(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式の化合物であって：
【化１】
0004634514.tif 000036
ここで、
各Ｒ１はＨであり；そしてｔは４であり；
Ｒ２は、１個〜６個の炭素を有するアルキル基であり；
ＸはＯまたはＳであり；
ｎは０または１であり；
Ψ−は、クロライド、ブロマイド、およびヨーダイドから選択される生物学的に適合可能な対イオンであり；
Ｑは下式のＱ１またはＱ２を有し：
0004634514.tif 000037
ＱがＱ１の場合、
Ｒ４は、
0004634514.tif 000038
で示されるＴＡＩＬであり；
Ｒ５は、フェニル基であり；
Ｒ６は、Ｈであり；
ＱがＱ２の場合、
Ｒ４は、１個〜６個の炭素を有するアルキル基、または
0004634514.tif 000039
もしくは
0004634514.tif 000040
で示されるＴＡＩＬであり；
Ｒ５は、１個〜６個の炭素を有するアルキル基；フェニル基；または
0004634514.tif 000041
もしくは
0004634514.tif 000042
で示されるＴＡＩＬであり；
Ｒ１２は、独立して、Ｈ；
0004634514.tif 000043
で示されるＴＡＩＬ；または−ＯＲ８であり；ここで、Ｒ８は、１個〜６個の炭素を有するアルキル基であり；
ここでＱがＱ２の場合、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ１２のうちの１つはＴＡＩＬである。
【請求項２】
下式の１つまたはそれ以上の色素分子と非共有結合した核酸ポリマーを含有する、蛍光複合体：
【化１】
0004634514.tif 000044
ここで、
各Ｒ１はＨであり；そしてｔは４であり；
Ｒ２は、１個〜６個の炭素を有するアルキル基であり；
ＸはＯまたはＳであり；
ｎは０または１であり；
Ψ−は、クロライド、ブロマイド、およびヨーダイドから選択される生物学的に適合可能な対イオンであり；
Ｑは下式のＱ１またはＱ２を有し：
0004634514.tif 000045
ＱがＱ１の場合、
Ｒ４は、
0004634514.tif 000046
で示されるＴＡＩＬであり；
Ｒ５は、フェニル基であり；
Ｒ６は、Ｈであり；
ＱがＱ２の場合、
Ｒ４は、１個〜６個の炭素を有するアルキル基、または
0004634514.tif 000047
もしくは
0004634514.tif 000048
で示されるＴＡＩＬであり；
Ｒ５は、１個〜６個の炭素を有するアルキル基；フェニル基；または
0004634514.tif 000049
もしくは
0004634514.tif 000050
で示されるＴＡＩＬであり；
Ｒ１２は、独立して、Ｈ；
0004634514.tif 000051
で示されるＴＡＩＬ；または−ＯＲ８であり；ここで、Ｒ８は、１個〜６個の炭素を有するアルキル基であり；
ここでＱがＱ２の場合、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ１２のうちの１つはＴＡＩＬである。
【請求項３】
前記核酸ポリマーが染色体である、請求項２に記載の蛍光複合体。
【請求項４】
前記核酸ポリマーが天然または合成オリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の蛍光複合体。
【請求項５】
前記複合体が生物学的構造体中に封入される、請求項２に記載の蛍光複合体。
【請求項６】
前記複合体が、水溶液または水と混和性の溶液中に存在する、請求項２に記載の蛍光複合体。
【請求項７】
前記複合体が、電気泳動マトリックス中に存在する、請求項２に記載の蛍光複合体。
【請求項８】
前記複合体が、流体培地中に存在する、請求項２に記載の蛍光複合体。
【請求項９】
前記核酸ポリマーが、修飾核酸塩基または結合を含む、請求項２に記載の蛍光複合体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の分野
本発明の色素は、ピリジニウムまたはキノリニウム環系上の定義された置換基あるいはピリジニウムまたはキノリニウム環の窒素原子のすぐ近くに隣接する置換基を含有する非対称シアニン色素であり、核酸に対する色素の透過性、選択性および親和性を改変する。このクラスの色素のメンバーは、細胞膜強度の検出、および、ゲル中および溶液中、および生および死細胞中の核酸（DNAおよびRNAを含む）の染色または検出においてより有効である。環窒素に隣接する位置で置換される色素は、一般にその位置で置換されていない色素よりも予想外に高い量子収率を有する。さらに、環置換基は、特に置換基の適切なヘテロ原子の含有によって、色素の透過性および親和性の選択可能な変更を可能にするために容易に改変される。さらに、簡単な合成の改変によって、可視および近赤外スペクトルの大部分にわたる吸収および発光スペクトル特性を有する色素のファミリーを調製し得る。適切に置換された色素の選択は、種々の技術を用いる核酸分析の感度を増強する。
【発明の概要】
【０００２】
発明の要旨および好ましい実施態様の説明
本発明の置換非対称シアニン色素は、水溶液中に希釈された場合、実質的に非蛍光性である。しかし、核酸ポリマー（例えば、DNAおよびRNA）と結合した場合、得られる色素−核酸複合体は、照射されると、極端に蛍光性となる。本発明の色素は、微生物を含む広範囲のサンプル（特に、水溶液、電気泳動ゲル、および広範囲の細胞）中の核酸を標識する。
【０００３】
色素の構造
本発明の色素は以下を包含する：１）置換ベンズアゾリウム環である第１のヘテロ環式環系、２）架橋メチン、および３）ピリジニウムまたはキノリニウム環系である第２のヘテロ環式環、これらの１つまたはそれ以上の位置が、少なくとも１つのヘテロ原子を含むTAILによって置換され得る。第１および第２の環系は、以下に記載するように、必要に応じて種々の置換基によってさらに置換される。
【０００４】
TAIL
TAILはヘテロ原子含有側鎖であり、式LINK-SPACER-CAPによって記載される。LINKは結合部分であり、これによってTAILは本発明の色素のコア構造に付与される。SPACERは共有結合であり、LINKをCAPに結合させる。CAPはTAILの一部分であり、ヘテロ原子成分を有する。
LINKは単共有結合、エーテル結合（-O-）、チオエーテル結合（-S-）、またはアミン結合（-NR20-）である。各々の実施態様において、LINKは、色素コア構造とSPACERとの間の結合を形成する。LINKがアミンである場合、アミン置換基（R20）は、必要に応じてＨであり、従ってLINKは-NH-である。あるいは、R20は１個〜８個の炭素を有する直鎖または枝分かれアルキルである。本発明の別の実施態様において、R20は-SPACER'-CAP'であり、下式を有するTAILを生成する：
【化１】
0004634514.tif 000002
ここで、SPACER'およびCAP'はそれぞれ、SPACERおよびCAPと同一であり得るかまたは異なり得、そしてそれぞれSPACERおよびCAPに対して定義される同様の選択枝から選択される。記述を簡単にするために、SPACERおよびCAPを、SPACERの記述がSPACER'を含み、そしてCAPの記述がCAP'を含むという了解のもとに定義する。
【０００５】
SPACERは共有結合であり、LINKとCAPとを連結する。SPACERは、１個〜16個のＣ、Ｎ、Ｐ、ＯまたはＳ原子の直鎖、枝分かれ、環式、ヘテロ環式、飽和または不飽和の配置列（arrangement）である。あるいは、SPACERは単共有結合であり、従ってLINKおよびSPACERの両方は同時に単共有結合ではない。好ましくは、SPACER結合は炭素原子で始まりそして炭素原子で終わらなければならない。代表的に、SPACERが単一の原子からなる場合、炭素原子であることが必要とされ、従ってSPACERにおける最初および最後の原子（この特殊な例では、それらは同一の原子である）は炭素である。SPACERを構成する１個〜16個の原子が、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、あるいはアミド結合；または単結合、二重結合、三重結合あるいは芳香族炭素−炭素結合；またはリン−酸素結合；またはリン−硫黄結合；または窒素−窒素結合；または窒素−酸素結合；または芳香族あるいはヘテロ芳香族結合の適切な組み合わせを用いて結合される。SPACERは、さらに水素によって置換され、SPACERの各々の原子の原子価状態を調節する。
【０００６】
一般に、SPACERの原子は、SPACERの直鎖骨格中の全てのヘテロ原子が少なくとも１個の炭素原子によって隔てられ、そして好ましくは少なくとも２個の炭素原子によって隔てられるように配列される。代表的に、SPACERは、直鎖または枝分かれ飽和鎖中の、１個〜６個の炭素原子である。本発明のある実施態様において、SPACERは６員環芳香族環（フェニレン結合）を含む。本発明の別の実施態様において、SPACERは５員環または６員環ヘテロ芳香族環を含み、ここでヘテロ原子はＯ、Ｎ、またはＳである。あるいは、SPACERは、直鎖配列（例えば、-CH2-CH2-(C=O)-NH-CH2-CH2-CH2-）にアミド結合、エステル結合、単純エーテルおよびチオエーテル、およびアミンを含む。好ましくは、SPACERは、連続したメチレン基（-（CH2）k-、ここでｋは１〜８である）からなる直鎖である。
【０００７】
LINKおよびSPACERは共に、ヘテロ原子含有基（CAP）を色素コア構造に付与するのに役立つ。CAPは、式-O-R21、-S-R21、-NR21R22、または-N+R21R22R23Ψ-に従い、酸素、硫黄または窒素を含み得る。置換基R21、R22、およびR23は、独立して、Ｈ、または１個〜８個の炭素を有する直鎖または枝分かれアルキルまたはシクロアルキルである。R21、R22、およびR23のいずれかがアルキルまたはシクロアルキルである場合、それらは必要に応じてさらにハロゲン、ヒドロキシ、１個〜８個の炭素を有するアルコキシ、アミノ、カルボキシ、またはフェニル（ここでフェニルは必要に応じてさらにハロゲン、ヒドロキシ、１個〜８個の炭素を有するアルコキシ、アミノ、１個〜８個の炭素を有するアミノアルキル、または１個〜８個の炭素を有するカルボキシアルキルによって置換される）によって置換される。本発明の別の実施態様において、R21、R22、およびR23の１つまたはそれ以上はSPACERと共に、芳香族、ヘテロ芳香族、脂環式またはヘテロ脂環式環である５員環または６員環を形成する。５員環または６員環がヘテロ芳香族またはヘテロ脂環式である場合、環は、Ｏ、ＮまたはＳである１個〜３個のヘテロ原子を含む。あるいは、R21、R22、およびR23の１つまたはそれ以上はR20およびSPACERと共に、上記の芳香族、ヘテロ芳香族、脂環式またはヘテロ脂環式環である５員環または６員環を形成する。好ましくは、R21、R22は水素、または１個〜８個の炭素を有するアルキルである。R23は、代表的にＨまたは１個〜８個の炭素を有するアルキルである。CAPが-N+R21R22R23Ψ-である場合、置換基R21、R22、およびR23は、代表的に水素ではなく、従ってアンモニウム窒素上に存在する正電荷が、水溶液中において平衡中和（neutralization）されない。
【０００８】
CAPが-N+R21R22R23Ψ-である場合、生物学的に適合可能な対イオンΨ-がCAP窒素上に存在する正電荷を釣り合わせ、ここでCAP内の窒素は第４級アンモニウム塩である。本明細書において使用するように、生物学的に適合可能な物質は使用において無毒であり、そして生物分子に対して実質的に有害な影響を有しない。Ψ-の例は、とりわけクロライド、ブロマイド、ヨーダイド、スルフェート、アルカンスルホネート、アリールスルホネート、ホスフェート、パークロレート、テトラフルオロボレート、テトラアリールボライド、ニトレート、および芳香族または脂肪族カルボン酸のアニオンを包含する。好ましいΨ-対イオンは、クロリド、ヨーダイド、パークロレートおよび種々のスルホネートである。
【０００９】
さらに、本発明のいくつかの実施態様があり、ここでCAPは環式構造を含む。これらの実施態様において、CAPは、代表的に４員環〜10員環、好ましくは５員環または６員環を含み、少なくとも１個の窒素原子を含む。環式構造内に含まれる窒素原子は、必要に応じてR23によって置換されてアンモニウム塩を与える。CAPが環式構造を含む場合、環式構造は必要に応じてさらなるヘテロ原子（代表的に、酸素または硫黄）を含む。CAPの特定の例示は、表１に挙げるCAPを包含するがこれらに限定されない。
【００１０】
〔表１〕特定のCAP部分の例示
0004634514.tif 000003
CAPは、好ましくは-NR21R22または-N+R21R22R23Ψ-であり、ここでR21、R22、およびR23は１個〜６個の炭素を有するアルキルである。より好ましくは、CAPは-N(CH3)2または-N+(CH3)3Ψ-である。
好ましくは、TAILは６個〜10個の水素以外の原子を含み、LINKおよびCAPを含む。
【００１１】
TAILの選択される例を表２に挙げる。各TAILに対する、LINK、SPACERおよびCAPの同一性について詳細に述べる。R21、R22、またはR23をR20またはSPACERのどちらかと結合した場合、その組み合わせを表に示す。
【００１２】
〔表２〕TAIL部分の特定の例示
0004634514.tif 000004
0004634514.tif 000005
0004634514.tif 000006
【００１３】
コア構造
本発明の色素のコア構造は、下式によって記述される：
【化２】
0004634514.tif 000007
ここで、左側の置換ベンズアゾリウム環系は、メチン架橋によって右側のピリジニウムまたはキノリニウム環系に結合される。コア構造上の１つまたはそれ以上の置換基は、必要に応じてTAILである。
【００１４】
ベンズアゾリウム環系上のR1は通常Ｈであるが、１つまたはそれ以上の水素以外の置換基R1を含有させることにより、得られる色素の吸収および発光スペクトルをうまく調和させるのに使用され得る。ベンズアゾールは、１つ以上の置換基R1を含み得、これは同一であり得るか、または異なり得る（ｔは１〜４である）。各R1は必要に応じて１個〜６個の炭素を有するアルキル基；またはトリフルオロメチル；またはハロゲン；または１個〜６個の炭素を有するアルコキシである。代表的に、各化合物は、ＨでないR1を１つ含むにすぎない。好ましくは、R1はＨまたはアルコキシであり、より好ましくは各R1は、Ｈである。
【００１５】
置換基R2は、１個〜６個の炭素を有するアルキル基であり、好ましくはメチルまたはエチルであり、より好ましくはメチルである。
【００１６】
対イオンΨ-は、上記のように、生物学的に適合可能なイオンである。好適な Ψ-対イオンはクロライド、ヨーダイド、パークロレートおよび種々のスルホネートである。
【００１７】
ＸはＯ、Ｓ、SeまたはNR15のうちの１つであり、ここでR15は１個〜６個の炭素を有するアルキル基である。あるいは、ＸはCR16R17であり、ここでR16およびR17（これらは同一であり得るか、または異なり得る）は、独立して、Ｈまたは１個〜６個の炭素を有するアルキル基であり、またはR16およびR17の炭素は、一緒になって５員環または６員環飽和環を形成する。ＸがCR16R17である場合、R16およびR17は代表的にメチルである。好ましくは、ＸはＯまたはＳであり、より好ましくは、ＸはＳである。
【００１８】
２つのヘテロ環式環系は、広域の電子の非局在化を許容とするように、１個、３個または５個のメチン（-CH=）基によって結合される。ヘテロ芳香族環の間のメチン基の数は、色素のスペクトル特性に影響を及ぼす。好ましくは、ｎは０または１であり、より好ましくは、ｎは０である。
【００１９】
Ｎ結合置換基R5は、１個〜６個の炭素を有するアルキル、アルケニル、ポリアルケニル、アルキニルまたはポリアルキニル基である。あるいは、R5は、環式置換基またはTAILである。代表的に、R5は１個〜６個の炭素、好ましくは１個〜２個の炭素を有するアルキルであるか、あるいはR5は環式置換基である。あるいは、R5はTAILである。代表的に、R5がTAILである場合、SPACER部分はフェニレン結合を含む。
【００２０】
R5が環式置換基である場合、環式置換基は、１個〜４個のヘテロ原子（ここで、ヘテロ原子はＯ、ＮまたはＳである）を含む１個〜２個の脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族、またはヘテロ芳香族環に２個〜16個の環炭素を有する飽和または不飽和、置換もしくは非置換環系であり、単結合によってピリジニウムまたはキノリニウム環系に直接結合する。脂環式環系は、結合されるかまたは縮合されるかのどちらかである。代表的に、R5は３個〜10個の炭素を有するアリール、ヘテロアリール、またはシクロアルキルであり、より代表的には、アリールまたはヘテロアリール基である。代表的に、アリールはフェニルまたはナフチル基であり、そしてヘテロアリール置換基は５員環または６員環ヘテロ芳香族環であり、ここでヘテロ原子はＯ、ＮまたはＳである。脂環式およびヘテロ脂環式置換基の例は、置換もしくは非置換シクロヘキシル、シクロヘキセニル、モルホリノ、ピペリジニルおよびピペラジニルである。芳香族およびヘテロ芳香族環置換基の例は、置換もしくは非置換ナフチル、フェニル、チエニル、ベンゾチアゾリル、フラニル、オキサゾリル、ベンズオキサゾリル、およびピリジニルを包含する。このような環式置換基上の置換基は、独立して水素、ハロゲン、アルキル、パーフルオロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシまたはカルボキシアルキルであり、各アルキル基は１個〜６個の炭素を有する。好ましい環式置換基は、置換もしくは非置換ナフチル、フェニル、チエニル、モルホリノ、および３個〜10個の炭素を有するシクロアルキルであり、より好ましくは、置換もしくは非置換フェニルである。
【００２１】
第２の環系は、-CR3=CR4-である環フラグメントＹを含み、ただしｐ＋ｍが１となるように下付き文字ｐおよびｍは０または１である。全ての実施態様について、環は、これらの下式のうちの１つに従う６員環ピリジニウム骨格のヘテロ環を含む。
【化３】
0004634514.tif 000008
本発明の好ましい実施態様において、ｍは１であり、そしてｐは０（「４−ピリジニウム」および「４−キノリニウム」）である。
環置換基R3およびR4は、独立してＨ、またはハロゲン、または１個〜６個の炭素を有するアルキル、アルケニル、ポリアルケニル、アルキニルまたはポリアルキニル基である。R3およびR4はまた、必要に応じて、および独立して、-OR8、-SR8、-(NR8R9)であり、ここでR8およびR9（これらは、同一であり得るか、または異なり得る）は、独立してＨ、１個〜６個の炭素を有するアルキル基、１個〜２個の脂環式または芳香族環であり、あるいはR8およびR9は一緒になって、-(CH2)4-または-(CH2)5-であり、５員環または６員環を与える。さらに、R3およびR4は、必要に応じて、および独立して、-OSO2R19であり、ここでR19は１個〜６個の炭素を有するアルキル、または１個〜６個の炭素を有するパーフルオロアルキル、またはアリールである。
【００２２】
環置換基R6およびR7は、必要に応じて、R3およびR4に対して定義された-OSO2R19を除く任意の置換基である。あるいは、R6およびR7は一緒になって-（CH2）v-であり、ここでｖは３または４であり、縮合５員環または６員環を形成するか、あるいはR6およびR7は一緒に縮合６員環芳香族環を形成する。
【００２３】
あるいは、R3、R4、R6またはR7のいずれかは、R5について先で定義したように、環式置換基であり得る。好ましい環置換基は、独立して、Ｈ、アルキル、ハロゲン、-OR8、-SR8、-(NR8R9)、-OSO2R19、環式置換基、またはTAILである。本発明の全ての実施態様について、好ましくは、R4は水素ではない。本発明のある実施態様において、R4はハロゲン、-OR8、-SR8、-(NR8R9)、または-OSO2R19である。本発明の別の実施態様において、R4は１個〜６個の炭素を有するアルキルである。本発明のさらに別の実施態様において、R4はTAILである。
【００２４】
R6およびR7が一緒になって縮合６員環芳香族環を形成する場合、本発明の実施態様は下式に従うキノリニウム誘導体であり：
【化４】
0004634514.tif 000009
ここで環置換基R11、R12、R13、およびR14は、同一であり得るか、または異なり得、そして独立して、Ｈ；または１個〜６個の炭素を有するアルキル、アルケニル、ポリアルケニル、アルキニルまたはポリアルキニル基；またはハロゲン；または-OR8、-SR8、-(NR8R9)、ここでR8およびR9は先に定義した通りであり；またはR5に対して定義されたような環式置換基；またはTAILである。本発明の好ましい実施態様はキノリニウムであり、ここでｍは１であり、そしてｐは０（「４−キノリニウム」）である。
【００２５】
代表的に、R3、R4、R5、R6、R7、R11、R12、R13およびR14のうちの１つまたはそれ以上はTAILである。本発明のある実施態様において、R3、R4、R5、R6、R7、R11、R12、R13およびR14のうちの少なくとも１つはTAILである必要がある。好ましくは、R4、R6およびR12の少なくとも１つがTAILであり、より好ましくは、R4がTAILである。R4がTAILである場合、LINKは、好ましくは-NR20-または-S-である。TAILがR4またはR5以外の任意の位置である場合、LINKは、好ましくは-O-または単結合である。
【００２６】
本発明のある実施態様において、R5はTAILであり、そしてR3、R4、R6、R7、R11、R12、R13またはR14のうちの１つは水素ではなく、好ましくはR4は水素ではない。
【００２７】
本発明の別の実施態様において、R5は環式置換基ではなく、そしてR4は水素ではない。化合物（ここで、R4は水素ではない）は、核酸を染色することに対して顕著な利点を有する。特に、色素（ここで、R4は水素ではない）は、類似の色素（ここで、R4はＨである）に関して促進された量子収率を有する。このクラスの色素に対し、R5は、好ましくは１個〜６個の炭素を有するアルキルである。R4は、代表的に-OR8、-SR8、-(NR8R9)であり、またはR4はTAILであり、好ましくは、R4はTAILである。本発明の特定の実施態様において、本発明の色素は４−ピリジニウムまたは４−キノリニウムであり、ここで、R5は１個〜６個の炭素を有するアルキルであり、そしてR4は水素ではない。
【００２８】
本発明のさらに別の実施態様において、R5は、環式置換基であり、そしてR3、R4、R6、R7、R11、R12、R13またはR14のうちの少なくとも１つは、-N+R21R22R23Ψ-であるCAPを有するTAILであり、または４員環〜10員環を含むCAPは、好ましくは少なくとも１個の窒素原子を含む５員環または６員環である。
【００２９】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、第２のヘテロ環式環は、厳密には２つの水素以外の置換基を含み、それらの１つはTAILである。
【００３０】
R4にTAIL部分を有する本発明の色素のいくつかは、細胞および微生物の染色に対して特定の有用性を示す。本発明の色素の特定の実施態様の有用性は、細胞および微生物の染色において、一般にTAIL部分の化学的性質、およびR5に存在する基の同一性に依存する。例えば、CAPが第４級アンモニウム塩であるこれらの化合物は、一般に、ある酵母細胞を除く生存細胞に対し不透過性である。しかし、CAPが第１級または第２級アミンであり、そしてLINKが第２級または第３級アミンであるこれらの化合物の透過性は、R5（Ｎ置換基）の性質に関連する：R5がアリール基である場合、化合物は、一般に全ての細胞（生残または死滅）に対し透過性であるが、R5にアルキル置換基を有する対応する化合物は、一般に細胞膜に対し不透過性である。R5置換基との同様の関係が、TAILが窒素含有ヘテロ環である場合に観察される：R5がアリール基である場合、化合物は、一般に全ての細胞に対し透過性であるが、R5がアルキル基である場合、色素は、一般に哺乳動物細胞に対してのみ透過性である。
【００３１】
代表的に、不透過性細胞プローブとして有用な色素は、２個〜３個の正電荷、好ましくは３個の正電荷を有する色素であり、より好ましくは２個〜３個の正電荷を有する色素（ここで、R5はアルキルである）である。透過性細胞プローブに対して好ましい色素は、R5が１個〜６個の炭素を有するアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、そしてCAPが-O-R21または-S-R21である色素である。電気泳動ゲルを染色するのに好ましい色素は、代表的にジアルキルアミノ基であるCAPを有する。
【００３２】
本発明の選択される実施態様のリストを表３、４および５に示す。表は多くの好ましい実施態様を包含するが、表に示す色素が、本発明の色素のただ１つの掲載であることを意図しない。置換基および色素構造における多数の改変、置換、および変更は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく可能である。
【００３３】
〔表３〕４-キノリニウム色素の特定の例示
0004634514.tif 000010
0004634514.tif 000011
0004634514.tif 000012
0004634514.tif 000013
【００３４】
〔表４〕４-ピリジニウム色素の特定の例示
0004634514.tif 000014
【００３５】
〔表５〕２-キノリウム色素の特定の例示
0004634514.tif 000015
【００３６】
合成
本発明の色素に対する有用な合成経路は、化合物の記載について、自然分解に続き、３つの部分で記載され得る。一般的に、これらの色素の合成は、以下の３つの前駆体を必要とする：ベンズアゾリウム塩、ピリジニウム（またはキノリニウム）塩（この両者は適切な化学置換基を有するか、または適切な置換基に転換され得る）、および（ｎ＝１または２である場合は）メチンスペーサーのための供給源。これらの化合物を核酸に対する有用な染色剤とすることを可能にする組み合わせは、以前には記載されていなかったが、これらの前駆体を調製および合わせるために必要であって、任意の対象となる誘導体(subject derivatives)を生じる化学物質は、当業者には一般に充分理解されている。同等の結果を生じ得る多くの可能な変形例があるが、本明細書中で本発明者らは、これらの化学的改変体の合成および取り込みについてのいくつか有用な一般的な方法を提供する。
【００３７】
ピリジニウムまたはキノリニウム部分
本発明の化合物の強共役環系は、環原子上の１つの正電荷の共鳴安定化を全分子上に分布させる。特に、電荷は色素の各々のヘテロ環窒素原子上での部分的局在化によって安定化される。対象となる色素は本明細書中に記載されるように、正電荷は色素のベンズアゾリウム部分上に形式的に局在化している。しかし、正電荷が色素のピリジニウム部分に形式的に局在化する同等の共鳴構造式が、記載され得ることが、一般に理解される。結果的に、共鳴構造においては、ジヒドロピリジンまたはジヒドロキノリンと形式的に呼ばれるが、本発明者らは通常、この分子の後半部分をピリジン、ピリジニウム、キノリン、またはキノリニウム部分と言う。
【００３８】
本発明においてキノリニウム部分を含有する化合物は、親構造のR6およびR7の部分で縮合する４個の炭素原子を含有するさらなる芳香環の存在下のみで、１つのピリジニウム環を含有する化合物とは異なる。特別なピリジンまたはピリジニウム塩への言及がなされる場合を除き、ピリジンまたはピリジニウム塩についての記載は、ベンゾピリジンおよびベンゾピリジニウム塩を包含し、キノリンまたはキノリニウム塩と形式的に呼ばれることが理解される。キノリンおよびキノリニウム塩についての記載は、２つの縮合した芳香環を含有する構造のみを言う。
【００３９】
本発明の色素の合成において、第２のヘテロ環前駆体は、通常、すでに適切に置換されているピリジニウム塩である（実施例２、９、および11）。あるいは、置換基は、色素のベンズアゾリウム部分の結合の後に、ピリジニウム構造中に取り込まれ得る(実施例５)。ベンズアゾリウム前駆体との反応前または反応後に取り込まれ得る１つの置換基は、TAILである。
【００４０】
ピリジンとキノリンとの間の構造的な相違はさておき、本発明において記載される色素のファミリー中には、２つの主な構造的な相違点があり、ピリジニウム部分の結合点に関連する。１つの場合（ｍ＝０およびｐ＝１の場合）、結合部分はメチン架橋を環窒素に隣接するように配置する(2-ピリジン)。さらに一般的な場合(ｍ＝１およびｐ＝０の場合)、窒素原子の位置は、結合点に対してパラ位である(4-ピリジン)。
【００４１】
一般的に、必要とされるピリジニウム塩前駆体は以下の構造を有し：
【化５】
0004634514.tif 000016
そしてキノリニウム塩前駆体は以下の一般構造を有し：
【化６】
0004634514.tif 000017
置換基は先に定義した通りである。いかなる場合も、環は６員環ピリジニウムベースのヘテロ環である。
【００４２】
ｎ＝０である場合、Ｂはメチルであるか、またはＢはクロロ、ブロモ、ヨードである。ｎ＝１または２である場合、Ｂはメチルである。ｎ＝１またはｎ＝２の場合のみ、Ｂの任意の部分は最終化合物に取り込まれる。
【００４３】
ピリジニウム誘導体の合成について、いくつかの一般的方法があり、ピリジニウム誘導体は、任意の利用可能な部分で置換基を有するこれらの誘導体、TAILであるか、またはベンゾアゾリウム部分との反応前または反応後にTAILに転換され、色素のコア構造を形成し得る置換体を包含する。R5での置換、またはR5に結合する窒素原子に直接隣接する部分での置換（すなわち、R4でｍ＝１およびｐ＝０の場合）は、特に重要である。
【００４４】
方法１．主要な脂肪族ハライド、スルフェートエステル、スルホネートエステル、エポキシド、または類似の試薬のようなアルキル化剤を用いて、適切に置換されたキノリンの窒素原子のアルキル化は、置換キノリニウム塩を直接生じる。例えば、1,3-ジヨードプロパンと塩基とを用いてキノリンを処理し、トリメチルアミンを用いて加熱すると、R5でTAIL置換基が生じる（実施例18）。R5以外の位置で、TAIL置換基がある場合またはTAIL置換基に転換され得る基がある場合、メチルヨーダイドまたはジメチルスルフェートのような単純なアルキル化試薬は、R5がアルキルである、R5置換基を付加するに充分である。
【００４５】
方法２．アリールまたはヘテロアリールであるR5置換基が、アニリンまたは置換アニリン、あるいはピリドン誘導体またはキノロン誘導体のUllmann反応によって最良に取り込まれる。この方法においては、ジアリールアミンまたはアリールヘテロアリールアミン(一般に市販されている)は、ジケテンおよび酸で縮合され、4-メチル-N-アリールキノロンまたは4-メチル-N-ヘテロアリールキノロンを生じる（実施例１）。
【化７】
0004634514.tif 000018
上記の式においては、ARYLは任意の芳香環系または任意のヘテロ芳香環系であり得る。さらにR11、R12、R13、R14、およびARYL上の置換基はTAILであり得るか、またはTAILに容易に転換され得る置換基であり得る（実施例10）。
【００４６】
次いで、4-メチル-2-キノロンは、グリニャール試薬または有機リチウム試薬のような有機金属試薬との反応によって所望の4-メチル-2-置換キノリニウム塩に転換される（実施例９および10）。
【化８】
0004634514.tif 000019
このような方法で結合したR4置換基は、芳香族または脂肪族であり、そしてTAILであり得るか、またはTAILに置換され得る（実施例13）。但し、置換基の性質は、必要とされる有機金属試薬の調製を妨げない。
【００４７】
窒素原子が以下のような反応により水素置換される場合、ピリドンおよびキノロン前駆体もまた、適切に置換された前駆体のUllmann反応により調製され得る：
【化９】
0004634514.tif 000020
【００４８】
様々な4-メチル-2-キノロンは市販されている一方、所望の誘導体は、アニリンまたは置換アニリンとをアセトアセテートまたはジケテンのようなアセトアセテートと等価な試薬とを反応させることにより合成される。
【化１０】
0004634514.tif 000021
【００４９】
R5で水素基を含有しないピリドンおよびキノロン中間体は、R4で置換される広範な他のピリジニウムおよびキノリニウム塩に対して特に重要な前駆体である。特に、塩は、例えば以下の反応において、適切なピリドンまたはキノロンをPCl5、POCl3またはSOCl2のような強塩素化剤で処理することにより形成される（実施例２）。同様に、ピリドンまたはキノロンを適切な無水硫酸を用いて処理することにより、スルホネートはR4で置換され得る。
【化１１】
0004634514.tif 000022
【００５０】
ハロゲン置換
2-ハロゲン化ピリジニウムまたはキノリニウム中間体の反応性により、２位でTAILおよびTAIL前駆体を含む、様々な置換基を結合するための様々な合成方法が提供される。しかし、2-ハロ誘導体の反応性は、ベンズアゾリウム前駆体との共役の後さえも保持され、R4がハロゲンである得られた色素の、ピリジニウムおよびキノリニウム前駆体について記載したような、適切なアルコキシ、アミノおよびチオレートアナログへの転換を可能にする。本発明の色素にとっての特別な有用性の中には、アミンによる2-クロロ置換基の置換(LINKが-NR20-である場合、TAILまたはTAIL前駆体を生じる)、チオールによる置換(LINKが-S-である場合、TAILまたはTAIL前駆体を生じる)、あるいはアルコールによる置換(LINKが-O-である場合、TAILまたはTAIL前駆体を生じる)がある。アミンによるクロライドの置換は、実施例５に記載されており、そしてチオールによるクロライドの置換は実施例７に記載されている。
さらに、ピリドンまたはキノロン前駆体の2-オキソ基は、DIBAL-H(ジイソブチルアルミニウムハイドライド)を含む様々な試薬を用いて、R4がＨである誘導体に化学的に還元され得る。
【００５１】
TAIL
上記のように、TAILは３つの部分(LINK、SPACERおよびCAP)から構成される。TAILがR5として存在する場合、LINKは単結合になり、TAIL内のＮ-S、Ｎ-O、またはＮ-Ｎ結合のポテンシャルを除去する。SPACERの化学的組成は、LINKによる色素のコア構造とともにCAP内のヘテロ原子に結合する必要がある化学物質によって決定される。
【００５２】
上記のように、R4がTAILである、4-ピリジニウムまたは4-キノリニウムである本発明のこれらの色素は、チオール、アルコキシドまたは１級アミンまたは２級アミンによるハロゲンの求核置換反応による色素のベンズアゾリウム部分の縮合前または縮合後のいずれかに、2-ハロピリジニウムまたは2-ハロキノリニウム前駆体から最も首尾良く合成される。
【００５３】
CAPは、ピリジニウムまたはキノリニウム塩のベンズアゾリウム塩との縮合前後に直接、TAILに取り込まれ得るか、またはCAPは合成の後の工程で添加され得るかまたはさらに改変され得る。例えば、CAPが環式または非環式の、１級、２級、または３級アミンである場合、CAPはアルキル化され、４級アンモニウムとなり得る（実施例６、７および８）。この反応は色素の極性を増大させるために用いられ、それゆえ生体細胞膜を通る色素の透過を制限し、さらに核酸に対する色素の親和性を増加する。
【００５４】
TAILに対する前駆体は、カルボン酸、ハライド、アルコールおよびチオールを包含する。各々のこれらの反応基が用いられ、部分(すなわちCAP)を含有するヘテロ原子を色素のコア構造に、一般にアミドの形成(実施例15および16)、エーテルまたはチオエーテルの形成を介して結合し、SPACERが色素のコア構造に結合する前(実施例15)または後(実施例16)にSPACERに取り込まれる。
【００５５】
色素の縮合
Hauglandらの米国特許第5,436,134号(1995)に概説されている合成手順によって、ベンズアゾリウム前駆体は、ピリジニウム塩またはキノリニウム塩を用いて調製され、縮合される。用いられる特定の共役方法および用いられる試薬により、２つの環系の間にメチン、トリメチンまたはペンタメチン架橋を生じる。
【００５６】
使用方法
本発明の使用は、本発明の色素を核酸ポリマーを含有するまたは含有すると考えられるサンプルと合わせる工程、色素とサンプルとの混合物をサンプル内で核酸ポリマーと合わせるに充分な時間インキュベートし、検出可能な蛍光シグナルを有する１つまたはそれ以上の色素−核酸複合体を形成する工程を包含する。色素−核酸複合体の特徴は、存在、位置、強度、励起および発光スペクトル、蛍光重合、蛍光寿命、および蛍光シグナルの他の物理的な特性を包含し、検出、識別化、選別、定量、および／またはサンプルの局面または一部の分析のために用いられ得る。本発明の色素は、必要に応じて、異なるスペクトル特性を有する同一のクラスの色素を包含する、１つまたはそれ以上のさらなる試薬（好ましくは検出可能なように異なる蛍光試薬）と合わせて用いられる。
【００５７】
染色溶液
代表的には、対象となる色素は染色溶液（好ましくは、サンプルおよび意図される使用物と相容性である水溶液または水と混和性の溶液）中で、色素を溶解させることにより使用するために調製される。生物学的なサンプルに対して、細胞形態学または細胞生理学の最小限の摂動が所望される場合、染色溶液はしかるべくして選択される。色素は代表的には、水のような水性溶媒中で、または緩衝生理食塩水のような緩衝溶液中で直接溶解されるか、もしくはジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド(DMF)、あるいはメタノールまたはエタノールのような低級アルコールのような水に混和性の有機溶媒中で、染色溶液中で用いられる濃度の約100倍を超える濃度で溶解され、次いで色素が有効量で存在するように水または緩衝液のような水性溶媒を用いて１倍またはそれ以上に希釈される。
【００５８】
色素の有効量は、核酸と合わせて検出可能な蛍光応答を与えるに充分な量である。溶液中の色素濃度は、バックグラウンドの蛍光を最小にする一方、サンプル中で核酸と接触することと、シグナルを与えるに充分な量で核酸を合わせることとの両方に充分でなければならない。代表的には、細胞サンプルのための染色溶液は、0.1nMを超えかつ50μM未満、より代表的には1nMを超えかつ10μM未満、好ましくは0.5μMと５μMとの間の色素濃度を有する。一般的に、低濃度の色素は、原核生物よりも真核生物に必要とされ、そして高感度の色素が必要とされる。求電子性ゲルのための染色溶液は、代表的には0.1μMを超えかつ10μM未満、より代表的には約0.5μM〜２μMの濃度の色素を有し；色素が、核酸と合わせる前に、ゲル（前もって形成済み）に加えられる場合も同様に保持される。溶液中の遊離核酸の検出および定量のための染色溶液は、代表的には0.1μM〜２μMの濃度を有する。染色溶液の最適濃度および最適組成はサンプルの性質（物理的、生物学的、生化学的および生理学的特性を含む）、色素−サンプルの相互作用の性質（色素の核酸部位への輸送速度を含む）、および行われる分析の性質により決定され、そして以下の実施例で記載される手順の標準的手順によって決定され得る。
【００５９】
サンプルのタイプ
色素は、核酸を含有するまたは含有すると思われるサンプルと結合する。サンプル内の核酸の存在は、天然の生物学的プロセスのためであり得るか、または成功したあるいは不成功の合成あるいは実験的方法の結果、所望しない汚染、または疾患状態であり得る。核酸は内在性であるか、伝染、トランスフェクション、または治療処置によるような、外来性物質として導入され得る。
【００６０】
サンプル内の核酸は、RNAあるいはDNA、またはこれらの混合物またはこれらのハイブリッドである。DNAは、いずれも必要に応じて一本鎖DNA、二本鎖DNA、三本鎖DNA、または四本鎖DNAであり；RNAは、いずれも必要に応じて一本鎖(「ss」)または二本鎖(「ds」)である。核酸は天然のポリマー(生物学的由来)、または合成ポリマー(人工的に修飾または調製される)であり得る。核酸ポリマー（好ましくは、少なくとも８塩基または塩基対を含有する）は、核酸フラグメント、オリゴヌクレオチド、または２次構造または３次構造を有するより大きな核酸ポリマーとして存在し得る。核酸は必要に応じて、凝縮相(condensed phase)(例えば、染色体(実施例26、27))に存在する。核酸ポリマーは、必要に応じて１またはそれ以上の修飾塩基または結合を含有するか、または非共有結合的または共有結合的に結合する標識を含有する。例えば、修飾塩基は、tRNA中のΨ(プソイドウリジン)、5-メチルシトシン、6-メチルアミノプリン、6-ジメチルアミノプリン、1-メチルグアニン、2-メチルアミノ-6-ヒドロキシプリン、2-ジメチルアミノ-6-ヒドロキシプリン、または他の公知の微量塩基(Davidson編、THE BIOCHE MISTRY OF THE NUCLEIC ACIDS(1976)参照)のような天然の修飾塩基であり得るか、または合成的に改変されてモルホリン由来のホスフェート(AntiVirals,Inc.,Corvallis,OR)のような特異な結合剤、またはN-(2-アミノエチル)グリシン単位(W ittungら、Nature 368,561(1994))のようなペプチド核酸を含有するか、または脂肪族アミン、カルボン酸、アルコール、チオールまたはヒドラジンである単一の反応官能基(<10炭素)を含有するか、または蛍光標識または他のハプテンであって、その標識がヌクレオチド上またはポリマーの3'または5'末端上、または核酸に非共有的に結合するリガンドに初めから結合している蛍光標識、または他のハプテンを含有する（例えば、実施例28、29）。一般的な修飾塩基としては、イノシン、ブロモデオキシウリジン、およびヨードデオキシウリジンが挙げられ、ビオチン、ジゴキシゲニン、または2,4-ジニトロフェニルのようなハプテン、または蛍光団で標識される。このような標識の存在は、DNA増幅、またはゲル上もしくは溶液中におけるその後の分析を顕著には阻害しない(実施例33；図２)。
【００６１】
核酸を含有するサンプルは、必要に応じて生物学的構造体(すなわち、生物または生物の個別の単位)、または溶液(生物学的構造体を含有する溶液を含む)、または固体物質または半固体物質である。それゆえ、本発明を実施するために用いられる核酸は、必要に応じて溶液中で遊離しているか、固体物質または半固体物質の中またはその上に固定されているか、生物学的構造体(例えば、溶解した細胞、組織、生物、またはオルガネラ)から抽出されるか、または生物学的構造体中に封入されたままである。核酸を封入する生物学的構造体は、必要に応じて、細胞または組織であり、例えば、ここで核酸は細胞または間質空間中に、原核生物または真核生物微生物として、またはウイルス、ウイロイド、染色体またはオルガネラとして存在する。あるいは、生物学的構造体は組織または細胞中に封入されず、ウイルスとしてまたは微生物もしくは他の細胞のいずれかとして存在するか、またはその親細胞から取り出された細胞成分(例えば、プラスミドまたは染色体、またはミトコンドリアまたは核または他のオルガネラ)として存在する。
【００６２】
一般的に、サンプルは、液体供給源から直接、または(有機または無機の)固体物質からの洗浄液(wash)としてか、または細胞が培養のために導入されている成長培地としてか、または核酸または生物学的構造体が評価のためにおかれている緩衝液溶液として得られる細胞であるか、または水性溶液または水と混和性の溶液である。あるいは、サンプルは固形物であり、必要に応じてスメアまたは掻き出し物(scrape)、または液体あるいは蒸気(vapor)から濾過により取り出される保留物(retentate)である。本発明の１つの局面において、サンプルは、尿、髄液、血液、リンパ液、組織ホモジネート、間質液、細胞抽出物、粘液、唾液、痰、糞便、生理学的分泌物または他の類似の流体のような生物学的流体から得られる。あるいは、サンプルは土壌、水、空気のような環境供給源、または排物流(waste stream)、水源、供給ライン、または製品ロットから採取されるような産業供給源から得られる。産業供給源としてはまた、生物学的リアクター(reactor)からのような発酵培地、もしくは醸造物のような食品発酵プロセス、または肉、穀類、農産物、または乳製品のような食料品が挙げられる(実施例42)。
【００６３】
サンプル溶液としては、オリゴヌクレオチドのような精製されたまたは合成核酸の１つから、細胞抽出物またはホモジネートまたは他の生物学的流体のような粗混合物、または生物学的、産業、または環境供給源からの希釈溶液にまで及び得る。場合によって、色素と組み合わせる前に、溶液中で生体分子または流体の混合物から核酸を分離することが望ましい。核酸の分離および生成には、非常に多くの技術があるが、これらは多くの支持体または溶液を用いるかまたは流体流(flowing stream)中か、または核酸分解物を用いる、クロマトグラフィー技術および電気泳動技術のような手段を包含する。
【００６４】
色素が効果的な核酸染色物となる細胞のタイプは、核を有するまたは有しない細胞を含み、植物細胞および動物細胞(特に脊椎動物細胞)のような真核生物、花粉および配偶子細胞；原核生物、特に細菌(グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の両者を含む)；および酵母ならびに他の菌類、および胞子を含むが、これらに限定されない。細胞は必要に応じて、単細胞(微生物を含む)であり、または２次元または３次元の層中で他の細胞と結合する多細胞(多細胞生物、胚、組織、バイオプシー、フィラメント、バイオフィルム(biofilm)などを含む)である。細胞は生細胞または死細胞またはそれらの混合物である。あるいは、細胞は泡状突起が出ているか、またはアポトーシスであるか、または成長サイクルまたは細胞分裂サイクル中にある。色素はどの細胞タイプにおいても染色効果が等しいわけではないが、特定の色素は一般に、他の色素よりも透過する。生細胞では、死細胞よりも色素が透過せず、そして原核生物では真核生物よりも透過しない(表６を参照のこと)。いくつかの色素は一般に、無傷の(intact)膜を有する生細胞へ透過せず；他の色素は一般に、真核生物には透過するが、原核生物には透過せず；さらに他の色素は細胞膜強度が崩壊されている細胞(例えば、いくつかの死細胞)のみに透過する。細胞膜の、色素に対する相対的透過性は経験的に測定される(例えば、死滅細胞の染色プロフィールまたは染色パターンとを比較することによる)。所望の程度の透過性を有する色素、および核酸に結合した場合の高い吸光度および量子収量は、サンプルと結合されるように選択される。
【００６５】
さらに、細菌細胞およびより高度の真核細胞(dell)のいくつかの色素に対する特異な透過性は、生哺乳動物細胞の選択的染色を可能にし、生細菌の染色はほとんど、または全く伴わない。細菌に透過するように選択された色素は、真核生物のみに透過し、真核生物の存在下で細菌を識別する色素と組み合わせて用いられ得る。劣化した(compromised)膜を有する死細菌(例えば、活性マクロファージまたは好中球のファゴ液胞(phagovacuole)中の死細菌)は、色素に対して透過可能にされ得、それ以外はこの色素は食細胞が産出する毒性因子の結果として、真核細胞に透過するのみである（実施例44）。
【００６６】
〔表６〕本発明の選択される色素の透過性
0004634514.tif 000023
0004634514.tif 000024
【００６７】
色素−核酸複合体の形成
サンプルを、色素と核酸との間で接触を促進する任意の方法(代表的には単に混合する工程)によって染色溶液と合わせる。サンプルが溶液である場合、染色溶液はサンプル溶液に直接、または電気泳動液、シーブマトリックスまたはランニングバッファー(runnning buffer)のような液体分離媒体中で、または沈殿物( 例えば、スクロース)もしくは浮遊密度勾配(例えば、CsCl含有密度勾配)中で、またはブロットまたはゲルのような不活性マトリックス、試験ストリップ、または他の任意の固体支持体または半固体支持体上で加えられる。適切な支持体としてはまた、ポリマー微粒子(常磁性体微粒子を含む)、ポリアクリルアミドおよびアガロースゲル(変性および未変性の両方)、ニトロセルロースフィルター、コンピューターチップ(写真平板用シリコンチップのようなチップ)、天然の膜および合成膜、リポソームおよびアルギン酸ヒドロゲル、およびガラス(光学フィルターを含む)、および他のシリカ基礎支持体およびプラスチック支持体が挙げられるが、これらに限定されない。色素は必要に応じて、ゲルまたはキャピラリー電気泳動、勾配遠心分離、または他の分離工程の前、分離中、または核酸が分離した後に、核酸溶液と合わせられる。あるいは、色素は、核酸溶液添加前のキャピラリーの不活性のマトリックスまたは溶液と合わせるが、前もって形成したゲル(pre-cast gel)としては、キャピラリー電気泳動または予め形成した密度あるいは沈降勾配がある。
【００６８】
核酸が生物学的構造体に封入されている場合、サンプルは典型的に色素と共にインキュベートされるが、色素を生物学的構造体に輸送するために適切な他のいずれの技術も用いられ得る。いくつかの細胞は、その細胞膜透過性にかかわらず、細胞膜を横切って活発に輸送する(例えば、生物または他の取り込み機構によるエンドサイトシースまたは摂取)。色素(または予め形成した色素−核酸複合体)を細胞膜を横切って輸送する適切な人工的手段は、界面活性剤、酵素、またはアデノシン三リン酸のような化学薬剤の作用；レセプター媒体取り込みまたは輸送タンパク質媒介取り込み；リポソームまたはアルギン酸ヒドロゲル；食作用または他のタイプの摂取；孔形成タンパク質(pore-forming protein)；ミイクロインジェクション；エレクトロポレーション；低浸透圧(hypoosmotic)ショック；または掻き出し物の充填(scrape loading)、パッチクランプ方法、または色素で被覆した固体粒子、もしくは色素存在下で被覆した固体粒子を用いたボンバーメント(bombardment)のような最小限の物理的破壊を包含するが、これらに限定されない。無傷の構造体を所望する場合は、好ましくは、染色方法は細胞の生存能力および細胞の強度または細胞内膜強度の最小限の破壊を引き起こす。あるいは、特に病原性生物の存在が疑わしい場合は、ルーチンの組織化学的手順または細胞化学的手順を用いて細胞は固定され、そして処理される。細胞は一般に、細胞中に色素を保持するアルデヒド固定剤を用いて染色した後、ただちに固定される。細胞の固定化は、細胞膜中で多数の架橋を生じ、そのため固定時に無傷であった膜は、死細胞染色に対する不透過性を維持する。それゆえ、病原性細菌は固定化の後に生存性についてアッセイされ、曝露の危険性を減少する。典型的に細胞は、3.7％ホルムアルデヒドまたは４％グルタルアルデヒドのようなpH−緩衝化固定剤を用いて固定化される。固定化時に、サンプルの細胞は好ましくは洗浄され、過剰の固定剤を除去し、次いで染色される。場合によって、生細胞または死細胞は、以前に生きていた細胞の細胞膜透過性を実質的に増加することなく、染色前に固定化され、そのため固定化前にすでに死んでいた細胞だけが、細胞−不透過性色素で染色される。
【００６９】
サンプルは、蛍光核酸−色素復合体を形成するに充分な時間、このましくは高いシグナル対バックグラウンド比を提供することを必要とする最小限の時間の間に色素と合わせられる。至適時間は、通常、使用される濃度において、色素が最も高い標的特異的シグナルを達成する一方、その時間の間サンプルの分解を避け、そして色素による他の全ての蛍光シグナルを最小限にするために必要な最小限の時間である。例えば、色素を、特定の核酸ポリマーまたは特定のタイプの細胞について選択的であるように選択する場合、至適時間は通常、そのポリマーまたはそのタイプの細胞について最も高いシグナルを達成するが、他の核酸または他の細胞タイプからのシグナルを伴わないようにするために必要な最小限の時間である。
【００７０】
好ましくは、色素は、色素の操作パラメーター内で、核酸の生物学的活性の最適な温度(通常５℃と50℃との間、これより高い温度では色素の安定性が低下する)でサンプルと合わせられる。インビトロでのアッセイのために、色素は典型的におよそ室温(23℃)でサンプルと合わせる。室温では、核酸溶液中の検出可能な蛍光は、本質的に一瞬であり、用いられる器具の感受性に依存し；溶液中の蛍光は一般に、色素添加後の５秒間、肉眼で見え、そして２分〜５分間内に、一般に測定可能であるが、染色平衡状態に達するにはさらに長い時間がかかり得る。室温でのゲル染色は、通常、５分〜２時間かかり、ゲルの厚さおよびアガロースまたはポリアクリルアミドのパーセント、および架橋の程度に依存する。一般に、染色後のミニゲルは、染色されて20分〜30分で平衡に達する。細胞および他の生物学的構造体に対して、色素が膜を横切る輸送は、膜が無傷であるかまたは破壊されているかにかかわらず必要である。好ましい実施態様のためには、目視で検出可能な蛍光が、室温で、細胞と共にインキュベーションする15分〜20分、通常は約５分間以内に、得られる。いくつかの実施態様は、細胞内で約２分間未満で検出可能な蛍光を与える。５μMの色素溶液を充填されたリンパ球は、５秒未満で蛍光反応を与える。この特性は、(例えば、有糸分裂またはアポトーシスの間に起こるような)核の構造および再配置を観察するのに有用である。
【００７１】
色素−核酸複合体の蛍光
サンプルを本発明の色素で染色する間に形成される核酸−色素複合体は、１またはそれ以上の色素分子と非共有結合する核酸ポリマーを含む。色素と核酸とを組み合わせると、蛍光シグナルを生じ、そのシグナルは色素単独の蛍光よりも著しく増強される。色素−核酸複合体の蛍光が、6.5未満のpHまたは８を超えるpHで減少する場合は、一般に適度のpHに戻すことによって蛍光が回復される。
【００７２】
結合しない色素の量子収量は、代表的に<0.01、通常<0.002、およびしばしば<0.001であり、それぞれ>100倍、>500倍、および>1000倍の最大の増強を生じる。多くの適用に対して、色素は選択され、核酸との結合時に、約0.3を超える、好ましくは0.6を超える量子収量を与える。結合した色素の蛍光増強のレベルは一般に、結合していない色素より約100〜1000倍大きく、代表的に約200倍を超え、そのため色素は、核酸に結合する際に、量子収量の増加を簡単に検出し得る。より典型的には、蛍光の増強は300倍を超え、好ましくは1000倍を超える。色素の最も長い波長の吸収ピークでのモル吸光率(吸光係数)は、ｎ＝０である色素については、典型的に>50,000であり、しばしば>60,000であり、ｎ＝１または２である色素については、モル吸収率は典型的に90,000を超える。励起波長での高い吸光係数を有する色素は、最も高い感度のために好ましい。
【００７３】
〔表７〕示された核酸/染料複合体の量子収量
0004634514.tif 000025
【００７４】
色素の蛍光特性  二本鎖仔ウシ胸腺DNA(ds DNA)に対して結合する選択色素の量子収量、E．coliリボゾームRNA、一本鎖M13ファージDNA(ss DNA)、およびオリゴヌクレオチド(合成24マー)。
二本鎖DNAについての蛍光励起および発光最大値を示す；単位はnmである。
【００７５】
複合体の蛍光は、約450nmを超える、好ましくは約480nmを超える、より好ましくは500nmを超える波長で得られる光発光の検出によって定性的にまたは定量的に検出される。キノリニウム環系を有する色素は、通常、ピリジニウム環系を有する類似の置換色素よりも長い最大波長で吸収し、発光する。発光は目視検査、CCDカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、またはレーザー走査装置、蛍光計、フォトダイオード、量子カウンター(quantum counter)、プレートリーダー(plat e reader)、エピ蛍光(epifluorescence)顕微鏡、走査型顕微鏡、共焦点顕微鏡(confocal microscope)、フローサイトメーター、キャピラリー電気泳動検出器のような現行の機器の使用により、または光電子増倍管チューブのようなシグナルを増幅するための手段によって検出される。このような機器の多くは、蛍光シグナルを利用可能であり、細胞を分類し、そして細胞を定量するか、または核酸を定量する(例えば、イメージ分析システムまたはフローサイトメーター(実施例47、48、49))。色素は発光バンドを有するように選択され得、フルオレイセン用のフィルターセットまたはいくつかの励起および発光バンドを有する多様な蛍光団を検出するためのフィルターセットような購入可能なフィルターセットに一致する。
【００７６】
複合体の使用
色素−核酸復合体が形成されると、その存在が検出され得、そしてサンプル内の核酸の存在、位置、またはタイプのインジケータ(indicator)としてか、または細胞を分類する基礎としてか、あるいはサンプルまたはサンプル内の細胞を特徴付ける手がかりとして用いられ得る(表６〜９および12；実施例41)。このような特徴付けは、さらなる試薬(蛍光試薬を含む)の使用によって強化され得る。色素−核酸複合体を形成するために用いられるポリマーへの共有結合性標識の結合は、以後の蛍光複合体の形成を妨げない(図２；実施例33)。定性分析における使用に加え、サンプル内の核酸はまた、核酸−色素複合体の蛍光とサンプル内の核酸の濃度との間の公知の関係を比較することによって定量され得る(実施例21、22、38、48；図３、４、10)。
【００７７】
本発明の色素は、小さな核酸ポリマーを用いても(いくつかの実施態様に関しては、僅か８塩基程度または塩基対)、非常に少量の核酸を用いても、強い蛍光シグナルを与える。蛍光顕微鏡を用いて、単一の核酸分子が検出され得る(実施例37)。僅か５つの哺乳動物の細胞由来の核酸含量が、細胞抽出物中で検出され得る(実施例38)。僅か25ピコグラムのds DNA/mLの溶液が、蛍光計で検出される( 実施例21)。トランスイルミネーターに接続すれば、電気泳動ゲルの１バンド当たり僅か10ピコグラムのds DNAを検出することが可能である(実施例19)；いくつかの色素は、普通の蛍光灯による照射によってもこのような明るいシグナルを与え、１バンド当たり僅か１ngのDNAが検出される。染色前のまたは染色後の電気泳動ゲルに用いる場合、本発明の高感度の色素により、安価な器具(例えば、UVトランス-またはエピ-イルミネーター(epi-illuminator))を用いて、脱色する必要もなく、以前では測定不可能であった核酸の量が検出可能である(表８参照)。
【００７８】
〔表８〕電気泳動ゲル中での核酸検出の感受性
0004634514.tif 000026
【００７９】
あるいは、蛍光シグナルの存在または位置が、生物学的構造(例えば、染色された細胞またはオルガネラ)の存在または位置に対応する場合、上記のように染色した場合、核酸の存在および位置は同様に、生物、細胞、または核酸を含有するオルガネラの存在または位置を示すのに順次使用され得る。細菌、マイコプラズマ、マイコバクテリア、ウイルスならびに寄生微生物、および他の細胞のような伝染性因子は染色され得、そして真核生物細胞中で検出され得るが、個々のウイルス粒子によって生じる蛍光シグナルは、標準的な検出器具の解像レベルを下回る。本発明のさらなる実施態様においては、色素−核酸複合体の形成から生じる蛍光シグナルは、細胞を分類するための基礎（例えば、染色されていない細胞から染色された細胞を分類すること、または１つのセットのスペクトル特性を有する細胞を、別のセットのスペクトル特性を有する細胞から分類すること）として用いられる(実施例45、47；図８、９)。
【００８０】
核酸の存在または位置、およびそれらの封入構造体の検出に加え、色素−核酸複合体の形成から生じる染色プロフィールは、サンプルの１つまたはそれ以上の特徴を示す。染色プロフィールによって、蛍光色素−核酸複合体の励起から生じる蛍光シグナルのプロフィールの形状、位置、分布、スペクトル特性が表される。サンプルを単に染色すること、およびサンプルの特徴を示す染色プロフィールを検出することによってサンプルは特徴付けられ得る。より効果的な特徴付けは、サンプルの特定の特徴に対して選択的な色素を利用すること、またはさらなる試薬(以下参照)(このさらなる試薬は、より大きいまたはより小さい程度で同じ特徴に対して選択的であるか、またはそのさらなる試薬は、同じサンプルの異なる特徴に対して選択的である)を利用することによって達成される。
【００８１】
本発明の１つの実施態様では、細胞膜の強度は、上記のように細胞を染色することにより、劣化した膜を有する細胞の検出可能な蛍光シグナルを与えるに充分な時間および色素濃度について測定する。選択された色素が無傷の膜を有する細胞にとって不透過的である場合、細胞内の蛍光色素−核酸複合体の形成は、細胞膜の強度が崩壊することを示し、そして細胞内の蛍光色素−核酸複合体の欠如は、細胞が無傷であるかまたは生存可能であることを示す。不透過的な色素は、必要に応じて検出可能な異なるシグナルを与え、そして代謝的に活性な細胞を示す対比染色と共に用いられるか、または不透過的な色素と共に用いられ、無傷の膜を有する細胞を示す。あるいは、本発明のより透過的な色素は、無傷の膜を有する細胞と破壊された膜を有する細胞との両方を、破壊された膜を有する細胞の検出可能な異なるシグナルを与える対比染色と共に染色するために用いられ、生細胞を死細胞から区別することを可能にする。破壊された膜を有する細胞の検出可能な異なるシグナルを与える対比染色は、必要に応じて、本発明の不透過的な色素、または細胞膜の強度の損失あるいは死細胞の代謝活性の損失を示す他の試薬である。生細菌を染色することが知られている色素濃度で細胞を染色する場合、蛍光強度の相対的減少は、活発にタンパク質を発現しない静止状態の細菌を、代謝が活性な細菌から区別するために用いられ得る(図８Ａおよび図８Ｂ；実施例45)。
【００８２】
〔表９〕選択される色素の染色パターン
0004634514.tif 000027
【００８３】
本発明のさらなる実施態様において、色素−核酸複合体の染色プロフィールの形状および分布は、染色された核酸を含有する細胞または生物学的構造体のタイプを示す。細胞は、視覚的な蛍光シグナルに基づいて、目視によって識別され得るか、または蛍光シグナルのスペクトル特性に基づいて、上記のような器具によって識別され得る。例えば、細胞内オルガネラ中の核酸を染色することに対して非選択的な色素は、そのようなオルガネラの非存在または欠如、または核酸および異常なまたは疾患細胞の特徴を含む小核および他の異状なサブ粒子(subparticle)の存在を同定するために用いられ得る。サンプルは、可視染色プロフィールに基づく泡状突起を有する細胞(blebbing cell)または核を含有することを特徴とし得る。特定のオルガネラ(例えば、核酸、ミトコンドリア、ミトコンドリアヌクレオチド)中の核酸について選択的な色素は、細胞質または他のオルガネラ中に核酸の制限された染色の存在下でも、シグナルの強度および位置に基づくそのようなオルガネラの含有または欠損として細胞を特徴付けるために用いられ得、サンプルが特徴付けるための器具の使用が可能となる。典型的に、サンプルを特徴付けるために用いられる染色プロフィールは、オルガネラまたは細胞(細胞は生物学的流体中、組織中、または他の細胞中に位置する)の存在、形状、または位置を示す。細胞集団(cell population)のDNAの含量の分布を反映する蛍光強度シグナルの分布を与える色素は、細胞周期分析のために用いられ得る。
【００８４】
本発明の他の実施態様においては、染色プロフィールは、電気泳動ゲル、または沈降もしくは遠心分離勾配における色素−核酸複合体の形成から生じる。ゲル中の核酸の存在を示すことに加え、染色プロフィールは、ゲルに適用される核酸溶液の１つまたはそれ以上の特徴を示す。例えば、バンドの数および／または染色プロフィールの１バンド当たりのシグナルの強度は、核酸溶液の純度または均質度を示す。バンドの堅固度(band tightness)およびスメアの程度は、溶液中の核酸ポリマーの強度を示す。ポリマーのサイズ、コンフォメーション、および組成は、ゲルを通るポリマーの相対的な移動度によって示され(実施例34、35)、タンパク質結合活性または酵素活性のような核酸ポリマーを用いた分析物の相互作用によって生じる変化を検出するために用いられ得る。色素の好ましい実施態様は本来低い蛍光を有するので、ゲルを脱色して遊離の色素を除去する必要がない。さらに、色素−核酸複合体の蛍光は、尿素、およびホルムアルデヒドのような変性剤によって消光せず、染色の前にゲルからそれらを除去する必要を省く。
【００８５】
本発明のさらなる他の実施態様においては、サンプルを特徴付けるために用いられる核酸のタイプの存在または優位を示す。本発明の１つの実施態様においては、色素は高AT含有または高GC含有ポリマーに対してより選択的であるように選択され、そのような染色プロフィールは、これらの塩基の相対的な割合を示す(実施例41、表12)。本発明の別の実施態様においては、核酸−色素複合体のスペクトル特性は、複合体に存在する核酸の二次構造に依存して変化する。典型的には、スペクトル特性は、蛍光の増強、蛍光偏光、蛍光存在時間、励起波長または発光波長、好ましくは発光波長において変化する。未知の核酸のサンプルの蛍光反応と、染色された既知の二次構造の核酸の蛍光反応とを比較することによって、未知の核酸の二次構造を決定することが可能であり、そしてサンプル内の核酸が定量される。この様式では、RNAおよび一本鎖のDNAは、二本鎖のDNAから区別され得る(実施例40)。ヌクレアーゼを溶液中または固定した細胞中の核酸ポリマーに加え、色素と合わせる前にRNAまたはDNAを消化する場合、色素−核酸複合体からの蛍光シグナルは、ヌクレアーゼの存在下、未消化のポリマーから消化されなかった核酸ポリマーを識別するために用いられ得る（実施例39）。
【００８６】
モノメチン色素による２次構造に対する感度のこの同じ特性は、ss核酸の存在下のds核酸の定量に使用され得る。dsおよびssの両方のDNAまたはRNAを含有するサンプルは、高い色素：塩基比では、緑およびより長い波長の領域の両方に、発光最大を生ずる。溶液中のss核酸およびds核酸の量に関する有意義な情報は、低色素比のサンプルのスペクトルと高色素比のサンプルのスペクトルとを直接比較することにより得られ得る。例えば、核酸溶液（例えば、精製されたオリゴヌクレオチド、DNA増幅反応物、cDNA合成物、プラスミド調製物、または細胞抽出物）を、高色素濃度（すなわち、核酸塩基の濃度より大きいかまたは同じ）で染色する場合、ss核酸により形成された複合体から得られる蛍光シグナルは、ds核酸により形成される蛍光シグナルからレッドシフトする。色素が、ds核酸を高い量子収量で与えるように選択され、そしてレッドシフトする蛍光シグナルの量子収量が最小である場合、より強いシグナルの量子収量が、ss核酸の存在下でさえも、サンプル中のds核酸の量を定量するために使用され得る（実施例40；図６）。
【００８７】
この適用および他の適用での核酸は、色素−核酸複合体由来の検出可能な蛍光シグナルと所定量の核酸の特性を有する蛍光スタンダードとを比較することにより定量され得る（実施例21、22、38、39、48）。色素−核酸複合体の形成により得られる蛍光との比較に使用される蛍光の参照値は、既知の核酸含量のサンプル、または経時的な所定の細胞集団中の核酸含量の分布により決定される。サンプル中のあるタイプの核酸が選択的に完全に消化された場合、蛍光シグナルは、消化後に残っているポリマーを定量するために使用され得る（実施例39）。あるいは、染色される前に、核酸ポリマーの溶液は、標準的な分離技術を使用して別々の画分に分けられ、そしてそれぞれの画分に存在する核酸の量は、その部分に対応する蛍光シグナルの強度を用いて定量される。溶液は、精製された合成または天然の核酸、または細胞抽出物または組織ホモジネートの粗混合物であり得る。単一のサンプル由来のアリコートが経時的に用いられ、そして各アリコートの核酸含量が定量される場合、細胞または核酸増殖の速度は、経時的な対応する蛍光の変化（実施例38）、または細胞周期コンパートメントにわたる細胞分布の変化（実施例48および49）により容易に決定される。
【００８８】
本発明の別の局面では、色素−核酸複合体は、分析物の存在についての蛍光トレーサーまたはプローブとして使用される。本発明の１つの局面では、色素−核酸複合体は、サイズまたは移動度のスタンダード（例えば、電気泳動またはフローサイトメトリーでの）として使用される。あるいは、色素と核酸ポリマーとが相互作用することにより得られる蛍光シグナルは、核酸と相互作用する他の分子の活性または存在を検出または定量するために使用され得る。色素−核酸複合体を形成するために使用される核酸ポリマーは、必要に応じて固体または半固体の支持体に結合されるか、または溶液中に遊離しているか、または生物学的構造物中に封入される。このような分子は、薬剤、他の色素、タンパク質（例えば、ヒストン、またはdsあるいはssのDNAまたはRNA結合タンパク質）、または酵素（例えば、エンドヌクレアーゼまたはトポイソメラーゼ）を包含する。本発明の１つの局面では、核酸に対してアッセイされる分析物よりもより大きな結合親和性を有する色素は、分析物を置換するか、あるいは、分析物と核酸ポリマーとの相互作用を妨害する。例えば、高親和性（すなわち、溶液中で3bp：色素分子よりも大きな比で）の色素（例えば色素1114）と強く結合しているDNAテンプレートは、ggDNase I活性から保護される。代表的には10-6Mよりも小さい、より代表的には10-8Mよりも小さい解離定数を有する色素は、核酸と相互作用する分析物を効果的に置換する。色素の親和性は、色素−核酸複合体の蛍光を測定することにより決定される。得られたデータを平衡反応式に当てはめ、そして会合定数について解く。本発明の別の局面では、アッセイされる分析物よりも小さい結合親和性を有する色素は、分析物の存在により、色素−核酸複合体から置換され、蛍光の損失を生じる。例えば、２本鎖DNAに既に結合している低親和性色素分子が、ヒストンで置換される。
【００８９】
１つの実施態様では、複合体は、酵素活性の指標として（つまり、ヌクレアーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、および核酸と相互作用する他の酵素の基質として）使用される（実施例24）。いくつかの実施態様の色素は、非特異的なヌクレアーゼ活性を阻害するが、しかしある色素：塩基対比で制限エンドヌクレアーゼ活性を阻害しない。あるいは、複合体は、核酸に結合するタンパク質（例えばヒストン）、またはDNA結合薬剤（例えば、ジスタマイシン(distamycin)、スペルミン、アクチノマイシン、ミトラマイシン、クロモマイシン）の豊富さを定量するために使用される。蛍光複合体は、分析物および量的または質的に分析物の存在を示す得られた蛍光シグナルの増大または減少を含有すると考えられるサンプルと組み合わされる。
【００９０】
添加試薬
本発明の色素は、別々に検出可能な１以上の添加試薬と併用して使用され得る。添加試薬は、別々に使用される場合（例えば、同じサンプルの異なるアリコートを染色するために使用される（例えば、実施例39））、またはサンプルの異なった部分または成分を染色する場合（例えば、実施例42）、添加試薬のシグナルが、色素−核酸複合体の蛍光シグナルと検出可能に異なるか否かにかかわらず、別々に検出可能であり得る。あるいは、本発明の色素は、対象の色素と組み合わせて使用されることが所望される他の試薬の反応とは異なる、検出可能な反応を与えるように選択され得る。好ましくは、１つまたは複数の添加試薬は、蛍光性であり、そして色素−核酸複合体のスペクトル特性とは異なるスペクトル特性を有する。例えば、600nmを越える励起を生じさせる複合体を形成する色素は、通常使用される蛍光抗体（例えば、フルオレセインイソチオシアネートまたはフィコエリトリンで標識した蛍光抗体）と組み合わせて使用され得る。
【００９１】
任意の蛍光検出システムは、色素間のスペクトル特性の差異を異なる感度レベルで検出するために使用され得る。このような差異は、励起および／または発光最大、蛍光寿命、同一または異なる励起波長での蛍光発光強度、吸光率、蛍光偏光、標的物質と組み合わせた蛍光増強、またはそれらの組み合わせでの差異を包含するが、それに限定されない。検出可能に異なる色素は、必要に応じて、異なるスペクトル性質および異なる選択性を有する本発明の色素のうちの１つである。本発明の１つの局面では、色素−核酸複合体および添加検出試薬は、同一または重複する励起スペクトルを有するが、しかし、可視的に異なる発光スペクトルを保有し、通常、>10nm、好ましくは>20nm、より好ましくは>50nm隔てられた最大発光を有する。あるいは、添加試薬は、対象の色素−核酸複合体を励起するために使用される波長とは異なる波長で、同時にまたは続いて励起される（例えば、実施例44）。別の場合では、１以上の添加試薬は、色素−核酸複合体の蛍光を消光する、または部分的に消光するために使用される（例えば、特定の核酸の選択性、またはAT/GC選択性を改良するために、第２の試薬を添加することによる）。
【００９２】
Saitohら，CELL 76,609(1994)の、中期染色体にバンドを付けるための手順を改良して、本発明の緑の蛍光色素は、本質的に非選択的に染色体全体に結合し、そして選択的に高AT含量の領域に結合するメチルグリーンにより消光される。結果は、薄暗い高AT領域で隔てられた一連の蛍光緑色バンドであり、これは特定の染色体に特有である（実施例27）。これにより、核型分析および構造分析が可能となり、これは遺伝的異常（例えば、トリソミーおよび転座）の同定を包含する。
【００９３】
本発明の色素は、通常、ハロゲン化デオキシウリジン（好ましくは、ブロモデオキシウリジンまたはクロロデオキシウリジン）の添加により消光されない。それゆえ、スペクトルがビスベンズイミダゾール色素（例えば、Hoechst 33258、Hoechst 33342、Molecular Probes、Oregon）と重複し、そして、ビスベンズイミダゾール色素と極めて近接して核酸に結合する色素が、ハロゲン化デオキシウリジンおよびビスベンズイミダゾール色素と併用して、細胞増殖の分析のために使用され得る。本発明の色素と組み合わせた添加試薬の効果は、蛍光定量装置により分析される（実施例49）。
【００９４】
添加色素は、必要に応じて、サイズ、形状、代謝状態、生理学的条件、遺伝子型、または他の生物学的媒介変数、またはそれらの組み合わせにより、核酸を含有する細胞または無細胞サンプルを区別付けるために使用される。添加試薬は、必要に応じて、同じ特性について非選択的な試薬と併用して使用するために、サンプルの特定の特性に対して選択的であるか、または、サンプルの他の特性に対して選択的である試薬と併用して使用するために、サンプルの１つの特性に対して選択的である。本発明の１つの局面では、１または複数の添加色素は、細胞内で代謝されて、蛍光産物を特定の細胞の内側には与えるが他の細胞の内側には与えず、従って、本発明のシアニン色素の蛍光応答は、このような代謝過程が起きない場合にのみ優勢である。あるいは、１または複数の添加色素は、細胞の細胞外成分（例えば、細胞表面タンパク質またはレセプター（例えば、蛍光レクチンまたは抗体））に特異的である（実施例32）。本発明の別の局面ではまた、１または複数の添加色素は、能動的または受動的に細胞膜に交差し、そして細胞膜の完全性または機能を示すために使用される(例えば、カルセイン(calcein)AMまたはBCECF AM)。別の局面では、添加試薬は、ATが豊富な核酸に選択的に結合し、そして染色体のバンド化を示すために使用される。本発明の別の局面では、添加試薬は細胞内小器官染料（すなわち、特定の細胞内小器官に対して選択的である染料）であり、例えば、添加試薬は、ミトコンドリアへの潜在的に感受性の吸収（例えば、ローダミン123またはテトラメチルローザミン）または生細胞の細胞内小器官中のpH勾配による吸収(例えば、Diwuら、CYTOMETRY補足７,p77,要約426B(1994))に対して選択され得る。
【００９５】
添加色素は、当該分野で通常公知の標準的な手順により決定された最適な色素濃度でサンプルに有効量添加される。各色素は、必要に応じて、別々の溶液に、または１つの溶液に合わせて、意図する使用に応じて調製される。上記のように染色された細胞を適切な波長で照射した後、細胞を照射に対する蛍光応答に従って分析する。さらに、特異な蛍光応答は、細胞または核酸をさらに分析または実験用に選別するための基礎として使用され得る。例えば、ある手順では「生存する」全ての細胞が選別され、またはサンプル中のあるタイプの細胞が選別される。細胞は、手で、または自動化技術（例えは、フローサイトメトリー）を使用して、当該分野で公知の手順（例えば、Mansourら(1987)の米国特許第4,665,024号）に従って、選別され得る。
【００９６】
以下の実施例は、本発明の実施を例示するために与えられる。これらは、本発明の全体の範囲を限定または定義することを意図しない。
実施例１．1,2-ジヒドロ-4-メチル-1-フェニル-2-キノロン(1)の調製
以下の化合物を調製する：
【化１２】
0004634514.tif 000028
合成前駆体(1)を、Hauglandら(1995)の米国特許第5,436,134号の実施例１に従って調製する。
【００９７】
実施例２．2-クロロ-4-メチル-1-フェニルキノリニウムクロライド(２)の調製
以下の化合物を調製する：
【化１３】
0004634514.tif 000029
20mLの塩化メチレン中の2.8gの1(11.9ミリモル)に、1.85gのPOCl3および触媒量のジメチルホルムアミドを添加する(Marson,TETRAHEDRON.,48,3659(1992))。得られた混合液を加熱して24時間還流する。粗生成物をさらに精製することなく使用するか、またはカラムクロマトグラフィーを使用して精製する。
メトキシキノリニウム類似体を、１の代わりに1,2-ジヒドロ-7-メトキシ-4-メチル-1-フェニル-2-キノロンを使用することを除いて、同じ方法で調製する。
【００９８】
実施例３．色素640の調製
市販の2-クロロ-3-メチルキノリンを、過剰のヨウ化メチルとともに、シールしたチューブ内で120℃にて１時間加熱することにより、メチル化する。反応の最後に、酢酸エチルを添加し、そして沈殿物を濾過してヨウ化キノリニウムを単離する。次いで、この中間化合物を、１当量のトリエチルアミンの存在下で、塩化メチレン中で、3-メチル-2-メチルチオベンゾチアゾリニウムトシレート(3-methyl-2-methylthiobenzothiazolinium tosylate)とともに撹拌し、所望の生成物を得る。
【００９９】
実施例４．2-クロロ-4-[2,3-ジヒドロ-3-メチル-(ベンゾ-1,3-チアゾール-2-イル)-メチリデン]-1-フェニルキノリニウムヨーダイド(3)の調製
以下の化合物を調製する：
【化１４】
0004634514.tif 000030
化合物３を、Hauglandら(1995)の米国特許第5,436,134号の実施例７に従って調製する。
化合物３のピリジニウム類似体を、２のピリジニウム類似体を使用することを除いて、同じ方法で調製する。
トリメチン色素類似体を、3-メチル-2-メチルチオベンゾチアゾリウムトシレートの代わりに、2-(2-アニリノビニル)-3-メチルベンゾチアゾリウムトシレートを使用することを除いて、同様に調製する。
【０１００】
実施例５．色素937の調製
色素937を、３を55℃にて1,2-ジクロロエタン(1,2-dichloroetheane)中、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N-プロピルアミンの存在下で２時間加熱することにより調製する。
類似のアミノアルキルアミノ置換色素のファミリーを、適切な2-クロロ誘導体を選択されたアミンで処理することにより、同様に調製する（例えば、色素211、298、342、377、396、397、856、938、993、1004、1168、および10101）。
【０１０１】
実施例６．色素1107の調製
色素937を、過剰のヨウ化メチルおよびPROTON-SPONGE(Aldrich)で処理し、ジメチルアミンをメチル化し、第４級のアンモニウム塩を得る。類似のアンモニウムアルキルアミノ置換色素のファミリーを、適切なアミノアルキルアミノ置換色素（実施例５参照）をヨウ化メチルおよびPROTON-SPONGEで処理することにより、同様に調製する（例えば、色素308、309、345、398、1107、1114、1170、1172、および3102）。
【０１０２】
実施例７．色素1004の調製
2-ジメチルアミノエタンチオールを、塩化メチレン中の2-クロロ-4-[2,3-ジヒドロ-3-メチル-(ベンゾ-1,3-オキサゾール-2-イル)-メチリデン]-1-フェニルキノリニウムヨーダイド（３のベンゾオキサゾリウム類似体）に添加し、続いてトリエチルアミンを添加し、そして得られた混合物を室温にて1.5時間撹拌する。溶媒の容量を、減圧下で減少させ、そして生成物を濾過により単離する。
類似のアミノアルキルチオエーテル置換色素のファミリーを、適切な2-クロロ誘導体を選択されたアミノアルキルチオールで１当量のトリエチルアミンの存在下で処理することにより、同様に調製する(例えば、色素365、380、387、996、1004、および1169)。得られた色素は、実施例６の方法を使用して四級化し、対応するアンモニウムアルキルチオエーテル置換色素を得る(例えば、色素352、391、1155、および1167)。
【０１０３】
実施例８．色素314および色素316の調製
1,2-ジヒドロ-4-メチル-1-フェニル-2-キノロンを、トルエン中で1.3当量のオキシ塩化リンおよび１当量のDMFとともに還流しながら１時間加熱して、2-クロロ-4-メチル-1-フェニルキノリニウムクロライド(3)を生成する。次いで、塩化物を塩化メチレン中、対応するジメチルアミノエタンチオール中で撹拌し、対応する2-ジメチルアミノエチルチオ-1-フェニルキノリニウムクロライドを生成する。次いで、これをそれぞれ１当量の2-(2-アニリノビニル)-3-メチル-ベンゾオキサゾリウムトシレート、トリエチルアミン、および無水酢酸と反応させ、対応するトリメチン誘導体を生成する。
ジメチルアミノ誘導体を、過剰なヨウ化メチルおよびPROTON-SPONGEを使用して四級化し、色素316を得る。
【０１０４】
実施例９．色素381の調製
出発1,2-ジヒドロ-4-メチル-1-(4'-メトキシフェニル)-2-キノロンを、2-ヒドロキシ-4-メチルキノリンと4-ヨードアニソールとのウルマン反応によって調製する。メチルエーテルを、三臭化ホウ素で脱メチル化し、そして得られたフェノールをアセトン中で3-ジメチルアミノプロピルクロライドおよび炭酸カリウムでアルキル化し、ジメチルアミノアルキルエーテルキノロンを得る。THF中のこのキノロンに-78℃で、３当量のn-ブチルリチウムを添加する。低温下で１時間後、反応を５当量の酢酸で止め、そして室温まで温め、さらに数時間撹拌し続ける。揮発性成分を真空下で除去し、そして得られた粗キノリニウム塩を、3-メチル-2-メチルチオベンゾチアゾリウムトシレートとともに塩化メチレン中でトリエチルアミンの存在下で撹拌し、対応する2-ブチル-1-((3'-ジメチルアミノプロポキシ)フェニル)-シアニンを生成し、これは、上記のようにヨウ化メチルおよびPROTON-SPONGEで四級化して所望の生成物を得る。
【０１０５】
実施例10．色素374の調製
手順は、1,2-ジヒドロ-7-(3'-ジメチルアミノプロポキシ)-4-メチル-1-フェニル-2-キノロンを1,2-ジヒドロ-4-メチル-1-(4'-(3"-ジメチルアミノプロポキシフェニル))-2-キノロンの代わりに出発物質として用いる以外は、色素381（実施例８）の調製に用いられる手順と同様である。
【０１０６】
実施例11．色素3100の調製
以下の化合物を調製する：
【化１５】
0004634514.tif 000031
2,4-ルチジンを、ヨウ化メチルとともに、シールしたチューブ中で100℃にて加熱し、ヨウ化ピリジニウムを生成し、次いでこれを、１当量のトリエチルアミンの存在下で、3-メチル-2-メチルチオベンゾチアゾリウムトシレートで処理し、所望の生成物を得る。
【０１０７】
実施例12．色素3103の調製
対応する2-クロロ誘導体を、約90℃にて、シールしたチューブ中で、1:1 v/vクロロホルム／メタノール混合物中で10時間加熱し、所望の生成物を得る。
【０１０８】
実施例13．色素388の調製
THF中の、1,2-ジメチル-4-キノロンに-78℃で、３当量の4-ジエチルアミノメチルフェニルリチウムを添加する。反応混合物を、室温にて１時間撹拌し、これに５当量の酢酸を添加し、混合物を室温に温め、そしてさらに３時間撹拌する。全ての揮発性物質を真空下で除去し、そして粗残渣をそれぞれ１当量の３-メチル-2-メチルチオベンゾチアゾリウムトシレートおよびトリエチルアミンとともに塩化メチレン中で撹拌し、ジエチルアミノアルキル誘導体を得る。これを、直接、過剰量のヨウ化メチルおよびPROTON-SPONGEにより四級化し、所望の生成物を得る。
【０１０９】
実施例14．色素390の調製
色素390を、1,2-ジヒドロ-1,4-ジメチル-2-キノロンを1,2-ジメチル-4-キノロンの代わりに使用することを除いて、色素388と同様に調製する。
【０１１０】
実施例15．色素380の調製
4-ジメチルアミノブチリルクロライドを、トリエチルアミンの存在下で、１当量の5-アミノ-1,3,4-チアジアゾール-2-チオール(Aldrich)で処理し、対応するアミドチオールを生成する。次いでこの中間産物を、2-クロロ-4-[2,3-ジヒドロ-3-メチル(ベンゾ-1,3-チアゾール-2-イル)-メチリデン]-1-フェニルキノリニウムヨーダイドで処理し、所望の生成物を得る。
【０１１１】
実施例16．色素1189の調製
2-クロロ-4-(2,3-ジヒドロ-3-メチル-(ベンゾ-1,3-チアゾール-2-イル)-メチリデン)-1-フェニルキノリウムヨーダイドを、4-アミノチオフェノールで処理し、対応する2-(4'-アミノチオフェノキシ)誘導体を得る。次いでこのアニリンを4-ブロモブチリルクロライド(Lancaster)で処理し、4-ブロモブチルアミドを得る。この中間体を、過剰のピリジンとともに加熱し、最終産物を得る。
【０１１２】
実施例17．色素517の調製
1,2-ジメチル-4-メトキシ-キノリニウムヨーダイドに、それぞれ１当量の2-(2-アニリノビニル)-3-メチルベンゾチアゾリウムトシレート、トリエチルアミン、および無水酢酸をこの順に添加する。反応物を室温で一晩撹拌し、生成物を得る。
【０１１３】
実施例18．色素300の調製
以下の化合物を調製する：
【化１６】
0004634514.tif 000032
2、4-ジメチルキノリンを、10当量の1,3-ジヨードプロパン（正味）とともに150℃にて加熱し、ヨウ化キノリニウムを得る。次いで、このヨウ化物を、3-メチル-2-メチルチオベンゾオキサゾリウムトシレートと、１当量のトリエチルアミンの存在下で反応させ、1-ヨードプロピル中間体を生成し、大過剰のトリメチルアミンとともにシールしたチューブ中で100℃にて加熱することにより、これを次に最終産物に転換する。
【０１１４】
実施例19．電気泳動用ゲル中のdsDNA
HaeIII制限エンドヌクレアーゼで消化したφX174複製型（２本鎖）バクテリオファージDNA、またはHindIII制限エンドヌクレアーゼで消化したλ cI857バクテリオファージDNA（どちらのDNAも市販されている）の一連の希釈液を、10 mM Tris-HCl(pH7.5)、1mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)(TE)中で調製する。等量の15％FICOLLをそれぞれのサンプルに添加し、そしてサンプルを、HaeIII消化については５％ポリアクリルアミドゲルに、HindIII消化については１％アガロースゲル上にロードする。電気泳動は、標準条件下で行う。得られたゲルを、89mM Tris塩基、89mMホウ酸、1mM EDTA(pH8)(TBE)中の色素377の１μM溶液を含有する小さな染色皿に移す。次いで染色溶液をホイルでおおって、室内照明から保護し、そして穏やかに15〜30分間かき混ぜる。次いでゲルを、直接トランスイルミネーターに移し、そして300nmの透照または254nmの落射照明、白黒Polaroid 667プリントフィルムおよびWratten 15ゼラチンフィルターを使用して撮影する。DNAは、明るい緑色の蛍光のバンドとして可視的に現れる。
【０１１５】
実施例20．電気泳動用ゲル中のss核酸
E.coliリボソームRNA、M13１本鎖DNA、または合成オリゴヌクレオチドの一連の希釈液の天然または変性の電気泳動ゲルを、標準法を使用して調製する。次いて、ゲルをTBE中の１μMの色素388で染色し、そして実施例19のように可視化する。RNAおよびDNAのバンドは、明るい緑色の蛍光のバンドとして現れる。
【０１１６】
実施例21．溶液中の２本鎖DNAの定量
未知の濃度の一連の２本鎖DNAサンプルを、TE中に調製する。0.8μM色素377の作業溶液をTE中に調製し、そして光から保護する。各DNA溶液１mLを蛍光キュベット中におく。１mLの作業色素溶液をそれぞれのキュベットに添加する；サンプルを混合し、そして２〜５分間、光から保護しながらインキュベートする。蛍光を、標準的な蛍光計またはマイクロタイタープレートリーダーで、485nmの励起光を使用し、そして520nmでの発光を測定することにより測定する。蛍光強度を、既知のDNA濃度を含有するサンプルから作成した標準曲線と比較する。未知のサンプルのDNA濃度は、標準曲線のデータの補間により決定される。１μg/mL以上DNAが含有されているサンプルを、定量前に希釈する。このアッセイは、DNA濃度が約25pg/mLと400ng/mLとの間では、図３に示されるように線形である。このアッセイは、YOYO-1法またはYO-PRO-1法(0.5〜1ng/mL)のいずれかで達成され得るよりも約20倍以上敏感であり、Hoechst 33258法(10ng/mL)よりも約400倍以上敏感であり、そしてUV吸光測定法（約１μg/mL）よりも約40,000倍以上敏感である。
【０１１７】
実施例22．溶液中の１本鎖オリゴヌクレオチドの定量
未知の濃度の溶液中の標準的な、またはモルホリン改変の誘導体(AntiVirals Inc.,Corvallis,OR)から合成された、少なくとも８塩基長の、一連の１本鎖合成オリゴヌクレオチドを、蛍光キュベット中のTE中１mLに希釈する。TE中の色素309の0.5μM溶液１mLを各サンプルに添加し、そして、サンプルを光から保護しながら、２〜５分間、室温にてインキュベートする。サンプルを、485nmにて照射し、そして各サンプルの蛍光を520nmにて測定する。各溶液の濃度は、図４に示されるように、既知の量のオリゴヌクレオチドを使用して作成した標準曲線と比較することにより決定される。約１μg/mL以上の核酸を含有するサンプルは、分析する前に希釈する。標準的な塩基および結合を有する約100pg/mL程度の合成オリゴヌクレオチドを含有するサンプルをアッセイし得る。モルホリン改変結合を有するサンプルは、より低い感度で検出し得、このような感度は、配列の関数である。少なくとも８塩基長のオリゴヌクレオチドを測定し得る。この感度は、UV吸光度の測定（これは、現在最も通常に、オリゴヌクレオチドの検出および定量に使用される方法である）よりも10,000倍以上より敏感である。
【０１１８】
実施例23．血液中のオリゴヌクレオチドの検出
全血を、EDTAを含有するバイアルに採集する。血液の0.5mLアリコートを、1.5 mLの微小遠心チューブに移す。各サンプルに、24塩基のオリゴヌクレオチドを、できる限り小さい容量で（１〜約50μL）、計１ng〜計約10μgまでの範囲の量で添加する。血球を、微小遠心管中で１〜２分間、5000rpm、室温での遠心分離によりペレット化する。上清液を、ペレットを乱さずに新しいチューブに取り出す。残存細胞を、１〜２分間、10,000rpm、室温での再遠心分離により除去する。上清液を、ペレットを乱さないように注意して再び新しいチューブに移す。等容量のフェノール:CHCl3:イソアミルアルコール(24:24:１)を各チューブに添加し、チューブを勢いよくボルテックスし、そして微小遠心管中で遠心分離し、相分離させる（室温）。水層を、注意深く界面を避けながら、新しいチューブに分取する。抽出を繰り返す。各サンプルを200μLずつ含有するアリコートを、800μL のTEを含有する蛍光キュベットに移す。TE中の色素309の0.5μM溶液１mLを各キュベットに添加し、そして、サンプルを反転により混合する。存在するオリゴヌクレオチドの量は、オリゴヌクレオチドを全く含有しないコントロールのサンプルで観察された蛍光を差し引くことにより、実施例22に概説した方法に従って決定される。
【０１１９】
実施例24．DNase活性の検出
DNase活性を呈示すると考えられるサンプルを、37℃にて５分間、PstI制限エンドヌクレアーゼで消化したφX174RF（２本鎖）DNA10ngとともに、50mM Tris-H Cl(pH7.5)、10 mM MgCl2、１mM CaCl2、および50μg/mLウシ血清アルブミンからなる総容量10μLの緩衝液中でインキュベートする。反応は、2.5μLの100mM EDTAを添加し、そして直ちに勢いよく混合することにより止める。等容量の15％FICOLLを各サンプルに添加し、そしてサンプルをいくらか混合し、次いで１％アガロースミニゲルに、0.05％ブロモフェノールブルー追跡用色素および7.5％FICOLLを含有する分子量マーカーとともにロードする。ゲルを、標準条件下で、ブロモフェノールブルーが少なくとも１ 1/2〜２インチ移動するまで電気泳動する。次いで、ゲルを電気泳動装置から取り出し、そして染色皿におく。TBE中に１μMの色素377を含有する溶液をゲルに添加し、そして光から保護しながら、少なくとも20分間、ゲルを穏やかにかき混ぜる。ゲルをトランスイルミネーターに移し、300nmの透照、または254nmの落射照明で照射し、Polaroid 667白黒プリントフィルムでWratten 15ゼラチンフィルターを通して撮影する。DNase活性は、１本の鋭いPstI消化されたDNAバンドのスメア(smearing)として現れる。このようにして、6.5pg〜２×10-5単位の程度のDNaseIを検出し得る。制限エンドヌクレアーゼ活性またはRNase活性を、適切な基質核酸分子を使用して同様の方法でアッセイし得る。
このアッセイは、トポイソメラーゼ、ジャイレース、制限エンドヌクレアーゼ、RNase、エキソヌクレアーゼ、または電気泳動度を変えるようにDNAに作用する任意の酵素について一般化可能である。
【０１２０】
実施例25．支持体上の核酸の検出
プラスミドpUC19 DNAを、一晩、単一の制限エンドヌクレアーゼまたは２つの酵素の混合物で消化する。次いで、各サンプル１μgを、５％ポリアクリルアミドゲルにロードし、そして標準的な手順に従って電気泳動する。次いで、ゲルを、上記の実施例19に記載のように色素398で染色する。バンドを、UV照射により可視化し、そしてバンド中の核酸を変性し、そして電気泳動的にナイロンメンブレンにトランスファーする。トランスファー後、緑の蛍光DNAバンドが、色素398の保持により、携帯UVランプを使用して可視化される。メンブレンを、標準的手順に従って、ビオチン標識M13配列決定プライマー（lacZ遺伝子に特異的）を使用して、プレハイブリダイズ、ハイブリダイズ、および洗浄する。ハイブリダイズしたバンドを、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼをNBT/BCIP基質とともに使用して検出する。プライマー結合部位を含有する全てのフラグメントは、特異的なハイブリダイゼーションシグナル（青みを帯びた／紫色）を示す。さらに、色素の存在はまた、ハイブリダイゼーションの効率に影響を与えない。なぜなら、同じ時に染色されずにブロットおよびハイブリダイズした同一の（コントロールの）ゲルは、同一のシグナルを示すからである。色素のシグナルは、ハイブリダイゼーションの間に失われるために、ブロットは全てのDNAバンドを可視化するために再染色される。RNAもまた、フィルターメンブレン上で、適切な色素で染色することにより検出され得る。
【０１２１】
実施例26．中期の染色体および間期の核の対比染色
ヒト中期染色体展開を、標準的な手順に従って調製する。標準的な手順に従って、展開を変性し、プレハイブリダイズし、そして、ランダムプライミングによりビオチン標識ヌクレオチド三リン酸で標識しておいたα動原体反復プローブとハイブリダイズさせる。次いで、ハイブリダイズしたプローブを、TEXAS RED発蛍光団標識ストレプトアビジン(Molecular Probes,Inc.,Eugene OR)でさらに標識して検出し、そしてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の色素1114の１μM溶液を適用することにより対比染色する。サンプルを載せ、カバーガラスを封じ、そして染色された染色体を蛍光顕微鏡およびフルオレセインフィルターセット（対比染色を見るため）およびTEXAS RED発蛍光団に適切なフィルターセット（動原体シグナルを可視化するため）で可視化した。このアッセイは、ヌクレオシド三リン酸またはストレプトアビジンのいずれか（これらは、スペクトルにより対比染色とは区別される）において、発蛍光団標識とともに使用されるように一般化され得る。
【０１２２】
実施例27．染色体のバンド化
ヒト中期染色体展開を、標準的な手順に従って調製する。カバーガラスをPBSですすぎ、次いで、0.1Mリン酸ナトリウム(pH6.5)中の0.1μMの色素1114で、37℃にて30分間染色し、そしてPBSですすぐ。次いで、染色体を同じ緩衝液中の10mg/mLメチルグリーンで、37℃にて30分間、対比染色する。このスライドを、PBS で２回すすぎ、次いで、1mg/mL p-フェニレンジアミンを含有する10％ PBSおよび78％グリセロールに載せる。バンドを含有する染色体は、標準的な蛍光フィルターセットを装備した蛍光顕微鏡を通して観察される。
【０１２３】
実施例28．既標識DNAテンプレートを使用するゲル中のタンパク質/DNA複合体の検出
１本鎖M13ファージDNAを、適切な結合緩衝液中で、以下のようなT4ファージ複製に必要なタンパク質とともにインキュベートする：g41p（ヘリカーゼ）、g61p（プライマーゼ）、およびg61p存在下のg41p。サンプルを、複合体形成に十分な時間インキュベートし、次いで、DNA/タンパク質複合体の形成に最適な泳動緩衝液を使用してアガロースゲルで電気泳動する。ゲルを、上記の実施例19に記載のように色素377で染色する。DNA含有バンドは、254nmの落射照射または300nmの透照を使用することにより直接可視化される。プライマーゼ単独、またはプライマーゼ＋ヘリカーゼを含有するサンプルは、タンパク質を全く含有しないサンプルと比較してシフトした電気泳動移動度複合体を生じる。ヘリカーゼは、それだけではシフトした複合体を生じない。このアッセイは、結合の際にテンプレートの電気泳動移動度のシフトを生じる任意の核酸結合タンパク質または因子の結合を検出するように一般化され得る。
【０１２４】
実施例29．細胞抽出物中の配列特異的DNA結合タンパク質の検出
目的の配列を含有する約25〜約200塩基対長のDNAテンプレートを、色素1114とともに、色素：bp比が１：30で、暗所にて、室温でインキュベートする。試験配列を欠くことを除いて実質上同一のDNAテンプレートを、標識し、そして平行に処理する。抽出物を、目的の細胞から標準的な技術を使用して調製する。およそ１ng〜１μgのDNAを、緩衝液中の約２μgのポリ(dI-dC)・ポリ(dI-dC)キャリアー核酸およびウシ血清アルブミンの存在下で、粗抽出物由来の約15μgのタンパク質とともにインキュベートする。サンプルを、約15分間、約30℃、暗所にてインキュベートする。一般に、抽出物の滴定は、特異的結合相互作用を検出するための最適濃度を決定するために試験されなければならない。FICOLLまたはグリセロールを最終濃度約５〜7.5％になるように添加し、そしてサンプルを、低イオン強度の緩衝液を使用してキャストされるポリアクリルアミドゲルにロードする。ブロモフェノールブルー追跡用色素、およびFICOLLまたはグリセロール単独を含有するサンプルを、平行にロードする。サンプルを、ブロモフェノールブルーが、少なくとも数インチはゲル中に泳動されるまで、電気泳動する。ゲル装置を分解し、そして緑の蛍光バンドを、254nmまたは300nmのUV光を使用する照射、または約490nmの励起光および約530nmの収集フィルターを有するレーザースキャナーにより直接観察する。目的のテンプレートを認識する配列特異的結合因子を含有する抽出物は、他の抽出物およびこのような抽出物をコントロールのDNAテンプレートと組み合わせたものに比べて、シフトした移動度のバンドを生じる。
【０１２５】
実施例30．既標識マーカーDNAの調製および使用
実施例19の同じ標識技術を使用して、非標識DNAマーカーを染色し、既標識DNAマーカーを調製する。いくつかのバンドは、通常の蛍光室内灯のみの存在下で目視でき、または上記のように可視化される。バンドの位置は、サンプルが移動した距離を示し、そして、同じゲル上で縦列して電気泳動する他のDNA分子のサイズを決定するために使用され得る。
【０１２６】
実施例31．スクロース勾配におけるリボソームRNAの検出
哺乳動物細胞を標準的な条件下で生育させる。RNAを標準的なプロトコルを用いて調製する。スクロースの勾配（10〜40％ w/v）を、ポリプロピレン遠心チューブ中に20mM Tris-Cl、pH8.0、５mM EDTA、および１μM色素388を含有する緩衝液中に調製する。0.5mL以下の容量で、RNAを勾配の上部に注意深く重層させる。勾配を光から保護しておく。このチューブを、Beckman SW28（または等価物）ローターにロードし、26,000rpmで24時間15℃で遠心分離する。このチューブを、ローターから注意深く取り出し、そして核酸を、携帯用UVランプを用いて、明るい緑色の蛍光バンドとして可視化する。リボソームRNAは、３つの独立した移動種として見える；最も迅速なものは23Sであり、次は16Sであり、そして最も遅いものは5S種およびtRNAである。核酸を、21ゲージ針を用いて、勾配の底に穴を空けることにより回収する。小さな（0.5mL）画分を回収し、そして各々のアリコートを、既知のサイズのRNAと比較するゲル電気泳動により分析する。
【０１２７】
実施例32．添加検出試薬でプローブした固定組織培養細胞の対比染色
マウス線維芽細胞（NIH3T3）を、標準的な条件下で生育させる。細胞培地を除去し、そして細胞をHBSS（マグネシウムおよびカルシウム含有Hanks平衡塩類溶液）で手短に洗浄する。細胞を、HBSS中の3.7％ホルムアルデヒドで固定し、そしてPBSでさらに３回洗浄する。細胞を、５分間撹拌しながら、PBS中の0.1％TRITON X-100で透過化処理する。細胞をPBSで３回リンスし、PBS中の２％ウシ胎児血清、0.1％Tween20とともに30分〜１時間インキュベートすることによりブロックする。ゴルジ膜に対するウサギ抗体を、１時間ブロッキング溶液中に適用する。細胞をPBS中でリンスし、次いでTEXAS RED色素（ブロッキング緩衝液中に希釈した）に結合している抗ウサギ二次抗体とともにインキュベートし、次いでPBS中で再び洗浄する。対比染色するために、0.4〜0.01μMの色素1114を含有する溶液を、この細胞に適用し、そしてそれらを室温で10分間インキュベートする。細胞をPBS中で手短に洗浄し、蛍光顕微鏡および標準的な蛍光フィルター（対比染色を可視化するため）を用いて、そしてTEXAS RED色素に対するフィルターセット（ゴルジ染色を可視化するため）を通して可視化する。核は明るい緑色の蛍光を示し、そして細胞質はわずかに暗い緑色に見える。
【０１２８】
実施例33．DNA増幅産物の検出および定量
標的特異的プライマーは、それらの5'末端にハプテンまたは発蛍光団標識を含有する。これらは、ビオチン、ジニトロフェニル、蛍光発蛍光団、BODIPY FL発蛍光団、BODIPY TMR発蛍光団、またはBODIPY TR発蛍光団（Molecular Probes，Eugene OR）である。標的DNA含有サンプルを、適切な緩衝液の存在下でプライマーペアと合わせ、そしてサンプルを、それぞれのプライマーペアの至適条件により増幅する。このような条件は、経験的に決定される。次いでDNA増幅産物を、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル上にサンプルのアリコートをロードし、続いて実施例19のように染色するか、または実施例21のように溶液アッセイを行うことにより検出する。増幅反応の終わりに存在するDNA増幅産物の量は、元来のサンプル中に存在する標的の量の直接的な指標であり、従って、標的数が少な過ぎて実施例21に記載の技術の直接的な適用によりアッセイできない場合でさえ、標的数をアッセイするために用いられ得る。この色素の増強した感度はまた、より少ない増幅サイクル後の増幅産物の分析を可能にする。この手順を、図２に概略的に説明する。
【０１２９】
実施例34．１本鎖高次構造多型の検出
ヒトp53およびK-ras遺伝子のセクションを含有する、100〜250塩基対の範囲のサイズを有するDNA増幅産物を、Perkinsらに記載（NUCLEIC ACIDS RESEARCH，21，3637(1993)）のようにヒト胃腺癌から調製する。５μLの容量中の約20〜100ngのDNA増幅産物を、0.4μLの１Mメチル水銀水酸化物、１μLの15％FICOLL、および13.6μLのTBE緩衝液と混合する。混合物を４分間85℃に加熱し、次いで氷上で急速に冷却する。TBE緩衝液を用いて調製された20％ポリアクリルアミドゲルを、規定温度（それぞれのサンプルについて経験的に決定される）で前平衡化し、そしてこのサンプルを、FICOLLおよび追跡用色素のみを含有するサンプルとともにゲルにロードする。このゲルを、マーカー色素がゲルの底に近づくまで、一定温度調節下で電気泳動する。このゲルを、実施例19に記載のようにTBE中の色素377の１μM溶液で染色し、254nm〜300nmのUV照射を用いて可視化する。配列が異なるDNA分子は、明瞭に分離した移動性を有するバンドとして現れる。それ故、異なる移動性を有するバンドの存在は、標的遺伝子中の単一の点変異でさえ指示する。
【０１３０】
実施例35．ゲル電気泳動による超らせん状態の決定
標準的な手順を用いて、閉環状DNAを調製する。閉環状DNAのサンプルおよびサイズマーカーDNAサンプルを、0.01μM〜約１μMの範囲の濃度で色素を含有する一連の0.7％アガロースミニゲルに適用する。サンプルを、環状形態がゲルの長さの少なくとも半分まで移動するまで電気泳動する。次いでゲルを、紫外線照射を用いて直接的に可視化するか、または実施例19に記載のように、色素377で後染めし、次いで可視化する。閉環状サンプルは一般に、スーパーコイルDNA分子および弛緩状DNA分子の両方を含有する。トポイソメラーゼまたはジャイレースのような酵素での処理は、閉環状DNAのトポロジー特性（例えば、一定の分子に存在するスーパーコイルの数）を変化させ得る。エチジウムブロマイドのようなインターカレーションを起こす色素を、負のスーパーコイルを有するテンプレート対弛緩状DNA分子を有するテンプレートに結合させる場合、より多くの色素分子が、弛緩状分子よりも負のスーパーコイルテンプレートに結合する。さらに、負のスーパーコイルDNAがエチジウムブロマイドで滴定される場合、この分子は、負のスーパーコイル形態から弛緩状DNAになり、次いで最終的には正のスーパーコイルになる。これらの３つの異なるトポロジー形態は、電気泳動ゲルにおけるそれらの移動度により特徴付けられる。一般に、スーパーコイルDNAの移動は、同一のサイズの弛緩状分子または線状DNAの移動よりも迅速である。負のスーパーコイルDNAから弛緩状DNAへの変化、そして弛緩状DNAから正のスーパーコイルDNAへの変化を誘導するエチジウムブロマイドの臨界濃度が存在する。エチジウムブロマイドに関するこの臨界濃度は、約0.1〜0.5μg/mL色素で生じる。色素 377のような本発明の色素もまた、トポロジー形態のこの変化を引き起こし得る。これらの色素は、ゲル上のバンドにおけるより少ないDNAの検出を可能にするので、これらの色素は、この適用に関してエチジウムブロマイドのような色素よりも大いに感度の高いアッセイを提供する。さらに、この新規の色素は、感度の高い後染めとして、エチジウムブロマイドと組み合わせて用いられ得る。従って色素377は、閉環状DNA分子のトポロジー状態をプローブするために用いられ得、それゆえこのようなテンプレートにおけるトポイソメラーゼまたはジャイレース活性をアッセイするために用いられ得る。
【０１３１】
実施例36．DNAのマイクロインジェクションのための標識
プラスミドDNAを、DNAの５塩基対あたりわずか１色素分子を含有する溶液とともに、遮光して、室温で少なくとも５分間インキュベートすることにより色素1114で標識する。DNAを、標準的な技術（Noueiryら、CELL,76,925(1994)）を用いて細胞にマイクロインジェクトする。標識DNAは、蛍光フィルターセットを取り付けた蛍光顕微鏡を用いて、細胞中で明るい緑色の蛍光として見える。
【０１３２】
実施例37．単一DNA分子の標識および検出
個々のファージλDNA分子を、ビオチン/ストレプトアビジン結合を介して１つの末端をつなぎとめること、またはポリリジン伸長結合のいずれかにより顕微鏡スライドにつなぎ止める（Perkinsら、SCIENCE 264,822(1994)；Perkinsら、SCIENCE，264,819(1994)）。TE中の10μMの色素1114を含有する溶液を、2％βメルカプトエタノールとともにスライドに適用する。カバーガラスを、色素染色溶液および封入剤の存在下でスライドガラス上に載せる。単独染色DNA分子を、標準的な蛍光光学フィルターセットを有する蛍光顕微鏡で観察し得る。分子を、光学ピンセット（optical tweezer）を用いて広げ、または伸ばし得る（Perkinsら、およびPerkinsら、上記；Bensimonら、SCIENCE 265,2096(1994)）。単一核酸分子を、この色素で染色した後(TOTO-1核酸染色での染色に用いられる様式と類似した様式で(Goodwinら、NUCLEIC ACIDS RESEARCH 21，803(1993);Castroら、ANAL.CHEM．65,849(1949)))、フローサイトメーターにおいて検出し得、そしてサイズを計り得る。
【０１３３】
実施例38．細胞数の定量
組織培養細胞を、標準的な条件下で生育させる。細胞を、非接着細胞について遠心分離により、そして、接着細胞についてトリプシン処理に続いて遠心分離およびPBS中で洗浄することにより採取する。細胞ペレットを、水中の0.1％ TRITO N X-100界面活性剤溶液100μL中で懸濁することにより溶解する。細胞溶解物をTBEで１mLまで希釈し、次いでTBE中の色素410の0.8μM溶液１mLに直接添加し、混合する。サンプルを、約５分間暗所でインキュベートし、次いで標準的な蛍光光度計を用いて485nmで励起した後、520nmにおける蛍光を測定する。蛍光発光の強度は、以下の表10に示されるように、存在する２本鎖DNAの量に直接比例し、これは細胞数に直接比例する。蛍光発光を、存在するDNAの量を測定するために、既知量のDNAから作成された標準曲線（実施例21、図３に記載）と直接比較し、そして細胞数について直接アッセイするために既知の量の同一タイプの細胞で作成した標準曲線からの結果と比較する。このアッセイのダイナミックレンジは、図5Aに示されるように非常に大きいので、図5Bに示されるように、5〜10細胞/mL程度の少ない細胞が、この手順を用いて検出され得る。この色素はまた、このようにして、細胞増殖の阻害または増強のいずれかを行う試薬、薬物、またはホルモンをアッセイするためにも用いられ得る。
【０１３４】
〔表１0〕細胞数とDNA含有量との間の関係
0004634514.tif 000033
【０１３５】
実施例39．蛍光色素と組み合わせてヌクレアーゼを用いるRNA、dsDNA、およびssD NAの識別
RNA、２本鎖DNA、または１本鎖DNAのいずれか、またはこれらの核酸の組み合わせを約100pg/mL〜約１μg/mLの濃度で含有するサンプルを、以下の試薬とともに個々に、それぞれの酵素について適切な緩衝液の存在下でインキュベートする：a）DNaseＩ（２本鎖DNAを消化する）、b）RNase AおよびT1 Nuclease（RNA を消化する）、c）ヤエナリヌクレアーゼ（１本鎖DNAを消化する）、またはd）RNase H（DNA/RNAハイブリッドおよびいくつかの２本鎖RNAハイブリッドを消化する）。さらに、酵素消化にかけないコントロールサンプルを調製する。消化を完了させた後、サンプルを0.4〜0.8μMの本発明の色素（例えば、色素309）を含有するキュベットに加える；次いでサンプルを混合し、そして暗所で５分間インキュベートする。蛍光強度を、蛍光光度計で測定する。サンプル中に存在する核酸のタイプを、表11を用いて決定する。サンプルが未消化コントロールにより生じる量と等しい蛍光（表中で＋で示す）を生じる場合、このサンプルは、酵素により標的化される核酸から主になるわけではない。このセットのデータは、純粋な２本鎖DNA、１本鎖DNA、RNA、およびRNA/DNAハイブリッドで作成した標準曲線を用いて、混合サンプル中に存在する核酸のそれぞれの種の量を測定するために用いられ得る。
【０１３６】
〔表１１〕選択されたヌクレアーゼに対する酵素消化応答
0004634514.tif 000034
【０１３７】
実施例40．蛍光色素を用いるdsDNAとssDNAとの識別
0.2μMより低い濃度を有する２つの核酸サンプルを調製する。第１のサンプルを、蛍光キュベット中でTE中に0.2μM色素の最終濃度まで本発明のモノメチン色素と混合する（1:1比）。第２のサンプルを、蛍光キュベット中でTE中に約１μM以上の最終濃度まで、同一の色素と混合する。両サンプルとも暗所において室温で少なくとも５分間インキュベートする。標準的な蛍光光度計を用いて、約485nmで励起後、蛍光発光スペクトルが、それぞれのサンプルについて生成される。２本鎖DNAのみを含有するサンプルは、両色素:塩基比ともに、約500〜535nmで緑色の波長において最大の蛍光発光スペクトルを生じる。しかし、１本鎖DNAのみを含有するサンプルは、色素:塩基比が1:1より少ない場合にのみ、緑色（約500〜535nm）において最大の蛍光発光スペクトルを生じる。色素:塩基比が1:1よりも大きい場合には、１本鎖核酸の発光最大は、より長い波長（代表的には550〜580nm）にシフトする。
【０１３８】
色素のいくつか（例えば、色素377）は、より長い波長の発光に対し非常に強度が低く、そして緑色の蛍光を単に失ったように見える。最終濃度1.5nM 塩基の核酸を、0.8μMの濃度の色素377とともにインキュベートする。仔ウシ胸腺DNAを２本鎖分子（dsDNA）として使用し、そしてM13ファージDNAを１本鎖DNA（ssDNA）として使用した。２本鎖DNAの最大発光波長は約520nmであるが、これらの条件下における１本鎖DNAについては、発光のピークは約550nmである（図６に示す）。
一方、他の色素（例えば、色素1114）は、緑色の発光とほぼ同じ強度の注目に値するより長い波長のシグナルを有し、そして２本鎖および１本鎖核酸は、細胞中で識別され得る。エタノール死滅したE.coli細胞を、約108細胞/mLの濃度で水中に懸濁する。次いで３つの細菌懸濁物を、それぞれ0.1μM、0.5μM、および1.0μMの濃度で色素1114とともに室温でインキュベートする。染色後、このサンプルを480nmで照射し、そして図７に示されるように、蛍光発光を490nmから700nmまで記録する。低い染色濃度（0.1μM）では、蛍光応答は主として強い緑色蛍光（約520nm）である。染色濃度が増加すると（0.5μM）、緑色蛍光の強度は幾分増加し、赤色蛍光（約630nm）の増加をともなう。色素の濃度が増加し続けると（1.0μM）、赤色蛍光の強度は、減少した分の緑色蛍光に匹敵する。この赤色蛍光発光は、染色されたE.coliに存在する１本鎖核酸の存在に起因する。
【０１３９】
実施例41．選択される色素の塩基選択性
リボ核酸またはデオキシリボ核酸の合成ホモポリマーを、20〜50μMの濃度で、それぞれTE中で約１μMの濃度の色素937、1004、993、309、396、410とともに、約５分間、室温で、暗所においてインキュベートする。485nmにおける励起後、約500〜530nmの蛍光発光を、それぞれのサンプルについて蛍光分光計で測定する。特定の色素は、表12で示されるホモポリマーの性質に従って、蛍光における顕著な選択性を示す。従って、これらの色素は、一次核酸構造についての情報を決定するために、Hoechst33258（AT選択性である）のような他の色素と組み合わせて用いられ得る。
【０１４０】
〔表１２〕選択された色素の塩基選択性
0004634514.tif 000035
【０１４１】
量子収量を、いくつかの異なる核酸基質に結合したいくつかの色素について示す。ポリリボGはおそらく、非常に高い量子収量を示す。なぜなら、塩基選択性の結果としてよりもむしろ、３本鎖分子のようなより高次の構造を形成しているためである。ポリdIは、イノシンのポリマーであり、これは、核酸においてグアニンと大いに同様に挙動する。
【０１４２】
実施例42．食物サンプルにおける生存細菌の検出
粉砕した牛肉の１gのサンプルを、ボルテックスミキサー中で中程度の速度で１分間、９mLの滅菌水とともに撹拌する。３つの0.1mLのアリコートを取り出し、そして３つの100mmのエオシン-メチレンブループレートの表面に均一に拡げ、続いて24〜48時間37℃でインキュベートする。800μLのアリコートを取り出し、そして200μLの滅菌蒸留水中の５％ウシ血清アルブミンを添加する。１μLの色素345の５mM DMSO溶液および100μLのウサギ抗0157:H7 IgGの１mg/ml溶液をこのサンプルに添加し、次いで15分間室温で緩徐に混合しながらインキュベートする。次いでサンプルを、1.5mLチューブ中で10,000×gで20秒間遠心分離することにより洗浄し、そして４％グルタルアルデヒドを有する１mLの滅菌水中に再懸濁する。室温で15分間のインキュベーション後、この細菌を、上記のような遠心分離によりペレット化し、そして１mlの滅菌水中に再懸濁する。２μLのDMSO中の１mM DAPI溶液、１μLの５mM 色素345、および20μLの１mg/mL TEXAS RED発蛍光団結合ヤギ抗ウサギIgGを続いて添加し、そしてこのサンプルを15分間室温で緩徐に混合しながらインキュベートする。生細菌は青色の蛍光であり、死細菌は緑色の蛍光である。腸病原性E.coliだけが赤い蛍光である。
【０１４３】
実施例43．フローサイトメトリーを用いる抗生物質のMICの測定
E.coliの培養物を、栄養ブイヨン中で振盪しながら37℃で、対数期中期まで生育させる。対数期の培養物を新鮮な0.2μフィルター濾過したトリプトンブイヨンの６つのチューブ中で再懸濁する。それぞれのチューブは、４mlの2×106cfu/mLの細胞を含有する。それぞれのチューブに、2×濃度のアンピシリン（２、20、200、2000、20000μg/mL）を含有する新鮮な0.2μフィルター濾過したトリプトンブイヨン、またはトリプトンブイヨンのみ（コントロール）を４mL添加する。懸濁物を、０、２、４、および６時間インキュベートし、そして２mLのサンプルをそれぞれの時点で取り出す。２mLのサンプルに、２μlの5mM 色素398を添加し、そして懸濁物を10分間インキュベートする。蛍光強度の分布を、488nmの励起、およびチャンネルI（緑色）蛍光発光検出でフローサイトメトリーにより分析する。次いで、アンピシリンとのインキュベーションのそれぞれの時間について、蛍光強度を細菌の前方散乱に対してプロットし、アンピシリンの最小阻害濃度（MIC）を決定する。
【０１４４】
実施例44．好中球の殺菌活性のインサイチュでの評価
生存する細菌ではなく哺乳動物細胞に対する色素397の特異な透過性を用いて食作用を受けた細菌の生存度を測定する。接着細胞（好中球およびマクロファージを包含する）をヒト末梢血液から精製する。E.coliを、栄養ブイヨン中で対数期後期まで生育させ、ウサギ抗E.coli IgGでオプソニン化し、1×107cfu/mLの密度まで滅菌水中に洗浄し、そして１μL/mLの赤色細菌透過性（red bacteria-permeant）色素314の１mM DMSOストック溶液を添加することにより染色する。この細菌を、15分間染色し、次いで充分に洗浄し、細胞外色素の全ての痕跡を除去する。１μL/mLの色素397の１mM DMSO溶液を食細胞に添加し、そして培養物を15分間インキュベートする。残渣の色素を培地ですすぎ落とし、１μMの色素397を含有する新鮮な培地を添加する。標識した細菌を、色素負荷した細胞に添加し、そして食細胞の殺菌活性を、フルオレセイン長流路フィルターセット（fluorescein long-pass filter set）を備えた顕微鏡で観測されるように、細胞内細菌の緑色蛍光の染色の進行の増加により示す。
【０１４５】
実施例45．フローサイトメトリーを用いる細菌の代謝活性の測定
Salmonella typhimuriumを、栄養ブイヨン中で37℃で、対数期中期まで生育させる。細菌を、滅菌Ｅ純水中で２回洗浄し、1×105/mLのS.typhimuriumを、50mLの異なる強度：100％、10％、１％、および０％（純水）のトリプトン培地に接種する。37℃で４時間生育させた後、細菌のそれぞれの培養物を、10,000×gで10分間の遠心分離により濃縮し、そして続いて70％イソプロパノールに１時間再懸濁することにより透過化処理する。100％栄養ブイヨンで培養した細菌のアリコートに、20μgの熱不活性化RNase Aを添加し、そしてこのアリコートを、37℃で60分間インキュベートする。次いで全ての細菌サンプルを、遠心分離により２回洗浄し、そして５μMの最終濃度の色素1114で室温で30分間染色する。
細菌サンプルを、アルゴンレーザーを備えたフローサイトメーターを用いて分析する。蛍光検出器を、530nm付近の光を収集するように設定する。図8Aにおける上部のシグナルクラスターは、対数的に増殖する細菌（100％ブイヨンで培養された）を表す。図8Bにおける幾分下部のシグナルクラスターは、１％栄養ブイヨンで３時間維持した培養物から得られる。生じる散乱プロットの外観は、100 ％および0％のスタンダードに関して、細菌サンプルの代謝活性の尺度を与える。
【０１４６】
実施例46．細胞表面への細菌の付着のアッセイ
Madin-Darby Canine Kidney（MDCK）細胞を、70％集密まで96ウェルプレート中で培養する。増殖培地をウェルから除去し、そして100μLの滅菌生理食塩水（ PS、10mM NaHEPES、135mM NaCl、５mM KCl、１mM MgCl2、２mM CaCl2、５mMグルコース、pH 7.4）と置き換える。Salmonella typhimurium細菌の100mLの培養物を、37℃栄養ブイヨン中で200rpmで撹拌することにより、対数期中期まで増殖させる。この細菌を、遠心分離により洗浄し、そして2×107/mlの濃度でPS中に再懸濁する。10mLの細菌懸濁物を取り出し、そして１時間の70％イソプロピルアルコールでの処理により死滅させる。次いで死滅した細菌をPS中で２回洗浄し、本来の容量に再懸濁する。同じアリコートを、PS中で２回洗浄し、そして同一の容量で再懸濁する。５mLのそれぞれのサンプルを一緒に混合し、そして10μLの５mM 色素1114を添加する。この混合物を、10分間室温でインキュベートする。次いで10μLの色素314を添加し、そしてこの混合物をさらに20分間インキュベートする。次いでこの染色した細菌懸濁物をPS中で２回洗浄し、そして1:10で４回連続して希釈する。３点平行で、100μLのそれぞれの細菌希釈物、またはPS単独を、MDCK細胞を含有する96ウェルプレート中のウェルに加える。このプレートを37℃ で20分間、30秒おきに撹拌しながらインキュベートする。次いで全てのウェルをPSで３回穏やかに洗浄し、そして150μlのPSを充填する。このウェルの緑色の蛍光を、485nmでの励起および520nmの発光を用いて、マルチウェル蛍光プレートリーダーで定量する；赤色の蛍光を、590nmでの励起および620nmでの発光により測定する。蛍光の相対的な比率を、異なる量の細菌懸濁物を用いて細胞を含有するスタンダードウェルと比較する。
【０１４７】
実施例47．フローサイトメトリーを用いる細胞膜完全性の測定
細菌サンプルを、水１mLあたり約６×106の細菌の密度で水中に懸濁する。哺乳動物細胞を、１mLあたり約1×106の密度でHEPES緩衝生理食塩水中に懸濁する。サンプルを色素1114、万能細胞不透過性染色（universally cell-impermeant stain）で染色する。細菌サンプルを５μMの色素1114で染色し、哺乳動物細胞を 1〜5μMの色素1114で染色する。30分のインキュベーション後、このサンプルを、488nm線のアルゴンレーザーを用いる装置においてフローサイトメトリーにより分析する。前方（低角度）光散乱を、分析される生物学的被検体に適切な増幅レベルに設定する。蛍光検出器を、530nm付近の光を収集するように設定する。一般的に、細菌は対数のシグナル増幅を必要とし、一方哺乳動物細胞は、線形のシグナル増幅で分析され得る。生存細胞および非生存細胞の相対的な量は、コントロールサンプルの蛍光および散乱特性との比較により、定量され得る。この実験の結果を、生細菌と死細菌の1:1混合物について、図９中に示す。シグナルの最上部のクラスターは、死細菌に相当し、一方最下部のクラスターは、生細菌を表す。図９の差し込みプロットは、計算した生/死比と測定した生/死比との間の優れた一致を示す。同様の結果が哺乳動物細胞について得られ得る。
【０１４８】
実施例48．真核細胞の細胞周期分布の測定
pH7.4に設定した100mM Tris/HCl；154mM NaCl、１mM CaCl2、0.5mM MgCl2、および0.1％Nonidet P-40である染色用緩衝液を調製する。この緩衝液に、乾性DMSO中の500μMのストック溶液由来の500nMの色素1114を補充する。ヒトリンパ球を遠心分離し、細胞ペレットを得、そしてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に穏やかに再懸濁し、単一細胞懸濁物を得る。この細胞懸濁物を、氷水浴を用いて冷却した４倍容量の無水エタノールに緩徐に注入し、その間懸濁物を最大速度でのボルテックスにより混合させる。このようにして80％エタノール（最終濃度）に固定したサンプルを、-20℃の冷凍器に少なくとも１時間放置する。このサンプルを遠心分離し、ペレットを得、そしてこのペレットを少なくとも５mLのPBS中に再懸濁し、そして室温で少なくとも15分間インキュベートする。このサンプルをペレット化し、そしてPBS中に再懸濁し、次いで細胞懸濁物の１mLあたり５μg のRNaseAを加える。このサンプルを37℃で少なくとも30分間インキュベートする。このサンプルをペレット化し、そして懸濁物が１mLあたり1×105〜5×105細胞含有するように、染色用緩衝液中に再懸濁する。室温で少なくとも15分染色した後、このサンプルを488nm線について100mWの出力に設定されたアルゴンレーザーを備えたフローサイトメトリーで分析する。前方（低角度）光散乱シグナル増幅を、シグナルがシグナル検出範囲の上半分に現れるように設定する。蛍光検出器における装置の捕捉トリガー論理（acquisition trigger logic）を、530nm付近の光を収集するように設定する（「フルオレセイン検出器」）。上記検出器のシグナル増幅率を、調査下のサンプルからのシグナルが検出範囲内に出現するように設定する。530nm蛍光検出器からのシグナルの分布を、細胞周期分布アルゴリズムで分析する。図10Aに示されるように、フローサイトメトリー分析は代表的に、細胞周期のG1、S、およびG2コンパートメントに相当する水平方向の雲状のシグナルを示す。このデータから、細胞周期のG1、S、およびG2コンパートメント間の細胞の分布を示すヒストグラムが得られる（図10B）。
【０１４９】
あるいは、細胞周期の分布は、顕微鏡画像解析システムを用いて分析され得る。この場合、カバーガラス上で生育した細胞を、37℃でPBSで２回リンスし、37 ℃で10分間PBS中の3.7％ホルムアルデヒドで固定し、室温でPBSで３または４回リンスし、そして-20℃で10分間アセトン中で透過化処理する。次いで固定した細胞を室温で10分間PBS中で再水和し、そして少なくとも15分間室温で2×生理食塩水-クエン酸ナトリウム緩衝液中の500nMの色素1114で染色する。カバーガラスを観察し、そして可視光スペクトルの蛍光領域中のシグナルを捕捉する専用の画像分析システムで分析し、シグナルの分布を上記のように分析する。
【０１５０】
実施例49．連続的なブロモデオキシウリジン標識および可変性蛍光標識による細胞増殖の分析
PBS中の5-ブロモデオキシウリジン（BrUrd）の10mMストック溶液を調製し、そして濾過滅菌する。10％ウシ胎児血清および100μM BrUrdを補充したDMEM-F12培養培地中でヒト黒色腫細胞の培養物を、37℃で50時間暗所で生育させる。生じる細胞をトリプシン処理により採取し、遠心分離し、PBSで１回洗浄し、そしてペレットを緩衝溶液中に再懸濁する。生じる懸濁物に、懸濁物が１mlあたり1×105〜5×105の細胞を含有するように、1.2μgのHoechst33342色素を補充する。このサンプルを、室温で暗所において少なくとも15分間染色する。この染色したサンプルに、50nMの最終濃度を生成する量の色素1114を加え、そしてこのサンプルを室温で暗所においてさらに15分間染色する。このサンプルを、２つのアルゴンレーザーを備えたフローサイトメーターで分析する；第１のレーザーを488nm線について100mWの出力に設定し、そして第２のレーザーをUV線について40mWの出力に設定する。前方（低角度）光散乱シグナル増幅を、488nmのレーザー線からのシグナルがシグナル検出範囲の上半分に現れるように設定する。蛍光検出器における装置の捕捉トリガー論理を、530nm付近の光を収集するように設定する。UV レーザー光線から現れる400nmと480nmとの間の光を収集する検出器のシグナル増幅率（「Hoechstチャンネル」）、および488nm励起からの530nm付近の光を収集する検出器のシグナル増幅率（「1114チャンネル」）を、調査下のサンプルからの全てのシグナルが両方の検出器の検出範囲内に現れるように設定する。蛍光検出器からのシグナルの分布を、適切なソフトウェアパッケージを用いて分析する。
【０１５１】
分析の代表的な結果を図11に示す。図11Aは、Hoechstチャンネル（横軸）および1114チャンネル（縦軸）におけるシグナル分布を表す二変量サイトグラム（bivariate cytogram）を示す。G0/G1とラベルしたサイトグラムにおける最も右のクラスターは、観測期間の間に細胞周期を開始しなかった細胞を表す。このクラスターから左上部に移動するシグナル跡は、最初の細胞周期のS期における細胞を表す。この跡の末端に、最初の細胞周期のG2期に到達した細胞が現れる。有糸分裂を経験した細胞は、左側およびG2クラスターから下側に現れる（G1としてラベルされる）。図11Bは、Hoechst軸に横側に細胞周期コンパートメント間の細胞分布を示す。
【０１５２】
上記の発明は、説明および実施例により詳細に記載されているが、多数の改変、置換、および変更が、以下の請求の範囲に記載されるような本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】ds仔ウシ胸腺DNA存在下、Dye309に対する蛍光励起および発光スペクトル。励起スペクトルのUV領域における低強度の吸収が、蛍光がこれらの波長での、しかし低蛍光収率での励起によって発生され得ることを示すことに注意すべきである。
【図２】本発明の色素を用いる多重標識実験。核酸ポリマーが生成され、蛍光団、アビジン、ストレプトアビジンまたは他のハプテン（Ｘ、Ｙ、およびＺ）である検出試薬を用いて標識される。分離後、得られたバンドを可視化し、そして本発明の色素を用いて染色することによって定量する。バンドは、適切な試薬（例えば、ビオチン、または抗体（Ｘ*、Ｙ*、またはＺ*））で処理することによって個々に同定され得る。この技術については実施例33に概説する。
【図３】実施例21に記載の、DNA濃度の関数としての線形蛍光応答。アッセイは25pg/mL（挿入図を参照のこと）から1000ng/mLまでの直線である。
【図４】実施例22に記載の、オリゴヌクレオチド濃度の関数としての線形蛍光応答。アッセイはオリゴヌクレオチド濃度100pg/mL（挿入図を参照のこと）から１μg/mLのまでの直線である。
【図５】実施例38に記載の、細胞数の関数としての線形蛍光応答。標準濃度プロットをNIH/3T3細胞およびPX3細胞の両方に対して示す。
【図６】実施例40に記載の、核酸タイプの関数としての蛍光発光。
【図７】実施例40に記載の、色素負荷の関数としての蛍光発光。
【図８】実施例45に記載の、細菌の代謝活性の分析。図8Aにおけるデータのクラスターは代謝が活性な細菌を表す。図8Bにおけるシグナルクラスターは代謝が不活発な細菌を表す。
【図９】実施例47に記載の、フローサイトメトリーによる細胞懸濁液の分析。挿入図に示すように、２つの領域における細胞分布とサンプルにおける生細胞の実際のパーセントとの間に直線関係が存在する。
【図１０】実施例48に記載の、フローサイトメトリーを用いる細胞周期分布の分析。図10Aは、細胞周期のG1、ＳおよびG2期における細胞に対応するシグナルのクラスターを示す。図10Bは、細胞周期のG1と、Ｓと、G2とのコンパートメント間の細胞分布を示すヒストグラムを示す。
【図１１】実施例49に記載の、ブロモデオキシウリジン標識、続いて二変量染色を用いる細胞増殖の分析。図11Aは、細胞周期のG0/G1、ＳおよびG2期における細胞に対応するシグナルのクラスターを示す。図11Bは、細胞周期のG0/G1と、Ｓと、G2とのコンパートメント間の細胞分布を示すヒストグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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