(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（１）で示される３−デメチルチロフォリニン。
（１）
0004769959.tif 000010
【請求項２】
請求項１に記載の化合物を主成分として含有する医薬品組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
【請求項４】
腫瘍が、胃癌、肺癌、大腸癌および子宮頸部癌から成る群より選択される、請求項３記載の抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗腫瘍剤、並びにガン細胞傷害活性を有する新規なフェナンスロインドリジジンアルカロイド化合物に関する。
背景技術
正常細胞が、ガン細胞に変化するためには多くの段階があり、また多種多様な因子が関与している。中でも前ガン細胞およびガン細胞におけるガン細胞傷害活性の誘導は、ガンの発生の予防、ガン再発の予防、更にはガン治療において重要な意義がある。そこで抗腫瘍試験において高い効果を示す化合物の開発が望まれていた。
従来から多くの化合物が、抗腫瘍試験の対象として利用されている。たとえば、化学的に合成された化合物や、様々な由来の天然成分が試験対象となった。天然成分としては、カビや植物から抽出された多くの成分について、その抗腫瘍効果の確認が行われた。しかし昆虫に由来する成分の抗腫瘍活性に関する報告は少ない。抗腫瘍活性を示す、まったく異なった構造の化合物を見つけ出すには、これまでに試みられたことのない天然成分に目を向ける意義は大きい。たとえば、これまでに開発されてきた化合物とは由来を異にする化合物によって、薬剤耐性を持つ腫瘍に対する有効性を期待できる化合物に結びつく可能性がある。
発明の開示
本発明の課題は、昆虫に由来する天然成分を有効成分とする抗腫瘍剤の提供を課題とする。あるいは本発明は、昆虫に由来するガン細胞傷害活性を有する新規な化合物、並びに該化合物を有効成分とする医薬の提供を課題とする。
本発明者らは、天然物中から有用物質を検出すべく鋭意研究を行ったところ、ガガイモ科植物のツルモウリンカ（Ｔｙｌｏｐｈｏｒａ  ｔａｎａｋａｅ）を食草とするマダラチョウ科のリュウキュウアサギマダラ（Ｉｄｅｏｐｓｉｓ  ｓｉｍｉｌｉｓ）抽出物に、１０万倍希釈濃度で顕著なガン細胞傷害活性を見出した。さらに、その抽出物の分画成分を精製することにより、ガン細胞傷害活性を有する新規化合物フェナンスロインドリジジンアルカロイド化合物（３−デメチルチロフォリニン；３−ｄｅｍｅｔｈｙｌｔｙｌｏｐｈｏｒｉｎｉｎｅ）、および構造が既知のフェナンスロインドリジジンアルカロイド化合物（３−デメチル−１４α−ヒドロキシイソチロクレブリン；３−ｄｅｍｅｔｈｙｌ−１４α−ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｔｙｌｏｃｒｅｂｒｉｎｅ）を単離することに成功した。更に、３−デメチルチロフォリニンがリュウキュウアサギマダラ（Ｉｄｅｏｐｓｉｓ  ｓｉｍｉｌｉｓ）に由来するもので、その食草であるツルモウリンカ（Ｔｙｌｏｐｈｏｒａ  ｔａｎａｋａｅ）には検出できないことを確認し、本発明を完成させた。ツルモウリンカ（Ｔｙｌｏｐｈｏｒａ  ｔａｎａｋａｅ）の葉の抽出物が抗腫瘍活性を示すことは公知である（Ｋｏｙａｍａ  Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｊｐｎ．Ａｃａｄ．１９９９，７５Ｂ，７−９）。しかし、本発明を構成する化合物は、明らかに昆虫に由来するもので、昆虫の食草には見出すことができない。すなわち本発明は、以下の抗腫瘍剤、あるいは抗腫瘍活性を持つ新規化合物、およびこの化合物を有効成分とする医薬組成物に関する。
〔１〕下記一般式（１）で示されるフェナンスロインドリジジンアルカロイド化合物を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
一般式（１）
0004769959.tif 000002
（式中、Ｘは水素原子、またはメトキシ基ＣＨ３Ｏを表す。）
〔２〕下記構造式（１）で示される３−デメチルチロフォリニン。
（１）
0004769959.tif 000003
〔３〕〔２〕に記載の化合物を主成分として含有する医薬品組成物。
また本発明は、前記一般式で（１）で表される化合物の抗腫瘍剤の製造における使用に関する。あるいは本発明は、前記一般式で（１）で表される化合物の腫瘍の治療における使用に関する。更に本発明は、前記構造式（１）で示される３−デメチルチロフォリニンの医薬組成物の製造における使用に関する。
本発明の抗腫瘍剤において有効成分とする化合物は、マダラチョウ科のリュウキュウアサギマダラの有機溶媒抽出物である。これら化合物の製造方法の一例として、リュウキュウアサギマダラのさなぎを出発原料とする製造法を以下に示す。
リュウキュウアサギマダラのさなぎを、抽出に先立ち粉砕または粉末化する。粉砕には超音波処理等を利用することができる。これをメタノール等の有機溶媒で抽出する。抽出方法としては、一般に用いられる方法でよく、例えば有機溶媒中に粉砕したリュウキュウアサギマダラのさなぎを、長時間浸漬する方法、有機溶媒の沸点以下の温度で加温、攪拌しながら抽出を行い、濾過して抽出物を得る方法などがある。得られた抽出液を減圧濃縮することにより有機溶媒抽出物とする。有機溶媒抽出物を水に溶解し、ヘキサン等の疎水性有機溶媒で抽出、脱脂した後、水層に濃塩酸を加え酸性（ｐＨ  ２）にし、酢酸エチル等の有機溶媒で洗浄する。更に水層をアンモニア水により、塩基性（ｐＨ  ９）にして、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出する。
脱脂工程に使用する疎水性有機溶媒としては、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素類が挙げられる。抽出工程に使用する有機溶媒としては、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル等の低級脂肪酸エステル類、またはメタノール、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類、またはメチルエーテル、エチルエーテル、テトラヒドラジン、ジオキサン等のエーテル類、またはアセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、またはトルエン、ベンゼン等の芳香族炭化水素類、またはジクロロメタン、クロロフォルム等のハロゲン化炭化水素類が挙げられ、これらの有機溶媒の混合溶媒ならびに親水性溶媒と疎水性溶媒の混合溶媒も用いることができる。
目的とする化合物はこの塩基性画分に含まれる。有機溶媒で抽出した分画から、高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと省略する）により、該化合物を分離、精製する。ＨＰＬＣでは、ＯＤＳ、オクチル、フェニル、シアノプロピル等の逆相系クロマト充填剤や、シリカゲル等の吸着系クロマト充填剤を用いることができる。使用し得る条件としては、ＯＤＳを担体とし、アセトニトリル、メタノール、テトラヒドロフランなどの水溶性有機溶媒と水、あるいは緩衝液との混合溶媒を用いる一般的な条件が使用できるが、アセトニトリルと水の混合溶媒を用いるのが好ましい。目的とする化合物を含むカラムの画分は、ＯＤＳカラムと含水アセトニトリルを用いた分取ＨＰＬＣを繰り返すことにより、更に精製することができる。このようにして最終的にＨＰＬＣによる分析で単一ピークを与える請求項１の一般式として記載の化合物を単離することができる。各化合物のＨＰＬＣプロフィールは実施例として示したとおりである。
あるいは本発明によって抗腫瘍活性を明らかにした化合物は、その構造的な情報に基づいて化学的に合成することもできる。たとえば、フェニルアラニンから誘導されるベンゾイル酢酸（１）と１−ピロリン（２）との反応を経て、ジアリルヘキサヒドロインドリジン類（３）が合成されている。この化合物は、チロフォリンの生合成前駆体であると報告されている（Ｒ．Ｂ．Ｈｅｒｂｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｉ，１９８４，８２５−８３１．；Ｒ．Ｂ．Ｈｅｒｂｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１９７７，９５５−９５６．；Ｄ．Ｓ．Ｂｈａｋｕｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，３７，４０１−４０７，１９８１）。さらに生合成経路にしたがって、フェナンスロインドリジン類の合成が可能である。一連の合成工程を式（２）に示す。式中、Ｒ、Ｒ１、およびＲ２は、それぞれ置換可能な１または複数の位置に結合した水酸基またはメトキシ基を、そしてＲ３は水酸基または水素原子を示す。
（２）
0004769959.tif 000004
上記の方法によって得られた本化合物のガン細胞傷害活性は、公知の方法によって測定することができる。たとえば、ヒト胃ガン細胞ＴＭＫ−１を用い、ＷＳＴ−１アッセイ（同仁化学株式会社製）により細胞傷害性効果を測定することができる。そして、同様の手法によって公知の抗腫瘍剤の細胞障害性効果を測定することにより、本発明によって提供される抗腫瘍剤の細胞障害活性を評価することができる。本発明の抗腫瘍剤の細胞障害性効果は、たとえば、現在実用化されている癌の化学療法剤であるＴａｘｏｌに匹敵する。すなわち、本発明の抗腫瘍剤の抗癌活性は、たいへん優れていると言うことができる。また実施例に示すとおり、本発明において抗腫瘍活性を確認することができた化合物は、幅広い腫瘍細胞に対して有効性を示した。したがって、これらの化合物は、作用スペクトルの広い抗腫瘍剤として期待できる。
本発明において、抗腫瘍活性を確認することができたリュウキュウアサギマダラ由来の化合物のうち、次の化合物は新規である。すなわち本発明は、次の構造式（１）で表される新規３−デメチルチロフォリニンに関する。更に本発明は、３−デメチルチロフォリニンを有効成分として含有する医薬品組成物に関する。（１）
0004769959.tif 000005
本発明において抗腫瘍活性を見出された化合物は、公知の製剤化技術を利用して抗腫瘍剤、あるいは医薬組成物とすることができる。すなわち、これらの化合物を薬学的に許容される賦形剤と配合することによって抗腫瘍剤、あるいは医薬組成物を得ることができる。
本発明の化合物はそのまま、あるいは慣用の製剤担体と共に動物および人に投与することができる。投与形態としては、特に限定がなく、必要に応じ適宜選択して使用される。具体的には、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、あるいは注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。
経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等の賦形剤を用いて常法に従って製造される。この種の製剤には、適宜、前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を使用することができる。
また、本発明の化合物は、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤としても投与することができ、これらの各種剤形には、矯味矯臭剤、着色剤を含有してもよい。
非経口剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。その他の非経口剤としては、外用液剤、軟膏等の塗布剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、常法に従って製造される。
本発明による抗腫瘍剤、あるいは医薬品組成物における有効成分の含有量は、選択された投与ルートによって必要な投与量を与えることができるように適宜調整することができる。。具体的には、通常の投与量は、体重１ｋｇあたり、０．００１μｇ〜１ｍｇ、望ましくは０．０１μｇ〜０．１ｍｇ、より望ましくは０．１μｇ〜０．０１ｍｇを示すことができる。最終的な投与量は、投与の対象となる患者の、体重、年齢、性別、そして症状等を総合的に考慮して適宜調整される。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら制限されるものではない。
［実施例１］ガン細胞傷害活性試験
（１）各抽出物の調製
使用したリュウキュウアサギマダラのさなぎは、石垣島で採取されたものであり、「（株）広島みかど」から購入した。リュウキュウアサギマダラのさなぎ５頭（２．８ｇ）をホモジナイズし、超音波処理を２０分間３回、室温にて行い、メタノール（４０ｍｌ）で抽出した。溶液を減圧濃縮し、０．２ｇのメタノール抽出物を得た。その残留物を水に溶解し、ｎ−ヘキサンで抽出した。続いて濃塩酸を水層に加え（ｐＨ２）、１０ｍｌの酢酸エチルで抽出した。この水層をアンモニア水により、アルカリ性（ｐＨ９）にして、３回酢酸エチルで抽出した。もとのメタノール抽出物（０．２ｇ）、ｎ−ヘキサン抽出物（６７．０ｍｇ）、酸性酢酸エチル抽出物（１３．７ｍｇ）、塩基性酢酸エチル抽出物（２．４ｍｇ）、および水抽出物について、ガン細胞傷害活性を調べた。
１９匹のリュウキュウアサギマダラの成虫（１．０ｇ）についても同様に、メタノール（２５０ｍｌ  ｘ  ３）で抽出し、同じ方法で塩基性画分（５．１ｍｇ）を得た。
（２）細胞傷害性試験の方法
細胞傷害性試験には、ヒト胃ガン細胞ＴＭＫ−１を用いた。コンフルエントに近い状態の細胞を、トリプシン処理の後、収集し、１０％ウシ胎仔血清を含むイーグル培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で、５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌに希釈した。１００μｌの細胞懸濁液を、９６−ウェルプレート上のウェルへ分配し、希釈した抽出物サンプルを添加した。５％炭酸ガス存在下３７℃で、９６時間インキュベーションした後、細胞傷害性効果を、ＷＳＴ−１（２−（４−ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ、同仁化学製）アッセイにより測定した。
（３）測定結果
メタノール抽出物のＩＣ５０値は、１０７ｎｇ／ｍｌであった。塩基性画分に８７％のガン細胞傷害活性が濃縮された。単離した化合物Ａ（請求項記載の一般式（１）の式中、Ｘが水素原子；以下、化合物Ａと省略）、および化合物Ｂ（請求項記載の一般式（１）の式中、Ｘがメトキシ基；以下、化合物Ｂと省略）のガン細胞傷害活性は、ＩＣ５０値が、それぞれ０．５、および０．７ｎｇ／ｍｌであった。
［実施例２］ガン細胞傷害活性を有する化合物の同定
メタノール抽出物を酸および塩基で処理した後、各分画のガン細胞傷害性を評価した。ガン細胞傷害活性の認められた塩基性分画は、２０ｍＭリン酸二水素カリウム緩衝液中のアセトニトリルの勾配溶媒系を有するＯＤＳカラム（Ｓｈｉｓｅｉｄｏ  Ｃａｐｓｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８，４．６ｍｍ  ｘ  ２５０ｍｍ，資生堂（株）；０〜８０分において１０〜２５％の線形勾配）上で、ＨＰＬＣにより分離した（流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、ＵＶ：２５４ｎｍ）。顕著なガン細胞傷害性が、３０〜３４分（ピークＩ）、および３４〜３８分（ピークＩＩ）の保持時間の画分で観察された。ピークＩ、およびＩＩに相当する各ガン細胞傷害性活性はそれぞれ、ＨＰＬＣへアプライした全ガン細胞傷害性の３４％、および３４％であった。５０頭のさなぎから、より多い量のガン細胞傷害性化合物を調製するために、超音波処理を２０分間３回、室温にて行い、２００ｍｌのメタノールで抽出した。メタノール抽出物を、上記のように、ｎ−ヘキサン、酸、および塩基で処理した。塩基性画分（３８．７ｍｇ）を同じ勾配溶媒システムでＨＰＬＣにより精製した。ＨＰＬＣプロフィール（図２）中のピークＩ、およびＩＩを含む画分を選択し、化合物Ａ（２．２ｍｇ）、およびＢ（３．７ｍｇ）を単離した。抽出過程および各抽出物のガン細胞傷害活性の比率を図１に示した。
上記の勾配系により、それぞれ３３．０分、および３７．０分の保持時間を示す化合物Ａ、およびＢにおいて、顕著なガン細胞傷害性が見られた。同様に、１５％アセトニトリル−２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４における化合物Ａ、およびＢの保持時間は、それぞれ１８．２分、および２３．６分であった。
更に、これらの抗腫瘍活性化合物が食草に由来するものではないことを確認するために、ツルモウリンカ（Ｔｙｌｏｐｈｏｒａ  ｔａｎａｋａｅ）の地上部のホモジェネートについて、同じ条件で抽出を行い、ＨＰＬＣ分析を行った。その結果も図２に示した。図２から明らかなように、ツルモウリンカ（Ｔｙｌｏｐｈｏｒａ  ｔａｎａｋａｅ）の抽出物には、小さいながら化合物Ｂに相当するピークが認められた。しかし化合物Ａに相当するピークは確認できなかった。
［実施例３］化合物の構造の解析
化合物Ａは、無色な微細な結晶として単離され、鉄（ＩＩ）塩化物を利用したＴＬＣ試験により、フェノール水酸基を有することが推定された。化合物ＡのＵＶスペクトルは、フェナンスロインドリジジン骨格に帰する２５９、２８５、および３１４ｎｍの吸光度を示した。化合物Ａの陽イオンＥＩ−ＭＳでは、分子イオンピークが、ｍ／ｚ３６５（Ｍ）＋に見られた。さらに、フェナンスロインドリジジンアルカロイドに特徴的な、レトロディールスアルダー反応によって生成する、ｍ／ｚ２９６（Ｍ−６９）＋フラグメントイオンピーク、およびピロリジン環に対応したｍ／ｚ７０基準ピークが見られた。これらのフラグメントはＣ１４位に水酸基の存在を示唆した。分子イオンピーク（Ｍ）＋の高分解能ＭＳ解析により、化合物Ａの分子式がＣ２２Ｈ２３ＮＯ４であることが判った。化合物Ａの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは、３，６，７−三酸化フェナンスロインドリジジンアルカロイド骨格、および２つのメトキシ基の存在を示すシグナルが見られた（δ３．９１および３．９９）。分子式を考慮すると、１つのフェノール水酸基、およびベンジル水酸基の存在が推定された。ＮＯＥＳＹ（ｎｕｃｌｅａｒ  Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ  ａｎｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）スペクトルでは、相関が、以下の間に見られた。
Ｈ−１（δ８．１３）とＨ−１４（δ４．９０）
Ｈ−１（δ８．１３）とＨ−２（δ７．０９）
Ｈ−５（δ７．９１）とＨ−４（δ７．９２）
Ｈ−５（δ７．９１）とＯＣＨ３−６（δ３．９９）
Ｈ−８（δ７．１６）とＯＣＨ３−７（δ３．９１）
Ｈ−８（δ７．１６）とＨ−９（δ４．５０）
ＯＣＨ３−６（δ３．９９）とＯＣＨ３−７（δ３．９１）
このことから、３，１４−ジヒドロキシ−６，７−ジメトキシ置換が示唆された。Ｃ−１４β−配置メチン水素に対応するδ４．９０は水酸基とカップリング（Ｊ＝９．６Ｈｚ）しており、Ｃ−１３ａ水素との結合定数がほぼ０であることから、この水素とＣ−１３ａ水素との二面角が、およそ９０度であることが示された。
以上の結果から化合物Ａは、次の構造式（１）を持つ３−デメチルチロフォリニン（３，１４α−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−６，７−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｉｎｄｏｌｉｚｉｄｉｎｅ）と決定した。この化合物は新規化合物である。
（１）
0004769959.tif 000006
化合物Ｂは、淡黄色な微細な結晶として単離され、鉄（ＩＩ）塩化物を利用したＴＬＣ試験により、フェノール水酸基を有することが推定された。化合物ＢのＵＶスペクトルは、２６１および３１９ｎｍの吸光度を示し、化合物Ａと非常に類似していた。化合物Ｂの陽イオンＥＩ−ＭＳでは、分子イオンピークが、ｍ／ｚ３９５（Ｍ）＋に見られた。さらに、ｍ／ｚ３２６（Ｍ−６９）＋フラグメントイオンピーク、およびｍ／ｚ７０基準ピークが見られた。これらのフラグメントは、フェナンスロインドリジジン骨格の特徴を表し、Ｃ−１４位の水酸基の存在を示唆した。分子イオンピーク（Ｍ）＋の高分解能ＭＳ解析により、化合物Ｂの分子式がＣ２３Ｈ２５ＮＯ５であることが判った。化合物Ｂの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは、３，４，６，７−四酸化フェナンスロインドリジジンアルカロイド構造、および３つのメトキシ基の存在を示すシグナルが見られた（δ３．８４，４．０４および４．０８）。分子式を考慮すると、１つのフェノール水酸基、およびもう一つの酸素の存在が推定された。化合物Ｂの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータは、化合物Ａと類似していたが、Ｈ−４プロトンは消失し、Ｈ−５プロトンはＣ−５位のメトキシ基の影響で、低磁場領域へとシフトした。陽イオンＥＩ−ＭＳによって推定される分子式から、化合物Ｂは、化合物ＡのＨ−４プロトンがメトキシ基へと変化したものであることが示された。以上の結果から、化合物Ｂは３−デメチル−１４α−ヒドロキシイソチロクレブリン（３，１４α−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−４，６，７−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｉｎｄｏｌｉｚｉｄｉｎｅ）であることが判明した。この化合物の構造は公知（Ａｂｅ  Ｆ．，Ｉｗａｓｅ  Ｙ．，Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ｔ．，Ｈｏｎｄａ  Ｋ．，ａｎｄ  Ｈａｙａｓｈｉ  Ｎ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９，６９５−６９９，１９９５；Ａｂｅ  Ｆ．，Ｈｉｒｏｋａｗａ  Ｍ．，Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ｔ．，Ｈｏｎｄａ  Ｋ．，Ｈａｙａｓｈｉ  Ｎ．，Ｉｓｈｉｉ  Ｍ．，Ｉｍａｇａｗａ  Ｓ．，ａｎｄ  Ｉｗａｈａｎａ  Ｍ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４６，７６７−７６９，１９９８）である。先の報告においては波照間島産のガガイモ科植物ツルモウリンカから３−デメチル−１４α−ヒドロキシイソチロクレブリンが単離され、ＮＭＲやＩＲなどの通常の物理的手法、あるいは化学的手法を用いて構造が決定された。しかし昆虫にこの構造を持つ抗腫瘍性の化合物が存在することを示唆するものではない。
本発明の化合物の物理化学的特性および分光特性は以下の通りである。
・３−デメチルチロフォリニン：
色・性状：  無色微細結晶
旋光度：  ［α］Ｄ２７＋２０．８°（ｃ＝０．１，ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ）
ＵＶ  λｍａｘ：  ＣＨ３ＣＮ−ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ５）：２５９，２８５，３１４ｎｍ
高分解能陽イオンＥＩ−ＭＳ：
理論値Ｃ２２Ｈ２３ＮＯ４（Ｍ＋）：３６５．１６２７
実測値：３６５．１６１７
陽イオンＥＩ−ＭＳ：  ３６５（１７．５），３２６（３．２），２９６（５６．２），１４８（８．０），７０（１００）
0004769959.tif 000007
0004769959.tif 000008
・３−デメチル−１４α−ヒドロキシイソチロクレブリン：
色・性状：  淡黄色微細結晶
旋光度：  ［α］Ｄ２７＋２４．０°（ｃ＝０．１，ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ）
ＵＶ  λｍａｘ：  ＣＨ３ＣＮ−ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ  ５）：２６１，３１９ｎｍ
高分解能陽イオンＥＩ−ＨＳ：
理論値Ｃ２３Ｈ２５ＮＯ５（Ｍ＋）：３９５．１７３２
実測値：３９５．１７３０
陽イオンＥＩ−ＭＳ：  ３９５（２４．５），３７９（４．１），３２６（５８．６），３１１（１４．８），２９６（５．６），２５５（４．３），１４９（７．３），７０（１００）
0004769959.tif 000009
［実施例４］
３種類のヒト癌細胞株、Ａ５４９（肺癌細胞株）、ＤＬＤ−１（大腸癌細胞株）及びＫ５６２（白血病細胞株）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，米国）より入手した。Ｈｅｌａ  子宮頸部癌細胞株は、理研細胞バンク（つくば、日本）より入手した。浮遊細胞であるＫ５６２は、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，米国）添加ＲＰＭＩ−１６４０培地中に２．５×１０３細胞を含む細胞懸濁液１００μｌを、９６ウェルプレートの各ウェルに分配した。直ちに各ウエルに滅菌した試験化合物を加え、５％炭酸ガス存在下３７℃で９６時間処理した。付着細胞であるＡ５４９、ＤＬＤ−１、Ｈｅｌａ、及びＴＭＫ−１については、同培地中に１×１０３細胞を含む細胞懸濁液１００μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに分配した。２４時間後に培地を交換し、各細胞に滅菌した試験化合物を加え、５％炭酸ガス存在下３７℃で９６時間処理した。これらの処理を行った後、細胞傷害性の効果をＷＳＴ−１｛２−（４−ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，熊本、日本｝アッセイにより計測した。
化合物Ａを試験化合物として用いた場合、ＩＣ５０（ｎｇ／ｍｌ）値は、Ａ５４９（肺癌細胞株）で０．４、ＤＬＤ−１（大腸癌細胞株）で０．５、Ｈｅｌａ（子宮頸部癌細胞株）で０．８、Ｋ５６２（白血病細胞株）で０．４を示した。一方、化合物ＢのＩＣ５０（ｎｇ／ｍｌ）値は、Ａ５４９癌細胞で０．５、ＤＬＤ−１で０．８、Ｈｅｌａで１．０、Ｋ５６２で０．５を示した。
産業上の利用の可能性
本発明は、これまで抗腫瘍化合物の探索が試みられたことの少ない昆虫に由来する化合物を有効成分とする新規な抗腫瘍剤を提供した。本発明は、新たな構造に抗腫瘍活性を見出した点において新規であり、抗腫瘍活性を期待できる新たな構造を報告した点において大きな意義を持つ。
【図面の簡単な説明】
図１は、リュウキュウアサギマダラのさなぎからの抽出物を得る工程、および各抽出物のガン細胞傷害活性の比率を示す図。
図２は、リュウキュウアサギマダラのさなぎ、成虫、およびツルモウリンカからの抽出物の塩基性画分における、ＨＰＬＣプロフィールを示す図。横軸は保持時間（分）を、縦軸はＨＰＬＣのシグナル（２５４ｎｍにおける吸光度）を表す。
【図１】
0004769959.tif 000011
【図２】
0004769959.tif 000012