレベルの細胞形質転換を生じる；ｉｉｉ）ＥｒｂＢ−２過剰発現関連乳癌細胞において、ＥｒｂＢ−３細胞はまた、高度に発現される；ｉｖ）ＥｒｂＢ−３はまた、ＥｒｂＢ−２トランスジェニックマウス由来のＥｒｂＢ−２過剰発現腫瘍細胞において過剰発現される。
【００４３】
本発明者らは、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３が、この２つのレセプターで同時トランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞において、リガンド非依存的様式で相互作用するか否かを試験した。共免疫沈降によって、ＥｒｂＢ−２は、ＮＲＧ−１の非存在下で培養した細胞由来のＥｒｂＢ−３沈降物中で検出され、逆に、ＥｒｂＢ−３が、ＥｒｂＢ−２沈降物中に検出された。ＥｒｂＢ−２／３複合体はまた、架橋実験において同定された。これらのリガンド依存的およびリガンド非依存的なＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマーは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で異なる移動度の２つの架橋ダイマーによって区別された。しかし、リガンド非依存的ヘテロダイマーにおけるＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３の両方はリン酸化され、そしてＳｈｃ（細胞内細胞シグナル伝達タンパク質）に結合する。これらのリガンド非依存的ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマーはまた、ＥｒｂＢ−２過剰発現ヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３、ＴＢ−４７４およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３由来の細胞において検出された。このリガンド非依存的ヘテロダイマーが乳癌において細胞増殖を活性化し得るか否かを試験するために、上記の３つのヒト乳癌細胞株を、細胞増殖アッセイにおいて、抗ＥｒｂＢ−２細胞外ドメイン抗体および抗ＥｒｂＢ−３細胞外ドメイン抗体で処理した。抗ＥｒｂＢ−２抗体Ｎ１２は、３つ全ての癌細胞株において増殖を阻害し、一方、抗ＥｒｂＢ−３抗体は、ＢＴ−４７４およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３癌細胞株の増殖を減少した。興味深いことに、ＳＫ−ＢＲ−３癌細胞の培養において、ＥｒｂＢ−２抗体をＥｒｂＢ−３抗体と合わせた場合、この２つの抗体は、癌細胞の増殖に対して相乗的な阻害効果を有した。これらの結果は、ＥｒｂＢ−３が、ＥｒｂＢ−２とのリガンド非依存性ヘテロダイマー化によって、ヒト乳癌細胞増殖に関与することを示す。
【００４４】
（結果）
ＮＲＧ−１の非存在下でのＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３の相互作用を研究するために、本発明者らは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用した。このＮＩＨ３Ｔ３細胞は、低レベルのＥｒｂＢ−２を発現し、他のＥｒｂＢレセプターを検出可能なレベルで発現せず、そしてＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３の両方を一過的に発現する。細胞培養培地の血清中の潜在的なＮＲＧ−１を回避するために、細胞を無血清培地で２４時間培養して、その後回収した。次いで、ＥｒｂＢ−２またはＥｒｂＢ−３を、いずれかのレセプターに特異的な抗体を使用して沈降させ、そしてその沈降物をウエスタンブロットによって分析した。抗ＥｒｂＢ−２抗体を使用する免疫ブロットは、ＥｒｂＢ−３沈降物中にＥｒｂＢ−２を検出した（図１ａ、中パネル、レーン３）。これは、これらの抗体の交差反応ではなかった。なぜなら、抗ＥｒｂＢ−３抗体は、ＥｒｂＢ−２を沈降させ得ず（図１ａ、真ん中のパネル、レーン５）、またこのウエスタンブロットにおいてＥｒｂＢ−２に結合し得なかった（図１ａ、下パネル、レーン１）からである。同様に、抗ＥｒｂＢ−２抗体は、ＥｒｂＢ−３を沈降させ得ず（図１ａ、下のパネル、レーン１）、またこのウエスタンブロットにおいてＥｒｂＢ−３に結合し得なかった（図１ａ、中パネル、レーン２）。この複合体形成は、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３の膜会合を必要とした。なぜなら、可溶性レセプターは、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３で別々にトランスフェクトした細胞の、混合した細胞抽出物において、複合体を形成し得ないからである（図１ａ、中パネル、レーン５）。ＥｒｂＢ−３レセプターはまた、ＥｒｂＢ−２／３を同時トランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞由来の抗ＥｒｂＢ−２沈降物のウエスタン免疫ブロッティングによって検出された（図１ｂ）。予測されたように、ＮＲＧ−１の存在は、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３のヘテロダイマー化を増強する（図１ａ、レーン４；図１ｂ、レーン２）。
【００４５】
免疫ブロッティングは、ＮＲＧ−１で処理したＥｒｂＢ−２／３細胞またはＮＲＧ−１で処理しなかったＥｒｂＢ−２／３細胞由来の、１８０ｋＤａタンパク質のリン酸化チロシンの存在を検出した（それぞれ、図１ａ、上パネル、レーン３およびレーン４）。このリン酸化は、細胞内ＥｒｂＢ−２および／またはＥｒｂＢ−３上に存在し、これらが、リガンド非依存性ヘテロダイマーを形成したことが予測される。ＥｒｂＢ−２とは異なり、ＥｒｂＢ−３は、欠損性のキナーゼドメインを有し、そして他のタンパク質をリン酸化することができなかった。従って、これは、このリン酸化されたタンパク質が、ほぼおそらくＥｒｂＢ−３であることを示す。
【００４６】
共免疫沈降によって検出されたＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３の複合体がヘテロダイマーであるか否かを試験するために、ＥｒｂＢ−２またはＥｒｂＢ−３を単独でトランスフェクトした細胞、またはＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３で同時トランスフェクトした細胞を用いて、架橋実験を行った。これらの細胞溶解物を、抗ＥｒｂＢ−２抗体または抗ＥｒｂＢ−３抗体で免疫沈降させた。ＥｒｂＢ−２過剰発現は、ホモダイマー化を生じる（２本のタンパク質バンドが約３６０ｋＤａで検出され、一方で、モノマーレセプターが、約１８０ｋＤａで検出されたように（図２ａ、上パネル、レーン１））。このＥｒｂＢ−２ホモダイマーの形成は、リガンド刺激に非依存的であった（図２ａ、上パネル、レーン１  対  レーン２）。
【００４７】
３６０ｋＤａダイマーはまた、ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３同時トランスフェクト細胞において検出された（図２ａ、レーン５）。これはヘテロダイマーである。なぜなら、このタンパク質は、抗ＥｒｂＢ−３抗体で沈降され、そして抗ＥｒｂＢ−２抗体でのウエスタンブロット上に検出されたからである。しかいｓ、ＥｒｂＢ−２ホモダイマーとは異なり、このＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマーは、単一のバンドのみからなった。ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３同時トランスフェクトした細胞のＮＲＧ−１刺激に応答して、ＥｒｂＢ−２トランスフェクト細胞において見られたのと同様の低い移動度のヘテロダイマー複合体が存在した（図２ａ、上パネル、レーン１  対  レーン６）。このリガンド活性化ヘテロダイマーの移動度の減少は、チロシンリン酸化の増加に起因しなかった。なぜなら、ｉ）この２本のダイマーは、チロシン残基上で両方ともリン酸化され；そしてｉｉ）リガンド依存性ヘテロダイマーおよびリガンド非依存性ヘテロダイマーの両方が、同様のレベルのチロシンリン酸化を有したからである（図２ａ、中パネル、レーン５および６）。再度、ＥｒｂＢ−２／３ヘテロダイマーの存在は、抗体の交差反応性の結果ではなかった。なぜなら、このＥｒｂＢ−２ホモダイマーは、抗ＥｒｂＢ−３抗体によって検出されなかったからである（図２ａ、下パネル、レーン１および２）。ＥｒｂＢ−３は、たとえＮＲＧ−１の存在下であっても、限定された量のホモダイマーしか形成し得なかった（図２ａ、下パネル、レーン３および４）。
【００４８】
ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３のヘテロダイマー化が、血清中の未知のリガンドによって刺激され得るか否かを試験するために、ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３同時トランスフェクト細胞を、無血清培地または血清含有培地のいずれかにおいて培養した。図２ｂ、左パネルおよび右パネルに示されるように、同様のバンドパターンが、血清を含む培地または血清を含まない培地で培養した細胞から検出される。
【００４９】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３過剰発現媒介へテロダイマー形成が、ＥｒｂＢ−２を過剰発現する癌細胞に対する関連性を有したか否かを試験するために、ヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３およびＢＴ４７４（これらは、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３を過剰発現する）を研究した。同時トランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるように、抗ＥｒｂＢ−３抗体を使用して、ＥｒｂＢ−２はＥｒｂＢ−３と共に共沈降した（図３ａ）。また、同時トランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞からのデータと一貫して、ＮＲＧ−１は、これらの細胞におけるＥｒｂＢ−２／３ヘテロダイマーの形成を有意に増強した（図３ａ）。
【００５０】
リガンド刺激したＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマーは、細胞シグナル分子Ｓｈｃに結合することが知られているので、本発明者らは、リガンド非依存性ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマーもまたＳｈｃに結合するか否かを試験した。同様の量のＳｈｃは、ＮＲＧ−１の非存在下で、ＥｒｂＢ−２トランスフェクト細胞およびＥｒｂＢ−２／３同時トランスフェクト細胞由来のＥｒｂＢ−２と共免疫沈降した（図４ａ、レーン１および２）。ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＥｒｂＢ−２の過剰発現は、ＥｒｂＢ−２ホモダイマーを生じるので（図２ａ）、このデータは、Ｓｈｃが、ＥｒｂＢ−２ホモダイマーに結合し得ることを示す。しかし、Ｓｈｃはまた、ＮＲＧ−１の非存在下および存在下でＥｒｂＢ−２／３トランスフェクト細胞由来のＥｒｂＢ−３と共免疫沈降した（図４ｂ、レーン２および３）。Ｓｈｃは、ＥｒｂＢ−３を単独で発現する細胞由来のＥｒｂＢ−３と共免疫沈降しなかったので、このデータは、Ｓｈｃが、ＮＲＧ−１の存在下および非存在下でＥｒｂＢ−２／３ヘテロダイマーと会合することを示す。
【００５１】
次に、Ｓｈｃがまた、ヒト乳癌細胞においてＥｒｂＢ−２／３ヘテロダイマーと会合するか否かを試験した。再度、Ｓｈｃが、各癌細胞株由来のＥｒｂＢ−３と共免疫沈降することが見い出された（図４ｃ）。試験した各細胞株において、ＮＲＧ−１は、ＳｈｃのＥｒｂＢ−３との共免疫沈降を増大させ、これは、Ｓｈｃが、ＥｒｂＢ−２／３ヘテロダイマーと相互作用することを示す。
【００５２】
リガンド非依存性ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマーが、細胞シグナル伝達および細胞増殖刺激において活性であるか否かを試験するために、市販の抗ＥｒｂＢ−２（Ｎ１２）細胞外ドメイン抗体および抗ＥｒｂＢ−３（Ａｂ５）細胞外ドメイン抗体を使用して、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３を過剰発現するヒト乳癌細胞の培養物を処理した。これらの抗体の組み合わせは、前形成されたＥｒｂＢ−２／３ヘテロダイマーを崩壊し、従って、そのシグナル伝達特性およびおそらく細胞増殖刺激を崩壊することが予測された。Ｎ１２は、種々の癌細胞株の増殖を阻害することが以前に報告されており、そしてここで、この抗体がＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞、ＢＴ−４７４細胞およびＳＫ−ＢＲ−３細胞を含む癌細胞株の足場依存性増殖を阻害すること確認する（図５）。ＢＴ−４７４細胞は、他の細胞株と比較して、Ｎ１２に対してより感受性であった。しかし、Ａｂ５もｍた、ＢＴ−４７４細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞の両方において増殖を阻害することが見い出された（それぞれ、図５ａおよびｂ）。Ｎ１２を用いた場合と同様に、ＢＴ−４７４細胞は、試験した他の癌細胞株と比較して、Ａｂ５により感受性であった。Ｎ１２およびＡｂ５を組み合わせてこれらの乳癌細胞を処理した場合、これらは、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞およびＢＴ−４７４細胞に対して相加効果を有し、そしてＳＫ−ＢＲ−３細胞に対して相乗効果を有した。Ｔ４７Ｄ細胞およびＭＣＦ−７細胞もまた、この細胞増殖アッセイで試験した。Ｔ４７Ｄ細胞において、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３が過剰発現され、そしてＭＣＦ−７細胞において、ＥｒｂＢ−１、３および４が、高度に発現される。しかし、Ｎ１２およびＡｂ５のいずれに対する細胞応答も存在せず、これは、ＥｒｂＢ−３の増殖活性が、活性なＥｒｂＢ−２（これは、抗ＥｒｂＢ−２抗体に応答し得る）の存在に依存することを示す（データは示さず）。従って、ＥｒｂＢ−２／３ヘテロダイマーは、リガンドの非存在下でさえ、多くのヒト乳癌細胞において活性であり、そしてこのヘテロダイマーは、細胞増殖を刺激することを担うということが結論付けられた。
【００５３】
（考察）
全体として、本発明者らは、リガンドＮＲＧ−１の非存在下でのＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３によって誘発される細胞増殖刺激効果を示した。これは、ヒト乳癌細胞におけるＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３の過剰発現に関連する。この知見は、以下の観察によって支持される：ｉ）過剰発現されたＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３は、抗ＥｒｂＢ−２抗体阻害効果に応答する、ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３同時トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞、およびＥｒｂＢ−２過剰発現ヒト乳癌細胞においてヘテロダイマーを形成する；ｉｉ）リガンド非依存性ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマーにおいて、ＥｒｂＢ−３は、チロシン残基上でリン酸化されている；ｉｉｉ）リガンド非依存性ヘテロダイマーは、細胞シグナル伝達分子Ｓｈｃに結合する；ｉｖ）市販の抗ＥｒｂＢ−３抗体（これは、癌細胞に対して阻害効果を有さないと以前に報告されている）は、ヒト乳癌細胞増殖を阻害し、そして抗ＥｒｂＢ−２抗体と組み合わせた場合に、これらは、細胞増殖阻害に対して相加的または相乗的な効果のいずれかを示す。従って、ＥｒｂＢ−３は、過剰発現されたＥｒｂＢ−２とのリガンド非依存性相互作用を介してヒト乳癌細胞増殖に関与すると結論付けられる。
【００５４】
初期の研究は、ＥｒｂＢ−２過剰発現単独が、腫瘍形成を誘導するのに十分であると仮定した。このような結論は、以下の観察からなされた：ｉ）ＥｒｂＢ−２は、種々のヒト癌細胞において、このＥｒｂＢ−２遺伝子が増幅されるので、過剰発現される；ｉｉ）ＥｒｂＢ−２過剰発現は、その細胞内ドメインのリン酸化ならびに細胞シグナル伝達タンパク質ＳｈｃおよびＧｒｂ２への結合を生じる；ｉｉｉ）培養線維芽細胞の野生型ＥｒｂＢ−２遺伝子でのトランスフェクションは、細胞形質転換を生じる；およびｉｖ）ホモダイマー化が増大される、ＥｒｂＢ−２変異体が、より高いレベルの形質転換活性を示す。しかし、ＥｒｂＢ−２変異体は細胞を形質転換し得るが、野生型ＥｒｂＢ−２もまた細胞を形質転換し得るか否かは明らかではない。なぜなら、他の研究は、ＥｒｂＢ−２単独について、このような活性を同定することが出来ないからである。ＥｒｂＢ−３発現が、ＥｒｂＢ−２トランスジェニック株由来の腫瘍細胞において生じるように、これらの少数のＥｒｂＢ−２形質転換細胞において、ＥｒｂＢ−３もまた発現されるか否かは明らかではない。従って、たとえＥｒｂＢ−２が癌細胞増殖または細胞形質転換に関与するとしても、ＥｒｂＢ−２単独が、細胞増殖または細胞形質転換についての細胞シグナルを媒介するに十分であるか否かは明らかではない。ＥｒｂＢ−２ホモダイマーでなく、ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマーだけが、腫瘍形成に直接関与する可能性がある。
【００５５】
本研究は、リガンド結合なく、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３ヘテロダイマー複合体が、ＥｒｂＢ−２を過剰発現しかつＥｒｂＢ−３を高度に発現する細胞における細胞表面上に存在することを示す。これは、同時トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞由来のＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３の共免疫沈降によって支持される。この共免疫沈降はまた、ＥｒｂＢ−２を過剰発現しかつ高レベルのＥｒｂＢ−３を発現するが、ＮＲＧ−１を発現しない、ヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ３、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３およびＢＴ−４７４でも得られる。このリガンド非依存性ヘテロダイマーは、ＥｒｂＢ−３ホモダイマーよりも、ＮＲＧ−１に対してより高い親和性を有し得ることが考えられる。ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３の人為的なヘテロダイマーは、人為的なＥｒｂＢ−３ホモダイマーまたはモノマーよりも、はるかに高いリガンド結合親和性を有する。しかし、以前の研究は、リガンドが、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３のダイマー化を惹起することを示唆した。この明らかな矛盾は、十分に説明されていない。従って、これらの研究からは、このダイマーが、ＥｒｂＢ−３へのリガンド結合の前後のいずれで形成されるかは明らかでない。さらに、現在の知見は、ＥｒｂＢ−３の存在が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のＥｒｂＢ−２ホモダイマーの２本のバンドの形成を妨げ得るように、ＥｒｂＢ−２−ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマー複合体のリガンド非依存性の形成は、ＥｒｂＢ−２ホモダイマーの形成よりも優性であり得ることを示唆する。
【００５６】
リガンド依存性のＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマーが、リガンド非依存性ヘテロダイマーよりも、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でより低い移動度を有することは予想されない。この差異は、レセプターに架橋し得る、リガンドＮＲＧ−１の分子量に起因し得る。しかし、この実験において使用されるリガンドは、約７ｋＤａのＥＧＦドメインのみを含み、従って、リガンドの分子量は、ヘテロダイマーの移動度を有意に変化し得ることはありそうにない。代わりに、この移動度の差異は、架橋試薬によって固定されるこの２つのヘテロダイマー間の異なるコンフォメーション、または異なるリン酸化のレベルに起因し得るが、両方のヘテロダイマーは、抗ホスホチロシン抗体によって検出される匹敵するレベルでリン酸化される。
【００５７】
本研究の別の重要な局面は、抗ＥｒｂＢ−３抗体媒介癌細胞増殖阻害である。本研究で使用した抗ＥｒｂＢ−３抗体（Ｈ３．１０５．５）は以前に調べられており、そしてＥｒｂＢ−３を発現する癌細胞の増殖に対して効果を有さないことが見い出された（ＮｅｏＭａｒｋｓ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ．１９９９）。この種々の観察は、使用した異なる細胞株に起因し得る。以前の研究とは異なり、本発明者らは、５つのヒト乳癌細胞株：ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３およびＢＴ−４７４を試験した。最後の２つの細胞株由来の細胞は、ＥｒｂＢ−３抗体単独に対して応答する。興味深いことに、ＳＫ−ＢＲ−３細胞は、ＥｒｂＢ−３抗体単独に対して有意に応答しないが、ＥｒｂＢ−２抗体単独よりも２．５倍より高いＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３抗体の組み合わせに対する応答を示す。重要なことに、ＥｒｂＢ−３抗体に応答する３つの全ての細胞株はまた、ＥｒｂＢ−２抗体に対して応答する。ＭＣＦ−７細胞およびＴ４７Ｄ細胞は、たとえＭＣＦ−７細胞がＥｒｂＢ−１、３および４を発現し、そしてＴ４７ＤがＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３を過剰発現するとしても、ＥｒｂＢ−２抗体およびＥｒｂＢ−３抗体のいずれに対しても応答しない。抗ＥｒｂＢ−２抗体ヘルセプチン（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（これは、癌細胞増殖抑制のために乳癌患者において使用されている）は、５０％の患者に対してのみ効果的であることを考慮すると、両方の抗体に対するこれら３つの細胞応答の同時発生は、ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマーが、癌細胞増殖の刺激において活性形態にのみあり得ることを示唆する。
【００５８】
本発明の１つの局面は、ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロダイマー形成をブロックまたは干渉することによる、癌治療のための新規アプローチである。
【００５９】
多くの変更および／または改変が、特定の実施形態に示されているような本発明に対して、広範に記載されている本発明の精神または範囲から逸脱することなく成され得ることが、当業者に理解される。従って、本実施形態は、全ての局面において例示としてみなされ、限定するものとみなされない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＥｒｂＢ−２は、ＮＲＧ−１の非存在下で、ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３で同時トランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞において、ＥｒｂＢ−３と相互作用する。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、またはＥｒｂＢ−２とＥｒｂＢ−３で、一過的にトランスフェクトした。４８時間後、１つの同時トランスフェクトされたサンプルを、ニューレグリン１（ＮＲＧ−１）（５０ｎＭ）で１０分間処理した。この細胞を溶解し、そしてレセプターを抗ＥｒｂＢ−２または抗ＥｒｂＢ−３抗体で免疫沈降した。この沈降物を、８％ＰＡＧＥで分離し、そしてウエスタンブロットによって分析した。
ａ）（上のパネル）抗ホスホチロシン抗体でのウエスタンブロット分析。ＥｒｂＢ−２レセプターは、ＥｒｂＢ−２でトランスフェクトされた細胞中でリン酸化され、そしてＮＲＧ−１は、ＥｒｂＢ−２／３で同時トランスフェクトされた細胞においてレセプターのリン酸化レベルを増強したことに注意のこと。
ａ）（中央のパネル）抗ＥｒｂＢ−２抗体でのウエスタンブロット分析。ＥｒｂＢ−２レセプターは、ＥｒｂＢ−２単独でトランスフェクトされた細胞およびＥｒｂＢ−２とＥｒｂＢ−３で同時トランスフェクトされた細胞において検出された。ＮＲＧ−１はまた、ＥｒｂＢ−２とＥｒｂＢ−３の相互作用を増加した。
ａ）（下のパネル）抗ＥｒｂＢ−３抗体でのウエスタンブロット分析。ＥｒｂＢ−２でトランスフェクトされた細胞を除いて、すべての他のサンプルは、大きいＥｒｂＢ−３のバンド（１６５ｋＤａ）を示した。
ｂ）ＥｒｂＢ−２／３同時トランスフェクト細胞を、抗ＥｒｂＢ−２抗体で免疫沈降した。ホスホチロシン、ＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−２を、ウエスタンブロットによって検出した（それぞれ上から下のパネルまで）。ＮＲＧ−１は、チロシンリン酸化レベルおよびＥｒｂＢ−２とＥｒｂＢ−３の相互作用を増強したことに注意のこと。従って、ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３の相互作用は、この同時免疫沈降実験によって示される。
【図２】  ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３は、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３で同時トランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞においてヘテロダイマーを形成し、そしてこのへテロダイマーは、交差連結実験によって同定される。
ａ）ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、またはＥｒｂＢ−２／３同時トランスフェクト細胞を、１２時間血清飢餓させた。コントロール細胞を、ＨＲＧ  ｂ１で１０分間刺激した。交差連結を、ＢＳ３試薬を用いて室温で３０分間行った。細胞を溶解し、そして抗ＥｒｂＢ−２抗体または抗ＥｒｂＢ−３抗体で免疫沈降し、そして沈降物を、４％  ＰＡＧＥに供し、そして抗ＥｒｂＢ−２抗体（上のパネル）、抗ホスホチロシン抗体（中のパネル）、および抗ＥｒｂＢ−３抗体（下のパネル）でのウエスタンブロット分析に供した。ダイマーおよびモノマーの位置を示す。ＮＧＲ−１は、ヘテロダイマーのバンド形成シフトを生じたが、ホモダイマーのバンド形成パターンに影響しなかったことに注意のこと。
ｂ）非血清飢餓ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３同時トランスフェクト細胞の類似の交差連結アッセイ。上記のように、ダイマーおよびモノマーを示す：ダイマーにおける類似のバンド形成シフトは、ＮＲＧ−１刺激に応答して観察されることに注意のこと。
【図３】  ＥｒｂＢ−２とＥｒｂＢ−３のヘテロダイマーは、リガンド、ニューレグリン１の非存在下でヒト乳癌細胞において同定される。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＢＴ−４７４およびＳＫ−ＢＲ−３細胞を、無血清培地で２４時間飢餓させ、次いで、ＮＲＧ−１で刺激した。細胞を溶解し、そして抗Ｅｒｂ−３抗体で免疫沈降した。次いで沈降物を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そして抗ＥｒｂＢ−２抗体（上のパネル）、抗ホスホチロシン抗体（中のパネル）および抗ＥｒｂＢ−３抗体（下のパネル）を用いるウエスタンブロット分析に供した。すべての細胞株において、ＥｒｂＢ−２レセプターは、抗ＥｒｂＢ−３抗体で同時免疫沈降した。ＮＲＧ−１は、これらの乳癌細胞株におけるＥｒｂＢ−２レセプターおよびＥｒｂＢ−３レセプターの相互作用を有意に増強した（上のパネル）。ＮＲＧ−１はまた、チロシンリン酸化のレベルを上昇することが示された（中のパネル）。
【図４】  ＥｒｂＢ−３は、リガンドの非存在下で、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３同時トランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３およびヒト乳癌細胞においてシグナル伝達タンパク質Ｓｈｃに結合する。
ａ）ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／３同時トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１２時間血清飢餓させ、そしてＮＲＧ−１で処理した。細胞溶解物を、抗ＥｒｂＢ−３抗体で免疫沈降し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、次いでウエスタンブロットで分析した。抗ＥｒｂＢ−２抗体および抗ＥｒｂＢ−３抗体でのＳｈｃの同時免疫沈降を、特異的抗Ｓｈｃ抗体によって検出した。図４ａは、４６ｋＤおよび５２ｋＤのＳｈｃアイソフォームが、ＥｒｂＢ−２単独およびＥｒｂＢ−２／３同時トランスフェクトされた細胞における抗ＥｒｂＢ−２抗体によって同時沈降されたことを示し、そしてＮＲＧ−１は、レセプターへのＳｈｃの結合を増強するようである（下のパネル）。上のパネルは、これらのトランスフェクトされた細胞における抗ＥｒｂＢ−２抗体によって検出されたＥｒｂＢ−２レセプターを示す。
ｂ）２つのＳｈｃアイソフォームを、乳癌細胞における抗ＥｒｂＢ−３抗体によって同時免疫沈降した。Ｓｈｃが、ＥｒｂＢ−３単独でトランスフェクトされた細胞においてＥｒｂＢ−３レセプターに結合し得なかったことに注意のこと。４つのヒト乳癌細胞株を、１２時間血清飢餓させ、次いで、またはマークしたようにリガンドＨＲＧ  ｂ１で、１０分間刺激した。次いで細胞を回収し、そして抗ＥｒｂＢ−３抗体での免疫沈降に供した。
ｃ）沈降されたＥｒｂＢ−３を、ＥｒｂＢ−３タンパク質の量の正規化のために抗ＥｒｂＢ−３抗体によって検出した。
【図５】  リガンド、ニューレグリン−１の非存在下でのヒト乳癌細胞の抗ＥｒｂＢ−２および抗ＥｒｂＢ−３抗体媒介性増殖障害。（Ａ）ＢＴ−４７４、（Ｂ）ＳＫ−ＢＲ−３および（Ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−４５３ヒト乳癌細胞株を、９６ウェルプレートに、ウェルあたり２０００細胞の密度で播種した。プレートに接着させた後（１６時間）、培養物を示される抗体で処理した。各抗体の濃度は、以下であった：ＩｇＧ  ５  ｍｇ／ｍｌ；Ａｂ５（抗ＥｒｂＢ−３抗体）  ２．５ｍｇ／ｍｌ；Ｎ１２（抗ＥｒｂＢ−２抗体）２．５ｍｇ／ｍｌ。培養物を１４日間増殖させ、培地および抗体を、７日目に補充した。１４日後、細胞の数を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  非放射活性細胞増殖キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して確証した。
【図６】  ＥｒｂＢ構築物でトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞の病巣形成。パネルＡに示されるように、野生型ＥｒｂＢ−２またはＥｒｂＢ−３（ＷＴ）でトランスフェクトされた細胞（上の列）あるいはＥｒｂＢ−２／Ｈ−ｒａｓまたはＥｒｂＢ−３／Ｈ−ｒａｓで同時トランスフェクトされた細胞を、病巣形成のために培養した。野生型ＥｒｂＢ−２（ＷＴ）、ＥｒｂＢ−２  Ｖ／Ｅ６５９６５９変異体（Ｖ６５９Ｅ）またはＨ−ｒａｓ単独を、パネルＢに示されるように病巣形成のために細胞にトランスフェクトした。病巣をキシレン染色によって明らかにした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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